(57)【要約】【課題】新規な骨吸収抑制活性を有する化合物を見出すこと。【解決手段】下記式（Ｉ）【化１】2004099462.tif 000021（式中、Ｒ１は水素原子または炭素数１乃至６のアルキル基を表し、Ｒ２は３−シクロヘプテニル基またはシクロヘプチル基を表し、Ｒ３はフェニル基またはシクロヘキシル基を表し、Ｒ４はフェニル基またはシクロヘキシル基を表す）で表わされる化合物またはその塩。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
2004099462.tif 000020
（式中、Ｒ１は水素原子または炭素数１乃至６のアルキル基を表し、Ｒ２は３−シクロヘプテニル基またはシクロヘプチル基を表し、Ｒ３はフェニル基またはシクロヘキシル基を表し、Ｒ４はフェニル基またはシクロヘキシル基を表す）で表わされる化合物またはその塩。
【請求項２】
請求項１記載の式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が３−シクロヘプテニル基であり、Ｒ３がフェニル基であり、Ｒ４がフェニル基である化合物またはその塩。
【請求項３】
下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）物質の性状：白色粉末；
２）［α］２０Ｄ−５６．９°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：クロロホルム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可溶、アセトン、酢酸エチルに易溶、水に不溶；
４）アミノ酸分析：加水分解物としてフェニルアラニンおよびプロリンが認められた；
５）分子式：Ｃ４３Ｈ５６Ｎ８Ｏ７；
６）分子量：　７９６（ＦＡＢ−ＭＳ法）
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ４３Ｈ５６Ｎ８Ｏ７Ｎａとして）
実測値：８１９．４１８４
計算値：８１９．４１７０；
６）紫外線吸収スペクトル：末端吸収；
８）赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠剤中νｍａｘ　ｃｍ−１）：
３２５６、３０２６、２９２７、１６３７、１５４３、１４９７、１４４４、１４０５、１２５２、９２０、７４３、７００；
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；　δ　（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中重クロロホルムの溶媒スペクトルを内部基準として測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は、次に示す通りである；
１７３．７（ｓ），１７３．４（ｓ），１７１．７（ｓ），１７１．１（ｓ），１７０．６（ｓ），１７０．５（ｓ），１３７．２（ｓ），１３７．０（ｓ），１３２．５（ｄ），１３０．５（ｄ），１２９．５（ｄ）×４，１２８．５（ｄ）×４，１２６．９（ｄ），１２６．７（ｄ），６１．７（ｄ），５９．７（ｄ），５６．４（ｄ），４９．９（ｄ），４８．８（ｔ），４７．２（ｔ），４６．８（ｄ），４６．７（ｄ），４６．５（ｔ），３７．４（ｔ），３７．２（ｄ），３５．０（ｔ），３４．４（ｔ），３１．７（ｔ），３１．５（ｑ），２９．０（ｔ），２７．２（ｔ），２６．２（ｔ），２５．２（ｔ），２４．８（ｔ），２４．３（ｔ），２０．９（ｔ），２０．３（ｔ）；
１０）高速液体クロマトグラフィー
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
保持時間：　４．１分。
【請求項４】
請求項１記載の式（Ｉ）において、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２が３−シクロヘプテニル基であり、Ｒ３がフェニル基であり、Ｒ４がフェニル基である化合物またはその塩。
【請求項５】
下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）物質の性状：白色粉末；
２）溶解性：クロロホルム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可溶。アセトン、酢酸エチルに易溶、水に不溶；
３）分子式：Ｃ４４Ｈ５８Ｎ８Ｏ７；
４）分子量：　８１０（ＦＡＢ−ＭＳ法）
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ４４Ｈ５８Ｎ８Ｏ７Ｎａとして）
実測値：８３３．４３２２
計算値：８３３．４３２６；
５）紫外線吸収スペクトル：末端吸収；
６）赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠剤中νｍａｘｃｍ−１）：
３２５８、３０２５、２９４０、１６５９、１４９７、１４４１、１４０９、１２４８、９１９、７４２、６９９；
７）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；　δ（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中重クロロホルムの溶媒スペクトルを内部基準として測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は、次に示す通りである；
１７４．１（ｓ），１７２．９（ｓ），１７２．５（ｓ），１７１．５（ｓ），１７１．２（ｓ），１７０．５（ｓ），１３７．１（ｓ），１３６．５（ｓ），１３３．０（ｄ），１３０．１（ｄ），１２９．７（ｄ）×２，１２９．１（ｄ）×２，１２８．７（ｄ）×２，１２８．４（ｄ）×２，１２７．２（ｄ），１２６．６（ｄ），６５．８（ｑ），６２．６（ｄ），６０．７（ｄ），５４．６（ｄ），５０．６（ｄ），４７．６（ｔ），４７．３（ｔ），４７．１（ｔ），４６．９（ｄ），４６．０（ｄ），３９．３（ｔ），３６．５（ｄ），３５．９（ｔ），３５．４（ｔ），３１．６（ｑ），３１．３（ｔ），２９．１（ｔ），２７．６（ｔ），２６．４（ｔ），２５．９（ｔ），２４．６（ｔ），２４．５（ｔ），２１．１（ｔ），２０．２（ｔ）；
８）高速液体クロマトグラフィー
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
保持時間：　４．９分。
【請求項６】
請求項１記載の式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がシクロヘプチル基であり、Ｒ３がフェニル基であり、Ｒ４がフェニル基である化合物またはその塩。
【請求項７】
下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩：
１）物質の性状：白色粉末；
２）溶解性：クロロホルム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可溶、アセトン、酢酸エチルに易溶、水に不溶；
３）分子式：Ｃ４３Ｈ５８Ｎ８Ｏ７；
４）分子量：　７９８（ＦＡＢ−ＭＳ法）
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ４３Ｈ５８Ｎ８Ｏ７Ｎａとして）
実測値：８２１．４３３５
計算値：８２１．４３２６；
５）紫外線吸収スペクトル：末端吸収；
６）赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠剤中νｍａｘｃｍ−１）：
３２６１、３０２８、２９２６、２８５７、１６２７、１５４４、１４９８、１４４４、１４０２、１２５３、１２００、９２０、７４０、６９９；
７）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；　δ　（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中重クロロホルムの溶媒スペクトルを内部基準として測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は、次に示す通りである；
１７４．２（ｓ），１７３．４（ｓ），１７１．７（ｓ），１７１．２（ｓ），１７０．８（ｓ），１７０．５（ｓ），１３７．１（ｓ），１３７．０（ｓ），１２９．６（ｄ）×２，１２９．５（ｄ）×２，１２８．５（ｄ）×４，１２６．９（ｄ），１２６．７（ｄ），６１．７（ｄ），５９．８（ｄ），５６．３（ｄ），５０．１（ｄ），４８．７（ｔ），４７．２（ｔ），４６．９（ｄ），４６．８（ｄ），４６．５（ｔ），３８．６（ｄ），３７．４（ｔ），３５．０（ｔ），３１．５（ｑ），３１．２（ｔ），３０．７（ｔ），２８．８（ｔ），２７．７（ｔ）×２，２７．３（ｔ），２６．５（ｔ），２５．３（ｔ），２４．８（ｔ），２４．３（ｔ），２１．０（ｔ）　，２０．３（ｔ）；
８）高速液体クロマトグラフィー
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
保持時間：　５．０分。
【請求項８】
請求項１記載の式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がシクロヘプチル基であり、Ｒ３がシクロヘキシル基であり、Ｒ４がフェニル基である化合物またはその塩。
【請求項９】
下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩：
１）物質の性状：白色粉末；
２）溶解性：クロロホルム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可溶、アセトン、酢酸エチルに易溶、水に不溶；
