(57)【要約】【課題】本発明は、ケトカルボン酸を還元して、高い光学純度の光学活性ヒドロキシカルボン酸を生成するＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードする新規なポリヌクレオチドの提供を課題とする。【解決手段】α−ケトカルボン酸に広く作用し、Ｄ−α−ヒドロキシカルボン酸を生成する高活性な酵素をスクリーニングした結果、エンテロコッカス・フェーカリス　がこのような特徴を持つＤ−マンデル酸脱水素酵素を生産することを見出した。そしてＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードする新規な遺伝子の単離に成功した。これにより光学活性ヒドロキシカルボン酸の効率的な製造が可能である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のＤ−マンデル酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項２に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項２に記載のタンパク質、請求項４に記載の形質転換体、もしくはその処理物をケトカルボン酸に作用させ、該ケトカルボン酸を還元し光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造することを特徴とする、光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項７】
ケトカルボン酸がベンゾイルギ酸誘導体であり、光学活性ヒドロキシカルボン酸が（Ｒ）−マンデル酸誘導体である請求項６に記載の光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【請求項８】
請求項２に記載のタンパク質、請求項４に記載の形質転換体、もしくはその処理物をラセミ体ヒドロキシカルボン酸に作用させ、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性ヒドロキシカルボン酸を取得することを特徴とする、光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造に有用である新規なＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いた光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性ヒドロキシカルボン酸は、種々の医薬品の合成原料として重要な化合物である。例えば、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸はアンジオテンシン変換酵素阻害剤の原料として、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸は血液凝固阻害剤の原料やジアステレオマー分割の分割剤として、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸は糸状菌の生産する生理活性物質ＰＦ１０２２の前駆物質　（Ｊ．　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　４５，　６９２（１９９２）　）　として重要な物質である。これらの光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造方法として以下の方法などが報告されている。
・ラセミ体の分別結晶による光学分割法（特開２００１−７２６４４）
・クロマトグラフィーによる光学分割法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．　（１９８３），２８２，　８３−８）
・ニトリラーゼを用いる方法（特開平４−９９４９６、特開平６−２３７７８９）
・ラセミ体の一方を酸化することにより光学活性体を得る方法（特開平６−１６５６９５）
・ヒドロキシルニトリルリアーゼを用いる方法（特開　２００１−３５４６１６）
【０００３】
ラセミ体の分別結晶による光学分割や、クロマトグラフィーによる光学分割では、目的とする光学異性体を回収する一方で、不要な対掌体を利用できないため、原料の一部を失う結果になる。つまり、原料を有効に利用できないため、コストを高める原因となる。同様に、ラセミ体の一方を酸化することで光学活性体を得る方法は、目的とする光学活性体を回収する一方で、不要な対掌体を利用できないため、コストを高める原因となる。不要な対掌体を回収して、ラセミ化することで原料として再利用する方法も報告されているが、操作が煩雑である。
【０００４】
ニトリラーゼを用いる方法は、原料としてマンデロニトリル誘導体を必要とする。マンデロニトリル誘導体の合成には、青酸ソーダが必要であり、その青酸ソーダは、酵素ニトリラーゼを阻害するため、青酸ソーダ濃度のコントロールが必要となり、工業的な生産には適していない。
【０００５】
ヒドロキシニトリルリアーゼを用いる方法は原料として、ベンズアルデヒドと青酸を原料とする。青酸は人に対する毒性が高く、また、酵素に対する毒性も高いため、工業的な生産には適していない。
【０００６】
一方、ケトカルボン酸を原料として、不斉還元反応により光学活性なヒドロキシカルボン酸を生産する方法は、理論上原料を１００％生産物に変換可能なこと、一般に酵素を用いた不斉還元反応は立体選択性が高く、光学純度の高いヒドロキシカルボン酸を合成しうることから工業的に有利である。特に、このような不斉還元反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を、異種の宿主に導入し、還元酵素を高発現させた遺伝子組換え菌を用いて不斉還元反応を行うことにより光学活性なヒドロキシカルボン酸を得る方法は、高い生産性と高い立体選択性が得られるため、工業的に有利である。
【０００７】
従来、ケトカルボン酸を還元し、光学活性、特に　（Ｒ）　−２−ヒドロキシカルボン酸を生成するＤ−α−ヒドロキシ酸脱水素酵素としては、
・Ｄ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＬＤＨ）、
・Ｄ−α−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素（Ｄ−ＨｉｃＤＨ）、
・Ｄ−マンデル酸脱水素酵素（Ｄ−ＭａｎＤＨ）
・Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素
・α−ケト酸還元酵素　（還元活性は有するが、酸化活性は有しない酵素）
などが高度に精製され、その諸性質が明らかにされている。
【０００８】
Ｄ−乳酸脱水素酵素としては、大腸菌　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２４３，　２５７９−２５８６　（１９６８））　、ラクトバチルス・コンフューサス　（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏｎｆｕｓｕｓ　ＤＳＭ　２０１９６，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１８，　７５−８５　（１９８３））　などから精製され、その性質が報告されているが、ピルビン酸に対する還元活性に比較して、ベンゾイルギ酸、フェニルピルビン酸やα−ケトイソカプロン酸などに対する活性が低く、汎用的な光学活性ヒドロキシカルボン酸の合成に利用するには適していない。
【０００９】
Ｄ−α−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素、Ｄ−フェニル乳酸脱水素酵素としては、
・キャンディダ・マルトーサ　（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｆｌａｎｚ．　１８１，　１８９−１９８　（１９８６））
