(57)【要約】【課題】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＭＡＣ）からｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｏｌｉｐｉｄ（ＧＰＬ）を短時間かつ簡単に抽出可能な方法を提供する。【解決手段】ＭＡＣをアセトン若しくはメタノールに懸濁させ、この試料液に微小球を入れてミキサーミルで激しく振とうすることにより菌を破砕する。溶媒がアセトンの場合は、破砕試料をそのままインキュベート（５５℃、５分間）する。溶媒が、メタノールの場合は、破砕試料に、２倍量のクロロホルムと少量の水を加えて混合し、これを遠心分離して下層（粗脂質層）を取り出し、濃縮後、これをアセトンに溶解し、前記条件でインキュベートする。インキュベート後、アセトン溶液を遠心分離し、上清を採取し、これをシリカゲルミニカラムで精製する。溶出液としてはメタノール／クロロホルム混合液が使用できる。得られたＧＰＬはＨＰＬＣ等で同定することにより（図１参照）、ＭＡＣの血清型を診断できる。【選択図】  図１
2004154081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌からのｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｏｌｉｐｉｄ（ＧＰＬ）の抽出方法であって、下記の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の各工程を含む方法。
（Ａ）菌を含む試料液において、前記菌を破砕する工程。
（Ｂ）前記破砕試料をアセトンに懸濁し、これをインキュベートした後、遠心分離してＧＰＬ画分を採取する工程。
（Ｃ）前記ＧＰＬ画分をカラム精製する工程。
【請求項２】
前記（Ａ）工程において、前記試料液が、アセトンに菌を懸濁させた試料液であり、前記（Ｂ）工程において、前記破砕試料をそのままインキュベートする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記（Ａ）工程において、前記試料液が、メタノールに菌を懸濁させた試料液であり、破砕後、クロロホルムおよび水を加えて混合して遠心分離し、その下層部分を破砕試料とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記（Ｂ）工程において、前記インキュベートの条件が、温度３０〜６０℃で時間１〜１０分間である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記（Ｃ）工程において、前記カラム精製が、シリカゲルミニカラムを用いた精製である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記（Ａ）工程において、前記菌の粉砕が、前記試料液に微小球を入れて激しく振とうすることにより行われる請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記（Ａ）工程において、菌の破砕がミキサーミルを用いて行われる請求項６記載の方法。
【請求項８】
菌が、抗酸菌である請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
抗酸菌が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＭＡＣ）、Ｍ．  ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｈａｂａｎａ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｍ．ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｅ、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｆａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓおよびＭ．ｐｏｒｃｉｎｕからなる群から選択される少なくとも一つである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
菌からのｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ（ＧＬ）の抽出方法であって、請求項１の前記（Ｂ）および（Ｃ）工程において、ＧＰＬに代えてＧＬ画分を採取し、これをカラム精製すること以外は請求項１から７のいずれかに記載の方法を実施することによりＧＬを抽出する方法。
【請求項１１】
菌が抗酸菌である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
抗酸菌が、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、エム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）、エム・ゴルドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、エム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、エム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、チモテ菌（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、エム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム・シミエー（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、エム