(57)【要約】【課題】鉄イオンと高い結合能を有し、抗菌活性を示す物質ならびにその製造法を提供する。【解決手段】下記の式（Ｉ）：【化１】2004269357.tif 000015または下記の式（ＩＩ）：【化２】2004269357.tif 000016または下記の式（ＩＩＩ）：【化３】2004269357.tif 000017で表される化合物もしくはその塩、及び該化合物の微生物を用いた製造法。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）：
【化１】
2004269357.tif 000012
または下記の式（ＩＩ）：
【化２】
2004269357.tif 000013
または下記の式（ＩＩＩ）：
【化３】
2004269357.tif 000014
で表される化合物もしくはその塩。
【請求項２】
シュードアルテロモナス属に属し、請求項１記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に請求項１記載の化合物を生成蓄積させ、該培養物から請求項１記載の化合物を採取することを特徴とする請求項１記載の化合物の製造法。
【請求項３】
微生物が、シュードアルテロモナスｓｐ．  ＫＰ−２０−４株又はその類似菌株であることを特徴とする請求項２記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物が生産する、鉄と高い結合能を有する化合物、および微生物を用いた該化合物の製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
鉄はほとんどの生物にとって必須の元素である。鉄は、地球において最も豊富に存在する元素ではあるものの、酸素の存在下で容易に２価イオンから３価イオンに酸化され、この３価の鉄イオンは、中性あるいはアルカリ性において、生物が利用することができない難溶性の塩を生じる。このような鉄イオンの性質が、生物が鉄イオンを摂取することを困難にしている。そこで、多くの微生物は、環境中にわずかに存在する鉄イオンを取り込むために、シデロフォアと呼ばれる３価の鉄イオンと高い親和力を有する比較的低分子の有機化合物を分泌する。一般的にシデロフォアは、微生物を鉄を制限した状態で培養すると分泌される。分泌されたシデロフォアは、環境中に微量に存在する３価の鉄イオンと結合し、鉄−シデロフォア複合体を形成する。この複合体は、そのシデロフォアに特異的な外膜レセプターを介して細胞内にとりこまれ、取り込まれた複合体から、シデロフォアの加水分解あるいは鉄を２価に還元するような酵素によって、鉄が複合体からはずれ、微生物に利用される。
【０００３】
微生物、特に病原菌のシデロフォアの産生は宿主への感染と病原性の発現に深く関与していることから、病原菌のシデロフォア産生はよく研究され多くのシデロフォアが単離・構造決定されている（非特許文献１参照）。ある種の微生物にとっては、特定のシデロフォアしか利用することができず、他のシデロフォアによって生育が抑制されることも考えられ、シデロフォアを抗菌剤として用いようとする考え方がある（Ｗａｒｄ，  Ｃ．  Ｇｉｌｌｏｎ、Ｔｈｅ  Ｊｏｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｕｍａ：  Ｉｎｊｕｒｙ，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｒｅ，  Ｖｏｌ．  ４１，  Ｎｏ  ２，  ｐｐ  ３５６  −３６１  （１９９６））。また、シデロフォアのなかでも、ストレプトマイセス属の放線菌が産生するデフェロキサミンＢの様に鉄排出薬として実用化されているものもある（Ｂｕｌｌｅｎ，  Ｊ．  Ｊ．、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｄｉｓ，  １０，  ６１３  （１９９１））。
【０００４】
【非特許文献１】
山本重雄：ファルマシア、第３１巻６号、５８８頁（１９９５年）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
抗生物質の出現は多くの感染症に対し極めて有効な治療薬となっている。その一方で、その安易な使用が耐性菌の出現を招き、新たな作用機序を有する抗菌剤が必要とされている。また、鉄排出剤としてより強力で副作用の少ない化合物も必要とされている。
【０００６】
本発明は、鉄と高い結合能を有する物質、該物質を微生物を用いて生産するための方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、シュードアルテロモナス属に属する菌株の培養液から得られた化合物が、従来まったく知られていない新規な化合物であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、下記の式（Ｉ）：
【０００９】
【化４】
2004269357.tif 000002
または下記の式（ＩＩ）：
【００１０】
【化５】
2004269357.tif 000003
