(57)【要約】【課題】有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で酵素を触媒として効率的に利用する方法を提供する。【解決手段】アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、該酵素をアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に発現させた酵母を用いて有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で該触媒反応を行う方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、該酵素をアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に発現させた酵母を用いて有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で該触媒反応を行う方法。
【請求項２】
該酵母が、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、該ペプチド及び／又はタンパク質をアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に共発現させた酵母である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子、触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子、及び該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡにより、該酵素をアグルチニンの全長又はその一部及び該ペプチド及び／又はタンパク質を含む融合タンパク質として細胞表層に発現させた酵母を用いて有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で該触媒反応を行う方法。
【請求項４】
有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行うための酵素であって、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、アグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として酵母の細胞表層に発現させた酵素。
【請求項５】
該酵母が、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、該ペプチド及び／又はタンパク質をアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に共発現させた酵母である請求項４に記載の酵素。
【請求項６】
有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行うための酵素であって、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子、該触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子、及び該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡにより、アグルチニンの全長又はその一部及び該ペプチド及び／又はタンパク質を含む融合タンパク質として酵母の細胞表層に発現させた酵素。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の酵素を含み、有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行うための触媒。
【請求項８】
有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行うための触媒を含む酵母であって、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、アグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に発現させた該酵素を含む酵母。
【請求項９】
該酵母が、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、該ペプチド及び／又はタンパク質をアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に共発現させた酵母である請求項８に記載の酵母。
【請求項１０】
有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行うための触媒を含む酵母であって、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子、該触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子、及び該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡにより、アグルチニンの全長又はその一部及び該ペプチド及び／又はタンパク質を含む融合タンパク質として細胞表層に発現させた該酵素を含む酵母。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と触媒反応のための酵素をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより細胞表層に融合タンパク質として該酵素を発現させた酵母を有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒として用いる方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、有機化合物の合成に酵素や微生物などを触媒として使用する技術が注目されている。これらの生体触媒は、通常、２５−４０℃及び中性ｐＨ条件という温和な条件下での反応が可能である。また、反応生成物の位置選択性や立体特異性に優れることから、医薬品原体等の製造に既に利用がなされている。酵素反応は酵素の変性を防ぐために、通常は水溶液系で行われている。反応原料が有機溶媒可溶性で水に不溶性の物質である場合には、原料を生体触媒を含む水溶液中に懸濁させるか、または反応液中に界面活性剤を併存させて生体触媒と反応させることになるが、この方法では、水溶液中の反応原料濃度が低いことから一般的に反応効率が低い。
