(57)【要約】【課題】微生物による含硫複素環式硫黄化合物の脱硫反応において、最終生成物である硫酸イオンやヒドロキシ体による阻害作用を解消し、連続的脱硫を可能にすることにある。【解決手段】マイコバクテリウム属に属する微生物、特にヒドロキシ化合物をメチル化する能力を有する微生物に、硫酸イオンの抑制を受けることなく恒常的に発現するプロモーター、およびＣ−Ｓ結合を選択的に切断する酵素をコードする脱硫遺伝子を、機能しうる態様で導入した組換え微生物。該組換え微生物を用いた脱硫法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム属に属する微生物に、硫酸イオンの抑制を受けることなく恒常的に発現するプロモーターおよびＣ−Ｓ結合を選択的に切断する酵素をコードする脱硫遺伝子を機能しうる態様で導入した組換え微生物。
【請求項２】
微生物が、ヒドロキシ化合物をメチル化する能力を有する微生物である、請求項１記載の組換え微生物。
【請求項３】
プロモーターが、ｋａｐ１プロモーター（配列番号１）である、請求項１または２記載の組換え微生物。
【請求項４】
脱硫遺伝子が、ロドコッカス属ＩＧＴＳ８株由来の脱硫遺伝子、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＡＤ１０９株由来の分解遺伝子、ペニバチルス属Ａ１１−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０２５）由来の脱硫遺伝子、および同Ａ１１−２株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２６）由来の脱硫遺伝子からなる群より選ばれるいずれか１の遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項５】
脱硫遺伝子が、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚ　ＡＢＣＤ（配列番号６）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
微生物が、マイコバクテリウム属　ＮＣＩＭＢ１０４０３株またはそれと実質的に同等の菌学的性質を有する細菌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
マイコバクテリウム属　ＮＣＩＭＢ１０４０３株に、ｋａｐ１プロモーター（配列番号１）、およびロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚ　ＡＢＣＤ（配列番号６）を、機能しうる態様で導入して作製される組換え微生物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え微生物を含硫複素環式化合物とともに培養することにより、該含硫複素環式化合物を脱硫する方法。
【請求項９】
含硫複素環式化合物がベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェンおよびそれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１以上の化合物である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
含硫複素環式化合物がアルキル化ベンゾチオフェン類およびアルキル化ジベンゾチオフェン類からなる群より選ばれる少なくとも１以上の化合物である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
含硫複素環式化合物の連続的脱硫が可能であることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を利用した含硫複素環式化合物の脱硫方法に関する。より詳しくは、微生物による脱硫反応の最終生成物である硫酸イオンとヒドロキシ体による阻害を受けることなく、連続的脱硫反応を可能とした新規脱硫方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
石油等の化石燃料油中には多種類の硫黄化合物が含有されているが、硫黄は大気中に放出されると環境に重大な影響を与えるため、これらの脱硫が求められている。世界の種々の原油中に含まれる硫黄の濃度はそれぞれ異なるが、平均して１．１３％程度であり、代表的な含有硫黄化合物はメルカプタン類、スルフィド類、チオフェン類である。原油を蒸留分別した各留分中では、重い留分ほどベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン等のチオフェン類の比率が高い。
【０００３】
石油の脱硫方法としては、アルカリ洗浄、溶剤洗浄、吸着などの方法も知られているが、現在では水素化脱硫が主流である。水素化脱硫は、石油留分中の硫黄化合物を高温・高圧、金属触媒の存在下で水素と反応させ、硫黄を硫化水素として除去する、完成度の高い脱硫プロセスである。金属触媒としては、通常アルミナを担体としたコバルト、モリブデン、ニッケル、タングステンなどが使用される。
【０００４】
しかし、水素化脱硫法は化石燃料全体の硫黄濃度を低下させることはできても、難脱硫性の含硫複素環式化合物を十分に脱硫することができない。最近は、こうした難脱硫性化合物を効果的に除去し、軽油中の硫黄分を１ｐｐｍ以下に削減する超深度脱硫の研究が進められ、そのための触媒の改良や反応温度・圧力の向上が試みられている。
【０００５】
これに対し、微生物による酵素反応を利用して比較的穏和な条件下で脱硫を行う方法としてバイオ脱硫法がある（Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　３９−４５（１９９４））。バイオ脱硫法では、酵素の高い基質特異性により、水素化脱硫では脱硫できなかった硫黄も比較的穏和な条件で除去することが可能である。例えば、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　ＣＢ１（Ｉｓｂｉｓｔｅｒ，　Ｊ．Ｄ．　ａｎｄ　Ｋｏｂｙｌｉｎｓｋｉ，Ｅ．Ａ．（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏａｌ，　ｉｎ　Ｃｏａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｒ．９，　ｐ．６２７　（１９８５））、ロドコッカスロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＩＧＴＳ８　（ＡＴＣＣ５３９６８）　（Ｋｉｌｂａｎｅ，Ｊ．Ｊ．　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄ　Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，　３，　６９−７０　（１９９０））、ロドコッカス　エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｋｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＫＡ２−５−１株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１６２７７）（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．　Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｋ．，　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｏ．，　Ｈｉｒａｓａｗａ，Ｋ．，　Ｉｓｈｉｉ，Ｙ．，　Ｆｕｊｉｎｏ，Ｋ．，　Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｈ．　ａｎｄ　Ｍａｒｕｈａｓｈｉ，Ｋ．，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６５（２），　２８９−３０４，　２００１）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．　ＳＹ−１　（Ｏｈｍｏｒｉ，　Ｔ．，　Ｍｏｎｎａ，Ｌ．，Ｓａｉｋｉ，　Ｙ．　ａｎｄ　Ｋｏｄａｍａ，Ｔ．　Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８，９１１−９１５，　１９９２）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　ｓｐ．　ＤＯ　（ｖａｎ　Ａｆｆｅｒｄｅｎ，　Ｍ．，Ｓｃｈａｃｈｔ，　Ｓ．，　Ｋｌｅｉｎ，　Ｊ．ａｎｄＴｒｕｐｅｒ，Ｈ．Ｇ．，Ａｒｃｈ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５３，　３２４−３２８，１９９０）や、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）　Ｋ３ｂ（Ｄａｈｌｂｅｒｇ，　Ｍ．Ｄ．（１９９２）　Ｔｈｉｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｏａｌ，　Ｍａｙ４−７，　ＣｌｅａｒｗａｔｅｒＢｅａｃｈ，ＦＬ，ｐｐ．１−１０．Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　ＰａｌｏＡｌｔｏ，　ＣＡ．）を用いた脱硫方法がこれまで報告されている。微生物脱硫法では、水素化脱硫法のように高い温度や圧力を必要とすることなく、ベンゾチオフェン類等を脱硫できる利点がある。
