(57)【要約】　　　（修正有）【課題】癌、とりわけ乳癌の検査に有用な新規なマーカーを利用した癌の検査方法及びそのための核酸を提供すること。【解決手段】採取した細胞中の、エクソン６の５’末端領域が欠失しているプロゲステロンレセプターｍＲＮＡを測定することを含む癌の検査方法を提供した。該塩基配列又は該塩基配列中の連続する１５塩基以上の部分であって少なくともある特定の配列の間の融合部位を含む核酸を提供した。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取した細胞中の、エクソン６の５’末端領域が欠失しているプロゲステロンレセプターｍＲＮＡを測定することを含む癌の検査方法。
【請求項２】
プロゲステロンレセプターｍＲＮＡのエクソン３又はエクソン４が欠失していないか否かを調べることをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
プロゲステロンレセプターｍＲＮＡのエクソン５の３’末端領域と、エクソン６の５’末端領域の欠失領域に続く領域に跨る領域にハイブリダイズする核酸を一方のプライマーとして用いて核酸増幅法を行い、増幅した核酸を測定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記プライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の２５３２ｎｔと２５３３ｎｔの間の融合部位を含む領域又はその相補鎖にハイブリダイズする核酸である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーの塩基数が１５〜５０であり、前記融合部位の上流及び下流にハイブリダイズする領域がそれぞれ２０％以上ずつ存在する請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記プライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の２５３２ｎｔと２５３３ｎｔの間の融合部位を含む領域又はその相補鎖と同一の塩基配列又は該塩基配列の１０％以下の塩基が置換された配列を有する請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の２５３２ｎｔと２５３３ｎｔの間の融合部位を含む領域又はその相補鎖と同一の塩基配列を有する請求項６記載の方法。
【請求項８】
エクソン３の３’末端領域と、エクソン４の５’末端領域の欠失領域に続く領域に跨る領域にハイブリダイズする核酸を他方のプライマーとして用いて核酸増幅法を行い、増幅した核酸を測定することを含む請求項３ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記他方のプライマーは、配列表の配列番号１に示す塩基配列の２０８１ｎｔと２０８２ｎｔの間の融合部位を含む領域又はその相補鎖にハイブリダイズする核酸である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
プロゲステロンレセプターｍＲＮＡのエクソン５の３’末端領域と、エクソン６の５’末端領域の欠失領域に続く領域に跨る領域を核酸増幅法により増幅し、その塩基配列を決定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸増幅法は、プロゲステロンレセプターｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを増幅することにより行われる請求項３ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌は乳癌である請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は、乳房組織を構成する細胞である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
配列表の配列番号１に示す塩基配列又は該塩基配列中の連続する１５塩基以上の部分であって少なくとも２５３２ｎｔと２５３３ｎｔの間の融合部位を含む核酸。
【請求項１５】
配列表の配列番号１に示す塩基配列の２５３２ｎｔと２５３３ｎｔの間の融合部位を含む領域又はその相補鎖と同一の塩基配列又は該塩基配列と１０％以下の塩基が置換された配列を有し、プロゲステロンレセプターｍＲＮＡのエクソン６の５’末端領域が欠失しているか否かの検査に有用な核酸。
【請求項１６】
塩基数が１５〜５０であり、前記融合部位の上流及び下流にハイブリダイズする領域がそれぞれ２０％以上ずつ存在する請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
