(57)【要約】【課題】簡便かつ正確に細菌を識別する方法を提供する。【解決手段】特定の細菌を識別するために選択したＤＮＡ又はその部分から一本鎖ＤＮＡを増幅する第１段階、該一本鎖ＤＮＡを特定の塩基配列を含む１ないし数種類の縮退プライマーを用いてＰＣＲ反応を行う第２段階、該第２段階で得られた反応産物をゲル電気泳動することにより電気泳動パターンを取得する第３段階から成る。既知の代表的な菌を用いて標準的な電気泳動のパターンのデータを蓄積しておき、どのパターンに一致するかを判定する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の細菌を識別するために選択したＤＮＡ又はその部分から一本鎖ＤＮＡを増幅する第１段階、該一本鎖ＤＮＡを特定の塩基配列を含む１ないし数種類の縮退プライマーを用いてＰＣＲ反応を行う第２段階、該第２段階で得られた反応産物をゲル電気泳動することにより電気泳動パターンを取得する第３段階、一方各種細菌について該第１〜３段階の処理を行うことにより特定の縮退プライマーについて対応する電気泳動パターンを予め取得しておく第４段階、及び該第３段階で得た電気泳動パターンを該第４段階で予め得ておいた電気泳動パターンと比較する第５段階から成る細菌の識別法。
【請求項２】
前記第１段階において細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子又はその一部を増幅する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記縮退プライマーが、Ｎ１Ｎ２Ｎ３・・ＮｎＸ１Ｘ２・・Ｘｍ（式１）、Ｎ１Ｎ２Ｎ３・・Ｘ１Ｘ２・・ＸｍＮｎ（式２）、Ｎ１Ｎ２Ｎ３・・Ｘ１Ｘ２・・ＸｍＮｎ−１Ｎｎ（式３）、・・・・・・又はＸ１Ｘ２・・ＸｍＮ１Ｎ２Ｎ３・・Ｎｎ−１Ｎｎ（式ｎ）（式中、Ｎ１〜Ｎｎは、４種類の塩基Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣのいずれかを表すが、ランダムであり、一方Ｘ１〜Ｘｍは特定の塩基配列を表し、ｍ及びｎはそれぞれ自然数を表す。）で表わされるオリゴヌクレオチドである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｎが５〜８、前記ｍが３〜６である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｎが６、前記ｍが４である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記縮退プライマーを構成する各塩基配列の上流にイノシンを付加した請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記付加するイノシンの個数が４〜８個である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記付加するイノシンの個数が６である請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細菌を識別する方法に関し、より詳細には、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（以下「１６ＳｒＤＮＡ」という。）等の細菌を識別するために選択したＤＮＡやその一部から電気泳動パターンを得て、これを既得の電気泳動パターンと比較して細菌を識別する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌種の識別には、そのサイズが検査に適当である等の理由から、１６ＳリボソームＲＮＡが常用されている（日本細菌学会誌　４９，　８１２−８２１　（１９９４）；　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２，　２９９−３０５　（１９９９）；　Ｌｅｔｔ．　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２１（２），　８７−９２（１９９５）；　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（ＮＹ）　８（３），　２３３−６　（１９９０）；　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２（３），　３２３−７　（１９９９）等）。その細菌の迅速同定法として、ＰＣＲ法が用いられているが、各細菌に対応した特異的プライマー又はプローブを必要とするため、細菌を同定するためには多数のプライマー／プローブを用いる必要があり、その検査数は膨大なものとなっている。
【０００３】
