(57)【要約】【課題】生物工学的手法を用いた高機能な高分子化合物構造体およびその製造方法を提供することにある。【解決手段】基材表面の少なくとも一部にポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成用の酵素を利用してＰＨＡを被覆してＰＨＡ被覆部を有する構造体を得る際に、ＰＨＡ合成酵素として、基材との結合能を有するアミノ酸配列を有する酵素を用いる。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートによって被覆したポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の製造方法であって、
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成用の酵素を該基材表面に固定する工程と、
該酵素の基質となる３−ヒドロキシアシル補酵素Ａの存在下に該基材表面でポリヒドロキシアルカノエートを合成し、該基材表面の少なくとも一部を合成されたポリヒドロキシアルカノエートで被覆して該構造体を得る工程と、
を有し、
前記酵素が、前記基材への結合能を有するアミノ酸配列を含む
ことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の製造方法。
【請求項２】
ポリヒドロキシアルカノエートが、式［１］から式［１０］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートであり、それぞれ対応する３−ヒドロキシアシル補酵素Ａが式化学式［１２］から化学式［２１］に示す３−ヒドロキシアシル補酵素Ａのいずれかである、請求項１に記載の製造方法。
【化１】
2004065001.tif 000126
（ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
Ｒ１が水素原子（Ｈ）であり、ａが０から　１０　の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がハロゲン原子であり、ａが１から　１０　の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が発色団であり、ａが１から　１０　の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から１０の整数であるモノマーユニット、
Ｒ１が、
【化２】
2004065001.tif 000127
であり、ａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【化３】
2004065001.tif 000128
（ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化４】
2004065001.tif 000129
（ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化５】
2004065001.tif 000130
（ただし、式中ｄは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化６】
2004065001.tif 000131
（ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５及び−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化７】
2004065001.tif 000132
（ただし、式中ｆは０から７の整数のいずれかを表す。）
【化８】
2004065001.tif 000133
（ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表す。）
【化９】
2004065001.tif 000134
（ただし、式中ｈは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、　−ＣＯＯＲ’、−ＳＯ２Ｒ’’、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【化１０】
2004065001.tif 000135
（ただし、式中ｉは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’及び−ＳＯ２Ｒ’’からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【化１１】
2004065001.tif 000136
（ただし、式中ｊは１から９の整数のいずれかを表す。）
【化１２】
2004065001.tif 000137
（ただし、前記化学式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、式中Ｒ１およびａは、前記化学式［１］と同様に定義される。）
【化１３】
2004065001.tif 000138
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｂ及びＲ２は前記化学式［２］と同様に定義される。）
【化１４】
2004065001.tif 000139
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｃ及びＲ３は前記化学式［３］と同様に定義される。）
【化１５】
2004065001.tif 000140
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｄ及びＲ４は前記化学式［４］と同様に定義される。）
【化１６】
2004065001.tif 000141
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｅ及びＲ５は前記化学式［５］と同様に定義される。）
【化１７】
2004065001.tif 000142
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｆは前記化学式［６］と同様に定義される。）
【化１８】
2004065001.tif 000143
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｇは前記化学式［７］と同様に定義される。）
【化１９】
2004065001.tif 000144
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｈ及びＲ６は前記化学式［８］と同様に定義される。）
【化２０】
2004065001.tif 000145
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｉ及びＲ７は前記化学式［９］と同様に定義される。）
【化２１】
2004065001.tif 000146
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｊは前記化学式［１０］と同様に定義される。）
【請求項３】
該ポリヒドロキシアルカノエートが親水性官能基を有する請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
該ポリヒドロキシアルカノエートがアニオン性官能基を有する請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
該ポリヒドロキシアルカノエートがカルボキシル基を有する請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記カルボキシル基を有するポリヒドロキシアルカノエートが、式［１１］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートであり、それぞれ対応する３−ヒドロキシアシル補酵素Ａが式［２２］に示す３−ヒドロキシアシル補酵素Ａのいずれかである、請求項５に記載の製造方法。
【化２２】
2004065001.tif 000147
（ただし、ｋは１から１０の整数のいずれかである。）
【化２３】
2004065001.tif 000148
（ただし、前記式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、式中ｋは前記式［１１］と同様に定義される。）
【請求項７】
前記３−ヒドロキシアシル補酵素Ａの組成を経時的に変化させることにより、前記ポリヒドロキシアルカノエートの３−ヒドロキシアルカン酸ユニット組成を前記ポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の積層方向において変化させる請求項１から６の何れかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記基材を被覆するポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部に化学修飾を施す工程をさらに有する請求項１から７の何れかに記載の製造方法。
【請求項９】
前記の化学修飾を施す工程が、ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部にグラフト鎖を付加せしむ工程である請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記グラフト鎖を付加せしむ工程が、ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部と、末端に反応性官能基を有する化合物とを反応させる工程である請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートである請求項９または１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記の末端に反応性官能基を有する化合物が、アミノ基を有する化合物である請求項１０または１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記アミノ基を有する化合物が、末端アミノ変性化合物である請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記末端アミノ変性化合物が、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン及び末端アミノ変性ポリシロキサンからなる群より選択される少なくとも一つである請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記の化学修飾を施す工程が、ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部を架橋化せしむ工程である請求項８に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記架橋化工程が、ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部と架橋剤とを反応させる工程である請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートである請求項１５または１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記架橋剤が、ジアミン化合物、無水コハク酸及び２−メチル−４−メチルイミダゾールからなる群より選択される少なくとも一つである請求項１６または１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記ジアミン化合物がヘキサメチレンジアミンである請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記架橋化工程が、ポリヒドロキシアルカノエートに電子線を照射する工程である請求項１５に記載の製造方法。
【請求項２１】
基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が、ランダムペプチドライブラリのスクリーニングによって決定されたアミノ酸配列である請求項１に記載の製造方法。
【請求項２２】
基材表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートによって被覆したポリヒドロキシアルカノエート含有構造体であって、
該ポリヒドロキシアルカノエート合成用の酵素が該基材表面に固定化された構造を有し、
該酵素が該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むものである
ことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項２３】
ポリヒドロキシアルカノエートが、式［１］から式［１０］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートである請求項２２に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【化２４】
2004065001.tif 000149
（ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
Ｒ１が水素原子（Ｈ）であり、ａが０から　１０　の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がハロゲン原子であり、ａが１から　１０　の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が発色団であり、ａが１から　１０　の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から１０の整数であるモノマーユニット、
Ｒ１が、
【化２５】
2004065001.tif 000150
であり、ａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【化２６】
2004065001.tif 000151
（ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化２７】
2004065001.tif 000152
（ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化２８】
2004065001.tif 000153
（ただし、式中ｄは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化２９】
2004065001.tif 000154
（ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５及び−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化３０】
2004065001.tif 000155
（ただし、式中ｆは０から７の整数のいずれかを表す。）
【化３１】
2004065001.tif 000156
（ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表す。）
【化３２】
2004065001.tif 000157
（ただし、式中ｈは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’、−ＳＯ２Ｒ’’、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【化３３】
2004065001.tif 000158
（ただし、式中ｉは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’、−ＳＯ２Ｒ’’からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【化３４】
2004065001.tif 000159
（ただし、式中ｊは１から９の整数のいずれかを表す。）
【請求項２４】
該ポリヒドロキシアルカノエートが親水性官能基を有する、請求項２３に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項２５】
該ポリヒドロキシアルカノエートがアニオン性官能基を有する、請求項２４に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項２６】
該ポリヒドロキシアルカノエートがカルボキシル基を有する、請求項２５に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項２７】
前記カルボキシル基を有するポリヒドロキシアルカノエートが、式［１１］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートである、請求項２６に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【化３５】
2004065001.tif 000160
（ただし、ｋは１から１０の整数のいずれかである。）
【請求項２８】
前記ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成が前記ポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の積層方向において変化している請求項２２から２７の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項２９】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、化学修飾されたポリヒドロキシアルカノエートである請求項２２から２８の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項３０】
前記の化学修飾されたポリヒドロキシアルカノエートが、少なくともグラフト鎖を有するポリヒドロキシアルカノエートである請求項２９に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項３１】
前記グラフト鎖が、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートの化学修飾によるグラフト鎖である請求項３０に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項３２】
前記グラフト鎖が、アミノ基を有する化合物のグラフト鎖である請求項３０または３１に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項３３】
前記アミノ基を有する化合物が、末端アミノ変性化合物である請求項３２に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項３４】
前記末端アミノ変性化合物が、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン及び末端アミノ変性ポリシロキサンからなる群より選択される少なくとも一つである請求項３３に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項３５】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートである請求項２９に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項３６】
前記架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートが、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートが架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートであるである請求項３５に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項３７】
前記架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートが、ジアミン化合物、無水コハク酸及び２−エチル−４−メチルイミダゾールから選択される少なくとも１つを利用した反応並びに電子線照射からなる群より選択される少なくとも一つにより架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートである請求項３５または３６に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項３８】
前記ジアミン化合物がヘキサメチレンジアミンである請求項３７に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項３９】
基材が銅フタロシアニンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：２４）、
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：２５）、
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号：２６）、
Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２７）、
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列番号：２８）、
Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ（配列番号：２９）、
Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（配列番号：３０）、
Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号：３１）、
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（配列番号：３２）、
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号：３３）、
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号：３４）、
Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（配列番号：３５）、
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号：３６）、
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：３７）、
Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ（配列番号：３８）、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの全部または一部である請求項１から２１の何れかに記載の製造方法。
【請求項４０】
基材が銅フタロシアニンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：２４）
の全部または一部である請求項３９に記載の製造方法。
【請求項４１】
基材が銅フタロシアニンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：２５）
の全部または一部である請求項３９に記載の製造方法。
【請求項４２】
基材がカーボンブラックであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：３９）、
Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：４０）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号：４１）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号：４２）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（配列番号：４３）、
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号：４４）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ（配列番号：４５）、
Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号：４６）、
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号：４７）、
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号：４８）、
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（配列番号：４９）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号：５０）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ（配列番号：５１）、
Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（配列番号：５２）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ（配列番号：５３）、
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（配列番号：５４）、
Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号：５５）、
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号：５６）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（配列番号：５７）、
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：５８）、
Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号：５９）、
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（配列番号：６０）、
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：６１）、
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：６２）、
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ（配列番号：６３）、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの全部または一部である請求項１から２１の何れかに記載の製造方法。
【請求項４３】
基材がカーボンブラックであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：３９）
の全部または一部である請求項４２に記載の製造方法。
【請求項４４】
基材がカーボンブラックであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：４０）
の全部または一部である請求項４２に記載の製造方法。
【請求項４５】
基材が酸化チタンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：１５０）、
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：１５１）、
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（配列番号：１５２）、
Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号：１５３）、
Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号：１５４）、
Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ（配列番号：１５５）、
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（配列番号：１５６）、
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ（配列番号：１５７）
からなる群より選ばれた少なくとも１つの全部または一部である請求項１から２１の何れかに記載の製造方法。
【請求項４６】
基材が酸化チタンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：１５０）
の全部または一部である請求項４５に記載の製造方法。
【請求項４７】
基材が酸化チタンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：１５１）
の全部または一部である請求項４５に記載の製造方法。
【請求項４８】
基材がシリコン基板であり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列がＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（配列番号：２１）である請求項１から２１の何れかに記載の製造方法。
【請求項４９】
基材が銅フタロシアニンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：２４）、
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：２５）、
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号：２６）、
Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号：２７）、
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列番号：２８）、
Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ（配列番号：２９）、
Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（配列番号：３０）、
Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号：３１）、
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（配列番号：３２）、
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号：３３）、
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号：３４）、
Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（配列番号：３５）、
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号：３６）、
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：３７）、
Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ（配列番号：３８）、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの全部または一部である請求項２２から３８の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項５０】
基材が銅フタロシアニンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：２４）
の全部または一部である請求項４９に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項５１】
基材が銅フタロシアニンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：２５）
の全部または一部である請求項４９に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項５２】
基材がカーボンブラックであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：３９）、
Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：４０）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号：４１）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号：４２）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（配列番号：４３）、
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号：４４）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ（配列番号：４５）、
Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号：４６）、
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号：４７）、
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号：４８）、
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（配列番号：４９）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号：５０）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ（配列番号：５１）、
Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（配列番号：５２）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ（配列番号：５３）、
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（配列番号：５４）、
Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号：５５）、
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号：５６）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（配列番号：５７）、
