(57)【要約】【課題】胆管側膜上でのヒトＭＤＲ３の発現を亢進させ、リン脂質の胆管内への輸送を促進する優れた効果を有する、肝内結石症の予防又は治療剤、或いはその再発の予防剤を提供する。【解決手段】【化１】2004149489.tif 000004で表されるα−〔４−（４−クロルベンゾイルアミノエチル）フェノキシ〕イソ酪酸（一般名：ベザフィブラート）またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。例えば、有効成分であるベザフィブラートを経口投与する場合、成人１日当たり１００〜１０００ｍｇ、好ましくは４００〜６００ｍｇの範囲で投与し、症状に応じて適宜増減する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2004149489.tif 000003
で表されるα−〔４−（４−クロルベンゾイルアミノエチル）フェノキシ〕イソ酪酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、肝内結石症の予防又は治療剤、或いはその再発の予防剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝内結石症の予防又は治療剤、或いはその再発の予防剤に関するものである。
【０００２】
詳しくは、式
【０００３】
【化２】
2004149489.tif 000002
【０００４】
で表されるα−〔４−（４−クロルベンゾイルアミノエチル）フェノキシ〕イソ酪酸〔一般名：ベザフィブラート（ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ）、以下ベザフィブラートという〕またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、肝内結石症の予防又は治療剤、或いはその再発の予防剤に関するものである。
【０００５】
【従来の技術】
肝内結石症  （ｈｅｐａｔｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ）  は肝内胆管内に結石が生じる難治性疾患である。また、本症は、肝内胆管癌のハイリスク群である。その成因としては、従来より指摘されている胆道感染や胆管狭窄（例えば、非特許文献１参照）に加えて、最近では、胆汁うっ滞（例えば、非特許文献２，３参照）が重要視されている。胆汁排泄においては、胆汁中の胆汁酸、リン脂質、コレステロールなどの成分が重要であり、これらがミセルまたはベジクルを形成して胆汁排泄を促している。しかしながら、本病態においては、コレステロール／リン脂質比が上昇しており、コレステロールが過飽和を来たし、胆汁のバランスが崩れることにより、コレステロール結晶が析出し、コレステロール成分が多い結石形成を引き起こしている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００６】
胆管側膜上には種々のＡＢＣ（ＡＴＰ−結合カセット）トランスポーターが存在している。最近、肝内結石症の疾病肝において、リン脂質の胆汁への分泌にかかわるＡＢＣトランスポーターであるＭＤＲ３Ｐ−糖蛋白（以下ＭＤＲ３という）に発現異常が存在することが報告されている（例えば、非特許文献５参照）。それ故、本病態においては、胆管側膜上でのＭＤＲ３の発現低下によりリン脂質の分泌が低下しており、上述の如く胆汁中におけるコレステロール／リン脂質比の上昇が結石形成の原因の一つと考えられている。現在、肝内結石症に対しては外科的治療が専ら行われており、その再発率も非常に高いことが問題になっている。このような状況に鑑み、肝内結石症の薬物療法が待望されている。
【０００７】
本発明の前記式（Ｉ）で表されるベザフィブラートまたはその薬理学的に許容される塩はコレステロール低下作用を有し、高脂血症治療剤として有用な化合物であり、既に高脂血症治療において広範に使用されている。また、ベザフィブラートを始めとするフィブラート系薬物が、マウスのｍｄｒ２ｍＲＮＡの発現を上昇させる事が報告されている（例えば、非特許文献６参照）。しかしながら、ベザフィブラートの胆管側膜上でのヒトＭＤＲ３の発現およびその機能賦活に関する効果について全く報告がなく、またベザフィブラートが肝内結石症に有効であることは何ら示唆されていない。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｎａｋａｙａｍａ  Ｆ．，「  Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  Ｃａｌｃｕｌｉ  」，（米国），Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ．Ｉｎｃ．，  １９８４年，ｐ．１７−２８
