(57)【要約】【課題】生体に対して利用価値が高く、優れた創収縮効果を奏する創収縮剤を提供する。【解決手段】口腔粘膜上皮細胞又は血小板から精製されたトロンボスポンジン１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌを、１０：１〜１：１の量比でＬＴＧＦと混合する。この混合物を有効成分とし、更に基剤と合わせて、創収縮剤とする。【選択図】　　　　図６
2004035526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンボスポンジンと、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βと、を含む創収縮剤。
【請求項２】
前記ＴＧＦ−βが、潜伏型ＴＧＦ（ＬＴＧＦ）である請求項１記載の創収縮剤。
【請求項３】
トロンボスポンジンとＬＴＧＦとが、１０：１〜１：１の量比で存在する請求項２記載の創収縮剤。
【請求項４】
トロンボスポンジンが、１００ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度である請求項１乃至３のいずれか１項記載の創収縮剤。
【請求項５】
前記トロンボスポンジンは、口腔粘膜上皮細胞及び血小板の少なくともいずれかに由来のものである請求項１乃至４のいずれか１項記載の創収縮剤。
【請求項６】
口腔粘膜上皮細胞の培養上清からトロンボスポンジンを精製し、
精製されたトロンボスポンジンとＬＴＧＦとを、基剤と混合する
ことを特徴とする創収縮剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、創収縮剤及びその製造方法に関し、特に、生体に対して利用価値が高く、優れた創収縮効果を奏する創収縮剤及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚などの組織が傷付いたとき、感染症の危険性を減少させるために、より早期に治癒することが要求され、例えば、各種細胞因子による細胞増殖、細胞接着や細胞遊走性などの作用を利用して創傷を治癒することが提案されている。
また、培養上皮細胞移植は、少量の組織から大量の移植組織が確保できることから広範囲の上皮欠損創の治療に用いられている。更に培養上皮移植は、自家移植・同種移植を問わず、移植部の治癒促進効果をもつことが臨床的に認められている。その理由として、上皮細胞の分泌する液性因子が創収縮促進効果・治癒促進効果を有することが報告されている。
【０００３】
創傷治癒効果を有する細胞因子として、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）が知られている。ＴＧＦ−βは、線維芽細胞の増殖や、細胞外マトリクスの産生促進作用、上皮系細胞の遊走作用などの効果が報告されている。
【０００４】
一方、ＴＧＦ−βを活性化する因子の１つとして、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）が注目されている。また、ＴＳＰには、血管新生作用や組織の再形成などに利用できることが見出されて、創傷治癒剤（例えば、特開平４−２１１０１９号公報）や、抗腫瘍活性及び腫瘍細胞の抗転移活性を利用する薬剤（例えば、特開平５−１７８７５７号公報及び特開平６−１０７５５９号公報）が提案されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＴＧＦ−βの生理作用は時として許容範囲を超えることがあるため、ＴＧＦ−βの投与には副作用が問題となることがあった。このため、ＴＧＦ−βの使用に際して細心の注意が要求されている。
また創傷治癒時に適切な創収縮促進及び血管増殖抑制が成されなければ肥厚性瘢痕が形成されてしまう。このため、上記文献においてＴＳＰが血管新生作用に基づく創傷治癒剤として利用できることが示唆されているとしても、創収縮剤として効果的に利用できることまで示唆されるものではない。
そこで、本発明では、生体に対して利用価値が高く、優れた創収縮効果を奏する創収縮剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の創収縮剤は、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）と、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βと、を含むものである。
ここで、ＴＧＦ−βは、非活性型である潜伏型ＴＧＦ（ＬＴＧＦ）であることが特に好ましい。
