(57)【要約】【課題】ミデカマイシンの生合成に関与する遺伝子を提供すること。【解決手段】ストレプトマイセス　マイカロファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ）のゲノムＤＮＡからゲノムライブラリーを作製した。その中からミデカマイシンの生合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を見出した。これらの遺伝子の解読を行い、ミデカマイシンの生合成経路に関する機能の解析を行った。これらの遺伝子を利用し、ミデカマイシン又はミデカマイシン以外のマクロライド系化合物を微生物にて生産する方法、その生産性を向上させる方法を提供する。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミデカマイシンの生合成に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該タンパク質が配列番号２〜１０、１３、１４、１６、１９、２０、２２〜２６、２８〜３８から選択されるアミノ酸配列により特定されるか、又は該タンパク質がそのタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている配列番号２〜１０、１３、１４、１６、１９、２０、２２〜２６、２８〜３８から選択されるアミノ酸配列により特定されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリヌクレオチドがＯＲＦ１〜ＯＲＦ９、ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１３、ＯＲＦ１５、ＯＲＦ１８、ＯＲＦ１９、ＯＲＦ２１〜ＯＲＦ２５、ＯＲＦ２７〜ＯＲＦ３７からなる遺伝子の群から選択され、該遺伝子が配列番号１の塩基２９２４４−４２７７９、４２８２３−４８６５７、４８７１２−５９８０２、５９８５０−６４５５６、６４６８７−７０３６５、７０３６５−７１０７８、７１１１３−７２３６０、７２４００−７３６６５、７３６９４−７５０４３、７８０３９−７９３１３、７９３９１−８１０５２、８２７６０−８３３６２、２７９３７−２８９８３、２６１８０−２７３９１、２４４６０−２５６５０、２３５５５−２４４６３、２２５３４−２３５７１、２１７３３−２２５２７、２０３０７−２１７４３、１７５２２−１８８９５、１５６４３−１７４６６、１４０７４−１５０９６、１３０１６−１４０４４、１１７２９−１２９６１、１０５２１−１１６０３、９３２８−１０４５８、９０１２−９３３５、８１４９−９０１５、６６５３−７９４５、６０４８−６６２９により示される請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ミデカマイシンＰＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該ドメインが、それぞれ、配列番号２のアミノ酸配列１７−４２２、５２４−８７８、９１９−１００４、１０３１−１４５６、１５６２−１９１６、２１６１−２４４９、２４７５−２５６０、２５８３−３００８、３１２９−３４８３、３４９９−３６９９、４０２２−４３１５、４３３３−４４１８に対応するＫＳ０ｎｕｌｌ、ＡＴ０、ＡＣＰ０、ＫＳ１、ＡＴ１、ＫＲ１、ＡＣＰ１、ＫＳ２、ＡＴ２、ＤＨ２、ＫＲ２、ＡＣＰ２により特定されるか、又は該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている該アミノ酸配列により特定されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが配列番号１の塩基２９２９２−３０５０９、３０８１３−３１８７７、３１９９８−３２２５５、３２３３４−３３６１１、３３９２７−３４９９１、３５７２４−３６５９０、３６６６６−３６９２３、３６９９０−３８２６７、３８６２８−３９６９２、３９７３８−４０３４０、４１３０７−４２１８８、４２２４０−４２４９７よりなる群から選択される請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ミデカマイシンＰＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該ドメインが、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列３５−４６０、５７７−９２９、９４３−１１６９、１４５７−１７４４、１７５９−１８４４に対応するＫＳ３、ＡＴ３、ＤＨ３、ＫＲ３、ＡＣＰ３により特定されるか、又は該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている該アミノ酸配列により特定されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドが配列番号１の塩基４２９２５−４４２０２、４４５５１−４５６０９、４５６４９−４６３２９、４７１９１−４８０５４、４８０９７−４８３５４よりなる群から選択される請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
ミデカマイシンＰＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該ドメインが、それぞれ、配列番号４のアミノ酸配列４２−４６７、５６８−９１６、１１３７−１４０８、１４１７−１５０２、１５２２−１９４８、２０６４−２４１４、２４２６−２６１８、２９３９−３２２９、３２１９−３５０４、３５２０−３６０５に対応するＫＳ４、ＡＴ４、ＫＲ４ｎｕｌｌ、ＡＣＰ４、ＫＳ５、ＡＴ５、ＤＨ５、ＥＲ５、ＫＲ５、ＡＣＰ５により特定されるか、又は該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている該アミノ酸配列により特定されるポリヌクレオチド。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが配列番号１の塩基４８８３５−５０１１２、５０４１３−５１４５９、５２１２０−５２９３５、５２９６０−５３２１７、５３２７５−５４５５５、５４９０１−５５９５３、５５９８７−５６５６５、５７５２６−５８３９８、５８３６６−５９２２３、５９２６９−５９５２６よりなる群から選択される請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
ミデカマイシンＰＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該ドメインが、それぞれ、配列番号５のアミノ酸配列３４−４５８、５６３−９１４、１１３４−１４１８、１４２７−１５０９に対応するＫＳ６、ＡＴ６、ＫＲ６、ＡＣＰ６により特定されるか、又は該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている該アミノ酸配列により特定されるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが配列番号１の塩基５９９４９−６１２２３、６１５３６−６２５９１、６３２４９−６４１０３、６４１２８−６４３７６よりなる群から選択される請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ミデカマイシンＰＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該ドメインが、それぞれ、配列番号６のアミノ酸配列３５−４６０、５７６−９２９、１２１７−１５００、１５０４−１５９１、１５８８−１８９２に対応するＫＳ７、ＡＴ７、ＫＲ７、ＡＣＰ７、ＴＥ７により特定されるか、又は該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている該アミノ酸配列により特定されるポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが配列番号１の塩基６４７８９−６６０６６、６６４１２−６７４７３、６８３３５−６９１８６、６９１９６−６９４５９、６９４４８−７０３６２よりなる群から選択される請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載されたポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載された組換えベクターを含んでなる宿主。
