(57)【要約】【課題】カンゾウタケの子実体と同様の有効成分を含む菌糸体を簡易な手段で常時、大量に確保することのできる培養方法を提供することである。【解決手段】炭素源としてコーンスターチを１．０〜５．０重量％含有する液体培地にカンゾウタケの種菌を接種し、液体培地の初発ｐＨ（培養開始時の液体培地のｐＨ値）が３．５〜６．５の範囲、培養温度が１５〜３５℃の範囲で培養するカンゾウタケ菌糸体の培養方法である。【選択図】　　　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源としてコーンスターチを１．０〜５．０重量％含有する液体培地にカンゾウタケの種菌を接種し、これを所定温度で培養することを特徴とするカンゾウタケ菌糸体の培養方法。
【請求項２】
前記液体培地の初発ｐＨが２．５〜６．０の範囲に調整されている請求項１記載のカンゾウタケ菌糸体の培養方法。
【請求項３】
前記液体培地の所定温度が１５〜３５℃の範囲である請求項１記載のカンゾウタケ菌糸体の培養方法。
【請求項４】
前記液体培地には、カゼイン由来のペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス等の有機体窒素、ソイトン、カザミノ酸等のタンパク質分解物、硝酸カリウム、硝酸カルシウム等の硝酸体窒素、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム体窒素の中から選択された１又は２以上の窒素源を含有する請求項１記載のカンゾウタケ菌糸体の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カンゾウタケの菌糸体を人工的に培養する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カンゾウタケ（Ｆｉｓｔｕｌｉｎａ　ｈｅｐａｔｉｃａ）は、温帯域に広く分布し、初夏から梅雨期にかけて、シイの大木の根際に発生するきのこである。傘は扇形から舌状で、表面は赤紅色ないし暗赤褐色、多汁な肉質で切ると血のような赤い汁液がにじみ出る。欧米では「ビーフステーキ菌」の名で知られており、バターで炒めてステーキのように食べられており、またフランスでは「ｌａｎｇｕｅ　ｄｅ　ｂｏｅｕｆ（牛の舌）」と言われ、生のままスライスしてサラダの具などに利用されているが、天然のものは絶対量が少ないために市場には出回っておらず、一般に広く食べられているとは言えない。従来からカンゾウタケの子実体を人工的に栽培する方法も知られている（特開平５−２５２８２８号、特開平７−１６０２３号、特開平７−９５８２０号、特開平７−９５８２１号及び特開平７−９５８２２号を参照）が、年間を通して大量に確保できるまでには至っていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、最近ではカンゾウタケに抗腫瘍効果の高いβ−グルカンが多量に含有されていることが判明し、にわかに注目されるようになってきたが、このβ−グルカンを上述したような子実体から取出す方法ではその量に限りがある。そこで、従来にあっては、カンゾウタケの菌糸体を人工的に培養し、この培養された菌糸体から抗腫瘍性物質を製造する技術が知られている（特公昭５４−２７９１２号参照）。カンゾウタケの菌糸体を培養する方法としては、子実体の組成、又は胞子を適当な寒天培地に移植し、適温で培養した母菌を液体培地に接種して培養する方法が採られ、この液体培地の組成としては通常の培養に用いられる諸栄養が含有された培地が使用されていた。即ち、炭素源としては一般的なブドウ糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖等が使用されていたために、必ずしも菌糸体を常時、大量に確保することができなかった。
【０００４】
そこで、本発明者らは、カンゾウタケの子実体と同様の有効成分を含む菌糸体が、液体培地の中に炭素源としてコーンスターチを含有させることによって飛躍的に得られることを見い出した。即ち、本発明の目的は、カンゾウタケの菌糸体を簡易な手段で常時、大量に確保することのできるカンゾウタケ菌糸体の培養方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明に係るカンゾウタケ菌糸体の培養方法は、炭素源としてコーンスターチを１．０〜５．０重量％含有する液体培地にカンゾウタケの種菌を接種し、これを所定温度で培養することを特徴とするものである。
【０００６】
本発明のコーンスターチは、炭素源として通常使用されるブドウ糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖などに比べて菌糸体の成長に極めて有効に作用し、特に１．０〜５．０重量％を添加したときの成長が著しく大きい。
【０００７】
