(57)【要約】【課題】ＮＡＮＢＨ伝染の予防に有効なワクチンおよび免疫治療用の治療剤を開発に利用可能なスクリーニング系を提供すること、および、ＮＡＮＢＨを起こす病原体に感染した培養細胞を提供すること。培養中でＨＣＶを増殖するのに使用される細胞、およびそのような培養物により産生されるウイルス抗原、および、例えば診断薬のような、そのような抗原の使用を提供すること。【解決手段】ＨＣＶに感染した細胞株。ＨＣＶに感染しているインビトロの細胞からの抗原を含有する抗ＨＣＶ抗体検出用の組成物。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶに感染した細胞株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はウイルス複製のためのインビトロの細胞系に関する。特に、非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）の病原体、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）がその中で複製する細胞株に関する。
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【０００２】
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【０００３】
【従来の技術】
非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、ウイルスに引き起こされると考えられる伝染性疾患あるいは家族性疾患であり、他のウイルスが関与する肝臓疾患と区別し得る。他のウイルスが関与する肝臓疾患には、既知の肝炎ウイルス、すなわちＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびデルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）あるいはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に引き起こされるものが含まれる。ＮＡＮＢＨは輸血を受けた個人で最初に同定された。ヒトからチンパンジーヘの伝染およびチンパンジーでの連続継代によって、ＮＡＮＢＨが、伝染性の、１つあるいは複数の病原体によって起こることの証拠が提供された。ＨＣＶウイルスは、ＮＡＮＢＨの病原体として同定された。
【０００４】
ＮＡＮＢＶのキャリアーおよびＮＡＮＢＶに汚染した血液あるいは血液製剤を同定するための感度が高く、特異的なスクリーニング方法の必要性は重大である。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は、輸血患者の約１０％に起こり、これらのケースの９０％までがＮＡＮＢＨである。この疾患の主な問題は、慢性の肝臓障害への進行（２５−５５％）である。
【０００５】
患者の看護および、血液および血液製剤あるいは親密な個人間の接触によるＮＡＮＢＨ伝染の予防には、ＮＡＮＢＶに関連する核酸、抗原および抗体を検出する、信頼性の高い診断用および予後診断用の手段を必要とする。さらに、有効なワクチンおよび、この疾患の予防および／あるいは治療のための免疫治療用の治療剤が必要である。
【０００６】
ＮＡＮＢＨを起こす病原体に感染した培養細胞は、イムノアッセイおよび／あるいはワクチンに使用し得るウイルスポリペプチドの原料を提供する。さらに、この疾患の治療用抗ウイルス剤を開発するための薬物スクリーニングプログラムにも有用である。
【０００７】
肝由来の不死化したヒトあるいは非ヒト霊長類細胞株で、ＮＡＮＢＨの原因である病原体に意図的に感染させたものは、１９８７年４月１日出願、１９８７年１０月８日公開のＷＯ／８７／０５９３０に報告されている。報告によると、これらの細胞株は非リンパ細胞の性質を有する。さらに、これらの細胞中で複製する物質がこの疾患の原因となることは、証明されていない。
【０００８】
さらに、ＮＡＮＢＨ患者から分離した、意図的に主にリンパ球からなる単核白血球が、感受性のあるチンパンジーに注入した際にＮＡＮＢＨを起こしたことが報告されている。Ｈｅｌｌｉｎｇｓら、（１９８５）を参照のこと。しかし、ＮＡＮＢＨ感染の証拠は、意図的に感染させたチンパンジーにおける形態的変化および組織学的変化であり、間接的である。さらに、この血球を注入された２匹のチンパンジーのうちの１匹しか意図的に感染させられていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
ＮＡＮＢＨを起こす病原体に感染した培養細胞を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、培養中でＨＣＶを増殖するのに使用される細胞に向けられる。本発明はさらに、そのような培養物により産生されるウイルス抗原、および、例えば診断薬のような、そのような抗原の使用に向けられる。
【００１１】
従って、本発明の１つの観点は、ＨＣＶに感染している細胞株である。
【００１２】
本発明の他の観点は、ＨＣＶに感染しているインビトロの細胞からの抗原を含有する、抗ＨＣＶ抗体検出用の組成物である。この組成物では、この抗原は固体基質に付着しており、そして前記抗ＨＣＶ抗体に免疫学的に反応性がある。
【００１３】
さらに本発明の別の観点は、ＨＣＶ抗原に対する抗体を検出するためのイムノアッセイであり、これは、以下の工程を包含する：
（ａ）抗ＨＣＶ抗体を含む疑いのあるサンプルを、抗体−抗原複合体を形成させる条件下で、インビトロの細胞株で生産したＨＣＶ抗原とともにインキュベートする工程；および
（ｂ）ＨＣＶ抗原を有する抗体−抗原複合体を検出する工程。
【００１４】
本発明の他の観点は、ＨＣＶを抑制／阻害する物質をスクリーニングする方法である。
【００１５】
さらに本発明の他の観点は、ＨＣＶ感染細胞培養中で増殖させることを包含する、ウイルスの増殖法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
定義
用語「Ｃ型肝炎ウイルス」は、これまで未知であったＮＡＮＢＨの病原体に対して、この分野に従事する者によって使用されてきた。従って、本願で使用されるように、「Ｃ型肝炎ウイルス」（ＨＣＶ）とはＮＡＮＢＨの原因である物質のことであり以前にＮＡＮＢＶおよび／あるいはＢＢ−ＮＡＮＢＶと呼ばれていたものである。ＨＣＶ、ＮＡＮＢＶおよびＢＢ−ＮＡＮＢＶという用語は、本願では、互換的に使用される。この語法の延長として、以前にＮＡＮＢ肝炎（ＮＡＮＢＨ）と呼ばれていた、ＨＣＶによって起こる疾患はＣ型肝炎と呼ばれる。本願では、ＮＡＮＢＨおよびＣ型肝炎という用語は互換的に使用され得る。
【００１７】
本願で使用されるように、「ＨＣＶ」という用語は、その病原性株がＮＡＮＢＨを起こすウイルス種、およびそれに由来する弱毒株あるいは欠陥干渉粒子を意味する。ＨＣＶのゲノムは、ＲＮＡからなる。ＲＮＡを含有するウイルスは、比較的高い割合で自然に変異することが知られている。すなわち、報告によると、組み込まれたヌクレオチド当り１０−３から１０−４の確率で起こる（ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐｅ（１９８６））。従って、ＨＣＶ種には多数の株が存在し、それらは病原性あるいは非病原性であり得る。ＨＣＶは、フラビ様ウイルスと考えられている。フラビウイルス粒子の形態および組成は知られており、Ｂｒｉｎｔｏｎに記載されている（１９８６）。概して、形態に関しては、フラビウイルスは、２層の脂質に囲まれたヌクレオキャプシドを中心に有する。ビリオンは球状であり、直径は約４０−５０ｎｍである。それらのコアは直径が約２５−３０ｎｍである。ビリオンエンベロープの外側の表面には、先端に直径約２ｎｍのノブを有する約５−１０ｎｍの長さの突起がある。
【００１８】
ＨＣＶ１と呼ばれるＨＣＶ株のゲノムに対するｃＤＮＡは、本願譲受人が共有する、本願１９８９年５月１８日出願の米国特許出願番号第３５５，００２号（代理人整理番号２３００−００６３．２８）に記載されており、それをすべて本願に参考文献として引用する。また、本願に参考文献として引用する、ＥＰＯ公開ＮＯ．０　３１８　２１６およびＰＣＴ出願ＮＯ．　　ＵＳ８８／０４１２５を参照のこと。ＨＣＶ　ｃＤＮＡセンスストランドを構成する配列を図１に示す。ＨＣＶの異なる株あるいは分離株は、ＨＣＶ１と比較して、アミノ酸および核酸レベルに多様性を有すると考えられる。多くの分離株が、ＨＣＶ１と比較して、総アミノ酸配列に高い相同性（すなわち、約４０％より高い）を有すると考えられる。しかし、他の相同性の低いＨＣＶ分離株も、種々の基準に従ってＨＣＶ株として定義されることが有り得る。その基準とは、例えば、ＨＣＶ１のそれとサイズが類似するポリタンパク質をコードするＯＲＦ、ＨＣＶ１のそれと類似の疎水性および抗原性の特徴を有するポリタンパク質およびＨＣＶ１にも保存されている共直線性（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ）のペプチド配列の存在などである。
【００１９】
ＨＣＶは、少なくとも１つの、ＨＣＶ１のゲノムにコードされているエピトープと免疫学的に同一とみなし得るエピトープをコードする。他の既知のフラビウイルスと比較して、このエピトープはＨＣＶにユニークである。エピトープの特異性は、その抗ＨＣＶ抗体との免疫反応性および他のフラビウイルス種に対する抗体との免疫反応性の欠如によって同定し得る。免疫反応性を決定する方法は当該分野で公知であり、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、および凝集反応がある。ＨＣＶエピトープの免疫反応性を決定する適切な方法は、本願の譲受人が共有する米国特許出願番号第０７／３４１，３３４、Ｃｈｏｏら、（１９８９）および　Ｋｕｏら、（１９８９）に記載されている。
