(57)【要約】【課題】無脊椎動物の電位依存性カルシウムチャネルに対する作用薬剤を、能率的かつ効果的にスクリーニングするための手段を新たに提供する。【課題解決手段】ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）に対する阻害活性および／または活性化活性を指標として、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質を含有することを特徴とする、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングするための材料。
【請求項２】
ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質、並びに電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび／または哺乳類骨格筋電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットを含有することを特徴とする無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングするための材料。
【請求項３】
ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質のｍＲＮＡを含有する細胞を用いることを特徴とする、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングするための材料。
【請求項４】
ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質、並びに電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび／または哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットの各ｍＲＮＡを含有する細胞を用いることを特徴とする、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングするための材料。
【請求項５】
細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である、請求項３または４に記載の材料。
【請求項６】
ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質、並びに電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび／または哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットの各ｍＲＮＡを含有してなる細胞。
【請求項７】
細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質を含有するスクリーニング系において、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）の発現電流に対する被験物質の阻害活性及び／または活性化活性を指標として被験物質を選別すること特徴とする、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質、並びに電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび／または哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットを含有するスクリーニング系において、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）の発現電流に対する被験物質の阻害活性および／または活性化活性を指標として被験物質を選別することを特徴とする、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングするための材料および該材料を用いて無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　電位依存性カルシウムチャネルは様々な細胞機能、特に神経伝達の調節に重要な役割を果たしている。哺乳類においては、現在少なくとも１０種の分子種が知られており、薬理学的にL-, N-, P/Q-, R-, または T-型カルシウムチャネルとして分類されている（Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:521-555 (2000)， Jpn. J. Pharmacol. 72:83-109 (1996)）。
【０００３】
　無脊椎動物のヤリイカでは、神経系、特に星状神経節の巨大シナプスが神経伝達の研究に使われてきている（The Squid Giant Synapse: a model for chemical transmission. Oxford University Press (1999)）。CharltonとAugustine（Brain Res. 525:133-139 (1990)）は、巨大シナプスのシナプス前膜にあるカルシウムチャネルはT-, L-, または、N-型のカルシウムチャネルにも分類できないと報告している。Ｐ型の電流を流すカルシウムチャネルがヤリイカの視神経節にあると報告があり、またＦＴＸという毒に感受性のあるカルシウムチャネルがイカの巨大シナプスのシナプス前膜に存在すると報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1689-1693 (1989)）。更に、星状神経節のジャイアントファイバーローブの細胞にω-agatoxin IVAに感受性のあるP-型カルシウムチャネルが観察されると報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:5067-5071 (1996)）。
【０００４】
