(57)【要約】【課題】酵素、特にチトクロムｃ酸化酵素をリン脂質小胞に再構成する方法を最適化して、漏れのない再構成膜を提供する。【解決手段】再構成膜を形成させるために水溶液中にチトクロムｃ酸化酵素とリン脂質とを分散させ、この分散液を緩衝液を外液として特定の条件で透析する。この透析段階において、外液である緩衝液の濃度を０．１〜３００ｍＭの間で少なくとも３段階で徐々に低濃度とし、この濃度が最低となった後に最低濃度よりも高濃度とすることを特徴とする。本発明の条件で、界面活性剤で可溶化した酵素とリン脂質懸濁液の混合液を透析すると、界面活性剤の濃度が次第に減少し、酵素の溶解度が低下し、そのためにリン脂質ベシクルに取り込まれる。本発明の方法により作製したリン脂質小胞の水素イオン輸送活性は、図３に示すように、還元型チトクロムｃの添加後一定値をとり、膜が水素イオンを透過させにくいことを意味する。【選択図】　　図３
2004049112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中にリン脂質を分散させる段階、酵素を界面活性剤により可溶化させる段階、水溶液に分散させたリン脂質と可溶化させた酵素とを混合する段階、及び該混合液を透析する段階から成る酵素を含むリン脂質小胞を製造する方法であって、リン脂質と該酵素の純度をそれぞれ９０％以上とし、該混合液中のリン脂質に対する該酵素のモル比を６５００以上とし、該透析する段階において、透析回数を少なくとも４回とし、該混合液を内液とし緩衝液を外液として該緩衝液の濃度を０．１〜３００ｍＭの間で少なくとも３段階で徐々に低濃度とし、該濃度が最低となった後に該最低濃度よりも高濃度とすることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記内液に対する前記外液の体積比を５０〜３００倍とし、透析時間を２〜２０時間とし、前記緩衝液のｐＨを６．０〜８．０とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記透析回数を４回とし、前記緩衝液の濃度を１回目は２０〜３００ｍＭ、２回目は１回目よりも低濃度で１〜１００ｍＭ、３回目は２回目よりも低濃度で０．１〜１０ｍＭ、４回目は３回目よりも高濃度で０．５〜５０ｍＭとし、前記内液に対する外液の体積比を１回目は５０〜１５０倍、２〜４回目はぞれぞれ１５０〜３００倍とし、透析時間を１、２及び４回目はそれぞれ２〜６時間、３回目は１０〜２０時間とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
その後更に、水素イオン輸送活性の高い分画を選別する段階を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールから成る群から選択される少なくとも１種であり、前記酵素が、チトクロムｃ酸化酵素、ミトコンドリア内膜の複合体Ｉ、チトクロムｂｃｌ、コハク酸脱水素酵素、プロトンＡＴＰ合成酵素、ＡＴＰ／ＡＤＰトランスロケース又はサーモジェニンである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素がチトクロムｃ酸化酵素である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記リン脂質がホスファチジルコリンである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により製造された酵素含有リン脂質小胞。
【請求項９】
請求項８に記載の酵素含有リン脂質小胞にｐＨ指示色素を取り込ませて成る溶存酸素検出装置。
【請求項１０】
請求項８に記載の酵素含有リン脂質小胞から成る金属陽イオン除去濃縮装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、チトクロムｃ酸化酵素等の酵素をその膜中に含むリン脂質小胞（ベシクル、リポソーム）を製造する方法に関し、より詳細には、水素イオン（プロトン）の漏れのないチトクロムｃ酸化酵素をリン脂質小胞に再構成する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
