(57)【要約】      （修正有）【課題】新規タンパク質ＰＧＣ−１ｖと、このタンパク質の遺伝子操作材料および抗体を提供する。【解決手段】ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体コアクチベーター（ＰＧＣ−１）の派生体タンパク質であるＰＧＣ−１ｖタンパク質と、これらのタンパク質をコードする遺伝子、およびこれらのＰＧＣ−１ｖタンパク質を特異的に認識する抗体を提供する。本タンパク質は、ＰＧＣ−１タンパク質よりも高い転写因子活性能を有し、肥満や痩身等の体形異常、代謝調節異常等の疾患の診断や治療に有効である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ＰＧＣ−１ｖをコードするヒト遺伝子。
【請求項２】
配列番号５のアミノ酸配列を有するマウスタンパク質ＰＧＣ−１ｖをコードするマウス遺伝子。
【請求項３】
請求項１のヒト遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のマウス遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または４のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
請求項３または４のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項７】
請求項３または４のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７の組換えベクターによる形質転換体細胞。
【請求項９】
請求項１のヒト遺伝子の発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ＰＧＣ−１ｖ。
【請求項１０】
請求項２のマウス遺伝子の発現産物であって、配列番号５のアミノ酸配列を有するマウスタンパク質ＰＧＣ−１ｖ。
【請求項１１】
配列番号２または５における連続５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
【請求項１２】
請求項９または１０のタンパク質ＰＧＣ−１ｖを認識する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲγ）コアクチベーター（ＰＧＣ−１）の派生体タンパク質ＰＧＣ−１ｖとこのタンパク質をコードする遺伝子に関するものである。さらに詳しくはこの出願の発明は、肥満や痩身等の体形異常、代謝調節異常等の疾患の診断や治療に有効な新規タンパク質ＰＧＣ−１ｖとその遺伝子材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシソームは動植物の細胞中に見られるオルガネラ（細胞小器官）であり、コレステロールなどの脂質代謝や吸収に関与する酵素群を含んでいる。ペルオキシソームは、食餌や生理的な要因によっても増加するが、ペルオキシソーム増殖剤（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ：例えば抗脂血薬、殺虫剤およびフタル酸類の可塑剤など）によってもそのサイズと数を劇的に増加させると同時に、β−酸化サイクルに必要とされる酵素の発現増加を介してペルオキシソームの脂肪酸代謝能を高めることが知られている。そして、このペルオキシソーム増殖剤によって活性化される核内受容体として、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）が同定されている。
【０００３】
ＰＰＡＲは、その構造などから核内受容体ファミリーメンバーと考えられ、リガンドとの結合により活性化され、標的遺伝子上流域に存在する応答配列に結合して標的遺伝子の転写を活性化する。特許文献１には、ＰＰＡＲのリガンド（アゴニストおよびアンタゴニスト）をスクリーニングする方法が開示されている。
【０００４】
またＰＰＡＲは、他の核内受容体と同様、その転写活性化作用を発揮するためには共役転写因子（コアクチベーター）群との相互作用が必要であると考えられている。ＰＰＡＲには、αタイプ、δタイプおよびγタイプの３種類のサブタイプが知られているが、特に脂肪組織で発現して脂肪細胞の分化に関与するＰＰＡＲγ（非特許文献１、２）のコアクチベーターとしてＰＧＣ−１が報告されている（非特許文献３）。
【０００５】