本発明の創収縮剤では、ＴＳＰとＬＴＧＦとは、１０：１〜１：１の量比で存在することが好ましく、またＴＳＰは、１００ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度であることが好ましい。
なお、本発明の創収縮剤では、ＴＳＰは、口腔粘膜上皮細胞及び血小板の少なくともいずれかに由来のものであることが好ましい。
【０００７】
また、本創収縮剤の製造方法は、口腔粘膜上皮細胞の培養上清からトロンボスポンジンを精製し、精製されたトロンボスポンジンとＬＴＧＦとを、基剤と混合することを特徴としている。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の創収縮剤は、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）と、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βと、を含むものである。ＴＳＰは、創傷治癒効果、特に創収縮効果を有することが知られているＴＧＦ−βを活性化することが知られているが、ＴＳＰ自体は無毒な因子として生体内の種々の組織に存在しているので、ＴＧＦ−βよりも容易に使用することができる。このため、ＴＧＦ−βの代わりにＴＳＰを投与して、生体内のＴＧＦ−βを活性化し、創収縮効果を得ることができる。この結果、ＴＧＦ−βの投与量を減らして生体内でのＴＦＧ−βの量を適切な範囲内に維持しつつ、ＴＧＦ−βによる創収縮効果を穏やかに且つ効率よく発揮させることができる。
【０００９】
ＴＳＰは、種々の細胞種から産生される液性因子であり、５つのアイソフォームがあることが知られている。このうち特にＴＳＰ−１が、ヒト生体内に一般的に存在し、発生、細胞増殖、腫瘍増殖抑制効果などを有し且つ精製可能ものであると共に、特にＴＧＦ−β１を活性化することができるため、好ましい。ＴＳＰ−１は、３つのジスルフィド結合したサブユニットからなる３量体の糖タンパク質であり、１８００００〜４５００００ダルトンの分子量を有する。そのアミノ酸配列は既に公知であり、例えば、Ｓａｎｔｒｏ　ＳＡ，　Ｆｒａｚｉｅｒ　ＷＡ，　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ，　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，　１９８７，　１４４，　ｐ．４３８−ｐ．４４６に記載されている。
【００１０】
本発明におけるＴＳＰは、公知のアミノ酸情報から合成しても良いが、細胞由来のものも同様に使用することができる。このような細胞由来のＴＳＰは、人工的に合成するよりも生理活性が高く、使用に際しての安全性も高いため好ましい。細胞由来のものを使用する場合には、血小板、線維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、腫瘍細胞、上皮細胞などで合成、分泌されているものを回収して使用することができる。このうち、採取の容易性や、収率の観点から上皮細胞、特に口腔粘膜上皮細胞及び、血小板の少なくともいずれかに由来するものが好ましい。なお、このような細胞が培養細胞であることが、供給元の安定確保の観点から特に好ましい。
【００１１】
特に、口腔粘膜上皮培養細胞の場合には、他の上皮細胞と比較して細胞の増殖速度が早く、また抗原性が低いため、移植用皮膚として適していることが知られている。このように移植用として非常に優れた口腔粘膜上皮培養細胞が、ＴＳＰを産生していることは、本発明によって見出されたことである。このため、口腔粘膜上皮細胞に由来するＴＳＰは、移植に必要な量の口腔粘膜上皮細胞を培養によって得ると同時に採取することができるため、効率良くまた作業性よく得ることができ、特に好ましい。
なお、これらの生体由来のもの又は合成物に相当する市販品も、そのまま使用することができる。
【００１２】
ＴＳＰは、上記の細胞から採取される場合、細胞の培養上清から精製することによって入手することができる。
上記細胞の培養には、細胞の培養に通常用いられる液体培地（培地）を使用することができる。この用途に用いられる培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（以下、ＤＭＥＭ）などを挙げることができ、使用する細胞種に適した培地が選択され、必要に応じて血清、抗生物質などが添加される。なお、細胞の培養は、通常の培養条件をそのまま適用することができる。
培養上清からＴＳＰを精製する場合には、この目的に使用される通常の方法、例えば、限外濾過クロマトグラフィー、フィブリノーゲン親和クロマトグラフィー、塩化バリウム沈降、ＨＰＬＣによるアニオン交換クロマトグラフィーを用いて、分子量などに基づいて精製することができる。また、精製物として市販されているものも同様に使用することができる。また、ＴＳＰの各種誘導体も知られているが、ＴＳＰの創傷治癒効果が損なわれない限り、これらも同様に使用することができる。