・クロストリジウム・スポロゲネス　（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｎ．　Ｊ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１４，　４２９−４３５　（１９６８））
・フザリウム・サムブキナム　（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６７，　１１７４１−１１７４４　（１９９２））
・ハロフェラックス・メディテラネイ　（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ　Ｒ４、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ
８２，　１１４３−１１５０　（２０００））
・ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・シュードプランタラム　（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｐｓｅｕｄｏｐｌａｎｔａｒｕｍ　ＤＳＭ　２０００８、特公平　０１−２７７１７）
・ラクトバチルス・クルベイタス　（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｕｒｖａｔｕｓ　ＤＳＭ　２００１９、特開昭６２−１００２８６）
・ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・バルガリス　（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ　ＬＭＧ６９０１、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２２４，　４３９−４４６　（１９９４））
・ミセリア・ステリリア　（Ｍｙｃｅｌｉａ　ｓｔｅｒｉｌｉａ，　ＷＯ　０１／８１５６３）
・ロドトルラ・グラミニス　（Ｒｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｒａｍｉｎｉｓ　ＫＧＸ３９、Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１３５，　２０３５−２０４４　（１９８９））
・　ストレプトコッカス・フェーカリス　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＩＦＯ　１２９６４、現在の菌株名はエンテロコッカス・フェーカリス、特公平　０２−３４５９８）
【００１０】
α−ケト酸還元酵素としては、本発明者らがこれまでに、
・　ロイコノストック・オエノス　（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｏｅｎｏｓ、特許公報　２７５００１７）
・　ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム　（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）
から、酵素が部分精製、もしくは、精製され、その諸性質が報告されている。
【００１１】
しかしながら、これらの中で、その遺伝子がクローニングされ、異種微生物での高発現が報告されているのは、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・シュードプランタラム　（特開平　０２−８４１８４）、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・バルガリス　（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２２４，　４３９−４４６　（１９９４））、ミセリア・ステリリア　（ＷＯ　０１／８１５６３）、ロイコノストック・オエノス　（特開２０００−２３８６８２）、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム　）のみである。
【００１２】
また、光学活性ヒドロキシカルボン酸の生産においては、α−ケトカルボン酸の還元反応だけでなく、光学活性ヒドロキシカルボン酸の立体選択的な脱水素活性を併せ持つ酵素は、ラセミ体ヒドロキシカルボン酸を立体選択的に酸化することにより、逆の立体の光学活性ヒドロキシカルボン酸を合成できるため、産業上有意であるが、上記、クローニング済みの酵素の中で、酸化反応、還元反応が共に報告されているのは、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・シュードプランタラム、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・バルガリス由来の２種のみである。
【００１３】
また、ロイコノストック・オエノス、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム由来のα−ケト酸還元酵素は、いずれも比較的基質特異性が狭く、汎用的な光学活性ヒドロキシカルボン酸の合成には不適である。
【００１４】
更に、Ｄ−α−ヒドロキシ酸脱水素酵素を用いた光学活性ヒドロキシカルボン酸の合成においては、対応する補酵素ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの再生が必須であるが、異種の微生物などによりＤ−α−ヒドロキシ酸脱水素酵素を生産した後に、生産菌より酵素を精製し、得られたＤ−α−ヒドロキシ酸脱水素酵素と、補酵素再生用の酵素としてアルコール脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、もしくは、ギ酸脱水素酵素などを加えた膜型リアクターなどを利用した光学活性ヒドロキシカルボン酸を合成する方法　（特公平　０３−６２３９３）　は、酵素の調製にコストがかかること、精製した酵素は一般に安定性が低下すること、高価な補酵素を添加する必要があること、など産業上の利用には不向きである。ケトカルボン酸還元酵素を利用した光学活性ヒドロキシカルボン酸の合成には、Ｄ−α−ヒドロキシ酸脱水素酵素と補酵素再生用のグルコース脱水素酵素やギ酸脱水素酵素を同一の異種微生物中で高発現させ、異種微生物に内在する補酵素を利用して、菌体そのものを利用して反応を行わせることが、コスト、労力両面から優れているが、これまでＤ−α−ヒドロキシ酸脱水素酵素と補酵素再生用酵素を同一の菌体内で高発現させ、両酵素を含有する菌体を利用した光学活性ヒドロキシカルボン酸の生産は報告されていない。α−ケトカルボン酸を還元する酵素が還元反応のみを触媒する還元酵素の場合には酸化還元反応の平衡を考慮する必要がないが、α−ケトカルボン酸を還元する酵素がＤ−α−ヒドロキシ酸脱水素酵素を利用する場合は、酸化還元反応が可逆的であるため、不斉還元反応を効率よく進めるためには、補酵素再生用酵素により菌体内の補酵素の酸化型、還元型の存在割合を還元型に傾けておく必要があるため、この補酵素再生用酵素を同一の菌体内で発現させることは、Ｄ−α−ヒドロキシ酸脱水素酵素を利用する場合に特に効果的である。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ケトカルボン酸を還元して、高い光学純度の光学活性ヒドロキシカルボン酸を生成するＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードする新規なポリヌクレオチドを提供することを課題とする。