(57)【要約】【課題】高重合度オリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼを提供するとともに、その製造方法を提供する。【解決手段】野生型のコージビオースホスホリラーゼより重合度の大きいコージオリゴ糖を生成する能力を有する新規酵素と、当該酵素をコードするＤＮＡと、当該酵素を産生する微生物を栄養培地中で培養し、産生した酵素を培養物中から採取する酵素の製造方法により解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとの混合溶液に作用させた際、グルコース重合度が１０乃至１４のコージオリゴ糖を含む高重合度コージオリゴ糖の生成能を有する配列表における配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する高重合度オリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載の高重合度オリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼをコードする配列表における配列番号２に記載の塩基配列又はその塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載の高重合度オリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼをコードするＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体を栄養培地に培養し、培養物から産生した高重合度オリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼを採取することを特徴とする高重合度オリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高重合度のオリゴ糖を生成するコージビオースホスホリラーゼに関し、更に詳細には、無機質のリン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「無機リン酸」と略称する。）の存在下コージビオースを分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「β−Ｄ−グルコース−１リン酸」と略称する。）を生成し、また、逆に、β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースからコージビオースと無機リン酸を生成する作用を示す酵素コージビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させることによって、高重合度オリゴ糖の生成が高まったコージビオースホスホリラーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献１】
特開平１０−３０４８８２号公報
【非特許文献１】
『酵素ハンドブック』朝倉書店（１９８２年）
【非特許文献２】
ジャーナル・オブ・バイオサイエンス・アンド・バイオエンジニアリング（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ）、第９２巻、第２号、第１７７乃至１８２頁、２００１年
【非特許文献３】
ジャーナル・オブ・アプライド・グリコサイエンス（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＧＬＹＣＯＳＣＩＥＮＣＥ）、第４８巻、第４号、第４１３頁、２００１年
【０００３】
近年、マルトース、トレハロースなどのオリゴ糖とその機能が注目され、これらオリゴ糖の多様な生産方法が各方面から広く検討されるようになってきた。これらオリゴ糖を生産する方法としてマルトースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼなど種々のホスホリラーゼの利用が知られている。これらホスホリラーゼとその作用については非特許文献１にまとめられている。しかしながら、当時、コージビオースを生成しうるホスホリラーゼは学術的にも未報告で、その存在さえ知られておらず、その提供が望まれていた。
【０００４】
斯かる状況下、本発明者等は、当時、未知のコージビオースホスホリラーゼを求めて、その酵素を産生する微生物を広く検索し、その結果、特許文献１に開示されているように、サーモアナエロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）に属する微生物サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ  ３５０４７）が、新規酵素コージビオースホスホリラーゼを産生することを見いだし、下記の理化学的性質を有することを明らかにするとともに、その製造方法を確立した。
（１）  作用
（ａ）無機リン酸存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成する。
（ｂ）β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからコージビオースと無機リン酸を生成し、さらにβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として、他の糖質にグルコース基の転移を触媒する。
（２）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、８３，０００±５，０００ダルトン
（３）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ４．４±０．５
（４）  至適温度
ｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近
（５）  至適ｐＨ
６０℃、３０分間反応でｐＨ５．５付近
（６）  温度安定性
ｐＨ５．５、１時間保持の条件で６５℃付近まで安定
（７）  ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件でｐＨ約５．５乃至１０．０
