(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＩＶ治療に有効な新規化合物の提供。【解決手段】任意に薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤中の以下の式（Ｉ）を有するエナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキサニルプリンヌクレオシドのＨＩＶ治療量を投与することを包含する、ＨＩＶに感染したヒトの治療のための方法および組成物であり、ここで、Ｒは、ＯＨ、Ｃｌ、ＮＨ２、またはＨ、あるいはその化合物の薬学的に受容可能な塩または誘導体である。2004149543.tif 000026【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有するエナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラニルヌクレオシド：
【化１】
2004149543.tif 000025
ここで、ＲはＮＨ２であり、そしてＸは、水素、アルキル、アシル、モノホスフェート、ジホスフェート、およびトリホスフェートからなる群より選択され、そして該化合物の９７％は、対応するβ−Ｌ−エナンチオマーを含まない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府は、国立アレルギー感染病研究所の公衆衛生局、および本発明に導く研にを一部資金を供給した退役軍人局の助成金により本発明の権利を有する。
本発明は、抗ウイルス活性を有する有機化合物の分野であり、特に、エナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソランヌクレオシドの調製プロセス、および１つ以上の記載した化合物の有効量を投与する工程を含むウイルス性疾患の治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
多くの２’，３’−ジデオキシヌクレオシドは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こす因子である、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する強力な抗ウイルス剤であることが見いだされている。ＡＺＴ（３’−アジド−２’−デオキシチミジン、Ｍｉｔｓｕｙａ，Ｈ．；Ｂｒｏｄｅｒ，Ｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８６  ８３，１９１１）は、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連合併症患者の治療用に、米国食品医薬品庁に承認された最初の化合物である。他の合成ヌクレオシドは、現在のところ、承認されているかまたは種々のステージの臨床試験を実行中であり、これらには、２’，３’−ジデオキシイノシン（ＤＤＩ）、２’，３’−ジデオキシシチジン（ＤＤＣ）（Ｙａｒｃｈｏａｎ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４５，４１２を参照のこと）、および２’−フルオロ−アラビノフラノシル−２’，３’−ジデオキシシチジン（Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．Ａ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，３３，２１３７；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．Ａ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，３３，２１４５；Ｓｔｅｒｚｙｃｋｉ，Ｒ．Ｚ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，３３，２１５０）が含まれる。
【０００３】
細胞キナーゼによる５’−トリホスフェートへの細胞リン酸化の後、これらの合成ヌクレオシドは増殖中のウイルスのＤＮＡ鎖に取り込まれて、３’−ヒドロキシル基がないために鎖の停止を引き起こし得る。
【０００４】
ヌクレオシド誘導体の立体化学は、それらの生物学的活性に重要な役割を果たす。ヌクレオシド中のリボースのＣ１’位（ヘテロ環塩基の窒素に結合した炭素）は、炭素が４つの異なる部分に結合するので、キラル中心である。同様に、ヌクレオシドのＣ４’位（ヌクレオチド中でリン酸化されているヒドロキシメチル基に結合した環の炭素）に、光学活性中心がある。天然に存在するヌクレオシド中で、Ｃ１’に結合する塩基およびＣ４’原子に結合するヒドロキシメチル基の両方ともβ配置（糖の平面上）である。対応する天然に存在しないα異性体（その部分が糖の平面の下である）はほとんど生物学的活性がなく、典型的には毒性である。
【０００５】
最近、６つの活性な抗ＨＩＶヌクレオシド剤および２つの不活性な抗ＨＩＶヌクレオシド剤の固体状態のコンフォメーションの解析が行われ、ある立体化学的特徴の存在または非存在を高ＨＩＶ活性と関連づけることが試みられた。Ｖａｎ  Ｒｏｅｙ，Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８８，１１０，２２７７；およびＶａｎ  Ｒｏｅｙ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９，８６，３９２９。
【０００６】
ヌクレオシドの３’炭素がヘテロ原子と置換されているヌクレオシド誘導体の合成が最近興味が持たれている。Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，１９８９，３０，６２６３中でＮｏｒｂｅｃｋ，Ｄ．Ｗ．らは、（±）−１−［（２β，４β）−２−（ヒドロキシメチル）−４−ジオキソラニル］チミン（以下（±）−ジオキソラン−Ｔという、図１を参照のこと）の合成を報告し、Ｃ４’原子についてジアステレオマーのラセミ混合物を得ている。生成物は、Ｃ３’原子がＯ３’原子に置換された３’−デオキシチミジンの誘導体である。この生成物は、ベンジルオキシアルデヒドジメチルアセタールと（±）−メチルグリセレートから５つの工程で合成され、１：１のジアステレオマー混合物を７９％の収率で得た。生成物のＸ線結晶解析により、ジオキソラン環は、エンド位にＯ３’原子を有し、通常リボヌクレオシドで見られる３Ｔ４コンフォメーションを採っていることが明らかになった。Ｎｏｒｂｅｃｋは、ジオキソラン−Ｔのラセミ混合物がＡＴＨ８細胞で２０μＭの抗ＨＩＶ活性を示し、ウイルスに対する低い有効性がＯ３’原子のエンドコンフォメーションの影響のためであることを報告した。Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３０（４６），６２４６，（１９８９）。
【０００７】
ＩＡＦ  ＢｉｏＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．に譲渡されているヨーロッパ特許出願第０  ３３７  ７１３号および米国特許第５，０４１，４４９号には、一般式２−置換−４−置換−１，３−ジオキソランが抗ウイルス活性を示すことを開示している。
【０００８】
Ｂｅｌｌｅａｕらは、ＡＩＤＳについての第５回国際会議（モントリオール、カナダ、１９９０年６月４〜９日、論文番号Ｔ．Ｃ．Ｏ．１．）において、３’位に酸素または硫黄を含むシチジンヌクレオシドの合成方法を報告した。ジオキソラン環はＲＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯとグリセリンとの縮合により調製された。Ｎｏｒｂｅｃｋの合成と同様に、Ｂｅｌｌｅａｕの合成は、ヌクレオシドのＣ４’炭素についてジアステレオマーのラセミ混合物を生じる。Ｂｅｌｌｅａｕは、ＮＧＢＰ−２１または（±）ＢＣＨ−１８９（図１を参照）と呼ばれる硫黄アナログが抗ＨＩＶ活性を有することを報告した。
【０００９】
Ｂｅｌｌｅａｕのヨーロッパ特許出願第９２３０００５６．６号はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の治療のためのＢＣＨ−１８９の使用を開示している。ＢＣＨ−１８９は現在米国食品医薬品庁の監督下で臨床試験中である。
【００１０】
米国特許第５，０４７，４０７号およびヨーロッパ特許出願第０  ３８２  ５２６（これもまたＩＡＦ  ＢｉｏＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．に譲渡されている）は、一般式２−置換−５−置換−１，３−オキサチオランヌクレオシドが抗ウイルス活性を有することを開示している。
