(57)【要約】【課題】組織の損傷部位に投与された際に、その部位に安定に保持することが可能であり、さらにその特性により循環器組織の再生・修復に有効である肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の誘導体を提供すること。【解決手段】本発明は、生理的条件下で安定なコラーゲン結合性を示し、ＨＧＦ本来の活性を失わずに内皮細胞への増殖活性を示すＨＧＦ誘導体を開示する。この誘導体はファイブロネクチンのコラーゲン結合性ドメインから選択されたアミノ酸配列とＨＧＦのキメラ蛋白質（融合蛋白質）として設計され、上記の２つの活性を同時に長期間にわたって示すため、投与された損傷組織に保持され、その部位に血管新生を誘導することが可能である。さらに循環器組織の再生に有用な、コラーゲンおよび／またはゼラチンを含む構造物に上記キメラタンパク質を結合させてなる組織工学的材料も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦとＨＧＦ以外のポリペプチドでありコラーゲン結合性を有するポリペプチドが直接あるいは他の介在配列を介して連結されてなる融合蛋白質であるＨＧＦの誘導体であって、該ポリペプチドによるコラーゲン結合性が維持されるとともにＨＧＦとしての活性も維持されることを特徴とするＨＧＦ誘導体。
【請求項２】
該ポリペプチドはファイブロネクチンの部分配列である請求項１に記載のＨＧＦ誘導体。
【請求項３】
前記ファイブロネクチンの部分配列が、アミノ酸番号２６０から４８４までの配列あるいは２６０番から５９９までの配列のいずれかである請求項２に記載のＨＧＦ誘導体。
【請求項４】
配列表５番のアミノ酸番号２２から９５１で示される配列で表される請求項１〜３のいずれかに記載のＨＧＦ誘導体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＨＧＦ誘導体とコラーゲン材料を組み合わせた生体移植材料。
【請求項６】
前記生体移植材料は、表面にコラーゲン材料が存在する人工血管もしくはステント、シート状成型物であり、該コラーゲン材料にＨＧＦ誘導体が結合した請求項５に記載の生体移植材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、肝細胞増殖因子ＨＧＦの誘導体に関する。また本発明はその誘導体の用途に関する。
【０００２】
【従来技術】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は当初、肝細胞の増殖刺激因子として発見されたものであり、その遺伝子は１９８９年にクローニングされている（Ｍｉｙａｚａｗａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ，  ＢＢＲＣ．  １６３，  ９６７−９７３  （１９８９）；  Ｎａｋａｍｕｒａ．  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，  ４４０−４４３  （１９８９））。その後ＨＧＦは、培養腎尿細管細胞の分散を促進する因子（Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｆａｃｔｏｒ，  ＳＦ）と同一のものであることが明らかとなり（Ｇｈｅｒａｒｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６，  ２２８  （１９９０））、さらには、上皮細胞の増殖促進、遊走性を高める活性、メラノーマなどの癌細胞の増殖抑制効果、抗アポトーシス作用、抗繊維化作用など様々な活性をもつことが明らかとなってきている。このような多様な生物活性のうちでも、特に注目されているのが血管新生活性であり、治療への応用が期待されている。
【０００３】
Ｒｕｂｉｎら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８，  ４１５−４１９  （１９９１））は、繊維芽細胞から精製されたヘパリン結合性の増殖因子が、血管内皮細胞に対しても増殖刺激活性を持つことを報告している。内皮細胞に対するこのような活性は、ＦＧＦ２などと同等であった。彼らによれば、この因子はＨＧＦの変異体であり、Ｍｉｙａｚａｗａらが報告した配列に比べると連続する５アミノ酸が欠失したものであった。この変異体が生体内で実質的な血管の新生を誘導するかどうかは、明らかにはなっていない。Ｎａｋａｍｕｒａら（１９９６）は、ＨＧＦが血管内皮細胞に対して他の血管新生因子、ＦＧＦ２（塩基性繊維芽細胞増殖因子）やＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）に比べてより強い活性をもつこと、また血管平滑筋細胞には効果を示さないことを報告し、血管内皮に特異的な成長因子であると述べている（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，  ２８，４０９−１３；  Ｊ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．  １４，  １０６７−７２）。
このような培養細胞を用いた実験は単に増殖効果を見ているだけの可能性があるため、より直接的には生体内での効果を見る方が望ましい。たとえば生体に対する血管新生活性を評価する手法として、鶏卵漿尿膜（ＣＡＭ）や実験動物の角膜に投与するアッセイ方法が知られている。初期の報告として例えば、特開平６−９６９１は、ＣＡＭ法で血管新生活性をもつ因子を卵巣腫瘍由来の細胞から精製したところ、その実体がＨＧＦであったことを述べている。また、Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１９，  ６２９−６４１  （１９９２））やＧｒａｎｔら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  １９３７−１９４１  （１９９３））は、角膜にＨＧＦを投与して、血管新生が誘導されることを明らかにしている。Ｍｏｒｉｓｈｉｔａらはさらに、下肢を虚血状態にしたウサギにＨＧＦを血管内投与して下肢での血管新生が誘導されることを報告している（Ｃｉｒｃｕａｌｔｉｏｎ，  １００，  ＩＩ３０１−８；  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，  ３３，  １３７９−８４  （１９９９））。
【０００４】
これらの報告を背景に、ＨＧＦを血管新生療法に利用しようとする試みが続けられている。すなわち、血管が失われた組織部位あるいは近傍にＨＧＦを投与して、閉塞した血管の代わりに新しい血管を誘導して、血流を回復し下肢や心筋などの虚血状態を改善する治療法である。例えば、冠動脈の閉塞により下流の微小血管が消滅して虚血状態となり、心筋壊死・心筋梗塞に至るが、従来このような病状に対して、バルーンカテーテルやステントによる血管の拡張手術や、あるいは、他の部分の血管を移植するバイパスグラフト（ＣＡＢＧ）などの方法が行われてきた。しかし、これらの治療法における、再発（血管の再狭窄）の問題は解決されていない。それらの治療法に変わる新しい試みとして、血管新生因子（ＨＧＦやＶＥＧＦ）を投与して、心筋梗塞部位に新しい血管を新生させ（バイパス血管、側副血行路）、心筋壊死の進行をとめ、心機能の保全を図る方法が検討されている。
しかしながら、蛋白質性の成長因子は、一般的に溶液中では半減期が短くまた投与部位に長期間保持されないことから、目的とする部位での血管新生を十分に誘導できない可能性も指摘されている。実際にこれまで動物実験では効果があるとされていたＦＧＦ２（Ｈｅｎｒｙら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １０２，  ＩＩ−３０９  （２０００））やＶＥＧＦ（Ｓｉｍｏｎら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １０５，  ７８８−７９３  （２００２））がヒトでの臨床試験（冠動脈内投与）では著明な効果が無かったとされている。従ってこれらの血管新生因子の効果を持続させるような方法が求められている。
【０００５】
蛋白質性の成長因子自体でなく、代わりその遺伝子を用いる方法も検討されている。まずＶＥＧＦの遺伝子が検討され、ヒトでの臨床試験でも効果があると報告された（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら、  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ９７，１１１４−１１２３（１９９８）；Ｉｓｎｅｒら、  Ｊ．  Ｖａｓｃ．  Ｓｕｒｇ．  ２８，  ９６４−７３（１９９８）；  Ｌｏｓｏｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５，  ２０１２−２０１８  （２００２））。また同様にＨＧＦの遺伝子治療の効果も下肢虚血動物で報告され（Ｔａｎｉｙａｍａら、  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ８，１８１−１８９（２００１））、臨床試験も開始されている。これらの試験ではいずれも、遺伝子のベクターとしてはプラスミドを用いている。遺伝子が細胞に取り込まれてその中で発現するため、効果が持続すること、また因子は投与部位付近のみで作用し、拡散して他の部位に副作用を及ぼす可能性が低いとされている。ただし、プラスミドベクターを用いているため、多量のプラスミドＤＮＡを調整して注射する必要がある（１ｍｇ前後）。また遺伝子が発現するまでには時間がかかり、蛋白質性の成長因子の即効性に比べると欠点といえる。
