(57)【要約】【課題】　本発明は、Ｇｓα遺伝子の異常発現に関連した脂肪代謝における障害の評価および治療方法を提供する。【解決手段】　被験者が脂肪代謝における障害が進行しつつある状態またはその危険がある状態にあるか否かを評価する方法である。該方法は、被験者からの試料を準備すること、および該試料中のＧｓα発現レベルを測定することとを含む。該試料中のＧｓα発現レベルが正常な被験者からの試料中のものと異なれば、被験者は脂肪代謝における障害が進行しつつある状態またはその危険がある状態にあることを示している。また、脂肪代謝における障害の治療のための化合物の決定方法、並びに該障害の治療のための方法および組成物も開示されている。【選択図】　　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　被験者が脂肪代謝における障害が進行しつつある状態またはその危険がある状態にあるか否かを評価する方法であって、
被験者からの試料を準備すること、および
該試料中のＧｓα発現レベルを測定すること
を含む評価方法。
【請求項２】
　前記試料は脂肪組織試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
　前記試料は白色脂肪組織試料である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
　被験者が脂肪代謝における障害が進行しつつある状態またはその危険がある状態にあるか否かを評価する方法であって、
被験者からの試料を準備すること、および
該試料中のＧｓα活性レベルを決定すること
を含む評価方法。
【請求項５】
　前記試料は脂肪組織試料である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
　前記試料は白色脂肪組織試料である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
　脂肪代謝における障害の治療に用いる化合物を決定する方法であって、
化合物を細胞に接触させること、および
細胞中のＧｓα発現レベルを測定すること
を含む決定方法。
【請求項８】
　前記試料は脂肪組織試料である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
　前記試料は白色脂肪組織試料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
　脂肪代謝における障害の治療に用いる化合物を決定する方法であって、
化合物を細胞に接触させること、および
細胞中のＧｓα活性レベルを決定すること
を含む決定方法。
【請求項１１】
　前記試料は脂肪組織試料である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
　前記試料は白色脂肪組織試料である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
　Ｇｓαタンパク質をコードする核酸または該核酸と相補的な配列を有する核酸、および製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
　Ｇｓαタンパク質および製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
　脂肪代謝における障害の治療のために用いられる、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、脂肪代謝の障害の評価および治療並びにこのような障害の治療に用いる治療用化合物の決定における、Ｇタンパク質興奮性αサブユニット（Ｇｓα）遺伝子の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
　細胞膜の細胞質側には、三量体Ｇタンパク質（α、βおよびγサブユニット）が存在しており、β−アドレナリン作用性ホルモンのようなホルモンや神経伝達物質に対する７回膜貫通型受容体と相互作用している（非特許文献１を参照）。単量体Ｇｓαは、ＧＴＰに対する結合により活性化されると、二量体βγサブユニットから解離する。解離したＧＴＰ結合Ｇｓαは次いで、細胞増殖を含む細胞応答を誘起するために、二次メッセンジャーｃＡＭＰを産生するためのアデニル酸シクラーゼのようなエフェクタータンパク質を活性化させる（非特許文献２を参照）。
【０００３】
　なお、Ｇｓα遺伝子またはタンパク質の発現に関連する疾患としては、腎近位尿細管および赤血球においてＧｓαの発現が減少すると、それぞれ偽性上皮小体機能低下症タイプＩＢおよびオルブライト遺伝性骨ジストロフィーを招くことが知られている（非特許文献３および４を参照）。
【非特許文献１】Neer (1995) Cell 80, 249-257
【非特許文献２】Hepler and Gilman (1992) TrendsBiochem Sci 17, 383-387
