(57)【要約】      （修正有）【課題】  糖尿病の病態やその改善、特にβ細胞機能不全改善の指標となる遺伝子を見出し、該遺伝子やその産物を利用することにより、インスリン抵抗性治療薬やインスリン分泌促進剤等のβ細胞機能不全改善剤の新規な評価方法を提供する。あるいは、被験者のβ細胞機能不全の新規な評価方法を提供する。【解決手段】  被験物質の投与条件下における、検体中の、特定のの塩基配列で示される遺伝子、またはその産物の発現量を指標として、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果、あるいは被験者のβ細胞機能不全を評価する方法、および該方法のためのプライマー、プローブ等を含むキット。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の投与条件下における、検体中の、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子またはその産物（配列番号９〜１６）の発現量を指標として、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する方法。
【請求項２】
評価が、被験物質の投与条件下における、検体中の、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子またはその産物（配列番号９〜１６）の発現量と、非投与条件下における当該発現量との相違に基づいて行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
下記の工程を含む、被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する方法：
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する；
２）上記動物の血液または細胞中における、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子の発現量を検出する；
３）被験物質の投与および非投与条件下における、上記遺伝子の発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【請求項４】
前記方法において、さらに、血液または細胞中より全ＲＮＡを抽出する工程を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
遺伝子の発現量が、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、およびメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出されることを特徴とする、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
遺伝子の発現量が、ＲＴ-ＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ法によって検出されることを特徴とする、請求項３または４記載の方法。
【請求項７】
下記の工程を含む、被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する方法：
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する；
２）上記動物の血液または細胞中における、配列番号９〜１６のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパクを、該タンパクに特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）被験物質の投与および非投与条件下における、上記タンパクの発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【請求項８】
タンパクの発現量が、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出されることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
タンパクの発現量が、ウェスタンブロット法によって検出されることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
細胞が膵ランゲルハンス氏島β細胞である、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
動物が２型糖尿病モデル動物である、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
動物がマウスである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
下記の工程を含む、被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する方法：
１）細胞を被検物質の添加または非添加条件下で培養する；
２）上記細胞中の配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子の発現量を検出するか、または、その産物であるタンパク（配列番号９〜１６）の発現量を該タンパクに特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）被検物質の添加および非添加条件下における、上記遺伝子またはタンパクの発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【請求項１４】
β細胞機能不全改善効果が、インスリン抵抗性改善効果に基づくものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
被験者より単離された血液中における、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子のヒトオーソログ産物の発現量を測定することにより、該被験者のβ細胞機能不全を評価する方法。
【請求項１６】
タンパクの発現量が、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出されることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
タンパクの発現量が、ウェスタンブロット法によって検出されることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
下記のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる、少なくとも一つ以上を含む、β細胞機能不全改善効果またはβ細胞機能不全の評価用キット。
ａ）配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号９〜１６のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパクに特異的に結合し、該タンパクを検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病におけるβ細胞機能不全改善の指標となる遺伝子またはその産物を利用したβ細胞機能不全改善剤あるいはβ細胞機能不全の評価のための方法、ならびに該方法のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本では糖尿病患者が急増しており、その数は７００万人にのぼると推定され、糖尿病は高血圧症に次いで頻度の高い疾患となっている。特に、日本人の糖尿病患者の９５％は２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）であり、早期発見、早期治療がその予後の点から重要である。
【０００３】
２型糖尿病は、遺伝的素因や環境因子等、多様な成因により発症する。２型糖尿病におけるインスリン作用不足の原因としては、インスリン感受性機構の異常（インスリン抵抗性）とインスリン分泌の低下が挙げられる。欧米では多くは前者、すなわちインスリン抵抗性が２型糖尿病の主な原因であるが、日本ではインスリン分泌不全が主な原因である場合も少なくない。
【０００４】
膵臓は外分泌系細胞（アミラーゼやリパーゼ等の外分泌酵素を産生する）と内分泌系細胞（インスリン、グルカゴン等を産生する）から構成され、後者は、α細胞（グルカゴンを産生）、β細胞（インスリンを産生）等からなるランゲルハンス氏島とよばれる組織を形成する。このうちβ細胞はランゲルハンス氏島細胞の約90％を占め、インスリンを合成・分泌することにより血糖値を低下させる働きを有しているため、その機能不全はインスリン産生の低下およびインスリン分泌の低下をもたらし、糖尿病を発症させる。
【０００５】
１型糖尿病では、β細胞が免疫系により完全に破壊されて、インスリン産生細胞が欠乏するため、インスリン代償療法が治療に用いられる。一方、２型糖尿病では、グルコース取り込みに対して標的組織がインスリン抵抗性を示すことにより、β細胞の機能が低下し、やがてβ細胞機能不全を生じる。
【０００６】
ところで、β細胞におけるインスリンの分泌は、血中のグルコースが刺激となって生じる。グルコースは、β細胞の膜上に局在するグルコーストランスポーター(GLUT2)を介して細胞内に取り込まれ、グルコキナーゼにより解糖系へ導入される。そして、このグルコースの代謝過程で産生されたATPがβ細胞におけるインスリン分泌シグナルとして機能する。
【０００７】
1984年にCookらにより発見されたATP感受性カリウムチャンネル（KATP）は（例えば、非特許文献１参照）、グルコース代謝により産生された細胞内ATPの濃度増加によって閉鎖し、細胞膜の脱分極を引き起こす。これに引き続いて電位依存性カルシウムチャンネルが開口し、β細胞内へのカルシウムイオンの流入が起こる。細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇は、カルシウム依存性のインスリン分泌開口放出反応を活性化する（例えば、非特許文献２参照）。
【０００８】
インスリン分泌を促進する２型糖尿病の治療薬としては、従来よりスルホニル尿素剤が広く用いられている。この薬剤は、β細胞のKATPチャンネルを閉鎖することによりインスリン分泌を促進するが、血糖値とは無関係にインスリン産生や分泌を促進するという欠点がある。そのため、この種の薬剤では、低血糖に注意しながら食物摂取量を制御しなければならない。
【０００９】
これに対し、現在新たな２型糖尿病薬としてGlucagon-like peptide-1 (GLP-1) が開発されつつある。GLP-1は、腸管で preproglucagon から翻訳後修飾により産生されるアミノ酸であるが、スルホニル尿素剤とは異なり、血糖値依存的にインスリン分泌を促進することが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。GLP-1は、インスリン分泌を促進するだけでなく、グルカゴンの放出を阻害することによっても、血糖値の正常化を促進する。さらに、GLP-1は、ヘキソキナーゼの遺伝子発現を促進し、インスリンの生合成を増大させることも報告されている（例えば、非特許文献４参照）。
【００１０】
現在のところ、インスリン分泌を促進する薬剤としては、上述したスルホニル尿素およびGLP-1以外には有効な薬剤はない。そのため、２型糖尿病患者のβ細胞機能不全に対する新たな治療薬の開発が望まれている。
【００１１】
一方、インスリン感受性機構を正常化する２型糖尿病の治療薬として、インスリン抵抗性改善剤が開発されてきている。「インスリン抵抗性改善剤」は、インスリン受容体のシグナル伝達を司るチロシンキナーゼの活性を増強することにより、インスリン作用の感受性を高めて、インスリンの作用不足を補い、インスリン抵抗性を改善する薬剤である。そのようなインスリン抵抗性改善剤としては、例えば、トログリタゾン（例えば、特許文献１参照）、ピオグリタゾン（例えば、特許文献２〜４参照）、ロシグリタゾン（例えば、特許文献５〜７参照）、ＧＩ−２６２５７０（例えば、特許文献８参照）、ＪＴＴ−５０１（例えば、特許文献９〜１１参照）、ＡＺ−２４２（例えば、特許文献１２〜１４参照）、ＭＣＣ−５５５（例えば、特許文献１５〜１７参照）、ＹＭ−４４０（例えば、特許文献１８〜２０参照）、ＫＲＰ−２９７（例えば、特許文献２１および２２参照）、Ｔ−１７４（例えば、特許文献２３〜２５参照）、ＮＣ−２１００（例えば、特許文献２６〜２８参照）、ＮＮ−６２２（例えば、特許文献２９および３０参照）、ＢＭＳ−２９８５８５（例えば、特許文献３１参照）のようなオキサゾール化合物、オキサジアゾリジン化合物、チアゾリジン化合物またはフェノキサジン化合物等を挙げることができる。
【００１２】
上記のインスリン抵抗性改善剤のうち、トログリタゾン、ロジグリタゾン、およびピオグリタゾンのようなチアゾリジン誘導体は既に臨床の場で用いられている（例えば、非特許文献５〜７、および特許文献３２参照）。これらは、基本構造としてチアゾリジン環骨格を有することを特徴としており、核内レセプターであるＰＰＡＲγを標的分子とし、肝臓、筋肉、および脂肪細胞における遺伝子発現を変化させることにより、２型糖尿病患者のインスリン抵抗性を改善すると考えられている。
【００１３】
近年、分子生物学の進歩により、ディファレンシャル・ディスプレイ法やマイクロアレイ法を用いて、迅速かつ網羅的な遺伝子の発現解析が可能になってきた。２型糖尿病患者のβ細胞機能不全に対する新たな治療薬の開発には、その標的となる遺伝子の同定が必要である。しかしながら、膵β細胞については、培養細胞株を用いて、β細胞の特性や機能に関わる遺伝子の発現解析は行われているものの、糖尿病の発症や改善に関連した遺伝子の網羅的な解析は行われていない。
【００１４】
【特許文献１】特開昭６０−０５１１８９号公報
【特許文献２】特開昭６１−２６７５８０号公報
【特許文献３】欧州特許第１９３，２５６号明細書
【特許文献４】米国特許第４，６８７，７７７号明細書
【特許文献５】特表平９−５１２２４９号公報
【特許文献６】国際公開第９５／２１６０８号パンフレット
【特許文献７】米国特許第５，００２，９５３号明細書
【特許文献８】国際公開第００／８００２号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９５／１８１２５号パンフレット
【特許文献１０】欧州公開第６８４，２４２号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，７２８，７２０号明細書
【特許文献１２】国際公開第９９／６２８７２号明細書
【特許文献１３】欧州特許出願公開第１，０８４，１０３号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，２５８，８５０号明細書
【特許文献１５】特開平６−２４７９４５号公報
【特許文献１６】欧州特許出願公開第６０４，９８３号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，５９４，０１６号明細書
【特許文献１８】国際公開第９４／２５４４８号パンフレット
【特許文献１９】欧州特許第６９６，５８５号明細書
【特許文献２０】米国特許第５，６４３，９３１号明細書
【特許文献２１】特開平１０−８７６４１号公報
