(57)【要約】      （修正有）【課題】ブタの品種を相互に識別する方法の提供。【解決手段】ブタのゲノムＤＮＡについて下記（１）と、（２）及び／又は（３）との組み合わせからなるアレルの検出を行い、その結果に基づいてブタの品種を特定することを特徴とする、ブタの品種の識別方法：（１）ＭＣ１Ｒ遺伝子上の、（ｉ）特定のＤＮＡ配列の塩基番号２０２６〜２０２７の位置に存在する連続した２塩基の挿入若しくは非挿入であるアレル、（ｉｉ）特定のＤＮＡ配列の塩基番号２２７０の位置に存在する塩基Ｔ若しくはＣであるアレル、及び（ｉｉｉ）特定のＤＮＡ配列の塩基番号２６９２の位置に存在する塩基Ｇ若しくはＡであるアレル；（２）ＫＩＴ遺伝子上の特定のＤＮＡ配列の塩基番号１３１３の位置に存在する塩基Ｇ若しくはＡであるアレル；（３）ＫＩＴ遺伝子上のＤＮＡ配列の塩基番号３８８４〜３８８７の位置に存在する連続した４塩基の欠失若しくは非欠失であるアレル。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタのゲノムＤＮＡについて下記（１）と、（２）及び／又は（３）との組み合わせからなるアレルの検出を行い、その結果に基づいてブタの品種を特定することを特徴とする、ブタの品種の識別方法：
（１）  ＭＣ１Ｒ遺伝子上の、
（ｉ）  配列番号１に示す塩基番号２０２６〜２０２７の位置に存在する連続した２塩基の挿入若しくは非挿入であるアレル、
（ｉｉ）  同塩基番号２２７０の位置に存在する塩基Ｔ若しくはＣであるアレル、及び
（ｉｉｉ）  同塩基番号２６９２の位置に存在する塩基Ｇ若しくはＡであるアレル；
（２）  ＫＩＴ遺伝子上の、配列番号５７に示す塩基番号１３１３の位置に存在する塩基Ｇ若しくはＡであるアレル；
（３）  ＫＩＴ遺伝子上の、配列番号５７に示す塩基番号３８８４〜３８８７の位置に存在する連続した４塩基の欠失若しくは非欠失であるアレル。
【請求項２】
次の（４）のアレルを検出することをさらに含む、請求項１記載の方法：
（４）  ＭＣ１Ｒ遺伝子の上流領域の、配列番号１に示す塩基番号２２１〜２７９の位置に存在する連続した７塩基若しくは２２塩基の挿入又は欠失であるアレル。
【請求項３】
ブタの品種が、メイシャン種、デュロック種、ハンプシャー種、白色種及びバークシャー種、並びにそれらのうちの２種以上を用いた交雑種である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
検出が、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＦＬＰ法、及びＤＮＡチップを用いる方法からなる群より選ばれる一つまたは二つ以上の方法を用いて行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
検出が、（１）−（ｉ）のアレルについてはＰＣＲ−ＦＬＰ法、（１）−（ｉｉ）のアレルについては制限酵素ＡｃｉＩを用いるＲＦＬＰ法、（１）−（ｉｉｉ）のアレルについては制限酵素ＨｈａＩを用いるＲＦＬＰ法、（２）のアレルについては制限酵素ＮｌａＩＩＩを用いるＲＦＬＰ法、（３）のアレルについてはＰＣＲ−ＦＬＰ法、を用いて行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
下記（１）と、（２）及び／又は（３）とを含む、ブタの品種識別用の試薬又はキット：
（１）  配列番号６及び７に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマーと、
配列番号８及び９に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー、及び制限酵素ＡｃｉＩと、
配列番号１０及び１１に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー、及び制限酵素ＨｈａＩと、
の組み合わせ；
（２）  配列番号１２及び１３に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー、並びに制限酵素ＮｌａＩＩＩ；
（３）  配列番号１４及び１５に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項７】
下記（１）と、（２）及び／又は（３）との組み合わせを含む、オリゴヌクレオチド又はその標識物のセット：
（１）  配列番号１に示す塩基番号２０２６〜２０２７の位置に存在する塩基を含む、配列番号１〜４に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物と、
配列番号１に示す塩基番号２０２６〜２０２７の位置に存在する塩基を含む、配列番号５に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物と、
配列番号１に示す塩基番号２２７０の位置に存在する塩基を含む、配列番号２に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物と、
配列番号１に示す塩基番号２６９２の位置に存在する塩基を含む、配列番号３に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物と、
の組み合わせ；
（２）  配列番号５７に示す塩基番号１３１３の塩基Ｇが塩基Ａに置換されている、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列、若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物；
（３）  配列番号５７に示す塩基番号３８８４〜３８８７の塩基配列ＡＧＴＴが欠失している、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列、若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物。
【請求項８】
下記（１）〜（４）からなる群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物をさらに含む、請求項７記載のセット。
（１）  配列番号１に示す塩基番号２２７０の位置に存在する塩基を含む、配列番号３〜５に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物；
（２）  配列番号１に示す塩基番号２６９２の位置に存在する塩基を含む、配列番号１、２、４若しくは５に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物；
（３）  配列番号５７に示す塩基番号１３１３の塩基Ｇが塩基Ａに置換されている、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物、及び
（４）  配列番号５７に示す塩基番号３８８４〜３８８７の塩基配列ＡＧＴＴを含む、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物。
【請求項９】
配列番号１６〜３５に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチド又はその標識物のセット。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド又はその標識物のセットを固定化した固相担体。
【請求項１１】
下記（１）及び／又は（２）を含む、ブタの品種識別用の試薬又はキット：
（１）  請求項１０記載の固相担体
（２）  配列番号３６〜４５に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマーのセット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブタの品種の識別方法及びブタの品種の識別用ＤＮＡチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在生産されているブタ肉は、大ヨークシャー種又はランドレース種（いずれも白色種）と、デュロック種（褐色種）とを用いた三元交雑により得られるものが主流である。
【０００３】
一方、市場では黒ブタ肉としてバークシャー種の肉が販売されている。バークシャー種を代表とする黒ブタは、産子数が少なく、肥育に時間がかかるが、その肉は白色種（大ヨークシャー種及びランドレース種）よりも美味とされていることから、黒ブタ肉は他のブタ肉と比べて高値で取り引きされている。
【０００４】
しかしこの高値に便乗して、近年では、黒ブタ肉として販売されているものの中に、白色ブタと黒ブタの交雑により得た肉や、全く黒ブタを交雑していない豚肉などが出回っている。そこで、黒ブタ品種を識別する手法が求められている。
【０００５】
ところで近年では、生物のもつ遺伝子の多型と遺伝的形質とをを関連付ける研究が盛んに行われている。
例えば、ある遺伝子の遺伝子多型を調べる方法として、制限酵素断片長多型（以下、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ：ＲＦＬＰと呼ぶ）による解析技術が知られている。ＲＦＬＰは、生物の個体間で遺伝子の構造の異なる部位に制限酵素部位が存在すると、その制限酵素による切断断片のサイズが異なることを利用してその遺伝子の多型を解析するものである。多型を示すＤＮＡ領域が特定されている場合には、その領域をマーカーとすることにより、ある単離遺伝子が由来する個体を識別することも可能である。
【０００６】
同様の多型解析法として、塩基配列中にギャップ（挿入又は欠失）が存在するとき、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をそのまま電気泳動することにより、その増幅断片長の違いからギャップの存在を検出する方法も知られている（以下、ＰＣＲ  ｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：  ＰＣＲ−ＦＬＰ法と呼ぶ）。多型を示すＤＮＡ領域が特定されている場合には、その領域をマーカーとして上記のような多型解析法を用いることにより、単離遺伝子が由来する個体を識別することも可能である。
【０００７】
従来、多型解析法を用いるブタの識別法としては、ブタ遺伝子の制限断片長多型を利用してブタをいくつかの品種グループに分類する方法が知られている（特許文献１を参照）。またブタの外観の表現型と関連する遺伝子、例えば皮膚の色に関わるＭＣ１Ｒ遺伝子及び毛色に関わるＫＩＴ遺伝子について、複数の挿入／欠失多型が知られている（例えば、特許文献１〜３、並びに非特許文献１及び２を参照）。
【０００８】
ところで最近、ＤＮＡチップを用いたＤＮＡ多型解析も可能となった。ＤＮＡチップは、シリコンやガラスの基板上に既知の塩基配列を有するＤＮＡ（プローブＤＮＡ）をスポット状に貼り付けたものである。このガラス上に、蛍光色素等でラベルしたターゲットＤＮＡ（被検体のＤＮＡ）を流し込み、該ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせ、各スポットについて測定される蛍光強度の違いにより遺伝子の多型を特定する。
【０００９】
このＤＮＡチップにより、ＳＮＰ（一塩基多型）解析を行うことが可能となった。つまり、完全に相補的な配列のターゲットＤＮＡと、１塩基が異なるターゲットＤＮＡ（すなわちＳＮＰを有する）とでは、チップ上のプローブＤＮＡに対するハイブリダイゼーション効率が異なるため、蛍光強度の差としてＳＮＰの存在を検出することができる。このＳＮＰの検出法を用いると、同様に被検体を識別することが可能である。
【００１０】
【特許文献１】
特開２０００−３５０５８６号公報
【特許文献２】
特表平１１−５１４２１２号公報
【特許文献３】
特表２００１−５２００５２号公報
【非特許文献１】
Ｊ．  Ｍ．  Ｈ．  Ｋｉｊａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  （２００１）  １５８：  ７７９−７８５
【非特許文献２】
Ｐｉｅｌｂｅｒｇ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  （２００２）  Ｊａｎ；  １６０（１）：  ３０５−１１
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ブタの品種を相互に識別する方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ブタのゲノムＤＮＡについて、ＭＣ１Ｒ遺伝子とＫＩＴ遺伝子に存在する特定の５つの遺伝子多型についてのアレルを検出し、検出されたアレルの組み合わせに基づいて前記ゲノムＤＮＡの属するブタ品種を特定する方法により、ブタの品種を相互に識別することに成功した。本発明はこの成果に基づいて完成された。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］    ブタのゲノムＤＮＡについて下記（１）と、（２）及び／又は（３）との組み合わせからなるアレルの検出を行い、その結果に基づいてブタの品種を特定することを特徴とする、ブタの品種の識別方法：
（１）  ＭＣ１Ｒ遺伝子上の、
（ｉ）  配列番号１に示す塩基番号２０２６〜２０２７の位置に存在する連続した２塩基の挿入若しくは非挿入であるアレル、
（ｉｉ）  同塩基番号２２７０の位置に存在する塩基Ｔ若しくはＣであるアレル、及び
（ｉｉｉ）  同塩基番号２６９２の位置に存在する塩基Ｇ若しくはＡであるアレル；
（２）  ＫＩＴ遺伝子上の、配列番号５７に示す塩基番号１３１３の位置に存在する塩基Ｇ若しくはＡであるアレル；
（３）  ＫＩＴ遺伝子上の、配列番号５７に示す塩基番号３８８４〜３８８７の位置に存在する連続した４塩基の欠失若しくは非欠失であるアレル。
【００１４】
［２］    次の（４）のアレルを検出することをさらに含む、上記［１］記載の方法：
（４）  ＭＣ１Ｒ遺伝子の上流領域の、配列番号１に示す塩基番号２２１〜２７９の位置に存在する連続した７塩基若しくは２２塩基の挿入又は欠失であるアレル。
【００１５】
上記の［１］又は［２］の方法においては、ブタの品種が、メイシャン種、デュロック種、ハンプシャー種、白色種及びバークシャー種、並びにそれらのうちの２種以上を用いた交雑種であることが望ましい。
【００１６】
また、上記［１］又は［２］の方法においては、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＦＬＰ法、及びＤＮＡチップを用いる方法からなる群より選ばれる一つまたは二つ以上の方法を用いて検出を行うことができる。
【００１７】
さらに具体的な上記［１］又は［２］の方法においては、（１）−（ｉ）のアレルについてはＰＣＲ−ＦＬＰ法、（１）−（ｉｉ）のアレルについては制限酵素ＡｃｉＩを用いるＲＦＬＰ法、（１）−（ｉｉｉ）のアレルについては制限酵素ＨｈａＩを用いるＲＦＬＰ法、（２）のアレルについては制限酵素ＮｌａＩＩＩを用いるＲＦＬＰ法、（３）のアレルについてはＰＣＲ−ＦＬＰ法、を用いて、好適に検出を行うことができる。
【００１８】
［３］    下記（１）と、（２）及び／又は（３）とを含む、ブタの品種識別用の試薬又はキット：
（１）  配列番号６及び７に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマーと、
配列番号８及び９に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー、及び制限酵素ＡｃｉＩと、
配列番号１０及び１１に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー、及び制限酵素ＨｈａＩと、
の組み合わせ；
（２）  配列番号１２及び１３に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー、並びに制限酵素ＮｌａＩＩＩ；
（３）  配列番号１４及び１５に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー。
【００１９】
［４］    下記（１）と、（２）及び／又は（３）との組み合わせを含む、オリゴヌクレオチド又はその標識物のセット：
（１）  配列番号１に示す塩基番号２０２６〜２０２７の位置に存在する塩基を含む、配列番号１〜４に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物と、
配列番号１に示す塩基番号２０２６〜２０２７の位置に存在する塩基を含む、配列番号５に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物と、
配列番号１に示す塩基番号２２７０の位置に存在する塩基を含む、配列番号２に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物と、
配列番号１に示す塩基番号２６９２の位置に存在する塩基を含む、配列番号３に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物と、
の組み合わせ；
（２）  配列番号５７に示す塩基番号１３１３の塩基Ｇが塩基Ａに置換されている、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列、若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物；
（３）  配列番号５７に示す塩基番号３８８４〜３８８７の塩基配列ＡＧＴＴが欠失している、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列、若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドの群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物。
【００２０】
［５］    上記［４］のセットに、下記（１）〜（４）からなる群から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物をさらに含むセット。
（１）  配列番号１に示す塩基番号２２７０の位置に存在する塩基を含む、配列番号３〜５に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物；
（２）  配列番号１に示す塩基番号２６９２の位置に存在する塩基を含む、配列番号１、２、４若しくは５に示す塩基配列上の連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物；
（３）  配列番号５７に示す塩基番号１３１３の塩基Ｇが塩基Ａに置換されている、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物、及び
（４）  配列番号５７に示す塩基番号３８８４〜３８８７の塩基配列ＡＧＴＴを含む、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物。
【００２１】
［６］    配列番号１６〜３５に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチド又はその標識物のセット。
［７］    上記［４］〜［６］のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド又はその標識物のセットを固定化した固相担体。
【００２２】
［８］    下記（１）及び／又は（２）を含む、ブタの品種識別用の試薬又はキット：
（１）  上記［７］記載の固相担体
（２）  配列番号３６〜４５に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマーのセット。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明はブタの品種を相互に識別する方法に関する。
本発明は、ブタのゲノムＤＮＡについて、ＭＣ１Ｒ遺伝子に存在する３つの遺伝子多型（２塩基挿入／非挿入部、黒色検出部及び褐色検出部）のアレルと、ＫＩＴ遺伝子に存在する２つの遺伝子多型（白色検出部及び４塩基欠失／非欠失部）の少なくとも一方のアレルとを検出し、検出されるそれらのアレルの組み合わせを各ブタ品種に特有の組み合わせと比較して、前記ゲノムＤＮＡを有するブタの品種を特定することによって、ブタの品種を識別する方法に関する。本発明はまた、そのような識別法においてアレルの検出に用いることができる、好適なＤＮＡチップも提供する。
【００２４】
