(57)【要約】　　　（修正有）【課題】真核細胞と原核細胞の両方の細胞死を促進する酵母因子を提供する。【解決手段】酵母由来の特定のアミノ酸配列を有し、真核細胞と原核細胞の細胞死を促進する因子ＹＯＲ００４ｗとこのＹＯＲ００４ｗをコードするポリヌクレオチド、これらのＹＯＲ００４ｗまたはそのポリヌクレオチドを含有する細胞死促進剤。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素配列番号２のアミノ酸配列を有し、真核細胞と原核細胞の細胞死を促進する因子ＹＯＲ００４ｗをコードする酵母遺伝子。
【請求項２】
ｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有する請求項１の酵母遺伝子。
【請求項３】
請求項１の酵母遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド、またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４の組換えベクターによる形質転換体細胞。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列を有し、真核細胞と原核細胞の細胞死を促進する精製因子ＹＯＲ００４ｗ。
【請求項７】
請求項３のポリヌクレオチドの発現産物である請求項６の精製因子ＹＯＲ００４ｗ。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列における一部連続配列からなるポリペプチド。
【請求項９】
請求項４の組換えベクターを含有する細胞死促進剤。
【請求項１０】
請求項６または７の精製因子ＹＯＲ００４ｗ、もしくは請求項８のポリペプチドを含有する細胞死促進剤。
【請求項１１】
真核細胞または原核細胞の細胞死を促進する方法であって、請求項９または１０の細胞死促進剤を細胞に接触させる工程を含む方法。
【請求項１２】
真核細胞が、動物体内の細胞である請求項１１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、真核細胞と原核細胞の細胞死促進因子ＹＯＲ００４ｗと、その利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
活性化細胞死（またはアポトーシス）は現在のところ多細胞的な概念として捉えられているが、徐々に単細胞的な概念としても受け取られつつある。しかしながらこのような細胞死に対して、多細胞および単細胞；有核細胞および原核細胞等の系統発生的に広汎な生物種における包括的な理解は欠けている。
【０００３】
このような細胞死に対する包括的な理解は、生命に対する基礎的な解明に役立つと共に、新しい癌治療の開発や新しいタイプの殺菌剤や抗真菌剤の創製などといった産業上有用な応用開発にとっても極めて重要である。
【０００４】
広範な生物種における細胞死に関連して、ヒストンのシャペロンとして機能する核因子１　ＡＳＦ１／ＣＩＡ１を断片化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＡＳＦ１／ＣＩＡ１）が、核の断片化、染色質断片化および凝縮、ミトコンドリア膜電位の減少およびプロトンポンプ機能不全、チトクロームｃ放出、および細胞拡大などの表現型を示して死滅することが、近年判明した（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　６，　１０４３−１０５４，　２００１）。この表現型は大部分がアポトーシス的であり、わずかに壊死性であるため、この死は「プロトタイプ的活性化細胞死」と名付けられているが、このような死を促進する仮想因子は未知のまま残されている（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　６，　１０４３−１０５４，　２００１）。さらにＥ．　ｃｏｌｉ細胞（原核性の単細胞）における活性細胞死（Ｃｒｉｔｉ．　Ｒｅｖ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２３，　２０７−２１４，　１９９７；　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２８０，　５８３−５９６，　１９９８；Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７３，　１１３８４−１１３９１，　１９９８；　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　Ｒｅｖ．　６４，　５０３−５１４，　２０００）と共に、酵母細胞（有核性の単細胞）においてもアポトーシス様の死が報告されている（Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１７，　２４６８−２４７４，　１９９７；　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４３８，　６１−６５，　１９９８；　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１５５，　７２５−７３１，　２００１）。
【０００５】
ゆえに、活性化細胞死は有核性および原核性の単細胞においても存在する可能性があるため、今回の研究では酵母を対象として、活性化細胞死に役割を果たす可能性のある因子を探索した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、活性化細胞死は有核性および原核性の単細胞においても存在する可能性があり、これを制御する因子を同定することは、生命に対する基礎的な理解を深めることばかりか、様々な有用医薬品等の開発のためには極めて重要である。
【０００７】
この出願の発明は以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、真核細胞と原核細胞の両方の細胞死を促進する因子を提供することを課題としている。
【０００８】
またこの出願の発明は、この因子の利用発明を提供することを課題としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１２）の発明を提供する。
（１）　　酵素配列番号２のアミノ酸配列を有し、真核細胞と原核細胞の細胞死を促進する因子ＹＯＲ００４ｗをコードする酵母遺伝子。
（２）　　ｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有する前記発明（１）の酵母遺伝子。
（３）　　前記発明（１）の酵母遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド、またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチド。
（４）　　前記発明（３）のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
（５）　　前記発明（４）の組換えベクターによる形質転換体細胞。
（６）　　配列番号２のアミノ酸配列を有し、真核細胞と原核細胞の細胞死を促進する精製因子ＹＯＲ００４ｗ。
（７）　　前記発明（３）のポリヌクレオチドの発現産物である前記発明（６）の精製因子ＹＯＲ００４ｗ。
（８）　　配列番号２のアミノ酸配列における一部連続配列からなるポリペプチド。
（９）　　前記発明（４）の組換えベクターを含有する細胞死促進剤。
（１０）　前記発明（６）または（７）の精製因子ＹＯＲ００４ｗ、もしくは前記発明（８）のポリペプチドを含有する細胞死促進剤。
