(57)【要約】【課題】超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質を効率的に生産することのできる発現ベクターを提供する。【解決手段】目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を組み込んで発現させることにより、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との融合タンパク質が得られる発現ベクターであって、（ａ）古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードし、プロモーターに有効に連結する第１コード領域、（ｂ）第１コード領域と同じ解読枠内であって、第１コード領域の下流にあり、目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域、及び、（ｃ）第１コード領域と目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域との間にあり、同じ解読枠内で翻訳されてプロテアーゼ消化アミノ酸配列となる領域からなる発現ベクター。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を組み込んで発現させることにより、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との融合タンパク質が得られる発現ベクターであって、
（ａ）古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードし、プロモーターに有効に連結する第１コード領域、
（ｂ）前記第１コード領域と同じ解読枠内であって、前記第１コード領域の下流にあり、前記目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域、及び、
（ｃ）前記第１コード領域と前記目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域との間にあり、同じ解読枠内で翻訳されてプロテアーゼ消化アミノ酸配列となる領域からなる
ことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２】
請求項１記載の発現ベクターに目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を組み込んでなることを特徴とする発現ベクター。
【請求項３】
古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項１又は２記載の発現ベクター。
【請求項４】
古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、超好熱菌又は好熱菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の発現ベクター。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４記載の発現ベクターを内包することを特徴とする宿主。
【請求項６】
大腸菌であることを特徴とする請求項５記載の宿主。
【請求項７】
古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との融合タンパク質であって、前記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと前記目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有することを特徴とする融合タンパク質。
【請求項８】
超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質であって、請求項７記載の融合タンパク質をプロテアーゼ消化アミノ酸配列を消化するプロテアーゼで消化して得られることを特徴とするタンパク質。
【請求項９】
古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との融合タンパク質を製造する方法であって、請求項２、３又は４記載の発現ベクターを内包する宿主を、前記発現ベクターの発現条件下で培養することを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
超好熱菌又は好熱菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との融合タンパク質を製造する方法であって、少なくとも、
請求項４記載の発現ベクターを内包する宿主を、前記発現ベクターの発現条件下で培養することにより前記融合タンパク質を得る工程と、
加熱処理によって宿主由来タンパク質を熱変性し沈殿除去することにより前記融合タンパク質を精製する工程とを有する
ことを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質の製造方法であって、請求項２、３又は４記載の発現ベクターを内包する宿主を、前記発現ベクターの発現条件下で培養し、得られた融合タンパク質をプロテアーゼ消化アミノ酸配列を消化するプロテアーゼで消化することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性に優れ、産業上有用な超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質を効率的に生産することのできる発現ベクター、宿主、融合タンパク質、タンパク質、融合タンパク質の製造方法及びタンパク質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、種々の生物のゲノム解析が終了しつつあり、今後は遺伝子の発現産物であるタンパク質の網羅的な機能解析へと進むと考えられている。個々のタンパク質の性質を明らかにするとともに、タンパク質同士の相互作用を網羅的に解析することで、生命現象解明の一助としようとする研究が急速に増えつつある。一方、各種の生理活性物質と特異的に結合し、その作用を伝達する細胞内受容体タンパク質も、その受容体タンパク質と結合する活性物質が、新規医薬品の候補物質となり得ることから、その３次元構造決定に重大な関心が持たれ、新規医薬品のスクリーニングにおいて注目されている。このようなタンパク質の性質を決定しようとする場合、該当する遺伝子をベクター遺伝子上に組み込み、バクテリア、酵母、昆虫細胞等の宿主にトランスフォーメーションし、発現させて得られる組み換えタンパク質の性質を調べる方法が一般的である。
【０００３】