さらに、本発明は、該ポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された形質転換体、特に補酵素再生用酵素をコードするポリヌクレオチドをあわせて含むベクターで形質転換された形質転換体を利用して、高い光学純度の光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造する方法の提供を課題とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、α−ケトカルボン酸に広く作用し、Ｄ−α−ヒドロキシカルボン酸を生成する高活性な酵素をスクリーニングした結果、エンテロコッカス・フェーカリス　（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＩＡＭ　１００７１）　がこのような特徴を持つＤ−マンデル酸脱水素酵素を生産することを見いだした。更に、このＤ−マンデル酸脱水素酵素を精製した結果、２種類　（Ｄ−ＭａｎＤＨ１及びＤ−ＭａｎＤＨ２）　の酵素が存在することを見いだし、その諸性質を明らかにしている　（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６８，　９４７−９５１　（２００２））。エンテロコッカス・フェーカリスは、旧名ストレプトコッカス・フェーカリスであり、ストレプトコッカス・フェーカリスよりＤ−２−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素が以前に精製され、その諸性質が明らかにされていたが（特公平　０２−３４５９８）　、驚くべき事に、ストレプトコッカス・フェーカリス由来のＤ−２−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素は、ドデシル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲル電気泳動　（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）　におけるサブユニットの分子量が３４，０００、ゲル濾過による分子量が７２，０００のホモダイマーであるのに対し、エンテロコッカス・フェーカリスより本発明者らが精製したＤ−マンデル酸脱水素酵素は、Ｄ−ＭａｎＤＨ１，　Ｄ−ＭａｎＤＨ１　のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるサブユニットの分子量が３２，０００と４０，０００、ゲル濾過における分子量が１１０，０００と１３０，０００のいずれもホモテトラマーであり、明らかに異なる酵素であった。
【００１７】
本発明者らは、このＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードする遺伝子を大腸菌にクローニングし、その塩基配列を解析した結果、驚くべき事に、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、これまでに報告されているＤ−２−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素をコードする遺伝子との相同性の低い、全く新規なポリヌクレオチドであることが分かった。
【００１８】
すなわち本発明は、光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造に有用な新規なＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を用いる該酵素並びに光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造する方法に関し、より具体的には、
〔１〕　下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のＤ−マンデル酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
〔２〕　〔１〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質。
〔３〕　〔１〕に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
〔４〕　〔１〕に記載のポリヌクレオチド、または〔３〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
〔５〕　〔４〕に記載の形質転換体を培養する工程を含む、〔２〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔６〕　〔２〕に記載のタンパク質、〔４〕に記載の形質転換体、もしくはその処理物をケトカルボン酸に作用させ、該ケトカルボン酸を還元し光学活性ヒドロキシカルボン酸を製造することを特徴とする、光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
〔７〕　ケトカルボン酸がベンゾイルギ酸誘導体であり、光学活性ヒドロキシカルボン酸が（Ｒ）−マンデル酸誘導体である〔６〕に記載の光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
〔８〕　〔２〕に記載のタンパク質、〔４〕に記載の形質転換体、もしくはその処理物をラセミ体ヒドロキシカルボン酸に作用させ、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性ヒドロキシカルボン酸を取得することを特徴とする、光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造方法、を提供するものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明における「脱水素酵素」とは、脱水素反応、すなわち水素を含む化合物から水素が除去される酸化反応、を触媒する酵素を意味する。さらに該酵素は、ケトンに対する還元活性を有し、還元的条件下においては、酸化反応の逆反応を触媒することができる。従って本発明における「脱水素酵素」は、前記酸化反応の逆反応である水素を付加する還元反応を触媒する作用を有する。一般に「デヒドロゲナーゼ」、「酸化還元酵素」、「オキシダーゼ」または「レダクターゼ」等の名称で呼ばれる酵素も同様の作用を有する場合には本発明による「脱水素酵素」に含まれる。
【００２０】
本発明において、Ｄ−マンデル酸に対する酸化活性は、例えば、次のようにして測定することができる。トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ　７．５）−５０　ｍＭ、ＮＡＤ＋−５．０　ｍＭ、Ｄ−マンデル酸−１０　ｍＭ及び酵素を含む反応液を、３０℃で反応し、ＮＡＤＨの増加にともなう３４０　ｎｍの吸光度の上昇を測定することにより、確認することができる。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの増加を触媒する酵素量とする。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行うことができる。
【００２１】
また、ベンゾイルギ酸に対する還元活性は、例えば、次のようにして測定することができる。トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ　７．５）−５０　ｍＭ、ＮＡＤＨ−０．１　ｍＭ、ベンゾイルギ酸−１０　ｍＭ及び酵素を含む反応液を、３０℃で反応し、ＮＡＤＨの減少にともなう３４０　ｎｍの吸光度の減少を測定することにより、確認することができる。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とする。本発明において、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素活性の有無の評価は、例えば、上記の酸化・還元活性測定方法により実施することができる。より具体的には、後述の実施例に記載の方法により行うことが可能である。
