(57)【要約】【課題】ヌクレオチドプローブおよびそれを用いたグリコペプタイド抗生物質耐性グラム陽性バクテリア検出キットならびに検出方法を提供する。【解決手段】ヌクレオチドプローブがＤＮＡまたはＲＮＡであり、下記ヌクレオチドＶ１またはＶ２であることを特徴とするヌクレオチドプローブ。2004024251.tif 000111【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチドプローブがＤＮＡまたはＲＮＡであり、下記ヌクレオチドＶ１またはＶ２であることを特徴とするヌクレオチドプローブ。
2004024251.tif 000110
【請求項２】
請求項１に記載するヌクレオチドプローブにおいて、該ヌクレオチドプローブが、グラム陽性バクテリアにおいて、グリコペプタイド群の抗生物質またはバンコマイシンならびに／もしくはテイコプラニンに対する抵抗性のためのタンパク質をコードするシーケンスに対して特異的であり、該シーケンスにおいて包括的であることを特徴とするヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
請求項１に記載するヌクレオチドプローブにおいて、該ヌクレオチドプローブは、グラム陽性バクテリア中において、グリコペプタイド群の抗生物質またはバンコマイシンならびに／もしくはテイコプラニンに対して高レベルの抵抗性を発現するために必要なタンパク質をコードするヌクレオチドシーケンスに対して特異的であることを特徴とするヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
請求項１に記載するヌクレオチドプローブにおいて、該ヌクレオチドプローブは、グラム陽性バクテリア中において、グリコペプタイド群の抗生物質またはバンコマイシンならびに／もしくはテイコプラニンに対して低レベルの抵抗性を発現するために必要なタンパク質をコードするヌクレオチドシーケンスに対して特異的であることを特徴とするヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載するヌクレオチドプローブにおいて、該ヌクレオチドプローブが、グリコペプタイド群の抗生物質またはバンコマイシンならびに／もしくはテイコプラニンに対して抵抗性を有する菌種の非クロモソ−ムヌクレオチドシーケンスとハイブリダイゼーションすること、またはグラム陽性球菌の菌種もしくは腸内球菌の菌種もしくはＥ．　ｆａｅｃｉｕｍ　４１４７の非クロモソ−ムヌクレオチドシーケンスとハイブリダイゼーションすることを特徴とするヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
グリコペプタイド群の抗生物質またはバンコマイシンならびに／もしくはテイコプラニンに対して抵抗力を有するグラム陽性バクテリアの菌種であって、グラム陽性球菌に属する菌種、特に腸内球菌もしくはＥ．　ｆａｅｃｉｕｍ　の存在をインビトロで検出するためのキットであって、該キットが、
ａ．請求項１ないし５のいずれか１項に記載するヌクレオチドプローブと、
ｂ．ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰならびにｄＧＴＰからなるオリゴヌクレオチドトリホスフェートと、
ｃ．ＤＮＡポリメリゼーション剤と、
なることを特徴とするキット。
【請求項７】
グリコペプタイド群の抗生物質またはバンコマイシンならびに／もしくはテイコプラニンに対して抵抗力を有するグラム陽性バクテリアの菌種であって、グラム陽性球菌に属する菌種であり、特に腸内球菌もしくはＥ．　ｆａｅｃｉｕｍ　の存在をインビトロで検出するための検出方法であって、該検出方法が、
ａ．生物学的試料を、請求項１ないし５のいずれか１項に記載するヌクレオチドシーケンスによって構成されるプライマーと、請求項６に記載するオリゴヌクレオチドトリホスフェートと、請求項６に記載するＤＮＡポリメリゼーション剤とに接触させて装着して、プライマーとハイブリダイゼーションした各ヌクレオチドに対して延伸生産物を得る延伸工程と、
ｂ．マトリクスとして作用する該延伸生成物からマトリクスを分離する分離工程と、
ｃ．工程ａの延伸工程を繰り返して検出可能な量の所望のヌクレオチドシーケンスを作製する作製工程と、
ｄ．該ヌクレオチドシーケンスの増幅生産物を検出する検出工程と、
からなることを特徴とする検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特にグラム陽性バクテリアについての、殊にグラム陽性球菌群についてのグリコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力の発現に係るポリペプタイドに関するものである。本発明は同様にそのポリペプタイドをコードするヌクレオチドシーケンスに関するものである。更に、本発明はグリコペプタイドに対する抵抗力を菌体外で検出することによってポリペプタイドとそのヌクレオチドシーケンス（配列）を使用することに関する。グラム陽性球菌のうち、本発明はとリわけ腸内球菌、連鎖球菌ならびにブドウ球菌を対象とし、これらの球菌は本発明の成果を利用するために特別に関心があるものである。
【０００２】
グリコペプタイド、そのうちで特にバンコマイシンとテイコプラニンは、バクテリアの細胞壁の合成を阻害する抗生物質である。それらの抗生物質は、特にペニシリンに対するアレルギーならびに抵抗を有するグラム陽性球菌（腸内球菌、連鎖球菌ならびにブドウ球菌）による感染症の治療に利用することができる。バンコマイシンは長い間使用されたにも拘らず、その抗生物質は、抵抗力を有する最初の菌種が始めて単離された１９８６年まではほとんど全ての菌種に対して活性を保持してきた。それ以来、グリコペプタイドに対する抵抗力はヨーロッパやアメリカの数多くの微生物学者によって検出され、特に免疫抑制による患者から単離された菌種については、院内感染による病原微生物の感受性について体系づけられた評価が必要である。
グリコペプタイドの活性は、抗生物質内での複合体ならびにペプチドグリカンの前駆物質の形成と、細胞壁の代謝に係る酵素との直接的な相互作用に基づいている。特に、ペプチドグリカンの前駆物質の末端残基であるＤ−アラニン−Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ）にグリコペプタイドが直接固定することが確認されている。
【０００３】
特に腸内球菌についてのグリコペプタイドに対する抵抗力が最近発現したことにより、あるいくつかの結果が得られると同時にその抵抗力を付与した要因についての検索が行われた。
例えば、ある特定の腸内細菌であるエンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）ＢＭ４１４７において、グリコペプタイドに対する抵抗力の決定因子は３４ｋｂのプラスミドであるプラスミドｐＩＰ８１６に位置していることが確認されている。この決定因子はＥ．ｃｏｌｉにクローンされている（Ｂｒｉｓｓｏｎ　Ｎｏｅｌ　ｅｔ　ａｌ：　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．；　３４，　９２４−９２７，　１９９０）。
【０００４】
今日までに得られた結果によれば、グリコペプタイドに対する抵抗力は約４０ｋＤａの分子量を持つタンパク質の生成に関連していて、そのタンパク質の合成はバンコマイシンのようなあるいくつかのグリコペプタイドの阻止濃度に影響を及ぼしている。
【０００５】
グラム陽性球菌のあるいくつかの菌種に対する抵抗力ならびにグリコペプタイド、特にバンコマイシンとテイコプラニンについての検討並びに究明の結果、本発明者は抵抗菌種についてのプラスミドによって一般的に保持されているシーケンスによってコードされているいくつものタンパク質またはポリペプタイドの発現が関連していることを確認した。本発明者によって得られた新規な結果によって、更には、抵抗の２つの表現型をコードする遺伝子を識別し、一方ではグリコペプタイドに対する高いレベルの抵抗力を有する菌種を、他方ではその低いレベルの抵抗菌種を識別することが可能になった。
【０００６】
高いレベルの抵抗力を有する菌種によって、バクテリアの菌種、特にグラム陽性バクテリアの菌種については、バンコマイシン並びにテイコプラニンのそれらの菌種に対する最小阻止濃度がそれぞれ３２並びに８マイクログラム／ｍｌより高いことが理解されている。バンコマイシン並びにテイコプラニンの低いレベルの抵抗力を持つ菌種に対する最小阻止濃度は１６と３２マイクログラム／ｍｌの間である。これらの菌種は明らかにテイコプラニンに対して感受性を有している。
【０００７】
本発明者は、グリコペプタイドに対する抵抗力を発現するのに必要な成分のうちリガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａとある同族性を有するＶＡＮＡまたはＶａｎＡと名づけられた特定のタンパク質を単離し、精製した。ＶａｎＡはそれにもかかわらずリガーゼとは機能的に区別される。
【０００８】
原則的には、遺伝子については「ｖａｎ」を接頭語として付け、アミノ酸の配列については「Ｖａｎ」を接頭語として付けて命名されている。
【０００９】
本発明はグリコペプタイド群の抗生物質、特にバンコマイシンおよび／またはテイコプラニンに対する抵抗力の発現に係るポリペプタイドやタンパク質に関すると同時に、そのような複合物をコードするヌクレオチドシーケンスに関するものである。
同様に、本発明は、グリコペプタイドに対する抵抗力の検出のために、特に連鎖ポリメライゼーション（ＰＣＲ）のためにまたは抗体の作用を調べる試験のために利用できるヌクレオチドのプライマー（旗印、探索子）を目的としている。
【００１０】
また本発明はポリペプタイドの組成物に関するものであり、そのポリペプタイドの組成物は少なくとも、シーケンスリストにてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１（ＶａｎＨ）、ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ２（ＶａｎＡ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ３（ＶａｎＸ）またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１９（ＶａｎＣ）によって同定されるアミノ酸シーケンスから選ばれたタンパク質またはタンパク質部分、またはＶａｎＨ、ＶａｎＡ、ＶａｎＸもしくはＶａｎＣに対する抗体によって認識される全タンパク質もしくはタンパク質部分、または、厳重なまたは余り厳重でない条件下で、シーケンスリストにおいてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ８、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ９、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１０またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２１によって同定されるヌクレオチド連鎖の１つとハイブリッドもしくは下記に示す部分シーケンスＶ１またはＶ２の１つとハイブリッドされたシーケンスによってコードされている全タンパク質もしくはタンパク質部分によって特徴付けられている。
【００１１】
2004024251.tif 000002
【００１２】
本発明において、グリコペプタイドに対する抵抗力の発現に係るある特定の第１の組成物は、それにはグラム陽性バクテリアに対してグリコペプタイド群の抗生物質、特にバンコマイシンおよび／またはテイコプラニンに対する抵抗力を付与するのに必要な、もしくはグラム陽性球菌群の菌種に対してかかる抵抗力を助長するタンパク質の１つもしくはそれ以上の少なくとも３つのタンパク質もしくはその全タンパク質部分であって、そのタンパク質またはタンパク質部分が、
ａ）シーケンスリストにてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ３によって同定されるシーケンスの１つに対する抗体によって認識されるか、または、
ｂ）シーケンスリストにおいてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ８、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ９またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１０によって同定されたシーケンス、または厳重なまたは余り厳重でない条件下で該シーケンスもしくは相補性シーケンスの１つとハイブリッドされているシーケンスもしくはシーケンスＶ１またはＶ２の１つとハイブリッドされているシーケンスを含む遺伝子によってコードされていることによって特徴付けられる。
【００１３】
そのうえ、それらのシーケンスは、それぞれＯＲＦ３、遺伝子ｖａｎＨ、ｖａｎＡ（またはＯＲＦ２）を含むＯＲＦ１によって示され、それらは菌種エンテロコッカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）ＢＭ４１４７から得られるような抵抗タンパク質を特徴付けている（Ｌｅｃｌｅｒｑ　ｅｔ　ａｌ：　Ｎ．
Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．；　３１９，　１５７−１６１）。
【００１４】
リガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａに結びつくが異なる特異性を有する別のタンパク質であるＶａｎＣはエンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｃｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）ＢＭ４１７３によって特徴付けられ、その遺伝子ｖａｎＣは、その検出に関わるｖａｎＡを決定する領域に対応するために遺伝子ｖａｎＡと十分な相同性を有するドメインを提供する。
エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｇａ１１ｉｎａｒｕｍ）は、バンコマイシンの弱いレベルの抵抗型分離株である（Ｄｕｔｋａ−Ｍａｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ：　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｂｅｒ．；　３４（１９９０ｂ），　１８７５−１８７９）。