【００２０】
上記に加えて、次に示す核酸相同性およびアミノ酸相同性のパラメーターが、単独あるいは組み合わせて、株あるいは分離株をＨＣＶとして同定するのに適用され得る。ＨＣＶ株および分離株は、進化的に関連しているので、ヌクレオチドレベルでのゲノムの全体的相同性は、おそらく約４０％あるいはそれより高く、たぶん約６０％あるいはそれより高く、そして、よりおそらく約８０％あるいはそれより高いと考えられる。そして、さらに、少なくとも約１３個のヌクレオチドからなる連続した配列に対応する配列がある。推定上のＨＣＶ株ゲノム配列とＨＣＶ１ｃＤＮＡ配列との間の対応性は、当該分野に公知の方法で調べ得る。例えば、推定上のＨＣＶ由来のポリヌクレオチドの配列情報を直接、本願に記載のＨＣＶ　ｃＤＮＡと比較して調べ得る。さらに、例えば、相同性のある領域（例えば、Ｓ１消化前に使用する領域）間を、安定した２重鎖ポリヌクレオチドを形成する条件下でハイブリダイズさせ、次いで１本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、その後消化されたフラグメントのサイズを決定することにより、決定し得る。
【００２１】
ＨＣＶの株あるいは分離株間は進化的に関連しているので、推定上のＨＣＶ株あるいは分離株は、それらのポリヌクレオチドレベルにおける相同性によって、同定可能である。概して、ＨＣＶ株あるいは分離株は、ポリペプチドレベルで約４０％より高い相同性を有し、おそらくは約７０％より高い相同性を有し、そしてよりおそらくは、約８０％より高い相同性を有する。そして、あるものは約９０％より高い相同性を有し得る。アミノ酸配列の相同性を決める方法は当該分野で公知である。例えば、アミノ酸配列は直接決定し得、本願が提供する配列と比較し得る。または、推定上のＨＣＶのゲノム物質のヌクレオチド配列を、決定し（通常はｃＤＮＡ中間体を経て）、そこにコードされるアミノ酸配列を決定し、そして対応する領域を比較し得る。
【００２２】
本願で使用するように、特定のポリヌクレオチド配列「から派生する（に由来する）」ポリヌクレオチドとは、この特定のヌクレオチド配列の領域に対応する、少なくとも約６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個、より好ましくは少なくとも約１０−１２ヌクレオチド、そしてさらに好ましくは少なくとも約１５−２０個のヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド配列を意味する。「対応する」とは、特定の配列に相同性があるか、あるいは相補的であることを意味する。好ましくは、それからポリヌクレオチドが派生する領域の配列は、
ＨＣＶゲノムに特有な配列に相同性あるいは相補性がある。配列がＨＣＶにゲノムに特有であるかどうかは、当業者に公知の方法で調べ得る。例えば、その配列が感染していない宿主あるいは他の生物に存在するかどうかをジーンバンクのようなデータバンクの配列と比較し得る。また、配列は、他のウイルス体の既知の配列と比較し得る。これらには、例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＤＶのような肝炎を起こすことが知られているもの、および他のフラビウイルス科に属するものが含まれる。派生した配列の、他の配列との対応性あるいは非対応性はまた、適切なストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションによって決定し得る。核酸配列の相補性を調べるためのハイブリダイゼーション法は、当該分野で公知であり、後述する。例えばＭａｎｉａｔｉｓら、（１９８２）を参照のこと。さらに、ハイブリダイゼーションで形成された２重鎖ポリヌクレオチドのミスマッチは、例えば、２重鎖ポリヌクレオチド中の１本鎖の部分を特異的に消化するＳ１のようなヌクレアーゼでの消化を含む、既知の方法で決定し得る。典型的なＤＮＡ配列を「派生する」領域には、例えば、特異的エピトープをコードする領域、および非転写領域および／あるいは非翻訳領域が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００２３】
派生したポリヌクレオチドは、示されたヌクレオチド配列から必ずしも自然に由来するわけではなく、いかなる様式でも生成し得、これには例えば、化学合成あるいはＤＮＡ複製あるいは逆転写あるいは転写が含まれる。さらに、特定の配列の領域に対応する領域の組み合わせは、意図する用途に適切なように、当該分野で公知の方法で改変し得る。
【００２４】
本願で使用されるように、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドあるいはデオキシポリヌクレオチドの、任意の長さのヌクレオチド重合体をいう。この用語は、その分子の一次構造のみを意味する。従ってこの用語には、２本鎖および１本鎖ＤＮＡおよび２本鎖および１本鎖ＲＮＡが含まれる。さらにこの用語には、修飾された形態および修飾されていない形態のポリヌクレオチドが含まれる。この修飾には、例えば、メチル化キャッピングおよび／あるいは、１つ以上の天然のヌクレオチド基をアナログに置換することを含む、当該分野で公知の他の修飾が含まれる。
【００２５】
「精製したウイルスポリヌクレオチド」という用語は、ウイルスポリヌクレオチドに天然に付随するポリペプチドが実質的に混じっていない、ウイルスゲノムあるいはそのフラグメントを意味する。すなわち、ウイルスペプチドに天然に付随するポリペプチドを約５０％より少なく、好ましくは約７０％より少なく、そしてより好ましくは約９０％より少なく、含む。ウイルスポリヌクレオチドをウイルス粒子から精製する方法は、当該分野で公知であり、例えば、カオトロピックな物質での粒子の破壊、分画抽出および、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度沈降によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの分離が含まれる。
【００２６】
「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域である。この領域は、コード配列の一部あるい全コード領域を表し得る。
【００２７】
「コード配列」とは、それが適切な調節配列の制御下に配置された場合にｍＲＮＡに転写される配列および／あるいはポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよび３’末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび組み換えポリヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
「〜と／〜として、免疫学的に同一とみなし得る」とは、通常はＨＣＶタンパク質である、特定の（複数の）ポリペプチドに存在する（複数の）エピトープおよび（複数の）ポリペプチドが存在することをいう。免疫学的同一性は、抗体の結合および／あるいは結合における抗体との競合によって決定し得る。これらの方法は、平均的な当業者には公知であり、また、後記で説明する。
【００２９】
本願で使用されるように、「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基をいう。エピトープは、エピトープにユニークな空間構造中の３個以上のアミノ酸を合有し得る。概して、エピトープは少なくとも５個のそのようなアミノ酸からなり、より一般的には、少なくとも８−１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的構造を決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴が含まれる。
【００３０】
ポリペプチドは、ポリペプチド内に含まれる特異的エピトープを抗体が認識することによって抗体と結合する場合に、「免疫反応性」である。免疫反応性は、抗体の結合によって、特に、抗体結合の速度論によって、および／あるいは、抗体が認識するエピトープを有する既知の（複数の）ポリペプチドを（複数の）競合物として使用する、結合に対する競合によって決定し得る。ポリペプチドが抗体に対して免疫反応性であるかどうかを調べる方法は、当該分野に公知である。
【００３１】
本願で使用されるように、「免疫原性ポリペプチド」という用語は、アジュバントの存在あるいは非存在下で、単独あるいは担体に結合している状態で、細胞性および液性応答を誘起するポリペプチドをいう。
【００３２】
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の重合体を意味し、生成物の長さを特定しない。従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語はさらに、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのようなポリペプチドの発現後の修飾を意味しないが、除外もしない。
【００３３】
本願で使用されるように、「個体」とは、脊椎動物、特に哺乳類動物種をいい、家畜、競技用動物および、ヒトを含む霊長類が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本願で使用されるように、核酸の「センスストランド」あるいは「プラスストランド」は、そのｍＲＮＡに配列相同性のある配列を有する。「アンチセンスストランド」あるいは「マイナスストランド」は、「センスストランド」あるいは「プラスストランド」の配列に相補的な配列を有する。
【００３５】
