(57)【要約】【課題】日本人に多い非肥満型の２型糖尿病に極めて類似した糖尿病モデルであり、神経因性のインスリン分泌制御の障害を特徴とするマウスを提供する。【解決手段】野性キャスタネウスマウスと近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの子孫マウスであって、以下の特性：（Ａ）正常系統マウスと比較した場合に高血糖および／または耐糖能異常を示す；（Ｂ）正常系統マウスと比較した場合に体重および／または肥満度が有意に低い；（Ｃ）正常系統マウスと比較した場合に内在性アドレナリンがα２−アドレナリンレセプターを介してインスリン分泌を抑制する作用が顕著に強い、を有することを特徴とする。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野性キャスタネウスマウスと近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの子孫マウスであって、以下の特性：
（Ａ）正常系統マウスと比較した場合に高血糖および／または耐糖能異常を示す；
（Ｂ）正常系統マウスと比較した場合に体重および／または肥満度が有意に低い；
（Ｃ）正常系統マウスと比較した場合に内在性アドレナリンがα２−アドレナリンレ　セプターを介してインスリン分泌を抑制する作用が顕著に強い、
を有することを特徴とする糖尿病モデルマウス。
【請求項２】
子孫マウスが兄妹交配第ｎ世代（ｎは１以上）マウスである請求項１の糖尿病モデルマウス。
【請求項３】
請求項１または２の糖尿病モデルマウスと他の糖尿病モデルマウスとの交配によって作出された糖尿病モデルマウス。
【請求項４】
請求項１、２または３の糖尿病モデルマウスの組織。
【請求項５】
請求項１、２または３の糖尿病モデルマウスの細胞。
【請求項６】
請求項１、２または３の糖尿病モデルマウスの受精卵。
【請求項７】
以下のステップ：
（１）複数の野性キャスタネウスマウスと近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを交配して得た子孫マウスからなる選抜基礎集団を作成すること；
（２）選抜基礎集団のマウスから、以下の基準：
（ａ）正常系統マウスと比較した場合に高血糖および／または耐糖能異常を示す；
（ｂ）正常系統マウスと比較した場合に体重および／または肥満度が有意に低い、
に合致する個体の兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第１世代マウスから、基準（ａ）および（ｂ）に合致する個体を選抜すること、
を含むことを特徴とする糖尿病モデルマウスの作出方法。
【請求項８】
さらに以下のステップ：
（３）ステップ（２）で選抜した兄妹交配第１世代マウスの兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第２世代マウスから、基準（ａ）および（ｂ）に合致する個体を選抜すること；および
（４）前記のステップ（３）を繰り返して、基準（ａ）および（ｂ）に合致する兄妹交配第ｎ世代（ｎは３以上）マウスを得ること、
を含む請求項７の糖尿病モデルマウスの作出方法。
【請求項９】
以下のステップ：
（１）複数の野性キャスタネウスマウスと近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを交配して得た子孫マウスからなる選抜基礎集団を作成すること；
（２）選抜基礎集団のマウスから、以下の基準：
（ｃ）正常系統マウスと比較した場合にα２−アドレナリンレセプターのアゴニス　ト投与後の血糖値が顕著に上昇する；
（ｄ）α２−アドレナリンレセプターのアンタゴニスト投与後に異常耐糖能が正常化する、
の少なくとも一方に合致する個体の兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第１世代マウスから、基準（ｃ）または（ｄ）に合致する個体を選抜すること、
を含むことを特徴とする糖尿病モデルマウスの作出方法。
【請求項１０】
さらに以下のステップ：
（３）ステップ（２）で選抜した兄妹交配第１世代子孫マウスの兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第２世代マウスから、基準（ｃ）および（ｄ）の少なくとも一方に合致する個体を選抜すること；および
（４）前記のステップ（３）を繰り返して、基準（ｃ）および（ｄ）の少なくとも一方に合致する兄妹交配第ｎ世代（ｎは３以上）マウスを得ること、
を含む請求項９の糖尿病モデルマウスの作出方法。
【請求項１１】
以下のステップ：
（１）複数の野性キャスタネウスマウスと近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを交配して得た子孫マウスからなる選抜基礎集団を作成すること；
（２）選抜基礎集団のマウスから、以下の基準：
（ａ）正常系統マウスと比較した場合に高血糖および／または耐糖能異常を示す；
（ｂ）正常系統マウスと比較した場合に体重および／または肥満度が有意に低い；
（ｃ）正常系統マウスと比較した場合にα２−アドレナリンレセプターのアゴニス　ト投与後の血糖値が顕著に上昇する；
（ｄ）α２−アドレナリンレセプターのアンタゴニスト投与後に異常耐糖能が正常化する、
のうち、基準（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に合致する兄妹マウスを交配させて得た兄妹マウス第１世代マウスから、前記と同様の基準に合致する個体を選抜すること、
を含むことを特徴とする糖尿病モデルマウスの作出方法。
【請求項１２】
さらに以下のステップ：
（３）ステップ（２）で選抜した兄妹交配第１世代マウスの兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第２世代マウスから、基準（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に合致する個体を選抜すること；および
（４）前記のステップ（３）を繰り返して、基準（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に合致する兄妹交配第ｎ世代（ｎは３以上）マウスを得ること、
を含む請求項１１の糖尿病モデルマウスの作出方法。
【請求項１３】
糖尿病治療薬をスクリーニングする方法であって、請求項１、２または３の糖尿病モデルマウスに候補物質を投与し、このモデルマウスの血糖値を改善する物質を特定することを特徴とする方法。
【請求項１４】
糖尿病治療薬をスクリーニングする方法であって、請求項１、２または３の糖尿病モデルマウスに候補物質を投与し、次いでα２−アドレナリンレセプターのアゴニストを投与し、アゴニスト投与後の血糖値の上昇を抑制する物質を特定することを特徴とする方法。
【請求項１５】
糖尿病治療薬をスクリーニングする方法であって、請求項１、２または３の糖尿病モデルマウスに候補物質を投与し、このモデルマウスにα２−アドレナリンレセプターのアンタゴニストを投与した後の異常耐糖能改善作用と同程度の改善作用をもたらす物質を特定することを特徴とする方法。
【請求項１６】
糖尿病治療薬をスクリーニングする方法であって、請求項１、２または３の糖尿病モデルマウスの膵臓組織または膵β細胞に候補物質を作用させ、次いでアドレナリンまたはα２−アドレナリンレセプターのアゴニストを作用させ、アドレナリンまたはアゴニスト投与後のインスリン分泌量の低下を抑制する物質を特定することを特徴とする方法。
【請求項１７】
糖尿病治療薬をスクリーニングする方法であって、請求項１、２または３の糖尿病モデルマウスの膵臓組織または膵β細胞にアドレナリン存在下で候補物質を作用させ、この膵臓組織または膵β細胞にα２−アドレナリンレセプターのアンタゴニストを作用させた後のインスリン分泌量の上昇と同程度のインスリン分泌量上昇をもたらす物質を特定することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、糖尿病モデルマウスとその作出方法、並びにこのモデルマウスの利用発明に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、日本人に多く発症する２型糖尿病を自然発症する新規のモデルマウスと、このモデルマウスの作出方法、並びにこのモデルマウスまたはその組織、細胞を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、患者数６９０万人、糖尿病発症の可能性を否定できない糖尿病予備群をあわせると１３７０万人にも上るいわば国民病である。糖尿病は慢性の高血糖を呈し、様々な合併症を引き起こす疾患であるが、その多くは「沈黙の病」といわれるように症状が現れにくく、口喝、多飲、多尿、多食などの症状が現れた時には病状が進行しており、すでに重篤な合併症を伴っている場合もある。そして、糖尿病性神経症、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症などの代表的な合併症以外に動脈硬化性の疾患を有することも多い疾患である。そして、これらの危険な合併症を伴う糖尿病は、膵β細胞からのインスリン供給の低下あるいはインスリン感受性組織におけるインスリン抵抗性が引き金となり発症すると考えられている。つまり、インスリン供給の低下やインスリン抵抗性、それによる代謝異常（血糖上昇）、合併症の発症というつながりを持つのが糖尿病の特徴である。
【０００３】
前述のように、糖尿病はインスリン供給量の低下とインスリン抵抗性の２つの機序で起こるインスリン作用不足により発症するが、その成因は多様である。糖尿病はその成因によって、（１）１型、（２）２型、（３）その他の特定の機序、疾患によるもの、（４）妊娠糖尿病に分類される（葛谷健他、糖尿病　１９９９；　４２（５）：３８５−４０４）。（１）は、インスリン分泌細胞である膵β細胞の破壊性病変でインスリンの欠乏が生じることによって起こる糖尿病と定義づけられており、これは膵島抗原に対する自己抗体が多く認められることが多いので、主に自己免疫機序が関与している疾患であると認識されている。つまり、“絶対的”インスリン欠乏をきたす自己免疫疾患である。一方、（２）はインスリン分泌低下とインスリン感受性組織におけるインスリン抵抗性の二者が様々な割合で混在して発症するタイプで、インスリン作用の“相対的”不足によって特徴づけられるものである。　（３）には、（Ａ）遺伝因子として遺伝子異常が同定されたもの（インスリン遺伝子そのものや、ＭＯＤＹなどのような膵β細胞の機能に関わる遺伝子異常、インスリン受容体遺伝子の異常などのようなインスリン作用の伝達機構に関わる遺伝子異常）と（Ｂ）他の疾患、条件に伴うもの（膵外分泌疾患、内分泌疾患、感染症）が含まれ、１型および２型糖尿病とは区別されて分類されている。また、（４）は妊娠中に発症もしくは初めて発見された糖代謝異常をいい、成因論的には他の型の糖尿病と共通の発症機序が根底にある。このように糖尿病は、成因によって４つに分類分けされており、その多くは遺伝子素因の影響を受けやすいことが特徴である。
【０００４】
２型糖尿病は全糖尿病患者の大部分を占め、遺伝的素因に、過食、食事内容、ストレス、運動不足といった多くの環境因子が加わって発症、進行するという複雑な多因子疾患である。２型糖尿病の発症要因であるインスリン分泌不全とインスリン抵抗性の両者の解析に関する最近の研究の結果、膵β細胞におけるグルコース依存性インスリン分泌の分子機構およびインスリン感受性細胞における受容体以降の細胞内情報伝達経路に関してはその大要が明らかとなった。更なる詳細な機構についても精力的に解析されており、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、細胞レベルでの研究は勿論のこと、発生工学的手法の技術進歩によって作成されたノックアウト（ＫＯ）マウス、トランスジェニック（Ｔｇ）マウスなどの動物モデルも大きく寄与してきた。