【非特許文献２】
Ｓｈｏｄａ  Ｊ．、外６名，「  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  」，１９９１年，第１０１巻，第３号，ｐ．８２１−８３０
【非特許文献３】
Ｓｈｏｄａ  Ｊ．、外４名，「  Ｄｉｇ．  Ｄｉｓ．  Ｓｃｉ．」，１９９３年，第３８巻，第号，ｐ．２１３０−２１４１
【非特許文献４】
Ｓｈｏｄａ  Ｊ．、外５名，「  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  」，１９９５年，第１０８巻，第５号，ｐ．１５３４−１５４６
【非特許文献５】
Ｓｈｏｄａ  Ｊ．、外１２名，「  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  」，２００１年，第３３巻，第５号，ｐ．１１９４−１２０５
【非特許文献６】
Ｃｈｉａｎａｌｅ  Ｊ．、外９名，「  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．」，１９９６年，第３１４巻，ｐ．７８１−７８６
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、薬物療法が存在しない肝内結石症の病態改善に向け、胆管側膜上でヒトＭＤＲ３の発現を増加させ、また機能を賦活させることができる、新規な薬物を開発することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、肝内結石症の予防又は治療剤、或いはその再発の予防剤を開発すべく鋭意研究を行った結果、前記式（Ｉ）で表されるベザフィブラートが胆管側膜上でヒトＭＤＲ３の発現を亢進させ、リン脂質の毛細胆管内への分泌を促進する優れた効果を有するという知見を得、本発明を成すに至った。
【００１１】
上述の如く、肝内結石症においては胆管側膜上でのＭＤＲ３の発現が低下しており、リン脂質の分泌が低下し、また胆汁中におけるコレステロール／リン脂質比が上昇していることから、その予防又は治療においては、胆管側膜上でＭＤＲ３の発現を亢進させ、リン脂質の毛細胆管内への分泌を促進することが重要である。
【００１２】
本発明者らは、ヒト由来の肝ガン細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いた、肝臓組織内でみられる微細胆管様の偽胆管を形成させる試験において、ベザフィブラートがその胆管側膜上においてＭＤＲ３の発現を有意に増加させることを確認した。
【００１３】
また、本発明者らは、ヒト由来の肝ガン細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いた、リン脂質の毛細胆管内への輸送能を確認する試験において、ベザフィブラートがフォスファチジルコリンの毛細胆管内への輸送を有意に促進させることを確認した。
【００１４】
以上の通り、ベザフィブラートは、リン脂質の輸送に重要な役割を担うＭＤＲ３の胆管側膜上での発現を増加させ、リン脂質の毛細胆管内への輸送を顕著に改善する優れた効果を有している。それ故、胆汁中の組成異常を是正することができ、ＭＤＲ３の低下に関わる肝内結石症に極めて有効である。
【００１５】
更に、既に高脂血症治療剤として広く用いられており、長期連投においても重篤な副作用も示さず安全であることが確認されている。
【００１６】
上述の如く、前記式（Ｉ）で表されるベザフィブラートまたはその薬理学的に許容される塩は、肝内結石症の予防又は治療剤或いはその再発の予防剤（肝内結石症の進展阻止のための使用を含む）として極めて有用な化合物である。従って、ベザフィブラートまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有させ、適宜医薬品添加物と混合することにより、肝内結石症の予防又は治療剤、或いはその再発の予防剤として極めて有用な医薬組成物を製造することができる。
【００１７】
本発明の医薬組成物を実際の予防又は治療に用いる場合、種々の剤型にして経口的あるいは非経口的に投与されるが、経口投与剤としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドライシロップ剤など、非経口投与剤としては、注射剤、座剤、貼付剤などを挙げることができる。
【００１８】
これらの医薬組成物は、通常の調剤学的手法に従い、その剤型に応じ適当な賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤などの医薬品添加物を適宜混合し、常法に従い調剤する事により製造する事ができる。
【００１９】
例えば、散剤は、有効成分に必要に応じ、適当な賦形剤、滑沢剤などを加え、よく混和して散剤とする。
