(57)【要約】　　　（修正有）【課題】関節の保護と正常な機能の確保に必要なヒアルロン酸と、これを分解する活性酵素を効率よく除去する酵素（ＳＯＤ）を結合させることによって得られた結合体の優れた抗炎症剤を提供する。【解決手段】ヒアルロン酸にヒト型Ｍｎ−ＳＯＤを結合することにより、活性酸素で分解しない安定で薬効のすぐれた抗炎症薬が得られる。【選択図】　図２
2004099581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸とヒト型マンガン・スーパーオキシドジスムターゼの結合体
【請求項２】
上記請求項１記載のヒアルロン酸とヒト型マンガン・スーパーオキシドジスムターゼの結合体を用いてヒトの各種炎症性疾患を治癒する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は抗炎症作用を持つ高分子ヒアルロン酸に活性酸素を消去するヒト型マンガン・スーパーオキシドジスムターゼを結合し、慢性関節リュウマチなどの炎症治療法に応用することに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は人体の多くの部位で生産される高分子多糖類で特に関節では潤滑油様の働きを司っている。関節炎やリュウマチなどではヒアルロン酸（ＨＡと略す）の分解により組織の破壊が見られる。一方、炎症部位では多くの白血球が浸潤集合して活性酸素を分泌しヒアルロン酸を分解している。
そこでこの活性酸素を分解消去可能な酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）が投与できればヒアルロン酸の分解が防止可能となる。従来これらのヒアルロン酸とＳＯＤは各々が独自に研究開発が行われてきたが上記の理由より両剤が共存することが好ましい。尚、両剤は本来人体組織に由来する物質ゆえ抗原性は無く安全な物質である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は組織特に関節の保護と正常な機能の確保に必要なヒアルロン酸とこれを分解する活性酸素を効率よく除去する酵素（ＳＯＤ）を結合させることによって得られた結合体の優れた抗炎症剤を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
前記の課題を解決する為に本研究者等は鋭意研究を続けた結果、本発明のヒアルロン酸とＳＯＤの結合体が抗炎症作用を生体内で相乗的に作用し、有効な薬剤であることを見出し本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、ヒアルロン酸とヒト型マンガン−ＳＯＤを一定の割合で結合させ両者の持つ薬剤としての特徴をさらに発揮せしめた新規な抗炎症剤に関するものである。
以下、本発明について詳しく説明する。
本発明のヒアルロン酸・ＳＯＤ結合物は高分子の多糖類であるヒアルロン酸に遺伝子操作技術によって製造されたヒト型Ｍｎ−ＳＯＤ（以下ｈＭｎ−ＳＯＤ）を化学的に結合して得られたものでありヒアルロン酸の示す組織保護作用とｈＭｎ−ＳＯＤの持つ抗炎症作用とがともに相乗的に効果を示したものである。
本発明のヒアルロン酸・ＳＯＤ結合物の作製に用いるヒアルロン酸としては分子量が約５０万〜１００万の高分子のものが好ましい。
本発明のヒアルロン酸・ＳＯＤ結合物の作製に用いるＳＯＤはヒト型でＭｎを含むＳＯＤが好ましい。Ｍｎ型ＳＯＤはＣｕＺｕ−ＳＯＤに比べて過酸化水素に対して耐性であると共に体内半減期が極めて長くそれ自体として薬効的に優れている。遺伝子操作技術によって大量に安定供給が可能である。
本発明の［ヒアルロン酸・ＳＯＤ結合体］（詳しくはＨＡ・ｈＭｎＳＯＤ結合体）は機能の異なる高分子多糖類と酵素ＳＯＤをそれぞれの持つアミノ酸、カルボキシル基あるいは水酸基など官能基を利用して両者の活性を保持できる条件の下で結合させたものであり、例えば（１）高分子ヒアルロン酸のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸とアミクロヘキシルカルボジイミドとを用いてエステルを導入し、これをＳＯＤのアミノ基に結合させることによって結合体を作製される方法。
（２）ヒアルロン酸の水酸基に塩化シアヌルを反応させた後、これをそのトリアジン環を介してＳＯＤのアミノ基に結合させることによって結合体を作製する方法。
（３）高分子ヒアルロン酸の水酸基に無水コハク酸を用いてカルボキシル基を導入し、さらにそのカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸とジサイクロキシルカルボジイミドとを用いてエステルを導入し、これをＭｎ−ＳＯＤのアミノ基に結合させる製造方法などによって作製することができる。
上記の結合体作製においてはヒアルロン酸とＳＯＤの重量比を各種検討したところ１０００：１〜１０００：１００の範囲が適当であり適応疾患によって最適剤形を選抜することが好ましい。
【０００５】
【実施例】
本発明を以下下記実施例をもって説明する。尚、これからの実施例は本発明を例示するためのものであってこれらにより本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の実施例で示したＳＯＤの活性測定はＭｃＣｏｒｄとＦｒｉｄｏｖｉｃｈ（Ｊ．Ｂ．Ｃ．１９８３）によった。
【０００６】
実施例１