【００１１】
本出願の優先日当時には、エナンチオマー的に純粋なジオキソランヌクレオシドを生じ、そして天然に見いだされるヌクレオシド（β立体異性体）と同じ立体化学を有する、３’位に酸素を有するヌクレオシドアナログの合成方法は報告されていない。ヌクレオシド誘導体の抗ウイルス活性への立体化学の影響についてのさらなる情報および新規な抗ＨＩＶ剤を提供するための研究手段となるような合成が必要とされている。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、エナンチオマー的に純粋なジオキソランヌクレオシドの合成方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、著しい抗ＨＩＶ活性を有するエナンチオマー的に純粋なジオキソランヌクレオシドを提供することである。
【００１４】
（発明の要旨）
ＨＩＶに感染したヒトの治療方法は、以下の式のエナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラニルプリンヌクレオシドのＨＩＶ治療量を投与する工程を含む：
【００１５】
【化１】
2004149543.tif 000002
ここで、ＲはＯＨ、Ｃｌ、ＮＨ２、またはＨ、あるいは薬学的に受容可能な塩または該化合物の誘導体であり、任意に薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む。Ｒがクロロである化合物は、特に、（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−６−クロロ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］プリンと称する。Ｒがヒドロキシである化合物は、（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］グアニンである。Ｒがアミノである化合物は、（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］アデニンである。Ｒが水素である化合物は、（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］プリンである。
【００１６】
特に開示したβ−Ｄ−ジオキソランヌクレオシド、あるいはそれらの薬学的に受容可能な誘導体または塩もしくはこれらの化合物を含む薬学的に受容可能な処方物は、ＨＩＶ感染および他の関連症状（例えば、ＡＩＤＳ関連合併症（ＡＲＣ）、存続全身性リンパ節症（ＰＧＬ）、ＡＩＤＳ関連神経学的症状、抗ＨＩＶ抗体ポジティブおよびＨＩＶポジティブ症状、カポジ肉腫、血小板減少性紫斑病、および日和見感染）の治療に有用である。さらに、これらの化合物または処方物は、予防的に用いられて、抗ＨＩＶ抗体またはＨＩＶ抗原ポジティブである個体あるいはＨＩＶに曝されている個体での臨床病の進行を遅らせ得る。
【００１７】
他の実施態様によれば、本発明は、特に開示したエナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラニルプリンヌクレオシドのプロドラッグのＨＩＶ治療量を投与する工程を包含する、ＨＩＶに感染したヒトの治療方法を含む。本明細書中で使用されるプロドラッグとは、特に開示したヌクレオシドの薬学的に受容可能な誘導体を指し、これは、インビボの投与でヌクレオシドに変換される。限定されない例は、薬学的に受容可能な塩（代わりに「生理学的に受容可能な塩」と称す）、ならびに活性化合物の５’およびＮ６アシル化またはアルキル化誘導体（代わりに「生理学的または薬学的に受容可能な誘導体」と称す）である。ある実施態様では、アシル基はカルボン酸エステルであり、そのエステル基の非カルボニル部分は、直線状、分枝状、または環状Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アルコキシアルキル（メトキシメチルを含む）；アラルキル（ベンジルを含む）；アリールオキシアルキル（例えば、フェノキシメチル）；アリール（例えば、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４アルキルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシで任意に置換されたフェニル）；ジカルボン酸（例えば、コハク酸）；スルホネートエステル（例えば、メタンスルホニルを含むアルキルまたはアラルキルスルホニル）；およびモノ、ジ、およびトリホスフェートエステルから選択される。
【００１８】
本明細書で用いられるように、アルキルという用語は、詳細には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、イソペンチル、アミル、ｔ−ペンチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルを含むが、これらには限定されない。本明細書中で用いられるように、アシルという用語は、詳細にはアセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、３−メチルブチリル、水素スクシネート（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、３−クロロベンゾエート、ベンゾイル、アセチル、ピバロイル、メシレート、プロピオニル、バレリル、カプロイック、カプリリック、カプリック、ラウリック、ミリスチック、パルミチック、ステアリック、およびオレイックを含むが、これらには限定されない。活性化合物の改変、特にＮ６および５’−Ｏ位における改変は、活性種のバイオアベイラビリティーおよび代謝速度に影響を与え、それ故活性種の送達にコントロールを提供し得る。
【００１９】
エナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラニルプリンヌクレオシドは、適当なエステル化剤（例えば、酸ハライドまたは酸無水物）との反応により薬学的に受容可能なエステルに変換され得る。ヌクレオシドまたはその薬学的に受容可能な誘導体は、従来の方法で（例えば、適当な塩基との処理により）それらの薬学的に受容可能な塩に変換され得る。エステルまたは塩は、例えば加水分解により、親ヌクレオシドに変換され得る。
【００２０】
開示される本発明はまた、エナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドの調製について非対称プロセスを含む。このプロセスは、１，６−アンヒドロマンノースからの（２Ｒ，４Ｒ）−および（２Ｒ，４Ｓ）−４−アセトキシ−２−（保護化オキシメチル）−ジオキソランを最初に調製することを含む。ここで糖は、エナンチオマー的に純粋な最終生成物に必要な立体化学を含み、糖の１位（後に形成されるヌクレオシドの４’位になる）について適切なジアステレオマー配置を含む。
【００２１】
（２Ｒ，４Ｒ）−および（２Ｒ，４Ｓ）−４−アセトキシ−２−（保護化オキシメチル）−ジオキソランは、ＳｎＣｌ４、他のルイス酸、またはトリメチルシリルトリフレートの存在下、有機溶媒（例えば、ジクロロエタン、アセトニトリル、または塩化メチレン）中で、所望のヘテロ環塩基と縮合され、立体化学的に純粋なジオキソラン−ヌクレオシドを得る。
【００２２】
いかなる所望のエナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソランプリンまたはピリミジンヌクレオシドも、本明細書中に開示されたプロセスに従って調製され得る。生成物は、インビトロでのＨＩＶの阻害を研究するための研究手段として用いられ得、またはインビボでＨＩＶの増殖を阻害するための薬学的組成物で投与され得る。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で用いられるように、用語「エナンチオマー的に純粋な」は、ヌクレオシドの単一のエナンチオマーを少なくとも９７％を含む、ヌクレオシド組成物を指す。
【００２４】
Ｉ．エナンチオマー的に純粋なジオキソランヌクレオシドの調製
エナンチオマー的に純粋なジオキソランヌクレオシドの調製において、ジオキソラン環を開裂させる強酸性条件を避けるよう注意を払うべきである。可能であれば、反応は塩基性または中性条件で行われるべきであり、そして酸性条件が必要なときは、反応時間を最小にすべきである。
【００２５】
Ａ．エナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドの調製
エナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドの合成で重要な開始物質は、１，６−アンヒドロマンノースである（化合物１、図２）。この糖はエナンチオマー的に純粋な最終生成物（例えば、化合物１１、図２を参照のこと）に必要なすべての立体化学を含み、糖の１位（後に形成されるヌクレオシドの４’位になる）について適切なジアステレオマー配置を含む。１，６−アンヒドロマンノースは、Ｋｎａｕｆ，Ａ．Ｅ．；Ｈａｎｎ，  Ｒ．Ｍ．；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃ．Ｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４１，６３，１４４７；およびＺｏｔｔｏｌａ，Ｍ．Ａ．；Ａｌｏｎｓｏ，Ｒ．；Ｖｉｔｅ，Ｇ．Ｄ．；Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ，Ｂ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５４，６１２３に記載された手順にしたがって調製され得る。ジオキソランヌクレオシドの以前の合成は、リボース部分の調製に出発物質のラセミ混合物を使用した。試薬のラセミ混合物を用いて合成を開始すると、エナンチオマー性のヌクレオシド生成物の望ましくないラセミ混合物が生成された。この混合物は、分離するのが非常に難しく、そして最終生成物の費用を著しく増加させる。さらに、天然に存在しない異性体の含有は生成物の毒性を増加させる。
【００２６】
１，６−アンヒドロマンノースは、ジメトキシプロパンとｐ−トルエンスルホン酸とでイソプロピリデン誘導体に変換され、単離することなく、化合物２の４位でベンゾイル化される（図２を参照のこと）。アシル基もまた４位を保護するために用いられ得る。次いで、化合物２のイソプロピリデン基は、触媒量の酸（例えば、硫酸、塩酸、蟻酸、トリフルオロ酢酸、スルファミン酸）により、６０％のジオキサン水溶液または他の適当な有機溶媒中で、約０〜５０℃の温度範囲で除去されて、（−）−１，６−アンヒドロ−４−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−マンノピラノースを白色固体として高収率で得る。
【００２７】
次の工程では、（−）−１，６−アンヒドロ−４−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−マンノピラノースのグリコールは、おおよそ室温で１時間、Ｈ２Ｏ／ＥｔＯＨ（１：１）中のＮａＩＯ４で処理することにより、酸化的に開裂されて、対応するジアルデヒドを生成する。四酢酸鉛はまたこの反応の酸化剤として用いられ得る。ジアルデヒドは、おおよそ室温またはそれ以下で、ＮａＢＨ４、ジイソブチルアルミニウムヒドリド（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）、水素化ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ４）、またはビス（２−メトキシエトキシ）−アルミニウムヒドリドナトリウム（Ｒｅｄ−Ａｌ）を含むすべての適当な還元剤で、その場ですぐに還元される。反応条件下で、化合物４は、２位から１位へのベンゾイルの移動により異性体化して、（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ベンゾキシ−１−ヒドロキシエチル）−２−（ヒドロキシメチル）−ジオキソラン（化合物５、図２）を生成する。
【００２８】
次いで、ジオキソランの２位は、例えば、３置換シリル基（トリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルなど）、トリチル、アルキル基、アシル基（アセチル、プロピオニル、ベンゾイル、ｐ−ＮＯ２ベンゾイル、またはトルイルなど）、メチルスルホニル、またはｐ−トルイルスルホニルなどの適当な酸素保護基で保護される。好ましい保護基はｔ−ブチルジフェニルシリルである。ジオキソランの２位を保護した後、ベンゾイル基は、約０〜５０℃で、メタノール中のナトリウムメトキシドまたはアンモニアなどの強塩基で、２−ヒドロキシエチル位から除去されて、（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−（保護化−Ｏ−メチル）−４−（１，２−ジヒドロキシエチル）−ジオキソラン（化合物６、図２）を高収率で生成する。
【００２９】
次の工程では、ジオキソランの４位の１，２−ジヒドロキシエチル基は、おおよそ０〜５０℃で、ＮａＩＯ４／ＲｕＯ２または四酢酸鉛などの酸化剤で、カルボン酸に変換されて、（＋）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−（保護化オキシメチル）−４−カルボキシジオキソラン（化合物７、図２を参照のこと）を生成する。
【００３０】
次いで、改変Ｈｕｎｓｄｉｅｃｋｅｒ反応（Ｄｈａｖａｌｅ，Ｄ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９８８，２９，６１６３）を、酢酸エチル中でＰｂ（ＯＡｃ）４を用いて行い、（＋）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−（保護化オキシメチル）−４−カルボキシジオキソランを、対応する重要な中間体である（２Ｒ，４Ｒ）−および（２Ｒ，４Ｓ）−４−アセトキシ−２−（保護化オキシメチル）ジオキソランに好収率で変換する（化合物８、図２を参照のこと）。
【００３１】
Ｂ．ヘテロ環塩基のジオキソラン誘導体との縮合
本反応スキームの次の工程で、Ａ項での記載のように調製されたエナンチオマー的に純粋なジオキソランは、乾燥有機溶媒中でトリメチルシリルトリフレート（トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート）またはルイス酸の存在下で、保護化塩基と縮合される。
【００３２】
あらゆる芳香族化合物、および特に電子欠乏中心と反応し得る窒素を含むプリンまたはピリミジンは、縮合反応に使用され得る。プリン塩基は、アデニン、ハイポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、６−アミノ−２−クロロプリン、２−アミノプリン、Ｎ６−アルキルプリン、Ｎ６−ベンジルプリン、Ｎ６−ハロプリン、およびグアニンを含むが、これらに限定されない。ピリミジン塩基は、チミン、シトシン、６−アザプリミジン、２−メルカプトピリミジン、およびウラシルを含むが、これらに限定されない。合成手順の間望ましくない副反応が起こる場合、ヘテロ環塩基上の機能的酸素および窒素基は、糖との縮合の前に保護されるべきである。保護基は、当業者に周知であり、そしてトリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、およびｔ−ブチルジフェニルシリル、トリチルメチル、アルキル基、アシル基（アセチルおよびプロピオニルなど）、メチルスルホニル、およびｐ−トルイルスルホニルを含む。
【００３３】
縮合反応に使用され得るＦｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ触媒（ルイス酸）は、ＳｎＣｌ４、ＺｎＣｌ４、ＴｉＣｌ４、ＡｌＣｌ３、ＦｅＣｌ３、ＢＦ３−ジエチルエーテル、およびＢＣｌ３を含む。水の存在が活性を低減させるので、これらの触媒は無水条件が必要である。触媒はまた、アルコールおよび有機酸などの活性水素を有する有機溶媒の存在下で不活性化される。触媒は、典型的には、二硫化炭素、塩化メチレン、ニトロメタン、１，２−ジクロロエタン、ニトロベンゼン、テトラクロロエタン、クロロベンゼン、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、またはアセトニトリルなどの溶媒中で用いられる。無水塩化アルミニウムは二硫化炭素に不溶である。Ｎｉｅｄｂａｌｌａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３９，２５（１９７４）。好ましい触媒はＳｎＣｌ４である。好ましい溶媒は、１，２−ジクロロエタンである。トリメチルシリルトリフレートは、上記と同じ条件下で、Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ触媒用に用いられ得る。反応は−１０℃〜２００℃までの範囲の温度で行われる。縮合用触媒の選択は最終生成物のα対βヌクレオシド生成物の比に影響を与える。例えば、ＣＨ２Ｃｌ２中でトリメチルシリルトリフレートの存在下、中間体（２Ｒ，４Ｒ）−および（２Ｒ，４Ｓ）−４−アセトキシ−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル）ジオキソラン（化合物８、図２）のシリル化チミジンとの縮合により、（−）−１−［（２Ｒ，４Ｒ）−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル）−４−ジオキソラニル］チミン  ９−β（４５％）および（＋）−１−［（２Ｒ，４Ｓ）−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル）−４−ジオキソラニル］チミン  １０−α（２９％）を得た。しかし、ＳｎＣｌ４を用いる反応では、ＴＬＣで検出可能な痕跡量のα異性体１０とともに、独占的にβ異性体９を生成した。