【請求項１５】
請求項１４に記載された宿主を培養し、得られる培養物からミデカマイシン又はミデカマイシン以外のマクロライド系化合物を採取することを含んでなる、ミデカマイシン又はミデカマイシン以外のマクロライド系化合物の製造法。
【請求項１６】
ミデカミシン生合成遺伝子をゲノム中に有する形質転換された微生物であって、ここで、該遺伝子の少なくとも１つがその遺伝子の内部フラグメントとの組換えにより破壊されており、それ以外の遺伝子が機能的であるところの形質転換された微生物。
【請求項１７】
請求項１６に記載された形質転換された微生物を培養し、得られる培養物からミデカマイシン以外のマクロライド系化合物を採取することを含んでなる、ミデカマイシン以外のマクロライド系化合物の製造法。
【請求項１８】
複数のＰＫＳモジュールを含有する機能的ミデカマイシン生合成遺伝子をゲノム中に有する形質転換された微生物であって、ここで、該遺伝子が、ａ）配列番号１で示されるより少なくとも１つ多い機能的ＰＫＳモジュールを含むか、又は機能的ＰＫＳモジュールが少なくとも１つ少ないか、あるいはｂ）ＫＲ、ＤＨもしくはＥＲドメインの欠失、不活性化もしくは付加により、あるいは、ｃ）異なるカルボン酸を特定するＡＴドメインの置換により、配列番号１で示される対応するモジュールとは異なるＰＫＳモジュールを含む形質転換された微生物。
【請求項１９】
請求項１８記載の形質転換された微生物を培養し、得られる培養物からミデカマイシン以外のマクロライド系化合物を採取することを含んでなる、ミデカマイシン以外のマクロライド系化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はミデカマイシンの生産に関与するミデカマイシン生合成遺伝子、詳しくは制限酵素Ｓａｕ３Ａ　Ｉの部分分解によって得られたＤＮＡ断片を有するコスミドベクターｐＣＯＭＷ１、ｐＣＯＭＷ２、及びｐＣＯＭＷ４に含まれる約８５　ｋｂのポリヌクレオチド中に含まれるミデカマイシン生合成遺伝子、当該遺伝子を保持する宿主、その宿主を用いたミデカマイシン並びにミデカマイシン以外のマクロライド系化合物誘導体の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マクロライド系抗生物質は、グラム陽性菌、マイコプラズマ、クラミジア等に有効であり、経口投与が可能で毒性が低いため、臨床上重要な抗菌剤に分類されている。その中でも、市販の１６員環マクロライド系抗生物質は耐性誘導されにくく、１４員環マクロライドに比べて他の薬剤との相互作用も少なく、腸管に与える影響も少ない等の利点があり、アジア諸国を中心に世界中で広く使用されている。
【０００３】
ミデカマイシン（第１図）は、１６員環マクロライド系抗生物質に属し、幾つかの類縁体が報告されている。また、そのアシル化誘導体であるミオカマイシン（Ｏｍｏｔｏ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，　２９，　５３６　（１９７６）；　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｐｎ．Ｊ．　Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，　３５，　１４６２　（１９８２））と共に、臨床的に幅広く使用されている。
【０００４】
ミデカマイシンは放線菌の一種　ストレプトマイセス　マイカロファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ（ＡＴＣＣ２１４５４））が生産し、本菌の発酵生産による工業化が確立している。放線菌は抗生物質や生理活性物質等の二次代謝産物の生産菌として発酵工業の分野では古くから重要な位置にあり、種々の菌株育種技術によりその生産性の改良が行なわれてきた。ストレプトマイセス　マイカロファシエンスによるミデカマイシンの生産も種々の変異原による突然変異誘導により菌株育種がなされてきた。
【０００５】
近年、二次代謝産物の生産性向上や新規活性物質の創出を目的として、遺伝子組換えの手法が取り入れられてきており、既に多くの二次代謝系の遺伝子が単離されている。例えばマクロライド系抗生物質の生産に関与する遺伝子としては、タイロシン生合成遺伝子（Ｍｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓ，　Ｌ．　Ａ．　ａｎｄ　Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，　Ｅ．，　Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１３，　３４９　（１９９４）；　Ｇａｎｄｅｃｈａ，　Ａ．　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ，　１８４，　１９７　（１９９７）；　Ｗｉｌｓｏｎ，　Ｖ．　Ｔ．　ａｎｄ　Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，　Ｅ．，　Ｇｅｎｅ，　２１４，　９５　（１９９８）；　Ｆｏｕｃｅｓ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　１４５，　８５５　（１９９９）；　Ｂａｔｅ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　１４６，　１３９（２０００）；　Ｒｅｖｉｅｗ：　Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎｔｏｎｉｅ　Ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，　７９，　２２９　（２００１）；　米国特許第ＵＳ５８７６９９１号、米国特許第ＵＳ５６７２４９７号、米国特許第ＵＳ５１４９６３８号、欧州特許第ＥＰ７９１６５５号、欧州特許第ＥＰ２３８３２３号）、ニダマイシン生合成遺伝子（Ｋａｋａｖａｓ，　Ｓ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７９，　７５１５　（１９９７）；　国際公開第ＷＯ９８／５１６９５号）、エリスロマイシン生合成遺伝子（Ｄｈｉｌｌｏｎ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　３，　１４０５　（１９８９）；　Ｃｏｒｔｅｓ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ，　３４８，　１７６　（１９９０）；　Ｄｏｎａｄｉｏ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２５２，　６７５　（１９９１）；　Ｈａｙｄｏｃｋ，　Ｓ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２３０，　１２０　（１９９１）；　Ｓｔａｓｓｉ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７５，　１８２　（１９９３）；　Ｌｉｎｔｏｎ，　Ｋ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ，　１５３，　３３　（１９９５）；　Ｇａｉｓｓｅｒ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２５６，　２３９　（１９９７）；　Ｓｕｍｍｅｒｓ，　Ｒ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　１４３，　３２５１　（１９９７）；　Ｇａｉｓｓｅｒ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２５８，　７８　（１９９８）；　Ｓａｌａｈ−Ｂｅｙ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２５７，　５４２　（１９９８）；　国際公開第ＷＯ９３／１３６６３号、米国特許第ＵＳ６００４７８７号、米国特許第ＵＳ５８２４５１３号、国際公開第ＷＯ９７／２３６３０号、米国特許第ＵＳ５９９８１９４号）等が単離されている。
【０００６】
