(57)【要約】【解決手段】麹菌が固体培養で生産するグルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）（すなわち、ｇｌａＢ遺伝子（グルコアミラーゼＢ遺伝子）から生産されるグルコアミラーゼ）、及び／又は、麹菌の固体培養物の抽出物を含有してなることを特徴とするオリ下げ剤。【効果】清酒等醸造酒の効率的オリ下げが可能となるが、該抽出物は加熱処理すると更に効果が高まり、必要あればシリカゾル、柿シブ、ゼラチン等既知のオリ下げ剤との併用も可能である。また、本オリ下げ剤は除タンパク剤としても使用可能である。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコアミラーゼＢ遺伝子（ｇｌａＢ遺伝子）から生産されるグルコアミラーゼを含有してなること、を特徴とするオリ下げ剤。
【請求項２】
麹菌固体培養物の抽出物を含有してなること、を特徴とするオリ下げ剤。
【請求項３】
該抽出物の加熱処理物を含有してなること、を特徴とする請求項２に記載のオリ下げ剤。
【請求項４】
加熱処理が、温度４０〜９０℃での５分〜６０分間処理であること、を特徴とする請求項３に記載のオリ下げ剤。
【請求項５】
該抽出物又はその加熱処理物が、それ自体のほか、その濃縮物、ペースト化物、乾燥物、希釈物の少なくともひとつであること、を特徴とする請求項２〜３のいずれか１項に記載のオリ下げ剤。
【請求項６】
更に、シリカゾル、タンニン、タンニン含有物の少なくともひとつを併用してなること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリ下げ剤。
【請求項７】
タンニン含有物が柿シブであること、を特徴とする請求項６に記載のオリ下げ剤。
【請求項８】
オリ下げ剤が除タンパク剤又はタンパク分離剤であること、を特徴とする請求項１〜７に記載のオリ下げ剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、清酒をはじめとする各種醸造液のオリ下げに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
清酒を火入れして貯蔵しておくと次第に透明度が悪くなり、薄く白濁してくる場合がある。これは白ぼけといわれるもので清酒中の熱変性タンパクが混濁することにより生じる。この白ぼけは、香味に変化をもたらさないが、火落菌による汚染と誤解されたり、サエが悪くなったりするなど商品価値を著しく低下させる原因となる。このような白ぼけを除去するためには、原酒中のタンパクを除去するためのオリ下げが必要とされている。
【０００３】
オリ下げ方法として（１）柿シブ、シリカゾル、ゼラチン等を混入してフロックを形成させてオリを沈降させる化学・物理的方法と、（２）プロテアーゼで混濁タンパクを一部切断し、新たにできた切断部分でタンパク分子を結合させて凝集させる酵素法、（３）限外ろ過膜を用いてろ過する法とがある。
【０００４】
しかし、フロックを形成させてオリを沈殿させる場合、オリ下げ剤の量比がフロック沈殿の成否を分ける重要なポイントとなるため、添加量を決めるには予備テストや長年の経験が必要であり、原酒処理工程の自動化を妨げている大きな原因となっている。また、酵素法はオリ下げに日数がかかり、特殊な場合を除き実用的には殆ど利用されていない。限外ろ過膜を用いる方法は高額な装置が必要である上、酒のうまみ物質まで除去することもあるという問題点もあり、広く普及されるには至っていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記の課題を解決するためには、現在最も一般的に使用されているオリ下げ法において、処理方法の効率化と標準化が必要である。すなわち原酒中のタンパクを速やかに凝集させることができて、処理する酒質に影響されないオリ下げ剤を開発し、迅速・簡便なオリ下げ方法を見いだすことが必要である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため、効果的なオリ下げ剤をさまざまな材料から鋭意スクリーニングすることとした。そして、数多くの材料の中から、「麹」に着目した。麹は、麹菌を蒸米上に生育させて作成するものであって、清酒醸造においては、清酒醸造の副原料として利用されている。そして、麹菌（アスペルギルス・オリゼー：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）は、清酒のほか、醤油や味噌などの我が国の伝統的発酵産業で使用されている糸状菌であって、格別な害作用は認められていない。
