(57)【要約】【課題】本発明は、転写レベルでの遺伝子の発現を調節する方法を提供する。また、遺伝子発現を調節し得る化合物を同定する方法も提供する。【解決手段】遺伝子の発現を調節する方法は、転写コアクチベーターを、標的核酸配列に特異的なDNA結合ドメインに連結させ、コアクチベーターと転写因子とを接触させることを含む。転写因子は、コアクチベーターによって介在される転写を誘発または抑制する。遺伝子発現を調節し得る化合物を同定する方法は、応答配列に作動可能に連結したレポーター遺伝子を含む核酸を提供し、該核酸と連結型コアクチベーターとを接触させることを含む。                                                                                          【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の遺伝子の転写を調節し得る試験化合物を同定する方法であって、
ｉ．応答配列に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸を提供すること、
ｉｉ．ａ）転写コアクチベーターから誘導される活性化機能を含むポリペプチド、および
ｂ）前記応答配列に特異的に結合し得るＤＮＡ結合部分
を含む連結型コアクチベーターと、
前記核酸とを接触させること、
ｉｉｉ． 連結型コアクチベーターと、天然環境において前記目的の遺伝子の発現の調節に関与する転写因子に由来する活性化機能を有するポリペプチドとを接触させることであって、ここで前記転写因子ポリペプチドは、前記キメラタンパク質との接触の前に前記試験化合物と接触されること、ならびに
ｉｖ．前記レポーター遺伝子の発現を検出すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記方法が細胞内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記転写因子ポリペプチドが、前記転写因子ポリペプチドをコードする異種遺伝子の細胞内での発現によって提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記調節が活性化である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記応答配列が前記目的の遺伝子に対して異種である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記転写因子が核ホルモン受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核ホルモン受容体がその天然のホルモンに会合する能力を、前記試験化合物が妨害する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試験化合物が、その能力において天然のホルモンの擬似物として作用し、核ホルモン受容体の活性を調節する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記転写因子がエストロゲン受容体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
非直接的エストロゲン応答を調節する能力について試験化合物をスクリーニングする方法であって、
ｉ．エストロゲン受容体と、レポーター遺伝子の発現を調節するＡＰ１部位を含むプロモーターとを含む細胞を提供すること、
ｉｉ．ａ）転写コアクチベーターから誘導される活性化機能を含むポリペプチド、および
ｂ）前記ＡＰ１部位に特異的に結合し得るＤＮＡ結合部分、
を含む連結型コアクチベーターと、
前記細胞とを接触させること、
ｉｉｉ． 前記細胞と前記試験化合物とを接触させること、ならびに
ｉｖ．前記レポーター遺伝子の発現を検出すること、
を含む方法。
【請求項１１】
前記細胞と前記連結型コアクチベーターとの接触の前に、前記細胞が前記試験化合物に接触される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、1997年４月４日に提出された米国仮出願第60/043,059号の利益を請求するものである。
連邦政府支援による研究に関する状態
本発明は、国立衛生研究所より与えられた承認番号第DK51083号および米軍より与えられた承認番号第AIBS 562号に基づく政府援助金により行われた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、転写レベルにおける遺伝子発現の調節の分野に関する。
本方法は、転写コアクチベーターを、応答配列に特異的なＤＮＡ結合ドメインに連結させ、コアクチベーターと転写因子とを接触させることを含む。
【背景技術】
【０００３】
多くの遺伝子の発現には、遺伝子の転写を増加または減少させるシグナルが介在する。例えば、細胞内または細胞の近傍にホルモンまたは他の化合物が存在するかまたは存在しないことによって、細胞内の特定の遺伝子または遺伝子ファミリーの発現のスイッチを入れたり、切ったりすることができる。細胞内または細胞間刺激に対する応答において遺伝子発現を調節することは、例えば、そのような調節が生物の発達に必要な場合、または生物環境の変化に対する生物の能力に必要な場合にしばしば所望される。しかし、場合により、遺伝子の発現が不適切に作動したり停止することがある。例えば、エストロゲン介在性遺伝子発現がいくつかの種類の乳癌および卵巣癌に関与することを示唆するいくつかの証拠がある。
【０００４】
エストロゲンおよび転写の他のモジュレーターが遺伝子発現に影響を及ぼす機構は複雑であり、完全には理解されていない。エストロゲンおよび他のステロイドホルモンの場合、例えば、ホルモンは、該ホルモンに特異的な核受容体に結合する。ホルモンが受容体に結合すると形態的変化が生じ、受容体は特定の標的部位に結合することができる。この標的部位はしばしば「応答配列」と呼ばれ、ホルモンによって調節される遺伝子の上流に位置する。核ホルモン受容体が介在する転写の調節には更に別のタンパク質も関与する。例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）は、２つのクラスのコアクチベーターに結合する。第１のクラスはP160と呼ばれ、SRC-1aおよびGRIP-1/TIF-2が挙げられる。これらのタンパク質は、ホルモンおよびリガンド結合ドメイン（LBD）トランス活性化機能（AF2）の完全さに依存する方法で核受容体のLBDと相互作用する。Onateら、Science 270：1354-7(1995)；Voegelら、ＥＭＢＯＪ.15:3667-3675；Hongら、Proc.Natl.Acad．Sci.USA 93:4948-52(1996)；Halachmiら、Science 264:1455-1458(1994)；Cavaillesら、Proc.Nat'l.Acad．Sci．USA 91：10009-10013(1994)。第２のクラスはCBPおよび密接に関連したタンパク質P300から成る。これらは、CREB、Jun/Fosなどの転写因子（現在も発見されてその種類が増えている）の転写活性化に必要である。Kameiら、Cell 85:403-14(1996)：Chakravartiら、Nature 383:99-103(1996)；Smithら、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 93:8884-8888(1996)；Hansteinら、Proc.Nat'l Acad.USA 93：11540-11545(1996)；JanknechtおよびHunter、Nature 383:22-23(1996)。２つのタイプのコアクチベーターは、ER介在性の転写活性化に必須である。p160ファミリーの要素が過剰発現すると核受容体の作用が増強されるが、主要なネガティブSRC-1aおよびGRIP-1は核受容体作用を阻害する。Onateら、前掲；Hongら、前掲。同様に、CBPまたはp300の過剰発現はER作用を増強するが、マイクロインジェクションされた抗CBP抗体は核受容体作用を阻害する。Kameiら、前掲；Chakravartiら、前掲。p160は、インビボでCBPおよびp300に強固に結合し(Kameiら、前掲；Hansteinら、前掲)、SRC-1aおよびCBPはインビトロでTBPおよびTFIIBの両方に結合する（Swopeら、J.Biol．Chem．271:28131-28145(1996)；Kwokら、Nature 370:223-226(1994)）ため、プロモーターにp160-CBP複合体を添入することによってERが作動し、この複合体が基本転写機構（BTM）への仲立ちとなっているモデルが仮定されている。
【０００５】
しかし、これらの初期の仮定は、ホルモンによる遺伝子発現の調節に関する全ての観察を説明するものではない。例えば、タモキシフェンおよび関連のアンチエストロゲンは、ホルモン依存性の乳癌を治療するのに使用され、ERに結合して、エストロゲンによるERの活性化を阻害する。しかし、タモキシフェンは、子宮細胞などの特定のタイプの細胞では、エストロゲン調節型遺伝子を抑制するよりむしろ活性化するという所望されない副作用を有する。Webbら、Mol．Endocrinol.9:443-456。これらのアンチエストロゲンによって活性化される遺伝子のプロモーター領域は、エストロゲン応答配列よりむしろAP-1応答配列を有することが見出されたが、アンチエストロゲンがER介在性転写を抑制するにも係わらず、AP-1介在性転写を活性化するという逆説的効果を及ぼし得るこの機構については依然として明らかにされていない。特定の農薬および他の化学物質などのような他のエストロゲン「類似物」は、特定の遺伝子に不適切なシグナルを出して、これらの遺伝子を所望されない方法で発現または抑制し、オスの「メス化」を引き起こし得る。これらのエストロゲン類似物は、これらの類似物が化学的にはエストロゲンには関連しないように見えていても、エストロゲンと同様に作用する可能性がある。他の化学物質も、神経伝達物質および成長因子などの他のクラスのシグナル分子の効果を不適切に刺激または抑制し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子発現を調節する方法は、多くの症状を治療するのに極めて重要であるが、核ホルモン受容体などの部分が遺伝子発現に対して効果を及ぼす機構が理解されていないために、そのような方法の開発は妨げられている。従って、遺伝子発現を調節する方法、およびシグナルが介在する遺伝子発現の変化を刺激または抑制し得る化合物を同定する方法が必要とされている。本発明は、これらおよび他の要件を達成するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、転写因子によって調節される遺伝子の発現を刺激する方法を提供する。本方法は、連結型コアクチベーターと、応答配列に作動可能に連結した目的の遺伝子を含む核酸とを接触させることを含む。連結型コアクチベーターは、転写コアクチベーターに由来する活性化機能を含むポリペプチド、および応答配列に特異的に結合し得るDNA結合部分を含む。連結型コアクチベーターは、転写因子から誘導される活性化機能を含む活性型転写因子ポリペプチドと接触する。連結型コアクチベーターと活性型転写因子ポリペプチドが接触すると、遺伝子の発現が刺激される。例えば、転写因子は、エストロゲン受容体またはエストロゲン受容体β、またはAP1転写因子などの核ホルモン受容体であり得る。