または下記の式（ＩＩＩ）：
【００１１】
【化６】
2004269357.tif 000004
で表される化合物もしくはその塩である。
【００１２】
また、本発明は、シュードアルテロモナス属に属し、上記の化合物を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に上記の化合物を生成蓄積させ、該培養物から上記の化合物を採取することを特徴とする上記の化合物の製造法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１４】
（１）本発明の化合物の構造及び性質
本発明の化合物には、下記の式（Ｉ）：
【００１５】
【化７】
2004269357.tif 000005
または下記の式（ＩＩ）：
【００１６】
【化８】
2004269357.tif 000006
または下記の式（ＩＩＩ）：
【００１７】
【化９】
2004269357.tif 000007
で表される化合物が含まれる。また、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、及び式（ＩＩＩ）の化合物の塩も本発明の化合物に含まれる。塩としては、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩等の酸付加塩、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。なお、本発明の化合物を医薬として使用する場合には、塩は薬学上許容されるものとするのが望ましい。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、及び式（ＩＩＩ）の化合物の性質は以下の通りである。
【００１９】
＜式（Ｉ）の化合物の性質＞
（１）  物質の色：無色
（２）  分子量：１０７８．０７
（３）  分子式：Ｃ４１Ｈ６３Ｎ１１Ｏ２１Ｓ
（４）  質量分析：高分解ＦＡＢＭＳ  実測値  １０７８．３９８６  （Ｍ＋Ｈ）＋
計算値  １０７８．３９９９  （Ｃ４１Ｈ６４Ｎ１１Ｏ２１Ｓ）
（５）  赤外線吸収スペクトル  （ＫＢｒ）
νｍａｘ  １０３５、１１４１、１２０２、１４３７、１５４３、１６６９、２９４０、３０８１、３３５６  ｃｍ−１
（６）  紫外線吸収スペクトル  （Ｈ２Ｏ，  ｐＨ  ４．０）
λｍａｘ  （ε）：  ２４９  （７１００），  ３１０  （４０００）
（７）  １Ｈ−ＮＭＲ（重ジメチルスルホキシド中で測定、５００ＭＨｚ）
δｐｐｍ  １．２０−１．７０（ｍ，  １８Ｈ），  ２．３７  （ｄ，  ２Ｈ），  ２．５１（ｄｄ，  １Ｈ），  ２．６５（ｄｄ，  １Ｈ），  ２．７７（ｂｒ  ｍ，  ２Ｈ），  ２．８８（ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ３．０７（ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ３．２０−３．３８  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．９１（ｄｄ，  １Ｈ），  ４．０７（ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ４．１０−４．１８  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．２７（ｂｒ  ｄｄ，  １Ｈ），  ４．４１（ｄ，  １Ｈ），  ４．５４（ｄ，  １Ｈ），  ４．６３（ｄｄ，  １Ｈ），  ４．６６（ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ６．９４（ｄ，  １Ｈ），  ７．１７  （ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ７．２７（ｄ，  １Ｈ），  ７．６５（ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ７．６８（ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ７．７８（ｂｒ  ｄ，  ２Ｈ），  ７．９９（ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ８．０５（ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ８．０８（ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ８．１８（ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ８．３２（ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ８．７５（ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ９，６５（ｂｒ  ｓ，  ２Ｈ）