【０００５】
例えば、インスリン生合成や、分泌に関する分子のＫＯマウスとして、膵β細胞型ＧＫ（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）　ＫＯマウス（Ｔｅｒａｕｃｈｉ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９５；　４４（１２）：１４４７−１４５７，　Ａｉｚａｗａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　１９９６；　２２９（２）：４６０−４６５）やＫｉｒ６．２（ＡＴＰ感受性Ｋチャンネル）　ＫＯマウス（Ｍｉｋｉ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　１９９８；　９５（１８）：１０４０２−１０４０６）が作成され、これらの分子がインスリン分泌に重要な役割を担っていることが示されている。また、ＩＰＦ−１　（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｆａｃｔｏｒ１；ＰＤＸ−１とも呼ばれる）　ＫＯマウス（Ｊｏｎｓｏｎ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　１９９４；　３７１（６４９４）：６０６−６０９）の解析からＩＰＦ−１が膵臓の形成に重要であることも明らかにされている。
【０００６】
また、インスリン作用に関するＫＯマウスとして、インスリン受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＩＲ）　ＫＯマウス（Ａｃｃｉｌｉ　ＲＬ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｎａｔ．　Ｇｅｔｅｔ．　１９９６；　１２（１）：　１０６−１０９）、骨格筋、膵β細胞、肝臓、脂肪組織特異的なＩＲ　ＫＯマウス（Ｗｏｊｔａｓｚｅｗｓｋｉ　Ｊ．ｅｔａｌ，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１９９９；１０４（９）：１２５７−６４，　植木浩二郎，　医学のあゆみ　２０００；　１９２（５）：３７４−３８０）、インスリン受容体基質（ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ：ＩＲＳ）−１，２，３　ＫＯマウス（Ｔａｍｅｍｏｔｏ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　１９９４；　３７２（６５０４）：１８２−１８６，　Ｋｕｂｏｔａ　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉａｂｅｔｅｓ．　２０００；　４９（１１）：　１８８０−１８８９，　Ｌｉｕ　ＳＣ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９９；　２７４（２５９）：　１８０９３−１８０９９）、組織特異的なＧＬＵＴ４　ＫＯマウス（Ｋａｔｚ　ＥＢ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　１９９５；　３７７（６５４５）：　１５１−１５５，　Ｋｉｍ　Ｊ．Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　２００１；　１０８（１）：　１５３−１６０，　Ａｂｅｌ　ＥＤ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　２００１；　４０９（６８２１）：　７２９−７３３）など多くのＫＯマウスが作成され、各々のタンパクのインスリン作用に関する役割のみならず、インスリン抵抗性の臓器特異的な解析、インスリン抵抗性存在下における膵β細胞の増殖の機序など、糖尿病の成因・病態を考える上での知見が数多く得られている。
【０００７】
これらの発生工学的手法を用いて開発された動物の応用研究は、インスリン分泌や作用の分子機構の詳細な解明に役立つだけでなく、幾つかの遺伝因子や環境因子の負荷により、多因子疾患としての２型糖尿病の病態解明を可能にするものと期待されている。また、糖尿病の発症や病態の解明に留まらず、遺伝子治療／再生医療を含む新しい治療法、治療薬の開発に応用されることが期待されるため、不可欠といえる研究分野である。
【０００８】
しかし、未知の糖尿病責任遺伝子の同定という観点からは、急増する遺伝子改変糖尿病動物の貢献は極めて小さい。なぜならば大多数の遺伝子改変糖尿病動物モデルは、糖尿病の発症に重要とわかっている既知の分子をターゲットに作製されるからである。これまでに遺伝子改変モデルの作製に取り上げられた遺伝子は糖尿病全体の数％を占めるにすぎない。多くの遺伝的要因が関与する２型糖尿病の全容解明のために、未知の原因遺伝子の同定は焦眉の課題である。
【０００９】
２型糖尿病患者を対象にした新規原因遺伝子同定のアプローチとしては、機能的に疾患に関与する可能性のある遺伝子を解析する“候補遺伝子アプローチ”、同胞発症家系を対象にランダムなマーカーを用いてゲノム全体をスクリーニングして疾患に関与する遺伝子の位置を同定する“ランダムマーカーアプローチ”などがある。実際に、このような遺伝子解析では幾つかの有望な遺伝子が特定されている（Ｆｒｏｇｕｅｌ　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　１９９３；　３２８，６９７−７０２　Ｈａｎｉｓ　ＣＬ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９９６；　１３（２）：　１６１−１６６，　Ｈｏｒｉｋａｗａ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　ｇｅｎｅｔ．　２０００；　２６（２）：　１６３−１７５，　Ｎｉｓｈｉｇｏｒｉ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．
２００１；　９８（２）：　５７５−５８０）。
【００１０】
ヒトにおける２型糖尿病のほとんどは、遺伝的あるいはそれ以外の要因が複雑に影響しあった結果として引き起されることは論をまたない。しかし、各々の催糖尿病因子を、糖尿病症例あるいは不均一な遺伝的バックグラウンドを持つ動物から同定する確率は非常に低いと予想される。なぜならば、ありふれた催糖尿病因子の影響は単独では非常に小さく、遺伝的に不均一な系ではその催糖尿病効果が隠蔽されてしまう可能性が高いからであり、また一方では未知の多数の遺伝子の影響を遺伝的不均一系で解析する方法は確立していないからである。そこで、未知の原因遺伝子同定に強力な手段となるのが、自然発症糖尿病動物モデルを用いた解析である。特に近交系モデル動物は、遺伝的バックグラウンドや外部環境を均一にできるため、糖尿病の病態生理の理解や原因遺伝子の探索の他、糖尿病治療薬の開発等においても重要な役割を果たしている。
【００１１】
これまでにも、いくつかの自然発症２型糖尿病モデル動物が開発されてきた。例えば、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウスは共に米国のジャクソン研究所で見いだされ、遺伝性肥満モデルとして広く用いられてきた。これらのマウスは、過食によるエネルギー摂取の増加に加え、エネルギー消費の低下をきたし、高血糖、高インスリン血症、インスリン抵抗性、白色脂肪細胞の重量増加などの表現型が認められる。そして、１９９４年にはｏｂ／ｏｂの責任遺伝子がポジショナルクローニングにより同定され、レプチンと命名された（Ｚｈａｎｇ　Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　１９９４；　３７２（６５０５）：４２５−４３２）。そして１９９５年には、レプチン受容体遺伝子がクローニングされｄｂ／ｄｂマウスの責任遺伝子であることが明らかにされた（Ｔａｒｔａｇｌｉａ　ＬＡ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　１９９５；　８３（７）：　１２６３−１２７１）。現在、この両マウスは、レプチンの生理機能、薬理機能を含めた糖尿病、肥満の研究に広く用いられているモデルである。
【００１２】
また、ＧＫラット（Ｋｉｍｕｒａ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｏｈｏｋｕ　Ｊ．　Ｅｘｐ．　ｍｅｄ．　１９８２；　１３７（４）：　４５３−４５９）は数少ない非肥満型の２型糖尿病モデルであり、インスリン分泌障害およびインスリン抵抗性をあわせもち、日本人の２型糖尿病患者に多く見られるフェノタイプを有している。このモデルは疾患感受性遺伝子のマッピングやインスリン分泌不全の病態解析などの研究に活用されている。
【００１３】
ＯＬＥＴＦラット（Ｋａｗａｎｏ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　１９９２；　４１（１１）：　１４２２−１４２８）、ＺＤＦラット（Ｚｕｃｋｅｒ　Ｌ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　１９６５；　１３１：　４４７−４５８）は、肥満、インスリン抵抗性を呈する２型糖尿病のモデルである。これらはいずれも膵β細胞量の減少が認められるため、２型糖尿病の発症における膵β細胞の脆弱性についての研究にも用いられている（島健二，分子糖尿病学の進歩　１９９９；　７６−８２）。その他にも、Ｗｉｓｔａｒ　ｆａｔｔｙラット（Ｉｋｅｄａ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　１９８１；３０（１２）：　１０４５−１０５０）、ＮＳＹマウス（Ｕｅｄａ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　１９９５；　３８（５）：　５０３−５０８）、Ａｋｉｔａマウス（Ｙｏｓｈｉｏｋａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　１９９７；　４６（５）：　８８７−８９４）などのモデルが開発されている。そして、これらの自然発症型モデル動物は、２型糖尿病の病態の解析、原因遺伝子の探索、治療法、治療薬の開発など幅広い目的で用いられ、臨床糖尿病学への有効な情報を提供してきた。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、これまでに多数の２型糖尿病モデル動物が開発されている。しかしながら、２型糖尿病はあまりにも複雑な多因子疾患であるので、既存のモデル動物を用いた解析で説明づけられる病態は、２型糖尿病のごく一部分である。従って、疾患感受性遺伝子の染色体マッピングなどの研究も盛んになっている昨今、ユニークな新規２型糖尿病モデル動物の開発は新たな原因遺伝子の発見の一助となることが期待されると同時に、２型糖尿病の複雑な病態生理を理解する上で役立つことが考えられる。
【００１５】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、日本人に多い非肥満型の２型糖尿病と類似の病態を自然発症する新しい糖尿病モデルマウスと、このモデルマウスの作出方法を提供することを課題としている。
