(57)【要約】【課題】発現効率を向上させたダンベル型非ウィルスベクターを提供する。【解決手段】環状のプラスミドＤＮＡを直線化し、その両端を熱的・熱力学的に安定なループを形成するオリゴヌクレオチドでキャッピングした。熱的・熱力学的に安定なループは、エキソヌクレアーゼ（分解酵素）に対する抵抗性を示し、分解されずに核に到達したＤＮＡが遺伝子を発現する。本発明は、一般式Ａ−Ｒ−Ｂ（式中、Ａ及びＢは、それぞれ同じであっても異なってもよく、塩基配列ｇａａ又はｇｎａａ（ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す。）を含む塩基数が６以下の単鎖オリゴヌクレオチドから成るループ及び塩基対数が４〜２０の２本鎖直鎖ＤＮＡから成り、Ｒは塩基対数が１〜１０ｋｂの２本鎖直鎖ＤＮＡであって、プロモーター、外来遺伝子及びポリＡ付加シグナルを含む。）で表されるベクターである。環状ＤＮＡに比較して５〜１０倍高い発現効率（転写効率）を示す。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ａ−Ｒ−Ｂ（式中、Ａ及びＢは、それぞれ同じであっても異なってもよく、塩基配列ｇａａ又はｇｎａａ（ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す。）を含む塩基数が６以下の単鎖オリゴヌクレオチドから成るループ及び塩基対数が４〜２０の２本鎖直鎖ＤＮＡから成り、Ｒは塩基対数が１〜１０ｋｂの２本鎖直鎖ＤＮＡであって、プロモーター、外来遺伝子及びポリＡ付加シグナルを含む。）で表されるベクター。
【請求項２】
前記Ｒが、塩基対数が１〜７ｋｂの２本鎖直鎖ＤＮＡである請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記ループが、塩基配列ｇａａ又はｇｎａａ（ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す。）の単鎖オリゴヌクレオチドである請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクターを用いて、外来遺伝子を、所望の核に導入する方法。
【請求項５】
請求項４の記載の方法により形質転換された細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、新規な非ウィルスベクターに関し、より詳細には、両端に熱的・熱力学的に安定なループ状オリゴヌクレオチドを有するダンベル型ＤＮＡ構造の非ウィルスベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
非ウィルスベクターによる遺伝子治療は、その安全性から非常に期待がもたれているものの、発現効率が低いという問題点を抱えている。現在まで、この問題を克服すべく様々な試みがなされてきたが、その多くは細胞内・核内への移行量を増加させることに焦点が絞られてきた。
このような問題を解決するために、核移行シグナル（ＮＬＳ）を両端に付加した２重鎖ＤＮＡが、感染効率を１０〜１０００倍に上げることが報告されている（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　ｖｏｌ．９６，　ｐｐ．９１−９６　（１９９９））。
また、プロモーター、外来遺伝子及びＲＮＡ安定化配列から成る転写ユニットとその両端に結合した２つのヘアピン型オリゴヌクレオチドとから成るベクターは、このような形をしないプラスミドに比べて、ベクターとしてより効率的であることが報告されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｖｏｌ．３，　Ｎｏ．５，　７９３−８００　（２００１））。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、発現効率を向上させた非ウィルスベクターを提供することを目的とする。