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、エム・キセノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）、エム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、鼠らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、エム・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エム・テレエ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、エム・ノンクロモジェニクム（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、エム・マルメンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、エム・アシアティクム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、エム・ヴァケエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）、エム・ガストリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）、エム・トリビアル（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ）、エム・ヘモフィラム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、エム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、エム・サーモレジスタブル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｂｌｅ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＭＡＣ）の血清型診断方法であって、請求項１から７のいずれかに記載の方法により、ＭＡＣからＧＰＬを抽出し、このＧＰＬの種類を同定することによりＭＡＣの血清型を診断する方法。
【請求項１４】
ＧＰＬの種類を同定する方法が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）および薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）の少なくとも一つの方法である請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、菌からのｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｏｌｉｐｉｄ（ＧＰＬ）の抽出方法およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＭＡＣ）の血清型診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＭＡＣ感染症は、日和見感染症であり、ヒトからヒトへの感染がなく、従来は治療の不要な疾患であると考えられてきた。ところが、近年その患者は日本の都心部を中心に増加している。日本の患者は、１９９７年の統計によれば、非定型抗酸菌症発症率が１０万人あたり３．５２人であり、過去２５年間で３．８倍に増加している。このうちＭＡＣ感染症患者は７０％をしめる（非特許文献１）。また、アメリカ合衆国では、ＡＩＤＳ患者の７０％がこの感染症にかかることから（非特許文献２）、その診断・治療の重要性は増している。その上、ＭＡＣ感染症は、長期に亘り感染が持続することが知られているが、進行のゆっくりした治療の不要な患者がいる一方で、急速に病状が進行し死に至る患者もいる。また、治療には、３若しくは４剤を１２カ月以上投薬するガイドラインが設定されたが（アメリカ１９９７年、日本１９９８年）、そのガイドラインに従っても、菌陰性化率４５．１％、臨床的改善率２９．４％であり、その治療効果は低い。さらに、投薬治療後の再排菌率が３９％と高率である。再排菌時の菌は、薬剤に耐性になっていることも少なくない。死亡率はガイドラインに従ったもので６．９％、従わなかったもので２４．２％であった（非特許文献３）。
【０００３】
ＭＡＣ血清型は２８種類が知られている。この血清型と臨床上の病態との関係は、現在のところ不明である。それは、今までＭＡＣ感染症があまり注目されていなかったこと、血清型の診断に時間と、コストがかかる上に不正確であったためである。しかし、大腸菌において血清型により重篤な食中毒を起こすもの（例えば、大腸菌Ｏ−１５７株）から病原性のないものがあることが知られているように、ＭＡＣについても、血清型により病態が異なることが想像される。もし血清型により病態が異なることがわかれば、治療の不要な患者と、きちんと治療する必要のある患者とが区別可能になる。これは、治療不要な患者にとっては長期の治療や、治療薬からの副作用から解放されることになり、また、医療経済の視点からみても医療上不要な経費を削減することにつながる。この様に、ＭＡＣの簡便な血清型診断法が確立された場合の効果は、はかりしれない。
【０００４】
各菌の血清型を同定する方法は、抗血清をもちいて菌の凝集反応を見る方法が一般的である。大腸菌などは、その方法で簡便に同定することができる。ところが、ＭＡＣについては各血清型由来ＧＰＬの構造の違いが少ないこと、共通構造も強い抗原性を有することから交差反応をおこすため、血清型が決定できない（非特許文献４）。そこで、ＧＰＬを抽出精製し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いてそのＲｆ  値により、血清型を決める方法が提案され、これが主流になっている（非特許文献５、非特許文献６）。この方法は、例えば、つぎのようにして実施される。