【００１５】
本明細書中で使用する用語「ポリペプタイド」には、タンパク質を含むアミノ酸のすべての連鎖、またはタンパク質のそれよりも小さい部分が含まれる。
【００１６】
上記で問題となる厳重な条件は、ヌクレオチドシーケンスのハイブリダイゼーションに関する常法に従って決定される。たとえば、遺伝子ｖａｎＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ８）のシーケンスとハイブリッドされるシーケンスに関しては，以下の条件が適用できる。つまり、
−厳重な条件下でのハイブリダイゼーションのためには：反応温度６５度で１夜、０．１％ＳＤＳ、０．７％脱脂粉ミルク、６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍナトリウムくえん酸、ｐＨ＝７．０）２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で６５度で洗浄
−余り厳重でない条件下でのハイブリダイゼーションのためには：
ハイブリダイゼーションの温度は６０度で１夜おいて、４５度の温度で洗浄
【００１７】
グリコペプタイドに対する抵抗力の発現は、グリコペプタイドに対して感受性のある通常の病原微生物による感染の持続性によって表される。
【００１８】
１つのポリペプタイドまたはタンパク質がグリコペプタイドに対する抵抗力の発現には必要であり、従ってそれがなければそのポリペプタイドもしくはそのタンパク質を含む菌種を、かかるポリペプタイドもしくはタンパク質が存在しない感受性菌種よりも、グリコペプタイドに対してよリ感受性を高くする。
【００１９】
グリコペプタイドに対する抵抗力のレベルは、特にグラム陽性球菌の菌種により異なっている。
【００２０】
本発明の好ましい態様によれば、ポリペプタイドは上記に定めた組成物に含まれ、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１（ＶａｎＨ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２（ＶａｎＡ）およびＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ３（ＶａｎＸ）としてシーケンスリストにて同定されたタンパク質の結合に対応している。
【００２１】
従って、本発明者によって、グラム陽性バクテリアについてのグリコペプタイドに対する抵抗力の発現には、少なくとも３つのタンパク質もしくはそのタンパク質に由来したポリペプタイドが発現することが必要であることが確認された。
【００２２】
本発明を実施する第１の態様によれば、組成物のポリペプタイドはそのうえ、グリコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力の発現に必要なアミノ酸シーケンスが、調節要素、特に、シーケンスリストにおいてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ４またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ５として同定されたシーケンスに対応するタンパク質、つまりそれぞれが調節シーケンスＲと感知（センサー）シーケンスＳに対応しているタンパク質の制御下にあることにより特徴付けられている。
【００２３】
タンパク質ＶａｎＳとＶａｎＲとは２つの構成要素に対する調節系を構成しておリ、ＶａｎＲは転写を活性化し、ＶａｎＳはＶａｎＲに依存している転写を増進している。ＶａｎＳは、外部培地に示されたバンコマイシンに応答してＶａｎＲのホスホリレーションのレベルを変化させることができ、従ってバンコマイシンに対する抵抗力を有する遺伝子の転写の制御に干渉する。
【００２４】
それらの調節シーケンスは、本発明のポリペプタイドに含まれた抵抗タンパク質の発現を助長する範囲内で、特に、抵抗のレベルを増大することができる。
【００２５】
本発明の有利な実施をするための別の態様では、上記組成物のポリペプタイドは、前述した５つのタンパク質をコードするシーケンスを表すところの、シーケンスリストにおいてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６として示すシーケンスによってコードされている。
【００２６】
本発明の別のシーケンスは、トランスポセース（ｔｒａｎｓ　Ｐｏｓａｓｅ）（シーケンスのｂｒｉｎ（−）にてコードされている）をコードするＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６の下流の連鎖のように、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６を含むＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１１として示され、そしてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６の下流の連鎖は３８ｂｐの繰り返し逆転シーケンスの遺伝子ｖａｎＹ及び遺伝子ｖａｎＺならびにそれぞれの末端に対応している。ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１１は、遺伝子がグリコペプタイドに対する抵抗力を確立するのに異なるレベルで干渉するトランスポゾンを構成している。
【００２７】
同様に、本発明は、前述した組成物ならびにポリペプタイドに属する精製タンパク質を目的としている。特に、本発明は、シーケンスリストにＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２として示したアミノ酸シーケンスに対応することを特徴とする精製タンパク質ＶａｎＡまたは遺伝子ｖａｎＡとハイブリダイゼーションできる遺伝子によってコードされているタンパク質ＶａｎＣを対象にしている。
【００２８】
タンパク質ＶａｎＡは３４３個のアミノ酸からなり、理論分子量は３７４００Ｄａである。タンパク質ＶａｎＣは３４３個のアミノ酸からなり、理論分子量は３７４０４Ｄａである。
本発明の構成において関係のある別のタンパク質はシーケンスリストにＳＥＱ　ＩＤＮｏ１（ＶａｎＨ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ３（ＶａｎＸ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ４（ＶａｎＲ）およびＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ５（ＶａｎＳ）として示されたシーケンスに対応している。
【００２９】
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１によって同定されたシーケンスは、遺伝子ｖａｎＨによってコードされたタンパク質ＶａｎＨを含んでいて、そのタンパク質は３２２個のアミノ酸からなっていて、メチオニンから始まっている。そのタンパク質はペプチドグリカンの合成に関わる酵素であって、３５７５４ｋＤａの分子量を有している。タンパク質ＶａｎＨは、２−ケトカルボン酸を形成するための対応する２−ヒドロキシカルボン酸のＮＡＤ＋に従属する酸化反応を触媒するデヒドロゲネースに類似するあるいくつかのものを提供する。実際は、タンパク質ＶａｎＨはＮＡＤ＋よりもむしろＮＡＤＰ＋を使用している。同様に、タンパク質ＶａｎＨは、恐らく直接に基質の結合に関係していて、触媒の作用をしている。タンパク質ＶａｎＨはリガーゼＶａｎＡの基質の合成に関与している。タンパク質ＶａｎＡの基質はＤ−α−ヒドロキシカルボン酸であって、これは、バンコマイシンとＮ−アセチル−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンと間に形成された水素結合がＤ−アラニン末端のＮＨ基と結合することによって水素結合が無くなって、ペプチドグリカンの前駆物質とバンコマイシンとの結合に作用するアミノ酸Ｄの場所にタンパク質ＶａｎＡによってＤ−アラニンと縮合している。「Ａｌａ」は「アラニン」の略語である。
【００３０】
本発明者はタンパク質ＶａｎＡとＶａｎＨにおける相互作用を明らかにし、特に次のように述べている。つまり、タンパク質ＶａｎＡ（その基質のために変更された特異性を持つリガーゼＤ−Ａｌａ：Ｄ−Ａｌａ）の性質はタンパク質ＶａｎＡによるＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａの異なる新規な構成物の生合成に関与するグリコペプタイドに対する抵抗を可能にし、そのペプタイドはペプチドグリカンに導入されているがバンコマイシンによっては認識されない。特に、遺伝子ｖａｎＨの生成物における特異的なα−セト酸レダクテースＤとの類似性を観察すると、その構成物がアミノ酸Ｄは有していないが、ヒドロキシ酸Ｄを有していることが決定されている。このヒドロキシ酸Ｄはしたがってペプチドグリカンの新規なデプシペプタイド前駆体を生成するタンパク質ＶａｎＨによってＤ−アラニンと関連している。
【００３１】
本発明は、上記タンパク質の１つもしくはそれ以上を含むハイブリッドタンパク質や、決定されたアミノ酸シーケンスに関連するそのタンパク質と同様に、抵抗複合体のその異なるタンパク質のすべての組み合わせを対象としている。
【００３２】
さらにまた、本発明の枠組みにおいて、ヌクレオチドシーケンスは前述したアミノ酸シーケンスの１つをコードしている。
【００３３】
ある特定のシーケンスは、前出の刊行物（レクレルクら：１９８８年）に記載されたプラスミドｐＩＰ８１６から得られるところの制限フラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩに対応する約７．３ｋｂのヌクレオチドシーケンスである。
【００３４】
その７．３ｋｂのシーケンスは３つの抵抗のタンパク質と、上記において問題とされる２つの調節タンパク質とをコードするヌクレオチド連鎖を含んでいる。コードされたそれらのシーケンスは内部フラグメントＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩに含まれている。同様にそれらはトランスポセースおよびレゾルベースのコードされたシーケンスの部分を含んでいる。
【００３５】
本発明は、制限フラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩのすべての部分、特に、抵抗タンパク質３つをコードする約３．４ｋｂのフラグメントＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩもしくはタンパク質ＶａｎＡをコードする約１．７ｋｂのフラグメントＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩまたは２つの調節タンパク質ＶａｎＲとＶａｎＳをコードする制限フラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩと同様に、上記制限フラグメントを含むヌクレオチドフラグメントを対象にしている。
【００３６】
本発明のヌクレオチドシーケンスの別の定義は、前述したｐＩＰ８１６から得られた下記制限部位の順番に含まれるヌクレオチドフラグメントに相当している。つまり、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ。
【００３７】
本発明による別のヌクレオチドシーケンスは、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ７、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１１またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２２によって同定されたシーケンスの中から選ばれた連鎖に対応するシーケンスまたはその連鎖もしくはその連鎖のすべての部分、さらには全ての連鎖もしくは相補ＤＮＡ連鎖もしくはそのＤＮＡの１つに対応するＲＮＡの連鎖によって特徴付けられる。そのシーケンスは、特にグラム陽性球菌群の菌種において、グリコペプタイド群の抗生物質、特にバンコマイシンおよび／またはテイコプラニンに対する抵抗を検出するためのハイブリダイゼーションのプライマーを構成しているか、それとも特にグラム陽性球菌群の菌種において、グリコペプタイド群の抗生物質、特にバンコマイシンおよび／またはテイコプラニンに対する抵抗を発現するために必要なまたは関連しているシーケンスをコードしているかのいずれかである。
【００３８】
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ７のシーケンスは、３つの抵抗タンパク質ＶａｎＨ、ＶａｎＡおよびＶａｎＸをコードしている。
【００３９】
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２２とＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１１のシーケンスは、図４ａに示すトランポゾンを含んでいて、このトランポゾンは、たとえば、抵抗の表現型を得るために必要な遺伝子の発現の調節に関与する抵抗か、または得られた抵抗ポリペプタイドの量に関与する抵抗に関連する遺伝子のように、グリコペプタイドに対する抵抗力の発現に必要な遺伝子を含んでいる。
【００４０】
上記定義に対応する特定のシーケンスは下記シーケンスのうちの１つである。つまり、
2004024251.tif 000003
【００４１】
シーケンスＶ１とＶ２とは、遺伝子ｖａｎＡとｖａｎＣを検出するために調べられた特異性の程度にしたがって、その他のヌクレオチドに関連した場合にはプライマーを構成することが可能であり、まるで連鎖ポリメライゼーション反応の開始端のように使用される。
【００４２】