　ヤリイカの電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2(以前の名称（SQCC1）から命名法（Neuron 25: 533-535 (2000)）に従い変更した)、DDBJ accession No. D86600）は、視神経節からクローニングした（Biochem. Biophys. Res. Commun. 230:147-154 (1997)）。カルシウムチャネルの相同性比較によりLoCav2はジヒドロピリジン非感受性のP/Q-, N-またはR-型に属した。
【０００５】
　無脊椎動物において、他にはクラゲ（J. Biol. Chem. 273:22792-22799 (1998)）およびショウジョウバエ（J. Neurosci. 15:1132-1143 (1995), J. Neurosci. 16:7868-7879 (1996)）、イエバエ（FEBS Lett. 339: 189-194 (1994)）のカルシウムチャネルα1サブユニットがクローニングされている。クラゲのカルシウムチャネルはL型チャネルに属するが、調べた薬剤や毒には低い感受性を示すのみであり、ショウジョウバエとイエバエのカルシウムチャネルは、インビトロでの発現の報告はない。また、線虫のゲノム配列中に電位依存性カルシウムチャネルと相同性を持つ配列が報告されているが、インビトロでの発現の報告はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
　上記従来の知見から明らかなように、電位依存性カルシウムチャネルは、哺乳動物のみならず、無脊椎動物においても神経伝達の調節に重要な役割を果たしており、この無脊椎動物における電位依存性カルシウムチャネルに対し作用する薬剤が得られれば、この薬剤は、例えば、殺虫剤等の有害無脊椎動物に対する防除剤として使用可能である。本発明の課題は、無脊椎動物の電位依存性カルシウムチャネルに対する作用薬剤を、能率的かつ効果的にスクリーニングするための材料および方法を新たに提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
　本発明者は鋭意研究の結果、驚くべきことに、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）が、昆虫の電位依存性カルシウムチャネルを阻害するクモ毒PLTX-IIにより阻害されることを見いだした。そして、このことは、無脊椎動物の電位依存性カルシウムチャネルには共通の毒感受性を有することを示しており、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャンネα1サブユニット（LoCav2）が、無脊椎動物の電位依存性カルシウムチャネルに対する作用薬をスクリーニングする手段として有効であると確信し、本発明を完成するに至ったものである。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）に関するものである。
（１）ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質を含有することを特徴とする、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングするための材料。
（２）ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質、並びに電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび／または哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットを含有することを特徴とする無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングするための材料。
（３）ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質のｍＲＮＡを含有する細胞を用いることを特徴とする、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングするための材料。
（４）ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質、並びに電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび／または哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットの各ｍＲＮＡを含有する細胞を用いることを特徴とする、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングするための材料。
（５）細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である、（３）または（４）に記載の材料。
（６）ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）をコードする遺伝子、並びに電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび／または哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットの各ｍＲＮＡを含有してなる細胞。
（７）細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である、（６）に記載の細胞。
（８）ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質を含有するスクリーニング系において、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）の発現電流に対する被験物質の阻害活性及び／または活性化活性を指標として被験物質を選別すること特徴とする、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬のスクリーニング方法。