チトクロムｃ酸化酵素（ＣｃＯ）はミトコンドリア内膜に存在する電子伝達系（呼吸鎖）の最後に位置する酵素であり、分子状酸素を４電子還元して水分子を生成する反応を触媒する。この分子状酸素の活性化反応に伴って、ミトコンドリア内膜を通してプロトンが汲み出される。既に、Ｘ線結晶解析によりウシとバクテリアのチトクロムｃ酸化酵素の三次元構造が明らかにされており（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２６９，　１０６９−１０７４　（１９９５）；　Ｎａｔｕｒｅ，　３７６，　６６０−６６９　（１９９５））、この三次元構造に基づいて酸素の還元反応とプロトンの汲み出しの機構が議論されてきた（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２７２，　１１３６−１１４４　（１９９６）；　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８０，　１７２３−１７２９　（１９９８）等）。
【０００３】
一方、チトクロムｃ酸化酵素による分子状酸素の還元反応は時間分割吸収分光法、極低温吸収分光法、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法等により研究されてきた（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３６，　５５４−５６５　（１９９７）等）。共鳴ラマン分光法はヘムやその近傍の微細構造を研究するのに適した手段であることが知られており、この方法を用いてチトクロムｃ酸化酵素による分子状酸素の還元反応を研究することにより、酸素の５種の中間体が特定されている（Ｐｒｏｇ．　Ｉｎｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．，　４５，　４３１−４７９　（１９９７）等）。また、プロトンの汲み出しの機構におけるＨ＋／ｅ−比に対する電子流の速度、膜のΔｐＨ及びアデニンヌクレオチドの影響が報告されている（ＦＥＢＳ　ｌｅｔｔｓ．，　４４３，　１０５−１０８　（１９９９）等）。
【０００４】
しかし、これらの活性は界面活性剤により可溶化されたチトクロムｃ酸化酵素について測定されたものであり、膜中に存在する場合に比べると、ヘム部分の構造が変わっている可能性がある。
チトクロムｃ酸化酵素をリン脂質小胞に再構成するとき、従来はリン脂質とチトクロムｃ酸化酵素とを混合後透析するか又は凍結融解する方法が採られるのが一般であるが、透析の適切な条件やリン脂質とチトクロムｃ酸化酵素の適切な比が用いられたとは必ずしもいえず、リン脂質やチトクロムｃ酸化酵素も必ずしも高純度のものが用いられたわけではない。
例えば、ウシ心筋チトクロムｃ酸化酵素を材料とし、９９％ホスファチジルコリンを使用してチトクロムｃ酸化酵素をリン脂質小胞に再構成したとの報告があるが（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　２３，　１４１３−１４１８　（１９８４））、水素イオン輸送活性を測定するに至っていない。また、バクテリアチトクロムｃ酸化酵素を材料とし、純度２０％以下のホスファチジルコリンを使用してチトクロムｃ酸化酵素をリン脂質小胞に再構成して水素イオン輸送活性を測定しているが（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，　６８２．２１６−２２６　（１９８２））、プロトンの漏れが認められる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、従来チトクロムｃ酸化酵素をリン脂質小胞に再構成して得られた再構成膜では、水素イオンが膜を通して漏れやすいことが問題点であり、漏れを無くすことが課題となっていた。
本発明は、酵素、特にチトクロムｃ酸化酵素をリン脂質小胞に再構成する方法を最適化して、漏れのない再構成膜を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、再構成膜を形成させるために水溶液中にチトクロムｃ酸化酵素とリン脂質とを分散させ、この分散液を緩衝液を外液として適切な条件で透析することにより、リン脂質からなる膜にこの酵素が適切に取り込まれることを見出し、本発明を完成させた。
