(57)【要約】【課題】本発明の分析方法によれば、ラジオアイソトープ法や蛍光法の問題点が解決された試料中の標的核酸の検出方法を提供することができ、精度よい遺伝子情報の取得が可能となる。【解決手段】標的核酸の塩基配列に相補的な塩基部分を有するプローブの２種以上を担体に固定したプローブ担体に試料を反応させ、該試料中に標的核酸が存在する場合に形成されるプローブと標的核酸とのハイブリッド体の有無を飛行時間型二次イオン質量分析法によって検出することで試料中の標的核酸を分析方法する際に、前記標的核酸と前記核酸プローブとしてＲＮＡとＤＮＡの組合せを用いる。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の塩基配列に相補的な塩基部分を有するプローブの２種以上を担体に固定したプローブ担体に試料を反応させ、該試料中に標的核酸が存在する場合に形成されるプローブと標的核酸とのハイブリッド体の有無を飛行時間型二次イオン質量分析法によって検出する試料中の標的核酸の分析方法であって、
前記標的核酸と前記核酸プローブがＲＮＡとＤＮＡの組合せであることを特徴とする試料中の標的核酸の分析方法。
【請求項２】
前記標的核酸に特有のフラグメントイオンを飛行時間型二次イオン質量分析法によって検出する請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記標的核酸がＲＮＡであり、前記フラグメントイオンが（ウラシル−Ｈ）−イオンである請求項２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである請求項１から３のいずれかに記載の分析方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡがｔＲＮＡである請求項１から３のいずれかに記載の分析方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡがｒＲＮＡである請求項１から３のいずれかに記載の分析方法。
【請求項７】
前記核酸プローブが前記担体の表面に共有結合によって結合されたＤＮＡである請求項３から６のいずれかに記載の分析方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡがデオキシリボヌクレオチドである請求項７に記載の分析方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項７に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記標的核酸がＤＮＡであり、前記フラグメントイオンが（チミン−Ｈ）−イオンである請求項２に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡである請求項１、２または１０に記載の分析方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項１、２または１０に記載の分析方法。
【請求項１３】
前記核酸プローブが前記担体の表面に共有結合によって結合されたＲＮＡである請求項１０から１２のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡがオリゴリボヌクレオチドである請求項１３に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子関連物質であるＲＮＡまたはＤＮＡの分析に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップ、また、ＲＮＡチップ等の核酸チップはゲノム解析、あるいは、遺伝子の発現解析などの遺伝子情報の取得を目的として利用されるようななってきており、また、それらの解析の結果は、癌、遺伝病、生活習慣病、感染症等の診断、予後予想、治療方針の決定等に重要な指標を提供するものと期待されている。
【０００３】
上記核酸チップの作製方法にはいくつかの方法が知られている。ＤＮＡチップを例にとって説明すると、基板上にフォトリソグラフィーを用いてＤＮＡプローブを逐次的に合成していく方法（米国特許第５４０５７８３公報等）、あるいは、あらかじめ合成したＤＮＡ、または、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）を基板上に供給し結合する方法（米国特許第５６０１９８０公報、特開平１１‐１８７９００号公報、Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２７０，　４６７，　１９９５等）が代表的なＤＮＡチップの作製法である。
【０００４】
いずれにしても、これらの方法によって核酸チップが作製され、作製された核酸チップを標的核酸を含む溶液中でハイブリダイゼーション条件におき、得られた核酸プローブと
