(57)【要約】【課題】畜産業の利益に資するために、鳥類の生育の制御に関与する遺伝子を単離する。【解決手段】本発明により、ニホンウズラインスリン様成長因子ＩＩポリペプチド及び、当該ポリペプチドをコードする遺伝子が与えられた。当該遺伝子を導入することにより、鳥類の生育を促進することが可能となる。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−１８７で示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
（ｂ）細胞の増殖・分化の促進作用を有し、（ａ）の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドをコードする、遺伝子。
【請求項３】
以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−５６４で示される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
（ｄ）細胞の増殖・分化の促進作用を有するポリペプチドをコードし、（ｃ）の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子。
【請求項４】
請求項２又は請求項３記載の遺伝子が鳥類に導入された、形質転換鳥類。
【請求項５】
請求項２又は請求項３記載の遺伝子を大腸菌内で発現させる事により得られる、組み換えニホンウズラインスリン様成長因子−ＩＩポリペプチド。
【請求項６】
請求項５記載の組み換えニホンウズラインスリン様成長因子−ＩＩポリペプチドに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニホンウズラインスリン様成長因子−ＩＩ（Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｑｕａｉｌ　ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−ＩＩ　：　ｊｑＩＧＦ−ＩＩ　）ポリペプチド及び、当該ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ　）は、プロインスリンとよく似た構造を有するペプチドホルモンであり、多くの組織や細胞の増殖・分化を促進することが知られている。ＩＧＦ　は成長ホルモンの働きを部分的に仲介するホルモンとして発見された生理活性ペプチドであり、血漿中の抗インスリン抗体では中和できないインスリン様活性物質として、さらに血漿中や細胞培養液中に存在する新しい細胞増殖因子として発見された。
【０００３】
ＩＧＦ　を単離・精製するための努力がなされ、増殖・分化を促進する活性の本体である２種類のペプチドが単離された。なおこれらのペプチドは、ＩＧＦ−Ｉ　およびＩＧＦ−ＩＩとよばれている。ＩＧＦ　はペプチドホルモンであるにも関わらず、体液中で特異的な結合蛋白質と会合して存在している。また、ＩＧＦ　はそれぞれのリガンドと特異的なレセプターと結合し、糖・アミノ酸の膜透過の促進など代謝性生理活性を発現するほかに、細胞の増殖・分化などを強く促進する。ヒトインスリン、ＩＧＦ−Ｉ　、ＩＧＦ−ＩＩの間で、それらの構造と機能を比較した結果を表１に示す。
【０００４】
【表１】
2004049111.tif 000002
【０００５】
細胞の増殖・分化に関与するＩＧＦ　は、最初はヒト由来のＩＧＦ−Ｉ　がクローン化され、そのｃＤＮＡから塩基配列とアミノ酸配列が決定された。その後ウシ、ラットやブタ等の哺乳類においてＩＧＦ　のクローニング及び遺伝子の配列決定が行われている。ＩＧＦ　の研究はＩＧＦ−Ｉ　のサブタイプにおいて進行しており、ＩＧＦ−ＩＩについての知見はまだ少ない。鳥類において、ニワトリ由来のＩＧＦ−ＩＩをコードする遺伝子がクローニングされているが、鳥類におけるＩＧＦ−ＩＩに関する知見はまだ少ないのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上記で述べた様に、ＩＧＦ　は細胞の分化・増殖を促進させる成長因子のペプチドホルモンであるので、鳥類の成長を促進させる目的において有効である。またＩＧＦ　は、生殖器官の成熟を促進したり、産卵率を向上させる作用もまた有することが知られている。これらのＩＧＦ　の生理作用を考えると、効率の良い食肉生産の目的にＩＧＦ　を利用することが可能である。より具体的には、ＩＧＦ　ポリペプチドを投与すること又はＩＧＦ　の遺伝子を発現させることにより、個体の成長を促進して増体を行ったり、性成熟を促進することができると考えられる。
【０００７】
よって、ＩＧＦ　の遺伝子又はポリペプチドを利用することにより、効率の良い食肉や卵の生産を達成することが期待される。言い換えるならば、鳥類において新規なＩＧＦ　を得ることができれば、鳥類の成長や生殖能が改善するように人為的に制御してその生育を促進することができる。例えば、家禽の生産において肉質を改善する目的でＩＧＦ　の遺伝子又はポリペプチドを使用することが可能である。その様な目的を達成するためには、鳥類において哺乳類のＩＧＦ　に相当する因子の遺伝子をクローニングし、その遺伝子の塩基配列を解析する必要がある。
【０００８】