【００１６】
またこの出願の発明は、この新しい糖尿病モデルマウスやその組織、細胞を用いた薬剤成分のスクリーニング方法を提供することを課題としている。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明者らは、前記の課題を解決するため、以下の作業仮説に基づき研究を重ね、この発明を完成させた。
【００１８】
一つには、これまでに開発された２型糖尿病モデル動物は、実験用系統の中に偶然見いだされた表現型の異常（例えば、肥満やインスリン分泌障害など）を基にして系統化されたものが多い。しかしながら、複雑な多因子疾患である２型糖尿病を構成する各々の病型に対する忠実なモデル系を作出するためには、個々の病態に即した表現型を選抜指標としてモデル動物となりうる個体を特定し、それらの交配によって表現型を固定する必要がある。なお、このように特定の指標に基づいて選抜交配を行うことにより作出された糖尿病モデル動物としては、糖負荷試験を選抜指標にしてＷｉｓｔａｒラットの選抜交配により作出されたＧＫラット（Ｇｏｔｏ　Ｙ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ．Ｊａｐ．Ａｃａｄ．　１９７５；　５１：　８０−８５）、および同じく糖負荷試験を指標として、アウトブレッド系統のＬｃｌ：ＩＣＲマウスから選抜交配により作出されたＮＳＹマウス（Ｕｅｄａ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　１９９５；　３８（５）：　５０３−５０８）がある。
【００１９】
２番目は、選抜指標の多元化である。特に、日本人に多い非肥満型の２型糖尿病モデルを作出するためには、体重や摂食摂水行動を指標に加えて選抜交配をすることが必要である。
【００２０】
３番目として、従来の糖尿病モデルマウスは実験用の近交系マウスを出発材料としているが、このような近交系マウスはその作出過程で２型糖尿病の自然発症に関わる重要な遺伝子の幾つかを失っている危険性が高い。従って、野性型マウスの多用な表現型を導入することが、ヒト２型糖尿病の自然発症を模したモデル動物の作出には極めて効果的である。
【００２１】
４番目には、神経性インスリン分泌制御の主要因子であるアドレナリンに対する感受性という大きな要因を選抜指標に加えたことである。昨今の２型糖尿病の急増の原因を考える上で、現代社会におけるストレスの増大等の神経性要因が内分泌代謝系に及ぼす影響を無視することができない。このため、単にインスリン分泌障害や非肥満であるだけでなく、神経性インスリン分泌制御の異常とその病態とを関連づけることのできるモデルマウスの作出が不可欠である。
【００２２】
この出願は、以上のとおりの作業仮説のもとに完成されたものであり、前記の課題を解決するものとして、以下の発明を提供する。
【００２３】
第１の発明は、野性キャスタネウスマウスと近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの子孫マウスであって、以下の特性：
（Ａ）正常系統マウスと比較した場合に高血糖および／または耐糖能異常を示す；
（Ｂ）正常系統マウスと比較した場合に体重および／または肥満度が有意に低い；
（Ｃ）正常系統マウスと比較した場合に内在性アドレナリンがα２−アドレナリンレセ
プターを介してインスリン分泌を抑制する作用が顕著に強い、
を有することを特徴とする糖尿病モデルマウス。
【００２４】
第２の発明は、前記第１発明の好ましい形態の一つであって、子孫マウスが兄妹交配第ｎ世代（ｎは１以上）マウスである糖尿病モデルマウスである。
【００２５】
第３の発明は、前記第１発明の糖尿病モデルマウスと他の糖尿病モデルマウスとの交配によって作出された糖尿病モデルマウスである。
【００２６】
第４の発明は、前記の糖尿病モデルマウスの組織である。
【００２７】
第５の発明は、前記の糖尿病モデルマウスの細胞である。
【００２８】
第６の発明は、前記の糖尿病モデルマウスの受精卵である。
【００２９】
第７の発明は、以下のステップ：
（１）複数の野性キャスタネウスマウスと近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを交配して得た子孫マウスからなる選抜基礎集団を作成すること；
（２）選抜基礎集団のマウスから、以下の基準：
（ａ）正常系統マウスと比較した場合に高血糖および／または耐糖能異常を示す；
（ｂ）正常系統マウスと比較した場合に体重および／または肥満度が有意に低い、
に合致する個体の兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第１世代マウスから、基準（ａ）および（ｂ）に合致する個体を選抜すること、
を含むことを特徴とする糖尿病モデルマウスの作出方法である。
【００３０】
第８の発明は、前記第７発明のステップ（１）（２）に加え、さらに以下のステップ：
（３）ステップ（２）で選抜した兄妹交配第１世代マウスの兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第２世代マウスから、基準（ａ）および（ｂ）に合致する個体を選抜すること；および
（４）前記のステップ（３）を繰り返して、基準（ａ）および（ｂ）に合致する兄妹交配第ｎ世代（ｎは３以上）マウスを得ること、
を含む糖尿病モデルマウスの作出方法である。
【００３１】
第９の発明は、以下のステップ：
（１）複数の野性キャスタネウスマウスと近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを交配して得た子孫マウスからなる選抜基礎集団を作成すること；
（２）選抜基礎集団のマウスから、以下の基準：
（ｃ）正常系統マウスと比較した場合にα２−アドレナリンレセプターのアゴニスト投与後の血糖値が顕著に上昇する；
（ｄ）α２−アドレナリンレセプターのアンタゴニスト投与後に異常耐糖能が正常
化する、の少なくとも一方に合致する個体の兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第１世代マウスから、基準（ｃ）または（ｄ）に合致する個体を選抜すること、を含むことを特徴とする糖尿病モデルマウスの作出方法である。
【００３２】
第１０の発明は、前記第９発明のステップ（１）（２）に加え、さらに以下のステップ：
（３）ステップ（２）で選抜した兄妹交配第１世代子孫マウスの兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第２世代マウスから、基準（ｃ）および（ｄ）の少なくとも一方に合致する個体を選抜すること；および
（４）前記のステップ（３）を繰り返して、基準（ｃ）および（ｄ）の少なくとも一方に合致する兄妹交配第ｎ世代（ｎは３以上）マウスを得ること、を含む糖尿病モデルマウスの作出方法である。
【００３３】
第１１の発明は、以下のステップ：
（１）複数の野性キャスタネウスマウスと近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを交配して得た子孫マウスからなる選抜基礎集団を作成すること；
（２）選抜基礎集団のマウスから、以下の基準：
（ａ）正常系統マウスと比較した場合に高血糖および／または耐糖能異常を示す；
（ｂ）正常系統マウスと比較した場合に体重および／または肥満度が有意に低い；
（ｃ）正常系統マウスと比較した場合にα２−アドレナリンレセプターのアゴニスト投与後の血糖値が顕著に上昇する；
（ｄ）α２−アドレナリンレセプターのアンタゴニスト投与後に異常耐糖能が正常
化する、のうち、基準（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に合致する兄妹マウスを交配させて得た兄妹マウス第１世代マウスから、前記と同様の基準に合致する個体を選抜すること、
を含むことを特徴とする糖尿病モデルマウスの作出方法である。
【００３４】
第１２の発明は、前記第１１発明のステップ（１）（２）に加え、さらに以下のステップ：
（３）ステップ（２）で選抜した兄妹交配第１世代マウスの兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第２世代マウスから、基準（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に合致する個体を選抜すること；および
（４）前記のステップ（３）を繰り返して、基準（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に合致する兄妹交配第ｎ世代（ｎは３以上）マウスを得ること、
を含む糖尿病モデルマウスの作出方法である。
【００３５】
第１３の発明は、糖尿病治療薬をスクリーニングする方法であって、前記第１、第２または第３発明の糖尿病モデルマウスに候補物質を投与し、このモデルマウスの血糖値を改善する物質を特定することを特徴とする方法である。
【００３６】
第１４の発明は、糖尿病治療薬をスクリーニングする方法であって、前記第１、第２または第３発明の糖尿病モデルマウスに候補物質を投与し、次いでα２−アドレナリンレセプターのアゴニストを投与し、アゴニスト投与後の血糖値の上昇を抑制する物質を特定することを特徴とする方法である。
【００３７】
第１５の発明は、糖尿病治療薬をスクリーニングする方法であって、前記第１、第２または第３発明の糖尿病モデルマウスに候補物質を投与し、このモデルマウスにα２−アドレナリンレセプターのアンタゴニストを投与した後の異常耐糖能改善作用と同程度の改善作用をもたらす物質を特定することを特徴とする方法である。
【００３８】
第１６の発明は、糖尿病治療薬をスクリーニングする方法であって、前記第１、第２または第３発明の糖尿病モデルマウスの膵臓組織または膵β細胞に候補物質を作用させ、次いでアドレナリンまたはα２−アドレナリンレセプターのアゴニストを作用させ、アドレナリンまたはアゴニスト投与後のインスリン分泌量の低下を抑制する物質を特定することを特徴とする方法である。
【００３９】
第１７の発明は、糖尿病治療薬をスクリーニングする方法であって、前記第１、第２または第３発明の糖尿病モデルマウスの膵臓組織または膵β細胞にアドレナリン存在下で候補物質を作用させ、この膵臓組織または膵β細胞にα２−アドレナリンレセプターのアンタゴニストを作用させた後のインスリン分泌量の上昇と同程度のインスリン分泌量上昇をもたらす物質を特定することを特徴とする方法である。
【００４０】
以下、これらの発明の実施形態について詳しく説明する。
【００４１】
【発明の実施の形態】
第１発明の糖尿病モデルマウスは、野性キャスタネウスマウスと近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの子孫マウスであって、以下の特性を有することを特徴としている。
（Ａ）　　正常マウスと比較した場合に耐糖能異常を示す。
（Ｂ）　　正常マウスと比較した場合に体重および肥満度が有意に低い。
（Ｃ）　　内在性アドレナリンがα２−アドレナリンレセプターを介してインスリン分泌を抑制する作用が、正常マウスに比べて強い。
【００４２】
第２発明の糖尿病モデルマウスは、前記第１発明のマウスの特徴を有する兄妹交配第ｎ世代（ｎは１以上）マウスである。
【００４３】
なお、以下の説明では、この糖尿病モデルマウスをＨＮＤマウス（Ｈｏｒｉｏ−Ｎｉｋｉ　Ｄｉａｂｅｔｉｃ　Ｍｏｕｓｅ）と記載することがある。
【００４４】
この出願のＨＮＤマウスは、第７〜１２発明の方法によって作出することができる。
【００４５】
第７発明の方法は、前記第１発明のＨＮＤマウスを作出する方法であり、以下のステップ（１）よび（２）を必須として含むことを特徴としている。
