(57)【要約】【解決手段】Ｉｌｅ−Ｈｉｓ、Ｉｌｅ−ＡｒｇまたはＩｌｅ−Ｌｙｓのアミノ酸配列を有するジペプチドまたはその塩及びこれを含有するアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。【効果】親水性で苦味がなく、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有し、高血圧症の予防・治療剤、飲食品に有用である。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉｌｅ−Ｈｉｓ、Ｉｌｅ−ＡｒｇまたはＩｌｅ−Ｌｙｓのアミノ酸配列を有するジペプチドまたはその塩。
【請求項２】
請求項１記載のジペプチドまたはその塩を有効成分とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載のジペプチドまたはその塩を有効成分とする高血圧症予防・治療剤。
【請求項４】
請求項１記載のジペプチドまたはその塩を含有する飲食品。
【請求項５】
飲食品が発酵乳である請求項４記載の飲食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なジペプチドに関し、更に詳しくは、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有する新規なジペプチド及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）は、生体内においてデカペプチドであるアンジオテンシンＩを切断し、オクタペプチドであるアンジオテンシンＩＩを生成する酵素である。このアンジオテンシンＩＩは、強力な血管収縮活性を有し、また、血管拡張作用を有するブラジキニンの生成を抑制することから、ＡＣＥ活性を抑制することは、即ち、血管の収縮を抑制する方向へシフトすることになり、高い血圧を下げるまたは血圧上昇を抑制する。実際、カプトプリルを始めとする強力なＡＣＥ阻害活性を持つ複数の合成ペプチドが医薬品に応用され（例えば、特許文献１参照。）、高血圧症の治療目的で医療現場で汎用されている。しかし、医薬品であることは同時にその作用が強いことをも意味し、一定の頻度で副作用の出ることは避けられない。
【０００３】
一方、食品由来の蛋白分解物（例えば、乳、大豆、魚等由来蛋白の発酵による分解、酵素消化または化学的分解したもの）のなかで、ある種のアミノ酸配列をもつペプチドが、ＡＣＥ阻害活性を有することが見出され（例えば、特許文献２参照。）、食品への応用が図られている。これらは、食品由来ということからも長期摂取による安全性が期待でき、いわゆる境界域の高血圧患者に対して、その予防効果を得る目的で継続摂取が可能という利点がある。しかし、これらのペプチドは味の点で苦味を有し、利用においては制限があった。また、これらペプチドは通常疎水性ペプチドであって、食品への応用においては自ずと制限があった。
【０００４】
【特許文献１】
特開平２−６２８２８号公報
【特許文献２】
特開平３−１２０２２５号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は長期間にわたって摂取しても安全であり、かつ苦味のないＡＣＥ阻害活性物質を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を行った結果、特定の親水性ジペプチドが苦味がなくＡＣＥ阻害活性を有し、高血圧症の予防・治療剤及び飲食品に有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明はＩｌｅ−Ｈｉｓ、Ｉｌｅ−ＡｒｇまたはＩｌｅ−Ｌｙｓのアミノ酸配列を有するジペプチドまたはその塩を提供するものである。
また、本発明はこれらのジペプチドまたはその塩を有効成分とするアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤及び高血圧症予防・治療剤を提供するものである。
更に、本発明はこれらのジペプチドまたはその塩を含有する飲食品を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のジペプチドまたはその塩は、該当するアミノ酸を基に通常の有機合成法で調製される。
例えば、本発明のジペプチドは、次式（１）
【０００９】
【化１】
2004099552.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｒ１はウレタン型またはアシル型のアミノ基の保護基、Ｉｌｅはイソロイシン残基を示す）
で表わされるアミノ保護イソロイシン誘導体と、次式（２）
【００１１】
【化２】
2004099552.tif 000003
【００１２】
（式中、ＸはＨｉｓ（ヒスチジン残基）、Ａｒｇ（アルギニン残基）またはＬｙｓ（リジン残基）、Ｒ２は水素原子またはウレタン型、アシル型もしくはアルキル型等のアミノ酸側鎖保護基、Ｒ３は水素原子、カルボキシル基の保護基または固相合成に使用されるレジンの結合を示す）
で表わされるアミノ酸誘導体を脱水縮合し、次いで保護基を脱保護して調製される。
【００１３】
式（１）の保護基Ｒ１は酸、塩基または接触還元にて脱離可能な保護基である。Ｒ１のうち、ウレタン型アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル基、β−（ｐ−トルエンスルホニル）エトキシカルボニル基等が、またアシル型アミノ基の保護基としては、ベンゾイル基、アセチル基、ホルミル基等が挙げられる。Ｒ１としてはｔ−ブトキシカルボニル基が特に好ましい。
【００１４】
式（２）のアミノ酸側鎖保護基Ｒ２は接触還元、酸、塩基またはその他の試薬によって脱離可能なウレタン型、アシル型、アルキル型等の保護基である。Ｒ２のうち、ウレタン型またはアシル型保護基としては、Ｒ１と同じ保護基が挙げられる。Ｒ２のうち、アルキル型保護基としてはトリフェニルメチル基等が挙げられる。
