(57)【要約】【課題】エシェリヒア属細菌を用いて、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満になるような条件でＬ−ロイシンを効率よく生産する。【解決手段】分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼをコードするｉｌｖＥ遺伝子を不活性化させ、かつｔｙｒＢ遺伝子にコードされる芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの活性を増強させたエシェリヒア属細菌を用いて、Ｌ−ロイシンを製造する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−ロイシンを生産するエシェリヒア属細菌であって、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満である細菌。
【請求項２】
ｉｌｖＥ遺伝子を不活性化させること、又はｉｌｖＥ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を減少させることにより、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満となった、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
ｔｙｒＢ遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増加した、請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
ｔｙｒＢ遺伝子を含むＤＮＡで形質転換されることによってｔｙｒＢ遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増加した、請求項３に記載の細菌。
【請求項５】
多コピーベクターを用いて形質転換された、請求項４に記載の細菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌を培地中で培養することにより、Ｌ−ロイシンを生産させて培地中に蓄積させる工程、及びＬ−ロイシンを培地から採取する工程を含む、Ｌ−ロイシンの製造方法。
【請求項７】
前記細菌がＬ−ロイシン生合成遺伝子の発現が上昇するように改変された、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物工業、特にアミノ酸の製造方法に関する。本発明はその中でも特に、エシェリヒア属細菌を用いたＬ−ロイシンの製造方法であって、製造されるＬ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの量が製造されるＬ−ロイシンの量の１％未満である方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−アミノ酸は天然源から得られた微生物の菌株、又はＬ−アミノ酸生産能を向上させるために特別に改変された、それらの菌株の変異体を用いた発酵法により工業生産されてきた。
【０００３】
発酵法によるＬ−ロイシンの製造に用いることのできるエシェリヒア属に属する種々の菌株が知られている。具体的には、Ｌ−ロイシン耐性株又は以下のようなＬ−ロイシンアナログに耐性を有する株、すなわち、４−アザロイシンもしくは５，５，５−トリフルオロロイシンに耐性を有する株（例えば、特許文献１参照）、β−２−チエニルアラニン及びβ−ヒドロキシロイシンに耐性を有する株（例えば、特許文献２参照）、Ｌ−バリン、４−アザロイシン、３−ヒドロキシロイシン及びＬ−ロイシンに耐性を有する株（例えば、特許文献３参照）；生育にリポ酸を要求する株（例えば、特許文献４参照）；ｉｌｖＥ遺伝子産物のようなＬ−ロイシン生合成に関与する酵素の活性が増加した株（例えば、特許文献５参照）；生成したＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が脱感作されたイソプロピルリンゴ酸シンターゼのような標的酵素を保持する株（例えば、特許文献６参照）、が知られている。
【０００４】
最もよく知られているＬ−ロイシン生産株は、Ｌ−バリンと少量のＬ−イソロイシンを同時に生産する。例えば、エシェリヒア・コリＡＪ１１４７８株（例えば、特許文献７参照）は１．９ｇ／ＬのＬ−ロイシンと０．０９ｇ／ＬのＬ−バリン（Ｌ−バリンの生産量はＬ−ロイシンの生産量の４．７％である）を同時に生産する。しかし、Ｌ−ロイシンと同時に生産されるＬ−バリン及びＬ−イソロイシンが、培養液からのＬ−ロイシンの回収を不便にしている。その上、Ｌ−バリン及びＬ−イソロイシンはＬ−ロイシンと共通の前駆体である２−ケトイソ吉草酸から生じるため、これらのアミノ酸が同時に生産されるとＬ−ロイシンの生産量が減少する。
【０００５】
ところでセラチア・マルセッセンスにおいて、ノルバリン、ホモイソロイシン及びノルロイシンのような通常でないアミノ酸がそれぞれα−ケト酪酸、α−ケト−β−メチル吉草酸、α−ケト−吉草酸から、Ｌ−ロイシン生合成酵素によって生成されることが早くより示されていた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第５７４４３３１号明細書
【特許文献２】
米国特許第５７６３２３１号明細書
【特許文献３】
ロシア特許第２１４０４５０号明細書
【特許文献４】
米国特許第６２１４５９１号明細書
【特許文献５】
米国特許第５１２０６５４号明細書
【特許文献６】
欧州特許第１０６７１９１号明細書
