(57)【要約】【課題】化学療法によりヒト感染性マラリア原虫類として、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫の増殖抑制をボレリジンで行うことによって、ヒト感染性マラリア原虫類の感染予防・治療剤として臨床できることが期待される。【解決手段】下記式【化１】2004269440.tif 000009で示されるボレリジンを有効成分として含有する、マラリア原虫類の感染予防・治療剤である。【効果】ボレリジンはヒト感染性熱帯熱マラリア原虫類に対してｉｎ ｖｉｔｒｏで抗マラリア活性を示し、ｉｎ ｖｉｖｏ系のネズミマラリア原虫感染モデルに対して予防及び治療効果を示し、特に薬剤耐性株に対して有効である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式
【化１】
2004269440.tif 000008
で表されるボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を有効成分として含有する、マラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【請求項２】
マラリア原虫類の増殖を抑制することからなる請求項１記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【請求項３】
マラリア原虫類が、ヒト感染性マラリア原虫であって、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫から選ばれた一つである請求項１または２項に記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【請求項４】
マラリア原虫類の感染予防・治療剤が薬剤耐性マラリア原虫に対して有効である請求項１ないし３項のいずれかに記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【請求項５】
マラリア原虫類の感染予防・治療剤が薬剤感受性マラリア原虫に対して有効である請求項１ないし３項のいずれかに記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【請求項６】
マラリア原虫類の感染予防・治療剤が経口投与形態または非経口投与形態である請求項１ないし５項のいずれかに記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【請求項７】
経口投与形態が単回投与である請求項６に記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【請求項８】
ヒト感染性マラリア原虫であって、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および卵形マラリア原虫の群から選ばれた疾患の感染予防および治療のための医薬の製造に用いられるマラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト感染性マラリア原虫類として、例えば熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫の増殖を既知の１８員環マクロライド系抗生物質、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）で抑制することによりマラリア原虫類の感染予防・治療に有効なマラリア原虫類の感染予防・治療剤に関する。
【０００２】
【背景及び従来の技術】
世界保健機関（ＷＨＯ）の熱帯病特別研究訓練計画は人類の中で制圧しなければならない８大熱帯病として、主に開発途上国での疾患であるマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、住血吸虫症、フィラリア症、ハンセン氏病、結核及びテング熱を挙げている。これらの疾患のうち、特にヒトに寄生するマラリア原虫類には熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）の４種類に分類される。これらの中で、最も厄介なものはマラリア感染者の８０％を占める熱帯熱マラリア原虫であり、重症の場合には脳性マラリアになって死に至る。
【０００３】
これらのマラリア原虫類に対する既存の抗マラリア剤としては、古典薬と呼ばれ、主に１９３０年〜１９６０年代に開発された化学合成医薬品であるクロロキンやファンシダール（ピリメサミンとスルファドキシンとの合剤）等、及び新薬と呼ばれ１９８０年以降に開発された生薬青蒿の有効成分であるアルテミシニン等が用いられていた。しかしながら、現在クロロキンやファンシダールに対する薬剤耐性マラリア原虫がマラリア流行地域に広く蔓延し、さらに、両者の多剤耐性株も出現しており、これらの抗マラリア剤としての有用性はマラリア流行地域で著しく低下している。また、アルテミシニンは作用として速効性であり、一時治療薬として注目されたが、完治せずに再燃し易いという問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このように、既存の抗マラリア剤に対する薬剤耐性株はマラリアが再興感染症として流行している一因でもあり、薬剤耐性株に有効な抗マラリア薬の開発が地球規模で望まれている。特に熱帯熱マラリア原虫の流行地域は、熱帯・亜熱帯と多岐にわたっており、これらの地域に属する開発途上国では極めて深刻な問題であり、寄生虫感染症による死亡原因の第一位がマラリアによるとされている。さらに、最近における地球規模での温暖化によりマラリア原虫類の流行地域が開発途上国のみならず温暖地域をも含む先進国へと拡大傾向の様相を呈しているのが実情である。