【０００５】
さらに、このコージビオースホスホリラーゼが配列表における配列番号３に記載の塩基配列にコードされており、配列表における配列番号４に記載のアミノ酸配列を有することも見いだした。また、本酵素をβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として各種糖質共存下で作用させることにより得られるグルコ転移糖含有糖質並びに該糖質を含有せしめた組成物の製造方法を確立した。
【０００６】
コージビオースホスホリラーゼは、β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからコージビオースと無機リン酸を生成するだけでなく、反応中に生成したコージビオースが基質となって、グルコース重合度が３のコージトリオースを生成し、さらに、反応が進行してグルコース重合度が４乃至７のコージテトラオース、コージペンタオース、コージヘキサオース、コージヘプタオースを生成することが、非特許文献２に報告されている。また、これらコージオリゴ糖のうち、コージビオース、コージトリオース、コージテトラオースは還元力が低く、還元性オリゴ糖にもかかわらずメイラード反応性は弱く、１００℃で４時間の条件でｐＨ３乃至５の範囲で安定であり、う蝕原性菌によって酸醗酵されなかったことや、コージトリオース及びコージテトラオースはグリコシダーゼや小腸粘膜酵素によってほとんど分解されなかったことが非特許文献３に報告されている。このように、コージビオースホスホリラーゼは、コージビオースだけでなく、グルコース重合度が３乃至７のコージオリゴ糖を生産するために有用な酵素であり、生産されるこれらオリゴ糖は、低い還元性、弱いメイラード反応性、高い安定性、非う蝕原性、難消化性など食品、化粧品、医薬品など用途に期待される糖質である。しかしながら、本コージビオースホスホリラーゼによるコージオリゴ糖生成においては、グルコース重合度が７のコージヘプタオースまでの重合度のコージオリゴ糖が報告されているのみで、さらに高い重合度のコージオリゴ糖は生成しないか、または少量しか生成しないと考えられており、高重合度のコージオリゴ糖を製造するためには、従来のコージビオースホスホリラーゼによるコージオリゴ糖生成反応よりも、高い重合度のコージオリゴ糖の生成を可能とする新しいコージビオースホスホリラーゼの実現が望まれていた。
【０００７】
酵素はタンパク質から出来上がっており、酵素が示す諸特性はその酵素タンパク質のアミノ酸一次配列に起因しており、酵素の触媒作用も、酵素のアミノ酸一次配列やその一次配列で形成される高次構造によって生み出されることは一般的に認識されているところである。現在では、遺伝子操作技術を用いて、酵素タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、ＤＮＡ配列を解読することにより、一義的に酵素タンパク質のアミノ酸配列を決定することができる。また、遺伝子ＤＮＡの塩基配列中の塩基を他の塩基に人為的に置換し、コードされるアミノ酸残基を変え、他のアミノ酸残基に置換した変異酵素タンパク質を作製することが可能であり、いくつかの酵素タンパク質においては、人為的に遺伝子変異を与えることによって、触媒作用に変化がもたらされた酵素や耐熱性が向上した酵素などが得られている。しかしながら、コージビオースホスホリラーゼにおいては、高い重合度のコージオリゴ糖の生成を可能とする酵素が望まれていたものの、その高重合度オリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼは実現していなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、コージビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させることによって、グルコース重合度が高いコージオリゴ糖の生成を可能とならしめる高重合度オリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼとその製造方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本発明者等は、先ず、サーモアナエロビウム・ブロッキイ  ＡＴＣＣ  ３５０４７由来の、配列表における配列番号３に記載の塩基配列を有するコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡをそのアミノ酸配列を変えることなく変異させ制限酵素切断部位などを導入し、それを大腸菌での発現プラスミドベクターｐＫＫ２２３−３に組換え、配列表における配列番号５に記載の塩基配列を有するコージビオースホスホリラーゼ高産生組換えプラスミドを作製した。次いで、得られた組換えプラスミドからコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡを取り出し、試験管内でランダムにＤＮＡ変異を与え、様々なアミノ酸置換が起こっているコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡ混合物を作製した。その変異ＤＮＡを組換えプラスミドに戻した後、大腸菌に形質転換して、変異コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ライブラリーを作製した。次に、得られた遺伝子ライブラリーから組換え大腸菌を単離し、培養し、得られた培養菌体から変異コージビオースホスホリラーゼを抽出し、それをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとを含む溶液に作用させ、その生成物を分析することによって、高重合度のコージオリゴ糖を生成する変異コージビオースホスホリラーゼ産生形質転換体をスクリーニングした。その結果、目的とする形質転換株を１株得ることができた。さらに、その形質転換体から組換えＤＮＡを抽出し、ＤＮＡの塩基配列を決定したところ、該ＤＮＡは配列表における配列番号２に記載の塩基配列を有しており、ランダム変異前の配列表における配列番号５に記載の塩基配列と異同を調べたところ、第２，０２７番目の塩基であるＧがＡに変異し、その変異によって配列表における配列番号４に記載のアミノ酸配列の第６７６番目のアミノ酸残基であるＳｅｒ（セリン）が、配列表における配列番号２の塩基配列に併記したアミノ酸配列に見られるとおり、Ａｓｎ（アスパラギン）に置換していたことがわかった。
