(57)【要約】　　　（修正有）【課題】カフェイン生合成反応系にて、これらの反応をそれぞれ触媒する酵素、及びこれら酵素をそれぞれコードする遺伝子の複合的な利用方法を提供する。【解決手段】酵素ａ．ｃ．ｄ．及び細胞抽出物ｂ．の２つ以上の組合せの下に、生体外で、キサントシンのメチル化、７−メチルキサントシンの脱リボース化、７−メチルキサンチンのメチル化及び／又はテオブロミンのメチル化を行うことによって、７−メチルキサンチン、テオブロミンまたはカフェインを生産する方法である。ａ．プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒し配列１に示すアミノ酸配列を有する酵素、ｂ．プリン環の９位での７−メチルキサントシンの脱リボース化を触媒し、大腸菌から得られる細胞粗抽出物、ｃ．プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒し配列４に示すアミノ酸配列を有する酵素、ｄ．プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒し特定のアミノ酸配列を有する酵素。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の酵素（ａ）　（ｃ）　（ｄ）　及び細胞抽出物（ｂ）　の２つ以上の組み合わせの触媒作用の下に、生体外で、プリン環の７位でのキサントシンのメチル化、プリン環の９位での７−メチルキサントシンの脱リボース化、プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化、及び／又は、プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を行うことによって、７−メチルキサンチン、テオブロミン又はカフェインを生産する方法。
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する活性を有し、配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する酵素、
（ｂ）　プリン環の９位での７−メチルキサントシンの脱リボース化を触媒する活性を有し、大腸菌から得られる細胞粗抽出物、
（ｃ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する活性を有し、配列表の配列番号：４に示すアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する活性を有し、配列表の配列番号：７に示すアミノ酸配列を有する酵素。
【請求項２】
酵素（ａ）　（ｃ）　（ｄ）　及び細胞抽出物（ｂ）　の少なくとも１つをこれらと同等の活性を有するものと代替する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
下記のＤＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の（ａ）　＋（ｂ）　の組み合わせ又は（ａ）　＋（ｂ）　＋（ｃ）　の組み合わせを、キサントシンを生合成しかつ７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性を有する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法。
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：２に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：８に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子。
【請求項４】
下記のＤＮＡ　分子（ｂ）　と（ｃ）　の組み合わせを、７−メチルキサンチンを生合成する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法。
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：８に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子。
【請求項５】
下記のＤＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の２つ以上の組み合わせを、テオブロミン又はカフェインを生合成する宿主生物内で発現させ、テオブロミン又はカフェインの生成量を改変する方法。
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：２に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：８に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子。
【請求項６】
ＤＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の少なくとも１つをこれらと同等の機能を有するもので代替する請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
下記のＲＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の（ａ）　＋（ｂ）　の組み合わせ又は（ａ）　＋（ｂ）　＋（ｃ）　の組み合わせを、キサントシンを生合成しかつ７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性を有する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法。
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：３に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：６に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：９に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子。
【請求項８】
下記のＲＮＡ　分子（ｂ）　と（ｃ）　の組み合わせを、７−メチルキサンチンを生合成する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法。
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：６に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：９に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子。
【請求項９】
下記のＲＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の２つ以上の組み合わせを、テオブロミン又はカフェインを生合成する宿主生物内で発現させ、テオブロミン又はカフェインの生成量を改変する方法。
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：３に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：６に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：９に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子。
【請求項１０】
ＲＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の少なくとも１つをこれらと同等の機能を有するもので代替する請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
宿主生物が植物であり、テオブロミン又はカフェインを生産又は増産することによって宿主植物を草食動物の食害から防御する、請求項３〜１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、キサントシンから７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミンを経てカフェインが生合成される一連の反応系の各工程を触媒するキサントシンメチル化酵素、７−メチルキサンチンメチル化酵素（テオブロミン合成酵素）及び３，７−ジメチルキサンチンメチル化酵素（カフェイン合成酵素）、及びこれら酵素をコードする複数のカフェイン生合成系遺伝子の複合的な利用方法、すなわち上記複数の酵素を２以上組み合わせて用いる方法、及び上記複数のカフェイン生合成系遺伝子を２以上組み合わせて用いる方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
カフェインはコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　）、コラ（Ｃｏｌａ　ａｃｕｍｉｎａｔｅ）及びマテ（Ｉｌｅｘ　ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ　）などの植物種において生合成されるプリンアルカロイドである。カフェインは中枢神経興奮作用などの様々な薬理作用を有するため医薬品として広く利用されている。また、この化合物は昆虫などに対する摂食忌避効果や殺虫効果を有するため、農薬として利用され得る可能性が示唆されている。
【０００３】
現在、カフェインは上記の植物から抽出するか化学合成することによって製造されている。そこで、より安価で大規模にカフェインを供給するために、遺伝子組換え技術を利用して、本来カフェインを生合成しない微生物又は植物にカフェインを生産させる技術を開発することが望まれている。また、植物においてカフェインを生産させる技術は、植物を直接的に草食動物の食害から防御するための方法としても期待される。
【０００４】
【従来の技術】
コーヒーノキやチャノキでは、アデニンヌクレオチド及びグアニンヌクレオチドの異化代謝中間産物であるキサントシンを出発材料として、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミンを経てカフェインが生合成される（図１）。この一連の反応はキサントシンメチル化酵素、７−メチルキサントシン脱リボース化酵素、テオブロミン合成酵素及びカフェイン合成酵素によって触媒される。テオブロミン合成酵素をコードするＣａＭＸＭＴ　ｃＤＮＡ　は既にコーヒーノキから単離されている（Ｏｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７６，　８２１３−８２１８（２００１）参照）。また、特開２００１−３７４９０号公報では、７−メチルキサンチン→テオブロミン→カフェインの２段階のメチル化反応を触媒するメチル化酵素のアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列が記載されている。更に、同公報ではメチルキサンチン類（７−メチルキサンチン、パラキサンチン、テオブロミン及びカフェイン）を生合成する植物において、該塩基配列を有するＤＮＡ　を導入することによって、メチルキサンチン類の組成を改変する方法が記載されている。しかしながら、本来メチルキサンチン類を生合成できない生物種においてこれらの化合物を生産させる技術は、未だ知られていない。
【０００５】
【発明の課題】
本発明はキサントシンから７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミンを経てカフェインが生合成される一連の反応において、これらの反応をそれぞれ触媒する酵素、及びこれら酵素をそれぞれコードする遺伝子の複合的な利用方法を提供することを目的とする。例えば、本発明によって以下の目的を達成することが可能になる。（１）　上記一連のカフェイン生合成反応系の各工程をそれぞれ触媒する複数の酵素を２以上組み合わせて用いてキサントシンからメチルキサンチン類（７−メチルキサンチン、テオブロミン又はカフェイン）を生産する。（２）　本来メチルキサンチン類を生合成しない生物の代謝を改変して、これらの化合物を生産させる。（３）　上記（２）　の方法により、植物を草食動物による食害から防御する。
【０００６】
【課題の解決手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく研究を重ねた結果、つぎの知見を得た。まず、配列表の配列番号：２、５及び８に示す塩基配列を有するＤＮＡ　断片をＰＣＲ　により増幅した。次に、これらのＤＮＡ　断片を発現ベクターに組み込んだ後、得られた組換えベクターを大腸菌に導入し、当該ＤＮＡ　に由来する組換えタンパク質を大量に発現させた。この組換えタンパク質を粗抽出又は精製して、その酵素学的性質を調べたところ、配列番号：２に由来するものはキサントシンのメチル化による７−メチルキサントシンの生成反応を触媒することを認め、配列番号：５に由来するものは７−メチルキサンチンのメチル化によるテオブロミンの生成反応を触媒することを認め、配列番号：８に由来するものはテオブロミンのメチル化によるカフェインの生成反応を触媒することを認めた。すなわち、当該ＤＮＡ　群はそれぞれ、キサントシンメチル化酵素、テオブロミン合成酵素及びカフェイン合成酵素をコードすることが確認された。また、大腸菌の細胞抽出物は７−メチルキサントシンの脱リボース化による７−メチルキサンチンの生成反応を触媒することを認めた。すなわち、本来メチルキサンチン類を生合成しない大腸菌の細胞抽出物も７−メチルキサントシン脱リボース化酵素（７−メチルキサントシン加水分解酵素又は７−メチルキサントシン加リン酸分解酵素）活性を有することが認められた。更に、上記の３種類の組換えタンパク質と大腸菌細胞抽出物の混合物はキサントシンからカフェインへの生成反応を触媒することを認めた。すなわち、３つの当該メチル化酵素活性と１つの当該脱リボース化酵素活性を用いて、生体外すなわち無細胞系において、カフェイン生合成経路を再構成できる、すなわち人工的に構成できることが確認された。
【０００７】
上記のカフェイン生合成経路の再構成に用いる酵素及び細胞抽出物は、これらと同等の活性を有するものであればいずれの生物に由来するものであっても適用し得る。例えば、コーヒーノキ由来のテオブロミン合成酵素とカフェイン合成酵素の代わりに、特開２００１−３７４９０号公報に記載されている、チャノキ由来の７−メチルキサンチン→テオブロミン→カフェインの２段階のメチル化反応を触媒するメチル化酵素を利用することができる。
【０００８】
また、カフェイン生合成経路の再構成は、上記の酵素及び細胞抽出物を用いて無細胞系で行うだけでなく、これらの酵素をコードする遺伝子をいずれかの生物種へ導入した形質転換生物系においても行うことができる。カフェイン生合成の出発材料となるキサントシンはプリンヌクレオチド異化代謝の中間産物として、コーヒーノキやチャノキのみならず、広範囲の生物種において存在している。また、プリンヌクレオシド脱リボース化酵素は一般的に特定のプリンヌクレオシド誘導体だけでなく、様々なプリンヌクレオシド誘導体に対しても反応することが知られており（Ｇｕｒａｎｏｗｓｋｉ，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　７０，　３４４−３４９　（１９８２）；　Ｐａｒｋｉｎ，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７１，　２１７１３−２１７１９　（１９９６）；　Ｏｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６７，　１７８３−１７８７　（２００１）　参照）、７−メチルキサントシンの脱リボース化反応は生物一般が有しているプリンヌクレオシド脱リボース化酵素によって触媒され得ると考えられる。このことは、本来メチルキサンチン類を生合成しない大腸菌が７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性を有していることからも容易に考えることができる（本明細書の実施例を参照）。すなわち、広範囲の生物種において、キサントシンメチル化酵素遺伝子、テオブロミン合成遺伝子及びカフェイン合成遺伝子を導入し、発現させることによって、カフェイン生合成経路を再構成することができる。
【０００９】
本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１１】
本発明の第１のものは、下記の酵素（ａ）　（ｃ）　（ｄ）　及び細胞抽出物（ｂ）　の２つ以上の組み合わせの触媒作用の下に、生体外で、プリン環の７位でのキサントシンのメチル化、プリン環の９位での７−メチルキサントシンの脱リボース化、プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化、及び／又は、プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を行うことによって、７−メチルキサンチン、テオブロミン又はカフェインを生産する方法である。
【００１２】
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する活性を有し、配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する酵素、