通常、透析はタンパク質溶液に混在している小分子の不純物を取り除くことを主な目的として行うが、本発明においては、ただ単に純度を上げるという目的の透析ではなく、チトクロムｃ酸化酵素を適切にリン脂質ベシクルに取り込ませるために適した条件で透析を行う点に特徴がある。
透析においては、まず水に不溶のチトクロムｃ酸化酵素を界面活性剤（コール酸等）で可溶化し、それとリン脂質懸濁液を混合する。この混合液を適切な透析すると界面活性剤が除去され、その濃度が次第に減少するため、チトクロムｃ酸化酵素の溶解度が低下し、そのためにチトクロムｃ酸化酵素がリン脂質ベシクルに取り込まれるものと考えられる。
【０００７】
なお、この透析を行う際に、チトクロムｃ酸化酵素に対するリン脂質の比を最適化することや、できるだけ純度の高いチトクロムｃ酸化酵素とリン脂質とを用いることを要する。これは、リン脂質から成る膜にチトクロムｃ酸化酵素を適切に取り込ませ、形成されるベシクルに不純物をできるだけ含ませないためである。ベシクルの生成に透析を用いたりこの条件を最適化するだけで、このような配慮をしなければ、漏れのないベシクルを作製することはできない。
【０００８】
即ち、本発明は、水溶液中にリン脂質を分散させる段階、酵素を界面活性剤により可溶化させる段階、水溶液に分散させたリン脂質と可溶化させた酵素とを混合する段階、及び該混合液を透析する段階から成る酵素を含むリン脂質小胞を製造する方法であって、リン脂質と該酵素の純度をそれぞれ９０％以上とし、該混合液中のリン脂質に対する該酵素のモル比を６５００以上とし、該透析する段階において、透析回数を少なくとも４回とし、該混合液を内液とし緩衝液を外液として該緩衝液の濃度を０．１〜３００ｍＭの間で少なくとも３段階で徐々に低濃度とし、該濃度が最低となった後に該最低濃度よりも高濃度とすることを特徴とする方法である。その後更に、水素イオン輸送活性の高い分画を選別する段階を含んでもよい。
【０００９】
この方法における各工程は明確に分離されるものでなくともよく、いくつかの工程を併せて行ってもよい。更に、これらの工程以外の、例えば精製工程などの工程を必要に応じて適宜付加してもよい。また水溶液に適宜必要成分を含ませてもよく、この水溶液を必要に応じて適宜緩衝液としてもよい。
本発明は更にこのようにして製造された酵素含有リン脂質小胞であり、このような酵素含有リン脂質小胞にｐＨ指示色素を取り込ませて成る溶存酸素検出装置であり、またこのような酵素含有リン脂質小胞から成る金属陽イオン除去濃縮装置である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の方法に用いるリン脂質として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールから成る群から選択される少なくとも１種、好ましくはホスファチジルコリンを挙げることができる。
一方、本発明の方法に用いる酵素として、チトクロムｃ酸化酵素、ミトコンドリア内膜の複合体Ｉ、チトクロムｂｃｌ、コハク酸脱水素酵素、プロトンＡＴＰ合成酵素、ＡＴＰ／ＡＤＰトランスロケース又はサーモジェニン等、好ましくはチトクロムｃ酸化酵素を挙げることができる。
【００１１】
本発明で用いるチトクロムｃ酸化酵素等の酵素は通常水に不溶であるため、界面活性剤により可溶化する。この界面活性剤として、コール酸、オクチルグルコシド等を用いることができる。通常酵素に対し界面活性剤を１０００〜２０００の割合（モル比）で用いる。
水溶液中（混合液中）のリン脂質の濃度は５〜１０ｍＭ、チトクロムｃ酸化酵素等の酵素の濃度は１〜３μＭ程度である。
混合液中のリン脂質に対する酵素のモル比は６５００以上であり、この比以上で酵素が洩れのない状態でリン脂質膜に取り込まれる。しかしこの比をあまり大きくするとチトクロムｃ酸化酵素等の酵素の入っていないベシクルが増えるため好ましくない。
【００１２】
