(57)【要約】【課題】　非共有結合的に複合体を形成した、多価プロテオソームサブユニットワクチンの産生のための改善された方法を提供する。【解決手段】　プロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセスであって、以下の工程：　ａ）プロテオソーム、透析可能な界面活性剤、および両親媒性決定因子の混合物を形成する工程、　ｂ）この混合物をダイアフィルトレーションまたは限外濾過に供してこの界面活性剤を除去することにより、両親媒性決定因子−プロテオソーム複合体を形成する工程、　ｃ）両親媒性決定因子−プロテオソーム複合体形成の量をモニターする工程、および　ｄ）この両親媒性決定因子−プロテオソーム複合体を回収する工程、を包含する、プロセス。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　プロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセスであって、以下の工程：
　ａ）プロテオソーム、透析可能な界面活性剤、および両親媒性決定因子の混合物を形成する工程、
　ｂ）該混合物をダイアフィルトレーションまたは限外濾過に供して該界面活性剤を除去することにより、両親媒性決定因子−プロテオソーム複合体を形成する工程、
　ｃ）両親媒性決定因子−プロテオソーム複合体形成の量をモニターする工程、および
　ｄ）該両親媒性決定因子−プロテオソーム複合体を回収する工程、
を包含する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　（１．発明の分野）
　本発明は、粘膜投与および非経口投与のための、非共有結合的に複合体を形成した多価プロテオソームワクチンの産生方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
　（２．発明の背景）
　多価サブユニットワクチンが、その構成要素の各々に対する至適な免疫応答を刺激するためには、適切な構成要素が、適切に会合し、そして各々が免疫系に利用可能であるべきであり、これによりそれらが免疫系の細胞によって効率的に認識されそしてプロセスされ得る。このような非共有結合的に複合体を形成したワクチンの主要な例としては、ペプチド、リポペプチド、トランスメンブランタンパク質またはトキソイドタンパク質、多糖類またはリポ多糖類（ＬＰＳ）（１９８７年６月２３日に出願された米国特許出願第０７／０６５，４４０号「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」；１９８９年４月１２日に出願された同第０７／３３６，９５２号「Ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｌａｒｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」；１９９２年１０月８日に出願された同第０７−９５８，４２６号「Ｏｒａｌ　ｏｒ　Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　Ｈａｖｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ　ａｎｄ　Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」；１９９３年３月１１日に出願された同第０８／０２９，６６６号「Ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」；１９９３年１０月２９日に出願された同第０８／１４３，３６５「Ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」；１９９３年１０月２９日に出願された同第９３／１０，４０２号「Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ　Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ　ａｓ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」；１９９４年５月１８日に出願された同第０８／０６３，６１３号「Ｓｏｌｉｄ　Ｆａｔ　Ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ　ａｓ　Ｖｅｈｉｃｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、ならびに刊行物Ｏｒｒ，　Ｎ．，　Ｒｏｂｉｎ，　Ｇ．，　Ｃｏｈｅｎ，　Ｄ．，　Ａｒｎｏｎ，　Ｒ．およびＬｏｗｅｌｌ，　Ｇ．　Ｈ．　（１９９３）．　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　Ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ　Ｏｒａｌ　ｏｒ　Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ　Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ　２ａ　ａｎｄ　Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｏｎｎｅｉ　Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ−Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｉｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｍｏｄｅｌｓ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　６１：２３９０；　Ｍａｌｌｅｔｔ，　Ｃ．　Ｐ．，　Ｔ．　Ｌ．　Ｈａｌｅ，　Ｒ．　Ｋａｍｉｎｓｋｉ，　Ｔ．　Ｌａｒｓｅｎ，　Ｎ．Ｏｒｒ，　Ｄ．　Ｃｏｈｅｎ，およびＧ．　Ｈ．　Ｌｏｗｅｌｌ．　１９９５．　Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ　ｏｒ　ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ−Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｐｒｏｔｅｃｔ　ａｇａｉｎｓｔ　ｌｅｔｈａｌ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ｉｎ　ａ　ｍｕｒｉｎｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．　６３：２３８２−２３８６．；　Ｌｏｗｅｌｌ　ＧＨ，　Ｋａｍｉｎｓｋｉ　ＲＷ，　Ｇｒａｔｅ　Ｓら、（１９９６）　Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ　ａｎｄ　ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ　ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ−ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ｂ　（ＳＥＢ）　ｔｏｘｏｉｄ　ｖａｃｃｉｎｅｓ：　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃａｃｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ｌｅｔｈａｌ　ＳＥＢ　ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｉｃｅ．　Ｉｎｆｅｃ．　Ｉｍｍｕｎ．　６４：１７０６−１７１３．；　Ｌｏｗｅｌｌ，　Ｇ．Ｈ．　（１９９０）　Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ，　Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　Ａｎｃｈｏｒｓ，　Ｉｓｃｏｍｓ　ａｎｄ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｆｏｒ　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ．　