【０００５】本発明者らは、クロロキンやファンシダール等の既存の抗マラリア剤に耐性のマラリア原虫にｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで有効な化合物を微生物代謝産物より探索すべく鋭意研究したところ、意外にもスピロヘータ類の回帰熱ボレリア及び豚赤痢トレポネーマ、グラム陽性菌、ウイルス等に対して効力を示し、さらに血管新生阻害作用を有するボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）が、マラリア原虫類の増殖抑制に対して優れた有効性を有することを見出した。
【０００６】ストレプトマイセス・エスピーより生産されるボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）自体は既に知られている。例えばアーチィブス・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）第２２巻、４７６〜４７８頁（１９４９年）、アンチミクロビアル・エージェンツ・アンド・ケモセラフィー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）第２７巻、２３９〜２４５頁（１９８５年）及び特開平８−１７３１７６号公報に製造法および性状が記載されており、Ｘ線による構造解析がオーストラリア・ジャーナル・ケミストリー（Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）第４２巻、７１７〜７３０頁（１９８９年）に報告され、スピロヘータ類の回帰熱ボレリア及び豚赤痢トレポネーマ、ある種のグラム陽性菌に対して強力な抗菌作用やある種のウイルスに対して抗ウイルス作用を示し、さらに血管新生阻害作用を有することが開示されていたが、抗マラリア剤としての有効性の開示はなされていなかった。
【０００７】
ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は一般に抗菌物質の中では醗酵での生産性が高いことから、該物質を生産するストレプトマイセス・エスピーの培養液を原料として、新たな血管新生阻害作用を指標に活性物質を精製した結果、若林らによってボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の類縁化合物の４種が提案された（特開平９−２２７５４９号公報）。これらの化合物はストレプトマイセス・エスピーにより生産される１８員環マクロライド系化合物、それらの製造法およびそれらを含有する医薬組成物、とりわけ血管新生の異常増殖を伴う各種疾患、例えばヒトにおけるリウマチ性関節炎、固形癌、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、血管腫、乾癬等に対して有効であることが開示されていた。また血管新生阻害作用を有するボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）誘導体としてＷＯ０１／０９１１３  Ａ２も開示されていた。しかしながら、これらの文献には、抗マラリア剤としての有効性の開示は全くなされていなかった。
【０００８】
そこで、本発明者らは上記の如く種々の問題点を解決すべく、微生物代謝産物中に該活性を示す生理活性物質を広範囲に探索した結果、土壌から採取した放線菌ＯＭ−００６０株が生産する物質が抗マラリア活性を有することを見出した。そこで、本物質の物理化学的性質を検討したところ、本物質は、既に報告された１８員環マクロライド系抗生物質、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）［Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．；Ｌ．Ｍ．Ｊａｍｐｏｌｓｋｙ  ＆  Ｍ．Ｗ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ：Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ，ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：４７６〜４７８，１９４９、Ｋｅｌｌｅｒ−Ｓｃｈｉｅｒｌｅｉｎ，Ｗ．；Ｄｉｅ  Ｋｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｄｅｓ  ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎｓ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，２２：３５５〜３５９，１９６６］と一致する化合物であると同定し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の目的は、化学療法によりヒト感染性マラリア原虫類、例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫の感染予防および増殖抑制をボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）で行うことによって、臨床に有効なヒト感染性マラリア原虫類の感染予防・治療剤を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の如く課題を解決すべく、微生物代謝産物中に該活性を示す生理活性物質を広範囲に探索した結果、見出されたものであり、下記式
【００１１】
【化２】
2004269440.tif 000002