【０００３】
この理由から、非水溶性の反応原料を有機溶媒に溶解して、その有機溶媒中で酵素や微生物を生体触媒として反応を行う方法や、有機溶媒と酵素や微生物を含有する反応水溶液とを混合して反応を行う方法が提案されている。しかしながら、これらの方法では、有機溶媒との接触により酵素が失活したり、微生物が死滅してしまうことが多い。特に、生体触媒として微生物を用いる場合、微生物が死滅してしまうと、死菌体を用いた反応のみが実施されることになる。従って、この方法は補酵素系の再生が必要な反応には使用することができない。
【０００４】
生体触媒として酵素を用いる場合、種々の担体に酵素を固定化したり、ポリエチレングリコール等のポリマーで修飾して、有機溶媒中においてもその活性を保持させる手段が検討されている。しかし、修飾反応のため新たな工程が必要となり、その為に製造コストが上昇するといった実用化への課題が残されている。生体触媒として微生物自体を用いる方法も提案されているが、この方法では、一般的に反応原料が微生物の細胞膜を透過し、目的とする酵素の存在する場所まで到達する必要があり、反応後には生成物が細胞膜を透過して細胞外へ放出される必要があることから、反応効率として酵素単独での反応に及ばない場合がある。特に、細胞膜を透過できない物質の場合には、反応は起こり得ないという問題点がある。一方、酵素単独で反応を行う場合にはこの様な細胞膜透過の問題はないものの、大量の酵素を得るためには煩雑な複数の精製工程が必要であり、実用化において問題がある。
【０００５】
細胞表層に酵素を発現させた微生物を用いて酵素反応を行う方法も提案されている。細胞表層に酵素を発現可能な微生物として、従来、原核生物であるグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、及び酵母、動物細胞、植物細胞の様な真核生物の利用が提案されているが、培養の容易さ、安全性、糖タンパク質の生合成が可能である点などから、酵母が最も優れている。例えば、植田等はグルコアミラーゼを酵母表層に固定化して、デンプンを唯一の炭素源として生育させ、エタノールを生産することに成功している（Ｕｅｄａ　ｅｔ　ａｌ，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６３，　１３３２−１３３６　（１９９７））。微生物の細胞表層に酵素を発現させ生体触媒として利用する技術に関しては、特表平７−５０８６５２号公報や特開平１１−２９００７８号公報に酵母表層にリパーゼ等の酵素を発現させて、水溶液中で生体触媒として利用する方法が開示されている。しかしながら、細胞表層に酵素を発現させた微生物を用いて酵素反応を行うこれらの方法はいずれも反応を水溶液中で行うものであり、上記刊行物には、反応溶媒としての有機溶媒の使用、又は有機溶媒と水との二層系中での反応に関して示唆ないし教示はない。
【０００６】
なお、有機溶媒中で酵素や微生物を触媒として利用する技術に関しては、例えば特開平６−２６９２８５号公報にイソプレノイドで修飾した酵素を有機溶媒中で利用する方法、特開平６−００００９０号公報に親水性担体に微生物を固定化して有機溶媒中で触媒として用いる方法が開示されているが、これらの方法は、微生物の細胞表層に酵素を発現させたものを触媒として用いるものではない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で酵素を触媒として効率的に利用する方法を提供することにある。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と触媒反応のための酵素をコードする遺伝子とを含むＤＮＡを用いて、該酵素を酵母の細胞表層に融合タンパク質として発現させ、その酵母を有機溶媒中または有機溶媒と水との二層系中で触媒として用いることにより、有機溶媒との接触による酵素の失活を軽減することができ、極めて効率的に種々の触媒反応を行うことができることを見出した。また、上記の融合タンパク質において、該酵素の有機溶媒中での酵素活性を高める作用を有するペプチドやタンパク質などをさらに含めた形態で発現させるか、あるいは別の融合タンパク質として共発現させることにより、さらに高い触媒活性を達成することができることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明により、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより該酵素をアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に発現させた酵母を用いて、有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で該触媒反応を行う方法が提供される。また、好ましい態様により、該酵母が、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、該ペプチド及び／又はタンパク質をアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に共発現させた酵母である上記の方法が提供される。
【０００９】
また、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子、触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子、及び該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡにより、該酵素をアグルチニンの全長又はその一部及び該ペプチド及び／又はタンパク質を含む融合タンパク質として細胞表層に発現させた酵母を用いて、有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で該触媒反応を行う方法が本発明により提供される。
