(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ヒトＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ遺伝子のヌクレオチド配列、およびそれらのコード化タンパク質のアミノ酸配列を提供する。【解決手段】ヒトＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ遺伝子のヌクレオチド配列、およびそれらのコード化タンパク質のアミノ酸配列、並びに抗原決定基を含むか機能的に活性であるそのフラグメントに関するものである。また、トポリズミックタンパク質へのホモタイピックまたはヘテロタイピック結合を媒介するトポリスミック遺伝子によりコードされるタンパク質（“トポリズミックタンパク質（ｔｏｐｏｒｙｔｈｍｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ）”）のフラグメント（ここでは“接着フラグメント”と呼ぶ）およびその配列に向けられる。ここで用いるトポリズミック遺伝子とはＮｏｔｃｈ、ＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅ遺伝子、並びに例えばここに記載した方法により同定しうるＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅファミリーの他のメンバーを指す。さらに、ヒトＮｏｔｃｈおよび接着フラグメントに対する抗体も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＮｏｔｃｈタンパク質とｉｎ　ｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、Ｄｅｌｔａタンパク質の精製されたフラグメント。
【請求項２】
図１３（配列番号：６）に示されるアミノ酸番号１−２３０に最大の相同性を有する、Ｄｅｌｔａタンパク質の一部である請求項１記載のフラグメント。
【請求項３】
第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現された第２のＤｅｌｔａタンパク質とｉｎ　ｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、Ｄｅｌｔａタンパク質の精製されたフラグメント。
【請求項４】
図１３（配列番号：６）に示されるアミノ酸番号約３２−２３０に対して最大の相同性を有する、Ｄｅｌｔａタンパク質の一部分である請求項３記載のフラグメント。
【請求項５】
異種タンパク質配列に結合した請求項１記載のフラグメントを含むか、または異種タンパク質配列に結合した請求項３記載のフラグメントを含むキメラタンパク質。
【請求項６】
第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＮｏｔｃｈタンパク質とｉｎ　ｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、Ｓｅｒｒａｔｅタンパク質の精製されたフラグメント。
【請求項７】
図１５（配列番号：９）に示したアミノ酸配列のアミノ酸番号約８５−２８３に最大の相同性を有するＳｅｒｒａｔｅタンパク質の一部分であるＳｅｒｒａｔｅタンパク質の精製されたフラグメント。
【請求項８】
異種タンパク質配列に結合した、請求項７記載のフラグメントを含むキメラタンパク質。
【請求項９】
第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現されたＮｏｔｃｈタンパク質とｉｎ　ｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、請求項１記載のフラグメントの誘導体またはアナログ。
【請求項１０】
第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現された第２のＤｅｌｔａタンパク質とｉｎ　ｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、請求項３記載のフラグメントの誘導体またはアナログ。
【請求項１１】
第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現された第２のタンパク質とｉｎ　ｖｉｔｒｏで結合できることにより特徴づけられる、請求項６記載のフラグメントの誘導体またはアナログであって、第２のタンパク質がＮｏｔｃｈタンパク質、Ｄｅｌｔａタンパク質、及び第２のＳｅｒｒａｔｅタンパク質からなる群から選択されるものである、誘導体またはアナログ。
【請求項１２】
請求項３記載のフラグメントをコードする精製された核酸。
【請求項１３】
請求項５記載のキメラタンパク質をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１記載のフラグメントに結合するか、または請求項３記載のフラグメントに結合するか、または請求項６記載のフラグメントに結合する抗体。
【請求項１５】
請求項１４記載の抗体のイディオタイプを含む、該抗体のフラグメントまたは誘導体。
【請求項１６】
（ａ）Ｓｅｒｒａｔｅタンパク質及びＤｅｌｔａタンパク質の両方に相同的な第１のアミノ酸配列、及び（ｂ）　Ｓｅｒｒａｔｅタンパク質またはＤｅｌｔａタンパク質のどちらか一方に相同的ではない第２のアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする精製された核酸。
【請求項１７】
図１５（配列番号：９）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号約７９−２８２に最大のホモロジーを有するＳｅｒｒａｔｅタンパク質の一部分である、Ｓｅｒｒａｔｅタンパク質の精製されたフラグメント。
【請求項１８】
（ａ）第１細胞の表面上に発現されるとき、第２細胞の表面上に発現された第２のＤｅｌｔａタンパク質またはフラグメントまたは誘導体にｉｎ　ｖｉｔｒｏで結合できること、及び（ｂ）第３細胞の表面上に発現されるとき、前記の細胞の表面上に発現されたＮｏｔｃｈタンパク質にｉｎ　ｖｉｔｒｏで結合することができないことにより特徴づけられる、Ｄｅｌｔａタンパク質の精製されたフラグメントまたは誘導体。
【請求項１９】
Ｄｅｌｔａタンパク質の細胞内ドメインを欠失している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のフラグメント。
【請求項２０】
Ｄｅｌｔａタンパク質の上皮成長因子様領域及び膜貫通領域をさらに欠失している、請求項１９記載のフラグメント。
【請求項２１】
前記フラグメントがＤｅｌｔａタンパク質の細胞内ドメインを欠失している、請求項５記載のタンパク質。
【請求項２２】
Ｄｅｌｔａタンパク質の上皮成長因子様領域及び膜貫通領域をさらに欠失している、請求項２１記載のタンパク質。
【請求項２３】
Ｄｅｌｔａタンパク質の細胞内ドメインを欠失している、請求項９または１０記載の誘導体またはアナログ。
【請求項２４】
Ｄｅｌｔａタンパク質の上皮成長因子様領域及び膜貫通領域をさらに欠失している、請求項２３記載の誘導体またはアナログ。
【請求項２５】
Ｓｅｒｒａｔｅタンパク質の完全上皮成長因子様繰返しを含まない、請求項１１記載の誘導体またはアナログ。
【請求項２６】
細胞を該細胞の分化を操作するのに効果的な量のトポリズミックタンパク質と接触させる工程を包含する細胞分化の操作方法。
【請求項２７】
前記トポリズミックタンパク質がＤｅｌｔａタンパク質またはＳｅｒｒａｔｅタンパク質である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
細胞を該細胞の分化を操作するのに効果的な量の第１のトポリズミックタンパク質のフラグメントまたは誘導体と接触させる工程を包含する細胞分化の操作方法であって、ここで該フラグメントまたは誘導体が第２のトポリズミックタンパク質を結合する能力によって特徴づけられる、操作方法。
【請求項２９】
前記第２のトポリズミックタンパク質がＮｏｔｃｈタンパク質である請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記第２のトポリズミックタンパク質がＤｅｌｔａタンパク質である請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のトポリズミックタンパク質がＳｅｒｒａｔｅタンパク質である請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のトポリズミックタンパク質がＤｅｌｔａタンパク質またはＳｅｒｒａｔｅタンパク質である、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
細胞を該細胞の分化を操作するのに効果的な量の、トポリズミックタンパク質と結合する抗体または該抗体のイディオタイプを含む該抗体のフラグメントと接触させる工程を包含する細胞分化の操作方法。
【請求項３４】
前記抗体あるいは該抗体のフラグメントまたは誘導体がトポリズミックタンパク質の接着部分に結合する請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体あるいは該抗体のフラグメントまたは誘導体が、ＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅからなる群から選択されるトポリズミックタンパク質に結合する請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体がトポリズミックタンパク質の細胞外ドメインに結合する、請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ｔｈｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　により付与された許可番号ＧＭ１９０９３　およびＮＳ２６０８４　のもとに一部政府の支持でなされた。政府は本発明に或る種の権利を有する。
【０００２】
１．序論
本発明は、ヒトのノッチ（Ｎｏｔｃｈ）遺伝子およびデルタ（Ｄｅｌｔａ）遺伝子並びにそれらの暗号化された生産物に関する。また、本発明は、トポリズミック（ｔｏｐｏｒｙｔｈｍｉｃ）　遺伝子により暗号化されたタンパク質中の配列への同型結合または異型結合を媒介するトポリズミック遺伝子により暗号化されたタンパク質中の配列（本明細書中、“接着配列”と称する）に関する。このような遺伝子はＮｏｔｃｈ、Ｄｅｌｔａ、およびセレイト（Ｓｅｒｒａｔｅ）　を含むが、これらに限定されない。
【０００３】
２．発明の背景
ショウジョウバエの遺伝子分析は、発達経路の複雑さを分析し、そして相互作用遺伝子座を同定するのに極めて有益であった。しかしながら、遺伝子相互作用を生じるプロセスの正確な性質を理解することは、当該遺伝子のタンパク質生産物の生化学的性質の知識を必要とする。
【０００４】
接合神経遺伝子座−Ｎｏｔｃｈ（Ｎ）　、Ｄｅｌｔａ（Ｄｌ）　、マスターマインド（ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ）（ｍａｍ）　、分割のエンハンサー（Ｅ（ｓｐｌ）　、神経化（ｎｅｕ）　、および大脳（ｂｉｂ）　−のいずれか一つ中のヌル突然変異は腹側および外側の表皮構造を犠牲にして神経系の肥大をもたらす。この作用は神経経路への表皮前駆体細胞のミスルーチングによるものであり、神経遺伝子機能が神経領域内の細胞を神経細胞の宿命から上皮の宿命へとそらすのに必要であることを意味する。グラスホッパー中の特定の胚神経芽細胞のレーザー切除の効果を評価した研究（ＤｏｅおよびＧｏｏｄｍａｎ１９８５，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１１，２０６−２１９）　は、神経芽細胞とその周囲の補助細胞の間の細胞相互作用が神経芽細胞宿命を選ぶことからこれらの補助細胞を抑制するのに利用できることを示した。これらの遺伝子的観察および発達の観察は、一緒になって、神経遺伝子座のタンパク質生産物が適当な表皮の発達に必要な細胞相互作用機構の成分として機能するという仮説へと導いた（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ，１９８８，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．４，　９５−１００）。　配列分析（Ｗｈａｒｔｏｎら，１９８５，Ｃｅｌｌ　４３，　５６７−５８１；Ｋｉｄｄ　ら，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，　３０９４−３１０８；Ｖａｓｓｉｎ　ら，１９８７，ＥＭＢＯ　Ｊ．６，　３４３１−３４４０；Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ　ら，１９８８，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．２，　１７２３−１７３５）　は、神経遺伝子座の二種であるＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａが単一時間で膜をスパンする膜貫通タンパク質を暗号化することが明らかであることを示した。Ｎｏｔｃｈ遺伝子は、３６の上皮増殖因子（ＥＧＦ）　様タンデム繰返し、続いてＮｏｔｃｈ／ｌｉｎ−１２　繰返し（Ｗｈ−ａｒｔｏｎ　ら，１９８５，Ｃｅｌｌ　４３，　５６７−５８１；Ｋｉｄｄ　ら，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．６，　３０９４−３１０８；Ｙｏｃｈｅｍ　ら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ３３５，　５４７−５５０）　と称される三つのその他のシステインに富む繰返しを含む大きなＮ末端細胞外ドメインで約３００ｋｄ　タンパク質（本発明者らは“Ｎｏｔｃｈ”を使用してこのタンパク質を表す）を暗号化する。Ｄｅｌｔａは、その細胞外ドメイン（Ｖａｓｓｉｎ　ら，１９８７，ＥＭＢＯ　Ｊ．６，　３４３１−３４４０；Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉら，　１９８８，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．２，　１７２３−１７３５）内に９のＥＧＦ　様繰返しを有する約１００ｋｄ　タンパク質（本発明者らは“Ｄｅｌｔａ”を使用してＤＬＺＭ、即ち主たる接合代謝産物および母性代謝産物のタンパク質生産物；Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ　ら，　１９８８，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．２，　１７２３−１７３５　を表す）　を暗号化する。これらの繰返しの機能上の重要性について殆ど知られていないが、ＥＧＦ　様モチーフは血液凝固カスケードに関与するタンパク質を含む種々のタンパク質中に見られた（Ｆｕｒｉｅ　ａｎｄ　Ｆｕｒｉｅ，１９８８，Ｃｅｌｌ　５３，　５０５−５１８）　。特に、このモチーフは、血液凝固因子ＩＸおよびＸ（Ｒｅｅｓ　ら，１９８８，ＥＭＢＯＪ．７，　２０５３−２０６１；　Ｆｕｒｉｅ　ａｎｄ　Ｆｕｒｉｅ，１９８８，Ｃｅｌｌ　５３，　５０５−５１８）　の如き細胞外タンパク質、その他のショウジョウバエ遺伝子（Ｋｎｕｓｔら，１９８７，ＥＭＢＯ　Ｊ．７６１−７６６；Ｒｏｔｈｂｅｒｇ　ら，１９８８，Ｃｅｌｌ　５５，　１０４７−１０５９）　、並びにトロンボモジュリン（Ｓｕｚｕｋｉ　ら，１９８７，ＥＭＢＯ　Ｊ．６，　１８９１−１８９７）およびＬＤＬ　レセプター（Ｓｕｄｈｏｆ　ら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８，　８１５−８２２）の如き幾つかの細胞表面レセプタータンパク質中に見られた。タンパク質結合部位はトロンボモジュリンおよびウロキナーゼ中のＥＧＦ　繰返しドメインにマッピングされた（Ｋｕｒｏｓａｗａ　ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，　５９９３−　５９９６；Ａｐｐｅｌｌａら，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，　４４３７−４４４０）　。
【０００５】
Ｎｏｔｃｈ突然変異とＤｅｌｔａ突然変異の相互作用の魅力的なアレイが記載されていた（Ｖａｓｓｉｎ　ら，１９８５，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔ．２，　２９１−３０８；　Ｓｈｅｐａｒｄ　ら，１９８９，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２，　４２９−４３８；Ｘｕ　ら，１９９０，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，４，　４６４−４７５）　。幾つかの遺伝子研究（Ａｌｔｏｎら，１９８９，Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０，　２６１−２７２に要約されている）　は、互いに関してＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの遺伝子供与が正常な発達に極めて重要であることを示した。野生型Ｎｏｔｃｈバックグラウンド中のＤｅｌｔａの供与量の５０％の低下は、翼静脈の拡張を生じてその基底で“Ｄｅｌｔａ”を形成させる（Ｌｉｎｄｓｌｅｙ　およびＧｒｅｌｌ，１９６８，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ６２７，Ｗａｓｈｉｎｇｔ−ｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｃａｒｎｅｇｉｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）　。同様の表現型が野生型Ｄｅｌｔａバックグラウンド中のＮｏｔｃｈの供与量の５０％の増加により生じる（“コンフルエンス”表現型；Ｗｅｌｓｈｏｎｓ，１９６５，Ｓｃｉｅｎｃｅ１５０，　１１２２−１１２９）　。このＤｅｌｔａ表現型はＮｏｔｃｈ供与の低下により部分的に抑制される。本発明者らの研究室における最近の研究は、Ｎｏｔｃｈ中のＥＧＦ　様繰返しの交互と相関関係がある対立遺伝子間の致死相互作用がＤｅｌｔａの投与量を減少することにより救済し得ることを示した（Ｘｕ　ら，１９９０，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．４，　４６４−４７５）　。Ｘｕら（１９９０，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．４，　４６４−４７５）　は、Ｄｅｌｔａまたはｍａｍのいずれかのヌル突然変異がアブルプテックス（Ａｂｒｕｐｔｅｘ）（Ａｘ）突然変異として知られている或る種のＮｏｔｃｈ対立遺伝子の異型接合の組み合わせ間の致死相互作用を抑制することを見出した。Ａｘ対立遺伝子はＮｏｔｃｈ細胞外ドメインのＥＧＦ　様繰返し内のミスセンス変異と関連する（Ｋｅｌｌｅｙら，１９８７，Ｃｅｌｌ　５１，　５３９−５４８；Ｈａｒｔｌｅｙら，　１９８７，ＥＭＢＯ　Ｊ．６，　３４０７−３４１７）　。
【０００６】
Ｎｏｔｃｈは胚神経細胞の外殖中に軸索プロセスで発現される（Ｊｏｈａｎｓｅｎ　ら，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０９，　２４２７−２４４０；Ｋｉｄｄ　ら，１９８９，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．３，　１１１３−１１２９）　。
【０００７】
研究は、Ｎｏｔｃｈの或る種のＡｘ対立遺伝子が成虫盤の知覚神経の外殖中に軸索開通をひどく変化し得ることを示したが、軸索それ自体またはその上皮（それに沿って軸索が成長する）中の異常なＮｏｔｃｈ発現がこの欠陥の原因であるか否かは未だ知られていない（Ｐａｌｋａら，１９９０，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０９，　１６７−１７５）　。
【０００８】
３．発明の要約
本発明は、ヒトのＮｏｔｃｈ遺伝子およびＤｅｌｔａ遺伝子のヌクレオチド配列、およびそれらの暗号化されたタンパク質のアミノ酸配列、並びに抗原決定基を含むこれらのフラグメントまたは機能的に活性であるこれらのフラグメントに関する。また、本発明は、トポリズミックタンパク質への同型結合または異型結合を媒介するトポリズミック遺伝子により暗号化されたタンパク質（“トポリズミックタンパク質”と称される）のフラグメント（本明細書中、“接着フラグメント”と称される）、およびこれらの配列に関する。本明細書に使用されるトポリズミック遺伝子は、遺伝子Ｎｏｔｃｈ、Ｄｅｌｔａ、およびＳｅｒｒａｔｅを表すだけでなく、例えば、下記の項５．３　に記載された方法により同定し得るＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅファミリーのその他の員を表す。結合活性を保持する接着フラグメントの類縁体および誘導体がまた提供される。ヒトのＮｏｔｃｈの抗体および接着フラグメントの抗体が更に提供される。
【０００９】
特別な実施態様において、Ｎｏｔｃｈの接着フラグメントは、ショウジョウバエのＮｏｔｃｈ　ＥＧＦ　様繰返し１１および１２に最も相同のＮｏｔｃｈ配列を含むフラグメントである。異型結合を媒介するＤｅｌｔａの接着フラグメントは、ショウジョウバエのＤｅｌｔａアミノ酸１−２３０　に最も相同の配列を含むフラグメントである。同型結合を媒介するＤｅｌｔａの接着フラグメントは、ショウジョウバエのＤｅｌｔａアミノ酸３２−２３０に最も相同の配列を含むフラグメントであり、そしてＳｅｒｒａｔｅの接着フラグメントはショウジョウバエのＳｅｒｒａｔｅアミノ酸８５−２８３または７９−２８２に最も相同の配列を含むフラグメントである。
【００１０】
３．１．定義
本明細書に使用される下記の用語は、示された意味を有する。
【００１１】
ＡＡ　＝アミノ酸
ＥＧＦ　＝上皮増殖因子
ＥＬＲ　＝ＥＧＦ　様（相同の）繰返し
ＩＣ　＝細胞内
ＰＣＲ　＝ポリメラーゼ
本明細書に使用される遺伝子の名称の下線は、下線の不在下で遺伝子の名称により示されるその暗号化されたタンパク質生産物に対比して、その遺伝子を示す。例えば、“Ｎｏｔｃｈ”はＮｏｔｃｈ遺伝子を意味し、一方、“Ｎｏｔｃｈ”はＮｏｔｃｈ遺伝子のタンパク質生産物を示す。
【００１２】
４．図面の説明
図１．Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を調べるための発現構築物および実験デザイン。対数増殖期のＳ２細胞を、示された三つの構築物の一つで一時的に移入した。ＭＧｌｌａ　ミニ遺伝子（ｃＤＮＡ／ゲノムキメラ構築物：ｃＤＮＡ誘導配列がスティップリングにより表され、ゲノム誘導配列が斜めハッチングにより表される（Ｒａｍｏｓら，１９８９，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２３，　３３７−３４８））により暗号化されたＮｏｔｃｈを、メタロチオネインプロモーターベクターｐＲｍＨａ−３（Ｂｕｎｃｈ　ら，１９８８，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６，　１０４３−１０６１）への挿入後に発現した。Ｄｌ１　ｃＤＮＡ（Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉら，１９８８，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．２，　１７２３−１７３５）により暗号化されたＤｅｌｔａを、同ベクターへの挿入後に発現した。細胞外Ｎｏｔｃｈ（ＥＣＮ１）　変異体を、完全Ｎｏｔｃｈ遺伝子座を含むゲノムコスミド（Ｒａｍｏｓら，１９８９，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２３，　３３７−３４８）　から、その細胞内ドメイン（δにより表される；Ｗｈａｒｔｏｎ　ら，１９８５，Ｃｅｌｌ４３，５６７−５８１）からアミノ酸１７９０−２６２５　のコード配列を欠失し、野生型配列からの２５の膜近位残基を新規な５９のアミノ酸テールに融合させることにより誘導した（下記の実験方法、項６．１　を参照のこと）。この構築物をＮｏｔｃｈプロモーター領域の調節のもとに発現した。メタロチオネインベクターを含む構築物に関して、トランスフェクション後に発現をＣｕＳＯ４で誘発した。次に、細胞を混合し、凝集条件下でインキュベートし、そして特定の抗血清および発現細胞を視覚化する免疫蛍光顕微鏡法を使用してそれらの凝集する能力につきスコアをつけた。ＭＴ、メタロチオネインプロモーター；ＡＴＧ　、翻訳開始部位；ＴＭ、膜貫通ドメイン；３’Ｎ　、Ｎｏｔｃｈ遺伝子ポリアデニル化シグナル；３’Ａｄｈ　、Ａｄｈ　遺伝子からのポリアデニル化シグナル；５’Ｎ　、Ｎｏｔｃｈ遺伝子プロモーター領域。
【００１３】
図２．培養細胞中のＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの発現。（Ａ）０．７ミリモルのＣｕＳＯ４で１２〜１６時間にわたって誘導された移入されていない細胞（Ｓ２）およびＮｏｔｃｈ移入細胞（Ｎ）　の溶解産物をナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のために調製し、３％〜１５％勾配ゲルで運転し、そしてニトロセルロースにブロットした。Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインに対してモノクローナル抗体（ＭＡｂ　Ｃ１７．９Ｃ６）を使用してＮｏｔｃｈを視覚化した。３００ｋｄ　の主バンドの下の多重バンドはＮｏｔｃｈの分解生産物に相当し得る。（Ｂ）移入されていない細胞（Ｓ２）およびＤｅｌｔａ移入細胞（Ｄ１）の溶解産物をＤｅｌｔａのモノクローナル抗体（ＭＡｂ　２０１）　で視覚化した。約１０５ｋｄ　の単一バンドを検出する。両方の場合に、Ｓ２細胞系には検出可能な内因性のＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａがなく、また交差反応性の種がない。それぞれのレーンにおいて、１０μｌ　の試料（実験方法に記載されたようにして調製した）を装填した。
【００１４】
図３．Ｎｏｔｃｈ形凝集物およびＤｅｌｔａ形凝集物を発現するＳ２細胞。全てのパネル中で、Ｎｏｔｃｈが緑で示され、Ｄｅｌｔａが赤で示される。
【００１５】
（Ａ）　単一Ｎｏｔｃｈ＋細胞。胞状構造だけでなく、明らかに染色されていない核を含む主要な細胞内染色に注目されたい。
【００１６】
（Ａ）　抗体染色の特異性を示す同フィールドの明るいフィールドの顕微鏡写真。
【００１７】
（Ｂ）　単一Ｄｅｌｔａ＋細胞。染色が主として細胞表面にある。
【００１８】
（Ｂ）　同フィールドの明るいフィールドの顕微鏡写真。
【００１９】
（Ｃ）２４　時間の凝集実験からのＤｅｌｔａ＋細胞の凝集物。染色が主として細胞表面にあることに反することに注目されたい。
【００２０】
（Ｄ）−（Ｆ）　単独で移入された細胞集団の１：１　の混合物から形成されたＮｏｔｃｈ＋細胞およびＤｅｌｔａ＋細胞の凝集物（これは室温で一夜凝集させられた）。（Ｄ）　はこの凝集物中のＮｏｔｃｈ＋細胞を示す。
【００２１】
（Ｅ）　はＤｅｌｔａ＋細胞を示し、そして（Ｆ）　は両方の細胞型を示す二重露出である。ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａのバンドはＮｏｔｃｈ＋細胞とＤｅｌｔａ＋細胞の接触点（矢印）で顕著である。（Ｆ）　において、これらのバンドは、これらの点で緑と赤の一致のために黄色に見える。明らかに二重に染色された単一細胞（＊）は実際には二種の細胞（他の細胞の上に一種の細胞）であり、一方がＮｏｔｃｈを表し、他方がＤｅｌｔａを表す。
【００２２】
（Ｇ）　および（Ｈ）　Ｎｏｔｃｈ＋−Ｄｅｌｔａ＋細胞凝集物のプソイドカラー共焦顕微鏡写真。（Ｇ）　において、少なくとも二つのＤｅｌｔａ＋細胞により形成された拡張部（矢印）が凝集物の中央でＮｏｔｃｈ＋細胞を完全に包囲することに注目されたい。（Ｈ）　は４℃で行われた２時間の凝集実験から形成された凝集物を示す。Ｎｏｔｃｈの濃いバンドがＤｅｌｔａ＋細胞と接触する領域内で明らかである。
【００２３】
（Ｉ）　Ｄｅｌｔａ＋細胞と、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメイン（ＥＣＮ１　構築物）のみを発現する細胞を含む凝集物。スケールバー＝１０μｍ　。
【００２４】
図４．ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａが同時移入細胞中で会合される。Ｎｏｔｃｈに関する染色が左欄（Ａ、Ｃ、およびＥ）に示され、Ｄｅｌｔａに関する染色が右欄（Ｂ、Ｄ、およびＦ）に示される。
【００２５】
（Ａ）　および（Ｂ）　Ｎｏｔｃｈ構築物およびＤｅｌｔａ構築物の両方で同時移入されたＳ２細胞。一般に、細胞表面（矢印）でＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａの局在間に良好な相関関係があった。
【００２６】
（Ｃ）　および（Ｄ）　同時移入細胞を、特定の抗血清による定着および染色の前に室温で１時間にわたってポリクローナル抗Ｎｏｔｃｈ抗血清（それぞれの抗細胞外ドメイン抗血清の１：２５０　希釈液）に露出した。ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの小さな斑点のある染色およびそれらのそれぞれの染色（矢印）の相関関係に注目されたい。
【００２７】
（Ｅ）　および（Ｇ）　細胞外Ｎｏｔｃｈ（ＥＣＮ１）　構築物およびＤｅｌｔａ構築物で同時移入され、誘発され、次に抗Ｎｏｔｃｈポリクローナル抗血清を使用してパッチされた細胞。全長Ｎｏｔｃｈについて観察された表面でＥＣＮ１染色とＤｅｌｔａ染色の間に密接な相関関係があった。スケールバー＝１０μｍ　。
【００２８】
図５．同時免疫沈殿は、ＤｅｌｔａおよびＮｏｔｃｈが移入細胞Ｓ２およびショウジョウバエ胚細胞からの溶解産物中で会合されていることを示す。全ての実験において、Ｄｅｌｔａを、定着スタフ（Ｓｔａｐｈ）Ａ細胞で沈殿されたポリクローナル抗Ｄｅｌｔａラット抗血清を使用してＮＰ−４０／デオキシコール酸塩溶解産物から沈殿させ、そして沈殿分画中のタンパク質をウェスタンブロットで視覚化した（詳しくは、実験方法を参照のこと）。レーン１、２、３、および５：ＭＡｂ　Ｃ１７．９Ｃ６　で視覚化されたＮｏｔｃｈ；レーン４および６：ＭＡｂ　２０１　で視覚化されたＤｅｌｔａ。
【００２９】
（Ａ）　において、レーン１および２はこれらの実験の対照である。レーン１は、Ｎｏｔｃｈについて視覚化されたＮｏｔｃｈ単独を発現する細胞からのポリクローナル抗Ｄｅｌｔａ免疫沈殿を示す。Ｎｏｔｃｈはこの試料中で検出できず、これはポリクローナル抗ＤｅｌｔａがＮｏｔｃｈと交差反応しないことを示す。レーン２は、抗Ｄｅｌｔａ抗血清による初期の処理を行わないでスタフＡで免疫沈殿され、そしてＮｏｔｃｈについて視覚化されたＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ同時移入細胞を示し、これはＮｏｔｃｈがスタフＡまたは二次抗体により非特異的に沈殿されないことを実証する。レーン３はＤｅｌｔａ（Ｄ１）について視覚化された抗Ｄｅｌｔａ抗血清で沈殿されたタンパク質を示し、そしてレーン４はＮｏｔｃｈ（Ｎ）　について視覚化された同試料を示す。レーン４は、Ｎｏｔｃｈが免疫沈殿されたＤｅｌｔａと共沈することを示す。Ｎｏｔｃｈが免疫沈殿中のＮｏｔｃｈに典型的であるようにダブレットとして現れることに注目されたい。
【００３０】
（Ｂ）　は、移入細胞溶解産物ではなく胚溶解産物を使用する同実験を示す。レーン５はＤｅｌｔａ（Ｄ１）　について視覚化された抗Ｄｅｌｔａ抗血清で沈殿されたタンパク質を示し、そしてレーン６はＮｏｔｃｈ（Ｎ）　について視覚化された同試料を示す。これらのレーンは、ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａが胚溶解産物中で安定に会合されることを実証する。Ｄｅｌｔａバンドの下のバンド（全てのレーン中）はスタフＡ（ＳＡ）並びに抗Ｄｅｌｔａ抗血清Ｈ鎖およびＬ鎖からのものである。
【００３１】
図６．Ｎｏｔｃｈ発現構築物およびＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ結合ドメインの欠失マッピング。対数増殖期のＳ２細胞を、示された発現構築物の系列で一時的に移入した。これらの図面は、生じた種々のＮｏｔｃｈ欠失変異体の予想タンパク質生産物を表す。全ての発現構築物を構築物＃１　ｐＭｔＮＭｇ　から誘導した。一時的に移入した細胞を、安定に形質転換された系Ｌ４９−６−７　からのＤｅｌｔａ発現細胞または一時的に移入したＳｅｒｒａｔｅ発現細胞と混合し、ＣｕＳＯ４で誘発し、凝集条件下でインキュベートし、次に特異的抗血清および免疫蛍光顕微鏡法を使用して凝集するそれらの能力につきスコアをつけた。凝集物をＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ発現細胞の両方を含む４個以上の細胞のクラスターと定義した。凝集率（％）に関して示された値は、Ｄｅｌｔａ（Ｄ１）（左欄）またはＳｅｒｒａｔｅ（Ｓｅｒ）（右欄）と共にこのようなクラスター中に見られる全てのＮｏｔｃｈ発現細胞の％を表す。種々のＮｏｔｃｈ欠失構築物が、連結接合部を示す継線で図示される。それぞれのＥＧＦ　繰返しが、点描された矩形のボックスとして表され、そして連結接合部の両側のＥＧＦ　繰返しの数が示される。連結接合部で、種々の欠失により生じた部分ＥＧＦ　繰返しがオープンボックスおよび閉じた括弧により表される（例えば、ΔＣｌａ＋ＥＧＦ（１０−１２）を参照のこと）。構築物＃３−１３はＣｌａＩ欠失系列に相当する。図示されるように、繰返し７、９、１７および２６中のＣｌａＩ部位の四つが、第三のシステインの直後で中央の繰返しを破断し（オープンボックス繰返しにより表される；更に明瞭にするために、図７を参照のこと）、一方、第五の殆どの３’部位がＥＧＦ　繰返し３０と３１の間できれいに分断する（密閉ボックス繰返し３１により表される；再度、図７を参照のこと）。構築物＃１５スプリットにおいて、スプリット点変異を有するＥＧＦ　繰返し１４が横線付きのボックスとして示される。構築物＃３３　ΔＣｌａ＋ＸＥＧＦ１０−１３）において、アフリカツメガエルＮｏｔｃｈ誘導ＥＧＦ　繰返しは、陰影の異なるパターンによりショウジョウバエ繰返しから区別される。ＳＰ、シグナルペプチド；ＥＧＦ　、上皮増殖因子繰返し；Ｎ、Ｎｏｔｃｈ／ｌｉｎ−１２　繰返し；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ｃｄｃ　１０、ｃｄｃ１０／アンキリン繰返し；ＰＡ、推定のヌクレオチド結合共通配列；ｏｐａ　、ｏｐａと称されるポリグルタミン伸長；Ｄ１、Ｄｅｌｔａ；Ｓｅｒ　、Ｓｅｒｒａｔｅ。
【００３２】
図７．Ｎｏｔｃｈ欠失構築物＃１９−２４　の詳しい構造。ＥＧＦ　繰返し１１および１２の両方がＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ凝集に必要とされる。ＥＧＦ　繰返し１０−１３　は上部に図示され、６個のシステイン残基（Ｃ）　の規則的な間隔を示す。これらの構築物に関して生じたＰＣＲ　生産物（図６に示された名称および数）は太い黒線により示され、そして正確な終点が種々のＥＧＦ　繰返しに関して示される。Ｄｅｌｔａと凝集する能力がそれぞれの構造物に関して（＋）　または（−）　として記録される。ＰＣＲ　フラグメントは、５個のＣｌａＩ部位のうちの４個と同じ場所で第三システインの直後で中央のＥＧＦ　繰返しを破断し、または最もＣ末端のＣｌａＩ部位と同じ場所で二つの繰返し間で正確に破断する。
【００３３】
図８．ショウジョウバエおよびアフリカツメガエルのＮｏｔｃｈからのＥＧＦ　繰返し１１および１２のアミノ酸配列の比較。ショウジョウバエのＮｏｔｃｈ（Ｗｈａｒｔｏｎ　ら，１９８５，Ｃｅｌｌ　４３：５６７−５８１；Ｋｉｄｄら，１９８６，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．６：３０９４−３１０８）　のＥＧＦ　繰返し１１および１２のアミノ酸配列が、アフリカツメガエルのＮｏｔｃｈ（Ｃｏｆｆｍａｎ　ら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１４３８−１４４１）　からの同じ二つのＥＧＦ　繰返しのアミノ酸配列と並べられる。同一のアミノ酸が箱形にされる。それぞれのＥＧＦ　繰返しの６個の保存システイン残基およびＣａ＋＋結合共通残基（Ｒｅｅｓ　ら，１９８８，ＥＭＢＯ　Ｊ．　７：２０５３−２０６１）がアステリスク（＊）　でマークされる。凝集しなかったアフリカツメガエルＰＣＲ　クローン中で見られたロイシンからプロリンへの変化が下に示される。
