(57)【要約】【課題】ミスマッチＤＮＡや一本鎖ＤＮＡの影響を極力抑制して二本鎖ＤＮＡの検出感度を高めるインターカレンタとして有用な、新規インターカレータを提供する。【解決手段】本発明の化合物は、下記式で示されるインターカレート部分がビス構造であるため、二本鎖ＤＮＡにインカレートした際、安定な複合体を形成することができる。また、二本鎖ＤＮＡに本発明の化合物が結合した際、２つの酸化還元活性部位がＤＮＡ塩基対内に平行に並ぶ形になり、塩基対間を伝わった電子移動（電子ホッピング、即ち酸化還元反応）を効率的に行うことができる。【化１】2004024114.tif 000028【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される新規インターカレータ。
【化１】
2004024114.tif 000021
（式中、Ａはアミノ酸又はその誘導体のビス体を示し、Ｂ、Ｃは、互いに独立に、アミノ基又はカルボキシル基に結合可能な基を示し、Ｄ、Ｅは、互いに独立に、ＤＮＡ二重らせんに結合する能力を有する分子であって、かつ、電気化学活性を有する基を示す。）
【請求項２】
上記式（Ｉ）中、Ａのうち少なくとも１つが塩基性アミノ酸又はその誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の新規インターカレータ。
【請求項３】
上記式（Ｉ）中、Ｄ、Ｅは、下記式（ＩＩ）〜（ＸＸＩＩ）で示される基のいずれか一であることを特徴とする請求項１に記載の新規インターカレータ。
【化２】
2004024114.tif 000022
2004024114.tif 000023
2004024114.tif 000024
2004024114.tif 000025
（各式中、Ｒ１、Ｒ５は、互いに独立に、アルキル基、
【化３】
2004024114.tif 000026
（Ｒ２はアルキレン基、Ｒ３、Ｒ４は互いに独立に水素原子又はアルキル基を示す）を示し、Ｒ６はアルキル基を示し、Ｒ７は水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｍはキレート配位可能な金属イオンを示す。）
【請求項４】
下記反応式（１）に示すように、化合物▲１▼と化合物Ｄとを反応させて化合物▲２▼を得る第一工程と、
下記反応式（２）に示すように、上記第一工程で得られた化合物▲２▼とレジン▲３▼と化合物▲４▼とをＦｍｏｃ法により反応させて化合物▲５▼を得る第二工程と、
下記反応式（３）に示すように、前記工程（２）により得られた化合物▲５▼のＮ末端を脱保護化し、かつ、Ｃ末端のレジンを切り出して目的物を得る第三工程と、
を含む新規インターカレータの製造方法。
【化４】
2004024114.tif 000027
（各式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅについては、前記式（Ｉ）中の当該基と同義であり、Ａ’はアミノ酸又はその誘導体を示す。）
【請求項５】
請求項１乃至３に記載の新規インターカレータを使用して特定の配列を有する核酸を検出する、遺伝子の電気化学的検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】
本発明は、二重らせん構造を構成するＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸塩基に対する縫い込み型インターカレータとして有用で、特に、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する新規インターカレータに関する。
【０００３】
【従来の技術】
従来から、特定の配列を有するＤＮＡ等の核酸を電気化学的に検出する方法が種々提供されており、この検出方法の媒体として、縫い込み型インターカレータが利用されている。例えば、特許第３２３３８５１号公報には、インターカレート部がナフタレンジイミド、酸化還元活性部がフィロセン化合物、リンカー部が置換イミノ基である縫い込み型インターカレータが開示されている。また、特開２０００−１４６８９４号公報、特開２００１−２２６３７６号公報、特開２００１−１６５８９４号公報には、主としてリンカー部が改良された縫い込み型インターカレータが開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のインターカレータは二本鎖ＤＮＡ鎖のみならず、不適正塩基対（ミスマッチＤＮＡ）にも結合するため二本鎖ＤＮＡの特異的検出は困難であった。また、１本鎖ＤＮＡにも静電的に結合し、検出感度に悪影響を及ぼしていた。