（８）  １３Ｃ−ＮＭＲ（重ジメチルスルホキシド中で測定、１２５ＭＨｚ）
δｐｐｍ  ２１．２０，  ２１．９６，  ２２．３６，  ２６．３１，  ２６．３８，  ２７．４０，  ２８．５８，  ３０．５８，  ３６．９３，  ３７．２７，  ３８．５６，  ３８．７３，  ３８．９１，  ４２．９５，  ４９．３８，  ５３．２２，  ５４．３２，  ５４．５１，  ５５．５６，  ５５．７２，  ６７．１９，  ６８．４７，  ６９．９７，  １１５．３７，  １１５．４１，  １１５．７７，  １３２．９３，  １４２．６３，  １４９．４０，  １６８．１１，  １６８．４２，  １６８．５８，  １６８．７２，  １６９．５２，  １７０．８３，  １７１．２１，  １７１．８０，  １７２．４６，  １７２．５６，  １７２．６０
（９）  溶解性  ：水に易溶、ＤＭＳＯ、メタノールに可溶、アセトン、酢酸エチルおよびクロロホルムに難溶。
（１０）  ＣＡＳアッセイ：ＣＡＳアッセイにおいて、対照のデフェロキサミンＢ（ＥＤ５０  １．７  ｍＭ）の５０倍の活性（ＥＤ５０  ３３μＭ）を示した。
（１１）  抗菌活性
バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌液を懸濁した寒天培地上に直径８ｍｍのペーパーディスクをのせ、そのペーパーディスクに該化合物１０  ｍＭの濃度の溶液を１０μＬ（１００ｎｍｏｌ／ｄｉｓｃ）のせ、４８時間後に観察を行なったところ、直経１８ｍｍの阻止円が観測された。
【００２０】
＜式（ＩＩ）の化合物の性質＞
（１）  物質の色：無色
（２）  分子量：１１０６．０８
（３）  分子式：Ｃ４１Ｈ６３Ｎ１３Ｏ２１Ｓ
（４）  質量分析：高分解ＦＡＢＭＳ  実測値  １１０６．４０８９  （Ｍ＋Ｈ）＋
計算値  １１０６．４０６０  （Ｃ４１Ｈ６４Ｎ１３Ｏ２１Ｓ）
（５）  赤外線吸収スペクトル  （ＫＢｒ）
νｍａｘ  １２０３、１４５９、１５４３、１６５６、２８５４、２９２５、３４２３  ｃｍ−１
（６）  紫外線吸収スペクトル  （Ｈ２Ｏ，  ｐＨ  ４．０）
λｍａｘ  （ε）：  ２４７  （１２０００），  ３１４  （３９００）
（７）  １Ｈ−ＮＭＲ（重ジメチルスルホキシド中で測定、５００ＭＨｚ）
δｐｐｍ  １．１９−１．７６  （ｍ，  １４Ｈ），  ２．３６  （ｄ，  ２Ｈ），  ２．４９  （ｄｄ，  １Ｈ），  ２．６５（ｄｄ，  １Ｈ），  ２．９１  （ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ３．０７（ｂｒ  ｍ，  ３Ｈ），  ３．２４  （ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ３．３１  （ｄ，  ２Ｈ），  ３．４３  （ｄｄ，  １Ｈ），  ３．９１（ｄｄ，  １Ｈ），  ４．０８（ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ４．１２  （ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ４．１７  （ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ４．２９  （ｂｒ  ｄｄ，  １Ｈ），  ４．４１（ｄ，  １Ｈ），  ４．５３  （ｄ，  １Ｈ），  ４．６２  （ｄｄ，  １Ｈ），  ４．６６（ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ６．９５  （ｄ，  １Ｈ），  ７．１６  （ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｄ，  １Ｈ），  ７．３４  （ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ７．６９  （ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ７．７４  （ｂｒ  ｄ，  ２Ｈ），  ７．９８  （ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ８．０１  （ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ８．０３  （ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ８．２１  （ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ８．３３  （ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ８．７３  （ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  １０．５６  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  １２．５２  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ）