ｉｎ　Ｎｅｗ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ：　Ｇ．　Ｃ．　ＷｏｏｄｒｏｗおよびＭ．　Ｍ．　Ｌｅｖｉｎｅ編（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，　ＮＹ）．第１２章（１４１−１６０頁）およびＬｏｗｅｌｌ，　Ｇ．Ｈ．，　Ｗ．Ｒ．　Ｂａｌｌｏｕ，　Ｌ．Ｆ．　Ｓｍｉｔｈ，　Ｒ．Ａ．　Ｗｉｒｔｚ，　Ｗ．Ｄ．　Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｗ．Ｔ．　Ｈｏｃｋｍｅｙｅｒ．　１９８８．　Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ−ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓ：　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｆｏｒ　ｍａｌａｒｉａ　ＣＳ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：８００．）を含む種々の抗原と非共有結合的に複合体を形成した、ナイセリア属の外膜タンパク質プロテオソームからなり得るプロテオソームワクチンが挙げられる。
【０００３】
　本明細書中に引用される全ての文献の内容は、明白に参考として援用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
　疾患に対して防御するためのワクチン投与における実際の適用については、個体が、種々の生物によって引き起こされる疾患の罹患（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）に感受性であるという事実に通常起因して、いくつかのこのような抗原を同時に送達することがしばしば必要である。さらに、いくつかの生物が、それらが互いに関連していてもいなくても、しばしば同一の場所に特有であり、そしてそれゆえ防御を必要とする個体は、いくつかの型のワクチンを接種する必要があり得る。
【０００５】
　過去において、構成要素の非共有結合的複合体形成を必要とするワクチンの産生は、単純な透析を用いて達成されてきた。その透析においては、構成要素が透析可能な界面活性剤の存在下で透析用チューブに入れられ、その混合物は界面活性剤を除去する目的で７〜１０日間透析される。このシステムの実施上の欠点は、以下を含むいくつかの理由によりこの技術の高度な開発および商業化をひどく妨害する傾向がある。１）時間：手順時間の長さ：ワクチンを透析している間にＧＭＰ供給源を何週間も用いる必要があることは、それにかかる過剰の費用およびこの長時間の間に起こる機械的もしくは生物学的な構成要素の分解もしくは汚染の機会を増大することの両方の理由により非実用的である。２）汚染：汚染の機会の増加：透析用チューブは滅菌することが難しく、透析用チューブは手で系を開けたり閉じたりすることを必要とし、それにより構成要素を入れるプロセスおよび取り出すプロセスの両方の間に、構成要素を汚染に曝す。チューブに入れる作業とチューブから取り出す作業との間に何日もあるので、プロセスの最初の日々における小さな混入の危険性が、何日もの透析の間に容易に拡大され得、この方法を実際的なワクチン製造のためには役立たないものにする。バッグに孔を開ける危険性は、産物が損失する結果となり得る。３）温度：関与する長期にわたる時間のために、この透析を４℃で行う必要性がある。４）透析する液体の容積：プロセスのスケールアップのためのワクチンを製造するために、多量の透析液の使用が必要である。なぜなら、透析チューブの外側の液体：透析用チューブの内側の液体の比、２００：１が、代表的には要求されるからである。従って、例えば、試験用の２リットルのワクチンの産生には、チューブの外液を１日あたり４００リットル、１０日あたり４，０００リットル必要とし、そして生産用の２０〜２００リットルの産生には、４０，０００〜４，０００，０００リットルを必要とする。これらの量は、本発明において使用する方法と比べて、浪費的でありそして非実践的である；多量の産物は問題が多いので、透析用チューブは計測不能である。そして５）ワクチンの効果を最大にするように界面活性剤の除去の完了を容易に測定することができない。透析用バッグは、２００容積の緩衝液を含む容器の中に置かれるので、界面活性剤除去の継続的な測定は、実践的でなく、また実行可能でもない。そして６）さらに、好ましい実施態様において使用される界面活性剤、Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢの存在の測定について記載されている方法はない。
【０００６】
　本発明において解決される第２の問題は、多価ワクチンの産生および送達の方法の実証である。構成要素は、一緒にまたは別々にのいずれかで作製され、そして投与前に一緒に混合され得る。本発明は、このような多価ワクチンを調製するための至適な方法を実証する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
　（３．発明の要旨）
　本発明の主題は、非経口投与または特に粘膜投与のいずれかについて設計されたプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンの産生および製造に広く関する。粘膜投与としては、呼吸性（例えば、鼻腔内、咽頭内、および肺内を含む）投与、胃腸性（例えば、経口または直腸を含む）投与、または局所性（例えば、結膜または耳を含む）投与が挙げられるがこれらに限定されず、これらは全身性（血清）抗体応答および粘膜性（呼吸性および胃腸性を含む）抗体応答の両方を誘導する。両親媒性決定因子は、疎水性および親水性の領域を有する分子であり、プロテオソームとともに適切に処方された場合には、プロテオソームと連携して、被験体に免疫応答を生じさせる複合体を形成する。代表的な両親媒性決定因子には、糖脂質、リポ糖類（無毒化されたリポ多糖類を含む）、リポペプチド、トランスメンブランタンパク質、エンベロープタンパク質もしくはトキソイドタンパク質、または内因性の疎水性アミノ酸アンカーを有するタンパク質もしくはペプチドが含まれる。これらの決定因子物質は、エシェリキア属、クレブシエラ属、シュードモナス属、ヘモフィルスブルセラ属、赤痢菌属、およびナイセリア属を含むグラム陰性細菌から得られ得る。より詳細には、本発明は、プロテオソームワクチンに関する。このプロテオソームワクチンにおいては、髄膜炎菌性の外膜タンパク質プロテオソーム調製物（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）または淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、もしくは他のナイセリア属の種の任意の株から調製される）が、天然のまたは無毒化された赤痢菌またはナイセリア属のリポ多糖類もしくはリポオリゴ糖類と非共有結合的に複合体化し、その結果、髄膜炎菌または赤痢菌を含む複合体の、任意の構成要素部分を含むグラム陰性生物によって引き起こされる疾患に対して防御するように設計されたワクチンを形成する。より詳細には、本発明は、赤痢菌リポ多糖類の型特異的菌体（ｓｏｍａｔｉｃ）多糖Ｏ抗原を認識し、それにより細菌性赤痢に対して同一防御を与える抗体応答を誘導するＬＰＳを含むプロテオソームワクチンに関する。なおより詳細には、プロテオソームと複合体化する場合、このような抗赤痢菌防御性免疫応答を誘導するリポ多糖類は、相同な生物または抗原的に交差反応する生物由来のＬＳＰを用いて、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｏｎｎｅｉ）病に対する免疫についてソンネ赤痢菌またはプレジオモナスシゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ　ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）のいずれかから、フレクスナー赤痢菌２ａ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　Ｆｌｅｘｎｅｒｉ　２ａ）病に対する免疫についてフレクスナー赤痢菌２ａから調製および精製され、フレクスナー赤痢菌２ａ（または３ａなど）、ボイド赤痢菌（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）、ソンネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）などによって引き起こされる細菌性赤痢に対する同一免疫を与える。なおより詳細には、本発明は、フレクスナー赤痢菌２ａ（フレクスナー赤痢菌２ａ病について）、およびプレジオモナスシゲロイデスまたはソンネ赤痢菌（ソンネ赤痢菌病について）由来の赤痢菌ＬＰＳを用いて独立に作製された、２つのプロテオソームワクチンが、一緒に投与され、それにより２つの生物を認識する抗体を誘導し、それにより２つの型の疾患に対しての防御を与える点において多価であるプロテオソーム−赤痢菌ワクチンの首尾良い投与を記載する。最も詳細には、本発明は、プロテオソーム−赤痢菌ＬＰＳワクチンに関し、グループＢ２ｂ型髄膜炎菌由来のプロテオソームが、中空繊維ダイアフィルトレーション技術を用いてプレジオモナスシゲロイデスＬＰＳと複合体化し、粘膜経路、呼吸経路、および／または胃腸経路により投与され、ソンネ赤痢菌の菌体Ｏ抗原ＬＰＳを認識し、それによりこの生物によって引き起こされる細菌性赤痢に対して防御する抗体を誘導するワクチンを産生する。他の従来の限外濾過／ダイアフィルトレーション（例えば、プラットフォームメンブレンおよびメンブレンカートリッジ）が、考察される。
