(57)【要約】　　　（修正有）【課題】花粉の形成に関わる遺伝子ＫＯＭ及びそのプロモーターを提供する。【解決手段】花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質、より詳細には配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、それをコードする遺伝子ＫＯＭ、より詳細には特定の塩基配列を有する遺伝子、ＫＯＭ遺伝子のプロモーター、より詳細には特定の塩基配列を有するプロモーター、ＫＯＭ遺伝子を利用することにより花粉の外部形態及び性質を改変する方法、ＫＯＭプロモーターを用いて雄性不稔植物を作出する方法、及びこの方法により得られた形質転換体に関する。【選択図】　なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質であって、花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
シロイヌナズナ由来である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡであって、花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ｃ）及び（ｄ）から選択されるＤＮＡであって、花粉発生段階における小胞子母細胞において局所的に発現するプロモーター活性を有するＤＮＡからなるプロモーター。
（ｃ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項６】
シロイヌナズナ由来である請求項５に記載のプロモーター。
【請求項７】
請求項３〜６に記載の遺伝子若しくはプロモーターを構成するＤＮＡ又は当該ＤＮＡの一部、を含むベクター。
【請求項８】
ベクターが相同組み換えを行うためのベクターである請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
配列番号２又は３で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補配列を含むヌクレオチド。
【請求項１１】
花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用するものである請求項１０に記載のヌクレオチド。
【請求項１２】
花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用するものである請求項１０に記載のヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項３又は４に記載の遺伝子を利用して、花粉の外部形態及び性質を改変する方法。
【請求項１４】
請求項３又は４に記載の遺伝子の発現を抑制して、植物の有する花粉を雌しべに付着しにくい花粉へと改変する方法。
【請求項１５】
請求項３又は４に記載の遺伝子を過剰発現させて、植物の有する花粉を雌しべに付着しやすい花粉へと改変する方法。
【請求項１６】
請求項３又は４に記載の遺伝子を利用して、植物の有する花粉を花粉症を誘発しない花粉へと改変する方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１６に記載の方法により花粉の外部形態及び性質が改変した形質転換植物。
【請求項１８】
請求項５又は６に記載のプロモーターを用いて、花粉発生段階における小胞子母細胞において局所的に任意の遺伝子を発現させる方法。
【請求項１９】
任意の遺伝子が花粉発生を阻害する遺伝子である請求項１８に記載の方法であって、植物を雄性不稔にする効果を有する方法。
【請求項２０】
花粉発生を阻害する遺伝子が、ＲＮａｓｅをコードする遺伝子である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０に記載の方法により形質が改変した形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質、及びそれをコードする遺伝子、及びＫＯＭ遺伝子のプロモーターに関する。
また本発明は、ＫＯＭ遺伝子を利用して花粉の外部形態及び性質を改変する方法、ＫＯＭプロモーターを利用して植物を雄性不稔にする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物において、有性生殖という現象は大きな興味をもって研究されてきた。有性生殖に関する様々な研究から、受精が起こるまでの現象について多くの知見が得られている。まず、雄の配偶体を運ぶ花粉は、雌しべの柱頭に付着し花粉管を発芽させる。花粉管が雌性配偶体に到達し、そこで放出された精細胞の核が卵細胞の核と融合することにより受精がおこる。
植物の花粉は、表面に特徴的なパターンの模様をもつ。この花粉の模様は植物種によって非常に多様であり、花粉の模様によってその花粉をつくった植物の科や、時には種を同定することも可能である。花粉の外部形態が種によって非常に多様なのは、花粉が柱頭へ物理的に付着する際に、自種の花粉だけを効率よく付着させるための知恵だと考えられている。
花粉の発生は多くの植物で調べられており、形態学的な知見も蓄積している。近年は、透過型電子顕微鏡を用いた細胞レベルでの研究も行われており、発生段階で重要な現象も明らかになりつつある（Ｏｗｅｎ　ａｎｄ　Ｍａｌａｒｏｆｆ，　１９５５）。
しかしながら、花粉発生段階においてどのような分子がいつどこで働いているかという、分子レベルでの知見は殆ど得られていない。花粉の発生を分子レベルで理解するのに、突然変異体を用いた分子遺伝学的なアプローチは有効な手段となる。シロイヌナズナにおいて最初に報告された雄性不稔突然変異体は、ｍｓ１である（Ｖａｎ　Ｄｅｒ　Ｖｅｅｎ　ａｎｄ　Ｗｉｒｔｚ，　１９６８）。以来、多くのグループが雄性不稔突然変異体や花粉の発生に異常のみられる突然変異体の探索を行ってきた（総説、Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ，　１９９８）。しかしながら、雄性不稔突然変異体の原因遺伝子として現在までに報告されているものは数えるほどしかない。
【０００３】
花粉発生の分子遺伝学的な研究により得られる知見は、雄性不稔植物の作出方法の開発に利用できる。この方法により得られた雄性不稔植物は、一代雑種（Ｆ１）種子の生産に極めて有用なものである。
雑種種子から成長した雑種植物は、２つの遺伝的に異なる育成系統の支配による雑種強制効果（ヘテロシス）の利益を受ける。いわゆるＦ１品種と呼ばれるものである。この雑種種子のメリットは、雑種強制の発現により収量性、耐病性などの農業形質が優れたものとなること、単因子優性の農業形質の付与が容易なこと、均一性が高いこと、また、次世代で遺伝形質の分離が起こるため育成者の権利が守られることなどが挙げられる。
自己種子の混入のない雑種種子を産生するためには、他家受粉を確実に行わせ、自家受粉から防御するために、受粉制御の方法を実施しなければならない。受粉制御の方法としては、雄性器官を機械的に取り除く方法、人為的に交配する方法、花粉の成熟を阻害する化学物質を用いる方法、遺伝的雄性不稔性・細胞質遺伝的雄性不稔性を利用する方法などがある。この中でも遺伝的雄性不稔性を利用する方法がもっとも効果があるものである。特に、花粉制御に関する分子遺伝学的メカニズムを利用した雄性不稔植物の作出方法は、商業的な種子生産のためにより広範な関心を引くものである。
特開２０００−３００２７３号公報には、ＤＡＤ１遺伝子を利用した雄性不稔植物の作出方法が記載されている。ＤＡＤ１遺伝子は葯の開裂及び花粉の成熟を制御する遺伝子である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、花粉の外部形態に異常があり稔性が低下するシロイヌナズナのｋｏｍｐｅｉｔｏ突然変異体の原因遺伝子をクローニングすることを目的とする。また、ｋｏｍｐｅｉｔｏ突然変異体の原因遺伝子を利用して、花粉の外部形態及び性質を改変する方法、並びに雌しべに付着しにくい花粉を作出する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
シロイヌナズナのｋｏｍｐｅｉｔｏ突然変異体（以下ｋｏｍ変異体と略称する）は、花粉の花粉表面のエキシン層の形成が異常であり外部形態が野生型と異なる。ｋｏｍ変異体はＥＭＳ（エチルメタンスルホン酸）処理された種子から得られた、劣勢の一遺伝子座による突然変異である。花粉の外部形態を微分干渉顕微鏡及び走査型電子顕微鏡で観察した結果を図１に示す。野生型の花粉は表面に網目状の模様が観察された（図１−Ｂ）のに対し、ｋｏｍ変異体の花粉は表面の網目状の模様は観察されず、かわりに多数の小突起が観察された（図１−Ｄ）。また、ｋｏｍ変異体の雌しべの柱頭を観察すると、付着している花粉が野生型よりも減少していた。野生型とｋｏｍ変異体で鞘の中の種子の数を比較したところ、ｋｏｍ変異体では稔性は野生型の１９．２％に低下していることが分かった。
このｋｏｍ変異体の原因遺伝子を単離すれば、この遺伝子を利用して花粉の外部形態及び機能を改変することが可能となり、課題を解決できる。
【０００６】
遺伝子を単離する前に、花粉表面の模様の形成機構を理解しｋｏｍ変異体においてどの段階でどのような異常が見られるか明らかにするために次の実験を行った。すなわち、花粉の発生を追って切片を作製し、光学顕微鏡又は電子顕微鏡で観察した。また、この観察においてアニリンブルー染色を行い、カロースの形成を観察した。