【００１０】
得られた高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体を培養したところ、当該コージビオースホスホリラーゼは組換え大腸菌内で高発現し容易に製造できることがわかった。得られた高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼの諸特性を調べて、アミノ酸配列に変異がないコージビオースホスホリラーゼ（本明細書では、野生型コージビオースホスホリラーゼと略することもある。）のものと比較したところ、至適ｐＨ、至適温度、ｐＨ安定性、熱安定性については、野生型コージビオースホスホリラーゼと相違がないものの、生成するコージオリゴ糖のグルコース重合度については、野生型コージビオースホスホリラーゼによる生成コージオリゴ糖が重合度９以下であるのに対して、本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼはグルコース重合度１４もの高い重合度のコージオリゴ糖を生成することがわかった。
【００１１】
本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼはグルコース重合度の高いコージオリゴ糖を生成する特性を有することから、当該酵素を用いることによって、従来の野生型コージビオースホスホリラーゼでは生成させることができなかったグルコース重合度が１０以上の高重合度コージオリゴ糖を生成せしめることができ、また、生成するコージオリゴ糖の平均グルコース重合度も高いため、本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼは、高重合度のコージオリゴ糖などの糖質製造において有利に利用できる。
【００１２】
次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００１３】
【実験１】
＜コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドの作製＞
配列表における配列番号６に示す５０塩基の合成ＤＮＡと配列表における配列番号７に示す４２塩基の合成ＤＮＡとを常法に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した後、その混合液を常法に従って熱処理して両ＤＮＡをアニーリングした。予め、制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＰｓｔＩとで切断したプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社販売）と、アニーリングした合成ＤＮＡとを混合した後、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、ｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ切断部位とＰｓｔＩ切断部位の間に合成ＤＮＡを挿入して新たにＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位を有するプラスミドｐＫＳＳ２を得た。
【００１４】
特許文献１に記載のコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＴＫＰ１を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社販売）をＰＣＲ酵素として、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＪ２０００（パーキン・エルマ社製造）を用いて、９５℃で１分間保持した後、９８℃で２０秒と７２℃で４分３０秒のサイクルを２５回した後、７２℃で１０分間保持することで、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅したＤＮＡを常法に従って精製した後、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＳｐｅＩとで切断し、予め、同じ酵素で切断したプラスミドｐＫＳＳ２と混合し、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、ｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間にコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有し、且つ、配列表における配列番号３に記載の塩基配列において、第１番目のＭｅｔ（メチオニン）をコードする塩基配列ＧＴＧがＡＴＧに置換したコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を得た。
【００１５】
コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を鋳型として、配列表における配列番号１０に示す塩基配列を有するプライマー３と、配列表における配列番号１１に示す塩基配列を有するプライマー４とを用いて、先に記述したＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。別途、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を鋳型として、配列表における配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー５と、配列表における配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー６とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。得られたコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードするＤＮＡと、コージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードするＤＮＡとを混合し、その混合物を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼの全域をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。この増幅したＤＮＡを上記と同様に操作しｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間に挿入し、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを得た。
