(57)【要約】【課題】シチジンヌクレオシド誘導体の効率的な合成法を提供する。【解決手段】シトシン誘導体とペントース−１−リン酸誘導体またはその塩から、ヌクレオシドホスホリラーゼまたは該酵素活性を有する菌体、酵素、培養液などを触媒として用い、シチジンヌクレオシド誘導体を製造するに際して、基質あるいは生成物の分解活性を特異的に失活させる手段を方法を採用することにより、高収率で高品質のシチジンヌクレオシド誘導体を製造できる。【効果】シチジンヌクレオシド誘導体の製造に際し、ほとんど副生物が生成しない。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物、該微生物培養液、該微生物の菌体処理物またはそれらの固定化物の存在下、シトシン誘導体とペントース１−リン酸誘導体またはその塩からシチジンヌクレオシド誘導体を製造する方法において、亜鉛塩を存在させ製造する事を特徴とする、シチジンヌクレオシド誘導体の製造方法。
【請求項２】
シトシン誘導体が一般式（１）［化１］
【化１】
2004024086.tif 000006
（ここでＥは窒素原子または炭素原子、Ｆは水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子を示す。）で示される化合物であり、ペントース１−リン酸誘導体またはその塩が一般式（２）［化２］
【化２】
2004024086.tif 000007
（ここでＲ１はヒドロキシメチル基またはカルボキシル基を示し、Ｘはハロゲン原子またはアルコキシ基を示し、ａ、ｂは各々独立して０から３の整数を示し、かつａ＋ｂ≦３である。）で示される化合物またはその塩であり、シチジンヌクレオシド誘導体が一般式（３）［化３］
【化３】
2004024086.tif 000008
（ここでＲ１、Ｅ、Ｆ、Ｘ、ａ、ｂは前記と同義である。）で示される化合物である請求項１記載のシチジンヌクレオシド誘導体の製造方法。
【請求項３】
シトシン誘導体がシトシンであり、ペントース１−リン酸誘導体またはその塩が、２−デオキシリボース１−リン酸２アンモニウム塩または２−デオキシリボース１−リン酸２シクロヘキシルアンモニウム塩であり、シチジンヌクレオシド誘導体が２’−デオキシシチジンである、請求項２に記載のシチジンヌクレオシド誘導体の製造方法。
【請求項４】
亜鉛塩が酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩基性炭酸亜鉛、水酸化亜鉛又は酸化亜鉛である事を特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載のシチジンヌクレオシド誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬品等の合成原料として有用なヌクレオシド誘導体の製造方法に関する。さらに詳しくは、亜鉛塩の存在下、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素、菌体、培養液またはそれらの混合物の処理物を用いてシチジンヌクレオシド誘導体を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシドホスホリラーゼはリン酸存在下でヌクレオシドのＮ−グリコシド結合を加リン酸分解する酵素の総称であり、リボヌクレオシドを例にすると次式で表される反応を触媒する。
リボヌクレオシド＋リン酸（塩）→核酸塩基＋リボース１−リン酸
プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンホスホリラーゼに大別されるヌクレオシドホスホリラーゼは、広く生物界に分布し、哺乳類、鳥類、魚類などの組織、酵母、細菌に存在する。この酵素反応は可逆的であり、逆反応を利用した各種ヌクレオシドの合成が以前より知られている。例えば、２´−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基（チミン、アデニンまたはグアニン）からチミジン（特開平０１−１０４１９０号公報）、２´−デオキシアデノシン（特開平１１−１３７２９０号公報）または２´−デオキシグアノシン（特開平１１−１３７２９０号公報）を製造する方法が知られている。この様にヌクレオシドホスホリラーゼを用いるヌクレオシド化合物の製造は、穏和な条件で立体特異的に製造することが可能であり、多くのヌクレオシド誘導体の合成が検討されている。
【０００３】
シチジンヌクレオシド誘導体の製造方法としては、特公平７−８９９４８号公報ではデオキシリボース−１−リン酸とシトシンから微生物の菌体を用いた反応によりデオキシシチジンを製造する方法が示されているが、該公報の方法には反応を触媒しているものが菌体でありヌクレオシドホスホリラーゼが反応に関与しているとは必ずしも言えない。例えば、菌体内に蓄積したデオキシシチジンが反応中に菌体内より溶出したものであったり、菌体内のヌクレオシドデオキシリボシルトランスファラーゼにより、基質として添加したシトシンが菌体内のデオキシヌクレオシドの塩基に転移した結果、デオキシシチジンが検出された可能性も考えられる。本発明者らはそれらの点をはっきりさせるため、該公報の実施例で寄託されている微生物のうち７株の分譲を受け当該公報の実施例に記載の方法で同じ試験を行った。その結果、何れの菌株を用いてもデオキシシチジンは全く検出されなかった。
【０００４】
