(57)【要約】【課題】本発明は担子菌の化学物質の物質変換に関与する細胞応答機構に着目した迅速、簡易かつ高精度な環境汚染物質の測定技術を確立することを目的とする。【解決手段】本発明者等は、上記課題を解決する目的で、環境汚染物質を効率的に検出するのに利用できる有用な遺伝子を取得するため、鋭意研究を重ねた結果、担子菌、詳しくは、Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物より、ケミカルストレス、詳しくは、芳香族化合物に特異的に発現挙動が変化する複数の遺伝子を取得し、その塩基配列を同定することに成功した。また、該遺伝子の発現量の相対的な比較を行い、該遺伝子の発現量が、ケミカルストレスの種類毎に異なることを見出した。本発明者らはこれらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項８】
請求項１〜７の遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現挙動を解析する工程を有し、前記遺伝子の発現挙動の変化をもって、試料中の目的化合物の定性的もしくは定量的分析を行うことを特徴とする芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物の分析方法。
【請求項９】
前記遺伝子の発現挙動を解析する工程において、前記請求項１〜７の遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に対して相補的な任意の１５〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドを用いる請求項８の方法。
【請求項１０】
請求項１〜７の遺伝子および、
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ、
から選択される２以上の遺伝子の発現挙動を解析する工程を有し、前記遺伝子の発現挙動の変化をもって、目的化合物の定性的もしくは定量的分析を行うことを特徴とする芳香族化合物から選択される２種類以上の化合物の同時分析方法。
【請求項１１】
前記遺伝子の発現挙動を解析する工程において、
請求項１〜７の遺伝子および、
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ、
から選択される少なくとも１つの遺伝子に対して相補的な任意の１５〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドであって、各ヌクレオチドが異なる上記遺伝子に対して相補的である２種類以上のオリゴヌクレオチドを用いる請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記請求項１〜７の遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に対して相補的な任意の１５〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドを含む芳香化合物から選択される少なくとも１種類含む芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物の分析用キット。
【請求項１３】
請求項１〜７の遺伝子および、
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ、
から選択される少なくとも１つの遺伝子に対して相補的な任意の１５〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドであって、各ヌクレオチドが異なる上記遺伝子に対して相補的である２種類以上のオリゴヌクレオチドを用いる芳香族化合物から選択される２種類以上の化合物の同時分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はケミカルストレス、詳しくは芳香族化合物に特異的に応答する新規遺伝子、すなわち、ケミカルストレスの存在下において応答的に発現挙動に変化が認められ、ケミカルストレスの検出用の指標として利用できる新規遺伝子およびそれらの利用、特に環境汚染物質の環境測定技術への利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、地球環境の悪化に伴い汚染土壌、水等の浄化が急務となっており、土壌修復などの環境修復事業の需要が高まっている。環境修復事業においては、汚染実態を把握する汚染サイトの調査が最も重要な項目の一つであり、環境汚染物質の特定、環境汚染物質の濃度、および汚染範囲を正確に把握する必要がある。そして、環境汚染物質には、種々の芳香族化合物が数多く含まれる。
従来においては、汚染サイトの調査は、原子吸光分析、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー質量分析、液体クロマトガスクロマトグラフィー等の機器分析を行うことにより行われていた。
しかしながら、これら従来の方法は、測定試料からの測定対象物の抽出、濃縮という複雑な前処理を要する、微量にしか存在しない環境汚染物質を測定するのに必要な感度が得られない、大型の分析機器を要する等、分析期間、分析コストおよび分析感度面に課題を有するものであった。
これらの方法に代わるものとして、簡易な装置を使用して、簡易かつ迅速に調査を行う簡易測定方法も開発されている。この簡易測定方法としては、パックテスト、検知管などの簡易分析装置、生物反応を利用したイムノアッセイなどがある。しかし、これらの測定方法にしても、多成分を簡易かつ同時に測定できるものではなく、環境汚染物質が特定されていない場合、環境汚染の実態把握に際して、多岐にわたる環境汚染物質について、各環境汚染物質毎にそれに適用した測定方法により検出を行う必要があるという問題点が解決されていなかった。したがって、多岐にわたる微量の環境汚染物質を網羅的に迅速かつ簡易、高精度に検出できる環境測定技術の確立が望まれていた。
