(57)【要約】【課題】虚血病態の治療又は予防に有用な、組織低酸素状態の改善剤を提供する。【解決手段】前記組織低酸素状態の改善剤は、（１）タイタスビル型変異を有するαグロビン、（２）前記タイタスビル型αグロビンのアミン酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は（３）前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、有効成分として含有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）タイタスビル型変異を有するαグロビン；
（２）前記タイタスビル型αグロビンのアミン酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（３）前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
を有効成分として含む、組織低酸素状態の改善剤。
【請求項２】
タイタスビル型変異を有するαグロビンのアミン酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現可能に有する、トランスジェニック非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織低酸素状態の改善剤に関する。本発明の組織低酸素状態改善剤は、虚血病態、例えば、呼吸不全又は虚血性疾患［例えば、虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞又は狭心症）、脳虚血、又は閉塞性血管障害（例えば、閉塞性動脈硬化）］の治療又は予防に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
慢性呼吸不全症では、種々の換気不全により末梢臓器が慢性の低酸素状態に暴露されている。このような虚血病態（すなわち、組織低酸素状態を伴う疾病）としては、呼吸不全症以外にも、種々の虚血性疾患、例えば、虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞又は狭心症）、脳虚血、又は閉塞性血管障害（例えば、閉塞性動脈硬化）などが挙げられる。これらの疾病における組織低酸素状態を改善させる方法の１つとして、ヘモグロビンの酸素親和性に着目したアプローチが公知である。
【０００３】
ヘモグロビンは、赤血球中に含まれ、肺から末梢組織への酸素運搬に主要な役割を果たす、４つのサブユニットからなる四量体のタンパク質である。より具体的には、α鎖群（α又はζ）グロビン２個と非α鎖群（β、γ、δ、又はε）グロビン２個の合計４個のグロビンに、それぞれ１個ずつのヘムが結合した四量体を形成する。ヘモグロビンには、１０００を超える変異体が知られており（非特許文献１）、例えば、ヘモグロビンの酸素親和性についても、低酸素親和性を示す変異体及び高酸素親和性を示す変異体が公知である。
ヘモグロビンの酸素親和性は、酸素解離曲線（例えば、後述の実施例２に示す図２参照）から把握することができ、例えば、低酸素親和性を示す変異ヘモグロビンでは、正常ヘモグロビンの酸素解離曲線と比較して、右方向への移動（右方移動）を呈し、高酸素親和性を示す変異ヘモグロビンでは左方向への移動（左方移動）を呈する。
【０００４】
ヘモグロビンの酸素親和性を低下させる（すなわち、ヘモグロビンの酸素解離曲線を右方移動させる）ことにより、組織低酸素状態を改善させる試薬としては、虚血性心疾患の治療薬として開発が行われている、２−［４−［［（３，５−二置換アニリノ）カルボニル］メチル］フェノキシ］−２−メチルプロプリオニックアシッド誘導体（ＲＳＲ１３）を有効成分とする合成アロステリック作用薬が公知である（非特許文献２）。
【０００５】
本発明者らは、前記合成アロステリック作用薬とは異なるアプローチとして、低酸素親和性を示す変異ヘモグロビンの１つであるプレズビテリアン（Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ）型変異ヘモグロビンを利用する方法を提案した（非特許文献３）。プレズビテリアン型変異では、βグロビン遺伝子における第１０８番目のアスパラギン（Ａｓｎ）がリジン（Ｌｙｓ）に置換されている。本発明者らは、プレズビテリアン型変異ヘモグロビンが組織へ及ぼす効果をインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で検討するために、プレズビテリアン型変異をマウスβグロビン遺伝子に導入したノックインマウスを作製した。
【０００６】
前記非特許文献３によれば、プレズビテリアン変異ヘテロマウス由来のプレズビテリアン型ヘモグロビンは、野生型マウス由来のヘモグロビンと比較して、右方移動を呈した。