こうした蛋白質あるいは遺伝子の投与とは別に、より直接的には血管になりうる細胞を患部へ移植する方法も検討されている。このような細胞治療の手法は、成人の循環血液中に血管の前駆細胞が存在しているという報告（Ａｓａｈａｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，  ９６５−７（１９９７））を契機として、急速に展開している。血管内皮の前駆細胞は、骨髄中に由来し血流中に循環していると考えられている。また同様の細胞は臍帯血中にもあることが明らかになっている。これまでに骨髄細胞の下肢虚血患者への移植例（Ｔａｔｅｉｓｈｉ−Ｙｕｙａｍａら、Ｌａｎｃｅｔ，３６０，  ４２７−３５（２００２））と骨髄及び末梢血細胞の心筋梗塞患者心筋への移植例（Ａｓｓｕｍｕｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６，６３−６１（２００２））が報告されている。
【０００６】
またさらに心筋梗塞の究極の治療としては、心筋に分化しうる細胞などを移植する、心筋再生療法が考えられている。ヒトでは心筋細胞は生後、分裂することがないため、壊死した心筋組織の再生は起こらないとされている（ただし近年、ラットなどの実験動物では虚血状態の心筋で細胞の増殖が認められるとの報告もある）。これに対し、胎児の心筋細胞は明確な分裂能をもち、ラットやイヌの胎児から採取され培養された心筋細胞を、成獣の心筋梗塞部位に移植すると心筋組織に生着し心機能が改善されたと報告されている（Ｋｏｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．９６，２０３４−４２  （１９９５）；  Ｌｉら、Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ７８，  ２８３−８（１９９６）；  Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ６２，  ６５４−６０（１９９６）；  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  ９６，  ＩＩ１７９−８６（１９９７）；  Ｓｃｏｒｓｉｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４，  ＩＩ３３７−４９  （１９９６）；  Ｃｏｎｎｏｌｄ，ら、Ｊ．  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．  １８，  ６３−７０（１９９７）；  Ｌｅｏｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４，  ＩＩ３３２−６（１９９６））。ただしこの方法がヒトに適用できるものではないのは倫理的に明らかである。そのため、ＥＳ細胞を心筋細胞に分化させることも考えられているが、移植時の拒絶の可能性についての対応を検討する必要がある。骨髄由来の細胞を株化して心筋細胞・組織へ誘導するという報告もあるが（Ｍａｋｉｎｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３，６９７−７０５）ヒトでの可能性については明らかではない。また自己の骨格筋の筋芽細胞を心筋細胞の代用とする研究も行われている（ＭｅｎａｓｃｈｅらＬａｎｃｅｔ  ３５７，２７９−２８０，（２００１））。
これらの移植治療で問題となるのは、移植する細胞をいかに効率的に生着させ組織形成を確実に誘導するかであるが、このような問題点を解決するためには、細胞が移植された環境を好適に整えることであり、特に血流が確保された環境を整えることが望ましい。
Ｇｏｌｄｂｅｒｇらは、血管グラフトや皮膚移植の際、ＨＧＦを同時に投与することが移植片の生着に有効であるとしている（米国特許５，９６５，５２３）。この特許は、ＨＧＦをマトリゲルに混合して組織に埋め込んだ場合に、その後投与部位近傍に血管新生が誘導されるということを開示したものであるが、実質的には前述のＣＡＭや角膜を用いるアッセイ法と同じであり、ＨＧＦ投与によって移植組織の生着に効果があったかどうかは明らかにしていない。上述のとおり蛋白質性の因子は投与部位で長期間活性が維持され難いため、因子の効果を持続させるための方法がさらに必要である。
【０００７】
以上の様に血管新生因子としてのＨＧＦについては、１）その蛋白質あるいは２）遺伝子を直接投与して虚血部位に血管新生を誘導する薬剤としての利用法が考えられており、また、３）組織を移植する際に併用して、血管新生を誘導し、移植環境を整えて移植組織の生着を図ることなどの応用が想定される。
このような利用法において、実質的な効果を得るためには、蛋白質としての安定性と投与部位で長期的に保持される特性を合わせて持つことが望ましいが、従来そのような特性を示すようにするための方法について開示されたものは無かった。また、組織構造を持たない分散された状態の細胞集団を移植し生着させる上で有効なＨＧＦの適用方法あるいは改良方法についても特に開示されたものはない。細胞が組織化に至るまでには、組織片の生着とは様式も異なり、また時間を要するため、ＨＧＦの効果をより持続させる方法が望まれる。
そのような方法としてＨＧＦを組織に親和性を持たせることが考えられる。中でも組織コラーゲンへの結合性が考えられる。コラーゲンは体中のほとんどの部位に存在しているためである。このような点について一つの示唆を与える報告がある。すなわちコラーゲンがＨＧＦへの結合性を有していることについての報告である（Ｓｃｈｕｐｐａｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１４，１３９−１５２  （１９９８））。しかしながらその報告によれば、この結合性は弱いものであり、生体への実質的な適用の上で効果が期待できない。例えば、生理的塩濃度（０．９％ＮａＣｌ、２９０ｍＯｓｍ）より低張な２００ｍＯｓｍ溶液中でも一旦結合したＨＧＦのほぼ１／２が解離するとしている。またＨＧＦ適用量がごく微量である場合にはその１０−２０％の量が結合するものの、添加濃度が高くなると３−４％が結合するのみで、結合容量は非常に低い。例えば４０ｎｇＨＧＦ／１００μｌで添加した場合には１．５ｎｇ程度で結合が飽和する結果が示されている。生理的条件下でも遊離するような弱い結合性であると、投与したＨＧＦの殆どは拡散し、目的以外の部位での血管新生など望ましくない副作用が懸念される。従ってＨＧＦがもつこのような特性を遙かに越えたコラーゲン結合性を付与することが望ましいが、これまでにそのような方法は開示されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、ＨＧＦを安定的に組織に固定化し長期間その活性を維持する方法については、知られていない。本発明の課題は従って、ＨＧＦ分子を改良して、強固な組織親和性を有するＨＧＦの誘導体を提供することにある。またさらにこの誘導体を用いて、細胞移植の際の生着率を高めるよう移植部位の血管新生を誘導する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の課題に対し検討した結果、遺伝子工学的に改変してコラーゲン結合性を付与したＨＧＦ誘導体が有効であることを見いだし本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下によって可能となる。
１）ＨＧＦとＨＧＦ以外のポリペプチドでありコラーゲン結合性を有するポリペプチドが直接あるいは他の介在配列を介して連結されてなる融合蛋白質であるＨＧＦの誘導体であって、該ポリペプチドによるコラーゲン結合性が維持されるとともにＨＧＦとしての活性も維持されることを特徴とするＨＧＦ誘導体。
２）該ポリペプチドがファイブロネクチンの部分配列である前記１に記載のＨＧＦ誘導体。
３）前記ファイブロネクチンの部分配列が、アミノ酸番号２６０から４８４までの配列あるいは２６０番から５９９までの配列のいずれかである請求項２に記載のＨＧＦ誘導体。なお、この場合のアミノ酸番号とはファイブロネクチン成熟蛋白質のアミノ末端から数えたアミノ酸の番号である。
４）配列表配列番号５番のアミノ酸番号２２から９５１で示される配列で表される前記１〜３のいずれかに記載のＨＧＦ誘導体。
５）前記１〜４のいずれかに記載のＨＧＦ誘導体とコラーゲン材料を組み合わせた生体移植材料。
６）前記生体移植材料は、表面にコラーゲン材料が存在する人工血管もしくはステント、シート状成型物であり、該コラーゲン材料にＨＧＦ誘導体が結合した前記５に記載の生体移植材料。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明をさらに説明する。
ＨＧＦに組織親和性を付与することにより、投与された組織部位でＨＧＦとしての効果が持続するような新規のＨＧＦ誘導体が可能となる。組織親和性とは本発明では組織中の細胞外マトリックスへの結合性を意味する。マトリックス成分の中でもコラーゲンが特に望ましい。コラーゲンは体中のほとんどの部位に存在し、組織損傷時に露出すると考えられる。組織損傷時とは、疾病やけがなどによって損傷する場合以外にも、注射針による穿刺や細胞・組織の移植操作によって組織構造が改変される場合も含む。このように露出したコラーゲンに対して、親和性を持たせるために、本発明では、ＨＧＦの融合蛋白質を設計した。またこのような結合性をもつＨＧＦ誘導体は、コラーゲン材料と組み合わせて移植などに用いることも可能となる。
