(57)【要約】【課題】抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を提供すること。およびそれを有効成分として含むことを特徴とする免疫組織染色試薬、免疫化学試薬、医薬ならびに診断薬を提供すること。【解決手段】ヒトＯｌｉｇ２またはその部分アミノ酸配列からなるフラグメントを免疫原とすることにより得られ、ヒトのオリゴデンドロサイトに特異的に結合する抗ヒトＯｌｉｇ２抗体、およびそれを有効成分として含むことを特徴とする免疫組織染色試薬、免疫化学試薬、医薬ならびに診断薬。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＯｌｉｇ２、またはその部分アミノ酸配列からなるフラグメント、またはそれと同様な免疫原性を有するフラグメントを免疫原として得られ、ヒトオリゴデンドロサイトと特異的に結合し、神経細胞、アストロサイト、脳室上衣細胞、ミクログリア、シュワン細胞とは反応しない抗ヒトＯｌｉｇ２抗体。
【請求項２】
Ｏｌｉｇ２のフラグメントが、Ｏｌｉｇ２のＣ末端の少なくとも１０個のアミノ酸配列を含むフラグメントである請求項第１項記載の抗ヒトＯｌｉｇ２抗体。
【請求項３】
Ｏｌｉｇ２のフラグメントが、次のペプチド配列
ＭＧＡＧＳＬＰＲＬＴＳＤＡＫ
である請求項第１項または第２項記載の抗ヒトＯｌｉｇ２抗体。
【請求項４】
請求項第１項から第３項のいずれかの項に記載の抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を有効成分として含有する免疫組織染色試薬および免疫化学試薬。
【請求項５】
請求項第１項から第３項のいずれかの項に記載の抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を有効成分として含有する医薬および診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヒトＯｌｉｇ２と特異的に結合する抗体、およびこれを利用する免疫組織染色試薬、免疫化学試薬、医薬、および診断薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オリゴデンドロサイトは中枢神経系組織実質内に存在する細胞の一種で、神経細胞の軸索を取り巻く髄鞘を形成して神経細胞の機能維持に極めて重要な役目を担うとともに、自己免疫疾患、神経変性疾患、脳腫瘍など、様々な疾患の標的にもなっている。
【０００３】
中枢神経系細胞のほとんどは非常に長く複雑な突起網を有し、またそのことが神経機能を発揮する上で極めて重要であるために、組織をすりつぶして得られる抽出物を研究対象とする生化学的手法だけでは神経科学の探究には限界がある。
【０００４】
その欠点を補うために、神経科学の分野では形態学的研究手法が頻用される。しかしヘマトキシリン−エオジン染色等の一般的な組織染色では複雑な突起網を十分に追跡することはできず、細胞の判別は主として核や細胞体の形態を頼りに行っていた。
【０００５】
このように形態情報のみでは十分な細胞の判別が困難なため、免疫組織化学的に中枢神経系細胞を区別する方法が開発されてきた。例として、神経細胞を認識する抗ニューロフィラメント抗体（例えば、非特許文献１参照。）やアストロサイトを認識する抗グリア線維酸性タンパク質抗体（例えば、非特許文献２参照。）などがあり、その有用性は広く認められている。
【０００６】
一方でオリゴデンドロサイトを認識する抗体は、髄鞘を構成する分子、例えばガラクトセレブロシドやミエリン塩基性タンパク質（例えば、非特許文献３参照。）などを標的にしたものが開発されている。これらの抗体は主に細胞の突起の部分に反応するため（図１ｄ、ｅ参照。図１ｄは抗ミエリン塩基性タンパク質で大脳皮質を染色したもの、図１ｅは抗ミエリン塩基性タンパク質で大脳白質を染色したもの。）、細胞の全体像を観察できる培養中のオリゴデンドロサイトの同定には使用可能であっても、組織切片上では細胞突起を十分に追跡できないために、細胞の同定には役に立たない。さらに、オリゴデンドロサイトには、組織標本を作製する過程で細胞質が脱落しやすい特徴があり、オリゴデンドロサイトを標的とした免疫組織染色は、結果が安定しない。
【０００７】
一般に脳腫瘍の病理組織学的診断に抗体を用いた免疫組織化学は極めて有効であり、抗ニューロフィラメント抗体や抗グリア線維酸性タンパク質抗体以外にも多数の抗体が開発され、また応用されている（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００８】