また、プレズビテリアン変異ヘテロマウスの前脛骨筋では、野生型マウスと比較して、酸化系酵素の豊富なＩＩＡ型線維の増加が認められ、また、酸化系酵素活性の指標であるサクシネートデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）活性の増加も、ＩＩＡ型線維及びＩＩＢ型線維のいずれにおいても認められた。これらの前脛骨筋における変化は、末梢組織において高い酸素代謝能（例えば、酸化系酵素活性の向上）を獲得したことを示しており、更に、呼吸代謝のパラメーターであるＯ２消費量及びＣＯ２生成量がプレズビテリアン変異ヘテロマウスにおいて増加していることから、酸素分子を末梢組織に効率よく運搬及び供給可能であることが確認された。
更に、自主的走行実験を行ったところ、プレズビテリアン変異ヘテロマウスは、野生型マウスと比較して、一日当たりの平均走行距離で２倍以上の値を示した。この走行実験の結果は、野生型マウスと比較して、酸素分子を末梢組織に効率よく運搬及び供給可能となったことにより、走行中の筋肉組織における組織低酸素状態が改善され、平均走行距離が延びたものと考えられる。なお、プレズビテリアン変異マウスでは、全ヘモグロビンに対するプレズビテリアン型ヘモグロビンの割合が、最大でも３０％以下であった。
【０００７】
本発明者らは、前記非特許文献３において、ヒトプレズビテリアン症例の生理学的特性についても報告している。ヒトプレズビテリアン症例では、軽度の貧血が認められるものの、低酸素換気応答検査及び二酸化炭素換気応答検査の結果、低酸素又は二酸化炭素の負荷により、健常者と比較して、呼吸数が約半分になることが判明した。この結果は、ヒトプレズビテリアン症例では、酸素分子を末梢組織に効率よく運搬及び供給可能であるため、健常者の約半分の呼吸数でも運動を継続することが可能となったことを示している。
これらのプレズビテリアン変異マウス及びヒトプレズビテリアン症例の解析から、本発明者らは、低酸素親和性を示すプレズビテリアン型変異ヘモグロビンが、酸素分子を末梢組織に効率よく運搬及び供給可能であり、その結果、組織低酸素状態の改善に効果があり、従って、虚血病態の治療又は予防に有効であることを示した。
【０００８】
【非特許文献１】
「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，（米国），１９９８年，第９１巻，ｐ．２６４３−２６４４
【非特許文献２】
「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」，（米国），１９９９年，第１０３巻，ｐ．７３９−７４６
【非特許文献３】
玉置正勝、清水孝彦、鈴木陽一、及び白澤卓二，「呼吸不全治療に関する分子生物学的研究」，厚生省特定疾患呼吸不全研究班平成１３年度研究報告書，呼吸不全研究班，２００１年，ｐ．１５０−１５４）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、プレズビテリアン型変異ヘモグロビンよりも更に組織低酸素状態の改善効果に優れた変異ヘモグロビンを取得することを目的として鋭意探索したところ、タイタスビル（Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ）型変異ヘモグロビンが、より優れた組織低酸素状態の改善効果を示すことを新たに見出した。より具体的には、自主的走行実験において、タイタスビル変異ヘテロマウスは、野生型マウスと比較して、一日当たりの平均走行距離で２．５倍以上（プレズビテリアン変異ヘテロマウスでは２倍以上）の値を示した。しかも、タイタスビル変異マウスでは、全ヘモグロビンに対するタイタスビル型ヘモグロビンの割合が、最大でも１５％以下（プレズビテリアン変異マウスでは３０％以下）であり、タイタスビル型ヘモグロビンは含有割合が低いにもかかわらず、優れた組織低酸素状態の改善効果を示すことが判明した。本発明は、このような知見に基づくものである。
すなわち、本発明の課題は、優れた組織低酸素状態の改善効果を示す、虚血病態の治療又は予防剤を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、
（１）タイタスビル（Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ）型変異を有するαグロビン；
（２）前記タイタスビル型αグロビンのアミン酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（３）前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター
を有効成分として含む、組織低酸素状態の改善剤により解決することができる。
また、本発明は、タイタスビル型変異を有するαグロビンのアミン酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現可能に有する、トランスジェニック非ヒト動物に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