【００１３】
精製されたＴＳＰは、好ましくは前記細胞の培養液又は体液に近い緩衝液中で保存される。より好ましくは、１０ｍＭ塩化カルシウム及び０．１％ヒト血清アルブミンを含有する１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中で保存される。ＴＳＰは常温で安定なタンパク質であるが、変性及び酸化を防止するために、好ましくは、遮光した状態で冷蔵保存、より好ましくは冷凍保存される。
本創収縮剤において、ＴＳＰの最終濃度は、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以上であり、５００ｎｇ／ｍｌ以下である。１００ｎｇよりも少ないと充分な創収縮効果が期待できず、５００ｎｇ／ｍｌよりも多い場合には増加量に伴った効果が期待できないため効率的でない。
【００１４】
本発明の創収縮剤では、ＴＳＰの他に、さらにＴＧＦ−βを含む。ＴＳＰをＴＧＦ−βと併用することによって、ＴＧＦ−βの効果を損なうことなく投与量を減らすことができ、一層効果的に創傷治癒を行うことができる。
【００１５】
本発明で用いられるＴＧＦ−βは、生体内から精製することもできるが、市販されている精製物を使用することもできる。ＴＧＦ−βを細胞由来のものとして使用する場合には、血小板のホモジネートから精製することによって得ることができる。
【００１６】
また本発明では、非活性型ＴＧＦ−βである潜伏型ＴＧＦ（ＬＴＧＦ）を使用することが特に好ましい。ＬＴＧＦは、ＴＧＦ−βの非活性型であるので、腫瘍増殖作用、細胞外基質の過剰発現などの副作用を著しく軽減することができる。ＬＴＧＦは、当業者に既知の方法に従って血小板から得ることができ、また市販のものをそのまま使用することもできる。
【００１７】
ＴＳＰとＬＴＧＦとは、好ましくは１０：１〜１：１の量比で混合され、２：１の量比でＴＳＰとＴＧＦ−βとを混合することが特に好ましい。この範囲外では、添加した量に対して期待される効果が充分に発揮されないので、好ましくない。ＴＧＦ−βとＴＳＰの混合は、ｐＨ及び温度の安定した緩衝液中で室温から３７℃の条件下で行うことができる。
【００１８】
本発明の創収縮剤では、上記ＴＳＰ及びＬＴＧＦは、基剤と混合される。特に、本発明の創収縮剤は、口腔粘膜上皮細胞の培養上清からトロンボスポンジンを精製し、精製されたトロンボスポンジンを１００ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇの最終濃度で、基剤と混合して作製される。
ここで用いられる基剤は、創収縮剤の形態に応じて適宜選択可能である。例えば、外用剤として調製する場合には、基剤として、白色ワセリン、黄色ワセリン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、植物油、豚脂、ミツロウ、サラシミツロウ等の疎水性基剤、　マクロゴール等の親水性基剤、又はヒドロゲル等の無脂肪性基剤を好適に選択することができる。
【００１９】
また創収縮剤には、好ましくは保存剤も含有することができる。この場合に用いられる保存剤には、軟膏剤の安定性を向上させるために含有されるものであり、日本薬局方に定められたものが好ましい。
本発明の創収縮剤を、外用剤、特に軟膏剤として調製することが好ましい。この場合には、適当な稠度を有し、全質均等な反固体形状又はペースト状の外用剤とする。軟膏剤を調製する場合には、必要な成分を配合した後、充分に混合撹拌して半固体状又はペースト状にする。
【００２０】
本発明の創収縮剤は、軟膏剤の他に、日本薬局方に従ってパスタ剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、硬膏剤としても調製することができる。硬膏剤として使用する際には、滅菌された布、紙、プラスチック製フィルム等に塗布して使用することが好ましく、創傷部位に貼付することもできる。創傷部位に貼付する場合には、治療促進効果を有するコラーゲン膜又はキチン膜を利用することがより好ましい。また、本発明の創収縮剤は、コラーゲンなどに包埋させて徐放性薬剤として調製しても良い。
【００２１】
さらに本発明の創収縮剤は、液状の注射剤とすることもできる。注射剤とする場合には、注射剤の安定性を向上させるための安定剤（酸化防止剤）及び保存剤、並びに注射時の痛みを緩和させるための無痛化剤から選択される少なくとも１つを含有させることが好ましい。或いは、安定化剤及び保存剤の組合せ、安定化剤及び無痛化剤の組合せ、又は保存剤及び無痛化剤の組合せを含有させてもよい。安定化剤、保存剤及び無痛化剤のすべてを含有させることが最も好ましい。