前述のように、コラーゲンがＨＧＦを結合する能力があることは報告されているが、その結合性は非常に弱く、いったん結合したものも生理的条件下では遊離するため拡散による副作用の可能性があると考えられる。そのため本発明では、ＨＧＦそのものには見られない、より強固で安定なコラーゲン結合性を持つように、改良・設計したＨＧＦ誘導体を提案している。本発明のＨＧＦ誘導体は、コラーゲンに対する結合性がＮａＣｌ濃度０．１５Ｍ以上さらには２Ｍであっても維持されるものであって、結合量は、濃度依存的に増加させることができ、状況に左右されずに安定したＨＧＦ活性が発揮されるるとともに、後述するようにＨＧＦ単体の場合より優れたＨＧＦ活性をも発揮することができる。
そして、本発明のＨＧＦ誘導体をコードする遺伝子も体内に投与することにより、該ＨＧＦ誘導体を直接投与する場合と同様、発現したＨＧＦ誘導体が投与部位に固定化され、あるいは滞留する特性を享受することができる。
【００１１】
前記ＨＧＦ誘導体を生産するにあたっては、ＨＧＦ誘導体をコードする遺伝子を組み込んだ組み換えウイルス、プラスミド等の組み換えベクターを用いることができる。組み換えベクターの宿主としては、真核生物の培養細胞が望ましく、生産効率の点からはさらに昆虫細胞であることが望ましく、これら宿主に常法あるいは後述の手法に従ってベクターを導入し、本発明のＨＧＦ誘導体を生産することができる。
なお、ＨＧＦ誘導体をコードする遺伝子を直接体内に投与する場合には、体内への投与について安全性が確認された組み換えベクターを単独で投与することができるが、また必要に応じてこの遺伝子が導入された適切な細胞を移植するという投与法も可能である。
そして本発明のＨＧＦ誘導体、あるいは該ＨＧＦ誘導体をコードする遺伝子を投与し、ＨＧＦ誘導体の有する投与部位あるいは特定部位への固定化あるいは滞留する特性により目的の部位に血管新生を誘導することができ、よって、細胞移植の際に、本発明のＨＧＦ誘導体、ＨＧＦを有する移植用材料、あるいはその両者を組み合わせて投与する細胞移植法を提供することができる。この際、投与は移植前あるいは移植と同時に行うことができる。この方法により移植細胞の生着効率が高めることが可能である。前記移植部位は心筋組織、特に心筋梗塞等の心臓疾患部位であり、さらに前記細胞が心筋細胞あるいは血管内皮細胞およびそれらの前駆細胞である場合、本発明の効果は特に発揮される。また、前駆細胞としては、末梢血中の細胞、骨髄中の細胞、骨格筋芽細胞、心筋芽細胞あるいはＥＳ細胞を使うことができる。
【００１２】
（発現ベクターの設計）
本発明のＨＧＦ誘導体は、以下の様に設計された発現ベクターを用いて取得することができる。すなわちまずヒト・ファイブロネクチンの部分配列より適切な配列を選択し、これをコードするＤＮＡ配列を取得する。次にヒト・ＨＧＦの成熟ポリペプチド部分をコードするＤＮＡ配列を取得する。この両者を適切なリンカー配列で連結して融合遺伝子を作製した。リンカー配列は融合遺伝子によってコードされるタンパク質中でファイブロネクチン部分とＨＧＦ部分が適切な距離で離れている様にするために挿入されているが、さらに適切なプロテアーゼ認識配列をコードする配列とすることもできる。実施例においてはエンテロキナーゼの認識配列が挿入されているが、そのほかのプロテアーゼ認識配列を用いることも可能である。あるいは必要に応じこのようなリンカー配列を除くか、プロテアーゼで切断されない配列とすることも可能である。
「ＨＧＦ遺伝子配列」
ＨＧＦ遺伝子配列は、特開平６−９６９１号に開示されている配列を用いた。この遺伝子配列は卵巣腫瘍由来細胞から精製された血管新生因子の遺伝子としてクローニングされたものであるが、既に報告されているＨＧＦと同一のものであった。
この配列を鋳型として、ＰＣＲ法によりシグナルペプチドを含まない成熟型ＨＧＦをコードする配列を取得した。またＰＣＲに用いるプライマーには制限酵素認識配列を付加しファイブロネクチン遺伝子配列およびベクターＤＮＡと連結が可能となっている。
「コラーゲン結合性配列の選択」
ファイブロネクチンの中でコラーゲン結合性を示すアミノ酸配列部分（コラーゲン結合性ドメイン、ＦＮＣＢＤ）については、ウシ由来のものについて報告がある（Ｓｋｏｒｓｔｅｎｇａａｒｄら、  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４０，  ２３５  （１９８４））。これを参考にヒト・ファイブロネクチン配列からから、ＨＧＦと遺伝子工学的に連結される配列が選択される。コラーゲン結合性ドメイン配列から任意の配列を選択しても立体構造が本来のものとは異なり、機能的にコラーゲン結合性を示さないため、配列を選択することが重要である。本発明の目的のためには例えば、ファイブロネクチン成熟型蛋白質のアミノ酸配列全体のうち、アミノ末端から２６０番目のアミノ酸（Ａｌａ）より４８４番目のアミノ酸（Ａｒｇ）までの配列を用いる。あるいは２６０（Ａｌａ）から５９９（Ｔｒｐ）までの配列である。プロテアーゼで切断されやすい部位で区切られたアミノ酸配列のまとまりが機能的な単位であって、他の蛋白質と融合されてもその本来の３次元的な立体構造をとりやすいとの考えにもとづき、コラーゲン結合性ドメインと見なされている配列から上記のような配列を選択したのである。これらの配列が、融合蛋白質を作る上での配列パートナーとして有効であることは、発明者らが既に報告している（特開２００１−１９０２８０号）。
これらの選択されたアミノ酸配列に対応する遺伝子配列は、ファイブロネクチンｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により取得することができる。ＰＣＲにおいて適切なプライマーを用いて増幅される配列の末端に制限酵素認識部位を導入し、ＨＧＦ遺伝子およびベクターとの連結が可能となる様にしている。この増幅配列を、上記のＨＧＦ成熟アミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込んだベクターに組み込むことが可能である。その際ファイブロネクチン配列は、ＨＧＦ遺伝子の５’上流側に連結されて融合遺伝子が形成される。
このようにして作製された融合遺伝子を、発現ベクターに挿入する。融合蛋白質を生産させるための宿主に応じて融合遺伝子はさらに加工され、また適切なベクターを選択する。たとえば宿主として哺乳動物の培養細胞を用いる場合は、前記の融合遺伝子にさらにＨＧＦの分泌シグナル配列を５’端側に連結してからベクターに挿入する。ベクターは種々報告されているので列挙はしないが、哺乳動物遺伝子の発現に適切なプロモーターを持っているベクターの一例として、ＣＡＧベクター（ｐＣＡＧＧＳなど）があげられる（ＮｉｗａらＧｅｎｅ  １０８，  １９３−２００  （１９９１））。ただし、一般に哺乳動物培養細胞を宿主とする発現系では組み換え蛋白質の生産量が低いとされているため、大量発現に汎用されるのは、昆虫細胞を宿主とするバキュロウイルス発現系である。この系を用いる場合は、前記の融合遺伝子をこの発現系用に開発されたベクターを用いる。後述する本発明実施例では一例としてｐＡｃＹＭ１−Ｍｅｌ（Ｔｏｍｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３１２，８４７−５３（１９９５））を使用している。このベクターはバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターをもちその下流にメリチンシグナル配列（Ｔｅｓｓｉｅｒら、  Ｇｅｎｅ  ９８，  １７７  （１９９１））が付加されている。その下流に読みとり枠がずれないように融合遺伝子を連結して、トランスファーベクターとする。このベクターは以下に述べるように昆虫細胞でＨＧＦ誘導体を生産する組み換えウイルスを作製するために用いられる。
【００１３】
（ＨＧＦ誘導体の生産と精製）
本発明の誘導体を生産するには、真核細胞を宿主とする発現系が望ましく、大量に取得するためには昆虫細胞の発現系がさらに望ましい。上述した発現ベクターはこのような昆虫細胞発現系用のベクター（トランスファーベクター）で、このベクターをバキュロウイルスＤＮＡと混合して昆虫細胞にトランスフェクションする。用いられる細胞株としてはＳｆ９，Ｓｆ２１などおよびそれらから由来する細胞株などがある。トランスフェクションによって細胞内に導入されたベクターＤＮＡとウイルスＤＮＡの間で組み換えが起こり、ＨＧＦ誘導体をコードする遺伝子が挿入された組み換えウイルスが生成される。培養上清中に出てきた組み換えウイルスを回収して、再度感染させ、組み換えウイルスを必要な数まで増幅させることができる。このようにして得られた組み換えウイルスを適当な細胞数に感染させることにより、ＨＧＦ誘導体が生産され、付加されているメリチンシグナルによって、培養上清中に分泌される。メリチンシグナルを持たない設計の場合には、多量に組み換え蛋白質は生産されるが、そのほとんどが細胞外へ分泌されることは無かった。従ってシグナル配列は重要である。
発現蛋白質の精製には、宿主細胞を無血清状態で培養することが望ましい。この状態で発現、分泌されるＨＧＦ誘導体は１本鎖の蛋白質として得られるが、血清と混合することによりＨＧＦα鎖とβ鎖の間が切断され天然型ＨＧＦと同様にヘテロ２本鎖となる。このことはＨＧＦ抗体を用いてイムノブロット法で確認することができる。
培養上清を回収し濃縮後、ヘパリンカラムクロマトグラフィーによって精製することができる（図１）。さらに高純度のものが必要であればＨＰＬＣで精製する。
【００１４】
（コラーゲン結合活性）
本発明のＨＧＦ誘導体がコラーゲン結合性を有していることは以下のように立証することができる。
