(57)【要約】【課題】本発明は、有用化学物質を散布等によって施用する場合の添加剤の選抜方法及び該方法を用いた有用化学物質の効力増強方法を提供することを課題とする。【解決手段】単離された植物クチクラ膜上に、有用化学物質及び添加剤を水に溶解または乳化、懸濁した溶液を添付処理し、クチクラ膜を透過した有用化学物質を定量分析することを特徴とする、有用化学物質の透過性を制御する添加剤の選抜方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された植物クチクラ膜上に、有用化学物質及び添加剤を水に溶解または乳化、懸濁した溶液を添付処理し、クチクラ膜を透過した有用化学物質を定量分析することを特徴とする、有用化学物質の透過性を制御する添加剤の選抜方法。
【請求項２】
単離した植物クチクラ膜を水に浮かべた状態で処理することを特徴とする請求項１記載の添加剤の選抜方法。
【請求項３】
有用化学物質が農薬活性成分である請求項１及び２記載の添加剤の選抜方法。
【請求項４】
農薬活性成分が茎葉処理除草剤である請求項３記載の添加剤の選抜方法。
【請求項５】
農薬活性成分が浸透性殺虫剤である請求項３記載の添加剤の選抜方法。
【請求項６】
農薬活性成分が浸透性殺菌剤である請求項３記載の添加剤の選抜方法。
【請求項７】
単離された植物クチクラ膜上に、有用化学物質及び添加剤を水に溶解または乳化、懸濁した溶液を添付処理し、クチクラ膜を透過した有用化学物質を定量分析することによって選抜された添加剤を混合処理することを特徴とする有用化学物質の効力増強方法。
【請求項８】
単離した植物クチクラ膜を水に浮かべた状態でクチクラ膜透過性を評価する請求項７記載の有用化学物質の効力増強方法。
【請求項９】
有用化学物質が農薬活性成分である請求項７及び８記載の効力増強方法。
【請求項１０】
農薬活性成分が茎葉処理除草剤である請求項９記載の効力増強方法。
【請求項１１】
農薬活性成分が浸透性殺虫剤である請求項９記載の効力増強方法。
【請求項１２】
農薬活性成分が浸透性殺菌剤である請求項９記載の効力増強方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、単離された植物クチクラ膜上に、有用化学物質及び添加剤を水に溶解または乳化、懸濁した溶液を添付処理し、クチクラ膜を透過した有用化学物質を定量分析することを特徴とする、有用化学物質の透過性を制御する添加剤の選抜方法、及び該方法を用いた有用化学物質の効力増強方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
農業において、農薬（殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、除草剤、植物成長調節剤等）や葉面散布肥料等の有用化学物質を含む製剤品（乳剤、水和剤、顆粒水和剤、フロアブル剤、水溶液剤、水溶剤等）を水に溶解、または乳化、懸濁させた溶液を、噴霧散布機を使用して霧状としたものを植物に吹きかける（以下散布という）ことによって、該有用化学物質を植物の葉や茎に付着せしめ、該植物を駆逐あるいは有害生物から保護する手法については、周知の事実である。有用化学物質の中には、該植物に付着した後、葉や茎の表面から植物内部へと浸透することによって効力を発揮するものや、植物内部へは浸透せずに葉や茎の表面に止まることによって効力を発揮するものがある。散布されたこれらの有用化学物質を効率的に利用されるようにするためには、効力発現における動態的な特徴を最適化する添加剤を選抜することが必要である。即ち、植物内部へと浸透することによって効力を発揮するものに対しては、浸透性を向上する添加剤を、表面に止まることによって効力を発揮するものに対しては、浸透性を抑制する添加剤を選抜することが、散布された有用化学物質を効率的に利用するために必要である。この添加剤の選抜に関しては、従来より、生物試験による選抜方法が最も一般的に行われている。即ち、ランダムに選択した添加剤を製剤中、あるいは散布液中に添加、混合し、目的とする生物効果が向上した添加剤を選抜する方法である。しかし、この方法は、多くの手間と時間を要ししかも明確な結果が得られ難いだけでなく、選抜された添加剤がどのような理由によって生物効果を向上させたのかが不明であるため、目的とする添加剤を効率的に選抜することは困難であり、技術の蓄積や向上が期待できない。
