(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規ＧＰＲ７リガンドおよびそのＤＮＡ等の提供。【解決手段】ヒト全脳、マウス全脳及びラット全脳由来の、Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい特定のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチドまたはその塩。【効果】本発明のＧＰＲ７リガンドはＧＰＲ７の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と抗肥満薬などの医薬品候補化合物のスクリーニングなどに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項３】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を有する請求項１記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項４】
Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を有する請求項１記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項５】
Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項６】
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項５記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項７】
配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有する請求項５記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項８】
Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有する請求項５記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項９】
Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有する請求項５記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項１０】
Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項１１】
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１０記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項１２】
配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：６８または配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を有する請求項１０記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項１３】
Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項１４】
配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１３記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項１５】
配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列を有する請求項１３記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項１６】
Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項１７】
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１６記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項１８】
配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列を有する請求項１７記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項１９】
配列番号：４９または配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と結合する能力を有している請求項１〜１８記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２０】
配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と結合する能力を有している請求項１〜１８記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２１】
配列番号：８４または配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と結合する能力を有している請求項１〜１８記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチドの部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチドの前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２４】
配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項２３記載の前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２５】
配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列を有する請求項２４記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２６】
配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項２３記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２７】
配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４または配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を有する請求項２６記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２８】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８または配列番号：７９で表わされる塩基配列を有する請求項２８記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２２記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項２３記載の前駆体ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：８０または配列番号：８１で表わされる塩基配列を有する請求項３１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
ＤＮＡである請求項２８〜３２記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項２８〜３３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項３５】
請求項３４記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項３６】
請求項３５記載の形質転換体を培養し、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドを生成せしめることを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドもしくはその前駆体ペプチドまたはその塩の製造法。
【請求項３７】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドもしくはその前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。
【請求項３８】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩の活性を不活性化する中和抗体である請求項３７記載の抗体。
【請求項３９】
請求項３７記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項４０】
肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である請求項３９記載の医薬。
【請求項４１】
請求項３７記載の抗体を含有してなる診断薬。
【請求項４２】
拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である請求項４１記載の診断薬。
【請求項４３】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬。
【請求項４４】
拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である請求項４３記載の医薬。
【請求項４５】
請求項２８記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項４６】
拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である請求項４５記載の医薬。
【請求項４７】
請求項２８記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
【請求項４８】
拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である請求項４７記載の診断薬。
【請求項４９】
請求項２８記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド。
【請求項５０】
請求項４９記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項５１】
肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である請求項５０記載の医薬。
【請求項５２】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項５３】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項５４】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項５５】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項５６】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項５７】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項５８】
請求項５２記載のスクリーニング方法または請求項５５記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
【請求項５９】
請求項５３記載のスクリーニング方法または請求項５６記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
【請求項６０】
請求項５４記載のスクリーニング方法または請求項５７記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
【請求項６１】
アゴニストである請求項５８〜６０記載の化合物またはその塩。
【請求項６２】
アンタゴニストである請求項５８〜６０記載の化合物またはその塩。
【請求項６３】
請求項５８〜６０のいずれかに記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項６４】
請求項６１記載のアゴニストを含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤。
【請求項６５】
請求項６２記載のアンタゴニストを含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤。
【請求項６６】
請求項５２記載のスクリーニング方法または請求項５５記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗肥満薬。
【請求項６７】
請求項５３記載のスクリーニング方法または請求項５６記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗肥満薬。
【請求項６８】
請求項５４記載のスクリーニング方法または請求項５７記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗肥満薬。
【請求項６９】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを用いることを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項７０】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを含有することを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項７１】
請求項６９記載のスクリーニング方法または請求項７０記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩。
【請求項７２】
発現量を増加させる化合物またはその塩である請求項７１記載の化合物またはその塩。
【請求項７３】
発現量を減少させる化合物またはその塩である請求項７１記載の化合物またはその塩。
【請求項７４】
請求項７１記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項７５】
請求項７２記載の化合物またはその塩を含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤。
【請求項７６】
請求項７３記載の化合物またはその塩を含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤。
【請求項７７】
哺乳動物に対して、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、請求項２８記載のポリヌクレオチド、請求項６１記載のアゴニスト、または請求項７２記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする拒食症の予防・治療方法。
【請求項７８】
哺乳動物に対して、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、請求項２８記載のポリヌクレオチド、請求項６１記載のアゴニスト、または請求項７２記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする食欲増進方法。
【請求項７９】
哺乳動物に対して、請求項３７記載の抗体、請求項４９記載のポリヌクレオチド、請求項６２記載のアンタゴニスト、または請求項７３記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法。
【請求項８０】
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質またはその塩。
【請求項８１】
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列を含有する請求項８０記載のタンパク質またはその塩。
【請求項８２】
請求項８０記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項８３】
請求項８０記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項８４】
ＤＮＡである請求項８３記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
配列番号：８７で表される塩基配列を含有する請求項８４記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
請求項８３記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項８７】
請求項８６記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項８８】
請求項８７記載の形質転換体を培養し、請求項８０記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成せしめることを特徴とする請求項８０記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の製造法。
【請求項８９】
請求項８０記載のタンパク質もしくは請求項８２記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
【請求項９０】
請求項８３記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項９１】
拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である請求項９０記載の医薬。
【請求項９２】
請求項８３記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
【請求項９３】
拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である請求項９２記載の診断薬。
【請求項９４】
請求項８０記載のタンパク質もしくは請求項８２記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
【請求項９５】
請求項８０記載のタンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である請求項９４記載の抗体。
【請求項９６】
請求項９４記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項９７】
肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である請求項９６記載の医薬。
【請求項９８】
請求項９４記載の抗体を含有してなる診断薬。
【請求項９９】
拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である請求項９８記載の診断薬。
【請求項１００】
請求項８３記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
請求項１００記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項１０２】
肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である請求項１０１記載の医薬。
【請求項１０３】
配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質またはその塩。
【請求項１０４】
配列番号：８８で表されるアミノ酸配列を含有する請求項１０３記載のタンパク質またはその塩。
【請求項１０５】
請求項１０３記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項１０６】
請求項１０３記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
ＤＮＡである請求項１０６記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
配列番号：８９で表される塩基配列を含有する請求項１０７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
請求項１０８記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１１０】
請求項１０９記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項１１１】
請求項１１０記載の形質転換体を培養し、請求項１０３記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成せしめることを特徴とする請求項１０３記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の製造法。
【請求項１１２】
請求項１０３記載のタンパク質もしくは請求項１０５記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１１３】
請求項１０６記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項１１４】
拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である請求項１１３記載の医薬。
【請求項１１５】
請求項１０６記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
【請求項１１６】
拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である請求項１１５記載の診断薬。
【請求項１１７】
請求項１０３記載のタンパク質もしくは請求項１０５記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
【請求項１１８】
請求項１０３記載のタンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である請求項１１７記載の抗体。
【請求項１１９】
請求項１１７記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項１２０】
肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である請求項１１９記載の医薬。
【請求項１２１】
請求項１１７記載の抗体を含有してなる診断薬。
【請求項１２２】
拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である請求項１２１記載の診断薬。
【請求項１２３】
請求項１０６記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
請求項１２３記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項１２５】
肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である請求項１２４記載の医薬。
【請求項１２６】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１２７】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１２８】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１２９】
請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１３０】
請求項１２６記載のスクリーニング方法または請求項１２８記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
【請求項１３１】
請求項１２７記載のスクリーニング方法または請求項１２９記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
【請求項１３２】
アゴニストである請求項１３０または１３１記載の化合物またはその塩。
【請求項１３３】
アンタゴニストである請求項１３０または１３１記載の化合物またはその塩。
【請求項１３４】
請求項１３０または１３１記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１３５】
請求項１３２記載のアゴニストを含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤。
【請求項１３６】
請求項１３３記載のアンタゴニストを含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤。
【請求項１３７】
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを用いることを特徴とする、配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１３８】
配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを含有することを特徴とする、配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１３９】
請求項１３７記載のスクリーニング方法または請求項１３８記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩。
【請求項１４０】
発現量を増加させる化合物またはその塩である請求項１３９記載の化合物またはその塩。
【請求項１４１】
発現量を減少させる化合物またはその塩である請求項１３９記載の化合物またはその塩。
【請求項１４２】
請求項１３９記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１４３】
請求項１４０記載の化合物またはその塩を含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤。
【請求項１４４】
請求項１４１記載の化合物またはその塩を含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤。
【請求項１４５】
配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを用いることを特徴とする、配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１４６】
配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを含有することを特徴とする、配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１４７】
請求項１４５記載のスクリーニング方法または請求項１４６記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩。
【請求項１４８】
発現量を増加させる化合物またはその塩である請求項１４７記載の化合物またはその塩。
【請求項１４９】
発現量を減少させる化合物またはその塩である請求項１４７記載の化合物またはその塩。
【請求項１５０】
請求項１４７記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１５１】
請求項１４８記載の化合物またはその塩を含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤。
【請求項１５２】
請求項１４９記載の化合物またはその塩を含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤。
【請求項１５３】
哺乳動物に対して、請求項８０記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、請求項８３記載のポリヌクレオチド、請求項１０３記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、請求項１０６記載のポリヌクレオチド、請求項１３２記載のアゴニスト、請求項１４０記載の化合物またはその塩、または請求項１４８記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする拒食症の予防・治療方法。
【請求項１５４】
哺乳動物に対して、請求項８０記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、請求項８３記載のポリヌクレオチド、請求項１０３記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、請求項１０６記載のポリヌクレオチド、請求項１３２記載のアゴニスト、請求項１４０記載の化合物またはその塩、または請求項１４８記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする食欲増進方法。
【請求項１５５】
哺乳動物に対して、請求項９４記載の抗体、請求項１００記載のポリヌクレオチド、請求項１１７記載の抗体、請求項１２３記載のポリヌクレオチド、請求項１３３記載のアンタゴニスト、請求項１４１記載の化合物またはその塩、または請求項１４９記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法。
【請求項１５６】
外来性の請求項２８記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物。
【請求項１５７】
非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１５６記載の動物。
【請求項１５８】
外来性の請求項２８記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクター。
【請求項１５９】
請求項２８記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞。
【請求項１６０】
該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された請求項１５９記載の胚幹細胞。
【請求項１６１】
非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１５９記載の胚幹細胞。
【請求項１６２】
請求項２８記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物。
【請求項１６３】
該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が請求項２８記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる請求項１６２記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１６４】
非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１６２記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１６５】
請求項１６３記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする請求項２８記載のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１６６】
外来性の請求項８３記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物。
【請求項１６７】
非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１６６記載の動物。
【請求項１６８】
外来性の請求項８３記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクター。
【請求項１６９】
請求項８３記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞。
【請求項１７０】
該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された請求項１６９記載の胚幹細胞。
【請求項１７１】
非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１６９記載の胚幹細胞。
【請求項１７２】
請求項８３記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物。
【請求項１７３】
該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が請求項８３記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる請求項１７２記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１７４】
非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１７２記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１７５】
請求項１７３記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする請求項８３記載のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１７６】
外来性の請求項１０６記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物。
【請求項１７７】
非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１７６記載の動物。
【請求項１７８】
外来性の請求項１０６記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクター。
【請求項１７９】
請求項１０６記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞。
【請求項１８０】
該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された請求項１７９記載の胚幹細胞。
【請求項１８１】
非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１７９記載の胚幹細胞。
【請求項１８２】
請求項１０６記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物。
【請求項１８３】
該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が請求項１０６記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる請求項１８２記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１８４】
非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１８２記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１８５】
請求項１８３記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする請求項１０６記載のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１８６】
拒食症の予防・治療剤を製造するための、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、請求項２８記載のポリヌクレオチド、請求項６１記載のアゴニスト、または請求項７２記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項１８７】
食欲増進剤を製造するための、請求項１〜２１のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、請求項２８記載のポリヌクレオチド、請求項６１記載のアゴニスト、または請求項７２記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項１８８】
肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤を製造するための、請求項３７記載の抗体、請求項４９記載のポリヌクレオチド、請求項６２記載のアンタゴニスト、または請求項７３記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項１８９】
拒食症の予防・治療剤を製造するための、請求項８０記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、請求項８３記載のポリヌクレオチド、請求項１０３記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、請求項１０６記載のポリヌクレオチド、請求項１３２記載のアゴニスト、請求項１４０記載の化合物またはその塩、または請求項１４８記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項１９０】
食欲増進剤を製造するための、請求項８０記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、請求項８３記載のポリヌクレオチド、請求項１０３記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、請求項１０６記載のポリヌクレオチド、請求項１３２記載のアゴニスト、請求項１４０記載の化合物またはその塩、または請求項１４８記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項１９１】
肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤を製造するための、請求項９４記載の抗体、請求項１００記載のポリヌクレオチド、請求項１１７記載の抗体、請求項１２３記載のポリヌクレオチド、請求項１３３記載のアンタゴニスト、請求項１４１記載の化合物またはその塩、または請求項１４９記載の化合物またはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＧＰＲ７等と結合する能力を有するペプチド、そのＤＮＡおよびそれらの用途、およびウシ由来のＧＰＲ７並びにＧＰＲ８、それらのＤＮＡおよびそれらの用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体のホメオスタシスの維持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器系、免疫系、消化器系、代謝系の調節、感覚受容などの重要な機能調節は、様々なホルモンや神経伝達物質のような内在性因子あるいは光や匂いなどの感覚刺激をこれらに対して生体が備えている細胞膜に存在する特異的な受容体を介して細胞が受容し、それに応じた反応をすることによって行われている。このような機能調節によるホルモンや神経伝達物質の受容体の多くはｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）と共役しており、このＧ蛋白質の活性化によって細胞内にシグナルを伝達して様々な機能を発現させることを特徴とする。また、これらの受容体タンパク質は共通して７個の膜貫通領域を有する。これらのことからこうした受容体はＧ蛋白質共役型受容体あるいは７回膜貫通型受容体と総称される。このように生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質およびそれに対する受容体蛋白質が存在して相互作用し、重要な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対する受容体が存在するかどうかについてはいまだ不明なことが多い。
近年、ヒトゲノムＤＮＡあるいは各種ヒト組織由来のｃＤＮＡのランダムな配列決定による配列情報の蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によってヒトの遺伝子が加速度的に解明されてきている。それにともない、機能未知の蛋白をコードすると予想される多くの遺伝子の存在が明らかになっている。Ｇ蛋白質共役型受容体は、７個の膜貫通領域を有するのみでなくその核酸あるいはアミノ酸に多くの共通配列が存在するためそのような蛋白の中から明確にＧ蛋白質共役型受容体として区分することができる。一方でこうした構造の類似性を利用したポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下、ＰＣＲと略称する）法によってもこうしたＧ蛋白質共役型受容体遺伝子が得られている。このようにしてこれまでに得られたＧ蛋白質共役型受容体のうちには既知の受容体との構造の相同性が高いサブタイプであって容易にそのリガンドを予測することが可能な場合もあるが、ほとんどの場合その内在性リガンドは予測不能であり、これらの受容体は対応するリガンドが見いだされていない。このことからこれらの受容体はオーファン受容体と呼ばれている。このようなオーファン受容体の未同定の内生リガンドは、リガンドが知られていなかったために十分な解析がなされていなかった生物現象に関与している可能性がある。そして、このようなリガンドが重要な生理作用や病態と関連している場合には、その受容体作動薬あるいは拮抗薬の開発が革新的な医薬品の創製に結びつくことが期待される（Ｓｔａｄｅｌ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．、ＴｉＰＳ、１８巻、４３０−４３７頁、１９９７年、Ｍａｒｃｈｅｓｅ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．、ＴｉＰＳ、２０巻、３７０−３７５頁、１９９９年、Ｃｉｖｅｌｌｉ，　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．、８４８巻、６３−６５頁、１９９９年、Ｈｏｗａｒｄ，　Ａ．　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．、ＴｉＰＳ、２２巻、１３２−１４０頁、２００１年）。
最近、幾つかのグループによってこうしたオーファン受容体のリガンド探索の試みがなされ、新たな生理活性ペプチドであるリガンドの単離・構造決定が報告されている。ＲｅｉｎｓｈｅｉｄらおよびＭｅｕｎｉｅｒらは独立に、動物細胞にオーファンＧ蛋白質共役型受容体ＬＣ１３２あるいはＯＲＬ１をコードするｃＤＮＡを導入して受容体を発現させ、その応答を指標としてｏｒｐｈａｎｉｎ　ＦＱあるいはｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎとそれぞれ名付けられた同一の新規ペプチドをブタ脳あるいはラット脳の抽出物より単離し、配列を決定した（Ｒｅｉｎｓｈｅｉｄ，　Ｒ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻、７９２−７９４頁、１９９５年、Ｍｅｕｎｉｅｒ，　Ｊ．−Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３７７巻、５３２−５３５頁、１９９５年）。このペプチドは痛覚に関与していることが報告されたが、さらに、受容体のノックアウトマウスの研究により記憶に関与していることが明らかにされた（Ｍａｎａｂｅ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９４巻、５７７−５８１頁、１９９８年）。
その後これまでにＰｒＲＰ（ｐｒｏｌａｃｔｉｎ　ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ）、ｏｒｅｘｉｎ、ａｐｅｌｉｎ、ｇｈｒｅｌｉｎおよびＧＡＬＰ（ｇａｌａｎｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ）などの新規ペプチドがオーファンＧ蛋白質共役型受容体のリガンドとして単離された（Ｈｉｎｕｍａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９３巻、２７２−２７６頁、１９９８年、Ｓａｋｕｒａｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｅｌｌ、９２巻、５７３−５８５頁、１９９８年、Ｔａｔｅｍｏｔｏ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２５１巻、４７１−４７６頁、１９９８年、Ｋｏｊｉｍａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０２巻、６５６−６６０頁、１９９９年、Ｏｈｔａｋｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３７０４１−３７０４５頁、１９９９年）。一方、これまで明らかでなかった生理活性ペプチドの受容体が解明された例もある。腸管収縮に関与するｍｏｔｉｌｉｎの受容体がＧＰＲ３８であることが明らかにされた（Ｆｅｉｇｈｎｅｒ，　Ｓ．　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４巻、２１８４−２１８８頁、１９９９年）ほか、ＳＬＣ−１がＭＣＨの受容体として同定され（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４００巻、２６１−２６５頁、１９９９年、Ｓａｉｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４００巻、２６５−２６９頁、１９９９年、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２６１巻、６２２−６２６頁、１９９９年、Ｌｅｍｂｏ，　Ｐ．　Ｍ．　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、１巻、２６７−２７１頁、１９９９年、Ｂａｃｈｎｅｒ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．、４５７巻、５２２−５２４頁、１９９９年）、また、ＧＰＲ１４（ＳＥＮＲ）がｕｒｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩの受容体であることが報告された（Ａｍｅｓ，　Ｒ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０１巻、２８２−２８６頁、１９９９年、Ｍｏｒｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２６５巻、１２３−１２９頁、１９９９年、Ｎｏｔｈａｃｋｅｒ，　Ｈ．−Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、１巻、３８３−３８５頁、１９９９年、Ｌｉｕ，　Ｑ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２６６巻、１７４−１７８頁、１９９９年）。さらに、最近、神経ペプチドであるｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ　Ｕ、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ　ＦＦの受容体が明らかにされたほか、これらのペプチド以外にもｃｙｓｔｅｉｎｙｌ　ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ類、ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ　ａｃｉｄ、ｓｐｈｉｎｇｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅなど低分子の生理活性脂質あるいは核酸誘導体がオーファン受容体のリガンドとして同定された（Ｈｏｗａｒｄ，　Ａ．　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．、ＴｉＰＳ、２２巻、１３２−１４０頁、２００１年）。ＭＣＨはそのノックアウトマウスが羸痩のｐｈｅｎｏｔｙｐｅを示すことから肥満に関与することが示されていたが（Ｓｈｉｍａｄａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９６巻、６７０−６７４頁、１９９８年）、その受容体が明らかにされたことにより抗肥満薬としての可能性を有する受容体拮抗薬の探索が可能となった。また、ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩはサルに静脈内投与することによって心虚血を惹起することから心循環系に強力な作用を示すことも報告されている（Ａｍｅｓ，　Ｒ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０１巻、２８２−２８６頁、１９９９年）。このように、オーファン受容体およびそのリガンドは新たな生理作用に関与する場合が多く、その解明は新たな医薬品開発に結びつくことが期待される。しかし、オーファン受容体のリガンド探索においては多くの困難さが伴うことが知られている。例えば、細胞に発現させたオーファン受容体がリガンドに応答した後にいかなる二次情報伝達系が作動するかは一般に不明であり、様々な応答系について検討する必要がある。また、リガンドの存在する組織は容易には予想されないため種々の組織抽出物を用意しなければならない。さらに、リガンドがペプチドである場合、受容体を刺激するのに必要なリガンド量はごく低濃度で十分であるためにこのようなリガンドの生体内の存在量は極微量であることが多いことに加え、ペプチドは蛋白分解酵素によって消化されて活性を失ったり、非特異的吸着によって精製過程において回収が悪かったりするために、生体より抽出して構造決定に必要な量を単離することは通常極めて困難である。これらの問題によって、これまでに数多くのオーファン受容体の存在が明らかにされながらそのリガンドが明らかにされた受容体はごく一部に過ぎない。
Ｇ蛋白質共役型受容体として報告されているものの一つにＧＰＲ７（配列番号：４９、Ｏ’Ｄｏｗｄ，　Ｂ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２８巻、８４−９１頁、１９９５年）がある。ＧＰＲ７はソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ３）およびオピオイド受容体（δ、κおよびμ）と低いホモロジーがある。また、ＧＰＲ７は、ＧＰＲ８（配列番号：６６、Ｏ’Ｄｏｗｄ，　Ｂ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２８巻、８４−９１頁、１９９５年）とアミノ酸レベルで６４％程度の相同性が認められるものである。このＯ’Ｄｏｗｄ，　Ｂ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．には、ＧＰＲ７の膜画分に［３Ｈ］ｂｒｅｍａｚｏｃｉｎｅが結合し、この結合がμオピオイド受容体選択的リガンドであるβ−ｆｕｎａｌｔｒｅｘａｍｉｎｅ、［Ｄ−Ｐｒｏ４］ｍｏｒｐｈｉｃｅｐｔｉｎ、β−エンドルフィン、κオピオイド受容体選択的リガンドであるＵ５０，４８８、δオピオイド受容体選択的リガンドであるｎａｌｔｒｉｎｄｏｌｅにより阻害されることが報告されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＧＰＲ７等に結合する能力を有する新規ペプチド、そのＤＮＡ、該ペプチドとＧＰＲ７等とを用いる医薬のスクリーニング方法などを提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者たちは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト全脳、マウス全脳およびラット全脳からＧＰＲ７と結合する能力を有する新規なペプチド（ＧＰＲ７リガンド）をコードするＤＮＡを取得することに成功し、ＧＰＲ７リガンドが食欲（摂食）増進作用を示すことを見出した。さらに、ウシ視床下部からＧＰＲ７およびＧＰＲ８をそれぞれコードするＤＮＡを取得することに成功した。本発明者たちは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（１）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（３）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を有する上記（１）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（４）Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を有する上記（１）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（５）Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（６）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（５）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（７）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有する上記（５）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（８）Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有する上記（５）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（９）Ｎ末端のトリプトファン残基が６−ブロモ化されている、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有する上記（５）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１０）Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１１）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（１０）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１２）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：６８または配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を有する上記（１０）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１３）Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１４）配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（１３）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１５）配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列を有する上記（１３）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１６）Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されていてもよい配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１７）配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（１６）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１８）配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列を有する上記（１７）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（１９）配列番号：４９または配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と結合する能力を有している上記（１）〜（１８）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２０）配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と結合する能力を有している上記（１）〜（１８）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２１）配列番号：８４または配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と結合する能力を有している上記（１）〜（１８）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２２）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチドの部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２３）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチドの前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２４）配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（２３）記載の前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２５）配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列を有する上記（２４）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２６）配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（２３）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２７）配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４または配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を有する上記（２６）記載のペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、
（２８）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（２９）配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：７７、配列番号：７８または配列番号：７９で表わされる塩基配列を有する上記（２８）記載のポリヌクレオチド、
（３０）上記（２２）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３１）上記（２３）記載の前駆体ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３２）配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：８０または配列番号：８１で表わされる塩基配列を有する上記（３１）記載のポリヌクレオチド、
（３３）ＤＮＡである上記（２８）〜（３２）記載のポリヌクレオチド、
（３４）上記（２８）〜（３３）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（３５）上記（３４）記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
（３６）上記（３５）記載の形質転換体を培養し、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドを生成せしめることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドもしくはその前駆体ペプチドまたはその塩の製造法、
（３７）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドもしくはその前駆体ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、
（３８）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩の活性を不活性化する中和抗体である上記（３７）記載の抗体、
（３９）上記（３７）記載の抗体を含有してなる医薬、
（４０）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（３９）記載の医薬、
（４１）上記（３７）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（４２）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（４１）記載の診断薬、
（４３）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬、
（４４）拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である上記（４３）記載の医薬、
（４５）上記（２８）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（４６）拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である上記（４５）記載の医薬、
（４７）上記（２８）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（４８）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（４７）記載の診断薬、
（４９）上記（２８）記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
（５０）上記（４９）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（５１）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（５０）記載の医薬、
（５２）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（５３）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（５４）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（５５）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（５６）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（５７）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（５８）上記（５２）記載のスクリーニング方法または上記（５５）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（５９）上記（５３）記載のスクリーニング方法または上記（５６）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（６０）上記（５４）記載のスクリーニング方法または上記（５７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（６１）アゴニストである上記（５８）〜（６０）記載の化合物またはその塩、（６２）アンタゴニストである上記（５８）〜（６０）記載の化合物またはその塩、
（６３）上記（５８）〜（６０）のいずれかに記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（６４）上記（６１）記載のアゴニストを含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤、
（６５）上記（６２）記載のアンタゴニストを含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤、
（６６）上記（５２）記載のスクリーニング方法または上記（５５）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗肥満薬、
（６７）上記（５３）記載のスクリーニング方法または上記（５６）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗肥満薬、
（６８）上記（５４）記載のスクリーニング方法または上記（５７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる抗肥満薬、
（６９）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（７０）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドをコードするＤＮＡを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（７１）上記（６９）記載のスクリーニング方法または上記（７０）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩、
（７２）発現量を増加させる化合物またはその塩である上記（７１）記載の化合物またはその塩、
（７３）発現量を減少させる化合物またはその塩である上記（７１）記載の化合物またはその塩、
（７４）上記（７１）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（７５）上記（７２）記載の化合物またはその塩を含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤、
（７６）上記（７３）記載の化合物またはその塩を含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤、
（７７）哺乳動物に対して、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、上記（２８）記載のポリヌクレオチド、上記（６１）記載のアゴニスト、または上記（７２）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする拒食症の予防・治療方法、
（７８）哺乳動物に対して、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、上記（２８）記載のポリヌクレオチド、上記（６１）記載のアゴニスト、または上記（７２）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする食欲増進方法、
（７９）哺乳動物に対して、上記（３７）記載の抗体、上記（４９）記載のポリヌクレオチド、上記（６２）記載のアンタゴニスト、または上記（７３）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法、
（８０）配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質またはその塩、
（８１）配列番号：８６で表されるアミノ酸配列を含有する上記（８０）記載のタンパク質またはその塩、
（８２）上記（８０）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（８３）上記（８０）記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（８４）ＤＮＡである上記（８３）記載のポリヌクレオチド、
（８５）配列番号：８７で表される塩基配列を含有する上記（８４）記載のポリヌクレオチド、
（８６）上記（８３）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（８７）上記（８６）記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
（８８）上記（８７）記載の形質転換体を培養し、上記（８０）記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成せしめることを特徴とする上記（８０）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（８９）上記（８０）記載のタンパク質もしくは上記（８２）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（９０）上記（８３）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（９１）拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である上記（９０）記載の医薬、
（９２）上記（８３）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（９３）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（９２）記載の診断薬、
（９４）上記（８０）記載のタンパク質もしくは上記（８２）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（９５）上記（８０）記載のタンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である上記（９４）記載の抗体、
（９６）上記（９４）記載の抗体を含有してなる医薬、
（９７）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（９６）記載の医薬、
（９８）上記（９４）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（９９）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（９９）記載の診断薬、
（１００）上記（８３）記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
（１０１）上記（１００）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１０２）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（１０１）記載の医薬、
（１０３）配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質またはその塩、
（１０４）配列番号：８８で表されるアミノ酸配列を含有する上記（１０３）記載のタンパク質またはその塩、
（１０５）上記（１０３）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（１０６）上記（１０３）記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（１０７）ＤＮＡである上記（１０６）記載のポリヌクレオチド、
（１０８）配列番号：８９で表される塩基配列を含有する上記（１０７）記載のポリヌクレオチド、
（１０９）上記（１０８）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、（１１０）上記（１０９）記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、（１１１）上記（１１０）記載の形質転換体を培養し、上記（１０３）記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成せしめることを特徴とする上記（１０３）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（１１２）上記（１０３）記載のタンパク質もしくは上記（１０５）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（１１３）上記（１０６）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１１４）拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤である上記（１１３）記載の医薬、
（１１５）上記（１０６）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（１１６）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（１１５）記載の診断薬、
（１１７）上記（１０３）記載のタンパク質もしくは上記（１０５）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（１１８）上記（１０３）記載のタンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である上記（１１７）記載の抗体、
（１１９）上記（１１７）記載の抗体を含有してなる医薬、
（１２０）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（１１９）記載の医薬、
（１２１）上記（１１７）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（１２２）拒食症、肥満症または摂食亢進症の診断薬である上記（１２１）記載の診断薬、
（１２３）上記（１０６）記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
（１２４）上記（１２３）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１２５）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記（１２４）記載の医薬、
（１２６）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１２７）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１２８）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１２９）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを含有することを特徴とする上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１３０）上記（１２６）記載のスクリーニング方法または上記（１２８）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（１３１）上記（１２７）記載のスクリーニング方法または上記（１２９）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩と配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
（１３２）アゴニストである上記（１３０）または（１３１）記載の化合物またはその塩、
（１３３）アンタゴニストである上記（１３０）または（１３１）記載の化合物またはその塩、
（１３４）上記（１３０）または（１３１）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１３５）上記（１３２）記載のアゴニストを含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤、
（１３６）上記（１３３）記載のアンタゴニストを含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤、
（１３７）配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを用いることを特徴とする、配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１３８）配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを含有することを特徴とする、配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１３９）上記（１３７）記載のスクリーニング方法または上記（１３８）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：８６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩、
（１４０）発現量を増加させる化合物またはその塩である上記（１３９）記載の化合物またはその塩、
（１４１）発現量を減少させる化合物またはその塩である上記（１３９）記載の化合物またはその塩、
（１４２）上記（１３９）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１４３）上記（１４０）記載の化合物またはその塩を含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤、
