(57)【要約】【課題】非常に簡便で、例えば小中学校などの学校教育にも使用でき、十分な効率で原核細胞にポリヌクレオチドを導入すること。【解決手段】ペプチドグルカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞に、カチオンリポソーム等のトランスフェクション試薬及びポリヌクレオチドの共存下に遺伝子導入を行うことを特徴とする方法、及びトランスフェクション試薬とポリヌクレオチドとの複合体を、賦活培地で培養中の原核細胞に添加することによりポリヌクレオチドを細胞に導入し、その後選択培地で細胞を培養する、誰もが行うことのできる非常に簡便な遺伝子導入手法。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、該方法をポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の共存下に行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を該原核細胞に接触させることにより、ポリヌクレオチドを該原核細胞に導入することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トランスフェクション試薬が脂質を主成分とする試薬である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
トランスフェクション試薬がカチオンリポソームである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
原核細胞が大腸菌又はラン藻であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬を含むトランスフェクションキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する細胞にポリヌクレオチドを導入する方法に関する。また、本発明は、特に義務教育にも適した教育用のトランスフェクションの方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
原核細胞にポリヌクレオチドを導入し、遺伝子やタンパク質を発現させることは、遺伝子の機能解析のためには必須となる技術である。そのため、種々の細胞にポリヌクレオチドを導入することにより、遺伝子やタンパク質を発現させることを目的として、様々な技術や試薬の改良が試みられている。
【０００３】
原核細胞へポリヌクレオチドを導入する方法としては、主として物理法と化学法とが知られている。
【０００４】
物理法は、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等を含み、例えば、エレクトロポレーション法の場合、大腸菌では対数増殖期の細胞を純水などの塩をほとんど含まない溶液にて洗浄し、氷上にてポリヌクレオチドと共存させた後、短い時間高電圧をかけることで細胞に一時的に小孔を生じさせ、ポリヌクレオチドを導入し、賦活培地にて１時間程度３７℃にて培養し、選択培地に植菌するものである。
【０００５】
化学法は、例えば、大腸菌の場合には、塩化カルシウム溶液などで細胞を処理し、氷上でポリヌクレオチドと共存させた後、４２℃で短時間温め、再度氷上で２分程度冷却した後に、賦活培地にて１時間程度３７℃にて培養し、選択培地に植菌するものである。
【０００６】
また真核細胞、特に培養細胞の場合には、化学法として上記の方法のほかにリポフェクション法が知られている。リポフェクション法は、主に正に荷電しているリポソーム（カチオンリポソーム）とポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、該カチオンリポソームを負に荷電している細胞表面に吸着させ、細胞膜と融合させることによって、細胞内にポリヌクレオチドを導入させる方法である（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００７】
これらの方法は従来から用いられてきた手法であり、以下に示すように問題点も多い。
【０００８】
例えば、化学法は、細胞を処理する操作が煩雑であり、熟練した技術が必要である。また、ヒートショック処理なども必要であり細胞に負担がかかる。
【０００９】
エレクトロポレーション法は、細菌類、菌類、酵母、植物細胞、動物細胞等ほとんどの細胞に対して高い導入効率を示すが、死滅する細胞が多く、導入した細胞に対して損傷又は分極を引き起こすために、テトラサイクリン耐性遺伝子等は他の遺伝子に比べて１／１００程度の低い効率でしか導入されないことがある。また、特別な装置を必要とする。
【００１０】
リポフェクション法は、ペプチドグリカン層やセルロース層などの細胞壁を有する細胞の場合、リポフェクション試薬と融合する細胞膜が露出していないため、適用対象が細胞壁を有さない細胞に限定されると考えられてきた。
【００１１】
【非特許文献１】
サムブルック・ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．）及びディー．ダブリュー．ラッセル（Ｄ．Ｗ．　Ｒｕｓｓｅｌｌ）著，「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」，（米国），第３版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ），２００１年
【００１２】
【非特許文献２】
ウイリアム・ジェイ・ダウアー（Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｊ．　Ｄｏｗｅｒ），ジェフ・エフ・ミラー（Ｊｅｆｆ　Ｆ．　Ｍｉｌｌｅｒ）及びチャールズ・ダブリュー・ラグスドール（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｗ．　Ｒａｇｓｄａｌｅ）著：「ハイ・エフィシェンシー・トランスフォーメーション・オブ・イー．コリ・バイ・ハイ・ボルテージ・エレクトロポレーション（Ｈｉｇｈ　ｅｆｆｉｃｅｎｃｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｂｙ　ｈｉｇｈ　ｖｏｌｔａｇｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）」，「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９８８年，Ｖｏｌ．１６，Ｎｏ．１３，ｐ．６１２７−６１４５