タンパク質の正しい性質を評価する際、そのタンパク質が、正しい立体構造に折り畳まれているか否かが非常に重要となる。しかしながら、異種生物由来のタンパク質を、上述の宿主発現系を用いたタンパク質発現法で作製しようとする場合、しばしばタンパク質のフォールディング異常により、立体構造の異なった異常型タンパク質しか得られないケースに遭遇する。このようなタンパク質は宿主内で封入体と呼ばれる凝集体として発現したり、宿主細胞のプロテアーゼにより、分解されたりすることが知られている。これらを解決するためには、目的タンパク質の宿主細胞内での折り畳み反応が正確に行われるよう制御することが極めて重要であると考えられる。
【０００４】
超好熱性菌又は好熱菌由来のタンパク質は一般に耐熱性が高く、また、有機溶剤に強い等、極めて高い安定性を有していることから、安定性が必要とされている酵素反応プロセスへの応用や、バイオセンサー等への応用が期待されている。しかし、上述のような常温性の宿主を用いて発現させようとすると、やはり、フォールディング異常による封入体形成の問題に直面するのが現状である。これらを解決するためには、目的タンパク質の宿主細胞内での折り畳み反応が正確に行われるよう制御することが極めて重要であると考えられる。
【０００５】
目的タンパク質が異常型タンパク質である封入体として発現した場合、その正常型を得る手段として、それをインビトロで正常型に変換する方法が一般的であった。即ち、宿主から封入体を回収し、高濃度の塩酸グアニジンや尿素等で可溶化後、適当な緩衝液等で３０〜１００倍程度に希釈することで、可溶化した目的タンパク質をリフォールディングさせる方法である。しかしながら、これらインビトロでリフォールディングさせる方法は、非常に手間がかかる割には、得られる収量は低い。
【０００６】
また、超好熱性菌又は好熱菌由来のタンパク質は、常温性生物種由来のタンパク質と比較して、リフォールディングに要する時間が長いことが明らかになりつつある。それに起因しているかどうかは不明であるが、特に超好熱性菌由来のタンパク質をインビトロでリフォールディングしようとしても凝集塊を形成してしまい、天然型の構造を持つタンパク質を得た例はこれまで報告がない。そのため、産業上有用と期待されている好熱菌由来タンパク質を効率的に生産する方法の確立が強く望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、耐熱性に優れ、産業上有用な超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質を効率的に生産することのできる発現ベクター、宿主、融合タンパク質、タンパク質、融合タンパク質の製造方法及びタンパク質の製造方法を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、超好熱性菌又は好熱菌由来タンパク質を、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとリンカーで連結させた融合タンパク質として発現させることで、本来、異常型として発現されるタンパク質を天然型の可溶体として大量に発現できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
本発明は、目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を組み込んで発現させることにより、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との融合タンパク質が得られる発現ベクターであって、（ａ）古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードし、プロモーターに有効に連結する第１コード領域、（ｂ）前記第１コード領域と同じ解読枠内であって、前記第１コード領域の下流にあり、前記目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域、及び、（ｃ）前記第１コード領域と前記目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域との間にあり、同じ解読枠内で翻訳されてプロテアーゼ消化アミノ酸配列となる領域からなる発現ベクターである。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明の発現ベクターは、目的タンパク質である超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質を第１コード領域がコードする古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質として発現するものであり、第１コード領域、目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質を挿入するための少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域、及び、プロテアーゼ消化アミノ酸配列となる領域からなるものである。
【００１０】
上記第１コード領域は、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードし、プロモーターに有効に連結するものである。
上記ＰＰＩａｓｅ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ　ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）は、タンパク質のフォールディングに関与する分子シャペロンの１つであり、細胞内でフォールディング途上のターゲットタンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシストランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有するものである。
【００１１】
ＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン型及びパーブリン型の３種類に分類される。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは免疫阻害剤の１つであるＦＫ５０６により活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅは、別の免疫阻害剤であるシクロスポリンに対して感受性を持つＰＰＩａｓｅ又はそのホモログである。一方、パーブリン型ＰＰＩａｓｅは、いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さず、ｊｕｇｌｏｎｅによりその活性が阻害されるものである。この３種類のＰＰＩａｓｅは、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどない。
【００１２】