【０００８】
もう１つの実施態様において、本発明は、応答配列に作動可能に連結した目的の遺伝子を含む核酸と連結型コアクチベーターとを接触させることによって、遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。連結型コアクチベーターは、転写子アクチベーターに由来する活性化機能および応答配列に特異的に結合し得るDNA部分を含む。連結型コアクチベーターは、予め活性化されて、転写因子に由来する抑制機能を含む活性型転写因子ポリペプチドと接触する。連結型コアクチベーターと活性型転写因子ポリペプチドとが接触すると、遺伝子の発現が抑制される。
【０００９】
本発明のもう１つの実施態様は、目的の遺伝子の転写を調節し得る試験化合物を同定する方法を提供する。本方法は、応答配列に作動可能に連結したレポーター遺伝子を含む核酸を提供し、該核酸と連結型コアクチベーターとを接触させることを含む。連結型コアクチベーターは、転写子アクチベーターに由来する活性化機能を有するポリペプチドおよび応答配列に特異的に結合し得るDNA結合部分を含む。連結型コアクチベーターは、天然の環境において目的の遺伝子発現の調節に関与する転写因子に由来する活性化機能を含む転写因子ポリペプチドと接触させる。連結型コアクチベーターに接触する前に、転写因子ポリペプチドを試験化合物に接触させる。レポーター遺伝子の発現を検出して、試験化合物が転写に影響を及ぼすかどうかを調べる。
【００１０】
もう１つの実施態様において、本発明は、非間接的エストロゲン応答を刺激または抑制する能力について試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。本方法は、エストロゲン受容体、およびAP1部位によって調節されるレポーター遺伝子、を含有する細胞を提供することを含む。連結型コアクチベーターは、AP1部位と会合するポリペプチドと接触する状態になるように、細胞内に配置される。細胞もまた試験化合物に接触し、レポーター遺伝子の発現が検出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
定義
本明細書において使用される「転写因子」は、遺伝子発現の刺激または抑制に関与するポリペプチドを含む。一般に、転写因子は、BarmesおよびAdcock,Clin.Exp.Allergy 25補遺2:46-9(1995)ならびにRoeder,Methods Enzymol.273:165-71(1996)において考察されている。転写因子は、該転写因子の少なくとも一部の制御下で発現される遺伝子の調節領域内のDNAに結合することができる。
【００１２】
「転写因子由来の活性化機能」とは、転写因子の部分がコアクチベーターに接触しようとする場合に、転写を刺激または抑制することができる該転写因子の機能をいう。
【００１３】
転写因子ポリペプチドが、特定の転写因子によって調節される遺伝子の転写を刺激または抑制し得るように、該転写因子ポリペプチドを修飾するリガントに接触する場合、この転写因子ポリペプチドを、それぞれ、「活性型」または「サイレント型」という。
【００１４】
本明細書において使用される「コアクチベーター」または「転写コアクチベーター」は、転写活性化を介在するのに必要なポリペプチドを含む。コアクチベーターは、基本転写には必要とされないが、シグナルに対する応答での遺伝子の発現の刺激に関与している。コアクチベーターは、天然の状態ではDNA結合ドメインを含まない。
【００１５】
転写メディエーターが天然に存在する状態で遺伝子の発現を調節する場合、転写因子、コアクチベーター、または他の転写メディエーターは天然の環境内で遺伝子の発現の調節に関与すると言われる。例えば、該遺伝子は、応答配列、および天然で生じた場合同様に遺伝子の発現を制御するプロモーターを有する。
【００１６】
用語「標的核酸」は、ポリペプチドまたは相補的核酸が特異的に結合することができる核酸配列をいう。本明細書において使用される「特異的に結合する」とは、ポリペプチドまたは相補的核酸が標的核酸に結合することをいう場合、該標的核酸への該ポリペプチドの非特異的結合が認められない条件下で、該ポリペプチドまたは相補的核酸が、特定の核酸配列に結合する能力をいう。
【００１７】
「サブ配列」とは、それぞれ、核酸またはアミノ酸（例えば、ポリペプチド）
のより長い配列の一部を含む拡散またはアミノ酸の配列をいう。
【００１８】
ポリペプチドに関する記載において、用語「実質的に同一」または「実質的に類似」は、対照配列に対して少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは対照配列に対して85％、最も好ましくは約10〜20個のアミノ酸残基の比較枠に渡って90％同一である配列を含むポリペプチドを示す。２つのポリペプチドの配列が実質的に同一であると示すことは、一方のペプチドが第２のペプチドに対して惹起される抗体に免疫学的に反応性であることを示唆する。従って、あるペプチドが第２のペプチドに実質的に同一である場合とは例えば、２つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合が挙げられる。
【００１９】
用語「組換え」を細胞に対して使用する場合は、該細胞が異種の核酸を複製するか、あるいは異種の核酸によってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、天然の(非組換えの)形態の細胞で見出されない遺伝子を発現することができる。
組換え細胞はまた、天然の形態の細胞で見出される遺伝子を発現することができ、ここで、該遺伝子は修飾され、人工的手段によって該細胞に再導入される。
【００２０】
「組換え核酸」は、人工的に構築された核酸から誘導される１種以上の核酸を含むか、該１種以上の核酸によってコードされる。例えば、該核酸は、BergerおよびKimmel、分子クローニング技術のための指針、Methods in Enzymology第152巻Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger)ならびにSambrookら(1998)Molecular Cloning-A Laboratory Manual（第２版）１〜３巻（Sambrook）ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編)、Greene Publ.Assoc.,Wiley-Interscience,NY,N.Y.(1992)教示される通り、異種の核酸を加えることによって形成されるクローン化された核酸を含むかまたは該核酸によってコードされ得る。あるいは、該核酸を化学的に合成することができる。
【００２１】
本明細書において使用される「異種配列」または「異種核酸」は、外来の供給源（または種）由来の配列または核酸であるか、あるいは同一の供給源に由来する場合は、その本来の形態から修飾を受けたものである。従って、プロモーターに作動可能に連結された異種核酸とは、プロモーターの元に由来する供給源とは異なる供給源に由来するか、または同一の供給源に由来する場合は、その本来の形態を修飾したものである。例えば、「転写因子をコードする異種遺伝子」とは、特定の細胞において通常存在しない転写因子遺伝子をいう。異種配列の構築とは、例えば、DNAを制限酵素で処置して、プロモーターに作動可能に連結することができるDNA断片を作製することを含み得る。修飾は、点特異的変異などの技術によって行うことができる。
【００２２】
本発明は、一遺伝子または遺伝子群の発現を転写レベルで調節する方法を提供する。目的の遺伝子の発現を調節し得る化合物を同定する方法についても提供される。これらの方法は、応答配列に特異的なDNA結合ドメインに人工的に連結する場合、連結したコアクチベーターが転写因子に接触した時に、転写コアクチベーターは応答配列の制御下で遺伝子の発現を刺激または抑制することができるという発見に基づく。驚くべきことに、遺伝子発現の調節には、転写因子が直接DNAに結合することは必要要件ではない。更に、遺伝子の発現が調節される程度は、転写因子の存在量を増加することによって調節を試みる場合に認められる程度をはるかに超えている。このことにより、連結型コアクチベーターを高感度のアッセイに使用して、遺伝子発現を転写レベルで調節し得る化合物を同定することが可能である。
Ａ．連結型コアクチベーター
本発明に使用される連結型コアクチベーターは、転写コアクチベーターに由来する活性化機能に連結したDNA結合部分を含む。本明細書において使用される用語「転写コアクチベーター」は、基本転写には必要ではなく、一因としてそれらはDNA結合ドメインを欠くため、それ自体で転写アクチベーターとして機能することはできない。コアクチベーターは、DNAに結合し得る転写因子などのような他のポリペプチドによって生じる転写の誘導または抑制を介在することができる。連結型コアクチベーターを構築することができるアクチベーターとして、p160ファミリーおよびp300ファミリーのコアクチベーターが挙げられるが、これらには限定されない。p160コアクチベーターには、SRC-1aおよびGRIP-1/TIF-2が含まれ、核酸受容体のリガンド結合ドメイン（LBD）と相互作用する。コアクチベーターのp300ファミリーとしては、CBPおよび密接に関連したタンパク質p300が挙げられ、これらはCREB、Jun/Fosによる転写活性化に必要である。DNA結合ドメインに連結し、本発明の方法において使用することができる更なるコアクチベーターとしては、例えば、GillおよびTjian（1992）Curr.Op.Genet.Devel.2:236-242；Dynlachtら（1991）Cell 66:563-576;Hongら(1996)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 93:4948-4952；およびJanknechtおよびHunter(1996)Nature 383:22-23に記載のコアクチベーターが挙げられる。
【００２３】
本発明の方法に有用な連結型コアクチベーターは、全長コアクチベーターポリペプチド、あるいはコアクチベーター介在性活性化(「活性化機能」)または抑制化(「抑制機能」)に深く関連するドメインを含むコアクチベーターのより小さな部分を含むことができる。コアクチベーターの同族体も連結型コアクチベーターの構築に有用である。転写因子ポリペプチドおよび転写開始に関連する他のタンパク質との機能的相互作用および／または構造的相互作用が可能な転写コアクチベーターの活性部分を、本明細書に記載の方法を用いて同定することができる。
所定のコアクチベーターの「部分」は、天然のコアクチベーターポリペプチドのうち少なくとも約20個、より好ましくは約40個、更に好ましくは約60個のアミノ酸を含むペプチドである。本発明の方法に有用な更なるコアクチベーターおよびコアクチベーターの有用な部分を同定するために、目的のコアクチベーター、またはその部分をDNA結合ドメインに連結して、連結型コアクチベーターによって介在される転写を誘発または抑制する転写因子の能力をアッセイすることができる。
【００２４】