本発明の方法を用いれば、現在市場に出回っている品種のほぼ１００％に当たるデュロック種、白色種（大ヨークシャー種及びランドレース種を含む）、バークシャー種及びハンプシャー種を、相互に識別することができるだけでなく、メイシャン種を含め、それらの品種のうち２種以上を交配した交雑種をも識別することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
１．ブタの品種
本発明において、識別の対象となるブタの品種は、メイシャン種、デュロック種、白色種（大ヨークシャー種及びランドレース種を含む）、バークシャー種及びハンプシャー種、並びにこれらの品種のうち少なくとも２種を交配に用いた交雑種である。現在、産業上出回っているブタ肉は、これらの品種に属するものがほとんどであるため、本発明の方法はそのようなブタ肉を識別する上で特に有用である。また本明細書では、これらのブタ品種に対する野生型の基準種として、日本イノシシを用いて本発明を説明する。
【００２６】
ここで、ブタ品種は、一般的に皮膚の色によって以下の通り分類される。
・黒色種：バークシャー種、メイシャン種、ハンプシャー種
このなかで、バークシャー種は脚先、尾端、鼻先が白いため六白と呼ばれており、ハンプシャー種は前脚にかけての胴回りが白いため（黒地）白ベルトと呼ばれている。
・褐色種：デュロック種
・白色種：大ヨークシャー種、ランドレース種
【００２７】
これらのうち、黒色種と白色種の間では肉の品質に差があるため、特に黒色種と白色種とを識別できることは産業上重要である。また、デュロック種は肉質が良いため、ブタ肉生産における交配にも広く用いられていることから、交雑種におけるデュロック種の関与を識別できることは有用である。
【００２８】
２．遺伝子多型とそのアレル
本明細書において「遺伝子多型」は、単一ヌクレオチド多型（１塩基多型：ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）、及び連続した複数ヌクレオチドにわたる挿入又は欠失による多型、並びに重複遺伝子間の対応する位置に存在する多型を包含するものとする。
【００２９】
本発明では、メラニン細胞刺激ホルモン受容体遺伝子（ＭＣ１Ｒ遺伝子）及びＫＩＴ遺伝子に見出される遺伝子多型を利用する。脊椎動物において体色に関与する褐色又は黒色の色素はメラニンであり、メラノサイトにおいてその形成が行われる。メラノサイトにおけるメラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）の受容体はメラニン細胞刺激ホルモン受容体（ＭＣ１Ｒ）であり、この受容体をコードするＭＣ１Ｒ遺伝子の変異によるレセプター活性の違いがメラノサイトにおけるチロシナーゼのレベルに変化をもたらし、そのレベルの程度により毛色が黒色又は褐色となる。またＫＩＴ遺伝子は、メラニン細胞の増殖、分化及び遊走に深く関与し、大ヨークシャー（白色種）ではこの遺伝子が重複していることが知られている（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｖｏｌ  ７，  ｐｐ８２２−８３０，  １９９６）。このため、ＫＩＴ遺伝子における遺伝子多型は、品種間での多型だけでなく、重複ＫＩＴ遺伝子間での多型も意味する。一方、有色種のＫＩＴ遺伝子は重複していない。
【００３０】
本発明のブタの品種の識別法においては、識別の対象とするブタのゲノムＤＮＡについて、ＭＣ１Ｒ遺伝子及びＫＩＴ遺伝子上の下記の５つの遺伝子多型を利用する。
〔１〕２塩基挿入／非挿入部：  ＭＣ１Ｒ遺伝子上の連続した２塩基の挿入、又は非挿入
〔２〕黒色検出部：  ＭＣ１Ｒ遺伝子上のヌクレオチド多型（Ｔ又はＣ）
〔３〕褐色検出部：  ＭＣ１Ｒ遺伝子上のヌクレオチド多型（Ｇ又はＡ）
〔４〕  白色検出部：  ＫＩＴ遺伝子上のヌクレオチド多型（Ｇ又はＡ）
〔５〕４塩基欠失／非欠失部：  ＫＩＴ遺伝子の連続した４塩基の欠失、又は非欠失
【００３１】
本発明では、上記の〔１〕〜〔３〕に加えて、〔４〕又は〔５〕の少なくとも一方の遺伝子多型のアレルを検出することによって、ブタの品種を相互に識別することができる。しかし、〔１〕〜〔５〕の遺伝子多型を全て利用することにより、その識別の精度をさらに高めることも可能である。
ここで、それぞれのブタ品種に対応するＭＣ１Ｒ遺伝子及び日本イノシシのＫＩＴ遺伝子について、本明細書に示す部分配列に対応する配列番号は表１の通りである。
【００３２】
【表１】
2004154024.tif 000002
【００３３】
上記〔１〕〜〔５〕の遺伝子多型の多型部位は、配列番号１又は５７に示す塩基番号を用いて次の通り特定される。
〔１〕２塩基挿入／非挿入部：  配列番号１に示す塩基番号２０２６〜２０２７の位置。なお、本明細書においては、２塩基挿入／非挿入部に関連する「挿入」とは、具体的には、配列番号１に示す塩基番号２０２６と２０２７の間の位置に連続した２塩基配列が挿入された結果、塩基番号２０２６〜２０２７に対応する塩基配列が連続した４塩基配列（ＧＣＣＣ）となっていることを意味する。一方、２塩基挿入／非挿入部に関連する「非挿入」とは、具体的には、配列番号１に示す塩基番号２０２６と２０２７の間の位置に連続した２塩基が挿入されておらず、塩基番号２０２６〜２０２７に対応する塩基配列が連続した２塩基配列（ＧＣ）となっていることを意味する。この用語「非挿入」は、進化学的な意味で用いない限り、配列の比較について述べる際に、用語「欠失」によって置き換えてもよい。
【００３４】
〔２〕黒色検出部：  ＭＣ１Ｒ遺伝子上の、配列番号１に示す塩基番号２２７０の位置。
〔３〕褐色検出部：  ＭＣ１Ｒ遺伝子上の、配列番号１に示す塩基番号２６９２の位置。
〔４〕白色検出部：  ＫＩＴ遺伝子上の、配列番号５７に示す塩基番号１３１３の位置。
【００３５】
〔５〕４塩基欠失／非欠失部：  ＫＩＴ遺伝子の、配列番号５７に示す塩基番号３８８４〜３８８７の位置。なお、本明細書においては、４塩基欠失／非欠失部に関連する「欠失」とは、具体的には、配列番号５７に示す塩基番号３８８４〜３８８７（塩基配列ＡＧＴＴ）に対応する連続した４塩基配列が欠失していることを意味する。一方、４塩基欠失／非欠失部に関連する「非欠失」とは、具体的には、配列番号５７に示す塩基番号３８８４〜３８８７（塩基配列ＡＧＴＴ）に対応する塩基配列が欠失しておらず、塩基番号３８８４〜３８８７に対応する連続した４塩基配列が存在していることを意味する。この用語「非欠失」は、進化学的な意味で用いない限り、配列の比較について述べる際に、用語「挿入」によって置き換えてもよい。
さらに、各ブタ品種が有する、ＭＣ１Ｒ遺伝子中の上記遺伝子多型のアレルを次の表２に具体的に示す。
【００３６】
【表２】
2004154024.tif 000003
【００３７】
また、各ブタ品種が有する、ＫＩＴ遺伝子中の各遺伝子多型のアレルを表３に示す。なお表３中、「Ｇ・Ａ」「４塩基欠失・非欠失」との表示は、それぞれ『ＧとＡの両方』『４塩基欠失と非欠失との両方』を意味する。
【００３８】
【表３】
2004154024.tif 000004
【００３９】
なお、本発明においては、上記遺伝子多型のアレルに加えて、ＭＣ１Ｒ遺伝子の上流領域に存在する連続した７塩基若しくは２２塩基の挿入又は欠失であるアレルを、さらにブタ品種の識別に利用することもできる。具体的には、配列番号１に示すＭＣ１Ｒ遺伝子の部分配列中の、開始コドンより上流に位置する塩基番号２２１〜２７９の領域には、メイシャン種において連続した７塩基長の欠失（配列番号１の塩基番号２７３〜２７９）が、デュロック種、ハンプシャー種、白色種及びバークシャー種において連続した２２塩基長の欠失（配列番号１の塩基番号２２１〜２４２）が存在する。これらの挿入／欠失のアレルは、例えば配列番号１の塩基番号２２１〜２７９の領域を増幅するように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られた増幅断片の断片長多型を解析することによって検出できる（ＰＣＲ−ＦＬＰ法）。この遺伝子多型は、日本イノシシと、メイシャン種と、デュロック種、ハンプシャー種、白色種及びバークシャー種からなる群とを区別することができるので、例えばメイシャン種の識別等に用いることが可能である。なお本明細書において、この遺伝子多型については、上記の日本イノシシ及び各ブタ品種における塩基配列を互いに比較した場合に、連続した７塩基又は２２塩基の配列が当該位置に存在するものを「挿入」、存在しないものを「欠失」として表す。
【００４０】
本明細書では、上記多型部位を含む遺伝子内領域を指定する場合にも、原則として日本イノシシの塩基配列を基準として記載する。基準として用いる日本イノシシの塩基配列は、ＭＣ１Ｒ遺伝子については該遺伝子の部分配列である配列番号１に示す塩基配列を、ＫＩＴ遺伝子については該遺伝子の部分配列である配列番号５７に示す塩基配列を用いる。
【００４１】
本明細書では、上記遺伝子多型の多型部位を複数のブタ品種について特定する場合、配列番号１又は５７（日本イノシシの配列）を引用し、かつ特定のブタ品種の塩基配列を示す配列番号を用いて記載する。例えば黒色検出部について、「ＭＣ１Ｒ遺伝子上の、配列番号１に示す塩基番号２２７０の位置に存在する塩基Ｔ若しくはＣであるアレル」と記載した場合、『配列番号１に示す塩基番号２２７０』は日本イノシシにおける黒色検出部の多型部位を意味するが、『配列番号１に示す塩基番号２２７０の位置』との表現は、日本イノシシ（配列番号１）だけでなく、メイシャン種（配列番号２）、デュロック種（配列番号３）、ハンプシャー種（配列番号４）、白色種及びバークシャー種（配列番号５）における黒色検出部の多型部位をも意味する。
【００４２】
さらに各ブタ品種における上記遺伝子多型を含む領域の塩基配列については、配列番号１又は５７の塩基配列中に示される塩基番号を用いて多型部位を特定した上で、ブタ品種毎の塩基配列を示す塩基番号を引用することによって、指定する。例えば、メイシャン種のＭＣ１Ｒ遺伝子（配列番号２）の黒色検出部を含む領域を指定する場合には、「配列番号１に示す塩基番号２２７０の位置に存在する塩基を含む、配列番号２に示す塩基配列上の連続した…配列」というような記載で表現する。
【００４３】
３．ＤＮＡの調製
本発明のブタ品種の識別法においては、品種を識別したいブタ個体から組織又は細胞等を取得してＤＮＡ採取源とし、その採取源から抽出したゲノムＤＮＡを試料として用いる。ＤＮＡの採取源は特に限定されるものではなく、例えば肉（もも肉、肩肉、ロース肉等）、血液、加工肉（ハム、ソーセージ等）等が挙げられる。
【００４４】
これら採取源からのゲノムＤＮＡの抽出及び調製は、公知のいずれかの方法により行うことができる（文献名：Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．９．１６−９．２３，  １９８９）。あるいは、市販のキット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ，  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （＃２００６００））を用いることもできる。なお、得られたＤＮＡが目的のものであるか否かを確認するため、適当なシークエンサーで塩基配列決定をしておくことが望ましい。
【００４５】
また、品種の識別を行う目的によっては、ゲノムＤＮＡの抽出を、複数のブタ個体に由来するＤＮＡ採取源からまとめて行ってもよい。例えば、特定の品種に由来するブタ肉製品の一群に異なるブタ品種に由来するブタ肉製品が混入していないことを確認するために、その群に使用された全てのブタの品種がその特定の品種に属するか否かを識別すれば足りる場合であれば、識別したいブタ肉製品の群に由来する複数のＤＮＡ採取源から、まとめてゲノムＤＮＡを抽出してもよい。個体毎に抽出したゲノムＤＮＡを混合して、次のアレルの検出に用いてもよい。
【００４６】
４．アレルの検出
次に、上記「３．ＤＮＡの調製」で抽出したゲノムＤＮＡについて、上記「２．遺伝子多型とそのアレル」に記載したＭＣ１Ｒ遺伝子上の３つの遺伝子多型（２塩基挿入／非挿入部、黒色検出部及び褐色検出部）のアレルと、ＫＩＴ遺伝子上の２つ遺伝子多型（白色検出部及び４塩基欠失／非欠失部）の少なくとも一方のアレルとを検出する。
【００４７】
本発明において「アレルの検出」とは、識別を行いたいブタのゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡを含有する試料を含む）について、上記遺伝子多型を示す多型部位に存在するアレルを判定することを意味する。「アレルを判定する」とは、アレルについて、その塩基配列を直接的に決定することであってもよいし、制限酵素による切断やハイブリダイゼーションの結果に基づいてその塩基配列を間接的に同定することであってもよい。また「アレルを判定する」とは、さらに、目的のゲノムＤＮＡについて多型部位の２つのアレルの一方を検出した結果に基づいて、その多型部位のアレルが検出したアレルであるか否かを判断することであってもよい。これは、あるブタゲノムＤＮＡについて、その多型部位のアレルが特定のブタ品種が有するアレルであるか否かを判定すれば、その特定の品種であるか否かを判断できる場合があるからである。
【００４８】
アレルの検出法としては、当業者に公知の様々な方法を任意に選択して用いればよい。例えば、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型）法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １６，２９６−２９７  （１９９４），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ２１，  ５１０−５１４  （１９９６）〕、ダイレクトシークエンス法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １１，  ２４６−２４９  （１９９１）〕、ＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法〔Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，１８９，  １５３−１５７  （１９９０）〕、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）法〔Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  １９，  ３５６１−３５６７  （１９９１），  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  ２０，４８３１−４８３７  （１９９２）〕、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；  ＤＧＧＥ）法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｓ，  ２７，  １０１６−１０１８  （１９９９）〕、ＲＮａｓｅＡ切断法〔ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １４，  ８７−９４  （１９９５）〕、化学切断法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ２１，  ２１６−２１８  （１９９６）〕、ＤＯＬ（Ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ）法〔Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ８，  ５４９−５５６  （１９９８）〕、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法〔Ｇｅｎｅｔ．  Ａｎａｌ．，  １４，  １４３−１４９  （１９９９），  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ３４，  ２９３３−２９３６  （１９９６）〕、インベーダー法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ５１０９，  ７７８−７８３（１９９３），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ３０，  ２１３８７−２１３９４  （１９９９），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １７，  ２９２−２９６  （１９９９）〕、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ／Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法〔Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ７，  ３７８−３８８  （１９９７），  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ３５，  ５４５−５４８  （１９９７）〕、ＴＤＩ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４，  １０７５６−１０７６１  （１９９７）〕、モレキュラー・ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）法〔Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１，  ｐ４９−５３  （１９９８）、遺伝子医学、４，  ｐ４６−４８（２０００）〕、ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （ＤＡＳＨ）法〔Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１，  ｐ８７−８８，  （１９９９）、遺伝子医学，  ４，  ｐ４７−４８  （２０００）〕、パドロック・プローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ  Ｐｒｏｂｅ）法��Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ３，  ｐ２２５−２３２  （１９９８）、遺伝子医学，  ４，  ｐ５０−５１  （２０００）〕、ＵＣＡＮ法〔タカラ酒造株式会社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ．ｃｏ．ｊｐ）参照〕、及びＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いる方法〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，  （１９８９），  Ｄｒｍａｎａｅ，  Ｒ．，  Ｌａｂａｔ，  Ｉ．，  Ｂｒｕｋｎｅｒ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｃｒｋｖｅｎｊａｋｏｖ，  Ｒ．，  ｐ１１４−１２８、Ｂｉｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１７  Ｎｏ．４，  「ＤＮＡチップ技術」  ｐ５−１１  （２０００）〕等が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００４９】
以下に、本発明において用いるアレルの検出法の例を説明する。
（１）  ＲＦＬＰ法及びＰＣＲ−ＦＬＰ法による、２塩基挿入／非挿入部、黒色検出部、褐色検出部、白色検出部及び４塩基欠失／非欠失部のアレルの検出
この検出においてはまず、２塩基挿入／非挿入部、黒色検出部、褐色検出部についてはＭＣ１Ｒ遺伝子の塩基配列（例えば配列番号１〜５）に基づいて、白色検出部及び４塩基欠失／非欠失部についてはＫＩＴ遺伝子の塩基配列（例えば配列番号５７）に基づいて、目的の遺伝子多型を含む領域を増幅可能なプライマーを設計する。次いで該プライマーを用いてＰＣＲ法により該遺伝子多型を含む増幅断片を得て、ＲＦＬＰおよびＰＣＲ−ＦＬＰ分析を行うことにより、上記遺伝子多型のアレルを検出することができる。なお、プライマーの合成は通常の化学合成により行うことができる。
【００５０】
ＲＦＬＰ法又はＰＣＲ−ＦＬＰ法におけるＰＣＲ増幅では、目的の遺伝子多型を含む領域を増幅可能であるように設計及び合成したプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び識別対象とするゲノムＤＮＡ（鋳型）を使用する。本発明で用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）  、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等が挙げられるが、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼが好ましい。