３）分子式：Ｃ４３Ｈ６４Ｎ８Ｏ７；
４）分子量：　８０４（ＦＡＢ−ＭＳ法）
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ４３Ｈ５８Ｎ８Ｏ７Ｎａとして）
実測値：８２７．４７６０
計算値：８２７．４７９６；
５）紫外線吸収スペクトル：末端吸収；
６）赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠剤中νｍａｘｃｍ−１）：
３２６２、２９２５、２８５４、１６３８、１５４３、１４９８、１４４５、１４０５、１２５０、１２００、１１２０、１０７３、９２１、６９９；
７）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；　δ（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中重クロロホルムの溶媒スペクトルを内部基準として測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は、次に示す通りである；
１７４．３（ｓ），１７３．９（ｓ），１７２．２（ｓ），１７１．４（ｓ），１７１．４（ｓ），１７１．４（ｓ），１３７．１（ｓ），１２９．６（ｄ）×２，１２８．５（ｄ）×２，１２６．７（ｄ），６１．６（ｄ），５９．９（ｄ），５２．９（ｄ），５０．４（ｄ），４８．４（ｔ），４７．３（ｄ），４７．３（ｄ），４７．２（ｔ），４６．７（ｔ），３８．５（ｄ），３７．６（ｔ），３５．７（ｔ），３４．８（ｄ），３３．８（ｔ），３３．０（ｔ），３１．５（ｑ），３１．１（ｔ），３０．９（ｔ），２８．８（ｔ），２７．７（ｔ），２７．５（ｔ），２７．２（ｔ），２６．９（ｔ），２６．６（ｔ），２６．４（ｔ），２６．３（ｔ），２５．６（ｔ），
２５．０（ｔ），２４．７（ｔ），２１．１（ｔ），２０．５（ｔ）；
８）高速液体クロマトグラフィー
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
保持時間：　７．４分。
【請求項１０】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する、請求項２または請求項３記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より請求項２または請求項３記載の化合物を採取することを特徴とする、請求項２または請求項３記載の化合物の製造法。
【請求項１１】
該生産菌がストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）ＳＡＮＫ　６２８０１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９８５）であることを特徴とする、請求項１０記載の製造法。
【請求項１２】
放線菌ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）ＳＡＮＫ　６２８０１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９８５）。
【請求項１３】
請求項１乃至請求項９のいずれか一つに記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項１４】
請求項１乃至請求項９のいずれか一つに記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する骨代謝異常症の治療薬または予防薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＯＢＭ／ＯＢＭ−ＢＰ結合阻害活性を有する化合物またはその塩、該化合物の生産菌、該化合物の製造方法、該化合物を有効成分として含有する医薬、及び、該化合物を有効成分として含有する各種骨代謝異常症の治療薬又は予防薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトなどの哺乳類の骨は正常時においても代謝されており、骨吸収と骨形成が絶えず行われている。骨吸収は血液幹細胞由来である破骨細胞が骨を溶解させることにより行われており、骨形成は間葉系細胞由来である骨芽細胞が中心となって行われている（非特許文献１参照）。この骨吸収と骨形成のバランスが骨吸収に傾くことにより発症すると考えられる骨代謝異常症の例としては、一次性骨粗鬆症（老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症及び特発性若年性骨粗鬆症）、内分泌骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群及び末端肥大症）、性機能低下に伴う骨粗鬆症（下垂体機能低下症、Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ症候群及びＴｕｒｎｅｒ症候群）、遺伝性及び先天性形態の骨粗鬆症（骨形成不全、ホモシスチン尿症、メンケス症及びライリー−デイ症候群）、重力負荷軽減又は四肢の固定や不動化による骨減少症、パジェット病、骨髄炎、骨喪失による感染性病巣、固形腫瘍（乳癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌等）に起因する高カルシウム血症、血液学的悪性疾患（多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病）、特発性高カルシウム血症、甲状腺機能亢進症又は腎臓機能不全に伴う高カルシウム血症、ステロイド投与に起因する骨減少症、他の薬物（メトトレキセート及びシクロスポリンＡ等の免疫抑制剤、ヘパリン及び抗てんかん薬）投与に起因する骨減少症、腎臓機能不全に伴う骨減少症、外科手術、消化器疾患（小腸障害、大腸障害、慢性肝炎、胃切除、原発性胆汁性肝硬変及び肝硬変）に伴う骨減少症、慢性関節リウマチ等の各種リウマチによる骨減少症、慢性関節リウマチ等の各種リウマチによる骨破壊及び関節破壊、ムチランス型リウマチ、変形性関節症、歯周骨喪失、癌の骨転移（骨溶解性転移）、外傷性負傷、ゴシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性紅性狼創若しくは非外傷性負傷に伴う骨壊死又は骨細胞死、腎性骨異栄養症等の骨異栄養症、低アルカリフォスファターゼ血症、糖尿病に伴う骨減少症、栄養障害又は摂食障害に伴う骨減少症、その他の骨減少症等が挙げられる。以上に挙げた疾患・症状はそれぞれ問題となっており、例えば、老人性骨粗鬆症や閉経後骨粗鬆症では急速に増加している高齢者人口とそれに伴う患者の増加による医療費の増大や寝たきりによる生活の質の低下が大きな問題となっている。
【０００３】
骨吸収と骨形成のバランスが骨吸収に傾いた状況を是正する一つの方法として骨吸収を抑制することが考えられ、骨吸収を司る破骨細胞の分化及び／または成熟及び／または活性化を阻害することにより達成できるものと考えられる（非特許文献１参照）。骨吸収抑制薬として上市されたものにはカルシトニン、女性ホルモン様薬、ビスフォスフォネート類が挙げられるが、これらに関してはその薬効や副作用、長期安全性の確認等の面で十分に満足できないものである。このため、新たな化合物、蛋白質の発見への努力は精力的に続けられている。
【０００４】
破骨細胞の分化のメカニズムについては、近年研究が進んでおり（非特許文献２）、破骨細胞分化抑制因子（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ：ＯＣＩＦと呼ぶ）が単離され（特許文献１）、また、骨芽細胞様細胞上に発現するＯＣＩＦ結合分子（ＯＣＩＦ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ＯＢＭと呼ぶ、特許文献２）が、未熟な破骨細胞前駆細胞上のＯＢＭに対する受容体（ＯＢＭ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＯＢＭ−ＢＰと呼ぶ、特許文献３）に結合することより破骨細胞の分化、成熟および活性化が促進することがわかった。このため、ＯＢＭとＯＢＭ−ＢＰの結合を阻害する化合物は、破骨細胞の分化、成熟および活性化を抑制する効果を有すると考えられ、骨吸収優勢による種々疾患、例えば骨粗鬆症や慢性関節リウマチにおける骨破壊、高カルシウム血症等の骨代謝異常症の治療薬として期待される。しかしながら、このような性質を有する低分子化合物は未だに発見されていない。
【０００５】
【非特許文献１】
藤田拓男著「オステオポローシス　―治療と診断―」ライフサイエンス社、１９９３年
【非特許文献２】
野田政樹著「骨のバイオロジー」羊土社、１９９７年
【特許文献１】
国際公開第９６／２６２１７号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第９８／４６６４４号パンフレット
【特許文献３】
特開平１１−３３２５８１号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、骨吸収抑制活性を有する新規化合物を見出すべく鋭意探索を行なった結果、放線菌培養物中に新規化合物を見出し、該化合物およびその誘導体が骨吸収抑制活性を有することを確認し、本発明を完成した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）　下記式（Ｉ）
【０００８】
【化２】
2004099462.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ１は水素原子または炭素数１乃至６のアルキル基を表し、Ｒ２は３−シクロヘプテニル基またはシクロヘプチル基を表し、Ｒ３はフェニル基またはシクロヘキシル基を表し、Ｒ４はフェニル基またはシクロヘキシル基を表す）で表わされる化合物またはその塩。