【００３４】
図９．この研究に使用された構築物。表ＩＶ中に特定されたＤｅｌｔａ変異体の略図が示される。細胞外のアミノ近位末端がそれぞれの場合に左にある。Ｓ、シグナルペプチド；“ＥＧＦ”、ＥＧＦ　様モチーフ；Ｍ、膜をスパンするらせん；Ｈ、ストップ−トランスファー配列；実線、その他のＤｅｌｔａ配列；陰影線、神経膠配列。矢じりは、翻訳可能なリンカー挿入の部位を示す。Ｓｃａ　、ＳｃａＩ；Ｎａｅ　、ＮａｅＩ；Ｂａｍ　、ＢａｍＨＩ　；Ｂｇｌ　、ＢｇｌＩＩ　；ＥＬＲ　、ＥＧＦ　様繰返し；Ｂｓｔ　、ＢｓｔＥＩＩ；Ｄｄｅ　、ＤｄｅＩ；Ｓｔｕ　、ＳｔｕＩ；ＮＧ１−ＮＧ５　、Ｄｅｌｔａ−神経膠キメラ。
【００３５】
図９Ａ．　インプットＤＮＡ　量に対する凝集の依存性。Ａ、それぞれ種々の量のｐＭＴＤｌ１　ＤＮＡ　（２　、４　、１０または２０μｇ／プレート）　で一時的に移入されたＳ２細胞集団（これらは続いて一定量のｐＭｔＮＭｇ　ＤＮＡ　（２０μｇ／プレート）　で一時的に移入されたＳ２細胞集団と凝集条件下でインキュベートされた）を使用して観察された異型凝集。示されたデータは、それぞれのインプットＤＮＡ　量に関する４以上の細胞の凝集物中のＤｅｌｔａ細胞の平均分率（％）±標準誤差である（２μｇ　および１０μｇ　インプット（これらに関してＮ＝２）を除いて、Ｎ＝３反復）。最低１００　のＤｅｌｔａ発現細胞を、それぞれの反復につきカウントした。Ｂ、それぞれ種々の量のｐＭＴＤｌ１ＤＮＡ　（２　、４　、１０または２０μｇ／プレート）　で一時的に移入されたＳ２細胞集団（これらは続いて凝集条件下でインキュベートされた）を使用して観察された同型凝集。データは、それぞれのインプットＤＮＡ　量に関する４以上の細胞の凝集物中のＤｅｌｔａ細胞の平均分率（％）±標準誤差である（Ｎ＝３反復）。最低５００　のＤｅｌｔａ発現細胞を、それぞれの反復につきカウントした。
【００３６】
図１０．　Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅアミノ末端配列の配列。残基はＤｅｌｔａ（Ｄ１、上の配列（配列番号：３）；アミノ酸２４で開始し、アミノ酸２２６で終了する）暗号配列およびＳｅｒｒａｔｅ（Ｓｅｒ、下の配列（配列番号：４）；アミノ酸８５で開始し、アミノ酸２８３　で終了する）暗号配列の概念上の翻訳に基いて番号を付される。二つの配列の間の垂直の線は、並べられたＤｅｌｔａ配列およびＳｅｒｒａｔｅ配列内で同一である残基を示す。ドットは配列中の間隙を表す。ボックスは並べられた領域内のシステイン残基を囲む。Ｎ１、アミノ近位ドメイン１；Ｎ２、アミノ近位ドメイン２；Ｎ３、アミノ近位ドメイン３。それぞれＳＴＵ　Ｂ　構築物［ＧＫＩＦＰ　によるＤｅｌｔａアミノ酸１３２（Ａ）の置換］およびＮＡＥ　Ｂ　構築物［Ｄｅｌｔａアミノ酸１９７　とアミノ酸１９８　の間のＲＫＩＦの挿入］と関連する翻訳可能な挿入が野生型Ｄｅｌｔａ配列の上に示される。
【００３７】
図１１．　Ｄｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互作用の潜在的な幾何学。Ａ、向かい合っている原形質膜の間で相互作用するＤｅｌｔａ（左）とＮｏｔｃｈ（右）分子の潜在的なレジスタ。Ｂ、同じ原形質膜内で相互作用するＤｅｌｔａ（左）とＮｏｔｃｈ（右）分子の潜在的なレジスタ。ＥＬＲ　、ＥＧＦ　様繰返し；オープンボックス、ＥＧＦ　様繰返し；ドット付きボックス、ＬＮＲ　繰返し；ソリッドボックス、膜をスパンするらせん。Ｄｅｌｔａアミノ末端ドメイン並びにＤｅｌｔａおよびＮｏｔｃｈ細胞内ドメインが長円体により表される。
【００３８】
図１２．　Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用の潜在的な幾何学。ＡおよびＢ、向かい合っている原形質膜の間で相互作用するＤｅｌｔａ分子の潜在的なレジスタ。Ｂ、同じ原形質膜内で相互作用するＤｅｌｔａ分子の潜在的なレジスタ。オープンボックス、ＥＧＦ　様繰返し；ソリッドボックス、膜をスパンするらせん。Ｄｅｌｔａアミノ末端細胞外ドメインおよび細胞内ドメインが長円体により表される。
【００３９】
図１３．　ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）。Ｄｌ１　ｃＤＮＡの５’−３’　鎖のＤＮＡ　配列が示され、これはＫｏｐｃｚｙｎｋｓｉら（１９８８，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．２，１７２３−１７３５）により示された配列と比較して幾つかの修正を含む。
【００４０】
図１４．　神経膠ｃＤＮＡ　１Ｂ７Ａ−２５０　の一次ヌクレオチド配列（配列番号：７）。これは１Ｂ７Ａ−２５０　ｃＤＮＡ　（Ａ．Ｊ．Ｂｉｅｂｅｒ，ｐｅｒｓ．ｃｏｍｍ．；Ｈｏｒｔｓｃｈら，１９９０，Ｎｅｕｒｏｎ４，　６９７−７０９）　の５’−３’　鎖の一部のＤＮＡ　配列である。ヌクレオチド２８９０は、概念上翻訳された神経膠−長い形態のタンパク質のアミノ酸９５２　を暗号化するイソロイシンコドンの第一ヌクレオチドに相当する。
【００４１】
図１５．　ＳｅｒｒａｔｅとＤｅｌｔａの間の核酸配列相同性。下に記載された暗号化されたＳｅｒｒａｔｅタンパク質配列（配列番号：９）（Ｆｌｅｍｉｎｇら，１９９０，Ｇｅｎｅｓ　＆Ｄｅｖ．４，　２１８８−２２０１、２１９３−９４）と共にショウジョウバエ・Ｓｅｒｒａｔｅヌクレオチド配列（配列番号：８）の一部が示される。ショウジョウバエのＤｅｌｔａ配列との高い配列相同性を示す四つの領域が線の上に番号を付され、括弧により示される。相同性の全体の領域が、Ｓｅｒｒａｔｅヌクレオチド配列（Ｆｌｅｍｉｎｇ　ら，１９９０，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．４，　２１８８−２２０１の図４のようなナンバリング）のヌクレオチド番号６２７　〜１２９０をスパンする。
【００４２】
図１６．　ヒトＮｏｔｃｈのクローニングのＰＣＲ　に使用されるプライマー。ヒト胎児の脳ｃＤＮＡライブラリー中のＤＮＡ　を増幅するためにＰＣＲ　に使用される三つのプライマーの配列が示される。三つのプライマー、ｃｄｃ１（配列番号：１０）、ｃｄｃ２（配列番号：１１）、およびｃｄｃ３（配列番号：１２）を、それぞれ、プライマー対ｃｄｃ１／ｃｄｃ２　またはｃｄｃ１／ｃｄｃ３　として２００ｂｐ　または４００ｂｐ　のフラグメントを増幅するように設計した。Ｉ：イノシン。
【００４３】
図１７．　ヒトＮｏｔｃｈクローンの略図。ヒトＮｏｔｃｈの略図が示される。その線図の下の太字体の線は、四つのｃＤＮＡクローンのそれぞれに含まれるＮｏｔｃｈ配列のその部分を示す。ＰＣＲ　に使用されたプライマーの位置、およびそれらの配向が矢印により示される。
【００４４】
図１８．　ショウジョウバエ・Ｎｏｔｃｈ配列と並べられたヒトＮｏｔｃｈ配列。番号を付された垂直の線はショウジョウバエ・Ｎｏｔｃｈ座標に相当する。それぞれのマップの下の水平の線は、クローンが配列の伸長（太い水平の線）に対して置かれている場所を示す。
【００４５】
図１９．　プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ２Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列。図１９Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：１３）が示され、これは３’末端でＥｃｏＲＩ　部位で開始し、３’から５’への方向に進む。図１９Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１４）が示され、これは５’末端でＥｃｏＲＩ　部位で開始し、５’から３’への方向に進む。図１９Ｃ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１５）が示され、これは図１９Ｂ　に示された配列の３’から開始し、５’から３’への方向に進む。示された配列は暫定的であり、オーバーラップ配列の決定による確認を受ける。
【００４６】
図２０．　プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列。図２０Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：１６）が示され、これは３’末端でＥｃｏＲＩ　部位で開始し、３’から５’への方向に進む。図２０Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１７）が示され、これは５’末端でＥｃｏＲＩ　部位で開始し、５’から３’への方向に進む。図２０Ｃ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１８）が示され、これは図２０Ｂ　に示された配列の３’から開始し、５’から３’への方向に進む。図２０Ｄ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１９）が示され、これは図２０Ａ　に示された配列の５’から開始し、３’から５’への方向に進む。示された配列は暫定的であり、オーバーラップ配列の決定による確認を受ける。
【００４７】
図２１．　プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ４Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列。図２１Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：２０）が示され、これは５’末端でＥｃｏＲＩ　部位で開始し、５’から３’への方向に進む。図２１Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：２１）が示され、これは３’末端付近で開始し、３’から５’への方向に進む。示された配列は暫定的であり、オーバーラップ配列の決定による確認を受ける。
【００４８】
図２２．　プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列。図２２Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：２２）が示され、これは５’末端でＥｃｏＲＩ　部位で開始し、５’から３’への方向に進む。図２２Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：２３）が示され、これは３’末端付近で開始し、３’から５’への方向に進む。図２２Ｃ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：２４）が示され、これは図２２Ａに示された配列の３’から開始し、５’から３’への方向に進む。図２２Ｄ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：２５）が示され、これは図２２Ｂ　に示された配列の５’から開始し、３’から５’への方向に進む。示された配列は暫定的であり、オーバーラップ配列の決定による確認を受ける。
【００４９】
図２３．　プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）。
【００５０】
図２４．　プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）。
【００５１】
図２５．　ｈＮ５Ｋとその他のＮｏｔｃｈ相同体の比較。図２５Ａ．ショウジョウバエＮｏｔｃｈの略図。シグナル配列（シグナル）、３６のＥＧＦ　様繰返し、三つのＮｏｔｃｈ／ｌｉｎ−１２　繰返し、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、６のＣＤＣ１０　繰返し、ＯＰＡ　繰返し、および　ＰＥＳＴ（プロリン、グルタミン酸、セリン、スレオニン）に富む領域が示される。図２５Ｂ．ｈＮ５Ｋの演繹アミノ酸配列とその他のＮｏｔｃｈ相同体の配列の配列。アミノ酸が左側で番号を付される。ｃｄｃ１０　領域およびＰＥＳＴに富む領域が両方とも箱形にされ、そして個々のｃｄｃ１０　繰返しがマークされる。三つ以上の配列中で同一であるアミノ酸が目立つように示される。ｈＮ５Ｋをクローン化するのに使用されたプライマーが、それらが設計された配列の下に示される。核局在配列（ＮＬＳ）　、カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）、および脊椎動物のＮｏｔｃｈ相同体の推定のＣｃＮ　モチーフのｃｄｃ２キナーゼ（ｃｄｃ２）部位が箱形にされる。また、ショウジョウバエＮｏｔｃｈの可能な二連の核標的配列（ＢＮＴＳ）および近位のホスホリル化部位が箱形にされる。
【００５２】
５．発明の詳細な説明
本発明は、ヒトのＮｏｔｃｈ遺伝子およびＤｅｌｔａ遺伝子のヌクレオチド配列、およびそれらの暗号化されたタンパク質のアミノ酸配列に関する。更に、本発明はトポリズミックタンパク質またはその接着フラグメントへの同型または異型の結合を媒介するトポリスミック遺伝子により暗号化されたタンパク質のフラグメント（本明細書中、“接着フラグメント”と称される）に関する。本明細書に使用されるトポリスミック遺伝子は、遺伝子Ｎｏｔｃｈ、Ｄｅｌｔａ、およびＳｅｒｒａｔｅを意味するだけでなく、例えば、下記の項５．３　に記載された方法により同定し得るＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅファミリーのその他の員を意味する。
【００５３】
本発明の核酸配列およびアミノ酸配列並びにその抗体は、ヒトのＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ並びに接着分子のｍＲＮＡの検出および定量化、その発現の研究、ヒトのＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ並びに接着配列の生産、分化プロセスの研究および操作に使用し得る。
【００５４】
開示の明瞭化のために、そして限定のためでなく、本発明の詳細な説明は下記の小区分の項に分けられる。
【００５５】
（ｉ）　トポリズミックタンパク質ドメインへの結合を媒介するトポリズミックタンパク質ドメインの同定およびその配列；
（ｉｉ）ヒトのＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａのクローニングおよび配列決定；
（ｉｉｉ）　Ｄｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅファミリーの付加的な員の同定；
（ｉｖ）トポリズミック遺伝子の発現；
（ｖ）　発現された遺伝子生産物の同定および精製；並びに
（ｖｉ）トポリズミックタンパク質およびその接着配列の抗体の生産
【００５６】
５．１．トポリズミック蛋白領域への結合を仲介するトポリズミック蛋白領域の同定およびその配列
本発明は、ホモタイプまたはヘテロタイプの結合（ここではこれを“接着性（ａｄｈｅｓｉｖｅ）”と称する）を仲介するトポリズミック蛋白フラグメント、およびそれらの類縁体または誘導体、そしてこれらに関連する核酸配列を提供する。
【００５７】
特定の実施例において、Ｎｏｔｃｈの接着性フラグメントは、ＥＬＲ１１および１２、すなわちショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＮｏｔｃｈ配列のアミノ酸４４７から５２７番目（配列番号：１）にほとんど相同なＮｏｔｃｈの部分を含むものである（図８参照）。他の特定の実施例において、ホモタイプ結合を仲介する　Ｄｅｌｔａの接着性フラグメントは、ショウジョウバエのＤｅｌｔａ配列のアミノ酸３２−２３０番目付近（配列番号：６）にほとんど相同なＤｅｌｔａの部分を含むものである。さらに別の特定の実施例において、Ｎｏｔｃｈへの結合を仲介するＤｅｌｔａの接着性フラグメントは、ショウジョウバエのＤｅｌｔａ配列のアミノ酸１−２３０番目付近（配列番号：６）にほとんど相同なＤｅｌｔａの部分を含むものである。Ｓｅｒｒａｔｅの接着性フラグメントに関する特定の実施例において、このフラグメントは、ショウジョウバエのＳｅｒｒａｔｅ配列のアミノ酸８５−２８３または７９−２８２番目付近にほとんど相同なＳｅｒｒａｔｅの部分を含むものである（図１０（配列番号：４）および図１５（配列番号：９）参照）。
【００５８】
トポリズミック接着性ドメインをコードする核酸配列は、霊長類を起源とする場合と同様に、ブタ、ウシ、ネコ、鳥類、馬又は犬から単離され得る。また既知のトポリズミック遺伝子（以下の遺伝子を含むがこれに限定されるものではない（カッコ内に配列の公表文献を示す）：Ｎｏｔｃｈ（Ｗｈａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８５，　Ｃｅｌｌ４３，５６７−５８１），Ｄｅｌｔａ（Ｖａｓｓｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８７，ＥＭＢＯ　Ｊ．６，３４３１−３４４０；　Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅｓ　Ｄａｖ．２，１７２３−１７３５；Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉらへの訂正、本文図１３（配列番号：５および配列番号：６）の配列に留意すること、およびＳｅｒｒａｔｅ（Ｆｌｅｍｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０，Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ，４，２１８８−２２０１）　を有する他の種が同定され得る。これらの配列は、機能的に同等の（接着性）分子を提供する置換、付加または欠失によって変更され得る。配列をコードするヌクレオチドの同義性により、この接着性配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードする、別のＤＮＡ配列も、本発明の実施上使用することができる。これらの中に、サイレント変化を生ずる配列中で機能的に等価なアミノ酸残基をコードする別のコドンの置換によって、変更された、Ｎｏｔｃｈ，ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅ遺伝子の全部または一部を含むヌクレオチド配列が含まれるが、これに限定されるものではない。同様に、本発明の接着性蛋白フラグメントまたはそれらの誘導体は、アミノ酸の一次配列として、機能的に同等のアミノ酸残基がサイレント変化を起こす配列の範囲内で置換された変更配列を含む接着ドメインのアミノ酸配列の全部又は一部を含む配列を含むが、これに限定されるものではない。例えば、当該配列中の１又はそれ以上のアミノ酸残基は、サイレント変更に結びつく機能的に同等の他のアミノ酸に置換され得る。配列中のアミノ酸の置換物として、そのアミノ酸が属するグループの別のものから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンがある。極性で中性のアミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンがある。陽性荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンがある。陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸がある。
【００５９】
トポリズミック蛋白の接着性フラグメント、および接着性トポリズミック蛋白配列に関連する潜在的な誘導体、類似体、またはペプチドは、目的とする結合活性等を、例えば実施例に記載されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ凝集検定によって、測定され得る。トポリズミック蛋白の接着性誘導体又は接着性類縁体は、その接着性フラグメントに実質的に相同な当該ペプチド、あるいはそれをコードする核酸が接着性フラグメントをコードする核酸配列に対してハイブリダイズすることができる当該ペプチドを含むがこれに限定されるものではない。そして、当該ペプチド及びペプチド類縁体は、例えば下記の実施例の節に述べるような凝集検定によるｉｎ　ｖｉｔｒｏでの試験で陽性の結合活性等を示す。これらの誘導体および類縁体は想像上のものであり、本発明の範囲に含まれる。
【００６０】
本発明の接着性蛋白に関連する誘導体、類縁体およびペプチドは、当分野で知られた種々の方法で調製し得る。これらを調製する操作は遺伝子または蛋白レベルで行なうことができる。例をあげると、クローン化された接着性蛋白をコードする遺伝子配列は、当分野で知られた数多くの戦略のいずれによってでも修飾することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，１９９０，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。配列は適当な位置で（１またはそれ以上の）制限酵素で切断され、所望によりさらに酵素的に修飾され、単離され、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで連結される。接着性ドメインに関連する誘導体、類縁体またはペプチドをコードする遺伝子の調製においては、修飾された遺伝子が、目的とする接着性活性がコードされた遺伝子の範囲内で、翻訳停止シグナルに阻止されずに、接着性蛋白と同じ翻訳読み取り枠内に確実にとどまるように、注意が必要である。
【００６１】
さらに、接着性をコードする核酸配列は、配列の翻訳、開始および／または終決の形成および／または破壊、あるいはコード領域の変更の形成および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位の形成またはそれまでの部位の破壊して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのそれ以上の修飾を促進させるために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏでの突然変異を起こさせることもできる。当分野で既知の突然変異誘発の技術のどれでも使用することができ、これらにはｉｎ　ｖｉｔｒｏでの部位特異的突然変異（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，１９７８，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２５３，　６５５１）、ＴＡＢＲリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）の使用、その他が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
接着性配列の操作は蛋白レベルで行なうこともできる。本発明の範囲には、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、蛋白加水分解、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結その他によって、翻訳中又はその後に特異的に修飾されたトポリズミック蛋白、類縁体または誘導体が含まれる。数多くの化学的修飾の中で以下に示すどれでも既知の技術で実施することができるが、これらに限定されるものではない：臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ　）の存在下での代謝合成；その他。
【００６３】
さらに、接着性フラグメントに関連する類縁体およびペプチドを化学的に合成することもできる。例えば、目的とする　ｉｎｖｉｔｒｏでの凝集活性を仲介するトポリズミック蛋白の部分に相当するペプチドがペプチド合成装置を用いることにより合成され得る。
【００６４】
本発明の別の特定の実施例は、他のＤｅｌｔａ蛋白またはフラグメントあるいはそれらの誘導体と結合する能力はあるが、Ｎｏｔｃｈには結合しない、あるＤｅｌｔａ蛋白のフラグメントまたは誘導体に関するものである。これらの結合あるいはその欠失は８節で述べるようにｉｎ　ｖｉｔｒｏで検定することができる。実施例に限定されるものではないが、これによれば、そのようなＤｅｌｔａ誘導体は、ショウジョウバエ蛋白のＤｅｌｔａの残基１９８と１９９の間にテトラペプチド、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ　が挿入されているものである。
【００６５】
５．２．ヒトＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａのクローン化および配列決定
本発明はさらに、抗原決定基を含む（すなわち、抗体によって認識され得る）又は機能的に活性な、ヒトＮｏｔｃｈ及びヒトＤｅｌｔａのアミノ酸配列及びそれらのフラグメント及び誘導体、並びにこれらをコードする核酸配列に関する。ここで使用される、“機能的に活性な”物質とは、全長（野生型）蛋白生成物と共通する既知の機能上の活性の１またはそれ以上を示す物質を称するものであり、例えばＮｏｔｃｈの場合ならば、Ｄｅｌｔａへの結合、Ｓｅｒｒａｔｅへの結合、抗原性（抗Ｎｏｔｃｈ抗体への結合）その他がある。
【００６６】
特定の実施例において、本発明は少なくとも４０アミノ酸、または少なくとも７７アミノ酸からなる、ヒトＮｏｔｃｈ蛋白のフラグメントを提供する。他の実施例において、本発明の蛋白は、本質的に、ヒトＮｏｔｃｈ蛋白の細胞内領域、貫膜部分、細胞外領域、ｃｄｃ１０部分、Ｎｏｔｃｈ／ｌｉｎ−１２の繰り返し、またはＥＧＦ相同繰り返し、または上記のいずれかの組合せを含むか、あるいは本質的にそれらからなっている。ヒトＮｏｔｃｈのＥＧＦ相同繰り返しのいくつかまたはすべてを欠失しているフラグメント、あるいはそのフラグメントを含む蛋白もまた提供される。
【００６７】
他の特定の実施例において、本発明はさらに、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、または少なくとも１２１ヌクレオチドからなる、ヒトＮｏｔｃｈおよびヒトＤｅｌｔａのヌクレオチド配列または副配列に及ぶ。上述の蛋白および蛋白フラグメントをコードする核酸もまた提供される。並びに、これらの核酸に相補的で、これらにハイブリダイズし得る核酸が提供される。ある実施例において、このような相補的配列として、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも１２１ヌクレオチドのヒトＮｏｔｃｈ　ｃＤＮＡ配列に相補的なものであろう。好ましさという点で、本発明はヒトＮｏｔｃｈまたはその一部をコードするｃＤＮＡ配列に関連する。特定の実施例において、本発明は、ヒトＮｏｔｃｈ遺伝子またはｃＤＮＡのヌクレオチド配列、特に図１９，２０，２１および／または２２に示す配列（配列番号：１３から配列番号：２５）、またはプラスミドｈＮ３ｋ，ｈＮ４ｋまたはｈＮ５ｋに含まれる配列（下記９節参照）、およびコードされたＮｏｔｃｈ蛋白配列に関するものである。きわめて明らかなことであるが、ここで使用する“Ｎｏｔｃｈ蛋白フラグメントまたはその一部分をコードする核酸”とは、Ｎｏｔｃｈ蛋白の中の対象とするフラグメントまたはその一部分のみをコードし、Ｎｏｔｃｈ蛋白のその他の部分はコードしない核酸を示すものと解釈されなければならない。
【００６８】
限定するものではないが、本発明の好ましい態様として、ヒトＮｏｔｃｈ　ＤＮＡ配列が下記９節に述べる方法によって、クローン化され、配列決定され得る。
【００６９】
ヒトＤｅｌｔａのクローニングの好ましい実施例として、以下に具体的な例を示すが、これに限定されるものではない：
ヒト発現ライブラリーを、当分野で既知の方法によって構築する。例えば、ヒトｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを生成させ、続いて宿主細胞中に導入した場合に、この宿主細胞によって発現することのできる発現ベクター（例えばバクテリオファージ誘導体）に連結する。そして、この発現されたヒトＤｅｌｔａ生成物を選別するために、種々のスクリーニング検定を使用することができる。ある例においては、ヒトＮｏｔｃｈの接着性領域（すなわちショウジョウバエＥＬＲ１１および１２（配列番号：１）にきわめて相同なヒトＮｏｔｃｈの部分）への陽性結合を基準として、選別が行なわれ得る。別の例では、選別のために抗Ｄｅｌｔａ抗体が使用され得る。
【００７０】
他の好ましい様相として、選別に先立ち、ＰＣＲにより、ライブラリー中の目的とする配列を増幅させることができる。例えば、ＰＣＲにおけるプライマーとして、目的とする遺伝子の相同体によってコードされた接着性領域の部分に相当するオリゴヌクレオチドプライマーが使用され得る。
【００７１】
上記の方法は、ヒトＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａのクローンを得るための方法についての、以下の一般的記述を限定するために述べたものではない。
【００７２】
ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ遺伝子の分子クローニングのための核酸源として、どのようなヒト細胞でも使用することが可能である。当該ＤＮＡは、クローン化されたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ“ライブラリー”）からの当分野で既知の標準的な操作法、化学合成、ｃＤＮＡクローニング、または目的とするヒト細胞から精製されたゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントのクローニング、のいずれかによって、得ることができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．），１９８５，ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ．参照）。ゲノムＤＮＡから誘導されるクローンはコード部分の他に調節およびイントロンＤＮＡ部分を含んでもよい；ｃＤＮＡから誘導されるクローンはエクソン配列のみを含むはずである。由来が何であれ、その遺伝子を当該遺伝子を増殖させるため、適当なベクター中に分子クローン化する必要がある。
【００７３】
ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡフラグメントが生成し、それらの中のいくつかは目的とする遺伝子をコードする。ＤＮＡは種々の制限酵素を使用することにより、特異的部位で切断してもよい。または、ＤＮＡをフラグメント化するため、マンガン存在下でＤＮＡアーゼを使用するか、又は例えば超音波処理によって、ＤＮＡを物理的に切断することもできる。そして、標準的な方法を用いて、線状ＤＮＡフラグメントが大きさによって分離され得る。こうした方法にはアガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィーがあるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
いったんＤＮＡフラグメントが生成すると、目的とする遺伝子を含んでいる特定のＤＮＡフラグメントの同定を、さまざまの方法で実施することができる。例えば、一定量のＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ遺伝子（種は限定されない）部分またはそれに特異的なＲＮＡの部分、あるいは例えば接着性ドメイン等の当該フラグメントが入手でき、精製および標識ができるならば、生成したＤＮＡフラグメントを、その標識プローブに核酸ハイブリダイズさせることによって、スクリーニングすることができる（Ｂｅｎｔｏｎ，Ｗ．ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ，Ｒ．，１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９６，１８０；　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｄ．，１９７５，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２，３９６１）。プローブに実質的に相同なＤＮＡはハイブリダイズするはずである。既知の制限マップがあれば、（１または複数の）制限酵素による消化を行い、この既知の制限マップを使って、フラグメントの大きさを目的とするものと比較することによって、適切なフラグメントを同定することも可能である。さらに、遺伝子の特性に基づいて、選別を行なうこともできる。その他に、遺伝子の存在を、その発現生成物の物理的、化学的または免疫学的特性に基づいた検定によって検出することも可能である。例えば、ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａに関して既知のものと類似または同一の電気泳動、等電点電気泳動、蛋白加水分解マップ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ凝集活性（“接着性”）あるいは抗原特性などを有する蛋白を生成する、ｃＤＮＡクローンまたは対応するｍＲＮＡをハイブリッド選択するＤＮＡクローンを選別することができる。ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａの抗体が入手できる場合は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）型の操作法を使用して、標識抗体をＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ合成クローンと推定される物質に結合させることにより、ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ蛋白を同定することができる。
【００７５】
ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ遺伝子は、核酸ハイブリダイズによるｍＲＮＡ選別とｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳によっても同定することができる。この方法においては、ハイブリダイズによって、相補的なｍＲＮＡを単離するために、フラグメントが使用される。このＤＮＡフラグメントは、入手可能な、精製された別の種（例えばショウジョウバエ）のＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ　ＤＮＡのことであり得る。単離されたｍＲＮＡの生成物を単離し、そのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳生成物の免疫沈降検定または機能検定（例えばｉｎ　ｖｉｔｒｏ凝集活性；下記の例参照）を行なうことによって、ｍＲＮＡが同定され、したがって目的とする配列を含む相補的なＤＮＡフラグメントが同定される。さらに、ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ蛋白質に対して特異的な固定化抗体に、細胞から単離したポリソームを吸着させることによって、特定のｍＲＮＡを選別することができる。この（吸着したポリソームから）選別したｍＲＮＡを鋳型として使用して、放射性標識ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａのｃＤＮＡを合成することができる。この放射性標識ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、つづいて、他のゲノムＤＮＡフラグメントを含むものの中から、ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａＤＮＡフラグメントを同定するために使用され得る。
【００７６】
ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａゲノムＤＮＡを単離する変法として、既知の配列からの遺伝子配列自体の化学合成、あるいはＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ遺伝子をコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡの生成が含まれるが、これに限定されるものではない。例えば、ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡはＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａを発現する細胞から単離され得る。他の方法も可能であり、本発明の範囲に含まれる。