本発明で用いられるＰＰＩａｓｅは、これらのうち、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅである。
本発明者らは、古細菌のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの機能について、鋭意検討した結果、興味深いことに、古細菌のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが上記ＰＰＩａｓｅ活性だけでなく、タンパク質の不可逆的凝集を抑制すると同時に、変性タンパク質のリフォールディングを促進させる分子シャペロン活性を有することを明らかにした（Ｆｕｒｕｔａｎｉ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３９，４５３−，２０００年；Ｉｄｅｎｏ、　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２６７，３１３９−，２０００年；Ｉｄｅｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５７，４６５−，２００１年；Ｉｄｅｎｏ、　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，４６４−、２００２）。
【００１３】
上記分子シャペロン活性とは、変性したタンパク質を元の天然型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性を意味する。例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田、バイオサイエンスとインダストリー　５６，　５９３−、１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率でその検定対象物の分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性タンパク質の再生率を評価する方法としては、例えばロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　４０、３６１−、１９９５年）が挙げられ、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法（Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６９、８５２９−、１９９４年）等が挙げられる。
【００１４】
上記分子シャペロン活性は、本来、分子シャペロンの１つとして知られるシャペロニンやＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ系のタンパク質折り畳みシステムに見いだされた活性である。これらは、細胞内で生合成されたポリペプチドが正しい形に折り畳まれるよう、サポートする機能を果たしている。その際、ＡＴＰ等の高エネルギー物質の加水分解を必要とする。古細菌のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、そのシャペロン活性を発揮する際、上記高エネルギー物質の加水分解反応を必要としない点で優れている。
【００１５】
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子量の違いにより、２種類に大別できる。一方は分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプであり、他方は２６〜３３ｋＤａ程度のロングタイプである。本発明におけるＰＰＩａｓｅは、ショートタイプ、ロングタイプのいずれの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであってもよい。しかしながら、一般的に、ショートタイプの方がより強い分子シャペロン活性を有する傾向にあること、タンパク質の分子量が大きくなるにつれて、その組み換えタンパク質の発現量が低下する傾向があること、の２点を考慮すると、本発明ではショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの方が好ましい。なお、上記した分子量の幅はこれまで見いだされているＰＰＩａｓｅの分子量幅であり、本発明で用いる古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、この分子量幅に限定されず、実質的に同じグループに属するものであればいずれであってもよい。
【００１６】
本発明における古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては特に限定されず、いずれの古細菌由来のものであってもよく、例えば、これまで見いだされている古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのうち、ショートタイプとしては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＫＳ−１由来、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のもの等が挙げられる（Ｍａｒｕｙａｍａ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ　５、８２１−、２０００）。一方、ロングタイプは、ゲノム解析やその他の解析の結果、ほとんどの古細菌のゲノム上で見いだされており、例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ　ｐｅｒｎｉｘ由来、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ　ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ　Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ由来、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ由来のもの等が挙げられる（Ｍａｒｕｙａｍａ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ　５、８２１−、２０００年）。ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの一例として、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のアミノ酸配列を配列番号１に、ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの一例として、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。