［１］本発明の医薬
本発明の組織低酸素状態改善剤（以下、単に、本発明の医薬と称することがある）は、その有効成分として、
（１）タイタスビル型変異を有するαグロビン；
（２）前記タイタスビル型αグロビンのアミン酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（以下、改善剤用ポリヌクレオチドと称する）；又は
（３）前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター（以下、改善剤用発現ベクターと称する）
を含有し、所望により、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤を更に含有することができる。すなわち、本発明の医薬は、前記有効成分の少なくとも１つを、それ単独で、あるいは、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、組織低酸素状態の改善を必要とする動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に、有効量で投与することができる。
【００１２】
本発明の医薬において有効成分として用いることのできる「タイタスビル型αグロビン」は、タイタスビル型変異を少なくとも有し、しかも、低酸素親和性（すなわち、右方移動）を示すヘモグロビンを形成可能であるαグロビンである限り、特に限定されるものではない。タイタスビル型変異とは、αグロビンの第９４番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がアスパラギン（Ａｓｎ）に置換されている変異を意味する。なお、本明細書において、前記αグロビンは、第９４番目のアミノ酸がアスパラギン酸であって、しかも、そのアスパラギン酸をアスパラギンに置換することによって低酸素親和性を示すヘモグロビンを形成可能なαグロビンである限り、特に限定されるものではないが、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、又はイルカ、好ましくはヒト又はマウス）αグロビンを挙げることができる。
【００１３】
前記タイタスビル型αグロビンとしては、例えば、ヒトα１グロビン（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＨ００２７１５）の第９４番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換した変異体、あるいは、マウスα１グロビン（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｖ００７１４）の第９４番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換した変異体などを挙げることができる。
【００１４】
本発明の医薬において有効成分として用いることのできる「改善剤用ポリヌクレオチド」は、前記タイタスビル型αグロビンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、タイタスビル型αグロビンのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。本明細書における「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。
【００１５】
本発明の医薬において有効成分として用いることのできる「改善剤用発現ベクター」は、改善剤用ポリヌクレオチドを含み、しかも、前記改善剤用ポリヌクレオチドでコードされるタイタスビル型αグロビンが投与対象内で発現可能な形で含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、改善剤用ポリヌクレオチドを遺伝子治療用ベクターに発現可能に挿入した発現ベクターを挙げることができる。
前記遺伝子治療用ベクターとしては、挿入される遺伝子を投与対象内で発現可能とする各種配列（例えば、プロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、又は転写終結配列など）を含むベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はレンチウイルスベクター等を挙げることができる。
【００１６】
本発明の医薬の投与方法は、タイタスビル型αグロビンが投与対象内でヘモグロビンとして機能可能である限り、特に限定されるものではなく、その有効成分に応じて適宜選択することができる。