【００１０】
別の観点からは、本発明により、有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行うための酵素であって、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、アグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として酵母の細胞表層に発現させた酵素が提供される。好ましい態様によれば、該酵母が、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、該ペプチド及び／又はタンパク質をアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に共発現させた酵母である上記の酵素が提供される。
【００１１】
また、有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行うための酵素であって、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子、該触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子、及び該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡにより、アグルチニンの全長又はその一部及び該ペプチド及び／又はタンパク質を含む融合タンパク質として酵母の細胞表層に発現させた酵素が提供される。これらの酵素を含み、有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行うための触媒も本発明により提供される。
【００１２】
さらに別の観点からは、有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行うための酵母であって、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、アグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に発現させた該酵素を含む酵母；該酵母が、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、該ペプチド及び／又はタンパク質をアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に共発現させた酵母である上記酵母；及び、有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行うための酵母であって、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子、該触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子、及び該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡにより、アグルチニンの全長又はその一部及び該ペプチド及び／又はタンパク質を含む融合タンパク質として細胞表層に発現させた該酵素を含む酵母も本発明により提供される。
【００１３】
これらの発明の好ましい態様によれば、該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高めるププチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子配列は、例えば１００　ｂｐ以上の微生物由来のＤＮＡ断片ライブラリーから選択された配列であり、宿主酵母としては有機溶媒耐性を増強された酵母を用いることができる。該酵素による触媒反応において酵母の補酵素系を用いる場合には、酵母として有機溶媒耐性を有する酵母を用いることが好ましい。また、該酵素は、例えば、オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、及びリガーゼからなる群から選ぶことができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子とを含むＤＮＡを用いて、アグルチニンの全長又はその一部及び該酵素を含む融合タンパク質を酵母の細胞表層に発現させ、該酵母を用いて有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で該触媒反応を行うことを特徴としている。好ましい態様によれば、該酵母は、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、該ペプチド及び／又はタンパク質をアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に共発現させた酵母である。また、触媒反応を行うための酵素、該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高めるペプチド及び／又はタンパク質、及びアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質を酵母の細胞表層に発現させ、その酵母を触媒反応に用いることもできる。
【００１５】
触媒反応を行うための酵素の種類は特に限定されず、任意の化学反応を触媒する酵素を用いることができる。化学反応としては、例えば、エステル化反応、加水分解反応、アシル化反応、水酸化や脱水素反応などの酸化反応、水素付加などの還元反応などを挙げることができるが、これらに限定されることはなく、多様な化学反応を触媒する酵素を用いることが可能である。１つの酵素が触媒する化学反応は２種類以上であってもよい。また、本発明の方法では、それぞれ別な反応を触媒する２種以上の酵素を同一の酵母の細胞表層に発現させることができる。具体的な酵素としては、例えば、オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、エステラーゼ、又はリガーゼなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。酵素は天然由来のものであってもよいが、天然由来の酵素のアミノ酸配列に対して他のアミノ酸による置換、挿入、及び／又は欠失を導入した改変体であってもよい。