【特許文献７】
米国特許第５７６３２３１号明細書
【非特許文献１】
ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、１９７６年、第８０巻第２号、ｐ．３３３−３３９
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、Ｌ−ロイシン生産細菌であって、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満である細菌を得ることである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼをコードするｉｌｖＥ遺伝子を不活性化することによって達成された。このアミノトランスフェラーゼはケト前駆体である２−ケト−メチル−ペンタン酸からのＬ−ロイシンの合成に関与するため、ｉｌｖＥ遺伝子を不活性化するとＬ−ロイシンの生産量が減少する。Ｌ−ロイシン合成に関与しうる他のアミノトランスフェラーゼとして、ｔｙｒＢ遺伝子にコードされる芳香族アミノ酸トランスアミナーゼがある。そこで、ｉｌｖＥ遺伝子が不活性化された場合にＬ−ロイシン合成を回復又はより増加させるため、例えばｔｙｒＢ遺伝子を含む多コピープラスミドで細菌を形質転換することによって、ｔｙｒＢ遺伝子にコードされる酵素の活性を増加させた。このようにして本発明は完成されるに至った。
【０００９】
したがって、本発明はＬ−ロイシンを生産するエシェリヒア属細菌であって、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満である細菌を提供する。さらに、本発明はＬ−ロイシンを生産するエシェリヒア属細菌であって、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満であって、かつｔｙｒＢ遺伝子にコードされる酵素の活性を増強させることによってＬ−ロイシン生産量を増加させた細菌を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、上記細菌を培地中で培養することにより、Ｌ−ロイシンを生産させて培地中に蓄積させる工程、及びＬ−ロイシンを培地から採取する工程を含む、発酵法によるＬ−ロイシンの製造法を提供する。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を提供する。
（１）　Ｌ−ロイシンを生産するエシェリヒア属細菌であって、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満である細菌。
（２）　ｉｌｖＥ遺伝子を不活性化させること、又はｉｌｖＥ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を減少させることにより、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満となった、（１）の細菌。
（３）　ｔｙｒＢ遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増加した、（２）の細菌。
（４）　ｔｙｒＢ遺伝子を含むＤＮＡで形質転換されることにより、ｔｙｒＢ遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増加した、（３）の細菌。
（５）　多コピーベクターを用いて形質転換された、（４）の細菌。
（６）　（１）〜（５）のいずれかの細菌を培地中で培養することにより、Ｌ−ロイシンを生産させて培地中に蓄積させる工程、及びＬ−ロイシンを培地から採取する工程を含む、Ｌ−ロイシンの製造方法。
（７）　前記細菌がＬ−ロイシン生合成遺伝子の発現が上昇するように改変された、（６）の方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明を、以下で詳細に説明する。
【００１３】
１．本発明の細菌
本発明の細菌はＬ−ロイシンを生産するエシェリヒア属細菌であって、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満である細菌である。
【００１４】
ここでいう「Ｌ−ロイシンを生産する細菌」という用語は、エシェリヒア・コリＫ−１２株のようなエシェリヒア・コリの野生株又は親株よりも多い量のＬ−ロイシンを生産して培地中に蓄積させることのできる細菌を意味し、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上の量のＬ−ロイシンを生産し培地中に蓄積することができる細菌を意味し、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量のＬ−ロイシンを生産し培地中に蓄積することができる細菌を意味する。
【００１５】
「エシェリヒア属細菌」という用語は、微生物学の分野における当業者に知られた分類に従ってエシェリヒア属に分類される細菌を意味する。本発明において用いるエシェリヒア属細菌の例として、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる
【００１６】
「Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満である」という文言は、Ｌ−ロイシン生産菌の培養完了後の培地中に存在するＬ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの量が、主産物であるＬ−ロイシンの生産量と比較して有意に少ないことを意味する。培地中に存在するＬ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの量がＬ−ロイシンの生産量と比較して有意に少ないとは、例えば、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの量がそれぞれＬ−ロイシンの生産量の１％未満、好ましくは０．５％未満、より好ましくは０．１％未満である場合をいう。特に好ましくは、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの量が、通常の方法によって、例えば薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）又はＨＰＬＣによって、検出できない量であることを意味する。
【００１７】
「ｉｌｖＥ遺伝子を不活性化する」という語句は、標的遺伝子を、改変遺伝子が、通常の方法では活性を検出できないような変異体酵素（不活性化酵素）をコードするように改変すること、又は改変遺伝子が酵素を発現できないように改変することを意味する。ｉｌｖＥ遺伝子は、α−ケトカルボン酸及びその塩のアミノ化反応を触媒することができる分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（３０９アミノ酸残基）をコードする。分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼは、例えば、α−ケトカプロン酸をＬ−ロイシンに、α−ケトイソ吉草酸をＬ−バリンに、α−ケト−β−メチル吉草酸をＬ−イソロイシンにそれぞれ変換する。ｉｌｖＥ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＣ＿０００９１３．１，　ｇｉ：１６１３１６２８の３９５０１０７番目から３９５１０３６番目）はｉｌｖＭ遺伝子とｉｌｖＤ遺伝子の間に位置する。遺伝子の不活性化は、紫外線照射やニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）処理を用いた変異処理、部位特異的変異法、相同組換え又は／及び挿入−欠失変異法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　２０００年，　第９７巻第１２号，　ｐ６６４０−６６４５）を用いた遺伝子破壊のような通常の方法により行うことができる。
【００１８】
「ｉｌｖＥ遺伝子にコードされるタンパク質の活性を減少させる」という文言は、ｉｌｖＥ遺伝子のタンパク質をコードする配列又はｉｌｖＥ遺伝子の発現制御配列を細胞あたりの酵素活性が低下するように改変することを意味する。タンパク質の活性を減少させる操作も、紫外線照射やニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）処理を用いた変異処理、又は部位特異的変異法を行った後に所望の表現型を持つ細菌を選択するというような、通常の方法によって行うことができる。前記タンパク質に「漏出型（ｌｅａｋｙ−ｔｙｐｅ）」変異を有する細菌も本発明において用いることができる。漏出型変異を有するタンパク質は、配列の改変によって活性が完全には消失しない変異タンパク質である（Ｇｅｎｅｓ　ＶＩＩ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｐｒｅｓｓ，　２０００年，　ｐ１６）。
【００１９】
本発明の細菌はまた、Ｌ−ロイシンを生産するエシェリヒア属細菌であって、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満であって、かつｔｙｒＢ遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増強した細菌でもあってもよい。
【００２０】
「ｔｙｒＢ遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増強した細菌」という語句は、細胞内の前記タンパク質分子の量が増加すること、または同タンパク質自身の活性が増加することを意味する。ｔｙｒＢ遺伝子は、グルタミン酸をアミノ基ドナーに用いて、アミノ基転移によりフェニルピルビン酸や４−ヒドロキシフェニルピルビン酸のようなα−ケト酸をそれぞれフェニルアラニンやチロシンのようなアミノ酸へ変換する反応を触媒する芳香族アミノ酸トランスアミナーゼ（３９７アミノ酸残基）をコードする。しかしここでは、「活性」という用語はグルタミン酸をアミノ基ドナーに用いて、α−ケトカプロン酸をＬ−ロイシンに変換する活性（エシェリヒア・コリとサルモネラ第２版、主編集者：Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ、ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｔｏｎ　Ｄ．Ｃ．、１９９６年）を意味することとする。ｔｙｒＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＣ＿０００９１３．１，　ｇｉ：１６１３１８８０の４２６４６９３番目から４２６５８８６番目）はａｌｒ遺伝子とａｐｈＡ遺伝子の間に位置している。
【００２１】
タンパク質の活性を増加させる技術、特に細胞内のタンパク質分子の量を増加させる技術としては、遺伝子のコピー数を増加させたり、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現性制御配列やエンハンサー配列を変えたりすることが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