本発明の医薬が有効成分としてタイタスビル型αグロビンを含む場合、その投与方法は、タイタスビル型αグロビンを含むヘモグロビンとして投与対象の血管内に注入可能な投与方法である限り、特に限定されるものではなく、例えば、人工血液として投与することができる。人工血液としては、例えば、（１）赤血球から得られるヘモグロビンを架橋することにより得られる架橋型又は重合型ヘモグロビン、あるいは、（２）リポソームにヘモグロビンをカプセル化したリポソーム型ヘモグロビンが知られている（Ｓｑｕｉｒｅｓ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９５，  １００２−１００４，  ２００２；特開平２００１−３４８３４１号公報）。適当な宿主、例えば、大腸菌（Ｌｏｏｋｅｒ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５６，  ２５８−２６０，  １９９２）又はトランスジェニック動物（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，  Ｊ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９，  ２７６９２−２７６９９，  １９９４）により、タイタスビル型αグロビンを含むリコンビナントヘモグロビンを産生し、前記人工血液として、本発明の医薬を投与することができる。
【００１７】
タイタスビル型αグロビンを有効成分として含む本発明の医薬では、前記タイタスビル型αグロビンを、タイタスビル型αグロビンを含むヘモグロビンとして含むことが好ましい。この場合、前記ヘモグロビン中に含まれるα鎖は、全てタイタスビル型αグロビンであることもできるし、あるいは、その一部のみがタイタスビル型αグロビンであって、非タイタスビル型αグロビン（例えば、正常αグロビン又はタイタスビル以外の変異型αグロビン）を含むこともできる。
後述の実施例に示すように、全ヘモグロビンに対するタイタスビル型ヘモグロビンの割合が最大でも１５％以下であるタイタスビル変異マウス［実施例２（１）参照］であっても、野生型マウスと比較して、一日当たりの平均走行距離で２．５倍以上の値を示す［実施例２（５）参照］。従って、ヘモグロビンとしてタイタスビル型αグロビンを含む本発明の医薬では、ヘモグロビン中に含まれるα鎖の一部のみがタイタスビル型αグロビンであっても、組織低酸素状態を充分に改善することができる。
【００１８】
本発明の医薬が有効成分として改善剤用ポリヌクレオチド又は改善剤用発現ベクターを含む場合、その投与方法としては、例えば、遺伝子治療における種々の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、（１）自家移植による方法、又は（２）胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法などを挙げることができる。
自家移植による方法では、例えば、投与対象から骨髄細胞を採取し、前記骨髄細胞中の造血幹細胞に改善剤用ポリヌクレオチド又は改善剤用発現ベクターを導入した後、必要に応じて遺伝子導入細胞を体外増幅（ｅｘ  ｖｉｖｏ増幅）させ、最終的に投与対象に戻すことにより、タイタスビル型αグロビンを含むヘモグロビンを投与対象内で発現させることができる。
また、胚性幹細胞を用いる方法では、例えば、胚性幹細胞に改善剤用ポリヌクレオチド又は改善剤用発現ベクターを導入した後、遺伝子導入細胞を造血幹細胞又は赤芽球に分化させ、最終的に投与対象に戻すことにより、タイタスビル型αグロビンを含むヘモグロビンを投与対象内で発現させることができる。
【００１９】
例えば、Ｐａｗｌｉｕｋ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９４，  ２３６８−２３７１，  ２００１には、ヒトβＡグロビン遺伝子の一塩基変異に起因する異常ヘモグロビン（ＨｂＳ）の形成を伴う鎌状赤血球病（ＳＣＤ）が、ＳＣＤモデルマウスにおいて、遺伝子治療により改善されたことが開示されている。より詳細には、異常ヘモグロビンＨｂＳの重合を抑制可能なβＡグロビン変異遺伝子を設計し、それをレンチウイルスベクターに組み込むことにより、遺伝子治療用発現ベクターを構築した。マウス骨髄から得られた造血幹細胞に、ウイルス感染により前記発現ベクターを導入した後、前記細胞をマウスに戻すことにより、１０箇月の長期に亘って赤血球系列に変異グロビンを発現させることができた。
【００２０】
本発明の医薬を用いる場合の投与量は、例えば、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、有効成分の種類、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。
【００２１】