透析はこのようにリン脂質と酵素を含む水溶液を混合液を内液とし緩衝液を外液として常法に従い透析を行う。透析の条件としては、透析回数を少なくとも４回とし、該混合液を内液とし緩衝液を外液として該緩衝液の濃度を０．１〜３００ｍＭの間で少なくとも３段階で徐々に低濃度とし（即ち、前段階よりも低濃度である段階を少なくとも２段階含む。）該濃度が最低となった後に該最低濃度よりも高濃度とする。前記内液に対する前記外液の体積比は５０〜３００倍、透析時間は２〜２０時間、前記緩衝液のｐＨは６．０〜８．０とすることが好ましい。透析回数は特に４〜６回程度が好ましい。この透析は通常０℃以上常温以下で行う。
【００１３】
この透析の条件は、透析回数を４回とし、緩衝液の濃度を１回目は２０〜３００ｍＭ、特に５０〜２００ｍＭ、２回目は１回目よりも低濃度で１〜１００ｍＭ、特に５〜５０ｍＭ、３回目は２回目よりも低濃度で０．１〜１０ｍＭ、特に０．２〜５ｍＭ、４回目は３回目よりも高濃度で０．５〜５０ｍＭ、特に１〜２０ｍＭとし、内液に対する外液の体積比を１回目は５０〜１５０倍、２〜４回目はぞれぞれ１５０〜３００倍とし、透析時間を１、２及び４回目はそれぞれ２〜６時間、３回目は１０〜２０時間とすることがより好ましい。
このような条件で、チトクロムｃ酸化酵素等の酵素が、形成したリン脂質小胞の膜内に洩れのない状態で取り込まれる。形成したリン脂質小胞のサイズは４０〜２００ｎｍ程度である。
【００１４】
【発明の効果】
本発明の方法により生成した、チトクロムｃ酸化酵素を再構成してリン脂質小胞は以下の用途に用いることができる。
（１）超高感度溶存酸素検出装置
酵素をリン脂質に再構成するとき、ｐＨ指示色素をベシクルの中に取り込ませる。嫌気条件下で還元剤により酵素を還元する。ベシクル内部のｐＨを色素の吸収又は蛍光により監視する。酸素が溶液中に存在すると、酵素が働き、ベシクル内部のｐＨが高くなることを通して、酸素が検出される。検出限界は０．１μＭ以下であると考えられる。
【００１５】
（２）選択的金属陽イオン除去濃縮装置
特定の金属陽イオンを環境から取り除き濃縮するための装置である。目的の金属陽イオンのイオノフォアを本発明により作成した再構成ベシクルと混合する。酸素の存在下で還元剤を加えると、酸素が働いて水素イオンが汲み出される結果、電荷の中性を保つため目的の陽イオンが選択的に環境から取り除かれベシクル中に濃縮される。たとえ目的陽イオンがほかの方法で除去できないほど低濃度であっても有効である。たとえば、カドミウムなどの有害なものに対する特異的イオノフォアを用いれば、カドミウムを選択的に環境から除去できる。また、必要な金属陽イオンを選択的に収集する目的にも使用可能である。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。リン脂質の純度は薄層クロマトグラフィーの分析による。
製造例１
　既報（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２５２，　５４９８−５５０８　（１９７７））に従ってウシの心筋から単離されたチトクロムｃ酸化酵素（分子量２１０，０００）を、０．２％のｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシドを加えた５０ｍＭリン酸ナトリムバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、攪拌式セル（ミリポア社アミコン　Ｍｏｄｅｌ　８２００）により濃縮して、微結晶化し、これを遠心により集めて精製した。結晶化してあることからこの酵素の純度は１００％である。この結晶の半分の体積の緩衝液に溶かしたものをウシ心筋チトクロムｃ酸化酵素溶液として使用した。
【００１７】
実施例１
　本実施例では、既報（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２３，　１４１３−１４１８　（１９８４））の方法に改良を加えて、チトクロムｃ酸化酵素を再構成してリン脂質小胞を作製し、カラムクロマトグラフィーにより、酵素が反対向きに入っているリン脂質小胞や酵素の入っていないリン脂質小胞を分離除去した。その工程を以下に示す。