【０００３】
また、近年、省エネルギー、省コストの分解方法として微生物による環境修復が注目されており、なかでも木材を栄養素して生育するキノコの一種である担子菌類が環境修復に有効な微生物として有望視されている。高い物質変換能を有し、この担子菌類に属する白色腐朽菌担子菌は芳香族天然高分子であるリグニンを完全無機化する唯一の微生物であり、リグニン分解酵素として、リグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）等を分泌することが知られている。更に、種々の難分解性環境汚染物質、特に多岐にわたる芳香族化合物を分解することが明らかにされている（Ｊｏｓｈｉ　ＤＫ．等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１７７９−８５等）。化学的に非常に安定な構造を有するダイオキシンも例外ではなく、白色腐朽菌によるダイオキシン類の分解の報告がなされており（Ｂｕｍｐｕｓ　ＪＡ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２８：１４３４−６等）、担子菌の芳香族化合物分解能には卓越したものがあることが明らかにされている。担子菌の複雑多岐にわたる物質変換には種々の細胞応答機構の関与が考えられるが、細胞生物学的解明はなされておらず、更に、担子菌の分解活性はペルオキダーゼ等の既知の酵素だけでは説明することが困難であることから、化学物質を投与することにより、解毒または生体防御のために発現する未知の酵素の存在、および酵素の発現に密接な関係を有する未知遺伝子の存在が予想される。したがって、高い物質変換能を有する担子菌へ化学物質を添加することにより、発現挙動が変化する遺伝子を追跡することにより、化学物質の存在の検知のための重要な情報がもたらされることが期待できる。
【０００４】
そこで、本発明は担子菌の化学物質の物質変換に関与する細胞応答機構に着目した迅速簡易かつ高精度な環境汚染物質の測定技術を確立することを目的とする。詳しくは、本発明は、多岐にわたる芳香族化合物が代表される環境汚染物質を検出するのに利用可能な、環境汚染物質に応答的に発現挙動が変化する遺伝子を提供することを目的とする。更に本発明は、該遺伝子の発現挙動の変化を指標とした、多成分分析も可能な迅速、簡易かつ高精度な環境測定方法の提供を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決する目的で、環境汚染物質を効率的に検出するのに利用できる有用な遺伝子を取得するため、鋭意研究を重ねた結果、担子菌、詳しくは、Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物より、ケミカルストレス、詳しくは、芳香族化合物に特異的に発現挙動が変化する複数の遺伝子を取得し、その塩基配列を同定することに成功した。また、該遺伝子の発現量の相対的な比較を行い、該遺伝子の発現量が、ケミカルストレスの種類毎に異なることを見出した。本発明者らはこれらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明を概説すれば、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子、
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ（請求項１）、
および、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子、
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ（請求項２）、
および、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子、
（ａ）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ（請求項３）、
および、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子、
（ａ）配列表の配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ（請求項４）、
および、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子、
（ａ）配列表の配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ（請求項５）、
および、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子、
（ａ）配列表の配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ（請求項６）、
および、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子、
（ａ）配列表の配列番号８に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ、（請求項７）に関する。ここで、化合物を与えることによって遺伝子の発現挙動が変化するとは、化合物に応答的に遺伝子の発現、および、遺伝子の発現量に変化がもたらされることを意味するものである。
【０００７】