このようなベクターは遺伝子治療や遺伝子導入法による研究に非常に有用である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、環状のプラスミドＤＮＡを直線化し、その両端を熱的・熱力学的に安定なループを形成するオリゴヌクレオチドでキャッピングすることにより、転写効率への影響を調べた。サイトメガロウィルスプロモーター下流にＧＦＰ遺伝子を有するプラスミドＤＮＡを制限酵素により切断した後、熱的・熱力学的に安定なループを形成するオリゴヌクレオチドでキャッピングした。このダンベル型ＤＮＡをＣＯＳ−７細胞の核内にマイクロインジェクションしたところ、環状ＤＮＡに比較して５〜１０倍高い発現効率（転写効率）を示し、発現効率がダンベル型ＤＮＡのサイズに依存することを見い出し、その結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は、一般式Ａ−Ｒ−Ｂ（式中、Ａ及びＢは、それぞれ同じであっても異なってもよく、塩基配列ｇａａ又はｇｎａａ（ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す。）を含む塩基数が６以下の単鎖オリゴヌクレオチドから成るループ及び塩基対数が４〜２０の２本鎖直鎖ＤＮＡから成り、Ｒは塩基対数が１〜１０ｋｂの２本鎖直鎖ＤＮＡであって、プロモーター、外来遺伝子及びポリＡ付加シグナルを含む。）で表されるベクターである。
更に、本発明は、このベクターを用いて外来遺伝子を所望の核に導入する方法であり、また、この方法により形質転換された細胞である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の特徴である、熱的・熱力学的に安定なループには以下の役割があると考えられる。第１は、このループにより本発明のダンベル型ＤＮＡがエキソヌクレアーゼ（分解酵素）に対する抵抗性を有することになる。分解されずに核に到達したＤＮＡのみが遺伝子を発現ことになるのであり、核内においてもＤＮＡを分解するエキソヌクレアーゼ活性を有する蛋白質は数多く存在する。従って、このループの存在は、発現の安定性という観点からも重要である。第２に、このループを認識して結合する蛋白質の存在である。特異的な結合蛋白質が存在すれば、発現効率の上昇や発現の維持に関与していると考えられる。第３に、上述したように、蛋白質と結合した状態で、このループ構造により大きなねじれを生じたユニークな構造をとらせる可能性があり、このために発現効率が上昇すると考えられる。
【０００７】
後述の実施例で明らかにされるが、本発明のダンベル型ＤＮＡの発現量はそのＤＮＡサイズに関係し、外来遺伝子の種類によって最適の鎖長が存在し、そのときに転写効率が高いことが示されている。本発明のダンベル型ＤＮＡの構造をもつベクターのサイズ（塩基対数）は、両端の短分子量のループを無視すると、１〜１０ｋｂであるが、好ましくは１〜７ｋｂである。
【０００８】
また、このダンベル型ＤＮＡの両端に位置するループ状オリゴヌクレオチドは塩基配列ｇａａ又はｇｎａａ（ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す。）を持ち、熱的・熱力学的に安定であることが特徴である。このサイズは、塩基数が６以下、好ましくは塩基配列がｇａａ又はｇｎａａ（ｎはａ、ｇ、ｃ又はｔを表す。）のみの３又は４である。このループには、ループ及び２本鎖直鎖ＤＮＡ（Ａ及びＢ）と塩基対数が１〜１０ｋｂの２本鎖直鎖ＤＮＡ（Ｒ）とを結合させるための付着末端部分を除いて、塩基対数が４〜２０、好ましくは４〜８の２本鎖直鎖ＤＮＡが結合している。また、この付着末端部分は、制限酵素の種類により定まり、ループ及び２本鎖直鎖ＤＮＡ（Ａ及びＢ）と２本鎖直鎖ＤＮＡ（Ｒ）とを結合させるように適宜選択される。