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：５８）、
Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号：５９）、
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（配列番号：６０）、
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：６１）、
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：６２）、
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ（配列番号：６３）、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの全部または一部である請求項２２から３８の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項５３】
基材がカーボンブラックであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：３９）
の全部または一部である請求項５２に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項５４】
基材がカーボンブラックであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：４０）
の全部または一部である請求項５２に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項５５】
基材が酸化チタンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：１５０）、
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：１５１）、
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（配列番号：１５２）、
Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号：１５３）、
Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号：１５４）、
Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ（配列番号：１５５）、
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（配列番号：１５６）、
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ（配列番号：１５７）
からなる群より選ばれた少なくとも１つの全部または一部である請求項２２から３８の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項５６】
基材が酸化チタンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：１５０）
の全部または一部である請求項５５に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項５７】
基材が酸化チタンであり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列が
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：１５１）
の全部または一部である請求項５５に記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項５８】
基材がシリコン基板であり、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列がＡｓｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（配列番号：２１）である請求項２２から３８の何れかに記載のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体。
【請求項５９】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が、該酵素の生産能を有する微生物、または該生産能に関与する遺伝子を宿主に導入した形質転換体により生産されるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項１から２１、および３９から４８の何れかに記載の製造方法。
【請求項６０】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）に属する微生物である、請求項５９に記載の製造方法。
【請求項６１】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｐ９１、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７３）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ　Ｈ４５、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ　ＹＮ２、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７５）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｊｅｓｓｅｎｉｉ　Ｐ１６１、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７６）からなる群から選択される少なくとも１つ以上の微生物である、請求項６０に記載の製造方法。
【請求項６２】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．）に属する微生物である、請求項５９に記載の製造方法。
【請求項６３】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、バルクホルデリア・セパシア・ＫＫ０１株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ　ＫＫ０１、ＦＥＲＭ　ＢＰ−４２３５）、バークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．　ＯＫ３、ＦＥＲＭ　Ｐ−１７３７０）、バークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．　ＯＫ４、ＦＥＲＭ　Ｐ−１７３７１）からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である、請求項６２に記載の製造方法。
【請求項６４】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ．）に属する微生物である、請求項５９に記載の製造方法。
【請求項６５】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、アルカリゲネス属・ＴＬ２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ．　ＴＬ２、ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９１３）である、請求項６４に記載の製造方法。
【請求項６６】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、ラルストーニャ属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｐ．）に属する微生物である、請求項５９に記載の製造方法。
【請求項６７】
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ６４株（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ　ＴＢ６４、ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９３３）、である、請求項６６に記載の製造方法。
【請求項６８】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する形質転換体の宿主微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、請求項５９に記載の製造方法。
【請求項６９】
着色材の表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む静電荷像現像トナーの製造方法であって、
基材を着色材とした請求項１から２１および３９から４７の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする静電荷像現像トナーの製造方法。
【請求項７０】
銅フタロシアニンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む静電荷像現像トナーの製造方法であって、請求項３９から４１の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする静電荷像現像トナーの製造方法。
【請求項７１】
カーボンブラックの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む静電荷像現像トナーの製造方法であって、請求項４２から４４の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする静電荷像現像トナーの製造方法。
【請求項７２】
酸化チタンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む静電荷像現像トナーの製造方法であって、請求項４５から４７の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする静電荷像現像トナーの製造方法。
【請求項７３】
着色材の表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む静電荷像現像トナーであって、
基材を着色材とした請求項２２から３８および４９から５７の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする静電荷像現像トナー
【請求項７４】
銅フタロシアニンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む静電荷像現像トナーであって、
請求項４９から５１の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする静電荷像現像トナー。
【請求項７５】
カーボンブラックの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む静電荷像現像トナーであって、
請求項５２から５４の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする静電荷像現像トナー。
【請求項７６】
酸化チタンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む静電荷像現像トナーであって、
請求項５５から５７の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする静電荷像現像トナー。
【請求項７７】
着色材の表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含むカラーフィルタ用着色組成物の製造方法であって、基材を着色材とした請求項１から２１および３９から４７の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とするカラーフィルタ用着色組成物の製造方法。
【請求項７８】
銅フタロシアニンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含むカラーフィルタ用着色組成物の製造方法であって、
請求項３９から４１の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とするカラーフィルタ用着色組成物の製造方法。
【請求項７９】
カーボンブラックの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含むカラーフィルタ用着色組成物の製造方法であって、
請求項４２から４４の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とするカラーフィルタ用着色組成物の製造方法。
【請求項８０】
酸化チタンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含むカラーフィルタ用着色組成物の製造方法であって、
請求項４５から４７の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とするカラーフィルタ用着色組成物の製造方法。
【請求項８１】
着色材の表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含むカラーフィルタ用着色組成物であって、基材を着色材とした請求項２２から３８および４９から５７の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とするカラーフィルタ用着色組成物。
【請求項８２】
銅フタロシアニンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含むカラーフィルタ用着色組成物であって、
請求項４９から５１の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とするカラーフィルタ用着色組成物。
【請求項８３】
カーボンブラックの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含むカラーフィルタ用着色組成物であって、
請求項５２から５４の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とするカラーフィルタ用着色組成物。
【請求項８４】
酸化チタンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含むカラーフィルタ用着色組成物であって、
請求項５５から５７の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とするカラーフィルタ用着色組成物。
【請求項８５】
着色材の表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む電気泳動粒子の製造方法であって、基材を着色材とした請求項１から２１および３９から４７の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする電気泳動粒子の製造方法。
【請求項８６】
銅フタロシアニンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む電気泳動粒子の製造方法であって、
請求項３９から４１の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする電気泳動粒子の製造方法。
【請求項８７】
カーボンブラックの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む電気泳動粒子の製造方法であって、
請求項４２から４４の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする電気泳動粒子の製造方法。
【請求項８８】
酸化チタンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む電気泳動粒子の製造方法であって、請求項４５から４７の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする電気泳動粒子の製造方法。
【請求項８９】
着色材の表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む電気泳動粒子であって、
基材を着色材とした請求項２２から３８および４９から５７の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする電気泳動粒子。
【請求項９０】
銅フタロシアニンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む電気泳動粒子であって、
請求項４９から５１の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする電気泳動粒子。
【請求項９１】
カーボンブラックの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む電気泳動粒子であって、
請求項５２から５４の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする電気泳動粒子。
【請求項９２】
酸化チタンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む電気泳動粒子であって、
請求項５５から５７の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする電気泳動粒子。
【請求項９３】
着色材の表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む顔料インクの製造方法であって、
基材を着色材とした請求項１から２１および３９から４７の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする顔料インクの製造方法。
【請求項９４】
銅フタロシアニンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む顔料インクの製造方法であって、
請求項３９から４１の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする顔料インクの製造方法。
【請求項９５】
カーボンブラックの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む顔料インクの製造方法であって、
請求項４２から４４の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする顔料インクの製造方法。
【請求項９６】
酸化チタンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む顔料インクの製造方法であって、
請求項４５から４７の何れかを製造工程の一部とすることを特徴とする顔料インクの製造方法。
【請求項９７】
着色材の表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む顔料インクであって、
基材を着色材とした請求項２２から３８および４９から５７の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする顔料インク。
【請求項９８】
銅フタロシアニンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む顔料インクであって、
請求項４９から５１の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする顔料インク。
【請求項９９】
カーボンブラックの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む顔料インクであって、
請求項５２から５４の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする顔料インク。
【請求項１００】
酸化チタンの表面の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆して得られた着色剤を含む顔料インクであって、
請求項５５から５７の何れかの構造体を少なくとも構成の一部とすることを特徴とする顔料インク。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート生合成反応に関与するポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を基材に固定化し、該酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成させることにより該基材の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆することを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の製造方法に関するものである。より詳しくは基材に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を該基材に固定化することにより該構造体を製造することを特徴とするポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の製造方法に関するものである。
【０００２】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートと基材および該基材に固定化されたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素とを備え、該ポリヒドロキシアルカノエートが該基材の少なくとも一部を被覆した構造を有していることを特徴とする構造体に関するものである。本発明の構造体には、粒状の基材にポリヒドロキシアルカノエートを被覆した粒状の構造体（以下、「カプセル構造体」という）と、平板またはフィルム状の基材の少なくとも一部ををポリヒドロキシアルカノエートで被覆した、平板またはフィルム状の構造体（以下、「積層構造体」という）とが包含される。
【０００３】
本発明の構造体は、機能性構造体として幅広い用途に利用可能であり、例えば、カプセル構造体であれば分散安定性に優れた顔料分散体や帯電性に優れた電子写真用トナーなど各種の機能性構造体として、また、積層構造体であればＯＨＰフィルムや電子デバイスなど各種の機能性構造体として、それぞれ幅広い用途に利用可能である。
【０００４】
【従来の技術】
高分子材料は現代の産業や生活に不可欠のものであり、安価軽量であること、成形性が良いことなどから、家電品の筐体をはじめ包装材や緩衝材、あるいは繊維材料など、多岐に渡って利用されている。一方、これら高分子材料の安定な性質を利用して、高分子の分子鎖に様々な機能を発現する置換基を配して、液晶材料やコート剤などの各種機能材料も得られている。これら機能材料は構造材料としての高分子よりも付加価値が高いため、少量生産でも大きな市場ニーズが期待できる。このような高分子機能材料は、これまで高分子の合成プロセスの中で、あるいは合成した高分子を置換基で修飾することにより、有機合成化学的手法により得られている。高分子機能材料の基本骨格となる高分子はほとんどの場合、石油系原料から有機合成化学的手法によって得られており、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミドなどがその典型的な例である。
【０００５】
ところで、本願発明者らは高分子化合物に大きな付加価値を与えるための一つの要素技術として、高分子化合物により基材を被覆した重層構造体に着目してきた。高分子化合物で特定の基材を被覆することによって、極めて有用な機能性を有する複合構造体を得ることができる。
【０００６】
従来、基材の被覆のために用いる高分子化合物は有機合成的手法により合成・構造体化され、これに種々の機能が付加されているが、近年、生物工学的手法によって高分子化合物を製造する研究が活発に行われてきており、一部で実用化されている。例えば、微生物由来の高分子化合物として、ポリ−３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸（以下、ＰＨＢと略す場合もある）や３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸と３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸との共重合体（以下、ＰＨＢ／Ｖと略す場合もある）等のポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと略す場合がある）、バクテリアセルロースやプルラン等の多糖類、ポリ−γ−グルタミン酸やポリリジン等のポリアミノ酸などが知られている。特にＰＨＡは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品に利用することができるうえ、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【０００７】
近年、上記のＰＨＢ合成酵素やＰＨＡ合成酵素を菌体外に取り出して、無細胞系（ｉｎｖｉｔｒｏ）でＰＨＡを合成しようとする試みが始まっている。
【０００８】
例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、６２７９−６２８３（１９９５）では、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）由来のＰＨＢ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。また、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、２５、５５−６０（１９９９）では、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡや３−ヒドロキシバレリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットや３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットからなるＰＨＡの合成に成功している。さらにこの報告では、ラセミ体の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させたところ、酵素の立体選択性によって、Ｒ体の３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットのみからなるＰＨＢが合成されたとしている。Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ　　Ｃｏｍｍｕｎ．、２１、７７−８４（２０００）においても、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素を用いた細胞外でのＰＨＢ合成が報告されている。
【０００９】
また、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１６８、３１９−３２４（１９９８）では、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ　ｖｉｎｏｓｕｍ）由来のＰＨＢ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。
【００１０】
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５４、３７−４３（２０００）では、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＰＨＡ合成酵素に３−ヒドロキシデカノイルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシデカン酸ユニットからなるＰＨＡを合成している。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、生物工学的手法を高分子化合物の合成に適用することによって、従来の有機合成的手法では実現が困難であった新たな高分子化合物の合成や、新たな機能・構造の付与が可能になると期待されている。また、従来の有機合成化学的手法では多段階に渡る反応を要していた製造工程を、１段階の工程のみで実現できる場合も多くあり、製造プロセスの簡略化やコストダウン、所要時間の短縮等の効果も期待されている。さらに、有機溶剤や酸・アルカリ、界面活性剤等の使用削減、温和な反応条件の設定、非石油系原料や低純度原料のからの合成等が可能となり、より環境低負荷かつ資源循環型の合成プロセスの実現が可能となる。なお、低純度原料からの合成についてさらに詳しく説明すれば、生物工学的合成プロセスでは一般に、触媒である酵素の基質特異性が高いため、低純度の原料を用いても所望の反応を選択的に進めることが可能であり、よって、廃棄物やリサイクル原料などの使用も期待できる。
【００１２】
一方、前記の通り、本願発明者らは高分子化合物に大きな付加価値を与えるための要素技術として、高分子化合物で基材を被覆した構造体に着目してきた。このように高分子化合物で特定の基材を被覆することによって、極めて有用な機能性を有する複合構造体を得ることができる。特に、かかる構造体を前述のような生物工学的手法により製造することができれば、従来の有機合成的手法では実現が困難であった新たな高分子化合物の利用や、新たな機能・構造の付与が可能になると期待できるうえ、より環境低負荷かつ資源循環型の製造プロセスを低コストで実現できるものと考えられる。例えば、生物の触媒作用に特有の極めて厳密な分子認識能や立体選択性を利用して、従来の有機合成化学的手法では実現が困難であった新たな機能性高分子化合物や、極めてキラリティーの高い高分子化合物により被覆されたカプセル構造体や積層構造体を、極めて簡便かつ環境低負荷なプロセスで製造することが可能になる。
【００１３】
従って、本発明の目的は、生物工学的手法を用いた高機能な高分子化合物構造体およびその製造方法を提供することにある。より詳しくは、ＰＨＢ合成酵素やＰＨＡ合成酵素を菌体外に取り出して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＰＨＡを合成することによって、ＰＨＡによって基材を被覆した構造体の製造しようとする場合に、より効果的な酵素の利用方法を提供することにある。また本発明は、機能性複合構造体として広範囲に利用可能な、高分子化合物により基材を被覆した構造体およびその効率的な製造方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、基材に対して結合能を有するペプチドのアミノ酸配列を、ペプチドライブラリからスクリーニングし、このアミノ酸配列のペプチドを、遺伝子工学的手法を用いてＰＨＡ合成酵素に融合させて提示させたところ、該ＰＨＡ合成酵素を効果的に基材表面に固定化することができ、ここに３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを添加して合成反応を行わせると、該基材表面を所望のＰＨＡで効率的に被覆することができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明はポリヒドロキシアルカノエートによって、基材の少なくとも一部を被覆されたポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の製造方法に関して、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を該基材に固定化し、酵素の基質となる３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを添加することにより該構造体を製造することである。
【００１５】
本発明によればＰＨＡ合成酵素を効果的に基材表面に固定化することができるので、３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを添加して合成反応を行わせると、孤立したＰＨＡグラニュールが生じず、効率的に基材表面をＰＨＡで効率的に被覆することができる。
【００１６】
本発明にかかる構造体は、基材表面の少なくとも一部をＰＨＡで被覆した構造を有するものであり、基材全体をＰＨＡ層で被覆した場合には基材を核とするカプセル構造体を得ることができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明において、ＰＨＡで被覆される基材とは、ＰＨＡ合成酵素を固定化することのできるものであれば、一般的な高分子化合物や無機系固形物、例えば、樹脂、ガラス、金属等から適宜選択して用いることができる。また、ＰＨＡ合成酵素の固定化方法や、作製した構造体の応用の形態等に応じて、基材の種類や構造を適宜選択して用いることができる。
【００１８】