一方、遺伝子の塩基配列を解析する方法として、１組の縮退プローブを遺伝子に由来する被検体核酸とハイブリダイズさせ、この被検体核酸を鋳型とし、プローブをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、各プローブから得られた反応産物をゲル電気泳動で分離し、電気泳動パターンをプローブについて比較し、被検体核酸の塩基配列を解析する方法が知られている（特開２００１−２１１８９８）。しかし、この方法を細菌の識別に応用する場合、迅速かつ簡便に未知の菌を同定するためには、どのようにすればいいのか明らかではなかった。また、この遺伝子解析法で用いるプライマー・プローブはｎ塩基の全ての組合せで解析する必要があり、例えば、４塩基でも２５６通りもあり、全てを電気泳動で分離するには、やはり、時間と労力がかかる。また、電気泳動のパターンから菌の種類を同定するにはどのようにすればいいのか明らかではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来法よりも簡便かつ正確に細菌を識別する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
以上の問題を解決するために、本発明は、プライマーを厳選して、１ないし数種類のプライマーのみを用いて、簡便な菌の同定法を提供するものである。
実際に、遺伝子の多型を解析するのには１ないし数種類の制限酵素を用いたＲＦＬＰ法が存在し、菌の同定にも利用され始めている。制限酵素では認識配列部位は制限酵素がない場合には利用できないが、プライマーを用いる限り、自由に設計できる利点がある。
また、この方法で菌を同定するには、必ずしも遺伝子データベースを利用する必要はない。実際に、既知の代表的な菌を用いて標準的な電気泳動のパターンのデータを蓄積しておき、どのパターンに一致するかを判定すればよい。
【０００６】
本発明の方法では、細菌の１６ＳｒＤＮＡのような特徴ある配列を対象として、数塩基（特に、３〜６塩基）のプライマーで伸長反応を行う。その結果、このプライマーは１６ＳｒＤＮＡに相補的な複数の場所から伸長を行い、フラグメントが検出されるが、そのパターンは細菌により異なり、再現性がある。実際には１種類のプライマーで一般的な院内感染に関与する菌は識別可能であることが判明している。このＦＰＰＥ（Ｆｉｎｇｅｒ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｂｙ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法と高精度並列キャピラリー電気泳動チップを解析に用いることにより、検査の簡便化及び迅速化を図ることができる。
【０００７】
現在のところ、１種類の４塩基プローブで細菌の識別が可能であることが分かったが、将来的に多数の病原細菌を同定できるようにしても、２〜３種類のプローブで十分であると考えられる。したがって、特異的プローブ／プライマーを用いたＰＣＲ法に比し、細菌同定に必要な検査数は圧倒的に少なくて済む。その結果、検査の迅速性も確保できる。特に、解析に泳動チップを用いるので泳動は数分以内に終了する。検査全体として３〜４時間で結果を得ることができる。また、この同定法には熟練した技術を要しない。
【０００８】
即ち、本発明は、特定の細菌を識別するために選択したＤＮＡ又はその部分から一本鎖ＤＮＡを増幅する第１段階、該一本鎖ＤＮＡを特定の塩基配列を含む１ないし数種類の縮退プライマーを用いてＰＣＲ反応を行う第２段階、該第２段階で得られた反応産物をゲル電気泳動することにより電気泳動パターンを取得する第３段階、一方各種細菌について該第１〜３段階の処理を行うことにより特定の縮退プライマーについて対応する電気泳動パターンを予め取得しておく第４段階、及び該第３段階で得た電気泳動パターンを該第４段階で予め得ておいた電気泳動パターンと比較する第５段階から成る細菌の識別法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
第１段階において、細菌を識別できるような特徴的配列であればその細菌のＤＮＡ又はその部分のいずれを用いてもよい。それらのなかで細菌の識別に常用されている１６ＳｒＤＮＡ又はその一部を用いることが好ましい。一本鎖のＤＮＡを得るために、非対称ＰＣＲを用いることが好ましい。通常ＰＣＲ法では同量の２つのプライマーを用いてその間のＤＮＡを増幅するが、この場合は２本鎖ＤＮＡができるため、非対称ＰＣＲでは、２つのプライマーのうち、片方だけを極端に少なくすることで１本鎖ＤＮＡが得ることができる。その比は１００対１〜２５対１程度が好ましい。
【００１０】
第２段階で用いる「縮退プライマー」とは、特定の塩基配列を有する固定部分（すなわち、塩基配列が一定の部分）と所定の塩基長の可変部分（すなわち、塩基配列が４種類の塩基のランダムな組み合わせからなる部分）とを有するプライマーである。本発明の方法においては、この縮退プライマーを１ないし数種類用いるが、具体的には１〜３種程度用い、この種類は少ないほど方法が簡便になるので好ましく、最も好ましくは１種の縮退プライマーを用いる。
【００１１】