ＰＧＣ−１の活性は多様であり、ＰＰＡＲγ以外に、ＰＰＡＲα、ＥＲ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＢＰ（ＣＲＥＢ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＮＲＦ１（ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １）、ＭＥＦ２（ｍｙｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  ２）等の転写因子に結合してこれらの転写調節活性を高め、これらの転写因子の下流にある遺伝子群の発現を制御している（非特許文献３−１０）。特に、欠失変異によるドメイン解析の結果、Ｎ末の約２００アミノ酸残基の領域にＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＥＲα等の転写因子が結合することが判明している（非特許文献３、４、６−９）。また、この領域の下流に存在するＮ末約２００−４００アミノ酸残基の領域は、前者の領域の活性に対して抑制的に働くため、Ｎ末約２００アミノ酸残基の領域が全長ＰＧＣ−１タンパク質に比較して、転写因子に対する高い活性化能を有することも知られている（非特許文献５）。そして活性化された転写因子は、褐色脂肪細胞の分化やＵＣＰ−１（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）の発現亢進（非特許文献１１、１２）、ミトコンドリア内の脂肪酸酸化回路酵素であるＭＣＡＤ（ｍｅｄｉｕｍ  ｃｈａｉｎ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）やＬＡＣＤ（ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）等の発現亢進（非特許文献６、７）を生じさせる。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１１−５６３６９号公報
【非特許文献１】
Ｔｏｎｔｏｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ８：１２２４−１２３４，  １９９４
【非特許文献２】
Ｔｏｎｔｏｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７９：１１４７−１１５６，  １９９４
【非特許文献３】
Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ９２：８２６−３３９，  １９９８
【非特許文献４】
Ｗｕ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ９８：１１５−１２４，  １９９９
【非特許文献５】
Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：１３６８−１３７１，  １９９９
【非特許文献６】
Ｖｅｇａ，  ＲＢ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０：１８６８−１８７６，  ２０００
【非特許文献７】
Ｂａｒｂｅｒａ，  ＭＪ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：１４８６−１４９３，  ２００１
【非特許文献８】
Ｔｃｈｅｒｅｐａｎｏｖａｌ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：１６３０２−０７，  ２０００
【非特許文献９】
Ｋｎｕｔｔｉ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０：２４１１−２４２２，  ２０００
【非特許文献１０】
Ｍｉｃｈａｅｌ，  ＬＦ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９８：３８２０−０５，  ２００１
【非特許文献１１】
Ｂｏｓｓ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６１：８７０−８７６，  １９９９
【非特許文献１２】
Ｒｏｓｅｎ，  ＥＤ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４：６１１−６１７，  １９９９
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、ＰＲＡＲγのコアクチベーターＰＧＣ−１は、様々な転写因子を活性化し、それによって褐色脂肪細胞を分化増殖させ、ＵＣＰタンパク質や脂肪酸酸化回路の酵素を増加させることによって、例えば肥満の改善等に機能すると考えられるが、その活性化領域はＰＧＣ−１の一部であり、他の領域は転写因子の活性化に対して抑制的である。
【０００８】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ＰＧＣ−１タンパク質よりもさらに高い転写因子活性化能を有する新規タンパク質を提供することを課題としている。
【０００９】