しかし、オリゴデンドロサイトの腫瘍であるオリゴデンドログリオーマは、ガラクトセレブロシドやミエリン塩基性タンパク質などの髄鞘分子をほとんど発現しなくなるので、オリゴデンドログリオーマはこれらに対する抗体にはほとんど反応しない（図１ｆ参照。図１ｆは抗ミエリン塩基性タンパク質でオリゴデンドログリオーマを染色したもの。）。
【０００９】
しかるに、オリゴデンドログリオーマと特異的に反応する抗体は開発されていない（例えば、非特許文献４参照。）。そのためにオリゴデンドログリオーマの病理組織学的診断にはしばしば困難を伴う。
【００１０】
最近、脳神経系細胞の分化制御に関与する転写因子のひとつであるＯｌｉｇ２が齧歯類や鳥類の脳においてオリゴデンドロサイトに特異的に発現していると報告された（例えば、非特許文献５参照。）。Ｏｌｉｇ２は、オリゴデンドロサイトの発生・分化を制御する転写因子で、齧歯類や鳥類ではオリゴデンドロサイト特異的に発生初期から成熟期に発現していることが分かっている。ヒトＯｌｉｇ２の配列は、米国ＮＣＢＩデータベース上でタンパク質として、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ００５８０６に開示されている。
【００１１】
ヒトのオリゴデンドロサイトとオリゴデンドログリオーマに対して、Ｏｌｉｇ２のｍＲＮＡを標的としたｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）法を実施した研究で、Ｏｌｉｇ２のｍＲＮＡが両者に特異的に発現していることが報告された（例えば、非特許文献６、７参照。）。
【００１２】
しかしＩＳＨ法を実施する際には、一般に、使用する組織標本の固定法や包埋等の条件に制限があり、技術的に特殊で手法が煩雑であり、再現性に乏しい欠点がある。
【００１３】
ヒトオリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドログリオーマの、とりわけ核に反応する抗体を開発することができれば、正常状態あるいは病的状態のヒト脳におけるオリゴデンドロサイトを免疫組織化学的に把握し、病理診断や病態を解明することが可能となる。免疫組織染色法はＩＳＨ法と比較して、一般に、組織標本作製上の制約が少なく、技術的に容易で、再現性が高い。
【００１４】
転写因子は一般に核内で働く分子なので、これを標的とする抗体は核に反応することが期待される。ヒトにおいてＯｌｉｇ２を標的分子としてオリゴデンドロサイトを抗体で同定することができれば、医学生物学の研究において極めて有用である。
【００１５】
【非特許文献１】「Ｙ．Ｎａｋａｚａｔｏら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ，１９８４、６４：３０−３６」
【非特許文献２】「栗坂昌宏、中里洋一編、脳腫瘍の免疫染色法、朝倉書店、１９８６」
【非特許文献３】「鈴木衣子、Ｇｌｉａ細胞（生田房弘編）、クバプロ、１９９９，１５５−１７８」
【非特許文献４】「Ｇ．Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．  ＩＡＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２０００，５５−６９」
【非特許文献５】「Ｑ．Ｚｈｏｕら、Ｎｅｕｒｏｎ，２０００，２５：３３１−３４３」
【非特許文献６】「Ｙ．Ｍａｒｉｅら、Ｌａｎｃｅｔ，２００１，３５８：２９８−３００」
【非特許文献７】「ＱＲ．Ｌｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＳｃｉＵＳＡ，２００１，９８：１０８５１−１０８５６」
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒトＯｌｉｇ２を特異的に認識する抗体を提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するための手段は、請求項２に記載のヒトＯｌｉｇ２Ｃ末端の少なくとも１０個のアミノ酸配列を含むフラグメントを免疫原とする抗ヒトＯｌｉｇ２抗体の作製である。より具体的には、請求項３に記載のペプチドを免疫原とする抗ヒトＯｌｉｇ２抗体の作製である。この配列は、公知のタンパク質解析手法によって抗原性、親水性、可動性を評価した結果、好ましい抗原候補として選択された部位である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