（１１）　真核細胞または原核細胞の細胞死を促進する方法であって、前記発明（９）または（１０）の細胞死促進剤を細胞に接触させる工程を含む方法。
（１２）　真核細胞が、動物体内の細胞である前記発明（１１）の方法。
【００１０】
すなわち、この出願の発明者らは、酵母の活性化細胞死に係わる因子を広範に探索した結果、機能未知のＹＯＲ００４ｗタンパク質が酵母の細胞死を促進する機能を有することを見出した。さらに、発明者らは、哺乳類細胞および微生物細胞におけるＹＯＲ００４ｗ発現の効果を検討した結果、哺乳類細胞が活性化細胞死に到り、微生物細胞は哺乳類細胞に似た活性化細胞死に到ることを見出した。
【００１１】
この出願の発明は、以上のとおりの新規の知見に基づいて完成されたものである。
【００１２】
なお、この出願において「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は特定塩基数の断片を意味するものでなく、一応の目安として１００ｂｐ以上の断片をポリヌクレオチド、１００ｂｐ未満の断片をオリゴヌクレオチドとするが、例外も存在する。同様に、ポリペプチドについても特定範囲のアミノ酸残基数に限定されるものではない。
【００１３】
以下、この出願の発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
発明（１）は、ＹＯＲ００４ｗタンパク質をコードする酵母遺伝子であり、この酵母遺伝子は、転写されるｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有している。
【００１５】
この発明（１）の遺伝子は、例えば、配列番号１の塩基配列またはその一部配列からなる精製ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとして酵母ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離するすることができる。得られたゲノム遺伝子は、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００１６】
なお、発明（１）の酵母遺伝子には、それがコードするタンパク質の発現に対する制御領域（プロモーター／エンハンサー、リプレッサー等）も含まれる。これらの発現制御領域は、ＹＯＲ００４ｗタンパク質の更なる機能を解明するためにも有用である。また、これらの発現制御領域は、これに結合する転写因子や化合物等を探索するためのターゲットとしても有用である。
【００１７】
発明（３）は、発明（１）のゲノム遺伝子やこの遺伝子が転写するｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡから精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片）である。例えば、ｃＤＮＡは酵母細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として、公知の方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２，　１６１−１７０，　１９８２；　Ｇｅｎｅ，　１５０，　２４３−２５０，　１９９４）を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−として、酵母細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。このようにして調製ｃＤＮＡは、具体的には配列番号１の塩基配列を有している。
【００１８】
発明（３）のポリヌクレオチドはまた、発明（１）のゲノム遺伝子やこの遺伝子が転写するｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡから精製されたポリヌクレオチドの一部連続配列からなるポリヌクレオチドである。すなわち、この部分ポリヌクレオチドの一態様は、配列番号１におけるコード領域（ＯＲＦ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００１９】
あるいはまた、ＹＯＲ００４ｗタンパク質は後記のとおりそのＮ末端側に細胞死促進活性領域を有しており、そのような活性領域をコードする部分ポリヌクレオチドもまたこの発明の範囲に含まれる。このような部分ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２のアミン酸配列における第１−１００アミノ酸配列の任意の領域をコードする塩基配列、すなわち配列番号１の第７０１−９９８塩基配列における任意の塩基配列からなるポリヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド）を例示することができる。
【００２０】
これらのポリヌクレオチドは、発明（４）の組換えベクターの形態で、例えばＹＯＲ００４ｗタンパク質の遺伝子工学的な製造に使用することができるほか、発明（９）の薬剤成分としても使用することもできる。
【００２１】
発明（４）の組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜なものを使用する。例えば、ｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域をインサートとしてこの発明のＹＯＲ００４ｗタンパク質を生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することができる。また、発明（１）のゲノム遺伝子ＤＮＡをインサートとする場合には、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターやコスミドベクター等を使用することもできる。
【００２２】
これらの組換えベクターは、例えばＹＯＲ００４ｗタンパク質の遺伝子工学的な製造に使用することができるほか、発明（９）の薬剤成分としても使用することもできる。
【００２３】
発明（５）の形質転換体細胞は、例えば、前記発明（４）の組換えベクターを用いてＹＯＲ００４ｗタンパク質を製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。また、アデノウイルス等に由来する形質転換細胞は、発明（９）の薬剤成分としても使用することができる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
【００２４】
発明（６）のＹＯＲ００４ｗタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、真核細胞と原核細胞の細胞死を促進する。
【００２５】
このＹＯＲ００４ｗタンパク質は、酵母細胞から単離する方法、配列番号２のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法等によって得ることができるが、好ましくは、前記発明（３）のポリヌクレオチドを用いて遺伝子工学的に製造することができる。すなわち、インビトロ転写翻訳系や、発明（５）の形質転換細胞の培養物から単離精製されるＹＯＲ００４ｗタンパク質（発明（７））である。
【００２６】
例えば、ＹＯＲ００４ｗタンパク質をインビトロ転写翻訳系で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作製する。このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ転写翻訳系に添加すれば、目的とするＹＯＲ００４ｗタンパク質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７　１８、ｐＴ７／３　１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩなどが例示できる。