標的核酸とのハイブリッドの有無を何らかの手段で検出し、さらに、分析することにより、標的核酸の塩基配列を分析し、結果として所望の遺伝子情報が取得される。この際、チップ上の核酸プローブは原理的に単分子膜レベルで存在し、また、そこにハイブリッドを形成する標的核酸の量は、標的核酸を含む溶液中の標的核酸濃度にも依存するので、場合によってはきわめて微量となる。従って、上記ハイブリッドの検出手段としては高感度な手段が必要とされ、その従来例としては、標的核酸のラジオアイソトープラベルとオートラジオグラフィーとの組合せ、また、標的核酸の蛍光ラベルと、例えば、蛍光スキャナー等の蛍光検出器との組合せをあげることができる。
【０００５】
しかしながら上記従来例には、ラジオアイソトープを用いる場合には、手法が煩雑、危険、特殊な施設、装置が必要等の理由で一般的ではない。また、蛍光法は、手法が比較的簡便で、また、感度もよいために広く用いられているが、よく知られているように、蛍光色素の安定性、クエンチング、蛍光色素の基板表面への非特異的吸着等、定量性、再現性の面で課題が残る場合がある。他に、一般的な高感度表面分析手段としてはＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光）法を用いたＡＴＲ法、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）法等があるが、いずれも核酸チップのプローブの定量的分析には十分な感度を有しているとはいえない。特に、核酸チップの基板として一般的なガラスを用いる場合には、例えばＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）ではガラスに起因する吸収の影響、ＸＰＳではチャージアップの影響等があり、有効な分析手段とはいえない。
また、別の高感度表面分析手段としては、レーザー共鳴イオン化法（ＲＩＳ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）によるＤＮＡの検出方法が米国特許第５８２１０６０公報に開示されている。これは試料表面から放出される注目元素のイオン化エネルギーに相当する波長のレーザービームを照射して当該元素をイオン化し検出するもので、試料表面から元素を放出させる手段としては、レーザービームを用いる方式、イオンを用いる方式が開示されているが、特定元素の検出しかできないという問題を持つ。さらに他の高感度表面分析手段としては、動的二次イオン質量分析法（ｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳ）があるが、この手法は二次イオンが生成する過程で有機化合物が小さいフラグメントイオン、または粒子にまで分解してしまうために質量スペクトルから得られる化学構造情報が乏しくなり、核酸関連物質のような有機物の分析には適していない。
【０００６】
これに対して、同じく二次イオン質量分析法の一手法として知られている、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法は、固体試料の最表面にどのような原子または分子が存在するかを調べるための分析方法であり、以下の様な特長を持つ。すなわち、１０９ａｔｏｍｓ／ｃｍ２（最表面１原子層の１／１０５に相当する量）の極微量成分の検出能があること、有機物、無機物のどちらにも適用できること、表面に存在するすべての元素や化合物を測定できること、試料表面に存在する物質からの二次イオンのイメージングが可能なことである。
【０００７】
以下、この方法の原理を簡単に説明する。高真空中で、高速のイオンビーム（一次イオン）を固体試料表面に照射すると、スパッタリング現象によって表面の構成成分が真空中に放出される。このとき発生する正または負の電荷を帯びたイオン（二次イオン）を電場によって一方向に収束し、一定距離だけ離れた位置で検出する。スパッタの際には、試料表面の組成に応じて様々な質量をもった二次イオンが発生するが、軽いイオンほど早く、反対に重いイオンほど遅い速度で飛行するため、二次イオンが発生してから検出されるまでの時間（飛行時間）を測定することで、発生した二次イオンの質量を分析することができる。
【０００８】
従来のｄｙｎａｍｉｃ−ＳＩＭＳ法では、すでに述べたように、イオン化の際に有機化合物が小さいフラグメントイオンまたは粒子にまで分解してしまうため、質量スペクトルから得られる化学構造情報が乏しいのに対し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでは一次イオン照射量が著しく少ないため、有機化合物は化学構造を保った状態でイオン化され、質量スペクトルから有機化合物の構造を知ることができる。固体試料表面の最も外側で発生した二次イオンのみが、真空中へ放出されるので、試料の最表面　（深さ数Å程度）の情報を得ることができる。
【０００９】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により、基板に固定した単分子膜レベルでの核酸が検出された例はすでに報告があり（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　１２ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　９５１，　１９９９）、この例では、ＴＯＦ−ＳＩＭＳで検出可能な核酸フラグメントイオンとして塩基の分解フラグメントイオン、および、リン酸バックボーンの分解フラグメントイオンがあげられている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を検出手段として、一般的に用いられている方法であるＤＮＡチップを標的用いてＤＮＡを検出することにより、所望の遺伝子情報を得ようとすると、