【００３４】
２，６−二置換プリン誘導体は、シリル化６−クロロ−２−フルオロプリンとアセテート８との縮合により合成され、１４および１３の混合物（α／β＝１／１．３）を得た（図３）。最初に形成されたＮ７異性体は、室温で一晩の撹拌の間に再びＮ９異性体に変換された。分析用サンプルは、展開溶媒としてＣＨ２ＣＬ２−アセトン（１９：１）を用いるプレパラティブＴＬＣにより、α，β混合物を個々の異性体１３および１４に分離することから得られた。しかし、最終生成物２１〜２４を調製する目的で、１３および１４の混合物をＤＭＥ中でＮＨ３で処理して（Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．；Ｖｚｎａｎｓｋｉ，Ｂ．核酸関連化合物．３４．ｔｅｒｔ−ブチルニトリトを用いる非水性ジアゾ化．プリンヌクレオシドのＣ−２でのフッ素、塩素、および臭素の導入．Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９８１，２６０８）、２１〜２４の混合物を得、これを個々の異性体１５（２４％）、１６（１８．６％）、１７（２５．８％）、および１８（１６％）に分離した。グアニン１９および２，６−ジアミノ２０誘導体は、エタノール中で１５をそれぞれ２−メルカプトエタノール／ＮａＯＭｅおよびアンモニアで処理して調製された。遊離のヌクレオシド２１〜２６は、対応する５’−シリル化ヌクレオシドをｎ−Ｂｕ４ＮＦで処理して好収率で得られた。α異性体２３および２４もまた、β異性体と同様の手順により調製された。
【００３５】
エナンチオマー的に純粋な（−）−β−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドの調製の本方法の最終工程で、ヌクレオシドの５’−Ｏ位が脱保護化される。脱シリル化は、酢酸、トリフルオロ酢酸、フッ化水素、ｎ−テトラブチルアンモニウムフルオリド、フッ化カリウム、およびピリジニウムＨＣｌを含む種々の試薬を用いて行われ得る。例えば、化合物９および１０のテトラブチルアンモニウムフルオリドを用いた脱シリル化により、それぞれ所望の遊離ヌクレオシド１１および１２を得た（図２）。酢酸は、高価でないので、商業スケールでの使用に好ましい。脱シリル化用の他の試薬は、当業者に公知である。脱アシル化は酸または塩基で行われる。５−Ｏ−エーテルはＢＣｌ３またはヨウ化トリメチルシリルで開裂され得る。
【００３６】
エナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドの調製方法は以下の実施例によりさらに例示される。実施例１は（２Ｒ，４Ｒ）−および（２Ｒ，４Ｓ）−４−アセトキシ−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル）ジオキソラン（化合物８、図２）の調製方法を詳細に記載している。実施例２は、（−）−β−Ｄ−ジオキソラン−Ｔと称する、（−）−１−［（２β，４β）−２−（ヒドロキシメチル）−４−ジオキソラニル］チミンの調製を記載している。実施例２に列挙した化合物は図２に記載された構造を指す。実施例３は、（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−６−クロロ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］プリン、（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］グアニン、および（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］アデニンを含む、多くのエナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラニルヌクレオシドの調製の詳細な例を提供する。
【実施例１】
【００３７】
（２Ｒ，４Ｒ）−および（２Ｒ，４Ｓ）−４−アセトキシ−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル）ジオキソラン（化合物８）の調製。
【００３８】
（−）−１，６−アンヒドロ−２，３−イソプロピリデン−４−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−マンノピラノース
１，６，−アンヒドロ−β−Ｄ−マンノピラノース（化合物１）をアセトン（８００ｍｌ）およびメタノール（３００ｍｌ）と混合し、そして流動性（ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗｉｎｇ）固体のみが残るまで、約３０分間撹拌した。次いで、ジメトキシプロパン（３００ｍｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（５ｇ）を添加し、そしてこの混合物を２時間撹拌した。
【００３９】
次いで、この反応混合物をトリエチルアミンで塩基性（ｐＨ８）にし、そして濾過して白色の固体物質を除去した。溶媒をエバポレートし、そして残渣を酢酸エチルに取り、次いで結晶化することにより、４グラムの２，３−イソプロピリデン化した生成物を透明な針状物として得た。
【００４０】
１，６−アンヒドロ−２，３−イソプロピリデン−β−Ｄ−マンノピラノース（５．０１ｇ、０．０２５モル）のピリジン（４０ｍｌ）溶液に、０℃で塩化ベンゾイル（３．７４ｍｌ、０．０６２モル）を滴下した。混合物を０℃で４５分間撹拌した。次いで反応混合物に氷を加えて、過剰の塩化ベンゾイルを除去した。溶媒を減圧下でエバポレートし、そして残渣を酢酸エチル（２００ｍｌ）に溶解した。有機層を水、飽和ＮａＨＣＯ３、および塩水で洗浄した。得られた物質を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、次いでエバポレートすることにより、（−）−１，６−アンヒドロ−２，３−イソプロピリデン−４−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−マンノピラノースの粗生成物（化合物２、８．７ｇ）を黄色の固体として得た。
【００４１】
（−）−１，６−アンヒドロ−４−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−マンノピラノース（３）
６０％のジオキサン（８２０ｍｌ）水溶液中の１，６−アンヒドロ−４−０−ベンゾイル−２，３−イソプロピリデン−β−Ｄ−マンノピラノース２（１０．０ｇ、３２．６ミリモル）溶液に、濃Ｈ２ＳＯ４（３．３６ｍｌ）を加えた。この混合物を７０〜８０℃で１５時間撹拌し、次いで氷浴で冷却し、ＮａＨＣＯ３で中和し、そして初めの容量の半分が残るまで濃縮した。次いで、この溶液を酢酸エチルで抽出し、そして合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液および水で洗浄し、乾燥し、そしてエバポレートすることにより、３を白色固体として得た。この固体をＣＨ２Ｃｌ２−ｎ−ヘキサンから結晶化して３を白色固体として得た（７．４ｇ、８５．３％）：
【００４２】
【化２】
2004149543.tif 000003
2004149543.tif 000004
【００４３】
（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ベンゾキシ−１−ヒドロキシエチル）−２−（ヒドロキシメチル）ジオキソラン（５）
３（７．４ｇ、２７．８ミリモル）の９５％エタノール（２００ｍｌ）溶液にＮａＩＯ４（６．５４ｇ、３０．７ミリモル）の水溶液（２００ｍｌ）を加えた。この混合物を室温で１時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにより、ジオールがジアルデヒドに確実に完全に変化したことを検査した後、反応混合物を初めの容積の半分まで濃縮した。メタノール（２００ｍｌ）を残渣に加え、そして混合物を５０℃まで冷却した。水素化ホウ素ナトリウム（４．２ｇ、１１１．０ミリモル）を混合物に少しずつ５分間添加し、そしてこの混合物を５０℃で１０分間撹拌し、氷酢酸で中和し、そして濃縮することにより、粗製の３を黄色の油として得た。この油をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製することにより、純粋な３を無色の油として得、これをジエチルエーテル／ｎ−ヘキサンから結晶化することにより、５（６．１２ｇ、８２％）を白色固体として得た：