本発明の医薬の有効成分であるタイタスビル型αグロビンそれ自体、あるいは、本発明の医薬の有効成分である改善剤用ポリヌクレオチド又は改善剤用発現ベクターによりコードされるタイタスビル型αグロビンは、投与対象の生体内で、タイタスビル型αグロビンを含むヘモグロビンとして機能することにより、肺から組織（例えば、筋肉、心臓、神経、又は皮膚）への酸素供給能を向上させることができる。すなわち、組織への酸素の運搬及び供給を効率よく行うことができるため、例えば、組織が低酸素状態となった場合でも、その組織低酸素状態を改善することができ、虚血病態、例えば、呼吸不全又は虚血性疾患などの治療又は予防に有用である。前記虚血性疾患には、例えば、虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞又は狭心症）、脳虚血、又は閉塞性血管障害（例えば、閉塞性動脈硬化）などが含まれる。
【００２２】
また、本発明の医薬は、投与対象の生体内で、タイタスビル型αグロビンを含むヘモグロビンとして機能することにより、例えば、
（１）組織（例えば、筋肉、心臓、神経、又は皮膚）における酸素代謝能の向上（例えば、酸化系酵素活性の向上）；
（２）組織（例えば、筋肉、心臓、神経、又は皮膚）の改変（例えば、有酸素運動に適した筋肉への改変）；又は
（３）運動能力の向上［例えば、走力の向上（例えば、走行距離の延長、又は走行負荷に対する耐性の向上など）］
などの効果を示し、従って、本発明の医薬は、組織における酸素代謝能の向上剤、組織の改変剤、又は運動能力の向上剤としても使用することができる。また、これらの効果を有するため、本発明の医薬は、例えば、脳血管性痴呆症の治療又は予防に有用である。
【００２３】
［２］本発明のトランスジェニック非ヒト動物
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、タイタスビル型αグロビンのアミン酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現可能に有する限り、特に限定されるものではなく、公知の方法（例えば、Ｓｈｉｒａｓａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８，  ５０３５−５０４３，  ２００３）により作製することができる。
前記非ヒト動物としては、例えば、ヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、又はイルカ）、鳥類（例えば、ニワトリ又はウズラ）、両生類（例えば、カエル）、又は爬虫類などを挙げることができる。
【００２４】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、タイタスビル型αグロビンを含むヘモグロビンを有するため、酸素分子を末梢組織に効率よく運搬及び供給可能であり、タイタスビル型αグロビンを含まない野生型非ヒト動物と比較して、組織低酸素状態に対して耐性を示す。従って、各種疾病、特には虚血病態に対する治療薬又はその候補化合物の評価に適している。例えば、虚血病態に対する治療薬又はその候補化合物の評価、すなわち、組織低酸素状態の改善作用を評価するためには、予め非ヒト動物を組織低酸素状態とすることが必要である。この場合、野生型非ヒト動物では、生命維持自体が困難な状態に陥る可能性が高いのに対して、本発明のトランスジェニック非ヒト動物では、組織低酸素状態に対して耐性を示すため、前記評価を実施することができる。
【００２５】
【作用】
タイタスビル型ヘモグロビンが低酸素親和性を示す機序は、プレズビテリアン型ヘモグロビンが低酸素親和性を示す機序と異なっている（Ｓｈｉｒａｓａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８，  ５０３５−５０４３，  ２００３）。プレズビテリアン型ヘモグロビンでは、グロビン四量体の中心部に配向するβ１０８ＡｓｎがＬｙｓに変異することにより、ヘモグロビン中心窩へＣｌ−を囲い、脱酸素状態で安定化する。一方、タイタスビル型ヘモグロビンでは、α１β２サブユニットの境界面に位置するα９４ＡｓｐがＡｓｎに変異することにより、脱酸素状態で安定化する。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《タイタスビル型ヘモグロビンを発現する変異マウスの作製》
本実施例では、ヘモグロビンα１グロビン遺伝子における第９４番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）をアスパラギン（Ａｓｎ）に置換することにより、α１グロビン遺伝子にタイタスビル変異を導入したノックインマウスを、以下の手順に従って作製した。
作製方針の概略を図１に示す。図１において、各記号「α１」、「ζ」、「ｎｅｏｒ」、及び「Ｅ」は、それぞれ、α１グロビン遺伝子、ζグロビン遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位を示し、記号「Ｄ９４Ｎ」及びその直下の記号「＊」は、「＊」で示す位置に、第９４番目のアスパラギン酸（Ｄ）をアスパラギン（Ｎ）に置換した変異を導入したことを示す。
【００２７】