【００５１】
増幅の条件は、９０℃〜９８℃で５秒〜３分、好ましくは９４℃で３０秒〜１分の変性工程、４０℃〜８０℃で５秒〜３分、好ましくは５５℃〜６６℃で３０秒〜１分のアニーリング工程、及び６０℃〜７４℃で１０秒〜１５分、好ましくは６６℃〜７２℃で３０秒〜７分の伸長工程を１サイクルとしてこれを２５〜５０サイクル行う。但し、鋳型ＤＮＡおよびプライマーを十分変性させるために、上記増幅サイクルの前に９５℃で５〜１０分の変性工程を加えてもよく、また、増幅されたＤＮＡを完全に伸長するために、増幅サイクルの後に７２℃で５〜１０分の伸長工程を加えてもよい。さらに、増幅断片を直ちに次の工程に供さない場合は、非特異的な増幅が起こらないようにするために、増幅断片を４℃で保存する工程を加えることが好ましい。このような増幅条件に従って、目的のＤＮＡ断片を増幅することができる。
【００５２】
続いて、ＲＦＬＰ法では、増幅断片を特定の酵素によって切断してから電気泳動にかけて、断片のサイズを決定する。またＰＣＲ−ＦＬＰ法では、増幅断片をそのまま電気泳動にかけて、断片のサイズを決定する。例えばアガロースゲル電気泳動では、泳動後のゲルを臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、ＤＮＡ断片をバンドとして検出することにより、その断片長を決定することができる。電気泳動法としては、アガロースゲル電気泳動の他、ポリアクリルアミドゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動を実施してもよい。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅断片から放出される蛍光を検出することによって、ＤＮＡ断片のバンドを検出してもよい。
【００５３】
以下に、ＲＦＬＰ法又はＰＣＲ−ＦＬＰ法による、各遺伝子多型についてのアレルの検出手順を具体的に説明する。
２塩基挿入／非挿入部については、例えば、配列番号１の塩基番号２０２６〜２０２７に位置する遺伝子多型部位を含む８１〜８３塩基長の断片を増幅するプライマー対を、配列番号１〜５に示される塩基配列に基づいて設計し、識別すべきブタのゲノムＤＮＡを鋳型としてそのプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られる増幅断片を電気泳動することにより、その泳動距離から該断片の長さを算出する。そしてこの断片長から、２塩基挿入／非挿入部のアレル（連続した２塩基の挿入又は非挿入）を判定する。配列番号１の塩基配列に基づいて予想される塩基長よりも算出された断片長が２ｂｐ長い場合には、アレルは２塩基挿入であり、その予想される塩基長と算出された断片長とが一致する場合には、アレルは非挿入である。なお、識別すべきゲノムＤＮＡについて、２塩基挿入／非挿入部のアレルが２塩基挿入であると判定されれば白色種又はバークシャー種由来、アレルが非挿入であると判定されればメイシャン種、デュロック種又はハンプシャー種由来と判断できる。
【００５４】
なお本明細書において「白色種由来」とは、白色種又は白色種を交配に用いた交雑種を意味する。このような用語「由来」を用いる表現は、他の品種に関するものであっても、同様に解釈される。
【００５５】
黒色検出部については、例えば、配列番号１〜５に示される塩基配列に基づいて、配列番号１の塩基番号２２７０の位置に存在する遺伝子多型部位を含む６４塩基長の断片を増幅するプライマー対を設計し、識別すべきブタのゲノムＤＮＡを鋳型としてそのプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られる増幅断片を制限酵素ＡｃｉＩによって消化し、その切断断片を電気泳動することにより、その泳動距離から制限断片長の長さを算出して、アレルを判定する。この遺伝子多型部位は、アレルが塩基Ｔ（配列番号１、３〜５）である場合は制限酵素ＡｃｉＩにより切断されないが、アレルが塩基Ｃである場合は制限酵素ＡｃｉＩによって切断される。従って、算出された制限断片長の長さにより、増幅断片が制限酵素ＡｃｉＩにより切断されないことが示される場合には、該ゲノムＤＮＡの黒色検出部のアレルは塩基Ｔであり、増幅断片が制限酵素ＡｃｉＩにより切断されることが示される場合には、該アレルは塩基Ｃであると判断される。表２に示される通り、黒色検出部のアレルが塩基Ｃであると判定されれば、そのゲノムＤＮＡはメイシャン種由来として特定される。一方、この黒色検出部のアレルが塩基Ｔであると判定されれば、デュロック種、ハンプシャー種、白色種又はバークシャー種由来として特定される。
【００５６】
褐色検出部については、例えば、配列番号１〜５に示される塩基配列に基づいて、配列番号１の塩基番号２６９２の位置に存在する多型部位を含む９６塩基長の断片を増幅するプライマー対を設計し、識別すべきブタのゲノムＤＮＡを鋳型としてそのプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られる増幅断片を制限酵素ＨｈａＩによって消化し、その切断断片を電気泳動することにより、その泳動距離から制限断片長の長さを算出して、アレルを判定する。この遺伝子多型部位は、アレルが塩基Ｇ（配列番号１、２、４及び５）である場合は制限酵素ＨｈａＩにより切断されるが、アレルが塩基Ａである場合は制限酵素ＨｈａＩによって切断されない。従って、算出された制限断片長の長さにより、増幅断片が制限酵素ＨｈａＩにより切断されたことが示される場合には、該ゲノムＤＮＡの黒色検出部のアレルは塩基Ｇであり、増幅断片が制限酵素ＨｈａＩにより切断されないことが示される場合には、該アレルは塩基Ａであると判断される。表２に示される通り、褐色検出部のアレルが塩基Ａであると判定されれば、そのゲノムＤＮＡはデュロック種由来として特定される。一方、この褐色検出部のアレルが塩基Ｇであると判定されれば、メイシャン種、ハンプシャー種、白色種又はバークシャー種由来として特定される。
【００５７】
白色検出部については、例えば、配列番号５７の塩基番号１３１３の位置に存在する塩基を含む５７塩基長の断片を増幅するプライマー対を、配列番号５７に示される塩基配列に基づいて設計し、識別すべきブタのゲノムＤＮＡを鋳型としてそのプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られる増幅断片を制限酵素ＮｌａＩＩＩによって消化し、その切断断片を電気泳動することにより、その泳動距離から制限断片長の長さを算出して、アレルを判定する。この遺伝子多型部位は、アレルが塩基Ｇである場合は制限酵素ＮｌａＩＩＩにより切断されないが、アレルが塩基Ａである場合は制限酵素ＨｈａＩによって切断される。従って、算出された制限断片長の長さにより、増幅断片が制限酵素ＨｈａＩにより切断されないことが示される場合には、該ゲノムＤＮＡの白色検出部のアレルは塩基Ｇであり、増幅断片が制限酵素ＮｌａＩＩＩにより切断されることが示される場合には、該アレルは塩基Ａであると判断される。なお白色種では、重複した各ＫＩＴ遺伝子は、白色検出部の多型部位に塩基Ｇ、又は塩基Ａをそれぞれ有するが、有色種では塩基Ｇのみを有する。すなわち表３に示される通り、白色検出部のアレルとして塩基Ｇと塩基Ａの両方が検出されれば、そのゲノムＤＮＡは白色種として特定される。一方、この白色検出部のアレルが塩基Ｇであると判定されれば、有色種であるメイシャン種、デュロック種、ハンプシャー種又はバークシャー種由来として特定される。
【００５８】
４塩基欠失／非欠失部については、例えば、配列番号５７の塩基番号３８８４〜３８８７の位置に存在する多型部位を含む６０〜６４塩基長の断片を増幅するプライマー対を、配列番号５７に示される塩基配列に基づいて設計し、識別すべきブタのゲノムＤＮＡを鋳型としてそのプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られる増幅断片を電気泳動することにより、その泳動距離から該断片の長さを算出する。そしてこの断片長から、４塩基欠失／非欠失部のアレル（連続した４塩基の欠失又は非欠失）を判定する。配列番号５７の塩基配列に基づいて予想される塩基長と算出された断片長とが一致する場合には、アレルは非欠失であり、その予想される塩基長よりも算出された断片長が４ｂｐ短い場合には、アレルは４塩基欠失である。なお上記の白色検出部と同様に、白色種では重複した各ＫＩＴ遺伝子が、４塩基欠失／非欠失部の多型部位に非欠失、又は４塩基欠失をそれぞれ有することから、白色種における４塩基欠失／非欠失部のアレルとしては、４塩基欠失と非欠失との両方が検出される。一方、有色種では、４塩基欠失／非欠失部のアレルは非欠失である。すなわち表３に示される通り、４塩基欠失／非欠失部のアレルが４塩基欠失と非欠失との両方であると判定されれば、そのゲノムＤＮＡは白色種由来として特定される。一方、この４塩基欠失／非欠失部のアレルが非欠失のみであると判定されれば、そのゲノムＤＮＡはメイシャン種、デュロック種、ハンプシャー種又はバークシャー種由来として特定される。
【００５９】
ところで、日本におけるブタ肉の生産は、主に三元交雑により、すなわちランドレース種（白色種）のメスに大ヨークシャー種（白色種）のオスを掛け合わせ、その子どものメスに、デュロック種（褐色種）のオスを掛け合わせることにより行っている。ブタ肉の生産では、さらに四元交雑により、すなわちランドレース種と大ヨークシャー種とを掛け合わせた子に、デュロック種とハンプシャー種又はバークシャー種とを掛け合わせて得た子を交配して、肉ブタとして用いている。
【００６０】
上記の三元交雑又は四元交雑により得られたブタにおいては、ＫＩＴ遺伝子の白色検出部のアレルとして、白色種と同様に塩基Ｇと塩基Ａの両方が検出され、また４塩基欠失／非欠失部のアレルとして、白色種と同様に４塩基欠失と非欠失との両方が検出される。従ってこの方法によって、上記の三元交雑種又は四元交雑種が白色種のもつアレルを有することを判定することもでき、その結果、交雑種の作製に白色種が確かに用いられたことを確認することができる。
【００６１】
（２）  ＤＮＡチップを用いる検出
ＤＮＡチップなどのＤＮＡマイクロアレイアッセイとしては、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭアッセイが有名である（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社；米国特許第６，０４５，９９６号、同第５，９２５，５２５号、及び同第５，８５８，６５９号参照）。しかしながら、本明細書において「ＤＮＡチップを用いる検出」とは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製のＤＮＡマイクロアレイを用いる方法に限定されるものではなく、核酸プローブを支持体に固定した各種の固相担体を用いる方法を包含する。そのため、本明細書において、本発明の検出法の説明のために用いる「ＤＮＡチップ」との用語は、核酸プローブを支持体に固定した各種の固相担体を包含するものとして用いる。
【００６２】
一般的には、ＤＮＡチップを用いる検出法は、支持体（例えばガラス基板）上に、塩基配列が既知の複数種の異なった核酸プローブを固定して、その上で標識したターゲット核酸のハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズした核酸プローブからの標識シグナル（一般的には蛍光シグナル）を特異的に検出する方法である。この検出には、当業者には公知の様々な標識シグナル読み取り法を用いることができるが、蛍光シグナルの検出の場合は通常、１〜２０μｍの解像度を有する蛍光スキャナで検出する。
【００６３】
ＤＮＡチップには、大きく分けてｃＤＮＡ、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド等の一本鎖核酸を支持体に固定するＤＮＡマイクロアレイ（張り付け型）と、オリゴヌクレオチドを支持体表面上で合成していくことにより該オリゴヌクレオチドを固定化するオリゴＤＮＡチップ（合成型）がある。一般的なチップの大きさは１〜１０ｃｍ２であり、この上に数千〜数十万種の核酸プローブを整列させることができる。一塩基多型を分別検出することを目的とする場合は、核酸プローブとしては、１０〜３０塩基長、好ましくは１５〜２５塩基長の長さの一本鎖オリゴＤＮＡを用いることが好ましい。
【００６４】
ＤＮＡチップを用いて上記遺伝子多型のアレルを検出する場合には、検出すべきアレル毎に、そのアレルを含むポリヌクレオチドを作製し、核酸プローブとして用いる。そのようなポリヌクレオチドとしては、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれを用いてもよい。またセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を用いることによって、その検出精度を向上させることができる。一方、ある多型部位に存在する２つのアレルのうち、特に検出すべきアレルがある場合には、検出すべきアレルを含むポリヌクレオチドのみを用いて、もう一方のアレルを含むポリヌクレオチドは用いずに、簡便に検出を行うこともできる。但し、ある多型部位に存在する２つのアレルについて、そのアレルのそれぞれを含むポリヌクレオチドをともに用いることによって、クロスハイブリダイゼーションの影響（ミスマッチプローブにもハイブリダイゼーションシグナルが検出されて判定が困難になること）を最小限に抑え、検出したいアレルに対する検出精度を向上させることができる。
【００６５】
５．本発明の固相担体及び固相担体を用いる検出法
本発明は、上記「４．アレルの検出」に好適に用いることができる固相担体にも関する。本発明における「固相担体」とは、上記「２．遺伝子多型とそのアレル」に記載のアレルを含む核酸プローブを支持体に固定したものを意味し、具体的には、ＤＮＡマイクロアレイ（ｃＤＮＡマイクロアレイ等）又はオリゴＤＮＡアレイ等のＤＮＡチップ、プローブ固定化メンブレンフィルター等が挙げられる。本発明において使用できる「支持体」は、核酸プローブを固定化して核酸試料とのハイブリダイゼーションに供しうる固相であれば特に限定されないが、例えばガラス基板、セラミック基板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリー、半導体基盤、ガラスや高分子からなる線状体及び樹脂等が挙げられる。
【００６６】
本発明の固相担体における核酸プローブとしては、２塩基挿入／非挿入部、黒色検出部及び褐色検出部のアレルをそれぞれ含む１０〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドと、白色検出部又は４塩基欠失／非欠失部の少なくとも一方のアレルを含む１０〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドとを適宜選択し、組み合わせて用いる。
【００６７】
本発明の固相担体においては、各遺伝子多型について、ブタ品種の識別に特に有用な特徴的なアレルを利用することが好ましい。そのような特徴的なアレルとは、主として、あるブタ品種に特有に検出されるアレルである。本発明の固相担体においては、少なくとも、そのような特徴的なアレルを有する核酸プローブを最小限必要な組み合わせで使用することが好ましい。また、そのような核酸プローブを１種類ずつ、最小限必要な組み合わせで使用することにより、最小限の核酸プローブ数でブタ品種を識別することが可能である。具体的には、本発明における上記遺伝子多型における特徴的なアレルとは、表４に示すものである。また、このような特徴的なアレルを用いる場合の、ブタ品種を相互に識別するのに必要な最低限の組み合わせについても表４に示す。
【００６８】
【表４】
2004154024.tif 000005
【００６９】
本発明の固相担体において使用できる、表４に記載した特徴的なアレルを有する核酸プローブは、以下（ａ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドを用いるものである。本発明の固相担体においては、（ａ）〜（ｅ）の組み合わせ、（ａ）〜（ｄ）及び（ｆ）の組み合わせ、及び（ａ）〜（ｆ）の組み合わせのうち、いずれの組み合わせの核酸プローブを用いても、ブタの品種の識別用に好適に用いることができる。
（ａ）  ２塩基挿入／非挿入部  ［アレル：  非挿入］
配列番号１に示す塩基番号２０２６〜２０２７の位置に存在する塩基を含む、配列番号１〜４に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列からなるオリゴヌクレオチド。
（ｂ）  ２塩基挿入／非挿入部  ［アレル：  ２塩基挿入］
配列番号１に示す塩基番号２０２６〜２０２７の位置に存在する塩基を含む、配列番号５に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
（ｃ）  黒色検出部  ［アレル：  塩基Ｃ］
配列番号１に示す塩基番号２２７０の位置に存在する塩基を含む、配列番号２に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００７０】
（ｄ）  褐色検出部  ［アレル：  塩基Ａ］
配列番号１に示す塩基番号２６９２の位置に存在する塩基を含む、配列番号３に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
（ｅ）  白色検出部  ［アレル：  塩基Ａ］
配列番号５７に示す塩基番号１３１３の塩基Ｇが塩基Ａに置換されている、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列、若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
（ｆ）  ４塩基欠失／非欠失部  ［アレル：  ４塩基欠失］
配列番号５７に示す塩基番号３８８４〜３８８７の塩基配列ＡＧＴＴが欠失している、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列、若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００７１】
上記の（ａ）〜（ｆ）のオリゴヌクレオチドに加えて、本発明では、各遺伝子多型の他のアレルを含むオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして任意に追加して使用することができる。そのようにして、多型部位に存在する２つのアレルのそれぞれを含むオリゴヌクレオチドを核酸プローブとして使用することにより、上記の特徴的なアレルとその他のアレルに対するシグナルの差が明確に示されることから、ブタ品種の識別の精度を高めることができる。本発明の固相担体において、核酸プローブとして追加的に使用できるそのようなオリゴヌクレオチドを、以下（ｇ）〜（ｊ）に示す。
【００７２】
（ｇ）  黒色検出部  ［アレル：  塩基Ｔ］
配列番号１に示す塩基番号２２７０の位置に存在する塩基を含む、配列番号１又は３〜５に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
（ｈ）  褐色検出部  ［アレル：  塩基Ｇ］
配列番号１に示す塩基番号２６９２の位置に存在する塩基を含む、配列番号１、２、４若しくは５に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
（ｉ）  白色検出部  ［アレル：  塩基Ｇ］
配列番号５７に示す塩基番号１３１３の塩基Ｇが塩基Ａに置換されている、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
（ｊ）  ４塩基欠失／非欠失部  ［アレル：  非欠失］
配列番号５７に示す塩基番号３８８４〜３８８７の塩基配列ＡＧＴＴを含む、配列番号５７に示す塩基配列の一部である連続した１０〜３０塩基の配列若しくはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００７３】
本発明の固相担体に使用する核酸プローブとしては、上記（ａ）〜（ｅ）の組み合わせ、（ａ）〜（ｄ）及び（ｆ）の組み合わせ、及び（ａ）〜（ｆ）の組み合わせのうちのいずれかの組み合わせのオリゴヌクレオチドを必須とするが、さらに（ｉ）〜（ｊ）のオリゴヌクレオチドから任意のものを選択して用いることができる。好ましくは、本発明の固相担体には、核酸プローブとして（ａ）〜（ｊ）のオリゴヌクレオチドを少なくとも１種ずつ使用する。
【００７４】
