(57)【要約】【課題】再生医療、生殖医療、トランスジェニック非ヒト動物の作出、所望遺伝子の自在の導入等の材料と方法を提供する。【解決手段】マウスの精子特異的な蛋白質であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＩＰＳ４０、このＴＩＰＳ４０をコードするマウス遺伝子、マウス遺伝子由来のポリヌクレオチド、前記マウスタンパク質ＴＩＰＳ４０を認識する抗体、およびＴＩＰＳ４０タンパク質を発現と他の任意タンパク質を発現するベクター、トランスジェニック非ヒト動物の作出方法とこれによる所望遺伝子の自在の導入方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスの精子特異的なタンパク質であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＩＰＳ４０。
【請求項２】
請求項１のＴＩＰＳ４０をコードするマウス遺伝子。
【請求項３】
遺伝子から転写されたｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有する請求項１のマウス遺伝子。
【請求項４】
請求項２のマウス遺伝子由来のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
請求項４のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項７】
配列番号２における連続５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
【請求項８】
請求項１のマウスタンパク質ＴＩＰＳ４０を認識する抗体。
【請求項９】
請求項４のポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドを保有する発現ベクター。
【請求項１０】
他のタンパク質が転写制御因子である請求項９の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９または１０の発現ベクターを非ヒト全能性細胞に導入し、この形質転換細胞を個体へと発生させることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物の作出方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法によって作出されたトランスジェニック非ヒト動物およびその子孫動物。
【請求項１３】
請求項１２の動物の雄と野性型雌とを交配させることによって、雌動物の卵子染色体に融合ポリヌクレオチドを導入することを特徴とする遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、マウスの精子特異的に発現する新規タンパク質ＴＩＰＳ４０とその用途に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ＴＩＰＳ４０とそれをコードする遺伝子を用いた形質転換、トランスジェニック非ヒト動物の作出、再生医療への応用等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
精子形成過程については以下が知られている。すなわち、雄配偶子（精子）は精原細胞から分化し、この精原細胞は始原生殖細胞から精子形成と呼ばれるプロセスによって単独に誘導される。雄胚中の始原生殖細胞は生殖隆起に達し、性索内に取り込まれる。性索は成熟時に空洞となり、精巣内の精子産生部位である精細管を形成する。生殖細胞に栄養を供給し、かつその発生を保護するセルトリ細胞は、これらの管の体細胞成分の上皮から分化する。発生段階は顕微鏡観察によって同定でき、発生プロセスの過程のどこで遺伝子の発現が生じるかを正確に決定することができるため、精子形成は分子レベルでの生殖細胞分化の調節機構を研究するのに優れたモデル系である。
【０００３】
精子形成は３つの段階に細分することができる。第１に、多数回の有糸分裂の後、精原細胞は減数分裂を開始して精母細胞を産生する。第２に、精母細胞は２回の連続する減数分裂を行い、４つの円形精子細胞を産生する。第３に、精子完成と呼ばれる複雑な形態形成現象が生じ、マウスにおいてはそれが約２週間持続して、円形半数体精子細胞が形態学的及び機能的に分化した精子に発達する。これらの形態形成現象は生殖細胞および体細胞の両者における組織化された段階特異的及び細胞特異的な遺伝子発現によって調節される（非特許文献１、２）。
【０００４】
精子形成の間、ヒストンおよび非ヒストンタンパク質が円形精子細胞においては転移タンパク質（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）として知られる塩基性タンパク質により、伸長精子細胞においてはプロタミンによって置換される（非特許文献３、４）。これらのタンパク質の遺伝子はそれらそれぞれの精細胞において転写される。このコンパクト化ＤＮＡ−タンパク質複合体は染色体を精子の頭部内に安全に保存するのに有用であるが、精子形成が完了するまで大部分の遺伝子の転写を不活性化するものと信じられる（非特許文献５、６）。
【０００５】
アデニルシクラーゼ・シグナル伝達経路は転写活性化因子ＣＲＥＭ（環状ＡＭＰ応答性要素［ＣＲＥ］モジュレータ）（これは成体精巣においてアイソフォーム（Ｃｒｅｍ−ｔ）を産生する）による精子形成および精子完成の転写調節において重要な役割を果たす（非特許文献７、８）。ＣＲＥＭ遺伝子を欠くマウスはＣＲＥ含有遺伝子を発現することができず、減数分裂後の遺伝子発現が劇的に減少する。これらの発達する精細胞は精子に分化することができないため、これらのマウスは生殖不能となる（非特許文献９、１０）。したがって、ＣＲＥＭは精子の構成に関与する半数体生殖細胞特異的遺伝子の活性化の原因であるものと考えられる。
【０００６】
一方、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）関連因子ＴＲＦ２は精子形成およひ精子完成の間の転写の別の重要な調節因子である（非特許文献１１）。Ｔｒｆ２の発現は後期パキテン期精母細胞において最初に検出され、次の段階を通して増加した後、段階Ｉから段階Ｖに進行する間に円形精細胞において連続的に減少する。Ｔｒｆ２遺伝子を欠くマウスは生存可能かつ健常であり、Ｔｒｆ２−／−雌は繁殖力を有するが、精子完成を大幅に欠くためＴｒｆ２−／−雄は生殖不能である（非特許文献１２）。Ｔｒｆ２−／−雄の精巣は伸長精細胞または精子の完全な不在を示し、これはＴｒｆ２による遺伝子の転写調節が精子完成に必須であることを示している。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｅｄｄｙ，　Ｅ．Ｍ．，　Ｗｅｌｃｈ，　Ｊ．Ｅ．，　ａｎｄ　　Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，　Ｄ．Ａ．　（１９９３）．　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　Ｍａｌｅ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．　Ｄ．Ｍ．　ｄｅ　Ｋｒｅｔｓｅｒ，　ｅｄ．　（Ｌｏｎｄｏｎ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），　ｐｐ．　１８１−２３２．
【非特許文献２】
Ｅｄｄｙ，　Ｅ．Ｍ．，　ａｎｄ　　Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，　Ｄ．Ａ．　（１９９８）．　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｍｅｉｏｓｉｓ．　Ｉｎ　Ｍｅｉｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｍ．Ａ．Ｈａｎｄｅｌ，　ｅｄ．　（Ｌｏｎｄｏｎ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），　ｐｐ．１４１−２００．
【非特許文献３】
Ｂａｌｈｏｒｎ，　Ｒ．　（１９８２）．　Ａ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｓｐｅｒｍ．　Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　９３，　２９８−３０５．
【非特許文献４】
Ｂｒａｕｎ，　Ｒ．Ｅ．　（１９９０）．　Ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔａｍｉｎｅ　１　ｇｅｎｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍｏｕｓｅ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｅｎｚｙｍｅ　４４，　１２０−１２８）．
【非特許文献５】
Ｅｄｄｙ，　Ｅ．Ｍ．，　ａｎｄ　Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，　Ｄ．Ａ．　（１９９８）．　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｍｅｉｏｓｉｓ．　Ｉｎ　Ｍｅｉｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｍ．Ａ．Ｈａｎｄｅｌ，　ｅｄ．　（Ｌｏｎｄｏｎ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），　ｐｐ．１４１−２００．
【非特許文献６】
Ｓｔｅｇｅｒ，　Ｋ．　（１９９９）．　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｓｐｅｒｍａｔｉｄｓ．　Ａｎａｔ．　Ｅｍｂｒｙｏｌ．　１９９，　４７１−８７．
【非特許文献７】
Ｆｏｕｌｋｅｓ，　Ｎ．Ｓ．，　Ｍｅｌｌｓｔｒｏｍ，　Ｂ．，　Ｂｅｎｕｓｉｇｌｉｏ，　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，　Ｐ．　（１９９２）．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｓｗｉｔｃｈｏｆ　ＣＲＥＭ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ；　ｆｒｏｍ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ　ｔｏ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ．　　Ｎａｔｕｒｅ　３５５，　８０−８４．
【非特許文献８】
Ｄｅ　Ｃｅｓａｒｅ，　Ｄ．，　Ｆｉｍｉａ，　Ｇ．Ｍ．，　Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，　Ｐ．　（１９９９）．　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｒｏｕｔｅｓ　ｔｏ　ＣＲＥＭ　ａｎｄ　ＣＲＥＢ：　ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓｃｉ．　２４，　２８１−２８５．
【非特許文献９】
Ｂｌｅｎｄｙ，　Ｊ．Ａ．，　Ｋａｅｓｔｎｅｒ，　Ｋ．Ｈ．，　Ｗｅｉｎｂａｕｅｒ，　Ｇ．Ｆ．，　Ｎｉｅｓｃｈｌａｇ，　Ｅ．，　Ｓｃｈｕｔｚ，　Ｇ．　（１９９６）．　Ｓｅｖｅｒｅ　ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ｌａｃｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ＣＲＥＭ　ｇｅｎｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　３８０，　１６２−１６５．
【非特許文献１０】
Ｎａｎｔｅｌ，　Ｆ．，　Ｍｏｎａｃｏ，　Ｌ．，　Ｆｏｕｌｋｅｓ，　Ｎ．Ｓ．，　Ｍａｓｑｕｉｌｉｅｒ，　Ｄ．，　ＬｅＭｅｕｒ，　Ｍ．，　Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ，　Ｋ．，　Ｄｉｅｒｉｃｈ，　Ａ．，　Ｐａｒｖｉｎｅｎ，　Ｍ．，　Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，　Ｐ．　（１９９６）．　Ｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ａｎｄ　ｇｅｒｍ−ｃｅｌｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ＣＲＥＭ−ｍｕｔａｎｔ　ｍｉｃｅ．　Ｎａｔｕｒｅ
３８０，　１５９−１６２．
【非特許文献１１】
Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ，　Ｍ．，　Ｗａｎｇ，　Ｚ．，　Ｍａｒｔｉｎｅｚ，　Ｅ．，　Ｔｊｅｒｎｂｅｒｇ，　Ａ．，　Ｚｈａｎｇ，　Ｄ．，　Ｖｏｌｌｍｅｒ，　Ｆ．，　Ｃｈａｉｔ，　Ｂ．Ｔ．，　ａｎｄ　Ｒｏｅｄｅｒ，　Ｒ．Ｇ．　（１９９９）．　Ｈｕｍａｎ　ＴＡＴＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ−２　（ｈＴＲＦ２）　ｓｔａｂｌｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｈＴＦＩＩＡ　ｉｎ　ＨｅＬａ　ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　　９６，　１３７２０−１３７２５．
【非特許文献１２】
Ｚｈａｎｇ，　Ｄ．，　Ｐｅｎｔｔｉｌａ，　Ｔ．Ｌ．，　Ｍｏｒｒｉｓ，　Ｐ．Ｌ．，　Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ｒｏｅｄｅｒ，　Ｒ．Ｇ．　（２００１）．　Ｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ｌａｃｋｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｔｒｆ２　ｇｅｎｅ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９２，１１５３−５．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
哺乳動物精巣において特異的に発現する遺伝子のリストは急速に増加しつつあるが、単離され、かつ特徴付けられている、哺乳動物における精子形成の減数分裂期の過程で、特には精子完成の過程で発生的に発現する遺伝子は比較的少ないのが実状である（前記非特許文献１、２）。
【０００９】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、精子完成の過程で発生的に発現するマウス遺伝子とその発現産物、およびその用途発明を提供することを課題としている。
【００１０】
またこの出願の発明は、前記の遺伝子材料を用いた形質転換、トランスジェニック動物の作出、所望遺伝子の導入、および再生医療、移植医療のための手段等を提供することを課題としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この発明は、マウスの精子特異的な蛋白質であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＩＰＳ４０を提供する。
【００１２】
この発明はまた、前記のマウスタンパク質ＴＩＰＳ４０をコードするマウス遺伝子を提供する。このマウス遺伝子は、さらに具体的には、転写されたｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有する遺伝子である。
【００１３】
この発明は、前記のマウス遺伝子由来のポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
この発明は、前記のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【００１５】
この発明は、前記のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する。
【００１６】
この発明は、配列番号２における連続５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを提供する。
【００１７】
この発明は、前記のマウスタンパク質ＴＩＰＳ４０を認識する抗体を提供する。
【００１８】
この発明はさらに、前記のポリヌクレオチドと他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを提供する。この発現ベクターにおいては、他のタンパク質が転写制御因子であることを好ましい態様としている。
【００１９】
さらにこの発明は、前記の発現ベクターを非ヒト全能性細胞に導入し、この形質転換細胞を個体へと発生させることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物の作出方法と、この方法によって作出されたトランスジェニック非ヒト動物および子孫動物を提供する。
【００２０】
またさらに、この発明には、前記のトランスジェニック非ヒト動物の雄と野性型雌とを交配させることによって、雌動物の卵子染色体に融合ポリヌクレオチドを導入することを特徴とする遺伝子導入方法を提供する。
【００２１】
すなわちこの出願の発明者らは、精子細胞特異的に発現するｂＺｉｐ型転写制御因子をコードする新規遺伝子（ＴＩＰＳ４０）をクローニングし、このＴＩＰＳ４０が精子を産生することのできる成体マウスの精巣にのみ発現し、なかでも一倍体生殖細胞である精子にのみ発現していることを見出した。また、この遺伝子産物ＴＩＰＳ４０ポリペプチドが、精子形成の最終段階でのみ翻訳されて精子の核に局在することを見出した。以上の知見は、ＴＩＰＳ４０ポリペプチドが受精によって精子核から放出され、卵子内の核まで運ばれて雄と雌の核が融合して発生が始まろうとする時（発生の最初の段階）の転写誘導を制御する役割を持つ新規分子であることを強く示唆する。
【００２２】
この出願の発明は、以上のとおりの新規な知見に基づいて完成されたものである。
【００２３】
なおこの出願の各発明において、「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡに存在し、特定のポリペプチド（タンパク質）をコードする２本鎖ＤＮＡであり、そのコード領域（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｇ　ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）、およびＯＲＦに対する発現制御領域（プロモーター／エンハンサー配列、リプレッサー配列）を含む。
【００２４】
この出願の発明において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」とは、それぞれ長鎖および単鎖のヌクレオチド鎖であり、ポリヌクレオチドが１００ｂｐ以上、オリゴヌクレオチドが１００ｂｐ未満を一応の基準とするが、例外も存在する。
【００２５】
この出願の発明において、「ポリペプチド」および「オリゴペプチド」とは、それぞれ長鎖および単鎖のペプチド鎖であり、ポリペプチドが３０アミノ酸残基以上、オリゴペプチドが３０アミノ酸残基未満を一応の基準とするが、例外も存在する。
【００２６】
また、この出願の発明において、「精子特異的」とは、精子形成および／または精子完成の過程を意味する。
【００２７】
この出願の発明におけるその他の定義等については、以下の発明の実施形態において詳しく説明する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８９；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　Ｎ．Ｙ，
１９９５等に記載されている
以下、発明の実施の形態を示し、この出願の各発明についてさらに詳しく説明する。
【００２８】
【発明の実施の形態】
この発明のマウスタンパク質ＴＩＰＳ４０は、マウス細胞から単離する方法、配列番号２のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法等によって得ることができ、またｃＤＮＡ等のポリヌクレオチドを用いた遺伝子組換え法によって大量に得ることもできる。例えばＴＩＰＳ４０遺伝子から調製したｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターに挿入し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写や発現ベクターによる形質転換体細胞から、ＴＩＰＳ４０　ｃＤＮＡがコードするタンパク質ＴＩＰＳ４０（ポリペプチド）を大量に得ることができる。形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。また、形質転換細胞の培養物からポリペプチドを単離・精製するには、公知の方法（例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等）を用いることができる。なお、この発明のタンパク質ＴＩＰＳ４０には、他の任意の蛋白質との融合蛋白質も含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質などが例示できる。さらに、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などである。
【００２９】
このようにして得られるタンパク質ＴＩＰＳ４０は、例えば抗体作製のための免疫原として有用である。
【００３０】
この発明のマウス遺伝子は、前記のタンパク質ＴＩＰＳ４０をコードするゲノム遺伝子（以下、ＴＩＰＳ４０遺伝子と記載することがある）である。このＴＩＰＳ４０遺伝子は、さらに具体的には、転写されるｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡが、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子である。
【００３１】
従って、この発明のＴＩＰＳ４０遺伝子は、そのｃＤＮＡ塩基配列情報（配列番号１）に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片としても定義することができる。ハイブリダイゼーションは、塩濃度、有機溶媒濃度および温度等を一定の範囲として行う「ストリンジェントな条件」のもとで行う。
【００３２】
このようにして特定されるＴＩＰＳ４０遺伝子ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）は、前記のプローブを用いて、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター、コスミドベクターやファージベクター等にクローニングされているマウスゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離するすることができる。そして、単離したゲノムＤＮＡ断片は、例えば蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による染色体異常を診断するためのプローブとしても用いることができる。
【００３３】
この発明のポリヌクレオチドは、前記のＴＩＰＳ４０遺伝子から調製されるゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、このｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡ、およびそれらの相補配列が含まれる。これらのポリヌクレオチドは公知の方法によって精製することができ、例えば、毒性試験等における被験対象として有用である。
【００３４】
さらに、これらのポリヌクレオチドは、相同遺伝子の検出とクローニングにも使用することができる。すなわち、例えば、配列番号１の塩基配列を用いるホモロジー検索により、ＴＩＰＳ４０遺伝子と相同のマウス以外の動植物遺伝子、例えばヒトゲノムＤＮＡにおける相同塩基配列を検出することができる。ホモロジー検索には、例えば、ＤＤＢＪ（　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｊｂ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｊｂ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）、ＮＣＢＩ（　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）等が提供する遺伝子データベースを用いることができる。相同遺伝子は、完全長塩基配列、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇｓ）、ＳＴＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇｇｅｄ　ｓｉｔｅｓ）、ＧＳＳ（ｇｅｎｏｍｅ　ｓｕｒｖｅｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等のかたちで知ることができる。また、これ等の相同遺伝子は、例えば、ヒト染色体ＤＮＡから直接（ヒトの精子や白血球等の染色体から抽出・調製したＤＮＡを用いることにより）、あるいは、この発明が提供するオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション、ＰＣＲプライマーによるＲＴ−ＰＣＲ等により、スクリーニングし、クローニングすることができる。
【００３５】