で表されるボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を有効成分として含有する、マラリア原虫類の感染予防・治療剤に関する。
【００１２】
本発明はさらに、マラリア原虫類の増殖を抑制することからなるマラリア原虫類の感染予防・治療剤に関し、マラリア原虫類がヒト感染性マラリア原虫であって、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫の群から選ばれた一つであり、該マラリア原虫類の予防・治療剤が、経口投与形態または注射剤、点滴剤等の非経口投与形態で用いられ、経口投与形態が単回投与である。
【００１３】
本発明はさらに、感染予防・治療剤が薬剤耐性マラリア原虫及び薬剤感受性マラリア原虫に対して有効であり、かつまた、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および卵形マラリア原虫の群から選ばれた疾患の感染予防および治療用の医薬の製造に用いられるマラリア原虫類の感染予防・治療剤に関する。
【００１４】
前記の式で表されるボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は放線菌ＯＭ−００６０株が生産する物質であり、その製造方法及びＮＭＲによる構造解析は、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．；Ｌ．Ｍ．Ｊａｍｐｏｌｓｋｙ  ＆  Ｍ．Ｗ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ：Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ，ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：４７６〜４７８，１９４９、Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．；Ｓ．Ｇｕｒｕｓｉｄｄａｉａｈ  ＆  Ｊ．Ｗｈａｌｅｎ：Ｔｒｅｐｏｎｅｍｙｃｉｎ，ａ  ｎｉｔｒｏｌｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｒｅｐｏｍｅｍａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２７：２３９〜２４５，１９８５、特開平８−１７３１７６号公報及びＫｅｌｌｅｒ−Ｓｃｈｉｅｒｌｅｉｎ  Ｗ．：Ｄｉｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｄｅｓ  ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎｓ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，２２：３５５〜３５９，１９６６に詳細に記載されている。その作用は、抗スピロヘータ剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤、血管新生阻害剤として開示されている。
【００１５】
ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の製造方法について説明すると、適量の組成の炭素源、窒素源、無機塩類等を含む種培地１００ｍｌにボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）生産菌を接種し、２８℃で７２時間、振盪培養を行い、種母とする。この種母を各々３０Ｌ容ジャー・ファーメンター２基の中に入ったボレリジン生産液体培地１５Ｌに植菌し、２８℃で１２０時間、通気攪拌培養する。このようにして得られる培養液３０Ｌを遠心分離し、上清と菌体に分離する。この上清をダイアイオンＨＰ−２０カラム（三菱化成社製、日本国）に吸着させ、活性画分を８０％アセトンで溶出させ、この溶出液を水溶液まで減圧濃縮し、得られた水溶液を酢酸エチルで抽出し、この抽出液を減圧濃縮し、抽出物を得る。
【００１６】
上記の抽出物をメタノールを溶出溶媒とするセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー、クロロホルム−メタノール及びヘキサン−アセトンを各々溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィー及び再シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を含む溶出画分を濃縮し、精製物６１１．２ｍｇを得る。この精製物をクロロホルム−ヘキサンより結晶化し、結晶４２０．０ｍｇのボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を得た。
【００１７】
上記において用いられる炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、糖密、澱粉、デキストリン、セルロース、グリセリン等が単独または組み合わせて用いられ、窒素源としては、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、コーン・スチープ・リカー、綿実粕、カゼイン等が単独または組み合わせて用いられ、更に無機塩類としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩等が挙げられ、必要に応じて添加される。
【００１８】