抗ヒトＯｌｉｇ２抗体は、ヒトＯｌｉｇ２、またはその部分アミノ酸配列からなるフラグメント、またはそれと同様な免疫原性を有するフラグメントを免疫原とし、当該分野で常用される適当な動物に投与することにより得られる。これにあたっては、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法を適宜利用することができる。
【００１９】
免疫原の調製方法に特に制限はなく、例えばＯｌｉｇ２を含む組織や細胞からＯｌｉｇ２を抽出したり、遺伝子工学的手法を用いて細胞にＯｌｉｇ２あるいはそのフラグメントを合成したものを使用したり、ペプチド合成機でＯｌｉｇ２の部分アミノ酸配列を合成すること等が考えられるが、本発明の抗ヒトＯｌｉｇ２抗体の製造に用いられる免疫原は、公知の方法に従って、Ｏｌｉｇ２遺伝子の塩基配列を基に予測されるアミノ酸配列から免疫原に適した部位を予測し、ペプチド合成機でそれを合成し、生体高分子化合物（キャリア分子とも言う）を付加することで得られる。
【００２０】
具体的に抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を得るには、以下に記した方法に限定されないが、例えば次のようにする。すなわち、Ｃ端から１４個のアミノ酸配列を含むフラグメントに、システインをそのＮ端に導入したもの（以下、「合成ペプチド」という）に生体高分子化合物を結合させた結合物が免疫原として用いられる。
【００２１】
上記の合成ペプチドと結合させる生体高分子化合物として、スカシ貝のヘモシアニンが用いられるが、特にこれに限定されるものではなく、サイログロブリン、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン等も用いることができる。
【００２２】
上記合成プペチドと生体高分子化合物との結合は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒトドキシスクシニミドエステルを用いて実施したが（マレイミド法）、この他にもグルタルアルデヒド法、カルボジイミド法などの公知の技術を挙げることができる。
【００２３】
上記の方法による合成ペプチドと生体高分子化合物との反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製することにより、合成ペプチドと生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物」ということがある）を得ることができる。
【００２４】
次に、上のようにして得られた結合物をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という。）に溶解し、これとアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバント、ＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（フナコシ社）など）を混合したものを免疫原として、ウサギに免疫する。なお、免疫される動物はウサギに限定されることはなく、当該分野で常用されるものをいずれも使用でき、例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ニワトリ等を挙げることができる。
【００２５】
免疫する際の免疫原の投与法は皮下注射とするが、この方法に限定されることはなく、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射のいずれでもよい。免疫原の投与は１回または複数回を適当な間隔で、具体的には１週間ないし５週間の間隔で行うことができる。
【００２６】
次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取し、そこから抗血清を分離する。この抗血清を、更に、例えば抗原カラムを用いてアフイニティー精製し、ポリクローナル抗体として抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を得ることができる。
【００２７】