（２）　（１）記載の式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が３−シクロヘプテニル基であり、Ｒ３がフェニル基であり、Ｒ４がフェニル基である化合物またはその塩。
（３）　下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）物質の性状：白色粉末；
２）［α］２０Ｄ−５６．９°（ｃ１．０，ＭｅＯＨ）；
３）溶解性：クロロホルム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可溶、アセトン、酢酸エチルに易溶、水に不溶；
４）アミノ酸分析：加水分解物としてフェニルアラニンおよびプロリンが認められた；
５）分子式：Ｃ４３Ｈ５６Ｎ８Ｏ７；
６）分子量：　７９６（ＦＡＢ−ＭＳ法）
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ４３Ｈ５６Ｎ８Ｏ７Ｎａとして）
実測値：８１９．４１８４
計算値：８１９．４１７０；
６）紫外線吸収スペクトル：末端吸収；
８）赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠剤中νｍａｘ　ｃｍ−１）：
３２５６、３０２６、２９２７、１６３７、１５４３、１４９７、１４４４、１４０５、１２５２、９２０、７４３、７００；
９）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；　δ　（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中重クロロホルムの溶媒スペクトルを内部基準として測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は、次に示す通りである；
１７３．７（ｓ），１７３．４（ｓ），１７１．７（ｓ），１７１．１（ｓ），１７０．６（ｓ），１７０．５（ｓ），１３７．２（ｓ），１３７．０（ｓ），１３２．５（ｄ），１３０．５（ｄ），１２９．５（ｄ）×４，１２８．５（ｄ）×４，１２６．９（ｄ），１２６．７（ｄ），６１．７（ｄ），５９．７（ｄ），５６．４（ｄ），４９．９（ｄ），４８．８（ｔ），４７．２（ｔ），４６．８（ｄ），４６．７（ｄ），４６．５（ｔ），３７．４（ｔ），３７．２（ｄ），３５．０（ｔ），３４．４（ｔ），３１．７（ｔ），３１．５（ｑ），２９．０（ｔ），２７．２（ｔ），２６．２（ｔ），２５．２（ｔ），２４．８（ｔ），２４．３（ｔ），２０．９（ｔ），２０．３（ｔ）；
１０）高速液体クロマトグラフィー
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
保持時間：　４．１分。
（４）　（１）記載の式（Ｉ）において、Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２が３−シクロヘプテニル基であり、Ｒ３がフェニル基であり、Ｒ４がフェニル基である化合物またはその塩。
（５）　下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩：
１）物質の性状：白色粉末；
２）溶解性：クロロホルム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可溶。アセトン、酢酸エチルに易溶、水に不溶；
３）分子式：Ｃ４４Ｈ５８Ｎ８Ｏ７；
４）分子量：　８１０（ＦＡＢ−ＭＳ法）
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ４４Ｈ５８Ｎ８Ｏ７Ｎａとして）
実測値：８３３．４３２２
計算値：８３３．４３２６；
５）紫外線吸収スペクトル：末端吸収；
６）赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠剤中νｍａｘｃｍ−１）：
３２５８、３０２５、２９４０、１６５９、１４９７、１４４１、１４０９、１２４８、９１９、７４２、６９９；
７）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；　δ（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中重クロロホルムの溶媒スペクトルを内部基準として測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は、次に示す通りである；
１７４．１（ｓ），１７２．９（ｓ），１７２．５（ｓ），１７１．５（ｓ），１７１．２（ｓ），１７０．５（ｓ），１３７．１（ｓ），１３６．５（ｓ），１３３．０（ｄ），１３０．１（ｄ），１２９．７（ｄ）×２，１２９．１（ｄ）×２，１２８．７（ｄ）×２，１２８．４（ｄ）×２，１２７．２（ｄ），１２６．６（ｄ），６５．８（ｑ），６２．６（ｄ），６０．７（ｄ），５４．６（ｄ），５０．６（ｄ），４７．６（ｔ），４７．３（ｔ），４７．１（ｔ），４６．９（ｄ），４６．０（ｄ），３９．３（ｔ），３６．５（ｄ），３５．９（ｔ），３５．４（ｔ），３１．６（ｑ），３１．３（ｔ），２９．１（ｔ），２７．６（ｔ），２６．４（ｔ），２５．９（ｔ），２４．６（ｔ），２４．５（ｔ），２１．１（ｔ），２０．２（ｔ）；
８）高速液体クロマトグラフィー
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
保持時間：　４．９分。
（６）　（１）記載の式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がシクロヘプチル基であり、Ｒ３がフェニル基であり、Ｒ４がフェニル基である化合物またはその塩。
（７）　下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩：
１）物質の性状：白色粉末；
２）溶解性：クロロホルム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可溶、アセトン、酢酸エチルに易溶、水に不溶；
３）分子式：Ｃ４３Ｈ５８Ｎ８Ｏ７；
４）分子量：　７９８（ＦＡＢ−ＭＳ法）
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ４３Ｈ５８Ｎ８Ｏ７Ｎａとして）
実測値：８２１．４３３５
計算値：８２１．４３２６；
５）紫外線吸収スペクトル：末端吸収；
６）赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠剤中νｍａｘｃｍ−１）：
３２６１、３０２８、２９２６、２８５７、１６２７、１５４４、１４９８、１４４４、１４０２、１２５３、１２００、９２０、７４０、６９９；
７）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；　δ　（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中重クロロホルムの溶媒スペクトルを内部基準として測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は、次に示す通りである；
１７４．２（ｓ），１７３．４（ｓ），１７１．７（ｓ），１７１．２（ｓ），１７０．８（ｓ），１７０．５（ｓ），１３７．１（ｓ），１３７．０（ｓ），１２９．６（ｄ）×２，１２９．５（ｄ）×２，１２８．５（ｄ）×４，１２６．９（ｄ），１２６．７（ｄ），６１．７（ｄ），５９．８（ｄ），５６．３（ｄ），５０．１（ｄ），４８．７（ｔ），４７．２（ｔ），４６．９（ｄ），４６．８（ｄ），４６．５（ｔ），３８．６（ｄ），３７．４（ｔ），３５．０（ｔ），３１．５（ｑ），３１．２（ｔ），３０．７（ｔ），２８．８（ｔ），２７．７（ｔ）×２，２７．３（ｔ），２６．５（ｔ），２５．３（ｔ），２４．８（ｔ），２４．３（ｔ），２１．０（ｔ）　，２０．３（ｔ）；
８）高速液体クロマトグラフィー
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
保持時間：　５．０分。
（８）　（１）記載の式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がシクロヘプチル基であり、Ｒ３がシクロヘキシル基であり、Ｒ４がフェニル基である化合物またはその塩。
（９）　下記の物理化学的性状を有する化合物またはその塩：
１）物質の性状：白色粉末；
２）溶解性：クロロホルム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可溶、アセトン、酢酸エチルに易溶、水に不溶；
３）分子式：Ｃ４３Ｈ６４Ｎ８Ｏ７；
４）分子量：　８０４（ＦＡＢ−ＭＳ法）
高分解能ＦＡＢ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ４３Ｈ５８Ｎ８Ｏ７Ｎａとして）
実測値：８２７．４７６０
計算値：８２７．４７９６；
５）紫外線吸収スペクトル：末端吸収；
６）赤外線吸収スペクトル（臭化カリウム錠剤中νｍａｘｃｍ−１）：
３２６２、２９２５、２８５４、１６３８、１５４３、１４９８、１４４５、１４０５、１２５０、１２００、１１２０、１０７３、９２１、６９９；
７）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；　δ（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中重クロロホルムの溶媒スペクトルを内部基準として測定した核磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ）は、次に示す通りである；