【００１５】
Ｒ３としては、メチル基、エチル基等の低級アルキル基やベンジル基、またはそれらの誘導体が挙げられる。その誘導体としては、メトキシメチル基、クロロベンジル基、メトキシベンジル基が好ましい。Ｒ３は固相合成に使用されるレジンとの結合であってもよい。レジンとしては、例えば、ヒドロキシメチルフェニル−レジン、ヒドロキシメチルフェノキシアセチルノルロイシルクロスリンクトエトキシレートアクリレート−レジン等が挙げられる。
【００１６】
式（１）と式（２）の化合物の脱水縮合反応は、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジ−２−ピリジルカルボネート、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）等の縮合剤を用いるか、またはｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド等の活性エステルを経由することによって行うのが好ましい。得られたジペプチド誘導体は、常法によって各保護基を別々にまたは同時に脱離することにより所望のジペプチドに変換される。
【００１７】
また、本発明のジペプチドの塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩及び酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、ペプチドを構成するアミノ酸はＬ体が好ましい。
【００１８】
本発明のジペプチドは、また、当該アミノ酸配列を有する天然蛋白質を基質として、発酵によってまたは酵素分解によっても得ることができる。すなわち、獣乳蛋白、特に牛乳蛋白を基質とし、乳酸菌、ビフィズス菌による発酵によって得ることができる。得られた培養液をジペプチド含有組成物としてそのまま利用することもできるが、培養によって得た当該ジペプチドは、その含量が高くないため、簡単な精製操作、すなわち、溶媒留去による濃縮や吸着と溶出による組み合わせによってジペプチド濃度を高くすることが好ましい。また、発酵によって得た本発明のジペプチドは、得られた培養液をろ過や遠心分離で菌体及び不溶性カゼインを除去後、逆相系の樹脂を用い、かつ溶出液に水を用いただけで、容易に他の疎水性ペプチドまたは蛋白と分離が可能であり、かつそのまま必要な程度濃縮して使用することができる。
【００１９】
かくして調製された本発明のジペプチド及びその塩は、親水性で苦味のないものである。
【００２０】
本発明のジペプチドまたはその塩の使用量は特に制限されないが、穏やかな降圧作用を有し、かつ経済性が良好である点から、ジペプチドとして１〜１，０００ｍｇ／日／ヒトであるのが好ましい。
【００２１】
本発明のジペプチドまたはその塩をＡＣＥ阻害剤または高血圧症予防・治療剤として用いる場合には、常法に従って薬学的に許容される担体とともに種々の剤型の医薬組成物とすることができる。例えば、経口用固形製剤を調製する場合には、上記組成物に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものを用いればよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、硅酸等を；結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を；崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を；滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を；矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
【００２２】
経口用液体製剤を調製する場合は、本発明のジペプチドまたはその塩に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００２３】
また、本発明のジペプチドまたはその塩は、飲食品として用いることも可能である。ここで好ましい飲食品としては、発酵乳、果汁加工飲料、栄養ドリンク、クッキー、キャンディー、タブレット食品等が例示され、特に種々の生理効果を有し、健康に寄与する食品として長く親しまれてきた発酵乳とすれば、風味が良く降圧効果も高いため好ましい。なお飲食品には動物の飼料も含まれる。
【００２４】
また、飲食品の製造に際しては、その他の食品素材、すなわち各種糖質や乳化剤、増粘剤、甘味料、酸味料、果汁等を適宜添加することができる。具体的には、蔗糖、異性化糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール類、アスパルテーム、ステビア、アセスルフォムカリウム、スクラロース等の高甘味度甘味料、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、カラギーナン、キサンタンガム、グァーガム、ペクチン、ローカストビーンガム等の増粘（安定）剤、クエン酸、乳酸、リンゴ酸等の酸味料、レモン果汁、オレンジ果汁、ベリー系果汁等の果汁類等が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等のビタミン類やカルシウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類等を添加することが可能である。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
参考例　Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＮＳｕの合成
