(57)【要約】【課題】グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成に関与する酵素及び遺伝子を同定、取得し、さらにそれらの遺伝子を利用してグルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成能を強化させ、それによってキシリトール等の有用物質の生産能を向上させる。【解決手段】グルコノバクター属細菌を用いて、生合成における還元反応にＮＡＤＨを必要とする目的物質を製造するに方法において、前記細菌として、ＮＡＤＨ生成に関与する一又は複数の酵素、例えばトランスアルドラーゼ−グルコース−６−リン酸イソメラーゼ複合体、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リブロキナーゼ、又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの活性が増強された細菌を用いる。【選択図】　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質。
【請求項２】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質。
【請求項３】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質。
（Ｃ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである請求項６に記載のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である請求項７に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質。
（Ｅ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡである請求項１０に記載のＤＮＡ。
（ｅ）配列番号２０に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２０記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
下記（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質。
（Ｇ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１４】
下記（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｇ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１５】
下記（ｇ）又は（ｈ）に示すＤＮＡである請求項１４に記載のＤＮＡ。
（ｇ）配列番号２２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である請求項１５に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
グルコノバクター属細菌を目的物質の生合成原料に作用させて目的物質を生成せしめる、目的物質の製造法において、前記目的物質はその生合成における還元反応に還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを必要とし、かつ、前記細菌は還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド生成に関与する一又は複数の酵素活性が増強されるように改変されたことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記酵素活性が、トランスアルドラーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リブロキナーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれる１又は２以上の酵素の活性である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素活性の増強が、それぞれの酵素をコードする遺伝子の発現の増強によるものである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子の細胞内のコピー数を高めること、又は前記遺伝子の発現調節配列の機能が強化されることにより、同遺伝子の発現が強化されたことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記目的物質がキシリトールであり、前記還元反応がＤ−キシルロースからキシリトールへの変換反応である請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌は、さらにキシリトールデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変された請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌は、グルコノバクター・オキシダンスである請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
トランスアルドラーゼ−グルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、リブロキナーゼ遺伝子、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子の発現が強化されるように改変されたグルコノバクター属細菌。
【請求項２５】
さらにキシリトールデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変された請求項２４に記載のグルコノバクター属細菌。
【請求項２６】
グルコノバクター・オキシダンスである請求項２４又は２５に記載のグルコノバクター属細菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成に関与する新規遺伝子、及びＮＡＤＨ生成能が強化されたグルコノバクター属細菌に関する。本発明の細菌は、キシリトール等の有用物質の生産に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
天然に存在する糖アルコールであるキシリトールの需要は今後増加することが予想される。キシリトールは、蔗糖よりもカロリーが低く、蔗糖に匹敵する甘味を呈するため低カロリー甘味料として将来有望である。加えて、抗う蝕性を有しており、虫歯予防甘味料として利用されている。さらに、キシリトールは血糖値を上昇させないため、糖尿病治療の際の輸液として利用されている。
【０００３】
現在、キシリトールは主として米国特許第４，００８，８２５号に記載されるようなＤ−キシロースの水素添加により工業生産されている。原料となるＤ−キシロースは、硬木、藁、とうもろこしの穂軸、オート麦の外皮、その他キシランに富んだ植物材料を出発材料とし、これを加水分解することによって得られる。
【０００４】
また近年は、微生物を用いてキシリトールを製造する方法が開発されている。例えば、他のペンチトールを出発原料としてキシリトールを生産する方法が開発されてきた。容易に手に入るペンチトールのひとつがＤ−アラビトールであり、Ｄ−アラビトールは酵母を用いて製造できる（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１　（１９８５）　４６７−４７１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９　（１９９３）　１０４７−１０５４）。そこで、Ｄ−アラビトールを原料とするキシリトール生産法がいくつか開発されている。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，　１８　（１９６９）　１０３１−１０３５には、デバリオミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｈａｎｓｅｎｉｉ）　ＡＴＣＣ２０１２１を用いて、発酵によりグルコースからＤ−アラビトールを生産し、次に、アセトバクター・サブオキシダとしてンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｕｂｏｘｙｄａｎｃｅ　ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）を用いて同Ｄ−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、さらにキャンディダ・ギリエルモンディ・ヴァリ．ソヤ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　ｖａｒ．　ｓｏｙａ）を同Ｄ−キシルロースに作用させキシリトールに変換する方法が報告されている。
【０００５】
さらに、耐浸透圧酵母を用いてＤ−アラビトールを発酵生産し、次にアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属細菌またはクレブジエラ属細菌を用いて同Ｄ−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、次いで同キシルロースにグルコース（キシロース）イソメラーゼを作用させてキシロースおよびキシルロース混合物を生成し、さらに生成したキシロース／キシルロースに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている（ヨーロッパ特許出願公開第４０３３９２号および同第４２１８８２号）。また、同キシロース／キシルロース混合物中のキシロースを予備濃縮し、これに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている。
【０００６】
しかし、上記Ｄ−アラビトールを原料とするキシリトール生産法は、比較的高収率でキシリトールを生成することができるが、多段階の反応ステップを必要とするためにプロセスが煩雑なものとなるという欠点があり、そのため経済的にも満足のいくものではなかった。
【０００７】
これらの問題点を解決するものとして、本発明者らはＤ−アラビトールをキシリトールに直接変換する能力を持つ微生物を見出し、該微生物をＤ−アラビトールに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法を開発した（ヨーロッパ特許出願公開第１　０２６　２５４号）。前記微生物としては、グルコノバクター・サブオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ）等のグルコノバクター属細菌またはアセトバクター属細菌等が含まれる。
【０００８】
上記の方法は、発酵法によって、Ｄ−アラビトールを簡単な一段階のプロセスで効率よくキシリトールに変換できる優れた方法であるが、反応の安定性や、キシリトールの収率に改善の余地があった。そこで、本発明者らはＤ−アラビトールをキシリトールに直接変換する能力を持つ菌を解析し、本変換反応においてはＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ活性およびＤ−キシルロースリダクターゼ活性が関与することを明らかにした。そしてＤ−アラビトールからキシリトールへの変換反応の際に炭素源又は還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を添加して反応を行うことによって、安定して高収率でキシリトールが生産できることを見出している（ヨーロッパ特許出願公開第１　０２６　２５５号）。
【０００９】
一方、遺伝子操作技術によりキシリトール発酵菌の育種が試みられている。クレブジエラ属細菌由来のアラビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を、アラビトール発酵菌（キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属またはチゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母）に導入した遺伝子組換え菌を用いて、グルコースからキシリトールの発酵生産が試みられている（ＷＯ９４／１０３２５号国際公開パンフレット）。
【００１０】
さらに、エシェリヒア属細菌等の還元力供給能を有する微生物にグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入し、同微生物をＤ−キシルロースに作用させ、キシリトールを生成させる方法が開発されている（米国特許第６，２４２，２２８号）。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、グルコノバクター属細菌等を用いてＤ−アラビトールからキシリトールを製造する方法が開発されているが、Ｄ−キシルロースを還元してキシリトールに変換する工程の収率には改善の余地があった。本発明者らは、この反応（キシリトールデヒドロゲナーゼ反応）には補酵素ＮＡＤＨが必要であることから、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨの供給能を上昇させることにより、キシリトール生産能が向上すると考えた。しかし、グルコノバクター属細菌は、一般的にＮＡＤＨ生成経路とされるＴＣＡ回路が不完全であることが知られており、ＮＡＤＨの生成経路は不明であった。