なお、この発明のポリヌクレオチドには、それぞれの連続１０〜９９塩基断片（オリゴヌクレオチド）をも含む。これらのオリゴヌクレオチドは、例えば、ＴＩＰＳ４０遺伝子の変異を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして有用である。
【００３６】
これらのオリゴヌクレオチドは、常法により合成して調製することもでき、あるいは場合によっては前記のポリヌクレオチドやｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断することによってもできる。
【００３７】
この発明のプライマーセット群は、前記のＴＩＰＳ４０遺伝子やｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するための合成オリゴヌクレオチドの集合であり、これらのプライマーセットを用いたＰＣＲによって、ＴＩＰＳ４０遺伝子の発現変調や変異を検出することができる。
【００３８】
これらのプライマーセットは、配列番号１の塩基配列に基づき、設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、ＰＣＲの成否はプライマー設計とこれに係る諸条件の設定に大きく依存するので、最適プライマーの調製には種々の創意工夫と試行を要する。プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ　ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００３９】
この発明の抗体は、前記のタンパク質ＴＩＰＳ４０を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の集合である。この抗体群は、精細胞でのＴＩＰＳ４０ポリペプチドの発現を調べるための材料等として有用である。この抗体には、ＴＩＰＳ４０ポリペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、前記のＴＩＰＳ４０ポリペプチドやその部分ペプチドを抗原として用いて動物を免疫した後、血清から得ることが出きる。あるいは、上記の発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したＢ細胞をミエロ−マと融合させてハイブリド−マを作製すれば、モノクロ−ナル抗体を産生することができる。またこの発明の抗体には、各種の標識（酵素、放射性同位体、蛍光色素等）を結合したものも含まれる。
【００４０】
この発明の発現ベクターは、前記のＴＩＰＳ４０ポリヌクレオチドと、他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドを保有する。すなわわち、この場合の「他のタンパク質をコードするポリヌクレオチド」とは、マウスまたは非マウス由来の任意のタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、この発現ベクターの用途等に応じて適宜に選択することができる。特に、トランスジェニック動物の作出に使用する場合等には、任意の転写制御因子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）が好ましい。この発現ベクターは、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターの任意のクローニング部位に融合ポリヌクレオチドを挿入結合することによって作製することができる。
【００４１】
この発明のトランスジェニック非ヒト動物の作出方法は、前記の発現ベクターを用い、公知のトランスジェニック動物作製法（例えば、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｌ．　ＵＳＡ　７７；７３８０−７３８４，　１９８０）に従って実施することができる。すなわち、前記の融合ポリヌクレオチド（以下、「導入遺伝子」と記載することがある）を非ヒト動物（好ましくはマウス）の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって目的とするトランスジェニック動物を作製することができる。
【００４２】
遺伝子を導入する全能性細胞としては、受精卵や初期胚、ＥＳ細胞等を用いることができる。また全能性細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、ＤＮＡの物理的注入（マイクロインジェクション）法を採用することができる。
【００４３】
遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（例えば、尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰＣＲ法により導入遺伝子の存在を確認する。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Ｆｏｕｎｄｅｒ）とすれば、導入遺伝子はその子（Ｆ１）の５０％に伝達される。さらに、このＦ１個体を野生型動物または他のＦ１動物と交配させることにより、２倍体染色体の片方（ヘテロ接合）または両方（ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体（Ｆ２）を作成することができる。
【００４４】
そして、このように作出されたトランスジェニック非ヒト動物は、ＴＩＰＳ４０遺伝子を有する導入遺伝子によって、その精子細胞において特異的に融合ポリヌクレオチドを発現する。さらにこの融合ポリヌクレオチドは、受精時に卵子の核に移行するため、結果として、任意タンパク質（例えば、任意の転写制御因子）をコードするポリヌクレオチドを受精卵卵染色体に導入することが可能となる。そしてこの受精卵を個体へと発生させることによって、体細胞において融合タンパク質を発現する動物個体を作出することができる。
【００４５】
以下、実施例として、この発明のタンパク質ＴＩＰＳ４０とＴＩＰＳ４０遺伝子の同定と、その機能解析のために行った実験的研究を示す。
【００４６】
【実施例】
１：方法
１．１：サブトラクション（減数化）ｃＤＮＡライブラリの調製および分析
ｐＡＰ３ｎｅｏベクターを用いたリンカー・プライマー法（Ｆｕｊｉｉ，　Ｔ．，　Ｔａｍｕｒａ，　Ｋ．，　Ｃｏｐｅｌａｎｄ，　Ｎ．Ｇ．，　Ｇｉｌｂｅｒｔ，　Ｄ．Ｊ．，　Ｊｅｎｋｉｎｓ，　Ｎ．Ａ．，　Ｙｏｍｏｇｉｄａ，　Ｋ．，　Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ａｂｉｋｏ，　Ｙ．　（１９９９）．　Ｓｐｅｒｉｚｉｎ　ｉｓ　ａ　ｍｕｒｉｎｅ　ＲＩＮＧｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　５７，　９４−１０１）に従い、２００万の独立したクローンを含む成体精巣ｃＤＮＡライブラリを３５日齢マウスから構築した。次に、若年マウス（１７日齢）の精巣からｍＲＮＡを調製し、ホトビオチンを用いてそのｍＲＮＡをビオチン化した。ｆ１ヘルパーファージをトランスフェクトすることによってｃＤＮＡライブラリを一本鎖形態に変換した後、文献（Ｋｏｂｏｒｉ，　Ｍ．，　Ｉｋｅｄａ，　Ｙ．，　Ｎａｒａ，　Ｈ．，　Ｋａｔｏ，　Ｍ．，　Ｋｕｍｅｇａｗａ，　Ｍ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｋａｗａｓｈｉｍａ，　Ｈ．　（１９９８）．　Ｌａｒｇｅ　ｓｃａｌｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　３，　４５９−４７５）の記載に従って、それをビオチン化ｍＲＮＡとハイブリダイズさせ、ビオチン−アビジン相互作用によってそれを減数化した。ハイブリダイズしなかったクローンを二本鎖形態に変換した後、コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の形質転換に用い、２万の独立したクローンを有する減数化ｃＤＮＡライブラリを生成した。
【００４７】
この第１段階減数化ｃＤＮＡライブラリの品質を分析するため、プラスミドＤＮＡを７４０の無作為に選択したｃＤＮＡクローンから調製し、各プラスミドＤＮＡのアリコートを計数してＳｍａＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、各々順番に配置されたクローンをシート当たり８０含む１０シートのサザンブロットを調製した。また、クローン＃１〜＃２０のｃＤＮＡインサートをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化することによって精製し、３２Ｐ標識して重複クローンを見出すサザン分析だけではなくＴＩＳＰクローンを同定するノーザン分析にプローブとして用いた。各々のノーザンシートは、幼体（１７日齢）及び成体（３５日齢）マウスの精巣から抽出したＲＮＡ用の２つのレーンのみを含んでいた（図１Ａ）。ＴＩＳＰクローンのＤＮＡ配列を、ｃＤＮＡインサートの５’末端から、ジデオキシ鎖終結反応により、自動ＤＮＡシーケンサー（Ｌｉｃｏｒ　４０００Ｌ；Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を用いて決定した。これらの分析の後、次回のｃＤＮＡインサートの調製、放射標識、及びノーザン／サザン分析用に２０の非ハイブリダイズ・クローンをサザン分析によって（＃２１〜から）選択した。この手順を、サザン分析における７４０クローンの全ての非ハイブリダイズｃＤＮＡの選択が完了するまで繰り返した。総計で、１６９のクローンをノーザン／サザン分析に処した。
１．２：ｃＤＮＡライブラリの段階的サブトラクション
第１段階減数化ｃＤＮＡライブラリのＤＮＡ配列決定の後、１６９のプラスミドＤＮＡを各々０．１μｇ集めて１本のチューブに入れ、混合し、ＮｏｔＩでＤＮＡを消化し、５μｇをＴ７ＲＮＡポリメラーゼ反応に処してｃＤＮＡインサートをＲＮＡ形態に変換した。その反応混合物を７０単位のＤＮａｓｅＩで処理してＤＮＡ基質を除去した。生成したＲＮＡをＰｈｏｔｏｐｒｏｂｅ　ｂｉｏｔｉｎ（ＶＥＣＴＯＲ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を用いてビオチン化し、２５μｌの４０％ホルムアミド、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％　ＳＤＳ、及び０．２Ｍ　ＮａＣｌを含む総容積２５μｌのハイブリダイゼーション混合物中で一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）形態の第１段階減数化ｃＤＮＡライブラリと混合した。加えて、１μｇのマスキング・オリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴＣＧ　ＡＡＴＴＣＣＣ−３’）をこの混合物に添加したが、これはｐＡＰ３ｎｅｏベクターとｃＤＮＡインサートとの接合領域を通した非特異的ハイブリダイゼーションを防止するように設計された。次に、その反応混合物をＦＵＮＡ−ＰＣＲチューブ（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ、Ｔｏｋｙｏ）に入れて６５℃で１０分間加熱し、４２℃で４８時間インキュベートしてＲＮＡとｓｓＤＮＡとをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、ストレプトアビジン−フェノール／クロロホルム抽出の改変プロトコル（Ｓｉｖｅ，　Ｈ．　Ｌ．，　ａｎｄ　Ｓｔ　Ｊｏｈｎ，　Ｔ．　（１９８８）．　Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　　　ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ　ｂｉｏｔｉｎ　ａｎｄ　ｐｈｅｎｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１６，１０９３７）を文献（Ｆｕｊｉｉ，　Ｔ．，　Ｔａｍｕｒａ，　Ｋ．，　Ｃｏｐｅｌａｎｄ，　Ｎ．Ｇ．，　Ｇｉｌｂｅｒｔ，　Ｄ．Ｊ．，　Ｊｅｎｋｉｎｓ，　Ｎ．Ａ．，　Ｙｏｍｏｇｉｄａ，　Ｋ．，　Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ａｂｉｋｏ，　Ｙ．　（１９９９）．　Ｓｐｅｒｉｚｉｎ　ｉｓ　ａ　ｍｕｒｉｎｅ　ＲＩＮＧ　ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　５７，　９４−１０１）の記載に従って用いた。サブトラクションｓｓＤＮＡを回収し、文献（Ｋｏｂｏｒｉ，　Ｍ．，　Ｉｋｅｄａ，　Ｙ．，　Ｎａｒａ，　Ｈ．，　Ｋａｔｏ，　Ｍ．，　Ｋｕｍｅｇａｗａ，　Ｍ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｋａｗａｓｈｉｍａ，　Ｈ．　（１９９８）．　Ｌａｒｇｅ　ｓｃａｌｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ，　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　３，　４５９−４７５）の記載に従って、ＢｃａＢＥＳＴ　ＤＮＡポリメ��ーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いて二本鎖形態に変換した。エレクトロポレーションによってこの二本鎖プラスミドＤＮＡをコンピテント大腸菌に形質転換し（Ｋｏｂｏｒｉ，Ｍ．，　ａｎｄ　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．　（１９９３）．　Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｉｎ　ａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｐｒｉｏｒ　ｔｏ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２１，　２７８２）、約２．０×１０４個の独立クローンを有する第２段階減数化ｃＤＮＡライブラリを調製した。この第２段階減数化ｃＤＮＡライブラリからプラスミドＤＮＡ調製用に４８８のクローンを無作為に選択し、それらのうちの２５９をノーザン／サザン分析に処した。