【０００５】
すなわち、まず、患者分離菌株を、抗酸菌用固形培地（小川培地等）若しくは液体培地（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｔｕｂｅ等）に植菌する。ＧＰＬを抽出するためには、さらに、これらの培地から２００乃至４００ｍｌの液体培地に植えついで約１ヶ月間培養し増菌する必要がある。その後、集菌し、菌を破砕する。それから、クロロホルム、メタノール、および水を加えてＦｏｌｃｈの２層分配をする。一晩おいてきれいに分離したところでクロロホルム相を分取し、濃縮して粗脂質を得る。この粗脂質を、弱アルカリ加水分解し、アルカリに不安定な脂質を除去する。得られた試料は、ＧＰＬを多く含む分画である。その試料を用いて薄層クロマトグラフィーでＧＰＬのＲｆ値を求め、標準品のＲｆ値と比較して血清型を同定する。
【０００６】
しかしながら、この方法では、増菌するためＧＰＬの抽出に約１ヶ月を要し、その培地も効果であるため、多量のサンプルを検査する臨床検査に適用するのは現実的でない。また、上述したように、凝集反応による血清型の診断では、交差反応を示すので不確実であることが問題である。
【０００７】
【非特許文献１】
坂谷光則  １９９９．    非定型抗酸菌症の疫学と臨床。結核７４、３７７−３８４．
【０００８】
【非特許文献２】
Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｋｈｏｏ，  Ｋ．−Ｈ．  ２００１．  Ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｏｌｉｐｉｄｓ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ２００１．  ５８，  ２０１８−２０４２．
【０００９】
【非特許文献３】
小橋吉博、沖本二郎、松島敏春、重藤えり子、他  ２００２．  ガイドラインに沿った肺Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｃｏｍｐｌｅｘ  症の治療成績。結核  ７７、４３５−４４１．
【００１０】
【非特許文献４】
ＭｃＣｌａｔｃｈｙ，  Ｊ．Ｋ．    １９８１    Ｔｈｅ  ｓｅｒｏａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｒｅｖ−Ｉｎｆｅｃｔ−Ｄｉｓ．    Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；  ３，  ８６７−８７０．  ｓ
【００１１】
【非特許文献５】
Ｂｒｅｎｎａｎ  ＰＪ，  Ｈｅｉｆｅｔｓ  Ｍ，  Ｕｌｌｏｍ  ＢＰ．  １９８２．  Ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｓ  ａ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．    Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍａｒ；１５（３）：４４７−５５．
【００１２】
【非特許文献６】
佐藤明正  ２０００．    Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｉｕｍ  ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  症患者分離株の血清型から見た地域特異性。感染症学雑誌  ７４：（１）６４−７２．
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、ＧＰＬを短時間かつ簡単に抽出できる抽出方法の提供を第１の目的とし、ＭＡＣの血清型を正確かつ簡便に診断できる血清型診断方法の提供を第２の目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
前記第１の目的を達成するために、本発明のＧＰＬの抽出方法は、菌からのｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｏｌｉｐｉｄ（ＧＰＬ）の抽出方法であって、下記の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の各工程を含む方法である。
（Ａ）菌を含む試料液において、前記菌を破砕する工程。
（Ｂ）前記破砕試料をアセトンに懸濁し、これをインキュベートした後、遠心分離してＧＰＬ画分を採取する工程。
（Ｃ）前記ＧＰＬ画分をカラム精製する工程。
【００１５】
この抽出方法は、培養を必要とせず、例えば、約３時間という短時間で行うことができ、特別の装置や器具を必要とせずに、簡単にＧＰＬを抽出できる。
【００１６】
なお、本発明の方法を、少し変形すれば、ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ等のｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ（ＧＬ）を抽出することができる。すなわち、本発明のＧＬの抽出方法は、前記本発明のＧＰＬ抽出方法の前記（Ｂ）および（Ｃ）工程において、ＧＰＬに代えてＧＬ画分を採取し、これをカラム精製すること以外は前記本発明の方法を実施することによりＧＬを抽出できる。具体的に言えば、ＧＰＬはアセトン可溶であり、ＧＬはアセトン不溶であるから、前記（Ｂ）工程の遠心分離後の上清がＧＰＬ画分であり、沈殿物がＧＬ画分である。
【００１７】