この縮退プライマーとして、Ｎ１Ｎ２Ｎ３・・ＮｎＸ１Ｘ２・・Ｘｍ（式１）、Ｎ１Ｎ２Ｎ３・・Ｘ１Ｘ２・・ＸｍＮｎ（式２）、Ｎ１Ｎ２Ｎ３・・Ｘ１Ｘ２・・ＸｍＮｎ−１Ｎｎ（式３）、・・・・・・又はＸ１Ｘ２・・ＸｍＮ１Ｎ２Ｎ３・・Ｎｎ−１Ｎｎ（式ｎ）（式中、Ｎ１〜Ｎｎは、４種類の塩基Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣのいずれかを表すが、ランダムであり、一方Ｘ１〜Ｘｍは特定の塩基配列を表し、ｍ及びｎはそれぞれ自然数を表す。）で表わされるオリゴヌクレオチドが好ましい。このようなプライマーは当業者に周知の方法、例えば市販のＤＮＡ自動合成機によって容易に合成できる。
【００１２】
このＮ１〜ｎとして、Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣのどれでもよく、実際に合成する過程でＮにはＧ、Ａ、Ｔ及びＣの混合液を使うので、ｂｙ　ｃｈａｎｃｅ　でどれかになる。数塩基の固定部分のプライマーのみではプライマーとして十分働かないので安定性を増すため、どれとでもアニールするように結合したものである。このプライマーの特徴的な固定部分によりＰＣＲ反応が行われ、この固定部分に対応したＰＣＲ反応産物が得られる。従って、ＰＣＲ増幅機能はｍ塩基に存在するが、プライマー自体はｎ＋ｍ塩基の長さとなる。このｎは好ましくは５〜８、より好ましくは６、ｍは好ましくは３〜６、より好ましくは４である。
【００１３】
またこの縮退プライマーを構成する各塩基配列の上流にユニバーサル・ヌクレオチドであるイノシンを付加することにより、細菌の識別能力が向上する。この付加するイノシンの個数は好ましくは４〜８個、より好ましくは６個である。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
まず、細菌として表皮ブドウ球菌（日本細菌学会教育用菌株）を用い、その１６ＳｒＤＮＡから、下記の方法により１本鎖ＤＮＡを調製した。
１本鎖核酸を得るために、非対称ＰＣＲを行った。プライマーとして、既報（ｆｒｏｍ　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　（１９９０）　２８：　１９４２）に従って、プライマー０　：　５’−ｇａｇｔｔｔｇａｔｃｎｔｇｇｃｔｃａｇ−３’（配列番号１）とプライマーＣ５　：５’−ｔａｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３’（配列番号２）を用いた。これらプライマーの濃度比は、１６Ｓの相補鎖によるサイクル伸長産物が電気泳動的に無視できるように、実験で決めた。実施したプロトコールは以下のようにまとめられる。
【００１５】
【表１】非対称ＰＣＲミックス（１サンプル当たり）　　　　　　　　　
細菌　　　　　　　コロニーピック又はＯＤ　１．０　×　５μｌ程度
プライマーＰＯ　（１００ｐｍｏｌｅ／μｌ）　　　　　　　１μｌ
プライマーＰＣ５　　（４ｐｍｏｌｅ／μｌ）　　　　　　　１μｌ
Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭ　ＰＣＲミックス＊　　　　　　　１錠
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　バランス　　　
全量　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５μｌ
【００１６】
＊　Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭ　ＰＣＲミックスを２５μｌに溶かしたときの主な内容物は下記のとうりである。
【表２】
１．５　ｕｎｉｔｓ　ｏｆ　Ｔａｑ
１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（室温でｐＨ　９．０）
５０　ｍＭ　ＫＣｌ
１．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２
２００　μＭ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰ
【００１７】
非対称ＰＣＲは下記の手順で行った。
９４度１分→（９０度７０秒→５５度２．５分→７２度３分）×２３回
このＰＣＲ産物（即ち、１本鎖ＤＮＡ）を、マイクロカラム（Ｇ−５０）でＴＥ（２５μｌ）に回収した。サイクル伸長反応には１サンプル当たり１０μｌ使用した。
【００１８】
次に、得られた１本鎖ＤＮＡにポリメラーゼ伸長反応を行い、その産物をゲル電気泳動にかけた。
オリゴヌクレオチド（ｇｃａｇ）をＤＮＡ自動合成機（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製３８１型等）により合成し、これにランダムに６個の塩基を付加し、全長１０塩基の縮退プライマーとした。
上記で得られた一本鎖ＤＮＡ、縮退プライマー、ポリメラーゼ酵素、ヌクレオチド、緩衝液、蛍光ラベル−ｄＵＴＰを混合して以下の温度サイクルでサイクル伸長反応を行った。伸長反応の産物は更に精製され、変性条件で電気泳動してフラグメント解析を行った。