【特許文献２２】米国特許５，９４８，８０３号明細書
【特許文献２３】特開昭６４−５６６７５号公報
【特許文献２４】欧州特許第２８３０３５号明細書
【特許文献２５】米国特許第４，８９７，３９３号明細書
【特許文献２６】特開平９−１００２８０号公報
【特許文献２７】欧州特許出願公開第７８７７２５号明細書
【特許文献２８】米国特許第５，６９３，６５１号明細書
【特許文献２９】国際公開第９９／１９３１３号パンフレット
【特許文献３０】米国特許６，０５４，４５３号明細書
【特許文献３１】国際公開第０１／２１６０２号パンフレット
【特許文献３２】特開昭６０−０５１１８９号公報
【非特許文献１】「ネイチャー（Nature）」 (1984) 311, p271-273
【非特許文献２】「フィジオロジー  レビュー（Physiological Revue）」 (1981) 61, p914-973
【非特許文献３】「ダイアベティース（Diabetes）」(1994) Apr., 43(4):535-9
【非特許文献４】「エンドクリノロジー (Endocrinology)」 (1995) Nov;136(11), p4910-7
【非特許文献５】「ライフ・サイエンス (Life Science)」 (2000) 67, p2405-2416
【非特許文献６】「日本臨床」 (2000) 58, p389-404
【非特許文献７】「ファーマコセラピー (Pharmacotherapy)」 (2001) 21, p1082-1099
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、糖尿病の病態やその改善、特にβ細胞機能不全の改善に関与する遺伝子を特定し、これを利用した糖尿病治療薬または糖尿病の評価系や、該評価系のためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、糖尿病患者の膵ランゲルハンス氏島細胞で発現が増加しており、糖尿病治療薬の投与によってその発現量が正常化される遺伝子は、糖尿病の病態やその改善の指標になりうると考えた。そしてこれら遺伝子やその産物の発現量を解析することにより、糖尿病の病態やその改善の評価が可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
すなわち、本発明は、被験物質の投与条件下における、検体中の、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子またはその産物（配列番号９〜１６）の発現量を指標として、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する方法を提供する。
【００１８】
上記方法において、評価は、被験物質の投与および非投与条件下における、前記遺伝子またはその産物の発現量の相違を比較評価するものであってもよい。
【００１９】
一つの実施態様［Ｉ］において、本発明の方法は下記の工程を含む。
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する；
２）上記動物の血液または細胞中における、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子の発現量を検出する；
３）被験物質の投与および非投与条件下における、上記遺伝子の発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【００２０】
ここで、前記工程２）は、さらに、血液または細胞中より全ＲＮＡを抽出する工程を含み、この全ＲＮＡより遺伝子の発現量を検出してもよい。
【００２１】
前記遺伝子の発現量は、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、およびメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出することができ、特にＲＴ-ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。
【００２２】
また、別な実施態様［II］において、本発明の方法は下記の工程を含む。
１）動物を被験物質の投与または非投与条件下で飼育する；
２）上記動物の血液または細胞中における、配列番号９〜１６のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパクを、該タンパクに特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）被験物質の投与および非投与条件下における、上記タンパクの発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【００２３】
ここで、前記タンパクの発現量は、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出することができ、特にウェスタンブロット法が好ましい。
【００２４】
前記態様［Ｉ］および態様［II］において、細胞は膵ランゲルハンス氏島β細胞を用いることが好ましい。
また、動物は２型糖尿病モデル動物、特に２型糖尿病モデルマウスを用いることが好ましい。
【００２５】
さらに、別な実施態様［III］において、本発明の方法は下記の工程を含む。
１）細胞を被検物質の添加または非添加条件下で培養する；
２）上記細胞中の配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子の発現量を検出するか、または、その産物であるタンパク（配列番号９〜１６）の発現量を該タンパクに特異的に結合する抗体を用いて検出する；
３）被検物質の添加および非添加条件下における、上記遺伝子またはタンパクの発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【００２６】
前記態様［III］において、細胞は、糖尿病におけるβ細胞機能不全病態を反映し、前記遺伝子やその産物が高発現している細胞が好ましい。
【００２７】
本発明はまた、被験者より単離された血液中における、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子のヒトオーソログ産物の発現量を測定することにより、該被験者のβ細胞機能不全を評価する方法を提供する。
【００２８】
ここで、前記タンパクの発現量は、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＥＬＩＳＡ法、およびＲＩＡ法から選ばれるいずれか一つの方法によって検出することができ、特にウェスタンブロット法が好ましい。
【００２９】
本発明はまた、被験物質のβ細胞機能不全改善効果、または被験者のβ細胞機能不全の評価用のキットを提供する。該キットは、下記のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる、少なくとも一つ以上を含む。
ａ）配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号９〜１６のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパクに特異的に結合し、該タンパクを検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
なお、上記したβ細胞機能不全改善効果を評価する方法、およびそのためのキットにおいて、該β細胞機能不全改善効果はインスリン抵抗性の改善によってもたらされる効果であってもよい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子の発現量は、糖尿病におけるβ細胞機能不全やその改善を評価するための新たな指標となりうることが示された。したがって、該遺伝子やその産物の発現量を指標とすれば、インスリン抵抗性改善剤やインスリン分泌促進剤等のβ細胞機能不全改善剤の簡便なスクリーニング、あるいはβ細胞機能不全の診断を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子、またはその産物（配列番号９〜１６）の発現量を指標として、被験物質のβ細胞機能不全改善効果、あるいは被験者のβ細胞機能不全を評価する方法に関する。
【００３２】
１．  標的遺伝子
本発明の方法で用いられる遺伝子（以下、「標的遺伝子」という）は、糖尿病におけるβ細胞機能不全改善の指標となりうる遺伝子である。そのような遺伝子は、糖尿病患者の膵ランゲルハンス氏島において発現が著しく増加しており、かつ、β細胞機能不全が改善することに伴い、当該遺伝子の発現量が正常化される遺伝子として同定することができる。
【００３３】
例えば、前記遺伝子は、以下の工程によって同定することができる。
１）まず、糖尿病患者と健常人、あるいは糖尿病モデル動物と正常動物の、膵ランゲルハンス氏島由来の全ＲＮＡを調製する；
２）次いで、上記各全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、糖尿病患者と健常人の間、あるいは糖尿病モデル動物と正常動物の間で、発現量が有意に異なる遺伝子を抽出する；
３）抽出された遺伝子のうち、β細胞機能不全改善剤（例えば、インスリン抵抗性改善剤やインスリン分泌促進剤等）を投与することにより、β細胞機能不全病態の改善にともなって、その発現量が正常化される遺伝子を標的遺伝子として選択する。
【００３４】
上記工程中、全ＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはｃＤＮＡの調整方法、ならびに遺伝子発現量の解析方法については、次項「２．１  標的遺伝子を指標とした被験物質の評価方法（in vivo系）」において詳細に説明する。
【００３５】
かくして、本発明者らは、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される以下の８つの遺伝子を、本発明の標的遺伝子として同定した。なお、遺伝子の選択にあたって、糖尿病との関連が既に示唆されている遺伝子は除外した。したがって、本発明の標的遺伝子は、その配列は既に公知であるが、糖尿病との関連性については全く未知のものである。
【００３６】
配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される標的遺伝子は、それぞれ配列番号９〜１６のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパクをコードする（実施例３の表２参照）。各遺伝子とそのタンパクに関する他の情報は、GenBank、DDBJ等の遺伝子データベースより入手することができる。
【００３７】
本発明では、便宜上、上記標的遺伝子を配列番号１〜８に示される塩基配列で特定するが、該遺伝子はこれらの塩基配列に限定されるものではない。その遺伝子が配列番号１〜８に示される遺伝子と類似の配列を有し、かつ同等の機能を有する限り本発明の標的遺伝子に含まれる。したがって、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される標的遺伝子には、そのオーソログ（ortholog）が含まれる。ここで「オーソログ」とは、オーソロガス遺伝子（orthologous gene）のことであり、進化的に同じ起源をもち構造と機能が類似した異なる種の遺伝子を意味する。同様に、本発明で用いられるタンパクには、配列番号９〜１６で示されるタンパクのほか、前記オーソログによってコードされるタンパクも含むものとする。
【００３８】
以下に示すように、配列番号１〜８で示される遺伝子のヒトオーソログは配列番号４９〜５６で示される塩基配列を有し、配列番号５７〜６４で示されるアミノ酸配列を有するタンパクをコードする。ヒトにおけるβ細胞機能不全の診断には、これらヒトオーソログおよびオーソログ産物を利用する。
【００３９】
マウス             ヒトオーソログ      
GenBank    遺伝子        タンパク      GenBank      遺伝子       タンパク    
AK005296  配列番号１  配列番号９    BC012531      配列番号４９  配列番号５７
AK005484  配列番号２  配列番号１０  NM_030968.1   配列番号５０  配列番号５８
NM_021434 配列番号３  配列番号１１  NM_180989     配列番号５１  配列番号５９
AK006207  配列番号４  配列番号１２  AF151877      配列番号５２  配列番号６０
BC010831  配列番号５  配列番号１３  NM_018487     配列番号５３  配列番号６１
AK013996  配列番号６  配列番号１４  NM_024006     配列番号５４  配列番号６２
AF272044  配列番号７  配列番号１５  NM_030926     配列番号５５  配列番号６３
NM_007786 配列番号８  配列番号１６  NM_005212     配列番号５６  配列番号６４  
【００４０】
２．  β細胞機能不全改善効果の評価方法
本発明の方法は、被験物質の投与条件下における、検体中の、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子、またはその産物（配列番号９〜１６）の発現量を指標として、該被験物質のβ細胞機能不全を評価する方法である。
【００４１】
前記方法は、１つの被験物質について、その投与および非投与条件下における、検体中の標的遺伝子、またはその産物の発現量を比較して評価するものであってもよいし、２つ以上の被験物質について同様な比較評価を行うものであってもよい。あるいは、標的遺伝子、またはその産物の発現量とβ細胞機能不全改善効果の相関が経験的に確立されれば、その関係に基づき、被験物質のβ細胞機能不全改善効果を比較対照なしに絶対評価してもよい。
【００４２】
また、本発明の方法は、８つの標的遺伝子から選ばれる１つの遺伝子、またはその産物の発現量を単独評価するものであってもよいし、８つの標的遺伝子から選ばれる２つ以上の遺伝子、またはそれらの産物の発現量（発現プロファイル）を総体的に評価するものであってもよい。
【００４３】
本発明の評価方法において、β細胞機能不全改善効果は、標的遺伝子の発現量を指標として評価してもよいし、当該遺伝子の産物の発現量を指標として評価しても良い。さらに、評価系は動物を用いたin vivo系であってもよいし、培養細胞を用いたin vitro系であってもよい。
【００４４】
なお、本発明において「β細胞機能不全」とは、膵ランゲルハンス氏島β細胞がその正常な機能を失うことを意味する。具体的には、インスリン感受性機構の異常（いわゆる、インスリン抵抗性）およびインスリン分泌の低下、ならびにこれらによってもたらされる、血糖値の上昇を含む各種糖尿病病態を意味する。
【００４５】
本発明において、「検体」とは、培養細胞やその抽出物、あるいは動物から単離された血液、体液、組織、細胞、排泄物またはそれらの抽出物等、本発明の標的遺伝子が含まれる試料を意味する。特に本発明においては、血液または標的遺伝子やその産物が高発現している細胞が好ましく、したがって、膵ランゲルハンス氏島細胞、特にそのβ細胞が最も好ましい。
【００４６】
また本発明において、被験物質の「投与」とは、生物への“投与”や培養液への“添加”など、被験物質が検体中に存在する状態を作り出すことの全てを含むものとする。