【００１２】
本発明は、上記観点からなされたものであり、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成に関与する酵素及び遺伝子を同定、取得し、さらにそれらの遺伝子を利用してグルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成能を強化させ、それによってキシリトール等の有用物質の生産能を向上させることを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グルコノバクター・オキシダンスの無細胞抽出液を用いたＤ−アラビトール→キシリトール変換反応アッセイ系を構築し、キシリトール収率を向上させる因子を単離、同定することに成功した。さらにこれらの因子の一つをコードする遺伝子がオペロンを形成しており、オペロン中の他の遺伝子もキシリトール収率を向上させる因子であることを見出した。そして、これらの遺伝子の発現を強化することにより、キシリトール生産能を向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質。
（２）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質。
（３）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（２）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（３）のＤＮＡ。
【００１５】
（５）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質。
（Ｃ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（６）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（７）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（６）のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（７）のＤＮＡ。
【００１６】
（９）下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質。
（Ｅ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質。
（１０）下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質。
（１１）下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡである（１０）のＤＮＡ。
（ｅ）配列番号２０に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２０記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１２）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（１１）のＤＮＡ。
【００１７】
（１３）下記（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質。
（Ｇ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１４）下記（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｇ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１５）下記（ｇ）又は（ｈ）に示すＤＮＡである（１４）のＤＮＡ。
（ｇ）配列番号２２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１６）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（１５）のＤＮＡ。
【００１８】
（１７）グルコノバクター属細菌を目的物質の生合成原料に作用させて目的物質を生成せしめる、目的物質の製造法において、前記目的物質はその生合成における還元反応に還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを必要とし、かつ、前記細菌は還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド生成に関与する一又は複数の酵素活性が増強されるように改変されたことを特徴とする方法。（１８）前記酵素活性が、トランスアルドラーゼ−グルコース−６−リン酸イソメラーゼ複合体、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リブロキナーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれる１又は２以上の酵素の活性である（１７）の方法。
（１９）前記酵素活性の増強が、それぞれの酵素をコードする遺伝子の発現の増強によるものである（１９）の方法。
（２０）前記遺伝子の細胞内のコピー数を高めること、又は前記遺伝子の発現調節配列の機能が強化されることにより、同遺伝子の発現が強化されたことを特徴とする（１９）の方法。
（２１）前記目的物質がキシリトールであり、前記還元反応がＤ−キシルロースからキシリトールへの変換反応である（１７）〜（２０）のいずれかの方法。
（２２）前記細菌は、さらにキシリトールデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変された（２１）の方法。
（２３）前記細菌は、グルコノバクター・オキシダンスである（１７）〜（２２）のいずれかの方法。
（２４）トランスアルドラーゼ−グルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、リブロキナーゼ遺伝子、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子の発現が強化されるように改変されたグルコノバクター属細菌。
（２５）さらにキシリトールデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変された（２４）のグルコノバクター属細菌。
（２６）グルコノバクター・オキシダンスである（２３）又は（２５）のグルコノバクター属細菌。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する
＜１＞本発明のタンパク質及びＤＮＡ
本発明の第一のタンパク質は、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質（以下、「ＴＡＬ−ＰＧＩ」ともいう）であり、本発明の第一のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「ｔａｌ−ｐｇｉ」ともいう）である。同タンパク質は、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の両方を有するタンパク質であることが好ましい。トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性を単一ペプチド上に有するタンパク質は今まで報告されておらず、新規な酵素である。尚、本明細書において、ＴＡＬ−ＰＧＩは、トランスアルドラーゼ活性に言及するときは「ＴＡＬ」、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性に言及するときは「ＰＧＩ」ということがある。
【００２０】
本発明の第二のタンパク質は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、「６ＰＧＡＤＨ」ともいう）であり、本発明の第二のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「ｇｎｄ」ともいう）である。
【００２１】
本発明の第三のタンパク質は、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質（以下、「ＲＫ」ともいう）であり、本発明の第三のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「ｒｋ」ともいう）である。
【００２２】
本発明の第四のタンパク質は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、「Ｇ６ＰＤＨ」ともいう）であり、本発明の第四のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「ｚｗｆ」ともいう）である。
【００２３】
本発明のＤＮＡは、上記のタンパク質の１又はそれ以上をコードするものであってもよい。特に、グルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡから、本発明の第一のＤＮＡ及び第二のＤＮＡは、単一ＤＮＡ断片として取得され得る。
【００２４】
これらのＤＮＡは、本発明を完成するに際しては、グルコノバクター・オキシダンスの無細胞抽出液を用いたＤ−アラビトール→キシリトール変換反応アッセイ系において、キシリトール収率を向上させる因子として単離された因子をコードする遺伝子、及びそれに隣接する遺伝子として取得されたものである。しかし、本発明によってそれらの塩基配列が明らかになったので、それらの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、グルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより増幅することによって、取得することができる。また、前記塩基配列に基づいて調製したプローブ、又はＰＣＲにより増幅した部分断片をプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーションによっても、本発明のＤＮＡは取得され得る。グルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（Ｈ．　Ｓａｉｔｏ　ａｎｄ　Ｋ．Ｍｉｕｒａ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ　ｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　７２，　６１９　（１９６３）、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
前記プライマーとしては、表６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２５】
グルコノバクター属細菌としては、グルコノバクター・オキシダンス、グルコノバクター・サブオキシダンス等が、具体的にはグルコノバクター・オキシダンスＡＪ２８４７株（ＡＴＣＣ６２１）、グルコノバクター・サブオキシダンスＮＲＲＬ　Ｂ−７７５株が挙げられる。同株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，　Ｍａｎａｓｓａｓ，　ＶＡ　２０１１０−２２０９，　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）及びアグリカルチュアル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＮＲＲＬ））（１８１５　Ｎｏｒｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｔｒｅｅｔ，　Ｐｅｏｒｉａ，　Ｉｌｌｉｏｉｓ　６１６０４，　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）から入手することができる。
【００２６】
本発明のＤＮＡの取得、及び、後述する本発明の細菌の構築に際して、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，　１．２１　（１９８９）等に記載されている。
【００２７】
上記のようにして得られる本発明のｔａｌ−ｐｇｉを含むＤＮＡ断片の塩基配列の一例を配列番号１６に示す。このＤＮＡ断片中には、ＴＡＬ−ＰＧＩをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流及び下流のそれぞれに、別のＯＲＦが見出された。これらは、トランスケトラーゼ及び６ＰＧＡＤＨをそれぞれコードしており、前記ＤＮＡ断片は、オペロンを形成していると推定された。トランスケトラーゼのアミノ酸配列を配列番号１７に、ＴＡＬ−ＰＧＩのアミノ酸配列を配列番号１８に、６ＰＧＡＤＨのアミノ酸配列を配列番号１９に示す。