また、モノクローナル抗体を作製するための方法も特に限定されず、当業者が通常使用する方法を用いることができる。具体的には、免疫動物への抗原の注入はポリクローナル抗体の作製の場合と同様に行うことができ、かかる免疫感作の後、免疫した動物よりハイブリドーマ作製のための抗体産生細胞を単離する。なお、本発明のモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞はＢ細胞であり、Ｂ細胞は体内を循環しているが、脾臓などに蓄積されることも知られている。従って、免疫した動物の脾臓を摘出して、そこから抗体産生細胞を調製するのが好ましいが、必ずしも脾臓でなくてもよく、Ｂ細胞が多く存在する部分を使用することもできる。次いで、このようにして得た抗体産生細胞をミエローマ細胞（パートナー細胞）と融合し、不死化する。
【００２８】
細胞融合技術としては、公知の技術を用いることができる。細胞融合は、一般的には、抗体産生細胞とヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損無限増殖性細胞株であるミエローマ細胞とを、融合促進剤を含有する培地中で保温することにより行われる。また抗体産生細胞とミエローマ細胞を電気的に融合することもできる。
【００２９】
ミエローマ細胞の種類は特には限定されず、公知のものを使用することができ、例えばマウスのものとしては、Ａｇ８．６５３、Ｐ３Ｕ１などが挙げられる。ミエローマ細胞の選択の際には抗体産生細胞との適合性を考慮するのが好ましい。融合促進剤としては、ポリエチレングリコールなどの化学物質、センダイウイルスなどの細胞融合媒介ウイルスを用いることができ、さらに融合効率を高めるための補助剤を添加してもよい。
【００３０】
上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを適当な比率、一般的には抗体産生細胞：ミエローマ細胞が１：１から１：１００、好ましくは２：１から１０：１の比率で、細胞培養培地中で混合した後に、融合促進剤を添加することにより細胞融合を行う。次いで、適当な培地の添加、および上清の除去を繰り返すことによりハイブリドーマを形成する。次いで、ヒポキサンチン−アミノプリテン−チミジン（ＨＡＴ）培養液中で培養し、融合細胞のみを選択する。ＨＡＴ培地での細胞の培養は、ハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な期間行えばよく、通常は数日から数週間の期間行えばよい。
【００３１】
なお、抗体産生細胞の不死化は、細胞融合（ハイブリドーマの作製）によるものに限定されるわけではなく、その他の公知の技術を用いることができる。例えば、抗体産生細胞としてのヒトのＢリンパ球を用いる場合には、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）を用いて形質転換することにより不死化を行ってもよい。
【００３２】
次いで、上記により得られたハイブリドーマについて、本発明のヒトＯｌｉｇ２を認識する抗体を産生する単一のクローンを得るためにスクリーニングを行う。単一のクローンを得るためのクローニング法は公知の方法を用いればよく、例えば、限界希釈法、軟寒天法、単一細胞分離法などを用いることができる。また、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを得るためのスクリーニング法も公知の方法を用いればよく、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法、プラーク法、凝集反応法、ＲＩＡ法、免疫組織化学染色法などの抗体を検出するための各種方法により行うことができる。
【００３３】
スクリーニングは、作業効率の向上などの観点から１次スクリーニングと２次スクリーニングなどのように段階的に行ってもよい。上記のようにして得られた所望の抗体を産生する細胞株は、通常の培地において継代培養が可能であり、また液体窒素中などで長期保存が可能である。
【００３４】
本発明によるヒトＯｌｉｇ２を認識するモノクローナル抗体を、上記のようにして得たハイブリドーマから得るための方法の例としては、以下の２つの方法が挙げられる。第１の方法によれば、上記のハイブリドーマを一定の時間、適当な培地中で培養し、その培養上清から、例えばアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどを用いてそのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を単離精製することができる。
