(57)【要約】【課題】ＵＣＰを活性化することにより、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーから熱エネルギーへの変換効率を向上させることができる、脱共役蛋白質発現誘導剤を提供すること。【解決手段】脂質および炭水化物の代謝改善剤として有用な脱共役蛋白質発現誘導剤が開示されている。本発明の脱共役蛋白質発現誘導剤は、ミカン科植物抽出物を有効成分として含有するか、あるいは以下の式（Ｉ）：【化１】2004149432.tif 000013（ここで、Ｒ１は水素原子、あるいは分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子あるいは分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基であり、そしてＲ５は、分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）で表されるポリアルコキシフラボノイドを有効成分として含有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミカン科植物抽出物を有効成分として含有する、脱共役蛋白質発現誘導剤。
【請求項２】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
2004149432.tif 000011
（ここで、Ｒ１は水素原子、あるいは分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子あるいは分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基であり、そしてＲ５は、分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）で表されるポリアルコキシフラボノイドを有効成分として含有する、脱共役蛋白質発現誘導剤。
【請求項３】
前記ポリアルコキシフラボノイドが、以下の式（ＩＩ）：
【化２】
2004149432.tif 000012
で表されるノビレチンである、請求項２に記載の脱共役蛋白質発現誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脱共役蛋白質の発現を誘導するための組成物に関し、より詳細には、脱共役蛋白質を活性化させることにより、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーから熱エネルギーへの変換効率を向上させることのできる、脱共役蛋白質発現誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の酸化的リン酸化において、電子伝達で得られたエネルギーがＡＴＰ合成反応に共役することが阻害される場合がある。このような阻害を一般に脱共役という。
【０００３】
脱共役は、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーを熱エネルギーに変換する点で重要な生体機能の１つである。脱共役蛋白質（以下、ＵＣＰという）は、脂肪組織、骨格筋、肝臓などの中のミトコンドリアに存在し、生体内の酸化的リン酸化において電子伝達で得られたエネルギーがＡＴＰ合成反応に共役することを阻害して、ＡＴＰ合成に共役する化学エネルギーを熱エネルギーに変換するプロトンチャンネル蛋白質として機能する。このようなＵＣＰを活性化することができれば、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーから熱エネルギーへの変換効率が向上すると考えられる。
【０００４】
しかし、従来、このようなＵＣＰの活性化に寄与するＵＣＰ発現誘導剤はほとんど知られておらず、そのような薬剤の開発が所望されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、ＵＣＰを活性化することにより、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーから熱エネルギーへの変換効率を向上させることができる、脱共役蛋白質発現誘導剤を提供することにある。
【０００６】
本発明は、ミカン科植物抽出物を有効成分として含有する、脱共役蛋白質発現誘導剤である。
【０００７】
本発明はまた、以下の式（Ｉ）：
【０００８】
【化３】
2004149432.tif 000002
【０００９】
（ここで、Ｒ１は水素原子、あるいは分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子あるいは分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基であり、そしてＲ５は、分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）で表されるポリアルコキシフラボノイドを有効成分として含有する、脱共役蛋白質発現誘導剤である。
【００１０】
好ましい実施態様では、上記ポリアルコキシフラボノイドは、以下の式（ＩＩ）：
【００１１】
【化４】
2004149432.tif 000003
【００１２】
で表されるノビレチンである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述するにあたり、まず本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導剤について説明する。
【００１４】
本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導剤は、ミカン科植物抽出物を有効成分として含有する。
【００１５】