その結果、ｋｏｍ変異体では減数分裂直前から減数分裂中にかけて、小胞子母細胞を包むカロース壁がほとんど観察されなかった。四分子期においてもカロース壁は著しく減少していた。また、四分子期には野生型の小胞子で見られる原形質膜の「波打ち」が見られず、膜の形態が乱れていた。その後表面に沈着するスポロポレニンも、野生型のような規則的なパターンではなく、ランダムな塊として沈着していた。このことから、花粉表面のエキシン層のパターン形成にはカロース壁や原形質膜を介したメカニズムが働くことが示唆された。
【０００７】
マップベースクローニング法によりｋｏｍ変異体の原因遺伝子ＫＯＭを同定し、染色体上の位置と配列を特定した。その結果を図２に示す。マップベースクローニング法とは、その名のとうり遺伝地図上に存在する目標遺伝子の位置を決定し、その近傍に存在するＤＮＡマーカーを利用して、遺伝子の候補ゲノム領域（塩基配列）を絞り込む手法である。
まず、各染色体上のＳＳＬＰマーカーを用いて突然変異形質との分離を調べた結果、ＫＯＭ遺伝子は１番染色体上にあることが分かった。次に詳細なマッピングを行うためにＣｏｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）株由来であるｋｏｍ突然変異株とＬｅｒ（Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ　ｅｒｅｃｔａ）株をかけあわせたＦ２植物より約１０００個体の組み換え体を選抜し、既存のＣＡＰＳマーカーおよびＳＳＬＰマーカーを用いてマッピングを行った。その結果、ＫＯＭ遺伝子はマーカーＡＤＨとマーカーＴ８Ｋ１４の間にあることが分かった。
この領域でＣｏｌ株とＬｅｒ株の塩基配列の違いを利用して更に多くのマーカーを作製した。これらのマーカーを用いたマッピングの結果、ＫＯＭ遺伝子はＢＡＣクローンＦ２８Ｋ１９上の特定の範囲（作製したマーカーＦ２８Ｋ１９−１とＦ２８Ｋ１９−３の間）に存在することが明らかとなった。
ＧＲＡＩＬを用いた予測により、上記の２つのマーカーの間にはＯＲＦが４個存在すると予想された。これらのＯＲＦについてＣｏｌ株とｋｏｍ突然変異株で塩基配列を全て決定したところ、１つのＯＲＦ（ＯＲＦ７）に塩基置換による変異が見つかった。さらに、上記の２つのマーカーではさまれた領域の全塩基配列をＣｏｌ株とｋｏｍで比較したが、変異はその一カ所のみであった。そこで、ＯＲＦ７がｋｏｍ原因遺伝子であると判断した。以下この遺伝子のことをＫＯＭ遺伝子と呼ぶ。
【０００８】
さらに、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲによりＫＯＭ　ｃＤＮＡの全長を決定した。ＫＯＭ遺伝子は全長が１５０５ｂｐであり、エクソンが６つ存在した。ｋｏｍ変異体のＫＯＭ　ｃＤＮＡを単離したところ、ｋｏｍ変異体では第５エクソンのスプライシングアクセプターサイトにおいて、塩基がＧからＡに変わっていた。この変異によりｋｏｍ変異体のＫＯＭ　ｃＤＮＡでは第５エクソンの開始がずれ、フレームシフトを起こしていた。
【０００９】
ＫＯＭ　ｃＤＮＡの塩基配列から、ＫＯＭタンパク質（ＫＯＭ遺伝子のコードするタンパク質）は３８５アミノ酸からなることが推定された。このアミノ酸配列に対してドメイン検索をＳＭＡＲＴで、また他のタンパク質との相同性の検索をＢＬＡＳＴを用いて行った。ＫＯＭタンパク質は膜貫通ドメインを７つもつと推測された。また、ショウジョウバエのＲｈｏｍｂｏｉｄ−１タンパク質と２４％の相同性があった。Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１はショウジョウバエのＥＧＦシグナル伝達系において、リガンド分子であるＳｐｉｔｚを切断するセリンプロテアーゼである（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，２００１；　Ｕｒｂａｎ　ｅｔ　ａｌ．２００１）。Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１のプロテアーゼ活性に必要なアミノ酸として６つのアミノ酸が知られているが（Ｕｒｂａｎ　ｅｔ　ａｌ．２００１）、ＫＯＭでもそのうち大部分は保存していた。
【００１０】
ＫＯＭ遺伝子の発現している部位を調べるために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、ＫＯＭ遺伝子の発現は鞘・葉・根では見られず、花においてのみ発現が見られた。
さらに、ＫＯＭ遺伝子の発現している細胞と時期を詳細に調べるため、インサイチュハイブリダイゼーション（ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。この結果、ＫＯＭ遺伝子は減数分裂直前または減数分裂中の小胞子母細胞で特異的に発現していることが分かった。
ｋｏｍ変異体では減数分裂直前から減数分裂中にかけて、小胞子母細胞を包むカロース壁がほとんど観察されなかったことと合わせて考えると、ＫＯＭ遺伝子が花粉発生段階におけるカロース合成制御に関わるものであることが明らかとなった。この遺伝子を利用すれば、花粉の外部形態及び性質を改変させることができる。
【００１１】
さらに上記の発現解析から、ＫＯＭ遺伝子のプロモーターは減数分裂直前または減数分裂中の小胞子母細胞で特異的に発現するプロモーター活性を持つ、極めて有用なプロモーターであることが明らかとなった。相補性検定により、ＫＯＭ遺伝子上流のプロモーター領域を特定した。
このプロモーターを用いれば、花粉の発生を阻害する遺伝子を小胞子母細胞でのみ発現させて、他の組織に悪影響を及ぼすことなく植物を雄性不稔にすることが可能となる。
【００１２】
すなわち本発明は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質であって、花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質に関する。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１３】
また、本発明の遺伝子は、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡであって、花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００１４】
また、本発明のプロモーターは、以下の（ｃ）及び（ｄ）から選択されるＤＮＡであって、花粉発生段階における小胞子母細胞において局所的に発現するプロモーター活性を有するＤＮＡからなるプロモーターである。
（ｃ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００１５】
本発明は、ＫＯＭ遺伝子又はＫＯＭプロモーターを含むベクター、及びそのベクターにより形質転換された形質転換体を提供する。またＫＯＭ遺伝子及びプロモーターの塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補配列を含むヌクレオチドを提供する。
本発明は、ＫＯＭ遺伝子を利用して、花粉の外部形態及び性質を改変する方法を提供する。また、ＫＯＭ遺伝子の発現を抑制して植物の有する花粉を雌しべに付着しにくい花粉へと改変する方法、ＫＯＭ遺伝子を過剰発現させて植物の有する花粉を雌しべに付着しにくい花粉へと改変する方法、ＫＯＭ遺伝子を利用して植物の有する花粉を花粉症を誘発しない花粉へと改変する方法を提供する。さらにこの方法により得られた形質転換体を提供する。
本発明は、ＫＯＭプロモーターを利用して、任意の遺伝子を花粉発生段階における小胞子母細胞において局所的に発現させる方法に関する。また、ＲＮａｓｅなどをＫＯＭプロモーターを用いて発現させて植物を雄性不稔にさせる方法、及びこれらの方法により得られた形質転換植物に関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子ＫＯＭは、花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質をコードする遺伝子である。ＫＯＭ遺伝子の発現を抑制することにより、花粉の外部形態を改変して雌しべに付着しにくくさせることができる。そして、植物の稔性を著しく低下させることができる。
本発明のＫＯＭプロモーターは、花粉発生段階における小胞子母細胞にて局所的に働くプロモーターである。ＫＯＭプロモーターを用いて、花粉の発生を阻害する遺伝子を局時的かつ局所的に発現させて、植物を雄性不稔にすることが可能となる。
【００１７】
（Ｉ）本発明のタンパク質、すなわち第１発明及び第２発明のタンパク質は、花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質であり、後記配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
また、この他に後記配列表の配列番号１で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、花粉発生段階におけるカロース合成を制御する機能が失われない程度であればよく、通常１〜約７７個、好ましくは１〜約３９個である。このようなタンパク質は、配列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