【００２０】
錠剤は、有効成分に必要に応じ、適当な賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤などを加え、常法に従い打錠して錠剤とする。さらに必要に応じ、適宜コーティングを施し、フィルムコート錠、糖衣錠、腸溶性皮錠などにする。
【００２１】
カプセル剤は、有効成分に必要に応じ、適当な賦形剤、滑沢剤などを加え、よく混和した後、あるいは又、常法により、顆粒あるいは細粒とした後、適当なカプセルに充填してカプセル剤とする。
【００２２】
更に、このような経口用製剤の場合は治療方法に応じて速放性あるいは徐放性製剤とすることもできる。
【００２３】
本発明の医薬組成物を実際の予防又は治療に使用する場合、有効成分の投与量は、患者の年齢、体重、疾患の程度、治療効果等によって適宜決定されるが、概ね、経口投与の場合、ベザフィブラート又はその薬理学的に許容される塩を、成人１日当たり、１００〜１０００ｍｇ、好ましくは４００〜６００ｍｇの範囲で投与する。症状に応じて適宜増減してもよい。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明の内容を以下の実施例により更に詳細に説明する。
【００２５】
【実施例】
実施例１
ＭＤＲ３の胆管側膜上への発現量の測定試験
（１）試薬および材料
細胞は理研ジーンバンクより分与を受けた。Ｄ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）、ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を購入し、細胞培養に用いた。抗体は抗ＭＤＲ３Ｐｇｐモノクローナル抗体（ケミコン）、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭヤギ抗体（ＫＰＬ）、抗ＣＤ２６ウサギ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ｃｙ３結合抗ウサギＩｇＧロバ抗体（ケミコン）を用いた。免疫蛍光染色では、コラーゲンＩコート済み２連チャンバースライド（ＢＩＯＣＯＡＴ，ベクトンディッキンソン）に細胞を播種して実験に用いた。また、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）およびＳｌｏｗＦａｄｅ  Ａｎｔｉｆａｄｅｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた。
【００２６】
（２）細胞培養
ＨｅｐＧ２細胞は理研ジーンバンクより分与を受けた。培養は１０％Ｆｅｔａｌ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）にて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。全ての実験は、完全なコンフルエント状態で行った。
【００２７】
（３）ベザフィブラートの添加
コンフルエントに達しているＨｅｐＧ２細胞を添加１もしくは２日前に１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を各ウエル２ｍＬ加える。各最終濃度の１００倍濃度のベザフィブラートを２０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
【００２８】
（４）免疫蛍光染色
３．７％ホルムアルデヒドで固定化した細胞をＰＢＳにて洗浄後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳにて３０分間室温でインキュベーションを行った。さらに２％ＢＳＡを含むＰＢＳにて１時間室温でインキュベーションを行った。抗ＭＤＲ３Ｐｇｐモノクローナル抗体およびウサギ抗ＣＤ２６ポリクローナル抗体にてインキュベーションして、洗浄後、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体とＣｙ３結合ウサギＩｇＧ抗体でインキュベーションする。洗浄後、ＳｌｏｗＦａｄｅ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  ｋｉｔにて封入固定した。各スライドを共焦点レーザー走査顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２にて観察した。励起波長は４８８ｎｍおよび５４３ｎｍで行い、同時に画像を取り込んだ。ベザフィブラートの添加４、８、１６及び２４時間後において効果を確認した。定量は、ＭＤＲ３及びＤＰＰＩＶに結合している蛍光を共焦点レーザー顕微鏡にてバックグラウンドと分離して測定し、ＭＤＲ３／ＤＰＰＩＶ比を算出した。
【００２９】