【００７７】
同定され、単離された遺伝子は、つづいて、適当なクローニングベクター中に挿入され得る。当分野で既知の数多くのベクター−宿主系が使用され得る。可能なベクターとしては、プラスミドまたは改変ウィルスが含まれるがこれに限定されるわけではない。しかし、そのベクター系は、使用する宿主と適合しなければならない。こうしたベクターとして、限定するわけではないが、ラムダ誘導体等のバクテリオファージまたはＰＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体が含まれる。クローニングベクター中への挿入は、例えば、相補的付着末端を有するクローニングベクター中に、ＤＮＡフラグメントを連結させることによって、実施することができる。しかし、ＤＮＡをフラグメント化したときに使用した制限部位がそのクローニングベクターに存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端を酵素によって修飾してもよい。その他、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）を連結させることによって、必要などんな部位でも作成することができる；こうした連結リンカーとして、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成オリゴヌクレオチドが含まれる。他の方法において、切断されたベクターとＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ遺伝子をホモポリマー末端法によって修飾するものがある。遺伝子配列の多数のコピーを生成させるために、形質転換、形質導入、感染、エレクトロポーレーションその他により、組み換え体分子を宿主細胞に導入することができる。
【００７８】
他の方法において、目的とする遺伝子を”ショットガン”法によって適当なクローニングベクター中に挿入した後、同定し単離することもある。例えばサイズ分画などによる、目的遺伝子の富化は、クローニングベクター中への挿入前に実施することができる。
【００７９】
特定の実施例において、単離ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａ遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ配列を組み入れた、組み換え体ＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換によって、その遺伝子の多数のコピーの作成が可能である。こうして、形質転換体を増殖させ、その形質転換細胞から組み換え体ＤＮＡ分子を単離し、必要ならば、単離した組み換え体ＤＮＡから挿入遺伝子を回収することによって、大量の遺伝子を得ることができる。
【００８０】
本発明によって提供されるヒトＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ配列は、トポリズミック蛋白の接着性部分について、上記５．１節に述べたように、ヒトＮｏｔｃｈおよびヒトＤｅｌｔａ中で発見されたアミノ酸配列と実質的に等しいアミノ酸をコードするヌクレオチド配列、および機能的に同等なアミノ酸からなる、コードされたアミノ酸配列を含むものである。
【００８１】
５．３．Ｄｅｌｔａ　／Ｓｅｒｒａｔｅ　ファミリーのその他のメンバーの同定
Ｄｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ遺伝子ファミリーのその他のメンバーの合理的な検索は、Ｓｅｒｒａｔｅ　とＤｅｌｔａ　との間の顕著な相同を保存する部分が存在すること　（第１０図、配列番号：３　および：４参照）　を利用する方法を用いて、実施することができる。例えば、この遺伝子ファミリーのその他のメンバーは、多様の核酸配列の中から、ＳｅｒｒａｔｅおよびＤｅｌｔａの双方に相同する配列　（第１３図　（配列番号：５）および第１５図　（配列番号：８））　を選び、この選ばれた配列の中から、ＳｅｒｒａｔｅおよびＤｅｌｔａに相同でない核酸配列をも含有するものを同定することによって、決定することができる。「相同でない」という用語は、少なくとも約６個の連続したヌクレオチドを含み、その中の少なくとも約２個がＳｅｒｒａｔｅおよびＤｅｌｔａ配列と異なっている領域を意味するものと解されてよい。
【００８２】
例えば、本発明の好ましい特定の態様は、下記の方法を提供する。ＤｅｌｔａとＳｅｒｒａｔｅとの間の２つの保存された部分、即ちＤｅｌｔａＡＡ６３−７３およびＤｅｌｔａＡＡ　１９５−２０６　（　第１３図、配列番号：６）に対応して、約１０〜２０個のヌクレオチドの縮重オリゴヌクレオチドプローブの組を合成することができ、この組は約３〜７個の連続したコドンについてのＤｅｌｔａ　およびＳｅｒｒａｔｅ　のいずれかに見出されるアミノ酸のすべての有り得るコード配列を表わしている。他の態様では、第１５図　（配列番号：８　および：９）　に示されたＤｅｌｔａ　とＳｅｒｒａｔｅ　との間の４つの高度に保存された領域の部分、即ちＳｅｒｒａｔｅＡＡ　１２４−１３４　、１４９−１５８、　２１４−２１９、および２５０−２５９　で表わされる部分に対応して、オリゴヌクレオチドを得ることができる。この合成オリゴヌクレオチドは、有望な源　（ＲＮＡまたはＤＮＡ）　からの配列をＰＣＲによって増幅するためのプライマーとして利用されうる　（ＰＣＲは、例えばパーキン・エルマーシータスの熱循環器および　Ｔａｑポリメラーゼ　（Ｇｅｎｅ　ＡｍｐＴＲ）　の使用によっで実施することができる）　。これには、Ｓｅｒｒａｔｅ　およびＤｅｌｔａ　に密接に関連したポリペプチドを発現しうるいずれかの真核生物の種からの、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが含まれるだろう。このＰＣＲ反応を実施することによって、ＳｅｒｒａｔｅとＤｅｌｔａとの間の保存配列の上記セグメントを共有する遺伝子、または遺伝子産物を検出することができる。数種の異なった縮重プライマーを合成することを選ぶ場合には、かなり少数のＰＣＲ反応で完全な検索を実施することが可能となろう。さらに未知の遺伝子とＳｅｒｒａｔｅまたはＤｅｌｔａ　との間のヌクレオチド配列の類似性の程度の多少を許容するために、ＰＣＲ反応の開始に用いられるハイブリッド形成条件のストリンジェンシー（緊縮性）を変更することも可能である。もしＳｅｒｒａｔｅ　／Ｄｅｌｔａ　遺伝子ファミリーのうちのそれまで未知のメンバーのセグメントが首尾よく増幅されるならば、このセグメントは分子クローニングされ、配列決定され、そして完全なｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するプローブとして利用されうる。その後、これは未知の遺伝子の完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の分析、および機能分析用のタンパク質産物の生産を可能にするだろう。この方法で、「接着」タンパク質をコード化するその他の遺伝子が同定されうる。
【００８３】
さらに本発明は、Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｄｅｌｔａ遺伝子ファミリーのメンバーではあるが、自然には存在しないかも知れない新規な組換え分子の設計において、Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｄｅｌｔａ　配列相同の使用を可能にする。例えば、制限を課する意味ではないが、Ｓｅｒｒａｔｅ　とＤｅｌｔａ　との双方の遺伝子の部分より成る組換え分子を、本発明によって構築することができる。このような分子は、Ｓｅｒｒａｔｅ　およびＤｅｌｔａ　の双方に関連する特性を示し、アゴニストおよびアンタゴニストを含む生物活性の新しい側面を表わしうる。Ｓｅｒｒａｔｅ　およびＤｅｌｔａ　の一次配列は、コンピュータ・シミュレーション　（ホップおよびウッズ、１９８１年、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　７８，　３８２４−３８２８）を用いて分子の三次構造を推定する目的に使用されうる。三次構造および生物学的機能間の相関を考慮して、Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｄｅｌｔａ　のキメラ組換え遺伝子を設計することができるであろう。同様に、トポリズミック遺伝子ファミリー　（例えばＮｏｔｃｈ）　の一つ以上のメンバーの部分より成るキメラ遺伝子を、構築することができる。
【００８４】
５．４．トポリズミック遺伝子の発現
トポリズミックタンパク質　（好ましくはＮｏｔｃｈ、Ｓｅｒｒａｔｅ、またはＤｅｌｔａ）の接着断片、またはその接着性類似体または誘導体、またはヒトＮｏｔｃｈ　またはＤｅｌｔａ　またはその機能的に活性な断片または誘導体をコードするヌクレオチド配列は、挿入されるタンパク質をコードする配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターのような、適当な発現ベクターに、挿入できる。必要な転写および翻訳シグナルは、未然トポリズミック遺伝子、および／またはそのフランキング領域によって、提供される。タンパク質コード配列を発現するために、多種の宿主・ベクター系を利用できる。これらにはウイルス　（例えばワクシニア・ウイルス、アデノウイルス等）　に感染する哺乳動物の細胞系や、ウイルス　（例えばバキュロウイルス）　に感染する昆虫細胞系や、酵母ベクターを含む酵母のような微生物や、バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで転換されるバクテリアを含むが、これらに限られない。ベクターの発現要素は、その強度および特異性が変化する。利用される宿主・ベクター系に依って、多数の適当な転写および翻訳要素のいずれか一つを使用してもよい。特定の態様において、例えばＥＧＦ−様繰返し１１および１２をコードするＮｏｔｃｈ　遺伝子の接着部分が発現される。他の態様では、例えばアミノ酸１−２３０をコードするＤｅｌｔａ遺伝子の接着部分が発現される。他の特定態様では、ヒトＮｏｔｃｈ　またはヒトＤｅｌｔａ遺伝子、またはヒトＮｏｔｃｈ　またはＤｅｌｔａ　の機能的に活性な部分をコードする配列が発現される。されらに別の態様では、Ｓｅｒｒａｔｅ遺伝子の接着部分が発現される。
【００８５】
ベクターへのＤＮＡ断片の挿入に使用される上述の方法のいずれかを、適切な転写／翻訳調節シグナルと、タンパク質コード配列とより成るキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築するために用いてもよい。これらの方法には、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え体ＤＮＡおよび合成技術、さらにｉｎ　ｖｉｖｏ組換え体　（遺伝子組換え）　を含むことがある。トポリズミックタンパク質またはペプチド断片をコードする核酸配列の発現は、このトポリズミックタンパク質またはペプチドが組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主で発現されるように、第二の核酸配列によって調節されてもよい。例えば、トポリズミックタンパク質の発現を、当該分野で周知のプロモーターまたはエンハンガー要素のいずれかによって制御してもよい。トポリズミック遺伝子発現を制御するために用いられうるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域　（ＢｅｒｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ，　１９８１，　Ｎａｔｕｒｅ，　２９０，　３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロング・ターミナル・リピートに含まれるプロモーター　（山本ら，　１９８０，Ｃｅｌｌ　２２，　７８７−７９７）　、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（　ワグナーら，　１９８１，　「Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　」７８，１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列　（ブリンスターら，　１９８２，　２９６，　３９−４２）、β−ラクタマーゼプロモーターのような原核発現ベクター　（ビラ・カマロフら，　１９７８，　「Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．」　７５，　３７２７−３７３１）　または　ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ　ら，１９８３，　「Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．　Ｓ．　Ａ．　」８０，２１−２５）、さらに「サイエンティフィクアメリカン」１９８０，　２４２，　７４−９４掲載「組換えバクテリアからの有用なタンパク質」参照、ノパリンシンセターゼプロモーター領域　（ヘレラ・エストレラら，「ネイチア」３０３，　２０９−２１３）　または、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ　ＲＮＡプロモーター　（ガードナーら，　１９８１，「Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．」９，　２８７１）、および光合成酵素リブロースビホスフェート・カルボキシラーゼ　（ヘレラ・エストレラら，　１９８４，「ネイチア」３１０，　１１５−１２０）　を含む植物発現ベクター、および酵母または　Ｇａｌ　４　プロモーター、ＡＤＣ　（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ　（ホスホグリセロール・キナーゼ）　プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、および膵臓房状細胞内で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域　（スイフトら，１９８４，「細胞」３８，　６３９−６４６；　オーニッツら，　１９８６，「ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．　Ｑｕａｍｔ．　Ｂｉｏｌ．　５０，　３９９−４０９　；　マクドナルド，　１９８７，　「肝臓学」　７，　４２５−５１５）；　膵臓ベータ細胞内で活性なインシュリン遺伝子制御領域　（ハナハン、１９８５「ネイチア」　３１５，　１１５−１２２）、リンパ細胞内で活性な免疫グロ���リン遺伝子制御領域　（グロスケドルら、１９８４，　「細胞」　３８，　６４７−６５８；　アダムスら、１９８５，「ネイチア」３１８，　５３３−５３８，　アレキサンダーら，　１９８７，　「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　」７，　１４３６−１４４４）　、精巣、乳房、リンパ細胞およびマスト細胞内で活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域　（レダーら，　１９８６，　「細胞」４５，　４８５−４９５）、肝臓内で活性なアルブミン遺伝子制御領域　（ピンカートら，　１９７８，　「遺伝子および開発」　１，２６８−２７６）、肝臓内で活性なアルファ・フェトプロテイン遺伝子制御領域　（クルムラウフら，　１９８５，　「Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．」５，　１６３９−１６４８；　ハンマーら，　１９８７，　「科学」　２３５，　５３−５８）、肝臓内で活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域　（ケルセイら，１９８７，　「遺伝子および開発」　１，　１６１−１７１）、骨髄細胞内で活性なベータグロビン遺伝子制御領域　（モグラムら，　１９８５，「ネイチア」３１５，　３３８−３４０；　コリアズら　１９８６，「細胞」　４６，　８９−９４）　、脳のオリゴデンドロサイト細胞内で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域　（リードヘッドら，　１９８７，　「細胞」　４８，　７０３−７１２）　、骨格筋内で活性なミオシン軽鎖２遺伝子制御領域　（サニ，　１９８５，「ネイチア」，　３１４，２８３−２８６）、および視床下部内で活性な生殖腺刺激性放出ホルモン遺伝子制御領域　（メイソンら，　１９８６，　「科学」　２３４，　１３７２−１３７８）　などの、組織特異性を示しトランスジェニック動物に利用された上記の動物転写制御領域などが含まれるが、これらに限られない。
【００８６】
トポリズミック遺伝子挿入体を含有する発現ベクターは、ａ核酸ハイブリッド形成、ｂ「マーカー」遺伝子機能の存在または不在、およびｃ挿入された配列の発現という、３つの一般的な方法によって、同定することができる。第一の方法では、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたトポリズミック遺伝子と相同な配列より成るプローブを用いる核酸ハイブリッド形成によって、検出することができる。第二の方法においては、組換え体ベクターまたは宿主系は、ベクターへの外来遺伝子の挿入によって生じる或る「マーカー」遺伝子機能　（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換発現型、バキュロウイルス内の封入体形成など）　の存在または不在をもとにして、同定し選択することができる。例えば、もしトポリズミック遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されると、トポリズミック挿入体を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定することができる。第三の方法では、組換え体発現ベクターは、この組換え体によって発現された外来遺伝子産物を分析することによって同定することができる。これらの分析は、例えば凝集　（接着）　能力　（下記第６−８節参照）　のような、試験管内分析系におけるトポリズミック遺伝子産物の物理的または機能的特性にもとずいて行なうことができる。
【００８７】
特定の組換えＤＮＡ分子が同定され単離されると、それを増殖させるために、当該分野で知られたいくつかの方法を用いることができる。適当な宿主系と増殖条件が一旦決定されると、組換え体発現ベクターは多量に増殖され調製されることができる。すでに説明されたように、使用できる発現ベクターは、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物のウイルス、バキュロウイルスのような昆虫のウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター　（例えばラムダ）　、およびプラスミドとコスミドＤＮＡベクターを、その少数例とする上記のベクターとその誘導体を含むが、それに限られない。
【００８８】
さらに、所望の特定な方法で挿入された配列の発現を調整するか、または遺伝子産物を修飾しプロセシングする宿主細胞株を選択することも可能である。ある種のプロモーターからの発現は、ある種の誘導物質の存在下に向上させることができる。かくして遺伝子操作されたトポリズミックタンパク質の発現の制御が、可能となる。その上、異なった宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングや修飾　（例えばグリコシル化や切断）　のための、特徴的で特異な機構をもっている。発現された外来タンパク質の所望の修飾とプロセシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。例えばバクテリア系での発現を用いて、グリコシル化されていないコアタンパク質産物を生産することができる。酵母での発現は、グリコシル化された産物を得ることとなる。異種の哺乳類トポリズミックタンパク質の「天然」のグリコシル化を確実にするために、哺乳類細胞での発現を使用することができる。さらにさまざまのベクター／宿主発現系が、タンパク質切断のようなプロセシング反応を、さまざまな程度に実現することを可能とする。
【００８９】
他の具体的態様においては、接着性トポリズミックタンパク質、断片、類似体、または誘導体を、融合またはキメラタンパク類産物　（タンパク質、断片、類似物または誘導物を異種タンパク質配列に結合したもの）　として、発現させることができる。このようなキメラ産物は、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を、公知の方法で適当な読み枠内で相互に連結し、キメラ産物を当該分野で広く知られた方法によって発現させることによって、製造することができる。また、このようなキメラ産物は、例えばペプチド合成機を使用するタンパク質合成技術によって、製造することができる。
【００９０】
ｃＤＮＡならびにゲノム双方の配列をクローニングし、発現させることができる。
【００９１】
他の態様では、ヒトのＮｏｔｃｈ　ｃＤＮＡ配列を、染色体をもとにして統合しかつ発現することが、可能である。公知の同種組換え手順が使用され得る。
【００９２】
５．４．１．発現された遺伝子産物の同定および精製
トポリズミック遺伝子配列を発現する組換え体が一旦同定されると、遺伝子産物の分析が可能となる。これは、生産物の放射性標識付けと、それに続くゲル電気泳動分析とを含めた、生産物の物理的または機能的特性に基づく分析によってなしとげられる。
【００９３】
トポリズミックタンパク質が一旦同定されると、クロマトグラフ法　（例えばイオン交換、アフィニティー、およびサイズカラムクロマトグラフ法）　、遠心分離、示差溶解度を含む標準方法によるか、タンパク質の精製を目的とする他の標準方法によって、単離され精製されることが可能となる。機能的特性は、凝集分析（第６．８節参照）　を含むがこれに限られない適当な分析を使用して、評価することが可能である。
【００９４】
５．５．トポリズミックタンパク質に対する抗体の生成およびその接着性配列
本発明によると、ホモタイプまたはヘテロタイプの結合を仲介するトポリズックタンパク断片、その類似体、またはその誘導体、つまりヒトＮｏｔｃｈ　またはヒトＤｅｌｔａ　タンパク質またはその断片を、抗トポリズミックタンパク質抗体を生成するための免疫原として使うことが可能となる。これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。一つの具体的態様では、Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ様繰返し１１および１２に特異的な抗体の調製が可能となる。他の態様においては、Ｄｅｌｔａ　の「接着部分」に反応する抗体を生成することができる。これら抗体の一例は、試験管内分析での凝集を防ぐことができる。他の態様では、ヒトのＮｏｔｃｈ　に特異的な抗体が生産される。
【００９５】
トポリズミックタンパク質またはペプチドに対するポリクローナル抗体の生産には、公知の種々の手順を用いることが可能である。ある特別の態様では、第１９，　２０，　２１，　または２２図　（配列番号：１３−２５）に示された配列によりコードされたヒトＮｏｔｃｈ　タンパク質のエピトープに対するウサギポリクローナル抗体、またはそのサブ配列を得ることができる。抗体の生産のためには、ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、これらに限られない種々の宿主動物を、天然のトポリズミックタンパク質、またはその合成品を注射することによって、免疫することができる。宿主の種に依っては、免疫学的な応答を増強するために種々のマジュバントを用いることが可能であり、これらにはフロインド　（完全および不完全）　、水酸化アルミニウムのような鉱物質ゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン類、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ　（カルメット−ゲラン杆菌）　やコリネバクテリウム・パルバムのような有用なヒトアジュバントを含むが、これに限られない。
【００９６】
トポリズミックタンパク質の配列に向けられたモノクローナル抗体の調製の目的で、連続細胞系による抗体分子の生産をもたらす技術が、使用可能である。例としては、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術　（コズポーら，１９８３「現代免疫学」　４，７２）　、およびヒトモノクローナル抗体を生産するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術　（コールら，１９８５「モノクローナル抗体および癌治療」アランＲ．リス社，　ＰＰ７７−９６）、およびコーラーとミルスタインにより初めて開発されたハイブリドーマ技術　（１９７５「ネイチア」２５６，　４９５−４９７）　があげられる。
【００９７】
分子のイディオタイプを含む抗体断片は、既知の技術によって生成される。例えば、これら断片は、抗体分子のペプシン消化によって生産できる　（ａｂ’）２　断片、Ｆ（ａｂ’）２　断片のジスルフィド橋を還元することによって生成できるＦａｂ’断片、およびパパインと還元剤とで抗体分子を処理することによって生成できるＦａｂ　断片を含むが、これらに限るものではない。
【００９８】
抗体の生産においては、所望の抗体のスクリーニングが、例えば　ＥＬＩＳＡ　（酵素結合イムノソルベント分析）　のような公知の技術によって、なしとげられる。例えば、トポリズミックタンパク質の接着性ドメインを認識する抗体を選ぶためには、このドメインを含むタンパク質断片に結合する生産物について生成されたハイブリドーマを、分析してもよい。ヒトＮｏｔｃｈ　に特異な抗体の選択には、ヒトＮｏｔｃｈ　に対するポジティブ結合およびショウジョウバエのＮｏｔｃｈ　への結合の不在に基づいて選ぶことができる。
【００９９】
上述の抗体は、本発明のタンパク質配列の局在化および活性に関する、公知の方法に用いることができる。例えば、種々の公知の免疫分析法が使用できる。ほんの数例をあげると、ラジオイノムアッセイ、　ＥＬＩＳＡ　（酵素結合イムノソルベント分析）　、「サンドイッチ」イムノアッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散分析、凝集分析、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、および免疫電気泳動分析があるが、これらに限られない。
【０１００】
５．６．Ｎｏｔｃｈ　発現細胞への薬剤の運搬
本発明はまた、Ｎｏｔｃｈ　発現細胞への作用薬剤の運搬の方法を提供する。以下の第８節に述べるように、Ｎｏｔｃｈ　発現細胞の表面上のＮｏｔｃｈ　タンパクへ結合すると、Ｄｅｌｔａ　たんぱく質はＮｏｔｃｈ　発現細胞に取り込まれるように見える。かくして本発明は、Ｄｅｌｔａ　タンパク質またはＮｏｔｃｈ　に結合することができるその接着性断片または誘導体に薬剤を結合させ、そしてＮｏｔｃｈ　発現細胞をこの結合体に露出し、かくしてこの結合体を細胞に取り込ませることによって、Ｎｏｔｃｈ　発現細胞への薬剤の運搬を可能にする。この結合された薬剤は、標識または生理活性物質であってもよいが、これに限られない。生理活性物質は、治療剤、トキシン、化学療法剤、成長因子、酵素、ホルモン、薬剤、核酸　（例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）　などであってよい。一つの態様においては、Ｘ線像影用の金属コントラスト剤、磁気共鳴イメージング剤、およびラジオイメージング用の放射性核種（例えば、アイソトープ）を含むが、それらに限らないイメージング剤であってよい。好ましい側面では、この剤は、Ｄｅｌｔａ　分子のアミノ末端の半分の部位に結合される。
【０１０１】
Ｄｅｌｔａ　と薬剤の結合体は、Ｎｏｔｃｈ　発現細胞を、Ｄｅｌｔａ　と薬剤との結合体を発現している細胞に露出するか、またはＮｏｔｃｈ　発現細胞を溶液、懸濁液、または他のキャリアー中でＤｅｌｔａ　と薬剤の結合体に露出することによって、Ｎｏｔｃｈ　発現細胞に受け渡すことができる。この受け渡しが生物体中でなされる場合は、Ｄｅｌｔａ　と薬剤の結合体は、製薬上許容される担体または賦形剤の中に配合して薬剤組成物とすることができる。製薬的に許容される担体は、塩水、リン酸緩衝溶液などを含有できる。Ｄｅｌｔａ　と薬剤の結合体は、液体、錠剤、丸剤、粉末、徐放性形態、リポソームなどとして調合することができ、経口、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、腹膣内注射などにより、投薬される。これらはほんの少数例にすぎない。好まし選択は、当業者の知識にもとづいて、容易になされる。
【０１０２】
６．ショウジョウバエ中の２つのＥＧＦ−相同遺伝子である神経　　遺伝子座Ｎｏｔｃｈ　およびＤｅｌｔａ　のタンパク質産物間の分子相互作用
ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ遺伝子の産物間の分子間会合の可能性を検討すべく、我々はショウジョウバエ・シュナイダーの２　（Ｓ２）　細胞　（フェホンら，１９９０，　「細胞」６１，　５２３−５３４）における凝集に対するそれらの発現の効果を研究した。我々はここに、Ｎｏｔｃｈ　とＤｅｌｔａ　の間の分子間相互作用の直接の証拠を提示し、この相互作用の構成単位を切開する場合に用いられる分析系を説明する。我々は、Ｎｏｔｃｈ　を発現する普通は接着性を示さないショウジョウバエＳ２の培養細胞が、Ｄｅｌｔａ　を発現する細胞に特異的に結合すること、およびこの凝集がカルシウムに依存することを示す。さらに、Ｎｏｔｃｈ　を発現する細胞は相互に結合せず、Ｄｅｌｔａ　を発現する細胞は相互に結合するが、この事はＮｏｔｃｈ　とＤｅｌｔａ　とが細胞の表面でＤｅｌｔａ　との結合について競合することができることを示唆する。さらに我々はＮｏｔｃｈ　とＤｅｌｔａ　とが培養細胞および胚細胞の双方で、洗剤に可溶な複合体を形成することを示す証拠を示すが、この事はＮｏｔｃｈ　およびＤｅｌｔａ　が、試験管内および生体内で分子レベルで、直接に相互作用することを暗示する。我々の分析結果は、ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａ　のタンパク質が、それらの細胞外ドメインを介して、細胞表面で相互作用することを示唆する。
【０１０３】
６．１．実験の手順
６．１．１．発現構築物
Ｎｏｔｃｈ　発現構築物を得るために、ＭｇＩＩａ　内のＮｏｔｃｈ　コード配列の５’端からの６ｋｂのＨｐａＩ断片　（ラモスら，１９８９，　「ゼネティックス」１２３，　３３７−３４８）　を、メタロチオネインプロモーターベクターｐＲｍＨａ−３　（バンチら，　１９８８，　「Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．」１６，　１０４３−１０６１）をＥｃｏＲＩ　で切断した後の該ベクターに平滑末端で連続し、、その末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で修復した　（マニアチスら，　１９８２，　「分子クローニング」：　研究所教本　（コールドスプリングハーバー，　ニューヨーク，　コールドスプリングラボラトリー））。方向が正しくなかった単一の形質転換体が単離された。この形質転換体からのＤＮＡは次いで、ＳａｃＩで消化され、ｐＲｍＨａ−３　からのポリリンカーに融合されたＮｏｔｃｈ　コード配列の５’端を含む３ｋｂの断片が単離された。この断片は正しい方向でｐＲｍＨａ−３　のＳａｃＩ部位に連結された。この構築物からのＤＮＡはＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化して、Ｎｏｔｃｈ　配列の大部分とｐＲｍＨａ−３　内のＡｄｈ　ポリアデニレーションシグナルのすべてを除去し、Ｎｏｔｃｈ　コード配列の残部およびポリアデニレーションに必要な３’配列を含むＭｇＩＩａ　からの１１ｋｂのＫｐｎＩ−ＸｂａＩ　断片に連結された。その結果得られた構築物をｐＭｔＮＭｇと名付け、ｐＲｍＨａ−３　内のメタロチオネインプロモーターは、翻訳開始部位の２０ヌクレオチド上流で開始するＮｏｔｃｈ　配列に融合される。
【０１０４】
細胞外Ｎｏｔｃｈ　構築物　（ＥＣＮ１）　を得るために、体内での正常Ｎｏｔｃｈ　機能に必要なＮｏｔｃｈ　ゲノム配列すべてを含むＣｏｓＰ４７９ＢＥ　Ｎｏｔｃｈ　コスミド　（ラモスら，１９８９，　「遺伝子学」１２３，　３３７−３４８）　をＡａｔＩＩ　で部分的に消化した。断片の末端はＴ４　ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクリアーゼ活性を用いて平滑化し　（マニアチスら，１９８２，　「分子クローニング」；　研究所教書　（コールドスプリングハーバー，　ニューヨーク：コールドスプリングハーバー研究所））、断片は次いでＳｔｕＩで完全に再消化した。得られた断片は、低融点アガロースゲル（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ，　ＦＭＣ　バイオプロダクト）　内で分離され、最大の断片が切り取られた。この断片は次いで、鈍端側でそれ自体に平滑末端で連結された。結果として、アミノ酸１７９０から２６２５までのＮｏｔｃｈ　コード配列の内部欠失　（ワートンら，　１９８５，「細胞」４３，　５６７−５８１）と、新規な５９個のアミノ酸カルボキシ末端を生産する予想されたフレームシフトとがもたらされた。　（この構築物の連結された接合点は、配列決定によるチェックが、まだなされてない。）
Ｄｅｌｔａ　発現構築物を得るために、Ｄｅｌｔａ　の完全なコード能を含むＤ１１　ｃＤＮＡ（コプチンスキーら，　１９８８，　「遺伝子開発」２，　１７２３−１７３５）　が、ｐＲｍＨａ−３　のＥｃｏＲＩ　部位に挿入された。この構築物はｐＭＴＤ１１と名づけられた。
【０１０５】
６．１．２．抗体の調製
ハイブリドーマ細胞系　Ｃ１７．９Ｃ６を、Ｎｏｔｃｈ　の細胞内ドメインの大部分のコード配列　（アミノ酸１７９１−２５０４　；ワートンら，　１９８５，「細胞」４３，　５６７−５８１）を含む２．１ｋｂのＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片にもとづく融合タンパク質で免疫されたマウスから得た。この断片は、　ｐＵＲ２８９　（　ルーサおよびムラー・ヒル，　１９８３，　「ＥＭＢＯ　Ｊ」２，　１７９１−１７９４）　にサブクローンされ、次いで　ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　断片として、ｐＡＴＨ　１発現ベクター　（デイクマンおよびツアゴロフ，　１９８５，　「Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６０，　１５１３−１５２０」　に移入された。可溶性融合タンパク質が発現され、２５％　（ＮＨ４）２ＳＯ４で沈澱され、６Ｍ尿素に再懸濁され、Ｒｏｔｏｆｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　（詳細については、Ｆｅｈｏｎ，　１９８９，「Ｒｏｔｏｆｏｒ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｎｏ．７，「ブレチン」１５１８，　リッチモンド，　カリフォルニア：Ｂｉｏ−Ｒａｄ　研究所」　を使用した分離用等電点電気泳動によって精製された。
【０１０６】
マウスポリクローナル抗血清が、適切なｐＧＥＸ発現ベクター　（スミスおよびジョンソン，　１９８８，　「細胞」６７，　３１−４０）に単独で枠内挿入された第５ＥＧＦ様繰返しから、膜貫通ドメインを横切って延びた、０．８ｋｂ　（アミノ酸　２３７−５０１：ワートンら，１９８５，　「細胞」４３，　５６７−５８１）、１．１ｋｂ　（アミノ酸　５０１−　８６８）、０．９９ｋｂ　（アミノ酸　８６８−１２００）、および１．４ｋｂ　（アミノ酸　１４６５−１９３５）の長さのＢｓｔＹｌ　断片４つを使用して、Ｎｏｔｃｈ　の細胞外ドメインに対して生起された。融合タンパク質は、グルタチオン−アガロースビーズ　（ＳＩＧＭＡ）上で精製された。マウスとラットの抗血清は、５０％の　（ＮＨ４）２ＳＯ４で再沈澱され、０．０２％　ＮａＮ３を含むＰＢＳ　（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　１４ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，　６ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４）　中に再懸濁された。