従来、ミカン科植物の抽出物またはその成分は、脂肪分解促進剤（特開平０８−０８１３８２号公報）、抗菌効果（特開平０９−１８８６１０号公報）、ヒアルロン酸産生促進剤（特開２０００−０９６０５０号公報）などを有することが知られている。しかし、このようなミカン科植物に脱共役蛋白発現誘導効果があることは知られていなかった。
【００１６】
本発明に用いられるミカン科植物は、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）属の植物である。シトラス属植物の具体的な例としては、ヒラミレモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｄｅｐｒｅｓｓａ）、オオベニミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｔａｎｇｅｒｉｎａ）、コベニミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｓａ）、ダイダイ（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ）、ナツミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  Ｎａｔｓｕｄａｉｄａｉ）、ザボン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、ユズ（Ｃｉｔｒｕｓ  Ｊｕｎｏｓ）、ポンカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｒｅｒｉｃｕｌａｔａ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）、カラタチ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ）、およびマルブシュカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｍｅｄｉａｃａ  Ｌ．）が挙げられる。特に、ヒラミレモン、ウンシュウミカン、ダイダイおよびポンカンが好ましい。本発明においては、上記ミカン科植物を組み合わせて使用してもよい。
【００１７】
本発明に用いられるミカン科植物抽出物は、例えば、以下のようにして得ることができる。
【００１８】
まず、上記ミカン科植物は、好ましくは所望のサイズに裁断または粉砕される。用いられるミカン科植物は、採取後の生の状態のものであっても、乾燥された状態のものであってもよい。さらに使用される植物の部位の例としては、成熟したまたは未成熟の、果実、果皮、種子、葉、葉柄、枝、根および花、これらの組合せが挙げられる。特に、後述するポリアルコキシフラボノイドをより多く含有する点から、果実および果皮が好ましい。
【００１９】
次いで、このミカン科植物は適切な溶媒に浸漬されることにより、ミカン科植物抽出物を得ることができる。
【００２０】
上記ミカン科植物の浸漬に使用され得る溶媒は、通常の植物からの抽出に使用されるものであれば特に限定されないが、具体的な例としては、水；メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノールなどの低級アルコール類；アセトンなどのケトン類；酢酸エチルエステルなどのエステル類；
ジエチルエーテル、石油エーテルなどのエーテル類；クロロホルム、ジクロロメタンなどの塩素系有機溶媒；ならびにこれらの組合せが挙げられる。特に、本発明に用いられるミカン科植物抽出物を効率的に得るためには、メタノール、エタノールまたは酢酸エチルエステル、あるいはこれら溶媒と水との組合せが好ましく、毒性が低いという生体内での安全性を考慮すれば、エタノール、またはエタノールと水との混合溶媒を用いることがさらに好ましい。
【００２１】
使用される溶媒の量は、浸漬されるべきミカン科植物が完全に浸る程度の量であればよく、好ましくは浸漬されるべきミカン科植物の重量に対して、２倍量から１００倍量の量が選択される。
【００２２】
上記浸漬（抽出）は室温で行うこともできるが、好ましくは、４℃〜１２０℃、より好ましくは、４０℃〜１００℃にて行われる。抽出時間は、設定される抽出温度によって変化するが、例えば、室温付近の抽出温度下では１日〜１０日であり、５０℃以上の抽出温度下では１時間〜９６時間である。
【００２３】
次いで、当業者に公知の手段を用いて、上記混合物から浸漬されたミカン科植物が濾別され、抽出液が取り出される。取り出された抽出液はそのまま本発明に用いられるミカン科植物抽出物として使用することができるが、この抽出液を濃縮してもよく、あるいは生体にとって安全な（すなわち、毒性の低い）適切な溶媒（例えば、エタノールなどの低級アルコール類；水；またはこれらの組合せ）を用いて希釈してもよい。あるいは、この抽出液を蒸発乾固して、残存した固形分を取り出してもよい。
【００２４】
このようにして、本発明に用いられるミカン科抽出物を得ることができる。
【００２５】
本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導剤は、経口投与または非経口投与の目的で、任意の形態に調製され得る。経口投与のために用いられる形態の例としては、医薬品ならびに飲食物（例えば、液体飲料および加工食品）の形態が挙げられる。非経口投与のために用いられる形態の例としては、化粧料、医薬部外品および医薬品の形態が挙げられる。上記形態のうち、特に加工食品のより具体的な例としては、顆粒、錠菓、ゼリー、およびキャンディーが挙げられる。また、特に化粧料のより具体的な例としてはジェル状クリーム、洗顔クリーム、化粧水、乳液、およびパックが挙げられる。
【００２６】
本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導剤において、その他の投与剤形もまた特に限定されず、日本薬局方にしたがって適切な剤形に加工され得る。具体的には、経口投与を目的とする場合には、カプセル剤、錠剤、粉剤、除法剤などの剤形に加工されてもよい。非経口投与を目的とする場合には、注射剤、輸液剤などの剤形に加工されてもよい。