プロモーターとしては、例えば、サイトメガトロウイルスプロモーターやＳＶ４０プロモーターなどを用いることが出来るが、導入する細胞や外来遺伝子により適宜選択する。
また、外来遺伝子は如何なるものを用いてもよいが、サイズは０．０２〜１ｋｂ程度が適している。
【０００９】
本発明のダンベル型ＤＮＡの製法に制限はないが、例えば、以下のように製造することができる。まず、ＡとＢ部分を化学的に合成し、その５’−末端をリン酸化する。Ｒとして、プラスミドＤＮＡをプロモーター、外来遺伝子及びポリＡ付加シグナルを含む部位（発現カセット）内部に認識配列を持たない制限酵素で消化する。Ａ、Ｒ及びＢをＤＮＡリガーゼで連結する。
【００１０】
【発明の効果】
後述の実施例に示すように、本発明の熱力学的に安定なループを両末端に有するダンベル型ＤＮＡは、高い転写効率を示す。しかし、プロモーターや外来遺伝子の位置の違いによる転写量の違いは認められなかった。従って、環状プラスミドＤＮＡに比べて、本発明のダンベル型ＤＮＡは有用な遺伝子治療用のベクターであるといえる。また、サイズを最適化することにより、遺伝子発現効率を上昇させることができる。
【００１１】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
熱的・熱力学的に安定なループ（下線部）を有し、Ａｏｒ１３Ｈ　Ｉによる切断部位への接着性末端を有する下記塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成した。
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＧＧＣＧＡＡＧＣＣＡＴＴ−３’（配列番号１）
このオリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解し８０℃、５分で加温した後徐々に室温まで冷やした（アニーリング）。アニーリングしたループ−オリゴヌクレオチド（５０ｐｍｏｌ／μｌ）１．１μｌ、１０ｍＭ　ＡＴＰ　４μｌ、１０×Ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ　Ｂ　２μｌ及びＴ４　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅ　（東洋紡）　２０Ｕを混ぜ、３７℃、１時間インキュベーションした。さらにＴ４　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅ　２０Ｕを加え、再び３７℃、１時間インキュベーションし（リン酸化）、ループ−オリゴヌクレオチドとした。
【００１２】
一方、外来ＤＮＡとしてＧＦＰをコードしたｐＱＢＩ２５−６３（７．６ｋｂ）を用いて直線状ＤＮＡを作成した（図１Ａ）。ｐＱＢＩ２５（宝酒造）は、ＧＦＰ遺伝子の他に哺乳動物由来のウイルスＳＶ４０プロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を有する。ｐＱＢＩ２５−６３は、ｐＱＢＩ２５のＧＦＰ遺伝子部分とバックボーンに哺乳動物細胞内で機能する部分が存在しないと思われるｐＱＢＩ６３（宝酒造）のバックボーンを用いて常法により構築した。このｐＱＢＩ２５−６３（環状プラスミドＤＮＡ）（１μｇ／μｌ）３０μｌをＡｏｒ１３Ｈ　Ｉ
１２０Ｕで消化し、直線状ＤＮＡとした。
この直線状ＤＮＡ　０．２６ｐｍｏｌと上記リン酸化したループ−オリゴヌクレオチド２５．０ｐｍｏｌをＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　（東洋紡）　４μｌを加えて１６℃、３０分間処理することにより、これらを連結した。
【００１３】