マクロライド系抗生物質を生産する微生物において、マクロライド生合成遺伝子の大部分はゲノムの７０−８０　ｋｂの領域中に一緒に集まっていることが多い（Ｄｏｎａｄｉｏ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２５２，　６７５　（１９９１）；　ＭａｃＮｅｉｌ，　Ｄ．　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ，　１１５，　１１９　（１９９２）；　Ｓｃｈｗｅｃｋｅ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　９２，　７８３９　（１９９５））。これらのクラスターの中心には巨大な多機能性タンパク質をコードするＩ型ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）という相同性の高い遺伝子が存在する。
【０００７】
ＰＫＳは通常３〜５個の遺伝子から構成され、そのタンパク質は、イニシエーターモジュール及び幾つかのエクステンダーモジュールからなる複合体を形成する。それらの各々は合成途中のポリケチド鎖に特定のアシル−ＣｏＡ前駆体を付加し、β−ケト基を特異的に修飾する。従って、ポリケチドの構造は、ＰＫＳ中のそれらのモジュールの組成及び順序により決定される。モジュールは幾つかのドメインを含み、それらの各々は特定の機能を果たす。
【０００８】
イニシエーターモジュールは、前駆体のアシル基が結合するアシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）ドメインとＡＣＰドメインへのアシル基の付加を触媒するアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインからなる。このＡＴドメインの特異性の違いにより、そこに付加するアシル−ＣｏＡの種類が決まる。全てのエクステンダーモジュールは、先に存在するポリケチド鎖を新しいアシル−ＡＣＰに脱炭酸縮合により付加するβ−ケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインとＡＴドメイン及びＡＣＰドメインを含有する。
【０００９】
また、エクステンダーモジュールは、これらに加えて特定のβ−ケト基を修飾するドメインの幾つかを含有し、含有するドメインの構成により、β−ケト基の修飾が決まる。これらには、β−ケト基をヒドロキシル基に還元するβ−ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン、ヒドロキシル基を除き、二重結合を生成するデヒドラターゼ（ＤＨ）ドメイン及び二重結合を還元し、飽和した炭素結合を生成するエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメインがある。
【００１０】
最後のエクステンダーモジュールは、ＰＫＳからポリケチドを環化して遊離するチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインにて終わる。ＰＫＳのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、モジュール、ドメインの境界は、既知のＰＫＳ遺伝子の配列情報に基づいて予測することができる。
【００１１】
ＰＫＳにより生成したポリケチド骨格は、メチル化、アシル化、酸化、還元、特有な糖の付加等のさらなる修飾を受け、最終的にマクロライド系抗生物質が合成される。これらの修飾のために必要とされる遺伝子の大部分はＰＫＳ遺伝子の周辺に存在する。
【００１２】
デオキシ糖生合成酵素をコードする遺伝子は、エリスロマイシンやタイロシン等で明らかとなっている（Ｓｕｍｍｅｒｓ，　Ｒ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　１４３，　３２５１　（１９９７）；　Ｇａｉｓｓｅｒ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２５６，　２３９　（１９９７）；　Ｍｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓ，　Ｌ．　Ａ．　ａｎｄ　Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，　Ｅ．，　Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　１３，　３４９　（１９９４））。これらのデオキシ糖の合成は、ヌクレオチド二リン酸の付加によるグルコースの活性化並びにそれに続く脱水、還元、エピ化、アミノ化、メチル化等の反応を含む。それらの糖は特定のグリコシルトランスフェラーゼの作用によりマクロライド中に導入される。
【００１３】
ミデカマイシンの構造はタイロシンの構造に類似しているため、ほぼ同様の生合成経路を通ると推測される。ミデカマイシンの生合成は、ポリケチド骨格の前駆体であるマロニルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、メトキシマロニルＣｏＡの合成に始まる。これらの前駆体はポリケチド合成酵素により、段階的な縮合反応を受け、環化され、結果としてポリケチド骨格が合成される。その後、糖鎖付加、ヒドロキシル化、ホルミル化、アシル化といった修飾反応を経て最終的にミデカマイシンが合成される。
【００１４】
遺伝子組み換えにより生産性を向上させるには、律速反応となっている生合成反応をコードする遺伝子の発現増強、生合成遺伝子の発現を制御する遺伝子の発現増強や遺伝子破壊、不必要な二次代謝系の遮断等が行われている（Ｋｅｎｎｅｄｙ，　Ｊ．　ａｎｄ　Ｔｕｒｎｅｒ，　Ｇ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２５３，　１８９　（１９９６）；　Ｒｅｖｉｅｗ：　Ｂａｌｔｚ，　Ｒ．Ｈ．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｒｅｖｉｓｅｄ　ａｎｄ　Ｅｘｐａｎｄｅｄ，　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ｐｐ．４９　（１９９７）；　Ｒｅｖｉｅｗ：　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，　Ｃ．　Ｒ．　ａｎｄ　Ｃｏｌｏｍｂｏ，　Ａ．　Ｌ．，　Ｊ．　Ｉｎｄ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　２３，　６４７　（１９９９）；　Ｒｅｖｉｅｗ：　Ｂｒａｋｈａｇｅ，　Ａ．　Ａ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｖ．　６２，　５４７　（１９９８））。そのため、生合成遺伝子が特定されれば、適当なベクターに連結し、二次代謝産物の生産菌に導入することにより、遺伝子組換えにより生産性を向上させることができる。
【００１５】
一方、遺伝子組み換えにより新規活性物質を創出するには、ポリケチド合成酵素のドメイン改変（Ｒｅｖｉｅｗ：　池田と大村，　蛋白質核酸酵素，　４３，　１２６５　（１９９８）；　Ｒｅｖｉｅｗ：　Ｃａｒｒｅｒａｓ，　Ｃ．　Ｗ．　ａｎｄ　Ｓａｎｔｉ，　Ｄ．　Ｖ．，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，　９，　４０３　（１９９８）；　Ｒｅｖｉｅｗ：　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，　Ｃ．　Ｒ．，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１，　３１９　（１９９８）；　Ｒｅｖｉｅｗ：　Ｋａｔｚ，　Ｌ．　ａｎｄ　ＭｃＤａｎｉｅｌ，　Ｒ．，　Ｍｅｄ．　Ｒｅｓ．　Ｒｅｖ．，　１９，　５４３　（１９９９）；　国際公開第ＷＯ９３／１３６６３号、国際公開第ＷＯ９５／０８５４８号、国際公開第ＷＯ９６／４０９６８号、国際公開第ＷＯ９８／０１５４６号、国際公開第ＷＯ９８／４９３１５号、国際公開第ＷＯ９８／５１６９５号、国際公開第ＷＯ００／４７７２４号、米国特許第ＵＳ５６７２４９１号、米国特許第ＵＳ５７１２１４６号、米国特許第ＵＳ６３９１５９号）、生合成系遺伝子の破壊、他の生物からの修飾酵素遺伝子の導入（Ｒｅｖｉｅｗ：　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，　Ｃ．　Ｒ．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１２，　３７５　（１９９４））等が行われている。そのため、生合成遺伝子が特定されれば、適当なベクターに連結し、二次代謝産物の生産菌に導入することにより、遺伝子組換えにより新規活性物質を創出することが可能となる。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