【０００５】
本発明は、上記のような問題点を解決することを目的としてなされたものであり、ミスマッチＤＮＡや一本鎖ＤＮＡの影響を極力抑制して二本鎖ＤＮＡの検出感度を高めるインターカレンタとして有用な、新規インターカレータの提供を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは二本鎖ＤＮＡにビスインターカレートすることにより安定な複合体を形成することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明によれば、上記課題は、下記式（Ｉ）で表される新規インターカレータにより解決される。
【化５】
2004024114.tif 000002
（式中、Ａはアミノ酸又はその誘導体のビス体を示し、Ｂ、Ｃは、互いに独立に、アミノ基又はカルボキシル基に結合可能な基を示し、Ｄ、Ｅは、互いに独立に、ＤＮＡ二重らせんに結合する能力を有する分子であって、かつ、電気化学活性を有する基を示す。）
ここで、「ビス体」とは、アミノ酸又はその誘導体が２個存在することを意味し、同種のアミノ酸又はアミノ酸誘導体のみならず、異種のアミノ酸又はアミノ酸誘導体であってもよい。
【０００８】
また、「ＤＮＡ二重らせんに結合する能力を有する分子」とは、例えば、溝結合試薬を挙げることができる。この「溝結合試薬」とは、グルーブバインダー（ｇｒｏｏｖｅ　ｂｉｎｄｅｒ）と称される物質であり、二本鎖ＤＮＡに異種化合物を挿入するために用いられるものをいう。
【０００９】
「電気化学活性を有する基」とは、電位をプラスまたはマイナスにかけることによって酸化や還元が行われ、それに伴う電子の出し入れが起こる物質をいう。この電気化学活性を有する基としては、可逆的に酸化還元が起こるものがより好ましい。
【００１０】
ここで、電気化学的活性を有する基として下記式（ＩＩ）〜（ＸＶＩＩＩ）の化合物を挙げることができる。
【００１１】
【化６】
2004024114.tif 000003
2004024114.tif 000004
2004024114.tif 000005
ここで、上記式中、Ｒ１で示されるアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられ、特にエチル基であることが好ましい。また、Ｒ１における下記式（ＸＸＩＩＩ）
【００１２】
【化７】
2004024114.tif 000006
で示される化合物において、Ｒ２で示されるアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基等が挙げられ、特にエチレン基であることが好ましい。また、Ｒ３、Ｒ４で示されるアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられ、特にメチル基であることが好ましい。
【００１３】
また、Ｒ５で示されるアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられ、特にエチル基であることが好ましい。また、Ｒ５における下記式（ＸＸＩＩＩ）
【００１４】
【化８】
2004024114.tif 000007
で示される化合物において、Ｒ２で示されるアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基等が挙げられ、特にエチレン基、プロピレン基であることが好ましく、Ｒ３、Ｒ４で示されるアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられ、特にメチル基であることが好ましい。
【００１５】
また、Ｒ６で示されるアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられ、特にメチル基、エチル基であることが好ましい。
【００１６】
また、Ｒ７で示されるハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられ、特に塩素であることが好ましい。
【００１７】
また、「ＤＮＡ二重らせんに結合する能力を有する分子」としては、下記式（ＸＩＸ）〜（ＸＸＩＩ）の化合物を挙げることができる。
【００１８】
【化９】
2004024114.tif 000008
2004024114.tif 000009