（１）ホスファチジルコリン（純度９９％、シグマアルドリッチジャパン（株）、製品番号Ｐ７４４３、分子量７５８）２０ｍｇを２５ｍＭコール酸ナトリウムを含む１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ　（ｐＨ７．４）　３ｍｌに分散させた（Ｈｅｐｅｓ：　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）。
（２）（１）で得た液を穴径０．２μｍのフィルターで濾過した。
（３）Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ　社製　Ｍｏｄｅｌ　Ｗ−２２５型超音破砕機の出力を６０％として氷冷しながら超音波を３０秒かけて３０秒休む。これを一周期として合計三周期行った。
（４）（２）と同じフィルターで濾過した。
（５）これに、製造例１で得たウシ心筋チトクロムｃ酸化酵素を、ホスファチジルコリンに対するチトクロムｃ酸化酵素のモル比が７０００となるように加え、５分間静かに攪拌した。
【００１８】
（６）（５）の混合液を４℃で以下の条件で合計４回透析した。
（ｉ）１００倍体積の１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ，　ｐＨ　７．４　に対して４時間。
（ｉｉ）２００倍体積の１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ，　ｐＨ　７．４　（２７ｍＭ塩化カリウム、７３ｍＭ蔗糖を含む）に対して４時間。
（ｉｉｉ）２００倍体積の１ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ，　ｐＨ　７．２　（３０ｍＭ塩化カリウム、８０ｍＭ蔗糖を含む）に対して１２時間。
（ｉｖ）２００倍体積の２．５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ，　ｐＨ　７．４　（２５０ｍＭ蔗糖、２２．５ｍＭ硫酸カリウムを含む）に対して４時間。
（７）２．５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ，　ｐＨ　７．４　（２５０ｍＭ蔗糖、２２．５ｍＭ硫酸カリウムを含む）で平衡化したＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ・ＣＬ（直径０．９ｃｍ長さ１０ｃｍの円筒形カラム）に、６で得た再構成ベシクル混合物１ｍｌをのせた。
（８）（７）で平衡化に用いたのと同じ緩衝液を２ｍｌ流した。
（９）８ｍｌの５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ，　ｐＨ　７．４　（２５０ｍＭ蔗糖、４５ｍＭ硫酸カリウムを含む）を流した。
（１０）２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ，　ｐＨ　７．４　（１５０ｍＭ硫酸カリウムを含む）を流し、２８０ｎｍに光学濃度を持つ分画を収集した。
（１１）（１０）で得た分画をチトクロムｃ酸化酵素の濃度が１．３〜２．３μＭの範囲に収まるように濃縮した。
（１２）５００倍体積の１ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ，　ｐＨ　７．２に対して４℃で８時間透析した。
（１３）（１２）を繰り返した。
【００１９】
比較例１
　工程（５）において、ウシ心筋チトクロムｃ酸化酵素を、ホスファチジルコリンに対するチトクロムｃ酸化酵素のモル比が３５００となるように加えた他は、実施例１と同様の操作を行い、チトクロムｃ酸化酵素を再構成してリン脂質小胞を作製した。
比較例２
　工程（５）において、ウシ心筋チトクロムｃ酸化酵素を、ホスファチジルコリンに対するチトクロムｃ酸化酵素のモル比が１７５０となるように加えた他は、実施例１と同様の操作を行い、チトクロムｃ酸化酵素を再構成してリン脂質小胞を作製した。
比較例３
　工程（１）において純度が２０％のホスファチジルコリンを用いた他は、実施例１と同様の操作を行い、チトクロムｃ酸化酵素を再構成してリン脂質小胞を作製した。
【００２０】
参考例１
