(57)【要約】【課題】ＤＮＡ二重鎖切断の修復における２つの経路のうち、ＤＮＡ相同組換え修復を阻害すること。【解決手段】ウィザフェリンＡ又はその誘導体を有効成分とするＤＮＡ相同組換え修復阻害剤。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ相同組換え修復阻害作用を有する化合物を有効成分とする抗癌剤。
【請求項２】
ＤＮＡ相同組換え修復阻害作用を有する化合物を有効成分とする放射線増感剤。
【請求項３】
ＤＮＡ相同組換え修復阻害剤の有効量及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４】
ＤＮＡ相同組換え修復阻害剤の有効量及び薬学的に許容される担体を含む放射線増感剤。
【請求項５】
ＤＮＡ相同組換え修復阻害作用を有する化合物がウィザフェリンＡ又はその誘導体である請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項６】
ＤＮＡ相同組換え修復阻害作用を有する化合物がウィザフェリンＡ又はその誘導体である請求項２に記載の放射線増感剤。
【請求項７】
ウィザフェリンＡ及びウオルトマニンを有効成分とする抗癌剤。
【請求項８】
ウィザフェリンＡ及びウオルトマニンを有効成分とする放射線増感剤。
【請求項９】
ウィザフェリンＡ又はその誘導体を対照として用いるＤＮＡ相同組換え修復阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項７に記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗癌剤等として有用なＤＮＡ相同組換修復阻害作用を有する化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞が電離放射線等による傷害を受け、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ：Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｒｅａｋ）が起こった場合、図１に示すように、ＤＮＡを修復する２つの経路があることが解明された（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
第１の経路は、ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ等の遺伝子群が関与し、全細胞周期に働き、ＤＳＢの両断端を直接つなぐ非相同末端結合（ＮＨＥＪ：Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｎｄ−Ｊｏｉｎｉｎｇ）修復経路であり、第２の経路は、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４等の遺伝子群が関与し、相同なＤＮＡ鎖を必要とする相同組換え（ＨＲ：Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）修復経路である。
【０００４】
これらのうち、第２の経路であるＨＲ修復経路は、放射線などによる損傷の修復においてＤＮＡ合成期とそれに続くＧ２期だけに特異的に働いている重要な修復系であることがわかってきている。特に、癌細胞の特徴が細胞分裂を繰り返す（ＤＮＡ合成を繰り返す）ことであるのに対し、正常細胞はあまり分裂しないことから、このＤＮＡ合成期やＧ２期に誘導されたＤＳＢ修復を特異的に阻害することは、正常細胞と区別して特異的に癌細胞を殺すことができることを意味している。
【０００５】
【非特許文献１】
内海博司著，「ＤＮＡ二本鎖切断修復と放射線効果」，蛋白質  核酸  酵素，２００１年，Ｖｏｌ．４６，  Ｎｏ．８，  ｐ．１０８９−１０９６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、ＤＮＡ合成期とそれに続くＧ２期だけ特異的に働くＨＲ修復経路を阻害することにより、癌細胞の修復又は増殖を抑制することであり、また、正常細胞と区別して癌の放射線治療の効果を高める技術を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＤＳＢの修復において重要なＤＮＡ合成期とそれに続くＧ２期だけに特異的に働くＨＲ修復経路を阻害する化合物を初めて見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は以下の項１〜項１０に関する。
【０００９】
１．ＤＮＡ相同組換え修復阻害作用を有する化合物を有効成分とする抗癌剤。
【００１０】