（１４４）上記（１４１）記載の化合物またはその塩を含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤、
（１４５）配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを用いることを特徴とする、配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１４６）配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質をコードするＤＮＡを含有することを特徴とする、配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１４７）上記（１４５）記載のスクリーニング方法または上記（１４６）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、配列番号：８８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質の発現量を変化させる化合物またはその塩、
（１４８）発現量を増加させる化合物またはその塩である上記（１４７）記載の化合物またはその塩、
（１４９）発現量を減少させる化合物またはその塩である上記（１４７）記載の化合物またはその塩、
（１５０）上記（１４７）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１５１）上記（１４８）記載の化合物またはその塩を含有してなる拒食症の予防・治療剤または食欲増進剤、
（１５２）上記（１４９）記載の化合物またはその塩を含有してなる肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤、
（１５３）哺乳動物に対して、上記（８０）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（８３）記載のポリヌクレオチド、上記（１０３）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（１０６）記載のポリヌクレオチド、上記（１３２）記載のアゴニスト、上記（１４０）記載の化合物またはその塩、または上記（１４８）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする拒食症の予防・治療方法、
（１５４）哺乳動物に対して、上記（８０）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（８３）記載のポリヌクレオチド、上記（１０３）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（１０６）記載のポリヌクレオチド、上記（１３２）記載のアゴニスト、上記（１４０）記載の化合物またはその塩、または上記（１４８）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする食欲増進方法、
（１５５）哺乳動物に対して、上記（９４）記載の抗体、上記（１００）記載のポリヌクレオチド、上記（１１７）記載の抗体、上記（１２３）記載のポリヌクレオチド、上記（１３３）記載のアンタゴニスト、上記（１４１）記載の化合物またはその塩、または上記（１４９）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法、
（１５６）外来性の上記（２８）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（１５７）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１５６）記載の動物、
（１５８）外来性の上記（２８）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクター、
（１５９）上記（２８）記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（１６０）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された上記（１５９）記載の胚幹細胞、
（１６１）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１５９）記載の胚幹細胞、（１６２）上記（２８）記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（１６３）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が上記（２８）記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（１６２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１６４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１６２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１６５）上記（１６３）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする上記（２８）記載のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１６６）外来性の上記（８３）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（１６７）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１６６）記載の動物、
（１６８）外来性の上記（８３）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクター、
（１６９）上記（８３）記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（１７０）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された上記（１６９）記載の胚幹細胞、
（１７１）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１６９）記載の胚幹細胞、（１７２）上記（８３）記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（１７３）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が上記（８３）記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（１７２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１７４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１７２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１７５）上記（１７３）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする上記（８３）記載のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１７６）外来性の上記（１０６）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（１７７）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１７６）記載の動物、
（１７８）外来性の上記（１０６）記載のＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクター、
（１７９）上記（１０６）記載のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（１８０）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された上記（１７９）記載の胚幹細胞、
（１８１）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１７９）記載の胚幹細胞、（１８２）上記（１０６）記載のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（１８３）該ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が上記（１０６）記載のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（１８２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１８４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１８２）記載の非ヒト哺乳動物、
（１８５）上記（１８３）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする上記（１０６）記載のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（１８６）拒食症の予防・治療剤を製造するための、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、上記（２８）記載のポリヌクレオチド、上記（６１）記載のアゴニスト、または上記（７２）記載の化合物またはその塩の使用、
（１８７）食欲増進剤を製造するための、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のペプチド、その部分ペプチド、そのアミド、もしくはそのエステルまたはその塩、上記（２８）記載のポリヌクレオチド、上記（６１）記載のアゴニスト、または上記（７２）記載の化合物またはその塩の使用、
（１８８）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤を製造するための、上記（３７）記載の抗体、上記（４９）記載のポリヌクレオチド、上記（６２）記載のアンタゴニスト、または上記（７３）記載の化合物またはその塩の使用、
（１８９）拒食症の予防・治療剤を製造するための、上記（８０）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（８３）記載のポリヌクレオチド、上記（１０３）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（１０６）記載のポリヌクレオチド、上記（１３２）記載のアゴニスト、上記（１４０）記載の化合物またはその塩、または上記（１４８）記載の化合物またはその塩の使用、
（１９０）食欲増進剤を製造するための、上記（８０）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（８３）記載のポリヌクレオチド、上記（１０３）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、上記（１０６）記載のポリヌクレオチド、上記（１３２）記載のアゴニスト、上記（１４０）記載の化合物またはその塩、または上記（１４８）記載の化合物またはその塩の使用、および
（１９１）肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤を製造するための、上記（９４）記載の抗体、上記（１００）記載のポリヌクレオチド、上記（１１７）記載の抗体、上記（１２３）記載のポリヌクレオチド、上記（１３３）記載のアンタゴニスト、上記（１４１）記載の化合物またはその塩、または上記（１４９）記載の化合物またはその塩の使用を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：１３または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、本発明のペプチドと略記する場合がある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するペプチドであってもよく、合成ペプチドであってもよい。
【０００７】
配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：１３または配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のペプチドが有する活性（例えば、後述の疾患の予防・治療活性、ＧＰＲ７との結合活性、ＧＰＲ７発現細胞に対する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等））などがあげられる。
実質的に同質とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
【０００８】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
（ｉ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：２で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列、
（ｖ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｖｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｘ）上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【０００９】
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
（ｉ）配列番号：４で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：５で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列、
（ｖ）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｖｉ）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｘ）上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１０】
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
（ｉ）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：８で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号：９で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列、
（ｖ）配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列、
（ｖｉ）配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号：６８で表わされるアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｘ）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：６８または配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｘ）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：６８または配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｘｉ）配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：６８または配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｘｉｉ）　配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：６８または配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｘｉｉｉ）上記（ｉｘ）〜（ｘｉｉ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１１】
配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
（ｉ）配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列、
（ｖ）配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｖｉ）配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５または配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｘ）上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１２】
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、
（ｉ）配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号：１８で表わされるアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列、
（ｖ）配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｖｉ）配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８または配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｘ）上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１３】
本発明のペプチドの具体例としては、例えば、
〔ペプチドＡ〕
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチド、
配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチド、
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチド、
配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチド、
〔ペプチドＢ〕
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチド、
配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチド、
配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチド、
配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチド、
〔ペプチドＣ〕
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチドまたはそのアミド体、
配列番号：９で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチドまたはそのアミド体、
配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチドまたはそのアミド体、
配列番号：６８で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチドまたはそのアミド体、
〔ペプチドＤ〕
配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチド、
配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチド、
配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチド、
配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチド、
〔ペプチドＥ〕
配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチド、
配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチド、
配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチド、
配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチド、
〔ペプチドＦ〕
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型ペプチド、
配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型ペプチド、
配列番号：１８で表わされるアミノ酸配列を有するラット型ペプチド、
配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列を有するウシ型ペプチドなどが挙げられる。
【００１４】
本発明の部分ペプチドとしては、前記した本発明のペプチドの部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、通常、アミノ酸が５個以上、好ましくは１０個以上からなるペプチドが好ましく、さらには、本発明のペプチドと同様の活性を有するものが好ましい。
【００１５】
本発明のペプチドの前駆体ペプチドとしては、前記した本発明のペプチドを含むポリペプチドであり、適当なペプチダーゼ等で切断することによって、本発明のペプチドを製造し得るものである。
具体的には、配列番号：１９または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質などが用いられる。配列番号：１９または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。
【００１６】
配列番号：１９または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１９または配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、
（ｉ）　配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列（ヒト型）、
（ｉｉ）　配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列（マウス型）、
（ｉｉｉ）　配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列（ラット型）、
（ｉｖ）　配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列（ウシ型）、
（ｖ）　配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｖｉ）　配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）　配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）　配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１または配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｘ）　上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１７】
配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、
（ｉ）　配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列（ヒト型）、
（ｉｉ）　配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列（マウス型）、
（ｉｉｉ）　配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列（ラット型）、
（ｉｖ）　配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列（ウシ型）、
（ｖ）　配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４または配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｖｉ）　配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４または配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）　配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）　配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４または配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｉｘ）　上記（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【００１８】
配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型前駆体ペプチドＧは、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を有するヒト型前駆体ペプチドＨから分泌シグナル配列を除いたものである。
配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を有するマウス型前駆体ペプチドＧは、配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列を有するマスウ型前駆体ペプチドＨから分泌シグナル配列を除いたものである。
配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を有するラット型前駆体ペプチドＧは、配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列を有するラット型前駆体ペプチドＨから分泌シグナル配列を除いたものである。
配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列を有するラット型前駆体ペプチドＧは、配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を有するラット型前駆体ペプチドＨから分泌シグナル配列を除いたものである。
本発明の前駆体ペプチドは、本発明のペプチドと同様の活性を有していてもよい。
【００１９】
配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質（ヒトＧＰＲ７）、配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質（ラットＴＧＲ２６）、配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質（ヒトＧＰＲ８）、配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質（ウシＧＰＲ７）または配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質（ウシＧＰＲ８）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。
【００２０】
配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
（ｉ）　配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
（ｉ）　配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
（ｉ）　配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
（ｉ）　配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
（ｉ）　配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
ヒトＧＰＲ７、ラットＴＧＲ２６、ヒトＧＰＲ８、ウシＧＰＲ７またはウシＧＰＲ８（以下、合わせてＧＰＲ７と略記する）の部分ペプチドとしては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであっていてもよいが、好ましくは、本発明のペプチドに対する結合能を有する部分ペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含有する部分ペプチド等が用いられる。
【００２１】
本発明のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチド、特に本発明のペプチドには、Ｎ末端アミノ酸残基がブロモ化されたものも含まれる。Ｎ末端アミノ酸残基としては、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）などが好ましい。
具体的には、Ｎ末端のトリプトファン残基（Ｔｒｐ）がブロモ化された配列番号：１〜配列番号：１２、配列番号：１９〜配列番号：２１、配列番号：６６〜配列番号：６９および配列番号：７２から選ばれる配列番号で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドなどが用いられ、なかでもＮ末端のトリプトファン残基（Ｔｒｐ）がブロモ化された配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：６６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましく用いられる。ブロモ化の位置は特に限定されないが、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）の６位が好ましい。
より具体的には、Ｎ末端のトリプトファン残基（Ｔｒｐ）が６−ブロモ化されている、配列番号：１〜配列番号：１２、配列番号：１９〜配列番号：２１、配列番号：６６〜配列番号：６９および配列番号：７２から選ばれる配列番号で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましく用いられ、なかでもＮ末端のトリプトファン残基（Ｔｒｐ）が６−ブロモ化されている、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：６６または配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を含有するペプチドが好ましく用いられる。
本発明のペプチド、その部分ペプチドまたはその前駆体ペプチド（以下、本発明のペプチドと略記する場合がある）、ＧＰＲ７またはその部分ペプチド（以下、ＧＰＲ７と略記する場合がある）は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００２２】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。以下、塩も含めて、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７と称する。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００２３】
本発明のペプチドもしくはＧＰＲ７またはそれらのアミド体の合成には、通常市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の本発明のペプチド、ＧＰＲ７またはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００２４】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２５】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００２６】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したペプチドとを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のアミド体を得ることができる。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のアミド体と同様にして、所望の本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のエステル体を得ることができる。
【００２７】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の部分ペプチドは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＧＰＲ７の部分ペプチドについては、ＧＰＲ７を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のペプチド、ＧＰＲ７の部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法があげられる。
▲１▼Ｍ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　およびＭ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）
▲２▼ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）
▲４▼矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座　１、　タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチド、ＧＰＲ７またはその部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる本発明のペプチド、ＧＰＲ７の部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２８】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７のｍＲＮＡを定量することができる。
【００２９】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
【００３０】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００３１】
より具体的には、
（ｉ）　配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＡをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｉｉ）　配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＡをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｉｉｉ）　配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＡをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｉｖ）　配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＢをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖ）　配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＢをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖｉ）　配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＢをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖｉｉ）　配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＣをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖｉｉｉ）　配列番号：８で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＤをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｉｘ）　配列番号：９で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＣをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘ）　配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＤをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｉ）　配列番号：１１で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＣをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｉｉ）　配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＤをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｉｉｉ）　配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＥをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｉｖ）　配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＥをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｖ）　配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＥをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｖｉ）　配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ペプチドＦをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｖｉｉ）　配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ペプチドＦをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｖｉｉｉ）　配列番号：１８で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ペプチドＦをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｉｘ）　配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＡをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘ）　配列番号：６７で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＢをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｉ）　配列番号：６８で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＣをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｉｉ）　配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＤをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｉｉｉ）　配列番号：７０で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＥをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｖｉ）　配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ペプチドＦをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３２】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２５〜配列番号：４２および配列番号：７４〜配列番号：７９のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明の前駆体ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：４３または配列番号：４６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明の前駆体と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：４３または配列番号：４６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：４３または配列番号：４６のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