請求項１５又は１６記載の核酸を含む核酸増幅法用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌、特に乳癌の検査方法及びそのための核酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、乳癌の腫瘍マーカーとしては、ＣＡ１５−３やＣＥＡ等が知られている。しかしながら、これらの腫瘍マーカーの乳癌陽性率はいずれも５０％以下であり、より陽性率の高いマーカーが望まれる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、癌、とりわけ乳癌の検査に有用な新規なマーカーを利用した癌の検査方法及びそのための核酸を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、プロゲステロンレセプターのｍＲＮＡにこれまでに知られていなかった、複数の新規なスプライシングバリアント（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｖａｒｉａｎｔ）が存在することを見出し、かつ、これらのスプライシングバリアントが、陽性率の高い乳癌のマーカーとして有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は、採取した細胞中のプロゲステロンレセプターｍＲＮＡのエクソン６の５’末端領域が欠失しているか否かを調べることを含む癌の検査方法を提供する。また、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列又は該塩基配列中の連続する１５塩基以上の部分であって少なくとも２５３２ｎｔと２５３３ｎｔの間の融合部位を含む核酸を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列の２５３２ｎｔと２５３３ｎｔの間の融合部位を含む領域又はその相補鎖と同一の塩基配列又は該塩基配列と１０％以下の塩基が置換された配列を有し、プロゲステロンレセプターｍＲＮＡのエクソン６の５’末端領域が欠失しているか否かの検査に有用な核酸を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
プロゲステロンは黄体ホルモンの１つで、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）に結合することが知られている。ＰＲ遺伝子は公知であり、その塩基配列も決定されている。ＰＲ遺伝子のｍＲＮＡには、複数のスプライシングバリアントが存在することが知られている（文献：Ｒｉｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　Ｔｒｅａｔ　４８，　２３１−２４１，　１９９８；Ｂａｌｌｅｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ　８４，　１３７０−７，　１９９９）。これらの公知のスプライシングバリアントには、エクソン６全体が欠失しているものは知られているが、エクソン６の５’末端領域が欠失し、エクソン６の他の領域が存在するスプライシングバリアントは知られていない。
【０００７】
下記実施例に詳述するように、本願発明者らは、ＰＲ遺伝子のｍＲＮＡのエクソン５中の領域及びエクソン７中の領域にハイブリダイズするプライマーを用いた逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）法を駆使し、エクソン６中の５’末端から５２　ｂｐの領域が欠失した新規なスプライシングバリアントを見出した。さらに、この新規なスプライシングバリアントのエクソン５の３’末端領域から、上記欠失部分に続くエクソン６の領域に跨る領域にハイブリダイズするリバースプライマーと、エクソン２中の領域にハイブリダイズするフォワードプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、エクソン３が欠失したスプライシングバリアント（「Δ（ｄｅｌｔａ）　３＋６／２」と命名）、エクソン４が欠失したスプライシングバリアント（「Δ（ｄｅｌｔａ）４＋６／２」と命名）及びエクソン３も４も欠失していないスプライシングバリアント（「Δ（ｄｅｌｔａ）　６／２」と命名）を見出した。さらに、これらのスプライシングバリアントの全塩基配列を決定した。なお、これら３種類のスプライシングバリアントは、いずれも新規なものである。
【０００８】