ここで、前記式中、Ｍで示されるキレート配位可能な金属イオンとしては２価の金属イオンが好ましく、特に、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ３＋、Ｒｕ２＋、Ｏｓ２＋であることが好ましい。
【００１９】
また、上記課題は、前記式（Ｉ）のインターカレータを製造する方法であって、下記反応式（１）に示すように、化合物▲１▼と化合物Ｄとを反応させて化合物▲２▼を得る第一工程と、下記反応式（２）に示すように、上記第一工程で得られた化合物▲２▼とレジン▲３▼と化合物▲４▼とをＦｍｏｃ法により反応させて化合物▲５▼を得る第二工程と、下記反応式（３）に示すように、前記工程（２）により得られた化合物▲５▼のＮ末端を脱保護化し、かつ、Ｃ末端のレジン（樹脂）を切り出して目的物を得る第三工程と、を含む新規インターカレータの製造方法によっても解決する。
【００２０】
【化１０】
2004024114.tif 000010
（各式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅについては、前記式（Ｉ）中の当該基と同義であり、Ａ’はアミノ酸又はその誘導体を示す。）
なお、上記式中、「Ｒｅｓｉｎ」とは、アミノ酸のＣ末端を保護するための樹脂を意味し、例えば、市販のＦｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−Ｒｅｓｉｎ（渡辺化学社製）を用いることができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の新規ビスインターカレータ（以下、「本発明の化合物」ともいう）を、その好ましい形態に基づいて詳細に説明する。
【００２２】
本発明の化合物は、前記式（Ｉ）で表される新規物質である。そして、本発明の化合物は、特に、二重らせん構造を構成するＤＮＡやＲＮＡ等の核酸塩基に対する縫い込み型インターカレータとして有用なものである。
【００２３】
その基本的構成を概念的に説明したものを図１に示す。本発明の化合物１は、図１（ａ）に示すように、ハイブリッドＤＮＡの溝に挿入するための「インターカレート部」２（式（Ｉ）におけるＡ）、ＤＮＡを修飾して導電性を付与するための「酸化還元活性部」３（式（Ｉ）におけるＤ及びＥ）、インターカレート部と酸化還元活性部とを連結するための「リンカー部」４（式（Ｉ）におけるＢ及びＣ）とから構成される。
【００２４】
従って、上記Ａは、ＤＮＡ断片の二本鎖（二重らせん）等の塩基対間に平行に挿入されるジペプチド構造の縫い込み型インターカレート部分として機能し、上記Ｄ及びＥは酸化還元活性部分として機能する。これにより、本発明の化合物は、電気化学活性縫い込み型インターカレータとしての機能を発揮することができる。
【００２５】
縫い込み型インターカレータとしての本発明の化合物１は分子の大きさがＤＮＡの二本鎖間の「すきま」に合ったサイズをしており、二本鎖ＤＮＡ結合の「揺らぎ」が起こる際、図１（ｂ）に示すように、二本鎖ＤＮＡ５の間に挿入される。その際、二つの酸化還元活性部３が主溝Ａと副溝Ｂにそれぞれ位置するような複合体を形成する。すなわち、二つの酸化還元活性部３のうち一方の酸化還元活性部３が二本鎖塩基対間を通り抜けるため、二つの酸化還元活性部３のうちいずれかがストッパーとしての役割を果たすものである。
【００２６】
このような縫い込み型インターカレータを用いることにより、二本鎖ＤＮＡに結合しているインターカレータを電流量で測定することが可能となり、二本鎖ＤＮＡ形成量とインターカレータ量との相関関係からプローブＤＮＡと試料ＤＮＡとで形成されるハイブリッドＤＮＡの存在を検出・定量することができる。
【００２７】
ここで、前記式（Ｉ）中、Ａに示すアミノ酸としては、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチンであることが好ましく、二本鎖ＤＮＡにインカレートした際の安定性の観点からは、２つのアミノ酸のうち少なくとも１つは塩基性アミノ酸、特にリジンであることが特に好ましい。なお、アミノ酸の順序は特に制限はなく、−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−でも、−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−でもよい。また、−Ｌｙｓ−とその他のアミノ酸、−Ａｒｇ−とその他のアミノ酸、−Ｈｉｓ−とその他のアミノ酸、−Ｏｒｎ−とその他のアミノ酸との組み合わせでもよい。