ステップ（１）：
複数の野性キャスタネウスマウスと近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを交配して得た子孫マウスからなる選抜基礎集団を作成する。
ステップ（２）：
選抜基礎集団のマウスから、以下の基準：
（ａ）正常系統マウスと比較した場合に高血糖および／または耐糖能異常を示す；
（ｂ）正常系統マウスと比較した場合に体重および／または肥満度が有意に低い、に合致する個体の兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第１世代マウスから、前記基準（ａ）および（ｂ）に合致する個体を選抜する。
【００４６】
ステップ（１）において、「野性キャスタネウスマウス」（以下「Ｃａｓマウス」と記載する）は、東南アジアに分布するマウスであり、それらの地域で棲息するマウスを捕獲して使用することができる。「Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス」（以下「Ｂ６マウス」と記載する）は、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓを起源とする一般的な近交系実験用マウスであり、遺伝背景が確立されていて絶えることなく継代が可能である。また、このＢ６マウスは、通常食下において耐糖能、血糖値などは正常領域にあるため、既存の糖尿病モデルマウスの解析においても、対照系統として用いられているマウスの一つである。このＢ６マウスは実験動物供給業者から容易に入手することができる。
【００４７】
これらのマウスを交配して選抜基礎集団の子孫マウスを得る場合には、どちらを雌雄としてもよいが、Ｃａｓマウス雄とＢ６マウス雌を交配する方が後の交配で子孫を得る点において好ましい。また、ステップ（１）の選抜基礎集団は、ＣａｓマウスとＢ６マウスとを交配して得た子孫マウスをそのまま使用することもできるが、好ましくは、以下の方法によって得た子孫マウス集団を用いる。すなわち、Ｃａｓマウス雄とＢ６マウス雌とを交配し、その子孫マウスの雌をＣａｓマウスに戻し交配する。そして、この戻し交配世代について絶食時の血糖値を測定し、高血糖（具体的には血清中のグルコース値が１３０−１４０ｍｇ／ｄｌ以上）の雄を選抜し、この雄マウスを再度Ｂ６マウス雌と交配させ、得られた子孫マウスを選抜基礎集団（Ｆ０）とする。
【００４８】
なお、前記の戻し交配世代の選抜指標である「血糖値」は、例えばグルコースオキシダーゼ法に基づく市販キット（グルコースＢテストワコー、和光純薬工業株式会社）を用いて測定することができる。すなわち、マウス血清１．５μｌに対して酵素液２５０μｌを加え３７℃で２０分インキュベーションした後、５０５ｎｍにおける吸光度を測定し、標準液の吸光度より血清中のグルコース濃度を求めることができる。また、「絶食時」とは１２−１４時間絶食させた後の状態をいう（これに対し、「非絶食時」とは、約１時間の絶食を除き、自由摂食の状態をいう）。
【００４９】
ステップ（２）では、前記の選抜基礎集団のマウス群から前記の基準（ａ）および（ｂ）の両方を満たすマウス個体を選抜する。なお、これらの基準はマウス個体の任意の週齢時点で行うことができるが、好ましくは６週齢、１２週齢、２０週齢、４０週齢のいずれか１または２以上の時点で行うようにする。
【００５０】
基準（ａ）において、比較の対象となる「正常系統マウス」とは、血糖値やインスリン分泌能に異常を示さないマウスを例外なく使用することもできるが、好ましくは、交配の一方の系統であり、既存の糖尿病モデルマウスの解析において対照系統として用いられているＢ６マウスを使用する。「高血糖」であることの基準は、前記のとおり、絶食時の血清中のグルコース値が１３０−１４０ｍｇ／ｄｌ以上、好ましくは１７５ｍｇ／ｄｌ以上、最も好ましくは２００ｍｇ／ｄｌ以上とすることができる。また、「耐糖能異常」とは糖負荷試験（後記の実施例参照）を行い、グルコース（２ｇ／ＫｇＢＷ）投与後１２０分の血糖値が１４０ｍｇ／ｄｌ以上、好ましくは１７５ｍｇ／ｄｌ以上以上の個体
を耐糖能異常と判定するが、最も好ましくは、糖尿病判定の常法（Ｕｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　１９９５；　３８（５）：５０３−５０８）に基づき、血清中グルコース値が２００ｍｇ／ｄｌ以上の個体を耐糖能異常と判定する。
【００５１】
基準（ｂ）において、「正常系統マウス」は前記基準（ａ）と同様とすることができる。「体重」は、例えばマウスをエーテル麻酔し、通常の計量計を用いて測定することができる。また肥満度（（ＢＭＩ：Ｂｏｄｙ　ｍａｓｓ　ｉｎｄｅｘ）は、体重を測定した後に、鼻の先から肛門までの長さ（Ａｎａｌ−ｎａｓａｌ　ｌｅｎｇｔｈ＝身長）をノギスを用いて測定し、以下の式によって求める。
【００５２】
ＢＭＩ（ｇ／ｃｍ２）＝Ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ（ｇ）／（Ａｎａｌ−ｎａｓａｌ　ｌｅｎｇｔｈ）２（ｃｍ）２
さらに、これらの体重および／または肥満度が「有意に低い」とは、それぞれの値についての正常マウスと子孫マウスとの差を通常の有意差検定（例えば、ｔテスト）によって比較した場合、有意水準５％以下、好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下の差がある場合をいう。以下、「有意に」または「統計的有意に」という表現は、前記のような有意差検定による差異を意味する。
【００５３】
以上のステップ（１）および（２）によって、非肥満型で高血糖の糖尿病モデルマウス（兄妹交配第１世代：Ｆ１）が得られるが、好ましくは前記ステップ（１）（２）に加え、さらに以下のステップを繰り返して、近交化モデルマウスを作出する（第８発明）。
ステップ（３）：
ステップ（２）で選抜した兄妹交配第１世代マウスの兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第２世代マウス（Ｆ２）から、基準（ａ）および（ｂ）に合致する個体を選抜する。
ステップ（４）：
前記のステップ（３）を繰り返して、基準（ａ）および（ｂ）に合致する兄妹交配第ｎ世代（ｎは３以上）マウス（Ｆｎ）を得る。
【００５４】
なお、この発明において「近交化モデルマウス」とは、兄妹交配第３世代以上、好ましくは第１５世代以上、最も好ましくは第２０世代以上の子孫マウスを意味する。兄妹交配第２０世代以上のマウスはほぼ完全に一致した遺伝背景を有し、全ての子孫マウスが前記基準（ａ）および（ｂ）を満たしている。
【００５５】
前記第１発明のＨＮＤマウスは、第９発明および第１０発明の方法によっても作出することができる。すなわち、第９発明の方法は、前記第７発明と同様のステップ（１）と、以下のステップ（２）を必須として含むことを特徴としている。
ステップ（２）：
選抜基礎集団のマウスから、以下の基準：
（ｃ）正常系統マウスと比較した場合にα２−アドレナリンレセプターのアゴニスト
投与後の血糖値が顕著に上昇する；
（ｄ）α２−アドレナリンレセプターのアンタゴニスト投与後に異常耐糖能が正常
化する、
の少なくとも一方に合致する個体の兄妹マウスを交配させて得た兄妹交配第１世代マウスから、基準（ｃ）または（ｄ）に合致する個体を選抜する。
【００５６】
このステップ（２）の基準（ｃ）は、絶食時または非絶食時にα２−アドレナリンレセプターのアゴニスト（例えばクロニジン）を投与し、３０〜１２０分後の血糖値を測定する。そして、同一の処理を受けたコントロールマウス（Ｂ６マウス等）の血糖値上昇と比較して、統計的有意に血糖値上昇を確認した場合を、基準（ｃ）を満たす状態と判定する。基準（ｄ）は、α２−アドレナリンレセプターのアンタゴニスト（例えばヨヒンビン）を投与し、３０〜１２０分後の血糖値を測定し、コントロール（生理食塩水投与）と比較して統計的有意に血糖値が低下した場合を基準（ｃ）を満たす状態と判定する。
【００５７】
以上の基準（ｃ）および／または（ｄ）により選抜された子孫マウス（兄妹交配第１世代マウス）は、「正常系統マウスと比較した場合に内在性アドレナリンがα２−アドレナリンレセプターを介してインスリン分泌を抑制する作用が顕著に強い」（第１発明の糖尿病モデルマウスの特性（Ｃ））マウスであり、さらにこの特性によってインスリン分泌が抑制され、結果として高血糖および耐糖能異常（特性（Ａ））を示すマウスである。またこのマウスは、神経性要因の一つであるアドレナリン作用によってインスリン分泌を強く抑制し、肥満を伴わない高血糖を呈する（特性（Ｂ））マウスである。なお、統制（ｃ）において「作用が顕著に強い」とは、操作的定義として、前記のとおりα２−アドレナリンレセプターのアゴニストやアンタゴニストを投与した場合の血糖値増減の程度が正常系統マウスと比較して統計的有意に強いことを意味する。
【００５８】
そして、この基準（ｃ）および／または（ｄ）を満たす兄妹交配第１世代マウスから基準（ａ）および（ｂ）に合致する兄妹マウスを交配させて兄妹交配第２世代マウスを得、さらに同様の選別交配を繰り返すことによって兄妹交配（近交化）第ｎ世代マウスを得ることができる（第１０発明）。
【００５９】
さらにまた、前記第１発明の糖尿病モデルマウスは、第１１発明および第１２発明の方法によっても作出することができる。すなわち、第１１発明の方法は、前記第７発明および第９発明と同一のステップ（１）と、以下のステップ（２）を必須として含むことを特徴としている。
ステップ（２）：
選抜基礎集団のマウスから、以下の基準：
（ａ）正常系統マウスと比較した場合に高血糖および／または耐糖能異常を示す；
（ｂ）正常系統マウスと比較した場合に体重および／または肥満度が有意に低い；
（ｃ）正常系統マウスと比較した場合にα２−アドレナリンレセプターのアゴニスト投与後の血糖値が顕著に上昇する；
（ｄ）α２−アドレナリンレセプターのアンタゴニスト投与後に異常耐糖能が正常
化する、のうち、基準（ａ）および（ｃ）；（ａ）および（ｄ）；（ｂ）および（ｃ）；（ｂ）および（ｄ）；（ａ）、（ｂ）および（ｃ）；（ａ）、（ｂ）および（ｄ）；または（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に合致する兄妹マウスを交配させて得た兄妹マウス第１世代マウスから、前記と同様の基準に合致する個体を選抜する。
【００６０】
基準（ａ）および（ｂ）は前記第７発明と同一であり、基準（ｃ）および（ｄ）は前記第９発明と同一である。そして、好ましくは基準（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）に合致する個体の雌雄を交配させて兄妹交配第１世代マウスを得、さらにこのマウスから同基準に合致するマウス個体を選別することによって、前記第１発明の糖尿病モデルマウスを作出することができる。また、この基準（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）を満たす子孫マウスから同様の選抜交配を繰り返すことによって近交化モデルマウスを得ることができる（第１２発明）。
【００６１】