（９）ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）またはその変異タンパク質、並びに電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび／または哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットを含有するスクリーニング系において、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）の発現電流に対する被験物質の阻害活性または活性化活性を指標として被験物質を選別することを特徴とする、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【０００９】
従来、無脊椎動物のカルシウムチャネルに作用する薬剤のスクリーニングには、動物個体を使い、個体への影響をみる方法や、動物種毎に組織を取り出し神経筋接合部などの神経伝達を電気生理学的に測定し、その阻害効果を見る方法などが主であった。また、実験の度に個体を殺し組織を準備する必要があり、また、パッチクランプ法などの高度な電気生理学的方法を用いる必要があり、極めて非効率であった。
【００１０】
これに対して、本発明は、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニットLoCav2を用いるのみで、無脊椎動物一般の電位依存性カルシウムチャネルに作用する薬剤をスクリーニングすることを可能にするものであり、しかも後記する実施例に示すように、簡便な２電極電位固定法で十分であり、本発明によれば、簡便かつ非常に効率的な、無脊椎動物電位依存性カルシウムチャネルに作用薬剤のスクリーニング手段を提供できる。また、電位依存性カルシウムチャネルに作用する薬剤は、神経伝達を阻害し遮断するか、あるいは神経伝達を異常に活性化させて神経の異常興奮をもたらし、動物を死に至らしめる。したがって、本発明は、例えば、殺虫剤等の有害無脊椎動物に対する防除剤等の研究に大いに資するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
　本発明において使用するヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）は、前記したようにヤリイカの視神経節からクローニングされたポリペプチドであり、その製法の概略および詳細は、Biochem. Biophys. Res. Commun. 230:147-154(1997)により記載されている。このポリペプチドのアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列を配列番号１、２に示す。
【００１２】
　本発明は、上記したように、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）をコードする遺伝子をアフリカツメガエル卵母細胞中で発現させ、電気パルス刺激により生じる発現電流をクモ（Plectreutys tristesの毒腺から発見、J. Neurosci. 7:4195-4200 (1987)）のペプチド性毒であるPLTX-IIが阻害することを見いだした点に起因するものではあるが、この発現電流の阻害性は、他のクモのペプチド性毒であるω-agatoxin IVA（Agelenopsis aperetaの毒腺から発見、Nature 355:827-829 (1992))においても本発明者により観測されている。
【００１３】
　このPLTX-IIは、ショウジョウバエの神経筋接合部のシナプス前部にある電位依存性カルシウムチャネルを阻害することで知られているものである。PLTX-IIによる、ショウジョウバエの神経筋接合部のシナプス前部にある電位依存性カルシウムチャネル阻害活性については、Neuron 3:767-772 (1989), J. Neurosci. 7:4195-4200 (1987)に記載されている。
【００１４】
　一方、ω-agatoxin IVAについていうと、無脊椎動物において、ザリガニの神経細胞の電流の一部は、ω-conotoxin GVIAやL-typeチャネルを阻害する薬剤では阻害されないが、ω-agatoxin IVAにより阻害されることが知られている(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 4224-4228 (1994)、 J. physiol. (Lond.) 496, 347-361 (1996)、J. Neurophysiol. 77, 76-85 (1997)、J. Exp. Biol. 202, 429-440 (1999))。またω-Agatoxin IVAはヤリイカの巨大シナプス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 1689-1693 (1989))やジャイアントファイバーローブ(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5067-5071 (1996))やバッタ(Neurosci. Lett. 181, 113-116 (1994))のCa2+電流を阻害することが知られており、さらに、ゴキブリ(J. Neurophysiol. 77, 186-199 (1997))やアメフラシ(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 4771-4775 (1994))の神経細胞でω-agatoxin IVAが一部Ca2+電流を阻害することが知られている。このようにω-agatoxin IVAは、昆虫から軟体動物まで幅広い無脊椎動物の神経細胞に作用を持つことが知られている。
【００１５】