【００１７】
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、なかでも超好熱菌又は好熱菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが好ましい。超好熱菌又は好熱菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを用いると、後述するように、得られた融合タンパク質の精製が容易になる。
【００１８】
本発明において第１コード領域が有効に連結するプロモーターとしては特に限定されず、例えば、Ｐｌａｃプロモーター、Ｐｔａｃプロモーター、ｘｙｌＡプロモーター、ＡｒａＢプロモーター、ｌａｍｂｄａプロモーター、Ｔ７プロモータ−、ｇａｌ１／ｇａｌ１０プロモーター、ｎｍｔ１プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、マウスメタロチオネインプロモーター等が挙げられる。
【００１９】
本発明の発現ベクターは、上記第１コード領域と同じ解読枠内であって、第１コード領域の下流、即ち３’側にあって目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域を有する。このような制限酵素サイトはマルチクローニングサイトとも呼ばれる。この領域は、目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を第２コード領域として挿入する領域である。
本発明の発現ベクターでは、これらのマルチクローニングサイトに目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、第１コード領域とそれに続く目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子が上記プロモーターにより翻訳されて、目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質は古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質として発現される。
【００２０】
本発明の発現ベクターは、上記第１コード領域と上記目的とする超好熱性菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる少なくとも１つの制限酵素サイトを有する領域との間にあり、同じ解読枠内で翻訳されてプロテアーゼ消化アミノ酸配列となる領域を有する。
上記プロテアーゼ消化アミノ酸配列は、本発明の発現ベクターの発現により得られる古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との融合タンパク質において、両タンパク質をつなぐペプチドリンカーとなるものである。両タンパク質をつなぐペプチドリンカーがプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有することにより、プロテアーゼを作用させることによって容易に融合タンパク質を消化して、目的とする超好熱性菌又は好熱菌由来タンパク質を得ることができる。
【００２１】
上記プロテアーゼとしては特に限定されず、例えば、トロンビン、ファクターＸａ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。これらのプロテアーゼはファルマシアバイオテク社等から市販されている。上記ペプチドリンカーとなるべき塩基配列の長さは特に限定されないが、１５〜９０塩基程度であることが好ましく、翻訳されてグリシンやセリン等の中性アミノ酸となる塩基配列を多く含むことが好ましい。
【００２２】
本発明の発現ベクターには他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。上記他の公知の塩基配列としては特に限定されず、例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を付与するシグナル配列、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等が挙げられる。
【００２３】
本発明の発現ベクターに目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を第２コード領域として組み込んで発現させることにより、第１コード領域にコードされる古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、即ち、分子シャペロン活性を有するポリペプチドと第２コード領域にコードされる目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との融合タンパク質が得られる。更に、両者の間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を含むリンカーペプチドが含まれることから、得られた融合タンパク質をプロテアーゼで消化すれば、目的タンパク質を容易に融合タンパク質から切り出すことができる。
このような、本発明の発現ベクターに目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質をコードする遺伝子を組み込んでなる発現ベクターもまた、本発明の１つである。
また、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との融合タンパク質であって、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有する融合タンパク質、及び、超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質であって、上記融合タンパク質をプロテアーゼ消化アミノ酸配列を消化するプロテアーゼで消化して得られるタンパク質もまた、本発明の１つである。
【００２４】