【００４８】
第３段階減数化ライブラリを調製するため、これらの２５９のクローンの各々から０．１μｇのプラスミドＤＮＡを集め、それらをＲＮＡ形態に変換して、上述のように第２段階減数化ｃＤＮＡライブラリのｓｓＤＮＡとハイブリダイズさせた。新規ＴＩＳＰクローンを同定するため、プラスミドＤＮＡ調製用に２３５を無作為に選択し、８４のクローンをノーザン／サザン分析に処した。第５段階減数化ライブラリを得るまでこの手順を繰り返した。このプロセスの間、新規ＴＩＳＰクローンを同定するため第４及び第５段階減数化ライブラリから３１７及び３２０のクローンをプラスミドＤＮＡ調製用に無作為に選択し、それぞれ１１０及び３２のクローンをノーザン／サザン分析に処した。第４及び第５段階減数化ライブラリを調製するため、それぞれ８４及び１１０のクローンの各々について０．１μｇのプラスミドＤＮＡを集めてサブトラクションハイブリダイゼーション用にＲＮＡ形態に変換した。第３、第４及び第５段階減数化ｃＤＮＡライブラリの複雑性は約１．０×１０４、１．４×１０４、及び１．２×１０４独立クローンであった。１．３：ＧＦＰ−またはＧＳＴ−Ｔｉｓｐ４０融合タンパク質の調製及び発現
ＧＦＰ−タグ付加Ｔｉｓｐ４０タンパク質を調製するため、まず、ＴＩＳＰ４０　ｃＤＮＡをテンプレートとするＰＣＲによってＴＩＳＰ４０の全ＯＲＦを有するＤＮＡ断片を合成した。インフレームＡｓｃｌ−ＮｏｔＩ部位を有得るＴＩＳＰ４０のｃＤＮＡインサートを得るため、ＴＩＳＰ４０の開始コドン（５’−ＴＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＡＴＡＴＧＡＴＡＣＡＣＴＧＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡ−３’：下線はＡｓｃｌ部位）及び終止コドン（５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣ　ＡＴＣＴＣＡＴＣＴＧＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＴＣＣ−３’：下線はＮｏｔＩ部位）周辺の一組のオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーとしてＰＣＲに用いた。ＴＩＳＰ４０遺伝子の同一性は５つの独立したクローンのＤＮＡを配列決定することによって確認し、いかなる不一致も含まないプラスミドＤＮＡを選択した。次に、このＴＩＳＰ４０のＡｓｃｌ／ＮｏｔＩ断片をｐＥＧＦＰ３Ｂベクター（大阪大学のＮ．Ｙａｂｕｔａが構築）に組み込んだ。ＴｒａｎｓＩＴＴＭポリアミン・トランスフェクション試薬（Ｐａｎ　Ｖｅｒａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用い、製造者のプロトコルに従って、ＨｅＬａ細胞にＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０を有するプラスミドＤＮＡ又はベクター単独をトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＨｅＬａ細胞を培養皿（φ＝６ｃｍ）において、３７℃、ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。光学画像を倒立レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭ４１０又はＬＳＭ５１０）によって記録した。
【００４９】
同じＡｓｃｌ−ＮｏｔＩ　ＴＩＳＰ４０　ｃＤＮＡをｐＧＥＸ６Ｐベクターに融合させた。大腸菌内での発現及びＧＳＴ−Ｔｉｓｐ４０の精製をＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼシステムを用いて製造者のプロトコルに従って行った（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。
１．４：ノーザンブロット及びｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析
様々な組織（生殖細胞、Ｌｃｙｄｉｇ細胞、及びセルトリ細胞）分画からのＲＮＡを、文献（Ｋｏｇａ，　Ｍ．，　Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｙｏｍｏｇｉｄａ，　Ｋ．，　Ｎｏｚａｋｉ，　Ｍ．，　Ｔｓｕｃｈｉｄａ，　Ｊ．，　Ｏｈｔａ，　Ｈ．，　Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ｙ．，　Ｍａｓａｉ，　Ｋ．，　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，　Ｙ．，　Ｙａｍａｎａｋａ，　Ｍ．，　Ｉｇｕｃｈｉ，　Ｎ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．，　Ｍａｔｓｕｍｉｙａ，　Ｋ．，　Ｏｋｕｙａｍａ，　Ａ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．　（２０００）．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｎｏｖｅｌ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ；　ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ　ＣｏＡ：３−Ｏｘｏ　ａｃｉｄ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．　Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｐｒｏｄ　．　６３，　１６０１−１６０９；Ｉｇｕｃｈｉ，　Ｎ．，　Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｆｕｊｉｉ，　Ｔ．，　Ｔａｍｕｒａ，　Ｋ．，　Ｋａｎｅｋｏ，　Ｙ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ，　ａｎｄ　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．　（１９９９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｅｋｔｉｎ　ｃＤＮＡ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｔｅｓｔｉｓ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４５６，　３１５−３２１）の記載に従って調製した。ＳｍａＩ及びＮｏｔＩ制限酵素によってプラスミドから切り出したｃＤＮＡインサートをＲａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｒ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（ＴａＫａＲａ、日本）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで放射標識し、ハイブリダイゼーション・プローブとして用いた。ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの手順は文献（Ｆｕｊｉｉ，　Ｔ．，　Ｔａｍｕｒａ，　Ｋ．，　Ｃｏｐｅｌａｎｄ，　Ｎ．Ｇ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，　Ｄ．Ｊ．，　Ｊｅｎｋｉｎｓ，　Ｎ．Ａ．，　Ｙｏｍｏｇｉｄａ，　Ｋ．，　Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ａｂｉｋｏ，　Ｙ．　（１９９９）．　Ｓｐｅｒｉｚｉｎ　ｉｓ　ａ　ｍｕｒｉｎｅ　ＲＩＮＧ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　５７，　９４−１０１）の記載に従った。
１．５：免疫ブロット及び免疫染色
ニュージーランドウサギをＴｉｓｐ４０のアミノ酸＃３ないし＃１６に相当する合成ペプチド（ＨＣＳＥＴＳＰＧＲＤＳＧＶＳ）（図３Ａ）、又は上述のようにＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼシステムを用いてアフィニティ精製した組換えＴｉｓｐ４０で免疫することにより、Ｔｉｓｐ４０に対するポリクローナル抗体を調製した。免疫の２ヶ月後、ペプチドカラムクロマトグラフィーによって抗血清をアフィニティ精製した。免疫ブロット及び免疫染色は文献（Ｙａｍａｎａｋａ，　Ｍ．，　Ｋｏｇａ，　Ｍ．，　Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ｙ．，　Ｏｈｔａ，　Ｈ．，　Ｙｏｍｏｇｉｄａ，　Ｋ．，　Ｔｓｕｃｈｉｄａ，　Ｊ．，　Ｉｇｕｃｈｉ，　Ｎ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．，　Ｎｏｚａｋｉ，　Ｍ．，　Ｍａｔｓｕｍｉｙａ，　Ｋ．，　Ｏｋｕｙａｍａ，　Ａ．，　Ｔｏｓｈｉｍｏｒｉ，　Ｋ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．　（２０００）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｍｕｒｉｎｅ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．　　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ．　６２，　１６９４−７１０１）の記載に従って行った。免疫組織化学のため、組織切片をＴｉｓｐ４０に対するポリクローナルウサギ抗体（１／１００希釈）及び二次抗ウサギビオチン化抗体（１／１００希釈）と共にインキュベートし、最後にストレプトアビジン−ＣＹ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にインキュベートすることによって発色させた。染色画像を倒立レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭ５１０）で可視化し、Ａｄｏｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて処理した。
２：結果
２．１：段階的サブトラクションによるＴＩＳＰ　ｃＤＮＡの単離
若年（１７日齢）マウスの精巣に由来するｍＲＮＡで減数化した３５日齢マウスの成体精巣に由来するｃＤＮＡライブラリを調製した。ノーザン分析は、分析した成体精巣からのｃＤＮＡクローンの約３０％が若年精巣からのものに比較してより高い強度のバンドを示すことを示したが、これらのバンドは、強度の変動に基づいて３つのタイプに分類できる（図１Ａ）。タイプ１のクローンは若年精巣においてはバンドを示さないが、成体精巣におけるバンドの強度は非常に強かった。タイプ２のクローンは成体精巣においては強いバンドを示したが、若年精巣においても弱いバンドを観察することができた。タイプ３のクローンは少なくとも２つのバンドを示し、そのうちの一方は若年及び成体精巣においてほぼ等しく、他方は、まさにタイプ１のクローンのように、成体精巣において排他的に観察された。これらのｃＤＮＡクローンをＴＩＳＰ（ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｉ；精子完成において転写後に誘導される）と命名した。クローン選択のプロセスの過程でこれらのＴＩＳＰクローンの数を計数し、横軸のクローン総数に対してプロットした場合、その増加曲線は横軸の数が増加するに従って平坦になることが見出されるものと期待した（図１Ｂ）。実際、単離したタイプ１、タイプ２及びタイプ３のクローンを合計７４０のクローンに対してプロットしたとき、全ての場合において平坦化した曲線が観察された（図１Ｃ）。このように、第１段階減数化ｃＤＮＡライブラリについてのスクリーニングにおいて、３１のタイプ１クローン、１１のタイプ２クローン、及び７のタイプ３クローンを単離した。
