(57)【要約】【課題】Ｉκ−Ｂキナーゼ阻害作用を有し抗炎症剤として有用なＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩を提供すること。【解決手段】式（Ｉ）2004292403.tif 000006で表されるＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する抗炎症剤、およびオイディオデンドロン（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）属に属する微生物を培地に培養し、該培地中にＥＮ１７６１ＫＡ化合物を生成、蓄積させ、該培地から該化合物を採取することを特徴とする該化合物の製造法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2004292403.tif 000005
で表されるＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１記載のＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項３】
請求項１記載のＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する抗炎症剤。
【請求項４】
オイディオデンドロン（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）属に属する微生物を培地に培養し、該培地中にＥＮ１７６１ＫＡ化合物を生成、蓄積させ、該培地から該化合物を採取することを特徴とする該化合物の製造法。
【請求項５】
微生物が、オイディオデンドロン・エスピー（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐ．）ＥＮ１７６１Ｋ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８６）である、請求項４記載の製造法。
【請求項６】
オイディオデンドロン・エスピー（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐ．）ＥＮ１７６１Ｋ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８６）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗炎症剤として有用なＥＮ１７６１ＫＡ化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＦ−κＢは刺激誘導される多くの遺伝子の転写調節領域に結合し、これらの遺伝子の転写を活性化する転写因子である。通常は不活性型のＮＦ−κＢが細胞質中に存在し、ＩκＢと呼ばれる抑制タンパク質と複合体を形成している。ＩκＢ  としては、これまでにＩκＢ−α、  ＩκＢ−β、ＩκＢ−γ、ＩκＢ−ε、Ｂｃｌ−３の５種類が同定されている。これらは、一般的には、ＮＦ−κＢに結合し、ＮＦ−κＢ活性化を抑制する機能を持つ（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
細胞外刺激によりＩκＢがリン酸化されて不活性化し、ＮＦ−κＢは解離して核内に移行し、活性型となる。このときにＩκＢをリン酸化するのがＩκＢキナーゼ（ＩκＢ  ｋｉｎａｓｅ、以下ＩＫＫと略記する。）と呼ばれる複合体である。
従って、ＩＫＫによるＩκＢのリン酸化を阻害することでＮＦ−κＢの活性化を抑制し、ＮＦ−κＢの活性化が関与する疾患を治療することができると考えられる。
【０００４】
ＩＫＫを阻害する化合物としては、例えば、βカルボリン誘導体が報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
一方、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物のようなジベンゾフラン誘導体に関しては多くの報告がある。例えば、ロドミルトキシン（ｒｈｏｄｏｍｙｒｔｏｘｉｎ）類（例えば、非特許文献２および非特許文献３参照。）、アキロフラン（ａｃｈｙｒｏｆｕｒａｎ）（例えば、非特許文献４参照。）、ＡＢ００２２Ａ（例えば、非特許文献５参照。）等が知られているが、これらのジベンゾフラン誘導体がＩＫＫ阻害活性を有しているとの報告は無い。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開第０１／６８６４８号パンフレット
【０００６】
【非特許文献１】
「ザ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９７年、第１６巻、ｐ．１４１３−１４２６
【０００７】
【非特許文献２】
「ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイアティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、１９５７年、ｐ．４１４−４１９
【０００８】
【非特許文献３】
「ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイアティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、１９６９年、第Ｃ巻、ｐ．２４０３−２４０８
【０００９】
【非特許文献４】
「ジャーナル・オブ・ナチュラル・プロダクツ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」、２００２年、第６５巻、ｐ．２０３−２０５
【００１０】
【非特許文献５】
「ザ・ジャーナル・オブ・アンタイバイオティクス（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」、２０００年、第５３巻、ｐ．９５９−９６６
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＩＫＫ阻害作用を有し抗炎症剤として有用なＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
（１）  式（Ｉ）
【００１３】
【化２】
2004292403.tif 000002
【００１４】
で表されるＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩。
【００１５】
（２）  上記（１）記載のＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬。
【００１６】
（３）  上記（１）記載のＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する抗炎症剤。
【００１７】
（４）  オイディオデンドロン（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）属に属する微生物を培地に培養し、該培地中にＥＮ１７６１ＫＡ化合物を生成、蓄積させ、該培地から該化合物を採取することを特徴とする該化合物の製造法。
【００１８】
（５）  微生物が、オイディオデンドロン・エスピー（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐ．）ＥＮ１７６１Ｋ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８６）である、上記（４）記載の製造法。
【００１９】
（６）  オイディオデンドロン・エスピー（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐ．）ＥＮ１７６１Ｋ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８６）。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
ＥＮ１７６１ＫＡ化合物の物理化学的性質は、以下に示すとおりである。なお、物理化学的性質は以下の機器により測定した。
ＦＡＢマススペクトルおよび高分解能ＦＡＢマススペクトル：日本電子  ＪＭＳ  ＨＸ／ＨＸ−１１０Ａ型質量分析装置
紫外部吸収スペクトル：島津製作所  ＵＶ−１６００ＰＣ型紫外分光光度計
核磁気共鳴スペクトル：Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭ−５００  （５００  ＭＨｚ）  型核磁気共鳴装置
【００２１】
ＥＮ１７６１ＫＡ化合物の物理化学的データ
性状：黄色針状結晶
分子式：Ｃ１８Ｈ１４Ｏ８
ＦＡＢマススペクトル：ｍ／ｚ  ３５８（Ｍ）＋，  ３５７（Ｍ−Ｈ）−
高分解能ＦＡＢマススペクトル：
実測値  ３５７．０６０６
理論値  ３５７．０６１０  （Ｃ１８Ｈ１３Ｏ８として）
紫外吸収スペクトル：λｍａｘ（ＣＨ３ＯＨ）  ｎｍ（ε）  ２７０（３７，０００），  ２８３（３０，０００），  ３０４（１５，０００），  ３９３（３，４００）
１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：δ（ＣＤＣｌ３）  ２．１５  （３Ｈ，  ｓ），  ２．７０  （３Ｈ，  ｓ），  ２．７１  （３Ｈ，  ｓ），  １０．１１  （１Ｈ，  ｓ），  １３．７６  （１Ｈ，  ｂｒ  ｓ）  ｐｐｍ．
１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル：δ（ＣＤＣｌ３）  ７．６５  （ｑ），  ３１．７  （ｑ），  ３２．７  （ｑ），９７．６  （ｓ），  １００．０  （ｓ），  １０５．４  （ｓ），  １０６．１（ｓ），  １０７．１  （ｓ），  １０９．８  （ｓ），  １５４．８  （ｓ），  １５６．６（ｓ），  １５７．９  （ｓ），  １５９．９  （ｓ），  １７２．２  （ｓ），  １７３．３  （ｓ），  １８２．３  （ｄ），  ２０３．９  （ｓ），  ２０４．２  （ｓ）  ｐｐｍ．
【００２２】
溶解性：クロロホルムおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に可溶
呈色試薬：リンモリブデン酸／硫酸セリウム試薬に陽性