【００４４】
【化３】
2004149543.tif 000005
【００４５】
（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ベンゾキシ−１−ヒドロキシエチル）−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−メチル）−ジオキソラン
３（２．８ｇ、１０．４ミリモル）およびイミダゾール（２．０４ｇ、３０．０ミリモル）のジメチルホルムアミド（４０ｍｌ）溶液に、ｔ−ブチルジフェニルシリルクロライド（３ｍｌ、１１．５ミリモル）を添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をエバポレートすることにより、黄色の油が得られ、これをシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製することにより、４（４．４８ｇ、８５％）を無色の油として得た：
【００４６】
【化４】
2004149543.tif 000006
【００４７】
（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル）−４−（１，２−ジヒドロキシエチル）−ジオキソラン（６）
（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−４−（２−ベンゾキシ−１−ヒドロキシエチル）−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ−メチル）−ジオキソラン（２．５２ｇ、５．０ミリモル）のメタノール（４０ｍｌ）溶液に、０．０７８Ｍのナトリウムメトキシド（７．３ｍｌ）のメタノール溶液を加えた。この混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を酢酸で中和し、そして濃縮した。ついで、残渣を酢酸エチルと水との間に分配し、そして水層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液、次いで水で洗浄し、次いで乾燥し、エバポレートし、そしてシリカゲルでのクロマトグラフィーにより精製することにより、６（１．９ｇ、９５％）を無色の油として得た：
【００４８】
【化５】
2004149543.tif 000007
【００４９】
（＋）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル）−４−カルボキシルジオキソラン（７）
６（１．６ｇ、４．０ミリモル）のＣＨ３ＣＮ（８ｍｌ）、ＣＣｌ４（８ｍｌ）、およびＨ２Ｏ（１２ｍｌ）の２層性溶液に、ＮａＩＯ４（３．５９ｇ、１６．８ミリモル）およびＲｕＯ２水和物（８．５ｍｇ）を加えた。この混合物を室温で５時間、激しく撹拌した。メチレンクロライド（４０ｍｌ）をこの混合物に加えた。有機層を分離した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、セライトパッドを通して濾過し、次いで濃縮することにより、粗製の７（１．２ｇ、７７．４％）を黒色の油として得、これをさらに精製しないで次の反応に用いた。分析用に、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより粗製の７を精製することにより、７を白色の泡状物として得た：
【００５０】
【化６】
2004149543.tif 000008
【００５１】
（２Ｒ，４Ｒ）−および（２Ｒ，４Ｓ）−４−アセトキシ−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル）ジオキソラン（８）
７（０．４６ｇ、１．１４ミリモル）の酢酸エチル（１０ｍｌ）溶液に、ピリジン（０．０９ｍｌ，１．２５ミリモル）およびＰｂ（ＯＡｃ）４（０．６６ｇ、１．４９ミリモル）を加えた。この混合物をＮ２雰囲気下にて室温で１５時間撹拌し、次いでセライトパッドを通して濾過し、次いで濃縮し、そしてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製することにより、８（０．２９ｇ、６３．５％）を無色の油として得た：
【００５２】
【化７】
2004149543.tif 000009
【実施例２】
【００５３】
（−）−１−［（２Ｒ，４Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−ジオキソラニル］チミン（１１）の調製
（−）−１−［（２Ｒ，４Ｒ）−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル）−４−ジオキソラニル］チミン（９）および（＋）−１−［（２Ｒ，４Ｓ）−２−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル）−４−ジオキソラニル］チミン（１０）
チミン（０．１５ｇ、１．２ミリモル）のヘキサメチルジシラザン（１０ｍｌ）懸濁液に、触媒量の（ＮＨ４）２ＳＯ４を加え、そしてこの混合物を３時間還流した。得られた透明な溶液を濃縮することにより、シリル化されたチミンを無色の油として得た。８（０．２４ｇ、０．６ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）溶液をシリル化チミンのＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）溶液に加え、そしてこの混合物を５℃まで冷却した。冷却した混合物に、トリメチルシリルトリフレート（０．２３ｍｌ、１．２ミリモル）を加え、そしてこの混合物を窒素雰囲気下にて室温で１時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍｌ）をこの混合物に加え、そして混合物を再度室温で３０分間撹拌した。次いで有機層を分離し、そして水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液および水で洗浄し、乾燥し、濃縮し、そしてシリカゲルでのカラムクロマログラフィーにより分離することにより、９（０．１２５ｇ、４４．６％）を白色の泡状物として、そして１０（０．０８ｇ、２８．６％）を白色の泡状物として得た：
【００５４】
【化８】
2004149543.tif 000010
2004149543.tif 000011
【００５５】
（−）−１−［（２Ｒ，４Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−ジオキソラニル］チミン（１１）
９（９３．３ｍｇ、０．２ミリモル）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３ｍｌ）溶液に、１．０Ｍのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオライド（０．２４ｍｌ、０．２４ミリモル）ＴＨＦ溶液を加え、そしてこの混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、この混合物を濃縮し、そしてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製することにより、１１（４２ｍｇ、９２．１％）を白色の固体として得た：
【００５６】
【化９】
2004149543.tif 000012
2004149543.tif 000013
【００５７】
（＋）−１−［（２Ｒ，４Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−ジオキソラニル］チミン（１２）
１１について上記したのと同じ手順に従って、１０（６０ｍｇ、０．１３ミリモル）の脱保護を行い、１２（２６ｍｇ、８７．６％）を白色の泡状物として得た：
【００５８】
【化１０】
2004149543.tif 000014
【実施例３】
【００５９】
エナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラニルプリンヌクレオシドの調製
（２Ｒ，４Ｒ）および（２Ｒ，４Ｓ）−９−［［２−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］メチル］−１，３−ジオキソラン−４−イル］−６−クロロ−２−フルオロプリン（１３および１４）