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する細胞に対して、簡便、安全且つ効率良くポリヌクレオチドを導入する方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の如き従来技術の問題点を解決するために、鋭意研究を重ねてきた。その結果、ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する細胞に対して、トランスフェクション試薬、特に脂質を主成分とするトランスフェクション試薬を用いて遺伝子導入を行うことにより、簡便、安全且つ効率良くポリヌクレオチドを導入できることを見出した。
【００１５】
即ち、本発明は、以下のポリヌクレオチドを導入する方法に関する。
【００１６】
項１．ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、該方法をポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の共存下に行うことを特徴とする方法。
【００１７】
項２．ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を該原核細胞に接触させることにより、ポリヌクレオチドを該原核細胞に導入することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【００１８】
項３．トランスフェクション試薬が脂質を主成分とする試薬である請求項１に記載の方法。
【００１９】
項４．トランスフェクション試薬がカチオンリポソームである請求項１に記載の方法。
【００２０】
項５．原核細胞が大腸菌又はラン藻であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【００２１】
項６．ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬を含むトランスフェクションキット。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明のポリヌクレオチドを細胞に導入する方法は、ペプチドグリカンを細胞壁に有する原核細胞に、通常のトランスフェクション試薬、特に脂質を主成分とするトランスフェクション試薬を使用することに特徴がある。
【００２３】
本発明においてポリヌクレオチドが導入される原核細胞は、ペプチドグリカン又はペプチドグリカンに類似する物質を細胞壁に有する原核細胞であり、例えば、大腸菌、枯草菌等を含む細菌類、ラン藻類等が挙げられる。その中でも、利便性等の点から大腸菌、ラン藻類等が好ましい。
【００２４】
大腸菌の種類は限定されず、例えば、通常遺伝子組換えに使用されているＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＢＬ２１（ＤＥ３）等のＫ１２株由来のものを挙げることができる。また、ラン藻類の種類も限定されず、例えば、シネココッカス、シネコキスチス、スピルリナ等を挙げることができる。
【００２５】
学校・大学教育用に使用する場合は、病原性を示さず、伝播性を有さない菌株が必要である。例えば、大腸菌　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２株、その誘導体等を挙げることができる。また、宿主ベクター系については、文部科学省告示第５号「組換えＤＮＡ実験指針」に記載されている宿主ベクター系を用いることが必要である。この宿主ベクターとしては、例えば、Ｂ１、Ｂ２レベルの認定宿主ベクター系、大腸菌Ｋ１２株系、χ１７７６などを例示できる。
【００２６】
本明細書において、ポリヌクレオチドとは各種ＤＮＡを含み、例えば、自己増殖するプラスミド、ＰＣＲ断片等も含むものとする。ポリヌクレオチドの種類、調製法等は特に限定されず、実験の目的等に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
得られたポリヌクレオチドを原核細胞に導入する際に、トランスフェクション試薬を用いることが必要である。トランスフェクション試薬は一般に動物の培養細胞に使用されるトランスフェクション試薬を用いることができ、脂質を主成分とするトランスフェクション試薬を用いることが好ましく、カチオンリポソームを主成分とするものが特に好ましい。
【００２８】
本明細書において、脂質としては、限定されるものではなく、例えば、単純脂質、複合脂質、誘導脂質、リポ多糖、リポタンパク質、ステロイド、カルテノイド、テルぺノイド等も含むものとする。
【００２９】
また、カチオンリポソームとは、例えば、不飽和度が低い炭素分子鎖を主体とする分子の片端にカチオンとなる原子団（カチオン荷電分子）を有する荷電した分子を意味する。
【００３０】
炭素分子鎖を主体とする分子の例として、炭素数１２〜２０、二重結合の数が０〜４の脂肪酸の他に、官能基を有するベンゼン環、窒素原子を含む複素環化合物が挙げられる。具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等や、（Ｓ）−２−メチル−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−４−カルボン酸（（Ｓ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−１，４，５，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、（Ｓ）−２−メチル−５−ヒドロキシ−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−４−カルボン酸（（Ｓ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−１，４，５，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）等が例示できる。これらを単独で使用することもできるし、２種以上使用することもできる。
【００３１】
カチオン荷電分子とは、カチオンに荷電する分子をいい、例えば、アミン塩、第４級アンモニウム塩、ピリジニウム塩等が挙げられる。これらも単独で使用しても良いし、２種以上用いても良い。
【００３２】
炭素分子鎖を主体とする分子とカチオン荷電分子とは、任意の組み合わせで用いることができ、これらを結合させる方法は適宜選択することができる。
【００３３】