２．ＤＮＡ相同組換え修復阻害作用を有する化合物を有効成分とする放射線増感剤。
【００１１】
３．ＤＮＡ相同組換え修復阻害剤の有効量及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【００１２】
４．ＤＮＡ相同組換え修復阻害剤の有効量及び薬学的に許容される担体を含む放射線増感剤。
【００１３】
５．ＤＮＡ相同組換え修復阻害作用を有する化合物がウィザフェリンＡ又はその誘導体である上記項１に記載の抗癌剤。
【００１４】
６．ＤＮＡ相同組換え修復阻害作用を有する化合物がウィザフェリンＡ又はその誘導体である上記項２に記載の放射線増感剤。
【００１５】
７．ウィザフェリンＡ及びウオルトマニンを有効成分とする抗癌剤。
【００１６】
８．ウィザフェリンＡ及びウオルトマニンを有効成分とする放射線増感剤。
【００１７】
９．ウィザフェリンＡ又はその誘導体を対照として用いるＤＮＡ相同組換え修復阻害剤のスクリーニング方法。
【００１８】
１０．請求項７に記載のスクリーニング方法を用いて得られる化合物。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明におけるＤＮＡ相同組換え修復阻害作用を有する化合物又は薬剤とは、ＤＳＢの修復経路のうち相同組換え（ＨＲ）修復経路を阻害する化合物又は薬剤をいう。
【００２０】
ＨＲ修復阻害作用を有する化合物又はＨＲ修復阻害剤としては、ＨＲ修復阻害作用を有していれば特に限定されるものではないが、例えば、ウィザフェリンＡ又はその誘導体が例示できる。
【００２１】
ウィザフェリンＡ又はその誘導体
ウィザフェリンＡは、以下の一般式１で表され、アシュワガンダ（Ａｓｈｗａｇａｎｄｈａ、学名：Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ  Ｄｕｎａｌ、英名：Ｗｉｎｔｅｒ  Ｃｈｅｒｒｙ）と呼ばれるナス科の低木植物から抽出される。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
ウィザフェリンＡとしては、アシュワガンダ等の植物から、例えば、「Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｓｅｔｈｈｉ，  Ｐ．Ｄ．（１９６９）  Ｗｉｔｈａｆｅｒｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ｒｏｏｔｓ．  Ｃｕｒｒ．Ｓｃｉ．Ｉｎｄｉａ，３８，２６７−２６８．」等に記載されているような公知の方法で抽出したもの、例えば、「Ｍ．Ｈｉｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．（１９８１）  １，８８．」に記載されているような公知の方法で合成したもの、又は市販されているものを使用することができる。
【００２４】
ウィザフェリンＡの誘導体としては、ＨＲ修復の阻害作用を有していれば特に限定されない。２位の炭素と３位の炭素の間の二重結合がＨＲ修復阻害作用において重要であると考えられるため、それらの炭素以外において、例えば、ウィザフェリンＡに炭素数１〜４の炭化水素基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、エステル、カルボニル、ニトリル、アミド、ハロゲン元素等を置換基として有するものが例示できる。上記炭化水素基は直鎖であっても分岐鎖であってもよく、不飽和結合を有していてもよい。
【００２５】
該誘導体は、上記置換基をウィザフェリンＡ  中に１又は２以上有していてもよく、２以上有する場合は、それぞれの置換基が同一又は異なっていてもよい。
【００２６】
また、以下の一般式２で表されるような化合物（これもウィザフェリンＡの誘導体とする。）でもよい。
【００２７】
【化２】
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【００２８】
式中、Ｒ１基は、炭素数１〜１２で表される炭化水素基が例示できる。該炭化水素基は直鎖状であっても分岐鎖を有していてもよく、また、飽和炭化水素基であっても不飽和炭化水素基であってもよい。更には、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、エステル、カルボニル、ニトリル、アミド、ハロゲン元素等の置換基を有していてもよい。該化合物は、このような置換基を１又は２以上有していてもよく、２以上有する場合は、同じ置換基を有していても異なる置換基を有していてもよい。
【００２９】
