(57)【要約】【課題】アルツハイマー病の遺伝子診断に用いる核酸プローブおよびプライマーの提供。【解決手段】Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子における、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、アルツハイマー病の予測または診断に用いるための核酸分子。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子における、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、アルツハイマー病の予測または診断に用いるための核酸分子。
【請求項２】
配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１に示される第１１０５〜６７６４ヌクレオチドまたは配列番号２に示される第５２〜１５０９ヌクレオチドを含んでなるものである、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１に示される第１１０５〜６７６４ヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号１中の第４６３２番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されたもの、または配列番号２に示される第５２〜１５０９ヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１００５番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されたものである、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号３中の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドの、配列番号３中の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
アルツハイマー病が若年性アルツハイマー病である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子における、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、アルツハイマー病の予測または診断に用いるためのプライマーペア。
【請求項９】
配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、配列番号３中の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項８に記載のプライマーペア。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１に示される第１１０５〜６７６４ヌクレオチドまたは配列番号２に示される第５２〜１５０９ヌクレオチドを含んでなるものである、請求項９に記載のプライマーペア。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１に示される第１１０５〜６７６４ヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号１中の第４６３２番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されたもの、または配列番号２に示される第５２〜１５０９ヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１００５番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されたものである、請求項９に記載のプライマーペア。
【請求項１２】
アルツハイマー病が若年性アルツハイマー病である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のプライマーペア。
【請求項１３】
Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子の変異を検出することにより、アルツハイマー病を予知または検出する方法であって、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項８〜１２のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子における、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定する工程を含んでなる、方法。
【請求項１４】
アルツハイマー病が若年性アルツハイマー病である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項８〜１２のいずれか一項に記載のプライマーペアを含んでなる、アルツハイマー病の予測または診断用キット。
【請求項１６】
アルツハイマー病が若年性アルツハイマー病である、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、アルツハイマー病の遺伝子診断およびこれに用いるための核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
アルツハイマー病の病因遺伝子としては、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子、プレセニリン１（ＰＳ１）遺伝子、プレセニリン２（ＰＳ２）遺伝子、およびアポリポプロテインＥのε４アレルが知られている。
【０００３】
上述の通り、ＡＰＰ遺伝子、ＰＳ１遺伝子、またはＰＳ２遺伝子はアルツハイマー病の原因遺伝子とされているが、家族性アルツハイマー病においてこれらの変異により説明可能なケースは１０〜２０％に過ぎないことが知られている。
【０００４】
アポリポプロテインＥのε４アレルは、晩期発症型家族性および弧発性アルツハイマー病のリスクファクターとして、いずれの人種についても使用可能であるものとされている（Ｃｏｒｄｅｒ　Ｅ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２６１，　９２１−９２３，　１９９３；　Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ａ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，　４３，　１４６７−１４７２，　１９９３；　Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ　Ｗ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９０，　１９７７−１９８１，　１９９３）。しかしながら、これにより説明可能なケースは約５０％もしくはそれ以下であることが報告されている（例えば、Ｆａｒｒｉｅｒ　Ｌ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＪＡＭＡ，　２７８，　１３４９−１３５６，　１９９７）。
【０００５】
さらに、アメリカ合衆国の研究者により、インターロイキン１αの転写開始点から上流側の８８９番目のＣ／Ｔ多型が若年性アルツハイマー病のリスクファクターとなることが報告されている（Ｇｒｉｍａｌｄｉ　Ｌ．Ｍ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎ．　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．，４７，　３６１−３６５，　２０００）。しかしながら、このリスクファクターは年齢による影響を受けないことが、イタリアの研究者により報告されている（Ｄｕ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，　５５，　４８０−４８４，　２０００）。よって、このリスクファクターは、人種を超えて若年性アルツハイマー病の診断に用いられるものとは認められていない。
