(57)【要約】【課題】本発明の課題は、唾液などの生物学的試料中に存在するアミラーゼ活性をより簡便に測定する手段を提供するものであり、特に、高濃度にアミラーゼを含有する試料を希釈することなくそのまま測定する手段（方法、試薬）を提供しようとするものである。【解決手段】修飾オリゴ糖基質を用いた酵素法において、オリゴ糖基質と競合するオリゴ糖などの糖類を添加することにより、高活性値のアミラーゼ試料のアミラーゼ活性を希釈することなく直接測定する方法を見いだし、本発明に到達した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質である修飾オリゴ糖及び該修飾オリゴ糖と拮抗して競合的に作用する競合阻害剤を少なくとも含むことを特徴とする酵素法によるアミラーゼ測定用試薬。
【請求項２】
競合阻害剤が、分子構造が基質の分子構造と類似している糖類である請求項１のアミラーゼ測定用試薬。
【請求項３】
基質を２〜５００ｍｍｏｌ、競合阻害剤を０．０１〜２ｍｏｌの比率で含有する請求項１又は２に記載のアミラーゼ測定用試薬。
【請求項４】
基質である修飾オリゴ糖が、Ｇ２〜７から選ばれるオリゴ糖であって、還元末端を色原体で修飾されている請求項１〜３の何れか一に記載のアミラーゼ測定用試薬。
【請求項５】
色原体が、４−ニトロフェノール（ＰＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェノール（ＣＮＰ）、２，４−ジクロロフェノール（Ｃｌ２Ｐ）から選ばれる請求項４に記載のアミラーゼ測定用試薬。
【請求項６】
修飾オリゴ糖が、以下から選ばれる請求項１〜３の何れか一に記載のアミラーゼ測定用試薬；
２−クロロ−４−ニトロフェノール−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトサイド（以下　ＧＡＬ−Ｇ２−ＣＮＰ）、ＧＡＬ−Ｇ４−ＣＮＰ、ＧＡＬ−Ｇ５−ＣＮＰ、Ｇ５−ＣＮＰ、Ｇ６−ＣＮＰ、Ｇ７−ＣＮＰ、Ｇ５−ＰＮＰ、Ｇ７−ＰＮＰ。
【請求項７】
競合阻害剤が、オリゴ糖又はでんぷんである請求項１〜６の何れか一に記載のアミラーゼ測定用試薬。
【請求項８】
競合阻害剤であるオリゴ糖が、三糖以上である請求項７に記載のアミラーゼ測定用試薬。
【請求項９】
競合阻害剤であるオリゴ糖が、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースから選ばれる請求項８に記載のアミラーゼ測定用試薬。
【請求項１０】
競合阻害剤であるオリゴ糖が、マルト−スである請求項７に記載のアミラーゼ測定用試薬。
【請求項１１】
基質及び競合阻害剤が、液状である請求項１〜１０の何れか一に記載のアミラーゼ測定用試薬。
【請求項１２】
基質及び競合阻害剤が、支持体に担持されている状態である請求項１〜１０の何れか一に記載のアミラーゼ測定用試薬。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載のアミラーゼ測定用試薬を用いる高濃度にアミラーゼを含有する生物学的試料中のアミラーゼの測定方法。
【請求項１４】
生物学的試料が、人唾液、血液又はそれらの由来物である請求項１３に記載のアミラーゼの測定法。
【請求項１５】
アミラーゼを含有する生物学的試料を希釈することなく直接測定する請求項１４に記載のアミラーゼの測定方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５の何れか一に記載のアミラーゼの測定法によって、人唾液中のアミラーゼ活性を測定することを含む、被験者のストレスレベルの検定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアミラーゼ活性の測定試薬及び測定方法に関する。詳しくは、高いアミラーゼ活性を呈する試料のアミラーゼ活性を希釈することなく直接測定する試薬及び方法に関する。加えて本発明は、測定した唾液アミラーゼ活性値より、被験者のストレスを測定する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