【非特許文献３】J Clin Invest. 2000Nov;106(9):1167-74
【非特許文献４】J Clin Endocrinol Metab. 1990Nov;71(5):1208-14
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
　本発明の目的は、Ｇｓα遺伝子の異常発現に関連した脂肪代謝における障害について、その評価および治療方法並びに該治療のための医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
　本発明は、被験者が脂肪代謝における障害が進行しつつある状態またはその危険がある状態にあるか否かを評価する方法であって、被験者からの試料を準備すること、および該試料中のＧｓα発現レベルを測定すること、を含む評価方法である。また本発明は、Ｇｓα遺伝子の異常発現に関連した脂肪代謝障害の評価および治療方法、および該障害の治療に用いられる治療用化合物の決定方法、並びにＧｓαタンパク質をコードする核酸等を含有する医薬組成物である。本発明の一または複数の実施形態の詳細は、以下の記載により示される。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、詳細な開示および特許請求の範囲から明確であろう。
【発明の効果】
【０００６】
　本発明によれば、Ｇｓα遺伝子の異常発現に関連した脂肪代謝における障害の評価および治療がより効率的になされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
　「脂肪代謝の障害」とは、異常な（すなわち、正常レベルより高いまたは低い）脂肪代謝に関連した障害である。肥満症が該障害の一例である。
【０００８】
　一の態様では、本発明は、被験者が脂肪代謝における障害が進行しつつある状態またはその危険がある状態にあるか否かを評価する方法に関する。例えば、本発明の方法は、被験者からの試料を準備すること、および該試料中のＧｓα発現レベルを測定することを含む。該試料中のＧｓα発現レベルが正常な被験者からの試料中のものと異なれば、被験者は脂肪代謝における障害が進行しつつある状態またはその危険がある状態にあることを示している。試料は脂肪組織、例えば白色脂肪組織、の生検によっても調製されうる。Ｇｓα発現レベルは、例えば、ＧｓαｍＲＮＡ量またはＧｓαタンパク質自体の量の測定によって決定されうる。ＧｓαｍＲＮＡ発現レベルは、例えば、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、またはノーザンブロット分析によって決定されうる。Ｇｓαタンパク質レベルは、例えば、ウエスタンブロット分析によって決定されうる。また例えば、本発明の方法は、被験者からの試料を準備すること、および該試料中のＧｓα活性レベルを決定することを含む。該試料中のＧｓα活性レベルが正常な被験者からの試料中のものと異なれば、被験者は脂肪代謝における障害が進行しつつある状態またはその危険がある状態にあることを示している。Ｇｓα活性は、例えば、Ｇタンパク質のβγサブユニットに対する結合、エフェクターの活性化、または膜への指向性の測定によって決定されうる。
【０００９】
　他の態様では、本発明は、脂肪代謝における障害の治療に用いる化合物を決定する方法に関する。例えば、本発明の方法は、化合物を細胞（例えば、白色脂肪細胞のような脂肪細胞）に接触させること、および細胞中のＧｓα発現レベルを測定することを含む。該化合物が存在する場合のＧｓα発現レベルが、化合物が存在しない場合と異なれば、該化合物は脂肪代謝における障害の治療に対する候補化合物である。また例えば、本発明の方法は、化合物を細胞に接触させること、および細胞中のＧｓα活性レベルを決定することを含む。該化合物が存在する場合のＧｓα活性レベルが、化合物が存在しない場合と異なれば、該化合物は脂肪代謝における障害の治療に対する候補化合物である。
【００１０】
　さらに他の態様では、本発明は、脂肪代謝における障害を治療する方法に関する。本発明の方法は、脂肪代謝における障害が進行しつつあるかまたはその危険がある被験者を同定すること、および該被験者におけるＧｓαレベルを上昇させるための組成物を該被験者に対して投与することを含む。
【００１１】
　よって、脂肪代謝における障害の治療のための医薬組成物も本発明の範囲内のものである。該組成物は、Ｇｓαタンパク質をコードする核酸または該核酸と相補的な配列を有する核酸、および製薬上許容される担体を含みうる。替わりに、該組成物はＧｓαタンパク質自体、および製薬上許容される担体を含みうる。
【００１２】