【０００８】
　本発明は、非共有結合的に複合体化したワクチンを、以下に記載する様式で産生する方法論を提供する；１）必要な時間を減少させる、２）汚染の機会を減少させる、３）このようなワクチンが産生され得る温度を室温にまで上昇させる、４）最小限の試薬の使用を必要とするように、産生プロセスの効率的なスケールアップを可能にする、５）透析物の信頼のおけるそして効率的なサンプリングを可能にし、界面活性剤の除去速度を反復的に測定し得、そうして作業の効率を至適化する。これは、ワクチンの複合体化の効率を直接増大させ、その結果より低い用量で測定可能により大きな免疫原性を有するワクチンを産生する。このようにして、産物の全体の質が顕著に増強される。６）さらに、好ましい実施態様において使用される界面活性剤、Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢの存在を測定する方法が記載される。他の透析可能な界面活性剤が、Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢの代わりに使用され得る。さらに、本発明の方法を用いて、ワクチンが、ワクチン免疫原性により測定される至適なワクチン効力を保持する様式で凍結乾燥、そして再水和され得る。
【０００９】
　本発明の方法は、界面活性剤の除去によって複合体化をもたらすための中空繊維限外濾過／ダイアフィルトレーションカートリッジの使用を包含する。カートリッジのハウジングの大きさを変えることにより、多くのワクチンを産生するための透析時間が＞７〜１０日から７２時間未満に、そして通常４８または２４時間未満に減少され得る。この短時間が用いられるので、産物のプロセスまたは完全性を損なわずに反応温度を４℃から通常の室温にまで上昇させ得る。プロセスは約２０℃で行われたが、０℃〜４０℃の間の温度が意図される。このシステムは閉鎖されるので、汚染の可能性が高度に減少される。さらに、ハウジングの大きさを増大することにより、非常に大量の材料が、比較的短時間内に処理され得、それにより商業的開発のための手順の効率的なそして再現性のあるスケールアップを可能にする。さらに、透過物が界面活性剤の除去を測定するために反復的にサンプルされ得る。これは、界面活性剤Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢ（好ましい実施態様において使用される界面活性剤）の存在を測定するための本発明の試験を用いて達成され得る。本発明の方法論の独自性は、実験での評価が必要であった。なぜなら、定常的な透析用バッグを用いて７〜１０日間かけてゆっくりと透析することによって達成された免疫原性物質へのワクチンの複合体化および構造が、中空繊維技術（ここでは、複合体化される部分が、定常的な透析用チューブの流速に比べて非常に高い流速でチューブを通して移動している）を用いる際に、匹敵され得るかまたは改善され得るかが明白ではなかったからである。
【００１０】
　用いたメンブレンの見かけの分子量カットオフが、１，０００、３，０００、５，０００、１０，０００、３０，０００、５０，０００、またはそれより大きいものから選択され得るので、非共有結合的に複合体化されるべき構成要素の大きさに依存して、このシステムは、天然または無毒化されたリポ多糖類、脂質、ペプチド、リポペプチド、リポ糖類、多糖類、ガングリオシド、またはトランスメンブランタンパク質、エンベロープタンパク質もしくは天然のタンパク質もしくはトキソイドタンパク質を、互いに、またはプロテオソームの髄膜炎菌外膜タンパク質調製物に複合体化させることに容易に適応可能である。
【００１１】
　得られる産物は、非経口的に、または粘膜から（すなわち、呼吸管または胃腸管を介して、例えば、鼻腔内から、経口的に、口咽頭吸入により、局所的に、または直腸から）のいずれかで投与されるワクチンとして使用され得る。記載される実施例において、プロテオソームは、プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳと非共有結合的に複合体を形成し、ソンネ赤痢菌性赤痢に対する防御のために必要な抗ソンネ赤痢菌ＬＰＳ応答を誘導するワクチンを形成する。
【００１２】
　本方法論は、３つの段階を有する：予備的作業；プロテオソームと両親媒性決定因子（例えば、プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳ）との複合体化；その後の滅菌濾過。
【００１３】
　多価ワクチンを至適に送達するために、本発明は最良の方法が、特定のワクチンを独立に作製し、次いで２つの個々に作製されたワクチンを用いて、同日にそれぞれ至適な濃度で免疫することであることを示す。非共有結合的複合体の形成される間にハイブリッドワクチンを作製するような他の可能性もまた、達成されているか、または考慮されている。
【００１４】
　（５．発明の詳細な説明）
　本発明は以下を提供する。
（１）プロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセスであって、以下の工程：
　ａ）プロテオソーム、透析可能な界面活性剤、および両親媒性決定因子の混合物を形成する工程、
　ｂ）この混合物をダイアフィルトレーションまたは限外濾過に供してこの界面活性剤を除去することにより、両親媒性決定因子−プロテオソーム複合体を形成する工程、
　ｃ）両親媒性決定因子−プロテオソーム複合体形成の量をモニターする工程、および
　ｄ）この両親媒性決定因子−プロテオソーム複合体を回収する工程、
を包含する、プロセス。
（２）上記限外濾過が、接線方向流を含む、項目１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（３）上記限外濾過が、中空繊維カートリッジ、プラットフォームメンブレン、およびメンブレンカートリッジから選択されるシステムにおいて行われる、項目１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（４）上記限外濾過システムが、１０，０００のＮＭＷＣ孔サイズを有する中空繊維カートリッジである、項目３に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（５）上記限外濾過システムが、３，０００のＮＭＷＣ孔サイズを有する中空繊維カートリッジである、項目３に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（６）上記透析可能な界面活性剤をモニターする工程が、浸透する試料の継続的な測定を包含する、項目１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（７）上記モニターする工程が、透過物試料または滞留物試料の光学密度を測定する工程を包含する、項目１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（８）上記モニターする工程が、透過物試料を、界面活性剤が存在する場合に、既知量のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と混合して沈澱を形成し、そして沈澱の量を決定することにより、界面活性剤除去の量を測定する工程を包含する、項目１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（９）上記透過物中の上記界面活性剤が本質的に除去されたときに、ＬＰＳ−プロテオソーム複合体が回収される、項目８に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（１０）上記界面活性剤がＥｍｐｉｇｅｎ　ＢＢである、項目１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（１１）上記両親媒性決定因子がリポ多糖である、項目１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（１２）上記リポ多糖がグラム陰性細菌から得られる、項目１１に記載のプロテオソーム−リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