アミラーゼ（酵素番号ＥＣ３．２．１．１）は膵・唾液腺などで分泌され、主に唾液腺・膵に分布し、その他にも筋肉・卵巣・卵管などに存在していることが知られており、組織から逸脱したアミラーゼが血中や尿中に存在していることも知られている。一部の膵臓・唾液腺、腎・肝機能障害、腫瘍などの疾患においては、血清中や尿中・膵液中のアミラーゼ値が高値を示すことが知られている。これらのアミラーゼ活性の測定方法としては、従来よりＣａｒａｗａｙ法やオリゴ糖基質を用いた酵素法などが知られている。これらの方法はいずれも数千ＩＵ／Ｌまでのアミラーゼ活性を測定でき、正常値が数十から数百ＩＵ／Ｌ程度の血清・膵液・尿試料などの測定に用いられてきた。
【０００３】
近年の研究より、唾液アミラーゼ活性値が、被験者のストレスと相関しているとの報告がされており〔医用電子と生体工学　３９（３），　ｐ２３４−２３９（２００１）、山口昌樹　他〕、唾液試料中のアミラーゼ活性値を測定する方法が望まれている。
しかしながら、唾液中のアミラーゼ活性値は、正常値が数万ＩＵ／Ｌとなるため、従来のアミラーゼ測定法では直接測定することは不可能であった。そのため、試料を希釈するなどの余分な操作が必要となるうえ、数百倍の希釈が必要なため測定精度の低下を招くという問題点が存在する。
【０００４】
【発明が解決しようとしている課題】
本発明の課題は、唾液などの生物学的試料中に存在するアミラーゼ活性をより簡便に測定する手段を提供するものであり、特に、高濃度にアミラーゼを含有する試料を希釈することなくそのまま測定する手段（方法、試薬）を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決する方法】
本発明者らは、修飾オリゴ糖基質を用いた酵素法において、オリゴ糖基質と競合するオリゴ糖などの糖類を添加することにより、高活性値のアミラーゼ試料のアミラーゼ活性を希釈することなく直接測定する方法を見いだし、本発明に到達した。
【０００６】
すなわち、本発明は、
「１．基質である修飾オリゴ糖及び該修飾オリゴ糖と拮抗して競合的に作用する競合阻害剤を少なくとも含むことを特徴とする酵素法によるアミラーゼ測定用試薬、
２．競合阻害剤が、分子構造が基質の分子構造と類似している糖類である前項１のアミラーゼ測定用試薬、
３．基質を２〜５００ｍｍｏｌ、競合阻害剤を０．０１〜２ｍｏｌの比率で含有する前項１又は２に記載のアミラーゼ測定用試薬、
４．基質である修飾オリゴ糖が、Ｇ２〜７から選ばれるオリゴ糖であって、還元末端を色原体で修飾されている前項１〜３の何れか一に記載のアミラーゼ測定用試薬、
５．色原体が、４−ニトロフェノール（ＰＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェノール（ＣＮＰ）、２，４−ジクロロフェノール（Ｃｌ２Ｐ）から選ばれる前項４に記載のアミラーゼ測定用試薬、
６．修飾オリゴ糖が、以下から選ばれる前項１〜３の何れか一に記載のアミラーゼ測定用試薬；
２−クロロ−４−ニトロフェノール−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトサイド（以下　ＧＡＬ−Ｇ２−ＣＮＰ）、ＧＡＬ−Ｇ４−ＣＮＰ、ＧＡＬ−Ｇ５−ＣＮＰ、Ｇ５−ＣＮＰ、Ｇ６−ＣＮＰ、Ｇ７−ＣＮＰ、Ｇ５−ＰＮＰ、Ｇ７−ＰＮＰ、
７．競合阻害剤が、オリゴ糖又はでんぷんである前項１〜６の何れか一に記載のアミラーゼ測定用試薬、
８．競合阻害剤であるオリゴ糖が、三糖以上である前項７に記載のアミラーゼ測定用試薬、
９．競合阻害剤であるオリゴ糖が、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースから選ばれる前項８に記載のアミラーゼ測定用試薬、
１０．競合阻害剤であるオリゴ糖が、マルト−スである前項７に記載のアミラーゼ測定用試薬、
１１．基質及び競合阻害剤が、液状である前項１〜１０の何れか一に記載のアミラーゼ測定用試薬、
１２．基質及び競合阻害剤が、支持体に担持されている状態である前項１〜１０の何れか一に記載のアミラーゼ測定用試薬、
１３．前項１１又は１２に記載のアミラーゼ測定用試薬を用いる高濃度にアミラーゼを含有する生物学的試料中のアミラーゼの測定方法。
１４．生物学的試料が、人唾液、血液又はそれらの由来物である前項１３に記載のアミラーゼの測定法、
１５．アミラーゼを含有する生物学的試料を希釈することなく直接測定する前項１４に記載のアミラーゼの測定方法、