ヌクレオチドの好ましい別の連鎖は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ８、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ９、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１０、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２１、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１２（トランスポセース）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１３（レゾルベース）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１４（ｖａｎＹ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１５（ｖａｎＺ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２３（ｖａｎＲ）、またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２４（ｖａｎＳ）の連鎖、またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ８（ｖａｎＡ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ９（ｖａｎＨ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１０（ｖａｎＸ）またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２１（ｖａｎＣ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１２（トランスポセース）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１３（レゾルベース）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１４（ｖａｎＹ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１５（ｖａｎＺ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２３（ｖａｎＲ）、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２４（ｖａｎＳ）にて示される連鎖にてコードされたタンパク質のそれに類似している免疫学的および／または機能的な性質を有するタンパク質をコードしているその連鎖の１つの変異種もしくはグリコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力を有する菌種を検出することが可能であるところの連鎖である。
【００４３】
変異種には下記性質を有するシーケンスのフラグメントの全てを含んでいる。このシーケンスは、抵抗タンパク質ＶａｎＨ、ＶａｎＡ及びＶａｎＸをコードしている。
【００４４】
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ８で命名されたヌクレオチドシーケンスは、プラスミドｐＡＴ２１４（配列表その２）上の位置３７７のコドンＡＴＧと位置１４０６のコドンＴＧＡとの間に位置する１０２９ｐｂのＤＮＡフラグメントに相応している。
【００４５】
本発明は同様に、５つのタンパク質（２つの調節タンパク質と３つの抵抗クンパク質Ｖ）をコードしたシーケンスに対応し、かつ、同じようにコードされたシーケンスに関連する並列シーケンスを含むまたはその連鎖を含むＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６で同定された連鎖に相当するヌクレオチドシーケンスを対象としている。
【００４６】
本発明の枠組みの中には同様に、並列シーケンスが欠落することによって特徴付けられるＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６について修飾されたシーケンスが含まれる。この並列シーケンスは後記の様に表されかつ次のように定められる連鎖である。つまり、
−配列表その１のシーケンスの塩基１と塩基１４７６の間のＲをコードするシークエンスの上流の連鎖
−配列表その１のシーケンスの塩基３３４７と塩基３５００の間の感知タンパク質ＳおよびＯＲＦ１をコードするシーケンスの間の連鎖、または
−配列表その１のシーケンスの塩基６１６８と塩基７２２７の間のＯＲＦ３をコードするシーケンスの下流の連鎖。
【００４７】
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６と名付けられたシーケンスはまた次の順序の部位を含むフラグメントによって特徴付けられている。つまり、
ＢｇｌＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ。
【００４８】
調節タンパク質及び抵抗タンパク質の位置は図３に示している。
【００４９】
本発明者らは、定められたレベルのグリコペプタイドに対する抵抗力の発現に必要なまたは関連する遺伝子ｖａｎＲ、ｖａｎＳ、ｖａｎＨ、ｖａｎＡおよびｖａｎＸの上流並びに下流に、トランスポセース及びレゾルベース（上記グループの上流に）及び遺伝子ｖａｎＹとｖａｎＺ（そのグループの下流に）をコードする遺伝子を同定した。トランスポセースならびにレゾルベースの遺伝子は形質転換に関与していて、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチデースをコードする遺伝子ｖａｎＹは、ペプチドグリカンの代謝に関与し、かつ、たとえ複製の数を増やしたプラスミドに含まれる遺伝子ｖａｎＲ、ｖａｎＳ、ｖａｎＨ、ｖａｎＡおよびｖａｎＸが単独で高いレベルの抵抗を付与したとして、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７についてのグリコペプタイドに対する抵抗力に寄与している。
【００５０】
トランスポセースをコードするシーケンスは、遺伝子ｖａｎＲ、ｖａｎＳ、ｖａｎＨ、ｖａｎＡ、ｖａｎＸ、ｖａｎＹ、ｖａｎＺならびにレゾルベースをコードするＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２２で示されるシーケンスのｂｒｉｎ（−）上に位置していることは注目に値する。
【００５１】
本発明は下記シーケンスリストにて同定したＤＮＡシーケンスばかりでなく相補ＤＮＡシーケンスや対応するＲＮＡシーケンスをも対象としている。本発明はその上、前述したタンパク質、ポリペプタイドもしくはそれらのフラグメントの発現の点でまたは、例えば連鎖ポリメライゼーション反応による、バンコマイシンやテイコプラニンのようなグリコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力を有するグラム陽性バクテリアの菌種を検出する能力の点で均等な前記シーケンスにも関している。
【００５２】
同様に本発明には、上記ヌクレオチドシーケンスの１つを含む組換えシーケンスによって特徴付けられる。　本発明はまた、上記ヌクレオチドシーケンスの１つを含むこと、特定された宿主についての特にバンコマイシンやテイコプラニンのような抗生物質に対する抵抗力の発現を干渉することができる調節要素の制御下において複製にとっては必須ではない部位に上記ヌクレオチドシーケンスの１つが含まれていることを特徴とする組換えベクターに関する。
【００５３】
本発明を実施するに当たって特に有利な組換えベクターは次のベクターである。つまり、タンパク質ＶａｎＡをコードするヌクレオチドシーケンスを含む１７６１ｂｐのフラグメントＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩＩを含むｐＡＴ２１４であり、本発明のシーケンスはプロモーターｌａｃのようなプロモーターの制御下にあるベクター内に配置するのが有利である。
【００５４】
本発明は更に、バンコマイシンおよび／またはテイコプラニンのようなグリコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力の発現に関わる条件下で、前記したようなヌクレオチドシーケンスまたは前述したベクターを含む組換え細胞宿主を対象としていて、その宿主は例えば特にグラム陽性球菌のようなバクテリアから選ばれる。
【００５５】
本発明はまた酵母、菌類、昆虫細胞またはほ乳動物にも適用できる。
【００５６】
同様に本発明は、前出のシーケンスとハイブリダイゼーションができることを特徴とするヌクレオチドプライマーを対象とし、そのプライマーは必要により標識が付けられる。そのプライマーはグリコペプタイドに対する抵抗を有するタンパク質を特定している場合もあり、また特定していない場合もある。
【００５７】
本発明に使用される標識物質には、周知の放射性標識物質と同様に酵素標識物質や化学蛍光標識物質のようなその他の標識物質も含まれる。
【００５８】
そのように標識されたプライマーはグラム陽性バクテリアについてのグリコペプタイドに対する抵抗力を検出するためのハイブリダイゼーションによる試験に利用できる。その場合には、厳しくない条件を使用できる。
【００５９】
本発明に係るヌクレオチドプライマーは、特にバンコマイシンおよび／またはテイコプラニンのようなグリコペプタイドに対する抵抗力を持つタンパク質をコードするシーケンスをグラム陽性バクテリアについて特定することを特徴とし、そのプライマーはその上そのシーケンスの中で包括的である。
【００６０】
本発明においては、感受性菌種全体について示されたシーケンスと交差ハイブリダイゼーション反応も増殖（ＰＣＲ）反応も示さないような、本発明の前記タンパク質の１つをコードするヌクレオチドシーケンスと、特定されたそのプライマーによってハイブリッドされた全てのオリゴヌクレオチドが含まれる。
連鎖ポリメライゼーション反応（ＰＣＲ）に使用できるオリゴヌクレオチドに包括的な特長はグリコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力を持つグラム陽性バクテリアのどれか１つの菌種についての抵抗に関わるヌクレオチドシーケンスの増殖を特異的に促進する能力によって決定される。
【００６１】
本発明に係るヌクレオチドプライマーの部分は調べた利用の機能が異なっていてもよい。ＰＣＲに使用されるオリゴヌクレオチドはその技術において通常の長さのフラグメントに左右される。そのプライマーを作製するためには、例えば２００個のヌクレオチドのプライマーフラグメントのような本発明のシーケンスの全ての部分を用いる。
【００６２】
本発明を実現する特定の実現態様によれば、ヌクレオチドプライマーは特にバンコマイシンやテイコプラニンのようなグリコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力を高いレベルで持つグラム陽性バクテリアについての発現に必要なタンパク質をコードするヌクレオチドシーケンスの特異性またはそのヌクレオチドシーケンスに基づいて選択される。
【００６３】
関係のあるプライマーの例としては、遺伝子ｖａｎＡの遺伝子間部分中から選択することができる。
【００６４】
本発明の実現のために有利な別のプライマーは、前記定義によって包括的であるが、抵抗遺伝子にとっては特異的ではない性質によって特徴付けられる。それらはＰＣＲの開始端としても同様に使用され、それらは次のように示される。つまり、
2004024251.tif 000004
【００６５】
Ｖ１とＶ２とは遺伝子ｖａｎＡとｖａｎＣとハイブリダイゼーションされ、グリコペプタイドに対する抵抗力に関連するタンパク質を別の微生物について検出することができる。
【００６６】
本発明の特有の別のプライマーは、特にグラム陽性バクテリアについて特にバンコマイシンのようなグリコペプタイド群の抗生物質に対し低いレベルの抵抗の発現に必要なタンパク質をコードするヌクレオチドシーケンスの特異的な性質を有している。
【００６７】
同様に、タンパク質ＶａｎＡをコードする遺伝子ｖａｎＡのシーケンスに由来するオリゴヌクレオチドのプライマーは高いレベルまたは低いレベルの抵抗を一様に調べるために使用することができる。
【００６８】
本発明においては、特に好ましい型のプライマーは、特にバンコマイシンおよび／またはテイコプラニンのようなグリコバプタイドに対する抵抗力を持つグラム陽性の菌種の染色体もしくは非染色体のヌクレオチドシーケンスとのハイブリッド、特にグラム陽性の球菌、例えば腸内球菌、好ましくはＥ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７もしくはＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍの染色体もしくは非染色体のヌクレオチドシーケンスとのハイブリッドによって特徴付けられる。
【００６９】
高いレベルの抵抗を持つ菌種を低いレベルの抵抗を持つ菌種から識別するためには、厳しい条件を使用したハイブリダイゼーションによる試験を行う。
【００７０】
本発明のオリゴヌクレオチドは制限酵素で切断したリ、または古典的な方法による化学合成によって得られる本発明のシーケンスから得ることができる。
【００７１】
さらに、本発明は、上記ポリペプタイドまたは前記アミノ酸シーケンスを認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を対象にしている。
【００７２】
それらの抗体は抗体製造の古典的な方法に従って製造することができる。特にモノクローナル抗体は、コーラー・ミルシュタインの方法に従って製造される。この方法は、古典的な方法によって事前に本発明のポリペプタイドまたはその組成物で免疫したマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させることによってモノクローナル抗体を製造する方法である。
【００７３】
本発明のモノクローナル抗体は、特にバンコマイシンならびにテイコプラニンに対する抵抗力によって特徴付けられるタンパク質の存在を検出するために有利に使用できる。
【００７４】
特に関係のある抗体はタンパク質ＶａｎＡまたはタンパク質ＶａｎＣに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。これらの抗体は、グリコペプタイド群の抗生物質に対して高いレベルの抵抗力を持つ特にグラム陽性球菌のようなバクテリアの菌種を有利に検出できる。その場合、検出のためにマウスの試料細胞を事前に溶解する段階では、その試料を抗体と前もって接触させることができる。
【００７５】
その検出を可能にするためには、たとえば放射性物質もしくはその他で標識した抗体を使用するのが有利である。
【００７６】
したがって、本発明の枠組みによれば、グリコペプタイドに対する抵抗力をグラム陽性バクテリアについて検出するための試験にはＥＬＩＳＡ法が使用される。