【０００６】
従って、アルツハイマー病を高い確率で検出しうるリスクファクターが、依然として必要とされている。また、人種を超えて用いることのできる若年性アルツハイマー病のリスクファクターについては、未だに報告されていない。
【０００７】
一方で、上記ＡＰＰと結合し、その代謝に影響を及ぼすタンパク質としてＦｅ６５Ｌ２が知られている。Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子は染色体５上に位置し、そのゲノム上のヌクレオチド配列およびｍＲＮＡに対するｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、コードされているアミノ酸配列とともに、それぞれＡＢ０２４７４５およびＡＢ０１８２４７のアクセス番号でＧｅｎＢａｎｋに登録されている。Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子は１３個のエクソンを含み、その１１番目のエクソン上には、Ｆｅ６５Ｌ２の第３１８アミノ酸（トレオニン）をコードするコドンの３番目のヌクレオチドにおけるＣ／Ｔの一塩基多型が存在することが報告されている（Ｔａｎａｈａｓｈｉ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｍｕｔａｔ．　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　Ｒｅｐｏｒｔ　＃８８，　Ｏｎｌｉｎｅ，　１９９９；　Ｔａｎａｈａｓｈｉ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｍｕｔａｔ．　１５，　１２１，　２０００）。この一塩基多型は、痴呆または神経疾患に罹患していない日本人１０７人についての調査の結果として見出されたものである。
【０００８】
【発明の概要】
本発明者らは、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子上の、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドにおけるＣ／Ｔの一塩基多型が、アルツハイマー病の診断に利用可能であることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明は、アルツハイマー病の遺伝子診断に用いるための核酸分子およびプライマーペア、診断用キット、ならびにアルツハイマー病の予知／検出方法の提供を目的とする。
【００１０】
そして、本発明による核酸分子は、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子における、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、アルツハイマー病の予測または診断に用いるための核酸分子である。
【００１１】
さらに、本発明によるプライマーペアは、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子における、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、アルツハイマー病の予測または診断に用いるためのプライマーペアである。
【００１２】
さらに、本発明によるアルツハイマー病の予知／検出方法は、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子の変異を検出することにより、アルツハイマー病を予知または検出する方法であって、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを用いて、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子における、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定する工程を含んでなる、方法である。
【００１３】
さらに、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる、アルツハイマー病の予測または診断用キットである。
【００１４】
【発明の具体的説明】
本発明によれば、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子における多型部位のヌクレオチドを同定することにより、アルツハイマー病の遺伝子診断が可能となる。
【００１５】
本発明により同定されるヌクレオチドは、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子中の、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドであり、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子は、この位置においてＣ／Ｔの一塩基多型（本発明において「ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型」という）を有する。ここで、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質は配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含んでなるものである。また、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３で表わされるアミノ酸配列をコードするものであり、例えば、配列番号１で表わされるゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＢ０２４７４５）および配列番号２で表わされるｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＢ０１８２４７）が挙げられる。ｃ９５４Ｃ＞Ｔの位置は、配列番号１においては第４６３２番目のヌクレオチドに相当し、配列番号２においては第１００５番目のヌクレオチドに相当する。
【００１６】
ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型におけるＣアレル、特にＣＣの遺伝子型は、アルツハイマー病のリスクファクターとして使用できる。これに対し、Ｔアレルは、アルツハイマー病のリスクを下げる保護効果を有するものと考えられる。従って、ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドがＣであるかＴであるかを同定することにより、アルツハイマー病の予測または診断が可能となる。さらに、上記のＣアレル（特にＣＣの遺伝子型）は、若年性アルツハイマー病、特に６０歳未満で発症するアルツハイマー病の予測または診断においては、特に好ましいリスクファクターである。
【００１７】
本発明による核酸分子は、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、アルツハイマー病の予測または診断に用いるための核酸分子である。本発明の好ましい実施態様によれば、前記核酸分子は、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。ここで、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質は、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含んでなるものである。
