(57)【要約】【課題】優れた安全性で、遺伝子を細胞に導入できる遺伝子導入方法を提供する。【解決手段】粘土鉱物からなる遺伝子導入用担体に目的遺伝子を担持させ、これを細胞に添加することによって前記細胞内に前記目的遺伝子を導入することができる。前記粘土鉱物は、層状粘土鉱物であることが好ましく、モンモリロナイト、バーミキュライト、イライト等が使用できる。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子を担持し、かつ、細胞内に前記遺伝子を導入するための担体であって、粘土鉱物を含むことを特徴とする遺伝子導入用担体。
【請求項２】
粘土鉱物が層状粘土鉱物である請求項１記載の遺伝子導入用担体。
【請求項３】
粘土鉱物が、カオリナイト群、バイロフィライト−タルク群、スメクタイト群、バーミュキュライト群、雲母群、脆雲母群、緑泥石群およびセピオライト−パリゴスカイト群からなる群から選択された少なくとも一つの結晶質型粘土鉱物である請求項１または２記載の遺伝子導入用担体。
【請求項４】
粘土鉱物が、モンモリロナイト、バーミキュライトおよびイライトからなる群から選択された少なくとも一つの粘土鉱物である請求項３記載の遺伝子導入用担体。
【請求項５】
粘土鉱物が、有機物が除去された粘土鉱物である請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子導入用担体。
【請求項６】
粘土鉱物が、脱鉄処理された粘土鉱物である請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子導入用担体。
【請求項７】
粘土鉱物の純度が、８５％以上である請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子導入用担体。
【請求項８】
粘土鉱物が、層間に交換性陽イオンを有する請求項２〜７のいずれか一項に記載の遺伝子導入用担体。
【請求項９】
交換性陽イオンが、ナトリウムイオン、アンモニウムイオンおよび第４級アンモニウムイオンからなる群から選択された少なくとも一つの陽イオンである請求項８記載の遺伝子導入用担体。
【請求項１０】
交換性陽イオンが、アミノ酸、アミン化合物、アミド化合物、カチオン性界面活性剤およびカチオン性金属錯体からなる群から選択された少なくとも一つの物質の陽イオンである請求項８記載の遺伝子導入用担体
【請求項１１】
酸性条件下では遺伝子を放出せず、中性またはアルカリ性条件下で遺伝子を放出する請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子導入用担体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子導入用担体と、これに担持された遺伝子とを含む遺伝子導入剤。
【請求項１３】
前記遺伝子（Ａ）と粘土鉱物（Ｂ）との混合割合（重量比Ａ：Ｂ）が、１：０．００１〜１．１の範囲である請求項１２記載の遺伝子導入剤。
【請求項１４】
前記遺伝子が、目的遺伝子をベクターに組込んだ組換えベクターである請求項１２または１３記載の遺伝子導入剤。
【請求項１５】
ベクターがプラスミドである請求項１４記載の導入方法。
【請求項１６】
形態が分散液の形態である請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤。
【請求項１７】
ｐＨが、６．５〜７．５の範囲である請求項１６記載の遺伝子導入剤。
【請求項１８】
さらにカチオン性ポリマーを含む請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤。
【請求項１９】
カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリリジンおよびポリヒスチジンからなる群から選択された少なくとも一つのポリマーである請求項１８記載の遺伝子導入剤。
【請求項２０】
請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤を用いて、細胞に遺伝子を導入させる遺伝子導入方法。
【請求項２１】
細胞と遺伝子導入剤に含まれる粘土鉱物との割合が、細胞１×１０６個に対して、粘土鉱物０．０１〜１００μｇの範囲である請求項２０記載の遺伝子導入剤。
【請求項２２】
細胞と遺伝子導入剤に含まれる担持された遺伝子との割合が、細胞１×１０６個に対して、遺伝子１０〜１００μｇの範囲である請求項２０または２１記載の導入方法。
【請求項２３】
細胞が培養細胞である請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の導入方法。
【請求項２４】
培養細胞に前記遺伝子導入剤を添加して遺伝子を導入する前に、前記培養細胞をインキュベートする請求項２１記載の導入方法。
【請求項２５】
遺伝子を導入するために培養細胞に前記遺伝子導入剤を添加した後、３〜７２時間の範囲でインキュベートする請求項２１または２２記載の導入方法。
【請求項２６】
細胞が生体細胞であって、生体内に前記遺伝子導入剤を投与して、前記遺伝子導入剤により器官または組織の細胞に遺伝子を導入する請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の導入方法。
【請求項２７】
投与が経口投与である請求項２４記載の導入方法。
【請求項２８】
遺伝子を導入する器官が、小腸である請求項２４または２５記載の導入方法。
【請求項２９】
生体がヒトである請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の導入方法。
【請求項３０】
生体がヒト以外の動物である請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の導入方法。
【請求項３１】
請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の導入方法により遺伝子を導入した細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、細胞内に遺伝子を導入するための遺伝子導入用担体、前記担体を用いた遺伝子導入剤、前記導入剤を用いた遺伝子導入方法、および前記方法によって遺伝子を導入した遺伝子導入細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ガンや遺伝子疾患等、種々の疾患の治療法として、例えば、欠損遺伝子や変異した遺伝子の正常型遺伝子、あるいは発現遺伝子のアンチセンス等を細胞内に導入することによって遺伝子レベルで治療を行う、いわゆる遺伝子治療が実用化されるようになってきている。
【０００３】
この遺伝子治療を達成するためには、安全性が高く、しかも優れた効率で細胞内に遺伝子を導入できる方法の開発・確立が必要不可欠である。
【０００４】
現在、臨床分野で実施が試みられている遺伝子治療法は、その多くが遺伝子導入用の担体としてウイルスベクターを使用しているが、前記ウイルスベクターは安全性の面で多くの問題がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、安全に優れる、新たな遺伝子導入用担体、遺伝子導入剤、遺伝子導入方法、およびそれによって遺伝子を導入した細胞の提供である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の遺伝子導入用担体は、遺伝子を担持し、かつ、細胞内に前記遺伝子を導入するための担体であって、粘土鉱物を含むことを特徴とする。