【００２２】
本発明は、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡやＲＮＡのような天然に存在するポリヌクレオチドであることもできるし、人工的に合成されたヌクレオチド誘導体を含むポリヌクレオチドであっても良い。
【００２３】
本発明のＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：１に示す塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明によるＤ−マンデル酸脱水素酵素の好ましい態様を構成する。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者であれば、配列番号：１記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　１０，ｐｐ．６４８７　（１９８２），　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８　（１９８３），　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄＥｄｔ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）　，　ＰＣＲ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ．２００　（１９９１）　などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することが可能である。
【００２５】
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドはとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、例えばＥＣＬ　ｄｉｒｅｃｔ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｉｃａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（ｗａｓｈ：４２℃、０．５ｘ　ＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ）において、又は、０．２ｘＳＳＣ　（１ｘＳＳＣ：　１５　ｍＭ　クエン酸３ナトリウム、１５０　ｍＭ　塩化ナトリウム）、０．１％　ＳＤＳ溶液中で６０℃，　１５分間洗浄する条件において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００２６】
ストリンジェントな条件下で配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドには、配列番号：１と類似する塩基配列を含むものが含まれる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードしている可能性が高い。
【００２７】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％または８０％、より好ましくは９０％以上のホモロジーを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質のホモロジー検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、ＦＡＳＴＡ　ｐｒｏｇｒａｍやＢＬＡＳＴ　ｐｒｏｇｒａｍなどを用いて、例えば、インターネット上で行うことができる。配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてＤＤＢＪを対象にＢＬＡＳＴ　ｐｒｏｇｒａｍを用いてホモロジー検索を行った結果、高いホモロジーを示したのは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス　（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｌａｃｔｉｓ）　由来の２−デヒドロパント酸２−還元酵素　（２−ｄｅｈｙｄｒｏｐａｎｔｏａｔｅ　２−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）　の６９％　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　であるが、この配列はゲノム解析の結果得られたＤＮＡ配列より予想されたタンパク質であり、タンパク質としての実在、機能などは不明である。その他の３０％以上のホモロジーが示されたアミノ酸配列も全てゲノム配列由来であり、２−デヒドロパント酸２−還元酵素と予想されているものの、その機能は特定されていなかった。本発明者らがロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムよりクローニングした２−クロロベンゾイルギ酸に対して還元作用のみを有し、酸化活性を有しないケト酸還元酵素　（ＬｍＫＡＲ１）　もまた、２−デヒドロパント酸２−還元酵素と予想されているいくつかのアミノ酸配列に相同性を示したため、本発明のＤ−マンデル酸脱水素酵素　（Ｄ−ＭａｎＤＨ１）　のアミノ酸配列との相同性をＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法で調べた結果、３８．５％の相同性を示した。上記したように、ＬｍＫＡＲ１と本発明Ｄ−マンデル酸脱水素酵素とは、反応の特異性、基質特異性において大きな差異を有する。またＬｍＫＡＲ１は、２−デヒドロパント酸２−還元酵素の生理的基質である２−ケトパント酸に対して極めてわずかにしか活性を示さず、本発明Ｄ−マンデル酸脱水素酵素もまた、２−ケトパント酸に対してベンゾイルギ酸の１％の活性しか示さなかった。
【００２８】
本発明の５０％以上のホモロジーとは、例えば、ＢＬＡＳＴ　ｐｒｏｇｒａｍを用いたタンパク質全体に対するＩｄｅｎｔｉｔｙの値を示す。
【００２９】
本発明において、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするこれらのポリヌクレオチドは、特に配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対するホモログと言う。ホモログは、変異の導入の他、配列番号：１に記載された塩基配列に基づいて他の生物からＰＣＲクローニングやハイブリダイズによって単離することもできる。例えば配列番号：１に記載の塩基配列は、エンテロコッカス・フェーカリスより単離された遺伝子のものである。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のＤ−マンデル酸脱水素酵素の遺伝子工学的な製造に有用である。あるいは本発明のポリヌクレオチドによって、光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造に有用なＤ−マンデル酸脱水素酵素活性を有する微生物を遺伝子工学的に作り出すことができる。
【００３１】
本発明のＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、エンテロコッカス・フェーカリスよりＤ−マンデル酸脱水素酵素を精製し、その部分アミノ酸配列を明らかにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションなどの手法により単離することも可能であるが、エンテロコッカス・フェーカリスより得られるＤ−マンデル酸脱水素酵素の量はわずかであり　（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６８，　９４７−９５１　（２００２））、部分アミノ酸配列を得ることは困難であった。
【００３２】
