(57)【要約】【課題】生体内又は生体外の標的物質と効果的かつ安定に結合し得る多価結合性分子集合体、並びに、前記多価結合性分子集合体を含み、生体内又は生体外の捕捉対象を捕捉する捕捉剤、薬剤投与の際の基材となる薬剤基材、カルシウムを効果的にキレートするカルシウムキレート剤、及び、薬剤と共に使用され薬剤の吸収等を補助する薬剤補助剤を提供する。【解決手段】官能基及びリガンドの少なくともいずれかを複数有してなり、水溶液中における動的光散乱（ＤＬＳ）測定より算出した流体力学的半径（Ｒｈ）と、静的光散乱（ＳＬＳ）測定の結果より作成したＺｉｍｍプロットをもとに算出した慣性自乗半径（Ｒｇ）との比（Ｒｈ／Ｒｇ）が、１．０以下であることを特徴とする多価結合性分子集合体。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
官能基及びリガンドの少なくともいずれかを複数有してなり、水溶液中における動的光散乱（ＤＬＳ）測定より算出した流体力学的半径（Ｒｈ）と、静的光散乱（ＳＬＳ）測定の結果より作成したＺｉｍｍプロットをもとに算出した慣性自乗半径（Ｒｇ）との比（Ｒｈ／Ｒｇ）が、１．０以下であることを特徴とする多価結合性分子集合体。
【請求項２】
官能基及びリガンドの少なくともいずれかを複数有してなり、水溶液中における動的光散乱測定から算出される拡散定数（Ｄ）値が、散乱ベクトル定数（Ｋ）値が大きくなるにつれて増加することを特徴とする多価結合性分子集合体。
【請求項３】
複数の環状分子と、該複数の環状分子を貫通した状態で保持可能な線状分子と、該線状分子の両末端をキャップする嵩高い置換基とを有してなり、該複数の環状分子のうち少なくとも２つが官能基及びリガンドの少なくともいずれかを置換基として有することを特徴とする多価結合性分子集合体。
【請求項４】
嵩高い置換基が、線状分子に対し生体内で分解可能に結合した請求項３に記載の多価結合性分子集合体。
【請求項５】
ポリロタキサンである請求項１から４のいずれかに記載の多価結合性分子集合体。
【請求項６】
環状分子がシクロデキストリンである請求項３に記載の多価結合性分子集合体。
【請求項７】
シクロデキストリンの空洞部内に存在するグルコースＣ３及びＣ５プロトンが、１次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、遊離シクロデキストリンの空洞部内に存在するグルコースＣ３及びＣ５プロトンに比して、０．１〜１．０ｐｐｍ高磁場側及び低磁場側のいずれかにシフトしている請求項６に記載の多価結合性分子集合体。
【請求項８】
シクロデキストリンに包接された線状分子が、１次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、シクロデキストリンに包接されていない前記線状分子に比して、０．０１〜１．０ｐｐｍ高磁場側及び低磁場側のいずれかにシフトしている請求項６に記載の多価結合性分子集合体。
【請求項９】
シクロデキストリン空洞部内に存在するグルコースＣ３及びＣ５プロトンが、２次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、線状分子に存在するプロトンとの核オーバーハウザー効果によるクロスピークが観察され、化学シフト値が、前記Ｃ３及びＣ５プロトンについては３．０〜４．０ｐｐｍ、線状分子については１．０〜６．０ｐｐｍの範囲にある請求項６に記載の多価結合性分子集合体。
【請求項１０】
示差走査型熱量測定におけるＤＳＣチャートにおいて、線状分子の融解ピークが観察されない請求項６に記載の多価結合性分子集合体。
【請求項１１】
官能基が末端にカルボキシル基を含む基である請求項１から１０のいずれかに記載の多価結合性分子集合体。
【請求項１２】
末端にカルボキシル基を含む官能基がカルボキシアルコキシカルボニル基である請求項１１に記載の多価結合性分子集合体。
【請求項１３】
リガンドが糖リガンドである請求項１から１２のいずれかに記載の多価結合性分子集合体。
【請求項１４】
複数のシクロデキストリンと、該複数のシクロデキストリンを貫通した状態で保持可能な線状分子と、該線状分子の両末端をキャップする嵩高い置換基とを有してなり、該シクロデキストリン分子のうち少なくとも２つにおける、Ｃ６第１級水酸基、Ｃ２第２級水酸基及びＣ３第２級水酸基の２次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのピーク面積が、置換基を有さないシクロデキストリンの相当する水酸基に比して、１０〜９５％減少していることを特徴とする多価結合性分子集合体。
【請求項１５】
捕捉対象を捕捉する機能を有し、請求項１から１４のいずれかに記載の多価結合性分子集合体を少なくとも含有することを特徴とする捕捉剤。
【請求項１６】
薬剤を結合可能であり、請求項１から１４のいずれかに記載の多価結合性分子集合体を少なくとも含有することを特徴とする薬剤基材。
【請求項１７】
カルシウムをキレート可能であり、請求項１１及び１２のいずれかに記載の多価結合性分子集合体を少なくとも含有することを特徴とするカルシウムキレート剤。
【請求項１８】
薬剤薬効を補助するために用いられ、請求項１１及び１２のいずれかに記載の多価結合性分子集合体を少なくとも含有することを特徴とするカルシウムキレート剤。
【請求項１９】
該複数の環状分子のうち少なくとも２つが置換基としてリガンドを有する多価結合性分子集合体であることを特徴とする請求項１８に記載の薬剤補助剤。
【請求項２０】
複数の環状分子と、該複数の環状分子を貫通した状態で保持可能な線状分子と、該線状分子の両末端をキャップする嵩高い置換基とを有してなり、該複数の環状分子のうち少なくとも２つが官能基及びリガンドの少なくともいずれかを置換基として有することを特徴とする多価結合性分子集合体に用いられることを特徴とするポリロタキサン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内又は生体外の標的物質と効果的かつ安定に結合し得る多価結合性分子集合体、並びに、前記多価結合性分子集合体を含み、生体内又は生体外の捕捉対象を捕捉する捕捉剤、薬剤投与の際の基材となる薬剤基材、カルシウムを効果的にキレートするカルシウムキレート剤、及び、薬剤と共に使用され薬剤の吸収等を補助する薬剤補助剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年になって、生体内の種々のレセプターと高い結合性を有するリガンドを含む化合物は、該レセプターに関する種々の機能に関与することができることから、新しい医薬療法としても注目されている。こうしたレセプターとの高い結合性を保持するリガンドを含む化合物を得るため、低分子化合物の開発や、数多くのリガンドを導入することにより多価相互作用を持たせた高分子化合物の開発が盛んに行われている（非特許文献１参照）。しかしながら、レセプターと相互作用しうる各種リガンドを導入した低分子化合物や水溶性高分子では、結合の安定性や効率の面で限界があり、実用性の有る多価相互作用が望めない現状にある。すなわち、低分子化合物では導入できるリガントの数は限られており、結合安定性も十分ではなかった。また、従来までの水溶性高分子では、リガントを多数導入できるものの、分子の屈曲性が高いために、リガンドを多数導入するとリガンド同士が疎水性相互作用によって会合し、水溶性高分子を外殻とする分子内及び分子間会合体を形成することが知られている。そのため、多数のリガンドを導入しても、標的とするレセプターとの効果的かつ安定な結合が期待できなかった。また、いずれの場合でも分解崩壊性はなく、結合の制御を行うことはできなかった。したがって、結合安定性が高く、特に、その結合安定性が空間的又は時間的に制御できるリガンドを含む化合物の開発が待たれていた。
【０００３】
一方、薬剤補助剤としては、アクリル酸単位を有する樹脂（Ｃａｒｂｏｍｅｒａｎｄ　Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｐｈｉｌ）が、タンパク質又はペプチド性の薬剤の粘膜透過性を高めるものとして使用できることが知られている（非特許文献２参照）。ポリアクリレート樹脂は、カルシウムをキレートすることにより小腸上皮のタイトジャンクション（接着結合部）を開口させる。さらに、トリプシン或いはキモトリプシンなどのタンパク質分解酵素からカルシウムをキレートすることにより、腸管内腔でのタンパク質の分解を阻害する。以上より、カルシウムをポリアクリル酸でキレートする方法は、タンパク質の分解を阻害し、消化管上皮の透過性を増強する。しかし、ポリアクリル酸と酵素の直接の結合がタンパク分解酵素の活性阻害の主たる要因であるという報告もある。この報告は、カルシウムをキレートすることよりもむしろカルボキシル基による水素結合や静電気的相互作用などの分子間結合が生物活性に重要な役割を果たしていることを示している。ポリアクリル酸のカルシウムキレート化及び非特異的相互作用は有用な性質であるが、これらの作用を制御することができない点で問題があった。したがって、カルシウムキレート化及び生体成分との物理的相互作用を制御でき、粘膜への結合、薬剤透過性、及びタンパク質分解酵素阻害が調節できる新しい材料を考案が望まれていた。
【０００４】
さらに、炭水化物結合ポリマーは、多価のタンパク質−糖相互作用のモデルとして研究されてきた（非特許文献３参照）。様々な糖分子が、合成線状ポリマー、ポリペプチド、デンドリマーなどの骨格ポリマーと複合体を形成することが報告されている（非特許文献４参照）。これらの複合体は、生物学的阻害剤または促進剤として注目され、多価相互作用におけるクラスタリング効果は、細胞表面のタンパク質等と相互作用することにより、細胞シグナルのスイッチングに利用できると考えられている（非特許文献５参照）。しかし、これらの糖の複合体は、タンパク質との親和性が十分でないものが多く、また、その親和性を自由に設定、制御することができない課題があった。
【０００５】
これに対し、ポリロタキサンが生体内分解性医薬高分子集合体として用いることができることは、発明者らにより報告されている（特許文献１参照）。しかし、官能基またはリガンドを有するポリロタキサンの多価の効果については、明らかにされていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｋｏｐｅｃｅｋ，　Ｊ．；　Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，　Ｐ．；　Ｍｉｎｋｏ，　Ｔ．；　Ｌｕ，　Ｚ．　Ｒ．；　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，　Ｃ．　Ｍ．；　Ｊ．　Ｃｏｎｔｒｏｌ．　Ｒｅｌ．　２００１，７４　１４７−１５８
【非特許文献２】
Ｓｉｎｇｌａ，　Ａ．　Ｋ．；　Ｃｈａｗｌａ，　Ｍ．；　Ｓｉｎｇｈ，　Ａ．，　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，　２０００，　２６，　９３１−９２４
【非特許文献３】
Ｍａｍｍｅｎ，　Ｍ．；　Ｃｈｏｉ，　Ｓ．−Ｋ．；　Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，　Ｇ．　Ｎ．　Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．１９９８，　３７，　２７５５−２７９４
【非特許文献４】
Ｂｏｖｉｎ，　Ｎ．　Ｖ．，　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｊ．　１９９８，　１５，　４３１−４４６．
【非特許文献５】
Ｌｅｅ，　Ｙ．　Ｃ．；　Ｌｅｅ，　Ｒ．　Ｔ．　Ａｃｃ．　Ｃｈｅｍ．　Ｒｅｓ．　１９９５，　２８，　３２１−３２７．
【特許文献１】
特開平０８−０９２１３０号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、生体内又は生体外の標的物質と効果的かつ安定に結合し得る多価結合性分子集合体、並びに、前記多価結合性分子集合体を含み、生体内又は生体外の捕捉対象を捕捉する捕捉剤、薬剤投与の際の基材となる薬剤基材、カルシウムを効果的にキレートするカルシウムキレート剤、及び、薬剤と共に使用され薬剤の吸収等を補助する薬剤補助剤を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、複数の環状分子と、該複数の環状分子を貫通した状態で保持可能な線状分子と、該線状分子の両末端をキャップする嵩高い置換基とを有してなる多価結合性分子集合体のように、屈曲性が低い化合物は、多数の官能基又はリガンドを導入しても分子内会合性が低く、標的物質と効果的かつ安定に結合することができ、また、前記官能基やリガンドの導入量を調節することで、結合安定性等を制御することができるとの知見を得た。また、必要により前記嵩高い置換基を生体内分解性基とし、該生体内分解性基が生体内で分解されて超分子骨格そのものが崩壊することにより多価結合性を低下させ、標的物質との結合安定性を空間的又は時間的に制御することができるとの知見を得た。
【０００９】
さらに、本発明者らは、官能基としてカルボキシル基を導入したポリロタキサンが、カルシウムをキレートし、トリプシン阻害活性を有するとの知見を得た。
【００１０】
本発明は、これらの知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は以下の通りである。即ち、
＜１＞　官能基及びリガンドの少なくともいずれかを複数有してなり、水溶液中における動的光散乱（ＤＬＳ）測定より算出した流体力学的半径（Ｒｈ）と、静的光散乱（ＳＬＳ）測定の結果より作成したＺｉｍｍプロットをもとに算出した慣性自乗半径（Ｒｇ）との比（Ｒｈ／Ｒｇ）が、１．０以下であることを特徴とする多価結合性分子集合体である。
＜２＞　官能基及びリガンドの少なくともいずれかを複数有してなり、水溶液中における動的光散乱測定から算出される拡散定数（Ｄ）値が、散乱ベクトル定数（Ｋ）値が大きくなるにつれて増加することを特徴とする多価結合性分子集合体である。
＜３＞　複数の環状分子と、該複数の環状分子を貫通した状態で保持可能な線状分子と、該線状分子の両末端をキャップする嵩高い置換基とを有してなり、該複数の環状分子のうち少なくとも２つが官能基及びリガンドの少なくともいずれかを置換基として有することを特徴とする多価結合性分子集合体である。
＜４＞　嵩高い置換基が、線状分子に対し生体内で分解可能に結合した前記＜３＞に記載の多価結合性分子集合体である。