そこで本発明の課題は、鳥類由来の新規なＩＧＦ−ＩＩの遺伝子を採取することにより、畜産業に資することである。ニホンウズラにおいてＩＧＦ−ＩＩポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする遺伝子が得られたならば、鳥類の食肉の生産向上に寄与する新たな方法が提供されると思われる。下記の実施例において示す様に、本発明者らは、ニホンウズラにおいてＩＧＦ−ＩＩをコードしている遺伝子のｃＤＮＡを採取してその塩基配列を決定した。また更にその塩基配列から推定されるアミノ酸配列を決定した。鳥類においてニワトリ以外のＩＧＦ−ＩＩはほとんど得られていないことを考えると、本発明によって達成される意義は大きいと思われる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の観点は、配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−１８７で示すアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドである。細胞の増殖・分化の促進作用を有し、その一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチドもまた、本発明の範囲内である。
【００１０】
本発明の第二の観点は、上記のポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００１１】
本発明の第三の観点は、配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−５６４で示される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子である。細胞の増殖・分化の促進作用を有するポリペプチドをコードし、その一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなることを特徴とする、遺伝子もまた、本発明の範囲内である。
【００１２】
本発明の第四の観点は、上記の遺伝子が鳥類に導入された形質転換鳥類である。
【００１３】
本発明の第五の観点は、、上記の遺伝子を大腸菌内で発現させる事により得られる、組み換えニホンウズラインスリン様成長因子−ＩＩポリペプチドである。
【００１４】
本発明の第六の観点は、その組み換えニホンウズラインスリン様成長因子−ＩＩポリペプチドに対する抗体である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、鳥類に由来する新規のＩＧＦ−ＩＩを採取することを目的として、ニホンウズラからＩＧＦ−ＩＩを採取することを試みた。各種の動物のＩＧＦ−ＩＩにおいて保存されている部分をプローブとして、ニホンウズラ肝臓のｃＤＮＡライブラリーよりＩＧＦ−ＩＩをコードするｃＤＮＡを探索し、その塩基配列を決定した。以下、ニホンウズラ由来のＩＧＦ−ＩＩをＪａｐａｎｅｓｅ　ｑｕａｉｌ　ＩＧＦ−ＩＩ　、略してｊｑＩＧＦ−ＩＩと称する。当該遺伝子の発見により、畜産業に大きな利益をもたらすことが期待される。
【００１６】
本発明のｊｑＩＧＦ−ＩＩ遺伝子は、配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−５６４で示される塩基配列からなることを特徴とする遺伝子である。上述した様に、ｊｑＩＧＦ−ＩＩ遺伝子は、ニホンウズラのインスリン様成長因子をコードする遺伝子であり、細胞の増殖・分化の促進作用を有する。
【００１７】
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むものである。
【００１８】
即ち、配列表の配列番号２に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号２に示す塩基配列において、１０個以下、好ましくは５個以下、更に好ましくは２個以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な遺伝子と配列番号２に示す塩基配列とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましく９９％以上の相同性を有する遺伝子である。その様な遺伝子も、細胞の増殖・分化の促進作用を有するポリペプチドをコードしている限り、本発明の範囲内である。またその様な遺伝子は、配列番号２に示す塩基配列の遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００１９】
上述した様に、本発明のｊｑＩＧＦ−ＩＩ遺伝子は細胞の増殖・分化の促進作用を有するペプチドホルモンをコードする遺伝子である。よって、当該遺伝子を導入する事により鳥類の成長を促進させることが可能であり、家禽の肉量や肉質が向上することが期待される。
【００２０】
上記の効果を達成する目的で、本発明のｊｑＩＧＦ−ＩＩ遺伝子を種々の鳥類に導入する事が可能である。当該遺伝子を導入する鳥類の例として、ウズラ、ニワトリ、シチメンチョウ、トキ、カカポ及びキウイ等が挙げられる。しかしそれらに限定されるものではなく、本発明の遺伝子を導入することができる限り任意の鳥類を対象とすることができる。遺伝子を導入する手段としては、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法等の本技術分野において通常に用いられている方法が挙げられる。その様にして作成した形質転換鳥類もまた本発明の範囲内である。
【００２１】
また、本発明のｊｑＩＧＦ−ＩＩポリペプチドは、配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−１８７で示すアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチドである。上述した様に、ｊｑＩＧＦ−ＩＩポリペプチドは、ニホンウズラのインスリン様成長因子のポリペプチドであり、細胞の増殖・分化の促進作用を有する。当該ペプチドは、配列表の配列番号２記載の遺伝子から翻訳されて生成するポリペプチドである。なお、ｊｑＩＧＦ−ＩＩポリペプチドにおいて、その２９番目から８４番目の計５６個のアミノ酸は、インスリン、インスリン様成長因子、リラキシンなどのファミリーに見られる特異的なモチーフを形成している。