上記（ａ）〜（ｊ）のそれぞれに対するオリゴヌクレオチドは、（ａ）〜（ｊ）のそれぞれの区分につき少なくとも１種類ずつを選択すればよい。使用するオリゴヌクレオチドは、塩基配列から予想されるアニーリング温度に基づいて、適切な配列長及び塩基配列となるように設計することが好ましい。また、固相担体に固定化するオリゴヌクレオチドの組み合わせの間で、好適なハイブリダイゼーション条件が大きく異ならないように、予想されるアニーリング温度がほぼ同程度になるような塩基配列を設計することが好ましい。塩基配列に基づくアニーリング温度の推定及びそれに基づく核酸プローブの設計の最適化は、当業者に公知の方法を用いて行う。しかしながら、上記（ａ）〜（ｊ）のそれぞれに対するオリゴヌクレオチドは、（ａ）〜（ｊ）のそれぞれの区分内から、配列長の異なる複数種類のものを設計して使用してもよいし、センス鎖とアンチセンス鎖をともに設計して使用してもよい。核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリダイゼーションの結果は、実験条件によって多少の差異が出ることは避けられないため、各区分について好適なハイブリダイゼーション条件が若干異なる複数のオリゴヌクレオチドを設計して用いることによって、固相担体を用いたブタ品種の識別の精度をさらに高めることができる。
【００７５】
本発明において、核酸プローブに特に好適に用いることができるオリゴヌクレオチドは、以下に記載する配列番号１６〜３５に示される塩基配列をそれぞれ有するものである。
2004154024.tif 000006
【００７６】
本発明の核酸プローブには、目的の多型部位以外の多型部位は含まないことが好ましいが、他の多型部位を含む場合には、他の多型部位に存在するアレルのそれぞれをさらに含む核酸プローブを作製して使用する。
【００７７】
さらに、本発明において用いる上記核酸プローブは、検出用に好適となるように標識されたものでもよい。例えば、蛍光色素、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものであってよい。
【００７８】
蛍光色素を用いる場合には、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の定量、検出等に用いられる蛍光が好適に使用でき、例えば、Ｃｙ３（１−［６−［（２，５−Ｄｉｏｘｏ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）ｏｘｙ］−６−ｏｘｏｈｅｘｙｌ］−２−［３−［１−［６−［（２，５−ｄｉｏｘｏ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）ｏｘｙ−６−ｏｘｏｈｅｘｙｌ］−１，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｓｕｌｆｏ−２Ｈ−ｉｎｄｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ］−１−ｐｒｐｐｅｎｙｌ］−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−ｓｕｌｆｏ−３Ｈ−ｉｎｄｏｌｉｕｍ）、ビオチン（Ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−２−ｏｘｏ−１Ｈ−ｔｈｉｅｎｏ［３，４−ｄ］ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｐａｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ｖｉｔａｍｉｎ  Ｈ）、ＨＥＸ（４，７，２’，４’，５’，７’−ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＮＥＤ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（アプライドバイオシステムズ社商品名、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎ）またはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ））等を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用できる〔Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４，  ｐ３０３−３０８  （１９９６）〕参照」。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製  オリゴヌクレオチドＥＣＬ  ３’  −オリゴラベリングシステム等）。
【００７９】
本発明の固相担体の製造においては、核酸プローブは、支持体上で合成することができる。核酸プローブの合成は、例えば固相化学合成法と半導体産業において用いられているフォトリソグラフィー製造技術とを組み合わせた光照射化学合成法（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）に従って行うことができる。この方法では、チップの化学反応部位の境界を明確するためにフォトリソグラフィーマスクを利用し、特定の化学合成工程を行うことによって、アレイの所定の位置にオリゴヌクレオチドプローブが貼り付けられた高密度アレイを構築することができる。
【００８０】
また本発明の固相担体の製造においては、核酸プローブは、ＰＣＲ等の方法により調製してから、支持体上に固定してもよい。この方法では、例えば、予め調製したＤＮＡを高精度分注機で基板にスポットすることによってＤＮＡチップを製造する技術を用いることができる（米国特許第５，８０７，５２２号、米国特許第５，７１６，５８４号）。スポット方法としては、ピン方式、インクジェット方式、バブルジェット方式、キャピラリー方式等が開発されており、各方式に対応した分注機（スポッター、アレイヤーなどと称される）も、複数の製造業者から販売されている。スポット処理後は、必要に応じてＵＶ照射によるクロスリンク形成、表面のブロッキング、洗浄等の後処理を行う。またスポット方法では、核酸プローブは、表面処理した固相に共有結合で固定化させる。そのため、基板表面は、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種シランカップリング剤で処理することが好ましい。一方、核酸プローブには、末端に官能基としてアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチン等を導入する。
【００８１】
本発明の固相担体の製造において、支持体への核酸プローブの固定は、上記の方法によるものに限定されず、当業者に公知の任意の方法によって行えばよい。しかしながら、いずれの方法であっても、各核酸プローブはその後のターゲット核酸とのハイブリダイゼーションの際に特定される必要があるため、その固定位置、塩基配列または部分配列等の情報によって特徴付けられている必要がある。
【００８２】
本発明の固相担体を用いる識別法においては、ターゲット核酸として、識別を行うべきゲノムＤＮＡをそのまま用いることもできるが、好ましくは、検出するアレルの存在する多型部位を含む領域をＰＣＲ増幅して得られる増幅断片、又は該領域を含むＤＮＡ又はＲＮＡ断片を調製して用いる。
【００８３】
ターゲット核酸の調製のために、検出するアレルの存在する多型部位を含む領域をＰＣＲ増幅する場合には、該多型部位を含むように設計したＰＣＲプライマー、又は該多型部位を含む領域を増幅するように設計したＰＣＲプライマーを用いることが好ましい。
【００８４】
本発明の固相担体を用いたブタ品種の識別法において、遺伝子多型部位を含むＰＣＲプライマーとしては、上記の（ａ）〜（ｆ）及び（ｇ）〜（ｊ）に記載したオリゴヌクレオチドのうち、目的のアレルを含むオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００８５】
一方、遺伝子多型部位を含む領域を増幅するように設計するＰＣＲプライマーとしては、配列番号１〜５及び５７に示す塩基配列に基づいて５７〜９６塩基長の断片が増幅されるように適宜設計したプライマーを用いればよい。これらのプライマーの設計においては、増幅断片が、完全に相同な配列を有する核酸プローブに特異的にハイブリダイズし、かつ配列上にミスマッチを有する核酸プローブにはハイブリダイズしないようなオリゴヌクレオチドとなるように考慮される。このＰＣＲプライマーとしては、本発明では、好ましくは以下に記載する配列番号３６〜４５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる。
【００８６】
〔１〕２塩基挿入／非挿入部を含む領域の増幅用
５’−  ＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴ  −３’  ［配列番号３６］  （２０ｍｅｒｓ：ｆｏｒｗａｒｄ  Ｔｍ６９．９）
５’−  ＴＧＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＧＣＧＧＣ  −３’  ［配列番号３７］  （２０ｍｅｒｓ：ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｍ７５．１）
〔２〕黒色検出部を含む領域の増幅用
５’−  ＧＴＧＡＧＣＡＡＣＲＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧ  −３’  ［配列番号３８］  （２１ｍｅｒｓ：ｆｏｒｗａｒｄ  Ｔｍ７０．６）
５’−  ＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＧＣ  −３’  ［配列番号３９］  （１８ｍｅｒｓ：ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｍ８０．２）
〔３〕褐色検出部を含む領域の増幅用
５’−  ＣＴＣＣＡＣＡＡＧＡＣＧＣＡＧＣＡＣＣＣ  −３’  ［配列番号４０］  （２０ｍｅｒｓ：ｆｏｒｗａｒｄ  Ｔｍ７０．４）
５’−  ＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡ  −３’  ［配列番号４１］  （２０ｍｅｒｓ：ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｍ６９．７）
〔４〕白色検出部を含む領域の増幅用
５’−  ＴＧＡＴＴＣＴＡＡＴＴＡＣＧＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡ  −３’  ［配列番号４２］  （２６ｍｅｒｓ：ｆｏｒｗａｒｄ  Ｔｍ６８．１）
５’−  ＧＧＧＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＧ  −３’  ［配列番号４３］  （２１ｍｅｒｓ：ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｍ７０．９）
〔５〕４塩基欠失／非欠失部を含む領域の増幅用
５’−  ＣＡＣＣＴＴＧＣＣＡＡＡＧＧＣＡＣＣＴＣ  −３’  ［配列番号４４］  （２０ｍｅｒｓ：ｆｏｒｗａｒｄ  Ｔｍ６９．５）
５’−  ＣＡＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＡＡＣＡＴＣＴＴＡＡＡＧＡＡ  −３’  ［配列番号４５］  （２６ｍｅｒｓ：ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｍ６９．６）
【００８７】
本発明における上記ＰＣＲプライマーとしては、上記のオリゴヌクレオチドを検出用に標識したものを用いてもよい。例えば、蛍光色素、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されている上記オリゴヌクレオチドであってもよい。なお、ＰＣＲプライマーの標識用に用いることができる蛍光色素は、上記で核酸プローブについて記載したものと同じである。
【００８８】
また本発明のＰＣＲプライマーには、その末端にアレル検出のためのリンカー配列が付加されたものも含む。このようなリンカー配列としては、例えば、インベーダー法で用いられるオリゴヌクレオチド５’末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。
【００８９】
なお、本明細書中における「核酸」は、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを包含するものとする。また「ポリヌクレオチド」「オリゴヌクレオチド」はＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含むものとする。また「ポリヌクレオチド」は２本鎖であっても１本鎖であってもよく、したがって、ある配列を有するポリヌクレオチドには、これに相補的な配列を有するポリヌクレオチドも常に包含される。さらに、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする。さらに、本発明の「ポリヌクレオチド」「オリゴヌクレオチド」は、ハイブリダイゼーションにより形成される二本鎖の安定性が増すように設計された各種の修飾塩基（例えばホスホロチオ酸誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド等）を含有するように改変又は合成したものでもよい。
【００９０】
本発明の固相担体を用いた識別法においては、配列番号１６〜３５に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチド又はその標識物のセットをガラス基板に固定したＤＮＡチップが、特に好適に用いられる。
【００９１】
本発明の固相担体を用いた識別法では、まず固相担体と、目的の多型部位を含むターゲット核酸とを高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズさせ、そのターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することによって、ハイブリダイズした核酸プローブを同定する。このハイブリダイゼーションの検出には、本発明では当業者に公知の様々な技術を用いることができる。例えば、ハイブリダイゼーションの検出は、ハイブリダイズしている核酸プローブの有する標識、又はハイブリダイズしているターゲット核酸の有する標識からのシグナル（例えば蛍光）を検出することによって行うことができる。ターゲット核酸と核酸プローブとの配列が完全に一致しているハイブリダイゼーションの場合、検出されるシグナルの強度は強い。一方、ターゲット核酸と核酸プローブとの間で配列のミスマッチが存在するハイブリダイゼーションの場合、検出されるシグナルの強度はごく弱いか又は検出されない。
【００９２】
ターゲット核酸と核酸プローブとの間のハイブリダイゼーションを検出する具体的手順としては、例えば、ＰＣＲプライマーを蛍光標識しておき、そのプライマーを用いて増幅することにより増幅産物（ターゲット核酸）を蛍光標識し、該ターゲット核酸を固相担体上の核酸プローブとハイブリダイズさせ、さらに該ターゲット核酸からのシグナルを蛍光読み取りスキャナーで読み取ることによって、ターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出する例が挙げられる。
【００９３】
ここで、ある遺伝子多型部位のアレルのそれぞれを含む核酸プローブを固定した固相担体を使用して、ターゲット核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせると、ターゲット核酸の配列と一致するアレルを有する核酸プローブについては、他のアレルを含みミスマッチのある核酸プローブよりも非常に強いシグナルが検出される。この検出結果から、強いシグナルが検出される核酸プローブに含まれるアレルが、ターゲット核酸のアレルであると判定することができる。
【００９４】
また、ある複数のアレルを有する遺伝子多型について、いずれかのアレルを含む核酸プローブのみを固定した固相担体を使用してターゲット核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせると、ターゲット核酸のアレルがその核酸プローブと一致する場合には、強いシグナルが検出される。一方、ターゲット核酸とその核酸プローブとの間でアレルが異なり、配列間にミスマッチがある場合には、弱い標識シグナルしか検出されないか又は標識シグナルが全く検出されない。従って、この場合に、強いシグナルが検出された場合には、ターゲット核酸はその特定のアレルを有しているものと判定できる。もし弱い標識シグナルしか検出されないか又は標識シグナルが全く検出されない場合には、ターゲット核酸はその特定のアレルを有しないものと判定される。
【００９５】
核酸プローブは固相担体における位置、塩基配列情報等で特徴付けされているため、ターゲット核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションがシグナル等を用いて検出されれば、そのターゲット核酸の有するアレルが何であるかは容易に判定することができる。
【００９６】
６．検出結果の解析
本発明においては、上記のようにして検出されるブタゲノムＤＮＡの上記遺伝子多型のアレルの組み合わせを、各ブタ品種が有する組み合わせと比較することによって、そのゲノムＤＮＡを有するブタの品種を特定することができる。
【００９７】
下の表５には、各ブタ品種が有する上記遺伝子多型のアレルの組み合わせを示す。表５において、”＋”は、当該品種においてそのアレルが検出されることを意味する。
【００９８】
【表５】
2004154024.tif 000007
【００９９】
本発明のブタの品種の識別法においては、あるゲノムＤＮＡの上記遺伝子多型のアレルの組み合わせを表５と比較し、アレルの組み合わせが一致する品種を同定することにより、そのゲノムＤＮＡを有するブタの品種を特定することができる。
【０１００】
例えば、あるブタ個体が有するゲノムＤＮＡについて、２塩基挿入／非挿入部のアレルが非挿入、黒色検出部のアレルが塩基Ｔ、褐色検出部のアレルが塩基Ｇ、４塩基欠失／非欠失部のアレルが非欠失であると判定された場合には、表５を参照すると、そのゲノムＤＮＡを有するブタの品種は、ハンプシャー種であると判断できる。
【０１０１】
また、本発明の識別法において、表４に示した特徴的なアレルを含む核酸プローブのみを使用したＤＮＡチップによる検出法を用いてアレルを検出する場合には、その検出法により検出された特徴的なアレルを表４又は５と比較し、その組み合わせが一致する品種を特定することにより、そのゲノムＤＮＡを有するブタの品種を特定することができる。
【０１０２】
この場合の例としては、例えば、あるブタ個体に由来するゲノムＤＮＡについて、特徴的なアレルとして、２塩基挿入／非挿入部に対する「非挿入」及び「２塩基挿入」、黒色検出部に対する「塩基Ｃ」、褐色検出部に対する「塩基Ａ」、並びに白色検出部に対する「塩基Ａ」のアレルをそれぞれ含む核酸プローブのみを使用したＤＮＡチップを用いてアレルを検出した結果、２塩基挿入／非挿入部については「２塩基挿入」のアレルが検出されたが、黒色検出部については「塩基Ｃ」のアレルが検出されず、褐色検出部については「塩基Ａ」のアレルが検出されず、さらに白色検出部については「塩基Ａ」のアレルが検出されない場合、検出されたアレルは２塩基挿入／非挿入部の「２塩基挿入」のみなので、表４より、そのゲノムＤＮＡはバークシャー種由来であると判断することができる。
【０１０３】
さらに、ゲノムＤＮＡが由来するブタ個体が、メイシャン種、デュロック種、ハンプシャー種、白色種及びバークシャー種のうちの２種以上を用いた交雑種である場合にも、そのゲノムＤＮＡのアレルの組み合わせを表４又は表５と比較することにより、交雑種であることの判断及びその交雑に関与した品種の推定を行うことができる。
【０１０４】
具体的には、ブタ１個体から得たゲノムＤＮＡについて、そのアレルの組み合わせが表５に示した品種のいずれにも当てはまらない場合には、そのゲノムＤＮＡを有するブタは、これらの品種の２つ以上を交配した交雑種である可能性がある。
【０１０５】
例えば、三元交雑種、すなわちランドレース種（白色）のメスに大ヨークシャー種（白色）のオスを掛け合わせ、その子どものメスに、デュロック種（褐色）のオスを掛け合わせたブタのゲノムＤＮＡを、本発明の識別法に供すると、そのアレルは、２塩基挿入／非挿入部について２塩基挿入と非挿入との両方、黒色検出部について塩基Ｔ、褐色検出部について塩基Ａと塩基Ｇの両方、白色検出部について塩基Ａと塩基Ｇの両方、及び４塩基欠失／非欠失部について４塩基欠失と非欠失との両方が検出される。このアレルの組み合わせは、表５を参照すると、白色種とデュロック種に特徴的なアレルの組み合わせを含むことが分かる。従って、このゲノムＤＮＡを有するブタは、少なくとも白色種とデュロック種とを交配に用いた交雑種として識別することができる。このように、本発明の方法による識別結果は、上記三元交雑ブタにおける交配パターンを正しく反映する。
