(57)【要約】【課題】ヒューミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼ等に由来するセルラーゼの新規な変異体を含んでなる組成物。【解決手段】例えば、ヒューミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）由来の、例えば、次の変異体：Ｔ６Ｓ，　Ｒ７Ｉ，　Ｒ７Ｗ，　Ｙ８Ｆ，　Ｗ９Ｆ，　Ｃ１２Ｍ／Ｃ４７Ｇ，　Ｗ１８Ｙ，　Ｗ１８Ｆ，　Ｓ４５Ｔ，　Ｓ４５Ｎ，　Ｄ１１４Ｎ，　Ｆ１３２Ｄ，　Ｙ１４７Ｄ，　Ｙ１４７Ｃ，　Ｙ１４７Ｗ，　Ｙ１４７Ｖ，　Ｙ１４７Ｒ，　Ｙ１４７Ｇ，　Ｙ１４７Ｑ，　Ｙ１４７Ｎ，　Ｙ１４７Ｋ，　Ｙ１４７Ｈ，　Ｙ１４７Ｆ及びＹ１４７Ｓから成る群から選択されたセルラーゼ変異体を含んで成る酵素組成物。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒューミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）由来の次の変異体：Ｔ６Ｓ，　Ｒ７Ｉ，　Ｒ７Ｗ，　Ｙ８Ｆ，　Ｗ９Ｆ，　Ｃ１２Ｍ／Ｃ４７Ｇ，　Ｗ１８Ｙ，　Ｗ１８Ｆ，　Ｓ４５Ｔ，　Ｓ４５Ｎ，　Ｄ１１４Ｎ，　Ｆ１３２Ｄ，　Ｙ１４７Ｄ，　Ｙ１４７Ｃ，　Ｙ１４７Ｗ，　Ｙ１４７Ｖ，　Ｙ１４７Ｒ，　Ｙ１４７Ｇ，　Ｙ１４７Ｑ，　Ｙ１４７Ｎ，　Ｙ１４７Ｋ，　Ｙ１４７Ｈ，　Ｙ１４７Ｆ及びＹ１４７Ｓから成る群から選択されたセルラーゼ変異体を含んで成る酵素組成物。
【請求項２】
ヒューミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）由来の次の変異体：Ｒ４Ｈ，　Ｒ４Ｑ，　Ｋ１３Ｌ，　Ｋ１３Ｒ，　Ｋ１３Ｑ，　Ｐ１４Ａ，　Ｐ１４Ｔ，　Ｓ１５Ｔ，　Ｓ１５Ｈ，　Ｃ１６Ｍ／Ｃ８６Ｇ，　Ａ１９Ｐ，　Ａ１９Ｔ，　Ａ１９Ｇ，　Ａ１９Ｓ，　Ｋ２０Ｇ，　Ｄ４２Ｙ，　Ｄ４２Ｗ，　Ｃ４７Ｇ，　Ｅ４８Ｄ，　Ｅ４８Ｑ，　Ｅ４８Ｄ／Ｐ４９＊，　Ｅ４８Ｎ／Ｐ４９＊，　Ｓ１１０Ｎ，　Ｌ１１５Ｉ，　Ｇ１１６Ｄ，　Ｈ１１９Ｒ，　Ｈ１１９Ｑ，　Ｈ１１９Ｆ，　Ｎ１２３Ａ，　Ｎ１２３Ｍ，　Ｎ１２３Ｑ，　Ｎ１２３Ｙ，　Ｎ１２３Ｄ，　Ｖ１２９Ｌ，　Ｄ１３３Ｎ及びＤ１７８Ｎ　から成る群から選択されたセルラーゼ変異体を含んで成る酵素組成物。
【請求項３】
チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）由来の次の変異体：Ｐ１９Ａ，　Ｇ２０Ｋ，　Ｑ４４Ｋ，　Ｎ４８Ｅ，　Ｑ１１９Ｈ及びＱ１４６Ｒから成る群から選択されたセルラーゼ変異体を含んで成る酵素組成物。
【請求項４】
シュードモナス・フルオレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来の次の変異体：Ｙ４Ｒ，　Ｈ１５Ｓ，　Ｎ１１９Ｑ及びＱ１４６Ｒから成る群から選択されたセルラーゼ変異体を含んで成る酵素組成物。
【請求項５】
クリニペリス・スカベラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ　ｓｃａｂｅｌｌａ）由来の次の変異体：Ｖ４Ｒ，　Ｔ１３２ａ＊，　Ｑ１３３Ｄ及びＱ１４６Ｒから成る群から選択されたセルラーゼ変異体を含んで成る酵素組成物。
【請求項６】
キシラナーゼ、マンナナーゼ、他のセルラーゼ成分、キチナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼから成る群から選択された１又は複数の追加の酵素をさらに含んで成る請求項１〜５のいずれか１項記載の酵素組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の酵素組成物を含んで成る洗浄組成物。
【請求項８】
洗浄用途のためへの請求項７記載の洗浄組成物の使用。
【請求項９】
セルロース含有の紙及びパルプの処理のためへの請求項１〜５のいずれか１項記載の酵素組成物の使用。
【請求項１０】
前記処理が、脱樹皮、脱繊維、ファイバー変性、排水改良、ファイバー間結合及び酵素的脱インキから成る群から選択される請求項９記載の使用。
【請求項１１】
布の生物−磨き及び石−洗浄のためへの請求項１〜５のいずれか１項記載の酵素組成物の使用。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項記載の酵素組成物のセルラーゼ変異体をコードするｃＤＮＡを含んで成るベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、ＤＳＭ１０８１１として寄託されているプラスミドから得ることができる請求項１２記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載のベクターを含んで成る宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、Ｅ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）又はアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）である請求項１４記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の酵素組成物の生成方法であって、請求項１２記載のベクターを用いて、請求項１４又は１５記載の宿主細胞を形質転換し、前記セルラーゼ変異体の発現のために適切な条件下で前記宿主をインキュベートし、前記発現された変異体を精製し、そして前記酵素組成物を調製することを含んで成る方法。
【請求項１７】
キシラナーゼ、マンナナーゼ、他のセルラーゼ成分、キチナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼから成る群から選択された１又は複数の酵素を、前記酵素組成物に添加することをさらに含んで成る請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
アミノ酸置換、欠失又は挿入によりセルロース分解酵素の性質を改良するための方法であって、
ａ．　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ登録４ＥＮＧから知られているヒューミコラ・インソレンスからのエンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）に類似する立体構造を有することが知られている少なくとも２種のアミノ酸配列の複数のアラインメントを構成し；
ｂ．　ＥＧＶの構造に基づいてセルロース分解酵素の相同−構築された立体構造体を構成し；
ｃ．　５Å以下の基質結合裂け目からの距離で存在するアミノ酸残基位置を同定し、
ｄ．　前記酵素の表面―暴露されたアミノ酸残基を同定し；
ｅ．　前記酵素のすべての荷電されているか又は潜在的に荷電されているアミノ酸残基位置を同定し；
ｆ．　前記アミノ酸残基が置換され、欠失され、又は挿入が提供される予定である１又は複数の位置を選択し；そして
ｇ．　前記置換、欠失又は挿入を、従来のタンパク質構築技法を用いることによって実施する段階を含んで成る方法。
【請求項１９】
前記段階ｆが、段階ａのアラインメントの結果として、一列整列された配列の大部分において、好ましくは一列整列された配列の少なくとも６３％において同じアミノ酸残基を担持する位置を選択することによって実施される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
段階ｆが、一列整列された配列において、異なったアミノ酸残基を担持する位置を選択することによって実施される請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、置換、挿入及び／又は欠失により親セルラーゼ、即ちエンド−β−１，４−グルカナーゼから得られたセルラーゼ変異体、即ちエンド−β−１，４−グルカナーゼ変異体に関する。ここで、該変異体は、位置５においてアラニン残基（Ａ）、セリン残基（Ｓ）、又はトレオニン残基（Ｔ）を保持し；位置８においてフェニルアラニン残基（Ｆ）、又はチロシン残基（Ｙ）を保持し；位置９においてフェニルアラニン残基（Ｆ）、トリプトファン残基（Ｗ）、又はチロシン残基（Ｙ）を保持し；位置１０においてアスパラギン酸残基（Ｄ）を保持し；並びに位置　１２１においてアスパラギン酸残基（Ｄ）を保持する触媒コアドメインを有する。
【０００２】
背景技術
セルラーゼ又はセルロース分解酵素はセルロースの加水分解に関連する。ネイティブセルロースの加水分解において、関連する３つの主要な型のセルラーゼ酵素、即ちセロビオヒドロラーゼ（１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ、ＥＣ　３．２．１．９１）、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ　３．２．１．４）及びβ−グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）　が存在することが知られている。
【０００３】
特に、エンド−β−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ　Ｎｏ．３．２．１．４）　は、言及される工業的使用のためのヒドロラーゼの関心ある群を構成する。エンドグルカナーゼは、セルロース、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース）、リケニン、穀類のβ−Ｄ−グルカン又はキシログルカンのようなβ−１，３グルカン混合物中のβ−１，４結合、及びセルロース部分を含む他の植物材料の内部加水分解を触媒する。許可されている名前はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼであるが、略した用語でエンドグルカナーゼと本明細書に用いる。　Ｔ．−Ｍ．Ｅｎｖｅｒｉ，　”Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ”　（Ｗ．Ｍ．Ｆｏｇａｒｔｙ，　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　ｐ．１８３−２２４　（１９８３））；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　（１９８８）　Ｖｏｌ．１６０，　ｐ．２００−３９１　（ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｏｏｄ，　Ｗ．Ａ．　ａｎｄ　Ｋｅｌｌｏｇｇ，　Ｓ．Ｔ．）；　Ｂｅｅｇｕｉｎ，　Ｐ．，　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ”，　Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　（１９９０），　Ｖｏｌ．４４，　ｐｐ．２１９−２４８；　Ｂｅｅｇｕｉｎ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ａｕｂｅｒｔ，　Ｊ−Ｐ．，　”Ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ”，　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　１３　（１９９４）　ｐ．２５−５８；　Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，　Ｂ．，　”Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ”，　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　（１９９４），　Ｖｏｌ．１，　ｐｐ．１６９−１９６を参照のこと。
【０００４】
セルラーゼは、真菌、放線菌、粘液細菌及び真性細菌を含む多数の微生物により、並びに植物によっても合成される。特に、広範囲の種のエンドグルカナーゼが同定されている。
【０００５】
セルロース分解酵素の極めて重要な工業的使用は、例えば界面活性組成物又は布帛軟化組成物中の成分としての、セルロースの編物又は布帛の処理のため、新しい布帛をバイオポリッシングする（衣類の仕上げをする）ため、及びセルロース含有布帛、特にデニムの“ストーンウォッシュ”の外観を得るための使用であり、これらの処理のためのいくつかの方法は、例えば　ＧＢ−Ａ−１　３６８５９９，　ＥＰ−Ａ−０　３０７　５６４及び　ＥＰ−Ａ−０　４３５　８７６，　ＷＯ　９１／１７２４３，　ＷＯ　９１／１０７３２，　ＷＯ　９１／１７２４４，　ＰＣＴ／ＤＫ９５／０００１０８及び　ＰＣＴ／ＤＫ９５／００１３２　において示唆される。セルロース分解酵素の他の重要な工業的使用は、例えば排水を改善するため又は再生紙のインキを抜くための、製紙用パルプの処理のための使用である。
【０００６】
セルラーゼは、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）　を有しても有していなくてもよいことも知られている。　ＣＢＤは、酵素のセルロース含有繊維への結合を増強し、その酵素の触媒活性部分の効率を増加させる。
真菌及び細菌は、配列の類似性（疎水性クラスター分析）に基づいてグリコシルヒドロラーゼの異なるファミリーに分類することができる特定範囲のセルロース分解酵素（セルラーゼ）を作り出す（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ　Ｂ　＆　Ｂａｉｒｏｃｈ　Ａ；　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．　１９９３，　２９３，　７８１−７８８）。現在、グリコシルヒドロラーゼのファミリー５，６，７，８，９，１０，　１２，　２６，　４４，　４５，　４８，　６０、及び６１に属するセルラーゼが知られている。
【０００７】
工業的に十分に機能するエンド−β−１，４−グルカナーゼは、例えば　ＷＯ　９１／１７２４３，　ＷＯ　９１／１７２４４　及び　ＷＯ　９１／１０７３２　に記載されており、特定のセルラーゼ変異体は　ＷＯ　９４／０７９９８　に記載される。
本発明の目的は、セルロース分解酵素の新規変異体であって、親酵素と比べた時に改良された能力を示す変異体を供することである。
【０００８】
発明の概要
工業生産に役立つセルロース分解酵素、即ちエンド−１，４−グルカナーゼにおいて、酵素の特性に、及びそれによりこれらのプロテアーゼにおける能力に重要であるいくつかのアミノ酸残基の位置が同定された。
【０００９】
従って、第１の態様において、本発明は、アミノ酸置換、欠失又は挿入によりセルロース分解酵素の特性を改善するための方法であって、
ａ．プロテイン・データ・バンク登録４ＥＮＧから知られるヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ　）からのエンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）　に類似する３次元構造を有することが知られている少くとも２のアミノ酸配列の多重アラインメントを構築し；
ｂ．　ＥＧＶの構造に基づくセルロース分解酵素の相同性で構築した３次元構造を作製し；
ｃ．５Å以下の基質結合クレフトから所定距離にあるアミノ酸残基の位置を同定し；
ｄ．前記酵素の表面に露出したアミノ酸残基を同定し；
ｅ．前記酵素の全ての荷電した又は潜在的に荷電したアミノ酸残基の位置を同定し；
ｆ．アミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を行う１又は複数の位置を選択し；
ｇ．慣用的なタンパク質工学技術を用いることにより置換、欠失又は挿入を行う
ことを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の方法を用いることにより、それ自体周知であるタンパク質工学法により、要求される特性を、１つのセルラーゼから他のセルラーゼに変えることが有効に可能になる。
より詳しくは、本発明は、変化した（増加又は減少した）触媒活性；及び／又は陰イオン性界面活性剤に対する変化したセンシティビテー；及び／又は変化したｐＨ至適性及びｐＨプロフィール活性様式及び安定性様式に関して改良されたセルラーゼ変異体を供する。
【００１１】
従って、更なる態様において、本発明は、置換、挿入及び／又は欠失により親セルラーゼから得られた触媒コアドメインを有するセルラーゼ変異体であって、位置５においてアラニン残基（Ａ）、セリン残基（Ｓ）、又はトレオニン残基（Ｔ）を保持し；
位置８においてフェニルアラニン残基（Ｆ）、又はチロシン残基（Ｙ）を保持し；
位置９においてフェニルアラニン残基（Ｆ）、トリプトファン残基（Ｗ）、又はチロシン残基（Ｙ）を保持し；
位置１０においてアスパラギン酸残基（Ｄ）を保持し；及び
位置　１２１においてアスパラギン酸残基（Ｄ）を保持する（セルラーゼのナンバリング）
セルラーゼ変異体を供する。
【００１２】
発明の詳細な開示
セルラーゼ変異体
本発明は、置換、挿入及び／又は欠失により親セルラーゼから得られた新規セルラーゼ変異体を供する。本発明のセルラーゼ変異体は、天然に見い出されないアミノ酸配列を有する、セルラーゼ変異体又は突然変異させたセルラーゼである。本発明のセルラーゼ変異体は、特に増加した触媒活性；及び／又は変化した陰イオン界面活性剤に対するセンシティビティー；及び／又は変化したｐＨ至適性；及び／又は変化した熱安定性に関して改良された能力を示す。
【００１３】
形式的には、本発明のセルラーゼ変異体又は突然変異させたセルラーゼは、親セルラーゼ（即ちネイティブ又は野生型酵素）の機能的誘導体と考えることができ、親酵素をコードする、親遺伝子の　ＤＮＡヌクレオチド配列又はその誘導体を変化させることにより得ることができる。本セルラーゼ変異体又は突然変異させたセルラーゼは、該セルラーゼ変異体をコードする　ＤＮＡヌクレオチド配列を適切な宿主生物内の適切なベクターに挿入した時に発現させ、作り出すことができる。宿主生物は親遺伝子を得た生物と必ずしも同一である必要はない。
本明細書において、酵素変異体は、変異体、突然変異体又はムテインとも呼ばれる。
【００１４】
アミノ酸
本発明の文脈において、アミノ酸及びアミノ酸残基についての以下の記号及び略語を用いる：
Ａ＝Ａｌａ　＝アラニン
Ｃ＝Ｃｙｓ　＝システイン
Ｄ＝Ａｓｐ　＝アスパラギン酸
Ｅ＝Ｇｌｕ　＝グルタミン酸
Ｆ＝Ｐｈｅ　＝フェニルアラニン
Ｇ＝Ｇｌｙ　＝グリシン
Ｈ＝Ｈｉｓ　＝ヒスチジン
Ｉ＝Ｉｌｅ　＝イソロイシン
Ｋ＝Ｌｙｓ　＝リシン
Ｌ＝Ｌｅｕ　＝ロイシン
Ｍ＝Ｍｅｔ　＝メチオニン
Ｎ＝Ａｓｎ　＝アスパラギン
Ｐ＝Ｐｒｏ　＝プロリン
Ｑ＝Ｇｌｎ　＝グルタミン
Ｒ＝Ａｒｇ　＝アルギニン
Ｓ＝Ｓｅｒ　＝セリン
Ｔ＝Ｔｈｒ　＝トレオニン
Ｖ＝Ｖａｌ　＝バリン
Ｗ＝Ｔｒｐ　＝トリプトファン
Ｙ＝Ｔｙｒ　＝チロシン
Ｂ＝Ａｓｘ　＝　Ａｓｐ又はＡｓｎ
Ｚ＝Ｇｌｘ　＝　Ｇｌｕ又はＧｌｎ
Ｘ＝Ｘａａ　＝いずれかのアミノ酸
＊＝欠失又は欠損したアミノ酸
【００１５】
セルラーゼのナンバリング
本発明の文脈において、セルロース分解酵素中のアミノ酸残基の位置の特定のナンバリングを用いる。以下の第１表に示すように、周知のセルラーゼのアミノ酸配列をアラインすることにより、そのアミノ酸配列が周知であるなら、アミノ酸位置番号を、いずれかのセルロース分解酵素中のいずれかのアミノ酸残基に明白に割り当てることが可能である。
【００１６】
以下の第１表において、異なる微生物源のセルラーゼの１１の選択されたアミノ酸配列をアラインする。これらは、（ａ）ヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ　）；（ｂ）アクレモニウム種（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）；（ｃ）ボルテルラ・コルレクトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ　ｃｏｌｌｅｃｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）；（ｄ）ソルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ　ｆｉｍｉｃｏｌａ　）；（ｅ）チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）；（ｆ）フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）；（ｇ）マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）；（ｈ）クリニペルリス・スカベルラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ　ｓｃａｂｅｌｌａ）；（ｉ）マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ　ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ　）；（ｊ）シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）；（ｋ）ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ　ｍａｙｄｉｓ　）である。セルラーゼ（ａ−ｉ）は　ＷＯ　９６／２９３９７　に記載され、（ｊ）はＧｅｎｅＢａｎｋに認証番号Ｇ４５４９８で示され、そして（ｋ）はＧｅｎｅＢａｎｋに認証番号Ｓ８１５９８で、及び　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ　１９９５，　３７６　（１０）　６１７−６２５において示される。
【００１７】
例えばいくつかの他のセルラーゼのアミノ酸配列とアラインされた配列が第１表の第１コラムに示される　ＷＯ　９１／１７２４３　に開示されるヒュミコラ・インソレンスＤＳＭ　１８００の株から得られたセルラーゼ（エンド−β−１，４−グルカナーゼ）のアミノ酸配列からのナンバリングシステムを用いて、セルロース分解酵素中のアミノ酸残基の位置を明確に示すことが可能である。
本発明により作られ又は考慮される種々のセルラーゼ変異体を記述するに際して、参照を容易にするため以下の命名法を適用する：
〔もとのアミノ酸；位置；置換したアミノ酸〕
【００１８】
従って、位置　１１９におけるグルタミンのヒスチジンでの置換は　Ｑ１１９Ｈと示される。
ヒュミコラ・インソレンスからのセルラーゼのアミノ酸配列に関して挿入を示すアミノ酸は、先行するセルラーゼ番号に、アルファベット順で文字を付加することによりナンバリングされる。例えば、位置　＊２１ａＶは、第１表を比べて、ヒュミコラ・インソレンスからのセルラーゼのアミノ酸配列の位置２１のリシンと位置２２のアラニンとの間の、アミノ酸残基が存在しない場所に“挿入された”バリン（Ｖ）を示す。
ヒュミコラ・インソレンスからのセルラーゼのアミノ酸配列の位置４９におけるプロリン（Ｐ）の欠失はＰ４９＊として示す。
【００１９】
多重の変異はスラッシュ記号（“／”）により分ける。例えば、　Ｑ１１９Ｈ／Ｑ１４６Ｒ　は、位置　１１９及び　１４６における、各々グルタミンＱをヒスチジン（Ｈ）で、グルタミン（Ｑ）をアルギニン（Ｒ）で置換する変異を示す。
置換を、例えばヒュミコラ・インソレンスの株から得られたセルラーゼにおける変異により行うなら、その産物は、例えば“ヒュミコラ・インソレンス／＊４９Ｐ”で示す。
セルラーゼナンバリングにより本願において言及される全ての位置は、上述のセルラーゼ番号をいい、例えば第１表（ａ）のヒュミコラ・インソレンス由来のセルラーゼのアミノ酸配列に対して決定する。
【００２０】
第１表
アミノ酸配列アラインメント；
異なる微生物源の選択されたセルラーゼのセルラーゼナンバリング