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ  値：０．２５
薄層：シリカゲル  ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ社製  Ｃｒｏｍａｔｏｐｌａｃａｓ  ＨＰＴＬＣ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４  １．０５６４２）
展開溶媒：メタノール：クロロホルム（１：９  、ｖ／ｖ  ）
ＥＮ１７６１ＫＡ化合物は、後述のとおりＩＫＫを阻害する活性を有するので、ＮＦ−κＢの活性化が関与しているとされる疾患の治療剤として有用である。
【００２３】
ＮＦ−κＢの活性化が関与している疾患としては、例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性強皮症、ベーチェット病、結節性動脈周囲炎、潰瘍性大腸炎、活動性慢性肝炎、慢性糸球体腎炎、変形性関節症、痛風、アテローム硬化症、シェーグレン症候群、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、じん麻疹、食物アレルギー、各種脳炎、エンドトキシンショック、敗血症、炎症性大腸炎、糖尿病、肺炎、臓器移植に伴う拒絶反応、脳脊髄炎、食欲不振、急性肝炎、薬物中毒性肝障害、アルコール性肝炎、ウイルス肝炎、黄疸、肝硬変、肝不全、心房粘液腫キャッスルマン症候群、メサンギウム増殖性腎炎、虚血性再灌流障害、くも膜下出血、再発狭窄症（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、変形性関節症、悪液質、サイトメガロウイルス性肺炎、サイトメガロウイルス性網膜症、アデノウイルス性感冒、アデノウイルス性プール熱、アデノウイルス性眼炎、エイズ、肉芽腫を伴う肺疾患、急性骨髄芽球性白血病、多発性骨髄腫、レンネルトＴリンパ腫、腎細胞ガン等があげられる。
【００２４】
ＥＮ１７６１ＫＡ化合物の生物活性について、以下の試験例で説明する。
試験例１  ＩＫＫ阻害試験
（ａ）ＩＫＫの調製
Ｊｕｒｋａｔ細胞（理化学研究所  ＲＣＢ０８０６）を、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）５００ｍｌに７．５  ％炭酸水素ナトリウム溶液（ナカライテスク社製）１２．５  ｍｌ、ウシ胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）５０  ｍｌ、５０  ｍｍｏｌ／ｌ  ２−メルカプトエタノール０．５  ｍｌ、２００  ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−グルタミン溶液（ナカライテスク社製）５  ｍｌ、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製）５  ｍｌを添加して得られる培地中で、３７℃、７２時間培養し、得られた培養液に５  ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（インタージェン社製）を添加し、３７℃で１０分間培養した後、細胞を集めた。
【００２５】
集めた細胞をりん酸緩衝生理食塩水〔０．４５ｇ／ｌりん酸二水素ナトリウム二水和物、３．３２ｇ／ｌりん酸一水素ナトリウム十二水和物、８．００ｇ／ｌ塩化ナトリウムを含む〕で２回洗浄後、約５倍量の細胞溶解バッファー〔２０  ｍｍｏｌ／ｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ７．５）、１  ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン四酢酸、１  ｍｍｏｌ／ｌ  エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、０．５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、０．２５％トリトンＸ−１００、０．３  ｍｍｏｌ／ｌ  ｏ−バナジン酸ナトリウム、１０  ｍｍｏｌ／ｌグリセロール−２−りん酸、１０  ｍｍｏｌ／ｌふっ化ナトリウム、１０  ｍｍｏｌ／ｌ  ｐ−ニトロフェニルりん酸、１  ｍｍｏｌ／ｌジチオスレイトール、１  ｍｍｏｌ／ｌ  ペファブロック（ｐｅｆａｂｌｏｃ、ロシュ社製）、コンプリート  プロテアーゼ  インヒビター  ミクスチャー（ロシュ社製）および１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含む〕で溶解し、１００，０００ｇ、１時間遠心分離して細胞抽出液を得た。
【００２６】
この細胞抽出液を１００倍量の透析バッファー〔５０  ｍｍｏｌ／ｌ  ビス−トリスプロパン塩酸塩（ｐＨ７．０）、５０  ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１  ｍｍｏｌ／ｌジチオスレイトールおよび０．０２５％  Ｂｒｉｊ−３５（ナカライテスク社製）を含む〕で３回透析し、透析された細胞抽出液を１０，０００ｇ、１０分間遠心分離することにより、細胞抽出液中の不溶物を除去した。この細胞抽出液を透析バッファーと同じ組成からなるバッファーで平衡化した強塩基性陰イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ  ＨＱ、ロシュ社製）に供し、塩化ナトリウム濃度勾配（５０  ｍｍｏｌ／ｌ〜１  ｍｏｌ／ｌ）により溶出した。