　上記したようにPLTX-IIおよびω-agatoxin IVAという２種の昆虫の電位依存性カルシウムチャネルを阻害する物質が、ともにヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）をも阻害することは、昆虫の電位依存性カルシウムチャネルとヤリイカの電位依存性カルシウムチャネル（LoCav2）には共通の毒感受性があることを示し、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）に対する作用物質は、少なくとも昆虫の電位依存性カルシウムチャネルに対しても作用することになる。また、上記２種の物質が、ヤリイカと昆虫というような、生物分類学上全く離れた無脊椎動物間の電位依存性カルシウムチャネルに共通の作用を有していたこと、および特にω-agatoxin IVAが、昆虫から軟体動物まで幅広い無脊椎動物の神経細胞に作用を有することをあわせみると、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）に対する作用物質は、無脊椎動物一般の電位依存性カルシウムチャネルにも作用する物質であるといえ、また、さらにいうと、昆虫と軟体動物間のみでなく、無脊椎動物一般の電位依存性カルシウムにおいては共通の物質感受性があるということを強く示唆する。
【００１６】
　他方、本発明のヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）は、例えば昆虫等の電位依存性カルシウムチャネルに比べ、インビトロで電流を発現させることができる点で有利である。昆虫や軟体動物を含めた無脊椎動物の電位依存性カルシウムチャネルの中で、cDNAがクローニングされているのは、ヤリイカとクラゲ、ショウジョウバエ、イエバエのものであるが、アフリカツメガエル卵母細胞発現系などのインビトロの系で発現に成功している報告があるのは、ヤリイカとクラゲのものの２つである。クラゲのものはL型のチャネルに属すると考えられているが、その薬理学的特性は不明瞭である。一方、ヤリイカのものはPLTX-IIにより阻害を受けることが明確でありその性質がよくわかっており、スクリーニングの結果の解釈が一義的である。この様にヤリイカのものを用いれば、作用を受けている分子種を明らかにしてスクリーニングを行っていくことが可能である。
【００１７】
　もちろん、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）を阻害する物質がすべて、無脊椎動物全部の電位依存性カルシウムチャネルに作用するものであるとはいえないが、このような物質は、昆虫その他の無脊椎動物の電位依存性カルシウムチャネルに作用する可能性は充分有し、本発明におけるヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）の使用は、少なくとも無脊椎動物の電位依存性カルシウムチャネルに作用する薬剤の１次スクリーニングの手段として有効である。また、無脊椎動物の電位依存性カルシウムチャネルに作用する薬剤を探索するには、現状のところ、無脊椎動物の個体毎に神経組織を取り出し、被験物質の各々について神経伝達を電気生理学に測定しなければならず、極めて非効率であり、本発明のような無脊椎動物に共通するスクリーニング手段は極めて簡便で有用な手段である。
　また、本発明においては、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）の変異タンパク質も使用可能である。本発明者が調製した該変異タンパク質のアミノ酸配列および対応する遺伝子ＤＮＡにおける塩基配列を配列表の配列番号３および４に示す。
【００１８】
　本発明においては、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）あるいはその変異タンパク質のｍＲＮＡを、細胞に導入し細胞中においてヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）を生成させ、この状態で被験物質の、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット発現電流に対する阻害活性または活性化活性を測定する。この場合は結合の有無だけでなく、阻害活性を持つのか活性化活性を持つのかが直接わかる点でより有利である。使用する細胞としては、例えばアフリカツメガエル卵母細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等があげられる。
【００１９】
　さらに、本発明のスクリーニングにおいては、上記ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）のみでなく、電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび／または哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットを共存させると、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）の発現電流量が多くなり、被験物質の阻害性検出の感度が向上する。すなわち、電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび／または哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットは、本発明のヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）の発現電流の増強剤として作用する。使用する上記電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットは、特に動物種に限定されないが、これには、たとえば、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニット（LoCavβ1a）、哺乳類電位依存性カルシウムチャネルβサブユニット（β１−４）等が挙げられ、β１a、β１ｂ、β２ａ、β２ｂあるいはβ２ｃ等のバリアントも含む。特に哺乳類のものを用いると、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）の電流発現までの時間が短く、より簡便である。