例えば、粒子状の基材（コア）としては、スチレン、α−メチルスチレン、β−メチルスチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、２、４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレンなどのスチレン系重合性モノマー、メチルアクリレート、エチルアクリレート、ｎ−プロピルアクリレート、ｉｓｏ−プロピルアクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、ｉｓｏ−ブチルアクリレート、ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート、ｎ−アミルアクリレート、ｎ−ヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、ｎ−オクチルアクリレート、ｎ−ノニルアクリレート、シクロヘキシルアクリレート、ベンジルアクリレート、ジメチルフォスフェートエチルアクリレート、ジエチルフォスフェートエチルアクリレート、ジブチルフォスフェートエチルアクリレート、２−ベンゾイルオキシエチルアクリレートなどのアクリル系重合性モノマー、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ｎ−プロピルメタクリレート、ｉｓｏ−プロピルメタクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ｉｓｏ−ブチルメタクリレート、ｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート、ｎ−アミルメタクリレート、ｎ−ヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、ｎ−ノニルメタクリレート、ジエチルフォスフェートエチルメタクリレート、ジブチルフォスフェートエチルメタクリレートなどのメタクリル系重合性モノマー、メチレン脂肪族モノカルボン酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ベンゾエ酸ビニル、酪酸ビニル、安息香酸ビニル、ギ酸ビニルなどのビニルエステル類、ビニルメチルエーテル、ビニルエチルエーテル、ビニルイソブチルエーテル等のビニルエーテル類、ビニルメチルケトン、ビニルヘキシルケトン、ビニルイソプロピルケトン等のビニルケトン類などのビニル系重合性モノマー、からなる群より選択された重合性モノマーを重合させて製造された樹脂微粒子；あるいは、上記モノマー系に極性基重合体や着色剤などの各種添加剤を添加して製造された樹脂微粒子；パラフィンワックス、ポリオレフィンワックス、フィッシャートロピッシュワックス、アミドワックス、高級脂肪酸、エステルワックス及びこれらの誘導体又はこれらのグラフトまたはブロック化合物等を含有する微粒子；カオリナイト、ベントナイト、タルク、雲母等の粘土鉱物；アルミナ、二酸化チタン等の金属酸化物；シリカゲル、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムゲル等の不溶性無機塩；カーボンブラック、酸化銅、二酸化マンガン、アニリンブラック、活性炭、非磁性フェライト、マグネタイトなどの黒色顔料；黄鉛、亜鉛黄、黄色酸化鉄、カドミウムイエロー、ミネラルファストイエロー、ニッケルチタンイエロー、ネーブルスイエロー、ナフトールイエローＳ、ハンザーイエローＧ、ハンザイエロー１０Ｇ、ベンジジンイエローＧ、ベンジジンイエローＧＲ、キノリンイエローレーキ、パーマネントイエローＮＣＧ、タートラジンレ��キなどの黄色顔料；赤色黄鉛、モリブデンオレンジ、パーマネントオレンジＧＴＲ、ピラゾロンオレンジ、バルカンオレンジ、ベンジジンオレンジＧ、インダスレンブリリアントオレンジＲＫ、インダスレンブリリアントオレンジＧＫなどの橙色顔料；ベンカラ、カドミウムレッド鉛丹、硫化水銀、カドミウム、パーマネントレッド４Ｒ、リソールレッド、ピラゾロンレッド、ウォッチングレッド、カルシウム塩、レーキレッドＣ、レーキレッドＤ、ブリリアントカーミン６Ｂ、ブリリアントカーミン３Ｂ、エオキシンレーキ、ローダミンレーキＢ、アリザリンレーキなどの赤色顔料；紺青、コバルトブルー、アルカリブルーレーキ、ビクトリアブルーレーキ、フタロシアニンブルー、無金属フタロシアニンブルー、フタロシアニンブルー一部分塩素化合物、ファーストスカイブルー、インダスレンブルーＢＣなどの青色顔料；マンガン紫、ファストバイオレットＢ、メチルバイオレットレーキなどの紫色顔料；酸化クロム、クロムグリーン、ピグメントグリーンＢ、マラカイトグリーンレーキ、ファイナルイエローグリーンＧなどの緑色顔料；亜鉛華、酸化チタン、アンチモン白、硫化亜鉛などの白色顔料；バライト粉、炭酸バリウム、クレー、シリカ、ホワイトカーボン、タルク、アルミナホワイトなどの体質顔料；などを用いることができるが、もちろんこれらに限定されるものではない。これらは必要に応じて２種以上を組合せて用いることができる。コアの形状は、その用途に応じて適宜選択可能であるが、例えば、粒径０．１μｍから１．０　ｍｍ　の範囲内の粒径を有する粒子を用いると良い。
【００１９】
また、その他の形態の基材としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ジアセテート、トリアセテート、セロハン、セルロイド、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリビニルクロライド、ポリビニリデンクロライド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどのプラスチックからなるフィルム、ポリビニルクロライド、ポリビニルアルコール、アセチルセルロース、ポリカーボネート、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、テフロン等からなる多孔性高分子膜、木板、ガラス板、シリコン基板、木綿、レーヨン、アクリル、絹、ポリエステルなどの布、上質紙、中質紙、アート紙、ボンド紙、再生紙、バライタ紙、キャストコート紙、ダンボール紙、レジンコート紙などの紙を用いることができるが、もちろんこれらに限定されるものではない。なお、前記基材の表面が滑らかなものであっても、凹凸のついたものであっても良いし、透明、半透明、不透明のいずれであっても良い。また、これら前記基材の中より２種類以上を互いに張り合わせたものであっても良い。
【００２０】
本発明の基材に対する結合能を有するペプチドのアミノ酸配列を得るためには、例えば以下に述べるファージディスプレイペプチドライブラリー法が挙げられる。ファージランダムペプチドライブラリーを構築する方法としては、例えばＭ１３　系ファージの表面蛋白質（例えばｇｅｎｅＩＩＩ　蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結し作製すれば良い。その方法としてはＳｃｏｔｔ、　ＪＫ．ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ、　ＧＰ．、　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．　２４９、　３８６、　１９９０、　やＣｗｉｒｌａ、　ＳＥ　ｅｔ　ａｌ．、　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　Ｖｏｌ．　８７、　６３７８、　１９９０　等の報告がある。挿入する遺伝子の大きさはペプチドが安定に発現できれば特に制限はないが、作製したライブラリーがすべてのランダム配列を網羅し、しかも結合能を有するためには６から４０アミノ酸に相当する長さ（分子量約６００から４０００に相当）が適当で、中でも７から１８アミノ酸が好ましい。目的の基材に結合するファージを選択するためには基材を例えばカラムやプレート上に固定化し上記のライブラリーを基材に接触させ結合ファージを残し非結合ファージは洗浄で洗い流す。洗浄後残ったファージを酸などにより溶出し緩衝液で中和した後大腸菌に感染させファージを増幅する。この選別を複数回繰り返すと目的の基材に結合能のある複数のクローンが濃縮される。ここで単一なクローンを得るため再度大腸菌に感染させた状態で培地プレート上にコロニーを作らせる。それぞれの単一コロニーを液体培地で培養した後、培地上清中に存在するファージをポリエチレングリコール等で沈殿精製し、その塩基配列を解析すればペプチドの構造を知ることができる。
ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドライブラリーの作製方法としては、上記のようなファージを用いる方法のほか化学合成したペプチドを用いることも可能である。その方法として例えばビーズを用いる方法（Ｌａｍ、ＫＳ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、３５４、　８２、　１９９１）　、液相フォーカシング法（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、　ＲＡ　ｅｔ　ａｌ．、　Ｎａｔｕｒｅ、　３５４、８４、　１９９１）、マイクロプレート法（Ｆｏｄｏｒ、　ＳＰＡ　ｅｔ　ａｌ．、　Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２５１、　７６７、　１９９１）などが報告されており、何れも本発明に供し得る。
【００２１】
上記方法により得られた基材に対する結合能を有するペプチドのアミノ酸配列は、通常の遺伝子工学的手法を用いて、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素に融合して利用される。基材に対する結合能を有するペプチドはポリヒドロキシアルカノエート合成酵素のＮ末端あるいはＣ末端に連結して発現することができる。また適当なスペーサー配列を挿入して発現することもできる。
【００２２】
スペーサー配列としては、約３〜約４００アミノ酸が好ましく、また、スペーサー配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペーサー配列は、ＰＨＡ合成酵素が機能するのを妨害せず、また、ＰＨＡ合成酵素が基材に結合するのを妨害しないものである。
【００２３】
＜ＰＨＡ＞
本発明に利用可能なＰＨＡとしては、ＰＨＡの生合成反応に関わるＰＨＡ合成酵素によって合成され得るＰＨＡであれば、特に限定はされない。
【００２４】
ここで、ＰＨＡの生合成は、原料となる各種アルカン酸から、生体内の様々な代謝経路（例えば、β酸化系や脂肪酸合成経路）を経て生成された（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がＰＨＡ合成酵素（ＰＨＡポリメラーゼ、ＰＨＡシンターゼともいう）である。
なお、ＣｏＡとは補酵素Ａ（ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ）の略称であり、その化学構造は下記式の通りである。
【００２５】
【化３６】
2004065001.tif 000002
【００２６】
以下に、β酸化系およびＰＨＡ合成酵素による重合反応を経て、アルカン酸がＰＨＡとなるまでの反応を示す。
【００２７】
【化３７】
2004065001.tif 000003
【００２８】
一方、脂肪酸合成経路を経る場合は、該経路中に生じた（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ（ＡＣＰとはアシルキャリアプロテインのことである）から変換された（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを基質として、同様にＰＨＡ合成酵素によりＰＨＡが合成されると考えられる。
【００２９】
さらに、上記のＰＨＢ合成酵素やＰＨＡ合成酵素を菌体外に取り出して、無細胞系（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でＰＨＡを合成できることもわかっており、以下のような実例がある。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、６２７９−６２８３（１９９５）では、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）由来のＰＨＢ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。また、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、２５、５５−６０（１９９９）では、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡや３−ヒドロキシバレリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットや３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットからなるＰＨＡの合成に成功している。さらにこの報告では、ラセミ体の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させたところ、酵素の立体選択性によって、Ｒ体の３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットのみからなるＰＨＢが合成されたとしている。Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎ．、２１、７７−８４（２０００）においても、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素を用いた細胞外でのＰＨＢ合成が報告されている。また、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１６８、３１９−３２４（１９９８）では、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ　ｖｉｎｏｓｕｍ）由来のＰＨＢ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５４、３７−４３（２０００）では、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＰＨＡ合成酵素に３−ヒドロキシデカノイルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシデカン酸ユニットからなるＰＨＡを合成している。
【００３０】
このように、ＰＨＡ合成酵素は、生物体内でのＰＨＡ合成反応系における最終段階を触媒する酵素であり、従って、生物体内において合成され得ることが知られているＰＨＡであれば、いずれも該酵素による触媒作用を受けて合成されていることになる。よって、所望のＰＨＡに対応する３−ヒドロキシアシルＣｏＡを、本発明における基材に固定化された該酵素に作用させることによって、生物体内において合成され得ることが知られているあらゆる種類のＰＨＡで顔料を被覆したカプセル構造体を作成することが可能である。
【００３１】
本発明で使用されるＰＨＡとして、具体的には、下記式式［１］から式［１０］で表されるモノマーユニットを少なくとも一つ含むＰＨＡを例示することができる。
【００３２】
【化３８】
2004065001.tif 000004
【００３３】
（ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
【００３４】
Ｒ１が水素原子（Ｈ）であり、ａが０から　１０　の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がハロゲン原子であり、ａが１から　１０　の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が発色団であり、ａが１から　１０　の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から１０の整数であるモノマーユニット、
Ｒ１が、
【００３５】
【化３９】
2004065001.tif 000005
【００３６】
であり、ａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００３７】
【化４０】
2004065001.tif 000006
【００３８】
（ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００３９】
【化４１】
2004065001.tif 000007
【００４０】
（ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００４１】
【化４２】
2004065001.tif 000008
【００４２】
（ただし、式中ｄは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００４３】
【化４３】
2004065001.tif 000009
【００４４】
（ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５及び−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００４５】
【化４４】
2004065001.tif 000010
【００４６】
（ただし、式中ｆは０から７の整数のいずれかを表す。）
【００４７】
【化４５】
2004065001.tif 000011
【００４８】
（ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表す。）
【００４９】
【化４６】
2004065001.tif 000012
【００５０】
（ただし、式中ｈは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’、−ＳＯ２Ｒ’’、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００５１】
【化４７】
2004065001.tif 000013
【００５２】
（ただし、式中ｉは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’及び−ＳＯ２Ｒ’’からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）
【００５３】
【化４８】
2004065001.tif 000014
【００５４】
（ただし、式中ｊは１から９の整数のいずれかを表す。）
なお、前記のハロゲン原子の具体例としては、フッ素、塩素、臭素などを挙げることができる。
【００５５】
上記ＰＨＡを合成する基質として用いる３−ヒドロキシアシルＣｏＡとして、具体的には、下記式化学式［１２］から化学式［２１］で表される３−ヒドロキシアシルＣｏＡを例示することができる。
【００５６】
【化４９】
2004065001.tif 000015
【００５７】
（ただし、前記化学式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、式中Ｒ１およびａは前記化学式［１］と同様に定義される。）
【００５８】
【化５０】
2004065001.tif 000016
【００５９】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｂ及びＲ２は前記化学式［２］と同様に定義される。）
【００６０】
【化５１】
2004065001.tif 000017
【００６１】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｃ及びＲ３は前記化学式［３］と同様に定義される。）
【００６２】
【化５２】
2004065001.tif 000018
【００６３】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｄ及びＲ４は前記化学式［４］と同様に定義される。）
【００６４】
【化５３】
2004065001.tif 000019
【００６５】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｅ及びＲ５は前記化学式［５］と同様に定義される。）
【００６６】
【化５４】
2004065001.tif 000020
【００６７】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｆは前記化学式［６］と同様に定義される。）
【００６８】
【化５５】
2004065001.tif 000021
【００６９】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｇは前記化学式［７］と同様に定義される。）
【００７０】
【化５６】
2004065001.tif 000022
【００７１】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｈ及びＲ６は前記化学式［８］と同様に定義される。）
【００７２】
【化５７】
2004065001.tif 000023
【００７３】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｉ及びＲ７は前記化学式［９］と同様に定義される。）
【００７４】
【化５８】
2004065001.tif 000024
【００７５】
（ただし、式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｊは前記化学式［１０］と同様に定義される。）
また、本発明のＰＨＡ含有構造体において基材表面を親水性にする場合には、ＰＨＡ含有構造体を構成するＰＨＡとして、親水性官能基を有するものを用いる。親水性官能基としてはいかなるものでもよいが、アニオン性官能基を用いることができ、また、アニオン性官能基としてはいかなるものを用いてもよいが、特にカルボキシル基を用いることができる。カルボキシル基を有するＰＨＡとしては、下記式［１１］に示すモノマーユニットを少なくと１つ含むＰＨＡを例示できる。
【００７６】
【化５９】
2004065001.tif 000025
【００７７】
（ただし、式中ｋは１から１０の整数のいずれかである。）
また、上記ＰＨＡのうち、さらに具体的に、下記式［２３］で示される３−ヒドロキシピメリン酸を含有するＰＨＡ
【００７８】
【化６０】
2004065001.tif 000026
【００７９】
を例示できる。
【００８０】
また、上記式［１１］で示されるＰＨＡを合成する基質として用いる３−ヒドロキシアシルＣｏＡとして、下記式［２２］で表される３−ヒドロキシアシルＣｏＡを例示することができる。
【００８１】
【化６１】
2004065001.tif 000027
【００８２】
（ただし、前記式中−ＳＣｏＡ　はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、式中ｋは前記式［１１］と同様に定義される。）
また、上記式［２３］で示される３−ヒドロキシピメリン酸を含有するＰＨＡを合成する基質として用いる３−ヒドロキシアシルＣｏＡとして、下記式［２４］で表される３−ヒドロキシピメリルＣｏＡ
【００８３】
【化６２】
2004065001.tif 000028
【００８４】
を示すことができる。
【００８５】
なお、前記のハロゲン原子の具体例としては、フッ素、塩素、臭素などを挙げることができる。また、前記の発色団としては、その３−ヒドロキシアシルＣｏＡ　体がＰＨＡ合成酵素の触媒作用を受け得るものである限り特に限定はされないが、高分子合成時の立体障害などを考慮すると、３−ヒドロキシアシルＣｏＡ　分子内において、ＣｏＡの結合したカルボキシル基と発色団との間に炭素数１から５のメチレン鎖があるほうが望ましい。また、発色団の光吸収波長が可視域にあれば、体質顔料を用いても着色したＰＨＡ含有構造体が得られる。このような発色団の例として、ニトロソ、ニトロ、アゾ、ジアリールメタン、トリアリールメタン、キサンテン、アクリジン、キノリン、メチン、チアゾール、インダミン、インドフェノール、ラクトン、アミノケトン、ヒドロキシケトン、スチルベン、アジン、オカサジン、チアジン、アントラキノン、フタロシアニン、インジゴイドなどを挙げることができる。
【００８６】
本発明において用いられるＰＨＡとしては、上記モノマーユニットを複数含むランダム共重合体やブロック共重合体を用いることも可能であり、各モノマーユニットや含まれる官能基の特性を利用したＰＨＡの物性制御や複数の機能の付与、官能基間の相互作用を利用した新たな機能の発現等が可能となる。さらに、基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡの添加量や添加順序を適宜制御することによって、任意の順序および組成比のブロック共重合体を基材表面に合成することも可能である。また必要に応じて、ＰＨＡを合成したのち、あるいは、合成中に、さらに化学修飾等を施しても良い。
【００８７】
例えば、基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡの種類や濃度などの組成を経時的に変化させることによって、ポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の積層方向においてＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることも可能である。これによって、例えば、基材と親和性の低いＰＨＡで被覆構造体を形成する必要がある場合、まず基材を基材と親和性の高いＰＨＡで被覆し、その基材と親和性の高いＰＨＡのモノマーユニット組成を、目的とするＰＨＡのモノマーユニット組成に積層方向に変化、例えば多層構造あるいはグラディエント構造とすることで、基材との結合を強固にしたＰＨＡ被膜を形成することが可能となる。
【００８８】
また、該ＰＨＡに化学修飾を施すことにより、各種の特性等を改良したポリヒドロキシアルカノエート含有構造体を得ることができる。例えば、該ＰＨＡにグラフト鎖を導入することで、該グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたＰＨＡにより、基材の少なくとも一部を被覆したポリヒドロキシアルカノエート含有構造体を得ることができる。また、該ＰＨＡを架橋化せしめることで、所望の物理化学的性質（例えば、機械的強度、耐薬品性、耐熱性など）を備えたＰＨＡにより、基材の少なくとも一部を被覆したポリヒドロキシアルカノエート含有構造体を得ることができる。なお、本発明における化学修飾（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とは、高分子材料の分子内または分子間、あるいは高分子材料と他の化学物質との間で化学反応を行わせることにより、該高分子材料の分子構造を改変することを言う。また、架橋（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）とは、高分子材料の分子内または分子間を化学的あるいは物理化学的にに結合せしめて網状構造をつくることを言い、架橋剤（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）とは、前記架橋反応を行うために添加する、前記高分子材料と一定の反応性を有する物質を言う。
【００８９】
なお、本発明の構造体に用いる、ＰＨＡ合成酵素により合成されるＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【００９０】
ＰＨＡの合成基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、例えば、酵素を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成法、微生物や植物などの生物体を用いたｉｎ　ｖｉｖｏ合成法、化学合成法等の中から適宜選択した方法で合成して用いることができる。特に、酵素合成法は該基質の合成に一般に用いられている方法であり、市販のアシルＣｏＡシンセターゼ（アシルＣｏＡリガーゼ、Ｅ．Ｃ．６．２．１．３）を用いた下記反応、
【００９１】
【化６３】
2004065001.tif 000029
【００９２】
を用いた方法などが知られている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５４、３７−４３（２０００）など）。酵素や生物体を用いた合成工程には、バッチ式の合成方法を用いても良く、また、固定化酵素や固定化細胞を用いて連続生産してもよい。
【００９３】
＜ＰＨＡ合成酵素およびその生産菌＞
本発明に用いるＰＨＡ合成酵素は、該酵素を生産する微生物から適宜選択された微生物、あるいは、それら微生物のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体により生産されたものを用いることができる。
【００９４】
ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物としては、　ＰＨＢやＰＨＢ／Ｖ生産菌を用いることができ、このような微生物として、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ．）、クロマチウム属（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ　ｓｐ．）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）のなどの他に、本発明者らにより分離された、バルクホルデリア・セパシア・ＫＫ０１株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ　ＫＫ０１）、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ６４株（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ　ＴＢ６４）、アルカリゲネス属・ＴＬ２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ．　ＴＬ２）などを用いることができる。なお、ＫＫ０１株は寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−４２３５として、ＴＢ６４株は寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９３３として、ＴＬ２株は寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６９１３として寄託されている。
【００９５】
また、ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物として、ｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの生産菌を用いることができ、このような微生物として、シュードモナス・オレオボランス、シュードモナス・レジノボランス、シュードモナス属６１−３株、シュードモナス・プチダ・ＫＴ２４４２株、シュードモナス・アエルギノーサなどのほかに、本発明者らにより分離された、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｐ９１）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ　Ｈ４５）、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ　ＹＮ２）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｊｅｓｓｅｎｉｉ　Ｐ１６１）等のシュードモナス属微生物や、特開２００１−７８７５３号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．　ＯＫ３、ＦＥＲＭ　Ｐ−１７３７０）、特開２００１−６９９６８号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．　ＯＫ４、ＦＥＲＭ　Ｐ−１７３７１）などのバークホルデリア属微生物を用いることができる。また、これら微生物に加えて、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｓｐ．）などに属し、ｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【００９６】
なお、Ｐ９１株は寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７３として、Ｈ４５株は寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７４として、ＹＮ２株は寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７５として、Ｐ１６１株は寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３７６として寄託されている。また、上記のＦＥＲＭ番号の寄託は、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許微生物寄託センター（旧名：経済産業省産業技術研究所（通商産業省工業技術院）生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター）での寄託であり、ＢＰは特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づく寄託である。
【００９７】
本発明にかかるＰＨＡ合成酵素の生産に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡ合成酵素の生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地、酵母エキスなど）や、栄養源を添加した合成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【００９８】
培養は液体培養や固体培養等、該微生物が増殖する方法であればいかなる方法をも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【００９９】
前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、ＰＨＡ合成酵素を生産する場合は、例えば、オクタン酸やノナン酸等のアルカン酸を含む無機培地で該微生物を増殖させ、対数増殖期から定常期初期にかけての微生物を遠心分離等で回収して所望の酵素を抽出する方法などを用いることができる。なお、上記のような条件で培養を行うと、添加したアルカン酸に由来するｍｃｌ−ＰＨＡが菌体内に合成されることになるが、この場合、一般に、ＰＨＡ合成酵素は菌体内に形成されるＰＨＡの微粒子に結合して存在するとされている。しかし、本発明者らの検討によると、上記の方法で培養した菌体の破砕液を遠心分離した上清液にも、相当程度の酵素活性が存在していることがわかっている。これは、前記の如き対数増殖期から定常期初期にかけての比較的培養初期には、菌体内で該酵素が活発に生産され続けているため、遊離状態のＰＨＡ合成酵素も相当程度存在するためと推定される。
【０１００】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源（例えば、リン酸塩等）、窒素源（例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等）など、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２１８、９７−１０６（１９５６））、Ｍ９培地等を挙げることができる。なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
【０１０１】
Ｎａ２ＨＰＯ４　　　　　：　　６．２　ｇ
ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　：　　３．０　ｇ
ＮａＣｌ　　　　　　　　：　　０．５　ｇ
ＮＨ４Ｃｌ　　　　　　　：　　１．０　ｇ
（培地１リットル中、ｐＨ７．０）
さらに、良好な増殖及びＰＨＡ合成酵素の生産のためには、上記の無機塩培地に以下に示す微量成分溶液を０．３％（ｖ／ｖ）程度添加するのが好ましい。
（微量成分溶液）
ニトリロ三酢酸：　１．５　ｇ
ＭｇＳＯ４　　　：　　３．０　ｇ
ＭｎＳＯ４　　　：　　０．５　ｇ
ＮａＣｌ　　　　：　　１．０　ｇ
ＦｅＳＯ４　　　：　　０．１　ｇ
ＣａＣｌ２　　　：　　０．１　ｇ
ＣｏＣｌ２　　　：　　０．１　ｇ
ＺｎＳＯ４　　　：　　０．１　ｇ
ＣｕＳＯ４　　　：　　０．１　ｇ
ＡｌＫ（ＳＯ４）２：　　０．１　ｇ
Ｈ３ＢＯ３　　　：　　０．１　ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４：　　０．１　ｇ
ＮｉＣｌ２　　　：　　０．１　ｇ
（１リットル中）
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば　１４〜４０℃、好ましくは　２０〜３５℃程度が適当である。
【０１０２】