【００２７】
ＹＯＲ００４ｗタンパク質を、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、目的の酵素を発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的タンパク質を大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００２８】
さらに、ＹＯＲ００４ｗタンパク質を真核細胞で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成する。このベクターを真核細胞内に導入して培養すれば、目的とするタンパク質を発現する形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３Ｔ、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２９】
形質転換細胞で発現させたＹＯＲ００４ｗタンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３０】
なお、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明の酵素タンパク質の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、メチル化などである。
【００３１】
発明（８）は、配列番号２のアミノ酸配列における一部連続配列からなるポリペプチドである。すなわち、ＹＯＲ００４ｗタンパク質は後記のとおりそのＮ末端側に細胞死促進活性領域を有しており、そのような活性領域のアミノ酸配列からなるポリペプチドもこの発明の範囲に含まれる。このようなポリペプチドは、例えば、配列番号２における第１−１００アミノ酸配列の任意領域のアミノ酸配列から構成される。このようなポリペプチドは、化学合成によってペプチドを合成する方法や、前記の部分ポリヌクレオチドを用いて遺伝子工学的に作成する方法、あるいは前記発明（６）または（７）のＹＯＲ００４ｗタンパク質を適当なプロテアーゼで消化する方法等によって作成することができる。
【００３２】
以上の発明（６）〜（８）のＹＯＲ００４ｗタンパク質またはポリペプチドは、発明（１０）の薬剤成分等として使用することができる。
【００３３】
発明（９）は、前記発明（４）の組換えベクターを含有する細胞死促進剤である。また、発明（１０）は、前記発明６）〜（８）のＹＯＲ００４ｗタンパク質またはポリペプチドを含有する細胞死促進剤である。これらの細胞死促進剤は、第１には制癌剤として使用することができる。すなわち、癌細胞は正常な調節経路、特に賦活性経路が欠損していることによって、細胞死を免れ、異常に増殖していると考えられる。ＹＯＲ００４ｗタンパク質はその細胞死促進作用によって癌細胞を死滅させ、十分な治療効果を発揮する。この発明の細胞死促進剤の別の用途は、殺菌剤または抗真菌剤である。すなわち、現在までに多数の抗生物質が開発され多くの疾患治療に成功を収めているが、他方で、抗生物質耐性菌（例えばメシチリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ：ＭＲＳＡ）を原因とする疾患も急増している。ＹＯＲ００４ｗタンパク質は酵母と微生物の両方に対して効果的に細胞死を促進する因子であることから、このタンパク質は新しい殺菌剤または抗真菌剤の有効成分として極めて有望である。
【００３４】
発明（９）の細胞死促進剤は、ＹＯＲ００４ｗタンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを、生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等に組み込んで製剤化することができる。
【００３５】
また、発明（１０）の細胞死促進剤は、例えばＹＯＲ００４ｗタンパク質と薬理学的に許容される担体溶液とを混合して製剤化することができる。
【００３６】
そして、これらの細胞死促進剤は、発明（１１）および発明（１２）の方法において使用することができる。すなわち、発明（１１）の方法はこれらの細胞死促進剤を細胞に接触させる工程を含む真核細胞または原核細胞の細胞死促進方法である。具体的には、この方法は、培養条件下にある細胞、または人体皮膚に寄生している真菌等を対象とする方法であり、細胞死促進剤は殺菌剤や抗真菌剤として使用する。また発明（１１）の方法は、動物体内（好ましくは人体内）にある細胞を対象とするものであり、具体的には体内の癌細胞に対する抗癌剤、または感染菌に対する抗菌剤として使用する。
【００３７】
例えば、体内に存在する細胞に対して使用する場合、発明（９）の細胞死促進剤は、遺伝子治療の手法により体内に導入することができる。その場合に、ＹＯＲ００４ｗタンパク質をコードするポリヌクレオチドの血中濃度が約０．１μＭ〜約１０μＭに達するように、十分な量を投与することが好ましい。また発明（１０）の細胞死促進剤は、例えばマイクロインジェクション法により癌組織に局所注入することができる。あるいは、最近開発された脂質による細胞内導入法（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）、Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｆ社、米国）等）を採用することによっても癌組織にタンパク質またはポリペプチドを導入することができる。このような注入形態において、タンパク質またはポリペプチドの含有量は、担体溶液１ｍｌに対して、１ｎｇ〜１０ｍｇ程度とすることができる。また、特に人体内への投与を対象とする発明（１０）の細胞死促進剤の場合には、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻孔内、気管内、または直腸内等の経路によって投与するために製剤化することができる。また、製剤化のための担体は、これらの投与経路に依存するが、例えば、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、およびこの技術分野で公知のその他の材料を含む。また、「薬剤的に許容される」という用語は、細胞、細胞培養、組織、または生体のような生物学的システムに適合し、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しないような非毒性材料を意味する。薬剤的に許容される製剤化の調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　１８ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　ｅｄ．　Ａ．　Ｇｅｎｎａｒｏ，　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，　Ｅａｓｔｏｎ，　ＰＡ，　１９９０に記載されている。
【００３８】
以下、この発明の酵素の同定と、その機能解析のために行った実験を示し、この発明についてさらに詳細に説明する。
（１）　　方法
（１−１）　　クローニング、突然変異。