（１）ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法は表面近傍のごく薄い層のみが検出されること、
（２）プローブＤＮＡと標的ＤＮＡから生起するフラグメントイオン種が同一である、というふたつの理由により標的ＤＮＡのハイブリッドの有無を特異的に検出できない場合が生じるという問題がある。
【００１１】
このような問題点を解決する手段としてＰＮＡ（ペプチド核酸）を固相に結合してプローブとし標的核酸とハイブリッドを形成させる方法がある（Ｊ．　Ｃ．　Ｆｅｌｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ：ＳＩＭＳ　ＸＩＩＩ国際会議；２００１年１１月１１日〜１６日、奈良）。この方法によれば、ペプチド核酸は塩基部分はＤＮＡと同じではあるが、リン酸バックボーンを持たないので、リン酸バックボーンによるフラグメントイオンが検出されれば、ＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリッド形成が確認されることになる。
【００１２】
しかしながら、ペプチド核酸は価格が高いため、ペプチド核酸をプローブとしたチップを用いる遺伝子情報の取得は高コストとなり、実用的とはいえない場合が多い。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明にかかる分析方法は、標的核酸の塩基配列に相補的な塩基部分を有するプローブの２種以上を担体に固定したプローブ担体に試料を反応させ、該試料中に標的核酸が存在する場合に形成されるプローブと標的核酸とのハイブリッド体の有無を飛行時間型二次イオン質量分析法によって検出する試料中の標的核酸の分析方法であって、前記標的核酸と前記核酸プローブがＲＮＡとＤＮＡの組合せであることを特徴とする試料中の標的核酸の分析方法である。
【００１４】
本発明の分析方法によれば、ラジオアイソトープ法や蛍光法の問題点が解決された試料中の標的核酸の検出方法を提供することができ、精度よい遺伝子情報の取得が可能となる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明においては、担体上に固定されたプローブは、特定の標的物質に対して特異的に結合可能なものである。このプローブとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡが用いられる。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡや所定の配列を持って合成されたオリゴデオキシヌクレオチドやポリデオキシヌクレオチドが利用できる。所定の配列を持って合成されたＲＮＡとしては、オリゴリボヌクレオチドなどを用いることができる。
【００１６】
担体上に支持されるプローブの一例としては、標的核酸とハイブリダイゼーション可能な塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドの一部に、必要に応じてリンカーを介して担体との結合部を有するもので、担体との結合部において担体表面に連結された構造を有するものを挙げることができる。なお、このような構成の場合における担体と結合部のオリゴヌクレオチドの分子内での位置は、所望とするハイブリダイゼーション反応を損なわない範囲内において特に限定されない。
【００１７】
本発明においては、これらのプローブの複数種を、それぞれ独立した領域、例えば各プローブの固定化領域をドット状スポットとして担体表面に固定したものをプローブ担体といい、所定の間隔で配列されたものをプローブ・アレイという。また、高密度で固定化領域を配列したものはマイクロアレイに相当する。また、プローブ担体には、ＤＮＡチップ、また、ＲＮＡチップ等の核酸チップも含まれる。
【００１８】
一方、プローブは担体表面に結合可能な構造を有しており、担体上へのプローブの固定がこの結合可能な構造を介して行われていることが望ましい。その際、プローブが有する担体表面に結合可能な構造は、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、酸ハライド化物（ハロホルミル基；−ＣＯＸ）、ハライド化物（−Ｘ）、アジリジン、マレイミド基、スクシイミド基、イソチオシアネート基、スルフォニルクロリド基（−ＳＯ２Ｃｌ）、アルデヒド基（ホルミル基；−ＣＨＯ）、ヒドラジン及びヨウ化アセトアミドなどの有機官能基の少なくとも１種を導入する処理により形成されたものであることが好ましい。また、プローブ側の担体への結合に必要な構造に応じて、担体の表面に必要とされる処理、例えばチオール基用のマレイミド基、アミノ基用のエポキシ基、アルデヒド基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基などを担体表面に形成する処理を施すことで共有結合によるプローブの固定が可能となる。なお、プローブは安定性を考えると、基板表面に共有結合によって結合されていることが望ましい。