第２発明のタンパク質は、第１発明のタンパク質のうちシロイヌナズナ由来のものである。
【００１８】
本発明のタンパク質は、それをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、ＫＯＭをコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、酵母を用いることが好ましい。
本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを得る方法は、下記の第２発明及び第３発明の項に記載する。
【００１９】
（ＩＩ）本発明の遺伝子、すなわち第３発明及び第４発明の遺伝子は、花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、後記配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するものが挙げられる。
また、この他に後記配列表の配列番号２で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質が花粉発生段階においてカロース合成を制御する機能を有するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号２で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
【００２０】
本発明の遺伝子は、適当な植物の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。植物としては本発明の遺伝子を有するものであれば特に限定されず、例えば、アブラナ科、イネ科、キク科、アカザ科の植物などを挙げることができる。
遺伝子のスクリーニング及び単離は、ホモロジークローニング法などにより好適に実施できる。
例えば、減数分裂段階のコムギの花芽組織を遺伝子源として用い、これからｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を調製する。これからｃＤＮＡライブラリーを構築し、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）　データベースの検索によって得られるＫＯＭ類似配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ／ＤＤＢＪ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＢＪ２１２１２２）　に相当するプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって花粉発生段階におけるカロース合成を制御しているタンパク質のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
得られたｃＤＮＡについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定することができる
【００２１】
得られたＫＯＭ遺伝子のｃＤＮＡから調製した、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を用いて、インビトロ翻訳法［Ｈｅｄｉｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ、第１０６４巻、３６０項、１９９１年］により、ＫＯＭタンパク質を合成し、電気泳動によりタンパク質のサイズ、糖付加の有無等を検討することができる。
【００２２】
得られたＫＯＭ遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号２に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することができる。
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．著、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓより１９８９に発刊］に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
【００２３】
本発明の遺伝子としては、上記のｃＤＮＡの配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｍａｒｋ，　Ｄ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２項（１９８４年）］　等によって実施できる。
【００２４】
あるＤＮＡが花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質をコードするかどうかは相補性検定により判断できる。すなわち、そのＤＮＡを内在ＫＯＭ遺伝子の発現が抑制された植物（例えばシロイヌナズナのｋｏｍ変異体）に導入し、それにより花粉の外部形態が回復するかどうかを調べることにより判断できる。
【００２５】
（ＩＩＩ）本発明のプロモーター、すなわち第５発明及び第６発明のプロモーターは、花粉発生段階における小胞子母細胞で発現するプロモーター活性を有するものであり、後記配列表の配列番号３に示される塩基配列を有するものが挙げられる。また、この他に後記配列表の配列番号２で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。
また、本発明のプロモーターは、適当な植物を遺伝子源として用いて単離取得できる。単離する方法としては、上記のＫＯＭ遺伝子の単離方法により様々な生物種のＫＯＭ遺伝子を単離すれば、その上流域をＫＯＭプロモーターとして得ることができる。
植物としては本発明のプロモーターを有するものであれば特に限定されず、例えば、アブラナ科、イネ科、キク科、アカザ科の植物などを挙げることができる。
【００２６】
あるＤＮＡが、花粉発生段階における小胞子母細胞で局所的に発現するプロモーター活性を持つかどうかは、例えば次の方法により確かめることができる。
すなわち、解析したいＤＮＡとＧＵＳ等のレポーター遺伝子を連結したコンストラクトを作製し、これを適当な植物に導入する。次にレポーター遺伝子による発色などが、花粉発生段階において小胞子母細胞において局所的に認めらるかどうかで判断できる。
【００２７】
（ＩＶ）第７発明は、本発明の遺伝子若しくはプロモーター、又はその一部を含むベクターを提供する。第８発明は、ＫＯＭ遺伝子相同組み換えのためのベクターを提供する。第９発明は、これらのベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
これらの発明で用いられるベクターは、宿主及び目的に応じて選択することができ、市販のもの又はそれを改良したものを使用することが出来る。形質転換法は宿主及びベクターに応じて好適な方法を選択することが出来る。
【００２８】
第８発明のＫＯＭ遺伝子相同組み換えのためのベクターは、例えばＫＯＭ遺伝子が破壊された雄性不稔植物の作製に用いることができる。本発明のＤＮＡまたはその一部を薬剤耐性遺伝子などのマーカーと結合した後ベクターに組み込み、ＫＯＭ遺伝子を破壊するためのベクターとすることができる。ベクター及び宿主への形質転換法は、宿主に応じて適したものが選択される。マーカーとしてはカナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられ、形質転換方法としてはエレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。
相同組み換えを行うための本発明のＤＮＡとは、ＫＯＭタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち細胞内で、ゲノム上のＫＯＭ遺伝子と相同組み換えを起こすことができ、それによってＫＯＭ遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性があげられる。また、ＫＯＭ遺伝子のエクソン部分と相同性を有するＤＮＡを必ず含む必要はなく、ＫＯＭのゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡであればよい。また相同組み換えを行うためのＤＮＡは本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
【００２９】
（Ｖ）第１０発明、第１１発明、第１２発明は、配列番号２又は３で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上、好ましくは２０塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを提供するものである。
本発明のヌクレオチドは、花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用することができ、また、当該タンパク質をコードする遺伝子やそれと相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子などを入手する際のプライマーとして使用することができ、さらに、そのアンチセンス鎖などにより花粉発生段階におけるカロース合成を制御するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用することもできる。