さらに、「遺伝子」という用語は、ＤＮＡのみならず、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡの全てを含むものとし、２本鎖と１本鎖の両方を含むものとする。
【００４７】
２．１  標的遺伝子を指標とした被験物質の評価方法（in vivo系）
標的遺伝子を指標としたin vivoにおける被験物質のβ細胞機能不全改善効果の評価方法は、下記の工程を含むことが好ましい。
【００４８】
工程１：動物を被験物質の投与または非投与の条件で飼育する。
工程２：上記動物の血液または細胞中における標的遺伝子の発現量を検出する。
工程３：被験物質の投与および非投与条件下における、標的遺伝子の発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【００４９】
工程１：動物の飼育
本発明の方法で用いられる「動物」は特に限定されないが、β細胞機能不全を呈する２型糖尿病モデル動物が好ましい。そのような動物は市販のものであっても、公知の方法にしたがって作製されたものであってもよい。市販の２型糖尿病モデル動物としては、例えば、KKマウス（例えば、KK/Taマウス、KK/Sanマウス等）、KK-Ayマウス（例えば、KK-Ay/Taマウス等）、C57BL/KsJ db/dbマウス、C57BL/6J db/dbマウス、ob/obマウス等の２型糖尿病モデルマウス、およびGKラット等の２型糖尿病モデルラット等を挙げることができる。これらのマウスやラットは、例えば、日本クレア株式会社より購入することができる。
【００５０】
前記動物は、被験物質の投与または非投与条件下で適当な期間飼育を行う。動物への被験物質の投与量は特に限定されず、被験物質の性状や動物の体重に合わせて、適宜設定する。また、動物への被験物質の投与方法および投与期間も特に限定されず、被験物質の性状に合わせて、適宜設定すればよい。
【００５１】
工程２：標的遺伝子の検出
次に、被験物質の投与または非投与条件下で飼育された動物から血液または細胞を単離し、該血液または細胞中の標的遺伝子の発現量を検出する。
検出対象とする細胞としては、標的遺伝子やその産物が高発現している細胞が好ましく、したがって膵ランゲルハンス氏島細胞、特にそのβ細胞が好ましい。
【００５２】
標的遺伝子の検出方法としては、例えば、単離された血液または細胞からまず全ＲＮＡを抽出し、該全ＲＮＡ中における標的遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を検出する方法を挙げることができる。
【００５３】
（１）全ＲＮＡの抽出
全ＲＮＡの抽出は、公知の方法にしたがい、単離された血液または細胞よりＲＮＡ抽出用溶媒を用いて抽出する。該抽出溶媒としては、例えば、フェノール等のリボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの（例えば、TRIzol試薬：ギブコ・ビーアールエル社製等）が好ましい。ＲＮＡの抽出方法は特に限定されず、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159）等を採用することができる。なかでも、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。
【００５４】
抽出された全ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いてもよい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施することができる。まず、抽出した全ＲＮＡにビオチン化オリゴ（ｄＴ）プローブを加えてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子担体を加え、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを捕捉させる。洗浄操作の後、最後にオリゴ（ｄＴ）プローブからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出する。この方法のほか、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させ、これを溶出して精製する方法も採用してもよい。溶出されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により分画してもよい。
【００５５】
（２）標的遺伝子の検出
次に、被験物質の投与または非投与条件下における、全ＲＮＡ中の標的遺伝子の発現量を検出する。遺伝子の発現量は、得られた全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを適当な標識化合物でラベルすることにより、そのシグナル強度として検出することができる。
【００５６】
以下、遺伝子の発現量の検出方法について、ｉ）固相化試料を用いた解析方法、ii）ＲＴ−ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法）、iii）その他の解析方法に分けて、具体的に説明する。
【００５７】
ｉ）固相化試料を用いた解析方法
公知の遺伝子を固定した固相化試料に、被験物質の投与または非投与条件下における標識したｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ（以下、「標識プローブ」という。）を、同じ条件で別個に、あるいは混合して同時にハイブリダイズさせる（Brown, P. O. et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment、33-37）。前記標識プローブは、標的遺伝子のｍＲＮＡクローンでも、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものでもよい。プローブ作製のための出発材料としては、精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いることがより好ましい。固相化試料としては、例えば下記のものを挙げることができる。
【００５８】
ａ）遺伝子チップ：
本発明で用いられる遺伝子チップは、検出対象である標的遺伝子が固相化されているものであれば、市販のものであっても、公知の方法（Lipshutz, R. J. et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment、20-24）に基づき作製されたものであってもよい。例えば、マウスの遺伝子が固定化された市販の遺伝子チップとしては、アフィメトリクス社製マウスMG-U74（U74A,U74B,U74C,U74v2）等を挙げることができる。
【００５９】
遺伝子チップによる検出と解析は、常法にしたがって実施することができる。例えば、アフィメトリクス社製チップを用いる場合であれば、製品に添付されたプロトコールにしたがい、ビオチン標識したｃＲＮＡプローブを調製する。次いで、該プロトコールにしたがってハイブリダイゼーションを行い、アビジンによる発光を検出、解析すれば遺伝子の発現量を求めることができる。
【００６０】
ｂ）アレイまたはメンブレンフィルター：
本発明で用いられるアレイまたはメンブレンフィルターは、検出対象である標的遺伝子が固相化されているものであれば、市販のもの（例えば、インテリジーン：宝酒造社製、アトラスシステム：クローンテック社製等）であっても、公知の方法に基づいて作製されたものであってもよい。固相化する遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列情報をもとに作製されたプライマーにより逆転写酵素反応やＰＣＲを行って作製した、クローン化ｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物を用いる。
【００６１】
アレイを用いた検出では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）で標識されたｄ−ＵＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製する。このとき、被験物質の投与条件下におけるポリ（Ａ）＋ＲＮＡと被験物質の非投与条件下におけるポリ（Ａ）＋ＲＮＡをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時に両者を混合して一度に測定を行うことができる。検出は、例えば、宝酒造社の市販アレイであれば、同社のプロトコールにしたがい、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行い、蛍光シグナル検出機（例えば、ＧＭＳ４１８アレイスキャナー：宝酒造社製等）を用いて蛍光シグナルの検出、解析を行う。
【００６２】
メンブレンフィルターを用いた検出では、逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、32Ｐ、33Ｐ）で標識されたｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行う。例えば、市販のフィルター製マイクロアレイ：アトラスシステム（クローンテック社製）の場合は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クローンテック社製等）を用いて検出、解析を行う。
【００６３】
いずれの固相化試料を用いる場合も、比較する試料（被験物質の投与および非投与条件下）の両プローブをそれぞれハイブリダイズさせ、その遺伝子発現量の相違を検出する。このとき、各プローブのハイブリダイゼーション条件は同じにする。前述したように、蛍光標識プローブの場合は、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることで、遺伝子発現量の相違を検出することができる（Brown, P. O. et al. (1999) Nature genet. 21, suppliment、33-37）。
【００６４】
ii）ＲＴ−ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ法）
ＲＴ−ＰＣＲ法、およびその１つであるリアルタイムＰＣＲ（TaqMan PCR）法は、微量なＤＮＡを高感度かつ定量的に検出できるという点で本発明の評価方法に適している。
【００６５】
リアルタイムＰＣＲ（TaqMan PCR）法では、5’端を蛍光色素（レポーター）で、3’端を蛍光色素（クエンチャー）で標識され、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からTaq DNAポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Taq DNAポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが5’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。
【００６６】
例えば、本発明の場合であれば、標的遺伝子（ｍＲＮＡ）を特異的に増幅するプライマー（例えば、配列番号１７〜３２に示される塩基配列からなるプライマー）、および標的遺伝子を特異的に検出するためのプローブ（例えば、配列番号３３〜４０に示される塩基配列からなるプローブ）を設計し、リアルタイムＰＣＲ（TaqMan PCR）を行って、標的遺伝子の発現量を検出、解析する。
【００６７】
iii）その他の解析方法
上記以外に、遺伝子発現量を解析する方法としては、例えば、サブトラクション法（Sive, H. L. and John, T. St. (1988) Nucleic Acids Research  16, 10937、Wang, Z., and Brown, D. D. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 11505-11509）、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Liang, P., and Pardee, A. B. (1992) Science 257, 967-971、Liang, P., Averboukh, L.,Keyomarsi, K., Sager, R., and Pardee, A. B. (1992) Cancer Research 52, 6966-6968）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（John, T. St., and Davis, R. W. Cell (1979) 16, 443-452）、また、適当なプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション法（”Molecular Cloning, A Laboratory Manual” Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press）等を挙げることができる。上記方法は、複数の標的遺伝子の発現プロファイルを総体的に評価検討する場合に有用である。
【００６８】
ａ）サブトラクションクローニング法：
サブトラクションクローニング法とは、特定の細胞に特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡを取得し、該ｃＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより遺伝子をクローニングする方法である。サブトラクションの方法としては、全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを作製し、これと別の細胞から得られた全ＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ハイドロキシアパタイトカラムでハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、このｃＤＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（バイオマニュアルシリーズ３、遺伝子クローニング実験法、羊土社 (1993)、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）や、ｃＤＮＡライブラリーをまず作製し、このライブラリーからヘルパーファージ等を用いて一本鎖ＤＮＡを調製し、この一本鎖ＤＮＡと別の細胞から得られた全ＲＮＡにビオチン標識したものとをハイブリダイズさせた後、アビジンを利用してハイブリダイズしなかった一本鎖ＤＮＡを単離し、ＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖に戻してｃＤＮＡライブラリーを作製する方法（Tanaka, H., Yoshimura, Y., Nishina, Y., Nozaki, M., Nojima, H., and Nishimune, Y. (1994) FEBS Lett. 355, 4-10）等が挙げられる。
【００６９】