続いて、１％低融点アガロースゲルに、得られた連結ＤＮＡをアプライし、５０Ｖで約１．５時間電気泳動を行った。ＵＶを照射しゲルから目的の断片をスパーテルでとり、それらをＴ１Ｅ０．１　４００μｌ、５Ｍ　ＮａＣｌ　１５μｌを入れた１．５ｍｌサンプルチューブに回収し、ヒーターで７０℃、１０分間でゲル片を融かし、熱いうちにフェノール５００μｌを加え、よく撹拌し、フェノール抽出を行った。さらに、等容のフェノール：クロロホルム（１：１）でフェノールクロロホルム抽出、等容のクロロホルムでクロロホルム抽出を行い、遠心濃縮機で約３００μｌまで濃縮し、２．５倍容のエタノールを入れ、−８０℃、３０分間放置してエタノール沈殿を行った。４℃、２０分、１５，０００ｒｐｍで遠心した後、上清を捨て沈殿に冷えた７０％エタノール８００μｌでリンスし上清を捨て沈殿を乾燥させ、滅菌水１０μｌに溶かし室温に３０分間放置し、よく撹拌した。このようにして、ダンベル型ＤＮＡ（７．６　ｋｂ）を作製した。
この得られたダンベル型ＤＮＡ　１μｌを滅菌水９μｌで希釈し、１％アガロースゲル電気泳動を行いＥｔＢｒでゲルを染色した。ＮＩＨイメージによりそれぞれの直鎖状ＤＮＡの定量を行った。コントロールとして濃度既知の環状ＤＮＡを用いた。
【００１４】
実施例２
下記塩基配列のＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位への接着性末端を有するオリゴヌクレオチドを合成した。
５’−ＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＧＡＡＧＣＣＡＴＴ−３’（配列番号２）
一方、ｐＱＢＩ２５−６３（環状プラスミドＤＮＡ）（１μｇ／μｌ）３０μｌをＨｉｎｄＩＩＩ　１２０Ｕで消化して直線状ＤＮＡとし、これらを用いて実施例１と同様の操作によりダンベル型ＤＮＡ（７．６　ｋｂ）を作製した。
実施例３
下記塩基配列のＢｇｌＩＩによる切断部位への接着性末端を有するオリゴヌクレオチドの塩基配列を合成した。
５’−ＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＧＡＡＧＣＣＡＴＡ−３’（配列番号３）
一方、ｐＱＢＩ２５−６３（環状プラスミドＤＮＡ）（１μｇ／μｌ）３０μｌをＢｇｌＩＩ　１２０Ｕで消化して直線状ＤＮＡとし、これらを用いて実施例１と同様の操作によりダンベル型ＤＮＡ（７．６　ｋｂ）を作製した。
【００１５】
実施例４
ｐＱＢＩ２５−６３（環状プラスミドＤＮＡ）（１μｇ／μｌ）３０μｌをＨｉｎｄＩＩＩ　１２０ＵとＢｇｌＩＩ　１２０Ｕで消化して直線状ＤＮＡとし、これと実施例２及び３で合成した２種のオリゴヌクレオチド（配列番号２及び３）を用いて実施例１と同様の操作によりダンベル型ＤＮＡ（２．３　ｋｂ）を作製した。
実施例５
ｐＱＢＩ２５−６３　（７．６　ｋｂ）を　ＢｇｌＩＩとＮｒｕＩ　で消化し、これを自己連結し、これを用いて実施例２と同様の操作によりダンベル型ＤＮＡ（５．７　ｋｂ）を作製した。
実施例６
ｐＱＢＩ２５−６３　（７．６　ｋｂ）を　ＢｇｌＩＩとＭｌｕＩ　で消化し、これを自己連結し、これを用いて実施例２と同様の操作によりダンベル型ＤＮＡ（６．８　ｋｂ）を作製した。
実施例７
ｐＱＢＩ２５−６３　（７．６　ｋｂ）を　ＢｇｌＩＩとＭｌｕＩ　で消化し、生成した０．７　ｋｐｂ　の断片をｐＱＢＩ２５−６３のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、これを用いて実施例２と同様の操作によりダンベル型ＤＮＡ（８．３　ｋｂ）を作製した。
実施例８
ｐＱＢＩ２５−６３　（７．６　ｋｂ）を　ＢｇｌＩＩとＮｒｕＩ　で消化し、生成した１．８　ｋｐｂ　の断片をｐＱＢＩ２５−６３のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、これを用いて実施例２と同様の操作によりダンベル型ＤＮＡ（９．４　ｋｂ）を作製した。
【００１６】
比較例１
比較のため、ｐＱＢＩ２５−６３　（７．６　ｋｂ、環状ＤＮＡ）をそのまま用いた。
比較例２