ミデカマイシンの生合成に関与する遺伝子としては、ミデカマイシンの自己耐性遺伝子（ｍｄｍＡ；　Ｈａｒａ，　Ｏ．　ａｎｄ　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，　Ｃ．　Ｒ．，　Ｊ．　Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，　４３，　９７７　（１９９０））、３−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ｍｄｍＢ）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｍｄｍＣ；　Ｈａｒａ，　Ｏ．　ａｎｄ　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，　Ｃ．　Ｒ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７４，　５１４１　（１９９２））、４”−Ｏ−プロピオニルトランスフェラーゼ遺伝子（ｍｐｔ；　Ｘｕｌｕｎ，　Ｚ．　ａｎｄ　Ｙｉｇｕａｎｇ，　Ｗ．，　Ａｃｔａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｓｉｃ．，　３６，　４１７　（１９９６））が報告されているが、ミデカマイシンの生合成に関与する他の遺伝子は報告されていない。そのため、残るミデカマシン生合成遺伝子を単離し配列を決定することにより、ミデカマイシンの生産性を向上させることや新規生理活性物質を生産させることが可能なポリヌクレオチドを得ることができる。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の点に臨み、鋭意研究を行った結果、放線菌由来のポリケチド合成酵素遺伝子に相同な配列をプライマーとするポリメラーゼ　チェーン　リアクション（ＰＣＲ）により増幅したストレプトマイセス　マイカロファシエンス由来のＤＮＡ断片をプローブとして用い、ストレプトマイセス　マイカロファシエンスのゲノムＤＮＡから作製したゲノムライブラリーからミデカマイシン生合成遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することに成功した。これにより、ミデカマイシンの生産性を向上させることや新規生理活性物質を生産させることが可能となった。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【００１８】
従って、本発明はミデカマイシン生合成遺伝子、該遺伝子を包含する組換えベクター、該組換えベクターを有する宿主、その宿主を用いたミデカマイシン並びにミデカマイシン以外のマクロライド系化合物誘導体の製造法に関する。
【００１９】
（１）ミデカマイシンの生合成に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該タンパク質が配列番号２〜１０、１３、１４、１６、１９、２０、２２〜２６、２８〜３８から選択されるアミノ酸配列により特定されるか、又は該タンパク質がそのタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている配列番号２〜１０、１３、１４、１６、１９、２０、２２〜２６、２８〜３８から選択されるアミノ酸配列により特定されたポリヌクレオチド。
（２）ポリヌクレオチドがＯＲＦ１〜ＯＲＦ９、ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１３、ＯＲＦ１５、ＯＲＦ１８、ＯＲＦ１９、ＯＲＦ２１〜ＯＲＦ２５、ＯＲＦ２７〜ＯＲＦ３７からなる遺伝子の群から選択され、該遺伝子が配列番号１の塩基２９２４４−４２７７９、４２８２３−４８６５７、４８７１２−５９８０２、５９８５０−６４５５６、６４６８７−７０３６５、７０３６５−７１０７８、７１１１３−７２３６０、７２４００−７３６６５、７３６９４−７５０４３、７８０３９−７９３１３、７９３９１−８１０５２、８２７６０−８３３６２、２７９３７−２８９８３、２６１８０−２７３９１、２４４６０−２５６５０、２３５５５−２４４６３、２２５３４−２３５７１、２１７３３−２２５２７、２０３０７−２１７４３、１７５２２−１８８９５、１５６４３−１７４６６、１４０７４−１５０９６、１３０１６−１４０４４、１１７２９−１２９６１、１０５２１−１１６０３、９３２８−１０４５８、９０１２−９３３５、８１４９−９０１５、６６５３−７９４５、６０４８−６６２９により示される（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）ミデカマイシンＰＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該ドメインが、それぞれ、配列番号２のアミノ酸配列１７−４２２、５２４−８７８、９１９−１００４、１０３１−１４５６、１５６２−１９１６、２１６１−２４４９、２４７５−２５６０、２５８３−３００８、３１２９−３４８３、３４９９−３６９９、４０２２−４３１５、４３３３−４４１８に対応するＫＳ０ｎｕｌｌ、ＡＴ０、ＡＣＰ０、ＫＳ１、ＡＴ１、ＫＲ１、ＡＣＰ１、ＫＳ２、ＡＴ２、ＤＨ２、ＫＲ２、ＡＣＰ２により特定されるか、又は該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている該アミノ酸配列により特定されたポリヌクレオチド。
（４）ポリヌクレオチドが配列番号１の塩基２９２９２−３０５０９、３０８１３−３１８７７、３１９９８−３２２５５、３２３３４−３３６１１、３３９２７−３４９９１、３５７２４−３６５９０、３６６６６−３６９２３、３６９９０−３８２６７、３８６２８−３９６９２、３９７３８−４０３４０、４１３０７−４２１８８、４２２４０−４２４９７よりなる群から選択される（３）に記載のポリヌクレオチド。
（５）ミデカマイシンＰＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該ドメインが、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列３５−４６０、５７７−９２９、９４３−１１６９、１４５７−１７４４、１７５９−１８４４に対応するＫＳ３、ＡＴ３、ＤＨ３、ＫＲ３、ＡＣＰ３により特定されるか、又は該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている該アミノ酸配列により特定されたポリヌクレオチド。
（６）ポリヌクレオチドが配列番号１の塩基４２９２５−４４２０２、４４５５１−４５６０９、４５６４９−４６３２９、４７１９１−４８０５４、４８０９７−４８３５４よりなる群から選択される（５）に記載のポリヌクレオチド。
（７）ミデカマイシンＰＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該ドメインが、それぞれ、配列番号４のアミノ酸配列４２−４６７、５６８−９１６、１１３７−１４０８、１４１７−１５０２、１５２２−１９４８、２０６４−２４１４、２４２６−２６１８、２９３９−３２２９、３２１９−３５０４、３５２０−３６０５に対応するＫＳ４、ＡＴ４、ＫＲ４ｎｕｌｌ、ＡＣＰ４、ＫＳ５、ＡＴ５、ＤＨ５、ＥＲ５、ＫＲ５、ＡＣＰ５により特定されるか、又は該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている該アミノ酸配列により特定されるポリヌクレオチド。
（８）ポリヌクレオチドが配列番号１の塩基４８８３５−５０１１２、５０４１３−５１４５９、５２１２０−５２９３５、５２９６０−５３２１７、５３２７５−５４５５５、５４９０１−５５９５３、５５９８７−５６５６５、５７５２６−５８３９８、５８３６６−５９２２３、５９２６９−５９５２６よりなる群から選択される（７）に記載のポリヌクレオチド。
（９）ミデカマイシンＰＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該ドメインが、それぞれ、配列番号５のアミノ酸配列３４−４５８、５６３−９１４、１１３４−１４１８、１４２７−１５０９に対応するＫＳ６、ＡＴ６、ＫＲ６、ＡＣＰ６により特定されるか、又は該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている該アミノ酸配列により特定されるポリヌクレオチド。