マウスα１グロビン遺伝子における３７２ｂｐの５’フランキング配列（１〜３７２番のヌクレオチド；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｖ００７１４）をプローブとして、マウスゲノムのλファージ（λＦＩＸＩＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）ライブラリー１２９個をスクリーニングすることによって、前記遺伝子の全エクソンをカバーする２個のオーバーラップクローンを得た。α１グロビンの全エクソンを含む１．０ｋｂフラグメントを増幅した後、市販のミュータジェネシスキット（ｐＡＬＴＥＲ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、第９４番目のＡｓｐに対応するコドンＧＡＴを、Ａｓｎに対応するコドンＡＡＴに改変した。５’相同フラグメント（６．８ｋｂ）、変異導入済みα１グロビン遺伝子（１．０ｋｂ）、ネオマイシン耐性遺伝子、及び３’相同フラグメント（２．２ｋｂ）をこの順に配置した構築物を、Ｓｈｉｒａｓａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８，  ５０３５−５０４３，  ２００３に記載の手順に従って構築し、ベクターｐＭＣ１ＤＴ−Ａ（Ｂ）（オリエンタル酵母）にクローニングした。
【００２８】
得られたベクターを制限酵素により線状化し、ＥＳ細胞のエレクトロポレーションに使用した。Ｇ４１８耐性ＥＳクローン２４０個の各ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、図１に示すプローブ（８００ｂｐ）を用いるサザンブロット分析により、所望の相同組換えが起こったクローンをスクリーニングした。選択したＥＳクローンを用いて、アグリゲーション法（Ｈｕｍ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ８，  ２１８０−２１８４，  １９９３）によりキメラマウスを作製した。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６ＣｒＳｌｃマウス（日本ＳＬＣ）と交配させた後、図１に示すプライマーｐ１及びｐ２を用いるＰＣＲ増幅により、生殖細胞系への伝達を確認した。
【００２９】
比較用として、ヘモグロビンβグロビン遺伝子における第１０８番目のアスパラギン（Ａｓｎ）をリジン（Ｌｙｓ）に置換することにより、βグロビン遺伝子にプレズビテリアン変異を導入したノックインマウスを、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２９５，  ８６９−８７６，  ２００２に記載の手順に従って作製した。
【００３０】
【実施例２】
《変異マウスの解析》
（１）ヘモグロビン構成及び全血球算定
タイタスビル変異マウス及びプレズビテリアン変異マウス末梢血から各ヘモグロビンを調製し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。なお、前記調製及び分析は、Ｓｈｉｒａｓａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８，  ５０３５−５０４３，  ２００３に記載の手順に従って実施した。タイタスビル変異ホモマウスでは、全ヘモグロビンにおける全αグロビンに対するタイタスビル型αグロビンの割合の割合が、最大でも１５％以下であり、プレズビテリアン変異ヘテロマウスでは、全ヘモグロビンにおける全βグロビンに対するプレズビテリアン型βグロビンの割合の割合が、最大でも３０％以下であった。
また、タイタスビル変異マウス及び野生型マウスにおける全血球算定の結果を表１に示す。表１に示すデータは、平均値±ＳＥＭである。表１から明らかなように、タイタスビル変異マウスでは、特に異常は認められなかった。
【００３１】
2004269386.tif 000002
【００３２】
（２）赤血球の酸素解離特性の分析
タイタスビル変異マウス（Ｔｉｔｕ／Ｗｔ）、プレズビテリアン変異マウス（Ｐｒｅｓ／Ｗｔ）、タイタスビル及びプレズビテリアン二重変異マウス（Ｔｉｔｕ／Ｗｔ，  Ｐｒｅｓ／Ｗｔ）、並びに野生型マウス（Ｗｔ／Ｗｔ）からそれぞれ調製した赤血球を用いて、酸素解離特性を分析した。赤血球の酸素解離曲線を図２に示し、赤血球のＨｉｌｌプロット（Ｈｉｌｌ’ｓ  ｐｌｏｔ）を図３に示す。図２及び図３における記号「ｐＯ２」は酸素分圧を意味する。なお、前記分析は、Ｈｅｍｏｘ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＴＣＳ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて３７℃で行った。
【００３３】
図２に示す酸素解離曲線では、プレズビテリアン型ヘモグロビン（Ｐ５０＝４３．５ｍｍＨｇ）は、野生型ヘモグロビン（Ｐ５０＝４７．０ｍｍＨｇ）と比較して、右方移動を呈した。また、タイタスビル型ヘモグロビン（Ｐ５０＝６６．０ｍｍＨｇ）並びにタイタスビル及びプレズビテリアン型ヘモグロビン（Ｐ５０＝７２．０ｍｍＨｇ）は、更に顕著に右方移動を呈した。