ｔ−ブトキシカルボニル−Ｉｌｅ−ＯＨ　１２．２ｇ（５０ｍｍｏｌ）を１ｍｏｌ／ＬＮ−ヒドロキシサクシイミド（Ｈ−ＯＮＳｕ）のジクロルメタン溶液５０ｍＬ（５０ｍｍｏｌ）中に溶解し−５℃に冷却した。次いで、０．５ｍｏｌ／Ｌジシクロヘキシルカルボジイミドのジクロルメタン溶液１００ｍＬを加え、そのまま−５℃で１時間反応させた後、室温において一夜反応させた。この間、反応液のｐＨを中性付近に維持するために適時トリエチルアミンを添加した。析出したジシクロヘキシル尿素をろ別し、ジクロルメタンを減圧留去してオイル状のｔ−ブトキシカルボニルイソロイシル−Ｎ−ヒドロキシサクシイミド（Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＮＳｕ）を得た。このＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＮＳｕはジクロルメタン５０ｍＬに再溶解し以降の反応に用いた。
【００２７】
実施例１　Ｈ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−ＯＨ（イソロイシルヒスチジン）の合成
Ｈ−Ｈｉｓ−ＯＣＨ３・２ＨＣｌ　２ｇ（８ｍｍｏｌ）をジクロルメタン３０ｍＬに懸濁し、トリエチルアミン８ｍｍｏｌを加えて溶解した後、参考例で調製したＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＮＳｕのジクロルメタン溶液８ｍＬを加え、室温で一夜撹拌した。この間、反応液のｐＨを中性付近に維持するために適時トリエチルアミンを添加した。ジクロルメタンを減圧留去後、酢酸エチル２００ｍＬを加えて溶解し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、５重量％重曹水、飽和食塩水にて洗浄した後、硫酸ナトリウムにて乾燥後、次いで酢酸エチルを減圧留去した。メタノール２０ｍＬに再溶解し、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム４ｍＬを加えてメチルエステルをケン化して脱保護した。更に、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸で中和後、メタノールを減圧留去後酢酸エチル２００ｍＬを加えて溶解し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、飽和食塩水にて洗浄した後、硫酸ナトリウムにて乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。これを氷冷後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２０ｍＬを加えてそのまま１５分間撹拌した。更に室温で１時間撹拌してｔ−ブトキシカルボニル基を脱保護した。減圧留去によりジクロルメタンとトリフルオロ酢酸を取り除き、残ったオイル状残渣に冷却したエチルエーテル２００ｍＬを加えて固化させ、減圧ろ過によって目的物Ｈ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−ＯＨ・ＴＦＡ０．１６ｇを得た。
【００２８】
実施例２　Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−ＯＨ（イソロイシルリジン）の合成
Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ　１ｇ（４ｍｍｏｌ）をジクロルメタン３０ｍＬに溶解し、参考例で調製したＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＮＳｕのジクロルメタン溶液８ｍＬを加え、室温で一夜撹拌した。この間、反応液のｐＨを中性付近に維持するために適時トリエチルアミンを添加した。ジクロルメタンを減圧留去後、酢酸エチル２００ｍＬを加えて溶解し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、飽和食塩水にて洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去してオイル状残渣を得た。これを氷冷後、トリフルオロ酢酸２０ｍＬを加えてそのまま１５分間撹拌した後、更に室温で１時間撹拌してｔ−ブトキシカルボニル基を脱保護した。減圧留去によりジクロルメタンとトリフルオロ酢酸を取り除き、残ったオイル状残渣に冷却したエチルエーテル２００ｍＬを加えて固化させ、減圧ろ過により目的物Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−ＯＨ・２ＴＦＡ　０．２７ｇを得た。
【００２９】
実施例３　Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−ＯＨ（イソロイシルアルギニン）の合成
Ｈ−Ａｒｇ−ＯＣ２Ｈ５・２ＨＣｌ　５ｇ（１８ｍｍｏｌ）をジクロルメタン１５ｍＬに懸濁し、トリエチルアミン１８ｍｍｏｌを加えて溶解した後、参考例で調製したＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＮＳｕのジクロルメタン溶液１８ｍＬを加え、室温で一夜撹拌した。この間、反応液のｐＨを中性付近に維持するために適時トリエチルアミンを添加した。ジクロルメタンを減圧留去後、酢酸エチル２００ｍＬを加えて溶解し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、飽和食塩水にて洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥後、酢酸エチルを減圧留去してオイル状の残渣を得た。メタノール２０ｍＬに再溶解し、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム４ｍＬを加えて、エチルエステルをケン化して脱保護した。更に０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸で中和後、メタノールを減圧留去後酢酸エチル２００ｍＬを加えて溶解し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、飽和食塩水にて洗浄した後、硫酸ナトリウムにて乾燥後、酢酸エチルを減圧留去した。これを氷冷後、トリフルオロ酢酸２０ｍＬを加えそのまま１５分間撹拌した。更に室温で１時間撹拌しｔ−ブトキシカルボニル基を脱保護した。減圧留去によりジクロルメタンとトリフルオロ酢酸を取り除き、残ったオイル状残渣に冷却したエチルエーテル２００ｍＬを加えて固化させ、減圧ろ過により目的物Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−ＯＨ・２ＴＦＡ　０．２１ｇを得た。