１７４．３（ｓ），１７３．９（ｓ），１７２．２（ｓ），１７１．４（ｓ），１７１．４（ｓ），１７１．４（ｓ），１３７．１（ｓ），１２９．６（ｄ）×２，１２８．５（ｄ）×２，１２６．７（ｄ），６１．６（ｄ），５９．９（ｄ），５２．９（ｄ），５０．４（ｄ），４８．４（ｔ），４７．３（ｄ），４７．３（ｄ），４７．２（ｔ），４６．７（ｔ），３８．５（ｄ），３７．６（ｔ），３５．７（ｔ），３４．８（ｄ），３３．８（ｔ），３３．０（ｔ），３１．５（ｑ），３１．１（ｔ），３０．９（ｔ），２８．８（ｔ），２７．７（ｔ），２７．５（ｔ），２７．２（ｔ），２６．９（ｔ），２６．６（ｔ），２６．４（ｔ），２６．３（ｔ），２５．６（ｔ），
２５．０（ｔ），２４．７（ｔ），２１．１（ｔ），２０．５（ｔ）；
８）高速液体クロマトグラフィー
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
保持時間：　７．４分。
（１０）　ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する、（２）または（３）記載の化合物の生産菌を培養し、その培養物より（２）または（３）記載の化合物を採取することを特徴とする、（２）または（３）記載の化合物の製造法。（１１）　該生産菌がストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）ＳＡＮＫ　６２８０１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９８５）であることを特徴とする、（１０）記載の製造法。
（１２）　放線菌ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）ＳＡＮＫ　６２８０１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９８５）。
（１３）　（１）乃至（９）のいずれか一つに記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する医薬。
（１４）　（１）乃至（９）のいずれか一つに記載の化合物またはその塩を有効成分として含有する骨代謝異常症の治療薬または予防薬。
に関する。
【００１０】
本発明においては、（１）乃至（９）のいずれか一つに記載の化合物を、Ａ−８１８３０物質と総称する。
【００１１】
上記（１）の一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、炭素数１乃至６の直鎖または分枝鎖アルキル、または、水素原子である。炭素数１乃至６の直鎖または分枝鎖アルキルとしては、メチル基、エチル基、プロピル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソヘキシル基などを例示することが出来る。上記（１）の一般式（Ｉ）において、Ｒ２は、３−シクロヘプテニル基またはシクロヘプチル基であり、Ｒ３およびＲ４は、フェニル基またはシクロヘキシル基である。
【００１２】
また、本発明においては、上記（２）または（３）に記載の化合物、または、下記式（ＩＩ）
【００１３】
【化３】
2004099462.tif 000003
【００１４】
で表される化合物をＡ−８１８３０とよび、同じく上記（４）または（５）に記載の化合物、または、下記式（ＩＩＩ）
【００１５】
【化４】
2004099462.tif 000004
【００１６】
で表される化合物をＡ−８１８３０−ａとよび、さらに上記（６）または（７）に記載の化合物、または、下記式（ＩＶ）
【００１７】
【化５】
2004099462.tif 000005
【００１８】
で表される化合物をＡ−８１８３０−ｂとよび、さらに上記（８）または（９）に記載の化合物、または、下記式（Ｖ）
【００１９】
【化６】
2004099462.tif 000006
【００２０】
で表される化合物をＡ−８１８３０−ｃとよぶ。
【００２１】
上記式（Ｉ）で表されかつ該一般式中のＲ１が炭素数１乃至６の直鎖または分枝鎖アルキル基を示す化合物は、上記式（Ｉ）においてＲ１が水素原子を示す化合物を、各種アルキル化剤等と反応させることにより合成することができる。アルキル化剤としては、ジアゾメタンやジアゾエタンのようなジアゾアルカン類が挙げられるが、本発明はこれに限られるものではない。反応は溶剤の存在下で行なわれる。使用される溶剤としては反応に影響を与えないものであれば特に限定は無く、アルコール類、エーテル類またはアミド類等が好ましい。好適にはエタノール類であり、より好適にはメタノールである。反応温度、反応時間は使用する試薬、溶剤などで異なるが、通常、室温から５０℃、１時間乃至２４時間が好適である。
【００２２】
また、Ａ−８１８３０物質のうち、上記式（Ｉ）のＲ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つが不飽和結合を含む化合物において、該不飽和結合は、常法に従って還元することができる。いずれの不飽和結合が還元されるかは、反応条件等により異なるが、本発明は還元されうる全ての組み合わせを含む。還元反応の一例として、Ａ−８１８３０、Ａ−８１８３０−ａ、Ａ−８１８３０−ｂまたはＡ−８１８３０−ｃを酸化白金を触媒とし、水素気流下で反応させる方法が挙げられるが、本発明はこれに限定されない。このようにして得られた反応液中には、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうち１つ乃至３つが還元された、複数種類のＡ−８１８３０物質が混在しているが、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の精製手段により、それぞれ単一な化合物として単離することができる。
【００２３】
Ａ−８１８３０物質は、いくつかの不斉炭素原子およびいくつかの二重結合を有し、種々の光学および幾何異性体が存在する。本発明においては、これらの異性体がすべて単一の式で示されているが、ラセミ化合物を含むこれらの異性体およびこれらの異性体の混合物も全てＡ−８１８３０物質に含まれるものである。
立体特異的合成法が使用される場合、または光学活性化合物が原料化合物として使用される場合、個々の異性体は直接的に製造してもよい。一方、該異性体の混合物が製造されれば、個々の異性体は常法により得てもよい。
【００２４】
Ａ−８１８３０物質は、常法に従って塩にすることができる。Ａ−８１８３０物質の塩は、医薬用途又は医薬以外の用途に使用され得る。医薬に使用されるＡ−８１８３０物質の塩としては、薬理学上許容されれば特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。医薬以外の用途（例えば、合成中間体としての用途）に使用されるＡ−８１８３０物質の塩としては、特に限定されるものではないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属の塩、カルシウム塩、バリウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属の塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属の塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；及びグリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩等を挙げることができる。
【００２５】
また、本発明の化合物またはその塩は、溶剤和物となることがある。例えば、大気中に放置したり、または、再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があるが、そのような溶剤和物も本発明に包含される。
【００２６】
さらに本発明は、生体内において代謝されてＡ−８１８３０物質に変換される化合物、いわゆるプロドラッグも全て含むものである。
【００２７】
【発明の実施の形態】Ａ−８１８３０はＡ−８１８３０を生産する放線菌の培養物中に存在する。Ａ−８１８３０の生産菌としては、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する放線菌を挙げることができ、好適には、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）、より好適には、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）ＳＡＮＫ　６２８０１株（ＦＥＲＭＢＰ−７９８５；以下、単に「ＳＡＮＫ　６２８０１株」と呼ぶ。）を挙げることができる。ＳＡＮＫ　６２８０１株は東京都八王子市で採集したチョウセンマキの根圏土壌から分離したものであり、その菌学的特徴は以下に記載する通りである。
【００２８】
１．　形態学的特徴
ＳＡＮＫ　６２８０１株は、インターナショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｐｒｏｊｅｃｔ；以下、ＩＳＰと呼ぶ）規定の寒天培地上２８℃、１４日間培養後、顕微鏡下観察では、ＳＡＮＫ　６２８０１株の基生菌糸は良好に伸長、分岐し、白乃至黄味茶色を示すが、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属菌株様の菌糸断裂やジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は単純分岐し、茶味白乃至明るい茶味灰色を示す。気菌糸の先端に１０乃至５０個またはそれ以上の胞子連鎖を形成し、胞子連鎖の形態はループ、フック、鈎状や螺旋状を示す。走査型電子顕微鏡による観察では、胞子の表面構造は平滑（Ｓｍｏｏｔｈ）状を示す。胞子は楕円形で、その大きさは０．７乃至０．８×０．８乃至１．２μｍである。また、気菌糸の車軸分岐、菌核や胞子のうなどの特殊器官は観察されない。
