(57)【要約】　　　（修正有）【課題】グラム陽性球菌、特に腸球菌に起因する感染の治療用として活性な分子、特に抗生物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】グラム陽性菌においてバンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な型の糖ペプチド耐性、特にバンコマイシン耐性に関与するタンパク質ＶａｎＢに関する。更に、糖ペプチド耐性の検出のための遺伝子ｖａｎＢのヌクレオチドフラグメントの使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　グラム陽性球菌、特に腸球菌に起因する感染の治療用として活性な分子、特に抗生物質のスクリーニング方法であって、特にＶａｎＢ型のバンコマイシン耐性表現型を有する細菌でこれらの分子の活性を検出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、特にグラム陽性菌、特にグラム陽性球菌科の細菌においてバンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な型の、糖ペプチドファミリーの抗生物質に対する耐性の発現に関連するポリペプチドに係る。本発明は更に、これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にも係る。本発明は更に、糖ポリペプチド耐性のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出手段としてのこれらのポリペプチド及びそのヌクレオチド配列の使用にも係る。グラム陽性球菌のうちで、本発明は特に腸球菌、連鎖球菌及びブドウ球菌を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
　糖ペプチド、特にバンコマイシン及びテイコプラニンは細菌壁の合成を阻害する抗生物質である。これらの抗生物質は、特にペニシリンアレルギー及び耐性の場合にグラム陽性球菌（腸球菌、連鎖球菌及びブドウ球菌）に起因する重度感染の治療に頻繁に使用されている。
【０００３】
　１９８６年までに、バンコマイシンは腸球菌株のほぼ全てに対して有効であることが判明した。
【０００４】
　糖ペプチドの活性は、細胞壁の代謝酵素との直接相互作用よりも、抗生物質とペプチドグリカンの前駆物質との複合体の形成に依存する。特に、糖ペプチドはペプチドグリカンの前駆物質の末端残基Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニン（Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａ）に結合することが確認された。
【０００５】
　数種の糖ペプチド耐性表現型が明らかになり、特に高濃度の糖ペプチドに対する耐性株と、低濃度耐性株が区別された。
【０００６】
　高濃度耐性株とは、バンコマイシン及びテイコプラニンの最小阻害濃度（ＭＩＣ）が夫々＞３２μｇ／ｍｌ及び＞８μｇ／ｍｌである細菌株、特にグラム陽性球菌株を意味する。低濃度耐性株ではバンコマイシンのＭＩＣは８〜３２μｇ／ｍｌである。表現型ＶａｎＢは、バンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な耐性を特徴とする。一旦誘導されると、この耐性は可変濃度の種々の糖ペプチド、特にバンコマイシン及び／又はテイコプラニンに対して存在し得る。
【０００７】
　表現型ＶａｎＢ（クラスＢ）に対応する腸球菌株としては、特にＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ及びＥ．ｆａｅｃｉｕｍ株が挙げられる。
【０００８】
　Ａｌ−Ｏｂｅｉｄ　Ｓ．ら（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　７０　（１９９０）　１０１−１０６）は、４種の腸球菌株でバンコマイシンにより誘導可能な糖ペプチドに対する耐性タンパク質を比較し、この比較に基づいて３種のタンパク質の存在をつきとめ、そのうちの１種は低濃度バンコマイシンに対して耐性のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ株に存在すると述べている。この文献の著者らによると、低レベル耐性株では分子量約３９．５ｋＤａのタンパク質が誘導され、この耐性はバンコマイシンによる誘導に結び付けられると予想された。これらの株は更に、同様にバンコマイシンにより誘導されるテイコプラニン耐性も有すると予想された。
【０００９】
　Ａｌ−Ｏｂｅｉｄらによると、３９．５ｋＤａのこのタンパク質は多種多様な形態で存在するらしいが、どのような種類が存在するかについては研究されていない。前記著者らによると、該当菌種及び耐性レベルに応じて構造特異性が存在すると考えられ、これを確認することが必要とされている。
【００１０】
　上記文献中で、Ａｌ−Ｏｂｅｉｄらは３９．５ｋＤａのこのタンパク質のＮ末端配列の１１個のアミノ酸に言及しており、この配列が種々の機能を有する原核又は真核起源の多数の膜タンパク質と約７０％の相同度を有すると述べている。同著者らによると、この比較に基づいてタンパク質の未確定な機能を確定することはできなかった。最後に、Ａｌ−Ｏｂｅｉｄらは他のタンパク質も多少誘導されることに着目している。
【００１１】
　本発明は、糖ペプチドファミリーの抗生物質、特にバンコマイシン及び／又はテイコプラニンに対する耐性の発現に関与するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、並びに該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に係る。上記耐性はバンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な型である。
【００１２】
　「耐性の発現に関与」又は「耐性に関与」なる表現は、耐性が出現するために本発明のタンパク質が必要であることを意味する。
【００１３】
　本発明は更に、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は抗体を用いる試験により糖ペプチド耐性を検出するために使用可能なヌクレオチドプローブにも係る。
【００１４】
　従って、本発明は、下記アミノ酸配列Ｉ：
【００１５】
【化１】
2004065257.tif 000002
を含み、グラム陽性菌においてバンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な型の糖ペプチド耐性、特にバンコマイシン耐性に関与することを特徴とするタンパク質ＶａｎＢに関する。
【００１６】
　「誘導型耐性」なる表現は、所定のグラム陽性菌、特に所定の腸球菌株が濃度０．０５〜１μｌ／ｍｌのバンコマイシンの存在下でタンパク質ＶａｎＢを産生できることを意味する。
【００１７】
　１種以上の所定の糖ペプチドに対する耐性は、当該糖ペプチドに対して通常は感受性の細菌に起因する感染の持続により観察できるし、あるいはアンチバイオグラム（特に高レベル耐性の場合）、ＭＩＣ、（例えばＰＣＲによる増幅後の）プローブとのハイブリダイゼーションにより検出することができる。
【００１８】