　ここで、Ｇｓαタンパク質をコードする核酸配列またはこれに相補的な配列としては従来公知の配列を利用できる。例えばヒトについては、文献（Harris,B.A.(1998) Nucleic Acids Res. 16(8),3585）に記載の配列またはジーンバンクの受託番号（accession number）Ｘ５６００９もしくはＸ０７０３６の配列を利用でき、マウスについては、文献（Sullivan,K.A., et al.(1986) Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83(18),6687-6691）に記載の配列またはジーンバンクの受託番号Ｍ１３９６４の配列を利用できる。「Ｇｓαタンパク質」とは、野生型Ｇｓαタンパク質、および等価な生物学的機能を有するその変異体（例えば、野生型Ｇｓαタンパク質の断片）の双方を指している。該組成物は、被験者の脂肪組織（例えば、白色脂肪組織）に対して直接投与されうる。さらに他の態様では、上記の医薬組成物は、脂肪代謝における障害の治療に好ましく用いられる。
【００１３】
　本発明は、Ｇｓαが脂肪代謝において重要な役割を果たしているという予期せぬ発見に基づく。下記の実施例において明らかなように、ミトコンドリア含量およびエネルギー酸化が特異的におよび有意に増加しているＣ／ＥＢＰαβマウスの白色脂肪細胞（ＷＡＴ）において、Ｇｓαは特異的にアップレギュレーションされる（up-regulated）。さらに、ヒトまたはマウスの脂肪細胞におけるヒトまたはマウスのＧｓα遺伝子の過剰発現（over-expression）により、脂肪の蓄積が効果的に阻害されるのみならず、該細胞内に貯蔵されている脂肪が効率よく消費される。
【００１４】
　本発明は、Ｇｓα遺伝子の異常発現に関連した脂肪代謝障害の評価および治療方法、および該障害の治療に用いられる治療用化合物の決定方法を提供する。
【００１５】
　本発明の評価方法は、被験者から調製された試料（例えば、白色脂肪細胞の試料のような脂肪細胞の生検）中のＧｓα遺伝子発現レベルまたはＧｓαタンパク質活性レベルを、正常な被験者、すなわち脂肪代謝障害を抱えていないな被験者から調製された試料中のものと比較することを含む。Ｇｓαの発現または活性レベルが低いまたは高い場合には、該被験者は脂肪代謝が異常であることを示している。本発明の方法は、単独でまたは適切な被験者の脂肪代謝障害を評価するための他の処置とともに用いられうる。
【００１６】
　ここで、本発明において「被験者」とは、哺乳動物であれば特に制限されず、例えばヒト、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギおよびラット等が例示される。また、被験者としては、イヌおよびネコ等の愛玩動物、マウス、モルモット、ウサギおよびラット等の実験動物並びにヒトがより好ましく、ヒトが特に好ましい。
【００１７】
　Ｇｓα発現レベルは、ｍＲＮＡレベルでもタンパク質レベルでも決定されうる。組織試料中のｍＲＮＡレベルの測定方法は、当該技術分野においては公知である。ｍＲＮＡレベルを測定するためには、細胞を溶解させ、該溶解物（lysate）中のまたは該溶解物から精製もしくは半精製されたＲＮＡ中のＧＳαｍＲＮＡレベルを、制限されないが、検出可能とするためにラベル化されたＧｓα特異的ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ、および適切なＧｓα特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いた定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を利用したハイブリダイゼーション分析を含む種々の方法により決定しうる。替わりに、例えば、組織断片または非溶解細胞懸濁液、および（例えば、蛍光的にまたは酵素的に）検出可能となるようにラベル化されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いた定量的または半定量的ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析が行われうる。ｍＲＮＡを定量するさらなる方法は、ＲＮＡ保護分析（RNA protection assay）（ＲＰＡ）およびＳＡＧＥを含む。
【００１８】
　組織試料または体液中のタンパク質レベルを測定する方法もまた、当該技術分野においては公知である。このような方法の多くは、Ｇｓαタンパク質に対して特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を用いる。このような分析においては、該抗体自体または該抗体に対して結合する二次抗体が検出可能となるようにラベル化されうる。替わりに、抗体はビオチンと結合してもよく、また検出可能となるようにラベル化されたアビジン（ビオチンに結合したポリペプチド）がビオチン化抗体の存在を検出するために用いられうる。上記手法の感度を向上させるため、当業者にとって周知のこれらの手法の組み合わせ（「多層サンドイッチ」分析を含む）が用いられうる。これらのタンパク質測定分析には、体液または細胞の溶解液に対して適用しうるもの（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット）と、組織断片または非溶解細胞懸濁液に対して適用しうるもの（例えば、免疫組織化学的手法または蛍光フローサイトメトリー）がある。