１）まず、予め０．３から０．０１％の範囲のコラーゲン溶液で、コートした容器（ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートなど）を用意し、コートされたウェルをさらにブロッキング剤（血清アルブミンやカゼインなど）でブロッキングする。ウェルをさらに洗浄液（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ；Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％程度加える）でよく洗浄した後、ＨＧＦ誘導体の精製標品を、ウェルに種々の濃度で添加する。添加後、３７℃で２時間保温する。温度は４℃で行うことも可能である。また反応時間は適宜変えることができる。保温後、洗浄液でウェルを繰り返し洗浄する。洗浄後、ウェルに結合した誘導体蛋白質の量を、抗ＨＧＦ抗体を用いて測定する。コラーゲンへの結合性は２次抗体にリンクされている酵素の反応で生じる発色の測定値として表される。
その結果、図３に見られるように、天然型ＨＧＦはほとんどコラーゲンに結合しないことが示された。ごくわずかな量の結合は見られるが、低い添加濃度（０．５ｎＭ）での結合の飽和が認められる。これはＳｃｈｕｐｐａｎら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１４，１３９−１５２  （１９９８））が報告している現象と一致するものと考えられる。これに対してＨＧＦ誘導体はいずれの添加濃度においても、天然型ＨＧＦより遙かに高い結合性を示した（図３）。また添加濃度１０ｎＭまで、結合の飽和は認められなかった。すなわちＨＧＦそのものに比べて２０倍以上の高濃度で添加しても結合の飽和は起こっていない。発色反応は、結合量が高値になるほど比例的には増加しない特性をもつため、実際の結合性は図３から読みとれるより遙かに高いことが推測される。より定量的に結合量を示すには、結合反応後、ウェル中の溶液を回収しその液のＨＧＦ誘導体量を測定し、添加量からその値を除して求めることができる。あるいは、放射性標識したＨＧＦ誘導体を用いてより直接的に求めることもできるであろう。
２）さらにＨＧＦ誘導体が結合可能なコラーゲンタイプを調べるとＩ型以外にも、ＩＩからＩＶ型まで、いずれにも用量依存的な結合性を示した（図４）。また、変性コラーゲンであるゼラチンにもよく結合することが明らかであった。
３）結合の強さについては、上記１）の洗浄液の塩濃度をさらに高くすることで検討することができる。結合性は２Ｍ  ＮａＣｌを含む洗浄液で洗浄しても低下しなかった。これに対し天然型ＨＧＦは２Ｍではほとんど結合しないことが前記の報告例で示されている（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１４，１３９−１５２  （１９９８））。
【００１５】
（細胞増殖活性）
ＨＧＦ誘導体の生物学的活性、すなわち内皮細胞への増殖促進活性は、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）や冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）、皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）などヒトの内皮細胞を用いて測定することができる。
１）まずＨＧＦ誘導体自体の活性は、内皮細胞の培養液に添加した際の活性（すなわち溶液中での活性）として測定することができる。すなわち、内皮細胞用の培地（例えばＥＢＭ２など）に成長因子を添加しないか、あるいは少なくとも血管新生効果を持つ因子を添加しない条件で細胞を播種し、培地に天然型ＨＧＦあるいはＨＧＦ誘導体を添加し、一定の培養期間の後、ＷＳＴ１法（Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  １，  ２６７−７１（１９９５））により測定する。この方法はＭＴＴ法やＸＴＴ法などと同じくミトコンドリア酵素による代謝活性を測定するものであり、酵素活性と細胞数が対応することを利用して、細胞数の増加を見るものである。この他に、放射性チミジンやブロモデオキシウリジンの取り込み量で測定することも可能である。またより直接的には、顕微鏡写真を撮影して細胞数を計測することもできる。
その結果、ＨＧＦ誘導体は、天然型ＨＧＦとほぼ等しいかそれ以上の増殖活性を用量依存的に示した。すなわち、融合蛋白質としての構造が、本来のＨＧＦ活性を妨げていないことが明らかとなった（図５）。また、ＨＧＦそのもの以上の活性を示していることの理由としては、本発明で採用した設計方法によって、ＨＧＦが分解や変性に耐性な蛋白質分子構造に改良され、結果として活性が高まっている可能性が考えられる。
２）次にこのような増殖活性が、コラーゲンへの結合後も保持されるかを見るために、コラーゲンコートした培養器に、ＨＧＦ融合蛋白質を結合させてから増殖活性を測定する。この活性は本発明のＨＧＦ誘導体がもつ特性として特に重要である。コラーゲンコートした容器の培養ウェルに、ＨＧＦ誘導体あるいはＨＧＦそのものを種々の濃度で添加し一定時間結合させる（たとえば３７℃で２時間）。その後ＰＢＳでウェルを繰り返しよく洗浄し、細胞を播種する。適当の培養期間の後、増殖活性を前記１）の方法で測定する。
その結果、ＨＧＦ誘導体を結合させたウェルでは、添加した量に依存的な増殖活性を示した。図６は、培養後の顕微鏡写真で、ＨＧＦ誘導体がコラーゲンコートしたウェルに固定化され状態で内皮細胞の増殖を促進していることが明らかである。これに対して天然型ＨＧＦの増殖活性は非常に低かった。すなわち、ＨＧＦはコラーゲンにほとんど結合しないため、ＰＢＳの洗浄によって容器から失われ、増殖の程度は因子の添加がない対照ウェルと同じ程度にとどまったと考えられる。
３）活性の安定性
ＨＧＦ誘導体の活性の安定性を調べるため、まずコラーゲンに結合させてから、培地を添加して細胞を播種せずに３７℃で保温した。一定期間保温した後（たとえば、１週間）に再度ウェルを洗浄しそれから内皮細胞を播種する。このようにして一定期間の間結合を維持していた誘導体の増殖活性を測定することができ、活性の安定性が示される。その結果、ＨＧＦ誘導体は少なくとも１週間高い活性を保ったままで、結合していることが示される。これに対し、天然型ＨＧＦにはこのような活性は認められなかった。
【００１６】
（組織への投与効果）
以上述べてきたように、本発明のＨＧＦ誘導体は、コラーゲン結合性と内皮細胞増殖活性を併せ持つ新規の血管新生因子であると言える。強固なコラーゲン結合性により、本発明の蛋白質は組織に投与すると投与部位に露出するコラーゲンに安定に結合し、ＨＧＦとしての活性が維持されることとなる。このような融合蛋白質が長期間一定の部位にとどまれば、その機能としての血管新生活性が長期間局所に固定化されるため、その部位に新しい血管が有効に誘導されると考えられる。このような効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで簡便に検討するためには以下のような血管内皮細胞のゲル内培養法が考えられる。すなわちコラーゲンコートしたウェルにＨＧＦ誘導体を添加するとそこに固定化される。これは損傷組織に注入したＨＧＦ誘導体が露出したコラーゲンに結合した状態と見なせる。そしてここに内皮細胞を播種し、さらにその上にコラーゲンゲルを重層する（損傷組織内の血管が壊れた状態と見なす）。培養を続けると内皮細胞がネットワーク様構造を形成する。ＨＧＦそのものに比べ、ＨＧＦ誘導体を投与した場合に、より効率的に構造が形成されることから（図７）、ＨＧＦ誘導体が損傷組織での血管新生（修復）に効果的であったと考えることができる。
動物を用いた実験としては例えば、適当な濃度になるように希釈したＨＧＦ誘導体を、ラットなどの実験動物の筋肉に注射し、検証することができる。対照としてＨＧＦそのものを別の実験個体に注射する。注射後、適当な期間をおいて、組織を摘出し、組織切片を作成し、抗ＨＧＦ抗体あるいは抗ファイブロネクチン抗体で染色し、投与した因子の残存状態が示される。さらにアザン染色を行いその組織部位でのコラーゲン分布を知ることができ、投与したＨＧＦ誘導体がコラーゲン部位に結合していることが明らかとなる。ＨＧＦ投与の場合には、投与部位から短期間に消失していることが示される。また、切片を一般的な病理学的な染色法（ヘマトキシリン・エオシン）などで染色し、血管密度を知ることができる。対照とするＨＧＦ投与組織との比較で、血管密度の増加を確認することができる。以上のような血管密度の増加を検討するには、動脈を結紮するなどして組織を虚血状態にしたモデル動物をつかうことが望ましい。血管の分布はより厳密には血管内皮細胞に特異的なマーカー分子に対する抗体を用いた免疫染色で確認することが望ましい。例えば、抗ＣＤ３１抗体や抗フォンビルブラント因子抗体などが適切である。そして細胞を同時にあるいは、一定期間後に移植すると、その部位での細胞の生着を可能としかつ、その細胞による組織再生が効率的に進むと考えられる。
上記の様な実験は、適切に作成された心筋梗塞の動物モデルに対しても行うことができる。その際に、ＨＧＦ誘導体投与と同時にあるいは、投与後適当な期間をおいて例えば、血管新生が開始されてから細胞を移植する実験により移植細胞の生着効率をみることが可能である。移植する細胞としては、例えば骨髄、臍帯血、末梢血等から分離した単核球、さらにそれから分離したＣＤ３４陽性細胞などが用いられる。そのほかにも適切な方法で血管内皮前駆細胞を培養して（Ａｓａｈａｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，９６５  （１９９７））用いることができる。これら移植細胞を何らかの方法で標識するか、本来持っている特異的マーカーや性質を利用して、移植細胞の組織への生着性が高まることを確認することができる。