先に本発明者らは、特開２００２−８２０３９において、単離した植物クチクラ膜を媒質入りの容器に浮かべ、ここに化合物の溶液を添付し、媒質中に透過した化合物を定量分析することを特徴とする化合物の植物クチクラ膜透過量及び／または透過速度測定方法を提示したが、添加剤の選抜や生物活性の向上への応用に関しては不明であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、有用化学物質を散布等によって施用する場合の添加剤の選抜方法及び該方法を用いた有用化学物質の効力増強方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、農薬有効成分化合物の単離された植物クチクラ膜透過量と農薬活性とが相関することを見出し、単離された植物クチクラ膜上に、有用化学物び添加剤を水に溶解または乳化、懸濁した溶液を添付処理し、クチクラ膜を透過した有用化学物質を定量分析する方法により、有用化学物質の透過性を制御する添加剤を効率的に選抜でき、選抜された添加剤によって有用化学物質の効力が増強できることを見出した。
【０００５】
即ち本発明は、
１．単離された植物クチクラ膜上に、有用化学物質及び添加剤を水に溶解または乳化、懸濁した溶液を添付処理し、クチクラ膜を透過した有用化学物質を定量分析することを特徴とする、有用化学物質の透過性を制御する添加剤の選抜方法であり、
２．単離した植物クチクラ膜を水に浮かべた状態で処理することを特徴とする１に記載の添加剤の選抜方法であり、
３．有用化学物質が農薬活性成分である１及び２に記載の添加剤の選抜方法であり、
４．　農薬活性成分が茎葉処理除草剤である３に記載の添加剤の選抜方法であり、
５．農薬活性成分が浸透性殺虫剤である３に記載の添加剤の選抜方法であり、
６．農薬活性成分が浸透性殺菌剤である３に記載の添加剤の選抜方法であり、
７．単離された植物クチクラ膜上に、有用化学物質及び添加剤を水に溶解または乳化、懸濁した溶液を添付処理し、クチクラ膜を透過した有用化学物質を定量分析することによって選抜された添加剤を混合処理することを特徴とする有用化学物質の効力増強方法であり、
８．単離した植物クチクラ膜を水に浮かべた状態でクチクラ膜透過性を評価する７に記載の有用化学物質の効力増強方法であり、
９．有用化学物質が農薬活性成分である７及び８に記載の効力増強方法であり、
１０．農薬活性成分が茎葉処理除草剤である９に記載の効力増強方法であり、
１１．農薬活性成分が浸透性殺虫剤である９に記載の効力増強方法であり、
１２．農薬活性成分が浸透性殺菌剤である９に記載の効力増強方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
有用化学物質のクチクラ膜透過性の測定方法は、特に限定されることはないが、特開２００２−８２０３９に記載の方法が簡便であり、望ましい。即ち、酵素溶液に植物から切り取った切片を浮かべて処理することにより単離した植物クチクラ膜を媒質入りの容器に浮かべ、ここに化合物の溶液を添付し、媒質中に透過した化合物を経時的に定量分析する方法である。
【０００７】
本発明に使用できる植物は作物、雑草、イネ科植物、広葉植物等の植物の種類または、生育ステージに限定されるものではなく、いかなる種類の植物でも使用できる。例えば、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネ、ダイズ、インゲン、ピーマン、ナス、トマト、ジャガイモ、サツマイモ等の野菜類、ミカン、リンゴ、ナシ、モモ等の果樹類、エノコログサ、メヒシバ、イチビ、イヌビユ、アカザ、オナモミ、アサガオ等の雑草類が挙げられる。また、植物の部位は特に葉に限定されることはなく、どの部位でも利用することができる。例えば、花弁、がく、茎等である。
【０００８】