特開平３−１２７８６公報では、プリン塩基とピリミジン塩基の両方に作用する新規なヌクレオシドホスホリラーゼが報告されており、ピリミジン塩基としてデオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシチミジンに作用すると記載されてはいるが、その基質特異性を何ら実施例で開示していない。また、該公報はすでに取り下げられており、その活性を確認することはできないが、該公報と同じ発明者らは、該公報と同一名の菌株よりヌクレオシドホスホリラーゼを精製し、その特徴をＡｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５６，ＰＰ３８３０−３８３４，（１９９０）で報告しており、該酵素はシトシン、シチジン及びデオキシシチジンに対する活性はないと記載されている。
【０００５】
上記以外ではプリンヌクレオシドホスホリラーゼあるいはピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの何れにおいても核酸塩基としてシトシンまたはシトシン誘導体が基質となることは報告されておらず、例えば、Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５１，ＰＰ４３７〜４４２（１９７８）ではサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｒａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のピリミジンホスホリラーゼの一種であるチミジンホスホリラーゼにはデオキシシチジンに対する反応性は認められないと記載されている。また、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２４８，Ｎｏ．６，ＰＰ２０４０〜２０４３（１９７３）ではサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｒａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のプリンヌクレオシドホスホリラーゼにはピリミジンヌクレオシドへの活性は認められないと記載され、ウリジン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジンが例示されている。
以上の知見を総合的に勘案すると、これら知見より想定される当時の技術水準では、シチジンヌクレオシド誘導体を酵素的に合成する事はできなかったと結論するのが妥当である。
【０００６】
近年、この酵素反応を利用し、リン酸を不溶化する事が可能なアルカリ金属を加える事で反応の平衡を目的物であるヌクレオシド合成側に傾け、効率的にヌクレオシド誘導体を製造する方法が報告されている（ＥＰ１１７９５９８）。しかしながら、本特許においてはシチジンヌクレオシド誘導体の製造は何ら記載せれていない。我々はシトシンを用いた２’−デオキシシチジンの合成を試みたが、図−１（図１）に示すように、菌体中に存在するシトシンデアミナーゼやシチジンデアミナーゼなどの作用により副反応が進行し、目的物を得る事は出来なかった。
更に、シチジンヌクレオシド誘導体はアンチセンス医薬品や診断薬の原料として使われており、微量の副生物の混入も問題である。特にウラシル誘導体、ウリジン誘導体などシチジンヌクレオシド誘導体と類似の骨格を有する不純物の混入は０．１％であっても、大きな問題である。その為、高品質、高効率的なシチジンヌクレオシド誘導体の製造法が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、シチジンヌクレオシド誘導体の合成において、ヌクレオシドホスホリラーゼの活性を維持したままシトシンデアミナーゼおよびシチジンデアミナーゼの活性を選択的に失活或いは減少させることにより、より高収率で、かつ高品質のシチジンヌクレオシド誘導体を製造する方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこれらの課題を解決するために鋭意検討した結果、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素、菌体、培養液またはそれらの混合物の存在下、シチジンヌクレオシド誘導体を製造する方法において、亜鉛塩の存在下に反応すると、反応により生成するリン酸が不溶化することによりシチジン誘導体が生成する方向へ反応の平衡を傾ける事が可能となったばかりでなく、亜鉛塩の存在により、シトシンデアミナーゼやシチジンデアミナーゼ活性を選択的に失活させる事が出来ることが判明した。そして、この事により、反応収率の向上、シチジンヌクレオシド誘導体の品質の向上を同時に達成することが可能となることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいてなされたものである。
【０００９】
本発明の方法により、ヌクレオシドホスホリラーゼの活性を維持したまま、高選択的に基質と生成物を分解する活性を特異的に失活させることが可能となり、シトシン誘導体とペントース−１−リン酸誘導体またはその塩から副生物をほとんど生成せずにシチジンヌクレオシド誘導体を製造できる。
【００１０】
即ち本発明は、
［１］ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物、該微生物培養液、該微生物の菌体処理物またはそれらの固定化物の存在下、シトシン誘導体とペントース１−リン酸誘導体またはその塩からシチジンヌクレオシド誘導体を製造する方法において、亜鉛塩を存在させ製造する事を特徴とする、シチジンヌクレオシド誘導体の製造方法であり、