本化合物を各種疾患の予防・治療剤として投与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などとして経口的に投与してもよいし、また注射剤、点滴剤として非経口的に投与してもよい。投与量は症状の程度、年齢、疾患の種類などにより異なるが、通常成人１日当たり約５０ｍｇ〜５００ｍｇを１日１〜数回に分けて投与する。
【００１９】
製剤化の際は通常の製剤担体を用い、常法により製造する。経口用固形製剤を調製する場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤などを加えた後、常法により溶剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などとする。注射剤を調製する場合には、主薬に必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加し、常法により皮下、静脈内用注射剤とする。
【００２０】
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は若林らの方法による特開平８−１７３１７６号公報に記載の方法を改良して調製した。すなわち、適量の組成の炭素源、窒素源、無機塩類等を含む種母培養液液体培地に放線菌ＯＭ−００６０株を接種し、２７℃で４８時間、振盪培養を行い、種母とした。この種母を５００ｍｌ容三角フラスコに適量の組成の炭素源、窒素源、無機塩類等を含むボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）生産培養培地１００ｍｌに植菌し、２７℃で１６８時間、振盪培養した。このようにして得られた培養液１０Ｌを遠心分離し、培養上清と菌体に分離した。培養上清からのボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の精製方法は、得られた上清を酢酸エチルで抽出し、減圧濃縮し、抽出物５４１ｍｇを得た。
【００２２】
上記の抽出物をクロロホルム−メタノールを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を含む溶出画分を濃縮し、３０４ｍｇの粗物質Ｉを得た。この粗物質Ｉをさらに、トルエン−アセトンを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を含む溶出画分を濃縮し、１７７．６ｍｇの粗物質ＩＩを得た。これをトルエン−アセトンを展開溶媒とするプレパラティブ−シリカゲル薄層プレートにて分離し、活性画分を掻き取り、これをクロロホルム−メタノールにて溶出し、減圧濃縮し、８５．８ｍｇの粗物質ＩＩＩを得た。さらに、これをメタノールを溶出溶媒とするセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにて精製し、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を含む溶出画分を濃縮し、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の白色粉末を７５．９ｍｇ得た。
【００２３】
一方、菌体からのボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の精製方法は、得られた菌体をアセトンで抽出し、菌体抽出液を濃縮し、水溶液とした。これを酢酸エチルで抽出し、抽出物１．１９ｇを得た。この抽出物を前述の培養上清からのボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の精製方法と同様に、クロロホルム−メタノール及びトルエン−アセトンを溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィー及びトルエン−アセトンを展開溶媒とするプレパラティブ−シリカゲル薄層プレート及びメタノールを溶出溶媒とするセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーにて精製し、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を含む溶出画分を濃縮し、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の白色粉末を２０．２ｍｇ得た。このようにして、培養上清及び菌体からのものを合わせると９６．１ｍｇのボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の純品を得た。
【００２４】
前記の熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の薬剤耐性のＫ１株（東京大学大学院医学系研究科の北潔教授より分与可能）及び薬剤感受性のＦＣＲ３株（東京大学大学院医学系研究科の北潔教授より分与可能）に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の抗マラリア活性の測定は、乙黒らの方法［Ｏｔｏｇｕｒｏ，Ｋ．，Ｋｏｈａｎａ，Ａ．，Ｍａｎａｂｅ，Ｃ．，Ｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｕｉ，Ｈ．，Ｓｈｉｏｍｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｏｍｕｒａ，Ｓ．：Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，Ｘ−２０６，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，５４：６５８−６６３（２００１）］に従って行った。
【００２５】