【００５０】
段階的サブトラクションを実施することにより、不必要なｃＤＮＡクローンの単離を回避することができ、さらに２７のタイプ１クローン、２４のタイプ２クローン、及び１２のタイプ３クローンを単離した。この段階的サブトラクションを第５段階減数化ｃＤＮＡライブラリまで繰り返すことにより、最終的に、それぞれ８０、５６、及び３６種類のタイプ１、タイプ２、及びタイプ３ｃＤＮＡクローンを単離した。第５段階減数化ｃＤＮＡライブラリにおいて、サザンブロット分析による評価で、無作為に単離した３２０のクローンのうちには３２種類のｃＤＮＡクローンのみが存在していたことが見出され、３、４及び３種類のタイプ１、タイプ２及びタイプ３ｃＤＮＡクローンを単離した。したがって、第１段階減数化ｃＤＮＡライブラリに含まれていたＴＩＳＰクローンのほぼ全てを単離していたものと判断した。
２．２：ＴＩＳＰ　ｃＤＮＡクローンの発現及び構造
Ｓｍａｌ及びＮｏｔＩ制限酵素での消化によって単離ＴＩＳＰクローンから切り出された３２Ｐ標識ｃＤＮＡインサートを用いて、タイプ１　ＴＩＳＰクローンについては図２の右パネルに示されるように、異なる年齢のマウスの精巣から抽出したＲＮＡについてノーザンブロットを行った。マウスの様々な組織に由来するＲＮＡのサザンブロットは、タイプ１　ＴＩＳＰクローンの全てが、他の組織においても発現するＴＩＳＰ１２（Ｙａｍａｎａｋａ，　Ｍ．，　Ｋｏｇａ，　Ｍ．，　Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ｙ．，　Ｏｈｔａ，　Ｈ．，　Ｙｏｍｏｇｉｄａ，　Ｋ．，　Ｔｓｕｃｈｉｄａ，　Ｊ．，　Ｉｇｕｃｈｉ，　Ｎ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．，　Ｎｏｚａｋｉ，　Ｍ．，　Ｍａｔｓｕｍｉｙａ，　Ｋ．，　Ｏｋｕｙａｍａ，　Ａ．，　Ｔｏｓｈｉｍｏｒｉ，　Ｋ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．　（２０００）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｍｕｒｉｎｅ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ．　６２，　１６９４−７１０１）を除いて、精巣において優先的に発現することを示した。これは、これらのＴＩＳＰ遺伝子が精巣において特有の機能を有することを示唆する（図２、左パネル）。ＴＩＳＰ１４及びＴＩＳＰ４４はそれらが卵巣においても発現するという意味において例外であり、それらが卵巣の発生においても役割を果たし得ることが示唆される。
【００５１】
様々な年齢のマウスに由来するＲＮＡについてのノーザンブロットは、全てのＴＩＳＰ遺伝子の発現レベルが成熟期前の精巣（２−５、８及び１７日齢）においては非常に低いが、成熟期後の精巣（２３日齢）においてはそれらの転写が急激に誘導され、２９日齢マウスの精巣においてはさらに増加することを示した。それらのうちの幾つかは、その後、図２（右パネル）に示されるように、成体（３５日齢）マウスの精巣において減少した。この結果は、多くのＴＩＳＰ遺伝子の転写が、成熟期前の精巣においてのみ生じる精子形成後に誘導されることを示唆する。実際、これまで試験した全てのＴＩＳＰ遺伝子は、分画試料のノーザン分析による判定、及びｉｎ　ｓｉｓｕハイブリダイゼーション分析における判定で、精子完成の過程で成熟期前の精巣の生殖細胞において転写的に誘導される（例えば、Ｆｕｊｉｉ，　Ｔ．，　Ｔａｍｕｒａ，　Ｋ．，　Ｃｏｐｅｌａｎｄ，　Ｎ．Ｇ．，　Ｇｉｌｂｅｒｔ，　Ｄ．Ｊ．，　Ｊｅｎｋｉｎｓ，　Ｎ．Ａ．，　Ｙｏｍｏｇｉｄａ，　Ｋ．，　Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ａｂｉｋｏ，　Ｙ．　（１９９９）．　Ｓｐｅｒｉｚｉｎ　ｉｓ　ａ　ｍｕｒｉｎｅ　ＲＩＮＧ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　５７，　９４−１０１）。多くのＴＩＳＰ遺伝子の転写のピークは約３５日であり、すなわち、転写は成熟期の２週間後であっても依然として活性である。したがって、精子完成の過程の転写は従来信じられているように沈黙ではないと結論付ける。
【００５２】
また、分化生殖細胞を欠く精巣、例えば、潜在睾丸（Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．，　Ｈａｎｅｊｉ，Ｔ．，　ａｎｄ　Ａｉｚａｗａ，　Ｓ．　（１９８１）．　Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ　ＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ：　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｒｙｐｔｏｒｃｈｉｄｉｓｍ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｕｒｇｉｃａｌ　ｒｅｖｅｒｓａｌ．　Ｆｅｒｔｉｌ．　Ｓｔｅｒｉｌ．　３５，　３５９−３６２）、ｊｓｄ／ｊｓｄ（Ｍｉｚｕｎｕｍａ，　Ｍ．，　Ｄｏｈｍａｅ，　Ｋ．，　Ｔａｊｉｍａ，　Ｙ．，　Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ，　Ｕ．，　Ｗａｔａｎａｂｅ，　Ｄ．，　ａｎｄ　　　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．　（１９９２）．　Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｓｐｅｒｍ　ｉｎ　ｊｕｖｅｎｉｌｅ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａｌ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　（ｊｓｄ）　ｍｕｔａｎｔ　ｍｉｃｅ　ｉｓ　ａｓｃｒｉｂｅｄ　ｔｏ　ａ　ｄｅｆｅｃｔ　ｏｎ　ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｔｏ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．　Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１５０，　１８８−１９）、Ｓｌ１７Ｈ／Ｓｌ１７Ｈ（Ｂｒａｎｎａｎ，　Ｃ．　Ｉ．，　Ｂａｄｅｌｌ，　Ｍ．　Ａ．，　Ｒｅｓｎｉｃｋ，　Ｊ．　Ｌ．，　Ｅｐｐｉｇ，　Ｊ．　Ｊ．，　Ｈａｎｄｅｌ，　Ｍ．　Ａ．，　Ｗｉｌｌｉａｍｓ，　　Ｄ．　Ｅ．，　Ｌｙｍａｎ，　Ｓ．　Ｄ．，　Ｄｏｎｏｖａｎ，　Ｐ．　Ｊ．，　Ｊｅｎｋｉｎｓ，　Ｎ．　Ａ．，　ａｎｄ　Ｃｏｐｅｌａｎｄ，　Ｎ．Ｇ．　（１９９２）．　　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ　ｉｎ　Ｓｔｅｅｌ　１７Ｈ　ｍｉｃｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｆｒｏｍ　ａ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｄｅｆｅｃｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｅｅｌ
ｆａｃｔｏｒ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｔａｉｌ．　Ｇｅｎｅｓ．　Ｄｅｖ．　１０，　１８３２−１８４２）、及びＷ／ＷＶ（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，　Ｋ．，　Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，　Ｓ．，　Ｏｇａｗａ，　Ｍ．，　Ｈａｙａｓｈｉ，　Ｓ．−Ｉ．，　Ｋｕｎｉｓａｄａ，　Ｔ．，　Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，　Ｔ．，
ａｎｄ　Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，　Ｓ．−Ｉ．　（１９９１）．　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｃ−ｋｉｔ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ：　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ　ａｓ　ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｉｔｅ　ｏｆ　　ｃ−ｋｉｔ　　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　　１１３，　６８９−６９９）（これらは全て、精巣中に生殖細胞を欠くことが公知である）から得られたＲＮＡを用いて、ノーザンブロット分析によりＴＩＳＰクローンの転写を分析した。期待される通り、ノーザンブロットはこれらの突然変異体マウスの精巣において全てのＴＩＳＰ遺伝子の発現レベルが非常に低いか、又はほとんど検出不能であることを示し、精子完成におけるそれら特有の役割がさらに強調された。
２．３：ＴＩＳＰ遺伝子の新規性
これらの遺伝子のＤＮＡ配列決定は、表１に列挙されるように２０のタイプ１　ＴＩＳＰ遺伝子が同一であり、かつ１４が既知遺伝子と相同であるが、残りの４６のタイプ１　ＴＩＳＰ遺伝子は新規で機能未知の遺伝子であることを示した。既知遺伝子のうち、プロタミン１（ＴＩＳＰ１８）、プロタミン２（ＴＩＳＰ１）及び遷移タンパク質２が見出され、これらは精子完成において中心的な役割を果たすことが公知である（Ｅｄｄｙ，　Ｅ．Ｍ．，　ａｎｄ　　Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，　Ｄ．Ａ．　（１９９８）．　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｍｅｉｏｓｉｓ．　Ｉｎ　Ｍｅｉｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｍ．Ａ．Ｈａｎｄｅｌ，　ｅｄ．　（Ｌｏｎｄｏｎ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），　ｐｐ．１４１−２００）。また、精巣特異的な方法で発現することが従来公知である遺伝子、例えば、精巣特異的ホスホグリセレートキナーゼ（ＴＩＳＰ４）、精子ミトコンドリア・カプシル（ｃａｐｓｉｌｅ）タンパク質（ＴＩＳＰ１１）、システイン関連上皮性精子形成タンパク質（ＴＩＳＰ１４）、遷移タンパク質２（ＴＩＳＰ２８）、精子−卵認識タンパク質前駆体（ＴＩＳＰ２９）、精巣特異的セリンキナーゼの基質（ｔｓｓｋ−１及びｔｓｓｋ−２）（ＴＩＳＰ３７）、ｔｓｓｋ−２（ＴＩＳＰ４７）、及び精巣特異的発現ｃＤＮＡ−２（ｔｓｅｃ−２）（ＴＩＳＰ６１）（Ｅｄｄｙ，　Ｅ．Ｍ．，　Ｗｅｌｃｈ，　Ｊ．Ｅ．，　ａｎｄ　　Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，　Ｄ．Ａ．　（１９９３）．　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　Ｍａｌｅ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．　Ｄ．Ｍ．　ｄｅ　Ｋｒｅｔｓｅｒ，　ｅｄ．　（Ｌｏｎｄｏｎ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），　ｐｐ．　１８１−２３２；Ｅｄｄｙ，　Ｅ．Ｍ．，　ａｎｄ　　Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，　Ｄ．Ａ．　（１９９８）．　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｍｅｉｏｓｉｓ．　Ｉｎ　Ｍｅｉｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．　Ｍ．Ａ．Ｈａｎｄｅｌ，　ｅｄ．　（Ｌｏｎｄｏｎ：　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ），　ｐｐ．１４１−２００）も存在した。これらの結果は、精子完成特異的遺伝子の包括的単離についての戦略及び技術が適切であったことを示す。興味深いことに、精子の尾の潜在的成分である繊維性鞘成分（ＴＩＳＰ５２）及びテクチン（ＴＩＳＰ７６）の遺伝子（Ｉｇｕｃｈｉ，　Ｎ．