【００２７】
得られた溶出液をセントリプレップ３０（ミリポア社製）で濃縮し、ゲルろ過カラム（ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０、アマシャムファルマシア社製）に供し、ゲルろ過溶出バッファー（５０  ｍｍｏｌ／ｌ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ７．５）、１５０  ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１  ｍｍｏｌ／ｌジチオスレイトール、０．５  ｍｍｏｌ／ｌエチレンジアミン四酢酸および０．０２５％  Ｂｒｉｊ−３５を含む）により分離した。
高分子量（７００キロダルトン）付近の画分を集め、セントリプレップ３０で濃縮したのち、濃縮液に等量のグリセロールを添加し、−２０℃で保存した。
【００２８】
（ｂ）マルトース結合蛋白質−ＩκＢ−α融合蛋白質の調製
既知となっているヒトＩκＢ−αのアミノ酸配列［ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション・ナンバーＰ２５９６３］１から２８７のうち２８３のセリンを、以下のような方法によりアラニンに置換した。
【００２９】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＩ  サイトに組み込まれたヒトＩκＢ−αｃＤＮＡをテンプレートとし、配列番号１および配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用い、ＰＣＲ法によりアミノ酸置換を行った。  ＰＣＲ反応は、反応液［テンプレート  １．５〜２．５ｐｍｏｌ、プライマー各２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物それぞれ２００ｍｍｏｌ／ｌ、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）１．２４ｕｎｉｔ］を用い、９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１．５分間の反応を１サイクルとして、３０サイクル反応させることにより行った。反応生成物から制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩによりヒトＩκＢ−αＤＮＡ断片を切り出した。
【００３０】
得られたＤＮＡ断片を、ｐＭＡＬ−ｃ２（ニューイングランドバイオラブ社製）のＥｃｏＲＩサイトとＳａｌＩサイトの間に付属のインストラクションマニュアルにしたがって組み込み、マルトース結合蛋白質とＩκＢ−αの融合蛋白質を発現させるベクターを構築した。この発現ベクターを大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）株（ストラタジーン社製）に導入し形質転換株を得た。この形質転換株を培養し、得られた菌体を溶解させて、蛋白質抽出液を得た。この蛋白質抽出液からアミロースレジン（ニューイングランドバイオラブ社製）を用いて付属のインストラクションマニュアルにしたがって精製を行い、マルトース結合蛋白質−ＩκＢ−α融合蛋白質を得た。
【００３１】
（ｃ）ＩＫＫ活性の測定
７５μｌのマルトース結合蛋白質−ＩκＢ−α融合蛋白質溶液（マルトース結合蛋白質−ＩκＢ−α融合蛋白質１５μｇ／ｍｌおよび５０  ｍｍｏｌ／ｌ  炭酸水素ナトリウム／炭酸ナトリウムを含む、ｐＨ９．５）を白色９６ウェルプレート（ＭＳ−８４９６Ｗ、住友ベークライト社製）の各ウェルに分注し、室温で２時間放置することによりマルトース結合蛋白質−ＩκＢ−α融合蛋白質をウェル表面に吸着させた。余分な溶液を除去した後、３００μｌのブロッキング・バッファー〔５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（よつば乳業社製）、１０  ｍｍｏｌ／ｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ７．５）、１５０  ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０（バイオラッド社製）を含む〕を加えて、室温で１時間放置し、ウェル表面をブロッキングした。
【００３２】