また、培養時における液体培地の初発ｐＨおよび培養温度が菌糸体の成長速度に大きく関わることから、本発明では上記コーンスターチを炭素源として使用したときの液体培地の初発ｐＨを２．５〜６．０の範囲に調整し、また液体培地の培養温度を１５〜３５℃の範囲、好ましくは２５〜３２℃で培養することで、菌糸体の成長をより促進させている。さらに、本発明では暗期条件の下、好気的雰囲気の中で培養することによって、より菌糸体の成長を促すことができる。
【０００８】
上記の液体培地の中には炭素源の他に窒素源が栄養源として含まれている必要がある。窒素源としてはカゼイン由来のペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス等の有機体窒素、ソイトン、カザミノ酸等のタンパク質分解物、硝酸カリウム、硝酸カルシウム等の硝酸体窒素、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム体窒素が利用可能である。なお、カンゾウタケの子実体からは赤色の色素が得られるが、人工培養して得られる菌糸体も窒素源としてカゼイン由来のペプトン、カザミノ酸を使用したときに、特異的に赤色を呈することが分った。例えば、水の中にコーンスターチとカゼイン由来のペプトンあるいはカザミノ酸を溶かして液体培地を調製し、この液体培地を用いて培養した場合、１５〜３０日程度で赤色の菌糸体が得られた。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。上述したように、カンゾウタケ菌糸体の成長を左右する大きな要因の一つとして液体培地の初発ｐＨがある。本発明では液体培地の初発ｐＨを１規定の塩酸、又は１％水酸化ナトリウムで２．５〜６．０の範囲に調整することで菌糸体の成長を促している。液体培地の初発ｐＨが６．０以上になると菌糸体の成長が遅くなる傾向が見られ、多少酸性側にある方が菌糸体の培養期間を短縮することができる。液体培地の初発ｐＨは培地の配合割合や使用する水のｐＨ等によって大きく変わりうるので、適宜に調整する必要がある。
【００１０】
上記液体培地は、炭素源や窒素源、無機塩類など菌糸体を培養する際の成長に必要な栄養素を含んでいる。また、培地の中にビタミン類やミネラルを適宜含有させることでより効果的となる。炭素源や窒素源は、菌糸体が成長するための必須栄養素であり、その種類や添加濃度などによって成長の違いが見られる。
【００１１】
液体培地に含まれる炭素源としては、コーンスターチが最も有効であり、通常使用されるブドウ糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖などに比べて菌糸体の収量が飛躍的に多くなる。なお、コーンスターチを単独で添加する場合のみならず、上記のブドウ糖や麦芽糖などと一緒に添加することも可能である。
【００１２】
上記コーンスターチの添加量は、液体培地全体の１．０〜５．０重量％、好ましくは１．５〜４．５重量％の範囲である。従来のブドウ糖などに比べて菌糸体の成長が著しく、例えばコーンスターチを２．５重量％添加した時の成長はブドウ糖の約２．５倍である。
【００１３】
一方、上記の液体培地に添加される窒素源としては、カゼイン由来のペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス等の有機体窒素、ソイトン、カザミノ酸等のタンパク質分解物、硝酸カリウム、硝酸カルシウム等の硝酸体窒素、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム体窒素が挙げられる。この中でも、特にカゼイン由来のペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキスが菌糸体の成長に良い結果をもたらし、さらには酵母エキス、麦芽エキスが最も有効である。前記炭素源と同様、一種類のみを添加するのではなく、ポリペプトンと酵母エキスといったように二種類以上を組み合わせて用いることもできる。なお、窒素源の種類によって生産される菌糸体の色素の色が異なってくる。ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、ソイトン、硝酸カリウム、硝酸カルシウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムを使用した場合には菌糸体は白色に近いが、窒素源としてカゼイン由来のペプトンあるいはカザミノ酸を用いた場合には菌糸体赤色に変化する。
【００１４】
また、上記窒素源の添加量も菌糸体の成長速度に影響を与えることから、適正な範囲内で添加する必要がある。本発明では液体培地全体の０．１〜１０％重量、好ましくは０．５〜５．０重量％の範囲である。
【００１５】