【００２８】
また、本発明のｒｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードし得るＲＫのアミノ酸配列の一例を、配列番号２０及び２１に示す。
さらに、本発明のｚｗｆを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードし得るＧ６ＰＤＨのアミノ酸配列の一例を、配列番号２０及び２１に示す。
【００２９】
本発明の第一のＤＮＡは、コードされるタンパク質のトランスアルドラーゼ活性又はグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性、好ましくはこれらの両方の活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むＴＡＬ−ＰＧＩをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３０】
本発明の第二のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む６ＰＧＡＤＨであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３１】
本発明の第三のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、リブロキナーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むＲＫであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３２】
本発明の第四のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むＧ６ＰＤＨであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３３】
上記のようなＴＡＬ−ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、又はＧ６ＰＤＨと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、ｔａｌ−ｐｇｉ、ｇｎｄ、ｒｋ、又はｚｗｆの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００３４】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、ＴＡＬ−ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、又はＧ６ＰＤＨと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するＴＡＬ−ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、又はＧ６ＰＤＨをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番号１６に記載の塩基配列のうち、塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列もしくは塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列、配列番号２０に記載の塩基配列のうち、塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列、配列番号２２に記載の塩基配列のうち、塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列、又はこれらの塩基配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、トランスアルドラーゼ活性もしくはグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性グルタミンシンテターゼ活性又はこれらの両方の活性、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性、リブロキナーゼ活性、又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、ＴＡＬ−ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、又はＧ６ＰＤＨと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３５】
プローブとして、配列番号１６、２０又は２２の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、これらの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００３６】
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎトランスアルドラーゼ活性もしくはグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性又はこれらの両方の活性、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性、リブロキナーゼ活性、又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を、例えば後述の実施例８に記載の方法で、それぞれ測定することによって、容易に選別することができる。
【００３７】
ＴＡＬ−ＰＧＩと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号１８に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつＴＡＬ−ＰＧＩ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３８】
また、６ＰＧＡＤＨと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号１９に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ６ＰＧＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３９】
ＲＫと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号２１に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつＲＫ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００４０】
また、Ｇ６ＰＤＨと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号２３に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつＧ６ＰＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００４１】
＜２＞ＮＡＤＨ生成能が強化されたグルコノバクター属細菌
本発明の細菌は、ＮＡＤＨ生成能が強化されたグルコノバクター属細菌である。
本発明の細菌は、具体的には、細胞内の、ＮＡＤＨ生成に関与する一又は複数の酵素活性が増強されるように改変されたグルコノバクター属細菌である。本発明の細菌として、例えば、ＴＡＬ、ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、Ｇ６ＰＤＨよりなる群から選ばれる１又は２以上の酵素の活性が増強されるように改変されたグルコノバクター属細菌が挙げられる。これらの酵素のうち、好ましくは２つの酵素、より好ましくは３つの酵素、さらに好ましくは４つ、最も好ましくは５つ全ての酵素活性が増強されることが望ましい。尚、ＴＡＬ活性、ＰＧＩ活性を有する酵素としては、ＴＡＬ−ＰＧＩ複合体が挙げられるが、ＴＡＬ−ＰＧＩは、少なくともいずれか一方の活性を有していればよく、両方の活性を有していてもよい。ＴＡＬ、ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、及びＧ６ＰＤＨは、いずれも触媒する反応によって直接ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成するか、あるいは、ペントースリン酸回路全体の活性あるいは速度を増加させるか、又は、ペントースリン酸回路に流入する炭素源を増加させる反応を触媒し、結果としてＮＡＤＨの産生に寄与する。
【００４２】
本発明のグルコノバクター属細菌として具体的には、ＮＡＤＨを必要とする還元反応を含む生合成経路によって生成する目的物質を産生する細菌が挙げられる。このような目的物質としては、その生合成に還元反応を含み、同反応にＮＡＤＨを必要とする限り特に制限されず、キシリトール等の糖類、光学活性アルコール類、糖アルコール類等が挙げられる。「目的物質を産生する」とは、本発明の細菌を培養したときに、目的物質を培地中、又は細菌の細胞内に蓄積すること、好ましくは培地中に目的物質を蓄積することをいう。この目的物質を産生する性質は、グルコノバクター属細菌の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。
【００４３】
「酵素活性が増強されるように改変された」とは、細胞当たりの遺伝子産物の活性が非改変株、例えば野生型のグルコノバクター属細菌のそれよりも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりの遺伝子産物の分子の数が増加した場合や、遺伝子産物の分子当たりの比活性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野生型のグルコノバクター属細菌とは、例えばグルコノバクター・オキシダンスＡＪ２８４７株（ＡＴＣＣ６２１）である。
【００４４】
酵素活性の増強は、例えば、該酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによって達成される。遺伝子の発現量の増強は、該遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、目的とする遺伝子断片を、グルコノバクター属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これを目的物質生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよい。また、目的物質生産能を有しないグルコノバクター属細菌に上記組換えＤＮＡを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株に目的物質生産能を付与してもよい。
【００４５】
導入する遺伝子は、エシェリヒア・コリにおいて自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９，　ｐＨＳＧ３９９，　ｐＨＳＧ３９８，　ＲＳＦ１０１０，　ｐＢＲ３２２，　ｐＡＣＹＣ１８４，　ｐＭＷ２１９等が挙げられる。
【００４６】
グルコノバクター属細菌で機能するベクターとは、例えばグルコノバクター属細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的には、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３１７１株由来の内在性プラスミドｐＡＧ５、またはその誘導体が挙げられる（米国特許第６，１２７，１７４号）。また、これらのベクターからグルコノバクター属細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びグルコノバクター属細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。このようなシャトルベクターとしては、ｐＳＧ８、ｐＳＧ６、及び実施例に記載したｐＳＡ１９（Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５８（１０），　１８９９−１９０１，　１９９４）等が挙げられる。
【００４７】
なお、ｐＳＧ８を保持するエシェリヒア　コリＪＭ１０９株は、プライベートナンバーＡＪ１３４８５が付与され、平成１９９８年７月２１日に独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６郵便番号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１６９０３が付与され、１９９９年６月１４日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６７６０が付与されている。