実施例２において、制限酵素で消化した直線状ＤＮＡを、これにループ状オリゴヌクレオチドを結合させずに、そのまま用いて実施例２と同様の操作により直鎖状ＤＮＡ（７．６　ｋｂ）を作製した。
比較例３
実施例４において、制限酵素で消化した直線状ＤＮＡを、これにループ状オリゴヌクレオチドを結合させずに、そのまま用いて実施例４と同様の操作により直鎖状ＤＮＡ（２．３　ｋｂ）を作製した。
【００１７】
評価
実施例１〜３、実施例４〜８及び比較例１〜３で調製した各種ＤＮＡを用いて、外来遺伝子であるＧＦＰ遺伝子の発現を調べ、これにより、直線化、ＤＮＡカセットの位置、サイズ等の転写効率への影響を調べた。
（Ａ）ＣＯＳ−７細胞とＮＩＨ／３Ｔ３細胞の培養を以下のようにして行った。
ＤＭＥＭ　５００　ｍｌに対して、５６℃で３０分間加熱処理することにより非働化させたＦＢＳ５０　ｍｌ、ＭＥＭ　１００ｘ　ＮＥＡＡ　５　ｍｌ、３％　グルタミン５　ｍｌ、１０％　炭酸水素ナトリウム１０　ｍｌ、１０　ｍＭ　硫酸ストレプトマイシン　／　ペニシリンＧカリウム５　ｍｌを添加した培地を用いて、ＣＯＳ−７細胞（ミドリザルの腎臓由来、理化学研究所から入手）又はＮＩＨ／３Ｔ３細胞（マウス線維芽由来、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手）の培養を、５％　ＣＯ２、３７℃の条件で行った。
細胞の保存は、上記の方法でトリプシン溶液を反応させ、遠心分離により得られた細胞約３．３×１０６個を細胞凍結用保存液１　ｍｌに懸濁させ、液体窒素中に凍結保存した。
【００１８】
（Ｂ）ＤＮＡのＣＯＳ−７細胞の核へのマイクロインジェクションは以下のようにして行った。
ａ）テトラメチルローダミン標識デキストランの調製
テトラメチルローダミン標識デキストラン（分子量７０，０００）１　ｍｇをＰＢＳ　（−）　２００　ｍｌによく溶解した後、４℃、５分、１２，０００　ｒｐｍで遠心し、得られた上清を別のサンプルチューブに移し、以下の工程で用いた。
ｂ）マイクロインジェクション
マイクロインジェクション前日に２×１０５個　／　ｍｌになるように乾熱滅菌済みのカバーガラスを敷いた細胞培養用６　ｃｍディッシュにＣＯＳ−７細胞を播いた。マイクロインジェクション当日、あらかじめ２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ培地１０　ｍｌを入れた６　ｃｍディッシュを用意し、３７℃、５％　ＣＯ２でインキュベーションした。マイクロインジェクションを行う前にカバーガラスをあらかじめインキュベーションしたディッシュに移した。ＤＮＡ分子数１，０００個　／　ｃｅｌｌ、５００個　／　ｃｅｌｌ、１００個　／　ｃｅｌｌ、１０個　／　ｃｅｌｌ及び１個　／　ｃｅｌｌになるようにｐＱＢＩ　２５−６３（１μｇ　／μｌ）１．６μｌをａ）で調製したテトラメチルローダミン標識デキストラン溶液９８．４　μｌに溶解し、合計１００μｌとした。テトラメチルローダミン標識デキストラン溶液に溶解した上記ＤＮＡの溶液を注入針に４　μｌ入れ、注入圧３０　ｈＰａ、維持圧４０　ｈＰａ、インジェクション時間０．２秒に設定し、核１個当たり約０．５　ｐｌの割合でマイクロインジェクションを行った。
ダンベル型ＤＮＡによる遺伝子発現の安定性の検証においては、様々なＤＮＡを核１個当たりに１，０００分子になるように、ａ）で調製したテトラメチルローダミン標識デキストラン溶液に希釈した。コントロールとしてキャッピングしていないＤＮＡを用いた。
ｃ）細胞の固定
マイクロインジェクション４８時間後、２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ培地を取り除きＰＢＳ　（−）　２　ｍｌでディッシュを２回洗浄し、１％　グルタルアルデヒド１　ｍｌをディッシュに入れ室温に３０分間放置した。ＰＢＳ　（−）　２　ｍｌでディッシュを２回洗浄した後、ＰＢＳ　（−）　２　ｍｌをディッシュに入れ４℃に保存した。
【００１９】
（Ｃ）ＤＮＡの哺乳動物細胞へのトランスフェクションは以下のようにして行った。