ラベル量の測定方法は、該ラベルの性質に依存するが、当業者には周知である。適切なラベルとしては、制限されないが、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、もしくは３２Ｐ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、もしくはβーガラクトシダーゼ）、蛍光部分（moiety）もしくはタンパク質（フルオレッセイン、ロダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、もしくはＢＦＰ）、または発光部分（moiety）（例えば、Quantum Dot社製のＱｄｏｔＴＭナノ粒子）を含む。その他適用可能な手法としては、定量的免疫沈降法または補体結合法が挙げられる。
【００１９】
　Ｇｓα活性は、当業者にとって周知の方法、例えば、Ｇｓαのβγサブユニットに対する結合、エフェクターの活性化、および膜に対する指向性の測定により決定されうる（Evanko, et al. (2000) J. Biol. Chem 275, 1327-1336を参照）。
【００２０】
　本発明はまた、細胞（例えば、白色脂肪細胞のような脂肪細胞）中のＧｓα遺伝子発現レベルまたはＧｓαタンパク質活性レベルを上昇させる候補化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティクス（peptidomimetics）、ペプトイド、抗体、小分子またはその他の薬物）の決定方法を提供する。こうして決定された化合物は、異常なＧｓα活性により特徴づけられる症状、例えば、脂肪代謝障害を治療するために用いられうる。
【００２１】
　本発明の候補化合物は、本技術分野において周知のコンビナトリアルライブラリー法（combinatorial library methods）における種々の手法を用いることにより得られる。前記ライブラリーは、ペプチドライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有するが、酵素分解に対し耐性の、新規な非ペプチド主鎖を有する分子のライブラリー）、空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries）、デコンボルーション（deconvolution）またはアフィニティークロマトグラフィー選択により得られる合成ライブラリー、および「１ビーズ−１化合物」ライブラリーを含む。例えば、Zuckermann, et al. (1994) J. Med. Chem. 37, 2678-85; and Lam (1997)Anticancer Drug Des. 12, 145を参照のこと。
【００２２】
　本技術分野における分子ライブラリーの作製方法の例は、例えば、DeWitt, etal. (1993) PNAS USA 90, 6909、Erb, et al. (1994) PNAS USA 91, 11422、Zuckermann,et al. (1994) J. Med. Chem. 37, 2678、Cho, et al. (1993) Science 261, 1303、Carrell,et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059、Carell, et al. (1994) Angew.Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061、およびGallop, et al. (1994) J. Med. Chem. 37,1233に記載されている。
【００２３】
　化合物ライブラリーは、溶液中で（例えば、Houghten (1992)Biotechniques 13,412-421）、またはビーズ上に（Lam (1991) Nature 354, 82-84）、チップ上に（Fodor (1993) Nature 364,555-556）、細菌上に（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上に（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上に（Cull, et al.(1992) PNAS USA 89, 1865-1869）、もしくはファージ上に（Scott and Smith (1990) Science 249,386-390、Devlin (1990) Science 249, 404-406、Cwirla, et al. (1990) PNAS USA 87,6378-6382、Felici (1991) J. Mol. Biol. 222, 301-310、およびLadner supra）提供されうる。
【００２４】