【００７７】
たとえばＥ．ｆａｅｃｉｕｍもしくはＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍなどのたとえば腸内球菌などの特に球菌に属するところの特にバンコマイシンおよび／またはテイコプラニンなどのグリコペプタイドに対する抵抗力を持つグラム陽性菌種の存在をｉｎ　ｖｉｔｒｏで診断するためのキットは、下記を含むものとして特徴付けられる：
−標識された場合には上記定義に応答する抗体
−抗体−抗原免疫反応の検出のための試薬
−必要に応じて、試験試料の細胞を溶解するための試薬。
【００７８】
その他、本発明者によって完成された手段は、連鎖ポリメライゼーション反応（ＰＣＲ）によるグリコペプタイドに対する抵抗力を持つグラム陽性菌種の検出するための迅速かつ信頼性のある試験またはキットを実現するために適合されるまったく興味のある利点を提供する。そのような試験は、あまり信頼性が高くなくかつある場合にはグラム陽性バクテリアについてのグリコペプタイドに対する抵抗力を持つタンパク質をコードする遺伝子群の代表的な全てを検出できる現行の試験の感度を改良することができる。
【００７９】
そのタンパク質の遺伝子を増殖する方法による試験はＰＣＲ法によってまたはＩＰＣＲ（逆連鎖ポリメライゼーション反応の略語）法によって行うことができる。
【００８０】
ＩＰＣＲ法は、検出が望まれている遺伝子の末端ＮＨ２およびＣＯＯＨ領域を増幅することができる。　ある特定の開始端は弱いレベルの抵抗菌種の遺伝子を増幅することが可能である。その開始端はたとえば抵抗タンパク質ＶａｎＡをコードするシーケンスから選択される。
【００８１】
たとえば、後述するシーケンスの例はＰＣＲ法またはＩＰＣＲ法による増幅を検出するためのプライマーを製造するための開始端として使用することができる。つまり、
2004024251.tif 000005
（式中、Ｘは塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのうちの１つを表すかまたはイノシンの場合にはその全てに対応する）
【００８２】
本発明は、当然のことながら、場合によっては、それが対応するＲＮＡプライマーと同様な前述したオリゴペプタイドの相補性プライマーを対象としている。
【００８３】
たとえばＥ．ｆａｅｃｉｕｍもしくはＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍなどのたとえば腸内球菌などの特に球菌に属するところの特にバンコマイシンおよび／またはテイコプラニンなどのグリコペプタイドに対する抵抗力を持つグラム陽性菌種の存在をｉｎ　ｖｉｔｒｏで診断するためのキットは、下記を含むものとして特徴付けられる：
−上記定義に応答するヌクレオチドのプライマー及び場合により
−調べるシーケンスの増幅をするために必要な量のオリゴヌクレオサイドトリホスフェート
−ハイブリダイゼーションのバッファー
−ＤＮＡのポリメライゼーション剤
【００８４】
同様に、たとえばＥ．ｆａｅｃｉｕｍもしくはＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍなどのたとえば腸内球菌などの特に球菌に属するところの特にバンコマイシンおよび／またはテイコプラニンなどのグリコペプタイドに対する抵抗力を持つグラム陽性菌種の存在をｉｎ　ｖｉｔｒｏで検出する方法は、下記のステップを含むものとして特徴付けられる：
ａ）抵抗菌種を含む余地がある生物試料を、グリコペプタイドに対する抵抗力を発現するために必要な対象ヌクレオチドシーケンスとハイブリダイゼーションができるところの、上記ヌクレオチドシーケンスから構成されている開始端と、または前記シーケンスの部分全と接触させる手段からなり、それらのシーケンスをマトリックスとして、その開始端とハイブリダイゼーションされるそれぞれのヌクレオチドシーケンスに対して、マトリックスに相補するそれぞれの開始端からの延長生成物が合成されるようなハイブリダイゼーションの条件下で、４つの異なるオリゴヌクレオサイドトリホスフェートとポリメライゼーション剤の存在下にて使用するステップ
ｂ）そのマトリックスおよび得られた延長生成物の分離ステップであって、そのときに後者をマトリックスのように作用させるステップ
ｃ）対象ヌクレオチドシーケンスを検出できる量を得るための上記ステップａ）を繰り返すステップ
ｄ）該ヌクレオチドシーケンスの増幅生成物を検出するステップ。
【００８５】
対象シーケンスの延長生成物の検出は、ＰＣＲ法またはＩＰＣＲ法を実施するために使用される開始端と同一のプライマーまたはプライマーが標識されている場合には該開始端とは異なる該プライマーによって可能である。
【００８６】
ＰＣＲ法を使用する手段に関する詳細は特許公報ＥＰ０２２９７０１およびＥＰ０２００３６２に記載されている。
（配列表その１）
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６と対応するタンパク質を示す。
（配列表その２）
遺伝子ｖａｎＡと対応するタンパク質のシーケンス。
（配列表その３）
図５で示したトランスポゾンのヌクレオチドシーケンスと対応するタンパク質のアミノ酸シーケンス。ヌクレオチドシーケンスは、その上にトランスポセースのコードシーケンスが局在するｂｒｉｎ（＋）とｂｒｉｎ（−）（位置１から位置３１８９までに局在しているｂｒｉｎ（＋）と相補的であるシーケンスに対応している）。
（配列表その４）
遺伝子ｖａｎＣ含むプラスミドｐＡＴ２１６の１３４７ｂｐのＳａｃＩ−ＰｓｔＩのフラグメントのヌクレオチドシーケンス。番号は制限部位ＳａｃＩの最初の塩基Ｇから付けられている。位置２１５の翻訳開始コドンＡＴＧの上流の潜在的なシーケンスＲＢＳには下線を付けている。ＳＴＱＰ（ＴＧＡ）コドンには＊印を付けている。遺伝子ｖａｎＣのコード領域ならびにそのアミノ酸シーケンスは太く肉付けした文字で示している。重なったシーケンスのクローンはバクテリオファージＭ１３ｍｐ１０（英国アマシャム社）中でのプラスミドｐＡＴ２１６のサブクローンの制限フラグメントによって作製される。包括的な開始端（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｂｅｖｅｆｌｙ　ＭＡ）は組換えファージの挿入体をシーケンスするために使用される。このシーケンスはＤＮＡポリメレースＴ７（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ；ＵＳ　Ｂ　ＣＯＲＰ社製；アメリカ国オハイオ州）と［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（英国アアマシャム社製）を使用してヌクレオチドジデオキシ法（サンガーら：ＰＮＡＳ；　７４，　５４６３−５４６７，　１９７７）によって行われる。反応生成物は６％変性ポリアクリルアミドのゲル上に注入された。
（配列表その５）
タンパク質ＶａｎＣ、ＶａｎＡ、ＤｄｌＡ及びＤｄｌＢのアミノ酸シーケンスの配列。（Ｉ）で示したアミノ酸と４つのシーケンス甲の保存代替（Ｃ）は配列中に示している。保存代替を分類するために、アミノ酸を次のようにグループ分けした。つまり、ＲＫ、ＬＦＰＭＶＩ、ＳＴＱＮＣ、ＡＧＷ、Ｈ、ＥＤおよびＹ。ドメイン１、２、３及び４の同族（ホモローグ）部分の領域には下線を付けている。ペプタイド１および２に相当するシーケンス早印で示している。
【００８７】
遺伝子ｖａｎＶの同定法
遺伝子ｖａｎＶの同定と特徴化のための材料と方法
2004024251.tif 000006
エンテロコッカス細胞膜の製造
【００８８】
エンテロコッカス・ファセシウムＢＭ４１４７をハートブレインブイヨン（培地ブロスＢＨＩ）５００ｍｌ中で光学密度（ＤＯ６００）が０．７になるまで培養した。誘発はバンコマイシン（米国イーライリリー杜製）１０マイクログラム／ｍｌで実施した、最終ステージは４度で実施した。細胞は６０００Ｇで１０分間遠心分離して分離し、バッファーＴＥ（０．ＯｌＭ　ＴＲＩＳ−ＨＣｌ，　０．００２Ｍ　ＥＤＴＡ，　ｐＨ７．０）で洗浄し、ガラスビーズ（直径１００マイクロメータ）に２分間ブラウン装置を用いて溶菌した。細胞残査は６０００Ｇで１０分間遠心分離をして分離した。細胞膜は６５０００Ｇで遠心分離して回収し、バッファーＴＥ０．５ｍｌ中に懸濁させた。
【００８９】
ミニセルの製造
プラスミドを、形質転換によって、バクテリアのサック状に調整したイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＲ１０６２中に導入した。バクテリアサックはしょ糖傾斜にて回収し、タンパク質はランバッハとホグネスの方法（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．　ＵＳ；　７４，　５０４１−５０４５，　１９７７）に従って［３５Ｓ］Ｌ−メチオニン（英国アマシャム社製）５０マイクロＣｉで標識した。
【００９０】
イー・コリの細胞膜フラクションと細胞質フラクションの製造
イー・コリＪＭ８３とその誘導種を光学密度〔ＯＤ６００〕が０．７になるまでＢＨＩ培地にて培養し、バッファーＴＥで洗浄し、懸濁した。細胞懸濁液はブランソンＢ７型超音波発生装置を用いた細胞フラグメンテーション装置にて５０Ｗの用量で超音波で２０秒間処理し、全細胞を６０００Ｇで遠心分離して除去した。上清液を１０００００Ｇで１時間遠心分離して細胞膜フラクションと細胞質フラクションとに分画した。
【００９１】
ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
バクテリアフラクションのタンパク質はポリアクリルアミド（７．５％−１５％）（ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ），　Ｎａｔｕｒｅ：　２２７，　６８０−６８５，　１９７０）の直線傾斜ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。電気泳動は２００Ｖで１時間、３５０Ｖで３時間行った。ゲルはクマシー色素で染色した。抽出液のタンパク質は１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィーで発色させた。
【００９２】
タンパク質バンドの精製とＮ末端シーケンスの決定
エンテロコッカス・ファセシウムＢＭ４１４７の培養液の細胞膜フラクションのタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。得られたゲルは、泳動装置（電気泳動装置ＬＫＢ２１１７マルチフォーＩＩ）を用いて装置製造者のマニュアルに従ってポリビニリデンジフルオライド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ，　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で２００ｍＡで１時間電気泳動をした。泳動したタンパク質はポンソー赤色素で染色し、所望のタンパク質を有する膜部分を切り出し、テフロンフィルターに装着し、シークエンサー（アプライドバイオシステム４７０Ａ型シークエンサー）のセル中に装着した。タンパク質はエドマンの自動分解法によりシーケンスされた（Ｅｕｒ．　Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ：　１，８０−８１，　１９６７）。
【００９３】
プラスミドの構造
プラスミドｐＡＴ２１３（ブリッソン−ノエル等：Ａｎｔｉｍｉｃｆｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ；３４，９２４−９２７，１９９０）は、グラム陽性とグラム陰性の両性のベクターのＥｃｏＲＩ部位でのエンテロコッカスクローンのプラスミドｐＩＰ８１６の４．０ｋｂのＤＮＡフラグメントＥｃｏＲＩからなっている（Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ　ｅｔ　ａｌ．：　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ；　４８，　２８９−２９４，１９８７）。ｐＡＴ２１４の構造を決めるために、ｐＡＴ２１３の１７６１ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩのＤＮＡフラグメントを精製し；イー・コリのポリメラーゼＤＮＡのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理し、前もってＳｍａＩで消化し脱リン酸化したｐＵＣ１８のＤＮＡではり合わせた（図２）。クローン化は、制限酵素（ベーリンガーマンハイム・ファルマシア社製）、リガーゼＤＮＡ　Ｔ４（ファルマシア社製）およびフォスファターゼアルカリン（ファルマシア社製）を、製造者のマニュアルに従って用いて行った（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８２）。
【００９４】
Ｍ１３でのサブクローン化とヌクレオチドシーケンス
制限ＤＮＡでのフラグメントを、ファルマシアＰ−Ｌバイオケミカルス社製のバクテリオファージＭ１３（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ：　Ｇｅｎｅ；　２６，　１０１−１０６，　１９８３）から誘導したｍｐ１８とｍｐ１９の複製であるポリリンカーでサブコローンした。イー・コリＪＭｌ０３は組換えファージでトランスフェクションされ、そして単純なｂｒｉｎのＤＮＡを得た。ヌクレオチドシーケンスはＴ７ポリメラーゼＤＮＡ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ，　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ　Ｏｈｉｏ）と［α３５Ｓ］ｄＡＴＰ（英国アマシャム社製）を用いたジデオキシヌクレオチドの酵素法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ：　Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．　ＵＳＡ；　７４，　５４６３−５４６７）で実施した。反応生成物は６％に調整したバッファーを含むポリアクリルアミドゲル中に展開された。
【００９５】
シーケンスの情報解析とデータベース