【０００７】
本発明者らは、遺伝子工学等の研究分野や臨床医療の分野において、細胞に対する安全性が高い新規の遺伝子導入用担体を見出すべく鋭意研究を行った結果、前記粘土鉱物を遺伝子導入用担体として用いれば、容易に細胞内に遺伝子を導入できることを見出した。前記「粘土鉱物」とは、通常、粘土に含まれるケイ酸塩鉱物を言い、従来から、例えば、化粧品の成分として、また医薬分野において発布剤の基材や制酸剤として、また光学材料や触媒としても広く利用されている。しかしながら、本発明のように、粘土鉱物を、細胞に遺伝子を導入するための担体として使用できることは、本発明者らが初めて見出したことである。本発明の遺伝子導入用担体によれば、例えば、前記遺伝子導入用担体と導入させる遺伝子とを溶液内で混合させるだけで、前記遺伝子が粘土鉱物に担持され、さらに、この遺伝子を担持した遺伝子導入用担体を目的細胞に接触させるだけで、細胞内に遺伝子を導入できる。このため、遺伝子導入の操作も、極めて簡便になる。また、粘土鉱物は、前述のように従来から広く化粧品や医薬品に使用されているという事実からも、生体に対する、特にヒトに対する安全性は十分に立証されているところである。したがって、このような安全に極めて優れる粘土鉱物を含む遺伝子導入用担体は、前記臨床医療の分野等において、広く適用することができ、かつ有用である。
【０００８】
なお、本発明の遺伝子導入担体が細胞に遺伝子を導入するメカニズムは明らかではないが、おそらく前記遺伝子導入用担体が、遺伝子を担持した状態で細胞内に取り込まれ、細胞内で遺伝子を離すと考えられる。
【０００９】
また、本発明の遺伝子導入剤は、前記本発明の遺伝子導入用担体とこれに担持された遺伝子とを含む遺伝子導入剤である。前述のように本発明の遺伝子導入用担体は極めて安全性に優れる担体であるため、前記担体とこれに担持された遺伝子含む遺伝子導入剤を用いれば、安全性に優れた遺伝子導入が可能になる。また、前述と同様に、例えば、粘土鉱物と遺伝子とを混合すること等によって、前記遺伝子が粘土鉱物に担持されるため、本発明の遺伝子導入剤は、非常に調製が容易であり、遺伝子導入の操作も簡便となる。
【００１０】
また、本発明の遺伝子導入方法は、前記本発明の遺伝子導入剤を用いて、細胞に遺伝子を導入する方法である。この遺伝子導入方法は、メカニズムは不明であるが、例えば、遺伝子が粘土鉱物に担持されている前記遺伝子導入剤を、目的細胞に接触させるだけで、容易に遺伝子が前記細胞内に導入されるため、操作も簡便であり、かつ高い安全性での遺伝子導入が実現できる。このような安全性に優れる簡便な方法は、前記臨床医療の分野において非常に有用である。
【００１１】
そして、本発明の遺伝子導入細胞は、前記本発明の導入方法により遺伝子を導入した細胞である。前記遺伝子導入細胞は、細胞に対する安全性が非常に高い前記本発明の導入方法によって作製されるため、例えば、従来のように担体としてウイルスベクター等を使用した場合に見られる弊害等も回避できる。このため、本発明の遺伝子導入細胞を、例えば、患部の組織細胞に接触させる治療方法等にも、高い安全性で適用することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（実施形態１）
遺伝子導入用担体
本発明の遺伝子導入用担体において、前記粘土鉱物としては、特に制限されないが、例えば、層状粘土鉱物であることが好ましい。このような層状構造の粘土鉱物は、通常、その層間にイオンや水が挟み込まれた構造をとる。このため、前記層状粘土鉱物を遺伝子導入用担体として用いれば、前記層間物質と遺伝子とが置き換わり、層間に遺伝子がインターカレートするため、遺伝子を担持することができると推測される。
【００１３】
前記層状粘土鉱物の層間物質は、例えば、交換性陽イオンであることが好ましい。層間物質が交換性陽イオンの場合、通常、この陽イオンは、層の内側面の水酸基（−ＯＨ）と結合している。このため、例えば、前記層状粘土鉱物と遺伝子とを溶液中で混合させれば、前記交換性陽イオンと遺伝子とが置き換わって、遺伝子のリン酸基と前記内側面の水酸基とが水素結合し、遺伝子が担持されると考えられるからである。なお、前記交換性陽イオンを層間物質として有する粘土鉱物を、以下、「交換性陽イオン型」の粘土鉱物ともいう。
【００１４】
このように水素結合によって遺伝子を担持する粘土鉱物を含む遺伝子導入用担体であれば、例えば、酸性条件下で遺伝子を放出することなく、中性またはアルカリ性条件下で遺伝子を放出することもできるため、条件に応じて選択的に遺伝子を放出させる際に有用である。
【００１５】
前記交換性陽イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、アンモニウムイオン、第４級アンモニウムイオン等があげられる。これらの中でも、天然型の粘土鉱物の多くが有していることからナトリウムイオンが好ましく、また、大きな立体構造である第４級アンモニウムイオンも好ましい。前記第４級アンモニウムイオンは、例えば、物質の種類が豊富であるため層間距離のコントロールが容易であり、また、電荷調節も可能であるため、遺伝子担持の容易性、遺伝子との結合力、遺伝子の放出の容易性を制御することが可能だからである。前記第４級アンモニウムイオンとしては、例えば、塩化テトラメチルアンモニウムイオン、塩化ベンジルトリメチルアンモニウムイオン等がある。
【００１６】
また、これら以外にも、例えば、α−アミノ酸やβ−アミノ酸等の各種アミノ酸、ドーパミン等のアミン化合物、アクリルアミド等のアミド化合物等の陽イオンでもよいし、アルキルアンモニウム、アルキルトリメチルアンモニウム、テトラメチルホスホニウム、アルキルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤や、ルテニウムテトラアンモニウム、トリスフェナンスロリンロジウム等のカチオン性金属錯体の陽イオンでもよい。前記カチオン性金属錯体としては、例えば、ルテニウム等のアンモニア錯体等が使用できる。また、メチルビオロゲン等でもよい。
【００１７】
本発明における前記層状粘土鉱物としては、特に制限されず、例えば、カオリナイト、バイロフィライト−タルク、スメクタイト、バーミュキュライト、雲母、脆雲母、緑泥石およびセピオライト−パリゴスカイトの合計８群の結晶質型粘土鉱物が使用できる。結晶質型の中でも、カオリナイト群はケイ酸塩層の型が「１：１型」であり、その他７つのグループは、「２：１型」である。層電荷のない前記カオリナイト群に属する粘土鉱物としては、例えば、カオリナイト、デイッカイト、ハロイサイト、ナクライト、クリソタイル、リザルダイト、同じく層電荷のないバイロフィライト−タルク群に属する粘土鉱物としては、例えば、バイロフィライト、タルクがあげられる。また、層電荷を有するスメクタイト群としては、例えば、モンモリロナイト、バイデライト、ノントロライト、サポナイト、ヘクトライト、スチブンサイトが、バーミュキュライト群としては、例えば、ｄｉ−バーミュキュライト、ｔｒｉ−バーミュキュライトが、雲母群としては、例えば、白雲母、パラゴライト、イライト、フロゴパイト、黒雲母、レピドライトが、脆雲母群としては、例えば、マーガライト、クリントナイトが、緑泥石群としては、ドンパサイト、スドウ石、クッカイト、クリノクロア、シャモサイトが、それぞれあげられる。また、層電荷のないセピオライト−パリゴスカイト群としては、セピヲライト、パリゴルスカイトがあげられる。これらの中でも、層電荷を有する結晶質粘土鉱物が好ましく、より好ましくは、スメクタイト群、バーミキュライト群、雲母群である。具体的には、モンモリロナイト、バーミキュライト、イライトが好ましく、特にモンモリロナイトが好ましい。