以上の方法によって作出された第１発明または第２発明のＨＮＤマウスは、さらに他の糖尿病モデルマウスと交配させることができる（第３発明）。すなわち、第１発明および第２発明のＨＮＤマウスは、（Ａ）高血糖で、かつ耐糖能異常であり、（Ｂ）非肥満であり、そして（Ｃ）神経因性インスリン分泌異常であることを特徴としているが、このＨＮＤマウスに他の糖尿病モデルマウス（例えば、他の要因で高血糖を示すマウス）を交配することによって、より重篤な耐糖能異常や高血糖を発症し、複雑な２型糖尿病の病態に類似したモデルマウスを得ることができる。なお、この場合の「他の糖尿病モデルマウス」としては、ＨＮＤマウスが複数の糖尿病関連遺伝子が関与していると推定されることから、単一遺伝子により糖尿病を発症する系統が好ましい。例えば、自然発症型のモデルマウスでは、インスリン抵抗性（インスリン作用不全）を有するＡｙ（ｙｅｌｌｏｗ　ｏｂｅｓｅ）マウス、ｏｂ／ｏｂマウス、Ｔｕｂｂｙマウス、Ｆａｔマウス、インスリン分泌不全を有するＮＳＹマウス等が好ましい。さらに、発生工学的手法で作成されたインスリン抵抗性やインスリン分泌不全を示す、ＫＯ（ノックアウト）マウスやＴＧ（トランスジェニック）があげられる。
【００６２】
このようなさらなる交配によって得られた第３発明の糖尿病モデルマウスは、そのＦ０世代であってもよく、あるいは前記の基準（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）、あるいはその他の基準に基づいて選抜交配を繰り返し、近交化したものであってもよい。
【００６３】
以上のとおりの第１〜３発明の糖尿病モデルマウスは、２型糖尿病の病態解析や遺伝子解析の他、第１３〜１５発明のスクリーニング方法の発明に使用することができる。
【００６４】
第４発明は、前記第１〜３発明の糖尿病モデルマウスの組織である。この場合の「組織」とは、糖尿病の病態に関連した変化（インスリン量、アドレナリン感受性の変化など）を有する組織であり、例えばマウスの臓器、器官、体液、さらにはＤＮＡやタンパク質等を意味する。例えば、臓器としては膵臓であり、体液としては血液や尿である。これらの組織は、例えば第１４、１５発明のスクリーニング方法の発明に使用することができる。
【００６５】
第５発明は、前記第１〜３発明の糖尿病モデルマウスの細胞である。この場合の「細胞」とは、糖尿病の病態に関連した変異を発現する細胞であり、例えば膵Ｂ細胞等である。このような細胞もまた、第１４、１５発明のスクリーニング方法の発明に使用することができる。
【００６６】
第６発明は、前記第１〜３発明の糖尿病モデルマウスの受精卵である。この受精卵は、この発明の糖尿病モデルマウスを安定的に保存し、かつ供給するために有用である。
【００６７】
第１３〜１５発明は、前記第１〜３発明の糖尿病モデルマウスを用いて糖尿病治療薬の成分物質をスクリーニングする方法である。第１３発明の方法は、具体的には、モデルマウスに候補物質を投与し、モデルマウスの糖尿病症状（例えば、血糖値、インスリン分泌量、体重等）を改善する物質を選択する。「候補物質」としては、未知および既知の有機または無機化合物、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等を含有する。また、「投与」とは候補物質を注射によってマウス体内に導入する方法や、食餌または飲料水に候補物質を混入させて摂取させるようにしてもよい。ポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片）の場合には、アデノウイルス等を利用した遺伝子治療の方法等を採用することもできる。
【００６８】
第１４発明の方法は、具体的には、糖尿病モデルマウスに候補物質を投与し、次いでα２−アドレナリンレセプターのアゴニスト（例えばクロニジン）を投与し、アゴニスト投与後の血糖値の上昇を抑制する候補物質を特定する方法である。また、第１５発明の方法は、糖尿病モデルマウスに候補物質を投与し、このモデルマウスにα２−アドレナリンレセプターのアンタゴニスト（例えばヨヒンビン）を投与した後の血糖値の低下と同程度の血糖値低下をもたらす候補物質を特定する方法である。これらの場合の血糖値上昇や抑制の判定は、前記第９発明のステップ（２）の基準（ｃ）を判定する場合と同様に行うことができる。これらのスクリーニング方法では、特にストレス下ののインスリン分泌不全に対して治療効果を有する物質が特定される。
【００６９】
第１６、１７発明の方法は、前記糖尿病モデルマウスの膵臓組織や膵Ｂ細胞を用いて、糖尿病治療薬の成分物質をスクリーニングする方法である。すなわち、膵臓組織や細胞にアドレナリンやα２−アドレナリンレセプターのアゴニスト（例えばクロニジン）を作用させ（第１６発明）、あるいはα２−アドレナリンレセプターのアンタゴニスト（例えばヨヒンビン）を作用させて、組織や細胞のインスリン分泌量の変化を指標として目的物質を特定する。インスリン分泌量の測定は、後記の実施例に記載の方法に準じて行うことができる。また、アゴニストやアンタゴニスト、候補物質を組織や細胞に「作用」させるとは、それらの物質が組織や細胞に何らかの変化（例えば、血糖値の変化）を生じさせるように操作することを意味する。例えば、物質を組織や細胞に接触させること、物質を組織や細胞内に物理的に導入することなどを意味する。
【００７０】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００７１】
【実施例】
実施例１：糖尿病モデルマウスの作出とその近交化
この発明の糖尿病モデルマウスを作出し、その近交化を行った。
（１）　　材料と方法
（１−１）　　マウスとその飼育条件
Ｃａｓマウスはフィリピンのマニラ近郊で１９９４年に並河鷹夫博士（名古屋大学農学部動物遺伝学制御講座）によって捕獲されたものを使用した。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ（Ｂ６）マウスは日本エスエルシー株式会社から購入した。すべてのマウスは、温度２２±２℃、湿度５０±５％、明暗サイクル１２Ｌ１２Ｄ（８：００−２０：００）の環境で飼育し、固形飼料（ノーサンラボＭＲブリーダー、日本農産工業株式会社）および、水を自由摂取させた。また、１２−１４時間絶食させた状態（絶食開始時間：午後８時）を絶食時とし、午前９時から約１時間を絶食させた状態を非絶食時とした。
（１−２）　　血糖値の測定
グルコースオキシダーゼ法に基づく市販キット（グルコースＢテストワコー、和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。血清１．５μｌに対して酵素液２５０μｌを加え３７℃で２０分インキュベーションした後、５０５ｎｍにおける吸光度を測定し、標準液の吸光度より血清中のグルコース濃度を求めた。
（１−３）　　糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ：Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｅｓｔ）
マウスを約１４時間絶食させ、体重を測定した後、６μｌの血液を尾静脈より採血した。そのすぐ後にグルコースの投与量がマウスの体重１ｋｇあたり２ｇとなるように２０％のグルコース溶液を（１００μｌ／１０ｇ体重）腹腔内へ注射し、グルコース投与後３０分、６０分、１２０分で６μｌの血液を尾静脈より採取した。採取した血液はグルコース濃度の測定までは氷中で保存し、微量遠心機（トミー精工株式会社製ＮＲＸ−１５０）で１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して得られた血清１．５μｌを用いて、グルコース濃度を測定した。
【００７２】
耐糖能異常の判定は、糖尿病判定の常法（Ｕｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ　１９９５；　３８（５）：５０３−５０８）に基づき、グルコース（２ｇ／ＫｇＢＷ）投与後１２０分の血糖値が２００ｍｇ／ｄｌ以上の個体を耐糖能
異常と判定した。
（１−４）　　体重および肥満度の測定
マウスをエーテルで麻酔し、体重を測定した後に、鼻の先から肛門までの長さ（Ａｎａｌ−ｎａｓａｌ　ｌｅｎｇｔｈ＝身長）をノギスを用いて測定した。下の式によりＢＭＩを求めた。
【００７３】
ＢＭＩ（ｇ／ｃｍ２）＝Ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ（ｇ）／（Ａｎａｌ−ｎａｓａｌ　ｌｅｎｇｔｈ）２（ｃｍ）２
（２）　　交配と選別
雄性のＣａｓマウスと雌性のＢ６マウスとを交配し、その子孫マウスを得た。この子孫マウスの雌をＣａｓマウスに戻し交配し、得られた戻し交配世代（約１０００匹）について、絶食時の血糖値を測定し、その値が１３０−１４０ｍｇ／ｄｌ以上の雄を選抜した。選抜された雄を再度、雌のＢ６マウスと交配し、得られた子孫マウスを選抜基礎集団（Ｆ０）とした。
【００７４】
次いで、Ｆ０集団のなかで、摂食時（非絶食時）に高血糖を示した個体同士を交配して子孫マウスを得た。この子孫マウスに対して、糖負荷試験を行い、耐糖能異常を選抜指標として、兄妹交配を行い、兄妹交配第１世代マウスを得た。さらに、耐糖能異常に加え、体重および肥満度を指標として選抜交配を繰り返し、兄妹交配第１７世代までの近交化糖尿病モデルマウス系統（ＨＮＤマウス系統）を作出した。このＨＮＤマウス系統は、理論的には全ゲノムの６２．５％がＢ６マウス由来と考えられる。
実施例２：マウス個体における糖尿病形質の解析
実施例１で作出した近交化ＨＮＤマウス系統（兄妹交配第１２世代）について、糖尿病形質を調べた。
（１）　　方法
（１−１）　　ＡＵＣ（Ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ）
耐糖能試験の０，３０，６０，１２０分の時間を横軸に、各時間での血糖値を縦軸にプロットした折れ線グラフの面積のことであり、以下の式で算出した。耐糖能試験の４点の血糖値をすべて反映するため、耐糖能の総合的な評価として用いた。
０分血糖値＝ａ、３０分血糖値＝ｂ、６０分血糖値＝ｃ、１２０分血糖値＝ｄとする。
【００７５】
ＡＵＣ（ｍｇ／ｄｌ×ｍｉｎ）＝１５ａ＋３０ｂ＋４５ｃ＋３０ｄ
（１−２）　　インスリン濃度の測定
絶食時と非絶食時に、非麻酔下で眼窩静脈から約１６０μｌを採血し、実施例１の糖負荷試験と同様に遠心して血清を得て、測定時まで−２０℃で保存した。ラジオイムノアッセイ（ＳｈｉｏｎｏＲＩＡ，塩野義製薬株式会社）を用いて、血清中イムノリアクテイブインスリン（ＩＲＩ）レベルを測定した。血清５０μｌに１２５Ｉでラベルされたインスリン溶液を５０μｌを添加し、インスリン抗血清溶液を５０μｌ加えて２５℃で２時間インキュベートした後、二次抗体懸濁液５００μｌを加えて免疫沈降を行なうため３０分間２５℃でインキュベートした。２，０００ｇで１０分間遠心後、上清をアスピレー夕ーで除去し、沈殿に残存した放射能をオートウェルガンマカウンター（アロカＡＲＣ−３８０）で測定した。ラットインスリンを標準に用いて、検体中のインスリン濃度を求めた。インスリン抗体に１２５Ｉインスリンと検体中のインスリンを競合反応させるとインスリン抗体に結合する１２５Ｉインスリンの量は、マウスより採取した血清中の非標識インスリンの量にしたがって減少する。すなわち、二次抗体の添加により沈殿するインスリン−インスリン抗体結合物の放射能活性を測定することによって検体中のインスリン濃度を測定することができる。
（１−３）　　インスリン分泌能試験
マウスを約１４時間絶食させ、体重を測定した後、非麻酔下で眼窩静脈から５０μｌの血液を採取した。そのすぐ後にグルコースの投与量がマウスの体重１Ｋｇあたり２ｇとなるように２０％
のグルコース溶液を（１００μｌ／１０ｇ体重）腹腔内へ注射し、グルコース投与後１０分、３０分で５０μｌの血液を眼窩静脈から採取した。そして、前記と同様に遠心して血清を得て、測定時まで−２０℃で保存した。インスリン濃度は、２０μｌの血清を用い、インスリン測定キット（株式会社森永生科学研究所）で測定した。