（ａ）ヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ　）；（ｂ）アクレモニウム種（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｓｐ．）；（ｃ）ボルテルラ・コルレクトトリコイデス（Ｖｏｌｕｔｅｌｌａ　ｃｏｌｌｅｃｔｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）；（ｄ）ソルダリア・フィミコラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ　ｆｉｍｉｃｏｌａ　）；（ｅ）チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）；（ｆ）フサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）；（ｇ）マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）；（ｈ）クリニペルリス・スカベルラ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ　ｓｃａｂｅｌｌａ）；（ｉ）マクロホミナ・ファセオリナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ　ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ　）；（ｊ）シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）；（ｋ）ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ　ｍａｙｄｉｓ　）。
【００２１】
【表１】
2004065255.tif 000002
【００２２】
【表２】
2004065255.tif 000003
【００２３】
【表３】
2004065255.tif 000004
【００２４】
【表４】
2004065255.tif 000005
【００２５】
【表５】
2004065255.tif 000006
【００２６】
【表６】
2004065255.tif 000007
＊この位置においてアミノ酸残基が欠失
【００２７】
本発明の酵素（エンド−β−１，４−グルカナーゼ）変異体
本発明は、セルラーゼ変異体に関する。より詳しくは、本発明は、置換、挿入及び／又は欠失により親セルラーゼから得られる触媒コアドメインを有するセルラーゼ変異体であって、
−位置５においてアラニン残基（Ａ）、セリン残基（Ｓ）、又はトレオニン残基（Ｔ）を保持し；
−位置８においてフェニルアラニン残基（Ｆ）、又はチロシン残基（Ｙ）を保持し；
−位置９においてフェニルアラニン残基（Ｆ）、トリプトファン残基（Ｗ）、又はチロシン残基（Ｙ）を保持し；
−位置１０においてアスパラギン酸残基（Ｄ）を保持し；そして
−位置　１２１においてアスパラギン酸残基（Ｄ）を保持する（セルラーゼナンバリング）
セルラーゼ変異体を供する。
【００２８】
本発明のエンドグルカナーゼは、その酵素の一体化した一部分として存在するセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）　を含んでいても、又は他の源からの　ＣＢＤをエンドグルカナーゼに導入して、これにより酵素ハイブリッドを作ってもよい。本文脈において、用語“セルロース結合ドメイン”は、　Ｐｅｔｅｒ　Ｔｏｍｍｅら”Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｄｏｍａｉｎｓ：　Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”　（”Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ”，　Ｊｏｈｎ　Ｎ．Ｓａｄｄｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｈ．Ｐｅｎｎｅｒ　（Ｅｄｓ．），　ＡＣＳ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ，　Ｎｏ．６１８，　１９９６）　により定義されるように理解されることを意図する。この定義は、　１２０超のセルロース結合ドメインを１０のファミリー（Ｉ−Ｘ）に分類し、　ＣＢＤが種々の酵素、例えばセルラーゼ類、キシラナーゼ類、マンナナーゼ類、アラビノフラノシダーゼ類、アセチルエステラーゼ類及びキチナーゼ類において見い出されることを示す。
【００２９】
ＣＢＤは、藻類、例えば紅藻ポルフィラ・プルプレア（Ｐｏｒｐｈｙｒａ　ｐｕｒｐｕｒｅａ　）においても非加水分解性ポリサッカライド結合タンパク質として見い出されている（Ｔｏｍｍｅら、前掲を参照のこと）。しかしながら、　ＣＢＤのほとんどはセルラーゼ及びキシラナーゼからのものであり、　ＣＢＤはタンパク質のＮ末端及びＣ末端に、又は内部に見い出される。酵素ハイブリッドは当該技術で周知であり（例えば　ＷＯ　９０／００６０９　及び　ＷＯ　９５／１６７８２　を参照のこと）、エンドグルカナーゼをコードする　ＤＮＡ配列に、リンカーと共に又はリンカーなしで、連結されたセルロース結合ドメインをコードする　ＤＮＡの少くとも１のフラグメントを含む　ＤＮＡ構成物を宿主細胞に形質転換し、そして該宿主細胞を増殖させてその融合した遺伝子を発現させることにより調製することができる。
【００３０】
酵素ハイブリッドは、次式：
ＣＢＤ−ＭＲ−Ｘ又はＸ−ＭＲ−ＣＢＤ
（式中、　ＣＢＤは、少くともセルロース結合ドメインに対応するアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端領域であり；ＭＲは、中央領域（リンカー）であり、そして結合、もしくは短いリンキング基、好ましくは約２〜約　１００炭素原子、より好ましくは２〜４０炭素原子のものであり；又は好ましくは約２〜約　１００アミノ酸、より好ましくは２〜４０アミノ酸のものであり；並びにＸは、本発明による酵素のＮ末端又はＣ末端領域である）
により記述することができる。
【００３１】
本発明の方法
他の態様において、本発明は、アミノ酸置換、欠失又は挿入によりセルロース分解酵素の特性を改善するための方法であって、
ａ．プロテイン・データ・バンク登録４ＥＮＧから知られるヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ　）からのエンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）　に類似する３次元構造を有することが知られている少くとも２のアミノ酸配列の多重アラインメントを構築し；
ｂ．　ＥＧＶの構造に基づくセルロース分解酵素の相同性で構築した３次元構造を作製し；
ｃ．５Å以下の基質結合クレフトから所定距離にあるアミノ酸残基の位置を同定し；
ｄ．前記酵素の表面に露出したアミノ酸残基を同定し；
ｅ．前記酵素の全ての荷電した又は潜在的に荷電したアミノ酸残基の位置を同定し；
ｆ．アミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を行う１又は複数の位置を選択し；
ｇ．慣用的なタンパク質工学技術を用いることにより置換、欠失又は挿入を行う
ことを含む方法に関する。
【００３２】
本方法のステップｆは、好ましくは、ステップａのアラインメントの結果として、そのアラインされた配列の大部分において；より好ましくはアラインされた配列の少くとも６３％において同じアミノ酸残基を有する位置；更により好ましくは、アラインされた配列において、例えば以下の異なるアミノ酸残基を有する位置を選択することにより行われる。
【００３３】
好ましい実施形態において、セルラーゼの比活性は、好ましくは、５Å以下、より好ましくは３Å以下、更により好ましくは　２．５Å以下の基質結合クレフトからの距離内に存在するアミノ酸の位置において置換、欠失又は挿入を行うことにより改良することができる。　２．５Å以下の距離内に存在する残基は基質と直接、接触することができると信じられる。
【００３４】
他の好ましい実施形態において、セルラーゼのｐＨ活性プロフィール、ｐＨ活性至適性、ｐＨ安定性プロフィール、又はｐＨ安定性至適性は、好ましくは５Å以下、より好ましくは３Å以下、更により好ましくは　２．５Å以下の基質結合クレフトからの距離にあるアミノ酸残基の位置において；又は局所的に又は全体的に静電環境を変えるように酵素の表面に露出したアミノ酸残基の位置において、置換、欠失又は挿入を行うことにより変えることができる。荷電した又は潜在的に荷電した残基に関する置換を行うことが好ましく、ここでこの残基はもとの残基か又は置換残基である。本文脈において、荷電した又は潜在的に荷電した残基は、Ａｒｇ，　Ｌｙｓ，　Ｈｉｓ，　Ｃｙｓ（ジスルフィド架橋の一部でないなら），　Ｔｙｒ，　Ｇｌｕ，　Ａｓｐを含むことを意味する。
【００３５】
更に他の好ましい実施形態において、陰イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性成分の存在下でのセルラーゼの安定性は、好ましくは、酵素の表面に露出したアミノ酸残基の位置において置換、欠失又は挿入を行い、それにより局所的に又は全体的に静電環境を変えることにより変えることができる。荷電した又は潜在的に荷電した残基に関する置換を行うことが好ましい。ここで、この残基はもとの残基又は置換残基である。本文脈において、荷電した又は潜在的に荷電した残基は、Ａｒｇ，　Ｌｙｓ，　Ｈｉｓ，　Ｃｙｓ（ジスルフィド架橋の部分でないなら），　Ｔｙｒ，　Ｇｌｕ，　Ａｓｐを含むことを意味する。より負電荷のａａ残基に対する変異は陰イオン性界面活性剤の存在下でセルラーゼの安定性を改善するが、より正電荷のａａ残基に対する変異は陰イオン性界面活性剤に対するセルラーゼの安定性を減少させる。
【００３６】
更に、本明細書に開示される２又はそれ超のアミノ酸置換、欠失又は挿入のいずれかの組合せを含むセルラーゼ変異体、例えば例示される変異体も本発明の範囲内である。
【００３７】
セルラーゼの多重配列アラインメント
多重配列アラインメントは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ　８．１−ＵＮＩＸ　（ＧＣＧ，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，　Ｉｎｃ．）　に含まれるＰｉｌｅｕｐアルゴリズムを用いて行われる。用いる方法は、Ｈｉｇｇｅｎｓ　ａｎｄ　Ｓｈａｒｐ　（ＣＡＲＢＩＯＳ　１９８９，　５，　１５１−１５３）により記載される方法に似ている。　３．０のギャップクリエーションペナルティー及び　０．１のギャップエンステンションペナルティーを、各々の値をその行及び列の合計で割り、そして０の平均及び　１．０の標準偏差に標準化することにより再スケール化した、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９８６　１４　（１６）　６７４５−６７６３　（Ｄａｙｈｏｆｆ　ｔａｂｌｅ　（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，　Ｒ．Ｍ．　ａｎｄ　Ｄａｙｎｏｆｆ，　Ｍ．Ｏ．）；　Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　（Ｄａｙｈｏｆｆ，　Ｍ．Ｏ．　Ｅｄ．）；　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ．Ｃ．　１９７９　３５３−３５８）に記載されるような点数化マトリックスと一緒に用いる。ＦＹ　（Ｐｈｅ−Ｔｙｒ）の値はＲＷ＝１．４２５　である。完全な適合は　１．５に設定し、完全な適合より優れたいずれの行での適合もない）。
【００３８】
セルラーゼの対式（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）　配列アラインメント
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ　（ＧＣＧ）　内の　ＧＡＰルーチンに含まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎ　＆　Ｗｕｎｓｃｈ　（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　１９７０，　４８，　４４３−４５３）　により記載されるアルゴリズムを用いて対式配列アラインメントを行う。　ＧＡＰルーチンに用いたパラメータは、先のＰｉｌｅｕｐルーチンと同じである。
【００３９】
強制対形成（Ｆｏｒｃｅｄ　Ｐａｉｒｉｎｇ）でのセルラーゼの対式配列アラインメント
残基の強制対形成での対式配列アラインメントを、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ　（ＧＣＧ）　内の　ＧＡＰルーチンに含まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎ　＆　Ｗｕｎｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　１９７０，　４８，　４４３−４５３）　により記載されるアルゴリズムを用いて行う。　ＧＡＰルーチンに用いたプラメータは、先のＰｉｌｅｕｐルーチンと同じであるが、点数化マトリックスを、対を形成する残基を記号化するＸと呼ぶ残基を組み込むように改良する。Ｘと対を形成したＸについてのダイアゴナル値を　９．０に設定し、全てのＸに関するオフ・ダイアゴナル値を０に設定する。
【００４０】
ヒュミコラ・インソレンスエンドグルカナーゼ及びセルロヘプタオースの間の複合体
セルロヘプタオースとの複合体中のヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶエンドグルカナーゼ不活性変異体（ＤＩＯＮ）のコアドメインのＸ線構造に基づいて、セルロヘプタオースとの複合体中のネイティブヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶエンドグルカナーゼコアドメインの構造のモデルを、以下のステップを用いて構築する：
【００４１】
１．Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ　９５．０（Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ　９５．０　Ｕｓｅｒ　Ｇｕｉｄｅ，　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９５．　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ：　Ｂｉｏｓｙｍ　／ＭＳＩ，　１９９５）を用いて、Ｎ１０をアスパラギン酸で置換する。
２．全ての分子をコピーすることによりサブ部位−３を占有する糖単位のコピーを作り、余分な原子を削除する。占有されていない−１結合部位をベスト・フィットするように新しい糖単位を手動で動かす。その新しい糖単位を２つの存在するセルロトリオース単位に結合させるための結合を形成する。
３．オーバラップする結晶の水分子を削除する。これらを　Ｓｕｂｓｅｔ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｂｙ　Ａｔｏｍ　２．５コマンドを用いることにより同定する。
４．　８．０のｐＨで水素を構築し、荷電した末端を適用する。
【００４２】
５．　Ｒｅｓｉｄｕｅ　Ｒｅｐｌａｃｅ　＜Ｄ１２１　ｒｅｓｉｄｕｅ　ｎａｍｅ＞　ＡＳＰ　Ｌコマンドを用いてＤ１２１をプロトン化する。
６．コマンドＰｏｔｅｎｔｉａｌｓ　ＦｉｘによりＣＶＦＦフォースフィールドテンプレートを適用する。
７．その新しい糖単位を除く全ての原子を固定する。
８．全て分子メカニックスプログラム　Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　９５．０／３．０．１　（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　９５．０／３．０．０　Ｕｓｅｒ　Ｇｕｉｄｅ，　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９５．　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ：　Ｂｉｏｓｙｍ　／ＭＳＩ，　１９９５）を用いて、単純エネルギー最少化　３００サイクル、次に１ｆｓ単純分子ダイナミクス５０００ステップ、最後に単純エネルギー最少化　３００サイクルを用いて新しい糖単位の原子位置を弛緩させる。
【００４３】
セルラーゼの相同性構築
ヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼの周知のＸ線構造に基づく周知のアミノ酸配列のセルラーゼの構造モデルの作製は、以下のステップからなる：
１．モデル化すべき構造のコア領域の適切な範囲（ｅｘｔｅｎｄ）及び多くの周知の工業的に利用できるセルラーゼ配列間の多重配列アラインメントに基づくシステインのアラインメントを規定する。
２．新しい配列と周知のＸ線構造の配列との間の対式配列アラインメント
３．配列アラインメントに基づく構造的に保存されている領域（ＳＣＲ）　を規定する。
【００４４】
４．　ＳＣＲ内のモデル構造についての配置を指定する。
５．ループ構造データベース内のサーチにより　ＳＣＲ間のループ又は可変領域（ＶＲ）についての構造を見つけ出す。
６．そのデータベースサーチの結果からモデル構造中のＶＲについての配置を指定する。
７．ジスルフィド結合を形成し、プロトン化状態を設定する。
８．分子メカニクスを用いて構築した構造を精密化する。
【００４５】
ヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼの周知のＸ線構造は、以下において、標準構造と呼ぶ。モデル化すべき構造はモデル構造と呼ぶ。
Ａｄ１：酵素のコア部分の適切な範囲を、多くの周知のセルラーゼ配列を含む多重配列アラインメントにより決定する。標準構造は酵素のコア部分についての原子位置のみを含むので、標準構造のコア部分とアラインしたモデル化すべき配列中の残基のみがモデル構築に含まれ得る。このアラインメントは、システインのアラインメントも決定する。多重配列アラインメントは、上述のＰｉｌｅｕｐアルゴリズムを用いて行われる。
【００４６】
Ａｄ２：対式配列アラインメントを上述の通り行う。保存されているジスルフィド架橋及び／又は活性部位残基（Ｄ１０及びＤ１２１）中のシステインをアラインしないなら、保存されているジスルフィド架橋及び／又は活性部位残基中のシステインの強制対形成を用いる対式配列アラインメントを上述の通り行う。その配列アラインメントの主要な目的は、モデル構造形成のために用いるＳＣＲ（後述）を規定することである。
【００４７】
Ａｄ３：その配列アラインメントに基づき、構造的に保存された領域（ＳＣＲ）　を、挿入又は欠失のないオーバーラップする配列の連続領域として規定する。
Ａｄ４：コンピュータープログラムＨｏｍｏｌｏｇｙ　９５．０（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　Ｕｓｅｒ　Ｇｕｉｄｅ，　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９５．　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ：　Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳＩ，　１９９５）を用いて、モデル構造中の原子配置を、コマンド　Ａｓｓｉｇｎ　Ｃｏｏｒｄｓ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓを用いて標準構造の原子配置から作り出すことができる。
【００４８】
Ａｄ５：コンピュータープログラム　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　９５．０を用いて、可変領域（ＶＲ）と呼ぶ残りの領域についての可能なコンホメーションを、　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　９５．０に含まれるループ構造データベースにおけるサーチによって見つけ出す。この手順を各々のＶＲについて行う。
Ａｄ６：ＶＲの長さが６残基より少いなら、データベースサーチの結果における最初のループ構造を配置形成のために選択する。より長いループが形成される場合、きびしい原子のオーバーラップを有さないリストの中の最初の解を選択する。原子のオーバーラップの程度を、コンピュータープログラムＩｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ　９５．０（Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ　９５．０　Ｕｓｅｒ　Ｇｕｉｄｅ　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９５．　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ：　Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳＩ，　１９９５）におけるＢｕｍｐ　Ｍｏｎｉｔｏｒ　Ａｄｄ　Ｉｎｔｒａコマンドを用いて分析することができ、Ｂｕｍｐコマンドの０．２５のパラメータは、激しいオーバーラップを示すであろう。
【００４９】
挿入されたループ領域とタンパク質の残りの部分との間に１０を超える衝突が存在するなら、次の解をテストする。これらのパラメータで解が見い出せないなら、最も少ない衝突の解を選択する。ＶＲ領域の配置を、プログラム９５．０内のコマンド　Ａｓｓｉｇｎ　Ｃｏｏｒｄｓ　Ｌｏｏｐｓを用いて形成する。
【００５０】
Ａｄ７：ジスルフィド結合を、Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ　９５．０　のバイオポリマーモジュール内の　Ｂｏｎｄ　Ｃｒｅａｔｅコマンドを用いて作り、プロトン化状態を、　Ｈｙｄｒｏｇｅｎｓコマンドを用いて荷電したキャップでｐＨ　８．０に適合するよう設定する。最後に、活性プロトン供与体（標準構造内のＤ１２１に等価な残基）を、残基置換＜Ｄ１２１残基名＞　ＡＳＰＬコマンドを用いてプロトン化する。モデルのデータを仕上げるために、適切なフォースフィールドテンプレートを、コマンドＰｏｔｅｎｔｉａｌｓ　ＦｉｘによりＣＶＦＦフォースフィールドを用いて適用する。
【００５１】
Ａｄ８：最後に、モデル化した構造を、分子メカニクスプログラム　Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　９５．０／３．０．１　（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　９５．０／３．０．０　Ｕｓｅｒ　Ｇｕｉｄｅ，　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９５．　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ：　Ｂｉｏｓｙｍ　／ＭＳＩ，　１９９５）を用いる　５００サイクルエネルギー最小化にかける。上述の手順からの出力は、ヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼに対する配列相同性に基づく新しいセルラーゼのコアドメインについての構造モデルを記述する原子配置である。
【００５２】
セルラーゼ構造の重ねあわせ
２つのセルラーゼ構造を重ねるため、それら構造の重ねあわせを、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　９５．０（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　Ｕｓｅｒ　Ｇｕｉｄｅ，　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９５．　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ：　Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳＩ，　１９９５）の　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔコマンドを用いて行う。そのコマンドのための全てのパラメータをデフオルト値として選択する。
【００５３】
基質から３Å及び５Å内の残基の決定