【０００６】
ところで、化石燃料中に存在する含硫複素環式化合物の９０％以上はジベンゾチオフェン類であり、その他の微量硫黄化合物は、ベンゾチオフェン類（ｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ベンゾテトラナフチールチオフェン類（ｂｅｎｚｏｔｅｔｅｒｎａｐｔｈｙｌｔｈｉｏｐｈｅ）、ベンゾナフチルチオフェン類　（ｂｅｎｚｏｎａｐｈｔｈｙｌｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）である。これらは、Ｃ−Ｃ結合を切断するような方法で脱硫しようとすると、化石燃料中の他の芳香族炭化水素の分解によるエネルギー含有量の低下をまねくため、一般にＣ−Ｓ結合を特異的に切断する微生物を用いて脱硫されている。このＣ−Ｓ結合の特異的切断による脱硫反応では、含硫複素環式化合物からの最終分解生成物はヒドロキシ体と硫酸イオンになる。
【０００７】
しかしながら、従来の脱硫微生物では、脱硫に関連した脱硫酵素遺伝子が培養液中の無機硫黄化合物や含硫アミノ酸によって発現抑制を受けることが報告されている（Ｍａｍｉｅ　Ｚ．Ｌ．，　Ｓｚｕｉｒｅｓ　Ｃ．Ｈ．，　Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ　Ｄ．Ｊ．，　ａｎｄ　Ｃｈｉｌｓ　Ｊ．Ｄ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７８，　６４０９−６４１８，　１９９６）。これは、主に脱硫酵素遺伝子の発現を制御しているプロモーターが誘導型であることによる。すなわち、脱硫反応によって生成した硫黄が硫酸イオンとして培養液中に溶出し、培養液中の硫黄濃度が高くなるにつれて、脱硫遺伝子の発現が抑制され、脱硫効率が低下する。そのため、これまで硫黄濃度が高くなるような連続培養条件では、脱硫反応を行うことは事実上不可能であった。
【０００８】
一方、ヒドロキシ体は脱硫反応後の菌体内に生成し、大部分は油相中に排出されるが、一部分は菌体内や水相中に残存して菌体内の脱硫酵素活性を低下させる。しかも、ヒドロキシ体は脱硫酵素の反応を阻害するばかりでなく、微生物の蛋白質に対して広く阻害作用を有することが知られている。そのため、従来のバイオ脱硫法では、脱硫生成物であるヒドロキシ体を除去しなければ連続的脱硫ができないとか、休止菌体による脱硫反応は行えるが、生育条件下での連続的脱硫はできないといった問題があった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、微生物による含硫複素環式硫黄化合物の脱硫反応において、最終生成物である硫酸イオンやヒドロキシ体による阻害作用を解消し、連続的脱硫を可能にすることにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒドロキシ体をメチル化する酵素を有するマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物に、硫黄による抑制を受けることなく、恒常的かつ高発現に機能するｋａｐ１プロモーターと、これに機能しうる態様で連結させた脱硫遺伝子を導入した組換え微生物を作成した。そして、この組換え微生物を用いれば、ヒドロキシ体による阻害作用を受けることなく、連続的脱硫反応が可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）　マイコバクテリウム属に属する微生物に、硫酸イオンの抑制を受けることなく恒常的に発現するプロモーターおよびＣ−Ｓ結合を選択的に切断する酵素をコードする脱硫遺伝子を機能しうる態様で導入した組換え微生物。
（２）　微生物が、ヒドロキシ化合物をメチル化する能力を有する微生物である、上記（１）に記載の組換え微生物。
（３）　プロモーターが、ｋａｐ１プロモーター（配列番号１）である、上記（１）または（２）記載の組換え微生物。
【００１２】
（４）　脱硫遺伝子が、ロドコッカス属ＩＧＴＳ８株由来の脱硫遺伝子、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＡＤ１０９株由来の分解遺伝子、ペニバチルス属Ａ１１−１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０２５）由来の脱硫遺伝子、および同Ａ１１−２株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２６）由来の脱硫遺伝子からなる群より選ばれるいずれか１の遺伝子である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の組換え微生物。
（５）　脱硫遺伝子が、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚ　ＡＢＣＤ（配列番号６）である、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【００１３】
（６）　微生物が、マイコバクテリウム属　ＮＣＩＭＢ１０４０３株またはそれと実質的に同等の菌学的性質を有する細菌である、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の組換え微生物。
（７）　マイコバクテリウム属　ＮＣＩＭＢ１０４０３株に、ｋａｐ１プロモーター（配列番号１）、およびロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚ　ＡＢＣＤ（配列番号６）を、機能しうる態様で導入して作製される組換え微生物。
（８）　上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の組換え微生物を含硫複素環式化合物とともに培養することにより、該含硫複素環式化合物を脱硫する方法。
【００１４】
（９）　含硫複素環式化合物がベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェンおよびそれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１以上の化合物である、上記（８）記載の方法。
（１０）　含硫複素環式化合物がアルキル化ベンゾチオフェン類およびアルキル化ジベンゾチオフェン類からなる群より選ばれる少なくとも１以上の化合物である、上記（８）記載の方法。
（１１）　含硫複素環式化合物の連続的脱硫が可能であることを特徴とする、上記（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、マイコバクテリウム属に属する微生物に、硫酸イオンの抑制を受けることなく恒常的に発現するプロモーターおよびＣ−Ｓ結合を選択的に切断する脱硫遺伝子を機能しうる態様で導入した、組換え微生物を提供する。
【００１６】
１．宿主微生物
本発明の組換え微生物の宿主は、マイコバクテリウム属に属する微生物である。該微生物は、化石燃料中に存在する含硫複素環式化合物から硫黄を脱硫した後に生成するヒドロキシ化合物の水酸基をメチル化できる酵素を有する微生物であることが好ましい。そのような微生物としては、例えば、マイコバクテリウム属ＮＣＩＭＢ１０４０３株およびこれと実質的に同等の菌学的性質を有する菌株を挙げることができる。
【００１７】
ここで、「実質的に同等の菌学的性質を有する菌株」とは、ＮＣＩＭＢ１０４０３株を起源とし、これら菌株と同様にヒドロキシ体をメチル化する能力を有しているが、その起源である菌株とは他の１つ以上の性質において異なっている菌株を意味する。そのような菌株としては、ＮＣＩＭＢ１０４０３株の変異株や形質転換体を挙げることができる。
ＮＣＩＭＢ１０４０３株はＮＣＩＭＢ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ；　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｒｕｇａ−ｇ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｐ／ｎｃｉｍｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）より入手できる。表１に、ＮＣＩＭＢ１０４０３株に関する情報を記載する。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
化石燃料中に存在する含硫複素環式化合物であるジベンゾチオフェン、ベンゾチオフェン、ベンゾテトラナフチールチオフェンもしくはベンゾナフチルチオフェン、またはこれらのアルキル置換体は、脱硫反応後ヒドロキシ体を生成する。このヒドロキシ体は、脱硫反応中に大部分が化石燃料中（油相）に移行するが、一部は菌体内や培養液中（水相）に残存する。そして、ヒドロキシ体は、脱硫酵素をはじめとする微生物の蛋白質に広く阻害作用を有するため、微生物の脱硫活性を次第に低下させる。