これらの塩基配列及び全長ｍＲＮＡ（「ＰＲ−ＦＬ」）のｃＤＮＡの塩基配列を対比して図１ないし図５に示す。図１ないし図５には、エクソンとエクソンの境界部分も示されている。例えば、エクソン２とエクソン３の境界は、「ｅｘ２＊＊ｅｘ３」と表示されている２つの米印の間にある。また、塩基配列は、全長のもの（ＰＲ　ＦＬ）を基準とし、これに対応する塩基が存在しない部位は「＿」（アンダーライン）で示す。また、コード領域の塩基は大文字で、非コード領域の塩基は小文字で示す。なお、Δ６／２、Δ３＋６／２、Δ４＋６／２及びＰＲ　ＦＬの塩基配列は、配列表の配列番号１から４にそれぞれ記載されている。
【０００９】
下記実施例に具体的に記載するように、３９例の乳癌患者から分離した癌細胞のうち、Δ６／２が陽性であったものは２４例であり（陽性率６１．５％）、同一患者の非癌部では陽性は僅かに３例であることが明らかになり、Δ６／２が乳癌のマーカーとして有用であることが示された。さらに、Δ３＋６／２及びΔ４＋６／２の乳癌陽性率は低いが、これらが検出される患者では、全ての例においてΔ６／２も検出されているので、エクソン６の５’末端領域に欠失が存在するか否かを調べることにより、Δ６／２、Δ３＋６／２及びΔ４＋６／２の区別を付けなくても乳癌の検査を行うことができることが明らかになった。
【００１０】
本発明は、上記した新知見に基づくものであり、ＰＲのｍＲＮＡのエクソン６の５’末端領域が欠失しているか否かを調べることにより癌の検査を行うというものである。今回見出された新規スプライシングバリアントの塩基配列及び欠失領域の位置が図１ないし図５に示すように本発明により明らかにされたるので、エクソン６の５’末端領域が欠失しているＰＲ　ｍＲＮＡのスプライシングバリアントが細胞中に存在するか否かは、種々の周知の方法により容易に調べることができる。
【００１１】
例えば、エクソン５の３’末端と、エクソン６の５’末端領域の欠失部に続く領域との融合部位（すなわち、配列番号１に示す塩基配列の２５３２ｎｔと２５３３ｎｔの間、以下、この融合部位を便宜的に「２５３２／２５３３融合部位」と言うことがある）を含む領域を核酸増幅法により増幅し、増幅断片の塩基配列を決定することにより行うことができる。核酸増幅法自体は、この分野において種々の方法が周知であり、そのためのキットも市販されているので、本発明により明らかにされた情報に基づいてプライマーを適切に設定すれば、２５３２／２５３３融合部位を含む核酸断片を容易に増幅することができる。なお、核酸増幅法自体は、何ら限定されるものではなく、例えばＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法とも呼ばれる）のようにｍＲＮＡ自体を鋳型としてｍＲＮＡを増幅する方法を採用することもできるし、ｍＲＮＡを鋳型にして先ずｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ断片を増幅する方法（例えば、逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）等）を採用することもできる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法のＰＣＲ法として、リアルタイム検出ＰＣＲ法（ＲＴＤ−ＰＣＲ法）を採用することにより、ｍＲＮＡの定量を行うことも可能である。このように、本明細書において、単に「核酸増幅法」と言う場合には、ｍＲＮＡ自体を鋳型にしてＲＮＡを増幅するものと、ｍＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡを増幅するものの両者を包含し、また、リアルタイム検出核酸増幅法も包含する。これらのＮＡＳＢＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴＤ−ＰＣＲ法自体は、いずれもこの分野において周知であり、これらを行うためのキットも市販されているので、容易に実施することができる。
【００１２】
ＰＣＲ法等の核酸増幅法に用いるプライマーは、配列番号１に示す配列中の２５３２／２５３３融合部位を含む断片の両端部にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、そのサイズは、特に限定されないが、塩基数で１５〜５０程度が適当であり、１８〜４０程度が好ましい。増幅断片のサイズは、特に限定されないが、効率良く増幅を行う観点から、通常、塩基数で５０〜５００程度であり、５０〜３００程度が好ましい。増幅断片の塩基配列の決定は、市販のシーケンサーを用いた常法により容易に行うことができる。なお、この方法では、Δ６／２、Δ３＋６／２及びΔ４＋６／２の区別をつけようとすると増幅断片のサイズが大きくなって手間がかかるので、通常、Δ６／２、Δ３＋６／２及びΔ４＋６／２の区別はつけない。しかし、上記のように、これでも癌の検査には支障がない。
【００１３】