本願で使用されるように、ウイルスの「ポジティブストランドゲノム」とは、ＲＮＡあるいはＤＮＡである、ゲノムが１本鎖であり、そして（複数の）ウイルスポリペプチドをコードするゲノムをいう。ポジティブストランドＲＮＡウイルスの例には、トガウイルス科、コロナウイルス科、レトロウイルス科、ピコルナウイルス科、およびカリシウイルス科が含まれる。以前はトガウイルス科に分類されていたフラビウイルス科もこれに含まれる。ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐｅ（１９８６）を参照のこと。
【００３６】
本願に使用されるように、ＨＣＶゲノムの「複製型中間体」は、ＲＮＡストランドあるいはそのフラグメントを意味し、それはウイルスゲノムに相補的であり、ウイルス複製過程の間に合成される。複製型中間体は、ポジティブＲＮＡストランド合成の鋳型として機能する。
【００３７】
本願で使用されるように、「精製ＨＣＶ」とは、ウイルスが通常付随している細胞成分および感染組織中に存在し得る他の型のウイルスから単離されたＨＣＶ調製物をいう。ウイルスを単離する方法は、当業者には公知であり、例えば、遠心分離およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。精製ＨＣＶの調製法は後述する。
【００３８】
本願で使用されるように、「生物試料」とは、個体から分離された組織あるいは体液をいい、例えば以下のものが含まれるが、それらに制限されない。すなわち、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、外部皮膚切片、呼吸器道、消化管および尿生殖器道、涙、唾液、乳汁、血球、腫瘍、器官、さらに、インビトロ細胞培養物の成分（細胞培養液中での細胞生育により得られるを馴化培地、ウイルスに感染していると推定される細胞、組換え細胞および細胞成分が含まれるが、これらに限定されない）である。
【００３９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本願で使用されるように、検出されるべきプライマー、プローブ、オリゴマーフラグメント、オリゴマーコントロールおよびラベルされていないブロック用オリゴマーをいい、３個以上のデオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドを有する分子として定義される。典型的には４個より多く、典型的には最高約１００個のヌクレオチドを有する。その正確なサイズは多くの因子によって決まり、それはすなわち、オリゴヌクレオチドの最終的機能あるいは使用によって決まる。
【００４０】
「プライマー」という用語は、本願で使用されるように、ポリヌクレオチドに相補的な、プライマーからの延長産物の合成を触媒する条件下に置かれた場合に、相補的ストランドにそったポリペプチド合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドをいう。そのような条件には、４種の異なるヌクレオチド３リン酸あるいはヌクレオシドアナログの存在および、適切なバッファー（「バッファー」には、コファクターである置換基あるいは、ｐＨ、イオン強度などに影響する置換基が含まれる）中のＤＮＡポリメラーゼあるいは逆転写酵素および適切な温度が含まれる。
【００４１】
本願で使用されるように、「標的領域」とは、増幅されるべき、および／あるいは検出されるべき核酸の領域をいう。
【００４２】
本願で使用されるように、「プローブ」という用語は、標的領域中の配列に相補的な、プローブ中の少なくとも１つの配列と、ハイブリッドを形成するポリヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドをいう。しかし、好ましくは、プローブは、ポリメラーゼチェーンリアクションを開始させるのに使用される（複数の）配列に相補的な配列は含まれない。
【００４３】
本願に使用されるように、「耐熱性ヌクレオチドポリメラーゼ」という用語は、Ｅ．　　ｃｏｌｉのヌクレオチドポリメラーゼに比較して熱に対して比較的安定である、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素をいう。一般にこの酵素は、標的配列の３’末端で、プライマーを使用して合成を開始し、合成が終了するまで５’方向に鋳型にそって進む。Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）から単離された代表的な耐熱性酵素およびその使用法は、Ｓａｉｋｉら、（１９８８）に記載されている。
【００４４】
本願に使用されるように、ＨＣＶ　ＲＮＡを含む「ウイルスＲＮＡ」という用語は、ウイルスゲノムのＲＮＡ、そのフラグメント、それらの転写物およびそれらに由来する変異した配列をいう。
【００４５】
本願で使用されるように、「細胞株」とは、最初の継代培養後増殖された培養細胞をいい、従って種々の実施態様があり、これには、細胞株と呼ばれる細胞の個々の細胞、回収された細胞、細胞を含有する培養物が含まれる。「派生する」とは、後代あるいは排出物を意味する。さらに当該分野では、自然な変化あるいは誘導された変化が、保存あるいは移動の間に核型に起こることが知られている。従って、細胞株と呼ばれるものに由来する細胞が、祖先の細胞あるいは培養物と全く同一でないことも有り得、従って細胞株と呼ばれるものには、そのような変異体も含まれる。「細胞株」という用語には、不死化した細胞も含まれる。好ましくは、細胞株には、例えばトリオーマのような３つのタイプの細胞の融合に由来する細胞は入らない。
【００４６】
本願に使用されるように、「インビトロ」の細胞系とは、インビトロで複製した細胞をいい、従って、初代培養および細胞株が含まれる。
【００４７】
本願に使用されるように、「血球」という用語は、循環血、組織、あるいは骨髄にある細胞をいい、これには骨髄系、単球系、巨核球系、赤血球系、リンパ球系および形質細胞系の細胞が含まれる。これらの細胞を区別し得る形態は、ＴＨＥ　ＭＯＲＰＨＯＬＯＧＹ　ＯＦ　ＨＵＭＡＮ　ＢＬＯＯＤ　ＣＥＬＬＳ（１９８５）に記載されている。
【００４８】
本願に使用されるように、「末梢血細胞」という用語は、循環血中にある細胞をいい、一般に好酸球、好中球（桿状および分葉の両方）、好塩基球、単球、血小板、赤血球、リンパ球および形質細胞をいう。
【００４９】
本願に使用されるように、「白血球」という用語は、赤血球および血小板を除く、不均一なタイプの血球の集団をいう。
【００５０】
本願で使用されるように、「リンパ球」という用語は、免疫応答に関与する、直径６−１２μｍの球形の細胞であり、大きくて丸い、濃染色される核と非常に少ない細胞質を有する。リンパ球には、Ｂリンパ球およびＴリンパ球が含まれる。
【００５１】
本願で使用されるように、「Ｂリンパ球」は、脊椎動物の白血球であり、成熟すると、抗体産生に関与する。成熟処女Ｂリンパ球（すなわち、抗原にまだ出会っていないもの）は、次の表面マーカーの存在によって同定される；　　すなわち、抗原に対する単量体ＩｇＭレセプター、ＩｇＧに対するＦｃレセプターおよび補体の活性化Ｃ３ｂ成分に対するレセプターである。
【００５２】
Ｂ前駆リンパ球は免疫グロブリン産物を欠くが、特異的モノクローナル抗体によって同定し得る他の特徴的な分子を発現し得る。これらの細胞は分裂し、そして急速に移行して、細胞質内にμヘビーチェーンを有するが、ライトチェーンを有しない大きなリンパ芽球になる。プレＢ細胞のフェノタイプ（細胞質内μチェーン＋、ライトチェーン−、表面Ｉｇ−）は、活発にＤＮＡ合成を行っているリンパ芽球に先ず、発現され得る。ヒトのプレＢ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ分子をその表面に発現し、さらに補体フラグメントＣ３ｂに対するレセプターを発現し得る。しかし、それらはＩｇＧに対するＦｃレセプターを欠き、Ｃ３ｄ／ＥＢＶレセプターをほとんど持たない。Ｂ前駆リンパ球はまた、ピーナッツアグルチニンヘの結合能により、認められる。
【００５３】
成熟Ｂリンパ球は、活性化しているか、あるいは静止状態にある。活性化Ｂ細胞は、静止Ｂ細胞には検出されないいくつかのタイプの分子を発現する。これらのマーカー分子は当業者に公知であり、これには例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）レセプターおよびトランスフェリンレセプターが含まれる（後者はすべての種類の細胞に発現している）。Ｂ細胞の活性化は膜ＩｇＤの消失を引き起こし、そしてＦｃγおよびＣ３ｂに対するレセプターの両方が外膜から消えるが、Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス（ＥＢ）Ｖに対するレセプターは有意に影響されない。
【００５４】
抗原あるいはマイトジェンによる刺激後、Ｂリンパ球は、２つの分化経路のいずれかにそって進み得る。Ｂリンパ球は、プラズマ細胞に分化し得るか、あるいは分裂し、そしてメモリーＢ細胞となって静止状態に戻る。メモリーＢ細胞は、活性化の間にＩｇＤを消失する。この分子は、メモリー細胞プールに入った細胞では再合成されない。
【００５５】
「プラズマ細胞」は、終末まで分化したＢ細胞である。これらの細胞は、卵形で、車輪のスポークのような変わった核および非常に好塩基性の細胞質を有する。免疫グロブリンの決定基に対する蛍光色素でラベルした抗体で染色すると、固定したプラズマ細胞は、細胞質全体に強い蛍光を示す。膜に結合している（膜結合）免疫グロブリンおよびＤＲ分子は乏しく、Ｆｃγ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄあるいはＥＢＶに対するレセプターは、一般に検出できない。
【００５６】
「プラズマ芽球」は形態的にも機能的にも、活性化リンパ球（Ｂリンパ芽球とも呼ばれる）段階とプラズマ細胞段階と間にある。細胞は大きく、プラズマ細胞より大きい割合の核：細胞質を有する。膜結合免疫グロブリンおよびＦｃγレセプタ−は存在する。