基質から特定の距離以内のアミノ酸残基を決定するために、所定のセルラーゼ構造を、上述のヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶエンドグルカナーゼとセルロヘプタオースとの間の複合体のモデル構造のセルラーゼ部分に重ねあわせる。次に、基質の特定距離以内の残基を、Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ　９５．０（Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ　９５．０　Ｕｓｅｒ　Ｇｕｉｄｅ，　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９５．　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ：　Ｂｉｏｓｙｍ　／ＭＳＩ，　１９９５）を用いて見つけ出す。特定された距離はそのプログラムにパラメータとして供される。
【００５４】
この決定の結果を以下の第２表及び３に示す。
表面アクセスビリティーの決定
溶媒アクセスビリティーを決定するために、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　９５．０（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　Ｕｓｅｒ　Ｇｕｉｄｅ，　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９５；　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ：　Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳＩ，　１９９５）のＡｃｃｅｓｓ　Ｓｕｒｆコマンドを用いた。そのプログラムは、　Ｌｅｅ及びＲｉｃｈａｒｄｓ（Ｌｅｅ，　Ｂ．　＆　Ｒｉｃｈａｒｄｓ，　Ｆ．Ｍ．　”Ｔｈｅｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：　Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔａｔｉｃ　ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ”，　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　１９７１，　５５，　３７９−４００）　により提唱される定義を用いる。　１．４Åの溶媒プローブ半径を用い、重原子（即ち非水素原子）のみを計算に含めた。０アクセスビリティーの残基は埋もれているとして定義し、全ての他の残基を溶媒に露出した及び酵素構造の表面上として規定した。
【００５５】
セルラーゼ間の比活性の転移レベル
２つのセルラーゼの間の触媒活性のレベルを移すために、以下のプロトコルを上述の方法を用いて適用する。この方法は、比活性の差の原因であるアミノ酸残基を正確に指摘するであろう。そして１又は複数のこれらのアミノ酸残基は、比較セルラーゼから比活性のレベルを移すために１つの配列内で置換されなければならない：
【００５６】
１）（トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼを除く）全ての周知の工業的に役立つセルラーゼの多重配列アラインメントを行う。これから、２つの関連する配列の中の保存されたジスルフィド架橋を同定し、そしてヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼの配列を同定し、活性部位残基（Ｄ１０及びＤ１２１）を配置する；
【００５７】
２）ヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼコアドメイン（残基１−２０１）で、各々の配列の対式配列アラインメントを行う。保存されているジスルフィド架橋中のシステインが同じ位置にアラインされないなら及び／又は２つの活性部位残基（Ｄ１０及びＤ１２１）が同じ位置にアラインされないなら、強制対形成法でのセルラーゼの対式配列アラインメントを用いる。ヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼのコアドメイン（残基１〜２０１）とオーバーラップする配列内の残基のみを含める；
【００５８】
３）各々の配列の相同性で構築した構造を作り出す；
４）相同性構築構造の各々内の基質から３Å以内の残基の決定。これらの位置における配列間の差は、大部分、おそらく、比活性の差の原因となる残基であろう。挿入物内の残基が上述の距離内の配列のいずれかにおいて見い出される場合、その完全な挿入物は、比活性の差の原因であり得、そして完全な挿入物は、その挿入物のない配列に移されなければならず、又はその完全な挿入物はその挿入物を有する配列内で削除されなければならない；
【００５９】
５）基質の３Å以内の残基の置換により全ての比活性が保存されないなら、相同性構築構造の各々の中の基質から５Å以内の残基の決定は、残りの比活性の差の原因である最も可能性のある残基を示すであろう。挿入物内の残基が上述の距離以内の配列のいずれかにおいて見い出される場合、完全な挿入物は比活性の差の原因であり得、そしてその完全な挿入物は、その挿入物のない配列に移されなければならず、又はその完全な挿入物に挿入物のある配列内で削除されなければならない。
【００６０】
セルラーゼ間の陰イオン性界面活性剤に対する安定性のレベルの転移
２つのセルラーゼ間で陰イオン性界面活性剤に対する安定性のレベルを移すために、上述の方法を用いて以下のプロトコルを適用する。この方法は、陰イオン性界面活性剤に対する安定性のレベルの差の原因となるアミノ酸残基を正確に指摘するであろう。そして１又は複数のこれらのアミノ酸残基は、比較セルラーゼから比活性のレベルを移すために１つの配列内で置換されなければならない：
【００６１】
１）（トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼを除く）全ての周知の工業的に役立つセルラーゼの多重配列アラインメントを行う。これから、２つの関連する配列の中の保存されたジスルフィド架橋を同定し、そしてヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼの配列を同定し、活性部位残基（Ｄ１０及びＤ１２１）を配置する；
【００６２】
２）ヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼコアドメイン（残基１−２０１）で、各々の配列の対式配列アラインメントを行う。保存されているジスルフィド架橋中のシステインが同じ位置にアラインされないなら及び／又は２つの活性部位残基（Ｄ１０及びＤ１２１）が同じ位置にアラインされないなら、強制対形成法でのセルラーゼの対式配列アラインメントを用いる。ヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼのコアドメイン（残基１〜２０１）とオーバーラップする配列内の残基のみを含める；
【００６３】
３）各々の配列の相同性で構築した構造を作り出す；
４）酵素の表面に位置する残基の決定。これは、表面アクセスビリティーの計算により行う。　０．０Å２　より大きい表面アクセスビリティーの残基は表面に露出される；
【００６４】
５）次のアミノ酸の群：Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｋ，Ｒ及びＣに属する表面に露出されたいずれの残基も、２つの配列間で差のあるジスルフィド架橋に関連しないなら、大部分、おそらく、陰イオン性界面活性剤に対する安定性のレベルの差の原因であろう。挿入物中の残基が上述のアミノ酸型の群の中の配列のいずれかにおいて見い出される場合、完全な挿入物は陰イオン性界面活性剤に対する安定性のレベルの差の原因であり得、そして完全な挿入物がその挿入物のない配列に移されなければならず、又はその完全な配列が、その挿入物のある配列内で削除されなければならない。
【００６５】
ジスルフィド架橋
ジスルフィド架橋（即ち　Ｃｙｓ−Ｃｙｓ架橋）は酵素の構造を安定化する。酵素の正確な安定性を維持するために特定数の安定化ジスルフィド架橋が必要であると確信される。しかしながら、ジスルフィド架橋は、タンパク質構造から除去して、なお大きな活性を有するが、より安定でない、特に熱安定性の小さい酵素変異体を作り出すことができることも考えられる。
【００６６】
それゆえ、他の態様において、本発明は、次のジスルフィド架橋：Ｃ１１−Ｃ１３５；　Ｃ１２−Ｃ４７；　Ｃ１６−Ｃ８６；　Ｃ３１−Ｃ５６；　Ｃ８７−Ｃ１９９；　Ｃ８９−Ｃ１８９；　及びＣ１５６−１６７（セルラーゼナンバリング）の４又はそれ超を保持するセルラーゼ変異体を供する。より好ましい実施形態において、本発明の変異体は、次のジスルフィド架橋：Ｃ１１−Ｃ１３５；　Ｃ１２−Ｃ４７；　Ｃ１６−Ｃ８６；　Ｃ３１−Ｃ５６；　Ｃ８７−Ｃ１９９；　Ｃ８９−Ｃ１８９；　及び　Ｃ１５６−Ｃ１６７の５又はそれ超を保持する。その最も好ましい実施形態において、本発明の変異体は、次のジスルフィド架橋：Ｃ１１−Ｃ１３５；　Ｃ１２−Ｃ４７；　Ｃ１６−Ｃ８６；　Ｃ３１−Ｃ５６；　Ｃ８７−Ｃ１９９；　Ｃ８９−Ｃ１８９；　及びＣ１５６−Ｃ１６７（セルラーゼナンバリング）の６又はそれ超を保持する。
他の実施形態において、本発明は、システインが位置　１６，　８６，　８７，　８９，　１８９、及び／又は１９９（セルラーゼナンバリング）の１又は複数において他の天然のアミノ酸により置換されているセルラーゼ変異体を供する。
【００６７】
結合クレフト置換
更なる態様において、本発明は、基質結合クレフト内に位置した１又は複数のアミノ酸残基における置換、挿入及び／又は欠失により親セルラーゼから得られるセルラーゼ変異体を供する。基質に近い位置に導入された変異は、酵素−基質相互作用結合に影響を与える。
【００６８】
構造内の潜在的な基質と相互作用する残基を決定する適切な方法は、“シェル”内の構造を分割することである。そのシェルは次の通り規定される。即ち第１のシェルは基質と直接、相互作用する残基であり、即ち水素原子を両方とも含む、基質と残基との間の最も近接した内部原子の距離が、水素結合及び他の非結合的相互作用による全ての直接的相互作用を含むであろう　２．５Å未満である。次の（第２、第３等の）シェルは、基質に対して　２．５Å未満の内部原子の距離の残基又は全ての以前に決定されたシェルと同じ方法で規定される。この方法において、構造は、シェル内で分割されよう。プログラムＩｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ　９５．０（Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ　９５．０　Ｕｓｅｒ　Ｇｕｉｄｅ，　Ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９５．　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ：　Ｂｉｏｓｙｍ　／ＭＳＩ，　１９９５）におけるルーチン”ｓｕｂｓｅｔｚｏｎｅ”　を、シェルを決めるのに用いることができる。
【００６９】
好ましい実施形態において、本発明により考慮されるアミノ酸残基は、基質結合クレフト内の基質から５Åまでの距離に位置する。
アラインされたセルラーゼを上述のコンピューターモデリング法にかける場合、基質から５Åまでの距離内の次の位置：４，５，６，７，８，９，１０，　１１，　１２，　１３，　１４，　１５，　１６，　１８，　１９，　２０，　２１，　２１ａ，　４２，　４４，　４５，　４７，　４８，　４９，　４９ａ，　４９ｂ，　７４，　８２，　９５ｊ，　１１０，　１１１，　１１２，　１１３，　１１４，　１１５，　１１６，　１１９，　１２１，　１２３，　１２７，１２８，　１２９，　１３０，　１３１，　１３２，　１３２ａ，　１３３，　１４５，　１４６，　１４７，　１４８，　１４９，　１５０ｂ，　１７８　、及び／又は１７９（セルラーゼナンバリング）が示される（第２表）。
【００７０】
従って、より好ましい実施形態において、本発明は、これらのアミノ酸残基の１又は複数における置換、挿入及び／又は欠失により親セルラーゼから得られたセルラーゼ変異体を供する。特定の実施形態において、セルラーゼ変異体は、第２表において同定されたセルラーゼ（（ａ）ヒュミコラ・インソレンス；（ｂ）アクレモニウム種；（ｃ）ボルテルラ・コルレクトトリコイデス；（ｄ）ソルダリア・フィミコラ；（ｅ）チエラビア・テルレストリス；（ｆ）フサリウム・オキシスポルム；（ｇ）マイセリオフトラ・サーモフィラ；（ｈ）クリニペルリス・スカベルラ；（ｉ）マクロホミナ・ファセオリナ；（ｊ）シュードモナス・フルオレセンス；（ｋ）ウスチラゴ・マイジス）の１つから、これらのセルラーゼについて第２表において同定された位置の１又は複数における置換、挿入及び／又は欠失により得られる。
【００７１】
第２表
基質から５Å未満のアミノ酸残基
セルラーゼナンバリングにより同定された位置
（ａ）ヒュミコラ・インソレンス；（ｂ）アクレモニウム種；（ｃ）ボルテルラ・コルレクトトリコイデス；（ｄ）ソルダリア・フィミコラ；（ｅ）チエラビア・テルレストリス；（ｆ）フサリウム・オキシスポルム；（ｇ）マイセリオフトラ・サーモフィラ；（ｈ）クリニペルリス・スカベルラ；（ｉ）マクロホミナ・ファセオリナ；（ｊ）シュードモナス・フルオレセンス；（ｋ）ウスチラゴ・マイジス。
【００７２】
【表７】
2004065255.tif 000008
【００７３】
【表８】
2004065255.tif 000009
【００７４】
他の好ましい実施形態において、本発明により考慮されるアミノ酸残基は、基質から３Åまでの距離において基質結合クレフト内に位置する。
アラインしたセルラーゼを上述のコンピューターモデリング法にかけた時、基質から３Åまでの距離内に次の位置：６，７，８，１０，　１２，　１３，　１４，　１５，　１８，　２０，　２１，　４５，　４８，　７４，　１１０，　１１１，　１１２，　１１３，　１１４，　１１５，　１１９，　１２１，　１２７，　１２８，　１２９，１３０，　１３１，　１３２，　１３２ａ，　１４６，　１４７，　１４８，　１５０ｂ，　１７８、及び／又は１７９（セルラーゼナンバリング）（第３表）を示す。
【００７５】
従って、より好ましい実施形態において、本発明は、これらのアミノ酸残基の１又は複数における置換、挿入及び／又は欠失により親セルラーゼから得られたセルラーゼ変異体を供する。特定の実施形態において、セルラーゼ変異体は、第３表において同定されたセルラーゼ（（ａ）ヒュミコラ・インソレンス；（ｂ）アクレモニウム種；（ｃ）ボルテルラ・コルレクトトリコイデス；（ｄ）ソルダリア・フィミコラ；（ｅ）チエラビア・テルレストリス；（ｆ）フサリウム・オキシスポルム；（ｇ）マイセリオフトラ・サーモフィラ；（ｈ）クリニペルリス・スカベルラ；（ｉ）マクロホミナ・ファセオリナ；（ｊ）シュードモナス・フルオレセンス；（ｋ）ウスチラゴ・マイジス）の１つから、これらのセルラーゼについて第３表において同定された位置の１又は複数における置換、挿入及び／又は欠失により得られる。
【００７６】
第３表
基質から３Å未満のアミノ酸残基
セルラーゼナンバリングにより同定された位置
（ａ）ヒュミコラ・インソレンス；（ｂ）アクレモニウム種；（ｃ）ボルテルラ・コルレクトトリコイデス；（ｄ）ソルダリア・フィミコラ；（ｅ）チエラビア・テルレストリス；（ｆ）フサリウム・オキシスポルム；（ｇ）マイセリオフトラ・サーモフィラ；（ｈ）クリニペルリス・スカベルラ；（ｉ）マクロホミナ・ファセオリナ；（ｊ）シュードモナス・フルオレセンス；（ｋ）ウスチラゴ・マイジス。
【００７７】
【表９】
2004065255.tif 000010
【００７８】
部分的に保存されたアミノ酸残基
本明細書に定義される“部分的に保存されたアミノ酸残基”は、その位置について第１表に示される１１残基の７〜１０アミノ酸残基の間の位置（即ち６３％超）が同一である位置において第１表に従って同定されたアミノ酸残基である。
【００７９】
従って、本発明は、第１表において同定された１１残基のうちの７〜１０アミノ酸残基の間の位置が同一である第１表に従う１又は複数の位置においてアミノ酸残基が保存されたアミノ酸残基に変換されているセルラーゼ変異体を更に供する。好ましい実施形態において、本発明は、次の位置：１３，　１４，　１５，　２０，　２１，　２２，　２４，　２８，　３２，　３４，　４５，　４８，　５０，　５３，　５４，　６２，　６３，　６４，　６５，　６６，　６８，　６９，　７０，　７１，　７２，　７３，　７４，　７５，　７９，　８５，　８８，　９０，　９２，　９３，　９５，　９６，　９７，　９８，　９９，　１０４，　１０６，　１１０，　１１１，　１１３，　１１５，　１１６，　１１８，　１１９，　１３１，　１３４，　１３８，　１４０，　１４６，　１５２，　１５３，　１６３，１６６，　１６９，　１７０，　１７１，　１７２，　１７３，　１７４，　１７４，　１７７，　１７８，　１７９，　１８０，　１９３，　１９６　、及び／又は１９７（セルラーゼナンバリング）の１又は複数における置換、挿入及び／又は欠失により親セルラーゼから得られたセルラーゼ変異体を供する。
【００８０】
より好ましい実施形態において、本発明は、以下の第４表に同定される位置における１又は複数のアミノ酸残基を含むように、置換、挿入及び／又は欠失にかけられているセルラーゼ変異体を供する。第４表中の位置は、全て第１表においてアラインした配列中に実際に存在する結合クレフト中の基質の５Å以内に存在する“部分的に保存されたアミノ酸残基位置”及び保存されていない位置を反映する。
【００８１】
第４表
選択された置換、挿入及び／又は欠失
セルラーゼナンバリングにより同定された位置
【表１０】
2004065255.tif 000011
【００８２】
【表１１】
2004065255.tif 000012
【００８３】
更により好ましい実施形態において、本発明は、以下の第５表〜第６表に示される１又は複数のアミノ酸残基における置換、挿入及び／又は欠失により親セルラーゼから得られるセルラーゼ変異体を供する。そのセルラーゼ変異体は、示される位置において言及されるアミノ酸残基を保持するいずれかの親セルラーゼから得ることができる。特に、親セルラーゼは、ヒュミコラ・インソレンスセルラーゼ；アクレモニウム種セルラーゼ；ボルテルラ・コルレクトトリコイデスセルラーゼ；ソルダリア・フィミコラセルラーゼ；チエラビア・テルレストリスセルラーゼ；フサリウム・オキシスポルムセルラーゼ；マイセリオフトラ・サーモフィラセルラーゼ；クリニペルリス・スカベルラセルラーゼ；マクロホミナ・ファセオリナセルラーゼ；シュードモナス・フルオレセンスセルラーゼ；又はウスチラゴ・マイジスセルラーゼであり得る。
【００８４】
更に、そのセルラーゼ変異体は、特に、第５表〜第６表にも示されるように、
１．増加した触媒活性として定義される改良された能力；
２．陰イオン性界面活性剤に対する変化したセンシティビティー；及び／又は
３．変化したｐＨ至適性
に関して改良された能力を有することを特徴とし得る。第５表に列記される位置は、第１表においてアラインされた異なるセルラーゼ間の特性の転移を反映する。第６表に列記される位置は、ヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶからの第１表においてアラインされた他のセルラーゼへの特性の転移を反映する。
【００８５】
第５表
好ましいセルラーゼ変異体
セルラーゼナンバリングにより同定された位置
【００８６】
【表１２】
2004065255.tif 000013
【００８７】
【表１３】
2004065255.tif 000014
【００８８】
【表１４】
2004065255.tif 000015
【００８９】
第６表
好ましいセルラーゼ変異体
セルラーゼナンバリングにより同定された位置
【表１５】
2004065255.tif 000016
【００９０】
【表１６】
2004065255.tif 000017
【００９１】
【表１７】
2004065255.tif 000018
【００９２】
陰イオン界面活性剤に対する変化したセンシティビティー
上述の通り、陰イオン性界面活性剤は、界面活性組成物に頻繁に組み込まれる製品である。時々、陰イオン性界面活性剤に対する安定性の増加を有するセルロース分解酵素が要求され、そして時に、センシティビティーの増加したセルロース分解酵素が好まれる。更なる態様において、本発明は、変化した陰イオン性界面活性剤センシティビティーのセルラーゼ変異体を供する。
【００９３】
従って、変化した陰イオン性界面活性剤センシティビティーの本発明のセルラーゼ変異体は、次の位置：２，４，７，８，１０，　１３，　１５，　１９，　２０，　２１，　２５，　２６，　２９，　３２，　３３，　３４，　３５，　３７，　４０，　４２，　４２ａ，　４３，　４４，　４８，　５３，　５４，　５５，　５８，　５９，　６３，　６４，　６５，　６６，　６７，　７０，　７２，　７６，　７９，　８０，　８２，　８４，　８６，　８８，　９０，　９１，　９３，　９５，　９５ｄ，　９５ｈ，　９５ｊ，　９７，　１００，　１０１，　１０２，　１０３，　１１３，　１１４，　１１７，　１１９，　１２１，　１３３，　１３６，　１３７，　１３８，　１３９，　１４０ａ，　１４１，　１４３ａ，　１４５，　１４６，　１４７，　１５０ｅ，　１５０ｊ，　１５１，　１５２，　１５３，　１５４，　１５５，　１５６，　１５７，　１５８，　１５９，　１６０ｃ，　１６０ｅ，　１６０ｋ，　１６１，　１６２，　１６４，　１６５，１６８，　１７０，　１７１，　１７２，　１７３，　１７５，　１７６，　１７８，　１８１，　１８３，　１８４，　１８５，　１８６，　１８８，　１９１，　１９２，　１９５，　１９６，　２００、及び／又は２０１（セルラーゼナンバリング）の１又は複数における置換、挿入及び／又は欠失により親セルラーゼから得られたセルラーゼ変異体である。これらの位置は、第１表においてアラインされたセルラーゼ配列の少くとも１つの中に、荷電した又は潜在的に荷電したａａ残基を含む。
【００９４】
特定の実施形態において、そのセルラーゼ変異体は、以下の第７表において同定されたセルラーゼ（（ａ）ヒュミコラ・インソレンス；（ｂ）アクレモニウム種；（ｃ）ボルテルラ・コルレクトトリコイデス；（ｄ）ソルダリア・フィミコラ；（ｅ）チエラビア・テルレストリス；（ｆ）フサリウム・オキシスポルム；（ｇ）マイセリオフトラ・サーモフィラ；（ｈ）クリニペルリス・スカベルラ；（ｉ）マクロホミナ・ファセオリナ；（ｊ）シュードモナス・フルオレセンス；（ｋ）ウスチラゴ・マイジス）の１つから、これらのセルラーゼについて第７表において同定された位置の１又は複数における置換、挿入及び／又は欠失により得られる。
【００９５】
第７表
陰イオン性界面活性剤に対する変化したセンシティビティー
セルラーゼナンバリングにより同定した位置
（ａ）ヒュミコラ・インソレンス；（ｂ）アクレモニウム種；（ｃ）ボルテルラ・コルレクトトリコイデス；（ｄ）ソルダリア・フィミコラ；（ｅ）チエラビア・テルレストリス；（ｆ）フサリウム・オキシスポルム；（ｇ）マイセリオフトラ・サーモフィラ；（ｈ）クリニペルリス・スカベルラ；（ｉ）マクロホミナ・ファセオリナ；（ｊ）シュードモナス・フルオレセンス；（ｋ）ウスチラゴ・マイジス。
【００９６】
【表１８】
2004065255.tif 000019
【００９７】
【表１９】
2004065255.tif 000020
【００９８】
【表２０】
2004065255.tif 000021
【００９９】
酵素組成物
なお更なる態様において、本発明は、上述のようなセルロース分解活性を示す酵素を含む酵素組成物に関する。
本発明の酵素組成物は、本発明のセルラーゼに加えて、１又は複数の他の酵素型、例えばヘミセルラーゼ、例えばキシラナーゼ及びマンナナーゼ、他のセルラーゼ成分、キチナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、パクチンメチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、又はアミラーゼを含む。
【０１００】
本酵素組成物は、当該技術で周知の方法に従って調製することができ、液体又は乾燥組成物の形態であり得る。例えば、本酵素組成物は、粒子又は微粒子の形態であり得る。その組成物内に含まれる酵素は、当該技術で周知の方法に従って安定化することができる。
本発明の酵素組成物の好ましい使用の例を以下に示す。本発明の酵素組成物の投与量及びその組成物を用いる他の条件は、当該技術で周知の方法に基づいて決定することができる。
【０１０１】
本発明による酵素組成物は、以下の目的の少くとも１つのために役立ち得る。