【００２２】
配列表の配列番号１に示すポリペプチドの一部が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドとは、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１０個以下、好ましくは５個以下、更に好ましくは２個以下の塩基が置換されたポリペプチドである。また、その様な遺伝子と配列番号２に示すアミノ酸配列とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましく９９％以上の相同性を有するポリペプチドである。その様な遺伝子も、細胞の増殖・分化の促進作用を有するポリペプチドである限り、本発明の範囲内である。
【００２３】
更に、本発明のｊｑＩＧＦ−ＩＩ遺伝子を利用して、本技術分野における周知の方法を用いて組み換えｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質の大量生産を行うことができる。ｊｑＩＧＦ−ＩＩ遺伝子をベクターに結合して例えば大腸菌に組み込み、ｊｑＩＧＦ−ＩＩ遺伝子を導入したその大腸菌を大量に培養し、その菌体が生産した組み換えｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質を精製するなどの手法によって、組み換えｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質を大量に生産する事ができる。そして、その様にして生産された組み換えｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質も本発明の範囲内である。この組み換えｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質を例えば鳥類に投与することによって鳥類の成長を促進することが可能であり、食肉の生産性向上等の有用な効果を得ることができる。組み換えｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質を鳥類に投与する時期は特に限定されるものではなく、初期胚の段階で投与することも、孵化した後に投与することも可能である。また、ＩＧＦ−ＩＩは性成熟を促進する作用も有するために、組み換えｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質を投与された鳥類は通常より早期に産卵を開始するものと考えられる。更には産卵率を上昇させることが可能であり、組み換えｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質は効率の良い卵生産にも有用である。
【００２４】
また、上記の組み換えｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質に対する抗体も本発明の範囲内である。組み換えｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質に対する抗体は、当該蛋白質又はその部分ペプチドにより動物を免疫する等の、本技術分野における周知の方法を用いて作製することができる。当該抗体を用いることにより、例えばブロッティングの手法によりｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質の発現量を評価することができる。そして、ｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質の発現量を、例えば成長能のメルクマークとして使用する事が可能である。
以下の実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。上記の記載及び下記の実施例は、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２５】
【実施例】
（オリゴヌクレオチドプライマーの設計）
ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓ　）、ゼブラフィンチ（Ｔａｅｎｏｐｙｇｉａ　ｇｕｔｔａｔａ）、ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ブタ（Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆａ）　、マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の５種類のＩＧＦ−ＩＩ　ｃＤＮＡ　クローンの保存領域から保存性の高い部位を選び、ニワトリＩＧＦ−ＩＩ　ｃＤＮＡ　塩基配列の１９２−２１１　塩基部に相当するセンスプライマー１（ｃＳＰ１）、２６６−２８５　塩基部に相当するセンスプライマー２（ｃＳＰ２）、１０４７−１０６９　塩基部に相当するアンチセンスプライマー３（ｃＳＰ３）、および１５１６−１５３５　塩基部に相当するアンチセンスプライマー４（ｃＳＰ４）を合成した。
【００２６】
（ウズラ肝臓全ＲＮＡ　の抽出）