【００１６】
反応を行う有機溶媒の種類は特に限定されず、水と実質的に混じりあわない有機溶媒のほか、水と混じりあう性質の有機溶媒を用いてもよい。例えば、ペンタン、ヘキサンなどの炭化水素系溶媒、メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒、酢酸エチルなどのエステル系溶媒、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、クロロホルム、ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素系溶媒、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素系溶媒、ピリジンなどの含窒素芳香族系溶媒、アセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのアミド系溶媒、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、スルホランなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１７】
有機溶媒は実質的に完全に無水の溶媒として用いてもよいが、必要に応じて、適宜の含水溶媒として用いることもできる。水の含有量は特に限定されないが、０．０１〜４０質量％程度である（本明細書において「〜」で表される数値範囲は上限及び下限の数値を含む。）。水と実質的に混じりあわない有機溶媒を用いる場合には、反応を二層系で行うことができる。
【００１８】
酵母の細胞表層に酵素を融合タンパク質として発現させるための手段は公知であり、例えば、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼを細胞表層に発現させるプラスミドｐＷＲＳＬ１７を含む酵母ＭＴ８−１／ｐＷＲＳＬ１７の生産方法が知られている（Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５６，　６８１−６８６　（２００１））。本発明の方法に用いる酵母は、上記の刊行物に記載された方法に従って、必要に応じて適宜の修飾ないし改変を加えることにより、当業者が容易に生産できる。
【００１９】
宿主として用いる酵母の種類は特に限定されないが、該酵素による触媒反応におこなうにあたり、酵母の補酵素系が触媒反応に関与する場合には、有機溶媒耐性を有する酵母を用いることが好ましい。一方、触媒反応において酵母が有する補酵素系の関与が必要ない場合には、有機溶媒中で酵母が死滅しても差し支えないので、一般的には、有機溶媒耐性を有する酵母を用いる必要はない。例えば、サッカロミセス類、ジゾサッカロミセス属、キャンデイダ属などに属する酵母を好ましく用いることができるが、サッカロミセス属に属する酵母を用いることがより好ましく、具体的にはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＴ８−１などを挙げることができる（Ｔａｊｉｍａ，　Ｍ．，　Ｙｅａｓｔ，　１，　６７−７７　（１９８５））。
【００２０】
一般的に、有機溶媒に対して耐性を有する微生物の取得方法として、土壌等からのスクリーニングやニトロソ化剤等による突然変異を利用する方法が知られているので（例えばＡｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５６，　１４５−１４６　（１９９２））、この方法を利用して有機溶媒耐性の酵母を取得することができる。もっとも、土壌からのスクリーニング等で得られた微生物は、遺伝子操作を加えなければ外来酵素の遺伝子工学的な発現に用いることができない場合がある。このような方法に替わる方法として、外来ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子の導入により有機溶媒に対して耐性を獲得した微生物を作出する方法が提案されている。この方法によれば、外来ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子の導入により高度な有機溶媒耐性を獲得した微生物を作出し、その微生物をそのまま任意の酵素を細胞表層に発現させるための宿主として利用することができる。例えば、植田らにより、酵母由来のＤＮＡ断片ライブラリーをａ−アグルチニンとの融合タンパク質として酵母表層に発現させ、有機溶媒（ノナン）耐性の酵母を作出したことが報告されている（Ｕｄｅａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５８，　８０６−８１２，　２００２）。
【００２１】
触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高めるペプチド及び／又はタンパク質の種類は特に限定されず、酵素の種類や基質の種類、あるいは触媒反応の条件などに応じて適宜選択することができる。また、このようなペプチド及び／又はタンパク質には、有機溶媒耐性を高めるためのペプチド及び／又はタンパク質が含まれる。例えば、該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高めるププチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子配列は、例えば１００　ｂｐ以上の微生物由来のＤＮＡ断片ライブラリーから選択することができるが、このような配列に限定されることはない。
【００２２】
本発明により提供される酵母は、その細胞表層に触媒反応のための酵素を発現しており、該酵素はアグルチニンの全長又は一部をコードする配列との融合タンパク質として発現されている。また、好ましい態様によれば、該酵母が、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子と該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡにより、該ペプチド及び／又はタンパク質をアグルチニンの全長又はその一部を含む融合タンパク質として細胞表層に共発現させた酵母である。さらに、アグルチニンの全長又はその一部をコードする遺伝子、触媒反応を行うための酵素をコードする遺伝子、及び該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡにより、該酵素をアグルチニンの全長又はその一部及び該ペプチド及び／又はタンパク質を含む融合タンパク質として細胞表層に発現させた酵母であってもよい。