また、前述のＰＨＡ生産菌の持つＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いて、所望のＰＨＡ合成酵素を生産することも可能である。ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製、および、形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体においては、培養に用いる培地として、天然培地あるいは合成培地、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は２５から３７℃の範囲で、好気的に８〜２７時間培養することにより、微生物の増殖を図る。その後集菌し、菌体内に蓄積されたＰＨＡ合成酵素の回収を行うことができる。培地には、必要に応じて、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加しても良い。また、発現ベクターにおいて、誘導性のプロモーターを用いている場合は、形質転換体を培養する際に、該プロモーターの対応する誘導物質を培地に添加して発現を促しても良い。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等が誘導物質として挙げられる。
【０１０３】
ＰＨＡ合成酵素としては、微生物の菌体破砕液や、硫酸アンモニウム等によりタンパク質成分を沈殿・回収した硫安塩析物などの粗酵素を用いても良く、また、各種方法で精製した精製酵素を用いても良い。該酵素には必要に応じて、金属塩、グリセリン、ジチオスレイトール、ＥＤＴＡ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの安定化剤、付活剤を適宜添加して用いることができる。
【０１０４】
ＰＨＡ合成酵素の分離・精製方法は、ＰＨＡ合成酵素の酵素活性が保持される方法であればいかなる方法をも用いることができる。例えば、得られた微生物菌体を、フレンチプレス、超音波破砕機、リゾチームや各種界面活性剤等を用いて破砕したのち、遠心分離して得られた粗酵素液、またはここから調製した硫安塩析物について、アフィニティクロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等の手段を単独または適宜組み合わせることによって精製酵素を得ることができる。特に、遺伝子組換えタンパク質は、Ｎ末端やＣ末端にヒスチジン残基等の「タグ」を結合した融合タンパク質の形で発現させ、このタグを介して親和性樹脂に結合させることによって、より簡便に精製することができる。融合タンパク質から目的のタンパク質を分離するには、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ等のプロテアーゼで切断する、ｐＨを低下せしめる、結合競合剤として高濃度のイミダゾールを添加する等の方法を用いると良い。あるいは、発現ベクターとしてｐＴＹＢ１（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ　Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いた場合のようにタグがインテインを含む場合はｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌなどで還元条件として切断する。アフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能とする融合タンパク質には、ヒスチジンタグの他にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、あるいはチオレドキシン（ＴＲＸ）等も公知である。ＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ親和性レジンによって精製することができる。
【０１０５】
ＰＨＡ合成酵素の活性測定は、既報の各種方法を用いることができるが、例えば、３−ヒドロキシアシルＣｏＡがＰＨＡ合成酵素の触媒作用により重合してＰＨＡになる過程で放出されるＣｏＡを、５、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）で発色させて測定することを測定原理とする、以下に示す方法によって測定することができる。試薬１：ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１　Ｍ　トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に３．０　ｍｇ／ｍｌ溶解、試薬２：３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを０．１　Ｍ　トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）　に３．０　ｍＭ溶解、試薬３：トリクロロ酢酸を０．１　Ｍ　トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）　に１０　ｍｇ／ｍｌ溶解、試薬４：５、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を０．１　Ｍ　トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）　に２．０　ｍＭ溶解。第１反応（ＰＨＡ合成反応）：試料（酵素）溶液１００μｌに試薬１を１００μｌ添加して混合し、３０℃で１分間プレインキュベートする。ここに、試薬２を１００μｌ添加して混合し、３０℃で１〜３０分間インキュベートしたのち、試薬３を添加して反応を停止させる。第２反応（遊離ＣｏＡの発色反応）：反応停止した第１反応液を遠心分離（１５、０００×ｇ、１０分間）し、この上清５００μｌに試薬４を５００μｌ添加し、３０℃で１０分間インキュベートしたのち、４１２　ｎｍの吸光度を測定する。酵素活性の算出：１分間に１μｍｏｌのＣｏＡを放出させる酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【０１０６】
＜構造体の作製＞
本発明のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の製造方法の一例としては、▲１▼基材に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むＰＨＡ合成酵素を基材に固定化する工程、▲２▼基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡを添加する工程、▲３▼ＰＨＡ合成反応を行う工程、▲４▼ＰＨＡにより被覆されたポリヒドロキシアルカノエート含有構造体を用途に応じて必要なら加工する工程、を少なくとも有する方法を挙げることができる。
【０１０７】
本発明の基材に対する結合能を有するアミノ酸配列は、ランダムペプチドライブラリのスクリーニングによって決定されたアミノ酸配列もしくは基材の化学的性質により合理的に設計されたアミノ酸配列である。
【０１０８】
本発明に用いられるランダムペプチドライブラリとしては、ランダムペプチドを可溶性の形で化学的に合成したランダム合成ペプチドライブラリーや、樹脂ビーズ上で合成した固相固定化ペプチドライブラリー、化学合成されたランダム配列のＤＮＡをリボソーム無細胞系で生合成したペプチドライブラリ、例えばＭ１３　系ファージの表面蛋白質（例えばｇｅｎｅＩＩＩ　蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結して調製されたファージディスプレイペプチドライブラリー、同様の手法で細菌の膜タンパク質、Ｏｍｐ　Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　ら、１９９３、ＰＮＡＳ、９０、１０４４４−１０４４８あるいはＰｉｓｔｏｒ　と　Ｈｏｂｏｒｎ、１９８９、Ｋｌｉｎ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．、６６、１１０−１１６）、ＰＡＬ（Ｆｕｃｈｓ　ら、１９９１、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、１３６９−１３７２）、Ｌａｍｂ（Ｃｈａｒｂｉｔ　ら、１９８８、Ｇｅｎｅ、７０、１８１−１８９　及び　Ｂｒａｄｂｕｒｙ　ら、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５６５−１５６８）、フィンブリン（Ｈｅｄｅｇａａｒｄ　と　Ｋｌｅｍｍ、１９８９、Ｇｅｎｅ、８５、１１５−１２４　及び　Ｈｏｆｎｕｎｇ、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、３４、７７−１０５）、およびＩｇＡプロテアーゼβ領域（Ｋｌａｕｓｅｒ　ら、１９９０、ＥＭＢＯ　Ｊ．、９、１９９１−１９９９）に融合して提示したランダムペプチドライブラリ、などを挙げることができる。
【０１０９】
これらのランダムペプチドライブラリを用いて基材に対して結合能を有するアミノ酸配列をスクリーニング手法としては、化学合成ペプチドライブラリを用いる場合には、ペプチドライブラリと基材とを接触させ、基材に対して結合能を有しないペプチドを除き、しかる後に基材に結合しているペプチドを回収しエドマン分解等を用いてそのアミノ酸配列を決定する。
【０１１０】
一方、ファージディスプレイペプチドライブラリーを用いる場合には、基材が粒形の場合にはカラムやプレート上に該基材を固定化し、あるいは基材が板状の場合にはそのままその表面に、上記のライブラリーを添加することによって接触させ結合ファージを残し非結合ファージは洗浄で洗い流す。洗浄後残ったファージを酸などにより溶出し緩衝液で中和した後大腸菌に感染させファージを増幅する。この選別を複数回繰り返すと目的の基材に結合能のある複数のクローンが濃縮される。ここで単一なクローンを得るため再度大腸菌に感染させた状態で培地プレート上にコロニーを作らせる。それぞれの単一コロニーを液体培地で培養した後、培地上清中に存在するファージをポリエチレングリコール等で沈殿精製し、その塩基配列を解析すればペプチドの構造を知ることができる。
ファージディスプレイペプチドライブラリを用いた基材に対して結合能を有するペプチドのスクリーニングは、基材に対してより強く結合するファージを濃縮する、いわゆるパンニング操作を含んでいるために、より信頼性のあるペプチド候補を選別できるので本発明に好適に用いることができる。ファージランダムペプチドライブラリーを構築する方法としては、例えばＭ１３　系ファージの表面蛋白質（例えばｇｅｎｅＩＩＩ　蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結し作製すれば良い。その方法としてはＳｃｏｔｔ、　ＪＫ．ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ、　ＧＰ．、　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．　２４９、　３８６、　１９９０、　やＣｗｉｒｌａ、　ＳＥ　ｅｔ　ａｌ．、　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　Ｖｏｌ．　８７、　６３７８、　１９９０　等の報告がある。挿入する遺伝子の大きさはペプチドが安定に発現できれば特に制限はないが、作製したライブラリーがすべてのランダム配列を網羅し、しかも結合能を有するためには６から４０アミノ酸に相当する長さ（分子量約６００から４０００に相当）が適当で、中でも７から１８アミノ酸が好ましい。
【０１１１】
ファージディスプレイペプチドライブラリのスクリーニングによって、基材に対して結合能を有するペプチドが、二種類以上得られた場合には、これらのペプチドからなる群より選ばれた少なくとも１つのペプチドの、全部または一部分のアミノ酸配列を適当な組合せで直列に繋いだ配列を、基材に対して結合能を有するペプチドとして用いても良い。この際、二種類のアミノ酸配列の間には適当なスペーサー配列を設けることが望ましい。スペーサー配列としては、約３〜約４００アミノ酸が好ましく、また、スペーサー配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペーサー配列は、ＰＨＡ合成酵素が機能するのを妨害せず、また、ＰＨＡ合成酵素が基材に結合するのを妨害しないものである。
【０１１２】
本発明の基材に対する結合能を有するアミノ酸配列は、ランダムペプチドライブラリのスクリーニングによって決定されたアミノ酸配列の他、基材の化学的性質により合理的に設計されたアミノ酸配列とすることもできる。
【０１１３】
基材に対するＰＨＡ合成酵素の固定化は、合成酵素に融合され提示された該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列を介して成される。ＰＨＡ合成酵素などの酵素タンパク質は、アミノ酸が多数結合したポリペプチドであり、リシン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの遊離のイオン性基を有するアミノ酸によってイオン吸着体としての性質を示し、またアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリンなどの遊離の疎水性基を有するアミノ酸によって、また有機高分子であるという点で疎水吸着体としての性質を有している。従って、程度の差はあるが、イオン性や疎水性、もしくはイオン性と疎水性の両方の性質を有する基材に固定化させることが可能である。
【０１１４】
主にイオン性官能基を表面に露出している基材、例えば、粘土鉱物や金属酸化物等を主要な成分とする無機顔料を基材として用いる場合には、合成酵素に融合され提示される該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列として、リシン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの遊離のイオン性基を有するアミノ酸を多く含んだ配列を選ぶことによって、イオン吸着法によってＰＨＡ合成酵素を固定化することができる。
【０１１５】
また、主に表面が非極性である基材、例えば、芳香環を複数有するアゾ顔料や縮合多環のフタロシアニン系顔料、アントラキノン系顔料等の有機顔料、カーボンブラックなどの炭素結晶からなる無機顔料を基材として用いる場合には、合成酵素に融合され提示される該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列として、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリンなどの遊離の疎水性基を有するアミノ酸を多く含んだ配列を選ぶことによって、疎水吸着によってＰＨＡ合成酵素を固定化することができる。
【０１１６】
上記方法により得られた基材に対する結合能を有するペプチドのアミノ酸配列は、通常の遺伝子工学的手法を用いて、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素に融合して利用される。基材に対する結合能を有するペプチドはポリヒドロキシアルカノエート合成酵素のＮ末端あるいはＣ末端に連結して発現することができる。また適当なスペーサー配列を挿入して発現することもできる。
【０１１７】
スペーサー配列としては、約３〜約４００アミノ酸が好ましく、また、スペーサー配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペーサー配列は、ＰＨＡ合成酵素が機能するのを妨害せず、また、ＰＨＡ合成酵素が基材に結合するのを妨害しないものである。
【０１１８】
前記ファージディスプレイペプチドライブラリのスクリーニングなどの操作によって、基材に対して結合能を有するペプチドが、二種類以上決定された場合には、これらのペプチドをそれぞれ個別にＰＨＡ合成酵素に融合した、複数種類のＰＨＡ合成酵素を、混合物として本発明に用いることができる。
【０１１９】
基材に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むＰＨＡ合成酵素の分離・精製方法は、上述したように、該ＰＨＡ合成酵素の酵素活性が保持される方法であればいかなる方法をも用いることができる。
【０１２０】
基材にＰＨＡ合成酵素を固定化する工程は、基材に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むＰＨＡ合成酵素を水性媒体中で基材と接触させることにより達成される。
【０１２１】
本工程のＰＨＡ合成用の水性媒体の組成は、ＰＨＡ合成反応を行う工程を妨げないものであればよいが、後の工程の省略化を図るために、ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る組成としておくこともできる。ここで、ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る組成として、例えば緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、生化学的反応に用いられる一般的な緩衝液、例えば、酢酸バッファー、リン酸バッファー、リン酸カリウムバッファー、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）バッファー、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳ）バッファー、トリス塩酸バッファー、グリシンバッファー、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（ＣＨＥＳ）バッファーなどが好適に用いられる。ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る緩衝液の濃度は、一般的な濃度、即ち５ｍＭから１．０Ｍの範囲で使用することができるが、望ましくは１０〜２００ｍＭで行うことが好ましい。また、ｐＨは５．５から９．０、好ましくは７．０から　８．５となるように調製するが、使用するＰＨＡ合成酵素の至適ｐＨやｐＨ安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【０１２２】
また、基材が粉体の場合、水性媒体中での基材の分散状態を保つために、後の工程を妨げない種類及び濃度であれば、適当な界面活性剤を添加してもよい。このような界面活性剤の例として、例えばオレイン酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルピリジニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤、３−〔（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、パルミトイルリゾレシチン、ドデシル−β−アラニン等の両性イオン界面活性剤、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０）、ポリオキシエチレンドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ、Ｌｕｂｒｏｌ）、ポリオキシエチレン−ｉ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ）ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（Ｎｏｎｉｄｅｔ　　Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｎ）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（Ｓｐａｎ）、ポリオキシエチレンソリビトールエステル（Ｔｗｅｅｎ）等の非イオン界面活性剤などを挙げることが出来る。
【０１２３】
また、水性媒体中での粉体状基材の分散状態を保つために、後の工程を妨げない種類及び濃度であれば、適当な補助溶媒を添加してもよい。補助溶媒としては、例えばヘキサン等、直鎖脂肪族炭化水素、またメタノール、エタノール等の１価アルコール類やグリセロール等の多価アルコール類及び脂肪酸エーテル類、カルボン酸エステル類等の誘導体から選ばれる一種又は二種以上のものを選択し使用することができる。
【０１２４】
イオン吸着法または疎水吸着法によるＰＨＡ合成酵素の基材への固定化は、基材とＰＨＡ合成酵素を所定の水性媒体中で所定の濃度となるように混合することによって達成される。このとき、酵素が基材の表面に均等に吸着されるよう、反応容器を適当な強度で振盪あるいは攪拌することが望ましい。
【０１２５】
上記固定化処理において、基材と酵素の混合された水性媒体の組成としては、水性媒体のｐＨや塩濃度によって基材およびＰＨＡ合成酵素の表面電荷の正負や電荷量、疎水性が変化するので、それを考慮した組成とするのが望ましい。例えば、基材が主にイオン吸着性である場合には、塩濃度を下げることにより、基材とＰＨＡ合成酵素との吸着に寄与する電荷量を増やすことができる。また、ｐＨを変える事により、両者の反対電荷を増やすことができる。基材が主に疎水吸着性である場合には、塩濃度を上げることによって両者の疎水性を増やすことができる。また、予め電気泳動やぬれ角等を測定し、基材やＰＨＡ合成酵素の荷電状態や疎水性を調べることで、吸着に適した組成を設定をすることもできる。さらに、基材とＰＨＡ合成酵素との吸着量を直接測定して組成を求めることもできる。吸着量の測定は、例えば、基材に濃度既知のＰＨＡ合成酵素溶液を添加し、吸着処理を行った後、溶液中のＰＨＡ合成酵素濃度を測定し、差し引き法により吸着酵素量を求める等の方法を用いればよい。
【０１２６】
イオン吸着法や疎水吸着法による酵素の固定化を補強する目的で、操作の煩雑さや酵素の失活の可能性を考慮すれば共有結合法によってもかまわない。例えば、芳香族アミノ基を有する基材をジアゾ化し、これに酵素をジアゾカップリングする方法や、カルボキシル基、アミノ基を有する基材と酵素の間にペプチド結合を形成させる方法、ハロゲン基を有する基材と酵素のアミノ基等との間でアルキル化する方法、臭化シアンで活性化した基材と酵素のアミノ基を反応させる方法、基材のアミノ基と酵素のアミノ基との間を架橋する方法、アルデヒド基またはケトン基を有する化合物とイソシアニド化合物の存在下、カルボキシル基、アミノ基を有する基材と酵素を反応させる方法、ジスルフィド基を有する基材と酵素のチオール基との間で交換反応させる方法などがある。
【０１２７】
上記方法により作製された固定化酵素は、そのままでも用いることができるが、さらに凍結乾燥等を施した上で使用することもできる。酵素の固定化処理を行う時間は１分から２４時間が望ましく、より望ましくは１０分から１時間である。過剰な静置あるいは放置は酵素活性の低下を招くので好ましくない。
【０１２８】
３−ヒドロキシアシルＣｏＡの重合によりＰＨＡが合成される反応において放出されるＣｏＡ量が１分間に１μｍｏｌとなるＰＨＡ合成酵素量を１単位（Ｕ）としたとき、基材に固定する酵素の量は、例えば基材がカプセル構造体のコアである場合、基材１　ｇあたり１０　単位（Ｕ）から１、０００単位（Ｕ）、望ましくは５０　単位（Ｕ）から５００単位（Ｕ）　の範囲内に設定すると良い。
【０１２９】
基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡを添加する工程では、前記の固定化酵素は所望のＰＨＡの原料となる３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む水系反応液中に投入され、基材表面のＰＨＡ合成酵素によりＰＨＡが合成されることにより、基材がＰＨＡにより被覆された構造体を形成する。上記水系反応液は、ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る条件に調整された反応系として構成されるべきであり、例えば通常、ｐＨ５．５からｐＨ９．０、好ましくはｐＨ７．０からｐＨ　８．５となるよう、緩衝液により調製する。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適ｐＨやｐＨ安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。緩衝液の種類は、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば、設定するｐＨ領域等に応じて適宜選択して用いることができるが、例えば、一般の生化学反応に用いられる緩衝液、具体的には、酢酸バッファー、リン酸バッファー、リン酸カリウムバッファー、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）バッファー、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳ）バッファー、トリス塩酸バッファー、グリシンバッファー、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（ＣＨＥＳ）バッファーなどを用いると良い。緩衝液の濃度も、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば特に限定はされないが、通常５．０　ｍＭから１．０　Ｍ、好ましくは０．１　Ｍから０．２　Ｍの濃度のものを使用すると良い。反応温度は、使用するＰＨＡ合成酵素の特性に応じて適宜設定するものであるが、通常、４℃から５０℃、好ましくは２０℃から４０℃に設定すると良い。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適温度や耐熱性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。反応時間は、使用するＰＨＡ合成酵素の安定性等にもよるが、通常、１分間から２４時間、好ましくは３０分間から３時間の範囲内で適宜選択して設定する。反応液中の３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度は、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る範囲内で適宜設定するものであるが、通常、０．１　ｍＭから１．０　Ｍ、好ましくは０．２　ｍＭから０．２　Ｍの範囲内で設定すると良い。なお、反応液中における３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度が高い場合、一般に、反応系のｐＨが低下する傾向にあるため、３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度を高く設定する場合は、前記の緩衝液濃度も高めに設定することが好ましい。
また、上記工程において、水系反応液中の３−ヒドロキシアシルＣｏＡの種類や濃度などの組成を経時的に変化させることによって、基材の垂直方向に基材を被覆するＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることができる。
【０１３０】
このモノマーユニット組成の変化した基材の形態として、例えば、ＰＨＡ被膜の組成変化が連続的で、垂直方向に組成の勾配を形成した１層のＰＨＡが基材を被覆した形態を挙げることができる。製造方法としては、例えば、ＰＨＡを合成しながら反応液中に別組成の３−ヒドロキシアシルＣｏＡを添加するなどの方法によればよい。
【０１３１】
また別の形態として、ＰＨＡ被膜の組成変化が段階的で、組成の異なるＰＨＡが基材を多層に被覆した形態を挙げることができる。この製造方法としては、ある３−ヒドロキシアシルＣｏＡの組成でＰＨＡを合成した後、洗浄などによって調製中の基材を反応液からいったん回収し、これに異なる３−ヒドロキシアシルＣｏＡの組成からなる反応液を再度添加するなどの方法によればよい。
【０１３２】
上記反応により得られた構造体は、必要に応じて、洗浄工程に供する。構造体の洗浄方法は、該構造体製造の目的上好ましくない変化を、該構造体に及ぼすものでない限り、特に限定はされない。構造体が、基材をコアとしＰＨＡを外被とするカプセル構造体である場合は、例えば、遠心分離によって該構造体を沈殿させ、上清を除去することによって、反応液に含まれる不要成分を除去することができる。ここに水、緩衝液、メタノール等の該ＰＨＡが不溶である洗浄剤を添加し、遠心分離をする操作を行うことにより、さらに洗浄することもできる。また、遠心分離の替わりに、濾過等の手法を用いても良い。一方、構造体が、平板状の基材をＰＨＡで被覆した構造体である場合は、例えば、上記洗浄剤に浸漬するなどして洗浄することができる。さらに、上記構造体は、必要に応じて、乾燥工程に供することができる。さらに該構造体に各種二次加工や化学修飾等の処理を施して使用することもできる。
【０１３３】
例えば、基材表層のＰＨＡに化学修飾を施すことにより、さらに有用な機能・特性を備えたポリヒドロキシアルカノエート含有構造体を得ることができる。例えば、グラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたポリヒドロキシアルカノエート含有構造体を得ることができる。例えば、後述するポリシロキサンをグラフト鎖として導入すれば、機械的強度、分散性、耐候性、撥（耐）水性、耐熱性等が向上したポリヒドロキシアルカノエート含有構造体を得ることができる。また、基材表層のＰＨＡを架橋化せしめることにより、ポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の機械的強度、耐薬品性、耐熱性などを向上させることが可能である。
【０１３４】
化学修飾の方法は、所望の機能・構造を得る目的を満たす方法であれば特に限定はされないが、例えば、反応性官能基を側鎖に有するＰＨＡを合成し、該官能基の化学反応を利用して化学修飾する方法を、好適な方法として用いることができる。
【０１３５】
前記の反応性官能基の種類は、所望の機能・構造を得る目的を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、前記したエポキシ基を例示することができる。エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡは、通常のエポキシ基を有するポリマーと同様の化学的変換を行うことができる。具体的には、例えば水酸基に変換したり、スルホン基を導入することが可能である。また、チオールやアミンを有する化合物を付加することもでき、例えば、末端に反応性官能基を有する化合物、具体的には、エポキシ基との反応性が高いアミノ基を末端に有する化合物などを添加して反応させることにより、ポリマーのグラフト鎖が形成される。
【０１３６】
アミノ基を末端に有する化合物としては、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、アミノ変性ポリシロキサン（アミノ変性シリコーンオイル）などのアミノ変性ポリマーを例示することができる。このうち、アミノ変性ポリシロキサンとしては、市販の変性シリコーンオイルを使用しても良く、また、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、７８、２２７８（１９５６）などに記載の方法で合成して使用することもでき、該ポリマーのグラフト鎖の付加による機械的強度、分散性、耐光性、耐候性、撥（耐）水性、耐熱性の改善等の効果が期待できる。
また、エポキシ基を有するポリマーの化学的変換の他の例として、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミン化合物、無水コハク酸、２−エチル−４−メチルイミダゾールなどによる架橋反応が、物理化学的変換の例として電子線照射などによる架橋反応が挙げられる。このうち、エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡとヘキサメチレンジアミンとの反応は、下記のスキームに示すような形で進行し、架橋ポリマーが生成する。
【０１３７】
【化６４】
2004065001.tif 000030
【０１３８】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体において、基材に固定化された酵素は、該ポリヒドロキシアルカノエートと該基材との親和性および密着性を高め、該基材を被覆する該ポリヒドロキシアルカノエートを剥がれにくくする、という効果がある。
【０１３９】
得られた構造体において、基材がＰＨＡで被覆されていることを確認する方法としては、一般には、例えば、ガスクロマトグラフィー等による組成分析と電子顕微鏡等による形態観察とを組み合わせた方法や、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）とイオンスパッタリング技術を用いて、各構成層のマススペクトルから構造を判定する方法などを用いることができる。しかし、さらに直接的かつ簡便な確認方法として、本発明者らによって新たに開発された、ナイルブルーＡ染色と蛍光顕微鏡観察とを組み合わせた方法を用いることもできる。本発明者らは、ＰＨＡ合成酵素を用いた無細胞系（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でのＰＨＡ合成を簡便に判定できる方法について鋭意検討を続けてきた結果、ＰＨＡに特異的に結合して蛍光を発する性質を有する薬剤であり、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４４、２３８−２４１（１９８２）　において微生物細胞（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でのＰＨＡ生産の簡易的判別に用いることができると報告されているナイルブルーＡが、適切な使用方法および使用条件の設定によって、無細胞系でのＰＨＡ合成の判定にも用いることができることを見出し、上記の方法を完成させた。即ち、本方法では、所定濃度のナイルブルーＡ溶液を濾過したのち、ＰＨＡを含む反応液に混合し、蛍光顕微鏡で一定の波長の励起光を照射しながら観察することにより、合成されたＰＨＡのみから蛍光を発せしめ、これを観察することによって、無細胞系でのＰＨＡ合成を簡易に判定することができる。使用した基材が上記条件下で蛍光を発する性質を有するものでない限り、上記方法を本発明の構造体の製造に応用することにより、基材の表面を被覆したＰＨＡを直接的に観察し、評価することができる。
【０１４０】
ＰＨＡの分子量は特に制限はないが、ポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の強度を維持するため、数平均分子量が１，０００〜１０，０００，０００、より好ましくは、３，０００〜１，０００，０００の範囲とするのが望ましい。ＰＨＡの分子量は、ポリヒドロキシアルカノエート含有構造体からクロロホルムによってＰＨＡを抽出した後、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によって測定すればよい。
【０１４１】
＜構造体の利用＞
本発明の特徴の一つは、通常の有機合成化学的手法では製造が困難であった構造体の製造を可能にしたことであり、従って、従来の有機合成化学的手法で製造されたカプセル構造体や積層構造体にはない優れた特性を付与した構造体を得ることが可能である。例えば、従来の有機合成的手法では実現が困難であった新たな高分子化合物の利用や、新たな機能・構造の付与が可能になる。さらに具体的には、生物の触媒作用に特有の極めて厳密な分子認識能や立体選択性を利用して、従来の有機合成化学的手法では実現が困難であった新たな機能性高分子化合物や、極めてキラリティーの高い高分子化合物により被覆されたカプセル構造体や積層構造体等を、極めて簡便なプロセスで製造することが可能になる。