【００２９】
２．　各種培養基上の諸性質
各種培養基上で２８℃、１４日培養後の性状は下記表１に示した通りである。色調の表示はマンセル方式による日本色彩研究所版「標準色票」のカラーチップ・ナンバーを表す。
【００３０】
【表１】
2004099462.tif 000007
2004099462.tif 000008
＊１　Ｇ：生育、ＡＭ：気菌糸、Ｒ：裏面、ＳＰ：可溶性色素
＊２　性状の欄の（　）内はマンセル方式による色調表示
３．　生理学的性質
２５℃、２６℃、２８℃または３７℃で培養後、２乃至２１日間に観察したＳＡＮＫ　６２８０１株の生理学的性質は表２に示した通りである。
【００３１】
【表２】
2004099462.tif 000009
＊培地１：トリプトン・イーストエキス・ブロス（ＩＳＰ１）、培地２：ペプトン・イーストエキス・鉄寒天（ＩＳＰ６）、培地３：チロシン寒天（ＩＳＰ７）、培地４：イーストエキス・麦芽エキス寒天（ＩＳＰ２）。
【００３２】
また、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ＩＳＰ９）を使用して、２８℃、１４日間培養後に観察したＳＡＮＫ　６２８０１の炭素源の資化性は表３に示す通りである。
【００３３】
【表３】
炭素源　　　　　　資化性
―――――――――――――――
Ｄ−グルコース　　　　＋
Ｄ−フルクトース　　　＋
Ｌ−アラビノース　　　＋
Ｌ−ラムノース　　　　＋
Ｄ−キシロース　　　　＋
シュークロース　　　　−
イノシトール　　　　　＋
ラフィノース　　　　　−
Ｄ−マンニトール　　　−
対照　　　　　　　　　−
―――――――――――――――
＋：利用する、−：利用しない。
４．　菌体成分について
ＳＡＮＫ　６２８０１の細胞壁は長谷川らの方法（Ｔ．　Ｈａｓｅｇａｗａ　ｅｔ．　ａｌ．，（１９８３）　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２９，　３１９−３２２）に従い検討した結果、ＬＬ−ジアミノピメリン酸が検出されたことから細胞壁タイプＩであることが確認された。また、ＳＡＮＫ　６２８０１の全細胞中の糖成分を上述の長谷川らの方法に従い検討した結果、特徴的なパターンは認められなかった。また、細胞に含まれるメナキノン分子種を放線菌の分類と同定〔日本放線菌学会編、（２００１年）〕の方法に従い検討した結果、主要メナキノン分子種はＭＫ−９（Ｈ６）であった。
【００３４】
ＩＳＰ基準（Ｅ．　Ｂ．　Ｓｈｉｒｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄ．　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，　　（１９６６）　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｓｙｓｔ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１６，　３１３−３４０）、ワックスマン（Ｓ．　Ａ．　Ｗａｋｓｍａｎ）著“ジ・アクチノミセテス（Ｔｈｅ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）”（１９６１）第２巻、ブキャナンとギボンズ（Ｒ．　Ｅ．　Ｂｕｃｈａｎａｎ　ａｎｄ　Ｎ．　Ｅ．　Ｇｉｂｂｏｎｓ）編“バージーズ・マニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）”（１９７４年）第８版、ホルト（Ｊ．　Ｇ．　Ｈｏｌｔ）編“バージーズ・マニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）”（１９８９年）第４巻、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌に関する最近の文献によって同定を行い、本菌株が放線菌の中でもストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属すると判断した。そこで、本菌株をストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）ＳＡＮＫ　６２８０１株と命名した。なお、本菌株は２００２年３月２７日に日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに国際寄託され、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９８５を付与された。
周知のとおり、放線菌は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こし易く、本発明のＳＡＮＫ　６２８０１株もこの点は同じであるが、ＳＡＮＫ　６２８０１株はそのすべての変異株を包含する。
【００３５】
また、これらの変異株の中には、遺伝学的方法、例えば組み換え、形質導入、形質転換等により得られたものも包含される。即ち、Ａ−８１８３０を生産する、ＳＡＮＫ　６２８０１株およびその変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は、すべてＳＡＮＫ　６２８０１株に包含されるものである。
【００３６】
上述のように、Ａ−８１８３０はＳＡＮＫ　６２８０１株を培養することによって製造することができる。ＳＡＮＫ　６２８０１株の培養は通常用いられている放線菌の培養法が適用される。
【００３７】
培養のために用いられる炭素源としてはブドウ糖、果糖、麦芽糖、乳糖、澱粉、デキストリン、グリセリン、イノシトール、などが単独または組み合わせて用いられる。さらに菌の資化性によっては炭化水素、アルコール類、有機酸、脂肪酸、油脂なども用いられる。
【００３８】
窒素源としては無機もしくは有機窒素含有物、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなどが、また天然窒素含有物、例えば、大豆蛋白、大豆粉、綿実粕、グルテンミール、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母菌体、カザミノ酸、小麦蛋白などが、単独または組み合わせて用いられる。
【００３９】
このほか必要に応じて食塩、マグネシウム、カルシウム、リン、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛、コバルトなどの塩類が使用されるほか、本菌の生育やＡ−８１８３０の生産を促進する有機物や無機物を適当に添加する事ができる。
【００４０】
ＳＡＮＫ　６２８０１株の培養は、３乃至３５℃の温度範囲で行なうことが出来るが、好適な温度範囲は１６乃至３４℃である。
【００４１】
ＳＡＮＫ　６２８０１株の培養に使用する培地のｐＨは、微酸性から微アルカリ性の範囲にあることが望ましい。好適にはｐＨ６．５乃至９．０である。
【００４２】
ＳＡＮＫ　６２８０１株の培養期間は培養条件により変化するが、３乃至１２日程度である。ＳＡＮＫ　６２８０１株の培養はＡ−８１８３０の生成が確認できた時、好ましくは生成量が最大に達したときに停止する。
【００４３】
培養方法としては、微生物の培養に通常用いられる方法であれば特に限定されないが、例えば、固形培地を用いた培養法、攪拌培養法、振とう培養法、通気培養法、通気攪拌培養法等を挙げることができ、好適には振とう培養法、通気攪拌培養法であり、より好適には振とう培養法である。なお、工業的製造には通気攪拌培養法が最適である。
【００４４】
培養終了後、培養液中の液体部分に存在するＡ−８１８３０は、菌体、その他の固形部分を珪藻土をろ過助剤とするろ過操作または遠心分離によって分別し、そのろ液または上清中に存在するＡ−８１８３０をその物理化学的性状を利用し抽出精製することにより得られる。
【００４５】
例えば、活性炭または吸着用樹脂であるアンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（以上ローム・アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−５０、ＣＨＰ２０Ｐ（以上三菱化学（株）社製）等が使用される。Ａ−８１８３０を含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて不純物を吸着させて取り除くか、またはＡ−８１８３０を吸着させた後、メタノール水、アセトン水等の水と有機溶剤との混合溶剤を用いて溶出させることにより得られる。
【００４６】
このようにして得られたＡ−８１８３０は、さらにシリカゲル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、アビセル（旭化成工業（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィーおよび順相、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製することができる。
【００４７】
また、Ａ−８１８３０を含む溶液をイオン交換樹脂、例えば水と混和しない有機溶剤、たとえば、ｎ−ブタノール、酢酸エチル、メチレンクロライド等の単独またはそれらの組合せにより、不純物を抽出、除去することによる精製も可能である。
【００４８】