【００２３】
酵母の細胞表層に酵素をアグルチニン又はその部分配列を含む融合タンパク質として発現させるための好ましいＤＮＡは、例えば、プロモーター、分泌シグナル配列、酵素の遺伝子配列、アグルチニンの全長又は一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を有する。該酵素の触媒反応活性並びに／あるいは立体選択性及び／又は位置選択性を実質的に高める該ペプチド及び／又はタンパク質をアグルチニン又はその部分配列を含む融合タンパク質として発現させるための好ましいＤＮＡは、上記のＤＮＡにおける酵素の遺伝子配列に替えて該ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を有している。また、酵素と該ペプチド又はタンパク質とをアグルチニン又はその部分配列を含む融合タンパク質として発現させるための好ましいＤＮＡは、上記のＤＮＡにおける酵素の遺伝子配列とともに該ペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる。以下、上記ＤＮＡの好ましい態様について説明するが、本発明はこの好ましいＤＮＡを用いる場合に限定されることはない。
【００２４】
プロモーターとしては、酵母におけるタンパク質の発現に通常利用されるプロモーターであれば特に限定されないが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーター（Ｓａｗａｉ−Ｈａｔａｎａｋａ，　Ｈ．，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５９，　１２２１−１２２８　（１９９５））、及びガラクトキナーゼ（Ｇａｌａｃｔｏｋｉｎａｓｅ）のプロモーター（ＧＡＬ１）（Ｄａｖｉｓ，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　４，　１４４０−１４４８　（１９８４））、キャンデイダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）のイソクエン酸リアーゼ（ＩＣＬ）のプロモーター（ＵＰＲ−ＩＣＬ）（Ｋａｎａｉ　ｅｔ　ａｌ，　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　４４，　７５９−７６５　（１９９６））などが利用される。
【００２５】
分泌シグナルは、酵母における発現及び分泌に通常利用されるシグナル領域であれば特に限定されないが、例えば、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のグルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル領域や、酵母のα−ファクターのプレプロ配列（Ｗａｌｋｅｒ，　Ｇ．　Ｍ．，　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　ｐ２６５，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｌｙｄ．，　Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ　（１９９８））などを利用できる。これらのプロモーター及び分泌シグナルは、既知の方法、例えば既知配列を基にして作成されたプライマーを用いて、前記微生物のゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ法、あるいはＡｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５１，　６５−７０　（１９９５）やＡｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５７，　６９７−７０１　（２００１）に記載のプラスミドｐＧＡ１１及びｐＧＰＭ６を適当な制限酵素反応により切り出してもよい。
【００２６】
アグルチニン遺伝子またはその断片は酵母から得られるが、中でもサッカロミセス属に属する酵母が好ましく、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＴ８−１などを挙げることができる（Ｔａｊｉｍａ，　Ｍ．，　Ｙｅａｓｔ，　１，　６７−７７　（１９８５））。アグルチニンはａ−アルグチニン及びα−アグルチニンのいずれであってもよく、その断片は表層に発現する酵素活性に悪影響を与えなければどの様な配列であってもよい。好ましくはサッカロミセス属由来のａ−アグルチニンのＡＧＡ２配列をコードする配列が用いられる。このＡＧＡ２は、ＧＰＩアンカーを介して細胞壁に固定化されているＡＧＡ１に２つのジスルフィド結合で結合することにより細胞表層に固定化される。また、好ましくはサッカロミセス属由来のα−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列が用いられる。このアミノ酸配列中には４個所の糖鎖結合部位があるが、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーがフォスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼ（ＰＩ−ＰＬＣ）で切断された後に、この糖鎖と細胞壁を構成するペプチドグリカンとが共有結合することにより、α−アグルチニンのＣ末端配列部分が細胞壁と結合して保持される。
【００２７】
上記ａ−アルグチニンを用いる場合は、ＡＧＡ１配列の３’末端側に目的とする酵素配列を融合させることが可能であり、該酵素のＮ末端がａ−アルグチニンに融合する事になる。一方、上記α−アグルチニンを用いる場合には、α−アグルチニンの５’末端側に目的とする酵素配列を融合させる事が可能であり、該酵素のＣ末端がα−アルグチニンに融合することになる。一般的に、酵素を融合タンパク質として発現させる場合には酵素の活性部位からできるだけ遠い部位で融合する事が好ましく、上記ａ−アルグチニン及びα−アグルチニンは、目的とする酵素によって使い分けることができる。