具体的には、まず被験物質の投与または非投与条件下の検体それぞれについてｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを精製し、投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α-３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識することもできる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することによりＲＮＡのみを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを生成させる。この一本鎖ｃＤＮＡと、非投与条件下の検体から抽出したＲＮＡとを混合し、適当な条件下で静置すると、ヌクレオチド配列の相補性から安定な二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドが形成される。すなわち、非投与条件下でも発現している全ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡはハイブリッドを形成するが、投与条件下でのみ特異的に発現しているＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡは一本鎖のままである。次いで、ハイドロキシアパタイトカラムで二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドと一本鎖ｃＤＮＡとを分離し、一本鎖ｃＤＮＡのみを精製する。このステップを繰り返すことで目的とした組織に特異的なｃＤＮＡを濃縮することができる。濃縮された特異的ｃＤＮＡは放射性同位元素等で標識されている場合は、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用することができる。なお、この操作は市販のキット（例えば、ＰＣＲセレクトｃＤＮＡサブトラクションキット：クローンテック社製等）を利用して行うこともできる。
【００７０】
ｂ）ディファレンシャル・ディスプレイ法：
ディファレンシャル・ディスプレイ法は、Liangらの方法（Science (1992) 257, 967-971）に準じ、例えば、以下のようにして実施することができる。まず、比較する２つの試料（本発明の場合は被験物質の投与および非投与条件下の検体）からｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてこれを一本鎖ｃＤＮＡに変換する。次いで、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行う。プライマーとしては、例えば、ランダムプライマー（任意の配列からなる約１０〜１２ｍｅｒのプライマー）を用いることができる。あるいは、アンカードプライマー（anchored primer）およびアービトラリープライマー（arbitrary primer）各一種ずつを組み合わせて用いてもよい。アンカードプライマーとしては、オリゴｄ（Ｔ）ｎＶＸ［ｎ＝１１〜１２；Ｖ＝グアニン、アデニンまたはシトシン；Ｘ＝グアニン、アデニン、チミンまたはシトシン］からなるプライマーを用いることができる。また、アービトラリープライマーとしては、任意の配列からなる約１０ｍｅｒのランダムプライマーを用いることができる。このようなＰＣＲを、種々のプライマーを組み合わせて行うことで、広範囲の遺伝子群をスクリーニングすることが可能となる。
【００７１】
続いて、得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動し、ゲル上に展開（ディスプレイ）される全ＲＮＡの発現パターン（フィンガープリント）を比較解析することにより、いずれかの検体で特異的に発現している遺伝子を単離することができる。なお、この方法は、市販されているキット（例えば、ＲＮＡイメージ・キット：ジェンハンター社製等）を用いて行うこともできる。
【００７２】
ｃ）ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法：
ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法は、目的の組織の全ＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを、目的組織および対照組織の全ＲＮＡから合成した３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブでスクリーニングし、目的組織のプローブとのみハイブリダイズするクローンを選択する方法である。例えば、まず被験物質の非投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡより、常法にしたがってｃＤＮＡライブラリーを作製し、そのライブラリーから２組のレプリカフィルターを作製する。次に、該非投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡは、合成時に［α-３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることで標識する。標識されたｃＤＮＡと鋳型となった全ＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することにより全ＲＮＡのみを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを精製することができる。同様に、被験物質の投与条件下の検体から精製した全ＲＮＡを鋳型として、３２Ｐで標識された一本鎖ｃＤＮＡを作製する。これら両方の標識ｃＤＮＡをそれぞれプローブとして、非投与条件下の検体から作製したフィルターとハイブリダイゼーションを行う。最後に、Ｘ線フィルムのオートラジオグラフィー像を比較し、投与または非投与条件下のｃＤＮＡプローブの一方にのみハイブリダイズするクローンを選択する。かくして、被験物質の投与によって特異的に発現量が変化する遺伝子をクローニングすることができる。
【００７３】
ｄ）クロスハイブリダイゼーション法：
クロスハイブリダイゼーション法は、被験物質の投与または非投与条件下のいずれかの検体に由来するｃＤＮＡライブラリーに対して、適当なＤＮＡをプローブとして、ストリンジェンシーの低い条件でハイブリダイゼーションを行い、一方にのみ発現しているクローンを選択する方法である。すなわち、前記ハイブリダイゼーションにより陽性クローンを得て、この陽性クローンをプローブとして、それぞれの検体に由来する全ＲＮＡに対してノーザンハイブリダイゼーションを行い、一方にのみ発現しているクローンを選択する。
【００７４】
こうして得られたｃＤＮＡをプローブとして、投与または非投与条件下の検体の全ＲＮＡに対してノーザンブロッティングを行うことにより、選択した遺伝子が投与条件下で特異的に発現していることを確認できる。
【００７５】
工程３：β細胞機能不全改善効果の評価
最後に、被験物質の投与および非投与条件下における、標的遺伝子の発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【００７６】
すなわち、被験物質の投与条件下で非投与条件下よりも標的遺伝子の発現量が有意に減少している場合、該被験物質はβ細胞機能不全改善効果を有すると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の投与および非投与条件下での標的遺伝子の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
【００７７】
なお、評価は８つの標的遺伝子から選ばれる１つの遺伝子の発現量を単独評価するものであってもよいし、８つの標的遺伝子から選ばれる２つ以上の遺伝子の発現量（発現プロファイル）を総体的に評価するものであってもよい。
【００７８】
２．２  標的遺伝子の産物の発現を指標とした被験物質の評価方法（in vivo）
標的遺伝子の産物であるタンパク（配列番号９〜１６）の発現量を指標としたin vivoにおける被験物質のβ細胞機能不全改善効果の評価は、下記の工程を含む方法であることが好ましい。
工程１：動物を被験物質の投与または非投与の条件下で飼育する。
工程２：上記動物の血液または細胞中における、配列番号９〜１６のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパクを、該タンパクに特異的に結合する抗体を用いて検出する。
工程３：被験物質の投与および非投与における、上記タンパクの発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【００７９】
工程１：動物の飼育
動物は、前項２．１に記載した方法にしたがい、被験物質の投与または非投与の条件下で飼育する。
【００８０】
工程２：タンパクの発現量の検出
次に、被験物質の投与または非投与条件下で飼育された動物から血液または細胞を単離し、該血液または細胞中における配列番号９〜１６のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパクの発現量を、該タンパクに特異的に結合する抗体を用いて検出する。
【００８１】
（１）試料の調製
検体は、血液または標的遺伝子の産物が高発現している細胞が好ましく、したがって膵ランゲルハンス氏島細胞、特にそのβ細胞が好ましい。
前記血液または細胞（細胞抽出液として使用する）は、必要に応じて高速遠心を行うことにより不溶性の物質を除去した後、以下のようにして、検出用試料として調製する。
【００８２】
固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）用の試料は、回収した血清をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット法用（電気泳動用）試料は、細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ社製等）と混合したものを用いる。ドット／スロットブロット法用試料は、例えば、回収した細胞抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用して、直接メンブレンへ吸着させたものを用いる。
【００８３】
（２）試料の固相化
抗体を用いたタンパクの検出にあたっては、まず、検出すべきタンパクが含まれる試料中のポリペプチドをメンブレンあるいは９６穴プレートのウェル内底面等に固相化する。
【００８４】
ウエスタンブロット法、およびドット／スロットブロット法では、メンブレンに試料を固相化する。固相化は、試料を一旦ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、展開されたポリペプチドをメンブレンに転写する方法（ウエスタンブロット法）と、直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませる方法（ドット／スロットブロット法）を挙げることができる。用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等を挙げることができる。また、ブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2 ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober）、セミドライ式ブロッティング法（上記CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2 参照）等を挙げることができる。
【００８５】
一方、ＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法では、９６穴プレートに試料を固相化する。固相化は、例えば、前記９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば、０．０５％  アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃〜室温で一晩、または３７℃で１〜３時間静置して、ウエル底面にポリペプチドを吸着させればよい。
【００８６】
（３）抗体の調製
本工程で用いられる抗体は、常法により（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、p.389-397、1992）、検出すべきタンパク、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを用いて動物を免疫し、該動物生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975、Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p.365-367, 1980, Prenum Press, N.Y.）にしたがって、目的とする抗体を産生する抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを樹立し、このハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体を用いてもよい。
【００８７】
抗体作製用の抗原としては、またはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体を付加した誘導体を用いることができる。特に、検出すべきタンパクのＮ末端に、キーホールリンペットヘモシアニンを担体として結合させたものが好ましい。
【００８８】
前記抗原ポリペプチドは、遺伝子操作を用いて、適当な宿主細胞に産生させてもよい。例えば、本発明の標的遺伝子の発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させればよい。
【００８９】
前記宿主細胞としては、原核細胞であれば、例えば、大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）等が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。該ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与しうる配列を有するものが好ましい。
【００９０】
例えば、大腸菌であれば、Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株やベクターを使用できる。また、大腸菌で用いられるプロモーターとしては、例えば、トリプトファン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（tac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Tu（tufB）プロモーター等を挙げることができ、いずれも好適に用いることができる。
【００９１】
また、枯草菌であれば、２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93）等が用いられるが、これに限定されるものではない。なお、ベクターに枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００９２】