【００２０】
しかし、前記微生物は、メチル化反応に必要なメチル供与体であるＳ−アデノシールメチオニンを自ら合成し、脱硫反応の最終生成物であるヒドロキシ体をメチル化することにより、ヒドロキシ体を疎水性のメトキシ体に変換することができる。疎水性の高いメトキシ体は油相中に移行し、これにより脱硫反応の進行に伴う酵素活性の阻害が解消され、連続的な脱硫反応が可能となる。
【００２１】
２．プロモーター
本発明で用いられるプロモーターは、硫酸イオンによる抑制を受けることなく、恒常的に発現するプロモーターであれば、特に限定されない。そのようなプロモーターとしては、例えば、ｋａｐ１プロモーターを挙げることができる。
【００２２】
ｋａｐ１プロモーターは、本発明らが、脱硫細菌　ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）　ＫＡ２−５−１株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１６２７７）から単離したプロモーター（特願２００１−３４８３８４号）で、ロドコッカス属、マイコバクテリウム属、ゴルドニア属等の微生物において、硫酸イオンの影響を受けることなく、恒常的かつ高活性で発現する。したがって、このプロモーター下流に連結された脱硫遺伝子は恒常的に発現し、連続的脱硫反応を可能にする。
【００２３】
ｋａｐ１プロモーターの塩基配列を配列番号１に示すが、この配列に限定されず、配列番号１に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、ｋａｐ１と同等のプロモーター活性を有する限り、ｋａｐ１プロモーターに含まれる。なお、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６５℃、０．５×ＳＳＣ、より好ましくは、５５℃、０．１×ＳＳＣのような条件をいう。
【００２４】
３．脱硫遺伝子
本発明で用いられる脱硫遺伝子は、含硫複素環式化合物のＣ−Ｓ結合を選択的に切断する酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されない。そのような酵素は、アルキル化ジベンゾチオフェン類を脱硫して、相当するヒドロキシビフェニール体を生成することができる。
【００２５】
前記遺伝子としては、例えば、ロドコッカス属ＩＧＴＳ８株由来の脱硫遺伝子（Ｃ．Ｓ．Ｐｉｄｄｉｎｔｏｎ，　Ｂ．Ｒ．Ｋｏｖａｃｅｖｉｃｈ　ａｎｄ　Ｌ．Ｒａｍｂｏｓｅｋ，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６１，４６８−４７５（１９９５））、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子（Ｋ．Ｈｉｒａｓａｗａ，　Ｙ．Ｉｓｈｉｉ，　Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，　Ｋ．Ｋｏｉｚｕｍｉ　ａｎｄ　Ｋ．　Ｍａｒｕｈａｓｈｉ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６５（２），　２３９−２４６，２００１）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属ＡＤ１０９株由来の分解遺伝子（ＷＯ　９８／４５４４６）、ペニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属Ａ１１−１ｌ株およびＡ１１−２株由来の脱硫遺伝子（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６０２５，　ＦＥＲＭ　ＢＰ−２６）を挙げることができる。
【００２６】
特に望ましくは、ロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚ　ＡＢＣＤ（Ｋ．Ｈｉｒａｓａｗａ，　Ｙ．Ｉｓｈｉｉ，　Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，　Ｋ．Ｋｏｉｚｕｍｉ　ａｎｄ　Ｋ．　Ｍａｒｕｈａｓｈｉ，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６５（２），　２３９−２４６，２００１；配列番号６）が用いられる。このＤｓｚＡＢＣＤは難脱硫性のアルキル化ベンゾチオフェンを２−ヒドロキシベンゾチオフェン（２−ＨＢＰ）に分解することができる。
【００２７】
４．組換え微生物の構築
４．１　発現ベクターの作製
本発明の組換え微生物は、マイクロバクテリウム属に属する微生物に、硫酸イオンによる抑制を受けることなく、恒常的に発現するプロモーター（例えば、ｋａｐ１プロモーター）およびＣ−Ｓ結合を選択的に切断する酵素をコードする脱硫遺伝子を機能しうる態様で導入することにより、作製される。
【００２８】
微生物への上記遺伝子の挿入は、該プロモーターおよび脱硫酵素遺伝子を含む発現ベクターを用いて行うことができる。用いられるベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、ファージ、ウィルス、ＹＡＣ等を使用することができるが、特にトランスポゾンまたはトランスポソームを用いることが好ましい。
【００２９】
該発現ベクターは、プロモーターと脱硫遺伝子、あるいはさらに適当なターミネーター配列を、機能しうる態様で含む。ここで、「機能しうる態様」とは、脱硫遺伝子がプロモーターの支配下で適切に発現しうる態様をいう。したがって、脱硫遺伝子はプロモーターの下流に位置することになる。
【００３０】
前記発現ベクターには、上述の必須の配列のほか、その目的と効果を損なわない範囲で、他の遺伝子や配列を含むことができる。該遺伝子や配列としては、例えばプラスミドベクターの複製に関与する遺伝子や組換え体の選抜に使用するマーカー遺伝子、相同性組換えベクターにおける置換用の塩基配列およびトランスポゾンベクターの反復ＤＮＡ配列等が挙げられる。
【００３１】
本発明の好ましい態様として、トランスポゾンを用いた発現ベクターを以下のようにして作製することができる。トランスポゾンを用いた方法は、染色体へのＤＮＡ挿入の強力なツールとして既に当技術分野では公知であり、例えばｐＭＯＤ１（エア・ブラウン社）等を用いた方法等が知られている。
【００３２】
トランスポゾンは転移性遺伝因子とも呼ばれ、宿主生物の染色体内において新たな位置へ移動する独特な能力（転移能力）を有している。そのため、染色体相同組換え法とは大きく異なり、該因子と標的部位との間に相同性のあるＤＮＡ領域を必要としない。またトランスポゾンはその構造上、ＤＮＡの両末端の塩基配列のみがトランスポゾンとしての基本機能、すなわち転移に必要であり、この両末端の塩基配列に挟まれた領域に種々の機能性因子、例えば抗生物質耐性遺伝子のようなマーカー遺伝子、制限酵素切断部位等の任意のＤＮＡ配列を組み込むことが出来る。
【００３３】
トランスポゾンには、選抜をより容易にするために、適当なマーカー遺伝子をレポーター遺伝子とともに挿入することが好ましい。該マーカー遺伝子としては、例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
【００３４】
トランスポゾンの染色体への挿入は、公知の形質転換、形質導入、接合伝達（ｃｏｎｊｕｇａｌ　ｍａｔｉｎｇ）または電気穿孔法等により行うことができる。トランスポゾンの挿入組換え体は、例えば上述のトランスポゾン上のマーカー遺伝子により選抜することができる。
【００３５】
本発明では、ｐＭＯＤ１のように大腸菌内で複製可能なプラスミドに内包されたトランスポゾン内に、硫酸イオンの抑制を受けることなく恒常的に発現するプロモーター（例えば、配列番号１で示される塩基配列からなるｋａｐ１プロモーター）、その下流に脱硫遺伝子（例えば、ｄｓｚＡＢＣＤ遺伝子）および抗生物質耐性因子等の組換え体選抜のためのマーカー遺伝子を組み込む。次に、適当な制限酵素でトランスポゾン部分を切断し、アガロースゲル電気泳動等により単離する。単離したトランスポゾンＤＮＡ断片をトランスポゼースと反応させることにより、宿主内で脱硫酵素遺伝子を発現させる発現ベクターとして使用可能なトランスポソームが調製できる。
【００３６】
４．２　微生物の形質転換
微生物の形質転換は、例えば前記発現ベクターを公知の方法によって宿主微生物に導入することによって達成される。導入法は特に限定されず、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等、利用可能な任意の方法を用いればよい。
【００３７】
４．３　組換え微生物の菌体生産（培養）
前記組換え微生物を、脱硫方法に供する菌体生産ために培養する。培養は、微生物の通常の培養法にしたがって行えばよい。培養の形態は固体培養でも液体培養でもよいが、液体培養が好ましい。培地の栄養源としては通常用いられているものが広く用いられる。炭素源としては利用可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、コハク酸、クエン酸、酢酸等が使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物等の有機栄養物質が使用される。硫黄源としては利用可能な無機硫黄化合物であればよく、たとえば硫酸塩等が使用される。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類等が必要に応じて用いられる。