Ｙ　　ＯＲ００４ｗ全長をコードするｃＤＮＡは、酵母ゲノムＤＮＡのテンプレートを用いてＰＣＲ増幅により取得し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）クローニングした。同様に、ＹＯＲ００４ｗの半分、すなわちＹＯＲ００４ｗ（１−１００）およびＹＯＲ００４ｗ（１０１−２５４）のそれそれをコードするｃＤＮＡを調製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩのフレーム内に個別にクローニングした。ＹＯＲ００４ｗの突然変異体（すなわち、Ｖ２８−Ｌ２９−Ｖ３０→Ａ２８−Ａ２９−Ａ３０；ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ））をコードするｃＤＮＡは、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１，　１８３−１８９　（１９９８）を用いて調整し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩのフレーム内にクローニングした。
（１−２）　　酵母細胞
Ｗ３０３−１ａ酵母株に由来する酵母細胞を使用した。前記の各ｃＤＮＡはＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてｐＡＫ０２１ベクターにクローニングし、ｐＡＫ０２１−ＹＯＲ００４ｗおよびｐＡＫ０２１−ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）ベクターを得た。次にこれらのベクターを用いて細胞を形質転換した。細胞は固体（−Ｌｅｕ）ＳＣプレート（アミノ酸の無い０．１７％酵母窒素塩基、０．５％硫酸アンモニウム、２％グルコース、０．０１％アデニン、０．２％ウラシル、０．２％　Ａｒｇ、０．２％　Ｍｅｔ、０．３％　Ｔｙｒ、０．３％　Ｉｌｅ、０．３％　Ｌｙｓ、０．６％　Ｐｈｅ、０．００２％　Ｈｉｓ、０．００２％　Ｔｒｐ、および２％寒天、およびＬｅｕ無し）上で３０℃で前培養し、細胞を定常フェーズに到達させた。次に細胞は固体（−Ｌｅｕ）ＳＧプレート（グルコースの代わりに２％がラクトースを含有）上で７２時間以下で培養し、遺伝子を発現させた。
【００３９】
細胞ＤＮＡを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２ｍｇ／ｍｌ　Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−１００Ｔ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ　Ｋｏｇｙｏ）、１％　ＳＤＳ、１．２５Ｍ　酢酸カリウムを含む溶解緩衝液を用いて酵母から抽出し、次にＲＮａｓｅ（５μｇ／ｍｌ、ウシ膵臓；Ｓｉｇｍａ）を用いて処置した。ＤＮＡは３３％イソプロパノールを用いて１５０ｍＭ酢酸ナトリウム存在下で沈殿させ、寒天ゲル電気泳動（Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　２６９，　１９２−２００，　１９７２）に供してＤＮＡラダー測定を行った。
【００４０】
細胞をガラスビーズおよび抽出緩衝溶液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　ＫＣｌ、５％　グリセリン、３ｍＭ　ＤＴＴ）存在下でホモジナイズし、１時間１５，０００ｒｐｍで４℃で延伸することにより、酵母細胞から全細胞抽出物を調製し、カスパーゼ活性測定に用いた。抽出物中のタンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いることにより決定した。カスパーゼ活性測定はＣａｓｐａｓｅ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（哺乳類カスパーゼ用、ＭＢＬ）を製造者の指示に従って用いることにより行った。
【００４１】
ミトコンドリアは酵母細胞から単離し、分光光度分析法（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　６，　１０４３−１０５４，　２００１）に従ってチトクロームｃ放出測定を行った。
（１−３）　　哺乳類細胞
ＨｅＬａおよびＣＯＳ７細胞を使用した。細胞は５％　ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（Ｎｉｓｓｕｉ）中で３７℃、５％　ＣＯ２存在下、４８時間で前培養した。前記の各ｃＤＮＡをｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングし、組換えベクターｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１−ＹＯＲ００４ｗ、ｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１−ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）、ｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１−ＹＯＲ００４ｗ（１−１００）、およびｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１−ＹＯＲ００４ｗ（１０１−２５４）を作成し、細胞をこれらのベクターのいずれかの存在下、同じ条件で培養を行うことにより形質転換させた。発現および局在化は緑蛍光を直接観察することにより確認した。同様に、ｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１の代わりにｐＳＧ５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をカスパーゼ測定目的のみに用いて、ＧＦＰによる蛍光汚染を避けたが、この発現は、同時発現するルシフェラーゼが放出するルミネセンスを観察することによって確認した。
【００４２】
ミトコンドリアを哺乳類細胞から単離し、抗ヒトチトクロームｃウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いたウエスタンブロット法によりチトクロームｃ放出測定を行った。ミトコンドリアの単離は、まず抽出溶液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌアプロチニン、および２５μｇ／ｍｌ　ＡＬＬＮ）中で細胞をホモジナイズし、ホモジナイズした溶液を１，０００×ｇ、４℃で１０分間、および１０，０００×ｇ、４℃で１時間の条件で、連続して遠心分離することにより行った。
【００４３】
カスパーゼ活性測定のためには、まず哺乳類細胞を抽出緩衝液を用いてホモジナイズし、次に４０，０００ｒｐｍで１時間、４℃で遠心分離し、さらに哺乳類細胞からの全細胞抽出物を上清分画として調製した。同じアッセイに用いる正の対照として、ＨｅＬａおよびＣＯＳ７細胞から全細胞抽出物を同じように調製し、細胞をさらに１５時間にわたり同じ条件下、抗ＦＡＳ／ＣＤ９５抗体（マウスＩｇＭ、ＭＢＬ）およびスタウロスポリン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で培養し、アポトーシスを促進した（Ｎａｔｕｒｅ　４０１，　１６８−１７３，　１９９９）。カスパーゼ活性測定は酵母細胞に用いるものと同じ手順を用いて行った。
【００４４】
ＤＮＡの抽出は、最初に哺乳動物細胞を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０を含む溶解緩衝液を用いて処理し、次にＲＮａｓｅ（５μｇ／ｍｌ、ウシ膵臓；Ｓｉｇｍａ）およびプロテイナーゼＫ（５μｇ／ｍｌ、Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ；Ｓｉｇｍａ）を添加し、次にＤＮＡ沈殿を１．２５Ｍ酢酸アンモニウムの存在下で６２．２％エタノール沈殿を用いて行い、結果的に得られた沈殿を寒天ゲル電気泳動（Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　２６９，　１９２−２００，　１９７２）に供してＤＮＡラダー測定を行った。