【００５７】
本願で使用されるように、「Ｔリンパ球」は、種々の細胞媒介性免疫応答に関与し得る胸腺由来の細胞である。種々のタイプのＴ細胞があり、それらはその機能および細胞表面マーカーによって区別し得る。Ｔ「ヘルパー」およびＴ「サプレッサー」タイプのクラスを含む、Ｔリンパ球のクラスを区別する方法は当該分野で公知である。例えば、モノクローナル抗体は、ＣＤ（分化クラスター、Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）抗原を含む細胞の表面抗原を検出するのに使用し得る。ＣＤ抗原でマークされるＴ細胞のタイプおよび特異抗原を検出する抗体を表１に示す。
【００５８】
【表１】
2004049235.tif 000002
本願で使用するように、「大型顆粒リンパ球」（ＬＧＬ）またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と呼ばれる細胞は、別のタイプのリンパ球である。これらの細胞には孤立する大型リンパ球集団が含まれ、例えばそれらの細胞質内にある特徴的なアズール親和性顆粒によって、形態的に区別し得る。さらに、ＬＧＬは、特異的モノクローナル抗体を使用する方法によっても同定し得る。これらの細胞上に存在するＦｃレセプター（Ｌｅｕ　１１）あるいは特異的分化抗原（Ｌｅｕ７、ＨＮＫ−１、ＮＫＨ−１、ＮＫＨ−２）のいずれかを検出する、いくつかのモノクローナル抗体が入手可能である。ある種のＬＧＬ細胞はさらに、ＣＤ２Ｔ細胞ファミリーの抗原を発現する。さらに機能性試験の方法は当該分野で公知であり、それらは、これらの非免疫細胞の、例えば赤白血症細胞株Ｋ５６２のような特定の標的細胞を死滅させる能力に基づいている。細胞障害性を測定する方法は当該分野に公知であり、これには例えば、５１Ｃｒ放出アッセイが含まれる。
【００５９】
本願に使用されるように、「単球」は、食作用を有する大型の無顆粒性白血球である。ヒトでは、これらの細胞は直径が約１０−１２μｍであり、卵形の核を有する。組織にある単球は、マクロファージとして知られている。単球／マクロファージは、それらの形態によって同定し得る。それらは、顆粒球およびほとんどのリンパ球より大きい。それらは、明染色される細かい顆粒を有する、丸形あるいは腎臓のような形の核を有する。それらは、非特異的エステラーゼあるいはα−ナフトールエステラーゼを染色することで検出し得る。特異的分化抗原に対するモノクローナル抗体も入手可能であり、これには例えばＬｅｕ　Ｍ３およびＯＫＴ　Ｍ１が含まれる。「単球」という用語には、単芽球および前単球が含まれる。単核食細胞系の細胞およびそれらの分布を表２に示す。細胞のタイプを区別する方法は、ＢＡＳＩＣ　＆　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，　６ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎに記載されている。
【００６０】
【表２】
2004049235.tif 000003
本願で使用されるように、「顆粒球」という用語は、多くの細胞質内顆粒および分葉した核を有する多型核白血球をいう。顆粒球には、好中球、好酸球および好塩基球が含まれる。好中球は、アメーバ様の形で、食作用を有し、そして塩基性および酸性色素で染色される。好酸球および好塩基球はそれぞれ、酸性色素および塩基性色素で染色される顆粒を細胞質内に有する。
【００６１】
「骨髄細胞」には、初代骨髄組織および霊長類およびヒトのような哺乳類由来の骨髄細胞株の両方が含まれる。初代骨髄細胞のインビトロ培養法およびＩＭ−９、ＫＧ−１およびＫＧ−１ａのような骨髄細胞株の培養法は公知である。例えば、ＡＴＣＣ　ＣＡＴＡＬＯＧ（前出）の３６１を参照のこと。初代骨髄細胞は、本願に記載の白血球およびリンパ球に加えて、多分化能性幹細胞のような始原細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ）を含み得る。例えば、Ｃｉｖｉｎ　米国特許Ｎｏ．４，７１４，６８０を参照のこと。
ＩＩ．発明の開示
本願に記載の発明は、細胞株中でのＨＣＶの複製を可能にする。本発明の方法では、複製するウイルスに感染した末梢血細胞が検出される。好ましくは、検出は、ＨＣＶ感染細胞を含有する調製物中にウイルスゲノムの複製型中間体を同定することによりなされる。または、ビリオンはＨＣＶ感染細胞集団を検出するイムノアッセイを用いて検出し得る。ＨＣＶに感染した細胞株が調製される。これらの細胞株は通常、血球あるいはそれらの前駆細胞、より通常には、単核球あるいはそれらの前駆細胞に由来する。感染した細胞株の調製は、種々の方法によってなされ得る。これらの方法には、次のものが含まれる。１つの選択は、ウイルスを複製している細胞の短期初代培養から採取した培養液の濃縮液で感受性の細胞を培養する方法である。他の選択では、感受性の細胞を直接単離したＨＣＶ粒子に感染させる方法である。さらに別の選択では、感受性の細胞を、ＨＣＶ感染細胞と接触させて生育させる方法である。感受性の細胞は、確立した細胞株あるいは初代培養から得られる。または、ＨＣＶを有する個体からの感染細胞を、細胞株からの確立された細胞と融合して永久細胞株を作製する。さらに別の方法では、個体から単離されたＨＣＶ感染血球を不死化し得る。ＨＣＶ感染細胞株によって産生されるビリオンは、抗ＨＣＶ抗体検出用のイムノアッセイに有用であり、またＨＣＶ治療用ワクチンの生産用基質として有用である。
【００６２】
本発明の実施には、特に示されない限り、従来の分子生物学、微生物学、血液学、細胞および器官培養、組換えＤＮＡおよび免疫学の、当該分野内の技術を用いる。そのような技術は、文献に詳細に記載されている。例えば、ＡＴＣＣ　ＣＡＴＡＬＯＧ　ＯＦ　ＣＥＬＬ　ＬＩＮＥＳ　＆　ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ，６ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８８（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）；　ＢＡＳＩＣ　＆　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，　６ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｔｉｔｅｓ，　ＳｔｏｂｏおよびＷｅ１１編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ　ａｎｄ　Ｌａｎｇｅ，　Ｎｏｒｗａｌｋ　Ｃｏｎｎ／Ｌｏｓ　Ａｌｔｏｓ，　Ｃａ，　１９８７）；　ＢｏｇｇｓおよびＷｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、ＷＨＩＴＥ　ＣＥＬＬ　ＭＡＮＵＡＬ，　ｅｄｉｔｉｏｎ　４　（Ｆ．Ａ．Ｄａｖｉｓ　Ｃｏ．，　Ｐｈｉｌａ．，　１９８３）；　Ｄｉｇｇｓ，　ＳｔｕｒｍおよびＢｅ１１（１９８５）、　ＴＨＥ　ＭＯＲＰＨＯＬＯＧＹ　ＯＦ　ＨＵＭＡＮ　ＢＬＯＯＤ　ＣＥＬＬＳ（アボットラボラトリーズ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ，　Ｉｌ．）；　Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）、ＣＵＬＴＵＲＥ　ＯＦ　ＡＮＩＭＡＬ　ＣＥＬＬＳ：　Ａ　ＭＡＮＵＡＬＯＦ　ＢＡＳＩＣ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ（Ａｌａｎ　Ｒ．　Ｌｉｓｓ，　Ｉｎｃ．，　Ｎ．Ｙ．）；　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ；　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（１９８２）；　ＤＮＡ　ＣＬＯＮＩＮＧ，　ＶＯＬＵＭＥＳ　Ｉ　ＡＮＤＩＩ　（Ｄ．Ｎ　Ｇｌｏｖｅｒ編１９８５）；　ＬＹＭＰＨＯＫＩＮＥＳ　ＡＮＤ　ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮＳ：　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｃｌｅｍｅｎｓ，　ＭｏｒｒｉｓおよびＧｅａｒｉｎｇ編、１９８７）；　ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥＳ：　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｋｌａｕｓ編、１９８７）；　ＶＩＲＯＬＯＧＹ；　ＡＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍａｈｙ編、１９８５）；　ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；　ＮＵＣＬＥＩＣ　ＡＣＩＤ　ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；　ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　ＣＥＬＬＳ　ＡＮＤ　ＥＮＺＹＭＥＳ（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；　Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，　Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＧＵＩＤＥ　ＴＯ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）；　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；　ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＶＥＣＴＯＲＳ　ＦＯＲ　ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、コールドスプリングハーバーラボラトリー）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ．１５４およびＶｏｌ．１５５（それぞれＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編、およびＷｕ編）；　ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、（１９８７）；　ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｓｃｏｐｅｓ（１９８７）；　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：　ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　ＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）；　およびＨＡＮＤＢＯＯＫ　ＯＦ　ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，　ＶＯＬＵＭＥＳ　Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）を参照のこと。前出および後出の本願に記載の全ての特許、特許出願書および出版物を、参考文献として本願に引用する。
Ａ．個体からのＨＣＶ感染細胞の検出および単離
生物試料中のＨＣＶ感染細胞をＨＣＶポリペプチドあるいはＨＣＶポリヌクレオチドの存在についてスクリーニングした。通常この生物試料は、血液サンプルである。このサンプルから、例えば、フィコールパック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｏｒｐ．）溶液による沈降法のような、当該分野で公知の方法を用いて、ＨＣＶに感染している、および／あるいはＨＣＶを複製している細胞が単離され、そして部分精製される。
【００６３】
ウイルスの物質を検出するのに用いられるスクリーニング法は、非常に限られた量を検出するのに十分な感度でなければならない。例えば、ビリオンの存在は、イムノアッセイによって、（複数あるいは単数の）ビリオンポリペプチドに対する抗体を用いて、検出され得る。適当な抗体は、１９８９年５月１８日に出願された、米国特許出願Ｎｏ．３５５，００２（代理人整理番号２３００−００６３．２８）に記載されている。イムノアッセイの方法およびシグナル増強の方法は、当該分野で知られている。
【００６４】
ＨＣＶゲノム物質およびその複製型中間体もまた、核酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る。通常この系は、ハイブリダイゼーションアッセイでの増幅法を含む。このような方法は、当該分野で知られている。例えば、ＥｎｚｏＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのバイオブリッジ（Ｂｉｏ−Ｂｒｉｄｇｅ）システムでは、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、未修飾の３’−ポリ−ｄＴ−テールをＤＮＡプローブに加える。このポリｄＴテールを加えたプローブは、標的のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、次にビオチン修飾したポリＡにハイブリダイズする。ＰＣＴ出願第８４／０３５２０号およびＥＰＡ第１２４２２１号には、以下のＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイが記載されている。その中で、（１）分析物は、酵素ラベルしているオリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖ＤＮＡプローブにアニールし；そして（２）得られたテールを有する二重鎖は、酵素ラベルしたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。ＥＰＡ２０４５１０号には、分析物のＤＮＡが、ポリｄＴテールのようなテールを有するプローブ、ポリＡ配列のようにプローブのテールとハイブリダイズする配列を有するアンプリファイヤー鎖と接触する、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイが記載されている。このアンプリファイヤー鎖は、複数のラベルした鎖と結合し得る。とくに望ましい方法では、まず、血清中の標的ＨＣＶ配列を、その配列が検出し得るレベルになるまで増幅させる。このことは、例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）、Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号、およびＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，２０２号に記載のポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法によってなされる。次に増幅した複数の配列を、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出し得る。これは、１９８７年１０月１５日に出願された、同時係属中の米国特許出願第１０９，２８２号（代理人整理番号２３００−０１７１）、米国特許出願第１８５，２０１号（１９８８年４月２２日に出願）、および米国特許出願第２５２，６３８号（１９８８年９月３０日に出願）に記載されている。これらは本出願の譲受人に譲渡されており、本明細書に参考として援用されている。１０６／ｍｌのレベルで配列を検出しなければならないこれらのハイブリダイゼーションアッセイでは、一本鎖の核酸分析物、およびさらに複数のラベルした一本鎖オリゴヌクレオチドと結合する、核酸多量体を用いる。ラベルしたポリヌクレオチドプローブを用いて使用し得る、適当な液相サンドイッチアッセイ、およびプローブの調製法は、１９８７年６月１６日に公表された、ＥＰＯ２２５，８０７号に記載されている。これは、本出願の譲受人に譲渡されており、そして本明細書に参考として援用されている。
【００６５】
ＨＣＶゲノムの配列を検出する好ましい方法は、実施例に記載してある。この方法は、１９８９年５月１８日に出願の米国特許出願（代理人整理番号２３００−００６３．２７）に記載のＨＣＶ／ｃＰＣＲ法に基づいている。これは本出願と同一の譲受人が、所有しており、そして本願に参考として援用されている。この方法では、ＨＣＶゲノムの一部のｃＤＮＡレプリカのファミリーに基づいたプライマーおよびプローブを用いる。このｃＤＮＡファミリー由来のｃＤＮＡのプラスストランドの構成配列を図１に示す。この方法の第一の工程は、逆転写酵素を用いて、ＨＣＶゲノムあるいはその複製型中間体に対するｃＤＮＡを合成することである。複製型中間体が検出される場合、プライマーは、ＨＣＶ　ＲＮＡのネガティブストランド（すなわち、複製型中間体のストランド）のみに相補的である。ＨＣＶ　ｃＤＮＡの合成の後、増幅の前に、サンプル中のＲＮＡは、例えば、アルカリ変性、あるいはＲＮＡ特異的ＲＮａｓｅなどによる、当該分野で知られている方法によって分解される。
【００６６】
ＨＣＶの変異株が、様々な個体の感染細胞中に存在することが予想される。従って、検出法は、ＨＣＶのゲノムの配列のコンスタントなエピトープに向けられるものでなければならない。
【００６７】
ＨＣＶ／ｃＰＣＲ法を、フィコールパークで分離した血球画分のスクリーニングに用いて、末梢血液由来の細胞の部分的に精製された組成物中に、ＨＣＶゲノムの複製型中間体が検出された（以下の実施例を参照のこと）。この組成物はリンパ球、単球／マクロファージ、血小板および少量の他の白血球細胞型を含む。フィコールパークによる沈降法で、密度の高い赤血球および顆粒球から、この中間面に集まるこれらの細胞が分画される。
【００６８】
例えば、血球の様々な型を区別するイムノアッセイなどの当該分野で公知の方法を用いて、感染細胞の型をさらに同定し得る。様々なリンパ球、および単球／マクロファージ上の表面エピトープに対するモノクローナル抗体が当該分野で知られている。従って、ＨＣＶ感染細胞は、特異的細胞表面抗原に対する免疫学的結合によって、単離されそして同定され得る。
Ｂ．インビトロの感染細胞系の調製
様々な方法を用いて、ＨＣＶに感染した、インビトロの細胞（細胞株を含めた）を調製し得る。インビトロでの感染および増殖のための候補の細胞は、例えばリンパ球あるいは骨髄細胞の様な上記の任意の細胞型から得られる。ＨＣＶゲノムの複製型中間体が、感染したヒトの末梢血液の白血球中に存在するという発見により、インビトロのウイルスの複製を支持し得る細胞の型が示唆される。すなわち、フィコールパークによって沈降した白血球懸濁液の中間面に集まる、白血球群の中の少なくとも１つの細胞型、すなわち、単核球である。（一般的に、この方法で、末梢血液サンプルの正常な赤血球および顆粒球が除去される）。さらに単核球の異なる型を分離するのに分画法が用いられ、これらの細胞型に付随するＨＣＶ複製型中間体および／あるいはＨＣＶ抗原の存在を決定し得る。例えば、様々な型のリンパ球およびマクロファージなどの異なる型の単球を分離する方法が当該分野で知られている。例えば、ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥＳ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｋｌａｕｓ編）を参照のこと。これらの方法では、特定の細胞型に対するモノクローナル抗体が用いられ得る。モノクローナル抗体は、例えばウェル付プレート、あるいは磁気ビーズのような固体の基質に固定され得る。あるいは、セルソーター機器による、分別法が用いられ得る。選別によって、単核球の集団中の所望の細胞を積極的にあるいは消極的に富化および／あるいは選択し得る。リンパ球およびマクロファージを単球の集団から単離する分画実験に基づいて、複製に好ましい細胞型は、リンパ球および／あるいはマクロファージ／単球で有り得ることが示唆される。