【００１８】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【００１９】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２０】
Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドは、ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるヒトＦｅ６５Ｌ２遺伝子のゲノムＤＮＡ、またはこれに由来するｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡとすることができる。前記ゲノムＤＮＡは、ヒトＦｅ６５Ｌ２遺伝子の全エクソン（エクソン１〜１３）を含むものであればよく、従って、上記ポリヌクレオチドは、エクソン１の５’末端からエクソン１３の３’末端まで、すなわち、配列番号１に示される第１１０５〜６７６４ヌクレオチドを含んでなるものであることが好ましい。前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、ヒトＦｅ６５Ｌ２タンパク質のアミノ酸をコードする全コドンを含むものであればよく、従って、上記ポリヌクレオチドは、配列番号２に示される第５２〜１５０９ヌクレオチドを含んでなるものであることが好ましい。
【００２１】
また、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質をコードする上記ポリヌクレオチドは、ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドがチミン（Ｔ）であるヒトＦｅ６５Ｌ２遺伝子のゲノムＤＮＡ、またはこれに由来するｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡとすることができる。前記ゲノムＤＮＡは、ヒトＦｅ６５Ｌ２遺伝子の全エクソン（エクソン１〜１３）を含むものであればよく、従って、上記ポリヌクレオチドは、エクソン１の５’末端からエクソン１３の３’末端まで、すなわち、配列番号１に示される第１１０５〜６７６４ヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号１中の第４６３２番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されたものであることが好ましい。前記ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、ヒトＦｅ６５Ｌ２タンパク質のアミノ酸をコードする全コドンを含むものであればよく、従って、上記ポリヌクレオチドは、配列番号２に示される第５２〜１５０９ヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号２中の第１００５番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されたものであることが好ましい。
【００２２】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、検出の標的をゲノムとする場合には、本発明による核酸分子は、エクソンにハイブリダイズする部分だけでなく、イントロンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２３】
本発明による核酸分子は、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号３中の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００２４】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドとする。
【００２５】
また、本発明による核酸分子は、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、本発明による変異型ポリヌクレオチドの、配列番号３中の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００２６】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。
【００２７】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１８〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、上記ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドを同定する上で好ましいものである。
【００２８】
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、アルツハイマー病の予測または診断に用いるためのプライマーペアが提供される。本発明の好ましい実施態様によれば、前記プライマーペアは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、配列番号３中の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００２９】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドを同定することができ、これにより、アルツハイマー病を予知または検出することができる。上記の同定の結果、ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドがＣであった場合には、アルツハイマー病が予知または検出されたと判断することができる。
【００３０】
また、Ｃアレルを有する場合の遺伝子型としてはＣ／ＣおよびＣ／Ｔが考えられるが、被検者がＣ／Ｔを有する場合よりもＣ／Ｃを有する場合の方が、より確実にアルツハイマー病の予知または検出を判断することができる。従って、本発明の好ましい態様によれば、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いて、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位の遺伝子型を同定する工程を含んでなる、アルツハイマー病を予知または検出する方法が提供される。
【００３１】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドを同定するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被検者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドを同定する工程を含んでなる、アルツハイマー病の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。
【００３２】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸増幅法およびこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。
【００３３】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００３４】
また、ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位は制限酵素ＡｃｉＩの認識配列に含まれており、該多型部位のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかは、増幅産物のＡｃｉＩによる消化によって生ずるヌクレオチド断片のパターンによって同定することができる。例えば、上記の核酸増幅において次のプライマーペア：