つぎに、前記第２の目的を達成するために、本発明のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＭＡＣ）の血清型診断方法であって、前記本発明に方法により、ＭＡＣからｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｏｌｉｐｉｄ（ＧＰＬ）を抽出し、このＧＰＬの種類を同定することによりＭＡＣの血清型を診断する方法である。
【００１８】
この診断方法は、培養することがないため、短時間かつ簡単に行うことができ、また凝集反応を使用しないため、従来法に比べて正確性に優れる。ＧＰＬの同定の方法は、特に制限されず、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＴＬＣ等があるが、このなかでも、ＨＰＬＣが簡便であるため、好ましい。ＨＰＬＣでの診断がはっきりしない場合、ＬＣ／ＭＳにより診断することが好ましい。また、これらの方法は組み合わせてもよい。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２０】
本発明の抽出方法の前記（Ａ）工程において、菌を含む前記試料液の溶媒は、特に制限されず、例えば、アセトン、メタノール等がある。アセトンを溶媒として使用した場合、菌を破砕した破砕試料は、前記（Ｂ）工程において、そのままインキュベートできるため、好ましい。一方、メタノールを溶媒として使用した場合、菌を破砕した後、これにクロロホルムおよび水を加えて混合し、これを遠心分離し、その下層部分（粗脂質層）を破砕試料とする。この方法は、Ｆｏｌｃｈの２層分配法ともいう。クロロホルムの割合は、特に制限されないが、例えば、前記試料液に対し、２倍容量であり、水の割合も特に制限されず、少量加えることが好ましく、例えば、前記試料液に対し、０．０１〜１倍容量加えることができる。
【００２１】
本発明の抽出方法の前記（Ａ）工程の破砕は、特に制限されず、例えば、前記試料液に微小球（ビーズ）を加えて激しく振とうすることにより、実施される。この破砕は、例えば、ミキサーミルを用いて実施でき、ミキサーミルは市販されている。ミキサーミルの破砕原理は、試料液と菌粉砕用の微小球を充填した粉砕ジャーが、激しく振とう（例えば、水平方向）することにより、前記微小球で菌を粉砕するというものである。振とうの程度は、例えば、３Ｈｚ〜３０Ｈｚ（１２０〜１８００（振動数）／分）である。前記微小球も特に制限されない。前記微小球としては、例えば、タングステンカーバイドビーズ、ステンレスビーズ、アルミナビーズ、ジルコニアビーズ、ガラスビーズ等がある。前記微小球の大きさも特に制限されず、菌の種類等によって適宜決定され、例えば、０．０１〜１０ｍｍ、好ましくは０．１〜８ｍｍ、より好ましくは１〜６ｍｍ、さらに好ましくは、約５ｍｍである。この他にも、破砕は、例えば、超音波処理により行ってもよい。
【００２２】
本発明の抽出方法の前記（Ｂ）工程において、前記インキュベートの条件は、特に制限されないが、加温すると分離効率が良くなるため、加温したインキュベートが好ましい。加温の条件は、特に制限されないが、アセトンの気化を考慮すると、例えば、温度３０〜６０℃で時間１〜１０分間の条件があげられ、好ましい条件としては、温度４０〜５５℃で１〜１０分間の条件があげられ、最適条件としては、５５℃で５分の条件があげられる。
【００２３】
本発明の抽出方法の前記（Ｃ）工程において、前記カラム精製は、特に制限されず、例えば、シリカゲルカラムがある。カラムは、オープンカラムでも中圧カラムでもよい。また、利便性から、シリカゲルミニカラムを用いることが好ましい。前記カラム精製の条件も特に制限されず、例えば、メタノール／クロロホルム混合溶液による溶出がある。
【００２４】
本発明のＧＰＬ抽出方法の適用対象となる菌は、ＧＰＬを持つ菌であれば、特に制限されず、例えば、抗酸菌がある。ＧＰＬを持つ菌としては、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（ＭＡＣ）、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｈａｂａｎａ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ａｂｏｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｍ．ｓｅｎｅｇｏｌｅｕｓｅ、Ｍ．ｒｅｕｏｐｉ、Ｍ．ｆａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓおよびＭ．ｐｏｒｃｉｎｕｎｓ等がある。この中でも、ＭＡＣを対象とし、そのＧＰＬを抽出して血清型を診断することが好ましいのは、前述のとおりである。
【００２５】
つぎに、本発明のＧＰＬの抽出方法およびＭＡＣの血清型診断方法の一例について、説明する。
【００２６】
すわわち、まず、小川斜面培地から数コロニーを掻き取り、メタノールまたはアセトンに懸濁してミキサーミル  ＭＭ３００  （Ｒｅｔｓｃｈ，  Ｈａａｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて菌を破砕する。その後、メタノールに懸濁したものについてはクロロホルムを２倍容加え、水も少量加えて振とうし、遠心分離してから上層を吸引除去する。下層を濃縮した後、アセトンに溶解する。この試料および先にアセトンに懸濁・破砕した試料は、５５°Ｃ，  ５分間インキュベートした後、遠心分離して上清を分取し、濃縮する。これを１００  μｌの２％  メタノール−クロロホルム溶液に溶解してサンプルとし、シリカゲルミニカラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  １  ｃｃ，  Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＣ）を用いて精製する。予め、カラムは、２％  メタノール−クロロホルム溶液１ｍｌで洗浄しておき、これにサンプルをいれ、次に２％  メタノール−クロロホルム溶液１ｍｌで不要な部分を溶出する。