【０１０７】
ハイブリドーマ細胞系　２０１は、ｐＵＲ　２８８　のｌａｃＺ遺伝子　（ルーサおよびムーラ・ヒル，　１９８３「ＥＭＢＯ　Ｊ．」２，　１７９１−１７９４）　内のＣｌａＩ部位にサブクローニングされたＤｅｌｔａ　（　コプチンスキーら，　１９８８，「遺伝子開発」２，　１７２３−１７３５）　の細胞外ドメインからのコード配列を含む０．５４ｋｂ　ＣｌａＩ　断片を土台とした融合タンパク質で免疫されたマウスから得られた。この断片は、Ｄｅｌｔａ　内の第４ないし第９のＥＧＦ−様繰返しに亘る配列（アミノ酸　３５０−５２９）　を含む。融合タンパク質は、封入体の単離　（ギルマーら，　１９８２，　「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７９，　２１５２−２１５６）　によって調製された。封入体は、免疫に使用する前に尿素中で可溶化された　（キャロールおよびローホン，　１９８７，　「ＤＮＡクローニング」第ＩＩＩ巻，　Ｄ．Ｍ．グローバ　（オックスフォード：ＩＲＬプレス）　、ＰＰ．８９−１１１）。
【０１０８】
ラットポリクローナル抗血清は、同じ融合タンパク質構築物から誘導された抗原で免疫されることにより得られた。この場合、融合タンパク質は、ＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉ　バッファー　（キャロールおよびローン，１９８７，「ＤＮＡクローニング」第ＩＩＩ巻，Ｄ．Ｍグローバ　（オンクスフォード：ＩＲＬプレス）　ＰＰ．８９−１１１）中でのＩＰＴＧ−誘導細胞の溶解、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分離、ゲルからの適切なバンドの切り出し、および免疫に用いるためにゲルスライスからの抗原の電気溶出　（ハーローおよびレイン，　１９８８，　「抗体」研究所教本　（コールドスプリングハーバー，　ニューヨーク；コールドスプリングハーバ研究所））によって調製した。
【０１０９】
６．１．３．細胞培養およびトランスフェクション
Ｓ２細胞系統　（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，　１９７２，　Ｊ．　Ｅｍｂｒｙｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｍｏｒｐｈ，　２７，　３５３−３６５　）を、２．５ｍｇ／ｍｌ　Ｂａｃｔｏ−ペプトン　（Ｄｉｆｃｏ），　１ｍｇ／ｍｌ　ＴＣＹｅａｓｔｏｌａｔｅ　（Ｄｉｆｃｏ）、１１％　熱不活性化ウシ胎児血清　（ＦＣＳ）　（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、および１００　Ｕ／ｍｌペニシリン−１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン−０．２５μｇ／ｍｌフンジゾン（Ｈａｚｌｅｔｏｎ）　を添加したＭ３培地　（ＨａｚｌｅｔｏｎＣｏ．，　製）　中で生育させた。−２×１０６個／ｍｌで対数期生育中の細胞をＨＥＰＥＳ　緩衝液（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，　１９８７，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．７，　２７４５−２７５２）　の代わりにＢＥＳ　緩衝液　（ＳＩＧＭＡ）　を用いたほかは前記したとおり　（Ｗｉｇｌｅｒ等．，　１９７９，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７８，　１３７３−１３７６）、培養液５ｍｌ当たり１ｍｌ中、ＤＮＡ　リン酸カルシウム共沈殿２０μｇ　でトランスフェクションした。１６〜１８時間後、細胞を円錐遠沈管に写し、臨床用遠心分離器で、最大速度で３０秒間沈殿させ、新鮮な完全培地１／４容で一回洗浄し、初期容量の完全培地中に再懸濁し、そして元のフラスコに戻した。次にトランスフェクションされた細胞を誘導前２４時間に回復させた。
【０１１０】
６．１．４．凝集検定
Ｎｏｔｃｈ　およびＤｅｌｔａ　メタロチオネイン構築物の発現は、０．７ｍＭとなるまで硫酸銅を添加することにより誘導した。ＥＣＮ１構築物でトランスフェクションした細胞も同様に処理した。２種類の凝集検定を用いた。第１の検定では、合計３ｍｌの細胞　（５−１０×１０６個／ｍｌ）を２５ｍｌ容の三角フラスコに入れ、室温で２４〜４８時間回転振とう器上で４０〜５０ｒｐｍ　で振とうした。これらの実験では、細胞は誘導開始後１〜４時間に混合し、誘導は凝集期間を通じて継続した。第２の検定では、細胞約０．６ｍｌ　を、室温で一夜　（１２〜１６時間）　誘導後０．６ｍｌ容のエッペンドルフ試験管に入れ　（微小気泡は残す）　、そして４℃で１〜２時間穏やかに浸とうした。抗体抑制およびＣａ２＋依存性試験は、後者の検定を用いて実施した。Ｃａ２＋依存性試験では、細胞をまず採取し、１１％　ＦＣＳ　添加平衡塩類溶液　（ＢＳＳ）（ＢＳＳ−ＦＣＳ；　ＦＣＳ　は０．９％　ＮａＣｌ，　５ｍＭトリス　（ｐＨ７．５）で透析）　中、または、１０ｍＭ　ＥＧＴＡ　含有Ｃａ２＋非含有ＢＳＳ−ＦＣＳ　（Ｓｎｏｗ　等．，　１９８９，　Ｃｅｌｌ　５９，３１３−３２３）　中で洗浄し、次に、初期容量の同じ培地中に再件だした。抗体抑制実験では、Ｎｏｔｃｈ　トランスフェクション細胞を採取し、Ｍ３培地で洗浄し、次に、凝集前にＮｏｔｃｈ　の細胞外ドメイン由来の断片を有する融合蛋白で免疫化したマウス４匹の各々から得た免疫血清または前免疫血清の１：２５０　希釈液で４℃で１時間Ｍ３培地中で処理した　（前述の抗体調製参照）　。
【０１１１】
６．１．５．免疫蛍光分析
細胞を遠心分離（エッペンドルフマイクロ遠心分離器中２０秒間３０００ｒｐｍ）　により採取し、室温で１０分間、新たに調製したＰＢＳ　中２％　パラホルムアルデヒド　０．５ｍｌで０．６ｍｌ　容のエッペンドルフ試験管中、固定化した。固定化後、細胞を遠心分離により採取し、ＰＳＢ　で２回洗浄し、０．１％　サポニン（ＳＩＧＭＡ）　および１％　正常ヤギ血清　（Ｐｏｃｏｎｏ　Ｒａｂｂｉｔ　Ｆａｒｍ，　Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ，　ＰＡ）　を添加したＰＢＳ　中の一次抗体中で１時間染色した。モノクローナル抗体上澄みを１：１０希釈し、マウスまたはラットの血清をこの段階では１：１０００倍希釈した。次に細胞をＰＢＳ　中で一回洗浄し、ＰＢＳ−サポニン−正常ヤギ血清中の特異的二次抗体（二重標識等級ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ラット、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）　中で１時間染色した。このインキュベーションの後、細胞を２回　ＰＢＳ中で洗浄し、９０％　グリセロール、１０％　１Ｍトリス　（ｐＨ８．０）、および０．５％　ｎ−　プロピルガレート中でスライドに搭載した。細胞はＬｅｉｔｚ　Ｏｒｔｈｏｐｌａｎ　２顕微鏡上で、表面蛍光下で観察した。
【０１１２】
共通焦点の顕微鏡写真を、Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｖｅｒｔ複合顕微鏡に連結したＢｉｏ−Ｒａｄ　ＭＲＣ　５００　システムを用いて撮影した。像はＢＨＳ　およびＧＨＳ　フィルターセットを用いて集め、ＡＬＩＧＮ　プログラムを用いて整列させ、ＭＥＲＧＥ　を用いてマージさせた。グリーンからレッドのチャンネルへの蛍光のブリードスルーは、ＢＬＥＥＤ　プログラムを用いて低減させた（全ソフトウエアはＢｉｏ−Ｒａｄ　製）。写真はＫｏｄａｋＥｋｔａｒ　１２６　フィルムを用いてコンピューターモニターから直接得た。
【０１１３】
６．１．６．細胞分解物、免疫沈降およびウエスタンブロット
組織培養および野生型　Ｃａｎｔｏｎ−Ｓ　胚の非変性洗剤分解物は、１ｍＭ　フェニルメチルスルホニルフロリド　（ＰＭＳＦ）　およびジイソプロピルフルオロホスフェート２５００倍希釈物をプロテアーゼ阻害剤として用いながら、約１０細胞容量の分解緩衝液　（３００ｍＭ　ＮａＣｌ，　５０ｍＭトリス　［ｐＨ８．０］，　０．５％　ＮＰ−４０，　０．５％　デオキシコレート、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２）　中で、氷上で調製した。分解物は、順次、１ｃｃ　ツベルクリンシリンジに連結した１８Ｇ　、２１Ｇ　および２５Ｇ　の針を用いてトリチュレートし、次に４℃で１０分間ミクロ遠心分離器中で最高速度で遠心分離して不溶性物質を除去した。免疫沈降を行うために、細胞分解物　２５０〜５００　μｌ　に抗体約１μｇ　（ポリクローナル抗血清　１−２μｇ）を添加し、攪拌しながら４　℃で１　時間インキュベートした。この混合物にヤギ抗マウス抗体　（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；　これらの抗体はマウスおよびラットのＩｇＧ　の両方を認識する）　１５μｇ　を添加し、攪拌しながら４℃で１時間インキュベートした。次に、予め採取し、分解緩衝液で５回洗浄し、更に１時間インキュベートしておいた固定スタフィロコッカス・アウレウス　（Ｓｔａｐｈ　Ａ）菌　（Ｚｙｓｏｒｂｉｎ．　Ｚｙｍｅｄ；　製造者の指示に従って再懸濁）　１００μｌ　を添加した。次に、Ｓｔａｐｈ　Ａ−抗体複合体を遠心分離により沈殿させ、分解緩衝液で３回洗浄し、その後、分解緩衝液でそれぞれ１５分間２回洗浄した。新しい試験管に移した後、沈殿した物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液５０μｌ　中に懸濁し、即座に１０分間煮沸し、３％〜１５％　の勾配ゲル上を泳動させ、ニトロセルロース上にブロットし、モノクローナル抗体およびＨＲＰ−結合ヤギ抗マウス二次抗体を用いて前述したように（Ｊｏｈａｎｓｅｎ　等．，　１９８９，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１０９，　２４２７−２４４０）　検出した。ウエスタンブロットに使用する全細胞蛋白試料（図２）を得るため、細胞は遠心分離により収集し、１ｍＭ　ＰＭＳＦ含有試料緩衝液１０細胞容量中で分解し、即座に煮沸した。
【０１１４】
６．２．結果
６．２．１．培養細胞中のＮｏｔｃｈ　およびＤｅｌｔａ　の発現
Ｎｏｔｃｈ　とＤｅｌｔａ　の間の相互作用を検知するために、凝集検定を用いてその表面上にこれらの蛋白を発現する細胞の挙動を調べた。いくつかの理由からこれらの試験のためにはＳ２細胞系統（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，　１９７２，　Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｍｏｒｐｈ．　２７，　３５３−３６５）　を選択した。先ず、これらの細胞は比較的非付着性であり、懸濁液中で生育し、そして、ファスシクリンＩＩＩ　作用を調べるための同様の検定において過去に用いられている（Ｓｎｏｗ　等．，　１９８９，　Ｃｅｌｌ　５９，　３１３−３２３）。第２　に、これらは容易にトランスフェクションでき、そして、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培養細胞中の外来性遺伝子の発現のために設計されている誘導可能なメタロチオネインプロモータベクターが入手できる（Ｂｕｎｃｈ等．，　１９８８，　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６，　１０４３−１０６１）。第３　に、Ｓ２細胞はＮｏｔｃｈ　コード配列の５’末端の再配列のために、異常Ｎｏｔｃｈ　メッセージを発現し、検知可能なＮｏｔｃｈ　は発現しない　（下記参照）　。これらの細胞はまた、検知可能なＤｅｌｔａ　も発現しない（下記参照）　。
【０１１５】
使用した構築物の模式図を図１　に示す　（詳細はセクション６．１の実験方法参照）。培養細胞中でＮｏｔｃｈ　を発現するために、Ｒａｍｏｓ等（１９８９，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１２３，　３３７−３４８）　の記載したＮｏｔｃｈ　ミニ遺伝子　ＭＧｌｌａをメタルロチオネインプロモーターベクターｐＲｍＨａ−３（Ｂｕｎｃｈ等．，　１９８８，　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１６，　１０４３−１０６１）　に挿入した。Ｄｅｌｔａ発現構築物は、主要な胚Ｄｅｌｔａ　転写物由来のＤｅｌｔａ　のための全コード配列を有するＤｌｌ　ｃＤＮＡ（５．４Ｚ；　Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ　等．，　１９８８，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．２，　１７２３−１７３５）を同じベクターに挿入することにより作成した。第３　の構築物は、「細胞外Ｎｏｔｃｈ　１　」のためのＥＣＮ１と称し、これは５’Ｎｏｔｃｈ　プロモーター領域および３’Ｎｏｔｃｈ　ポリアデニル化シグナルを含んでおり、また、ゲノム配列由来のＮｏｔｃｈ　遺伝子の細胞外および膜間の領域のためのコード容量を有しているが、約１０００アミノ酸の細胞内ドメインの８３５　アミノ酸に対応するコード配列は有していない。更に、予測されるフレームシフトのため、残りの７８のＣ末端アミノ酸残基は新しい５９のアミノ酸Ｃ末端尾部により置き換えられている（　実験方法参照）　。
【０１１６】
本明細書に記載した実験の全てについて、発現構築物は、Ｓ２細胞にトランスフェクションし、安定な形質転換体中ではなくむしろ一過性の発現を行った。発現細胞は典型的には、免疫蛍光染色で判断した場合、総細胞数の１〜５％を占める（データ示さず）。トランスフェクション後に発現した蛋白のウエスタンブロットを図２に示す。非トランスフェクション細胞は検知可能なレベルでＮｏｔｃｈ　やＤｅｌｔａ　を発現しなかった。しかしながら、トランスフェクション後は、予測された見かけの分子量の蛋白はそれぞれ、これらの蛋白の各々に特異的なモノクローナル抗体を用いて容易に検知できる。Ｎｏｔｃｈ　の場合、トランスフェクション細胞中、約３００ｋｄの全長の産物より下に複数のバンドが認められた。これらのバンドが試料調製中のＮｏｔｃｈ　の分解を示すものか、または、細胞内に存在するＮｏｔｃｈ　の合成またはプロセシングの中間体であるか不明であるが、トランスフェクション細胞および胚から得た試料中一貫してこれらを検出している。更に、これらの蛋白の細胞表面発現を試験するために、各蛋白の細胞外ドメインに特異的な抗体を用いて生存トランスフェクション細胞の免疫蛍光染色を行った。各々の場合において、表面抗原で予測されるとおりの表面染色結果を観察した。即ち、これらの結果は、明らかに、Ｎｏｔｃｈ　およびＤｅｌｔａ　の構築物は予測される大きさの蛋白の発現および細胞下局在化（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｇａｔｉｏｎ）を支持することを示している。
【０１１７】
６．２．２．ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　の凝集物を発現する細胞
Ｎｏｔｃｈ　とＤｅｌｔａ　が相互作用するという予測を調べるために、我々は、簡単な凝集検定を考案してＳ２細胞表面上に発現した蛋白の間のこれらの相互作用を検出した。Ｎｏｔｃｈ　とＤｅｌｔａ　が細胞表面上で安定なヘテロタイプの複合体を形成することができる場合、これらの蛋白を発現する細胞は相互に結合し、適切な条件下で凝集物を形成すると考えた。同様の検定系が最近、ファスシクリンＩＩＩ　蛋白についても報告されている（Ｓｎｏｗ　等．，　１９８９，　Ｃｅｌｌ　５９，　３１３−３２３）。
【０１１８】
対数期生育中のＳ２細胞を個別に、Ｎｏｔｃｈ　またはＤｅｌｔａ　メタロチオネインプロモーター構築物の何れかでトランスフェクションした。硫酸銅で誘導した後、トランスフェクション細胞を同数混合し、室温で一夜凝集させた　（詳細はセクション６．１　の実験方法参照）　。また、代謝活性の低下を意図した一部の実験では、細胞を１　〜２　時間４　℃で穏やかに混合した。凝集物が形成されたかどうかを判断するために、各遺伝子産物に特異的な抗体および異なるように標識された蛍光二次抗体を用いて免疫蛍光顕微鏡用に処理した。前述したとおり、安定ではなく一過性の形質転換体を使用したため、発現細胞は通常は総細胞数の５　％未満に相当した。残りの細胞は所定の蛋白を発現しないか、または発現しても極めて低レベルであるため、免疫蛍光顕微鏡では検知できなかった。対照実験として、単一の種類のトランスフェクション細胞のみを用いて凝集を行った。
【０１１９】
図３　は凝集実験で得た顕微鏡写真の代表的なものを示しており、表Ｉ　は結果を数値で示したものである。図３　Ｃおよび表Ｉから明らかな通り、Ｎｏｔｃｈ　発現（Ｎｏｔｃｈ＋）　細胞単独では、我々の検定では凝集物が形成されず、Ｄｅｌｔａ　発現（　Ｄｅｌｔａ＋）　細胞は凝集体を形成した。
【０１２０】
【表１】
2004065243.tif 000002
【０１２１】
Ｄｅｌｔａ＋細胞が凝集する傾向は、非凝集対照試料においても明らかであり　（表Ｉ）　、この対照試料では、有糸分裂姉細胞間の付着により恐らくは生じる４　〜８　個の細胞の細胞集塊が共通して生じた。しかしながら、集塊は凝集条件下でのインキュベート後でより共通して観察され（　例えば、インキュベート前の凝集物中のＤｅｌｔａ＋細胞１９％はｖｓインキュベート後の凝集物のＤｅｌｔａ＋細胞３７％；　表Ｉ　の実験１）、Ｄｅｌｔａ＋細胞は本検定において安定した相互接触が可能であることを示している。非染色細胞は我々の一過性トランスフェクションでは細胞の９０％を超える部分を占めていたが、これらを凝集物中にはみとめなかったことは注目に値する。稀に、非染色細胞は凝集物の端縁に認められた。凝集物の端縁では弱く染色された細胞が主に生じるため、これらの見かけ上は非発現の細胞は、トランスフェクションされたが、発現したＤｅｌｔａのレベルは免疫蛍光で検知するには不十分であったと考えられる。
【０１２２】
Ｎｏｔｃｈ＋細胞のみを用いた対照実験とは明らかに対照的に、Ｎｏｔｃｈ＋およびＤｅｌｔａ＋細胞の混合物の凝集物は２０まであるいはそれ以上もの細胞の集塊を形成した　（図３Ｄ−３Ｈ，　表Ｉ）。表Ｉ　が示すとおり、凝集２４時間後に４　個以上の染色細胞の集塊中に認められた発現細胞の画分は、Ｎｏｔｃｈ＋およびＤｅｌｔａ＋細胞の混合物中３２〜５４％の範囲であった。この範囲はＤｅｌｔａ＋細胞のみでみとめられたもの（３７　〜４０％）　と同様であったが、Ｎｏｔｃｈ＋細胞のみでみとめられたもの（僅か　０〜５　％）とは非常に異なっていた。Ｄｅｌｔａ＋細胞のみよりなる集塊も数個みとめられたが、Ｎｏｔｃｈ＋細胞は、Ｄｅｌｔａ＋細胞も存在する場合でなければ、４　〜５　個の細胞より多い集塊中にはみとめられなかった。ここでも、これらの集塊に含まれる全ての細胞は、トランスフェクション細胞が総細胞の僅かの部分しか占めなかったにもかかわらず、Ｎｏｔｃｈ　またはＤｅｌｔａ　の何れかを発現した。４８時間（　表Ｉ　、実験５　及び６）では、凝集度はより高くなり（６３　〜７１％）　、これらの条件下では２４時間後には凝集がまだ最大に達していないことを示唆している。また、Ｎｏｔｃｈ　構築物およびＤｅｌｔａ　構築物に同時トランスフェクションさせた細胞（　これにより全てのトランスフェクション細胞が両方の蛋白を発現）　は、同じ実験条件下で同様の挙動で凝集した。
【０１２３】
これらの結果は、これらの実験で観察された凝集は、Ｎｏｔｃｈ　およびＤｅｌｔａ　の発現を必要としており、非トランスフェクションＳ２細胞中の別の相互作用蛋白の偶然の発現によるものではないことを示している。更に、非トランスフェクションＳ２細胞でＮｏｔｃｈ＋細胞およびＤｅｌｔａ＋細胞を１０倍希釈し、これらを室温で２４時間凝集させることにより、この相互作用の特異性を試験した。この実験において、発現細胞は、それらは全細胞数の０．１　％未満であったものの、その発現細胞の３９％が他の発現細胞とともに凝集物中にみとめられた。しかしながら、これらの凝集物は標準凝集実験でみられるものよりも平均して小型であった。更に、Ｎｏｔｃｈ＋細胞は、それらが細胞表面上の単一の種類の蛋白を過剰発現するためＤｅｌｔａ＋凝集物に非特異的に取り込まれるという可能性を制御するために、Ｄｅｌｔａ＋細胞をメタロチオネインプロモーターの制御下にニューログリアン、即ち膜間細胞表面蛋白（Ｂｉｅｂｅｒ　等．，　１９８９，　Ｃｅｌｌ　５９，　４４７−４６０）を発現する細胞を混合した（　このメタロチオネイン−　ニューログリカン構築物はＢｉｅｂｅｒおよびＣ，Ｇｏｏｄｍａｎから提供された）　。ニューログリカン＋細胞がＤｅｌｔａ＋凝集物に付着する傾向はみとめられず、Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ　凝集物は単に細胞表面上の高レベルの蛋白発現の結果ではないことが示された。
【０１２４】
さらにまた、凝集に対する、Ｎｏｔｃｈ　のほぼ全ての細胞外ドメインに広がっている融合蛋白に対するポリクローナル抗血清の混合物の作用を調べることにより凝集過程におけるＮｏｔｃｈ　の関与を直接調べた（　セクション６．１　の実験方法三章）　。表面抗原のパッチングへの代謝応答により生じる混乱要因を最小限にするために、抗体処理および凝集検定はこの実験中は４　℃で行った。Ｎｏｔｃｈ＋細胞は１　時間前免疫または免疫マウス血清の何れかとともにインキュベートし、Ｄｅｌｔａ＋細胞を添加し、そして凝集は１　〜２　時間行った。前免疫血清で前処理されたＮｏｔｃｈ＋細胞はＤｅｌｔａ＋細胞と凝集した（３実験のうちの１　つでは、Ｎｏｔｃｈ＋細胞の２３％がＮｏｔｃｈ＋−　Ｄｅｌｔａ＋細胞凝集物中にみとめられた）　が、免疫血清で処理されたものは凝集しなかった（　Ｎｏｔｃｈ＋細胞の僅か２　％のみが凝集物中に有った）　。凝集の低下が抗血清へのＮｏｔｃｈ＋細胞の暴露から生じる抑制的な立体的作用または膜構造作用によるものであるという可能性を排除することはできないが、上記した結果は、Ｎｏｔｃｈ　の細胞外ドメインがＮｏｔｃｈ＋−　Ｄｅｌｔａ＋細胞凝集に必要とされることを示唆している。
【０１２５】
その他の３　つの重要な観察結果が図３　に示されている。先ず、Ｄｅｌｔａ　は細胞表面のみにほぼ常時認められた　（図３　および３Ｃ）　が、Ｎｏｔｃｈ　染色は細胞表面を細胞内の両方に常時認められ、嚢胞構造を伴うことが多かった　（図３Ａ）　。第２　に、一夜インキュベートした混合凝集物中では、Ｄｅｌｔａ＋およびＮｏｔｃｈ＋細胞の間に形態学的な差が一貫してみとめられた。Ｄｅｌｔａ＋細胞はしばしばＮｏｔｃｈ＋細胞に隣接して完全に包囲するような伸びを示したが、Ｎｏｔｃｈ＋細胞はほぼ常時丸い外観を有し、細胞質の伸びは認められなかった　（図３Ｇ）　。第３　に、Ｎｏｔｃｈ　およびＤｅｌｔａ　はしばしばＮｏｔｃｈ＋　細胞およびＤｅｌｔａ＋細胞の間の接触領域内に集合するように観察され、免疫蛍光染色の明確なバンドを形成していた　（図３Ｄ−３Ｆ）。これらのバンドは共焦顕微鏡上で見られる光学区画中で容易に観察でき　（図３Ｈ）　、これらは単にマウント全体の混乱要因によるものではないことが示された。さらにまた、これらのバンドは急速　（細胞混合２　時間以内）　に、そして　４℃で形成され、その形成は恐らくは細胞代謝とは無関係であることが示された。これらの観察結果は、細胞接触領域内でＮｏｔｃｈ　およびＤｅｌｔａ　が相互に結合し、このため不動化されると仮定すれば、予測されるものである。この発現様式はまた、細胞凝集を媒介するその他の蛋白で観察されるものと合致している（Ｔａｋｅｉｃｈｉ，　１９８８，　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０２，　６３９−６５５；　Ｓｎｏｗ　等．，　１９８９，　Ｃｅｌｌ　５９，　３１３−３２３）。
【０１２６】
６．２．３．Ｎｏｔｃｈ　−　Ｄｅｌｔａ　媒介凝集はカルシウム依存性である
以前の試験により、特定のコンセンサス配列を有するＥＧＦ　様繰返しはカルシウム（Ｃａ２＋結合ドメインとして作用することが示唆された（Ｍｏｒｉｔａ　等．，　１９８４，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９．　５６９８−５７０４；　Ｓｕｇｏ等．，　１９８４，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，５７０５−５７１０；　Ｒｅｅｓ等．，　１９８８　ＥＭＢＯ　Ｊ．７，　２０５３−２０６１；　Ｈａｎｄｆｏｒｄ　等．，　１９９０，　ＥＭＢＯ　Ｊ．９，　４７５−４８０）　。これらの蛋白のうち少なくとも２　つについては、Ｃ　およびＣ１，　Ｃａ２＋結合が、他の蛋白との相互作用の必要要素であることが更に示されている（Ｖｉｌｌｉｅｒｓ　等．，　１９８０，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　１１７，　２８９−２９４；　Ｅｓｍｏｎ等．，　１９８３，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，　５５４８−５５５２；　Ｊｏｈｎｓｏｎ等．，　１９８３，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，　５５５４−５５６０）。Ｎｏｔｃｈ　内のＥＧＦ−相同繰返しの大部分およびＤｅｌｔａ　内のこれらの殆どは、これらの蛋白がカルシウムに実際に結合するかどうかはまだ決定されていないが、Ｃａ２＋結合のための必要なコンセンサス配列を含んでいる（Ｒｅｅｓ　等．，　１９８８，　ＥＭＢＯ　Ｊ．２０５３−２０６１；　Ｓｔｅｎｆｌｏ　等．，　１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，　３６８−３７２；　Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ　等．，　１９８８，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ，　２，１７２３−１７３５；　Ｈａｎｄｆｏｒｄ　等．，　１９９０，　ＥＭＢＯ　Ｊ．９，　４７５−４８０）　。従って、発現細胞がＣａ２＋イオンの存在下または非存在下で凝集することができる能力を調べ、これによりＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ　凝集にＣａ２＋イオンが必要であるかどうか決定した。Ｃａ２＋の除去への代謝応答により生じうる非特異的作用を最小限にするために、これらの実験は４　℃で行った。４　℃でＣａ２＋含有培地中凝集条件下でインキュベートしたＮｏｔｃｈ＋細胞およびＤｅｌｔａ＋細胞の対照混合物は容易に凝集物を形成した　（平均３４％　±１３％，　平均±ＳＤ，　ｎ＝３；　表ＩＩ）　。対照的に、Ｃａ２＋イオン欠乏ＥＧＴＡ含有培地中で混合した細胞は殆ど凝集物を形成しなかった（５％±５％）　。これらの結果は、Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ−媒介凝集の外来性Ｃａ２＋依存性を明らかに示しており、またＳ２細胞中のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａファスシクリンＩＩＩ　蛋白およびファスシクリンＩ　蛋白に関する最近の文献発表内容と対照的であり　（Ｓｎｏｗ　等．，　１９８９，　Ｃｅｌｌ　５９，　３１３−３２３；　Ｅｌｋｉｎｓ　等．，　１９９０，　Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１１０，　１８２５−１８３２）、これら文献では何れの蛋白により媒介される凝集に対してもＣａ２＋イオン除去の影響は認められなかった。
【０１２７】
【表２】
2004065243.tif 000003
【０１２８】
６．２．４．ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａは単一細胞内で相互作用する
ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａ　が両方の蛋白を発現する１つの細胞の膜内で会合しているかどうかを、同時トランスフェクション細胞中のＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　の分布を調べることにより検討した。図４Ａおよび４Ｂに示されるとおり、これらの２つの蛋白は同時トランスフェクション細胞の表面で極めて似た分布を示す場合が多い。観察される併存局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）が偶然であるかまたは　ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａ　の間の安定な相互作用を示しているかを調べるために、過剰のポリクローナル抗Ｎｏｔｃｈ　抗血清で生存細胞を処理した。免疫蛍光分析で検知されたように、この処理により個々のパッチへの発現細胞表面上の　Ｎｏｔｃｈの「パッチング」が起こった。この処理の後のこれらの細胞の表面上の　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　の分布の間には明らかな相関があり　（図４Ｃおよび４Ｄ）　、これらの蛋白が膜内で会合することを示していた。これらの実験は、この会合が直接のものであるか、または細胞骨格のような別の成分により媒介されているかという問題に向けたものではないことに留意しなければならない。　Ｄｅｌｔａは本実験で非特異的にパッチングされるという可能性を制御するために、　Ｎｏｔｃｈおよび前述したニューログリアン構築物　（Ａ．Ｂｉｅｂｅｒと　Ｃ．Ｇｏｏｄｍａｎ，　未発表データ）　で細胞を同時トランスフェクションし、抗Ｎｏｔｃｈ抗血清とパッチングさせた。この場合、Ｎｏｔｃｈとニューログリアンの間には見かけの相関はなかった。
【０１２９】
６．２．５．Ｄｅｌｔａ　との相互作用はＮｏｔｃｈ　の細胞内ドメインを必要としない
ＥＧＦ様繰返しを含む大型の細胞外ドメインの外に、　Ｎｏｔｃｈは約９４０アミノ酸の大型の細胞内　（ＩＣ）　ドメインを有している。　ＩＣドメインはリン酸化部位　（Ｋｉｄｄ等．，　１９８９，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　３，　１１１３−１１２９）　、推測ヌクレオチド結合ドメイン、ポリグルタミン鎖（Ｗｈａｒｔｏｎ等．，　１９８５，　Ｃｅｌｌ　４３，　５６７−５８１；　Ｋｉｄｄ等．，　１９８６，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　６，　３０９４−３１０８）　、および酵母の細胞周期制御に関与する酵母ｃｄｃ１０遺伝子と相同の配列を有する　（ＢｒｅｅｄｅｎとＮａｓｍｙｔｈ，１９８７，　Ｎａｔｕｒｅ　３２９，　６５１−６５４）。このドメインの大きさおよび構造的複雑性を考えた場合、それが　Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用に必要であるか疑問である。従って、上記した全ての構造的特徴を含むＩＣドメインの約　８３５個のアミノ酸に対するコード配列を欠失させた変異体　Ｎｏｔｃｈ構築物を用いた　（２５の膜隣接アミノ酸および新しい５９アミノ酸のＣ末端を残した；詳細は実験方法および図１を参照）　。この構築物は、ＥＣＮ１と命名したが、これはメタロチオネインプロモーター構築物で観察されるよりも低レベルでトランスフェクション細胞中の正常な　Ｎｏｔｃｈプロモーターの制御下で、構造的に発現されるが、免疫蛍光分析で容易に検知できる。
【０１３０】
凝集検定において、ＥＣＮ１構築物を発現する細胞は一貫して　Ｄｅｌｔａ＋細胞と凝集物を形成　（３実験のうちの１つではＥＣＮ１発現細胞の３１％が凝集物中に有った；図３Ｉ参照）　したが、それ等自身とは形成せず　（凝集物中僅か４％）　、これらは未損傷のＮｏｔｃｈを発現した細胞で観察したとおりであった。また、Ｄｅｌｔａ＋細胞との接触領域内にＥＣＮ１染色の明確なバンドが観察され、ここでも、細胞間の接触領域内のＥＣＮ１の局在化が示された。膜内での相互作用を調べるために、ＥＣＮ１および　Ｄｅｌｔａ構築物で同時トランスフェクトした細胞を用いて表面抗原同時パッチング実験を繰返しした。未損傷の　Ｎｏｔｃｈで観察したとおり、ＥＣＮ１をＮｏｔｃｈ　の細胞外ドメインに対するポリクローナル抗血清を用いてパッチングする場合、ＥＣＮ１およびＤｅｌｔａ　は細胞表面に併存局在化することが解った　（図４Ｅおよび４Ｆ）　。これらの結果は、膜内における　ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａ　の間の観察された相互作用は　Ｎｏｔｃｈの　ＩＣドメインの欠失部分を必要とせず、従って、恐らくは細胞外ドメインにより媒介されることを示している。しかしながら、ＥＣＮ１中の残りの膜貫通ドメイン配列または　ＩＣドメイン配列は単一の細胞内で相互作用を媒介するのに十分である可能性がある。
【０１３１】
６．２．６．ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａは泡沫洗剤可溶性分子間複合体を形成する
前記した結果は総合すると、同じ膜内に存在する　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　の間および異なる細胞上で発現されるこれらの蛋白の間の分子相互作用を示していると解釈できる。このような相互作用に関する別の試験として、これらの蛋白が　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　を発現する細胞の非変性洗剤抽出物から同時沈降するかどうか調べた。
【０１３２】
ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　が細胞間または細胞内の何れかで安定な分子間複合体を形成する場合、これらの蛋白の１つに対する特異的抗血清を用いて細胞抽出物から両方の蛋白を沈降させることが可能である。この分析を、ＮＰ−４０由来ポリクローナル抗血清／一夜凝集させてある　Ｎｏｔｃｈ構築物およびＤｅｌｔａ　構築物で同時トランスフェクションした細胞、または、０〜２４時間野生型胚のデオキシコレート分解物（実験方法を参照）　でＤｅｌｔａを免疫沈降させることにより行なった。逆免疫沈降は、Ｓｔａｐｈ　Ａバンドのバックグラウンド上の弱いＤｅｌｔａ　バンドを明確に識別できなかったため実施できなかった。このポリクローナル抗Ｄｅｌｔａ抗血清を、細胞分解物中の　Ｎｏｔｃｈに対する交叉反応性　（図５Ａ、レーン１）　について、そして免疫蛍光分析　（例えば図３Ｄと３Ｅを比較）　を用いて調べたところなにも発見できなかった点が重要である。非特異的に付着している蛋白を除去するために洗浄を繰返した後、ウエスタンブロット上のＮｏｔｃｈに対するモノクローナル抗体　（ＭＡｂ　Ｃ１７．９Ｃ６）を用いてＮｏｔｃｈ　の同時沈降を調べた。
【０１３３】
図５に示すとおり、同時トランスフェクション細胞および胚から得たＤｅｌｔａ免疫沈降中、　Ｎｏｔｃｈの同時沈降は検知されなかった。しかしながら、同時沈降したＮｏｔｃｈはＤｅｌｔａ　より遙かに少ない量で存在するように観察され、従って検知は困難であった。この格差は手順中の細胞融解および洗浄の工程の間の　Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ複合体の破壊によるものである可能性が大きい。しかしながら、この格差は　ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａ　の間の非等モル相互作用、または、これらの蛋白を検出するために用いた抗血清の親和性が極めて異なることを反映している可能性もある。Ｄｅｌｔａの免疫沈降がＮｏｔｃｈ　の同時沈降をもたらしたという事実は、これらの２つの蛋白が、トランスフェクションされたＳ２細胞中、および胚細胞中、安定な分子間複合体を形成することの直接的な証拠となる。
【０１３４】
６．３．考　察