【００４８】
上記ベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００４９】
目的遺伝子とグルコノバクター属細菌で機能するベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、目的遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はＴ４　ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００５０】
組換えＤＮＡをグルコノバクター属細菌に導入するには、通常の形質転換法、例えば電気パルス法等を用いることができる（米国特許第６，１２７，１７４号）。
目的遺伝子のコピー数を高めることは、該遺伝子をグルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。グルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡ上に目的遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。
【００５１】
遺伝子の発現の強化は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上またはプラスミド上の目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変により目的遺伝子の発現が強化される。これら発現調節配列の改変は、遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００５２】
発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。
本発明のグルコノバクター属細菌を用いてキシリトールを効率よく生産するには、ＮＡＤＨ生成能の強化と同時に、キシリトール生合成に関与する酵素の活性が上昇するにように改変されたた菌株を用いるのが好ましい。このような酵素としては、例えばキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）が挙げられる。キシリトールデヒドロゲナーゼは、Ｄ−キシリトールからキシリトールを生成する反応を触媒するＤ−キシルロースリダクターゼ活性を有している。本発明においては、この活性を、ＸＤＨ活性という。
【００５３】
ＸＤＨ活性の増強は、例えば、ＸＤＨをコードする遺伝子の発現を増強することによって達成される。同遺伝子の発現量の増強は、ＸＤＨをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、ＸＤＨをコードする遺伝子断片を、グルコノバクター属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これをキシリトール生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよい。
【００５４】
ＸＤＨをコードする遺伝子としては、ピヒア・スティピティス（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，　３２４，　９　（１９９３））及びモルガネラ・モルガニ（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｌ３４３４５）由来の遺伝子、及び、グルコノバクター・オキシダンスのＸＤＨ１遺伝子、及びＸＤＨ２遺伝子（米国特許第６，２４２，２２８号）が挙げられる。発現容易の観点からは、グルコノバクター属細菌由来の遺伝子を用いることが好ましい。
【００５５】
グルコノバクター属細菌のＸＤＨをコードする遺伝子（ｇｄｈ遺伝子）の塩基配列は、既に明らかにされている（米国特許第６，２４２，２２８号）ので、その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば表１１に示すプライマーを用いて、グルコノバクター属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって、ＸＤＨ遺伝子を取得することができる。グルコノバクター属細菌等の他の微生物のＸＤＨをコードする遺伝子も、同様にして取得され得る。
【００５６】
ＸＤＨ遺伝子のグルコノバクター属細菌への導入は、前記のＮＡＤＨ生成に関与する遺伝子と同様にして行うことができる。
【００５７】
＜３＞目的物質の製造法
本発明の方法は、グルコノバクター属細菌を目的物質の生合成原料に作用させて目的物質を生成せしめる、目的物質の製造法において、前記目的物質はその生合成における還元反応にＮＡＤＨを必要とし、かつ、前記細菌はＮＡＤＨ生成に関与する一又は複数の酵素の活性が増強されるように改変されたことを特徴とする方法である。
【００５８】
本発明のグルコノバクター属細菌は、ＮＡＤＨ生成能が強化されており、生合成における還元反応にＮＡＤＨを必要とする目的物質を効率良く産生することができる。
【００５９】
目的物質の生合成原料としては、目的物質によって、本発明のグルコノバクター属細菌の培養に必要とするグルコース等の炭素源であってもよいし、目的物質の生合成の中間体であってもよい。例えば、目的物質がキシリトールである場合は、原料としてはＤ−アラビトール、Ｄ−キシルロースが挙げられる。
【００６０】
本発明のグルコノバクター属細菌を生合成原料に作用させるには、同細菌を培養する培地に前記原料を添加してもよいし、同細菌の菌体と原料を液体中で混合してもよい。さらに、本発明の細菌又はその処理物を固定化した担体を詰めたカラムに、原料溶液を通液してもよい。
【００６１】
以下に、目的物質としてキシリトールを製造する方法を例示する。
本発明の細菌を培養する培地は格別の制限はなく、該細菌によって利用される通常の炭素源、窒素源、リン源、無機イオン、更に必要ならば有機栄養源を含む通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、等が使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩その他が用いられる。リン源としてはリン酸のカリウム塩、ナトリウム塩等が使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、硫酸イオンその他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有するレバーエキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜用いられる。
【００６２】
また、本発明の細菌が持つＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼまたはキシリトールデヒドロゲナーゼの誘導剤として、Ｄ−キシロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−アラビトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトールなどの糖類や糖アルコールを培地に添加することによって、Ｄ−アラビトールをキシリトールに変換する反応に関与する酵素の活性が向上する場合がある。
【００６３】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下ｐＨ５〜８及び温度２５〜４０℃の範囲内で、ｐＨ及び温度を適当に制限しつつ１２〜７２時間程度培養を行なえばよい。
【００６４】
かくして培養されたグルコノバクター属細菌を、Ｄ−アラビトールに接触反応させることにより、反応液中にキシリトールを生成することができる。本発明の方法において前記「グルコノバクター属細菌」は、菌体そのものであってもよいし、Ｄ−アラビトールをキシリトールに変換する能力を有する限り菌体の処理物であってもよい。具体的には、菌体を含む培養物、該培養物から分離・回収した菌体、該菌体固定化処理物、アセトン処理または凍結乾燥等した菌体、菌体破砕液、Ｄ−アラビトールデヒドロゲナーゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼを含む菌体破砕液の分画物もしくは精製酵素画分、又はこれらの処理物の固定化物等が挙げられる。
【００６５】
Ｄ−アラビトール濃度に格別の制限はなく、通常１〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは５〜４０％（ｗ／ｖ）が好ましい結果を与える。また反応の際、基質のＤ−アラビトールを分割添加することにより収率が向上する場合がある。反応条件にも格別の制限はなく、通常は、好気的条件下で、反応温度２０〜６０℃、望ましくは３０〜４０℃で、反応ｐＨ３．０〜１０．０望ましくはｐＨ４．０〜７．０で好結果を与える。尚、反応液に炭酸カルシウムを例えば２％（ｗ／ｖ）となるように添加するなどして、反応時のｐＨの低下を防ぐと、キシリトールの収率を高めることができる場合がある。反応には、静置反応あるいは撹はん反応のいずれの方法も採用し得る。反応時間は、使用する菌体の活性、Ｄ−アラビトール濃度などの条件によって異なるが、１〜１００時間が望ましい。
【００６６】
本発明において、菌体を用いる場合には反応系に炭素源を添加することが、収率の点から好ましい。また、菌体処理物を用いる場合には反応系にさらにＮＡＤＨ又はＮＡＤ＋を添加してもよい。
【００６７】
前記炭素源としては、代謝される際にＮＡＤＨの生成を伴う炭素源であれば特に制限はないが、糖、糖の誘導体、アルコール類、アルデヒド類、および有機酸類等が挙げられる。糖としてはグルコース、フルクトース、スクロース、ラクトースが挙げられる。糖の誘導体としてはソルビトール、マンニトール、グリセロール等の糖アルコール、グルコン酸等のアルドン酸等が挙げられる。また、アルコール類としてはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオールなどが、アルデヒド類としてはホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、イソブチルアルデヒド、グリセロアルデヒドなどが、また有機酸類としてはギ酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸などが挙げられる。これらの炭素源は、単独で使用してもよく、任意の２種または３種以上の炭素源を混合物として使用してもよい。これら炭素源の添加量は、使用する菌体の活性、Ｄ−アラビトール濃度などの条件によって異なるが、合計で０．２〜４０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜２０％（ｗ／ｖ）が好ましい結果を与える。これらの炭素源の添加時期は格別の制限はなく、反応開始時から添加しても、反応途中で添加しても、また分割添加してもよい。
【００６８】
本発明の細菌を用いたＤ−アラビトール→キシリトール変換反応の進行には、Ｃｏ２＋イオンの存在が有効である。本発明の方法によるキシリトールの生産においては、前記変換反応は、０．１ｍＭ以上のＣｏ２＋イオンの存在下で行うことが好ましい。
【００６９】
上記のようにして培養液中に生成したキシリトールは、常法に従って反応液より採取分離される。具体的には、遠心分離、ろ過等により固形物を除去した後、活性炭、イオン交換樹脂により脱色、脱塩し、その溶液から結晶化する方法が採用できる。
【００７０】
また、キシリトール以外の目的物質についても、目的物質に応じて採取分離方法を適宜選択すればよい。
【００７１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００７２】
【実施例１】インビトロ再構成系でのアラビトール→キシリトール変換反応系の構築
Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓの可溶性画分に存在するキシリトール収率向上因子を単離・精製するために、以下のアッセイ系を構築した。
【００７３】
Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＪ２８４７株（ＡＴＣＣ６２１）をＹＰＧプレート（３ｇ／ｄｌ　グルコース、０．５ｇ／ｄｌ　イーストエキストラクト、０．３ｇ／ｄｌペプトン、２ｇ／ｄｌ　寒天末）で３０℃、２４ｈｒ、リフレッシュ培養したのちに、ＳＲ培地（２ｇ／ｄｌ　グルコン酸ナトリウム、０．５ｇ／ｄｌ　グルコース、０．３ｇ／ｄｌ　グリセロール、０．３ｇ／ｄｌ　イーストエキストラクト、０．２ｇ／ｄｌ　ペプトン、ｐＨ　６．５）を５０ｍｌ入れた坂口フラスコに一白金耳接種し、３０℃で一晩振盪培養した。得られた培養液を５０ｍｌ　のＳＲ培地を入れた坂口フラスコ４本に５％接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。
【００７４】