１６．前項１３〜１５の何れか一に記載のアミラーゼの測定法によって、人唾液中のアミラーゼ活性を測定することを含む、被験者のストレスレベルの検定方法」からなる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明においてアミラーゼとは、主にヒト唾液腺や膵腺より分泌されるα−アミラーゼが代表的である。アミラーゼはデンプン、アミロースなどの多糖類を加水分解する分子量５４，０００〜６２，０００の消化酵素である。唾液中のアミラーゼ活性値は、体調による変動や、個人差が非常に大きい事が知られている。正常値は数万ＩＵ／Ｌ程度であるが、体調や、体質によっては、健常人においても１０万ＩＵ／Ｌを越える事があることが知られている。
【０００８】
本発明において使用されるアミラーゼ活性測定のための基質は、修飾オリゴ糖が使用される。修飾とは、オリゴ糖の末端、還元末端に識別標識化合物が結合されていることを意味し、アミラーゼ又は共役酵素によって遊離されうる。修飾オリゴ糖の糖数はＧ２〜Ｇ７であり、好ましくはＧ２〜Ｇ５である。修飾化合物は、色原体といわれるものが一般的に使用でき、好適な基としては、４−ニトロフェノール（ＰＮＰ）、２−クロロ−４−ニトロフェノール（ＣＮＰ）、２，４−ジクロロフェノール（Ｃｌ２Ｐ）が例示される。このような色原体で修飾されたオリゴ糖の具体例としては、２−クロロ−４−ニトロフェノール−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシルマルトサイド（以下　ＧＡＬ−Ｇ２−ＣＮＰ）、ＧＡＬ−Ｇ４−ＣＮＰ、ＧＡＬ−Ｇ５−ＣＮＰ、Ｇ５−ＣＮＰ（２−クロロ−４−ニトロフェニル−マルトペンタオース）、Ｇ７−ＣＮＰ、Ｇ５−ＰＮＰ（ｐ−ニトロフェニル−マルトペンタオース）、Ｇ６−ＣＮＰ（２−クロロ−ｐ−ニトロフェニルマルトテトラオース）、Ｇ７−ＰＮＰがあげられる。このうち、特に、アミラーゼによる加水分解時の切断箇所が１箇所に限定されるＧＡＬ−Ｇ２−ＣＮＰやＧＡＬ−Ｇ４−ＣＮＰなどが好ましい。
【０００９】
修飾オリゴ糖を一般式で表すと以下となる。
【化１】
2004024236.tif 000002
【００１０】
式中のＲ１、Ｒ２はそれぞれ水素原子あるいは保護基を示す。保護基は格別限定されるものではないが、例えば、非置換または置換の低級アルキル基、低級アルコキシル基またはフェニル基、アジド基、ハロゲン原子、Ｎ−モノアルキルカルバモイルオキシ基、アルキル若しくはアリールスルホニルオキシ基またはアルキルオキシ基、α−グルコシル基、α−マルトシル基、β−ガラクトシル基であり、Ｒ１、Ｒ２は互いに架橋していてもよく、該架橋基にはさらに置換基を有していてもよい。Ｒ３はシグナル発生基、例えば光学的にシグナルを検出可能な基（好適には発色性芳香族基）であり、ｎは０〜５である。上記式では−ＯＲ３は、還元性末端グルコースの１位にβ−結合したものであるが、α−結合したものであってもよい。
【００１１】
本発明で、基質の反応性に対して競合的に作用する競合阻害剤とは、アミラーゼが、基質である修飾オリゴ糖と拮抗して競合的に作用しうる化合物を意味し、例えば分子構造が基質の分子構造と類似している糖類が好適に例示される。具体的には、修飾オリゴ糖に使われたオリゴ糖以外のオリゴ糖或いはでんぷんが例示される。そして、オリゴ糖は２以上の糖を含むもの、好ましくはＧ２〜Ｇ７、より好ましくはＧ２〜Ｇ５が使用される。具体的には、マルト−ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースであり、最適にはマルトトリオースが例示される。なお、Ｇ２化合物は、一般的には基質には適していないが、本発明では驚いたことにきわめて好適な競合阻害剤となりえた。
【００１２】
本発明のアミラーゼ測定試薬における、基質と競合阻害剤の存在比率は、競合阻害剤が基質の存在量に比して大過剰で、１．５〜１００倍、好ましくは２〜５０倍、より好ましくは２〜１０倍量である。具体的には、基質を２〜５００ｍｍｏｌ、競合阻害剤を０．０１〜２ｍｏｌの比率で含有する。液状の試薬の場合、基質量は、通常は０．０５ｍＭ〜１Ｍ程度、好ましくは２〜５００ｍＭの濃度になるように調製される。
【００１３】