ウズラ肝臓に１ｍｌ　のＤ溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％サルコシン、０．１Ｍ　２−メルカプトエタノール）を加え、ポリトロンホモジナイザーで９０秒間ホモジナイズし、細胞の破壊と蛋白の変性を行った。このホモジネート液に対し１００　μｌ　の２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ　４．０）、１ｍｌ　の水飽和フェノール、１．８ｍｌ　のクロロフォルム／イソアミルアルコール（４９：１）を加え、添加ごとに１０秒間激しく混合した。
【００２７】
１５分間氷冷後、４℃、１０，０００　ｘ　ｇで２０分間遠心分離を行い、ＲＮＡを含む水層を別のチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えてよく混合し、−２０℃で１時間静置した。４℃、１０，０００　ｘ　ｇで２０分間遠心分離を行い、上清を除きＲＮＡ　の沈殿をＤ溶液に完全に溶解した後、等量のフェノール／クロロフォルム（１：１　）を加えてよく混合し、４℃、１０，０００　ｘ　ｇで２０分間遠心分離を行った。
【００２８】
ＲＮＡ　を含む水層を新しいチューブに移し、２倍量のエタノールを加え　−２０℃で１時間静置し、４℃、１０，０００　ｘ　ｇで２０分間遠心分離を行った。遠心後、清を除きＲＮＡ沈殿に７５％エタノールを加え洗浄した。４℃、１０，０００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離を行い、上清を除き、ＲＮＡ　沈殿を乾燥させた後、適量のジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理滅菌水に溶解した。ＲＮＡ　濃度は２６０ｎｍ　での吸光度を測定し、１．０　ＯＤ２６０　＝４０μｇ／ｍｌとして算出した。
【００２９】
（ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　からのｃＤＮＡ合成）
ウズラ肝臓から抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　１　μｇ　とオリゴｄＴプライマー、　１μｌ　の逆転写酵素ｓｕｐｅｒ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ　：　２００ｕｎｉｔｓ　／μｌ　）を加えて４２℃、１時間反応させＲＮＡ　に相補的なｃＤＮＡを合成した。
【００３０】
（合成ｃＤＮＡからのＰＣＲ　増幅）
前記で得たｃＤＮＡの　１μｌ　に１０ｐｍ　／μｌ　のセンス・アンチセンスプライマーをそれぞれ　１μｌ　、２μｌ　のｄＮＴＰ混合液（各２５ｍＭ）、２．５μｌ　の１０ｘ　反応バッファー、０．１　μｌ　のＥｘＴａｑ　（Ｔａｋａｒａ　：　５ｕｎｉｔｓ／μｌ　）を加えＰＣＲ　反応を行った。用いたセンス・アンチセンスプライマーは、図１に示した様に作成したものをそれぞれ組み合わせて用いた。
【００３１】
ｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｉ　を用いて約２５０，　４１０，　５６０　ｃＤＮＡクローンのライゲーションを行った。これをコンピテントセル（ＪＭ１０９　）に導入し、このクローンの単離、サイズの確認を行い、目的のクローンを得た。
【００３２】
（塩基配列の決定）
前記において得た２つのクローンについてシークエンスを行い塩基配列を決定した。決定した塩基配列及びそれから得られた推定アミノ酸配列、即ちｊｑＩＧＦ−ＩＩ遺伝子と当該遺伝子がコードするｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質の配列を図２に示す。
【００３３】
さらに、ニホンウズラ由来のＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列と、他種由来のＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列の相同性の比較を行った。種々のＩＧＦ−ＩＩの間でアミノ酸アラインメントの比較を行った結果を図３に示す。ニホンウズラ由来ＩＧＦ−ＩＩと種々の動物のＩＧＦ−ＩＩとの相同性を検討したところ、ニワトリＩＧＦ−ＩＩとの相同性は９８．５％、ゼブラフィンチＩＧＦ−ＩＩとの相同性は９０．３％、ブタＩＧＦ−ＩＩとの相同性は５９．０％、ヒトＩＧＦ−ＩＩとの相同性は５８．２％、ヒツジＩＧＦ−ＩＩとの相同性は５７．５％、ラットＩＧＦ−ＩＩとの相同性は５５．６％、マウスＩＧＦ−ＩＩとの相同性は５５．６％、コイＩＧＦ−ＩＩとの相同性は５０．８％であった。また上記の相同性より作製した進化の系統樹を図４に示した。
【００３４】
【発明の効果】
本発明により、ニホンウズラインスリン様成長因子ＩＩポリペプチド及び、当該ポリペプチドをコードする遺伝子が与えられた。当該遺伝子を導入することにより、鳥類の生育を促進することが可能となる。
【００３５】
【配列表】
2004049111.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、オリゴヌクレオチドプライマーの設計のストラテジーを示す図である。
【図２】図２は、ｊｑＩＧＦ−ＩＩの遺伝子の塩基配列及びｊｑＩＧＦ−ＩＩ蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図３は、種々のＩＧＦ−ＩＩの間におけるアミノ酸アラインメントの比較を示す図である。
【図４】図４は、アミノ酸アラインメントの比較より作製した進化の系統樹を示す図である。
【図１】
2004049111.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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