より具体的には、
（ｉ）　配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｉｉ）　配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｉｉｉ）　配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｉｖ）　配列番号：７２で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡとしては、配列番号：８０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖ）　配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖｉ）　配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖｉｉ）　配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列を含有するラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖｉｉｉ）　配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を含有するウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：８１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３３】
本発明のペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、本発明のペプチド遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定された本発明のペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のペプチド遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のペプチド関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のペプチド遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のペプチド関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のペプチド関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のペプチド遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。本発明のペプチド遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、本発明のペプチド遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００３４】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００３５】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば　Ｊ．　Ｋａｗａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ　Ｔｅｃｈ　Ｊａｐａｎ，　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．２４７，　１９９２；　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．３９５，　１９９２；　Ｓ．　Ｔ．　Ｃｒｏｏｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　ｅｄ．，　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９３　などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のペプチドの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００３６】
ヒトＧＰＲ７をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ７と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：５０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：５０で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ラットＴＧＲ２６をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：６０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列を有するラットＴＧＲ２６と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：６０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：６０で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ヒトＧＰＲ８をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：８５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：６６で表わされるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ８と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：８５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：８５で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ウシＧＰＲ７をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：８７で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列を有するウシＧＰＲ７と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：８７で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：８７で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ウシＧＰＲ８をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列を有するウシＧＰＲ８と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：８９で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列を含有するヒトＧＰＲ７をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、配列番号：５９で表わされるアミノ酸配列を含有するラットＴＧＲ２６をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、配列番号：８４で表わされるアミノ酸配列を含有するヒトＧＰＲ８をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、配列番号：８６で表わされるアミノ酸配列を含有するウシＧＰＲ７をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、配列番号：８８で表わされるアミノ酸配列を含有するウシＧＰＲ８をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３７】
ＧＰＲ７の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述したＧＰＲ７の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ヒトＧＰＲ７の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：５０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ヒトＧＰＲ７と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：５０で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ラットＴＧＲ２６の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：６０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ラットＴＧＲ２６と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：６０で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ヒトＧＰＲ８の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述したヒトＧＰＲ８の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ヒトＧＰＲ８の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：８５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ヒトＧＰＲ８と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：８５で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ウシＧＰＲ７の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述したウシＧＰＲ７の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ウシＧＰＲ７の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：８７で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ウシＧＰＲ７と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：８７で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ウシＧＰＲ８の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述したウシＧＰＲ８の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ウシＧＰＲ８の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、ウシＧＰＲ８と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
【００３８】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするＤＮＡは、自体公知の方法で標識化されていてもよく、具体的にはアイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３９】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ　ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のペプチドまたはＧＰＲ７をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどがあげられる。
【００４０】
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
【００４１】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス　セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス　ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア　パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
【００４２】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ　細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ），１３，　２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７（ＣＯＳ７），Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００４３】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　６，　４７−５５（１９８８））などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。このようにして、ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００４４】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｋ．　Ｌ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｇ．　Ａ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ　１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明のペプチドｍａｔａｈａＧＰＲ７を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のペプチドまたはＧＰＲ７を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００４５】
本発明のペプチドまたはＧＰＲ７を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のペプチドまたはＧＰＲ７の精製は、自体公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のペプチドまたはＧＰＲ７が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のペプチドまたはＧＰＲ７を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００４６】
本発明のペプチドに対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明のペプチドに対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のペプチドに対する抗体は、本発明のペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００４７】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のペプチドは、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５　（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ペプチド（蛋白質）抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４８】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００４９】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００５０】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）としては、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のペプチドのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
以下に、▲１▼本発明のペプチド、▲２▼本発明のＤＮＡ、▲３▼本発明の抗体、および▲４▼アンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
【００５１】
（１）本発明のペプチドが関与する各種疾病の治療・予防剤
本発明のペプチドは後述の実施例６に示すとおり、ＧＰＲ７発現細胞の細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等）を有し、ＧＰＲ７の内因性リガンドである。また、本発明のペプチドは後述の実施例１４に示すとおり、食欲（摂食）増進作用を有している。さらに、本発明のペプチドは、神経調節物質もしくは神経内分泌物質として作用したり、記憶や学習、あるいはストレスの調節に関与していると考えられる。
従って、本発明のペプチドまたは本発明のＤＮＡに異常があったり、欠損している場合、またはＧＰＲ７またはＧＰＲ７をコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合には、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（ＩＩ型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の種々の疾病が発症する可能性が高い。
従って、本発明のペプチド、本発明のＤＮＡは、例えば、上記の種々の疾病（特に拒食症）の治療・予防剤などの医薬（特に、食欲（摂食）増進剤等）として使用することができる。
【００５２】
本発明のペプチドおよび本発明のＤＮＡは、例えば、生体内において本発明のペプチドが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のペプチドを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のペプチドを該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のペプチドの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のペプチドを上記の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のペプチドを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００５３】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
【００５４】
本発明のペプチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、拒食症の治療目的で本発明のペプチドを経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該ペプチドを約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該ペプチドの１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、拒食症の治療目的で本発明のペプチドを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該ペプチドを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５５】
（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
（２−１）スクリーニング方法Ａ
本発明のペプチドはＧＰＲ７のリガンドとしての機能などを有するため、本発明のペプチドの機能を促進する化合物またはその塩は、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（ＩＩ型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病の治療・予防剤など（特に食欲（摂食）増進剤等）の医薬として使用できる。
一方、本発明のペプチドの機能を阻害する化合物またはその塩は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）などの安全で低毒性な予防・治療剤、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
該スクリーニングは、本発明のペプチドを用いるか、または組換え型本発明のペプチドの発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩をスクリーニングすることができる。このような化合物には、本発明のペプチドのＧＰＲ７を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性など）を有する化合物（即ちＧＰＲ７アゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ちＧＰＲ７アンタゴニスト）などが含まれる。「リガンドとの結合性を変化させる」とは、リガンドとの結合を阻害する場合とリガンドとの結合を促進する場合の両方を包含するものである。
【００５６】
すなわち、本発明は、
本発明のペプチドを用いることを特徴とする本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、具体的には、
（ｉ）ＧＰＲ７またはその部分ペプチド（以下、これらを単にＧＰＲ７と略称する）に、本発明のペプチドを接触させた場合と（ｉｉ）ＧＰＲ７に、本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７の結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）ＧＰＲ７に、本発明のペプチドを接触させた場合と（ｉｉ）ＧＰＲ７に、本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えばＧＰＲ７に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法は具体的には、
▲１▼標識した本発明のペプチドを、ＧＰＲ７に接触させた場合と、標識した本発明のペプチドおよび試験化合物をＧＰＲ７に接触させた場合における、標識した本発明のペプチドのＧＰＲ７に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
▲２▼標識した本発明のペプチドを、ＧＰＲ７を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した本発明のペプチドおよび試験化合物をＧＰＲ７を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した本発明のペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼標識した本発明のペプチドを、ＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ７に接触させた場合と、標識した本発明のペプチドおよび試験化合物をＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ７に接触させた場合における、標識した本発明のペプチドのＧＰＲ７に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
【００５８】
▲４▼ＧＰＲ７を活性化する化合物（例えば、本発明のペプチド）をＧＰＲ７を含有する細胞に接触させた場合と、ＧＰＲ７を活性化する化合物および試験化合物をＧＰＲ７を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ７を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼ＧＰＲ７を活性化する化合物（例えば、本発明のペプチドなど）をＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ７に接触させた場合と、ＧＰＲ７を活性化する化合物および試験化合物を、ＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ７に接触させた場合における、ＧＰＲ７を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法などである。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＧＰＲ７としては、本発明のペプチドをリガンドとして認識するものであれば何れのものであってもよいが、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたＧＰＲ７などが適している。ＧＰＲ７は前述の方法に従って製造することができる。
本発明のスクリーニング方法において、ＧＰＲ７を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
ＧＰＲ７を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
ＧＰＲ７を含有する細胞としては、ＧＰＲ７を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。また、ＧＰＲ７を発現した宿主細胞は、前述の本発明のペプチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体の製造方法と同様の方法などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧＰＲ７と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該ＧＰＲ７を含有する細胞や膜画分中のＧＰＲ７の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００６０】
本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前記の▲１▼〜▲３▼を実施するためには、適当なＧＰＲ７画分と、標識した本発明のペプチドなどが用いられる。ＧＰＲ７画分としては、天然型のＧＰＲ７画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＧＰＲ７画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識されたリガンドなどを利用することができる。このうち好ましくは、〔１２５Ｉ〕で標識されたリガンドである。
具体的には、本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まずＧＰＲ７を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるＧＰＲ７や本発明のペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のペプチドを添加し、同時に１０−１０〜１０−７Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００６１】
本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前記の▲４▼〜▲５▼の方法を実施するためには、ＧＰＲ７を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ＧＰＲ７を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＧＰＲ７を発現した細胞が必要である。ＧＰＲ７を発現した細胞としては、前述のＧＰＲ７発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【００６２】
本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング用キットは、ＧＰＲ７またはその塩、ＧＰＲ７の部分ペプチドまたはその塩、ＧＰＲ７を含有する細胞、あるいはＧＰＲ７を含有する細胞の膜画分、および本発明のペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
▲１▼測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
▲２▼ＧＲＰ７標品
ＧＰＲ７を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
▲３▼標識リガンド
〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識した本発明のペプチドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
▲４▼リガンド標準液
本発明のペプチドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００６３】
２．測定法
▲１▼１２穴組織培養用プレートにて培養したＧＰＲ７を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
▲２▼１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のペプチドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍの本発明のペプチドを５μｌ加えておく。
▲３▼反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識された本発明のペプチドを０．２Ｎ　ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
▲４▼液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
〔数１〕
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ　　：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０　　：最大結合量
【００６４】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物（本発明のペプチドの活性を促進または阻害する化合物）であり、具体的にはＧＰＲ７を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆるＧＰＲ７アゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆるＧＰＲ７アンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。上記ＧＰＲ７アゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ｉｉ）に従えばよい。
（ｉ）前記▲１▼〜▲３▼のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のペプチドとＧＰＲ７との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記したＧＰＲ７を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＧＰＲ７アゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩はＧＰＲ７アンタゴニストである。
（ｉｉ）（ａ）試験化合物をＧＰＲ７を含有する細胞に接触させ、上記ＧＰＲ７を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩はＧＰＲ７アゴニストである。
（ｂ）　ＧＰＲ７を活性化する化合物（例えば、本発明のペプチドまたはＧＰＲ７アゴニストなど）をＧＰＲ７を含有する細胞に接触させた場合と、ＧＰＲ７を活性化する化合物および試験化合物をＧＰＲ７を含有する細胞に接触させた場合における、ＧＰＲ７を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。ＧＰＲ７を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩はＧＰＲ７アンタゴニストである。
【００６５】
該ＧＰＲ７アゴニストは、ＧＰＲ７に対する本発明のペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のペプチドと同様に安全で低毒性な医薬（例えば、拒食症の予防・治療薬、食欲（摂食）増進剤，下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕の予防・治療薬等）として有用である。
逆に、ＧＰＲ７アンタゴニストは、ＧＰＲ７に対する本発明のペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）　などの安全で低毒性な予防・治療剤、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
【００６６】
本発明のスクリーニング方法Ａまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法Ａまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、拒食症治療の目的でＧＰＲ７アゴニストを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、拒食症治療の目的でＧＰＲ７アゴニストを注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、例えば、肥満症治療の目的でＧＰＲ７アンタゴニストを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満症治療の目的でＧＰＲ７アンタゴニストを注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６８】
（２−２）スクリーニング方法Ｂ
次に、ＧＰＲ７リガンドの発現量を調節する化合物のスクリーニング方法について説明する。
本発明のスクリーニング方法Ｂは、具体的には、（ｉ）ＧＰＲ７リガンドを発現し得る細胞または組織を、試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのＧＰＲ７リガンドの発現量またはＧＰＲ７リガンドをコードするｍＲＮＡ量を測定し、比較することを特徴とするＧＰＲ７リガンドの発現量を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法である。