Ｈｉｌｌ係数については、プレズビテリアン型ヘモグロビンでは、野生型ヘモグロビンと比較して顕著な差は認められなかったのに対して、タイタスビル型ヘモグロビン並びにタイタスビル及びプレズビテリアン型ヘモグロビンでは、Ｈｉｌｌ係数が低下した。タイタスビル型ヘモグロビンにおけるＨｉｌｌ係数の低下は、酸素結合型ヘモグロビン四量体としての立体特性の変化をもたらすことを示唆している。
【００３４】
（３）血液ガス分析及び代謝分析
変異型ヘモグロビンの酸−塩基バランスへの影響を検討するために、タイタスビル変異マウス、プレズビテリアン変異マウス、及び野生型マウスにおける動脈血液のｐＨ、動脈血液におけるＣＯ２分圧（ＰａＣＯ２）、及び動脈血液におけるＯ２分圧（ＰａＯ２）をそれぞれ測定した。なお、前記測定は、Ｓｈｉｒａｓａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８，  ５０３５−５０４３，  ２００３に記載の手順に従って、血液ガス分析器（ＯＰＴＩ  ＣＣＡ；ＡＶＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を用いて３７℃で行った。タイタスビル変異マウス及び野生型マウスについて、結果を表２に示す。表２に示すデータは、平均値±ＳＥＭである。
タイタスビル変異マウスでは、通常大気下（ｒｏｏｍ  ａｉｒ）又は低酸素症状態（ｈｙｐｏｘｉａ）のいずれにおいても、野生型マウスと同じように、正常なｐＨ、ＰａＣＯ２、及びＰａＯ２を示した。一方、プレズビテリアン変異マウスでは、通常大気下又は低酸素症状態のいずれにおいても、ｐＨの低下とＰａＣＯ２の上昇が認められた（データは示さず）。
【００３５】
《表２》
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【００３６】
次に、タイタスビル変異マウス、プレズビテリアン変異マウス、及び野生型マウスにおける代謝パラメーターとして、Ｏ２消費量、ＣＯ２生成量、及び呼吸商を測定した。なお、前記測定は、Ｓｈｉｒａｓａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８，  ５０３５−５０４３，  ２００３に記載の手順に従って行った。タイタスビル変異マウス及び野生型マウスについて、結果を表３に示す。表３に示すデータは、平均値±ＳＥＭであり、各記号「ａ」及び「ｂ」は、タイタスビル変異マウスと野生型マウスとの間に有意差（ａ：  ｐ＜０．０５，  ｂ：  ｐ＜０．０１；  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔｅｓｔによる）が認められることを示す。
両変異マウスとも、通常大気下又は低酸素症状態のいずれにおいても、野生型マウスと比べて、より多くのＯ２を消費し、より多くのＣＯ２を生成した。
【００３７】
2004269386.tif 000004
【００３８】
（４）筋肉の組織化学的分析及び酵素学的分析
タイタスビル変異マウス、プレズビテリアン変異マウス、及び野生型マウスの前脛骨筋の筋線維構成を検討するために、ＡＴＰアーゼ活性に基づく組織化学的染色を実施した。なお、前記染色は、Ｓｈｉｒａｓａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８，  ５０３５−５０４３，  ２００３に記載の手順に従って行った。
タイタスビル変異マウス（Ｔｉｔｕ／Ｗｔ）及び野生型マウス（Ｗｔ／Ｗｔ）について、前脛骨筋の深層部における組織化学的染色の結果を図４の上段に示し、前記染色に基づいて算出した筋線維構成を図５に示す。図４における各記号「ＩＩＡ」及び「ＩＩＢ」は、それぞれ、ＩＩＡタイプ繊維及びＩＩＢタイプ繊維を意味し、下段左側（Ｗｔ／Ｗｔ，  ＳＤＨ）の右下隅のスケールバーは、長さ５０μｍを示す。図５に示すデータは、平均値±標準偏差（ｎ＝５）であり、図５に示す記号「＊」は、タイタスビル変異マウスと野生型マウスとの間に有意差（ｐ＜０．００１；  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔｅｓｔによる）が認められることを示す。
【００３９】
タイタスビル変異マウス及びプレズビテリアン変異マウスのいずれにおいても、前脛骨筋の深層部（骨に近い側）、中層部、及び表層部（筋肉の表面に近い側）での筋線維の肥大及び萎縮は観察されなかった（データは示さず）。しかし、図４に示すように、タイタスビル変異マウスでは、野生型マウスと比較して、ＩＩＡタイプ繊維の割合が高くなり、ＩＩＢタイプ繊維の割合が低下していた。また、プレズビテリアン変異マウスにおいても、同様の傾向が認められた。具体的には、ＩＩＡタイプ繊維及びＩＩＢタイプ繊維の割合は、野生型マウスでは３９．５％及び６０．５％であるのに対して、タイタスビル変異マウスでは５１．４％及び４８．６％であり、プレズビテリアン変異マウスでは４９．８％及び５０．２％であった。なお、ＩＩＡタイプ繊維は、ＩＩＢタイプ繊維と比較して、酸化系酵素が豊富である。