つづいて、各ウェルを５００μｌの洗浄バッファー〔１０  ｍｍｏｌ／ｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ７．５）、１５０  ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（バイオラッド社）を含む〕でオートセルウォッシャー（バイオテック社製）を使用して４回洗浄した。このウェルに反応液１００μｌ〔５０  ｍｍｏｌ／ｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ７．５）、１０  ｍｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウム、０．４  ｍｍｏｌ／ｌペファブロック、１０μｍｏｌ／ｌ  ＭＧ−１３２（ペプチド研究所社製）、０．１  ｍｍｏｌ／ｌアデノシン三りん酸、２０μｇ／ｍｌ  ＩＫＫ（酵素添加の場合）、１％（ｖ／ｖ）ジメチルスルフォキシド、およびＥＮ１７６１ＫＡ化合物（被験化合物添加の場合）を含む〕を加え、３０℃で５０分間放置した後、各ウェルをオートセルウォッシャーを用いて５００μｌの洗浄バッファーで洗浄し、反応を停止させた。
【００３３】
１００μｌの抗ホスフォセリン３２、および１００μｌのホスフォセリン３６ＩκＢ−αモノクローナル抗体溶液（５Ａ５、セルシグナリングテクノロジー社製）を抗体希釈液〔５％（ｗ／ｖ）  脱脂粉乳、１０  ｍｍｏｌ／ｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ７．５）、１５０  ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む〕で１６０００倍希釈したものを該ＥＬＩＳＡプレートに加えて室温で１時間放置した後、５００μｌの洗浄バッファーでオートセルウォッシャーを用いて４回洗浄した。ユーロピウム標識抗マウスＩｇＧ抗体溶液（アマシャムファルマシア社製）を希釈液（ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ、アマシャムファルマシア社製）で５０倍希釈したものを１００μｌ加えて、室温で１時間放置した後、５００μｌの洗浄バッファーでオートセルウォッシャーを用いて４回洗浄した。１００μｌのエンハンスメント溶液（アマシャムファルマシア社製）を加え、マルチラベルカウンター（ＡＲＶＯ１４２０、ワラックオイ社製）でユーロピウムの時間分解蛍光（励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長６１５ｎｍ）を付属のインストラクションマニュアルにしたがって測定した。
【００３４】
ＥＮ１７６１ＫＡ化合物を添加した場合の蛍光強度、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物を添加しない場合の蛍光強度、ならびにＩＫＫおよびＥＮ１７６１ＫＡ化合物を添加しない場合の蛍光強度を測定し、それぞれＡ、ＢおよびＣとして、以下の式により、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物のＩＫＫ活性の阻害率を求めた。
ＩＫＫ活性の阻害率（％）＝１００−〔（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００〕
この結果、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物によるＩＫＫ活性の阻害率は、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物の濃度が１μｍｏｌ／ｌの場合には５３．９％であり、１０μｍｏｌ／ｌの場合には、８４．５％であった。
【００３５】
試験例２  抗炎症作用試験
抗炎症作用は、マウスカラゲニン誘発エアポーチ炎症モデル［Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ    Ｍｅｄ．，  ７，  １２９１−１２９７，  ２００１］を用いて試験した。ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（雄性、７週齢、日本チャールス・リバー社）を一群１０匹とし、マウス背部皮下に２日毎に計４回、空気（３〜４ｍｌ／回）を注入してエアポーチを形成させた。４回目の空気を注入した翌日に０．２％（ｗ／ｖ）カラゲニン（シグマ・アルドリッチ社製）１ｍｌをエアポーチ内に注入して炎症反応を惹起した。
【００３６】
ＥＮ１７６１化合物は０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０（和光純薬工業社製）を含む生理食塩液（大塚製薬工場社製）で最終濃度０．３および１ｍｇ／ｍｌとなるように懸濁し、カラゲニン注入と同時に０．１ｍｌ／１０ｇ（体重）の割合で腹腔内投与し、それぞれＥＮ１７６１ＫＡ化合物の３ｍｇ／ｋｇ投与群および１０ｍｇ／ｋｇ投与群とした。また、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含む生理食塩液のみを同様に腹腔内投与し、溶媒投与群とした。カラゲニン注入２４時間後に、マウスを麻酔下に脱血死させ、エアポーチ内に生理食塩液２ｍｌを注入し、エアポーチ内の液を回収し、液中の浸潤白血球数を全自動血球計数器ＣｅｌｌｔａｃαＭＥＫ−６１５８（日本光電社製）を用いて測定した。統計学的な危険率（ｐ値）はＤｕｎｎｅｔｔ検定により求めた。
この結果、細胞浸潤は溶媒投与群と比較してＥＮ１７６１ＫＡ化合物の３ｍｇ／ｋｇ投与群で４７．５％（ｐ＝０．０１１２）、１０ｍｇ／ｋｇ投与群で４２．４％（ｐ＝０．０２３８）となり、いずれのＥＮ１７６１ＫＡ化合物の投与群でも細胞浸潤は有意に抑制されることが示された。