フォワードプライマー：５’−ＴＡＣＡＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＣＧＣＴＧ−３’（配列番号４）；
リバースプライマー：５’−ＴＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＡＣ−３’（配列番号５）；
を用いた場合には、増幅産物として１８３ｂｐの断片が得られるが、これをＡｃｉＩで消化すると、上記多型部位のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）である場合には７１ｂｐおよび１１２ｂｐの２種の断片が得られ、チミン（Ｔ）である場合には１８３ｂｐの１種の断片が得られる。
【００３５】
本発明による予測法または診断法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、一方のプライマーを多型部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを多型部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記多型にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。
【００３６】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等によるＦｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドの同定にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、アルツハイマー病の予知法もしくは検出法または予測法もしくは診断法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型にかかるいずれかのアレルの存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００３７】
この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）を参照することができる。
【００３８】
Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、また、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００３９】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４０】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４１】
Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００４２】
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法においては、ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドを含む領域に対して、ＣアレルおよびＴアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付され、さらに３’末端がリン酸化されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができるため特に制限されないが、例えば、以下のようなヌクレオチド配列とすることができる：
【００４３】
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｃアレル用：　５’−ＴＡＣＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧ−３’（ＦＡＭラベル）（配列番号６）
Ｔアレル用：　５’−ＴＡＣＣＣＴＣＡＣＴＧＣＣＡＧ−３’（ＶＩＣラベル）（配列番号７）；
【００４４】
プライマー：
ＦｅＡｃｉ／Ｆ２：　５’−ＣＡＧＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣ−３’（配列番号８）
ＦｅＡｃｉ／Ｒ２：　５’−ＡＧＡＧＴＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴ−３’（配列番号９）。
【００４５】
また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型（Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｔ、またはＴ／Ｔ）が容易に決定される。
【００４６】
本発明による予知法、検出法、予測法および診断法において、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であると評価されたサンプル、特に遺伝子型がＣ／Ｃであると評価されたサンプルは、アルツハイマー病、特に若年性アルツハイマー病を有するものと、あるいは将来においてその可能性があるものと診断することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００４７】
以上のようなアルツハイマー病の予知、検出、予測および診断のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子におけるｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型部位のヌクレオチドを同定するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００４８】
【実施例】
例１：Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子上の多型とアルツハイマー病との関連
Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子において見出された４つの一塩基多型、ＩＶＳ７−３２Ｃ＞Ｔ、ｃ９５４Ｃ＞Ｔ（Ｔ３１８Ｔ）、ｃ１０２３Ｔ＞Ｃ（Ｈ３４１Ｈ）およびｃ１２６２Ｇ＞Ａ（Ｒ４２１Ｑ）に関し、アルツハイマー病（ＡＤ）患者１３４人および健常対照１５８人について、各多型の検出を行なった。多型の検出は、文献に記載の方法（Ｔａｎａｈａｓｈｉ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｍｕｔａｔ．　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　Ｒｅｐｏｒｔ　＃８８，　Ｏｎｌｉｎｅ，　１９９９；　Ｔａｎａｈａｓｈｉ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ．　Ｍｕｔａｔ．　１５，　１２１，２０００）に従って行なった。得られたデータについて統計学的な解析を行なったところ、ｃ９５４Ｃ＞Ｔ（Ｔ３１８Ｔ）について、アルツハイマー病患者と健常対照との間で有意差が見られた。
【００４９】