（８）  １３Ｃ−ＮＭＲ（重ジメチルスルホキシド中で測定、１２５ＭＨｚ）
δｐｐｍ  ２１．１８，  ２２．３５，  ２４．６２，  ２６．３２，  ２７．４３，  ２８．２５，  ２８．５６，  ３０．４４，  ３６．８７，  ３７．３１，  ３８．５０，  ３８．７２，  ４０．１９，  ４２．９９，  ４９．３３，  ５３．１４，  ５４．２７，  ５４．４８，  ５５．５６，  ５５．６６，  ６７．１８，  ６８．５０，  ６９．９８，  １１５．３８，  １１５．４４，  １１５．７５，  １３２．９３，  １４２．６３，  １４９．３５，  １５６．３２，  １６８．１０，  １６８．５４，  １６８．５５  １６８．６８，  １６９．５１，  １７０．８４，  １７１．２３，  １７１．７３，  １７２．２８，  １７２．４６，  １７２．５５
（９）  溶解性  ：水に易溶、ＤＭＳＯ、メタノールに可溶、アセトン、酢酸エチルおよびクロロホルムに難溶。
（１０）  ＣＡＳアッセイ：ＣＡＳアッセイにおいて、対照のデフェロキサミンＢ（ＥＤ５０  １．７  ｍＭ）の５０倍の活性（ＥＤ５０  ３４μＭ）を示した。
（１１）  抗菌活性：バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌液を懸濁した寒天培地上に直径８ｍｍのペーパーディスクをのせ、そのペーパーディスクに該化合物１０  ｍＭの濃度の溶液を１０μＬ（１００ｎｍｏｌ／ｄｉｓｃ）のせ、４８時間後に観察を行なったところ、直経１６ｍｍの阻止円が観測された。
【００２１】
＜式（ＩＩＩ）の化合物の性質＞
（１）  物質の色：無色
（２）  分子量：１０２６．０２
（３）  分子式：Ｃ４１Ｈ６３Ｎ１３Ｏ１８
（４）  質量分析：高分解ＦＡＢＭＳ  実測値  １０２６．４５１０  （Ｍ＋Ｈ）＋
計算値  １０２６．４４９２  （Ｃ４１Ｈ６４Ｎ１３Ｏ１８）
（５）  赤外線吸収スペクトル  （ＫＢｒ）
νｍａｘ  １１３９，  １２０２，  １５４３，  １６７０，  ２９２９，  ３３５５  ｃｍ−１
（６）  紫外線吸収スペクトル  （ＭｅＯＨ）
λｍａｘ  （ε）：  ３１０  （２９００）
（７）  １Ｈ−ＮＭＲ（重ジメチルスルホキシド中で測定、５００ＭＨｚ）
δｐｐｍ  １．２−１．８  （ｍ），  ２．３７  （ｄ，  ２Ｈ），  ２．５０  （ｄｄ，  １Ｈ），  ２．６５（ｄｄ，  １Ｈ），  ２．９０  （ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ３．０７  （ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ３．２６  （ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ３．２９  （ｔ，  ２Ｈ），  ３．３３  （ｄｄ，  １Ｈ），  ３．９１（ｄｄ，  １Ｈ），  ４．０８（ｂｒ  ｍ，  １Ｈ），  ４．１４  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１８  （ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ４．２９  （ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ４．４１（ｄ，  １Ｈ），  ４．５４（ｄ，  １Ｈ），  ４．６３（ｄｄ，  １Ｈ），  ４．６７（ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ６．６７  （ｔ，  １Ｈ），  ６．９１    （ｄｄ，  １Ｈ），  ７．１６  （ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ７．４９  （ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ７．７０  （ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ７．６８（ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ７．８２  （ｂｒ  ｓ，  ２Ｈ），  ８．００  （ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ８．０５（ｂｒ  ｄ，  ２Ｈ），  ８．２１  （ｂｒ  ｔ，  １Ｈ），  ８．３３  （ｂｒ  ｄ，  １Ｈ），  ８．７５  （ｂｒ  ｔ，  １Ｈ）
（８）  １３Ｃ−ＮＭＲ（重ジメチルスルホキシド中で測定、１２５ＭＨｚ）