【００３７】
ＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩は、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用されるものである。
本発明の医薬製剤は、活性成分としてＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩を単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。本発明の医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において用いられる任意の方法により製造される。
【００３８】
投与経路としては、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内等の非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、注射剤等があげられる。
経口投与に適当な、例えば錠剤等は、乳糖、マンニット等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。
【００３９】
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
【００４０】
ＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常経口の場合、成人一人当り０．０１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１ｇ、さらに好ましくは０．０５〜５０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与等の非経口投与の場合、成人一人当り０．００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
【００４１】
次に、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物の製造法について説明する。
ＥＮ１７６１ＫＡ化合物は、オイディオデンドロン（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）属に属する微生物を培地に培養し、該培地中に該化合物を生成、蓄積させ、該培地から該化合物を採取することによって製造される。
ＥＮ１７６１ＫＡ化合物を生成する能力を有する微生物としては、オイディオデンドロン（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）属に属し、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物を生成する能力を有する微生物であればいずれの微生物でも用いることができる。
【００４２】
また、これらの微生物を人工的変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ  線照射、変異誘起剤処理などによって変異させた変異株または自然的に変異した変異株でも、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物生産能を有するものであれば本発明に用いることができる。
本発明に用いられる微生物としては、例えば、オイディオデンドロン・スピーシーズ（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐ．）ＥＮ１７６１Ｋ株等をあげることができる。
【００４３】
オイディオデンドロン・スピーシーズ（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐ．）ＥＮ１７６１Ｋ株は、土壌より分離した微生物で、その菌学的性質は次のとおりである。
１．肉眼的観察
本菌株を、麦芽エキス寒天培地を用いて、２５℃で培養したとき、集落の直径は、培養１０日目で１７〜２４ｍｍ、培養１７日目で２０〜３１ｍｍに達する。培養１７日目の集落の表面中央部は、灰黄色、その外側は極めて薄い黄色を呈する。また、中央部に薄黄色の溶液を生産する。集落の裏面中央部は暗い灰黄緑色、外側は薄い緑みの黄色を呈する。
【００４４】
本菌株を、バレイショ・ブドウ糖寒天培地を用いて、２５℃で培養したとき、集落の直径は、培養１０日目で２５〜２８ｍｍ、培養１７日目で３５〜３８ｍｍに達する。培養１７日目の集落の表面中央部は、明るい灰黄緑色、その外側は極めて薄い黄色を呈する。集落の裏面中央部は暗い黄色、その外側はくすんだ黄色を呈する。また、表面中央部と集落の周囲に薄褐色の溶液を生産する。
【００４５】
本菌の生育温度範囲は１１．５〜３４．５℃で、２９．０℃付近で最も良好に生育する。生育ｐＨ範囲は３．０〜９．０で、ｐＨ６．０前後で最も良好に生育する。
２．光学顕微鏡観察
本菌株を、麦芽エキス寒天培地を用いて、２５℃で１０日間培養したときの本菌の光学顕微鏡による観察結果は以下の通りである。
【００４６】