［２］シトシン誘導体が一般式（１）［化４］
【００１１】
【化４】
2004024086.tif 000002
【００１２】
（ここでＥは窒素原子または炭素原子、Ｆは水素原子、低級アルキル基又はハロゲン原子を示す。）で示される化合物であり、ペントース１−リン酸誘導体またはその塩が一般式（２）［化５］
【００１３】
【化５】
2004024086.tif 000003
【００１４】
（ここでＲ１はヒドロキシメチル基またはカルボキシル基を示し、Ｘはハロゲン原子またはアルコキシ基を示し、ａ、ｂは各々独立して０から３の整数を示し、かつａ＋ｂ≦３である。）で示される化合物またはその塩であり、シチジンヌクレオシド誘導体が一般式（３）［化６］
【００１５】
【化６】
2004024086.tif 000004
【００１６】
（ここでＲ１、Ｅ、Ｆ、Ｘ、ａ、ｂは前記と同義である。）で示される化合物である請求項１記載のシチジンヌクレオシド誘導体の製造方法であり、
［３］シトシン誘導体がシトシンであり、ペントース１−リン酸誘導体またはその塩が、２−デオキシリボース１−リン酸２アンモニウム塩または２−デオキシリボース１−リン酸２シクロヘキシルアンモニウム塩であり、シチジンヌクレオシド誘導体が２’−デオキシシチジンである、請求項２に記載のシチジンヌクレオシド誘導体の製造方法であり、
［４］亜鉛塩が酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩基性炭酸亜鉛、水酸化亜鉛又は酸化亜鉛である事を特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載のシチジンヌクレオシド誘導体の製造方法である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素とは、シトシン誘導体を基質としてシチジンヌクレオシド誘導体を生成する活性を有すれば動物、植物、微生物の何れの起源であっても構わない。このような酵素の具体例としては、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に含まれる微生物の従来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼとして知られている酵素を好適な例として挙げることができる。
【００１８】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物とは、一般的なヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有し、且つ、シトシンまたはシトシン誘導体を基質としてシトシンヌクレオシド化合物を生成するヌクレオシドホスホリラーゼを発現していれば、特に限定されない。このようなヌクレオシドホスホリラーゼを生産する微生物の具体例としては、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に含まれる微生物を好適な例として挙げることができる。
【００１９】
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、上述の微生物株のプリンヌクレオシドホスホリラーゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出することが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。かかる技術水準に鑑み、このようなヌクレオシドホスホリラーゼの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌も本発明のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物に包含されるものとする。
【００２０】
ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示している。プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）・アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）・中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、ヌクレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
【００２１】
ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能なプラスミドの例とヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物して、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７をベクターとして利用することができる。
【００２２】
ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