（１−４）　　微生物細胞
微生物細胞として、ＢＬ２１コドンに（ＤＥ３）−ＲＩＬを加えたＥ．　ｃｏｌｉ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含むＴＢＧ−Ｍ９緩衝液中で、細胞の前培養を１日にわたり２７℃で行った。前記のｃＤＮＡをｐＧＥＸベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にクローニングして組換えベクターｐＧＥＸ−ＹＯＲ００４ｗおよびｐＧＥＸ−ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）を構築し、次にいずれかのベクターの存在下でさらに２時間にわたり、０．４ｍＭｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を添加した同一条件下で細胞を培養して形質転換を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて発現を確認した（Ｎａｔｕｒｅ　２２７，　６８０−６８５，
１９７０）。
【００４５】
ＤＮＡをＤＮＡラダー分析のため微生物細胞から調製したが、これは酵母および哺乳類細胞の場合と同一の手順、すなわちゲノムＤＮＡの特異的単離法（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ．　Ｖｏｌ．　１　（ｅｄｓ．　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　ｅｔａｌ．），　２．４．１−２．４．２　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．，　１９９４）を用いて行った。微生物細胞の全細胞抽出物は、酵母細胞に関して記述したものと同じ方法を用いて、カスパーゼ活性測定のために調製を行った。
（１−５）　　顕微鏡検査法
酵母、哺乳類、および微生物細胞の分析には、文献（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　６，　１０４３−１０５４，　２００１）の記載に従い、差分干渉対照（ＤＩＣ）補助を受けた光学、蛍光、共焦点レーザースキャニング、および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いた。
（１−６）　　染色技術
細胞の生存度の決定は、酵母細胞についてはＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｙｅａｓｔ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｋｉｔ（ＦＵＮ−１、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒｅ　ｗｈｉｔｅ　Ｍ２Ｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を、哺乳類細胞についてはＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｒｅｄｕｃｅｄ　Ｂｉｏｈａｚａｒｄ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ　Ｋｉｔ（ＳＹＴＯ　１０、ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を、微生物細胞についてはＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　ＢａｃＬｉｇｈｔ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｋｉｔ（ＳＹＴＯ　９、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて行った。酵母と哺乳類細胞の核の変化はＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ６，　１０４３−１０５４，　２００１）を用いて同定し、微生物細胞ではＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　ＢａｃＬｉｇｈｔ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｋｉｔを用いて行った。
【００４６】
ＤＮＡ断片化の同定は、ＴＵＮＥＬ染色をｉｎ　ｓｉｔｕ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＫｉｔのＰＯＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）およびＳｔａｂｌｅＤＡＢ（ＫＰＬ）と共に用いることにより行った。細胞膜転座の同定は、アネキシンＶ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４複合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を用いたアネキシンＶ染色により行った。これらの染色手順はいずれも製造業者の指示に従って行った。酵母および微生物細胞の染色を行う前に、文献（Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，　１３９，　７２９−７３４，　１９９７）の記載に従い、細胞壁をβ−ｇｌｕｓｕｌａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）およびｌｙｔｉｃａｓｅ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｌｕｔｅｕｓ　ｓｐ．、Ｓｉｇｍａ）を用いて処理した。
（２）　　結果
（２−１）　　ＹＯＲ００４ｗにより促進される酵母の細胞死
ＹＯＲ００４ｗが酵母細胞において細胞死を促進するか否かを検討するため、ＹＯＲ００４ｗを保有するＳ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞（ＹＯＲ００４ｗ細胞）を７２時間まで培養し、次にこれらの細胞を生存度染色と組み合わせた蛍光顕微鏡を用いて観察した（図２ａ）。その結果、ベクターのみを用いて（すなわちＹＯＲ００４ｗ無しで）培養した酵母細胞、つまり対象細胞の生存度と比較して、ＹＯＲ００４ｗ細胞の生存度が著しく減少していることが確認された。次に、ＹＯＲ００４ｗ中のＣＡＲＤ様ドメインが細胞死の原因であるか否かという点について検討するため、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）（ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）細胞；図１参照）の同様な発現後に、同様に細胞の生存度を観察することによって酵母の運命を解析し、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）細胞中では対照細胞における細胞死のレベルまで細胞死が抑制されることが確認された。
【００４７】