連結型コアクチベーターとしては、コアクチベーターポリペプチドに加えて、標的核酸に特異的に結合することができるDNA結合ドメインが挙げられる。標的部位は、典型的に、発現すべき遺伝子の上流に位置する。標的部位は、転写制御因子が結合し得る部位として認識することができるか、または標的部位は、単純に遺伝子のプロモーターの近傍であることに基づいて選択することができる。エンハンサーは標的部位の１つの例であるが、一般に転写開始部位の上流側に様々な距離で見出される。例えば、米国特許第5,512,483号；MitchelおよびTjian（1989）Science 245:371；PtashneおよびGann（1990）Nature 346:329；ならびにLewin(1990)Cell 61:1161を参照のこと。１つの実施態様において、DNA結合ドメインはホルモンに対する応答配列などの応答配列に特異的であり、この場合、DNA結合ドメインは、典型的に、クロマチンDNA上のホルモン応答配列（ＨＲＥ）に結合する受容体タンパク質の部分を含む。これらのDNA結合ドメインの範囲は同定されており、ステロイドホルモンスーパーファミリーを対象にその特徴が調べられている。例えば、Giguereら(1986)Cell 46:645-652;Hollenbergら(1987)Cell 49:39-46;GreenおよびChambon(1987)Nature 325:74-78；Miesfieldら（1987）Science 236:423-427；ならびにEvans(1988)Science 240:889-895を参照のこと。グルココルチコイド応答配列（GRE）およびエストロゲン応答配列（ERE）を含む応答配列についても、例えば、Jantzenら(1987)Cell49:29；Martinezら（1987）EMBO J.6:3719；ならびにBurchら（1988）Mol.Cell.Biol.8:1123に記載されている。
ウイルス遺伝子の発現を調節するために、標的核酸は、遺伝子の転写の調節に関与する転写因子に対する結合部位であり得る。
【００２５】
完全なタンパク質をDNA結合ドメインとして使用することができるが、核酸に結合することができるこれらの分子の部分も、直接的または間接的に、キメラ連結型コアクチベーターにおけるDNA結合ドメインとして有用である。そのようなDNA結合ドメインを同定するために、目的の核酸配列を、DNA配列に結合し得る分子の様々な断片に会合させる電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）(scottら（1994）J.Biol.Chem.269:19848-19858)などのアッセイを実施することができる。
タンパク質の一部分と核酸とが会合すると核酸の電気泳動移動が遅れる。ガイドドメインとしての使用に適切なDNA結合部分を同定することができるもうｌつの方法は、DNaseＩフットプリンティングであり、当業者に周知である。
【００２６】
特定の適用について、連結型コアクチベーターは、通常特定のコアクチベーターの制御下にはない遺伝子を調節する標的核酸に特異的に結合するDNA結合ドメインを有する。例えば、酵母GAL4転写因子由来のDNA結合ドメインを用いて、ホルモン調節性の転写（例えば、CBP、SRC-1a、またはGRIP-1に連結したGAL4 DBD）に関連するコアクチベーターの全部または活性部分を含をもキメラタンパク質を作製することができる。GAL4のDNA結合ドメインについては、例えば、Careyら（1989）J.Mol.Biol.209:423-432に記載されている。通常、コアクチベーターが関与するシステムの部分ではないDNA結合ドメインおよび対応する応答配列を用いる利点の１つは、異種DNA結合ドメインを有する連結型コアクチベーターが得られることにより、DNA結合機能とは別に活性化機能を分析することが可能になることである。
【００２７】
DNA結合ドメインはポリペプチドまたは核酸のいずれかであり得る。DNA結合ドメインが核酸である場合、該核酸は応答配列などの標的核酸部位に特異的にハイブリダイズすることができる。核酸の標的部へのハイブリダイゼーションにより連結された遺伝子の発現活性化または抑制に適切な位置にコアクチベーターポリペプチドを配置することができる。化学的カップリングにより部分に化学的に連結されたオリゴヌクレオチドの例が、Coreyら（1989）Biochemistry 28:8277-8286に認められる。
【００２８】
コアクチベータードメインおよびDNA結合ドメインはともに連結して連結型コアクチベーターを形成する。例えば、ドメインがスルフィド結合によって連結され得るように、ドメインのいずれかの末端にシステインを配置することができる。組換えまたは化学的方法を用いて変異を行うことができる。より典型的には、コアクチベータードメインおよびDNA結合ドメインをリンカードメインによって結合させる。リンカードメインは、約５個〜200個のアミノ酸、代表的には約10個〜100個のアミノ酸のポリグリシン配列などの典型的なポリペプチド配列である。いくつかの実施態様において、プロリン残基をリンカーに組み込んで、リンカーによる重篤な二次構造配列の形成を防止する。好適なリンカーは、しばしば、組換え融合タンパク質の部分として合成される可撓性のアミノ酸サブ配列である。ある実施態様において、可撓性のリンカーは、Gly(x)-Pro-Gly(x)（式中、ｘは約３〜100の数値である）などのプロリンを含むアミノ酸サブ配列である。
リンカーはまた、単一のペプチド結合または１個以上のアミノ酸残基である。他の実施態様において、合成的または組換え的に産生されたコアクチベーターとDNA結合ドメイン配列を結合するために、化学的リンカーが使用される。そのような可撓性のリンカーは、当業者に公知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーがShearwater Polymers,Inc.Huntsville,Alabamaより市販されている。これらのリンカーは、任意に、アミド結合、スルフヒドリル結合、またばヘテロ官能基結合を有する。
【００２９】
連結型コアクチベーターは、宿主細胞における組換え発現により簡便に産生される。BergerおよびKimmel、分子クローニング技術のための指針、Methods in Enzymology第152巻Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger)ならびにSambrookら（1998）MolecularCloning−A Laboratory Manual（第２版）１〜３巻（Sambrook）に教示される通り、例えば、核酸は連結型コアクチベーターをコードするか、あるいは、異種核酸を加えることによってDNA結合ドメインまたは活性促進型活性ドメインのいずれかが形成され得る。あるいは、核酸を化学的に合成することができる。連結型コアクチベーターの発現のために宿主に核酸を導入するために使用される特定の手順は重要ではない。宿主細胞に外来性ヌクレオチド配列を導入するための周知のいずれの手順を使用してもよい。これらには、リン酸カルシウム、スフェロプラスト、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター(plasma vector)、ウイルスベクター、および、宿主細胞にクローン化されたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来性遺伝子材料を導入するための他の周知の方法のいずれも（Berger、AusubelおよびSambrook、全て上述、を参照のこと）が含まれる。
Ｂ．遺伝子発現の調節
本発明は、遺伝子に作動可能に連結された応答配列と連結型コアクチベーターとを接触させることによって遺伝子の発現を調節する方法を提供する。連結型コアクチベーターはまた、転写因子に由来する活性化機能を含む活性型転写因子ポリペプチドと接触される。これらの方法に使用される連結型コアクチベーターは、発現すべき遺伝子の5'フランキング領域、一般に、通常、遺伝子の発現を駆動するプロモータの直ぐ上流の領域の標的DNA配列に特異的に結合し得るＤＮＡ結合ドメインを含む。標的DNA配列は、応答配列または遺伝子発現の調節に関与する他の認識された転写制御配列であってもく、またはそれらでなくてもよい。ＤＮＡ結合ドメインは、コアクチベーターを遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域内に位置させるように機能し、ここで、転写因子ポリペプチドに接触する際に、コアクチベーターは基本転写機構および／または転写に関与する他の因子と相互作用する。標的配列として遺伝子ファミリーのそれぞれの要素の5'フランキング領域中に存在するヌクレオチド配列を選択することによって、単一のタイプの連結型コアクチベーターを使用して、ファミリー内の複数の遺伝子の発現を調節することができる。
【００３０】
特定の適用に好適なコアクチベーターポリペプチドは、一部は、どの調節経路を調節するのかに依存し得る。例えば、CBP/p300およびp160コアクチベーターはSRC-1aおよびGRIP-1/TIF-2を含み、目的の遺伝子が核ホルモン受容体によって調節される際に有用である。CBP/p300コアクチベーターから誘導されるコアクチベーターペプチドを含む連結型コアクチベーターは、核酸ホルモン受容体のほかに、AP-1転写因子(例えば、Jun、Fos)、Sap-1a、MyoD、およびYY1を含む様々な転写因子によって調節される遺伝子の発現を調節するのに有用である。例えば、Janknecht、ぜんけいを参照のこと。ウイルスによってコードされる転写因子(例えば、ヘルペスウイルスのVP16、肝炎ウイルスのタンパク質Ｘなど)の制御下にある遺伝子も、これらの連結コアクチベーターを用いて調節することができる。
【００３１】
インビボにおける遺伝子発現の調節を所望する場合、ペプチドの形で連結型コアクチベーターを投与することができるか、または連結型コアクチベーターをコードする遺伝子を含む発現ベクターを用いて細胞内で連結型コアクチベーターを発現させることができる。遺伝子を、目的の的の細胞において発現されるプロモーターに連結する。プロモーターは、細胞において構成的に発現され得るか、または誘導可能であり得る。
例えば、特定の組織の細胞において連結型コアクチベーターを所望する場合、組織特異的プロモーターを用いて連結型コアクチベーター遺伝子の発現を駆動する。同様に、発達の特定の段階で遺伝子の発現を調節することを所望する場合、連結型遺伝子を、発達段階で調節されるプロモーター領域の制御下に配置することができる。あるいは、連結型コアクチベーター遺伝子を、該連結型コアクチベーター遺伝子の発現を所望する時点に細胞に適用する刺激によって誘導可能なプロモーターの制御下に配置することができる。例えば、プロモーターを活性化する化合物を投与することによって、発現を作動させることができる。
【００３２】