δｐｐｍ  ２１．２０，  ２２．４５，  ２４．７０，  ２６．４５，  ２７．４３，  ２８．３２，  ２８．７０，  ３０．５２，  ３６．９５，  ３７．３５，  ３８．５１，  ３８．５８，  ４０．２１，  ４３．０３，  ４９．４１，  ５３．２３，  ５４．３９，  ５４．５４，  ５５．６４，  ５５．７４，  ６７．２６，  ６８．５８，  ７０．０３，  １１４．８８，  １１６．９４，  １１７．６３，  １１８．５１，  １４５．９５，  １４９．３３，  １５６．５４，  １６８．２０，  １６８．６３，  １６８．７８，  １６９．３８，  １６９．６３，  １７０．９２，  １７１．３７，  １７１．８７，  １７２．４２，  １７２．５３，  １７２．６１
（９）  溶解性  ：水に易溶、ＤＭＳＯ、メタノールに可溶、アセトン、酢酸エチルおよびクロロホルムに難溶。
（１０）  ＣＡＳアッセイ：ＣＡＳアッセイにおいて、対照のデフェロキサミンＢ（ＥＤ５０  １．７  ｍＭ）の５０倍の活性（ＥＤ５０  ３３μＭ）を示した。
（１１）  抗菌活性
バシラス  サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌液を懸濁した寒天培地上に直径８ｍｍのペーパーディスクをのせ、そのペーパーディスクに該化合物１０  ｍＭの濃度の溶液を１０μＬ（１００ｎｍｏｌ／ｄｉｓｃ）のせ、４８時間後に観察を行なったところ、直経２２  ｍｍの阻止円が観測された。
【００２２】
（２）本発明の化合物の製造
本発明の化合物は、微生物を培地に培養し、培養物中に本発明の化合物を生成蓄積させ、該培養物から本発明の化合物を採取することにより製造することができる。本発明に用いる菌株としては、シュードアルテロモナス属に属し、本発明の化合物を生産する能力を有する菌株であればどのようなものでもよく、例えば、シュードアルテロモナスｓｐ．  ＫＰ−２０−４株やこの菌株の類似菌株を挙げることが出来る。ここでいう類似菌株としては、シュードアルテロモナスｓｐ．  ＫＰ−２０−４株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号１に示す）と９５％以上相同な塩基配列で表される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を持つ菌株を挙げることができる。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の相同性は９５％以上であればよいが、９７％以上であることが好ましく、９８％以上であることが更に好ましく、１００％相同であることが最も好ましい。
【００２３】
シュードアルテロモナスｓｐ．  ＫＰ−２０−４株は、自然界から新たに単離した株であり、その細菌学的性質については以下の通りである。
【００２４】
なお、形態観察は、培地にシュードアルテロモナスｓｐ．  ＫＰ−２０−４株を植菌し、３０℃で２４〜４８時間培養したのちに光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡を用いて行った。培地は、マリンアガー（Ｂａｃｔｏ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ  ２２１６，  Ｄｉｆｃｏ社製）あるいはマリンブロス（Ｂａｃｔｏ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ  ２２１６，  Ｄｉｆｃｏ社製）を用いた。また、本菌株は培地中の塩化ナトリウム濃度が１％以下では菌の生育が認められないことから、生化学的性状の試験は７５％人工海水を用いて培地を作製するか、あるいは培地中に３％塩化ナトリウムを添加することによって行った。
【００２５】
ａ．  形態
１）  細胞の形および大きさ：桿菌、１．５−２．６×０．５−０．９μｍ
２）  細胞の多形性の有無：無し
３）  運動性の有無、鞭毛の着生状態：有り、極毛。
４）  胞子の有無：無し
５）  グラム染色性：陰性
【００２６】
ｂ．  各培地における生育状態
１）  マリンアガー平板培養    ：良好に生育，コロニーは円形，凸円状，全縁，湿光，周辺部乳白色、中心部淡黄色
２）  マリンアガー斜面培養    ：良好に生育，糸状，淡黄色
３）  マリンブロス培養        ：良好に生育，均質に濁る。
４）  マリンブロスゼラチン穿刺培養：液化する。
５）  リトマスミルク            ：リトマスを弱く還元する。
【００２７】
2004269357.tif 000008
【００２８】
【表１】
2004269357.tif 000009
１３）  エスクリンの分解：分解する。
１４）  アルギニンの分解：分解しない。
１５）  ＤＮＡの分解：分解する。
１６）  好塩性：有り  生育塩濃度範囲  １〜７％
１７）  β−ガラクトシダーゼ：陰性
１８）  ＧＣ含量：４３（モル％）
１９）  イソプレノイドキノン：Ｑ−８
【００２９】