【００１６】
次いで、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを鋳型として、配列表における配列番号１０に示す塩基配列を有するプライマー３と、配列表における配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー７とを用いて、先に記述したＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。別途、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを鋳型として、配列表における配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー５と、配列表における配列番号１５に示す塩基配列を有するプライマー８とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。得られたコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードするＤＮＡと、コージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードするＤＮＡとを混合し、その混合物を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼの全域をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。この増幅したＤＮＡを上記と同様に操作しｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間に挿入し、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを得た。このようにして得られた組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを通常のジデオキシ法により分析したところ、配列表における配列番号５に記載の塩基配列を有していた。配列表における配列番号３に記載の塩基配列及びアミノ酸配列と異同を調べたところ、コードするアミノ酸配列は同一で、即ち、配列表における配列番号３に記載のアミノ酸配列中の第１番目のＭｅｔ（メチオニン）をコードする塩基配列ＧＴＧが同じくＭｅｔをコードする塩基配列ＡＴＧに置換しており、且つ、第２６９番目のＳｅｒ（セリン）をコードする塩基配列ＴＣＡが同じくＳｅｒをコードする塩基配列ＴＣＧに置換していることによりＸｈｏＩ切断部位（ＣＴＣＧＡＧ）が導入され、第７００番目のＴｈｒ（スレオニン）をコードする塩基配列ＡＣＡが同じくＴｈｒをコードする塩基配列ＡＣＣに置換していることによりＫｐｎＩ切断部位（ＧＧＴＡＣＣ）が導入されたコージビオースホスホリラーゼ遺伝子であることが判明した。本プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して得られた形質転換体を『ＫＢＫ１４ＸＫ』と名付けた。
【００１７】
【実験２】
＜コージビオースホスホリラーゼ遺伝子への変異導入＞
組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＳｐｅＩとで切断し、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を常法に従って精製した後、このＤＮＡを鋳型として、配列表における配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー６と配列表における配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー７とを用い、ＰＣＲ変異キット（商品名『ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＰＣＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ』、ストラタジーン社販売）を用い、そのキットに添付されていたプロトコールに従って、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡにランダムな変異を導入した。変異処理したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩと制限酵素ＫｐｎＩとで切断した後、ランダム変異が導入された約１．３ＫｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って精製した。別途、ｐＫＢＫ１４ＸＫを同じ制限酵素で切断した後、約５．６ＫｂｐＤＮＡ断片を常法に従って精製した後、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて上記の変異導入された約１．３ＫｂｐのＤＮＡ断片と連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子にランダムな変異が導入された組換えプラスミドを有する組換え大腸菌ライブラリーを作製した。
【００１８】
【実験３】
＜高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼのスクリーニング＞