２５３２／２５３３融合部位を含むｍＲＮＡの検出のためのより簡便な方法として、配列番号１に示す配列中の、２５３２／２５３３融合部位を含む領域又はその相補鎖にハイブリダイズするプライマーを核酸増幅法の一方のプライマーとして用いる方法を挙げることができる。この方法によれば、２５３２／２５３３融合部位を含むｍＲＮＡが被検試料中に存在する場合にのみ核酸の増幅が起きるので、増幅断片の塩基配列を決定することなく、２５３２／２５３３融合部位を含むｍＲＮＡが被検試料中に存在するか否かを決定することができる。以下、ＲＴ−ＰＣＲ法を例にとって、この方法の好ましい態様について説明する。
【００１４】
ｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡの合成自体は、ランダムプライマー等を用いた常法により容易に行うことができる。ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅する際の一方のプライマーとして、２５３２／２５３３融合部位を含む領域又はその相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いる。２５３２／２５３３融合部位を含む領域又はその相補鎖にハイブリダイズするプライマーは、フォワード側プライマーでもリバース側プライマーでもよい。なお、本明細書において、「ハイブリダイズする」とは、核酸増幅法におけるアニーリング工程の条件下においてハイブリダイズし、核酸増幅法のプライマーとして機能し得ることを意味する。プライマーのサイズは、特に限定されないが、塩基数で１５〜５０程度が適当であり、１８〜４０程度が好ましい。増幅断片のサイズは、特に限定されないが、効率良く増幅を行う観点から、通常、塩基数で５０〜５００程度であり、１００〜３００程度が好ましい。プライマーは、２５３２／２５３３融合部位の上流及び下流にハイブリダイズする領域がそれぞれ２０％以上ずつ存在することが好ましく、３０％以上ずつ存在することがさらに好ましい。また、その塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列の２５３２／２５３３融合部位を含む領域又はその相補鎖と同一の塩基配列を有することが好ましいが、１０％以下の塩基が置換していても、通常、塩基配列特異的なハイブリダイゼーションが起きるので許容できる。このプライマーを用いる点以外は、通常の方法によりＰＣＲを行うことができる。また、このＰＣＲをＲＴＤ−ＰＣＲにより行うことにより、２５３２／２５３３融合部位を含むｍＲＮＡの定量も可能になる。
【００１５】
２５３２／２５３３融合部位を含む領域の相補鎖にハイブリダイズするプライマーをリバースプライマーとして用い、フォワードプライマーとしては、エクソン３の３’末端とエクソン４の５’末端に跨る領域、すなわち、配列番号１に示す塩基配列中の２０８１ｎｔと２０８２ｎｔの間の融合部位（以下、「２０８１／２０８２融合部位」と言うことがある）にハイブリダイズするプライマーを用いることによりΔ６／２のみをΔ３＋６／２及びΔ４＋６／２から区別して検出することができる。なぜなら、上記のように、Δ３＋６／２ではエクソン３が欠失しており、Δ４＋６／２ではエクソン４が欠失しているので、エクソン３の３’末端とエクソン４の５’末端に跨る領域にハイブリダイズするプライマーを用いれば、Δ３＋６／２及びΔ４＋６／２の場合にはハイブリダイゼーションが起きず、従って、増幅が起きない。このため、増幅されるのは、Δ６／２のみとなる。２０８１／２０８２融合部位を含む領域とハイブリダイズするフォワードプライマーは、２０８１／２０８２融合部位の上流及び下流にハイブリダイズする領域がそれぞれ２０％以上ずつ存在することが好ましく、３０％以上ずつ存在することがさらに好ましい。また、その塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列の２０８１／２０８２融合部位を含む領域又はその相補鎖と同一の塩基配列を有することが好ましいが、１０％以下の塩基が置換していても、通常、塩基配列特異的なハイブリダイゼーションが起きるので許容できる。
【００１６】
２５３２／２５３３融合部位を含むｍＲＮＡが存在するか否かは、また、２５３２／２５３３融合部位を含む領域とハイブリダイズする核酸をプローブとして用いることによっても行うことができる。この場合、Δ６／２、Δ３＋６／２及びΔ４＋６／２の細胞中の存在量は微量であるので、先ず、２５３２／２５３３融合部位を含む核酸断片を上記方法により増幅し、増幅断片と上記プローブとをハイブリダイズさせて２５３２／２５３３融合部位の有無を調べることが好ましい。プローブを用いて特定の塩基配列を有する核酸の有無を調べる方法自体は、この分野において周知であり、周知のいずれの方法を用いてもよい。増幅断片を固相化し、標識プローブをこれにハイブリダイズさせて、洗浄後、標識を検出する方法や、プローブを固相化し、増幅断片をこれにハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された増幅断片を検出する方法等があり、いずれの方法をも用いることができる。後者の場合には、増幅に用いるヌクレオチドとして放射標識ヌクレオチド等を用いて増幅断片を標識する方法や、固相化プローブにハイブリダイズして固相に結合された増幅断片に、標識プローブをさらにハイブリダイズさせ、結合された標識を検出する方法等が包含されるが、いずれの方法をも採用することができる。