【００６９】
ＨＣＶの複製は、インビボでは単核球中で起こることから、感染した細胞株は、これらの型の既知の確立された細胞株由来であり得ることが予想される。このうちの多くは、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能であり、その中には、例えばＢ細胞株（例えば、Ｂ９５−８、ＤＡＫＩＫＩ、ＬＴＲ２２８、Ｍｏ−Ｂ、ＳＣ−１、ＷＩＬ２−ＮＳのようなＥＢＶ形質転換Ｂ細胞由来の株；Ｉａ２、ＢＬ−３、ＵＣ　７２９−６、Ｎａｍａｌｗａ、Ｕ−９３７、Ｒａｍｏｓ（ＲＡ−１）、ＢＣＬ１クローン５Ｂ１ｂ、ＭＣ／ＣＡＲ、ＩＡ２、ＹＢ２／０、ＣＡ３−Ｆ４、ＳＨＭ−Ｄ３３、ＣＷ１３．２０−３Ｂ３、ＢＣ９−Ｅ％、ＷＭ−１１５、ＷＭ２６６−４、ＷＥＨＩ−２３１、ＷＥＨＩ−２７９、ＮＦＳ−１．０　Ｃ−１のようなＢ細胞株）；単球株（例えば、ＴＨＰ−１、ＷＥＨＩ−２７４．１）、マウスリンパ腫株（例えば２ｐｋ−３）、プロ−Ｂリンパ芽球（例えば、ＮＦＳ−７０　Ｃ−１０）、プレ−Ｂリンパ芽球（例えばＮＦＳ−２５　Ｃ−３）、Ｔ細胞由来株（例えば、ＣＴＬＬ−２ＨｕＴ１０２、Ｄ１０．Ｇ４．１、ＬＢＲＭ−３３クローン４Ａ２、ＨｕＴ７８、Ｃｌ．Ｌｙ１＋２−／９、ＵＣＤ−ＭＬＡ−１４４、６Ｔ−ＣＥＭ２０、６Ｔ−ＣＥＭ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｈ９／ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、ＣＣＲＦ−ＳＢ；ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２、ＣＥＭ−ＣＭ３、Ｍｏ、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＢＷ５１４７．３、ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４、Ｃ１４９８、ＲＡＷ８．１、ＣＴＬＬ−２、およびＢＷ５１４７．Ｇ．１．４．ＯＵＡＲ．１）が含まれる。さらに関連の別のヒト白血球細胞株には、Ｋ５６２およびＡＲＨ−７７が含まれる。これらの細胞のインビトロの培養の条件は、ＡＴＣＣ　ＣＡＴＡＬＯＧ　ＯＦ　ＣＥＬＬ　ＬＩＮＥＳ　ＡＮＤ　ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ第６版（１９８８）に記載されている。
【００７０】
ＨＣＶがインビトロで複製し得る別の型の細胞系は、インビボでＨＣＶに感染した細胞型の初代培養物である。本明細書での初代培養物とは、個体の細胞あるいは組織から直接得られた細胞の培養物およびこれらの細胞の継代により得られた細胞をいい、不死化細胞のことではない。特に単核球の初代培養物を調製する方法およびそのインビトロでの生育の条件は、当該分野で知られている（例えば、ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥＳ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｋｌａｕｓ編）、特にＨｕｎｔ（１９８７）；およびＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）を参照のこと）。一般的に、正常の成熟マクロファージは、増殖しない；しかし、マクロファージの増殖前駆細胞は当該分野で既知の方法によって培養され得る。例えばＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）、ｐｐ．２８４−２８７を参照のこと。
【００７１】
さらに別の型のＨＣＶが複製され得る細胞系は、単核球の初代培養物由来の不死化細胞株中にある。単核球型の不死化細胞株の型を得る方法は、当該分野で知られている。例えば、培養中のＢ細胞、Ｔ細胞、およびマクロファージを生育させる方法および不死化させる方法が、ＬＹＭＰＨＯＣＹＴＥＳ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｋｌａｕｓ編）；ＬＹＭＰＨＯＫＩＮＥＳ　ＡＮＤ　ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮＳ（Ｃｌｅｍｅｎｓ、Ｍｏｒｒｉｓ、およびＧｅａｒｉｎｇ編）、およびＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）に記載されている。例えば、Ｂ細胞株は、しばしばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）による感染によって不死化される。これは、感染細胞由来の単核球を、例えばＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６１２細胞（Ｂ９５−８）のようなＥＢＶを常に放出するＥＢＶ感染細胞からの上清とインキュベートすることによりなされ得る。
【００７２】
培養中の単核球の生育には、しばしば培養培地中に刺激タンパク因子（サイトカインとも呼ばれる）の存在が要求される。これらの因子は通常、他の型の細胞により産生される。サイトカインの供給は、馴化培地、すなわち、所望の因子を産生する細胞からの細胞培養上清になされ得る。あるいは、支持細胞によって供給され得る。精製したサイトカインの供給によってもこの要求は満たされ得る。サイトカインには、例えば以下が含まれる。すなわち、インターロイキン１αおよびβ（リンパ球活性化因子、表皮細胞由来胸線細胞活性化因子、およびヘモポイエチンＨ１とも呼ばれる）である。このようなリンホカインは、単球、リンパ球、およびケラチノサイトを含む、様々な細胞から誘導される。インターロイキン１−αおよびβは、インターロイキン２産生を刺激すること、および造血活性を含めた複数の作用を有する。インターロイキン２（Ｔ細胞増殖因子とも呼ばれる）は、Ｔ−リンパ球から誘導され、Ｔ細胞およびＢ細胞の増殖および分化、マクロファージ活性化、およびナチュラルキラー細胞の活性化を刺激する。インターロイキン３（マルチ−ＣＳＦとも呼ばれる）は、Ｔリンパ球から誘導され、増殖および分化に多能性の影響を有し、肥満細胞の増殖を刺激する。インターロイキン４（Ｂ細胞増殖因子１とも呼ばれる）は、Ｔリンパ球から誘導され、そしてＴ細胞およびＢ細胞の増殖および分化を刺激する。インターロイキン５（Ｂ細胞増殖因子ＩＩとも呼ばれる）は、Ｔリンパ球から誘導され、好酸球分化を刺激する（そしてマウスの系では、Ｂ細胞増殖因子として作用する）。低分子量のＢ細胞増殖因子は、Ｔリンパ球から誘導され、Ｂ細胞増殖を刺激する。Ｂ細胞刺激因子２（インターフェロンβ−２とも呼ばれる）は、Ｔリンパ球から誘導され、Ｂ細胞分化を刺激する。インターフェロンγ（免疫インターフェロンとも呼ばれる）は、Ｔリンパ球によって産生され、マクロファージを活性化する。顆粒球コロニー刺激因子は、数多くの細胞型から誘導され、顆粒球の増殖および分化を刺激する。マクロファージコロニー刺激因子（ＣＳＦ１）は、数多くの細胞型から誘導され、単球／マクロジャージの増殖および分化を刺激する。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子は、数多くの細胞型から誘導され、単球／穎粒球の増殖および分化を刺激する。
【００７３】
感受性の細胞株のＨＣＶによる感染は、特に、ＲＮＡウイルス、そしてより特定的にはフラビウイルスであるウイルスで細胞を感染させるのに当該分野で使用されている、数種類の方法のうちの任意の１つによってなされ得る。一般的に、ウイルス粒子は、生理的温度で培養細胞に吸着する。ウイルスは、侵入し、脱外皮し、核あるいは細胞質で核酸を複製し、そして転写および翻訳の後、子孫のビリオンを組立て、それが細胞の溶解あるいは出芽によって放出される。１つの細胞から放出される子孫ウイルス粒子の数は、バーストサイズとして表される。ウイルスの力価は、段階１０倍希釈物を細胞に吸着させ、そして許容温度で適当にインキュベーションした後、生じたプラークを数えて計測する。
【００７４】
感受性細胞のウイルスの感染は、感受性細胞とＨＣＶ感染細胞の同時培養によって達成され得る。ＨＣＶ感染細胞は、初代培養物に由来し得る。通常ＨＣＶ感染細胞および初代培養細胞のほぼ同数を、適当な細胞培養培地で一緒にインキュベートする。培地は、ポリブレン、あるいは機能的に類似の物質を適当な濃度で含み得る。インキュベーションは、ＨＣＶ感染細胞由来の新しく複製されたウイルスが感受性細胞に付着し取り込まれるのに十分な時間と適切な温度でなされる。
【００７５】
さらに感受性細胞の感染は、ＨＣＶ感染細胞の細胞を含まない上清を含むウイルスを用いても達成され得る。一般的に感受性細胞は、適当な濃度のポリブレン（あるいは機能的に類似の物質）で前処理され、次に、感染した個体由来の初代培養ＨＣＶ感染細胞の短時間培養物から回収され、濃縮された培養液に曝される。
【００７６】
感受性の細胞はまた、ＨＣＶ含有生物試料から単離されたウイルスで感染され得る。ウイルス、特にＲＮＡを含むウイルス、およびより特定的にはトガウイルスおよびフラビウイルスを単離する適当な方法は、当該分野で知られている。例えば、ＶＩＲＯＬＯＧＹ：Ａ　ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍａｈｙ　編）を参照のこと。さらに、この本には、感染に適当な細胞およびこれらの細胞の増殖条件が記載されている。