上記培養液から遠心分離により集菌し、５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）（以下、ＫＰＢと略する）で洗浄した湿菌体２ｇを１０ｍｌのＫＰＢ　（ｐＨ６．５）に懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。８０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を２回行って菌体残さを除いた上清を、５００００ｒｐｍで３０分間超遠心分離した。得られた上清を可溶性画分として得た。一方沈殿をＫＰＢで洗浄した後に２ｍｌのＫＰＢに溶解し、膜画分を調製した。
【００７５】
上記のようにして調製した膜画分と可溶性画分を用いて、以下の組成の反応液でアラビトール→キシリトール変換反応を行った。反応は１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブ中で３０℃で２４時間行った。
【００７６】
〔反応溶液組成〕
０．５ｇ／ｄｌ　　Ｄ−アラビトール
２０ｍＭ　ＮＡＤ　（ｐＨ５．０）
５０ｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ６．０）
１ｍｇ　タンパク質／ｍｌ　膜画分
１ｍｇ　タンパク質／ｍｌ可溶性画分
【００７７】
上記反応液２００μｌをサンプリングし、１０μｌの１００％　ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を添加して、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してタンパク質を沈殿させ、得られた上清に１０μｌの６Ｎ　ＫＯＨを添加して中和した後に、下記条件のＨＰＬＣにて生成キシリトール量を定量した。その結果、０．５ｇ／ｄｌのＤ−アラビトールから０．１４ｇ／ｄｌのキシリトールが生成した。
【００７８】
〔ＨＰＬＣ分析条件〕
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＣ１２１１〔昭和電工社製品〕
移動層：　５０ｐｐｍ　Ｃａ−ＥＤＴＡ水溶液
流　速：１　ｍｌ／分
温　度：８０℃
検　出：ＲＩ検出器
【００７９】
【実施例２】アラビトール→キシリトール変換反応に対する金属イオンの添加効果
５０ｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ６．０）、１ｇ／ｄｌ　アラビトール、１０ｍＭ　ＮＡＤ　（ｐＨ５）、１ｍｇ　タンパク質／ｍｌ膜画分、１ｍｇタンパク質／ｍｌ可溶性画分からなる反応液に、以下に示す金属イオンを終濃度１ｍＭとなるように添加して３０℃で６時間反応を行い、アラビトール→キシリトール変換反応に対する金属イオンの添加効果を検討した。
【００８０】
〔添加金属イオン〕
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣｏＳＯ４、ＮｉＣｌ２、ＭｎＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＥＤＴＡ
【００８１】
反応液中のキシリトール、Ｄ−キシルロース及びＤ−アラビトールをＨＰＬＣにより定量した結果を表１に示す。ＣｏＳＯ４添加区において、生成キシリトール量の増加が認められ、Ｄ−アラビトールからのキシリトール生産にＣｏ２＋が効果的であることが明らかとなった。
【００８２】
【表１】
2004024140.tif 000003
【００８３】
【実施例３】Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓの還元力供給因子の精製
Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＪ２８４７株（ＡＴＣＣ６２１）の可溶性画分から還元力供給因子の精製を以下の通り行った。還元力供給能は、インビトロのＤ−アラビトール→キシリトール変換反応系での生成キシリトールの増加で検出した。反応条件を示す。
【００８４】
〔反応溶液組成〕
５０ｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ６．０）
１ｇ／ｄｌ　アラビトール
１０ｍＭ　ＮＡＤ　（ｐＨ５）
１ｍｇタンパク質／ｍｌ膜画分
１ｍｇタンパク質／ｍｌ可溶性画分
１ｍＭ　ＣｏＣｌ２
【００８５】
〔反応条件〕
３０μｌ酵素画分／２００μｌ反応液、３０℃、１６時間反応後、ＴＣＡ処理・中和処理を行いＨＰＬＣにて定量した。
【００８６】
（１）可溶性画分の調製：
洗浄菌体約１０ｇ（１Ｌ培養分）を４５ｍｌの５０ｍＭ　ＫＰＢ（ｐＨ　６．５）に懸濁し、４℃で２０分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（×８０００ｒｐｍ、１０分間×２回）により菌体残渣を除き、さらに超遠心分離（ｘ５００００ｒｐｍ、３０分間）し、得られた上清を可溶性画分とした。また、沈殿は適宜ＫＰＢに懸濁し、膜画分としてインビトロ再構成系での酵素源とした。
【００８７】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ
上記の可溶性画分１８ｍｌをバッファーＡ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６））で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　２６／１０（ファルマシア社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をバッファーＡを用いて洗い流した後、ＫＣｌ濃度を０Ｍから０．７Ｍまで直線的に変化させて吸着したタンパク質の溶出を行った（総溶出液量１００ｍｌ）。各溶出画分についてインビトロ再構成系に供してキシリトール生成量の増加効果を検出したところ、３５０〜４５０ｍＭに相当する位置と、５５０ｍＭに相当する位置の２箇所にキシリトール生成活性（以下、「ＮＲＦ活性」ということがある）のピークを検出した。以下、それぞれのピークを順に「ＮＲＦ１」、「ＮＲＦ２」ということがある。また、これらを総称してＮＲＦと呼ぶことがある。
【００８８】
（３）　ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　２００　ＨＰ）
ＮＲＦ１、ＮＲＦ２を含む画分をそれぞれ集めて、バッファーＡに対して透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液（それぞれ３０ｍｌ、６ｍｌ）を、限外ろ過膜ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　１０（アミコン社製）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、バッファーＢ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１Ｍ　ＫＣｌ）で平衡化されたゲルろ過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　２００　ＨＰ（ファルマシア社製））にアプライし、１ｍｌ／分の流速で溶出した。ＮＲＦ１は２回に分けて、ＮＲＦ２は１回で、それぞれ０．８ｍｌずつ分離操作を行った。この操作によりＮＲＦ１及びＮＲＦ２は、それぞれ、６９〜７２ｍｌ、７０〜７４ｍｌの画分に溶出された。
【００８９】
（４）陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５／５）
得られた画分（ＮＲＦ１：１２ｍｌ、ＮＲＦ２：４ｍｌ）を０．４５μｍのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーＡで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｍｏｎｏ−Ｑ　ＨＲ　５／５（ファルマシア社製））に供した。この操作により、ＮＲＦは担体に吸着した。
【００９０】
バッファーＡにより非吸着タンパク質を洗い流した後、ＫＣｌ濃度を直線的に０ｍＭから７００ｍＭへ変化させてタンパク質の溶出を行った（総液量１５ｍｌ）。各溶出画分についてＮＲＦ活性を測定し、ＫＣｌ濃度が３００ｍＭ　、５００ｍＭの溶出位置にそれぞれＮＲＦ活性が認められた。
【００９１】
（５）疎水性クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　ＨＰ　ＨＲ　５／５）
活性が検出されたそれぞれの溶液をバッファーＣ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ　７．０）に対して透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーＣで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラム（Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　ＨＰ（ファルマシア社製））に供した。この操作によりＮＲＦは担体に吸着した。
【００９２】
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーＣを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで直線的変化させてＮＲＦを溶出をさせた。得られた各溶出画分についてＮＲＦ活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ２００〜４００ｍＭ、１００〜２００ｍＭの溶出位置にＮＲＦ活性がそれぞれ認められた。
【００９３】
以上のカラムクロマト操作により精製した画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、ＮＲＦ１画分については約１００ｋＤａに相当する位置にほぼ単一なバンドとして検出された。またＮＲＦ２画分は約６０ｋＤａのバンドが検出された。
【００９４】
【実施例４】ＮＲＦ１、ＮＲＦ２のＮ末アミノ酸配列の決定
精製したＮＲＦ１、およびＮＲＦ２について、タンパク量約１０μｇ分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲル中のＮＲＦ１およびＮＲＦ２をミリポア社ミニブロットを用いてＰＶＤＦフィルターに転写し、プロテインシーケンサー（ＡＢＩ社製、モデル４７６Ａ）によってアミノ酸配列をＮ末端から解析した。
【００９５】
また、ＮＲＦ１の内部アミノ酸配列についても解析を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の試料をリジルエンドペプチダーゼ処理し（ｐＨ８．５、３５℃、２０時間）、逆相ＨＰＬＣに供して断片ペプチドを分離した。分取した画分のうち、１つのフラクションについてアミノ酸配列を決定した。結果を表２に示す。表中、カッコ内はアミノ酸配列決定において不明瞭であったアミノ酸残基を示す。
【００９６】
【表２】
2004024140.tif 000004
【００９７】
【実施例５】ｎｒｆ１、ｎｒｆ２遺伝子のクローニング
Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＴＣＣ６２１株をＹＰＧ培地を用いて３０℃で一晩培養した。この培養液５ｍｌを種菌として、１００ｍｌの　ＹＰＧ　培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液１００ｍｌを遠心分離操作（１２０００×Ｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
【００９８】
決定したＮＲＦ１、ＮＲＦ２それぞれのＮ末端アミノ酸配列およびＮＲＦ１の内部アミノ酸配列をもとに、以下のミックスプライマーを合成した（表３）。
【００９９】
【表３】
2004024140.tif 000005
【０１００】
作製したミックスプライマーを用いて、カセットＰＣＲ法によるｎｒｆ１，ｎｒｆ２遺伝子断片の取得を行った。カセットＰＣＲ法はＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＰＣＲ　インビトロ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（宝酒造社）を使用し、本キットに添付に添付のマニュアルに記載の方法に準じて行った。
【０１０１】
塩基配列の決定は、Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＡＢＩ社製）を用いたＰＣＲ反応により行った。また電気泳動は、ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　３７３もしくはｍｏｄｅｌ　３１１（ＡＢＩ社製）を用いて行った。
【０１０２】
カセットＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片の一部を用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによって全長遺伝子の取得を行った。ＤＮＡプローブの作製はＤＩＧ　Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ（ロシュダイアグノスティック社製）を使用して、説明書通りに３７℃で一晩インキュベートしてプローブの標識を行った。プローブとして用いたＤＮＡ断片の増幅に用いたＰＣＲプライマーの配列を表４に示す。