【００２８】
また、前記式（Ｉ）中、Ｂ、Ｃに示す「アミノ基又はカルボキシル基に結合可能な基」とは、ＡとＤ又はＡとＥを連結することが可能な基であれば特に制限がないという意である。具体的には、リジン、オルニチン等が挙げられる。
【００２９】
また、前記式（Ｉ）中、Ｄ、Ｅに示す「ＤＮＡ二重らせんに結合する能力を有する分子であって、かつ酸化還元活性を有する基」としては、核酸に対する結合時の障害を回避できる点で、立体的に嵩高くない基、例えば、アクリジン、アントラキノン、ナフタレンジイミド等であることが好ましい。
【００３０】
本発明の化合物のうち、下記式（ＸＸＩＶ）で表される化合物は、特にインターカレータとして使用する場合において、二本鎖ＤＮＡに対する結合効率を向上させる点で好ましい。
【００３１】
【化１１】
2004024114.tif 000011
本発明の化合物は、前記式（Ｉ）で示されるＡに該当するインターカレート部分がビス構造であるため、二本鎖ＤＮＡにインカレートした際、安定な複合体を形成することができる。
【００３２】
また、二本鎖ＤＮＡに本発明の化合物が結合した際、２つの酸化還元活性部位がＤＮＡ塩基対内に平行に並ぶ形になり、塩基対間を伝わった電子移動（電子ホッピング、即ち酸化還元反応）を効率的に行うことができる。
【００３３】
本発明の化合物は、次のようにして製造することができる。即ち、前記反応式（１）に示すように、化合物▲１▼と化合物Ｄとを反応させて化合物▲２▼を得た後、　前記反応式（２）に示すように、上記工程で得られた化合物▲２▼とレジン▲３▼と化合物▲４▼とをＦｍｏｃ法により反応させて化合物▲５▼を得る。次いで、前記反応式（３）に示すように、前記工程（２）により得られた化合物▲５▼のＮ末端を脱保護化し、かつ、Ｃ末端のレジンを切り出して目的物を得た後、必要に応じて分離・精製を行う。
【００３４】
ここで、前記反応式（１）にかかる反応は、縮合反応である。例えば、フェノールを８０℃以上で加熱溶解し、これにアクリジン誘導体を添加し完全に溶解させた後、５５℃から６５℃でＦｍｏｃアミノ酸誘導体を添加して、必要に応じてエーテルを加え、濾過して乾燥させることにより目的物を得ることができる。
【００３５】
前記反応式（２）にかかる反応は、ペプチドの合成反応である。ペプチドの変性防止のため、Ｎ末端はアセチル化することが好ましい。また、ペプチド合成は固相法で行うことができ、Ｆｍｏｃ法、メリフィールド法のいずれでも行うことがきるが、ペプチドのラセミ化、分解などの副反応を抑制する観点からはＦｍｏｃ法で行うことが好ましい。
【００３６】
前記反応式（３）にかかる反応は、アミノ基の脱保護反応である。当該反応は通常の方法により脱保護を行うことができる。
【００３７】
前記製造方法における合成反応後に、分離操作および精製操作を行うことにより、より高純度の化合物を得ることができる。この際、分離操作および精製操作は、高速液体クロマトグラフィーなど、通常の分離・精製操作に用いられる方法で行うことができる。
【００３８】
また、前記の一連の反応は固相法で行うが、液相法でも行うことができる。この場合の溶媒は、原料若しくは反応生成物の全部或いは一部を溶解することができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であれば特に制限はない。
【００３９】
反応温度は、４℃から１００℃の範囲内で行うことができるが、１５℃から６０℃の範囲内で行うことが好ましく、２０℃から３０℃の範囲内で行うことが特に好ましい。
【００４０】
本発明の化合物は、その用途に特に制限されず、種々の用途に応用することができるが、前述の通り、二重らせん構造を構成するＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸塩基に対するインターカレータとして用いることが好適である。
【００４１】
本発明の化合物をインターカレータとして使用する際には、核酸との相互作用について、紫外可視吸収スペクトル解析やＳｃａｔｃｈａｒｄ（スキャッチャード）解析等により評価でき、二本鎖核酸の電気的検出効果について、ディファレンシャルパルスボルタモグラフィー（ＤＰＶ）による測定等により評価することができる。
【００４２】
また、本発明の化合物は、該インターカレータとして、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡを検出する、遺伝子の電気化学的検出方法に適用することができる。