試験原虫としては、ＴＲＡＧＥＲとＪＥＮＳＥＮの方法［Ｔｒａｇｅｒ，Ｗ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．：Ｈｕｍａｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９３：６７３−６７７，（１９７６）］を若干改変し、維持、継代を行ったものを用いた。すなわち、培養シャーレ内で、１０％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ１６４０培地と新鮮なヒト赤血球を用いて継代した原虫感染赤血球を希釈し（ヘマトクリット値：２〜５％、原虫感染赤血球率：０．２５〜１％）、３７℃にて３％Ｏ２  −４％ＣＯ２  −９３％Ｎ２  の混合ガス下で培養を行い、２〜３日毎に培地交換と新鮮な赤血球を添加して連続培養を行った。
【００２６】
薬剤感受性試験は、ＤＥＳＪＡＲＤＩＮＳらの方法［Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ｊ．，Ｈａｙｎｅｓ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ  Ｃｈｕｌａｙ，Ｊ．Ｄ．：Ｑａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ａ  ｓｅｍｉａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１６：７１０−７１８（１９７９）］を改変し、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに前培養された原虫浮遊液（ヘマトクリット値：２％、原虫感染赤血球率：０．５または１％）１９０μｌと本化合物の溶液（５％ジメチルスルホキサイド溶液）１０μｌを添加し、混和後、前述の混合ガス下で７２時間培養を行った。
【００２７】
原虫増殖の測定は、ＭＡＫＬＥＲらの方法［Ｍａｋｌｅｒ，Ｍ．Ｔ．，Ｒｉｓｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ａ．，Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｊ．Ｅ．，Ｐｉｐｅｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｇｉｂｂｉｎｓ，Ｂ．Ｌ．ａｎｄ  Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，Ｄ．Ｊ．：Ｐａｒａｓｉｔｅ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｓ  ａｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍｄｒｕｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，４８：７３９−７４１（１９９３）］を改変し、Ｍａｌｓｔａｔ試薬（Ｆｌｏｗ社製、米国）にて原虫の乳酸脱水素酵素（ｐ−ＬＤＨ）を比色定量する方法で行った。
【００２８】
すなわち、７２時間の培養を終了した９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを直接−２０℃下で１８時間凍結後、３７℃下で融解することにより、原虫感染赤血球を溶血及び原虫を破壊させ粗酵素液を調製した。新たな９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌにＭａｌｓｔａｔ試薬（Ｆｌｏｗ社製、米国）１００μｌと粗酵素液２０μｌを添加、混和し、１５分間室温にて反応後、ニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）２ｍｇ／ｍｌ：フェナジンエトサルフェート（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）０．１ｍｇ／ｍｌ＝１：１溶液２０μｌを各ｗｅｌｌに添加し、遮光条件下、室温にて２時間反応させた。
【００２９】
反応により生じたブルーフォルマザン（ｂｌｕｅ  ｆｏｒｍａｚａｎ）生成物をマイクロプレートリーダー（Ｌａｂｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、フィンランド国）にて測定波長６５５ｎｍでの吸光度を測定することにより、原虫の増殖の有無を比色定量した。本化合物の５０％原虫増殖阻止濃度（ＩＣ５０値）は化合物濃度作用曲線より求めた。本発明に用いたボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）と既知の抗マラリア剤の培養熱帯熱マラリア原虫に対する抗マラリア活性は下記に示す通りであった。
【００３０】
培養熱帯熱マラリア原虫に対する既知の抗マラリア剤としては、アルテメーター（Ｃｅｒｂｉｏｓ  Ｐｈａｒｍａ社製、スイス国）、アルテスネート（Ｃｅｒｂｉｏｓ  Ｐｈａｒｍａ社製、スイス国）、アルテミシニン（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）、クロロキン（Ｓｉｇｍａ社製、米国）、ピリメサミン（Ｓｉｇｍａ社製、米国）がそれぞれ用いられた。また耐性株としては、薬剤耐性のＫ１株及び薬剤感受性のＦＣＲ３株を用いた。
【００３１】
2004269440.tif 000003
【００３２】