転写因子ポリペプチドを得ることができる４つのスーパークラスの転写因子が知られている：塩基性ドメインスーパークラス、亜鉛配位ＤＮＡ結合ドメインファミリー、ヘリックス−ターン−ヘリックススーパークラス、およびβ骨格スーパークラス(例えば、TRANSFACデータベース、Wingenderら、Nature Acids Res.24:238-241(1996)を参照のこと)。例えば、転写因子ポリペプチドは、「塩基性ドメイン」サブクラスのロイシンジッパークラスの要素から、特にjunおよびfosサブファミリーを含むAP-1ファミリーの要素から得ることができる。亜鉛配位ＤＮＡ結合ドメインスーパークラスのCys4ジンクフィンガークラスは、核ホルモン受容体を含み、これは、転写因子ポリペプチドの適切な供給源のもう１つの例である。このクラスは、転写因子のステロイドホルモン受容体ファミリーおよび甲状腺ホルモン受容態様ファミリーを含む。核ホルモン受容体は、ステロイドおよび甲状腺ホルモン、レチノイド、ビタミンD3、プロスタグランジンなどの小さな脂溶性リガンドに対する主要な細胞内標的を提示する転写因子である。ホルモンまたはアナログがホルモン受容体に結合すると、ホルモン受容体に対する応答配列によって調節される遺伝子の転写を誘導することができる。
【００３３】
転写因子ペプチドは転写因子から誘導される活性化機能を含む。例えば、核受容体はいくつかの保存されたドメインを含んでおり、これは、配列の比較（Krustら（1986）EMBO J.5:891）および構造機能の分析（Giguereら（1986）Cell 46:645；Kumarら（1987）Cell 51:941；KumarおよびChambon（1988）Cell 55:145；ならびにGreenおよびChambon(1987)Nature 325:75）によって実証されている。DNA結合ドメイン（DBD）は最も高度に保存されたドメインであって、中心領域に位置し、２つのジンクフィンガーを含む66〜68アミノ酸コアを含有する。リガンド結合ドメイン(LBD；ホルモン結合ドメイン（HBD）ともいう）は、カルボキシル末端側に存在し、アミノ末端側は転写活性化ドメイン（AD）を含む。このドメインは、ホルモンドメインの中でもそれほど良好には保存されておらず、リガンド誘導性転写開始機能を含有する。活性化ドメインは、機能性DNA結合ドメインと組み合わせる場合に、RNAポリメラーゼによって生産性の転写開始を宜進するポリペプチド領域として定義することができる。グルココルチコイドおよびエストロゲン受容体の保存性の低いＮ末端A/B領域もまた転写活性ドメインを含有する。HagerおよびArcher,Nuclear Hormone Receptors:Molecular Mechanisms,Cellular functions and Clinical Abnormalities,(Parker,M.G.編)、Academic Press Ltd.217,1991、ならびに、核ホルモン受容体およびそれらの構造についての検討に関しては米国特許第5,512,483号を参照のこと。エストロゲン受容体の場合、転写因子ポリペプチドは、AF1およびAF2のいずれか一方または両方を含むことができる。
【００３４】
連結型コアを誘発または抑制する転写因子ポリペプチドは、細胞に対して外因性または内因性であり得る。「外因性」転写因子ポリペプチドとは、細胞内で天然には存在しないが、ポリペプチドとしてまたは発現ベクターの使用を介した異種遺伝子の発現産物として細胞に添入されている転写因子ポリペプチドである。
連結型コアクチベーターの発現について上述したように、プロモーターを適切に選択することによって、所望する時および／または場所で転写因子ポリペプチドの発現を達成することができる。
【００３５】
本発明の方法における使用のために、転写因子ポリペプチドを達成することができる。活性化は、転写因子ポリペプチドとホルモンまたは転写因子ポリペプチドがそのホルモンアナログのための結合ドメインを有するようなホルモンアナログとを接触させることを含む。転写因子ポリペプチドを達成するための他の方法としては、例えば、薬物またはペプチドホルモン（例えば、EGFなど）を投与することなどの当業者に公知の方法によって、リン酸化カスケード（例えば、MAPキナーゼまたはタンパク質キナーゼＡカスケードなど）を刺激することが挙げられる。転写因子ポリペプチドは、連結型コアクチベーターが応答配列に結合する前、同時に、または後に活性化することができる。例えば、ERおよびERβは、受容体にエストロゲンまたはエストロゲンアナログを投与することによって活性化することができる。グルココルチコイド受容体は、例えば、グルココルチコイドまたはデキサメタゾンなどのグルココルチコイドアナログで処置することによって活性化することができる。
【００３６】
１つの実施態様において、連結型コアクチベーターと転写因子ポリペプチドとを接触させると遺伝子の発現が刺激される。例えば、細胞内に遺伝子は存在するが、まったく発現されていないかまたは十分なレベルで発現されていない病態などで、より大きなレベルの発現が所望される遺伝子の発現を増大するためには、本方法が有用である。遺伝子発現の活性化のために、好適な実施態様において、p160ファミリーまたはCBP/p300ファミリーコアクチベーターに由来する連結型コアクチベーターおよびエストロゲン受容体(ER)、エストロゲンβ(ERβ)受容体、あるいはjunまたはfosなどのAP-1転写因子から誘導される対応する転写因子ポリペプチドが使用される。
【００３７】
もう１つの実施態様において、本発明の方法は遺伝子の発現を抑制するのに有用である。本方法は、遺伝子の過剰発現、または不適切な時期での特定の遺伝子の発現が関与する疾忠などの、特定の遺伝子の発現が所望されない状況において有用である。遺伝子発現の抑制のためには、好適な実施態様においては、連結型CBPコアクチベーターおよびグルココルチコイド受容体に由来する活性型転写因子ポリペプチドが使用される。活性型グルココルチコイド受容体ポリペプチドを、DNA結合ドメインに連結したCBPコアクチベーターを含有する細胞に添入すると、エストロゲン受容体およびエストロゲンが遺伝子の転写を刺激する能力を抑制することができる。
【００３８】
これらの方法は、例えば、細胞またはウイルスの遺伝子の転写を刺激あるいは抑制するのに有用である。ヒトおよび他の動物を処置するために、必要であれば、連結型コアクチベーターを当業者に公知の方法でポリペプチドとして投与することができる。例えば、ポリペプチドを、非経口、局所、経口または局所投与に有用な薬学的組成物として、例えば、エアゾルまたは経皮的に、予防的および／または治療的処置のために処方することができる。薬学的組成物は、投与方法に依存する様々な単位の剤形で投与することができる。例えば、経口投与に適切な単位剤形としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセルおよびトローチ剤が挙げられる。経口投与する場合、連結型コアクチベーターおよび転写因子ポリペプチドは消化から保護されなければならないことが認められている。このことは、典型的に、該タンパク質と、酸的および酵素的加水分解に耐性にする組成物とを複合すること、またはリポソームなどの適切な耐性キャリア中に該タンパク質を封入することのいずれかによって達成される。タンパク質を消化から保護するための手段については当該分野において周知である。
【００３９】
もう１つの実施態様において、組成物は、静脈内投与あるいは体腔内または器官の内腔への投与などの非経口的投与に有用である。投与のための組成物は、一般に薬学的に許容可能なキャリア、好ましくは水溶性キャリア中に溶解した転写因子ポリペプチドを有するまたは有さない連結型コアクチベーターの溶液を含む。様々な水溶性キャリア、例えば、緩衝化生理食塩水などを使用することができる。これらの溶液は滅菌されているかまたは所望でされない物質を含まない。これらの組成物を従来の周知の滅菌技術によって滅菌してもよい。薬学的組成物はまた、転写因子ポリペプチドを活性化し得る因子を含有することができるか、あるいは、該活性化因子を個別に投与することができる。組成物は、pH調節および緩衝化剤、毒性中和剤などの、生理学的条件に近似するのに必要な薬学的に許容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。これらの処方物中の連結コアクチベーターの濃度は広範に変化することができ、主に液体の容積、粘度、本体重量などに依存して選択された、個々の投与の形態および患者の要求に従って選択される。
【００４０】
静脈内投与のための典型的な薬学的組成物は、約0.1〜10mg／患者／日である。特に、薬物を、体腔内または器官の腔内などの血流ではない隔離された部位に投与する場合、0.1ｍｇ／患者／日〜約100mg／患者／日までの剤形を使用してもよい。局所投与では実質的により高い用量が可能である。非経口的な投与が可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に明らかであり、Remington's Pharmaceutical science）第１５版、Mack Publishing Company,Easton,Pensylvanla(1980)のような開示物により詳細に記載されている。
【００４１】
連結型コアクチベーターを含有する組成物またはそのカクテル（即ち、転写因子ポリペプチドなどの他のタンパク質を伴う）を、治療的処置のために投与することができる。治療的適用において、疾患あるいは特定の遺伝子または遺伝子群の過少発現または過剰発現を特徴とする他の症状を患う患者に、該疾患およびその合併症を治癒するまたは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で組成物が投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」と定義される。この用途の有効な量は、疾患の重症度および患者の健康の全体的状態に依存する。
組成物の単回または複数回の投与を、患者によって要求かつ認容される用量および回数に依存して投与される。いずれにせよ、組成物は、患者を有効に処置するのに十分な量の本発明のタンパク質を提供するべきである。
【００４２】
連結型コアクチベーターおよび転写因子ポリペプチドをコードする核酸を導入するために、遺伝子治療を使用することができる。そのような遺伝子治療の手順は、後天的および先天的遺伝子欠損、癌、およびこれらのことに関連するウイルス感染を修正するために使用されている。ヒトにおいて人工的遺伝子を発現させる能力は、他の療法による処置が受け入れられない多くの疾患を含む多くの重要なヒトの疾患の予防および／または治癒を容易にする。例として、コレステロール調節遺伝子、HIVの複製を選択的に阻害する遺伝子、およびヒト忠者における腫瘍抑制遺伝子のインビボでの発現は、それぞれ、心臓病、エイズ、および癌の治療を劇的に改善する。遺伝子治療の手順の検討には、Anderson,Science(1992)256:808-813；NabelおよびFelgner（1993）TIBTECH 11:211-217；MitaniおよびCaskey（1993）TIBTECH 11:162-166；Mulligan（1993）Science 926-932；Dillon(1993)TIBTECH 11:167-175；Miller(1992)Nature 357:455-460；Van Brunt（1988）Biotechnology 6(10):1149-1154；Vigne（1995）Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36；KremerおよびPerricaudet(1995)British Medical Bulletin 51(1)31-44：Haddadaら(1995)Current Topicsin Microbiology and Immunology DoerflerおよびBohm（編）Springer-Verlag,Heidelberg Germany；ならびにYuらGene Therapy(1994)1:13-26を参照のこと。