＜５＞　ポリロタキサンである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の多価結合性分子集合体である。
＜６＞　環状分子がシクロデキストリンである前記＜３＞に記載の多価結合性分子集合体である。
＜７＞　シクロデキストリンの空洞部内に存在するグルコースＣ３及びＣ５プロトンが、１次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、遊離シクロデキストリンの空洞部内に存在するグルコースＣ３及びＣ５プロトンに比して、０．１〜１．０ｐｐｍ高磁場側及び低磁場側のいずれかにシフトしている前記＜６＞に記載の多価結合性分子集合体である。
＜８＞　シクロデキストリンに包接された線状分子が、１次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、シクロデキストリンに包接されていない前記線状分子に比して、０．０１〜１．０ｐｐｍ高磁場側及び低磁場側のいずれかにシフトしている前記＜６＞に記載の多価結合性分子集合体である。
＜９＞　シクロデキストリン空洞部内に存在するグルコースＣ３及びＣ５プロトンが、２次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、線状分子に存在するプロトンとの核オーバーハウザー効果によるクロスピークが観察され、化学シフト値が、前記Ｃ３及びＣ５プロトンについては３．０〜４．０ｐｐｍ、線状分子については１．０〜６．０ｐｐｍの範囲にある前記＜６＞に記載の多価結合性分子集合体である。
＜１０＞　示差走査型熱量測定におけるＤＳＣチャートにおいて、線状分子の融解ピークが観察されない前記＜６＞に記載の多価結合性分子集合体である。
＜１１＞　官能基が末端にカルボキシル基を含む基である前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の多価結合性分子集合体である。
＜１２＞　末端にカルボキシル基を含む官能基がカルボキシアルコキシカルボニル基である前記＜１１＞に記載の多価結合性分子集合体である。
＜１３＞　リガンドが糖リガンドである前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載の多価結合性分子集合体である。
＜１４＞　複数のシクロデキストリンと、該複数のシクロデキストリンを貫通した状態で保持可能な線状分子と、該線状分子の両末端をキャップする嵩高い置換基とを有してなり、該シクロデキストリン分子のうち少なくとも２つにおける、Ｃ６第１級水酸基、Ｃ２第２級水酸基及びＣ３第２級水酸基の２次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのピーク面積が、置換基を有さないシクロデキストリンの相当する水酸基に比して、１０〜９５％減少していることを特徴とする多価結合性分子集合体である。
＜１５＞　流速１ｍｌ／ｍｉｎ以下の条件下で行ったゲル浸透クロマトグラフィーにおける溶出時間が、環状分子、線状分子及び嵩高い置換基の各溶出時間よりも１〜３０分短い前記＜３＞に記載の多価結合性分子集合体である。
＜１６＞　捕捉対象を捕捉可能な捕捉剤として用いられる前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載の多価結合性分子集合体である。
＜１７＞　薬剤基材として用いられる前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載の多価結合性分子集合体である。
＜１８＞　カルシウムキレート剤として用いられる前記＜１１＞及び＜１２＞のいずれかに記載の多価結合性分子集合体である。
＜１９＞　薬剤補助剤として用いられる前記＜１１＞及び＜１２＞のいずれかに記載の多価結合性分子集合体である。
＜２０＞　捕捉対象を捕捉する機能を有し、前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載の多価結合性分子集合体を少なくとも含有することを特徴とする捕捉剤である。
＜２１＞　薬剤を結合可能であり、前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載の多価結合性分子集合体を少なくとも含有することを特徴とする薬剤基材である。
＜２２＞　カルシウムをキレート可能であり、前記＜１１＞及び＜１２＞のいずれかに記載の多価結合性分子集合体を少なくとも含有することを特徴とするカルシウムキレート剤である。
＜２３＞　薬剤薬効を補助するために用いられ、前記＜１１＞及び＜１２＞のいずれかに記載の多価結合性分子集合体を少なくとも含有することを特徴とするカルシウムキレート剤である。
＜２４＞　該複数の環状分子のうち少なくとも２つが置換基としてリガンドを有する多価結合性分子集合体であることを特徴とする前記＜２３＞に記載の薬剤補助剤である。
＜２５＞　複数の環状分子と、該複数の環状分子を貫通した状態で保持可能な線状分子と、該線状分子の両末端をキャップする嵩高い置換基とを有してなり、該複数の環状分子のうち少なくとも２つが官能基及びリガンドの少なくともいずれかを置換基として有することを特徴とする多価結合性分子集合体に用いられることを特徴とするポリロタキサンである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の多価結合性分子集合体の第一の態様は、官能基及びリガンドの少なくともいずれかを複数有してなり、水溶液中における動的光散乱（ＤＬＳ）測定より算出した流体力学的半径（Ｒｈ）と、静的光散乱（ＳＬＳ）測定の結果より作成したＺｉｍｍプロットをもとに算出した慣性自乗半径（Ｒｇ）との比（Ｒｈ／Ｒｇ）が、１．０以下であるものであれば特に制限はない。（Ｒｈ／Ｒｇ）は、０．２０〜０．６０であることが好ましい。
【００１２】
これに対し、従来の多価結合性分子集合体である、球状のミセル、リポソーム及び粒子等の（Ｒｈ／Ｒｇ）は、１．２８〜１．３０である。従来の高分子の多価結合分子集合体が、全体としてエネルギー的に安定な球状の形状をとるため、多くの官能基又はリガンドを導入すると分子内会合性が高く、標的物質と会合できる官能基又はリガンドは限られ、結合安定性が低かったのに対し、本発明の屈曲性が低い多価結合性分子集合体は、多数の官能基又はリガンドを導入しても分子内会合性が低く、標的物質と効果的かつ安定に結合することができる。
【００１３】
ここで、動的光散乱（ＤＬＳ）及び静的光散乱（ＳＬＳ）は、大塚電子（株）製の光散乱測定装置（ＤＬＳ７０００）を用いて、静的光散乱の場合には波長６３３ｎｍ、出力１０ｍＷのＨｅ−Ｎｅレーザーを、動的光散乱の場合には波長４８８ｎｍ、出力７５ｍＷのＡｒレーザーを、それぞれ光源として用いて測定することができ、流体力学的半径（Ｒｈ）、慣性自乗半径（Ｒｇ）は公知の方法により計算することができる。
【００１４】
前記官能基としては、前記多価結合性分子集合体の特徴的な反応性の原因となるような原子又は原子団であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。このような官能基としては、炭素や水素以外のヘテロ原子、あるいはこれを含む原子団や、炭素原子間の多重結合を含む構造などがある。具体例としては、例えば、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えばメトキシ、ｎ−ブトキシ、ｎ−オクチルオキシ、メトキシエトキシ、ベンジルオキシ）、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基、（例えばフェノキシ、ｐ−トリルオキシ、４−メトキシフェノキシ、４−ｔ−ブチルフェノキシ）、ホルミル基、ケト基、アシル基、アロイル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基（例えばメトキシカルボニル、ｎ−ブトキシカルボニル、２−エチルヘキシルオキシカルボニル）、アルケニルオキシカルボニル基、アルキニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基（例えばｎ−ブチルスルホニル、ｎ−ドデシルスルホニル）、アリールスルホニル基（例えばｐ−トリルスルホニル、ｐ−ドデシルフェニルスルホニル、ｐ−ヘキサデシルオキシフェニルスルホニル）、アミノアシル基、アミノ基、シアノ基、イミドイル基、メルカプト基、ニトロ基、スルホン基、ハロゲン原子、スルフィド結合を有する基、ジスルフィド結合を有する基、炭素−炭素二重結合を有する基、炭素−炭素三重結合を有する基、及び、カルボン酸無水物の残基、イミド残基（例えばスクシンイミドエステル）、等が挙げられる。また、Ｎ−アシルイミダゾール、スクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、メチルエステル、トシル基、アルデヒド基、アリル基、メタクリル基、アクリル基、ハロゲン化アルキル基、イソシアネート基、チオール基などの活性化基なども挙げられる。なお、これらは、さらにこれらの基により置換されていてもよい。
【００１５】
これらの中でも、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいカルボキシル基、ヒドロキシル基、又は、これらの基により置換された基が好ましい。
【００１６】
前記リガンドとしては、生体内又は生体外の受容体と特異的に結合し得るものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、リガンドと受容体とは相対的な概念であり、リガンドと受容体とを特に区別せず、特異的に結合し得る二つの物質の組合せと解釈すべきである。この物質としてはペプチド、糖、糖タンパク、脂質、糖脂質、核酸、アミノ酸、低分子化合物、イオン、などが含まれ、リガンドと受容体との組合せとしては、ペプチドとペプチド、ペプチドと糖、糖とペプチド、糖と核酸等、どのような組合せであってもよい。具体例を表１に挙げるが、これに限定するものではない。
【００１７】
【表１】
2004027183.tif 000002
【００１８】
これらの官能基又はリガンドは、棒状化合物に貫通された環状化合物に直接結合されていてもよいし、他の官能基を介して結合されていてもよい。
これらの複数の官能基又はリガンドは、すべて同一のものであってもよいし、２種以上の官能基又はリガンドを含んでいてもよい。例えば２以上のレセプターを同時に結合できるように２種以上の異なるリガンドを結合させることもできる。
本発明の多価結合性分子集合体の第二の態様は、官能基及びリガンドの少なくともいずれかを複数有してなり、水溶液中における動的光散乱測定から算出される拡散定数（Ｄ）値が、散乱ベクトル定数（Ｋ）値が大きくなるにつれて増加するものであれば特に制限はない。これに対し、従来の球状のミセル、リポソーム及び粒子などの（Ｄ）値は、（Ｋ）値に依存せずに一定の値となる。
【００１９】
本発明の多価結合性分子集合体の第三の態様は、複数の環状分子と、該複数の環状分子を貫通した状態で保持可能な線状分子と、該線状分子の両末端をキャップする嵩高い置換基とを有してなり、該複数の環状分子のうち少なくとも２つが官能基及びリガンドの少なくともいずれかを置換基として有するものであれば特に制限はない。
【００２０】
このような構成をとることにより、前記屈曲性が低いことによる利点の他、複数の環状分子が、前記線状分子に貫通された状態で、該線状分子上を移動及び回転運動することができることから、捕捉対象を捕捉しやすい利点がある。
【００２１】
前記線状分子としては、複数の環状分子を貫通した状態で保持可能なものであればどのようなものでもよく、親水・疎水性高分子としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、及びそれらのブロック・ランダム共重合体、ポリアミノ酸、多糖、脂肪酸等を挙げることができる。この線状分子としては、嵩高い置換基の導入が行える点で、ポリエチレングリコール等が特に好ましい。
【００２２】
前記嵩高い置換基としては、前記線状分子の両末端をキャップして前記複数の環状分子の脱離を防止するものであればどのようなものでもよく、アミノ酸、オリゴペプチド、単糖、オリゴ糖、核酸、蛍光分子などが挙げられる。具体的には、Ｎ一ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リシン、アルギニン、ヒスチジンのいずれかの単位若しくはこれらの誘導体、複数の単位からなるオリゴペプチド等を挙げることができるが特に制限されるものではない。
【００２３】
嵩高い置換基は、線状分子に対し生体内で分解可能に結合したものであることが好ましい。ポリロタキサン両末端部位に存在する嵩高い置換基を酵素的あるいは非酵素的に加水分解可能な結合、例えば、ペプチド結合、アミド結合、エステル結合、ホスホジエステル結合等を導入した場合、これらの結合を加水分解するとシクロデキストリンが媒体中に数分から数ヶ月のオーダーで放出される。この場合、加水分解時間も数分から数ヶ月のオーダーに設定可能である。その解析は、ＧＰＣ、逆相クロマトグラフィー、ＮＭＲ等で行うことができる。
【００２４】
このような生体内で分解可能な嵩高い置換基を用いる場合、従来の多価結合性の高分子化合物では、生体分解性基を導入しても、疎水性会合によって酵素の接近が立体的に障害され、分解が進行しないという欠点があったが、前記多価結合性分子集合体では、分子鎖の屈曲性や会合性が低いので、酵素は容易に末端に接近でき、分解が進行するという利点もある。
【００２５】
前記環状分子としては、官能基及びリガンドの少なくともいずれかを有することができるものであれば特に制限はないが、例えば、シクロデキストリン（ＣＤ）、クラウンエーテル、サイクロフラクタン等を挙げることができる。これらの中でも、シクロデキストリンであることが好ましく、シクロデキストリンとしては、α−、β−、γ−などグルコース単位数の異なるシクロデキストリンが挙げられる。
【００２６】
前記シクロデキストリンにおいては、シクロデキストリンのヒドロキシル基を利用して、前記官能基及びリガンドを導入することができる。これらの官能基又はリガンドは、直接ヒドロキシル基に結合されていてもよく、他の官能基を介して結合されていてもよい。構造例１に示すような、ビオチンが導入された多価結合性分子集合体の場合を例にとると、リガンドであるビオチンは、ビオチンヒドラジドのヒドラジド基がＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）由来のカルバモイル結合を介してシクロデキストリンのヒドロキシル基に導入されている。また２−アミノエタノールもカルバモイル結合を介して導入される。