【００１８】
また、前記層状粘土鉱物の他にも、例えば、イモゴライト、アロフェン、ヒシンゲライト等の非結晶質型粘土鉱物も使用できる。
【００１９】
前記粘土鉱物は、天然の粘土から採取してもよいが、種々の市販品が使用できる。モンモリロナイトとしては、例えば、商品名クニピアＦ（クニミネ工業社製）、サポナイトとしては、例えば、商品名スメクトンＳＡ（クニミネ工業社製）等がある。また、日本粘土学会からも、各種粘土鉱物を入手することができる。
【００２０】
また、粘土鉱物は、特に制限されないが、含有もしくは付着している各種不純物が除去された、精製粘土鉱物であることが好ましい。このように精製されていれば、粘土鉱物への遺伝子のインターカレーションを効率良く行えるからである。前記不純物とは、例えば、土壌中の有機物（各種アミノ酸やリグニン等）や、鉄、カリウム、カルシウム、マグネシウム等がある。
【００２１】
具体的には、通常のＸ線回折または元素分析による純度が、例えば、８５％以上であることが好ましく、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である。このＸ線回折による純度は、一般に行われるように、標準サンプルとの回折パターンを比較した、回折線の強度比から決定することができる。
【００２２】
前述のような不純物を除去する方法としては、特に制限されないが、例えば、前記有機物を除去する場合には、以下の方法等が適用できる。
【００２３】
この有機物の除去処理は、例えば、粘土鉱物に過酸化水素水を添加して分散させ、この分散液を、加熱処理することによって行うことができる。過酸化水素水の濃度は、例えば、３〜１５重量％であり、好ましくは３〜１０重量％であり、より好ましくは５〜７重量％である。過酸化水素水の添加割合は、粘土鉱物１ｇに対して、例えば、１０〜３０ｍｌであり、好ましくは１５〜３０ｍｌであり、より好ましくは１５〜２０ｍｌである。また、加熱処理の条件は、例えば、温度２５〜５０℃であり、好ましくは２５〜４０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃である。加温時間は、特に制限されないが、例えば、加温による発泡（酸素）がなくなるまで行うことが好ましく、発泡終了後、残留した過酸化水素を除去するために、さらに加温処理を行うことがより好ましい。なお、これらの条件には限定されない。
【００２４】
このような有機物処理によって、通常、純度が８５〜１００％の粘土鉱物を得ることができる。また、使用する粘土鉱物における有機物の含有量は、例えば、５％以下であることが好ましく、より好ましくは２％であることが好ましく、特に好ましくは１％以下である。
【００２５】
前記有機処理後の粘土鉱物を遺伝子導入用担体とする場合は、例えば、ろ過や遠心分離等によって前記粘度鉱物分散液から粘土鉱物を回収し、水、緩衝液、生理食塩水等の溶液で洗浄したものを使用すればよい。なお、このように有機物処理を行った粘土鉱物の層間物質は、原料として用いた処理前の粘土鉱物と同様であり、例えば、ナトリウムイオンの他にも、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の各種交換性陽イオンがあげられる。
【００２６】
また、前記粘土鉱物は、例えば、粘土鉱物に付着または含まれる鉄を除去するために、前記有機物の除去処理に代えて、またはそれに加えて、以下に示す脱鉄処理を施すことが好ましい。脱鉄処理された粘土鉱物であれば、例えば、鉄による結晶構造評価が安定するばかりでなく、鉱物の物理化学特性も一定になり、実用面でも安定した品質となるため、さらに粘土鉱物の層間への遺伝子のインターカレーションを容易にすることができるからである。この脱鉄処理は、例えば、以下に示す方法によって行うことができる。
【００２７】
前記過酸化水素水で処理した前記粘土鉱物分散液を加熱し、ここにクエン酸ナトリウム水溶液および炭酸水素ナトリウム水溶液を添加して十分に攪拌する。この混合液に、さらにハイドロサルファイトナトリウム（ハイドロ亜硫酸ナトリウム）水溶液を加えて攪拌し、この混合液を静置する。この脱鉄処理後の粘土鉱物を遺伝子導入用担体とする場合には、前記有機物処理の場合と同様に各種溶媒で洗浄したものを使用すればよい。
【００２８】
前記方法において、粘土鉱物１ｇに対する各物質の添加割合は、例えば、クエン酸ナトリウム５０〜７０ｍｍｏｌ、炭酸水素ナトリウム１５〜３０ｍｍｏｌ、ハイドロサルファイト２０〜３５ｍｍｏｌの範囲であり、好ましくはクエン酸ナトリウム５５〜６５ｍｍｏｌ、炭酸水素ナトリウム２２〜２８ｍｍｏｌ、ハイドロサルファイト２６〜２９ｍｍｏｌの範囲である。
【００２９】
また、有機物処理後または脱鉄処理後の粘土鉱物は、例えば、粘土鉱物層間への遺伝子のインターカレーション効率をより一層向上するために、さらに、イオン交換反応による各種交換性陽イオン型への誘導処理を施してもよい。処理前から層間にナトリウム等の交換性陽イオンを含む場合であっても、この誘導処理を施すことによって、例えば、層間距離が広がり、さらに、遺伝子との親和性の高い物質を用いてイオン交換することで、遺伝子のインターカレーション効率が向上するからである。具体例として、以下に、交換性ナトリウム型への誘導処理の一例を示す。
【００３０】
粘土鉱物を交換性ナトリウム型への誘導処理する場合には、例えば、前記有機物除去処理または脱鉄処理を行った粘土鉱物を、塩化ナトリウム飽和水溶液に添加・分散し、ろ過や遠心分離によって前記粘土鉱物を回収すればよい。前記塩化ナトリウムの添加と粘土鉱物の回収とは、１回でもよいが、十分にナトリウム型への誘導を行うために二回以上行うことが好ましく、より好ましくは３〜５回である。また粘土鉱物に対する塩化ナトリウム飽和水溶液の添加割合は、粘土鉱物１ｇに対して、例えば、３０〜８０ｍＬの範囲であり、好ましくは４０〜６０ｍＬ、より好ましくは５０〜６０ｍＬの範囲である。塩化ナトリウム飽和水溶液に対する粘土鉱物の懸濁は、特に制限されないが、例えば、１０秒以上であることが好ましく、より好ましくは３０〜６０分である。
【００３１】
交換性ナトリウム型への誘導に使用する溶媒としては、前記塩化ナトリウム水溶液には限定されず、この他にも、例えば、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム等のナトリウム塩を含む水溶液が使用できる。また、これらの溶液におけるナトリウム塩濃度は、特に制限されないが、前述のように飽和溶液であることが好ましい。
【００３２】
また、より一層完全にナトリウム型への誘導を行う場合は、前記塩化ナトリウム飽和溶液による誘導処理に代えて、若しくはこれに加えて、例えば、クエン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、アジ化ナトリウム等のナトリウム塩の水溶液や、前記ナトリウム塩を二種以上含む水溶液等によって誘導処理を行えばよい。