，　Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｆｕｊｉｉ，　Ｔ．，　Ｔａｍｕｒａ，　Ｋ．，　Ｋａｎｅｋｏ，　Ｙ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ，　ａｎｄ　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．　（１９９９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｅｋｔｉｎ　ｃＤＮＡ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｔｅｓｔｉｓ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４５６，　３１５−３２１）も単離された。ホスホリパーゼＣデルタ４（ＰＬＣ−δ４）のスプライシングアイソフォームは精巣において���先的に発現することが知られ、受精に必要な開口分泌現象であるアクロソーム反応において機能することが近年見出されている（Ｆｕｋａｍｉ，　Ｋ．，　Ｎａｋａｏ，　Ｋ．，　Ｉｎｏｕｅ，　Ｔ．，　Ｋａｔａｏｋａ，　Ｙ．，　Ｋｕｒｏｋａｗａ，　Ｍ．，Ｆｉｓｓｏｒｅ，　Ｒ．Ａ．，　Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ｋ．，　Ｋａｔｓｕｋｉ，　Ｍ．，　Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，　Ｋ．，　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｎ．，　Ｔａｋｅｎａｗａ，　Ｔ．　（２００１）．　Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｃｄｅｌｔａ４　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｚｏｎａ　ｐｅｌｌｕｃｉｄａ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｒｏｓｏｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２９２，　９２０−９２３）。また、既にこれらのＴＩＳＰ遺伝子のうちの幾つかの機能を解析し（表１において星印で示される）、それらが精子完成特異的な方法で実際に発現及び機能することを見出している（Ｆｕｊｉｉ，　Ｔ．，　Ｔａｍｕｒａ，　Ｋ．，　Ｃｏｐｅｌａｎｄ，　Ｎ．Ｇ．，　Ｇｉｌｂｅｒｔ，　Ｄ．Ｊ．，　Ｊｅｎｋｉｎｓ，　Ｎ．Ａ．，Ｙｏｍｏｇｉｄａ，　Ｋ．，　Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ａｂｉｋｏ，　Ｙ．　（１９９９）．　Ｓｐｅｒｉｚｉｎ　ｉｓ　ａ　ｍｕｒｉｎｅ　ＲＩＮＧ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　５７，　９４−１０１；Ｉｇｕｃｈｉ，　Ｎ．，　Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｆｕｊｉｉ，　Ｔ．，　Ｔａｍｕｒａ，　Ｋ．，　Ｋａｎｅｋｏ，　Ｙ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ，　ａｎｄ　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．　（１９９９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｅｋｔｉｎ　ｃＤＮＡ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｔｅｓｔｉｓ．　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４５６，　３１５−３２１；Ｔｏｓａｋａ，　Ｙ．，　Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，　Ｙａｎｏ，　Ｙ．，　Ｍａｓａｉ，　Ｋ．，　Ｎｏｚａｋｉ，　Ｍ．，　Ｙｏｍｏｇｉｄａ，　Ｋ．，　Ｏｔａｎｉ，　Ｓ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．（２０００）．　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｅｓｔｉｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ａｎｔｉｚｙｍｅ　（ＯＡＺ−ｔ）　ｇｅｎｅ：　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｉｎｇ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　　５，　２６５−２７６；Ｙａｍａｎａｋａ，　Ｍ．，　Ｋｏｇａ，　Ｍ．，　Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ｙ．，　Ｏｈｔａ，　Ｈ．，　Ｙｏｍｏｇｉｄａ，　Ｋ．，　Ｔｓｕｃｈｉｄａ，　Ｊ．，　Ｉｇｕｃｈｉ，　Ｎ．，　Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．，　Ｎｏｚａｋｉ，　Ｍ．，　Ｍａｔｓｕｍｉｙａ，　Ｋ．，　Ｏｋｕｙａｍａ，　Ａ．，　Ｔｏｓｈｉｍｏｒｉ，　Ｋ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｎ���，　Ｙ．　（２０００）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｍｕｒｉｎｅ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒｏｄ．　６２，　１６９４−７１０１；Ｋｏｇａ，　Ｍ．，　Ｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｙｏｍｏｇｉｄａ，　Ｋ．，　Ｎｏｚａｋｉ，　Ｍ．，　Ｔｓｕｃｈｉｄａ，　Ｊ．，　Ｏｈｔａ，　Ｈ．，　Ｎａｋａｍｕｒａ，　Ｙ．，　Ｍａｓａｉ，　Ｋ．，　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，　Ｙ．，　Ｙａｍａｎａｋａ，　Ｍ．，　Ｉｇｕｃｈｉ，　Ｎ．，　Ｎｏｊｉｍａ，Ｈ．，　Ｍａｔｓｕｍｉｙａ，　Ｋ．，　Ｏｋｕｙａｍａ，　Ａ．，　Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，　Ｙ．　（２０００）．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｈａｐｌｏｉｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｎｏｖｅｌ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ；　ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ｓｕｃｃｉｎｙｌ　ＣｏＡ：３−Ｏｘｏ　ａｃｉｄ　ＣｏＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．　Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｐｒｏｄ　．　６３，　１６０１−１６０９）。
【００５３】
【表１】
2004024246.tif 000002
【００５４】
次に、ヒトゲノム配列決定についてのＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴネットワークサービス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ｐａｇｅ．ｃｇｉ？　Ｆ＝ＨｓＢｌａｓｔ．ｈｔｍｌ＆＆ＯＲＧ　＝Ｈｓ）を用いて、ＴＩＳＰ遺伝子のヒト相同体の染色体位置を決定した。全てのＴＩＳＰ遺伝子は常染色体上に遍在するが、Ｘ又はＹ染色体上には位置しないことはない。Ｘ又はＹに局在するマウス遺伝子はそれらのヒト相同体とシンテニーであると考えられるため、これは性染色体上に局在するマウスＴＩＳＰ遺伝子が存在しないことを示唆する。したがって、精子完成の過程でのＸ−精子及びＹ−精子特異的ＴＩＳＰ遺伝子の発現はないものと思われる。近年、Ｘ染色体が哺乳動物精子形成の前減数分裂段階において優先的な役割を有することが報告された。これは、マウスの精原形成において特異的に発現する２５の遺伝子のうち、３がＹ関連であり、１０がＸ関連であるためである（Ｗａｎｇ，　Ｐ．Ｊ．，　ＭｃＣａｒｒｅｙ，　Ｊ．Ｒ．，　Ｙａｎｇ，　Ｆ．，　Ｐａｇｅ，　Ｄ．Ｃ．　（２００１）．　Ａｎ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｏｆ　Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ．　Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．　２７，　４２２−６）。しかしながら、この出願における解析の結果は、ＴＩＳＰ遺伝子が、それらの染色体局在に関する限り、この仮説に従わないことを示す。
２．４：ＴＩＳＰ４０のノーザン及びインサイツ・ハイブリダイゼーション分析
前記のサブトラクション法によって得たＴＩＰＳクローンのうち、ＴＩＰＳ４０について詳しく解析した。
【００５５】
ノーザンブロット分析はＴＩＳＰ４０が精巣において１．２ｋｂの転写産物として排他的に発現し、停留精巣、ｊｓｄ／ｊｓｄ、Ｓｌ１７Ｈ／Ｓｌ１７Ｈ、及びＷ／ＷＶ突然変異体マウスの精巣においては転写産物が観察されないことを示した（図３Ａ）。新生児マウスの精巣においては、２３日齢まで雄生殖細胞発生の過程でＴＩＳＰ４０　ｍＲＮＡは検出されなかった。その後、２９−３５日齢の間に、ＴＩＳＰ４０遺伝子の急激な転写誘導が観察された（図３Ｂ）。分画マウス精巣細胞（生殖、Ｌｅｙｄｉｇ、及びセルトリ細胞）から精製したトータルＲＮＡを用いるノーザン分析は、ＴＩＳＰ４０　ｍＲＮＡが生殖細胞において排他的に発現することを示した（図３Ｃ）。これらの結果は、ＴＩＳＰ４０の発現が厳密な発生調節の下で精巣の生殖細胞においてのみ生じることを示している。
【００５６】
ＴＩＳＰ４０　ｍＲＮＡを特異的に発現する生殖細胞の発生段階を決定するため、ＴＩＳＰ４０　ｃＤＮＡから生成したアンチセンス及びセンスｃＲＮＡプローブを用い、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を行った。図３Ｄ及び３Ｅに示されるように、アンチセンスプローブでの特異的染色を、主として精細管の円形精子細胞層においてではあるが、伸長精子細胞層においても観察した。他の生殖細胞又は支持細胞においては陽性染色は検出されなかった。この結果は、ＴＩＳＰ４０転写産物が主としてマウス精巣内の輸精管のステップ５ないしステップ９精子細胞には存在するが、最終成熟期（ステップ１５−１６）の精子細胞には存在しないことを示し、上述のノーザンブロット分析によって得られた結果が確認された。
２．５：Ｔｉｓｐ４０は塩基性ロイシンジッパータンパク質である