【００１９】
実施したプロトコールは以下のようにまとめられる。
【表３】サイクル伸長反応ミックス（１サンプル当たり）　　　　　
上記作成済の核酸　　　　　　　　　　　　１０μｌ
縮退プライマー　（１００ｐｍｏｌ／μｌ）　　　　　　５μｌ
Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭ　ＰＣＲ　ミックス　　　　　　　１錠
サーモシークエナーゼ　　　　　　　　　　３．２Ｕ
Ｒ６Ｇ−ｄＵＴＰ　（１００μＭ）　　　　　　　　　　　　０．５μｌ
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　バランス　　
全量　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５μｌ
【００２０】
サイクル伸長反応を下記の手順で行った。
９６度１分→（９６度３０秒→２０度１５秒→６０度４分）×２０回
ＰＣＲ産物をマイクロカラム（Ｇ−５０）で精製し、標準プロトコールに従い電気泳動してＲ６Ｇの蛍光でフラグメント解析を行った。
同時に、サイズスタンダードとしてＧｅｎｓＳｃａｎ　２５００　ＲｅｄＤｙｅ（ＲＯＸ）を流す。データはサイズスタンダードを元に塩基長で表示した。装置は、ＡＢＩ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　３１０　及び解析ソフト　ＧｅｎｅＳｃａｎＴＭ　ｖｅｒ２．１を用いた。
【００２１】
実施例２〜４
オリゴヌクレオチドを、ｇｃｔｇ、ｇｃｃｇ又はｔｇｇｃとして実施例１と同様の縮退プライマーを作製し、実施例１と同様の操作を行った。
実施例１〜４で得られた電気泳動パターンを図１に示す。それぞれ縮退プライマーの固定部分に対応して特徴的な電気泳動パターンが得られることがわかる。この電気泳動パターンはまた細菌の種類によって特徴的である。
【００２２】
実施例５、比較例１
縮退プライマーの上流に常法によりイノシンを６個付加し、これを縮退プライマーとして実施例１と同様の操作を繰り返し、電気泳動パターンを得た（実施例５）。
比較のため、縮退プライマーとして、実施例１のＮ１〜６を付加せずに、イノシンを６個付加したものを用いて、実施例１と同様の操作を行い、電気泳動パターンを得た（比較例１）。
実施例１、５及び比較例１の電気泳動パターンを図２に示す。比較例１のものは各ピークが明確でないのに対し、実施例１と５のものは比較例１よりも遥かに各ピークが明確であり、実施例５のものは実施例１のものより更にピークが明確である。各ピークが明確であるということはこれらパターンを比較し、それにより細菌の同定を行うのに適しているといえる。
【００２３】
実施例６
固定部分をｇｃｃｇとして実施例１と同様に縮退プライマーを作製し、５種の菌株（赤痢菌、腸炎ビブリオ、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロテウス・ブルガリス、及びパラチフスＡ菌、いずれも日本細菌学会教育用菌株である。）を用いて、実施例１と同様の操作を行った。得られた電気泳動パターンを図３に示す。これらの電気泳動パターンは明確に区別できるので、一種の縮退プライマーにより各種細菌を識別することができることが分かる。
このようにして代表的な菌について標準的な電気泳動のパターンのデータを蓄積しておき、被検体である細菌について得られたパターンがどのパターンに一致するかを判定すれば、容易に細菌の種類を同定することができる。
【００２４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】表皮ブドウ球菌の１６ＳｒＤＮＡから得た一本鎖ＤＮＡを各種プライマーを用いて伸長した電気泳動パターンを示す図である。プライマーの固定部分：（１）ｇｃａｇ（実施例１）、（２）ｇｃｔｇ（実施例２）、（３）ｇｃｃｇ（実施例３）、（４）ｔｇｇｃ（実施例４）
【図２】表皮ブドウ球菌の１６ＳｒＤＮＡから得た一本鎖ＤＮＡを各種プライマーを用いて伸長した電気泳動パターンを示す図である。（５）プライマーの固定部分：ｇｃａｇ、可変部分：ランダムな６塩基（実施例１）、（６）プライマーの固定部分：ｇｃａｇ、可変部分：なし、上流にイノシン６個付加（比較例１）、（７）プライマーの固定部分：ｇｃａｇ、可変部分：ランダムな６塩基、更に上流にイノシン６個付加（実施例５）
【図３】５種の菌株（赤痢菌、腸炎ビブリオ、肺炎桿菌、プロテウス・ブルガリス、及びパラチフスＡ菌）の１６ＳｒＤＮＡから得た一本鎖ＤＮＡを、プライマーの固定部分をｇｃｃｇとした一種のプライマーを用いて伸長した電気泳動パターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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