（１０）ポリヌクレオチドが配列番号１の塩基５９９４９−６１２２３、６１５３６−６２５９１、６３２４９−６４１０３、６４１２８−６４３７６よりなる群から選択される（９）に記載のポリヌクレオチド。
（１１）ミデカマイシンＰＫＳドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドであって、該ドメインが、それぞれ、配列番号６のアミノ酸配列３５−４６０、５７６−９２９、１２１７−１５００、１５０４−１５９１、１５８８−１８９２に対応するＫＳ７、ＡＴ７、ＫＲ７、ＡＣＰ７、ＴＥ７により特定されるか、又は該ドメインがそのドメインの機能特性に影響を及ぼさない１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入がなされている該アミノ酸配列により特定されるポリヌクレオチド。
（１２）ポリヌクレオチドが配列番号１の塩基６４７８９−６６０６６、６６４１２−６７４７３、６８３３５−６９１８６、６９１９６−６９４５９、６９４４８−７０３６２よりなる群から選択される（１１）に記載のポリヌクレオチド。
（１３）　（１）〜（１２）のいずれか一項に記載されたポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
（１４）　（１３）に記載された組換えベクターを含んでなる宿主。
（１５）　（１４）に記載された宿主を培養し、得られる培養物からミデカマイシン又はミデカマイシン以外のマクロライド系化合物を採取することを含んでなる、ミデカマイシン又はミデカマイシン以外のマクロライド系化合物の製造法。
（１６）ミデカミシン生合成遺伝子をゲノム中に有する形質転換された微生物であって、ここで、該遺伝子の少なくとも１つがその遺伝子の内部フラグメントとの組換えにより破壊されており、それ以外の遺伝子が機能的であるところの形質転換された微生物。
（１７）　（１６）に記載された形質転換された微生物を培養し、得られる培養物からミデカマイシン以外のマクロライド系化合物を採取することを含んでなる、ミデカマイシン以外のマクロライド系化合物の製造法。
（１８）複数のＰＫＳモジュールを含有する機能的ミデカマイシン生合成遺伝子をゲノム中に有する形質転換された微生物であって、ここで、該遺伝子が、ａ）配列番号１で示されるより少なくとも１つ多い機能的ＰＫＳモジュールを含むか、又は機能的ＰＫＳモジュールが少なくとも１つ少ないか、あるいはｂ）ＫＲ、ＤＨもしくはＥＲドメインの欠失、不活性化もしくは付加により、あるいは、ｃ）異なるカルボン酸を特定するＡＴドメインの置換により、配列番号１で示される対応するモジュールとは異なるＰＫＳモジュールを含む形質転換された微生物。
（１９）　（１８）記載の形質転換された微生物を培養し、得られる培養物からミデカマイシン以外のマクロライド系化合物を採取することを含んでなる、ミデカマイシン以外のマクロライド系化合物の製造方法。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明のミデカマイシン生合成遺伝子は、例えば以下の方法によりストレプトマイセス　マイカロファシエンス（ＡＴＣＣ２１４５４）から単離することができる。また、本発明に開示するように配列が明らかとなっているため、関与する遺伝子は人工的に合成してもよいが、ストレプトマイセス　マイカロファシエンス又はその変異体から得るのが普通である。
【００２１】
ストレプトマイセス　マイカロファシエンスの菌体から、Ｋｉｅｓｅｒ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，　Ｎｏｒｗｉｃｋ，　ＵＫ（２０００）に記載の慣行法によりゲノムＤＮＡを抽出する。このゲノムＤＮＡを適当な制限酵素にて切断後、適当なベクターと連結することにより、ストレプトマイセスマイカロファシエンスのゲノムＤＮＡからなるゲノムライブラリーを作製する。
【００２２】
ベクターとしては、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター等、多様なものが使用できる。
【００２３】
ゲノムライブラリーから、目的のミデカマイシン生合成遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るには、適当なプローブを用いたハイブリダイゼーションにより達成できる。プローブとしては、例えば、既知のポリケチド合成酵素のアミノ酸配列の保存領域を元に、適当なプライマーを合成し、それを用いてストレプトマイセス　マイカロファシエンスのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片を使用することができる。また、本発明に開示するようにミデカマイシン生合成遺伝子の配列が明らかであることから、配列情報を元に適当なプライマーを合成し、ストレプトマイセス　マイカロファシエンスのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片をプローブとして用いることもできる。このようにして得たＤＮＡ断片をプローブとして用い、ゲノムライブラリーのスクリーニングを行う。
【００２４】
また、本発明に開示するようにミデカマイシン生合成遺伝子の配列が明らかであることから、配列情報を基に所望の遺伝子を増幅させるためのプライマーを合成し、ストレプトマイセス　マイカロファシエンスのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することにより単離することができる。さらに、本発明のＤＮＡ断片は、コスミドベクターと連結した形態で、ｐＣＯＭＷ１、ｐＣＯＭＷ２、ｐＣＯＭＷ４に含まれ（第２図）、これをＰＣＲの鋳型として用いることもできる。さらに。これらの寄託されたコスミドベクターから、適当な制限酵素にて所望のＤＮＡ断片を切出して用いることも可能である。
【００２５】
微生物の寄託
ｐＣＯＭＷ１で形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）は、平成１４（２００２）年７月１６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３５である。
ｐＣＯＭＷ２で形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）は、平成１４（２００２）年７月１６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３６である。
ｐＣＯＭＷ４で形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）は、平成１４（２００２）年７月１６日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３７である。
【００２６】
このようにして、ストレプトマイセス　マイカロファシエンスのポリケチド合成酵素遺伝子、及びその周辺領域を単離することができる。単離したＤＮＡ断片は、必要に応じて慣行法により塩基配列を決定することができる。本発明の遺伝子は、遺伝子工学の慣行法（例えば部位指定変異等）を用いて本遺伝子に、付加、挿入、欠失又は置換等の改変を行ったＤＮＡ断片も本発明に包含される。塩基配列が決定されれば、遺伝子解析ソフトウェア等を用いた各遺伝子の位置の予測、及び遺伝子配列データベースを用いた相同性検索の結果から、ミデカマイシンの生合成経路を予測することができる。
【００２７】
さらに単離したＤＮＡ断片が、ミデカマシシン生合成遺伝子を含むか否かを確認するには、標的遺伝子の内部フラグメントを含有するベクター、又は、標的遺伝子の内部を分断する形で選択マーカー遺伝子を挿入したベクターを組込むことにより、相同組換えを誘発し、特定の遺伝子が破壊された株を作製する。この遺伝子破壊株が培養時にミデカマイシンを生産しないことを調べれば良い。ミデカマイシンは、適当な有機溶媒で培養液から抽出し、抽出液をＨＰＬＣで分析することにより検出できる。また、ミデカマイシン感受性の細菌に培養液を処理し、細菌の生育を調べることでも検出できる。
【００２８】
単離したＤＮＡ断片を、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）に記載の遺伝子組換え技術の慣行法を用い、目的に応じて適当な形態に修飾して、遺伝子導入用のベクターを作製することができる。