【０１０６】
但し、ゲノムＤＮＡが複数のブタ個体よりなる集団からまとめて得た試料である場合に、本発明の識別法においてブタの品種が２種以上特定されたときは、それらのブタ品種の交雑種が含まれる可能性の他、それらのブタ品種が集団中に別個に含まれる可能性もある。
以上説明した通り、識別したいブタのゲノムＤＮＡについて検出した上記アレルの組み合わせに基づいて、ゲノムＤＮＡが有するブタの品種を特定することができる。
【０１０７】
７．その他の実施形態
本発明は、本発明の固相担体に固定するか又は上記のＰＣＲプライマーとして用いる、上記「５．本発明の固相担体及び固相担体を用いる検出法」に記載されている（ａ）〜（ｅ）の組み合わせ、（ａ）〜（ｄ）及び（ｆ）の組み合わせ、及び（ａ）〜（ｆ）の組み合わせのオリゴヌクレオチド又はその標識物のセットにも関する。
【０１０８】
さらに本発明は、同項目５．に記載されている（ｇ）〜（ｊ）からなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその標識物をさらに含むそのようなセットであって、本発明の固相担体に固定するか又は上記のＰＣＲプライマーとして用いる、オリゴヌクレオチド又はその標識物のセットにも関する。
【０１０９】
さらに本発明は、本発明の固相担体に固定するか又は上記のＰＣＲプライマーとして用いる、配列番号１６〜３５に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチド又はその標識物のセットにも関する。
【０１１０】
なお、本明細書において、「オリゴヌクレオチド又はその標識物のセット」とは、目的の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（又はその標識物）がそれぞれ含まれるように構成された、オリゴヌクレオチド又はその標識物の集合体を意味する。
【０１１１】
本発明はまた、ＲＦＬＰ法及びＰＣＲ−ＦＬＰ法を用いる本発明の識別法において好適に用いることができる、以下の（１）〜（５）の試薬を含むキットにも関する。
（１）  配列番号６及び７に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー（２塩基挿入／非挿入部検出用）
（２）  配列番号８及び９に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー、並びに制限酵素ＡｃｉＩ（黒色検出部検出用）
（３）  配列番号１０及び１１に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー、並びに制限酵素ＨｈａＩ（褐色検出部検出用）
【０１１２】
（４）  配列番号１２及び１３に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー、並びに制限酵素ＮｌａＩＩＩ（白色検出部検出用）
（５）  配列番号１４及び１５に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー（４塩基欠失／非欠失部検出用）。
但し、（４）及び（５）の試薬は、少なくとも一方が含まれていればよい。もちろん（４）と（５）の両方が含まれていてもよい。
【０１１３】
さらに本発明は、上記の固相担体、及び／又は配列番号３６〜４５に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマーのセット（ターゲット核酸を得るためのＰＣＲプライマーのセット）を含む、試薬及びキットにも関する。この試薬やキットは、固相担体を用いる本発明の識別法において、好適に用いることができる。
【０１１４】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これら実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【０１１５】
〔実施例１〕ブタゲノムＤＮＡの調製
各ブタ品種｛大ヨークシャー４１頭、ランドレース８６頭、デュロック３３頭、メイシャン３９頭、バークシャー１１４頭、（日本バークシャー５６頭、アメリカバークシャー５８頭）、ハンプシャー２８頭｝の血餅、血液及び肉片を農林水産省畜産試験場（茨城県）、沖縄県畜産試験場（沖縄県）、鹿児島県畜産試験場（鹿児島県）、神奈川県畜産試験場（神奈川県）、石川県畜産試験場（石川県）、岡山県畜産試験場（岡山県）、三井物産株式会社（東京都）から入手し、ゲノムＤＮＡを得た。また、群馬県の山中で、狩猟により採取された日本イノシシの耳介の肉片を入手し、ゲノムＤＮＡを得た。
【０１１６】
血餅からのゲノムＤＮＡ抽出の場合、血餅約４〜５ｍｌに対し、３５０μｌのＣｅｌｌ  ｌｙｓｉｓＮＰ−４０  バッファー  （ＮａＣｌ  １４０ｍＭ，  ＭｇＣｌ２  １．５ｍＭ，  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５    １００ｍＭ，  ０．５％  ＮＰ−４０）、４．５ｍｌの細胞溶解  ＳＤＳバッファー（ＥＤＴＡ  １２ｍＭ，  ＮａＣｌ  １２０ｍＭ，  ＳＤＳ  １．２％）、５０μｌのプロテイナーゼＫ  溶液  （１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、撹拌した後、５５℃で一晩反応させた。次に７０℃で１０分間熱を加えることによりプロテイナーゼ  Ｋを失活させた後、２０μｌのＲｎａｓｅ  溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、２時間放置しＲＮＡを消化した。その後、同量のフェノール液で２回抽出し、さらにフェノール・クロロホルムで１回抽出した。水層を分離し、２容のエタノールと１／１０容の３Ｍ  酢酸ナトリウムを加え、析出したＤＮＡをガラス棒でとり、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、２００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶かした。ＯＤ２６０ｎｍで吸光度を測定し、ＤＮＡ濃度を決定した後、５０ｎｇ／μｌのＤＮＡサンプルとして調整した。
【０１１７】
血液からのゲノムＤＮＡ抽出の場合、抗凝固剤としてＥＤＴＡ−２Ｎａ（血液１ｍｌに対し、ＥＤＴＡ−２Ｎａを１．５ｍｇ使用）または、ヘパリンナトリウム（血液１０ｍｌに対し、ヘパリンナトリウム９０単位）を用い、タカラ酒造製のＤＮＡ抽出キット、ＧｅｎとるくんＴＭ（血液用）を用い、説明書に従ってＤＮＡを抽出した。すなわち、血液２ｍｌに対して、１０ｍｌのＧｅｎＴＬＥ  溶液Ｉを加え、直ちに数秒間撹拌し、室温で１０分間静置後、遠心分離を室温で１２，０００×ｇ、５分間行った。上清を除いた後、沈澱物に１２ｍｌのＧｅｎＴＬＥ  溶液ＩＩを加え、転倒混和した後、室温において１２，０００×ｇ、２分間遠心分離を行った。上清を除いた後、沈澱物に７ｍｌのＧｅｎＴＬＥ  溶液ｎＩＩＩを加え、１０秒間撹拌を行った。室温において１２，０００×ｇ、５分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールを加え、転倒混和を充分行った。この時、ＤＮＡの白い沈殿が確認できるが、それを１２，０００×ｇ、５分間遠心分離により回収後、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、２００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶かした。ＯＤ２６０ｎｍで吸光度を測定し、ＤＮＡ濃度を決定した後、５０ｎｇ／μｌのＤＮＡサンプルとして調整した。
【０１１８】
肉片からのゲノムＤＮＡ抽出の場合、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＤＮＡ抽出キット（ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；  ♯２００６００）を用い、説明書の手順を改変した方法によりＤＮＡを抽出した。方法の概略を次に示す。肉片約３００ｍｇをハサミで細分化し（１〜２ｍｍ角程度）、２ｍｌのマイクロチューブ内に入れ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２を７３７μｌ加え、よく混ぜ合わせた後、ｐｒｏｎａｓｅ（２２５ｍｇ／ｍｌ）を２．７μｌ加え、転倒撹拌しながら３７℃で一晩放置した。次に氷上で１０分間おいた後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３を２６３μｌ加え、５分間氷上に静置した。２，０００×ｇで１５分間遠心後、上清を新しい２ｍｌのマイクロチューブに移し、ＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）を２μｌ加え３７℃で１５分間静置した。その後、１容のイソプロパノールを加え、析出したＤＮＡをチップの先で回収した。これを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、２００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶かした。ＯＤ２６０ｎｍで吸光度を測定し、ＤＮＡ濃度を決定した後、５０ｎｇ／μｌのＤＮＡサンプルとして調整した。
【０１１９】
〔実施例２〕ＰＣＲ法によるブタＢＡＣライブラリーのスクリーニング：メラニン細胞刺激ホルモンレセプター（ＭＣ１Ｒ）遺伝子について
プライマーとしてＭＲ０１１（ｆｏｒｗａｒｄ；配列番号４６）とＭＲ０１２（ｒｅｖｅｒｓｅ；配列番号４７）を使用した。ここでｆｏｒｗａｒｄはフォワードプライマーを、ｒｅｖｅｒｓｅはリバースプライマーを表す。なおマウスのＭＣ１Ｒ遺伝子の配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ；Ｘ６５６３５）の塩基番号によると、ＭＲ０１１の５’側の最初の塩基は１９４番の塩基に相当し、ＭＲＯ１２の５’側の最初の塩基は５９８番の塩基に相当する。このプライマーを用いたＰＣＲによってブタＭＣ１Ｒ遺伝子の４０５ｂｐの増幅産物が得られる。ブタＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ライブラリーとしては農林水産先端技術研究所（ＳＴＡＦＦ研：茨城県つくば市）の所有する１０万クローンを用い、ＭＣ１Ｒ遺伝子の存在するクローンを検索した。その結果、番号（１３Ｆ１２）のクローンを抽出した。
【０１２０】
〔実施例３〕ブタＢＡＣクローンからのＤＮＡ抽出
ＭＣ１Ｒ遺伝子を含んだブタＢＡＣクローン（番号１３Ｆ１２）から、ＢＡＣ−ＤＮＡを抽出した。ＢＡＣ−ＤＮＡの抽出にはＱＩＡＧＥＮ社のＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔｓを用いた。方法の概略を以下に示す。
【０１２１】
ＢＡＣクローンをクロラムフェニコール（Ｃｍ＋：１２μｇ／ｍｌ）としたＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培養液２ｍｌに入れ、試験管で１晩増殖させる。次に１００ｍｌのＴＢ（Ｃｍ＋）にＢＡＣクローン培養液を入れ、さらに１晩震盪させる。
【０１２２】
増殖後、培養液を５００ｍｌのチューブに入れ、４℃、６，０００ｒｐｍで２０分間遠心する。上清を捨て、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ＫｉｔｓのＰ１  ｂｕｆｆｅｒを１５ｍｌ加え、震盪器にかけて、菌体を完全に懸濁させる。これにＰ２  ｂｕｆｆｅｒを１５ｍｌ加え、３回反転させて撹拌し、室温で５分間静置する。その後、氷冷したＰ３  ｂｕｆｆｅｒ  １５ｍｌを加え、ゆっくり３回反転させて、撹拌した後、氷中で１５分間冷却する。氷冷後、４℃、８，０００ｒｐｍで３０分間遠心する。Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ＫｉｔｓのＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ  １００（カラム）を事前にＱＢＴ  ｂｕｆｆｅｒ４ｍｌを滴下した後で、そのカラムにろ過したＢＡＣクローンの上清を滴下する。カラムはＱＣ  ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍｌで２回洗浄し、６５度で温めておいたＱＦ  ｂｕｆｆｅｒ、５ｍｌをカラムに通すことで、ＤＮＡを抽出する。この抽出液に等量のイソプロパノールを加え、４℃で３０分間静置した後、４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、ＤＮＡを沈殿させた後、上清を捨て、７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させ、１５０ｕｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶かして試料とした。
【０１２３】
〔実施例４〕ダイレクトシークエンシングによるＭＣ１Ｒ遺伝子とその構造領域上流の塩基配列決定
上記の方法で抽出、精製したＢＡＣ−ＤＮＡの塩基配列を、ダイレクトシークエンシング法により決定した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡ  ＳＥＱＵＥＮＣＥＲ）とＤＮＡシークエンシング用試薬（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いた。プライマー  ＭＲ０１２からＭＣ１Ｒ遺伝子の制御領域に向い、塩基配列の決定のためにプライマーウォーキングを行った。この方法はまずプライマーを用い、ダイレクトシークエンシングで塩基配列を決定した後、その決定した配列の先の部分にプライマーを作製し、次のダイレクトシークエンシングで更に先まで塩基配列を順次決定していく方法である。方法の概略を以下に示す。
【０１２４】
上記に抽出したＢＡＣ−ＤＮＡ  ５μｌを鋳型として、８μｌ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  ＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘ  、各３．２ｐｍｏｌプライマー（ＭＲ０１２）に蒸留水を加え２０μｌの反応液とした。ＰＣＲ機（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００；  ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ製）を用い、熱変性９６℃１０秒、アニーリング５０℃５秒、伸長反応６０℃４分を１サイクルとし、これを２５回行った。エタノール沈殿のため、２０μｌの反応液に対し５０μｌの１００％エタノールと２μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、氷上で１０分間静置した後、４℃で１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心した。沈殿を分離し、７０％のエタノールを加え洗浄した後、遠心乾燥器で乾燥した。
【０１２５】
乾燥した反応物に対し、４μｌのローディング溶液（脱イオンホルムアミド：ブルーデキストラン溶液＝５：１、ブルーデキストラン溶液は２５ｍＭ  ＥＤＴＡにブルーデキストラン（５０ｍｇ／ｍｌ）を溶かして作る）を加え、ＤＮＡをよく溶かした後、９０℃で２分間加熱し、加熱後すぐにサンプルを氷上に置き急冷した。
【０１２６】
ＤＮＡシークエンシングは、４８ｃｍのゲル板（３７７，４８ｃｍガラスプレート；ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）と、アクリルアミドゲルはバイオメイト製のＤＮＡシーケンス分析用ゲル調整液（Ｐａｇｅｓｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ）を用いた。室温下で２時間以上静置し、アクリルアミドを完全にゲル化した後、シークエンシングを行った。シークエンシングはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  ＳＥＱＵＥＮＣＥＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用い、８時間の電気泳動を行った。塩基配列の解析には、３７７シークエンサーに付属のソフトウエア（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７  Ａｎａｌｙｓｉｓ）及びソフトウエア開発株式会社製のＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８を用いた。
【０１２７】
プライマーＭＲ０１２で配列を確定した後、さらに構造領域上流にかけて配列を決定しながらプライマーを６個作製し、ＭＣ１Ｒ遺伝子の翻訳開始点から１９６８ｂｐまでの塩基配列を決定した。さらに、その到達点から配列確定用のｆｏｒｗａｒｄプライマーを３つ合成した。合成したプライマーは以下の通りである。
【０１２８】
ＭＲ０１６（＋５０番、ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号４８
ＭＲ０１７（−７９番、ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号４９
ＭＲ０１８（−２７１番、ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号５０
ＭＲ０１９（−８１５番、ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号５１
ＭＲ０２０（−１３２２番、ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号５２
ＭＲ０２６（−１９６８番、ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号５３
ＭＲ０２７（−１０６９番、ｒｅｖｅｒｓｅ）：配列番号５４
ＭＲ０２８（−１２１７番、ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号５５
ＭＲ０２９（−１９１２番、ｆｏｒｗａｒｄ）：配列番号５６
【０１２９】
カッコ内の番号は、塩基配列の確定後、ＭＣ１Ｒ遺伝子の翻訳開始コドンの最初の塩基を＋１番とした場合における、各プライマーの５’端の塩基がハイブリダイズする位置の番号である。
【０１３０】
ＭＣ１Ｒ構造遺伝子部分については、ＭＲ０１１（ｆｏｒｗａｒｄ；配列番号４７）を用い、ブタＢＡＣクローン（番号１３Ｆ１２）のシークエンスを行った。配列番号１のサンプルにおいて塩基番号２，７３９番目の塩基まで１方向で配列を決定し、塩基番号２，７３９番目の塩基を５’端とするリバースプライマー２６４（ＤｕＲ：配列番号１０）を作製し、シークエンシングにより配列を確定した。
【０１３１】
〔実施例５〕ＬＡ−ＰＣＲによる各ブタ品種のＭＣ１Ｒ遺伝子構造領域上流の塩基配列決定（１）  ＬＡ−ＰＣＲ
ＬＡ−ＰＣＲのためのＴａｑポリメラーゼは宝酒造製のＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭを用いた。ＤＮＡ２５０ｎｇを鋳型として、４００μＭ    ｄＮＴＰｓ、１μＭ    プライマー（Ｋｉｔ１６Ｎ，Ｋｉｔ１９Ｃ）、１×ＰＣＲ  バッファーＩに、２．５ユニットのＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑＴＭを加え、５０μｌの反応液とした。ＰＣＲ機（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００；  ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ製）を用い、熱変性９８℃秒、アニーリングと伸長反応６８℃７分を１サイクルとしたシャトルＰＣＲで、これを３５サイクル行った。
（２）  アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の確認