【００２８】
上記のプロモーター、分泌シグナル配列、酵素の遺伝子配列、アグルチニンの全長又は一部をコードする配列、及びＧＰＩアンカー付着シグナル配列を含むＤＮＡは、プラスミドの形態又は染色体に組み込まれた形態のどちらでもよい。ＤＮＡの取得の簡易化の点からは、大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。上記ＤＮＡを調製するための出発材料は特に限定されないが、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（２μｍ）とＣｏｌＥ１の複製開始点（ｏｒｉ）を有しており、また、酵母選択マーカー（例えばＴＲＰ、ＵＲＡ３等）及び大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）を有することが好ましい。また、酵素を発現させるために、この遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等のいわゆる調節配列をも含んでいることが望ましい。酵素を細胞表層で発現させるためのベクターによる酵母の形質転換は定法に従って行うことができる。例えば、酢酸リチウム法、電気パルス法、又はプロトプラスト法等により形質転換体を得ることができる。形質転換体の培養方法も公知であり、例えばＭ．　Ｄ．　Ｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ，　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｇｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０）等に記載された方法を適宜使用できる。
【００２９】
上記の酵母を用いて有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行う方法は特に限定されず、有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中に上記の酵母を添加し、基質である出発原料や反応種となる有機化合物を適宜の濃度で添加して反応を行えばよい。酵母又は基質などの添加順序は特に限定されない。また、使用する酵母の濃度又は基質濃度も反応の種類や反応温度などの条件に応じて適宜選択できる。反応は通常は室温〜５０℃までの範囲で行うことができるが、耐熱性の酵素を用いる場合には例えば１００℃以下の温度範囲を選択できる場合がある。反応液のｐＨも特に限定されず、通常は中性付近を選択することができるが、耐酸性又は耐アルカリ性の酵素を用いる場合には、それぞれ酸性側又はアルカリ側の液性で反応を行うことも可能である。
【００３０】
有機溶媒と水との二層系中で反応を行う場合には、通常の二層系の反応のように激しく攪拌を行い、主として水層に存在する酵母と主として有機溶媒中に存在する基質などの有機化合物を充分に接触させる必要がある。二層系で反応を行う場合には、酵母の生育に必要な成分を水層に添加しておくこともできる。また、二層系で反応を行う場合には必要に応じて相間移動触媒を混入させて反応を行ってもよい。相間移動触媒としては、テトラブチルアンモニウムクロライド、ベンジルトリブチルアンモニウムクロリド、テトラブチルアンモニウムハイドロゲンスルフェートなどが挙げられるがこれらに限定されることはない。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されることはない。
実施例１：長鎖脂肪酸エステルの有機溶媒中での加水分解
Ａ：ＭＴ８−１／ｐＷＲＳＬ１７粉末の作成
アグルチニン遺伝子のＣ末端３２０アミノ酸をコードする配列を含み、Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　５６，　６８１−６８６　（２００１）記載のリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼを細胞表層に発現させるプラスミドｐＷＲＳＬ１７を含む酵母ＭＴ８−１／ｐＷＲＳＬ１７を０．６７％　Ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ、２％グルコースを含むＳＤ培地で２４時間培養した後、得られた酵母を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間）により分離し、蒸留水で２回洗浄した。得られた酵母を一晩凍結乾燥してＭＴ８−１／ｐＧＰＭＲＯＬ粉末を得た。培養液の６００　ｎｍの吸光度１．０，　１．０　ｍＬ当たり、約０．７　ｍｇのＭＴ８−１／ｐＷＲＳＬ１７粉末を得た。
【００３２】
Ｂ：有機溶媒中での酵素活性の測定
Ｊ．　Ｃ．　Ｂａｒａｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ，　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｔｅｃｈｎｏｌ．，　１８，　４１７−４２２　（１９９６）記載の方法に従ってヘプタン中での長鎖脂肪酸エステルの有機溶媒中での加水分解活性について評価した。５０　ｍＭのパルミチン酸　ｐ−ニトロフェニルエステル（シグマ）のヘプタン溶液２　ｍＬ中に、前記工程Ａにより得られた酵母　０．５、１、２　ｍｇをそれぞれ添加し、３０℃で振とうしながら反応させた。一定時間ごとに反応液を取り出し０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液と混合し、水層に存在する加水分解により生成したｐ−ニトロフェノールの４１０　ｎｍにおける吸光度を測定した。モル吸光係数：１７９５０を用い、各時点での反応量を測定し、反応初速度を算出した。この反応初速度を酵母濃度に対しプロットしたグラフの傾きより、酵素活性を算出した。酵素活性はＵ／ｇであらわし、１Ｕは１分間に基質１マイクロモルを加水分解する酵素活性と定義した。
【００３３】