菌糸は、隔壁を有し、幅０．８〜２．０μｍ、平滑、無色、よく分岐する。分生子柄は、培地から直立し、隔壁を有し、幅１．５〜２．０μｍ、長さ１５〜６７μｍ、平滑、淡灰黄緑色で、分生子柄の上部で分岐する。分岐した分生子柄の基部から先は分生子に分化し、そこが卵形〜円筒形の分節型分生子となる。分生子は淡灰黄緑色その表面は平滑、長さは１．５〜４．０μｍ、幅は１．５〜２．０μｍである。本菌株は、上述したアナモルフのみ観察され、テレオモルフは観察されない。
【００４７】
以上の菌学的性質から、本菌株の分類学的位置を［Ｊ．  Ａ．  ｖｏｎ  Ａｒｘ，  Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉ  Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｕｒｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｌｕｂｒｅｃｈｔ    ａｎｄ  Ｃｒａｍｅｒ，  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  １９７４］に従って検索した結果、本菌株は糸状不完全菌オイディオデンドロン（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）属に属することが明らかとなり、オイディオデンドロン・スピーシーズ（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐ．）ＥＮ１７６１Ｋと命名した。本菌株は、ブダペスト条約に基づいて、平成１４年６月２１日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８０８６として寄託されている。
【００４８】
オイディオデンドロン（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）属に属し、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物を生成する能力を有する微生物の培養に際しては、通常の糸状菌の培養法を用いることができる。
培地としては、該微生物の資化し得る炭素源、窒素源、無機物などを程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用できる。
【００４９】
炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フルクトース、シュクロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜等が単独または組合せて用いられる。さらに、微生物の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸等も用いられる。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸等が単独または組合せて用いられる。
【００５０】
そのほか、必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム・８水塩、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅等の無機塩類を加えてもよい。
さらに、該微生物の生育、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物の生産を促進する微量成分としてビタミン、ｐＨ緩衝剤等を添加してもよい。
【００５１】
培養法としては、液体培養法、特に深部攪拌培養法が適している。培養は、１６〜３７℃、好ましくは  ２５〜３２℃の温度で、ｐＨ  ４〜１０、好ましくはｐＨ  ６〜８  で行われる。
培地のｐＨの調整にはアンモニア水や炭酸アンモニウム溶液などが用いられる。通常、１〜１０日で、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物が培養液中に生成蓄積されるが、培養液中の蓄積量が最大に達したときに培養を停止することが好ましい。
【００５２】
培養液中に蓄積したＥＮ１７６１ＫＡ化合物を培養物から採取するに方法としては、通常の微生物代謝産物を培養物から単離精製するために通常用いられる方法を用いることができる。例えば、培養液または培養液中の菌体から抽出液を得て、該抽出液からＥＮ１７６１ＫＡ化合物を得ることができる。抽出液としては、培養液にメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン等のアルコールを加え、活性成分を抽出し、ろ過等により菌体を除去してこれを抽出液としてもよいし、２−ブタノン、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ブタノール等の溶媒で２層分配抽出して、有機層に活性成分を抽出し、これを抽出液としてもよい。また、培養液を濾過により培養濾液と菌体とに分け、該菌体から、クロロホルム、アセトン、メタノール等の溶媒で菌体成分を抽出し、ろ過等により菌体を除去したものを抽出液としてもよい。
【００５３】