上記のＬＡ−ＰＣＲによって得られた産物について電気泳動を行った。電気泳動装置としては、コスモ・バイオ製のミューピッドを用いた。ゲルトレーに泳動ゲル（組成は１％アガロース；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製、ｕｌｔｒａ  ＰＵＲＥ  Ａｇａｒｏｓｅ、１×ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ）緩衝液）を作製し、ＰＣＲの終了したサンプルを５μｌ添加した。次いで１００ボルトの電圧をかけて電気泳動し、分離したＤＮＡバンドをＥｔＢｒ溶液（ｅｔｈｙｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ；１０μｇ／１００ｍｌ）で染色した。その後紫外線（２６０ｎｍ）をあて、増幅したＤＮＡのバンドを確認した。
（３）  ＤＮＡ断片の精製
上記の方法でＤＮＡの増幅が確認できた段階で、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから抽出、精製した。大きめのウェル（５０μｌが入る程度）を作ることができるコームを用い、ゲルトレーに泳動ゲル（組成は１％アガロース；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製、ｕｌｔｒａ  ＰＵＲＥ  アガロース、１×ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ）緩衝液）を作製し、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡを全量添加した。次いで１００ボルトの電圧をかけて電気泳動し、分離したＤＮＡバンドをＥｔＢｒ溶液（ｅｔｈｙｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ；１０μｇ／１００ｍｌ）で染色し、紫外線（２６０ｎｍ）をあてることにより蛍光発色したＤＮＡバンドをカッターナイフの刃で切り取り、ゲル抽出キット（キアゲン製、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用い抽出、精製した。方法の概略を以下に示す。
【０１３２】
増幅したＤＮＡを含むアガロースゲル断片の重さを計り、ゲル１容に対し３容のＱＧ  バッファーを加え５０℃で１０分間加温することにより、ゲルの断片を完全に溶かした。この溶液に、ゲル１容に対しイソプロパノール１容を加えた。以下の手順は室温で行った。スピンカラム（ＤＮＡトラップ用のメンブレンがある）を２ｍｌのコレクションチューブ上においた後、スピンカラムに上記のサンプル溶液を添加した。１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、コレクションチューブにたまった液を除いた。
【０１３３】
この操作をサンプル溶液がなくなるまで繰り返した。次にスピンカラムに０．５ｍｌのＱＧバッファーを加え、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、コレクションチューブに溜まった液を除いた。次にスピンカラムに０．７５ｍｌのＰＥ  バッファーを加え、５分間静置後、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、コレクションチューブにたまった液を除いた。  再度、遠心によりスピンカラムからＰＥ  バッファーを完全に除いた後、スピンカラムを１．５ｍｌのマイクロチューブにおき、５０μｌのＥＢバッファーを加え、１分間静置後、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、溶出したＤＮＡ溶液を回収した。
【０１３４】
（４）  ダイレクトシークエンシング及びＴＡクローニングによるＭＣ１Ｒ遺伝子構造領域上流の塩基配列決定
実施例１に記述した方法と同様にしてＭＣ１Ｒ遺伝子構造領域上流の塩基配列を決定した。その結果、アガロースゲルでの増幅ＤＮＡ断片の確認では、約２．５Ｋｂｐであることが分かった。
【０１３５】
ダイレクトシークエンシングの結果、個体内で変異が存在した場合と、ＰＲＥ１配列でアデニン（Ａ）の繰り返しのため、ダイレクトシークエンシングで配列が確定できなかった場合には、各配列の確定のためＴＡクローニングを行った。ＴＡクローニングにはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いた。以下に方法の概略を示す。
【０１３６】
（１）により得られたＰＣＲ産物１μｌ（１０ｎｇ／μｌ）に１μｌ  のＰＣＲ−ＴＯＰＯ  ベクターを加え、３μｌの滅菌水で計５μｌとし、室温で５分間放置することにより、ＰＣＲ産物のベクターへのライゲーションを行った。Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ｃｅｌｌ（コンピテントセル）のバイアルを氷上に置き、コンピテントセルを解凍した後、２μｌの０．５Ｍ  β−メルカプトエタノールを加え、ピペットで緩やかに混ぜ合わせた。このコンピテントセルに上記のライゲーションを行ったベクターを２μｌ加え、氷上で３０分間放置後、４２℃で３０秒間ヒートショックを行った。２５０μｌのＳＯＣ  培地を加え、３７℃で３０分間培養した後、ＬＢ寒天培地（ＬＢ  ｐｌａｔｅ；  ５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１．６ｍｇ／プレート  Ｘ−ｇａｌ、１ｍｇ／プレート  ＩＰＴＧを含む）に広げ、３７℃でオーバーナイトのインキュベーションを行った。
【０１３７】
インサートの入っている白色のコロニーを、２ｍｌのＬＢ  培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  培地、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）にピックアップし、オーバーナイトで培養した後、プラスミド抽出キット（ＧＦＸＴＭ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ；  ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用い、プラスミドを抽出した。以下に方法の概略を示す。
【０１３８】
培養した大腸菌を２ｍｌのマイクロチューブに入れ、室温で１３，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心することにより集菌した。上清を捨て、大腸菌のぺレットに溶液Ｉを３００μｌ加え、ボルテックスで完全にぺレットをとかした。次に溶液ＩＩを３００μｌ加え、マイクロチューブを１０〜１５回転させた後、溶液ＩＩＩを６００μｌ加え、マイクロチューブを１０〜２０回転させた。室温で１３，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、コレクションチューブ上においたＧＦＸカラムに上清を移し、室温で１分間静置後、室温で１３，０００ｒｐｍ、１分間遠心した。コレクションチューブに溜まった液を捨て、残りの上清をＧＦＸカラムに移し、室温で１分間静置後、室温で１３，０００ｒｐｍ、１分間遠心した。４００μｌの洗浄バッファーをカラムに入れ、室温で１３，０００ｒｐｍ、１分間遠心した後、ＧＦＸカラムを１．５ｍｌのマイクロチューブに移した。プラスミドを溶出させるため、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）をＧＦＸカラムに入れ、室温で１分間静置後、室温で１３，０００ｒｐｍ、１分間遠心し、プラスミド溶液を回収した。
【０１３９】
各ブタ個体（バークシャー種、ハンプシャー種、デュロック種、大ヨークシャー種、ランドレース種、ピエトレン種、メイシャン種、日本イノシシ）について、各３〜１２サンプルずつプラスミドを抽出した。ＰＲＥ１配列のアデニン（Ａ）の並びを明らかにすることができるプライマーを用いて、すなわち、プライマーＭＲ０２７とプライマーＭＲ０２８を用いてアデニン（Ａ）の数を確定した。得られたＤＮＡについてダイレクトシークエンシングを行い、全ての塩基配列を決定した。
【０１４０】
（５）ダイレクトシークエンシングにより決定したＭＣ１Ｒ遺伝子構造領域上流の塩基配列
ＭＣ１Ｒ遺伝子の塩基配列を決定した結果、配列番号１〜５に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。日本イノシシ１頭を調べた結果、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。メイシャン種１頭を調べた結果、配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。デュロック種１頭を調べた結果、配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。ハンプシャー種１頭を調べた結果、配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。大ヨークシャー種、ランドレース種、バークシャー種及びピエトレン種各１頭を調べた結果、配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡを得た。
【０１４１】
配列番号１〜５に示す塩基配列を有するＤＮＡをソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８のマルチアライメント機能を用い、塩基配列の比較を行った。塩基の変異部位を図１に示す。この表は、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡを基準とし、同じ塩基については（−）で、また、異なった塩基についてはその塩基の記号（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔのいずれか）を記した。欠失の場合は（＊）で記した。ここで、１番目の塩基は、ＭＣ１Ｒ遺伝子の翻訳開始コドンの最初の塩基を＋１番とした場合における、−１９６８番目の塩基である。
【０１４２】
（６）図１に示される遺伝的変異
配列番号１〜５に示す塩基配列を有するＤＮＡについて塩基配列の比較を行った。結果、塩基置換の類似性が観察された。例えば配列番号１〜２に示す塩基配列を有するＤＮＡの塩基置換のパターンはよく似ていた（全体で７０箇所の変異のうち、３９箇所が同じ塩基）。これらの配列を有するブタ品種は日本イノシシ、メイシャン種等の東洋を起源とするものであるため、これらの配列は東洋起源と推察される。
【０１４３】
配列番号３〜５に示す塩基配列を有するＤＮＡの塩基置換のパターンはよく似ていた（全体で７０箇所の変異のうち、６３箇所が同じ塩基）。これらの配列を有するブタ品種は大ヨークシャー種、ランドレース種、デュロック種、バークシャー種、ハンプシャー種、ピエトレン種といった西洋を起源とするものであるため、これらの配列は西洋起源と推察される。
【０１４４】
〔実施例６〕ＲＦＬＰ及びＰＣＲ−ＦＬＰ分析によるＭＣ１Ｒ遺伝子の２塩基挿入／非挿入部、黒色検出部及び褐色検出部の多型検出
配列番号１〜５に示す塩基配列について、図１に示す＋６２と＋６３番目の連続するギャップ（塩基配列ＣＣの挿入／非挿入）をＰＣＲ−ＦＬＰ法で、＋３０７番目の多型  ［黒色検出部］と＋７２９番目の多型をＲＦＬＰ法で調べた。本明細書では、この＋６２と＋６３番目の連続するギャップ（挿入／非挿入）を、２塩基挿入／非挿入部と名付けた。また＋３０７番目の多型を黒色検出部、＋７２９番目の多型を褐色検出部と名付けた。
【０１４５】
この検出では、まずＰＣＲ法により多型を含む部分について増幅を行い、２塩基挿入／非挿入部についてはそのまま電気泳動にかけ、また黒色検出部及び褐色検出部については、制限酵素でＤＮＡを切断し、電気泳動によりＤＮＡ断片を確認した。
【０１４６】
（１）  ＰＣＲ増幅及び電気泳動
ＰＣＲのためのＴａｑポリメラーゼはＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ製のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを用いた。ＤＮＡ１００ｎｇを鋳型として、２００μＭ    ｄＮＴＰｓ、１μＭ    フォワードプライマー及び１μＭ    リバースプライマー、１×ＰＣＲ  バッファー、２０ｎｇ  ＢＳＡに、２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを加え、５０μｌの反応液とした。ＰＣＲ機（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００；  ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ製）を用い、熱変性９４℃１０分１サイクルの後、熱変性９４℃３０秒、アニーリングと伸長反応７２℃４０秒を１サイクルとし、これを１０回行った後、熱変性９４℃３０秒、アニーリング６７．５℃１５秒、伸長反応７２℃４０秒を１サイクルとし、これを４０回行った。
【０１４７】
フォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、次のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
ａ）  ２塩基挿入／非挿入部：
プライマー１６１（ＭＲ０３１：  ５’−  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴ  −３’  ［配列番号１２］）  （ｆｏｒｗａｒｄ  Ｔｍ６９．９）
プライマー１６０（ＭＲ０３０：  ５’−  ＴＧＧ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＴＴＧ  ＧＣＧ  ＧＣ  −３’  ［配列番号１３］）（ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｍ７５．１）
ｂ）  黒色検出部：
プライマー２６１（ＭｅｉＦ：  ５’−  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＲＴＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  −３’  ［配列番号６］）（ｆｏｒｗａｒｄ  Ｔｍ７０．６，  Ｒはａとｇで縮重）
プライマー２８２（ＭｒＣ６：  ５’−  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  −３’  ［配列番号７］）（ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｍ８０．２）
ｃ）  褐色検出部：
プライマー２６３（ＤｕＦ：  ５’−  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＣＣ  −３’  ［配列番号８］）（ｆｏｒｗａｒｄ  Ｔｍ７０．４）
プライマー２６４（ＤｕＲ：  ５’−  ＴＧＣ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＡ  −３’  ［配列番号９］）（ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｍ６９．７）
【０１４８】
以上のＰＣＲ条件に基づき、メイシャン種、デュロック種、ハンプシャー種、ランドレース種、バークシャー種、三元交雑ブタ（ランドレース種のメスに大ヨークシャー種のオスを掛け合わせ、その子どものメスに、デュロック種のオスを掛け合わせたブタ）のブタ個体から得たゲノムＤＮＡのそれぞれを鋳型として用いて増幅し、ＰＣＲ産物を調製した。
２塩基挿入／非挿入部に対するＰＣＲ産物については、そのまま次のポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
【０１４９】
黒色検出部と褐色検出部に対するＰＣＲ産物については、次いでまず実施例５に記述したのと同様の方法で、アガロースゲル電気泳動に供して確認を行った。この確認によって示されたＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ、塩基配列から推定される６４ｂｐ及び９６ｂｐと一致していた。続いて、ＰＣＲ増幅済みの反応液１０μｌに対し、制限酵素０．５μｌ、制限酵素に添付されている１０×バッファーを２μｌ加え、滅菌水で２０μｌとして、３７℃でインキュベートすることにより制限酵素処理を行った。制限酵素は、黒色検出部に対してはＡｃｉＩ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ製）、褐色検出部に対してはＨｈａＩ（ニッポンジーン製）を用いた。制限酵素と４時間以上反応させることにより充分に切断したこれらの断片を、続いてポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
【０１５０】
続くポリアクリルアミドゲル電気泳動は、以下の通り行った。泳動装置は日本エイドー製の恒温式２連スラブ電気泳動槽（ＮＡ−１１１３型）を用いた。１０％のポリアクリルアミドゲルプレート（組成は１０％アクリルアミド；アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１、１×ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ）緩衝液）を作製し、ＰＣＲ増幅産物および制限酵素処理したサンプルを１０μｌ添加した。次いで１００ボルトの電圧をかけて電気泳動し、分離したＤＮＡバンドをＥｔＢｒ溶液（ｅｔｈｙｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ；１０μｇ／１００ｍｌ）で染色した。その後紫外線（２６０ｎｍ）をあて、ＤＮＡのバンドを確認した。得られた電気泳動結果を、図２に示す。
【０１５１】
なお、図２中の略語の説明は以下の通りである。
ｍ：  分子量マーカー（２５ｂｐラダーマーカー）
Ｍ：  メイシャン種のゲノムＤＮＡを鋳型として得たＰＣＲ産物
Ｄ：  デュロック種のゲノムＤＮＡを鋳型として得たＰＣＲ産物
Ｂ：  バークシャー種のゲノムＤＮＡを鋳型として得たＰＣＲ産物
Ｈ：  ハンプシャー種のゲノムＤＮＡを鋳型として得たＰＣＲ産物
Ｌ：  ランドレース種のゲノムＤＮＡを鋳型として得たＰＣＲ産物
Ｔ：  三元交雑ブタのゲノムＤＮＡを鋳型として得たＰＣＲ産物
ＨＤはヘテロ鎖（Ｈｅｔｅｒｏ−ｄｕｐｌｅｘ  ｆｏｒｍ）である。
【０１５２】
（２）  多型検出
ａ）  ２塩基挿入／非挿入部
２塩基挿入／非挿入部に対するＰＣＲ産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果は図２ａに示した。
図２ａに示す通り、２塩基挿入／非挿入部に対する上記のＰＣＲ産物は、ブタ品種によって異なる２つのサイズの断片として増幅された。バークシャー種及びランドレース種においては、メイシャン種、デュロック種及びハンプシャー種と比較して長い断片長のＰＣＲ産物が示された。三元交雑ブタにおいては、両方の長さのＰＣＲ産物が示された。
【０１５３】
一方、配列番号２〜５の塩基配列からは、メイシャン種、デュロック種、ハンプシャー種において８１ｂｐのＰＣＲ産物が、また白色種及びバークシャー種においては８３ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されると推定される。図２ａの結果は、この推定断片長と一致するものであった。すなわち図２ａでは、２塩基挿入／非挿入部のアレルが非挿入であるメイシャン種、デュロック種及びハンプシャー種において８１ｂｐのＰＣＲ産物が示され、また２塩基挿入／非挿入部のアレルが２塩基（ＣＣ）挿入であるランドレース種及びバークシャー種において、８３ｂｐのＰＣＲ産物が示された。さらに白色種とデュロック種を交配した三元交雑ブタにおいては、８１ｂｐと８３ｂｐの両方のＰＣＲ産物が示された。なお三元交雑ブタのレーンにみられる最もサイズの大きいバンドは、８３ｂｐと８１ｂｐのＤＮＡ鎖のヘテロ鎖である。
【０１５４】
従って、ＰＣＲ−ＦＬＰ法による検出を行うことにより、２塩基挿入／非挿入部のアレルとして、メイシャン種、デュロック種及びハンプシャー種における非挿入を、白色種及びバークシャー種における２塩基挿入を、検出できることが示された。また三元交雑種においては、２塩基挿入／非挿入部のアレルとして、メイシャン種、デュロック種及びハンプシャー種で検出される非挿入と、白色種及びバークシャー種で検出される２塩基挿入との両方を検出できることが示された。
【０１５５】
ｂ）  黒色検出部
ＰＣＲ産物をＡｃｉＩ処理したサンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図２ｂに示した。
図２ｂに示す通り、黒色検出部に対する上記ＰＣＲ産物のＡｃｉＩ切断断片は、ブタ品種によって異なる２つのサイズの断片として増幅された。メイシャン種においては、デュロック種、バークシャー種、ハンプシャー種、ランドレース種及び三元交雑ブタにはみとめられない、かなり短い断片長のＰＣＲ産物が示された。