「ｔｙｒＢ遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換する」という語句は、例えば従来の遺伝子のコピー数を増加させる方法によって、該ＤＮＡを細菌細胞に導入することを意味する。遺伝子のコピー数は、遺伝子を多コピーベクターに挿入して組換えＤＮＡを作製し、かかる組換えＤＮＡを微生物に導入することによって増加させてもよい。組換えＤＮＡの導入に用いることのできるベクターとして、例えばｐＭＷ１１８、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＡＣＹＣ１８４等のプラスミドベクター、ｌ１０５９、ｌＢＦ１０１、Ｍ１３ｍｐ９、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）等のファージベクター、及びＭｕ、Ｔｎ１０、Ｔｎ５等のトランスポゾン（Ｂｅｒｇ，　Ｄ．Ｅ．　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｃ．Ｍ．，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，　第１巻第４１７頁、１９８３年）が挙げられる。相同組換え用プラスミド等を用いる方法により遺伝子を染色体に組込むことによって、遺伝子のコピー数を増加させることもできる。
【００２３】
発現制御配列やエンハンサー配列を変化させる技術を、遺伝子のコピー数を増加させる技術と組み合わせることもできる。
【００２４】
上記遺伝子の発現量が増加したエシェリヒア属細菌を作製するためには、主にエシェリヒア・コリ遺伝子の既に入手可能となった情報に基づいたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって、遺伝子の必要な領域を取得してもよい。例えば、ｔｙｒＢ遺伝子はエシェリヒア・コリＫ１２株又はエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡからＰＣＲ法を用いてクローン化することができる。
【００２５】
ｔｙｒＢ構造遺伝子を強力なプロモーターの制御下に置くことによって、ｔｙｒＢタンパク質をコードするＤＮＡの発現制御配列を改変することができる。強力なプロモーターとしては、例えばｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λファージのＰＬプロモーターが知られている。一方で、例えばプロモーター下流に位置する遺伝子の転写レベルを増加させるような変異をプロモーターに導入することによって、プロモーター活性を増強させることもできる。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンの間のスペーサー領域における数塩基の置換、特に開始コドンの直近の上流配列の置換がｍＲＮＡの翻訳効率に大きく影響することも知られている（Ｇｏｌｄら、Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　第３５巻、３６５−４０３頁、１９８１年；Ｈｕｉら、ＥＭＢＯ　Ｊ、第３巻、６２３−６２９頁、１９８４年）。
【００２６】
さらには遺伝子の転写レベルを増加させるために、エンハンサーを新たに導入してもよい。遺伝子又はプロモーターを含むＤＮＡを染色体に導入する技術は、例えば国際公開ＷＯ第００／１８９３５号パンフレット及び特開平１−２１５２８０号公報に記載されている。
【００２７】
Ｌ−ロイシン生合成に関与する一又はそれ以上の遺伝子の発現を増加させることによって、本発明の細菌をさらに改良してもよい。そのような遺伝子としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害に脱感作された（欧州特許第１０６７１９１号明細書）イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｌｅｕＡ遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＣ＿０００９１３．１，　ｇｉ：１６１２８０６８の８１９５８番目から８３５２９番目）を含む、Ｌ−ロイシンオペロン、すなわちｌｅｕオペロン内の遺伝子を例示することができる。Ｌ−ロイシンオペロンはｌｅｕＢ（ｇｉ：　１６１２８０６７）、ｌｅｕＣ（ｇｉ：　１６１２８０６６）、ｌｅｕＤ（ｇｉ：　１６１２８０６５）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＣ＿０００９１３．１，それぞれ８０８６７番目から８１９６１番目；７９４６４番目から８０８６４番目；７８８４８番目から７９４５３番目）も含む。
【００２８】
ｉｌｖＥ遺伝子にコードされる分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼを不活性化させ、ｔｙｒＢ遺伝子にコードされる芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの活性を増強させるための親株としては、エシェリヒア・コリＫ１２株又はエシェリヒア・コリＷ１６００株などのようなエシェリヒア属細菌を用いることができる。また親株として、４−アザロイシン又は５，５，５−トリフルオロロイシンに耐性を有する、エシェリヒア・コリＨ−９０６８株（ＡＴＣＣ２１５３０）、エシェリヒア・コリＨ−９０７０株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４７０４）、エシェリヒア・コリＨ−９０７２株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４７０６）（米国特許第５７４４３３１号明細書）、Ｌ−ロイシンによるイソプロピルリンゴ酸シンターゼのフィードバック阻害が脱感作されたエシェリヒア・コリ株（欧州特許第１０６７１９１号明細書）、β−２チエニルアラニン及びβ−ヒドロキシロイシンに耐性を有するエシェリヒア・コリＡＪ１１４７８株（米国特許第５７６３２３１号明細書）などのようなＬ−ロイシン生産エシェリヒア属細菌を用いることもできる。