【０１４２】
上記の如き構造体の応用の一例としては、電子写真用高機能カプセルトナーや分散安定性に優れたマイクロカプセル化顔料インク、電気泳動表示用電気泳動粒子、カラーフィルター用着色組成物などが挙げられる。
【０１４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は本発明の最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１４４】
（参考例１）　ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製、および、ＰＨＡ合成酵素の生産
ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体を以下の方法で作製した。即ちＹＮ２株を１００　ｍＬのＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で３０℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全分解した。ベクターにはｐＵＣ１８を使用し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。末端の脱リン酸処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、１、５７２、（１９８９）；　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）ののち、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造）を用いて、ベクターの切断部位（クローニングサイト）と染色体ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ完全分解断片とを連結した。この染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドベクターを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を形質転換し、ＹＮ２株のＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１４５】
次に、ＹＮ２株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号：５および配列番号：６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク）、このオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅されてきたＤＮＡ断片をプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販の標識酵素系ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔ（アマシャムファルマシア・バイオテク）を利用して行った。得られた標識化プローブを用いて、ＹＮ２株の染色体ＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法によってＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【０１４６】
ここで取得した遺伝子ＤＮＡ断片を、不和合性グループであるＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ、あるいはＩｎｃＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターｐＢＢＲ１２２（Ｍｏ　Ｂｉ　Ｔｅｃ）に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株（ＰＨＡ合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、ＹＮ２ｍｌ株のＰＨＡ合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ断片は、シュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【０１４７】
このＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド鎖をコードする、配列番号：２および配列番号：４で示される塩基配列が存在することが確認された。下で述べるように、個々のペプチド鎖からなる蛋白質は、ともに酵素活性を有しており、配列番号：２および配列番号：４で示される塩基配列はそれぞれＰＨＡ合成酵素遺伝子であることを確認することができた。すなわち、配列番号：１に示すアミノ酸配列を配列番号：２の塩基配列はコードしており、配列番号：３に示すアミノ酸配列を配列番号：４の塩基配列はコードしており、この何れか一方のアミノ酸配列を有する蛋白質のみで、ＰＨＡ合成能が発揮されることを確認した。
【０１４８】
配列番号：２で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子について、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。
【０１４９】
配列番号：２で示される塩基配列に対して、上流側プライマーとなる、その開始コドンよりも上流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：７）および下流側プライマーとなる、終止コドンよりも下流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：８）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク）。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０１５０】
同様に、配列番号：４で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子についても、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。配列番号：４で示される塩基配列に対して、上流側プライマーとなる、その開始コドンよりも上流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：９）および下流側プライマーとなる、終止コドンよりも下流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：１０）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク）。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０１５１】
次に、得られたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＰＣＲ増幅断片を、それぞれについて制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いて完全分解した。また、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａも制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、１巻、５７２頁、１９８９年；Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）した。この発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造）を用いて連結した。
【０１５２】
得られた組換えプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１：宝酒造）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドをそれぞれ回収した。配列番号：２の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをｐＹＮ２−Ｃ１（配列番号２由来）、配列番号：４の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをｐＹＮ２−Ｃ２（配列番号４由来）とした。
【０１５３】
ｐＹＮ２−Ｃ１、ｐＹＮ２−Ｃ２で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１ｆＢ　ｆａｄＢ欠損株）を塩化カルシウム法により形質転換し、それぞれの組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株、ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株、ｐＹＮ２−Ｃ２組換え株を得た。
【０１５４】
ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株、ｐＹＮ２−Ｃ２組換え株それぞれを酵母エキス０．５％、オクタン酸０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌに植菌して、３７℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、常法によりプラスミドＤＮＡを回収した。
【０１５５】
ｐＹＮ２−Ｃ１に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１１）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１２）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク）。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＹＮ２−Ｃ１をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ制限部位、下流にＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０１５６】
同様にｐＹＮ２−Ｃ２に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１３）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１４）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク）。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＹＮ２−Ｃ２をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０１５７】
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ‐６Ｐ‐１（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）の対応する部位に挿入した。これらのベクター（ｐＧＥＸ−Ｃ１およびｐＧＥＸ−Ｃ２）を用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加　（終濃度　１ｍＭ）　し、３７℃で４￣１２時間培養を続けた。
【０１５８】
ＩＰＴＧ　誘導した大腸菌を集菌　（８０００×ｇ、　２分、４℃）　し、１／１０　量の　４℃　ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心　（８０００×ｇ、　１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｂｅａｄｓ：　アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。
【０１５９】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８０００×ｇ、１分、４℃）　した後、４％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース　４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬ　に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ１およびＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ２をグルタチオンセファロースに吸着させた。
吸着後、遠心　（８０００×ｇ、　１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０　ｍＭグルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心　（８０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【０１６０】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１およびＹＮ２−Ｃ２の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそれぞれ６０．８ｋＤａ、および６１．５ｋＤａのシングルバンドを示すことを確認した。
【０１６１】
各精製酵素活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。各精製酵素の活性測定の結果を表１に示した。
【０１６２】
【表１】
2004065001.tif 000031
【０１６３】
該酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０　Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。
【０１６４】
（参考例２）　３−ヒドロキシアシルＣｏＡの合成
（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイル−ＣｏＡは、Ｒｅｈｍ　ＢＨＡ、　Ｋｒｕｇｅｒ　Ｎ、　Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ　Ａ　（１９９８）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７３　ｐｐ２４０４４−２４０５１に基づき、若干の変更を加え次のように行った。ａｃｙｌ−ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を、２　ｍＭ　ＡＴＰ、　５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、　２　ｍＭ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ、　２ｍＭ　（Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏａｔｅを含むトリス塩酸緩衝液（５０　ｍＭ、　ｐＨ　７．５）に溶解し、０．１ミリユニット／マイクロリットルとした。３７℃の温浴中で保温し、適時サンプリングし反応の進行をＨＰＬＣで分析した。サンプリングした反応溶液に硫酸を０．０２　Ｎになるように添加して酵素反応を止めた後、ｎ−ｈｅｐｔａｎｅで未反応の基質である（Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏａｔｅを抽出して除去した。ＨＰＬＣによる分析には、ＲＰ１８カラム（ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃ１８、　７ｍｍ、　Ｋｎａｕｓｅｒ）を用い、２５　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　５．３）を移動相として、アセトニトリルの直線濃度勾配をかけて溶出し、ダイオードアレイ検出器で２００から５００　　ｎｍの吸光スペクトルをモニターすることによって、酵素反応によって生成したチオエステル化合物を検出した。同様にして、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡおよび（Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）バレリルＣｏＡを調製した。
【０１６５】
（実施例１）　銅フタロシアニンに対する結合能を有するアミノ酸配列の取得
▲１▼銅フタロシアニン　（ａ型　東京化成工業社製）をメタノールに５　ｍｇ／ｍｌの濃度に成るように懸濁した。この１．５ｍｌをポリスチレン製プレートに加え、メタノールを蒸発させて除くことによって、ポリスチレン製プレートの表面に銅フタロシアニンの皮膜を固着させた。固着した銅フタロシアニンの皮膜は０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファー（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．５、　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ）で洗浄しても脱離しないことを確認した。
▲２▼ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキングバッファー（　０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）、　５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、　０．１ｍｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、　０．０２％ＮａＮ３）を、銅フタロシアニンの固着したポリスチレン製プレートに満たし４℃で１時間静置した。その後ブロッキングバッファーを捨てＴＢＳＴバッファー（ＴＢＳバッファー　＋　０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを１０回洗浄した。
▲３▼Ｐｈ．Ｄ．−７ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）の１．４　ｘ　１０１１ｐｆｕ相当をプレートに添加し、２５℃で６０分間静置した。
▲４▼プレートの溶液を捨て、ＴＢＳＴバッファーで１０回洗浄した。
▲５▼１ｍｌの溶出バッファー（０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）、　１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を加えて３分間静置した後、溶液を微量遠沈チューブに移し、１５０ｍｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、溶出されたファージを得た。
▲６▼溶出されたファージを対数増殖初期の大腸菌ＥＲ２５３７（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）に感染させ増幅した。３７℃で４．５時間培養した。次にファージを遠心分離により細胞から分離し、ポリエチレングリコールの沈殿により精製した。精製、増幅されたファージはＴＢＳバッファーに懸濁され、適当な希釈系列を大腸菌に感染させることによって力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。
▲７▼増幅されたファージを用いて、前記▲１▼から▲６▼をあと３回繰返した。ただし用いるＴＢＳＴバッファー中のＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０．５％に上げることによって、洗浄の条件を厳しくした。
２回目からは、ポリスチレン製プレートにＢＳＡによるブロッキングのみを行ったものに対しても同様の操作を行い、コントロールとした。各サイクルにおいて溶出されたファージの力価（ｔｉｔｅｒ）を表２に示す。
【０１６６】
【表２】
2004065001.tif 000032
【０１６７】
最終的に溶出されたファージを大過剰の大腸菌に感染させることによってクローン化した。各クローンを大腸菌に感染させ増幅した後、ｓｓＤＮＡを調製し、ランダム領域の塩基配列を解読し、ディスプレイしているペプチドのアミノ酸配列を決定した。その結果、ピックアップした３０クローンのアミノ酸配列と頻度を表３に示す。
【０１６８】
【表３】
2004065001.tif 000033
【０１６９】
アミノ酸配列ＶｘＨｘＬＶｘなる銅フタロシアニン結合モチーフ、特にアミノ酸配列ＶＦＨＫＬＶＷ（配列番号：１５）なる銅フタロシアニン結合配列を決定することができた。
【０１７０】
（実施例２）　銅フタロシアニンに対する結合能を有するＰＨＡ合成酵素の調製
アミノ酸配列ＶＦＨＫＬＶＷ（配列番号：１５）なる銅フタロシアニン結合配列を、スペーサー配列ＧＧＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡは二本鎖合成オリゴヌクレオチドとして作製し、ｐＧＥＸ−Ｃ１プラスミドの適切な制限開裂部位（ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ）にライゲーションする。この場合に、２つの合成オリゴヌクレオチドＯ１（５’　ＧＡＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＡＴＴＡＧＴＧＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＧＧＡＧＣＴ、配列番号：１６）およびＯ２（５’　ＣＣＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＣＴＡＡＴＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＣＧ、配列番号：１７）を製造業者の説明に従いＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した。続いて８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させた。この二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のクローニングに直接用いた。
【０１７１】
プラスミドｐＧＥＸ‐Ｃ１をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩにより消化し、前記二本鎖ＤＮＡ断片を挿入した。このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて調製したプラスミドＤＮＡをテンプレートとしてｐＧＥＸ５’　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いたシークエンシングによってインサートの塩基配列を決定することにより行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加　（終濃度　１ｍＭ）　し、３７℃で４￣１２時間培養を続けた。
【０１７２】
ＩＰＴＧ　誘導した大腸菌を集菌　（８０００×ｇ、　２分、４℃）　し、１／１０　量の　４℃　ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心　（８０００×ｇ、　１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｂｅａｄｓ：　アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。
【０１７３】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８０００×ｇ、１分、４℃）　した後、４％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース　４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬ　に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ１をグルタチオンセファロースに吸着させた。
【０１７４】
吸着後、遠心　（８０００×ｇ、　１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０　ｍＭグルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心　（８０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【０１７５】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより６１．９ｋＤａのシングルバンドを示すことを確認した。
【０１７６】
精製酵素活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。酵素濃度は１．９　Ｕ／ｍｌまた比活性は　４．０　Ｕ／ｍｇタンパク質であった。精製酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０　Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。
【０１７７】
（実施例３）　銅フタロシアニンに対する結合能の評価
銅フタロシアニンを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。この１０ｍｌをテフロン製遠沈管にとり、ここに、実施例２で調整したＰＨＡ合成酵素ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）および参考例１で調整したＹＮ２−Ｃ１の０．５Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうした。遠心分離操作（１０、０００　ｘ　ｇ、４℃、１０分間）によって銅フタロシアニン粒子を沈殿として回収し、銅フタロシアニンに結合しなかった酵素を含む上清と分離した。銅フタロシアニンを再び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに懸濁し、遠心操作を繰返すことによって、銅フタロシアニンを洗浄した。洗浄した銅フタロシアニンの懸濁液の酵素活性を測定した結果を表４に示す。
【０１７８】
【表４】
2004065001.tif 000034
【０１７９】
コントロールの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、銅フタロシアニン結合配列を融合した酵素ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化できることが確かめられた。
【０１８０】
（実施例４）　銅フタロシアニンのＰＨＡカプセル構造体
銅フタロシアニンを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。この１０ｍｌをテフロン製遠沈管にとり、ここに、ＰＨＡ合成酵素ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）またはＹＮ２−Ｃ１の０．５Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうした。一度遠心分離操作によって銅フタロシアニンを回収し、これを再び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。次に参考例２で調整した　（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを終濃度５ｍＭになるように添加した。３７℃で３０分間インキュベートすることによって、合成反応を行った。
【０１８１】
反応液中で生成したＰＨＡをナイルブルーＡで染色し蛍光顕微鏡観察したところ、ＹＮ２−Ｃ１を添加した試料については遊離のＰＨＡグラニュールが観察されたが、ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）を添加した試料については遊離のＰＨＡグラニュールが観察されず、合成酵素による効率的なＰＨＡ合成がなされたことが確認できた。
【０１８２】
反応液を、遠心分離（１０、０００　ｘ　ｇ、４℃、１０分間）して、銅フタロシアニンをコアにするカプセル構造体の含水ケーキを得た。この含水ケーキを水に再懸濁した後、再度遠心分離操作によってカプセル構造体を回収した。この操作を３回繰返すことで洗浄した。
【０１８３】
作製したカプセル構造体の含水ケーキの一部を、真空乾燥したのち、２０　ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径　０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、図１に示す通り、当該ＰＨＡは３−ヒドロキシオクタン酸をモノマーユニットとするＰＨＡであることが確認された。さらに、該ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ　ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝２１、０００、Ｍｗ＝４０、０００であった。
【０１８４】
（実施例５）　カーボンブラックに対する結合能を有するアミノ酸配列の取得
▲１▼カーボンブラック　（シグマ　アルドリッチ　ジャパン社製）をメタノールに５　ｍｇ／ｍｌの濃度に成るように懸濁した。この１．５ｍｌをポリスチレン製プレートに加え、メタノールを蒸発させて除くことによって、ポリスチレン製プレートの表面にカーボンブラックの皮膜を固着させた。固着したカーボンブラックの皮膜は０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファー（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．５、　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ）で洗浄しても脱離しないことを確認した。
▲２▼ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキングバッファー（　０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）、　５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、　０．１ｍｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、　０．０２％ＮａＮ３）を、カーボンブラックの固着したポリスチレン製プレートに満たし４℃で１時間静置した。その後ブロッキングバッファーを捨てＴＢＳＴバッファー（ＴＢＳバッファー　＋　０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを１０回洗浄した。
▲３▼Ｐｈ．Ｄ．−７ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）の１．４　ｘ　１０１１ｐｆｕ相当をプレートに添加し、２５℃で６０分間静置した。
▲４▼プレートの溶液を捨て、ＴＢＳＴバッファーで１０回洗浄した。
▲５▼１ｍｌの溶出バッファー（０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）、　１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を加えて３分間静置した後、溶液を微量遠沈チューブに移し、１５０ｍｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、溶出されたファージを得た。
▲６▼溶出されたファージを対数増殖初期の大腸菌ＥＲ２５３７（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）に感染させ増幅した。３７℃で４．５時間培養した。次にファージを遠心分離により細胞から分離し、ポリエチレングリコールの沈殿により精製した。精製、増幅されたファージはＴＢＳバッファーに懸濁され、適当な希釈系列を大腸菌に感染させることによって力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。
▲７▼増幅されたファージを用いて、前記▲１▼から▲６▼をあと３回繰返した。ただし用いるＴＢＳＴバッファー中のＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０．５％に上げることによって、洗浄の条件を厳しくした。
２回目からは、ポリスチレン製プレートにＢＳＡによるブロッキングのみを行ったものに対しても同様の操作を行い、コントロールとした。各サイクルにおいて溶出されたファージの力価（ｔｉｔｅｒ）を表５に示す。
【０１８５】
【表５】
2004065001.tif 000035
【０１８６】
最終的に溶出されたファージを大過剰の大腸菌に感染させることによってクローン化した。各クローンを大腸菌に感染させ増幅した後、ｓｓＤＮＡを調製し、ランダム領域の塩基配列を解読し、ディスプレイしているペプチドのアミノ酸配列を決定した。その結果、ピックアップした３０クローンのアミノ酸配列と頻度を表６に示す。
【０１８７】
【表６】
2004065001.tif 000036
【０１８８】
アミノ酸配列ＷｘＷＩＬｘＮなるカーボンブラック結合モチーフ、特にアミノ酸配列ＷＦＷＩＬＶＮ（配列番号：１８）なるカーボンブラック結合配列を決定することができた。
【０１８９】
（実施例６）　カーボンブラックに対する結合能を有するＰＨＡ合成酵素の調製
アミノ酸配列ＷＦＷＩＬＶＮ（配列番号：１８）なるカーボンブラック結合配列を、スペーサー配列ＧＧＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＣ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡは二本鎖合成オリゴヌクレオチドとして作製し、ｐＧＥＸ−Ｃ２プラスミドの適切な制限開裂部位（ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ）にライゲーションする。この場合に、２つの合成オリゴヌクレオチドＯ３（５’　ＣＴＡＧＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＧＣ、配列番号：１９）およびＯ４（５’　ＴＣＧＡＧ　ＣＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡ　Ａ、配列番号：２０）を製造業者の説明に従いＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した。続いて８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させた。この二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のクローニングに直接用いた。