【００３０】
（ＶＩ）第１３発明、第１４発明、第１５発明、第１６発明、第１７発明は、本発明の遺伝子ＫＯＭを利用して植物の有する花粉の外部形態及び性質を改変し、雌しべに付着しにくい花粉や、雌しべに付着しやすい花粉、花粉症を誘発しない花粉を作出する方法を提供する。また、この方法により花粉の外部形態及び性質が改変された形質転換植物を提供する。
これらの方法は、植物の有するＫＯＭ遺伝子の発現を抑制させるか過剰発現させることにより可能となる。
植物の有するＫＯＭ遺伝子の発現を抑制する方法としては、例えば以下のアンチセンス法、ジーンターゲッティング法、遺伝子破壊型タギング法などを利用する方法が挙げられる。
【００３１】
アンチセンス法による本発明の方法は、適当なプロモーターとその下流に配置された逆向きのＫＯＭ遺伝子（アンチセンスＤＮＡ）とを含むベクターを構築し、それを植物に導入することによりＫＯＭ遺伝子の発現を抑制する方法である。ここで用いるプロモーターとしては小胞子母細胞の減数分裂段階でプロモーター活性を有するものが好ましいが、ＣａＭＶ３５Ｓなどの恒常的・全組織的プロモーター活性を有するものでも可能である。
【００３２】
ジーンターゲッティング法による本発明の方法は、相同組み換えにより本発明の遺伝子ＫＯＭの一部に他のＤＮＡを挿入し、ＫＯＭ遺伝子をノックアウトすることによるＫＯＭ遺伝子の発現を抑制する方法である。この方法には、第８発明のベクターが利用できる。
また、このような特定の遺伝子をノックアウトする方法としては、例えば、Ｋｅｍｐｉｎらの方法（Ｋｅｍｐｉｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　３８９：　８０２−８０３．　１９９７）に従って行うことができる。すなわち、ＫＯＭ遺伝子からなるＤＮＡ内にカナマイシン耐性遺伝子などを挿入したターゲッティングベクターを作製し、これを植物に導入し、相同組み換えを起こさせ、植物の有するＫＯＭ遺伝子をノックアウトする。相同組み換えが起こったかどうかは、ＰＣＲやサザンハイブリダイゼーションにより確認することが出来る。
【００３３】
遺伝子破壊型タギング法による本発明の方法は、Ｔ−ＤＮＡやトランスポゾンをゲノム中にランダムに挿入させ、ＰＣＲを利用してＫＯＭ遺伝子破壊株をスクリーニングする方法である。
Ｔ−ＤＮＡタギングに用いるベクターは、特に限定されず、例えば、ｐＢＩＨ１−ＩＧを使用することができる。また、トランスポゾンタギングに使用するトランスポゾンについては、特に限定されず、例えばＡｃ−Ｄｓ系等のＤＮＡ型トランスポゾンや、レトロトランスポゾンを使用することが出来る。
【００３４】
ＫＯＭ遺伝子を過剰発現させる方法としては、適当なプロモーターとその下流に配置されたＫＯＭ遺伝子とを含むベクターを構築し、それを植物に導入することによりＫＯＭ遺伝子を過剰発現させる方法が挙げれる。プロモーターとしては特に限定されずそれほど強いプロモーター活性を有する必要はないが、ＣａＭＶ３５Ｓなどの強力なプロモーターであってももちろんよい。
【００３５】
第１４発明は、上記の記載の方法等によりＫＯＭ遺伝子の発現を抑制することによって、植物の有する花粉を雌しべに付着しにくい花粉に改変することを可能にするものである。
この方法により得れらた雄性不稔性形質転換植物は、自家受粉する能力が著しく低下している。このため、正常な花粉を有する他の植物個体による他家受粉を促すことができ、得られる種子は雑種強勢（ヘテロシス）の利益を受けることができる。
また、この方法により得られた雄性不稔性形質転換植物の花粉は、送粉昆虫などにより飛散しても他の植物個体に受粉する能力が著しく低下している。このため、遺伝子組み換え作物などのトランスジーンを環境中の植物に拡散させることを防ぐことができる。
【００３６】
（ＶＩＩ）第１８発明、第１９発明、第２０発明、第２１発明は、本発明のプロモーターを用いて、任意の遺伝子を花粉発生段階における小胞子母細胞で局所的に発現させる方法、本発明のプロモーターで花粉発生を阻害する遺伝子を局所的に発現させて植物を雄性不稔にする方法、本発明のプロモーターでＲＮａｓｅを局所的に発現させて雄性不稔にする方法、及びこれらの方法により得られた形質転換植物を提供する。
本発明のプロモーターを用いて任意の遺伝子を花粉発生段階における小胞子母細胞で局所的に発現させる方法としては、本発明のプロモーターと任意の遺伝子を連結したコンストラクトを作製し、これを適当なベクターに組み込んで形質転換を行うことにより可能となる。
ベクター及び宿主への形質転換法は、宿主に応じて適したものが選択される。例えばベクターとしてバイナリベクターｐＰＺＰ２１１（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）を用い、アグロバクテリウムＡＳＥ系統に導入し、減圧浸潤法を用いて形質転換することが可能である。
【００３７】
第２０発明の、本発明のプロモーターを用いて花粉発生を阻害する遺伝子を局所的に発現させて植物を雄性不稔にする方法としては、例えば次の方法により可能となる。すなわち、花粉発生を阻害する遺伝子、例えばＲＮａｓｅや細菌毒素をコードする遺伝子などを前段落の方法を用いて局所的に発現させることにより可能となる。
この方法は、花粉発生を阻害する遺伝子が花粉発生段階における小胞子母細胞において局所的に発現するため、他の組織に悪影響を及ぼすことなく植物を雄性不稔にすることを可能とする優れた方法であり、また汎用性があるものである。この方法により得られた雄性不稔植物は自家受粉することができないため、Ｆ１品種の生産に極めて有用である。
【００３８】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１：　ｋｏｍ変異体の観察
（１）ｋｏｍ変異体の探索
ｋｏｍ突然変異体は、シロイヌナズナＣｏｌ株をＥＭＳ処理した個体のＦ２個体の中から得られた。以下の解析には、野生型Ｃｏｌに２回戻し交配をしたｋｏｍ突然変異体を用いた。
ｋｏｍの鞘は野生型と比べて短く、鞘に含まれる種子も少ない。ｋｏｍ植物では野生型に比べて稔性がどれだけ低下しているか調べるために、野生型とｋｏｍで鞘の中の種子の数を比較した（表１）。この結果、ｋｏｍでは稔性は野生型の１９．２％に低下していることが分かった。また、１つの鞘当たりにできる種子の数のばらつきは、野生型より大きかった（表１）。
以上の結果を以下の表１に示した。
【００４０】
2004024108.tif 000002
【００４１】
野生型との戻し交配の結果、野生型とｋｏｍ突然変異体は　５３：１５の比で分離した。つまり、劣性の１遺伝子座の胞子体型突然変異体であることが分かった。ｋｏｍ植物において配偶体には異常がないことを顕微鏡観察でも確認した。まず、花を透明化して雌しべ内の胚珠を観察した。また、ＤＡＰＩ染色により花粉の核を、アニリンブルー染色により花粉管を観察した。その結果、花粉の核や、雌しべ内での花粉管の伸長には異常は見られなかった。また、ｋｏｍにおいても雌性配偶体の発生は正常であり、花粉管が胚珠に到達した場合には、受精も正常に行われていることが分かった。また、このことから、ｋｏｍにおける稔性の低下は配偶体や胚の異常によるものではないことが示唆された。
【００４２】
ｋｏｍにおける形態的な異常は、花粉の表層のみに観察された。その結果を図１に示す。
走査型電子顕微鏡を用いて観察すると、野生型の花粉は表面に網目状の模様が観察された（図１Ｂ）。それに対し、ｋｏｍの花粉は表面に網目状の模様は観察されず、かわりもこ多数の小突起が観察された（図１Ｄ）。このことから、ＫＯＭ遺伝子は正常な花粉表面の形態形成に必要であることが示唆された。また、ｋｏｍ植物体の雌しべの柱頭を観察すると、付着している花粉が野生型よりも減少していた。
【００４３】
（２）光学顕微鏡による詳細な観察。
ｋｏｍ花粉では花粉の外部形態に異常が見られた。花粉表面の模様の形成機構を理解し、ｋｏｍ突然変異体においてどの段階でどのような異常が見られるか明らかにするために、テクノビット樹脂に包理して切片を作製し、花粉の発生を追って観察した。突然変異体の観察をするにあたり、まず、野生型の花粉の発生を詳細に観察し、ステージを定めた。発生段階のステージ分けは、既に発表されている研究を参考にし、本研究から得られた知見を併せてまとめた。各ステージの特徴を、以下に記す。
なお、本研究では小胞子母細胞の細胞壁を、「始原細胞壁（Ｉｎｉｔｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｗａｌｌ）」と呼び、他の細胞の細胞壁とは区別する。また、花粉壁のうち、インティン層のみを細胞壁として定義する。カロース壁、エキシン層は細胞壁に含めず、独立の層として定義する。
【００４４】
ステージ１：Ｐｒｅｍｅｉｏｓｉｓ１
ステージ１は、小胞子母細胞が形成されてから、小胞子母細胞の原形質膜の外側にカロース壁が形成されるまでの期間である。
小胞子母細胞は、葯の中で胞原細胞から体細胞分裂により生じる。小胞子母細胞は、４層の細胞層に包まれている。すなわち、小胞子母細胞に近い順にタペート組織、中間層、内被、そして表皮細胞である。タペート組織の役割は、小胞子母細胞に栄養分を供給することだと言われている（Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ，１９９４）。