本発明に用いたボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の薬剤耐性のＫ１株に対して既存の抗マラリア剤のどれよりも優れた抗マラリア活性を示し、アルテメーターの４倍、アルテスネートの５．８倍、アルテミシニンの１２．６倍、クロロキンの１８７．９倍、ピリメサミンの５２，６３２倍の強い抗マラリア活性をそれぞれ示した。さらに、薬剤感受性のＦＣＲ３株に対してはアルテメーター及びアルテスネートと同程度かそれ以上の抗マラリア活性を示し、アルテミシニンの１０倍、クロロキンの１６倍、ピリメサミンの４．３倍の強い抗マラリア活性を示した。
【００３３】
このことから、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は薬剤耐性のＫ１株と薬剤感受性のＦＣＲ３株に対して同程度の活性があり、しかも既存の抗マラリア剤よりも優れた強い活性を示し、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は薬剤耐性マラリア原虫におけるクロロキンやピリメサミン等の作用メカニズムと異なる作用メカニズムで抗マラリア活性をＫ１株及びＦＣＲ３株の両株に作用していることを示すものである。
【００３４】
実施例２
本発明に用いたボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の細胞毒性試験は、乙黒らの方法［Ｏｔｏｇｕｒｏ，Ｋ．，Ｋｏｈａｎａ，Ａ．，Ｍａｎａｂｅ，Ｃ．，Ｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｕｉ，Ｈ．，Ｓｈｉｏｍｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｏｍｕｒａ，Ｓ．：Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，Ｘ−２０６．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，５４：６５８−６６３，（２００１）］に準じて行った。すなわち、宿主細胞のモデルとしてヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞ＭＲＣ−５細胞［Ｄｒ．Ｌ．Ｍａｅｓ（Ｔｉｂｏｔｅｃ  ＮＶ，Ｍｅｃｈｅｌｅｎ，ベルギー国）より分与可能］を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）及び抗生物質添加ＭＥＭ培地にて維持、継代培養を行ったものを用いた。
【００３５】
ヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞ＭＲＣ−５細胞を１０％ＦＣＳ−ＭＥＭにて１×１０３  ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように浮遊液を調整し、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１００μｌを添加し混和後、３７℃にて５％ＣＯ２  −９５％ａｉｒ下で２４時間培養を行った後、各ｗｅｌｌに１０％ＦＣＳ−ＭＥＭ９０μｌとボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の溶液（５％ジメチルスルホキサイド溶液）１０μｌを添加し、混和後、前述のガス下で７日間培養を行った。ＭＲＣ−５細胞の増殖の有無はＭＴＴ法にて比色定量した。ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の５０％原虫増殖阻止濃度（ＩＣ５０値）は化合物濃度作用曲線より求めた。その結果は下記の通りであった。
【００３６】
2004269440.tif 000004
【００３７】
本発明に用いたボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）のヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞ＭＲＣ−５細胞に対する細胞毒性（ＩＣ５０値）は４１０ｎＭであり、抗マラリア活性との選択毒性比（細胞毒性のＩＣ５０値／抗マラリア活性のＩＣ５０値）は薬剤耐性のＫ１株で２１６、薬剤感受性のＦＣＲ３株で２２８であり、高い選択毒性を示した。
【００３８】
実施例３
本発明に用いたボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）のネズミマラリア原虫類Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ  Ｎ株（薬剤感受性株）及びＰ．ｙｏｅｌｉｉ  ｓｓｐ．ＮＳ株（クロロキン耐性株）［両株ともＤｒ．Ｗ．Ｐｅｔｅｒｓ（Ｎｏｒｔｈｗｉｃｋ  Ｐａｒｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｅｄｄｌｅｓｅｘ，英国）より分与可能］感染実験モデルに対するｉｎｖｉｖｏでの治療効果の測定は乙黒らの方法［Ｏｔｏｇｕｒｏ，Ｋ．，Ｋｏｈａｎａ，Ａ．，Ｍａｎａｂｅ，Ｃ．，Ｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｕｉ，Ｈ．，Ｓｈｉｏｍｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｏｍｕｒａ，Ｓ．：Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，Ｘ−２０６．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，５４：６５８−６６３，（２００１）、Ｏｔｏｇｕｒｏ，Ｋ．，Ｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｕｉ，Ｈ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｍａｎａｂｅ，Ｃ．