【０１９０】
プラスミドｐＧＥＸ‐Ｃ２をＳｐｅＩおよびＸｈｏＩにより消化し、前記二本鎖ＤＮＡ断片を挿入した。このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて調製したプラスミドＤＮＡをテンプレートとしてｐＧＥＸ　３’　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いたシークエンシングによってインサートの塩基配列を決定することにより行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加　（終濃度　１ｍＭ）　し、３７℃で４￣１２時間培養を続けた。
【０１９１】
ＩＰＴＧ　誘導した大腸菌を集菌　（８０００×ｇ、　２分、４℃）　し、１／１０　量の　４℃　ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心　（８０００×ｇ、　１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｂｅａｄｓ：　アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。
【０１９２】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８０００×ｇ、１分、４℃）　した後、４％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース　４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬ　に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ１をグルタチオンセファロースに吸着させた。
【０１９３】
吸着後、遠心　（８０００×ｇ、　１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０　ｍＭグルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心　（８０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【０１９４】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ２（ｃｂ）の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより６１．９ｋＤａのシングルバンドを示すことを確認した。
【０１９５】
精製酵素活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。酵素濃度は２．１　Ｕ／ｍｌまた比活性は　４．１　Ｕ／ｍｇタンパク質であった。精製酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０　Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。
【０１９６】
（実施例７）　カーボンブラックに対する結合能の評価
カーボンブラックを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。この１０ｍｌをテフロン製遠沈管にとり、ここに、実施例６で調整したＰＨＡ合成酵素ＹＮ２−Ｃ２（ｃｂ）および参考例１で調整したＹＮ２−Ｃ２の０．５Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうした。遠心分離操作（１０、０００　ｘ　ｇ、４℃、１０分間）によってカーボンブラック粒子を沈殿として回収し、カーボンブラックに結合しなかった酵素を含む上清と分離した。カーボンブラックを再び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに懸濁し、遠心操作を繰返すことによって、カーボンブラックを洗浄した。洗浄したカーボンブラックの懸濁液の酵素活性を測定した結果を表７に示す。
【０１９７】
【表７】
2004065001.tif 000037
【０１９８】
コントロールの酵素ＹＮ２−Ｃ２に比べて、カーボンブラック結合配列を融合した酵素ＹＮ２−Ｃ２（ｃｂ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化できることが確かめられた。
【０１９９】
（実施例８）　カーボンブラックのＰＨＡカプセル構造体
カーボンブラックを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。この１０ｍｌをテフロン製遠沈管にとり、ここに、ＰＨＡ合成酵素ＹＮ２−Ｃ２（ｃｂ）または　ＹＮ２−Ｃ２の０．５Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうした。一度遠心分離操作によってカーボンブラックを回収し、これを再び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。次に参考例２で調整した　（Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡを終濃度５ｍＭになるように添加した。３７℃で３０分間インキュベートすることによって、合成反応を行った。
反応液中で生成したＰＨＡをナイルブルーＡで染色し蛍光顕微鏡観察したところ、ＹＮ２−Ｃ２を添加した試料については遊離のＰＨＡグラニュールが観察されたが、ＹＮ２−Ｃ２（ｃｂ）を添加した試料については遊離のＰＨＡグラニュールが観察されず、合成酵素による効率的なＰＨＡ合成がなされたことが確認できた。
【０２００】
反応液を、遠心分離（１０、０００　ｘ　ｇ、４℃、１０分間）して、カーボンブラックをコアにするカプセル構造体の含水ケーキを得た。この含水ケーキを水に再懸濁した後、再度遠心分離操作によってカプセル構造体を回収した。この操作を３回繰返すことで洗浄した。
【０２０１】
作製したカプセル構造体の含水ケーキの一部を、真空乾燥したのち、２０　ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径　０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、図２に示す通り、当該ＰＨＡは３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸をモノマーユニットとするＰＨＡであることが確認された。さらに、該ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ　ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝１６、０００、Ｍｗ＝３６、０００であった。
【０２０２】
（実施例９）　シリコン基板に対する結合能を有するアミノ酸配列の取得
▲１▼単結晶シリコン基板　（ＦＺ法により製造、（１　０　０）面、比抵抗１００Ω・ｃｍ〜１ｋΩ・ｃｍ）の表面をメタノールで洗浄し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキングバッファー（　０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）、　５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、　０．１ｍｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、　０．０２％ＮａＮ３）で表面を満たし４℃で１時間静置した。その後ブロッキングバッファーを捨てＴＢＳＴバッファー（ＴＢＳバッファー　＋　０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）でシリコン基板を洗浄した。
▲２▼Ｐｈ．Ｄ．−７ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）の１．４　ｘ　１０１１ｐｆｕ相当をシリコン基板上に添加し、２５℃で６０分間静置した。
▲３▼シリコン基板上の溶液を捨て、ＴＢＳＴバッファーで洗浄した。
▲４▼１ｍｌの溶出バッファー（０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）、　１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を加えて表面を満たし３分間静置した後、溶液を微量遠沈チューブに移し、１５０ｍｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、溶出されたファージを得た。
▲５▼溶出されたファージを対数増殖初期の大腸菌ＥＲ２５３７（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）に感染させ増幅した。３７℃で４．５時間培養した。次にファージを遠心分離により細胞から分離し、ポリエチレングリコールの沈殿により精製した。精製、増幅されたファージはＴＢＳバッファーに懸濁され、適当な希釈系列を大腸菌に感染させることによって力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。
▲６▼増幅されたファージを用いて、前記▲１▼から▲５▼をあと３回繰返した。ただし用いるＴＢＳＴバッファー中のＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０．５％に上げることによって、洗浄の条件を厳しくした。
各サイクルにおいて溶出されたファージの力価（ｔｉｔｅｒ）を表８に示す。
【０２０３】
【表８】
2004065001.tif 000038
【０２０４】
最終的に溶出されたファージを大過剰の大腸菌に感染させることによってクローン化した。各クローンを大腸菌に感染させ増幅した後、ｓｓＤＮＡを調製し、ランダム領域の塩基配列を解読し、ディスプレイしているペプチドのアミノ酸配列を決定した。その結果、ピックアップした３０クローンのアミノ酸配列と頻度を表９に示す。
【０２０５】
【表９】
2004065001.tif 000039
【０２０６】
アミノ酸配列ＤＳｘｘＴＩＮなるシリコン基板結合モチーフ、特にアミノ酸配列ＤＳＨＦＴＩＮ（配列番号：２１）なるシリコン基板結合配列を決定することができた。
【０２０７】
（実施例１０）　シリコン基板に対する結合能を有するＰＨＡ合成酵素の調製
アミノ酸配列ＤＳＨＦＴＩＮ（配列番号：２１）なるシリコン基板結合配列を、スペーサー配列ＧＧＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡは二本鎖合成オリゴヌクレオチドとして作製し、ｐＧＥＸ−Ｃ１プラスミドの適切な制限開裂部位（ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ）にライゲーションする。この場合に、２つの合成オリゴヌクレオチドＯ５（５’　ＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＡ　ＣＡＴＴＴＴＡＣＴＡＴＴＡＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＧＧＡＧＣＴ、配列番号：２２）およびＯ６（５’　ＣＣＧＡＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＴＣＧ、配列番号：２３）を製造業者の説明に従いＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した。続いて８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させた。この二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のクローニングに直接用いた。
【０２０８】
プラスミドｐＧＥＸ‐Ｃ１をＢａｍＩおよびＳａｃＩにより消化し、前記二本鎖ＤＮＡ断片を挿入した。このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて調製したプラスミドＤＮＡをテンプレートとしてｐＧＥＸ　５’　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いたシークエンシングによってインサートの塩基配列を決定することにより行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加　（終濃度　１ｍＭ）　し、３７℃で４￣１２時間培養を続けた。
【０２０９】
ＩＰＴＧ　誘導した大腸菌を集菌　（８０００×ｇ、　２分、４℃）　し、１／１０　量の　４℃　ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心　（８０００×ｇ、　１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｂｅａｄｓ：　アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。
【０２１０】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８０００×ｇ、１分、４℃）　した後、４％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース　４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬ　に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ１をグルタチオンセファロースに吸着させた。
【０２１１】
吸着後、遠心　（８０００×ｇ、　１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０　ｍＭグルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心　（８０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【０２１２】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１（Ｓｉ）の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより６１．９ｋＤａのシングルバンドを示すことを確認した。
【０２１３】
精製酵素活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。酵素濃度は２．１　Ｕ／ｍｌまた比活性は　４．１　Ｕ／ｍｇタンパク質であった。精製酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０　Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。
【０２１４】
（実施例１１）　シリコン基板に対する結合能の評価
シリコン基板表面を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳＴバッファーで洗浄した。ここに、実施例１０で調整したＰＨＡ合成酵素ＹＮ２−Ｃ１（Ｓｉ）または参考例１で調整したＹＮ２−Ｃ１の０．５Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうした。ＴＢＳＴバッファーでシリコン基板表面を洗浄し、シリコン基板に結合しなかった酵素を除いた。洗浄したシリコン基板表面をＴＢＳＴバッファーで満たし、ここに酵素の基質である３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを加え、ＣｏＡの生成速度から、シリコン基板表面に固定化された酵素活性を測定した。結果を表１０に示す。
【０２１５】
【表１０】
2004065001.tif 000040
【０２１６】
コントロールの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、シリコン基板結合配列を融合した酵素ＹＮ２−Ｃ１（Ｓｉ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化できることが確かめられた。
【０２１７】
（実施例１２）　シリコン基板のＰＨＡ積層構造体
シリコン基板表面を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳＴバッファーで洗浄した。ここに、ＰＨＡ合成酵素ＹＮ２−Ｃ１（Ｓｉ）または　ＹＮ２−Ｃ１の０．５Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうした。ＴＢＳＴバッファーでシリコン基板表面を洗浄し、シリコン基板に結合しなかった酵素を除いた。洗浄したシリコン基板表面をＴＢＳＴバッファーで満たし、参考例２で調整した　（Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）バレリルＣｏＡを終濃度５ｍＭになるように添加した。３７℃で３０分間インキュベートすることによって、合成反応を行った。
反応液上清中およびシリコン基板上で生成したＰＨＡをナイルブルーＡで染色し蛍光顕微鏡観察したところ、ＹＮ２−Ｃ１を添加した試料については遊離のＰＨＡグラニュールが観察されたが、ＹＮ２−Ｃ１（Ｓｉ）を添加した試料については反応液上清中に遊離のＰＨＡグラニュールが観察されず、合成酵素による効率的なＰＨＡ合成がなされたことが確認できた。またシリコン基板上に積層したＰＨＡを蛍光染色観察することができた。
【０２１８】
作製したＰＨＡ積層シリコン基板構造体を、真空乾燥したのち、２０　ｍｌのクロロホルムに浸漬し、６０℃で２０時間攪拌して積層しているＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径　０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、図３に示す通り、当該ＰＨＡは（Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）吉草酸をモノマーユニットとするＰＨＡであることが確認された。さらに、該ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ　ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝１７、０００、Ｍｗ＝３７、０００であった。
（実施例１３）　カプセル構造体の作製（グラジェント構造）
実施例２で調整した発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）（１０　Ｕ／ｍｌ）１０質量部に沈降法によって粒径をそろえた銅フタロシアニン粒子（体積平均粒子径１．４５μｍ）１質量部、ＰＢＳ　３９質量部を添加し３０℃にて３０分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を銅フタロシアニンに固定化した。これを遠心分離（１０、０００×ｇ、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（１０、０００×ｇ、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
【０２１９】
上記固定化酵素を３０　ｍＭ　（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）に記載の方法で調製）、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を含む０．１　Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１００質量部に浸漬した。次いで、３０℃で緩やかに振盪しながらこの反応液に３０　ｍＭ　（Ｒ）−３−ヒドロキシピメリルＣｏＡ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８２、２７５３−２７６０（２０００）　に記載の方法で調製）、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を含む０．１　Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）をマイクロチューブポンプ（東京理化器械社製ＭＰ−３Ｎ）を用いて１分間に２５質量部の割合で添加した。
【０２２０】
３０分間振とう後、０．１　Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で洗浄して、未反応物等を除去して風乾し、カプセル構造体を得た。
【０２２１】
このカプセル構造体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ　ＩＶ、ＣＡＭＥＣＡ製）により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体表面は３−ヒドロキシピメリン酸と３−ヒドロキシオクタン酸の共重合体（モル比１７：１）で構成されていることがわかった。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体表面を少しずつ削りながら同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、前記共重合体における３−ヒドロキシピメリン酸の組成比率が次第に減少し、３−ヒドロキシオクタン酸の組成比率が増加した。これより、本実施例のカプセル構造体は、表面を親水性官能基を有するポリヒドロキシピメレートで被覆し、その下を親水性官能基を有する３−ヒドロキシピメリン酸と疎水性官能基を有する３−ヒドロキシオクタン酸の共重合体によって、下層に至るにつれて３−ヒドロキシオクタン酸の組成比率を高めながら被覆したカプセル構造体であることがわかった。
【０２２２】
また、該ＰＨＡの平均分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ　ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝２１、０００、Ｍｗ＝４０、０００であった。
【０２２３】
（実施例１４）　カプセル構造体の作製（化学修飾）
実施例２で調整した発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）（１０　Ｕ／ｍｌ）１０質量部に銅フタロシアニン粒子（粒径０．１２μｍ〜１３５μｍ）１質量部、ＰＢＳ　３９質量部を添加し３０℃にて３０分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を銅フタロシアニンに固定化した。これを遠心分離（１０、０００×ｇ、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（１０、０００×ｇ、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
【０２２４】
上記固定化酵素を０．１　Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ（３−フェノキシプロパナールとブロモ酢酸エチルとのＲｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応で得られた３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸を得たのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）に記載の方法で調製）０．８質量部、（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−７、８−エポキシオクタノイルＣｏＡ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、１２、８５−９１（１９９０）に記載の方法で合成した３−ヒドロキシ−７−オクテン酸の不飽和部分を３−クロロ安息香酸でエポキシ化したのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）に記載の方法で調製）０．２質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪して試料１を得た。
【０２２５】
比較対照として、（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−７、８−エポキシオクタノイルＣｏＡを、３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡに変更する以外は、上記と同様の方法で試料２を得た。
【０２２６】
上記の試料１０μｌをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液１０μｌを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（３３０〜３８０　ｎｍ励起フィルタ、４２０　ｎｍロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、いずれの試料においても、銅フタロシアニン粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該銅フタロシアニン粒子はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。
【０２２７】
対照として、０．１　Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４９質量部に銅フタロシアニン１質量部を添加し、３０℃で２．５時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーＡで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、銅フタロシアニン粒子表面は全く蛍光を発しなかった。
【０２２８】
さらに、試料の一部を遠心分離（１０、０００×ｇ、４℃、１０分間）により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について１Ｈ−ＮＭＲ分析を行った（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ　ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ、使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％を表１１に示す。
【０２２９】
【表１１】
2004065001.tif 000041
【０２３０】
上記の試料１を５０質量部遠心分離（１０、０００×ｇ、４℃、１０分間）してカプセル構造体を回収し、精製水５０質量部に懸濁する操作を３回繰返したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した（これを試料３とする）。さらに、試料３を７０で１２時間反応させた（これを試料４とする）。
上記試料３及び試料４をクロロホルムに懸濁し、６０で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出し、真空乾燥によりクロロホルムを除去し、示差走査熱量計（ＤＳＣ；パーキンエルマー社製、Ｐｙｒｉｓ　１、昇温：１０℃／分）装置で測定を行った。その結果、試料３では９０付近に明確な発熱ピークがみられ、ポリマー中のエポキシ基とヘキサメチレンジアミンとの反応が起こり、ポリマー同士の架橋が進行していることが示される。一方、試料４では明確なヒートフローは見られず、架橋反応がほぼ完了していることが示される。
さらに、同様のサンプルにつき、赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）。その結果、試料３で見られたアミン（３３４０　ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２　ｃｍ−１付近）のピークが試料４では消失している。
【０２３１】
以上の結果より、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることにより、架橋ポリマーが得られることが明らかとなった。
【０２３２】
一方、比較対照として試料２について同様の評価を行ったが、前記の如き、ポリマー同士の架橋を明確に示す評価結果は得られなかった。
【０２３３】
（実施例１５）　銅フタロシアニンに対する結合能を有するアミノ酸配列の取得
▲１▼銅フタロシアニン　（ａ型　東京化成工業社製）を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファー（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．５、　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ）に５　ｍｇ／ｍｌの濃度に成るように懸濁した。この１０μｌをエッペンドルフチューブに加え、９９０μｌ　ＴＢＳＴバッファー（ＴＢＳバッファー　＋　０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えて希釈した。
▲２▼Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）の４　ｘ　１０１０ｐｆｕ相当をチューブに添加し、２５℃で１０分間静置した。
▲３▼チューブを遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て沈殿として顔料を回収した。回収した顔料を再びＴＢＳＴバッファーに懸濁し遠心分離を繰返すことによって、顔料をＴＢＳＴバッファーで１０回洗浄した。
▲４▼１００μｌの溶出バッファー（０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）、　１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を加えて１分間静置した後、遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）し、上清を別のエッペンドルフチューブに移し、１５ｍｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、溶出されたファージを得た。
▲５▼溶出されたファージを対数増殖初期の大腸菌ＥＲ２５３７（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）に感染させ増幅した。３７℃で４．５時間培養した。次にファージを遠心分離により細胞から分離し、ポリエチレングリコールの沈殿により精製した。精製、増幅されたファージはＴＢＳバッファーに懸濁され、適当な希釈系列を大腸菌に感染させることによって力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。
▲６▼増幅されたファージを用いて、前記▲１▼から▲５▼をあと３回繰返した。ただし用いるＴＢＳＴバッファー中のＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０．５％に上げることによって、洗浄の条件を厳しくした。
２回目からは、エッペンドルフチューブに対しても同様の操作を行い、コントロールとした。各サイクルにおいて溶出されたファージの力価（ｔｉｔｅｒ）を表１２に示す。
【０２３４】
【表１２】
2004065001.tif 000042
【０２３５】
最終的に溶出されたファージを大過剰の大腸菌に感染させることによってクローン化した。各クローンを大腸菌に感染させ増幅した後、ｓｓＤＮＡを調製し、ランダム領域の塩基配列を解読し、ディスプレイしているペプチドのアミノ酸配列を決定することによって、銅フタロシアニンに対して結合能を有するアミノ酸配列を取得した。結果のアミノ酸配列と頻度を表１３に示す。
【０２３６】
【表１３】
2004065001.tif 000043
【０２３７】
（実施例１６）　実施例２と同様にして銅フタロシアニンに対する結合能を有するＰＨＡ合成酵素の次のようにして調製した。各アミノ酸配列（配列番号：２４から配列番号３８）に対して、スペーサー配列ＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは二本鎖合成ＤＮＡとして作製するために、次の表１４に挙げる合成オリゴヌクレオチドのセットを用意した。
【０２３８】
【表１４】
2004065001.tif 000044
【０２３９】
表１４に挙げたそれぞれのアミノ酸配列に対する２種の合成ＤＮＡを夫々製造業者の説明に従いＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した。続いて２種の合成ＤＮＡを等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片を形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のクローニングに直接用いた。
【０２４０】
プラスミドｐＧＥＸ‐Ｃ１をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩにより消化し、前記二本鎖ＤＮＡ断片を挿入した。このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて調製したプラスミドＤＮＡをテンプレートとしてｐＧＥＸ５’　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いたシークエンシングによってインサートの塩基配列を決定することにより行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加　（終濃度　１ｍＭ）　し、３７℃で４￣１２時間培養を続けた。
【０２４１】
ＩＰＴＧ　誘導した大腸菌を集菌　（８０００×ｇ、　２分、４℃）　し、１／１０　量の　４℃　ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心　（８０００×ｇ、　１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｂｅａｄｓ：　アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。