上記の炭素源および窒素源の他に、リン酸カリウムやリン酸ナトリウムなどのリン酸塩を液体培地に添加するのが好ましい。このような無機塩類を添加することによって、培養時における菌糸体の分解生成物などによる液体培地の急激なｐＨ変動を抑えることができるからである。
【００１６】
上記の液体培地は、上述の炭素源、窒素源、無機塩類などの所定量を水に分散させたのち、常圧又は高圧殺菌することによって準備することができる。
【００１７】
上述のようにして調製された液体培地に接種されるカンゾウタケの種菌は、継代培養してあるカンゾウタケの保存菌株（ＰＤＡ培地の斜面培地を用いて２週間〜６ヶ月間、約４℃、暗期条件下で保存したもの）の一部をＰＤＡ培地に接種し、室温２５℃において２１日間暗期条件下で平面培養したものが用いられる。接種した後の培養温度は、２５〜３２℃の範囲に保たれることが望ましい。また、培養期間中は暗期条件下で好気的雰囲気が保持されることが望ましい。本発明において用いられるカンゾウタケの種菌は、カンゾウタケ属カンゾウタケ科カンゾウタケに分類されるものである（「原色日本新菌類図鑑」保育社版）。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
実施例１：液体培地の初発ｐＨ効果試験
まず種菌を作る。保存しておいたカンゾウタケの斜面培地培養菌糸体をＰＤＡ培地（ポテトエキス４．０ｇ、ぶどう糖２０．０ｇ、寒天１５．０ｇ、水１Ｌ）（ＤＩＦＣＯ社製）に接種し、室温２５℃において２１日間暗期条件下で平面培養した。これを種菌として用いた。
【００２０】
次に液体培地を作る。カゼイン由来のペプトン０．３％、コーンスターチ１．０％、リン酸カリウム０．１％、リン酸ナトリウム０．１％の培地組成で初発ｐＨ５．０に調整した液体培地を基本培地として作り、初発ｐＨを２．０〜７．５の範囲で０．５間隔に変えて調整し、１００ｍｌリム無し三角フラスコに各７０ｍｌずつ分注したのちオートクレーブ滅菌した。
【００２１】
上述の各液体培地を室温まで放冷した後、種菌を内径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜きそのディスク片を接種した。接種後は室温２５℃、湿度６０％の暗期条件下で往復振とう培養（１００ｒ．ｐ．ｍ．）を行った。
【００２２】
培養を始めてから２１日目に、菌糸体をろ過してから集菌し、６０〜８０℃で送風乾燥して試料とした。
【００２３】
上記集菌した菌糸体の収量を、基本培地の初発ｐＨ５．０で培養した乾燥品の収量を１．０としたときの比計算によって算出した。その結果を図１に示す。
【００２４】
図１に示されるように、初発ｐＨ２．５〜６．０でカンゾウタケ菌糸体に良好な成育がみられ、特に初発ｐＨ３．５〜５．５の範囲では菌糸体の収量増率が大きい。
【００２５】
実施例２：液体培地の培養温度試験
種菌は、上記実施例１と同様、カンゾウタケの斜面培地培養菌糸体をＰＤＡ培地に接種し、これを室温２５℃において２１日間暗期条件下で平面培養したものを用いた。
【００２６】
次に液体培地を作る。カゼイン由来のペプトン０．３％、コーンスターチ１．０％、リン酸カリウム０．１％、リン酸ナトリウム０．１％の培地組成で初発ｐＨ５．０に調整した液体培地を基本培地として作り、これを１００ｍｌリム無し三角フラスコに７０ｍｌずつ分注したのちオートクレーブ滅菌した。
【００２７】
上述の液体培地を室温まで放冷した後、種菌を内径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、そのディスク片を接種した。接種後は室温２５℃を基本として１５〜３５℃を２．０〜５．０℃間隔、湿度６０％の暗期条件下で静置培養を行った。
【００２８】
培養を始めてから２１日目に、菌糸体をろ過してから集菌し、６０〜８０℃で送風乾燥して試料とした。
【００２９】
上記集菌した菌糸体の収量を、基本培地で培養温度３０℃で培養したときの収量を１．０とし、それに対する比計算によって算出した。その結果を図２に示す。
【００３０】
図２に示されるように、培養温度が２５〜３２℃で菌糸体収量が多く、特に２８〜３０℃での収量が極めて多くなっている。
【００３１】
実施例３：液体培地の炭素源の効果試験
種菌は、上記実施例１と同様、カンゾウタケの斜面培地培養菌糸体をＰＤＡ培地に接種し、これを室温２５℃において２１日間暗期条件下で平面培養したものを用いた。
【００３２】
次に液体培地を作る。カゼイン由来のペプトン０．３％、ぶどう糖１．０％、リン酸カリウム０．１％、リン酸ナトリウム０．１％の培地組成で初発ｐＨ５．０に調整した液体培地を基本培地として作った。また、ぶどう糖の代わりに果糖、麦芽糖、乳糖、ショ糖、トレハロース、コーンスターチ、デキストリン、マンニトール、グリセロールを１．０％になるようにそれぞれ添加し、これを１００ｍｌリム無し三角フラスコに７０ｍｌずつ分注したのちオートクレーブ滅菌した。
【００３３】