【００４０】
次に、マウス前脛骨筋の酸化系酵素の指標であるサクシネートデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）活性を測定した。ＳＤＨ活性に基づく組織化学的染色は、Ｓｈｉｒａｓａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８，  ５０３５−５０４３，  ２００３に記載の手順に従って行った。タイタスビル変異マウス及び野生型マウスについて、組織化学的染色の結果を図４の下段に示し、前記染色に基づいて算出したＩＩＡタイプ繊維及びＩＩＢタイプ繊維におけるＳＤＨ活性の結果を図６に示す。図６に示すデータは、平均値±標準偏差（ｎ＝５）であり、図６に示す記号「＊」は、タイタスビル変異マウスと野生型マウスとの間に有意差（ｐ＜０．００１；  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔｅｓｔによる）が認められることを示す。
タイタスビル変異マウスでは、野生型マウスと比較して、酸化系酵素活性が本来豊富であるＩＩＡタイプ繊維においてＳＤＨ活性が増加しただけでなく、ＩＩＢタイプ繊維においてもＳＤＨ活性の増加が認められた。また、プレズビテリアン変異マウスにおいても、同様の傾向が認められた。タイタスビル変異マウス及びプレズビテリアン変異マウスにおけるこれらの前脛骨筋における変化は、末梢組織において高い酸素代謝能を獲得したことを示している。
【００４１】
（５）自主的走行実験
タイタスビル変異マウス、プレズビテリアン変異マウス、及び野生型マウスにおける末梢組織への酸素運搬及び供給能力を検討する目的で、自主的走行実験を行い、一日当たりの平均走行距離を比較した。自主的走行実験は、飼育ケージ（２０ｃｍ×３０ｃｍ×１２ｃｍ）内にランニングホィール（幅＝５ｃｍ、直径＝２５．５ｃｍ）を設置し、Ｓｈｉｒａｓａｗａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８，  ５０３５−５０４３，  ２００３に記載の手順に従って行った。
タイタスビル変異マウス（Ｔｉｔｕ／Ｗｔ）及び野生型マウス（Ｗｔ／Ｗｔ）の結果を図７に示し、プレズビテリアン変異マウス（Ｐｒｅｓ／Ｗｔ）及び野生型マウス（Ｗｔ／Ｗｔ）の結果を図８に示す。図７及び図８に示すデータは、平均値±標準偏差（ｎ＝５）である。
【００４２】
タイタスビル変異マウスの一日当たりの平均走行距離は、野生型マウスと比較して、約２．５倍以上（プレズビテリアン変異マウスでは、野生型マウスと比較して、約２倍以上）の値を示した。しかも、前記実施例２（１）に示したように、タイタスビル変異マウスでは、全ヘモグロビンに対するタイタスビル型ヘモグロビンの割合が、最大でも１５％以下（プレズビテリアン変異マウスでは３０％以下）であり、タイタスビル型ヘモグロビンは含有割合が低いにもかかわらず、比較用のプレズビテリアン型ヘモグロビンよりも、優れた酸素運搬及び供給能力を示すことが確認された。この結果は、タイタスビル型ヘモグロビンが、比較用のプレズビテリアン型ヘモグロビンと比較して、より優れた組織低酸素状態の改善効果を有することを示している。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の組織低酸素状態改善剤は、プレズビテリアン型ヘモグロビンよりも優れた効果を示すタイタスビル型ヘモグロビンを利用するため、組織低酸素状態の改善に関して優れた効果を示し、虚血病態の治療又は予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】タイタスビル変異マウスの作製方針を模式的に示す説明図である。
【図２】各変異マウス及び野生型マウスから調製した各赤血球の酸素解離曲線である。
【図３】各変異マウス及び野生型マウスから調製した各赤血球のＨｉｌｌプロットである。
【図４】タイタスビル変異マウス及び野生型マウスについて、ＡＴＰアーゼ活性又はＳＤＨ活性に基づく組織化学的染色の結果を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図５】タイタスビル変異マウス及び野生型マウスの前脛骨筋における筋線維構成を示すグラフである。
【図６】タイタスビル変異マウス及び野生型マウスにおける筋線維ＳＤＨ活性を示すグラフである。
【図７】タイタスビル変異マウス及び野生型マウスにおける自主的走行実験の結果を示すグラフである。
【図８】プレズビテリアン変異マウス及び野生型マウスにおける自主的走行実験の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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