完全なＤＮＡのシーケンスはコンピュタープログラムＤＢＣＯＭＰとＤＢＵＴＩＬを用いて組み合わせて決定した（Ｓｔａｄｅｎ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ；　８，　３６７３−３６９４，　１９８０）。タンパク質データベースであるパスツール研究所のＰＳＥＱＩＰはクラベリー（Ｃｌａｖｅｒｉｅ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ；　１２，　３９７−４０７，　１９８４）によって開発されたアルゴリズムを用いてスクリーニングした。アミノ酸のシーケンス対の間の配置はウイルバー等のアルゴリズムを用いて行った（Ｗｉｌｂｕｒ　ｅｔ　ａｌ：　Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．　ＵＳＡ；８０，　７２６−７３０，　１９８３）。ホモローグの統計学上の有意差はリップマン・ピアソン（Ｌｉｐｍａｎ　＆　Ｐｅａｒｓｏｎ：　Ｓｃｉｅｎｃｅ；　２２７，　１４３５−１４４０，　１９８５）のアルゴリズムを用いて評価した。
【００９６】
それぞれの比較のために、アミノ酸２０個のシーケンスを使用して危険結果の平均標準偏差を計算した。
【００９７】
遺伝相補試験
プラスミドを形質転換によって、非修飾Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａリガーゼで処理した温度過敏性変異株であるイー・コリＳＴ６４０に導入した（Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒｇ　ｅｔａｌ．：　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．；　１１０，　２６−３４，　１９７３）。形質転換株は１００マイクログラム／ｍｌのアンピシリンを含有したプレート上で３０度で選択し、調べた切断部分のプラスミドＤＮＡの存在と制限カードが確認された。アンピシリン含有ＢＨＩブロス培地中に３０度で生育させた特有のコロニーを１００マイクログラム／ｍｌのアンピシリンと５０マイクロモル以内のイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラソサイド（ＩＰＴＧ）を含む寒天ＢＨＩ培地中に一度に加え、そのプレートを３０度の許容温度から４２度の非許容温度までの温度で培養した。相補性の試験は４２度で１８時間培養した後コロニーが現れれば陽性であると考えられる。
【００９８】
結果
タンパク質ＶａｎＡとＮ末端シーケンスの同定
１部誘導条件下でその他は非誘導条件下で培養したエンテロコッカス・ファセシウムＢＭ４１４７の細胞膜フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。バンコマイシンの阻止濃度に関連して見いだされた一つの相違は推定分子量が約４０ｋＤａであるタンパク質に対応するバンドの標識強度である。誘導細胞中にも非誘導細胞中においても、タンパク質のバンドは、プラスミドｐＩＰ８１６を欠落したエンテロコッカス・ファセシウムＢＭ４１４７の誘導体の細胞膜が存在しないこれらの細胞と同じタンパク質を表している。ＶａｎＡと命名された誘導タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製された後、５０ｐｍｏｌのサンプルについてエドマン自動分解法で分析した。ＶａｎＡのＮ末端のシーケンスの新規なアミノ酸は次の通りであった。つまり、Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕである。
【００９９】
遺伝子ｖａｎＶのサブクローニング
４．０ｋｂのプラスミドｐＡＴ２１３の挿入体はエンテロコッカス・ファセシウムＢＭ４１４７のグリコペプタイドに対する抵抗力についての決定因子を有している。その挿入体の数個の制限フラグメントはｐＵＣ１８中にサブクローニングした。またイー・コリのタンパク質ＶａｎＶ特異性の組換えプラスミドは細胞質と細胞膜のフラクションのタンパク質またはバクテリアサックの抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して同定された。この手法はイー・コリがグリコペプタイドに対して強い抵抗力を示すので使用された。プラスミドｐＡＴ２１４のＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩ挿入体はエンテロコッカス・ファセシウムＢＭ４１４７の細胞膜生成物から由来したタンパク質ＶａｎＶと共に移動する４０ｋＤａの特有のポリペプタイドをコードしている。
【０１００】
プラスミドｐＡＴ２１４の挿入体のヌクレオチドシーケンスと遺伝子ｖａｎＶをコードするシーケンスの同定
プラスミドｐＡＴへの１７６１ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩ挿入体のヌクレオチドシーケンスは図２に記載した手法によりＤＮＡの２つのｂｒｉｎについて決定した。ＤＮＡの各ｂｒｉｎ上の３つの解読カード内の末端コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）の位置は、タンパク質ＶａｎＡをコードするのに十分な大きさを有する解読開始特有のカード（ＯＲＦ）の存在を示している。この解読開始カードＯＲＦは２８１番目の位置にあるコドンＴＡＡおよび１４０６番目の位置にあるコドンＴＡＧとの間に位置している。ＯＲＦから結論されるアミノ酸のシーケンスすることによって、タンパク質ＶａｎＡのＮ末端のそれと対比される。タンパク質をシーケンスとして同定された新規なアミノ酸は３７７位置のコドンＡＴＧ（メチオニン）（図３）から始まるヌクレオチドシーケンスによってコードされている。翻訳開始コドンはシーケンス（ＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡ）が先にあり、このシーケンスは、その部分（３’ＯＨ　ＵＣＵＵＵＣＣＵＣＣ　５’）中のバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の自己結合部位１６ＳのＡＲＮｒの８個の塩基に対して相補的であるところのグラム陽性バクテリアのリボゾーム（ＲＢＳ）に対する連結部位を特徴付けている（Ｍｏｒａｎ　ｅｔ　ａｌ：　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．；　１８６，　３３９−３４６，　１９８２）。解読開始ＯＲＦカード中には、２８１位置と３７７位置との間には別の開始コドンＡＴＧまたはＧＴＧは存在していない。３７７位置のコドンＡＴＧから１４０６位置のコドンＴＧＡに延長している１０２９ｂＰのシーケンスは３４３個のアミノ酸残基を含むタンパク質をコードしている。そのタンパク質の測定分子量は３７４００Ｄａであり、この値は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって得られた推定値４０ｋＤａと一致している。
【０１０１】
タンパク質ＶａｎＡのアミノ酸シーケンスと酵素Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａリガーゼのホモローグ　タンパク質データバンクＲＳＥＱＩＰのスクリーニングによると、タンパク質ＶａｎＡとイー・コリのリガーゼＤ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａ（ＥＣＯＡＬＡ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ；　１６７，　８０９−８１７，　１９８６）との間とＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＤＡＬＩＧＤａｕｂ　ｅｔ　ａｌ：　Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ：　２７，　３７０１−３７０８，　１９８６）のホモローグ（同族体）が示されている。タンパク質対について計算した類似率は同定したアミノ酸の２８％と３６％との間であり、アミノ酸同族体を構成するもののうちの４８％から５５％までである。ＶａｎＡとＤＡＬＩＧとは密接に結合している。この類似の統計学的有意差は、ＶＡＮＡの形式で評価され、シーケンスはＤＡＬＩＧまたはＥＣＯＡＬＡと同じアミノ酸組成を含んでいる（Ｌｉｐｍａｎ　＆　Ｐｅａｒｓｏｎ：　Ｓｃｉｅｎｃｅ；　２２７，　１４３５−１４４０，　１９８５）。
【０１０２】
リガーゼＤ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａの活性に対する遺伝相補性試験
菌種イー・コリＳＴ６４０はリガーゼＤ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａに対する活性が欠如している温度感受性変異株である（Ｌｕｇｔｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．；　ｌ１３，　９６−１０４，　１９７３）。プラスミドｐＵＣ１８とプラスミドｐＡＴ２１４は形質転換によって菌種イー・コリＳＴ６４０中に導入された。イー・コリＳＴ６４０とイー・コリＳＴ６４０（ｐＵＣ１８）は３０度の許容温度でしか通常は生育しないのに対して、イー・コリＳＴ６４０（ｐＡＴ２１４）は３０度の許容温度でも４２度の非許容温度でも生育した。
【０１０３】
本試験では、ＶＡＮＡがイー・コリ中のリガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａと機能的に結合し、ＤＡＬＩＧと同じ連結反応（リゲーション）を恐らく触媒することができる。
【０１０４】
ＩＩ　ペプチドグリカンの前駆物質であるデプシペプタイドの合成を制御する二重成分ＶａｎＳ−ＶａｎＲの調節系
菌種、プラスミドおよび培養条件
プラスミドｐＩＰ８１６の制限フラグメント（Ｔｒａ−、Ｍｏｂ＋、Ｖｍｒ）グラム陽性とグラム陰性の両性のベクターを構成するベクターｐＡＴ２９の誘導体（ｏｒｉＲ　ｐＡＭβ１，ｏｒｉＲ　ｐＵＣ，ｏｒｉＴ　ＲＫ２，ｓｐｃ，ｌａｃＺα）（Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ　ｅｔ　ａｌ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄｓＲｅｓ．；　１８，　４２９６，　１９９０）中にクローン化した。このベクターは本発明者らによって調整され、イー・コリＪＭ１０３の形質転換のために使用された（△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ），ｓｕｐＥ，ｔｈｉ，ｓｔｒＡ，ｓｂｃＢ１５，ｅｎｄＡ，ｈｓｐＲ４，Ｆ　ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ＬａｃＩｇ，ＩａｃＺ△Ｍ１５）（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．；　１０１，　２０−７８，　１９８３）。プラスミドＤＮＡは少量のアルカリ溶解物のプロトコルによって調製され（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＮＹ），そして電気形質転換（Ｃｒｕｚ−Ｒｏｄｚ　Ａ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ：　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．；　２２４，　１５２−１５４，　１９９０）によってエンテロコッカス・ファエカリスＪＨ２−２（ＦｕｓＲ、ＲｉｆＲ）（Ｊａｃｏｂ　Ａ．　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．；　ｌ１７，　３６０−３７２，　１９７４）中にジーンパルス装置（米国カリフォルニア、リッチモンドのバイオラッド社製）を用いて導入した。エンテロコッカス・ファエカリスとイー・コリから精製したプラスミドの制限ナロフィールはＤＮＡの最終編成物の発見のために比較される。
【０１０５】
融合プラスミドｐＡＴ１１３（Ｍｏｂ＋、ＥｍＲ、ＫｍＲ、ｏｒｉＲ、ＰＡＣＹＣ１８４、ａｔｔＴｎ１５４５、ＬａｃＺα）（Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔｅｔａｌ：　Ｇｅｎｅ；　１０６，　２１−２７）はトランスポゾンＴｎ１５４５が結合した末端を有している。このベクターはグラム陽性バクテリアを複製しないけれども、トランスポゾンＴｎ１５４５またはＴｎ９１６のインテグラーゼによって組換えられた宿主の染色体を結合する（Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ　ｅｔ　ａｌ：前述）。融合プラスミドは電気形質転換によってエンテロコッカス・ファエカリスＢＭ４１４８（ＪＨ２−２：Ｔｎ９１６）中に導入した。これらの菌株はトランスポゾンＴｎ９１６により修飾される（Ｆｒａｎｑｕｅ　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．；　１４５，　４９４−５０２，１９８１）。
【０１０６】
培養はハート・ブレインブイヨン（ＢＨＩ）または寒天を用いて３７、度で行った。ミュラー・ヒントン培地を用いてバクテリアの最小阻止濃度を決定した（Ｓｔｅｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ：　Ａｎｔｉｂｉｏｔ．　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．　Ｂａｓｅｌ；　９，　３０７−３１１）。
【０１０７】
組換えＤＮＡ技術
制限酵素（ベーリンガー・マンハイム・ファルマシア杜製）によるＤＮＡの断片化、アガロースからの制限ＤＮＡフラグメントの精製、イー・コリ（ベーリンガー・マンハイム・ファルマシア社製）のＤＮＡポリメラーゼ１のＫｌｅｎｏｗのフラグメントでの結合末端の自由末端への変換、羊腸のホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム杜製）でのＤＮＡ末端の脱リン酸化、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（英国アマシャム杜製）でのＤＮＡフラグメントの連結は標準的手法で実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＮＹ）。
【０１０８】
プラスミドの構成
ここの構成による組換えプラスミドのために使用するベクターと挿入体の源歯下記の通りである。
【０１０９】