【００３８】
好適な培地としては、天然栄養培地：例えばＬＢ培地や２ＹＴ培地、あるいは無機塩類を主体とする合成培地：例えば、特開平　１１−１８１４４６号「脱硫活性微生物の製造方法」に記載の組成である基本培地等を用いることができる。培養は、微生物が生育可能である温度、ｐＨで行われ、使用する微生物の最適培養条件で行うのが好ましい。一般的には、培地のｐＨを適当なｐＨ、例えばｐＨ６〜９とし、また、適当な温度、例えば約３０℃にて、振盪または通気条件下で好気的に行われる。
【００３９】
５．　組換え微生物（マイコバクテリウム属　ＭＲ３４株）
本発明にかかる組換え微生物の好ましい例として、マイコバクテリウム属　ＮＣＩＭＢ１０４０３株に、ｋａｐ１プロモーター（配列番号１）、およびロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚ　ＡＢＣＤ（配列番号６）を、機能しうる態様で導入して作製される組換え微生物を挙げることができる。そのような微生物の具体的な例は、マイコバクテリウム属　ＭＲ３４株およびこれと実質的に同等の菌学的性質を有する菌株である。
【００４０】
ＭＲ３４株はヒドロキシ化合物をメチル化する能力を有するマイコバクテリウム属ＮＣＩＭＢ１０４０３株に、ｋａｐ１プロモーターとロドコッカス属ＫＡ２−５−１株由来の脱硫遺伝子ｄｓｚＡＢＣＤ（Ｋ．Ｈｉｒａｓａｗａ，　Ｙ．Ｉｓｈｉｉ，　Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，　Ｋ．Ｋｏｉｚｕｍｉ　ａｎｄ　Ｋ．　Ｍａｒｕｈａｓｈｉ，Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６５（２），　２３９−２４６，２００１）、および組換え体の選抜のための生理的マーカーであるゲンタマイシン耐性因子を、前述したトランスポソームを用いて組み込んだ、組換え微生物である。
【００４１】
ＭＲ３４株は、難脱硫性のアルキル化含硫複素環式化合物の菌体膜透過性が高く、また導入したプロモーターと脱硫酵素遺伝子により、硫酸イオンによる脱硫阻害を受けることなく、効率のよい脱硫が可能である。しかし、これに止まらず、ＭＲ３４株は連続的な脱硫反応が可能である。これは、ＭＲ３４株が分解生成物を疎水性の高いメチル化体に変換する能力があるからである。化石燃料中に存在する含硫複素環式化合物のジベンゾチオフェンとそのアルキル置換体は脱硫反応後、ヒドロキシ体を生成する。生成したヒドロキシ体は脱硫反応中に大部分が化石燃料中である油相中に移行するが、一部は菌体内や培養液中に残存する。そして、このヒドロキシ体は、脱硫酵素をはじめとする微生物の蛋白質に広く阻害作用を有するため、微生物の脱硫活性を次第に低下させる。しかし、ＭＲ３４株は、生成したヒドロキシ体を速やかにメチル化し、疎水性を高めて油相中に移行させることによって、ヒドロキシ体による酵素阻害を解消し、連続的な脱硫反応を可能とする。
【００４２】
特に、水素化脱硫後の化石燃料中に多く含有している４，６位にアルキル側鎖を有するジベンゾチオフェン類から生成するヒドロキシ体はメチル化されやすく、これまでの微生物において特に難脱硫といわれている４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンでさえも、ＭＲ３４株では容易に脱硫することができる。
【００４３】
以上のとおり本発明の組換え微生物は、外部環境に関わらず脱硫酵素を高活性に発現し、難脱硫性のアルキル化含硫複素環式化合物を効率的に脱硫しうる。したがって、工業的レベルでの脱硫菌として、水素化脱硫を補完する脱硫方法に応用可能である。
【００４４】
６．　組換え微生物を用いた脱硫方法
本発明にかかる脱硫方法は、本発明の組換え微生物を含硫複素環式化合物を含む培養液中に添加し、該微生物の生育条件下で連続的に実施することができる。具体的には、本発明の脱硫方法は以下のようにして行われる。
【００４５】
６．１　菌体の培養
まず、新鮮な培地に種菌を適当量、例えば１〜２容量％接種する。培地としては、前項で記載した培地を用いることができるが、特に後述のＮＫＩＩＩ培地（表２）が好ましい。種菌としては、対数増殖期初期から定常期までのいずれかの状態の菌を用いればよく、好ましくは対数増殖期後期のものを用いる。種菌の量は必要に応じて増減することができる。その後、ｐＨ６〜９、約３０℃にて１〜２日間往復または回転振盪培養する。
【００４６】
６．２　連続培養条件下での脱硫
さらに、培地にグルコースを追加添加することにより、菌体の濃度をより上げることができる。好ましくはＯＤ６６０　が３０に達したところで、脱硫対象である化石燃料、例えば、軽油等を添加し、通気攪拌して脱硫反応を開始させる。培地は、前述のＮＫＩＩＩ培地をそのまま用いることができる。脱硫に用いる化石燃料の油量と培養液との油水比は０．０１〜１００の間、特に１〜１０の間が好ましいが、必要に応じて増減できる。反応温度は２５〜３０℃程度が好ましいが、微生物が生育可能な限り、その他の適当な温度でもかまわない。
【００４７】
こうして通気撹拌しながら培養を行い、菌体が一定濃度まで増殖したら、化石燃料をさらにフィードする。連続的に化石燃料をフィードする場合、新鮮培地も同時に添加すると共に、フィードされる化石燃料と等量の半応液を抜き取り、培養液を常に一定量に保つ。抜き取った反応液には水相も混じっているが、この水相は連続反応槽に戻しても良い。
【００４８】
６．３　含硫複素環式化合物
本発明の脱硫方法の対象となる含硫複素環式化合物は、特に限定されず、例えば、石油等の化石燃料油中に含まれる含硫複素環式化合物類を広く対象とすることができる。特にｋａｐ１プロモーターの挿入により、本発明の組換え微生物は外部環境にかかわらず脱硫酵素遺伝子を高いレベルで発現させる。
【００４９】
したがって、挿入する脱硫酵素を選ぶことで、難脱硫性のベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン類やアルキル化ベンゾチオフェン類を好適に脱硫することができる。かかるアルキル化ベンゾチオフェンとしては２−メチルジベンゾチオフェン、３−メチルベンゾチオフェン、５−メチルベンゾチオフェン、５−メチルベンゾチオフェン、２−エチルチオフェン等が例示される。アルキル化ジベンゾチオフェンとしては、４−メチルジベンゾチオフェン、４−エチルジベンゾチオフェン、４−プロピルジベンゾチオフェン、４−ブチルジベンゾチオフェン、４−ペンチルジベンゾチオフェン、４−ヘキシルジベンゾチオフェン、４，６−ジメチルベンゾチオフェン、４，６−ジエチルジベンゾチオフェン、４，６−ジプロピルジベンゾチオフェン、３，４，６−トリメチルジベンゾチオフェン、３−プロピル，４，８−ジメチルジベンゾチオフェン等が例示される。
【００５０】
６．４　本発明の脱硫方法の利点
本発明の脱硫方法は、導入したプロモーターと脱硫酵素遺伝子により、脱硫遺伝子が恒常的に発現し、反応生成物である硫酸イオンによるフィードバック阻害を受けることなく、連続的な脱硫反応が可能になる。
【００５１】
また、宿主として、脱硫生成物であるヒドロキシ体をメチル化する能力を有する微生物を選ぶことで、より効果的な脱硫が可能となる。前述のとおり、脱硫反応の最終生成物であるヒドロキシ体は、脱硫酵素をはじめとする微生物の蛋白質に広く阻害作用を有するため、微生物の脱硫活性を次第に低下させ、連続的な脱硫反応を阻害する。しかし、本発明の脱硫方法では、このヒドロキシ体をメチル化することによって、これをすみやかに油相中に移行させ、酵素阻害作用を解消し、連続的な脱硫反応を可能にすることができる。
【００５２】
以上のとおり、本発明の脱硫方法は、外部環境に関わらず脱硫酵素を高活性に発現させ、含硫複素環式化合物を効率的に脱硫しうる。しかも、生育培養条件下での脱硫方法では、微生物は自ら増殖するため、補充することなく一定の微生物濃度を保つことができる。すなわち、本発明の脱硫方法は、脱硫活性の低下なく、微生物の追加補充の必要性もなく、化石燃料に含有する含硫複素環式化合物を半永久的に連続して脱硫することができる。したがって、水素化脱硫を補完する工業的レベルでの脱硫方法として利用価値が高い。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を参考例および実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
〔参考例１〕プロモーター検索用トランスポゾンの作製
ロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株よりプロモーター配列を検索するためのトランスポゾンを以下のようにして作製した。
（１）　トランスポゾンＤＮＡ断片の作製
トランスポゾンを含むプラスミドであるｐＭＯＤ１（エア・ブラウン社）からトランスポゾンＤＮＡ断片を調製した。まずｐＭＯＤ１をテンプレートとして、以下のプライマーによりＰＣＲ反応を行った。プライマーは、ｐＭＯＤ１に含まれるトランスポゾン中の制限酵素切断部位　ＰｖｕＩＩをＳｔｕＩに置換し、かつ３’側にＨｐａＩの制限酵素認識部位が導入されるようにデザインされている。