そして、本発明は、請求項１〜７の遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現挙動を解析する工程を有し、前記遺伝子の発現挙動の変化をもって、試料中の目的化合物の定性的もしくは定量的分析を行うことを特徴とする芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物の分析方法に関し、好ましくは、前記遺伝子の発現挙動を解析する工程において、前記請求項１〜７の遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に対して相補的な任意の１５〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドを用いるものである（請求項８、９）。ここで、試料としては、汚染土壌、汚染水等の環境試料が好適に利用することができる。
【０００８】
更に、請求項１〜７の遺伝子および、
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ
から選択される２以上の遺伝子の発現挙動を解析する工程を有し、前記遺伝子の発現挙動の変化をもって、目的化合物の定性的もしくは定量的分析を行うことを特徴とする芳香族化合物から選択される２種類以上の化合物の同時分析方法に関し、好ましくは、前記遺伝子の発現挙動を解析する工程において、
請求項１〜７の遺伝子および、
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ、
から選択される少なくとも１つの遺伝子に対して相補的な任意の１５〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドであって、各ヌクレオチドが異なる上記遺伝子に対して相補的である２種類以上のオリゴヌクレオチドを用いるものである（請求項１０、１１）。ここで、試料としては、汚染土壌、汚染水等の環境試料が好適に利用することができる。
【０００９】
また、前記請求項１〜７の遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に対して相補的な任意の１５〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドを含む芳香化合物から選択される少なくとも１種類含む芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物の分析用キット、および、
請求項１〜７の遺伝子および、
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動の変化が認められ、（ａ）に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡ、
から選択される少なくとも１つの遺伝子に対して相補的な任意の１５〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドであって、各ヌクレオチドが異なる上記遺伝子に対して相補的である２種類以上のオリゴヌクレオチドを含む芳香族化合物から選択される２種類以上の化合物の同時分析用キット、に関する（請求項１２、１３）。
【００１０】
本発明により、ケミカルストレス、詳しくは、芳香族化合物に特異的に応答する新規な遺伝子、Ｎｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−２、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４の塩基配列が判明したので、この配列情報に基づいて、これらの遺伝子を一般的な遺伝子工学手法を用いて、取得または作製することができる。例えば、遺伝子ライブラリーを構築し、適当なプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、所望のクローンを選択することができる。プローブとしては、本発明で判明した配列情報に基にして、化学合成されたオリゴヌクレオチド、および本発明で取得された遺伝子およびその断片を用いることができる。また、ＰＣＲ法によっても本発明の遺伝子を取得することができる。この配列情報に従って合成することができる。したがって、ＰＣＲプライマーとしては本発明の遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限はなく、本発明の配列情報に基いて適宜設定することができる。通常プライマーとしては１０〜３５程度のオリゴヌクレオチド、好ましくは、１５〜３５程度のオリゴヌクレオチド程度の長さを有する本発明の遺伝子の部分配列を有するものを挙げることができる。
【００１１】
ＰＣＲにおいて用いるオリゴヌクレオチドの合成は、例えば、ホスホアミダイト法を用いて（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）常法に従って合成できる。また、業者に依頼して合成することもできる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下にさらに詳細に本発明を説明する。
【００１３】
（１）本発明の遺伝子は、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物、例えば、ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ）、ジベンゾフラン（ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ）、カテコール（ｃａｔｅｃｏｌ）、１，２，４‐トリハイドロキシベンゼン（１，２，４‐ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ）、べラトリルアルコール（ｖｅｒａｔｒｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ）、４−プロピルフェノール（４−ｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｏｌ）等の存在下において特異的に発現挙動に変化が認められる遺伝子であり、Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物、例えばＰｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ　ｃｈｙｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍからディファレンシャルディスプレイ法を用いた以下のような方法によって単離することができる。