（１３）上記グラム陰性細菌がプレジオモナスである、項目１２に記載のプロテオソーム−リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
（１４）上記プレジオモナスがプレジオモナスシゲロイデスである、項目１３に記載のプロテオソーム−リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
（１５）上記グラム陰性細菌が赤痢菌属である、項目１２に記載のプロテオソーム−リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
（１６）上記赤痢菌属が、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌、またはボイド赤痢菌である、項目１５に記載のプロテオソーム−リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
（１７）上記グラム陰性菌がナイセリア属である、項目１２に記載のプロテオソーム−リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
（１８）上記ナイセリア属が髄膜炎菌である、項目１７に記載のプロテオソーム−リポ多糖ワクチンを調製するためのプロセス。
（１９）上記プロテオソームが、髄膜炎菌または淋菌に由来する、項目１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（２０）上記ＬＰＳ−プロテオソーム複合体の回収が、界面活性剤除去のモニターされた割合が減少している場合か、または一定の場合に、達成される、項目１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（２１）項目１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセスであって、以下の工程：
　ｅ）上記回収されたプロテオソーム−両親媒性決定因子複合体を、生理学的に受容可能なキャリアと混合してワクチンを形成する工程、
をさらに包含する、プロセス。
（２２）ＬＰＳ−プロテオソーム複合体を上記複合体の回収前に濃縮する工程をさらに包含する、項目２１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（２３）上記濃縮が、所望の最終濃度まで継続される、項目２２に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（２４）上記プロセスが、異なる両親媒性決定因子型を用いて行われて、一連のプロテオソーム−両親媒性決定因子複合体が形成され、ここでこの複合体は多価ワクチンを形成するように工程ｅ）においてアゼンブリされる、項目２１に記載のプロテオソーム−両親媒性決定因子ワクチンを調製するためのプロセス。
（２５）項目２４に記載のプロセスによって調製される多価ワクチン。
（２６）有効量でレシピエントに投与することによって疾患に対して防御するための、項目２５に記載のワクチン。
（２７）レシピエントに投与することによって疾患に対して防御するための、項目２１に記載のプロセスに従って調製されるワクチン。
（２８）項目２１に記載のプロセスによって調製される多価ワクチン。
【実施例】
【００１５】
　（実施例１）
　本実施例は、約２〜３グラムのタンパク質を含むプロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスワクチンの産生について詳述する。手順は、メンブレンカートリッジのハウジングの大きさの適切なスケールアップおよび容量の適切な増加を伴って、１０〜１０００倍多い材料を用いたスケールアップについても、等しく適用可能である。複合体化されるべき抗原を保持するために適切な大きさの分子量カットオフを有する、適切な大きさのメンブレンを用いて、本実施例の手順は、プロテオソームと、他の天然もしくは無毒化されたリポ多糖類、脂質、ペプチド、リポペプチド、リポ糖類、多糖類、ガングリオシド、またはトランスメンブランタンパク質、エンベロープタンパク質もしくは天然のタンパク質もしくは無毒化されたタンパク質との、互いとの、あるいはプロテオソームの髄膜炎菌外膜タンパク質調製物との複合体化にも等しく適用可能である。Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢは、本実施例の手順において例として使用される界面活性剤である；本実施例の手順は、構成要素を可溶化する任意の透析可能な界面活性剤に、等しく適用可能である。本実施例の手順は、Ａ／Ｇ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのカートリッジを使用するが、任意のブランドのカートリッジタイプの限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムに等しく適用可能である。
【００１６】
　（５．０．０．１　予備的作業）
　５．０．０．１．　３０％　Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢ（これは、本実施例のプロセスにおいて用いられる界面活性剤である）のストック溶液を滅菌濾過する。
【００１７】
　５．０．０．２．　２×ＴＥＥＮ／２％Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢ（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．０２ＭナトリウムＥＤＴＡ、０．３Ｍ塩化ナトリウム、ＷＦＩ、および２％Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢ、ｐＨ　８．０）を調製する。
【００１８】
　５．０．０．３．　０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ　８．０）を含むＴＮＳ（Ｔｒｉｓ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｓａｌｉｎｅ）の溶液１５０Ｌを、界面活性剤を透析除去する目的で調製する。
【００１９】
　５．０．０．４．　ＵＦカートリッジ洗浄のために、１０リットルの水酸化ナトリウムを調製する。
【００２０】
　５．０．０．５．　必要な量のフレクスナー赤痢菌２ａリポ多糖（ＬＰＳ）を解凍する。
【００２１】
　（５．０．１．　プロテオソームとフレクスナー赤痢菌２ａ　ＬＰＳとの複合体化）
　５．０．１．６．　等容量の２×ＴＥＥＮ緩衝液をＬＰＳの容量に添加し、そして十分に混合する。
【００２２】
　５．０．１．７．　ある量のバルクプロテオソームを解凍し、ｍｇで測定し、工程５で解凍したＬＰＳの量に等しくする。
【００２３】
　５．０．１．８．　このプロテオソームに、１リットルあたり３０ｍｌの滅菌濾過したＥｍｐｉｇｅｎを添加する。十分に混合し、そして工程５からのＬＰＳと混ぜ合わせる。
【００２４】
　５．０．１．９．　両方の構成要素を十分に混合する。通常、撹拌プレート上での１５分間と撹拌棒の組合せが適切である。
【００２５】
　５．０．１．１０．　プロテオソーム複合体が形成され得るように界面活性剤を透析除去するために、１０，０００の見かけの分子量カットオフ（ＮＭＷＣ）孔サイズを有する、滅菌されたシリコンチューブおよび蠕動ポンプに連結された中空繊維カートリッジ（Ａ／Ｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．によって製造される）を用いて、限外濾過システム（接線方向流技術に基づく）をセットアップする。衛生圧力計をカートリッジの入水口側および出水口側に取り付け、作業の間中圧力をモニターする。背圧バルブを、背圧を調節するためにカートリッジの出水口側に取り付ける。