ＧＰＲ７リガンドを発現し得る細胞または組織としては、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、神経細胞、内分泌細胞、神経内分泌細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、肝細胞、脾細胞、メサンギウム細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等）、もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸（精巣）、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋等を用いても良い。その際、株化細胞、初代培養系を用いてもよい。また、前記したＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質変換体を使用してもよい。
ＧＰＲ７リガンドを発現し得る細胞の培養方法は、前記した形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、前記の試験化合物の他、ＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
【００６９】
ＧＰＲ７リガンドの発現量は抗体などを用いて免疫化学的方法などの公知の方法により測定することもできるし、ＧＰＲ７リガンドをコードするｍＲＮＡをノザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲやＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いて、公知の方法により測定することもできる。
ｍＲＮＡの発現量の比較をハイブリダイゼーション法によって行うには、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法等に従って行なうことができる。
具体的には、ＧＰＲ７リガンドをコードするｍＲＮＡの量の測定は、公知の方法に従って細胞から抽出したＲＮＡと、ＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドとを接触させ、ＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドと結合したｍＲＮＡの量を測定することによって行われる。ＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドを、例えば放射性同位元素、色素などで標識することによって、ＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドに結合したｍＲＮＡの量が容易に測定できる。放射性同位元素としては、例えば３２Ｐ、３Ｈなどが用いられ、色素としては、例えばｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＦＡＭ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＪＯＥ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＲＯＸ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）などの蛍光色素が用いられる。また、ｍＲＮＡの量は、細胞から抽出したＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換した後、ＧＰＲ７リガンドをコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲによって、増幅されるｃＤＮＡの量を測定することによって行うことができる。
このように、ＧＰＲ７リガンドをコードするｍＲＮＡの量を増加させる試験化合物を、ＧＰＲ７リガンドの発現量を増加させる活性を有する化合物として選択することができ、また、ＧＰＲ７リガンドをコードするｍＲＮＡの量を減少させる試験化合物をＧＰＲ７リガンドの発現量を減少させる活性を有する化合物として選択することができる。
【００７０】
さらに、本発明は、
（ｉｉ）ＧＰＲ７リガンドをコードする遺伝子のプロモーター領域またはエンハンサー領域の下流にレポーター遺伝子を連結した組換えＤＮＡで形質転換した形質転換体を試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのレポーター活性を測定し、比較することを特徴とする当該プロモーター活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。
レポーター遺伝子としては、例えば、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、成長因子、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＧＦＰ）、β−ラクタマーゼなどが用いられる。レポーター遺伝子産物（例、ｍＲＮＡ、タンパク質）の量を公知の方法を用いて測定することによって、レポーター遺伝子産物の量を増加させる試験化合物を本発明のＧＰＲ７リガンドのプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に促進）する作用を有する化合物、すなわちＧＰＲ７リガンドの発現量を増加させる活性を有する化合物として選択できる。逆に、レポーター遺伝子産物の量を減少させる試験化合物をＧＰＲ７リガンドのプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に阻害）する作用を有する化合物、すなわちＧＰＲ７リガンドの発現量を減少させる活性を有する化合物として選択することができる。
試験化合物としては、前記と同様のものが使用される。
形質転換体の培養は、前記の形質転換体と同様にして行うことができる。
レポーター遺伝子のベクター構築やアッセイ法は公知の技術に従うことができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３，　２９−４３，　１９９９）。
【００７１】
ＧＰＲ７リガンドの発現量を増加させる活性を有する化合物は、安全で低毒性な医薬（例えば、拒食症の予防・治療薬、食欲（摂食）増進剤，下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕の予防・治療薬等）として有用である。
ＧＰＲ７リガンドの発現量を減少させる活性を有する化合物は、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）　などの安全で低毒性な予防・治療剤、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法Ｂまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００７２】
本発明のスクリーニング方法Ｂまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、拒食症治療の目的でＧＰＲ７リガンドの発現量を増加させる化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、拒食症治療の目的でＧＰＲ７リガンドの発現量を増加させる化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、例えば、肥満症治療の目的でＧＰＲ７リガンドの発現量を減少させる化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満症治療の目的でＧＰＲ７リガンドの発現量を減少させる化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７３】
（３）本発明のペプチドの定量
本発明の抗体は、本発明のペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のペプチドの定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のペプチドの定量法を提供する。
【００７４】
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のペプチドのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のペプチドのＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて本発明のペプチドの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のペプチドの定量法は、　特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００７５】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００７６】
本発明のサンドイッチ法による本発明のペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江　寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江　寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．　７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、　同書　Ｖｏｌ．　７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、　同書　Ｖｏｌ．　７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、　同書　Ｖｏｌ．　８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ　：　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ　：　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ　：　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のペプチドを感度良く定量することができる。
【００７７】
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のペプチドの濃度を定量することによって、本発明のペプチドの濃度の減少が検出された場合、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（ＩＩ型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のペプチドの濃度の増加が検出された場合には、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のペプチドを検出するために使用することができる。また、本発明のペプチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のペプチドの検出、被検細胞内における本発明のペプチドの挙動の分析などのために使用することができる。
【００７８】
（４）遺伝子診断剤
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡの発現低下が検出された場合は、　例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（ＩＩ型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡの発現過多が検出された場合は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）　、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などである可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００７９】
（５）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）　、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの予防・治療薬として使用することができる。
【００８０】
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００８１】
（６）本発明の抗体を含有する医薬
本発明のペプチドの活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）　、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの予防・治療薬などの医薬として使用することができる。
【００８２】
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の肥満症患者の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【００８３】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００８４】
（７）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００８５】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のペプチドを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のペプチドの機能を抑制するペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００８６】
本発明のペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００８７】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流　に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００８８】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のペプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能亢進症や、本発明のペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のペプチドの増加症状を有することから、本発明のペプチドに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００８９】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ペプチドによる正常ペプチドの機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のペプチドの増加症状を有することから、本発明のペプチドまたはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異ペプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能不活性型不応症などを含む、本発明のペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のペプチドが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００９０】
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のペプチドの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００９１】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知　ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００９２】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１−０．５％トリプシン／０．１−５ｍＭ　ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．　Ｊ．　Ｅｖａｎｓ及びＭ．　Ｈ．　Ｋａｕｆｍａｎ，　ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．　Ｒ．　Ｍａｒｔｉｎ　プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．　Ｃ．　Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ　ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の細胞生物学的検討において有用である。
【００９３】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質のホモ発現不全個体を得ることができる。
【００９４】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のペプチドの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００９５】
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００９６】
例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（ＩＩ型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の摂食量、血糖値および体重変化などを経時的に測定する。
【００９７】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の摂食量等が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００９８】
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のペプチドの発現する組織で、本発明のペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００９９】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のペプチドの発現を促進し、該ペプチドの機能を促進することができるので、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（ＩＩ型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤（特に、食欲（摂食）増進剤）などの医薬として有用である。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のペプチドの発現を阻害し、該ペプチドの機能を阻害することができるので、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）などの予防・治療剤、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０１００】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の肥満症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のペプチドのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０１０１】
さらに、本発明のウシＧＲＰ７、ウシＧＰＲ８（以下、ウシＧＰＲ７／８と略記する）の用途について説明する。
本発明のウシＧＰＲ７／８に対する抗体（以下、単にウシＧＰＲ７／８抗体と称する場合がある）は、本発明のウシＧＰＲ７／８に対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明の抗体は、本発明のウシＧＰＲ７／８を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。具体的には、前記した本発明のペプチドに対する抗体と同様に製造することができる。
【０１０２】
本発明のウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡ（以下、ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、ウシＧＰＲ７／８アンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）としては、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のウシＧＰＲ７／８のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
以下に、▲１▼本発明のウシＧＰＲ７／８、▲２▼本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ、▲３▼本発明のウシＧＰＲ７／８抗体、および▲４▼ウシＧＰＲ７／８アンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
【０１０３】
（１）本発明のウシＧＰＲ７／８が関与する各種疾病の治療・予防剤
本発明のウシＧＰＲ７／８は後述の実施例２５に示すとおり、本発明のペプチドに対する受容体である。
従って、本発明のウシＧＰＲ７／８または本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに異常があったり、欠損している場合には、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（ＩＩ型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の種々の疾病が発症する可能性が高い。
従って、本発明のウシＧＰＲ７／８、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡは、例えば、上記の種々の疾病（特に拒食症）の治療・予防剤などの医薬（特に、食欲（摂食）増進剤等）として使用することができる。
【０１０４】
本発明のウシＧＰＲ７／８および本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡは、例えば、生体内において本発明のウシＧＰＲ７／８が減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のウシＧＰＲ７／８を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを挿入し、本発明のウシＧＰＲ７／８を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のウシＧＰＲ７／８を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のウシＧＰＲ７／８の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のウシＧＰＲ７／８またはウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、前記した本発明のペプチドまたは本発明のＤＮＡを含有する医薬と同様に製造し、使用することができる。
【０１０５】
（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
（２−１）スクリーニング方法Ａ
本発明のウシＧＰＲ７／８と本発明のペプチドとの結合を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法は前記したとおりである。
（２−２）スクリーニング方法Ｂ
次に、ウシＧＰＲ７／８の発現量を調節する化合物のスクリーニング方法について説明する。
本発明のスクリーニング方法Ｂは、具体的には、（ｉ）ウシＧＰＲ７／８を発現し得る細胞または組織を、試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのウシＧＰＲ７／８の発現量またはウシＧＰＲ７／８をコードするｍＲＮＡ量を測定し、比較することを特徴とするウシＧＰＲ７／８の発現量を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法である。
ウシＧＰＲ７／８を発現し得る細胞または組織としては、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、神経細胞、内分泌細胞、神経内分泌細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、肝細胞、脾細胞、メサンギウム細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等）、もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸（精巣）、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋等を用いても良い。その際、株化細胞、初代培養系を用いてもよい。また、前記したウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質変換体を使用してもよい。
ウシＧＰＲ７／８を発現し得る細胞の培養方法は、前記した形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、前記の試験化合物の他、ＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
【０１０６】
ウシＧＰＲ７／８の発現量は抗体などを用いて免疫化学的方法などの公知の方法により測定することもできるし、ウシＧＰＲ７／８をコードするｍＲＮＡをノザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲやＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いて、公知の方法により測定することもできる。
ｍＲＮＡの発現量の比較をハイブリダイゼーション法によって行うには、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法等に従って行なうことができる。
具体的には、ウシＧＰＲ７／８をコードするｍＲＮＡの量の測定は、公知の方法に従って細胞から抽出したＲＮＡと、ウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のウシＧＰＲ７／８アンチセンス・ポリヌクレオチドとを接触させ、ウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のウシＧＰＲ７／８アンチセンス・ポリヌクレオチドと結合したｍＲＮＡの量を測定することによって行われる。ウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のウシＧＰＲ７／８アンチセンス・ポリヌクレオチドを、例えば放射性同位元素、色素などで標識することによって、ウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のウシＧＰＲ７／８アンチセンス・ポリヌクレオチドに結合したｍＲＮＡの量が容易に測定できる。放射性同位元素としては、例えば３２Ｐ、３Ｈなどが用いられ、色素としては、例えばｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＦＡＭ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＪＯＥ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＲＯＸ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）などの蛍光色素が用いられる。
また、ｍＲＮＡの量は、細胞から抽出したＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換した後、ウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のウシＧＰＲ７／８アンチセンス・ポリヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲによって、増幅されるｃＤＮＡの量を測定することによって行うことができる。
このように、ウシＧＰＲ７／８をコードするｍＲＮＡの量を増加させる試験化合物を、ウシＧＰＲ７／８の発現量を増加させる活性を有する化合物として選択することができ、また、ウシＧＰＲ７／８をコードするｍＲＮＡの量を減少させる試験化合物をウシＧＰＲ７／８の発現量を減少させる活性を有する化合物として選択することができる。
【０１０７】
さらに、本発明は、
（ｉｉ）ウシＧＰＲ７／８をコードする遺伝子のプロモーター領域またはエンハンサー領域の下流にレポーター遺伝子を連結した組換えＤＮＡで形質転換した形質転換体を試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのレポーター活性を測定し、比較することを特徴とする当該プロモーター活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法を提供する。
レポーター遺伝子としては、例えば、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、成長因子、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＧＦＰ）、β−ラクタマーゼなどが用いられる。レポーター遺伝子産物（例、ｍＲＮＡ、タンパク質）の量を公知の方法を用いて測定することによって、レポーター遺伝子産物の量を増加させる試験化合物を本発明のウシＧＰＲ７／８のプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に促進）する作用を有する化合物、すなわちウシＧＰＲ７／８の発現量を増加させる活性を有する化合物として選択できる。逆に、レポーター遺伝子産物の量を減少させる試験化合物をウシＧＰＲ７／８のプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に阻害）する作用を有する化合物、すなわちウシＧＰＲ７／８の発現量を減少させる活性を有する化合物として選択することができる。
試験化合物としては、前記と同様のものが使用される。
形質転換体の培養は、前記の形質転換体と同様にして行うことができる。
レポーター遺伝子のベクター構築やアッセイ法は公知の技術に従うことができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３，　２９−４３，　１９９９）。
【０１０８】
ウシＧＰＲ７／８の発現量を増加させる活性を有する化合物は、安全で低毒性な医薬（例えば、拒食症の予防・治療薬、食欲（摂食）増進剤，下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕の予防・治療薬等）として有用である。
ウシＧＰＲ７／８の発現量を減少させる活性を有する化合物は、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）　などの安全で低毒性な予防・治療剤、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの安全で低毒性な予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法Ｂまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のペプチドの機能を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法Ｂまたはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、前記した本発明のペプチドの発現量を変化させる化合物またはその塩を含有する医薬と同様に製造し、使用することができる。
【０１０９】
（３）本発明のウシＧＰＲ７／８の定量
本発明の抗体は、本発明のウシＧＰＲ７／８を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のウシＧＰＲ７／８の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明のウシＧＰＲ７／８抗体と、被検液および標識化された本発明のウシＧＰＲ７／８とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のウシＧＰＲ７／８の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のウシＧＰＲ７／８の定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のウシＧＰＲ７／８の定量法を提供する。
【０１１０】
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のウシＧＰＲ７／８のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のウシＧＰＲ７／８のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８に対するモノクローナル抗体を用いて本発明のウシＧＰＲ７／８の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明のウシＧＰＲ７／８抗体を用いる本発明のウシＧＰＲ７／８の定量法は、　特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【０１１１】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のウシＧＰＲ７／８モノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のウシＧＰＲ７／８モノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のウシＧＰＲ７／８量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【０１１２】
本発明のサンドイッチ法による本発明のウシＧＰＲ７／８の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のウシＧＰＲ７／８モノクローナル抗体は、本発明のウシＧＰＲ７／８の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のウシＧＰＲ７／８のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のウシＧＰＲ７／８抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のウシＧＰＲ７／８の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江　寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江　寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．　７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、　同書　Ｖｏｌ．　７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、　同書　Ｖｏｌ．　７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、　同書　Ｖｏｌ．　８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ　：　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ　：　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ　：　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明のウシＧＰＲ７／８抗体を用いることによって、本発明のウシＧＰＲ７／８を感度良く定量することができる。
【０１１３】
さらには、本発明のウシＧＰＲ７／８抗体を用いて本発明のウシＧＰＲ７／８の濃度を定量することによって、本発明のウシＧＰＲ７／８の濃度の減少が検出された場合、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（ＩＩ型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８の濃度の増加が検出された場合には、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のウシＧＰＲ７／８を検出するために使用することができる。また、本発明のウシＧＰＲ７／８を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のウシＧＰＲ７／８の検出、被検細胞内における本発明のウシＧＰＲ７／８の挙動の分析などのために使用することができる。
【０１１４】
（４）遺伝子診断剤
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡの発現低下が検出された場合は、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（ＩＩ型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションによりｍＲＮＡの発現過多が検出された場合は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）　、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などである可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【０１１５】
（５）ウシＧＰＲ７／８アンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）　、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの予防・治療薬として使用することができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【０１１６】
（６）本発明のウシＧＰＲ７／８抗体を含有する医薬
本発明のウシＧＰＲ７／８の活性を中和する作用を有する本発明のウシＧＰＲ７／８抗体は、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）　、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常（特に肥満症等）などの予防・治療薬などの医薬として使用することができる。