（１−４）　　インスリン負荷試験（ＩＴＴ：ｉｎｓｕｌｉｎ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｅｓｔ）
マウスを約１４時間絶食させ、体重を測定した後、８μｌの血液を尾静脈より採血した。ヒトインスリン（ヒューマリンＲ、塩野義製薬株式会社）溶液をインスリン投与量がマウスの体重１ｋｇあたり０．５Ｕとなるように腹腔内へ注射し、インスリン投与後１５分、３０分、６０分で８μｌの血液を尾静脈より採取した。採取した血液はグルコース濃度の測定までは氷中で保存し、前記と同様に遠心して血清を採取しそのうち２μｌを用いて、グルコース濃度を測定した。
（１−５）　　血中脂質成分の分析
７週齢時の絶食時、非絶食時において、前記のように非麻酔下でマウスの眼窩静脈から採血して得られた−２０℃保存の血清を用いて、中性脂肪、遊離脂肪酸、総コレステロールについて、酵素法に基づく市販キットで濃度を求めた。
【００７６】
中性脂肪の測定には、トリグリセライドＥテストワコー（和光純薬株式会社）を用いて測定した。酵素液２００μｌに血清２μｌを加え、３７℃で５分インキーべートした後、６００ｎｍにおける吸光度を測定し、標準液の吸光度より血清サンプル中の中性脂肪濃度を求めた。
【００７７】
遊離脂肪酸の測定には、ＮＥＦＡザイム−Ｓ（栄研化学株式会社）を用い、測定した。酵素液２００μｌに血清５μｌを加え、３７℃で１０分インキュベートした後、５５５ｎｍにおける吸光度を測定し、標準液の吸光度より血清サンプル中の遊離脂肪酸濃度を求めた。
【００７８】
総コレステロールの測定には、コレステロールＥテストワコー（和光純薬株式会社）を用いた。酵素液２００μｌに血清２μｌを加え、３７℃で５分インキュベートした後、６００ｎｍにおける吸光度を測定し、標準液の吸光度より血清サンプル中の総コレステロール濃度を求めた。
（１−６）　　その他の方法
肥満度、血糖値の測定、糖負荷試験は、実施例１と同様に行った。
（２）　　結果
（２−１）　　体重、肥満度
ＨＮＤマウス系統の個体は、６−４０週齢のいずれにおいても体重、肥満度ともに対照系統であるＢ６マウスより、有意に低い値を示した（図１）。肥満と非肥満の判定は難しいが、ＨＮＤマウス系統は非肥満型の系統と判断された。また、Ｂ６は４０週齢時まで体重の増加が観察されたのに対し、ＨＮＤマウス系統の個体は２０週齢時から４０週齢時からの体重増加が認められず、逆に減少する傾向を示した。
（２−２）　　耐糖脳試験
６週齢時における糖負荷試験の結果、ＨＮＤマウス系統の耐糖能異常発症率は若齢にもかかわらず７４％という高率であった（表１）。また、ＨＮＤマウス系統は糖負荷後３０分値を除いたすべての時間において、Ｂ６よりも高値を示した（図２（ａ））。その中で、耐糖能異常の判定基準となる１２０分値は、Ｂ６マウスの１２２±３ｍｇ／ｄｌに比し、ＨＮＤマウスマウス系統は２８７±１９ｍｇ／ｄｌと顕著に高く、糖尿病領域の値を示していた。また、ＡＵＣについても大きな差が認められた（図４）。このようにＨＮＤマウス系統は、６週齢時ですでに明確かつ高率な耐糖能異常が観察された。そして、１２、２０、３０週齢においてもＢ６と比較して糖負荷後の血糖が高く、ＡＵＣにおいても有意な差を認めていた（図２（ｂ）−（ｄ）、図４）。ＨＮＤマウス系統で認められる耐糖能異常発症率は１２週齢時には８０％と最も高く、２０週齢では６３％、３０週齢では４３％であった。
【００７９】
【表１】
2004065181.tif 000002
【００８０】
（２−３）　　血糖値
ＨＮＤマウス系統の６週齢時における血糖値は、非
絶食時で３５８±３１ｍｇ／ｄｌ、絶食時で１３１±５ｍｇ／ｄｌとＢ６（非絶食時：１７６±６，絶食時：８９±３）に比べて顕著に高かった（図４）。これは、明らかに糖尿病領域を示す値である。
（２−４）　　血中インスリン濃度
７、２３、４０週齢時におけるＨＮＤマウス系統の血中インスリン濃度は、非絶食時、絶食時のいずれにおいてもＢ６マウスと違いを認めなかった（図５）。
（２−５）　　グルコース刺激インスリン分泌試験
７週齢時のマウスを用いて、糖負荷試験と同様の条件下のもとで、血中インスリン濃度を測定したところ、Ｂ６では、糖負荷後の血中インスリン濃度の上昇が認められたのに対し、ＨＮＤマウス系統では全く上昇が認められなかった（図６（ａ））。つまり、ＨＮＤマウス系統は、グルコース刺激によるインスリン分泌に明らかな障害が認められた。また、２０週齢時のＨＮＤマウス系統のマウスをＩＰＧＴＴ　１２０分値が２００ｍｇ／ｄｌを境界に、高値を示すものをｄｉａｂｅｔｅｓ群、低値を示すものをｎｏｎ−ｄｉａｂｅｔｅｓ群と分けて検討したとき、ｄｉａｂｅｔｅｓ群は血中インスリン濃度の上昇が認められず、Ｎｏｎ−ｄｉａｂｅｔｅｓ群では上昇が認められた（図６（ｂ））。このことから、グルコース刺激インスリン分泌能の障害が、ＨＮＤマウス系統の耐糖能異常の主因として考えられた。
（２−６）　　インスリン負荷試験
７、２０、４０週齢時において、インスリン負荷試験を行ったところＢ６マウスとＨＮＤマウス系統の間にインスリン負荷後の血糖低下に違いは認めなかった（図７）。従って、ＨＮＤマウス系統の末梢組織でのインスリン作用は、Ｂ６マウスのそれと違いがないと考えられた。
（２−７）　　血中脂質成分
７週齢において絶食時、非絶食時の血中脂質成分（遊離脂肪酸、中性脂肪、総コレステロール）について解析を行った。
遊離脂肪酸：
絶食時において、Ｂ６（１６７５±１８７μＥｑ／ｌ）とＨＮＤマウス系統（１６９２±１６６μＥｑ／ｌ）に違いは認められなかった。しかし、非絶食時の時Ｂ６（７９０±６２μＥｑ／ｌ）に比較して、ＨＮＤマウス系統（１０７１±８２μＥｑ／ｌ）は有意に高い値を示した（図８（ａ））。
中性脂肪：
絶食時においては、Ｂ６マウスとＨＮＤマウス系統の両マウス間で違いは認められなかった。しかし、非絶食時においては、Ｂ６マウス（１４９±１１ｍｇ／ｄｌ）に比し、ＨＮＤマウス系統（２１４±２７ｍｇ／ｄｌ）で高い値が観察された（図８（ｂ））。
総コレステロール：
絶食時においては、Ｂ６（１１６±１ｍｇ／ｄｌ）に比し、ＨＮＤマウス系統で１０５±４ｍｇ／ｄｌとわずかに低い値を示した。非絶食時においては両マウス間で違いは認められなかった（図８（ｃ））。
実施例３：単離膵島におけるインスリン分泌能の解析
実施例１で作出したＨＮＤマウス系統は、実施例２に示したとおり末梢組織でのインスリン作用は正常であった。そこで、インスリン分泌組織である膵臓のランゲルハンス島（膵島）を単離し、そのインスリン分泌量を解析した。
（１）　　方法
（１−１）　　膵臓からの膵島単離
（１−１−１）　　試薬
Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ：
最終濃度、各々１１９ｍＭ　Ｎａｃｌ，４．７５ｍＭ　ＫＣｌ，５ｍＭ　ＮａＨＣ０３，２．５４ｍＭ　ＣａＣｌ２，１．２　ｍＭＭｇＳＯ４，１．２ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳとなるように蒸留水で調製後、ＮａＯＨでｐＨ７．４に合わせたものをｓｔｏｃｋ　ｓｏｌｕｔｉｏｎとした。必要に応じ、実験当日に３ｍＭグルコース、５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡを添加しｗｏｒｋｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎとした。
Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ：
Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｔｙｐｅ　ＸＩ（ＳＩＧＭＡ）を４ｍｇ／ｍＬとなるようにＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３ｍＭグルコース）に溶解した。
（１−１−２）　　コラゲナーゼ消化による膵島単離
マウスの膵臓をコラゲナーゼの作用により消化して、膵島と周囲の外分泌細胞とを分離した。すなわち、非絶食条件下のマウスをジエチルエーテル麻酔し、開腹後脱血により屠殺した。その後、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎが膵臓全体に均一にゆきわたるように、２７Ｇ注射針を用いて、膵臓に少しずつ何度も注入した。膵臓を傷つけないように注意して摘出した後、残りのコラゲナーゼ溶液と共にバックに入れて３７℃で３分間消化反応を行った（注入に使ったもの、バックに入れたもの合わせて２．５ｍｌのコラゲナーゼ溶液を使った）。反応後の組織を５０ｍＬチューブに移し、ボルテックスミキサーで攪拌後、ガラス試験管に移し換えた。膵島は大きな細胞集団であるため溶液中では沈降するため、これを利用して外分泌細胞との分離を行った。具体的には、消化された組織をＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３ｍＭグルコース）により懸濁し、２分間静置した。その後、下から４ｃｍ程の溶液（膵島が沈降した部分）を残し、その上の液を再び新しいＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３ｍＭグルコース）と置き換えた。これと同様の操作を２回繰り返し行った。これにより外分泌細胞をできる限り取り除き、最後に残った下層をガラスシャーレに移した。それから、実体顕微鏡下で膵島をオートピペッターを用いてピックアップし、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３ｍＭグルコース、５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）の入ったガラスシャーレに移し替えた。この一連の操作により、膵島を外分泌細胞から分離することができる。
（１−２）　　膵島を用いたインスリン分泌実験の方法
（１−２−１）　　Ｂａｔｃｈ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ法
単離した膵島をＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３ｍＭグルコース、５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）入ったガラスシャーレ上に集め、実体顕微鏡下で大きさ、形の整った膵島を選別して実験に用いた。用いる膵島の大きさが不均一にならないように実体顕微鏡下で４個ずつマッチングした。次いで、小試験管（ＩＷＡＫＩ）に０．６ｍｌのＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３ｍＭグルコース、５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を注入し、その試験管１本あたり４個となるように膵島を添加し、実験に用いた。３７℃のインキュベーターで１時間プレインキュベートした後、溶液をできるだけ除去した。そして、様々な試薬（グルコース，ＧＬＰ−１，ＧＩＰ、グルカゴン、アドレナリン、ソマトスタチン、クロニジン）をＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）で調製し、これをｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍとして０．６ｍｌ添加し、恒温槽で軽く振とうしながら３７℃で１時間インキューベートを行った。終了後直ちに上清を回収し、インスリン濃度をラジオイムノアッセイ（ＳｈｉｏｎｏＲＩＡ，塩野義製薬株式会社）を用いて測定した。
（１−２−２）　　グルコース刺激インスリン分泌試験