また、Ｒ１基は環状であってもよく、その場合は三〜六員環が例示できる。該環は飽和又は不飽和であってもよく、複素環であってもよい。更に、該環は炭素数１〜４の炭化水素基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、エステル、カルボニル、ニトリル、アミド、ハロゲン元素等の置換基を有していてもよい。該環は、このような置換基を１又は２以上有していてもよく、２以上有する場合は、それぞれの置換基が同一又は異なっていてもよい。
【００３０】
これらのウィザフェリンＡの誘導体は、公知の方法を用いて適宜製造することができる。
【００３１】
スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法とは、ウィザフェリンＡ又はその誘導体あるいは新規化合物のＨＲ修復阻害効果を、ＤＳＢ損傷のＨＲ修復系とＮＨＥＪ修復系の活性を区別できる特殊な真核細胞培養系を用いて、比較検討する方法をいう。
【００３２】
本発明スクリーニング方法において使用する細胞の種類は限定されず、ニワトリ、マウスなどあらゆる種類の真核細胞を用いることができるが、遺伝子バックグランドを同じくして、ある機能に関わる複数の遺伝子を簡単にノックアウトできるニワトリＤＴ細胞株が好ましい。
【００３３】
本発明においてノックアウト細胞とは、調べたい遺伝子の機能を壊した（ノックアウト）変異細胞又は変異細胞株のことをいい、「Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．１７  Ｎｏ．１８  ｐｐ．５４９７−５５０８，  １９９８」に記載されているような公知の方法により得ることができる。
【００３４】
相同組換え（ＨＲ）修復を阻害された細胞を得るためには、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４等の遺伝子をノックアウトすることにより得られるが、ＨＲ修復遺伝子ノックアウト細胞のうちＲａｄ５４をノックアウトした細胞が、Ｘ線やγ線に最も高感受性で、電離放射線のＤＳＢ修復に特異的に働く遺伝子であると考えられることからＲａｄ５４ノックアウト細胞を使用するのが好ましい。
【００３５】
また、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復を測定する細胞は、ＮＨＥＪ修復を司るＫｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ等の遺伝子をノックアウトすることにより得られるが、Ｋｕ７０をノックアウトした細胞を使用するのが好ましい。
【００３６】
対照（コントロール）として、遺伝子をノックアウトしていない野性株の細胞、ＨＲ修復及びＮＨＥＪ修復の両経路をノックアウトした細胞も使用することが望ましい。
【００３７】
この４種類の細胞にＸ線等の放射線を照射してＤＳＢ損傷を作り、新規化合物並びにウィザフェリンＡ又はその誘導体を作用させ、２種類のＤＳＢ修復系のどちらに特異的であるか、効果の強さの違い等を比較検討することにより、新規化合物のスクリーニングを行うことができる。その際の実験条件は適宜選択することができる。
【００３８】
ウィザフェリンＡ又はその誘導体の使用
ウィザフェリンＡ又はその誘導体を癌の治療に使用する場合に、単独で使用してもよいが、抗癌剤の多くがＤＮＡに傷をあたえることから１種又は２種以上の抗癌作用を有する薬剤及び／又は放射線と併用してもよい。
【００３９】
ウィザフェリンＡ又はその誘導体と併用する抗癌作用を有する薬剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、もう一方のＤＳＢ修復系であるＮＨＥＪ修復系の阻害剤としても知らるＰＩ−３キナーゼの阻害剤であるウオルトマニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）や、抗癌剤であるナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、イホスファミド、ニムスチン、ラニムスチン、カルボコン等のアルキル化剤、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、テガフール、カルモフール、ドキシフルリジン、シタラビン、アンシタビン、Ｎ４−アシルＡｒａ−Ｃ、シタラビンオクホスフェート、６−メチルカプトプリン、チオイノシン、６−チオグアニン等の代謝拮抗薬、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アクラルビシン、ピラルビシン、エピルビシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ネオカルチノスタチン等の抗腫瘍性抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド、カンプトテシン、イリノテカン等の植物アルカロイド類、その他、Ｌ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ミトキサントロン、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシカルバミド、ソブゾキサン等が挙げられる。