，Ｙａｎ．Ｇ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｙ．，Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｏｍｕｒａ，Ｓ．：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，Ｋ−４１  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｒｕｇ  ｒｅｇｉｓｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，５５：８３２−８３４，（２００２）］及びＰＥＴＥＲＳらの方法［Ｐｅｔｅｒｓ，Ｗ．；Ｐｏｒｔｕｓ，Ｊ．Ｈ．ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．：Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆｒｏｄｅｎｔ  ｍａｌａｒｉａ．ＸＸＩＩ．Ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ  ｉｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｓｃｈｉｚｏｎｔｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｎｎ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，６９：１５５−１７１，（１９７５）］を若干改変して行った。
【００３９】
すなわち、供試動物としてはＩＣＲマウス（日本チャールス・リバー社、日本国）の雄、体重１８〜２０ｇの一群５匹を用い、ｉｎ ｖｉｖｏ  ｐａｓｓａｇｅにて維持・継代した原虫を２×１０６  個の寄生虫感染赤血球に調整し、尾静脈接種にて感染させた。治療実験は４  ｄａｙｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｔｅｓｔで行った。感染日をｄａｙ  ０とすると、感染２時間後に本化合物の溶液（１０％ジメチルスルホキサイド溶液−Ｔｗｅｅｎ  ８０）を皮下（ｓ．ｃ．）、経口（ｐ．ｏ．）または静脈（ｉ．ｖ）（ｉ．ｖの場合、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は１％ＮａＨＣＯ３  水で溶解）投与し、以後１日１回３日間連続投与し（ｄａｙｓ  １〜３）、ｄａｙ  ４で尾静脈より血液塗抹標本を作成し、原虫感染赤血球率（ｐａｒａｓｉｔａｅｍｉａ）を観察し、本化合物非投与群の感染率より治療効果を判定した。
【００４０】
ネズミマラリア原虫感染モデルに対するボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）及び既存薬剤の皮下投与による化合物の５０％有効濃度（ＥＤ５０値）及び９０％有効濃度（ＥＤ９０値）は化合物濃度作用曲線より求めた。その結果は、下記の通りであった。
【００４１】
2004269440.tif 000005
【００４２】
本発明に用いたボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を皮下投与した場合、ネズミマラリア原虫感染モデルにおいて薬剤感受性のＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ  Ｎ株に対して、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は低用量で有効であり、既存の抗マラリア剤のアルテメーターやアルテスネートよりＥＤ５０値で５．３〜９．４倍の優れた治療効果が認められ、ＥＤ９０値ではクロロキンより若干優れ、アルテメーター及びアルテスネートの１．９〜５倍の治療効果が認められた。
【００４３】
更に、ネズミマラリア原虫感染モデルにおいて薬剤耐性のＰ．ｙｏｅｌｉｉ  ｓｓｐ．ＮＳ株に対して、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は低用量で有効であり、既存の抗マラリア剤のアルテメーター、アルテスネート及びクロロキンよりＥＤ５０値で５．７〜６４．３倍、ＥＤ９０値で６．４〜＞１２５倍の優れた治療効果が認められた。ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の皮下投与では薬剤感受性株よりも薬剤耐性株に対してＥＤ５０値及びＥＤ９０値は２．５倍〜２．６倍優れた治療効果があることが示された。
【００４４】
ネズミマラリア原虫感染モデルに対するボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）及び既存薬剤の経口投与による化合物の５０％有効濃度（ＥＤ５０値）及び９０％有効濃度（ＥＤ９０値）は化合物濃度作用曲線より求めた。その結果は、下記の通りであった。
【００４５】
2004269440.tif 000006
【００４６】
本発明に用いたボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を経口投与した場合、ネズミマラリア原虫感染モデルおいて薬剤耐性のＰ．ｙｏｅｌｉｉ  ｓｓｐ．ＮＳ株に対して、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は低用量で有効であり、既存の抗マラリア剤のアルテメーター、アルテスネート及びクロロキンよりＥＤ５０値で１３．３〜１６．７倍、ＥＤ９０値で３６．４〜＞９１倍の優れた治療効果が認められた。