【００７７】
インビトロでのＨＣＶ感染細胞の他の調製法は、ＨＣＶ感染単核細胞と感受性細胞との融合であり得る。体細胞の融合法および融合細胞の選択法は当該分野で知られている。例えば、融合は、融合を誘導するようなウイルス（例えば、ＥＢＶ、センダイウイルスなど）の存在、あるいは化学物質（例えば、ポリエチレングリコール）の存在によって媒介され得る。感受性の細胞は、選択培地での細胞の増殖を妨げるマーカーを有し得る。例えば、細胞は、チミジンキナーゼネガティブの表現型で有り得る。次にチミジンキナーゼ要求培地、例えばＨＡＴ培地中で選択される。この方法は、感染した個体から単離されるＨＣＶ感染単核細胞が、インビトロで増殖しない場合、特に適切である。ＨＣＶを複製し得る融合細胞の調製に適切な方法は、トリオーマを形成するのに用いられる組織特異的細胞（報告では肝細胞）がＨＣＶ感染単核球に置き換えられた以外は、Ｗ０８７／０５９３０に記載されている。
【００７８】
さらに他のＨＣＶ感染細胞株を調製する方法は、ＨＣＶ感染個体から単離した感染細胞を不死化することによる。一般的に、単核細胞は、末梢血から単離される。もし所望ならば、単核細胞集団は、さらに分画され得る。次に細胞を初代培養で増殖させる。不死化は、細胞を細胞危機期間を通して増殖させ、継代していくことで達成し得る。この期間に培養細胞の大部分は死に、結果として残った細胞は不死化している。不死化Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージを産生する他の方法は、前出に記載の通りである。
【００７９】
前出に記載のように調製したＨＣＶ感染細胞株中でのＨＣＶ複製は、様々なアッセイによって検出され得る。例えば、ウイルスアッセイは、ウイルスの細胞変性の性質あるいは形質転換の性質に依存し得る。細胞変性ウイルスは、マイクロタイタープレートでの抗代謝効果により、あるいは適当な単層感受性宿主細胞中の特徴的なプラーク形成によってアッセイされ得る。ウイルスの懸濁物は、段階希釈され、そして、単層培養プレートに加えられる。限界希釈で形成されたプラークの数が、培地上清中の感染性粒子の数と等しいと考えられ、出発のサンプル中のウイルスの濃度を計算できる。ウイルスの特徴付けは、前出に記載のように、特異的抗血清によって、ウイルスの細胞変性効果を測定して、イムノアッセイによって、あるいはＨＣＶ　ＲＮＡのｃＰＣＲ／ＨＣＶアッセイによってなされ得る。
【００８０】
形質転換ウイルスは、例えば、浮遊形質転換クローンの選択的増殖、あるいは単層培養の形質転換コロニー（ｆｏｃｉ）の検索によって、アッセイされ得る。
【００８１】
目的のウイルスが検出し得る細胞変性効果も形質転換効果も示さない場合、ウイルスは、感染細胞調製物あるいは感染細胞の溶解物中で多くの方法によって、検出され得る。この中には例えば、ウイルスに特異的なラベルした（複数の）抗体を用いたイムノアッセイ、抗ＨＣＶ抗体を用いた、複製中にラベルしたポリペプチドのイムノアッセイ、および、富化したウイルスのポジティブストランドに相補的なネガティブストランドの集団、あるいはインビトロのウイルス合成期間中にラベルしたウイルス核酸のようなウイルス核酸の検出が含まれる。
Ｃ．ＨＣＶ感染細胞由来の抗原を用いるイムノアッセイ
ＨＣＶ抗体を含有する血清と免疫学的に反応するＨＣＶ感染細胞由来の抗原は、生物試料中のＨＣＶ抗体の存在を検知するイムノアッセイに有用である。ＨＣＶ抗原は種々の形態を取り得、とりわけ、精製されたあるいは部分的に精製されたウイルス粒子もしくはウイルスポリペプチド、粉砕されたウイルスあるいは感染細胞またはこれらの細胞の溶解液の形を取り得る。組織培養物からの種々な形態のウイルス抗原が生産されることは当業者に公知である。イムノアッセイのデザインには非常に多様性があり、それらの多様性は当業者に公知である。たとえば、イムノアッセイは、同一または異なるウイルスのポリペプチドに由来するウイルスエピトープの組合せを使用し得る。たとえば、ＨＣＶに感染した細胞からあるいは単離したＨＣＶから、１つまたはそれ以上のウイルス抗原を使用することができる。別の方法では、ウイルスエピトープが内部であるいは外部で発現している場合は、培養液から直接固定した細胞を用い得る。あるいはまた別の方法として、細胞の溶解液を使用し得る。さらに、また、例えば粉砕したビリオン全体を使用し得る。粉砕したビリオンを調製する一般的な方法は当業者によく知られている。
【００８２】
イムノアッセイプロトコールは種々替わり得る。プロトコールは、例えば、競合的な、あるいは直接的な反応またはサンドイッチタイプアッセイに基づき得る。プロトコールは、また例えば、固形の支持体を使用し得、あるいは免疫沈降でもあり得る。ほとんどのアッセイが、ラベルした抗体あるいはポリペプチドの使用を包含し得る。ラベルは、例えば蛍光、化学発光、放射能、あるいは染料分子であり得る。プローブからの信号を増幅するアッセイもまた公知である。これらの例は、ビオチンおよびアビジンを使用するアッセイ、酵素−ラベルおよび酵素が介在するイムノアッセイ、たとえばＥＬＩＳＡアッセイである。
【００８３】
適切なイムノアッセイでは、粉砕したビリオンをＥＬＩＳＡの形態で用い得る。酵素に連結した免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）方法は、抗原あるいは抗体のいずれかに結合した酵素に依るもので、結合した酵素活性を定量的なラベルとして使用する。抗体の測定には、公知の抗原を固相（例えば、マイクロプレートあるいはプラスチックカップ）に固定し、酵素でラベルした抗−イムノグロブリンとともにインキュベートし、再び洗浄する。ラベルに適した酵素は当業者に公知であり、例えば、西洋ワサビのパーオキシダーゼが含まれる。固相に結合した酵素活性は、特異性のある基質を添加して測定し、生成物あるいは基質の使用を比色定量的に測定する。結合した酵素の活性は結合した抗体の量の直接的な関数である。
【００８４】
抗体の測定には、既知の特異的抗体を固相に固定し、抗原を含有する試験物質を添加してインキュベートした後、固相を洗浄し、第２の酵素ラベルした抗体を加える。洗浄後、基質を添加して、酵素活性を比色定量的に算出し、抗体濃度に相関させる。
【００８５】
このように例えば、ＥＬＩＳＡ方式を用いて抗−ＨＣＶ抗体を検知するためには、適当なマイクロタイタープレートをコートするのに、たとえば界面活性剤等で溶解した、単離したＨＣＶを使用し得る。ウイルス抗原が結合した後、さらに別のタンパク質を、プレートをコートするために使用して抗体の非特異的な結合を防ぐ。抗ＨＣＶ抗体をテストする生物学的サンプルをプレートに添加し、そしてＨＣＶ抗体−ＨＣＶ抗原複合体の形成を検出する。
【００８６】
他の適当なイムノアッセイとして、ＨＣＶ溶解液のゲル電気泳動を使用し得、その後、抗ＨＣＶ−抗体のテストをする生物学的サンプルでウエスタンブロットを行う。ＨＣＶ抗体−ＨＣＶ抗原複合体の形成を公知の技術で検出する。
【００８７】
免疫診断用に好適で、ラベルされた適切な試薬を含有するキットは、適当な物質をパッケージして構成し、これには、ＨＣＶ感染細胞由来の抗原を、その他のアッセイを実施するのに必要な試薬および物質、並びに、適切なアッセイの説明書のセットとともに適当な容器に入れたものを包含する。
Ｄ．抗ウイルス剤のスクリーニングにおける感染可能な細胞の使用
ＨＣＶの複製が可能である、本明細書で記載する細胞は、ＨＣＶの複製を阻害する抗ウイルス剤、特に、優先的に細胞の生育および増殖をさせるがウイルスの複製を阻害する抗ウイルス剤のスクリーニングに使用し得る。使用し得るスクリーニング法は、推定上の抗ウイルス剤の存在下、ウイルス複製の阻害を試験する方法である。一般的に、抗ウイルス剤は、種々の濃度で、ウイルスの複製を助ける細胞培養系におけるウイルス複製の阻害効果をテストし、次に、動物モデル系における感染阻害あるいはウイルスの病原性（および低レベルの毒性）阻害の試験をテストする。
【００８８】
抗ウイルス剤には、ウイルス感染をブロックする抗体（中和抗体）が含まれる。抗−ＨＣＶ抗体が、インビトロで、細胞への感染を妨げる能力は、推定上の抗−ＨＣＶ抗体の存在下、ウイルス複製が阻害されるか否かを決定する、本明細書に記載されたアッセイを用いて、決定され得る。さらに例えば、感染細胞で産生されるウイルスが、抗原源として用いられ得、抗体がＨＣＶに特異的か否かが決定される。
【００８９】
【実施例】
Ａ．ＮＡＮＢＨを有する個体からの単核球におけるＨＣＶ　ＲＮＡの検出
慢性ＮＡＮＢＨを有する個体の血液の単核球におけるＨＣＶ　ＲＮＡの検出は、実質的には、米国特許出願番号０７／３５５，９６１に記載のｃＰＣＲ／ＨＣＶアッセイを用いて行った。
【００９０】
慢性ＮＡＮＢＨを有する５つの個体から得られ、ＨＣＶ−Ｃ１００抗原イムノアッセイで抗−ＨＣＶ抗体陽性である血液、および５つのコントロール個体（ＮＡＮＢＨがないと報告され、イムノアッセイ陰性）の血液について、単核球画分中のＨＣＶ　ＲＮＡの存在を調べた。サンプルからの単核球画分は、製造者の説明書に従って、フィコールパック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）による沈降で得た。
【００９１】
これらの研究に使用されたｃＰＣＲ／ＨＣＶアッセイは、以下の方法を用いて行われる。すなわち、ＲＮＡの調製、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写、ｃＤＮＡの特定のセグメントのＰＣＲによる増幅、およびＰＣＲ生産物の分析である。
【００９２】