（ｂ）　プリン環の９位での７−メチルキサントシンの脱リボース化を触媒する活性を有し、大腸菌から得られる細胞粗抽出物、
（ｃ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する活性を有し、配列表の配列番号：４に示すアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する活性を有し、配列表の配列番号：７に示すアミノ酸配列を有する酵素。
【００１３】
第１発明において、酵素（ａ）　（ｃ）　（ｄ）　及び細胞抽出物（ｂ）　の少なくとも１つをこれらと同等の活性を有するものと代替することもできる。
【００１４】
つぎに、本発明による形質転換生物系のカフェイン生合成経路の再構成法に関する第２〜８発明について説明をする。
【００１５】
本発明の第２のものは、下記のＤＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の２以上の組み合わを宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法に関するものであり、より詳しくは、下記のＤＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の（ａ）　＋（ｂ）　の組み合わせ又は（ａ）　＋（ｂ）　＋（ｃ）　の組み合わせを、キサントシンを生合成しかつ７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性を有する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法である。
【００１６】
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：２に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：８に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子。
【００１７】
本発明の第３のものは、下記のＤＮＡ　分子（ｂ）　と（ｃ）　の組み合わせを、７−メチルキサンチンを生合成する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法である。
【００１８】
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：８に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子。
【００１９】
本発明の第４のものは、下記のＤＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の２つ以上の組み合わせを、テオブロミン又はカフェインを生合成する宿主生物内で発現させ、テオブロミン又はカフェインの生成量を改変する方法である。
【００２０】
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：２に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：８に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子。
【００２１】
第２〜４発明において、ＤＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の少なくとも１つをこれらと同等の機能を有するもので代替することもできる。
【００２２】
本発明の第５のものは、下記のＲＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の２以上の組み合わを宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法に関するものであり、より詳しくは、下記のＲＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の（ａ）　＋（ｂ）　の組み合わせ又は（ａ）　＋（ｂ）　＋（ｃ）　の組み合わせを、キサントシンを生合成しかつ７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性を有する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法である。
【００２３】
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：３に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：６に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：９に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子。
【００２４】
本発明の第６のものは、下記のＲＮＡ　分子（ｂ）　と（ｃ）　の組み合わせを、７−メチルキサンチンを生合成する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法である。
【００２５】
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：６に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：９に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子。
【００２６】
本発明の第７のものは、下記のＲＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の２つ以上の組み合わせを、テオブロミン又はカフェインを生合成する宿主生物内で発現させ、テオブロミン又はカフェインの生成量を改変する方法である。
【００２７】
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：３に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：６に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：９に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子。
【００２８】
第５〜７発明において、ＲＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の少なくとも１つをこれらと同等の機能を有するもので代替することもできる。
【００２９】
本発明の第８のものは、第２〜７発明において、宿主生物が植物であり、テオブロミン又はカフェインを生産又は増産することによって宿主植物を草食動物の食害から防御する、方法である。
【００３０】
【発明の実施の形態】
第１発明は、無細胞系のカフェイン生合成経路の再構成法に関するものであり、下記の酵素（ａ）　（ｃ）　（ｄ）　及び細胞抽出物（ｂ）　の２つ以上の組み合わせの触媒作用の下に、生体外で、プリン環の７位でのキサントシンのメチル化、プリン環の９位での７−メチルキサントシンの脱リボース化、プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化、及び／又は、プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を行うことによって、７−メチルキサンチン、テオブロミン又はカフェインを生産する方法である。
【００３１】
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する活性を有し、配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する酵素、
（ｂ）　プリン環の９位での７−メチルキサントシンの脱リボース化を触媒する活性を有し、大腸菌から得られる細胞粗抽出物、
（ｃ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する活性を有し、配列表の配列番号：４に示すアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する活性を有し、配列表の配列番号：７に示すアミノ酸配列を有する酵素。
【００３２】
本明細書では上記キサントシンのメチル化を触媒するキサントシンメチル化酵素、７−メチルキサンチンのメチル化を触媒するテオブロミン合成酵素、及びテオブロミンのメチル化を触媒するカフェイン合成酵素をカフェイン合成系メチル化酵素と総称する。
【００３３】