【００４３】
細胞への遺伝子または遺伝子材料の送達は、疾患の遺伝子治療処置において最初の重要な工程である。多くの送達方法が当業者に周知である。そのような方法としては、例えば、注入によるまたは粒子ボンバーメント装置の使用による裸状DNAの送達(Felgner、米国特許第5,580,859号）、リボソームを用いた遺伝子送達（DebsおよびZhu（1993）WO 93/24640；ManninoおよびGould-Fogerite（1988）BioTechniques 6(7):682-691;Rose米国特許第5,279,833号;Brigham(1991)WO 91106309；ならびにFelgnerら（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7414）およびレトロウイルスゲノムの部分として治療的ポリヌクレオチド配列を有する複製能欠損レトロウイルスベクター(例えば、Millerら（1990）Mol.Cell.Biol.10:4239(1990)；Kolberg（1992）J.NIH Res.4:43およびCornettaらHum.Gene Ther.2:215(1991)を参照のこと)による裸状DNAの送達が挙げられる。広範に使用されているレトロウイルスのベクターとしては、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびこれらの組み合わせに基づくレトロウイルスベクターが挙げられる。例えば、Buchscherら（1992）J.Virol.66(5)2731-2739；Johannら（1992）J.Virol.66(5):1635-1640(1992)；Sommerfeltら（1990）Virol.176:58-59；Wilsonら（1989）J.Virol.63:2374-2378；MillerらJ.Virol.65:2220-2224(1991)；Wong-StaalらPCT/US94/05700ならびにRosenburgおよびFauci(1993)Fundamental Immunology第３版Paul（編）Raven Press,Ltd.,New Yorkならびに本明細書に記載の参考文献、ならびにYuら、Gene Therapy(1994)前掲を参照のこと。
【００４４】
例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボでの遺伝子治療手順において、細胞に標的核酸を導入するために、アデノウイルスに基づくベクターも使用される。Westら（1987）Virology 160:38-47；Carterら（1989）米国特許第4,797,368号；CarterらWO 93/24641(1993)；Kotin（1994）Human Gene Therapy 5:793-801；Muzyczka(1994）J．Clin.Invst.94:1351ならびにAAVベクターの考察についてはSamulski（前掲）を参照のこと。組換えAAVベクターの構築については、Lebkowski、米国特許第5,173,414号；Tratschlnら（1985）Mol.Cell.Biol.5(11):3251-3260;Tratschinら(1984)Mol.Cell.Biol.,4:2072-2081；HermonatおよびMuzyczka（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466-6470；McLaughlinら（1988）ならびにSamulskiら（1989）J.Virol.,63:03822-3828を含む多くの開示物に記載されている。rAAVによって形質転換され得る細胞株としては、Lebkowskiら（1988）Mol.Cell.Blol.,8:3988-3996に記載の細胞株が挙げられる。
【００４５】
本発明はまた、核受容体介在性転写調節に関与する以前に知られていないコアクチベーターを同定する方法を提供する。目的の遺伝子が発現される細胞から得られるmRNAから、cDNA分子の発現ライブラリーが調製される。発現スクリーニングについては、例えば、Ausubel、前掲、に記載されている。ライブラリーのために使用される発現ベクターは、cDNAクローンの挿入部位に隣接してDNA結合ドメインコーディング領域を含む。発現ライブラリーのDNAは、転写因子ポリペプチドとともに宿主細胞に同時導入され、異種遺伝子の発現によっても提供され得る。ホルモンまたは転写因子ポリペプチドに結合するアナログも細胞に導入され、従って、転写因子ポリペプチドが活性化される。好適な実施態様において、宿主細胞はまた、発現ベクターによってコードされるDNA結合ドメインに対応する応答配列に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含有する。コアクチベーターの活性化ドメインをコードするクローンは、応答配列に作動可能に連結された遺伝子の発現を誘発する。
Ｃ．転写調節化合物に対する高スループットアッセイ
本発明はまた、遺伝子転写の調節に有用な因子を同定するための方法および組成物を提供する。これらの因子は、１種以上の遺伝子の所望されない転写、または所望されるが欠如している転写を特徴とする病態を診断および処置するのに有用である。そのような疾患としては、微生物、菌およびウイルス感染症、癌、炎症性疾忠、免疫疾忠などが挙げられる。本発明の方法は、目的の遺伝子の転写を調節し得る試験化合物を迅速に同定するためのアッセイを提供する。
【００４６】
本発明によって提供される転写調節化合物を同定するためのアッセイは、プロモーター配列の上流に位置する応答配列の制御下にあるレポーター遺伝子を、連結型コアクチベーター及び転写因子ポリペプチドと接触させることを含む。一般に、転写因子ポリペプチドと連結型コアクチベーターおよび応答配列が接触させられる前に、転写因子ポリペプチドは、試験化合物に接触させられる。レポーター遺伝子の発現を検出し、コントロールと比較して、転写が増大するのか、減少するのか、または不変であるのかが決定される。
【００４７】
１つの実施態様において、転写因子ポリペプチドは、天然環境において目的の遺伝子の発現の調節に関与する転写因子に由来する。従って、連結型コアクチベーターによって介在される転写を誘発または抑制する転写因子の能力に影響を及ぼす試験化合物は、おそらくインビボでの遺伝子の転写にも同じ効果を及ぼすであろう。
【００４８】
これらのアッセイにおいて特定の化合物が転写に影響を及ぼすかどうかを決定するために、レポーター遺伝子が簡便に使用される。レポーター遺伝子は、典型的に、遺伝子産物が存在する場合には容易に検出されるよう、構造遺伝子に作動可能に連結された最小のプロモーター配列を含む。最小のプロモーターとは、例えば、TATAボックスおよびTATAボックスの約20〜50塩基下流に位置する転写開始部位（SmaleおよびBaltimore（1989）Cell 57:103）を含有するイニシエーター配列をいう。典型的に、それ以外の上流の配列は提供されない。最小のプロモーターは、哺乳動物またはウイルス由来である。簡便に、最小のプロモーターは、応答配列の挿入物に対するプロモーターの上流、およびレポーター構造遺伝子の挿入物のプロモーターの下流に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むベクター内に存在する。様々なレポーター遺伝子プラスミド系が既知であり、例えば、一般的なクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）およびβ−ガラクトシダーゼ（例えば、細菌lacZ遺伝子)、レポーター系、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（例えば、Caraら(1996)J.Biol.Chem.271:5393-5397を参照のこと)、グリーン蛍光タンパク質(例えば、Chalfieら（1994）Science 263:802を参照のこと)およびその他多くのものがある。本発明のベクターのクローニングを容易にする選択マーカーも場合に応じて含まれる。SambrookおよびAusubel(両者とも前掲)は、選択マーカーについての考察を提供している。
【００４９】
これらのアッセイは典型的にインビボで、転写因子ポリペプチドおよび１種以上の発現ベクターから細胞において産生される連結型コアクチベーターを用いて実施される。レポーター遺伝子を保持するベクターもまた、適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができる。あるいは、転写因子ポリペプチドおよび連結型コアクチベーターを、当業者に既知の方法でペプチドとして細胞に移すことができる。特定の転写因子ポリペプチドに対して適切な因子との接触によって、転写因子ポリペプチドを活性化（またはサイレント化）することができる。試験化合物は、試験化合物との接触の前、同時、または後にある。レポーター遺伝子の発現を検出して、化合物が、転写を刺激する活性型転写因子ポリペプチドの能力を阻害するか、または不活性型転写因子ポリペプチドの抑制効果を克服するかを決定する。
【００５０】
細胞が、転写に必要とされる基本転写機構（BTM）を含む更なる転写成分を含有する限り、スクリーニングアッセイに使用される細胞の種類の特定は重要ではない。例えば、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞を含む真核細胞は、宿主細胞として適切である。
【００５１】
疾患に関連する遺伝子の転写の刺激を阻害する化合物は特に興味深い。例えば、エストロゲンおよびエストロゲン受容体によって調節される遺伝子の過剰発現は、乳癌と関係がある。同様に、ウイルス遺伝子を含む病因遺伝子のコアクチベーター介在性発現を阻害することができる化合物は、病原体によって生じる病気に対して有効な処置を提供するであろう。本発明が阻害剤について提供するスクリーニング方法の対象となるそのような遺伝子としては、HIV-1またはHIV-2LTR、HTLV-LTR、ヘルペスウイルスtkプロモーター、ワクシニアプロモーター、ポックスウイルスプロモーター、インフルエンザウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターの制御下にある遺伝子が挙げられる。スクリーニング方法はまた、ヒトパピローマウイルスのE7遺伝子およびアデノウイルスのE1A遺伝子などのウイルス性癌遺伝子、ならびにRb、E2F、myc、ab1などの細胞性癌遺伝子を含む癌遺伝子の転写を調節することができる化合物を同定するのに有用である。好適な試験化合物は、連結型コアクチベーターと転写因子ポリペプチドとの間の相互作用、または転写因子ポリペプチドとその同起源のリガンドとの間の相互作用を調節、好ましくは中断する。
【００５２】