【００４０】
これらの抗癌作用を有する薬剤の中でも、もう一方のＤＳＢ修復系であるＮＨＥＪ系を阻害するウオルトマニンと併用すると、放射線で作られたＤＳＢ修復系の２系統全てを阻害することになるので、特に好ましい。
【００４１】
本発明の抗癌剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又は  ｉｎ  ｓｉｔｕ遺伝子治療においても、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下といった注射、鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、坐剤、外用剤等により生体（対象となる細胞や臓器）に直接本発明抗癌剤を導入することも考えられる。その際、徐放性製剤を体内に埋め込む等して一定の場所に留めるように工夫することが望ましい。
【００４２】
当該ウィザフェリンＡ又はその誘導体を初めとするＨＲ修復阻害剤は、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。）などと混合して医薬組成物として調整することができる。
【００４３】
本発明の抗癌剤は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、筋肉、腹腔等への局部注射、除放性製剤の局部への埋め込み等が例示される。
【００４４】
また、投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、一日投与量として、通常有効成分である本発明化合物の量を０．１ｎｇ〜２００ｍｇ程度、好ましくは１ｎｇ〜３０ｍｇ程度とするのがよく、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
【００４５】
癌治療において、細胞又は生体に照射する光線の種類は特に限定されるものではなく、紫外線、可視光線、赤外線、レーザー光、Ｘ線、γ線などの低ＬＥＴ（線エネルギー付与）放射線や、陽子線、重粒子線などの高ＬＥＴ放射線が使用できる。
【００４６】
本発明の抗癌剤は、放射線治療装置として世界中で使われているＸ線、γ線などの安価な低ＬＥＴ放射線装置の欠点（殺細胞効果が低い）を補い、高価な重粒子線以上の治療効果を上げることが期待できることから、重粒子線にも適用できるが、Ｘ線、γ線等に適用するのがより好ましい。
【００４７】
また、最近Ｘ線治療に取り入れられたコンピューターを用いて、放射線を癌細胞にターゲティング（強度変調治療Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）する治療法と、この薬剤とを併用することもできる。
【００４８】
放射線を照射する線量も、使用する化合物、使用する状況等に応じて適宜選択することができ、例えば、種々の動物細胞においては、放射線の線量も限定されず、適宜選択することができ、例えば、１〜３０Ｇｙ程度、好ましくは１〜２０Ｇｙ程度が例示される。
【００４９】
放射線を照射する方法も限定されないが、例えば、種々の動物細胞においては、分割照射が好ましい。この場合、１〜２Ｇｙ程度の線量を照射し、２時間〜数日程度間隔をあけるという方法を繰り返すことが好ましい。このとき、線量の合計は、３０〜６０Ｇｙ程度、好ましくは１０〜３０Ｇｙ程度が例示できる。
【００５０】
放射線照射をヒトに適用する際には、当業者が上記の数値を基にして適切な値を容易に換算することができる。
【００５１】
ウィザフェリンＡ又はその誘導体を細胞に作用させるタイミングは、放射線を照射する前でも後でもどちらでもよいが、放射線照射の効果を高めるためにも放射線を照射する前が好ましい。
【００５２】
また、種々の培養動物細胞において、ウィザフェリンＡ又はその誘導体を添加する濃度も適宜選択され得るが、例えば、１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に対して、０．１〜１００μＭ程度、好ましくは０．５〜５０μＭ程度が例示できる。この数値を基にして、当業者が容易に適切な値に換算することができる。
【００５３】