第１発明において、酵素（ａ）　（ｃ）　（ｄ）　及び細胞抽出物（ｂ）　の少なくとも１つをこれらと同等の活性を有するものと代替することもできる。例えば、コーヒーノキ由来のテオブロミン合成酵素とカフェイン合成酵素の代わりに、特開２００１−３７４９０号公報に記載されている、チャノキ由来の７−メチルキサンチン→テオブロミン→カフェインの２段階のメチル化反応を触媒するメチル化酵素を利用することができる。
【００３４】
本明細書では上記の（ａ）　及びこれと同等のものをキサントシンメチル化酵素、（ｂ）　及びこれと同等のものを７−メチルキサントシン脱リボース化酵素、（ｃ）　及びこれと同等のものをテオブロミン合成酵素、（ｄ）　及びこれと同等のものをカフェイン合成酵素とそれぞれ総称する。
【００３５】
上記の酵素及び細胞抽出物の組み合わせの例として、キサントシンからカフェインを合成するためには　（ａ）＋（ｂ）＋（ｃ）＋（ｄ）の組み合わせ、キサントシンからテオブロミンを合成するためには　（ａ）＋（ｂ）＋（ｃ）の組み合わせ、７−メチルキサンチンからカフェインを合成するためには　（ｃ）＋（ｄ）の組み合わせを挙げることができる。
【００３６】
本発明による形質転換生物系のカフェイン生合成経路の再構成法に関する第２発明は、下記のＤＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の（ａ）　＋（ｂ）　の組み合わせ又は（ａ）　＋（ｂ）　＋（ｃ）　の組み合わせを、キサントシンを生合成しかつ７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性を有する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法である。
【００３７】
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：２に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：８に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子。
【００３８】
第２発明において、キサントシンからカフェインを合成するためには　（ａ）＋（ｂ）＋（ｃ）の組み合わせ、キサントシンからテオブロミンを合成するためには　（ａ）＋（ｂ）の組み合わせが用いられる。
【００３９】
第３発明は、下記のＤＮＡ　分子（ｂ）　と（ｃ）　の組み合わせを、７−メチルキサンチンを生合成する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法である。
【００４０】
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：８に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子。
【００４１】
第４発明は、下記のＤＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の２つ以上の組み合わせを、テオブロミン又はカフェインを生合成する宿主生物内で発現させ、テオブロミン又はカフェインの生成量を改変する方法である。
【００４２】
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：２に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：８に示す塩基配列を有するＤＮＡ　分子。
【００４３】
第２〜４発明において、ＤＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の少なくとも１つをこれらと同等の機能を有するもので代替することもできる。
【００４４】
第２〜４発明では、プリン環の７位でのキサントシンのメチル化、プリン環の９位での７−メチルキサントシンの脱リボース化、プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化、及び／又は、プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化により、７−メチルキサンチン、テオブロミン又はカフェインが得られる。
【００４５】
第５発明は、下記のＲＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の（ａ）　＋（ｂ）　の組み合わせ又は（ａ）　＋（ｂ）　＋（ｃ）　の組み合わせを、キサントシンを生合成しかつ７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性を有する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法である。
【００４６】
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：３に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：６に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：９に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子。
【００４７】
第５発明において、キサントシンからカフェインを合成するためには　（ａ）＋（ｂ）＋（ｃ）の組み合わせ、キサントシンからテオブロミンを合成するためには　（ａ）＋（ｂ）の組み合わせが用いられる。
【００４８】
第６発明は、下記のＲＮＡ　分子（ｂ）　と（ｃ）　の組み合わせを、７−メチルキサンチンを生合成する宿主生物内で発現させ、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産する方法である。
【００４９】
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：６に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：９に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子。
【００５０】
第７発明は、下記のＲＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の２つ以上の組み合わせを、テオブロミン又はカフェインを生合成する宿主生物内で発現させ、テオブロミン又はカフェインの生成量を改変する方法である。
【００５１】
（ａ）　プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：３に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｂ）　プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：６に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子、
（ｃ）　プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードし、配列表の配列番号：９に示す塩基配列を有するＲＮＡ　分子。
【００５２】
第５〜７発明において、ＲＮＡ　分子（ａ）　（ｂ）　（ｃ）　の少なくとも１つをこれらと同等の機能を有するもので代替することもできる。
【００５３】
第５〜７発明では、プリン環の７位でのキサントシンのメチル化、プリン環の９位での７−メチルキサントシンの脱リボース化、プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化、及び／又は、プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化により、７−メチルキサンチン、テオブロミン又はカフェインが得られる。
【００５４】
本発明の第８のものは、第２〜７発明において、宿主生物が植物であり、テオブロミン又はカフェインを生産又は増産することによって宿主植物を草食動物の食害から防御する、方法である。
【００５５】
上記のカフェイン生合成系メチル化酵素をコードするＤＮＡ　分子は、例えば、これに特異的にハイブリダイズするオリゴ塩基をプライマーとして用いたＰＣＲ　技術（植物のＰＣＲ　実験プロトコール（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ２）秀潤社（１９９５））を利用して、カフェイン生合成系メチル化酵素を生産する生物から分離することができる。
【００５６】