【００３５】
あるいは第２の方法によれば、上記のハイブリドーマをそれと適合性のある（即ち、同質遺伝子または半同質遺伝子を有する）哺乳動物、例えばマウスなどの腹腔内に注射し、一定時間後に、その動物の血清または腹水からそのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を単離精製することができる。
【００３６】
また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマから得られるものだけでなく、抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを公知の細胞株、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ等に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させたモノクローナル抗体を用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２，７６７−７７５，１９９０  を参照。）。
【００３７】
かくして得られる抗ヒトＯｌｉｇ２抗体は、それを含むことを特徴とする免疫組織染色試薬、免疫化学試薬、医薬、診断薬として使用することができる。
【００３８】
免疫組織染色試薬の具体的用途としては、例えば、ヒト由来の病理組織標本において、オリゴデンドロサイトやオリゴデンドログリオーマを免疫組織染色により簡便に、かつ特異的に同定するために使用することができる。例えば、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、エタノール等を用いる固定法により固定された組織標本のパラフィン切片、あるいは当該分野で常用されるその他の包埋材を用いて包埋された組織切片、または凍結組織切片等において、抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を用いる免疫組織染色は、特に制約はなく、酵素抗体法、蛍光抗体法、金コロイド標識法等の公知の手段により実施される（改訂三版  酵素抗体法、渡辺慶一、中根一穂、学際企画出版等を参照）。
【００３９】
免疫化学試薬の具体的用途としては、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法等の公知の技術を挙げることができる。
【００４０】
医薬および診断薬の具体的用途としてはオリゴデンドロサイトが関与する疾患の治療および診断が考えられ、例えば医薬としては抗腫瘍薬等、診断薬としては脳腫瘍、神経変性疾患等の診断薬としての用途が考えられる。有効成分の投与量は、患者の容態、性別、体重などに応じて適宜選択できるが、一般的には約１μｇ／ｋｇ／日〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【００４１】
【実施例】
以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制約されるものではない。
【００４２】
［抗ヒトＯｌｉｇ２抗体の調製］
次の配列１で示されるＯｌｉｇ２のＣ端の１４アミノ酸のＮ端側にキャリア蛋白導入のために必要なシステインを加えた計１５アミノ酸の合成ペプチドを作製した。この合成ペプチドのＮ端側のシステインにキャリア蛋白としてスカシ貝のヘモシアニンをマレイミド法に従って導入した。このスカシ貝のヘモシアニン結合合成ペプチド１．２５ｍｇをアジュバント（商品名ＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ，フナコシ社）と良く混和し、ウサギ（日本白色腫；２．５ｋｇ）に投与した。二週間後、追加免疫として、スカシ貝のヘモシアニン結合合成ペプチド１．２５ｍｇをフロイント不完全アジュバントと良く混和したものを投与した。以後は二週間隔で追加免疫を計４回行い、最終的にウサギから採血して抗血清を採取した。
【００４３】
配列１：ＭＧＡＧＳＬＰＲＬＴＳＤＡＫ
【００４４】
一方、ＣＮ−Ｂｒ活性化セファロース（ファルマシア社製）に上記の合成ペプチドを結合させたものをカラムに充填し、このカラムを用いて、上記抗血清をアフィニティクロマトグラフィ法で精製し、合成ペプチドに特異性のある抗体、即ち、抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を得た。