　本発明の第１の態様によると、タンパク質ＶａｎＢは腸球菌、例えばＥ．ｆａｅｃｉｕｍ又はＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ属の株において糖ペプチド、特にバンコマイシンに対して誘導可能な型の耐性に関与することを特徴とする。
【００１９】
　本発明は更に、改変後のタンパク質ＶａｎＢがグラム陽性菌においてバンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な型の糖ペプチド耐性、特にバンコマイシン耐性に関与することを前提として、１個以上のアミノ酸の欠失、挿入又は置換により配列Ｉを改変したアミノ酸配列を含むことを特徴とするタンパク質ＶａｎＢにも係る。
【００２０】
　本発明は更にアミノ酸配列Ｉに対応するか又は、グラム陽性菌、例えば腸球菌科の細菌における糖ペプチド、特にバンコマイシンに対する誘導型耐性に基本的に関連する前記配列の任意部分に対応することを特徴とするタンパク質ＶａｎＢの任意ペプチドフラグメントにも係る。
【００２１】
　有利には、本発明のペプチドフラグメントは付加的又は択一的に抗原特性を有しており、従って、タンパク質ＶａｎＢに対して形成された抗体により認識される。
【００２２】
　配列Ｉの特定フラグメントは例えば下記配列：
【００２３】
【化２】
2004065257.tif 000003
に対応するか、又はこの配列を含む。
【００２４】
　本発明の別の態様によると、これらの抗原はタンパク質ＶａｎＢに特異的であり、従って、ヨーロッパ特許出願第９１９２０７５３号に記載されているようなタンパク質ＶａｎＡ及びＶａｎＣを認識する抗体により認識されない。
【００２５】
　本発明は更に、グラム陽性菌においてバンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な型の糖ペプチド耐性、特にバンコマイシン耐性に関与するアミノ酸配列Ｉを含むタンパク質ＶａｎＢをコードすること、又はこのコーディング配列の相補的ＤＮＡ配列もしくは対応するＲＮＡ配列であることを特徴とするヌクレオチド配列に係る。
【００２６】
　「相補的配列」なる用語は、配列Ｉのヌクレオチドに相補的であり且つ逆向きのヌクレオチドを有する任意ＤＮＡ配列を意味する。
【００２７】
　この定義に対応する特定ヌクレオチド配列は下記ヌクレオチド配列ＩＩ：
【００２８】
【化３】
2004065257.tif 000004
を含むか又は、グラム陽性菌においてバンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な型の糖ペプチド耐性、特にバンコマイシン耐性に関与するタンパク質をコードすることを前提としてＩＩを改変したヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
【００２９】
　一般に、本発明は更に、上記配列ＩＩに定義したような配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズすることが可能であることを特徴とするヌクレオチドフラグメントにも係る。
【００３０】
　ストリンジェント条件とは、０．１％ＳＤＳ、０．７％脱脂粉乳、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣｌ及び０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０）を含有する溶液中で６５℃で一晩反応させ、周囲温度で２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで洗浄した後、６５℃で０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで洗浄することを意味する。
【００３１】
　有利には、上記定義に対応するヌクレオチドフラグメントは、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドを有する。
【００３２】
　このために、特定ヌクレオチド配列は下記配列：
【００３３】
【化４】
2004065257.tif 000005
を含む。
【００３４】
　本発明のペプチド及びポリペプチドは、これらのペプチドをコードするヌクレオチド配列がプローブを構成する配列ＩＩとストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能であることを特徴とする遺伝子型クラスを決定することができる。
【００３５】
　これらのフラグメントは、増幅反応用プライマー又はプローブとして利用することができる。
【００３６】
　特に有利なプライマーは下記配列：　プライマー１：５’　ＡＴＧＧＧＡＡＧＣＣＧＡＴＡＧＴＣ　３’（配列Ｉのヌクレオチドの２４１〜２５８位）及びプライマー２：５’　ＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣ　３’（配列Ｉのヌクレオチド８６０〜８７７のフラグメントの逆相補的配列）に対応する。
【００３７】
　本発明のヌクレオチドプローブは上記定義に従って誘導可能な糖ペプチド耐性、特にバンコマイシン及び／又はテイコプラニン耐性に関与するタンパク質ＶａｎＢをコードする配列をグラム陽性菌で検出するために特異的であり得、該プローブは更にこれらの配列間で共通であり得る。
【００３８】
　「ｖａｎＢの特異的プローブ」なる用語は、上記のような本発明のタンパク質ＶａｎＢをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズし且つ、感受性株全体に存在する配列と交差ハイブリダイゼーション又は増幅（ＰＣＲ）反応を生じない任意オリゴヌクレオチドを意味する。
【００３９】
　本発明の特定のヌクレオチドフラグメントは、バンコマイシンに対して感受性の球菌株のＤＮＡ、特にＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ　ＪＨ２−２及びＥ．ｆａｅｃｉｕｍ　ＢＭ４１０７株のＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリダイズしないことを特徴とする。
【００４０】
　これらの参考株は夫々ＪａｃｏｂｓとＨｏｂｂｓ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１７，１９７４，３６０−３７２）及びＬｅｃｌｅｒｃｑら（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　３３，１９８９）により記載されている。
【００４１】
　本発明の範囲で有用な別のヌクレオチドフラグメントは、国際特許出願第ＰＣＴ　９１９２０７５３号に記載されているような遺伝子ｖａｎＡ及びｖａｎＣとストリンジェント条件下でハイブリダイズしないという意味で遺伝子ｖａｎＢに特異的である。
【００４２】
　本発明の範囲で特に有用なヌクレオチドフラグメントは、配列ＩＩに対応するフラグメントである。
【００４３】
　このフラグメントは、腸球菌株で耐性に関与する遺伝子に由来する内部フラグメントである。耐性は可変レベルの糖ペプチド濃度に対して存在し得る。
【００４４】
　本発明は更に、改変後のフラグメントが糖ペプチド耐性、特にバンコマイシン耐性に関連する機能的タンパク質ＶａｎＢのフラグメントを上記条件下でコードするか又は遺伝子ｖａｎＢとハイブリダイズすることを前提として、ヌクレオチドの突然変異、付加又は欠失により上記配列を改変したヌクレオチドフラグメントにも係る。