全ＲＮＡ画分は、単核球画分から単離した。ＰＣＲ反応の鋳型として用いるｃＤＮＡは、対応するｃＤＮＡの調製用と指定されたサンプルを用いて調製した。それぞれのＲＮＡサンプル（血液１０μｌ中の細胞に相当する）を２５μｌの反応液中でインキュベートした。反応液は、それぞれのプライマー１μＭ、それぞれのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）１ｍＭ、５０ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ８．３、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、７３ｍＭ　ＫＣｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤４０ユニット（ＲＮＡＳＩＮ）、およびＡＭＶ逆転写酵素５ユニットを含有する。インキュベートは、３７℃、６０分間行った。ｃＤＮＡ合成後、反応液を脱イオン水（ＤＩＷ）５０μｌで希釈し、１０分間煮沸して、氷冷した。
【００９３】
ＨＣＶ　ｃＤＮＡのセグメントの増幅は、２つの１６−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。これらの配列はＨＣＶ　ｃＤＮＡクローン３６（アンチセンス）および３７ｂ（センス）由来のものである。クローン３６からのプライマーの配列は；
５’　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　Ｔ　３’　　であった。クローン３７ｂからのプライマーの配列は；
５’　ＡＣＡ　ＡＴＡ　ＣＧＴ　ＧＴＧ　ＴＣＡ　Ｃ　３’　　であった。プライマーは、それぞれ最終濃度１μＭを使用した。プライマーによってはさまれたＨＣＶ　ｃＤＮＡのセグメントを増幅するために、製造者の説明書に従って、ｃＤＮＡサンプルを０．１μｇのＲＮａｓｅ　Ａおよび、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＰＣＲ　ｋｉｔ（Ｎ８０１−００４３あるいはＮ８０１−００５５）のＰＣＲ反応液とインキュベートした。ＰＣＲ反応は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒを用いて、３０サイクルもしくは６０サイクルを行った。それぞれのサイクルは、９４℃、１分の変性ステップ、３７℃、２分のアニーリングステップ、および７２℃、３分の伸長ステップからなる。しかし、最終サイクル（３０あるいは６０）の伸長ステップは、３分ではなく７分行った。増幅後、サンプルを等量のフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、ついで、等量のクロロホルムで抽出した後、サンプルを０．２Ｍ酢酸ナトリウムを含有するエタノールで沈澱させた。
【００９４】
ｃＰＣＲ生成物は、以下のように分析した：生成物をＭｕｒａｋａｗａら（１９８８）の方法にしたがって、１．８％アルカリ性アガロースゲル電気泳動にかけ、０．４Ｍ　ＮａＯＨ中、ゼータプローブペーパー（ＢｉｏＲａｄ　Ｃｏｒｐ．）上にゲルを一晩ブロットさせて、移した。ブロットは、２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウムを含む）で中和し、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、１５ｍＭ　リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ　６．８、１５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．０％　ＳＤＳ、０．５％脱脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ　Ｃｏ．）および０．５ｍｇ／ｍｌの超音波処理した変性サケ精子ＤＮＡ中で、プレハイブリダイズした。ＨＣＶ　ｃＤＮＡフラグメントについて分析されるブロットを、３２Ｐ−ラベルされたプローブとハイブリダイズさせた。このプローブは、図２に示されるクローン３５中のＨＣＶ　ｃＤＮＡ挿入配列をニックトランスレーションして作成した。ハイブリダイズした後、ブロットを０．１ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，０．０１Ｍ　クエン酸ナトリウムを含む）で、６５℃で洗浄し、乾燥後、オートラジオグラフィーにかけた。予想した生成物のサイズは、５８６ヌクレオチドの長さであり、プローブとハイブリダイズし、ゲル中でこのサイズ範囲に移動した生成物は、ウイルスＲＮＡ陽性として記録した。
【００９５】
コントロールとして、α１−アンチトリプシンｍＲＮＡを増幅するようにデサインされたｃＰＣＲプライマーを、解析したそれぞれのサンプル中にＲＮＡが存在することの証明のために使用した。α１−アンチトリプシン遺伝子のコード領域は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８４）に記載されている。α１−アンチトリプシン遺伝子のコード領域の３６５ヌクレオチドフラグメントを増幅するようにデザインした１６−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレオチド２２−３７（センス）およびヌクレオチド３７２−３８７（アンチセンス）由来のものである。ＰＣＲ生成物は３２Ｐ−ニックトランスレートしたプローブで検出した。このプローブは、ｃＤＮＡ／ＰＣＲプライマー配列の間にあって、この配列を含むものではない。
【００９６】
ＰＣＲ反応が非常に鋭敏であることから、すべてのサンプルは最低３回実験した。以下の事前の注意を払うとすべての偽陽性のシグナルは除かれた。１）ゴムの０−リングシールのついたスクリューキャップを用いてエアロゾル（ａｅｒｏｓｏｌｓ）を除くこと；２）使い捨てのピストン／キャピラリーを備えたＲａｎｉｎ　Ｍｉｃｒｏｍａｎ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｐｉｐｅｔｔｅｒｓを用いて、ピペッティングすること；３）ｃＤＮＡおよびＰＣＲプライマーに対するオリゴヌクレオチド配列を２つの隣接しないｃＤＮＡクローンから選択すること。
【００９７】
その結果は、５つのＨＣＶ抗−Ｃ１００抗体陽性サンプルのうちの５つから得た単核球が、ｃＰＣＲ／ＨＣＶアッセイにおいてＨＣＶ　ＲＮＡに対して陽性であったことを示した。すべてのコントロールは、同じアッセイで陰性であった。Ｂ．ＨＣＶ感染個体からの単核細胞におけるＨＣＶ　ＲＮＡマイナスストランドの検出
末梢血単核球のマイナスストランドの検出は、実質的にセクションＩＩＩ．Ａ．に記載したｃＰＣＲ／ＨＣＶアッセイを使用して行われたが、ｃＤＮＡの合成に、セクションＩＩＩ．Ａ．に記載したＨＣＶ　ＲＮＡのプラスストランドを開始するためのクローン３６からの１６−ｍｅｒプライマー（即ち、プライマー３６／１６Ａ）、あるいはネガティブストランドを開始するための、その１６−ｍｅｒの相補体（即ち、プライマー３６／１６Ｂ）を使用した点で異なる。連続的なＰＣＲ反応と行うために、ｃＤＮＡ反応混合物を煮沸し、第２のプライマー添加前にＲＮａｓｅで処理した。
【００９８】
ｃＰＣＲ／ＨＣＶアッセイの結果、５つのＨＣＶ抗−Ｃ１００抗体サンプルはＨＣＶのネガティブストランドＲＮＡに対して陽性であったことを示した；これら５つのサンプルのうち、２つはＨＣＶ　ＲＮＡネガティブストランドが高レベルであることを示した。５つのこれらのサンプルすべてがＨＣＶ　ＲＮＡのプラスストランドに対して、ほぼ同等に陽性であった。５つのコントロールサンプルはすべて、ＨＣＶ　ＲＮＡのプラスおよびマイナスストランドの両方に陰性であった。
【００９９】
追加のコントロールとしての３つのＨＣＶ陽性個体からの血漿サンプルを分析した。ポジティブストランドから得られたシグナルは、ネガティブストランドから得られたシグナルの少なくとも５から１０倍強かった。このように、血漿サンプルはプラスストランドに対しては強い陽性を示したのに対し、マイナスストランドに対しては、ほんの弱い陽性か、あるいは陰性を示した。
【０１００】
フラビ様のＨＣＶにおいては、ウイルスゲノムはポジティブストランドＲＮＡである。単球におけるＨＣＶ　ＲＮＡのネガティブストランドが血漿中におけるそれよりもはるかに多いという発見は、ウイルスゲノムの複製型中間体が、これらの細胞中に存在することを示唆する。
商業的有用性
ＨＣＶ感染細胞株を含む、インビトロで感染および／または複製するＨＣＶに感染した細胞系は、ＨＣＶ抗体の検出に有用であり、従って、ＨＣＶの診断およびＨＣＶに対する生物学的物質（血液を含む）のスクリーニングに有用なウイルス抗原の供給源となる。これらの抗原はウイルス感染処置（予防および／または治療）用のワクチンの調製にも使用され得る。さらに、これらの細胞系は、感染を中和することができる、あるいは抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を仲介する抗体を包含する、ＨＣＶの複製を阻止するための抗ウイルス剤のスクリーニングに有用である。
【０１０１】
本発明を、上記のように例示して説明したが、本発明はそれらに限定されるものではなく、本発明の範囲は添付した請求の範囲およびその同等範囲で決定されるべきである。上記した文献は、参考文献として本発明に引用する。
【０１０２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＣＶのＨＣＶ１株に由来するＨＣＶ　ｃＤＮＡセンスストランドを構成する配列を示す。
【図２】ＨＣＶ　ｃＤＮＡクローン３５のヌクレオチド配列、およびそこにコードされるアミノ酸を示す。
【図１】
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【図２】
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