本発明のアミラーゼ測定試薬において、基質と競合阻害剤は液状又は支持体に担持されている状態である。液状とは、試験管等の試料採取用容器にあらかじめ基質と競合阻害剤を水溶液又は最適安定化条件の水溶液若しくは緩衝液中に存在させることをいい、該容器に唾液等の試料を希釈することなくそのまま添加し、アミラーゼ反応をおこさせる。支持体に担持とは、水不溶性の有機又は無機担体に基質と競合阻害剤が固定化又はトラップされている状態をいう。そして支持体の形状は、薄膜が好適であり、厚さ１００〜５００μｍ、好ましくは１５０〜４００μｍである。薄膜は、一般的に遊離する修飾物質の発色を色判別センサーで測定することから、光の乱反射が制御されたものが好ましく、膜表面が出来る限り均一なものが良い。薄膜の材質は、紙、ニトロセルロース、ナイロン、多孔性ガラス等が好適に例示されるがこれに限定されず、本発明で定義する基質と競合阻害剤を効率的に担持又は保持できるものであれば広く利用可能である。
【００１４】
本発明の測定方法における反応は、競合阻害剤である糖類を反応系に加える（存在させる）ことにより、試料中のアミラーゼが、修飾オリゴ糖基質だけではなく、競合阻害剤であるオリゴ糖も分解する。つまり基質と競合阻害剤であるオリゴ糖が反応を競合し、同じ基質量でより高いアミラーゼ活性を測定することが出来るようになるのである。
【００１５】
本発明の測定方法における反応温度は、特に限定されないが、好ましくは約２５〜４０℃である。反応時間は、１〜１０数分で十分であるが、基質および所望により使用される共役酵素の種類に依存する。反応至適ｐＨは特に限定されないが、液状の試薬では、所望により適当な緩衝液でｐＨ６〜８に調節しても良い。さらに、所望により、反応の促進のために、公知のα−アミラーゼの活性化剤を用いてもよい。
【００１６】
本発明の測定方法における測定は、修飾物質であるＣＮＰやＰＮＰ等の色源体の遊離による、試料液又は試料支持体の発色による光吸度変化を量的にとらえアミラーゼ活性を決定する。通常は、大過剰のアミラーゼの作用によって、この色原体の遊離は可能であるが、所望により、アミラーゼの加水分解反応後に、アミラーゼとα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ等によって色原体を遊離させる反応を含んだ共役酵素法が用いられることもある。この場合は、追加の酵素を試薬として添加する手段の導入が必要となる。
【００１７】
発色による変化の測定は、色判別センサーが好適に利用される。支持体による発色の変化は反射光又は透過光によって測定することが便宜であり、光源には発光ダイオード、反射光を計測する場合には角度が０〜４５度、測定対象との距離が１０〜３０ｍｍ、試料スポット径が１〜５ｍｍの条件を満足する測定装置が好適に用いられる。
【００１８】
かくして提供される本発明の試薬を利用したアミラーゼの測定方法は、生物学的試料として、高濃度にアミラーゼを含有する試料に適している。例えば、唾液、血液、尿等がサンプルになりうるが、唾液がもっとも好ましい。本発明ではこれら試料を希釈することなく直接測定することが可能である。
【００１９】
人唾液中のアミラーゼ活性を簡便に測定することを可能とする本発明は、被験者のストレスレベルの検定方法のための簡便・効果的な手段を可能とする。具体的には、被験者の安静時に採取した唾液中のα−アミラーゼ活性を測定し、その活性値を記録、記憶して基準値とする。然る後に被験者の任意の状態におけるα−アミラーゼ活性を測定し、安静時に記録、記憶した基準値と比較する。基準値より酵素活性が大きければ、不快なストレス（ｄｉｓｔｒｅｓｓ）を受けていると判定し、小さければ、快適なストレス（ｅｕｓｔｒｅｓｓ）を受けていると判定できる。また、基準値との差が大きいほど、受けているストレスも大きく、身体または精神に受けているストレスの程度も判定できる。
【００２０】
また、連続してα−アミラーゼ活性を測定することにより経時的なストレスの変化を捉えることができる。不快なストレスを受けると唾液中のα−アミラーゼ活性が上昇する。この際の正の時間勾配の大きさによってストレスの大きさの程度を判定することができる。逆に快適なストレスを受けている場合はα−アミラーゼの酵素活性が低下するので、負の時間勾配として現れ、同様にその大きさの程度も判定できる。
【００２１】
更には経時的にα−アミラーゼ活性を測定し、測定時間内に加えられた任意のストレスによる酵素活性変化を捉え、ストレス負荷前の値（基準値）に戻るまでの時間・変化の大きさからストレスの大きさの程度を判定することができる。