【００２７】
本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導は、上記ミカン科植物抽出物を有効成分として含有するものであれば、上記経口投与または非経口投与のための形態に応じて、任意の他の成分を含有していてもよい。
【００２８】
本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導剤を経口投与の目的で用いる場合に含有していてもよい他の成分としては、特に限定されないが、例えば、水、油、果汁、甘味料、香味料、増粘剤、防腐剤、乳化剤、着色料、ｐＨ調整剤、当業者に周知の任意の他の有効成分（例えば、水溶性ビタミン類および油溶性ビタミン類を包含する）、抗酸化剤、アルコールおよび香料、ならびにこれらの組合せが挙げられる。加工食品の形態が用いられる場合の、上記他の成分のより具体的な例としては、特に限定されないが、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、昆布、ワカメ、テングサなどの粉類；水飴；乳糖；グルコース；果糖；スクロース；マンニトール；ならびにこれらの組合せが挙げられる。医薬品の形態が用いられる場合の、上記他の成分のより具体的な例としては、特に限定されないが、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、およびこれらの組合せが挙げられる。
【００２９】
本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導剤を非経口投与の目的で用いる場合に含有していてもよい他の成分としては、特に限定されないが、例えば、界面活性剤、油剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、色剤、粉体、ｐＨ調整剤、当業者に周知の任意の薬効成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、香料、アルコール、および水、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
【００３０】
本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導剤は、全量に対し、上記ミカン科抽出物を、好ましくは０．０００１重量％〜１００重量％、より好ましくは０．０１重量％〜１００重量％の割合で含有する。ミカン科植物抽出物の含有量が０．０００１重量％を下回ると、ＵＣＰを充分に活性化するには困難となり、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーから熱エネルギーへの変換効率を向上させることができない恐れがある。
【００３１】
本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導剤は、その形態に応じた方法で適切に使用者に投与される。その際の用量もまた、使用者の体重、当該脱共役蛋白質発現誘導剤の形態等によって変化するため、特に限定されず、任意に設定され得る。
【００３２】
本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導剤は、上記ミカン科植物抽出物および必要に応じて添加される他の成分を、乳鉢のような手段を用いて混合することにより製造されてもよく；一旦各成分を適切な溶媒に溶解させて溶液とし、次いで、これらを合わせて濃縮乾燥させることにより製造されてもよく；あるいはＶ型混合機を用いて混合することにより製造されてもよい。このような混合において用いられる条件は、当業者によって適切に選択され得る。
【００３３】
本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導剤は、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーを熱エネルギーに変換することができ、ＵＣＰ−１、ＵＣＰ−２、ＵＣＰ−３、ＵＣＰ−４などのいずれのＵＣＰに対しても有効である。本発明の第一の脱共役蛋白質発現誘導剤は、脂質および炭水化物の代謝改善剤として特に有効に使用され得る。
【００３４】
次に、本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤について説明する。
【００３５】
本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤は、以下の式（Ｉ）：
【００３６】
【化５】
2004149432.tif 000004
【００３７】
（ここで、Ｒ１は水素原子、あるいは分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子あるいは分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基であり、そしてＲ５は、分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）で表されるポリアルコキシフラボノイドを有効成分として含有する。本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤においては、上記式（Ｉ）で表されるポリアルコキシフラボノイドが単数種類で含有されていてもよく、あるいは少なくとも２種類が組み合わされて含有されていてもよい。
【００３８】