【００３３】
一方、交換性アンモニウム型への誘導処理を行う場合には、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩を含む溶液で、前述のナトリウム型への誘導方法と同様に処理を行えばよい。また、第４級アンモニウム型の場合は、例えば、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム等の４級アンモニウム塩を含む溶液が使用できる。また、例えば、前述のようなカチオン性界面活性剤を用いたピラー化や、前述のようなアミン化合物、アミド化合物、カチオン性金属錯体等による置換によっても、鉱物機能の修飾が可能である。
【００３４】
このように交換性陽イオン型への誘導処理を行った粘土鉱物は、例えば、透析を行った後に遺伝子導入用担体として使用すればよい。
【００３５】
また、以上に示した各種粘土鉱物は、例えば、溶液に分散させた状態でそのまま遺伝子導入用担体として使用することもできるが、凍結乾燥等により乾燥させた乾燥物を遺伝子導入用担体としてもよい。前記乾燥物であれば、後述する遺伝子導入剤を調製する際に、分散液を所望の濃度に調製し易いからである。
【００３６】
（実施形態２）
遺伝子導入剤
本発明の遺伝子導入剤は、前述のように、粘土鉱物を含む前記遺伝子導入用担体と、これに担持された遺伝子とを含む。
【００３７】
前記遺伝子導入剤において、前記遺伝子（Ａ）と粘土鉱物（Ｂ）との混合割合（重量比Ａ：Ｂ）は、１：０．００１〜１：１の範囲であることが好ましく、より好ましくは１：０．０１〜１：０．１の範囲、特に好ましくは１：０．０１〜１：０．０５の範囲である。
【００３８】
前記遺伝子導入用担体に担持させる遺伝子は、特に制限されないが、例えば、目的遺伝子を発現ベクターに組込んだ組換えプラスミド、あるいは、２本鎖ｃＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ等があげられる。また、このような遺伝子の種類は、本発明の用途等によっても適宜決定でき、例えば、遺伝子治療等のために目的遺伝子からのタンパク質合成を目的とする場合には、組換えプラスミドが好ましく、また、アンチセンス療法等を目的とする場合には、１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡが好ましい。
【００３９】
この遺伝子導入剤の形態としては、前記遺伝子導入用担体とこれに担持された遺伝子とを含んでいれば特に制限されず、例えば、これらが分散された分散液であってもよいし、凍結乾燥品であってもよい。また、前記分散液を凍結させた形態でもよく、この場合は、使用時に解凍すればよい。
【００４０】
次に、本発明の遺伝子導入剤について、遺伝子として組換えプラスミドを使用する場合の調製方法の一例を示す。まず、目的の遺伝子を組込んだ組換えプラスミドを含むプラスミド分散液と、前記粘土鉱物（遺伝子導入用担体）を含む粘土鉱物分散液とを調製する。
【００４１】
前記プラスミド分散液における組換えプラスミドの濃度は、特に制限されないが、例えば、１０〜１００μｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは１０〜５０μｇ／ｍＬ、特に好ましくは１５〜２５μｇ／ｍＬである。この分散液の分散媒は、特に制限されず、例えば、蒸留水、生理食塩水、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）等があげられ、また、後述するように培養細胞への遺伝子導入に使用する場合には、これらの他に液体培地等を用いてもよい。なお、これらの分散媒は、コンタミネーションを防止するために滅菌処理されていることが好ましい。前記プラスミド分散液のｐＨは、特に制限されず、例えば、中性付近があげられる。
【００４２】
前記粘土鉱物分散液における粘土鉱物の濃度は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１００μｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは０．１〜５０μｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．２〜２５μｇ／ｍＬである。この分散液の分散媒としては、前述と同様のものが使用できる。前記粘土鉱物分散液のｐＨも、前記プラスミド分散液と同様に特に制限されない。
【００４３】
そして、前記プラスミド分散液と粘土鉱物分散液とを混合することによって、遺伝子導入剤を調製できる。このように液中で組換えプラスミドと粘土鉱物とを混合することによって、粘土鉱物の層間に組換えプラスミドが入り込み、遺伝子が担持された複合体が形成できる。なお、前記プラスミド分散液と粘土鉱物分散液とを混合した前記遺伝子導入剤における、組換えプラスミド（Ａ）と粘土鉱物（Ｂ）との割合（重量比Ａ：Ｂ）は、前述と同様である。
【００４４】
また、前記プラスミド分散液と粘土鉱物分散液とを混合した混合液（遺伝子導入剤）は、さらに、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリリジン、ポリヒスチジン等のカチオン性ポリマーを含有してもよく、好ましくはＰＥＩである。このようにＰＥＩ等を含有することによって、より一層細胞内への導入効率を向上することができる。
【００４５】
このＰＥＩの添加順序は、例えば、前記プラスミド分散液と粘土鉱物分散液とを混合した後に添加することが好ましい。
【００４６】
また、前記ＰＥＩの添加割合は、特に制限されないが、例えば、プラスミド（Ａ）とＰＥＩ（Ｃ）の重量比（Ａ：Ｃ）が、例えば、１：１であることが好ましい。
【００４７】
前記プラスミド分散液と粘土鉱物分散液とを混合した混合液（遺伝子導入剤）は、通常、細胞や生体を対象とするため、そのｐＨは特に制限されないが、例えば、ｐＨは中性付近（例えば、ｐＨ約６．５〜７．５）に設定すればよい。また、前述のように、粘土鉱物の層間に交換性陽イオンを含み、前記層間に遺伝子がインターカレートし、前記層間の陽イオンに配位する場合あるいは粘土層との水素結合によって前記層間に担持される場合にも、同様に制限されず、例えば、中性付近のｐＨに調整すればよい。なお、このような遺伝子導入剤によれば、例えば、プラスミドを保持させた状態で、酸性条件下におかれた後であっても、影響を受けることとなく遺伝子の導入を行うことができる。このため、例えば、強酸性条件である胃を通過しても遺伝子導入が影響を受けることがなく、後述のような経口投与に適しているといえる。
【００４８】
この分散液形態の遺伝子導入剤は、このまま使用してもよいし、前述のように使用時まで凍結させてもよい。また、乾燥状態にする場合には、例えば、凍結乾燥、スプレードライ等の方法が適用でき、使用時に前述のような分散媒に分散させればよい。
【００４９】
（実施形態３）
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　での遺伝子導入方法