ステージ１では、小胞子母細胞の原形質膜は、細胞壁（始原細胞壁）と接していた。アニリンブルー染色の結果、このステージでは原形質膜と細胞壁の間にカロースは存在しないことが分かった。
このステージでは、タペート細胞は一核である。
ステージ２：Ｐｒｅｍｅｉｏｓｉｓ２
ステージ２は、小胞子母細胞の原形質膜の外側にカロース壁が形成されてから減数分裂が始まるまでの間である。
ステージ２の小胞子母細胞の細胞壁と原形質膜の間には、隙間が観察される。アニリンブルー染色により、この隙間にはカロースが存在することが確認された。このステージで見られるカロース壁は、後のステージでみられるものよりも厚さは薄い。また、始原細胞壁から離れた細胞質の形は、後のステージと比べるとより多角形で、不規則な形をしている。
このステージで、タペート組織は有糸分裂を開始する。
ステージ３：Ｍｅｉｏｓｉｓ１
ステージ３は、小胞子母細胞が減数分裂の第一分裂を開始してから第二分裂に入るまでの期間である。
減数分裂の第一分裂の結果、このステージの小胞子母細胞には核が二つ観察される。細胞質の形は、ステージ２と比べてより円形に近い形になる。このステージの細胞質も、カロース壁に覆われている。このステージにはさらなるカロースの合成が起こるため、カロース壁は前のステージよりも厚さを増している。また細胞質には、多数の小胞が観察される。
ステージ３のタペート細胞は、有糸分裂を完了させる。この有糸分裂は細胞質の分裂を伴わないため、タペート細胞は核を２つもった細胞となる。この段階では、タペート細胞どうしはまだ接しており、細胞の間に隙間は観察されない。
【００４５】
ステージ４：Ｍｅｉｏｓｉｓ２
ステージ４は、小胞子母細胞が減数分裂の第二分裂を開始してから細胞質分裂を行うまでの期間である。
核の分裂は細胞質分裂よりも先に起こるため、小胞子母細胞は核を４つ持つ。カロース壁は、引き続き小胞子母細胞の原形質膜と始原細胞壁の間に存在し、リング状の形をしているのが観察される。
ステージ４になると、タペート細胞の細胞壁が分解され始める。タペート細胞どうしの間に隙間が観察されるようになる。
ステージ５：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ
ステージ５は細胞質分裂期である。
まず、小胞子母細胞の核は細胞質の端の方へと移動している。続いて、小胞子母細胞において細胞質分裂が起こる。小胞子母細胞の細胞質は外側からくびれるようにして分かれる。この細胞質分裂時には、小胞子母細胞を取り囲んでいたカロース壁が、小胞子と小胞子の間に入る。この細胞質のくびれた形は、ｃｌｅａｖａｇｅｆｕｒｒｏｗと呼ばれている。このステージでは、更なるカロースの蓄積が見られる。ｃｌｅａｖａｇｅ　ｆｕｒｒｏｗに沿って内側へとカロース壁が進入している様子が観察される。
タペート細胞の細胞壁は、引き続き分解を受ける。
ステージ　６：Ｔｅｔｒａｄ１
ステージ６は、細胞質分裂の終了後から始原細胞壁の分解が始まるまでの期間である。小胞子母細胞の細胞質分裂は終了し、４つの小胞子が形成される。各々の小胞子は半数体の核を持つ。このステージでは、細胞質分裂により１つの小胞子母細胞から生じた４つの小胞子はカロース壁に包まれている。そのため、四分子（Ｔｅｔｒａｄ）と呼ばれている。
小胞子の原形質膜は規則的なパターンで波打つような形態をとる（Ｐａｘｏｎ‐Ｓｏｗｄｅｒｓ　ｅｔ　ａ１．，２００１）。この原形質膜の形態を、「波打ち」と定義する。小胞子はプライムエキシンと呼ばれる物質を分泌し、小胞子の原形質膜の外側にはプライムエキシンの層が形成し始める。カロース壁の、小胞子に面した側には電子線により濃く見える物質の層が見られる（図４Ｂ、矢尻。透過型電子顕微鏡を用いた観察については、実施例２に詳しく述べる）。
また、このステージにはエキシン層の元となる物質（スポロポレニンと呼ばれている）が小胞子の表面に沈着する（図４Ｃ、実施例２に詳しく述べる）。スポロポレニンはタペート細胞から分泌されるとされている。
【００４６】
ステージ　７：Ｔｅｔｒａｄ２
ステージ７は、始原細胞壁の分解が始まってからカロースの分解が完了するまでの期間である。
このステージでは四分子の分離が始まる。カロース壁の分解に先立ち、まず、始原細胞壁が分解される。始原細胞壁の分解により、各々の四分子を分けていたカロース壁どうしは融合する。ついでカロース壁の分解が起こる。タペート細胞から分泌されたカラーゼにより、カロースは分解されることが知られている。
小胞子の原形質膜の突出した場所にはスポロポレニンが沈着し、柱状のテクタム構造をとりはじめる。
タペート細胞では、小胞体が発達し、幾層もの層状の構造として観察される。カラーゼの分泌には小胞体の層状化が必要であることが示唆されている（Ｆｅｉ　ｅｔ
ａｌ．，１９９９）。タペート細胞の細胞壁は、完全に分解される。
ステージ８：Ｒｅｌｅａｓｅｄ　Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ１
ステージ８は、カロースが分解された時点より始まる。
このステージの小胞子をアニリンブルーで染色しても、カロースはまったく観察されない。小胞子は遊離の状態で約中に存在する。このステージの小胞子の形は、後のステージと比べてより多角形をしている。表面のエキシン層はあまり発達しておらず、光学顕微鏡による観察ではほとんど確認することができない。成熟した花粉は三細胞からなるが．このステージでは小胞子は一細胞である。
タペート組織には多数の小胞が観察される。タペート細胞からはエンドサイトーシスにより盛んに物質が分泌されており、細胞の表面はスポンジ状の形態をとることが知られている。
ステージ９：Ｒｅｌｅａｓｅｄ　Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ２
ステージ９では、小胞子内に多数の液胞が観察される。また、表面のエキシン層はその厚さを増し、光学顕微鏡による観察でもはっきりと確認できるようになる。エキシン層と原形質膜の間には、インティンと呼ばれる細胞壁に相当する層が形成されはじめる。
タペート細胞では、層状の小胞体が観察される。
【００４７】
ステージ１０：Ｖａｃｕｏｌａｔｅｄ　ＭｉｃｒｏｓＰｏｒｅ
ステージ１０は、小胞子の中に見られた多数の液胞がひとつにまとまる時期である。
このステージでは、液胞は細胞の大部分を占める。液胞の発達に伴い、小胞子内部の核は細胞質の端、すなわち細胞の表面に近いところに移動する。
タペート細胞の状態には、前のステージと大きな違いは観察されない。
ステージ１１：Ｂｉｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｏｌｌｅｎ　Ｇｒａｉｎｓ１
ステージ１１は、小胞子の核が有糸分裂を行い二細胞になる時期である。
細胞の端に移動した核は、そこで最初の有糸分裂を行い、二核になる。この有糸分裂は非対称であり、小胞子の細胞質の大部分を受け継ぎ大きな液胞を含む細胞と、小さな細胞とに分かれる。大きな細胞は栄養細胞と呼ばれる。小さな細胞は精細胞と呼ばれ、このステージでは栄養細胞の表面に存在する。小胞子は、この有糸分裂により二細胞になると、花粉と呼ばれる。インティンは厚みを増す。エキシン層は、このステージ前後に完成する。
タペート細胞では分解が進み、このステージではその核は観察されなくなる。
ステージ１２：Ｂｉｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｏｌｌｅｎ　Ｇｒａｉｎｓ２
ステージ１２では、精細胞が栄養細胞の細胞壁から離れ、栄養細胞の細胞質中へと移動する。その結果、精細胞は栄養細胞の中に入れ子状になって存在する。このステージ前後に、インティンは完成するとされる。
タペート細胞からは、物質が盛んに分泌される。
【００４８】
ステージ１３：Ｓｅｃｏｎｄ　Ｍｉｔｏｔｉｃ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
シロイヌナズナにおいては、精細胞は花粉が成熟する前にもう一度有糸分裂を行い、二つの精細胞となる。このステージでは精細胞の有糸分裂が行われる。栄養細胞内には、多くの液胞が観察される。
タペート細胞はほとんど完全に分解される。また、中間層もほとんど完全に分解され、非常に薄い細胞として観察される。また、内被の細胞壁が厚みを増す。
ステージ１４：Ｍａｔｕｒｅ　Ｐｏｌｌｅｎ　Ｇｒａｉｎｓ
成熟した花粉には、エキシン層の間に物質が見られる。これらの物質はタペート細胞から分泌されることが知られており、粘着物質層と呼ばれる層を構成する。また、花粉内には多くの貯蔵体が見られる。
タペート細胞と中間層は完全に分解される。
【００４９】
野生型のカロースについてまとめると、以下のとおりである。
（イ−１）減数分裂直前から減数分裂終了までの段階（ステージ２から４）において、原形質膜と始原細胞壁との間にカロース壁が見られた。
（イ−２）四分子期（ステージ６から７）において、始原細胞壁と四分子の間には前のステージから引き続きカロースが見られた。
（イ−３）四分子期（ステージ６から７）において、小胞子と小胞子の間には厚いカロース壁が存在していた。
【００５０】
次に、ｋｏｍの茎頂を固定し、テクノビット樹脂に包理して切片を作製し、ｋｏｍ花粉の発生をステージを追って観察した。花粉のステージは、前節で記した野生型花粉のステージを用いた。
また、各ステージを通して、ｋｏｍのタペ一ト細胞は野生型とは変わりは見られなかった。そのため、タペート細胞の状態も、ｋｏｍにおいて花粉のステージを決めるのに用いることができた。