【００４５】
実  施  例  １
ウェスタンブロッティングによる特異性の確認：
次に、得られたポリクローナル抗体がＯｌｉｇ２を認識することを確認するために、Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って、脳抽出物を電気泳動し、ウェスタンブロッテイングを行った。
【００４６】
ヒト脳組織を、５μｇ／ｍｌのアプロチニンと５μｇ／ｍｌのロイペプチンを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に入れて破砕し、４℃に保ちながら１００００ｇで３０分間遠心した。得られた上清の一部を５倍量の１％ドデシル硫酸ナトリウム、１％２−メルカプトエタノール、２０％グリセロールを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）に混和し、９５℃で５分加熱した。
【００４７】
ヒトＯｌｉｇ２タンパク質の調製に用いられる出発材料は、ヒト脳組織には限定されず、例えば、脳腫瘍、培養細胞等、Ｏｌｉｇ２タンパク質を含むものであれば何でもよい。またＯｌｉｇ２タンパク質の抽出に用いられる溶媒の組成は、上記に限定されることはなく、常用されるその他のプロテアーゼ阻害剤や緩衝液を使用できる。
【００４８】
自家調製した１０％のポリアクリルアミドゲル上でＬａｅｍｍｌｉの方法で電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）を行った。電気泳動されたタンパク質は、セミドライ法によってＰＶＤＦ膜へ電気的に転写した。ＰＶＤＦ膜は１％スキムミルクを添加したＰＢＳでブロッキングし、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した抗ヒトＯｌｉｇ２抗体と４℃で一晩反応させた。反応後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ溶液で洗浄し、ＨＲＰ標識抗ウサギ免疫グロブリン抗体（商品名シンプルステイン、ニチレイ社製）を二次抗体として反応させ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ溶液で洗浄後、３，３’−ジアミノベンチジン溶液で発色させた。
【００４９】
一方、比較のため、抗ヒトＯｌｉｇ２抗体の活性を、免疫原に使用した合成ペプチドを用いて吸収して、前項と同様にウェスタンブロッティングを実施した。即ち、抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を作製するために使用した合成ペプチドと、適切に希釈された抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を２４時間３７℃で反応させ、その後、４℃に保ちながら１００００ｇで６０分遠心し、上清を回収した。このようにして得られた抗体活性を吸収した抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を前項に記載の抗ヒトＯｌｉｇ２抗体に置き換えて、同様にして発色を試みた。
【００５０】
このウェスタンブロッティングの結果を図２に示す。抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を使用した場合、３２ｋＤ付近に単一の濃いバンドが出現した（図２左レーン）のに対し、抗体活性を免疫原で吸収した抗ヒトＯｌｉｇ２抗体ではバンドは認められなかった（図２右レーン）。ヒトＯｌｉｇ２の分子量は約３２ｋＤであることがＯｌｉｇ２遺伝子の構造から判明しており、これらの結果から抗ヒトＯｌｉｇ２抗体が特異的にヒトＯｌｉｇ２を認識することが確認できた。
【００５１】
実  施  例  ２
免疫組織染色に先立つ加熱処理の効果：
免疫組織染色における前処理として当該分野で常用される、オートクレーブ、マイクロウェーブ（家庭用電子レンジ）、または調理用鍋等による加熱処理は、しばしばその染色性を増強させることが知られている。ここではオートクレーブを用いて、抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を用いた免疫組織染色における加熱処理の効果を検討した。試料としては、数日間ホルマリン固定されたのちにパラフィン包埋された神経疾患のないヒト脳の組織切片５例を用いた。