プライマー：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５−ＣＣＴＡＧＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧ−３（配列番号２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５−ＣＴＴＡＡＧＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＧＴＴＡＡＣＣＣＴＧＡＡＧＣ−３（配列番号３）
次に、反応液の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１３０ｂｐの遺伝子増幅断片（目的とするトランスポゾンＤＮＡ断片）が得られたことを確認した。
【００５４】
（２）　ｐＭＯＤＳｔの作製
大腸菌由来のベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）　（ストラタジーン社）を制限酵素ＳａｃＩおよびＫｐｎＩと３７℃、１時間反応させ、プラスミドＤＮＡを切断した。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に、これと等容量の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液および２．５容のエタノールを加え、析出した沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ　ＥＤＴＡ　：ｐＨ８．０］に溶解した。回収した溶液に０．１容のＢｌｕｎｔｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ、０．１容のＫＯＤＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を加え、７２℃、５分反応させてＤＮＡ制限酵素切断面を平滑化した。
【００５５】
（１）で調製したｐＭＯＤ１　ＤＮＡ反応液（トランスポゾンＤＮＡ断片含む）とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ（＋）ＤＮＡ断片を含む液を等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を２倍量加え、よく攪拌した後、１６℃、６０分間インキュベートした。
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ　塩化ナトリウム，　０．００２５Ｍ　塩化カリウム、０．０１Ｍ　硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ　塩化マグネシウム、０．０２Ｍ　グルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とうした。得られた大腸菌よりプラスミドを抽出し、その塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンズエルマー社）を用いて解析し、（１）で作製したトランスポゾンＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを選別した。このプラスミドは、ｐＭＯＤＳｔと命名した。
【００５６】
（３）　ｐＴｎＫＳｔの作製
トランスポゾンの抗生物質耐性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を利用するためにｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクター（ＡＴＣＣ　８７０９７　Ｊｕｓｔｉｎ　Ａ．Ｃ．Ｐｏｗｅｌｌ　＆　Ｊｏｈｎ　Ａ．ｃ．Ａｒｃｈｅｒ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｈｐ　ｏｐｅｒｏｎ　”Ａｎｔｏｎｉｅ　ｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ　７４：１７５−１８８，１９９８）より前記マーカー遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を調製した。すなわち、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢをテンプレートとして、以下のプライマーによりＰＣＲ反応を行った。
プライマー：
Ｆｏｒｗａｒｄ：５−ＣＴＡＧＣＴＴＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＣＡＣＴＣＡＧＧＧＣＧＣ−３（配列番号４）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５−ＣＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣ−３（配列番号５）
反応液の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１．２Ｋｂの遺伝子増幅断片が得られたことを確認した。
【００５７】
ｐＭＯＤｓｔを制限酵素ＨｐａＩで３７℃、１時間反応させ、プラスミドＤＮＡを切断した。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離を行い、上層を採取した。採取した上層にその０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ　ＥＤＴＡ　：ｐＨ８．０］に溶解した。上記のｐＫ１８ｍｏｂＳａｃＢ　ＤＮＡ　反応物とｐＭＯＤｓｔ　ＤＮＡ断片を含む液を等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を２容加え、よく攪拌した後、１６℃、６０分間インキュベートした。
【００５８】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ　塩化ナトリウム，　０．００２５Ｍ　塩化カリウム、０．０１Ｍ　硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ　塩化マグネシウム、０．０２Ｍグルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とうした。次にカナマイシン硫酸塩２００ｐｐｍを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、バクトアガー１．５％］に塗沫した。カナマイシン耐性を示した大腸菌よりプラスミドを抽出し、これらのプラスミドの塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンズエルマー社）を用いて解析し、目的の改変がなされたプラスミドを選別した。このプラスミドをｐＴｎＫＳｔと命名した。
【００５９】
（４）　レポーター遺伝子（ｒｓＧＦＰ）の挿入
プロモーター配列の挿入を視覚的に確認できるよう、ｐＱＢＩ６３（宝酒造社）由来のｒｓＧＦＰ（ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子をレポーター遺伝子として挿入した。まず、ｐＱＢＩ６３を制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで３７℃、１時間反応させて切断後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、約８００ｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸ　ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収し、ｒｓＧＦＰを調製した。このｒｓＧＦＰ　ＤＮＡ断片溶液を同様にＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＴｎＫＳｔ　ＤＮＡ溶液と等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を２容加え、よく攪拌した後、１６℃、６０分間インキュベートした。
【００６０】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ　塩化ナトリウム，　０．００２５Ｍ　塩化カリウム、０．０１Ｍ　硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ　塩化マグネシウム、０．０２Ｍグルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とうした。次にカナマイシン硫酸塩２００ｐｐｍを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、バクトアガー１．５％］に前記反応液を塗沫した。得られた大腸菌よりプラスミドを抽出し、これらのプラスミドの塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンズエルマー社）を用いて解析し、ｒｓＧＦＰが挿入されたプラスミドを選別した。このプラスミドをｐＴｎＫｇｆｐと命名した。