つぎに、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　で、培養細胞に前記遺伝子導入剤を用いて目的遺伝子を導入する遺伝子導入方法の一例を説明する。この方法では、目的遺伝子を導入する対象の培養細胞に、前記遺伝子導入剤を添加してインキュベートすればよい。本発明によれば、このように前記遺伝子導入剤を添加後インキュベートするだけで、前記目的細胞に目的遺伝子を導入することができる。
【００５０】
培養細胞は、予め、その種類に応じた液体培地で一定時間プレインキュベートした後に、前記遺伝子導入剤を添加して、さらにインキュベートすることが好ましい。このように、前記複合体溶液の添加前に予めプレインキュベートすることによって、例えば、培養細胞への遺伝子導入剤による遺伝子導入をスムーズに行うことができ、また、添加後、一定時間インキュベートを行うことによって、確実に導入遺伝子が核に到達し、転写あるいは翻訳が行われる。
【００５１】
前記液体培地の種類は、前述のように細胞に応じて適宜決定でき、特に制限されないが、例えば、細胞の成育環境を安定化できることから、血清を含むことが好ましい。リポフェクトアミンのような従来の遺伝子導入剤は、血清中のタンパク質が遺伝子導入を阻害する場合があるため、血清非存在下で細胞への導入を行う必要があったが、本発明の遺伝子導入剤であれば、血清存在下であっても十分に効率よく遺伝子の導入を行うことができる。
【００５２】
培養細胞に対する前記遺伝子導入剤の添加割合は特に制限されないが、例えば、細胞１×１０６個に対する粘土鉱物の添加割合が０．０１〜１００μｇの範囲となるように、前記遺伝子導入剤を添加することが好ましく、より好ましくは粘土鉱物の添加割合０．１〜５０μｇ、特に好ましくは０．２〜２５μｇである。また、細胞１×１０６に対するプラスミドの割合が１０〜１００μｇの範囲となるように、前記遺伝子導入剤を添加することが好ましく、より好ましくはプラスミドの添加割合１０〜５０μｇ、特に好ましくは１５〜２５μｇである。
【００５３】
目的遺伝子を導入する培養細胞としては、制限されないが、例えば、小腸、鼻粘膜、皮膚組織、皮下組織、骨組織、軟骨組織および歯周等の種々の細胞に本発明の方法を適用することができる。また、ヒト細胞やヒト以外の動物細胞、これらの他にも、例えば、微生物、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、昆虫等、全ての生物種の細胞にも適用できる。前記細胞培養に関しても、前述のように特に制限されず、細胞の種類に応じた公知の液体培地を用いて、公知の培養条件に従って行うことができる。
【００５４】
以下に培養条件の具体例を示すが、前述のように条件は培養細胞の種類に応じて適宜決定すればよいため、これらには限定されない。例えば、培養細胞に前記遺伝子導入剤を添加する前、予め、細胞を培養（プレインキュベート）する場合、その培養時間は、例えば、１８〜３０時間であることが好ましく、より好ましくは１８〜２４時間、特に好ましくは２２〜２４時間である。一方、前記遺伝子導入剤添加後のインキュベート時間は、例えば、前記組換えプラスミドが細胞内に導入されればよく、特に制限されないが、例えば、３時間以上であり、好ましくは１８時間以上、より好ましくは２４時間以上、特に好ましくは４８時間以上である。この時間の上限は、特に制限されないが、例えば、３時間〜７２時間程度に設定してもよい。培養温度は、通常、３７℃であり、５％二酸化炭素の存在下で培養することが好ましい。
【００５５】
以上の方法によって得られた、遺伝子を導入した細胞は、以下のような治療に使用することも可能である。例えば、ある疾患の原因となる欠損遺伝子等を本発明の導入方法によって培養細胞に導入する。そして、得られた遺伝子導入細胞を、その疾患の患部に投与する。そうすれば、投与した細胞における導入遺伝子より、コードされたタンパク質が発現し、この発現したタンパク質の供給によって、疾患の症状の緩和や治癒を図ることができる。なお、前記投与方法としては、例えば、患部への注射、担体に前記遺伝子導入細胞を担持させて、患部や皮下もしくは腹腔に埋め込む外科的処置等がある。
【００５６】
（実施形態４）
つぎに、ｉｎ　ｖｉｖｏ　で、細胞が生体細胞であって、生体に前記遺伝子導入剤を投与して、前記遺伝子導入剤により器官または組織の細胞に遺伝子を導入する一例を説明する。この方法では、前記遺伝子導入剤を、例えば、経口投与によって、または目的の器官や組織に外科的処置や注射等により投与するだけで、生体内の目的の細胞に前記目的遺伝子（アンチセンスも含む）を導入することができる。
【００５７】
生体の中でも、例えば、小腸細胞に遺伝子を導入する場合には、前記遺伝子導入剤を経口投与することが好ましい。経口投与は簡便であり、また投与量も治療の結果に応じて調整し易いことからも好ましく、しかも、本発明の遺伝子導入剤を使用した場合、目的遺伝子を選択的に確実に前記小腸細胞へ導入できるからである。このように小腸に選択的に遺伝子を導入できるのは、以下の理由によると考えられる。
【００５８】
前述のように、例えば、交換陽イオン型の層状粘土鉱物と遺伝子を混合させることによって、前記遺伝子は層間の前記陽イオンと置き換わり、そのリン酸基が前記層の水酸基と水素結合して前記層間に担持されることとなる。このように水素結合によって遺伝子が担持された、遺伝子と粘土鉱物との複合体は、ｐＨが酸性条件下であると電荷が大きくなるため、前記遺伝子は前記層間でしっかりと担持される。一方、中性またはアルカリ性条件下では、電荷が小さくなるために、水素結合が解離して遺伝子は遊離し放出される。前記粘土鉱物は、このようなメカニズムを持つため、前記遺伝子導入剤を経口投与すると、遺伝子を放出することなく酸性条件の胃を通過し、小腸へと達するのである。また、粘土鉱物であるため胃で消化されることもない。そして、小腸は中性付近のｐＨであって、胃に比べて電荷が小さくなるため、前記遺伝子導入剤の粘土鉱物から遺伝子が放出されるのである。従来の遺伝子導入用担体であるリポゾーム等は、経口投与すると胃で消化されてしまい、また、静脈注射した場合も様々な細胞に入り込むため、小腸への選択的投与が困難であった。しかし、このように本発明によれば、簡便な経口投与によって、小腸への選択的投与を容易に行うことが可能となるのである。
【００５９】
このような小腸への選択的な遺伝子導入剤の接触により、腸管免疫を利用したアレルギー治療を、簡便な経口投与で実現することもできる。例えば、各種アレルギーの原因となる遺伝子を遺伝子導入用担体に担持させて、遺伝子導入剤を調製し、これを定期的にアレルギー患者に経口投与する。すると、前記遺伝子導入剤は、小腸に運ばれ、小腸細胞内で選択的に目的遺伝子を放出するため、腸管免疫において免疫寛容の現象がおき、アレルギー症状が減退されるのである。このような方法は、従来の減感作療法に比べて、例えば、注射による頻回投与の必要性がなく、また、遺伝子を投与するため一度に大量のタンパク質が投与された際にみられるアナフィラキシーショックの危険性も少ないという理由等からも、患者への負担が少なく優れた療法であるといえる。また、腸内細胞は、通常、二週間程度で剥がれ落ちるため、遺伝子導入された細胞が長期間にわたって体内に残ることもないため、本発明を適用すれば、より一層安全性に優れた治療方法を提供できるといえる。
【００６０】