【０１５６】
一方、ＡｃｉＩ処理した上記６４ｂｐの断片は、メイシャン種では黒色検出部の配列が塩基置換によってＡｃｉＩ部位となるため３０ｂｐ、１３ｂｐ、１２ｂｐ、９ｂｐの４つのＤＮＡ断片となり、デュロック種、ハンプシャー種、白色種及びバークシャー種では４３ｂｐ、１２ｂｐ、９ｂｐの３つのＤＮＡ断片となることが、塩基配列から推定される。図２ｂの結果は、この推定断片長と一致するものであった。すなわち図２ｂでは、黒色検出部のアレルとして塩基Ｃを有するメイシャン種においては３０ｂｐの断片が、黒色検出部のアレルとして塩基Ｔを有するメイシャン種、デュロック種、バークシャー種、ハンプシャー種及びランドレース種においては４３ｂｐの断片が示された。さらに白色種とデュロック種を交配した三元交雑ブタにおいても、４３ｂｐの断片が示された。
【０１５７】
したがって、ＲＦＬＰ法による検出を行うことにより、黒色検出部のアレルとして、メイシャン種における塩基Ｃを、デュロック種、ハンプシャー種、白色種及びバークシャー種において塩基Ｔを検出できることが示された。また三元交雑ブタにおいても、デュロック種及び白色種で検出される塩基Ｔを検出できることが示された。
【０１５８】
ｃ）  褐色検出部
確認のためのアガロースゲル電気泳動によって示された、褐色検出部に対するＰＣＲ産物のサイズは、塩基配列から推定される９６ｂｐと一致していた。
また、該ＰＣＲ産物をＨｈａＩ処理したサンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果は図２ｃに示した。
【０１５９】
図２ｃに示す通り、褐色検出部に対する上記ＰＣＲ産物のＨｈａＩ切断断片は、ブタ品種によって異なる２つのサイズの断片として増幅された。メイシャン種、バークシャー種、ハンプシャー種及びランドレース種においては、デュロック種にはみとめられない、かなり短い断片長のＰＣＲ産物が示された。三元交雑ブタでは、両方の長さのＰＣＲ産物が示された。
【０１６０】
一方、ＨｈａＩ処理した上記９６ｂｐの断片は、メイシャン種、バークシャー種、ハンプシャー種及びランドレース種では褐色検出部の配列がＨｈａＩにより切断されるため、４８ｂｐの２つのＤＮＡ断片となることが推定される（実際には、ＨｈａＩの切断により２塩基の付着端が生じるため、ＤＮＡ鎖の端末から数えると４７ｂｐと４９ｂｐの断片となるが、電気泳動では単鎖となった付着端部分が相殺されるため、見かけ上４８ｂｐの２つのＤＮＡ断片となる）。一方、デュロック種では、褐色検出部の配列が塩基置換によってＨｈａＩで切断されなくなるため、９６ｂｐの断片のままであると推定される。図２ｃの結果は、この推定断片長と一致するものであった。すなわち図２ｃでは、褐色検出部のアレルとして塩基Ｇを有するメイシャン種、バークシャー種、ハンプシャー種及びランドレース種においては９６ｂｐの断片が、褐色検出部のアレルとして塩基Ａを有するデュロック種においては４８ｂｐの断片が示された。さらに白色種とデュロック種を交配した三元交雑ブタにおいては、９６ｂｐと４８ｂｐの両方のＰＣＲ産物が示された。
【０１６１】
したがって、ＲＦＬＰ法による検出を行うことにより、褐色検出部のアレルとして、メイシャン種、バークシャー種、ハンプシャー種及び白色種における塩基Ｇを、デュロック種における塩基Ａを検出できることが示された。また三元交雑種においては、褐色検出部のアレルとして、デュロック種で検出される塩基Ａと、白色種で検出される塩基Ｇとの両方を検出できることが示された。
【０１６２】
本実施例においては、ＭＣ１Ｒ遺伝子の３つの遺伝子多型（２塩基挿入／非挿入部、黒色検出部及び褐色検出部）についての上記のようなＲＦＬＰ及びＰＣＲ−ＦＬＰ分析を、さらに、大ヨークシャー種４１頭、ランドレース種８６頭、デュロック種３３頭、メイシャン種３９頭、バークシャー種１１４頭（日本バークシャー５６頭、アメリカバークシャー５８頭）、ハンプシャー種２８頭の計３４１頭から得たＤＮＡサンプルについて行い、各ブタ品種が有するアレルを確認した。その結果、大ヨークシャー、ランドレースおよびバークシャーでは、すべての個体で配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡを保持していると考えられた。一方、メイシャンは配列番号２、デュロックは配列番号３、ハンプシャーは配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡを保持していると考えられた。これらの結果から、各ブタ品種は、ＭＣ１Ｒ遺伝子の上記３つの遺伝子多型について、上述のアレルをほぼ１００％の確率で有することが示された。
【０１６３】
〔実施例７〕ＰＣＲ−ＲＦＬＰ及びＰＣＲ−ＦＬＰ法による白色検出部及び４塩基欠失／非欠失部の多型検出
ＫＩＴ遺伝子の塩基配列は、特許第３１１６０４９号明細書において報告されている部分塩基配列を利用する。また白色種では、ＫＩＴ遺伝子が重複していること、及びＫＩＴ遺伝子の少なくとも一方には、白色検出部のアレルとして塩基Ａ、４塩基欠失／非欠失部のアレルとして塩基配列ＡＧＴＴの欠失が存在することが知られている。
【０１６４】
本明細書では、基準種とする日本イノシシのＫＩＴ遺伝子の部分配列を配列番号５７として示す。本発明のブタの品種の識別法に用いるＫＩＴ遺伝子の遺伝子多型、白色検出部と４塩基欠失／非欠失部の多型部位は、それぞれ配列番号５７に示される塩基番号１３１３及び塩基番号３８８４〜３８８７の位置に存在する。
【０１６５】
本検出は、基本的には実施例６と同様にして行った。
（１）  ＰＣＲ増幅及び電気泳動
フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、次のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
ａ）  白色検出部：
プライマー１６２（ＷｈｉｔｅＦ：  ５’−  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＧＴＣ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＴＧＧ  −３’：  配列番号１０；１２８５番）（ｆｏｒｗａｒｄ  Ｔｍ６８．１）
プライマー１３０（ＷｈｉｔｅＲ：  ５’−  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＧＴＣ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＧＣＧ  ＴＧＧ  −３’：  配列番号１１；１３４１番）（ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｍ７０．９）
ｂ）  ４塩基欠失／非欠失部：
プライマー１３５（Ｋｉｔ４ｇＦ：５’−  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＴＣ  −３’：  配列番号１４；３８６４番）（ｆｏｒｗａｒｄ  Ｔｍ６９．５）
プライマー１６４（Ｋｉｔ４ｇＲ：５’−  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  ＡＡ  −３’：  配列番号１５；３９２７番）（ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｍ６９．６）
なおカッコ内の番号は、配列番号５７に示す塩基配列の最初の塩基を１番とした場合の、プライマーの５’端の塩基がハイブリダイズする位置の番号である。
【０１６６】
ＰＣＲ反応は、次の設定で行った。すなわち、熱変性９４℃１０分１サイクルの後、熱変性９４℃３０秒、アニーリング６５℃１５秒、伸長反応７２℃４０秒を１サイクルとし、これを１０回行った後、熱変性９４℃３０秒、アニーリング６２℃１５秒、伸長反応７２℃４０秒を１サイクルとし、これを３０回行った。
ＰＣＲ増幅のための条件は、上記以外の事項については実施例６と同様にして行った。
次いで、４塩基欠失／非欠失部に対するＰＣＲ産物については、そのまま次のポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
【０１６７】
また白色検出部に対するＰＣＲ産物については、まず実施例５に記述したのと同様の方法で、アガロースゲル電気泳動に供して確認を行った。この確認によって示されたＰＣＲ産物のサイズは、塩基配列から推定される５７ｂｐと一致していた。続いてこのＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｌａＩＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いて実施例６と同様の手順で制限酵素処理し、得られた処理断片を次にポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。この電気泳動も、実施例６と同様にして行った。得られた電気泳動結果を図３に示す。図３中の略語の意味は、図２と同じである。
【０１６８】
（２）  多型の検出
ａ）  白色検出部
白色検出部に対するＰＣＲ産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果は図３ａに示した。
図３ａに示す通り、白色検出部に対する上記のＰＣＲ産物については、ブタ品種によって増幅される断片のサイズが異なっていた。ランドレース種及び三元交雑ブタにおいては、メイシャン種、デュロック種、バークシャー種及びハンプシャー種と同じ断片長のＰＣＲ産物に加えて、それらの品種にはみとめられない短い断片長のＰＣＲ産物が示された。
【０１６９】
一方、ランドレース種を含む白色種では、重複した一方のＫＩＴ遺伝子の白色検出部の配列が塩基置換によってＮｌａＩＩＩ部位となるため、ＮｌａＩＩＩ処理した上記６４ｂｐの断片は２８ｂｐと２９ｂｐの２つのＤＮＡ断片となることが、配列番号５７の塩基配列から推定される（具体的にはＮｌａＩＩＩの切断により、４塩基の付着端が生じ、ＤＮＡ鎖の端末からでは２６ｂｐと３１ｂｐの断片となるが、電気泳動では単鎖となった付着端部分が相殺されるため、見かけ上２８ｂｐと２９ｂｐの２つのＤＮＡ断片となる）。白色種におけるもう一方のＫＩＴ遺伝子、並びにメイシャン種、デュロック種、バークシャー種及びハンプシャー種のＫＩＴ遺伝子については、白色検出部の配列はＮｌａＩＩＩにより切断されないため、５７ｂｐの断片のままであると推定される。すなわち、白色種の場合、５７ｂｐの断片の他に、２８ｂｐと２９ｂｐの断片が出現するが、有色種の場合は２８ｂｐと２９ｂｐの断片は示されない。図３ａの結果は、この推定断片長と一致するものであった。すなわち図３ａでは、白色検出部のアレルとして塩基Ｇと塩基Ａの両方を有するランドレース種においては５７ｂｐ、２８ｂｐ及び２９ｂｐの断片が、白色検出部のアレルとして塩基Ｇを有するメイシャン種、デュロック種、バークシャー種及びハンプシャー種においては２８ｂｐと２９ｂｐの断片が示された。また白色種とデュロック種を交配した三元交雑ブタにおいても、５７ｂｐ、２８ｂｐ及び２９ｂｐの断片が示された。
【０１７０】
したがって、ＰＣＲ−ＦＬＰ法による検出を行うことにより、白色検出部のアレルとして、白色種において塩基Ｇと塩基Ａの両方を、メイシャン種、デュロック種、バークシャー種及びハンプシャー種において塩基Ｇを検出できることが示された。また三元交雑ブタにおいても、デュロック種と白色種で検出される塩基Ｇと白色種で検出される塩基Ａの両方を検出できることが示された。
【０１７１】
ｂ）  ４塩基欠失／非欠失部
４塩基欠失／非欠失部に対するＰＣＲ産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果は図３ｂに示した。
図３ｂに示す通り、４塩基欠失／非欠失部に対する上記のＰＣＲ産物については、ブタ品種によって増幅される断片のサイズが異なっていた。ランドレース種及び三元交雑ブタにおいては、メイシャン種、デュロック種、バークシャー種及びハンプシャー種と同じ断片長のＰＣＲ産物に加えて、それらの品種にはみとめられない短い断片長のＰＣＲ産物が示された。
【０１７２】
一方、配列番号５７の塩基配列に基づく算出により、メイシャン種、デュロック種、バークシャー種及びハンプシャー種において６４ｂｐのＰＣＲ産物が、また白色種においては６０ｂｐと６４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されると推定される。図３ｂの結果は、この推定断片長と一致するものであった。すなわち図３ｂでは、４塩基欠失／非欠失部のアレルとして塩基配列ＡＧＴＴの欠失を有するランドレース種において、６０ｂｐと６４ｂｐのＰＣＲ産物が示され、また４塩基欠失／非欠失部のアレルとして非欠失のみを有するメイシャン種、デュロック種、バークシャー種及びハンプシャー種において、６４ｂｐのＰＣＲ産物が示された。さらに白色種とデュロック種を交配した三元交雑ブタにおいても、６０ｂｐと６４ｂｐのＰＣＲ産物が示された。なお三元交雑ブタのレーンにみられるサイズの大きい２つのバンドは、６０ｂｐと６４ｂｐのＤＮＡ鎖のヘテロ鎖である。
【０１７３】
従って、ＰＣＲ−ＦＬＰ法による検出を行うことにより、４塩基欠失／非欠失部のアレルとして、白色種において４塩基の欠失と非欠失との両方を、メイシャン種、デュロック種、バークシャー種及びハンプシャー種において非欠失を、検出できることが示された。また三元交雑種においては、４塩基欠失／非欠失部のアレルとして、白色種で検出される４塩基の欠失と、メイシャン種、デュロック種、バークシャー種、ハンプシャー種及び白色種で検出される非欠失との両方を検出できることが示された。
【０１７４】
本実施例においては、ＫＩＴ遺伝子の２つの遺伝子多型（白色検出部及び４塩基欠失／非欠失部）についての上記のようなＲＦＬＰ及びＰＣＲ−ＦＬＰ分析を、さらに、大ヨークシャー種４１頭、ランドレース種８６頭、デュロック種３３頭、メイシャン種３９頭、バークシャー種１１４頭（日本バークシャー５６頭、アメリカバークシャー５８頭）、ハンプシャー種２８頭の計３４１頭から得たＤＮＡサンプルについて行い、各ブタ品種が有するアレルを確認した。白色検出部についての制限酵素ＮｌａＩＩＩを用いたＲＦＬＰ分析では、大ヨークシャー種の全個体と、ランドレース種の８２個体で、５７ｂｐ、３１ｂｐ、２６ｂｐの３つのＤＮＡ断片となった。一方、有色種である他の品種（メイシャン種、デュロック種、バークシャー種、ハンプシャー種）では、全て５７ｂｐの１つのＤＮＡ断片となった。さらに、４塩基欠失／非欠失部についてのＰＣＲ−ＦＬＰ分析の場合、大ヨークシャー種およびランドレース種の全個体で、６４ｂｐ、６０ｂｐの２つのＤＮＡ断片となった。一方、有色種である他の品種（メイシャン種、デュロック種、バークシャー種、ハンプシャー種）では、全て６４ｂｐの１つのＤＮＡ断片となった。これらの結果から、各ブタ品種は、ＫＩＴ遺伝子の上記２つの遺伝子多型について、上述のアレルをほぼ１００％の確率で有することが示された。すなわち、白色検出部及び４塩基欠失／非欠失部のアレルを利用することによって、ほぼ１００％の確率で白色種を識別できることが示された。
【０１７５】
〔実施例８〕ＤＮＡチップの作製
本実施例では、アルデヒド基でコーティングしたスライドガラス（シリレイトガラス）に、アミノ基で修飾した２０種類のオリゴＤＮＡ（２塩基挿入／非挿入部、黒色検出部、褐色検出部、白色検出部及び４塩基欠失／非欠失部のアレイを含むオリゴヌクレオチド）をスポットし、アルデヒド基とアミノ基を共有結合させることにより、オリゴＤＮＡをガラス基板上に固定した。アミノ化オリゴＤＮＡは通常の化学合成により得た。
【０１７６】
使用したアミノ化オリゴＤＮＡを以下に示す。
〔１〕２塩基挿入／非挿入部のアレイ検出用
ＤＣ１３６：  ５’−  ＣＡＧ  ＣＣＧ  −−Ｃ  ＣＣＣ  ＣＣＧ  ＣＣ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号１６］  非挿入検出
ＤＣ１３４：  ５’−  Ｃ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  −−Ｃ  ＣＣＣ  ＣＣＧ  ＣＣ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号１７］  非挿入検出
ＤＣ１３５：  ５’−  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＣＧ  Ｃ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号１８］  塩基配列ＣＣ挿入検出
ＤＣ１３２：  ５’−  Ｃ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＣＧ  Ｃ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号１９］  塩基配列ＣＣ挿入検出
〔２〕黒色検出部のアレイ検出用
ＤＣ１０：  ５’−  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  Ａ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号２０］  塩基Ｃ検出
ＤＣ６９：  ５’−  Ｇ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  Ａ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号２１］  塩基Ｃ検出
ＤＣ１１：  ５’−  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  Ａ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号２２］  塩基Ｔ検出
ＤＣ３２：  ５’−  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号２３］  塩基Ｔ検出
〔３〕褐色検出部のアレイ検出用
ＤＣ３７：  ５’−  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＡ  Ｇ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号２４］  塩基Ａ検出
ＤＣ７６：  ５’−  Ａ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＡ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号２５］  塩基Ａ検出
ＤＣ３６：  ５’−  Ａ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＡ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号２６］  塩基Ｇ検出
ＤＣ７４：  ５’−  ＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＡ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号２７］  塩基Ｇ検出
ＤＣ１３０：  ５’−  ＧＡ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号２８］  塩基Ｇ検出
ＤＣ１３１：  ５’−  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＡ  ＧＧ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号２９］  塩基Ｇ検出
〔４〕白色検出部のアレイ検出用
ＤＣ２０：  ５’−  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  Ｃ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号３０］  塩基Ａ検出
ＤＣ８３：  ５’−  Ｃ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  Ｃ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号３１］  塩基Ａ検出
ＤＣ４１：  ５’−  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  Ｃ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’［配列番号３２］  塩基Ｇ検出