神経原性の座の２つの蛋白産物、即ち　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　の間の相互作用を調べることにより、その細胞機能を更に解明した。通常は非付着性のＳ２細胞を用いるｉｎ　ｖｉｔｒｏ凝集検定により、　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　を発現する細胞は相互に特異的に付着することを示した。この相互作用の特異性は、これらの実験では総細胞数の大部分が非発現細胞で構成されていたものの、Ｎｏｔｃｈ＋−Ｄｅｌｔａ＋細胞凝集物が殆ど非発現細胞を含まないという観察結果から明らかである。この凝集は発現細胞の表面上に存在する　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　の細胞外ドメインの間のヘテロタイプの結合により媒介されると考える。この考え方を裏付けるものとして、　Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインに対する抗血清は　Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ媒介凝集を抑制し、Ｎｏｔｃｈ　細胞内ドメインのほぼ全てを欠失している　ＥＣＮ１Ｎｏｔｃｈ変異体が　Ｄｅｌｔａを発現する細胞の凝集を媒介できることを我々は発見している。さらにまた、　Ｄｅｌｔａのみを発現する細胞は相互に凝集するが、Ｎｏｔｃｈ　のみを発現する細胞は凝集しないことも発見した。これらの所見は、Ｄｅｌｔａ　は近接する細胞の表面上に存在する際にホモタイプの相互作用に関与するが、Ｎｏｔｃｈ　は我々の検定条件下ではそうではないことを示唆している。
【０１３５】
ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　が細胞表面で相互作用を示すという考え方は、次の３点の証拠によっても裏付けられる。第１に、　Ｎｏｔｃｈ＋細胞および　Ｄｅｌｔａ＋細胞の接触領域内に両方の蛋白の緊密な局在化を観察したが、これは、　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　は、異なる細胞内に発現された場合であっても直接相互作用を示すことを示唆している。第２に、　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　は両方の蛋白を発現する細胞の表面上に併存局在化しており、これは、これらの蛋白が細胞膜内で相互作用を示すことを示唆している。第３に、　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　は両方の蛋白を発現する培養細胞の非変性洗剤抽出物ならびに胚細胞抽出物から同時沈降できる。これら３点を考えあわせると、　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　は同じ細胞または異なる細胞の何れの表面に発現された場合もヘテロタイプの相互作用を示すという仮説が強力に裏付けられる。
【０１３６】
観察された　ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａ　の間および　Ｎｏｔｃｈとｍａｔｎの間　（Ｘｕ等．，１９９０，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　４，　４６４−４７５）の間の遺伝子相互作用の根拠は、これらの遺伝子によりコードされる蛋白の間の用量感受性相互作用であると考えられる。
【０１３７】
次の２つの証拠は、　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　の蛋白はｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ　で同様に機能することを示唆している。第１に、遺伝子分析は　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　の化学量はその機能が現われるために必須であることを示している。Ｎｏｔｃｈ−ＤｅｌｔａおよびＤｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａの会合の両方がｉｎ　ｖｉｔｒｏで起こるという我々の観察結果は、ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａがＤｅｌｔａへの結合において競合しているかもしれないことを示唆する。即ち、　ＮｏｔｃｈとＤｅｌｔａ　の間の用量感受性遺伝子相互作用はその蛋白産物の間の競合結合相互作用によるものであろう。第２に、我々は免疫沈降を用いて培養細胞の分解物中およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚の分解物中に　Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａの会合を検知することができた。総合すると、これらの遺伝子的生物化学分析は、　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　が実際に、我々の凝集検定に基づいて我々が提案した様式と同様の様式でｉｎ　ｖｉｖｏで会合することを示唆している。
【０１３８】
Ｎｏｔｃｈの遺伝子的および分子的分析は、更に、個々のＮｏｔｃｈ蛋白の間にも相互作用がある可能性を与える（Ｐｏｒｔｉｎ，　１９７５，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８１，　１２１−１３３；　Ｋｅｌｌｅｙ等．，　１９８７，　Ｃｅｌｌ　５１，　５３９−５４８；　Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ，　１９８８，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．　４，　９６−１００）。実際、　Ｋｉｄｄ　等　（１９８９，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　３，　１１１３−１１２９）は、明確に証明されているわけではないが、この蛋白がジスルフィド交叉結合二量体を形成することを提案している。共有結合性交叉結合の形成の有無に関わらず、このような相互作用は恐らくは単一の細胞内、または細胞間の何れかで生じる。しかしながら、　Ｎｏｔｃｈ＋細胞がホモタイプの凝集を示さないという我々の知見は、　Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈ会合は単一の細胞内では起こると考えられるが細胞間では起こらないことを示唆している。あるいは、ホモタイプの　Ｎｏｔｃｈ相互作用は、Ｓ２細胞内で発現されない遺伝子産物を必要とする可能性もある。
【０１３９】
我々の分析で示された　Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ　相互作用は、恐らくは、これらの蛋白の細胞外ドメインにより媒介される。この結論は、Ｎｏｔｃｈ　のほぼ全ての細胞内ドメインを欠失させているか、または、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異により変化させているＥＧＮ１構築物を用いた凝集実験により確認された。同時パッチング能力に基づいた膜内のＥＣＮ１−Ｄｅｌｔａ会合を実証する別の実験によれば、これらの相互作用はＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの細胞外ドメインにより媒介されるかもしれないことを示している。ただし、この場合、膜貫通ドメインまたはＮｏｔｃｈ　細胞内ドメインの残りの部分の関与の可能性を排除できない。これらの結果は、　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　の両方がその細胞外ドメイン内にＥＧＦ様繰返しを有するという事実を考慮すると特に興味深い（Ｗｈａｒｔｏｎ等．，　１９８５，　Ｃｅｌｌ　４３，　５６７−５８１；　Ｋｉｄｄ等．，　１９８６，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　６，３０９４−３１０８；　Ｖａｓｓｉｎ　等．，　１９８７，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　６，３４３１−３４４０；　Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ　等．，　１９８８，
Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　２，　１７２３−１７３５）　。
【０１４０】
ＥＧＦドメインに関する第２の論点は、それらがＥＧＦ様繰返し内の保存された部位Ａｓｐ，　Ａｓｐ／Ａｓｎ，　Ａｓｐ／Ａｓｎ　およびＴｙｈ／Ｐｈｅ　残基よりなるコンセンサス配列を有する場合、それらはＣａ２＋結合ドメインとして機能することができるという考え方である　（Ｒｅｅｓ等．，　１９８８，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　７，　２０５３−２０６１；　Ｈａｎｄｆｏｒｄ　等．，　１９９０，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　９，　４７５−４８０）。Ｃａ２＋結合のための考えられるコンセンサス配列との比較により、同様の配列が多くの　ＮｏｔｃｈのＥＧＦ様繰返し内（Ｒｅｅｓ　等．，　１９８８，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　７，　２０５３−２０６１）および大部分のＤｅｌｔａのＥＧＦ様繰返し内　（Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉ等．，　１９８８，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　２，　１７２３−１７３５）　にみとめられたことが解った。更に、　Ｎｏｔｃｈ突然変異の配列分析によれば、特定のＡｘ対立遺伝子がこの推定Ｃａ２＋結合ドメイン内のアミノ酸の変化に関与していることが示された　（Ｋｅｌｌｅｙ等．，　１９８７，　Ｃｅｌｌ　５１，　５３９−５４８；　Ｈａｒｔｌｅｙ　等．，　１９８７，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　６，　３４０７−３４１７；　Ｒｅｅｓ　等．，　１９８８，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　７，　２０５３−２０６１）。例えば、ＡｘＥ２突然変異は２９番目のＥＧＦ様繰返しにおけるＨｉｓ　からＴｙｒ　への変化と相関し、この繰返しをＣａ２＋結合のためのコンセンサスに向けて変化させるようである。逆に、Ａｘ９Ｂ２突然変異は、　ＡｓｐからＶａｌ　への変化の結果として２４番目のＥＦＧ様繰返しをこのコンセンサスから離れるように変化させるようである。即ち、Ａｘ対立遺伝子とＤｅｌｔａ　突然変異の間の遺伝子相互作用　（Ｘｕ等．，１９９０，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，　４，　４６４−４７５）　はＣａ２＋イオンが　Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用におけるある役割りを果たすという可能性を生じさせる。外来性Ｃａ２＋はトランスフェクションされたＳ２細胞の　Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ媒介凝集に必要であるという我々の知見はこの主張を支援するものである。
【０１４１】
我々が議論したとおり　（Ｊｏｈａｎｓｅｎ等．，　１９８９，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０９，　２４２７−２４４０；　Ａｌｔｏｎ　等．，　１９８９，　Ｄｅｖ．　Ｇｅｎｅｔ．　１０，　２６１−２７２）　、以前の分子分析および遺伝子分析に基づけば、ＮｏｔｃｈまたはＤｅｌｔａの何れかの細胞機能が細胞−細胞相互作用への関与を超えているということを、確信をもって予測することはできない。しかしながら、ここに示した結果を考慮すると、　ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａ　はｉｎｖｉｖｏで細胞間の付着相互作用を媒介する機能を有することを示唆するのは合理的と考えられる。同時に、観察された　Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａの相互作用は単に付着機能を反映しているのみならず、ｉｎ　ｖｉｖｏで起こる受容体−リガンド結合相互作用も反映している可能性がかなりある。実際、　Ｎｏｔｃｈ内の構造的に複雑な１０００個のアミノ酸の細胞内ドメインの存在は、付着相互作用のみよりはむしろ、シグナル形質導入における役割りに、より適合していると考えられる。ＮｏｔｃｈがＤｅｌｔａと協力して付着機能を有すると考えれば、Ｎｏｔｃｈの軸策発現は軸策の導入においてある役割りを果たしていると考えられる。
【０１４２】
７．ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰返し１１および１２はＮｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ−媒介凝集に必要で十分である
本試験では、セクション６に記載した凝集検定ならびに　Ｎｏｔｃｈの欠失変異体を用いてＤｅｌｔａとの相互作用に必要なＮｏｔｃｈの細胞外ドメイン内の領域を同定した。ＮｏｔｃｈのＥＧＦ繰返しはこの相互作用に直接関与し、そして３６ＥＧＦ繰返しのうち僅か２つのみが必要であると考えられた証拠を示す。これらの２つのＥＧＦ繰返しがＤｅｌｔａ　への結合に十分であり、そして　Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ媒介凝集のカルシウム依存性もまたこれらの２つの繰返しに関連することを実証する。最後に、　Ｎｏｔｃｈと相同のＸｅｎｏｐｕｓ　由来の２つの相当するＥＧＦ繰返しもまた、　Ｄｅｌｔａとの凝集を媒介し、このことは　Ｎｏｔｃｈの構造が進化論的に保存されるのみならず、その機能も保存されることを示している。これらの結果は、　Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインが意外にもモジュール的であり、Ｄｅｌｔａ　以外の種々の蛋白にも潜在的に結合可能であることを示唆している。
【０１４３】
７．１．実験方法
７．１．１．発現構築物
記載した構築物は全て全長の　Ｎｏｔｃｈ発現構築物＃１　ｐＭｔＮＭｇの誘導体である　（上記セクション６参照。全ての連結は低融点アガロースゲル（Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ，　ＦＭＣ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）　から得たＤＮＡ断片を用いて実施した。　Ｎｏｔｃｈの全細胞外ドメインを含むｐＭｔＮＭｇ由来の６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ　断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入連結し、ＲＩ／ＸＢＳと命名した。その後全てのＥＧＦ繰返しの欠失および挿入はこのサブクローンを用いて実施した。次にこれらのＲＩ／ＸＢＳ誘導体のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を含む　Ｎｏｔｃｈ配列を細胞内ドメインを含むｐＭｔＮＭｇ由来の５．５ｋｂ　ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ　断片およびポリアデニル化のために必要な３’配列と混合し、そして、３ピース連結でｐＲＭＨａ−３　（Ｂｕｎｃｈ等，　１９８８，　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１６，　１０４３−１０６１）　のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位に挿入した。以下に記載する全ての数はＷｈａｒｔｏｎ　等　（１９８５，　Ｃｅｌｌ　４３，　５６７−５８１）　に従った　Ｎｏｔｃｈ配列のヌクレオチド配位を指す。
【０１４４】
構築物＃２　ＤＳｐｈについては、ＲＩ／ＸＢＳはＳｐｈＩで完全に消化し、次に再環化し、ＳｐｈＩ　（９９６）からＳｐｈＩ（４５４５）までの３．５ｋｂ　のインフレーム欠失を行なった。
【０１４５】
構築物＃３　ΔＣｌａ　については、ＲＩ／ＸＢＳをＣｌａＩで完全に消化し、次に、再連結し、ＣｌａＩ（１６６８）からＣｌａＩ（４４０７）までの２．７ｋｂ　のインフレーム欠失を行なった。連結部はＳｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｋｉｔ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．，　Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）　を用いて二重鎖シーケンシング　（Ｘｕ等の記載に従う、１９９０，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　４，　４６４−４７５）により確認した。４５６６位のＣｌａＩ部位は配列に従って存在していたが、これは我々の条件下ではＣｌａＩ制限酵素では認識されなかったことが解った。
【０１４６】
構築物＃４−１２については、ＲＩ／ＸＢＳをＣｌａＩで部分的に消化し、そして再連結して以下に示すような全ての可能なインフレーム欠失の組合せを作成した。構築物＃４　ΔＥＧＦ７−１７はＣｌａＩ（１６６８）とＣｌａＩ（２８２９）の間の配列を除去した。構築物＃５　ΔＥＧＦ９−２６はＣｌａＩ（１９０５）とＣｌａＩ（３８５５）の間の配列を除去した。構築物＃６　ΔＥＧＦ１７−３１はＣｌａＩ（２８２０）とＣｌａＩ（４４０７）の間の配列を除去した。構築物＃７　ΔＥＧＦ７−９はＣｌａＩ（１６６８）とＣｌａＩ（１９０６）の間の配列を除去した。構築物＃８　ΔＥＧＦ９−１７はＣｌａＩ（１９０５）とＣｌａＩ（２８２０）の間の配列を除去した。構築物＃９ΔＥＧＦ１７−２６はＣｌａＩ（２８２０）とＣｌａＩ（３８５５）の間の配列を除去した。構築物＃１０　ΔＥＧＦ２６−３０はＣｌａＩ（３８５５）とＣｌａＩ（４４０７）の間の配列を除去した。構築物＃１１　ΔＥＧＦ９−３０はＣｌａＩ（１９０５）とＣｌａＩ（４４０７）の間の配列を除去した。構築物＃１２　ΔＥＧＦ７−２６　はＣｌａＩ（１６６８）とＣｌａＩ（３８５５）の間の配列を除去した。
【０１４７】
構築物＃１３　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ９−１７および＃１４　ΔＣｌａ　＋ＥＧＦ１７−２６については、ＣｌａＩ（１９０５）とＣｌａＩ（２８２０）の間の約０．９ｋｂの断片、およびＣｌａＩ（２８２０）とＣｌａＩ（３８５５）の間の約１．０ｋｂの断片をそれぞれ、構築物＃３　ΔＣｌａの唯一のＣｌａＩ部位に挿入した。
【０１４８】
構築物＃１６スプリットについては、ｐＭｔＮＭｇの１１ｋｂのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片を、ＥＧＦ繰返し１４中のスプリット突然変異を有する　Ｎｏｔｃｈミニ遺伝子構築物由来の相当するＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片で置換した。
【０１４９】
構築物＃１７−２５については、ポリメラーゼ連鎖反応　（ＰＣＲ）のための合成プライマーを、ＥＧＦ繰返しのストレッチを増幅し、かつ、繰返しの３番目のシステインのすぐ後の共通なＣｌａＩ部位と同じ場所の増幅された片の末端でＥＧＦ繰返しを破壊するように設計した　（図７参照）　。ＰＣＲ生成物は通常通りゲル精製し、ＤＮＡポリメラーゼＩの　Ｋｌｅｎｏｗ　断片で充填することにより平滑末端とした構築物　３＃ΔＣｌａ　らのＣｌａＩ部位に連結した　（Ｍａｎｉａｔｉｓ等．，　１９９０，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。挿入物の正しい配位は、挿入物のセンス鎖プライマー並びにＥＧＦ繰返し３５内のアンチセンス鎖プライマーを用いてＰＣＲにより決定した。全てのプライマーは２０量体であり、　Ｗｈａｒｔｏｎ等　（１９８５，　Ｃｅｌｌ　４３，　５６７−５８１）　の　Ｎｏｔｃｈ配列のヌクレオチド配位に従って、その５’末端のヌクレオチドの番号で命名し、Ｓはセンス鎖プライマーを指し、Ａはアンチセンス鎖プライマーを指すものとした。構築物＃１６　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（９−１３）　はプライマーＳ１９１７およびＡ２３６７を使用した。構築物＃１７　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１１−１５）　はプライマーＳ２１４１およびＡ２５９１を使用した。構築物＃１８　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１３−１７）　はプライマーＳ２３７５およびＡ２８１９を使用した。構築物＃１９　ΔＣａｌ＋ＥＧＦ　（１０−１３）　はプライマーＳ２０１８およびＡ２３６７を使用した。構築物＃２０　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１１−１３）　はプライマーＳ２１４１およびＡ２３６７を使用した。構築物＃２１　ΔＣｌａ＋ＥＦＧ　（１０−１２）　はプライマーＳ２０１８およびＡ２０１５を使用した。構築物＃２２　ΔＣｌａ　＋ＥＧＦ　（１０−１１）　はプライマーＳ２０１８およびＡ２３２２を使用した。構築物＃２３　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１０−１２）　はプライマーＳ２０１８およびＡ２３２２を使用した。構築物＃２４　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１１−１２）　はプライマーＳ２０８１およびＡ２３２２を使用した。
【０１５０】
構築物＃２５　ΔＥＧＦについては、構築物ＲＩ／ＸＢＳをＳｐｈＩ（９９６）で完全に消化し、そしてＢａｍＨＩ（５１３５）　で部分的に消化した。得られた非適合末端は、唯一のＣｌａＩ部位を形成するように設計された合成リンカーを用いて結合させた。これにより、繰返し１の前の半分を除いて全ての３６ＥＧＦ繰返しを除去するインフレーム欠失を行なった。構築物＃２６−２９については、ＥＧＦ断片は、相当する構築物＃１３，　１６，　１９および２３で前記したとおり、このＣｌａＩ部位に挿入した。
【０１５１】
構築物＃３０　ΔＥＣＮについては構築物ＲＩ／ＸＢＳをＢｇｌＩ，　ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで完全に消化した。約０２ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩ断片（７２２−９４８）および約０．７ｋｂのＢｇｌＩ−ＸｈｏＩ（５８７３−６６２７）断片は、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ切断Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターおよび唯一のＣｌａＩ部位を形成するように設計された合成リンカーを用いて連結し、繰返し１の最初の１／３　ならびに３Ｎｏｔｃｈ／ｌｉｎ−１２繰返しを除いて全ての３６ＥＧＦ繰返しを除去したＢｇｌＩ（９４１）　からＢｇｌＩ（５８７３）のインフレーム欠失を行なった。構築物＃３１および３２については、ＥＧＦ断片は、構築物＃１９および２３について前に記載したとおり、唯一のＣｌａＩ部位に挿入した。
【０１５２】
構築物＃３３および３４については、Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｎｏｔｃｈ　配列に基づいたＰＣＲプライマーＳ１５０８およびＡ１８５９　（Ｃｏｆｆｍａｎ　等．，　１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，　１４３８−１４４１；　数は本明細書で使用するヌクレオチド配位を指す）　を用いてＸｅｎｏｐｕｓ　ステージ１７　ｃＤＮＡ　ライブラリからＥＧＦ繰返し１１および１２を増幅した　（ライブラリはＤ．　Ｍｅｌｔｏｎ　が作成し、Ｍ．Ｄａｎｉｌｃｈｅｋ　により提供された）　。断片は構築物　３＃　ＤＣｌａ　に連結し、配列決定した。
【０１５３】
７．１．２．細胞培養およびトランスフェクション
Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ　Ｓ２細胞系統を、セクション６に記載したとおり生育させトランスフェクションさせた。Ｄｅｌｔａ　発現安定形質転換Ｓ２細胞系統Ｌ−４９−６−７（Ｌ．Ｃｈｅｒｂａｓ作成）　を、１１％熱不活性化ウシ胎児血清ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ），　１００Ｕ／ｍｌペニシリン−１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン−０．２５ｕｇ／ｍｌ　フンジゾン　（Ｈａｚｌｅｔｏｎ）　、２×１０−７Ｍメトトレキセート、０１ｍＭヒポキサンチンおよび０．０１６ｍＭ　チミジン添加Ｍ３培地（Ｈａｚｌｅｔｏｎ　Ｃｏ．製）　中で生育させた。
【０１５４】
７．１．３．凝集検定および免疫蛍光試験
凝集検定およびＣａ２＋依存性実験はセクション６に記載の通りである。細胞を抗Ｎｏｔｃｈモノクローナル抗体９Ｃ６．Ｃ１７および抗Ｄｅｌｔａラットポリクローナル抗血清　（詳細はセクション６に記載）　で染色した。非透過性にした細胞中の　Ｎｏｔｃｈ　構築物の表面発現は、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメイン由来の０．８ｋｂ　（アミノ酸２３７−５０１；　Ｗｈａｒｔｏｎ等．，１９８５，　Ｃｅｌｌ　４３，　５６７−５８１）　ＢｓｔＹＩ　断片に対して作成されたラットポリクローナル抗血清を用いて検定した。細胞はＬｅｉｔｚ　Ｏｒｔｈｏｐｌａｎ　２　顕微鏡上で表面蛍光下で観察した。
【０１５５】
７．２．結　論
７．２．１．Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２はＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　媒介凝集のために必要である
我々は、Ｎｏｔｃｈ　が媒介する相互作用の正確なドメインを同定するために、我々がＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用に関連することを既に示している　（上記、第６節）　、Ｎｏｔｃｈ　蛋白の細胞外領域の広範囲の欠失分析に着手した。我々は第６節に記載されている凝集アッセイを使用して、Ｄｅｌｔａ　と相互作用させるため種々の欠失構築物を移入した細胞の能力を試験した。簡単に述べると、Ｎｏｔｃｈ　欠失構築物は経過的にドロソフィラＳ２細胞に移入され、ＣｕＳＯ４で誘引し、次いでセルラインＬ４９−６−７（ｃｈｅｒｂａｓ）を発現する安定的に移入されたＤｅｌｔａ　からの少量の細胞とともに室温で１晩凝集させ、約１％Ｎｏｔｃｈ　発現細胞及び約５％Ｄｅｌｔａ　発現細胞から典型的に成る集団をいずれの蛋白をも発現しない残存細胞で収穫した。凝集の度合をアッセイするために、細胞を各遺伝子生成物に特異的な抗血清で染色し、免疫蛍光顕微鏡で試験した　（詳細については実験方法を参照）　。凝集体はＮｏｔｃｈ　及びＤｅｌｔａ　発現細胞の両方を含む４個以上の細胞のクラスターとして定義され、そして第６図に示される値はこのようなクラスターに見い出されるＮｏｔｃｈ　を発現する全ての細胞のパーセントを表わす。すべての数は、少なくとも　１００個のＮｏｔｃｈ　発現細胞単位　（単一細胞又はクラスター）　が計測された少なくとも２個の別個のトランスフェクション実験からの平均的結論を、表わしている。
【０１５６】
試験された構築物の模式図及び凝集実験の結果は第６図に示されている　（詳細については実験的方法を参照）　。すべての発現構築物は、全長のＮｏｔｃｈ　発現構築物＃１　ｐＭｔＮＭｇ　（上述の第６節）　の誘導体であった。
【０１５７】
最初の構築物　（＃２　ＤＳｐｈ及び＃３　ΔＣｌａ）はＥＧＦ繰り返しの大部分を欠失していた。Ｎｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　凝集を促進することが不可能なことは、Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返しがＤｅｌｔａ　との相互作用に関連していたことを示していた。我々はＥＧＦ繰り返し７及び３０の間でさらに領域を切断するため、一連の６個のイン−フレームＣｌａＩ制限部位を利用した。繰り返しの間の配列相同性のため、ＣｌａＩ部位の５個は３番目のシステインのすぐ後の、ＥＧＦ繰り返しの同一の相対的場所で生じ、一方第６の部位はＥＧＦ繰り返し３１の最初のシステインの直前で生ずる　（第７図）　。こうして、ＣｌａＩの部分的消化を行い、次に再結合することにより、我々はＮｏｔｃｈ　蛋白の読み取り枠　（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）　を保存しているのみならず、さらに、構造上の完全さを維持し、再結合により生成されたキメラＥＧＦ繰り返しにおける３個のジスルフィド結合の空間を少なくとも理論的に保持した　（第６図、構築物＃４−１４）　。残念なことに、いちばん多くの３’　ＣｌａＩ　部位は消化に抵抗性であったが、次に多い３’ＣｌａＩ部位はＥＧＦ繰り返し３０と３１の間で切断した。それゆえ、種々のＣｌａＩ消化物の断片は完全なＣｌａＩ消化物　（構築体＃３　ΔＣｌａ）のフレームワーク内に再び挿入されると、ＥＧＦ繰り返しの全体の構造は明らかに３’結合で中断された。
【０１５８】
このシリーズの構築物についての幾つかの点は、何の価値もない。第１に、ＥＧＦ繰り返し９及び１７において切断したＣｌａＩ制限断片の除去は　（構築物＃８　ΔＥＧＦ９−１７）　Ｄｅｌｔａ　との凝集を放棄し、一方、ＥＧＦ繰り返し７−３０を欠いている、構築物＃３　ΔＣｌａ　にこの部分を再挿入するとほぼ野性型のレベル　（構築物＃１３　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ９−１７）　まで凝集を回復したが、これはＥＧＦ繰り返し９から１７まではＤｅｌｔａ　に結合するために重要な配列を含んでいることを示唆している。第２に、このシリーズ　（＃４−１４）　中のすべての構築物は、ＥＧＦ繰り返し９から１７までに対する結合部位マッピングに合致した。これらの繰り返し　（＃６，　７，　９，　１０，　１３）　を含有する発現構造体はＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用を促進するが、これらの繰り返し　（＃４，　５，　８，　１１，　１２，　１４）　を欠く構築物は促進しなかった。Ｄｅｌｔａ　細胞とは凝集できないことは、単に細胞表面に到達するのに変異が誘発されたＮｏｔｃｈ　蛋白が失敗したことによるのみならず、実際に必要な結合部位が欠けているということを確認するために、我々はＮｏｔｃｈ　の細胞外領域に特異的な抗体でトランスフェクトされた生細胞を免疫蛍光学的に染色することにより、すべての構築物の細胞表面発現を試験した。Ｎｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用を媒介することに失敗したすべての構築物は、細胞表面において通常発現されるように思われる蛋白を生成した。第３に、凝集アッセイは定量的ではないが、ＥＧＦ繰り返し９−１７，　＃９　ΔＥＧＦ１７−２６又は最も認識しうる＃１０　ΔＥＧＦ２６−３０を含む２個の構築物は、表面上低いレベルで凝集した。固定され、かつ浸透された細胞は普通に染色された同一の抗体と反応するが、構築物＃９　ΔＥＧＦ１７−２６及び１０　ΔＥＧＦ２６−３０でトランスフェクトされた細胞は通常よりかなり低い表面染色を示していることは、我々が抗血清により認識されるエピトープを単に欠失させたのではないことを示している。浸透した又は生細胞集団のいずれかにおいてトランスフェクトされた細胞のパーセントを比較することにより、我々は構築物＃９　ΔＥＧＦ１７−２６のためにトランスフェクトされた細胞の約５０％及び構築物＃１０ΔＥＧＦ２６−３０のための１０％が細胞表面において検出可能な蛋白を生成することを見い出した。このようにこれらの２個の構築物は細胞表面にしばしば到達し損なった蛋白を生成したが、これは誤って折りたたまれ、そのことにより衰えているのであって、Ｄｅｌｔａ　発現細胞と凝集するためのトランスフェクトされた細胞の能力を放棄したからではない。
【０１５９】
ＥＧＦ繰り返し９から１７までの結合部位をマップした後で、我々は分子の損傷が確認されたいずれかのＮｏｔｃｈ　変異体をこの領域にマップできるか否かチェックした。唯一のこのような変異体はスプリット、即ちＥＧＦ繰り返し１４におけるポイント突然変異に相関する半優性のＮｏｔｃｈ　対立遺伝子であった　（ハートレーら，　１９８７，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　６，　３４０７−３４１７；　ケーレーら，　１９８７，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　６，　３０９４−３１０８）。事実、スプリットの第２部位の修飾因子に対する遺伝子スクリーンはＤｅｌｔａ　の数個の対立遺伝子を示しており、これはＮｏｔｃｈ　のスプリットした対立遺伝子とＤｅｌｔａ　の間の特別の関係を示している　（ブランド及びカンパス−オルテガ、１９９０，　Ｒｏｕｘ’ｓ　Ａｒｃｈ．　Ｄｅｖ．　Ｂｉｏｌ．　１９８（５），　２７５−２８５）。Ｎｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　媒介凝集に対するスプリット突然変異の可能な効果を試験するために、スプリット関連のミスセンス変異を含む１１ｋｂ断片をＮｏｔｃｈ　発現構築物にクローンさせた　（＃１５スプリット）　。しかしながら、Ｄｅｌｔａ　−発現細胞との凝集はこの構築物においては起こらず、このことは、次の構築物により確認されたように、Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１４は我々の組織培養アッセイによりモデル化されたＤｅｌｔａとは相互作用を起こさないことを示唆している。
【０１６０】
このため、ＥＧＦ繰り返し９−１７内のＤｅｌｔａ　結合ドメインを位置決めするため、我々はこの領域の数個のサブフラグメントを製造するための特異的なオリゴヌクレオチドプライマー及びＰＣＲ法を使用した。Ｄｅｌｔａ　と相互作用可能であった蛋白を生成した構築物＃４−１４と合致させるため、我々は共通のＣｌａＩ部位と同じ場所において、第３番目のシステインの直後のＥＧＦ繰り返しをスプライスするプライマーをデザインした　（第７図）　。得られたＰＣＲ生成物は構築体＃３　ΔＣｌａ　のＣｌａＩ部位へ結合させた。３個の重複する構築物、＃１６，　１７及び１８が生成され、このうちの唯一の＃１６　ΔＣｌａ　＋ＥＧＦ９−１３はＳ２細胞にトランスフェクトされた時、Ｄｅｌｔａ　細胞と凝集可能であった。ＥＧＦ繰り返し９を欠いている構築物＃１９　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１０−１３）　は、さらにＥＧＦ繰り返し１０−１３をＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用に必要な領域として定義した。
【０１６１】