対照実験としてリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）の細胞抽出物乾燥粉末である酵素Ａｍａｎｏ　Ｆ−ＡＰ１５（アマノエンザイム株式会社）について、同様の実験を行った。該酵素は前記酵母表層に発現させたものと同じリパーゼを含む粉末である。結果を表１に示す。水溶液中でのリパーゼを表層発現させた酵母（ＭＴ８−１／ｐＷＲＳＬ１７）の加水分解活性はＡｍａｎｏ　Ｆ−ＡＰ１５の約１／５であったが、ヘプタン中での加水分解活性はＡｍａｎｏ　Ｆ−ＡＰ１５の約１５倍であった。これはＡｍａｎｏ　Ｆ−ＡＰ１５中に酵素単体として存在するリパーゼがヘプタン中で変性失活するのに対し、酵母表層に発現したリパーゼは周辺の細胞壁成分の保護作用により変性失活しなかった結果と推定される。
【００３４】
Ｃ：水溶液中での酵素活性の測定
比較実験として、前記Ｂに記載の文献の方法に従って水溶液中での加水分解活性について評価した。１６．５　ｍＭのパルミチン酸　ｐ−ニトロフェニルエステルの２−プロパノール溶液を調製し、０．４％のトリトンＸと０．１％のアラビアゴムを含むＴｒｉｓ／ＨＣｌ　（ｐＨ　８．０）で１０倍に希釈した。この溶液０．９　ｍＬに対し、前記工程Ａにより得られた酵母　２，　４，　６　ｍｇをそれぞれ添加したＴｒｉｓ／ＨＣｌ　（ｐＨ　８．０）　溶液０．１　ｍＬを加え、３０℃で振とうさせながら反応させた。一定時間ごとに反応液を取り出し、遠心分離（１５，０００　ｒｐｍ，　１分間）により酵母を除き、上清に存在するｐ−ニトロフェノールの４１０ｎｍの吸光度を測定した。モル吸光係数１２７５０を用い、前記Ｂと同様にして酵素活性を算出した。
【００３５】
【表１】
2004049074.tif 000002
【００３６】
実施例２：長鎖脂肪酸の有機溶媒中でのエステル化反応
実施例１で作成した酵母ＭＴ８−１／ｐＷＲＳＬ１７の凍結乾燥粉末を用いヘプタン中でのパルミチン酸とｎ−ペンタノールとのエステル化反応について評価した。１００　ｍＭのパルミチン酸及び１００　ｍＭのｎ−ペンタノールを含むヘプタン溶液２　ｍＬ中に、前記実施例１により得られた酵母（ＭＴ８−１／ｐＷＲＬＳ１７）６　ｍｇを添加し、３０℃で振とうしながら反応させた。ヘプタンはモレキュラーシーブ３Ａにより脱水したものを用いた。また、この反応系に水　０．２，　０．５，　１．０％を添加し、同様の反応を行った。一定時間ごとに反応液を取り出しテトラメチルシリルジアゾメタンのヘキサン溶液（東京化成）を添加して残存するカルボン酸をメチルエステル化した後、ガスクロマトグラフィーにより各時点での反応量を測定した（カラム；Ｊ＆Ｗ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＤＢ−５（Ｌｅｎｇｔｈ：１５ｍ、内径　：　０．２５ｍｍ）、カラム温度：１００℃→　昇温：５℃／分　→２５０℃、気化室温度：２８０℃、検出器温度：３００℃）。
【００３７】
実施例１と同様にして、Ａｍａｎｏ　Ｆ−ＡＰ１５についても同様の対照実験を行った。結果を表２に示す。酵母（ＭＴ８−１／ｐＷＲＬＳ１７）及びＡｍａｎｏ　Ｆ−ＡＰ１５とも脱水ヘプタン中での酵素活性はともに０．０３　ｍＭ／ｈｒと同じであった。微量の水の添加により酵素活性はいずれも高まったが、Ａｍａｎｏ　Ｆ−ＡＰ１５が最大約５倍（０．５％添加時）であるのに対し、酵母（ＭＴ８−１／ｐＷＲＬＳ１７）では約２１倍（０．２％添加時）にまで高まった。これはＡｍａｎｏ　Ｆ−ＡＰ１５中のリパーゼは微量の水が存在しても変性失活し易いのに対し、酵母表層に発現したリパーゼは活性構造維持に必要な水和水が細胞壁成分中に安定に保持されるため、高い酵素活性を発現したものと考えられる。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
実施例３：長鎖脂肪酸の有機溶媒中でのエステル化反応
実施例１で作成した酵母ＭＴ８−１／ｐＷＲＳＬ１７の凍結乾燥粉末を用いヘプタン中での硬化油の有機溶媒中でのエステル化活性について評価した。１００　ｍＭの硬化油加水分解物（日本化成、Ｃ１７Ｈ３５ＣＯ２Ｈ　；　１８．４ｗｔ％，　Ｃ１９Ｈ３９ＣＯ２Ｈ　；　８．５ｗｔ％，　Ｃ２１Ｈ４３ＣＯ２Ｈ　；　７３．１ｗｔ％）及び１００ｍＭのｎ−ペンタノールを含むｎ−オクタン溶液３　ｍＬ中に、前記実施例１により得られた酵母（ＭＴ８−１／ｐＷＲＬＳ１７）１０　ｍｇを添加し、４５℃で振とう（１６０　ｒｐｍ）しながら反応させた。一定時間ごとに反応液を取り出しテトラメチルシリルジアゾメタンのヘキサン溶液（東京化成）により残存するカルボン酸をメチルエステル化後、ガスクロマトグラフィーにより各時点での反応量を測定した（カラム；Ｊ＆Ｗ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＤＢ−１７（Ｌｅｎｇｔｈ：３０　ｍ、内径　：　０．２５　ｍｍ）、カラム温度：１００℃（５分）→　昇温：１０℃／分　→　２５０℃、気化室温度：２８０℃、検出器温度：３００℃）。結果を図１に示す。対照実験としてリパーゼＡｍａｎｏ　ＡＫ２０について同様の実験を行い、その結果を図２に示した。図１及び２から明らかな様に、酵素表層にリパーゼを発現させた酵母ＭＴ８−１　／ｐＷＲＳＬ１７の方がエステル化反応速度が速いことがわかった。
【００４０】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、触媒反応のための酵素をアグルチニンの全長又はその一部の配列とともに融合タンパク質として細胞表層に発現させた酵母を用いて、有機溶媒中又は有機溶媒と水との二層系中で触媒反応を行うことができる。例えば２５〜４０℃及び中性などの温和な条件下で効率的に触媒反応を行うことが可能であり、有機溶媒との接触による酵素の失活もないという特徴がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵母を用いてｎ−オクタン中で硬化油のエステル化を行った結果（実施例３）を示した図である。
【図２】比較例として市販のリパーゼを用いてｎ−オクタン中で硬化油のエステル化を行った結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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