　細胞中のＧｓα遺伝子発現レベルまたはＧｓαタンパク質活性レベルを調節しうる化合物を決定するためには、細胞（例えば、白色脂肪細胞のような脂肪細胞）を候補化合物と接触させ、Ｇｓα遺伝子の発現レベルまたはＧｓαタンパク質の活性レベルを該候補化合物が存在しない場合との比較で評価する。前記細胞は、Ｇｓα遺伝子を含有するが原始的には該遺伝子を発現しない細胞、原始的にＧｓαを発現する細胞、または、例えば、マーカー遺伝子に連結されたＧｓαプロモーターを有する組換え核酸を発現するように修飾された細胞であってもよい。Ｇｓα遺伝子発現またはマーカー遺伝子発現のレベル、およびＧｓαタンパク質活性またはマーカータンパク質活性のレベルは、上記の方法および本技術分野において周知の他の方法により決定されうる。候補化合物の存在下におけるＧｓα遺伝子もしくはマーカー遺伝子の発現レベルまたはＧｓαタンパク質もしくはマーカータンパク質の活性レベルが該候補化合物の存在しない場合と比較して低いまたは高い場合には、該候補化合物は脂肪代謝障害の潜在的な治療薬として決定される。
【００２５】
　本発明はまた、脂肪代謝障害の治療方法を提供する。治療されるべき被験者は、例えば、上記の方法により被験者から調製された試料中のＧｓα遺伝子発現レベルまたはＧｓαタンパク質レベルを測定することにより決定されうる。被験者からの試料中のＧｓα遺伝子発現レベルまたはＧｓαタンパク質レベルが正常な被験者からの試料中のものと比較して低いまたは高い場合には、該被験者は被験者におけるＧｓαレベルを調節する化合物の適量を用いた治療の候補となる。
【００２６】
　本発明による治療方法は、インビボでまたはエクスビボで、単独でまたは他の薬剤もしくは療法と併用して行われうる。
【００２７】
　インビボの一手法においては、治療用組成物（例えば、細胞におけるＧｓα遺伝子発現レベルもしくはＧｓαタンパク質活性レベルまたはＧｓαタンパク質自体を調節しうる化合物を含有する組成物）が被験者に対して投与される。一般に、前記化合物は製薬上許容される担体（例えば、生理食塩水）中に懸濁され、経口的にもしくは静脈内点滴により投与され、または、皮下に、筋肉内に、髄膜下に、腹腔内に、直腸内に、膣内に、鼻腔内に、胃内に、気管内に、もしくは肺内に、注射されもしくは埋め込まれる。脂肪代謝障害を治療するためには、前記化合物は脂肪組織（例えば、白色脂肪組織）に直接送達されうる。
【００２８】
　必要とされる投与量は、投与経路の選択、剤形の性質、患者の症状の特性、患者のサイズ、体重、表面積、年齢、および性、他の薬剤の投与、並びに従事する医師の判断に依存する。適当な投与量は０．０１〜１００．０μｇ／ｋｇの範囲である。必要とされる投与量の範囲が広いのは、用いられうる化合物の多様性および種々の投与経路における有効性の相違の観点からすれば予期しうる。例えば、経口投与では静脈注射による投与と比較して高用量が必要とされることが予想される。このような投与量レベルの多様性は、本技術分野で周知の、最適化のための標準的で経験的な手法を用いることで調整されうる。前記化合物を適当な送達媒体（例えば、重合性ミクロ粒子または埋め込み可能な装置）中にカプセル化することで、特に経口投与における、送達効率が向上しうる。
【００２９】
　替わりに、Ｇｓαタンパク質をコードする核酸配列またはこれに相補的な配列を含有するポリヌクレオチドが、例えば、本技術分野で周知の、重合性の生分解性ミクロ粒子またはミクロカプセル送達装置の利用により患者に対して投与されうる。
【００３０】
　核酸の取り込みを達成するための他の方法は、常法により調製されたリポソームを用いる。ベクターは、単独でまたは組織特異的抗体とともにこれらの送達媒体に組み込まれうる。替わりに、プラスミドまたは静電力もしくは共有結合によりポリ−Ｌ−リジンに結合した他のベクターからなる分子接合体（molecular conjugate）が調製されうる。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞上の受容体に結合しうるリガンドに対して結合する（Cristiano,et al. (1995) J. Mol. Med. 73, 479）。替わりに、本技術分野において周知の組織特異的転写制御因子（ＴＲＥ）の利用により、組織特異的標的化が達成されうる。筋肉中、皮内の、または皮下の部位への「裸のＤＮＡ（naked DNA）」（すなわち、送達媒体を用いない）の送達は、インビボの発現を達成するための別の手段である。
【００３１】
　関連するポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）において、Ｇｓαタンパク質をコードする核酸配列またはこれに相補的な配列は、プロモーターまたはエンハンサー−プロモーターの結合に操作により連結される。エンハンサーは、時間、場所、およびレベルの点での発現特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、転写開始点からいかなる距離に位置しても、プロモーターが存在すれば機能しうる。エンハンサーはまた、転写開始点の下流にも存在しうる。