以上の菌学的性質からバージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジーの分類基準に従って公知の菌種と比較した。本菌株は好気性グラム陰性桿菌で極鞭毛を有する。好塩性で生育にナトリウムとマグネシウムまたはカルシウムを要求し、ブドウ糖を酸化的に分解することからシュードアルテロモナス属に所属すると考えられ、シュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．と同定した。そして、この菌株をシュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）  ｓｐ．ＫＰ−２０−４とし、平成１３年８月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１８４７７として寄託した。
【００３０】
本発明に用いる微生物の培養は、通常の微生物の培養方法が用いられる。培地としては、資化可能な炭素源、窒素源、無機物および必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。炭素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フラクトース、シュクロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などを単独または組み合わせて用いられる。さらに、必要に応じて炭化水素、アルコール類、有機酸やトリプトファン等のアミノ酸なども用いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組み合わせて用いられる。そのほか、必要に応じて食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、燐酸二水素カリウム、燐酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛などの無機塩類を加える。さらに使用菌の生育や本発明の化合物の生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。培養法としては、液体培養法が最も適している。培養温度３０〜３５℃が適当であり、培養中の培地のＰＨは７〜８に維持することが望ましい。液体培養で通常２〜５日間培養を行うと、目的物質が培養液中ならびに菌体中に生成蓄積される。培養物中の生成量が最大に達した時に培養を停止する。
【００３１】
培養物から本発明の化合物の単離精製は、微生物代謝生産物をその培養物から単離精製するために常用される方法に従って行われる。例えば培養物を濾過や遠心分離により培養瀘液と菌体に分け、菌体を含水メタノール、含水エタノールなどで抽出する。ついで、抽出液と培養瀘液もしくは培養瀘液を酢酸エチル、クロロホルムなどで抽出した抽出液とを合わせて濃縮し、高速液体クロマトグラフィーなどにより、本発明の化合物を得る。
【００３２】
（３）本発明の化合物の用途
本発明の化合物は、鉄イオンとの親和性が高いのでデフェロキサミンＢと同様に鉄排出剤として利用できる。また、抗菌活性を持つので抗菌剤としても利用できる。
【００３３】
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】
シュードアルテロモナス  ｓｐ．  ＫＰ−２０−４株の培養を以下の様に行った。５００ｍｌの三角フラスコ１本あたり、生産培地（カザミノ酸  ５  ｇ／Ｌ、グリセリン  ３  ｍｌ／Ｌ、グリセロリン酸  ０．１  ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  １５．５  ｇ／Ｌ、塩化カリウム  ０．８  ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物  １２．４  ｇ／Ｌ、塩化カルシウム・二水和物  ２．９  ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム  １  ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳナトリウム塩  ２．６  ｇ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム  ０．１７  ｇ／Ｌ、塩化鉄  ０．０１  μＭ  （滅菌前ｐＨ  ６．８））４００  ｍｌを入れ、オートクレーブにて滅菌したフラスコ各々（計２０本、８  Ｌ）に、該菌株懸濁液（Ｏ．Ｄ．  １．０  （６００ｎｍ）に調整したもの）４００  μＬ接種し、３０℃、震盪培養（１００  ｒｐｍ）にて７２時間培養を行った。培養中、ｐＨは特に制御しなかった。
【００３５】
培養物からのシデロフォアの精製は以下の様に行った。精製はＣＡＳ（Ｃｈｒｏｍｅ  ａｚｕｒｏｌ  Ｓ）アッセイ［Ｓｃｈｗｙｎ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｎｅｉｌａｎｄｓ，  Ｊ．  Ｂ．  ：  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．  １６０，  ４７−５６  （１９８７）］を指標に行った。培養物を遠心分離（８，０００  ｘｇ、４℃、２０  ｍｉｎ）により菌体と上清を分離した。分離した上清のｐＨを塩酸にてｐＨ  ３に調整し、芳香族系合成吸着樹脂ＨＰ２０樹脂（三菱化学社製）を２  Ｌ加え、４℃に２４時間放置した。ガラスフィルターを用いて樹脂を濾過し、瀘別した樹脂は、塩酸にてｐＨ  ３に調整した超純水１６  Ｌで洗浄した。洗浄したＨＰ２０樹脂をビーカーに移し、８  Ｌのメタノールに２４時間浸漬した。次に、グラスフィルターを用いて、メタノールと樹脂を濾別し、得られたメタノール溶液をエバポレーターを用いて減圧濃縮し、８  ｇの固形物を得た。