【００２６】
　５．０．１．１１　限外濾過システムを、温度５０℃で６０分を超える時間、ＷＦＩおよび０．５Ｎ　ＮａＯＨで洗浄しそして衛生化する。このシステムを、使用前に、ＷＦＩでフラッシュし、そしてＴＮＳ緩衝液で平衡化する。
【００２７】
　５．０．１．１２．　入水口の液体を容器から吸引し、そして回復（ｒｅｔｕｒｎ）滞留物を同じ貯蔵槽に戻すように、滅菌貯蔵槽容器を並べて配置する。液体が、カートリッジメンブレン（浸透または濾過）を通過したら、ＴＮＳ緩衝液を、直接添加することによるか、または連続的給送システムによるかのいずれかで補充する。試料貯蔵槽へのＴＮＳ緩衝液を含む容器にシリコンチューブを連結することにより、連続的給送システムをセットアップし、次いで試料貯蔵槽を密閉する。液体が濾過により試料貯蔵槽から除去されるにつれ、真空が形成され、「ＴＮＳ」緩衝液がその容器から試料貯蔵槽に吸引される。システムが密閉されたままであれば、貯蔵槽の試料のレベルは一定に保たれる。
【００２８】
　５．０．１．１３．　ダイアフィルトレーションを開始するために再循環ポンプを始動する。ポンプスピードおよび背圧バルブを調節し、１５±４ｐｓｉの背圧を得る。
【００２９】
　５．０．１．１４．　Ｅｍｐｉｇｅｎ　Ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ　Ｔｅｓｔを用いて、１０〜１５リットル毎に取り出される透過物試料を試験することにより、Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢの累進的除去を評価する。この試験は、チェッカーボード型のアッセイを形成するために、透過物および既知量のＥｍｐｉｇｅｎ　ＢＢを含む標準溶液の連続希釈を作製し、溶液を酸性化するためにＨＣｌを添加し、次いでＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の連続希釈を添加することからなる。ＥｍｐｉｇｅｎとＳＤＳとの等量が存在する場合に、最大量の沈殿物が形成される。このようにして、最大量の沈澱物が形成されるＳＤＳ、透過物、および標準の希釈を記録することにより、存在するＥｍｐｉｇｅｎの量を定量し得る。ダイアフィルトレーションが進行するにつれ、Ｅｍｐｉｇｅｎの量がより少なくなり、そしてより少ないＳＤＳを含むチューブが、最大量の沈澱物を有するチューブである。分光光度計を用いてＯＤを６００ｎｍで測定することにより、沈殿物の存在を定量する。
【００３０】
　５．０．１．１５．　本実施例で使用した構成要素の量を得るには、少なくとも１２０リットルの透過物を処理し、そしてＥｍｐｉｇｅｎ　Ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ　Ｔｅｓｔにおいて顕著に沈殿物がなくなる（最大ＯＤ　６００ｎｍが０．０５よりも低い）まで、ダイアフィルトレーションを続ける。
【００３１】
　５．０．１．１６．　透析が完了した後、最終容量が６．０に近いＯＤ２８０値を得るように、産物を濃縮する。システムを排水し、そして３００〜４００ｍｌの「ＴＮＳ」緩衝液で洗浄する。システムを再び排水し、そして両方のプールを合わせる。多量のＷＦＩを再循環させ、その後５０℃で、＞６０分間、０．５Ｎ　ＮａＯＨを再循環させることにより、カートリッジを洗浄する。ＮａＯＨをＷＦＩですすぎ出し、そして０．０１Ｎ　ＮａＯＨ中にシステムを保存する。
【００３２】
　（５．０．２．　滅菌濾過）
　５．０．２．１７．　所望ならば、複合体を滅菌濾過し得る。０．２２μ濾過の前または後に、プロテオソーム濃度を調節し得る。滅菌濾過は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐからの濾過ユニットを用いて通常行われる。これらのユニットは、Ｍｉｌｌｉｐａｒｋｓと呼ばれ、種々のサイズがある。濾過されたバルクを、充填作業まで４℃で貯蔵し、そして無菌性について試験する。
【００３３】
　５．０．３．０　特定の目的：髄膜炎菌外膜タンパク質プロテオソームのバルクＧＭＰ調製物と、フレクスナー赤痢菌２ａリポ多糖とを合わせ、界面活性剤を除去することにより非共有結合複合体にする。
【００３４】
　５．０．３．１　適用：このＧＭＰ手順により、フレクスナー赤痢菌２ａ感染に対するワクチンとして使用するための、プロテオソームとフレクスナー赤痢菌２ａリポ多糖との非共有結合複合体のバルク調製物形成の産生が生じる。
【００３５】
　（実施例２）
　バルク髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株９１６２の精製外膜タンパク質（プロテオソーム）と、８５３２株から精製されたアルカリで無毒化した髄膜炎菌Ｌ８リポオリゴ糖との非共有結合複合体形成。
【００３６】
　５．１．０　バルク９１６２外膜タンパク質（プロテオソーム）ロット０１３６、およびバルク無毒化された髄膜炎菌Ｌ８リポオリゴ糖（ＬＯＳ）ロット０２０３を、貯蔵から取り出し、そして室温で解凍した。５００ｍｇのＬＯＳを含む滅菌蒸留水中のバルクＬＯＳの容量（１８２ｍｌ）と、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ、および０．１％　Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢを含む緩衝液中のタンパク質４００ｍｇを含むバルクプロテオソームの容量（３０６ｍｌ）とを合わせた。
【００３７】
　５．１．２　０．２２μｍの孔サイズのフィルターを通してＥｍｐｉｇｅｎ　ＢＢ（３０％溶液）を滅菌濾過し、そして６０分の１容量を、プロテオソーム、ＬＯＳ混合溶液に添加し、そして室温で１時間撹拌した。
【００３８】
　５．１．３　界面活性剤緩衝液溶液を、プロテオソーム、ＬＯＳ溶液から除去し、そして３０００分子量カットオフ孔サイズを有するＡ／Ｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ限外濾過カートリッジＵＦＰ−３−Ｃ−６を用いた限外濾過により、滅菌蒸留水と交換した。
【００３９】
　５．１．４　装置のセットアップ、衛生化、洗浄、洗浄、および清浄の手順は、実施例１に記載のものと同一であった。入水口の圧力は、１５±４ＰＳＩであり、そして透過流速度は、１７５ｍｌ／分であった。
【００４０】
　５．１．５　毎３〜４リットル後に、実施例１に記載の沈澱方法によって、Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢ界面活性剤の存在について透過物を試験した。試験において得られる沈殿物がなくなるまで、そしてさらに５リットル、限外濾過を続けた。総計３７リットルの透過物を、回収した。
【００４１】
　５．１．６　滞留物は清澄で、そしてこれをタンパク質およびＬＯＳについてアッセイされた０．２２μｍ孔サイズフィルターを通して滅菌濾過し、そしてバルク産物として４℃で保存した。
【００４２】
　５．１．７　バルク産物を、０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈し、そしてＮａＣｌの濃度を０．１５Ｍに調節した。０．０１％のチオメルサール（Ｔｈｉｍｅｒａｓｏｌ）を防腐剤として添加し、そして得られるバルクを滅菌条件下で最終容器バイアルに分け、標識し、そして−７０℃で保存した。
【００４３】
　５．１．８　生理食塩水溶液として与えられ、そしてアジュバントとしての水酸化アルミニウムゲルに吸収された場合の、免疫原性について、この産物をマウスにおいて試験した。結果を以下の表１に示し、これはワクチン複合体がマウスの腹腔内に与えられた場合に免疫原性であったことを示す。
【００４４】
【表１】
2004099619.tif 000002
【００４５】
