(57)【要約】【目的】ミオイノシトールをｐＨ電極又は指示薬を用いて測定する。【構成】可逆反応の可能なミオイノシトールデヒドロゲナーゼと、ミオイノシトールに作用しない別のデヒドロゲナーゼからなるサイクリング反応において、生成又は減少する還元型補酵素によるｐＨ変化をｐＨ電極又はｐＨ指示薬により検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
可逆反応が可能なミオイノシトールデヒドロゲナーゼ反応と、酸化型補酵素を還元型に戻す別のデヒドロゲナーゼ反応を組み合わせ、生成した正反応による還元型補酵素の増加分又は増加率を電極法又はｐＨ検出法（プロトン検出法）により検出し、ミオイノシトールを測定するミオイノシトールの簡易測定法。
【請求項２】
可逆反応が可能なミオイノシトールデヒドロゲナーゼ反応と、還元型補酵素を元の酸化型に戻す別のデヒドロゲナーゼ反応を組み合わせ、逆反応による還元型補酵素の減少分又は減少率を電極法又はｐＨ検出法（プロトン検出法）により検出し、ミオイノシトールを測定するミオイノシトールの簡易測定法。
【請求項３】
前記電極法が、還元型補酵素を、電子伝達体との反応によって生じる電気的量によって検出するものである、請求項１又は２記載の簡易ミオイノシトール測定法。
【請求項４】
反応液の緩衝能が小さく、検出がｐＨ検出法（プロトン検出法）である、請求項１又は２記載のミオイノシトールの簡易測定法。
【請求項５】
前記ｐＨ検出法（プロトン検出法）が、ｐＨ電極を用いるものである請求項４記載のミオイノシトールの簡易測定法。
【請求項６】
前記ｐＨ電極が、イオン感応電界効果トランジスタを用いるｐＨ電極である請求項５記載のミオイノシトールの簡易測定法。
【請求項７】
前記ｐＨ検出法（プロトン検出法）が、ｐＨ感応色素を用いるものである請求項４記載のミオイノシトールの簡易測定法。
【請求項８】
前記ｐＨ検出法（プロトン検出法）が、ｐＨ試験紙を用いるものである請求項５記載のミオイノシトールの簡易測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ミオイノシトールを簡便に測定する簡易測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿中ミオイノシトールは糖尿病予備群の判別指標であり、かつ無浸しゅう測定ができることから、将来、予防医学上極めて有望な測定項目になりうる。無浸しゅう測定は、家庭、小医院、ベッドサイド、職場等で行われて初めて有用性が増大する。しかるに、家庭、小医院等で使用できるような小型で簡便な測定器を実現させる測定原理については開発されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ポケットサイズ程度に小型で、簡便な測定器を開発するには、電極等を用いた測定法の開発が最も望ましく、そのために最適な測定原理を開発する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
ミオイノシトールデヒドロゲナーゼを用い、ミオイノシトールと補酵素ＮＡＤから、還元型ＮＡＤを得、これを電気化学的に測定し、尿中ミオイノシトールを測定する方法では、尿中のミオイノシトールが微量であるため不可能であった。又、可逆なミオイノシトールデヒドロゲナーゼによりサイクリング反応を行い、還元型ＮＡＤを増幅し、それを電気化学的に測定する方法は一見成功しそうに思えるが、実際はサイクリング反応の還元型補酵素の和は最初と増幅後では同じであり、電極法等の簡易測定法の原理として用いることができないことがわかった。
【０００５】
発明者は、サイクリング反応に、別のデヒドロゲナーゼを組み合わせた方式のみが電極法等の簡易測定法に適用でき、それによって尿中ミオイノシトールの簡易測定法が可能であるという結論に至った。このサイクリング反応により、ミオイノシトールを測定するには、正反応で生成する還元型補酵素の増加を検出するか、逆反応による還元型補酵素の減少を検出するかのいずれかによる。還元型補酵素の検出は、電極法による方法又はｐＨ検出法による。
【０００６】
まず、この別のデヒドロゲナーゼの組み合わせ方式を説明する。可逆的ミオイノシトールデヒドロゲナーゼとは、ミオイノシトールと酸化型補酵素（例えばＮＡＤ）とからミオイノソースと還元型酵素（例えばＮＡＤＨ２）を生成する正反応と同時に、ミオイノソースとＮＡＤＨ２からミオイノシトールとＮＡＤを生成する逆反応を共に触媒するものである。ここで、逆反応の補酵素として、反応の初期にＮＡＤＨとは別の還元型補酵素（例えばチオＮＡＤＨ２）を加えておけば、正反応で生成したミオイノソースとチオＮＡＤＨ２から、ミオイノシトールが生成し、これはＮＡＤと反応して正反応によりミオイノソースとＮＡＤＨ２が生成する。これが繰り返されて、初期に加えたチオＮＡＤＨ２は減少するが、正反応によりＮＡＤＨ２が次々と生成するサイクリング反応が成立する。しかし、この基本的サイクリング反応の場合、正反応で生成するＮＡＤＨ２と、逆反応で消費されるチオＮＡＤＨ２とは相殺してしまうために電極法等の簡易測定法を適用することは困難であることがわかった。