構築物＃２０−２４は、さらに同一のＰＣＲストラトジーを使用するこの領域の分析の試みを代表した　（第７図）　。我々は最初にＥＧＦ繰り返し１１及び１２の両方が必要であるかどうか、次に、ＥＧＦ繰り返し１０及び１３からのフランキング配列がＤｅｌｔａ　への結合に直接関連したかどうか調べた。構築物＃２０　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１１−１３）、ここにおいてＥＧＦ繰り返し１２が添加された唯一の完全繰り返し部分であり、及び＃２１　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１０−１２）　、ここにおいてＥＧＦ繰り返し１１が添加された唯一の完全繰り返し部分である、は凝集を媒介できなかったが、これはＥＧＦ繰り返し１１又は１２のいずれか１個の存在はＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用にとり十分ではないことを示唆している。しかしながら、これらの構築物の３’結合の連結はＥＧＦ繰り返しの全体の構造を妨害するから、短い　“バッファー”　ゾーンが重要な繰り返しを正常に機能させるのに必要とされることはありうる。こうして、例えば、＃１９　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１０−１３）　構築物において、ＥＧＦ繰り返し１２はＤｅｌｔａ　への結合には直接には関連しないかもしれないが、ＥＧＦ繰り返し１１の構造を保護するために必要とされる最少量のバッファー配列に寄与しうるものであり、そのことによりＤｅｌｔａ　との相互作用が可能となる。構築物＃２２−２４はこの問題を解決する。我々は、ＥＧＦ繰り返しの末端で切断、それゆえ、３’結合の連結においてＥＧＦジスルフィド形成を中断することはありえないようなＰＣＲプライマーをデザインした。構築物＃２２　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１０−１１）　、これは凝集を仲介しなかった、及び＃２３　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１０−１２）　、これは仲介した、再び繰り返し１１及び１２の両方を必要とし、繰り返し１３からのフランキング配列は明らかにそうでないことを示唆していた。最後に、今や、５’結合で構造的に中断されることがありうるであろうが、構築物＃２４　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１１−１２）　は、確実にＥＧＦ繰り返し１０からの配列は重要でないことを示していた。このように２４個の構築物からの完全に一致したデータに基づいて、我々は、Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２が伴にトランスフェクトされたＳ２細胞においてＤｅｌｔａ　への結合のために必要な部位を含む、この分析から得られる最小の機能的単位を定義するということを提唱する。
【０１６２】
７．２．２．Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２は、Ｎｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　介在凝集のために十分である
ＰＣＲ断片が挿入された大きなＣｌａＩ欠失　（＃３　Ｃｌａ）は、オリジナルの３６のＥＧＦ繰り返し並びに３個のＮｏｔｃｈ　／ｌｉｎ−１２繰り返しの約１／３　を保持している。これらは凝集を促進するには明らかに十分ではないが、特定のＥＧＦ繰り返しがＤｅｌｔａ　と相互作用可能であるために必要なフレームワークをそれらが形成することは可能である。たった二，　三のＥＧＦ繰り返しが実際に凝集を促進させるのに十分であるか否かを試験するため、我々は２個の構築物、繰り返し１の最初の３分の２を除いて３６個のＥＧＦ繰り返しすべてを欠いている＃２５　ΔＥＧＦ、及びＥＧＦ繰り返し１の最初の３個及び膜貫通ドメインの直前の−３５アミノ酸を除いてＮｏｔｃｈの完全な細胞外部分を欠失している＃３０　ΔＥＣＮをデザインした。構築物＃２５　ΔＥＧＦに挿入されたとき、構築物＃３　ΔＣｌａのバックグラウンドにおいてＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　凝集を媒介した断片はＤｅｌｔａ　との相互作用を再び促進することができた　（構築物＃２６−３０）　。
【０１６３】
Ｎｏｔｃｈ　／ｌｉｎ−１２繰り返しも存在していない類似の構築物　（＃３１，３２）　は、再度Ｎｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　凝集を成功裏に仲介した。こうして、ＥＧＦ繰り返し１１及び１２は、Ｎｏｔｃｈ　の大部分の細胞外領域が存在しない場合においてさえ、Ｓ２細胞においてＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用を仲介するのに十分である独立の分子単位として機能するように思われる。
【０１６４】
７．２．３．Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２は、Ｎｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　介在凝集のカルシウム依存性を維持する
上述の第６節に記載したように　（フェホンら，　１９９０，　Ｃｅｌｌ　６１，５２３−５２４）、我々はＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　−介在Ｓ２細胞凝集はカルシウム依存性であることを示した。それゆえ、我々は或る欠失構築物を発現する細胞のＣａ＋＋イオンの存在下又は非存在下における細胞発現Ｄｅｌｔａ　による凝集能力を試験した。
【０１６５】
我々は、コントロールとしての＃１　ｐＭｔＮＭｇ構築物、及び＃１３，１６，　１９，　２３，　２４，２６，　２７及び２８を試験し、そして、Ｃａ＋＋を含有する媒質において混合された細胞は４℃で容易に凝集物を形成するのに対し、Ｃａ＋＋を含有しないＥＧＴＡ媒質で混合された細胞は凝集しないことを見い出した　（第ＩＩＩ表）。
【０１６６】
【表３】
2004065243.tif 000004
【０１６７】
明らかに、最小の構築物においてさえ、相互作用のカルシウム依存性が保持されており、このことはＥＧＦ繰り返し１１及び１２を含む最少の構築物は全長のＮｏｔｃｈ　のそれと同様の態様によりＤｅｌｔａに結合するという概念と合致している。この結果は、また、特定のコンセンサス配列を有するＥＧＦ−様の繰り返しはＣａ＋＋結合領域として作用するかもしれないということを示唆する最近の研究に照らして興味がある　（モリタら，１９８４，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５９，５６９８−５７０４　；　スゴら，　１９８４，Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５９，　５７０５−５７１０　；リーズら，１９８８，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　７，　２０５３−２０６１；　ハンドフォードら，　１９９０，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　９，　４７５−４８０）　。繰り返し１１及び１２を含め、Ｎｏｔｃｈ　におけるＥＧＦ繰り返しの半分以上はこのコンセンサスに合致し、さらに、ＥＧＦ繰り返し１１及び１２がＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用を促進するために関係するという議論を強化している。
【０１６８】
７．２．４．Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２のＤｅｌｔａ　結合機能はＮｏｔｃｈ　のアフリカツメガエル（ｘｅｎｏｐｕｓ）　同族体において保存される。
Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２へのＤｅｌｔａ　結合部位を位置決めしてから、我々はアフリカツメガエルで確認されたＮｏｔｃｈ　同族体の中にこの機能が保存されているか否か調べることに興味をもった　（コフマンら，　１９９０，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，　１４３８−１４４１）　。この蛋白は全体構造及び組織においてショウジョウバエのＮｏｔｃｈ　に驚く程の類似性を示す。例えば、ＥＧＦ繰り返しの内部で繰り返しの数及び線形機能の両方が保存されていたが、同様に可能な機能保存を示唆している。これを試験するため、我々はアフリカツメガエルのＮｏｔｃｈ　配列に基づいたＰＣＲプライマーを製造し　（コフマンら，　１９９０，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，　１４３８−１４４１）　、いずれかの側において繰り返し１０及び１３が半分隣接したＥＧＦ繰り返し１１及び１２を含むアフリカツメガエルステージ１７　ｃＤＮＡライブラリーから約３５０ｂｐフラグメントを得るためにこれらを使用した。このフラグメントは構築物＃３　ΔＣｌａ　にクローンされ、そして３個の独立したクローンにつき細胞培養凝集アッセイにおいてＤｅｌｔａ　と相互作用しうるか否か試験した。クローンのうちの２個、＃３３ａ＆ｂ　ΔＣｌａ＋ＸＥＧＦ（１０−１３）　、はＳ２細胞へトランスフェクトされるとき、類似のショウジョウバエのＮｏｔｃｈ　構築物＃１９　ΔＣｌａ＋ＥＧＦ　（１０−１３）　とほぼ同等のレベルで、そして、再カルシウム依存性の態様でＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用を媒介できた　（第ＩＩＩ表）。しかしながら、非透過性の生細胞を染色して判断したとき蛋白は細胞表面で通常発現されるが、第３番目のクローン＃３３ｃ　ΔＣｌａ＋ＸＥＧＦ　（１０−１３）　はＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用を介在することはできなかった。構築物＃３３ａ及び３３ｃにおけるアフリカツメガエルのＰＣＲ生成物の配列比較によれば、構築物＃３３ｃのＥＧＦ繰り返し１１においてロイシンをプロリンに変化させるミスセンス変異が明らかであった　（アミノ酸＃４５３，　コフマンら，１９９０，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，　１４３８−１４４１）　。この残基はショウジョウバエ及びアフリカツメガエルのＮｏｔｃｈ　の間で保存されないが　（第８図）　、プロリン残基の導入はＥＧＦ繰り返しの構造を容易に中断し、これによりＤｅｌｔａ　による適切な相互作用からそれを保護することができる。
【０１６９】
ショウジョウバエ及びアフリカツメガエルのＮｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２のアミノ酸配列の比較は、カルシウム結合コンセンサス配列を含め、高度のアミノ酸の同一性を示した（第８図，配列番号：１及び２）　。しかしながら、相同性のレベルは、他のＥＧＦ繰り返しの多くの間で共有されているものとは著しくは異なっておらず、全体としてアミノ酸レベルで約５０％の同一性を示している。個々のＥＧＦ繰り返しの間のこの　１：１　対応は、恐らくそれらはまた保存された機能単位を含むことを示唆している。Ｄｅｌｔａ　相互作用は、再びカルシウムイオン−依存性の態様である。
【０１７０】
７．３．結　論
我々は、上述の第６節に記載したインビトロＳ２細胞凝集アッセイを使用して、遺伝子Ｎｏｔｃｈ　及びＤｅｌｔａ　の蛋白質生成物の間の相互作用の研究を続けた。Ｎｏｔｃｈ　の細胞外ドメインの広範な欠失分析に基づいて、我々はＥＧＦ−相同性の繰り返し１１及び１２を含むＮｏｔｃｈ　のドメインはＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　−媒介凝集にとって必要であり、かつ十分であること、及び、このＤｅｌｔａ　結合能力はアフリカツメガエルのＮｏｔｃｈ　の同一の２個のＥＧＦ繰り返しにおいて保存されていることを示している。凝集はＮｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２を写像しているということの我々の発見は、Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返しはまた特定の蛋白結合ドメインとして機能するということを示している。
【０１７１】
最近の研究によれば、特定のコンセンサス配列を含むＥＧＦ領域はＣａ＋＋イオンを結合しうることが示されている　（モリタら，１９８４，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｅｈｍ．　２５９，　５６９８−５７０４　；　スゴら，　１９８４，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２５９，　５７０５−５７１０；　リーら，　１９８８，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　７，　２０５３−２０６１；ハンドフォルドら，　１９９０，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　９，　４７５−４８０）　。実際に繰り返し１１及び１２を含め、Ｎｏｔｃｈ　におけるＥＧＦ繰り返しの約半分はこのコンセンサスに従っている。我々はトランスフェクトされたＳ２細胞のＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　介在凝集のために外因性のＣａ＋＋が必要であることを示した　（第６節；フェーホンら，１９９０，　Ｃｅｌｌ．　６１，　５２３−５３４）。我々は我々の欠失構築物のサブセットを試験し、そして、ＥＧＦ繰り返し１１及び１２のみが　（＃３２　ΔＥＣＮ＋ＥＧＦ　（１１−１２））Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ　相互作用のＣａ＋＋依存性を維持するのに十分であることを見い出した。
【０１７２】
Ｎｏｔｃｈ　とＤｅｌｔａ　の間の遺伝子相互作用はそれらの蛋白生成物の間で用量感受性相互作用を反映しうるということを多くの研究が示唆している。遺伝子研究によればＮｏｔｃｈ　及びＤｅｌｔａ　の相対的遺伝子用量は通常の成長にとり重要であることが示されている。例えば、キュ　（Ｘｕ）　らは、　（１９９０，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　４，　４６４−４７５）、Ｄｅｌｔａにおけるヌル　（ｎｕｌｌ）　変異はＥＧＦ繰り返し内のミスセンス変異と相関する一群のＮｏｔｃｈ　変異である、アブラプテックス　（Ａｂｒｕｐｔｅｘ：Ａｘ）　対立遺伝子のヘテロ接合性　（ｈｅｔｅｒｏ−ｚｙｇｏｕｓ）の組み合わせの間で致死相互作用を抑制しうることを見い出している　（ハートレーら，　１９８７，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　６，　３４０７−３１４７；　ケーリーら，　１９８７，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　６，　３０９４−３１０８）　。我々がＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　及びＤｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ　会合の両方を観察していることを記載したインビトロ相互作用　（第６節参照）　は、Ｄｅｌｔａ　への結合に対するＮｏｔｃｈ　とＤｅｌｔａ　の間の競争的相互作用は、観察された遺伝的相互作用に対する根元的な基礎を反映し得ることを意味する。さらに、我々は組織培養及び胚細胞抽出物の両方からＮｏｔｃｈ　及びＤｅｌｔａ　を共免疫沈澱　（ｃｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）させることができた（　第６節参照）　が、これはこの２個の蛋白がインビボで会合する可能性を示している。加えて、胚におけるＮｏｔｃｈ　及びＤｅｌｔａ　発現パターンのｍＲＮＡイン　シツー（ｉｎ　ｓｉｔｕ）　分析は、この２つの発現は重複するが、同一ではないことを示唆している　　（コプジンスキー及びムスカビッチ、１９８９，　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０７，　６２３−６３６；　ハートレーら，１９８７，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　６，　３４０７−３４１７）　。最近になって、Ｎｏｔｃｈ　蛋白発現の詳細な抗体分析は、Ｎｏｔｃｈ　発現は従前の研究が示していたよりは、組織及び細胞下レベルにおいて一層限定的であることを明らかにしている　（ジョナサンら，　１９８９，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１０９，　２４２７−２４４０；　キッドら，　１９８９，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　３，　１１１３−　１１２９）　。
【０１７３】
アフリカツメガエルのＮｏｔｃｈ　相同体からの同一の２個のＥＧＦ繰り返しが組織培養細胞においてＤｅｌｔａ　との相互作用を介在しうるという我々の発見は、類似の機能がインビボで保存されるであろうことを強く示している。これらの２個のＥＧＦ繰り返しはインビトロにおいては十分であるが、もちろんインビボではより多くのＮｏｔｃｈ　分子がＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用を促進するために必要であるかもしれないことはありうる。事実、我々は、Ｄｅｌｔａ　結合部位が幾つかのＡｘ変異が落ち着くことが示されていたＥＧＦ繰り返しの位置決めをしないことを知るための２つの理由によりやや驚かされたが、その第１の理由はＡｘ対立遺伝子とＤｅｌｔａ　変異の間の相互作用を示している遺伝子スクリーンのためであり　（Ｘｕら．，１９９０，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　４，　４６４−４７５）、第二には、或る種のＡｘ対立遺伝子がＥＧＦ繰り返しの推定上のＣａ＋＋結合コンセンサス内において一個のアミノ酸と会合することを示した配列分析のためである。例えば、ＡＸＥ２変異はＥＧＦ繰り返し２９をＣａ＋＋結合コンセンサスに変えたが、ＡＸ９Ｂ２変異はＥＧＦ繰り返し２４をコンセンサスから離れたものとした。インビボにおいてＮｏｔｃｈ　蛋白のこれらの領域はＤｅｌｔａ　及び／又は他の蛋白のいずれかとの相互作用に関連するかもしれないことはありうるが、このことは我々の細胞培養アッセイによっては正確にはモデル化できなかった。
【０１７４】
Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２へＤｅｌｔａ　結合領域をインビトロでマッピングすると、Ｎｏｔｃｈ　の構造領域に対して機能を最初に割り当てることが説明される。事実、種々の欠失構造物は、それらが置かれた状態とは独立に、これらの２個のＥＧＦ繰り返しがモジュール単位として機能することを示唆している。このため、残りの３４個のＥＧＦ繰り返し又は３個のＮｏｔｃｈ　／ｌｉｎ−１２繰り返しは、いずれも機能するＥＧＦ１１及び１２にとって必要な構造的フレームワークを確立するのに必要でないように思われる。興味あることに、ほとんど逆の効果が観察された。我々の凝集アッセイは相互作用の力を測定するものではないが、結合部位をより小さなフラグメントに狭めれば狭める程、Ｄｅｌｔａ　発現細胞と凝集するトランスフェクトされた細胞の能力を増大させることが発見されたが、これは正常の隣接するＥＧＦ配列は現実に蛋白の間の会合を妨害することを示している。構築物＃３　ΔＣｌａ　のバックグランドにおける　（＃９，　１６，　１９，　２３を比較されたい）　又は構築物＃２５ΔＥＧＦのバックグラウンドにおける　（＃２６，　２７，　２８を比較されたい）　、２個の分離した系列の構築物について、我々は凝集力の増大を観察しており、その結果、最小の構築物　（＃１９，　２３，　２８，２９）　が、一貫して野性型　（＃１　ｐＭｔＮＭｇ）　のレベル以上に凝集する。これらの結果は、周囲のＥＧＦ繰り返しはＥＧＦ繰り返し１１及び１２がＤｅｌｔａ　にアクセスする能力を限定するように作用し、そのことにより恐らくインビボにおいてＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用を調節している。
【０１７５】
Ｎｏｔｃｈ　は、ショウジョウバエが成長する間、プレオトロピック　（ｐｌｅｏｔｒｏｐｉｃ）　な役割を果たすと言われてきた構造的な複合トランスメンブラン蛋白をコード化する。ＥＧＦ繰り返し１１及び１２が少なくとも細胞培養時にＤｅｌｔａ　と相互作用をするのに十分な独立したモジュール単位として機能するようにみえるという事実は、直ちに、これらは成長の諸段階でＮｏｔｃｈ　と相互作用する他の蛋白に対するモジュール結合領域をも形成しうるという仮説の役割に疑問を与える。
【０１７６】
アフリカツメガエルのＮｏｔｃｈ　に加えて、Ｃ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）の成長の間或る細胞の死の特定化に関与する細胞−細胞相互作用に機能すると考えられた２つの遺伝子、ｌｉｎ−１２及びｇｌｐ−１　は、ショウジョウバエ及びアフリカツメガエルのＮｏｔｃｈ　に構造的に極めて類似するＥＧＦ相同のトランスメンブラン蛋白をコード化する。４つの蛋白はすべてＥＧＦと相同の繰り返しをもち、１個のトランスメンブラン領域の細胞外領域において他の３個のシステインに富んだ繰り返し　（Ｎｏｔｃｈ　／ｌｉｎ−１２繰り返し）　、及び細胞内ドメインで６個の　ｃｄｃ１０／アンキリン（ａｎｋｙｒｉｎ）　繰り返しが続いている。配列比較及び我々のＤｅｌｔａ　結合アッセイの両方によれば、ショウジョウバエＮｏｔｃｈ　の直接の機能的対照物をコード化するように思われるアフリカツメガエルのＮｏｔｃｈ　とは異なって、ｌｉｎ−１２及びｇｌｐ−１　は多分同じ遺伝子ファミリーの明確なメンバーをコード化する。予想した蛋白生成物のｌｉｎ−１２及びｇｌｐ−１　をＮｏｔｃｈ　と比較すると、構造上のモチーフの全体的に類似した組織にもかかわらず、特別の差異が明らかである。最も明らかな差異は、アフリカツメガエル及びショウジョウバエのＮｏｔｃｈ　の両方とも３６個のＥＧＦ繰り返しを有するのに比べて、ｌｉｎ−１２及びｇｌｐ−１　蛋白はそれぞれ僅か１３及び１０のＥＧＦ繰り返しを含むことである。加えて、線虫類の遺伝子においては、ＥＧＦ繰り返しの配列は最初のＥＧＦ繰り返しの後で、Ｎｏｔｃｈ　にはない明らかに伸長した配列により中断されている。さらに、我々がＮｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２として定義したＤｅｌｔａ　結合ドメインに関して、Ｃａ＋＋結合コンセンサス配列を示すｌｉｎ−１２又はｇｌｐ−１　蛋白における２個の隣接するＥＧＦ繰り返しが存在せず、さらに、Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２に極めて類似性を示す２個の隣接する繰り返しがないことは、再び、ｌｉｎ−１２及びｇｌｐ−１　遺伝子生成物が恐らくＮｏｔｃｈ　とは機能的に異なることを示唆する。
【０１７７】
Ｎｏｔｃｈ　のＥＧＦ繰り返し１１及び１２は別個のＤｅｌｔａ　結合単位を形成するという我々の知見は、各々のＥＧＦ繰り返し又は繰り返しの小さなサブセットは、恐らく他の蛋白との直接相互作用を通じて、成長の間独特の役割を果たし得るという考えを支持する最初の具体的な証拠を示す。Ｄｅｌｔａ　及びＳｅｒｒａｔｅ　（Ｓｅｒｒａｔｅ：後述の第８．３．４節を参照）　の粘着領域の間に見られる相同性は、Ｓｅｒｒａｔｅの相同である部位はそれが他のトポリズミック蛋白への結合を媒介するという点において”粘着性”　であることを示唆する。加えて、スカブラス　（ｓｃａｂｒｏｕｓ）遺伝子、これはフィブリノーゲンに類似して分泌蛋白をコードするが、はＮｏｔｃｈ　と相互作用可能である。
【０１７８】
ＥＧＦ繰り返しに加えて、他の構造上のモチーフの多数のコピーが一般に広範の蛋白で生じる。その１つの例は　ｃｄｃ１０／アンキリンモチーフであり、これの６個のコピーはＮｏｔｃｈ　の細胞内領域で見い出されている。アンキリンはこれらの繰り返しの２２を含む。恐らく、構造上のモチーフの反復する配列は、一般に、一連のモジュール蛋白結合単位の線形アンセンブリーを表わす。これらの結果をＮｏｔｃｈ　の既知の構造的、遺伝的及び成長の複雑性と一緒にしてみると、Ｎｏｔｃｈ　は正確に制御された時間的及び空間的パターンにより成長の間多くの異なるリガンドと相互作用するのかもしれない。細胞骨格蛋白及び細胞質蛋白は細胞内　ｃｄｃ１０／アンキリンモチーフにより介在されることができるのに対し、細胞外蛋白質との相互作用はＥＧＦ及びＮｏｔｃｈ　／ｌｉｎ−１２繰り返しにより介在されうる。
【０１７９】
８．Ｄｅｌｔａ　のアミノ末端はＮｏｔｃｈ　及びＤｅｌｔａ　と相互作用するＥＧＦ−結合領域である。
Ｎｏｔｃｈ　とのヘテロタイプの相互作用及びホモタイプのＤｅｌｔａ　相互作用に必要なＤｅｌｔａ　の配列を詳述するために、野性型及び変異型Ｄｅｌｔａ　蛋白を発現するように企図された培養細胞の凝集が用いられた。我々は、Ｄｅｌｔａ　細胞外ドメインのアミノ末端がヘテロタイプ　　（Ｄｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ）及びホモタイプ　（Ｄｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ）の相互作用にＤｅｌｔａ　が関与するために必要かつ十分であることを見い出した。我々はＤｅｌｔａ　のアミノ末端はＥＧＦモチーフ−結合ドメイン　（ＥＢＤ）　であると推測しており、Ｎｏｔｃｈ　ＥＧＦ様配列がＤｅｌｔａとのヘテロ型の相互作用を介在するのに十分であることが仮定される。Ｄｅｌｔａ　ＥＢＤは明らかに２個の活性：ＥＧＦ−関連配列を結合する能力及び自己会合する能力を有する。我々は、また、Ｄｅｌｔａ　はＮｏｔｃｈ　を発現する培養細胞により取り込まれることを見い出しているが、これはこれらの蛋白がｉｎ　ｖｉｖｏ　で相互作用するメカニズムを反映しているかもしれない。
【０１８０】
８．１．材料及び方法
８．１．１．セルライン
これらの実験で使用されたＳ２ドロソフィーラセルラインは　（シュナイダー，　１９７２，　Ｊ．　Ｅｍｂｒｙｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｍｏｒｐｈ．　２７，　３５３−３６５）、第６節に記載されているようにして、増殖させた。
【０１８１】
８．１．２．免疫プローブ
免疫組織化学は、上記第６節に記載されたようにして、又は、この方法を僅かに変更して実施された。使用した抗血清及び抗体には、次のものが含まれる。第４番目から第９番目のＥＬＲｓ　まで広がるＤｅｌｔａ　ＥＬＲ配列セグメントに対して産生されたマウスポリクローナルＤｅｌｔａ　血清　（上記第６節参照）　；　同じＤｅｌｔａ　セグメントに対して産生されたラットポリクローナル抗Ｄｅｌｔａ　血清　（第６節参照）；第５番目から第１３番目のＥＬＲｓ　に広がるＮｏｔｃｈＥＬＲ配列セグメントに対して産生されたラットポリクローナル抗−Ｎｏｔｃｈ　血清；Ｎｏｔｃｈ　細胞内ドメインを認識するマウスモノクローナル抗体　Ｃ１７．９Ｃ６　（第６節参照）　；及びショウジョウバエ神経膠細胞の長い形態を認識するマウスモノクローナル抗体　ＢＰ−１０４（　ホルシュら，　１９９０，　Ｎｅｕｒｏｎ　４，　６９７−７０９）。
【０１８２】
８．１．３．発現ベクター構築物
野性型Ｄｅｌｔａ　（ｐＭＴＤｌ１）及び野性型Ｎｏｔｃｈ　（ｐＭＴＮＭｇ）を発現するプログラムに用いられる構築物は、上記第６節に記載されている。変異型のＤｅｌｔａ　蛋白の発現を指示する構築物は、ｐＭＴＤｌ１，　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋にクローン化されたＤｌ１　ｃＤＮＡ　（ｐＢＳＤｌｌ；コプジンスキーら．，　１９８８，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　２，　１７２３−１７３５）　、及びメタロチオネインプロモーターベクターｐＲｍＨａ−３　（　ブンチら．，　１９８８，　Ｎｕｃｌ．　ＡｃｉｄｓＲｅｓ．　１６，　１０４３−１０６１）　に１Ｂ７Ａ２５０　ｃＤＮＡが挿入されたものから成るｐＲｍＨａ　３−１０４　（Ａ，　Ｊ．ビーバー，　個人的レター）　、及びショウジョウバエ神経膠細胞の長い形態の発現を誘導できる支持体　（ホルシュら，１９９０，　Ｎｅｕｒｏｎ　４，　６９７−７０９）を使用して産生された。
【０１８３】
簡単に述べると、構築物は以下のようにして製造された：
Ｄｅｌ（Ｓｃａ−Ｎａｅ）　−　ｐＢＳＤｌ１　をＳａｌＩ　（完全消化物）　及びＳｃａＩ　（部分）　で切断し、ベクターを含有するフラグメントを分離する。ｐＢＳＤｌ１をＮａｅＩ　（部分）　とＳａｌＩ　（完全）　で切断し、Ｄｅｌｔａ　カルボキシル−末端コード化フラグメントを分離する。フラグメントを結合させ、形質転換させ、そしてクローンを分離する。　ＥｃｏＲＩ挿入断片を　ｐＲｍＨａ−３　に転移させる。
【０１８４】
Ｄｅｌ（Ｂａｍ−Ｂｇｌ）　−　ｐＢＳＤ１１　をＢｇｌＩＩ　（完全）　及びＢａｍＨＩ　（部分）で切断し、末端をクレノーＤＮＡポリメラーゼで満たし、結合させ、形質転換させ、クローンを分離する。　ＥｃｏＲＩ挿入断片をｐＲｍＨａ−３に転移させる。
【０１８５】
Ｄｅｌ（ＥＬＲ１−ＥＬＲ３）　−　５−ＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＧＡＴＣＡＣＧＧＧ−３’（　配列番号：２６）及び５’−ＴＴＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＡＡＴＣＧ−３’（配列番号：２７）を用いてＤｌ１ｃＤＮＡの塩基対２３６−８３０　をＰＣＲ−増幅させ、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＳｃａＩ　（部分）　及び　ＢａｌＩＩ　（完全）　で切断した　ｐＢＳＤｌ１　に結合させ、そしてクレノウＤＮＡポリメラーゼで末端をみたし、形質転換し、そしてクローンを分離する。ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩＤｅｌｔａ　カルボキシル−末端コード化フラグメントをｐＲｍＨａ−３に転移させる。
【０１８６】
Ｄｅｌ（ＥＬＲ４−ＥＬＲ５）　−　ｐＢＳＤｌ１をＢｇｌＩＩで完全に、ＰｓｔＩで部分的に消化した。５．６ｋｂのベクターを含むフラグメントが分離され、１００　×モル過剰のオリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＣＴＧＣＡ−３’の存在下Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを使用して環状化し、形質転換してからクローンを分離した。得られたＥｃｏＲＩ挿入断片を次いでｐＲｍＨａ−３　へ転移させた。
【０１８７】
Ｔｅｒ（Ｄｄｅ）　−　ｐＢＳＤｌ１　をＤｄｅＩ　（部分）　で切断し、クレノウＤＮＡポリメラーゼで末端をみたし、　１００×モル過剰の５’−ＴＴＡＡＧＴＴＡＡＣＴＴＡＡ−３’（　配列番号：２８）と結合させ、形質転換させ、そしてクローンを分離する。　ＥＣｏＲＩ挿入断片をｐＲｍＨａ−３に転移させる。
【０１８８】
Ｉｎｓ（Ｎａｅ）Ａ　−　ｐＭＴＤｌ１　をＮａｅＩ　（部分）　で切断し、ベクター含有フラグメントを分離し、　１００×モル過剰の５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ−３’（　配列番号：２９）と結合させ、形質変換させ、そして、クローンを分離する。
【０１８９】
ＮＡＥ　Ｂ　−　ｐＭＥＤｌ１　をＮａｅＩで部分的に消化し、長さが約５．８ｋｂの一時的に直鎖状となった環状の集団を分離した。このフラグメントは、１００×モル過剰のオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ−３’（　配列番号：２９）の存在下でＴ４　ＤＮＡリガーゼを使用して再び環状化し、形質転換し、リンカーの多重　（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）　挿入断片を含むクローン　（ＮＡＥ　Ａ）を分離した。ＮＡＥ　Ａ　はＢｇｌＩＩ　で完全に消化し、生成した０４ｋｂ及び５４ｋｂのフラグメントを分離し、結合させ、形質転換し、そして、クローンを分離した。
【０１９０】
Ｉｎｓ（Ｓｔｕ）　−　ｐＭＴＤｌ１　をＳｔｕＩで切断し　（完全）　、ベクター含有フラグメントを分離し、　１００×モル過剰の５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ−３’（　配列番号：２９）と結合し、形質転換し、クローンを分離する。
【０１９１】
ＳＴＵ　Ｂ　−　ｐＭＴＤｌ１　をＳｔｕＩで完全に消化し、生成した５．８ｋｂのフラグメントを分離した。このフラグメントは　１００×モル過剰のオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣ−３’（　配列番号：２９）の存在下でＴ４　ＤＮＡリガーゼを使用して再び環状化し、形質変換させ、そしてリンカーの多重挿入断片を含むクローン（ＳＴＵ　Ａ）　を分離した。ＳＴＵ　Ｂ　はＢｇｌＩＩ　で完全に消化し、そして得られた０６ｋｂ及び５２ｋｂフラグメントを分離し、結合させ、形質変換させ、クローンを分離した。
【０１９２】
ＮＧ１　−　ｐＲｍＨａ　３−１０４　を　ＢｇｌＩＩ　（完全）　と　ＥｃｏＲＩ　（完全）　で切断し、ベクター含有フラグメントを分離する。Ｉｎｓ（Ｎａｅ）Ａ　を　ＥｃｏＲＩ　（完全）　及び　ＢｇｌＩＩ　（完全）　で切断し、Ｄｅｌｔａ　アミノ−末端コード化フラグメントを分離する。フラグメントを結合し、形質転換させ、そしてクローンを分離する。
【０１９３】
ＮＧ２　−　ｐＲｍＨａ　３−１０４　を　ＢｇｌＩＩ　（完全）　及び　ＥｃｏＲＩ　（完全）で切断し、ベクター含有フラグメントを分離する。Ｄｅｌ（ＥＬＲ１−ＥＬＲ３）を　ＥｃｏＲＩ　（完全）　及び　ＢｇｌＩＩ（完全）　で切断し、Ｄｅｌｔａ　アミノ−末端コード化フラグメントを分離する。フラグメントを結合し、形質転換し、そしてクローンを分離する。
【０１９４】
ＮＧ３　−　ｐＲｍＨａ　３−１０４　を　ＢｇｌＩＩ　（完全）　及び　ＥｃｏＲＩ　（完全）で切断し、ベクター含有フラグメントを分離する。ｐＭＴＤｌ１　をＥｃｏＲＩ　（　完全）　及び　ＢｇｌＩＩ　（完全）で切断し、Ｄｅｌｔａ　アミノ−末端コード化フラグメントを分離する。フラグメントを結合し、形質転換し、クローンを分離する。
【０１９５】
ＮＧ４　−　ｐＲｍＨａ　３−１０４　を　ＢｇｌＩＩ　（完全）　及び　ＥｃｏＲＩ　（完全）で切断し、ベクター含有フラグメントを分離する。Ｄｅｌ　（Ｓｃａ−Ｎａｅ）を　ＥｃｏＲＩ　（完全）　及び　ＢｇｌＩＩ（完全）　で切断し、Ｄｅｌｔａ　アミノ−末端コード化フラグメントを分離する。フラグメントを結合させ、形質転換し、そしてクローンを分離する。
【０１９６】
ＮＧ５　−　次のようにしてＤｅｌ（Ｓｃａ−Ｓｔｕ）を生成する：　ｐＭＴＤｌ１をＳｃａＩ　（完全）　及びＳｔｕＩ　（完全）　で切断し、ＳｃａＩ−ＳｃａＩ　アミノ−末端コード化フラグメント及びＳｔｕＩ−ＳｃａＩ　カルボキシル末端コード化フラグメントを分離し、結合させ、形質転換させ、そしてクローンを分離する。Ｄｅｌ（Ｓｃａ−Ｓｔｕ）を　ＥｃｏＲＩ　（完全）　及び　ＢｇｌＩＩ（完全）　で切断し、Ｄｅｌｔａ　アミノ−末端コード化フラグメントを分離する。ｐＲｍＨａ　３−１０４　を　ＢｇｌＩＩ　（完全）　及び　ＥｃｏＲＩ　（完全）　で切断し、ベクター含有フラグメントを分離する。フラグメントを結合させ、形質転換し、そしてクローンを分離する。
【０１９７】
種々のＤｅｌｔａ　変異体の配列内容を第ＩＶ表に示す。第ＩＶ表に定義されたＤｅｌｔａ　変異体の模式的一覧図は第９図に示されている。
【０１９８】
【表４】
2004065243.tif 000005
【０１９９】
Ａ　　Ｄｌｌ　ｃＤＮＡの順序　（第１２図）　に対応してＤｅｌｔａ　配列を調整する。
【０２００】
Ｂ　　挿入されたリンカーの正確な数は、この構築物のためには決定されていない。
【０２０１】
Ｃ　　神経膠細胞（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｎ）を調整する　（ビーバーら，　１９８９，Ｃｅｌｌ　５９，　４４７−４６０；ホルッシュら，　１９９０，　Ｎｅｕｒｏｎ　４，　６９７−７０９）Ｄｅｌｔａ　−神経膠細胞のキメラに存在するヌクレオチド配列は１Ｂ７Ａ−２５０　ｃＤＮＡ　の配列に相当し　（第１３図、配列番号：５）ボールドフェース型で示されている。
【０２０２】
Ｄ　　神経膠細胞アミノ酸配列は２Ｂ７Ａ−２５０　ｃＤＮＡ　ヌクレオチド配列の概念的翻訳に由来しており　（第１３図、配列番号：５）　ボールドフェース型で示されている。
【０２０３】
Ｅ　　配列番号：２８
Ｆ　　配列番号：２９
【０２０４】
８．１．４．凝集プロトコール
細胞のトランスフェクション及び凝集は、上記第６節に示されるようにして、又は、これを多少変更したものにより実施した。
【０２０５】
８．２．結　果
８．２．１．Ｄｅｌｔａ　細胞外領ドメインのアミノ−末端配列は、Ｎｏｔｃｈとのヘテロ型の相互作用にとり必要かつ十分である