脂質を主成分とする具体的なトランスフェクション試薬としては、例えば、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）、ＤＯＳＦＥＲ（１，３−Ｄｉ−Ｏｌｅｏｘｙｌｏｘｙ−２−（６−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）、Ｔｒａｎｓｏｍｅ（登録商標）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６等を例示することができる。
【００３４】
ポリヌクレオチドを原核細胞に導入する際には、ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬をあらかじめ室温で混合し、複合体を形成させることが好ましい。ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混ぜ合わせる割合は、ポリヌクレオチドの種類、用いるトランスフェクション試薬の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリヌクレオチド１μｇあたり脂質成分として１〜１０００μｇ程度が例示できる。
【００３５】
また、ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混ぜる方法は、ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とが複合体を形成する限り限定されないが、例えばマイクロチューブのようなケースにカチオンリポソームを含む溶液を予め入れておき、必要量のポリヌクレオチドを含む溶液を添加し、必要に応じて軽く混和し、約１分以上、好ましくは１０〜１５分間程度、例えば室温で静置すればよい。
【００３６】
上記のようにして得られた複合体を、原核細胞に接触させてポリヌクレオチドを原核細胞に導入する。複合体と原核細胞とを接触させる方法としては限定されるものではなく、例えば、以下に示すような方法が例示できる。
【００３７】
（Ｉ）方法１（図１；中ルート）
本発明における方法１を中ルートに例示するが、これは単なる例示であり、実験条件等はこれらに限定されない。また、左ルートは従来の化学法に関する実験手順を例示するものである。
【００３８】
例えば、ミリＱ水、ＨＥＰＥＳ　１ｍＭ　ｐＨ７．０、０．５Ｍマンニトール液等のような低塩濃度液中に予め原核細胞を懸濁しておき、その後、その原核細胞を複合体と接触させればよい。この操作は、好ましくは０〜５℃程度の温度下、例えば氷上で行うことが好ましい。
【００３９】
原核細胞と複合体とを接触させる方法も限定されず、細胞の希釈液に複合体を添加してもよいし、また、逆に複合体に細胞の希釈液を添加してもよい。このようにして得られた複合体と細胞との混合物を必要に応じて軽く混和し、１〜１０分程度、好ましくは２〜８分程度、更に好ましくは５分程度静置すればよい。複合体と原核細胞とを接触させる際の条件としても特に限定されるものではなく、菌体の生育可能温度であればよく、好ましくは約０〜５℃程度の温度下、例えば氷上で行うことが好ましい。
【００４０】
原核細胞と複合体との混合割合も、使用する細胞の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、細胞１×１０９個あたり、ポリヌクレオチド１〜１００ｎｇ程度、好ましくは１〜１０ｎｇ程度になるようにすることができる。
【００４１】
その後、例えば、ＳＯＣ培地のような賦活培地中で、３７℃程度で２０分〜２時間程度、好ましくは１時間程度振盪培養することが好ましい。次いで、選択培地で細胞を培養し、ポリヌクレオチドが原核細胞に導入されたことを、公知の方法により確認することができる。例えば、抗生物質耐性などによる確認、ＰＣＲによるポリヌクレオチドの検出が挙げられる。
【００４２】
ポリヌクレオチドの中に挿入できる遺伝子としては、例えば、アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）耐性遺伝子やカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子やクロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子、構造遺伝子、調節遺伝子等、種々のポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４３】
上記の抗生物質耐性遺伝子と共に、例えばＧＦＰ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等の遺伝子を導入してもよい。これらの遺伝子も同時に導入することにより、蛍光発色や、発光等により、遺伝子が導入されたことが細胞の外観から更にわかりやすくなるからである。
【００４４】
この方法１によれば、真核細胞にポリヌクレオチドを導入する際に通常使用されているリポフェクション試薬を用いることにより、非常に高い効率で原核細胞にポリヌクレオチドが導入できる。
【００４５】
（ＩＩ）方法２（図１；右ルート）
本発明における方法２を右ルートに例示するが、上記と同様に単なる例示であり、実験条件等はこれらに限定されない。
【００４６】
ＬＢ培地等のような、大腸菌などの原核細胞を培養する通常の培地で培養した原核細胞を、ＳＯＣ培地等のような低塩濃度の賦活培地で、例えばＯＤ６００＝０．６程度になるまで振盪培養する。その後、該賦活培地中にポリヌクレオチドとリポフェクション試薬との複合体を添加し、更に振盪培養する。
【００４７】
このときの実験条件は実験の目的等に応じて適宜選択される。例えば、細胞１×１０９個あたり、ポリヌクレオチド１〜１００ｎｇ程度、好ましくは１〜１０ｎｇ程度になるようにすることができる。原核細胞と複合体との混合物を振盪培養する時間としては限定されず、適宜選択することができる。例えば、５分〜１時間程度、好ましくは１０分〜１時間程度、更に好ましくは３０分〜１時間程度が挙げられる。
【００４８】
上記のようにして得られた原核細胞は、上記の方法（Ｉ）と同様に選択培地に培養し、ポリヌクレオチドが原核細胞に導入されたことを確認することができる。
【００４９】
この方法２（図１の右ルート）によれば、従来の化学法（図１の左ルート）のように、原核細胞の回収（集菌）、細胞の化学的処理、原核細胞とＤＮＡとの混合、ヒートショック、賦活培養等の煩雑でしかも数多くの工程を省略することができ、非常に簡便に原核細胞にポリヌクレオチドの導入を行うことができる。この方法は、本発明の方法１よりも更に簡便な方法である。そのため、学校、大学の教育に使用するための方法等としても非常に有用である。
【００５０】