本発明で植物クチクラ膜を単離するために使用される酵素の種類と濃度は、特に限定はないが、市販の粉末状のセルラーゼとペクチナーゼを任意の割合で混合し、これらを適正なｐＨに調整した緩衝液に溶解して溶液状態で使用するのが好ましい。任意の割合とは酵素の反応速度、温度とコストの関係で選択される割合であり、高濃度にすれば反応時間は短くて済むが、コストがかかる。好ましくは０．５〜１０％（Ｗ／Ｗ）の濃度であり、さらに好ましくは１〜５％（Ｗ／Ｗ）の濃度である。また、セルラーゼとペクチナーゼの混合割合はペクチナーゼの割合が多い方が好ましく、セルラーゼ：ペクチナーゼ＝１：２〜１：４が好ましい。適正なｐＨとは酵素が反応して植物組織を分解するための最適ｐＨのことであり、ｐＨ４〜８の範囲が好ましく、さらに好ましくはｐＨ５〜７の範囲である。
【０００９】
クチクラ膜単離作業の効率化のため、あるいは上述の酵素処理だけではクチクラ膜がきれいに単離できない場合、上述の酵素処理に酸処理を併用することができる。酸処理とは、酵素処理した植物の切片を塩化亜鉛を高濃度に溶解した濃厚な無機酸溶液に浮かべることにより、植物組織を完全に分解してクチクラ膜だけを単離する処理方法である。ここで使用する無機酸は植物組織を分解するものであれば特に限定されない。例えば、塩酸、硫酸、硝酸等であるが、作業性、後処理の点から塩酸を使用するのが好ましい。また、これら無機酸に溶解する塩化亜鉛の量はできる限り高濃度であることが好ましく、３０〜７０％（Ｗ／Ｗ）さらに好ましくは５０〜６０％である。
【００１０】
有用化学物質としては、液体か、固体か、あるいは有機化合物か、無機化合物か、また単一化合物か、混合物か等によって限定されるものではなく、透過した化合物を何らかの分析手段で定量することが可能であれば何でも用いることができる。例えば、農薬、肥料、界面活性剤、鉱物油、植物油等である。農薬の種類についても特に限定はなく、殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、除草剤、植物成長調節剤等なんら制限はない。
【００１１】
有用化学物質を処理する際、実際の農薬散布において使用される水和剤、乳剤、フロアブル剤、顆粒水和剤、ＥＷ剤等の散布用の農薬製剤品を使用濃度に合わせて水で希釈した溶液が使用できる。また、開発中の化合物で製剤化されていない化合物の場合、化合物をアセトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ等の水溶性の溶剤に溶解し、ツイーン、トリトン等の界面活性剤と水を加えて混合することによる簡易乳剤や、乳鉢中で細かくすりつぶした化合物にリグニンスルホン酸ソーダ、アルキルベンゼンスルホン酸ソーダ等の粉末状の界面活性剤と微紛化した鉱物質担体等を混合することによる簡易水和剤等の使用も可能である。
【００１２】
添加剤は、予め有用化学物質と共に製剤中に添加しておき、有用化学物質を水に希釈する際に同時に水に希釈しても、単独で使用して有用化学物質とは別々水に希釈しても良い。また、添加剤自身が水に難溶解性のものであっても、前述の簡易乳剤や簡易水和剤として添加することも可能である。
【００１３】
媒質は特に限定されることはないが、クチクラ膜を透過した化合物が媒質中に溶解した場合の安定性等を考慮するとｐＨが７．０付近で不純物が少ない蒸留水や脱イオン水が好ましい。しかしながら、化合物によって酸やアルカリ水溶液中でイオン化したり、不安定となるものがある。また、植物の種類によっては細胞内が酸性やアルカリ性を示すものがあり、実際の透過を再現するためには媒質のｐＨを調整した方がよい場合がある。このような場合は適正なｐＨに調整した緩衝液を媒質としても何ら問題はない。さらに、水溶解度が低いためにクチクラ膜を透過した化合物が溶解し難い場合には、メタノール，エタノール等のアルコール，ジメチルスルホキシド，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ−メチル−２−ピロリドン等の水溶性の有機溶剤を蒸留水や脱イオン水に混合した媒質を使用することも可能である。
【００１４】