本発明者らは、エンテロコッカス・フェーカリスより染色体ＤＮＡを調製し、制限酵素によりランダムに消化した染色体ＤＮＡをベクターに挿入することによりライブラリーを構築し、該ライブラリーにより形質転換された大腸菌約３０００コロニーを培養し、形質転換株がＤ−マンデル酸脱水素酵素活性有するか否かをプレート上での発色で判断し、更に、プレートで活性が認められた１株を通常の液体培地で培養し、その菌体を破砕し、その無細胞抽出液のＤ−マンデル酸脱水素酵素活性を測定することにより、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを含む形質転換株を得ることが出来た。
【００３３】
なお本発明のポリヌクレオチドは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得ることもできる。
【００３４】
このようにして単離された、本発明によるＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素を形質転換株より得ることができる。
【００３５】
本発明においてＮＡＤ＋を補酵素とするＤ−マンデル酸脱水素酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、ＮＡＤ＋を補酵素とするＤ−マンデル酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターにより形質転換され、ＮＡＤ＋を補酵素とするＤ−マンデル酸脱水素酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。
・エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属
・バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属
・シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属
・セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属
・ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
・コリネバクテリイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
・ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属
・ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌
・ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属
・ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
・サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属
・クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属
・シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属
・チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属
・ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属
・トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属
・ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属
・ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属
・キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
・ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属
・アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属
・セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属
・トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００３６】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラー・クローニング、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤ＋を補酵素とする（Ｒ）−Ｄ−マンデル酸脱水素酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのポリヌクレオチドを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のポリヌクレオチド鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｅｎｇ．　４３，　７５−１０２　（１９９０）、Ｙｅａｓｔ　８，　４２３−４８８　（１９９２）、などに詳細に記述されている。
【００３７】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドを利用でき、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、　ｔｒｃ　（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージ　ＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｄ（特開２０００−１８９１７０に記載）が好適に利用できる。
【００３８】
バチルス属においては、ベクターとしてｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてａｐｒ（アルカリプロテアーゼ）、　ｎｐｒ（中性プロテアーゼ）、ａｍｙ（α−アミラーゼ）などが利用できる。
【００３９】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａ）などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平５−２８４９７３）遺伝子などが利用できる。
【００４０】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ　３９，　２８１　（１９８５））などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００４１】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９６，　１７５　（１９８４）などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００４２】
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属においては、ｐＨＶ１３０１（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．　２６，　２３９　（１９８５）、ｐＧＫ１（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　５０，　９４　（１９８５））などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００４３】