【００１４】
芳香族化合物で処理した菌体及び無処理の菌体からトータルＲＮＡを抽出する。トータルＲＮＡの抽出は例えば、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ＡＧＰＣ法等の通常用いられる方法を用いておこなうことができる。
【００１５】
この抽出されたＲＮＡを鋳型としてｄＮＴＰ存在下で、例えば、デオキシチミジンが１２〜１８個つながったいわゆるオリゴｄＴ配列そのもの、あるいは、オリゴｄＴ配列を含有するような合成ＤＮＡにより構成されるプライマーＤＮＡをハイブリダイズさせ、逆転写酵素を用いてＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを合成する。また、ｃＤＮＡの合成手段には、市販のｃＤＮＡ合成キットを利用することができる。
【００１６】
前記オリゴｄＴプライマーと任意のプライマーを組み合わせてＰＣＲ法を用いてｃＤＮＡの増幅反応を行う。ＰＣＲ法では、例えば、耐熱性のＴａｑポリメラ−ゼを用い、ＤＮＡの変性の過程、プライマーＤＮＡのアニーリングの過程、伸長反応の過程よりなる温度サイクルを任意の回数繰り返すことで目的の遺伝子のみを指数的に増幅させることができる。
【００１７】
ＰＣＲ反応の反応後、増幅産物について、例えば、アガロ−スやポリアクリルアミドゲル等を用いたゲル電気泳動を行い、芳香族化合物で処理した菌体由来のバンドとコントロールの菌体由来のバンドを比較し、両者間で相違が認められるバンドを常法により、ゲルから回収、精製することによって、芳香族化合物の存在下において特異的に発現挙動が変化する遺伝子由来のｃＤＮＡフラグメントを取得することができる。
【００１８】
得られたフラグメントを常法によりプラスミドベクター等の適当なベクターに組みこみ、この組みこんだフラグメントを大腸菌等の適当な宿主に導入し、目的のｃＤＮＡフラグメントを含むベクターを有する形質転換体を選別する。形質転換方法は周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ＬＡＢＯＬＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）が参照される。
【００１９】
目的のフラグメントを含むベクターが選別できれば、このベクターに挿入されている目的のフラグメントの塩基配列の決定を、マキサム・ギルバート法あるいは、ジデオキシリボヌクレオチド法（サンガー法）により行うことができる。塩基配列の決定は、市販されているキットを用いても行うことができ、本発明で用いたＤＮＡシークエンサー　ＳＱ　５５００（ＨＩＴＡＣＨＩ）のような配列決定を自動的に行うオートシークエンサーを使用してもよい。
【００２０】
上記のようにして、配列番号１〜８に表される塩基配列からなる本発明の遺伝子が見いだされた。かくして見出された本発明の遺伝子は、芳香族化合物に特異的に応答して発現挙動が変化するものであり、本発明の遺伝子が発現量の変化が芳香族化合物の添加により確認されている。したがって、該遺伝子を用いて、存在する芳香族化合物の特定および濃度測定に利用することができるため、環境中、例えば汚染土壌、汚染水等に存在する、芳香族化合物が多く含まれる環境汚染物質の特定および濃度測定に利用することができる。
【００２１】
Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動に変化が認められ、配列表の配列認識番号１〜８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子も本発明の範囲であり、このような遺伝子も、環境中、例えば汚染土壌、汚染水等に存在する、芳香族化合物が多く含まれる環境汚染物質の特定および濃度測定に利用することができる。このようなＤＮＡ変異体は、本発明のＤＮＡに部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ　断片の変異、欠失、連結等の変異処理を行い、Ｐｈｅｎｅｒｏｃｈａｔｅ属に属する真核微生物が、芳香族化合物から選択される少なくとも１種類の化合物を与えることによって発現挙動が変化し、配列表の配列認識番号１〜８で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるを選択することによっても上記のような改変されたＤＮＡを得ることができ、このようなＤＮＡも本発明に含まれる。ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能か否かは以下のようにして調べることができる。まず、ナイロン膜にハイブリダイズの対象となるＤＮＡを固定化する。次にこの膜を、６×ＳＳＣ、０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液に６８℃で２時間浸漬する。上記組成のプレハイブリダイゼーション溶液に、標識した配列認識番号１で表される塩基配列を有する遺伝子または該遺伝子の転写産物である対応するＲＮＡを加えた溶液（ハイブリダイゼーション溶液）を調製する。この溶液に上記で得られたナイロン膜を浸漬し、６８℃で３〜１６時間ハイブリダイズさせる。その後、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを含む溶液中に一度浸して洗浄し、さらに２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で室温で約１５分洗浄する。そしてさらに０．５％または０．１％ＳＤＳ溶液中で６８℃で２時間洗浄する。その後標識に応じ適宜な手段で検出操作を行う。