本発明のウシＧＰＲ７／８抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、前記した本発明のペプチドに対する抗体を含有する医薬と同様に製造し、使用することができる。
【０１１７】
（７）ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ（以下、本発明の外来性ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物は、前記した本発明のＤＮＡ転移動物と同様に作製することができる。
本発明の正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のウシＧＰＲ７／８の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のウシＧＰＲ７／８の機能亢進症や、本発明のウシＧＰＲ７／８が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のウシＧＰＲ７／８の増加症状を有することから、本発明のウシＧＰＲ７／８に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の異常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のウシＧＰＲ７／８の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のウシＧＰＲ７／８の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
【０１１８】
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ高発現動物は、本発明のウシＧＰＲ７／８の機能不活性型不応症における本発明の異常ウシＧＰＲ７／８による正常ウシＧＰＲ７／８の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のウシＧＰＲ７／８の増加症状を有することから、本発明のウシＧＰＲ７／８またはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のウシＧＰＲ７／８により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異ウシＧＰＲ７／８を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のウシＧＰＲ７／８の機能不活性型不応症などを含む、本発明のウシＧＰＲ７／８に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のウシＧＰＲ７／８に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のウシＧＰＲ７／８産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のウシＧＰＲ７／８およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のウシＧＰＲ７／８の機能不活性型不応症を含む、本発明のウシＧＰＲ７／８に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のウシＧＰＲ７／８が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【０１１９】
（８）ウシＧＰＲ７／８ノックアウト動物
本発明は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、前記した本発明の非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物と同様に作製することができる。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のウシＧＰＲ７／８により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のウシＧＰＲ７／８の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【０１２０】
（８ａ）本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【０１２１】
例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（ＩＩ型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の摂食量、血糖値および体重変化などを経時的に測定する。
【０１２２】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の摂食量等が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上上昇した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のウシＧＰＲ７／８の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１２３】
（８ｂ）本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のウシＧＰＲ７／８の発現する組織で、本発明のペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のウシＧＰＲ７／８の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のウシＧＰＲ７／８欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０１２４】
本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のウシＧＰＲ７／８の発現を促進し、該ウシＧＰＲ７／８の機能を促進することができるので、例えば、拒食症、高血圧、自己免疫疾患、心不全、白内障、緑内障、急性バクテリア髄膜炎，急性心筋梗塞，急性膵炎，急性ウイルス脳炎，成人呼吸促迫症候群，アルコール性肝炎，アルツハイマー病，喘息，動脈硬化，アトピー性皮膚炎，バクテリア肺炎，膀胱がん，骨折，乳がん，過食症，多食症，火傷治癒，子宮頸部がん，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，慢性膵炎，肝硬変，大腸がん（結腸／直腸がん），クローン病，痴呆，糖尿病性合併症，糖尿病性腎症，糖尿病性神経障害，糖尿病性網膜症，胃炎，ヘリコバクター・ピロリ感染症，肝不全，Ａ型肝炎，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，肝炎，単純ヘルペスウイルス感染症，水痘帯状疱疹ウイルス感染症，ホジキン病，エイズ感染症，ヒトパピローマウイルス感染症，高カルシウム血症，高コレステロール血症，高グリセリド血症，高脂血症，感染症，インフルエンザ感染症，インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型），侵襲性ブドウ状球菌感染症，悪性黒色腫，がん転移，多発性骨髄腫，アレルギー性鼻炎，腎炎，非ホジキン性リンパ腫，インシュリン非依存性糖尿病（ＩＩ型），非小細胞肺がん，臓器移植，骨関節炎，骨軟化症，骨減少症，骨粗鬆症，卵巣がん，骨ペーチェット病，消化性潰瘍，末梢血管疾患，前立腺がん，逆流性食道炎，腎不全，リウマチ関節炎，精神分裂症，敗血症，敗血症ショック，重症全身性真菌感染症，小細胞肺がん，脊髄損傷，胃がん，全身性エリテマトーサス，一過性脳虚血発作，結核，心弁膜症，血管性／多発梗塞痴呆，創傷治癒，不眠症，関節炎、下垂体ホルモン分泌不全〔例、プロラクチン分泌不全（例、卵巣機能低下症、精嚢発育不全、更年期障害、甲状腺機能低下等）〕、瀕尿、尿毒症、または神経変成疾患等（特に拒食症等）の疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤（特に、食欲（摂食）増進剤）などの医薬として有用である。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のウシＧＰＲ７／８の発現を阻害し、該ウシＧＰＲ７／８の機能を阻害することができるので、例えば、肥満症［例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満　（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満　（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症　（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など］、摂食亢進症（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常などの予防・治療剤（プロラクチン産生抑制剤）などの予防・治療剤、好ましくは肥満症、摂食亢進症などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０１２５】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の拒食症患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の肥満症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のウシＧＰＲ７／８ＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のウシＧＰＲ７／８のプロモーター領域を含有するウシＧＰＲ７／８ＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のウシＧＰＲ７／８そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０１２６】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
Ａ　　　　　　：アデニン
Ｔ　　　　　　：チミン
Ｇ　　　　　　：グアニン
Ｃ　　　　　　：シトシン
Ｉ　　　　　　　　　　　　：イノシン
Ｒ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ　　　　　　　　　　　　：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）
Ｍ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｋ　　　　　　　　　　　　：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｓ　　　　　　　　　　　　：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｂ　　　　　　　　　　　　：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｄ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｖ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｎ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしくはチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基
ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＨＡ　　　　　：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ　　　：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ　　　　　：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｂｚｌ　　　　　：ベンジル
Ｂｏｍ　　　　　：ベンジルオキシメチル
Ｂｏｃ　　　　　：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ　　　　　：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ　　　　：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ　　　　　：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ　　　　　：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ　　　　：ジイソプロピルエチルアミン
【０１２７】
Ｇｌｙ又はＧ　　：グリシン
Ａｌａ又はＡ　　　：アラニン
Ｖａｌ又はＶ　　　：バリン
Ｌｅｕ又はＬ　　　：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ　　　：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ　　　　：セリン
Ｔｈｒ又はＴ　　　　：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ　　　　：システイン
Ｍｅｔ又はＭ　　　　：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ　　　　：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ　　　　：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ　　　　：リジン
Ａｒｇ又はＲ　　　　：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ　　　　：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ　　　　：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ　　　　：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ　　　　：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ　　　　：プロリン
Ａｓｎ又はＮ　　　　：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ　　　　：グルタミン
ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
Ｔｙｒ（Ｉ）　　：３−ヨードチロシン
ＤＭＦ　　　　　：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ　　　　：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ　　　　　：トリチル
Ｐｂｆ　　　　　：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
Ｃｌｔ　　　　　：２−クロロトリチル
Ｂｕｔ　　　　　　：ｔ−ブチル
Ｍｅｔ（Ｏ）　　：メチオニンスルフォキシド
【０１２８】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＡのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＡのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＡのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＢのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＢのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＢのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＣのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＤのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＣのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＤのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＣのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＤのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＥのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＥのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＥのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１９〕
分泌シグナルを含まないヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｇのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２０〕
分泌シグナルを含まないマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｇのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２１〕
分泌シグナルを含まないラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｇのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
分泌シグナルを含むヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。〔配列番号：２３〕
分泌シグナルを含むマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
分泌シグナルを含むラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２５〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＡをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＡをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＡをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＢをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＢをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＢをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＣをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＤをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＣをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＤをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＣをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＤをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＥをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＥをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＥをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
ヒト型ＧＰＲ７リガンドＦをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
マウス型ＧＰＲ７リガンドＦをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
ラット型ＧＰＲ７リガンドＦをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
分泌シグナルを含まないヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
分泌シグナルを含まないマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
分泌シグナルを含まないラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
分泌シグナルを含むヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４７〕
分泌シグナルを含むマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
分泌シグナルを含むラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４９〕
ヒトＧＰＲ７のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５０〕
ヒトＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５１〕
実施例１でヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５２〕
実施例１でヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５３〕
実施例２でマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５４〕
実施例２でマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５５〕
実施例３でラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５６〕
実施例３でラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡを示す。
〔配列番号：５７〕
参考例１で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５８〕
参考例１で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
ラットＴＧＲ２６のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６０〕
ラットＴＧＲ２６をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕
参考例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６２〕
参考例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：６３〕
実施例９で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６４〕
実施例９で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６５〕
実施例９で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６６〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＡのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６７〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＢのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６８〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＣのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６９〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＤのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７０〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＥのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７１〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＦのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７２〕
分泌シグナルを含まないウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｇのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７３〕
分泌シグナルを含むウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。〔配列番号：７４〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＡをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７５〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＢをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７６〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＣをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７７〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＤをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７８〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＥをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７９〕
ウシ型ＧＰＲ７リガンドＦをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８０〕
分泌シグナルを含まないウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＧをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８１〕
分泌シグナルを含むウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８２〕
実施例１２で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８３〕
実施例１２で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８４〕
ヒトＧＰＲ８のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８５〕
ヒトＧＰＲ８をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８６〕
ウシＧＰＲ７のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８７〕
ウシＧＰＲ７をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８８〕
ウシＧＰＲ８のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８９〕
ウシＧＰＲ８をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９０〕
実施例１６で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９１〕
実施例１６で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９２〕
実施例１６で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９３〕
実施例１７で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９４〕
実施例１７で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９５〕
実施例１７で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９６〕
実施例１８で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９７〕
実施例１８で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９８〕
実施例１９で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：９９〕
実施例１９で用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１００〕
ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）のアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
後述の実施例１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７Ｌ−１として２００１年６月２７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６４０として、２００１年６月１９日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ
１６６４４として寄託されている。
後述の実施例２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＡｍＧＰＲ７−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＡｍＧＰＲ７Ｌ−１として２００１年６月２７日から独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６４１として、２００１年６月１９日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ　１６６５６として寄託されている。
後述の実施例３で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＡｒＧＰＲ７−１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＡｒＧＰＲ７Ｌ−１として２００１年６月２７日から独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６４２として、２００１年６月１９日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ　１６６５７として寄託されている。
後述の実施例１２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＧＰＲ７Ｌ−１は、２００１年１２月１７日から独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７８２９として、２００１年１２月６日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ　１６７３６として寄託されている。
後述の実施例１８で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＧＰＲ７は、２００２年５月２４日から独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０５０として寄託されている。
後述の実施例１９で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＧＰＲ８は、２００２年５月２４日から独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０５１として寄託されている。
後述の参考例３で得られた形質転換体　大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ／ｐＡＫ−ｒＧＰＲ７は、２０００年１０月３１日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６４９６として、２０００年１１月１３日から日本国茨城県つくば市東１−１−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に受託番号　ＦＥＲＭ　　ＢＰ−７３６５としてそれぞれ寄託されている。
【０１３０】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
参考例１　ヒト染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるヒトＧＰＲ７　ＤＮＡの増幅
ヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、２種の合成プライマー（配列番号：５７および配列番号：５８）を用いたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を行なった。合成プライマーは受容体蛋白に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その際に遺伝子の５’側に制限酵素Ｃｌａ　Ｉの認識する塩基配列が付加され、３’側に制限酵素Ｓｐｅ　Ｉの認識する塩基配列が付加されるように、５’側および３’側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成は、ヒト染色体ＤＮＡ（タカラ）０．５μｇ、合成ＤＮＡプライマー各１μＭ、０．８　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ＫＯＤポリメラーゼ（トーヨーボー）１μｌおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は５０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（タカラ）を用い、９４℃・６０秒の加熱の後、９８℃・１５秒、６５℃・２秒、７４℃・３０秒のサイクルを３５回繰り返した。増幅産物の確認は、０．８％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【０１３１】
参考例２　ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入ＤＮＡ部分の塩基配列の解読による増幅ＤＮＡ配列の確認
参考例１で行なったＰＣＲ反応液を０．８％の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行なってＤＮＡを回収した。ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）クローニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）へサブクローニングした。これをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＤＨ５αｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（トーヨーボー）に導入して形質転換した後、ＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ＧＰＲ７を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ　（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。調整したＤＮＡの一部に対して制限酵素Ｃｌａ　ＩおよびＳｐｅ　Ｉによる切断を行ない、挿入されている受容体ＤＮＡ断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応はＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：５０）。配列番号：５０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡを保持するｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）プラスミドを、ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔヒトＧＰＲ７と命名した。配列番号：５０で表わされる塩基配列を有するＤＮＡがコードするヒトＧＰＲ７のアミノ酸配列を配列番号：４９に示した。ここで配列を決定したヒトＧＰＲ７のＤＮＡ配列はＯ’Ｄｏｗｄらの報告（Ｏ’Ｄｏｗｄ，　Ｂ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２８巻、８４−９１頁、１９９５年）にあるＤＮＡ配列とは２塩基が異なっていた。これらは配列番号：５０の８９３番目および８９４番目に当たり、Ｏ’Ｄｏｗｄらの報告ではそれぞれＣおよびＧであるが、本参考例ではＧおよびＣであった。これにより、翻訳されるアミノ酸配列において配列番号：４９の２９６番目のアミノ酸が、Ｏ’Ｄｏｗｄらの報告のＴｈｒが本実施例ではＳｅｒとなる。
【０１３２】