【００３６】
次に、逆相（ＯＤＳ）の樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーを行った。内径  ４  ｃｍ、長さ４０  ｃｍのガラスカラムにあらかじめ６０％メタノール−超純水で膨潤したＯＤＳ樹脂（コスモシール  ７５Ｃ１８−ＯＰＮ、ナカライ化学社製）２００  ｇをつめ、徐々にメタノールの割合を減らしつつ、最終的には、超純水に置換した。このカラムに、先の固形物８  ｇを超純水２０  ｍｌに溶解したものをロードし、超純水１．６  Ｌで溶出した。次に、２０％メタノール−超純水  ２Ｌ、さらに、５０％メタノール−超純水  ２Ｌで溶出した。ＣＡＳアッセイにて２０％メタノール−超純水溶出画分にシデロフォアが含まれていることがわかったので、この画分をエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥をおこない、褐色固形物１．６  ｇを得た。
【００３７】
次にＬＨ−２０樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーを行った。内径２  ｃｍ、長さ６０  ｃｍのガラスカラムに、あらかじめ２０％メタノール−超純水で膨潤したＬＨ−２０樹脂（アマシャム・ファルマシア社製）１５０ｇをつめ、２０％メタノール−超純水５００  ｍｌを流し、カラムを平衡化し、ここに、先の褐色固形物１．６  ｇを５  ｍｌの２０％メタノール−超純水に溶解したものをロードし、２０％メタノール−超純水にて溶出を行った。サンプルロード後、２０  ｍｌずつ分画をおこない、後にＣＡＳアッセイにてシデロフォアの存在する画分を検出した。シデロフォアを含む画分を集め、エバポレーターにて減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、淡褐色固形物３３０  ｍｇを得た。
【００３８】
次に、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて精製を行った。ＨＰＬＣシステムは、東ソー株式会社製のＨＰＬＣシステム（ポンプ  ＣＣＰＭ、ディテクター  ＵＶ−８０１０、コントローラー  ＳＣ−８０１０）を用いた。まず、カラムにコスモシール５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（内径２０  ｍｍ、長さ２５０  ｍｍ）を用い、移動相としては、３５％メタノール−超純水を用い、５  ｍｌ／ｍｉｎの流速で分画を行った。２分（１０  ｍｌ）ごとに分画をおこない、ＣＡＳアッセイを行い、シデロフォアを含む画分を集め、エバポレーターにて減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、淡黄色固形物３０ｍｇを得た。次に、カラムに、ＴＳＫ  ＧＥＬ  ＯＤＳ  ８０  Ｔｓ（内径７．８  ｍｍ、長さ３００  ｍｍ）を用い、２種類の溶媒（溶媒Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸−超純水、溶媒Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸−アセトニトリル）を用いたグラジエント溶出（初発の溶媒Ｂの濃度を５％とし、２０分後に２０％にあげる。流速２  ｍｌ／ｍｉｎ）を行った。２分（１０  ｍｌ）ごとに分画をおこない、ＣＡＳアッセイを行い、シデロフォアを含む画分を集め、エバポレーターにて減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、淡黄色固形物１０ｍｇを得た。最後に、先程と同様のカラム、ＴＳＫ  ＧＥＬ  ＯＤＳ  ８０  Ｔｓ（内径７．８  ｍｍ、長さ３００  ｍｍ）を用いて、移動相として０．１％トリフルオロ酢酸−１３％アセトニトリル−超純水を用い、検出波長２５０  ｎｍで分析、分画を行い、シングルピークとなるまで繰り返し精製を行い、三種類の化合物を得た。
【００３９】
ここで得た三種類の化合物は、前記した理化学的性質（式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、及び式（ＩＩＩ）の化合物の性質）を示した。
【００４０】
【発明の効果】
本発明は、鉄イオンと高い結合能を有する新規な化合物および該物質の微生物を用いた製造法を提供する。本発明の化合物は、抗菌剤、鉄排出剤として有用である。
【配列表】
2004269357.tif 000010
2004269357.tif 000011