６週齢のマウスから単離した膵島を実験に使用した。前記したように、１時間のプレインキュベートの後、その溶液を３，１０，１５，２０，４０ｍＭのグルコースを含む０．６ｍｌ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍに置き換え、１時間インキュベートした。そして、その溶液のインスリン濃度を測定した。
（１−２−３）　　　ＧＬＰ−１，ＧＩＰ，グルカゴンによるインスリン分泌促進効果の検討
６週齢のマウスから単離した膵島を実験に使用した。前記したように、１時間のプレインキューベートの後、その溶液を１５ｍＭグルコースに加え、各々１００ｎＭのＧＬＰ−１，ＧＩＰ，グルカゴン（全てＳＩＧＭＡ）を含む０．６ｍｌ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍに置き換え、１時間インキュベートした。そして、その溶液のインスリン濃度を測定した。（１−２−４）　　ソマトスタチン，アドレナリン，クロニジンによるインスリン分泌抑制効果の検討
２０−３０週齢のマウスから単離した膵島を実験に使用した。前記したように、１時間のプレインキュベートの後、その溶液を２０ｍＭグルコースに加え、１，１０，１００ｎＭソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｉｎ−２８、ＳＩＧＭＡ）、０．３，１，３，１０，３０ｎＭアドレナリン（［−］−ａｄｒｅｎｅｒｌｉｎｅ（＋）　ｂｉｔａｒｔａｒａｔｅ、ＳＩＧＭＡ）あるいは１，１０ｎＭクロニジン（クロニジン塩酸塩、和光純薬工業株式会社）を含む０．６ｍｌ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍに置き換え、１時間インキュベートした。そして、その溶液のインスリン濃度を測定した。（２）　　結果
（２−１）　　グルコース刺激インスリン分泌能
６週齢のマウスから膵島を単離して、ｂａｔｃｈ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ法によりグルコース刺激による１時間のインスリン分泌量を測定したところ、３−４０ｍＭのどのグルコース濃度においても、Ｂ６とＨＮＤマウス系統の両マウス間に違いは認められなかった（図９）。この結果から、ＨＮＤマウス系統の膵Ｂ細胞は、少なくとも単離膵島レベルではグルコースに応答するインスリン分泌能が正常に保たれていることが示唆された。
（２−２）　　ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、グルカゴンがインスリン分泌に与える影響
ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、グルカゴンはグルコース刺激によるインスリン分泌を促進する働きを持つホルモンである。従って、高濃度のグルコース（１５ｍＭ）存在下におけるこれらのホルモンの影響を検討した。その結果、どのホルモンを加えたときも、Ｂ６とＨＮＤマウス系統との間でインスリン分泌量に明らかな違いを認めなかった（図１０）。従って、ＨＮＤマウス系統ではこれらのインスリン分泌促進ホルモンの作用は正常に保たれており、ｉｎ　ｖｉｖｏで認められる明らかなインスリン分泌障害の要因となっていないことが示唆された。
（２−３）　　ソマトスタチン、アドレナリンがインスリン分泌に与える濃度依存的な影響
ソマトスタチン、アドレナリンはグルコース刺激によるインスリン分泌を抑制する働きを持つホルモンである。従って、高濃度のグルコース（２０ｍＭ）存在下における、これらのホルモンの濃度依存的な影響を検討した。
【００８１】
ソマトスタチンの場合、Ｂ６マウスにおいては１ｎＭ添加で約１０％の分泌抑制、１０ｎＭ添加で約３５％の抑制、１０ｎＭ添加で約５０％の抑制が見られた。これらの各濃度のソマトスタチンのインスリン分泌抑制作用は、ＨＮＤマウスにおいてもＢ６マウスと同程度に観察された（図１１−ａ）。すなわち、ソマトスタチンがインスリン分泌に与える作用に関しては、Ｂ６とＨＮＤマウス系統の両マウス間で差がないと推察された。
【００８２】
一方、アドレナリンの濃度依存的なインスリン分泌に対する影響を検討したところ、Ｂ６マウスでは０．３ｎＭ添加で約１０％、１ｎＭで約１５％、３ｎＭで約４０％、１０ｎＭで約６０％のインスリン分泌抑制が観察された。ＨＮＤマウス系統では１ｎＭおよび３ｎＭのアドレナリン添加の時に、Ｂ６マウスよりもインスリン分泌が有意に強く抑制されていた。のインスリン分泌量がＢ６マウスより有意に減少しており、３ｎＭのときも減少傾向が認められた（図１１−ｂ）。これらの結果は、ＨＮＤマウス系統の膵島はアドレナリンによるインスリン分泌の抑制がＢ６マウスよりも強く現れることを示している。そして、ｉｎ　ｖｉｖｏで認められるＨＮＤマウス系統のインスリン分泌障害の要因にアドレナリン作用が関与している可能性が示唆された。
（２−４）　　α２−アドレナリンレセプターアゴニストがインスリン分泌に与える影響アドレナリンはインスリン分泌を抑制するが、これは膵Ｂ細胞に発現しているα２−アドレナリンレセプターを介する作用によるものであることが知られている（ＤｉＴｕｌｌｉｏ　ＮＷ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　１９８４；　２２８（１）：　１６８−１７３，Ｎａｋａｉ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　１９８１；　２１６（３９）：　６０７−６１２，Ａｎｇｅｌ　Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　１９８８；　２４６（３）：１０９８−１１０３，　Ａｎｇｅｌ　Ｉ．　ａｎｄ　Ｌａｎｇｅｒ　ＳＺ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　１９８８；　１５４（２）：１９１−１９６）。従って、ＨＮＤマウス系統で認めたアドレナリン作用の増強が、α２−アドレナリンレセプターを介した作用によるものであるかどうかの検討を行うことにした。そこで、α２−アドレナリンレセプターの選択的なアゴニストであるクロニジンを用いて、グルコース（２０ｍＭ）刺激インスリン分泌に与える抑制効果を両マウス間で比較検討した。その結果、１ｎＭクロニジンを添加した場合、Ｂ６マウスの膵島に比較して、ＨＮＤマウス系統ではインスリン分泌量が減少している傾向が示された（図１２）。また、１０ｎＭ、クロニジン添加時には有意な減少が確認された。これらの結果から、ＨＮＤマウス系統で認められたアドレナリンによるインスリン分泌抑制効果の増強がα２−アドレナリンレセプターを介する作用によるものであることが示唆された。
実施例４：マウス個体におけるα２−アドレナリンレセプター作用の検討
実施例２の結果から、ＨＮＤマウス系統の耐糖能異常および高血糖がインスリン分泌障害に起因することが確認され、実施例３の結果から、インスリン分泌障害が膵Ｂ細胞のα２−アドレナリンレセプターを介すものであることが推測された。そこで、マウス個体におけるα２−アドレナリンレセプター作用と耐糖能異常との関係を検討した。
（１）　　方法
（１−１）　　クロニジン投与実験：血糖測定
１０−１４週齢あるいは４０週齢のマウスを用いて、絶食時あるいは非絶食時において実験を行った。まず、体重測定後６μｌの血液を尾静脈より採血した。そのすぐ後に、生理食塩水で調製したクロニジン溶液（クロニジン塩酸塩、和光純薬工業株式会社）をクロニジンの投与量がマウスの体重１ｋｇあたり、５μｇあるいは５０μｇとなるように腹腔内へ注射し（１００μｌ／１０ｇ体重）、クロニジン投与後３０分、６０分、１２０分で６μｌの血液を尾静脈より採取した。採取した血液はグルコース濃度の測定までは氷中で保存し、微量遠心機（トミー精工株式会社製　ＮＲＸ−１５０）で１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して得られた血清１．５μｌを用いて、グルコース濃度を測定した。（１−２）　　ヨヒンビン投与実験：血糖測定
１１−１６週齢マウスを約１４時間絶食させ、体重を測定した後、６μｌの血液を尾静脈より採血した。そのすぐ後に、生理食塩水または生理食塩水で調製したヨヒンビン溶液（ヨヒンビン塩酸塩、ＳＩＧＭＡ）を腹腔内へ注射した（１００μｌ／１０ｇ体重）。ヨヒンビン投与後３０分で６μｌの血液を尾静脈から採取した後、ＩＰＧＴＴを行った。ＩＰＧＴＴは、グルコースの投与量がマウスの体重１Ｋｇあたり２ｇとなるように２０％のグルコース溶液を（１００μｌ／１０ｇ体重）腹腔内へ注射
し、グルコース投与後３０分、６０分、１２０分で６μｌの血液を尾静脈より採取した。採取した血液はグルコース濃度の測定までは氷中で保存し、微量遠心機（トミー精工株式会社製　ＮＲＸ−１５０）で１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して得られた血清１．５μｌを用いて、グルコース渡度を測定した。
（１−３）　　ヨヒンビン投与実験：インスリン測定
１１−１６週齢マウスを約１４時間絶食させ、体重を測定した後、生理食塩水または生理食塩水で調製したヨヒンビン溶液（ヨヒンビン塩酸塩、ＳＩＧＭＡ）を腹腔内へ注射した（１００μｇ／１０ｇ体重）。ヨヒンビン投与後３０分で１６０μｌの血液を眼窩静脈から採取した。その後すぐに、グルコースの投与量がマウスの体重１Ｋｇあたり２ｇとなるように２０％のグルコース溶液を（１００μ
ｌ／１０ｇ体重）腹腔内へ注射し、グルコース投与後３０分で１６０μｌの血液を眼窩静脈より採取した。前記と同様に遠心して血清を得て、測定時まで−２０℃で保存した。血中インスリン濃度の測定は、ラジオイムノアッセイ（ＳｈｉｏｎｏＲＩＡ，塩野義製薬株式会社）を用いて行った。
（２）　　結果
（２−１）　　クロニジン投与実験の結果
絶食時あるいは非絶食時条件下において、クロニジン投与による血糖値の変化に着目して検討した。絶食時条件下において５μｇ／ｋｇ　ＢＷのクロニジンを投与した時、Ｂ６マウスでは血糖値の上昇を認めなかったのに対して、ＨＮＤマウス系統では約１２０ｍｇ／ｄｌの大きな上昇を認めた（図１３）。また、非絶食時条件下においては、Ｂ６が５０ｍｇ／ｄｌ程度の血糖値の上昇であったのに比べて、ＨＮＤマウス系統では約２２０ｍｇ／ｄｌ程度と明らかに大きな血糖値の上昇を認めた（図１４）。また、絶食時条件下において、より多量の５０μｇ／ｋｇ　ＢＷのクロニジンを投与した時も同様に、ＨＮＤマウス系統はＢ６よりも有意に大きな血糖値の上昇を認めた（図１５）。しかし、非絶食時条件下においてはこのクロニジンの投与量ではＢ６においても血糖の上昇の程度は大きく、Ｂ６とＨＮＤマウス系統で差を認めなかった（図１６）。また、５と５０μｇ／ｋｇＢＷの両濃度による血糖変化を比較したところ、Ｂ６ではクロニジンの投与量依存的に血糖値の上昇が明らかに大きくなったのに対して、ＨＮＤマウス系統では５ｍｇ／ｋｇ　ＢＷのクロニジン投与の場合でも大きな血糖上昇が観察され、５０ｍｇ／ｋｇ　ＢＷの投与を行ってもさらなる血糖値の上昇が見られなかった。すなわち、ＨＮＤマウス系統では少量のクロニジンの投与に対しても血糖値の上昇は十分におこることが示された（図１３−１６）。
（２−２）　　ヨヒンビン投与実験の結果
Ｂ６を用いた予備的な検討により、ヨヒンビンは投与量依存的に耐糖能を改善させる傾向が示された（図１７）。そして、１００μｇ／ｋｇ　ＢＷ投与では、Ｂ６においては耐糖能改善作用は見られない（図１７）。そこで、この投与量においてＢ６とＨＮＤマウス系統との間で、ヨヒンビンが耐糖能に与える影響について比較検討を行うことにした。
【００８３】