【００２９】
ミデカマイシン生合成遺伝子が明らかとなれば、ミデカマイシン生合成に関与するある種の遺伝子、例えばポリケチド合成酵素遺伝子の一部が、遺伝子組換えの技術により特異的に変えられている遺伝子、又は他の生物からの遺伝子の対応する部分で置換えられている遺伝子を有するストレプトマイセス　マイカロファシエンスを作製することにより、ミデカマイシン以外のマクロライド系化合物を合成できるはずである。
【００３０】
これは、ミデカマイシン生合成遺伝子の単一の又は複数の遺伝子を導入したストレプトマイセス　マイカロファシエンス以外の宿主においても実施可能である。ある種の遺伝子の一部が、他の生物からの遺伝子の対応する部分で置換えられている遺伝子を有する組換え体を作製するには、標的領域に隣接する塩基配列の間に新規フラグメントを有するベクターを導入して、二回の相同組換えを行い、標的領域を置換することにより、そのような株を作製することができる。このようにして作製したハイブリッド遺伝子は、新規な酵素反応を行う改変された機能を有するタンパク質を生産する。
【００３１】
この改変は、例えば元のＡＴドメインを基質特異性の異なるＡＴドメインと置換えたり、ＡＴドメインの基質特異性に関与するアミノ酸残基を目的とする基質と結合できるようなアミノ酸残基に対応する塩基配列の変異を導入することにより達成できる。
【００３２】
さらに、ＫＲ、ＤＨ、又はＥＲ等のドメインの機能に必須なアミノ酸を別のアミノ酸と置換して、ＫＲ、ＤＨ、又はＥＲの機能を欠失させることも考えられる。これにより、ミデカマイシン以外のマクロライド系化合物が組換え体の培養時に蓄積する。
【００３３】
ここで、本発明でいう「１つ若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加若しくは挿入」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないことを前提とし、その対象となるアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜４個、最も好ましくは１個である。
【００３４】
「置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように、１若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００３５】
また、ミデカマイシンのポリケチド合成酵素のＫＳ１ドメインの機能を欠損させ、外部から所望のＮ−アセチルシステアミンチオエステル誘導体を添加して、ミデカマイシン以外のマクロライド系化合物を合成することができる。
【００３６】
この手法は、例えばエリスロマイシンの誘導体を作製する際に用いられている（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，　Ｊ．　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２７７，　３６７　（１９９７））。ＫＳ１ドメインの機能を欠損させるには、ＫＳの機能に必須なアミノ酸を別のアミノ酸と置換えた塩基配列を有するベクターを導入し、二回の相同組換えを行い、標的領域を置換することにより、そのような株を作製することができるはずである。これにより、外部から所望のＮ−アセチルシステアミンチオエステル誘導体を添加することにより、ミデカマイシン以外のマクロライド系化合物が組換え体の培養時に蓄積する。
【００３７】
ミデカマイシン生合成遺伝子のある種の遺伝子が破壊されているストレプトマイセス　マイカロファシエンスの組換え体により特定の中間体又はその天然の誘導体を合成することができる。標的遺伝子の内部フラグメントを含有するベクター、又は、標的遺伝子の内部を分断する形で選択マーカー遺伝子を挿入したベクターを組込むことにより、相同組換えを誘発し、特定の遺伝子が破壊された株を作製することができる。これにより、この遺伝子のコードするタンパク質の基質又はそのいくつかの天然の誘導体がこの遺伝子破壊株の培養時に蓄積する。
【００３８】
ミデカマイシン生合成遺伝子のある種の遺伝子をストレプトマイセス　マイカロファシエンス以外のマクロライド系化合物生産菌に導入することにより、新規なマクロライド系化合物を合成することができる。目的遺伝子が対象微生物で発現するように、適当なプロモーター及びターミネーターと連結したベクターを対象微生物に導入することで、この遺伝子のコードするタンパク質の触媒作用により、ミデカマイシンで見られる置換基が付加したミデカマイシン以外のマクロライド系化合物が、この組換え体の培養時に蓄積する。
【００３９】
具体的には、ＯＲＦ１８が、１６員環マクロライド系化合物の９位のレダクターゼとして、ＯＲＦ１９が１６員環マクロライド系化合物の１９位のオキシゲナーゼとして、ＯＲＦ８がマイカミノシルトランスフェラーゼとして、ＯＲＦ３６がマイカロシルトランスフェラーゼとして利用できる。
【００４０】
使用するベクターは、宿主の種類に応じて決定され、特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌のベクターとしてｐＢＲ３２２系、ｐＵＣ系ベクター、枯草菌のベクターとして、ｐＵＢ１１０系、ｐＰＬ６０３系、ｐＣ１９４系ベクター、酵母のベクターとしてｐＹＣ系、ｐＹＥ系ベクター、放線菌のベクターとしてｐＩＪ１０１系、ｐＳＥＴ１５２系、ｐＳＧ５系、ＳＣＰ２＊系、ｐＳＡＭ２系、ｐＫＣ１１３９系、φＣ３１系ベクター（Ｋｉｅｓｅｒ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，　Ｎｏｒｗｉｃｋ，　ＵＫ　（２０００））が挙げられる。
【００４１】
次に得られたプラスミドによって宿主に遺伝子導入する。宿主は、用いるベクターの種類に応じて、放線菌、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、その他の微生物の中から適宜選択されてよい。
【００４２】
ベクターが放線菌用である場合の宿主として、特に好ましい例としては、ストレプトマイセス　マイカロファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス　セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス　ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトマイセスフラディエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ）、ストレプトマイセス　リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス　キタサトエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス　アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス　サーモトレランス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）が挙げられる。
【００４３】
ベクターを宿主菌に導入する方法としては、宿主やベクターの種類によって最も効率のよい方法が選択される。放線菌のベクターを使用する場合は、大腸菌との接合による伝達、放線菌ファージによる感染、宿主菌のプロトプラストへの導入等が実施できる（Ｋｉｅｓｅｒ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，　Ｎｏｒｗｉｃｋ，　ＵＫ　（２０００））。形質転換によって得られた組換え体の選別には、用いるベクターの保有する遺伝的指標、例えば、抗生物質耐性、ポック形成、メラニン生合成等が利用できる。
【００４４】
得られた組換え体を慣行の方法により、培養し、新たに獲得した性質を調べることができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としてはグルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸（リン酸水素２カリウム等）、硫酸（硫酸マグネシウム等）及びその他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（ＤＬ−アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、ミデカマイシン又はミデカマイシン以外のマクロライド系化合物の生産を促進するような有機物及び無機物を適当に添加することができる。