また、学校・大学教育用に本発明の方法を使用するためには、文部科学省告示第５号「組換えＤＮＡ実験指針」に規定されているような手法に従って実験を行うことが必要である。
【００５１】
また、実験に使用した器具、細胞等の後片付けについても、文部科学省告示第５号「組換えＤＮＡ実験指針」付属資料４の教育目的組換えＤＮＡ実験に係わる実験実施規定に従って行うことが必要である。例えば、実験終了後煮沸又は消毒液の投入等の措置により組換え体を滅菌し、組換え体の付着した器具などは消毒又は滅菌することが必要である。
【００５２】
更に、上記のポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体は冷蔵又は冷凍保存することができ、必要なときに使用することができ、トランスフェクションキットしても用いることができる。
【００５３】
また、学校・大学教育用に簡便に実験を行うために、例えば、ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬との複合体、宿主細胞、培地、実験を行うための器具、殺菌用の試薬等をセットにすると、そのセットがあれば実験を行うことができ、便利である。
【００５４】
【実施例】
以下に、実施例を示し、本発明の特徴とするところをより一層明瞭にする。
【００５５】
実施例１：ＤＨ５α　ＤＯＴＡＰ
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注する。一方にはトランスフェクション試薬　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００５６】
大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を氷上で、ミリＱ水を用いて５倍に希釈した前記の複合体にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上に５分置いた。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００５７】
トランスフェクション試薬を混ぜた方では、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり３．７×１０４株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００５８】
実施例２：ＤＨ５α　ＤＯＴＡＰ
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方には、トランスフェクション試薬　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）　ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００５９】
大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を氷上で、ＨＥＰＥＳ　１ｍＭ　ｐＨ７．０及びマンニトール０．５Ｍを含む溶液を用いて５倍に希釈した。前記の複合体にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上にて５分置いた。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６０】
トランスフェクション試薬を混ぜた方ではｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり１．９×１０５株のアンピシリンン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００６１】
実施例３：ＤＨ５α　ＤＯＳＦＥＲ
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方にはトランスフェクション試薬　ＤＯＳＦＥＲ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、ダイカチオニックタイプ、１，３−Ｄｉ−Ｏｌｅｏｘｙｌｏｘｙ−２−（６−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００６２】
大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を氷上で、ＨＥＰＥＳ　１ｍＭ　ｐＨ７．０及びマンニトール０．５Ｍを含む溶液を用いて５倍に希釈した。前記の複合体にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上で５分置いた。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６３】
トランスフェクション試薬を混ぜた方では、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり６．９×１０４株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００６４】
実施例４：ＤＨ５α　ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方にはトランスフェクション試薬として　ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６　　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、非リポソーマル型）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温で混合し、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００６５】
大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を氷上で、ＨＥＰＥＳ　１ｍＭ　ｐＨ７．０及びマンニトール０．５Ｍを含む溶液を用いて５倍に希釈した。前記の複合体にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上に５分おいた。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６６】
トランスフェクション試薬を混ぜた方では、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり１．０×１０５株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００６７】