上記目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質としては特に限定されず、例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来アミラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来セルラーゼ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ　ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼホモログ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ　ｆｕｒｇｉｄｕｓ由来リパーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来アミノアシルシンセターゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ　ｂｒｏｃｋｉｉ由来アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来乳酸脱水素酵素、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ由来サーモライシン等のプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＣＧＴａｓｅ等が挙げられる。
【００２５】
本発明の発現ベクターは宿主に導入されて目的タンパク質の発現に供される。上記宿主としては特に限定されず、例えば、細菌等の原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫細胞、ほ乳類細胞等が挙げられるが、使用される宿主と発現ベクターの特性は適合しなければならない。例えば、ほ乳類細胞系において融合タンパク質を発現する場合、発現ベクターは、ほ乳類細胞のゲノムから単離された、例えばマウスメタロチオネインプロモーター等のプロモーターや、これらの細胞で成長するウイルスから単離された、例えばバキュロウイルスプロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター等のプロモーターを用いることが好ましい。
【００２６】
上記宿主としては、なかでも大腸菌等の原核生物が好適に用いられる。グラム陰性細菌を宿主として用いる場合、融合タンパク質の発現は、細胞質であっても、ペリプラズム領域への発現であっても良い。
【００２７】
本発明の発現ベクターを宿主に導入する方法としては特に限定されず、公知の種々の方法を用いることができ、例えば、トランスフェクションとしてリン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔、リポソーム融合、核注入、ウイルス又はファージ感染等が挙げられる。本発明の発現ベクターを内包する宿主もまた、本発明の１つである。
【００２８】
本発明の発現ベクターを適切な宿主に導入し、宿主を大量の融合タンパク質を発現させる条件下で培養する。
古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との融合タンパク質を製造する方法であって、本発明の発現ベクターを内包する宿主を、前記発現ベクターの発現条件下で培養する融合タンパク質の製造方法、及び、超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質の製造方法であって、本発明の発現ベクターを内包する宿主を、前記発現ベクターの発現条件下で培養し、得られた融合タンパク質をプロテアーゼ消化アミノ酸配列を消化するプロテアーゼで消化するタンパク質の製造方法もまた、本発明の１つである。
【００２９】
本発明の発現ベクターを用いて得られた融合タンパク質を精製する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。
第１コード領域にコードされた古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが超好熱菌又は好熱菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅである場合には、上記融合タンパク質は、超好熱菌又は好熱菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅも、目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質も、いずれも熱に対して安定である。従って、宿主の破砕液を加熱処理することにより、簡単に融合タンパク質を精製することができる。即ち、宿主は大腸菌等の常温生物が主であるから、宿主由来のタンパク質は、加熱処理によって熱凝集するので、遠心分離等により固形物として回収される。一方、可溶性画分に発現した上記融合タンパク質は変性せず、可溶画分にとどまったままとなる。
超好熱菌又は好熱菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的とする超好熱菌又は好熱菌由来タンパク質との融合タンパク質を製造する方法であって、少なくとも、本発明の発現ベクターを内包する宿主を、発現ベクターの発現条件下で培養することにより融合タンパク質を得る工程と、加熱処理によって宿主由来タンパク質を熱変性し沈殿除去することにより融合タンパク質を精製する工程とを有する融合タンパク質の製造方法もまた、本発明の１つである。
【００３０】
その他の精製手段としては、例えば、融合タンパク質を適当なリガンドを介して固定化担体に結合する形態に設計する方法が挙げられる。例えば、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＮ末端側に、ヒスチジン６残基程度のタグを有するようベクターを設計すると、得られた融合タンパク質は、ニッケル等の金属をキレートした担体に、ヒスチジン残基を介して結合することができる。この担体を用いれば、宿主由来のタンパク質と融合タンパク質とを簡単に分離できる。担体に結合した融合タンパク質は、プロテアーゼでリンカーを切断することにより、目的タンパク質のみを簡単に担体から遊離させることができる。もちろん、切断することなく、融合タンパク質のまま担体から遊離させることも、イミダゾールで溶出すれば可能である。上記ヒスチジンタグ以外にも、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ又はその一部分をタグとし、グルタチオン樹脂によるアフィニティーにより精製する方法や、マルトース結合タンパク質又はその一部をタグとし、マルトース樹脂により精製する方法等を適用してもかまわない。
また、本発明で用いられる古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅはＦＫ５０６結合型であるので、ＦＫ５０６が結合した担体を用いれば、ＦＫＢＰとＦＫ５０６の両者のアフィニティーで精製が簡便化される。その他、抗体とのアフィニティーを用いてもかまわない。上記の精製タグは、ＰＰＩａｓｅのＮ端側に設計しても、目的タンパク質のＣ末端側に設計してもいずれであってもかまわない。これらの遺伝子操作や、アフィニティー精製方法は、当業者には一般的に理解されているものである。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＫＳ−１由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）と融合するための発現ベクター構築