（ｉ）プロモータ認識のためのベクターｐＡＴ７８：スタフィロコッカス・アウレウスのプラスミドｐＣ１９４のクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの遺伝子ｃａｔを増幅したＤＮＡ（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．；　１５０，　８１５−８２５，　１９８２）は連絡ベクターｐＡＴ２９の制限部位ＰｓｔＩとＳＰｈＩとの間に挿入した。ＰＣＲ法による増幅は、メトキシホスホルアミド法（Ｍａｂｉｌａｔ　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｌａｓｍｉｄ　２３，　２７−３４，　１９９０）によって合成された開始端Ａ１とＡ２によって実施された。開始端Ａ１のシーケンス（５’ＧＣＴＧＣＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＧＧＡＧＧ）は認識部位ＰｓｔＩ（下線部分）と、遺伝子ｃａｔのリボゾーム（ＲＢＳ；１８位置から２３位置までのＡＧＧＡＧＧ）に対する連結部位を含むｐＣ１９４の１８個の塩基（６から２３位置まで）とから構成されている。開始端Ａ２（５’ＣＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡ　ＧＣＣＡＧＴＣ）のシーケンスは切断部位ＳＰｈＩ（下線部分）を含み、遺伝子ｃａｔの３’末端の１７個の塩基（８から２４位置まで）と相補的である。開始端Ａ１とＡ２で増幅されたＤＮＡフラクメントはそれゆえ解読開始（ｏｒｆ）フェーズと、部位ＰｓｔＩとＳｐｈＩによって並ばれたＣＡＴ（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ等（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．；　１５０，　８１５−８２５）の付けた番号によれば１２３４から１９１２位置まで）に対するリボゾームの連結部位とから構成されている。１２３４位置は、クロラムフェニコールが存在してなくて翻訳を遮断するところのｍＲＮＡの二次構造のリングの内部に存在している。そのように増幅されたシーケンスは、プロモーターｃａｔも、翻訳の調節にとって必須であるリボゾームの相補的シーケンスも含んでいない（Ａｍｂｕｌｏｓ，　Ｎ．　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ：　Ｇｅｎｅ；　２８，　１７１−１７６，　１９８４）。
【０１１０】
（ｉｉ）発現ベクターｐＡＴ７９：エンテロコッカスプラスミドｐＪＨ１（Ｃａｉｌｌａｕｄ　ｅｔ　ａｌ：　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．；　２０７，　５０９−５１３，　１９８７）の遺伝子ａｐｈＡ−３のプロモーターＰ２を有する２４３ｂｐのＣｌａＩ−ＢｓｓＨＩＩフラグメントはｐＡＴ７８の制限位置ＥｃｏＲＩとＳａｃＩの間に挿入された。
【０１１１】
（ｉｉｉ）プラスミドｐＡＴ８０とその誘導体：ｐＩＰ８１６の５．５ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＡＴ７８のＢａｍＨＩとＸｂａＴ部位に挿入した。得られたプラスミドはｐＡＴ８０と命名され、ＨｉｎｃＩＩで部分的に消化され、トランスポゾンＴｎ９０３の遺伝子ａｐｈａ−１に結合された遺伝子を有するＥｃｏＲＶフラグメントで連結した（Ｏｋａ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．；　１４７，　２１７−２２６，　１９８１）。このフラグメントは、タイプＩの３’−アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｐｈＡ−１を含んでおり、カナマイシンに対する抵抗力を付与する。ａＰｈＡ−１は、ｐＡＴ８０の異なる３つの部位に挿入され、ｐＡＴ８１、ｐＡＴ８２およびｐＡＴ８３を作製した。ＢａｍＨＩとａｐｈＡ−１を含むＥｃｏＲＩのカセットはｐＡＴ８０の部位ＢａｍＨＩ（プラスミドｐＡＴ８４を構成するための）と部位ＥｃｏＲＩ（プラスミドｐＡＴ８２を構成するための）に挿入された。
【０１１２】
（ｉｖ）プラスミドｐＡＴ８６、ｐＡＴ８７、ｐＡＴ８８およびｐＡＴ８９：プラスミドｐＡＴ８６は、ｐＡＴ７９の部位ＳｍａＩのレベルで、ＶａｎＨとＶａｎＡとをコードするｐＡＴ８０の２８０３ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩＩフラグメントをクローン化することによって構成されている。プラスミドｐＡＴ８７は、プロモーターｐＡＴ７８を検出するベクターの遺伝子ｃａｔの上流にｐＡＴ８０の３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩブラグメントを挿入することによって得られた。プラスミドｐＡＴ８８は、ＥｃｏＲＩと、ｐＡＴ８０の１７３１ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを有するＢａｍＨＩとで消化されたｐＡＴ７８を連結することによって得られた。プラスミドｐＡＴ８９はｐＡＴ８０のＢｇｌＩＩ−ＡｃｃＩフラグメント（１位置から２３５６位置まで）を融合ベクターｐＡＴ１１３のポリリンカー中に挿入することによって作製された。
【０１１３】
Ｍ１３のサブクローニングとシーケンス化
ＤＮＡフラグメントはバクテリオファージＭ１３の複製誘導体のポリリンカー中にサブクローニングされ、得られた誘導体をｍｐ１８とｍｐ１９と命名された（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ：　Ｇｅｎｅ；　２６，　１０１−１０６，１９８３）。Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０３は組換えファージでトランスフェクションされ、１本の単純なＤＮＡｂｒｉｎを調製した。このヌクレオタイドは、修飾したＤＮＡポリメラーゼＴ７（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ：米国ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）と［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（英国アマシャム社製）を使用して、サンガーらの方法に従ってシーケンスされた（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ；　７４，　５４６３−５４６７，　１９７７）。反応生成物は６％ポリアクリルアミドのバッファー中で傾斜ゲル上で分解された。
【０１１４】
酵素試験
Ｆ・ｆａｅｃａｌｉｓの誘導体ＪＨ２−２はスペクチノマイシンを３００マイクログラム／ｍ１を含む完全ＢＨＩブロス培地中で光学密度［ＯＤ６００］が０．７になるまで培養した。細胞はリゾチームで処理し、超音波で溶解して、得られた細胞残査はクールバランらの方法にしたがって１０００００Ｇで４５分間遠心分離をして除去した（Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ：　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．；　１３，７１６−７２５，　１９７８）。５−チオ−２−ニトロベンゾエートの生成をクロラムフェニコールの存在下ならびに不存在下で３７度で測定し、そして特異的なＣＡＴ活性を１分間当たりのマイクロモルとタンパク質１ミリグラム当たりのマイクログラムで表した（Ｓｈａｗ　ｅｔ　ａｌ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．；　４３，　７３７−７５５，　１９７５）。
【０１１５】
結果
ｐＩＰ８１６の遺伝子ｖａｎＨとｖａｎＡは異種プロモータＰ２の制御下にあるプラスミドｐＡＴ７９中にクローン化し（Ｃａｉｌｌａｕｄ　ｅｔ　ａｌ：　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．；２０７，　５０９−５１３，　１９８７）、作製したプラスミドｐＡＴ８６は菌種Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓＪＨ２−２に対してバンコマイシンヘの抵抗力を付与しなかった。したがって、これらの遺伝子は拡生物質の不存在下ではペプチドグリカンの合成には十分ではない。ｐＩＰ８１６の異なる制限フラグメントはベクターｐＡＴ７８にクローン化される。ｐＡＴ８０の５．５ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩフラグメントはバンコマイシンに対する抵抗力を付与するよりも小さなフラグメントであった。
【０１１６】
遺伝子ｖａｎＲとｖａｎＳのヌクレオチドシーケンス
ｐＡＴ８０への挿入体のシーケンスは、部位ＢａｌＩＩからＶａｎＨの翻訳開始コドンＡＴＧまでのＤＮＡの二重ｂｒｉｎ上に決定されている。解読開始（ｏｒｆ）の二重フェーズは明らかに２４７５ｂｐのシーケンスの内部に位置していて、解読開始の最初のフェーズはヌクレオチド３８６からヌクレオチド１１２３まで延びている。４３１位置にはグラム陽性バクテリアのシーケンスＲＢＳに特徴的なシーケンスである翻訳開始コドンＡＴＧの上流に位置する６対の塩基が見いだされている（ＴＧＡＡＡＧＧＧＴＧ）。そのｏｒｆの他の翻訳開始コドンはその形式のシーケンスに先行していない。レベル４３１のコドンＡＴＧから１１２４位置のコドンＴＡＡまでの６９３ｂｐのシーケンスは分子量２６６１２Ｄａを有する２３１個のアミノ酸のタンパク質をコードしていて、これをＶａｎＲと命名した。
【０１１７】
解読開始の第２フェーズ（ヌクレオチド１０８９からヌクレオチド２２５５まで）では、その中の最初の翻訳開始コドン（１１０４位置のＴＴＧ）から結論されたアミノ酸のシーケンスは分子量４３８４７ＤＡを有する３８４個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていて、このタンパク質をＶａｎＳと命名した。１１１６位置のコドンＴＴＧと１１６４位置のコドンＡＴＧは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＲＮＡの結合部位１６Ｓの末端３’ＯＨと弱い相補性を持つシーケンスによって先行されるフェーズ中の翻訳開始コドンである（それぞれＧＧＧＧＧＧＴＴＧＧ−Ｎ８−ＴＴＧおよびＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡ−Ｎ６−ＡＴＧ）。
【０１１８】
ｖａｎＳの最終コドンとｖａｎＨの翻訳開始コドンＡＴＧとの間に１７ｂｐの繰返された逆転シーケンスを含む２１７ｂＰのシーケンスが識別されている。このシーケンスは転写ターミネーターのようには強力には機能しない。
【０１１９】
データバンクで得られたシーケンスを比較したところ、１６ＨＰＫ（ヒスチジン　タンパク質　キナーゼ）のキナーゼドメイン中の、ストックら（Ｓｔｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ：　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｒｅｖ．；　５３，　４５０−４９０，　１９８９）によって同定された保存アミノ酸の構成単位がＶａｎＳのＣ末端基中に見いだされることが示された。ＶａｎＳはＮ末端領域内に２種類の疎水性のアミノ酸を持っている。ＶａｎＳのヒスチジン残基１６４はＰｈｏＲ（Ｍａｋｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．；　１９２，　５４９−５５６，　１９８６）のＨｉｓ残基２１６と、そのタンパク質におけるホスホリレーションの推定部位であるＥｎｖＺ（Ｃｏｍｅａｕｅｔａｌ：　１６４，　５７８−５８４，　１９８５）のＨｉｓ残基２４３と並んでいる。
【０１２０】
同様に、ＶａｎＲの１から１２２までのアミノ酸は応答調節子ＲＲ（レスポンス・レギュレーター）のエフェクタードメインと類似している。ＶａｎＲのアスパラギン酸５３はホスホリレーションの部位であるかもしれず、この部位からこの残基は、ＣｈｅＡを合わせ持つＨＰＫによってホスホリレーションされ、かつ、タイプＲＲの別のタンパク質（Ｓｔｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ：同上）中の不変の位置に対応しているＣｈｅ　ＹのＡｓｐ５７と並んでいる。ＶａｎＲは、Ｅ．ｃｏｌｉの因子σ７０Ｓを含むポリメラーゼＲＮＡ（Ｓｔｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ：同上）によって仲介される転写開始を活性化するＲＲのサブクラスＯｍＲ−ＰｈｏＢに所属しうる。
【０１２１】
遺伝子ｖａｎの挿入による不活性化
プラスミドｐＡＴ８０中のカナマイシンに対する抵抗力のカセットを遺伝子ｖａｎのグループに挿入すると次のことが判明した。つまリ、ｖａｎＲへの挿入はバンコマイシンとクロラムフェニコールに対する抵抗力を取り除いてしまい、ｖａｎＲはバンコマイシンに対する抵抗力についての遺伝子を発現するために必要な転写活性化因子である。遺伝子ｖａｎＳの不活性化はクロラムフェニコールの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を２倍ほど減少させ、また特異的ＣＡＴの活性を３倍ほど減少させるが、バンコマイシンの最小阻止濃度は不変のままであった。したがって、遺伝子ｖａｎＳは、バンコマイシンに対する抵抗力の遺伝子を転写するレベルの力を得るために必要であるが、バンコマイシンに対する抵抗力の表現型を発現するのには必要ではない。
【０１２２】
ｖａｎＨ（ｐＡＴ８３）、ｖａｎＡ（ｐＡＴ８４）中へのまたはｖａｎＡ（ｐＡＴ８５）の下流の１．０ｋｂの領域中への挿入体を有するｐＡＴ８０の誘導体はクロラムフェニコールに対する抵抗力を取得することができるけれども、バンコマイシンに対する抵抗力は取得することができない。この表現型はバンコマイシンの存在下にバクテリアの細胞壁を構成するために必要なデプシペプタイドの前駆物質を合成する酵素をコードしている遺伝子を不活性化するのに適合している。
【０１２３】
遺伝子ｖａｎＡの下流には、明らかにｖａｎＡのコドンＴＧＡの後であるが部位ＳａｃＩＩの前にある３６５ｂｐのシーケンスに等しい不活性なｏｒｆがｐＡＴ８５に存在しており、これにはＲＢＳ様シーケンスに先行するフェーズの翻訳開始コドンＡＴＧが含まれている。これらのシーケンスはグリコペプタイドに対する抵抗力に必要な、ＶａｎＸと命名されたタンパク質をコードしていて、このタンパク質は最大で約３３０個のアミノ酸からなっている。