【００３２】
　適当な発現ベクターとしては、プラスミドおよびヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリヤポックスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス等のようなウイルスベクターが挙げられる。
【００３３】
　ポリヌクレオチドは、製薬上許容しうる担体に含有されて投与されうる。製薬上許容しうる担体は、ヒトに対する投与に適当な生物学的に適合性の媒体、例えば、生理食塩水またはリポソーム、である。治療有効量は、治療患者において医療上望ましい結果（例えば、Ｇｓαレベルの上昇または下降）が生じうるポリヌクレオチドの量である。医学分野においては周知のように、ある患者に対する投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の薬剤、性、投与時間および経路、総合的な健康状態、同時に投与される他の薬剤を含む多くの要素に依存する。用量は多岐にわたるが、ポリヌクレオチドの好ましい投与量は、ポリヌクレオチド分子の約１０６〜１０１２コピーである。必要であれば、この用量で複数回投与されうる。投与経路は、上記されたものであってもよい。
【００３４】
　不適切なＧｓα活性に関連する脂肪代謝障害の患者をエクスビボで治療する方法は、該患者から得られた細胞にＧｓαタンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクション（transfection）または形質導入（transduction）することを含む。替わりに、細胞に挿入するためにデザインされたベクターを、該細胞のゲノムにおける自然発生的な内因性Ｇｓα遺伝子の転写開始点上流への、新規の活性プロモーターの相同組換えによりインビトロでトランスフェクションしてもよい。
【００３５】
　ほとんどサイレントな遺伝子を「スイッチオン」させるこのような方法は本技術分野においては周知である。Ｇｓαを所望のレベルで発現する細胞を選択し増殖させた後、トランスフェクションされたまたは形質導入されたこの細胞は、次いで患者に戻される。前記細胞は、制限されないが、腎細胞、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞もしくはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、または筋細胞を含む幅広い型のいずれであってもよい。これらの細胞は、自身が患者の体内で生き残っている限り、Ｇｓαタンパク質の供給源として作用する。
【００３６】
　上記のエクスビボの方法は、患者から細胞を採取する工程と、該細胞を培養する工程と、培養された細胞に発現ベクターを形質導入する工程と、形質導入された細胞をＧｓα遺伝子の発現に適切な条件下で維持培養する工程とを含む。これらの方法は、分子生物学の分野においては周知である。前記形質導入工程は、リン酸カルシウム、リポフェクチン、エレクトロポレーション、ウイルス感染、およびバイオリスティック遺伝子導入（biolistic gene transfer）を含む、エクスビボ遺伝子治療のために使用される標準的な手段により達成される。替わりに、リポソームまたは重合性ミクロ粒子が用いられうる。うまく形質導入された細胞は、次いで例えばＧｓα遺伝子の発現を基準に選択されうる。該細胞は、次いで患者に対して注射され、または埋め込まれてもよい。
【００３７】
　本明細書に開示された全ての実施態様は、どのように組み合わせても用いられうる。また本明細書に開示された各実施態様は、同じ、等価な、または同様の目的を果たしうるその他の態様にも置換されうる。よって、特記しない限り、開示された各態様は等価または同様の一般的な一連の態様の例にすぎない。
【００３８】
　上記の記載から、当業者は本発明の本質的な特徴を理解でき、本発明の概念および範囲から逸脱しない限り、様々な使用法および条件に適応させるべく、本発明に種々の変更および修飾を加えうる。よって、他の実施態様もまた、特許請求の範囲内に含まれる。
【実施例】
【００３９】
　下記の例は単に例示のためのものであり、これ以外の態様を制限するものではない。より詳細な記載がなくとも、当業者は、本明細書の記載に基づき、本発明を全ての範囲において利用することができるであろう。
【００４０】
　材料および方法
　ｃＤＮＡサブトラクティブ（subtraction）分析
　Ｃ／ＥＢＰαβおよびコントロールマウスのＷＡＴから全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに変換させた。ｃＤＮＡサブトラクティブ分析は、ＰＣＲ増幅に基づく市販のキット（PCR-Select cDNA Subtraction Kit、クローンテック社製）を用いて行われた。次いで、サブトラクションされたｃＤＮＡを２つのプールに分けた。１つはＣ／ＥＢＰαβマウスのＷＡＴに存在するかまたは発現が誘導されたｍＲＮＡ分子に対応するｃＤＮＡ種を含み、もう１つはＣ／ＥＢＰαβマウスのＷＡＴに存在しないかまたは発現が抑制されたｍＲＮＡ分子に対応するｃＤＮＡ種を含む。サブトラクションされたｃＤＮＡ種は次いで自動化配列解析に供された。