ＤＣ８０：  ５’−  Ｃ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  Ｃ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号３３］  塩基Ｇ検
出
〔５〕４塩基欠失／非欠失部のアレイ検出用
ＤＣ３１：  ５’−  ＣＡ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号３４］  塩基配列ＡＧＴＴ非欠失検出
ＤＣ１１１：  ５’−  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  −−−  −ＧＡ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＴＴ  （６ＣＨ２）ＮＨ２  −３’  ［配列番号３５］  ４塩基欠失検出
【０１７７】
これらのオリゴＤＮＡは、オリゴヌクレオチドに、スぺーサーとして３’端にＣＨ２基を６個直鎖で挿入した後、アミノ基（ＮＨ２）を付加したものである。
上記のアミノ化オリゴＤＮＡをシリレイトガラス上にスポッティングするために、日立ソフト製のＳＰＢＩＯ２０００を用いた。ＢＭ機器製のスポッティング液、ＡｒｒａｙＩｔ  Ｍｉｃｒｏ−ｓｐｏｔｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＳＳ−１）にアミノ化オリゴＤＮＡを２０ｐｍｏｌ／μｌとなるように溶かし、径が５４０ミクロンのスポットピンを用い、ＢＭ機器製のシリレイトガラス（ＣＣＳ−２５）上に各アミノ化オリゴＤＮＡをスポットした。スライドガラス上へのアミノ化オリゴＤＮＡのスポット位置は図４に記した。
スポッティング後、２４時間室温で自然乾燥させ、次に示す工程によりガラスの加工を行った。
【０１７８】
ＡｒｒａｙＩｔ  Ｗａｓｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ（ＢＭ機器製：ＡＷ−１）に乾燥後のスライドガラスをセットした後、６００ｍｌのビーカーにスターラーを入れＷａｓｈ  Ｓｔａｔｉｏｎを入れた。ビーカーを０．２％  ＳＤＳで充たし、室温で２〜５分間スターラーで撹拌する。この工程は０．２％  ＳＤＳを交換して２回繰り返した。次にビーカーを蒸留水で充たし、室温で２〜５分間スターラーで撹拌する。この工程は蒸留水を交換して２回繰り返した。次にビーカーを沸騰した蒸留水で充たし、ホットスターラーで９５℃以上に保ちながら、２分間撹拌した後、蒸留水（室温）に交換し、室温で１〜５分撹拌した。次にＳｏｄｉｕｍ  ｂｏｒｏｈｙｂｒｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（還元用液：１．３ｇのＮａ２ＢＨ４をＰＢＳ  ３７５ｍｌに溶かし、１２５ｍｌのエタノールを加えて作製）にＷａｓｈ  Ｓｔａｔｉｏｎごとスライドガラスを入れ、室温で５分間スターラーで撹拌した。次にビーカーを０．２％  ＳＤＳで充たし、室温で１分間スターラーで撹拌した。この工程は０．２％  ＳＤＳを交換して３回繰り返した。次にビーカーを蒸留水で充たし、室温で１分間スターラーで撹拌した。この工程は蒸留水を交換して２回繰り返した。その後、スライドガラスを取り出して空気乾燥させた。
【０１７９】
〔実施例９〕ターゲットＤＮＡのＰＣＲ合成と回収
鋳型ＤＮＡとしては、メイシャン種、デュロック種、バークシャー種、ハンプシャー種、ランドレース種及び三元交雑種（ランドレース種のメスに大ヨークシャー種のオスを掛け合わせ、その子どものメスに、デュロック種のオスを掛け合わせたもの）の各１個体から常法により抽出したゲノムＤＮＡを、それぞれサンプルとして用いた。
【０１８０】
ＰＣＲのためのＴａｑポリメラーゼはＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ製のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを用いた。ＤＮＡ１００ｎｇを鋳型とし、２００μＭ    ｄＮＴＰｓとした。また５’Ｃｙ３化蛍光標識プライマーと５’ビオチン化プライマーを１μＭとしてセットで用い、増幅を行った。なお、５’ビオチン化プライマーは５’ｂｉｏ、５’Ｃｙ３蛍光化プライマーは５’Ｃｙ３と記した。
【０１８１】
ＰＣＲのためのＴａｑポリメラーゼはＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを用いた。ＤＮＡ１００ｎｇを鋳型として、２００μＭ    ｄＮＴＰｓ、１μＭ    プライマー（上記５’Ｃｙ３化−５’ｂｉｏ化プライマーのセット）、１×ＰＣＲ  バッファー、２０ｎｇ  ＢＳＡに、２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを加え、５０μｌの反応液とした。
【０１８２】
（１）ＭＣ１Ｒ遺伝子の増幅
用いたプライマーは以下の通りである。
プライマー２８３（ＭＲＯ３１−ｂｉｏ：５’ｂｉｏ：配列番号３６）及びプライマー２７５（ＭＲＯ３０−Ｃｙ３：５’Ｃｙ３：配列番号３７）。このプライマーセットによりＭＣ１Ｒ遺伝子の２塩基挿入／非挿入部を含む領域を増幅できる。
プライマー２７８（Ｍｅｉｂｉｏ：５’ｂｉｏ：配列番号３８）及びプライマー１３６（ＭｒＣ６−Ｃｙ３：５’Ｃｙ３：配列番号３９）。このプライマーセットによりＭＣ１Ｒ遺伝子の黒色検出部を含む領域［メイシャン種識別部分］を増幅できる。
【０１８３】
プライマー２８０（ＤｕＣｙ３：５’Ｃｙ３：配列番号４０）及びプライマー２８１（Ｄｕｂｉｏ：５’ｂｉｏ：配列番号４１）。このプライマーセットによりＭＣ１Ｒ遺伝子の褐色検出部を含む領域［デュロック種識別部分］を増幅できる。
【０１８４】
ＰＣＲ機（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００；  ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ製）を用い、熱変性９４℃１０分１サイクルの後、熱変性９４℃３０秒、アニーリングと伸長反応７２℃４０秒を１サイクルとし、これを１０回行った後、熱変性９４℃３０秒、アニーリング６７．５℃１５秒、伸長反応７２℃４０秒を１サイクルとし、これを４０回行った。
【０１８５】
（２）ＫＩＴ遺伝子の増幅
用いたプライマーは以下の通りである。
プライマー２５９（ＣｈｐＫ５Ｆ：５’ｂｉｏ：配列番号４２）及びプライマー１３０（ＫｔＣ１−Ｃｙ３：５’Ｃｙ３：配列番号４３）。このプライマーセットによりＫＩＴ遺伝子の白色検出部を含む領域［白色種（ランドレース、大ヨークシャー）識別部分］を増幅できる。
【０１８６】
プライマー１３５（ＫｔＣ６−Ｃｙ３：５’Ｃｙ３：配列番号４４）およびプライマー２６０（ＣｈｐＫ７Ｒ：５’ｂｉｏ：配列番号４５）。このプライマーセットによりＫＩＴ遺伝子の４塩基欠失／非欠失部［白色種（ランドレース、大ヨークシャー）識別部分］を増幅できる。
【０１８７】
ＰＣＲ機（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００；  ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ製）を用い、熱変性９４℃１０分１サイクルの後、熱変性９４℃３０秒、アニーリング６５℃１５秒、伸長反応７２℃４０秒を１サイクルとし、これを１０回行った後、熱変性９４℃３０秒、アニーリング６２℃１５秒、伸長反応７２℃４０秒を１サイクルとし、これを３０回行った。
【０１８８】
〔実施例１０〕ＤＮＡチップ上でのプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーション
（１）ＰＣＲ増幅産物の回収
各サンプルについて上記の５つのプライマーセットで目的のＤＮＡ断片を増幅させ、反応後にそれを１．５ｍｌのチューブ１本にまとめた。よく撹拌したストレプトアビジンセファロース（ファルマシア：１７−５１１３−０１）を４０μｌ加え、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ｛１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．６，  ２Ｍ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｝を１，２００μｌ（５倍量）加えた。１５分間撹拌し、セファロース側のアビジンとプライマー側のビオチンを結合させた。その後Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣの上部カラムに撹拌した液を入れ、３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、セファロース（増幅したＰＣＲ産物はビオチン−アビジン結合を介してセファロースと結合している）を回収した。上部カラムで回収したセファローズは、３，０００ｒｐｍで１分間の遠心により水分をよくきり、下部のチューブにたまったフロースルー液は捨てた。上部カラムのセファロースに０．２Ｎ  ＮａＯＨを１５０〜２００μｌ加え撹拌し、２本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物を１本鎖に解離させた。Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣを３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。１本鎖に解離したＣｙ３蛍光化ＰＣＲ増幅産物が下のチューブにたまるため、フロースルーがピンク色となる。カラムのセファロースが白色となり、蛍光化ＰＣＲ増幅産物がなくなったことをを確認した。ピンク色に着色したフロースルーをマイクロコン１０  ｛Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ａｍｉｃｏｎ：  ＹＭ−１０，カタログ番号４２４０７（１００）｝に入れ、中和Ｂｕｆｆｅｒ｛１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．６｝でカラムを満たし、１３，０００ｒｐｍで４０分間遠心した。フロースルーを捨て、中和Ｂｕｆｆｅｒ｛１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．６｝で上部カラムを満たし、さらに１３，０００ｒｐｍで４０分間遠心した。上部カラムの液量が２０〜５０μｌ程度に濃縮された後、マイクロコンの上部カラムを逆さにして、新しいチューブに入れ、５，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濃縮したＣｙ３蛍光化１本鎖プローブＤＮＡを回収した。
【０１８９】
（２）ハイブリダイゼーション
回収したプローブＤＮＡを４μｌとり、Ｕｎｉｈｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＭ機器製：ＵＨＳ−１）１６μｌを３０秒間６５℃で温めた後に加え、ピペッティングにより撹拌した。そのプローブＤＮＡ液２０μｌをＤＮＡチップスライドガラス上にのせ、カバーガラスをかけた。この時、カバーガラスとスライドガラスの間に空気が入らないようにした。カバーガラスをかけた後、３０μｌの蒸留水（カセット内の湿度を上げるためのもの）の入ったＡｒｒａｙＩｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＢＭ機器製：ＴＨＣ−１）に入れ、６０度で２〜４時間ハイブリダイゼーションを行った。
【０１９０】
〔実施例１１〕ハイブリダイゼーション後のスライドガラス洗浄と蛍光検出
ハイブリダイゼーションの後、ＡｒｒａｙＩｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅからスライドガラスを取り出し、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（１×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ）に浸しカバーガラスが自然に外れるようにした。その後、スライドガラスをＷａｓｈ  Ｓｔａｔｉｏｎにセットし、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（０．１×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ）で満たしたビーカーに入れ、室温で５分間スターラーで撹拌した。次にＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（０．１×ＳＳＣ）で満たされたビーカーに直ちに移し、室温で５分間スターラーで撹拌した。その後、スライドガラスを取り出して乾燥させた後、蛍光の検出を行った。
【０１９１】
蛍光検出はＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製のＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｌｉｔｅを用いた。共焦点レーザーでスキャン画像が鮮明に取り込めるように焦点を合わせ、解像度２０ミクロン、蛍光の強いスポット光が飽和する程度にレーザー強度を調節しスキャンを行った。スキャン画像はハードディスクにそのまま保存した。
【０１９２】
〔実施例１２〕検出結果と品種の特定
上述のＤＮＡチップを用いた検出の結果、得られた蛍光読み取り像を図５に示す。
（１）メイシャン種
図５の蛍光像と図４のオリゴＤＮＡのスポット位置を合わせて判断すると、強い蛍光シグナルが得られたアレルは以下の通りであった。
〔１〕２塩基挿入／非挿入部：  非挿入
〔２〕黒色検出部：  塩基Ｃ
〔３〕褐色検出部：  塩基Ｇ
〔４〕白色検出部：  塩基Ｇ
〔５〕４塩基欠失／非欠失部：  塩基配列ＡＧＴＴの非欠失
このアレルの組み合わせを表５と照らし合わせると、本検出結果は表５のメイシャン種の組み合わせと一致した。
【０１９３】
（２）デュロック種
図５の蛍光像と図４のオリゴＤＮＡのスポット位置を合わせて判断すると、強い蛍光シグナルが得られたアレルは以下の通りであった。
〔１〕２塩基挿入／非挿入部：  非挿入
〔２〕黒色検出部：  塩基Ｔ
〔３〕褐色検出部：  塩基Ａ
〔４〕白色検出部：  塩基Ｇ
〔５〕４塩基欠失／非欠失部：  塩基配列ＡＧＴＴの非欠失
このアレルの組み合わせを表５と照らし合わせると、本検出結果は表５のデュロック種の組み合わせと一致した。
【０１９４】
（３）バークシャー種
図５の蛍光像と図４のオリゴＤＮＡのスポット位置を合わせて判断すると、強い蛍光シグナルが得られたアレルは以下の通りであった。
〔１〕２塩基挿入／非挿入部：  塩基配列ＣＣの挿入
〔２〕黒色検出部：  塩基Ｔ
〔３〕褐色検出部：  塩基Ｇ
〔４〕白色検出部：  塩基Ｇ
〔５〕４塩基欠失／非欠失部：  塩基配列ＡＧＴＴの非欠失
このアレルの組み合わせを表５と照らし合わせると、本検出結果は表５のバークシャー種の組み合わせと一致した。
【０１９５】
（４）ハンプシャー種
図５の蛍光像と図４のオリゴＤＮＡのスポット位置を合わせて判断すると、強い蛍光シグナルが得られたアレルは以下の通りであった。
〔１〕２塩基挿入／非挿入部：  非挿入
〔２〕黒色検出部：  塩基Ｔ
〔３〕褐色検出部：  塩基Ｇ
〔４〕白色検出部：  塩基Ｇ
〔５〕４塩基欠失／非欠失部：  塩基配列ＡＧＴＴの非欠失
このアレルの組み合わせを表５と照らし合わせると、本検出結果は表５のハンプシャー種の組み合わせと一致した。
【０１９６】
（５）ランドレース種（白色種）
図５の蛍光像と図４のオリゴＤＮＡのスポット位置を合わせて判断すると、強い蛍光シグナルが得られたアレルは以下の通りであった。
〔１〕２塩基挿入／非挿入部：  塩基配列ＣＣの挿入
〔２〕黒色検出部：  塩基Ｔ
〔３〕褐色検出部：  塩基Ｇ
〔４〕白色検出部：  塩基Ｇ及び塩基Ａ
〔５〕４塩基欠失／非欠失部：  塩基配列ＡＧＴＴの非欠失、及び４塩基欠失
このアレルの組み合わせを表５と照らし合わせると、本検出結果は表５の白色種の組み合わせと一致した。
【０１９７】
（６）三元交雑種（白色種×白色種×デュロック種）
図５の蛍光像と図４のオリゴＤＮＡのスポット位置を合わせて判断すると、強い蛍光シグナルが得られたアレルは以下の通りであった。
〔１〕２塩基挿入／非挿入部：  塩基配列ＣＣの挿入、及び非挿入
〔２〕黒色検出部：  塩基Ｔ
〔３〕褐色検出部：  塩基Ｇ及び塩基Ａ
〔４〕白色検出部：  塩基Ｇ及び塩基Ａ
〔５〕４塩基欠失／非欠失部：  塩基配列ＡＧＴＴの非欠失、及び４塩基欠失
【０１９８】
このアレルの組み合わせを表５と照らし合わせると、本検出結果は表５の白色種とデュロック種のそれぞれの組み合わせを足し合わせたものと一致した。なお、この三元交雑種の検出結果の判断においては、まず、白色種に特徴的な「４塩基欠失（４塩基欠失／非欠失部）」が検出されていることから、白色種の関与が示された。さらに、デュロック種に特徴的な「塩基Ａ（褐色検出部）」が検出されていることから、デュロック種の関与が示された。一方、メイシャン種に特徴的な「塩基Ｃ（黒色検出部）」についてはメイシャン種で検出されたような強いシグナルは示されなかった。このように、三元交雑種において検出されたアレルの組み合わせは、白色種とデュロック種の交配への関与を示した。
【０１９９】
【発明の効果】
本発明によれば、５つの遺伝子多型のアレルの組み合わせから、メイシャン種、デュロック種、ハンプシャー種、白色種及びバークシャー種、並びにそれらのうちの２種以上を用いた交雑種を、相互に識別することが可能である。これらの品種は産業上利用されているブタ品種のほぼ１００％を占めるため、これらを相互に識別できることは非常に有用である。また、本発明の固相担体は、本発明の識別法に好適に用いることができるためだけでなく、１つの検出系で上記ブタ品種全てを識別できるため、商業的に提供する上で特に好適なツールとして用いることができる。
【０２００】
【配列表】
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【０２０１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号６〜５６は合成ＤＮＡである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＣ１Ｒ遺伝子とその上流域の塩基配列におけるブタ品種間の多型を示す図である。塩基番号は翻訳開始点を＋１とした場合の番号。＊印は欠失を示し、−印はニホンイノシシ（Ｊｐｎ．ＷＰ）の塩基と同じであったことを示す。
【図２】各ブタ品種のＭＣ１Ｒ遺伝子のＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＦＬＰ法による解析結果を示す写真である。左から順に２塩基挿入／非挿入部の断片長多型、黒色検出部を含む増幅断片の制限酵素ＡｃｉＩによる切断断片長多型、褐色検出部を含む増幅断片の制限酵素ＨｈａＩによる切断断片長多型を示す。ＨＤは８３ｂｐと８１ｂｐのＤＮＡ鎖のヘテロ鎖である。左レーンから、ｍ（２５ｂｐラダーマーカー）、Ｍ（メイシャン種）、Ｄ（デュロック種）、Ｂ（バークシャー種）、Ｈ（ハンプシャー種）、Ｌ（ランドレース種）、Ｔ（ｔｈｒｅｅ  ｗａｙ  ｃｒｏｓｓ：三元交雑ブタ）、ｍ（２５ｂｐラダーマーカー）。
【図３】各ブタ品種のＫＩＴ遺伝子のＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＦＬＰ法による解析結果を示す写真である。左から順に白色検出部を含む増幅断片の制限酵素ＮｌａＩＩＩによる切断断片長多型、４塩基欠失／非欠失部の断片長多型を示す。ＨＤは６０ｂｐと６４ｂｐのＤＮＡ鎖のヘテロ鎖である。左レーンから、ｍ（２５ｂｐラダーマーカー）、Ｍ（メイシャン種）、Ｄ（デュロック種）、Ｂ（バークシャー種）、Ｈ（ハンプシャー種）、Ｌ（ランドレース種）、Ｔ（ｔｈｒｅｅ  ｗａｙ  ｃｒｏｓｓ：三元交雑ブタ）、ｍ（２５ｂｐラダーマーカー）。
【図４】ＤＮＡチップ上に貼り付けたアミノ化オリゴＤＮＡの配置を示す模式図である。各スポットに対応する枠内には、チップに固定したアミノ化オリゴＤＮＡの名称、さらに括弧内にはそのオリゴＤＮＡにより検出されるアレルを示す。
【図５】ＤＮＡチップ上で、各品種１個体分のターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせ、蛍光検出した結果である。左上；メイシャン種、右上；デュロック種、左中；バークシャー種、右中；ハンプシャー種、左下；ランドレース種、右下；三元交雑種。
【図１】
2004154024.tif 000048
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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