実験２の方法で作製した組換え大腸菌ライブラリーを用いて、１％トリプトン（バクト社製造）、０．５％酵母エキス（バクト社製造）、１％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリンＮａ塩、及び１．５％寒天を含む培養プレート上で組換え大腸菌をコロニーとして分離し、この分離したコロニーのうち、１，３３０個を別々に同じ培地組成のスラント培地に移植し３７℃で２４時間培養した。培養した菌体を１白金耳採り、１．６％トリプトン、１％酵母エキス（バクト社製造）、０．５％塩化ナトリウム、及び、１００μｇ／ｍｌアンピシリンＮａ塩からなる液体培地（５ｍｌ）が入った試験管に移植し、３７℃で２４時間振とう培養した。得られた培養液の１ｍｌを、０．４ｍｇ／ｍｌリゾチーム及び５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）からなる水溶液（３ｍｌ）が入った試験管に加え、３７℃で３時間振とうし溶菌した後、６０℃で１時間保持して熱処理し、水冷後、５０ｍＭ酢酸緩衝液で４倍に希釈し、試験酵素液を調製した。２００ｍＭβ−Ｄ−グルコース−１リン酸、１００ｍＭＤ−グルコース及び５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む水溶液５０μｌに酵素液５０μｌを加えて６０℃で１６時間反応させた後、反応液を薄層クロマトグラフィー法（ＴＬＣ）に供した。ＴＬＣは、薄層プレートとしてキーゼルゲル６０（メルク社製造；アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を用い、展開溶媒に１−ブタノール：ピリジン：水＝６：４：１（容積比）を用いて、室温で２回展開した後、２０ｖ／ｖ％硫酸−メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で約１０分間加熱して発色させることによって行った。対照として、ランダム変異が導入されていないプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを有する組換え大腸菌『ＫＢＫ１４ＸＫ』を同様に、培養し、酵素調製し、反応させてＴＬＣを行った。ＴＬＣで移動度の小さなスポットが濃く発色した、即ち、グルコース重合度の高いオリゴ糖が比較的に多量生成した酵素液を選ぶことによって、高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼを産生する組換え大腸菌を１次選抜したところ、試験した１，３３０コロニーのうち、５４コロニーに由来する組換え大腸菌株が選抜できた。次いで、これら組換え大腸菌株及び対照のＫＢＫ１４ＸＫ株を上記と同様に培養し、培養液５ｍｌを遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）して菌体を回収し、得られた菌体を５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）８ｍｌに懸濁し、菌体破砕装置（商品名『ＵＨ−６００』、エスエムティー社製造）を用いて超音波処理して菌体を破砕した後、６０℃で１時間保持して熱処理して、２次選抜試験の酵素液を調製した。それぞれの酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定した後、最終濃度２００ｍＭβ−Ｄ−グルコース−１リン酸、１００ｍＭＤ−グルコース、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）含有基質溶液にβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位の酵素液を作用させ、６０℃で２４時間反応させた。１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させ、孔径０．４５μｍのフィルターで濾過し、その濾過液を電気透析器（商品名『ＭＩＣＲＯ  ＡＣＩＬＹＥＲ  Ｇ０』、旭化成株式会社製造）で脱塩した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法で糖組成を分析し��。ＨＰＬＣカラムはＴＳＫ−ＧＥＬ  ＡＭＩＤＥ  ８０カラム（東ソー株式会社製）を用い、カラム温度４０℃で、溶出溶媒が６０ｖ／ｖ％アセトニトリルで流速１ｍｌ／分の条件で通液し、示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０２０』、東ソー株式会社製造）を用いて検出した。その結果、試験した５６株のうち、１株（スクリーニング番号ＫＢ１−４２）のコージビオースホスホリラーゼ反応生成物が、図１のＨＰＬＣクロマトグラム（ＫＢ１−４２株）及び図２のＨＰＬＣクロマトグラム（対照のＫＢＫ１４ＸＫ株）に示すように、対照のＫＢＫ１４ＸＫ（野生型コージビオースホスホリラーゼ）の生成物と比べ、溶出時間が約９分以降の高分子コージオリゴ糖を著量生成していることがわかった。このＫＢ１−４２株を最終的にスクリーニング選択株として選抜し、高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼ変異組換え体として『ＫＢ１−４２』と名付けた。
【００１９】
なお、コージビオースホスホリラーゼの活性は次のようにして測定する。基質として１．０ｗ／ｖ％コージビオースを含む２０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、６０℃で３０分間反応させた後、反応液０．５ｍｌを１００℃、１０分間加熱し反応を停止させる。この反応停止液にＤ−グルコースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ試薬０．５ｍｌを添加、攪拌し、４０℃で３０分間放置した後、５Ｎ塩酸２．５ｍｌを添加、攪拌し、５２５ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性１単位は、前記反応条件下で、１分間当たり１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量とする。
【００２０】