ウィザフェリンＡはまた、ＮＨＥＪ系阻害剤（例えば、ウオルトマニン等）と併用することにより、その作用を増大させることができる。ウオルトマニンを用いるタイミングも濃度もウィザフェリンＡと同様でよい。両者を併用する際には、ウィザフェリンＡ及びウオルトマニンのどちらもより低い濃度で用いることも期待できる。
【００５４】
本発明の抗癌剤を用いる癌の種類としては、特に限定されるものではなく、あらゆる種類の癌に用いることができる。例えば、放射線抵抗性であるといわれる骨肉腫、脳腫瘍、メラノーマ等に特に有効である。
【００５５】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するために実施例を挙げるが、いうまでもなく本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５６】
実施例１
正常なニワトリＤＴ４０細胞株（ＤＴ４０）、このＤＴ４０細胞の遺伝子ノックアウトにより、ＨＲ修復に関与する修復酵素のＲＡＤ５４を欠損させた細胞株（ＲＡＤ５４−／−）、ＮＨＥＪ修復に関与する修復酵素のＫＵ７０酵素を欠損させた細胞株（ＫＵ７０−／−）、その両者を欠損させた細胞株（ＫＵ７０−／−／ＲＡＤ５４−／−）の４種類の細胞を用いた（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  Ｖｏｌ．１７，  Ｎｏ．１８，  ｐｐ．５４９７−５５０８，  １９９８等参照。）。
【００５７】
上記４種の細胞（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に５μＭのウィザフェリンＡを１時間前処理し、Ｘ線照射装置で種々の線量（横軸に図示：線量率は約５０ｃＧｙ／ｍｉｎ）を照射した。ここで、前処理とは、放射線照射の前に薬剤（ウィザフェリンＡ）を添加して、照射直後に薬剤を抜くことをいう。ウィザフェリンＡを処理しないものはウィザフェリンＡの溶剤（ＤＭＳＯ）を同量添加した。
【００５８】
その後、照射された線量に応じて細胞数を調整して血清や栄養入りのメチルセルロース培養液に播き込み、約１０日後にコロニー形成法により生細胞数を数えた。結果を図２に示す（ウィザフェリンＡを用いたものを●、用いなかったものを○で示す。）。
【００５９】
この結果から、ＲＡＤ５４遺伝子を持つＤＴ４０細胞（図２Ａ）とＫＵ７０−／−細胞  （図２Ｂ）はウィザフェリンＡ  を添加されると強い増感をうけ、細胞生存率が低くなっている。一方、ＲＡＤ５４遺伝子を持たないＲＡＤ５４−／−細胞（図２Ｃ）とＫＵ７０−／−／  ＲＡＤ５４−／−細胞（図２Ｄ）では、ほとんど増感されていない。
【００６０】
なお、図３は、Ｘ線だけを照射した（薬剤無処理の）生存率曲線を参考として示す（内海博司著の論文Ｒａｄｉａｔｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．  １５５，ｐｐ  ６８０−６８６  ，  ２００１のＦｉｇ．３参照。）。本実施例のニワトリ細胞を用いた図４〜６中の点線（荒い：ＤＴ４０、中：ＲＡＤ５４−／−、細かい：ＫＵ７０−／−／ＲＡＤ５４−／−）又は破線（ＫＵ７０−／−）は、薬剤無処理の生存率曲線の参考として図３中の生存率曲線をそのまま転記したものである。
【００６１】
以上の結果は、この薬剤がＲＡＤ５４遺伝子の支配するＨＲ修復系を選択的に阻害することを示唆している。しかしながら、照射前から薬剤を添加すると、修復阻害と副作用（細胞周期を止める等）を含めた複合効果が観察され、修復阻害との関係を明確に証明できない可能性がある。そこで、薬剤がＨＲ修復を選択的に阻害することを証明するには、（ＤＳＢを作られ修復が働き始める）照射直後に、薬剤を短時間処理することが重要である。そこで、次の実施例２で薬剤の後処理の実験を行った。
【００６２】
実施例２
４種の細胞（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に各種線量のＸ線を照射した直後に、ウィザフェリンＡ（１０μＭ）を添加した。１時間後に薬剤を洗って除去し、照射線量に応じて細胞数を調整して栄養入りのメチルセルロース培養液に播き込み、約１０日後にコロニー形成法により生細胞数を数えた。後処理した以外は、実施例１と同様に実験を行った。結果を図４に示す（ウィザフェリンＡを用いたものを●、用いなかったものを○で示す。）。
【００６３】
前処理実験（実施例１）の図２と同様な結果を得たことから、明らかにウィザフェリンＡが選択的にＨＲ修復を阻害していることを証明したことになる。更に、他のＨＲ修復遺伝子の欠損細胞を用いての同様な実験より、ウィザフェリンＡの標的がＲＡＤ５４遺伝子であることを示唆するデータ、ウィザフェリンＡが遺伝子組み換え頻度を低下させるデータも得た（データは示さず）。