その後３３％  メタノール−クロロホルム溶液  １  ｍｌで溶出すれば、ＭＡＣのＧＰＬが得られる。溶出試料は、濃縮することが好ましい。そして、得られたＧＰＬについて、ＨＰＬＣで分析する。ＨＰＬＣは、順相カラム（例えば、Ｉｍｔａｋｔ  ＵＫ−Ｓｉｌｉｃａ，  ２．０  ｍｍ  Ｉ．Ｄ．，  ２５０  ｍｍ  ｌｅｎｇｔｈ）を用い、Ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ／Ｍｅｔｈａｎｏｌ  を溶媒として用い、０．２−０．４  ｍｌ／ｍｉｎ．  の流速で溶出する。検出は、２５４  ｎｍの吸光度により、若しくはＭＳにより行う。ＧＰＬの同定は、標準品と溶出時間（Ｒｔ）を比較することにより行う。なお、ＨＰＬＣによる同定で、はっきりしない場合にはＬＣ／ＭＳを用いて確認することが好ましい。また、ＧＰＬの分析は、ＴＬＣを用いてもよい。
【００２７】
つぎに、ＭＡＣのＧＰＬについて説明する。
【００２８】
ＭＡＣの血清型は、ＧＰＬの構造の違いにより２８種類あるといわれており、そのうち、１４種類のＧＰＬの構造が解明されている。下記にＭＡＣのＧＰＬの一般構造を示す。ＧＰＬは、各血清型に共通のｆａｔｔｙ  ａｃｙｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−ａｌｌｏＴｈｒ−（Ｏ−６ｄＴａｌ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｙｌ−Ｏ−ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅと、それぞれに特有の糖鎖構造からなる。下記表１に、解明されているＧＰＬの糖鎖部分構造を示す。
【００２９】
【化１】
2004154081.tif 000003
【００３０】
【表１】
2004154081.tif 000004
【００３１】
つぎに、本発明のＧＬの抽出方法において、対象となる菌は、特に制限されないが、例えば、抗酸菌がある。抗酸菌としては、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、エム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）、エム・ゴルドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、エム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、エム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、チモテ菌（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、エム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム・シミエー（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、エム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、エム・キセノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）、エム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、鼠らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、エム・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エム・テレエ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、エム・ノンクロモジェニクム（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、エム・マルメンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、エム・アシアティクム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、エム・ヴァケエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）、エム・ガストリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）、エム・トリビアル（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ）、エム・ヘモフィラム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、エム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、エム・サーモレジスタブル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｂｌｅ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）等がある。
【００３２】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について説明する。
【００３３】
（実施例１）