またこの出願の発明は、この新規タンパク質の遺伝子操作材料と、抗体を提供することを課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、以下の（１）〜（１２）の発明を提供する。
（１）    配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ＰＧＣ−１ｖをコードするヒト遺伝子。
（２）    配列番号５のアミノ酸配列を有するマウスタンパク質ＰＧＣ−１ｖをコードするマウス遺伝子。
（３）    前記発明（１）のヒト遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
（４）    前記発明２のマウス遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
（５）    前記発明（３）または（４）のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
（６）    前記発明（３）または（４）のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
（７）    前記発明（３）または（４）のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
（８）    前記発明（７）の組換えベクターによる形質転換体細胞。
（９）    前記発明（１）のヒト遺伝子の発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ＰＧＣ−１ｖ。
（１０）  前記発明（２）のマウス遺伝子の発現産物であって、配列番号５のアミノ酸配列を有するマウスタンパク質ＰＧＣ−１ｖ。
（１１）  配列番号２または５における連続５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
（１２）  前記発明（９）または（１０）のタンパク質ＰＧＣ−１ｖを認識する抗体。
【００１１】
すなわちこの出願の発明者らは、ＰＰＡＲγのコアクチベーターとしての新規因子をヒトおよびマウスで探索した結果、ＰＧＣ−１タンパク質の派生体（スプライシングバリアントまたはアイソフォーム）としてＰＧＣ−１ｖタンパク質をを同定した。このＰＧＣ−１ｖタンパク質は、ＰＧＣ−１遺伝子からの選択的スプライシングにより発現されたｍＲＮＡより産生され、ヒトＰＧＣ−１（ＧｅｎＢａｎｋ／ＡＦ１０６６９８）のＮ末から２６８アミノ酸残基の領域とそのＣ末にＬｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕの３アミノ酸残基が付加されている（配列番号２）。またマウスＰＧＣ−１（ＧｅｎＢａｎｋ／ＡＦ０４９３３０）の派生体ＰＧＣ−１ｖタンパク質も同定した（配列番号５）。そして、後記の実施例に示したように、ＰＧＣ−１ｖタンパク質について以下の知見を得た。
（ａ）ＰＧＣ−１ｖタンパク質は生体内で生理的に存在し、ヒトでは皮膚、甲状腺、腎臓などに比較的多く発現している。
（ｂ）細胞内局在はＰＧＣ−１タンパク質とは異なり、細胞特異性が存在する。例えば、ＨｅＬａ細胞では細胞質に存在するが、褐色脂肪細胞やヒト乳癌由来細胞では細胞質に局在する場合と核に局在する場合が認められる。
（ｃ）ＰＧＣ−１ｖタンパク質の細胞内局在を特異的に調節する機構が存在し、転写因子ＥＲαをＨｅＬａ細胞に共発現させるとＥ２（エストラジオール）依存的にＰＧＣ−１ｖタンパク質は核に移行する。
（ｄ）ＰＧＣ−１ｖタンパク質が核内に存在する場合に、ＰＧＣ−１ｖタンパク質はＥＲαに対するコアクチベーターとして機能する。
（ｅ）  ＰＧＣ−１ｖタンパク質の２つの転写因子結合モチーフ（ＬＬＸＸＬ：但しＸは任意のアミノ酸）への変異導入が、Ｅ２存在下におけるＥＲα依存的なＰＧＣ−１ｖタンパク質の核内移行を阻害する。
（ｆ）  ＰＧＣ−１ｖタンパク質の核内移行は、ＥＲα以外の転写因子であるＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ２を共発現させることによっても、リガンド依存的に亢進する。
【００１２】
前記のとおり、ＰＧＣ−１タンパク質の欠失変異の解析から、ＰＧＣ−１タンパク質のＮ末約２００アミノ酸残基の領域は全長ＰＧＣ−１タンパク質よりも強い転写因子活性化能を有している。このＰＧＣ−１タンパク質の転写因子活性化領域にほぼ相当するＰＧＣ−１ｖタンパク質は従って、核に存在した場合は、ＰＧＣ−１タンパク質の欠失変異と同様にＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＥＲα等の転写因子を活性化させ、その結果、褐色脂肪細胞を増殖させ、ＵＣＰ−１タンパク質や脂肪酸酸化回路の酵素を増加させると結論することができる。例えば、ＵＣＰの過剰発現マウスでは、ＵＣＰタンパク質によるエネルギーの過剰消費により体重減少と痩身が観察されている（Ｃｌａｐｈａｍ，  ＪＣ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：４１５−４１８，  ２０００）。また褐色脂肪細胞はヒトでは腹腔内脂肪組織に存在し、肥満体に比べて痩身体ではＵＣＰ−１タンパク質の発現量が像体している（Ｏｂｗｅｋｏｆｌｅｒ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．  ３８：２１２５−２１３３，  １９９７）。さらに脂肪酸酸化回路の酵素増加により脂肪酸消費が増大すると考えられる。