　また、哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットとしては、哺乳類骨格筋電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットが用いられるが、神経型のものでもよい。
　さらに、特にヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）に加え、電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットの三者を共存させると、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）の発現電流量は、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）単独の場合に比べ、発現電流量は数十倍に向上し、極めて有利である。
【００２０】
　なお、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニット（LoCavβ1a）は、ヤリイカ視神経節よりクローニングされ、データベースへの直接登録（DDBJ Accession No. AB069676）により知られている。そのアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号５および６に示す。また、哺乳類骨格筋電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットのうちウサギ由来のものも、Science 241, 1661-1664 (1988)により知られており、そのアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号７および８に示す。
【００２１】
　本発明においては、電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび／または哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットは、これらのｍＲＮＡを、上記ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）あるいはその変異タンパク質のｍＲＮＡとともに細胞中に導入させ、これらｍＲＮＡを含有する細胞中においてこれら３者のポリペプチドを生成させることにより、これら３者のポリペプチドを共存させてもよい。
　これらのｍＲＮＡは、その遺伝子ＤＮＡの非翻訳領域を削除したＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼを作用させて合成してもよいし、これらが存在する生体組織あるいは細胞から抽出により直接採取してもよい。
　また、本発明においては、上記細胞中において発現効率さらに高めるために、上記ｍＲＮＡにさらに他のＲＮＡ配列を付加せしめることができる。たとえば、上記ｍＲＮＡの５’、３’末端側にカエルβグロビンの５’、および３’側の非翻訳領域をそれぞれ付加すれば、このＲＮＡを導入したアフリカツメガエル卵母細胞において、上記ｍＲＮＡに対応するタンパク質の発現効率を高めることが可能となる。
　したがって、本発明において、ｍＲＮＡというとき、該ｍＲＮＡに加え、さらに発現効率を高めるための付加的なＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子をも含む。
【００２２】
　さらに、本発明において使用するヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）、電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットおよび哺乳類電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットは、上記文献に示される製法のみでなく、これらの遺伝子を用いて常法の遺伝子組み換え手段を用いて、大腸菌、枯草筋、酵母、培養細胞等を形質転換することにより大量生産が可能である。例えば、cDNAを発現ベクター（例えば、pcDNA3 (Invitrogen社) やpSD64 vector）にクローニングしておく。発現ベクターは、大腸菌由来、枯草菌由来、及び酵母由来のプラスミド、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等の動物ウイルス等が使用でき、機能性タンパク質の発現を行う宿主に応じて適宜選択される。例えばアフリカツメガエルで発現させる場合にはpSD64、動物培養細胞で発現させる場合にはpcDNA3等のベクターを使用することが好ましい。また、宿主に応じてSP6プロモーターやCMVプロモーター等の適当なプロモーターの制御下で発現されるように、発現ベクター中でプロモーターの下流に連結することが好ましい。宿主としては、例えばエシェリヒア属、バチルス属等の細菌、酵母、昆虫、動物細胞等、当該分野で公知のものがいずれも使用できるが、発現されるタンパク質の生理的機能を解析する目的のためには、アフリカツメガエル卵母細胞、培養細胞等の動物細胞を使用することが好ましい。
【００２３】
　また、上記においては主にこれらを含有するスクリーニング系において、電気パルス刺激により生じる発現電流の阻害性を測定する方法について示したが、ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）に対する発現電流の阻害性は、被験物質がヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）と結合することにより生ずるものであるから、上記発現電流の阻害性を測定する手法のみならず、例えばリガンドバインディングアッセイや分子間相互作用を検出するための装置（例えば、表面フラズモン共鳴測定装置(ビアコア社)）などを用いて結合活性を生化学的に計測に使用することやBHKなどの真核培養細胞へ導入しパッチクランプ法を適用することも可能であり、また、培養細胞を用いることによりチャネルを通して細胞内に流入するカルシウムを細胞内カルシウム蛍光指示薬（Fura2など）を用いて計測し、同時に多検体を高効率にスクリーニングする系を構築することも可能である。