【００４３】
本発明の化合物を使用して、特定の配列を有する核酸を検出する方法および検出装置において、特定の配列を有する核酸を検出する方法としては、例えば、特許第３２３３８５１号公報に記載の検出方法および検出装置において、インターカレータとして本発明の化合物を使用する方法が挙げられる。このような検出方法によれば、本発明の化合物をインターカレータとして使用するため、前記ピペラジン環含有フェロセン化ナフラレンジイミド誘導体等の従来のインターカレータを用いた場合に比して、より簡便且つ高感度、ハイスループット（高速大量）に特定配列の核酸を検出することが可能となる。
【００４４】
また、本発明の化合物を使用して、特定の配列を有する核酸を検出する手段を備えてなる、遺伝子の電気化学的検出システム（電気化学的検出装置も含む）も、前記検出方法と同様に、より簡便且つ高感度、ハイスループット（高速大量）に特定配列の核酸を検出することが可能となるため有用である。
【００４５】
本発明の化合物は、遺伝子の検出方法、検出システム、解析方法、解析システム等に適用することにより、広く生物学、医学分野等において、遺伝子治療、遺伝子診断、食品衛生検査、家畜診断、植物病（感染症診断）、親子鑑定、法医学診断等に利用することができる。
【００４６】
例えば、本発明の化合物は、前記の検出方法等に適用することにより、薬剤代謝酵素、癌抑制遺伝子等の特定の遺伝子を解析したり、病気の発症と関連する一塩基多形（ＳＮＰ）や点突然変異を同定して、癌、高血圧等の成人病の予防等に役立てることができる。
【００４７】
【実施例】
次に、本発明の化合物を実施例に基づいて説明する。ここでは、テトラリジンの両末端リジンのイプシロンアミノ基にアクリジンを導入したビス−アクリジニルペプチドを合成し、それを用いて二本鎖ＤＮＡの検出感度の評価を行った。
【００４８】
（実施例１）ビス−アクリジニルペプチドの合成
（１）６−クロロ−２−メトキシ−９−フェノキシアクリジンの合成
【００４９】
【化１２】
2004024114.tif 000012
２００ｍｌのビーカーにフェノール（８０ｇ、８５０ｍｍｏｌ）を入れ、１００℃になるまで加熱した。これに、よく砕いた水酸化ナトリウム（３．３ｇ、８２．５ｍｍｏｌ）を加え、完全に溶解させた。これに、６，９−ジクロロ−２−メトキシアクリジン（２０ｇ、７２ｍｍｏｌ）を入れ、１００〜１１０℃で２時間加熱撹拌した。これをしばらく放冷し、固化させた後、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（４００ｍｌ）を注ぎ、生じた結晶をガラスフィルター（Ｇ−４）でろ過した。次いで、結晶を超純水で５回、アセトンで５回洗浄した後、減圧乾燥機（ベルト駆動型油回転真空ポンプ、ＴＳＷ−１００）で乾燥（室温、５時間）させた。これにより、白黄色固体の６−クロロ−２−メトキシ−９−フェノキシアクリジン（１８ｇ、収率：７７％）を得た。
【００５０】
（２）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｃｒ）−ＯＨの合成
【００５１】
【化１３】
2004024114.tif 000013
５０ｍｌのビーカーにフェノール（３０ｇ）を入れ８０℃まで加熱溶解させた。これに、前記方法により得た６−クロロ−２−メトキシ−９−フェノキシアクリジン（４．５４ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）を加え完全に溶解させた。その後、当該溶液を６０℃に維持しつつ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（４．４２ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加えて２時間攪拌した。それからしばらく（約２０分）放冷し、エーテル（３００ｍｌ）を攪拌しながら注いだ。次いで、得られた沈殿物を吸引濾過し、減圧乾燥機（ベルト駆動型油回転真空ポンプ、ＴＳＷ−１００）で乾燥（室温、５時間）させた。これにより、黄色固体のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｃｒ）−ＯＨ（７．５７ｇ、収率：９２％）を得た。
【００５２】
（３）Ａｃ−Ｌｙｓ（Ａｃｒ）−（Ｌｙｓ（Ｂｏｃ））２−Ｌｙｓ（Ａｃｒ）−Ｒｅｓｉｎの合成