ｉｎ　ｖｉｖｏ　での前記遺伝子導入方法は、例えば、ヒトの生体にも適用でき、また、ヒト以外の動物の生体にも適用することができる。また、前記遺伝子導入剤の投与量は、その目的や生体の種類等に応じて適宜決定できるが、例えば、細胞と粘土鉱物または遺伝子の割合は、前述のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　での導入と同じ割合でもよい。
【００６１】
以上のように本発明のｉｎ　ｖｉｖｏ　での遺伝子導入方法によれば、安全性に優れた遺伝子の導入が可能になり、さらに経口投与を行えば、外科的処置や注射を行うことなしに、選択的に小腸への遺伝子導入が可能になるため、遺伝子治療に有用な方法であるといえる。
【００６２】
【実施例】
（実施例１）
粘土鉱物を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの、小腸上皮細胞への緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子の導入を行った。
【００６３】
１．粘土鉱物の精製
粘土鉱物としては、クニミネ工業製「クニピアＦ」（鉱物種：モンモリロナイト）を以下の方法で精製した精製品を使用した。
【００６４】
ａ）有機物処理
前記粘土５ｇに、６重量％過酸化水素水（和光、特級）１００ｍｌを加え、３０〜４０℃で発泡がなくなるまで加温した。発泡終了後、残留した過酸化水素を除くため、さらに２０分加温処理を行った。
【００６５】
ｂ）脱鉄処理
前記過酸化水素水で処理した前記粘土分散液２０ｍｌ（粘土含有量１ｇ）を、ウォーターバスで８０℃に加熱した。ここに０．３Ｍクエン酸ナトリウム（和光、特級）水溶液２００ｍｌおよび１Ｍ炭酸水素ナトリウム（和光、特級）水溶液２５ｍｌを加えマグネティックスターラーで撹拌した。十分に混合した後、さらに、ハイドロサルファイトナトリウム（和光、化学用）５ｇを加えて撹拌し、この混合溶液を１５分間静置した。この過程は全て８０℃で行った。
【００６６】
ｃ）ナトリウム型への誘導
脱鉄処理を行った混合溶液に塩化ナトリウム飽和水溶液５０ｍｌを加えて遠心分離を行った。回収した粘土に、前記飽和水溶液を再度添加して懸濁し、遠心分離を行った、遠心分離は、商品名クボタ　ＫＲ−２００００Ｔ（クボタ工業社製）を使用して、３０００Ｇ、１０分の条件で、計３回行った。
【００６７】
遠心分離によって回収した粘土に、０．３Ｍクエン酸ナトリウム水溶液２００ｍｌおよび飽和塩化ナトリウム水溶液　５０ｍｌを加えて懸濁洗浄し、再度遠心分離によって粘土を回収した。次に、回収した粘土に２重量％炭酸水素ナトリウム水溶液２５０ｍｌを加えて懸濁し、９０℃で１５分間加熱処理した後遠心分離を行った。さらに回収した粘土に、１Ｍ酢酸ナトリウム（和光純薬工業社製、特級）水溶液と１Ｍ塩化ナトリウム水溶液との混合液（体積比１：１）２００ｍｌを加えて洗浄し、遠心分離を行った。この洗浄処理は３回行った。つぎに、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いて、同様にして３回洗浄処理を行った。
【００６８】
ｄ）透析
遠心分離によって回収した粘土を蒸留水に懸濁し、この懸濁液を透析膜（商品名Ｓｅａｍｌｅｓｓ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｔｕｂｉｎｇ　（２０／３２）：ＶＩＳＫＡＳＥ　ＳＡＬＥＳ　ＣＯＲＰ．製）に入れ、蒸留水で透析した。透析後の粘土は、遠心分離によって回収し、凍結乾燥した。この凍結乾燥品をナトリウム型モンモリロナイト（遺伝子導入用担体）として使用した。
【００６９】
２．粘土と遺伝子の複合化
小腸上皮細胞に導入するプラスミドとしては、文献（Ｎｉｗａ，　Ｈ．，　Ｙａｍａｍｕｒａ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｍｉｙａｚａｋｉ，　Ｊ．：　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　　ｈｉｇｈ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｖｅｃｔｏｒ．　　Ｇｅｎｅ，　１０８，　１９３−１９９　（１９９１）．）に記載の方法で構築したプラスミドベクター　ｐＣＡＧＧＳ　に、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子（プロメガ社製）組み込んだ　組換えプラスミド　ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ　を使用した。
【００７０】
前記組換えプラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ　を含むプラスミド分散液（１００μｇ／ｍｌ）を、下記組成の液体培地（以下同じ）で５倍に希釈した。一方、凍結乾燥したナトリウム型モンモリロナイトを蒸留水に懸濁し、所定の濃度（２０、１０、２μｇ／ｍｌ）のモンモリロナイト分散液を調製した。さらに、前記モンモリロナイト分散液に液体培地を加えて、１０倍（体積）に希釈した。そして、前記希釈プラスミド分散液５００μｌと前記希釈モンモリロナイト分散液５００μｌとを混合して、トータル１ｍｌのプラスミド・モンモリロナイト複合体分散液とした。これらの複合体分散液におけるモンモリロナイトの最終濃度はそれぞれ１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌであり、また、プラスミド１０μｇ当たりのモンモリロナイト量はそれぞれ１μｇ、０．５μｇ、０．１μｇである。この複合体分散液を、ゴミ等の夾雑物を除去するために、３０Ｇで２分程度遠心して、その上澄み溶液５００μＬを遺伝子導入剤として、以下の工程に使用した。
【００７１】
（液体培地組成）
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ　（日水製薬社製）
１０％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（大日本製薬社製）
０．１　ｕｎｉｔ／ｍｌ　インシュリン（Ｓｉｇｍａ社製）
１００　ｕｎｉｔ／ｍｌ　ペニシリン（明治薬品社製）
１００μｇ／ｍｌ　　　ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）
５０　ｎｇ／ｍｌ　　ｆｕｎｇｉｓｏｎｅ（ナカライテスク社製）
【００７２】
３．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　での遺伝子導入
小腸上皮細胞は、ＡＴＣＣより分譲されたＩＥＣ−６（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ１５９２）を使用した。前記小腸上皮細胞の培養は、前記液体培地を使用し、炭酸ガス濃度が５％となるように炭酸ガスインキュベーターで調整した。
【００７３】
具体的には、６ｃｍ培養ディッシュ（ファルコン社製）に液体培地２．５ｍｌを加え、ここに小腸上皮細胞を１×１０６個播種して３７℃で２４時間培養した後、前記遺伝子導入剤５００μｌを加えた。これを３７℃で２４時間培養した後、全細胞を回収した。
【００７４】