上述の液体培地を室温まで放冷した後、種菌を内径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、そのディスク片を接種した。接種後は室温２５℃、湿度６０％の暗期条件下で往復振とう培養（１００ｒ．ｐ．ｍ．）を行った。
【００３４】
培養を始めてから２１日目に、菌糸体をろ過してから集菌し、６０〜８０℃で送風乾燥して試料とした。
【００３５】
上記集菌した菌糸体の収量を、基本培地の炭素源としてぶどう糖を用いて培養したときの収量を１．０とし、それに対する比計算によって算出した。その結果を図３に示す。
【００３６】
図３に示されるように、コーンスターチは、他の炭素源に比べて菌糸体の成長が郡を抜いて良好である。
【００３７】
実施例４：コーンスターチの添加濃度試験
上記実施例３において、使用した炭素源のうち菌糸体の成長が極めて良好であったコーンスターチについて、０．０〜５．０重量％の濃度範囲で０．２〜０．５重量％ごとに濃度を変えて、その時の菌糸体の成長を比較した。コーンスターチの適正な濃度範囲を知るために、ぶどう糖についても同一の濃度範囲で菌糸体を培養した。ぶどう糖を使用したときに菌糸体の成長率が最も高い３．５重量％の時の菌糸体収量を１．０とし、それと略同一の菌糸体収量が得られた時のコーンスターチの濃度は１．０重量％であった。コーンスターチの濃度１．０重量％で培養したときの菌糸体収量を１．０とし、その他を成長比で表した。その結果を図４に示す。
【００３８】
図４に示されるように、コーンスターチの添加濃度が１．５〜４．５重量％の幅広い範囲で菌糸体の収量が多く、特に２．５重量％を中心としてその前後で菌糸体収量が極めて多くなっている。
【００３９】
実験例５：液体培地の窒素源の効果試験
種菌は、上記実施例１と同様、カンゾウタケの斜面培地培養菌糸体をＰＤＡ培地に接種し、これを室温２５℃において２１日間暗期条件下で平面培養したものを用いた。
【００４０】
次に液体培地を作る。カゼイン由来のペプトン０．３％、コーンスターチ２．５％、リン酸カリウム０．１％、リン酸ナトリウム０．１％の培地組成で初発ｐＨ５．０に調整した液体培地を基本培地として作った。また、カゼイン由来のペプトンの代わりにポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、カシトン、カザミノ酸、硝酸カリウム、硝酸カルシウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムを０．３％になるように添加し、これを１００ｍｌリム無し三角フラスコに７０ｍｌずつ分注したのちオートクレーブ滅菌した。
【００４１】
上述の液体培地を室温まで放冷した後、種菌を内径４ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、そのディスク片を接種した。接種後は室温２５℃、湿度６０％の暗期条件下で往復振とう培養（１００ｒ．ｐ．ｍ．）を行った。
【００４２】
培養を始めてから２１日目に菌糸体をろ過してから集菌し、６０〜８０℃で送風乾燥して試料とした。
【００４３】
上記集菌した菌糸体の収量を、基本培地で窒素源としてカゼイン由来のペプトンを用いて培養したときの収量を１．０とし、それに対する比計算によって算出した。その結果を図５に示す。
【００４４】
図５に示されるように、窒素源はポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキスなどの有機態窒素で菌糸体収量が多く、特に酵母エキスでの収量が極めて多くなっている。赤色の色素は、カゼイン由来のペプトンおよびカザミノ酸を添加した場合のみ生産された。
【００４５】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によるカンゾウタケ菌糸体の培養方法によれば、炭素源としてコーンスターチを所定範囲内で添加した液体培地を用い、且つ液体培地の初発ｐＨや培養温度を適正な範囲内に調整したので、カンゾウタケの菌糸体を常時大量にしかも短期間に得ることができた。また、窒素源の種類を選択することで、赤色の色素を有する菌糸体を得ることができるといった効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】液体培地の初発ｐＨの違いによる菌糸体の成長比を示すグラフである。
【図２】培養温度の違いによる菌糸体の成長比を示すグラフである。
【図３】炭素源の種類の違いによる菌糸体の成長比を示すグラフである。
【図４】コーンスターチの濃度の違いによる菌糸体の成長比を示すグラフである。
【図５】窒素源の種類の違いによる菌糸体の成長比を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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