さらには、血管内皮細胞（あるいはその前駆細胞）以外の細胞を移植する実験の際にもＨＧＦ誘導体を、移植に先立ってあるいは移植と同時に投与することができる。このような方法によって、ＨＧＦ誘導体が投与された部位の血管新生の程度と移植細胞の生着効率とが相関していることを検討することができる。移植する細胞としては、心筋に分化しうる細胞や筋芽細胞などを用いれば、心筋梗塞への治療効果も合わせて検討することが可能である。
【００１７】
（血管新生・血管修復を誘導する材料）
本発明のＨＧＦ誘導体は生体内に直接蛋白質あるいは遺伝子の形で投与するほかに、生体内に埋め込む医療用材料と複合化することも可能である。医療用材料自体がコラーゲンを含むのであればそのコラーゲンに、また含まないのであれば適切な方法で材料をコラーゲンコートした上で、本発明のＨＧＦ誘導体を結合させることが出来る。そのような例としてはステント、人工血管などが考えられる。これらは損傷した血管を拡張したり置換するために用いられるが、それ自体は自己組織化には至らない。そこでＨＧＦ誘導体を結合することによりその材料上で早期の内皮化が起こり自己組織との適合性が高まる。医療用材料はこれらに限らず、様々な形状をしたものであってよい。たとえばシート状、管状、スポンジ状のものなどのものを生体適合性材料によって成形するが、適用する部位や再生する組織に応じた形態を選択すれば良い。このような材料としてさらに望ましいのは生分解性物質である。例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそれらの混合物、共重合物などがよく知られている。このような基準を満たす材料をコラーゲンを含んで作製するか、あるいはコラーゲンなしに作製した場合はその表面にコラーゲンをコートする。コートしたコラーゲンがはがれない様な固定化の方法は様々提案されているので、それらの方法を用いればよく、また逆に適度にはがれるような固着方法を採用しても良い。
このようにして作製されるＨＧＦ複合化材料は、生体内に埋め込まれるとその部位で血管新生を進行させ、組織再生が効率的に行われる効果を示すであろう。
【００１８】
【実施例】
実施例１  ＨＧＦ誘導体生産のための発現ベクターの作製
１）ＨＧＦ遺伝子配列
ＨＧＦ遺伝子の配列は、特開平６−９６９１号に開示されているものを用いた。この配列は、ヒト卵巣腫瘍より樹立された細胞株（ＨＵＯＣＡ−ＩＩおよび−ＩＩＩ）が生産する血管新生活性を示す蛋白質をコードする遺伝子としてクローニングされたもので、その塩基配列を決定したところ、Ｍｉｙａｚａｗａら（ＢＢＲＣ．  １６９，  ９６７−９７３  （１９８９））が報告したＨＧＦの配列と同一であった。この配列を鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲ法によりＨＧＦ成熟ポリペプチドをコードする配列を取得した。
【００１９】
センスプライマー１：（配列表配列番号６）
ＧＴＧＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＣＡ
アンチセンスプライマー１：（配列表配列番号７）
ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＡＴＡＴＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＴ
【００２０】
センスプライマー１にはエンテロキナーゼが認識するアミノ酸配列ＤＤＤＫ（Ｄ＝アスパラギン酸、Ｋ＝リジン）をコードする配列を付加してある。またＨＧＦのｃＤＮＡ配列内に存在する制限酵素ＫｐｎＩの認識配列ＧＧＴＡＣＣは、アンチセンスプライマー１を用いることにより、認識されない配列ＧＧＴＴＣＣに変換された。
【００２１】
配列表配列番号１は、上記のプライマーを用いてＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ配列でＨＧＦ成熟ポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を含む
塩基番号１から４１はセンスプライマー１の配列
塩基番号３から８は制限酵素ＳａｌＩ認識配列
塩基番号６から２０はエンテロキナーゼ認識アミノ酸配列をコードする配列
塩基番号２１から２１１４はＨＧＦの成熟ポリペプチドをコードする配列
塩基番号２１０２は本来のＨＧＦ配列ではＡであるが制限酵素ＫｐｎＩによって切断されないよう、ＰＣＲによってＴに置換された。ただし、この置換によってコードされるアミノ酸は変化しない
塩基番号２０８２から２１２５はアンチセンスプライマー１と相補的な配列。
塩基番号２１１２から２１１４は終止コドン
塩基番号２１１８から２１２３は制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列
【００２２】
上記配列番号１の配列をさらに、制限酵素ＳａｌＩとＢａｍＨＩで消化し、同じ２つの酵素で切断されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に連結してプラスミドｐＨＨ２を得た。
【００２３】
２）ヒト・ファイブロネクチンのＤＮＡ配列
ヒトファイブロネクチンのｃＤＮＡ配列は既に報告されている（Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ４，  １７５５  （１９８５））。この配列をもとにＰＣＲ用プライマーを作成し、フィブロネクチンの部分配列を増幅した。すなわちまずヒト腎臓由来のＲＮＡを抽出し、逆転写によってｃＤＮＡに変換したのち、ＰＣＲでＤＮＡを増幅した。  用いたプライマーは以下のとおりである。
【００２４】
センスプライマー２：（配列表配列番号８）
ＧＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＴＡＣＣＡＡＣＣＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＣ
アンチセンスプライマー２：（配列表配列番号９）
【００２５】
ＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＴＧＣＧＡＧＴＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＴＧＴ
アンチセンスプライマー３：（配列表配列番号１０）
ＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＧＡＧＴＴＧＧＧＣＴＧ
センスプライマー２にはＫｐｎＩとＢａｍＨＩの認識配列が付加されている。またアンチセンスプライマー２，３にはＳａｌＩとＥｃｏＲＩの認識配列が付加されている
【００２６】
センスプライマー２とアンチセンスプライマー２を用いたＰＣＲによって得られた配列は配列番号２に示されている。この配列はヒトファイブロネクチンのアミノ酸番号２６０番から４８４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とそれを他のＤＮＡ配列と連結するための付加配列を含んでいる。なおアミノ酸番号は、シグナルペプチドが除かれた成熟型蛋白質としてのファイブロネクチンのアミノ末端から数えた番号である。
センスプライマー２とアンチセンスプライマー３を用いたＰＣＲによって得られた配列は配列番号３に示されている。この配列はヒトファイブロネクチンのアミノ酸番号２６０番から５９９番までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列とそれを他のＤＮＡ配列と連結するための付加配列を含んでいる。
【００２７】
配列表配列番号２の
塩基番号１から４４はセンスプライマー２の配列
塩基番号３から８は制限酵素ＫｐｎＩの認識配列
塩基番号９から１４は制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列
塩基番号１５は、フレーム合わせのために挿入した塩基
塩基番号１６から６９０はヒト・ファイブロネクチンのアミノ酸番号２６０（Ａｌａ）から４８４（Ａｒｇ）までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。
塩基番号６６４から７０６はアンチセンスプライマー２と相補的な配列
塩基番号６９１から６９６は制限酵素ＳａｌＩの認識配列
塩基番号７００から７０５は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列
【００２８】
配列表配列番号３の
塩基番号１から４４はセンスプライマー２の配列
塩基番号３から８は制限酵素ＫｐｎＩの認識配列
塩基番号９から１４は制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列
塩基番号１５は、フレーム合わせのために挿入した塩基
塩基番号１６から１０３５はヒト・ファイブロネクチンのアミノ酸番号２６０（Ａｌａ）から５９９（Ｔｒｐ）までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
塩基番号１００９から１０５１はアンチセンスプライマー３と相補的な配列
塩基番号１０３６から１０４１は制限酵素ＳａｌＩの認識配列
塩基番号１０４５から１０５０は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列
【００２９】