【００６１】
このようにして作製したｐＴｎＫｇｆｐを制限酵素ＳｔｕＩで３７℃、１時間反応させて切断後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけて、約２．２ＫｂのＤＮＡ断片をＧＦＸ　ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収した。回収したＤＮＡ溶液と等容量のトランスポゾーム溶液を加え、さらに２容の１００％グリセロールを加えてよく混ぜた後、室温にて２０分インキュベートした。調製したプロモーター検索用トランスポゾンをＴｎＫｇｆｐと命名した。
【００６２】
〔参考例２〕ロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株からのプロモーターの単離
（１）　トランスポゾンＴｎＫｇｆｐによるレポーター遺伝子の導入
５００ｍｌ容三角フラスコに入った滅菌済みのＬＢ培地１００ｍｌにロドコッカス・エリスロポリスＫＡ２−５−１株を植菌し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液を４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を滅菌水にて２回洗浄後、測定波長６６０ｎｍでの濁度が４０になるように１０％グリセロール水溶液に懸濁した。
【００６３】
前記懸濁液８０μｌに参考例１で調製したＴｎＫｇｆｐ溶液１μｌを添加し、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド社）を用いて２５μＦ、４００Ω、１．５ｋＶ／ｃｍの条件で処理した。処理液にＳＯＣ培地　０．４２ｍｌを添加し、３０℃、３時間培養を行った。得られた培養液をカナマイシン硫酸塩１００ｍｇ／ｌ、硫酸アンモニウム０．１ｍＭおよび寒天末１５　ｇ／ｌを含む基本培地（Ａ−ＫｍＡＳＡ培地）に塗末し、３０℃、４８時間培養した。基本培地は、特開平　１１−１８１４４６号「脱硫活性微生物の製造方法」に記載の組成を用いた。Ａ−ＫｍＡＳＡ培地においてコロニーを形成した菌を３０２ｎｍの紫外線照射下で観察し、ｒｓＧＦＰ特有の蛍光緑色を呈したコロニーを選抜した。
【００６４】
選抜したコロニーを硫酸アンモニウム０．１ｍＭおよびカナマイシン１００ｍｇ／ｌを含む基本培地２ｍｌに、１白菌耳量を植菌し、３０℃で７２時間培養した。培養液を４℃、１７０００ｇで５分間遠心分離し、沈殿した菌体を採取した。採取した菌体よりＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いて染色体ＤＮＡを分離精製した。
精製した染色体ＤＮＡの全量を制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間反応させ、染色体ＤＮＡを切断した。切断した染色体ＤＮＡは、ＧＦＸ　ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて精製した。
【００６５】
（２）　プロモーターのクローニングおよび塩基配列の決定
一方、大腸菌由来のベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）　（ストラタジーン社）を制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１時間反応させ、プラスミドＤＮＡを切断した。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ　ＥＤＴＡ　：ｐＨ８．０］に溶解した。
上記の染色体ＤＮＡ　反応物とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（＋）ＤＮＡ断片を含む液を等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（東洋紡社製）　を２容加え、よく攪拌した後、１６℃、６０分間インキュベートした。
【００６６】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ　塩化ナトリウム，　０．００２５Ｍ　塩化カリウム、０．０１Ｍ　硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ　塩化マグネシウム、０．０２Ｍグルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とうした。得られた培養液０．１ｍｌをカナマイシン２５ｍｇ／ｌ、寒天１５ｇ／１を含むＬＢ培地に塗布し、３７℃、１昼夜培養した。得られた大腸菌よりプラスミドを抽出し、これらのプラスミドの塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンズエルマー社）を用いて決定した。得られた塩基配列データは、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ／ＡＴＳＱ　ｖ３．０　およびＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ　ｖ８．０を用いて解析した。解析の結果得られた約３５０ｂｐの大腸菌プロモーターと相同性の高いＤＮＡ配列をＫＡＰ１と命名し、ＫＡＰ１を含むプラスミドをｐＫＡＰ１と命名した。
【００６７】
ｐＫＡＰ１のＤＮＡ溶液にＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを添加し、３７℃、１時間インキュベートした。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ　ＥＤＴＡ　：ｐＨ８．０］に溶解し、ＫＡＰ１　ＤＮＡ断片溶液とした。
【００６８】
〔参考例３〕　ロドコッカス・エリスロポリス　ＫＡ２−５−１株由来の　ｄｓｚＡＢＣＤ　ＤＮＡ断片の調製
（１）　ｐＳＫＡＢＣの作製
ロドコッカス・エリスロポリス　ＫＡ２−５−１株のｄｓｚＡＢＣＤ　遺伝子を含む組換えプラスミドｐＲＫＰＰＢＢ（　Ｋａｚｕａｋｉ　Ｈｉｒａｓａｗａ　ｅｔ．ａｌ．，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６５
【００６９】
（２）　２３９−２４６　（２００１））溶液にＤｒａＩ　及び　ＸｂａＩ溶液を添加し、３７℃、１時間インキュベートした。得られた反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動を用いてＤＮＡを分離し、約５．０　ｋｂのＤＮＡ断片をＧＦＸ　ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ　ＥＤＴＡ　：ｐＨ８．０］に溶解し、ｄｓｚＡＢＣＤ　を含むＤＮＡ断片とした。回収した溶液に０．１容のＢｌｕｎｔｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ、０．１容のＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を加え、７２℃、５分間反応させてＤＮＡ制限酵素切断面を平滑化した。
【００７０】
一方、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）（ストラタジーン社）を含む溶液にＳｍａＩ及びＥｃｏＲＶ溶液を添加し、３７℃、１時間インキュベートした。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に、その０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ　ＥＤＴＡ　：ｐＨ８．０］に溶解し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）／ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ断片とした。
上記のｄｓｚＡＢＣＤ　を含むＤＮＡ断片とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）／ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ断片を含む溶液を等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を２容加え、よく攪拌した後、１６℃、１時間インキュベートした。
【００７１】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ　塩化ナトリウム，　０．００２５Ｍ　塩化カリウム、０．０１Ｍ　硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ　塩化マグネシウム、０．０２Ｍグルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間振とうした。得られた大腸菌よりプラスミドを抽出し、これらのプラスミドの塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社製）を用いて目的のＤＮＡが挿入されたプラスミドを選別した。このプラスミドをｐＳＫＡＢＣと命名した。