有用化学物質に種々の添加剤を混合した際のクチクラ膜透過性を測定、比較することによって、最適な添加剤の種類や添加量を選抜することができる。ここで言う最適とは、要求される目的によって異なるが、一般的には有用化学物質の透過性が最も促進または抑制される水準のことである。例えば、有用化学物質が茎葉処理除草剤や浸透性殺菌剤、殺虫剤のように葉内に浸透することによって効力を発揮する場合は、クチクラ膜透過性を促進することが要求される。また、予防効果や残効性を目的とする殺菌剤や殺虫剤の場合には、クチクラ膜透過性を抑制することが要求される。何れの場合も該方法を利用することによって、有用化学物質のクチクラ膜透過性に対する添加剤の効果を簡便に評価でき、それによって最適な添加剤を選抜することが可能となる。また、選抜された添加剤を添加することによって、有用化学物質の効力を増強することが可能となる。
【００１５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は特にこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
［植物葉クチクラ膜の単離］
温室内で草丈１０ｃｍ前後まで栽培したアカザ（ｃｏｍｍｏｎ　ｌａｍｂｓｑｕａｒｔｅｒｓ）の葉の太い葉脈がない部分を、直径１ｃｍのコルクボーラーを使用してリーフディスクを切り取り、これらをＭＡＳＥＲＯＺＩＭＥ　Ｒ−１０（ヤクルト薬品製）２％とＣＥＬＬＵＬＡＺＥ　”ＯＮＯＺＵＫＡ”　Ｒ−１０（ヤクルト薬品製）１％を溶解したｐＨ５．６の酢酸―酢酸Ｎａ緩衝液（５０ｍＭ）に浮かべ、室温（２０〜２５℃）で５日間静置した。次に分離したクチクラ膜を下部組織と別け、蒸留水で洗浄後に試験に使用した。
【００１６】
［簡易水和剤の調製］
３−（４−クロロフェニル）−１，１−ジメチルウレア２５部をメノウ製の乳鉢で良くすりつぶし、ここに予めリク゛ニンスルホン酸Ｎａ８部、アルキルナフタレンスルホン酸Ｎａのホルマリン縮合物４部、アルキルヘ゛ンセ゛ンスルホン酸Ｎａ２部、アルキルナフタレンスルホン酸Ｎａ２部、鉱物質担体５９部を良く混合した後、ウルマックスＴＭ［ジェット粉砕機（日曹エンジニアリング（株）製］で粉砕した水和剤ベース７５部を加えて良く混合し、含量２５％の簡易水和剤を調製した。
【００１７】
［薬液調製］
先に調製した簡易水和剤を、３−（４−クロロフェニル）−１，１−ジメチルウレアの濃度が１，０００ｐｐｍとなるように、蒸留水またはＳｃｏｉｌＴＭ［メチレイテッドシードオイル／界面活性剤］，ニューコール２５［ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート；日本乳化剤（株）製］，ニューコール１１０３［ポリオキシエチレンラウリル；日本乳化剤（株）製］，ニューコール１１２０［ポリオキシエチレンラウリルエーテル；日本乳化剤（株）製］の各１％水溶液で希釈して薬液調製を行った。
【００１８】
［クチクラ膜透過性測定］
蒸留水５ｍｌを入れた直径５ｃｍのシャーレに、先に単離したアカザ葉クチクラ膜を２枚浮かべ、ここに調製した薬液をマイクロシリンジで５μＬずつ添付し、温度２５℃、相対湿度５０％に調整された室内に静置した。薬液添付２時間、８時間、２４時間、７２時間、１２０時間後にシャーレ内の蒸留水をすべてサンプリングし、新たに５〜１０ｍｌの蒸留水を添加した。サンプリング液は冷蔵庫に保存し、１２０時間後のサンプリング終了後にまとめてＨＰＬＣで定量分析した。また１２０時間後のサンプリング終了後、クチクラ膜上に残った薬剤も同時にＨＰＬＣでの定量分析を行った。結果を図表−１に示す。本発明により、各添加剤のクチクラ膜透過性向上効果は、ニューコール１１０３＞ＳｃｏｉｌＴＭ＞ニューコール１１２０≧ニューコール２５＞＞無添加のように序列化できることが判った。
【００１９】
［生物試験］
３−（４−クロロフェニル）−１，１−ジメチルウレアの２５％簡易水和剤と添加剤を所定の濃度になるように調製したサンプルを、温室内で草丈５〜７ｃｍまで栽培したアカザに、マイクロシリンジを使って１植物当たり１０μｌをドッティング処理した。風乾後、温室内で栽培し、処理１０日後に地上部を切り取って重量を測定し、下記の式より殺草率を求め、添加剤の違いによる効力を比較した。
殺草率＝（１−処理区の生重量／無処理区の生重量）×１００
結果を図表−２に示す。殺草率の比較から、各添加剤の生物効果に対する添加効果は、ニューコール１１０３＞ＳｃｏｉｌＴＭ＞ニューコール１１２０＞ニューコール２５＞無添加のように序列化できた。