さらに、上記ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型に関し、アルツハイマー病患者５５６人（発症年齢平均±ＳＤ：７０．３±８．９歳、年齢幅：４４〜９１歳、日本人、性別：男性１９２人、女性３６４人）および健常対照４８０人（年齢平均±ＳＤ：６７．７±１０．０歳、年齢幅：３０〜９１歳、日本人、性別：男性２０９人、女性２７１人）の計１０３６人について、統計学的な解析を行なった。アルツハイマー病患者は、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ診断基準に従ってアルツハイマー病と診断された患者である。健常対照は、ＭＭＳＥ（Ｍｉｎｉ−ｍｅｎｔａｌ　Ｓｔａｔｅ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）により知的正常であることを確かめられた健常者であり、一部の健常対照については、さらに、ＭＲＩ（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｉｍａｇｉｎｇ）およびＳＰＥＣＴ（ｓｉｎｇｌｅ　ｐｈｏｔｏｎ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｃｏｍｐｕｔｅｄ　ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）により知的正常であることが確認されている。解析に用いられたこれらの検体は、それぞれ本人からインフォームドコンセントが得られたものであり、さらに、国立精神神経センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，　Ｊａｐａｎ）の倫理委員会により承認されたものである。
【００５０】
まず、上記検体の全てについて、ＴａｑＭａｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）を用いて遺伝子型を決定した。このＴａｑＭａｎシステムにおいては、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＡＢＩ）、１ｎｇのサンプルＤＮＡ、各２００ｎＭの下記ＴａｑＭａｎ　ＭＧＢプローブ、および各９００ｎＭの下記プライマーを含む全２５μｌの反応溶液を調製し、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて、５０℃で２分間−９５℃で１０分間の反応の後、９２℃で１５秒間−６０℃で１分間の反応を４０サイクルまたは４５サイクル行なった。
【００５１】
ＴａｑＭａｎ　ＭＧＢプローブ
ＦｅＡｃｉＩ／Ｃ：　５’−ＴＡＣＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧ−３’（ＦＡＭラベル）（配列番号６）
ＦｅＡｃｉＩ／Ｔ：　５’−ＴＡＣＣＣＴＣＡＣＴＧＣＣＡＧ−３’（ＶＩＣラベル）（配列番号７）
【００５２】
プライマー
ＦｅＡｃｉ／Ｆ２：　５’−ＣＡＧＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣ−３’（配列番号８）
ＦｅＡｃｉ／Ｒ２：　５’−ＡＧＡＧＴＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴ−３’（配列番号９）
【００５３】
次いで、得られたデータの統計学的解析を、χ２検定、ならびに発症年齢および性別を合わせたロジスティック回帰分析の手法を用いて行なった。その結果を下記の表１および表２に示す。
【００５４】
【表１】
2004024043.tif 000002
【００５５】
【表２】
2004024043.tif 000003
【００５６】
解析に先立ち、いずれの一塩基多型も、対立遺伝子頻度から算出した期待値と実際の遺伝子型との間でのχ２検定による有意差はなく（アルツハイマー病：χ２＝２．０８，Ｐ＝０．１４９；健常対照：χ２＝０．０００６，Ｐ＝０．９８１）、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡が成り立つことが確認された。
【００５７】
表１では、アルツハイマー病患者と健常対照との間で、遺伝子型分布に有意差が見られた（χ２＝８．７６，ｄｆ＝２，Ｐ＝０．０１２５）。ＴＴ遺伝子型を対照として、年齢と性別を合わせたロジスティック回帰モデルにより得られるＣＣ遺伝子型を有する者のアルツハイマー病発症のオッズ比（ＯＲ）は、１．５８（９５％ＣＩ：１．０９−２．２８）であった。また、対立遺伝子頻度にも有意差が見られた（χ２＝８．０２，ｄｆ＝１，Ｐ＝０．００４６，Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ　ｅｘａｃｔ　Ｐ＝０．００５２）。
【００５８】
さらに、表２によれば、発症年齢が６０歳未満のグループにおいて、上記の有意差が特に顕著であることがわかる（遺伝子型：ｎ＝１７０，χ２＝７．１３，ｄｆ＝２，Ｐ＝０．０２８３，性別を合わせたロジスティック回帰モデルによる、ＣＣ遺伝子型を有する者のアルツハイマー病発症のＯＲ：３．１９（９５％　ＣＩ：　１．２５−８．１６）；対立遺伝子頻度：χ２＝７．３３，ｄｆ＝１，Ｐ＝０．００６８，Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ　ｅｘａｃｔ　Ｐ＝０．００７８）。しかし、発症年齢が６０歳以上のグループにおいては、６０歳未満のグループほどの有意差は見られない（遺伝子型：ｎ＝８６６，χ２＝４．４０，ｄｆ＝２，Ｐ＝０．１１１；対立遺伝子頻度：χ２＝３．５３，ｄｆ＝１，Ｐ＝０．０６０１，Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ　ｅｘａｃｔ　Ｐ＝０．０６７１）。また、発症年齢が６０歳以上のグループをさらに５歳ごとにグループ化して検定を行なった場合にも、遺伝子型分布において、６０歳未満のグループほどの有意差は見られない（６０歳以上６５歳未満：ｎ＝１２３，χ２＝２．０１，ｄｆ＝２，Ｐ＝０．３６５；６５歳以上７０歳未満：ｎ＝２０３，χ２＝４．３５，ｄｆ＝２，Ｐ＝０．１１４；７０歳以上７５歳未満：ｎ＝２２８，χ２＝１．１８，ｄｆ＝２，Ｐ＝０．５５４；７５歳以上：ｎ＝３１２，χ２＝０．１６，ｄｆ＝２，Ｐ＝０．９２３）。
また、発症年齢が６０歳未満のグループにおいて、Ｃアレルを１つ有するもの（ＣＴ）と２つ有するもの（ＣＣ）との間でＯＲを比較すると、Ｃアレルを２つ有するもののＯＲは１つ有するもののＯＲの約２倍となっている（発症年齢６０歳未満のグループにおいて、ＣＣのＯＲ：３．１９（９５％　ＣＩ：　１．２５−８．１６）；ＣＴのＯＲ：１．５９（９５％　ＣＩ：　０．６４−３．９６））。このことから、Ｃアレルは相乗効果を有するといえる。
【００５９】
さらに、アルツハイマー病のリスクファクターとされているアポリポプロテインＥのε４アレルを考慮し、このアレルを有する者、年齢および性別を合わせたロジスティック回帰モデル解析を行なったところ、ＣＣ遺伝子型を有する者のアルツハイマー病発症のＯＲは１．５０（９５％　ＣＩ：　１．０２−２．１９）であり、これを考慮していない上述のＯＲ（１．５８（９５％　ＣＩ：　１．０９−２．２８））と近似している。このことから、ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型は独立したリスクファクターであると考えられる。
【００６０】
以上の解析結果から、ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型におけるＣアレル、特にＣＣの遺伝子型は、アルツハイマー病のリスクファクターとして使用できることがわかる。さらに、ｃ９５４Ｃ＞Ｔ多型をアルツハイマー病のリスクファクターとする場合、これは年齢のファクターによる影響を受けるものと考えられる。これに対し、Ｔアレルは、アルツハイマー病のリスクを下げる保護効果を有するものと考えられる。
【配列表】
2004024043.tif 000004
2004024043.tif 000005
2004024043.tif 000006
2004024043.tif 000007
2004024043.tif 000008
2004024043.tif 000009
2004024043.tif 000010
2004024043.tif 000011
2004024043.tif 000012
2004024043.tif 000013
2004024043.tif 000014
2004024043.tif 000015
2004024043.tif 000016
2004024043.tif 000017
2004024043.tif 000018
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