真核細胞の宿主細胞としては、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が挙げられる。脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００９３】
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用できる。さらに、これは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（Invitrogen社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を備えたものを好適に用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845）、およびリポフェクション法（Lopata et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717, Sussman and Milman (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 1641-1643）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００９５】
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、所望の形質転換細胞を選択するために、導入遺伝子に抗生物質耐性等の選択マーカー（例えば、ネオマイシン（またはＧ４１８）耐性遺伝子ｎｅｏ等）を連結してトランスフェクションしたり、あるいは別個に調製した該選択マーカーと導入遺伝子とを同時トランスフェクションすることが好ましい。その後は、該選択マーカーの特性を利用することにより、安定的に形質転換された細胞を選択することができる。
【００９６】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やTrichoplusia niの卵細胞由来High Five細胞（Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog.ｉ: 391-396）等が宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパクのプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Kidd,ｉ. M. and V.C. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 420, 137-159)。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面蛋白質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的蛋白質のＮ末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である（Zhe-mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem., 379, 167-174）。
【００９７】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えば、パン酵母Saccharomyces cerevisiaeや石油酵母Pichia pastorisが好ましい。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5）等を好ましく利用できる。また、分泌型蛋白質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現させることも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Andrew, L. Niles,et al. (1998) Biotechnol.Appl. Biochem. 28, 125-131）。
【００９８】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法にしたがって培養することにより、その細胞内、または細胞外に目的のタンパクを産生する。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択できる。例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）等の培地に、必要に応じウシ胎児血清等の血清成分を添加したものを使用できる。
【００９９】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生された組換えタンパクは、その物理的性質や化学的性質等を利用した公知の分離操作法により、分離・精製することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、を単独あるいは組合せて利用できる。また、発現させる組換えタンパクに６残基からなるヒスチジンを繋げれば、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することもできる。目的とするタンパクは、以上に記載した方法を適宜組み合わせることにより、容易に高収率、高純度で製造できる。
【０１００】
（４）検出
得られた抗体は、単独、あるいは該抗体を一次抗体とし、これを特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と組み合わせて検出に用いられる。
【０１０１】
前記標識の種類として好ましいものは、酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）としては、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）が、各種市販されている。なお、ＲＩＡの場合は125Ｉ等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
【０１０２】
検出すべきタンパクの発現量は、これら標識された酵素等の活性を検出することにより測定される。なお、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合、これら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
【０１０３】
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法を利用すれば目視で検出することができる。ＥＬＩＳＡ法では、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定し、定量することが好ましい。また上述の抗体作製に使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行い、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することも可能である。
【０１０４】
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては、Ｘ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。さらに、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
【０１０５】
（５）測定操作
ａ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば、５％  スキムミルク、０．０５〜０．１％  ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、１〜１０％のウシ血清アルブミン、０．５〜３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６〜２４時間、または室温で１〜３時間である。
【０１０６】
次に、メンブレンを０．０５〜０．１％  ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、ブロッキング溶液で適宜希釈した溶液中に抗体を一定時間浸して、メンブレン上の抗原に該抗体を結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、前記組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備的なウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で２時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続き二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合はブロッキング溶液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載にしたがう）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で４５分〜１時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０１０７】
ｂ）ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法
まず、試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。
【０１０８】
次に、ウェル内を０．０５〜０．１％  ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、洗浄液で適宜希釈した抗体を分注して一定時間インキュベーションし、抗原に該抗体を結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば、上記組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備的なＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続き二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば、市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００〜２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載にしたがう）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１〜３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えば、まずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０１０９】
例えば、本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは以下に記載する方法により実施することができる。まず、検出すべきタンパクの各アミノ酸配列より、親水性に富む領域をそれぞれ２箇所選択する。次に、各領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を標識しておく。標識しなかった方の抗体は、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【０１１０】
工程３：β細胞機能不全改善効果の評価
最後に、被験物質の投与および非投与における、配列番号９〜１６のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパクの発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【０１１１】
すなわち、被験物質の投与条件下で非投与条件下よりも前記タンパクの発現量が有意に減少している場合、該被験物質はβ細胞機能不全改善効果を有すると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の投与および非投与条件下での該タンパクの発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
【０１１２】
配列番号９〜１６のいずれか一つのアミノ酸配列で示される８種のタンパクのうち、いずれか１のタンパクの発現量を単独評価するものであってもよいし、これらから選ばれる２以上のタンパクの発現量（発現プロファイル）を総体的に評価するものであってもよい。
【０１１３】
２．３  標的遺伝子、またはその産物を指標とした被験物質の評価方法（in vitro）
標的遺伝子、またはその産物を指標としたin vitroにおける被験物質のβ細胞機能不全改善効果の評価方法は、下記の工程を含むことが好ましい。
【０１１４】
工程１：細胞を被検物質の添加または非添加条件下で培養する。
工程２：上記細胞中の標的遺伝子の発現量を検出するか、または、その産物であるタンパクの発現量を該タンパクに特異的に結合する抗体を用いて検出する。
工程３：被検物質の添加および非添加条件下における、上記標的遺伝子またはその産物であるタンパクの発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【０１１５】
工程１：細胞の培養
本発明の評価方法で用いられる細胞は、本発明にかかる標的遺伝子を発現している哺乳動物細胞であれば特に限定されない。好ましくは哺乳動物由来、特に哺乳動物のランゲルハンス氏島由来の培養細胞が好ましく、特にそのβ細胞が好ましい。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラットまたはハムスター等が好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。
【０１１６】
特に、前記細胞は糖尿病におけるβ細胞機能不全病態を反映し、本発明にかかる標的遺伝子を高発現している細胞が好ましい。そのような細胞としては、例えば、２型糖尿病モデル動物（例えば、前述の糖尿病モデルマウス等）由来の初代培養細胞を挙げることができる。また、本発明の標的遺伝子をそのプロモーター領域とともに導入した細胞など、人為的に形質転換された細胞を作製し、使用してもよい。
【０１１７】
細胞は、被検物質の添加または非添加条件下で培養する。培養方法は特に限定されず、当該細胞に適した培養方法を適宜選択すればよい。培養細胞への被検物質の添加（投与）方法や添加量も特に限定されず、例えば、被検物質を培養培地に添加して細胞を一定期間培養するなどすればよい。被検物質存在下で培養する期間も適宜設定すればよいが、好ましくは３０分〜２４時間である。
【０１１８】
工程２：標的遺伝子、またはその産物の発現量の検出
次に、被検物質の添加および非添加条件下における、上記細胞中の標的遺伝子の発現量の相違を検出するか、または、その産物であるタンパクの発現量の相違を該タンパクに特異的に結合する抗体を用いて検出する。
【０１１９】
標的遺伝子の検出は、基本的に２．１に記載した方法にしたがって行えばよい。また、抗体を用いたタンパクの検出は、２．２に記載した方法にしたがって行えばよい。