トランスフェクションを行う前日に１×１０５個　／　ｍｌになるように細胞培養用６　ｃｍディッシュにＣＯＳ−７又はＮＩＨ／３Ｔ３細胞を播いた。トランスフェクション当日、血清及び抗生物質を含まないＤＭＥＭ培地２５０μｌにＤＮＡ溶液を加え、さらにＰＬＵＳ　Ｒｅａｇｅｎｔ　８μｌを加えよく混合し、室温で１５分間インキュベーションした。別のサンプルチューブに血清及び抗生物質を含まないＤＭＥＭ培地２５０μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔ　ＡＭＩＮＥ　Ｒｅａｇｅｎｔ　１２μｌを加え、よく混合した。１５分後この溶液にＰＬＵＳ　Ｒｅａｇｅｎｔを加えたＤＮＡ溶液を入れ、よく混合し、室温で１５分間インキュベーションした。前日に細胞を播いたディッシュのＤＭＥＭ培地を除き、血清及び抗生物質を含まないＤＭＥＭ培地２　ｍｌを入れた。新しいＤＭＥＭ培地に交換したディッシュに先の溶液５００μｌを加えて、３７℃、５％ＣＯ２、３時間インキュベーションした。３時間後、１０％血清及び抗生物質が入ったＤＭＥＭ培地６　ｍｌに交換し、３７℃、５％ＣＯ２、４８時間インキュベーションした。
用いたＤＮＡ量によってトランスフェクション効率に大きな差が生じるので、ＤＮＡと用いた試薬のコンプレックス形成時の電荷（Ｎ／Ｐ比）　について考慮しなければならない。そこで、ＤＮＡ量が１，０００，　５００，　１００，　１０及び１（ｆｍｏｌ）になるように必要なＤＮＡの量を計算し、それぞれのＤＮＡ量（μｇ）　に対してＰＬＵＳ　Ｒｅａｇｅｎｔ　約４倍量（μｌ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ　ＡＭＩＮＥ　約６倍量（μｌ）を用いてトランスフェクションを行って、４８時間後に細胞を固定した。
【００２０】
（Ｄ）ＤＮＡのＣＯＳ−７細胞の細胞質へのマイクロインジェクションは以下のようにして行った。
各ＤＮＡを上記ａ）で調製したテトラメチルローダミン標識デキストラン溶液により希釈した。上記ｂ）に準じたが、注入圧２００　ｈＰａ、維持圧４０　ｈＰａ、インジェクション時間０．２秒に設定して細胞質内にマイクロインジェクションして、４８時間後に上記ｃ）に準じて細胞を固定した。
【００２１】
（Ｅ）蛍光顕微鏡によるＧＦＰ発現の観察は以下のようにして行った。
蛍光フィルターをＦＩＴＣに合わせ、約４８０ｎｍの波長の光によりＧＦＰの蛍光を発する細胞を数えた。蛍光フィルターをローダミンに合わせ、約５４０ｎｍの波長の光により細胞質でテトラメチルローダミンの蛍光を発する細胞を数えた。結果は細胞全体に対する蛍光を発する細胞の割合（％）で示す。
【００２２】
結果１
表１に示すように、ダンベル型ＤＮＡ（実施例１〜３）は環状ＤＮＡ（比較例１）よりも高い発現効率が観察された。
【表１】
2004065173.tif 000002
【００２３】
ＤＮＡ数が５０分子の時、ダンベル型ＤＮＡ（実施例１〜３）のＧＦＰ発現効率は７５％であり、一方、環状ＤＮＡ（比較例１）のＧＦＰ発現効率は１８％であった。その１０倍の環状ＤＮＡ５００分子をインジェクションした時、約７５％の発現効率が認められた。表１より５０％の発現率を得るためには、ダンベル型ＤＮＡ２０分子、環状ＤＮＡ１００分子が必要であると計算された。
これらから、本発明のダンベル型ＤＮＡは、環状ＤＮＡに比べ、転写効率が約５〜１０倍上昇することが明らかになった。
一方、図１Ｃ（実施例４）に示したＣＭＶプロモーター及びＧＦＰ遺伝子の位置の違いによる発現量の違いは認められなかった。すなわち、転写効率について考える上で、プロモーターや外来遺伝子の位置による違いはあまり重要ではないことが示された。
【００２４】
結果２
さらに、外来ＤＮＡのサイズの違いによる転写効率を比較検討し、その結果を表２に示す。
【表２】
2004065173.tif 000003
【００２５】