【００２３】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素または、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物としては市販の酵素、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物の菌体、該菌体処理物またはそれらの固定化物などが本発明の方法に使用できる。ここにおいて菌体処理物とは、例えばアセトン乾燥菌体や機械的破壊、超音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧処理、浸透圧処理、自己消化、細胞壁分解処理、界面活性剤処理などにより調製した菌体破砕物などであり、また、必要に応じて硫安沈殿やアセトン沈殿、カラムクロマトグラフィーにより精製を重ねたものを用いても良い。固定化物とはポリアクリルアミドゲル、カラギーナン等の一般的に酵素、微生物菌体の固定化に使用される資材で酵素、微生物菌体、菌体処理物を固定化されたものを指している。
【００２４】
本発明におけるシチジンヌクレオシド誘導体とは、ペントース−１−リン酸誘導体またはその塩と、核酸塩基としてシトシン誘導体がＮ−グリコシド結合で結合した化合物のことである。その代表例を挙げると、例えばシチジン、２’−デオキシシチジン、３’−デオキシシチジン、２’，３’−ジデオキシシチジン、アザシチジン、メチルシチジン、２’−デオキシアザシチジン、２’−デオキシメチルシチジン、５−フルオロシチジン、５−フルオロデオキシシチジンなどを挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明におけるシトシン誘導体とは、例えば、シトシン、アザシトシン、５−メチルシトシン、５−フルオロシトシンなどを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
本発明におけるペントース−１−リン酸誘導体とは、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンおよびその誘導体の１位にリン酸がエステル結合したもののことである。
これらの代表例を挙げると、例えばリボース１−リン酸、２−デオキシリボース１−リン酸、２，３−ジデオキシリボース１−リン酸、アラビノース１−リン酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
ここでいうポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンとは、天然物由来のものとしては、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−リキソーズ、Ｄ−リボースのようなアルドペントース、Ｄ−キシルロース、Ｌ−キシルロース、Ｄ−リブロースのようなケトペントース、Ｄ−２−デオキシリボース、Ｄ−２，３−ジデオキシリボースのようなデオキシ糖類を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明におけるペントース１リン酸誘導体の塩または一般式（２）の塩とは、リン酸とイオン結合可能なものであれば特に限定はないが、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等の無機塩基による塩や、アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、シクロヘキシルアンモニウム塩、ジシクロヘキシルアンモニウム塩等の有機塩基等が挙げられ、リン酸の価数に応じ、同種または異なる１または２個のイオンと塩を形成する事が出来る。
これらの代表例を挙げると、例えばリボース１−リン酸２シクロヘキシルアンモニウム塩、リボース１−リン酸２ナトリウム塩、リボース１−リン酸２アンモニウム塩、２−デオキシリボース１−リン酸２シクロヘキシルアンモニウム塩、２−デオキシリボース１−リン酸２アンモニウム塩、２−デオキシリボース１−リン酸２カルシウム塩、２−デオキシリボース１−リン酸２バリウム塩、２−デオキシリボース１−リン酸２リチウム塩、２，３−ジデオキシリボース１−リン酸２アンモニウム塩、２，３−ジデオキシリボース１−リン酸２シクロヘキシルアンモニウム塩、２，３−ジデオキシリボース１−リン酸２カルシウム塩、２，３−ジデオキシリボース１−リン酸２ナトリウム塩、アラビノース１−リン酸２アンモニウム塩、アラビノース１−リン酸２シクロヘキシルアンモニウム塩、アラビノース１−リン酸２カルシウム塩などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
Ｆで表される低級アルキル基とは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基や、トリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基、ヘプタフルオロプロピル基、トリクロロメチル基等のパーハロゲン化アルキル基が挙げられる。
Ｆ、Ｘで表されるハロゲン原子とはフッ素原子、クロル原子、臭素原子、よう素原子を示す。
Ｘで表されるアルコキシ基とは、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロピルオキシ基、メトキシメチルオキシ基、２−メトシキエトキシ基、２−エトシキエトシキ基、トリフルオロエトキシ基等が挙げられる。