更に、上記のカフェイン生合成系メチル化酵素をコードするＤＮＡ　分子は、これの全長又は一部をプローブに用いて、カフェイン生合成系メチル化酵素を生産する生物由来のｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックライブラリーをハイブリダイゼーションスクリーニング（バイオ実験イラストレイテッド４、苦労なしのクローニング（細胞工学別冊、目で見る実験ノートシリーズ）秀潤社（１９９７））することによっても分離することができる。
【００５７】
この様なＰＣＲ　技術やハイブリダイゼーションスクリーニング、又は他の方法によって得られるカフェイン生合成系メチル化酵素をコードするＤＮＡ　分子は、これの翻訳産物が目的とするメチル化酵素活性を有していれば如何なる塩基配列であってもよく、必ずしも、配列番号：２、５又は８のいずれかの塩基配列と相同性を有する必要はない。
【００５８】
上記のカフェイン生合成系メチル化酵素をコードするＤＮＡ　分子を分離するために用いる生物は、メチルキサンチン類を生成する生物であればいずれも使用できるが、配列番号：２、５又は８のいずれかの塩基配列を有するＤＮＡ　分子、又はこれらと相同性を有するＤＮＡ　分子を分離するためには、コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属植物及びカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ　）属植物などが好ましい。
【００５９】
上記のカフェイン生合成系メチル化酵素をコードするＲＮＡ　分子は、Ｓｐ６　ＲＮＡ　プロモーターやＴ７プロモーターといったＲＮＡ　ポリメラーゼが認識するプロモーターの下流に、上記の方法で得たカフェイン生合成系メチル化酵素ＤＮＡ　を連結し、これをＳｐ６　ＲＮＡ　ポリメラーゼやＴ７　ＲＮＡポリメラーゼなどで転写させて得ることができる。また、動物又は植物ウイルスにカフェイン生合成系メチル化酵素をコードするＤＮＡ　又はＲＮＡ　を挿入するか、後で述べる様に適当な遺伝子発現カセットにカフェイン生合成系メチル化酵素ＤＮＡ　を挿入することによって組換え分子を形成し、この組換え分子を宿主生物に導入することにより、宿主生物の転写活性を利用してを得ることもできる。
【００６０】
上記のカフェイン生合成系メチル化酵素をコードするＤＮＡ　分子又はＲＮＡ　分子から組換えタンパク質を発現、調製するためには、１）原核細胞発現系、２）酵母発現系、３）植物細胞発現系、４）昆虫細胞発現形、５）哺乳類細胞発現系、６）Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　転写／　翻訳系、などを利用することができる。
【００６１】
上記の組換えタンパク質の精製試料を得るためには１）原核細胞発現系が最も有用であり、例えば、ＧＳＴ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）　を用いた場合、ベクターの構築から組換えタンパク質の発現及び精製までを全て付属の説明書に従って行うことができる。
【００６２】
上記のカフェイン生合成系メチル化酵素をコードするＤＮＡ　分子又はＲＮＡ　分子の機能を同定するためには、上記の方法で組換えタンパク質（粗抽出物又は精製物）を調製し、組換えタンパク質、メチル基受容体（キサントシン、７−メチルキサンチン又はテオブロミン）及びメチル基供与体（Ｓ−アデノシル−Ｌ−　メチオニン）からなる酵素反応液をインキュベーションし、この酵素反応液中の生成物をＴＬＣ　解析又はＨＰＬＣ解析する方法が行われる（本明細書の実施例を参照）。
【００６３】
上記のカフェイン生合成系メチル化酵素をコードするＤＮＡ　分子又はＲＮＡ　分子の複合利用によってカフェイン生合成経路を再構成できるかどうかは、上記の方法で組換えタンパク質（粗抽出物又は精製物）を調製し、２種類以上の組換えタンパク質、メチル基受容体（キサントシン又は７−メチルキサンチン）及びメチル基供与体（Ｓ−アデノシル−Ｌ−　メチオニン）からなる酵素反応液をインキュベーションし、この酵素反応液中の生成物をＴＬＣ　解析又はＨＰＬＣ解析することによって調べることができる（本明細書の実施例を参照）。
【００６４】
本発明による形質転換生物系のカフェイン生合成経路の再構成法は、１）キサントシンを生合成し、７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性を有する、又は２）７−メチルキサンチンを生合成する、の何れかの条件を満たす生物種であれば宿主として利用できる。
【００６５】
上記の条件を満たす生物種の中でも、植物一般はメチルキサンチン類の毒性に対して比較的強く、宿主として適している。
【００６６】
本発明による形質転換生物系のカフェイン生合成経路の再構成法について、宿主として植物を利用した例を以下に説明する。
【００６７】
植物における遺伝子発現は、１）宿主細胞内でのＤＮＡ　からｍＲＮＡへの転写を可能とするプロモーター、２）プロモーターの下流にセンス方向で連結したカフェイン生合成系メチル化酵素ＤＮＡ　、３）必要に応じて該ＤＮＡ　の下流に連結された転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列、などを含む発現カセットを植物細胞に導入して、これを形質転換する方法が利用できる。
【００６８】
上記の発現カセットは、挿入されているＤＮＡ　を恒常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有し得る。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ　プロモーター、イネのアクチン遺伝子プロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、病原菌の感染や侵入によって活性化するイネのキチナーゼ遺伝子プロモーターやタバコのＰＲタンパク質遺伝子プロモーター、傷害によって活性化するタバコのＷＩＰＫ遺伝子プロモーターなどが挙げられる。
【００６９】
植物細胞の中に発現カセットを導入するためには、様々な手法を用いることができる。これらの手法には、直接導入法（パーティクルボンバードメント法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法）、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）を用いたＴ−ＤＮＡ　導入法、及びその他の可能性が含まれる。
【００７０】
直接導入法では特別に必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ　誘導体の様な単純なプラスミドを用いることができる。Ｔ−ＤＮＡ　導入法ではＴ−ＤＮＡ　のボーダー配列を含有するバイナリーベクターなどを用いる必要がある。
【００７１】
発現カセットの導入により形質転換された植物細胞は、常法に従って再生過程を経ることにより植物組織又は植物体に変換することができる。
【００７２】
カフェイン生合成経路を再構成するためには、植物細胞に２種類以上の発現カセットを導入する必要がある。
【００７３】
直接導入法を用いた場合、複数種類の発現カセットを含有する単一のベクター、又は、単一又は複数の発現カセットを含有する複数のベクターを植物細胞に導入することによって、カフェイン生合成経路を再構成した形質転換体を得ることができる。また、単一又は複数の発現カセットを含有する単一のベクターを植物細胞に導入し、得られた形質転換体を他の形質転換体と交配することによっても、カフェイン生合成経路を再構成した形質転換体を得ることができる。
【００７４】
Ｔ−ＤＮＡ　導入法を用いた場合、複数種類の発現カセットを含有する単一のＴ−ＤＮＡ　を導入することによって、カフェイン生合成経路を再構成した形質転換体を得ることができる。また、単一又は複数の発現カセットを含有する単一のＴ−ＤＮＡ　を植物細胞に導入し、得られた形質転換体を他の形質転換体と交配することによっても、カフェイン生合成経路を再構成した形質転換体を得ることができる。
【００７５】
これらの方法により作出された植物体（組織や細胞を含む）又はその繁殖媒体（種子、塊茎、切穂など）から得られた植物体は、カフェイン生合成経路が再構成され、メチルキサンチン類すなわち７−メチルキサンチン、テオブロミン、カフェインのうち少なくとも一つを生成する。
【００７６】
カフェイン生合成経路が再構成された植物における、メチルキサンチン類の生成量や生成比などはＨＰＬＣ解析によって調べることができる。このＨＰＬＣ解析は本明細書の実施例において示したものと同様の条件によって行うことができる。
【００７７】
カフェイン生合成経路の再構成によってテオブロミン又はカフェインを生成する植物は、草食動物（昆虫類、ナメクジ及びカタツムリなど）に対して摂食忌避効果及び殺虫効果を有している。すなわち、この植物は農薬の効果を内在している。
【００７８】
【実施例】