死にやすい傾向のある細胞内での細胞および核の変化を同定するため、７２時間培養後のＹＯＲ００４ｗ細胞を、微分干渉対照（ＤＩＣ）−補助光学顕微鏡および４’，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）染色と組み合わせた蛍光顕微鏡を用いて解析した。細胞は細胞拡大および溶解を示していたが、これらは多細胞における壊死の特徴である。しかしながら、同時に細胞は核の断片化を示しており（ＤＡＰＩ染色により同定）、これは多細胞におけるアポトーシス特徴である。核のこの変化を確認するため、さらにＴＥＭを用いて細胞の観察を行い（図２ｄ）、細胞は染色体の断片化および濃縮と同時に、実際に核の断片化を示していることを確認した。これらは全てアポトーシス特徴である。
【００４８】
細胞死がＤＮＡ断片化や細胞膜転座などの他のアポトーシス特徴を誘導しているかどうかを調査するため、７２時間培養細胞を対照に、共焦点レーザースキャニング顕微鏡および特異的染色法（すなわちＴＵＮＥＬおよびアネキシンＶ）を実施した。ＴＵＮＥＬおよびアネキシンＶは強力に細胞を染色しており（それぞれ図３ａおよび３ｂ）、広範囲のＤＮＡ断片化と広範囲の細胞膜転座を示していた。このような広範囲のＤＮＡ断片化が、多細胞のアポトーシス細胞においてよく観察されるようなＤＮＡラダーを示すかどうかを調べるために、ＤＮＡラダー分析を行ったが、ＤＮＡラダーを示す電気泳動上のプロフィールは観察されなかった（データ示さず）。これまでの報告によれば、ＤＮＡラダーは、ヒストンシャペロン断片化酵母細胞において促進された細胞死においても観察されていない（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　６，　１０４３−１０５４，　２００１）。
【００４９】
細胞死に伴うチトクロームｃ放出は、文献（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　６，　１０４３−１０５４，　２００１）の記載と同様に分光光度分析を用いて確定されたが（図３ｅ）、この放出はアポトーシス特徴の一つである。なお、カスパーゼ活性分析では、カスパーゼ活性は十分な有意性が見られず決定的にならなかった。
（２−２）　　哺乳類細胞におけるＹＯＲ００４ｗにより促進された細胞死
ｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１−ＹＯＲ００４ｗ（ＹＯＲ００４ｗ細胞）、ｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１（遺伝子無し、すなわちこれらが対照細胞となる）、あるいはｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１−ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）（ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）細胞）を形質移入した細胞（ＨｅＬａおよびＣＯＳ７）を４８時間まで培養し、次に蛍光顕微鏡およびＤＩＣ補助蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）によって、ＹＯＲ００４ｗの発現は接着細胞および懸濁細胞のいずれにおいても生じており、両細胞の大半が死滅していることが確認された。生存度染色により、４８時間培養したＹＯＲ００４ｗ、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）、および対照細胞（図４ａ）の生存度は、それぞれ〜３０％、〜６０％、および〜８０％であることが明らかになり（〜６００個の細胞をそれぞれの測定に使用）、これによってＹＯＲ００４ｗ変異は緩やかに（すなわち元の母集団レベルの約半分程度まで）哺乳類細胞における死を抑制することが示された。
【００５０】
次に、ＹＯＲ００４ｗの機能部位を決定するため、接着細胞中のＹＯＲ００４ｗ産物をＧＦＰおよび蛍光顕微鏡を用いて局在化した（図４ｂ）。培養時間が１５時間未満の場合（上部パネル）には産物は副核の点に制限されており、培養時間が３６時間の場合（下部パネル）には産物は核領域全体に分散し、核断片化および細胞収縮を示した。副核の点が仁のように見えることに注意する。
【００５１】
ＹＯＲ００４ｗには２つの明らかなドメインがある（図１参照）。いずれのドメインが表現型または局在化の原因となっているのかを同定するため、ｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１−ＹＯＲ００４ｗ（ＹＯＲ００４ｗ細胞）、ｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１−ＹＯＲ００４ｗ（１−１００）（ＹＯＲ００４ｗ（１−１００）細胞）、あるいはｐＥＧＦＰＰ−Ｃ１−ＹＯＲ００４ｗ（１０１−２５４）（ＹＯＲ００４ｗ（１０１−２５４）細胞）により形質転換した細胞を同じように４８時間まで培養し、これらの細胞を共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用いて観察した（図４ｃ）。生存度染色により、ＹＯＲ００４ｗ（１−１００）細胞の生存度は〜３０％というＹＯＲ００４ｗ細胞の値に類似した値になり、ＹＯＲ００４ｗ（１０１−２５４）細胞の生存度は〜６０％というＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）細胞に類似た値となることが示された。このため第１ドメインの欠損によって、変異により抑制される場合と同様のレベルまで死が抑制されたが、第２ドメインではこれは生じなかった。この表現型を局在化と関連づけるため、次に３６時間培養した接着細胞中のこれらの産物を、共焦点レーザースキャニング顕微鏡により局在化させ、緑蛍光を観察した。ＹＯＲ００４ｗ（１−１００）の産物は核内および核膜に沿った小顆粒の凝集物として観察されたが、ＹＯＲ００４ｗ（１０１−２５４）の産物は副核の点に制限されており、このような副核はＹＯＲ００４ｗの産物の局在と同様であった。
【００５２】
３６時間培養ＹＯＲ００４ｗ細胞の細胞死における核の変化を、ＤＡＰＩ染色（図４ｄ）およびＴＥＭ（図４ｅ）と組み合わせた蛍光顕微鏡を用いて調べた。顕微鏡写真により、細胞は染色体の断片化および凝縮と並んで核の断片化を示していることが明らかになった。
【００５３】
３６時間培養ＹＯＲ００４ｗ細胞におけるＤＮＡ断片化と細胞膜転座を、ＴＵＮＥＬ（図５ａ）およびアネキシンＶ染色（図５ｂ）と組み合わせた蛍光顕微鏡を用いて調べた。この結果、細胞は広範囲のＤＮＡ断片化と細胞膜転座の両方を示しつつ死滅しているが確認された。ＤＮＡラダー分析（図５ｃ）を行い、ＴＵＮＥＬ法により同定されたＤＮＡ断片化が、ＤＮＡラダーとしても同定されるかどうかを調査した。ＤＮＡラダーが示されなかった酵母細胞とは対照的に、哺乳類細胞では典型的なＤＮＡラダープロファイルが現れた（図５ｃのレーン２を参照）。チトクロームｃ放出は３６時間培養ＨｅＬａおよびＣＯＳ７細胞の両方において、チトクロームｃ放出アッセイでウェスタンブロット分析を用いることにより確認された（図５ｄのレーン２を参照）。
【００５４】
カスパーゼ活性測定によれば、３６時間培養ＨｅＬａおよびＣＯＳ７細胞においては、有意な活性化が同定されなかった。しかしながら、予想どおりに正の対照細胞（すなわちアポトーシス誘導された細胞）においては有意な活性化が同定され、カスパーゼ２、３、および９はそれぞれ〜５、〜１０、および〜５倍の活性になった（データ示さず）。
（２−３）　　微生物細胞におけるＹＯＲ００４ｗにより促進された細胞死
ｐＧＥＸ−ＹＯＲ００４ｗベクターまたはｐＧＥＸ−ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）ベクターによりＥ．　ｃｏｌｉ細胞を形質転換し（ＹＯＲ００４ｗ細胞またはＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）細胞）、ＧＳＴタグ化産物を発現させた。