ここで、本明細書中に用いられる用語「分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキル基」とは、１個〜６個の炭素数を有する、直鎖、分岐鎖および環状アルキル基を包含していい、例えば、メチル、エチル、ブチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、およびイソヘキシルが挙げられる。本発明においては、上記のうち、直鎖のアルキル基が好ましい。また、本明細書中に用いられる用語「分岐鎖または環を形成していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基」とは、１個〜６個の炭素数を有する、直鎖、分岐鎖および環状アルコキシ基を包含していい、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、およびｔｅｒｔ−ブトキシが挙げられる。本発明においては、上記のうち、直鎖のアルコキシ基が好ましい。
【００３９】
本発明においては、上記式（Ｉ）で表されるポリアルコキシフラボノイドのうち、Ｒ１およびＲ５がメチルであり、そしてＲ２、Ｒ３およびＲ４がそれぞれメトキシである、以下の式（ＩＩ）：
【００４０】
【化６】
2004149432.tif 000005
【００４１】
で表される化合物（ノビレチン）、およびＲ１およびＲ５がメチルであり、Ｒ２およびＲ３おがそれぞれメトキシであり、そしてＲ４が水素原子である、以下の式（ＩＩＩ）：
【００４２】
【化７】
2004149432.tif 000006
【００４３】
で表される化合物（タンゲレチン）が好ましく、特に式（ＩＩ）で表されるノビレチンがより好ましい。
【００４４】
本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤に用いられる上記式（Ｉ）のポリアルコキシフラボノイドは、当業者に公知の方法を用いて化学的に合成可能であり、市販により入手可能であり、かつ植物抽出物（例えば、上記ミカン科植物抽出物）から単離かつ精製して得ることができる。
【００４５】
上記式（Ｉ）で表されるポリアルコキシフラボノイドを、ミカン科植物抽出物から単離する場合、例えば、上記と同様にして得られたミカン科植物抽出物を、適切な溶離液を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけて分離することにより、得ることができる。このようなミカン科植物抽出物のクロマトグラフィーに使用される適切な溶離液の例としては、酢酸エチル、メタノール、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、またはキシレンのような溶媒と；ヘキサン、ヘプタン、クロロホルム、またはジクロロメタンのような溶媒と；の混合溶媒を使用することが好ましい。上記クロマトグラフィーにより得られた物質は、例えば、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲなどの当業者に周知の手段を用いることにより、上記式（Ｉ）で表されるポリアルコキシフラノイドであることが容易に同定され得る。
【００４６】
本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤は、上記第一の脱共役蛋白質発現誘導剤と同様に、経口投与または非経口投与の目的で、任意の形態に調製され得る。経口投与のために用いられる形態の例としては、医薬品ならびに飲食物（例えば、液体飲料および加工食品）の形態が挙げられる。非経口投与のために用いられる形態の例としては、化粧料、医薬部外品および医薬品の形態が挙げられる。上記形態のうち、特に加工食品のより具体的な例としては、顆粒、錠菓、ゼリー、およびキャンディーが挙げられる。また、特に化粧料のより具体的な例としてはジェル状クリーム、洗顔クリーム、化粧水、乳液、およびパックが挙げられる。
【００４７】
本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤において、その他の投与剤形もまた特に限定されず、日本薬局方にしたがって適切な剤形に加工され得る。具体的には、経口投与を目的とする場合には、カプセル剤、錠剤、粉剤、除法剤などの剤形に加工されてもよい。非経口投与を目的とする場合には、注射剤、輸液剤などの剤形に加工されてもよい。
【００４８】
本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導は、上記式（Ｉ）で表されるポリアルコキシフラボノイドを有効成分として含有するものであれば、上記経口投与または非経口投与のための形態に応じて、任意の他の成分を含有していてもよい。
【００４９】
本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤を経口投与の目的で用いる場合に含有していてもよい他の成分としては、特に限定されないが、例えば、水、油、果汁、甘味料、香味料、増粘剤、防腐剤、乳化剤、着色料、ｐＨ調整剤、当業者に周知の任意の他の有効成分（例えば、水溶性ビタミン類および油溶性ビタミン類を包含する）、抗酸化剤、アルコールおよび香料、ならびにこれらの組合せが挙げられる。加工食品の形態が用いられる場合の、上記他の成分のより具体的な例としては、特に限定されないが、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、昆布、ワカメ、テングサなどの粉類；水飴；乳糖；グルコース；果糖；スクロース；マンニトール；ならびにこれらの組合せが挙げられる。医薬品の形態が用いられる場合の、上記他の成分のより具体的な例としては、特に限定されないが、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、およびこれらの組合せが挙げられる。
【００５０】