【００２７】
【化１】
2004027183.tif 000003
．．．（構造例１）
【００２８】
シクロデキストリンの空洞部内に存在するグルコースＣ３及びＣ５プロトンは、１次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、遊離シクロデキストリンの空洞部内に存在するグルコースＣ３及びＣ５プロトンに比して、０．１〜１．０ｐｐｍ高磁場側及び低磁場側のいずれかにシフトする。また、シクロデキストリンに包接された線状分子は、１次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、シクロデキストリンに包接されていない前記線状分子に比して、０．０１〜１．０ｐｐｍ高磁場側及び低磁場側のいずれかにシフトする。
【００２９】
また、高分子鎖がシクロデキストリンに貫通している場合、前記多価結合性分子集合体に由来する全てのピークは、高分子鎖が貫通していない場合に比して、０．０１〜０．５ｐｐｍ程度ブロードなピークとなる。
【００３０】
シクロデキストリン空洞部内に存在するグルコースＣ３及びＣ５プロトンは、２次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、線状分子に存在するプロトンとの核オーバーハウザー効果によるクロスピークが観察される。その化学シフト値は、Ｃ３及びＣ５プロトンが観測される３．５〜４．０ｐｐｍと貫通している線状分子の１．０〜６．０ｐｐｍの範囲にある。
【００３１】
また、示差走査型熱量（ＤＳＣ）測定のＤＳＣチャートにおいてにおいて、シクロデキストリンを貫通した線状分子を有する多価結合性分子集合体では前記線状分子の融解ピークは消失するが、シクロデキストリンと高分子鎖の混合物の場合には高分子鎖の融解ピークが観察される。なお、ＰＥＧ若しくはＰＥＧとの共重合体を線状分子として用いた場合、融解温度は０〜２００℃である。
多価結合性分子集合体は、ポリロタキサンであることが好ましい。
【００３２】
前記多価結合性分子集合体は、流速１ｍｌ／ｍｉｎ以下の条件下で行ったゲル浸透クロマトグラフィーにおける溶出時間が、環状分子、線状分子及び嵩高い置換基の各溶出時間よりも１〜３０分短いことが好ましい。その時間差はシクロデキストリンの貫通数により異なる。前記ゲル浸透クロマトグラフィーのカラムは、市販のカラム、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｂｉｏ−Ｓｉｌ　ＳＥＣ　１２５−５、ＧＦ−７１０ＨＱ，　Ｓｈｏｗａ　ＤｅｎｋｏＣｏ．　Ｌｔｄ．、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０，　Ｇ−７５，　Ｇ−２５，　Ｇ−１０、Ｔｏｓｏｈ，　ＧＭＰＷＸＬ等を使うことができる。
【００３３】
本発明の多価結合性分子集合体の第四の態様は、複数のシクロデキストリンと、該複数のシクロデキストリンを貫通した状態で保持可能な線状分子と、該線状分子の両末端をキャップする嵩高い置換基とを有してなり、該シクロデキストリン分子のうち少なくとも２つにおける、Ｃ６第１級水酸基、Ｃ２第２級水酸基及びＣ３第２級水酸基の２次元１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのピーク面積が、置換基を有さないシクロデキストリンの相当する水酸基に比して、１０〜９５％減少している。シクロデキストリンの水酸基に官能基やリガンドを導入したことにより、シクロデキストリンのＣ６第１級水酸基及びＣ２及びＣ３第２級水酸基ピーク面積が１０〜９５％減少したものである。
【００３４】
本発明の多価結合性分子集合体は、官能基がカルボキシル基を含むことが、カルシウムキレート能を有し、トリプシン阻害活性を有することから好ましい。カルシウムキレート能は、後述するカルシウム結合アッセーにより、トリプシン阻害活性については、後述するトリプシン阻害アッセーにより実証されている。カルボキシル基を含む官能基としては、例えば、カルボキシアルコキシカルボニル基が挙げられ、カルボキシエトキシカルボニル基が好ましい。
【００３５】
本発明の多価結合性分子集合体の一例である機能性ポリロタキサンは、まずポリロタキサン骨格を合成し、そのα―ＣＤのヒドロキシル基に、官能基や、受容体を捕捉するリガンドを導入することにより生成することができる。α−ＣＤがベンジルオキシカルボニル−フェニルアラニン（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ）によりキャップされたポリオキシエチレン鎖に貫かれたポリロタキサンは、公知の方法により調製することができる。すなわち、α−ＣＤとポリオキシエチレン（ＰＥＯ−ＢＡ）の包接錯体は、α−ＣＤの飽和水溶液と、ＰＥＯ−ＢＡ水溶液とを単純に混ぜることにより調製した。そして、Ｚ−Ｌ−ＰｈｅとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの縮合反応により調製されたＺ−Ｌ−Ｐｈｅのスクシンイミドエステルを、ＤＭＳＯに溶解した包接錯体の末端アミノ基と反応させることにより、α−ＣＤ数約２２のポリロタキサン骨格が合成できる。
【００３６】
ビオチン−ポリロタキサン複合体を具体例として、リガンドの導入について以下に説明する。構造例２は、ビオチン−ポリロタキサン複合体の合成方法の一例を示す構造例である。
【００３７】
【化２】
2004027183.tif 000004
．．．（構造例２）
【００３８】
ビオチン分子をポリロタキサン骨格に導入するために、ポリロタキサン中のα−ＣＤｓのヒドロキシル基を、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）により活性化し、ビオチンヒドラジドのヒドラジド基と反応できるようにする。
前記ＣＤＩ−活性化ポリロタキサン（ポリロタキサン分子中のα−ＣＤｓ数は２２、ポリロタキサン分子中のＮ−アシルイミダゾール基は０．２４ｍＭ）は、２ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解し、その溶液に窒素ガス下において、０．２４ｍＭのビオチンヒドラジドと０．２４ｍＭのＨＯＢｔとを添加する。前記混合溶液は室温にて２４時間攪拌し、９．９ｍＭの２−アミノエタノールを反応混合液に滴下し、同一環境下でさらに２４時間攪拌する。得られた反応液は水に対して透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ（登録商標）ＭＷＣＯ；１０００）を介して透析され、凍結乾燥され、ビオチン−ポリロタキサン複合体が得られる。
また、カルボキシエチルエステル−ポリロタキサン複合体では、ポリロタキサンのヒドロキシル基とピリジン中の無水コハク酸との間の反応によりカルボキシエチルエステルを導入した。
【００３９】
本発明の多価結合性分子集合体は、結合安定性が高く、特に、その結合安定性が空間的又は時間的に制御できる特色がある。即ち、本発明者らは、多価のリガンドの生物学的受容体に対するターゲティクングのモデルとして、ビオチン−ポリロタキサン複合体とストレプトアビジンの結合の結合・解離キネティクス（速度論）をＳＰＲ技術を用いて解析した。擬似１次キネティクスを仮定した場合において、ポリロタキサン１分子に結合するビオチンの量を増加させるにつれ、結合速度定数（ｋｂｉｎｄ）の増加よりも、解離速度定数（ｋｄｉｓｓ）の減少が観察された。解離反応は擬似１次キネティクスに従わず、ビオチン−ポリロタキサン複合体のストレプトアビジン吸着表面への再結合が観察された。競合阻害実験の結果より、ビオチン−ポリロタキサン複合体の阻害活性はビオチン−α−ＣＤ複合体の阻害活性より強いことが示された。したがって、ビオチン−α−ＣＤ複合体をビオチン−ポリロタキサン複合体という超分子構造にすることにより、単価結合を多価結合へと転換させ、多価のキネティクスを実現した。また、多価結合性分子集合体の多価性は合成時に調節することができることから、結合安定性を制御することができる。さらに、必要に応じて、一定の条件で嵩高い置換基が分解されるような設計を採用することにより、環状化合物の線状分子からの解離を制御し、これにより結合安定性を変化させることもできる。このように、本発明の多価結合性分子集合体は、結合安定性が高く、特に、その結合安定性が空間的又は時間的に制御できるきわめて優れた性質を有する。
【００４０】
本発明の多価結合性分子集合体は、捕捉対象を捕捉可能な捕捉剤として用いることができる。前記多価結合性分子集合体の官能基及びリガンドのいずれかとして、捕捉対象を捕捉しうるものを導入することにより、結合性が高く、捕捉対象を捕捉したり、放出したりする場合の結合性を自由に設定でき、制御可能な捕捉剤として使用することができる。
【００４１】
また、本発明の糖リガンドを有する多価結合性分子集合体は、例えば、ウイルス、細菌または細胞等の表面のレセプターや結合タンパク質を捕捉対象として、糖−タンパク質の親和性を利用して、種々の細胞シグナルのスイッチングに用いることができる。
本発明のリガンドを有する多価結合性分子集合体を捕捉剤として用いる場合には、例えば、環状分子としてα−ＣＤ、線状分子としてＰＥＧを用いる態様においては、多価結合性分子集合体におけるα−ＣＤの貫通率には好適な範囲があり、その貫通率により効果に著しい差異がある。最適値は導入するリガンドにより適宜選択することができるが、マルトースのモデルによれば、α−ＣＤの貫通率は２０％〜６０％が好ましく、３０％から５０％がより好ましい。また、一つα−ＣＤ当たりの糖リガンドの数は、α−ＣＤの貫通率によって適宜選択することができ、例えばα−ＣＤ貫通率３０％から５０％の場合、２〜３個程度が好ましい。ＰＥＧの数平均分子量は２，０００から５０．０００が好ましく、１０，０００から５０，０００がより好ましく、１０，０００から３５，０００が特に好ましい。２，０００以下であると、導入できるリガンドの数が限られるため、多価結合性の効果が少ない観点から好ましくなく、５０，０００以上であると分子が巨大になることによる分子運動性の低下などの観点から好ましくない。
α−ＣＤの貫通率を変えることで、線状分子の屈曲性や、α−ＣＤがスライドすることによるリガンドの自由度を制御することができる。
【００４２】
また、本発明の多価結合性分子集合体は、薬剤基材として用いることができる。前記多価結合性分子集合体の性質は、薬剤基材としても有用な性質である。即ち、薬剤を前記多価結合性分子集合体の官能基又はリガンドを介して前記多価結合性分子集合体に導入することにより製剤し、これを生体に投与することができる。
必要に応じて、一定の条件で嵩高い置換基が分解されるよう設計することにより、薬剤のポリロタキサン骨格からの解離を制御することもできる。また、薬剤自体がリガンドとして働くものであってもよい。
【００４３】
また、本発明のカルボキシル基を有する多価結合性分子集合体は、カルシウムキレート剤、薬剤補助剤として用いられることができる。前記カルシウムキレート能等により、トリプシン等の阻害や、小腸のタイトジャンクションの開口などの作用を有し、カルシウムキレート剤及び薬剤補助剤等に用いることができ、その他にもカルシウムキレートの生物学的効果への応用が可能である。
本発明のカルボキシル基を有する多価結合性分子集合体をカルシウムキレート剤および薬剤補助剤として用いる場合には、多価結合性分子集合体１分子当たりのカルボキシル基の数は多価結合性の効果を発揮できる観点から多い方がよく、例えば、環状分子としてα−ＣＤ、線状分子としてＰＥＧを用いる態様においては、α−ＣＤの貫通率は５０％から１００％が好ましく、一つα−ＣＤ当たりのカルボキシル基の数は２〜６個が好ましい。ＰＥＧの数平均分子量は２，０００から３５，０００が好ましい。２，０００未満であると、導入できるカルボキシル基の数が限られるため、多価結合性の効果が少ない観点から好ましくなく、３５，０００を超えると分子が巨大になることによる会合体形成とそれに伴うカルボキシル基運動性の低下などの観点から好ましくない。
【００４４】
本発明の捕捉剤は、捕捉対象を捕捉する機能を有し、本発明の多価結合性分子集合体を少なくとも含有すること以外は特に制限は無く、多価結合性分子集合体の官能基及び／又はリガンドは、捕捉対象となる受容体に合わせて適宜公知の官能基又はリガンドから選択することができる。また、捕捉剤は、補助剤等の他の材料を含んでいてもよいし、薬剤等の受容体を含んでいてもよい。
【００４５】
本発明の薬剤基材は、薬剤を結合可能であり、本発明の多価結合性分子集合体を少なくとも含有すること以外は特に制限はなく、多価結合性分子集合体の官能基及び／又はリガンドは、結合する薬剤に合わせて適宜公知の官能基又はリガンドから選択することができる。また、薬剤基材は、他の材料を含んでいてもよいし、薬剤を含んでいてもよい。
【００４６】
本発明のカルシウムキレート剤は、カルシウムをキレート可能であり、本発明の多価結合性分子集合体を少なくとも含有すること以外は特に制限はなく、適宜目的に合わせて、公知の材料から選択される他の材料を含んでいてもよい。
本発明の薬剤補助剤は、薬剤薬効を補助するために用いられ、本発明の多価結合性分子集合体を少なくとも含有すること以外は特に制限はなく、適宜目的に合わせて、公知の材料から選択される他の材料を含んでいてもよい。
【００４７】
【実施例】
（材料）
α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）は横浜バイオリサーチコーポレーション（横浜）から購入した。α−（３−アミノプロピル）−ω−（３−アミノプロピル）ポリオキシエチレン（ＰＥＯ−ＢＡ：Ｍｎ＝４０００）は、三洋化成工業株式会社（京都）により提供を受けた。
ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅ）、２−エタノール、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、蟻酸、及び、ｄ−ビオチンは、和光純薬工業株式会社から購入した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）は、ペプチド研究所（大阪）より購入した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｉｄｉｎｉｉ　のストレプトアビジンはナカライテスク（京都）より購入した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ／Ｔ）（１０ｍＭリン酸化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カルシウム、１３８ｍＭ塩化ナトリウム、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）リン酸バッファーされた生理食塩水（ＰＨ７．４）は、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，　Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＵＳＡ）から購入したＰＢＳ／Ｔパウダーを溶解して調製し、使用まで４℃で保存された。ＥＺ−Ｌｉｎｋ−Ｂｉｏｔｉｎ　Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（商標）及びＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ストレプトアビジンは、ＰＩＥＲＣＥ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）から購入した。相互分析システム（ＩＡｓｙｓ）のためのビオチンキュベットは、アフィニティーセンサーズ　ケンブリッジ社（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｓｅｎｓｏｒｓ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　Ｉｎｃ．，　ＵＫ）から購入した。ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）は、和光純薬工業株式会社から購入し、通常の方法で蒸留した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のためのＤＭＳＯは、キシダ化学株式会社（大阪）から購入し、使用した。その他のすべての化学品は、試薬グレードである。
【００４８】
（実施例１）
ビオチン−ポリロタキサンとビオチン−α−ＣＤ複合体の合成
α−ＣＤがＺ−Ｌ−ＰｈｅによりキャップされたＰＥＯ鎖に貫かれたポリロタキサンは、公知の方法により調製された。簡単に記載すると、α−ＣＤとＰＥＯ−ＢＡの包接錯体は、α−ＣＤの飽和水溶液と、ＰＥＯ−ＢＡ水溶液とを単純に混ぜることにより調製した。そして、Ｚ−Ｌ−ＰｈｅとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの縮合反応により調製された、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅのスクシンイミドエステルは、ＤＭＳＯに溶解した包接錯体の末端アミノ基と反応することができる。化学構造は、７５０ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲを使ったＦＴ−ＮＭＲスペクトロメーター（Ｖａｒｉａｎ　ＦＴ−ＮＭＲ　Ｇｅｍｉｎｉ７５０、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＵＳＡ）により特定された。α−ＣＤｓの数は、１Ｈ−ＮＭＲにより４．７５（α−ＣＤｓのＣ１Ｈ）と３．４９（ＰＥＯのＣＨ２ＣＨ２Ｏ）のシグナルの積分値を比較することにより、約２２であると決定された。
【００４９】
次に、ビオチン分子をポリロタキサン骨格に導入するために、ポリロタキサン中のα−ＣＤｓのヒドロキシル基を、ＣＤＩにより活性化し、ビオチンヒドラジドのヒドラジド基と反応するようにした。即ち、前記ポリロタキサン（１３．６μＭ、ヒドロキシル基６．１ｍＭ）は、２０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解させ、３０．７ｍＭのＣＤＩを溶液に加え、室温にて、窒素ガス下で３時間攪拌した。反応混合液は、過剰のエーテルにゆっくり注がれ、沈殿ろ過させ、室温で真空乾燥させＣＤＩ−活性化ポリロタキサンを得た。ポリロタキサンのヒドロキシル基の活性化は、Ｎ−アシルイミダゾール基のアルカリ加水分解後のイミダゾールの比色検定により確かめられた。α−ＣＤｓの数が約２２であり、活性化量は、ひとつのα−ＣＤにつき約１０であると算出されるため、ポリロタキサン分子全体での活性化量は約２２０である。この結果は、数百のビオチンが理論的にはポリロタキサン骨格に導入され得ることを示している。
【００５０】
前記ＣＤＩ−活性化ポリロタキサン（ポリロタキサン分子中のα−ＣＤｓ数は２２、ポリロタキサン分子中のＮ−アシルイミダゾール基は０．２４ｍＭ）は、２ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解され、その溶液に窒素ガス下において、０．２４ｍＭのビオチンヒドラジドと０．２４ｍＭのＨＯＢｔとが添加された。前記混合溶液は室温にて２４時間攪拌され、９．９ｍＭの２−アミノエタノールが反応混合液に滴下され、同一環境下でさらに２４時間攪拌された。得られた反応液は水に対して透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ（登録商標）ＭＷＣＯ；１０００）を介して透析され、凍結乾燥され、ビオチン−ポリロタキサン複合体が得られた。
【００５１】
ビオチンヒドラジドとの反応後、結果物は水溶性を示した。ポリロタキサンのα−ＣＤｓのヒドロキシル基間の水素結合は限られた水溶性を示すことが知られている。ヒドロキシプロピレーションのような化学修飾による水素結合性の低減は、ポリロタキサンの親水性を大きく向上させることができる。親水性のリガンドであるビオチン導入後の親水性の低下は、ビオチン中のアルキル鎖との会合によるものと考えられる。この理由からも、α−ＣＤｓの２−アミノエタノールによる化学修飾（ヒドロキシエチルカルバモイル化）が行われた。期待されたように、ポリロタキサンの親水性は反応後増加した。
【００５２】
ビオチンヒドラジドと２−アミノエタノールを結合させたポリロタキサンは、ゲル浸透クロマトグラフィーと１Ｈ−ＮＭＲ分光法により解析された。ゲル浸透クロマトグラフィーのカラムはＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＨＨＲ＋Ｇ５０００ＨＨＲ（東ソー株式会社、東京）、溶出液はＤＭＳＯ流速０．８ｍＬ／分、検出はＯＲ−９９０（日本分光株式会社、東京）による旋光度により行った。
【００５３】
収量は３４ｍｇ。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、ｐｐｍ）：δ９．３９（ｄ、Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ×１１、固定化された結合である−ＯＣＯＮＨ−ＮＨＣＯ−）、７．３８〜７．１６（ｂｒｍ、１０Ｈ×２、Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅの芳香環）、７．１５〜６．８０（ｂｒｍ、１Ｈ×１０４、−ＯＣＯＮＨ−ヒドロキシエチルカルバモイル基の固定化された結合、６．４０、６．３４（ｓ、２Ｈ×１１、ビオチンのＮＨ）４．８９（ｂｒｍ、６Ｈ×２０、α−ＣＤのＣ１Ｈ、Ｃ６Ｈ２、Ｃ４ＨおよびＣ２Ｈ）、３．５１（ｓ、４Ｈ×９０、ＰＥＯのＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、３．０４（ｂｒｍ、４Ｈ×１０４、ヒドロキシエチルカルバモイル基のＣＨ２）、２．８２（ｄｄ、Ｊ＝４．５、７．５Ｈｚ　１Ｈ×１１、ビオチンのＣεＨ）、２．５８（ｄ、Ｊ＝１２．８Ｈｚ、１Ｈ×１１、ビオチンのＣεＨ’）、２．０８（ｍ、２Ｈ×１１、ビオチンのＣαＨ）、１．６３〜１．２３（ｍ、６Ｈ×１１、ビオチンのＣβＨ／ＣγＨ／ＣδＨ）α−ＣＤｓの数と、固定化されたビオチンは７５０ＭＨｚ１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから決定された。
【００５４】
図１（ａ）から図１（ｅ）においては、図１（ａ）は精製されたビオチン−ポリロタキサン複合体、図１（ｂ）はヒドロキシエチルカルバモイル−ポリロタキサン、図１（ｃ）はビオチン−α−ＣＤ複合体（α−ＣＤあたりのビオチン結合数は０．６）、図１（ｄ）はα−ＣＤ、及び図１（ｅ）はｄ−ビオチンのゲル浸透クロマトグラフィーの結果を表す。ビオチン−ポリロタキサン複合体に起因するピークは、ビオチン−α−ＣＤ複合体、α−ＣＤ、及びｄ−ビオチンと比較して有意に短い溶出時間における、単一ピークとして検出された。さらに、ビオチン−ポリロタキサン複合体の溶出時間は、ヒドロキシエチルカルバモイル−ポリロタキサンの溶出時間と極めて類似していた。これらの結果は、得られた生成物が、成分中にコンタミネーションのないポリロタキサン誘導体であることを示している。
【００５５】
前記ポリロタキサン誘導体（ビオチン−ポリロタキサン複合体）の化学組成を確認するために、ビオチンヒドラジド及びヒドロキシエチルカルバモイル−ポリロタキサンとの比較において、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが分析された（図２（ａ）から図２（ｃ））。図２（ａ）はビオチン−ポリロタキサン複合体、図２（ｂ）はｄ−ビオチン、図２（ｃ）はヒドロキシエチルカルバモイル−ポリロタキサンの分析結果を表す。ビオチン−ポリロタキサン複合体の分析結果に、ｄ−ビオチン及びヒドロキシエチルカルバモイル−ポリロタキサンに起因するピークが確認された。ヒドラジド基に起因するピーク（図２（ｂ）中のδ＝８．９１）の、より低い磁場への（図２（ａ）中δ＝９．３９）シフトが見られた。このピークシフトは、ｄ−ビオチンヒドラジドが、ポリロタキサンのα−ＣＤｓのヒドロキシル基にカルバモイル結合により導入されたことを表す。このように、この分析結果から、ビオチン−ポリロタキサン複合体が合成され、超分子構造がビオチン固定化の後に維持されたことが示された。
【００５６】
ひとつのポリロタキサン分子に対する、α−ＣＤｓ、ビオチン、及びヒドロキシエチルカルバモイル基の数は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによると、それぞれ、２０、１１、１０４であり、このことはビオチン分子はα−ＣＤ分子２つに１つ導入されることを示す。
水溶液中の合成されたビオチン−ポリロタキサン複合体のコンフォーメーションを２次元核オーバーハウザー効果分光法（２Ｄ　ＮＯＥＳＹ）により分析した。α−ＣＤｓのグルコース単位同士の間では、いくつかの相関するピークが観られたが、ｄ−ビオチン（ＮＨ、Ｃα−δＨ、ＣεＨ、ＣεＨ’、ＣζＨ、ＣζＨ’）のピークとヒドロキシエチルカルバモイル−ポリロタキサン（Ｚ−Ｌ−Ｐｈｅの芳香環、α−ＣＤのＯ６Ｈ、Ｃ５Ｈ、Ｃ６Ｈ２、Ｃ４Ｈ、Ｃ３Ｈ、Ｃ２Ｈ及びＣ１Ｈ、ＰＥＯのＣＨ２ＣＨ２Ｏ、及び、ヒドロキシエチルカルバモイル基のＣＨ２）のピークとの間では、相関するピークは観られなかった。おそらく、結合による構造の変化によると考えられる。この結果は、複合体中のビオチン分子は互いに会合することなく水溶性の環境に曝されていることを表す。
【００５７】
（実施例２）
表面プラズモン共鳴解析装置（ＳＰＲ解析装置）を用いたストレプトアビジンを吸着させた表面へのビオチン−ポリロタキサン複合体の結合解析
ＳＰＲ実験は、レゾナンスミラーバイオセンサーによる広範囲の生物分子相互作用を測定できるＩＡｓｙｓ装置（ＩＡｓｙｓ　Ａｕｔｏ＋、アフィニティーセンサーケンブリッジ社、英国）を用いて行った。装置は２５℃にて使用した。ビオチンキュベットの共鳴層を４０μＬのＰＢＳ／Ｔにて洗浄し、１０分間、平衡化した。この間に、ストレプトアビジンを１ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ／Ｔを用いて溶かした。このストレプトアビジンＰＢＳ／Ｔ溶液（２０μＬ）をキュベット内のＰＢＳ／Ｔに加え、１０分間反応させ、ビオチン化した表面へ結合させた。５０μＬのＰＢＳ／Ｔで３回洗浄した後、キュベットは３分間放置し、ベースラインを安定化させた。結合されたストレプトアビジン量は、ＩＡｓｙｓのキャリブレーションカーブに基づき得られたセンサーグラムを用いて計算した。ストレプトアビジンを結合させた表面を４５μＬのＰＢＳ／Ｔで平衡化後、ＰＢＳ／Ｔに溶かしたビオチン複合体（複合体中に５０ｎＭビオチンを含む）をキュベット中のＰＢＳ／Ｔに添加し、結合を１０分間モニターした。その後、キュベットは５０μＬのＰＢＳ／Ｔで洗浄し、解離を５分間、観察した。最後に１Ｍの蟻酸を加えて、ビオチン−ストレプトアビジンの結合を破壊し、それからキュベットをＰＢＳ／Ｔで３回、洗浄した。異なる濃度のビオチン−ポリロタキサン複合体についても同様に行った。得られたセンサーグラムを、擬似１次キネティクスに基づき分析し、キネティックパラメータを取得した。
【００５８】
前述のように、ビオチン−固定化ＩＡｓｙｓのキュベット上に、ストレプトアビジン４量体を吸着させた。吸着されたストレプトアビジンの密度は、２．５×１０−５ｎｍｏｌ／ｍｍ２であった。この密度の値は、ストレプトアビジン４量体が６４．２ｎｍ２ごとに吸着されていることを表しており、隣り合うストレプトアビジン４量体の平均距離は約８．０ｎｍである。ストレプトアビジン４量体のサイズは、５．５ｎｍと想定されるので、ストレプトアビジン吸着表面の分布イメージを図３に表す。
【００５９】
α−ＣＤｓの深さは０．７ｎｍで、ＰＥＯ鎖（Ｍｎ：４０００）中のα−ＣＤｓの化学量論的な数は４５であるから、ポリロタキサンのロットの理論上の長さは、３２ｎｍと考えられる。複合体中のα−ＣＤｓの数（約２０）及び吸着されたストレプトアビジンの表面密度から考えて、相互作用のポテンシャルは、４つのストレプトアビジン４量体とひとつの複合体との間でのものである（図３）。
ストレプトアビジン吸着表面への結合曲線を図４に示す。濃度は、ビオチン残基で計算した。ストレプトアビジン吸着表面への複合体の注入は、濃度を１から５０ｎＭに高くするに伴い、反応を増加させた。しかし、１ｍＭのビオチンでプレコートされたストレプトアビジン表面が使用された場合には前記反応の増加は見られなかった。これらの結果は、複合体中のビオチンは実際にストレプトアビジンにより認識されたことを示す。
【００６０】
（実施例３）
結合解離キネティクスにおける複合体中のビオチン分子数の影響
前述の実験により、約１１分子のビオチンを含むビオチン−ポリロタキサン複合体がストレプトアビジン吸着表面により認識されることがわかった。なお、ストレプトアビジンはポリロタキサン自身とは結合しない。次に、複合体中のビオチンの数がどのようにビオチン−ポリロタキサン複合体の多価性に関連する、結合解離キネティクスに影響を及ぼすかを検討した。