参考例３　ラット全脳由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ラット全脳ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、ヒトＧＰＲ８をコードするＤＮＡの塩基配列を元に設計した２個のプライマー、プライマー１（配列番号：６１）およびプライマー２（配列番号：６２）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は、上記ｃＤＮＡを１０分の１量鋳型として使用し、　Ａｄｖａｎｔａｇｅ−２　ｃＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１／５０量、プライマー３　０．２μＭ、プライマー２　０．２μＭ　、ｄＮＴＰｓ　２００μＭ、および酵素に添付のバッファーを加え、２５μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、▲１▼９４℃・２分の後、▲２▼９４℃・２０秒、７２℃・２分のサイクルを３回、▲３▼９４℃・２０秒、６６℃・２０秒、６８℃・２分のサイクルを３回、▲４▼９４℃・２０秒、６０℃・２０秒、６８℃・２分のサイクルを３６回繰り返し、最後に６８℃・７分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応後の反応産物を、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従い、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＤＨ５αに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で、ｃＤＮＡを持つクローンを選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：６０）を得た。このＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：５９）を含有する新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をＴＧＲ２６と命名した。
配列番号：５９で表されるアミノ酸配列は、既知のヒトＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であるＧＰＲ７〔　ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），２８巻，８４−９１頁，１９９５年〕　との間に８４．８％の相同性を有していた。
ＴＧＲ２６をコードするＤＮＡを挿入したプラスミドを有する前述した形質転換体から１クローンを選択し、アンピシリンを含むＬＢ培地で振とう培養し、プラスミドを得た。これを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで処理し、ＴＧＲ２６をコードするインサート部分を切り出した。同様に制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで処理したｐＡＫＫＯ−１．１１ＨおよびＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ１０Ｂにエレクトロポーレーション法にて導入した。得られたクローンについては、有する発現細胞構築用プラスミドの構造を、制限酵素処理および配列解析で確認したうえ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ／ｐＡＫ−ｒＧＰＲ７と命名した。
【０１３３】
参考例４　ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞の作製
参考例３に記載の発現プラスミドｐＡＫ−ｒＧＰＲ７で形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（トーヨーボー）を培養後、Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてｐＡＫ−ｒＧＰＲ７プラスミドＤＮＡを調製した。これをＣｅｌｌＰｈｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、添付のプロトコールに従ってＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に導入した。５μｇのＤＮＡをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、４８時間前に３ｘ１０５個のＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を播種した直径６ｃｍシャーレ２枚に添加した。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地である１０％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地中に増殖してくるＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞である形質転換細胞のコロニー４４クローンを選択した。
【０１３４】
実施例１　ヒト全脳ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＧＰＲ７リガンド前駆体遺伝子の取得と発現プラスミドの構築
クローンテック社より購入したヒト全脳ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ　による増幅を行った。
ＧＳＦ１：　５’−ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＣＧＣＧＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号：５１）
ＧＳＲ２：　５’−ＧＣＴＡＧＣＡＧＣＧＧＴＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＡ−３’（配列番号：５２）
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１　μｌ、０．５　μｌ　ＧＳＦ１（１０　μＭ）、０．　５　μｌ　ＧＳＲ２（１０　μＭ）、２．５　μｌ添付の１０　ｘ　反応液、２．５　μｌ　ｄＮＴＰ（１０　ｍＭ）、０．５　μｌ　ＫｌｅｎＴａｑ（クローンテック）、１７．５　μｌ大塚蒸留水を加えて合計２５　μｌにした。反応液を、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ９６００を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５　℃２　分の変性の後、９８　℃１０　秒、６０　℃２０　秒、７２　℃２０秒のサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約４００　ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図１で示す配列がえられた。図１のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図２に示すものであった。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴＡｈＧＰＲ７−１を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドｐＴＡｈＧＰＲ７−１をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図１と同じヒト型ＧＰＲ７リガンド　ｃＤＮＡであることを確認した。次にそのプラスミドから制限酵素Ｓａｌ１ＩおよびＮｈｅＩによって消化後約０．４ｋｂのヒト型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡ断片を得た。さらに、動物細胞用の発現ベクターであるｐＡＫＫＯ−１１１Ｈはマルチクローニングサイト部分の制限酵素サイトＳａｌＩおよびＮｈｅＩによって消化後、電気泳動を行い、ベクター部分を回収した。以上の操作によって調製したヒト型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡ断片および発現ベクターをライゲーションによって連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換してＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＡＫ−Ｓ６４を得た。
形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＡＫ−Ｓ６４を培養し、プラスミドｐＡＫ−Ｓ６４のＤＮＡを大量に調製した。
【０１３５】
実施例２　マウス全脳ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＧＰＲ７リガンド前駆体遺伝子の取得マウス全脳ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ　による増幅を行った。
ＭＦＳＡＬ１：　５’−ＧＴＣＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＧＧＡＣＧＣＴＧ−３’（配列番号：５３）
ＭＲＮＨＥ１：　５’−ＧＣＴＡＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＡＴＣＡＧＴＣＴＣＧＴＧ−３’（配列番号：５４）
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１　μｌ、０．５　μｌ　ＭＦＳＡＬ１（１０　μＭ）、０．　５　μｌ　ＭＲＮＨＥ１（１０　μＭ）、２．５　μｌ添付の１０　ｘ　反応液、２．５　μｌ　ｄＮＴＰ（１０　ｍＭ）、０．５　μｌ　ＫｌｅｎＴａｑ（クローンテック）、１７．５　μｌ大塚蒸留水を加えて合計２５　μｌにした。反応液を、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ９６００を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５　℃２　分の変性の後、９８　℃１０　秒、６０　℃２０　秒、７２　℃２０秒のサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約４００　ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図３で示す配列がえられた。図３のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図４に示すものであった。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴＡｍＧＰＲ７−１を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドｐＴＡｍＧＰＲ７−１をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図３と同じマウス型ＧＰＲ７リガンド　ｃＤＮＡであることを確認した。
【０１３６】
実施例３　ラット全脳ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるＧＰＲ７リガンド前駆体遺伝子の取得ラット全脳ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ　による増幅を行った。
ＲＦ：　５’−ＣＡＣＧＧＣＴＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧＧＴＧＴＡＧＧＡＣＧ−３’（配列番号：５５）
ＲＲ：　５’−ＣＡＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＣＡ−３’（配列番号：５６）
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１　μｌ、０．５　μｌ　ＲＦ（１０　μＭ）、０．　５　μｌ　ＲＲ（１０　μＭ）、２．５　μｌ添付の１０　ｘ　反応液、２．５　μｌ　ｄＮＴＰ（１０　ｍＭ）、０．５　μｌ　ＫｌｅｎＴａｑ（クローンテック）、１７．５　μｌ大塚蒸留水を加えて合計２５　μｌにした。反応液を、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ９６００を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５　℃２　分の変性の後、９８　℃１０　秒、６０　℃２０　秒、７２　℃２０秒のサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約４００　ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図５で示す配列がえられた。図５のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図６に示すものであった。
次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴＡｒＧＰＲ７−１を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドｐＴＡｒＧＰＲ７−１をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が図５と同じラット型ＧＰＲ７リガンド　ｃＤＮＡであることを確認した。
【０１３７】
実施例４　ＧＰＲ７発現プラスミドおよびレポータープラスミドのチャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）細胞での一過的な発現
参考例２で得たヒト型ＧＰＲ７　ＤＮＡを、自体公知の方法により動物細胞用発現プラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたコロニーを単離・培養後、ＱＵＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてＧＰＲ７発現プラスミドＤＮＡの調製を行なった。また、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子が連結されたｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（クロンテック社）のプラスミドＤＮＡを同様の方法で調製した。
ＧＰＲ７発現プラスミドおよびｐＣＲＥ−Ｌｕｃは受容体遺伝子を挿入していない発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞に一過性に発現させた。ＣＨＯ細胞は９６−ウェルプレート（コーニングコースター社）に４０，０００　細胞／ウェル、培養液量１００μｌで播種し、３７℃で一晩培養した。プレート上での培養にはＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ，　ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）に１０％のウシ胎児血清のみを添加した培地を用いた。各プラスミドは２４０ｎｇ／μｌの濃度に希釈し、ＧＰＲ７の発現プラスミド９　μｌとｐＣＲＥ−Ｌｕｃ　１　μｌの割合で２４０　μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）に添加した。これを、同じく２４０　μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉに１０　μｌのリポフェクトアミン２０００（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン２０００に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドＤＮＡの複合体を形成させた。これを２５μｌ／ｗｅｌｌずつＣＨＯ細胞の培養液に添加し、その４時間後に培養液をアッセイバッファー（０．１％のウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ）に交換して無血清化し、３７℃で一晩培養した。
【０１３８】
実施例５　リガンド遺伝子のＣＨＯ細胞での発現
実施例１で作製したヒト型リガンドｃＤＮＡを挿入した動物細胞用発現プラスミドｐＡＫ−Ｓ６４を実施例４と同様の方法でＣＨＯ細胞に一過性に発現させた。ただし細胞は６−ウェルプレート（ファルコン社）に６００，０００細胞／ウェルで播種し、一晩培養の後、リガンド遺伝子プラスミドを導入した。２４０ｎｇ／μｌの濃度に希釈したプラスミドを１０　μｌと２４０　μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉに添加し、これを、同じく２４０　μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉに１０　μｌのリポフェクトアミン２０００を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン２０００に添付のマニュアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドＤＮＡの複合体を形成させた。これを５００μｌ／ウェルずつＣＨＯ細胞の培養液に添加し、その４時間後に培養液をアッセイバッファーに交換し、無血清化をおこなった。培地交換の１８時間後に各ウェルの培地を回収しリガンドペプチドを含むＣＨＯ細胞培養上清を得た。
【０１３９】
実施例６　Ｓ６４発現細胞上清によるＧＰＲ７を一過性に発現させたＣＨＯ細胞でのルシフェラーゼ活性の抑制の検出
実施例４の方法に従いＧＰＲ７を一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培養液に、実施例５で調製したｐＡＫ−Ｓ６４発現培養上清および終濃度２　μＭとなるようにホルスコリンを添加した。またリガンド遺伝子を挿入していない空の発現ベクター（ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ）を実施例５の方法で一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培養上清も同様に添加した。その際発現上清はアッセイバッファーにて２倍、４倍、８倍、１６倍に希釈した。上清を添加してから４時間３７℃でインキュベーションを行ない、受容体を介したリガンドのアゴニスト活性によって惹起される細胞内シグナル伝達に由来するレポーター（ルシフェラーゼ）遺伝子の転写・翻訳の促進あるいは抑制を誘導した。インキュベーション終了後に各ウェルのアッセイバッファーを除去し、ＰｉｃａＧｅｎｅ　ＬＴ２．０　（東洋インキ社）発光基質を５０　μｌずつ加えた。細胞が溶解し、基質と充分に混合した後、各ウェルのレポーター遺伝子の発現誘導量に由来する発光量をプレートリーダー（ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンター、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて測定した。その結果、ｐＡＫ−Ｓ６４の培養上清を添加した際にのみレポーター遺伝子の発現抑制がルシフェラーゼ活性の低下として検出された（図８）。さらに、この抑制の程度はｐＡＫ−Ｓ６４の培養上清の濃度依存的であった。このことはｐＡＫ−Ｓ６４に挿入されたプラスミドによって発現した産物が、ＧＰＲ７を介した細胞内のシグナルを伝達した、すなわちＧＰＲ７のリガンドとして作用したことを示している。
【０１４０】
実施例７　Ｓ６４発現細胞上清によるＴＧＲ２６を一過性に発現させたＣＨＯ細胞でのルシフェラーゼ活性の抑制の検出
参考例３で得たＴＧＲ２６　ＤＮＡを、自体公知の方法により動物細胞用発現プラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入したプラスミドを用いて、実施例４と同様の方法でＴＧＲ２６発現プラスミドＤＮＡの調製を行なった。これをやはり実施例４に示した方法でＣＨＯ細胞にルシフェラーゼ遺伝子とともに一過性に発現させた。この細胞に、実施例５で調製したｐＡＫ−Ｓ６４発現培養上清、空の発現ベクターのみを発現させた細胞の培養上清および終濃度２μＭとなるようにホルスコリンを添加し、実施例６と同様の方法でリガンド活性の検出を試みた。その結果ｐＡＫ−Ｓ６４の上清は、ホルスコリンによって上昇したルシフェラーゼ活性を濃度依存的に低下させた（図９）。
【０１４１】
実施例８　Ｓ６４発現細胞上清によるＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞のｃＡＭＰ産生量の抑制
実施例４にて作製したＧＰＲ７発現用プラスミドを用いて自体公知の方法によりＧＰＲ７の安定的な発現ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−ＧＰＲ７を作製した。ＣＨＯ−ＧＰＲ７あるいは受容体遺伝子を導入していないｍｏｃｋ　ＣＨＯ細胞を２００００ｃｅｌｌｓ／ウェルの濃度で９６ウェルプレート（ベクトンデッキンソン）に播種し、３７℃　５％ＣＯ２で１晩培養したものをアッセイに使用した。サンプルバッファーはダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ、ギブコ）に０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ）および０．２ｍＭ　ＩＢＭＸ（シグマ）を添加したものを用いた。細胞をサンプルバッファーで２回洗浄し、３７℃　５％ＣＯ２で３０分間プレインキュベーションした後、さらに細胞を２回洗浄し、サンプルを添加して３７℃　５％ＣＯ２で３０分間インキュベーションした。サンプルはサンプルバッファーのみ（無処理）、ｃＡＭＰ産生の上昇を促す試薬であるホルスコリン（和光純薬工業）１μＭ、実施例５においてｐＡＫ−Ｓ６４を一過性に発現させて得たＣＨＯ細胞の培養上清とホルスコリンを同時に添加したもの（Ｓ６４上清）、およびｐＡＫＫＯ−１１１Ｈを発現させたＣＨＯ細胞の培養上清（ｐＡＫＫＯ上清）とホルスコリンを同時に添加したものの４種類であった。サンプルとのインキュベーションの後、細胞内のｃＡＭＰ産生量はｃＡＭＰ　Ｓｃｒｅｅｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定した。その結果、Ｓ６４上清を添加することによりＣＨＯ−ＧＰＲ７特異的に細胞内ｃＡＭＰ産生量の抑制反応が認められ（図１０）、ｍｏｃｋＣＨＯ細胞では細胞内ｃＡＭＰ産生量の抑制反応が認められなかった（図１１）。
【０１４２】
実施例９　ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰＲ７リガンドｍＲＮＡのラットにおける組織分布の検討
Ｗｉｓｔａｒラットより各種臓器を摘出し、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをｍＲＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）により、それぞれのマニュアルにしたがって調製した。得られたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ　１μｇをＤｎａｓｅＩ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｇｒａｄｅ，　ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社）処理後、１６０ｎｇ分をＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いて、マニュアルに従い４２℃でｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡはｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ換算で４ｎｇ／μｌの溶液とし、以後のＲＴ−ＰＣＲの鋳型として用いた。　ＲＴ−ＰＣＲはＳｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｐｒｉｓｍ　７７００（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、増幅と検出のためのプライマーとして５’−ＣＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＣＣＡＣＡＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号：６３），　５’−ＴＴＧＣＧＣＡＧＡＧＧＴＡＣＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号：６４）　およびＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）−ＣＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＧＣＧＴＧＡＣＣＴＴＧＴＴ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：６５）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液はＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２．５μｌに、それぞれ１００μＭのプライマー溶液を０．０５μｌ、５μＭのＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅを０．５μｌ、および上記で調製したｃＤＮＡ溶液を０．５μｌ加え、蒸留水で総反応液量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は５０℃　２分、９５℃　１０分の後、９５℃　１５秒、６０℃　１分のサイクルを４０回繰り返した。得られたラット各種組織におけるＧＰＲ７リガンドのｍＲＮＡ発現量はｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ　１ｎｇあたりのコピー数として算出した（図１２）。
【０１４３】
実施例１０　ウシ視床下部からの内因性ＧＰＲ７リガンドの精製
ヒトＧＰＲ７リガンド前駆体ｍＲＮＡは視床下部、脊髄で多く発現していることが認められたため、内因性ＧＰＲ７リガンドの精製を、ウシ視床下部を出発材料として、ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞を用い、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性（ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定）を指標にして行った。
まず、凍結保存されたウシ視床下部１．０ｋｇをミリＱ水中で煮沸し、冷却後酢酸を１Ｍとなるように加え、ポリトロンでホモジナイズした。一晩撹拌した後、遠心にて上清を得た。上清にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を０．０５％となるように加え、Ｃ１８カラム（Ｐｒｅｐ　Ｃ１８　１２５Å；　Ｗａｔｅｒｓ）にアプライした。カラムに結合したペプチドを０．５％ＴＦＡを含む１０、４０、６０％アセトニトリルでステップワイズに溶出した。４０％アセトニトリル画分に二倍量の２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．７）で希釈し、イオン交換カラム　ＨｉＰｒｅｐ　ＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライした。イオン交換カラムに結合したペプチド１０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．７）中の０〜０．５Ｍ　ＮａＣｌの濃度勾配で溶出した。もっとも多く活性物質が含まれていたＮａＣｌ画分（０．３〜０．３５Ｍ）に２倍量の冷アセトンを加え、遠心にて沈殿を除き上清をエバポレ−トにて濃縮した。濃縮された上清に０．１％となるようＴＦＡを加え、逆相ＨＰＬＣカラム　ＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＲＰＣ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　にてさらなる分離を行った。ＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＲＰＣの分離は２０〜３０％アセトニトリルの濃度勾配で行い、主たる活性は、およそ２２％アセトニトリルで溶出された。この活性画分に３倍量の冷アセトンを加え、遠心にて沈殿を除き上清をエバポレートにて濃縮した。濃縮された上清に０．１％となるようＴＦＡを加え、逆相ＨＰＬＣカラム　Ｖｙｄａｃ　Ｃ１８　２１８ＴＰ５４１５　（Ｖｙｄａｃ）　にてさらなる分離を行った。Ｖｙｄａｃ　Ｃ１８　２１８ＴＰ５４１５の分離は２０〜３０％アセトニトリルの濃度勾配で行い、主たる活性は、およそ２５％アセトニトリルで溶出された。この活性画分を１０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．７）中での０．３〜０．５Ｍ　ＮａＣｌの濃度勾配を用いた陽イオン交換カラム　ＴＳＫ−ｇｅｌ　ＣＭ−２ＳＷ（ト−ソ−）で分離したところ、主たる活性は、およそ０．５Ｍ　ＮａＣｌで溶出された。活性を含むＣＭ−２ＳＷカラムの画分に０．１％となるようＴＦＡを加え、１６−２４％アセトニトリルの濃度勾配を用いた逆相カラム　μＲＰＣ　Ｃ２／Ｃ１８　ＳＣ２．１／１０で最終精製し、活性と一致する単一のピ−クを得た（図１３）。
【０１４４】
実施例１１　最終精製標品のＮ末端アミノ酸配列分析およびマススペクトルによる分子量測定
実施例１０で得られた最終精製標品を、約半量をＮ末端アミノ酸をプロティンシ−クエンサ−（ｍｏｄｅｌ　４９１ｃＬＣ；　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析、残り半量をＥＳＩＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ）で分析した。
Ｎ末端配列分析の結果、２サイクル目から２５サイクル目までウシＧＰＲ７リガンド前駆体の２６位から４９位に相当する配列を読むことができた（図１４）。サイクル１は同定できなかった（ｘ）ことから、翻訳後修飾を受けているものと推定された。２サイクル目以降は、明瞭に上記の配列と同定された。
ＥＳＩＭＳ測定（図１５上）では、フルマススキャンモードでの測定から３２４１．５の値を得た。マススペクトルから算出された分子量とＭＳ／ＭＳスペクトルの解析結果（図１５下）から、Ｎ末端２残基の何れかが翻訳後修飾を受けているものと推定した。Ｎ末端配列分析結果を考え合わせて、１位Ｔｒｐが修飾されているものと推定した。
ズームスキャンモードで測定した３価の分子イオンの同位体プロファイル（図１６）を考え合わせて、本物質は２９残基ＧＰＲ７リガンドで、１位トリプトファン残基がブロモ化されていると推定した。
この推定を確認するため、ＤＬ−５−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＤＬ−６−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）からＰＴＨスタンダードを作成して分析した。ＤＬ−５−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎまたはＤＬ−６−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　２００ｎｍｏｌを、ｅｔｈａｎｏｌ：ｔｒｉｅｔｈｙａｍｉｎｅ：ＤＷ：ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ｓｉｇｍａ）＝７：１：１：１　２０ｕｌを加え室温で２０分反応し、乾燥後ＴＦＡ　５０ｕｌを加えて５０℃１０分反応し、乾燥後２Ｎ　ＨＣｌ：ｍｅｔｈａｎｏｌ＝１：１を５０ｕｌ加えて５０℃１０分反応し、逆相ＨＰＬＣにて精製して、５−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎまたは６−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎのＰＴＨ誘導体を得た。最終物の確認はプロテインシーケンサーにて行った（図１７および図１８）。これらのＰＴＨ誘導体を２０アミノ酸ＰＴＨスタンダード（ＡＢＩ）に混合し、これらが分離するプロトコルを作成し（表１および表２）、内因性ウシＧＰＲ７リガンドを分析したところ、１位アミノ酸はＰＴＨ−６−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎのピークと一致した（図１９）。
これらの分析結果より、ウシ視床下部からの最終精製標品はウシＧＰＲ７リガンド前駆体の２５位Ｔｒｐから５３位Ａｌａに相当する２９アミノ酸（配列番号：６７）からなるペプチドで、１位Ｔｒｐは翻訳後修飾で６−ブロモ化されていることが判明した。
【０１４５】
【表１】
2004049003.tif 000002
表１は、通常のペプチド用メソッド（Ｐｕｌｓｅｄ−Ｌｉｑｕｉｄ　ｃＬＣ）とブロモトリプトファン用メソッド（ＢｒＴｒｐ−ｌｉｑｕｉｄ　ｃＬＣ）の、サイクルとグラディエントの比較を示す。
【０１４６】
【表２】
2004049003.tif 000003
表２は、４９１ｃＬＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　（ＡＢＩ）　の通常のペプチド用（Ｎｏｒｍａｌ　１　ｃＬＣ）とブロモトリプトファン分析用に作成した（Ｎｏｒｍａｌ　ｆｏｒ　ＢｒＷ　ｃＬＣ，　ＢｒＴｒｐ　ｃＬＣ）　グラディエントの比較を示す。
【０１４７】
Ｎ末端配列分析は、４９１ｃＬＣ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　（ＡＢＩ）で、通常のペプチド分析用メソッド（Ｎｏｒｍａｌ　１ｃＬＣ）をｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ分析用に改良（ＢｒＴｒｐ−ｌｉｑｕｉｄ　ｃＬＣ）したものを用いて行った。上記の条件以外は、メーカーのマニュアルに従った。改良したグラディエント（ＢｒＴｒｐ　ｃＬＣ）を用いると、Ｂｒ付加位置の異なる５−／６−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎを判別することが可能である。
改良したメソッド、ＢｒＴｒｐ−ｌｉｑｕｉｄ　ｃＬＣを用いて分析すると、ブランク、スタンダード及び２サイクル目までのみ５−／６−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ分析用グラディエント（ＢｒＴｒｐ　ｃＬＣ）が適応され、３サイクル目以降は異なるグラディエント（Ｎｏｒｍａｌ　ｆｏｒ　ＢｒＷ
ｃＬＣ）が適応される。
【０１４８】
実施例１２　ウシ視床下部ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体遺伝子の取得
ウシ視床下部ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ　による増幅を行った。
ＢＦ１：　５’−ＣＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＡＴＧＣＴＧＧＴＣＧＣＣ−３’　（配列番号：８２）
ＢＲ１：　５’−ＴＣＡＣＴＴＧＣＧＡＣＡＧＴＣＣＧＡＧＧＣＧＣＴＧＡＧＣＧＡ−３’　’　（配列番号：８３）
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１　μｌ、０．５　μｌ　ＢＦ１（１０　μＭ）、０．　５　μｌ　ＢＦ２（１０　μＭ）、２．５　μｌ添付の１０　ｘ　反応液、２．５　μｌ　ｄＮＴＰ（１０　ｍＭ）、０．５　μｌ　ＫｌｅｎＴａｑ（クローンテック）、１７．５　μｌ大塚蒸留水を加えて合計２５　μｌにした。反応液を、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ９６００を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５　℃２　分の変性の後、９８　℃１０　秒、６０　℃２０　秒、７２　℃２０秒のサイクルを３５回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約４００　ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図２０で示す配列がえられた。図２０のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図２１に示すものであった。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＧＰＲ７Ｌ−１を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドｐＴＡｂＧＰＲ７Ｌ−１をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列がウシ型ＧＰＲ７リガンド　ｃＤＮＡであることを確認した。
【０１４９】
実施例１３　ＧＰＲ７リガンドの合成
ＧＰＲ７リガンド（ＧＰＲ７Ｌ）およびＧＰＲ８リガンド（ＧＰＲ８Ｌ）は、ＡＢＩ　４３３ペプチド合成機にて、Ｆｍｏｃ／ＤＣＣ／ＨＯＢｔプロトコルで合成した。ＤＬ−６−Ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）は、Ｂｏｃ−　ＤＬ−６−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ＯＭｅとした後キラル分割して、それぞれをペプチド合成に用いた。
（１）ＤＴｒｐ（６Ｂｒ）１−ｈｕｍａｎＧＰＲ７Ｌ（２９）（配列番号：４で表されるアミノ酸配列のＮ末端Ｄ−トリプトファンの６位がブロモ化されたもの）：
（Ｄ−Ｔｒｐ（６Ｂｒ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）、
（２）ＬＴｒｐ（６Ｂｒ）１−ｈｕｍａｎＧＰＲ７Ｌ（２９）（配列番号：４で表されるアミノ酸配列のＮ末端Ｌ−トリプトファンの６位がブロモ化されたもの）：
（Ｔｒｐ（６Ｂｒ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）、
（３）Ｔｒｐ１−ｈｕｍａｎＧＰＲ７Ｌ（２９）（配列番号：４）：
（Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）　、
（４）Ｔｒｐ１−ｈｕｍａｎＧＰＲ７Ｌ（２３）（配列番号：１）：
（Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）　、
（５）ＤＴｒｐ（６Ｂｒ）１−ｂｏｖｉｎｅＧＰＲ７Ｌ（２９）（配列番号：６７で表されるアミノ酸配列のＮ末端Ｄ−トリプトファンの６位がブロモ化されたもの）：
（Ｄ−Ｔｒｐ（６Ｂｒ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）　、
（６）ＬＴｒｐ（６Ｂｒ）１−ｂｏｖｉｎｅＧＰＲ７Ｌ（２９）（配列番号：６７で表されるアミノ酸配列のＮ末端Ｌ−トリプトファンの６位がブロモ化されたもの）：