【００３０】
実施例４　ＡＣＥ阻害活性
実施例１〜３で調製したジペプチドのＡＣＥ阻害活性を測定した結果を表１に示す。
【００３１】
ＡＣＥ阻害活性の測定法
ＡＣＥ阻害活性は、クッシュマンらの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　２０，　１６３７−１６４８，（１９７１）］に準じ、生物化学実験法３８［川岸舜郎編、学会出版センター（１９９６）］及び江藤らの方法［日本栄養・食糧学会誌、５２，　３０１−３０６，（１９９９）］を参考に若干修正した次法により測定した。
測定用試料または対照液（精製水）０．０８ｍＬに、０．３ｍｏｌ／Ｌ　塩化ナトリウム含有０．２ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）で調製した５ｍｍｏｌ／Ｌヒプリルヒスチジルロイシン溶液０．２ｍＬを加えた後、２ｍＵ　ＡＣＥを含んだ０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．０２ｍＬを加え、３７℃で３０分間反応させた。１ｍｏｌ／Ｌ塩酸０．２５ｍＬを添加して反応を停止させ、反応液に酢酸エチル１．７ｍＬを混和して２０秒間振盪する。遠心分離（３，０００ｒ／ｍｉｎ，　１０ｍｉｎ）後、酢酸エチル層を１．４ｍＬ分取し、ブロックヒーター上で蒸発乾固（１４０℃，　２０ｍｉｎ）させた後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液１．５ｍＬに溶解する。塩化ナトリウム溶液中のヒプリル酸の紫外部吸収を２２８ｎｍで測定し、得られた吸光度から下記の式よりＡＣＥ阻害率を求めた。
【００３２】
ＡＣＥ阻害率（％）＝［（Ｂ−Ｄ）／（Ａ−Ｃ）］×１００
【００３３】
Ａ：水を酵素と基質で反応させた時の吸光度
Ｂ：試料を酵素と基質で反応させた時の吸光度
Ｃ：水と基質のみで反応させ、反応停止後、酵素を添加した時の吸光度
Ｄ：試料と基質のみで反応させ、反応停止後、酵素を添加した時の吸光度
測定試料の濃度を複数取って各々ＡＣＥ阻害活性を測定し、得られた値からＡＣＥ活性を５０％阻害する試料濃度を求め、これをＩＣ５０値とした。
【００３４】
【表１】
2004099552.tif 000004
【００３５】
実施例５　発酵によるジペプチドの調製
加熱殺菌した３０重量％脱脂乳溶液１Ｌに、ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３６６）、ラクトコッカス・ラクティスＹＩＴ２０２７（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６２２４）、ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２０３７（ＡＴＣＣ　１９２５８）及びラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシズ・ブルガリクスＹＩＴ０１８１（ＡＴＣＣ　１１８４２）菌株を接種し、３０℃で３日間培養した。培養液を遠心分離して菌体及び不溶性カゼインを除き、培養上清０．８Ｌを得た。そのうち１０ｍＬをメタノール及びイオン交換水にてコンディショニングした固相抽出用逆相系カラム（ＳＰＥカラム　Ｂｏｎｄ　Ｅｌｕｔｅ　Ｃ１８ｍ　ＶＡＲＩＡＮ社）に通し、更にイオン交換水７０ｍＬを通液した。通過液を集め、濃縮後、親水性化合物用ＯＤＳカラム（ダイソーパックＯＤＳ−ＢＰ）にて、移動相に水を用いてクロマトグラフィーを行い、０．５ｍＬずつ分取した。各画分のＡＣＥ阻害活性を測定し、活性を示した二つの画分のアミノ酸シークエンスを行った結果、それぞれよりイソロイシルヒスチジン及びイソロイシルリジンが同定された。各々の収量は約２μｇ／ｍＬ及び２５μｇ／ｍＬであった。
【００３６】
実施例６　発酵乳
実施例５で得られた培養液１Ｌをホモジナイザーで均質化し、これに殺菌した２０重量％ショ糖溶液を等量混合した。更に適量の香料を混合、撹拌し、ポリスチレン容器に充填して発酵乳製品を製造した。この発酵乳製品をパネラー５名で官能評価したところ、風味は非常に良好であった。
また、菌株としてストレプトコッカス・サーモ　フィルスＹＩＴ２１０９とラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０３１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３５９）を用いる以外は、実施例５と同様に発酵乳を調製した。（この発酵乳中にイソロイシルヒスチジン、イソロイシルアルギニン及びイソロイシルリジンは同定されなかった。）この発酵乳食品に疎水ペプチドであるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ（カゼイン由来）を３０μｇ／ｍＬ添加し、上記と同様に官能評価したところ、好ましくない苦味が発現し、風味の低下が感じられた。
【００３７】
【発明の効果】
本発明のジペプチド及びその塩は、親水性で苦味がなく、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有し、高血圧症の予防・治療剤、飲食品に有用である。