【００６１】
なお、１分子のポリロタキサン中のビオチンの分子数はＣＤＩ活性化したポリロタキサンとＥＺ−Ｌｉｎｋビオチンヒドラジドの量比を変化することにより変えることができた（表２）。
【００６２】
【表２】
2004027183.tif 000005
【００６３】
表２中のＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚは、ビオチン−ポリロタキサン複合体を表し、ＢＩＯ−αＣＤは、ビオチン−α−ＣＤ複合体を表す（＊１）。ビオチン−ポリロタキサン複合体を表す前記記号のスラッシュ（／）より前は、貫通されたＣＤ及びその官能基又はリガンドに関する情報を表す。例えば１１ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚでは、１１個のビオチンを官能基として有し、環状分子がα−ＣＤであることを表す。また、スラッシュ（／）より後ろは、貫通する線状分子及びキャップする嵩高い置換基に関する情報即ち前記の例では、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｚ−ＰＨＥ）によりキャップされた平均分子量４，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を表す。［Ｂｉｏ］は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）ビオチンヒドラジドの濃度を、［Ｉｍ］は、Ｎ−アシルイミダゾール基（ポリロタキサン中のα−ＣＤの活性化されたヒドロキシル基）の濃度を表す（＊２）。α−ＣＤ数及びヒドロキシエチルカルバモイル基（ＨＥＣ）の数は、７５０ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから算出した（＊３）。導入されたＮ―アシルイミダゾール基は、α−ＣＤにひとつずつである（＊４）。
【００６４】
１１ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ、３５ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ、及び７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚのストレプトアビジン吸着表面への結合と解離を示すＳＰＲセンサーグラムを図５に示す。複合体中のビオチンの濃度は５０ｎＭであり、図５中細かい破線は１１ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの、荒い破線は３５ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの、実線は７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの反応を表す。おのおのの複合体をストレプトアビジン吸着表面に注入することにより反応の増強が認められたが、複合体中のビオチンの数による質的な結合反応の差異は観察できなかった。ビオチン−ポリロタキサン複合体を解離させるために、溶液をＰＢＳ／Ｔ緩衝液に置換し、注入後４分に、解離曲線を得た（図５）。解離曲線の傾きは複合体中のビオチンの数が増加するにつれ小さくなるようであった。この結果は、ビオチンの数が結合よりも解離に影響を与えることを示唆する。
【００６５】
結合及び解離のキネティクスを詳細に検討するために、図５の結合曲線を、リガンド（Ｌ、この場合ビオチン−ポリロタキサン複合体）と固定した受容体（Ｒ，この場合ストレプトアビジン）との相互作用に基づく、擬似１次キネティクスとして解析した。
【００６６】
【数１】
2004027183.tif 000006
【００６７】
上記数式（３）において、ｋｂｉｎｄ、ｋｄｉｓｓ、及びＫαは、それぞれ結合定数、解離定数、及び結合平衡定数を表す。時間ｔにおけるＳＰＲ反応であるＲｔと、結合比ｄＲ／ｄｔは、相互作用のキネティクスに用いることができる。
ｄＲ／ｄｔ＝ｋｂｉｎｄＣＬ（Ｒｍａｘ−Ｒｔ）−ｋｄｉｓｓＲｔ　　（４ａ）
Ｒｔ＝Ｒｅｑ［１−ｅｘｐ（−ｋｏｂｓｔ）］　　　　　　　　　　　（４ｂ）
ｋｏｂｓ＝ｋｂｉｎｄＣＬ＋ｋｄｉｓｓ　　　　　　　　　　　　　　（４ｃ）
【００６８】
ここで、ＣＬは、注入された複合体の量（この場合、結合したビオチン残基）、Ｒｍａｘは最大結合反応、ｋｏｂｓは、結合の擬似１次比である。複合体のｋｏｂｓの値は、複合体の濃度を変化させることによって得られる結合曲線から計算した。複合体中のビオチン濃度の関数としてのｋｏｂｓは（式（４ｃ））、線形最小二乗法を用いると、直線に乗る（ｒ２＝０．９８７−０．９９８）。そこで、ｋｂｉｎｄとｋｄｉｓｓは式（４ｃ）を用いて計算した。表３は、１１ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ、３５ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ、７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚのキネティックパラメータをまとめたものである。
【００６９】
【表３】
2004027183.tif 000007
【００７０】
ｋｄｉｓｓ値は、複合体中のビオチンの数が増加するにつれ顕著に減少するが、ｋｂｉｎｄはほぼ同じくらいである。この結果として、７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−ＺのＫａ値は１１ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ及び３５ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚのそれよりも１２から２２倍高い。多価の結合による高親和性は、多価のリガンドの結合速度が増加するためではなく、解離速度が減少することによることが知られている。したがって、ｋｄｉｓｓ値の減少は、複合体中のビオチンが固定されたストレプトアビジンに多価のリガンドとして結合していることを示唆する。
【００７１】
しかし、Ｗｉｎｚｏｒらは、擬似１次キネティクスは多価の相互作用を解析するには不適であると指摘していることから、解離キネティクスは、擬似１次キネティクスに従うかを検証した。
解離キネティクスを評価するために、擬似１次関係に基づく解離の古典的表現について検討した。ＳＰＲキュベット中の複合体を含む緩衝液は緩衝液自身で置換されるので、式（４ａ）〜（４ｃ）のＣＬは解離反応ではゼロである。したがって、解離キネティクスの式は下記のように表される。
Ｒｔ・Ｒ０＝ｅｘｐ（−ｋｄｉｓｓｔ）　　　　　　　（５ａ）
ｌｎ（Ｒｔ／Ｒ０）＝−ｋｄｉｓｓｔ　　　　　　　　（５ｂ）
ここで、Ｒ０は緩衝液注入開始時のＳＰＲ反応である。もし、解離キネティクスが式（５ｂ）に従うのであれば、ｌｎ（Ｒｔ／Ｒ０）は時間と１次相関するはずである。図６は、１１ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ（図６中■）、３５ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ（図６中▲）又は７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ（図６中●）についてｌｎ（Ｒｔ／Ｒ０）と、時間との関係を示している。図６中、細かい破線は、１１ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの、荒い破線は、３５ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの、実線は、７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの、それぞれ表３のｋｄｉｓｓ値を用いた理論上の直線を表す。ＳＰＲセンサーグラムのテキストデータを基にした図は、（５ｂ）の対数式から予測される直線上にはこなかった。複合体中のビオチンの数を増加したものについても、すべての曲線は０．６から０．８分後に曲線がなだらかになった。この結果は、ビオチン−ポリロタキサン複合体が、ストレプトアビジン吸着表面に再結合したとみなすことができ、このことは、多価としての特性を強く支持する。図６中の点の無い直線は、表３中のｋｄｉｓｓ値を式（５ｂ）に挿入したときに得られる理論上の相関である。この直線は、実際の実験の点とは一致しなかった。しかし、直線の傾きは、再結合後の実験値の点が作る傾きと一致しているようである。したがって、表３で計算されるｋｄｉｓｓ値は、多価のキネティクスを表していることがわかる。
【００７２】
（実施例４）
ストレプトアビジン−ビオチン結合の多価阻害剤（ビオチン−ポリロタキサン）及び単価阻害剤（ビオチン−α−ＣＤ）による競合阻害
ビオチン−ポリロタキサン複合体とビオチン−α−ＣＤ複合体のキネティクスを比較するために、まず、ビオチン−α−ＣＤ複合体（表２での１ＢＩＯ−αＣＤ）のストレプトアビジン吸着表面への結合をＳＰＲにより解析した。残念ながら、１ＢＩＯ−αＣＤについての有意のＳＰＲセンサーグラムはこの分子が低分子であるために得ることができなかった。現在のＳＰＲ技術では、低分子量リガンド（Ｍｎ　＜　〜５０００）と固定化した受容体間の相互作用は、センサー表面での分子体積の増加がｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　ｉｎｄｅｘを変化させるには小さすぎるため、検出が困難である。そこでこれに代わるものとして、固定化したリガンドと可溶性受容体との相互作用を阻害する物質を定量化する方法としての競合阻害アッセーを行った（Ｍａｍｍｅｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｇｅｗ．　ＣＨｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．　３７　（１９９８）　２７５４−２７９４；　Ｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１２０　（１９９８）　１０５７５−１０５８２；　Ｓｉｇａｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１１８　（１９９６）　３７８９−３８００）。
【００７３】
競合アッセー
ビオチン−ポリロタキサン複合体あるいはビオチン−α−ＣＤ複合体を用いた競合アッセーはＫｉｅｓｓｌｉｎｇらの報告に従った。ビオチン−ポリロタキサン複合体あるいはビオチン−α−ＣＤ複合体（それぞれ表２の７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚと１ＢＩＯ−αＣＤに該当）をＰＢＳ／Ｔにビオチン濃度が１ｍＭになるように溶かし、それから、０．２５、０．５、１．０、１０、及び１００μＭになるよう希釈した。
【００７４】
１００μＬのストレプトアビジンを含むＰＢＳ／Ｔ溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ，１．５μＭ）をそれぞれのサンプル（０．９ｍｌ）に加え、攪拌機を用いて十分に攪拌する。これらの溶液は室温で１時間反応させた。得られた溶液を５μＬずつ、４５μＬ（１０倍量）のＰＢＳ／Ｔで平衡化したビオチンキュベットの共鳴層に注入した。ＳＰＲ反応はビオチンキュベットを用いた結合解析とまったく同様に行った。
【００７５】
阻害係数（Ｋｉ）を得るために、ＳＰＲのデータを修正直角双曲線の関係（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ　ｈｙｐｅｒｂｏｌｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を用いた溶液競合平衡により解析した。
ｆ＝［Ｉ］／（［Ｉ］＋Ｋｉ（１＋Ｆ／Ｋｄ））　　　（６）
ここでｆは阻害物質（ビオチン複合体）非存在下で得られた平衡値を用いて計算される分画阻害（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）であり、［Ｉ］は阻害物質（ビオチン残基）の濃度であり、Ｆはストレプトアビジンとの結合に用いうるフリーの結合部の濃度であり、Ｋｄはストレプトアビジンの表面に対する解離定数である。
ＦとＫｄを決定するために、ビオチンキュベット表面へのストレプトアビジンの結合反応のデータをストレプトアビジンの最終濃度０．１から１０μｇ／ｍｌの範囲で集め、その反応値を以下の直角双曲線の式（ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ　ｈｙｐｅｒｂｏｌｉｃ）に挿入した。
Ｒｅｑ＝Ｒｍａｘ［ＳＶ］／（Ｋｄ＋［ＳＶ］）、Ｋｄ＝Ｒｍａｘ／２　（７）
ここで、Ｒｅｑは平衡反応であり、Ｒｍａｘはストレプトアビジンの最大結合反応であり、［ＳＶ］はストレプトアビジンの濃度である。Ｆ及びＫｄの計算値は７．９±０．４６ｎＭ及び３．２±０．９２ｎＭであった。７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚと１ＢＩＯ−αＣＤのＫｉ値は、マイクロコカルオリジン６．０ソフトウェアを用いて、（６）式のｆと［Ｉ］グラフを挿入することにより得た。
【００７６】
さまざまな量のビオチン−ポリロタキサン複合体とビオチン−α−ＣＤ複合体の存在下で、０．０１５μＭストレプトアビジンの結合反応を測定することにより得た濃度阻害曲線を図７（ａ）及び図７（ｂ）に示す。即ち、図７（ａ）及び図７（ｂ）は、０、０．０２５、０．０５、０．１、１、及び１０μＭの複合体中のビオチンによる、ビオチン固定化センサー表面への０．０１５μＭのストレプトアビジン結合の阻害カーブであり、図７（ａ）は７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚによる阻害を、図７（ｂ）は１ＢＩＯ−αＣＤによる阻害を表す。Ｒｅｑ値は複合体非存在下では１０００〜１２００ａｒｃ／ｓｅｃｏｎｄであり、両方の複合体の濃度を増加することにより減少した（ビオチン残基の濃度で０〜１０μＭ）。低濃度域（０．０２５〜０．１μＭ）では、７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−ＺのＲｅｑ値は１ＢＩＯ−αＣＤのＲｅｑ値より比較的小さく、７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの溶液中におけるストレプトアビジンへの結合能は１ＢＩＯ−αＣＤのそれよりも大きいことが示唆された。