安定化剤、保存剤及び無痛化剤はいずれも、日本薬局方に定められたものが好適に使用される。また注射剤溶液は等張液であることが好ましい。
【００２２】
また。本発明の創収縮剤は、上記半固体状及び液状の他に粉末形態であってもよい。この場合には、例えば、凍結乾燥したものを粉末化して使用する。
本発明の創収縮剤を構成する配合剤の混合は、通常、ｐＨ７．４前後、室温〜３７℃の条件下で行われる。
【００２３】
【実施例】
以下の実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ用いられるものであり、本発明を制限するものでないことは、当業者には明らかである。
【００２４】
１．口腔粘膜上皮細胞の採取及び培養系の作製
ヒト口腔粘膜上皮細胞は、名古屋大学医学部附属病院歯科口腔外科にて患者（平均年令１８．４歳）の承認を得て、外科手術中に余剰となった組織から無菌的に採取された。なお、ドナー患者は健康な成人で、各種感染症、血液像等の各種スクリーニング検査において異常は認められなかった。
採取された上皮細胞は、１０００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ（明治製菓社製）、１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ社製）、２．５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ（ギブコ社製）及び１０％ウシ胎児血清（フィルトロン社製；以下、ＦＣＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社製、以下、ＤＭＥＭ）に浸漬し、４℃で保存した。採取された口腔粘膜上皮細胞は、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，　Ｇｒｅｅｎ，“Ｎａｔｕｒｅ”，１９７７　，　２６５，　ｐ．４１２−ｐ．４２４に記載された方法に従って培養された。
【００２５】
２．培養口腔粘膜上皮細胞からの培養上清液の採取
口腔粘膜上皮細胞は、上記文献に記載された方法に従って培養し、培養上清液を採取した。簡単に説明すれば、口腔粘膜上皮細胞を直径１０ｃｍのファルコンディッシュ（ベクトン・ディッキンソン社製）にて集密化するまで培養する。集密化（約２．０×１０６個／ディッシュ）に到達したら、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄してから、１０μｇ／ｍｌヘパリン（ナカライ・テスク社製）を含有するＤＭＥＭ１０ｍｌ中で、３７℃、１０％ＣＯ２にてインキュベートした。培養２４時間後に、培養上清液を回収し、遠心分離してデブリスを除去して、使用まで−２０℃で保存した。
【００２６】
３．ヒト線維芽細胞の準備
ヒト正常皮膚線維芽細胞を、名古屋大学医学部附属病院歯科ロ腔外科及び形成外科にて、手術の際に余剰となった組織から、患者（平均年齢１５．５歳）の承認を得て採取した。なお、ドナー患者には、感染症や血液検査における異常は認められなかった。採取された細胞を、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）添加ＤＭＥＭにて、３７℃、５％ＣＯ２下で維持した。６〜１０回継代した細胞を実験に用いた。
【００２７】
４．ヘパリンセファロースアフィニティクロマトグラフィー
生物活性因子は多くの場合、ヘパリン結合タンパク質であることが知られている。このため、我々は、ヘパリン−セファロースによるカラムクロマトグラフィーによって口腔粘膜上皮細胞培養上清を分画した。培養上清の分画は以下の通りである。
３Ｌの口腔粘膜上皮細胞培養上清を、０．２Ｍ塩化ナトリウムの塩濃度の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化された１．０×３．０ｃｍのヘパリンセファロースカラム（ファルマシア・バイオテック社製）に添加した。３種類（０．５Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ塩化ナトリウム）の塩濃度の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用いて、段階的にタンパク質を溶出した。
【００２８】
５．培養口腔粘膜上皮細胞培養上清中のＴＳＰ−１の特定