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたｐＡＭβ１（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１３７，　６１４　（１９７９））などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００４４】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）から単離されたプラスミドベクターが使用可能である　（Ｊ．
Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１３８，１００３　（１９９２）　）。
【００４５】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属においては、ＨｏｐｗｏｏｄらのＧｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（１９８５）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）においては、ｐＩＪ４８６　（Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２０３，　４６８−４７８，　１９８６）、ｐＫＣ１０６４（Ｇｅｎｅ　１０３，９７−９９　（１９９１）　）、ｐＵＷＬ−ＫＳ　（Ｇｅｎｅ　１６５，１４９−１５０　（１９９５）　）が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｌ．　１１，　４６−５３　（１９９７）　）。
【００４６】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　においては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（ＥＰ　５３７４５６など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ＡＤＨ（アルコール脱水素酵素）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、ＰＨＯ（酸性フォスファターゼ）、ＧＡＬ（β−ガラクトシダーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＥＮＯ（エノラーゼ）などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４７】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来２μｍ系プラスミド、ｐＫＤ１系プラスミド（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１４５，　３８２−３９０　（１９８１））、キラー活性に関与するｐＧＫｌ１由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子ＫＡＲＳ系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（ＥＰ　５３７４５６など）などが利用可能である。また、ＡＤＨ、ＰＧＫなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４８】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＲＳ　（自律複製に関与する遺伝子）及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　６，　８０　（１９８６））。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＤＨプロモーターなどが利用できる（ＥＭＢＯ　Ｊ．　６，　７２９　（１９８７））。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００４９】
チゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ　（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）由来の　ｐＳＢ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３，　４２６７　（１９８５））などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来　ＰＨＯ５　プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来　ＧＡＰ−Ｚｒ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）のプロモーター（Ａｇｒｉ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　５４，　２５２１　（１９９０））などが利用可能である。
【００５０】
ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属においては、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子　（ＰＡＲＳ１、　ＰＡＲＳ２）などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　５，　３３７６　（１９８５））、高濃度培養とメタノールで誘導可能な　ＡＯＸ　など強いプロモーターが利用できる（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１５，　３８５９　（１９８７））。また、ピキア・アンガスタ（Ｐｉｃｈｉａ　ａｎｇｕｓｔａ、旧名ハンゼヌラ・ポリモルファ　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（ＨＡＲＳ１、　ＨＡＲＳ２）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Ｙｅａｓｔ　７，　４３１−４４３　（１９９１））。また、メタノールなどで誘導される　ＡＯＸ（アルコールオキシダーゼ）、　ＦＤＨ（ギ酸脱水素酵素）のプロモーターなどが利用可能である。
【００５１】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ウチルス　（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）　などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Ａｇｒｉ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　５１，　５１，　１５８７　（１９８７））、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平　０８−１７３１７０）。
【００５２】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー　（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　、アスペルギルス・オリジー　（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７，　２８３−２８７　（１９８９））。
【００５３】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７，　５９６−６０３　（１９８９））。
【００５４】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ　３１５，　５９２−５９４　（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００５５】