【００４５】
　ヌクレオチドフラグメントをプローブとして使用する場合には、常法により標識を行う。例えば、放射性又は酵素マーカーを使用する。
【００４６】
　本発明のヌクレオチドフラグメントは、所与の生物サンプルに含まれる核酸を例えばＰＣＲにより増幅するためのプライマーとして利用することができる。
【００４７】
　本発明は更に、バンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な型の耐性である、糖ペプチドのファミリーの抗生物質、特にバンコマイシンに対する耐性に関与する遺伝子の所定の宿主におけるクローニング又は発現に介在し得る調節エレメントの制御下で上記ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ配列に係る。
【００４８】
　耐性に関与するこの遺伝子は例えば、ヌクレオチド配列ＩＩを含むか又は、配列ＩＩとハイブリダイズする配列に由来し、誘導型耐性に関して機能的な任意部分を含む遺伝子ｖａｎＢである。
【００４９】
　本発明は更に、バンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な型の耐性である、糖ペプチドファミリーの抗生物質、特にバンコマイシンに対する耐性の所定の宿主における発現に介在し得る調節エレメントの任意制御下でその複製に非必須の部位に上記ヌクレオチド配列を含むことを特徴とするクローニング又は発現用組換えベクターにも係る。
【００５０】
　特定ベクターは例えばプラスミド、ファージ、コスミド、ＹＡＣである。
【００５１】
　好適ベクターは、１９９２年１２月１１日付けでＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託番号Ｉ−１２７７で寄託されたプラスミド、ｐＡＴ２０１である。
【００５２】
　別の好適ベクターは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｖ５８３の遺伝子ｖａｎＢを含む３．３ｋｂフラグメント（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ）を含むプラスミドｐＵＣ１９Ωから形成されるプラスミドｐＡＴ２０２である。
【００５３】
　ｐＡＴ２０２を大腸菌ＪＭ８３に導入し、１９９３年３月２９日付けでＣＮＣＭに寄託番号Ｉ−１２９１で寄託した（大腸菌ＢＭ２９７３）。
【００５４】
　これらのベクターを使用して、本発明のヌクレオチド配列をクローニング又は発現させるために細胞宿主を形質転換又はトランスフェクトすることができる。
【００５５】
　本発明の組換え細胞宿主は、上記ヌクレオチド配列又はベクターにより改変されていることを特徴とする。
【００５６】
　好ましくは細胞宿主は、糖ペプチドに対する誘導型耐性に関して機能的なタンパク質ＶａｎＢの発現を可能にする条件下でこの配列により改変される。
【００５７】
　本発明は更に、上記組換え細胞宿主から得られる組換えタンパク質ＶａｎＢにも係り、得られるタンパク質ＶａｎＢは、そのペプチド骨格が上記アミノ酸配列を含むことと、該タンパク質がグラム陽性菌においてバンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な型の糖ペプチド耐性、特にバンコマイシン耐性に関与することを特徴とする。
【００５８】
　本発明のタンパク質ＶａｎＢを利用して、上記タンパク質ＶａｎＢ又はペプチドフラグメントを特異的に認識することを特徴とするモノクローナル又はポリクローナル抗体を製造することができる。
【００５９】
　これらの抗体は、慣用抗体製造法により得られる。特に、モノクローナル抗体を製造するには、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法を使用し、常法に従って本発明のポリペプチド又は組成物で予め免疫感作したマウスの骨髄腫細胞と脾細胞との細胞融合によりモノクローナル抗体を製造する。
【００６０】
　本発明の抗体は、バンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な型の糖ペプチド耐性、特にバンコマイシン及びテイコプラニン耐性を特徴とするタンパク質の存在を検出するために利用できるという利点を有する。
【００６１】
　本発明は更に、特にグラム陽性球菌に属しており、特にテイコプラニンではなくバンコマイシンによる誘導後に糖ペプチド耐性となる株、特に腸球菌株、例えばＥ．ｆａｅｃｉｕｍの存在を生物サンプルでｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断するためのキットにも係り、該キットは、任意に標識された上記抗体と、抗体−抗原型の免疫原反応の検出用試薬と、任意要素として被験サンプルの溶菌を実施するための試薬と、任意要素として耐性を誘導するための所定濃度のバンコマイシンとを含むことを特徴とする。
【００６２】
　本発明は更に、タンパク質ＶａｎＡに対して特異的な抗体及び／又はタンパク質ＶａｎＣに対して特異的な抗体を更に含む上記キットにも係る。
【００６３】
　本発明の別の態様によると、キットは表現型ＶａｎＡ、ＶａｎＢ又はＶａｎＣに対応する耐性を無差別に検出することができ、ＶａｎＡ、ＶａｎＢ及びＶａｎＣを認識する抗体を含む。これらの抗体は、３種のタンパク質に共通のエピトープを認識する能力により選択することができる。また、タンパク質の各々に固有の異なるエピトープを認識する抗体の混合物を用いてもよい。
【００６４】
　本発明の別の態様によると、低レベル糖ペプチド耐性株、特にバンコマイシン耐性株の存在のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断用キットは、ストリンジェント条件下で遺伝子ｖａｎＢのヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドプローブと、任意に、ヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰとＤＮＡ重合剤を含むことを特徴とする。
【００６５】
　別の検出キットは更に、遺伝子ｖａｎＡと特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドプローブ及び遺伝子ｖａｎＣと特異的にハイブリダイズすることが可能なプローブを含む。
【００６６】
　このキットは、グラム陽性球菌、特に腸球菌、例えばＥ．ｆａｅｃｉｕｍにおける耐性の検出に使用できるという利点を有する。
【００６７】
　本発明は更に、表現型ＶａｎＡ、ＶａｎＢ又はＶａｎＣの１種に対応する糖ペプチド耐性、特にバンコマイシン耐性のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出用キットにも係り、該キットは、遺伝子ｖａｎＡ、ｖａｎＢ及びｖａｎＣとハイブリダイズするヌクレオチドプローブと、ヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰと、ＤＮＡ重合剤を含む。
【００６８】