リアクションベッセル（ＡＢＩ社製、製品番号６００６５１）にＦｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ　Ｒｅｓｉｎ（２００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ／ｇ）を入れ、カートリッジ１および４にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｃｒ）−ＯＨ（０．３４ｇ）入れ、カートリッジ２および３にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（０．２２ｇ）を入れた。後は、ペプチドシンセサイザー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、製品番号４３１Ａ）を用いて合成を行った。合成方法は、スタンダードＦｍｏｃ法で行い、Ｎ末端はアセチル化した。これにより、黄色固体のＡｃ−Ｌｙｓ（Ａｃｒ）−（Ｌｙｓ（Ｂｏｃ））２−Ｌｙｓ（Ａｃｒ）−Ｒｅｓｉｎ（０．３４ｇ）を得た。
【００５３】
（４）Ａｃ−Ｌｙｓ（Ａｃｒ）−（Ｌｙｓ（Ｂｏｃ））２−Ｌｙｓ（Ａｃｒ）−Ｒｅｓｉｎの側鎖の脱保護およびレジンからの切り出し
５０ｍｌのナス型フラスコに、前記方法により得たレジン（０．３４ｇ）を入れ、これにｍ−クレゾール（０．０８ｍｌ）、チオアニソール（０．４８ｍｌ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、３．４４ｍｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。その後、吸引濾過しＴＦＡ（３ｍｌ）で洗浄した。ＴＦＡを真空ポンプで減圧留去（３０分）した後、氷浴中でエーテル（２０ｍｌ）を加えた。超音波照射後（室温、２分）、氷浴中で約１０分放置し、上澄み液を取り除いた。次に、氷浴中で酢酸エチル（２０ｍｌ）を加えて、超音波洗浄器（ヤマト社製２５１０Ｊ−ＭＴ）で超音波照射（室温、２分）後、約１０分放置した。その後、吸引濾過しエーテルで洗浄後、減圧乾燥機（ベルト駆動型油回転真空ポンプ、ＴＳＷ−１００）で乾燥（室温、３時間）させた。これにより、所望のビス−アクリジニルペプチド（黄色固体、０．１７ｇ）を得た。
【００５４】
（５）ＨＰＬＣによる純度チェック
純度を測定するために、ＨＰＬＣ（日立社製、Ｄ−７０００）による分析を行った。条件を以下に示す。
【００５５】
【表１】
2004024114.tif 000014
また、グラジエント条件を以下に示す。
【００５６】
【表２】
2004024114.tif 000015
ＨＰＬＣチャートを図２に示す。側鎖の脱保護およびレジンからの切り出し直後は不純物が若干混ざっていたため（図２（ａ））、ＨＰＬＣにより精製した（図２（ｂ））。これにより、精製後は非常に純度の高い目的物を得ることができた。
【００５７】
精製後の化合物について、質量分析（ＴＯＦ　ＭＡＳＳ）により同定を行った。その結果を図３に示す。
【００５８】
以上の結果より、得られた化合物が下記化学構造の化合物であることを確認（同定）した。
【００５９】
【化１４】
2004024114.tif 000016
（試験例１）ビス−アクリジニルペプチドのＤＰＶ測定
金電極にＳＨ修飾一本鎖ＤＮＡ（ＳＨ−ｄＴ２０）を固定し、これに相補的なｄＡ２０のハイブリダイゼーション操作の前後でＤＰＶ（デファレンシャルパルスボルタンメトリー）測定を行った。なお、金電極に固定させるＳＨ−ｄＴ２０の量を２０ｐｍｏｌ／μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌ、５ｐｍｏｌ／μｌ、２ｐｍｏｌ／μｌと変化させて行った。測定条件は以下の通りである。
【００６０】
【表３】
2004024114.tif 000017
以下にそれぞれの固定量に対する一本鎖、二本鎖ＤＮＡのＤＰＶの測定結果を図４から図７に示す。ここで、Δｉとは、ハイブリダイゼーション後の応答電流値からハイブリダイゼーション前の応答電流値を減じ、その値をハイブリダイゼーション前の応答電流値で除した値に１００を乗じて得られた値であり、具体的には　Δｉ＝（ｉ−ｉ０）／ｉ０×１００　の式にて示される。このΔｉの値が大きければビス−アクリジニルペプチドの二本鎖ＤＮＡに対する特異性が高く、高感度で二本鎖ＤＮＡを検出できたことを意味し、逆にΔｉの値が小さければ一本鎖ＤＮＡの干渉を受け、検出感度が低いことを意味する。
【００６１】