Ａ−８１８３０物質には骨吸収を抑制する作用があると考えられ、骨吸収と骨形成のバランスが骨吸収に傾くことにより発症すると考えられる各種骨代謝異常症の治療または予防薬として有用である。本発明において骨代謝異常症とは、一次性骨粗鬆症（老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症及び特発性若年性骨粗鬆症）、内分泌骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群及び末端肥大症）、性機能低下に伴う骨粗鬆症（下垂体機能低下症、Ｋｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ症候群及びＴｕｒｎｅｒ症候群）、遺伝性及び先天性形態の骨粗鬆症（骨形成不全、ホモシスチン尿症、メンケス症及びライリー−デイ症候群）、重力負荷軽減又は四肢の固定や不動化による骨減少症、パジェット病、骨髄炎、骨喪失による感染性病巣、固形腫瘍（乳癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌等）に起因する高カルシウム血症、血液学的悪性疾患（多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病）、特発性高カルシウム血症、甲状腺機能亢進症又は腎臓機能不全に伴う高カルシウム血症、ステロイド投与に起因する骨減少症、他の薬物（メトトレキセート及びシクロスポリンＡ等の免疫抑制剤、ヘパリン及び抗てんかん薬）投与に起因する骨減少症、腎臓機能不全に伴う骨減少症、外科手術、消化器疾患（小腸障害、大腸障害、慢性肝炎、胃切除、原発性胆汁性肝硬変及び肝硬変）に伴う骨減少症、慢性関節リウマチ等の各種リウマチによる骨減少症、慢性関節リウマチ等の各種リウマチによる骨破壊及び関節破壊、ムチランス型リウマチ、変形性関節症、歯周骨喪失、癌の骨転移（骨溶解性転移）、外傷性負傷、ゴシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性紅性狼創若しくは非外傷性負傷に伴う骨壊死又は骨細胞死、腎性骨異栄養症等の骨異栄養症、低アルカリフォスファターゼ血症、糖尿病に伴う骨減少症、栄養障害又は摂食障害に伴う骨減少症、その他の骨減少症等である。
【００４９】
本発明において、ＯＣＩＦとは破骨細胞分化抑制因子（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ：国際公開番号ＷＯ９６／２６２１７参照）のことであり、ＯＢＭとはＯＣＩＦ結合分子（ＯＣＩＦ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ：国際特許出願ＷＯ９８／４６６４４参照）のことであり、ＯＢＭ−ＢＰとは破骨細胞前駆細胞上のＯＢＭの受容体（ＯＢＭ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：特開平１１−３３２５８１参照）のことである。ＯＢＭが破骨細胞前駆細胞上のＯＢＭ−ＢＰと結合することにより、破骨細胞の分化、成熟および活性化が促進されるため、ＯＢＭ／ＯＢＭ−ＢＰの結合を阻害する物質には骨吸収抑制効果があると考えられる。
【００５０】
Ａ−８１８３０物質の骨吸収抑制効果は、ＯＢＭとＯＢＭ−ＢＰの結合阻害実験により測定することができる。Ａ−８１８０物質のＯＢＭ／ＯＢＭ−ＢＰ結合阻害活性は、該二分子間の結合を測定できる方法であればどのような方法を利用しても測定できるが、たとえば、Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ（ＨＴＲＦ）法（Ｇ．　Ｍａｔｈｉｓ，（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌｉｇａｎｄ　Ａｓｓａｙ　２０，１４１−１４５）を利用して測定することができる。ＨＴＲＦ法では蛍光団同士がある一定の距離の範囲以内に接近するとエネルギーが転移することを利用している。励起・蛍光波長が短い蛍光団Ａと励起・蛍光波長が長い蛍光団Ｂの組み合わせであった場合、単に蛍光団ＡとＢを混合した溶液では蛍光団Ａの励起光を照射しても蛍光団Ｂの蛍光は観察されないが、二つの蛍光団が蛋白質間の結合のようにかなり接近すると蛍光団Ａの励起光を照射した場合でも蛍光団Ｂの蛍光が観察されることを応用している。すなわち、可溶性ＯＢＭおよび可溶性ＯＢＭ−ＢＰにそれぞれ異なる標識蛋白質を連結させた融合蛋白質の混合液に、それぞれの標識蛋白質に対する抗体を異なる蛍光物質で標識したものを加えてインキュベーションし、ＨＴＲＦ用の測定機で蛍光を測定することにより、ＯＢＭとＯＢＭ−ＢＰの結合を測定することができる。該二分子の結合測定をＡ−８１８３０物質の存在下と非存在下で行なうか、またはＡ−８１８３０物質の濃度を変化させて行なうことにより、Ａ−８１８３０物質のＯＢＭ／ＯＢＭ−ＢＰ結合阻害活性を測定することができる。この結合測定法において、ＯＢＭおよびＯＢＭ−ＢＰそれぞれに対する抗体を異なる蛍光物質で標識して用いることもできるし、ＯＢＭおよびＯＢＭ−ＢＰ自体を異なる蛍光物質で標識して用いることもできる。
【００５１】
Ａ−８１８３０物質を骨代謝異常症の治療薬または予防薬として用いる場合、種々の形態で投与されうるが、その投与形態としては例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与または注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）などをあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
【００５２】
錠剤の形態に成形するに際しては、単体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等が例示できる。さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、たとえば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００５３】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばブドウ糖、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナラン寒天等の崩壊剤等が例示できる。
【００５４】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセリド等を挙げることができる。
【００５５】
注射剤として調製される場合には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているものをすべて使用でき、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに十分な量の食塩、ブドウ糖、あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００５６】
さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有せしめてもよい。
【００５７】
上記医薬製剤中に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常全組成物中１乃至７０重量％、好適には１乃至３０重量％含まれる量とするのが適当である。
【００５８】
上記医薬製剤の投与方法は特に限定されるものではなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与される。
また注射剤の場合には単独であるいはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、さらには必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合には直腸内投与される。
【００５９】
その使用量は症状、年齢、体重、投与方法および剤形等によって異なるが、通常は成人に対して１日１ｍｇから１０００ｍｇを一回または数回に分けて投与することが好ましい。
【００６０】
【実施例】以下、実施例および試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００６１】
実施例１．Ａ−８１８３０生産菌の培養
表４で示される培地組成からなる種培養培地４５０ｍｌを２０００ｍｌ容三角フラスコ２本にそれぞれ分注し、１２１℃で３０分間滅菌し、３０℃に冷却した後、ＳＡＮＫ　６２８０１株をスラントより１白金耳づつ接種し、２１０ｒｐｍの回転振とう培養機において２８℃で９６時間培養し、種培養液とした。
【００６２】
【表４】
〈種培養培地組成〉
――――――――――――――――――――――――
可溶性澱粉　　　　　　　　１．０％
グルコース　　　　　　　　２．０％
イースト生菌　　　　　　　０．９％
エルリッヒ肉エキス　　　　０．５％
ポリペプトン　　　　　　　０．５％
炭酸カルシウム　　　　　　０．３％
塩化ナトリウム　　　　　　０．５％
消泡剤ＣＢ−４４２　　　０．０１％
――――――――――――――――――――――――
滅菌前にｐＨ７．４に修正した。
表５で示される培地組成からなる生産培地１５Ｌを３０Ｌ容培養槽に仕込み、１２１〜１２５℃で３０分間滅菌し、３０℃に冷却した後、前述の種培養液４５０ｍｌを接種し、培養温度３０℃、通気量１５Ｌ／ｍｉｎ、培養槽内圧力１００ｋＰａ、溶存酸素濃度５ｐｐｍを保持させるように攪拌回転数を１００乃至１７１ｒｐｍの範囲内で調整し、１２０時間攪拌培養した。
【００６３】
【表５】
〈生産培地組成〉
――――――――――――――――――――――――
グルコース　　　　　　　　３．０％
ポリペプトン　　　　　　　１．０％
酵母エキス　　　　　　　　０．５％
炭酸カルシウム　　　　　　０．３％
塩化ナトリウム　　　　　　０．５％
消泡剤ＣＢ−４４２　　　０．０１％