【０１２４】
遺伝子ｖａｎの転写のトランスアクチベーション
ＶａｎＲとＶａｎＳをコードしている融合プラスミドｐＡＴ８９をＥ・ｆａｅｃａｌｉｓＢＭ４１３８の染色体に導入した。遺伝子ｖａｎＨ、ｖａｎＡおよびｖａｎＸを有するプラスミドｐＡＴ８７をプロモーターの欠如した遺伝子ｃａｔの上流でクローンすると、そのｐＡＴ８７はこの菌種についてバンコマイシンに対して抵抗力を付与するけれども、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓＪＨ２−２に対しては抵抗力を付与しない。ｐＡＴ８７の遺伝子ｃａｔの菌種ＢＭ４１３８：：ｐＡＴ８９とＪＨ２−２とへの発現のレベルは、ＶａｎＲが遺伝子ｖａｎのグループの３’末端に位置する遺伝子の転写を活性化することを示している。ＣＡＴを合成する場合に同様なレベルがｐＡＴ８８にも観察され、これはｖａｎＡの５’部分と遺伝子ｃａｔとの間での転写による融合物を有している。得られたものは、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓＢＭ４１３８：：ｐＡＴ８９（ｐＡＴ８７）中でＶａｎＲとＶａｎＳとがバンコマイシンに対する抵抗力を取得するのを可能にするｐＡＴ８７のｖａｎＡ、ｖａｎＨおよびｖａｎＸの転写を活性化する染色体をコードしていることを示している。
【０１２５】
他方、遺伝子の発現は、ｖａｎＲとｖａｎＳとが多重コピーのコスミッドｐＡＴ８０に保持されたときに実質的には構成され、調節タンパク質の遺伝子が宿主の染色体上に存在するときに僅かに誘発される。
【０１２６】
ＩＩＩ　エンテロコッカス・ガリナルムＢＭ４１７４の遺伝子ｖａｎＣのシーケンスの特長化
リガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａとバンコマイシンに対する抵抗力に関与している結合タンパク質とをコードする遺伝子の増幅のための包括的な開始端部の定義並びに利用
【０１２７】
タンパク質ＶａｎＡは、グリコペプタイドに対する抵抗力に等しい高さからＥ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７に発現させるのが必要であり、このＥ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１３８はＥ．ｃｏｌｉのリガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａとはアミノ酸が約２８％から３６％までも共通しているが、このリガーゼのそれとは異なる基質に対しては特異性を有している。Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７に発現することが必要である。得られたペプタイドはペプタイド１とペプタイド２と命名され、それらのペプタイドはＥ．ｃｏｌｉのリガーゼＤｄｌＡとＤｄｌＢ（Ｚａｗａｄｚｋｅ：　３０，　１６７３−１６８２，　１９９１）のシーケンス中に保持されており、またタンパク質ＶａｎＡ中においてそれらのペプタイドはリガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａもしくは結びつく酵素をコードする遺伝子の内部フラグメントを増幅することを意図された包括的切り出し端部を合成するために選択される。目標ペプタイドＧＥＤＧ（Ｓ／Ｔ）（Ｉ／Ｌ）ＱＧとＮＴ（Ｉ／Ｌ）ＰＧＦＴとは代わりに図ＩＶ．１に示すように変質したオリゴヌクレオチドＶ１とＶ２を得るために翻訳される。ＶａｎＡのペプタイド１と２のように、ＤｄｌＡとＤｄｌＢとは類似する長さのアミノ酸シーケンスによって分離され、増幅生成物のために予定された切断片は約６４０ｂｐである。
【０１２８】
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ８３とＥ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７のＤＮＡをもちいてのＰＣＲ法による増幅は、予想した切断片に相当する生成物を増幅するために行われ、続いて精製されて、バクテリオファージＭ１３ｍｐ１０にクローン化した（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ：　Ｇｅｎｅ；　２６，　１０１−１０６，　１９８３）。Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ８３を用いて得られた挿入体をシーケンスすると、ＰＣＲでの生成物がＤｄｌＡの内部フラグメントであることが示された。ＢＭ４１４７を増幅したフラグメントを用いて得られた組換えファージから作製したプライマーはＢＭ４１４７とＢＭ４１４７−１のＤＮＡをサザン法で分析するために使用する。ＢＭ４１４７−１はバンコマイシンに感受性を持つＢＭ４１４７の誘導体でありプラスミドｐＩＰ８１６が欠落しているものである（Ｌｅｃｌｅｒｃｑｅｔａｌ：　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．；　３１９，　１５７−１６１，　１９８８）。このプライマーはＢＭ４１４７の４ｋｂのＥｃｏＲＩのＤＮＡとハイブリダイゼーションされるが、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７−１のＤＮＡとはハイブリダイゼーションされない。同様に、遺伝子ｖａｎＡはｐＩＰ８１６の４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントによって保持され、得られたものは、その切り出し端部が同様にｖａｎＡの部分の増幅を可能にしていることを示している。したがって、オリゴペプタイドＶ１とＶ２とはリガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａに結びつく異なるタンパク質で、しかも異なる種類のタンパク質をコードする遺伝子のフラグメントを増幅させることができる。
【０１２９】
遺伝子ｖａｎＣの増幅、クローニングおよびシーケンス
ＰＣＲ法での増幅でＥ．ｇａ１１ｉｎａｒｕｍＢＭ４１７４と得られた増幅生成物の全ＤＮＡが実現され、約６４０ｂｐがバクテリオファージＭ１３ｍＰ１０中にクローンされた。組換えファージから単離された単純なｂｒｉｎのＤＮＡはプライマーＣを構成するのに用いられる（Ｈｕ　ｅｔ　ａｌ：　Ｇｅｎｅ；　１７，　２１７１−２１７７，　１９８２）。サザン法での分析によって、そのプラィマーはＢＭ４１７４の１．７ｋｂのＰｓｔＩフラグメントとハイブリダイゼーションするが、ＢＭ４１４７とＢＭ４１４７−１のＤＮＡとはハイブリダイゼーションしない。
【０１３０】
ＢＭ４１７４のＤＮＡはＰｓｔＩで消化され、１．５ｋｂと２ｋｂのフラグメントはアガロースゲルでの電気泳動により精製され、ｐＵＣ１８にクローンした（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ：　１９８３，　同上）。組換えプラスミドは形質転換によってＥ．ｃｏｌｉＪＭ８３に導入され，プライマーＣを用いてコロニーでハイブリダイゼーションするためにスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｖ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＮＹ）。同族体（ホモローグ）は、ｐＡＴ２１６と呼ばれる、１．７ｋｂの挿入体ＰｓｔＩを含んでいるプラスミドを収容している形質転換体を用いて検出できる。ｐＡＴ２１６の挿入体の１３４７ｂｐのＳａｃＩ−ＰｓｔＩの部分のシーケンスはＤＮＡの二重ｂｒｉｎ上に明らかに位置付けられている。それぞれのＤＮＡｂｒｉｎの３つの解読カード中の終止コドンの位置決定によって、ＯＲＦフェーズが位置４７と位置１２４４とにあるコドンＴＧＡの間に存在していることが明らかになっている。位置２１５にある転写開始コドンＡＴＧは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの結合部位１６ＳのＲＮＡと相補性のあるＲＢＳシーケンスに特徴的であるシーケンスＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡによって先行されている（Ｍｏｒａｎ　ｅｔ　ａｌ：Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．；１８６、３３９−３４６、１９８２）。位置２１５のコドンＡＴＧから位置１２４４のコドンＴＧＡまで延びている１０２９ｂｐのシーケンスは、理論分子量が３７５０４ＤａでＶａｎＣと命名された３４３個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしうる。シーケンスの類似性はＶａｎＣ、ＶａｎＡおよびＥ．ｃｏｌｉのリガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａの間に検出される。特に、ＶａｎＡと腸内バクテリアのリガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａとの間に前もって見いだされた相同する部分の４つのドメインはＶａｎＣに等しく備わっている。そのタンパク質について算定した同定アミノ酸の割合は二つで推定したとこれでは２９％−３８％であった。４つのシーケンスの列は、オリゴヌクレオチドのプライマーＶ１とＶ２を規定するために使用されるペプタイド１と２を保持する残基を含む不変のアミノ酸５７個が存在していることを明らかにしている。
【０１３１】
遺伝子ｖａｎＣの挿入による不活性化
Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍＢＭ４１７４についてバンコマイシンに対する抵抗力に対する遺伝子ｖａｎＣの寄与具合を評価するために、遺伝子ｖａｎＣを挿入して不活性化された。遺伝子ｖａｎＣ内の６９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｃＩＩフラグメントは、グラム陽性バクテリア中に複製できないｐＡＴ１１４にクローンされた。得られたプラスミドｐＡＴ２１７は電気形質転換のためにＢＭ４１７４に導入され（Ｃｒｕｚ−Ｒｏｄｚｅｔａｌ：Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．；２２４，１５２−１５４，１９９０）、ｐＡＴ２１７をｖａｎＣに組み込むホモローグ組換えの結果であると推測されるクローンをエリスロマイシンでスクリーニングした。クローンＢＭ４１７５をプライマーＣとｐＡＴ１１４に対して特異的であるａｐｈＡ−３とを使用したサザンハイブリダイゼーションによってＢＭ４１７４と比較した。２つのプライマーはＢＭ４１７５の８．６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントとハイブリダイゼーションされる。その結果は６．１ｋｂのプラスミドｐＡＴ２１７が遺伝子ｖａｎＣに組み込まれていることが示されている。バンコマイシンのＢＭ４１７４ならびにＢＭ４１７５に対する最小阻止濃度がそれぞれ１６ｍｇ／ｌと２ｍｇ／ｌであることは遺伝子ｖａｎＣ中への挿入による不活性化によってバンコマイシンに対する抵抗力が消失したことを示している。
【０１３２】
したがって、ｖａｎＣはバンコマイシンに対する抵抗力にとり必要である。それゆえペプチドグリカンの前駆物質に組み込まれるがバンコマイシンによって認識されないジペプタイドまたはデプシペプタイドをそれらのタンパク質に合成させることを考えることができる。
【０１３３】
本発明の目的を達成するシーケンスはそのシーケンスの説明を含むシーケンスリストの後に示している。シーケンスリストの中には、タンパク質はタンパク質の末端のアミノ酸に対応するヌクレオチド塩基の位置を示している。
【０１３４】
シーケンスリスト
（このリストには、下記に示すシーケンス１（Ｉａ、Ｉｂ）とＩＩもしくは配列表その１のシーケンスが含まれる）
【０１３５】
アミノ酸のシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１（ＶａｎＨ）：抵抗力を有する最初のタンパク質のシーケンスで、解読開始フェーズ第３番（ＯＲＦ）のアミノ酸のシーケンスに相当し、塩基３５０１に始まり塩基４５２９にて終止し、塩基３５６４と４５２９との間に遺伝子ｖａｎＨをコードするシーケンスを含んでいて、配列表その１またはシーケンスＩａのヌクレオチド６０１８と６９８３との間のシーケンスに相当する
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２（ＶａｎＡ）：タンパク質ＶａｎＡのシーケンスで、解読開始フェーズ第１番（ＯＲＦ）のアミノ酸のシーケンスに相当し、塩基４４２９に始まり塩基５５５３にて終止し、配列表その１またはシーケンスＩａのヌクレオチド６９７７と７８０７との間のシーケンスに相当する
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ３（ＶａｎＸ）：抵抗力を有する三番目のタンパク質のシーケンスで、解読開始フェーズ第３番（ＯＲＦ）のアミノ酸のシーケンスに相当し、塩基５５２６に始まり塩基６１６７にて終止し、配列表その１またはシーケンスＩａのヌクレオチド７８１６と８６２１との間のシーケンスに相当する
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ４（ＶａｎＲ）：調節タンパク質Ｒのシーケンスで、解読開始フェーズ第１番（ＯＲＦ）のアミノ酸のシーケンスに相当し、塩基１４７７に始まり塩基２２１４にて終止し、配列表その１またはシーケンスＩａのヌクレオチド３９７６と４６６８との間のシーケンスに相当する
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ５（ＶａｎＳ）：センサータンパク質Ｓのシーケンスで、解読開始フェーズ第２番（ＯＲＦ）のアミノ酸のシーケンスに相当し、塩基２１８０に始まり塩基３３４６にて終止し、配列表その１またはシーケンスＩａのヌクレオチド４６４８と５８００との間のシーケンスに相当する