【０１０３】
【表４】
2004024140.tif 000006
【０１０４】
サザン解析は、染色体ＤＮＡ　１μｇを各種制限酵素で完全に消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下キットに添付のマニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ　ＥａｓｙＨｙｂ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行い、５０℃　で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、Ｏ／Ｎでハイブリダイゼーションさせた。バンドの検出はＤＩＧ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて行った。
【０１０５】
コロニーハイブリダイゼーションは、以下のようにして行った。染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で処理後、サザン解析にて検出されたバンド長に相当する大きさの断片を回収してｐＵＣ１８又はｐＵＣ１１８に連結し、連結反応液でＥ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を形質転換してライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂを用いて行った。フィルターをバッファー中に浸し、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作製した標識プローブを添加し、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ＳＳＣでの洗浄後、プローブとハイブリダイズするコロニーの検出を、ＤＩＧ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行った。
【０１０６】
（１）ｎｒｆ１（ｔａｌ−ｐｇｉ）およびｇｎｄ遺伝子のクローニング
ｎｒｆ１のクローニングは、以下のようにして行った。まず決定したＮ末アミノ酸配列の情報を基にカセットＰＣＲ法でコード領域を取得した。次に取得した遺伝子断片をプローブとしたサザン解析とコロニーハイブリダイゼーションにより、合わせて約８．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。
【０１０７】
カセットＰＣＲ法によるｎｒｆ１遺伝子断片の取得はＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＰＣＲ　インビトロ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（宝酒造社）を使用し、本キットに添付のマニュアルに記載の方法に準じて行った。まず、染色体ＤＮＡ　５μｇをＨｉｎｄＩＩＩで消化した。次に、制限酵素断片にＨｉｎｄＩＩＩ　Ｃａｓｓｅｔｔｅを連結し、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃ１とＰｒｉｍｅｒ　ＮＲＦ１−Ｎ１を使用して１回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ＰＥＲＳＯＮＥＬ（宝酒造社製）を用いて行い、以下の条件で３０サイクル行った。９４℃　３０秒、５５℃　２分、７２℃　１分。
【０１０８】
次に、この反応液を１００倍に希釈して、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃ２及びＰｒｉｍｅｒ　　ＮＲＦ１−Ｎ２を新たに加えて２回目のＰＣＲを行った。条件は１回目と同じであった。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約２．２ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認された。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列が、ＮＲＦ１のＮ末端アミノ酸配列と一致しており、目的のｎｒｆ１遺伝子が取得されたことが確認された。
【０１０９】
ｎｒｆ１遺伝子全長の取得は以下の方法で行った。まず取得したｎｒｆ１遺伝子の内部を表３に示すプライマーを用いて増幅し、これらをプローブとしてサザン解析を行ったところ、それぞれプローブと強くハイブリダイズする約３．６ｋｂｐのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片（上流域）と、約４．８ｋｂｐのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片（下流域）を検出した。そこで、定法に従いコロニーハイブリダイゼーションによりこれらの断片を取得し、塩基配列を決定した（配列番号１６）。
【０１１０】
ｎｒｆ１遺伝子をクローニングした結果、本遺伝子のコード領域は２８７１ｂｐで、９５７アミノ酸残基からなる１０３ｋＤａのタンパク質をコードしていた。推定されるアミノ酸配列（配列番号１７）を相同性検索にかけたところ、Ｎ末側の１７〜３８１番残基はトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）との相同性が認められ、Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ由来ＴＡＬと４６％の相同性を有していた。また、Ｃ末側の４３４〜７６９番残基はグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）との相同性が認められ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来ＰＧＩと２７％の相同性を有していた。
【０１１１】
また、ｎｒｆ１の周辺領域をクローニングした結果、ｎｒｆ１の上流、下流に１つずつｏｒｆが存在しており、これら３つの遺伝子はオペロンを形成していると推定された。上流のｏｒｆ１は６８５アミノ酸残基からなる７３．５ｋＤａのタンパク質をコードしており（配列番号１８）、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）との相同性を有していた。また、下流のｏｒｆ２は３３２アミノ酸残基からなる３５．９ｋＤａのタンパク質をコードしており（配列番号１９）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（「６ＰＧＡＤＨ」または「ＧＮＤ」と省略する。またこれをコードする遺伝子を「ｇｎｄ」と略す。）との相同性を有していた。具体的には、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ由来ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ＧＮＤと４３％の相同性を示した。このことから、ｎｒｆ１オペロンは、ペントースリン酸回路の遺伝子をコードしているものと推定された。一般的に、ＧＮＤはＮＡＰＤ型であることが広く知られているが、ｏｒｆ２はＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ＧＮＤとより高い相同性が認められられたことから、本遺伝子産物がＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ＧＮＤである場合には、還元力（ＮＡＤＨ）供給遺伝子としての効果を有する可能性が考えられた。
【０１１２】
（２）ｎｒｆ２（ＲＫ）遺伝子のクローニング
ｎｒｆ２のクローニングは、以下のようにして行った。まず、遺伝子の上流領域をカセットＰＣＲで取得し、次に取得した遺伝子断片をプローブとしたサザン解析とコロニーハイブリダイゼーションにより、合わせて約４．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。
【０１１３】
ｎｒｆ１遺伝子断片のクローニングと同様に、カセットＰＣＲ法により、Ｐｒｉｍｅｒ　ＮＲＦ２ＡＳ１とＮＲＦ２ＡＳ３を用いてｎｒｆ２遺伝子上流域の増幅を行ったところ、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認された。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列が、ＮＲＦ２のＮ末端アミノ酸配列と一致しており、目的のｎｒｆ２遺伝子の上流領域が取得されたことが確認された。
【０１１４】
ｎｒｆ２遺伝子全長の取得は以下の方法で行った。まず取得したｎｒｆ２遺伝子の内部を表４に示すプライマーを用いて増幅し、これらをプローブとしてサザン解析を行ったところ、プローブと強くハイブリダイズする約４．２ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片を検出した。そこで定法に従いコロニーハイブリダイゼーションによりこれら断片を取得し、塩基配列を決定した（配列番号２０）。
【０１１５】
ｎｒｆ２遺伝子のコード領域は１６４４ｂｐであり、５４８アミノ酸残基からなる５９ｋＤａのタンパク質（配列番号２１）をコードしていた。アミノ酸配列の相同性検索を行ったところ、ＲＫ、リビトールキナーゼやキシルロキナーゼなどのシュガーキナーゼとの高い相同性が認められた。具体的には、Ｅ．　ｃｏｌｉ由来リビトールキナーゼと４４％の相同性を示した。
【０１１６】
【実施例６】Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓのＮＡＤ−ＮＡＤＰ型Ｇ６ＰＤＨおよびＮＡＤ−ＮＡＤＰ型６ＰＧＡＤＨ活性の検出
以上の結果より、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓのペントースリン酸回路を強化することにより還元力（ＮＡＤＨ）が得られることが示された。そこで、以下の方法で、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓのペントースリン酸回路の酵素活性を測定したところ、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓにおいてＮＡＤＨを供給する酵素として、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）と６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＡＤＨ）を新たに見出した。
【０１１７】
〔グルコース−６−リン酸　（Ｇ６Ｐ）デヒドロゲナーゼ活性測定反応液〕
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ２ＳＯ４　（ｐＨ８．２）
０．５ｍＭ　ＮＡＤ（Ｐ）
１５ｍＭ　グルコース−６−リン酸
【０１１８】
〔６−ホスホグルコン酸　（６ＰＧＡ）デヒドロゲナーゼ活性測定反応液〕
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ８．２），　０．５ｍＭ　ＮＡＤ（Ｐ），　１５ｍＭ　６−ホスホグルコン酸
【０１１９】
ともに、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓの可溶性画分を酵素源とし、３４０ｎｍの吸光度の増加を測定した。また、それぞれの酵素活性のｐＨプレフィールを測定した。ｐＨプレフィール作成には、酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．０〜６．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　７．０〜８．５）、グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ　９．０〜１０．５）の各バッファーを用いた。結果を図１及び図２に示す。
【０１２０】
以上の検討により、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓにおいて、Ｇ６ＰＤＨと６ＰＧＡＤＨの２つの酵素が、ＮＡＤとＮＡＤＰのいずれも補酵素とし得るＮＡＤ−ＮＡＤＰ型酵素であることを見出した。
広く一般的には、これらの酵素はＮＡＤＰ特異的酵素として知られているが、Ｇ６ＰＤＨについては、ある特定の種においては（例えばＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型活性を示すことが報告されている（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１６９，　３３４　（１９８７））。しかし、酢酸菌においてはＧ６ＰＤＨはＮＡＤＰ型とされており（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｒｅｖ．　５５，　３５　（１９９１）；　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６０，　１３７７　（１９９６））、酢酸菌Ｇ６ＰＤＨがＮＡＤにも活性を示すことを今回はじめて見出した。