【実験４】
＜ＤＮＡ分析＞
実験３の方法で得た組換え体ＫＢ１−４２株を常法に従い、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振とう培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、配列表における配列番号２に示す塩基配列のＤＮＡを含んでおり、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列をコードしていることが判明した。ランダム変異前のＫＢＫ１４ＸＫ株由来の野生型コージビオースホスホリラーゼ遺伝子である配列表における配列番号５に示す塩基配列及び配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列と異同を調べたところ、本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼ遺伝子の塩基配列は、第２，０２７番目の塩基であるＧがＡに変異し、その変異によって第６７６番目のアミノ酸残基であるＳｅｒ（セリン）がＡｓｎ（アスパラギン）に置換していることがわかった。
【００２１】
【実験５】
＜高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼの産生＞
１６ｇ／ｌポリペプトン、１０ｇ／ｌ酵母エキス及び塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調整した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験３の方法で得た組換え体ＫＢ１−４２を接種し、２７℃で約２４時間回転振とう培養したものを種培養液とした。次に、５ｇ／ｌデキストリン、２０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌポリペプトン及び１ｇ／ｌリン酸１水素ナトリウムを含む水溶液をｐＨ７．０に調整し、１０ｌ容ジャーファメンターに７ｌ入れ、１２０℃で２０分間加熱処理し、冷却した後、アンピシリンナトリウム塩７００ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製し、種培養液を７０ｍｌ接種し、２７℃で約２４時間通気攪拌培養した。この培養物を、常法にしたがい、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して湿重量約１９５ｇの菌体を回収し、それを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６７０ｍｌに懸濁し、リゾチーム２７０ｍｇを加えて３７℃で１時間静置した後、菌体破砕装置（商品名『ＵＨ−６００』、エスエムティー社製造）を用いて超音波処理して菌体を破砕した。それを６０℃で１時間熱処理し、冷却後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して不溶物を除去し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４８時間透析し、再度、遠心分離して不溶物を除去して、酵素液約７５０ｍｌを得た。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、菌体湿重量１ｇ当たりに換算すると約７５．４単位の当該酵素が産生されていた。
【００２２】
第一の対照として、実験１の方法で得た野生型コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫＢＫ１４ＸＫ株を、上述の場合と同一条件で、培養し、培養菌体（約２２０ｇ）から菌体破砕物の上清を採取し、透析して酵素液を調製し、コージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、酵素産生は菌体湿重量１ｇ当たり約４４５単位であった。第二の対照として、遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイ  ＡＴＣＣ  ３５０４７を特許文献１に記載の方法に準じて、温度６０℃、約４０時間嫌気培養し、培養液約４０ｌを遠心分離して採取した湿重量９２ｇの培養菌体を上述と同一の条件で処理して、酵素液を調製した。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイ  ＡＴＣＣ  ３５０４７の酵素産生は菌体湿重量１ｇ当たり約４２．５単位であった。本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫＢ１−４２株の酵素活性産生能は、第一の対照のＫＢＫ１４ＸＫ株のものと比較して低い値であるものの、遺伝子供与体のサーモアナエロビウム・ブロッキイ  ＡＴＣＣ  ３５０４７株のものと比較して有意に高い産生能であることがわかった。
【００２３】
【実験６】
＜コージオリゴ糖生成＞
濃度２００ｍＭβ−Ｄ−グルコース−１リン酸、濃度１２．５ｍＭＤ−グルコース、及び１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む水溶液に、実験５の方法で得た本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり２０単位加え、６０℃で２４時間反応した後、１００℃で１０分間熱処理して反応を停止した。反応液を孔径０．４５μｍのフィルターで濾過し、その濾過液を電気透析器（商品名『ＭＩＣＲＯ  ＡＣＩＬＹＥＲ  Ｇ０』、旭化成株式会社製造）で脱塩した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法で糖を分離し、直接、質量分析計（商品名『ＬＣＱ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ』、サーモクエスト社製造）に導入して、分離した糖質を質量分析した。対照として、実験５の方法で得た組換え体ＫＢＫ１４ＸＫ株由来の野生型コージビオースホスホリラーゼを用いて、同一条件で反応し分析した。ＨＰＬＣカラムはＭＣＩＧＥＬ  ＣＫ０４ＳＳカラム（三菱化学株式会社製造）を用い、カラム温度８５℃で、溶出溶媒が水で流速０．４ｍｌ／分の条件で通液し、示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０２０』、東ソー株式会社製造）を用いて検出した。質量分析は、ＨＰＬＣの示差屈折計を、直接、質量分析計の試料導入口に繋いで、ＨＰＬＣから溶出した糖液を質量分析計のイオン化室に入れエレクトロスプレー法でイオン化し、イオントラップ型分析計でイオン化した糖質の質量を測定することによって行った。標準糖質として、Ｄ−グルコース、特許文献１に方法に準じて調製したコージビオース、非特許文献２に記載の方法に準じて調製したコージトリオース及びコージテトラオースを用いた。