【０００７】
本発明者らは、麹菌の固体培養物である麹に着目し、麹に希食塩水を加えて麹タンパクを抽出した。そして、この麹タンパクを熱変性させてシリカゾルと共に原酒に添加したところ、全く予期さぜることに、シリカゾルと清酒中のタンパク質とが容易にフロックを形成し、迅速に凝集・沈殿することをはじめて見いだした。そして、ゲルろ過カラム（ＳｕｐｅｒｒｏｓｅＨＲ１２　ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、逆相カラム（ＣｏｓｍｏｓｉｌＮａｋａｒａｉ　ｔｅｓｑｕｅ社製）を用いて麹の抽出タンパクからオリ下げを促進するタンパクを単離した結果、このタンパクは麹菌が固体培養で生産するグルコアミラーゼＢ（アスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼＢ遺伝子（ｇｌａＢ）の遺伝子産物）であることをはじめてつきとめた。
【０００８】
シリカゾルとゼラチンを使ったオリ下げでは両者がある一定の割合で添加しないとフロック形成は起こらないため事前に予備テストを行うなどの検討が必要であった。しかし、このｇｌａＢ遺伝子産物を添加することで、オリ下げが可能なシリカゾルの濃度範囲は著しく広くなり、ゼラチンの厳密な添加量を定める必要はない。このため予備テストの作業の省力化が可能となる。また、フロックの形成やオリの沈降速度についてもゼラチンよりも良好であった。
【０００９】
ｇｌａＢ遺伝子産物のオリ下げ効果は、従来用いられてきたゼラチンより高く、オリ下げ時間を短縮することも期待できる。さらに、添加量もゼラチンに比べて少量で十分タンパクを除去できることも確認した。このグルコアミラーゼＢ（ｇｌａＢ遺伝子産物）によるオリ下げは、液体培養で主に生産されるグルコアミラーゼＡ（ｇｌａＡ遺伝子産物）では効果が少なく、ｇｌａＢタイプのグルコアミラーゼに特異的であった。
【００１０】
本発明は、上記した有用新知見に基づき、更に研究の結果、遂に完成されたものであって、ｇｌａＢ遺伝子（グルコアミラーゼ遺伝子）産物であるグルコアミラーゼ（「ｇｌａＢ遺伝子（グルコアミラーゼＢ遺伝子）から生産されるグルコアミラーゼ」であって、「麹菌の固体培養で生産されるグルコアミラーゼ」又は「麹菌の糖鎖含量が非常に高いグルコアミラーゼ」ともいわれるが、以下において、『グルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）』という。）を含有してなるオリ下げ剤を基本的技術思想とするものである。
【００１１】
グルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）は、精製酵素が使用できるほか、粗製酵素や酵素含有物も使用可能である。
【００１２】
酵素含有物としては、麹菌の固体培養物の抽出物が例示される。麹菌の固体培養物としては、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）を蒸米上に生育させて製麹した「麹」が例示されるが、この米麹のほか、各種穀類を用いた麹も使用可能である。また、Ａ．ｏｒｙｚａｅ以外のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌においても、グルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）タイプのグルコアミラーゼ生産菌が存在しており、これらの酵素も同様の作用効果を示すことから、これら各種Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属菌を用いて製麹した各種麹も適宜使用可能である。
なお、以下において、麹菌の固体培養物としては、上記した「麹」を代表例にとり、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
麹は、そのままオリ下げ剤として使用してもよいが、麹を抽出処理して得られる麹抽出物として使用するのが好適である。抽出処理としては、麹に水性溶媒を加えて、必要あれば振とう、攪拌すればよい。水性溶媒としては、水のほか、水に塩類を溶解せしめた溶液が使用される。塩類としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等アルカリ金属又はアルカリ土金属の塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩等無機酸又は有機酸塩が例示され、更に具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウムが挙げられる。