本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤を非経口投与の目的で用いる場合に含有していてもよい他の成分としては、特に限定されないが、例えば、界面活性剤、油剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、色剤、粉体、ｐＨ調整剤、当業者に周知の任意の薬効成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、香料、アルコール、および水、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
【００５１】
本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤は、全量に対し、上記式（Ｉ）のポリアルコキシフラボノイドを、好ましくは０．０００１重量％〜１００重量％、より好ましくは０．０１重量％〜１００重量％の割合で含有する。式（Ｉ）で表されるポリアルコキシフラボノイドの含有量が０．０００１重量％を下回ると、ＵＣＰを充分に活性化するには困難となり、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーから熱エネルギーへの変換効率を向上させることができない恐れがある。
【００５２】
さらに、本発明の脱共役蛋白質発現誘導剤においては、上記式（Ｉ）で表されるポリアルコキシフラボノイドとともに、上記ミカン科植物抽出物を混合して用いてもよい。この場合の混合比は当業者に必要に応じて選択され得る。
【００５３】
本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤は、その形態に応じた方法で適切に使用者に投与される。その際の用量もまた、使用者の体重、当該脱共役蛋白質発現誘導剤の形態等によって変化するため、特に限定されず、任意に設定され得る。
【００５４】
本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤は、上記式（Ｉ）で表されるポリアルコキシフラボノイド、ならびに必要に応じて添加される他の成分および／または上記ミカン科植物抽出物を、乳鉢のような手段を用いて混合することにより製造されてもよく；一旦各成分を適切な溶媒に溶解させて溶液とし、次いで、これらを合わせて濃縮乾燥させることにより製造されてもよく；あるいはＶ型混合機を用いて混合することにより製造されてもよい。このような混合において用いられる条件は、当業者によって適切に選択され得る。
【００５５】
本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤は、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーを熱エネルギーに変換することができ、ＵＣＰ−１、ＵＣＰ−２、ＵＣＰ−３、ＵＣＰ−４などのいずれのＵＣＰに対しても有効である。本発明の第二の脱共役蛋白質発現誘導剤もまた、脂質および炭水化物の代謝改善剤として特に有効に使用され得る。
【００５６】
【実施例】
以下、本発明を具体的に記述するために実施例を記載する。しかし、これによって本発明は特に限定されない。
【００５７】
＜実施例１：ダイダイ抽出物でなる脱共役蛋白質誘導発現剤の製造＞
ダイダイ（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ）の乾燥した未熟果皮５００ｇを、７０（Ｖ／Ｖ）％エタノール中に浸漬し、７０℃にて１時間抽出した。次いで、この混合物を濾過し、濾液を減圧下にて濃縮し、２０．６ｇでなる残渣（ダイダイ抽出物）を得た。得られたダイダイ抽出物をそのまま用いて、脱共役蛋白質発現誘導剤とした。
【００５８】
＜実施例２：ポンカン抽出物でなる脱共役蛋白質誘導発現剤の製造＞
ポンカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｒｅｒｉｃｕｌａｔａ）の乾燥した未熟果皮５００ｇを、７０（Ｖ／Ｖ）％エタノール中に浸漬し、７０℃にて１時間抽出した。次いで、この混合物を濾過し、濾液を減圧下にて濃縮し、２５．２ｇでなる残渣（ポンカン抽出物）を得た。得られたポンカン抽出物をそのまま用いて、脱共役蛋白質発現誘導剤とした。
【００５９】
＜実施例３：ヒラミレモン抽出物でなる脱共役蛋白質誘導発現剤の製造＞
ヒラミレモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｄｅｐｒｅｓｓａ）の乾燥した未熟果皮５００ｇを、７０（Ｖ／Ｖ）％エタノール中に浸漬し、７０℃にて１時間抽出した。次いで、この混合物を濾過し、濾液を減圧下にて濃縮し、１８．７ｇでなる残渣（ヒラミレモン抽出物）を得た。得られたヒラミレモン抽出物をそのまま用いて、脱共役蛋白質発現誘導剤とした。
【００６０】
＜実施例４＞
実施例２で得られたポンカン抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液として、酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（容量比１：１）を使用）にかけ、ＴＬＣ（展開溶媒として、クロロホルム：メタノール（容量比２０：０．５）を使用）でモニターしながら分取を行った。得られた分画を濃縮乾固した後、ジエチルエーテルで結晶化させ、２種類の物質ＡおよびＢを得た。
【００６１】
得られた物質Ａの融点は１３７℃〜１３８℃であり、そして得られた物質Ｂの融点は１５６℃〜１５７℃であった。さらに、得られた物質Ａおよび物質Ｂの１３Ｃ−ＮＭＲおよび１Ｈ−ＮＭＲの測定結果を表１および表２にそれぞれ示す。
【００６２】
【表１】
2004149432.tif 000007
【００６３】
【表２】
2004149432.tif 000008
【００６４】
上記で得られた各物質の融点およびＮＭＲスペクトルの結果を、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．１９９７，４５，ｐ３６４−３６８に記載の数値と比較したところ、上記で得られた物質Ａがノビレチンであり、かつ上記で得られた物質Ｂがタンゲレチンであることが同定された。得られたノビレチンおよびタンゲレチンをそれぞれそのまま用いて、脱共役蛋白質発現誘導剤とした。