【００１７】
以上、エクソン６の５’末端領域が欠失しているプロゲステロンレセプターｍＲＮＡを測定するいくつかの方法を説明したが、測定方法はこれらに限定されるものではなく、要するに、エクソン６の５’末端領域が欠失しているプロゲステロンレセプターｍＲＮＡを測定することができるいずれの方法をも採用することができる。なお、本明細書において、「測定」には、検出と定量の両者が包含される。
【００１８】
Δ６／２、Δ３＋６／２及びΔ４＋６／２は、本発明により初めて発見された新規なｍＲＮＡスプライシングバリアントである。そして、上記のように、これらは、エクソン６の５’末端に５２塩基の欠失を有しており、この欠失領域の有無を調べることにより癌、とりわけ乳癌の検査を行うことができる。従って、本発明はまた、配列表の配列番号１に示す塩基配列又は該塩基配列中の連続する１５塩基以上の部分であって少なくとも２５３２ｎｔと２５３３ｎｔの間の融合部位を含む核酸をも提供するものであり、この核酸は、プライマー又はプローブとして、又は、塩基配列を決定する対象として上記の通り癌の検査に有用である。なお、Δ６／２、Δ３＋６／２及びΔ４＋６／２がｍＲＮＡスプライシングバリアントであることは、下記実施例に示されるように、これらが見出される乳癌細胞中においても、正常な全長のＰＲ　ｍＲＮＡ（ＰＲ　ＦＬ）が検出されることからも明らかである。
【００１９】
上記した本発明の方法は、特に乳癌の検査に有用である。この場合、被検細胞は、乳房組織を構成する細胞であることが好ましい。乳房組織を構成する細胞は、通常のバイオプシーにより容易に採取可能である。また、本発明の方法は、他の腫瘍マーカーを用いる検査と組み合わせて行ってもよく、そのようにすることによりさらに信頼性を高めることができる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
（Ｉ）　プロゲステロンレセプター（ＰＲ）　ｍＲＮＡ　スプライシングバリアントの発見
（１）プライマーの合成
ＰＲ遺伝子のエクソン５領域に設定したプライマー５’−ｔｇａ　ｃｃａ　ｇａｔ　ａａｃ　ｔｃｔ　ｃａｔ　ｔｃａ　ｇｔａ　ｔｔｃ　ｔｔｇ　ｇ−３’を化学合成し、フォワードプライマーとし、ＰＲ遺伝子のエクソン７領域に設定したプライマー５’−ｔｔｔ　ｇａｃ　ｔｔｃ　ｇｔａ　ｇｃｃ　ｃｔｔ　ｃｃａ　ａａｇ−３’を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００２２】
（２）核酸抽出およびｃＤＮＡ合成
乳癌組織由来セルラインＭＣＦ７（入手先：Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ））および健常人末梢血細胞　１０６個からＤＮＡをＧＥＮＯＭＩＸ（ＴＡＬＥＮＴ社製）を用いて抽出した。１０６個の細胞に溶液１（ＧＥＮＯＭＩＸ）を１．５ｍＬ加え、１５分間６５℃で保温後、クロロホルム３ｍＬ加え、転倒混和した。３０００×ｇ　１０分間遠心し、上層に溶液２（ＧＥＮＯＭＩＸ）を３ｍＬ加え、３０００×ｇ　１０分間遠心した。遠心後、沈澱に１．５ｍＬの溶液３（ＧＥＮＯＭＩＸ）を加え溶解し、溶解後、１００％エタノールを加え、３０００×ｇ　１０分間遠心した。遠心後、５ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、５０μＬのＴＥ溶液（２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８．５））で溶解した。
【００２３】
また、１０６個の細胞にＲＮＡ抽出試薬　Ｉｓｏｇｅｎ　（日本ジーン社製）１ｍＬを添加し、３０秒攪拌した。攪拌後、２００μＬのクロロホルムを添加し、再度３０秒攪拌した。攪拌後、１２０００×ｇ　１５分間遠心し、水相に等量のイソプロパノールを加え、１２０００×ｇ　１５分間遠心した。遠心後、１ｍＬの７５％エタノールで２回洗浄し、５０μＬのＲＮａｓｅ阻害剤添加ＤＥＰＣ処理水で溶解した。溶解したＲＮＡ溶液から、以下のｃＤＮＡ合成溶液を用いてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成は１時間実施した。反応溶液の組成は次の通りであった。
【００２４】
2004065182.tif 000002
【００２５】
（３）ＰＣＲ反応