――――――――――――――――――――――――
滅菌前にｐＨ７．４に修正した。
実施例２．Ａ−８１８３０の精製
得られた培養液３５Ｌにアセトンを等量加え、１時間攪拌抽出後、ろ過してアセトン抽出液を得た。ろ過助剤としてセライト５４５（ジョンズ　マンビル　プロダクト　コーポレーション製）２Ｋｇを加えてろ過し、菌体のケーキを得た。得られた菌体のケーキに８０％アセトン水２４Ｌを加え、１時間攪拌抽出後、ろ過をしてアセトン抽出液１を得た。菌体残渣にさらに８０％アセトン水２５Ｌを加え、攪拌後ただちにろ過してアセトン抽出液２を得た。次に、その菌体残渣に８０％アセトン水２３Ｌを加え、攪拌後ただちにろ過することでアセトン抽出液３を得た。その菌体残渣に、さらに７５％アセトン水４０Ｌを加えて、ｐＨ３に調整した後、ろ過してアセトン抽出液４を得た。最後に、その菌体残渣に８０％アセトン水３０Ｌを加えてｐＨ３に調整したのちろ過してアセトン抽出液５を得た。以上５回の抽出により得られたアセトン抽出液を合わせて、計１４２Ｌを減圧下濃縮して濃縮液３２Ｌを得た。濃縮液３２Ｌを２０Ｌの酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下濃縮してろ過し、Ａ−８１８３０を含む油状抽出物２２．８ｇを得た。次いでこの油状物２２．８ｇを、ＨＰＬＣを用いて分取し、精製した。あらかじめＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−ＡＭ　Ｒ−３１０５−２０ＡＭ：直径１００ｍｍ×長さ５００ｍｍ）を６５％アセトニトリル水で平衡化し、ＭｅＯＨ　１００ｍｌで油状抽出物２２．８ｇを溶解し、試料溶液として全量を注入後、６５％アセトニトリル水を溶媒として流速２００ｍｌ／分で溶出した。検出波長２１０ｎｍでモニタ−して保持時間６４．４から８３．４分の溶出液を集め、分取液を濃縮した後、酢酸エチルで２回抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下濃縮乾固してＡ−８１８３０の白色粉末３．６６ｇを得た。
【００６４】
この白色粉末の一部を採取し高速液体クロマトグラフィ−で分析したところ、下記の結果を得た：
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
保持時間：　４．１分
実施例３．　Ａ−８１８３０−ａの合成
３０ｍｇのＡ−８１８３０をメタノール２ｍｌに溶解し、ジアゾメタン０．５ｍｌを少量ずつ滴下して反応を行った。反応液を減圧下で濃縮乾固した後、下記の条件で分取用ＨＰＬＣに供与した。移動相としてアセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸を用い、２０分間でアセトニトリル含有率（ｖ／ｖ）を１０％から９０％まで直線的に変化させ溶出した。
【００６５】
カラム　：　μＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ　Ｃ８
（直径１９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
流速　　：　１０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
上記条件で保持時間２２．６分に溶出される画分を分取した後、減圧下で濃縮乾固して、Ａ−８１８３０−ａを２２ｍｇ単離した。
【００６６】
以下の条件でＨＰＬＣによる分析を行った。
【００６７】
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
上記条件でＡ−８１８３０−ａは保持時間４．９分に溶出された。
【００６８】
実施例４．　Ａ−８１８３０−ｂの合成
１００ｍｇのＡ−８１８３０をメタノール５ｍｌに溶解し、酸化白金を触媒量加えた後、水素気流下で１５時間反応を行った。反応終了液をセライトろ過して得られた溶出液を減圧下で濃縮乾固した後、以下に示した条件で分取用ＨＰＬＣに供与した。
【００６９】
カラム　：　μＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ　Ｃ８
（直径１９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸（８５：１５）
流速　　：　１０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
保持時間６．５分に溶出される画分を分取した後、減圧下で濃縮乾固して、Ａ−８１８３０−ｂを２８ｍｇ単離した。
【００７０】
以下の条件でＨＰＬＣによる分析を行った。
【００７１】
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
上記条件でＡ−８１８３０―ｂは保持時間５．０分に溶出された。
実施例５．　Ａ−８１８３０−ｃの合成
１００ｍｇのＡ−８１８３０をメタノール５ｍｌに溶解し、酸化白金を触媒量加えた後、水素気流下で１５時間反応を行った。反応終了液をセライトろ過して得られた溶出液を減圧下で濃縮乾固した後、以下に示した条件で分取用ＨＰＬＣに供与した。
【００７２】
カラム　：　μＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ　Ｃ８
（直径１９ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸（８５：１５）
流速　　：　１０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
保持時間８．３分に溶出される画分を分取した後、減圧下で濃縮乾固して、Ａ−８１８３０−ｃを１１ｍｇ単離した。
【００７３】
以下の条件でＨＰＬＣによる分析を行った。
【００７４】
カラム　：　シンメトリーＣ１８
（直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ（ウォーターズ社製））
移動相　：　アセトニトリル：水（８０：２０）
流速　　：　１．０ｍｌ／分
検出波長：　２１０ｎｍ
上記条件でＡ−８１８３０−ｃは保持時間７．４分に溶出された。
試験例１．　マウスＯＢＭ細胞外領域とマウスＯＢＭ−ＢＰ細胞外領域の結合阻害試験
１．マウスＯＢＭ細胞外領域の発現
１−１．大腸菌およびプラスミド
ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片のクローニング用ベクターとして、ｐＣＲＴＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を用い、その宿主には、大腸菌ＪＭ１０９株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を用いた。また、ＧＳＴ融合蛋白質の発現プラスミドは、ｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社より購入）を用い、宿主には大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を用いた。
【００７５】
１−２．マウス可溶性ＯＢＭのクローニング
ＳｍａＩ切断サイトを導入した、下記の配列のオリゴヌクレオチドをＢｅｃｋｍａｎ社製ＤＮＡ合成装置ＯＬＩＧＯ１０００を用いて合成し、配列表の配列番号１記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲのセンスプライマーとして、配列表の配列番号２記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲのアンチセンスプライマーとして用いた。プライマーの配列はマウスＯＢＭの細胞外ドメインの配列を元に設計した（国際公開番号ＷＯ９８／４６６４４参照）。
５’−ＧＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧ−３’　　　　　（配列表の配列番号１）
５’−ＣＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＡＧＴＣＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡＡＣＴ−３’　　　（配列表の配列番号２）
逆転写反応の鋳型ＲＮＡとしては、マウス骨髄初代細胞由来のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用い、逆転写反応にはＲＮＡ−ＰＣＲ　ｋｉｔ　（ＡＭＶ）　ｖｅｒ．２．１（宝酒造社より購入）を用いた。逆転写反応は、ランダム９ｍｅｒプライマーを使用し、反応液組成、反応温度、反応時間はキットのマニュアルに従った。ＰＣＲの条件は９５℃２０秒、５５℃　３０秒、７２℃　６０秒のサイクルを３５回繰り返して行い、ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をｐＣＲＴＭＩＩに挿入して大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００７６】
１−３．マウス可溶性ＯＢＭ発現ベクターの作成とＧＳＴ−可溶性マウスＯＢＭ融合蛋白質の発現及び精製