ＴＩＳＰ４０　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列決定は、それが３１５アミノ酸のタンパク質をコードし、かつ塩基性アミノ酸に富むドメインとそれに続くロイシンジッパーモチーフを有し、その構造がｂＺｉｐ転写因子の間に一般的に見出される新規遺伝子であることを示した（図４Ａ）。ＢＬＡＳＴネットワークサービス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）を用いたＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおける相同性検索では、多くの典型的なｂＺｉｐタンパク質、例えば、ｃ−Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、及びＣＲＥＢ転写因子がＴｉｓｐ４０の相同体として見出された。Ｔｉｓｐ４０タンパク質の塩基性及びロイシンジッパードメインに対するＵＰＧＭＡパッケージ（ＳＤＣ　ｓｏｆｔｗａｒｅ、東京）を用いた系統樹の作製でも、Ｔｉｓｐ４０がｂＺｉｐ転写因子ファミリーに属することが示された（図４Ｂ）。最も緊密な相同タンパク質はＬＺＩＰ（Ｊｉｎ，　Ｄ．Ｙ．，　Ｗａｎｇ，　Ｈ．Ｌ．，　Ｚｈｏｕ，　Ｙ．，　Ｃｈｕｎ，　Ａ．Ｃ．，　Ｋｉｂｌｅｒ，　Ｋ．Ｖ．，　Ｈｏｕ，　Ｙ．Ｄ．，　Ｋｕｎｇ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｊｅａｎｇ，　Ｋ．Ｔ．　（２０００）．　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏｒｅｐｒｏｔｅｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｏｓｓ　ｏｆ　ＬＺＩＰ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１９，　７２９−７４０）であり、これはＣＲＥ依存性転写を活性化し、かつ細胞増殖を調節し、したがって、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の形質転換の推定核補因子である（Ｆｒｅｉｍａｎ，　Ｒ．Ｎ．，　ａｎｄ　Ｈｅｒｒ，　Ｗ．　（１９９７）．　Ｖｉｒａｌ　ｍｉｍｉｃｒｙ；　ｃｏｍｍｏｎ　ｍｏｄｅ　ｏｆ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＨＣＦ　Ｂｙ　ＶＰ１６　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＬＺＩＰ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１１，３１２２−３１２７）。長期間培養した星状細胞及びグリオーシス組織において見出される転写因子であるオアシス（Ｈｏｎｍａ，　Ｙ．，　Ｋａｎａｚａｗａ，　Ｋ．，　Ｍｏｒｉ，　Ｔ．，　Ｔａｎｎｏ，　Ｙ．，　Ｔｏｊｏ，　Ｍ．，　Ｋｉｙｏｓａｗａ，　Ｈ．，　Ｔａｋｅｄａ，　Ｊ．，　Ｎｉｋａｉｄｏ，　Ｔ．，　Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，　Ｔ．，　Ｙｏｋｏｙａ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｗａｎａｋａ，　Ａ．　（１９９９）．　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｇｅｎｅ，　ＯＡＳＩＳ，ｗｈｉｃｈ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ｆｏｒ　ａ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ＣＲＥＢ　ＡＴＦ　ｆａｍｉｌｙ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｇｌｉｏｔｉｃ　ｔｉｓｓｕｅ．　Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　６９，　９３−１０３）もＴｉｓｐ４０に類似することが見出された。Ｔｉｓｐ４０のアミノ酸と相同タンパク質との比較は、塩基性／ロイシンジッパードメインにおいて類似性が最も明白であることを示した（データは示さず）。Ｔｉｓｐ４０及びＬＺＩＰ／オアシスタンパク質の間の相同領域は、相同が塩基性／ロイシンジッパードメインに限定される他のＣＲＥＢ／ＡＴＦファミリー転写因子とは対照的に、塩基性／ロイシンジッパードメインを取り巻く領域にまで広がる。ＬＺＩＰ／オアシス様タンパク質はヒト（ＨｓＬｚｉｐ）、Ｃ．エレガンス（Ｃ．　ｅｌｅｇａｎｓ）（ＣｅＦ５７Ｂ１０．１及びＣｅＣ２７Ｄ６．４）、及びＤ．メラノガスタ（Ｄ．　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＣｒｅｂＡ／ＢＢＦ２）においても見出されるが、それらの機能は捕らえどころのないままである。これらの結果は、Ｔｉｓｐ４０がＣＲＥＢ／ＡＴＦ転写因子ファミリーのタンパク質に属することを示す。
２．６：ウェスタンブロット及び免疫組織化学的分析
Ｔｉｓｐ４０の機能をさらに解析するため、Ｔｉｓｐ４０のアミノ酸３−１６からなるＮ末端ペプチド（図４Ａにおいて「エピトープ」で示される）に対するウサギ抗血清を作製し、アフィニティ精製した。ウェスタンブロット分析において、この抗体（α−Ｔｉｓｐ４０ｐｅｐで示される）は、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎシステムで調製したＧＳＴ非含有Ｔｉｓｐ４０（図５Ａ、レーン２）に加えて、大腸菌細胞においてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現され、グルタチオン−セファロースカラムクロマトグラフィーでアフィニティ精製された組換えＴｉｓｐ４０タンパク質（図５Ａ、レーン１）を特異的に認識した。精製Ｔｉｓｐ４０のサイズ（４０ｋＤａ）は算出されたサイズ（３５ｋＤａ）よりも大きく、ＧＳＴ−Ｔｉｓｐ４０のサイズ（６８ｋＤａ）はこのサイズ変化を反映する（４０ｋＤａに加えてＧＳＴの２８ｋＤａ）。
【００５７】
この抗体を用いて、Ｔｉｓｐ４０に期待されるサイズ（図５Ｂ、レーン２）よりもゆっくりと移動する５２ｋＤａのバンド（図５Ｂ、レーン１）を精子中に検出した。さらに、成体精巣において、２、３の余分の非特異的バンドに加えて８０ｋＤａのバンドがα−Ｔｉｓｐ４０ｐｅｐで検出された（図５Ｂ、レーン３）。この結果は、Ｔｉｓｐ４０が精巣の自由可動精子又は不動精子のいずれかにおいて明確に修飾されていることを示唆する。これらのバンドの信頼性を調べるため、アフィニティ精製Ｔｓｉｐ４０タンパク質に対する別の抗体を作製した。この抗体（α−Ｔｉｓｐ４０で表される）でも６８ｋＤａにＧＳＴ−Ｔｉｓｐ４０（図５Ｃ、レーン１）の、５２ｋＤａにＴｉｓｐ４０（図５Ｃ、レーン２）のバンドが検出され、両抗体がＴｉｓｐ４０タンパク質を認識したことが示された。このα−Ｔｉｓｐ４０抗体は、おそらくはＴｉｓｐ４０の分解産生物を表す、４０ｋＤａタンパク質よりも早く移動する幾つかのバンドも検出した。自由精子において、α−Ｔｉｓｐ４０は４０ｋＤａにもバンドを検出したが、尾を引いた背景が精巣における８０ｋＤａのバンドの明瞭な検出を妨害した。α−Ｔｉｓｐ４０ｐｅｐ抗体は試験した様々な組織のうちで成体精巣においてのみ８０ｋＤａに二重線バンドを検出し（図６Ｅ）、そのバンドは３５日齢の後にのみ現れた。他方、５２ｋＤａのバンドは可動精子においてのみ検出され、他の分画マウス精巣細胞（生殖、Ｌｅｙｄｉｇ、及びセルトリ細胞）においては検出されなかった。Ｔｉｓｐ４０タンパク質の発現のタイミングは精子完成の過程で他の標的遺伝子の転写を調節するために非常に遅いことに注目すべきである。
【００５８】
Ｔｉｓｐ４０を修飾する分子を同定するため、まず成体精巣の抽出物をコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）セファロースカラムクロマトグラフィーに通し、通過及び結合分画をウェスタンブロット分析によってＴｉｓｐ４０の存在について分析した。この結果はＴｉｓｐ４０がＣｏｎＡカラムに結合しないことを示し、Ｔｉｓｐ４０に対するグリコシル化が存在しないことを示す（データは示さず）。次に、ホスファターゼ阻害剤の存在下又は不在下においてホスファターゼで処理することにより、Ｔｉｓｐ４０のホスホリル化を検出できるかどうかを試験した。Ｔｉｓｐ４０はホスホリル化されるが、ホスホリル化によって生じるより遅いバンドシフトは非常に小さく、精子及び精巣において観察される大規模なバンドシフトを説明することはできない。したがって、Ｔｉｓｐ４０の修飾の分子的同定は捕らえどころのないままである。
２．７：Ｔｉｓｐ４０は核内のクロマチン結合タンパク質である
次に、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）−Ｔｉｓｐ４０融合タンパク質を発現するプラスミドＤＮＡを調製し、ＨｅＬａ細胞を形質転換することにより、Ｔｉｓｐ４０の細胞下局在を調べた。図６Ａに示されるように、ＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０は核においてほぼ排他的に検出された。本来のサイズのＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０がＨｅＬａ細胞において発現することをウェスタンブロット分析によって確認した（図６Ｂ）。Ｔｉｓｐ４０は３つの注目すべきドメイン、すなわち、核局在シグナル（ＮＬＳ）、塩基性領域、及びロイシンジッパーを有する。どのモチーフがＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０の核局在に必要であるのかを知るため、Ｃ末端から順次切り詰められたＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０の突然変異体形態を発現する一連のプラスミドＤＮＡ（Ｔ１−Ｔ５）を調製した。Ｔ１−Ｔ３構築体は核内に検出され、Ｔ４構築体は部分的に核から漏出し、Ｔ５構築体はＧＦＰ単独のように細胞全体を通して分布することが見出された（図６Ｃ）。ウェスタンブロット分析は、図６Ｄにおいて矢印で示されるように、これらの突然変異体構築体が切り詰められたＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０をそれらの期待されるサイズで発現することを示した。
【００５９】
核内でＴｉｓｐ４０がクロマチンに結合するかどうかを知るため、文献（Ｍｅｎｄｅｚ，　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｓｔｉｌｌｍａｎ，　Ｂ．　（２０００）．　Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｏｒｉｇｉｎ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ，　ｃｄｃ６，　ａｎｄ　ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ：　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｐｒｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｉｎ　ｌａｔｅ　ｍｉｔｏｓｉｓ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２２，　８６０２−８６１２）の記載に従い、ＨｅＬａの全細胞抽出物（ＴＣＥ）を可溶性（Ｓ１）及びクロマチン富化ペレット（Ｐ３）に生化学的に分画した。これらの画分に対するウェスタンブロット分析は、図６Ｅ（最上段パネル）に示されるように、Ｔｉｓｐ４０の主要部分がクロマチン画分に分布することを示した。クロマチンとの会合は、クロマチンに直接結合することが公知（Ｍｅｎｄｅｚ，　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｓｔｉｌｌｍａｎ，　Ｂ．　（２０００）．　Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｏｒｉｇｉｎ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ，　ｃｄｃ６，　ａｎｄ　ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ：　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｐｒｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｉｎ　ｌａｔｅ　ｍｉｔｏｓｉｓ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　２２，　８６０２−８６１２）であるから、起点認識複合体（Ｏｒｃ２；中央パネル）と同程度に緊密であるものと考えられる。これは、小球菌ヌクレアーゼ（Ｍ−ｎｕｃ）での処理によってさえタンパク質の小部分のみがクロマチンから溶出したためである。この実験において、クロマチン画分ではＧＦＰ単独は検出されないことが確認された（最下段パネル）。まとめると、これらの結果は、Ｔｉｓｐ４０がクロマチンに結合する精子特異的核タンパク質であることを示す。
【００６０】
また、アフィニティ精製Ｔｉｓｐ４０タンパク質を用いるゲルシフトアッセイも行い、Ｔｉｓｐ４０が二本鎖ＤＮＡに直接結合することが見出された（データは示さず）。類似の一組のゲルシフトアッセイを文献（Ｎｏｊｉｍａ，　Ｈ．，　Ｌｅｅｍ，　Ｓ−Ｈ．，　Ａｒａｋｉ，　Ｈ．，　Ｓａｋａｉ，　Ａ．，　Ｎａｋａｓｈｉｍａ，　Ｎ．，　Ｋａｎａｏｋａ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｏｎｏ，　Ｙ．　（１９９４）．　Ｈａｃ１：　Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｙｅａｓｔ　ｂＺＩＰ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ＣＲＥ　ｍｏｔｉｆ　ｉｓ　ａ　ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ　ｆｏｒ　ｃｄｃ１０　ｍｕｔａｎｔ　ｏｆ　Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ．　Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２２，　５２７９−５２８８）の記載に従って実施することにより、ＡＰ１、ＣＲＥ、及びＴＲＥがＴｉｓｐ４０の標的配列でないことが見出された。しかしながら、おそらくはこの実験手順の過程で生じるＴｉｓｐ４０の分解産生物（図５Ｃ、レーン２を参照）のため、ＳＡＡＢプロトコル（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，　Ｔ．Ｋ．，　ａｎｄ　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，　Ｈ．　（１９９０）．　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＭｙｏＤ　ａｎｄ　Ｅ２Ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５０，　１１０４−１１１０）によってはＴｉｓｐ４０の抽出物標的配列を同定することはできなかった。