本発明で表される亜鉛塩とは、亜鉛と塩を形成するものであれば特に限定はないが、例えば、フッ化亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、よう化亜鉛、酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、水酸化亜鉛、酸化亜鉛、塩基性炭酸亜鉛、硫酸亜鉛、４−シクロヘキシル酪酸亜鉛、Ｎ，Ｎ−ジベンジルジチオカルバミン酸亜鉛、ジブチルジチオカルバミン酸亜鉛、ジエチルジチオカルバミン酸亜鉛、２リン酸亜鉛、ぎ酸亜鉛、乳酸亜鉛、硝酸亜鉛、シアン化亜鉛などが挙げられ、好適には酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩基性炭酸亜鉛、水酸化亜鉛、酸化亜鉛である。
【００２７】
原料であるペントース−１−リン酸誘導体またはその塩は、試薬として購入するか、またはヌクレオシドホスホリラーゼの作用によりヌクレオシド化合物の加リン酸分解反応を行って製造する方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１８４、４３７、１９５０）や、アノマー選択的な化学合成法等（ＷＯ０１５８９２０）によっても調製することができる。
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生物、該微生物の培養液、該微生物の菌体、菌体処理物、またはそれらの固定化物等は特に限定はないが、通常、水溶液又は水性懸濁液として供給される。
ここで用いられるヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素、微生物菌体、培養液等は、必要に応じて１００℃以下、好適には７０℃以下で温度処理やメタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒で前処理する事も可能である。酵素前処理の際、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を維持する事を目的に、ペントース−１−リン酸誘導体またはその塩を加える事も可能である。酵素前処理の際、ペントース−１−リン酸誘導体またはその塩を加える時は、ヌクレオシドホスホリラーゼの活性を維持できれば特に限定はないが、通常、０．１ｍＭ／Ｌ以上、好ましくは０．５ｍＭ〜１００ｍＭ／Ｌ使用すれば良い。
【００２８】
前処理時のｐＨはシトシンデアミナーゼ活性およびシチジンデアミナーゼ活性を選択的に失活させることができれば特に限定はないが、通常４．０以上１０．０以下であり、好ましくは６．０以上９．０以下である。
処理を行なう時間はヌクレオシドホスホリラーゼ活性を維持出来れば特に限定はないが、通常、１０分間から４８時間、好ましくは１〜２４時間である。
【００２９】
本発明におけるシチジンヌクレオシド誘導体は、シトシン誘導体とペントース−１−リン酸誘導体またはその塩を基質として、前記ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する処理液を触媒として反応させる事により合成する事が出来る。
用いられるペントース−１−リン酸またはその塩はシトシン誘導体に対し０．７当量以上用いれば良く、好ましくは０．８〜３当量である。
ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する処理液の量は反応に支障がなければ特に限定はないが、シトシン誘導体に対し、０．１重量倍以上用いれば良い。
反応は適切なｐＨ、温度、反応時間などの条件を選べば良いが、通常、ｐＨ４〜１０好ましくはｐＨ７〜１０、温度１０〜８０℃好ましくは１０〜６０℃、反応時間は１〜４８時間好ましくは５時間〜３０時間の範囲で行うことができる。反応溶媒としては、反応を阻害しなければ特に限定はないが、水を含有する溶媒中で行なえば良い。水を含有する溶媒とは、水または水と常温で溶液状態を示す有機溶媒との混合液であり、混合液としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジメチルホルムアミドなどのアミド類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ヘキサン、ヘプタン、トルエンなどの炭化水素類等を任意の割合で１種ないしは数種含んだ溶液である。
反応に使用するペントース−１−リン酸誘導体とシトシン誘導体の濃度は０．５〜２０％好ましくは２〜１０％で行なう事が出来る。
加えられる亜鉛塩の量は、使用するペントース−１−リン酸に対し、１〜１０当量、好ましくは１〜５当量使用すれば良い。
ｐＨを制御する目的で、塩酸、硫酸、硝酸、ぎ酸、酢酸、プロピオン酸などの酸類、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、水酸化リチウム、炭酸リチウム、アンモニアなどの塩基類を用いる事も可能である。
【００３０】
この様にして製造したシチジンヌクレオシド誘導体は、濾過、濃縮、晶析、溶解、電気透析処理や、イオン交換樹脂、活性炭、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどの吸脱着処理などの常法を適用する事により単離する事が出来る。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例で本発明を説明するが、本発明はこれら実施例によって何等制限されるものではない。
［分析法］