　本発明は更に、特にグラム陽性球菌科に属する糖ペプチド耐性株、特にバンコマイシン及び／又はテイコプラニン耐性株、特に腸球菌株、例えばＥ．ｆａｅｃｉｕｍ又はＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの存在のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法にも係り、該方法は、
ａ）耐性の発現に関与する所望のヌクレオチド配列を鋳型として使用し、プライマーとハイブリダイズした各ヌクレオチド配列毎に鋳型の各相補的プライマーの伸長産物を合成するハイブリダイゼーション条件下で、４種の異なるヌクレオシド三リン酸と重合剤の存在下に、耐性株を含む疑いのある生物サンプルを、前記ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能な上記本発明のヌクレオチドフラグメントにより構成されるプライマーと接触させる段階と、ｂ）鋳型と、同様に鋳型として機能し得る合成伸長産物とを分離する段階と、
ｃ）検出可能な量の所望のヌクレオチド配列が得られるまで段階ａ）を繰り返す段階と、
ｄ）ヌクレオチド配列の増幅産物を検出する段階とを含むことを特徴とする。
【００６９】
　従って、使用されるプローブはヌクレオチド配列ＩＩ又は配列ＩＩとストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列に特異的であり得る。これらの条件下で本発明の方法は、バンコマイシンにより誘導可能であり且つテイコプラニンにより誘導不能な糖ペプチド耐性を検出することができる。
【００７０】
　本発明の特定態様によると、本方法は更に、生物サンプルを遺伝子ｖａｎＡの特異的ヌクレオチドフラグメント及び／又は遺伝子ｖａｎＣの特異的ヌクレオチドフラグメントと接触させる段階を含む。この場合、本発明の方法は種々の耐性表現型を検出できるという利点がある。
【００７１】
　別の態様によると、遺伝子ｖａｎＡ、ｖａｎＢ又はｖａｎＣに共通のプローブを使用することにより、表現型ＶａｎＡ、ＶａｎＢ又はＶａｎＣに対応する耐性を無差別に検出する。このようなプローブは図２のポリペプチド配列アラインメントから作成することができる。
【００７２】
　本発明の他の特徴及び利点は下記実施例及び図面に明示される。
【００７３】
　図面
　図１：
　遺伝子ｖａｎＢに対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列。Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼを使用してチェーンターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒら，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）により、ｐＵＣ１８に含まれるインサートから２本鎖のヌクレオチド配列を決定した。
【００７４】
　下線配列ＲＢＳはリボソームと結合するシャイン−ダルガノ配列を表す。
【００７５】
　図２：
　タンパク質ＶａｎＢの推定アミノ酸配列と、大腸菌のＶａｎＡ、ＶａｎＣ、ＤｄＬＡ及びＤｄＬＢ（Ｄｕｔｋａ−Ｍａｌｅｎら，１９９２　Ｇｅｎｅ，１１２：５３−５８）、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｖ５８３のＤｄｌ並びにＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＤｄｌＡ（Ｄａｕｂら　−　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７，１９８８，３７０１−３７０８）の対応領域とのアラインメント。７種の配列における同一アミノ酸（Ｉ）及び保存置換（Ｃ）をアラインメントの下部に示した。置換による分類を保つために、アミノ酸をＲＫ、ＬＦＰＭＶＩ、ＳＴＱＮＣ、ＡＧＷ、Ｈ、ＥＤ及びＹにまとめた。
【００７６】
　ドメイン１、２、３及び４は高相同領域に対応する。
【００７７】
　図３：
　遺伝子ｖａｎＢのＤＮＡを増幅するために使用したオリゴヌクレオチドＶ１及びＶ２。
【００７８】
　図４：
　Ｅｎ．ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｖ５８３の遺伝子ｄｄｌのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列。ＢａｍＨＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で消化したｐＵＣ１９にＳａｕ３ＡＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で部分的に消化した組換えバクテリオファージλのＤＮＡをサブクローニングすることにより、プラスミドｐＡＴ２０３を構築した。ｐＡＴ２０３の１５ｋｂのインサートは遺伝子ｄｄｌを含む。ｐＡＴ２０３の連続する１０７９ｐｂのヌクレオチド配列をチェーンターミネーター法により２本鎖で決定した。配列の最初の塩基対を１位と定める。リボソームとの結合配列ＲＢＳは開始コドンＴＴＧの上流１９位に位置する。終止コドンＴＴＡも示す。タンパク質Ｄｄｌの推定アミノ酸配列も示す。
【００７９】
　実験アプローチ
　バンコマイシン（Ｖｍ）及びテイコプラニン（Ｔｅ）等の糖ペプチドファミリーの抗生物質は、ペプチドグリカンの前駆物質のＣ末端残基Ｄ−Ａｌａに結合し、細菌細胞壁へのその取り込みを阻止する（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｐ．Ｅ．１９８９　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：９４３−９５０）。残基Ｄ−Ａｌａは、リガーゼＤ−Ａｌａ：Ｄ−Ａｌａ（ＤＤＬ）により合成されるジペプチドの形態で細胞壁のレベルで前駆物質に取り込まれる（Ｗａｌｓｈ，Ｃ．Ｔ．１９８９　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６４：２３９３−２３９６）。リガーゼＶａｎＡはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａの代わりにジペプチドＤ−Ａｌａ−Ｄ−ｌａｃを合成し、バンコマイシンと低親和性で結合する前駆物質を合成する（Ｂｕｇｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０：１０４０８−１０４１５（１９９１），　Ｈａｎｄｗｅｒｇｅｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５９８２−５９８４（１９９２），　Ｍｅｓｓｅｒ及びＲｅｙｎｏｌｄｓ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ　９４：１９５−２００（１９９２））。
【００８０】
　腸球菌における糖ペプチド耐性は不均一である（Ｄｕｔｋａ−Ｍａｌｅｎら，１９９０　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　３４：１８７５−１８７９）。
【００８１】