【００１３】
すなわち、ＰＧＣ−１ｖタンパク質が核に局在した場合には、ＰＧＣ−１タンパク質に比較して強い褐色脂肪細胞分化とＵＣＰ−１タンパク質の増加および脂肪酸代謝の亢進が引き起こされる。その結果、褐色脂肪細胞は増加し、脂肪酸が燃焼され、ＵＣＰ−１タンパク質により産生されたエネルギーが熱変換され、肥満が改善される。
【００１４】
さらに、ＰＧＣ−１ｖタンパク質の細胞内局在は、ＰＧＣ−１ｖタンパク質がコアクチベーターとして機能するＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＥＲα等の転写因子の存在によって、それぞれのリガンド依存的に調節される。細胞特異的なＰＧＣ−１ｖタンパク質の細胞内局在の変化は、これらの転写因子が存在する細胞（褐色脂肪細胞や乳ガン由来細胞など）でリガンド依存的に核移行するためと考えられる。そして、これらの細胞でコアクチベーターとしての機能を最大に発揮すると考えられる。以上のことから、ＰＧＣ−１ｖタンパク質を外来性に投与した場合でも、ＰＧＣ−１ｖタンパク質のコアクチベーター活性は特定の細胞や臓器（褐色脂肪組織や乳腺など）でのみ発現すると考えられる。
【００１５】
以上のことから、ＰＧＣ−１ｖタンパク質やそれをコードする遺伝子ポリヌクレオチドは、肥満や痩身等の体形異常の診断、治療のための新たな材料自体として、あるいはそれらの材料を探索するためのプローブとして極めて有用である。
【００１６】
この出願の発明は、以上のとおりの新規な知見に基づいてなされたものである。
なお、この出願の発明において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は特定塩基数の断片を意味するものでなく、一応の目安として１００ｂｐ以上の断片をポリヌクレオチド、１００ｂｐ未満の断片をオリゴヌクレオチドとするが、例外も存在する。同様に、オリゴペプチドについても特定範囲のアミノ酸残基数に限定されるものではない。この発明において使用するその他の用語や概念については、発明の実施形態や実施例の記載において説明する。また、この発明を実施するために使用する様々な遺伝子操作技術等は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能なものである。
【００１７】
以下、この出願の発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
発明（１）および（２）は、それぞれ、ヒトおよびマウスのＰＧＣ−１ｖタンパク質をコードするゲノム遺伝子である。
【００１９】
さらに具体的には、発明（１）のヒトＰＧＣ−１ｖ遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＰＧＣ−１ｖタンパク質をコードし、この遺伝子から転写されるｍＲＮＡからは配列番号１の塩基配列を有するｃＤＮＡが合成される。
【００２０】
発明（２）のマウスＰＧＣ−１ｖ遺伝子は、配列番号５のアミノ酸配列を有するマウスＰＧＣ−１ｖタンパク質をコードし、そのｍＲＮＡからは配列番号４の塩基配列を有するｃＤＮＡが合成される。さらに詳しくは、このマウスＰＧＣ−１ｖゲノム遺伝子の部分配列は配列番号３に示したとおりである。
【００２１】
発明（１）および（２）のＰＧＣ−１ｖ遺伝子は、例えば、それぞれ配列番号１、３、４の塩基配列またはその一部配列からなる精製ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとしてヒトおよびマウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離するすることができる。得られたゲノム遺伝子は、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００２２】
なお、この発明（１）および（２）の遺伝子には、それがコードするタンパク質の発現に対する制御領域（プロモーター／エンハンサー、サプレッサー等）も含まれる。これらの発現制御領域は、ＰＧＣ−１ｖタンパク質やその遺伝子の更なる機能を解明するためにも有用である。また、発現制御領域に対する転写因子の探索は、肥満や代謝異常疾患の治療薬成分としても有用である。