使　用
洗浄及び着用の間、染色した布帛又は衣類からの染料は、慣用的には、それら布帛から流れ出て、色あせてかつ使い古して見えるであろう。布帛からの表面繊維の除去は、部分的にもとの色及び布帛の外観を回復するであろう。本明細書に用いる用語“色浄化”とは、多数の洗浄サイクルによる布帛又は衣類の最初の色の部分的回復を意味する。
【０１０２】
用語“脱ピリング”とは、布帛表面からの毛玉（ｐｉｌｌｓ）　の除去をいう。
用語“浸漬液”とは、慣用的な洗浄工程にかける前に洗濯物を浸漬させ得る水性の液体をいう。浸漬液は、洗浄又は洗濯工程に慣用的に用いられる１又は複数の成分を含み得る。
用語“洗浄液”とは、洗濯物が洗浄工程、即ち通常、手で又は洗濯機での化学的及び機械的作用との組み合わせにおける水性の液体をいう。慣用的には、洗浄液は、粉末又は液体界面活性組成物の水溶液である。
【０１０３】
用語“すすぎ液”とは、洗濯物をすすぐため、本質的にはその洗濯物から界面活性剤を除去するために、慣用的には洗浄工程にかけた直後に、洗濯物を浸漬し、処理する水性の液体をいう。すすぎ液は、布帛コンディショニング又は軟化組成物を含み得る。
【０１０４】
本発明の方法にかける洗濯物は、慣用的な洗浄可能な洗濯物であり得る。好ましくは、洗濯物の大部分は、綿、綿混合物又は天然のもしくは人工のセルロース物（例えばキシラン含有セルロース布帛、例えば木材パルプから得られるもの）又はそれらの混合物から作られた、ニット、編み物、デニム、織り物、ヤーン、及びタオル地のものを含む縫った又は縫っていない布帛である。混合物の例は、綿又はレーヨン／ビスコースの、１又は複数のコンパニオン材料、例えばウール、合成繊維（例えばポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリビニルクロライド繊維、ポリビニリデンクロライド繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）、及びセルロース含有布帛（例えばレーヨン／ビスコース、ラミー、アマ／リネン、ジュート、セルロースアセテート繊維、リオセル（ｌｙｏｃｅｌｌ））　との混合物である。
【０１０５】
界面活性剤の開示及び例
界面活性システム
本発明による界面活性組成物は、その界面活性剤が非イオン性及び／又は陰イオン性及び／又は陽イオン性及び／又は両性及び／又は双性イオン性及び／又は半極性界面活性剤から選択することができる界面活性システムを含む。
界面活性剤は、典型的には、　０．１重量％〜６０重量％のレベルで存在する。
【０１０６】
界面活性剤は、好ましくは、その組成物中に存在する酵素成分と適合するように調剤される。液体又はゲル組成物において、界面活性剤は、最も好ましくは、それがこれらの組成物中のいずれの酵素の安定性も促進し、又は少くとも分解しないように調剤される。
本発明に従って用いられる好ましいシステムは、界面活性剤として、１又は複数の本明細書に記載される非イオン性及び／又は陰イオン性界面活性剤を含む。
【０１０７】
ポリエチレン、ポリプロピレン、及びアルキルフェノール類のポリブチレンオキシド縮合物が、本発明の界面活性システムの非イオン性界面活性剤として用いるのに適するが、ポリエチレンオキシド縮合物が好ましい。これらの化合物は、アルキレンオキシドとの、直鎖又は分枝鎖型の、約６〜約１４炭素原子、好ましくは、約８〜約１４炭素原子を有するアルキルフェノール類の縮合産物を含む。好ましい実施形態において、エチレンオキシドは、アルキルフェノール１分子当り、約２〜約２５分子、より好ましくは約３〜約１５分子のエチレンオキシドに等しい量で存在する。この型の商業的に利用できる非イオン性界面活性剤は、　ＧＡＦ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより市販される　ＩｇｅｐａｌＴＭ　ＣＯ−６３０；及び全て　Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ　Ｃｏｍｐａｎｙにより市販される　ＴｒｉｔｏｎＴＭ　Ｘ−４５，　Ｘ−１１４，　Ｘ−１００及び　Ｘ−１０２を含む。これらの界面活性剤は、一般に、アルキルフェノールアルコキシレート（例えばアルキルフェノールエトキシレート）と呼ばれる。
【０１０８】
約１〜約２５分子のエチレンオキシドを有する第１級及び第２級脂肪族アルコールの縮合産物は、本発明の非イオン性界面活性システムの非イオン性界面活性剤として用いるのに適する。脂肪族アルコールのアルキル鎖は、直鎖又は分枝鎖の第１級又は第２級であり得、一般に、約８〜約２２の炭素原子を含む。アルコール１分子当り約２〜約１０分子のエチレンオキシドを伴う約８〜約２０炭素原子、より好ましくは約１０〜約１８炭素原子を含むアルキル基を有するアルコールの縮合産物が好ましい。アルコール１分子当り約２〜約７分子のエチレンオキシド、最も好ましくは約２〜５分子のエチレンオキシドが前記縮合産物中に存在する。
【０１０９】
この型の市販の非イオン性界面活性剤の例は、両方とも　Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより市販される、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ　１５−Ｓ−９（９モルのエチレンオキシドとのＣ１１−Ｃ１５直鎖アルコールの縮合産物）、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ　２４−Ｌ−６　ＮＭＷ（せまい分子量分布の６モルのエチレンオキシドとのＣ１２−Ｃ１４第１級アルコールの縮合産物）；Ｓｈｅｌｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙにより市販される、ＮｅｏｄｏｌＴＭ　４５−９（９モルのエチレンオキシドとのＣ１４−Ｃ１５直鎖アルコールの縮合産物）、ＮｅｏｄｏｌＴＭ　２３−３　（３．０モルのエチレンオキシドとのＣ１２−Ｃ１３直鎖アルコールの縮合産物）、ＮｅｏｄｏｌＴＭ　４５−７（７モルのエチレンオキシドとのＣ１４−Ｃ１５直鎖アルコールの縮合産物）、ＮｅｏｄｏｌＴＭ　４５−５（５モルのエチレンオキシドとのＣ１４−Ｃ１５直鎖アルコールの縮合産物）、Ｐｒｏｃｔｅｒ　＆　Ｇａｍｂｌｅ　Ｃｏｍｐａｎｙにより市販されるＫｙｒｏＴＭ　ＥＯＢ（９モルのエチレンオキシドとのＣ１３−Ｃ１５アルコールの縮合産物）、及び　Ｈｏｅｃｈｓｔにより市販されるＧｅｎａｐｏｌ　ＬＡ　０５０（５モルのエチレンオキシドとのＣ１２−Ｃ１４アルコールの縮合産物）を含む。これらの製品における　ＨＬＢの好ましい範囲は、８〜１１、最も好ましくは８〜１０である。
【０１１０】
また、本発明の界面活性システムの非イオン性界面活性剤としては、約６〜約３０炭素原子、好ましくは、約１０〜約１６炭素原子を含む疎水性基を有するＵＳ　４，５６５，６４７に開示されるアルキルポリサッカライド並びに約　１．３〜約１０、好ましくは約１．３〜約３、最も好ましくは約　１．３〜約　２．７のサッカライド単位を含む親水性基を有するポリサッカライド、例えばポリグリコシドも役立つ。５又は６炭素原子を含むいずれかの還元サッカライド、例えばグルコース、ガラクトース及びガラクトシル成分が、グリコシル成分のかわりに置換することができる（任意に、疎水性基は、２−，３−，４−、等位に結合させることができ、これによりグルコシド又はガラクトシドに対してグルコース又はガラクトースを供する）。サッカライド間の結合は、例えば、次のサッカライド単位の１つの位置と先のサッカライド単位上の２−，３−，４−、及び／又は６−位置との間であり得る。
【０１１１】
好ましいアルキルポリグリコシド類は、式　Ｒ２Ｏ（ＣｎＨ２ｎＯ）ｔ（グリコシル）ｘ
（式中、Ｒ２は、アルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル、及びそれらの混合物からなる群から選択され、ここでアルキル基は、約１０〜約１８、好ましくは約１２〜約１４の炭素原子を含み；ｎは２又は３、好ましくは２であり；ｔは０〜１０、好ましくは０であり；そしてｘは約　１．３〜約１０、好ましくは約　１．３〜約３、最も好ましくは約　１．３〜約　２．７である）
を有する。グリコシルは、好ましくは、グルコースから得られる。これらの化合物を調製するために、アルコール又はアルキルポリエトキシアルコールが最初に形成され、そして次にグルコース又はグルコースのソースと反応してグリコシド（１−位に結合したもの）を形成する次に、次のグルコシル単位は、それらの１−位と、先行するグリコシル単位２−，３−，４−、及び／又は６−位、好ましくは主に２−位と、の間に結合することができる。
【０１１２】
プロピレンオキシドのプロピレングリコールとの縮合により形成された疎水性塩基とのエチレンオキシドの縮合産物も、本発明の更なる非イオン性界面活性システムとして用いるのに適する。これらの化合物の疎水性部分は、好ましくは、約１５００〜約１８００の分子量を有するであろう。そして水不溶性を示すであろう。この疎水性部分へのポリオキシエチレン成分の添加は、全体としてその分子の水溶性を増加させる傾向があり、そしてその産物の液体特性は、ポリオキシエチレン成分が、約４０モルまでのエチレンオキシドとの縮合に相当する縮合産物の全重量の約５０％である点まで保持される。この型の化合物の例は、ＢＡＳＦにより市販される市販のＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ界面活性剤を含む。
【０１１３】
本発明の非イオン性界面活性システムの非イオン性界面活性剤として用いるために適するのは、ポリエチレンオキシドとエチレンジアミンとの反応から生ずる産物とのエチレンオキシドの縮合産物でもある。これらの産物の疎水性成分は、エチレンジアミン及び過剰なプロピレンオキシドの反応生成物からなり、一般に、約２５００〜約３０００の分子量を有する。この疎水性成分は、その縮合産物が約４０重量％〜約８０重量％のポリオキシエチレンを含み約　５，０００〜約１１，０００の分子量を有する程度まで、エチレンオキシドと縮合される。この型の非イオン性界面活性剤の例は、ＢＡＳＦにより市販されるＴｅｔｒｏｎｉｃＴＭ化合物を含む。
【０１１４】
アルキルフェノール類のポリエチレンオキシド縮合物、約１〜約２５分子のエチレンオキシドを有する第１級及び第２級脂肪族アルコールの縮合産物、アルキルポリサッカライド、及びそれらの混合物を本発明の界面活性システムの非イオン性界面活性剤として用いるために好ましい。最も好ましいのは、３〜１５のエトキシ基を有するＣ８−Ｃ１４アルキルフェノールエトキシレート及び２〜１０のエトキシ基を有するＣ８−Ｃ１８アルコールエトキシレート（好ましくは平均Ｃ１０）、並びにそれらの混合物である。
【０１１５】
極めて好ましい非イオン性界面活性剤は、式：
【化１】
2004065255.tif 000022
【０１１６】
（式中、Ｒ１はＨであるか、又はＲ１はヒドロカルビル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル又はそれらの混合物であり、Ｒ２はＣ５−３１ヒドロカルビルであり、Ｚは、鎖に直接、連結した少くとも３のヒドロキシルを有する直鎖ヒドロカルビル鎖、又はそのアルコキシル化誘導体である）のポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤である。好ましくは、Ｒ１はメチルであり、Ｒ２は直鎖Ｃ１１−１５アルキル又はＣ１６−１８アルキルもしくはアルケニル鎖、例えばココナッツアルキル又はそれらの混合物であり、Ｚは還元糖、例えばグルコース、フルクトース、マルトース又はラクトースから、還元的アミノ化反応において得られる。
【０１１７】
極めて好ましい陰イオン性界面活性剤は、アルキルアルコキシル硫酸界面活性剤を含む。その例は、式ＲＯ（Ａ）ｍＳＯ３Ｍ（式中、ＲはＣ１０−Ｃ２４アルキル成分、好ましくはＣ１２−Ｃ２０アルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはＣ１２−Ｃ１８アルキル又はヒドロキシアルキルを有する置換されていないＣ１０−Ｃ２４アルキル又はヒドロキシアルキル基であり、Ａはエトキシ又はプロポキシ単位であり、ｍは０より大きく、典型的には約　０．５〜約６の間、より好ましくは約　０．５〜約３の間であり、ＭはＨ又はカチオン、例えば金属陽イオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム等）、アンモニウム又は置換化アンモニウムカチオンである）の水溶性の塩又は酸である。
【０１１８】
アルキルエトキシ化スルフェート及びアルキルプロポキシ化スルフェートが本明細書において考慮される。置換化アンモニウムカチオンの特定の例は、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオン及び第４アンモニウムカチオン、例えばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペリジニウムカチオン並びにアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、それらの混合物等から得られるものを含む。
【０１１９】
典型的な界面活性剤は、Ｃ１２−Ｃ１８アルキルポリエトキシレート（１．０）　スルフェート（Ｃ１２−Ｃ１８Ｅ（１．０）Ｍ）、Ｃ１２−Ｃ１８アルキルポリエトキシレート（２．２５）スルフェート（Ｃ１２−Ｃ１８（２．２５）Ｍ）、Ｃ１２−Ｃ１８アルキルポリエトキシレート（３．０）　スルフェート（Ｃ１２−Ｃ１８Ｅ（３．０）Ｍ）、及びＣ１２−Ｃ１８アルキルポリエトキシレート（４．０）　スルフェート（Ｃ１２−Ｃ１８Ｅ（４．０）Ｍ）であり、ここでＭは、慣用的には、ナトリウム及びカリウムから選択される。
【０１２０】
用いるのに適した陰イオン性界面活性剤は、“Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ　Ｓｏｃｉｅｔｙ”，　５２　（１９７５），　ｐｐ．３２３−３２９に従って気体の　ＳＯ３でスルホン化されたＣ８−Ｃ２０カルボン酸（即ち脂肪酸）の直鎖エステルを含むアルキルエステルスルホネート界面活性剤である。適切な出発材料は、獣脂、パーム油等から得られる天然の脂肪物質を含むであろう。
【０１２１】
特に、洗濯に適用するための、好ましいアルキルエステルスルホネート界面活性剤は、構造式：
【化２】
2004065255.tif 000023
【０１２２】
（式中、Ｒ３はＣ８−Ｃ２０ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれらの組合せであり、Ｒ４はＣ１−Ｃ６ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれらの組合せであり、Ｍはアルキルエステルスルホネートと共に水溶性の塩を形成するカチオンである）のアルキルエステルスルホネート界面活性剤を含む。適切な塩形成性カチオンは、金属、例えばナトリウム、カリウム、及びリチウム等、並びに置換化又は非置換化アンモニウムカチオン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンを含む。好ましくは、Ｒ３はＣ１０−Ｃ１６アルキルであり、Ｒ４は、メチル、エチル又はイソプロピルである。特に好ましいのは、Ｒ３がＣ１０−Ｃ１６アルキルであるメチルエステルスルホネートである。
【０１２３】
他の適切な陰イオン性界面活性剤は、式ＲＯＳＯ３Ｍ（式中、Ｒは、好ましくはＣ１０−Ｃ２４ヒドロカルビル、好ましくはＣ１０−Ｃ２０アルキル成分を有するアルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましはＣ１２−Ｃ１８アルキル又はヒドロキシアルキルであり、ＭはＨ又はカチオン、例えばアルカリ金属カチオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム）、又はアンモニウムもしくは置換化アンモニウム（例えば、メチル−、ジメチル−、及びトリメチルアンモニウムカチオン及び第４アンモニウムカチオン、例えばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペルジニウムカチオン並びにアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、及びそれらの混合物から得られた第４アンモニウムカチオン等）である）の水溶性塩又は酸であるアルキルスルフェート界面活性剤を含む。典型的には、Ｃ１２−Ｃ１６のアルキル鎖は、低い洗浄温度（例えば約５０℃未満）のために好ましく、Ｃ１６−Ｃ１８アルキル鎖は高い洗浄温度（例えば約５０℃超）のために好ましい。
【０１２４】
界面活性目的のために役立つ他の陰イオン性界面活性剤も本発明の洗濯用界面活性組成物に含めることができる。これらは、セッケンの塩（例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、及び置換化アンモニウム塩、例えばモノ−、ジ−及びトリエタノールアミン塩）、Ｃ８−Ｃ２２第１級又は第２級アルカンスルホネート、Ｃ８−Ｃ２４オレフィンスルホネート、例えば英国特許明細書第　１，０８２，１７９号に記載されるようにアルカリ土類金属クエン酸塩の熱分解産物のスルホン化により調製されるスルホン化ポリカルボン酸、Ｃ８−Ｃ２４アルキルポリグリコールエーテルスルフェート（１０分子までのエチレンオキシドを含むもの）；アルキルグリセロールスルホネート、脂肪酸グリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールスルフェート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルフェート、パラフィンスルホネート、アルキルホスフェート、イセチオネート、例えばアシルイセチオネート、Ｎ−アシルタウレート、アルキルスクシナメート及びスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に飽和及び不飽和Ｃ１２−Ｃ１８モノエステル）及びスルホスクシネートのジエステル（特に飽和及び不飽和Ｃ６−Ｃ１２ジエステル）、アシルサルコシネート、アルキルポリサッカライドのスルフェート、例えばアルキルポリグルコシドのスルフェート（非イオン性非硫酸化化合物は以下に記述される）、分枝した第１級アルキルスルフェート、及びアルキルポリエトキシカルボキシレート、例えば式ＲＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋ−ＣＨ２ＣＯＯ−Ｍ＋（式中、ＲはＣ８−Ｃ２２アルキルであり、ｋは１〜１０の整数であり、Ｍは可溶性塩形成性カチオンである）のものを含み得る。樹脂酸並びに水素化樹脂酸、例えばロジン、水素化ロジン、並びにトールオイル中に存在する又はそれから得られる樹脂酸及び水素化樹脂酸も適切である。
【０１２５】
アルキルベンゼンスルホネートが極めて好ましい。特に好ましいのは、そのアルキル基が好ましくは１０〜１８の炭素原子を含む直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）　である。
更なる例は、“Ｓｕｒｆａｃｅ　Ａｃｔｉｖｅ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ”（Ｖｏｌ．Ｉ及びＩＩ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，　Ｐｅｒｒｙ　ａｎｄ　Ｂｅｒｃｈ）に記載される。種々のこのような界面活性剤は、ＵＳ　３，９２９，６７８（引用により本明細書に組み込まれる；コラム２３、５８行〜コラム２９、２３行）にも一般に開示される。
【０１２６】
その中に含まれる場合、本発明の洗濯用界面活性組成物は、典型的には、約１重量％〜約４０重量％、好ましくは約３重量％〜約２０重量％のこれらの陰イオン性界面活性剤を含む。
本発明の洗濯用界面活性組成物は、陽イオン性、両性、双性イオン性及び半極性界面活性剤、並びに非イオン性及び／又は既に本明細書に記載したもの以外の陽イオン性界面活性剤も含み得る。
【０１２７】
本発明の洗濯用界面活性組成物に用いるために適した陽イオン性界面活性剤は、１つの長鎖ヒドロカルビル基を有するものである。このような陽イオン性界面活性剤の例は、アンモニウム界面活性剤、例えばアルキルトリメチルアンモニウムハロゲン化物、及び、式：
〔Ｒ２（ＯＲ３）ｙ〕〔Ｒ４（ＯＲ３）ｙ〕２Ｒ５Ｎ＋Ｘ−
【０１２８】
（式中、Ｒ２はアルキル鎖中に約８〜約１８の炭素原子を有するアルキル又はアルキルベンジル基であり、各々のＲ３は、−ＣＨ２ＣＨ２−，　−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−，　−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−，　−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２　−、及びそれらの混合物であり；各々のＲ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４ヒドロキシアルキル、２つのＲ４基を連結することにより形成されるベンジル環構造、−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨＯＨＣＯＲ６ＣＨＯＨＣＨ２ＯＨ（式中、Ｒ６はヘキソース又は約１０００未満の分子量を有するヘキソースポリマーのいずれかである）、及びｙが０でないなら水素からなる群から選択され；Ｒ５はＲ４と同じであるか、又はアルキル鎖であり、ここで炭素原子の総数又はＲ２＋Ｒ５は約１８以下であり；各々のｙは０〜約１０であり、ｙの値の合計は０〜約１５であり；Ｘはいずれかの適合可能なアニオンである）
を有する界面活性剤を含む。
【０１２９】
極めて好ましい陽イオン性界面活性剤は、式：
Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｎ＋Ｘ−　　　　　　　　　　　（ｉ）
（式中、Ｒ１はＣ８−Ｃ１６アルキルであり、Ｒ２，Ｒ３及びＲ４の各々は独立して、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４ヒドロキシアルキル、ベンジル、及び−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｘＨ（ここで、ｘは２〜５の値を有する）であり、Ｘはアニオンである）を有する本組成物に役立つ水溶性第４アンモニウム化合物である。Ｒ２，Ｒ３又はＲ４の１超がベンジルであるべきではない。
【０１３０】
Ｒ１のための好ましいアルキル鎖長は、特にアルキル基がココナッツもしくはパーム仁脂肪から得られ又はオレフィン構築もしくは　ＯＸＯアルコール合成により合成して得られる場合、Ｃ１２−Ｃ１５である。
Ｒ２Ｒ３及びＲ４のための好ましい基はメチル及びヒドロキシエチル基であり、アニオンＸは、ハライド、メトスルフェート、アセテート及びホスフェートイオンから選択することができる。
【０１３１】
ここで用いるための式（ｉ）の適切な第４アンモニウム化合物の例は：
ココナツトリメチルアンモニウムクロライド又はブロミド；
ココナツメチルジヒドロキシエチルアンモニウムクロライド又はブロミド；
デシルトリエチルアンモニウムクロライド；
デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロライド又はブロミド；
Ｃ１２−１５ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロライド又はブロミド；
ココナツジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロライド又はブロミド；
ミリスチルトリメチルアンモニウムメチルスルフェート；
ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド又はブロミド；
ラウリルジメチル（エトキシ）４アンモニウムクロライド又はブロミド；
コリンエステル（Ｒ１が
【０１３２】
【化３】
2004065255.tif 000024
【０１３３】
でありＲ２Ｒ３Ｒ４がメチルである式（ｉ）の化合物）；
ジ−アルキルイミダゾリン（式（ｉ）の化合物）
である。
ここで役立つ他の陽イオン性界面活性剤は、ＵＳ　４，２２８，０４４及びＥＰ　０００　２２４にも記載される。
中に含まれるなら、本発明の洗濯用界面活性組成物は、典型的には、　０．２重量％〜約２５重量％、好ましくは約１重量％〜約８重量％のこれらの陽イオン性界面活性剤を含む。