　耐性タンパク質ＶａｎＡ及びＶａｎＣ（１９９１年１０月２９日付けヨーロッパ特許出願第９１９２０７５３．０号参照）は、大腸菌のＤ−Ａｌａ：Ｄ−Ａｌａリガーゼ（Ａｌａ＝アラニン）と３０〜３７％のアミノ酸相同（詳細は表ＩＩＩ参照）を示す（Ｄｕｔｋａ−Ｍａｌｅｎら，１９９２　Ｇｅｎｅ　１１２：５３−５８）。タンパク質ＶａｎＡ及びＶａｎＣの構造遺伝子は、表現型ＶａｎＢ株のＤＮＡとはハイブリダイズしない（Ｄｕｔｋａ−Ｍａｌｅｎら，１９９０，Ｌｅｃｌｅｒｃｑら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　３６：２００５−２００８（１９９２））。
【００８２】
　本発明者らは、表現型ＶａｎＢを有しており且つバンコマイシンで誘導後に耐性となる腸球菌株のバンコマイシン耐性に関与するヌクレオチド配列を同定するに至った。
【００８３】
　細菌株：低濃度又は高濃度のバンコマイシンに対して耐性であり且つテイコプラニンに対して感受性であるＥ．ｆａｅｃｉｕｍ（２８株）及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ（１１株）の３９の単離株を試験した（表ＩＩ）。感受性ディスク試験によると、これらの株のうちでＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｖ５８３（Ｓａｈｍ　Ｄ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｓｔｈｅｒ　１９８９，３３：１５８８−９１）及びＥ．ｆａｅｃｉｕｍ　Ｄ３６６（Ｇｕｔｍａｎｎ　Ｌ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　１９９２，３６：７７−８０）を含む２４株は低濃度のバンコマイシンに対して耐性であった。これらの株はクラスＢの表現型に属する。Ｖ５５３の自然突然変異株であるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ株Ｖ５８３−２（Ｚａｒｌｅｎｇａ　ＬＪ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９２，３６：９０２−５）及びＵＭＨ−１（Ｓｃｈｗａｌｂｅ　Ｒ．ら，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　９１ｓｔ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ：Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９１に所収のＡｂｓｔｒａｃｔ　Ａ−１１７）を含めて、低濃度バンコマイシン（ＭＩＣ≧１２８μｇ／ｍｌ）に対して耐性の１５の単離株も試験した。表現型Ａ及びＣに属し、夫々プローブＶａｎＡ及びＶａｎＣとハイブリダイズする十分に特徴付けられた腸球菌株を対照株として使用した。特に、バンコマイシン及びテイコプラニンに対して高耐性の６種のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ臨床単離株（ＢＭ４１４７を含む）を対照株とした。クラスＣに属するＢＭ４１７４を含むＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株も対照として使用した。低濃度バンコマイシンに対して本質的に耐性であり且つテイコプラニンに対して感受性の単離株であるＡＴＣＣ２５７８８株を含むＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ株も対照として使用した（Ｌｅｃｌｅｒｃａ　Ｒ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９２，３６：２００５−８）。
【００８４】
　下記株：Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ　ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ　Ａ　１２４（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａｓｔｅｕｒ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ　ＡＴＣＣ　１４８６９、Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　ＡＴＣＣ　３９３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏｎｆｕｓｕｓ　ＡＴＣＣ　１０８８１、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｔｕｍ　ＡＴＣＣ　９３３８、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　ＡＴＣＣ　８０１４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ　ＡＴＣＣ　２３２７２、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｈａｍｎｏｓｕｓ　ＡＴＣＣ　７４６９、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ　ＡＴＣＣ　１１７４１，Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａｃｉｄｉｌａｃｔｉ　ＡＴＣＣ　８０４２、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ　３３３１６、及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　ＣＩＰ　１６４０７も試験した。糖ペプチドファミリーの抗生物質に対して感受性の下記腸球菌：Ｅ．ｄｕｒａｎｓ　ＡＴＣＣ　１９４３２、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ　ＡＴＣＣ　１９４３４、ＢＭ４１０７（Ｌｅｃｌｅｒｃｑ　Ｒ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９２，３６：２００５−８）、Ｄ３６６から誘導されるバンコマイシンに対して感受性の株であるＭＴ１０Ｒ（Ｇｕｔｍａｎｎ　Ｌ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，１９９２，３６：７７−８０）、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ　ＡＴＣＣ　２９２１２、ＡＴＣＣ　３３１８６、ＪＨ２−２（Ｌｅｃｌｅｒｃｑ　Ｒ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９２，３６：２００５−８）、Ｖ５８３から誘導されるバンコマイシンに対して感受性の株であるＶ５８３−Ｃ１（表ＩＩ）、並びにＥ．ｆａｅｃｉｕｍ及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの臨床単離株を負の対照として使用した。参考株の特徴を表Ｉに示す。リファンピン及びフシジン酸の両者に対して耐性であるＥ．ｆａｅｃｉｕｍ　ＢＭ４１０７及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ　ＪＨ２−２（Ｌｅｃｌｅｒｃｑ　Ｒ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９２，３６：２００５−８）を接合実験用受容株として使用した。