【００４１】
　ノーザンブロッティングによる確認
　Ｃ／ＥＢＰαβマウスのＷＡＴより単離された全ＲＮＡのプローブとして選択されたｃＤＮＡ種を用いた。全ＲＮＡを１％ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、ナイロン膜にブロットし、３２Ｐでラベル化されたｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。
【００４２】
　アデノウイルス発現系
　選択されたｍＲＮＡ種の発現パターンを確認した後、対応する全長ｃＤＮＡをクローニングした。ヒトのＧｓα配列に関しては、ジーンバンクの受託番号Ｘ５６００９を参照し、マウスに関しては、ジーンバンクの受託番号Ｍ１３９６４を参照した。前記全長ｃＤＮＡは次いで、感染効率を可視化し測定するためのクラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むアデノウイルス導入ベクターにサブクローニングした。サブクローニングされたｃＤＮＡは、哺乳動物細胞における常時発現のためのＣＭＶプロモーターにより調節して発現させた。次いで、インサートｃＤＮＡ種を含むアデノウイルス導入ベクターを、修飾アデノウイルスゲノム（ウイルス複製能を除去するためＥIおよびＥIII遺伝子が欠失している）と、大腸菌に同時形質転換させた。所望のｃＤＮＡ断片が組み込まれている正しい組換えアデノウイルスゲノムを含む形質転換大腸菌を選択した。次いで、該組換えアデノウイルスゲノムを大腸菌のクローンより抽出し、アデノウイルス粒子を産生させるため、キット（AdEasykit、ＱＢＩ社製）の説明書に従い２９３ＨＥＫ細胞にトランスフェクションした。培養脂肪細胞に感染させるため、前記感染細胞から放出されたアデノウイルス粒子を含有する培地を直接使用した。
【００４３】
　マウス脂肪細胞培養
　マウスの前駆脂肪細胞（pre-adipocyte）細胞系である３Ｔ３−Ｌ１を培養し、密集（confluency）するまで細胞を増殖させて脂肪産生脂肪細胞（fat-laden adipocyte）へ誘導した。次いで、培地にインスリン、ＤｅｘおよびＩＢＭＸを４日間添加し、脂肪生成を誘導した（Yeh, et al. (1995)Genes & Dev. 9, 168-181）。
【００４４】
　ヒト脂肪細胞の培養
　他の病気の外科的治療を受けたヒト患者の腹部より採取した脂肪生検の２ｇを、０．１％コラゲナーゼで処理し、３７℃で１時間穏やかに振盪して細胞を解離させた。次いで１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを用いてコラゲナーゼ活性を中和し、細胞を１２００ｇで１０分間遠心分離して細胞ペレットを得た。該ペレットを１６０ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌに再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートして赤血球を溶解させた。次いで前駆脂肪細胞（pre-fat cell）を１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩インキュベートした。一晩培養後、結合していない細胞を除去し、培養期間中は２日おきに培地を交換した（Zuk,et al. (2001) Tissue Engineering 7, 211-228）。ヒト脂肪細胞の分化を誘導する際には、マウス３Ｔ３−Ｌ１を脂肪細胞へ分化させる際に用いた方法を若干の修正を加えて使用した。
【００４５】
　アデノウイルス感染
　脂肪産生脂肪細胞（fat-laden fat cells）を作製後（２日後に脂肪生成が開始した）、古い培地を除去し、アデノウイルス粒子を含有する培地１００μＬ（２４ウェル培養プレートの各ウェルに対して）を脂肪細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで新鮮な脂肪細胞培地０．５ｍＬを各ウェルに添加し、該脂肪細胞を継続して培養した。培養期間中は２日おきに培地を交換した。
【００４６】
　ＧＦＰを用いた測定
　各々１種の所望のインサートＤＮＡ種を有するアデノウイルスベクターは、蛍光顕微鏡下で緑色の蛍光を発するＧＦＰタンパク質マーカーをも有している。アデノウイルスに感染した脂肪細胞は、いずれも緑色の蛍光を発し、感染しなかった細胞は蛍光を発しない。したがって、脂肪細胞のアデノウイルスによる感染の有無は、脂肪の蓄積状態で区別され、比較されうる。
結果
　Ｃ／ＥＢＰαβマウスのＷＡＴ特異的発現ｍＲＮＡ種のスクリーニング