【０２４２】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８０００×ｇ、１分、４℃）　した後、４％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース　４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬ　に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−ａａ２４−ＹＮ２−Ｃ１〜ＧＳＴ−ａａ３８−ＹＮ２−Ｃ１をグルタチオンセファロースに吸着させた。［融合タンパク質ＧＳＴ−ａａ＃＃−ＹＮ２−Ｃ１におけるａａ＃＃は配列番号＃＃のアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰＨＡ合成酵素とＧＳＴの間に融合して発現していることを意味する。］
吸着後、遠心　（８０００×ｇ、　１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０　ｍＭグルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心　（８０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【０２４３】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、それぞれの発現タンパク質ａａ２４−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）〜ａａ３８−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）の最終精製物を得た。［発現タンパク質ａａ＃＃−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）におけるａａ＃＃は配列番号＃＃のアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合して発現していることを意味する。］
それぞれの精製酵素の活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。酵素濃度は１．９　Ｕ／ｍｌまた比活性は　４．０　Ｕ／ｍｇタンパク質であった。精製酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０　Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。
【０２４４】
（実施例１７）　銅フタロシアニンに対する結合能の評価
銅フタロシアニンを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。この１０ｍｌをテフロン製遠沈管にとり、ここに、実施例１６で調整したＰＨＡ合成酵素ａａ２４−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）〜ａａ３８−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）、および参考例１で調整したＹＮ２−Ｃ１の０．５Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうした。遠心分離操作（１０、０００　ｘ　ｇ、４℃、１０分間）によって銅フタロシアニン粒子を沈殿として回収し、銅フタロシアニンに結合しなかった酵素を含む上清と分離した。銅フタロシアニンを再び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに懸濁し、遠心操作を繰返すことによって、銅フタロシアニンを洗浄した。洗浄した銅フタロシアニンの懸濁液の酵素活性を測定した結果を表１５に示す。
【０２４５】
【表１５】
2004065001.tif 000045
【０２４６】
コントロールの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、銅フタロシアニン結合配列を融合した酵素ａａ２４−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）〜ａａ３８−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化できることが確かめられた。
【０２４７】
（実施例１８）
銅フタロシアニンに対する結合能を有する二種類のアミノ酸配列、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：２４）およびＰｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：２５）の全部を、スペーサー配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介してこの順番に直列に繋いだ配列Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：１４４）を、さらにスペーサー配列ＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、二種類の合成オリゴヌクレオチド、
５’−ＧＡＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＣＣＧＴＣＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＣＣＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＡＡＣＣＧＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＣＴ−３’（配列番号：１４５）および５’−ＣＴＴＣＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＣＧＧＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴＴＧ−３’（配列番号：１４６）をそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した後、等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片として形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、実施例１６と同様にして、プラスミドｐＧＥＸ‐Ｃ１のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに挿入し、このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。実施例１６と同様にして、配列番号１４４のアミノ酸配列をＮ末端に融合した発現タンパク質ａａ１４４−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）を精製し、１０　Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。実施例１７と同様にして精製酵素の銅フタロシアニンに対する結合能を評価した。結果を表１６に示す。
【０２４８】
【表１６】
2004065001.tif 000046
【０２４９】
コントロールの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、銅フタロシアニン結合配列を融合した酵素ａａ１４４−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化できることが確かめられた。
【０２５０】
（実施例１９）　カーボンブラックに対する結合能を有するアミノ酸配列の取得
▲１▼カーボンブラック　（シグマ　アルドリッチ　ジャパン社製）を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファー（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．５、　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ）に５　ｍｇ／ｍｌの濃度に成るように懸濁した。この１０μｌをエッペンドルフチューブに加え、９９０μｌ　ＴＢＳＴバッファー（ＴＢＳバッファー　＋　０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えて希釈した。
▲２▼Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）の４　ｘ　１０１０ｐｆｕ相当をチューブに添加し、２５℃で１０分間静置した。
▲３▼チューブを遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て沈殿として顔料を回収した。回収した顔料を再びＴＢＳＴバッファーに懸濁し遠心分離を繰返すことによって、顔料をＴＢＳＴバッファーで１０回洗浄した。
▲４▼１００μｌの溶出バッファー（０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）、　１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を加えて１分間静置した後、遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）し、上清を別のエッペンドルフチューブに移し、１５ｍｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、溶出されたファージを得た。
▲５▼溶出されたファージを対数増殖初期の大腸菌ＥＲ２５３７（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）に感染させ増幅した。３７℃で４．５時間培養した。次にファージを遠心分離により細胞から分離し、ポリエチレングリコールの沈殿により精製した。精製、増幅されたファージはＴＢＳバッファーに懸濁され、適当な希釈系列を大腸菌に感染させることによって力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。
▲６▼増幅されたファージを用いて、前記▲１▼から▲５▼をあと４回繰返した。ただし用いるＴＢＳＴバッファー中のＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０．５％に上げることによって、洗浄の条件を厳しくした。
２回目からは、エッペンドルフチューブに対しても同様の操作を行い、コントロールとした。各サイクルにおいて溶出されたファージの力価（ｔｉｔｅｒ）を表１７に示す。
【０２５１】
【表１７】
2004065001.tif 000047
【０２５２】
最終的に溶出されたファージを大過剰の大腸菌に感染させることによってクローン化した。各クローンを大腸菌に感染させ増幅した後、ｓｓＤＮＡを調製し、ランダム領域の塩基配列を解読することによって、カーボンブラックに対して結合能を有するアミノ酸配列を取得した。結果のアミノ酸配列と頻度を表１８に示す。
【０２５３】
【表１８】
2004065001.tif 000048
【０２５４】
【表１９】
2004065001.tif 000049
【０２５５】
（実施例２０）　次のようにしてカーボンブラックに対する結合能を有するＰＨＡ合成酵素を調製した。各アミノ酸配列（配列番号：３９から配列番号６３）に対して、スペーサー配列ＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは二本鎖ＤＮＡとして作製するために、次の表１９に挙げる合成オリゴヌクレオチドのセットを用意した。
【０２５６】
【表２０】
2004065001.tif 000050
【０２５７】
【表２１】
2004065001.tif 000051
【０２５８】
表１９に挙げたそれぞれのアミノ酸配列に対する２種の合成ＤＮＡを夫々製造業者の説明に従いＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した。続いて２種の合成ＤＮＡを等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片を形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のクローニングに直接用いた。
【０２５９】
プラスミドｐＧＥＸ‐Ｃ１をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩにより消化し、前記二本鎖ＤＮＡ断片を挿入した。このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて調製したプラスミドＤＮＡをテンプレートとしてｐＧＥＸ５’　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いたシークエンシングによってインサートの塩基配列を決定することにより行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加　（終濃度　１ｍＭ）　し、３７℃で４￣１２時間培養を続けた。
【０２６０】
ＩＰＴＧ　誘導した大腸菌を集菌　（８０００×ｇ、　２分、４℃）　し、１／１０　量の　４℃　ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心　（８０００×ｇ、　１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｂｅａｄｓ：　アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。
【０２６１】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８０００×ｇ、１分、４℃）　した後、４％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース　４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬ　に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−ａａ３９−ＹＮ２−Ｃ１〜ＧＳＴ−ａａ６３−ＹＮ２−Ｃ１をグルタチオンセファロースに吸着させた。［融合タンパク質ＧＳＴ−ａａ＃＃−ＹＮ２−Ｃ１におけるａａ＃＃は、配列番号＃＃のアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰＨＡ合成酵素とＧＳＴの間に融合して発現していることを意味する。］
吸着後、遠心　（８０００×ｇ、　１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０　ｍＭグルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心　（８０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【０２６２】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、それぞれの発現タンパク質ａａ３９−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）〜ａａ６３−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）の最終精製物を得た。［発現タンパク質ａａ＃＃−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）におけるａａ＃＃は配列番号＃＃のアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰＨＡ酵素のＮ末端に融合して発現していることを意味する。］
それぞれの精製酵素の活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。酵素濃度は１．９　Ｕ／ｍｌまた比活性は　４．０　Ｕ／ｍｇタンパク質であった。精製酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０　Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。
【０２６３】
（実施例２１）　カーボンブラックに対する結合能の評価
カーボンブラックを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。この１０ｍｌをテフロン製遠沈管にとり、ここに、実施例２０で調整したＰＨＡ合成酵素ａａ３９−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）〜ａａ６３−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）、および参考例１で調整したＹＮ２−Ｃ１の０．５Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうした。遠心分離操作（１０、０００　ｘ　ｇ、４℃、１０分間）によってカーボンブラック粒子を沈殿として回収し、カーボンブラックに結合しなかった酵素を含む上清と分離した。カーボンブラックを再び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに懸濁し、遠心操作を繰返すことによって、カーボンブラックを洗浄した。洗浄したカーボンブラックの懸濁液の酵素活性を測定した結果を表２０に示す。
【０２６４】
【表２２】
2004065001.tif 000052
【０２６５】
コントロールの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、カーボンブラック結合配列を融合した酵素ａａ３９−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）〜ａａ６３−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化できることが確かめられた。
【０２６６】
（実施例２２）
カーボンブラックに対する結合能を有する二種類のアミノ酸配列、Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：３９）およびＡｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：４０）の全部を、スペーサー配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介してこの順番に直列に繋いだ配列Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：１４７）を、さらにスペーサー配列ＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、二種類の合成オリゴヌクレオチド、
５’−ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＴ−３’（配列番号：１４８）および５’−ＣＣＧＧＣＴＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＡＴＡＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣＡＣＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＡＧ−３’（配列番号：１４９）をそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した後、等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片として形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、実施例２０と同様にして、プラスミドｐＧＥＸ‐Ｃ１のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに挿入し、このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。実施例２０と同様にして、配列番号１４７のアミノ酸配列をＮ末端に融合した発現タンパク質ａａ１４７−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）を精製し、１０　Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。実施例２１と同様にして精製酵素のカーボンブラックに対する結合能を評価した。結果を表２１に示す。
【０２６７】
【表２３】
2004065001.tif 000053
【０２６８】
コントロールの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、カーボンブラック結合配列を融合した酵素ａａ１４７−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化できることが確かめられた。
＜実施例２３＞静電荷像現像トナーの作製及び評価
銅フタロシアニンを０．１　μｍ以下となるようにサンドミルで分散し、この１質量部に０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳバッファー３９　質量部を添加し懸濁した。この１０ｍｌをテフロン製遠沈管にとり、ここに、実施例１６で調整したＰＨＡ合成酵素ａａ２４−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）４Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうしてＰＨＡ合成酵素を顔料表面に吸着させた。これを遠心分離（９８、０００ｍ／ｓ２（１０、０００Ｇ）、４℃、１０　分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（９８、０００ｍ／ｓ２（１０、０００Ｇ）、４℃、１０　分間）して銅フタロシアニンにＰＨＡ合成酵素を固定化した。
【０２６９】
上記各固定化酵素を　０．１　Ｍリン酸バッファー（ｐＨ　７．０）４８　質量部に懸濁し、（Ｒ、Ｓ
）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５５、１４９０−１４９２（１９９０）に記載の方法で合成した３−フェノキシプロパナール及びブロモ酢酸エチルを原料とし、亜鉛によるＲｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応で得られた３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸を得たのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）　に記載の方法で調製）１質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１　質量部を添加し、３０　℃で２時間緩やかに振盪した。生成した青色のマイクロカプセル化顔料（以下着色剤と記す）を濾過洗浄乾燥し、着色剤１とした。
【０２７０】
この着色剤１を真空乾燥したのち、２０　ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０　℃で　２０　時間攪拌して外被を構成するポリマーを抽出した。抽出液を孔径　０．４５　μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析を行った。その結果、得られた着色剤１の外被の主成分は３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。
【０２７１】
さらに、このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ　ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；　４０　℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝２９、０００　であった。
【０２７２】
また、マイクロカプセル化前後の顔料の体積平均粒子径をレーザードップラー方式粒度分布測定機（ＵＰＡ−１５０　；日機装社製）を用いて測定し、結果を表２２にまとめた。
【０２７３】
次に下記組成
・スチレン−ブチルアクリレート共重合樹脂（ガラス転移温度７０℃）：１００質量部
・着色剤１：５質量部
・荷電制御剤（ヘキスト社製：ＮＸＶＰ　４３４）：２質量部
を混合し、二軸エクストルーダー（Ｌ／Ｄ＝　３０）で溶融混練した。この混練物を冷却後、ハンマーミルで粗粉砕し、ジェットミルで微粉砕した後に分級して、粉砕法によってシアン着色粒子（１）を得た。このシアン着色粒子（１）の粒度は、重量平均粒径　７．１　μｍ、微粉量は　６．０　個数％であった。
【０２７４】
このシアン着色粒子（１）１００　質量部に対して、流動向上剤として、ヘキサメチルジシラザンで処理した疎水性シリカ微粉体（ＢＥＴ：　２５０　ｍ２／ｇ）１．５　質量部をヘンシェルミキサーで乾式混合して、本実施例のシアントナー（１）を得た。更に、得られたシアントナー（１）７質量部と樹脂コート磁性フェライトキャリア（平均粒子径：　４５　μｍ）９３　質量部とを混合して、磁気ブラシ現像用の２成分系シアン現像剤（１）を調製し、後述する評価を行なった。
＜比較例１＞
ＰＨＡ合成酵素ａａ２４−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）の替わりにＹＮ２−Ｃ１を用いた他は実施例２３と同様の方法によりシアントナー（２）を得た。更にこれを用いて実施例　２３　と同様にして２成分系シアン現像剤（２）を得た。このトナーの特性を実施例　２３　と同様に評価した。
＜比較例２＞
ＰＨＡ合成酵素ａａ２４−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）４Ｕ相当の替わりにＹＮ２−Ｃ１を１０Ｕ相当用いた他は実施例２３と同様の方法によりシアントナー（３）を得た。更にこれを用いて実施例　２３　と同様にして２成分系シアン現像剤（３）を得た。このトナーの特性を実施例　２３　と同様に評価した。
＜比較例３＞
また、比較として着色剤１の替わりに銅フタロシアニンを５質量部使用する以外は実施例２３と同様の方法により、シアントナー（４）を得た。更にこれを用いて実施例　２３　と同様にして２成分系シアン現像剤（４）を得た。このトナーの特性を実施例　２３　と同様に評価した。
【０２７５】
＜評価１＞
上記現像剤（１）、（２）、（３）、（４）について、常温常湿（２５　℃、６０　％ＲＨ）、及び高温高湿（３０℃、８０　％ＲＨ）のそれぞれの環境下で１０　秒、及び　３００　秒攪拌後のトナーの帯電量を測定した。その結果を表２２にまとめて示した。
【０２７６】
【表２４】
2004065001.tif 000054
【０２７７】
マイクロカプセル化前後の顔料の粒径から、比較例１は比較例２と比べ顔料のマイクロカプセル化が十分ではないが、これは比較例１では顔料への酵素添加量が比較例２より少なかったためだと考えられる。一方、実施例２３の酵素添加量は比較例１と同じであるが、マイクロカプセル化は比較例２と同程度であり、優れた帯電量を示した。
【０２７８】
以上の結果から、実施例２３では少量の酵素によって顔料をマイクロカプセル化することができ、より効率的にトナーの帯電量を上げられることがわかった。
【０２７９】
次に上記着色剤を用いて画像形成を行なった。画像を形成する手段としては、図４に示したように、市販のレーザービームプリンターＬＢＰ−ＥＸ（キヤノン社製）にリユース機構を取り付けて改造し、再設定した画像形成装置を用いた。即ち、図３に示した画像形成装置では、転写後に感光体ドラム　２０　上に残った未転写トナーを、該感光体ドラム　２０　に当接しているクリーナー　２１　の弾性ブレード２２　により掻き落とした後、クリーナーローラーによってクリーナー　２１　内部へと送り、更にクリーナーリユース　２３　を経て、搬送スクリューを設けた供給用パイプ　２４　によってホッパー２５　を介して現像器　２６　に戻し、再度、回収トナーを利用するシステムを取り付
けられている。
【０２８０】
図４に示した画像形成装置では、一次帯電ローラー　２７　により、感光体ドラム２０　の表面の帯電がなされる。一次帯電ローラー　２７　には、ナイロン樹脂で被覆された、導電性カーボンが分散されたゴムローラー（直径　１２　ｍｍ、当接圧　５０　ｇ／ｃｍ）を使用し、静電潜像担持体（感光体ドラム　２０）上に、レーザー露光（６００　ｄｐｉ、不図示）により、暗部電位ＶＤ＝−７００　Ｖ、明部電位ＶＬ＝−２００　Ｖの静電潜像を形成した。トナー担持体として、その表面に、カーボンブラックが分散された樹脂がコートされている表面粗度Ｒａが　１．１　を呈する現像スリーブ　２８　を用いた。
【０２８１】
図５に、実施例　２４　、比較例２で用いた一成分現像剤用の現像装置の要部の拡大断面図を示した。静電潜像を現像する条件としては、該現像スリーブ　２８　の速度を、対向する感光ドラム　２０　面の移動速度に対して　１．１　倍の速さになるように設定し、更に、感光ドラム　２０　と現像スリーブ　２８　との間隔α（Ｓ−Ｄ間）を　２７０　μｍとした。トナーの層厚規制部材としては、ウレタンゴム製ブレード　２９　を当接させて用いた。又、トナー画像を定着させる加熱定着装置の設定温度は　１６０　℃とした。なお、定着装置は、図６及び図７に示した定着装置を用いた。
【０２８２】
以上のようにして、常温常湿（２５　℃、６０　％ＲＨ）環境下、８枚（Ａ４サイズ）／分のプリントアウト速度で、トナーを逐次補給しながら連続モード（即ち、現像器を休止させることなくトナーの消費を促進させるモード）で、３万枚までプリントアウトを行い、得られたプリントアウト画像について画像濃度を測定し、その耐久について下記に示した基準で評価した。又、１０、０００　枚目の画像を観察し、画像カブリについて下記の基準で評価した。又、同時に、耐久試験後における画像形成装置を構成している各装置の様子を観察し、各装置と上記の各トナーとのマッチングについても評価した。以上の結果を表２３にまとめて示した。
【０２８３】
［耐久時の画像濃度推移］
通常の複写機用普通紙（７５　ｇ／ｍ２）に、所定枚数のプリントアウトをして、初期の画像に対するプリント終了時における画像の画像濃度維持の程度により評価した。尚、画像濃度はマクベス反射濃度計（マクベス社製）を用い、原稿濃度が　０．００　の白地部分のプリントアウト画像に対する相対濃度を測定し、評価に用いた。
◎：優（終了時の画像濃度が　１．４０　以上）
○：良（終了時の画像濃度が　１．３５　以上　１．４０　未満）
△：可（終了時の画像濃度が　１．００　以上　１．３５　未満）
×：不可（終了時の画像濃度が　１．００　未満）
［画像カブリ］
通常の複写機用普通紙（７５　ｇ／ｍ２）に所定枚数のプリントアウトをし、プリント終了時のベタ白画像により評価した。具体的には、下記のような方法で評価した。
反射式濃度計（ＴＯＫＹＯ　ＤＥＮＳＨＯＫＵ　ＣＯ．、ＬＴＤ社製ＲＥＦＬＥＣＴＯＭＥＴＥＲ　ＯＤＥＬ　ＴＣ−６ＤＳ）を用いて測定したプリント後の白地部反射濃度の最悪値をＤｓ、プリント前の用紙の反射濃度平均値をＤｒとし、これらの値から（Ｄｓ−Ｄｒ）を求め、これをカブリ量とし、下記の基準で評価した。
◎：非常に良好（カブリ量が０％以上　１．５　％未満）
○：良好（カブリ量が　１．５　％以上　３．０　％未満）
△：実用可（カブリ量が　３．０　％以上　５．０　％未満）
×：実用不可（カブリ量が　５．０　％以上）
［画像形成装置マッチング評価］
１．現像スリーブとのマッチング
プリントアウト試験終了後、現像スリーブ表面への残留トナーの固着の様子とプリントアウト画像への影響を目視で評価した。
◎　：　　非常に良好（未発生）
○　：　　良好（殆ど発生せず）
△　：　　実用可（固着があるが、画像への影響が少ない）
×　：　　実用不可（固着が多く、画像ムラを生じる）
２．感光ドラムとのマッチング
感光体ドラム表面の傷や残留トナーの固着の発生状況とプリントアウト画像への影響を目視で評価した。
◎　：　　非常に良好（未発生）
○　：　　良好（僅かに傷の発生が見られるが、画像への影響はない）
△　：　　実用可（固着や傷があるが、画像への影響が少ない）
×　：　　実用不可（固着が多く、縦スジ状の画像欠陥を生じる）
３．定着装置とのマッチング
定着フィルム表面の様子を観察し、表面性及び残留トナーの固着状況の結果を総合平均化して、その耐久性を評価した。
【０２８４】
（１）表面性
プリントアウト試験終了後の定着フィルム表面の傷や削れの発生の様子を目視で観察し、評価した。
◎　：　　非常に良好（未発生）
○　：　　良好（殆ど発生せず）
△　：　　実用可
×　：　　実用不可
（２）残留トナーの固着状況
プリントアウト試験終了後の定着フィルム表面の残留トナーの固着状況を目視で観察し、評価した。
◎　：　　非常に良好（未発生）
○　：　　良好（殆ど発生せず）
△　：　　実用可
×　：　　実用不可
【０２８５】
【表２５】
2004065001.tif 000055
【０２８６】
顔料のマイクロカプセル化が十分に行なわれた実施例２３、比較例２のトナーではいずれの評価においても良好な結果を得ることができた。以上の結果から、実施例２３では少量の酵素によって効率的に優れた画像形成能を有するトナーを作製できることがわかった。
【０２８７】
＜実施例２４＞カラーフィルターの作製および評価
銅フタロシアニンを０．１　μｍ程度となるようにサンドミルで分散し、この１質量部に０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳバッファー３９　質量部を添加し懸濁した。この１０ｍｌをテフロン製遠沈管にとり、ここに、実施例１６で調整したＰＨＡ合成酵素ａａ２５−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）４Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうしてＰＨＡ合成酵素を顔料表面に吸着させた。これを遠心分離（９８、０００ｍ／ｓ２（１０、０００Ｇ）、４℃、１０　分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（９８、０００ｍ／ｓ２（１０、０００Ｇ）、４℃、１０　分間）して銅フタロシアニンにＰＨＡ合成酵素を固定化した。
【０２８８】
上記固定化酵素を０．１　Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、（Ｒ）−３−ヒドロキシピメリルＣｏＡ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）　に記載の方法で調製）１質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪した。生成したマイクロカプセル化顔料を遠心分離（１０、０００×ｇ、４℃、１０分間）により回収し、このマイクロカプセル化顔料４質量部に対し、エチレングリコール１０質量部、ジエチレングリコール１５質量部、スチレンーマレイン酸樹脂の　モノエタノールアミン塩（平均分子量３万、酸価３００）０．６質量部、イオン交換水７０．４質量部を添加し、攪拌翼による攪拌（８０ｒｐｍ）によって分散させた。この分散液を着色組成物（１）とした。
【０２８９】