【実施例】
【００２４】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこの実施例に特に限定されるものではない。また、特に記載の無い限りにおいて、遺伝子工学的手法の詳細は、"Molecular Cloning 2nd ed."（Sambrook,J., Fritsch,E.F., Maniatis,T. 著 Cold Spring Harvor Laboratory Press 1989年発刊）に記載の方法に従った。
【アフリカツメガエル卵母細胞発現系の構築】
【００２５】
　ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルa1サブユニットLoCav2（DDBJ accession No. D86600; Biochem. Biophys. Res. Commun. 230:147-154 (1997)）とヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルβサブユニット（LoCavβ1a、DDBJ accession No. AB069676）及びウサギ骨格筋電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニット（東京医科歯科大学田邊教授より供与されるウサギ骨格筋電位依存性カルシウムチャネルcDNAを含むプラスミドベクターpSPCA1（Nature 340, 230-233 (1989)）を使用）を使用した。LoCav2と LoCavβ1aのcDNAの非翻訳領域は削除され翻訳開始領域に共通する配列（CCACCATG: Nucleic Acid Res. 12:857-872 (1984)）に置き換えられた。
（１）LoCav2の5’側の非翻訳領域を削除するために次のプライマーを用いLoCav2 cDNAをテンプレートとしてＰＣＲを行った。上流プライマーとして5’-GCGGCCGCCACCATGAATACCTTCTCGGCTGACAC-3’を用いた。太文字は翻訳開始部位、イタリック文字は導入した翻訳開始領域に共通する配列、２重下線はプラスミドに組み込むために導入したNot Iサイトである。下流プライマーとして5’-CCATCCTTCCATCGTTACACATTG-3’を用いた。
（２）3’側の非翻訳領域を削除するために次のプライマーを用いLoCav2 cDNAをテンプレートとしてＰＣＲを行った。上流プライマーとして5’-ACGACAGGCATAGAAAACACAG-3’を用いた。下流プライマーとして5’-CTCGAGTCAACACCAGTCGTCATCCTCA-3’を用いた。太文字は転写終了部位、２重下線はプラスミドに組み込むために導入したXho Iサイトである。
（３）LoCavβ1aの5’および 3’の非翻訳領域を削除するために次のプライマーを用いた。上流プライマーとして5’-GGTACCACCATGCAGTCTCTTCTAGGA-3’を用いた。太文字は翻訳開始部位、イタリック文字は導入した翻訳開始領域に共通する配列、２重下線はプラスミドに組み込むために導入したKpn Iサイトである。下流プライマーとして5’-CTCGAGTTAAATATCTATACTGCC-3’を用いた。太文字は転写終了部位、２重下線はプラスミドに組み込むために導入したXho Iサイトである。この２つのプライマーを用いLoCavβ1a cDNAをテンプレートとしてPCRを行った。（１）の工程で得られたＰＣＲ産物をNot IおよびAge Iで消化し、pSD64TRベクター(pSP64T (Nucleic Acids Res. 12: 7057 (1984))にマルチクローニングサイトとカエルβグロビン遺伝子の5'及び3'非翻訳領域を加え、アフリカツメガエル卵母細胞での発現効率が上がるように改変されたベクター。T. Snutch博士より供給される。図１)のNot IサイトとLoCav2のAge IサイトにLigation High（東洋紡社）を用いて接続した。（２）の工程で得られたＰＣＲ産物をSac IIおよびXho Iで消化し、LoCav2のSac IIサイトとpSD64TRベクターのXho IサイトにLigation High（東洋紡社）を用いて接続し、5’および3’非翻訳領域を削除したLoCav2を組み込んだベクター、pSD64TR-LoCav2（図２）得た。（３）の工程で得られたＰＣＲ産物をKpn IとXho Iで消化し、pSD64TRベクターのKpn IサイトとXho IサイトにLigation High（東洋紡社）を用いて接続し、5’および3’非翻訳領域を削除したLoCavβ1aを組み込んだベクター、pSD64TR-LoCavβ1a（図３）得た。形質転換した大腸菌XL1Blue(Stratagene社)よりプラスミドを調製した(Wizard, Promega社)。LoCav2含むプラスミドはMlu I（本実験のために導入したサイト、図５）により、またLoCavβ1aを含むプラスミドは、Xba Iにより消化し線状化した。ウサギ骨格筋電位依存性カルシウムチャネルα2/δサブユニットを含むプラスミドは、Sal Iにより切断し線状化した。これら線状化したプラスミドをテンプレートとし、キャップアナログ（アンビオン社）を添加した反応液を用い、SP6 RNAポリメラーゼ（MEGA Script SP6 Kit; アンビオン社）によりキャップ構造を持つcRNAを合成し、アフリカツメガエル卵母細胞に注入するサンプルとした。
【００２６】