【００２２】
【実施例】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、基質である修飾オリゴ糖と拮抗して競合的に作用する競合阻害剤を含む酵素法によるアミラーゼ測定法に関する限り全て本発明の技術思想に包含される。
【００２３】
【実施例１】
アミラーゼ測定試薬であるエスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩ（ニプロ株式会社）の第１、第２試薬に、以下の糖類を添加し、基質と競合阻害剤を含む試薬液（▲１▼〜▲３▼）を調製した。
試薬▲１▼　それぞれ０．５ｍｏｌ／Ｌのマルトトリオースを溶解した。
試薬▲２▼　それぞれ０．５ｍｏｌ／Ｌのマルトテトラオースを溶解した。
試薬▲３▼　それぞれ０．５ｍｏｌ／Ｌのマルトペンタオースを溶解した。
【００２４】
【実施例２】
アミラーゼ測定試薬であるエスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩ（ニプロ株式会社）の第１、第２試薬に、以下の糖類を添加し、基質と競合阻害剤を含む試薬液（▲４▼〜▲５▼）を調製した。
試薬▲４▼　それぞれ０．１ｍｏｌ／Ｌのマルトトリオースを溶解した。
試薬▲５▼　それぞれ０．１ｍｏｌ／Ｌのマルトテトラオースを溶解した。
試薬▲６▼　それぞれ０．１ｍｏｌ／Ｌのマルトペンタオースを溶解した。
【００２５】
【実施例３】
以下の調製方法で基質と競合阻害剤を支持体に担持させた試薬▲７▼（試験紙）を調製した。
７０　ｍｍｏｌ／ＬのＧａｌ−Ｇ２−ＣＮＰ、３．５　ｍｏｌ／ＬのＫＳＣＮ、１　ｍｏｌ／Ｌのマルトテトラオースをバッファーに溶解した溶液に、Ａｄｖａｎｔｅｃ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｐａｐｅｒ　５１４Ａ（東洋濾紙社）を３分間含浸させた後に乾燥させた。この試験紙を７ｍｍｘ７ｍｍに切断した。
【００２６】
【実施例４】
以下の調製方法で基質と競合阻害剤を支持体に担持させた試薬▲８▼（試験紙）を調製した。
１４０　ｍｍｏｌ／ＬのＧａｌ−Ｇ２−ＣＮＰ、７　ｍｏｌ／ＬのＫＳＣＮ、０．５　ｍｏｌ／Ｌのマルトペンタオースをバッファーに溶解した溶液に、Ａｄｖａｎｔｅｃ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｐａｐｅｒ　５１４Ａ（東洋濾紙社）を３分間含浸させた後に乾燥させた。この試験紙を７ｍｍｘ７ｍｍに切断した。
【００２７】
【試験例１】
以下の処理により、実施例１の試薬を使ってアミラーゼ活性の測定をおこなった。
１．　５人の健常人より唾液試料を採取した（試料ａ〜ｅ）。
２．　上記試料および陰性対象（生理食塩水）のアミラーゼ活性値を、アミラーゼ測定試薬エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩ（ニプロ株式会社）で測定した（コントロール）。エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩは、Ｇａｌ−Ｇ２−ＣＮＰを用いた酵素法によるアミラーゼ測定試薬であり、２０００ＩＵ／Ｌまでのアミラーゼを測定できる。測定には自動分析装置７１７０（日立）を用いた。そのままでは測定限界を超えるため測定できないので、各試料を１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ（牛血清アルブミンの１％（Ｗ／Ｖ）生理食塩水溶液を意味する。以下同様）で１００倍希釈したものを代わりに測定した。測定結果は表１に示した。試料ａ〜ｅのアミラーゼ活性値は、それぞれ２１８００，　５９７００，　７３２００，　１１６０００，１５１０００　ＩＵ／Ｌである。
【００２８】
【表１】
2004024236.tif 000003
【００２９】
３．　実施例１の試薬▲１▼〜▲３▼を用いて試料ａ〜ｅを、希釈せずにそのアミラーゼ活性値の測定を行った。測定には自動分析装置７１７０（日立）を用い、分析機のパラメーターなどの測定条件は２．と同様とした。測定結果は表２の通りである。
【００３０】
【表２】
2004024236.tif 000004
【００３１】
エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲１▼〜▲３▼による測定結果の相関図は図１〜図３の通りである。各結果は、ともに相関係数ｒ＝１．００，　１．００，　１．００となり高い相関が示された。各試薬の測定値をそれぞれ、１７１、３６１、４７３倍すれば、従来法とほぼ等しい値となる。本発明試薬は、試料を希釈することなく直接唾液検体のアミラーゼ活性値を測定できる事が示された。
【００３２】
【試験例２】
以下の処理により、実施例２の試薬を使ってアミラーゼ活性の測定をおこなった。
１．　３人の健常人より唾液試料を採取した（試料ｆ〜ｈ）。
２．　上記試料および陰性対照試料（生理食塩水）のアミラーゼ活性値を、アミラーゼ測定試薬エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩ（ニプロ株式会社）で測定した。測定には自動分析装置７１７０（日立）を用いた。そのままでは測定限界を超えるため測定できないので、各試料を１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡで１００倍希釈したものを代わりに測定した。測定結果は表３に示した。
【００３３】
【表３】
2004024236.tif 000005
【００３４】
３．　実施例２の試薬▲４▼〜▲６▼を用いて各試料を希釈せずにそのアミラーゼ活性値の測定を行った。測定には自動分析装置７１７０（日立）を用い、測定条件は２．と同様とした。測定結果は表４に示した。ＨＩは測定限界を超えたために測定不能であったことを示す。
【００３５】
【表４】
2004024236.tif 000006
【００３６】
エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲４▼〜▲６▼による測定結果の相関は図４〜６の通りである。ｒ＝０．９９，　０．９９，　０．９８となり高い直線性が示された。各試薬の測定値をそれぞれ、１４、２０、５０倍すれば、従来法とほぼ等しい値となる。本発明試薬は、試料を希釈することなく直接唾液検体のアミラーゼ活性値を測定できる事が示された。
【００３７】
【試験例３】
以下の処理により、実施例１の試薬を使ってアミラーゼ活性の測定をおこなった。
１．　試験例１で用いた唾液試料ｄを、１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡで０．２，　０．４，　０．６，　０．８倍濃度となるように希釈した。
２．　上記試料および陰性対照試料（生理食塩水）のアミラーゼ活性値を、アミラーゼ測定試薬エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩ（ニプロ株式会社）で測定した。測定には自動分析装置７１７０（日立）を用いた。そのままでは測定限界を超えるため測定できないので、各試料を１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡで１００倍希釈したものを代わりに測定した。測定結果は表５に示した。
【００３８】
【表５】
2004024236.tif 000007
【００３９】
３．　同様に、実施例１で調製した試薬▲３▼を用いて各試料を希釈せずにそのアミラーゼ活性値の測定を行った。測定には自動分析装置７１７０（日立）を用い、測定条件は２．と同様とした。測定結果は表６に示した。
【００４０】
【表６】
2004024236.tif 000008
【００４１】
エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲３▼による測定結果の相関は図７の通りであり、ｒ＝０．９９となり高い直線性が示された。試薬▲３▼の測定値を４７３倍すれば、従来法とほぼ等しい値となり、本発明試薬は、希釈することなく直接唾液検体のアミラーゼ活性値を測定できる事が示された。
【００４２】
【試験例４】
以下の処理により、実施例３の試薬を使ってアミラーゼ活性の測定をおこなった。
１．　健常人より唾液試料を採取し（試料ｉ）、各試料を１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡで０．２，　０．４，　０．６，　０．８倍に希釈した。