【００８５】
　腸球菌の同定
　Ｆａｃｋｌａｍ及びＣｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８９，２７：７３１−４の方法により腸球菌を同定した。種の同定は、亜テルル酸カリウムの還元試験及び連鎖球菌ＡＰＩ　２０（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｍａｒｃｙ　ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ，フランス）のバンド上の炭水化物からの酸生成試験に基づいて実施した。３０℃での移動性試験及び炭水化物の発酵試験を使用して、Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ及びＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓをＥ．ｆａｅｃｉｕｍ及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓから区別した。寒天上の黄色色素生成に基づいてＥ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ株をＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ株から区別した。
【００８６】
　培地
　脳心臓及び寒天培地（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を使用した。感受性試験はＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｍａｒｎｅ　Ｌａ　Ｃｏｑｕｅｔｔｅ，フランス）で実施した。全インキュベーションは３７℃で実施した。
【００８７】
　抗生物質に対するｉｎ　ｖｉｔｒｏ感受性の決定
　ディスクにバンコマイシン３０μｇ又はテイコプラニン３０μｇ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｐａｓｔｅｕｒ）を加え、ディスク拡散試験を初期スクリーニングに使用した。各回１０４ＣＦＵとしてＳｔｅｅｒｓらの方法を用いて抗生物質のＭＣＩを決定した（Ｓｔｅｅｒｓ　Ｅ．ら，Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（Ｂａｓｅｌ）１９５９，９：３０７−１１）。
【００８８】
　抗生物質の耐性特徴の伝達
　Ｄｕｔｋａ−Ｍａｌｅｎ　Ｓ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９０．３４：１８７５−９に記載の方法に従ってフィルター上で接合を行った。接合体の選択のための抗生物質濃度は、リファンピン２０μｇ／ｍｌ、フシジル酸１０μｇ／ｍｌ、並びにバンコマイシン４及び８μｇ／ｍｌとした。
【００８９】
　酵素及び試薬
　リゾチームはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ＲＮａｓｅ　Ａ（ウシ膵臓）及びプロテイナーゼＫはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ及びトリエチルアンモニウム塩（比活性３０００ＣＩ／ｍｍｏｌ）はＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国から入手した。テイコプラニンはＧｒｕｐｐｏ　Ｌｅｐｅｔｉｔ（Ｍｉｌａｎ，イタリー）から入手し、バンコマイシンはＥｌｉ　Ｌｉｌｌｙ　＆　Ｃｏ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手した。
【００９０】
　ヨーロッパ特許出願第９１９２０７５３．０号に記載されているオリゴヌクレオチドＶ１及びＶ２は、ＰＣＲによりタンパク質ＶａｎＡ、ＶａｎＣ及びＤ−Ａｌａ：Ｄ−Ａｌａリガーゼをコードする遺伝子の内部フラグメントを増幅することができた（Ｄｕｔｋａ−Ｍａｌｅｎら，１９９２　Ｇｅｎｅ　１１２：５３−５８）。
【００９１】
　遺伝子ｖａｎＢの増幅はオリゴヌクレオチドＶ１及びＶ２とＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｖ５８３のＤＮＡ（２０ｎｇ）を用いて実施した（Ｓａｈｍら，１９８９　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　３３：１５８８−１５９１）。
【００９２】
　この増幅を実施するために、Ｄｕｔｋａ−Ｍａｌｅｎら，１９９２の文献に記載されている方法を使用した。得られたフラグメントをＴＥＡ緩衝液中アガロースゲル（１％）上で分離した処、約６００ｐｂの固有バンドを検出することができ、ＤＮＡ精製キット（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ，Ｂｉｏｌ０ｌ　Ｉｎｃ．，ｌａ　ＪＯＬＬＡ，ＣＡ）を使用してゲルから抽出した。ＤＮＡのレベルに平滑末端を得るためのキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）を使用することにより、フラグメントをＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、消化及び脱リン酸化したプラスミドｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位のレベルに連結した(Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら,１９８３，Ｇｅｎｅ　２６：１０１−１０６)。
【００９３】
　Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）及び［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）を使用してチェーンターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒら，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）により、組換えプラスミドのインサート（図１）に対応する６３２ｂｐの配列（プローブｖａｎＢ）を決定した。
【００９４】
　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼによる増幅はヌクレオチドを誤って取り込む恐れがあるので、配列を次のように確認した。図１のヌクレオチド配列の５１３〜５３０位の相補的オリゴヌクレオチドをホスホルアミダイト法（ｕｎｉｔｅ　ｄｅ　Ｃｈｉｍｉｅ　Ｏｒｇａｎｉｑｕｅ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａｓｔｅｕｒ，フランス）により合成し、プライマーＶ１と併用してｖａｎＢのフラグメントをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を直接（Ｍａｂｉｌａｔら，１９９０，Ｐｌａｓｍｉｄ　２３：２７−３４）、又はベクターｐＵＣ１８にクローニング後に配列決定し、Ｖ１及びＶ２を用いて得られたクローン化フラグメントとヌクレオチドが一致するかどうかを調べた。