（１）で合成したプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施した。
2004065182.tif 000003
ＰＣＲ反応は９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／３０秒を１サイクルとし、４０サイクル実施した。増幅産物は２．５％アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認（２８１ｂｐ）をした。
【００２６】
上記（１）、（２）、（３）の操作により、乳癌セルラインにおいて、目的増幅産物（２８１ｂｐ）の他に、２２９ｂｐ付近に増幅産物が確認された。健常人末梢血からは、目的増幅産物（２８１ｂｐ）のみが確認された。また、ＤＮＡ由来増幅産物は確認されなかった。
【００２７】
乳癌セルラインから検出された２２９ｂｐ付近の増幅産物をアガロースゲルから切り出し、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）にセットした。セット後、５０００×ｇで５分間遠心し、ＳＵＰＲＥＣ−０１の下層に溶出した溶液を回収した。
【００２８】
（４）ＰＣＲ反応
（１）で合成したプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施した。
2004065182.tif 000004
ＰＣＲ反応は９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／３０秒を１サイクルとし、４０サイクル実施した。増幅産物は２．５％アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認（２２９ｂｐ）をした。
【００２９】
（５）塩基配列の決定
上記操作により、増幅した２２９ｂｐ付近のＰＣＲ産物をシーブカラムにセットし、２５００×ｇで１分間遠心し、増幅産物を精製した。精製した２種類の増幅産物をダイレクトシークエンス法によって、塩基配列を決定した。
【００３０】
（１）で合成したプライマーを用いてサイクルシークエンス反応を実施した。
2004065182.tif 000005
【００３１】
ダイレクトシークエンス反応は９６℃／１０秒、５０℃／５秒、６０℃／４分を１サイクルとし、２５サイクル実施した。
2004065182.tif 000006
ダイレクトシークエンス反応は９６℃／１０秒、５０℃／５秒、６０℃／４分を１サイクルとし、２５サイクル実施した。
【００３２】
反応終了後、ＡＢＩ　３１００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＨＩＴＡＣＨＩ社製）にて塩基配列を得た。得られたフォワードプライマー側からの塩基配列（センス鎖）とリバースプライマー側からの塩基配列（アンチセンス鎖）を比較し、最終的に塩基配列を決定した。
【００３３】
上記（５）の操作により、決定された塩基配列はＰＲ遺伝子（Ｆｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｉｓｏｆｏｒｍ）に対し、エクソン６の５２ｂｐが欠失したものであった（配列番号１）。また、塩基配列から推測されるアミノ酸配列も配列番号１に併せて示されている。
【００３４】
エクソン６の５’側の５２塩基が欠失するスプライシングバリアントを他に発見するために、エクソン６の５２塩基欠失領域をリバースプライマーとして、他領域の欠失状態を調査した。
【００３５】
（６）プライマーの合成
ＰＲ遺伝子のエクソン６の５２塩基欠失領域に設定したプライマー５’−ｃｔｔ　ｇａｃ　ａａａ　ｃｔｃ　ｃｔｇ　ｔｇｇ　ｇａｔ　ｔｃａ　ｔｔｔ　ａ−３’を化学合成し、リバースプライマーとし、ＰＲ遺伝子のエクソン２領域に設定したプライマー５’−ｇｇｔ　ｃｔｔ　ｃｔｔ　ｔａａ　ｇａｇ　ｇｇｃ　ａａｔ　ｇｇａ　ａ−３’を化学合成し、フォワードプライマーとした。
【００３６】
（７）核酸抽出およびｃＤＮＡ合成
核酸抽出およびｃＤＮＡ合成は、上記と同様とした。
【００３７】
（８）ＰＣＲ反応
（６）で合成したプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施した。
2004065182.tif 000007
ＰＣＲ反応は９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／３０秒を１サイクルとし、４０サイクル実施した。増幅産物は２．５％アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認（６１５ｂｐ）をした。
【００３８】
上記（６）、（７）、（８）の操作により、乳癌セルラインにおいて、目的増幅産物（６１５ｂｐ）の他に、４９８ｂｐ付近と３０９ｂｐ付近に増幅産物が確認された。健常人末梢血およびＤＮＡ由来増幅産物は確認されなかった。