【００１４】
塩類溶液としては、０．０５〜１０％、好ましくは０．１〜５％溶液を用い、５〜５０℃、通常は室温にて所望する時間（５分〜５時間、好ましくは１０〜６０分間）、抽出すればよい。本処理によって、麹タンパク質が抽出される。抽出処理条件としては、麹タンパク質が抽出されればよく、上記した条件のみに限定されるものではない。
【００１５】
本発明においては、麹抽出物をそのまま使用してもよいが、抽出物を各種クロマトグラフィー処理、透析処理、電気泳動処理その他の分画処理、精製処理することによりオリ下げ促進成分を単離あるいは精製し、これらを使用してもよい。
【００１６】
また、本発明においては、麹抽出物を加熱処理して得られる加熱した麹抽出物も使用することができる。加熱処理条件としては、４０〜９０℃、５〜６０分間処理、好適には５０〜７０℃、２０〜４０分間処理が例示されるが、タンパク質が熱変性する条件であれば、上記条件のみに限定されるものではない。
【００１７】
加熱した麹抽出物についても、上記したように、分離、分画、精製処理して、オリ下げ成分を更に単離、精製してもよいし、上記した未加熱処理麹抽出物の単離物あるいは精製物を加熱処理してもよい。
【００１８】
また更に所望するのであれば、これらの濃縮物、ペースト化物、乾燥物、希釈物もオリ下げ成分として使用することができる。
【００１９】
オリ下げ処理は、常法にしたがって行えばよく、グルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）、麹固体培養物の抽出物、それを加熱した加熱抽出物、これらからタンパク成分を分離、分画、精製した麹タンパク、これらの濃縮物等各種処理物の少なくともひとつを含むオリ下げ剤を、対象品（清酒、みりん、発酵調味料、食酢もろみ、焼酒もろみ等の醸造品）に添加して行えばよい。その際、既知のオリ下げ剤（例えば、タンニン、タンニン含有物、柿シブ、シリカゾル、ゼラチンその他）を併用してもよい。
【００２０】
その添加量は、オリ下げ対象品の風味、品質、外観、成分等を変化させることなくオリ下げが行われる量であれば格別の限定はなく、適宜定めればよく、例えば、麹タンパク濃度０．０１〜５０ｐｐｍ、好ましくは０．０５〜１０ｐｐｍとなるように対象品に添加すればよいが、５ｐｐｍ程度でも有効性が確認された。
【００２１】
また、併用可能なオリ下げ剤の添加量も同様であって、上記にしたがい、また従来の添加量も考慮して適宜定めればよく、例えば、シリカゾルの場合、０．１〜２０００ｐｐｍ、好ましくは３００〜１８００ｐｐｍ添加すればよいが、４００〜１５００ｐｐｍ程度でも有効であった。
【００２２】
なお、グルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）、麹抽出物、同加熱処理物及び上記した既知のオリ下げ剤の場合も、いずれの場合においても、上記した添加量は一応の目安であって、対象品の種類によって変わることもあり、格別の害作用をひき起こすことなくオリ下げが行われるのであれば、上記範囲を逸脱してもかまわない。適宜、実験によって決定することも可能である。
【００２３】
本発明に係るオリ下げ剤は、上記したグルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）、麹抽出物等の有効成分、及び所望するのであれば柿シブ、タンニン、シリカゾル、ゼラチン等既知のオリ下げ有効成分から構成されるものであるが、これらの有効成分のみから構成してもよいし、液体又は固体の担体と混合して構成してもよく、これらの有効成分を含有するのであればすべての剤型を包含するものである。
【００２４】
なお、製剤にあたり、有効成分を同時に混合、製剤化すると、沈殿の生成、副反応の生成等の害作用が認められる場合には、有効成分を個々に用意しておき、使用時に併用できるよう用時製剤としてもよい。有効成分の配合量は、適宜常法にしたがえばよいし、実験によって定めてもよい。
【００２５】
また、本発明に係るオリ下げ剤は、タンパク質を凝集、沈殿せしめる作用にすぐれているため、夾雑タンパク質を除去するための除タンパク剤として、あるいはこれとは逆に、有用タンパク質を分離、精製するためのタンパク分離剤として、各種工業において広範に利用することができる。
【００２６】