【００９５】
　Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１：３−８（１９８４）の方法に従ってサザン型のハイブリダイゼーションを実施した。Ｂｏｕｑｕｅｎｅｃら，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：７２７−７３４に記載の方法に従って腸球菌株の全ＤＮＡ（表Ｉ）を調製し、酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ（米国、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）で消化し、１％アガロースゲル上で分離した。真空移送装置（Ｔｒａｎｓ．Ｖａｃ．ＴＥ８０，Ｈｏｅｆｅｒ，Ｓｃｈｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いてＤＮＡをナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ）に移した。ニックトランスレーションキット（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及び（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）を用いてクローン化ＰＣＲフラグメントを標識することによりプローブを得た。ハイブリダイゼーションは６８℃でストリンジェント条件下で実施した（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９８４，Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．　１：３−８）。膜を６５℃で０．１％　ＳＤＳ−２×ＳＳＣで洗浄した。
【００９６】
　プローブｖａｎＡは遺伝子ｖａｎＡの２６５ｐｂの内部フラグメントＰｓｔＩから構成した（Ｄｕｔｋａ　Ｍａｌｅｎ　Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９０，２２４：３６４−７２）。プローブｖａｎＣは遺伝子ｖａｎＣの６９０ｐｂの内部フラグメントＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｃＩＩから構成した（Ｌｅｃｌｅｒｃｑ　Ｒ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　１９９２，３６：２００５−８，Ｄｕｋｔａ　Ｍａｌｅｎ　Ｓ．ら　Ｇｅｎｅ，１９９２，１１２：５３−８）。プローブｖａｎＢは配列ＩＩに対応する。
【００９７】
　プラスミドｐＵＣ１８に含まれるインサートの推定アミノ酸配列を、種々のタンパク質配列と比較した（図２）。表５は、タンパク質ＶａｎＢ、ＶａｎＡ、ＶａｎＣ、ＥｌＤｄｌ、ＤｄｌＡ及びＤｄｌＢの配列を２種ずつ比較してアミノ酸一致百分率をまとめたものである。サザンハイブリダイゼーション条件下では、クローン化フラグメントは、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｖ５８３の３．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントとハイブリダイズした。プローブはバンコマイシンに対して感受性のＶ５８３の誘導体のＤＮＡ、又は参考として使用したバンコマイシンに対して感受性のＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ及びＥ．ｆａｅｃｉｕｍ株のＤＮＡとはハイブリダイズしない。ＰＣＲにより得られたクローン化ＤＮＡフラグメントは、耐性に関与する遺伝子の内部フラグメントに対応する。この遺伝子は、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａに代わる産物の合成に関与すると思われるＤ−Ａｌａ：Ｄ−Ａｌａリガーゼと同種の酵素ＶａｎＢをコードする。
【００９８】
　これらの試験の結果、腸球菌における高低レベルのバンコマイシン耐性の原因となるｖａｎＢと同種のただ１群の遺伝子を実証することができた（表１及び２）。
【００９９】
　非誘導下ではバンコマイシンに対して感受性の株、遺伝子ｖａｎＡもしくはｖａｎＣを有する株、又は本質的に耐性の株のＤＮＡと、プローブＶａｎＢとの間にハイブリダイゼーションは観察されなかった。
【０１００】
　下記段階を実施することにより、遺伝子ｖａｎＢの完全配列をクローニングした。
【０１０１】
　遺伝子ｖａｎＢを含む組換えバクテリオファージλの３．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＵＣ１９にサブクローニングすることにより、プラスミドｐＡＴ２０２を得た。クローニングは、製造業者の推奨に従って制限エンドヌクレアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ及びＰｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）及びアルカリホスファターゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して実施した。修飾Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）及びメトキシホスホルアミダイト法により合成した配列の相補的オリゴヌクレオチド（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，フランス）を使用することにより、チェーンターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒら，１９７７）により２本鎖でｐＡＴ２０２の連続する１０９０ｐｂのヌクレオチド配列を決定した。反応産物を６％変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離した。図面の配列の最初の塩基対は１位に対応する（図１）。４６位の開始コドンＡＴＧの上流のリボソームとの潜在連結部位（ＲＢＳ）（Ｍｏｒａｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８６（１９８２）３３９−３４６）を下線で示す。終止コドン（ＴＧＡ）には＊を付した。アミノ酸配列は各コドンの最初のヌクレオチドと整列させた。
【０１０２】
　フィルター上の接合による（１７種の腸球菌単離株のうち６種における）バンコマイシン耐性特徴の伝達は、低濃度又は高濃度抗生物質に対して耐性のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ株で観察された。
【０１０３】
　オリゴヌクレオチドＶ１及びＶ２から増幅した約６００ｂｐの他のフラグメントのうちで、１個のインサートはＥｎ．ｆａｅｃａｌｉｓのＶｍＲ又はＶｍＳ株のＤＮＡとハイブリダイズしたが、他の１８種の株のＤＮＡとはハイブリダイズしなかった。この遺伝子はＥｎ．ｆａｅｃａｌｉｓにおいてＤ−Ａｌａ：Ｄ−Ａｌａリガーゼをコードする。Ｅｎ．ｆａｅｃａｌｉｓで別のリガーゼ遺伝子は全く検出されなかったので、この遺伝子をｄｄｌと呼称した。
【０１０４】