【０１３４】
両性界面活性剤も本発明の洗濯用界面活性組成物に用いるのに適している。これらの界面活性剤は、第２級又は第３級アミンの脂肪族誘導体、又はヘテロ環式第２級及び第３級アミンの脂肪族誘導体として広く開示されており、ここでその脂肪族基は、直鎖又は分枝鎖であり得る。脂肪族置換基の１つは少くとも約８の炭素原子、典型的には約８〜約１８の炭素原子を含み、そして少くとも１つは陰イオン性水可溶化基、例えばカルボキシ、スルホネート、スルフェートを含む。両性界面活性剤の例についてはＵＳ　３，９２９，６７８（コラム１９、１８−３５行）を参照のこと。
【０１３５】
中に含まれるなら、本発明の洗濯用界面活性組成物は、典型的には、　０．２重量％〜約１５重量％、好ましくは約１重量％〜約１０重量％のこれらの両性界面活性剤を含む。
双性イオン性界面活性剤も、洗濯用界面活性組成物に用いるのに適切である。これらの界面活性剤は、第２級及び第３級アミンの誘導体、ヘテロ環式第２級及び第３級アミンの誘導体、又は第４級アンモニウム、第４級ホスホニウムもしくは第３級スルホニウム化合物の誘導体として広く開示されている。双性イオン性界面活性剤の例についてはＵＳ　３，９２９，６７８（コラム１９、３８行〜コラム２２、４８行）を参照のこと。
【０１３６】
中に含まれるなら、本発明の洗濯用界面活性組成物は、典型的には、　０．２重量％〜約１５重量、好ましくは約１重量％〜約１０重量％のこのような双性イオン性界面活性剤を含む。
半極性非イオン性界面活性剤は、約１０〜約１８炭素原子の１つのアルキル成分、並びに約１〜約３炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基からなる群から選択される２つの成分を含む水溶性アミンオキシド；約１０〜約１８炭素原子の１つのアルキル成分並びに約１〜約３炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基からなる群から選択される２つの成分を含む水溶性ホスフィンオキシド；並びに約１０〜約１８炭素原子の１つのアルキル成分並びに約１〜約３炭素原子のアルキル及びヒドロキシアルキル成分からなる群から選択される１つの成分を含む水溶性スルホキシドを含む非イオン性界面活性剤の特別のカテゴリーである。
【０１３７】
半極性非イオン性界面活性剤は、式：
【化４】
2004065255.tif 000025
【０１３８】
（式中、Ｒ３は、約８〜約２２炭素原子を含むアルキル、ヒドロキシアルキル、もしくはアルキルフェニル基又はそれらの混合物であり；Ｒ４は、約２〜約３炭素原子を含むアルキレンもしくはヒドロキシアルキレン基、又はそれらの混合物であり；ｘは０〜約３であり；各々のＲ５は約１〜約３炭素原子を含むアルキルもしくはヒドロキシアルキル基又は約１〜約３のエチレンオキシド基を含むポリエチレンオキシド基である）を有するアミンオキシド界面活性剤を含む。Ｒ５基は、例えば酸素又は窒素原子により互いに結合させて還構造を形成することができる。
【０１３９】
これらのアミンオキシド界面活性剤は、特に、Ｃ１０−Ｃ１８アルキルジメチルアミンオキシド及びＣ８−Ｃ１２アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミンオキシドを含む。
中に含まれるなら、本発明の洗濯用界面活性組成物は、典型的には、　０．２重量％〜約１５重量％、好ましくは約１重量％〜約１０重量％のこのような半極性非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４０】
ビルダーシステム
本発明による組成物は、ビルダーシステムを更に含み得る。アルミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレート及び脂肪酸、エチレンジアミンテトラアセテートのような材料、金属イオン封鎖剤、例えばアミノポリホスホネート、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸及びジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸を含むいずれかの慣用的なビルダーシステムが本明細書に用いるのに適切である。明らかな環境的理由のためあまり好ましくはないが、ホスフェートビルダーも本明細書に用いることができる。
【０１４１】
適切なビルダーは、無機イオン交換材料、一般に無機水和アルミノシリケート材料、より好ましくは水和合成ゼオライト、例えば水和ゼオライトＡ，Ｘ，Ｂ，ＨＳ又は　ＭＡＰであり得る。
他の適切な無機ビルダー材料は、層状シリケート、例えばＳＫＳ−６　（Ｈｏｅｃｈｓｔ）　である。　ＳＫＳ−６はケイ酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５）からなる結晶性層状シリケートである。
【０１４２】
１つのカルボキシ基を含む適切なポリカルボキシレートは、ベルギー特許第　８３１，３６８号、　８２１，３６９号及び　８２１，３７０号に開示されるような乳酸、グリコール酸及びそれらのエーテル誘導体を含む。２つのカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、コハク酸、マロン酸、（エチレンジオキシ）ジ酢酸、マレイン酸、及びドイツ　Ｏｆｆｅｎｌｅ−ｅｎｓｃｈｒｉｆｔ　２，４４６，６８６及び　２，４４６，４８７、ＵＳ　３，９３５，２５７に記載されるエーテルカルボキシレート並びにベルギー特許第　８４０，６２３号に記載されるスルフィニルカルボキシレートを含む。３つのカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、特に、水溶性シトレート、アコニトレート及びシトラコネート並びにコハク酸誘導体、例えば英国特許第　１，３７９，２４１号に記載されるカルボキシメチルオキシスクシネート、オランダ出願　７２０５８７３に記載されるラクトキシスクシネート、及びオキシポリカルボキシレート材料、例えば英国特許第　１，３８７，４４７に記載される２−オキサ−１，１，３−プロパントリカルボキシレートを含む。
【０１４３】
４つのカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、英国特許第　１，２６１，８２９号に開示されるオキシジスクシネートを含み、スルホ置換基を含む１，１，３，３−プロパンテトラカルボキシレートは、英国特許第　１，３９８，４２１号及び　１，３９８，４２２号並びにＵＳ　３，９３６，４４８号に開示されるスルホスクシネート誘導体、及び英国特許第　１，０８２，１７９号に開示されるスルホン化熱分解シトレートを含み、ホスホン置換基を含むポリカルボキシレートは、英国特許第　１，４３９，０００号に開示される。
【０１４４】
脂環式及びヘテロ環式ポリカルボキシレートは、シクロペンタン−シス、シス−シス−テトラカルボキシレート、シクロペンタジエニドペンタカルボキシレート、２，３，４，５−テトラヒドロ−フラン−シス，シス，シス−テトラカルボキシレート、２，５−テトラヒドロ−フラン−シス−ジスカルボキシレート、２，２，５，５−テトラヒドロフラン−テトラカルボキシレート、１，２，３，４，５，６−ヘキサン−ヘキサカルボキシレート及び多水酸基アルコール、例えばソルビトール、マンニトール及びキシリトールのカルボキシメチル誘導体を含む。芳香族ポリカルボキシレートは、メリト酸、ピロメリト酸及び英国特許第　１，４２５，３４３に開示されるフタル酸誘導体を含む。
【０１４５】
上述のもののうち、好ましいポリカルボキシレートは、１分子当り３までのカルボキシ基を含む、ヒドロキシ−カルボキシレート、より好ましくはシトレートである。
本組成物に用いるための好ましいビルダーシステムは、水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばゼオライトＡ又は層状シリケート（ＳＫＳ−６）　、及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、例えばクエン酸の混合物を含む。
【０１４６】
本発明による界面活性組成物中の封入のための適切なキレート化剤は、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）もしくはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、もしくはその置換化アンモニウム塩、又はそれらの混合物である。好ましいＥＤＤＳ化合物は、遊離酸形態及びそのナトリウム又はマグネシウム塩である。このようなＥＤＤＳのナトリウム塩の例は、　Ｎａ２ＥＤＤＳ及び　Ｎａ４ＥＤＤＳを含む。このような好ましいＥＤＤＳのマグネシウム塩はＭｇＥＤＤＳ及び　Ｍｇ２ＥＤＤＳを含む。本発明による組成物における封入のためにはマグネシウム塩が最も好ましい。
好ましいビルダーシステムは、水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばゼオライトＡ、及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、例えばクエン酸の混合物を含む。
【０１４７】
粒状組成物に用いるためのビルダーシステムの一部を形成することができる他のビルダー材料は、無機材料、例えばアルカリ金属カーボネート、重炭酸塩、シリケート、及び有機材料、例えば有機ホスホネート、アミノポリアルキレンホスホネート及びアミノポリカルボキシレートを含む。
他の適切な水溶性有機塩は、ホモ又は共重合酸又はそれらの塩であり、ここでポリカルボン酸は、２以下の炭素原子により互いから分離された少くとも２のカルボキシル基を含む。
【０１４８】
この型のポリマーは、ＧＢ−Ａ−１，５９６，７５６に開示される。このような塩の例は、　ＭＷ　２０００−５０００のポリアクリレート及びそれらのマレイン酸無水物とのコポリマーであり、ここでこのようなコポリマーは、２０，０００〜７０，０００、特に約４０，０００の分子量を有する。
界面活性剤ビルダー塩は、通常、その組成物の５重量％〜８０重量％の量で含まれる。液体界面活性剤のためのビルダーの好ましいレベルは５％〜３０％である。
【０１４９】
酵　素
好ましい界面活性組成物は、本発明の酵素調製物に加えて、洗浄能力及び／又は布帛ケアーの利益を供する他の酵素を含む。
このような酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アシラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（例えばラッカーゼ）を含む。
【０１５０】
プロテアーゼ：アルカリ溶液に用いるために適したいずれのプロテアーゼも用いることができる。適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物源のものを含む。微生物源のものが好ましい。化学的又は遺伝子的に改変した変異が含まれる。そのプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例はズブチリシン、特にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの、例えばズブチリシンＮｏｖｏ、ズブチリシン　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、ズブチリシン　３０９、ズブチリシン　１４７及びズブチリシン１６８　（ＷＯ　８９／０６２７９）である。トリプシン様プロテアーゼの例はトリプシン（例えばブタ又はウシ源のもの）及び　ＷＯ　８９／０６２７０　に記載されるフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼである。
【０１５１】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）　により商標名Ａｌｃａｌａｓｅ，　Ｓａｖｉｎａｓｅ，　Ｐｒｉｍａｓｅ，　Ｄｕｒａｚｙｍ、及びＥｓｐｅｒａｓｅで売られているもの、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌにより商標名　Ｍａｘａｔａｓｅ，　Ｍａｘａｃａｌ，　Ｍａｘａｐｅｍ，　Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ，　Ｐｕｒａｆｅｃｔ及びＰｕｒａｆｅｃｔ　ＯＸＰで売られているもの、並びにＳｏｌｖａｙ　Ｅｎｚｙｍｅｓにより商標名　Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ及びＯｐｔｉｍａｓｅで売られているものを含む。プロテアーゼ酵素は、本発明による組成物に、組成物の重量で　０．００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは組成物の重量で０．０００１％〜１％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは組成物の重量で　０．００１％〜　０．５％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは組成物の重量で０．０１％〜　０．２％の酵素タンパク質のレベルで組み込むことができる。
【０１５２】
リパーゼ：アルカリ溶液に用いるのに適したいずれのリパーゼも用いることができる。適切なリパーゼは、細菌又は真菌原のものを含む。化学的又は遺伝子的に改変された変異体が含まれる。
【０１５３】
有用なリパーゼの例は、例えばＥＰ　２５８　０６８及びＥＰ　３０５　２１６に記載されるようなヒュミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ　）リパーゼ、例えばＥＰ　２３８　０２３に記載されるようなリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ　）リパーゼ、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ　）リパーゼ、例えばＣ．アンタルクチカ（Ｃ．　ａｎｔａｒｃｔｉｃａ　）リパーゼ、例えばＥＰ　２１４　７６１に記載されるＣ．アンタルクチカリパーゼＡもしくはＢ、例えばＥＰ　２１８　２７２に記載されるようなシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）リパーゼ、例えばＰ．アルカリゲネス（Ｐ．　ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）及びＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ、例えばＥＰ　３３１　３７６に記載されるようなＰ．セパシア（Ｐ．　ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ、例えばＧＢ　１，３７２，０３４に開示されるような、Ｐ．スツトゼリ（Ｐ．　ｓｔｕｔｚｅｒｉ　）リパーゼ、Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ、バチルスリパーゼ、例えばＢ．サブチリス（Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　）リパーゼ（Ｄａｒｔｏｉｓら　（１９９３），　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　ａｃｔａ　１１３１，　２５３−２６０）　、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（ＪＰ　６４／７４４９９２）　及びＢ．プミルス（Ｂ．　ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（ＷＯ　９１／１６４２２）を含む。
【０１５４】
更に、いくつかのクローン化されたリパーゼが役立つ。例えば、　Ｙａｍａｇｕｃｈｉら（１９９１）（Ｇｅｎｅ　１０３，　６１−６７）　により記載されるペニシリウム・カメンベルチイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ　）リパーゼ、ゲオトリクム・カンジドウム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ，　Ｙら　（１９８９），　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０６，　３８３−３８８）、及び種々のリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）リパーゼ、例えばＲ．デレマル（Ｒ．　ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ（Ｈａｓｓ，　Ｍ．Ｊ．ら　（１９９１），　Ｇｅｎｅ　１０９，　１１７−１１３）　、Ｒ．ニベウス（Ｒ．　ｎｉｖｅｕｓ）　リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａら、（１９９２），　Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　５６，　７１６−７１９）及びＲ．オリザエ（Ｒ．　ｏｒｙｚａｅ　）リパーゼがある。
【０１５５】
脂肪分解酵素の他の型、例えばクチナーゼも役立つ。例えば、　ＷＯ　８８／０９３６７　に記載されるシュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａ　）由来のクチナーゼ、又は（例えば　ＷＯ　９０／０９４４６　に記載されるフサリウム・ソラニ・ピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌａｎｉ　ｐｉｓｉ）由来のクチナーゼがある。
特に適切なリパーゼは、Ｍ１　ＬｉｐａｓｅＴＭ，　Ｌｕｍａ　ｆａｓｔＴＭ及びＬｉｐｏｍａｘＴＭ　（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ），　ＬｉｐｏｌａｓｅＴＭ及びＬｉｐｏｌａｓｅ　ＵｌｔｒａＴＭ　（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ）　、及びＬｉｐａｓｅ　Ｐ　”Ａｍｉｎｏ”　（Ａｍａｎｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ．　Ｌｔｄ．）のようなリパーゼである。
【０１５６】
リパーゼは、通常、組成物の重量で　０．００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは組成物の重量で０．０００１％〜１％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは組成物の重量で　０．００１％〜　０．５％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは組成物の重量で０．０１％〜　０．２％の酵素タンパク質のレベルで界面活性組成物中に組み込まれる。
【０１５７】
アミラーゼ：アルカリ溶液中に用いるのに適したいずれのアミラーゼ（ａ及び／又はｂ）も用いることができる。適切なアミラーゼは、バクテリア又は真菌源のものを含む。化学的又は遺伝子的に改変された変異体が含まれる。アミラーゼは、例えば、ＧＢ　１，２９６，８３９により詳細に記載されるＢ．リケニホルミス（Ｂ．　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特定の株から得られるアミラーゼを含む。市販のアミラーゼは、ＤｕｒａｍｙｌＴＭ，　ＴｅｒｍａｙｌＴＭ，　ＦｕｎｇａｍｙｌＴＭ及びＢＡＮＴＭ（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓから市販）並びにＲａｐｉｄａｓｅＴＭ及びＭａｘａｍｙｌ　ＰＴＭ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒから市販）を含む。
【０１５８】
アミラーゼは、通常、組成物の重量で　０．００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは組成物の重量で０．０００１％〜１％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは組成物の重量で　０．００１％〜　０．５％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは組成物の重量で０．０１％〜　０．２％の酵素タンパク質のレベルで界面活性組成物中に組み込まれる。
【０１５９】
セルラーゼ：アルカリ溶液中に用いるのに適したいずれのセルラーゼも用いることができる。適切なセルラーゼは、細菌又は真菌源のものを含む。化学的又は遺伝子的に改変された変異体が含まれる。適切なセルラーゼは、ＵＳ　４，４３５，３０７に開示され、それは、ヒュミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）　から生産される真菌のセルラーゼを開示する。特に適したセルラーゼは色ケアーの利益を有するセルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許出願第　０　４９５　２５７号に記載されるセルラーゼ、及び本発明のエンドグルカナーゼである。
【０１６０】
市販のセルラーゼは、ヒュミコラ・インソレンスの株により生産されるＣｅｌｌｕｚｙｍｅＴＭ　（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ）、及びＫＡＣ−５００　（Ｂ）ＴＭ　（Ｋａｏ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　を含む。セルラーゼは、通常、組成物の重量で　０．００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは組成物の重量で０．０００１％〜１％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは組成物の重量で　０．００１％〜　０．５％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは組成物の重量で０．０１％〜　０．２％の酵素タンパク質のレベルで界面活性組成物中に組み込まれる。
【０１６１】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：ペルオキシダーゼ酵素は、過酸化水素又はそのソース（例えばペルカーボネート、ペルボレート、又はペルスルフェート）と組み合わせて用いられる。オキシダーゼ酵素は、酸素と組み合わせて用いられる。両方の型の酵素は、“溶液漂白”のため、即ち布帛を洗浄液と一緒に、好ましくは例えば　ＷＯ　９４／１２６２１　及び　ＷＯ　９５／０１４２６　に記載される増強剤と一緒に洗った時に染色された布帛から他の布帛に織物染料が移るのを防ぐために用いられる。適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は真菌源のものを含む。化学的又は遺伝子的に改変された変異体が含まれる。
【０１６２】
ペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼは、通常、組成物の重量で　０．００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは組成物の重量で０．０００１％〜１％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは組成物の重量で　０．００１％〜　０．５％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは組成物の重量で０．０１％〜　０．２％の酵素タンパク質のレベルで界面活性組成物中に組み込まれる。
上述の酵素の混合物、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及び／又はセルラーゼの混合物が包含される。
【０１６３】