【００２４】
ＨＰＬＣのクロマトグラムを、図３（本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼによる生成物）及び図４（対照の野生型コージビオースホスホリラーゼによる生成物）に示した。本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼによる生成物のＨＰＬＣクロマトグラムには、溶出時間約２３．６分乃至約６１．２分に１４個のピークが検出された。一方、対照の野生型コージビオースホスホリラーゼによる生成物のＨＰＬＣクロマトグラムには、溶出時間約２９．７分乃至約６１．２分に９個のピークしか検出されなかった。また、標準糖質のグルコース、コージビオース、コージトリオース、及び、コージテトラオースは、図３及び図４の溶出時間約６１．２分、約５７．０分、約５３．１分、約４７．５分のそれぞれのピークと一致した。さらに、質量分析計の分析によって、溶出時間約２３．６分乃至約６１．２分に溶出する１４個のピークの糖質は、溶出時間の長いピークの順に、グルコース、コージビオース、コージトリオース、コージテトラオース、コージペンタオース、コージヘキサオース、コージヘプタオース、コージオクタオース、コージノナオース、コージデカオース、コージウンデカオース、コージドデカオース、コージトリスカイデカオース、コージテトラカイデカオースそれぞれの質量と一致する質量を有することがわかった。以上のことから、本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼによって生成した一連の糖質は、グルコース、コージビオース、コージトリオース、コージテトラオース、コージペンタオース、コージヘキサオース、コージヘプタオース、コージオクタオース、コージノナオース、コージデカオース、コージウンデカオース、コージドデカオース、コージトリスカイデカオース、コージテトラカイデカオースのグルコース重合度が１４までのコージオリゴ糖であり、一方、対照の野生型コージビオースホスホリラーゼによって生成した一連の糖質は、グルコース、コージビオース、コージトリオース、コージテトラオース、コージペンタオース、コージヘキサオース、コージヘプタオース、コージオクタオース、コージノナオースのグルコース重合度が９までのコージオリゴ糖であることがわかった
【００２５】
【実験７】
＜高分子コージオリゴ糖生成＞
濃度２００ｍＭβ−Ｄ−グルコース−１リン酸、濃度１２．５乃至２００ｍＭＤ−グルコース、及び１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む水溶液に、実験５の方法で得た本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり２０単位加え、６０℃で２４時間反応した後、１００℃で１０分間熱処理して反応を停止した。反応液を、実験６と同じ方法で処理し、ＨＰＬＣ分析し、Ｄ−グルコース及びコージオリゴ糖の組成を求めた。対照として、実験５の方法で得た組換え体ＫＢＫ１４ＸＫ株由来の野生型コージビオースホスホリラーゼを用いて、同一条件で反応し分析した。また、糖組成中、Ｄ−グルコースを除くコージオリゴ糖について、組成とグルコース重合度から、コージオリゴ糖の平均グルコース重合度も算出した。これらの結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
2004154013.tif 000002
【００２７】
表１の結果から明らかなように、本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼを用いた反応では、β−Ｄ−グルコース−１リン酸２００ｍＭ及びＤ−グルコース１２．５乃至３３ｍＭの基質濃度条件でグルコース重合度が１４のコージテトラカイデカオースまでのコージオリゴ糖が生成し、β−Ｄ−グルコース−１リン酸２００ｍＭ及びＤ−グルコース５０ｍＭの基質濃度条件でグルコース重合度が１２のコージドデカオースまでのコージオリゴ糖が生成し、β−Ｄ−グルコース−１リン酸２００ｍＭ及びＤ−グルコース１００ｍＭの基質濃度条件でグルコース重合度が９のコージノナオースまでのコージオリゴ糖が生成し、β−Ｄ−グルコース−１リン酸２００ｍＭ及びＤ−グルコース２００ｍＭの基質濃度条件でグルコース重合度が８のコージオクタオースまでのコージオリゴ糖が生成する一方、対照の野生型コージビオースホスホリラーゼを用いた反応では、β−Ｄ−グルコース−１リン酸２００ｍＭ及びＤ−グルコース１２．５乃至３３ｍＭの基質濃度条件でグルコース重合度が９のコージノナオースまでのコージオリゴ糖が生成し、β−Ｄ−グルコース−１リン酸２００ｍＭ及びＤ−グルコース５０ｍＭの基質濃度条件でグルコース重合度が８のコージオクタオースまでのコージオリゴ糖が生成し、β−Ｄ−グルコース−１リン酸２００ｍＭ及びＤ−グルコース１００ｍＭの基質濃度条件でグルコース重合度が７のコージへプタオースまでのコージオリゴ糖が生成し、β−Ｄ−グルコース−１リン酸２００ｍＭ及びＤ−グルコース２００ｍＭの基質濃度条件でグルコース重合度が６のコージヘキサオースまでのコージオリゴ糖が生成することがわかり、本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼは、対照の野生型コージビオースホスホリラーゼと比べ、グルコース重合度の大きいコージオリゴ糖を生成することが判明した。