高分子量（５０万〜１００万）のヒアルロン酸を５００ｍｇ用いて１０ｍｌの水溶液に溶解する。この溶液に塩化シアヌル液を０．１Ｎの水酸化ナトリウムを用いてｐＨ８〜１０に保ちながら１０〜２０分間で滴下した後、０．０５Ｎの塩酸を滴下してｐＨを３以下にさげ、その１０倍量のアセトンを加えて沈殿を濾過分取する。この沈殿をアセトン洗浄後約４００ｍｇのヒアルロン酸の活性測定を行った。このようにして得られた例えば１００ｍｇの活性化ヒアルロン酸を遺伝子操作によって製造されたヒト型Ｍｎ−ＳＯＤ１０ｍｇを２ｍｌの０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）に溶解後、両者を混合し４〜６℃で極めて穏やかに混合攪拌した（約１０時間）。その後水に対して２〜３回透析し遠心分離後最終的に凍結乾燥品とした。この条件で作製されたヒアルロン酸には１〜２分子のＭｎ−ＳＯＤが結合しており、その酵素活性は８０〜９０％を保持していた。
【０００７】
実施例２
高分子ヒアルロン酸とｈＭｎ−ＳＯＤの結合体の体内半減期をラットを用いて検討した。実施例１で作製したヒアルロン酸・ＳＯＤ結合体をラットに静注後、経時的にＳＯＤの活性を指標に半減期を求めたところｈＭｎ−ＳＯＤの単独の半減期が約１２時間であったのに対して結合体のそれは４０〜６０時間であり大幅な半減期の延長が認められた。
【０００８】
実施例３
高分子ヒアルロン酸は炎症部位において浸潤してきた多数の白血球より放出される活性酸素によって分解され低分子化することが知られている。本発明によって創製されたヒアルロン酸・ＳＯＤ結合体は以下の実験においてこの低分子化を防御することが判明した。即ちヒアルロン酸あるいはＳＯＤ単独に比して本発明の結合体は有意にヒアルロン酸の特徴である粘性を保持することが判明した（図１）。高分子ヒアルロン酸が炎症部位（例えば関節）では活性酸素によって分解されてしまうことは一般に知られている事実である。そこで本実験ではｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒアルロン酸の分解の程度をその溶液の粘性の変化によって比較検討した。高分子ヒアルロン酸約２ｍｇ／ｍｌをヒポキサンチン存在下で前溶解し、一定時間後にキサンチンオキシダーゼを添加してヒアルロン酸の分解をその粘度を計測することによって判定した。
【０００９】
実施例４
整形外科の領域では変形性関節炎にたいしてヒアルロン酸の投与が症状の寛解をもたらすことが良く知られている。これはヒアルロン酸が疼痛を和らげ骨膜の修復などを誘導するためである。ところが慢性関節リュウマチ炎ではヒアルロン酸の薬効は殆ど示さない。
この原因として推察されるのが多量に浸潤集積した好中球からの活性酸素の分泌によるヒアルロン酸の分解が考えられている。そこで本発明の高分子ヒアルロン酸とＳＯＤの結合体が慢性関節リュウマチ炎の動物モデルであるアジュバント関節炎において薬効を示すかをヒアルロン酸単独投与をコントロールに調べたところ図２に示すように本発明の高分子ヒアルロン酸・ＳＯＤ結合体においてのみ有効性が示された。
【００１０】
実施例５
ラットを用いたブラジキニンによる実験的関節疼痛に対する本発明のヒアルロン酸・ＳＯＤ結合物の抑制効果はヒアルロン酸単独の場合により優れていることを示している。この事実は本発明のヒアルロン酸・ＳＯＤ結合体が慢性関節リュウマチ患者の“痛み”を和らげながら関節組織の改善をもたらし得ることを示している。
【００１１】
【発明の効果】
本発明の高分子ヒアルロン酸・ＳＯＤ結合体（ＨＡ・ｈＭｎ−ＳＯＤ）は活性酸素によるヒアルロン酸の分解を防ぎ、ヒアルロン酸の効果をさらに助長することによって両剤の本来示す薬効が相乗的に効果を示す優れた抗炎症剤である。
【００１１】
【発明の効果】
本発明の高分子ヒアルロン酸・ＳＯＤ結合体（ＨＡ・ｈＭｎ−ＳＯＤ）は活性酸素によるヒアルロン酸の分解を防ぎ、ヒアルロン酸の効果をさらに助長することによって両剤の本来示す薬効が相乗的に効果を示す優れた抗炎症剤である。
【００１２】
【図面の簡単な説明】
第１図は高分子ヒアルロン酸の粘度の測定結果を示す。（ａ）はヒアルロン酸のみで経時的に分解が起こり粘度が低下しているが、ヒアルロン酸はヒト型マンガンＳＯＤを結合した分子（ｂ）と（ｃ）では活性酸素によるヒアルロン酸の分解は防御されて７０〜９０％の粘度を保持している。第２図はラットアジュバンド関節炎モデル（ｎ＝１０）に対して（ａ）ＨＡ・ｈＭｎ−ＳＯＤのみを投与後８週間にわたって足部の容積を測定した結果を示す。（ｂ）は非投与コントロールで足容積の増大が大きいが（ａ）では薬剤の抗炎症効果が顕著に見られる。
【図１】
2004099581.tif 000003
【図２】
2004099581.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成14年12月3日(2002.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】高分子ヒアルロン酸の粘度の測定結果を示す。（ａ）はヒアルロン酸のみで経時的に分解が起こり粘度が低下しているが、ヒアルロン酸はヒト型マンガンＳＯＤを結合した分子（ｂ）と（ｃ）では活性酸素によるヒアルロン酸の分解は防御されて７０〜９０％の粘度を保持している。
【図２】ラットアジュバンド関節炎モデル（ｎ＝１０）に対して（ａ）ＨＡ・ｈＭｎ−ＳＯＤのみを投与後８週間にわたって足部の容積を測定した結果を示す。（ｂ）は非投与コントロールで足容積の増大が大きいが（ａ）では薬剤の抗炎症効果が顕著に見られる。