【００４５】
培地のｐＨは、例えばｐＨ５．５〜ｐＨ８程度である。培養法としては、好気的条件での固体培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法又は深部好気培養法により行うことができるが、特に深部好気培養法が最も適している。培養に適当な温度は、１５℃〜４０℃であるが、多くの場合２２℃〜３０℃付近で生育する。ミデカマイシン又はミデカマイシン以外のマクロライド系化合物の生産は、培地及び培養条件、又は使用した宿主により異なるが、いずれの培養法においても通常２日〜１０日間でその蓄積が最高に達する。培養中のミデカマイシン又はミデカマイシン以外のマクロライド系化合物の量が最高になった時に培養を停止し、培養物から目的物質を単離、精製する。
【００４６】
培養物からミデカマイシン又はミデカマイシン以外のマクロライド系化合物を採取するためには、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着又は分配カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法、結晶化法等を単独で、又は適宜組み合わせて抽出精製することができる。例えば、培養物中からはアセトン、メタノール、ブタノール、酢酸エチル、酢酸ブチル等で抽出される。
【００４７】
ミデカマイシン又はミデカマイシン以外のマクロライド系化合物をさらに精製するには、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤、セファデックス　ＬＨ−２０（ファルマシア社製）、又はトヨパールＨＷ−４０（東ソー社製）等を用いるクロマトグラフィーを行うと良い。
【００４８】
以上のような方法により、又はこれらを適宜組み合わせることにより、純粋なミデカマイシン又はミデカマイシン以外のマクロライド系化合物が得られる。
【００４９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００５０】
ゲノムＤＮＡの単離とゲノムライブラリーの作製
ストレプトマイセス　マイカロファシエンス（ＡＴＣＣ２１４５４）の凍結シードを５０　ｍｌのＳ＃１４培地（２％グルコース、１％ポリペプトン、０．０５％　Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％　ＭｇＳＯ４　７Ｈ２Ｏ、０．３％　ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に植菌し、２８℃にて２０時間培養した。Ｂｏｔｔｌｅ　ｔｏｐ　ｆｉｌｔｅｒ　０．２２μｍ（コーニング社製）を用いて、培養液をろ過した後、フィルター上の菌体を１０　ｍＭ　ＥＤＴＡにより２回洗浄し、菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素で凍結後、乳鉢と乳棒を用いて磨砕した。この磨砕した菌体からＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）により、添付のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを単離した。
【００５１】
単離したゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩにより部分分解した後、その末端を脱リン酸化した。このＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩとＸｂａＩ（ＸｂａＩ部位のみ脱リン酸化）で切断したＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（ストラタジーン社製）に連結し、組換えコスミドベクターを作製した。この組換えコスミドベクターについて、ＭａｘＰｌａｘ　パッケージング　イクストラックト（エピセンター　テクノロジーズ社製）により、添付のプロトコールに従ってインビトロパッケージングを行った。その後、この組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲ株に感染させ、プレートにて培養しコロニーを形成させた。
【００５２】
プローブの作製
ＰＫＳ遺伝子の保存領域から以下のプライマーを作製した。
ＫＳ−Ｆ：５’−ＣＧＧＴＳＡＡＧＴＣＳＡＡＣＡＴＣＧＧ−３’　　（配列番号４４）
ＫＳ−Ｒ：５’−ＧＣＲＡＴＣＴＣＲＣＣＣＴＧＣＧＡＲＴＧ−３’　（配列番号４５）
ＫＳ−Ｆ及びＫＳ−Ｒを使用し、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＥｘＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて実施した。増幅したＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ　ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクターに挿入した。
【００５３】
挿入ＤＮＡ断片のシークエンスは、ＤＮＡシークエンシングキット　ｄローダミン　ターミネーター　サイクルシークエンシング　レディーリアクション（パーキンエルマー社製）とＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　ジェネティックアナライザー（パーキンエルマー社製）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。これにより、単離したＤＮＡ断片がＰＫＳ遺伝子の一部であることを確認した。
【００５４】
コスミドライブラリーのスクリーニング
ミデカマイシンＰＫＳ遺伝子の一部を含むプラスミドを鋳型とし、プライマーＫＳ−ＦとＫＳ−Ｒを使用したＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、ハイブリダイゼーションのプローブとして使用した。
【００５５】
ゲノムライブラリーのコロニーを形成させたプレート上に、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を載せ、コロニーを付着させた。このメンブレンをアルカリ処理し、溶菌と共にメンブレン上の組換えコスミドＤＮＡを１本鎖に変性しメンブレンに吸着させた。メンブレン上の陽性クローンの検出はＥＣＬダイレクト　ヌクレイックアシッド　ラベリング　アンド　ディテクションシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、添付のプロトコールに従って行った。このようにしてプローブに相同な領域を含むコスミドクローンｐＣＯＭＷ１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３５）、ｐＣＯＭＷ２（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３６）を単離した。部分的に解析したｐＣＯＭＷ１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３５）の末端の配列からＰＣＲにより新たにプローブを作製した。このプローブを用いて、再度ゲノムライブラリーのスクリーニングを行い、ｐＣＯＭＷ４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３７）を単離した。
【００５６】
塩基配列の決定
ｐＣＯＭＷ１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３５）、ｐＣＯＭＷ２（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３６）を、ＨａｅＩＩＩで部分分解した後、電気泳動により約２　ｋｂの断片を精製し、ＳｍａＩで切断したｐＵＣ１９と連結した。このプラスミドを大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅに導入し、任意のコロニーからプラスミドを抽出し、−２１Ｍ１３フォワードプライマー及びＭ１３リバースプライマーをプライマーとして用い、ＡＢＩ３７００（パーキンエルマー社製）により、添付のプロトコールに従い、シークエンスを行った。得られた結果から、解析が不十分な領域については、解析済みの塩基配列を元に新たなプライマーを設計してシークエンスを行った。さらにこの解析結果を元に、プライマーウォーキングにより、ｐＣＯＭＷ４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３７）の部分配列を決定した。各コスミドクローンの位置を第２図に示す。