　５．１．９　プロテオソームとＬＯＳとの複合体化を、プロテオソームおよびＬＯＳ構成要素のカラムクロマトグラフィーにより、複合体化前および後に評価した（図９）。バルク髄膜炎菌Ｌ８　ＬＯＳおよび最終プロテオソーム／ＬＯＳ複合体のＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ３００低圧カラム上でのクロマトグラフ分析。カラムを０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液中で流した。タンパク質のアッセイは、２８０ｎｍでの吸光度によった。そしてＬＯＳのアッセイは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）の阻害によった。ＥＬＩＳＡにおいて、プラスチックプレートに吸収された精製Ｌ８　ＬＯＳに結合するＬ８モノクローナル抗体が、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌカラムからの画分の連続希釈により阻害された。複合体形成前に、ＬＯＳは３９番目の画分に中心のある広がったピークにおいてカラムから溶出した。複合体形成の後、ＬＯＳを、３３番目の画分にほぼ中心のあるピークにおいてプロテオソームとともに溶出した。
【００４６】
　５．１．１０　特定の目的：髄膜炎菌外膜タンパク質プロテオソームのバルクＧＭＰ調製物と、無毒化された髄膜炎菌リポ多糖とを合わせて、界面活性剤の除去により非共有結合複合体を形成させる。
【００４７】
　５．１．１１　適用：　本実施例のＧＭＰ手順により、髄膜炎菌感染に対するワクチンとしての使用のためのプロテオソームと無毒化された髄膜炎菌リポ多糖との非共有結合複合体のバルク調製物の形成が産生される。
【００４８】
　（実施例３）
　本実施例もまた、プロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスワクチンの産生に関する。手順は、メンブレンカートリッジのハウジングサイズの適切なスケールアップおよび容量の適切な増加を伴って、１０〜１０００倍多い材料を用いてスケールアップに等しく適用可能である。
【００４９】
　５．８．１　２５ｍＬの滅菌濾過したＥｍｐｉｇｅｎ　ＢＢ（３０％溶液）の調製。
【００５０】
　５．８．１．１　０．２μ孔サイズのメンブレンフィルターを有する１００ｍｌ　Ｎａｌｇｅｎｅディスポーザブルフィルターユニットを用いて、約２５ｍｌのＥｍｐｉｇｅｎ　ＢＢ（３０％溶液）を滅菌濾過する。
【００５１】
　５．８．２　２％Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢを有する４ＬのＴＥＥＮ　２×　（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．０２Ｍ　ＥＤＴＡＮａ２、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、ＷＦＩ、および２％Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢ溶液からなる）の調製。
【００５２】
　５．８．３　「ＴＮＳ」の１０Ｌ溶液を１５倍、合計１５０リットルに調製する：ＴＮＳは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ　８．０±０．２）からなる。
【００５３】
　５．８．４　１０ｌの０．５Ｎ　ＮａＯＨを調製する。
【００５４】
　５．８．６　必要ならば、バルクプレジオモナスシゲロイデスリポ多糖（ＬＰＳ）を解凍し、プロテオソームとの複合体化のために調製し、そしてロット番号およびＬＰＳの濃度、ＬＰＳのｍｇでの必要量および除去すべきＬＰＳの計算された容量を記録する。
【００５５】
　（５．９．０　プロテオソームとプレジオモナスシゲロイデスＬＰＳとの複合体化）
　（５．９．１　複合体化のためのＬＰＳの調製）
　５．９．１．２　バルクＬＰＳのアリコートを、清潔な、滅菌した、目盛りを付けた５Ｌのボトルの中へプールする。総容量を測定し、そしてＬＰＳの総量を決定する。
【００５６】
　５．９．１．３　工程５．９．１．２で使用したＬＰＳの容量と等容量の２×ＴＥＥＮ緩衝液を添加し、合わせた総容量を測定し、次いで、撹拌棒を入れて撹拌棒と撹拌プレートとの組合せで１５±２分間混合する。
【００５７】
　５．９．２　複合体化のためのプロテオソームの調製
　５．９．２．１　総時間を記録し、もしあれば、プロテオソームを解凍する。
【００５８】
　５．９．２．２　バルクプロテオソームのアリコートを、清潔な、滅菌した、１Ｌのメスシリンダー中にプールする。総容量を測定し、そしてプロテオソームの総量を決定する。
【００５９】
　５．９．２．３　工程５．９．２．２のシリンダーから、別の清潔な、滅菌した、１Ｌのメスシリンダーに、工程５．９．１．２で用いたＬＰＳのｍｇ量と等しいｍｇ量を含むプロテオソームの容量を移す。
【００６０】
　５．９．２．４　プロテオソームを含むシリンダーに、１Ｌのプロテオソームあたり３０ｍｌのＥｍｐｉｇｅｎ　ＢＢを用いて、０．２２μ濾過した３０％Ｅｍｐｉｇｅｎ　ＢＢを添加する。撹拌棒で１５±２分間混合する。
【００６１】
　５．９．３　プロテオソームとプレジオモナスシゲロイデスＬＰＳとの混合
　５．９．３．１　撹拌棒で穏やかに撹拌しながら、工程５．９．３．２からのプロテオソームを、ＬＰＳの入った目盛りの付いた５Ｌのボトルに添加し、そして１５±２分間撹拌する。
【００６２】
　５．９．３．３　１ｍｌサンプルを４つ取り出し、そして後のローリー法によるタンパク質およびＫＤＯアッセイによるＬＰＳの濃度の測定のために−７５℃で保存する。
【００６３】
　（５．９．４　限外濾過／ダイアフィルトレーションによる界面活性剤の除去）
　５．９．４．１　Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｄｅｔａｉｌｓ　Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ／Ｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｉｎｃ．中空繊維カートリッジ、１０，０００ＮＭＷＣ孔サイズ、ハウジングサイズ６、限外濾過カートリッジ。
注：グリセロールをフラッシュするように新しいカートリッジを調整することが必要である。これは、６リットルのＷＦＩを６ｓｑ／ｆｔカートリッジまたはそれ未満を通して背圧無しでフラッシュすることにより行い得る。透過物溶液は、貯蔵槽を補給するために再利用されるべきではない。
注：全ての限外濾過工程は、その後、洗浄、衛生化、および貯蔵工程が続く。新しいカートリッジは、使用前に清浄および衛生化されていなければならない。
【００６４】
　５．９．４．２　Ａ／Ｇ限外濾過システムをセットアップしそして衛生化する。システムを、５０±５℃の初期温度で最低６０分間２〜３リットルの０．５Ｎ水酸化ナトリウムで再循環することにより、清浄および衛生化する。システムを４〜５リットルのＷＦＩでフラッシュし、その後、２〜３リットルの「ＴＮＳ」（０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ／通常生理食塩水緩衝液（ｐＨ　８．０±０．２）を少なくとも２０±５分間再循環する。
【００６５】
　５．９．４．３　液体で満たした入水ラインと出水ラインを貯蔵槽から取り出し１リットルのメスシリンダー内に移し、そしてＵＦシステムが空になるまでポンピングすることによって、ＵＦシステム（チューブを含む）で保持し得る容量（ｈｏｌｄ　ｕｐ　ｖｏｌｕｍｅ）を測定する。
【００６６】
　５．９．４．４　２リットルのサイドアームの付いた容器を平皿（ｐａｎ）の中に置き、そしてダイアフィルトレーション手順の持続時間の間ウェットアイスで容器を包む。
【００６７】
　５．９．４．５　１．７〜１．９Ｌの工程５．９．３．３からのバルクプロテオソーム−ＬＰＳ混合物を、２Ｌのサイドアームの付いた容器中に移す。２つの１０ｍｌピペットを取り付けた２つ穴のストッパーを、容器の上に置き、そしてダイアフィルトレーションシステムからの入水口および出水口チューブを容器のピペットに連結する。
【００６８】
　５．９．４．６　再循環ポンプのスイッチを入れ、そしてポンプの設定を４〜６に調節する。背圧クランプを調節して１５±４ｐｓｉの入水圧を得る。１．０±０．１Ｌの総容量（保持容量を含む）まで濃縮する。
【００６９】
　５．９．４．７　工程５．９．３．３からの１±０．１Ｌの混合物を２Ｌのサイドアームの付いた容器に移し、そして工程５．９．４．６を反復する。
【００７０】
　５．９．４．８　工程５．９．３．３からの全てのプロテオソーム−ＬＰＳ混合物が２Ｌのサイドアームの付いた容器へ移され、そして保持容量を含む滞留物容量が１．４±０．２Ｌになるまで、工程５．９．４．７と同様に混合物を移し、そして工程５．９．４．９として濃縮を続ける。
【００７１】