２．８：Ｔｉｓｐ４０は精子核に特異的に局在する
α−Ｔｉｓｐ４０ｐｅｐ抗体を用いて、成体マウス精巣の断面に対して免疫組織化学的分析を行った。図７Ａに示されるように、Ｔｉｓｐ４０タンパク質の発現は精子完成の最終成熟期、発生段階１４ないし成熟精子（段階１６）に伸長精子細胞においてのみ観察された。免疫染色の拡大図により、Ｔｉｓｐ４０タンパク質が伸長精子細胞において優先的に検出されることがさらに確認された（図７Ｂ）。陰性対照として用いた前免疫血清（ＰＳ）での免疫染色では、そのような特異的な染色画像は示されなかった（図７Ｃ）。この観察は、精子完成の最終段階で半数体精細胞が伸長精子細胞に分化した後にＴｉｓｐ４０が特異的に発現することを示すウェスタンブロット分析の結果と良好に一致する。
【００６１】
また、精子内のＴｉｓｐ４０の局在を調べるのにα−Ｔｉｓｐ４０ｐｅｐも用いた。図７Ｄ（左パネル）に示されるように、Ｔｉｓｐ４０タンパク質は精子頭部の精子核において排他的に検出された。他方、ＰＳは精子の尾（鞭毛）及びアクロソームを染色した（右パネル）。
【００６２】
以上の結果から、精子特異的Ｔｉｓｐ４０タンパク質が精子完成の最終段階で発現する推定ｂＺｉｐ転写因子であり、精子の核に特異的に局在するものと結論される。
【００６３】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、マウスの精子特異的遺伝子ＴＩＰＳ４０と、これをコードする遺伝子およびその精製ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）、タンパク質ＴＩＰＳ４０を認識する抗体が提供される。また、この発明によって、トランスジェニック非ヒト動物の作出や、所望遺伝子の自在の導入等の新しい手段が提供される。
【００６４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】精子完成の間に段階的減数によって転写的に誘導された遺伝子の包括的単離の戦略。（Ａ）ノーザンブロット分析においてバンドの強度の変化によって分類される３つのタイプのＴＩＳＰ　ｃＤＮＡクローン。（Ｂ）５段階のサブトラクションの２段階ずつについて、単離したＴＩＳＰ　ｃＤＮＡクローンと分析したｃＤＮＡクローンの関係を示す収穫曲線の模式図。横軸はノーザンブロット分析に処した減数ｃＤＮＡライブラリにおけるｃＤＮＡクローンの数を表す。縦軸はノーザンブロット分析によって各タイプのＴＩＳＰクローンであると同定されたｃＤＮＡクローンの数を表す。各曲線の破線は、各段階のｃＤＮＡ減数を行わなかった場合にその曲線がとり得る可能性のある形状を表す。（Ｃ）第５の段階的減数まで実施することによって描かれた各タイプのＴＩＳＰ　ｃＤＮＡクローンの実際の収穫曲線。曲線の各節に示される数字は各減数段階の最後での単離ＴＩＳＰ　ｃＤＮＡの適合数を示す。
【図２】各ＴＩＳＰ　ｃＤＮＡクローンのノーザンブロット分析。ノーザンブロットは、プローブとしての各ＴＩＳＰ　ｃＤＮＡクローンの放射標識ｃＤＮＡインサートとのハイブリダイゼーションによって得た。放射標識β−アクチンｃＤＮＡとのノーザンブロットがブロット列における各カラムの頂部にローディング対照として示される。トータルＲＮＡ試料はマウスの様々な組織、４種類の突然変異体マウスの精巣、及び各年齢のマウスの精巣から得た。Ｂは脳、Ｈは心臓、Ｉは腸、Ｋは腎臓、Ｌｉは肝臓、Ｌｕは肺、Ｍは骨格筋、Ｏは卵巣、Ｓは脾臓、Ｔは精巣、ｃは潜在睾丸マウスの精巣、ｊはｊｓｄ／ｊｓｄマウスの精巣、ｓｌはＳｌ１７Ｈ／Ｓｌ１７Ｈマウスの精巣、ｗはＷ／ＷＶマウスの精巣である。２つのブロットの中央に示される数字は、各々のアガロースゲルの平行レーンにおいて走らせたＲＮＡサイズマーカー（示さず）による評価でのｍＲＮＡのサイズを表す。ＤＤＢＪデータバンクに登録された各ＴＩＳＰ　ｃＤＮＡ配列のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．は各ノーザンブロットの右端に示される。
【図３】ＴＩＳＰ４０遺伝子のノーザンブロット及びｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析。（Ａ、Ｂ）マウスの様々な組織、４種類の突然変異体マウスの精巣、及び指示された日齢のマウスの精巣から得たＲＮＡ試料のノーザンブロット分析。（Ｃ）成体マウスの精巣から分画した生殖、Ｌｅｙｄｉｇ、及びセルトリ細胞から精製したＲＮＡのノーザンブロット分析。ＴＩＳＰ４０　ｍＲＮＡのサイズはパネルの右に示される。（Ｄ及びＥ）マウス精巣中のＴＩＳＰ４０　ｍＲＮＡのｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析。成体マウス精巣の凍結切片をＴＩＳＰ４０アンチセンスプローブ（左）又はセンスプローブ（右）のいずれかとハイブリダイズした。アンチセンスＴＩＳＰ４０プローブを用いたときにのみ、輸精管の主として円形精細胞において陽性シグナルが特異的に検出され、伸長精細胞においてはそれより特異性に劣って検出された。（Ｆ）アンチセンスＴＩＳＰ４０プローブを用いて得られた輸精管染色の拡大図。この切片における生殖細胞は以下の３つのタイプに分類することができる：精母細胞（Ｃｙｔｅ）、発生段階４−６の円形精細胞、及び段階１５−１６の伸長精細胞。
【図４】Ｔｉｓｐ４０はｂＺＩＰタンパク質の新規サブファミリーを代表する。（Ａ）塩基性ドメイン、ロイシンジッパー、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、及び抗体の産生に用いられるオリゴヌクレオチド（エピトープ）の位置を示したＴｉｓｐ４０タンパク質の模式図。Ｌｚｉｐ／オアシスタンパク質に高度に相同であるアミノ酸領域も斜線付きバーで示される。（Ｂ）Ｔｉｓｐ４０を他のマウスｂＺＩＰタンパク質に関連付けるコンセンサス系統樹。塩基性／ロイシンジッパー領域の系統樹は、上に示されるように複数の整列化プログラムによって得られた各ｂＺＩＰタンパク質の相同領域を用いてＵＰＧＭＡプログラム（ＳＤＣ　ｓｏｆｔｗａｒｅ、東京）で描いた。節上の数字はブートストラップ信頼確率を表す。Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ｐｒｆ）又はＰＩＲ（ｐｉｒ）タンパク質配列データベースからのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．は：Ｔｉｓｐ４０、ＡＢ０４７６４７、Ｌｚｉｐ２、ｐｒｆ／２００７２７４Ａ；オアシス、ｐｒｆ／２５１９３６８Ａ；Ｃｒｅｍ−ｔａｕ、ｐｉｒ／Ｓ２０８２７；Ｃｒｅｂ、ｐｒｆ／２３１０４０８Ｂ；Ａｔｆ１、ｐｉｒ／Ａ４６４９０；Ｆｏｓ、ｐｉｒ／Ａ０１３４３；ｃ−Ｊｕｎ、ｐｒｆ／１５０１３９２Ａである。
【図５】２種類の抗Ｔｉｓｐ４０ポリクローナル抗体をプローブとして用いるウェスタンブロット分析。（Ａ）ＨｅＬａ細胞において発現される組換えＧＳＴ−Ｔｉｓｐ４０（６８ｋＤａ）及びＴｉｓｐ４０（４０ｋＤａ）の特異的検出を示すＮ末端ペプチド（Ｔｉｓｐ４０のアミノ酸３−１６）に対して生じたアフィニティ精製α−Ｔｉｓｐ４０抗体の品質。（Ｂ）α−Ｔｉｓｐ４０ｐｅｐをプローブとして用いるウェスタンブロットは可動性精子において５２ｋＤａにバンドを、成体精巣において８０ｋＤａに二重線バンドを検出した。（Ｃ）その分解産生物を伴うＧＳＴ−Ｔｉｓｐ４０（６８ｋＤａ）、Ｔｉｓｐ４０（４０ｋＤａ）の特異的検出を示す。Ｗｔは全精巣、Ｇｅは生殖細胞、Ｓｅはセルトリ細胞、ＬｙはＬｅｙｄｉｇ細胞、Ｓｐは可動性精子である。
【図６】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合したＴｓｉｐ４０タンパク質の細胞下局在化。（Ａ）ＨｅＬａ細胞において発現したＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０は核内に優先的に局在していた。（Ｂ）ウェスタンブロットは、抗ＧＦＰポリクローナル抗体をプローブとして用いて、ＧＦＰ単独（Ｆ）及びフルサイズＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０（Ｔ）をコードするプラスミド構築体に由来する未変性タンパク質のＨｅＬａ細胞における発現を示す。（Ｃ）ＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０のＣ末端に由来し、かつＨｅＬａ細胞において発現する一連の欠失構築体は、潜在的核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む塩基性ドメインがＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０の核局在化に必須であることを示した。（Ｄ）ウェスタンブロットは、予想されるサイズでのＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０の各切り詰め形態の発現を示す（矢印で示される）。（Ｅ）ＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０は、ＤＮＡ（複製起点）結合性タンパク質であることが知られるヒト起点認識複合体２（ｈＯｒｃ２）と同程度に緊密にクロマチンに結合する。ＨｅＬａの全細胞抽出物（ＴＣＥ）を、文献（Ｍｅｎｄｅｚ，　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｓｔｉｌｌｍａｎ，　Ｂ．　（２０００）．　Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｏｒｉｇｉｎ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ，　ｃｄｃ６，　ａｎｄ　ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ：　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｐｒｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｉｎ　ｌａｔｅ　ｍｉｔｏｓｉｓ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　　２２，　８６０２−８６１２）の記載に従い、低速遠心（１，３００×ｇ）によって上清（Ｓ１）及び各ペレット（Ｐ１）分画に分離した。Ｓ１を高速遠心（１４，０００×ｇ）によって上清（Ｓ２）及びペレット（Ｐ２）画分にさらに分画した。Ｐ１ペレットを０．２単位の小球菌ヌクレアーゼ（ＭＮ）の不在下（−）又は存在下（＋）のいずれかにおいて非塩バッファに再懸濁させた後、３７℃で１分間インキュベートした。次に、その溶液を氷上で３０分間インキュベートし、低速遠心（１，７００×ｇ）によって上清（Ｓ３）及びクロマチン富化ペレット（Ｐ３）に分離した。ＧＦＰ単独は可溶性タンパク質を含むことが知られるＳ２画分において検出され、それに対してＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０及びｈＯｒｃ２はクロマチン富化ペレット（Ｓ３）において検出され、そこからはＭＮ処理によってＧＦＰ−Ｔｉｓｐ４０又はｈＯｒｃ２のいずれかの小部分が放出された。
【図７】抗Ｔｉｓｐ４０ｐｅｐ抗体を用いる精巣及び精子の免疫組織化学的染色。（Ａ）精巣の染色画像を倒立レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭ５１０）によって可視化した。（Ｂ）矩形によって囲まれた精巣の拡大図が示される。染色画像は、発生段階１４−１６の伸長精細胞が優先的に検出される輸精管の中央領域で検出された。（Ｃ）陰性対照として免疫前血清（ＰＳ）での免疫染色も行った。（Ｄ）抗体はＴｉｓｐ４０を精子の核で特異的に検出し、それに対してＰＳはアクロソーム及び精子の尾を染色した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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