【０００７】
ただし、吸光法では、ＮＡＤＨ２とチオＮＡＤＨ２とは吸収波長が異なるので、適用可能である。本発明では、逆反応で生成した酸化型のチオＮＡＤを第二のデヒドロゲナーゼによって再びチオＮＡＤＨ２に戻すことにより、逆反応を継続させる反応を組み合わせることとした。こうすることにより、サイクリング反応の始点におけるチオＮＡＤＨ２量をベースとし、サイクリング反応の進展とともにＮＡＤＨ２が生成し、それが簡易測定法の定量下限以上となるまで維持させ、そこを測定点とする原理に基づいている。この原理によれば、上記基本的サイクリング反応の場合とは異なり、初期に加える還元型補酵素を、チオＮＡＤＨ２ではなく正反応で生成するＮＡＤＨ２とすることができる。この場合、初期にＮＡＤＨ２を必ずしも添加する必要はない。添加するのは、反応開始直後のｐＨを追跡したい場合のみである。添加する場合は、できる限り少量とするのが好ましい。
【０００８】
この第二のデヒドロナーゼとは別に、正反応で生成する還元型補酵素（例えばＮＡＤＨ２）を、第三のデヒドロゲナーゼを用いて、酸化型のＮＡＤに戻す反応を組み合わせる反応もある。すなわち、第三のデヒドロゲナーゼによって、正反応における還元型補酵素例えばＮＡＤＨ２（最初に加えておく）を酸化型のＮＡＤとし、サイクリング反応を充分行った後測定する。逆反応によって初期に加えたＮＡＤＨ２は一方的に減少するが、正反応で生成するＮＡＤＨ２は第二のデヒドロゲナーゼによって増加しないので両者の和は減少していく。それを電極法ｐＨ検出法等により検出するものである。
【０００９】
第二、第三のデヒドロゲナーゼは、可逆反応をおこさせるものではなく、かつ、ミオイノシトールを基質としないものが好ましい。
【００１０】
酸化型の補酵素としては、１つがチオＮＡＤ類、又はチオＮＡＤＰ類、別の１つとして、ＮＡＤ類、又はＮＡＤＰ類を用いることができる。チオＮＡＤＰ類にはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（チオＮＡＤＰ）またはチオニコチンアミドピポキサンチンジヌクレオチドホスフェートがある。チオＮＡＤ類には、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）またはチオニコチンアミドピポキサンチンジヌクレオチドがある。ＮＡＤＰ類には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ）およびニコチンアミドピポキサンチンジヌクレオチドホスフェート（デアミノＮＡＤＰ）がある。ＮＡＤ類には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンヌクレオクチド（アセチルＮＡＤ）およびニコチンアミドピポキサンチンヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）がある。
【００１１】
さて、第二のデヒドロゲナーゼを例にとると、その補酵素は、吸光光度法の場合のように基本反応の補酵素と異なってもよいが、一般には同じものを用いる。それをＮＡＤとすると、その還元型ＮＡＤＨ２は、正反応によりＮＡＤから生成するので原理的には反応の開始時に加えておく必要はないが、反応開始から測定終了までの時間を短縮するために、ＮＡＤＨ２を少量加えておいてもよい。その場合、開始初期におけるＮＡＤＨ２の添加量は、一般的には正反応の酸化型補酵素の１／１０モル以下、より好ましくは１／５０〜１／１０００モルまたはそれ以下であってもよい。
【００１２】
一般にＮＡＤの濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましい。第二のデヒドロゲナーゼ反応において、基本反応と同じ補酵素を用いる場合、第二のデヒドロゲナーゼの、その補酵素に対するＫｍ値は、基本反応のミオイノシトールデヒドロゲナーゼの、その補酵素に対するＫｍ値よりも大きくするか、もしくは、第二のデヒドロゲナーゼの酵素活性を、第二のミオイノシトールデヒドロゲナーゼよりも小さくする必要がある。第二のデヒドロゲナーゼの、ＮＡＤに対するＫｍ値と、基本サイクリング反応のＮＡＤＨ２に対するＫｍ値とから、それぞれのデヒドロゲナーゼの活性を決めると良い。
【００１３】
もし、第二のデヒドロゲナーゼの補酵素を正反応と異なるもの、例えばチオＮＡＤを用いることができる。その濃度は０．０５〜５０００μＭ、特に、５〜５００μＭが好ましい。ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの濃度は５〜１０００μ／ｍｌ、特に２０〜５００μ／ｍｌが好ましく、第二のデヒドロゲナーゼはＮＡＤＨ２に対するＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量（μ／ｍｌ単位）以上になるように調整すればよく、例えば１〜１００μ／ｍｌが好ましく、また第二のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０５〜２０ｍＭが好ましい。これらの量は被検体の種類等により適宜決定することができ、これ以上の量を用いることもできる。