生成したヌクレオシド化合物はすべて高速液体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は以下による。
カラム；ＹＭＣ　ＯＤＳ−Ａ　ＡＭ−３１２（６．０×１５０ｍｍ）
カラム温度；４０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出；ＵＶ２５４ｎｍ
溶離液；１０ｍＭリン酸２水素カリウム水溶液（３０００ｍｌ）をリン酸で　　ｐＨ３．８に調整し、アセトニトリル（６０ｍｌ）を加え、混合、脱気する。
内標準物質：３，５−ジヒドロキシ安息香酸
【００３２】
参考例１　ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する菌体の作製
大腸菌染色体ＤＮＡを次のようにして調製した。
【００３３】
エシェリヒア・コリＫ−１２／ＸＬ−１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲに用いた。
【００３４】
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のｄｅｏＤ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＥ０００５０８（コード領域は塩基番号１１５３１−１２２５０）に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（北海道システム・サイエンス株式会社に委託して合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
【００３５】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ　６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分間、アニーリング：５５℃、１分間、伸長反応：７４℃、１分間からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行なった。
【００３６】
上記反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。こうして得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリ　ＭＴ−１０９０５と名づけた。
【００３７】
エシェリヒア・コリ　ＭＴ−１０９０５株をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。培養液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を２０ｍＬの１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁液を再度１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、得られた菌体を−２０℃にて凍結保存した。
【００３８】
参考例２　応用酵素液の調製
参考例１で作成した菌体（３．５ｇ）を解凍し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．０、０．６ｇ）、２−デオキシリボース１−リン酸２アンモニウム塩（２０ｍｇ）を混合し、５５℃で２４時間攪拌処理し、酵素液を調製した。
【００３９】
実施例１　２’−デオキシシチジンの合成
シトシン（６．９６ｇ）、２´−デオキシリボース１−リン酸２アンモニウム塩（１５．５ｇ）、塩基性炭酸アンモニウム（１２．２ｇ）、参考例２で調整した酵素液（８．９ｇ）を水（９６．４ｇ）に加え、５０℃で２４ｈｒ反応した。反応終了後、ＨＰＬＣで分析した所、目的物である、２’−デオキシシチジンを１１．４ｇ（８０％）得た。この時、副生物であるウラシルは０．０６ｇ（０．９％）、２’−デオキシウリジンは０．０１ｇ（０．０７％）であった。
【００４０】
比較例１　２’−デオキシシチジンの合成
シトシン（６．９６ｇ）、２´−デオキシリボース１−リン酸２アンモニウム塩（１５．５ｇ）、水酸化マグネシウム（６．６ｇ）、参考例２で調整した酵素液（８．９ｇ）を水（９６．４ｇ）に加え、酢酸でｐＨを８．５〜９．０に調整しながら、５０℃で２４ｈｒ反応した。反応終了後、ＨＰＬＣで分析した所、目的物である、２’−デオキシシチジンを１０．４ｇ（７３％）得た。この時、副生物であるウラシルは０．３５ｇ（５．０％）、２’−デオキシウリジンは０．０９ｇ（０．６％）であった。
【００４１】
【発明の効果】
本発明は上記の実施例、比較例からも明らかなように、亜鉛塩存在下、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素、菌体、培養液またはその混合物を用いてシチジンヌクレオシド誘導体を製造する事で、分解反応及び副生成物を抑制し、高収率で且つ高品質のシチジンヌクレオシド化合物を簡便に製造する事が可能となる。
【００４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】微生物菌体を用いてシトシンと２’−デオキシリボース−１−リン酸から２’−デオキシシチジンを合成するに際して生じる副反応を示す反応経路の図である。
【図１】
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