カラムに吸着し、０．５Ｍの塩化ナトリウムで溶出された分画は、以下に説明するコラーゲンゲル収縮活性を有していた。このため、この分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｎ末端アミノ酸配列解析によって特定した。
Ｎ末端アミノ酸配列解析は、以下の通りに実施した。
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に試料を付した後、このゲルに保持されたタンパク質をフッ化ポリビニリデン（ＰｖＤＦ）膜（ミリポア社製のｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＳＱ）に転写し、その膜をクマシー・ブリリアント・ブルーにて染色した。分離したバンドを切り出して、ＡＢＩ　４９４Ａプロテインシークエンサー（パーキン・エルマー・ジャパン社製）を用いて解析した。
【００２９】
この分画中の３８ｋＤａのタンパク質が、ＴＳＰ−１と判明した（表１参照）。Ｎ末端アミノ酸配列解析の結果を表１に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのバンドを図１にそれぞれ示す。
【表１】
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【００３０】
６．ゲル収縮アッセイ
ヒトリコンビナントＴＳＰ−１（カルビオケム社製）のコラーゲンゲル収縮モデルにおける作用を確認した。このコラーゲンゲル収縮アッセイ系は、生体での創収縮効果を確認する系として、既知のものである。
【００３１】
コラーゲンゲルを、鷲見らの方法（“Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．”，　２０００，　１２７，　ｐ．２４７−ｐ．２５１）に従って、調製した。０．３％ペプシン処理化Ｉ型コラーゲン溶液（セルゲン）（高研社製）、６倍イーグルＭＥＭ（ギブコ社製）及びＰＢＳを４：１：１（容量比）で混合し、０．２％コラーゲン溶液（ｐＨ７・３）を調製した。線維芽細胞を０．０５％トリプシン及び０．０２％エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（ギブコＢＲＬ杜製）に浸漬し、約２×１０５個／ｍｌの濃度で０．２％コラーゲンゲル溶液に懸濁した。細胞懸濁液を、１２ウェルプレート（ファルコン社製）に各ウェル０．５ｍｌずつ小分けし、３７℃５％ＣＯ２下でインキュベートした。２時間後、ゲル中の細胞を注意深くＤＭＥＭで２回洗浄し、ＤＭＥＭに種々の試料を添加した培養液中でゲルをインキュベートし、以下のインビトロゲル収縮実験に用いた。ゲル収縮の測定は、２４時間毎に行われた。但し、ゲルの収縮は略均一に起こるが正円ではないため、各コラーゲンゲルにつきそれぞれ３カ所計測し、それらの平均値を記録して用いた。
【００３２】
無血清条件下で、種々の濃度のＴＳＰ−１を培地に添加し、７２時間観察した。ＴＳＰ−１は、ＴＧＦ−β１のゲル収縮活性よりも低いものの、１０、１００及び５００ｎｇ／ｍｌの量で、用量依存的に有意にコラーゲンゲル収縮活性を示した（図２Ａ）。また、このようなＴＳＰ−１の収縮促進作用は、抗ヒトＴＳＰ−１抗体によって阻害された（図２Ｂ）。
また、図３には、ゲル収縮アッセイ後のコラーゲンの様子を示している。コラーゲンの外周の位置から、コントロール（ＤＭＥＭのみ）と比較して、ＴＳＰ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）ではゲルの収縮が起こったことが明らかである。その一方で、抗ＴＳＰ−１抗体（１μｇ／ｍｌ；ネオ・マーカース社製）又は抗ＴＧＦ−β１抗体（１μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄシステムス社製）を同時に添加したものでは、ゲルの収縮が抑制された（それぞれ、図３中央上及び右上）。
従って、ゲル収縮促進作用は、明らかにＴＳＰ−１によるものであることが確認された。
【００３３】
７．コラーゲンゲル中の細胞数計測
コラーゲンゲル抑制アッセイにおいて線維芽細胞は通常増殖しないので、ＴＳＰ−１によって細胞が増殖しているか調べた。
コラーゲンゲル中の細胞数は、Ｅｈｒｌｉｓｈらの方法（“Ｅｘｐ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．”，　１９８６，　１６４，　ｐ．１５４−ｐ．１６２）に従った。すなわち、培養液を除去した後に、ゲルを１５ｍｌの遠心チューブ（ファルコン社製）に移し、０．１％コラゲナーゼ（和光純薬社製）を含有した１ｍｌのＤＭＥＭを添加して、３７℃で２０分間振盪した。遊離した細胞を遠心して回収し、１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭに再懸濁した。生細胞のカウントは、血球計算板を用いて行った。