ＭＡＣの血清型１−２０の各標準菌株を用い、７Ｈ９  液体培地でそれぞれ１２００ｍｌ、各２本を３乃至４週間培養した。高圧蒸気滅菌後、１１０００ｒｐｍ，２０分間遠心分離し、１回洗浄して菌体を集めた。菌はメタノール１５０ｍｌに懸濁し、超音波破砕した。クロロホルム３００  ｍｌと水を若干量加えＦｏｌｃｈの２層分配法で粗脂質を抽出した。粗脂質はｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒで濃縮したのち、アセトン沈殿法を用いて不要な糖脂質等を除去した。即ち、粗脂質にアセトン約１００  ｍｌを加え、よく懸濁し５０℃，  ３０分間加温後、４℃で一晩静置した。３０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を濃縮した。この試料をクロロホルムに溶解しアセトン上清試料とした。各血清型のアセトン上清試料は、カラムを用いて精製した。すなわち、充填剤としてシリカゲル６０  （４０〜６３  μｍ  ）を２５−３０  ｇ用いた。２％メタノール−クロロホルム溶液で懸濁したシリカゲルスラリーを空気が含まないようにオープンカラム（内径２．０  ｃｍ，  長さ３０  ｃｍ）または中圧カラム（直径  ２．０  ｃｍ，  長さ  ５０ｃｍ）に充填した。クロロホルム溶解性のものをあらかじめ溶出させるために、２％  メタノール−クロロホルム溶液を１００  ｍｌ流した。その後２００−３００  ｍｇの試料を入れて、２％  メタノール−クロロホルム溶液で溶出した。黄色層の色素が溶出した後、１０％メタノール−クロロホルム溶液、２０％メタノール−クロロホルム溶液、３３％メタノール−クロロホルム溶液で溶出し、これをフラクションコレクターで回収した。中圧カラムでは、４  ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した（小型ポンプＮｏ，  ５４０，山善、日本）。各分画を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ，  ２５  ＨＰＴＬＣ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｓｈｅｅｔｓ  ２０×２０  ｃｍ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｍｅｒｃｋ）を用いて確認した。展開溶媒はクロロホルム／メタノール／水（６０：１２：１）を用い、展開した。展開後１０％硫酸エタノール溶液を噴霧した後１８０℃、１０分間加熱発色した。ＧＰＬは特有の黄褐色を呈した。
【００３４】
（実施例２）
ＭＡＣ血清型２０の標準菌株から、前記実施例１と同じ方法で得られた３  μｇ，  ２  μｇ，  １  μｇ，  ０．５  μｇ，  ０．２  μｇのＧＰＬを用いてＨＰＬＣ  （ｓｉｍａｄｚｕ）で確認した。ここでは、逆相カラム（５Ｃ１８  ４．６  ｍｍ  ＩＤ×２５０  ｍｍ）を用い、  メタノールを０．５  ｍｌ／分で溶出した。ＵＶ検出器を用い、２５４  ｎｍの吸収を検出した。この結果を、図１のグラフに示す。図１に示すように、０．２μｇからＧＰＬの検出が可能であった。
【００３５】
（実施例３）
ＭＡＣ  血清型２０の乾燥菌体を０．０２ｍｇ〜２ｍｇまたは小川培地上のコロニーを掻き取ってエッペンドルフチューブにいれ、それぞれにメタノール  ２５０  μｌ、５  ｍｍ  径のアルミナボールを一つ加えてミキサーミル  ＭＭ３００  （Ｒｅｔｓｃｈ，  Ｈａａｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３０回／秒の速度で２分間振とうして菌を破砕した。そこへクロロホルム５００  μｌ，  水１００  ｍｌを加え、ボルテックスでよく攪拌した後、５０００  ｒｐｍ，  ５分間遠心して二層分配した。下層をｅｖａｐｏｒａｔｏｒまたは窒素ガスで乾固した。ここへアセトン５００  μｌを加え５５℃で５  分間加温した後５０００  ｒｐｍ，  ５  分間遠心した。クロロホルム１００  μｌで溶かしてサンプルとし、シリカゲルミニカラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  １  ｃｃ，  Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＣ）を用いて精製した。カラムはあらかじめクロロホルム１ｍｌで洗浄しておき、サンプルをいれ次にクロロホルム１ｍｌで不要な部分を溶出した。その後１０％  メタノール−クロロホルム溶液  （Ａ）  １ｍｌで溶出し、メタノール濃度を２０％  （Ｂ）  ，  ３３％  （Ｃ）  に増加して各１  ｍｌで溶出した。その溶出液をそれぞれ濃縮した後、ＴＬＣ（２５  ＨＰＴＬＣ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｓｈｅｅｔｓ  ２０×２０  ｃｍ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｍｅｒｃｋ）を用いて確認した。展開溶媒はクロロホルム／メタノール／水  （６０：１２：１）  を用い、展開した。展開後１０％硫酸エタノール溶液を噴霧した後１８０℃、１０分間加熱発色した。ＧＰＬは特有の黄褐色を呈した。この結果を図２に示す。図２に示すように、乾燥菌体０．１ｍｇからＴＬＣで確認できるＧＰＬ（１μｇ以上）が抽出できた。
【００３６】
（実施例４）
実施例３において、シリカゲルミニカラム精製における溶出液を、１０％メタノール  ・  クロロホルム溶液  （Ａ）、２０％メタノール  −  クロロホルム溶液  （Ｂ）、３３％メタノール−クロロホルム溶液  （Ｃ）と順にメタノール濃度をあげて溶出した。その結果、下記表２に示すように、血清型１から２０の全てにおいて、ＧＰＬが溶出した。
【００３７】
【表２】
2004154081.tif 000005
【００３８】
（実施例５）
試料として、２名のＭＡＣ感染患者（患者１、患者２）の試料と、ＭＡＣ血清型２０の標準菌を用いた。これらは、小川培地に培養したものである。これら３種類の試料について、実施例３と同じ方法で、ＧＰＬを分析した。その結果を、図３に示す。同図において、ＰＡＴ−１およびＰＡＴ−２は、それぞれ患者１および患者２を示し、ｃｏｌｏｎｙは前記標準菌を示す。図示のように、本発明の方法により、患者の試料からも、ＧＰＬを確認することができた。