【００２２】
また、本発明は本発明の遺伝子の発現挙動の変化をモニターを行い、試料中のケミカルストレス、詳しくは芳香族化合物を分析する方法を提供する。試量としては、土壌、水等のあらゆる環境試料が利用でき、本発明の方法は、環境中、例えば汚染土壌、汚染水等に含まれる環境汚染物質、詳しくは芳香族化合物を本発明の遺伝子の発現挙動の変化に基づき、定量的、定性的に分析する方法を提供するものである。詳しくは、本発明の遺伝子に相補的な塩基配列の少なくとも一部を有するオリゴヌクレオチドを使用することにより、前記遺伝子の発現挙動の変化を検出することができる。即ち、本発明の遺伝子は芳香族化合物を与えることにより応答的に発現挙動が変化する遺伝子であるため、芳香族化合物が存在すると本発明の遺伝子の発現挙動が変化することから、本発明の遺伝子の発現挙動をモニターすることにより発現挙動が変化すれば芳香族化合物が存在するとして、芳香族化合物を検出することができる。ここで本発明の遺伝子に相補的な塩基配列の少なくとも一部を有するオリゴヌクレオチドとは、本発明の遺伝子の配列情報に基づいて設定することができ、本発明の遺伝子と、特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドであり、本発明の遺伝子にコードされるヌクレオチドの塩基配列のその一部と特異的にハイブリダイズすることが可能な１５〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドを指し、例えば実施例２において使用したプライマーを指すものである。これらのオリゴヌクレオチドは周知の方法により、ＤＮＡ合成機により合成することができる。前記オリゴヌクレオチドは好ましくは標識され、標識化の方法は放射線同位元素標識法に限らず、アビジン・ビオチン系標識を含む酵素標識、ケミプローブ標識を含む蛍光標識法等公知の方法なら何でもよい。また、各ヌクレオチドが異なる本発明の遺伝子に対して相補的である２種類以上のオリゴヌクレオチドを用いることにより、実施例２で示すように同時に複数の化合物の分析が可能となる。
【００２３】
分析は、例えば、ノーザンブロット法を用いて行うことができ、前記オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行うことにより高感度に行うことができる。ハイブリダイゼーション条件は、反応温度、反応時間を考慮して適宜、設定でき、上記で挙げた条件が例示される。該分析方法について一例を挙げて詳しく説明すると、担子菌と測定対象試料を接触させ、該担子菌からＲＮＡ試料を調製し、該ＲＮＡ試料と上記オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションを行い、コントロールの菌体由来の試料と比較を行うことにより行うことができる。
【００２４】
また、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、芳香族化合物に特異的に発現挙動が変化する本発明の遺伝子をＰＣＲ法を用いて高感度に分析することができる。ＰＣＲ法による増幅後、本発明の遺伝子の検出は、例えば、アガロースゲルまたは、ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動、あるいは、ハイブリダイゼーションなど通常行われる周知の方法を用いて行うことができる。該分析方法について一例を挙げて詳しく説明すると、担子菌と測定対象試料を接触させ、該担子菌からＲＮＡ試料を調製し、該ＲＮＡ試料から逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、コントロールの菌体由来の試料と比較を行うことにより行うことができる。
【００２５】
更に、上記オリゴヌクレオチドをガラスなどの基板上に張り付けたＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップを用いて、本発明の遺伝子を効率的に解析することができる。試料と接触させた担子菌のＤＮＡを蛍光色素等で標識し、基板上のどのオリゴヌクレオチドと結合したか、蛍光検出機により解析することによって、試料中の化合物の分析をすることができる。したがって、環境中、例えば汚染土壌、汚染水等に含まれる環境汚染物質、詳しくは、芳香族化合物を分析用のＤＮＡチップとして利用できるものである。
【００２６】
また、芳香族化合物に対して特異的に発現挙動が変化する本発明の遺伝子に対して相補的な塩基配列の少なくとも一部を有するオリゴヌクレオチドを含む芳香族化合物の分析用キットの提供を含むものであり、また、各ヌクレオチドが異なる本発明の遺伝子に対して相補的である２種類以上のオリゴヌクレオチドを含む２種類以上の芳香族化合物の同時分析用キットの提供をも含むものである。これらオリゴヌクレオチドは必要に応じ、標識されるものである。該キットには、ハイブリダイゼーション、または、ＰＣＲ増幅に必要な各種試薬を含ませることが可能であり、これら試薬は溶液状、凍結乾燥物の状態等でもよく、キットとして揃えておくことで簡易に検出を行うことができる。
【００２７】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００２８】
（実施例１）ディファレンシャル　ディスプレイ法による本発明の遺伝子のスクリーニング