【００６４】
実施例３
４種の細胞（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に各種線量のＸ線を照射した直後に、ＮＨＥＪ系の阻害剤であるウオルトマニン（１０μＭ）で後処理した。薬剤が異なること以外は、実施例２と同様に実験を行った。
【００６５】
しかし、図５が示すように、ウィザフェリンＡとは全く逆の効果で、ＫＵ７０遺伝子を持つＤＴ４０細胞（図５Ａ）とＲＡＤ５４−／−細胞（図５Ｃ）は、ウオルトマニンで強い増感をうけ、細胞生存率が低くなっている（ウオルトマニンを用いたものを□、用いなかったものを○で示す。）。
【００６６】
一方、ＫＵ７０遺伝子を持たないＫＵ７０−／−細胞  （図５Ｂ）とＫＵ７０−／−／  ＲＡＤ５４−／−細胞（図５Ｄ）は、ほとんど増感されていない。これらの結果は、ウオルトマニンがＫＵ７０遺伝子の支配するＮＨＥＪ修復系を特異的に阻害することを示している。
【００６７】
実施例４
４種の細胞（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に各種線量のＸ線を照射した直後に、ＨＲ系の阻害剤であるウィザフェリンＡ（１０μＭ）及びＮＨＥＪ系の阻害剤であるウオルトマニン（１０μＭ）の併用実験を行った。両薬剤を同時に後処理した以外は、実施例２と同様に実験を行った。この結果が図６である（ウィザフェリンＡ及びウオルトマニンを用いたものを■、用いなかったものを○で示す。）。
【００６８】
図６が示すように両修復系を阻害されたことによって、ＤＴ４０細胞（図６Ａ）は、両修復系を持たないＫＵ７０−／−／  ＲＡＤ５４−／−（図６Ｄ）細胞と同じ程度にまで著しく増感された（ＫＵ７０−／−／  ＲＡＤ５４−／−細胞のＸ線生存率の点線と■が一致している）。但し、ＲＡＤ５４−／−細胞（図６Ｃ）とＫＵ７０−／−／  ＲＡＤ５４−／−細胞（図６Ｄ）は、更に増感されているが、この余分の増感機構はまだ明らかではない。
【００６９】
特筆すべきことは、このＸ線照射と両薬剤処理による増感された生存率曲線は、これらの各細胞を重粒子線のみで照射した生存率曲線より低い生存率曲線を示し、どの重粒子線よりも効率的な殺細胞効果があることが明らかになった（放射線医学総合医学研究所の重粒子線治療施設で照射して得た；データは示さず。）。
【００７０】
例えば、重粒子線として最も殺細胞効果のあるアルゴン（Ａｒ５５０）重粒子でも、そのＲＢＥ（相対的生物効果比）の最高値は２．５であるに対して、両薬剤使用によるＲＢＥ値は７．３であり、如何に効率よく細胞を殺しているかを示している。この両薬剤併用の結果は、放射線治療装置として安価で世界中の小型施設で使われているＸ線、γ線などの低ＬＥＴ放射線の殺細胞効果が小さいとうい欠点を補うことにより、高価で大型施設となる重粒子線以上の治療効果を上げることが期待される。
【００７１】
また、最近Ｘ線治療に取り入れられたコンピューターを用いることにより放射線を癌細胞にターゲティング（強度変調治療Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）する治療法と、この薬剤を併用すると更に高い治癒効果が期待される。
【００７２】
実施例５
ヒト子宮癌細胞に由来するＨｅＬａ細胞（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を用いて、同様の方法で薬剤処理をして得たデータを図７に示す。薬剤自体に毒性が無い条件で、各種線量のＸ線を照射した直後にＨＲ系の阻害剤であるウィザフェリンＡ（１５μＭ）とＮＨＥＪ系の阻害剤であるウオルトマニン（２０μＭ）のそれぞれ単独処理（それぞれ、●、□）及び同時併用処理（■）の実験データを示す。
【００７３】
それぞれの薬剤単独でも増感効果が得られたが（ウィザフェリンＡ：●、ウオルトマニン：□）、同時併用処理で相加的（ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ）ではなく、著しい相乗効果（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を示した（■）。例えば、５５０ｃＧｙの線量の薬剤併用の殺細胞効果は、各薬剤単独から仮定した殺細胞効果では約２１倍（●）だが、薬剤併用の結果は約５５０倍もの増感（■）を示した。
【００７４】
【発明の効果】