（Ｔｒｐ（６Ｂｒ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）　、
（７）Ｔｒｐ１−ｂｏｖｉｎｅＧＰＲ７Ｌ（２９）（配列番号：６７）：
（Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）　、
（８）Ｔｒｐ１−ｒａｔＧＰＲ７Ｌ（２９）（配列番号：６）：
（Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＨｉｓＩ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）、
（９）Ｔｒｐ１−ｒａｔＧＰＲ７Ｌ（２４）（配列番号：３）：
（Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ）
（１０）Ｔｒｐ１−ｈｕｍａｎＧＰＲ８Ｌ（２３）（配列番号：１００）：
（Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）（ＷＯ０１／９８４９４号）
【０１５０】
実施例１４　ＧＰＲ７リガンドのラット側脳室内投与による摂食量に及ぼす影響ＧＰＲ７リガンド（ＧＰＲ７Ｌ）のラット側脳室内投与による摂餌量に及ぼす影響を検討した。ラットは、照明時間を８時から２０時、室温２５℃において飼育した。成熟Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（手術時体重３００〜３２０ｇ）をペントバルビタール５０　ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与にて麻酔し、ラット脳定位固定装置に固定した。切歯用バーはインターオーラルラインから３．３　ｍｍ低くした。頭蓋骨を露出し、側脳室にガイドカニューレＡＧ−８（内径０．４　ｍｍ、外径０．５　ｍｍ、エイコム社）を埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開けた。また、その周囲３箇所にアンカービスを埋めた。ステンレス製ガイドカニューレ、ＡＧ−８を、その先端が側脳室の上部に位置するように挿入した。定位座標は、ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎ（１９９８）のアトラスに従い、ブレグマより、ＡＰ：　−０．８　ｍｍ、Ｌ：１．５　ｍｍ、Ｈ：−４．５ｍｍとした。ガイドカニューレは歯科用セメントおよびアンカービスで頭蓋骨に固定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダミーカニューレ、ＡＤ−８（外径　０．３５　ｍｍ、エイコム社）を挿入し、キャプナット（エイコム社）で固定した。術後、ラットは個別のケージで飼育した。
ガイドカニューレを埋め込んでから約１週間飼育して術後の回復を待ち、ラットの頭蓋骨に装着したキャップナットとダミーカニューレを取り外し、代わりにテフロン（登録商標）チューブ（長さ５０　ｃｍ、内径０．１　ｍｍ、外径０．３５　ｍｍ、エイコム社）につないだステンレス製マイクロインジェクションカニューレＡＭＩ−９（内径０．１７　ｍｍ、外径０．３５　ｍｍ、エイコム社）を挿入した。マイクロインジェクションカニューレの長さは、その先端１　ｍｍがガイドカニューレから露出するように調節しておいた。テフロン（登録商標）チューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、滅菌蒸留水（大塚製薬）、実施例１３で合成したブロム化されていないＧＰＲ７Ｌ（Ｔｒｐ１−ｂｏｖｉｎｅＧＰＲ７Ｌ（２９）、配列番号：６７）を溶解させた蒸留水を５μｌ／分の流速で計１０μｌ（１０　ｎｍｏｌ／ｒａｔ）を側脳室に注入した。注入終了後２分待ってからマイクロインジェクションカニューレを取り外し、再びダミーカニューレをキャップナットで固定した。注入は、１９時から２０時の間に行いその後の摂餌量を摂餌量測定措置Ｆｅｅｄ−Ｓｃａｌｅ（コロンバス社）を用いて経時的に測定した。図２２に示すごとくブロム化されていないＧＰＲ７Ｌ投与群は対象群に比し、投与２時間後より有意な摂餌量の増加が認められた。
【０１５１】
実施例１５　ウシ内因性ＧＰＲ７リガンドのＦＴＭＳ測定
ウシ内因性ＧＰＲ７Ｌを、ＡｐｅｘＩＩ（ブルカーダルトニクス）にてＥＳＩＦＴＭＳ分析した（図２３上）。図２３の中図に［Ｍ＋５Ｈ］５＋イオンの拡大図、下図に１Ｂｒ付加ウシＧＰＲ７Ｌの［Ｍ＋５Ｈ］５＋イオンの同位体理論プロファイルを示す。同位体プロファイル、マス値共によく一致したことで、修飾物はＢｒと同定された。
【０１５２】
実施例１６　ＲＴ−ＰＣＲによるＧＰＲ７リガンドｍＲＮＡのヒトにおける組織分布の検討
ｍＲＮＡの発現量は実施例９と同様の方法で行った。ただし鋳型となるｃＤＮＡには、ヒト各種組織由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）から以下の方法で合成したものを使用した。ＲＮＡ１μｇからランダムプライマー、逆転写酵素としてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社）を用い、添付のマニュアルに従って４２℃で反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して１００μｌに溶解した。発現量の定量も実施例９と同様にＳｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｐｒｉｓｍ　７７００を用いて行った。ただし増幅と検出のためのプライマーとして５’−ＣＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＴＡＣＡＧＡ−３’（配列番号：９０），５’−ＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＧＧＴＣ−３’（配列番号：９１）およびＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）ＡＧＣＣＴＣＧＣＴＧＴＧＴＧＣＧＴＣＣＡＧＧＡＣ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：９２）を使用した。
得られたヒト各種組織におけるＧＰＲ７のｍＲＮＡ発現量はｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ　１ｎｇあたりのコピー数として算出した（図２４）。
【０１５３】
実施例１７　ＲＴ−ＰＣＲによるラット型ＧＰＲ７（ラットＴＧＲ２６）ｍＲＮＡの組織分布の検討
ｍＲＮＡの発現量は実施例９と同様の方法で行った。実施例９で使用したラット各種臓器由来のｃＤＮＡを用いて、ラットＧＰＲ７ｍＲＮＡの発現量を求めた。ただし増幅と検出のためのプライマーとして５’−ＴＧＣＧＴＧＣＴＡＴＣＣＡＧＣＴＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号：９３），　５’−ＡＧＡＧＧＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＴ−３’（配列番号：９４）　およびＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅとして５’−（Ｆａｍ）ＣＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＧＣＧＴＧＡＣＣＴＴＧＴＴ−（Ｔａｍｒａ）−３’（配列番号：９５）を使用した。得られたラット各種組織におけるＧＰＲ７のｍＲＮＡ発現量はｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ　１ｎｇあたりのコピー数として算出した（図２５）。
【０１５４】
実施例１８　ウシ視床下部ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるウシ型ＧＰＲ７遺伝子の取得ウシ視床下部ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。
ＢＧＰＲ７Ｆ：　５’−ＧＴＣＧＡＣＣＧＡＧＴＧＴＣＴＧＴＣＣＴＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧ−３’　（配列番号：９６）
ＢＧＰＲ７Ｒ：　５’−ＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＴＧＴＴＡＴＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴ−３’　（配列番号：９７）
ＰＣＲの反応液はｃＤＮＡ溶液１　ｍｉｃｒｏｌ、０．５　ｍｉｃｒｏｌ　ＢＧＰＲ７Ｆ（１０　ｍｉｃｒｏＭ）、０．　５　ｍｉｃｒｏｌ　ＢＧＰＲ７Ｒ（１０　ｍｉｃｒｏＭ）、２．５　ｍｉｃｒｏｌ添付の１０　ｘ　反応液、２．５　ｍｉｃｒｏｌ　ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、０．５　ｍｉｃｒｏｌ　ＫｌｅｎＴａｑ（クローンテック）、１７．５　ｍｉｃｒｏｌ大塚蒸留水を加えて合計２５　ｍｉｃｒｏｌにした。反応液を、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ９６００を用いてＰＣＲ反応にかけた。ＰＣＲの条件は９５　℃２　分の変性の後、９８　℃１０　秒、６０　℃２０　秒、７２　℃６０秒のサイクルを４０回繰り返した。ＰＣＲ産物の一部を用いて電気泳動で約１０００　ｂｐのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図２６で示す配列がえられた。図２６のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図２７に示すものであった。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキット（インビトローゲン社）を用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＧＰＲ７を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドｐＴＡｂＧＰＲ７をプラスミド抽出機（クラボウ社）を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列がウシ型ＧＰＲ７受容体　ｃＤＮＡであることを確認した。
【０１５５】
実施例１９　ウシ視床下部ｃＤＮＡからのＰＣＲ法によるウシ型ＧＰＲ８遺伝子の取得
ウシ視床下部ｃＤＮＡを鋳型として、以下の２種類の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ　による増幅を行った。
ＢＧＰＲ８Ｆ：　５’−ＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧ−３’　（配列番号：９８）
ＢＧＰＲ８Ｒ：　５’−ＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＧＣＧＧＴ−３’　（配列番号：９９）
ＰＣＲの反応は実施例１８と同様の方法で行った。得られたＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて精製し、直接配列決定を行ったところ図２８で示す配列がえられた。図２８のＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列は図２９に示すものであった。次に、ゲルから回収したＰＣＲ産物をＴＡクローニングキットを用いて大腸菌ＪＭ１０９にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴＡｂＧＰＲ８を取得した。サブクローニングで得られた大腸菌からプラスミドｐＴＡｂＧＰＲ８をプラスミド抽出機を用いて抽出し、挿入断片の塩基配列を決定し、その配列がウシ型ＧＰＲ８ｃＤＮＡであることを確認した。
【０１５６】
実施例２０　ヒト型ＧＰＲ７リガンド発現ＣＨＯ細胞の培養上清からのＧＰＲ７リガンドの精製
実施例５で構築したヒト型ＧＰＲ７リガンド発現ＣＨＯ細胞の培養上清を２Ｌ集め、−８０℃にて保存した。培養上清は、解凍後湯せんにてボイルし、さらに遠心して上清を得た。上清にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を０．０５％となるように加え、Ｃ１８カラム（Ｐｒｅｐ　Ｃ１８　１２５Å；　ウォーターズ社）にアプライした。カラムに結合したペプチドを０．５％ＴＦＡを含む１０、４０、６０％アセトニトリルでステップワイズに溶出した。４０％アセトニトリル画分を三倍量の２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．７）で希釈し、イオン交換カラム　ＨｉＰｒｅｐ　ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　（ファルマシア社）にアプライした。イオン交換カラムに結合したペプチド１０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．７）中の０Ｍ￣０．５Ｍ　ＮａＣｌの濃度勾配で溶出した。各フラクションの一部をＳｅｐ−Ｐａｋ　ｐｌｕｓ　Ｃ１８　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（ウォーターズ社）を用いた脱塩後、ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に特異的な細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に特異的活性が見出されたＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅフラクションに０．１％となるようＴＦＡを加え、逆相ＨＰＬＣカラム　ＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＲＰＣ　（ファルマシア社）　にて、さらなる分離を行った。ＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＲＰＣの分離は１５−３０％アセトニトリルの濃度勾配で行い、主たるヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に特異的な細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性は、およそ２２％アセトニトリルで溶出された。この活性画分を１０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．７）中での０．２−０．５Ｍ　ＮａＣｌの濃度勾配を用いた陽イオン交換カラム　ＴＳＫｇｅｌ　ＣＭ−ＳＷ（ト−ソ−社）で分離したところ、主たる細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性は、およそ０．３Ｍ　ＮａＣｌで溶出された。このＣＭ−２ＳＷカラムの画分に０．１％となるようＴＦＡを加え、１５−２２％アセトニトリルの濃度勾配を用いた逆相カラム　μＲＰＣ　Ｃ２／Ｃ１８　ＳＣ２．１／１０で最終精製した結果、単一のピ−クが得られ、これはヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に特異的な細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性と一致した（図３０）。
この最終精製標品のＮ末端アミノ酸をプロティンシ−クエンサ−（ｍｏｄｅｌ　４９２；　アプライドバイオシステムス社）で分析したところ、図３１に示すアミノ酸配列が得られた。
また、ＥＳＩ−ＭＳ　（サーモクエスト社）を用いて、最終精製標品の分子量を測定したところ、２５０５．６の値を得た（図３２）。
これらの分析結果より、最終精製標品は前駆体の　Ｔｒｐ２５からＡｒｇ４８までに相当する２４アミノ酸からなるペプチドであることが判明した。
【０１５７】
実施例２１　ヒト型ＧＰＲ７リガンドのヨード標識体の作製
ｈＧＰＲ７Ｌ−２３（配列番号：１）　（０．１ｍＭ又は１ｍＭ）　２０μｌ、ラクトペルオキシダーゼ（シグマ社、１０μｇ／ｍＬに０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ　ｐＨ７．０を用いて調製）　２０μｌ、Ｉｄｏｉｎｅ−１２５（アマシャム社製、ＩＭＳ−３０、７４ＭＢｑ）２０μｌ、０．００５％　過酸化水素（和光純薬社製）　２０μｌ　を混合、室温で２０分から３０分静置した後、０．１％　ＴＦＡ　６００μｌを添加して逆相ＨＰＬＣにて分離、２つの標識体のピークを１ｍＬ　ＤＭＳＯを入れたチューブで分取した。直ちに氷上に保管し、一部を１／１００希釈してγ−カウンターで放射活性を測定し、残りの標品は分注して−３０℃にて保存した。
【０１５８】
実施例２２　ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分の調製
ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞を培養したフラスコを５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳで洗浄、５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳで細胞を剥がし、遠心して細胞を回収、２５ｍＬの　膜画分調製用緩バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５、　５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％　ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ（和光純薬社製）、　２０μｇ／ｍＬ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（ペプチド研究所製）、　０．１μｇ／ｍＬ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ（ペプチド研究所製）、　４μｇ／ｍＬ　Ｅ−６４（ペプチド研究所製））に懸濁、ポリトロンを用い氷上でホモジナイズした（１２，０００ｒｐｍ、１５秒×３回）。これを、高速冷却遠心機にて４℃、１，０００ｇ、１０分遠心し、上清を回収した。沈殿に２５ｍＬの膜画分調製用緩衝バッファーを加え、同様の操作で上清を回収した。これら上清をまとめ、セルストレーナーにかけた後、超遠心機用チューブに分注し、４℃、１００，０００ｇ、１時間遠心した。ペレットを回収し、少量の膜画分調製用バッファーに懸濁し、テフロン（登録商標）ホモジナイザーを用いて懸濁した後、一部を用いて蛋白量を測定し、残りを分注して−８０℃にて保存した。
【０１５９】
実施例２３　ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いたスキャッチャード解析
ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分、［Ｔｙｒ（１２５Ｉ）１１］−ｈＧＰＲ７Ｌ−２３（配列番号：１）を用いてスキャッチャード解析を行った。アッセイ用バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、　５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％　ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ（和光純薬社製）、　２０μｇ／ｍＬ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（ペプチド研究所製）、　０．１μｇ／ｍＬ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ（ペプチド研究所製）、　４μｇ／ｍＬ　Ｅ−６４（ペプチド研究所製））にて、膜画分を終濃度１μｇ／ｗｅｌｌとなるよう希釈、標識体を終濃度４００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１０ｐＭとなるよう希釈した。ポリプロピレン製９６穴プレートを用いて、アッセイバッファーのみ（トータル）と終濃度２μＭのｈＧＰＲ７Ｌ−２３（ＮＳＢ）各５０μｌを分注、各ｗｅｌｌに標識体溶液２５μｌを添加して攪拌後膜画分希釈液２５μｌを混合・攪拌して、室温で１．５時間インキュベート、９６穴プレート用セルハーベスターを用いて、洗浄用バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５）で予め湿らせたフィルターユニット（ＧＦ／Ｃ、ポリエチレンイミン処理）に吸着、５回洗浄用緩衝液で洗浄した後、充分に乾燥させた。インプットとして、標識体希釈液を直接フィルターユニット（ＧＦ／Ｃ、ポリエチレンイミン処理）に添加し、乾燥させた。これらに液体シンチレーターを５０μｌ分注し、トップカウント（パッカード）で放射活性を測定し、３連でデータを解析し（図３３）、Ｂｍａｘ＝１．２８ｐｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｋｄ＝３５．５ｐＭの値を得た。
【０１６０】
実施例２４　ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に対する各種ペプチドの結合阻害実験
アッセイ用バッファーを用いて、ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞の膜画分を終濃度１μｇ／ｗｅｌｌ、ｈＧＰＲ７Ｌ−２３ヨード標識体（配列番号：１）を終濃度１００ｐＭとなるよう希釈した。表３に示したペプチドは、１０−２Ｍ又は１０−３Ｍのストック溶液を、終濃度が１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍとなるようアッセイ用バッファーで希釈した。ＮＢＳとして終濃度１０−５ＭのｈＧＰＲ７Ｌ−２３を調製した。ポリプロピレン製９６穴プレートを用いて、調製した試料溶液、ＮＳＢ、トータルとしてアッセイバファーを５０μｌ分注し、ヨード標識体希釈液２５μｌを添加して攪拌後、ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分溶液２５μｌを分注して攪拌、室温１時間半インキュベートした。これを、９６穴プレート用セルハーベスターを用いて、洗浄用バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ７．５）で予め湿らせたフィルターユニットに吸着、６回洗浄用緩衝液で洗浄した後、充分に乾燥させた。液体シンチレーターを５０μｌ分注てトップカウント（パッカード社）で放射活性を測定し、３連でデータを解析した。ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分に対する各種ペプチドの結合阻害実験結果を表３にＩＣ５０値を示す。
【表３】
2004049003.tif 000004
【０１６１】
実施例２５　ＧＰＲ７およびＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対する各種ペプチドのアゴニスト活性の比較
ヒト型ＧＰＲ７、ウシ型ＧＰＲ８、ヒト型ＧＰＲ８、ウシ型ＧＰＲ８、ラット型ＧＰＲ７を発現させたＣＨＯ細胞に対する、各種ＧＰＲ７リガンドに関連したペプチドの、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を調べた。各受容体発現細胞を、９６穴プレートに４×１０４個／ｗｅｌｌで継代し、３７℃、５％ＣＯ２　　９５％ａｉｒで一日培養した。アッセイ用バッファーとして、Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社）に、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４、０．１％　ウシ血清アルブミン、０．２ｍＭ　３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（シグマ社）を加えたものを調製した。一晩培養したプレートは、まず、アッセイ用バッファー１５０μｌで二回洗浄後、アッセイ用バッファー１５０μｌに交換して、３０分、３７℃、１００％　ａｉｒで培養した。試料希釈用バッファーとしてアッセイ用バッファーに４μＭ　フォルスコリンを添加したものを作成、これを用い表　　　に示したペプチドのストック溶液（１０−２Ｍ又は１０−３Ｍ）を希釈して、終濃度１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍとなるよう試料溶液を調製した。アッセイ用バッファーで３０分培養したプレートを取り出し、アッセイ用バッファーで２回洗浄後、アッセイバッファーを５０μｌ、次に試料溶液５０μｌを添加した。一つの試料につき、測定は３連で行った。また、ｂａｓａｌ　ｌｅｖｅｌ測定用に同量のアッセイ用バッファー、ｍａｘｉｍｕｍ　ｌｅｖｅｌ測定用にフォルスコリンを加えたバッファーを添加した。プレートを、３０分、３７℃、１００％　ａｉｒで培養し、細胞内ｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰ−ＳｃｒｅｅｎＴＭ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ社）を用い、本キットのプロトコールに従い測定した。Ｍａｘｉｍａｍ　ｌｅｖｅｌのｃＡＭＰ量と各サンプルを添加した時のｃＡＭＰ量の差を算出して、フォルスコリンによるｃＡＭＰ産生促進量に対する百分率を算出し、これをｃＡＭＰの産生の抑制率とした。表４に各試料のＩＣ５０値を示す。
【表４】
2004049003.tif 000005
【０１６２】
実施例９　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーション法によるＧＰＲ７リガンドｍＲＮＡのラット脳における発現分布の検討
Ｗｉｓｔａｒラットをネンブタール麻酔下で開腹し、左心室から０．９％食塩水を２５０ｍｌ潅流し、続いて４％パラホルムアルデヒド溶液を２５０ｍｌ潅流した。取り出した脳を同溶液中に４時間４℃で浸漬したのち、２０％スクロース溶液に置換し，４℃で３日間浸漬し、解析に供する脳のサンプルを得た。
ＧＰＲ７リガンドアンチセンス、センスプローブは以下の方法で調製した。
まず、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ＋（ストラタジーン社）に自体公知の方法でラット型ＧＰＲ７リガンドｃＤＮＡを挿入した。このプラスミドをＢａｍＨＩもしくはＸｂａＩを用いて制限酵素処理し、失活させた後に、それぞれ０．５２μｇ／ｍｌ、０．４７μｇ／ｍｌとなるようにＴＥに溶かした。ＢａｍＨＩ処理したものを２μｌ、Ｔ３　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ社）４０Ｕ、ｓｕｐｐｌｉｅｄ　１０Ｘ　ｂｕｆｆｅｒ　２μｌ、ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ロッシュ社）２０Ｕ、ＤＩＧ　ＲＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｍｉｘ，１０Ｘ（ロッシュ社）２μｌ、最終容量が２０μｌとなるように水を加え、３７℃、２時間反応させた。０．２Ｍ　ＥＤＴＡを２μｌ加えて反応を止めた後にエタノール沈殿により生成したリボプローブを回収し、アンチセンスプローブとした。また、ＸｂａＩ処理したものを２μｌ、Ｔ３ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ社）４０Ｕ、ｓｕｐｐｌｉｅｄ　１０Ｘ　ｂｕｆｆｅｒ　２μｌ、ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ロッシュ社）２０Ｕ、ＤＩＧ　ＲＮＡ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｍｉｘ，１０Ｘ（ロッシュ社）２μｌ、最終容量が２０μｌとなるように水を加え、３７℃、２時間反応させた。０．２Ｍ　ＥＤＴＡを２μｌ加えて反応を止めた後にエタノール沈殿により生成したリボプローブを回収し、センスプローブとした。それぞれの濃度を測定し、アンチセンスプローブ濃度が０．２９μｇ／ｍｌ、センスプローブ濃度が０．２７μｇ／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅ　フリーの水に溶かした。
Ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは以下の方法で行った。上記で調製した脳試料をクライオスタットＣＭ３０５０（ライカ社）を用いて２５ミクロンの厚さに前額断で調製した。生成した切片を１０ｍｌの４ＸＳＳＣにて５分間、２回洗浄した後に、１０ｍｌのＰＫ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）中にプロテネースＫ（シグマ社）が最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃、１０分反応させる。１０ｍｌの４ＸＳＳＣにて５分間、２回洗浄した洗う。１０ｍｌのアセチレーションバッファー（ｐＨ７．５、１００ｍＭ　トリエタノールアミン）に０．２５％となるように無水酢酸を加え、室温で１０分反応させた。１０ｍｌの４ＸＳＳＣにて５分洗う。この操作を２回行った後に、ハイブリバッファー（ｐＨ７．４、６０％　ホルムアミド、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００μｇ／ｍｌ　イーストｔ−ＲＮＡ、１Ｘ　デンハルト，１０％　デキストラン硫酸、６００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．２５％　ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）１ｍｌ中にアンチセンス及びセンスプローブが０．２μｇ／ｍｌとなるように加えた溶液に切片を加え、５５℃、１３時間ハイブリさせた。１０ｍｌ洗浄バッファー（２ＸＳＳＣ、５０％ホルムアミド）で５５℃、１５分間、２回洗浄した。ＲＮａｓｅバッファー（ｐＨ８．０、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｍ　ＮａＣｌ）にＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社）が２．５μｇ／ｍｌとなるように加え、切片を移し、３７℃、３０分間反応させた。１０ｍｌ洗浄バッファーで５５℃、１５分間洗った。この操作を２回繰り返した後に、０．４ＸＳＳＣで５５℃、１５分間洗った。ブロッキング溶液（ロッシュ社）０．１ｇを１０ｍｌのバッファー　Ａ（ｐＨ７．５、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）に溶かしたものに切片を移し、室温で１時間反応させる。０．１％　トライトン　Ｘ−１００を含む１ｍｌのバッファー　Ａにアンチ−ジゴキシゲニン−ＡＰ、Ｆａｂ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ロッシュ社）を０．７５Ｕ加えたものに切片を移し、４℃で１６時間反応させた。その後１０ｍｌのバッファー　Ａで室温、１５分間洗った。この操作を２回繰り返した後、１０ｍｌのバッファー　Ｂ（ｐＨ９．５、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）で室温１５分間洗った。１０ｍｌのバッファー　Ｂに４０μｌのＮＢＴ溶液（ロッシュ社）及び３５μｌのＸ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液を加え、切片を移し、発色反応を行った。室温で２４時間反応させた後に５０ｍｌのＴＥに移す。切片をＭＡＳコートスライドガラス（松浪ガラス）に貼り付け、風乾させた後に、封入剤（５０％グリセロール、５％ゼラチン）にてカバーグラスを貼り付ける。アンチセンスプローブにて特異的に発色していたのは視床下部の内側視索前野、外側視索前野、視床下部外側野、海馬の海馬錐体細胞ＣＡ１−ＣＡ３領域、また中脳の中脳水道腹側部などであった。これらの領域ではセンスプローブによる発色は検出されなかった。
【０１６３】
【発明の効果】
本発明のペプチドおよびそのＤＮＡ、本発明のウシＧＰＲ７およびそのＤＮＡ、および本発明のウシＧＰＲ８およびそのＤＮＡは、例えば、拒食症の予防・治療薬、食欲（摂食）増進剤などとして有用である。
さらに、本発明のペプチド等はＧＰＲ７アゴニストやアンタゴニストのスクリーニング等にも有用である。
【０１６４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配列を示す。
【図２】ヒト型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
【図３】マウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配列を示す。
【図４】マウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
【図５】ラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配列を示す。
【図６】ラット型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
【図７】ヒト型、ラット型およびマウス型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈの比較図を示す。一致するアミノ酸はボックスで囲む。また矢印は分泌シグナルの予想される切断部位を示す。
【図８】リガンド発現ベクターｐＡＫ−Ｓ６４および空の発現ベクター（ｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ）を発現させたＣＨＯ細胞の培養上清を、ＧＰＲ７ｃＤＮＡを挿入した発現プラスミドを一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培地にホルスコリン（ＦＳＫ）とともに添加し、リガンド刺激によるルシフェラーゼ活性の抑制を検出した結果を示す。
【図９】Ｓ６４を一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培養上清を、ＴＧＲ２６を一過性に発現させたＣＨＯ細胞の培地にＦＳＫと共に添加した際のルシフェラーゼ活性の抑制を検出した結果を示す。
【図１０】Ｓ６４の一過性発現細胞上清によるＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞特異的なｃＡＭＰ産生量の抑制反応を調べた結果を示す。
【図１１】Ｓ６４の一過性発現細胞上清によるｍｏｃｋＣＨＯのｃＡＭＰ産生量の抑制反応を調べた結果を示す。
【図１２】ＧＰＲ７リガンドｍＲＮＡのラットにおける組織分布およびその発現量をＲＴ−ＰＣＲ法によって求めた結果を示す。
【図１３】ウシ視床下部からの内因性ＧＰＲ７リガンドの最終精製のクロマトパターンを示す。最終精製段階の　μＲＰＣ　Ｃ２／Ｃ１８　ＳＣ　２．１／１０　のクロマトパタ−ンと各フラクションをヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に反応させ、ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定したｃＡＭＰ産生量を示す。クロマトのチャートは２１５ｎｍの吸光度とアセトニトリルの溶出濃度を示す。
【図１４】ウシ視床下部より精製した内因性ＧＰＲ７リガンドのＮ末端配列分析結果を示す。
【図１５】ウシ視床下部より精製した内因性ＧＰＲ７リガンドのＥＳＩＭＳスペクトル（上）とＭＳ／ＭＳスペクトル（下）を示す。
【図１６】３価分子イオンのズームスキャンスペクトルを示す。
【図１７】ＰＴＨ−５−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（５ＢｒＷ）およびＰＴＨ−６−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　（６ＢｒＷ）を２０アミノ酸ＰＴＨスタンダード（＊で示したピーク）分析と混合してスタンダード分析し、スタンダード５ＢｒＷが未知試料５ＢｒＷとピークが重なることを確認した結果を示す。
【図１８】ＰＴＨ−５−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（５ＢｒＷ）およびＰＴＨ−６−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　（６ＢｒＷ）を２０アミノ酸ＰＴＨスタンダード（＊で示したピーク）分析と混合してスタンダード分析し、スタンダード６ＢｒＷが未知試料である６ＢｒＷとピークが重なることを確認した結果を示す。
【図１９】ウシ視床下部から精製したＧＰＲ７ＬのＮ末端配列分析結果を示す。スタンダード分析と２サイクル目までのクロマトグラムサイクル１のアミノ酸は、６−ｂｒｏｍｏｔｒｙｐｔｏｐｈａｎのピークと一致している。
【図２０】ウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体ＨのＤＮＡ配列を示す。
【図２１】ウシ型ＧＰＲ７リガンド前駆体Ｈのアミノ酸配列を示す。
【図２２】ブロム化されていないＧＰＲ７Ｌまたは蒸留水をラット側脳室内に投与後２時間ごとの摂餌量の経時的変動を示す。図中のＶｅｈｉｃｌｅは蒸留水を、またｂＧＰＲ７Ｌ（Ｂｒ−）はブロム化されていないウシ型ＧＰＲ７リガンドを示す。
【図２３】内因性ＧＰＲ７リガンドのＦＴＭＳスペクトルを示す。
【図２４】ＧＰＲ７リガンドｍＲＮＡのヒトにおける組織分布および発現量をＲＴ−ＰＣＲ法によって求めた結果を示す。
【図２５】ラット型ＧＰＲ７（ラットＴＧＲ２６）ｍＲＮＡの組織分布および発現量をＲＴ−ＰＣＲ法によって求めた結果を示す。
【図２６】ウシ型ＧＰＲ７のｃＤＮＡ配列を示す。
【図２７】ウシ型ＧＰＲ７のアミノ酸配列を示す。
【図２８】ウシ型ＧＰＲ８のｃＤＮＡ配列を示す。
【図２９】ウシ型ＧＰＲ８アミノ酸配列を示す。
【図３０】ヒト型ＧＰＲ７リガンド発現ＣＨＯ細胞の培養上清からのヒト型ＧＰＲ７リガンドの最終精製結果を示す。最終精製段階のμＲＰＣ　Ｃ２／Ｃ１８　ＳＣ　２．１／１０　のクロマトパタ−ンと各フラクションをヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞反応させて得られた特異的な細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。クロマトのチャ−トは２１５ｎｍの吸光度とアセトニトリルの溶出濃度を示す。
【図３１】ヒト型ＧＰＲ７リガンド発現ＣＨＯ細胞の培養上清から精製したＧＰＲ７リガンドのＮ末端配列分析結果を示す。
【図３２】ヒト型ＧＰＲ７リガンド発現ＣＨＯ細胞の培養上清から精製したＧＰＲ７リガンドのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図３３】ヒト型ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いたスキャッチャード解析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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