表２より発現量はＤＮＡのサイズに関係することが示された。核１個あたりにマイクロインジェクションしたＤＮＡ分子数を１個にすると、サイズの小さいダンベル型ＤＮＡ（２．３ｋｂ）が最も高い発現を示し、５．７ｋｂよりサイズの大きいダンベル型ＤＮＡは同じような発現パターンを示し、段階的に発現効率が低下した。すなわち、ＤＮＡのサイズを小さくすることにより、発現効率が上昇する可能性が示唆された。
サイズの小さいダンベル型ＤＮＡが高い転写効率を示したということは、ねじれの程度がサイズの小さいダンベル型ＤＮＡで特に大きいことが考えられる。もう一つの可能性としては、サイズの小さいダンベル型ＤＮＡは遺伝子発現に必要な部分のみを含み、他のサイズのＤＮＡはそれ以外の領域を含むために、特異的、非特異的に結合するタンパクの存在により転写効率が下がっているのではないかということが考えられる。
【００２６】
結果３
遺伝子治療において、一度投与されたＤＮＡを長時間細胞内に保持し、目的のタンパク質を目的の部位で長時間発現を維持することは、臨床上大変重要なことである。従って、発現量がどのくらい維持されるかどうか検討することにした。上記の結果は、マイクロインジェクション後４８時間（２日後）での結果であり、長時間細胞を培養すると逆の結果が得られる可能性がある。ダンベル型ＤＮＡによる遺伝子発現の安定性を調べるため、環状ＤＮＡとダンベル型ＤＮＡを核内へマイクロインジェクションし、１４日後までＧＦＰ遺伝子の発現を観察した。その結果を表３に示す。また、サイズの小さいダンベル型ＤＮＡ（２．３ｋｂ、実施例４）をマイクロインジェクションし、サイズの違いが与える影響を観察した。
【００２７】
【表３】
2004065173.tif 000004
【００２８】
核１個あたりＤＮＡ１，０００分子をマイクロインジェクションしたところ、表１の結果と同様に２日後のダンベル型ＤＮＡのＧＦＰ発現量は、環状ＤＮＡのＧＦＰ発現量よりも多かった。ダンベル型ＤＮＡ（２．３ｋｂ（実施例４）、７．６ｋｂ（実施例２））は、マイクロインジェクション１４日後まで環状ＤＮＡ（比較例１）に比べて高い発現を維持していたことが分かった。この結果は、細胞の増殖やマイクロインジェクションの際の細胞への傷害等、様々な要因が絡んでおり、その理由についての詳細は不明であるが、ダンベル型ＤＮＡは少なくとも１４日間発現を維持していることが示された。
一方、キャッピングしていない直鎖状ＤＮＡ（比較例２、３）は、早い段階で発現量が減少し１４日後においてはほとんど発現が観察されなかった。この原因として、インジェクションされたＤＮＡが核内に存在するヌクレアーゼにより分解を受けたのではないかと考えた。核内にヌクレアーゼが存在するのかは不明であるが、例えばＤＮＡポリメラーゼδ、εは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有していることが知られている。従って、核内においてキャッピングしていないＤＮＡがこれらによって分解されることは考えうる。
【００２９】
結果４
次に、様々なＤＮＡを用いて、直線化、ＤＮＡカセットの位置、及びサイズのＧＦＰ発現効率への影響をＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクションにより調べた。その結果を表４と表５に示す。
【表４】
2004065173.tif 000005
【００３０】
ダンベル型ＤＮＡ（実施例１〜３）は環状ＤＮＡ（比較例１）よりも高いＧＦＰ発現効率が観察された。ＤＮＡ　１，０００ｆｍｏｌにおいて、環状ＤＮＡ（比較例１）では１３％、ダンベル型ＤＮＡ（実施例１〜３）では２５％のＧＦＰ発現効率が認められた。しかし、表１で示した核へのマイクロインジェクションの結果と同様、ダンベル型ＤＮＡにおいてＤＮＡカセットの位置の違いによる差は認められなかった。ＧＦＰ発現効率が低かったので、表１で示した核へのマイクロインジェクションの結果と直接比較することは難しいが、表４で示したダンベル型ＤＮＡの発現効率の上昇は、表１で示した転写効率の促進によるものであると考えた。