【００１４】
第二のデヒドロゲナーゼ及び第二のデヒドロゲナーゼの基質としては、補酵素がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．１）とエタノール、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とグリセロール、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．８）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロール−３−リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、補酵素がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．４９）（酵母由来）とグルコース−６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．４２）（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．２．１．１７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｘａｌａｔｉｃｕｓ由来）とＣｏＡとグリオキシル酸、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．４４）（ラット肝、ビール酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．２．１．１３）（植物葉緑体由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン酸、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．２．１．７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来）とベンズアルデヒド等が挙げられる。
【００１５】
第三のデヒドロゲナーゼを用いる方法では、基本サイクリング反応のＮＡＤＨ２の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましい。ミオイノシトールデヒドロゲナーゼの濃度は５〜１０００μ／ｍｌ、特に２０〜５００μ／ｍｌが好ましく、第三のデヒドロゲナーゼはＮＡＤＨ２に対するＫｍ値（ｍＭ単位）の２０倍量（μ／ｍｌ単位）以上になるように調整すればよく、例えば１〜１００μ／ｍｌが好ましく、また第三のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０５〜２０ｍＭが好ましい。これらの量は被検体の種類等により適宜決定することができ、これ以上の量を用いることもできる。
【００１６】
第三のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、その補酵素がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．１）とアセトアルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とジヒドロキシアセトン、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．８）（ウサギ筋肉由来）とジヒドロキシアセトリン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とオギザロ酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸、補酵素がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤＰ類のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．１．１．４９）（酵母由来）とグルコノラクトン−６−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ．１．２．１．１．３）（植物葉緑体由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン等が挙げられる。
【００１７】
本発明のミオイノシトールデヒドロゲナーゼに関しては、例えば補酵素としてＮＡＤ類（好ましくはＮＡＤ）、チオＮＡＤ類（好ましくはチオＮＡＤ）、あるいはＮＡＤＰ類（好ましくはＮＡＤＰ）、チオＮＡＤＰ類（好ましくはチオＮＡＤＰ）を用いることができるが、これ以外に基質であるミオイノシトールに対する反応性を有するものであれば何でもよい。
【００１８】