分子シャペロン活性を有するＴｃＦＫＢＰ１８（Ｉｄｅｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５７、４６５−、２００１年）の発現プラスミドｐＥＦＥ１−３（Ｉｉｄａ、Ｇｅｎｅ　２２２、２４９−、１９９８）を鋳型とし、そのＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＴｃＦｕ―Ｆ１及びＴｃＦｕ―Ｒ２を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。一方、ＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質をプロテアーゼによりＴｃＦＫＢＰ１８と目的タンパク質とに切断するためのリンカーをコードする塩基配列として、Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２及びその相補鎖を設計した。Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２は、その５’側にＳｐｅＩサイトを、３’側にＥｃｏＲＩサイトをそれぞれ有している（図１）。Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２のトロンビン切断部分のＤＮＡ配列の下流には、ＢａｍＨＩサイト、ＮｄｅＩサイトを有しているため、目的タンパク質の遺伝子断片はこれらの制限酵素サイトを利用して導入することにより、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質を得ることができる（図１）。
上記ＴｃＦＫＢＰ１８の遺伝子断片と、トロンビン切断部分をコードするＤＮＡ断片を、各々の制限酵素で処理し、あらかじめＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにて処理したｐＥＴ２１ｄプラスミドＤＮＡ（ノバジェン社製）に、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子−Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆ２の順でライゲーションした。得られたＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質発現用プラスミドをＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２とした。
【００３３】
【表１】
2004024102.tif 000002
【００３４】
（実施例２）ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２を用いたＴｃＦＫＢＰ１８の発現
ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２をＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフォーメーションした。２Ｌの三角フラスコに２×ＹＴ培地（Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒｕｃｔ　１６ｇ／Ｌ、　ＢＡＣＴＯ　ＴＲＹＰＴＯＮ　２０ｇ／Ｌ、　ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、アンピシリン　１００マイクロｇ／ｍＬ、　ｐＨ７．５）７００ｍＬを入れ、組み換え大腸菌２〜３白金耳を接種した。３５℃で２４時間回転培養（１１０ｒｐｍ）した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）にて菌体を回収した。得られた菌体は１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。
【００３５】
得られた菌液を超音波破砕後、遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離した。沈殿画分は、更に封入体画分に精製するため、４％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁後、３０分間反応させることで膜成分を可溶化し、遠心分離にて沈殿する封入体成分を回収した。この操作を２回繰り返し、得られた沈殿部を封入体画分とした。可溶性画分１０μｇと、それに相当する封入体画分の容量をそれぞれ１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、ＴｃＦＫＢＰ１８に相当するバンドは、可溶性画分のみに見られた。本来ＴｃＦＫＢＰ１８が検出させる位置よりも見かけ上高分子量の位置に検出されたが（図２、レーン１）、これは、ＴｃＦＫＢＰ１８の構造遺伝子の３’末端に終止コドンが存在せず、マルチクローニングサイトが存在するため、その翻訳産物がＴｃＦＫＢＰ１８のＣ末端に連なっているためであると考えられる。
【００３６】
（実施例３）　ＴｃＦＫＢＰ１８と超好熱性古細菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ　ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼホモログからなる融合タンパク質の発現
Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ　ｐｅｒｎｉｘのゲノムを鋳型とし、そのロダネーゼホモログの構造遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅した。プライマーには表１に示したｒｈｏ―Ｆ２及びｒｈｏ―Ｒ２を用いることによりロダネーゼホモログ遺伝子断片の両端に制限酵素サイトを設けた。
得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＳａｃＩにより処理し、アガローズゲルを用いた電気泳動法により精製した。あらかじめＮｄｅＩ／ＳａｃＩ処理しておいたＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２に、このＤＮＡ断片をライゲーション後、実施例２と同様の方法により組み換え大腸菌を得た。得られた大腸菌を実施例２と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。
得られた菌液を超音波破砕後、遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離し、沈殿画分から、更に実施例２と同様の方法により、封入体画分を得た。可溶性画分、封入体画分は、実施例２と同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、ＴｃＦＫＢＰ１８とロダネーゼホモログの融合タンパク質は、一部封入体として発現するものの、ほとんどが可溶性画分に発現していた（図２、レーン２）。