【０１２１】
なお、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍにおいては、ＮＡＤＰ型酵素に加えて、ＮＡＤ型の酵素が報告されている　（Ｊ．　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２４８，　１６０３　（１９７３）；　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．，　３１０，　３６０　（１９９４））。ただし、このＮＡＤ型の酵素はＧ６Ｐだけでなくグルコースも基質とし、しかもｐＨ５．６に至適を持つ特異な酵素である。しかし、今回Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓに見出されたＮＡＤ型活性の至適ｐＨは約９．５であり、また、ＮＡＤを補酵素とした場合、グルコースを基質としたときには活性が検出されなかった。従って、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓにはＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍのような特異な酵素は存在せず、Ｇ６ＰＤＨがＮＡＤ−ＮＡＤＰ型の活性も示すと考えられる。一方、６ＰＧＡＤＨについては、酢酸菌においてはこれまで全く報告が無く、こちらも新規な酵素である。
【０１２２】
【実施例７】Ｇ６ＰＤＨ遺伝子（ｚｗｆ）のクローニング
Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを定法にしたがって調製し、これを鋳型として表５に示すプライマーを用いて、Ｅ．　ｃｏｌｉのＧ６ＰＤＨ遺伝子（ｚｗｆ）の一部を増幅した。得られた断片をプローブとして使用し、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓの染色体ＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーションを行なったところ、バンドが検出された。このうち、約４ｋｂのＢａｍＨＩ切断断片について、ｐＵＣ１８をベクターとして約５０００クローンよりなるライブラリーを構築した。このライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーションにより目的クローンを選抜した。挿入断片の塩基配列を決定し（配列番号２２）、ｚｗｆ遺伝子と推定される読み取り枠を見出した。この読み取り枠は、４８８アミノ酸残基よりなるタンパク質をコードしており（配列番号２３）、そのタンパク質はＥ．　ｃｏｌｉのＧ６ＰＤＨと４３．６％の相同性を示した。
【０１２３】
【表５】
2004024140.tif 000007
【０１２４】
【実施例８】ｔａｌ−ｐｇｉ、ｒｋ、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型Ｇ６ＰＤＨ（ｚｗｆ）およびＮＡＤ−ＮＡＤＰ型６ＰＧＡＤＨ（ｇｎｄ）のＥ．　ｃｏｌｉでの発現と酵素活性測定
ｎｒｆ１、ｎｒｆ２遺伝子をクローニングした結果、相同性検索からＮＲＦ１はトランスアルドラーゼとグルコースリン酸イソメラーゼの２機能酵素であることが、ＮＲＦ２はリブロキナーゼであることが示唆され、また、ｎｒｆ１の下流にＮＡＤ型６ＰＧＡＤＨの相同遺伝子が存在することが判明した。そこで、これらの遺伝子産物の機能を特定するために、Ｅ．　ｃｏｌｉでの発現と酵素活性の測定を行った。
【０１２５】
まず、ｎｒｆ１（ｔａｌ−ｐｇｉ）、ｎｒｆ２（ｒｋ）をＥ．　ｃｏｌｉで発現させるために、それぞれの遺伝子のＣ末に６×Ｈｉｓ−Ｔａｇを連結したものをｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流に挿入したプラスミドｐＵＣＴＡＬ−Ｈｉｓ、ｐＵＣＳＫ−Ｈｉｓを構築した。プラスミドの構築に先立ち、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＴＣＣ６２１株の染色体ＤＮＡを定法にしたがって調製し、これを鋳型として表６に示すプライマーを用いてそれぞれの遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。
【０１２６】
ｔａｌ−ｐｇｉおよびｒｋ発現プラスミド構築の際に使用したＰＣＲプライマーは、５’側はＳＤ配列の上流に制限酵素部位を導入し、３’側はｔａｌ−ｐｇｉおよびｒｋについては６×Ｈｉｓ−Ｔａｇを連結後に、終止コドンと制限酵素部位を導入するようにそれぞれ設計した。プライマーＴａｌ５’−ＳａｌおよびＴａｌ３’−Ｈｉｓ−Ｓｐｈを用いてＧ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＴＣＣ６２１染色体ＤＮＡより増幅した断片をＳａｌＩ／ＳｐｈＩ消化し、ｐＵＣ１８のＳａｌＩ／ＳｐｈＩサイトに挿入したプラスミドｐＵＣＴＡＬ−Ｈｉｓを構築した。また、プライマーＲＫ５’−ＥｃｏおよびＲＫ３’−Ｈｉｓ−Ｂａｍを用いてＧ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＴＣＣ６２１染色体ＤＮＡより増幅した断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入したプラスミドｐＵＣＳＫ−Ｈｉｓを構築した。
【０１２７】
また、ｎｒｆ１の下流に見出されたｇｎｄ相同遺伝子およびｚｗｆ遺伝子についても表６記載の配列のプライマーを用いて増幅し、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩに連結したプラスミドｐＵＣＧＮＤ、ｐＵＣＺＷＦをそれぞれ作製した。
【０１２８】
【表６】
2004024140.tif 000008
【０１２９】
構築した発現プラスミドをそれぞれＥ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に導入した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で一昼夜３７℃で振盪培養した。前培養液を５０ｍｌのＬＢ培地に１％シードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始約２時間後に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、５ｍｌの５０ｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ６．５）に懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
【０１３０】
トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）、グルコースリン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤＨ）　シュガーキナーゼの酵素活性の測定法は、以下に示す方法で行った。一分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生じる活性を１Ｕとした。なおＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおける分子吸光係数はε＝６．３×１０３として算出した。
【０１３１】
〔ＴＡＬ活性測定〕
５０ｍＭ　　ＫＰＢ　（ｐＨ７．６）
５ｍＭ　　フルクトース−６−リン酸
５ｍＭ　　エリスロース−４−リン酸
０．５ｍＭ　　ＮＡＤＨ
２Ｕ／ｍｌ　　グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ／トリオースリン酸イソメラーゼ
３０℃での３４０ｍＭの吸光度の減少を測定
【０１３２】
〔ＰＧＩ活性測定〕
５０ｍＭ　　ＫＰＢ　（ｐＨ７．０）
５ｍＭ　　フルクトース−６−リン酸
１ｍＭ　　ＮＡＤＰ
５Ｕ／ｍｌ　　グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
３０℃での３４０ｍＭの吸光度の増加を測定
【０１３３】
〔６ＰＧＡＤＨ活性測定〕
５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　　６−ホスホグルコン酸
１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２
１ｍＭ　　ＮＡＤ／ＮＡＤＰ
３０℃での３４０ｍＭの吸光度の増加を測定
【０１３４】
〔Ｇ６ＰＤＨ活性測定法〕
５０ｍＭ　　グリシン−ＮａＯＨ　（ｐＨ９．５）
１０ｍＭ　　グルコース−６−リン酸
１ｍＭ　　ＮＡＤ／ＮＡＤＰ
３０℃での３４０ｍＭの吸光度の増加を測定
【０１３５】
〔シュガーキナーゼ活性測定〕
５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．０）
５ｍＭ　　　　　　ＭｇＣｌ２
１ｍＭ　　ＡＴＰ
８．３Ｕ／ｍｌ　ラクテートデヒドロゲナーゼ
８．３Ｕ／ｍｌ　ピルビン酸キナーゼ
０．３ｍＭ　　　ＮＡＤＨ
１ｍＭ　　ホスホエノールピルビン酸
５ｍＭ　　基質糖
３０℃での３４０ｍＭの吸光度の減少を測定
【０１３６】
前述の方法で、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＵＣＴＡＬ−Ｈｉｓ及びｐＵＣＳＫ−Ｈｉｓを１Ｌづつ培養した。集菌、洗浄して得られた湿菌体３ｇから組換え酵素を精製した。精製はＨｉＴｒａｐキレートカラム（アマシャムファルマシア製）を用いて、プロトコル通りに行った。５００ｍＭのイミダゾールを含む溶出画分を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．６）に透析して酵素溶液とした。その結果、それぞれ、１００ｋＤａ、６０ｋＤａに相当するバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認された。さらに可溶性画分よりＮｉカラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｅ　カラム、アマシャムファルマシア製）で精製することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でほぼ単一のバンドとしてそれぞれのタンパク質が精製された。
【０１３７】
調製した組換え酵素を用いて遺伝子の相同性が認められたＴＡＬ、ＰＧＩおよびシュガーキナーゼの活性を測定した。その結果（表７）、ＮＲＦ１についてはＴＡＬ活性およびＰＧＩ活性の両方が検出され、本酵素がＴＡＬ−ＰＧＩの２機能酵素であることが明らかとなった。
【０１３８】
【表７】
2004024140.tif 000009
【０１３９】
また、ＮＲＦ２（シュガーキナーゼ）については基質特異性の特定のために、以下の基質について反応性を検討した。Ｄ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビトール、キシリトール、リビトール、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−グリセロール、Ｄ−ソルビトール。その結果（表８）、ＮＲＦ２はＤ−リブロースにのみ作用したことから、リブロキナーゼであることが明らかとなった。
【０１４０】
【表８】
2004024140.tif 000010
【０１４１】
また、ｎｒｆ１の下流に見出したｇｎｄ相同遺伝子についてもＥ．　ｃｏｌｉで発現させて酵素活性を測定し、補酵素特異性について検討した。その結果（表９）、対照株ではＮＡＤＰ依存的６ＰＧＡＤＨ活性のみ検出されたが、ｐＵＣＧＮＤ導入株においてはＮＡＤ依存的６ＰＧＡＤＨ活性も検出された。また、ＮＡＤ依存的活性（１．３Ｕ／ｍｇ）をＮＡＤＰ依存的活性の増加分（０．４９Ｕ／ｍｇ）と比較することにより、本遺伝子はＮＡＤＰとＮＡＤの双方を補酵素とする６ＰＧＡＤＨであること、およびＮＡＤＰよりＮＡＤに対してより高活性（約２．５倍）なＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ＧＮＤであることが明らかとなった。
【０１４２】
【表９】
2004024140.tif 000011
【０１４３】
また、ｚｗｆ遺伝子についてもＥ．　ｃｏｌｉで発現させたところ、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型のＧ６ＰＤＨ活性が検出され、クローニングした遺伝子が、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ｚｗｆであることが示された（表１０）。
【０１４４】
【表１０】
2004024140.tif 000012
【０１４５】