【００３１】
また、サイズの小さいダンベル型ＤＮＡ（２．３ｋｂ、実施例４）が最も高い発現効率を示した（表５）。
【表５】
2004065173.tif 000006
【００３２】
サイズが５．７ｋｂより大きいダンベル型ＤＮＡでは同じような傾向を示した。これは表３の核へのマイクロインジェクションの結果と同様な発現パターンであった。すなわち、トランスフェクションによる遺伝子発現効率に対するトポロジーやサイズの影響は、転写効率に大きく依存している可能性が考えられる。また、この結果からもサイズの小さいダンベル型ＤＮＡは非ウイルスベクターとして非常に有用であることが示された。
【００３３】
結果５
同様に、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞へのトランスフェクションにより調べた。その結果を表６及び表７に示す。
表４及び表５で示したＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクションの結果と同様、ダンベル型ＤＮＡ（実施例１〜３）は環状ＤＮＡ（比較例１）よりも高いＧＦＰ発現効率が観察された（表６）。
【表６】
2004065173.tif 000007
【００３４】
また、サイズの小さいダンベル型ＤＮＡ（２．３ｋｂ、実施例４）が最も高い発現効率を示した（表７）。
【表７】
2004065173.tif 000008
一方、サイズが５．７ｋｂより大きいダンベル型ＤＮＡでは同様の発現パターンを示した。このようにＣＯＳ−７細胞とＮＩＨ／３Ｔ３細胞で同様の結果が得られたことから、サイズの小さいダンベル型ＤＮＡは遺伝子発現に非常に有用であると考えられる。
【００３５】
結果６
細胞質から核内へのＤＮＡの取り込みは遺伝子発現に非常に重要な過程である。そこで、様々なＤＮＡを用いて、直線化、ＤＮＡカセットの位置、及びサイズの影響を、ＣＯＳ−７細胞の細胞質へのマイクロインジェクションにより調べた。その結果を表８と表９に示す。
ダンベル型ＤＮＡ（実施例２）は環状ＤＮＡ（比較例１）よりも高い発現効率が観察された（表８）。
【表８】
2004065173.tif 000009
【００３６】
さらに、サイズの小さいダンベル型ＤＮＡは他のサイズのダンベル型ＤＮＡよりもＧＦＰ発現細胞数が多かったことから、ＧＦＰ発現効率はＤＮＡのサイズに依存することが示唆された（表９）。
【表９】
2004065173.tif 000010
また、ＤＮＡ　１，０００分子においてダンベル型ＤＮＡと環状ＤＮＡでＧＦＰ発現効率に顕著な差が認められた。
この結果をＤＮＡのトポロジー、サイズの影響を核へのマイクロインジェクション、トランスフェクションの結果（表１、２、４、５）と比較すると、２．３ｋｂＤＮＡによる効果など、核へのマイクロインジェクション、トランスフェクションの結果と若干異なった傾向を示した。このことから、サイズの異なるＤＮＡのトランスフェクションによる発現効率の違いがエンドサイトーシスではなく、外来ＤＮＡの核内での転写効率によって決定されると考えられる。
【００３７】
【配列表】
2004065173.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で作製したダンベル型ＤＮＡの構造を示す図である。Ａは、ｐＱＢＩ２５−６３（７．６ｋｂ）の構造、Ｂは、ループ状のオリゴヌクレオチド、Ｃは、発現カセット（ＣＭＶプロモーター、ＡｍｐＲ（Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子）、ｏｒｉ（Ｅ．ｃｏｌｉの複製開始点））を含んだダンベル型ＤＮＡを示す。上から、それぞれ実施例３、実施例１、実施例２（以上７．６ｋｂ）、実施例４（２．３ｋｂ）のダンベル型ＤＮＡを示す。
【図１】
2004065173.tif 000012