上記抽出操作の後、抽出液をポリスチレン系吸着剤、例えばダイヤイオンＨＰ−２０  （三菱化学社製）等に通塔して活性成分を吸着させ、ついでメタノール、アセトン等で溶出する。
溶出液を常法により濃縮し、得られる濃縮液よりＥＮ１７６１ＫＡ化合物を得ることができる。
【００５４】
また、溶出液をそのまま、または常法により濃縮して、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、シアノプロピル基結合型シリカゲル、２，３−ジヒドロキシプロポキシプロピル基結合型シリカゲル、オクタデシル基結合型シリカゲル（ＯＤＳ）などによるカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどに供してＥＮ１７６１ＫＡ化合物を得ることもできる。
【００５５】
ＥＮ１７６１ＫＡ化合物の薬理学的に許容される塩に用いられる塩としては、薬理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩をあげることができる。金属塩としてはリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられ、アンモニウム塩としてはアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩があげられ、有機アミン付加塩としてはモルホリン、ピペリジン等の付加塩、アミノ酸付加塩としてはグリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン等の付加塩があげられる。
【００５６】
ＥＮ１７６１ＫＡ化合物の薬理学的に許容される塩は、該塩が得られる時はそのまま精製して得ることができる。また、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物が遊離の形で得られる時は適当な溶媒に溶解または懸濁し、上記塩を加えて、塩を形成させればよい。
また、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩は、水あるいは各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、それら付加物も本発明に包含される。
以下に、本発明の態様を実施例で説明する。
【００５７】
【実施例】
実施例１  ＥＮ１７６１ＫＡ化合物の製造
Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｓｐ．ＥＮ１７６１Ｋ株を、３００ｍＬ容三角フラスコ中の、２０ｇ／Ｌグルコース、３０ｇ／Ｌマッシュポテト、５ｇ／Ｌ酵母エキスを含有する培地（ｐＨ６．５）  ５０ｍＬに一白金耳ずつ、合計７本に植菌し、２５℃で１２０時間振盪培養を行った。以下の培養は全て同じ組成の培地を用いた。
【００５８】
得られた培養液を５Ｌ容ジャーファーメンター中の３Ｌの培地に３００ｍＬ植菌し、２８℃で４８時間、３００ｒｐｍで通気攪拌培養を行った。得られた培養液のうち７５０ｍＬを３０Ｌ容ジャーに入った培地１５Ｌに添加し、６本の５Ｌ容ジャーに入った培地３Ｌに一本につき１５０ｍＬずつ添加した。２５℃で１４４時間通気撹拌培養を行った。攪拌速度は、５Ｌ容のジャーファーメンターでは、３００ｒｐｍとし、３０Ｌ容ジャーファーメンターでは、２００ｒｐｍとした。
【００５９】
得られた培養液３２Ｌに水飽和２−ブタノン２７Ｌを加え、一時間攪拌した後に水層と有機層に分けた。水層には、さらに水飽和２−ブタノン２７Ｌを加え、一時間攪拌した後に水層と有機層に分けた。２回の抽出操作で得られた有機層３９Ｌを合わせ、減圧下で４Ｌまで濃縮した。得られた濃縮液に４Ｌの水を加え、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）を１．３Ｌ充填したカラムに通塔して活性成分を吸着させた。
【００６０】
３０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液１Ｌ、５０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液１Ｌで洗浄後、メタノール３．６Ｌおよびアセトン４Ｌで活性成分を溶出した。
高速液体クロマトグラフィー分析によりＥＮ１７６１ＫＡ化合物が検出された画分について、減圧下で有機溶媒を留去した後、塩酸で液性を酸性とし、クロロホルムを添加して、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物をクロロホルム層に抽出した。クロロホルムを減圧下で留去し、析出物を粗精製物として１．５ｇ得た。粗精製物１．５ｇを２，３−ジヒドロキシプロポキシプロピル基結合型シリカゲルで精製し、さらにクロロホルムを用いて再結晶を行い、ＥＮ１７６１ＫＡ化合物５１０ｍｇを得た。
【００６１】
【発明の効果】
本発明により、ＩＫＫ阻害活性を有し抗炎症剤として有用なＥＮ１７６１ＫＡ化合物またはその薬理学的に許容される塩が提供される。
【００６２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【００６３】
【配列表】
2004292403.tif 000003
2004292403.tif 000004