【００５１】
ｋｏｍでは以下の点に異常が見られた。
（イ‐１）減数分裂直前から減数分裂終了までの段階（ステージ２から４）において、原形質膜と始原細胞壁との間にカロースが見られなかった。
（イ‐２）同じ部分は四分子期（ステージ６から７）においてカロースがごくわずかにしか見られず、両者はほとんど接していた。
（イ‐３）四分子期（ステージ６から７）において、小胞子と小胞子の間には野生型よりも薄いカロース壁が存在していた。
（ロ）遊離後の小胞子（ステージ８以降）において、花粉表面のエキシン層の形態に異常が見られた。
【００５２】
実施例２：　透過型電子顕微鏡を用いたｋｏｍ変異株の観察。
光学顕微鏡を用いた観察により、ｋｏｍの形態学的な異常は、カロース壁やエキシン層にあることがわかった。花粉表面の形態形成をより詳細に調べるために、透過型電子顕微鏡を用いて花粉の発生を観察した。植物を外部から観察して花粉がどのステージにあるか知ることは困難であるため、一部のステージでは透過型電子顕微鏡による観察はできなかった。
【００５３】
（１）透過型電子顕微鏡による観察方法
Ｃｏｌまたはｋｏｍの茎頂全体を採取し、１ｍｌの固定液（４％パラホルムアルデヒド、１％グルタルアルデヒドを含む５０ｍＭカコジル酸緩衝液）を用いて固定した。試料は一時間脱気した後、室温で１１時間放置した。
次にｌｍｌの５０ｍＭカコジル酸緩衝液で２回洗った後、１％オスミウム酸水溶液を含む５０ｍＭカコジル酸緩衝液ｌｍｌで４℃に３時間置き、後固定した。ｌｍｌの５０ｍＭカコジル酸緩衝液で２回、ｌｍｌの蒸留水で−回洗った後、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、１００％のエタノールで１５分間ずつ室温で置換した。ｌ００％のエタノールで１５分間、２回置換した後、１００％のエタノールで４℃に−晩静置した。次に、５％、１０％、１５％、２０％、３０％のＳｐｕｒｒ’ｓ　ｒｅｓｉｎを含むプロピレンオキザイドに室温でそれぞれ１０分間おいた。ついで５０％で３０分間、８０％で１時間静置し、１００％のＳｐｕｒｒ’ｓ　ｒｅｓｉｎに液を置換し４℃で一晩静置した。
長さ約０．５ｍｍ以下の蕾を選び、ピンセットを用いてＯｌｙｍｐｕｓ　ＳＺＨ実体顕微鏡下で葯を取り出した。葯を１つずつＢＥＥＭ社のＢＥＥＭカプセルに入れ、Ｓｐｕｒｒ’ｓ　ｒｅｓｉｎに包埋し、ＥＹＥＬＡ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｖｅｎ　ＭＨＳ２０００を用いて７０℃で３日間重合させた。重合した試料はフェザー社の両刃または片刃のかみそりを用いてトリミングした。トリミングした試料はグラスナイフを用いて、ＬＫＢ８８００　ＵＬＴＲＯＴＯＭＥＩＩＩでｌｍｍの切片をつくり、トルイジンブルー染色し光学顕微鏡の観察に用いた。また、ＤＩＡＴＯＭＥ社のダイヤモンドナイフを用いて６０−８０ｎｍの超薄切片を作製し、透過型電子顕微鏡の観察に用いた。
超薄切片は、０．５％酢酸ウランで３０分、クエン酸鉛で５分間染色し、日本電子ＪＳＭ−１００ＳＸ透過型電子顕微鏡で８０ｋＶの電圧で観察した。
透過型電子顕微鏡の写真は、Ｆｕｊｉ　Ｆｉｌｍ　ＦＧフィルムで現像し、ＧＥＫＫＯ　ＶＲ２印画紙に焼き付けた。現像にはＫＯＤＡＫ　Ｄ−１９現像液を、停止には酢酸の希釈液を、定着にはＦｕｊｉ　ＳＵＰＥＲＦＵＪＩＩＦＩＸ定着液を用いた。
【００５４】
（２）野生型とｋｏｍ変異体での形態学的な違いの観察
ステージ１：
ステージ１の小胞子母細胞には、野生型とｋｏｍで形態学的な違いは観察されなかった（図３Ａ、Ｂ）。
ステージ２：
減数分裂の直前になると、野生型の小胞子母細胞では原形質膜と細胞壁（始原細胞壁）の間に隙間が見られるようになった。その隙間にはカロースが存在する。透過型電子顕微鏡による観察でも、ステージ２の野生型の小胞子母細胞では、原形質膜と始原細胞壁の間にカロースが観察された（図３Ｅ）。ｋｏｍでも、このステージでは原形質膜と始原細胞壁の間に隙間が観察された。しかしながら、この領域にはカロースは観察されなかった（図３Ｆ）。また、ｋｏｍの原形質膜の形態は、野生型よりも不規則な形態であった。
ステージ６：
四分子期の初期には、野生型では各小胞子はカロース壁に覆われている。透過型電子顕微鏡を用いた観察でも、四分子を隔てるようにカロース壁が観察された（図４）。それに対し、ｋｏｍではカロース壁は野生型ほど厚くなく、密度も低かった。また、始原細胞壁と小胞子の間にはｋｏｍではカロースがほとんど確認されず、小胞子と始原細胞壁はほとんど接していた。
このステージでは、原形質膜とカロース壁の間には電子密度の高い物質が存在していた（図４Ｂ）。ｋｏｍでもその物質は観察されたが、野生型のように一様に分布してはいなかった（図４Ｅ）。
また、この時期には原形質膜とカロース壁の間にプライムエキシンと呼ばれる物質が観察された（図４Ｂ、ＰＭ）。プライムエキシンの存在するところでは原形質膜は内側に陥入し、その結果原形質膜は規則的な波打つようなパターンになっていた（図４Ｂ）。それに対し、ｋｏｍでもプライムエキシンと思われる物質は見られたが（図４Ｅ）、原形質膜の形態は野生型よりも不規則であり、波打つようなパターンは明確には形成されていなかった（図４Ｅ）。
野生型では、原形質膜の突出した部分には電子密度の高い物質が沈着しているのが観察された（図４Ｃ）。この物質は、スポロポレニンだとされている（Ｏｗｅｎｅｔ　ａｌ．，１９９５）。ｋｏｍでもスポロポレニンの沈着は観察された（図４Ｆ）。
ステージ７：
四分子期の後期には、始原細胞壁とカロース壁の分解が観察された。始原細胞壁はカロース壁の分解に先立って分解されていた。そのため、このステージでは小胞子同士はカロース壁で繋がっていた（図５Ｂ）。原形質膜の表面にはさらなるスポロポレニンの沈着が観察され、柱状のエキシン層になっていた（図５Ｃ）。柱状のエキシンの構造は、ほぼ均等な間隔を置いて形成されていた。ｋｏｍでは、始原細胞壁が分解される前にカロース壁がほとんど見られなくなっていた（図５Ｅ）。また、スポロポレニンは野生型のように柱状をしていなかった（図５Ｆ）。スポロポレニンは原形質膜の表面に、大きな半球状の塊として沈着していた。また、その配置パターンもランダムであり、野生型のように規則的なパターンは見られなかった。
ステージ９：
カロース壁が分解され、遊離の状態になった小胞子を観察した（図６）。エキシン層はステージ７で観察されたのと同様、柱状の構造であった（図６Ｂ）。エキシンの柱状の構造が原形質膜の突出した部分から形成されることはステージ６で観察されていたが（図４）、このステージでも原形質膜はまだ「波打ち」構造を保っているのが観察された（図６Ｃ）。
ｋｏｍ小胞子は、野生型のような規則的な表面構造を持っていなかった（図６Ｄ）。スポロポレニンの沈着は、サイズの異なる半球状の塊として、ランダムな配置で沈着していた（図６Ｅ）。原形質膜の形態は、野生型よりも不規則であり、膜の形態とスポロポレニンの沈着する場所には相関が見られなかった（図６Ｆ）。
ステージ１４：
野生型では、成熟した花粉の表面には粘着物質層が形成されていた（図７Ａ）。この物質は、エキシンの柱状の構造の間に埋め込まれるようにして存在していた。成熟花粉では、原形質膜は波打っておらず、まっすぐな形態をとっていた（図７Ｃ）。
ｋｏｍにおいては、スポロポレニンは前のステージ同様、ランダムな塊で花粉表面に付着していた。粘着物質層は大きく減少していた（図７Ｄ）。スポロポレニンの塊の間には、粘着物質が存在する領域としない領域の両方が観察された（図７Ｅ）。また、原形質膜は野生型同様、まっすぐな形態であった（図７Ｆ）。
【００５５】
まとめると、透過型電子顕微鏡を用いた研究から、以下のことが明らかになった。光学顕微鏡による観察で明らかになっていたカロースの表現型を含め、詳細に異常が明らかになった。
野生型の小胞子母細胞では、（１）減数分裂直前に原形質膜と始原細胞壁の間にカロース壁が形成される。（２）四分子期には四分子どうしの間や、四分子と始原細胞壁の間に厚いカロース壁が見られる。（３）四分子期には原形質膜とカロース壁の間にプライムエキシンが見られる。プライムエキシンの存在するところで原形質膜が内側に陥入し、規則的な波打ち構造を取るようになる。スポロポレニンは原形質膜の突出したところに付着する。（４）原形質膜の「波打ち」パターンは、小胞子の放出後まで続く。（５）成熟花粉のエキシン層の間には、粘着物質層が見られる。
ｋｏｍでは（１）減数分裂直前に原形質膜と始原細胞壁の間にカロースが存在しない。また、原形質膜の形態も不規則である。（２）四分子期には四分子どうしの間にカロース壁は観察されるものの、その量は減少している。また、始原細胞壁と小胞子の間にはカロースはほとんど存在しない。（３）四分子期にはプライムエキシンは存在するものの、原形質膜は規則的なパターンを取らない。スポロポレニンはランダムな塊で沈着する。（４）原形質膜のパターンとスポロポレニンの沈着部位には相関は見られない。（５）成熟花粉のスポロポレニンの沈着している領域の間には、粘着物質層がほとんど見られない。
【００５６】
実施例３：　柱頭への花粉の接着実験。
ｋｏｍ花粉が柱頭に付着しにくいかどうか調べるため、花粉の接着実験を行った（図８）。この結果、ｋｏｍ花粉は野生型花粉に比べて柱頭に接着する数が有意に減少していることが分かった（スチューデントのＴ検定、ｐ＜０．００１）。ｋｏｍ花粉が野生型花粉に比べて柱頭から離れやすいかどうかは、明確な有意差は出なかった（スチューデントのＴ検定、ｐ＞０．３０）。ｋｏｍ植物は雌しべの柱頭に付着する花粉の数が減少していたが、この結果からｋｏｍ花粉の付着数の減少は、花粉が柱頭からはずれやすいためではなく、柱頭に付着しにくいためであると示唆された。