　５．９．４．１０　液体が膜を通して取り除かれるにつれ、ＴＮＳ（０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ、通常生理食塩水）が２リットルのサイドアームの付いた容器中に連続して供給されるように、限外濾過装置をセットアップする。ＴＮＳを含み、ボトルの底に伸びるチューブを取り付けた１０リットルのボトルを用いて、貯蔵槽をセットアップする。限外濾過システムからの入水および出水ラインを連結する。再循環ポンプのスイッチを入れ、そしてポンプのセッティングを４〜６に調節する。背圧クランプを調節し１５±４ｐｓｉの入水圧を得る。
【００７２】
　５．９．４．１１　ＵＦユニットにおいて透過物の流速を測定し、そして測定をするときの入水圧を記録する。
【００７３】
　５．９．４．１２　１５〜２０ｍｌの透過物のサンプルを、１２±５リットルが処理される毎に回収し、インハウス（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）標識（「透過物　Ｎ０．　Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３など」）を適用し、そして時間、処理された容量、およびサンプルの最大Ｏ．Ｄ．６００を記録する。Ｅｍｐｉｇｅｎ　Ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ　Ｔｅｓｔを用いてＥｍｐｉｇｅｎ　ＢＢの存在についてサンプルを試験することにより、Ｅｍｐｉｇｅｎの累進的除去を評価する。この試験は、チェックボード型のアッセイを形成するために、透過物および別に既知量のＥｍｐｉｇｅｎ　ＢＢを含む溶液の連続希釈を作製し、溶液を酸性化するためにＨＣｌを添加し、次いでＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の連続希釈を添加することからなる。最大沈澱は、等量のＥｍｐｉｇｅｎとＳＤＳが存在するときに形成される。このようにして、存在するＥｍｐｉｇｅｎの量は、沈澱が形成される透過物およびＳＤＳの希釈を記録し、そしてこれらの希釈を標準希釈と比較することにより定量され得る。ダイアフィルトレーションが進行するにつれ、Ｅｍｐｉｇｅｎの量はより少なくなり、そしてより少ないＳＤＳを含むチューブは、最大沈澱を有するチューブである。沈澱の存在は、分光光度計を用いて６００ｎｍでのＯＤを測定することにより定量する。
【００７４】
　本実施例において使用した構成要素の量を得るには、少なくとも１２０リットルの透過物が処理され、そしてＥｍｐｉｇｅｎ　Ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ　Ｔｅｓｔにおいて有意な沈澱がなくなる（最大ＯＤ　６００ｎｍが、０．０５未満）まで、ダイアフィルトレーションを続ける。
【００７５】
　５．９．４．１３　５００±５０ｍｌの最終滞留物容量（保持容量（工程９．４．３）を含む）まで産物を濃縮する。０．５ｍｌのサンプルを除去し、サンプルを１：１０に希釈し、そしてＯ．Ｄ．２８０を測定する。
【００７６】
　５．９．４．１４　濃縮された滞留物の所望の最小０．Ｄ．は、５．７である。Ｏ．Ｄ．が５．７未満の場合は、４００±５０ｍｌ（保持容量（工程５．９．４．３）を含む）まで濃縮を続け、そしてＯ．Ｄ．２８０を繰り返す。
【００７７】
　５．９．４．１５　滞留物ラインを滞留物溶液の外に出し、そして濾過物出水ラインを閉鎖して、カートリッジおよびラインが空になるまで逆方向にゆっくりポンピングする。供給ラインおよび滞留物ラインを、滞留物ボトルから３５０±５０ｍｌのＴＮＳを含む新しい清潔な容器に移す。ポンプを逆流させそしてＴＮＳを２〜３分間ゆっくりと再循環する。
【００７８】
　５．９．４．１６　ＴＮＳを再循環させた後、ポンプを止め、システムを排水し、滞留物洗浄溶液を、清潔な、滅菌した、１Ｌのメスシリンダーに収集し、そして容量およびＯ．Ｄ．２８０を測定する。
【００７９】
　５．９．４．１７　元の滞留物溶液（工程５．９．４．１２または５．９．４．１３）を洗浄滞留物溶液（工程５．９．４．１５）と合わせ、そして滞留物の最終容量を測定する。滞留物バルクを無菌濾過まで４℃±２℃で保存する。
【００８０】
　５．９．４．１８　ＷＦＩ、続いて０．５Ｎ水酸化ナトリウムを用いて濾過ユニットを、始め５０±５℃で最低６０分間洗浄する。洗浄剤をＷＦＩですすぎ出し、次いで保存剤として３〜４リットルの０．１Ｎ　ＮａＯＨでフラッシュする。
【００８１】
　（５．９．５　滅菌濾過）
　所望ならば、複合体を滅菌濾過し得る。バルク複合体化プロテオソームおよびＬＰＳを得、そして沈澱または混濁のあらゆる存在について検査する。バルク複合体化産物が透明ならば、Ｍｉｌｌｉｐａｋ　４０（０．２２μ濾過ユニット）を用いてそれを無菌濾過し、滅菌した、脱パイロジェン化した（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）容器に入れる。この工程はＳｔｅｒｉｌｅ　Ｃａｂｉｎｅｔにおいて行う。
【００８２】
　５．９．６　特定の目的：髄膜炎菌外膜タンパク質プロテオソームのバルクＧＭＰ調製物と、プレジオモナスシゲロイデスリポ多糖（ソンネ赤痢菌についての）のバルクＧＭＰ調製物とを合わせ、界面活性剤を除去することにより非共有結合複合体にする。
【００８３】
　５．９．７　適用：このＧＭＰ手順は、ソンネ赤痢菌感染に対するワクチンとしての使用のための、プロテオソームとプレジオモナスシゲロイデス２ａリポ多糖との非共有結合複合体のバルク調製物形成の産生をもたらす。
【００８４】
　（５．１０　免疫原性研究：）
　（５．１０．１　中空繊維限外濾過／ダイアフィルトレーションを用いたプロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳワクチンの免疫原性）
　図１および図２は、界面活性剤を除去しそして複合体化を容易にするために中空繊維（ＨＦ）ダイアフィルトレーション技術（ＨＦ−１、ＨＦ−２、およびＧＭＰ／ＨＦ−３）を用いて作製された３つの異なるプロテオソーム−赤痢菌ＬＰＳワクチン調製物が、試験された最も低い、最もストリンジェントな用量で、単純な透析用チューブ（ＤＴ）を用いて作製された調製物よりも効果的であることを実証する。すなわち、より強いＩｇＧ（図１）およびＩｇＡ（図２）免疫応答が、より古い、より非効率的な技術によって産生されたワクチンよりも、本発明を用いて産生されたワクチンにより誘発された。より強い免疫応答は、よりよいレベルの防御をもたらすので、これらのデータは、本発明が、作製するのにより効率的なだけでなく、より強力なワクチンを生ずることを明らかに示す。さらに、最も低い用量（０．１μｇ／用量）で投与された場合に、より強力な応答がこのワクチンによって誘発され、これにより、より古い技術を用いて必要とされるよりも少量のワクチンが、本発明を使用して必要とされることが示される。多価ワクチンの形成において多くの異なる抗原を必要とするので、投与されるワクチンの総量を最小化するためには、より低い用量で効果的なワクチン構成要素を用い得ることは非常に有利である。従って、中空繊維技術を用いてワクチンを産生する本発明の技術は、広範な特異性を有する多価ワクチンを処方する能力に直接影響し、そしてそれを促進する。ワクチンの商業的開発にとってワクチンを凍結乾燥し得ることは有利であるので、水溶液からのＨＦワクチン複合体の凍結乾燥が、驚くことに試験された全ての用量のうち最も高いものであった応答を常に誘発したワクチンを生じたことを見出したことを本発明者らはうれしく思った。従って、ＨＦ技術により作製された０．１μｇのワクチン（凍結乾燥を伴うか、または伴わない）が投与された場合、抗ＬＰＳ　ＩｇＧ（図１）およびＩｇＡ（図２）のより高い免疫原性が見出された。本発明のスケールアップおよびＧＭＰ手順は、ＨＦ技術を用いたので、これらのデータはＧＭＰ／ＨＦ−３を表す網目状の陰影を付けたバーにより図１および図２に示されるように有意である。
【００８５】
　（５．１０．２　多価ワクチンを用いた免疫原性研究）
　図３に示すように、プロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳ（ソンネ赤痢菌について）およびプロテオソーム−ソンネフレクスナー赤痢菌２ａワクチンの同日または同週間隔での投与は、両方のＬＰＳ構成要素：ソンネ赤痢菌ＬＰＳおよびフレクスナー赤痢菌２ａＬＰＳ、に対する良好な免疫原性を生じる。
【００８６】
　（５．１１　プロテオソーム−赤痢菌属ワクチンの電子顕微鏡写真）