【００２３】
発明（３）および（４）は、それぞれ前記のゲノムＰＧＣ−１ｖ遺伝子やその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ等から精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片）である。例えば、ｃＤＮＡはヒトおよびマウスのそれぞれの細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として合成することができる。例えばヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でもよい。ｃＤＮＡは、公知の方法（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２，  １６１−１７０，  １９８２；  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  ２５，  ２６３−２６９，  １９８３；  Ｇｅｎｅ，  １５０，  ２４３−２５０，  １９９４）を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−として、ヒトおよびマウスのそれぞれの細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。このようにして調製されるヒトＰＧＣ−１ｖ  ｃＤＮＡおよびマウスＰＧＣ−１ｖ  ｃＤＮＡは、具体的にはそれぞれ配列番号１（ヒト）および配列番号４（マウス）の塩基配列を有している。これらのポリヌクレオチドは、例えばこの発明のＰＧＣ−１ｖタンパク質の遺伝子工学的な製造に使用することができる。また、ヒトＰＧＣ−１ｖ遺伝子やそのポリヌクレオチドは肥満、痩身、代謝異常疾患に対する診断や治療材料等としても有用である。さらに、これらのポリヌクレオチドは、ＰＧＣ−１ｖに対するアゴニストやアンタゴニストをスクリーニングするための材料としても有用である（特許文献１参照）。またさらに、マウスＰＧＣ−１ｖ遺伝子やポリヌクレオチドは、例えばＰＧＣ−１ｖタンパク質の機能不全動物（例えばＰＧＣ−１ｖノックアウト動物）やＰＧＣ−１ｖタンパク質過剰発現動物（例えばＰＧＣ−１ｖトランスジェニック動物）の作出のための材料としても有用である。
【００２４】
発明（５）のオリゴヌクレオチドプローブは、前記のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片であり、例えば、配列番号１、３または４の塩基配列もしくはその相補配列における連続１０〜１００ｂｐのＤＮＡ断片等である。ここで、ストリンジェント条件とは、前記のポリヌクレオチドとプローブとの特異的なハイブリッド形成を可能とする条件であり、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアミド等）の濃度、温度条件によって規定される。詳しくは、米国特許Ｎｏ．  ６，１００，０３７等に詳しく規定されている。
【００２５】
発明（７）のプライマーセットは、前記のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するための１対のオリゴヌクレオチドである。これらのプライマーセットは、配列番号１または４の塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ  ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。例えば、マウスＰＧＣ−１ｖ  ｃＤＮＡのＰＣＲプライマーセットとしては配列番号６および７の合成オリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００２６】
発明（７）の組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、ｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域をインサートとしてこの発明のＰＧＣ−１ｖタンパク質を生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することができる。また、前記のゲノム遺伝子ＤＮＡをインサートとする場合には、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターやコスミドベクター等を使用することもできる。
【００２７】
発明（８）の形質転換体細胞は、例えば、前記発明（７）の組換えベクターを用いてＰＧＣ−１ｖタンパク質を製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
【００２８】