反応液については、使用するミオイノシトールデヒドロゲナーゼの各種補酵素間の相対活性等を考慮して二種の補酵素を適宜選択し、その後正反応と逆反応の至適ｐＨの間でｐＨ条件をサイクリング反応が効率よく進行するように設定すればよい。例えばＢａｃｉｌｌｕｓ、ｓｐ．ＮＯ．３（旭化成製）由来のミオイノシトールデヒドロゲナーゼについてみれば、補酵素にチオＮＡＤ類を用いた場合のＮＡＤ類を用いた場合に対する相対活性は約１０〜１５％であり、又、正反応の至適ｐＨは９．５付近で、また逆反応の至適ｐＨは７〜７．５である。
【００１９】
電極法としては、還元型補酵素をフェロセン誘導体、キノン誘導体等の電子伝達体と反応させ、電流又は電圧を測定する方式がある。例えば、ＮＡＤＨと［Ｆｅ（ＣＮ）］３−から、［Ｆｅ（ＣＮ）］４−とし一定電圧下の酸化還元電流と炭素電極や回転白金電極で測定するか、又は、白金電極でポテンショメトリックに測定する。このとき、ジアホラーゼを介在させることにより、より好ましい結果が得られる。又、例えばＮＡＤＨ２と水素受容体フラビンモノヌクレオチドと反応させ、生じたＦＭＮＨ２と白金電極で酸化に生じる電流値を測定してもよい。
【００２０】
特にミオイノシトールデヒロゲナーゼの至適ｐＨがアルカリ領域であるため、還元型補酵素は解離してプロトンＨ＋を放出するので、これをｐＨ電極あるいはｐＨ感応色素で検出してもよい。ｐＨ電極には、ガラス電極又はイオン感応電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）などがある。
【００２１】
５、１０、２０ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（各々ｐＨ１０．０）をそれぞれ２０ｍｌ調製し、それにＮＡＤＨ１２ｍＭ量を添加し、ｐＨ変化を測定した。５ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液では、０．２ｐＨの変化を認めた。１０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液では、０．１ｐＨの変化を認め、２０ｍＭ緩衝液では、変化は０．０５ｐＨであった。
【００２２】
本発明の第二のデヒドロゲナーゼを用いるサイクリング反応においては、酸化型補酵素ＮＡＤは０．０２〜１００ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭを加える。もし、２０ｍＭのＮＡＤを加えたとすると、サイクリング反応の理想終点では、２０ｍＭのＮＡＤＨ２が生成する。上記の緩衝液を用いたテストにおいては、約半分量の１２ｍＭのＮＡＤが反応して生成したＮＡＤＨ２でも十分なｐＨ変化が生じることがわかった。しかし、尿中ミオイノシトールの量は数十μＭしかないのでサイクリング反応を数時間行わなければこのようなｐＨ変化は得られない。そこで反応時間が短くてもｐＨ変化が観察できるには、緩衝液濃度は０．５ｍＭ以下、好ましくは０．１〜０．５ｍＭとするのがよい。
【００２３】
なお、測定に用いる尿の量は、反応液量の等量から数十分の一、好ましくは二分の一から十分の一とする。弱酸性尿（ｐＨ４）の場合、０．１ｍＭの緩衝液では尿の量を二分の一（反応液１ｍｌに対し５００μｌ）とすると、ｐＨの低下は０．２、すなわちｐＨ１０．２のものは、ｐＨ１０となり、全く問題はない。ｐＨが多少低下しても、低下したｐＨをスタートの基準とすればよい。緩衝液は、好ましくは０．１〜０．５ｍＭとして感度を上げる。
【００２４】
実験では、ｐＨ２の試料２０μｌを０．１ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）１ｍｌ（すなわち試料量は五十分の一）に加えた場合ｐＨは７．５となった。従って、アルカリ域ぎりぎりであり、尿試料のｐＨは２以上であることが必要である。ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ反応のｐＨは７〜１１でなければならなので、強酸性尿試料の場合は、０．０１〜０．１Ｍのアルカリを一滴加えて、ｐＨを弱酸性からアルカリにする。
【００２５】
プロトンＨ＋の検出を色素により行うには、吸光度変化による方法と試験紙による方法の二通りがある。ｐＨ感応色素は可視域に吸収を有するので、可視吸光光度法によりｐＨ変化をとらえることができる。可視吸光光度法を行うにはその光源は発光ダイオードでよいため、装置を極めて簡易にすることができる。試験紙による方法は、色素を試験紙に染み込ませて、保持させておき、本発明のサイクリング反応を行って、十分な、ｐＨ変化を生じさせた溶液に試験紙をつけ、色の変化をみて、尿中にミオイノシトールがあるか否かを判定するものである。色素としてはアルカリ領域の変化を検出する場合は、フェノールフタレイン、チモールフタレイン、チモールブルー、フェノールレッドが適している。
【００２６】
反応のｐＨを弱アルカリで行う場合、ニュートラルレッド、ブロムチモールブルーを用いることができる。一般に、臨床検査で尿のｐＨ測定に用いられる試験紙はメチルレッドとブロムチモールブルーを染み込ませてあり、短時間反応終了液中に浸し、色調表と比較することによってｐＨ７〜９を大まかに判定することができるので、これも用いることができる。
【００２７】