アフリカツメガエルは業者より購入した。成熟したメスのアフリカツメガエルをTricaine (0.5 g/l)を用いて麻酔し、腹腔より外科的にステージＶ−ＶＩの卵母細胞を採取した。採取した卵母細胞を、1 mg/ml のコラゲネース(S-1型、新田ゼラチン社)を含むMBS(-Ca2+)液中で３０分間処理し、濾胞細胞を除去した。濾胞細胞を除去した卵母細胞をMBS(-Ca2+)で１０分間６回洗浄し、コラゲネースを完全に洗い流した。翌日、ガラス針を用いて卵母細胞にｃRNAを注入した。注入したcRNAの濃度は、LoCav2: 1000ng/μl, α2/δ: 1000ng/μl, LoCavβ1a: 333ng/μlである。cRNAを注入した卵母細胞は５％ウマ血清を含むMBS(+Ca2+)液中で５日から１０日間培養した。
【発現電流の測定】
【００２７】
（１）発現した電流は、２本電極電位固定法にて測定した。電極はガラス電極を引き伸ばして作製し、電極内部を3M KClで満たした。電極抵抗が0.4-2MWである電極を使用した。テストプロトコールはソフトウェアpClamp8 (Axon Instruments社)を用いて作製した。発現した電流はOC-725C増幅器(Warner Instruments社)を用いて増幅し、DIGIDATA 1321 A/D変換機(Axon Instruments社)によりデジタル化しコンピュータに取り込んだ。卵母細胞は-80 mVに膜電位固定された。リーク電流はP/4 protocolによりオンラインで差し引いた。通常は、40 mM Ba(OH)2, 50 mM NaOH, 1 mM KOH, 0.5 mM Niflumic acid, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES, pH をmethanesulfonic acidで7.4に合わせてある溶液を測定溶液として用いた。ペプチド毒を使用する場合は、5 mM Ba(OH)2, 90 mM NaOH, 1 mM KOH, 0.5 mM Niflumic acid, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES, pHをmethanesulfonic acidで7.4に合わせてあり、毒の非特異的吸着を防ぐために0.1 mg/ml cytochrome c (Sigma社)を含む溶液を測定溶液として用いた。カルシウムによって活性化されるクロライド電流の混入を最小化するため、卵母細胞は電流測定前に、100 μMのBAPTA-AM (同仁堂社)を含むMBS(+)中で、少なくとも２時間インキュベーションした。
（２）LoCav2単独、並びにLoCav2にLoCavβ1aおよび／またはウサギ骨格筋α2/δサブユニットを組み合わせた場合のLoCav2の発現電流量を測定した。全てのデータは一匹のカエルから採取した卵母細胞を使用して測定したもので、ｃRNA注入後６日目に電流を測定した。測定においては膜電位を-80 mVに固定し100 msecの+20 mVへのパルスを与えて刺激した。結果を図４に示す。　　
　なお、データは平均 ± SEMで表している。例数 = 10である。
　これによれば、LoCav2単独、LoCav2とLoCavβ1a、または、LoCav2とα2/δでも電流は発現しているが、LoCav2、LoCavβ1aおよびウサギα2/δサブユニットの３者の組み合わせで、LoCav2の発現電流量は、数十倍になる。データは平均 ± SEM（標準誤差）で表している。例数 = 10。（３）膜電位を-80 mVに固定し、10 mV毎に増加させた刺激パルスを600 msec与え、アフリカツメガエル卵母細胞にて発現したLoCav2電流をトレースした。結果を図５に示す。なお、図５中のトレース上に示した数値は、与えたパルスの電圧値（ｍV）を表す。発現したLoCav2電流はほとんど不活性化しなかった。また、測定された電流を次ぎの式で計算し、電流電位相関を求めた。
式：-(Itest/Imax)、なお、Itestは発現電流、Imaxは最大発現電流を示す。このようにして規格化した電位電流関係によればLoCav2電流は-20 mV辺りで活性化を始め、20 mV付近で最大値を示したことから高閾値活性化型である(図６)。
【ＬｏＣａｖ２の発現電流に対する各種薬物の影響】
【００２８】
LoCav2発現電流に対する各種薬剤の影響を調べた。供試薬物はnifedipine, diltiazem, verapamil（以上、和光純薬工業社）、(-)BayK 8644（RBI社）, calcicludin, FS-2, ω-conotoxin SVIB, TaiCatoxin, ω-conotoxin GVIA, ω-conotoxin MVIIC, ω-agatoxin TK, FTX 3.3（以上、Alomone社）, ω-agatoxin IVA, SNX-482（ペプチド研究所）、PLTX-II（ペプチド研究所またはAlomone社）であり、これら薬物を測定液に溶解し、通常の測定液と置換することにより投与した。投与後５分から１０分後に、静止電位-80 mVから+20 mVへのステップパルスを100 msec与えた。例数 = 3-5。各薬剤の濃度と測定されたLoCav2発現電流との関係を図７に示す。
【００２９】
これによれば、LoCav2電流はL型チャネルの阻害剤として知られるnifedipine, diltiazem やverapamilで阻害されず、またL型チャネルの活性化剤の(-)BayK 8644に影響されなかった。LoCav2電流はまた、L型チャネルに対する阻害剤であるcalcicludine, FS-2, ω-conotoxin SVIBやTaiCatoxin, N型チャネルの阻害剤であるω-conotoxin GVIA, P/Q型チャネルの阻害剤であるω-conotoxin MVIIC, FTX-3.3やω-agatoxin TK、またはR型チャネルの阻害剤であるSNX-482によっても阻害されなかった。LoCav2電流はクモの２種のぺプチド性毒によってのみ阻害された。ω-agatoxin IVAはAgelenopsis apertaの毒腺から発見された毒で、LoCav2電流を10 μMで35 %阻害した。また、PLTX-IIはPlectreutys tristesの毒腺から発見された毒であり、このPLTX-IIがLoCav2電流を10 nMで45 %、1 μMで85 %阻害した。このPLTX-IIは、ショウジョウバエの神経筋接合部のシナプス前部にある電位依存性カルシウムチャネルを阻害することで知られている(Neuron 3:767-772 (1989), J. Neurosci. 7:4195-4200 (1987))。LoCav2電流がPLTX-IIによって阻害されたことから、LoCav2を無脊椎動物シナプス前部の電位依存性カルシウムチャネル作用薬をスクリーニングする試薬として使用できることが明らかとなった。