　赤痢菌属ＬＰＳとプロテオソームとの会合は、図４に示す電子顕微鏡写真にはっきりとそして劇的に示される。この図において、プロテオソーム粒子は、放射不透明の（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）黒いドットでちりばめられている。これらの点は、特定の抗赤痢菌ＬＰＳ抗体を認識する二次抗体に金ビーズで連結されている。従って、金のドットの存在は、赤痢菌ＬＰＳの存在を示す。観察されるように、金のドットは、プロテオソーム粒子を囲んでドットするので、プロテオソームに非共有結合的に連結したＬＰＳを有するプロテオソームワクチンの画像が、これにより確認されそして視覚化される。驚くことに、本発明のＨＦ技術を用いて作製されたワクチンの不変的な粒子的性質は、より古い技術を用いたＤＴ調製物が電子顕微鏡により検査された場合には見出されない（結果を示さず）。
【００８７】
　（５．１２　プロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳワクチンは、赤痢菌の動物モデルにおいて、致死性のソンネ赤痢菌肺炎に対して防御する）
　図５において見られ得るように、プロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳワクチンは、プレジオモナスシゲロイデスでの致死性の感染に対する非常に有意な防御を一貫して与えることが、動物が致死性の肺炎を誘導する生物で抗原投与された細菌性赤痢の動物モデルにおいて測定された。これらのデータはまた、プロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳワクチンによって産生されたのは正確かつ防御的な抗体だけでなく、この鼻腔内サブユニットワクチンもまた致死性の肺炎に対して防御し得ることを実証する。
【００８８】
　（５．１３　プロテオソーム−フレクスナー赤痢菌２ａ　ＬＰＳワクチンでの鼻腔内免疫または経口免疫は、免疫後３０〜６０日間持続し得る、抗赤痢菌ＬＰＳ　ＩｇＧおよびＩｇＡを血清中に、ならびにＩｇＡを腸および肺洗浄液に誘導する）
　図６に示すように、プロテオソーム−フレクスナー赤痢菌２ａ　ＬＰＳワクチンでの２つの免疫化は、免疫後３０〜６０日間持続し得る抗体を、血清中ならびに肺および腸の分泌において誘導する。これらのデータは、プロテオソームワクチンが共通の粘膜性免疫系を刺激し、免疫化部位から離れた場所でさえも特定の抗体を分泌し得ることを示す。詳細には、鼻腔内免疫は、腸の分泌において抗体を誘導し得、そしてその逆も可能である。この能力は、身体全体への入口の粘膜の門脈を通して宿主を侵襲する病原体に対して防御するプロテオソームワクチンの潜在的有用性を拡張する。
【００８９】
　５．１４　図７は、異なるワクチン量を用いたソンネ赤痢菌についての１または２用量のプロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳワクチンでのヒトのボランティアの鼻腔内または経口免疫後の、抗赤痢菌属ＬＰＳ　ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ末梢血ＡＳＣ応答、ならびに血清、唾液、および尿のＩｇＡおよびＩｇＧ抗体応答の誘導を示す。示すように、鼻腔内免疫は、用量依存性の様式で応答を誘発し、最も高い用量が６人全てのボランティアにおいて応答を誘導した。
【００９０】
　ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ血清応答が、鼻腔内群の各々において誘発された。さらに、強力な抗体分泌細胞ＡＳＣ応答が誘導され、これにより粘膜免疫が抗体分泌細胞（最も注目すべくはＩｇＡ分泌細胞）の輸送を刺激したことが示される。最も重要なことに、ＩｇＡ応答がまた、唾液において、そして特に尿試料において見出され、これにより分泌性ＩｇＡが粘膜表面で産生されことが示される（ＩｇＡは腎臓を透過しないので、尿ＩｇＡは、抗体の局所分泌性ＩｇＡを反映し、およびこのような鼻腔内ワクチンはまた、局所的腸ＩｇＡを産生し、そして鼻腔内ワクチンは、グラム陰性生物によって引き起こされる尿管感染に対して防御するために用いられ得ることを示唆する）。これらのＡＳＣおよび抗体応答の大部分が、１回のみの免疫後に見出されたことは注目に値し、これは追加免疫が必要でないかもしれないことを示唆する。ＩｇＡおよびＩｇＧのＡＳＣならびに尿ＩｇＡがまた、経口免疫後に見出された。経口投与の最も効果的な使用は、必要であれば、鼻腔内感作後の追加免疫としての使用であり得る。
【００９１】
　５．１５　多分子プロテオソームタンパク質とＬＰＳとの非共有結合複合体化の実証を図８に示す。グラフは、非複合体化プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳの適用後のＨＰＬＣ画分中のＬＰＳ（カラム溶出プロフィールのプロテオソーム−ＬＰＳワクチンを適用した場合とは異なる部分で起こる）を示す。プロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳワクチン適用後のＨＰＬＣ画分における、ＬＰＳとタンパク質との同時溶出を、プロテオソームの最も大きいタンパク質凝集体に対応するピークとともに示す。ＬＰＳを定量化するために阻害ＥＬＩＳＡを用いて、そしてプロテオソームタンパク質を定量するためにＡ２８０でのＯＤを用いてデータを測定した。ＨＰＬＣカラムはＴｏｓｏｈａａｓ　Ｇ５００００Ｐｗｘｌであった。そして分子量標準を矢印で示す。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、プロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳワクチンでの鼻腔内免疫：いくつかの調製物によって減少された用量で誘導された血清ＩｇＧ応答。
【図２】図２は、プロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳワクチンでの鼻腔内免疫：いくつかの調製物によって減少された用量で誘導された血清ＩｇＡ応答。
【図３】図３は、プロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳ（ソンネ赤痢菌について）とプロテオソーム−フレクスナー赤痢菌２ａワクチンとの一緒の同日のまたは同週間隔での投与により、ソンネ赤痢菌およびフレクスナー赤痢菌２ａＬＰＳ構成要素の両方に対する良好な免疫原性が生じる。
【図４】図４は、赤痢菌ＬＰＳのプロテオソームビヒクルとの会合を示す、プロテオソーム−赤痢菌ＬＰＳワクチンのイムノゴールド標識された電子顕微鏡写真。
【図５】図５は、プロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳワクチンは、細菌性赤痢の動物モデルにおける致死のソンネ赤痢菌肺炎に対して防御する。
【図６】図６は、プロテオソーム−フレクスナー赤痢菌２ａＬＰＳワクチンを用いた鼻腔内免疫または経口免疫は、免疫後３０〜６０日間持続し得る、抗赤痢菌属ＬＰＳ　ＩｇＧおよびＩｇＡを血清中に、ならびにＩｇＡを腸および肺の洗浄液中に誘導する。
【図７】図７は、異なる量のワクチンを用いた、ソンネ赤痢菌についてのプロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳワクチンの１または２用量でのヒトの鼻腔内免疫または経口免疫：抗赤痢菌属ＬＰＳ　ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ末梢血液ＡＳＣ応答、ならびに血清、唾液、および尿抗体応答の誘導。
【図８】図８は、複合体化されていないプレジオモナスシゲロイデスＬＰＳの適用後のＨＰＬＣ画分中のＬＰＳ、ならびにプロテオソーム−プレジオモナスシゲロイデスＬＰＳワクチンの適用後のＨＰＬＣ画分中でのＬＰＳとタンパク質との同時溶出によるＬＰＳとプロテオソームタンパク質との非共有結合複合体の実証。
【図９】図９は、髄膜炎菌外膜タンパク質−無毒化リポオリゴ糖ワクチンに対するマウスの殺菌性の抗体応答、髄膜炎菌株９１６２に対する相反力価の相乗平均。
【図１】
2004099619.tif 000003
【図２】
2004099619.tif 000004
【図３】
2004099619.tif 000005
【図４】
2004099619.tif 000006
【図５】
2004099619.tif 000007
【図６】
2004099619.tif 000008
【図７】
2004099619.tif 000009
【図８】
2004099619.tif 000010
【図９】
2004099619.tif 000011