【００５５】
各細胞の培養期間中に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて発現産物を確定した（図６ａ）。これらの遺伝子の発現に対するＹＯＲ００４ｗ、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）、および対照細胞の賦活活性を測定するため、各細胞をｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）存在下で２時間にわたり培養プレート上で培養し、結果として得られたコロニーを計数した（図６ｂ）。２時間培養したＹＯＲ００４ｗ細胞のコロニーは初期コロニーの〜１０　−３まで減少したが、ＹＯＲ００４ｗ変異は、対照細胞で観察された細胞死のレベルまで細胞死を有意に抑制した。共焦点レーザースキャニング顕微鏡を生存度染色と組み合わせることにより、ＹＯＲ００４ｗ細胞の大半が明らかに死滅しており、残りの細胞は生きているが賦活化されている可能性が低いことが判明した（コロニーの個体数の少なさが証拠になる）。ＹＯＲ００４ｗ細胞は、不均一ＤＮＡ分布および細胞伸張を顕著に含む表現型を示した。このような表現型は、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）細胞では対照細胞において観察される抑制レベルまで抑制された（図６ｃ）。
【００５６】
２時間培養したＹＯＲ００４ｗ細胞における、不均一なＤＮＡ分布と細胞伸張を含む細胞および超微細構造の変化を、ＴＵＮＥＬおよびアネキシンＶ染色を用いた共焦点レーザースキャニング顕微鏡と、電子顕微鏡を用いて調べた（図７ａおよび７ｂ）。共焦点レーザースキャニング顕微鏡写真により、酵母や哺乳類細胞と同様に、微生物細胞も広範囲のＤＮＡ断片化と細胞膜転座を示しつつ死滅することが確認された。電子顕微鏡写真（図７ｃ）により、微生物細胞は不均一ＤＮＡ分布、細胞伸張と溶解、および細胞壁小胞化を示したが、対照細胞はこれを示さないことが確認された。
【００５７】
最後に、微生物細胞を対象にしたカスパーゼ活性測定およびＤＮＡラダー測定により、カスパーゼ活性またはＤＮＡラダーのいずれも顕著ではないことが確認されたが、これは酵母細胞において観察されたものと類似していた（データ示さず）。
（３）　　考察
酵母、哺乳動物細胞および微生物細胞がＹＯＲ００４ｗ発現によって同様に死滅するが、表現型の特徴はそれぞれの細胞タイプによって異なっていた（表１参照）。
【００５８】
【表１】
2004049089.tif 000002
【００５９】
哺乳類の表現型には多数のアポトーシス特徴が含まれていたが、カスパーゼ活性化は含まれていなかったため、ＹＯＲ００４ｗは哺乳類細胞におけるアポトーシスを促進するとみられる。酵母表現型はこれまでに同定されたヒストンシャペロン断片化酵母におけるものと同一であると考えられ（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　６，　１０４３−１０５４，　２００１）、ほとんどのアポトーシス特徴を含んでいるが、若干の壊死特徴をも含んでいる。このため、ＹＯＲ００４ｗは「プロトタイプ的活性化細胞死」、すなわち多細胞のアポトーシスのプロトタイプを促進していると考えられれ。
【００６０】
最も驚くべき結果は、微生物細胞であるＥ．　ｃｏｌｉ（原核細胞）が、ＤＮＡ断片化および細胞膜転座などのアポトーシス特徴を明らかに含む表現型と共に細胞死を示したことである（図７ａおよび７ｂ）。さらに、これらの微生物細胞は不均一ＤＮＡ分布において識別可能であった（図６ｃおよび７ｃ）。酵母細胞と哺乳類細胞は、核断片化や染色質およびＤＮＡの濃縮などの核変化において、著しい類似を示した（酵母細胞は図２ｃおよび２ｄ；哺乳類細胞は図４ｂ、４ｄおよび４ｅ）。これらの核変化は、微生物細胞における不均一ＤＮＡ分布（図６ｃおよび７ｃ）に対する見かけ上の類似性を示したが、しかしながら、核構造は微生物細胞、すなわち原核細胞中では区別できなかった。微生物細胞における細胞壁の小胞化（図７ｃ）と細胞膜の小胞化の間にも類似性が見られたが、これは哺乳類細胞には観察されていない。ただし、しばしば他のタイプのアポトーシス性細胞においては観察されている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　３，　３３９−３４５，　２００１）。このため、微生物の表現型はほぼアポトーシス的であると結論できる。さらに酵母表現型（図２ｃ）と似て、微生物表現型には細胞伸張および溶解も含まれていたが、これは壊死性の特徴である（Ｉｎｔ．　Ｒｅｖ．　Ｃｙｔｏｌ．　６８，　２５１−３０６，　１９８０）。このような微生物表現型の酵母表現型に対する著しい類似性から、微生物細胞においてはＹＯＲ００４ｗが明らかに「プロトタイプ的活性化細胞死」を促進しており、これは酵母細胞におけるものと同様であることが示唆される。ここで得られたＹＯＲ００４ｗが有核細胞および原核細胞の両方において死を促進するという驚くべき発見から、「全般的な細胞死の経路」が任意の有機体に存在することが示唆される。
【００６１】
なお、ヒト細胞と微生物細胞とにおいて、酵母因子が細胞死を促進することは従来は全く知られていない。
【００６２】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、真核細胞と原核細胞の両方の細胞死を促進する酵母因子が提供される。また、この因子を有効成分とする制癌剤や抗菌剤等の薬剤が提供される。
【００６３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】カスパーゼ９およびｃｄｄ−３を共にしたＹＯＲ００４ｗのシーケンス配列。酵母中のＹＯＲ００４ｗは２つの個別のドメインを含んでおり、１個目はカスパーゼ９およびｃｄｄ−３のＣＡＲＤに類似しており（１−７９、青矢印で示す）、２個目はおそらくはＤＮＡ結合領域である（１９３−２３９、黄矢印）。抑制試験では、３個のアミノ酸のシーケンス（赤色のＶ２８−Ｌ２９−Ｖ３０）をＡ２８−Ａ２９−Ａ３０、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）に変異させた。この変異部位はα−らせんの中央部に位置しており、この部位はアポトーシスにおいてカスパーゼ９とＡｐａｆ−１の間（ヒト細胞）、およびｃｅｄ−３とｃｅｄ−４の間（線虫細胞）の結合時に機能する。陰付の領域は相同性のある残基を示す。
【図２】ＹＯＲ００４ｗの発現に応答する酵母細胞の細胞生存度および細胞と核の変化。ＹＯＲ００４ｗ、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）、および遺伝子の無いベクターのみ（対照）を持つ細胞を最大７２時間まで培養し、細胞生存度染色を行い、次に蛍光顕微鏡を用いて観察を行った。黄色は死亡細胞を、赤は生存細胞を示す。ａは７２時間培養されたＹＯＲ００４ｗ、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）、および対照細胞の生存度染色。ｂは、〜１，５００個の細胞を観察することにより測定された、ＹＯＲ００４ｗ細胞（オレンジ●）、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）細胞（緑●）、および対照細胞（黒四角）の培養期間の機能としての生存度の変化。ＹＯＲ００４ｗおよびＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）細胞の生存度は、対照細胞の生存度と比較して、培養期間の延長と共に有意に減少した。この変異は、ＹＯＲ００４ｗが促進した細胞死を対照細胞において観察された細胞死のレベルまで抑制した。ｃは、ＤＩＣ補助光学顕微鏡（上部パネル）および蛍光顕微鏡とＤＡＰＩ染色との組み合わせ（下部パネル）を用いて得られた、７２時間培養によるＹＯＲ００４ｗ細胞と対照細胞の顕微鏡写真。ＹＯＲ００４ｗ細胞は細胞拡大および溶解を示したが（上部パネル）、対照細胞はこれを示さなかった。ＹＯＲ００４ｗ細胞は核断片化を示したが（下部パネル）、対照細胞はこれを示さなかった。ｄは、ＹＯＲ００４ｗおよび対照細胞の電子顕微鏡写真。染色質濃度（★により示す）および核断片化は、ＹＯＲ００４ｗ細胞において生じたが、対照細胞では生じなかった。ＥＲ、小胞体；Ｍｔ、ミトコンドリア；Ｎ、核；Ｖ、液胞。スケールバーは１μｍである。