ＴＡＬ−ＰＧＩ、ＲＫが目的とする還元力供給因子であることを確認するために、調製した組換え酵素をインビトロ再構成系に添加してキシリトール生成量の増加効果について検討した。
【０１４６】
調製したＴＡＬ−ＰＧＩを０．１ｍｇ／ｍｌ、又はＲＫを０．０５ｍｇ／ｍｌ添加した区をそれぞれ設定し、３０℃で４０時間下記の反応液で反応を行って、生成キシリトール量を定量した。
【０１４７】
〔反応溶液〕
１００ｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ６．０）
１０ｍＭ　ＮＡＤ
１ｇ／ｄｌ　アラビトール
１ｍｇタンパク質／ｍｌ膜画分
０．５ｍｇタンパク質／ｍｌ可溶性画分
１ｍＭ　ＣｏＣｌ２
【０１４８】
その結果（図３）、アラビトールからの生成キシリトール量が、ＴＡＬ−ＰＧＩ添加区（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ＲＫ添加区（０．０５ｍｇ／ｍｌ）ともにコントロール区と比較して増加しており、これらの酵素がインビトロ再構成系における還元力供給因子であることが確認された。尚、図３中、「ｓｏｌ　Ｘ３」は、反応系の可溶性画分量を１．５ｍｇタンパク／ｍｌ可溶性画分に増加した区を示す。
【０１４９】
【実施例９】ｔａｌ−ｐｇｉ、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ｚｗｆ、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ｇｎｄおよびｒｋのＧ．　ｏｘｙｄａｎｓでの増幅効果検討
ｔａｌ−ｐｇｉ、ｚｗｆ、ｇｎｄ、ｒｋの各遺伝子とｘｄｈ（米国特許第６，２４２，２２８号に記載のｘｄｈ２）との共発現株を作製するために、それぞれの遺伝子をＥ．　ｃｏｌｉとＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒのシャトルベクターであるｐＳＡ１９に連結した発現プラスミドを構築した。ｐＳＡ１９は外内らによってＢｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５８（１０），　１８９９−１９０１，　１９９４にその構築方法が記載されている。具体的には、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ）ＢＰＲ２００１株の内在性プラスミドであるｐＡＨ４を定法（アルカリ−ＳＤＳ法）に従って単離し、ｐＡＨ４においてユニークな制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩサイトに連結してシャトルベクターｐＳＡ１９を得た。尚、ＢＰＲ２００１株は、現在はグルコノバクター・キシリナス　サブスピーシーズ　スクロファーメンタンス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｓｕｃｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＡＴＣＣ７００１７８と命名されている。
【０１５０】
発現プラスミド構築のために作製したプライマーの配列を表１１に、構築方法の模式図を図４〜６に示す。
【０１５１】
【表１１】
2004024140.tif 000013
【０１５２】
ｐＳＡ１９にそれぞれの遺伝子を連結したプラスミドｐＳＡＴＡＬ、ｐＳＡＺＷＦ、ｐＳＡＧＮＤと、共発現プラスミドｐＳＡＧＮＤ−ＸＤＨをそれぞれ構築し、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＪ２８４７株に導入した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＹＰＧ（ＹＰＧ−Ａｍｐ）プレートでリフレッシュ後、５０ｍｌのＳＲ培地に接種して、３０℃で２４時間培養した。集菌・洗浄後、前述の方法にしたがって菌体を破砕し、酵素活性を測定した。
【０１５３】
その結果、ｚｗｆ発現プラスミド導入株では、ＮＡＤ型Ｇ６ＰＧＨ活性が親株の４．３倍に増加しており、発現量の増加が認められた（表１２）。
ｇｎｄ発現プラスミド導入株では、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型６ＰＧＡＤＨ活性が親株の約３倍に増加しており、発現量の増加が認められた（表１３）。さらに、ｇｎｄの下流にｘｄｈ遺伝子を連結した共発現プラスミド（ｐＳＡＧＮＤ−ＸＤＨ）の導入株においては６ＰＧＡＤＨ活性、ＸＤＨ活性ともに増加しており、共発現株が作製できた。
【０１５４】
また、ＴＡＬ−ＰＧＩ発現プラスミド導入株では、ＰＧＩ活性で親株の約１．３倍発現していた（表１４）。
【０１５５】
【表１２】
2004024140.tif 000014
【０１５６】
【表１３】
2004024140.tif 000015
【０１５７】
【表１４】
2004024140.tif 000016
【０１５８】
【実施例１０】ペントース系遺伝子発現プラスミド導入株でのアラビトール→キシリトール変換反応の検討
ＹＰＧ−Ａｍｐプレート上で３０℃、２４時間リフレッシュ培養した菌体を３ｍｌのＹＰＧ−Ａｍｐに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液を５０ｍｌのシード培地を含む坂口フラスコに５％シードし、３０℃で２４時間振盪培養した。遠心分離で集菌後、５０ｍｌの変換培地に懸濁し、３０℃で振盪させてアラビトール→キシルロース変換反応を開始した。変換開始１６時間後に２５ｍｌずつ坂口フラスコに分注し、キシルロース→キシリトール変換反応を行った。後段の反応は２ｇ／ｄｌグルコース添加区及び無添加区を設定し、振とう反応にて実施した。
【０１５９】
〔シード培地〕
５ｇ／ｄｌ　グリセロール、０．３ｇ／ｄｌ　ＫＨ２ＰＯ４、０．１ｇ／ｄｌ　Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５ｇ／ｄｌ　ＭｇＳＯ４、０．５ｇ／ｄｌ　ＹＥ、０．５ｇ／ｄｌカザミノ酸、１ｇ／ｄｌ　Ｌ−グルタミン酸酸ナトリウム、金属混合物、ビタミン混合物。
【０１６０】
〔変換培地〕
１０ｇ／ｄｌアラビトール、０．３ｇ／ｄｌ　ＫＨ２ＰＯ４、０．１ｇ／ｄｌ　Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５ｇ／ｄｌ　ＭｇＳＯ４、０．５ｇ／ｄｌ　ＹＥ、０．５ｇ／ｄｌペプトン、金属混合物、ビタミン混合物、２ｇ／ｄｌ　炭酸カルシウム。
【０１６１】
１０ｇ／ｄｌのアラビトールを含む変換培地にシード培養で得た菌体全量を接種し、３０℃で１６時間振盪反応によってキシルロースへと変換し、さらに２ｇ／ｄｌのグルコースを添加して反応を行った。その結果（表１５）、還元力供給遺伝子導入株においては、グルコース添加区・無添加区ともにキシリトール生成量の増加が認められた。グルコース添加区においては、１０ｇ／ｄｌのアラビトールからのキシリトール収率がコントロール株で１２％であるのに対して、ｔａｌ−ｐｇｉ、ｚｗｆ、ｇｎｄおよびｇｎｄ−ｘｄｈ導入株ではそれぞれ１８％、１７％、１５％、２４％とキシリトール蓄積の増加が認められた。
【０１６２】
【表１５】
2004024140.tif 000017
【０１６３】
【発明の効果】
本発明により、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成に関与する新規酵素及びそれらをコードする遺伝子が提供される。
本発明のグルコノバクター属細菌は、同細菌を用いた目的物質の製造に好適に用いることができる。特に、本発明の方法は、キシリトールの製造に好適である。
【０１６４】
【配列表】
2004024140.tif 000018
【０１６５】
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【０１６６】
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【０１６７】
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【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
2004024140.tif 000024
【０１７１】
2004024140.tif 000025
【０１７２】
2004024140.tif 000026
【０１７３】
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【０１７４】
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【０１７５】
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【０１７６】
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【０１７７】
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【０１７８】
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【０１７９】
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【０１８０】
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【０１８１】
2004024140.tif 000049
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2004024140.tif 000051
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【０１８２】
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【０１８３】
2004024140.tif 000058
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【０１８４】
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【０１８５】
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【０１８６】
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【０１８７】
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2004024140.tif 000074
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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【０１９１】
2004024140.tif 000079
【０１９２】
2004024140.tif 000080
【０１９３】
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【０１９４】
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【０１９５】
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【０１９６】
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【０１９７】
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【０１９８】
2004024140.tif 000086
【０１９９】
2004024140.tif 000087
【０２００】
2004024140.tif 000088
【０２０１】
2004024140.tif 000089
【０２０２】
2004024140.tif 000090
【０２０３】
2004024140.tif 000091
【０２０４】
2004024140.tif 000092
【０２０５】
2004024140.tif 000093
【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＡＤＰ（●）又はＮＡＤ（黒三角）を補酵素としたときのＧ６ＰＤＨ活性（相対活性）を示す図。
【図２】ＮＡＤＰ（●）又はＮＡＤ（黒三角）を補酵素としたときの６ＰＧＤＨ活性（Ｕ／ｍｇ）を示す図。
【図３】インビトロ再構築系によるアラビトール→キシリトール変換反応におけるＴＡＬ−ＰＧＩ及びＲＫの効果を示す図。
【図４】ｔａｌ−ｐｇｉを含むプラスミドｐＳＡＴＡＬの構築を示す図。
【図５】ｇｎｄ、又はｇｎｄ及びｘｄｈを含むプラスミドｐＳＡＧＮＤ及びｐＳＡＧＮＤ−ＸＤＨの構築を示す図。
【図６】ｚｗｆを含むプラスミドｐＳＡＺＷＦの構築を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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