【００７２】
（２）　ｄｓｚＡＢＣＤ　を含むＤＮＡ断片の作製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）（ストラタジーン社）にｄｓｚＡＢＣＤ　遺伝子を含む組換えプラスミドｐＳＫＡＢＣ　溶液を加え、Ｘｂａ　Ｉ　及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ溶液を添加して３７℃、１時間インキュベートし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）のＸｂａＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩサイトにｄｓｚＡＢＣＤ　遺伝子群を組み込んだ。反応液は０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、約５．０ｋｂのＤＮＡ断片をＧＦＸ　ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ　ＥＤＴＡ　：ｐＨ８．０］に溶解して、ｄｓｚＡＢＣＤ　を含むＤＮＡ断片とした。
【００７３】
〔実施例１〕　ＴｎＧＫＡＰＤＳ　の作製
（１）　ｐＴｎＧＳｔの作製
トランスポゾンの抗生物質耐性マーカーとしてゲンタマイシン耐性遺伝子を利用するためにｐＪＱ２００　（入手先ＡＴＣＣ７７４８２）より前記マーカー遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍａＩ−　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　により調製した。
反応液の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約１．４Ｋｂの遺伝子増幅断片が得られたことを確認した。
【００７４】
ＰＭＯＤｓｔ（参考例１）を制限酵素ＨｐａＩで３７℃、１時間反応させ、プラスミドＤＮＡを切断した。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離を行い、上層を採取した。採取した上層にその０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ　ＥＤＴＡ　：ｐＨ８．０］に溶解した。上記のｐＪＱ２００のＤＮＡ　断片とｐＭＯＤｓｔ　ＤＮＡ断片を含む液を等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を２容加え、よく攪拌した後、１６℃、６０分間インキュベートした。
【００７５】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ　塩化ナトリウム，　０．００２５Ｍ　塩化カリウム、０．０１Ｍ　硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ　塩化マグネシウム、０．０２Ｍグルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とうした。次にゲンタマイシン硫酸塩２００ｐｐｍを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、バクトアガー１．５％］に塗沫した。ゲンタマイシン耐性を示した大腸菌よりプラスミドを抽出し、これらのプラスミドの塩基配列を３１０型ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンズエルマー社）を用いて解析し、目的の改変がなされたプラスミドを選別した。このプラスミドをｐＴｎＧＳｔと命名した。
【００７６】
（２）　ＴｎＧｓｔ／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片の作製
一方、トランスポゾンベクターｐＴｎＧｓｔを含むＤＮＡ溶液にＥｃｏＲＩおよび、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ溶液を添加し、３７℃、１時間インキュベートした。この溶液に等容量のフェノールクロロホルムを加えてよく混ぜた後、４℃、１７０００ｇで１０分間遠心分離し、上層を採取した。採取した上層に０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５容のエタノールを加え、析出する沈殿物を遠心分離により回収し、ＴＥ緩衝液［０．０２５Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０．０２５Ｍ　ＥＤＴＡ　：ｐＨ８．０］に溶解し、ＴｎＧｓｔ／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片とした。
【００７７】
（３）　組換えトランスポゾンＴｎＧＫＡＰＤＳの作製
上記のようにして得られたＴｎＧｓｔ／ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩのＤＮＡ断片溶液、ｄｓｚＡＢＣＤ　ＤＮＡ断片溶液（参考例３参照）、およびｋａｐ１　ＤＮＡ断片溶液（参考例１および２参照）を各等容量ずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ　（東洋紡社）を３容加え、よく攪拌した後、１６℃、３０分間インキュベートした。
【００７８】
大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、４２℃、１分間の熱処理を行い、ＳＯＣ培地［トリプトン２％、酵母エキス０．５％、０．０２５Ｍ　塩化ナトリウム，　０．００２５Ｍ　塩化カリウム、０．０１Ｍ　硫酸マグネシウム、０．０１Ｍ　塩化マグネシウム、０．０２Ｍ　グルコース：ｐＨ７．４］を加えて、３７℃、１時間、振とう培養した。得られた培養液０．１ｍｌをゲンタマイシン２５ｍｇ／ｌ、寒天１５ｇ／１を含むＬＢ培地に塗布し、３７℃、１昼夜培養した。得られた培養コロニーをゲンタマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地１．５ｍｌに植菌し、ＧＦＸ　ｍｉｃｒｏ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｋｉｔ（アマシャムファルマシア）を用いて調製したプラスミドＤＮＡを、５０μｌ　ＴＥ緩衝液に溶解し、ｐＴｎＧＫＡＰＤＳ遺伝子溶液とした。このようにして作製したｐＴｎＧＫＡＰＤＳ遺伝子溶液を制限酵素ＳｔｕＩで３７℃、１時間反応後、０．７％アガロースゲル電気泳動にかけ、約６ＫｂのＤＮＡ断片をＧＦＸ　ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社製）を用いて回収した。回収したＤＮＡ溶液に等容量のトランスポゾーム溶液を加え、さらに２容の１００％グリセロールを加えてよく混ぜた後、室温にて２０分インキュベートした。調製した組換えトランスポゾンをＴｎＧＫＡＰＤＳと命名した。
【００７９】
〔実施例２〕　マイコバクテリウム　ｓｐ．　ＮＣＩＭＢ１０４０３株のＴｎＧＫＡＰＤＳによる形質転換
５００ｍｌ容三角フラスコに入った滅菌済みのＬＢ培地１００ｍｌにマイコバクテリウム属ＮＣＩＭＢ１０４０３株（ＮＣＩＭＢ：Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ（　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｒｕｇａ−ｇ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｐ／ｎｃｉｍｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ”　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｒｕｇａ−ｇ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｐ／ｎｃｉｍｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）より入手）を植菌し、３０℃で２４時間培養した。得られた培養液を４℃、１０，０００ｒｐｍ、１０分遠心分離し、沈殿を滅菌水にて２回洗浄し、測定波長６６０ｎｍでの濁度が４０になるように１０％グリセロール水溶液に懸濁した。
【００８０】
該懸濁液８０μｌにＴｎＧＫＡＰＤＳ　トランスポゾン溶液１μｌを添加し、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド社）を用いて２５μＦ、４００Ω、１．５ｋＶ／ｃｍの条件で処理した。処理液にＳＯＣ培地０．４２ｍｌを添加し、３０℃、３時間培養した。得られた培養液を４℃、１０，０００ｇで遠心分離し、溶液部分を廃棄して等容量のＮＫＩＩＩ培地（表２）に再懸濁した。
【００８１】
【表２】
2004049116.tif 000003
【００８２】