【００３７】
（比較例１）超好熱性古細菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ　ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼホモログの単体での発現
実施例２で得られたＰＣＲ産物を、あらかじめＮｄｅＩ／ＳａｃＩ処理しておいたｐＥＴ２１ａにライゲーション後、実施例２と同様の方法で組み換え大腸菌を得た。
得られた大腸菌を実施例２と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。菌体は実施例２に記載した方法により、可溶性画分と封入体画分に分離し、同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、ロダネーゼホモログは、単体では可溶性画分には発現せず、すべて封入体画分に発現した（図２、レーン３）。
【００３８】
（比較例２）ロダネーゼホモログとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）からなる融合タンパク質の発現
実施例３で用いたプライマーの代わりに、表１に示したｒｈｏ―Ｆ１及びｒｈｏ―Ｒ１を用いることにより、ロダネーゼホモログ遺伝子断片の両端に制限酵素サイトを設けた。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩにより処理し、アガローズゲルを用いた電気泳動法により上記遺伝子断片を精製した。あらかじめＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ処理しておいた、ＧＳＴ融合タンパク質生産用プラスミド　ｐＧＥＸ−４Ｔ−１（アマシャム・ファルマシア）にライゲーションすることにより、ＧＳＴ融合ロダネーゼホモログの発現系を構築した。実施例２と同様の方法で組み換え大腸菌を取得した後、本菌を同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。
菌体は実施例２と同様の方法により、可溶性画分と封入体画分に分離し、同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、ロダネーゼホモログは、ＧＳＴと融合させても可溶性画分に発現せず、すべて封入体画分に発現することがわかった（図２、レーン４）。
【００３９】
（実施例４）　ＴｃＦＫＢＰ１８とロダネーゼホモログの融合タンパク質の精製
実施例２で得られた可溶性画分を下記の（ａ）及び（ｂ）の陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過の順でカラム精製を繰り返すことにより、ＴｃＦＫＢＰ１８−ロダネーゼホモログの融合タンパク質を単一にまで精製した（図３、レーン１）。精製の結果得られた融合タンパク質の量は、培地１リットルあたり約１００ｍｇと大量に得ることができた。
【００４０】
（ａ）ＤＥＡＥ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　ｃｏｌｕｍｎ（１６ｍｍ　ｘ　６０ｃｍ；ＴＯＳＯＨ　Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）
Ａ液：２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ　緩衝液（ｐＨ　６．８）
Ｂ液：０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ　緩衝液（ｐＨ
６．８）
（０−３００ｍｉｎ：Ｂ液０−１００％の直線グラジエント、３００−４２０　ｍｉｎ：Ｂ液１００％）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
【００４１】
（ｂ）ＨｉＬｏａｄ　２６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ　ｃｏｌｕｍｎ（２６ｍｍ　ｘ　６０ｃｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
溶離液：１００ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０；０．１５Ｍ　ＮａＣｌ含有）
流速：３ｍＬ／ｍｉｎ
【００４２】
（実施例５）　融合タンパク質のトロンビンによる切断
実施例３で精製した融合型タンパク質１ｍｇ当たり、１Ｕのトロンビンを加え、２２℃にて１６時間処理することにより、融合タンパク質のトロンビンサイトを切断した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、融合タンパク質は確かにＴｃＦＫＢＰ１８とロダネーゼホモログに切断されることが確認された（図３、レーン２）。
【００４３】
【発明の効果】
本発明は、上述の構成よりなるので、これまで発現が困難であった好熱菌由来のタンパク質を、大腸菌をはじめとするバクテリアや、酵母、昆虫細胞等の常温性宿主細胞を用い、簡単に発現することが困難となった。これにより、従来は、封入体として得られていたタンパク質をインビトロでリフォールディングするといった手間が不要となり、簡便かつ安価に製造することが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＫＳ−１由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと融合タンパク質を作製するためのベクターＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２の遺伝子配置を示す図である。
【図２】ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２を用いた場合のタンパク質の発現を示す図である。
【図３】精製した超好熱性古細菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ　ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼ−ＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質と、それをトロンビン処理した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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