白色腐朽菌　Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ３４５４１）を１００ｍｌのフラスコを用いて高炭素低窒素培地であるＫｉｒｋ液体培地（組成を表１Ｃに示す。）２０ｍｌ中で３０℃にて４日間静置培養し、アセトンに溶解して１００ｍＭに調製された芳香族化合物、ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（和光純薬）、ジベンゾフラン（和光純薬）、カテコール（和光純薬）、１，２，４‐トリハイドロキシベンゼン（和光純薬）、べラトリルアルコール（ＡＣＲＯＳ）、４−プロピルフェノール（ＡＬＤＯＲＩＣＨ）の化合物アセトン溶液を２０μｌ添加し、化合物の最終濃度を１００μＭとして２４時間培養した。このとき、コントロールとして無処理の菌体、アセトンを２０μｌ添加した菌体についても同様に培養した。
【００２９】
【表１】
Ｋｉｒｋ培地の組成表
2004049103.tif 000003
注１　Ｋｉｒｋ　ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ（６＊）の組成表
2004049103.tif 000004
【００３０】
所定時間の培養終了後、前記芳香族化合物を添加した菌体およびコントロールの菌体をろ過により培地と分離し、所定時間の培養終了後、菌体を吸引ろ過により培地と分離し、菌体を液体窒素で凍結した後、乳鉢、乳棒で破砕した。破砕した菌体から、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて供給者の指示に従って、トータルＲＮＡを単離した。粉末にした菌体を１０ｍｌのファルコンチューブに回収し、ＲＰＥ溶解バッファー５００μｌを添加し溶菌した。溶解した菌体をシュレッダーカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、１５，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離を行った。上清を回収し、上清の半量のエタノールを添加し、回転混和し、Ｒｎｅａｓｙスピンカラムに移し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＲＮＡを幕に結合させた。カラムにＲＷバッファーを３００μｌ添加し、カラム中の残存タンパク質を溶解するために回転混和した。１分間放置した後、１５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。これを再度行い、ＤＮａｓｅ混合液（Ｄｎａｓｅ１０μｌ、Ｂｕｆｆｅｒ　ＲＤＤ７０μｌ、ＱＩＡＧＥＮ　ＤＮａｓｅ　Ｓｅｔ）をカラムの中心に添加し、２５分間室温で放置した。ＲＷ１を４００μｌ加え、遠心分離し、ＲＰＥ　バッファー５００μｌで２回洗浄後、Ｒｎａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　３０μｌにて、ＲＮＡを溶出した。全ＲＮＡの濃度は２６０ｎｍの吸光度にて算出した。
【００３１】
次に、上記のようにして得られたトータルＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。上記で取得された１μｇのトータルＲＮＡ、２０ｐｍｏｌのテキサスレッドで蛍光標識されたオリゴｄＴプライマー（ＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ：配列認識番号９）を添加し、滅菌水にて９μｌに調製後、７０℃、１０分間、４℃にて２分間でアニールを行い、１μｌのＭＬＶ逆転写酵素、４μｌのＦｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ、４μｌの各２．５ｍＭｄＮＴＰ、および、２μｌのＤＴＴを添加後、逆転写反応を開始した。逆転写反応は４２℃で１時間行った後、５０℃で３０分間で行った。反応終了後、Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｔｒｅａｔｅｄ水を添加し、全量２０μｌとしたｃＤＮＡ溶液を取得した。
【００３２】
次に、上記得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、上記オリゴｄＴと任意のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅反応を行なった。上記プライマーはＰ４５０のヘム結合保存領域（ＦＧ［Ｆ，Ｈ，Ｙ］ＧＲＲ：配列番号１０、ＦＧＨＧＫＨＡ：配列番号１１、ＧＫＨＡＣＰＧ：配列番号１２、ＧＲＲ［Ｉ，Ｖ］Ｃ［Ｐ，Ａ］Ｇ：配列番号１３）より作製された４種類のミックスプライマー、ＴＴＹＧＧＩＹＷＹＧＧＩＭＧＩＭＧＩ：配列番号１４（ＦＧ［Ｆ，Ｈ，Ｙ］ＧＲＲ：配列番号１０）、ＴＴＹＧＧＩＣＡＹＧＧＩＡＡＲＣＡＹＧＣ：配列番号１５（ＦＧＨＧＫＨＡ：配列番号１１）、ＧＧＴＡＡＲＣＡＹＧ　ＣＩＴＧＹＣＣＩＧＧ：配列番号１６（ＧＫＨＡＣＰＧ：配列番号１２）、ＧＧＩＭＧＩＭＧＩＲＴＩＩＧＹＳＣＩＧＧ：配列番号１７（ＧＲＲ［Ｉ，Ｖ］Ｃ［Ｐ，Ａ］Ｇ：配列番号１３）を使用した。ＰＣＲ反応液（２０μｌ）は、上記で得られた２μｌのｃＤＮＡ溶液、０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼＥｘ　Ｔａｑ　、０．２μｌの１×Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ　＋）、プライマーとして０．２ｍＭの上記蛍光標識されたオリゴｄＴプライマー（配列番号９）、１０ｐｍｏｌのミックスプライマー、および０．２ｍＭの各ｄＮＴＰを含み、以下の条件下で増幅反応を行ない、増幅産物を得た。増幅反応は９４℃にて２分間、５５℃にて５分間、７２℃にて５分間、９４℃で３０秒間、５５℃にて１分間、７２℃にて１．５分間の反応を３５サイクル行った。