【０１２０】
上記方法のほか、標的遺伝子のプロモーター支配下に、該プロモーター活性の検出を可能にする遺伝子（以下「レポーター遺伝子」という。）を利用して、間接的に標的遺伝子やその産物の発現を検出することもできる。以下、レポーター遺伝子を利用した検出方法について説明する。
【０１２１】
（１）レポーター遺伝子
レポーター遺伝子は、宿主細胞が本試験方法の一連の過程において産生し得る他のいかなるタンパク質とも明確に区別可能な、レポーター蛋白質をコードするものであればよい。好ましくは、形質転換前の細胞が該レポーター蛋白質と同一または類似のタンパク質をコードする遺伝子を持たないようなものがよい。例えば、レポーター蛋白質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、レポーター遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるレポーター遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば、該レポーター遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。より好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなレポーター遺伝子としては、例えば、以下の酵素やタンパクをコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない。
【０１２２】
ａ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：
クロラムフェニコールにアセチル基を付加する酵素で、いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出することができる。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとして、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
ｂ）ホタルルシフェラーゼ：
ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量できる。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
ｃ）β−ガラクトシダーゼ：
呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている。
ｄ）分泌型アルカリホスファターゼ：
呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている。
ｅ）緑色蛍光タンパク質（green-fluorescent protein）：
酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
【０１２３】
（２）レポーター遺伝子の導入
レポーター遺伝子の導入は、公知の方法にしたがい、レポーター遺伝子発現プラスミドと、本発明の標的遺伝子を哺乳類細胞で発現可能にした組換えベクターを作製し、これらを細胞に同時トランスフェクションすればよい。ベクターとしては、ｐＣＲ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）等を好適に用いることができるが、これらに限定されない。
【０１２４】
細胞に発現プラスミドを導入する方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457）、電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845）、リポフェクション法（Lopata et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717, Sussman and Milman (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 1641-1643）等を挙げることができるが、これらに限定されず、汎用される任意の方法を採用することができる。ただし、細胞がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いることが必要である。
【０１２５】
（３）評価
得られた本発明の標的遺伝子の発現ベクターと、レポーター発現ベクターを同時トランスフェクションした細胞を培養すると、該標的遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現変化をみれば、標的遺伝子の発現変化を評価することができる。ここで、「レポーター遺伝子の発現が可能な条件」とは、レポーター発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞が生存して、レポーター遺伝子の産物（レポーター蛋白質）の生産が可能な条件であればよい。好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）で、４〜６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３４〜４０℃（最も好適には３７℃）で２〜３日間（最も好適には２日間）培養する。
【０１２６】
（４）その他（形質転換細胞株の樹立）
以上のような、一過的な遺伝子導入法を利用した試験方法とは別に、レポーター遺伝子、または本発明の標的遺伝子を含む２つの発現ベクターで、宿主細胞を二重に形質転換した細胞を利用した試験方法も採択可能である。この場合には、ｐＩＮＤ（インビトロジェン社製）やｐＴｅｔ−Ｏｎ（クロンテック社製）等の発現ベクターを利用して、本発明の標的遺伝子の発現を誘導する条件下で該レポーター遺伝子の発現が促進されるような細胞株を樹立することが必要となる。このような形質転換細胞では、導入される遺伝子は、宿主細胞の染色体に組み込まれるなどして、宿主細胞の継代を重ねても安定的に保持されることが望ましい。宿主細胞には、所望の形質転換細胞を選択するために、導入遺伝子に抗生物質耐性等の選択マーカー（例えば、ネオマイシン（またはＧ４１８）耐性遺伝子ｎｅｏ等）を連結してトランスフェクションしたり、あるいは別個に調製した該選択マーカーと導入遺伝子とを同時トランスフェクションすることが好ましい。その後は、該選択マーカーの特性を利用することにより、安定的に形質転換された細胞を選択することができる。
【０１２７】
こうして得られた細胞株を、本発明の標的遺伝子の発現が誘導される条件下におくと、該遺伝子の発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、標的遺伝子の発現量が評価できる。
【０１２８】
工程３：β細胞機能不全改善効果の評価
最後に、被験物質の投与および非投与における、標的遺伝子またはその産物の発現量の相違に基づき、該被験物質のβ細胞機能不全改善効果を評価する。
【０１２９】
すなわち、被験物質の投与条件下で非投与条件下よりも標的遺伝子またはその産物の発現量が有意に減少している場合、該被験物質はβ細胞機能不全改善効果を有すると評価できる。ここで、「有意に減少している」とは、例えば、被験物質の投与および非投与条件下での標的遺伝子またはその産物の発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
【０１３０】
なお、評価は、８つの標的遺伝子から選ばれる１つの遺伝子、またはその産物の発現量を単独評価するものであってもよいし、８つの標的遺伝子から選ばれる２つ以上の遺伝子、またはそれらの産物の発現量（発現プロファイル）を総体的に評価するものであってもよい。
【０１３１】
３．β細胞機能不全の評価
本発明にかかる、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子産物（配列番号９〜１６のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパク）の発現はβ細胞機能不全の指標となる。したがって、血液中における配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子のヒトオーソログ産物（配列番号５７〜６４）の発現量を指標として、被験者のβ細胞機能不全（糖尿病の病態）を診断することができる。
【０１３２】
すなわち、本発明は、被験者より単離された血液中（検体）における、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子のヒトオーソログ産物、すなわち、配列番号５７〜６４のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパクの発現量を測定することにより、該被験者のβ細胞機能不全を評価する方法を提供する。
【０１３３】
検体中のタンパクの発現量の測定は、前項２．２の工程２にしたがって実施することができる。検体中の当該タンパク質の発現量が正常人に比較して有意に高い場合、該被験者はβ細胞機能不全を生じている可能性が高いと評価することができる。ここで、「有意に高い」とは、例えば、健常人および被験者の血液中における該タンパクの発現量に統計的有意差（ｐ＜０．０５）があることを意味する。
【０１３４】
上記評価は、配列番号５７〜６４のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパクのうちいずれか１のタンパクの発現量を単独評価するものであってもよいし、これらから選ばれる２以上のタンパクの発現量（発現プロファイル）を総体的に評価するものであってもよい。
【０１３５】
４．β細胞機能不全改善効果の評価用キット
本発明は、また、本発明の標的遺伝子またはその産物の発現量を指標とした、被験物質のβ細胞機能不全改善効果、または被験者のβ細胞機能不全の評価用のキットを提供する。
【０１３６】
前記キットは、以下のａ）〜ｅ）からなる群より選ばれる少なくとも1以上を含む。
ａ）配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子を特異的に増幅するための、１５〜３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー
ｂ）配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子に特異的に結合し、該遺伝子を検出するための２０〜１５００塩基長の連続したポリヌクレオチドプローブ
ｃ）上記ｂ）記載のポリヌクレオチドプローブが固定された固相化試料
ｄ）配列番号９〜１６のいずれか一つのアミノ酸配列で示されるタンパクに特異的に結合し、該タンパクを検出するための抗体
ｅ）上記ｄ）記載の抗体に特異的に結合しうる二次抗体
【０１３７】
前記ａ）記載のプライマーは、本発明の標的遺伝子の塩基配列（配列番号１〜８）に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いるなど、常法にしたがい容易に設計し、増幅することができる。このようなプライマーの例としては、例えば配列番号１７〜３２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【０１３８】
また、前記ｂ）記載のプローブは、本発明の標的遺伝子（配列番号１〜８）に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、２０〜１５００塩基長程度のものが好ましい。具体的には、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、２０塩基長程度の1本鎖オリゴヌクレオチドか２本鎖ＤＮＡが好適に用いられる。また、マイクロアレイであれば、１００〜１５００塩基長程度の２本鎖ＤＮＡ、または２０〜１００塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。一方、Affimetrix社のGeneChipTMシステムは２５塩基長程度の１本鎖オリゴがよい。これらは、特に本発明の標的遺伝子の３’非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。これらのプライマーやプローブは、適当な標識試薬によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。このようなプローブの例としては、配列番号３３〜４０に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【０１３９】
また、前記ｃ）記載の固相化試料は、前記ｂ）記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料とその作製方法については、既に２．１で説明したが、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
【０１４０】
前記ｄ）およびｅ）記載の抗体は、２．２に記載した方法により作製することができる。該抗体は、適当な標識試薬によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。
【０１４１】
本発明のキットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ハイブリダイゼーション、プローブの標識、ラベル体の検出等、本発明にかかる評価方法に必要な他の試薬等を適宜含んでいてもよい。
【０１４２】
５．その他
５．１  β細胞機能不全の予測
本発明にかかる標的遺伝子は２型糖尿病モデル動物で高発現している遺伝子である。したがって、該遺伝子の発現量はヒトにおける２型糖尿病の病態を反映して増加する。特に、これら遺伝子は、β細胞機能不全の改善によって発現が正常化されることから、ヒトにおけるβ細胞機能不全を反映するものと思われる。ＰＣＲ等の増幅法が確立している遺伝子では、微量な発現量の変化を当該遺伝子産物であるタンパクの発現よりも早期に検出することが可能である。
【０１４３】
したがって、例えば、被験者の血液や細胞における当該遺伝子（配列番号４９〜５６）の発現量を測定することにより、該被験者の糖尿病の病態、特にβ細胞機能不全、の改善を予測することも可能である。こうした予測は、標的遺伝子とともに、他のβ細胞機能不全を反映する因子、例えば、TNF-αやアディポネクチン等の遺伝子の発現プロファイルを総体的に解析することにより、より正確に行うことができる。
【０１４４】
５．２  β細胞機能不全を有するモデル動物の作製
本発明にかかる標的遺伝子やその産物の発現を人為的に高めることにより、β細胞機能不全を有する動物（例えば、マウス等）を作製することも可能である。例えば、前記標的遺伝子（配列番号１〜８）を高発現するトランスジェニック動物を作製し、ヒト２型糖尿病に代表されるβ細胞機能不全病態が現れれば、該動物を利用してβ細胞機能不全やその改善についての研究を行うことができる。同様に、これらの産物であるタンパク（配列番号９〜１６）を直接動物に投与することによって、β細胞機能不全を有するモデル動物を作製することも可能と考えられる。
【実施例】
【０１４５】
以下、実施例および参考例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１４６】