　ベクターｐＵＣ１９に挿入した遺伝子ｄｄｌのクローニング及び配列決定（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒら，Ｇｅｎｅ　２６，１９８３，１０１−１０６）の結果、ｄｄｌ（３７．５％）とＥｎ．ｆａｅｃａｌｉｓの染色体（３７〜３９％）の塩基Ｇ及びＣ含有量は非常によく似ていることが判明した。
【０１０５】
　種々の観察の結果、遺伝子ｖａｎＢは外来起源であると予想される。（ｉ）遺伝子は接合により移入され得る。（ｉｉ）ｖａｎＢと同種のヌクレオチド配列はＥｎ．ｆａｅｃａｌｉｓ及びＥｎ．ｆａｅｃｉｕｍと他の１６種の腸球菌の典型例のＶｍＳ株のＤＮＡでは検出されなかった（表ＩＩＩ）。（ｉｉｉ）遺伝子ｖａｎＢの塩基ＧＣの含有量はＥｎ．ｆａｅｃａｌｉｓの染色体の場合と著しく異なる。（ｉｖ）Ｅｎ．ｆａｅｃａｌｉｓのＤｄｌとＶａｎＢとは類似性が低い（相同度３４％）ので、対応する遺伝子は最近の重複起源をもたないと考えられる。
【０１０６】
　Ｅｎ．ｆａｅｃａｌｉｓ　ＶｍＲ及びＶｍＳにおけるペプチドグリカンの前駆物質
　Ｅｎ．ｆａｅｃａｌｉｓ　ＪＨ２−２　ＶｍＲ又はＶｍＳ株（Ｊａｃｏｂ及びＨｏｂｂｓ　−　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１７，１９７４，３６０−３７２）の誘導前のＥｎ．ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｖ５８３を、細胞壁の阻害剤であるラモプラニン（９μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、ペプチドグリカン合成の通常サイクルで使用される細胞壁の前駆物質ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ（ＵＤＰ−Ｍｕｒ−ＮＡｃ−ペンタペプチド）を蓄積させた。
【０１０７】
　耐性の誘導後、株をラモプラニンと共にインキュベートした処、Ｅｎ．ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｖ５８３は細胞壁の３種の中間体を蓄積した（表ＩＶ）。これらの中間体はＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチド、ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチドのＣ末端部分Ｄ−Ａｌａを欠失するＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−テトラペプチド、及び主成分として、ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチドのＣ末端部分Ｄ−ＡｌａがＤ−乳酸に置換されたＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−テトラペプチド−Ｄ−乳酸であることが確認された。ＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−テトラペプチド−Ｄ−乳酸の存在は、表現型ＶａｎＡ及びＶａｎＢの株が同一の糖ペプチド耐性塩基機序を有することを示唆するものであり、同株は、Ｄ−Ａｌａを介してＶａｎＢ（又はＶａｎＡ）と結合可能なＤ−乳酸を合成してＤ−Ａｌａ−Ｄ−乳酸を合成した後、これをペプチドグリカンの前駆物質に取り込むと考えられる。
【０１０８】
　壁の前駆物質をイオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過脱塩により精製した。質量スペクトロスコピー（正イオンエレクトロスプレー質量スペクトロスコピー）、ＵＶ線（ウラシルの場合）、４時間及び２４時間加水分解後のアミノ酸の自動分析（ムラミン酸及びアミノ酸含有量）及びＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　Ｒ３９のＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼとの反応により得られる末端残基の特異的酵素反応による分析（Ｍｅｓｓｅｒ及びＲｅｙｎｏｌｄｓ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔｅｒ　９４，１９９２，１９５−２００）に基づいて同定した。
【０１０９】
　各培養で蓄積した前駆物質の合計量はほぼ同様であり、平均合成時間の０．６に対応するインキュベーション時間で６５μｍｏｌ／ｇ乾燥重量であった。
【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
【表２】
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【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１Ａ】遺伝子ｖａｎＢに対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１Ｂ】遺伝子ｖａｎＢに対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】タンパク質ＶａｎＢの推定アミノ酸配列と、大腸菌のＶａｎＡ、ＶａｎＣ、ＤｄＬＡ及びＤｄＬＢ（Ｄｕｔｋａ−Ｍａｌｅｎら，１９９２　Ｇｅｎｅ，１１２：５３−５８）、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｖ５８３のＤｄｌ並びにＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＤｄｌＡ（Ｄａｕｂら　−　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７，１９８８，３７０１−３７０８）の対応領域とのアラインメントを示す。
【図２Ｂ】タンパク質ＶａｎＢの推定アミノ酸配列と、大腸菌のＶａｎＡ、ＶａｎＣ、ＤｄＬＡ及びＤｄＬＢ（Ｄｕｔｋａ−Ｍａｌｅｎら，１９９２　Ｇｅｎｅ，１１２：５３−５８）、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｖ５８３のＤｄｌ並びにＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＤｄｌＡ（Ｄａｕｂら　−　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７，１９８８，３７０１−３７０８）の対応領域とのアラインメントを示す。
【図３】遺伝子ｖａｎＢのＤＮＡを増幅するために使用したオリゴヌクレオチドＶ１及びＶ２を示す。
【図４】Ｅｎ．ｆａｅｃａｌｉｓ　Ｖ５８３の遺伝子ｄｄｌのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列。
【図１Ａ】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４】
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【図１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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