【００４７】
また、ズミマラリア原虫感染モデルおいて薬剤感受性のＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ  Ｎ株に対しても、ボレリジンは（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は薬剤耐性株と同様に低用量で有効であり、既存の抗マラリア剤のアルテメーター、アルテスネートより優れた治療効果が認められ、クロロキンと同等の治療効果が認められた。なお、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の経口投与においも皮下投与の場合と同様に薬剤感受性株よりも薬剤耐性株に対してＥＤ５０値及びＥＤ９０値は優れた治療効果があることが確認された。
【００４８】
既存の抗マラリア剤のキニーネは、経口投与が不可能な重症の熱帯熱マラリア原虫感染の患者（脳性マラリア）に対して、点滴静注療法剤としても用いられている。そこで、ネズミマラリア原虫感染モデルとして薬剤感受性のＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ  Ｎ株に対してボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の静脈内投与による治療効果について予防的に検討した結果、ＥＤ５０値０．２ｍｇ／ｋｇ、ＥＤ９０値１．３ｍｇ／ｋｇという低用量で有効性が認められた。このとから、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は経口剤のみならず、前述の皮下注射剤及び点滴剤として非経口投与形態でも治療が可能であることが示唆された。
【００４９】
そこで、本発明者らは、マウス供試動物としての急性毒性試験においてボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を皮下投与した場合、５０ｍｇ／ｋｇ投与において致死するに至らなかった。
【００５０】
本発明者らはボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の単回経口投与におけるマラリア感染予防的効果を治療実験と比較してｉｎ ｖｉｖｏ感染モデル（薬剤感受性のＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ  Ｎ株）にて評価した。すなわち、供試動物としてはＩＣＲマウス（日本チャールス・リバー社、日本国）の雄、体重１８〜２０ｇの一群５匹を用い、ｉｎ ｖｉｖｏ  ｐａｓｓａｇｅにて維持・継代した原虫を２×１０６  個の寄生虫感染赤血球に調整し、尾静脈接種にて感染させた。
【００５１】
その一例を示すと、感染日をｄａｙ  ０  とすると、感染２時間後にボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の溶液（１０％ジメチルスルホキサイド溶液−Ｔｗｅｅｎ８０）６ｍｇ／ｋｇを単回経口（ｐ．ｏ．）投与した。予防的実験は感染日の前日（ｄａｙ  −１）に前述のボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の溶液６ｍｇ／ｋｇを単回経口（ｐ．ｏ．）投与した。投与後ｄａｙｓ  １〜４の毎日１回尾静脈より血液塗抹標本を作成し、経時的な原虫感染赤血球率（ｐａｒａｓｉｔａｅｍｉａ）を観察し、本化合物非投与群の感染率より治療効果（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ％）を判定した。
【００５２】
2004269440.tif 000007
【００５３】
本発明に用いたボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）６ｍｇ／ｋｇを単回経口投与した場合、ネズミマラリア原虫感染モデルの薬剤感受性のＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ  Ｎ株に対して、治療実験では、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は少なくともｄａｙｓ  １〜４まで５１．９〜６３．５％の治療効果がみられる。
【００５４】
さらに、原虫感染前日にボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を投与した予防的実験ではｄａｙｓ  ２〜４まで５１．２〜８３．８％の治療効果がみられ、その効果は原虫感染当日にボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）を投与した治療実験の効果より優れていた。これらのことは、生体内でのボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）の血中濃度が長く保たれ、半減期が長いことが示唆される。このように、ボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は、マラリア感染の治療剤であるばかりでなく、予防剤としての用途が可能であることを示すものである。
【００５５】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明に用いたボレリジン（Ｂｏｒｒｅｌｉｄｉｎ）は、ヒト感染性熱帯熱マラリア原虫類に対して抗マラリア活性を示し、マラリア原虫感染モデルに対して予防及び治療効果を示し、特に薬剤耐性株に対して有効であり、抗マラリア剤として臨床応用できることが期待される。