実施例５：ＤＨ５α　Ｔｒａｎｓｏｍｅ（登録商標）
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、マイクロチューブ２本に５μｌずつ分注した。一方にはトランスフェクション試薬としてカチオンリポソーム　Ｔｒａｎｓｏｍｅ（登録商標）（ニッポンジーン社、Ｓｍａｌｌ　Ｕｎｉａｍｅｌｌａｒ　Ｖｅｓｉｃｌｅタイプ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温で混合し、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００６８】
大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ、１×１０１０個ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を用いて、氷上にてＨＥＰＥＳ　１ｍＭ　ｐＨ７．０及びマンニトール０．５Ｍを含む溶液を用いて５倍に希釈した。前記のＤＮＡ溶液にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上に５分置いた。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６９】
トランスフェクション試薬を混ぜた方では，　ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり７．１×１０４株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００７０】
実施例６：ＤＨ１０Ｂ
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、マイクロチューブ２本に５μｌずつ分注した。一方にはトランスフェクション試薬としてカチオンリポソーム　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温で混合し、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００７１】
大腸菌ＤＨ１０Ｂ株をＳＢ培地にて培養し、ＯＤ６００約０．６で回収し、ミリＱ水にて数回洗浄し、最後は１０％グリセロール溶液にて懸濁し、エレクトロコンピテント細胞を自製し、５０μｌずつ分注し、−８０℃にて保存した。
【００７２】
氷上でコンピテント細胞を融解し、ＨＥＰＥＳ　１ｍＭ　ｐＨ７．０及びマンニトール０．５Ｍを含む溶液を用いて５倍に希釈した。前記の複合体にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上に５分おいた。そこに３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、アンピシリンを含むＬＢプレート培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００７３】
トランスフェクション試薬を混ぜた方では、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり７．８×１０２株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００７４】
実施例７：Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ
クロラムフェニコール耐性プラスミドｐＨＳＧ３９７より、クロラムフェニコール耐性遺伝子部をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーを設計し、同プラスミドをテンプレートとして増幅した。
【００７５】
ＰＣＲ産物をＤＮＡ精製カラムＳ−４００（アマシャムファルマシア社）により精製し、濃度を５０　ｎｇ／μｌに調整し準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方にはトランスフェクション試薬として　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温で混合し、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００７６】
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｐｌａｔｅｎｓｉｓ　ＩＡＭ　Ｍ１３５株をＳＯＴ培地で培養し、ＯＤ５５０が約０．６の時点で回収し、ミリＱ水にて数回洗浄し、最後は１０％グリセロール溶液にて懸濁した。
【００７７】
前記の複合体にそれぞれ５０μｌずつ加え、氷上に５分置いた。そこに３０℃に温めておいたＳＯＴ培地１ｍｌを加え、３０℃で一晩暗所にて培養し、０．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＳＯＴ培地に植菌し、３０℃で弱光下１週間培養した。
【００７８】
僅かに増殖してきている菌体を回収し、ゲノムを回収し、ＰＣＲにてクロラムフェニコール遺伝子の存在を確認したところ、トランスフェクション試薬を共存させたものについてのみクロラムフェニコール遺伝子の存在を確認した。
【００７９】
実施例８：ＤＨ５α　ＤＯＴＡＰ　　ＳＯＣ混合培養（対数増殖期）
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方にはトランスフェクション試薬　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し５分放置して、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００８０】
大腸菌ＤＨ５αを一晩ＬＢ培地にて培養したものからＳＯＣ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．６まで３７℃で振とう培養した。ここにポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体又はポリヌクレオチドを加え、さらに３０分培養を続けた。これを、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８１】
トランスフェクション試薬を混ぜた方では、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり２．５×１０２株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００８２】