この結果は図１の通りである。その結果、ベザフィブラート３００μｍｏｌ／Ｌ添加群で８、１６及び２４時間後において、対照群に対して蛍光比ＭＤＲ３／ＤＰＰＩＶ比の有意な上昇が観察された。また、ベザフィブラート１００μｍｏｌ／Ｌ添加群では１６及び２４時間後において、同様に蛍光比ＭＤＲ３／ＤＰＰＩＶ比の有意な上昇が観察された。このように、ベザフィブラートは、胆管側膜上においてＭＤＲ３の発現を有意に亢進させた。
【００３０】
実施例２
リン脂質の胆管内への輸送能の測定試験
（１）試薬および材料
細胞は理研ジーンバンクより分与を受けた。Ｄ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）、ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を購入し、細胞培養に用いた。蛍光ラベル体集積実験では、ガラスベースディッシュ（旭テクノグラス）に細胞を播種して実験に用いた。
【００３１】
（２）細胞培養
ＨｅｐＧ２細胞は理研ジーンバンクより分与を受けた。培養は１０％Ｆｅｔａｌ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）にて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で行った。全ての実験は、完全なコンフルエント状態で行った。
【００３２】
（３）ベザフィブラートの添加
コンフルエントに達しているＨｅｐＧ２細胞を添加１もしくは２日前に１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を各ウエル２ｍＬ加える。各最終濃度の１００倍濃度のベザフィブラートを２０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
【００３３】
（４）Ｃ６−ＮＢＤ−ＰＣの胆管への集積の推移
ＨｅｐＧ２細胞をガラスベースディッシュ（旭テクノグラス）に播種した。コンフルエント状態で蒸留水（対照群）およびベザフィブラート３００μｍｏｌ／Ｌ添加する。２４時間後に、３℃にてフォスファチジルコリンラベル体（Ｃ６−ＮＢＤ−ＰＣ，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａ）１μｍｏｌ／Ｌ（最終濃度）を添加した。同時に共焦点レーザー走査顕微鏡（ライカ、ＴＣＳ−ＳＰ２）のタイムラプス機能にて、０分（Ｓｔａｒｔ）より１分間隔で画像を収録した。本顕微鏡ソフトウエアにて、収録した画像の蛍光量を数字化（定量）した。各偽胆管の蛍光量／収録した視野全体の蛍光量を算出した。それぞれの最大蛍光量比を１００％とし、経時的に上述の比をグラフにプロットした。
【００３４】
この結果は図２の通りである。その結果、ベザフィブラート３００μｍｏｌ／Ｌ添加群では、対照群と比較して有意に（反復測定分散分析：Ｐ＜０．０１）Ｃ６−ＮＢＤ−ＰＣ集積が観察された。また、各時間で見たとき、実験開始１分後、２分後においてＣ６−ＮＢＤ−ＰＣの蛍光の有意な上昇が見られ（Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ  ｔｅｓｔ）、３分後においても蛍光の上昇傾向が観察された。このように、ベザフィブラートは、フォスファチジルコリンの毛細胆管内への輸送を有意に促進させた。
【００３５】
【発明の効果】
前記式（Ｉ）で表されるα−〔４−（４−クロルベンゾイルアミノエチル）フェノキシ〕イソ酪酸またはその薬理学的に許容される塩は、胆管側膜上でのヒトＭＤＲ３の発現を亢進させ、リン脂質の胆管内への輸送を促進する優れた効果を有する。それ故、当該化合物を有効成分とする本発明の医薬組成物は、肝内結石症の予防又は治療剤、或いはその再発の予防剤として供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】偽胆管膜におけるＭＤＲ３の発現変化を示したグラフである。縦軸は、ＭＤＲ３／ＤＰＰＩＶの比を表し、横軸は、ベザフィブラートの添加後の時間（時間）を表す。棒グラフは、左から対照群、ベザフィブラート１００μｍｏｌ／Ｌ添加群、ベザフィブラート３００μｍｏｌ／Ｌ添加群をそれぞれ表す。また、グラフ中の＊はＰ＜０．０５での有意差、＊＊はＰ＜０．０１での有意差をそれぞれ表す。
【図２】経時的なフォスファチジルコリン蛍光ラベル体（Ｃ６−ＮＢＤ−ＰＣ）の偽胆管への集積変化を示したグラフである。縦軸は、Ｃ６−ＮＢＤ−ＰＣの蛍光量（％）を表し、横軸は、Ｃ６−ＮＢＤ−ＰＣ添加開始後の時間（分）を表す。△は対照群、■はベザフィブラート３００μｍｏｌ／Ｌ添加群をそれぞれ表す。また、グラフ中の＊はＰ＜０．０１での有意差を表す。
【図１】
2004149489.tif 000005
【図２】
2004149489.tif 000006