【００２０】
［クチクラ膜透過性と生物試験結果の比較］
クチクラ膜透過性試験と生物試験結果の比較から、クチクラ膜透過性を向上させる添加剤ほど生物効果に対する添加効果が高いことが確認された。
【００２１】
実施例２
［水和剤の調製］
１−エチル−５−ヒドロキシ−４−［４−メタンスルホニル−２−メチル−３−（３−メチル−イソオキサゾール−５−イル）ベンゾイルピラゾール（ＷＯ９７／４１１１８記載の除草剤有効成分：以下化合物Ａ）２５部、リグニンスルホン酸Ｎａ６部、アルキルナフタレンスルホン酸Ｎａ６部、鉱物質担体及び有機質担体４３部を良く混合した後、ウルマックスＴＭ［ジェット粉砕機（日曹エンジニアリング（株）製］で粉砕して含量２５％の水和剤を調製した。
【００２２】
［薬液調整］
先に調製した水和剤を、化合物Ａの濃度が２５０ｐｐｍとなるように、蒸留水またはＳｃｏｉｌＴＭ［メチレイテッドシードオイル／界面活性剤］，　Ａｔｐｌｕｓ４１１Ｆ［ミネラルオイル／界面活性剤；ユニケマ製］の各１％水溶液，ニューコール２５［ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート；日本乳化剤（株）製］，　ＧｅｎａｍｉｎＴ１００［ポリオキシエチレンタロウアミノエーテル；クラリアント（株）製］の各０．２５％水溶液で希釈して薬液調製を行った。
【００２３】
［クチクラ膜透過性測定］
蒸留水５ｍｌを入れた直径５ｃｍのシャーレに、実施例１と同様のアカザ葉クチクラ膜を２枚浮かべ、ここに調製した薬液をマイクロシリンジで５μＬずつ添付し、温度２５℃、相対湿度５０％に調整された室内に静置した。薬液添付２時間、８時間、２４時間、７２時間、１２０時間後にシャーレ内の蒸留水をすべてサンプリングし、新たに５〜１０ｍｌの蒸留水を添加した。サンプリング液は冷蔵庫に保存し、１２０時間後のサンプリング終了後にまとめてＨＰＬＣで定量分析した。また１２０時間後のサンプリング終了後、クチクラ膜上に残った薬剤も同時にＨＰＬＣでの定量分析を行った。結果を図表−３に示す。本発明により、各添加剤のクチクラ膜透過性向上効果は、ＳｃｏｉｌＴＭ　１％＞ＧｅｎａｍｉｎＴ１００　０．２５％＞ニューコール２５　０．２５％≧Ａｔｐｌｕｓ４１１Ｆ　１％＞無添加のように序列化できることが判った。
【００２４】
［生物試験］
化合物Ａの２５％水和剤と添加剤を所定の濃度、容量になるように調製したサンプルを、温室内で草丈３〜５ｃｍまで栽培したアカザに、２５０Ｌ／ｈａの散布水量となるように散布処理した。風乾後、温室内で栽培し、処理６日、１３日、２１日後に無処理区と比較して、０（無作用）〜１０（完全枯死）の１１段階の指数評価を行い、添加剤の違いによる効力を比較した。
結果を図表−４に示す。指数の比較から、各添加剤の生物効果に対する添加効果は、ＳｃｏｉｌＴＭ１％＞ＧｅｎａｍｉｎＴ１００　０．２５％＞Ａｔｐｌｕｓ４１１Ｆ　１％＞ニューコール２５　０．２５％＞＞無添加のように序列化できた。
【表１】
2004099498.tif 000002
【００２５】
［クチクラ膜透過性と生物試験結果の比較］
クチクラ膜透過性試験と生物試験結果の比較から、クチクラ膜透過性を向上させる添加剤ほど生物効果に対する添加効果が高いことが確認された。
【００２６】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によって有用化学物質のクチクラ膜透過性を制御する添加剤を効率的に選抜することができ、選抜された添加剤を添加することによって有用化学物質の生物効果を増強することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】３−（４−クロロフェニル）−１，１−ジメチルウレアのアカザ葉クチクラ膜透過試験結果
【図２】３−（４−クロロフェニル）−１，１−ジメチルウレアの生物試験結果
【図３】化合物Ａのアカザ葉クチクラ膜透過試験結果
【図１】
2004099498.tif 000003
【図２】
2004099498.tif 000004
【図３】
2004099498.tif 000005