実施例９：ＤＨ５α　ＤＯＴＡＰ　　ＳＯＣ混合培養（定常期）
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方にはトランスフェクション試薬　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し５分放置して、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００８３】
大腸菌ＤＨ５αを一晩ＬＢ培地にて培養したものからＳＯＣ培地に植菌し、ＯＤ６００＝３．０まで３７℃で振とう培養する。ここにポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体又はポリヌクレオチドを加え、さらに３０分培養を続けた。これを、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８４】
トランスフェクション試薬を混ぜた方では、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり３．０×１０２株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００８５】
実施例１０：ＤＨ５α　ＤＯＳＦＥＲ　　ＳＯＣ混合培養（対数増殖期）
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方にはトランスフェクション試薬　ＤＯＳＦＥＲ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、ダイカチオニックタイプ、１，３−Ｄｉ−Ｏｌｅｏｘｙｌｏｘｙ−２−（６−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し５分放置して、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００８６】
大腸菌ＤＨ５αを一晩ＬＢ培地にて培養したものからＳＯＣ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．６まで３７℃で振とう培養した。ここにポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体（もしくはポリヌクレオチド）を加え、さらに３０分培養を続ける。これを、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８７】
トランスフェクション試薬を混ぜた方では、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり２．２×１０２株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００８８】
実施例１１：ＤＨ５α　ＤＯＳＰＥＲ　ＳＯＣ混合培養（定常期）
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方にはトランスフェクション試薬　ＤＯＳＦＥＲ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、ダイカチオニックタイプ、１，３−Ｄｉ−Ｏｌｅｏｘｙｌｏｘｙ−２−（６−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し５分放置して、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００８９】
大腸菌ＤＨ５αを一晩ＬＢ培地にて培養したものからＳＯＣ培地に植菌し、ＯＤ６００＝３．０まで３７℃で振とう培養した。ここにポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体（もしくはポリヌクレオチド）を加え、さらに３０分培養を続けた。これを、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００９０】
トランスフェクション試薬を混ぜた方では、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり２．５×１０２株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００９１】
実施例１２：ＤＨ１０Ｂ　　ＤＯＴＡＰ　ＳＯＣ混合培養（対数増殖期）
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方には、トランスフェクション試薬　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）　ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し５分放置し、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００９２】
大腸菌ＤＨ１０Ｂを一晩ＬＢ培地にて培養したものをＳＯＣ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．６まで培養した後、ここにポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体（もしくはポリヌクレオチド）を加え、さらに３０分培養を続けた。これを、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００９３】
トランスフェクション試薬を混ぜた方では、ｐＵＣ１９　ＤＮＡ　１μｇあたり２．０×１０２株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００９４】
【発明の効果】
本発明のポリヌクレオチドを原核細胞に導入する方法によれば、ペプチドグリカンを主成分とする細胞壁を有する原核細胞にポリヌクレオチドを導入する際に、トランスフェクション試薬を使用することにより、簡便に、効率良く導入することができる。
【００９５】
また、本発明の方法は、操作が簡便なので熟練した技術を要さず、特殊な器具等も使用しなくてすむので、誰でも行うことができる。例えば、小学校、中学校、高校、大学、専門学校等における実験、実習等にも使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実験の方法を例示する図である。
【図１】
2004024232.tif 000003