本発明の酵素、又は界面活性組成物に組み込まれるいずれかの他の酵素は、通常、組成物の重量で　０．００００１％〜２％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは組成物の重量で０．０００１％〜１％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは組成物の重量で　０．００１％〜　０．５％の酵素タンパク質のレベル、更により好ましくは組成物の重量で０．０１％〜　０．２％の酵素タンパク質のレベルで界面活性組成物中に組み込まれる。
【０１６４】
漂白剤
本発明の界面活性組成物中に含まれ得る更なる任意的界面活性成分は、漂白剤、例えばＰＢ１，　ＰＢ４及び粒径　４００〜８００　ミクロンのペルカーボネートを含む。これらの漂白剤成分は、１又は複数の酸素漂白剤、及び選択した漂白剤により、１又は複数のアクティベーターを含み得る。その酸素漂白化合物は、典型的には約１％〜約２５％のレベルで存在するであろう。一般に、漂白化合物は、非液体製剤、例えば粒状界面活性剤において任意的に加えられる成分である。
本明細書に用いるための漂白剤成分は、酸素漂白剤及び当該技術で周知の他のものを含む界面活性組成物のために役立つ漂白剤のいずれかであり得る。
本発明に適した漂白剤は、活性化された又は活性化されていない漂白剤であり得る。
【０１６５】
用いることができる酸素漂白剤の１つのカテゴリーは、ペルカルボン酸漂白剤及びその塩を含む。このクラスの剤の適切な例は、マグネシウムモノペルオキシフタレート６水和物、メタ−クロロペル安息香酸のマグネシウム塩、４−ノニルアミノ−４−オキソペルオキシブチル酸及びジペルオキシドデカンジオール酸を含む。このような漂白剤は、ＵＳ　４，４８３，７８１，　ＵＳ　７４０，４４１，　ＥＰ　０　１３３　３５４及びＵＳ　４，４１２，９３４に開示される。極めて好ましい漂白剤は、ＵＳ　４，６３４，５５１に記載される６−ノニルアミノ−６−オキソペルオキシカプロン酸も含む。
【０１６６】
用いることができる他のカテゴリーの漂白剤は、ハロゲン漂白剤を含む。ハイポハライト漂白剤の例は、例えば、トリクロロイソシアヌール酸並びにナトリウム及びカリウムジクロロイソシアヌレート並びにＮ−クロロ及びＮ−ブロモアルカンスルホンアミドを含む。このような材料は、通常、最終製品の重量で　０．５〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％で加えられる。
【０１６７】
過酸化水素放出剤は、漂白アクティベーター、例えばテトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ノナノイロキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ，　ＵＳ　４，４１２，９３４）、３，５−トリメチル−ヘキサノロキシベンゼンスルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ，　ＥＰ　１２０　５９１）　又はペンタアセチルグルコース（ＰＡＧ）　と組み合わせて用いることができ、過加水分解されて活性漂白種として過酸を形成し、漂白効果を改善する。更に、極めて適しているのは、漂白アクティベーターＣ８（６−オクタンアミド−カプロイル）オキシベンゼン−スルホネート、Ｃ９（６−ノナノアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート及びＣ１０（６−デカンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート又はそれらの混合物である。また、適切なアクティベーターは、欧州特許出願第９１８７０２０７．７に開示されるようなアシル化クエン酸エステルである。
【０１６８】
本発明による洗浄組成物に用いるための、ペルオキシ酸並びに漂白アクティベーター及び過酸素漂白化合物を含む漂白システムを含む、有用な漂白剤は、出願ＵＳＳＮ　０８／１３６，６２８　に記載される。
過酸化水素は、洗浄及び／又はそそぎ工程の前又は後に、過酸化水素を発生させることができる酵素システム（即ち酵素及びそのための基質）を加えることによっても存在し得る。このように酵素系は、欧州特許出願ＥＰ　０　５３７　３８１に開示される。
【０１６９】
酸素漂白剤以外の漂白剤も当該技術において周知であり、本明細書に利用することができる。特に関心のある非酸素漂白剤の１つの型は、光活性化漂白剤、例えばスルホン化亜鉛及び／又はアルミニウムフタロシアニンを含む。これらの材料は、洗浄工程の間に基質上に析出し得る。酸素の存在下で、例えば日昼に乾燥するまで衣類をつるすことにより、光での刺激に基づき、スルホン化亜鉛フタロシアニンは活性化され、そして結果として、その基質は漂白される。好ましい亜鉛フタロシアニン及び光活性化漂白工程はＵＳ　４，０３３，７１８に記載される。典型的には、界面活性組成物は、スルホン化亜鉛フタロシアニンの重量で約　０．０２５％〜約１．２５％を含むであろう。
漂白剤は、マンガン触媒も含み得る。マンガン触媒は、例えば、“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍａｎｇａｎｅｓｅ　ｃａｔａｌｙｓｔｓ　ｆｏｒ　ｌｏｗ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｂｌｅａｃｈｉｎｇ”，　Ｎａｔｕｒｅ　３６９，　１９９４，　ｐｐ．６３７−６３９に記載される化合物の１つであり得る。
【０１７０】
泡サプレッサー
他の任意成分は、シリコーン、及びシリカ−シリコーン混合物に代表される泡サプレッサーである。シリコーンは、一般に、アルキル化ポリシロキサン材料により代表され、シリカは通常、シリカエアロゲル及びキセロゲル並びに種々の型の疎水性シリカに例示される細かく分割された形態で用いられる。これらの材料は、粒子として組み込むことができ、ここでその泡サプレッサーは、有利には、水溶性又は水分散性の実質的に非表面活性剤不透過性の担体中に放出可能に組み込まれる。あるいは、泡サプレッサーは、液体担体に溶かし、又は分散させることができ、１又は複数の他の成分に、スプレーすることにより適用することができる。
【０１７１】
好ましいシリコーン泡抑制剤は、ＵＳ　３，９３３，６７２に開示される。他の特に有用な泡サプレッサーは、ドイツ特許出願ＤＴＯＳ　２，６４６，１２６に記載される自己乳化性シリコーン泡サプレッサーである。このような化合物の例は、シリコーン−グリコールコポリマーである　Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇから市販されるＤＣ−５４４である。特に好ましい泡抑制剤は、シリコーン油及び２−アルキル−アルカノールの混合物を含む泡サプレッサーである。適切な２−アルキル−アルカノールは、商標Ｉｓｏｆｏｌ　１２Ｒとして市販される２−ブチル−オクタノールである。
【０１７２】
このような泡サプレッサーシステムは、欧州特許出願ＥＰ　０　５９３　８４１に記載されている。
特に好ましいシリコーン泡抑制剤は、欧州特許出願第９２２０１６４９．８に記載される。前記組成物は、フュームト非多孔性シリカ、例えばＡｅｒｏｓｉｌＲとの組み合わせにおけるシリコーン／シリカ混合物を含み得る。
上述の泡サプレッサーは、通常、組成物の重量で　０．００１〜２重量％、好ましくは０．０１〜１重量％のレベルで用いられる。
【０１７３】
他の成分
本界面活性組成物中に用いられる他の成分、例えば土懸濁剤、土遊離剤、光増白剤、研磨剤、殺菌剤、変色抑制剤、着色剤、及び／又は被包化又は非被包化香料を用いることができる。
特に適した被包化材料は、ＧＢ　１，４６４，６１６に記載されるようなポリサッカライド及びポリヒドロキシ化合物のマトリックスからなる水溶性カプセルである。
【０１７４】
他の適切な水溶性被包材料は、ＵＳ　３，４５５，８３８に記載されるような置換化ジカルボン酸の非ゼラチン化デンプン酸エステル由来のデキストリンを含む。これらの酸−エステルデキストリンは、好ましくは、ろう質メイズ、ろう質モロコシ、サゴ、タピオカ及びポテトのようなデンプンから調製される。前記被包材料の適切な例は、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｔａｒｃｈにより製造された　Ｎ−Ｌｏｋを含む。　Ｎ−Ｌｏｋ被包材料は、改質化トウモロコシデンプン及びグルコースからなる。デンプンは、一種官能性置換化基、例えばオクテニルコハク酸無水物を加えることにより改質される。
【０１７５】
適した抗再析出剤及び土懸濁剤は、セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース、並びにホモ−又はコポリマーのポリカルボン酸又はそれらの塩を含む。この型のポリマーは、ビルダーとして先に言及されるポリアクリレート及び無水マレイン酸−アクリル酸コポリマー、並びにエチレンとの無水マレイン酸のコポリマー、メチルビニルエーテル又はメタクリル酸、を含み、ここでその無水マレイン酸はそのコポリマーの少くとも２０モル％を構成する。これらの材料は、通常、組成物の重量で、０．５〜１０重量％、より好ましくは０．７５〜８重量％、最も好ましくは１〜６重量％のレベルで用いられる。
【０１７６】
好ましい光増白剤は、陰イオン性の特徴であり、その例は、二ナトリウム４，４′−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２′ジスルホネート、二ナトリウム４，−４′−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ−スチルベン−２：２′−ジスルホネート、二ナトリウム４，４′−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２′−ジスルホネート、一ナトリウム４′，４″−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリ−アジン−６イルアミノ）スチルベン−２−スルホネート、二ナトリウム４，４′−ビス−（２−アニリノ−４−（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２′−ジスルホネート、二ナトリウム４，４′−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）−スチルベン−２，２′ジスルホネート、二ナトリウム４，４′ビス（２−アニリノ−４−（１−メチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２′ジスルホネート、ナトリウム２（スチルビル−４″−（ナフト−１′，２′：４，５）−１，２，３，−トリアゾール−２″−スルホネート及び４，４′−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニルである。
【０１７７】
他の有用なポリマー材料は、ポリエチレングリコール、特に分子量１０００〜１００００　、より好ましくは２０００〜８０００、最も好ましくは約４０００のものである。これらは、０．２０〜５重量％、より好ましくは０．２５〜２．５　重量％のレベルで用いられる。これらのポリマー及び上述のホモ−又はコポリマーのポリカルボン酸塩は、白さの保守、布帛灰の析出、及び遷移金属不純物の存在下での粘土、タンパク質含有及び酸化性の土の洗浄能力を改善するために価値がある。
【０１７８】
本発明の組成物に役立つ土遊離剤は、慣用的には、種々の配置のエチレングリコール及び／又はプロピレングリコール単位のテレフタル酸のコポリマー又はターポリマーである。このようなポリマーの例は、ＵＳ　４，１１６，８８５及び　４，７１１，７３０及びＥＰ　０　２７２　０３３に開示される。ＥＰ　０　２７２　０３３による特に好ましいポリマーは、式：
（ＣＨ３（ＰＥＧ）４３）０．７５（ＰＯＨ）０．２５〔Ｔ−ＰＯ）２．８（Ｔ−ＰＥＧ）０．４〕Ｔ（ＰＯＨ）０．２５（（ＰＥＧ）４３ＣＨ３）０．７５
（式中、　ＰＥＧは、−（ＯＣ２Ｈ４）Ｏ−であり、ＰＯは（ＯＣ３Ｈ６Ｏ）であり、そしてＴは（ｐＯＯＣ６Ｈ４ＣＯ）　である。）
を有する。
【０１７９】
また、ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコール及び１，２−プロパンジオールのランダムコポリマーのような改変させたポリエステルも極めて有用である。それら末端の基は、第１にスルホベンゾエート及び第２にエチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルからなる。その目的は、スルホベンゾエート基により両端がキャップされたポリマーを得ることであり、“第１に”、本文脈において本明細書における前記コポリマーのほとんどはスルホベンゾエート基により端がキャップされるであろう。しかしながら、いくつかのコポリマーは、完全にキャップされるわけではないであろう。それゆえ、それらの端の基は、エチレングリコール及び／又は１，２−プロパンジオールのモノエステルからなり得、それゆえ“第２に”、このような種からなる。
【０１８０】
本明細書で選択されるポリエステルは、約４６重量％のジメチルテレフタル酸、約１６重量％の１，２−プロパンジオール、約１０重量％のエチレングリコール、約１３重量％のジメチルスルホ安息香酸、及び約１５重量％のスルホイソフタル酸を含み、約３０００の分子量を有する。ポリエステル及びそれらの調製方法は、ＥＰ　３１１　３４２に詳細に記載される。
【０１８１】
軟化剤
布帛軟化剤も、本発明による洗濯用界面活性組成物に組み込むことができる。これらの剤は、無機又は有機の型でもよい。無機軟化剤は、ＧＢ−Ａ−１　４００　８９８及びＵＳ　５，０１９，２９２に開示されるスメクタイト粘土により例示される。有機布帛軟化剤は、ＧＢ−Ａ　１　５１４　２７６及びＥＰ　０　０１１　３４０に開示される水不溶性第３級アミンを含み、それらのモノＣ１２−Ｃ１４第４級アンモニウム塩との組合せはＥＰ−Ｂ−０　０２６　５２８に開示され、ジ長鎖アミドはＥＰ　０　２４２　９１９に開示される。布帛軟化システムの他の有用な有機成分は、ＥＰ　０　２９９　５７５及び　０　３１３　１４６に開示される高分子量ポリエチレンオキシド材料を含む。
【０１８２】
スメクタイト粘土のレベルは、通常、５〜１５重量％、より好ましくは８〜１２重量％であり、ここでその材料は、その製剤の残りに、乾燥混合成分として添加される。有機布帛軟化剤、例えば水不溶性第３級アミン又はジ長鎖アミド材料は、０．５〜５重量％、通常１〜３重量％のレベルで組み込まれ、高分子量ポリエチレンオキシド材料及び水溶性陽イオン材料は、　０．１〜２重量％、通常、０．１５〜１．５　重量％のレベルで加えられる。これらの材料は、通常、組成物の噴霧乾燥された部分に加えられるが、いくつかの場合は、それらを乾燥混合粒子としてより便利に加えることができ、又はそれらをその組成物の他の固体成分に、溶解した液体としてスプレーすることができる。
【０１８３】
ポリマー染料転移抑制剤
本発明による界面活性組成物は、　０．００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜２重量％、より好ましくは０．０５〜１重量％のポリマー染料転移抑制剤も含み得る。前記ポリマー染料転移抑制剤は、通常、色のついた布帛からそれと共に洗浄される布帛に染料が移るのを防ぐために、界面活性組成物に加えられる。これらのポリマーは、その染料がその洗浄において他の物に付着する機会を有する前に染色された布帛から洗い落とされる逃げた染料を複合体化し又は吸着する能力を有する。
【０１８４】
特に適したポリマー染料転移抑制剤は、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はそれらの混合物である。
このようなポリマーの添加も本発明による酵素の能力を増強させる。
本発明による界面活性組成物は、液体、ペースト、ゲル、バー又は粒子形態であり得る。
【０１８５】
非ダスト性粒子は、例えばＵＳ　４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２（両方ともＮｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ）に開示されるように作ることができ、任意に、当該技術で周知の方法によりコートすることができる。ろう質コーティング材料の例は、平均分子量１０００〜２００００　のポリ（エチレンオキシド）製品；１６〜５０のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール；そのアルコールが１２〜２０の炭素原子を含み、１５〜８０のエチレンオキシド単位があるエトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。流動床技術による適用に適したフィルム形成性コーティング材料の例はＧＢ　１４８３５９１に供される。
【０１８６】
本発明による粒状組成物は、“コンパクト形態”でもあり得、即ちそれらは慣用的な粒状界面活性剤より比較的高密度、即ち　５５０〜９５０　ｇ／ｌを有し得；このような場合、本発明による粒状界面活性組成物は、慣用的な粒状界面活性剤と比べて、少い量の“無機フィラー塩”を含むであろう；典型的なフィラー塩は、スルフェート及びクロライドのアルカリ土類金属塩、典型的には、硫酸ナトリウムであり；“コンパクト”界面活性剤は、典型的には、１０％以下のフィラー塩を含む。本発明による液体組成物は、“濃縮形態”でもあり得；このような場合、本発明による液体界面活性組成物は、慣用的な液体界面活性剤と比べて少い量の水を含むであろう。典型的には、濃縮液体界面活性剤の水分は、界面活性剤の重量で３０％未満、より好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満である。
【０１８７】
本発明の組成物は、例えば、手及び機械的洗濯界面活性組成物、例えば洗濯添加組成物及び染色された布帛のプレ処理に用いるのに適した組成物、リンス添加布帛転化組成物、及び一般的な家庭用硬質表面洗浄及び皿洗いに用いるための組成物として調剤することができる。
以下の例は、本発明についての組成物を例示するが、必ずしも、本発明の範囲を限定し又は規定することを意味しない。
【０１８８】
本界面活性組成物において、略称される成分は、以下の意味を有する：
ＬＡＳ　：ナトリウム直鎖Ｃ１２アルキルベンゼンスルホネート
ＴＡＳ　：ナトリウムタローアルキルスルフェート
ＸＹＡＳ：ナトリウム　Ｃ１Ｘ−Ｃ１Ｙアルキルスルフェート
ＳＳ　：式２−ブチルオクタン酸の第２セッケン界面活性剤
２５ＥＹ：平均Ｙモルのエチレンオキシドと縮合したＣ１２−Ｃ１５の主に直鎖の第１級アルコール
４５ＥＹ：平均Ｙモルのエチレンオキシドと縮合したＣ１４−Ｃ１５の主に直鎖の第１級アルコール
ＸＹＥＺＳ　：１分子当り平均Ｚモルのエチレンオキシドと縮合した　Ｃ１Ｘ−Ｃ１Ｙナトリウムアルキルスルフェート
【０１８９】
非イオン性：　ＢＡＳＦ　Ｇｍｂｈにより商標名Ｐｌｕｒａｆａｘ　ＬＦ４０４で売られる平均　３．８のエトキシ化の程度及び平均　４．５のプロポキシ化の程度を有するＣ１３−Ｃ１５混合エトキシ化／プロポキシ化脂肪アルコール
ＣＦＡＡ：Ｃ１２−Ｃ１４アルキルＮ−メチルグルカミド
ＴＦＡＡ：Ｃ１６−Ｃ１８アルキルＮ−メチルグルカミド
シリケート：アモルファスナトリウムシリケート（ＳｉＯ２：Ｎａ２Ｏ比＝２．０）
ＮａＳＫＳ−６　：式ｄ−Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５の結晶性層状シリケート
カーボネート：無水炭酸ナトリウム
ホスフェート：ナトリウムトリポリホスフェート
ＭＡ／ＡＡ：１：４マレイン酸／アクリル酸のコポリマー、平均分子量約８０，０００
ポリアクリレート：　ＢＡＳＦ　Ｇｍｂｈにより商標名ＰＡ３０で売られている平均分子量　８，０００のポリアクリレートホモポリマー
【０１９０】
ゼオライトＡ：１〜１０マイクロメーターの範囲の主な粒径を有する式Ｎａ１２（ＡｌＯ２ＳｉＯ２）１２・２７Ｈ２Ｏ　の水和したナトリウムアミノシリケート
シトレート：クエン酸三ナトリウム二水和物
クエン酸：クエン酸
ペルボレート：無水ナトリウムペルボレート一水和物漂白剤、経験上の式　ＮａＢＯ２・Ｈ２Ｏ２
ＰＢ４：無水ナトリウムペルボレート四水和物
ペルカーボネート：経験式　２Ｎａ２ＣＯ３・３Ｈ２Ｏ２　の無水ナトリウムペルカーボネート漂白剤
ＴＡＥＤ：テトラアセチルエチレンジアミン
ＣＭＣ　：ナトリウムカルボキシメチルセルロース
ＤＥＴＰＭＰ：商標名Ｄｅｑｕｅｓｔ　２０６０でＭｏｎｓａｎｔｏにより市販されるジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）
【０１９１】
ＰＶＰ　：ポリビニルピロリドンポリマー
ＥＤＤＳ：エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−ジコハク酸、ナトリウム塩の形態の〔Ｓ，Ｓ〕異性体
泡サプレッサー：２５％パラフィンワックスＭｐｔ　５０℃、１７％疎水性シリカ、５８％パラフィン油
粒状泡サプレッサー：粒状形態の１２％シリコーン／シリカ、１８％ステアリルアルコール、７０％デンプン
スルフェート：無水硫酸ナトリウム
ＨＭＷＰＥＯ：高分子量ポリエチレンオキシド
ＴＡＥ　２５：タローアルコールエトキシレート（２５）
【０１９２】
界面活性剤例Ｉ
本発明による粒状布帛洗浄組成物は、次の通り調製することができる：
ナトリウム直鎖Ｃ１２アルキル　　　　　　　　　　　６．５
ベンゼンスルホネート硫酸ナトリウム　　　　　　１５．０
ゼオライトＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　２６．０
ナトリウムニトリロトリアセテート　　　　　　　　５．０
本発明の酵素　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１
ＰＶＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５
ＴＡＥＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．０
ホウ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０
ペルボレート　　　　　　　　　　　　　　　　　１８．０
フェノールスルホネート　　　　　　　　　　　　　０．１
少量成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００まで
【０１９３】
界面活性剤例ＩＩ
本発明によるコンパクト粒状布帛洗浄組成物（密度　８００ｇ／ｌ）は、次の通り調製することができる：
４５ＡＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８．０
２５Ｅ３Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０
２５Ｅ５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．０
２５Ｅ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．０
ＴＦＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５
ゼオライトＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　１７．０
ＮａＳＫＳ−６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２．０
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．０
カーボネート　　　　　　　　　　　　　　　　　　７．０
ＭＡ／ＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０
ＣＭＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．４
本発明の酵素　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１
ＴＡＥＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．０
ペルカーボネート　　　　　　　　　　　　　　　２２．０
ＥＤＤＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３
粒状泡サプレッサー　　　　　　　　　　　　　　　３．５
水／少量成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００％まで
【０１９４】