本発明を下記の実施例により具体的に説明する。ただし、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
【００７９】
（１）　　コーヒーノキ由来ｍＲＮＡからの二重鎖ｃＤＮＡの合成
５ｇのコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ　ａｒａｂｉｃａ）未熟果実からＣＴＡＢ法（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｐ．，　１１，　１１３−１１６（１９９３）参照）によってｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。１００μｇのｔｏｔａｌＲＮＡからＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＩＩＩ　（Ｐｒｏｍｅ　ｇａ）を用いてｍＲＮＡを精製した。５μｇのｍＲＮＡとＺＡＰ−ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　を用いて二重鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００８０】
（２）　ＣａＭＸＭＴ　ｃＤＮＡ及びＣａＭＴＬ３　ｃＤＮＡ　と相同性を有する新規ｃＤＮＡの単離
ＣａＭＸＭＴ　ｃＤＮＡ　（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＡＢ０４８７９４）及びＣａＭＴＬ３　ｃＤＮＡ　（配列番号：５、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＡＢ０４８７９３）の保存配列を基に設計したＣａＣＳ−Ｎ２　プライマー（５−ＡＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＴＣＣＴ−３）とＣａＣＳ−Ｃ１　プライマー（５−ＣＴＴＴＴＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧ−３）　を合成した。上記ｃＤＮＡ、上記プライマー及びＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造）を用いてＰＣＲ　を行い、ｃＤＮＡ断片群を増幅した。このｃＤＮＡ断片群をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ−　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　のＥｃｏＲＶ　サイトへ挿入し、プラスミドライブラリーを作成した。プラスミドライブラリーの中から無作為に選択したプラスミドクローンについて塩基配列決定を行い、ＣａＭＴＬ３　ｃＤＮＡ　（配列番号：２）及びこれと高い相同性を有する新規なＣａＭＴＬ４　ｃＤＮＡ　（配列番号：５）及びＣａＭＴＬ５　ｃＤＮＡ　（配列番号：８）を単離した。
【００８１】
（３）　ＧＳＴ　融合タンパク質発現ベクターの構築
ＣａＭＴＬ３　ｃＤＮＡ、ＣａＭＴＬ４　ｃＤＮＡ　及びＣａＭＴＬ５　ｃＤＮＡ　をプラスミドクローンから切り出し、それぞれをｐＧＥＸ−４Ｔ−２　ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ　）遺伝子の下流に挿入した。以上の操作によって、ＧＳＴ　とＣａＭＴＬ３の融合タンパク質（ＧＳＴ−ＭＴＬ３）を発現させるためのｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ３　ベクター、ＧＳＴ　とＣａＭＴＬ４の融合タンパク質（ＧＳＴ−ＭＴＬ４）を発現させるためのｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ４　ベクター、及びＧＳＴ　とＣａＭＴＬ５の融合タンパク質（ＧＳＴ−ＭＴＬ５）を発現させるためのｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ５　ベクターを構築した。こうして得られたｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ３　ベクター、ｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ４　ベクター及びｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ５　ベクターを図２に模式的に示す。図２中、各ベクターは、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）によって制御されるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子（ＧＳＴ　）の下流に、推定メチル化酵素遺伝子（ＭＴＬ　）であるＣａＭＴＬ３　ｃＤＮＡ　（配列番号：２）、ＣａＭＴＬ４　ｃＤＮＡ　（配列番号：５）又はＣａＭＴＬ５　ｃＤＮＡ　（配列番号：８）を連結して構築したものである。
【００８２】
（４）　組換えタンパク質の生産
ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ３　、ｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ４　及びｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ５　によって大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。いずれの形質転換株も１００ｍＬ　の２ｘＹＴ　液体培地（１００ｍｇ／Ｌ　のアンピシリンを含む）において、培養の吸光度（Ａ６００）が約０．７　になるまで３７℃で振盪培養を行った。これらの培養に終濃度が１ｍＭ　になる様にイソプロピル−β−Ｄ−　チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に２０℃で１６時間、振盪培養を行った。以上の操作によって、大腸菌において組換えタンパク質（ＧＳＴ　、ＧＳＴ−ＭＴＬ３、ＧＳＴ−ＭＴＬ４及びＧＳＴ−ＭＴＬ５）の生産を行った。
【００８３】
（５）　組換えタンパク質の粗抽出と精製
組換えタンパク質を生産した大腸菌を遠心分離によって回収し、１０ｍＬの破砕洗浄液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ジチオスレイトール）に懸濁した。以降の操作は氷上又は４℃で行った。得られた懸濁液を超音波破砕処理した後、終濃度が１％になる様にＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を加えて３０分間インキュベーションした。得られた破砕液を遠心分離によって上清と沈殿に分離し、この上清を　　組換えタンパク質の粗抽出試料とした。粗抽出資料に１００　μＬ　のグルタチオンセファロース４Ｂ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加え、全体を３０分間穏やかに撹拌した。組換えタンパク質が結合したグルタチオンセファロース４Ｂ樹脂を遠心分離によって回収し、１ｍＬ　の破砕洗浄液で３回洗浄した後、同樹脂に１００　μＬ　の溶離液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．５］　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ジチオスレイトール、１０ｍＭグルタチオン）を加えてこの混合物を１５分間穏やかに撹拌した。混合物から溶出液を遠心分離によって回収し、これを組換えタンパク質の精製試料とした。粗抽出試料及び精製試料に組換えタンパク質が含まれていることをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析による組換えタンパク質の検出結果を図３に示す。
【００８４】
（６）　薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ　）による酵素反応生成物の同定
精製ＧＳＴ　、粗抽出ＧＳＴ　、精製ＧＳＴ−ＭＴＬ３、粗抽出ＧＳＴ−ＭＴＬ３，　精製ＧＳＴ−ＭＴＬ４、精製ＧＳＴ−ＭＴＬ５について、以下の酵素反応実験及びＴＬＣ　解析を行った。１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］　、２００　μＭ　ＭｇＣｌ２　、５００　μＭ　基質（キサントシン［ＸＲ］、７−メチルキサンチン［７ｍＸ］　又はテオブロミン［Ｔｂ］）、１６．８μＭ　Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−　１４Ｃ］メチオニン［ＳＡＭ］［２．２ＧＢｑ／ｍｍｏｌ；　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ］及び組換えタンパク質試料（５０μｇ　の粗抽出試料又は５　μｇ　の精製試料）からなる酵素含有混合液２５μＬ　を２７℃で１６時間インキュベーションした。