３）ファイブロネクチンとＨＧＦの融合遺伝子
増幅された配列番号２の配列を制限酵素ＫｐｎＩとＳａｌＩで切断し、同じ２つの酵素で切断されたｐＨＨ２に連結して、プラスミドｐＨＨ３Ｓを作製した。  これによりファイブロネクチン・コラーゲン結合性ドメインの部分配列と成熟型ＨＧＦの融合ポリペプチドをコードする配列が作成された。両者の間には介在配列としてエンテロキナーゼで認識されるアミノ酸配列をコードする配列が挿入されている。
次に、ｐＨＨ３Ｓを制限酵素ＭｓｔＩとＢａｍＨＩで消化し、２．８ＫｂのＢａｍＨＩ消化断片を単離した。この断片を、ｐＡｃＹＭ１−Ｍｅｌ（Ｔｏｍｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３１２，  ８４７−８５３  （１９９５））のＢａｍＨＩ部位に挿入してプラスミドｐＨＨ７を得た。このプラスミドにおいては、蜂毒素蛋白質メリチンのシグナル配列、ヒトファイブロネクチンの配列（Ａｌａ２６０からＡｒｇ４８４）、エンテロキナーゼ認識配列ＤＤＤＤＫ（Ｄ＝アスパラギン酸、Ｋ＝リジン）、そしてＨＧＦの成熟配列のそれぞれをコードするＤＮＡ配列が読みとり枠のずれがないように順次連結されている。この融合遺伝子の配列は配列番号４に示されている。またそれによってコードされる融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５に示されている。メリチンのシグナル配列はこの融合蛋白質を細胞外に分泌するために付加されものであり、分泌に際して切断除去されるものである。なお分泌された後の融合蛋白質、すなわちＨＧＦ誘導体（ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦ）のアミノ酸配列は、配列表配列番号５のアミノ酸番号２２から９５１の配列となる。
【００３０】
配列表配列番号４の
塩基番号１から６２はメリチンシグナル配列をコードする塩基配列（ｐＡｃＹＭ１−Ｍｅｌに由来）
塩基番号６３から６８は、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列
塩基番号６９は、フレーム合わせのために挿入された塩基
塩基番号７０から７４４はファイブロネクチンのアミノ酸番号２６０から４８４をコードする配列
塩基番号７４５から７５０は制限酵素ＳａｌＩの認識配列
塩基番号７４８から７６２はエンテロキナーゼの認識配列をコードする配列
塩基番号は７６３から２８５６は、ＨＧＦの成熟ポリペプチドをコードする配列塩基番号２８４４は本来ＡであるがＴに置換されている。変異はサイレントである
塩基番号２８５４から２８５６は終止コドン
【００３１】
配列表配列番号５の
アミノ酸番号１から２１はメリチンシグナル配列で、細胞外に分泌される際に蛋白質から除去される
アミノ酸番号２２から２３は、メリチンシグナル配列とフィブロネクチン配列の連結部（ＢａｍＨＩ部位）に生じたＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸
アミノ酸番号２４から２４８はファイブロネクチンのアミノ酸番号２６０から４８４までのアミノ酸配列
アミノ酸番号２４９から２５０はフィブロネクチン配列とＨＧＦ配列の連結部（ＳａｌＩ部位）に生じたＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸
アミノ酸番号２５０から２５４は  エンテロキナーゼ認識配列
アミノ酸番号２５５から９５１は  ＨＧＦ成熟ポリペプチドのアミノ酸配列
【００３２】
実施例２  ＨＧＦ誘導体の生産と精製
Ａ）組み換えウイルスの作成
上記実施例において作成されたプラスミドｐＨＨ７をトランスファーベクターとして野生型バキュロウイルスＤＮＡとを混合してトラスフェクションし、融合蛋白質をコードする遺伝子を持つ組み換えウイルスＡｃＨＨ７を以下のように取得した。
１）まず昆虫細胞Ｓｆ９の１ｘ１０６  個を１０％  牛胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＧｒａｃｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、径３５ｍｍ  の培養皿にいれた。３０分静置したのち、培地を除去し、無血清培地Ｓｆ−９００ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養皿をさらに３回洗浄した。
２）トランスファーベクターｐＨＨ７のＤＮＡ２μｇをエタノール沈殿し、乾燥後３．５μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ＰＨ８／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）  に溶かした。これにＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｌｉｎｅａｒ  ＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ，  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）の０．１μｇ（１μｌ）を混合し、さらに滅菌蒸留水（ＤＷ）を加えて全量で８μｌとした。この混合液に、２倍希釈したｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））の８μｌを加えて１６μｌとした。混合１５分後に、その５μｌ（あるいは１１μｌ）を１ｍｌのＳｆ−９００ＩＩとともに、培地を除去した上記１）の培養皿に添加した。
３）２８℃で終夜培養した後、液を除き、１ｍｌのＧｒａｃｅ培地（１０％血清添加）を加えてさらに３日培養した。この培養上清をウイルス液として回収保存した。
４）組み換えウイルスの単離
予め、１ｘ１０６  個をのＳｆ９細胞をφ３５ｍｍ  培養皿に播種し、３０分間静置後、培地を２００μｌ程度残して、吸引除去した。上記３）の保存培養上清（ウイルス液）を、Ｇｒａｃｅ培地で１００、１０００、１００００倍に希釈したものを１００μｌ培養皿に加え、細胞に感染させた。１５分ごとに液を攪拌し、これを４回行った後（１時間後）、液を吸引除去した。あらかじめオートクレーブしておいた３％低融点アガロースを、Ｇｒａｃｅ培地（１０％血清含む）で３倍希釈し３７℃に加温しておき、その２ｍｌをウイルス液を除去した上記の培養皿の細胞上に添加した。  ３０分間室温で静置し固化させたのち１ｍｌのＧｒａｃｅ培地（１０％血清を含む）を添加し、これを２８℃で５日培養した。培養後１ｍｌのＮｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、４時間以上静置した。これにより感染した部位の細胞が溶解しできるプラークを判別することができる。単一のプラーク部分のアガロースをパスツールピペットで打ち抜いて、５００μｌのＧｒａｃｅ培地（１０％血清含む）に懸濁してウイルスを遊離させ、４℃で保存した。得られたウイルス液を用いて上記の操作を繰り返し、単一のウイルスクローン（ＡｃＨＨ７）となるまで純化した。また回収液量あたりの感染性ウイルスの数（力価）も、上記のようなプラーク形成法により計測することができる。
純化されウイルスが得られた所で、徐々に培養スケールを大きくしながら感染を繰り返して、多量のウイルス液を得た。
【００３３】
Ｂ）ＨＧＦ誘導体発現の確認
Ｓｆ９細胞１ｘ１０６  個をφ３５ｍｍ  ｄｉｓｈに播種したのちＡｃＨＨ７ウイルスをｍ．ｏ．ｉ５ないし１０で感染させた。感染後４日間培養し培養上清を回収した。ＨＧＦ誘導体が、ＡｃＨＨ７感染細胞から培養上清中に分泌されていることを以下のようにイムノブロット（ウェスタンブロット）法によって確認した。
すなわちまず培養上清をＬａｅｍｍｌｉの方法に準じてＳＤＳポリアクリルアミド（７．５％）電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。その際、サンプルバッファーにはｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを添加しない非還元条件で泳動した。泳動後、Ｔｒｉｓ−ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液を用いセミドライ法にてＰＶＤＦ膜に転写した（２ｍＡ／ｃｍ２の電流で９０分）。転写されたＰＶＤＦ膜をＰＢＳで２回洗浄し、２５％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（大日本製薬）  ／  ＰＢＳで６０分間ブロッキングした。洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ）で１回洗浄後、抗ヒトＨＧＦ抗体（Ｔ−７７０１、特殊免疫研究所、１：１０００  に５％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅで希釈）で６０分反応させた。洗浄液で３回洗浄後、ビオチン標識抗マウス抗体（ＤＡＫＯ  Ｅ０４６４、１：５００希釈）で３０分反応した。洗浄液で３回洗浄した後ＰＯＤ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ  Ｐ０３９７、１：７００希釈）で３０分反応した。洗浄液で３回洗浄した後、ＨＧＦのバンドをＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて検出したところ、培養上清中に、抗体反応性のバンドが認められた。このバンドはまた、抗ファイブロネクチン抗体とも反応したことから、ＨＧＦ融合蛋白質（ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦ）が細胞上清中に分泌されていることが確認された。