【００３９】
乳癌セルラインから検出された４９８ｂｐ付近と３０９ｂｐ付近の増幅産物をアガロースゲルから切り出し、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造）にセットした。セット後、５０００×ｇで５分間遠心し、ＳＵＰＲＥＣ−０１の下層に溶出した溶液を回収した。
【００４０】
（９）ＰＣＲ反応
（６）で合成したプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施した。
2004065182.tif 000008
ＰＣＲ反応は９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／３０秒を１サイクルとし、４０サイクル実施した。増幅産物は２．５％アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認（４９８ｂｐ、３０９ｂｐ）をした。
【００４１】
（１０）塩基配列の決定
上記操作により、増幅した４９８ｂｐおよび３０９ｂｐ付近のＰＣＲ産物をシーブカラムにセットし、２５００×ｇで１分間遠心し、増幅産物を精製した。精製した２種類の増幅産物をダイレクトシークエンス法によって、塩基配列を決定した。
【００４２】
（６）で合成したプライマーを用いてサイクルシークエンス反応を実施した。
2004065182.tif 000009
【００４３】
ダイレクトシークエンス反応は９６℃／１０秒、５０℃／５秒、６０℃／４分を１サイクルとし、２５サイクル実施した。
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ダイレクトシークエンス反応は９６℃／１０秒、５０℃／５秒、６０℃／４分を１サイクルとし、２５サイクル実施した。
【００４４】
反応終了後、ＡＢＩ　３１００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＨＩＴＡＣＨＩ社製）にて塩基配列を得た。得られたフォワードプライマー側からの塩基配列（センス鎖）とリバースプライマー側からの塩基配列（アンチセンス鎖）を比較し、最終的に塩基配列を決定した。
【００４５】
上記（１０）の操作により、増幅産物の塩基配列が図１〜５のように決定した。決定された塩基配列はＰＲ遺伝子のエクソン６の５２ｂｐ欠失（ＰＲ　Δ６／２）に対し、エクソン６の５２ｂｐとエクソン３が欠失したもの（ＰＲ　Δ３＋６／２）、およびエクソン６の５２ｂｐとエクソン４が欠失したもの（ＰＲ　Δ４＋６／２）であった。なお、ＰＲ　Δ３＋６／２の塩基配列を配列番号２に、ＰＲ　Δ４＋６／２の塩基配列を配列番号３に、これらがコードする推定アミノ酸配列と共にそれぞれ示す。さらに、全長（ＰＲ　ＦＬ）の塩基配列を配列番号４に示す。
【００４６】
（ＩＩ）ＰＲ　Δ６／２，　Δ３＋６／２，　Δ４＋６／２の特異的検出
（１１）プライマーの合成
ＰＲ　Δ６／２　ｍＲＮＡを検出するために、ＰＲ遺伝子のエクソン３およびエクソン４領域にオーバーラップしたプライマー５’−ｇｃａ　ｔｇｇ　ｔｃｃ　ｔｔｇ　ｇａｇ　ｇｔｃ　ｇａａ−３’を化学合成し、フォワードプライマーとし、ＰＲ遺伝子のエクソン５およびエクソン６の欠失領域を除く領域にオーバーラップしたプライマー５’−ｃｔｔ　ｇａｃ　ａａａ　ｃｔｃ　ｃｔｇ　ｔｇｇｇａｔ　ｔｃａ　ｔｔｔ　ａ−３’を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００４７】
ＰＲ　Δ３＋６／２　ｍＲＮＡを検出するために、ＰＲ遺伝子のエクソン２およびエクソン４領域にオーバーラップしたプライマー５’−ａａｇ　ａｇｇ　ｇｃａ　ａｔｇ　ｇａａ　ｇｇｔ　ｃｇａ　ａ−３’を化学合成し、フォワードプライマーとし、ＰＲ遺伝子のエクソン５およびエクソン６の欠失領域を除く領域にオーバーラップしたプライマー５’−ｃｔｔ　ｇａｃ　ａａａ　ｃｔｃ　ｃｔｇ　ｔｇｇ　ｇａｔ　ｔｃａ　ｔｔｔ　ａ−３’を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００４８】
ＰＲ　Δ４＋６／２　ｍＲＮＡを検出するために、ＰＲ遺伝子のエクソン３およびエクソン５領域にオーバーラップしたプライマー５’−ｇｇｃ　ａｔｇ　ｇｔｃ　ｃｔｔ　ｇｇａ　ｇｇｔ　ｔｔｔ　ｃ−３’を化学合成し、フォワードプライマーとし、ＰＲ遺伝子のエクソン５およびエクソン６の欠失領域を除く領域にオーバーラップしたプライマー５’−ｃｔｔ　ｇａｃ　ａａａ　ｃｔｃ　ｃｔｇ　ｔｇｇ　ｇａｔ　ｔｃａ　ｔｔｔ　ａ−３’を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００４９】