ヘキサメチルジシラザン（９４０ｍＬ）中の２−フルオロ−６−クロロプリン（４．０５ｇ、２３．４７ミリモル）と硫酸アンモニウム（触媒量）との混合物を２時間還流した。得られた溶液を無水の条件下で濃縮することにより、シリル化された２−フルオロ−６−クロロプリンを白色の固体として得た。シリル化２−フルオロ−６−クロロプリン（５．６９ｇ、２３．６９ミリモル）ｂおよび化合物８（７．８４ｇ、１９．５７ミリモル）の乾燥塩化メチレン（１７５ｍＬ）溶液を冷却し（０℃）そして撹拌して、ＴＭＳＯＴｆ（４．４１ｍＬ、２３．４４ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温まで加温し、そして１６時間撹拌した。撹拌の間に、最初に形成したＮ７縮合生成物はすべてＮ９異性体に転換した。この反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）でクエンチし、そして室温でさらに２０分間撹拌し、減圧下で乾燥するまでエバポレートした。残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解し、水および塩水で洗浄し、乾燥し（無水Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、そしてシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃ）により精製することにより、β−アノマー１９とα−アノマー２０との混合物（１．３：１；β／α）（６．３０ｇ、６２．８％）を白色の結晶性固体として得た。発展系としてＣＨ２Ｃｌ２−アセトン（１９：１）を用いたプレパラティブＴＬＣにより分析用試料を精製することにより、ＮＭＲキャラクタリゼーション用の１３（Ｒｆ＝０．５ｐＯ）および１４（Ｒｆ＝０．５５）を得た：
【００６０】
【化１１】
2004149543.tif 000015
【００６１】
（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−９−［［２−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］メチル］−１，３−ジオキソラン−４−イル］−６−クロロプリン（１５）、（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−９−［［２−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］メチル］−１，３−ジオキソラン−４−イル］−２−フルオロアデニン（１６）、（＋）−（２Ｒ，４Ｓ）−２−アミノ−９−［［２−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］メチル］−１，３−ジオキソラン−４−イル］−６−クロロプリン（１７）、および（＋）−（２Ｒ，４Ｓ）−９−［［２−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］メチル］−１，３−ジオキソラン−４−イル］−２−フルオロアデニン（１８）
乾燥アンモニアガスを１３および１４（６．２５ｇ、１２．１８ミリモル）の撹拌したＤＭＥ（１２５ｍＬ）溶液中に１晩通じた。溶媒を減圧下でエバポレートし、そして残渣をシリカゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２中２０〜３０％酢酸エチル）にかけて４種の化合物をクロマトグラフィー的に分離した。１５（Ｒｆ＝０．３５、１．４９ｇ、２４％）：白色の結晶性固体。
【００６２】
【化１２】
2004149543.tif 000016
１６（Ｒｆ＝０．２１、１．１２ｇ、１８．６％）：無色の針状物。
【００６３】
【化１３】
2004149543.tif 000017
１７（Ｒｆ＝０．４３、１．６０ｇ、２５．７６％）：白色の結晶性固体。
【００６４】
【化１４】
2004149543.tif 000018
１８（Ｒｆ＝０．１２、０．９６ｇ、１６％）、微結晶性固体。
【００６５】
【化１５】
2004149543.tif 000019
【００６６】
（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−６−クロロ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］プリン（２１）
１５（０．４６ｇ、０．９１ミリモル）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液を１Ｍのｎ−Ｂｕ４ＮＦ／ＴＨＦ（１．１ｍＬ、１．１ミリモル）で処理することにより、２１（Ｒｆ＝０．５０、０．２Ｉｇ、８４％）を結晶性固体として得、これをＭｅＯＨから再結晶した。
【００６７】
【化１６】
2004149543.tif 000020
【００６８】
（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−フルオロ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］アデニン（２２）
１６（０．５６ｇ、１．１２ミリモル）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液を１Ｍのｎ−Ｂｕ４ＮＦ／ＴＨＦ（１．３５ｍＬ、１．３５ミリモル）で処理することにより、２２（０．２４ｇ、８５％）を白色の結晶性固体として得、これをＭｅＯＨから再結晶した。
【００６９】
【化１７】
2004149543.tif 000021
【００７０】
（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］アデニン（２５）
ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の１５（０．２９ｇ、０．５７ミリモル）、ＨＳＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（０．５１ｍＬ）、および１．０ＭのＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ（１１．５ｍＬ）の混合物を３時間還流した。この反応混合物を冷却し、そして氷酢酸で中和した。この溶液を乾燥するまでエバポレートし、次いで残渣をＣＨＣｌ３で粉砕し、濾過し、そして濾液を取って乾燥することにより１９の粗生成物（０．２１ｇ、７５％）を得、この粗生成物を、さらに精製せずに、２３の場合と同じ手順で脱シリル化して、化合物２５（０．０７ｇ、６１％）を微結晶性固体として得、この化合物をＭｅＯＨから再結晶した：
【００７１】
【化１８】
2004149543.tif 000022
【００７２】
（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］アデニン（２６）
鋼鉄製の容器（ｂｏｍｂ）を化合物１５（０．２８ｇ、０．５５ミリモル）、ＮＨ３で飽和させた無水エタノール（２０ｍＬ）て充填し、そして９０℃で６時間加熱した。冷却後、得られた化合物２０（０．２６ｇ、９５％）を真空下でエバポレートして溶媒を除去し、次いで２３の調製と同じ手順により脱シリル化することにより、２６（０．１０ｇ、７５％）を白色の微小針状物として得、ＭｅＯＨから再結晶した：
【００７３】
【化１９】
2004149543.tif 000023
【００７４】
（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］プリンは、炭素担持パラジウムおよび水素ガスまたは水素化トリブチル錫およびアザビスイソブチロニトリルを包含する種々の還元剤を用いて、化合物２１を還元して調製され得る。
【００７５】
ＩＩ．  ジオキソランヌクレオシドの抗ＨＩＶ活性
β−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドは、インビトロでのＨＩＶの増殖を阻害する研究手段として用いられ得、またはインビボでのＨＩＶの増殖を阻害するために、薬学的に人体に投与され得る。
【００７６】
β−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドがＨＩＶを阻害する能力を、種々の実験技法により測定し得る。本発明で用い、そして以下に詳細に説明する技法により、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激のＨＩＶ−１（ＬＡＶ株）感染ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭ）におけるウイルスの複製の阻害を測定する。産生されたウイルスの量を、ウィルスがコードする逆転写酵素を測定することにより測定する。産生された酵素の量を、ＨＩＶコントロールと比較する。この方法について、以下詳細に説明する。