発明（９）は、発明（１）のヒトＰＧＣ−１ｖ遺伝子の発現産物であり、配列番号２のアミノ酸配列を有する精製タンパク質（ヒトＰＧＣ−１ｖタンパク質）である。
【００２９】
発明（１０）は、発明（２）のマウスＰＧＣ−１ｖ遺伝子の発現産物であり、配列番号５のアミノ酸配列を有する精製ＰＧＣ−１ｖタンパク質である。
【００３０】
これらＰＧＣ−１ｖタンパク質は、抗体作製のための免疫源として、あるいは肥満や代謝異常疾患の治療薬成分として、あるいは治療薬を開発するための標的分子等として有用である。
【００３１】
これらの精製ＰＧＣ−１ｖタンパク質は、ヒトまたはマウスの細胞から単離する方法、配列番号２または５のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法等によって得ることができるが、好ましくは、前記発明（７）の発現ベクターおよび／または発明（８）の形質転換細胞を用いた遺伝子工学的方法（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系や宿主−ベクター系を用いる方法）によって大量に生産することができる。例えば、宿主−ベクター系を用いる方法の場合には、形質転換体細胞を培養し、その培養物から、例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によって単離、精製することによりこの発明の精製ＰＧＣ−１ｖタンパク質を大量に得ることができる。なお、このような遺伝子工学的手法によって得られたＰＧＣ−１ｖタンパク質には、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質などが例示できる。さらに、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などである。
【００３２】
発明（１１）のオリゴペプチドは、それぞれ配列番号２および５における連続５アミノ残基以上のアミノ酸配列からなるペプチドである。このペプチドは、前記発明（９）または（１０）のＰＧＣ−１ｖタンパク質を適当な分解酵素で分解する方法や、公知の固相ペプチド合成法によって調製することができる。これらのペプチドはＰＧＣ−１ｖタンパク質に対する抗体作製の抗原として有用である。
【００３３】
発明（１２）の抗体は、それぞれ前記のＰＧＣ−１ｖタンパク質を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、ＰＧＣ−１ｖタンパク質のエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、前記の精製ＰＧＣ−１ｖタンパク質またはそれらのペプチドを抗原として用いて動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したＢ細胞をミエロ−マと融合させてハイブリド−マを作製すれば、モノクロ−ナル抗体を産生することができる。
【００３４】
以下、実施例として、この発明のＰＧＣ−１ｖの機能解析の実験的データを示し、この発明についてさらに詳細かつ具体的に説明する。
【００３５】
【実施例】
実施例１
ＰＧＣ−１タンパク質の派生体であるＰＧＣ−１ｖタンパク質をコードする遺伝子をヒトおよびマウスから単離した。このゲノム遺伝子の解析から、ＰＧＣ−１ｖタンパク質は、図１に示したように、エキソン７の３’アクセプターサイトの選択的スプライシングによって産生されることが確認された。すなわち、ヒトＰＧＣ−１ｖ  ｃＤＮＡは、配列番号１の第８７９〜９１０番塩基がヒトＰＧＣ−１  ｃＤＮＡに挿入された結果、フレームシフト変位を生じ、ヒトＰＧＣ−１のＮ末から２６８アミノ酸残基の領域とそのＣ末にＬｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕの３アミノ酸残基を付加した全長２７１アミノ酸のヒトＰＧＣ−１ｖタンパク質をコードしている（配列番号１）。またマウスＰＧＣ−１ｖ  ｃＤＮＡは、配列番号４の第８６３〜９０４番塩基がマウスＰＧＣ−１  ｃＤＮＡに挿入された結果、フレームシフト変位を生じ、マウスＰＧＣ−１のＮ末から２６７アミノ酸残基の領域とそのＣ末にＬｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕの３アミノ酸残基を付加した全長２７０アミノ酸のマウスＰＧＣ−１ｖタンパク質をコードしている（配列番号４）。
実施例２
ヒトＰＧＣ−１ｖ遺伝子の組織特異的発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて試験した。結果は図２に示したとおりである。ヒトＰＧＣ−１ｖは皮膚、甲状腺、腎臓で比較的多く存在するが、ＰＧＣ−１の発現量を超えることはなかった。また、ＰＧＣ−１が多く発現する心臓、骨格筋でもＰＧＣ−１ｖの若干の存在が確認された。
実施例３