上記の結果をまとめた表を以下に示す。ＤＮＡの固定化量を増やしすぎると逆にハイブリダイゼーションの効率が悪くなり、Δｉが減少するものと考えられた。以上の結果から、１０ｐｍｏｌ／μｌが最適な修飾量であることが判明した。
【００６２】
【表４】
2004024114.tif 000018
（試験例２）ビス−アクリジニルペプチドによるミスマッチ検出
実施例１により得られたビス−アクリジニルペプチドを用いて、以下の要領でＤＮＡ配列のミスマッチの検出を行った。電極には金電極を用い、金電極への固定化量は２０ｐｍｏｌ／μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌで行い、それぞれの修飾量で４本ずつの電極を用いて測定した。測定条件は以下の通りである。
【００６３】
【表５】
2004024114.tif 000019
応答電流値が大きければビス−アクリジニルペプチドの結合量が多く、逆に応答電流値が小さければビス−アクリジニルペプチドの結合量が少ないことを意味する。即ち、一本鎖ＤＮＡおよびミスマッチＤＮＡの応答電流値に比べてフルマッチＤＮＡの応答電流値が高ければ、本発明のビス−アクリジニルペプチドの二本鎖ＤＮＡに対する特異性が高いことを意味する。
【００６４】
以下に各ＤＮＡ配列における応答電流値を示す。
【００６５】
【表６】
2004024114.tif 000020
また、図８および図９に特に検出感度が高かった電極５と電極１のＤＰＶの測定結果を示す。以上の結果より、フルマッチの場合に比べてミスマッチの応答電流値は大きく減少したことが判明した。一つミスマッチが入るだけでこのような大きな応答電流値の減少が起きた原因としては、この化合物はビスインターカレータであるため、一つのミスマッチが入ることにより、その両サイドの塩基対に化合物が入れなくなり、二つ以上の化合物が結合できなくなったことによると考えられた。また、二つ以上の化合物が結合できなくなるため、化合物間の電子ホッピングによる応答電流の増幅効果も抑制されたと考えられた。
【００６６】
【発明の効果】
本発明の化合物によれば、インターカレート部分を２つ有することにより、二本鎖ＤＮＡにインカレートした際、安定な複合体を形成することができる。
【００６７】
また、二本鎖ＤＮＡに本発明の化合物が結合した際、２つの酸化還元活性部位がＤＮＡ塩基対内に平行に並ぶ形になり、塩基対間を伝わった電子移動（電子ホッピング）を効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化合物の基本的構成を概念的に表した図である。
【図２】ＨＰＬＣで精製をする前（ａ）と後（ｂ）のビス−アクリジニルペプチドのピークを示すクロマトグラムを表す図である。
【図３】実施例１において得られた化合物のＭＡＳＳスペクトルの測定結果を示す図である。
【図４】試験例１において、ＤＮＡの添加量を２０ｐｍｏｌ／μｌとした場合のデファレンシャルパルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）測定結果を表す図である。
【図５】試験例１において、ＤＮＡの添加量を１０ｐｍｏｌ／μｌとした場合のデファレンシャルパルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）測定結果を表す図である。
【図６】試験例１において、ＤＮＡの添加量を５ｐｍｏｌ／μｌとした場合のデファレンシャルパルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）測定結果を表す図である。
【図７】試験例１において、ＤＮＡの添加量を２ｐｍｏｌ／μｌとした場合のデファレンシャルパルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）測定結果を表す図である。
【図８】試験例２における、電極５のデファレンシャルパルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）測定結果を表す図である。
【図９】試験例２における、電極１のデファレンシャルパルスボルタンメトリ（ＤＰＶ）測定結果を表す図である。
【符号の説明】
１…本発明の化合物、２…インターカレート部、３…酸化還元活性部、４…リンカー部、５…二本鎖ＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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