【ＬｏＣａｖ２遺伝子を発現している組織】
【００３０】
ヤリイカ電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット（LoCav2）遺伝子がどの組織で発現しているのかを、定量的RT-PCR法(Nucl. Acids Res. 20, 4939-4945(1992))を適用することにより検討した。ヤリイカより視神経節、星状神経節、外套筋、心臓、鰓、鰓心臓、胃、肝臓を摘出し、Trizol試薬（インビロトジェン社）を用いて全RNAを抽出した。各5μｇの全RNAを用いランダムプライマーにより一本鎖cDNAを逆転写酵素RevertraAce(東洋紡社)を使用して作製しPCR反応の鋳型とした。定量的RT-PCRの内部標準遺伝子としてβアクチン遺伝子を用いた。RT-PCRに用いたプライマー配列は以下の様である。LoCav2遺伝子の増幅には、上流プライマー；5’-ATGCAGTCTCTTCTAGGA-3’、下流プライマー；5’-AGTAGGTGGGGTAATGTTTG-3’、βアクチン遺伝子の増幅には別種のヤリイカ(Loligo pealei)のβアクチンの遺伝子配列(Mol. Biol. Evol. 17, 1353-1370)を参考に設計した上流プライマー；5’-ACCCCAAGGCCAACAG-3’、下流プライマー;5’-GAATCTCTCGTTACCAA-3’で反応を行った。PCR反応はDNAサーマルサイクラーPTC-200（エムジェーリサーチ社）にて行った。反応サイクルは、熱変性９４℃、３０秒、アニーリング５５℃、１分、伸長反応７２℃、１分である。PCR反応により増幅されたバンドを図８に示す。
定量化の為、βアクチン遺伝子の増幅では１３サイクルから２１サイクル、LoCav2遺伝子の増幅では１８サイクルから３２サイクルの間で（組織により異なる）、毎回一定量の反応液をサンプリングした。サンプリングしたPCR産物は１．２％の寒天ゲルによる電気泳動法で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。紫外線照射によるバンドの輝度の定量化をGel Doc 1000 (バイオラド社)と解析ソフトウエアMultiAnalyst（バイオラド社）を用いて行った。各サンプルのバンドの輝度を片対数グラフにプロットし直線を示す部分に対し指数関数による回帰計算を行い、定数項を遺伝子発現量の初期値と考え、LoCav2の定数項を同組織のβアクチンの定数項に対する割合で表し定量化した（図９）。図９のNDは、増幅量が極端に少なく定量化できなかったことを示す。
【００３１】
これによれば、LoCav2遺伝子の転写産物は主に視神経節と星状神経節に発現していることがわかる。外套筋、鰓、鰓心臓、胃でも１パーセント以下ながら発現が認められるが、全RNA調製時に使用した組織に神経組織が混入していた可能性は否定できない。心臓、肝臓ではバンドが薄く認められるが、薄過ぎて定量化できなかったことから非特異的増幅の可能性が考えられる。これらの結果からLoCav2は主に神経系に発現し、外套筋、鰓、胃にも発現している可能性のある電位依存性カルシウムチャネルであると考えられる。ノーザンブロットの結果も主に神経系に発現していると報告されており(Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 147-154 (1997))、またLoCav2タンパク質は、視神経節のシナプス部位に存在するという免疫組織化学の報告(Neuroreport 13, 2389-2393 (2002))もあることから、LoCav2はシナプス部に存在する電位依存性カルシウムチャネルと考えられ、神経筋接合部のシナプス前部の電位依存性カルシウムチャネルを阻害するPLTX-IIに感受性があるという薬理学的知見と一致する結果である。これらのことから、LoCav2は主に神経系で発現し、シナプス前部において神経伝達物質の放出等に関与していると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】プラスミドベクターpSD64TRの構造を示す図である。
【図２】LoCav2を組み込んだプラスミドベクターpSD64TR-LoCav2の構造を示す図である。
【図３】LoCavβ1aを組み込んだプラスミドベクターpSD64TR-LoCavβ1aの構造を示す図である。
【図４】LoCav2単独、並びにLoCav2にLoCavβ1aおよび／またはウサギ骨格筋α2/δサブユニットを組み合わせた場合のLoCav2の発現電流量を測定した結果を示す図である。
【図５】膜電位を-80 mVに固定し、10 mV毎に増加させた刺激パルスを600 msec与え、アフリカツメガエル卵母細胞にて発現したLoCav2電流をトレースした結果を示す図である。
【図６】LoCav2電流の電流電位相関を示す図である。
【図７】各種薬剤のLoCav2発現電流に対する影響を測定した結果を示す図である。
【図８】ヤリイカの各組織におけるLoCav2遺伝子の発現状態を調べるため、各組織からの抽出全RNAを逆転写したｃDNAを鋳型とするとともに、LoCav2遺伝子およびβアクチン遺伝子由来のDNA断片をプライマーとして、RT-PCRを行った結果得られたバンドの写真である。
【図９】図８に示されるバンドの輝度にもとづき、LoCav2遺伝子を定量化したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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