本発明のＨＲ修復阻害作用を有する化合物を使用することにより、癌の治療に使用することができる。更に、他の抗癌剤及び／又は放射線との併用により、癌の治療の効果を上げることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】電離放射線等の外的要因や内的な要因でＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）が生じるが、ヒトを含めた高等動物細胞での２種類のＤＮＡの２本鎖切断修復経路を持つ。ＨＲ修復は、相同もしくは姉妹染色体上の相同配列ＤＮＡと組み換え反応を起こして修復する。  正確に修復できるが、これに関与するＲａｄ５１、  Ｒａｄ５４などタンパク質の多くは分裂期でなければ発現していない。一方、ＮＨＥＪ修復は、切断したＤＮＡが再結合することによって修復を完了するが、正確には修復できないと考えられている。  ＨＲ修復とＮＨＥＪ修復の双方に関与するタンパク質（Ｍｒｅ１１／Ｒａｄ５０／Ｘｒｓ２）と、ＨＲ修復に関与するタンパク質（Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４Ａ、Ｒａｄ５４Ｂ、Ｒａｄ５１Ｂ、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｄ、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３）とＮＨＥＪ修復に関与するＤＮＡ−ＰＫ（Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）複合体とが再結合に関与している。ＨＲ修復とＮＨＥＪ修復とが存在するＳ期とＧ２期には、ＤＳＢをめぐる競合（Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、ＮＢＳ１、Ｋｕ７０）が起き、Ｋｕ７０が無い場合にはＨＲ修復系が亢進することが知られている。
【図２】４種類のニワトリ細胞にウィザフェリンＡを前処理した後Ｘ線照射した生存率曲線を示す。図２（Ａ）はＤＴ４０、図２（Ｂ）はＫＵ７０−／−を、図２（Ｃ）はＲＡＤ５４−／−を、図２（Ｄ）はＫＵ７０−／−／ＲＡＤ５４−／−を表す。○はウィザフェリンＡ未処理（ＤＭＳＯを添加添加）のものを、●はウィザフェリンＡ前処理したものを示す。
【図３】４種類のニワトリ細胞のＸ線照射だけの生存率曲線を示す。ＤＴ４０細胞（○）、ＫＵ７０−／−細胞（□）、ＲＡＤ５４−／−細胞（●）、ＫＵ７０−／−／ＲＡＤ５４−／−細胞（■）を表す。特にＫＵ７０−／−細胞は二相性曲線となるのが特徴である。この大きな肩のある曲線部分はＫＵ７０タンパクが無いことによる、ＨＲ修復系が亢進して修復効率が高くなった結果である。なお、以下の図４〜６での点線（荒い：ＤＴ４０、中：ＲＡＤ５４−／−、細かい：ＫＵ７０−／−／ＲＡＤ５４−／−）又は破線（ＫＵ７０−／−）は、本図のＸ線照射単独の生存率を示している（詳細は内海博司著，「ＤＮＡ二本鎖切断修復と放射線効果」，蛋白質  核酸  酵素，２００１年，Ｖｏｌ．４６，  Ｎｏ．８，  ｐ．１０８９−１０９６）。
【図４】ウィザフェリンＡを後処理した際の生存率曲線を示す。図４（Ａ）はＤＴ４０、図４（Ｂ）はＫＵ７０−／−を、図４（Ｃ）はＲＡＤ５４−／−を、図４（Ｄ）はＫＵ７０−／−／ＲＡＤ５４−／−を表す。○はウィザフェリンＡ未処理（ＤＭＳＯを添加添加）のものを、●はウィザフェリンＡ後処理したものを示す。
【図５】ウオルトマニンを後処理した際の生存率曲線を示す。図５（Ａ）はＤＴ４０、図５（Ｂ）はＫＵ７０−／−を、図５（Ｃ）はＲＡＤ５４−／−を、図５（Ｄ）はＫＵ７０−／−／ＲＡＤ５４−／−を表す。○はウオルトマニン未処理（ＤＭＳＯを添加添加）のものを、□はウオルトマニン後処理したものを示す。
【図６】ウィザフェリンＡとウオルトマニンを同時併用で後処理した際の生存率曲線を示す。図６（Ａ）はＤＴ４０、図６（Ｂ）はＫＵ７０−／−を、図６（Ｃ）はＲＡＤ５４−／−を、図６（Ｄ）はＫＵ７０−／−／ＲＡＤ５４−／−を表す。○は未処理（ＤＭＳＯを添加添加）のもの、■は１０μＭのウィザフェリンＡと１０μＭのウオルトマニンで併用後処理したものを示す。図４，図５はそれぞれの単独処理をした時と同じ実験である。
【図７】ヒト腫瘍であるヒーラ（ＨｅＬａ）細胞を用いてのウィザフェリンＡとウオルトマニンをそれぞれ又は同時併用処理をした際の生存率を示す。○は未処理（ＤＭＳＯを添加処理）のもの、●は１５μＭのウィザフェリンＡで後処理したもの、□は２０μＭのウオルトマニンで後処理したもの、■は１５μＭのウィザフェリンＡ及び２０μＭのウオルトマニンで同時併用後処理したものを示す。但し、小さい方の●は両薬剤の同時併用処理の効果は、それぞれの薬剤の単独処理効果が相加的と予想した生存率である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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