〔実施例１〕  C57BL/KsJ db/dbマウスへの薬剤投与および血液生化学値測定
１．投与薬物
インスリン抵抗性改善剤：５−[４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル]チアゾリジン−２,４−ジオン塩酸塩（以下、「化合物A」と記載する；化合物Aの製法については、特開平９−２９５９７０号公報（米国特許第５８８６０１４号明細書、欧州特許出願公開第７４５６００号明細書）、および参考例１参照）
【０１４７】
２．動物
糖尿病モデルマウスとして雄性C57BL/KsJ db/dbマウス、および正常マウスとして雄性C57BL/KsJ db/+mマウス（ともに、日本クレア社製）を使用した。マウスは5週齢で購入後、約1週間馴化した後、6週齢で実験に供した。飲水および摂餌（F2、船橋農場製）は、馴化・投与期間中ともに自由摂取とした。飼育および投与期間中の実験は、実験動物管理室により管理されている実験動物エリア内で行った。
【０１４８】
３．試験方法
ａ）処置および実験群
実験前にマウスの体重測定、および尾静脈から採血を行い血糖値を測定した。マウスは、体重および血糖値が群毎にほぼ等しくなるように群分けした。実験群は、1)db/+mマウス対照群、2)db/dbマウス対照群、3)db/dbマウス  化合物A(0.01%)投与群とし、各群７〜10匹ずつを実験に用いた。
ｂ）投与方法および期間
化合物Aの投与は、粉末の餌（F2、船橋農場製）に化合物Aを0.01%の濃度で添加することによって行った（混餌投与）。対照群には、化合物A非添加の餌を与えた。
ｃ）実験期間および採血、解剖、ラ氏島単離
実験期間は、6週齢より投与を開始し、8日後の午前中に採血および体重測定を行い、同日午後解剖を行った。マウスは、断頭後、開腹し、27G-30Ｇの静脈針を用いて膵管より膵臓にHBSS(Hank’s Balanced Salt Solution : Gibco BRL製 P/N24020-117)またはKRB(Krebs ringer buffer pH 7.4 : 129 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2mM KH2PO4, 2.5mM CaCl2, 5mM NaHCO3, 10mM HEPES pH7.4, 0.2 % BSA)に溶解した4 mg/ml Collagenase Type XI(Sigma製 P/N C7657)を約2.5ml灌流した。その後、膵臓を50mlのファルコンチューブに摘出し、37℃で3分30秒間インキュベートした。次いで、冷却したHBSSまたはKRBを30ml加え、穏やかにピペッティング後、氷上で4分間静置した。上清を約25ｍｌ取り除き、再び冷却したHBSSまたはKRBを30ml加え、穏やかにピペッティング後、氷上で3分間静置した。上清を約29ml取り除き（6ml程度残す）、残った懸濁物を茶漉しを使ってBacterial dish 2枚に濾過した。ピペットマン（P-10）を用いて実体顕微鏡下でラ氏島を拾い、回収した。採取したラ氏島は各群１本にまとめた後、Trizole reagent(Gibco BRL製 P/N 15596-018)で溶解し、RNA抽出用とした。
ｄ）血液生化学値の測定（測定項目および測定方法）
測定項目は、血糖値、体重、血中インスリン濃度とした。
血糖値はグルコローダーGXT（A&T社製）を用いて測定した。また血中インスリン濃度は、RAT INSULIN RIA KIT (LINCO Research, Inc.製)を用い、ラジオイムノアッセイ法により測定した。結果を表１および図１（Ａ〜Ｃ）に示す。
【０１４９】
【表１】
2004154136.tif 000002
【０１５０】
ｅ）評価
薬効の評価は、血糖値、血漿中インスリン濃度、体重の各項目について行った。
【０１５１】
４．結果
図１（Ａ〜Ｃ）に示すように、db/dbマウス対照群では、顕著な血糖値の上昇、血漿インスリン濃度の低下といった２型糖尿病に特徴的な症状がみられた。一方、db/dbマウス 化合物A(0.01%)投与群では、血漿インスリン濃度および血糖値の正常化が見られ、インスリン抵抗性の改善によるβ細胞機能の改善が示唆された。
【０１５２】
〔実施例２〕  ラ氏島からの全RNAの抽出
実施例１で採集したラ氏島は、Trizole reagent(Gibco BRL製 P/N 15596-018)に溶解後、0.2容量のクロロホルムを加え、15秒間転倒混和した。次いで、室温で10分間静置してから、12,000×g、4℃で15分間遠心分離した。遠心分離後、上層を回収し、0.8容量のリボヌクレアーゼ不含イソプロピルアルコールを加えて混和した。これを室温で10分間静置後、12,000×g、4℃で15分間遠心分離した後、上清を除去してリボヌクレアーゼ不含80％エタノールを加えた。さらに、これを12,000×g、4℃で10分間遠心分離し、上清を除去して、沈殿を乾燥させることにより、全RNAを得た。得られた全RNAは、Agilent 2100バイオアナライライザー（Agilent technologies製）を用いて、28Sおよび18Sの波形を確認することにより精製度を確認した。全RNAは、使用時まで-80℃に保存した。
【０１５３】
〔実施例３〕  GeneChipTM解析
１．試験方法
チップ解析は、アフィメトリクス社の発現解析技術マニュアル（Expression Analysis Technical Manual）にしたがって、以下の方法により行った。
ａ）cDNAの合成
上記実施例２で得られた全RNA各５μgを出発材料として、上記マニュアル記載の方法にしたがってcDNAの合成および精製を行った。
ｂ）cRNAの合成
上記ａ）で得られたcDNAを鋳型として、上記マニュアル記載の方法にしたがってcRNAの作製を行った。得られたcRNA  10μgは断片化し、プローブ溶液に加えた。
ｃ）プローブ溶液の作製
プローブ溶液に加える各種コントロールcRNA（GeneChipTM Eukaryotic Hybridization Control Kit）はアマシャム・ファルマシア社から購入した。
ｄ）ハイブリダイゼーション
上記ｃ）で得られたプローブとハイブリダイズさせるチップとして、アフィメトリクス社製マウスゲノムU74セット（Murine Genome U74 ver.2 Set：MG-U74Av2、MG-U74Bv2、MG-U74Cv2）を用いた。ハイブリダイゼーションとその後の洗浄操作は上記マニュアル記載にしたがって行った（ハイブリダイゼーション条件は、45℃、16−20時間とした）。
ｅ）解析
上記ｄ）でハイブリダイゼーション操作を行ったチップのデータ解析は、上記マニュアル記載にしたがって、GeneChipTM Microarray Suite 4.0 (Affymetrix社)にて行った。なお、遺伝子の発現レベルは、各遺伝子の相対的発現量を表す「Fold Change値（以下、Fold値という）」で示した。db/+mマウス対照群のデータを基準にして、db/dbマウス対照群およびdb/dbマウス 化合物A投与群で得られたデータを比較検討した。
【０１５４】
そして、MG-U74v2チップにおいて、db/+mマウス対照群と比較して、db/dbマウス対照群で発現が高い遺伝子の中でdb/dbマウスに化合物A投与を投与することにより、遺伝子発現が正常化してくる遺伝子を抽出した。なお、抽出にあたって、予め糖尿病との関連が判明している遺伝子は除くこととした。
【０１５５】
２．結果
結果として、糖尿病モデルマウス（db/dbマウス対照群）で高発現している遺伝子であって、かつインスリン抵抗性改善剤化合物A投与によってその発現が正常化してくる遺伝子として、表２に示すような８つの遺伝子が新たに特定された。
【０１５６】
【表２】
2004154136.tif 000003
【０１５７】
〔実施例４〕  TaqMan PCRによる遺伝子発現解析
実施例３で特定された８つの遺伝子ついて、さらにTaqMan PCRを用いてその発現量を解析した。
１．試験方法
ａ）cDNAの合成
（以下の実験には、SuperScript Preamplification System : Gibco BRL製 P/N 18089-011を使用）
上記実施例２で得られた各1μgの全RNAを出発材料として、10 x Reaction buffer 1μl、DNaseI(1U/μl : Gibco BRL P/N 18068-015) 1Uに水を加え全量10μlとし、室温で15分間インキュベートした。次に25mM EDTA 1μlを加え、65℃で15分間インキュベートした後、氷冷した。これにOligo(dT) (0.5μg/μl) 1μl加え、70℃で10分間インキュベートした後、氷冷した。次に、10 x PCR buffer 2μl、25mM MgCl2 2μl、10mM dNTP mix 1μl、0.1M DTT 2μl、SuperScript II RT (200U/μl) 1μlを加え、42℃で50分さらに70℃で15分インキュベートした。これにRNase H 1μl加え37℃で20分間インキュベートし、cDNAを作製した。スタンダード用サンプルについては、水を29μl加え、これを５倍希釈で６段階に希釈した（原液の濃度を625とした）。測定用のサンプルについては、水を229μl加えた。
さらに、比較のために、膵β細胞由来 培養系細胞 MIN6を用いて同様にサンプルを調整した。
【０１５８】
ｂ）反応液の調整
Upper primer (100μM) 0.1μl、Lower primer (100μM) 0.1μl、TaqMan Probe (6.5μM) 1.5μl、2 x TaqMan Universal PCR Master Mix(PE ABI  P/N 430447) 25μl、水 21.3μlを混ぜた反応液中に上記のa)で作製したcDNA 5μl加えた。プライマーは、Invitrogen社で合成したものを使用し、プローブは、AmershamでFAMラベルで合成したものを使用した。
【０１５９】
各Primerおよび Probeの配列を以下に示す。
i) AK005296用プライマーおよびプローブ
Upper Primer: 5’-TACTGACCCGAGAAGCAGCA-3’（配列番号１７）
Lower Primer: 5’-CAGCTCTACATCAAATGCCCA-3’（配列番号１８）
Probe (FAM label): 5’-CGGACCTTCTCGTCTCTGCACATTGA-3’（配列番号３３）
ii) Zsig37 (AF192499)用プライマーおよびプローブ
Upper Primer: 5’-TCCACCCCAGATCAACATCA-3’（配列番号１９）
Lower Primer: 5’-TTTTGCCGTACTTCCCCTG-3’（配列番号２０）
Probe (FAM label): 5’-CATCCTGAAAGGCGAGAAAGGTGACC-3’ （配列番号３４）
iii) hypothetical protein (NM_021434)用プライマーおよびプローブ
Upper Primer: 5’-GACATTGCCTCCCAAATTCA-3’（配列番号２１）
Lower Primer: 5’-CATCCGCACTATTGTCCAGC-3’（配列番号２２）
Probe (FAM label): 5’-ATGCTGTACCTGCTTCTGAGCCTGTGTATG-3’（配列番号３５）
iv) AK006207用プライマーおよびプローブ
Upper Primer: 5’-CCTGTATTTCCAAGCTCTGCG-3’（配列番号２３）
Lower Primer: 5’-ATCCCAGAGCAAACACCACA-3’（配列番号２４）
Probe (FAM label): 5’-ACATTTGTCCATGAAAGCCCTGCCTT-3’（配列番号３６）
v) BC010831用プライマーおよびプローブ
Upper Primer: 5’-CACAACCCACCCACATTGAT-3’（配列番号２５）
Lower Primer: 5’-TCCTTAGCAATGAGCATCCG-3’（配列番号２６）
Probe (FAM label): 5’-ACCAGGAGTCTGCTCTGGCCAAACTT-3’ （配列番号３７）
vi) AK013996用プライマーおよびプローブ
Upper Primer: 5’-ATCCTACTGGTGCTGAGTTCCC-3’（配列番号２７）
Lower Primer: 5’-GTGGTAATGCACACAATGCAGA-3’（配列番号２８）
Probe (FAM label): 5’-TACCTGGCCTGGATCCTGTTCTTTGTGTT-3’（配列番号３８）
vii) BR13 (AF272044)用プライマーおよびプローブ
Upper Primer: 5’-AGGCGGATCAACAAACGTG-3’（配列番号２９）
Lower Primer: 5’-TGAGCGTCTCCACCACAAAT-3’（配列番号３０）
Probe (FAM label): 5’-ACGCCATCCGCCACTTCGAGAATA-3’ （配列番号３９）
viii) κ‐casein (NM_007786)用プライマーおよびプローブ
Upper Primer: 5’-CTGCTGGAGTACCTTATGCCA-3’（配列番号３１）
Lower Primer: 5’-GGCGGTGTTATCCTGATTTTC-3’（配列番号３２）
Probe (FAM label): 5’-CAAACCCATCCTTTCTTGCCATGCC-3’（配列番号４０）
【０１６０】
ｃ）反応および測定
前項b)で調整したサンプルを、50℃で2分、95℃で10分反応させた後、95℃で15秒, 60℃で1分を40回繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の発光量ABI PRISM 7700を用いて測定した。
ｄ）解析
ABI PRISM 7700を用いて各遺伝子の相対的な発現量を計算し、それらをβ-actin遺伝子の発現量で補正したものを解析に用いた。結果を表３および図２〜図９に示す。
【０１６１】
【表３】
2004154136.tif 000004
【０１６２】
２．結果
表３および図２〜９より明らかなように、実施例３で特定された８つの遺伝子は、正常マウス（db/+mマウス）群およびβ細胞由来培養系細胞（MIN6）に比較して、糖尿病モデルマウス（db/dbマウス）群では顕著に高い発現量を示した。一方、化合物A投与群では、これら遺伝子の発現量は、より正常化されていることが確認された。
【０１６３】
以上の結果より、配列番号１〜８の塩基配列で示される遺伝子の発現量は、糖尿病の病態やその改善、特にβ細胞機能不全改善の指標となりうることが示された。
【０１６４】
〔実施例５〕  C57BL/KsJ db/dbマウス（薬剤非投与）におけるβ細胞機能不全の発症
２型糖尿病モデルマウスの血液生化学値を5週齢〜13週齢の間で測定し、当該マウスにおけるインスリン抵抗性とこれに伴うβ細胞機能不全の発症を観察した。
【０１６５】
１．動物
２型糖尿病モデルマウスとして雄性C57BL/KsJ db/dbマウス、および正常マウス（対照）として雄性C57BL/KsJ db/+mマウス（ともに、日本クレア社製）を使用した。マウスは5週齢で購入し、馴化した後、各週齢（5、6、7、8、10、11、12、13週齢）で実験に供した。マウスは、馴化・投与期間中ともに、飲水および摂餌（F2、船橋農場）は自由摂取とした。飼育および投与期間中の実験は、実験動物管理室により管理されている実験動物エリア内で行った。