表２に示すとおり、生細胞数は、ＴＳＰ−１の有無に関わらず変化なかった。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
８．ＴＳＰ−１によるコラーゲンゲル収縮活性のメカニズム
ＴＳＰ−１は、創収縮促進作用を有するＴＧＦ−β１の活性化因子として知られているので、ＴＳＰ−１の創収縮効果が、ＴＧＦ−β１の活性化機構によるものであることが考えられた。従って、コラーゲンゲル収縮アッセイにおけるＴＳＰ−１の作用機構を調べるために、潜伏型ＴＧＦ−β１（ＬＴＧＦ−β１）とＴＳＰ−１の作用について実験を行った。
【００３６】
ＴＧＦ−β１の定性及び定量方法は、以下の通りである。
１）ＥＬＩＳＡアッセイ
ヒトＴＧＦ−βの量は、ヒトＴＧＦ−β１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムス社製）を用いて測定した。簡単に説明すれば、抗ＴＧＦ−β１モノクローナル抗体が固定されたＥＬＩＳＡプレートを使用し、試料中のＴＧＦ−β１を補足する。この補足されたＴＧＦ−β１を、抗ＴＧＦ−β１ポリクローナル抗体を二次抗体とし、この二次抗体に対するビオチン標識化抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンを用いて検出する。コラーゲンゲル中のＴＧＦ−βの量は、０．１％コラゲナーゼ（和光純薬社製）で３７℃、２０分の処理によってゲルを溶解させ、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分間）によって細胞を除去した後に、製造者の取扱書に従って実施した。
２）ウェスタンブロッティング解析
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法（“Ｎａｔｕｒｅ”，１９７０，　２２７（１５），　ｐ．６８０−ｐ．６８５）に従って実施した。ウェスタンブロッティング解析は、Ｔｏｗｂｉｎらの方法（“Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．”，　（ＵＳＡ），　１９７９，　７６（９），　ｐ．４３５０−ｐ．４３５４）に従い、一次抗体にマウス抗ヒトＴＧＦ−β１抗体を、二次抗体にヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて実施した。免疫沈降バンドは、エンハンストケミルミネッセントキット（アマシャムライフサイエンス社製）を用いて検出した。結果は、対応タンパク質の誘導倍率をリコンビナントＴＧＦ−β（５００ｎｇ）に対する値として示した。
【００３７】
抗ヒトＴＧＦ−β１抗体を、ＴＳＰ−１添加培地に添加すると、ＴＳＰ−１によるゲル収縮活性が低下した（図３右上、図４Ａ）。次いで、ＴＳＰ−１及びＬＴＧＦを混合して、コラーゲンゲルの培養上清に添加した。ＬＴＧＦ及びＴＳＰ−１で処理したゲルの直径は、２４、４８及び７２時間で、それぞれ単独で使用した場合と比較して、有意に減少した（図４Ｂ、図５Ａ及びＢ）。更に、抗ヒトＴＳＰ−１抗体及び抗ヒトＴＧＦ−β１抗体は、ＴＳＰ−１及びＬＴＧＦの双方で処理したゲルの収縮を阻害した（図５Ａ、Ｂ）。
【００３８】
総ＴＧＦ−β１量（活性型ＴＧＦ−β１とＬＴＧＦとの合計）は、ＥＬＩＳＡによって測定したところ試料間に違いはほとんどなかった（図７Ｂ）が、ウェスタンブロッティング解析によれば、２５ｋＤａのＴＧＦ−β１は、ＴＳＰ−１処理試料の方で、３．３倍多かった（図７Ａ、Ｃ）。このことは、ＬＴＧＦからＴＧＦ−β１への変換がＴＳＰ−１によって促進されることを示唆している。
【００３９】
これらの結果から、ＴＳＰ−１がＴＧＦ−β１の収縮効果を促進することが確認された。また、ＬＴＧＦとＴＳＰ−１とを同時に作用させることによって、単独で使用するよりも収縮が促進されており、ＴＳＰ−１がＬＴＧＦを活性化してより効率よく創収縮させていることが示唆された。
【００４０】
９．ＴＳＰ−１及びＬＴＧＦの量比検討
次に、ＴＳＰ−１に対するＬＴＧＦの適正な量比を検討するために、ＬＴＧＦ活性化試験を行った。
前記ゲル収縮アッセイによって確認されたｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＴＳＰ−１の活性濃度１００ｎｇ／ｍｌを基準にして、ＬＴＧＦを、１−１０００ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度に設定して、ＰＢＳ中３７℃の条件下でＴＳＰ−１と共に２時間インキュベートした。