【００５２】
パラフィン切片をキシレン濃度系列溶液とアルコール濃度系列溶液により脱パラフィン・親水化した後、０．３％過酸化水素を含むメタノール溶液中に３０分切片を浸し、内因性パーオキシダーゼのブロッキング操作を行った。切片を水洗した後にＰＢＳに浸した。その後オートクレーブで１２０℃に加熱し、この温度を約１０分保った後、室温に放置して冷却した。
【００５３】
比較対照として、加熱処理を省略したこと以外は全く同様に処理したパラフィン切片を用意した。
【００５４】
加熱処理を加えた切片と加えなかった切片を用いて同時に免疫組織染色を行った。具体的な各工程は以下の通りである。ＰＢＳ中に浸してある切片を取り出して１０％正常ヤギ血清で３０分組織上を覆い、非特異反応部位のブロッキング操作を行った。次にＰＢＳで良く洗浄した後、抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて適宜希釈して組織上を覆い、４℃で一夜反応させた。ＰＢＳで良く洗浄した後、調整済みのビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（商品名ヒストファイン、ニチレイ社製）にて組織上を覆い、室温で３０分反応させた。ＰＢＳで良く洗浄した後、調整済みのＨＲＰ標識ストレプトアビジンにて組織上を覆い、室温で３０分反応させた。最後に充分にＰＢＳで洗浄した後、調整した３，３‘−ジアミノベンチジン溶液中で５分間反応させた。核の対比染色としてヘマトキシリン溶液中に数秒浸し、良く水洗した。この後・脱水・透徹・封入操作を行い、光学顕微鏡下で観察した。本反応に特有の褐色の発色が認められた場合に、Ｏｌｉｇ２陽性とした。
【００５５】
その結果を図３に示した。加熱処理を実施した場合（図３ａ）では、加熱処理を実施しなかった場合（図３ｂ）と比較して、染色性が著しく向上した。
【００５６】
実  施  例  ３
免疫組織染色試験：
抗ヒトＯｌｉｇ２抗体を用いて免疫組織染色試験を行った。試料としては、特に神経疾患のないヒト脳５例、ヒトオリゴデンドログリオーマ１０例、ヒト正常全身組織３例の切片を用いた。これらの切片は、ホルマリンまたは４％パラホルムアルデヒドで１日から数日間固定したパラフィン包埋切片である。
【００５７】
比較対照として、抗体活性を吸収した抗ヒトＯｌｉｇ２抗体、オリゴデンドロサイトの髄鞘を認識する抗ミエリン塩基性タンパク質抗体（ダコ社製）、アストロサイトを認識する抗グリア線維酸性タンパク質抗体（Ｎａｋａｚａｔｏら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，４６：６２１−６２６を参照）、ミクログリアを認識するＫｉ−Ｍ１Ｐ抗体（生化学工業社製）を用いた免疫組織染色を実施した。これらの抗体による染色には、ヒト脳組織、ならびにヒトオリゴデンドログリオーマを用いた。
【００５８】
抗ヒトＯｌｉｇ２抗体、および抗体活性を吸収した抗ヒトＯｌｉｇ２抗体による免疫組織染色は実施例３に記載した通りである。また、抗体活性を吸収した抗ヒトＯｌｉｇ２抗体の作成方法は実施例１に記載した通りである。
【００５９】
抗ミエリン塩基性タンパク質抗体および抗グリア線維酸性タンパク質抗体による免疫組織染色は、オートクレーブ加熱処理を省略したこと以外は、実施例２に記載した通りである。
【００６０】
Ｋｉ−Ｍ１Ｐ抗体による免疫組織染色は、オートクレーブ加熱処理を行わない点と、二次抗体として調製済みビオチン標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（ニチレイ社製）を用いる以外は実施例２に記載した通りである。
【００６１】
この結果、抗ヒトＯｌｉｇ２抗体による染色ではオリゴデンドロサイト、即ち大脳皮質においては神経細胞や血管に寄り添う位置に存在して比較的小型の円形核を有するｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ、また大脳白質においては髄鞘間に数珠状に並ぶ比較的小型の円形核を有するｉｎｔｅｒｆａｓｃｉｃｕｌａｒ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅがよく染色された。その結果を図１ａ、ｂに示した。（図１ａは大脳皮質、ｂは大脳白質における抗ヒトＯｌｉｇ２抗体による免疫組織染色の結果を示したもの。）