すなわち本発明は、前記Ｄ−マンデル酸脱水素酵素を発現する形質転換株を利用したケトカルボン酸の還元による光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造方法に関する。本発明のＤ−マンデル酸脱水素酵素は、ＮＡＤＰＨに比べて安価で安定なＮＡＤＨを補酵素として利用しうることから、工業的な利用において有利である。本発明のＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを含む形質転換株、形質転換株を含む培養物、その処理物を反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤＨを酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明におけるＤ−マンデル酸脱水素酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００５６】
本発明による光学活性ヒドロキシカルボン酸の製造方法において原料となるケト酸としては、２−ケト酪酸、２−ケト吉草酸、２−ケトイソ吉草酸、２−ケトカプロン酸、２−ケトイソカプロン酸、ベンゾイルギ酸、２−クロロベンゾイルギ酸、３−クロロベンゾイルギ酸、フェニルピルビン酸、インドールピルビン酸などをあげることができる。
【００５７】
また本発明は、前記Ｄ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを含む形質転換株を用いて、ラセミ体ヒドロキシカルボン酸の立体選択的酸化によるケト酸、並びに、光学活性Ｌ−２−ヒドロキシカルボン酸の製造方法に関する。本発明のＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを含む形質転換株、または、その処理物をラセミ体ヒドロキシカルボン酸に作用させ、反応産物であるケト酸、並びに、残存するＬ−２−ヒドロキシカルボン酸を製造することができる。本発明において基質とすることができるヒドロキシカルボン酸には、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシ吉草酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、２−ヒドロキシカプロン酸、２−ヒドロキシイソカプロン酸、マンデル酸、２−クロロマンデル酸、３−クロロマンデル酸、フェニル乳酸、インドール乳酸等が利用可能である。
【００５８】
なお本発明における「光学活性ヒドロキシカルボン酸」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるヒドロキシカルボン酸、もしくはある光学異性体のみからなるヒドロキシカルボン酸を意味する。さらに、本発明の「光学異性体」は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」と呼ばれる場合もある。
【００５９】
前記本発明によるケト酸製造方法においては、ＮＡＤＨの再生系を組み合わせることができる。Ｄ−マンデル酸脱水素酵素による酸化反応に付随して、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨが生成する。ＮＡＤＨからＮＡＤ＋への再生は、微生物の含有するＮＡＤＨからＮＡＤ＋を再生する酵素（系）によって行うことができる。また、ＮＡＤＨからＮＡＤ＋を生成する能力を有する微生物もしくは酵素、例えば、グルタミン酸脱水素酵素、ＮＡＤＨオキシダーゼ、ＮＡＤＨ脱水素酵素等を反応系に添加することにより行うことが可能である。
【００６０】
同様にヒドロキシカルボン酸の製造方法においては、ＮＡＤＨの再生系を組み合わせることができる。還元反応に付随して、ＮＡＤＨからＮＡＤ＋が生成する。ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤ＋還元能（解糖系など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤ＋還元能は、反応系にグルコースまたはエタノールを添加することにより、増強することが可能である。また、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、アルコール脱水素酵素などを含む微生物、その処理物、ならびに精製酵素を用いてＮＡＤＨの再生を行うことができる。例えば、上記グルコース脱水素酵素の場合には、グルコースからδ−グルコノラクトンへの変換を利用することにより、ＮＡＤＨの再生が行われる。
【００６１】
これらのＮＡＤＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるヒドロキシカルボン酸の製造のための反応系に添加、もしくは固定化したものを添加することができる。あるいはＮＡＤＨの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
【００６２】
また、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換した微生物を、菌体の状態で前記ヒドロキシカルボン酸の製造方法に利用する場合には、ＮＡＤＨ再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡＤＨ再生活性の高い微生物を宿主として用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＨ再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。
【００６３】
本発明の形質転換株並びにその処理物を用いた酸化反応もしくは還元反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルｔ−ブチルエーテルなどの有機溶媒中、もしくは、エタノールやアセトン、ジメチルスルホキシド等の水性媒体との２相混合系により行うことができる。
【００６４】
本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクター等を利用して行うことも可能である。
【００６５】
本発明のＤ−マンデル酸脱水素酵素による酵素反応は、例えば、以下の条件で行うことができる。
・反応温度：４−６０℃、好ましくは１０−３７℃
・ｐＨ：３−１０、好ましくは４−９、さらに好ましくはｐＨ５−８
・基質濃度：０．０１−５０％、好ましくは０．１−３０％
【００６６】
反応系には必要に応じて補酵素ＮＡＤ＋またはＮＡＤＨを０．００１ｍＭ−１００ｍＭ、好ましくは、０．０１−１０ｍＭ添加することができる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【００６７】
ＮＡＤＨ再生のために反応系に添加される化合物、例えばグルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくは２−プロパノール等は、基質ケトカルボン酸に対してモル比で０．１−２０、好ましくは０．５−５倍過剰に添加することができる。ＮＡＤＨ再生用の酵素、例えばグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素等は、本発明のＮＡＤ＋依存性Ｄ−マンデル酸脱水素酵素に比較して酵素活性で０．１−１００倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することができる。
【００６８】
本発明のケト酸の還元により生成する光学活性ヒドロキシカルボン酸、立体選択的酸化反応により生成する光学活性ヒドロキシカルボン酸やケト酸の精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理等による分離、溶媒抽出、蒸留、イオン交換クロマトグラフィー、晶析等を適当に組み合わせることにより行うことができる。