本発明はまた、転写に影響を及ぼす点に限リホルモンおよび他のリガンドに「擬似する」化合物を同定する方法を提供する。例えば、タモキシフェンおよび関連のアンチエストロゲンは、ホルモン依存性の乳癌を処置するために使用され、ERに結合して、エストロゲンによるその活性化を阻害する。しかし、タモキシフェンは、子宮細胞などの特定のタイプの細胞では、エストロゲン調節性遺伝子を抑制するよりむしろ活性化するという所望されない副作用を有する。Webbら、Mol.Endocrinol.9:443-456。転写因子junおよびfosはAP1 DNA配列に結合し、また、コアクチベーターCBPにも結合する。本発明者らは、エストロゲンおよびエストロゲン受容体がjun/fos結合性CBPを誘発して、AP1部位によって調節される遺伝子の転写を刺激し得ることを実証した。驚くべきことに、この活性のために、ERがER応答配列に結合する必要はない。
【００５３】
この発見によれば、いわゆるこの「間接的な」エストロゲンの応答を調節する能力について試験化合物をスクリーニングする方法が可能になる。本方法は、活性型エストロゲン受容体ならびにプロモーターおよびAP1部位の制御下にあるレポーター遺伝子を含む細胞を提供することを含む。細胞は、AP1に特異的に結合し得るDNA結合部分および転写コアクチベーターに由来する活性化機能を含むポリペプチドを含むキメラタンパク質と接触される。細胞は、キメラタンパク質と接触する前、同時、または後に試験化合物に接触される。レポーター遺伝子の発現が検出される。試験化合物の存在下で発現が減少する場合、化合物は間接的なエストロゲン応答を抑制する。
【００５４】
エストロゲンを擬似すると思われる他の化合物もまた、エストロゲン調節性遺伝子の所望されない刺激を引き起こすかもしれない。そのような化合物の同定は難しいかもしれない。何故なら、化合物は時に、エストロゲンに対する構造的類似性をほとんど有さないからである。本発明は、特定の化合物が実際にエストロゲン調節性遺伝子の転写を刺激するかどうかをアッセイするための簡単な手段を提供する。
以下の実施例により本発明を説明するが、本実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００５５】
：エストロゲン受容体は、連結型p160-CBPコアクチベーター複合対によって介在される発現を誘発する
Ａ．材料および方法
１．プラスミド
アデノウイルスE1b最小プロモーターの制御下にルシフェラーゼ構造遺伝子を配置することによって、レポーター遺伝子を構築した。５つのGAL4 17マー応答配列をE1bプロモーターの上流に配置した。これらの研究の目的のために、ベクターの骨格を修飾してpUC（Kushnerら、Mol Endocrinol 8:405-7(1994)）に天然に存在するAP-1部位を除去した。
【００５６】
エストロゲン受容体（ER）に由来する融合タンパク質をコードする遺伝子（E-GAL-E、図3B）では、GAL4 DNA結合ドメイン（GAL4-DBD）がエストロゲン受容体DNA結合ドメイン（ER-DBD）の代わりに使われている。重複伸長PCR技術による標準的なスプライシングによってE-GAL-Eを構築した。これは、ER-AB（アミノ酸１〜184)、GAL4-DBD（アミノ酸１〜147）およびERヒンジ／LBD（アミノ酸250〜595）に対する配列を含有する。ベクターHE-14（Chambon）を用いる点特異的変異により、野生型ER-LBDおよびER-LBD AF2変異の発現ベクターを構築した。他の全ての発現ベクターについては、Webbら、Mol.Endocrinol.9:443-456(1995)において先に記載されている。
【００５７】
SRC-1a（アミノ酸１〜1462）およびGAL-SRC-1aに対するCMV駆動性発現ベクターを調製した。酵母発現ベクターから全長GRIP-1-1 cDNAをEcoRI断片として単離し、SV40駆動性発現ベクターSG5に再クローン化した。GAL4-CBP融合物については先に記載されている(Swopeら、J.Biol.Chem.271:28138-45(1996)；Kwokら、Nature 370:223-6(1994))。CBP全長発現ベクターについては、Kameiら、Cell 85:403-14(1996)により記載されている。
【００５８】
マウスED-LBD(アミノ酸313〜599)およびER-LBC-AF2変異(547位のメチオニンおよび548位のロイシンのアミノ酸がそれぞれアラニンに置換している)ならびにGST-ABに対するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）−融合タンパク質については、既に記載されている(Webbら、前掲；Cavaillesら、EMBO J.14:3741-51(1995))。GST-CBP融合タンパク質については、Yangら、Nature 382:319-24(1996)により先に記載されている。全長CBP cDNAをBamHI断片としてSG5にクローニングすることによってアミノ末端CBPタンパク質を産生した。既に示しているように、これは約170Kdのタンパク質を産生し、CBP分子のアミノ末端側の３分の２を含有する(Chakravartiら、Nature 383:99-103(1996))。インビトロで翻訳されたCBPＣ末端発現ベクター（1678-2441）については先に記載されている(Kwokら、Natutre 370:223-6(1994))。
２．トランスフェクション
Webbら、前掲に記載の通りにHeLa細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは、５μｇのGAL4応答性レポーター遺伝子、１μｇのGAL4-DBD／コアクチベーター発現ベクター、トランスフェクション効率の正規化のための１μｇのpJ3-b-GALベクター、５μｇのERおよび５μｇの天然のコアクチベーター発現ベクターを含んだ。示されるように、トランスフェクションは３μｇのJunまたはfos発現ベクターを利用した。エストロゲンを添加して最終濃度を100nMとし、タモキシフェンを添加して５μＭとした。
３．インビトロでの結合アッセイ
Webbら、前掲に先に記載の通りにインビトロ結合アッセイを実施した。
Ｂ．結果および考察
本明細書に記載の実験の前に、仮定モデルでは、コアクチベーターがDNA結合転写因子と基本転写機構（BTM）との間の橋渡しとして作用していることを提唱した。このモデルは、コアクチベーターがプロモーターに添入されると、転写因子は重要ではなく、コアクチベーターはそれ自体で転写を活性化し得るはずであることを示唆する。この考えを検証するために、本発明者らは、ER-LBDおよびそのコアクチベーターがDNAに直接連結されるときに転写を活性化する能力を比較した(図1A)。酵母GAL4 DNA結合ドメイン（GAL-LBD）に融合したER-LBDは、エストロゲンの存在下で効率的にGAL4応答性標的プロモーターを活性化したが、GAL-SRC-1aおよびGAL-CBPのいずれも転写を誘導することはできなかった。コアクチベーターの組み合わせ、遊離のいずれか一方、またはGAL4融合タンパク質の過剰発現もGAL4応答性転写を活性化することはできなかった。このことは、SRC-1aおよびCBP（Swopeら、Kwokら、両者とも前掲）の両方とも強力な潜在的トランス活性化機能を有するが、それらの全長の形態では転写を若干活性化するのみであることを示す以前の結果と一致する。遊離のSRC-1a、GRIP-1およびCBPは、ER-LBDの転写活性を増強することができた。従って、SRC-1aおよびCBPは、ER-LBDによる転写活性化に関与するが、プロモーターに直接添入される場合は転写への介在は十分ではない。
【００５９】
ERコアクチベーターの見かけ上矛盾した挙動の説明の１つは、ERの接触はp160-CBP複合体の活性を誘発するのに必要であるだろうというものである。この仮定を検証するために、本発明者らは、プロモーターでの転写因子およびコアクチベーターの通常のコンホメーションを逆にした。本発明者らは、同起源のDNA結合部位の非存在下で、コアクチベーターがDNAに連結されるときに、ERがp160またはCBPのいずれか一方の活性を増強するかどうかを調べた。図1Bは、GAL4-SRC-1a融合タンパク質はエストロゲンの非存在下で転写を弱く活性化したのみであったが、エストロゲンまたはタモキシフェンの混合型アゴニスト／アンタゴニストのいずれか一方の存在下では強力に活性化したことを示す。ERはまた、GRIP-1に対するGAL4融合物の穏やかな活性およびGAL-CBPの活性を増強することができた。単離されたGAL4-DBDをアクチベーターとして使用した場合、またはERがトランスフェクションから除かれた場合、エストロゲンおよびタモキシフェンは両方ともプロモーターの活性を誘導することができなかった。
ERはまた、GAL4-SP1などの他の転写活性GAL4融合タンパク質を増強することができなかった。従って、ERは特異的に、そのコアクチベーター、SRC-1a、GRIP-1およびCBPの転写活性を増強することができる。
【００６０】
p160はインビボでCBPと相互作用することが知られているため、本発明者らはSRC-1aまたはGRIP-1のいずれかがGAL-CBPでER作用に関連するかどうかを調べた。
本発明者らは、まず、p160の過剰発現がCBPでのER作用に影響を及ぼすかどうかを調べた。図2Aは、トランスフェクトされたSRC-1aおよびGRIP-1の両者がGAL-CBPでタモキシフェンおよびエストロゲン作用を増強したことを示す。GRIP-1のより短い変異体（アミノ酸322〜1141）は、核受容体作用の主なネガティブ阻害剤として作用し(Hongら、上掲)、CBPでER作用を阻害した。CBP（またはp300、データ示さず）の過剰発現もGAL-CBPのER依存性活性化を約70％減少した。CBPが過剰発現されると、GAL4/ER-LBD融合タンパク質の活性が増強されたことから、上記の活性化の減少は、転写に対する非特異的影響ではないようである(図1A)が、この減少は、制限されているコアクチベーターの力価が測定されたことによるものと思われる。従って、GAL4-CBPでのER作用はSRC-1aおよびGRIP-1によって特異的に増強されることから、p160はERのCBP活性の増強に関与していることが示唆される。
【００６１】
本発明者らは、CBP活性のER調節が、SRC-1a結合に関連しているCBPカルボキシ末端内の領域に位置付けられているかどうかを調べた(図２Ｂ)。ERはGAL4に融合したカルボキシ末端ドメイン（アミノ酸1678〜2441）の活性を強力に増強することができた。これに対し、CBPの残りの部分はERリガンドに対して大きくても中程度の応答を示したに過ぎなかった。更にCBP Ｃ末端内のマッピングを行うことにより、アミノ酸2060〜2174にまたがるCBPのフラグメントにより転写活性の最大のER調節が得られることがわかった。このことは、潜在的CBPカルボキシ末端活性化機能(Swopeら、前掲)、またSRC-1aに対する部位（Kameiら、前掲）およびGRIP-1結合（以下を参照のこと）の位置と一致する。CBPに対するERの作用部位がp160の結合部位に位置付けられるという事実は、CBP活性のER調節におけるp160の役割と一致する。
【００６２】