【００３４】
Ｃ）大量培養
ＨＧＦ誘導体を大量に得るために、無血清状態でかつ多数の細胞を感染させ培養することが望ましい。そのために、まず細胞を懸濁状態でかつ無血清の条件に成育するよう以下のように馴化した。
始めに、１０％血清（ＦＣＳ）を含むＳｆ−９００ＩＩ  培地にＳｆ９細胞を３−５ｘ１０６  個／  ｍｌ  で三角フラスコ（ポリカーボン製三角フラスコベントタイプ：コーニング）を用いて培養開始した。２８℃で旋回培養器にのせ１２０  ｒｐｍ旋回で培養。初めの培養サイズは２５０ｍｌフラスコに５０ｍｌ培養液で、２−３日間培養し、継代した。継代後は１０００ｍｌフラスコに２５０ｍｌの培養液とした。
さらにこれを継代していく過程で、血清濃度を１０，  ５，  ２，  １，％と順次低下させて培養し、最終的に無血清の培地（Ｓｆ−９００ＩＩ）で培養した。
以上の無血清状態に馴化した細胞を、細胞密度＝２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整して培養（Ｓｆ−９００ＩＩ  ，  無血清、旋回培養）した。これを遠心分離して回収しｍ．ｏ．ｉ＝５から１０で組み換えウイルスＡｃＨＨ７を感染させた（室温で１時間）。この間適宜攪拌したのち、再び、遠心前の液量になるよう無血清培地を加えて旋回培養に戻した。３日間培養したのち培養上清を回収した。回収された上清を保存する場合は−８０℃の凍結保存とした。
【００３５】
Ｄ）精製
１）上記実施例において取得された培養上清は、あらかじめ以下のように処理した。まず凍結保存されている培養上清を溶解し、最終濃度０．０３  ％となるよう３０  ％  ＣＨＡＰＳ溶液を添加し、０．４５μｍフィルターでろ過した。
２）ＦＰＬＣを使用して以下のように精製した。ヘパリンカラム（Ｈｉｔｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ，  １ｍｌ  、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：１７−０４０６−０１）をあらかじめ１０ｍｌ以上のｂｕｆｆｅｒを用いて、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで流し平衡化した。Ｂｕｆｆｅｒの組成は１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ＰＢ），  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．０３％  ＣＨＡＰＳ  （ｐＨ７．２）である
３）上記１）で処理されたサンプル溶液を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎにてカラムに添加した。ついで、２０ｍｌ以上のｂｕｆｆｅｒを流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで流してカラムを洗浄した。
４）溶出は以下の緩衝液を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで流すことによって行った。
Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ              Ａ液    ０．１５Ｍ  Ｎａｃｌ，  １０ｍＭ  ＰＢ，  ０．０３％  ＣＨＡＰＳ  （ｐＨ７．２）
Ｂ液２Ｍ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  ＰＢ，  ０．０３％  ＣＨＡＰＳ  （ｐＨ７．２）
以下のＮａＣｌ濃度となる様Ａ，Ｂ液を混合し使用した。
０．１５Ｍ  ＮａＣｌにて５分間洗浄
０．４Ｍ  ＮａＣｌにて４０分間溶出。
０．７Ｍ  ＮａＣｌにて４０分間溶出。
フラクションサイズ＝２ｍｉｎ
２Ｍ  ＮａＣｌにて２０分間洗浄。
５）０．７Ｍ  ＮａＣｌ溶出フラクション２番目のピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１）にて精製度を確認した。
６）ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦを含むことが確認されたフラクションをプールして、１０ｍＭ    ＰＢ，  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．０３％  ＣＨＡＰＳ  （ｐＨ７．２）に対して一昼夜透析した。これをＨＧＦ誘導体の精製標品とした。分注後、−８０℃に保存した。
７）ＨＧＦ定量。ＥＬＩＳＡ法により、精製標品の濃度を、イムニス  ＨＧＦ  ＥＬＩＳＡ（特殊免疫研究所：ＣＯＤＥ    １ＥＨ１）にて定量した。すなわち標品の濃度はＨＧＦ量としてあらわされる。
【００３６】
Ｅ）ヘテロダイマー
天然型ＨＧＦは細胞内で１本鎖のペプチド鎖の型で合成され、細胞外に分泌された後に血中に存在するプロセシング因子によってα鎖とβ鎖の間が切断され、ヘテロダイマーとなる。ＨＧＦはこのプロセシング過程を経て始めて生物活性を発揮することができるようになるとされている。ただし１本鎖のまま活性を持つ可能性もある。
上記実施例において、バキュロウイルス−昆虫細胞の発現系で生産されたＦＮＣＢＤ−ＨＧＦは無血清条件下で培養・回収・精製したものであるため、プロセシングを受けていない１本鎖の状態と考えられる。そこで、細胞培養時に使用する血清（ＦＣＳ）を添加、３７℃でインキュベートすることによって分子のコンフォメーションが変化するか（ヘテロダイマーとなるか）を検討した。なお、用いる抗体が非還元条件でＨＧＦのα鎖を認識する抗体であるため非還元条件下で電気泳動を行いＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法にて検出した。
まずサンプルを以下のように血清処理した。すなわち氷冷したＦＮＣＢＤ−ＨＧＦ溶液９０μｌにＦＣＳ（或いはＰＢＳで５倍希釈したＦＣＳ）１０μｌを添加した。この混合液から３０μｌずつ別のｔｕｂｅ２本に分注した。各ｔｕｂｅを３７℃温浴中でインキュベートした。１５分及び６０分後、ｔｕｂｅに２Ｘ  ＳＤＳサンプルバッファー（還元剤除く）３０μｌを添加、氷冷した。処理された試料は上記Ｂ）の操作に従ってイムノブロットを行った。
その結果、図２に示すとおり、ＦＣＳ濃度２％、１０％にて１５分間インキュベートすることにより、電気泳動上の移動度が大きく変化した。この結果からＦＣＳに含まれる因子によってＦＮＣＢＤ−ＨＧＦが速やかにプロセシングされ、活性型のＨＧＦ分子を含む融合蛋白質になったと考えられた。なお、以後の実施例の評価実験ではプロセシング効果が確認されたＦＣＳ濃度２％条件で処理されたものを試料として用いた。
【００３７】
実施例３  ＨＧＦ誘導体の活性：
ａ）コラーゲン結合活性の検討
ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦのコラーゲン結合活性を以下のようにＥＬＩＳＡ方式で検討した
始めにＩ型コラーゲン（ウシ）  １０μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液（高研、ＣＥＬＬＧＥＮ）を氷冷下、１００μｌづつＥＬＩＳＡ用９６  ｗｅｌｌプレート（Ｎｕｎｃ  Ｐｏｌｙｓｏｒｐ  ９６ｗｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏ  ｍｏｄｕｌｅ）に分注し、４℃で一昼夜インキュベートした。ウェルを洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ）で３回洗浄後、５０％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ／ＰＢＳ液  ２５０μｌを分注し、室温で６０分間インキュベートした。３回洗浄後、各種濃度のＦＮＣＢＤ−ＨＧＦ溶液を１００μｌ分注し、３７℃で１２０分間インキュベートした。ウェルを５回洗浄後、抗ヒトＨＧＦ抗体（１：１０００  希釈）を１２０分間インキュベートした。５回洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウス抗体（ＤＡＫＯ  Ｐ０２６０、１：１０００  希釈）で６０分間インキュベートした。５回洗浄後、酵素基質（ＯＰＤ、Ｓｉｇｍａ）溶液１００μｌを分注し、室温で３０分間インキュベートした。各ウェルに２Ｎ硫酸  ５０μｌを添加して反応を停止し、吸光度（４９２ｎｍ−６２０ｎｍ）を測定した。
図２に示すように、ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦはウシＩ型アテロコラーゲンに対して濃度依存的に強く結合したが、ＨＧＦ（ＴＯＹＯＢＯ  ＨＧＦ−１０１、ＣＨＯ細胞発現リコンビナント蛋白質）はわずかな結合が見られるのみであった。添加濃度０．５ｎＭ（蛋白質濃度で約５０ｎｇ／ｍｌ）までは結合量が微量ながらも増加したが、それ以上濃度での結合の増加は見られなかった。このような結果はＳｃｈｕｐｐａｎら（Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１４，１３９−１５２（１９９８））が報告したように、コラーゲンがＨＧＦに弱い結合性を持つためと考えられる。この濃度での結合量は彼らの結果によれば約１．５ｎｇであり、添加量の４％程度である。ＨＧＦそのものの結合はこの段階で既に飽和しているといえる。これに対してＦＮＣＢＤ−ＨＧＦは、いずれの濃度においてもＨＧＦより高い結合性を示しかつ、添加濃度に対応して結合量が増大した。しかも添加溶液の濃度がＨＧＦの場合の２０倍であっても結合が飽和することは無く、より強固なコラーゲン結合性が付与されていることが示された。