また、対照の野生型コージビオースホスホリラーゼはグルコース重合度９までのコージオリゴ糖しか生成しなかったのに対して、本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼは、グルコース重合度１４までのコージオリゴ糖を生成することも判明した。更に、生成したコージオリゴ糖の平均グルコース重合度について調べたところ、対照の野生型コージビオースホスホリラーゼでは平均グルコース重合度２．９乃至５．３であり、且つ、基質Ｄ−グルコース濃度が１２．５乃至２５ｍＭの条件で平均グルコース重合度がほぼ一定の５．３にとどまるのに対して、本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼでは平均グルコース重合度３．２乃至７．４であり、且つ、基質Ｄ−グルコース濃度が低いほど平均グルコース重合度は高く、基質Ｄ−グルコース濃度が１２．５乃至５０ｍＭの条件で平均グルコース重合度が７．４乃至５．７で、対照の野生型コージビオースホスホリラーゼでの最高値である５．３を上回ることが判明した。
【００２８】
以上の実験の結果は、本来、コージビオースホスホリラーゼを産生する微生物から該酵素遺伝子をクローン化し、それに人為的な変異を与え、ＤＮＡの塩基を置換することによって、それがコードするアミノ酸残基を置換し、適当なベクターに組換え、適当な宿主に形質転換し組換え微生物を得、その組換え微生物を培養し、アミノ酸置換した酵素を生産させ採取することによって、本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼを製造できることを示している。本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼは、従来のアミノ酸置換のない野生型コージビオースホスホリラーゼでは生成することができなかった高重合度コージオリゴ糖、特にグルコース重合度が１０乃至１４のコージオリゴ糖を生成することができ、その生成するコージオリゴ糖の平均グルコース重合度も６又は７以上も可能であるため、高重合度のコージオリゴ糖の生産に有利に利用できることを示している。
【００２９】
【発明の効果】
叙上のように本発明は、組換えＤＮＡ技術を利用し、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡに変異を与え、コードするアミノ酸残基を置換し、これまで得ることができなかった高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼを作製するものである。本発明の高重合度コージオリゴ糖生成コージビオースホスホリラーゼは、高重合度のコージオリゴ糖の生産能が高く、更に組換え微生物からの酵素生産も高い。したがって、本発明の酵素を利用すれば、高重合度のコージオリゴ糖を大量且つ安価に製造できることから、本発明は、食品、化粧品、医薬品分野のみならず、農水畜産業や、化学工業等の産業界に貢献すること誠に多大な意義ある発明といえる。
【００３０】
【配列表】
2004154013.tif 000003
2004154013.tif 000004
2004154013.tif 000005
2004154013.tif 000006
2004154013.tif 000007
2004154013.tif 000008
2004154013.tif 000009
2004154013.tif 000010
2004154013.tif 000011
2004154013.tif 000012
2004154013.tif 000013
2004154013.tif 000014
2004154013.tif 000015
2004154013.tif 000016
2004154013.tif 000017
2004154013.tif 000018
2004154013.tif 000019
2004154013.tif 000020
2004154013.tif 000021
2004154013.tif 000022
2004154013.tif 000023
2004154013.tif 000024
2004154013.tif 000025
2004154013.tif 000026
2004154013.tif 000027
2004154013.tif 000028
2004154013.tif 000029
2004154013.tif 000030
2004154013.tif 000031
2004154013.tif 000032
2004154013.tif 000033
2004154013.tif 000034
2004154013.tif 000035
2004154013.tif 000036
2004154013.tif 000037
2004154013.tif 000038
2004154013.tif 000039
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースに作用させた反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図２】野生型コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースに作用させた反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図３】本発明のコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースに作用させた反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図４】野生型コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースに作用させた反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図１】
2004154013.tif 000040
【図２】
2004154013.tif 000041
【図３】
2004154013.tif 000042
【図４】
2004154013.tif 000043