ERは、他の核酸受容体と同様に、カルボキシ末端側のLBDを有し、強力なリガンド誘導性の転写活性機能AF2、中央に位置するDBD、およびアミノ末端（AB）ドメインを含有し、弱い構成的活性化機能AF1を含有する(Toraら、Cell 59:477-87(1989)；Berryら、EMBO J.9:2811-2818(1990)；Kumarら、Cell 51:941-951(1987)；およびLeesら、Nucl.Acids Res.17:5477-5488(1989))。本発明者らは、これらの従来のトランス活性化機能が、SRC-1aおよびCBP活性のER増強に必要であるかどうかを検討した(図3A)。顕著に、単離されたER-LBDは、エストロゲンに依存する様式で、ER-DBDの非存在下でも両コアクチベーターの活性を増強した。AF2を破壊する変異（L543、M544A）により、エストロゲン依存性の活性化が失われた。従って、AF2は、LBDがSRC-1aおよびCBPの両方でエストロゲン応答を介在するのに必要である。ERAB-DBD領域もまた、タモキシフェンリガンド結合性ERで得られる活性に類似の程度で、GAL-SRC-1aおよびGAL-CBPの活性を強力に増強した。ABドメィンを欠失すると、AB-DBD領域による全長ERの構成的活性化および全長ERによるタモキシフェン活性化が失われる(データ示さず)。従って、AF1は、ABドメインに留まり、連結型SRC-1aおよびCBPの両方を活性化する。本発明者らは、コアクチベーターでのER作用は、古典的なエストロゲン応答配列でのER作用と同様に、AF1およびAF2に関与すると結論する。
【００６３】
ERがDNAに結合する場合のAF1は一般に弱いが、連結型コアクチベーターを増強するのは強力であるため、本発明者らは、GAL4-DBDでER-DBDを置換したER融合物（E-GAL-E、図3B）について、GAL4応答性プロモーターに直接添入された場合にAF1およびAF2が正常に挙動することを確認した。従って、AF1は、DNAに結合する場合は弱いが、連結型コアクチベーターの増強については、プロモーターが同一であっても強力である。連結型コアクチベーターの活性化におけるAF1の相対強度から、何故その活性がAF1に反映する（Berryら、前掲）タモキシフェンリガンド結合性ERが、SCR-1aおよびCBPの両方を強力に活性化するかがわかる。
【００６４】
次に、本発明者らは、ER分子、の２つの生物学的に活性な領域LBDおよびABドメインが、インビトロでp160またはCBPのいずれか一方に結合し得るかどうかを調べた。予想した通り、ER-LBDは、エストロゲン依存性、AF2感受的様式で、SRC-1aおよびGRIP-1の両方と相互作用した(図4A)。他の核受容体（Kameiら、Chakravartiら、両方とも前掲）とは異なり、ER-LBDはCBPアミノ末端に結合することはできなかった。LBDはCBPのカルボキシ末端に結合したが、弱いもので、リガンドおよびAF2に非依存性であった。従って、ER-LBDはp160に結合して、CBPには結合せず、連結型コアクチベーターを刺激するエストロゲンおよびAF2依存性のER-LBDの能力とパラレルの様式である(図3A)。
【００６５】
AF1はSRC-1aおよびCBP作用を増強することができたため、本発明者らは、AF1を含有するABドメインもまた、コアクチベーター複合体の要素と相互作用するかどうかを調べた(図4A)。ER-ABドメインはSRC-1aおよびGRIP-1の両方と結合したが、LBD程強力ではなかった。ABドメインはCBPアミノ末端またはCBPカルボキシ末端のいずれとも相互作用しなかった。従って、両ER活性化機能AF1およびAF2は、p160タンパク質と結合することによって、コアクチベーター複合体と機能的に相互作用する能力を有する。
【００６６】
次に、本発明者らは、CBPカルボキシ末端内のp160およびER両方に対する結合部位の相対的位置をマッピングした。図4Bは、SRC-1aが、アミノ酸2041〜2240の長さの断片(D)と主に相互作用したことを示し、この領域内にSRC-1a結合部位を置換した他の報告（Kameiら、前掲）と一致した。GRIP-1もまた、CBPのこの断片と相互作用したが、SRC-1aより強力であった。対照的に、ERは、アミノ酸1678〜2000位のCBPＣ末端の２つの断片（ＡおよびＢ）に特異的に結合し、アミノ酸1801〜1880のみが重複していた。SRC-1a、GRIP-1またはERのいずれもCBPのアミノ末端部分とは相互作用しなかった(データ示さず)。従って、ERにより最も強力な影響を受けたCBP Ｃ末端の領域（図2C）は、SRC-1aおよびGRIP-1には結合するが、ERには結合しない。本発明者らは、内因性のp160とのERの相互作用が、図2Aに示すように連結型CBPを活性化するERの能力の根拠になっていると推測している。
このことは、コアクチベーター機能の増強においてER/p160接触の中心的役割を示している。
【００６７】
他の転写因子もコアクチベーターを増強し得るかどうかを調べるために、本発明者らは、AP-1タンパク質JunおよびFos（両方ともCBPに結合する）(Ariasら、Nature 370:226-229(1994);Bannisterら、Oncogene 11:2509-2514(1995)；Bannisterら、EMBO J.14:4758-4762(1995))がCBP作用を調節することができるかどうかを検討した。図5Aは、JunおよびJun/Fosは両方とも全長CBPの活性を増強したことを示す。AP-1タンパク質がCBPを活性化する能力は転写活性化機能に依存する。何故なら、Jun転写活性を抑制する変異（ser63、73ala）が、JunがCBP活性を増強する能力をも抑制したからである。全長CBPのJun活性化も、TNTα、EGFまたはPMA（これらはそれぞれ、CBP接触を必要とする機構を介してc-Junトランス活性化の能力を増強する(Ariasら、Bannisterら、前掲)）で処置することによって更に誘導された。２つの異なるタイプの転写因子ERおよびJun/Fosは、それらのコアクチベータータンパク質の活性を増強することができるという事実から、転写因子がコアクチベーターを調節する能力は広範であることが示唆される。
【００６８】
まとめると、本発明者らは、ERなどの転写因子がDNAに結合する場合、それらは、２つの段階でコアクチベーターと相互作用する（図6A）ということを提唱したい。第１にERはコアクチベーター複合体に添入される。第２に、これまで認識されていなかった段階で、ERはコアクチベーター複合体の活性を誘発する。コアクチベーターが人為的にDNAに連結される場合、添入におけるERの役割がバイパスされ、ERの誘発の役割が認められる(図6B)。本発明者らの研究は本来ERがどのようにしてコアクチベーター複合体の活性を誘発するのかを調べるものではなかったが、ERは基本転写因子と個別に接触して、プロモーターでの一般的な転写機構を安定化するか、コアクチベーター複合体の組み立てに役立つかまたは個々のコアクチベーターを不活性状態から活性状態に変換しているようである。別の角度からの証拠として、アクチベーターは、転写に対して個別の添入および誘発機能を有することも論じられている。例えば、アクチベータ−CREBは、サイクリックAMPによる刺激を受けてCBPに結合するが、活性化ドメイン内の１つの変異、Ser142Asp（CBPに対するCREB活性化機能の正常なサイクリックAMP誘導性結合をもたらす）にも係わらず転写活性が失われる、が可能である(SunおよびMaurer,J.Biol.Chem.270:7041-7044(1995))。このことは、CREB変異が添入に対しては有利であるが、誘発に対しては有利ではないという見解と一致する。同様に、ER AB-DBD領域がDNAに結合する場合、遊離のLBDはエストロゲンの存在下で更に転写を刺激する(Mcinerneyら、Proc.Nat'l.Acad．Sci USA 93:10069-10073(1996);Krausら、Proc.Nat'l.Acad.Sci USA 92:12314-12318(1995))。この驚くべき結果は、AB-DBD領域がコアクチベーター複合体を添入し、遊離のLBDがそれを誘発し得るという概念によって説明することができる。
【００６９】
ERがCBPなどのコアクチベーターを誘発し得、人為的にDNAに予め添入されるという事実（図6B）もまた、ERが、他の転写因子によって添入されているCBPを誘発し得ることを意味する。本発明者らが行った更なる実験では、AP-1を刺激するER（Gaubら、Cell 63:1267-1276；Webbら、Mol.Endocrinol.9:443-456(1995)；Umayaharaら、J.Biol.Chem.269:16433-16442(1994)およびPhilipsら、J.Biol.Chem.268:14103-14108(1993)）は、Jun、FosおよびElk-1の活性化機能に連結するCBPの活性を増強した。従って、ERがDNAに結合し、コアクチベーターを添入して遺伝子発現を刺激する周知の古典的な経路に加えて、ERはコアクチベーターとしてCBP利用する転写因子を介する遺伝子発現を調節する広範な能力を有する。
【００７０】
最後に、ERがDNAに結合する場合(図6A)、添入および誘発を組み合わせたプロセスは、AF1およびAF2の相乗的な活性を必要とし、これらのいずれも、単独では良好に作用しない(Toraら、Berryら、Kumarら、Leesら、およびMcInerneyら、全て前掲、ならびにDanielianら、EMBO J.11:1025-1033(1992)(図3Bも参照のこと))。対照的に、コアクチベーター複合体がDNAに予め添入される場合(図6B)、ER依存性の誘発はAF1またはAF2のいずれか一方を必要とし、これらは独立して強力に機能する(図３)。結論として、タモキシフェンは、その活性が単離されたAF1に反映し、予め添入されたコアクチベーター複合体を強力に誘発する。タモキシフェンは、インビボで、遺伝子発現に対し多様かつ複雑なエストロゲン様効果を示す(Webbら、前掲；Norrisら、Molecular Endocrinology 10:1605-1616(1996))。
本発明者らの結論より、これらの多くのタモキシフェンアゴニズムの例が、予め添入された複合体を有する遺伝子のER依存性誘発から生じることが証明することが示唆される。
Ｃ．結論の概要
エストロゲン受容体（ER）は、p160ファミリーおよびCBP/p300のコアクチベーターを要する機構により遺伝子発現を活性化する(Onateら、Kameiら、Hongら、Chakravartiら、およびHansteinら、全て前掲、ならびにVoegelら、EMBO J.15:3667-3675(1996)；Smithら、Proc.Natl.Acad．Sci.USA 93:8884-8888(1996))。コアクチベーターの機能を説明するための従来のモデルは、コアクチベーターがDNA結合転写因子と基本転写機構（BTM）との間の橋渡しとして作用することを示唆していた(JanknechtおよびHunter,Nature 383:22-23(1996))。このモデルは、ステロイド受容体がコアクチベーター添入のための不活性なプラットホームとして作用すること、そしてコアクチベーターが遺伝子発現の真のエフェクターであることを意味した。ここで、本発明者らは、SRC-1aおよびCBPが受容体の非存在下で直接DNAに連結された場合、転写を効率的には活性化しないことを明らかにする。しかし、ERを供給すると、ERのDNA結合がなく、両コアクチベーターが転写を活性化する能力が増強される。AP-1タンパク質JunおよびFosもまたそれらのコアクチベーターであるCBPの活性を増大する。従って、コアクチベーターは遺伝子発現を活性化するために転写因子を必要とする。本発明者らの結論より、転写因子はプロモーターにコアクチベーターを添入し、次いで、コアクチベーター複合体のその後の活性を誘発することが明らかである。