【００２９】
プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択などの方法は、当業者によく知られた一般的な方法を用いることができる。これらの方法は、例えば「モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）に記載されている。
【００３０】
２．本発明の方法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地中で培養することにより、Ｌ−ロイシンを生産させて培地中に蓄積させる工程と、Ｌ−ロイシンを培地から採取する工程を含む、Ｌ−ロイシンの製造方法である。
【００３１】
本発明において、培養、Ｌ−アミノ酸の培地からの採取及び精製等は、細菌を用いてアミノ酸を製造する従来の発酵法と同様の方法で行うことができる。
【００３２】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源及びミネラルを含み、さらに必要に応じて細菌の生育に必要な適量の栄養源を含む培地であれば、合成培地であっても、天然培地であってもよい。炭素源はグルコースやスクロースなどの様々な炭化水素及び様々な有機酸を含むものであってもよい。用いる微生物の同化の機構によっては、エタノールやグリセロールなどのアルコールを用いることもできる。窒素源としては、アンモニアや硫酸アンモニウムのような様々なアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトンのような天然の窒素源、大豆加水分解物及び消化された発酵性微生物などを用いることができる。ミネラルとしては、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウムなどを用いることができる。ビタミンとしては、チアミンや酵母エキスなどを用いることができる。
【００３３】
培養は振とう培養や通気攪拌培養のような好気条件下において、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の温度で行うことができる。培養ｐＨは通常５と９の間であり、好ましくは６．５〜７．２の間である。培地のｐＨはアンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、緩衝液などで調整できる。通常、１〜５日の培養で、目的のＬ−アミノ酸が培地中に蓄積する。
【００３４】
培養後、細胞などの固体は遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除くことができ、Ｌ−ロイシンを採取してイオン交換、濃縮、結晶化法によって精製することができる。
【００３５】
【実施例】
以下実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１：Ｌ−ロイシン産生エシェリヒア属細菌の調製
エシェリヒア・コリＫ１２野生株（ＶＫＰＭ　Ｂ−７）の細胞を変異誘導物質であるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（０．０５ｍｇ／ｍｌ）で３７℃、２０分間処理し、生理的溶液で４回洗ったのち、４．０ｍｇ／ｍｌのＤＬ−４−アザロイシンを添加したＭ９最小寒天培地上で平板培養した。培養プレートは３７℃で５日間インキュベートした。プレート上に出現したコロニーをピックアップし、Ｌ−寒天プレートに線状に培養して単一菌体を得た。得られたＤＬ−４−アザロイシンに耐性を示す変異体のうち最良の変異株である変異株５５は、２．１ｇ／ＬのＬ−ロイシンと０．８ｇ／ＬのＬ−バリンを生産した（表１、下記参照）。このエシェリヒア・コリ５５株を選択し、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの二重栄養要求性の誘導に用いた。多くの二重栄養要求性株、すなわち生育にＬ−イソロイシン及びＬ−バリンを要求する株が得られた。得られた二重栄養要求性株の中で最良のＬ−ロイシン生産株である、Ｌ−ロイシンを１．３ｇ／Ｌ生産する５０５株を選択した。この株はＬ−バリン及びＬ−イソロイシンを生産しなかったが、二重栄養要求性のためにＬ−ロイシンの生産が減少した。
【００３７】
Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの二重栄養要求性はｉｌｖＥ遺伝子の変異によって引き起こされた。このことは、ｉｌｖＥ遺伝子を含むプラスミド（米国特許第５１２０６５４号明細書）を５０５株に導入することによって、５０５株のＬ−イソロイシン及びＬ−バリン二重栄養要求性が相補されたことから証明された。さらに、５０５株においてｉｌｖＥ遺伝子にコードされる分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性を２−ケトイソ吉草酸を基質に用いて測定したところ、その活性が存在しないことがわかった。酵素活性測定の条件はＣｏｌｌｅｒＲ．Ｈ．　ａｎｄ　Ｋｏｈｌｈａｗ　Ｇ．の文献　（エシェリヒア・コリにおけるトランスアミナーゼＡのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ成分と芳香族アミノトランスフェラーゼ成分の非同一性：Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９７２年、第１１２巻第１号、ｐ３６５−３７１）に記載されている。