【００３３】
また、上記反応においてＴＴＹＧＧＩＹＷＹＧＧＩＭＧＩＭＧＩ：配列番号１４（ＦＧ［Ｆ，Ｈ，Ｙ］ＧＲＲ：配列番号１０）とオリゴｄＴプライマー：配列番号９で１５サイクル増幅させて得られた反応液を５倍に希釈し、それを鋳型として、ＧＧＩＭＧＩＭＧＩＲＴＩＩＧＹＳＣＩＧＧ：配列番号１７（ＧＲＲ［Ｉ，Ｖ］Ｃ［Ｐ，Ａ］Ｇ：配列番号１３）のプライマーにて、Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応を行った。増幅反応は、上記の反応条件に準じて３０サイクル行った。
【００３４】
上記ＰＣＲ反応、およびＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応で得られた各増幅産物を変性ゲルを用いて電気泳動を行い、増幅産物を蛍光イメージアナライザーによって可視化した。ディファレンシャルディスプレイの結果により得られたフィンガープリンティングパターンを図１および拡大したものを図２に示す。これらのバンドの中から、Ｎｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−２、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４と名付けたバンドを泳動ゲルから切り出し、５０μｌの水中で室温にて３０分間放置後、９６℃にて１０分間熱抽出を行い、ゲル断片からｃＤＮＡフラグメントを抽出した。
【００３５】
上記で抽出した抽出液を鋳型として、蛍光標識されていない上記オリゴｄＴプライマー：配列番号９および、上記ミックスプライマーを用いて、フラグメントの再増幅を行い、２％アガロースゲルにて分離切出後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて供給者の指示に従って精製した。精製したｃＤＮＡフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙベクターに組みこみ、この組みこんだＤＮＡ断片をコンピテント化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０９）に導入し、ＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天、０．１ｇ／ｌアンピシリン、０．２ｇ／ｌＩＰＴＧ、０．０５ｇ／ｌ　Ｘ−ｇａｌ）にて３７℃で培養した後、β−ガラクトシダーゼ活性の有無によりスクリーニングを行い、目的とするｃＤＮＡフラグメントを含むコロニーを分離した。
【００３６】
続いて、得られた形質転換体をＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、０．５％ＮａＣｌ）３０ｍｌ中で３７℃にて１２時間培養した後、２００ｒｐｍで遠心分離を行い、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて供給者の指示に従って形質転換体よりプラスミド回収した。回収したプラスミドを鋳型としてＴｈｅｒｍｏ　ｓｅｑｕｅｎａｓｅにてシークエンス反応を行った。シークエンス反応は供給者の指示に従い行った。反応産物をＤＮＡシークエンサーＳＱ　５５００にて分析し、Ｎｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−２、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４の塩基配列を決定した。Ｎｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−２、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４の各塩基配列を配列認識番号１、配列認識番号２、配列認識番号３、配列認識番号４、配列認識番号５、配列認識番号６、配列認識番号７、配列認識番号８にそれぞれ示す（図３，図４，図５）。そして、推定アミノ酸配列について、相同性検索を行った。相同性検索はＢＬＡＳＴプログラムにて行い、その結果を、図６，図７に示す。
【００３７】
その結果、ＮｅｓｔｅｄＰＣＲによって得られたＮｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−２、Ｎｅｓｔ１−３は塩基数は、３７６ｂｐ、３６３ｂｐ、３０３ｂｐと異なっているが、同じ塩基配列を有し、推定アミノ酸配列もほぼ同じであり、これら７２個のアミノ酸配列はＡｇａｒｉｇｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ由来ｐ４５０と相同性を有することが、Ｎｅｓｔ　２は３０３ｂｐであり、推定アミノ酸配列７７個は、Ｎｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ由来Ｐ４５０と相同性を有することが判明した。そして、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４はそれぞれ３６４ｂｐ、３３９ｂｐ、３１９ｂｐ、２６１ｂｐで、それぞれの推定アミノ酸配列６２個、６２個、６５個、６２個は、Ｃｏｒｉｏｒｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ由来Ｐ４５０と高い相同性を有することが判明した。
【００３８】
（実施例２）ＲＴ‐ＰＣＲによる発現量の比較