【００５７】
実施例４：　マップベースクローニング法によるＫＯＭ遺伝子の単離。
ｋｏｍはＥＭＳ処理された種子から得られた、劣性の一遺伝子座による突然変異である。ｋｏｍの原因遺伝子を決定するために、マップベースクローニング法（ポジショナル・クローニング）による遺伝子の決定を行った。
（１）ＫＯＭ遺伝子のマッピング
各染色体上のＳＳＬＰマーカーを用いて調べた結果、ＫＯＭ遺伝子は１番染色体上にあることが分かった（図２）。ＫＯＭ遺伝子をクローニングするため、より詳細なマッピングを行った。ｋｏｍ突然変異体はＣｏｌ株由来である。ｋｏｍとＬｅｒ株をかけ合わせたＦ２植物より約１０００個体の組み換え体を選抜し、既存のＣＡＰＳマーカーおよびＳＳＬＰマーカーを用いてマッピングを行った。その結果、ＫＯＭ遺伝子はマーカーＡＤＨとマーカーＴ８Ｋ１４の間にあることが分かった。
この領域でＣｏｌ株とＬｅｒ株の塩基配列の違いを利用して更に多くのマーカーを作製した。これらのマーカーを用いたマッピングの結果、ＫＯＭ遺伝子は１番染色体の下端のマーカーＦ２８ＫＩ９−１とＦ２８ＫＩ９−３の間の１２５７０ｂｐの領域に存在することが分かった。
【００５８】
（２）候補遺伝子の塩基配列の決定
Ｆ２８ＫＩ９−１とＦ２８ＫＩ９−３はともにＢＡＣクローンＦ２８ＫＩ９の上に存在する。ＧＲＡＩＬを用いた予測より、これらのマーカーの間にはＯＲＦが４個存在すると予想された。これらのＯＲＦについてＣｏｌ株とｋｏｍ突然変異体で塩基配列を全て決定したところ、１つのＯＲＦ（ＯＲＦ７）に塩基置換による変異が見つかった。さらに、上記の２つのマーカーではさまれた領域の全塩基配列をＣｏｌ株とｋｏｍで比較したが、変異はその一カ所のみであった。そこで、ＯＲＦ７がｋｏｍの原因遺伝子であると判断した。以下この遺伝子のことを、ＫＯＭ遺伝子と呼ぶ。
【００５９】
（３）ＫＯＭ　ｃＤＮＡの単離
ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲ、３’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲによりＫＯＭｃＤＮＡの全長を決定した。
ＫＯＭ遺伝子は全長が１５０５ｂｐであり、エクソンが６つ存在した。ＫＯＭｃＤＮＡを単離したところ、ｋｏｍ突然変異体では第５エクソンのスプライシングアクセプターサイトにおいて、塩基がＧからＡに変わっていた。この変異によりｋｏｍ　ｃＤＮＡでは第５エクソンの開始が２０ｂｐ後ろにずれ、フレームシフトを起こしていた。また、２３ｂｐ後ろにずれ、フレームシフトを起こす産物も得られた。
ＫＯＭ　ｃＤＮＡの塩基配列から、ＫＯＭタンパク質は３８５アミノ酸からなることが推定された（図９）。このアミノ酸配列に対してドメイン検索をＳＭＡＲＴで、また他のタンパク質との相同性の検索をＢＬＡＳＴを用いて行った。ＫＯＭタンパク質は膜貫通ドメインを７つもっと推測された。また、ショウジョウバエのＲｈｏｍｂｏｉｄ−１タンパク質と２４％の相同性があった。Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１はショウジョウバエのＥＧＦシグナル伝達系において、リガンド分子であるＳｐｉｔｚを切断するセリンプロテアーゼである（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，２００１；Ｕｒｂａｎ　ｅｔ　ａｌ．２００１）。Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−１のプロテアーゼ活性に必要なアミノ酸として６つのアミノ酸が知られているが（Ｕｒｂａｎ　ｅｔ　ａｌ．，２００１）、ＫＯＭでもそのうち大部分は保存していた（図９）。
ｋｏｍ突然変異型ｃＤＮＡより予想される遺伝子産物のアミノ酸配列を調べた。フレームシフトの結果、ｋｏｍ突然変異型ｃＤＮＡから予想される産物は、野生型の遺伝子産物と比較して、３０４番目以降のアミノ酸配列に変化が見られた。このことから、ＫＯＭ遺伝子の機能には３０４番目以降のアミノ酸が必要であると示唆された。
【００６０】
実施例４：　ＫＯＭ遺伝子の発現解析。
（１）ＲＴ−ＰＣＲ
ＫＯＭ遺伝子の発現している部位を調べるために、ＲＴ−ＰＣＲを行った（図１０）。ＫＯＭ遺伝子の発現は鞘・葉・根では見られず、花においてのみ発現が見られた。このことは、ｋｏｍ突然変異体の表現型が花粉においてのみ見られ、植物体の他の器官では見られないことと矛盾しない。
ＲＴ−ＰＣＲは以下の方法にて行った。
各組織のＲＮＡ０．４ｍｇに対し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｂｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を用いて、ＤＮａｓｅ処理しオリゴｄＴプライマーでｃＤＮＡを合成した。２０ｍｌのうち、０．５ｍｌと次の二つのプライマーを用い、９４℃３’（９４℃　３０’’　６０℃　３０’’　７２℃１’’）×３５のサイクルでＰＣＲを行った。
２６６３４ｆ：５’　ＣＡＴＴＡＴＧＧＧＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＧＣ　３’
２５７５１ｒ；５’　ＣＴＴＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＧ　３’
ポジティブコントロール反応には、ＡＣＴ８を用いた（Ａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６；Ａｉｄａ　ｅｔａｌ．，１９９７）。プライマーは次の二つである。
ＡＣＴ８ｆ：５’　ＡＴＧＡＡＧＡＴＴＡＡＧＧＴＣＧＴＧＧＣＡ３’
ＡＣＴ８ｒ：５’　ＴＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧＣＴＡＣ　３’
【００６１】
（２）インサイチュハイブリダイゼーション（ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
ＫＯＭ遺伝子の発現している細胞と時期を詳細に調べるため、インサイチュハイブリダイゼーションを行った（図１１）。小胞子母細胞（ステージ１）では、ＫＯＭ遺伝子の発現は見られなかった（図１１Ａ）。減数分裂の直前（ステージ２）では、ＫＯＭの発現は小胞子母細胞においてわずかに見られるものもあった（図１１Ｂ）。減数分裂期（ステージ３、４）になると、ＫＯＭ遺伝子の発現は減数分裂中の小胞子母細胞で観察された（図１１Ｃ、Ｄ）。この時期にはタペート細胞でも弱い染色が観察されたが、これはセンスコントロールでも見られること、全てのタペート細胞が一様に染まっているわけではないことから、非特異的な染色である可能性が高いと考えている。細胞質分裂期（ステージ５）、四分子期（ステージ６、７）では、シグナルは検出されなかった（図１１Ｅ）。四分子期以降のステージにおいても、発現は見られなかった（データ示さず）。このことから、ＫＯＭ遺伝子は減数分裂直前または減数分裂中の小胞子母細胞で特異的に発現していることが分かった。
インサイチュハイブリダイゼーションの操作手順は、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　ａｎｄ　ｏｋａｄａ，２００１　に従った。
ＫＯＭプローブ作製は、以下のプライマーを用いて増幅したＤＮＡ断片をｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ　ＳＫ＋にトランスフォーメーションして行った。
Ｋｏ１ｍｆＳａｌｌ：５’　ＧＧＡＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＡＴＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧ　３’
ＫｏｍｌｒＸｂａｌ：５’　ＡＧＣＣＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡ　３’
プローブの調製にはＤＩＧ　ＲＮＡ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（ロシュ・ダイアアグノスティック）を用いた。
【００６２】
実施例５：　相補テスト。
ＣｏｌのＫＯＭ遺伝子を含む３５８３塩基対をｋｏｍ突然変異体に導入した。まず、次の二つのブライマーでＴａＫａＲａ　ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲにより遺伝子を増幅した。
２８５５９ｆ：５’　ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＡＴＧＣ　３’
ｋｐｎ２４８２６ｒ：５’　ＧＡＧＡＴＡＣＡＡＣＴＣＴＴＣＧＧＡＡＡＧＧ　３’
５ｋｂのＰＣＲ断片を、ＫｐｎＩで消化してバイナリーベクターｐＰＺＰ２１１（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）にサブクローニングした。単離したクローンのうち、野生型と全く同じ塩基配列であることが確認されたクローンが得られたため、これを次の実験に使用した。これをアグロバクテリウムＡＳＥ系統に導入し、ｋｏｍ突然変異体を減圧浸潤法を用いて形質転換した（荒木、賀屋、２０００）。形質転換体のスクリーニングは、３０ｍｇ／ｍｌカナマイシン、１００ｍｇ／ｍｌカルベニシリンの条件下で行った。