【０１６６】
２．試験方法
ａ）実験期間および採血
実験は、各週齢の午前中に体重測定を行い、５時間絶食後、採血を行った。各群ともに5〜10匹を測定に用いた。
ｂ）血液生化学値の測定（測定項目および測定方法）
測定項目は血糖値、体重、血中インスリン濃度とし、実施例１と同様の方法で測定を行った（表４）。
ｃ）評価
薬効の評価は、血糖値、血漿中インスリン濃度、体重の各項目について行った。
【０１６７】
【表４】
2004154136.tif 000005
【０１６８】
３．結果
２型糖尿病モデルマウス（db/dbマウス）において、５週齢で正常であった血糖値は８週齢で急激に上昇し、その後も穏やかに増加した（図１０Ａ）。血漿中インスリン濃度は、db/dbマウスにおいては、６〜８週齢で約10ng/mlであったものが１０週齢では約３ng/mlに低下し、その後ほぼ一定の値を維持したものの、正常マウス（db/+mマウス）に比較してはるかに高値であった（図１０Ｂ）。以上の結果より、db/dbマウスは加齢に伴い、インスリン抵抗性を示し、その後、β細胞機能不全を引き起こすことが確認された。
【０１６９】
〔実施例６〕  遺伝子のクローニング
１．クローニングする遺伝子
Zsig37（配列番号２）およびκ-casein（配列番号８）
２．方法
Zsig37遺伝子およびκ-casein遺伝子を哺乳類細胞における発現ベクターであるpcDNA3.1 Directional TOPO Expression Kit（Invitrogen、K4900-01）にクローニングした。Zsig37遺伝子特異的プライマー（Primer-1）およびκ-casein遺伝子特異的プライマー（Primer-2）を作製し、実施例３で調整したcDNAを鋳型としてTOYOBO KOD -Plus (東洋紡  KOD-201)を用いてPCR反応により目的の遺伝子を増幅した。プライマーはORF全長を増幅するようにデザインしたものを作製した。
【０１７０】
Zsig37遺伝子特異的プライマー（Primer-1）
Upper primer: 5’-GAAGAGACGCCTCCCCGAGAGC-3’（配列番号４１）
Lower primer: 5’-TGCCAGGCAAGGAGGTCAGCAGTCC-3’（配列番号４２）
κ-casein遺伝子特異的プライマー（Primer-2）
Upper primer: 5’- CCAAATAAAGGTGCAATGATG-3’（配列番号４３）
Lower primer: 5’- CTTAGTGTTTTATGCTGCAGT-3’（配列番号４４）
【０１７１】
PCR反応は、cDNA 2μl 、Upper primer (20μM) 5 μl、Lower primer (20μM) 5μl、10 x KOD Buffer 5μl、dNTP Mixture (each 2.5mM) 5 μl 、MgSO4 2μl、TOYOBO KOD -Plus- Taq (1U) 1 μl、水 25μlを混合した反応液を、95℃、1分間の前熱処理の後、95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で１分間、を1サイクルとしてこれを35回繰り返した。増副産物は、1% アガロースゲルで電気泳動後、UV照射下で増副産物を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit (250)（QIAGEN 28706）を用いて抽出した。抽出した遺伝子断片 4μl、pCR-Blunt II-TOPO（Invitrogen）1μl、Salt Solution 1μlを混合し、室温で5分間放置することによりライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液を大腸菌DH5α株にトランスフォーメーションし、アンピシリン耐性をマーカーとしてクローンを得た（”Molecular Cloning, A Laboratory Manual” Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press）。得られたクローンの塩基配列の確認はSequencer（ABI PRISM 3700 DNA ANLYZER）を用いた。目的のORFを含むクローンを取得した。次に本クローンを鋳型として、TOYOBO KOD-Plus (東洋紡  KOD-201)を用いてPCR反応により、stopコドン配列を除いた遺伝子を増幅した。stopコドン配列を除く部分を増幅するプライマーとして、Zsig37遺伝子特異的プライマー（Primer-3）、κ-casein遺伝子特異的プライマー（Primer-4）を使用した。
【０１７２】
Zsig37遺伝子特異的プライマー（Primer-3）
Upper primer: 5’-CACCATGGGCTCCTGTGCACAGGG-3’（配列番号４５）
Lower primer: 5’-GGGCTCAGAGGCTGGCTTGA -3’（配列番号４６）
κ-casein遺伝子特異的プライマー（Primer-4）
Upper primer: 5’-CACCATGATGAGGAATTTTATCGTAG-3’（配列番号４７）
Lower primer: 5’-TGCTGCAGTTGAGGACACTGGG-3’（配列番号４８）
【０１７３】
PCR反応は、cDNA 2μl、Forward primer (20μM) 5μl、Reverse primer (20μM) 5μl、10 x KOD Buffer 5μl、dNTP Mixture (each 2.5mM) 5μl 、MgSO4 2μl、TOYOBO KOD -Plus- Taq (1U) 1μl、水 25μlを混合した反応液を、95℃、1分間の前熱処理の後、95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間、を1サイクルとしてこれを35回繰り返した。増副産物は、1% アガロースゲルで電気泳動後、UV照射下で増副産物を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit (250)（QIAGEN 28706）を用いて抽出した。抽出した遺伝子断片 4μl、pcDNA3.1D/V5-His-TOPOベクター（Invitrogen、K4900-01）1μl、Salt Solution 1 μlを混合し、室温で5分間放置することによりライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液を大腸菌DH5α株にトランスフォーメーションし、アンピシリン耐性をマーカーとしてクローンを得た（”Molecular Cloning, A Laboratory Manual” Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press）。得られたクローンの塩基配列はSequencer（ABI PRISM 3700 DNA ANLYZER）を用いて確認した。かくして、目的のORFを含むクローンを取得した。
【０１７４】
〔実施例７〕  分泌確認
１．使用した遺伝子
Zsig37（配列番号２）およびκ-casein（配列番号８）
２．方法
２．１  遺伝子の導入および培養上清の回収
ａ）１日目
１日目の午前中に、6cmシャーレに、10% FBS/DMEMで懸濁したCOS-1細胞を、翌日サブコンフレントになるように撒き、37℃、5% CO2存在下で培養した。
ｂ）２日目
前日に準備したCOS-1細胞をDMEM・FBS(-)で２回洗浄した後、DMEM・FBS(-) 2mlを加え、lipofetion用の細胞として準備した。
【０１７５】
予めエンドフリー  プラスミド  ミディー  キット（QIAGEN）を用いて精製した4.0μgのZsig37発現プラスミドDNA水溶液を、DMEM・FBS(-)で234μlとし、さらにPLUS reagentを16μl添加し混和後、室温で15分インキュベートした。次に、予めDMEM/FBS(-) 226μlにLipofectAMIN 24μlを加えて作製したLipofetAMIN混合液 250μlを加え、混和した後、室温で15分インキュベートすることにより、lipofection用DNA溶液とした。
Lipofection用の細胞にlipofection用DNA溶液をゆっくりと滴下し、37℃、5% CO2存在下で4時間培養した。その後、0% FBS/DMEMに交換して、37℃、5% CO2存在下で３日間培養した。
ｃ）５日目
培養上清を回収した。
【０１７６】
２．２タンパクの発現確認
ａ）培養上清1mlに対して、4mg/ml DOC in TCA 100μlを加え、15秒間転倒混和した。次いで、室温で5分間静置してから、15,000xgで5分間遠心分離した。遠心分離後、沈殿に冷アセトン500μlを加え、15秒間転倒混和した。次いで、15,000xgで5分間遠心分離した。遠心分離後、再度沈殿に冷アセトン500μlを加え、15秒間転倒混和した。次いで、15,000xgで5分間遠心分離した。遠心分離後、上清を除去して沈殿を乾燥させ、1x SDS sample beffer 20μlを加え、100℃で5分間ボイルし、電気泳動用サンプルとした。
ｂ）5-20% gradient gelに電気泳動用サンプルを全量アプライ後、電気泳動バッファー(Tris 15.15g、グリシン 72.05g、蒸留水 5L、SDS 5g)を用いて40mAで40〜50分間電気泳動した。
ｃ）次に、40V、200mAで、ブロティングバッファー(Tris 15.14g、グリシン 72.07g、蒸留水 3L、メタノール 1L)を用いて電気泳動したゲルをnitrocellulose membraneに２時間ブロッティングした。ブロッティング終了後、membraneをTBS-T溶液に浸した。
ｄ）membraneを5% skim milk/TBS-T溶液に移し、室温で1時間、シェーカー上で振盪した。
ｅ）membreneをTBS-T溶液で、5分 x 3回、振盪振盪することにより洗浄した。
ｆ）membraneを一次抗体溶液(anti-V5抗体 2μl、BSA 0.1g、TBS-T 10ml)に移し、室温で1時間、シェーカー上で振盪した。次に、membreneをTBS-T溶液で、5分 x 3回、振盪振盪することにより洗浄した。
ｇ）membraneを二次抗体溶液(anti-mouse抗体 10μl、BSA 0.1g、TBS-T 10ml)に移し、室温で1時間、シェーカー上で振盪した。次に、membreneをTBS-T溶液で、5分 x 3回、振盪振盪することにより洗浄した。
ｈ）membrane上にECL試薬 2mlをのせ、室温で1分間反応させた。
ｉ）ECL試薬を除去したmembraneは、サランラップで包み、X線フィルムに露光後、自動現像機で現像することにより、シグナルを評価した。
【０１７７】
３．結果
Zsig37およびκ-caseinをトランスフェクションした細胞の培養上清では、各々のタンパクが分泌されていることが確認された（図１１）。
【０１７８】
〔参考例１〕  ５−［４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル］チアゾリジン−２，４−ジオン塩酸塩（化合物A）の製造
特開平９−２９５９７０号公報（米国特許第５８８６０１４号明細書、欧州特許出願公開第７４５６００号明細書）に記載の方法によって合成した、５−［４−（６−メトキシー１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル］チアゾリジン−２，４−ジオン１０．６ｇ、および４規定塩酸−１，４−ジオサキン１００ｍｌの混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮後、酢酸エチルを加え、折出した成績体を濾取し、酢酸エチルで洗浄して、融点２７５−２７７℃を有する化合物Ａ１１．０ｇを得た。
【０１７９】
1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：δ（ｐｐｍ）：重ジメチルスルホキシド中、内部標準にＴＭＳ（テトラメチルシラン）を使用して測定した1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨz）：δ（ｐｐｍ）は次のとおりである。
【０１８０】
3.11（1Ｈ，dd，J=14Hzおよび9Hz），3.34（1Ｈ，dd，J=14Hzおよび4Hz），3.89（3H，s），3.98（3H，s），4.91（1Ｈ，dd，J=9Hzおよび4Hz），5.64（2H，ｓ），7.14（2H，d，J=9Hz），7.15（1H，d，J=9Hz），7.25（2H，d，J=9Hz），7.50（1H，s），7.70（1H，d，9H ），12.04（1H，s，D2O添加により消失）。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明にかかる、配列番号１〜８のいずれか一つの塩基配列で示される遺伝子の発現量は、糖尿病におけるβ細胞機能不全改善を評価するための新たな指標となりうる。したがって、該遺伝子やその産物の発現量を指標として、インスリン抵抗性改善剤やインスリン分泌促進剤等のβ細胞機能不全改善剤の簡便なスクリーニングを行うことができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１８２】
配列番号１７〜３２−人工配列の説明：プライマー
配列番号３３〜４０−人工配列の説明：プローブ
配列番号４１〜４８−人工配列の説明：プライマー
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１は、各群における血液生化学値および体重の測定結果を示すグラフである（Ａ：血糖値、Ｂ：血漿中インスリン濃度、Ｃ：体重）。
【図２】図２は、TaqMan PCRによるAK005296（配列番号１）mRNAの発現解析結果を示すグラフである。
【図３】図３は、TaqMan PCRによるZsig37（配列番号２）mRNAの発現解析結果を示すグラフである。
【図４】図４は、TaqMan PCRによるhypothetical protein（配列番号３）mRNAの発現解析結果を示すグラフである。
【図５】図５は、TaqMan PCRによるAK006207（配列番号４）mRNAの発現解析結果を示すグラフである。
【図６】図６は、TaqMan PCRによるBC010831（配列番号５）mRNAの発現解析結果を示すグラフである。
【図７】図７は、TaqMan PCRによるAK013996（配列番号６）mRNAの発現解析結果を示すグラフである。
【図８】図８は、TaqMan PCRによるBR13（配列番号７）mRNAの発現解析結果を示すグラフである。
【図９】図９は、TaqMan PCRによるκ-casein（配列番号８）mRNAの発現解析結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、２型糖尿病モデルマウスおよび正常マウスにおける、血液生化学値および体重の測定結果を示すグラフである（Ａ：血糖値、Ｂ：血漿中インスリン濃度、Ｃ：体重）。
【図１１】図１１は、Zsig37およびκ-caseinタンパクの分泌確認結果（ウェスタンブロッティング）を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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