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１６：シーケンスＩｂのヌクレオチド位置１５０と３１１２の間に存在するアミノ酸に相当するトランスポセースのシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１７：シーケンスＩａのヌクレオチド位置３１８７と３７５９の間に存在するアミノ酸に相当するレゾルベースのシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１８：シーケンスＩａのヌクレオチド位置９０４６と９９６０の間に存在するアミノ酸に相当するＶａｎＹのシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１９：シーケンスＩａのヌクレオチド位置１０１１６と１０５９８の間に存在するアミノ酸に相当するＶａｎＺのシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２０：シーケンスリストＩＩにて示したアミノ酸のＶａｎＣのシーケンス
【０１３６】
ヌクレオチドシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６：配列表その１で示した並行シーケンスのような５個のタンパク質をコードするシーケンスを含むヌクレオチドのシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ７：配列表その１で示した塩基３５０１に始まり塩基６１６７で終止する並行シーケンスのように３個のタンパク質をコードするシーケンスを含むヌクレオチドシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ８：配列表その１で示したシーケンスの塩基４４２９に始まり塩基５５５３で終止するかまたはシーケンスＩａのヌクレオチド６９７７と７８０７との間に位置するヌクレオチドシーケンスに相当する遺伝子ｖａｎＡのシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ９：シーケンスの塩基３５０１に始まり塩基４５２９で終止するＶａｎＨと命名された第１番目の抵抗タンパク質をコードするシーケンスであって、特にコードされたシーケンスを持つｖａｎＨは配列表その１で示したシーケンスの塩基３５６４と４５２９との間に位置するか、または、シーケンスＩａのヌクレオチド６０１８と６９８３との間に位置するヌクレオチドシーケンスに相当している。
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１０：配列表その１で示したシーケンスの塩基５５２６に始まり塩基６１６７で終止するかまたはシーケンスＩａのヌクレオチド７８１６と８６２１との間に位置するヌクレオチドシーケンスに相当する第３番目の抵抗力のあるタンパク質ＶａｎＸをコードするシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１１：トランスポセース、レゾルベース、ＶａｎＲ、ＶａｎＳ、ＶａｎＨ、ＶａｎＡ、ＶａｎＸ、ＶａｎＹおよびＶａｎＺをコードし、そのＮ末端およびＣ末端で繰り返される３８ｐｂの逆転シーケンスを含み、かつ、シーケンスＩａに相当するトランスポゾンのシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１２：シーケンスＩｂの塩基１５０で始まり塩基３１１２で終止するトランスポセースをコードするシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１３：シーケンスＩａの塩基３１８７で始まり塩基３７５９で終止するレゾルベースをコードするシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１４：シーケンスＩａの塩基９０４６で始まり塩基９９６０で終止するＶａｎＹをコードするシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ１５：シーケンスＩａの塩基１０１１６で始まり塩基１０５９８で終止するＶａｎＺをコードするシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２１：タンパク質ＶａｎＣに対応したリストＩＩに示したＶａｎＣをコードするシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２２：塩基１で始まり塩基１０８５１で終止するＥ．ｆａｅｃｉｕｍのトランスポゾンの完全なシーケンスＩａ
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２３：シーケンスＩａの塩基３９７６で始まり塩基４６６８で終止するタンパク質ＶａｎＲをコードするシーケンス
ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２４：シーケンスＩａの塩基４６４８で始まり塩基５８００で終止するタンパク質ＶａｎＳをコードするシーケンス
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】メンブレン分画のタンパク質をポリアクリルアミドＳＤＳ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルで電気泳動した図で、ライン１と４とは分子量が標準のものを示し、ライン２はバンコマイシンの不存在下で培養したＥ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７を示し、ライン３はバンコマイシン１０マイクログラム／ｍｌを含む培地で培養したＥ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７を示している。矢印の先端は抵抗タンパク質ＶａｎＡの位置を示す。
【図２】図２のＡはプラスミドｐＡＴ２１３とｐＡＴ２１４の挿入体の制限地図。ベクターとＤＮＡの挿入体とは明るい色の断片と暗い色の断片とからそれぞれ識別されている。矢印の後方は遺伝子ｖａｎＡを示している。図２のＢはプラスミドｐＡＴ２１４中の１７６１ｂｐの挿入体に対するヌクレオチドシーケンスのためのストラテジー。矢印はジデオキシ法によるシーケンス反応の方向と範囲を示している。オリゴヌクレオチドの合成開始端（５’ＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＴＣ３’ＯＨ）は位置３６１と位置３７８との間のシーケンスと相補的である。関係する制限位置をただ１つ示している。
【図３】シーケンスＲ、Ｓ、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３の位置。
【図４】ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６を示す。
【図５】図５ａは遺伝子ｖａｎＲ、ｖａｎＳ、ｖａｎＨ、ｖａｎＡ、ｖａｎＸ、ｖａｎＹ、ｖａｎＺ、トランスポセースの遺伝子、レゾルベースの遺伝子、並びにトランスポゾンの末端には３８ｂｐの繰り返し逆転末端シーケンスの局在場所を示している。
図５ｂはブラスミド地図作成法。
（Ａ）プラスミドｐＡＴ２９のポリリンカーとその研究中に組み立てられた誘導体。矢印Ｐ２はａＰｈＡ−３のプロモータＰ２の位置及びオリエンテーションを示している（Ｃａｉｌｌａｕｄ　ｅｔ　ａｌ：　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ，　Ｇｅｎｅｔ．；　２０７，　５０９−５１３，　１９８７）。
（Ｂ）プラスミドｐＡＴ８０の挿入体。白抜き長方形印はプラスミドｐＡＴ２９のＤＮＡを示すが、その寸法を示しているのではない。矢印で終わる長方形はコードされたシーケンスを示している。上下方向並びに水平方向の直線の矢印はそれぞれプラスミドｐＡＴ８０の誘導体中の遺伝子ａＰｈａ−１の位置とオリエンテーションを示している。制限位置は次の通りである。つまり、Ａｃ，ＡｃｃＩ；ＢａｍＨＩ；Ｂｇ，ＢｇｌＩＩ；Ｂｓ，ＢｓｓＨＩＩ；Ｅ，ＥｃｏＲｉ：Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｈｃ，ＨｉｎｃＩＩ；Ｋ，ＫｐｎＩ；Ｐ，ＰｓｔＩ；Ｓ，ＳｍａＩ；ＳＩ，ＳａｃＩ，ＳＩＩ，ＳａｃＩＩ；Ｓａ，ＳａｌＩ；Ｓｐ，ＳｐｈＩ；Ｘｂ，ＸｂａＩ。
（Ｃ）プラスミドｐＡＴ８６、ｐＡＴ８７、ｐＡＴ８８およびｐＡＴ８９への挿入体。その挿入体は直線で示し、対応するベクターは（）印で示している。
【図６】オリゴヌクレオチドＶ１およびＶ２の説明。
（Ａ）：タシパク質ＶａｎＡとリガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａのペプチド１および２のアミノ酸シーケンス。Ｎ末端基とペプチド１との間、ペプチド１と２との間およびペプチド２とＣ末端基との間のアミノ酸の番号が付けられている。３つのシーケンスのうち少なくとも２つのシーケンスの間の同定されたアミノ酸を太く肉付けした文字で表している。
（Ｂ）：目標ペプチドとそのヌクレオチドシーケンス。ＸはＤＮＡの何らかの塩基を示す。ＤｄＩＢのペプチド２は２つの位置（＊印を付けた）で目標ペプチドとはそのレベルが異なっている。
（Ｃ）：Ｖ１とＶ２とのヌクレオチドシーケンス。交互ヌクレオチドとＤＮＡの全塩基に相当するデオキシイノシン（Ｉ）は変異した目標ペプチドをコードするヌクレオチドシーケンスのための位置に利用される。矢印はＤＮＡ合成の方向を示している。オリゴヌクレオチドはバイオシステムＤＮＡ３８０Ｂ装置（米国アプライドバイオシステム社製）を使用してメトキシホスアラミド法によって合成された。ＤＮＡは、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（米国Ｉｎｓｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で抽出することによってバクテリア溶菌物から単離され（Ｌｅ　Ｂｏｕｇｕｅｎｅｃ　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．；　１７２，　７２７−７３４，　１９９０）、そしてマビラート等の記載にしたがって（Ｐｌａｓｍｉｄ；　２３，　２７−３４，１９９０）、温度制御システム（インテリゼント・ヒイーテイング・ブロック：ＩＢＨ１０１；英国ハイバリッド社製）を用いてＰＣＲによる増幅のためのマトリックスとして使用した。増幅生成物は、エチジウムブロミドで着色した後、０．８％ゲルで電気泳動して明らかにした。
【図７】遺伝子ｖａｎＣの挿入による不活性化。遺伝子ｖａｎＣは白抜きの矢印で示していて、６９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎＣＩＩの内部フラグメントは斜線を入れて示している。最後の線はプラスミドｐＡＴ１１４のＤＮＡを示していて、太線はＰＭ４１７４のクロモゾームＤＮＡを示し、矢印は抗生物質に対する抵抗力のある遺伝子を示していて、ａＰｈＡ−３は３’−アミノグルコシドホスホトランスフェレースをコードする遺伝子であり、ｅｒｍはＥＲＲメチルトランスフェレースをコードする遺伝子である。
（Ａ）：プラスミドｐＡＴ２１７はプラスミドｐＡＴ２１６のフラグメントＥｃｏＲＩ−ＨｉｎＣＩＩをＥｃｏＲＩとＳｍａＩで消化した自滅ベクターｐＡＴ１１４（Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ　ｅｔ　ａｌ：　Ｇｅｎｅ；　１０６，　２１−２７；１９９１）で連結して構成されている。
（Ｂ）：ＢＭ４１７４のクロモゾームＤＮＡのｖａｎＣの領域。
（Ｃ）：ｐＡＴ２１７の融合後のｖａｎＣの領域。
【図８】ＢＭ４１７４の遺伝子ｖａｎＣ中へのｐＡＴ２１７の融合についてのサザンブロットによる分析。
（左側の部分）：ＥｃｏＲＩで消化され１％アガロースゲルで電気泳動されて分解されたＢＭ４１７５（ライン２）とＢＭ４１７４（ライン３）の全ＤＮＡ。ＰｓｔＩで消化したバクテリオファージラムダのＤＮＡは分子量の標準として使用した（ライン１）。ＤＮＡは真空装置（Ｔｒａｎｓ−Ｖａｃ　ＴＥ８０；米国Ｈｏｅｆｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を使用してメンブレン（Ｎｙｔｒａｎ；米国Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）上を真空で移動させ、そしてＵＶ照射によってメンブレンに結合させた。ハイブリダイゼーションはプライマーＣ（中央）またはｐＡＴ１１４に特異的であるプライマーａＰｈＡ−３に対して行った（Ｌａｍｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ：　Ａｎｎａｌｅｓ　ｄｅ　ｌ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｐａｓｔｅｕｒ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．；　１３６（ｂ），　１３５−１５０，　１９８５）。
（右側の部分）：プライマーは切断断片を翻訳することによって３２Ｐ標識を付けた。分子量（ｋｂ）を示している。
【図９】Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７からのタンパク質ＶａｎＳおよびＥ．ｃｏｌｉのＰｈｏＲとＥｎｖＺからのアミノ酸シーケンスの配列。左側の番号は配列中の最初のアミノ酸の位置を示している。右側の番号は対応する列の最後のアミノ酸の位置を示している。同定されたアミノ酸は枠で囲んでいる。点線は類似物を最適化するために入れた欠落部分を示している。線は外部ＨＰＫ中のアミノ酸を保存しているモチーフの位置を示している。太い字で示したモチーフＩ中のヒスチジン残基はオートホスホリレエーションの潜在位置である。
【図１０】
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７のＶａｎＲとＥ．ｃｏｌｉのＯｍｐＲとＰｈｏＢならびにＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＣｈｅＹのアミノ酸シーケンスの配列。右側の番号は対応する列の最後のアミノ酸の位置を示している。同定されたアミノ酸は枠で囲んで示している。点線は類似物を最適化するために入れた欠落部分を示している。太い字で示した残基は外部のＲＲの効果ドメイン中に強く保持されているアミノ酸に対応している。ＣｈｅＹのアスパラギン酸残基５７はＣｈｅＡに関連したＨＰＫによってりん酸化される。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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