【００８５】
インキュベーション後の酵素反応液をフィルターカップ（ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ−ＭＣ　１０，０００　ＮＭＷＬ；　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　）によって濾過した。２　μＬ　の濾過液を２　μＬ　のメタノールと混合し、得られた混合液をＴＬＣ　プレート（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ　６０　Ｆ２５４；　Ｍｅｒｃｋ）に点着した。
【００８６】
又はインキュベーション後の酵素反応液に２５０　μＬ　のクロロホルムを加えて全体を激しく撹拌し、クロロホルム層を回収し、濃縮乾固することによって反応生成物を精製した。この精製物を４　μＬ　の５０％　メタノールに懸濁し、ＴＬＣ　プレートに点着した。
【００８７】
酵素反応液及びその精製物の代わりに標品として７−メチルキサントシン［７ｍＸＲ］　、［７ｍＸ］　、［Ｔｂ］、カフェイン［Ｃｆ］及びＳ−アデノシル−Ｌ−　メチオニン［ＳＡＭ］　（それぞれ１ｍＭ　水溶液）を用いて上記と同様のＴＬＣ　解析を行った。４　μＬ　の標品と４　μＬ　のメタノールの混合液をＴＬＣ　プレートに点着した。
【００８８】
その後、展開溶媒として水／　酢酸／ｎ−　ブタノール（２：１：４，　ｖ／ｖ／ｖ）を用いて１．５　時間展開を行った。反応生成物を展開した部分に増感剤（Ｅｎ３　Ｈａｎｃｅ；　Ｄｕｐｏｎｔ　ＮＥＮ　）を噴霧し、Ｘ　線フィルム（ＢｉｏＭａｘ　ＭＳ；　Ｋｏｄａｋ）を用いてオートラジオグラフィー（マイナス８０℃で３　日間の露光）を行い、１４Ｃ　レーベル化されたメチル基が付加された酵素反応生成物のスポットを検出した。標品を展開した部分に紫外光を照射して標品のスポットを検出した。ＴＬＣ　による解析の結果を図４から６
に示す。
【００８９】
図４から分かる様に、ＧＳＴ−ＭＴＬ３の精製試料は、メチル基受容体である［ＸＲ］及びメチル基供与体である［ＳＡＭ］　の存在下で［７ｍＸＲ］を生成した。すなわち、この試料は、［ＸＲ］のメチル化による［７ｍＸＲ］の生成反応を触媒することが分かった。
【００９０】
また、ＧＳＴ−ＭＴＬ３の粗抽出試料は、メチル基受容体である［ＸＲ］及びメチル基供与体である［ＳＡＭ］　の存在下で、［７ｍＸＲ］の脱リボース体である［７ｍＸ］　を生成した。すなわち、この試料は、［ＸＲ］のメチル化による［７ｍＸＲ］の生成、及び［７ｍＸＲ］の脱リボース化による［７ｍＸ］　の生成の２反応を触媒することが分かった。
【００９１】
図５から分かる様に、ＧＳＴ−ＭＴＬ４の精製試料は、メチル基受容体である［７ｍＸ］　及びメチル基供与体である［ＳＡＭ］　の存在下で［Ｔｂ］を生成した。すなわち、この試料は、［７ｍＸ］　のメチル化による［Ｔｂ］の生成反応を触媒することが分かった。
【００９２】
更に、ＧＳＴ−ＭＴＬ４の精製試料は、メチル基受容体であるパラキサンチン［Ｐｘ］及びメチル基供与体である［ＳＡＭ］　の存在下で［Ｃｆ］を生成した。すなわち、この試料は、［Ｐｘ］のメチル化による［Ｃｆ］の生成反応を触媒することが分かった。
【００９３】
図６から分かる様に、ＧＳＴ−ＭＴＬ５の精製試料は、メチル基受容体である［Ｔｂ］及びメチル基供与体である［ＳＡＭ］　の存在下で［Ｃｆ］を生成した。すなわち、この試料は、［Ｔｂ］のメチル化による［Ｃｆ］の生成反応を触媒することが分かった。
【００９４】
更に、ＧＳＴ−ＭＴＬ５の精製試料は、メチル基受容体である［７ｍＸ］　及びメチル基供与体である［ＳＡＭ］　の存在下で［Ｔｂ］を生成した。すなわち、この試料は、［７ｍＸ］　のメチル化による［Ｔｂ］の生成反応を触媒することが分かった。
【００９５】
更に、ＧＳＴ−ＭＴＬ５の精製試料は、メチル基受容体である［Ｐｘ］及びメチル基供与体である［ＳＡＭ］　の存在下で［Ｃｆ］を生成した。すなわち、この試料は、［Ｐｘ］のメチル化による［Ｃｆ］の生成反応を触媒することが分かった。
【００９６】
対照として用いたＧＳＴ　は、精製試料及び粗抽出試料ともにいずれのメチル化反応も触媒しなかった。
【００９７】
以上のように、ＣａＭＴＬ３タンパク質、ＣａＭＴＬ４タンパク質及びＣａＭＴＬ５タンパク質、及びこれらをコードする遺伝子群はそれぞれカフェイン生合成経路の構成要素であることが分かった。
【００９８】
（７）　試験管内でのカフェイン生合成経路の再構成
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］　、２００　μＭ　ＭｇＣｌ２　、５００　μＭ　キサントシン［ＸＲ］、１．５ｍＭ　Ｓ−アデノシル−Ｌ−　メチオニン［ＳＡＭ］　及び組換えタンパク質試料（２００　μｇ　の粗抽出試料又は２０μｇ　の精製試料）からなる酵素含有混合液１００　μＬ　を２７℃で１６時間インキュベーションした。上記の組換えタンパク質試料は、（Ａ　）粗抽出ＧＳＴ−ＭＴＬ３のみ、（Ｂ　）粗抽出ＧＳＴ−ＭＴＬ３及び精製ＧＳＴ−ＭＴＬ４、（Ｃ　）粗抽出ＧＳＴ−ＭＴＬ３、精製ＧＳＴ−ＭＴＬ４及び精製ＧＳＴ−ＭＴＬ５、の組み合わせで酵素反応に用いた。
【００９９】
インキュベーション後の酵素反応液に１ｍＬ　のクロロホルムを加えて全体を激しく撹拌し、クロロホルム層を回収し、濃縮乾固することによって反応生成物を精製した。この精製物を２００　μＬ　のＨＰＬＣ展開溶媒（５０ｍＭ　リン酸ナトリウム［ｐＨ６．０］／メタノール　［４：１，　ｖ／ｖ］）中に懸濁し、その内の２０μＬをＨＰＬＣ解析に用いた。ＨＰＬＣ解析のカラムにはＰｕｒｅｓｉｌ　Ｃ１８　（Ｗａｔｅｒｓ）を用い、１ｍＬ／分の流速で懸濁液を展開した。酵素反応生成物は紫外光（２７０ｎｍ　）の吸光によって検出した。酵素反応生成物の代わりに、標品として７−メチルキサンチン［７ｍＸ］　、テオブロミン［Ｔｂ］、カフェイン［Ｃｆ］を用いて上記と同様のＨＰＬＣ解析を行った。ＨＰＬＣによる解析の結果を図７に示す。
【０１００】
図７−Ａから分かるように、ＧＳＴ−ＭＴＬ３の粗抽出試料は、メチル基受容体である［ＸＲ］及びメチル基供与体である［ＳＡＭ］　の存在下で、［７ｍＸＲ］の脱リボース体である［７ｍＸ］　を生成した。すなわち、この試料は、ＴＬＣ　解析と同様にＨＰＬＣ解析においても、［ＸＲ］のメチル化による［７ｍＸＲ］の生成、及び［７ｍＸＲ］の脱リボース化による［７ｍＸ］　の生成の２反応を触媒することが確認された。
【０１０１】
図７−Ｂから分かるように、ＧＳＴ−ＭＴＬ３の粗抽出試料及びＧＳＴ−ＭＴＬ４の精製試料の組み合わせは、　［ＸＲ］　及び　［ＳＡＭ］の存在下で、［７ｍＸ］　及び［Ｔｂ］を生成した。すなわち、これらの試料の組み合わせは、［ＸＲ］のメチル化による［７ｍＸＲ］の生成、　［７ｍＸＲ］　の脱リボース化による［７ｍＸ］　の生成、及び［７ｍＸ］　のメチル化による［Ｔｂ］の生成の３反応を触媒することが分かった。
【０１０２】
図７−Ｃから分かるように、ＧＳＴ−ＭＴＬ３の粗抽出試料、ＧＳＴ−ＭＴＬ４の精製試料及びＧＳＴ−ＭＴＬ５の精製試料の組み合わせは、　［ＸＲ］　及び　［ＳＡＭ］の存在下で、［７ｍＸ］　、［Ｔｂ］及び［Ｃｆ］を生成した。すなわち、これらの試料の組み合わせは、［ＸＲ］のメチル化による［７ｍＸＲ］の生成、　［７ｍＸＲ］　の脱リボース化による［７ｍＸ］　の生成、　［７ｍＸ］　のメチル化による［Ｔｂ］の生成、及び［Ｔｂ］　のメチル化による［Ｃｆ］の生成の４反応を触媒することが分かった。
【０１０３】
以上の様に、ＣａＭＴＬ３タンパク質、ＣａＭＴＬ４タンパク質、ＣａＭＴＬ５タンパク質及び大腸菌の粗抽出物を複合的に利用することによって、試験管内でカフェイン生合成経路を再構成できることが分かった。
【０１０４】
【発明の効果】
本発明によれば、下記の様な効果が発揮される。
【０１０５】
（１）　一連のカフェイン生合成反応系の各工程をそれぞれ触媒する複数の酵素を２以上組み合わせて用いて、生体外で、プリン環の７位でのキサントシンのメチル化、プリン環の９位での７−メチルキサントシンの脱リボース化、プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化、及び／又は、プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を行うことによって、７−メチルキサンチン、テオブロミン又はカフェインを生産することができる。
【０１０６】
（２）　一連のカフェイン生合成反応系の各工程をそれぞれ触媒する複数の酵素をコードする複数のカフェイン生合成系遺伝子を２以上組み合わせて用いて、この組み合わせをテオブロミン又はカフェインを生合成する宿主生物内で発現させることにより、テオブロミン又はカフェインの生成量を改変することができる。