なお、ブランクとして、組換えプラスミドを導入していない細胞を、対照例と、非ウイルスベクターであるＰＥＩによって前記組換えプラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ　を導入した細胞をそれぞれ調製した。ＰＥＩによる組換えプラスミドの導入は、以下に示す方法により行った。
【００７５】
前記プラスミド・モンモリロナイト複合体分散液の調製に使用した前記希釈プラスミド分散液５００μＬ（プラスミド２０μｇ）と、３０重量％ＰＥＩ溶液（商品名Ｐ−７０、和光純薬工業社製）を前記液体培地で５倍（体積）希釈した希釈液５００μＬとを混合した（プラスミド／ＰＥＩ重量比＝１／１）。この混合液５００μＬを、前記上澄み溶液の代りに遺伝子導入剤として使用する以外は、前述と同様にして培養細胞への遺伝子の導入を行った。
【００７６】
４．遺伝子導入の確認
前記回収した全細胞からｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　を抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ　法によってＥＧＦＰ遺伝子の転写産物を増幅させ、組換えプラスミド　ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ　による細胞内へのＥＧＦＰ遺伝子の導入を確認した。
【００７７】
まず、回収した前記全細胞から商品名Ｉｓｏｇｅｎｅ　（ニッポンジーン社製）を用いてそのプロトコールに従って　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　を抽出した。
【００７８】
つぎに、このｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　から、商品名ＢｃａＢｅｓｔ　ＲＮＡ　ｋｉｔ　（Ｖｅｒ．　１．１）（宝酒造社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。前記ＢｃａＢｅｓｔ　ＲＮＡ　ｋｉｔの使用条件は、キット添付のプロトコールに従った。
【００７９】
調製したｃＤＮＡを鋳型として、商品名　ＥｘＴａｑ　（宝酒造社製）および商品名ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ　サーマルサイクラー（バイオラッド社製）を用いたＰＣＲ法により、ＥＧＦＰ遺伝子転写産物を増幅させた。前記　ＥｘＴａｑ　キットの使用条件および試薬溶液等は、商品に添付のプロトコールに従った。なお、ＰＣＲによる増幅反応が正常に行われていることを確認するために、ポジティブコントロールとしてβ−アクチンのＲＮＡの増幅を共に行った。以下に、使用したプライマー配列およびＰＣＲの条件を示す。
【００８０】
（使用したプライマー）
センスプライマー　　　；　５’−ＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴ−３’　（配列番号１）
アンチセンスプライマー；　５’−ＧＴＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＴＣＡＣＧＡ−３’　（配列番号２）
【００８１】
2004065237.tif 000003
【００８２】
得られたＰＣＲ産物について、０．８％アガロースゲルを用いたアガロースゲル電気泳動を行った。マーカーとして、バイオラボ社製の　１００ｂｐ　ｌａｄｄｅｒ　マーカーを使用した。これら電気泳動の結果を図１に示す。
【００８３】
図１において、レーン１〜６は、小腸上皮細胞から抽出したｍＲＮＡの結果であり、レーンＭがマーカーである。レーン１および３は組換えプラスミドを導入してない細胞、レーン２はＰＥＩにより組換えプラスミドを導入した細胞についての結果である。そして、レーン４は、前記重量比が１：０．１０である遺伝子導入剤、レーン５は、前記重量比が１：０．０５である遺伝子導入剤、レーン６は、前記重量比が１：０．０１である遺伝子導入剤で、それぞれ処理した細胞の結果である。これらの中で、レーン４〜６が実施例、レーン１および３がブランク、レーン２が対照例である。なお、ＥＧＦＰ遺伝子の増幅長は２５０ｂｐであり、ＰＣＲポジティブコントロールのβ−アクチン遺伝子の増幅長は３５０ｂｐである。
【００８４】
図１に示すように、組換えプラスミドを導入していないブランクのレーン１および３には、ＰＥＩを用いた対照例のレーン２と同じ移動度にＥＧＦＰ遺伝子のバンドが検出されなかったのに対して、実施例のレーン４〜６では、前記対照例におけるＥＧＦＰ遺伝子のバンドと同じ移動度にバンドが検出された。このことから、モンモリロナイトを用いた実施例によれば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　において、従来のＰＥＩと同様に遺伝子導入を行えることがわかった。なお、レーン１〜６の全てのＰＣＲ産物についてβ−アクチンのバンドが検出されていることから、ＰＣＲが確実に行われていることは明らかである。
【００８５】
（実施例２）
粘土鉱物を用いて、ｉｎ　ｖｉｖｏでの小腸上皮細胞への緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子の導入を行った。なお、導入する組換えプラスミドとしては、前記実施例１で調製した　ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ　を使用し、粘土鉱物は、前記実施例１で調製したナトリウム型モンモリロナイトを使用した。
【００８６】
１．粘土と遺伝子の複合化
組換えプラスミドの希釈、ナトリウム型モンモリロナイトの懸濁・希釈には、滅菌済みの蒸留水を使用し、組換えプラスミド濃度が５０μｇ／３００μｌであるプラスミド分散液、ナトリウム型モンモリロナイト濃度が２．５μｇ／３００μｌのモンモリロナイト分散液を調製した。そして、前記両者を３００μＬずつ混合した分散液を、夾雑物除去のために３０Ｇ（５０ｒｐｍ）で２分程度遠心して、その上澄み溶液を遺伝子導入剤とする以外は、前記実施例１と同様にして、粘土と遺伝子の複合化を行った。
【００８７】
２．Ｉｎ　ｖｉｖｏ　での遺伝子導入
ＢＡＬＢ／Ｃ　マウス（♂）６週令に、ゾンデを用いて前記遺伝子導入剤５００μｌを投与した。そして、４８時間後、解剖して胃および小腸を取り出し、図２に示すように、胃と小腸とに分画して、それぞれホモジナイザーで破砕した。なお、小腸は長さ約１．５ｃｍとなるよう３つに分画した（同図において、小腸１、小腸２、小腸３）。破砕した各分画から、前記実施例１と同様にして、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの抽出および　ｃＤＮＡ　の調製を行い、増幅させたＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行った。この電気泳動によって、　ＥＧＦＰ遺伝子の転写産物を検出し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける、組換えプラスミド　ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ　による各組織細胞内へのＥＧＦＰ遺伝子の導入を確認した。なお、アガロースゲル電気泳動の条件は、前記実施例１と同様とした。
【００８８】