また上記の実験において、ＮａＣｌ濃度を２Ｍまで高くした洗浄液を用いて洗浄してもＨＧＦ誘導体の結合量はほとんどかわらないことが認められた。
コラーゲン型別の結合活性を検討したところ、Ｉ型以外にもＩＩＩ型・ＩＶ型いずれにも高い結合活性を示した。ＩＩ型はこれらと比較すると吸光度値で約５０％の低値であるが、用量依存的な結合活性を示していた（図３）。
【００３８】
ｂ）血管内皮細胞に対する細胞増殖活性の検討
ヒト冠状動脈血管内皮細胞に対する細胞増殖効果を、（１）ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦを培養液に添加する実験系（図５）と（２）コラーゲンコート培養プレートにＦＮＣＢＤ−ＨＧＦを固定化した後に、細胞を播種する実験系（図６）で検討した。すなわち（１）溶液状中および（２）固相化された状態での活性を検討した。
（１）溶液中でのＨＧＦ誘導体の活性
ヒト冠状動脈血管内皮細胞（ＡＣＢＲＩ、大日本製薬より購入）を培養液（基本培地＝ＥＢＭ−２，  Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、添加試薬＝ＩＧＦ−Ｉ，  ２％  ＦＣＳ）に浮遊させ２４穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ  ２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に１穴あたり１ｘ１０４個／５００μｌを播種した。細胞接着確認後、ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦ溶液５μｌを添加し、３７℃，  ５％  ＣＯ２，  １００％  ｈｕｍｉｄｉｔｙで培養した。３日後ＷＳＴ−１試験液（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を５０μｌ／ｗｅｌｌ分注し、４時間後の吸光度（４５０−６２０ｎｍ）を測定した。
（２）コラーゲン結合ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦの細胞増殖活性
２４穴培養プレートにウシＩ型コラーゲン  １０μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液（氷冷）５００μｌを分注し、４℃で一昼夜インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄後、ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦ溶液５００μｌを分注し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄後、培養液（基本培地＝ＥＢＭ−２，  添加試薬＝ＩＧＦ−Ｉ，  ２％  ＦＣＳ）に浮遊させたヒト冠状動脈血管内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）１ｘ１０４個／５００μｌを播種した。以下、上記（１）と同様にＷＳＴ−１法にて細胞増殖活性を検討した。  溶液内投与実験の場合、ＨＧＦ濃度換算で０〜１００  ｎｇ／ｍｌの範囲内で濃度依存的な血管内皮細胞増殖効果を示した。しかもＨＧＦそのものが示す活性を上回る値であった。従って、本発明のＨＧＦ誘導体おいては、融合蛋白質としての設計によってその本来の増殖活性が失われていないばかりでなく、むしろ効果の安定性も実現されている可能性が考えられる。実際に細胞が増殖した像を図６に示す。
また、コラーゲン固定化後も濃度依存的に内皮細胞増殖活性を示した。固定化の系の場合、ＨＧＦそのものは僅かな増殖傾向を示すのみであった。ＥＬＩＳＡの結果が示すとおり、ＨＧＦ単独では洗浄後に残存した因子量がごく少量であるためと考えられる。
活性の安定性は、結合後１週間においても活性が高いレベルで維持されていたが、ＨＧＦそのものの場合は、結合が弱いためこのような効果は示されなかった。
【００３９】
Ｃ）血管新生効果の検討
１）血管ネットワーク様構造の形成。  組織中での血管新生効果を予測する実験として、ネットワーク様の構造が形成されるかを以下のように検討した。
まずコラーゲンコートされたウェル（２４穴プレート）に４０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦあるいは、ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦを添加して結合させた。結合後ウェルをＰＢＳで数回洗浄した。洗浄後、ヒト皮膚微小静脈内皮細胞（ＨＤＭＶＥＣ）  をウェルあたり２×１０４個播種し、ＥＢＭ２培地等で培養した（血清２％、成長因子としてＥＧＦ＋ＩＧＦを加え、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ２は加えない）。２４時間培養（３７℃）した後、０．３％コラーゲンゲルを重層し、３７℃で３０分から１時間静置してゲル化させたのち、培養液を１ｍｌ添加した。２４時間後の状態を、写真撮影した。その結果明らかに、ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦによるネットワーク形成の促進効果が認められた（図７）。
２）注射
ラット下肢を剃毛後、その部位にシリンジを用いて、ＨＧＦ誘導体あるいはＨＧＦの溶液を、皮下約３ｍｍの深さの筋肉に１５０μｌ注入した。１５秒間針を注入後穿刺部位にとどめてからシリンジを抜いた。
４時間後に組織を摘出し、凍結切片を作成した。これを抗ＨＧＦ抗体および抗ＦＮＣＢＤ抗体で免疫染色を行ったところ、ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦは筋繊維の間にあるコラーゲン繊維の部位に分布を認めた。コラーゲン繊維の分布はアザン染色で確認した。一方、ＨＧＦは筋肉組織中に残存していなかった。
【００４０】
【発明の効果】
以上のように本発明のＨＧＦ誘導体は、以下のような効果を持っている。
（１）強固かつ安定なコラーゲン結合性を持っているため、損傷部に投与するとその部位に固定化されＨＧＦとしての活性を発揮して血管新生を投与部位に誘導できる。
（２）またこのような効果を得るために遺伝子の形で投与することも可能である。
（３）細胞移植の際に、同時にあるいは事前に投与すると血管新生が誘導され、移植細胞の活性を高め、生着しやすくなる効果をもつ。その結果としての組織再生が適切に進行する。
（４）コラーゲンを成分として含むかコラーゲンを吸着させた医療用材料と複合化することが可能であり、早期に自己組織化が可能な生体埋め込み材料への応用が期待される。
（５）融合蛋白質として設計されることで、血管新生因子としての安定性が高まり、天然型ＨＧＦに比べて高い活性を示すという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＧＦ誘導体ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦの精製度を示す図である。
【図２】ＨＧＦ誘導体ＦＮＣＢＦ−ＨＧＦが血清処理により、ヘテロダイマーとなることを示す図である。
【図３】ＨＧＦ誘導体ＦＮＣＢＦ−ＨＧＦと天然型ＨＧＦとでコラーゲン結合性を比較した図である
【図４】各種コラーゲンへの結合活性を示す図である。
【図５】ＨＧＦ誘導体ＦＮＣＢＤ−ＨＧＦの溶液中での活性を示す図である。
【図６】コラーゲン結合後の活性を示す顕微鏡写真像である。
【図７】血管ネットワーク形成を培養条件下で示した図である。
【配列表フリーテキスト】
配列番号１
人工配列の説明：エンテロキナーゼ認識配列が付加されたヒト・ＨＧＦ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
配列番号２
人工配列の説明：ヒト・ファイブロネクチンコラーゲン結合性ドメイン内の配列（Ａｌａ２６０からＡｒｇ４８４）をコードするＤＮＡ配列
配列番号３
人工配列の説明：ヒト・ファイブロネクチンコラーゲン結合性ドメイン内の配列（Ａｌａ２６０からＡｒｇ５９９）をコードするＤＮＡ配列
配列番号４
人工配列の説明：ＨＧＦ誘導体（ヒト・ファイブロネクチンコラーゲン結合性ドメインとヒト・ＨＧＦ成熟ポリペプチドの融合蛋白質）をコードするＤＮＡ配列。
配列番号５
人工配列の説明：ＨＧＦ誘導体のアミノ酸配列。
配列番号６
人工配列の説明：ＨＧＦ配列を増幅するためのＰＣＲ用センスプライマー１
配列番号７
人工配列の説明：ＨＧＦ配列を増幅するためのＰＣＲ用アンチセンスプライマー１
配列番号８
人工配列の説明：フィブロネクチンコラーゲン結合ドメイン（ＦＮＣＢＤ）配列を増幅するためのＰＣＲセンスプライマー２
配列番号９
人工配列の説明：ＦＮＣＢＤ配列を増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー２
配列番号１０
人工配列の説明：ＦＮＣＢＤ配列を増幅するためのＰＣＲアンチセンスプライマー３
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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