界面活性剤例ＩＩＩ　
有色布帛の洗濯に特に役立つ本発明による粒状布帛洗浄組成物は次の通り調製した：
ＬＡＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．７　　　　　　−
ＴＡＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．４　　　　　　−
ＴＦＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　４．０
４５ＡＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　３．１　　　　　　１０．０
４５Ｅ７　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０　　　　　　−
２５Ｅ３Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　３．０
６８Ｅ１１　　　　　　　　　　　　　　　　　１．８　　　　　　−
２５Ｅ５　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　８．０
シトレート　　　　　　　　　　　　　　１５．０　　　　　　７．０
カーボネート　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　１０
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　２．５　　　　　　３．０
ゼオライトＡ　　　　　　　　　　　　　３２．１　　　　　　２５．０
Ｎａ−ＳＫＳ−６　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　９．０
ＭＡ／ＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　　５．０　　　　　　５．０
ＤＥＴＰＭＰ　　　　　　　　　　　　　　　　０．２　　　　　　０．８
本発明の酵素　　　　　　　　　　　　　０．１０　　　　　０．０５
シリケート　　　　　　　　　　　　　　２．５　　　　　　−
スルフェート　　　　　　　　　　　　　５．２　　　　　　３．０
ＰＶＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５　　　　　　−
ビニル−イミダゾール及びビニル−　　　−　　　　　　０．２
ピロリドンのポリ（４−ビニルピリ
ジン）−Ｎ−オキシド／コポリマー
ペルボレート　　　　　　　　　　　　　１．０　　　　　　−
フェノールスルホネート　　　　　　　　０．２　　　　　　−
水／少量成分　　　　　　　　　　　　　　　　１００％まで
【０１９５】
界面活性剤例ＩＶ
“洗浄を通して軟化する”能力を供する本発明による粒状布帛洗浄組成物は、次の通り調製することができる：
４５ＡＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　１０．０
ＬＡＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　７．６　　　　　　−
６８ＡＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　１．３　　　　　　−
４５Ｅ７　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０　　　　　　−
２５Ｅ３　　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　５．０
ココ−アルキル−ジメチルヒドロキ　　　１．４　　　　　　１．０
シ−エチルアンモニウムクロライド
シトレート　　　　　　　　　　　　　　５．０　　　　　　３．０
Ｎａ−ＳＫＳ−６　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　１１．０
ゼオライトＡ　　　　　　　　　　　　　１５．０　　　　　　１５．０
ＭＡ／ＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　　４．０　　　　　　４．０
ＤＥＴＰＭＰ　　　　　　　　　　　　　　　　０．４　　　　　　０．４
ペルボレート　　　　　　　　　　　　　１５．０　　　　　　−
ペルカルボネート　　　　　　　　　　　−　　　　　　１５．０
ＴＡＥＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０　　　　　　５．０
スメクタイト粘土　　　　　　　　　　　１０．０　　　　　　１０．０
ＨＭＷＰＥＯ　　　　　　　　　　　　　　　　−　　　　　　０．１
本発明の酵素　　　　　　　　　　　　　０．１０　　　　　０．０５
シリケート　　　　　　　　　　　　　　３．０　　　　　　５．０
カーボネート　　　　　　　　　　　　　１０．０　　　　　　１０．０
粒状泡サプレッサー　　　　　　　　　　１．０　　　　　　４．０
ＣＭＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２　　　　　　０．１
水／少量成分　　　　　　　　　　　　　　　　１００％まで
【０１９６】
界面活性剤例Ｖ
本発明による重務液体布帛洗浄組成物は次のように調製することができる：
2004065255.tif 000026
【０１９７】
他の実施形態において、本発明は、バイオ・ポリッシング工程における本発明のエンドグルカナーゼの使用に関する。バイオ・ポリッシングは、布帛の湿潤能を失うことなく取り扱い及び外観に関して布帛の質を改善するヤーン表面の特定の処理である。バイオ・ポリッシングの最も重要な効果は、けば及び毛玉形成の減少、光沢／つやの増加、布帛の取り扱いの改善、柔らかさの持ちの増加及び水吸収性の変化を特徴とし得る。バイオ・ポリッシングは、通常、編まれた及び織られた布帛の製造の湿潤工程においておこる。湿潤プロセッシングは、例えば糊抜き、すりみがき、漂白、洗浄、乾燥／型付け及び仕上げのようなステップを含む。これらのステップの各々の間、布帛は、多少、機械的作用にかけられる。一般に、織物を編み又は織った後、その布帛は糊抜き段階にかけられ、次にすりみがき段階等が行われる。
【０１９８】
糊抜きは、織物から糊を除去する作用である。機械織機で織る前に、ワープヤーンは、しばしば、それらの引張り強さを増加させるために糊デンプン又はデンプン誘導体でコートされる。織った後、糊コーティングは、均一かつ洗浄耐性の結果を確実にするために、布帛を更に処理する前に除去されなければならない。バイオ・ポリッシングの効果を達成するために、セルロース分解及び機械的作用の組合せが要求されることが知られている。セルラーゼでの処理を軟化剤での慣用的な処理と組み合わせる場合に“超−柔かさ”が達成され得ることも知られている。セルロース布帛のバイオ・ポリッシングのための本発明のエンドグルカナーゼの使用は有利であると考えられ、例えばより完全なポリッシングを達成することができる。バイオ−ポリッシングは、例えば　ＷＯ　９３／２０２７８　に記載される方法を適用することにより得ることができる。
【０１９９】
石洗浄
軽石の存在下で布帛から作られたデニムもしくはジーンズを洗浄してその布帛の色の要求される局所的な明るさを供することにより、又は布帛を酵素により、特にセルロース分解酵素で処理することにより、染色された布帛、特にデニム又はジーンズにおいて“ストーン・ウォッシュ”の外観（色の局所的すりへり）を供することが知られている。本発明のエンドグルカナーゼでの処理は、ＵＳ　４，８３２，８６４に開示されるように単独で、伝統的な工程において要求されるより少い量の軽石と一緒に、又は　ＷＯ　９５／０９２２５　に開示されるようにパーライトと一緒に行うことができる。
【０２００】
パルプ及び紙への適用
製紙工業において、本発明のエンドグルカナーゼは、例えば次のように有利に適用することができる：
−木の皮をはぐため：機械ドラムで木の皮をはぐ前にエンドグルカナーゼでの前処理は形成層を分解することができ、エネルギーの節約に有利である。
−デフィブレーションのため：精製及びビーティングの前のエンドグルカナーゼでのセルロース繊維含有材料の処理は、繊維間表面上のセルラーゼの加水分解効果によりエネルギー消費を減少させることができる。エンドグルカナーゼの使用は、本発明の酵素組成物は繊維壁を浸透する高い能力を有し得ると信じられるので、周知の酵素の使用と比べてエネルギー節約を改良し得る。
【０２０１】
−繊維改質のため、即ち繊維壁を横切る部分的加水分解が必要とされ、（例えばきめの細かい繊維をよりフレキシブルにするために）より深く浸透する酵素を要求する繊維特性の改善のため：高収量のパルプ又はリサイクルしたパルプの混合物のために繊維の深い処理が今まで可能でなかった。これは、繊維壁の孔マトリックスの物理的制限による酵素分子の通過を防ぐ繊維壁構造の性質に帰する。本エンドグルカナーゼは繊維壁に浸透することができると考えられる。
【０２０２】
−排水性の改良のため、製紙用パルプの排水性は、加水分解酵素、例えばセルラーゼでのパルプの処理により改良することができる。本エンドグルカナーゼの使用はより有効であり得、例えば繊維間及び製紙機械のワイヤーメッシュ内の中空空間をふさぐことにより排水の比率を制限する（繊維デブリスからなる）微粉画分中の強力に水和された微繊維の束を遊離させる高い程度を生ずる。パルプをセルラーゼ処理にかけた場合、カナダ標準フリーネス（Ｃａｎａｄｉａｎ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｆｒｅｅｎｅｓｓ）（ＣＳＦ）　は増加し、Ｓｃｈｏｒｐｅｒ−Ｒｉｅｇｌｅｒ排水インデックス（ｄｒａｉｎａｇｅ　ｉｎｄｅｘ）は減少する。例えば米国特許　４，９２３，５６５；ＴＡＰＰＩ　Ｔ２２７，　ＳＣＡＮ　Ｃ１９：　６５．　ｅｎｃｅを参照のこと。
【０２０３】
−繊維間結合のために：加水分解酵素は、繊維間結合を改善するための製紙用パルプの製造に適用される。酵素は不純物、例えばセルロース分解性デブリスのための繊維表面をそそぎ、これにより繊維壁への結合と共に露出したセルロースの領域を増強し、これにより繊維間水素結合能を改善する。この工程は、デホーニフィケーションとも呼ばれる。セルラーゼ含有酵素調製物で作られた紙及びボードは、改良された強度又は減少したグラメージ（ｇｒａｍｍａｇｅ）、より平滑な表面及び改良された印刷性を有し得る。
【０２０４】
−酵素によりインキを抜くため：セルラーゼのような加水分解酵素の使用によるパルピングの間又はそれに基づく再生紙の部分的な加水分解はインク粒子の除去及び塊形成を容易にすることが知られている。本エンドグルカナーゼの使用は、繊維壁のフィブリル様マトリックスへの酵素分子のより優れた浸透により表面構造からインクをより有効にゆるめることができ、これによりその表面を可欠化し、それによりインク粒子は有効に遊離し得る。遊離したインク粒子の凝集も、繊維を源とするインク粒子に結合して見い出されるセルロース分解フラグメントのより有効な加水分解のため、改善される。
リグノセルロースパルプの処理は、例えば　ＷＯ　９１／１４８１９，　ＷＯ　９１／１４８２２，　ＷＯ　９２／１７５７３　及び　ＷＯ　９２／１８６８８　に記載される。
【０２０５】
植物材料の分解
更に他の実施形態において、本発明は、植物材料、例えば細胞壁のデグラデーションのための本発明によるエンドグルカナーゼ及び／又は酵素調製物の使用に関する。
【０２０６】
本発明の新規エンドグルカナーゼ及び／又は酵素調製物は、収率を増加させるために、ワイン、果実又は野菜ジュースの調製に役立つ。本発明によるエンドグルカナーゼは、種々の植物細胞壁由来の材料又は廃棄材料、例えば農業残留物、例えば麦わら、トウモロコシの穂軸、完全な穀物の植物、ナッツのから、草、植物外皮、マメの外皮、消費穀物、シュガービートパルプ等の酵素的加水分解のためにも適用できる。異なる種類のプロセッシングを改善するため、穀類からのβ−グルカン又はβ−グルカンオリゴマーの精製のような他の成分の精製又は抽出を容易にするため、飼料価値を改善するため、水結合能を減少させるため、消費した水生植物の分解性を改善するため、例えば草及びコーンのエンシレージ等への転化を改善するために、分解することができる。
【０２０７】
実施例
本発明は、以下の例に更に詳述される。これらは、クレームされる本発明の範囲を限定するつもりはない。
材料及び方法
セルロース分解活性
本発明のセルラーゼ変異体は、改良された能力を示す。変異体のいくつかは触媒活性の増加に関して改良された能力を示し得る。
【０２０８】
本発明の文脈において、セルラーゼ活性は、Ｓ−ＣＥＶＵにおいて発現させることができる。セルロース分解酵素は　ＣＭＣを加水分解し、それによりインキュベーション混合物の粘度を増加させる。生じた粘度の減少は、バイブレーション粘度計（例えば、Ｓｏｆｒａｓｅｒ，　ＦｒａｎｃｅからのＭＩＶＩ　３０００）により決定することができる。
Ｓ−ＣＥＶＵに関して測定したセルロース分解活性の決定は、以下の分析法（アッセイ）に従って行うことができる：Ｓ−ＣＥＶＵアッセイは、サンプルがカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）　の溶液の粘度を減少させる能力を測定することによりサンプル中に存在する触媒活性の量を定量する。そのアッセイは、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースＨｅｒｃｕｌｅｓ　７　ＬＦＤ）　基質；酵素濃度約　０．１５　Ｓ−ＣＥＶＵ／ｍｌの粘度を減少させるための比較酵素標準を用いて、４０℃、ｐＨ　７．５、　０．１Ｍリン酸緩衝液；時間３０分で行われる。
【０２０９】
実施例１．セルラーゼ変異体の調製
開示される配列アラインメント（第１表）及びコンピューターモデリング法に基づき、位置　１１９はセルラーゼ変異体を作るための関心の特定の点として同定された。位置１１９（セルラーゼナンバリング）は基質から３Å以内に位置する。位置１１９において、野生型ヒュミコラ・インソレンスセルラーゼはヒスチジン残基（Ｈ）を保持するが、野生型チエラビア・テルレストリスセルラーゼはグルタミン残基（Ｑ）を保持する。
【０２１０】
この実験において、ヒスチジンは、チエラビア・テルレストリスセルラーゼ中のグルタミンにかわって置換した（それにより、セルラーゼ変異体チエラビア・テルレストリス／Ｑ１１９Ｈ　を得た）。得られた変異体を比活性についてテストした。
【０２１１】
全てのヒュミコラ・インソレンス変異体は、他に示されなければＳｔｒａｔａｇｅｎｅからの　ＣｈａｍｅｌｅｏｎＴＭ二本鎖部位特異的変異誘発キットの適用により作製される。次の合成オリゴヌクレオチド：
Ｓ／Ｍ　　　ＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＣＧＣＧＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣ、又は
Ｍ／Ｓ　　　ＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣ
を選択プライマーとして用いた。
Ｓ／Ｍはプラスミドのβ−ラクタマーゼ遺伝子中の　ＳｃａＩ部位を　ＭｌｕＩ部位で置きかえ、Ｍ／Ｓは逆である。後者は、最初の選択プライマーにより作られた変異体において２次変異を導入するのに用いられる。
【０２１２】
チエラビア・テルレスチスセルラーゼ変異体の作製のため、　ＤＳＭ　１０８１１として寄託されたプラスミドから得ることができるチエラビア・テルレスチス　ＥＧＶセルラーゼｃＤＮＡを用いた。　ＤＳＭ　１０８１１は、ブダペスト条約に従って、１９９５年６月３０日にＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託した。そのプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及び　ＮｏｔＩで消化した。４１５３ｂｐベクター部分及び　１２１１ｂｐ　ＢａｍＨＩ−　ＮｏｔＩフラグメントを単離した。１２１１ｂｐフラグメントの等しい部分を各々ＨｇｉＡＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、４８７ｂｐ　ＢａｍＨＩ−ＨｇｉＡＩ及び６９０ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−　ＮｏｔＩフラグメントを単離した。
【０２１３】
これらのフラグメント及びベクター部分を２つの一本鎖　ＤＮＡオリゴマー：
１８８０２：　ＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＴＧＧＧＡＴＣＴＡＡＣＣＡＣＴＴＣＧＡＴ
１８８０３：　ＡＴＣＧＡＡＧＴＧＧＴＴＡＧＡＴＣＣＣＡＧＧＴＣＧＣＣＧＣＣＴＧＴＧＣＴＣ
のアニーリングから生ずる５倍モル過剰の合成　ＤＮＡフラグメントの存在下で連結した。
【０２１４】
その連結混合物を大腸菌株ＸＬ１に移し、生じた形質転換体からチエラビア・テルレストリス／Ｑ１１９Ｈ　を単離し、　ＤＮＡ配列決定により確認した。
全てのセルラーゼ変異体は、その遺伝子をクローニングし、そして真菌のアミラーゼプロモーターとＡ．ニゲルからの　ＡＭＧターミネーターとの間に挿入した遺伝子を有するプラスミドを用いてアスペルギルス・オリザエに遺伝子をクローニングすることにより作った〔Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，　Ｔ．Ｗｏｅｌｄｉｋｅ，　Ｈ．Ｂｏｅｌ，　Ｅ．，　Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，　Ｓ．Ｂ．，　Ｈｊｏｒｔｓｈｏｅｊ，　Ｋ．，　Ｔｈｉｍ，　Ｌ．　ａｎｄ　Ｈａｎｓｅｎ，　Ｍ．Ｔ．　（１９８８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：　１４１９−１４２２　〕。
【０２１５】
セルロース結合ドメイン　ＣＢＤを有するセルラーゼを、それらのＡｖｉｃｅｌへの結合を利用することにより精製した。その生産生物からの細胞外流体の分離による発酵の後に、そのクローン化した産物を回収した。次に、そのセルラーゼを、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ　７．５でのスラリー中のＡｖｉｃｅｌ　１５０ｇを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより高度に精製した。Ａｖｉｃｅｌスラリーを、全部で約１ｇのタンパク質を含む粗発酵ブイヨンと混合した。４℃で２０分、混合した後、Ａｖｉｃｅｌ結合酵素を５０×２００ｍｍ　の寸法のカラム（全体で約４００ｍｌ）にパッキングする。
【０２１６】
そのカラムを　２００ｍｌの緩衝液で洗い、次にタンパク質がもはや溶出しなくなるまで同じ緩衝液中　０．５ＭのＮａＣｌで洗い、　５００ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ　８．５）で洗う。最後に、純粋な十分の長さの酵素を１％トリエチルアミンｐＨ１１．８で溶出する。その溶出した酵素溶液をｐＨ８に調節し、膜ＤＯＷ　ＧＲ６１ＰＰ（２０ｋＤカットオフのポリプロピレン）でのＡｍｉｃｏｎセルユニットを用いて１ｍｌ当り５ｍｇタンパク質まで濃縮する。その酵素を全て精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを作った。
【０２１７】
自然に　ＣＢＤを欠如するかもしくはリンカーがタンパク質分解により開裂されているセルラーゼ、又は、触媒ドメインの後に停止コドンを挿入することにより　ＣＢＳが除去されているセルラーゼはＡｖｉｃｅｌを用いて精製することができない。細胞外タンパク質を生産生物のない状態で回収する。そのコアセルラーゼを、カチオン交換クロマトグラフィーによりアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）タンパク質のないように精製した。その発酵ブイヨンをｐＨ　３．５に調節し、ろ過して沈殿したタンパク質を除く。次にそのタンパク質を、その溶出液の伝導度が１０００ｍＳ／ｃｍ未満になるまで６ｋＤカットオフのＤＯＷ　ＧＲ８１ＰＰ膜で限外ろ過した（濃縮し水で洗う）。そのサンプルを、最後に、２０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ　３．５で平衡化したＳ−セファロースカラムに適用した。
【０２１８】
その酵素は、この低いｐＨで　Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合するであろう。そしてそれは０〜５００ｍＭ　のＮａＣｌ勾配を用いて単一ピークとして溶出される。その溶出された純粋な酵素をＤＯＷ　ＧＲ８１ＰＰ膜のＡｍｉｃｏｎセルで濃縮した。全ての精製したセルラーゼがＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを供した。
比活性データを以下の表に要約する：
【０２１９】
【表２１】
2004065255.tif 000027
【０２２０】
この実験から、変異　Ｑ１１９Ｈをチエラビア・テルレストリスセルラーゼに導入することにより、生じたセルラーゼ変異体の比活性が相同なヒュミコラ・インソレンスセルラーゼのそれのレベルまで増加したことを見ることができる。
【０２２１】
実施例２．アルカリ能力プロフィールが改良されたチエラビア・テルレストリス変異体
本実験において、チエラビア・テルレストリス／Ｑ１１９Ｄ　を、以下の作製手順を用いた他は、実施例１に記載される通り作製した：容易なカセット交換及び標準的なプライマー利用性のため、ＣＴ１コーディング　ＤＮＡにＣ末端Ｘｂａ１部位を供し、以下に記載されるようにｐＣａＨｊ４１８ベクターにサグクローン化した。ＰＣＴ１を、２つのプライマー：
８９３９：　　ＣＧＡＣＴＴＣＡＡＴＧＴＣＣＡＧＴＣＧＧ
２５３３５：　　ＧＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＡＡＡＧＧＣＡＣＴＧＣ
を適用するａ　Ｐｗｏ　ポリメラーゼ　ＰＣＲ，　９４　Ｃ２　′−３ｘ（９４　Ｃ，　３０″−７２　Ｃ，　１′）−２５ｘ（９４　Ｃ，　３０″−５５　Ｃ，　３０　″−７２，　Ｃ　１′）−７２　Ｃ，　５　′におけるテンプレートとして用いた。
【０２２２】
生じた　７１８ｂｐ　ＰＣＲ産物をＳａｌ１及びＸｂａ１で消化し、その　１６５ｂｐフラグメントを単離した。このフラグメントをｐＣＴ１−２からの８３３ｂｐ　ＢａｍＨ１−Ｓａｌ１フラグメントと一緒に、ｐＣａＨｊ４１８の４．１ｋｂ　Ｘｂａ１−ＢａｍＨ１ベクターフラグメントに連結した。
この連結から、　ｐＣＴ１４１８を大腸菌形質転換体から単離した。
ＰＣＴ２を、テンプレートとして　ｐＣＴ１４１８、選択プライマーとしてＳ／Ｍプライマー及び以下の変異誘発プライマー：
１０９３３０：　ＣＧＡＣＣＴＧＧＧＡＴＣＧＡＡＣＧＡＣＴＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＴＧＣ
で、上述のような　ＣｈａｍｅｌｅｏｎＴＭ二本鎖部位特異的変異誘発キットにより作製した。
【０２２３】
上手く変異されたプラスミドｐＣＴ２を単離し、　ＤＮＡ配列決定により確認し、アスペルギルス・オリザエ株ＪａＬ２２８に形質転換した。
チエラビア・テルレストリスセルラーゼ及びチエラビア・テルレストリス／Ｑ１１９Ｄ　変異体をｐＨ　７．０及びｐＨ１０．０において実施例９に記載されるようにＰＡＳＣに対する活性についてテストした。
結果を以下の表に示す。それは、ｐＨ７における活性と比べたｐＨ１０における活性を示す。これは、チエラビア・テルレストリス／Ｑ１１９Ｄ　変異体が親チエラビア・テルレストリスと比べて相対的によりアルカリ活性を有することを示す。
【０２２４】
【表２２】
2004065255.tif 000028
【０２２５】
実施例３．セルラーゼハイブリッド変異体の作製
プラスミドｐＣＴ３は、チエラビア・テルレストリスエンドグルカナーゼコア酵素をコードする　ＤＮＡ及び次のヒュミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅａ　）のリンカー　ＣＢＤを含む。
ｐＣＴ３を、　ＰＷＯポリメラーゼを適用する配列オーバーラップエクステンション　ＰＣＲにより作製した。
【０２２６】
ヒュミコラ・グリセアのｃＤＮＡクローンから、　４１５ｂｐフラグメントを、以下のプライマー：
１０９４５２：　ＣＧＡＣＴＣＣＡＧＣＴＴＣＣＣＣＧＴＣＴＴＣＡＣＧＣＣＣＣＣ