得られた菌懸濁液を、１００ｍｌ容三角フラスコに入った培地（ＮＫＩＩＩ培地から硫黄源のみを除いた培地１０ｍｌに同容の４，６−ジエチルジベンゾチオフェン３００ｍｇ／ｌを含むテトラデカンを添加したもの）に添加し、３０℃で７２時間培養した。培養液をジベンゾチオフェン２５ｍｇ／ｌと寒天１５ｇ／ｌを含むジベンゾチオフェン寒天ＮＫＩＩＩ培地に塗布し、単一コロニーとして取得した。このＮＣＩＭＢ１０４０３株のＴｎＧＫＡＰＤＳ　による形質転換株をマイコバクテリウムＭＲ３４株と命名した。
【００８３】
〔実施例３〕　マイコバクテリウムＭＲ３４株による化石燃料中の含複素環式化合物に対する脱硫活性試験
（１）試験方法
ＮＫＩＩＩ培地（表２）１０ｍｌに、１白菌耳量のマイコバクテリウムＭＲ３４株を植菌し、３０℃で２４時間培養した。この培養液を上記と同じ組成の培地１００ｍｌに移植し、３０℃で培養し、グルコースの残存量をモニターして、グルコース濃度が０．５ｇ／ｌ以上に保たれるように、グルコースを追加添加しながら培養を行った。菌体濃度がＯＤ６６０ｎｍ＝３になったところで、ジベンゾチオフェンまたは４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンを含むｎ−ヘキサデカン溶液１００ｍｌを加え、３０℃にて１５０ｒｐｍで振とうし、脱硫反応を開始した。脱硫活性は経時的に油相中の４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンを測定することにより行った。
【００８４】
脱硫活性測定は、以下の条件で高速液体クロマトグラフィーにより、ｎ−ヘキサデカン中の４，６−ジプロピルジベンゾチオフェン量を測定することにより行った。
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム：ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー），　４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５ｃｍ
溶離液：Ａ−−−５％アセトニトリル水溶液（１％リン酸含有）
Ｂ−−−アセトニトリル（１％リン酸含有）
Ａ；　２５％　Ｂ；　７５％，
流速　：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
カラム温度：４０℃
検出器：多波長検出器　ＰＤ８０２０（東ソー）（定量波長：２４６ｎｍ）
【００８５】
（２）試験結果
反応液中のヒドロキシ体とメトキシ体の定量値を表３に示した。その結果、脱硫反応生成物であるヒドロキシ体の水相（培養液および菌体内）中の定量値は、油相中の定量値の約１００分の４であったが、メチル化体の水相中の定量値は油相中の定量値の約１０００分の４であり、メトキシ体はヒドロキシ体の１０分の１程度しか検出されなかった（表３）。一方、ＨＰＬＣの結果を図１に示したが、マイコバクテリウムＭＲ３４株では反応時間と共に全てのヒドロキシ体がメチル化され、４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンの脱硫最終生成物もメチル化されることが確認された（図１）。
【００８６】
【表３】
2004049116.tif 000004
【００８７】
〔実施例４〕　マイコバクテリウムＭＲ３４株による４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンに対する脱硫活性試験
（１）試験方法
実施例３において、最も流速の遅かった４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンについて、マイコバクテリウムＭＲ３４株を用いてさらに脱硫活性試験を行った。まず、ＮＫＩＩＩ培地（表２）１０ｍｌに、１白菌耳量のマイコバクテリウムＭＲ３４株を植菌し、３０℃で２４時間培養した。この培養液を上記と同じ組成の培地１００ｍｌに移植し、３０℃で培養し、グルコースの残存量をモニターして、グルコース濃度が０．５ｇ／ｌ以上に保たれるように、グルコールを追加添加しながら培養を行った。菌体濃度がＯＤ６６０ｎｍ＝３０になったところで、１．４　ｍＭ　４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンを含むｎ−ヘキサデカン溶液１００ｍｌを加え、３０℃にて１５０ｒｐｍで振とうし、脱硫反応を開始した。脱硫活性は経時的に油相中の４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンを測定することにより行った。対照としてロドコッカス　エリスロポリスＫＡ２−５−１株を用いて同様に脱硫活性の測定を行った。脱硫活性測定は、実施例３と同様の方法でｎ−ヘキサデカン中の４，６−ジプロピルジベンゾチオフェン量を測定することにより行った。
【００８８】
（２）試験結果
マイコバクテリウムＭＲ３４株およびＫＡ２−５−１株の脱硫反応試験結果を図２に示した。ＭＲ３４株において、ｎ−ヘキサデカン中の４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンは速やかに脱硫されたが、ロドコッカス　エリスロポリスＫＡ２−５−１株においては脱硫活性は極めて低かった。マイコバクテリウムＭＲ３４株は高い脱硫活性を示した。
【００８９】
このようにマイコバクテリウムＭＲ３４株が高い脱硫活性を示した理由としては、以下のようなことが考えられる。
▲１▼　脱硫反応中に生成した硫酸イオンのためにロドコッカス　エリスロポリスＫＡ２−５−１株では増殖菌体中の脱硫酵素遺伝子の発現が一部抑制され、脱硫酵素量が少なかったが、ＭＲ３４株ではこのような抑制はなかった。
▲２▼　４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンは長いアルキル側鎖を有するために菌体膜透過性が非常に低い。しかし、こうした膜透過性が低いアルキル化ジベンゾチオフェンに対して、ＭＲ３４株はＫＡ２−５−１株よりも菌体膜透過性が高い。そのため、４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンをより効果的に脱硫できた。
▲３▼　マイコバクテリウムＭＲ３４株は生成したヒドロキシ体を速やかにメチル化し、油相中に移行させたため、ヒドロキシ体による脱硫酵素蛋白および広く菌体内蛋白への阻害作用をほとんど受けなかった。したがって、菌体増殖速度も高く、高い脱硫活性を維持できた
【００９０】
〔実施例５〕　マイコバクテリウムＭＲ３４株による軽油の半連続的脱硫試験
（１）試験方法
ＮＫＩＩＩ培地（表２）２ｍｌに、１白菌耳量のマイコバクテリウムＭＲ３４株を植菌し、３０℃で２４時間培養した。この培養液１０ｍｌを上記と同じ組成の培地１００ｍｌに移植し、３０℃で培養を行い、実施例３と同様に培養を行った後、菌体濃度がＯＤ６６０ｎｍ＝３０となったところで同量の軽油を加え、３０℃にて１５０ｒｐｍで振とうし、脱硫反応を開始した。脱硫反応４時間毎に半分量の軽油を抜き取った後、同量の軽油を添加した。さらに、軽油の抜き取りとともに、抜き取った培養液分の１０％に相当する新鮮培地を添加して引き続き、脱硫反応を継続させた。脱硫活性は、抜き取った軽油中の硫黄濃度を７０００Ｓ硫黄分析機（Ａｎｔｅｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｔｅｘａｓ，　ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００９１】
（２）試験結果
マイコバクテリウムＭＲ３４株による軽油の半連続脱硫反応の経時変化を図３に示す。図３から明らかなように、マイコバクテリウムＭＲ３４株は、用いたＦ−軽油の硫黄濃度１２０ｍｇ／ｌを６０ｍｇ／ｌまで脱硫させた。半分量の軽油を抜き取った後、同量の新鮮軽油を添加した後、２時間毎に同様の操作を行い、半連続的に脱硫反応を行ったが、脱硫活性は低下することはなかった。
【００９２】
【発明の効果】
本発明によれば、化石燃料中に含有されるジベンゾチオフェン類、ベンゾチオフェン類、ベンゾテトラナフチールチオフェン類、ベンゾナフチルチオフェン類などの含硫複素環式化合物を、培養条件下で連続的に脱硫することができる。
【００９３】
【配列表】
2004049116.tif 000005
2004049116.tif 000006
2004049116.tif 000007
2004049116.tif 000008
2004049116.tif 000009
2004049116.tif 000010
【００９４】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：ｄｓｚＡＢＣＤ
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マイコバクテリウム　ＭＲ３４株による脱硫活性試験結果（ＨＰＬＣ分析結果）を示すグラフである。
【図２】図２は、ＭＲ３４株の培養菌体による、４，６−ジプロピルジベンゾチオフェンの脱硫反応の経時変化を示すグラフである。
【図３】図３は、ＭＲ３４株培養条件下での軽油の半連続脱硫反応の経時変化を示すグラフである。
【図１】
2004049116.tif 000011
【図２】
2004049116.tif 000012
【図３】
2004049116.tif 000013