　既報（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３５，　１０８００−１−８０６　（１９９６））に記載されている、チトクロムｃ酸化酵素を再構成してリン脂質小胞を作製する方法を記す。
（１）ホスファチジルコリン４０ｍｇを２４．５ｍＭコール酸ナトリウムを含む１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ　（ｐＨ７．１）　１ｍｌに分散させた。
（２）ＭＳＥ　Ｓｏｎｉｃａｔｏｒにより６μ（ｐｅａｋ　ｔｏ　ｐｅａｋ）強度で１分間超音波をかけた。
（３）ウシ心筋チトクロムｃ酸化酵素を、ホスファチジルコリンに対するチトクロムｃ酸化酵素のモル比が７０００となるように加える。
（４）（３）の混合液を４℃で以下の条件で合計３回透析した。
（ｉ）１００倍体積の１００ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，　ｐＨ　７．２　に対して４時間。
（ｉｉ）２００倍体積の１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，　ｐＨ　７．２　（２７ｍＭ塩化カリウム、７３ｍＭ蔗糖を含む）に対して４時間。
（ｉｉｉ）２００倍体積の１ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，　ｐＨ　７．２　（３０ｍＭ塩化カリウム、７９ｍＭ蔗糖を含む）に対して１２時間。
【００２１】
実施例２
　上記実施例１及び比較例１〜３で得たリン脂質小胞の活性及びＨ＋／ｅ−比の測定を行った。
上記実施例１及び比較例１〜３で得たリン脂質小胞を、０．２ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ　バッファー　ｐＨ　７．２００、４９．４ｍＭ　ＫＣｌ、８０ｍＭ　塩化コリン及び１６ｍＭ　蔗糖から成る溶液にチトクロムｃ酸化酵素の濃度が０．２５μＭとなるように溶解し、ベックマンφ７１ｐＨメータを用いてＫＯＨ及びＨＣｌ溶液により、溶液のｐＨを７．２００に調製した。
この溶液に、測定５分前にバリノマイシンを最終濃度が２μＭとなるように添加した。種々の量のフェロチトクロムｃ（還元型チトクロムｃ、シグマアルドリッチジャパン（株）、製品番号Ｃ７５５２）の添加によるｐＨの変化を測定した。この測定のノイズレベルは１０−４ｐＨ以下であった。
【００２２】
この測定をＣＣＣＰ（ｃａｒｂｏｎｙｌｃｙａｎｉｄｅ−ｍ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ、シグマアルドリッチジャパン（株）、製品番号Ｃ２７５９）を１０μＭ加えた場合と加えない場合について行った。プロトンはベシクル膜を通過できないが、ＣＣＣＰがあると通過することができる。ＣＣＣＰ添加前後のｐＨ変化を１０ｍＭ　ＫＯＨ及びＨＣｌを用いて較正した。
Ｈ＋／ｅ−比は、以下のようにして求めた。加えた還元型チトクロムｃの量から電子（ｅ−）数を算出し、Ｈ＋をベックマン社製のｐＨ電極によって測定し、これらの商としてＨ＋／ｅ−を計算した。この値が１であることは、チトクロムｃ酸化酵素によって汲み出されたプロトンがベシクル膜を通して漏れないことを示す。
【００２３】
図１は、フェロチトクロムｃによるｐＨの変化を示す。
図１Ａは、純度が９９％のリン脂質を用い、リン脂質／チトクロムｃ酸化酵素のモル比は７０００の場合を示す（実施例１）。フェロチトクロムｃの添加後は酸性化のみが認められ、アルカリ化は起こっていない（図１Ａ左）。このことはプロトンの洩れが起こっていないことを示す。フェロチトクロムｃを２０μｌ添加した場合の酸性化は１０μｌ添加した場合より大きいが、２倍ではない。引き続いて２０μｌ添加した場合には更にその酸性化は小さくなっている。フェロチトクロムｃを１０、２０、２０μｌ加えた場合のＨ＋／ｅ−比はそれぞれ１．１３、０．８２、０．１４であった。最初の２回のフェロチトクロムｃの添加ではＨ＋／ｅ−比は１に近く、その後の添加ではより小さい。ＣＣＣＰの存在下では、フェロチトクロムｃの添加量に従ってアルカリ化が起こったことが認められた（図１Ａ右）。この結果は、１５℃と２５℃においても同様であった。