相補テストの結果、変異が回復した。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の遺伝子ＫＯＭを利用することにより、花粉の外部形態及び性質を改変することができる。すなわち、植物の有するＫＯＭ遺伝子の発現を抑制することにより、植物の有する花粉を雌しべに付着にくくさせることができる。
また、本発明のプロモーターを用いることにより、花粉発生を阻害する遺伝子を局所的・局時的に発現させて、他の組織に悪影響を及ぼさずに雄性不稔植物を作出することが可能となる。
本発明により得られる形質転換植物は農業分野において優れて有用なものである。
【００６４】
【配列表】
2004024108.tif 000003
2004024108.tif 000004
2004024108.tif 000005
2004024108.tif 000006
2004024108.tif 000007
2004024108.tif 000008
2004024108.tif 000009
2004024108.tif 000010
2004024108.tif 000011
2004024108.tif 000012
2004024108.tif 000013
2004024108.tif 000014
2004024108.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【図１】花粉の外部形態を微分干渉顕微鏡及び走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す。
（Ａ）ｋｏｍ花粉の微分干渉顕微鏡像、花粉の表面に凹凸が見える。
（Ｂ）ｋｏｍ花粉の走査型電子顕微鏡像。表面には網目状の模様は観察されず、多数の小突起が見える。
（Ｃ）野生型花粉の微分干渉顕微鏡像。
（Ｄ）野生型花粉の走査型電子顕微鏡像。花粉の表面には網目状の模様が観察される。
【図２】マップベースクローニング法によりｋｏｍ変異体の原因遺伝子ＫＯＭを同定し、染色体上の位置と配列を特定した結果を示す。ＫＯＭ遺伝子は１番染色体上にあり、ＢＡＣクローンＦ２８Ｋ１９上の特定の範囲（作製したマーカーＦ２８Ｋ１９−１とＦ２８Ｋ１９−３の間）に存在することが明らかとなった。
この二つのマーカーの間には３つのＯＲＦが存在した。その中のＯＲＦ７で、スプライシングアクセプターサイトーに一塩基置換が見つかった。
【図３】透過型電子顕微鏡を用いて花粉の発生を観察した結果を示す。
（Ａ）野生型のステージ１の小胞子母細胞。原形質膜と始原細胞壁の間に隙間は見られない。
（Ｂ）ｋｏｍのステージ１の小胞子母細胞。野生型と同様、原形質膜と始原細胞壁の間に隙間は見られない。
（Ｃ）野生型のステージ２の小胞子母細胞。原形質膜と始原細胞壁の間に隙間が見られる。
（Ｄ）ｋｏｍのステージ２の小胞子母細胞。原形質膜と始原細胞壁の間に隙間が見られる。原形質の形状は野生型よりも不規則である。
（Ｅ）Ｃの拡大図。電子密度の濃い部分はカロースである。
（Ｆ）Ｄの拡大図。原形質膜と始原細胞壁の間にはカロースは見られない。
ＣＷ；カロース壁、ＩＣＷ；始原細胞壁、ＰＭ；原形質膜。倍率は（Ａ），（Ｂ）が２５００倍、（Ｃ）が１５００倍、（Ｄ）が３０００倍、（Ｅ）が６０００倍、（Ｆ）が１２０００倍。
【図４】ステージ６の野生型及びｋｏｍ変異体の花粉の発生を透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す。
（Ａ）野生型の四分子。各小胞子はカロース壁で覆われている。
（Ｂ）野生型の拡大図。カロース壁と原形質膜の間に、電子密度の高い領域（矢尻）が見られる。プライムエキシンの存在するところで原形質膜は内側に陥入している。
（Ｃ）スポロポレニンは原形質膜上に沈着し始める。
（Ｄ）ｋｏｍの四分子。カロースは殆ど見られない。小胞子と始原細胞壁の間に、電子密度の高い領域（矢尻）が見られる。原形質膜は野生型よりも不規則な形状である。
（Ｅ）ｋｏｍの拡大図。カロース壁と原形質膜の間に、電子密度の高い領域（矢尻）が見られる。原形質膜は野生型よりも不規則な形状である。
（Ｆ）スポロポレニンは原形質膜状に沈着し始める。
ＣＷ；カロース壁、ＩＣＷ；始原細胞壁、Ｐ；プライムエキシン、ＰＭ；原形質膜。倍率は（Ａ）が３０００倍、（Ｂ）が５００００倍、（Ｃ）が４００００倍、（Ｄ）が３０００倍、（Ｅ）が２００００倍、（Ｆ）が２００００倍。
【図５】ステージ７の野生型及びｋｏｍ変異体の花粉の発生を透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す。
（Ａ）野生型の四分子。各小胞子はカロース壁で覆われている。
（Ｂ）野生型の拡大図。始原細胞壁は分解され、カロース壁どうしが繋がっている。
（Ｃ）スポロポレニンは原形質膜上に沈着し、柱状のエキシンの構造をとる。
（Ｄ）ｋｏｍの四分子。カロースは殆ど見られない。
（Ｅ）ｋｏｍの拡大図。始原細胞壁はまだ残っているが、カロース壁は殆ど見られない。
（Ｆ）スポロポレニンは原形質膜状に沈着し始める。
ＣＷ；カロース壁、ＥＸ；エキシン、ＩＣＷ；始原細胞壁。倍率は（Ａ）が２０００倍、（Ｂ）が４０００倍、（Ｃ）が５００００倍、（Ｄ）が１５００倍、（Ｅ）が３００００倍、（Ｆ）が５００００倍。
【図６】ステージ９の野生型及びｋｏｍ変異体の花粉の発生を透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す。
（Ａ）野生型の小胞子。核は一核である。エキシンは規則的な間隔で柱状構造をとっている。
（Ｂ）野生型のエキシン層。エキシンは原形質膜の突出部から生じている。
（Ｃ）原形質膜。エキシンと接していないところは陥入している。
（Ｄ）ｋｏｍの小胞子。核は一核である。スポロポレニンはランダムな塊として沈着している。
（Ｅ）ｋｏｍの拡大図。エキシンは原形質膜の突出部から生じているわけではない。
（Ｆ）原形質膜。野生型よりも不規則な形態である。
ＥＸ；エキシン、ＰＭ；原形質膜。倍率は（Ａ）が５０００倍、（Ｂ）が３００００倍、（Ｃ）が３００００倍、（Ｄ）が５０００倍、（Ｅ）が３００００倍、（Ｆ）が３００００倍。
【図７】ステージ１４の野生型及びｋｏｍ変異体の花粉の発生を透過型電子顕微鏡で観察した結果を示す。
（Ａ）野生型の成熟花粉。
（Ｂ）野生型のエキシン層。エキシンの間には粘着物質（＊印）が見える。
（Ｃ）原形質膜。このステージでは直線構造に戻っている。
（Ｄ）ｋｏｍの成熟花粉。
（Ｅ）ｋｏｍのエキシンは不規則な形である。また、粘着物質層はほとんど見られない。
（Ｆ）原形質膜。ｋｏｍでも直線構造に戻っている。
倍率は（Ａ）が２５００倍、（Ｂ）が３００００倍、（Ｃ）が１０００００倍、（Ｄ）が２５００倍、（Ｅ）が３００００倍、（Ｆ）が１０００００倍。
【図８】ｋｏｍ花粉が柱頭に付着しにくいかどうか調べるため、花粉の接着実験を行った結果を示す。
【図９】ＫＯＭタンパク質と相同性を有するタンパク質との比較のためのアラインメントを行った結果を示す。
推定されるＫＯＭタンパク質（ｋｏｍｐｅｉｔｏ）、ショウジョウバエのＲｈｏｍｂｏｉｄ−１、Ｒｈｏｍｂｏｉｄ−２、テンサイ膜タンパク質（ｓａｃｃｈａｒｕｍ＿ｍｐ）のアミノ酸配列を比較した。これらの間で共通しているアミノ酸を＊印で示す。アラインメントの上の傍線部はＲｈｏｍｂｏｉｄ−１で推定される膜貫通領域を、アラインメントの下の傍線部はＫＯＭで推定される膜貫通領域を示す。
【図１０】茎、ロゼット葉、根、花序茎頂からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す。ＫＯＭ遺伝子の発現は花序茎頂のみで見られた。下段のＡＣＴ８はＲＮＡが存在することのコントロールを示す。ゲノムはゲノムＤＮＡを鋳型にしたコントロール。
【図１１】インサイチュハイブリダイゼーションによりＫＯＭ遺伝子の発現を調べた結果を示す。
（Ａ）ステージ１。ＫＯＭ遺伝子の発現は見られない。
（Ｂ）ステージ２。ＫＯＭ遺伝子の発現は小胞子（矢尻）でわずかに見られる。
（Ｃ）ステージ３。ＫＯＭ遺伝子の発現は小胞子（矢尻）で強く見られる。
（Ｄ）ステージ４。ＫＯＭ遺伝子の発現は小胞子（矢尻）で強く見られる。
（Ｅ）ステージ６。ＫＯＭ遺伝子の発現は見られない。
（Ｆ）ステージ３，センスコントロール。
スケールバーは２０μｍ。
【図１】
2004024108.tif 000016
【図２】
2004024108.tif 000017
【図３】
2004024108.tif 000018
【図４】
2004024108.tif 000019
【図５】
2004024108.tif 000020
【図６】
2004024108.tif 000021
【図７】
2004024108.tif 000022
【図８】
2004024108.tif 000023
【図９】
2004024108.tif 000024
【図１０】
2004024108.tif 000025
【図１１】
2004024108.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成14年7月4日(2002.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
2004024108.tif 000027