すなわち、本発明に係るオリ下げ剤は、除タンパク剤としても有効であって、飲料、医薬品、工業薬品、化粧品等の製造に使用可能であって、発酵液、微生物や細胞培養液から例えば酵素、ペプタイド、抗生物質その他の発酵生産物において、夾雑タンパク質を除去したり、あるいはそれとは逆に目的タンパク質を分離、採取したりするのに利用可能である（前者の場合は除タンパク剤であり、後者の場合はタンパク分離剤として作用する。）。
【００２７】
本発明において麹抽出物の調製に使用する麹菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＩＦＯ　３０１０４等各種寄託菌のほか、製麹用に市販されている麹菌、各種製品から分離した麹菌等がいずれも使用可能である。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２８】
【実施例１】
（麹抽出物によるオリ下げ）
麹１０ｇに０．５％ＮａＣｌ溶液５０ｍｌを加え、室温で３０分振とうして麹タンパクを抽出した。抽出液を一昼夜透析して低分子物質を除いたものを凍結乾燥し濃縮した。これをタンパク濃度５ｐｐｍとなるように原酒に添加し、ここにシリカゾルＦＣ２００スーパー（触媒化成（株）製）を加え混和した。また、この濃縮液を６０℃、３０分加熱したものについても同様にテストを行った。オリ下げにゼラチンは添加しなかった。シリカゾル添加１時間後の原酒上清のタンパク濃度を測定し、オリ下げ効果を評価した。結果を表１、表２に示す。
【００２９】
2004049092.tif 000002
【００３０】
（表２）
2004049092.tif 000003
【００３１】
タンパク濃度の測定は、原酒をＰＤ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で処理し低分子を除去した溶液０．５ｍｌとＢｉｏ−Ｒａｄ社のＰｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ試薬０．２ｍｌ、蒸留水０．３ｍｌを混和し５分後に５９５ｎｍの吸光度を測定することによって行った。
【００３２】
これらの表に示すように、テストに供した原酒は０〜２０００ｐｐｍのシリカゾル単独ではタンパク濃度の減少が見られず、全くオリ下げができなかった。麹抽出物を添加した場合も加熱処理を行わないと、対照と同じくタンパクの減少は見られなかった。一方、加熱した麹抽出物を添加した場合は４００〜１５００ｐｐｍのシリカゾルの範囲で著しくタンパクが減少し、オリの沈降が観察されオリ下げできた。このことは麹抽出物中にオリ下げを促進する成分が含まれており、この成分は熱変性によってはじめて効果を発揮することを意味している。
【００３３】
【実施例２】
（麹抽出物からのオリ下げ促進成分の単離）
実施例１でテストした麹抽出物からカラムクロマトによってオリ下げ促進成分を精製した。ＦＰＬＣのゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ１２）を用いて麹抽出液を分子量によって分画した。分析条件はリン酸バッファー（ｐＨ６．５）、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２８０ｎｍとした。分析した結果、９個のピークが確認できたので、それぞれのオリ下げ促進作用を調べた。添加したシリカゾルの濃度は８００ｐｐｍ、その他の条件は実施例１と同様とした。なお、各ピークのフラクションは加熱処理して実験に供した。結果を下記表３に示す。
【００３４】
2004049092.tif 000004
【００３５】
この結果からピーク２にオリ下げ促進作用があることが示された。
【００３６】
次に、このピーク２をＨＰＬＣの逆相カラムを用いてさらに精製を進めた。分析条件はバッファーＡ２０％アセトニトリル水溶液、バッファーＢアセトニトリルを用い、バッファーＡからバッファーＢを１５分のグラジェントで溶出した。流速は１０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２８０ｎｍとした。分析の結果、４つのピークが見られた。各ピークのオリ下げ促進作用のテスト結果を表４に示す。テスト方法は表３での実験と同様の方法で行った。
【００３７】
2004049092.tif 000005
【００３８】
この結果よりピーク４にオリ下げ作用が見られた。ＳＤＳ電気泳動から得られた分子量の大きさと泳動パターンから、本タンパクはＡ．ｏｒｙｚａｅの生産する酵素、グルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）であると判明した（図１）。図中、１は麹菌のグルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）を示し、２は本発明に係るオリ下げタンパクを示す。