【００７７】
ビオチン固定化表面へのストレプトアビジン結合の複合体による阻害定数Ｋｉ値は、部分阻害値と複合体濃度の相関図（図８）と式（６）とを用いることにより計算した。図中（●）は７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚを、（▲）１ＢＩＯ−αＣＤを表す。７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚと１ＢＩＯ−αＣＤのＫｉ値はそれぞれ２．１３±０．２５と９．４８±１．０８ｎＭであった。この結果はビオチン−ポリロタキサン複合体はビオチン−α−ＣＤ複合体よりも４〜５倍、活性が強いことを示している。
【００７８】
ストレプトアビジンは４つの結合部位を有する４量体を形成することが知られており、その大きさは５．５ｎｍと推定されている。α−ＣＤの幅は０．７ｎｍで、α−ＣＤのＰＥＯ鎖（Ｍｎ：４０００）への飽和結合数は約４５とされており、ポリロタキサン柱の長さは理論上、３２ｎｍと推定されている。７８ＢＩＯ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ上でのα−ＣＤの結合数（約２２）を考慮に入れると、大部分のビオチン−ポリロタキサン複合体はストレプトアビジンの二つの結合部位をまたぐことができ、これにより、ストレプトアビジンを非共有結合的に架橋することができるであろう（図９（ａ））。一方、１ＢＩＯ−αＣＤは、すべての結合部をまたぐことができない（図９（ｂ））。したがって、ビオチン−ポリロタキサン複合体のより強い阻害活性は、ＰＥＯ鎖（ポリロタキサン骨格）上に糸状に結合したビオチン化されたα−ＣＤが列をなすことによる多価の結合の影響とみなされる。
【００７９】
（実施例５）
新規カルシウムキレートポリマーであるカルボキシエチルエステル−ポリロタキサンの合成と評価
ポリロタキサンの水酸基とピリジン中の無水コハク酸と間の反応によりカルボキシエチルエステル基を導入した。ここで、この反応を用いたのは、無水物を用いた好核反応がポリロタキサンの構造を保持することが知られているからである（Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｍａｔｅｒ．　Ｓｃｉ．　Ｐｏｌｙｍ．　Ｅｄｎ．　１０　（１９９９）　１２７５−１２８８）。
【００８０】
具体的には、カルボキシエチルエステル−ポリロタキサンは田中等の方法の変法により合成した（Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，　４７　（１９９４）　１０２５−１０２９）。カルボキシエチルエステル−ポリロタキサン（１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ）の合成経路を、以下に示す。
【００８１】
【化３】
2004027183.tif 000008
．．．（構造例３）
【００８２】
上記構造例３において、Ｚ−Ｌ−ＰｈｅによりキャップされたＰＥＯ−ＢＡに多数のα−ＣＤがその空洞を貫かれたポリロタキサンは、前記ビオチン化ポリロタキサンの場合と同様の方法により合成した。得られたポリロタキサン（α−ＣＤ数は、１Ｈ−ＮＭＲ測定により３０と決定された）（６．０３　ｘ　１０−６モル）乾燥コハク酸（３．２６　ｘ　１０−６モル）（和光純薬工業株式会社製）とを無水ピリジンに溶かし室温で攪拌した。反応混合物を過剰量のエーテルに注ぎ、３回、エーテルで洗浄した。沈殿物を遠心して集め、真空乾燥し、カルボキシエチルエステル−ポリロタキサン（ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚｓ）を得た。
ＣＥＥ−α−ＣＤはＣＥＥ−ポリロタキサンと同様に合成した。
【００８３】
得られた試料の１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムより、すべてのピークは、α−ＣＤ、ＰＥＧ末端基、そしてカルボキシエチルカルボニル基と同定できた（図１０）。さらに、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの単一のピークが検出でき、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）解析では、その溶出時間は、６ＣＥＥ−α−ＣＤよりもかなり短かった（図１１）。これらの結果は、化学修飾のあともポリロタキサンの構造が保持されていることを示している。表４は合成結果を表す。なお、カルボキシエチルエステル−ポリロタキサン（ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚｓ）のＰＥＧのＭｎは４０００（＊１）。無水コハク酸とα−ＣＤのヒドロキシル基の量比は１．０である（＊２）。ＣＥＥ基の数は１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムより求めた（＊３）。
【００８４】
【表４】
2004027183.tif 000009
【００８５】
表４に表されるように、ＣＥＥ基の数は反応時間によりコントロールすることができる。ポリロタキサン中のα−ＣＤの水酸基と無水コハク酸との量比は、ＣＥＥ基の数のコントロールには影響しなかった。ＣＥＥ基は最大１３２であった。この結果は、ＣＥＥ基がポリロタキサン中のα−ＣＤのすべての１級水酸基に導入されたことを示していた。６ＣＥＥ−α−ＣＤ中のα−ＣＤのすべての１級水酸基もまた修飾された（表２）。
【００８６】
なお、ＣＥＥ基の置換の程度は１Ｈ−ＮＭＲスペクトラム上でのＣＥＥ基のメチレンのピーク（２．２８ｐｐｍ）とα−ＣＤのＣ（１）Ｈ（４．８８ｐｐｍ）との比で推定した。
ＣＥＥ−ポリロタキサン
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ　＋　ＮａＯＤ、　ｐｐｍ）：　δ７．３５−７．１８（Ｚ−Ｌ−フェニルアラニンの芳香族）、４．８８（α−ＣＤのＣ（１）Ｈ）、４．００−３．３０（α−ＣＤのＣ（３）Ｈ、Ｃ（５）Ｈ、Ｃ（６）Ｈ、Ｃ（４）Ｈ、Ｃ（２）Ｈ）、３．５８（ＰＥＯのメチレン基）、２．２８（ＣＥＥのメチレン基）
ＣＥＥ−α−ＣＤ
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ　＋　ＮａＯＤ、　ｐｐｍ）：δ４．８８（α−ＣＤのＣ（１）Ｈ）、４．００−３．３０（α−ＣＤ　のＣ（３）Ｈ、Ｃ（５）Ｈ、Ｃ（６）Ｈ、Ｃ（４）Ｈ、Ｃ（２）Ｈ）、３．５８（ＰＥＯのメチレン基）、２．５０−２．００（ＣＥＥのメチレン基）
【００８７】
次に、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚと６ＣＥＥ−α−ＣＤを用いて、ポリロタキサンの超分子構造の影響を、さまざまｐＨにおける溶解度、カルシウムキレート、そしてトリプシン阻害に関して解析した。
【００８８】
（実施例６）
さまざまなｐＨの緩衝液中での溶解度
１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ及び６ＣＥＥ−α−ＣＤ（表１）のさまざまなｐＨのリン酸緩衝液での溶解度はフェノール硫酸法により決定した。１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ及び６ＣＥＥ−α−ＣＤの過剰量をそれぞれ０．５Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した。ｐＨは５Ｍの水酸化ナトリウム液で調整した。フェノール硫酸法は以前の報告によった（Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｌｅｔｔ（１９９８）　１０３１−１０３２）。フェノール硫酸法によるグルコース（単糖）量としての定量結果より、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの濃度とポリロタキサン上のα−ＣＤ数が計算された。
【００８９】
図１２は、さまざまｐＨにおける１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ（●）と６ＣＥＥ−α−ＣＤ（▲）の溶解度を示している。１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚと６ＣＥＥ−α−ＣＤの溶解度はｐＨ４までは、カルボキシル基のイオン化により上昇した。ｐＨ４から８の間では、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの溶解度はほぼ一定で、その後ｐＨ１１まで減少した。この減少は、ナトリウムイオンによる中和効果で説明されるだろう。水酸化ナトリウム溶液は１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ溶液のｐＨを調整するために加えられたので、ナトリウムイオン濃度はｐＨとともに上昇した。このイオンによるカルボキシル基の中和は１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの水和を減少させたであろうことが推察される。このような中和の効果はカルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）について報告されている（Ｕｎｌｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈａｒｍ．　Ａｃｔａ．　Ｈｅｌｖ．，　６７　（１９９２）　５−１０）。１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚと異なり、６ＣＥＥ−α−ＣＤの溶解度はｐＨ５から減少した。ＮＭＲスペクトラムでＣＥＥ基のピークが下方にシフトしたので、ｐＨ５からの溶解度の減少はおそらく、ＣＥＥ基とα−ＣＤの内腔との内在性複合体形成によると推定される。１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの溶解度は６ＣＥＥ−α−ＣＤの溶解度よりも低かった。これは、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ中の非修飾の水酸基（２級水酸基）間での水素結合が溶解度を減少させたことを示唆する。これらのＣＥＥのエステル結合は、ｐＨ６〜８で２ヶ月以上安定であった。
【００９０】
（実施例７）
カルシウム結合アッセー
ポリロタキサン構造のカルシウムイオンキレートにおよぼす影響を調べるためカルシウム結合アッセーを行った。
１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ（０〜１．２９　ｘ　１０−４モル）又は６ＣＥＥ−α−ＣＤ（０〜３．２３　ｘ　１０−４モル）を、１３ｍＭの塩化カルシウムを含む１Ｍの水酸化カリウムでｐＨ６．７に調整した５０ｍＭの２−Ｎ−モルホリノエタン−スルホン酸（ＭＥＳ）水溶液（ＭＥＳ／ＫＯＨ緩衝液、ｐＨ６．７）に溶かし、室温で２時間攪拌する。遊離のカルシウムイオン濃度（［Ｃａ２＋］ｆｒｅｅ）は、カルシウムイオン感受性電極（ホリバ、日本）を用いて決定した。キレートされたカルシウムイオン濃度（［Ｃａ２＋］ｂｉｎｄ）は次式により計算した。
【００９１】
［Ｃａ２＋］ｂｉｎｄ＝［Ｃａ２＋］ｔｏｔａｌ−［Ｃａ２＋］ｆｒｅｅここで［Ｃａ２＋］ｔｏｔａｌは全カルシウムイオン濃度である。
【００９２】
全カルシウムイオン濃度に対するＣＥＥの濃度（［ＣＥＥ］／［Ｃａ２＋］ｔｏｔａｌ）の関数として、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ（●）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）（■）、及び６ＣＥＥ−α−ＣＤ（▲）のそれぞれに結合しているカルシウムイオン（［Ｃａ２＋］ｂｉｎｄ）を図１３に示している。ＰＡＡの［Ｃａ２＋］ｂｉｎｄは、［ＣＥＥ］／［Ｃａ２＋］ｔｏｔａｌ値が約２〜３になるまでほぼこれに比例して増加し、その後ゆるやかに［ＣＥＥ］／［Ｃａ２＋］ｔｏｔａｌとともに増加する。この結果は、ＫｒｉｗｅｔとＫｉｓｓｅｌの以前の報告と一致するものである（Ｋｒｉｗｅｔ　ａｎｄ　Ｋｉｓｓｅｌ，　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍ．　１２７　（１９９６）　１３５−１４５）。
【００９３】
１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚは、［ＣＥＥ］／［Ｃａ２＋］ｔｏｔａｌが増加するにつれ、９０％までカルシウムイオンをキレートする。この結果は、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚのカルシウムキレート能はＰＡＡと同等か、ごくわずか劣るものであることを示している。一方、６ＣＥＥ−α−ＣＤの最大［Ｃａ２＋］ｂｉｎｄ値は、約４０％であった。おそらく、前述したＣＥＥ基とα−ＣＤの内腔との内在的複合体形成と１分子あたりのＣＥＥの数が少ないことのどちらか、あるいは両方が結合能の低下をもたらしているのであろう。したがって、ＣＥＥ基の濃度が増加するのと相関してポリロタキサンの超分子構造によりカルシウムキレートは増強される。
【００９４】
なお、ポリアクリル酸（ＰＡＡ、Ｍｗ＝２５０００）と塩化カルシウムは和光純薬工業株式会社から購入した。２−Ｎ−モルフォロノエタン−スルホン酸（ＭＥＳ）は、ナカライテスク（京都）より購入した。
【００９５】
（実施例８）
トリプシン阻害アッセー