我々は、あるＤｅｌｔａ　変異体は細胞表面に効率的に局在しえないかもしれないと予想したので、我々は異なるトランスフェクションにおいてＤｅｌｔａ　発現構築物のインプット量を変えながら、野性型Ｄｅｌｔａ　の発現レベルとＮｏｔｃｈ　−発現細胞との凝集の程度の間の関係を調査した。我々は、このアッセイにおいてヘテロ型Ｄｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ　の相互作用は１０倍レベルのＤｅｌｔａ　インプットにのみ僅かに依存することを見い出した　（第９Ａ図）　。試験した範囲内でのヘテロ型相互作用の確からしさ及び我々が用いたＤｅｌｔａ　変異体のそれぞれがトランスフェクトされた細胞において実質的な表面蓄積を示すという我々の観察を仮定すると、一定のＤｅｌｔａ　変異体がヘテロ型の凝集を支持できないことは、ヘテロ型凝集における表面発現の減少したレベルの影響とは全く異なって、この変異体により示される機能の欠損を多分反映しているものと我々は推測する。
【０２０６】
Ｄｅｌｔａ　変異体及び野性型Ｎｏｔｃｈ　により介在されるヘテロ型凝集実験の結果は、第Ｖ表に示されている。
【０２０７】
【表５】
2004065243.tif 000006
2004065243.tif 000007
Ａ　　４個以上の細胞を含有する凝集物中の発現細胞の合計数
Ｂ　　神経膠細胞を基にする構築物　（ＮＧｎ）を発現する細胞は、神経膠細胞の細胞内領域を認識するモノクローナル抗体を使用して検出された　（材料及び方法を参照）
Ｃ　　（Ｈ）は２５ｍｌのエーレンマイヤーフラスコ中で細胞が凝集したことを示しており、（Ｂ）は細胞が１２−ウエルのマイクロ滴定プレート中で凝集したことを示す　（材料及び方法を参照）　。
【０２０８】
Ｄ　　凝集体及び非凝集体における個々の細胞型のデータ　（即ち、Ｄｅｌｔａ＋及びＮｏｔｃｈ＋）　は記録しなかった。
【０２０９】
Ｄｅｌｔａ　アミノ酸　（ＡＡ）　１−２３０　は、Ｎｏｔｃｈ　との相互作用にとって十分であると定義されている、現在最小の配列間隔である。これは、ＮＧ２−Ｎｏｔｃｈ　凝集の成功に基づく。この間隔内で、Ｄｅｌｔａ　ＡＡ１９８　−２３０は重要である。というのは、ＮＧ１構築物におけるこれらの欠失がＮＧ２構築物において観察されたＮｏｔｃｈ　−結合活性を不活性化するからである。また、この間隔内において、Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　３２−１９８　が重要である。なぜならば　ＮＧ４構築物内のこれらの欠失は、また、ＮＧ３構築物において観察されたＮｏｔｃｈ　−結合活性を不活性化するからである。Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　１９２−２３０の重要性は、また、ＡＡ　２３１−３３１を除いてすべてのＤｅｌｔａ　アミノ酸を含むＤｅｌ（ＥＬＲ１−ＥＬＲ３）変異体がＮｏｔｃｈ　結合活性を有するのに対して、ＡＡ　１９２−３３１を除きすべてのＤｅｌｔａ　アミノ酸を含む、Ｄｅｌ　（Ｂａｍ−Ｂｇｌ）　変異体がＮｏｔｃｈ　−結合活性について、明らかに不活性化されたという観察によっても支持される。
【０２１０】
Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　１９７／１９８の近傍におけるコンフォメーション及び／又は一次配列は明らかに重要である。なぜならばこれら２つの残基の間において、Ｉｎｓ（Ｎａｅ）Ａ　構築物のようにテトラペプチドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ〔一文字コードにおける　（例えば、レーニンガーら，１９７５，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　第２版，　第７２頁）　、ＲＫＩＦ〕（　配列番号：３０）を多量体挿入すると、野性型Ｄｅｌｔａ　で観察されたＮｏｔｃｈ　結合活性を不活性化したからである。
【０２１１】
加えて、Ｄｅｌ（ＥＬＲ１−ＥＬＲ３）構築物が凝集を支持したという観察は、ＥＬＲ１−ＥＬＲ３　はＤｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ　相互作用にとり必要でないということを意味する；Ｄｅｌ（ＥＬＲ４−ＥＬＲ５）構築物が凝集を支持したという観察は、ＥＬＲ４及びＥＬＲ５はＤｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ　相互作用にとって必要でないことを意味し、そして、Ｔｅｒ（Ｄｄｅ）構築物が凝集を支持したという観察は、Ｄｅｌｔａ　細胞内ドメインはＤｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ　相互作用にとり必要でないことを意味する。
【０２１２】
８．２．２．Ｄｅｌｔａ　細胞外領域におけるアミノ−末端配列は、ホモ型相互作用にとって必要かつ十分である
Ｄｅｌｔａ　変異体により介在されるホモ型凝集実験の結果は、第ＶＩ表に示されている。
【０２１３】
【表６】
2004065243.tif 000008
Ａ　　（Ｈ）は２５ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中で凝集した細胞を示し；（Ｂ）は細胞が１２−ウエルのマイクロ滴定プレート中で凝集したことを示す。
【０２１４】
Ｂ　　トランスフェクトされた細胞は凝集条件下で１晩培養され、次いで誘導物質の存在下適当量の対数期Ｓ２細胞に希釈され、凝集条件下でさらに４から６時間培養された。
【０２１５】
Ｃ　　誘導物質が添加されたトランスフェクト化細胞は適当な容積の対数期Ｓ２細胞に希釈され、これに誘導物質が添加され、そして細胞混合物は凝集条件下で１晩培養された。
【０２１６】
全長さのＤｅｌｔａ　蛋白からＤｅｌｔａＡＡ　３２−１９８　を削除したもの［Ｄｅｌ　（Ｓｃａ−Ｎａｅ）］又はＤｅｌｔａ　ＡＡ　１９２−３３１を削除したもの［Ｄｅｌ（Ｂａｍ−Ｂｇｌ）］は、Ｄｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用を消失する。Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　２３１−３３１の欠失［Ｄｅｌ（ＥＬＲ１−ＥＬＲ３）］はＤｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用を消失しなかった。それゆえ、Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　３２−２３０　の間の配列はＤｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ相互作用にとり必要である。
【０２１７】
Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　１９７／１９８の近傍のコンフォメーション及び／又は第一次配列はＤｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用にとって明らかに重要である。なぜならば、これらの２つの残基の間にＩｎｓ（Ｎａｅ）Ａ　構築物のようにテトラペプチド−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−（配列番号：３０）を多重挿入すると、Ｄｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用を不活性化したからである。
【０２１８】
加えて、Ｄｅｌ（ＥＬＲ１−ＥＬＲ３）構築物が凝集を支持できたという観察は、ＥＬＲ１−ＥＬＲ３　がＤｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用にとり必要でないことを意味する；Ｄｅｌ（ＥＬＲ−ＥＬＲ５）　構築物が凝集を支持したという観察は、Ｄｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用にとってＥＬＲ４及びＥＬＲ５は必要でないことを意味し、そして、Ｔｅｒ（Ｄｄｅ）構築物が凝集を支持したという観察は、Ｄｅｌｔａ　細胞内ドメインはＤｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用にとり必要でないことを意味する。
【０２１９】
種々の構築物によるヘテロ型及びホモ型のアッセイについての結果の概要を第ＶＩ−Ａ表に示す。
【０２２０】
【表７】
2004065243.tif 000009
ａ　：４個以上の細胞の凝集物におけるＤｅｌｔａ　又はＮｏｔｃｈ　細胞の平均分数　（％）（±標準誤差）　。他に記載されていない場合、Ｎ＝３　複製である。
【０２２１】
ｂ　：４個以上の細胞の凝集物におけるＤｅｌｔａ　細胞の平均分数　（％）　（±標準誤差）
。他に記載されていない場合、　Ｎ＝３　複製である。
【０２２２】
ｃ　：Ｎ＝５　複製。
【０２２３】
ｄ　：Ｎ＝４　複製。
【０２２４】
８．２．３．ヘテロ型及びホモ型相互作用に関連するＤｅｌｔａ　配列は定量的に異なる
ヘテロ型及びホモ型相互作用のための修復されたＤｅｌｔａ　配列のそれぞれの特性は、さらに短い、イン−フレーム、翻訳可能なリンカー挿入物がＤｅｌｔａ　アミノ末端へ導入されたＤｅｌｔａ　変異体（　即ち、ＮＡＥ　Ｂ　及び　ＳＴＵ　Ｂ；第９図、第ＶＩ−Ａ表）　を使用して定義された。Ｄｅｌｔａ　残基１３２（Ａ）をペンタペプチドＧＫＩＦＰ（ＳＴＵ　Ｂ　変異体）で置き換えると、Ｄｅｌｔａ　アミノ末端のヘテロ型及びホモ型の相互作用活性が不活性化する。このことは、これらの２個の異なる相互作用に必要な幾つかのＤｅｌｔａ　配列は、残基１３２　の近傍に一致し、そこにあることを示唆している。一方、Ｄｅｌｔａ　残基１９８　及び１９９の間でテトラペプチドＲＫＩＦを挿入すると　（ＮＡＥ　Ｂ　変異体）　、Ｎｏｔｃｈとヘテロ型相互作用を介在するためのＤｅｌｔａ　アミノ末端の能力を消失するが、ホモ型の相互作用を介在するための変更されたアミノ末端の能力に対しては明らかな作用を有していない。ＮＡＥ　Ｂ　挿入がＤｅｌｔａ　アミノ末端の２つの活性のうちの１つに対してのみ影響するということは、ヘテロ型及びホモ型相互作用を介在するＤｅｌｔａ　配列は一致するものの、量的に異なることを意味する。
【０２２５】
８．２．４．Ｄｅｌｔａ　はＮｏｔｃｈ　を発現する細胞により取り込まれる
多くのヘテロ型凝集実験の途中で、我々はときどき、Ｄｅｌｔａ　ではなくて、Ｎｏｔｃｈ　を発現するようにプログラムされた細胞内でＤｅｌｔａ　蛋白が見い出しうることを知った。我々は、Ｄｅｌｔａ　又はＮｏｔｃｈ　のいずれかを発現するようプログラムしている発現構築物で独立にトランスフェクトされた別個のＳ２細胞の集団を最初に混合することにより、ヘテロ型凝集アッセイを行う。しかしながら、我々はしばしばヘテロ型凝集物中に見い出されたＮｏｔｃｈ　発現細胞内でＤｅｌｔａ　−特異的抗血清を使用するとＤｅｌｔａ　の小さい斑点の染色が生ずるのを知った。我々の観察は、Ｄｅｌｔａ　は細胞表面で直接Ｎｏｔｃｈ　に結合し、続いて、細胞表面からエンドサイト−シスによりＤｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ　複合体が通過するということに合致している。
【０２２６】
８．３．議　論
８．３．１．ＥＧＦに関連しないアミノ−末端配列は、Ｄｅｌｔａ　及びＮｏｔｃｈ　の間の相互作用に関与している
我々は、Ｄｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ　相互作用を介在させるのに必要かつ十分である領域を、Ｄｅｌｔａ　細胞外ドメインのアミノ近傍の領域内において定義するため、細胞凝集アッセイを使用した。欠失及び十分な構築物の組み合わせによる機能分析によれば、この領域は、最大の場合、ＡＡ１からＡＡ　２３０にあることが明らかになった。この領域はＤｅｌｔａ　細胞外ドメインにあるいずれのＥＧＦ−様配列も含んでいないことは驚きである。Ｎｏｔｃｈ　との相互作用のために必要とされる十分な間隔内の特定のＤｅｌｔａ　配列はＡＡ　１９８−２３０を含む。なぜならば、これらの残基を欠失させるとＮｏｔｃｈ　−結合活性が消失するからである。ＡＡ　３２−１９８　の欠失もまたＮｏｔｃｈ　−結合活性を不活性化するという事実は、この欠失の有害なインパクトはＡＡ　１９８の直近における付加的なアミノ酸の除去によっても生じうるもので、ＡＡ　１９８に最も隣接するアミノ配列が必要であることを示唆している。
【０２２７】
Ｎｏｔｃｈ　との相互作用にとって十分なＤｅｌｔａ　内の配列は、それぞれのシステイン残基の含量において異なる３個のサブドメイン−　Ｎ１，　Ｎ２及び　Ｎ３−にグループ化され得る　（第１０図、配列番号：３）　。　Ｎ１及び　Ｎ３領域はそれぞれ６個のシステイン残基を有するのに対して、　Ｎ２領域は有しない。　Ｎ１及び　Ｎ３に存在するシステインの数がそれぞれ等しいということは、これらのサブドメインのそれぞれの構造は部分的には、特定のジスルフィド結合の形成により指図されるという可能性が考えられる。Ｄｅｌｔａ　アミノ末端の広範囲の組織パターンは、又、一般的に脊椎動物のＥＧＦ受容体の細胞外ドメインのそれに類似しており　（ラックスら，　１９８８，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　８，　１９７０−１９７８）、ＥＧＦと相互作用すると信じられているその配列は２個のシステインに富んだサブドメインにより結合されている。
【０２２８】
８．３．２．ホモ型相互作用及びホモ型ヘテロ型相互作用のために必要なＤｅｌｔａ　配列は、一致しているようにみえる
我々の結果は、ホモ型Ｄｅｌｔａ　相互作用のために必須の配列は間隔ＡＡ　３２−２３０　の間にあることを示している。このアミノ近傍ドメイン内で配列を欠失させるか、又は付加的にアミノ酸を挿入させると、独立で細胞凝集を促進させるためのＤｅｌｔａ　変異体の能力を消失させる。この結果、Ｄｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用のために必要な配列は、Ｄｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ　相互作用のために必要な配列と同じ蛋白の領域内に位置付けられる。
【０２２９】
８．３．３．Ｄｅｌｔａ　アミノ末端はＥＧＦ−結合モチーフを構成する
上述の実施例に記載の研究は、細胞凝集アッセイにおけるＤｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ　相互作用のために必要なＮｏｔｃｈ　配列が、Ｎｏｔｃｈ　細胞外ドメインのＥＧＦ−様繰り返し配列内に位置決めされることを明らかにしている。この知見は、Ｄｅｌｔａ　とＮｏｔｃｈ　はＮｏｔｃｈ　内のＥＧＦ−様配列にＤｅｌｔａ　アミノ末端が結合することにより相互作用を生じ、それゆえ、Ｄｅｌｔａ　細胞外ドメインのアミノ末端はＥＧＦ−結合領域を構成することを意味している　（第１１図）　。
【０２３０】
これらの結果は、また、ホモ型Ｄｅｌｔａ　相互作用はＤｅｌｔａ　の細胞外ドメインでＤｅｌｔａ　アミノ末端がＥＧＦ−様配列に結合することを必要とする可能性を提起する（第１２図）　。しかしながら、Ｄｅｌｔａ細胞外ドメイン内のＥＧＦ−様繰り返しのいずれも、Ｎｏｔｃｈ　の細胞外ドメイン内のいずれのＥＧＦ−様繰り返しとも同一でない（第１３図，　配列番号：６；　ウォートンら，　１９８５，　Ｃｅｌｌ　４３，　５６７−５８１）　。これが事実と仮定して、もしＤｅｌｔａ　ホモ型相互作用がＤｅｌｔａ　アミノ−末端とＤｅｌｔａ　ＥＧＦ−様繰り返しの間の相互作用によって実際に介在されるならば、Ｄｅｌｔａ　ＥＧＦ−結合領域は、少なくとも２個の異なるＥＧＦ−様配列と相互作用する能力を有する。
【０２３１】
８．３．４．Ｄｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ　相互作用に関連するＤｅｌｔａ　配列は、Ｓｅｒｒａｔｅ　蛋白中に保存される
Ｄｅｌｔａ　（　第１３図，　配列番号：６，　及び第１５図，　配列番号：９）　及びＳｅｒｒａｔｅ　（　フレミングら，　１９９０，　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．　４，　２１８８−２２０１；トーマスら，　１９９１，　Ｄｅｖｅｌ．　１１１，　７４９−７６１）のアミノ末端からアミノ酸配列を整合させると、構造上の特性及び配列組成の驚く程の保存がみられる。Ｓｅｒｒａｔｅ　蛋白のＤｅｌｔａ　Ｎ　１−　及びＤｅｌｔａ　Ｎ　３−相同ドメイン内に６個のシステイン残基が特別に生じているように、Ｄｅｌｔａ　アミノ残基の一般の　Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３サブドメイン構造は、Ｓｅｒｒａｔｅ　のアミノ末端内でも観察される。２個の顕著な保存ブロックは、Ｄｅｌｔａ　ＡＡ　６３−７３　（８／１１残基が同一）　及びＤｅｌｔａ　ＡＡ　１９５−２０６　（１０／１１　残基が同一）　に相当する。この間隔に付加的にアミノ酸を挿入すると、Ｎｏｔｃｈ　又はＤｅｌｔａ　に結合するＤｅｌｔａ　の能力を消失させることができることから、後者のブロックは特に興味がある。
【０２３２】
８．３．５．Ｄｅｌｔａ　とＮｏｔｃｈ　の間のシス及びトランス相互作用はＮｏｔｃｈ内で異なる配列を含むかもしれない。
Ｄｅｌｔａ　及びＮｏｔｃｈ　の全体的構造の検討によれば、Ｄｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ相互作用は、相互作用が対向する膜にある分子の間か、又は同一の膜内にある分子の間でなされるのかに依存して、Ｎｏｔｃｈ　内の二個の領域のいずれかを有するＤｅｌｔａ　−結合ドメインの間の接触を含むことができることを示唆する（　第１１図）　。細胞凝集アッセイ、これは恐らくは向かい合った膜にある分子の相互作用を検出するものであるが、これはＤｅｌｔａ　ＥＧＦ−結合ドメインがＮｏｔｃｈ　ＥＧＦ−様繰り返し１１及び１２と相互作用することを示す　（上記例を参照）　。もしＥＧＦ−様モチーフの一列に並んだ配列がＤｅｌｔａ　及びＮｏｔｃｈ　蛋白内でロッド状の構造を形成するならば　（エンゲル，　１９８９，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　２５１，　１−７）、細胞表面からのＤｅｌｔａ　ＥＧＦ−結合ドメインの予測される置換は、恐らくＮｏｔｃｈ　ＥＧＦ−結合繰り返し１−１０の固定した配列を収容するのに十分であろう。細胞表面からのＤｅｌｔａ　ＥＧＦ−結合領域の置換は、Ａｂｒｕｐｔｅｘ　突然変異体により影響されるＮｏｔｃｈ　ＥＧＦ−様繰り返し　（２５−２９）　の近傍にこの領域を置くことが可能であること　（ハートレーら，　１９８７，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　６，　３４０７−３４１７；　ケーレーら，　１９８７，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　６，　３０９４−３１０８）　、かつ同じ膜内にあるＤｅｌｔａ　とＮｏｔｃｈ　蛋白の相互作用について考慮することができることに注意することはまた、興味をそそる。
【０２３３】
８．３．６．脊椎動物におけるＤｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ　相互作用に類似の相互作用
ショウジョウバエにおけるＤｅｌｔａ　及びＮｏｔｃｈ　の間の相互作用を想定すると、Ｄｅｌｔａ　の相同体　（Ｈｅｌｔａ？）　が脊椎動物に存在することは確実にありうることであり、我々がショウジョウバエで定義したＤｅｌｔａ　−Ｎｏｔｃｈ　及びＤｅｌｔａ　−Ｄｅｌｔａ　相互作用の定量的かつ分子的な性質が、ヒトを含む脊椎動物中に高度に保存されているであろうことは、確実にあり得ることである。かかる相同体は第５．２節で記載したようにしてクローン化及び配列決定され得る。
【０２３４】
９．Ｎｏｔｃｈ　−Ｓｅｒｒａｔｅ　相互作用を介在する配列
我々は、Ｎｏｔｃｈ　とＳｅｒｒａｔｅ　の間の新規な分子間相互作用を報告し、かつ、Ｄｅｌｔａ　と相互作用を介在するＮｏｔｃｈ　の２個のＥＧＦ繰り返し、即ちＥＧＦ繰り返し１１及び１２、はまたＳｅｒｒａｔｅ　結合ドメインを構成することを示す。
【０２３５】
Ｎｏｔｃｈ　とＳｅｒｒａｔｅ　が直接に相互作用するか否か試験するため、Ｓ２細胞をＳｅｒｒａｔｅ　発現構築物で感染させ、我々の凝集検定法においてＮｏｔｃｈ　発現細胞と混合した。Ｓｅｒｒａｔｅ　発現構築物に対して、まず４４２　番目のイニシエーターＡＵＧに対して５’側に人工的なＢａｍＨＩ　サイトを含み（　すべての配列番号はフレミングらによる、１９９０，　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．　４：　２１８８−２２０１）　４６４番目までに対して相同のプライマーを、約２６０　塩基対のＤＮＡ断片を生じる６８１−６９８　位からの第２プライマーと連結せしめて使用した。このフラグメントを　ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ　（５７１　番目）　で切断し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋（ストラタジーン，　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　に結合させた。この構築物、ＢＴＳｅｒ５’ＰＣＲ　、の配列をチェックし、ＫｐｎＩで切断した。ＢＴＳｅｒ　５’　ＰＣＲ−Ｋｐｎを産生させるため、ＳｅｒｒａｔｅＫｐｎＩ　フラグメント　（５７１−２９８１）　が挿入され、適切な方向が選択された。ＢＴＳｅｒ　５’　ＰＣＲ−Ｋｐｎの５’　ＳａｃＩＩフラグメント　（ＳａｃＩＩ　は　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ポリリンカーに位置し、Ｓｅｒｒａｔｅ　にも位置する（１１９９））　を分離し、これをｃＤＮＡ　Ｃ１の５’　ＳａｃＩＩフラグメントを置換するために使用し　（フレミングら，１９９０，　Ｇｅｎｅｓ＆　Ｄｅｖ．　４：　２１８８−２２０１）、こうして、５’末非翻訳領域のない全長のＳｅｒｒａｔｅ　ｃＤＮＡが産生した。この挿入断片はＳａｌＩ及び部分的ＢａｍＨＩ　消化により分離され、最終の発現構築物の　Ｓｅｒ−ｍｔｎを産生させるため、ＢａｍＨＩ　及びｐＲｍＨａ−３　のＳａｌＩ部位に組み込んだ。
【０２３６】
我々は、Ｓｅｒｒａｔｅ　発現細胞はカルシウムに依存してＮｏｔｃｈ　発現細胞に粘着することを知った（　図６及び表ＶＩＩ）。しかしながら、Ｄｅｌｔａ　とは異なって、試験した実験条件下では、Ｓｅｒｒａｔｅ　はホモ的に相互作用しないようにみえた。加えて、我々はＳｅｒｒａｔｅ　とＤｅｌｔａ　の間で相互作用を検出していない。
【０２３７】
【表８】
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【０２３８】
我々は、Ｓｅｒｒａｔｅ　結合ドメインをマップするために我々のＮｏｔｃｈ　欠失構築物のサブセットを試験し、Ｄｅｌｔａ　への結合に加えて、ＥＧＦ繰り返し１１及び１２は、又、Ｓｅｒｒａｔｅ　との相互作用を介在することを見い出した　（第６図；構築物＃１，７−１０，　１３，　１６，　１７，　１９，　２８，及び３２）　。加えて、これらの繰り返しのＳｅｒｒａｔｅ　−結合機能はアフリカツメガエルのＮｏｔｃｈ　の相応の２個のＥＧＦ繰り返し　（＃３３　ΔＣｌａ＋ＸＥＧＦ　（１０−１３））の中に保存されていたように見える。これらの結果は、疑いなく、Ｎｏｔｃｈ　は　Ｄｅｌｔａ　及びＳｅｒｒａｔｅ　の両方と相互作用し、さらに、Ｎｏｔｃｈ　の同一の２個のＥＧＦ繰り返しは両方の相互作用を介在することを示している。我々はまた、Ｎｏｔｃｈ　／Ｓｅｒｒａｔｅ　凝集のために必須のＳｅｒｒａｔｅ　領域を規定することができた。ヌクレオチド６７６−１２８７を欠失させると　（即ち、アミノ酸　７９−２８２）　（第１５図参照）　、Ｓｅｒｒａｔｅ　タンパク質がＮｏｔｃｈ　と凝集する能力が消失する。
【０２３９】
Ｎｏｔｃｈ　とＳｅｒｒａｔｅ　は、Ｎｏｔｃｈ　とＤｅｌｔａ　よりはやや非効率に凝集するように見える。なぜならば、おそらく、Ｎｏｔｃｈ　−Ｓｅｒｒａｔｅ　間の相互作用はより弱いからであろう。例えば、Ｎｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　間の凝集を計測すると、すべてのＮｏｔｃｈ　発現細胞の約４０％がＤｅｌｔａ発現細胞とクラスターの状態にあり　（第６図、＃１　ｐＭｔＮＭｇ）　、そしてすべてのＤｅｌｔａ　発現細胞の約４０％はＮｏｔｃｈ　発現細胞と接触していることがわかった。Ｎｏｔｃｈ　−　Ｓｅｒｒａｔｅについて、すべてのＮｏｔｃｈ　発現細胞のたった約２０％が　（第６図；ｐＭｔＮＭｇ）　及びすべてのＳｅｒｒａｔｅ　発現細胞の約１５％が凝集状態にあることを知った。試験した種々のＮｏｔｃｈ　欠失構築物に対して、我々は、Ｄｅｌｔａ　とさえも著しく減少したレベルの凝集を示す構築物＃９及び１０の起こり得る例外と共に、Ｎｏｔｃｈ　とＳｅｒｒａｔｅ　の間の凝集の量は相応のＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　のレベル　（第６図）　に比較して一貫して減少していることを見い出している。凝集のこの減少した量に対する自明の説明は、我々のＳｅｒｒａｔｅ　構築物は単に細胞表面においてＤｅｌｔａ　構築物ほど多くの蛋白を発現せず、そのことにより相互作用の力を弱めているということであろう。あるいは、相互作用の力の差異は、ｉｎ　ｖｉｖｏ　で重要であるかもしれないＮｏｔｃｈ　−Ｄｅｌｔａ　間とＮｏｔｃｈ−Ｓｅｒｒａｔｅ　間の相互作用の基本的な機能上の差異を示しているのかもしれない。
【０２４０】
１０．ヒトＮｏｔｃｈ　配列のクローニング、配列決定、および発現
１０．１．ヒトＮｏｔｃｈ　の単離および配列決定
ヒトＮｏｔｃｈ　配列のクローンは、初めに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って、ラムダＺａｐＩＩベクター　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中の１７〜１８週齢のヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡを増幅することにより得られた。この反応に用いる縮重プライマーは、Ｎｏｔｃｈ　のアフリカツメガエル　（Ｘｅｎｏｐｕｓ）相同体のアミノ酸配列とショウジョウバエ　（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）　Ｎｏｔｃｈ　とを比較することによりデザインされた。３種のプライマー（ｃｄｃ１（配列番号：１０）、ｃｄｃ２（配列番号：１１）およびｃｄｃ３（配列番号：１２）；図１６）が、２００ｂｐまたは４００ｂｐフラグメントをそれぞれプライマー対ｃｄｃ１／ｃｄｃ２またはｃｄｃ１／ｃｄｃ３として増幅するためにデザインされた。
【０２４１】
その後、この方法で得られた４００ｂｐフラグメントをプローブとして用いて、ヒトＮｏｔｃｈ　クローンについて同一ライブラリーをスクリーニングした。最初のスクリーンは３つの特異なクローン、ｈＮ３ｋ、ｈＮ２ｋおよびｈＮ５ｋをもたらし、これらすべてはその後の配列解析によりヒトＮｏｔｃｈ　の３′末端に入ることがわかった（図１７）。ｈＮ３ｋの５′末端をプローブとして用いた２回目のスクリーンは、ヒトＮｏｔｃｈ　の５′末端を含むクローンを探すために行った。このスクリーンから１つの特異なクローンであるｈＮ４ｋが得られた。予備配列決定データから、これが該遺伝子の５′末端の大部分を含むことがわかった（図１７）。一緒にすると、クローンｈＮ４ｋ、ｈＮ３ｋおよびｈＮ５ｋは約１０ｋｂのヒトＮｏｔｃｈ　相同体を含み、これはＥＧＦ−繰返しの初期で開始して該遺伝子の３′非翻訳領域に延びている。３つのクローンはすべてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　のＥｃｏＲＩ部位中のｃＤＮＡ挿入物である。宿主　Ｅ．　ｃｏｌｉ株は　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　である　（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　１９９０，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　２ｄ　ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ｐ．Ａ１２を参照されたい）　。
【０２４２】
ｃＤＮＡクローンに含まれるＮｏｔｃｈ　の種々の部分の配列が決定され　（シークエナーゼ　（ＳｅｑｕｅｎａｓｅＲ）　、Ｕ．Ｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製を使用）　、それらを図１９〜２２（配列番号：１３〜２５）に示してある。
【０２４３】
ｈＮ３ｋおよびｈＮ５ｋに含まれるヒトＮｏｔｃｈ　ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列は、シークエナーゼキット（Ｕ．Ｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を使ってジデオキシ・チェイン・ターミネーション法により決定した。相応の読み枠中のヒトＮｏｔｃｈ　をコードするこれらのヌクレオチド配列は、３つの可能な読み枠からただ１つの翻訳が、発表されたショウジョウバエＮｏｔｃｈ　の推定アミノ酸配列と比較して、ショウジョウバエＮｏｔｃｈ　の配列に対して実質的な相同度を有する配列をもたらすので、容易に同定された。イントロンが存在しないので、３つすべての可能な読み枠の翻訳およびショウジョウバエＮｏｔｃｈ　との比較が簡単に達成され、コード領域の迅速な同定をもたらした。ｈＮ３ｋおよびｈＮ５ｋ中のヒトＮｏｔｃｈ　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列および推定タンパク質配列をそれぞれ図２３および２４に示す。クローンｈＮ３ｋは、第３Ｎｏｔｃｈ　／ｌｉｎ−１２　繰返し付近で出発してカルボキシ末端アミノ酸を欠く数個のアミノ酸までのＮｏｔｃｈ　ポリペプチドの部分をコードする。クローンｈＮ５ｋは、だいたいｃｄｃ１０領域の前で出発して該ポリペプチドの末端までのＮｏｔｃｈ　ポリペプチドの部分をコードし、３′非翻訳領域をも含む。
【０２４４】
図２３に示したＤＮＡおよびタンパク質配列（配列番号：３１および３２）を図２４に示したもの（配列番号：３３および３４）と比較すると、これらの配列間の顕著な差異が明らかとなり、このことはｈＮ３ｋおよびｈＮ５ｋが２つの異なるＮｏｔｃｈ　相同遺伝子の部分を表すことを示唆する。かくして、我々のデータは、ヒトゲノムが１より多いＮｏｔｃｈ　相同遺伝子を保有することを示唆する。これはショウジョウバエと違っており、ショウジョウバエの場合はＮｏｔｃｈ　が単一コピー遺伝子のように思われる。
【０２４５】
ｈＮ３ｋおよびｈＮ５ｋに含まれるヒトＮｏｔｃｈ　相同体のＤＮＡおよびアミノ酸配列と、対応するショウジョウバエＮｏｔｃｈ　配列（Ｗｈａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８５，　Ｃｅｌｌ　４３：５６７−５８１に発表されたもの）および対応するアフリカツメガエルＮｏｔｃｈ　配列　（Ｃｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：１４３８−１４４１　に発表されたもの、または　ＧｅｎｂａｎｋＲ　（受託番号　Ｍ３３８７４）から入手できる）と、の比較もまた差異を明らかにした。
【０２４６】
図２３に示したアミノ酸配列（ｈＮ３ｋ）を、Ｅｌｌｉｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｕｇｕｓｔ　１９９１，Ｃｅｌｌ　６６：６４９−６６１の図２に示したＴＡＮ−１ポリペプチドの予測配列と比較した。推定アミノ酸配列間には若干の差異が見られた。しかしながら、全体的なｈＮ３ｋ　Ｎｏｔｃｈ　ポリペプチド配列は対応するＴＡＮ−１領域（ＴＡＮ−１アミノ酸１４５５〜２５０６）と９９％同一である。４つの差異がわかった：すなわち、第３Ｎｏｔｃｈ／ｌｉｎ−１２繰返しと第１ｃｄｃ１０モチーフの間の領域には、Ｘ（ＴＡＮ−１アミノ酸１７６３）の代わりにアルギニン（ｈＮ３ｋ）がある；（２）Ｘ（ＴＡＮ−１、アミノ酸１７８７）の代わりにプロリン（ｈＮ３ｋ）がある；（３）グルタミン酸残基（ＴＡＮ−１、アミノ酸２４９５）の代わりにアスパラギン酸残基（ｈＮ３ｋ）の保存的変化がある；そして（４）カルボキシ末端領域がＴＡＮ−１アミノ酸２５０７〜２５３５間で実質的に相違する。
【０２４７】
図２４に示したアミノ酸配列（ｈＮ５ｋ）を、Ｅｌｌｉｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｕｇｕｓｔ　１９９１，Ｃｅｌｌ　６６：６４９−６６１の図２に示したＴＡＮ−１ポリペプチドの予測配列と比較した。推定アミノ酸配列間には差異が見られた。ｈＮ５ｋの推定Ｎｏｔｃｈ　ポリペプチドは、ｃｄｃ１０モチーフ（ＴＡＮ−１アミノ酸１８６０〜２２１７）とよく保存されたフランキング領域の両方を含むｃｄｃ１０領域においてＴＡＮ−１ポリペプチドと７９％同一（ショウジョウバエＮｏｔｃｈ　と６４％同一）である（図２５）。ｃｄｃ１０領域はＴＡＮ−１配列のアミノ酸１８６０〜２２１７にわたっている。さらに、ｈＮ５ｋコード化ポリペプチドは、ＰＥＳＴ（プロリン、グルタミン酸、セリン、トレオニン）に富む領域（ＴＡＮ−１アミノ酸２４８２〜２５５１）を含む該分子のカルボキシ末端において、ＴＡＮ−１ポリペプチドと６５％同一（ショウジョウバエＮｏｔｃｈ　と４４％同一）である（図２５Ｂ）。前記領域間の２１５個のアミノ酸の広がりは、ｈＮ３ｋ、ｈＮ５ｋおよびＴＡＮ−１により表されるＮｏｔｃｈ　相同クローン間であまり保存されていない。ｈＮ５ｋポリペプチドもショウジョウバエＮｏｔｃｈ　も、この領域において、他のタンパク質と有意なレベルのアミノ酸同一性を示さない（例えば、ｈＮ５ｋ／ＴＡＮ−１＝２４％の同一性；ｈＮ５ｋ／ショウジョウバエＮｏｔｃｈ　＝１１％の同一性；ＴＡＮ−１／ショウジョウバエＮｏｔｃｈ　＝１７％の同一性）。対照的に、アフリカツメガエルＮｏｔｃｈ　（Ｘｏｔｃｈ）　（配列番号：３５）、ラットＮｏｔｃｈ　（配列番号：３６）、およびＴＡＮ−１（配列番号：３７）は互いに有意なレベルの配列同一性を共有し続ける（例えば、ＴＡＮ−１／ラットＮｏｔｃｈ　＝７５％の同一性；ＴＡＮ−１／アフリカツメガエルＮｏｔｃｈ　＝４５％の同一性；ラットＮｏｔｃｈ　／アフリカツメガエルＮｏｔｃｈ＝５０％の同一性）。
【０２４８】
最後に、図２５Ｂに示した脊椎動物Ｎｏｔｃｈ　相同体の細胞内ドメインの配列の検討は予期せぬ知見を明らかにした：すなわち、ｈＮ５ｋを含むこれらのタンパク質はすべて、６つのｃｄｃ１０繰返しの最後に続く保存領域に、核ターゲッティング機能と関連した推定ＣｃＮモチーフを含んでいる（図２５Ｂ）。ショウジョウバエＮｏｔｃｈ　はこのような規定モチーフを欠くが、その配列の徹底した検討により、潜在的な、２つの部分から成る核局在化配列（Ｒｏｂｂｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９１，　Ｃｅｌｌ６４：６１５−６２３　）、並びに潜在的なＣＫＩＩおよびｃｄｃ２リン酸化部位の存在（すべて互いに比較的近接している）が明らかとなり、かくしてＣｃＮモチーフの別の型を規定している可能性がある（図２５Ｂ）。
【０２４９】
１０．２．ヒトＮｏｔｃｈ　の発現
上記の第１０．１節で論じたヒトＮｏｔｃｈ　ｃＤＮＡクローンを用いて発現構築物を作製した。ｈＮ３ｋとｈＮ２ｋの場合は、そのベクターから全クローンをＥｃｏＲＩ制限フラグメントとして切りだし、３つのｐＧＥＸベクター（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ発現ベクター；Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ，　１９８８，　Ｇｅｎｅ　７，　３１−４０）のそれぞれのＥｃｏＲＩ制限部位にサブクローニングした。これにより、サブクローンから正しい読み枠でＮｏｔｃｈ　タンパク質産物が発現される。ｈＮ５ｋの場合は、クローンが２つの内部ＥｃｏＲＩ制限部位を含み、２．６、１．５および０．６ｋｂのフラグメントを生成する。２．６および１．５ｋｂのフラグメントが共にｐＧＥＸベクターのそれぞれにサブクローニングされた。
【０２５０】
下記の構築物からヒトＮｏｔｃｈ　融合（キメラ）タンパク質の発現を得るために、ｐＧＥＸベクター系を用いた。それぞれの場合にクローン化Ｎｏｔｃｈ　ＤＮＡを相応のｐＧＥＸベクターに読み枠を合わせて　（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）　挿入した。その後、各構築物をエレクトロポレーションにより細菌　（Ｅ．　ｃｏｌｉ）に導入し、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質のカルボキシ末端に融合されたＮｏｔｃｈ　タンパク質配列を含む融合タンパク質として発現させた。融合タンパク質の発現は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による細胞タンパク質抽出物の分析により確認し、Ｎｏｔｃｈ　ＤＮＡが挿入されたｐＧＥＸプラスミドおよび挿入されていないｐＧＥＸプラスミドを含む細胞から得られたタンパク質抽出物を比較した。この融合タンパク質は水溶液中に可溶性で、（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのカルボキシ末端がグルタチオニンに結合するので）グルタチオン被覆アガロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより細胞溶解液から精製された。発現された融合タンパク質は、ウェスターンブロッティングにより検定して、ショウジョウバエＮｏｔｃｈ　に対する抗体と結合した。