ヒトＰＧＣ−１ｖ  ｃＤＮＡと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドとの融合遺伝子をＨｅＬａ細胞、褐色脂肪前駆細胞（ＨｉＢ−１Ｂ）および乳癌由来細胞（ＭＣＦ−７）にトランスフェクションし、ＰＧＣ−１ｖの細胞内局在を試験した。また、ＥＲα共存下での局在も試験した。結果は図３に示したとおりである。ＨｅＬａ細胞ではＰＧＣ−１ｖは細胞質に局在するのに対し、褐色脂肪前駆細胞や乳癌由来細胞では一定の割合で核に局在する。またＨｅＬａ細胞ではＥＲαを共発現させ、Ｅ２を添加すると、ＰＧＣ−１ｖは速やかに核に移行した。
実施例４
ＰＧＣ−１ｖが核内に存在する条件でのコアクチベーター活性をＥＲＥ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）−ルシフェラーゼアッセイによって検討した。具体的には、ＥＲＥ−ルシフェラーゼ遺伝子を、ＰＧＣ−１ｖ−ＧＦＰ融合遺伝子またはＰＧＣ−１−ＧＦＰ融合遺伝子、さらにＥＲα遺伝子とともにＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、Ｅ２存在下・非存在下で培養後細胞抽出液を調整した。また、すべてのサンプルにウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子を共発現させ、これを遺伝子導入効率の内部標準として、ＥＲＥ依存性のルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３６】
結果は図４に示したとおりであり、ＰＧＣ−１ｖ−ＧＦＰ融合タンパク質はＥ２依存性にＥＲαの転写活性を増加させた。この結果から、ＰＧＣ−１ｖがＥ２依存性のコアクチベーターであることが確認された。
実施例５
ＰＧＣ−１ｖのＥＲαに対する結合部位のアミノ酸を置換した変異ＰＧＣ−１ｖを作製し、ＰＧＣ−１ｖの核内移行の機構を検討した。具体的にはマウスＰＧＣ−１ｖの１４２番目のアミノ酸ＬをＡに、２１０番目のアミノ酸ＬをＡに、さらに１４２番目と２１０番目のアミノ酸ＬをＡに置換した変異ＰＧＣ−１ｖ−ＧＦＰを、ＨｅＬａ細胞にＥＲαと共発現させ、Ｅ２存在下・非存在下で各種ＰＧＣ−１ｖ−ＧＦＰタンパク質の核内移行を観察した。
【００３７】
結果は図５に示したとおりであり、Ｅ２存在下においてＥＲα依存的なＰＧＣ−１ｖの核内移行は、２１０番目のアミノ酸置換では軽度に、１４２番目のアミノ酸置換では高度に、また両方のアミノ酸置換ではさらに高度に阻害された。この結果から、Ｅ２存在下においてＥＲαと結合することがＰＧＣ−１ｖの核内移行に必要であることが確認された。
実施例６
ＥＲα以外の核レセプターにおいても、リガンド依存性にＰＧＣ−１ｖ蛋白を核内移行できるかを検討した。具体的にはＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ２を各々ＰＧＣ−１ｖ−ＧＦＰとＨｅＬａ細胞に共発現させ、リノレイン酸（ＬＡ）、オレイン酸（ＯＡ）、Ｌｙ１７１８８３、ＥＴＹＡなどの各種リガンド存在下および非存在下で、ＰＧＣ−１ｖ−ＧＦＰ蛋白の細胞内局在を検討した。
【００３８】
結果は図６に示したとおりである。ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ２においても、ＥＲαと同様に、ＰＧＣ−１ｖを核内に移行させることを確認した。また、その核内移行は各種リガンド存在下で優位に促進することを確認した。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、各種転写因子の新規コアクチベーターＰＧＣ−１ｖタンパク質と、このタンパク質の遺伝子操作材料および抗体が提供される。これらの発明によって、肥満や痩身、あるいは代謝異常疾患等の診断法や治療法、あるいは診断剤や治療薬剤の開発が促進される。
【００４０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＧＣ−１ｖおよびＰＧＣ−１遺伝子構造の一部を示した模式図である。
【図２】ＰＧＣ−１ｖタンパク質の発現局在を調べた結果を示す電気泳動像である。
【図３】ＰＧＣ−１ｖの細胞内局在を調べた結果を示す共焦点レーザー顕微鏡像である。
【図４】ＰＧＣ−１ｖのコアクチベーター活性を調べた結果を示すルシフェラーゼアッセイのグラフである。
【図５】ＰＧＣ−１ｖの核移行の機構を変異ＰＧＣ−１ｖを用いて調べた結果を示す共焦点レーザー顕微鏡像である。
【図６】ＰＰＡＲαまたはＰＰＡＲγ２転写因子の共発現によるＰＧＣ−１ｖの核移行を調べた結果を示す共焦点レーザー顕微鏡像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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