Ｂ６マウスでは、ヨヒンビン（１００μｇ／ｋｇ　ＢＷ）投与群と生理食塩水投与群においてグルコース投与後の血糖値の推移に違いは認められなかった（図１８−ａ）。一方、ＨＮＤマウス系統のヨヒンビン（１００μｇ／ｋｇ　ＢＷ）投与群では生理食塩水投与群に比較して、グルコース投与後６０、１２０分の血糖値が低下していた（図１８−ｂ）。この結果は、ＨＮＤマウス系統では、α２−アドレナリンレセプターの阻害によって血糖の低下作用が増強したことを示している。
【００８４】
次いで、このようなヨヒンビンによる耐糖能の改善が、インスリン分泌の改善によるものかどうかを検討した。その結果、ＨＮＤマウス系統の生理食塩水投与群では、実施例２での結果同様にグルコース投与後の血中インスリン濃度の上昇が認められず、インスリン分泌障害が観察きれた（図１９−ｂ）。しかし、ヨヒンビン投与群では明確な血中インスリン濃度の上昇が確認された（図１９−ｂ）。これ警告　７らの結果から、ヨヒンビン投与によるＨＮＤマウス系統の耐糖能異常の改善は、インスリン分泌障害を改善したことによるものであることが示唆された。つまり、ＨＮＤマウス系統のインスリン分泌障害にはα２−アドレナリンレセプター作用の増強が関与していることが示された。
【００８５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、日本人に多い非肥満型の２型糖尿病に極めて類似した糖尿病モデルであり、神経因性のインスリン分泌制御の障害を特徴とするマウス（ＨＮＤマウス）が提供される。これによって、２型糖尿病の病態解析や遺伝子解析が一層促進される。また、この出願の発明によって、２型糖尿病の治療薬の高精度でのスクリーニングが可能となる。さらに、このモデルマウスは７週齢前後の若齢から糖尿病を発症し、生体への長期の高血糖の作用を検出しうるという利点を有している。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）は、Ｂ６マウス（白丸）とＨＮＤマウス系統（黒四角）の体重変化を示したグラフであり、（ｂ）はＢ６マウス（白丸）とＨＮＤマウス系統（黒四角）の肥満度の変化を示したグラフである。個体数は５〜１５。数値は平均値±ＳＥＭ。＊はｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔテスト（以下、ｔ　テストと略す）によるＢ６マウスとの差がｐ＜０．００１水準で有意であることを示す。
【図２】（ａ）は６週齢のＢ６マウス（白丸：ｎ＝９）とＨＮＤマウス系統（黒四角：ｎ＝２４）に対する耐糖能試験による血中グルコース量の変化を示したグラフである。（ｂ）は１２週齢のＢ６マウス（白丸：ｎ＝１４）とＨＮＤマウス系統（黒四角：ｎ＝２０）に対する耐糖能試験による血中グルコース量の変化を示したグラフである。（ｃ）は、２０週齢のＢ６マウス（白丸：ｎ＝１０）とＨＮＤマウス系統（黒四角：ｎ＝２４）に対する耐糖能試験による血中グルコース量の変化を示したグラフである。（ｄ）は３０週齢のＢ６マウス（白丸：ｎ＝１２）とＨＮＤマウス系統（黒四角：ｎ＝３０）に対する耐糖能試験による血中グルコース量の変化を示したグラフである。数値は平均値±ＳＥＭ。＊および＊＊はそれぞれ、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１水準で有意であることを示す。
【図３】（ａ）は６−３０週齢のＢ６マウス（ｎ＝５−１５）とＨＮＤマウス系統（ｎ＝１６−４２）の耐糖能試験におけるＡＵＣを示したグラフである。数値は平均値±ＳＥＭ。＊は　ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０１水準で有意であることを示す。
【図４】（ａ）は６−４０週齢のＢ６マウス（ｎ＝５−１２）およびのＨＮＤマウス系統（ｎ＝１６−４２）の非絶食時の血中グルコース量である。（ｂ）は同じく絶食時の血中グルコース量である。数値は平均値±ＳＥＭ。＊、＊＊、＊＊＊はそれぞれ、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１水準で有意であることを示す。
【図５】（ａ）は６週齢のＢ６マウス（白バー：ｎ＝５−１２）とＨＮＤマウス系統（グレーバー：ｎ＝１６−４２）の非絶食（Ｎｏｎ−ｆａｓｔｉｎｇ）および絶食時（Ｆａｓｔｉｎｇ）における血中インスリン濃度を示したグラフである。（ｂ）は２３週齢マウス、（ｃ）は４０週齢マウスの同様の結果である。数値は平均値±ＳＥＭ。統計処理はｔテストによって行った。
【図６】（ａ）は７週齢のＢ６マウス（白丸）とＨＮＤマウス系統（黒四角）に対する耐糖能試験中のグルコース刺激によるインスリン分泌量の変化を示したグラフである。（ｂ）は２３週齢のＢ６マウス（白丸）とＨＮＤマウス系統（黒四角および黒三角）の同様のインスリン分泌量の変化を示したグラフである。ＨＮＤマウス系統は２０週齢時における血糖値の２００ｍｇ／ｄｌより多いか少ないかで糖尿病群（黒四角）および非糖尿病群（黒三角）に分けた。数値は６−８個体の測定の平均値±ＳＥＭ。＊および＊＊はそれぞれ、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１水準で有意であることを示す。
【図７】（ａ）は７週齢のＢ６マウス（白丸）とＨＮＤマウス系統（黒四角）に対するインスリン負荷試験による血中グルコース量の変化を示したグラフである。（ｂ）は２０週齢マウス、（ｃ）は４０週齢マウスの同様の結果を示したグラフである。数値は平均値±ＳＥＭ。＊は、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０１水準で有意であることを示す。
【図８】（ａ）は７週齢のＢ６マウス（白バー：ｎ＝７）とＨＮＤマウス系統（グレーバー：ｎ＝５−８）の非絶食（Ｎｏｎ−ｆａｓｔｉｎｇ）および絶食時（Ｆａｓｔｉｎｇ）における血清ＮＥＦＡ量を示したグラフである。（ｂ）は血清ＴＧ量、（ｃ）は血清ＴＣ量を同様に示したグラフである。平均値±ＳＥＭ。＊は、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０５水準で有意であることを示す。
【図９】６週齢のＢ６マウス（白丸）とＨＮＤマウス系統（黒四角）のそれぞれから単離した膵島のインスリン分泌に対するグルコースの投与量依存効果を示したグラフである。数値は３−６検体の測定の平均値±ＳＥＭ。統計処理はｔテストによって行った。
【図１０】６週齢のＢ６マウス（白バー）とＨＮＤマウス系統（黒バー）のそれぞれから単離した膵島のグルコース刺激インスリン分泌量に対するＧＬＰ−１、ＧＩＰまたはグルカゴンの効果を示したグラフである。数値は３−６検体の測定の平均値±ＳＥＭ。統計処理はｔテストによって行った。
【図１１】（ａ）は２０−３０週齢のＢ６マウス（白丸）とＨＮＤマウス系統（黒四角）のそれぞれから単離した膵島のグルコース刺激インスリン分泌量に対するソマトスタチンの投与量依存効果を示したグラフである。（ｂ）はアドレナリンの同様の効果を示したグラフである。数値は、（ａ）は４−７検体、（ｂ）は５−２０検体の測定の平均値±ＳＥＭ。＊は、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０５水準で有意であることを示す。
【図１２】２０−３０週齢のＢ６マウス（白バー）とＨＮＤマウス系統（黒バー）のそれぞれから単離した膵島のグルコース刺激インスリン分泌量にα２−アドレナリンレセプターのアゴニストであるクロニジンの効果を示したグラフである。数値は４−５検体の測定の平均値±ＳＥＭ。＊は、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０５水準で有意であることを示す。
【図１３】（ａ）は１０−１４週齢のＢ６マウス（白丸：ｎ＝６）とＨＮＤマウス系統（黒四角：ｎ＝８）の絶食時血糖値に対するクロニジン（５μｇ／ｋｇ　ＢＷ）の効果の経時的変化を示したグラフである。（ｂ）は同様の効果の時間依存性変化を示したグラフである。数値は平均値±ＳＥＭ。＊および＊＊はそれぞれ、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１水準で有意であることを示す。
【図１４】（ａ）は１０−１４週齢のＢ６マウス（白丸：ｎ＝４）とＨＮＤマウス系統（黒四角：ｎ＝８）の非絶食時血糖値に対するクロニジン（５μｇ／ｋｇ　ＢＷ）の効果の経時的変化を示したグラフである。（ｂ）は同様の効果の時間依存性変化を示したグラフである。数値は平均値±ＳＥＭ。＊、＊＊および＊＊＊はそれぞれ、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１水準で有意であることを示す。
【図１５】（ａ）は１０−１４週齢のＢ６マウス（白丸：ｎ＝８）とＨＮＤマウス系統（黒四角：ｎ＝１２の絶食時血糖値に対するクロニジン（５０μｇ／ｋｇ　ＢＷ）の効果の経時的変化を示したグラフである。（ｂ）は同様の効果の時間依存性変化を示したグラフである。数値は平均値±ＳＥＭ。＊および＊＊はそれぞれ、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０１およびｐ＜０．００１水準で有意であることを示す。
【図１６】（ａ）は１０−１４週齢のＢ６マウス（白丸：ｎ＝４）とＨＮＤマウス系統（黒四角：ｎ＝８）の非絶食時血糖値に対するクロニジン（５０μｇ／ｋｇ　ＢＷ）の効果の経時的変化を示したグラフである。（ｂ）は同様の効果の時間依存性変化を示したグラフである。数値は平均値±ＳＥＭ。＊はｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．００１水準で有意であることを示す。
【図１７】２５−５０週齢のＢ６マウスの耐糖能試験における生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）またはヨヒンビンの投与量依存効果を示したグラフである。数値は３−４検体の測定の平均値±ＳＥＭ。＊は、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０５水準で有意であることを示す。
【図１８】（ａ）は１１−１６週齢のＢ６マウス（ｎ＝８）の耐糖能試験における生理食塩水（白丸）またはヨヒンビン（黒四角：１００μｇ／ｋｇ　ＢＷ）の投与量依存効果を示したグラフである。（ｂ）はＨＮＤマウス系統（ｎ＝１０）における同様の効果を示したグラフである。（ｃ）はＡＵＣの結果であり、白バーは生理食塩水、グレーバーはヨヒンビン、左側がＢ６マウス、右側がＨＮＤマウス系統である。数値は平均値±ＳＥＭ。＊および＊＊はそれぞれ、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１水準で有意であることを示す。
【図１９】（ａ）は１１−１６週齢のＢ６マウス（ｎ＝３−４）の耐糖能試験中のインスリン分泌量に対する、生理食塩水（白丸）またはヨヒンビン（黒四角：１００μｇ／ｋｇ　ＢＷ）の効果を示したグラフである。（ｂ）はＨＮＤマウス系統（ｎ＝３−４）における同様の効果を示したグラフである。（ｃ）は試験中の初期３０分間の血中インスリン濃度の変化であり、白バーは生理食塩水、グレーバーはヨヒンビン、左側がＢ６マウス、右側がＨＮＤマウス系統である。数値は平均値±ＳＥＭ。＊および＊＊はそれぞれ、ｔテストによるＢ６マウスとの差がｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１水準で有意であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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