【０２５１】
ヒトＮｏｔｃｈ　−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をつくるために用いた構築物は次のとおりである：
ｈＮＦＰ＃２　−　ＰＣＲを使って、ｈＮ５ｋ挿入物のヌクレオチド１９２のｃｄｃ１０繰返しのすぐ前で出発してヌクレオチド１６９４のＰＥＳＴに富む領域のすぐ前までのフラグメントを得た。次いで、このＤＮＡをＢａｍＨＩとＳｍａＩで消化し、得られたフラグメントをｐＧＥＸ−３に連結させた。発現後、グルタチオンアガロースに結合させて融合タンパク質を精製した。精製したポリペプチドは４−１５％勾配のポリアクリルアミドゲル上で定量化した。得られた融合タンパク質はおよその分子量が８３ｋＤであった。
【０２５２】
ｈＮ３ＦＰ＃１　−　全ｈＮ３ｋ　ＤＮＡ挿入物（ヌクレオチド１〜３２３５）をＥｃｏＲＩで消化して　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（ＳＫ）ベクターから切り出した。このＤＮＡをｐＧＥＸ−３に連結させた。　ｈＮ３ＦＰ＃２　−　ｈＮ３ｋ　ＤＮＡ（ヌクレオチド１８４７〜３２３５）の３′セグメントおよびポリリンカーの一部を、ＸｍａＩで消化して　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（ＳＫ）ベクターから切り出した。このフラグメントをｐＧＥＸ−１に連結させた。
【０２５３】
精製した後、ヒトＮｏｔｃｈ　に対するポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体をつくるためにこれらの融合タンパク質が使用される。
【０２５４】
１１．微生物の寄託
ヒトＮｏｔｃｈ　の部分をコードするプラスミドを保有する次の組換え細菌は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定のもとに、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ，　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２）に１９９１年５月２日に寄託された。
【０２５５】
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本発明は寄託した微生物またはここに記載した特定の実施態様によってその範囲を限定されるものではない。実際、ここに記載したもののほかに本発明の種々の変更が、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかであろう。このような変更も請求の範囲に入るものである。
【０２５６】
種々の刊行物をここに引用したが、これらの開示内容は参照によりそのままここに組み込まれるものとする。
【０２５７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を調べるための発現構築物および実験デザインを示す。ＭＴ、メタロチオネインプロモーター；ＡＴＧ　、翻訳開始部位；ＴＭ、膜貫通ドメイン；３’Ｎ　、Ｎｏｔｃｈ遺伝子ポリアデニル化シグナル；３’Ａｄｈ　、Ａｄｈ　遺伝子からのポリアデニル化シグナル；５’Ｎ　、Ｎｏｔｃｈ遺伝子プロモーター領域。
【図２】培養細胞中のＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの発現を示す。
【図３ａ】Ｎｏｔｃｈ形凝集物およびＤｅｌｔａ形凝集物を発現するＳ２細胞を示す。全てのパネル中で、Ｎｏｔｃｈが緑で示され、Ｄｅｌｔａが赤で示される。（Ａ）　抗体染色の特異性を示す同フィールドの明るいフィールドの顕微鏡写真。（Ｂ）　単一Ｄｅｌｔａ＋細胞。染色が主として細胞表面にある。（Ｂ）　同フィールドの明るいフィールドの顕微鏡写真。（Ｃ）２４　時間の凝集実験からのＤｅｌｔａ＋細胞の凝集物。
【図３ｂ】単独で移入された細胞集団の１：１　の混合物から形成されたＮｏｔｃｈ＋細胞およびＤｅｌｔａ＋細胞の凝集物（これは室温で一夜凝集させられた）を示す。（Ｄ）　はこの凝集物中のＮｏｔｃｈ＋細胞を示す。（Ｅ）　はＤｅｌｔａ＋細胞を示し、そして（Ｆ）　は両方の細胞型を示す二重露出である。ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａのバンドはＮｏｔｃｈ＋細胞とＤｅｌｔａ＋細胞の接触点（矢印）で顕著である。
【図３ｃ】（Ｇ）　および（Ｈ）　Ｎｏｔｃｈ＋−Ｄｅｌｔａ＋細胞凝集物のプソイドカラー共焦顕微鏡写真を示す。（Ｉ）　Ｄｅｌｔａ＋細胞と、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメイン（ＥＣＮ１　構築物）のみを発現する細胞を含む凝集物を示す。
【図４ａ】ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａが同時移入細胞中で会合される。Ｎｏｔｃｈに関する染色が上欄（Ａ）に示され、Ｄｅｌｔａに関する染色が下欄（Ｂ）に示される。（Ａ）　および（Ｂ）　Ｎｏｔｃｈ構築物およびＤｅｌｔａ構築物の両方で同時移入されたＳ２細胞。
【図４ｂ】ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａが同時移入細胞中で会合される。Ｎｏｔｃｈに関する染色が上欄（Ｃ）に示され、Ｄｅｌｔａに関する染色が下欄（Ｄ）に示される。（Ｃ）　および（Ｄ）　同時移入細胞を、特定の抗血清による定着および染色の前に室温で１時間にわたってポリクローナル抗Ｎｏｔｃｈ抗血清（それぞれの抗細胞外ドメイン抗血清の１：２５０　希釈液）に露出した。
【図４ｃ】ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａが同時移入細胞中で会合される。Ｎｏｔｃｈに関する染色が上欄（Ｅ）に示され、Ｄｅｌｔａに関する染色が下欄（Ｆ）に示される。（Ｅ）　および（Ｆ）　細胞外Ｎｏｔｃｈ（ＥＣＮ１）　構築物およびＤｅｌｔａ構築物で同時移入され、誘発され、次に抗Ｎｏｔｃｈポリクローナル抗血清を使用してパッチされた細胞。
【図５】同時免疫沈殿は、ＤｅｌｔａおよびＮｏｔｃｈが移入細胞Ｓ２およびショウジョウバエ胚細胞からの溶解産物中で会合されていることを示す。
【図６ａ】Ｎｏｔｃｈ発現構築物およびＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ結合ドメインの欠失マッピングを示す。
【図６ｂ】Ｎｏｔｃｈ発現構築物およびＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ結合ドメインの欠失マッピングを示す。
【図７】Ｎｏｔｃｈ欠失構築物＃１９−２４　の詳しい構造を示す。
【図８】ショウジョウバエおよびアフリカツメガエルのＮｏｔｃｈからのＥＧＦ　繰返し１１および１２のアミノ酸配列の比較を示す。
【図９ａ】図９Ａ．　インプットＤＮＡ　量に対する凝集の依存性。Ａ、それぞれ種々の量のｐＭＴＤｌ１　ＤＮＡ　（２　、４　、１０または２０μｇ／プレート）　で一時的に移入されたＳ２細胞集団（これらは続いて一定量のｐＭｔＮＭｇ　ＤＮＡ　（２０μｇ／プレート）　で一時的に移入されたＳ２細胞集団と凝集条件下でインキュベートされた）を使用して観察された異型凝集。示されたデータは、それぞれのインプットＤＮＡ　量に関する４以上の細胞の凝集物中のＤｅｌｔａ細胞の平均分率（％）±標準誤差である（２μｇ　および１０μｇ　インプット（これらに関してＮ＝２）を除いて、Ｎ＝３反復）。最低１００　のＤｅｌｔａ発現細胞を、それぞれの反復につきカウントした。Ｂ、それぞれ種々の量のｐＭＴＤｌ１ＤＮＡ　（２　、４　、１０または２０μｇ／プレート）　で一時的に移入されたＳ２細胞集団（これらは続いて凝集条件下でインキュベートされた）を使用して観察された同型凝集。データは、それぞれのインプットＤＮＡ　量に関する４以上の細胞の凝集物中のＤｅｌｔａ細胞の平均分率（％）±標準誤差である（Ｎ＝３反復）。最低５００　のＤｅｌｔａ発現細胞を、それぞれの反復につきカウントした。
【図９ｂ】図９Ｃ　この研究に使用された構築物を示す。
【図１０】Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅアミノ末端配列の配列を示す。
【図１１】Ｄｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互作用の潜在的な幾何学を示す。Ａ、向かい合っている原形質膜の間で相互作用するＤｅｌｔａ（左）とＮｏｔｃｈ（右）分子の潜在的なレジスタ。Ｂ、同じ原形質膜内で相互作用するＤｅｌｔａ（左）とＮｏｔｃｈ（右）分子の潜在的なレジスタ。
【図１２】Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用の潜在的な幾何学を示す。ＡおよびＢ、向かい合っている原形質膜の間で相互作用するＤｅｌｔａ分子の潜在的なレジスタ。Ｂ、同じ原形質膜内で相互作用するＤｅｌｔａ分子の潜在的なレジスタ。
【図１３ａ】ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１３ｂ】ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１３ｃ】ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１３ｄ】ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１３ｅ】ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１４】神経膠ｃＤＮＡ　１Ｂ７Ａ−２５０　の一次ヌクレオチド配列（配列番号：７）を示す。
【図１５ａ】ＳｅｒｒａｔｅとＤｅｌｔａの間の核酸配列相同性を示す。
【図１５ｂ】ＳｅｒｒａｔｅとＤｅｌｔａの間の核酸配列相同性を示す。
【図１６】ヒトＮｏｔｃｈのクローニングのＰＣＲ　に使用されるプライマーを示す。
【図１７】ヒトＮｏｔｃｈクローンの略図。ヒトＮｏｔｃｈの略図が示される。
【図１８】ショウジョウバエ・Ｎｏｔｃｈ配列と並べられたヒトＮｏｔｃｈ配列を示す。
【図１９】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ２Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列を示す。図１９Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：１３）。図１９Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１４）。図１９Ｃ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１５）。
【図２０】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列を示す。図２０Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：１６）。図２０Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１７）。図２０Ｃ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１８）。図２０Ｄ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１９）。
【図２１】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ４Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列を示す。図２１Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：２０）。図２１Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：２１）。
【図２２】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列を示す。図２２Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：２２）。図２２Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：２３）。図２２Ｃ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：２４）。図２２Ｄ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：２５）。
【図２３ａ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｂ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｃ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｄ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｅ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｆ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｇ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｈ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｉ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｊ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｋ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｌ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｍ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｎ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｏ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｐ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｑ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２４ａ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｂ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｃ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｄ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｅ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｆ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｇ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２５ａ】ｈＮ５Ｋとその他のＮｏｔｃｈ相同体の比較を示す。図２５Ａ．ショウジョウバエＮｏｔｃｈの略図。
【図２５ｂ】図２５Ｂ．ｈＮ５Ｋの演繹アミノ酸配列とその他のＮｏｔｃｈ相同体の配列の配列を示す。
【図２５ｃ】図２５Ｂ．ｈＮ５Ｋの演繹アミノ酸配列とその他のＮｏｔｃｈ相同体の配列の配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅ】
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【図１３ｆ】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２３ｃ】
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【図２３ｄ】
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【図２３ｅ】
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【図２３ｆ】
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【図２３ｇ】
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【図２３ｈ】
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【図２３ｉ】
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【図２３ｊ】
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【図２３ｋ】
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【図２３ｌ】
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【図２３ｍ】
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【図２３ｎ】
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【図２３ｏ】
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【図２３ｐ】
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【図２３ｑ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２４ｄ】
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【図２４ｅ】
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【図２４ｆ】
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【図２４ｇ】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２５ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年6月19日(2003.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｎｏｔｃｈ−Ｄｅｌｔａ相互作用を調べるための発現構築物および実験デザインを示す。ＭＴ、メタロチオネインプロモーター；ＡＴＧ　、翻訳開始部位；ＴＭ、膜貫通ドメイン；３’Ｎ　、Ｎｏｔｃｈ遺伝子ポリアデニル化シグナル；３’Ａｄｈ　、Ａｄｈ　遺伝子からのポリアデニル化シグナル；５’Ｎ　、Ｎｏｔｃｈ遺伝子プロモーター領域。
【図２】培養細胞中のＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａの発現を示す。
【図３】（Ａ）〜（Ｃ）：Ｎｏｔｃｈ形凝集物およびＤｅｌｔａ形凝集物を発現するＳ２細胞を示す。全てのパネル中で、Ｎｏｔｃｈが緑で示され、Ｄｅｌｔａが赤で示される。
（Ａ）　抗体染色の特異性を示す同フィールドの明るいフィールドの顕微鏡写真。
（Ｂ）　単一Ｄｅｌｔａ＋細胞。染色が主として細胞表面にある。
（Ｂ）　同フィールドの明るいフィールドの顕微鏡写真。
（Ｃ）２４　時間の凝集実験からのＤｅｌｔａ＋細胞の凝集物。
（Ｄ）〜（Ｆ）：単独で移入された細胞集団の１：１　の混合物から形成されたＮｏｔｃｈ＋細胞およびＤｅｌｔａ＋細胞の凝集物（これは室温で一夜凝集させられた）を示す。
（Ｄ）　はこの凝集物中のＮｏｔｃｈ＋細胞を示す。
（Ｅ）　はＤｅｌｔａ＋細胞を示し、そして（Ｆ）　は両方の細胞型を示す二重露出である。ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａのバンドはＮｏｔｃｈ＋細胞とＤｅｌｔａ＋細胞の接触点（矢印）で顕著である。
（Ｇ）　および（Ｈ）　Ｎｏｔｃｈ＋−Ｄｅｌｔａ＋細胞凝集物のプソイドカラー共焦顕微鏡写真を示す。
（Ｉ）　Ｄｅｌｔａ＋細胞と、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメイン（ＥＣＮ１　構築物）のみを発現する細胞を含む凝集物を示す。
【図４】ＮｏｔｃｈおよびＤｅｌｔａが同時移入細胞中で会合される。Ｎｏｔｃｈに関する染色が上欄（Ａ）に示され、Ｄｅｌｔａに関する染色が下欄（Ｂ）に示される。
（Ａ）　および（Ｂ）　Ｎｏｔｃｈ構築物およびＤｅｌｔａ構築物の両方で同時移入されたＳ２細胞。
Ｎｏｔｃｈに関する染色が上欄（Ｃ）に示され、Ｄｅｌｔａに関する染色が下欄（Ｄ）に示される。
（Ｃ）　および（Ｄ）　同時移入細胞を、特定の抗血清による定着および染色の前に室温で１時間にわたってポリクローナル抗Ｎｏｔｃｈ抗血清（それぞれの抗細胞外ドメイン抗血清の１：２５０　希釈液）に露出した。
Ｎｏｔｃｈに関する染色が上欄（Ｅ）に示され、Ｄｅｌｔａに関する染色が下欄（Ｆ）に示される。
（Ｅ）　および（Ｆ）　細胞外Ｎｏｔｃｈ（ＥＣＮ１）　構築物およびＤｅｌｔａ構築物で同時移入され、誘発され、次に抗Ｎｏｔｃｈポリクローナル抗血清を使用してパッチされた細胞。
【図５】同時免疫沈殿は、ＤｅｌｔａおよびＮｏｔｃｈが移入細胞Ｓ２およびショウジョウバエ胚細胞からの溶解産物中で会合されていることを示す。
【図６ａ】Ｎｏｔｃｈ発現構築物およびＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ結合ドメインの欠失マッピングを示す。
【図６ｂ】Ｎｏｔｃｈ発現構築物およびＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ結合ドメインの欠失マッピングを示す。
【図７】Ｎｏｔｃｈ欠失構築物＃１９−２４　の詳しい構造を示す。
【図８】ショウジョウバエおよびアフリカツメガエルのＮｏｔｃｈからのＥＧＦ　繰返し１１および１２のアミノ酸配列の比較を示す。
【図９ａ】インプットＤＮＡ　量に対する凝集の依存性。Ａ、それぞれ種々の量のｐＭＴＤｌ１　ＤＮＡ（２　、４　、１０または２０μｇ／プレート）　で一時的に移入されたＳ２細胞集団（これらは続いて一定量のｐＭｔＮＭｇ　ＤＮＡ　（２０μｇ／プレート）　で一時的に移入されたＳ２細胞集団と凝集条件下でインキュベートされた）を使用して観察された異型凝集。示されたデータは、それぞれのインプットＤＮＡ　量に関する４以上の細胞の凝集物中のＤｅｌｔａ細胞の平均分率（％）±標準誤差である（２μｇ　および１０μｇ　インプット（これらに関してＮ＝２）を除いて、Ｎ＝３反復）。最低１００　のＤｅｌｔａ発現細胞を、それぞれの反復につきカウントした。
【図９ｂ】それぞれ種々の量のｐＭＴＤｌ１　ＤＮＡ　（２　、４　、１０または２０μｇ／プレート）　で一時的に移入されたＳ２細胞集団（これらは続いて凝集条件下でインキュベートされた）を使用して観察された同型凝集。データは、それぞれのインプットＤＮＡ　量に関する４以上の細胞の凝集物中のＤｅｌｔａ細胞の平均分率（％）±標準誤差である（Ｎ＝３反復）。最低５００　のＤｅｌｔａ発現細胞を、それぞれの反復につきカウントした。
【図９ｃ】この研究に使用された構築物を示す。
【図１０】Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅアミノ末端配列の配列を示す。
【図１１】Ｄｅｌｔａ−Ｎｏｔｃｈ相互作用の潜在的な幾何学を示す。Ａ、向かい合っている原形質膜の間で相互作用するＤｅｌｔａ（左）とＮｏｔｃｈ（右）分子の潜在的なレジスタ。Ｂ、同じ原形質膜内で相互作用するＤｅｌｔａ（左）とＮｏｔｃｈ（右）分子の潜在的なレジスタ。
【図１２】Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ相互作用の潜在的な幾何学を示す。Ａ、ＢおよびＣ、向かい合っている原形質膜の間で相互作用するＤｅｌｔａ分子の潜在的なレジスタ。Ｂ、同じ原形質膜内で相互作用するＤｅｌｔａ分子の潜在的なレジスタ。
【図１３ａ】ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１３ｂ】ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１３ｃ】ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１３ｄ】ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１３ｅ】ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１３ｆ】ＤｅｌｔａｃＤＮＡ　Ｄ１１の一次ヌクレオチド配列（配列番号：５）　およびＤｅｌｔａアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１４】神経膠ｃＤＮＡ　１Ｂ７Ａ−２５０　の一次ヌクレオチド配列（配列番号：７）を示す。
【図１５ａ】ＳｅｒｒａｔｅとＤｅｌｔａの間の核酸配列相同性を示す。
【図１５ｂ】ＳｅｒｒａｔｅとＤｅｌｔａの間の核酸配列相同性を示す。
【図１６】ヒトＮｏｔｃｈのクローニングのＰＣＲ　に使用されるプライマーを示す。
【図１７】ヒトＮｏｔｃｈクローンの略図。ヒトＮｏｔｃｈの略図が示される。
【図１８】ショウジョウバエ・Ｎｏｔｃｈ配列と並べられたヒトＮｏｔｃｈ配列を示す。
【図１９】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ２Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列を示す。図１９Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：１３）。図１９Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１４）。図１９Ｃ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１５）。
【図２０】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列を示す。図２０Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：１６）。図２０Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１７）。図２０Ｃ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１８）。図２０Ｄ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：１９）。
【図２１】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ４Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列を示す。図２１Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：２０）。図２１Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：２１）。
【図２２】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのヌクレオチド配列を示す。図２２Ａ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ配列（配列番号：２２）。図２２Ｂ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：２３）。図２２Ｃ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：２４）。図２２Ｄ　：ヒトＮｏｔｃｈインサートの一部のＤＮＡ　配列（配列番号：２５）。
【図２３ａ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｂ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｃ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｄ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｅ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｆ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｇ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｈ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｉ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｊ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｋ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｌ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｍ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｎ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｏ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｐ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２３ｑ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ３Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３１）およびアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２４ａ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｂ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｃ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｄ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｅ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｆ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２４ｇ】プラスミドｃＤＮＡクローンｈＮ５Ｋ中に含まれるヒトＮｏｔｃｈのＤＮＡ　配列（配列番号：３３）およびアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２５ａ】ｈＮ５Ｋとその他のＮｏｔｃｈ相同体の比較を示す。図２５Ａ．ショウジョウバエＮｏｔｃｈの略図。
【図２５ｂ】図２５Ｂ．ｈＮ５Ｋの演繹アミノ酸配列とその他のＮｏｔｃｈ相同体の配列の配列を示す。
【図２５ｃ】図２５Ｂ．ｈＮ５Ｋの演繹アミノ酸配列とその他のＮｏｔｃｈ相同体の配列の配列を示す。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2004065243.tif 000160
【図２】
2004065243.tif 000161
【図３】
2004065243.tif 000162
【図４】
2004065243.tif 000163
【図５】
2004065243.tif 000164
【図６ａ】
2004065243.tif 000165
【図６ｂ】
2004065243.tif 000166
【図７】
2004065243.tif 000167
【図８】
2004065243.tif 000168
【図９ａ】
2004065243.tif 000169
【図９ｂ】
2004065243.tif 000170
【図９ｃ】
2004065243.tif 000171
【図１０】
2004065243.tif 000172
【図１１】
2004065243.tif 000173
【図１２】
2004065243.tif 000174
【図１３ａ】
2004065243.tif 000175
【図１３ｂ】
2004065243.tif 000176
【図１３ｃ】
2004065243.tif 000177
【図１３ｄ】
2004065243.tif 000178
【図１３ｅ】
2004065243.tif 000179
【図１３ｆ】
2004065243.tif 000180
【図１４】
2004065243.tif 000181
【図１５ａ】
2004065243.tif 000182
【図１５ｂ】
2004065243.tif 000183
【図１６】
2004065243.tif 000184
【図１７】
2004065243.tif 000185
【図１８】
2004065243.tif 000186
【図１９】
2004065243.tif 000187
【図２０】
2004065243.tif 000188
【図２１】
2004065243.tif 000189
【図２２】
2004065243.tif 000190
【図２３ａ】
2004065243.tif 000191
【図２３ｂ】
2004065243.tif 000192
【図２３ｃ】
2004065243.tif 000193
【図２３ｄ】
2004065243.tif 000194
【図２３ｅ】
2004065243.tif 000195
【図２３ｆ】
2004065243.tif 000196
【図２３ｇ】
2004065243.tif 000197
【図２３ｈ】
2004065243.tif 000198
【図２３ｉ】
2004065243.tif 000199
【図２３ｊ】
2004065243.tif 000200
【図２３ｋ】
2004065243.tif 000201
【図２３ｌ】
2004065243.tif 000202
【図２３ｍ】
2004065243.tif 000203
【図２３ｎ】
2004065243.tif 000204
【図２３ｏ】
2004065243.tif 000205
【図２３ｐ】
2004065243.tif 000206
【図２３ｑ】
2004065243.tif 000207
【図２４ａ】
2004065243.tif 000208
【図２４ｂ】
2004065243.tif 000209
【図２４ｃ】
2004065243.tif 000210
【図２４ｄ】
2004065243.tif 000211
【図２４ｅ】
2004065243.tif 000212
【図２４ｆ】
2004065243.tif 000213
【図２４ｇ】
2004065243.tif 000214
【図２５ａ】
2004065243.tif 000215
【図２５ｂ】
2004065243.tif 000216
【図２５ｃ】
2004065243.tif 000217