【００７７】
ヒト末梢血液単核細胞における抗ウイルスアッセイおよび細胞毒性アッセイ
Ａ．Ｂ型肝炎およびＨＩＶ−１血清ネガティブの健常なドナーに由来する３日齢のフィトヘマグルチニン刺激ＰＢＭ細胞（１０６細胞／ｍｌ）を、１ｍｌ当たり５０％組織培養物感染用量（ＴＩＣＤ５０）の約１０倍の濃度のＨＩＶ−１（ＬＡＶ株）で感染させ、そして種々の濃度の抗ウイルス性化合物の存在下または非存在下で培養した。
【００７８】
Ｂ．感染後約４５分で、試験する化合物（培地における最終濃度の２倍）を有するかまたは有さない培地をフラスコに加えた（５ｍｌ；最終容積１０ｍｌ）。ＡＺＴをポジティブコントロールとして用いた。
【００７９】
Ｃ．細胞をウイルス（約２×１０５ｄｐｍ／ｍｌ、逆転写酵素アッセイで測定）に曝し、次いでＣＯ２インキュベータ内に置いた。ＨＩＶ−１（ＬＡＶ株）を、疾病管理センター（ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ジョージア州アトランタ、から入手した。ＰＢＭ細胞の培養、ウイルスの収穫（ｈａｒｖｅｓｔ）、そして逆転写酵素活性の測定に用いた方法は、菌領域（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）が培地に含まれなかったこと（Ｓｃｈｉｎａｚｉら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３２，１７８４−１７８７，（１９８８）を参照）以外は、ＭｃＤｏｕｇａｌら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．７６，１７１−１８３，１９８５）およびＳｐｉｒａら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｔｈ．２５，９７−９９，１９８７）により記載された方法であった。ウイルス感染コントロールの逆転写酵素活性は、約２×１０５ｄｐｍ／ｍｌであった。ブランクおよび非感染コントロールの値は、それぞれ約３００および１，０００ｄｐｍであった。工程Ｃを工程Ｂの前に行っても、同様の結果が得られる。
【００８０】
Ｄ．６日目に、細胞及び上清を１５ｍｌチューブに移し、そして約９００ｇで１０分間遠心分離を行った。５ｍｌの上清を取り除き、そして４０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する（Ｂｅｃｋｍａｎ  ７０．１  Ｔｉローター）ことにより、ウイルスを濃縮した。溶解したウイルスペレットを、逆転写酵素のレベルの測定にかけた。結果を、サンプリングした上清１ｍｌあたりのｄｐｍで表す。
【００８１】
逆転写酵素の測定から決定された、ウイルスの阻害百分率を化合物のマイクロモル濃度に対してプロットする。ＥＣ５０は、ウイルスの増殖を５０％阻害する化合物の濃度である。
【００８２】
このアッセイを用いて、少数のβ−Ｄ−ジオキソラニルプリンヌクレオシドが、有効な抗ＨＩＶ剤であることを見出した。特に、表１に示すように、化合物２１、２５、および２６は、０．０２７〜０．６９μＭの範囲に低い有効メジアン濃度を示す。
【００８３】
【表１】
2004149543.tif 000024
【００８４】
ＡＴＨ８細胞においては、β−Ｄ−（±）−ジオキソラン−チミンはＨＩＶに対して効力が低いという以前の報告とは対照的に、エナンチオマー的に純粋なβ型１１は、大きな抗ＨＩＶ活性（ＥＣ５０＝０．３μＭ）を示した。エナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−（−）−ジオキソラン−Ｔが、この化合物のラセミ混合物よりも顕著に大きな抗ＨＩＶ活性を有することを見出したのは、驚くべきことであった。この差異は、これらの系における１１のリン酸化の速度に基づいて説明され得る。予想通り、α−異性体１２は、何ら顕著な抗ＨＩＶ活性を示さなかった。ＰＢＭ細胞における（−）−１−［（２β，４β）−２−（ヒドロキシメチル）−４−ジオキソラニル］チミンのＥＣ５０は、０．２μＭと測定された。
【００８５】
ＩＩＩ．  ジオキソランヌクレオシドの毒性
化合物２１、２３、および２６の毒性を、非感染のヒトＰＢＭ細胞、ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手したＴ−リンパ芽球様（Ｉｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞系）、およびＶｅｒｏ（アフリカミドリザルの腎臓）細胞において評価した。この３種の化合物は、いずれの細胞系においても、濃度１００μＭで毒性はなかった。
【００８６】
ＩＶ．  薬学的組成物の調製
ＨＩＶ感染にかかっているヒトは、その患者に効果的な量の（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−６−クロロ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］プリン：（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］グアニン；（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］アデニン；または（−）−（２Ｒ，４Ｒ）−２−アミノ−９−［（２−ヒドロキシメチル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］プリン、あるいは薬学的に受容可能な誘導体またはその塩を、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤中で投与することにより、治療され得る。活性物質は、あらゆる適切な経路、例えば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、または局所的に、液体、または固形の形態で投与され得る。
【００８７】
活性化合物は、治療する患者に重大な毒性の影響を引き起こすことなく、治療的に効果的な量を患者に送達するのに充分な量で、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤中に含有される。
【００８８】
上記の条件の全てについて活性化合物の好ましい投薬量は、１日当たり、体重の約１ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、１日当たり、受容者の体重１キログラムに対し、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。薬学的に受容可能な誘導体の有効な投薬量の範囲は、送達される親ヌクレオシドの重量に基づいて算出され得る。誘導体がそれ自身で活性を示す場合、有効な投薬量は、誘導体の重量を用いて上記のように概算され得るか、または当業者に公知の他の手段により概算され得る。
【００８９】
化合物は、あらゆる適切な単位投与形態で都合良く投与され、単位投与形態当たり活性成分は７ｍｇ〜３０００ｍｇ、好ましくは７０ｍｇ〜１４００ｍｇを含有されるが、これらには限定されない。５０ｍｇ〜１０００ｍｇの経口投薬量が、通常好都合である。
【００９０】
理想的には、活性成分は、約０．２μＭ〜７０μＭ、好ましくは約１．０μＭ〜１０μＭの活性化合物の極大血漿濃度を達成するように投与されるべきである。これは、例えば、活性成分の０．１％〜５％溶液（必要に応じて生理食塩水中）の静脈内注射により達成され得るか、あるいは活性成分のボーラスとして投与され得る。
【００９１】
薬物組成物中の活性化合物の濃度は、薬物の吸収、不活性化、および排出速度、ならびに当業者に公知の他の因子に依存する。投薬量の値はまた、軽減すべき症状の重篤度で変化することに注目すべきである。あらゆる特定の目的について、特定の投薬法が、個々の必要性、および投与し、または組成物の投与を管理する人の専門的判断に従って、経時的に調節されるべきであり、そして本明細書中に挙げた濃度範囲が単に例示であり、請求の範囲の組成物の範囲または実施の限定を意図しないことがさらに理解されるべきである。活性成分は、一度に投与され得るか、または異なる時間の間隔で投与される数多くのより少ない投薬量に分けられ得る。
【００９２】
活性化合物の投与の好ましい態様は経口によるものである。経口組成物は、一般に不活性の希釈剤または食用のキャリアを含む。それらはゼラチンカプセルに納められ得るか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で用いられ得る。薬学的に適合可能な結合剤、および／または補助物質が、組成物の一部として含まれ得る。
【００９３】