その後、前記同様にヒトＴＧＦ−β１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムス社製）を用いて、総ＴＧＦ−β１量と活性化ＴＧＦ−β１量を各サンプルについて定量した。結果を図８に示す。
【００４１】
図８に示されるように、１００ｎｇ／ｍｌのＴＳＰ−１が、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＬＴＧＦにおいて、２５％以上の効率でＴＧＦ−β１に活性化することが明らかとなった。２５％以下の活性化率では、濃度依存性の活性が期待できず、創収縮効果が充分に発現しないと考えられるため好ましくない。また、特に、１００ｎｇ／ｍｌのＴＳＰ−１に対して、約５０ｎｇ／ｍｌのＬＴＧＦが最適濃度であると考えられる。
【００４２】
１０．ｉｎ　ｖｉｖｏ解析
ＴＳＰ−１の生体での創収縮効果を確認するために、コラーゲンスポンジをＴＧＦ−β１又はＴＳＰ−１に浸漬し、ラットの背部に移植した。
移植及び切片の作製は、以下の通りであった。コラーゲンスポンジ（テルダーミス）（テルモ社製）を、試料を含有するアテロコラーゲン溶液に２時間浸した。２００から２５０ｇの９〜１２週齢のウィスター系ラットを３５ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで麻酔し、カミソリで背部の毛を除去した後、皮膚筋肉下に裂け目を形成するように切開し、径８ｍｍ深さ１ｍｍのスポンジを埋め込んだ。
１、３又は７日後に、スポンジを埋め込んだ箇所から１×１ｃｍの皮膚組織を切り出して、１０％中性緩衝ホルマリン固定液を用いて３日間固定した。固定組織を、パラフィンに包埋して、厚さ９μｍの連続縦断面となる切片を作製した。切片は、一晩乾燥させた後で、密閉状態で保存した。切片は、ヘマトキシリン−エオジンで染色（Ｈ−Ｅ染色）した。
【００４３】
移植後１及び３日目に、多くの炎症細胞がＴＳＰ−１及びＴＧＦ−β１処理移植スポンジにて観察された。移植後７日目には、ＴＳＰ−１添加群及びＴＧＦ−β１添加群では、コントロール群に対して、それぞれ、線維芽細胞の遊走や好中球の増加が観察された（図９）。このような経過は、ＴＧＦ−β１の場合と同様であり、ＴＳＰ−１がＴＧＦ−β１とほぼ同等の効果を有することが確認された。
【００４４】
従って、培養口腔粘膜上皮細胞の培養上清中に存在するＴＳＰ−１は、ＴＧＦ−β１を活性化することによって、ＴＧＦ−β１の創収縮効果を効率よく発揮できることが明らかとなった。また、ＴＳＰ−１による創収縮は間接的なものであり、穏やかに発揮されるため、創収縮剤として有用性が高く、軟膏や被覆剤との併用により有効に利用することができる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、生体に対して利用価値が高く、優れた創収縮効果を奏する創収縮剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例にかかる細胞上清中のＴＳＰ−１のバンドを示す電気泳動の写真である。
【図２】図２Ａは、本発明の実施例において種々の濃度のＴＳＰ−１を使用したゲル収縮アッセイの結果を、図２ＢはＴＳＰ−１と抗ＴＳＰ−１抗体を使用したゲル収縮アッセイの結果をそれぞれ示すグラフである。
【図３】本発明の実施例にかかるゲル収縮アッセイの結果を示す写真である。
【図４】図４Ａは、本発明の実施例においてＴＳＰ−１と抗ＴＧＦ−β１抗体を使用したゲル収縮アッセイの結果を、図４ＢはＴＳＰ−１とＬＴＧＦを種々の濃度で組み合わせて使用したゲル収縮アッセイの結果をそれぞれ示すグラフである。
【図５】図５Ａは、本発明の実施例においてＴＳＰ−１とＬＴＧＦ、抗ＴＳＰ抗体を使用したゲル収縮アッセイの結果を、図５ＢはＴＳＰ−１とＬＴＧＦ、抗ＴＧＦ−β１抗体を使用したゲル収縮アッセイの結果をそれぞれ示すグラフである。
【図６】本発明の実施例にかかるゲル収縮アッセイの結果を示す写真である。
【図７】本発明の実施例においてコラーゲンゲル中の合計ＴＧＦ−β１の量を比較するため、図７Ａは、ウェスタンブロッティング解析によるゲル写真、図７Ｂは、ＥＬＩＳＡによるＴＧＦ−β１の量を比較するグラフ、図７Ｃは、エンハンストケミルミネッセントによるＴＧＦ−β１の量を比較するグラフである。
【図８】本発明の実施例におけるＴＳＰ−１とＬＴＧＦとの量比を検討したグラフである。
【図９】本発明の実施例におけるＴＳＰ−１のｉｎ　ｖｉｖｏ創収縮効果を示す顕微鏡写真像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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