２．　上記試料のアミラーゼ活性値を、アミラーゼ測定試薬エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩ（ニプロ株式会社）で測定した。測定には自動分析装置７１７０（日立）を用いた。そのままでは測定限界を超えるため測定できないので、各試料を１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡで１００倍希釈したものを代わりに測定した。測定結果は表７に示した。
【００４３】
【表７】
2004024236.tif 000009
【００４４】
３．　試薬▲７▼を用いて１．の試料のアミラーゼ活性値の測定を行った。測定にはＫＥＹＥＮＣＥ社の色判別センサーＣＺ−Ｖ１のＣモードを用いた。実施例３の試薬▲７▼に３μＬの試料を滴下し、反応前と反応１分後のセンサーの測定値の差を計測した。結果は表８に示した。
【００４５】
【表８】
2004024236.tif 000010
【００４６】
エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲７▼による測定結果の相関は図８に示した。ｒ＝　０．９８となり高い相関が示された。
試薬▲７▼の測定値を２１００倍すれば、従来法とほぼ等しい値となり、本発明試薬は、希釈することなく直接唾液検体のアミラーゼ活性値を測定できる事が示された。
【００４７】
【試験例５】
実施例４で調製した試薬▲８▼を用いて試験例２で用いた試料ｆおよびその希釈試料のアミラーゼ活性値の測定を行った。測定にはＫＥＹＥＮＣＥ社の色判別センサーＣＺ−Ｖ１のＣモードを用いた。試薬▲８▼に３μＬの試料を滴下し、反応前と反応１分後のセンサーの測定値の差を計測した。結果は表９に示した。
【００４８】
【表９】
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【００４９】
エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲８▼による測定結果の相関は図９の通りであり、ｒ＝　０．９８となり高い相関が示された。試薬▲８▼の測定値を５００倍すれば、従来法とほぼ等しい値となり、本発明試薬は、希釈することなく直接唾液検体のアミラーゼ活性値を測定できる事が示された。
【００５０】
【発明の効果】
上記したごとく本発明によれば、基質である修飾オリゴ糖と基質の反応性に対して競合的に作用する競合阻害剤を含む酵素法によるアミラーゼ測定用試薬を提供し、この試薬を使ってアミラーゼ活性を測定すれば、きわめて簡便に迅速に効果的にアミラーゼ活性を測定可能であり、その結果、その場で短時間に被検者のストレスを判定する技術を確立することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲１▼による測定結果の相関を示す。
【図２】エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲２▼による測定結果の相関を示す。
【図３】エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲３▼による測定結果の相関を示す。
【図４】エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲４▼による測定結果の相関を示す。
【図５】エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲５▼による測定結果の相関を示す。
【図６】エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲６▼による測定結果の相関を示す。
【図７】エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲３▼による測定結果の相関を示す。
【図８】エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲７▼による測定結果の相関を示した。
【図９】エスパ・アミラーゼ・リキッドＩＩによる１００倍希釈試料の測定結果と、試薬▲８▼による測定結果の相関を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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