【図３】酵母細胞におけるＹＯＲ００４ｗの発現に対するＤＮＡ断片化、細胞膜の転座、およびチトクロームｃ放出。ａは、ＹＯＲ００４ｗを含む細胞とベクターのみを含む細胞（対照細胞）に対する、７２時間培養細胞のＴＵＮＥＬ染色と組み合わせた、共焦点レーザースキャニング顕微鏡写真。ブラウン染色により示されるように、ＹＯＲ００４ｗ細胞に広範囲にわたるＤＮＡ断片化が現れている。ｂは、ａと同じ細胞に対する、アネキシンＶ染色と組み合わせた共焦点レーザースキャニング顕微鏡写真。ＹＯＲ００４ｗ細胞中の細胞膜の転座が明らかであり、これは赤く細胞を縁取る染色により示されている。ｃは、分光高度計による７２時間培養ＹＯＲ００４ｗと対照細胞のミトコンドリア分画内チトクロームｃの測定。スペクトル１および２は、それぞれナイスタチンの存在と非存在にあたる。矢印はソレー帯を示す。ｄは、文献（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　６，　１０４３−１０５４，　２００１）により報告されているチトクロームｃ放出比率。
【図４】ＨｅＬａ細胞中のＹＯＲ００４ｗの発現に対する細胞と核の変化。ａは、ＹＯＲ００４ｗ、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）、およびベクターのみ（対照細胞）を持つ４８時間培養細胞の、細胞生存度染色と組み合わせた蛍光顕微鏡写真。緑は生存細胞を、赤は死細胞を示す。核に局在する強い緑の蛍光は（ｂ参照）ＧＦＰの発現を示す。ＹＯＲ００４ｗ、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）、および対照細胞の生存度はそれぞれ〜３０％、〜６０％、および８０％であった。ｂは、ＹＯＲ００４ｗを持つ細胞の、１５時間培養（上パネル）および３６時間培養（下パネル）後のＤＩＣ補助蛍光（左パネル）および蛍光顕微鏡写真（右パネル）。１５時間培養細胞では、核（Ｎ）は無変化状態であり（左パネル）、ＹＯＲ００４ｗの産物は副核の点としてのみ局在している（右パネル）。対照的に、３６時間培養細胞においては、核（Ｎ）は断片化しており（左パネルの矢印で示す）、産物は核領域全体にわたり存在している（右）。ｃは、ＹＯＲ００４ｗ（１−１００）およびＹＯＲ００４ｗ（１０１−２５４）を持つ３６時間培養細胞の共焦点レーザースキャニング顕微鏡写真。ＹＯＲ００４ｗ（１−１００）の産物は核全体に、核−膜に沿って小顆粒として局在しており、核の断片化が生じたが、ＹＯＲ００４ｗ（１０１−２５４）の産物は副核の点として局在しており、核の断片化が生じた。ｄは、３６時間培養したＹＯＲ００４ｗと対照細胞に対する、ＤＡＰＩ染色と組み合わせた蛍光顕微鏡写真。ＹＯＲ００４ｗ細胞は明らかに広範囲の核断片化を示した。ｅは、３６時間培養したＹＯＲ００４ｗと対照細胞に対する透過型電子顕微鏡写真。ＹＯＲ００４ｗ細胞では、染色体の凝縮と断片化が明確に確認される。Ｎ、核。スケールバーは１μｍ。
【図５】哺乳類細胞におけるＹＯＲ００４ｗの発現に対するＤＮＡ断片化と細胞膜の転座。ａは、ＴＵＮＥＬ染色後の３６時間培養ＨｅＬａ細胞。ＹＯＲ００４ｗ細胞でのブラウン染色により示されるように、広範囲にわたるＤＮＡ断片化がはっきり現れている。ｂは、アネキシンＶ染色後の３６時間培養ＨｅＬａ細胞。赤く細胞を縁取る染色により示されるように、ＹＯＲ００４ｗ細胞中の細胞膜の転座がはっきり現れている。ｃは、３６時間培養ＨｅＬａ細胞のＤＮＡラダー分析（３．５μｇ　ＤＮＡ）。レーン１、２、３および４は、それぞれ対照（ベクターのみ）、ＹＯＲ００４ｗ、正の対照細胞（＋ＦＡＳ／ＣＤ９５抗原およびスタウロスポリン）、およびマーカーである。ＹＯＲ００４ｗおよび正の対照細胞は、典型的なＤＮＡラダープロファイルを等しく示したが、対照細胞は示さなかった。ｄは、３６時間培養ＨｅＬａ細胞（５μｇタンパク質）およびＣＯＳ７細胞（１．５μｇタンパク質）のチトクロームｃのウエスタンブロット分析。レーン１、２および３は、それぞれ対照、ＹＯＲ００４ｗ、および正の対照細胞である。ＹＯＲ００４ｗの発現によって、ＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ７細胞において共にチトクロームｃ放出が生じ、これは正の対照細胞における放出と同様であった。
【図６】微生物細胞のＹＯＲ００４ｗの発現に対する細胞生存度。ａは、ＩＰＴＧ存在下で２時間培養したＹＯＲ００４ｗおよびＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）を持つ微生物細胞と対照細胞（ベクターのみを持つ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて、発現を確認した。ＹＯＲ００４ｗおよびＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）細胞では、ＧＳＴタグ化産物は〜６０ｋＤａで測定された（ＧＳＴ−ＹＯＲ００４ｗにより矢印を用いて示す）。ｂは、２時間培養前後のＹＯＲ００４ｗ、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）、および対照細胞のコロニー群。ＹＯＲ００４ｗの発現は著しく細胞死を促進したが、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）の発現は促進しなかった（これらの細胞における細胞死は対照細胞におけるものと同様であった）。ｃは、ｂと同様の細胞に対するＤＮＡ染色。ＹＯＲ００４ｗ細胞は細胞拡大および溶解を、不均一なＤＮＡ分布と並び示したが、ＹＯＲ００４ｗ（ＶＬＶ／ＡＡＡ）および対照細胞はこれを示さなかった。
【図７】微生物細胞のＹＯＲ００４ｗの発現に対する細胞および超微細構造の変化。ａは、ＹＯＲ００４ｗを持つ２時間培養細胞および対照細胞における、ＴＵＮＥＬ染色と組み合わせた共焦点レーザースキャニング顕微鏡写真（挿入図は拡大した典型的な細胞を示す）。ＹＯＲ００４ｗ細胞はブラウン染色により示すように、広範囲にわたりＤＮＡ断片化を生じていた。ｂは、ａと同じ細胞に対する、アネキシンＶ染色と組み合わせた共焦点レーザースキャニング顕微鏡写真（挿入図は拡大した典型的な細胞を示す）。ＹＯＲ００４ｗ細胞は赤く縁取る染色により示すように、細胞−膜転座を示している。ｃは、２時間培養ＹＯＲ００４ｗ細胞と対照細胞の透過型電子顕微鏡写真。ＹＯＲ００４ｗ細胞は不均一なＤＮＡ分布（★により示す）、細胞溶解（矢じり印で示す）および細胞壁小胞化（矢印で示す）を示したが、対照細胞はこれを示さなかった。スケールバーは１μｍ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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