これらの電気泳動の結果を図３に示す。図３において、レーン１，５，９は胃についての結果、レーン２，６，１０は、小腸１についての結果、レーン３，７，１１は小腸２についての結果、レーン４，８，１２は、小腸３についての結果であり、レーンＭがマーカー（図１と同じ）である。また、レーン１〜４のグループＡ（同図においてＡ）は、組換えプラスミドを導入していないマウス、レーン５〜８のグループＢ（同図においてＢ、レーンＭは除く）は、ＰＥＩにより組換えプラスミドを導入したマウスの結果である。レーン９〜１２のグループＣ（同図においてＣ）は、組換えプラスミドとモンモリロナイトの重量比が１：０．０２である遺伝子導入剤で処理したマウスの結果である。これらの中で、グループＡがブランク、グループＢが対照例、グループＣが実施例である。なお、ＥＧＦＰ遺伝子の増幅長は２５０ｂｐであり、ＰＣＲコントロールのβ−アクチン遺伝子の増幅長は３５０ｂｐである。
【００８９】
図３の電気泳動に示すように、組換えプラスミドを導入していないブランクのレーン１〜４には、ＰＥＩを用いた対照例のレーン５〜８と同じ移動度にＥＧＦＰ遺伝子のバンドが検出されなかったのに対して、実施例のレーン９〜１２では、前記対照例におけるＥＧＦＰ遺伝子のバンドと同じ移動度にバンドが検出された。このことから、モンモリロナイトを用いた実施例によれば、ｉｎ　ｖｉｖｏ　において、従来のＰＥＩと同様に遺伝子導入を行えることがわかった。なお、レーン１〜１２の全てにおいてβ−アクチンのバンドが検出されていることから、全てについてＰＣＲによって増幅されていることは明らかである。
【００９０】
（実施例３）
粘土鉱物およびＰＥＩを用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの小腸上皮細胞へのβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子の導入を行った。なお、導入する組換えプラスミドとしては、前記実施例１と同じプラスミドベクターに、ｌａｃＺ遺伝子を組み込んだ組換えプラスミド　ｐＣＡＧＧＳ−ｌａｃＺ　を使用した。
【００９１】
前記実施例１で調製した上澄み溶液（実施例１における遺伝子導入剤）１００μｌに、さらにＰＥＩ　１μｇを添加した。これを遺伝子導入剤として使用し、前記実施例１と同様にして小腸上皮細胞に遺伝子導入を行った。なお、前記遺伝子導入剤におけるプラスミドと粘土鉱物とＰＥＩの重合比は、「１：０．０１：１」である。また、比較例として、前記組換えプラスミドのみ１μｇを投与し、対照例として、前記実施例１と同じ条件でＰＥＩにより前記組換えプラスミドを導入した（プラスミド：ＰＥＩ重合比＝１：１）。
【００９２】
そして、遺伝子導入の後、細胞を２４時間培養（培養液１００ｍｌ）した。培養後、前記培養液にグルタルアルデヒドを終濃度１％となるように添加し、細胞を５〜１０分固定した。そして、前記細胞を洗浄した後、下記組成のＸ−ｇａｌ溶液を添加して３７℃でインキュベートした。このＸ−ｇａｌ（５−フ゛ロモ−４−クロロ−３−イント゛リル−β−Ｄ−カ゛ラコヒ゜ラノシト゛）染色によって、ｌａｃＺ遺伝子の導入および発現を確認した。なお、ｌａｃＺ遺伝子が導入され、ｌａｃＺを発現した細胞は、Ｘ−ｇａｌの分解により青色に染色され、ｌａｃＺ遺伝子が導入されていない細胞は染色されない。
【００９３】
2004065237.tif 000004
【００９４】
これらの結果を図４に示す。図４は、遺伝子導入を行った細胞について、発現したｌａｃＺによるＸ−ｇａｌ分解（青色発色）の有無を示す写真であり、同図（Ａ）はプラスミドのみを添加した比較例であり、（Ｂ）はＰＥＩにより遺伝子導入を行った対照例、（Ｃ）が実施例３の結果である。前記（Ａ）に示すように、プラスミドのみを添加した場合、青色コロニーは確認されず、プラスミドが導入されなかったことがわかる。また、前記（Ｃ）に示す実施例３は、（Ｂ）に示すＰＥＩのみで遺伝子導入を行った対照例に比べて、青色コロニーが多く確認された。このことから、プラスミドと粘土鉱物との複合体である本発明の遺伝子導入剤に、さらにＰＥＩを添加することによって、遺伝子導入効率がさらに向上されるといえる。
【００９５】
（実施例４）
本発明の遺伝子導入剤について、ｐＨ（強酸性）の影響を確認した。前記実施例１で調製した上澄み溶液（実施例１における遺伝子導入剤）１００μｌに、さらにＰＥＩ　１μｇを添加した。そして、この溶液を塩酸によってｐＨ１に調整し、室温で３０分間処理した後、水酸化ナトリウムによって再度ｐＨを中性に戻した。これを遺伝子導入剤として使用した以外は、前記実施例３と同様に遺伝子導入を行い、ｌａｃＺの発現を同様にして確認した。
【００９６】
これらの結果を図５に示す。図５は、遺伝子導入を行った細胞について、発現したｌａｃＺによるＸ−ｇａｌ分解（青色発色）の有無を示す写真であり、同図（Ａ）はプラスミドのみを添加した比較例であり、（Ｂ）はＰＥＩにより遺伝子導入を行った対照例、（Ｃ）が実施例４の結果である。前記（Ａ）に示すように、プラスミドのみを添加した場合、青色コロニーは確認されず、プラスミドが導入されなかったことがわかる。また、前記（Ｃ）に示す実施例３は、（Ｂ）に示すＰＥＩのみで遺伝子導入を行った対照例に比べて、青色コロニーが多く確認された。さらに、前記実施例３の結果を示す図４（Ｂ）と、図５（Ｂ）とをそれぞれ比較した結果、図４（Ｂ）に比べて、図５（Ｂ）では青色コロニーがかなり減少していることがわかる。つまり、ＰＥＩのみを使用した場合、強酸条件下での処理によって、遺伝子導入効率が低下したといえる。これに対して、図５（Ｃ）と図４（Ｃ）とを比較しても、青色コロニーの数はほとんど違いが見られてなかった。つまり、本発明の遺伝子導入剤によれば、強酸条件にさらされても遺伝子導入が影響を受けにくく、優れた効率で遺伝子導入を行うことができるといえる。したがって、例えば、強酸条件である胃を通過できるといえ、前述のような経口投与での使用に適していると言える。
【００９７】
【発明の効果】
このように、本発明の遺伝子導入用担体を用いれば、高い安全性で細胞に目的遺伝子を導入することができる。このため、前記遺伝子導入用担体を用いた本発明の遺伝子導入方法は、遺伝子工学の研究分野や臨床医療の分野において、非常に有用である。
【００９８】
【配列表】
2004065237.tif 000005
2004065237.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例において、遺伝子導入細胞の転写産物の電気泳動図である。
【図２】本発明のその他の実施例において、遺伝子を導入したマウスの胃および小腸の切断部位を示した概略図である。
【図３】前記実施例において、遺伝子導入細胞の転写産物の電気泳動図である。
【図４】本発明のさらにその他の実施例において、遺伝子導入を行った細胞について、発現したｌａｃＺによるＸ−ｇａｌ分解（青色発色）の有無を示す写真である。
【図５】本発明のさらにその他の実施例において、遺伝子導入を行った細胞について、発現したｌａｃＺによるＸ−ｇａｌ分解（青色発色）の有無を示す写真である。
【図１】
2004065237.tif 000007
【図２】
2004065237.tif 000008
【図３】
2004065237.tif 000009
【図４】
2004065237.tif 000010
【図５】
2004065237.tif 000011