また、先に回収したマイクロカプセル化顔料のＰＨＡモノマーユニットの同定を実施例２３と同様に行ったところ、該ＰＨＡは３−ヒドロキシピメリン酸からなるＰＨＡであることが確認された。
【０２９０】
さらに、該ＰＨＡの分子量を実施例２３と同様にゲルパーミエーションクロマトグ
ラフィーにより評価した結果、Ｍｎ＝４７、０００であった。
【０２９１】
次に、着色組成物（１）を用いて、インクジェット記録装置によりガラス基板にブルーのインクドットを形成した。さらに、８０℃で２０分間、さらに１８０℃で１時間乾燥して、着色層を形成した。得られた着色層の厚みは０．４μｍであった。次に、このの顔料微粒子層上に透明保護膜として、熱硬化型樹脂（ハイコートＬＣ−２００１、三洋化成製）をスピンナーにより乾燥膜厚が０．５μｍになるように塗工し、１２０℃で３０分間プリベークした後、２００℃で３０分間、本ベークにより保護膜を形成して本発明の
カラーフィルタ（１）を得た。
【０２９２】
＜比較例４＞
ＰＨＡ合成酵素ａａ２５−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）の替わりにＹＮ２−Ｃ１を用いた他は実施例２４と同様の方法によりシアントナー（２）を得た。更にこれを用いて実施例　２４　と同様にして２成分系シアン現像剤（２）を得た。このトナーの特性を実施例　２４　と同様に評価した。
＜比較例５＞
ＰＨＡ合成酵素ａａ２５−ＹＮ２−Ｃ１（ｐｈｔ）４Ｕ相当の替わりにＹＮ２−Ｃ１を１０Ｕ相当用いた他は実施例２４と同様の方法によりシアントナー（３）を得た。更にこれを用いて実施例　２４　と同様にして２成分系シアン現像剤（３）を得た。このトナーの特性を実施例　２４　と同様に評価した。
＜比較例６＞
また、比較として着色組成物（１）の替わりに銅フタロシアニンを４質量部使用する以外は実施例２４と同様の方法により、シアントナー（４）を得た。更にこれを用いて実施例　２４と同様にして２成分系シアン現像剤（４）を得た。このトナーの特性を実施例　２４　と同様に評価した。
【０２９３】
＜評価２＞
実施例２４、比較例４，５，６の各着色組成物中のマイクロカプセル化顔料の体積平均粒子径及び３０日間室温で貯蔵した後の体積平均粒子径を体積平均粒子径は、レーザードップラー方式粒度分布測定機（ＵＰＡ−１５０；日機装社製）を用いて測定し、表２４に示した。
ここで、マイクロカプセル化前の顔料の粒子径は０．１０２であった。
【０２９４】
【表２６】
2004065001.tif 000056
【０２９５】
マイクロカプセル化前後（貯蔵前）の顔料の粒径から、比較例４は比較例５と比べ顔料のマイクロカプセル化が十分ではないが、これは比較例４では顔料への酵素添加量が比較例５より少なかったためだと考えられる。一方、実施例２４の酵素添加量は比較例４と同じであるが、マイクロカプセル化は比較例５と同程度であった。
マイクロカプセル化が十分に行なわれた実施例２４、比較例５ではマイクロカプセル化顔料の体積平均粒子径は、貯蔵前後でほぼ同等の値を示し、貯蔵安定性に優れていた。
【０２９６】
以上の結果から、実施例２４では少量の酵素によって顔料をマイクロカプセル化することができ、より効率的に顔料の凝集を防ぐことができることがわかった。
【０２９７】
次にカラーフィルター（１）、（２）、（３）、（４）について、以下のような評価を行
い、結果を表２５にまとめた。
（１）凝集ムラ
作製したカラーフィルタの画像を位相差顕微鏡で透過光による観察を行った。（２）着色層の基板との密着性
作製したカラーフィルタを１２５℃　　８５％　　６時間の条件でプレッシャークッカーテストにより評価した。
（３）透明性
作製したカラーフィルタの透明性について、透過率を測定して評価した。それぞれ４００ｎｍ〜７００ｎｍの範囲で最大透過率の得られる波長で測定した。また測定は画素について１０ケ所を測定し、その平均を求めた。
【０２９８】
また、同時に目視による官能評価によっても行った。
（４）色彩性
作製したカラーフィルタの色彩性を、目視による官能評価により評価した。
（５）コントラスト（消偏特性）
二枚の偏光板をこれらの光軸を変化できるように対向して配置し、これら偏光板の間に偏光板と接触させてカラーフィルタを配置した。この状態で、液晶パネル用バックライト（商品名：ＳＬＣ３ＬＣ１ＥＸ４ＵＡ、東芝ライテック社製）を用いてカラーフィルタにバックライト光を照射し、２枚の偏光板の光軸を変化させ、光軸が直交する時と、平行となる時における自然光での輝度（明度）を色彩輝度計（“トプコン”ＢＭ−５Ａ）を用いて測定し、これらの比を消偏特性として算出した。また、同時に目視による官能評価によっても行った。
【０２９９】
【表２７】
2004065001.tif 000057
【０３００】
顔料のマイクロカプセル化が十分に行なわれた実施例２４、比較例５のカラーフィルターでは凝集ムラもなく、密着性、透明性、色彩性、コントラストの全てにおいて良好な結果を示し、優れた特性を有することがわかった。
以上の結果から、実施例２４では少量の酵素によって優れた特性を有するカラーフィルターを効率的に作製できることがわかった。
【０３０１】
（実施例２５）　電気泳動粒子の作製および評価
界面活性剤としてＴｗｅｅｎ‐２０を１質量％加えた２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、顔料としてカーボンブラックを２５質量％の濃度で懸濁した。これをボールミルで混合することによって、カーボンブラックの分散液を調製した。レーザー光散乱法によるとその平均粒径は１．２μｍの単分散状態であった。
【０３０２】
次いで実施例２０で調整したＰＨＡ合成酵素ａａ３９−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）を４０Ｕ／ｍＬになるように加え、２０℃で３０分間静置した。次に参考例２で調整した　（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを終濃度５ｍＭになるように添加した。３７℃で３０分間インキュベートすることによって、合成反応を行った。
【０３０３】
反応液を、遠心分離（１０、０００　ｘ　ｇ、４℃、１０分間）して、カーボンブラックをマイクロカプセル化した電気泳動粒子の含水ケーキを得た。この含水ケーキをエタノールに再懸濁した後、再度遠心分離操作によって電気泳動粒子を回収した。この操作を３回繰返すことで脱水処理した。　次にケロセンで電気泳動粒子を懸濁し、遠心・洗浄を繰返すことによって、分散媒をケロセンに置換し、電気泳動表示用分散系（１）とした。
【０３０４】
上記電気泳動粒子を真空乾燥したのち、２０　ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径　０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、図３に示す通り、当該ＰＨＡは３−ヒドロキシオクタン酸をモノマーユニットとするＰＨＡであることが確認された。さらに、該ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ　ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝２２、０００、Ｍｗ＝４２、０００であった。
【０３０５】
＜比較例７＞
ＰＨＡ合成酵素ａａ３９−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）の替わりにＹＮ２−Ｃ１を用いた他は実施例２５と同様の方法により電気泳動粒子（２）を得た。更にこれを用いて実施例　２５　と同様にして電気泳動表示用分散系（２）を得た。
【０３０６】
＜比較例８＞
ＰＨＡ合成酵素ａａ３９−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）４０Ｕ相当の替わりにＹＮ２−Ｃ１を１００Ｕ相当用いた他は実施例２５と同様の方法により電気泳動粒子（３）を得た。更にこれを用いて実施例　２５と同様にして電気泳動表示用分散系（３）を得た。
【０３０７】
＜比較例９＞
カーボンブラック２５　ｇを、加熱溶融したポリエチレン樹脂７５　ｇに加え、ロールミルを用いて均一に分散した後に、冷却硬化させて微粉砕した粒子を電気泳動粒子（４）とし、これを用いて実施例　２５　と同様にして電気泳動表示用分散系（４）を得た。
【０３０８】
＜評価３＞
電気泳動粒子の絶縁性媒体に対する分散性の評価を行なった。
【０３０９】
試験管中に被検体である電気泳動粒子を３ｇと、分散媒（ケロセン）５０ｍｌと、必要ならば界面活性剤（ポリカルボン酸誘導体）０．６ｇとを添加し、マグネチックスターラで２時間攪拌した後、直ちに上澄みを１．０ｍｌ量り取り、これをオーブンで加熱して分散媒を完全に除去した後の重量を測定した。このときの重量をＷｏ　（ｇ）　とした。また、上記の試験管を所定時間静置した後、同様に上澄みを１．０　ｍｌ量り取り、これをオーブンで加熱して分散媒を完全に除去した後の重量を測定した。このときの重量をＷｉ　（ｇ）　とした。そして、下記の式により分散安定性Ｓを算出した。
【０３１０】
分散安定性Ｓ（％）＝Ｗｉ　（ｇ）　／Ｗｏ　（ｇ）×１００（式１）
このようにして求めた各電気泳動粒子の分散安定性Ｓ及びレーザー光散乱法による各電気泳動粒子の粒径の測定結果を表２６に示した。
【０３１１】
【表２８】
2004065001.tif 000058
【０３１２】
マイクロカプセル化前後の顔料の粒径から、比較例７は比較例８と比べ顔料のマイクロカプセル化が十分ではないが、これは比較例７では顔料への酵素添加量が比較例８より少なかったためだと考えられる。一方、実施例２５の酵素添加量は比較例７と同じであるが、マイクロカプセル化は比較例８と同程度であった。
【０３１３】
マイクロカプセル化が十分に行なわれた実施例２５、比較例８では電気泳動粒子の分散媒中での分散安定性に優れていた。
【０３１４】
以上の結果から、実施例２５では少量の酵素によって顔料をマイクロカプセル化することができ、電気泳動粒子とした際、より効率的に分散安定性を向上できることがわかった。
【０３１５】
次に各電気泳動粒子の動作確認を行なった。
【０３１６】
厚さ１５０μｍのＰＥＳフィルムからなる光透過性の第１基板上にＩＴＯ電極を成膜し、フォトリソグラフィー及びウエットエッチングによりライン状にパターニングした。この上に絶縁層として光を乱反射させて白色を示す酸化チタン微粒子含有樹脂層を形成した
。さらに第２電極として炭化チタンを成膜し、フォトリソグラフィー及びドライエッチングによりライン状に形成し、さらに第１電極上にのみ円形にエッチングし穴をあけた。第２電極上には、さらに絶縁層として高透明ポリイミド層を形成した。次に、熱融着性接着層を第２基板の接合部にパターン状に形成した。
【０３１７】
ＰＥＳフィルムからなる光透過性の第２基板を熱プレス成形によって凹形状を形成し、第１基板との接着部には第１基板と同様に熱融着性接着層を形成した。
【０３１８】
この第２基板の凹部に、透明な絶縁性液体及び実施例２５、比較例７，８，９で作製した電気泳動泳動粒子（１）、（２）、（３）、（４）を各々別々に充填した。絶縁性液体としては、第２基板材料であるＰＥＳフィルムよりも屈折率が大きいジヨードメタンを使用した。充填後、第１基板及び第２基板の接着層の位置を合わせて、熱をかけて張り合わせた。これに電圧印加回路を設けて表示装置とした。
【０３１９】
次に、作製した表示装置を用いて表示を行った。印加電圧は±５０Ｖとした。第１電極を正極、第２電極を負極になるように電圧を印加すると、顔料のマイクロカプセル化が十分に行なわれた電気泳動泳動粒子（１）、（３）は、第２基板の凹状構造底面の周辺部にある第２電極上に移動した。これを第２基板側から観察すると第２基板の凹状構造がレンズとして作用するため、第１基板の中央部に光が集光し、露出した白色の絶縁層に入射して、レンズ全体が白色を呈した。また、極性を逆転して、第１電極を負極、第２電極を正極になるように電圧を印加すると、電気泳動泳動粒子は中央部に集り、レンズ全体は電気泳動泳動粒子の黒色を呈した。この時の応答速度は２０ｍｓｅｃ以下であり、２色表示のできる表示装置を作製できた。
【０３２０】
一方、顔料のマイクロカプセル化が十分行なわれていない電気泳動泳動粒子（２）、（４）は電圧の印加による移動が不均一で、レンズ全体が明確に白色／黒色に変化しなかった。
【０３２１】
（実施例２６）顔料インクの作製および評価
界面活性剤としてＴｗｅｅｎ‐２０を１質量％加えた２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、顔料としてカーボンブラックを２５質量％の濃度で懸濁した。これをボールミルで混合することによって、カーボンブラックの分散液を調製した。レーザー光散乱法によるとその平均粒径は１０２　ｎｍの単分散状態であった。
【０３２２】
次いで実施例２０で調整したＰＨＡ合成酵素ａａ４０−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）を４０Ｕ／ｍＬになるように加え、２０℃で３０分間静置した。次に参考例２で調整した　（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを終濃度５ｍＭになるように添加した。３７℃で３０分間インキュベートすることによって、合成反応を行った。
【０３２３】
反応液を、遠心分離（１０、０００　ｘ　ｇ、４℃、１０分間）して、カーボンブラックをコアにするマイクロカプセル化顔料の含水ケーキを得た。この含水ケーキを水に再懸濁した後、再度遠心分離操作によってマイクロカプセル化顔料（１）を回収した。この操作を３回繰返すことで洗浄した。
【０３２４】
作製したマイクロカプセル化顔料の含水ケーキの一部を、真空乾燥したのち、２０　ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径　０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、当該ＰＨＡは３−ヒドロキシオクタン酸をモノマーユニットとするＰＨＡであることが確認された。さらに、該ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ　ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝１８、０００、Ｍｗ＝３７、０００であった。
【０３２５】
上記マイクロカプセル化顔料（１）を用いて水性黒色インクを調製した。黒色インクの組成は次の通りである。なお以下で示す各成分の量は重量部を表わすものとする。分散攪拌機（ＴＫホモディスパ２０型、特殊機化工業（株）製）を使用し、分散時間は３時間とした。
マイクロカプセル化顔料：５０部
グリセリン：６部
ジエチレングリコール：７部
ポリオキシエチレンドデシルエーテル：０．２部
Ｐｒｏｘｅｌ　ＸＬ−２：防腐剤（ＺＥＮＥＣＡ（株）製）：０．３部
ベンゾトリアゾール：腐食防止剤（関東化学（株）製）：０．００５部
水：残部
＜比較例１０＞
ＰＨＡ合成酵素ａａ４０−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）の替わりにＹＮ２−Ｃ１を用いた他は実施例２６と同様の方法によりマイクロカプセル化顔料（２）を得た。更にこれを用いて実施例　２６　と同様にして水性顔料インク（２）を調製した。
＜比較例１１＞
ＰＨＡ合成酵素ａａ３９−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）４０Ｕ相当の替わりにＹＮ２−Ｃ１を１００Ｕ相当用いた他は実施例２６と同様の方法によりマイクロカプセル化顔料（３）を得た。更にこれを用いて実施例　２６　と同様にして水性顔料インク（３）を調製した。
＜比較例１２＞
マイクロカプセル化顔料に替わって微粉砕カーボンブラックを用いた他は実施例２６と同様に水性顔料インク（４）を調製した。
＜評価４＞
このようにして調製した水性顔料インク（１）、（２）、（３）、（４）について分散安定性と平均粒径を評価した。分散安定性は７０℃、３日間貯蔵後の相分離の程度を尺度とし、顔料分の沈降により生じた上層の半透明部分の全分散液高さに対する割合で表した。平均粒径はレーザードップラ式粒度分析計マイクロトラック（ＵＰＡ１５０型、リーズ＆ノースロップ社製）で測定したメディアン径をもって平均粒径とした。結果を表２７に示す。
【０３２６】
【表２９】
2004065001.tif 000059
【０３２７】
マイクロカプセル化前後の顔料の粒径から、比較例１０は比較例１１と比べ顔料のマイクロカプセル化が十分ではないが、これは比較例１０では顔料への酵素添加量が比較例１１より少なかったためだと考えられる。一方、実施例２６の酵素添加量は比較例１０と同じであるが、マイクロカプセル化は比較例１１と同程度であった。
【０３２８】
マイクロカプセル化が十分に行なわれた実施例２６、比較例１１の水性顔料インクは分散安定性に優れていることが分かった。
【０３２９】
以上の結果から、実施例２６では少量の酵素によって顔料をマイクロカプセル化することができ、水性顔料インクとした際、分散安定性を著しく向上できることがわかった。
【０３３０】
次にインクジェットプリンター用インクとしての評価を行なった。
【０３３１】
上記水性顔料インク（１）、（２）、（３）、（４）を用い、３６０ｄｐｉの解像度の記録ヘッドを備えたインクジェットプリンタを用いて吐出周波数７．２ｋＨｚで主走査方向に７２０ｄｐｉの間隔で印字を行なった。ここでは記録ヘッドからのインク１滴当たりの吐出量は約２５
ピコリットルとして３６０ｄｐｉ×７２０ｄｐｉの解像度で形成されるところの１画素にインクを１滴打ち込んで記録を行なった。そしてベタ画像及び文字パターン等を印字して画像のＯＤ、ドット周囲形状、ベタ均一性、裏抜け性、スムージング性及び真円度を評価した。なおプリント媒体としてはキヤノン（株）社製ＰＢ用紙を用いた。
ここで、
・ＯＤは、５ｍｍ角のベタパターンの部分を測定したものである。
・ドット周囲形状は、線画像のエッジ部分のシャープネスをルーペによって目視にて確認した。
◎：線のエッジがきれいに直線状につながっている。
○：線のエッジの直線性が若干失われているものの、実用上問題はない。
×：線のエッジの直線性が失われている。
・ベタ均一性は５ｍｍ角のベタパターンにおける濃度の均一性を目視て確認した。
◎：白く抜けている部分が認められない。
○：白く抜けている部分が認められるものの目立たず、実用上問題がない。
×：白く抜けている部分が目立ち、画像品質に影響を与えている。
・裏抜け性はベタパターンを印字した部分を、裏面から目視にて観察しパターンが透けて見える否かを確認し、またマクベス濃度計を用いて裏面の対応部部の光学濃度を測定した。
◎：殆ど透けて見えず、またマクベス濃度計による光学濃度が０．２未満である。
○：やや透けて見えるが、殆んど気にならず、またマクベス濃度計による光学濃度が０．２以上０．２５未満である。
・真円度は、１滴のインクによってプリント媒体上に形成したインクドットの形状をルーペにて観察した。
◎：統計的に見て、殆どのドットが真円に近い。
○：統計的に見て、ドットの真円性が崩れているが、画像形成には支障が無い。
△：統計的に見て、かなりの数のドットの真円性が崩れ、いびつな形状のドットが形成されている。
以上の結果を下記表２８に示す。
【０３３２】
【表３０】
2004065001.tif 000060
【０３３３】
顔料のマイクロカプセル化が十分に行なわれた実施例２４、比較例５において調整されたインクは、インクジェットプリンター用インクとして用いたとき、記録媒体上（紙）での顔料の凝集物は細かい粒子状になってインクドット内に均一に分散し、適切な広がりを持つドット径を有し、且つドット内の画像濃度分布が均一で、またフェザリング等が殆どない、周囲や外形形状の優れたインクドットを得られることがわかった。
【０３３４】
以上の結果から、実施例２６では少量の酵素によって優れた特性を有する水性顔料インクを効率的に作製できることがわかった。
【０３３５】
（実施例２７）　酸化チタンに対する結合能を有するアミノ酸配列の取得
▲１▼酸化チタン　（和光純薬社製、酸化チタン（ＩＶ）、ルチル型）を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファー（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．５、　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ）に５　ｍｇ／ｍｌの濃度に成るように懸濁した。この１０μｌをエッペンドルフチューブに加え、９９０μｌ　ＴＢＳＴバッファー（ＴＢＳバッファー　＋　０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えて希釈した。
▲２▼Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）の４　ｘ　１０１０ｐｆｕ相当をチューブに添加し、２５℃で１０分間静置した。
▲３▼チューブを遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て沈殿として顔料を回収した。回収した顔料を再びＴＢＳＴバッファーに懸濁し遠心分離を繰返すことによって、顔料をＴＢＳＴバッファーで１０回洗浄した。
▲４▼１００μｌの溶出バッファー（０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）、　１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を加えて１分間静置した後、遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）し、上清を別のエッペンドルフチューブに移し、１５ｍｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、溶出されたファージを得た。
▲５▼溶出されたファージを対数増殖初期の大腸菌ＥＲ２５３７（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）に感染させ増幅した。３７℃で４．５時間培養した。次にファージを遠心分離により細胞から分離し、ポリエチレングリコールの沈殿により精製した。精製、増幅されたファージはＴＢＳバッファーに懸濁され、適当な希釈系列を大腸菌に感染させることによって力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。
▲６▼増幅されたファージを用いて、前記▲１▼から▲５▼をあと４回繰返した。ただし用いるＴＢＳＴバッファー中のＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０．５％に上げることによって、洗浄の条件を厳しくした。
２回目からは、エッペンドルフチューブに対しても同様の操作を行い、コントロールとした。各サイクルにおいて溶出されたファージの力価（ｔｉｔｅｒ）を表２９に示す。
【０３３６】
【表３１】
2004065001.tif 000061
【０３３７】
最終的に溶出されたファージを大過剰の大腸菌に感染させることによってクローン化した。各クローンを大腸菌に感染させ増幅した後、ｓｓＤＮＡを調製し、ランダム領域の塩基配列を解読することによって、酸化チタンに対して結合能を有するアミノ酸配列を取得した。結果のアミノ酸配列と頻度を表３０に示す。
【０３３８】
【表３２】
2004065001.tif 000062
【０３３９】
（実施例２８）　次のようにして酸化チタンに対する結合能を有するＰＨＡ合成酵素を調製した。各アミノ酸配列（配列番号１５０から配列番号１５７）に対して、スペーサー配列ＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは二本鎖ＤＮＡとして作製するために、次の表３１に挙げる合成オリゴヌクレオチドのセットを用意した。
【０３４０】
【表３３】
2004065001.tif 000063
【０３４１】
表３１に挙げたそれぞれのアミノ酸配列に対する２種の合成ＤＮＡを夫々製造業者の説明に従いＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した。続いて２種の合成ＤＮＡを等モル混合し、９５℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片を形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のクローニングに直接用いた。
【０３４２】
プラスミドｐＧＥＸ‐Ｃ１をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩにより消化し、前記二本鎖ＤＮＡ断片を挿入した。このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて調製したプラスミドＤＮＡをテンプレートとしてｐＧＥＸ５’　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いたシークエンシングによってインサートの塩基配列を決定することにより行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加　（終濃度　１ｍＭ）　し、３７℃で４￣１２時間培養を続けた。
【０３４３】
ＩＰＴＧ　誘導した大腸菌を集菌　（８０００×ｇ、　２分、４℃）　し、１／１０　量の　４℃　ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心　（８０００×ｇ、　１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｂｅａｄｓ：　アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。
【０３４４】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８０００×ｇ、１分、４℃）　した後、４％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース　４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬ　に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−ａａ１５０−ＹＮ２−Ｃ１〜ＧＳＴ−ａａ１５７−ＹＮ２−Ｃ１をグルタチオンセファロースに吸着させた。［融合タンパク質ＧＳＴ−ａａ＃＃−ＹＮ２−Ｃ１におけるａａ＃＃は、配列番号＃＃のアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰＨＡ合成酵素とＧＳＴの間に融合して発現していることを意味する。］
吸着後、遠心　（８０００×ｇ、　１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０　ｍＭグルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心　（８０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【０３４５】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、それぞれの発現タンパク質ａａ１５０−ＹＮ２−Ｃ１（ｔｉ）〜ａａ１５７−ＹＮ２−Ｃ１（ｔｉ）の最終精製物を得た。［発現タンパク質ａａ＃＃−ＹＮ２−Ｃ１（ｔｉ）におけるａａ＃＃は配列番号＃＃のアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰＨＡ酵素のＮ末端に融合して発現していることを意味する。］
それぞれの精製酵素の活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。酵素濃度は１．９　Ｕ／ｍｌまた比活性は　４．０　Ｕ／ｍｇタンパク質であった。精製酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０　Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。
【０３４６】
（実施例２９）　酸化チタンに対する結合能の評価
酸化チタンを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。この１０ｍｌをテフロン製遠沈管にとり、ここに、実施例２８で調整したＰＨＡ合成酵素ａａ１５０−ＹＮ２−Ｃ１（ｔｉ）〜ａａ１５７−ＹＮ２−Ｃ１（ｔｉ）、および参考例１で調整したＹＮ２−Ｃ１の０．５Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうした。遠心分離操作（１０、０００　ｘ　ｇ、４℃、１０分間）によって酸化チタン粒子を沈殿として回収し、酸化チタンに結合しなかった酵素を含む上清と分離した。酸化チタンを再び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに懸濁し、遠心操作を繰返すことによって、酸化チタンを洗浄した。洗浄した酸化チタンの懸濁液の酵素活性を測定した結果を表３２に示す。
【０３４７】
【表３４】
2004065001.tif 000064
【０３４８】
コントロールの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、酸化チタン結合配列を融合した酵素ａａ１５０−ＹＮ２−Ｃ１（ｔｉ）〜ａａ１５７−ＹＮ２−Ｃ１（ｔｉ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化できることが確かめられた。
【０３４９】
（実施例２２）
酸化チタンに対する結合能を有する二種類のアミノ酸配列、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：１５０）およびＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：１５１）の全部を、スペーサー配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介してこの順番に直列に繋いだ配列Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−　Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：１７４）を、さらにスペーサー配列ＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、二種類の合成オリゴヌクレオチド、
５’−ＧＡＴＣＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＧＧＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＣＧＡＧＣＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＡＴＧＡＧＣＴ−３’（配列番号：１７５）および
５’−ＣＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＧＣＴＣＧＧＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＣＧＣＡＴＧＧ−３’（配列番号：１７６）をそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した後、等モル混合し、９５℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片として形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、実施例２８と同様にして、プラスミドｐＧＥＸ‐Ｃ１のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに挿入し、このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。実施例２８と同様にして、配列番号１７４のアミノ酸配列をＮ末端に融合した発現タンパク質ａａ１７４−ＹＮ２−Ｃ１（ｔｉ）を精製し、１０　Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。実施例２９と同様にして精製酵素の酸化チタンに対する結合能を評価した。結果を表３３に示す。
【０３５０】
【表３５】
2004065001.tif 000065
【０３５１】
コントロールの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、酸化チタン結合配列を融合した酵素ａａ１７４−ＹＮ２−Ｃ１（ｔｉ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化できることが確かめられた。
【０３５２】
【発明の効果】
本発明のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体の製造方法によれば、様々な基材に対して、これに結合能を有するアミノ酸配列を選択することで、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を、該基材上に効率的に固定化することができる。さらに、酵素の基質となる３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを添加することによって、該基材の表面を所望のポリヒドロキシアルカノエートによって効率的に被覆することが可能となる。本発明のポリヒドロキシアルカノエート含有構造体は、様々な性質のポリヒドロキシアルカノエートで表面を被覆されているので、機能性構造体として、幅広い用途に利用可能である。
【０３５３】
【配列表】
2004065001.tif 000066
2004065001.tif 000067
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４の銅フタロシアニンのＰＨＡカプセル構造体の外殻のＧＣ−ＭＳ分析結果を示す図。
【図２】実施例８のカーボンブラックのＰＨＡカプセル構造体の外殻のＧＣ−ＭＳ分析結果を示す図。
【図３】実施例１２のシリコン基板のＰＨＡ積層構造体の積層体のＧＣ−ＭＳ分析結果を示す図。
【図４】トナーのリユース機構を有する画像形成装置の概略的説明図である。
【図５】一成分現像剤用の現像装置の要部の断面図である。
【図６】定着装置の要部の分解斜視図である。
【図７】定着装置の非駆動時のフィルム状態を示した要部の拡大断面図である。
【符号の説明】
１、２０　：感光体（静電潜像担持体）
２、２７　：帯電ローラー
３：露光
４、２６　：現像装置（４−１、４−２、４−３、４−４）
５：中間の転写体
６：被転写材
７：転写ローラー
１３　：感光体ドラム
１１、２８　：現像剤担持体
３０　：ステー
３１　：加熱体
３１　ａ：ヒーター基板
３１　ｂ：発熱体
３１　ｃ：表面保護層
３１　ｄ：検温素子
３２　：定着フィルム
３３　：加熱ローラー
３４　：コイルばね
３５　：フィルム端部規制フランジ
３６　：給電コネクター
３７　：絶縁部材
３８　：入口ガイド
３９　：出口ガイド（分離ガイド）
４３　：スクリーン
４５　：真空計
４７　：吸引口
４９　：電位計
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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