【００３９】
（実施例６）
ＭＡＣ  血清型２０の乾燥菌体１  ｍｇをとり、エッペンドルフチューブにいれ、アセトン５００  μｌ  を加えた。次に、ミキサーミル  ＭＭ３００  （Ｒｅｔｓｃｈ，  Ｈａａｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて菌を破砕した。破砕菌試料を５５℃で５  分間加温した後５０００  ｒｐｍ，  ５  分間遠心した。上清をとりＮ２  ガス  で乾固した後クロロホルム１００  μｌで溶解させてサンプルとし、シリカゲルミニカラム（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｖａｃ  １  ｃｃ，  Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＣ）を用いて精製した。カラムはあらかじめクロロホルム１ｍｌで洗浄しておき、サンプルをいれ次にクロロホルム１ｍｌで不要な部分を溶出した。その後１０％  メタノール−クロロホルム溶液  （Ａ）  １ｍｌで溶出した。その溶出液を濃縮した後、ＴＬＣ（２５  ＨＰＴＬＣ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｓｈｅｅｔｓ  ２０×２０  ｃｍ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｍｅｒｃｋ）を用いて確認した。展開溶媒はクロロホルム／メタノール／水  （６０：１２：１）  を用い、展開した。展開後１０％硫酸エタノール溶液を噴霧した後１８０℃、１０分間加熱発色した。ＧＰＬは特有の黄褐色を呈した。この結果を、図４に示す。また、同じ試料を用いて実施例４（Ｆｏｌｃｈ分配法）と同様にして得られたＧＰＬもＴＬＣで確認した。この結果も図４に示す。同図に示すように、アセトンのみでもＧＰＬを抽出することができ、その抽出効率は、Ｆｏｌｃｈ分配法に比べてよかった。
【００４０】
（実施例７）
実施例３において、Ｆｏｌｃｈの２層分配後に得られた粗脂質層（下層）をアセトンに溶解した。これを５５℃で５分間インキュベートした後、そのままＴＬＣで分析した。その他は、実施例３と同じである。また、比較として、インキュベート後、遠心分離（５０００ｒｐｍ，５分間）し、その上清をＴＬＣ分析した。この結果も、図５に示す。図示のように、インキュベート後、遠心分離しない場合は、ＧＰＬに加えてＧＬも確認され、遠心分離した場合は、ＧＰＬのみ確認された。この結果から、ＧＰＬは、遠心分離の上清に存在し、ＧＬは、遠心分離の沈殿物に存在するといえる。
【００４１】
（実施例８）
実施例６と同じ方法で、患者分離菌株（７株）からＧＰＬを抽出した。このＧＰＬについてＬＣ／ＭＳで血清型を調べた。ＨＰＬＣはＡｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０    （Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｌｄ，ＭＡ）を用いエレクトロンスプレーーイオントラップ質量分析計ＬＣＱ  （Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）に接続して測定した。カラムは順相カラム（ｓｉｌｉｃａ，  ２．０  ｍｍ  ＩＤ  ｘ  ２５０  ｍｍ，  ｉｍｔａｋｔ  ＵＫ−Ｓｉｌｉｃａ）を用い、酢酸エチルとメタノールを９：１の割合で溶出し始め４分後からメタノール濃度を上げ、２２分後に５０％とした。流速は０．２  ｍｌ／ｍｉｎ．とし、ポジティブイオンを検出した。さらに、各スキャンごとに、もっともイオン強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）  の高いイオンを選んでアルゴンガスと衝突させてできるフラグメントイオンを測定するＭＳ／ＭＳ分析も行った。これらの結果を、図６のチャートに示す。図示のように、７株とも約７分で溶出し、分子イオン１７２０または１７６２を検出した。これらの結果から、患者分離菌株の血清型は４型ないし２０型であることがわかった。
【００４２】
【発明の効果】
以上のように、本発明の抽出方法によれば、菌からＧＰＬを短時間かつ容易に抽出することができ、しかも特別な設備や装置を必要としない。したがって、この方法を、ＭＡＣの血清型診断方法に適用することにより、多数の試料について短時間かつ簡単に血清型を診断することができ、血清型と病態との関連を容易に調べることが可能となり、ＭＡＣ感染症の研究、診断、予防および治療等に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の一実施例におけるＨＰＬＣによるＧＰＬ抽出を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明のその他の実施例におけるＧＰＬ抽出を示すＴＬＣの写真である。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施例におけるＧＰＬ抽出を示すＴＬＣの写真である。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の実施例におけるＧＰＬ抽出を示すＴＬＣの写真である。
【図５】図５は、本発明のさらにその他の実施例におけるＧＬ抽出およびＧＰＬ抽出を示すＴＬＣ写真である。
【図６】図６は、本発明のさらにその他の実施例におけるＧＰＬの血清型をＬＣ／ＭＳで分離した結果を示すチャート図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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