【実施例２】
【００７１】
：グルココルチコイド受容体はCBP介在性エストロゲン刺激性転写を抑制する
本実施例は、エストロゲンおよびエストロゲン受容体がGAL4 DNA結合ドメインに連結したCBPコアクチベーターポリペプチドを介在して転写を刺激する能力に対するヒトグルココルチコイド受容体の効果を示す。これらの実験では、ルシフェラーゼ構造遺伝子の発現を駆動する最小プロモーター（TATAボックス）の直ぐ上流にある酵母タンパク質GAL4に対する５つの結合部位から成るレポーター遺伝子を用いる。GAL4 DNAのCBPのカルボキシル末端（アミノ酸1678〜2441）への融合物の発現ベクター、ヒトエストロゲン受容体の発現ベクター、およびヒトグルココルチコイド受容体の発現ベクターとともにレポーター遺伝子を、HeLa細胞にトランスフェクトした。
【００７２】
この実験の結果（図７に示す）は、エストロゲン（エストラジオール）が存在すると、レポーター遺伝子の発現が刺激されることを示す。この刺激は、デキサメタゾン、合成グルココルチコイドアゴニストの存在によって阻害される。この抑制はトランスフェクトされたグルココルチコイド受容体による機能である。HeLa細胞において見出される内因性グルココルチコイド受容体のため、若干の抑制が認められた。
【００７３】
更なる実験において、レポーター遺伝子を、GAL4 DNA結合ドメインの全長CBPへの融合物の発現ベクター、ヒトエストロゲン受容体の発現ベクター、およびヒトグルココルチコイド受容体の発現ベクターとともに、GT1細胞、視床下部細胞株にトランスフェクトした。図８に示すように、サイクリックAMPによる処置により、レポーター遺伝子が予め活性化された場合、合成グルココルチコイドデキサメタゾンは遺伝子発現を抑制する。この場合、GT1細胞内の内因性グルココルチコイド受容体は、抑制に十分である。
【実施例３】
【００７４】
：誘発の概念のもう１つの例示：トランスアクチベーターおよびコアクチベーターのシスでの連結
本発明者らは、トランスアクチベーターおよびコアクチベーターの両方を同一のプロモーターにおいて添入する場合、誘発が可能であるかどうかを調べた。本発明者らは、古典的なエストロゲン応答配列(ERE)及び単一のGAL-REをタンデムに含むレポーター遺伝子を利用し、最小コラゲナーゼTATAボックスの上流を利用した。このレポーターは、ERおよび連結型コアクチベーターがプロモーターで同時に結合することを可能にする。図９は、トランスフェクトしたERの場合、タモキシフェンではなくエストロゲンがレポーター遺伝子から弱い応答を誘発したことを示す。このことは、単離されたAF-1が単一のプロモーターからの転写を活性化し得ないことを示す以前の結果と一致する。更に、トランスフェクトされたGAL-GRIP1はほとんど活性を示さなかった。しかし、組み合わせた場合は、ERおよびGAL-GRIP1は、エストロゲンまたはタモキシフェンのいずれかに依存した様式で、強力な相乗効果を示した。従って、ERおよびGAL-GRIP1が同じプロモーターの組み合わせに配置され、この組み合わせがタモキシフェンの挙動を純粋なアンタゴニストから強力なアゴニストにさせるのに十分である場合、ERおよびGAL-GRIP1は相乗的に作用する。
【００７５】
本明細書に記載の実施例および実施態様は例示のみを目的とするものであって、本名明細書の内容に照らした種々の修正または変更は党業者に示唆されており、本出願の趣旨および権限ならびに添付の請求の範囲に含まれる。本明細書において引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、全ての目的において参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】ERが自身のコアクチベーターの活性を増強することを実証するデータを示す。コアクチベーターは、DNAに連結する際に転写に影響を及ぼさない。GAL4応答性レポーター遺伝子を、GAL4-DBD、GAL4-DBDコアクチベーター融合物、または比較のためにGAL4ER-LBDの発現ベクターとともにHeLa細胞にトランスフェクトした。図示された位置に遊離のSRC-1およびCBPの発現ベクターが含まれる。右側のパネルに、ER-LBDを駆動する遺伝子発現に対する遊離のコアクチベーターの影響が示される。
【図１Ｂ】ERが自身のコアクチベーターの活性を増強することを実証するデータを示す。ERは、連結型コアクチベーターの活性を増強する。ERをトランスフェクトし、タモキシフェンまたはエストロゲンのいずれかで処置した細胞において、GAL4-DBDまたはGAL4-コアクチベーター融合タンパク質の転写活性を測定した。GAL4-コアクチベーター融合タンパク質の概略図を図の上部に示す。CBP内の縞を施した帯および陰線を施した帯は、潜在的活性化機能のおおよその位置を示す。
【図２Ａ】CBPのER活性化がp160に関与することを実証するデータを示す。GAL-CBPのER活性化は、トランスフェクトされたp160によって更に増強される。ERおよび様々な天然のコアクチベーターの発現ベクターをトランスフェクトし、図1Bに示すホルモンで処置した細胞におけるGAL4-CBPの転写活性をモニターした。
【図２Ｂ】CBPのER活性化がp160に関与することを実証するデータを示す。ERは、CBPカルボキシ末端ドメイン内の候補p160結合部位を介してCBPを活性化する。GAL4-CBP融合タンパク質の転写活性能力に対するERの効果を測定した。左側のパネルは、GAL4-CBP融合物（アミノ酸1〜460位、227〜460位、1678〜2441位）に対するERの効果を示す。ERおよびホルモンの非存在下で得られる活性に対する誘導倍率としてデータを示す。右側のパネルに、GAL4-CBP1678-2441位によるER誘導とCBPカルボキシ末端の更に短い領域を有するGAL4-CBP融合物のER誘導とを比較した、より詳細な地図が示される。
【図３Ａ】コアクチベーターを活性化するのにERトランス活性化機能が必要であることを実証するデータを示す。全長ER(400位にバリンへの置換を有するかまたは有さない)、単離LBD(アミノ酸282〜595位)、543位および544位にアラニンへの置換を有する(本来はメチオニンおよびロイシン)LBD、ならびにABドメインおよびDBD（アミノ酸１〜281位）にまたがる領域、それぞれの発現ベクターを、GAL-SRC-1aおよびGAL-CBPを増強する能力について評価した。星印は、400位に野生型のグリシン残基を含有するER発現ベクターを示す。
【図３Ｂ】コアクチベーターを活性化するのにERトランス活性化機能が必要であることを実証するデータを示す。GAL4プロモーターを標的としたER活性化機能の活性。GAL4-DBD、GAL4-DBDをER-DBDと置換したER(E-GAL-E)、AF2またはAF1を含有するERのLBD領域またはAB領域とのGAL4融合体、各々の発現ベクターの存在化における、GAL4応答性レポーター遺伝子の活性。
【図４Ａ】ER活性化機能とp160およびCBPとの相互作用を実証するデータを示す。コアクチベーターのERへの結合。GST融合タンパク質は、p-GEX(親ベクター；Pharmacia Biotechより市販されている）、GST-LBDまたはAF2内に変異を有するGST-LBD(両者ともエタノールビヒクル、タモキシフェンまたはエストロゲン存在下で測定)、およびGST-AB(アミノ酸１〜184位)である。添入された放射性標識タンパク質は、全長SRC-1a、GRIP-1、CBPのアミノ末端側の３分の２の領域、およびCBPのカルボキシ末端側の３分の１の領域である。AF2の変異とは、547位および548位のアミノ酸であるメチオニンおよびロイシンをそれぞれアラニンに変換したものである。
【図４Ｂ】ER活性化機能とp160およびCBPとの相互作用を実証するデータを示す。SRC-1a/GRIP-1およびERは、CBPのＣ末端上の別個の部位に結合する。インビトロで翻訳されたp160および全長ERについて、上側に示すGST融合タンパク質として発現されたCBPの断片に結合する能力を試験した。トランスフェクションアッセイ(図2Bの右側のパネルを参照のこと)でERに対して最も強力な応答を示すことが見出された領域を示す。
【図５Ａ】AP-1タンパク質JunおよびFosがCBP活性を増強することを示す。トランスフェクトされた中空RSV駆動性発現ベクター、c-Jun、c-Fos、Jun/FosまたはJun ser63，73alaの、GAL-CBPの転写活性に対する効果についても評価した。
【図５Ｂ】AP-1タンパク質JunおよびFosがCBP活性を増強することを示す。Jun活性化機能を刺激するセカンドメッセンジャー経路を開始するリガンドもまた、CBPのjun活性化を増強する。実験は、図5Aに示すように実施した。ここで示したように、トランスフェクトした細胞をTNFα(10ng/ml)、EGF（10ng/ml）またはPMA（100nM）あるいは適切なビヒクルで処置した。
【図６Ａ】ERのコアクチベーター複合体との相互作用のモデルを示す。ERはDNAに結合し、ERトランス活性化機能は、コアクチベーター複合体（CBP+P160）を導入、次いでその転写活性を誘発するのに、相乗的に作用する。
【図６Ｂ】ERのコアクチベーター複合体との相互作用のモデルを示す。コアクチベーター(CBP)がDNAに予め導入される場合、導入物内のERの役割はバイパスされ、コアクチベーターの転写活性の誘発におけるERトランス活性化の効果が認められる。
【図７】デキサメタゾンがグルココルチコイド受容体を活性化して、エストロゲンおよびその受容体によって予め活性化された連結型CBPにより刺激された転写を抑制することを実証するデータを示す。
【図８】デキサメタゾンが、GT1細胞内にて8-ブロモサイクリックAMPおよびGAL-CBPによって刺激された転写を阻害することを実証するデータを示す。
【図９】コアクチベーターをプロモーターに連結させると、ER AF-1ドメインが転写を強力に刺激することが十分に可能であることを実証するデータを示す。TATAボックスの上流に単一の隣接EREおよびGALRE部位を有するCATレポーター遺伝子を、表示されたホルモンの存在下で、ER、ERおよびGAL-GRIP1、またはERとGAL-CBPとの各発現ベクターとともに、HeLa細胞にトランスフェクトした。
【図１Ａ】
2004154142.tif 000002
【図１Ｂ】
2004154142.tif 000003
【図２Ａ】
2004154142.tif 000004
【図２Ｂ】
2004154142.tif 000005
【図３Ａ】
2004154142.tif 000006
【図３Ｂ】
2004154142.tif 000007
【図４Ａ】
2004154142.tif 000008
【図４Ｂ】
2004154142.tif 000009
【図５Ａ】
2004154142.tif 000010
【図５Ｂ】
2004154142.tif 000011
【図６Ａ】
2004154142.tif 000012
【図６Ｂ】
2004154142.tif 000013
【図７】
2004154142.tif 000014
【図８】
2004154142.tif 000015
【図９】
2004154142.tif 000016