【００６２】
オリゴデンドログリオーマにおける抗ヒトＯｌｉｇ２抗体の染色では、腫瘍細胞の核に一致して強い陽性所見を認めた。その結果を図１ｃに示した。（図１ｃはオリゴデンドログリオーマにおける抗ヒトＯｌｉｇ２抗体による免疫組織染色の結果を示したもの。）
【００６３】
ヒト正常全身組織を用いた染色では、抗ヒトＯｌｉｇ２抗体と反応する細胞は認められなかった。
【００６４】
抗体活性を吸収した抗ヒトＯｌｉｇ２抗体でヒト脳組織を染色したところ何も染色されなかった。
【００６５】
公知のオリゴデンドロサイトマーカーである抗ミエリン塩基性タンパク質抗体では、ニューロピル（脳組織のうちで、核と細胞体以外の部分の総称）が染色された。オリゴデンドロサイトの突起（髄鞘）は、大脳白質に豊富で、大脳皮質には相対的に少ないため、抗ミエリン塩基性タンパク質抗体は大脳白質をびまん性に染色し、大脳皮質を線状に染色した。その結果を図１ｄ、ｅに示した。（図１ｄは大脳皮質、ｅは大脳白質における抗ミエリン塩基性タンパク質抗体による免疫組織染色の結果を示したもの。）
【００６６】
オリゴデンドログリオーマでは、抗ミエリン塩基性タンパク質抗体によって線状にわずかに染色されたが、陽性部分はオリゴデンドログリオーマ腫瘍細胞との連続性はなく、腫瘍と混在している既存の神経組織に対する反応と考えられた。その結果を図１ｆに示した。（図１ｆはオリゴデンドログリオーマにおける抗ミエリン塩基性タンパク質抗体による免疫組織染色の結果を示したもの。）
【００６７】
アストロサイトマーカーである抗グリア線維酸性タンパク質抗体でヒト脳組織の免疫組織染色を行ったところ、抗ヒトＯｌｉｇ２抗体で染色される細胞とは別の細胞、即ちアストロサイトの突起に染色像が得られた。
【００６８】
Ｋｉ−Ｍ１Ｐ抗体でヒト脳組織の免疫組織染色を行ったところ、抗ヒトＯｌｉｇ２抗体で染色される細胞とは別の細胞、即ちミクログリアの突起に染色像が得られた。
【００６９】
以上のことから、▲１▼抗ヒトＯｌｉｇ２抗体はヒトＯｌｉｇ２に対して特異的に反応すること、▲２▼抗ヒトＯｌｉｇ２抗体による免疫組織染色ではオリゴデンドロサイトの核が染色され、神経細胞、アストロサイト、脳室上衣細胞、ミクログリア、シュワン細胞は染色されず、この抗体がオリゴデンドロサイトに特異的に反応すること、▲３▼その染色像は、オリゴデンドロサイトの核に局在するので、従来技術である抗ミエリン塩基性タンパク質抗体を用いた免疫組織染色と比較して細胞の同定に優れていること、▲４▼ホルマリン固定、パラフィン組織標本で染色可能であり、汎用性があること、▲５▼抗ヒトＯｌｉｇ２抗体の免疫組織染色には、前処理として加熱処理が有効であることが明らかになった。
【００７０】
また、オリゴデンドログリオーマにおいても正常のオリゴデンドロサイトと同様に核に染色されることが確認された。オリゴデンドログリオーマはパラフィン切片上では人工変化のために細胞質が脱落しやすい特徴があるが、核を染める抗ヒトＯｌｉｇ２抗体ではその点は問題にならないことが明らかとなった。
【００７１】
【発明の効果】
本発明の抗ヒトＯｌｉｇ２抗体は、ヒトＯｌｉｇ２を特異的に認識し、ヒト由来の組織標本において、オリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドログリオーマの核を特異的に認識する。更に本発明の抗ヒトＯｌｉｇ２抗体は、生体組織中およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＯｌｉｇ２の分布や発現量を検出するのに有効であり、免疫組織染色試薬、免疫化学試薬、医薬ならびに診断薬として有用である。
【００７２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の抗ヒトＯｌｉｇ２抗体、および公知の抗ミエリン塩基性タンパク質抗体を用いてヒト組織を免疫組織染色し、両者の染色結果を比較した図面。（写真）
【図２】本発明の抗ヒトＯｌｉｇ２抗体の特異性を確認するウェスタンブロッティングの結果を示す図面。（写真）
【図３】オートクレーブ加熱処理による、抗ヒトＯｌｉｇ２抗体の染色性の向上を示す図面。（写真）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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