なお、データは示さないが、リン脂質／チトクロムｃ酸化酵素の重量比が４０（モル比１１，０００）の場合にも同様であった。
【００２４】
図１Ｂは、純度が９９％のリン脂質を用い、リン脂質／チトクロムｃ酸化酵素のモル比３５００の場合を示す（比較例１）。ＣＣＣＰの不存在下で、フェロチトクロムｃを３０、４０μｌ加えた場合の酸性化度はＡの場合に比べて小さい（図１Ｂ左）。この場合には酸性化と僅かのアルカリ化とが同時に起こっているものと考えられる。ＣＣＣＰの存在下では、フェロチトクロムｃの添加量に比例してアルカリ化が起こっている（図１Ｂ右）。
【００２５】
図１Ｃは、純度が９９％のリン脂質を用い、リン脂質／チトクロムｃ酸化酵素のモル比が１７５０の場合を示す（比較例２）。ＣＣＣＰの不存在下では、フェロチトクロムｃの添加量に比例してｐＨの小ジャンプが認められるが、安定した酸性化は認められない（図１Ｃ左）。ＣＣＣＰの存在下では、フェロチトクロムｃの添加量に比例してアルカリ化が起こっている（図１Ｃ右）。
【００２６】
図１Ｄは、粗リン脂質（純度２０％）／チトクロムｃ酸化酵素のモル比が７０００の場合を示す（比較例３）。ＣＣＣＰの不存在下では、フェロチトクロムｃを１０、２０、３０μｌ加えた後にｐＨが少し増加し、しばらく後にアルカリ化が起ったことが認められた（図１Ｄ左）。一方、ＣＣＣＰの存在下では、フェロチトクロムｃの添加直後にアルカリ化が起こり、ｐＨの増加は認められなかった（図１Ｄ右）。
【００２７】
また、参考例１のリン脂質小胞の水素イオン輸送活性を図２に示す。加えたチトクロムｃの量は１．５μＭである。図２から分かるように、一度酸性化した後に一定値をとらずにアルカリ化している。
【００２８】
以上の図１及び２に示す水素イオン輸送活性の測定結果は模式的に図３のように表すことができる。
本発明のリン脂質小胞の水素イオン輸送活性は実線のように表される。還元型チトクロムｃが添加されると、リン脂質小胞の膜内に存在するチトクロムｃ酸化酵素は下記の酸素分子の還元反応を触媒し、酸化還元のエネルギーを用いて膜外にプロトンを汲み出す。
Ｏ２　＋　４Ｈ＋　　＋　　４ｅ−　　　→　　２Ｈ２Ｏ
このため膜の内側はアルカリ化し、膜の外側は酸性化する。即ち、還元型チトクロムｃの添加により溶液が酸性化し、その後水素イオン濃度は一定値をとる。これは、膜が水素イオンを透過させにくいことを意味する。
一方、比較例や参考例に示す従来法で生成されたリン脂質小胞の水素イオン輸送活性は点線のように表される。還元型チトクロムｃが添加されると、リン脂質小胞の膜内に存在するチトクロムｃ酸化酵素の働きにより膜外にプロトンが汲み出されるが、膜が悪くプロトンが漏れるときは、一度輸送された水素イオンが時間と共に膜の内側へ戻る。そのため、溶液のアルカリ化が観測される。
【図面の簡単な説明】
【図１】リン脂質ベシクルに再構成したウシ心筋チトクロムｃ酸化酵素による水素イオン能動輸送を示す図である。横軸は時間、縦軸はｐＨを示す（上方ほどｐＨは低い。）。図中１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ、４０μｌと矢印で示す時点で、その量の１ｍＭ還元型チトクロムｃを添加した。（Ａ）〜（Ｄ）のいずれも実験開始のｐＨは７．２００とした。それぞれ左トレースはＣＣＣＰ添加前、右トレースは１０μＭ　ＣＣＣＰ添加後を示す。ＣＣＣＰを添加したときｐＨがずれるが、少量のＮａＯＨ又はＨＣｌを加えて、ｐＨ７．２００に戻した。従って各グラフの始点のｐＨは７．２００である。
【図２】既報（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３５，　１０８００−１−８０６　（１９９６））に記載のリン脂質ベシクルに再構成したチトクロムｃ酸化酵素による水素イオン能動輸送を示す図である。
【図３】リン脂質ベシクルに再構成したチトクロムｃ酸化酵素による水素イオン能動輸送を示す模式図である。横軸は時間、縦軸はｐＨを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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