【００５７】
塩基配列の解析
ＯＲＦの予測はＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア　ディベロップメント社製）に付属のフレーム　アナリシスにより行い、各ＯＲＦの機能はＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５，　４０３　（１９９０））により公共のデータベースを検索し予測した。各ＯＲＦの位置を第３図及び第１表に示した。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
また、各ＯＲＦの予測される機能を第２表に示した。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
さらに、機能から推測されるミデカマイシンの生合成経路を第４図〜第７図に記載した。
【００６２】
ミデカマイシンのポリケチド骨格前駆体であるメトキシマロニル−ＡＣＰに関しては、その生合成に必要な遺伝子（Ｗｕ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ，　２５１，　８１　（２０００））が全て存在していた（第４図）。エチルマロニル−ＣｏＡに関しては、その生合成系にＯＲＦ９（クロトニルＣｏＡレダクターゼ）を当てはめることができたが、その他の遺伝子は見出せなかった（第４図）。
【００６３】
ミデカマイシンポリケチド骨格の生合成には、ＯＲＦ１〜ＯＲＦ５（ＰＫＳ）、ＯＲＦ２４（タイプＩＩチオエステラーゼ）が関与すると考えられた（第５図）。ＯＲＦ１〜ＯＲＦ５内のモジュール及びドメインの位置を第８図及び第３表〜第７表に示す。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
【表４】
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【００６６】
【表５】
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【００６７】
【表６】
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【００６８】
【表７】
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【００６９】
ミデカマイシンＰＫＳ遺伝子のＯＲＦ１のＮ末端近傍には、１６員環マクロライド系化合物のＰＫＳ遺伝子に共通の特徴である機能しないＫＳ領域が存在していた（第３表、第８図）。これはＫＳ領域中の高度保存領域ＴＶＤＴＧＣＳＳＳＬＶ（配列番号４６）のＣがＱに置換しているためである（Ａｐａｒｉｃｉｏ，　Ｊ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ，　１６９，　９　（１９９６））。
【００７０】
また、ＯＲＦ３のモジュール４内のＫＲも機能していないと推測された（第５表、第８図）。これは、ＫＲ中の保存領域ＧＸＧＸＸＧＸＸＸＡ（配列番号４７）がＤＸＴＸＸＰＸＸＸＶ（配列番号４８）に変化しているためである（Ｋａｋａｖａｓ，　Ｓ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７９，　７５１５　（１９９７））。
【００７１】
マイカロースとマイカミノースの生合成経路に関しては、グルコース−１−リン酸からｄＴＤＰ−マイカロース及びｄＴＤＰ−マイカミノースに至る遺伝子が全て存在していた（第６図）。
【００７２】
ミデカマイシンポリケチド骨格の修飾に関わる遺伝子としては、マイカロースとマイカミノースのポリケチド骨格への結合に関与するグリコシルトランスフェラーゼ（ＯＲＦ８，　ＯＲＦ３６）、３位と４”位のアシルトランスフェラーゼ（ＯＲＦ１１、ＯＲＦ２６）、９位のレダクターゼ（ＯＲＦ１８）、１９位のオキシゲナーゼ（ＯＲＦ１９）といった全ての遺伝子が存在していた。
【００７３】
単離したＤＮＡ断片の各ＯＲＦの機能を確認するには、各ＯＲＦの内部フラグメントを含有するベクター、又は、各ＯＲＦの内部を分断する形で選択マーカー遺伝子を挿入したベクターを組込むことにより、相同組換えを誘発し、各ＯＲＦが破壊された株を作製する。この遺伝子破壊株が培養時に生産するミデカマイシンの中間体を適当な有機溶媒で培養液から抽出し、抽出液をＬＣ−ＭＳ等で分析することにより各ＯＲＦの機能を確認する（Ｗｉｌｓｏｎ，　Ｖ．　Ｔ．　Ｗ．　ａｎｄ　Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，　Ｅ．，　Ｇｅｎｅ，　２１４，　９５　（１９９８）；　Ｂｕｔｌｅｒ，　Ａ．　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．　６，　２８７　（１９９９）；　Ｋａｋａｖａｓ，　Ｓ．　Ｊ．　ｅｔａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７９，　７５１５　（１９９７））。また、各ＯＲＦが発現するように、適当なプロモーター及びターミネーターを有するベクターに連結し、これをストレプトマイセス　マイカロファシエンス以外の宿主微生物に導入する。導入したＯＲＦから予測される基質をこの組換え体の培養時に添加するか、または宿主微生物の内因性の基質を利用し、生産された化合物を適当な有機溶媒で培養液から抽出し、抽出液をＬＣ−ＭＳ等で分析することにより各ＯＲＦの機能を確認する（Ｈａｒａ，　Ｏ．　ａｎｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，　Ｃ．　Ｒ．，　Ｊ．　Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，　４３，　９７７　（１９９０）；　Ｈａｒａ，　Ｏ．　ａｎｄ　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，　Ｃ．　Ｒ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７４，　５１４１　（１９９２））。今回、単離、特定した各ＯＲＦの機能は、これらの手法により確認できる。
【００７４】
【発明の効果】
本発明のミデカマイシン生合成遺伝子は、これらの遺伝子を修飾し、適当なベクターに連結してストレプトマイセス　マイカロファシエンスや他の宿主に導入し、その発現を増強又は抑制、遺伝子中のドメインの機能の欠損、ドメインの置換を行うことにより、ミデカマイシンの生産性を向上させることやミデカマイシン以外のマクロライド系化合物を生産させることが可能である。特にストレプトマイセス　マイカロファシエンスを用いて相同組換えにより特定の遺伝子を破壊する場合は、目的遺伝子との相同性が極めて高い必要があり、他の微生物の相同遺伝子では目的は達せられないため、ストレプトマイセス　マイカロファシエンスの遺伝子が必要である。さらに本遺伝子をＤＮＡプローブとして使用することにより、各種微生物から同様の機能を有する遺伝子をクローニングすることができる。
【００７５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は、ミデカマイシンの構造を示したものである。
【図２】第２図は、各コスミドクローン（ｐＣＯＭＷ１、ｐＣＯＭＷ２、ｐＣＯＭＷ４）の位置を示したものである。
【図３】第３図は、各ＯＲＦの位置を示したものである。
【図４】第４図は、ポリケチド骨格前駆体の生合成経路を示したものである。
【図５】第５図は、ポリケチド骨格の生合成経路を示したものである。
【図６】第６図は、デオキシ糖の生合成経路を示したものである。
【図７】第７図は、ポリケチド骨格の修飾系を示したものである。
【図８】第８図は、ＰＫＳ内の各ドメインの位置を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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