【００３９】
【実施例３】
（ゼラチンとグルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）のオリ下げ効果の比較）
ゼラチンとグルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）の加熱処理タンパクを１〜５ｐｐｍの５段階の濃度を添加し、シリカゾルを５００ｐｐｍ加えてオリ下げを行った。テスト酒は当社純米酒を、シリカゾルは触媒化成工業（株）製のＦＣ２００スーパーを用いた。オリ下げ剤添加１時間後の原酒上清タンパクを測定した結果を表５に示す。
【００４０】
2004049092.tif 000006
【００４１】
加熱処理グルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）を加えた場合は全てのテスト区でタンパクが検出限界以下となった。一方、ゼラチンでは１〜３ｐｐｍで３０％以上のタンパクが残る結果となり、原酒中のタンパクを全量除くには５ｐｐｍ以上必要であることが示された。このことは、加熱処理グルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）はゼラチンより効果が高く効率的にオリ下げを可能にすることを意味している。
【００４２】
【実施例４】
（各種グルコアミラーゼのオリ下げ効果）
生産菌の異なるグルコアミラーゼをそれぞれ加熱処理して原酒に加えシリカゾルによるオリ下げテストを行った。用いたグルコアミラーゼは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ由来（ＴＯＹＯＢＯ社製）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来（Ｓｉｇｍａ社製）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来（当社精製酵素）の３種類である。テストの条件は上記と同様とした。結果を表６とした。
【００４３】
2004049092.tif 000007
【００４４】
グルコアミラーゼの中で特にＡ．ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）でオリ下げ効果が著しく高かった。Ｒｈｉｚｏｐｕｓ由来（ＴＯＹＯＢＯ社製）、Ａ．ｎｉｇｅｒ由来（Ｓｉｇｍａ社製）のグルコアミラーゼは、ｇｌａ１あるいはｇｌａＡと呼ばれるグループに分類されており、グルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）より糖含量が低く、タンパクの構造も大きく異なっている。糸状菌のグルコアミラーゼがすべてオリ下げに有効なわけではなく、ｇｌａＢタイプのグルコアミラーゼにのみ強力なオリ下げ促進効果が認められた。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、麹菌の固体培養で生産するグルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）タンパクを使用してオリ下げを行うことによりオリ下げ時間を短縮させることができることが分かった。また、グルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）タンパクは少量で効果を発揮するため、事前に添加量の検討を行う必要がなく作業の省力化を可能にする。さらにグルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）は清酒醸造において必要不可欠なタンパクとして長年利用されてきたものであり、その安全性は極めて高いことは周知の事実である。さらにグルコアミラーゼ（ｇｌａＢ）を用いたオリ下げは清酒中に異種クンパクを混入させることなくオリ下げが可能となる点でも非常に有効である。
【００４６】
また、本発明に係るオリ下げ剤は、除タンパク剤として不要タンパク質や夾雑タンパク質を除去するのに有用であり、あるいはこれとは逆に、タンパク質分離剤として、有用タンパク質の単離、精製等にも使用することができ、飲料、医薬品、工業薬品、化粧品等の技術分野において、広く有効利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】オリ下げ促進タンパクのＳＤＳ電気泳動パターンを示す図面代用写真である。
【図１】
2004049092.tif 000008