ＳｍａＩ処理して切り出したマウス可溶性ＯＢＭをコードするＤＮＡ断片とｐＧＥＸ−３Ｘを連結し、大腸菌ＴＯＰ１０株を形質転換した。得られた大腸菌株をＩＰＴＧ　０．１ｍＭ存在下、一晩培養した後に菌体を集菌した。Ｂｕｌｋ　ＧＳＴ　ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社より購入）とＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社より購入）を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製し、ＧＳＴ−可溶性マウスＯＢＭ融合蛋白質（配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端にＧＳＴ蛋白質を結合させた融合蛋白質）画分を得た。さらに、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社より購入）を用いて濃縮してＧＳＴ−可溶性マウスＯＢＭ融合蛋白質精製標品を得た。得られた溶液中の蛋白質量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。
【００７７】
２．　マウスＯＢＭ−ＢＰ細胞外領域の発現
２−１．大腸菌およびプラスミド
ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片のクローニング用ベクターとして、ｐＣＲＴＭＩＩを用い、その宿主には、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造社より購入）を用いた。ｃ−ｍｙｃ融合蛋白質の発現プラスミドにはｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を用い、宿主にはＣＯＳ１細胞を用いた。
【００７８】
２−２．マウスＯＢＭ−ＢＰのクローニング
下記の配列のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置ＯＬＩＧＯ１０００（Ｂｅｃｋｍａｎ社より購入）を用いて合成し、配列表の配列番号３記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲのセンスプライマーとして、配列表の配列番号４記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲのアンチセンスプライマーとして用いてＰＣＲを行なった。プライマーの配列はマウスＯＢＭ−ＢＰ細胞外ドメインの配列を元に設計した（特開平１１−３３２５８１参照）。
５’−ＡＧＧＴＧＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣ−３’　　　　　　（配列表の配列番号３）
５’−ＴＴＧＧＡＡＡＧＧＣＡＣＴＧＧＴＧＣＣ−３’　　　　　　（配列表の配列番号４）
逆転写反応の鋳型ＲＮＡとしては、マウス単球／マクロファージ系細胞株ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＴＩＢ７１、大日本製薬より購入）のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用い、逆転写反応にはＲＮＡ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ　（ＡＭＶ）　Ｖｅｒ．２．１（宝酒造社より購入）を用いた。
逆転写反応は、ランダム９ｍｅｒプライマーを使用し、反応液組成、反応温度、反応時間はキットのマニュアルに従った。ＰＣＲの条件は９５℃　２０秒、５５℃　３０秒、７２℃　６０秒のサイクルを５５回繰り返して行い、ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をｐＣＲＴＭＩＩに挿入して大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００７９】
２−３．マウスＯＢＭ−ＢＰの発現ベクター作成
マウスＯＢＭ−ＢＰ細胞外領域を発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａにフレームが合うようにＰＣＲ法により断片を調製した。すなわち、鋳型として前述のｐＣＲＴＭＩＩにマウスＯＢＭ−ＢＰ細胞外ドメインを挿入したプラスミドを用い、下記のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲを行った。
配列表の配列番号５記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲのセンスプライマーとして、配列表の配列番号６記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲのアンチセンスプライマーとして用いた。
５’−ＡＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣ−３’　　　（配列表の配列番号５）
５’−ＣＴＣＣＴＣＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＣＣＴＴＧＧＧ−３’　　　　　（配列表の配列番号６）
ＰＣＲ反応は９５℃　２０秒、５５℃　３０秒、７２℃　６０秒のサイクルを２２回繰り返して行った。得られたＤＮＡ断片はＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ処理した後にｐＳｅｃＴａｇ２Ａに挿入した。
【００８０】
２−４．可溶性マウスＯＢＭ−ＢＰ−ｃ−ｍｙｃ融合蛋白質の発現および精製
ｐＳｅｃＴａｇ２ＡにマウスＯＢＭ−ＢＰ細胞外ドメインを挿入したプラスミドを用いてＣＯＳ１細胞を形質転換した。形質転換翌日に培地を無血清のダルベッコ変法ＭＥＭ培地に交換し、さらに２日間培養した後に培地を回収した。この回収した培地をＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７．５）に供し、この素通り画分から、ＰｒｏＢｏｎｄＴＭ　ｃｏｌｕｍｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を用いて、キットの添付文書に従って可溶性マウスＯＢＭ−ＢＰ−ｃ−ｍｙｃ融合蛋白質（（配列表の配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＣ末端にｃ−ｍｙｃ蛋白質を結合させた融合蛋白質）を精製した。
３．ＯＢＭとＯＢＭ−ＢＰの結合阻害実験
前述の１−３で得られたＧＳＴ−可溶性マウスＯＢＭ融合蛋白質および２−４で得られた可溶性マウスＯＢＭ−ＢＰ−ｃ−ｍｙｃ融合蛋白質を用い、Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ（ＨＴＲＦ）法（Ｇ．　Ｍａｔｈｉｓ，（１９９７）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌｉｇａｎｄ　Ａｓｓａｙ　２０，　ｐ．１４１−１４５）により結合実験を行なった。すなわち、９６ウェルプレートの各ウェルに、終濃度３０ｎｇ／ｍｌのＧＳＴ−可溶性マウスＯＢＭ融合蛋白質と終濃度３５０ｎｇ／ｍｌのＸＬ６６５標識抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体（ＣＩＳ　ｂｉｏ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより購入）を０．５ＭＫＦ、０．１％　牛血清アルブミンおよび０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに調製した溶液１４．５μｌを用意した。Ａ−８１８３０、Ａ−８１８３０−ａ、Ａ−８１８３０−ｂおよびＡ−８１８３０−ｃのそれぞれをＤＭＳＯで希釈し、終濃度が２５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌまたは０．２５μｇ／ｍｌとなるように希釈系列を作製し、それぞれの希釈溶液を、各ウェルにそれぞれ０．５μｌずつ添加した。ここに可溶性マウスＯＢＭ−ＢＰ−ｃ−ｍｙｃ融合蛋白質および終濃度７０ｎｇ／ｍｌのユーロピュームクリプテート標識抗ＧＳＴモノクローナル抗体（ＣＩＳ　ｂｉｏ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより購入）の溶液５μｌを添加して、４℃にて１晩放置した。その後、ＨＴＲＦ測定機Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙを用いて測定した。結果は、溶媒のみ添加時の値を阻害率０％、ＯＣＩＦ　１μｇ／ｍｌ（雪印乳業より購入）での阻害を阻害率１００％として、各サンプルの阻害率を算出した。その結果、Ａ−８１８３０、Ａ−８１８３０−ａ、Ａ−８１８３０−ｂおよびＡ−８１８３０−ｃは用量依存的に、ＯＢＭとＯＢＭ−ＢＰの結合を阻害した。
【００８１】
【表６】
2004099462.tif 000010
【００８２】
【発明の効果】
上記のごとく、本発明により、骨吸収抑制活性を有する新規化合物、Ａ−８１８３０物質が提供された。Ａ−８１８３０物質を有効成分として含有する医薬は、各種骨代謝異常症の治療または予防薬として有用である。
【００８３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：ＰＣＲセンスプライマー１
配列番号２：ＰＣＲアンチセンスプライマー１
配列番号３：ＰＣＲセンスプライマー２
配列番号４：ＰＣＲアンチセンスプライマー２
配列番号５：ＰＣＲセンスプライマー３
配列番号６：ＰＣＲアンチセンスプライマー３
【００８４】
【配列表】
2004099462.tif 000011
2004099462.tif 000012
2004099462.tif 000013
2004099462.tif 000014
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2004099462.tif 000017
2004099462.tif 000018
2004099462.tif 000019