ポリアクリル酸（ＰＡＡ）によるトリプシン阻害の機構には二つの仮説がある。一つは、カルシウムイオンキレート（Ｌｕｅｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈａｒｍ．　Ｒｅｓ．　１２　（１９９５）　１２９３−１２９８；Ｌｕｅｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｓｃｉ．　４　（１９９６）　１１７−１２８５；Ｌｕｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｏｎｔｒｏｌ．　Ｒｅｌ．　４５　（１９９７）　１５−２３）、もうひとつは酵素との直接の結合である（Ｗａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈａｒｍ．　Ｒｅｓ．　１６　（１９９９）　１０７４−１０８０）。１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚがトリプシン活性阻害に及ぼす影響を評価するために、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ、ＰＡＡ、及び６ＣＥＥ−α−ＣＤ存在下におけるトリプシンによるＮ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）の分解を調べるトリプシン阻害アッセーを行った。
以下の試料をトリプシン阻害アッセーに用いるためにＭＥＳ／ＫＯＨ緩衝液ｐＨ６．７に溶かした。
ａ）０．１８％（ｗ／ｖ）　ＰＡＡ
ｂ）０．７５％（ｗ／ｖ）　１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ
ｃ）０．６６％　６ＣＥＥ−α−ＣＤ
【００９６】
本条件において、カルボキシル基を２５ｍＭに調整した。ＭＥＳ／ＫＯＨ緩衝液を対照として用いた。
試料溶液に１．５ｍｍｏｌのＮ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルを溶かした。異なる希釈度の基質希釈液のうち５ｍｌを分解実験に使用した。分解は最終濃度２４．０国際単位／ｍｌのトリプシンをそれぞれの試料に３７℃で加えることにより開始した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分解を解析するために、反応液（５０ｕｌ）を適宜採取し１ｍｌリン酸（ｐＨ２）に希釈することでトリプシン活性を停止した。分解産物（Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン、ＢＡ）は流速０．７５ｍｌ／分での逆相カラム（ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ、２５０　ｘ　４．５　ｍｌ；ナカライテスク、京都）を用いたＨＰＬＣで分析した。移動層は、溶出液Ａ、８６％（ｖ／ｖ）１０ｍＭ酢酸アンモニア（ｐＨ　４．２）と１４％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、溶出液Ｂ、８０％（ｖ／ｖ）１０ｍＭ酢酸アンモニア（ｐＨ　４．２）と２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル。勾配溶出は以下のように行った。０〜８分：９２％Ａ／８％Ｂ、同一濃度、８〜１０分：　５０％Ａ／５０％Ｂ、直線勾配、１０〜１３分：５０％Ａ／５０％Ｂ、同一濃度。ＢＡは２５３ｎｍで検出した。この条件では６．３５分にＢＡ溶出ピークが認められた。
【００９７】
トリプシン阻害の程度は、阻害係数（ＩＦ）で表わした（Ｍａｄｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　２０　（１９９９）　１７０１−１７０８）。
ＩＦ＝ＡＵＣｃｏｎｔｒｏｌ／ＡＵＣｐｏｌｙｍｅｒ
ここでＡＵＣは、ポリマー非存在下（ＡＵＣｃｏｎｔｒｏｌ）及びポリマー存在下（ＡＵＣｐｏｌｙｍｅｒ）での、ＢＡと時間曲線のグラフの面積である。
【００９８】
図１４は、これらの複合体のトリプシン活性に及ぼす影響を塩化カルシウム（２０ｍｇ／ｍｌ）存在下及び非存在下で調べた結果を表す。この実験では、トリプシン阻害に及ぼすカルシウムイオンキレートの影響を評価するために、トリプシン反応の直前に過剰の塩化カルシウムを添加した。塩化カルシウムを添加しない状況では、水解されたＮ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（Ｎ−α―ベンゾイル−アルギニン（ＢＡ））は、時間とともに、６ＣＥＥ−α−ＣＤ＞＞１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ＞ＰＡＡの順で増加した。この順番は、カルシウムキレート能と逆の順番のようである。
【００９９】
反応の前に過剰の塩化カルシウムを加えた場合、Ｎ−α―ベンゾイル−アルギニン（ＢＡ）の量は、過剰の塩化カルシウムを加えない場合に比べて、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ及びＰＡＡの存在下では６０分にわたり増加したが、６ＣＥＥ−α−ＣＤ存在下では増加しなかった。この結果は１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−ＺとＰＡＡのカルシウムキレートがトリプシン阻害と相関していることを示している。
【０１００】
阻害効果を定量的に調べるために、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ、ＰＡＡ、及び６ＣＥＥ−α−ＣＤの６０分間の反応における阻害係数（ＩＦ）を計算した（図１５）。図中＊は、ｔ−ｔｅｓｔ（Ｐ＜０．０５）において阻害係数に有意差があることを示す。１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−ＺとＰＡＡのＩＦは過剰の塩化カルシウム添加により、有意に低下したが、６ＣＥＥ−α−ＣＤのＩＦは変化しなかった。同様のＩＦに関する結果は１８０分の反応でも得られた。
【０１０１】
過剰の塩化カルシウム存在下では、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−ＺとＰＡＡの溶液は、それぞれ懸濁液、あるいは沈殿物の状態になっていた。ＰＡＡの沈殿はＰＡＡのすべてのカルボキシル基が分子量論的にカルシウムキレートになり（Ｋｒｉｗｅｔ、Ｋｉｓｓｅｌ、１９９６）、溶液中のＰＡＡの濃度が減少していることを示唆する。一方、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの懸濁は、カルシウムキレートに関与しないＣＥＥの存在を示唆し、このことは、ＰＡＡより軽度にカルシウムキレート化を起こすことにより支持される（図１３）。ＰＡＡはトリプシンに直接に結合しその活性を低下すると考えられているので（Ｗａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ，　Ｐｈａｒｍ．　Ｒｅｓ．　１６　（１９９９）　１０７４−１０８０）、過剰の塩化カルシウムとＰＡＡ存在下では、過剰のカルシウムイオン存在下にすべてのＰＡＡが溶けていれば、ＩＦ値は増加するはずである。したがって、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚによるトリプシン阻害は比較的弱いキレート能によるカルシウムキレートによるものである。６ＣＥＥ−α−ＣＤによるトリプシン阻害効果は、ほかの原因によることが推察される。おそらく、Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）及びトリプシンの両方、あるいはそのどちらかの芳香族基が６ＣＥＥ−α−ＣＤ空洞部に包接されることによってＮ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）へのトリプシンの接触を減少させることに関連するのだろう（Ｒｅｋｈａｒｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍ．　Ｒｅｖ．　９８　（１９９８）　１８７５−１９１７）。
【０１０２】
なお、トリプシン（ＥＣ　３．４．２１．４　ＩＸ型、ブタ膵臓由来）、Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）、Ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン（ＢＡ）はシグマ（セントルイス、ＭＯ、アメリカ合衆国）より購入した。他の化合物は最も純度の高いものを用いた。
前記トリプシン阻害実験により、カルボキシエチルエステルーポリロタキサンの阻害効果は、非特異的相互作用によるものではなく、カルシウムキレートによるものであることが示された。この特性により、本発明の多価結合性分子集合体は、カルシウムキレート剤として、トリプシン等の阻害や、小腸のタイトジャンクションの開口などに用いることができ、その他にもカルシウムキレートの生物学的効果への応用が可能である。
【０１０３】
（実施例９）
ＰＥＧの分子量およびα−ＣＤの貫通数を変化させたカルボキシエチルエステル化ポリロタキサンによるトリプシン酵素活性阻害
前述の実施例から、ＣＥＥ−ポリロタキサンの酵素活性阻害は非特異的な相互作用よりもカルシウムキレートに依存することが示唆された。そこで今回ＣＥＥ−ポリロタキサンの酵素活性阻害及びそのカルシウム依存性をさらに詳しく調べるために、ＰＥＧの分子量およびα−ＣＤの貫通数を変化させ、トリプシン酵素活性阻害の測定を行った。
【０１０４】
まず、カルボキシエチルエステル化ポリロタキサンを合成した。
ここでは、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−チロシン（Ｚ−Ｌ−Ｔｙｒ）を末端に有するポリロタキサン（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量：２０００または４０００）を用いた。該ポリロタキサン６．０３×１０−６ｍｏｌをピリジン溶媒中において無水コハク酸３．２６×１０−６ｍｏｌと不均一状態で攪拌した。その後、多量のエーテルにおいて再沈殿および洗浄を行った。得られた沈殿物は遠心分離により回収され、減圧乾燥することによりカルボキシエチルエステル化ポリロタキサン（ＣＥＥ−ポリロタキサン）が得られた。α−ＣＤの貫通数およびＣＥＥ基の導入数は１Ｈ−ＮＭＲ測定により算出した。表５に合成結果を示す。
【０１０５】
【表５】
ＣＥＥ−ポリロタキサンの合成
2004027183.tif 000010
ａ　　ＣＥＥ−α／Ｅ−ＴＹＲ−Ｚ：　カルボキシエチルエステル−ポリロタキサン
ｂ　　１Ｈ−ＮＭＲスペクトルからの算出
【０１０６】
分子量４，０００および２，０００のＰＥＧを用いて合成された、α−ＣＤの貫通数及びＣＥＥ基の導入数が等しい１３２ＣＥＥ−α２２／Ｅ４−ＴＹＲ−Ｚおよび１３２ＣＥＥ−α２２／Ｅ２−ＴＹＲ−Ｚ（表５）について、そのトリプシン酵素活性阻害効果を評価した。
ＣＥＥ−ポリロタキサンのトリプシン酵素活性阻害評価は、以下のように行った。
【０１０７】
２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ＭＥＳ／ＫＯＨ，　ｐＨ　６．７）にモデル基質であるＮ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）　１．５ｍＭと各ＣＥＥ−ポリロタキサンをそれぞれ溶解した。その後、３７℃の恒温槽にて一定温度条件下にし、トリプシン（２４．０ＩＵ／ｍＬ）を加えることで酵素分解を開始した。開始後、適宜時間となったとき試料５０μＬを採り、リン酸（ｐＨ　２）１ｍＬに入れ反応を停止させた。その後高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分解産物であるＮ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン（ＢＡ）を定量した。なお、溶液中のＣＥＥ−ポリロタキサンのカルボキシル基の量は一定にして行った。
【０１０８】
ここで、ＨＰＬＣの測定条件は、以下のとおりである。
カラム：　ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（ナカライテスク）、カラム温度：３７℃、流速：０．７５ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：ＵＶ（２５３ｎｍ）、展開溶媒：Ａ液；酢酸アンモニウム緩衝溶液８６％（ｖ／ｖ）＆アセトニトリル１４％（ｖ／ｖ）、Ｂ液；酢酸アンモニウム緩衝溶液５０％（ｖ／ｖ）＆アセトニトリル５０％（ｖ／ｖ）、グラディエント；０−８　ｍｉｎ　Ａ：Ｂ＝９２：８（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）、６−１８　ｍｉｎ　Ａ：Ｂ＝５０：５０（ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）、１０−１３　ｍｉｎ　Ａ：Ｂ＝５０：５０（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）
【０１０９】
評価結果を図１６に示す。ＰＥＧ２，０００を線状分子といて含む１３２ＣＥＥ−α２２／Ｅ２−ＴＹＲ−Ｚは、ＰＥＧ４，０００を線状分子といて含む１３２ＣＥＥ−α２２／Ｅ４−ＴＹＲ−Ｚよりも酵素活性阻害が高く、さらに、ＰＡＡよりも酵素活性阻害が高く、良好なトリプシンの酵素活性阻害を示した。このことから、ＣＥＥ基の数によるよりも、α−ＣＤの貫通率が高いことによるカルボキシル基の密度がトリプシンの酵素活性阻害に重要であることが示唆された。
【０１１０】
そこで、次に、α−ＣＤの貫通数によるトリプシン酵素活性の影響を検討するために、ＰＥＧ２，０００を線状分子として含み、α−ＣＤの貫通率を１００−５０％まで変化させたＣＥＥ−ポリロタキサン（表５）を用いて、そのトリプシン酵素活性阻害について検討を行った。ここでは、ＩＦ値により評価した。
【０１１１】
ＩＦ　＝　ＡＵＣｃｏｎｔｒｏｌ　／　ＡＵＣｐｏｌｙｍｅｒ
【０１１２】
ＡＵＣは時間に対するＢＡ濃度曲線の面積であり、ＡＵＣｃｏｎｔｒｏｌは基質と酵素のみの時間−ＢＡ曲線の面積、ＡＵＣｐｏｌｙｍｅｒは基質、酵素およびＣＥＥ−ポリロタキサンが含まれている場合の時間−ＢＡ曲線の面積である。ＩＦ値が大きいほど阻害が高いことを示す。さらにここでは、酵素活性阻害のメカニズムを明確にするために、過剰のカルシウム存在下において、同様にＩＦ値を測定し、カルボキシル基が酵素活性阻害に及ぼす効果を評価した。
【０１１３】