錠剤、ピル、カプセル剤、トローチ剤などは、任意の以下の成分、または類似の性質を有する化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたはラクトースのような賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはトウモロコシデンプンのような分散剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）のような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のようなグリダント（ｇｌｉｄａｎｔ）；ショ糖またはサッカリンのような甘味料；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料のような矯味料。投薬単位形態がカプセルである際には、上記のタイプの物質に加えて、脂肪油のような液体のキャリアが含有され得る。さらに、投薬単位形態は、投薬単位の物理的形態を改変する種々の他の物質を含有し得る。これには、例えば、糖、シェラックまたは他の腸溶剤のコーティングがある。
【００９４】
活性化合物または薬学的に受容可能な塩、あるいはその誘導体は、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、懸濁液、シロップ、ウェーファ、チューインガムなどの構成成分として投与され得る。シロップは、活性化合物に加えて、甘味料としてのショ糖、ならびに特定の保存剤、染料、および着色剤、ならびに香料を含有し得る。
【００９５】
活性化合物または薬学的に受容可能な誘導体、あるいはその塩はまた、所望の作用を損なわない他の活性物質と、または他のヌクレオシド抗ＨＩＶ化合物を含む、抗生物質、抗菌剤、抗炎症薬、または他の抗ウィルス性化合物のような所望の作用を供給する物質と混合され得る。
【００９６】
非経口、皮内、皮下、または局所適用のために用いられる溶液または懸濁液は、以下の構成成分を含み得る：注射用水、生理食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートのような緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような浸透圧を調節するための物質。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックから作られたアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量バイアル中に納められ得る。
【００９７】
静脈内に投与される場合、好ましいキャリアは、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００９８】
好ましい実施態様において、活性化合物は、制御された放出処方物のような身体からの急速な排出に対して化合物を保護するキャリアと共に調製され、これは、移植片およびマイクロカプセル化された送達系を包含する。生分解性、生体適合性ポリマーが用いられ得る（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）。そのような処方物の調製方法は、当業者には明らかである。物質はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販により得られ得る。
【００９９】
リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体と共に感染細胞を対象とするリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして好ましい。これらは、当業者に公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（これはすべて、本明細書中に参考として援用されている）に記載のように調製され得る。例えば、リポソームの処方物は、適切な１つまたは複数の脂質（例えば、ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロール）を無機溶媒中で溶解し、次いで、蒸発させ、容器表面上の乾燥した脂質の薄層フィルムを残すことにより調製され得る。次いで、活性化合物、またはそのモノホスフェート、ジホスフェート、および／またはトリホスフェート誘導体の水性溶液を、容器に導入する。次いで、容器を、手でかき混ぜて容器の側面から脂質物質をなくし、そして脂質凝集物を分散させ、それによりリポソーム懸濁液を形成させる。
【０１００】
Ｖ．β−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドのホスフェート誘導体の調製
β−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドのモノ、ジ、およびトリホスフェート誘導体は、以下のように調製され得る。
【０１０１】
モノホスフェートは、Ｉｍａｉら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３４（６）、１５４７−１５５０（１９６９年６月）の手順により調製され得る。例えば、約１００ｍｇのβ−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドおよび約２８０μｌのホスホリルクロライドを、約８ｍｌの乾燥酢酸エチル中で、約０℃にて約４時間、撹拌して反応させる。反応を氷でクエンチする。水相を、活性炭カラムで精製し、５％の水酸化アンモニウムを用いて、１：１のエタノールと水の混合物中で溶出させる。溶離液を蒸発させて、アンモニウム−（β−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシド）−５’−モノホスフェートを得る。
【０１０２】
ジホスフエートは、Ｄａｖｉｓｓｏｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５２（９）、１７９４−１８０１（１９８７）の手順により調製され得る。β−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドは、対応するトシレートから調製され得、それは、例えば、ヌクレオシドをトシルクロライドとピリジン中で、室温にて２４時間反応させることにより、調製され得、通常の方法で（例えば、それを洗浄し、乾燥させ、および結晶化させることにより）生成物を処理する。
【０１０３】
トリホスフェートは、Ｈｏａｒｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８７（８）、１７８５−１７８８（１９６５）の手順により調製され得る。例えば、β−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドは、当業者に公知の方法により、イミダゾリドを生成することにより）活性化され、そしてＤＭＦ中でトリブチルアンモニウムピロホスフェートで処理する。反応により、いくらかの未反応のモノホスフェートおよびいくらかのジホスフェートと共にヌクレオシドのトリホスフェートが主に得られる。ＤＥＡＥカラムの陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製に続いて、トリホスフェートが例えば、テトラナトリウム塩として単離される。
【０１０４】
本発明は、好ましい実施態様の参考例を用いて記載された。本発明の、エナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−ジオキソラン−ヌクレオシドの変更および改変は、先の本発明の詳細な説明から当業者には明らかである。これらの変更および改変の全てが、添付の請求の範囲内であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１ａ】（±）−１−［（２β，４β）−２−（ヒドロキシメチル）−４−（１，３−チオキソラン）］チミン（ＢＣＨ−１８９）の化学構造の図である。
【図１ｂ】（±）−１−［（２β，４β）−２−（ヒドロキシメチル）−４−ジキソラニル］チミン（ジオキソラン−Ｔ）の化学構造の図である。
【図２】エナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−（−）−ジオキソラン−チミンの合成方法の図である。
【図３】種々のエナンチオマー的に純粋なβ−Ｄ−（−）−ジオキソラニルプリンヌクレオシドの調製方法の図である
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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