化合物による発現量を検討するためにＮｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４に特異的なプライマーを製作し、ＲＴ‐ＰＣＲによる発現量の比較を行った。芳香族化合物を添加した後、１日培養した菌体から上記した方法に従って抽出された全ＲＮＡ１．５μｌを鋳型として上記した方法に準じて逆転写反応を行いｃＤＮＡ溶液を得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として表２に示すＮｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４に特異的な下流プライマー（配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０）および、上流プライマー（配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１）の存在下でＰＣＲ反応を行い増幅させた。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
ＰＣＲ反応液（１０μｌ）は、上記で得られた１μｌのｃＤＮＡ溶液、２ＵのＤＮＡポリメラーゼＥｘ　Ｔａｑ、１μＭの上流プライマーおよび下流プライマー、０．１μｌの１ｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰを含み、以下の条件でＰＣＲ反応を行い、増幅産物を得た。増幅反応は、９４℃で３０秒間加熱した後、９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、７２℃で４５秒間の反応を２０サイクル行った。各増幅産物を２％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドにて染色後、増幅産物を蛍光イメージアナライザーにて可視化した。Ｎｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４の発現量を確認した結果を図８に示す。また、アセトンを添加したコントロールを１００とした発現量の相対比を表３にまとめた。
【００４１】
【表３】
2004049103.tif 000006
【００４２】
その結果、これらＮｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−２、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４は、化合物の種類に応じて異なる発現パターンを有していることが明らかとなった。これらの遺伝子の発現挙動と化合物の種類の相関を利用することにより、存在する化合物の骨格構造、および、官能基の有無の推定が可能であり、存在する化合物の種類の推定が可能となる。したがって、土壌等の環境試料を担子菌に接触させ、担子菌における本発明の遺伝子の発現挙動を追跡することにより、環境中に存在する環境汚染物質の特定および、汚染物質濃度を測定することが可能であり、複合汚染系においても、複数の汚染物質を同時に検出することができる。
【００４３】
【発明の効果】
以上説明したように本発明により、ケミカルストレス、詳しくは芳香族化合物に対して応答的に発現挙動が変化する新規な遺伝子を提供することができる。したがって、環境汚染物質には多くの芳香族化合物が含まれることから、本発明の遺伝子は多くの環境汚染物質に対して応答的に発現挙動が変化するものである。したがって、本発明の遺伝子を利用することにより、環境汚染物質を簡易かつ迅速、精度よく定性的、定量的に分析できる環境測定技術を提供することができる。更には、環境汚染物質の種類と該遺伝子発現挙動の相関を利用することにより、存在する環境汚染物質の特定および、環境汚染物質濃度を測定することが可能であり、複合汚染系においても、複数の環境汚染物質を同時に定性的、定量的に分析することができる。
【００４４】
したがって、本発明の遺伝子を利用することにより、簡易かつ迅速、高精度に環境汚染の実態把握を可能であるため、環境修復手段の選択に極めて有用なものであり、ファーストスクリーニングとして環境修復事業への応用が期待できる。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲによる本発明の遺伝子の増幅断片を電気泳動した時のフィンガープリンティングパターンを示す図
【図２】図１のＮｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−２、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４のバンドの拡大図
【図３】Ｎｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−２、Ｎｅｓｔ１−３の塩基配列を示す図
【図４】Ｎｅｓｔ２の塩基配列を示す図
【図５】ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４の塩基配列を示す図
【図６】Ｎｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−２、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４の推定アミノ酸配列と種々の生物由来のＰ４５０との相同性検索の結果を示す図
【図７】Ｎｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−２、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４の推定アミノ酸配列と種々の生物由来のＰ４５０との相同性検索の結果を示す図
【図８】ＲＴ−ＰＣＲによるＮｅｓｔ１−１、Ｎｅｓｔ１−２、Ｎｅｓｔ１−３、Ｎｅｓｔ２、ＦＤＤ１、ＦＤＤ２、ＦＤＤ３、ＦＤＤ４の発現量の比較を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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