【０１０７】
（３）　一連のカフェイン生合成反応系の各工程をそれぞれ触媒する複数の酵素をコードする複数のカフェイン生合成系遺伝子を２以上組み合わせて用いて、この組み合わせを７−メチルキサンチンを生合成する宿主生物内で発現させることにより、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産することができる。
【０１０８】
（４）　一連のカフェイン生合成反応系の各工程をそれぞれ触媒する複数の酵素をコードする複数のカフェイン生合成系遺伝子を２以上組み合わせて用いて、組み合わせを、キサントシンを生合成しかつ７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性を有する宿主生物内で発現させることにより、該宿主生物の代謝を改変してテオブロミン又はカフェインを生産することができる。
【０１０９】
（５）　上記（３）　又は（４）　の方法により、本来テオブロミン又はカフェインを生合成しない生物の代謝を改変して、これらの化合物を生産させることができる。
【０１１０】
（６）　上記（３）　又は（４）　の方法を植物において実施することによって、植物を草食動物の食害から防御することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はコーヒーノキ及びチャノキにおける主要なカフェイン生合成経路を示すフローシートである。構造式の下に化合物の名称を併記する。ＳＡＭ　はＳ−アデノシル−Ｌ−　メチオニン、ＳＡＨ　はＳ−アデノシル−Ｌ−　ホモシステインを意味する。（１）　の反応はキサントシンメチル化酵素、（２）　の反応は７−メチルキサントシン脱リボース化酵素、（３）　の反応は７−メチルキサンチンメチル化酵素（テオブロミン合成酵素）、（４）　の反応は３，７−ジメチルキサンチンメチル化酵素（カフェイン合成酵素）によって触媒される。
【図２】図２はｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ３　ベクター、ｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ４　ベクター及びｐＧＥＸ−ＣａＭＴＬ５　ベクターを模式的に示した図である。該ベクターは、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）によって制御されるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子（ＧＳＴ　）の下流に、推定メチル化酵素遺伝子（ＭＴＬ　）であるＣａＭＴＬ３　ｃＤＮＡ　（配列番号：２）、ＣａＭＴＬ４　ｃＤＮＡ　（配列番号：５）又はＣａＭＴＬ５　ｃＤＮＡ　（配列番号：８）を連結して構築したベクターである。アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ　ｒ　）、ラックリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ　）、ｐＢＲ３２２複製起点（ｐＢＲ３２２ｏｒｉ　）を図中に示す。
【図３】図３はＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析による組換えタンパク質の検出を示すものである。ＧＳＴ　の粗抽出試料、ＧＳＴ　とＣａＭＴＬ３の融合タンパク質（ＧＳＴ−ＭＴＬ３）の粗抽出試料（図３　中に粗抽出試料ＭＴＬ３で示す）、ＧＳＴ　の精製試料、ＧＳＴ　とＣａＭＴＬ３の融合タンパク質（ＧＳＴ−ＭＴＬ３）の精製試料（図３　中に精製試料ＭＴＬ３で示す）、ＧＳＴ　とＣａＭＴＬ４の融合タンパク質（ＧＳＴ−ＭＴＬ４）の精製試料（図３　中に精製試料ＭＴＬ４で示す）、及びＧＳＴ　とＣａＭＴＬ５の融合タンパク質（ＧＳＴ−ＭＴＬ５）の精製試料（図３　中に精製試料ＭＴＬ５で示す）を９％　ゲルによって分離した後、クーマシーブリリアントブルー染色によってタンパク質を検出した。星印は組換えタンパク質のバンドを示す。
【図４】図４は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ　）解析による酵素反応生成物の検出を示すものである。図３で示した組換えタンパク質試料を用いて酵素反応を行った。左のパネルは酵素反応液を展開した後、オートラジオグラフィーによってメチル基（　１４Ｃ　レーベル化）　が付加された酵素反応生成物のスポットを検出した状態を示す。左パネルの上に酵素反応に用いたメチル基受容体を、左パネルの下に酵素反応の特異的生成物を示した。右のパネルは標品を展開した後、紫外光照射によって標品のスポットを検出した状態を示す。左と右のパネルは一枚のＴＬＣ　プレートを展開後、２分したものである。左と右のパネルの間に原点と移動率を示した。ＸＲはキサントシン、７ｍＸＲは７−メチルキサントシン、７ｍＸ　は７−メチルキサンチン、ＳＡＭ　はＳ−アデノシル−Ｌ−　メチオニンを意味する。
【図５】図５はＴＬＣ　解析による酵素反応生成物の検出を示すものである。図３で示した組換えタンパク質試料を用いて酵素反応を行った。左のパネルは酵素反応液を展開した後、オートラジオグラフィーによってメチル基（　１４Ｃ　レーベル化）　が付加された酵素反応生成物のスポットを検出した状態を示す。左パネルの上に酵素反応に用いたメチル基受容体を、左パネルの下に酵素反応の特異的生成物を示した。右のパネルは標品を展開した後、紫外光照射によって標品のスポットを検出した状態を示す。左と右のパネルは一枚のＴＬＣ　プレートを展開後、２分したものである。左と右のパネルの間に原点と移動率を示した。７ｍＸ　は７−メチルキサンチン、Ｔｂはテオブロミン、Ｐｘはパラキサンチン、Ｃｆはカフェイン、ＳＡＭ　はＳ−アデノシル−Ｌ−　メチオニンを意味する。
【図６】図６はＴＬＣ　解析による酵素反応生成物の検出を示すものである。図３で示した組換えタンパク質試料を用いて酵素反応を行った。左のパネルは酵素反応液又はその精製物（星印で示したレーン）を展開した後、オートラジオグラフィーによってメチル基（　１４Ｃ　レーベル化）　が付加された酵素反応生成物のスポットを検出した状態を示す。左パネルの上に酵素反応に用いたメチル基受容体を、左パネルの下に酵素反応の特異的生成物を示した。右のパネルは標品を展開した後、紫外光照射によって標品のスポットを検出した状態を示す。左と右のパネルは一枚のＴＬＣ　プレートを展開後、２分したものである。左と右のパネルの間に原点と移動率を示した。７ｍＸ　は７−メチルキサンチン、Ｔｂはテオブロミン、Ｐｘはパラキサンチン、Ｃｆはカフェイン、ＳＡＭ　はＳ−アデノシル−Ｌ−　メチオニンを意味する。
【図７】図７はＨＰＬＣ解析による酵素反応生成物の検出を示すものである。図３で示した組換えタンパク質試料を用い、メチル基受容体としてキサントシンだけを用いて酵素反応を行った。（Ａ　）は粗抽出ＭＴＬ３のみ、（Ｂ　）は粗抽出ＭＴＬ３及び精製ＭＴＬ４、（Ｃ　）は粗抽出ＭＴＬ３、精製ＭＴＬ４及び精製ＭＴＬ５を用いて行った酵素反応液のクロマトグラムを示す。（Ｄ　）は標品のクロマトグラムを示す。黒抜きの矢頭は特異的生成物及び標品のピークを示す。白抜きの矢頭は夾雑物のピークを示す。７ｍＸ　は７−メチルキサンチン、Ｔｂはテオブロミン、Ｃｆはカフェインを意味する。
【配列表】
2004049162.tif 000002
2004049162.tif 000003
2004049162.tif 000004
2004049162.tif 000005
2004049162.tif 000006
2004049162.tif 000007
2004049162.tif 000008
2004049162.tif 000009
2004049162.tif 000010
2004049162.tif 000011
2004049162.tif 000012
2004049162.tif 000013
2004049162.tif 000014
2004049162.tif 000015
2004049162.tif 000016
2004049162.tif 000017
2004049162.tif 000018
2004049162.tif 000019
2004049162.tif 000020
2004049162.tif 000021
2004049162.tif 000022
【図１】
2004049162.tif 000023
【図２】
2004049162.tif 000024
【図３】
2004049162.tif 000025
【図４】
2004049162.tif 000026
【図５】
2004049162.tif 000027
【図６】
2004049162.tif 000028
【図７】
2004049162.tif 000029