【００６９】
例えば２−クロロマンデル酸では、微生物菌体を含む反応液を遠心分離し、微生物菌体をのぞいた後、その上清に酸を添加することによりｐＨを２以下にし、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルｔ−ブチルエーテルなどの溶媒を添加して、２−クロロマンデル酸を溶媒層に抽出する。これを相分離後、エバポレーターにより濃縮し、結晶化することにより、純度の高い２−クロロマンデル酸を精製することができる。
【００７０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７１】
［実施例１］エンテロコッカス・フェーカリスのゲノムライブラリーの調製
エンテロコッカス・フェーカリス　ＩＡＭ　１００７１株をＭＲＳ培地　（Ｄｉｆｃｏ製）　３０℃で１昼夜培養し、菌体を調製した。菌体より斉藤・三浦の方法により染色体ＤＮＡを調製した。
【００７２】
得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩにより部分消化し、３０００−４０００ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ｐＢＫ−ＣＭＶファージミドベクター　（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ製）　のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ＺＡＰ　ＥＸＰＲＥＳＳ　Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔを用いて大腸菌ＸＬＯＬＲ株へ導入し、ゲノムライブラリーを構築した。
【００７３】
［実施例２］　Ｄ−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを含む形質転換株のスクリーニング
ファージミドを含む大腸菌を５０μｇ／ｍｌ　カナマイシンを含むＬＢ培地　（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム、ｐＨ　７．２。以下、ＬＢ培地と略す）を含むプレートに植菌し、一昼夜培養した。培養後、ＮＹＬＯＮ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＭＥＭＢＲＡＮＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製）により、コロニーをフィルター上に移し取り、このフィルターを再び５０μｇ／ｍｌ　カナマイシンを含むＬＢ培地のプレートに移して培養し、これをコピープレートとした。
【００７４】
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．７％　寒天を含むプレートにフィルターを移し、４℃で２時間放置した。その後、リゾチーム溶液　（２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸　（以下、ＥＤＴＡと略す）　、５０ｍＭリン酸緩衝液）　を加えて、３７℃に２時間放置し、溶菌を行った。溶菌の完了したフィルターを活性染色プレート（２０ｍＭ　Ｄ−マンデル酸、５ｍＭ　ＮＡＤ＋、０．３ｍｇ／ｍｌ　ニトロブルーテトラゾリウム、０．０５ｍｇ／ｍｌ　フェナジンメトサルフェート、１．７％　寒天）に移し、ＮＡＤＨの生成に由来するホルマザンの発色を検出することにより、ポジティブクローンのスクリーニングを行った。
【００７５】
約３０００株のクローンより、１株のポジティブクローンが見いだされた。
【００７６】
［実施例３］ポジティブクローンのＤ−マンデル酸脱水素酵素活性の確認
得られたポジティブクローンを５０μｇ／ｍｌ　カナマイシンを含むＬＢ培地に一白金耳植菌し、一昼夜前培養した。これを再び５０μｇ／ｍｌ　カナマイシンを含むＬＢ培地に１％量植菌し、ＯＤ６６０が１．０を超えるまで本培養した。得られた菌体に、湿菌体量の等倍量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）を加え、懸濁した。これを、１５分間超音波破砕した後、４℃で遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、上清を回収して粗酵素抽出液を得た。粗酵素抽出液のＤ−マンデル酸脱水素酵素活性の測定と、タンパク量の定量を行い、比活性を求めた。
【００７７】
活性染色において発色しなかったコロニー、すなわちネガティブクローンに対しても同様の実験を行い、これを比較した。ネガティブクローンにはＤ−マンデル酸脱水素酵素活性がまったく見られなかった。また、ポジティブクローンでは、ベンゾイル蟻酸を基質として加えた場合と加えなかった場合で、ＮＡＤＨの減少速度が大きく異なっていることから、ポジティブクローン中には確かに、ＭＤＨが存在していることが明らかとなった。
【００７８】
一方、マンデル酸の酸化反応を検討したところ、ポジティブクローンの菌体抽出液はＤ型のマンデル酸のみと特異的に反応し、Ｌ型のマンデル酸を基質としたときは全く活性を示さなかった。
【００７９】
【表１】
2004065049.tif 000002
【００８０】
［実施例４］Ｄ−マンデル酸脱水素酵素をコードする遺伝子の塩基配列の解析
実施例３で得られたポジティブクローンより、ファージミドを調製し、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配列は、配列番号：１に示した。また、配列番号：１に記載のＤＮＡ配列より予想されるアミノ酸配列を配列番号：２に示した。
【００８１】
［実施例５］大腸菌からのＤ−マンデル酸脱水素酵素の精製
実施例３により得られたＤ−マンデル酸脱水素酵素をコードする遺伝子を有する組換え大腸菌を培養し、その菌体よりＤ−マンデル酸脱水素酵素を文献　（Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６８，　９４７−９５１　（２００２））記載の方法により精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた分子量、基質ベンゾイルギ酸に対するＫｍ値より、クローニングした遺伝子は、エンテロコッカス・フェーカリスが生産する２種類の酵素のうち、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素ＩＩであることが確認できた。
【００８２】
［実施例６］Ｄ−マンデル酸脱水素酵素のα−ケトパント酸に対する活性
実施例４により得られた予想アミノ酸配列を用いてＢＬＡＳＴ検索を行った結果、種々のゲノム由来のα−ケトパント酸還元酵素と予想されるＯＲＦに対してホモロジーが見られたため、実施例５により得られたＤ−マンデル酸脱水素酵素を用いてα−ケトパント酸に対する還元活性を測定した。ベンゾイルギ酸に対する活性測定条件　（基質濃度１０ｍＭ）　で、基質をα−ケトパント酸に変え、活性を測定した結果、ベンゾイルギ酸に対する活性の約１％しか活性を有しなかった。
【００８３】
【発明の効果】
本発明により、Ｄ−マンデル酸脱水素酵素をコードする新規な遺伝子が提供された。該遺伝子を利用することにより、光学活性ヒドロキシカルボン酸を効率的に製造することが可能となった。さらに、本発明の酵素を利用して、収率よくアルコールを生産することも可能である。
【００８４】
【配列表】
2004065049.tif 000003
2004065049.tif 000004
2004065049.tif 000005
2004065049.tif 000006
2004065049.tif 000007
2004065049.tif 000008