【００６５】
なお、実施例１から３で得られた各抽出物について、表３に記載の条件でＨＰＬＣ分析を行ったところ、ノビレチンおよびタンゲレチンに相当するピークがそれぞれ保持時間２７．７分および３０．１分に認められた。
【００６６】
【表３】
2004149432.tif 000009
【００６７】
以上のことから、実施例１から３で製造された脱共役蛋白質発現誘導剤のいずれにおいても、ノビレチンおよびタンゲレチンを含有することが見出された。
【００６８】
＜実施例５＞
ラット褐色脂肪細胞培養キット（宝酒造（株）製）を、以下のようにして培養した：細胞数が２．５×１０２個／ｃｍ２密度となるように、平底６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で７０％〜９０％コンフルエンスになるまで、当該キットに付属の増殖培地中で培養した。
【００６９】
次いで、上記培地を、当該キットに付属の分化誘導培地に交換し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で４８時間培養した後、当該キットに付属の維持培地に交換し、さらにＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で４日間培養した。
【００７０】
上記４日間の培養後、実施例１で得られた脱共役蛋白質発現誘導剤（ダイダイ抽出物）（５０μｈ／ｍＬ）を含有する維持培地（上記ラット褐色脂肪細胞培養キット（宝酒造（株）製）に付属の培地に上記ダイダイ抽出物を含有させたもの）に交換し、さらに６時間培養し、その後、細胞を回収した。回収した細胞から、ＵＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量およびアクチン蛋白質のｍＲＮＡ発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。後述の比較例１（コントロール）のＵＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの、本実施例でのＵＣＰ−１のｍＲＮＡの発現量を相対値として、表４に示す。
【００７１】
＜比較例１＞
実施例１で得られた脱共役蛋白質発現誘導剤（ダイダイ抽出物）（５０μｈ／ｍＬ）を含有する維持培地を用いる代わりに、当該誘導剤を添加していない維持培地（上記ラット褐色脂肪細胞培養キット（宝酒造（株）製）に付属の培地のみ）を用いたこと以外は実施例５と同様にして、細胞を培養し、回収した細胞から、ＵＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量およびアクチン蛋白質のｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。得られたＵＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量を１００とした（表４に示す）。
【００７２】
＜実施例６＞
実施例１で得られた脱共役蛋白質発現誘導剤（ダイダイ抽出物）（５０μｈ／ｍＬ）を含有する維持培地を用いる代わりに、実施例２で得られた脱共役蛋白質発現誘導剤（ポンカン抽出物）（５０μｈ／ｍＬ）を含有する維持培地（上記ラット褐色脂肪細胞培養キット（宝酒造（株）製）に付属の培地に上記ポンカン抽出物を含有させたもの）を用いたこと以外は実施例５と同様にして、細胞を培養し、回収した細胞から、ＵＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量およびアクチン蛋白質のｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。比較例１（コントロール）のＵＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの、本実施例でのＵＣＰ−１のｍＲＮＡの発現量を相対値として、表４に示す。
【００７３】
＜実施例７＞
実施例１で得られた脱共役蛋白質発現誘導剤（ダイダイ抽出物）（５０μｈ／ｍＬ）を含有する維持培地を用いる代わりに、実施例４で得られた脱共役蛋白質発現誘導剤（ノビレチン）（１００μＭ）を含有する維持培地（上記ラット褐色脂肪細胞培養キット（宝酒造（株）製）に付属の培地に上記ノビレチンを含有させたもの）を用いたこと以外は実施例５と同様にして、細胞を培養し、回収した細胞から、ＵＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量およびアクチン蛋白質のｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。比較例１（コントロール）のＵＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの、本実施例でのＵＣＰ−１のｍＲＮＡの発現量を相対値として、表４に示す。
【００７４】
【表４】
2004149432.tif 000010
【００７５】
表４に示されるように、無添加の維持培地を用いて培養した細胞（比較例１）と比較して、ダイダイ抽出物、ポンカン抽出物またはノビレチンを含有する維持培地を用いて培養した細胞（実施例５、実施例６および実施例７）は、いずれもＵＣＰ−１のｍＲＮＡ発現量が著しく増大していることがわかる。
【００７６】
【発明の効果】
本発明によれば、ＵＣＰを有効に発現することができる。本発明の脱共役蛋白質発現誘導剤は、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーを熱エネルギーに変換することができ、脂質および炭水化物の代謝改善剤として特に有用である。