ｐＨ感応色素のｐＨによる吸光度変化は鋭敏なので０．０１ｐＨの変化を十分に見分けることができる。しかし、ｐＨ試験紙はｐＨ変化が１以上なければ目視による識別は困難である。もし、緩衝液の濃度を５ｍＭとした場合、ｐＨ１以上の変化を生じさせるのは無理がある。そこで、緩衝液は０．０１〜０．１ｍＭとする必要がある。０．０１〜０．１ｍＭ以上のような低緩衝であっても、尿試料のｐＨを中性から弱アルカリにあらかじめ調節しておけば反応が可能である。
【００２８】
ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ単独、もしくは、第二又は第三のデヒドロゲナーゼをも固定化し、酵素固定化電極により、反応と検出を同時に行うこともできる。なお、反応と検出とを別々に行うには、酵素固定化したカラムを作り、このミニカラム中に試料を通過させ、最後に還元型補酵素を前述のＮＡＤＨ２検出電極又はｐＨ検出法で検出する。反応と検出を同時に行うには、電極上に固定化酵素膜をあてて作製する。
【００２９】
酵素の固定化法としては、吸着法、包括法、架橋法、化学結合法などがある。本発明では、デヒドロゲナーゼを用いるので、吸着法、架橋法、包括法が適している。なお、本発明では２つのデヒドロゲナーゼを用いるが、両者を固定化することは必ずしも必要ではなく、一方を固定化し、他方は試料液中に含まれていてよい。すなわち、尿と、それにミオイノシトールデヒドロゲナーゼと補酵素を加えた液を、第二、又は第三のデヒドロゲナーゼを固定化した膜に接触させればｐＨ変化が生じる。
【００３０】
吸着法にはイオン交換膜、アセチルセルロールス膜、コロジオン膜、コラーゲン膜、ポリ塩化ビニル膜等を、適切なｐＨ、イオン強度の溶液にデヒドロゲナーゼを溶かした液にディップして吸着させる。架橋法では、例えばポリアクリルアミドゲルが本発明に適している。包括法では、コラーゲンフィブリル分散液にデヒドロゲナーゼを加えて混ぜ、それをガラス板上又はテフロン膜上に流し広げて風乾する方法がある。このコラーゲンフィブリル分散液にデヒドロゲナーゼを加えて混ぜ、そこに２枚の白金電極を挿入し、両極に直流電圧を印加して、白金電極上にコラーゲン酵素膜が析出するのでこれをグルタルアルデヒド液に短時間浸漬する。
【００３１】
【実施例１】
０．１ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）に２０ｍＭＮＡＤ（オリエンタル酵母）、１５０Ｕ／ｍｌアルコールデヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵母）、１ｋＵ／ｍｌミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（旭化成）を溶かし、再度ｐＨを８〜９に調節した。この溶液１ｍｌに、０、５０、１００μＭのミオイノシトール水溶液を５００μｌ及び５Ｍエタノールを１００μｌ添加し、３７℃でサイクリング反応を３０分行い、反応開始直後と比較してｐＨ変化を、イオン感応電界効果トランジスタ型ＩＳＦＥＴｐＨ電極（新電元製）にて測定した。その結果、１００μＭのミオイノシトール濃度ではｐＨ変化は０．２、５０μＭでは０．１、０μＭでは０となり、ミオイノシトール濃度とｐＨとの間にはほぼ直線関係がみられた。
【００３２】
【実施例２】
ｐＨ７．３の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液１ｍｌに、２．５ｍｇ過硫酸アンモニウム、２５０ｍｇアクリルアミド、４６ｍｇビスアクリルアミド、０．０３７５ｍｇリボフラビン、そして１ｇアルコールデヒドロゲナーゼを溶かし、次に窒素ガスで脱気し（７分）、それを、ＩＳＦＥＴセンサー部にコーティングした。それをリン酸緩衝液と水でよく洗浄した。別に、アルコールデヒドロゲナーゼ液を加えない液をつくり、それから対照ＩＳＦＥＴを得た。２つのＩＳＦＥＴの差動出力を増幅器で増幅し、レコーダーにつなぎ、差動出力イノシトールＦＥＴセンサーを得た。この回路では、オペアンプからなる帰還回路により両ＦＥＴには常に一定のドレイン電流が流れ、ＦＥＴのソース・ドレイン間には常に一定の電圧が加えられ、溶液の電位はＡｇ／ＡｇＣｌ電極により一定に保たれるようになっている。従って溶液のｐＨ変化によって生ずる溶液−ＦＥＴ界面電位変化がそのまま出力端子に現われ、差動増幅器に入ることになる。
【００３３】
このイノシトールＦＥＴセンサー部は光があたらないように暗ボックスの中に入れ、測定溶液の温度は３７℃の一定に保ち、固定化酵素膜ＩＳＦＥＴと対照ＩＳＦＥＴは３ｍｍの間隔をあけた。これと、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極とともに０．１ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０）に２０ｍＭＮＡＤ（オリエンタル酵母製）及び５０μＭチオＮＡＤ（三共製）、１ｋＵ／ｍｌミオイノシトールデヒドロゲナーゼ、０．５Ｍエタノールを加えた液１ｍｌ（ｐＨ８．５）に浸漬した。次に、そこにイノシトール１００μＭを含む水溶液１ｍｌ（ｐＨ８）を加え３７℃で３０分間反応させた結果、充分な差動出力を検出することができた。