欠失のないＰＲ　ｍＲＮＡを検出するために、ＰＲ遺伝子のエクソン３およびエクソン４領域にオーバーラップしたプライマー５’−ｇｃａ　ｔｇｇ　ｔｃｃ　ｔｔｇ　ｇａｇ　ｇｔｃ　ｇａａ−３’を化学合成し、フォワードプライマーとし、ＰＲ遺伝子のエクソン５およびエクソン６領域にオーバーラップしたプライマー５’−ｇａｔ　ｇａｔ　ｔｃｔ　ｔｔｃ　ａｔｃ　ｃｇｃ　ｔｇｔ　ｔｃａ　ｔｔｔ　ａ−３’を化学合成し、リバースプライマーとした。
【００５０】
（１２）ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
約１０ｍｇの乳癌患者由来組織（外科的切除：癌部、非癌部）にＲＮＡ抽出試薬　Ｉｓｏｇｅｎ（日本ジーン社製）１ｍＬを添加し、ホモジナイズ後、３０秒攪拌した。攪拌後、２００μＬのクロロホルムを添加し、再度３０秒攪拌した。攪拌後、１２０００×ｇ　１５分間遠心し、水相に等量のイソプロパノールを加え、１２０００×ｇ　１５分間遠心した。遠心後、１ｍＬの７５％エタノールで２回洗浄し、５０μＬのＲＮａｓｅ阻害剤添加ＤＥＰＣ処理水で溶解した。溶解したＲＮＡ溶液から、以下のｃＤＮＡ合成溶液を用いてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成は１時間実施した。反応溶液の組成は次の通りであった。
【００５１】
2004065182.tif 000011
【００５２】
（１３）ＰＣＲ反応
（１１）で合成したプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施した。
2004065182.tif 000012
ＰＣＲ反応は９５℃／３０秒、６０℃／３０秒、７２℃／３０秒を１サイクルとし、４０サイクル実施した。増幅産物は２．５％アガロースゲル電気泳動により、目的増幅産物の確認をした。
【００５３】
上記（１１）、（１２）、（１３）の操作により、乳癌組織において、ＰＲ　Δ６／２　ｍＲＮＡ由来増幅産物（４８７ｂｐ）、ＰＲ　Δ３＋６／２　ｍＲＮＡ由来増幅産物（４８７ｂｐ）、ＰＲ　Δ４＋６／２　ｍＲＮＡ由来増幅産物（１８２ｂｐ）およびＰＲ　ｍＲＮＡ由来増幅産物（４８７ｂｐ）が確認された。３９例の乳癌患者由来癌組織で、ＰＲ　ｍＲＮＡ（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ　ｉｓｏｆｏｒｍ）は全てのサンプルから検出され、ＰＲ　Δ６／２　ｍＲＮＡは２４例（６１．５％）で陽性となり、ＰＲ　Δ３＋６／２　ｍＲＮＡは１例のみ、ＰＲ　Δ４＋６／２　ｍＲＮＡは３例で陽性であった。また、ＰＲ　Δ３＋６／２　ｍＲＮＡ又はＰＲ　Δ４＋６／２　ｍＲＮＡの陽性例では、いずれもＰＲ　Δ６／２　ｍＲＮＡが陽性であった。一方、非癌部においては、ＰＲ　ｍＲＮＡ（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ　ｉｓｏｆｏｒｍ）は全てのサンプルから検出され、ＰＲ　Δ６／２　ｍＲＮＡは３例（７．７％）で陽性となり、ＰＲ　Δ３＋６／２　ｍＲＮＡおよびＰＲ　Δ４＋６／２　ｍＲＮＡは検出されなかった。このことから、ＰＲ　Δ６／２　ｍＲＮＡを検出することにより乳癌の診断を行うことができること、及び、エクソン６の５’末端領域の欠失の有無を検出すれば、ＰＲ　Δ６／２、ＰＲ　Δ３＋６／２およびＰＲ　Δ４＋６／２を識別しなくても検査を行うことができることが明らかになった。
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、癌、とりわけ乳癌の検査に有用な新規なマーカーを利用した癌の検査方法及びそのための核酸が提供された。上記実施例から明らかなとおり、本発明により見出された新たなＰＲ　ｍＲＮＡスプライシングバリアントであるＰＲ　Δ６／２の陽性率は、乳癌患者において、６１．７％と従来の乳癌腫瘍マーカーよりも高く、本発明の方法により従来よりも高い信頼性をもって乳癌の診断が可能になった。
【００５５】
【配列表】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
2004065182.tif 000049
【００７１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明により新たに見出されたプロゲステロンレセプターｍＲＮＡのスプライシングバリアントの塩基配列を、全長ｍＲＮＡの塩基配列と比較して示す図である。
【図２】図１の続きである。
【図３】図２の続きである。
【図４】図３の続きである。
【図５】図４の続きである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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