１０７８１９：　ＣＧＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＧＡＣＴＡＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧ
により作った。
（実施例２に開示される）ｐＣＴ１４１８から、　８７６ｂｐ　ＰＣＲフラグメントを、以下のプライマー：
１０１６２１：　ＧＧＡＴＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＴＡＧＣＡＡＣＣ
１０７８２３：　ＧＧＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＣＧ
により作った。
【０２２７】
両反応のために、次の設定：９６　Ｃ，　１′−３ｘ（９４　Ｃ，　３０　″−５０　　Ｃ，　１′−７２　　Ｃ，　１′）−２５ｘ（９４　Ｃ，　３０　″−６１　　Ｃ，　３０　″−７２　　Ｃ，　１′）−７２　Ｃ，　７′を用いた。その単離された　ＰＣＲフラグメントを、プライマー１０１６２１及び１０７８１９とのアセンブリー　ＰＣＲ反応においてテンプレートとして適用した：９４　Ｃ，　１′−３ｘ（９４　Ｃ，　３０　″−７０　　Ｃ，　１′−７２　　Ｃ，　２′）−２０ｘ（９４　Ｃ，　３０　″−６１　　Ｃ，　３０　″−７２　　Ｃ，　１，　５　″）−７２　Ｃ，　７′。生じた１２６１ｂｐ　ＰＣＲ産物を制限酵素　ＢａｍＨ１及びＸｂａ１により単離・切断し、生じた１１７２ｂｐ　ＤＮＡフラグメントを単離してＢａｍＨ１−Ｘｂａ１消化ｐＣａＨｊ４１８の４．１ｋｂベクターフラグメントに連結した。
正確なクローンを単離し、上述の連結反応により生じた大腸菌ＸＬ１形質転換体から単離したプラスミドの　ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２２８】
ヒュミコラ・グリセアのｃＤＮＡ配列：
【化５】
2004065255.tif 000029
【０２２９】
実施例４．ハイブリッドセルラーゼの変異体の作製
プラスミドｐＰｓＦ４５はＨ．インソレンス　ＥＧＶエンドグルカナーゼシグナルペプチドが先にあるシュードモナス・セルロリチカエンドグルカナーゼコア酵素をコードする　ＤＮＡ及び次の同酵素のリンカー　ＣＢＤを含む。
このハイブリッド酵素の２つの変異体を、以下の変異誘発プライマー：
ＰｓＦ４５／Ｈ１５Ｓ：　　ＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＧＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＴＡＡＣＧＴＧＣＣＣＧＣＧ
ＰｓＦ４５／Ｑ１１９Ｈ：　ＣＧＡＴＧＴＴＴＣＣＧＧＡＧＧＣＣＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧＧＴＴＣＣ
の適用により上述のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ（商標）キットにより作製した：　ＰｓＦ４５／Ｈ１５Ｓ及び　ＰｓＦ４５／Ｑ１１９Ｈ（セルラーゼナンバリング）。テンプレート配列からの誘導はボールドで示される。
【０２３０】
選択プライマーは、プラスミドのラクタマーゼ遺伝子内のユニークＳｃａ１部位をＭｌｕ１部位に変換した：
ＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＣＧＣＧＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣ
２つの変異体を　ＤＮＡ配列決定により確認し、各々の変異体の１つの正確な型を同定した。
変異配列ｐＰｓＦ４５Ｈ１５Ｓ及び　ｐＰｓＦ４５Ｑ１１９Ｈを有する２つのプラスミドを用いて、ＡＭＤＳ選択プラスミド　ｐＴｏＣ２０２と一緒にＡ．オリザエ株ＪａＬ１４２を形質転換した。生じた形質転換体から、　ＬａＣ２８２９及び　ＬａＣ２８３０を、胞子による３回の再単離ステップの後に単離した。
【０２３１】
実施例５．ジスルフィド架橋の除去
ジスルフィド架橋はタンパク質構造を安定化することが知られている。セルラーゼにおけるジスルフィド架橋の除去は、重大な活性を保持しつつ、酵素を不安定（熱安定性）にするであろう。これは、酵素の迅速な不活性化が好まれる適用、例えば、デニム又は織物への適用又は低温工程における適用に役立ち得る。
【０２３２】
この例において、ヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼ及びヒュミコラ・インソレンスセルラーゼの５つの変異体を、ジスルフィド架橋に関連する１つ又は両方の残基を変異することにより作製した。材料及び方法下に開示されるように比活性を測定した。その酵素の融点を、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｃａｌｏｍｅｔｒｙ，　ＤＳＣを用いて測定した。　ＤＳＣは、一定のスキャン比率で　ＭｉｃｒｏＣａｌｃ　Ｉｎｃ．　ＭＣ熱量計を用いて、１時間当り９０℃の比率で２０℃から９０℃に温度を上げて、中性ｐＨ（７．０）　で行った。
結果を以下の表に示す。これは、ジスルフィド架橋の除去はかなり低い融点の変異体を導くが、重大な活性は保持していることを示す。
【０２３３】
【表２３】
2004065255.tif 000030
【０２３４】
実施例６．基質から５Å未満の結合クレフト中の保存された残基の変異
基質から５Åの距離以内にある位置を、第１表の配列アラインメントと比較した時、これらの位置のアミノ酸の型は、次の位置：６，７，８，９，１０，　１１，　１２，　１８，　４５，　１１２，　１１４，　１２１，　１２７，　１２８，　１３０，　１３２，　１４７，　１４８，　１４９についてアラインされたセルラーゼにおいて保存されている。保存されている残基は、通常、活性に極めて重要であると考えられるが、本発明者らは、重大な活性を維持しながら特定の可変性が許容されることを見い出した。２つの残基Ｄ１０及びＤ１２１（セルラーゼナンバリング）のみが合理的な活性を維持するのに必要である。
ヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼの変異体を調製し、材料及び方法に開示されるように比活性を測定した。
【０２３５】
変異の型及び変異体比活性を以下の表に要約する：
【表２４】
2004065255.tif 000031
この実験から、結合クレフト内の保存された残基の変異は、セルラーゼ変異体の大きな活性を保持しつつ行うことができることがわかる。
【０２３６】
実施例７．基質から５Å未満の結合クレフト内の非保存性残基の変異
第１表の配列アラインメント及び開示されたコンピューターモデリング法に基づき、基質から５Åの距離以内に位置し、そのうちのアラインされた配列の中で保存されていない以下の残基をセルラーゼ変異体を作るための関心の点として同定した。
この実験において、基質から５Å以下に位置する非保存性残基をヒュミコラ・インソレンス　ＥＧＶセルラーゼにおいて改変し、その比活性を材料及び方法下に記載されるように測定した。
【０２３７】
変異の型及び変異体比活性を以下の表に要約する：
【表２５】
2004065255.tif 000032
【０２３８】
【表２６】
2004065255.tif 000033
この実験から、結合クレフト内の非保存性残基のほとんどがセルラーゼの活性の全て又はほとんどを保持しつつ変異させることができることがわかる。
【０２３９】
実施例８．界面活性剤における陰イオン性界面活性剤に対する耐性
Ａ．本発明の変異体は、陰イオン性界面活性剤に対して変化したセンシティビティーに関して改良された能力を示し得る。陰イオン性界面活性剤は、界面活性組成物に頻繁に組み込まれる産物である。今までテストされたセルラーゼの非ホールディング化は、タンパク質の固有の蛍光における減衰によって達成される。固有の蛍光は　Ｔｒｐ側鎖（及びより少い程度、　Ｔｙｒ側鎖）由来であり、側鎖環境の疎水性にセンシティブである。非ホールディング化は、側鎖が溶媒に露出されるにつれてより親水性環境を導き、これは蛍光を消光する。
【０２４０】
蛍光は、Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ　ＴＭ　ＬＳ５０　蛍光スペクトロメーターでとらえられる。実際、非ホールディング化への蛍光の大きな変化は、　２８０ｎｍにおける励起及び　３４５ｎｍにおける放射により得られる。（シグナルの大きさを制御する）スリット幅は、通常、５μｇ／ｍｌのタンパク質濃度における放射及び励起の両方について５ｎｍである。蛍光は、循還水浴でサーモスタット調温する２ｍｌクオーツキュベット内で測定され、小さな磁石で撹拌される。マグネットスターラーはスペクトロメーター内におく。
【０２４１】
非ホールド化は、利用できるソフトウェアーを用いて実際の時間において行うことができる。（５〜１０分未満内に完了する）迅速な非ホールド化は、Ｔｉｍｅ　Ｄｒｉｖｅオプションにおいてモニターされる。ここでは、蛍光は、数（２〜５）秒毎に測定される。より非ホールド化を遅くするために、各々のキュベットの蛍光を３０秒毎に測定する　Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　Ｐｒｏｇｒａｍ　オプションを用いてキュベットホルダー内で４つのキュベットを一度に測定することができる。全ての場合において、非ホールド化は、少量（典型的に５０μｌ）の濃酵素、溶液をサーモスタット調温したキュベット溶液に加えることにより開始され、ここでは迅速な磁石の回転により数秒以内に混合が完了する。
【０２４２】
ソフトウェアープログラムＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍにおいてデータを測定する。非ホールド化は、非ホールド化の単一半減期（又は非ホールド化速度定数）を得ることができる一階指数関数に全ての場合、適合する。
典型的な非ホールド化条件は：
ａ．１０ｍＭ　ＣＡＰＳ　ｐＨ　１０，　１０００ｐｐｍ　ＬＡＳ，　４０℃
ｂ．１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ　１０，　２００ｐｐｍ　ＬＡＳ，　２５℃
である。
【０２４３】
両方の場合、タンパク質濃度は５〜１０μｇ／ｍｌである（タンパク質濃度は、　ＬＡＳが過剰であるので、重大でない）。これらの条件下において、ヒュミコラ・インソレンスセルラーゼの非ホールド化は他の酵素と比べることができる。（第１表）。これにより我々は、陰イオン性界面活性剤に対する安定性について次のランク順を作り出すことができる。
チエラビア・テルレストリス／Ｑ１１９Ｈ　〜チエラビア・テルレストリス≫ヒュミコラ・インソレンス〜ヒュミコラ・インソレンス／Ｈ１１９Ｑ
【０２４４】
【表２７】
2004065255.tif 000034
【０２４５】
Ｂ．酵素の表面静電荷の変化はＬＡＳ（直鎖アルキルベンゼンスルホネート）のような陰イオン性界面活性剤に対するセンシティビティーに影響を与えるであろう。特に、正電荷の残基を除去した変異体及び／又は負電荷を導入した変異体は、ＬＡＳに対する耐性を増加させるであろうが、反対、即ち正電荷の残基の導入及び／又は負電荷の残基の除去は　ＬＡＳに対する耐性を低下させるであろう。残基Ａｒｇ　（Ｒ），　Ｌｙｓ　（Ｋ）及びＨｉｓ　（Ｈ）　は陽性又は潜在的に陽性電荷の残基として見られ、残基Ａｓｐ　（Ｄ），　Ｇｌｕ　（Ｅ）及びＣｙｓ　（Ｃ）　は、ジスルフィド架橋に含まれないなら、負又は潜在的に負電荷の残基として見られる。これらの残基のうちの１つを既に含む位置は、変異誘発のための第１の標的であり、第２の標的は、他のセルラーゼ中の等価の位置上のこれらの残基のうちの１つを有する位置であり、そして第３の標的は表面が露出した残基のいずれかである。本実験において、野生型ヒュミコラ・インソレンスセルラーゼは、全部で３つの上述のグループに属するヒュミコラ・インソレンスセルラーゼ変異体と比べられ、界面活性剤における　ＬＡＳに対する安定性を比べる。
【０２４６】
陰イオン性界面活性剤に対するセルラーゼ耐性を、陰イオン性界面活性剤の存在下でのＰＡＳＣ（リン酸膨潤セルロース）での活性対陰イオン性界面活性剤の不存在下でのＰＡＳＣでの活性として測定した。
反応媒体は、界面活性剤製造元ＮＯＰＡ　Ｄｅｎｍａｒｋから市販の通常の粉末界面活性剤５．０ｇ／ｌを含む。界面活性剤は、本実験のための界面活性剤なしで調剤し、ｐＨをｐＨ　７．０に調節した。更に、反応媒体は、　０．５ｇ／ｌのＰＡＳＣを含み、陰イオン性界面活性剤であるＬＡＳ（直鎖アルキルベンゼンスルホネート）あり又はなしであり、その反応は３０分、３０℃の温度で行った。セルラーゼは　０．２０　Ｓ−ＣＥＶＵ／ｌで投与した。３０分のインキュベーションの後、その反応を、２ＮのＮａＯＨで停止し、還元糖端の量を、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドの還元により決定した。還元ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドの吸収の減少はセルラーゼ活性に関する。
【０２４７】
変異の型及び　ＬＡＳ耐性の増加した変異体についての　ＬＡＳに対する耐性を以下の表に要約する。
【表２８】
2004065255.tif 000035
【０２４８】
この表から、正電荷の残基の除去及び／又は負電荷の残基の導入を生ずる残基の変異は　ＬＡＳに対する耐性を増加させることがわかる。
上述の通り、変異の型及び　ＬＡＳ耐性の減少した変異体についての　ＬＡＳに対する耐性を以下の表に要約する：
【０２４９】
【表２９】
2004065255.tif 000036
【０２５０】
【表３０】
2004065255.tif 000037
この表から、正電荷の残基の導入及び／又は負電荷の残基の除去を生ずる残基の変異は、　ＬＡＳに対する耐性を減少させることがわかる。
【０２５１】
実施例９．ｐＨ活性プロフィールの変化
セルラーゼのｐＨ活性プロフィールは、特定の滴定可能な基、典型的には活性部位中の酸性基のｐＨ依存性の挙動により左右される。ｐＨプロフィールは、ジスルフィド架橋に関連しないなら、荷電した又は潜在的に荷電した基、例えばＡｒｇ　（Ｒ），Ｌｙｓ　（Ｋ），　Ｔｙｒ　（Ｙ），　Ｈｉｓ　（Ｈ），　Ｇｌｕ　（Ｅ），　Ａｓｐ　（Ｄ）又はＣｙｓ　（Ｃ）　に関連する残基の置換により又は基質から５Å以内の結合クレフト内の変異によるこれらの特定の滴定可能な基の表面アクセスビリティーの変化により、これらの残基の静電環境を変えることにより変化させることができる。
【０２５２】
この例において、ヒュミコラ・インソレンスセルラーゼ及び荷電した又は潜在的に荷電した残基の置換に関連するヒュミコラ・インソレンスの変異体を、各々ｐＨ７及びｐＨ１０におけるＰＡＳＣに対する活性についてテストした。
【０２５３】
セルラーゼについてのｐＨ至適性を決定するために、我々は、有機緩衝液を選択した。なぜなら、例えばホウ酸塩は、モノ−及びオリゴ−サッカライドと共有結合複合体を形成し、リン酸塩はＣａイオンと共に沈殿し得るからである。ＤＡＴＡ　ＦＯＲＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　第３版　ＯＸＦＯＲＤ　ＳＣＩＥＮＣＥ　ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮＳ　ページ　２２３〜２４１　において、適切な有機緩衝液が見い出されている。それらの　ｐＫａ値に関して、我々は、４〜５．５　の範囲でＮａ−アセテートを、　６．０において　ＭＥＳを、　６．５〜７．５　の範囲においてＭＯＰＳを、　８．０〜８．５　の範囲においてＮａ−バルビツレートを、そして　９．０〜１０．５の範囲においてグリシンを用いることを決めた。
方　法：
その方法は、異なるｐＨにおけるカルボキシメチルセルロースの酵素分解である。緩衝液は、　０．５ｐＨ単位の間隔で　４．０〜１０．５の範囲で調製される。その分析は、カルボキシメチルセルロース中の新しい還元端の形成に基づき、これらは強アルカリ環境において　ＰＨＢＡＨとの反応により視覚化され、それらは　４１０ｎｍにおいて最大吸光度の黄色い化合物を形成する。
【０２５４】
実験プロトコル：
緩衝液調製：　０．２ｍｏｌ　の各々の緩衝液物質を計りとり、　Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水１ｌ中に溶かす。　２５０ｍｌの　０．２Ｍ緩衝液及び　２００ｍｌの　Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水を混合する。ｐＨを、ラジオメーターから標準緩衝液を用いて較正したラジオメーターＰＨＭ９２　ｌａｂｍｅｔｅｒを用いて測定する。緩衝液のｐＨを４Ｍ　ＮａＯＨ　又は４Ｍ　ＨＣｌを用いて実際のｐＨに調製し、水で全部で　５００ｍｌに調節する。Ｎａ−バービツレートをｐＨ　８．０に調節した時、いくらかの沈殿が生じ得るが、これは５０℃に加熱することにより再び溶かすことができる。
酢酸　１００％　０．２ｍｏｌ　＝　１２．０１ｇ．
ＭＥＳ　０．２ｍｏｌ＝　３９．０４ｇ．
ＭＯＰＳ　０．２ｍｏｌ　＝　４１．８６ｇ．
Ｎａ−バービツレート　０．２ｍｏｌ　＝　４１．２４ｇ．
グリシン　０．２ｍｏｌ　＝　１５．０１ｇ．
【０２５５】
緩衝液：
ｐＨ：４．０，　４．５，　５．０　＆　５．５　Ｎａ−アセテート　０．１Ｍ
ｐＨ：６．０　Ｎａ−ＭＥＳ　０．１Ｍ
ｐＨ：６．５，　７．０　＆　７．５　Ｎａ−ＭＯＰＳ　０．１Ｍ
ｐＨ：８．０　＆　８．５　Ｎａ−バービツレート　０．１Ｍ
ｐＨ：９．０，　９．５，　１０．０　＆　１０．５　Ｎａ．　グリシン　０．１Ｍ
実際のｐＨは、主要な値として処理したひと続きのものにおいて測定されるが、停止試薬なしでは、ｐＨは４０℃での２０分のインキュベーション後に測定される。
【０２５６】
基質沈殿：
磁石ロッドを有する　２５０ｍｌ円錐のガラスフラスコ中で、　２．０ｇの　ＣＭＣを　２．５ｍｌの９６％エタノールで湿らせ、　１００ｍｌの　Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水を加え、次に加熱マグネチックスターラーで透明になるまで煮沸する。約２分、煮沸し、マグネチックスターラー上で室温まで冷やす。
【０２５７】
停止試薬：
２％　ＮａＯＨ　に溶かした　１．５ｇの　ＰＨＢＡＨ及び５ｇのＫ−Ｎａ−タートレート
手　順：
５ｍｌのガラステストチューブを用いて３の主要値及び２のブランク値を作った（ｐＨ決定のための１の主要値）。
【０２５８】
【表３１】
2004065255.tif 000038
【０２５９】
Ｈｅｉｄｏｌｐｈ　ＲＥＡＸ　２０００ミキサー上で不変の混合及び最大速度で混合する（９）。温度制御と共に、水浴上でインキュベーションの間、撹拌は行わない。試薬を加え、混合した直後に、サンプルを１０分、煮沸する。５分間、冷やした水道水で冷やす。　４１０ｎｍの吸光度を読む。
【０２６０】
活性の測定
２つの主要値からの　４１０ｎｍにおける吸光度を加え、２で割り、２つのブランク値を加え、そして２で割り、２つの平均値を引いた。割合（％）を、最も高い値を　１００％として用いることにより計算する。
測定されたｐＨを比活性に対してプロットする。
【０２６１】
緩衝液試薬：
酢酸　１００％（ＭＥＲＣＫ　ｃａｔ．ｎｏ．１．０００６３，　ｂａｔｃｈｎｏ．　Ｋ２０９２８２６３　４２２，　ｐＫａ　４．７６，　ＭＷ　６０．０５）；
ＭＥＳ（２〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸）（ＳＩＧＭＡ　ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ−８２５０，　ｂａｔｃｈｎｏ．６８Ｆ−５６２５，　ｐＫａ　６．０９，　ＭＷ　１９５．２）；
ＭＯＰＳ（３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸）（ＳＩＧＭＡ　ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ−１２５４，　ｂａｔｃｈｎｏ．１１５Ｆ−５６２９，　ｐＫａ　７．１５，　ＭＷ　２０９．３）；Ｎａ−バルビツレート（５，５−ジエチルバルビツール酸ナトリウム塩）（ＭＥＲＣＫ　ｃａｔ．ｎｏ．６３１８，　ｂａｔｃｈｎｏ．Ｋ２０２３８０１８　４０４，　ｐＫａ　７．９８，　ＭＷ　２０６．２）；グリシン（ＭＥＲＣＫ　ｃａｔ．ｎｏ．４２０１，　ｂａｔｃｈｎｏ．Ｋ２０５５３５６０１　４０５，　ｐＫａ　９．７８，　ＭＷ　７５．０７）；
ＰＨＢＡＨ（ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）（ＳＩＧＭＡ　ｃａｔ．ｎｏ．Ｈ−９８８２，　ｂａｔｃｈｎｏ．５３Ｈ７７０４）；
Ｋ−Ｎａ−タートレート（酒石酸カリウムナトリウム四水和物）（ＭＥＲＣＫ　ｃａｔ．ｎｏ．８０８７，
ｂａｔｃｈｎｏ．Ａ６５３３８７　３０４）；
ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）（ＭＥＲＣＫ　ｃａｔ．ｎｏ．１．０６４９８，　ｂａｔｃｈｎｏ．Ｃ２９４７９８　４０４）；
ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ　（ＦＭＣ）　７ＬＦ　（１９８９年１１月））。
【０２６２】
陰イオン界面活性剤に対するセルラーゼ耐性を、中性ｐＨ（ｐＨ　７．０）におけるＰＡＳＣ（リン酸膨潤セルロース）での活性対アルカリ性ｐＨ（ｐＨ１０．０）におけるＰＡＳＣでの活性として測定した。
その反応媒体は、界面活性剤製造元ＮＯＰＡ　Ｄｅｎｍａｒｋからの市販の通常の粉末界面活性剤　５．０ｇ／ｌを含んでいる。そのｐＨを、各々ｐＨ　７．０及びｐＨ１０．０に調節した。更に、その反応媒体は　０．５ｇ／ｌのＰＡＳＣを含み、その反応を、３０分、温度３０℃で行った。セルラーゼを　０．２０　Ｓ−ＣＥＶＵ／ｌで投与した。３０分のインキュベーションの後、その反応を２ＮのＮａＯＨで停止させ、還元糖末端の量をｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドの還元により決定した。還元されたｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジドの吸光度の減少はセルラーゼ活性に関する。
【０２６３】
結　果：
結果を以下の表に示す。ｐＨ７に対するｐＨ１０の活性を、野生型ヒュミコラ・インソレンスセルラーゼのそれと比較する。
【０２６４】
【表３２】
2004065255.tif 000039
【０２６５】
上の表から、潜在的に荷電した残基に関する変異体を作ることにより及び／又は基質から５Å未満の結合クレフト内の残基を変えることにより相対的なアルカリ性活性が増加し得ることがわかる。
同様に、以下の表は、潜在的に荷電した残基に関連する他の変異により及び／又は基質から５Å未満の結合クレフト内の残基を変えることにより相対的な酸性活性を増加させることができることを示す。
【０２６６】
【表３３】
2004065255.tif 000040
【０２６７】
【表３４】
2004065255.tif 000041
【０２６８】
【表３５】
2004065255.tif 000042
【０２６９】
【表３６】
2004065255.tif 000043
【０２７０】
従って、この例は、比活性ｐＨプロフィールは、潜在的に荷電した残基に関連する変異体の形成により及び／又は基質から５Å未満の結合クレフト内の残基を変えることにより酸性又はアルカリ性ｐＨに対して変えることができることを証明する。
【０２７１】
実施例１０．陰イオン性界面活性剤に対して耐性であるように作られたセルラーゼの洗浄能力
陰イオン性界面活性剤に対して耐性に作られたセルラーゼの適用効果対ネイティブセルラーゼの適用効果を、　０．１リッターミニ−Ｔｅｒｇ−ｏ−Ｍｅｔｅｒ中のセルラーゼで洗濯したすりへった黒色の綿の布きれの‘色の明白化’として測定した。
その反応媒体はリン酸緩衝液ｐＨ　７．０及び　０．２〜１．０　ｇ／ｌの範囲の種々の濃度の　ＬＡＳを含んでいる。２つの布きれを３０分、４０℃で洗濯し、すすいで、次に乾燥させた。この洗濯サイクルを４回、くり返した。全ての酵素を各々の　ＬＡＳ濃度でテストした。
【０２７２】
最後に、黒色綿布きれを、ヒュミコラ・インソレンス、ＤＳＭ　１８００からの種々の投与量のネイティブセルラーゼ（商標名Ｃａｒｅｚｙｍｅ（商標）で市販）で洗った同様の布きれの標準に対して等級付けした。効果はＰＳＵ（パネルスコアーユニット）で表される。
【０２７３】
【表３７】
2004065255.tif 000044