評価結果を図１７に示す。Ｃａ２＋の添加がない条件において、α−ＣＤ貫通率が最も高くカルボキシル基の局所的密度が最も高い１３２ＣＥＥ−α２２／Ｅ２−ＴＹＲ−ＺはＩＦ値が最も高く、カルボキシル基数が少なくなるに従ってＩＦ値は減少した。これらの結果は、カルボキシル基密度とα−ＣＤ貫通率が共に大きくなるほどトリプシン阻害効果が大きくなることを示唆した。このトリプシン活性阻害のメカニズムとしては、トリプシン活性中心に存在しているＣａ２＋のキレートもしくは、トリプシンとの物理的相互作用による変性が要因として考えられる。図１７における過剰のＣａ２＋存在下におけるＩＦ値は、トリプシン活性阻害におけるＣａ２＋キレートの関与を調べたものである。
【０１１４】
測定結果によれば、１３２ＣＥＥ−α２２／Ｅ２−ＴＹＲ−Ｚでは、１以下の最も低い値を示したが、それ以外のＣＥＥ−ポリロタキサンでは依然として１以上のＩＦ値を示した（図１７）。過剰のＣａ２＋存在下では、ＣＥＥ−ポリロタキサンのカチオンキレート能が大きければ全てのカルボキシル基がＣａ２＋キレートに関与するものと考えられることから、カルボキシル基密度の高い１３２ＣＥＥ−α２２／Ｅ２−ＴＹＲ−Ｚでは、ほぼ全てのカルボキシル基がＣａ２＋キレートし、その結果、トリプシンとの物理的相互作用もしくは活性中心からのＣａ２＋キレートがなくなったものと考えられる。しかしながら、９６ＣＥＥ−α１６／Ｅ２−ＴＹＲ−Ｚと６６ＣＥＥ−α１１／Ｅ２−ＴＹＲ−Ｚでは、過剰のＣａ２＋存在下であるにも関わらず何らかのトリプシン活性阻害が残存していたので、Ｃａ２＋キレートに関与していないカルボキシル基がトリプシンとの物理的相互作用によって変性しているものと予想される。
【０１１５】
このことから、カルボキシル基密度とα−ＣＤ貫通率が共に大きくなるほどトリプシン阻害効果におけるカルシウムキレートの関与が大きくなり、カルシウムキレート剤としての効果が高いことを示唆した。
【０１１６】
（実施例１０）
次に、カルボキシル基密度とα−ＣＤ貫通率がトリプシンとの物理的相互作用に及ぼす影響を高濃度トリプシン条件での沈殿形成から検討した。α−ＣＤ数が大きくなるに伴い見かけの沈殿形成速度が大きくなり、透過率（％Ｔ）も低くなった（図１８（ａ））。さらにこの懸濁液に過剰のＣａ２＋を添加すると透過率（％Ｔ）は大きくなる傾向を示し、その見かけの透過率（％Ｔ）増加速度はＣＥＥ−α−ＣＤ数に比例していた（図１８（ｂ））。
【０１１７】
なお、図１８（ａ）および（ｂ）中、実線は６６ＣＥＥ−α１１／Ｅ２−ＴＹＲ−Ｚの結果を表し、一点鎖線は９６ＣＥＥ−α１６／Ｅ２−ＴＹＲ−Ｚの結果を表し、点線は１３２ＣＥＥ−α２２／Ｅ２−ＴＹＲ−Ｚの結果を表す。同様の傾向はポリカチオンであるポリリジンを用いたときも見られたことから、これらの沈殿形成はポリイオンコンプレックスによるものと示唆される。過剰のＣａ２＋存在下においてα−ＣＤ数が少ないにも関わらずトリプシン活性阻害が依然として見られたことは、高塩濃度条件においてもトリプシンとのポリイオンコンプレックスが解離せず、ＣＥＥ−ポリロタキサンが立体障害的にトリプシン活性を阻害しているものと考えられた。このことは逆に、ＣＥＥ−ポリロタキサン中のＣＥＥ−α−ＣＤ数の増大は、２価カチオンとの静電的相互作用に有利であり、トリプシンとのポリイオンコンプレックス解離の駆動力になったと考えられる。
【０１１８】
以上から、ＣＥＥ−ポリロタキサン中のＣＥＥ−α−ＣＤ数の変化は、トリプシンとのポリイオンコンプレックス形成に影響し、ＣＥＥ−ポリロタキサン中のＣＥＥ−α−ＣＤ数が多くなると、２価カチオンとの静電的相互作用を利用した、好ましい形態のトリプシン阻害が起こることがわかった。
【０１１９】
（実施例１１）
マルトース−ポリロタキサン複合体による多価相互作用の評価
マルトース−ポリロタキサン複合体により、多価相互作用の評価を行った。
まず、以下のように、マルトース−ポリロタキサン複合体を合成した。
α−ＣＤ水酸基がカルボキシエチルエステル化されたポリロタキサン（ＣＥＥ−ＰＲＸ）のカルボキシル基とモノアミノ化マルトース（β−マルトシルアミン）とをＢＯＰ試薬を用いた縮合反応によりマルトース（Ｍａｌ）−ポリロタキサン複合体を合成した。なお、精製は透析により行った。また比較としてＭａｌ−ポリアクリル酸（ＰＡＡ）も同様に合成した。α−ＣＤの貫通数およびＭａｌの導入率は１Ｈ−ＮＭＲにより算出した。表６に合成結果を示す。
【０１２０】
【表６】
マルトース−ポリロタキサン複合体の合成
2004027183.tif 000011
ａ　Ｍａｌ−ａ／Ｅ−ＴＹＲ−Ｚ：　マルトース−ポリロタキサン複合体
ｂ　１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから算出．
【０１２１】
次に、赤血球凝集阻害試験により、Ｍａｌ−ポリロタキサン複合体とコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）との相互作用を評価した。
９６穴プレート（Ｕ底）にＭａｌ−ポリロタキサン複合体生理食塩水溶液の希釈液２０μＬおよびＣｏｎＡ生理食塩水溶液２０μＬを加え、攪拌の後３７℃で３０分インキュベートした。その溶液に２％（ｖ／ｖ）ラット赤血球を４０μＬ加え、攪拌の後３７℃で３０分インキュベートした。赤血球の沈降状態から赤血球凝集の状態を観察し、赤血球凝集を阻害する最低濃度を決定した。なおＣｏｎＡ濃度は、赤血球凝集する最低濃度の４倍に設定した。
【０１２２】
種々のＭａｌ−ポリロタキサン複合体による赤血球凝集阻害の結果を図１９に示す。Ｍａｌでは９．１ｘ１０−３Ｍ以上で阻害効果があったが、Ｍａｌ−ポリロタキサン複合体では４．０ｘ１０−４Ｍから５．１ｘ１０−５Ｍ以上で阻害効果を示した。このようにＭａｌ−ポリロタキサン複合体ではＭａｌより２３−１８０倍の阻害効果があり、ＭａｌとＣｏｎＡとの結合においても、ポリロタキサン構造により多価相互作用性が発現したことが分かる。ＰＥＧの長さとしては、分子量１０，０００から５０，０００が阻害効果が高く、１０，０００から３５，０００が特に阻害効果が高かった。また、５１０Ｍａｌ−α１３０／Ｅ２０−ＴＹＲ−Ｚにおいて阻害効果が最大となったことから、多価相互作用性に、ポリロタキサンの超分子構造が関与していることが示唆された。
【０１２３】
そこで、阻害効果とα−ＣＤの貫通率との関係を図２０に示す。阻害効果は次式に示す相対的赤血球凝集阻害最低濃度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ＭＩＣ）により評価した。
Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ＭＩＣ　＝　（マルトースのＭＩＣ）　／　（複合体中のマルトースのＭＩＣ）
その結果、貫通率が低い場合はＲｅｌａｔｉｖｅ　ＭＩＣは高く、貫通率が高くなるとＲｅｌａｔｉｖｅ　ＭＩＣは低かった。これは、貫通率が高い場合、α−ＣＤまたはＭａｌ同士が密になり、ＣｏｎＡとＭａｌとの間に立障害が起こることで相互作用が低くなり、貫通数が低い場合は、α−ＣＤが比較的自由度を持っていることで、立体障害は低下しＣｏｎＡの結合サイトに効率良く結合したためと考えられる。
【０１２４】
（実施例１２）
Ｍａｌ−ポリロタキサン複合体における、α−ＣＤの貫通数およびＭａｌの導入率と、血液凝集阻害との関係を、より詳しく解析するために、平均分子量約２０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の線状分子に、α−ＣＤを５０、８５または１２０貫通させたカルボキシエチルエステルポリロタキサンを用いて、実施例１１と同様の方法で、図２１に表すＭａｌ−ポリロタキサン複合体を合成し、赤血球凝集阻害を測定した。図２１中、１〜３はカルボキシエチルエステルポリロタキサンの化学構造を表し、４〜８は前記１のカルボキシエチルエステルポリロタキサンを用いて合成されたＭａｌ−ポリロタキサン複合体を表し、９〜１３は前記２のカルボキシエチルエステルポリロタキサンを用いて合成されたＭａｌ−ポリロタキサン複合体を表し、１４〜１８は前記３のカルボキシエチルエステルポリロタキサンを用いて合成されたＭａｌ−ポリロタキサン複合体を表し、１９〜２３はＭａｌ−ポリアクリル酸複合体（Ｍａｌ−ＰＡＡ）を表す。
【０１２５】
Ｍａｌ−ポリロタキサンおよびＭａｌ−ＰＡＡの機能を調べるため、赤血球凝集阻害最低濃度（ＭＩＣ）を測定した。ＣｏｎＡ濃度は１．９６ｍｇ／ｍｌとした。赤血球凝集阻害の結果は図２２に表す。すべての複合体はマルトース単体よりも低濃度で赤血球凝集を阻害したことから、多価相互作用によりＣｏｎＡとの親和性が増大したことが分かる。また、どのＭａｌ−ポリロタキサン複合体もＭａｌ−ポリアクリル酸複合体よりもＭＩＣが小さくなる傾向があり、Ｍａｌ−ポリロタキサン複合体が、マルトースと親和性のある受容体であるＣｏｎＡとの多価複合体として優れていることが実証され、マルトースに代表される糖を結合したポリロタキサンが、糖リガンド認識受容体のよいリガンドになることが分かった。
【０１２６】
また、ＣＤ貫通数が少ないときには１ＣＤあたりのＭａｌ導入数を増やすほど親和性は大きくなったが（ＣＤ５０（貫通率２２％）の場合）、ＣＤ貫通数が多いときには、１ＣＤあたりのＭａｌ導入数をある程度以上増やすと却って親和性は少なくなった（ＣＤ１２５（貫通率５３％）の場合）。さらに、全体のマルトース濃度が同じ場合であっても、ＣＤ貫通数により親和性に差があり、ＣＤ貫通数は８５（貫通率３８％）の場合が各マルトース濃度を通して最も親和性が高く、Ｍａｌ導入数が２４０付近においてＣＤ貫通数が約８５（貫通率：３８％）であるときに最大の凝集阻害効果を示した。このことは、親和性が単に１分子中のＭａｌ導入数や密度に依存しているのではなく、ＣＤ貫通数に依存した最適な超分子構造的因子が存在していることを意味している。水溶液中での分子会合状態とＰＥＧ鎖中を移動するＣＤ分子のフレキシビリティーとがＣｏｎＡの分子認識に影響を与えていると考えられる。上述のように、マルトースに代表される糖リガンドとＣｏｎＡに代表される受容体との親和性は、ＤＣ貫通数に依存し、２０％から６０％程度が好ましく、３０から５０％程度が更に好ましい。
【０１２７】
【発明の効果】
本発明によると、生体内又は生体外の標的物質と効果的かつ安定に結合し得る多価結合性分子集合体、並びに、前記多価結合性分子集合体を含み、生体内又は生体外の捕捉対象を捕捉する捕捉剤、薬剤投与の際の基材となる薬剤基材、カルシウムを効果的にキレートするカルシウムキレート剤、及び、薬剤と共に使用され薬剤の吸収等を補助する薬剤補助剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（ａ）から図１（ｅ）は、ゲル浸透クロマトグラフィーによる解析結果を表す図である。
【図２】図２（ａ）から図２（ｃ）は、７５０ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの分析結果を表す図である。
【図３】図３は、ストレプトアビジン吸着表面の分布及びビオチン−ポリロタキサン複合体の結合イメージを表す図である。
【図４】図４は、ストレプトアビジン吸着表面へのビオチン−ポリロタキサン複合体の結合を表すＳＰＲによる曲線を表す図である。
【図５】図５は、ＳＰＲによるビオチン−ポリロタキサン複合体の結合解離カーブを表す図である。
【図６】図６は、図５の解離曲線を使った、ストレプトアビジンとビオチン−ポリロタキサン複合体の解離キネティクスの一次プロットを表す図である。
【図７】図７（ａ）及び図７（ｂ）は、複合体中ビオチンによる、ビオチン固定化センサー表面へのストレプトアビジン結合の阻害カーブを表す図である。
【図８】図８は、部分阻害値と複合体中のビオチン濃度の相関図である。
【図９】図９（ａ）及び図９（ｂ）は、結合のイメージを表す図である。
【図１０】図１０は、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚの１Ｈ−ＮＭＲ分析を表す図である。
【図１１】図１１は、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ及び６ＣＥＥ−α−ＣＤのゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）解析の結果を表す。
【図１２】図１２は、１３２ＣＥＥ−α／Ｅ４−ＰＨＥ−Ｚ及び６ＣＥＥ−α−ＣＤのｐＨに対する溶解度を表す図である。
【図１３】図１３は、カルシウム結合アッセーの結果を表す図である。
【図１４】図１４は、トリプシン活性に及ぼす影響を表す図である。
【図１５】図１５は、トリプシン阻害の阻害係数を表す図である。
【図１６】図１６は、ポリエチレングリコール鎖の長さがトリプシン阻害に与える影響を表す図である。
【図１７】図１７は、α−ＣＤの貫通数が異なるＣＥＥ−ポリロタキサンによるトリプシン阻害のＩＦ値を表す図である。
【図１８】図１８は、過剰のカルシウムクロライド不存在下（ａ）および存在下（ｂ）における、ＣＥＥ−ポリロタキサンとトリプシンとを含む液体の透過率変化を表す図である。
【図１９】図１９は、種々のＭａｌ−ポリロタキサン複合体による赤血球凝集阻害を表す図である。
【図２０】図２０は、α−ＣＤの貫通率と阻害効果との関係を示す表す図である。
【図２１】図２１は、Ｍａｌ−ポリロタキサン複合体およびＭａｌ−ＰＡＡの化学構造を表す図である。
【図２２】図２２は、Ｍａｌ−ポリロタキサン複合体およびＭａｌ−ＰＡＡの赤血球凝集阻害を骨格分子１モルあたりのマルトースユニットとＭＩＣの関係で表す図である。
【図１】
2004027183.tif 000012
【図２】
2004027183.tif 000013
【図３】
2004027183.tif 000014
【図４】
2004027183.tif 000015
【図５】
2004027183.tif 000016
【図６】
2004027183.tif 000017
【図７】
2004027183.tif 000018
【図８】
2004027183.tif 000019
【図９】
2004027183.tif 000020
【図１０】
2004027183.tif 000021
【図１１】
2004027183.tif 000022
【図１２】
2004027183.tif 000023
【図１３】
2004027183.tif 000024
【図１４】
2004027183.tif 000025
【図１５】
2004027183.tif 000026
【図１６】
2004027183.tif 000027
【図１７】
2004027183.tif 000028
【図１８】
2004027183.tif 000029
【図１９】
2004027183.tif 000030
【図２０】
2004027183.tif 000031
【図２１】
2004027183.tif 000032
【図２２】
2004027183.tif 000033