【００３８】
エシェリヒア・コリ５０５株はロシア国立工業微生物コレクション（ＶＫＰＭ）（ロシア１１３５４５、モスクワ、１　Ｄｏｒｏｚｈｎｙ　ｐｒｏｅｚｄ、１）に、２００１年５月１４日にＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＶＫＰＭ　Ｂ−８１２４で寄託された。
【００３９】
実施例２：エシェリヒア・コリｔｙｒＢ遺伝子のｐＡＣＹＣ１８４プラスミドへのクローン化
エシェリヒア・コリＫ１２株（ＶＫＰＭ−７）のｔｙｒＢ遺伝子を含む染色体フラグメントを、２種類のプライマー、すなわち配列表に示すプライマー１（配列番号１）とプライマー２（配列番号２）を用いたＰＣＲ法により増幅した。プライマー１、２（いずれも２４塩基）はそれぞれ５’末端にＢａｍＨＩ部位、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む配列を含有する。得られた１．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｃｈａｎｇ，　Ａ．Ｃ．Ｙ．　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ，　Ｓ．Ｎ．「Ｐ１５Ａ小サイズプラスミドに由来する増幅可能な多コピーＤＮＡクローニングベクターの構築及び構造解析」ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．第１３４巻、１１４１−１１５６頁、１９７８年；Ｒｏｓｅ　Ｒ．Ｅ．「ｐＡＣＹＣ１８４の塩基配列」Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．第１６巻、３５５頁、１９８８年）の対応する部位に連結し、ｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢを得た。プラスミドｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢを形質転換によりエシェリヒア・コリ５０５株の細胞に導入し、５０５／ｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢ株を構築した。
【００４０】
実施例３：ｔｙｒＢ遺伝子増幅のＬ−ロイシン生産に与える影響
５５、５０５、５０５／ｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢのそれぞれの株をプレートから一掻き分、Ｌ−培地を入れた２０ｍｌの試験管に移し、３２℃で一晩、通気しながら培養した。一晩培養した培養物の０．１ｍｌをそれぞれ２０ｍｌの試験管（内径２２ｍｍ）に移し、２ｍｌの発酵用培地に懸濁して、回転振とう培養機により３２℃で４８時間培養した。発酵用培地は６０ｇ／Ｌのグルコース、２５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．１ｍｇ／Ｌのチアミン、５ｇ／Ｌの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）及び２５ｇ／Ｌのチョークを含むもの（ｐＨ７．２）を用いた。グルコースとチョークは別々に滅菌した。
【００４１】
培養後に、プラスミドの安定性を従来法により決定した。また、培地中に蓄積したＬ−ロイシンの量はＴＬＣによって決定した。ＴＬＣの液層の組成は以下のとおりである：イソプロパノール８０ｍｌ、エチル酢酸８０ｍｌ、３０％水酸化アンモニウム２５ｍｌ、水５０ｍｌ。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
表１に見られるように、５０５及び５０５／ｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢ株はＬ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ホモロイシンを生産しなかった。しかし、５０５株ではｉｌｖＥ遺伝子の不活性化によってＬ−ロイシンの生産量の減少が生じた。５０５／ｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢ株においては、ｔｙｒＢ遺伝子の増幅によってＬ−ロイシン生産５０５株のＬ−ロイシン蓄積能が向上した。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のエシェリヒア属細菌を用いてＬ−ロイシンを生産することにより、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−ホモロイシンの生産量がＬ−ロイシンの生産量の１％未満になるような条件でＬ−ロイシンを効率よく生産することができる。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｌ−ロイシン及びＬ−バリンの代謝経路を示す図。
【図１】
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