　Ｃ／ＥＢＰαβマウスのＷＡＴにおいては、コントロールマウスのＷＡＴと比較してミトコンドリア含量が大きさおよび数の両方の点で有意に上昇していた。さらに、シトクロムｃオキシダーゼ活性によって、およびエネルギー酸化に重要な種々の因子の発現レベルによって測定されたＣ／ＥＢＰαβマウスのＷＡＴにおける代謝活性は有意に高かった。Ｃ／ＥＢＰαβマウスのＷＡＴにおけるミトコンドリア含量の上昇が、ミトコンドリアの生物発生に関連する遺伝子の発現の上昇によるものであるか、およびＣ／ＥＢＰタンパク質により調節されているかを調べるため、発現レベルがＣ／ＥＢＰαβマウスのＷＡＴにおいて特異的に上昇したまたは誘導されたｍＲＮＡ種、および発現レベルが脂肪細胞におけるミトコンドリアの生物発生に重要であるかもしれないｍＲＮＡ種を同定した。
【００４７】
　Ｃ／ＥＢＰαβマウスのＷＡＴにおいてのみまたはより多く発現しているｍＲＮＡ種を含有するサブトラクションされたｃＤＮＡのプールをクローニングし、次いで配列を決定した。さらに、Ｇタンパク質興奮性αサブユニット（Ｇｓα）ｍＲＮＡを含むいくつかのｍＲＮＡ種については、ノーザンブロット分析を行い、Ｃ／ＥＢＰαβマウスのＷＡＴにおけるこれらの発現パターンを確認した。
ヒト全長Ｇｓα、マウス全長Ｇｓα、および不完全Ｇｓαを含むアデノウイルス発現ベクターの構築
　ＷＡＴでのエネルギー酸化におけるＧｓαの役割を解析するため、Ｇｓαコーディング領域を含有する発現ベクターを構築し、脂肪細胞にＧｓαを導入および発現させた。成熟脂肪細胞は、高度に分化して静止状態にある。よって、リン酸カルシウムおよびリポフェクチン法のような常法によっては成熟脂肪細胞に効率よくトランスフェクションすることは困難である。したがって、脂肪細胞にＧｓαを発現させるためにアデノウイルス導入システムが用いられた。ＥIおよびＥIII遺伝子が欠失したアデノウイルスは、複製能はないが哺乳動物細胞に高効率で感染しうる。よって哺乳動物細胞に遺伝子を導入するための媒体として広く用いられている。
【００４８】
　ヒトおよびマウスＧｓαの全長ｃＤＮＡは、多くの哺乳動物細胞において活性なＣＭＶプロモーターによって調節されるＧＦＰ遺伝子を含有する導入ベクタープラスミドである、pAd.track.CMV（He, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,2509-2514）にクローニングした。次いでＧｓα遺伝子を含有する組換えアデノウイルスをキット（AdEasy、ＱＢＩ社製、He, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2509-2514）の説明書にしたがって作製した。Ｇｓα遺伝子の発現はまたＣＭＶプロモーターによる調節を受けているので、組換えアデノウイルスで感染させて緑色の蛍光を発する脂肪細胞もまたＧｓαを発現している。感染２９３ＨＥＫ細胞におけるＧｓαタンパク質の発現は、Ｇｓαに特異的な抗体を用いたウエスタンブロット分析により確認した。
【００４９】
　全長Ｇｓαを有するアデノウイルスに加え、Ｎ末端において５９塩基を欠く不完全マウスＧｓαを有する組換えアデノウイルスも作製された。この不完全Ｇｓαは、膜に対して指向性の二量体Ｇβγとの相互作用に必要なＮ末端ドメインを欠いているために、不活性である（Evanko, et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 1327-1336）。この不完全Ｇｓαは、下記の実験におけるコントロールとして用いられた。
【００５０】
　ヒトまたはマウス全長Ｇｓα遺伝子感染脂肪細胞における脂質蓄積の防止
　Ｃ／ＥＢＰαβマウスのＷＡＴの脂肪細胞においては、Ｇｓαの発現が特異的に増加していた。脂肪細胞での脂肪の蓄積に対するＧｓαの効果を調べるため、患者の腹部の脂肪細胞から単離されたヒト前駆脂肪細胞およびマウスの前駆脂肪細胞である３Ｔ３−Ｌ１から培養されたヒトおよびマウスの脂肪細胞に、ヒトおよびマウスのＧｓαを有する組換えアデノウイルスをそれぞれ感染させた。組換えアデノウイルスに感染した細胞からは、蛍光顕微鏡下において緑色の蛍光が観察された。
【００５１】
　脂肪細胞内部の脂質小滴は、反転光学顕微鏡（reverse light-microscope）により観察することができる。よって脂肪細胞における脂質蓄積の度合い（小滴の数および大きさ）は、顕微鏡を用いて容易に測定しうる。培養条件下では、正常脂肪細胞（ヒトおよびマウスの双方）における脂質蓄積は、２４時間毎の脂質小滴の数および大きさにおける変化で示したところ徐々に増加した。一方、ヒトまたはマウスの全長Ｇｓαを有する組換えアデノウイルスに感染した細胞においては、脂肪の蓄積は逆行していた。これに対し、不完全で不活性型のＧｓαを有する組換えアデノウイルスに感染した脂肪細胞は、感染していない脂肪細胞と同様に、脂質を蓄積しつづけた。これらの結果は、脂肪蓄積に対するＧｓαの効果はマウスおよびヒトにおいて共通していることを示している。なぜならば、ヒトおよびマウス双方のＧｓαが、脂肪細胞における脂肪蓄積の防止に効果を示したからである。