【００１９】
本発明においては、標的核酸に特有のフラグメントイオンを飛行時間型二次イオン質量分析法によって検出することで、ハイブリッド体の形成を確認することができる。このフラグメントイオンとしては、用いるプローブと標的核酸の組合せによって適宜設定することができる。プローブがＤＮＡであり、標的核酸がＲＮＡである場合には、フラグメントイオンとして（ウラシル−Ｈ）−イオンを選定してこれを検出用の指標とすることができる。すなわち、ＲＮＡは、ＤＮＡの塩基のひとつであるチミンをもたず、そのかわりとしてウラシルを有しているので、ＲＮＡに特異的なフラグメントイオンとして（ウラシル−Ｈ）−イオンが検出されればＤＮＡプローブと標的ＲＮＡのハイブリッドが形成されたことがわかることになる。
【００２０】
このＲＮＡとしてはＴＯＦ−ＳＩＭＳによって検出、分析可能なものであり、所望とする分析方法に利用できるものであればよい。ＲＮＡがｍＲＮＡであれば、転写された遺伝子情報をそのまま取得することが可能である。また、ＲＮＡがｔＲＮＡ、ｒＲＮＡである場合には、蛋白質へと翻訳される遺伝子情報を取得できるわけではないが、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡそのものの情報を得ることができる。
【００２１】
標的核酸がＤＮＡである場合は、フラグメントイオンとしてＤＮＡ特有の（チミン−Ｈ）−イオンを選定してこれを飛行時間型二次イオン質量分析法によって検出することで、ハイブリッド体の形成を確認することができる。標的核酸としてのＤＮＡとしては、例えばゲノムＤＮＡやｃＤＮＡが利用できる。この場合に用いられるプローブであるＲＮＡとしては、オリゴリボヌクレオチドまたはポリボヌクレオチドが好適に利用できる。
【００２２】
また、標的ＤＮＡとしてはＴＯＦ−ＳＩＭＳで検出、分析可能なＤＮＡであり、所望とする分析方法に利用できるものであればよい。標的ＤＮＡがゲノムＤＮＡであれば、ゲノムの遺伝子情報を直接取得することができ、また、標的ＤＮＡがｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）であれば、ｍＲＮＡに転写された遺伝子情報を間接的に知ることができる。また、ゲノムＤＮＡ、もしくは、ｃＤＮＡからＰＣＲ（ポリメレースチェインリアクション）によって増幅したＤＮＡを標的ＤＮＡとして用いることもできる。
【００２３】
本発明に用いるプローブ担体の製造方法における各プロセス自体は既知の方法によって行うことができる。場合によっては、プローブが、担体表面において逐次的に合成されたものであってもよいし、また、あらかじめ合成され、その後、担体表面に供給されたものであってもよい。
【００２４】
その際、プローブを担体表面に供給する手段としてインクジェット法を用いれば、微細、高密度なプローブ担体を製作することができ好適である。インクジェット法としては既知の、ピエゾジェット法、サーマルジェット法を用いることができる。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明する。なお、以下の実施例においてＲＮＡを取り扱う部分に関しては、ＲＮａｓｅフリーな条件で行った。
【００２６】
実施例１　（ｄＡ４０プローブによるＤＮＡプローブチップの作製）
公知の方法（特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法）に準じてＤＮＡプローブチップを作製した。
（１）基板洗浄
２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板をラックに入れ、純水で１０％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：ＧＰＩＩＩ）に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行って、そのまま次工程に供した。
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン　ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いでこの溶液に上記（１）で得た基板を室温で１時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に基板表面にアミノ基を導入した。次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。シランカップリング処理を行った石英基板をこのＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のスクシイミド基を反応させた。この段階で基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板はＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
（３）プローブＤＮＡの合成
ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼して配列１の一本鎖ＤＮＡ（ｄＡの４０量体）を合成した。なお配列１の一本鎖ＤＮＡの５’末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
配列１（配列番号：１）
５’　ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡ　　３’
（４）サーマルジェットプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
上記配列１の一本鎖ＤＮＡを８μＭの濃度でグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、及び、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む溶液に溶解した。サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターＢＪＦ−８５０（キヤノン）用のプリンターヘッドＢＣ−５０（キヤノン）を数１００μｌの溶液を吐出可能とするべく改造し、このヘッドを上記石英基板上へ吐出可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッドの改造タンク部に上記ＤＮＡ溶液を数１００μｌ注入し、吐出描画機にＥＭＣＳ処理基板を装着して、ここにスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は４ｐｌ／ｄｒｏｐｌｅｔで、スポッティングの範囲は基板の中央部に１０ｍｍ×１０ｍｍの範囲に２００ｄｐｉすなわち１２７μｍのピッチで吐出した。この条件ではスポッティングされたドットの直径は約５０μｍであった。
【００２７】
スポッティング終了後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。次いで、基板を純水で洗浄し、純水中で保存した。
【００２８】
実施例２（ＴＯＦ−ＳＩＭＳによるハイブリダイゼーションの検出、分析）
（１）モデル標的ＲＮＡの合成
実施例１と同様に合成業者に依頼して、配列２のモデル標的ＲＮＡ（Ｕ：ウラシルの４０量体）を合成した。
【００２９】
配列２（配列番号：２）
５’ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ　ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ　　ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ　ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ　３’
（２）ブロッキング
実施例１で作製したＤＮＡチップと上記モデル標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションを行うに先立ち、標的ＲＮＡのチップ表面への非特異的吸着等を防止するためにＢＳＡ（牛胸腺アルブミン）を用いてブロッキングを行った。すなわち、ＢＳＡ（シグマ−アルドリッチ・ジャパン）を２％の濃度で１Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解し、この溶液にＤＮＡチップを室温で３時間浸漬し、上記リン酸緩衝液でリンスした後、以下のハイブリダイゼーションを行った。
（３）ハイブリダイゼーション
Ｕの４０量体ＲＮＡを上記リン酸緩衝液に５０ｎＭの濃度で溶解し、この溶液２ｍｌ中にブロッキング処理を施したＤＮＡチップを封入（ハイブリパック中）し、４５℃で１５時間ハイブリダイゼーション処理を行った。その後、チップを上記リン酸緩衝液でリンスし、ついで、室温の純水でリンスした後、窒素ガスを吹き付けて乾燥し、真空デシケーター中に保存した。
（４）ＴＯＦ−ＳＩＭＳによる分析
ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをＴＯＦ−ＳＩＭＳで分析した。なお、使用した装置はＩＯＮ　ＴＯＦ社製ＴＯＦ−ＳＩＭＳ　ＩＶである。また、コントロールとしてブロッキングまでのチップを合せて分析した。以下に装置条件をまとめた。
＜一次イオン＞
一次イオン：２５ｋＶ　Ｇａ＋、ランダムスキャンモード
一次イオンのパルス周波数：２．５ｋＨｚ（４００μｓｅｃ　／　ｓｈｏｔ）
一次イオンパルス幅：１ｎｓ
一次イオンビーム直径：５μｍ
＜二次イオン＞一次イオンの照射パターンについて再構成しイメージング
二次イオン検出モード：ｎｅｇａｔｉｖｅ
測定領域：３００μｍ×３００μｍ
二次イオンｉｍａｇｅのｐｉｘｅｌ数：１２８×１２８
積算回数：２５６
（５）結果
まず、図１にコントロールとして用いたブロッキングまでの基板の測定結果の一部を示す。上述のようにＴＯＦ−ＳＩＭＳによるＤＮＡ、ＲＮＡの分析ではリン酸バックボーンの分解フラグメントイオンが検出されるが、図１の（１）はこのうちＰＯ２−（ｍ／ｚ＝６３）を指標としたＤＮＡチップのＤＮＡがドット状に結合されていることを示す分析（イメージング）結果である。図１の（２）は同じ部分を（アデニン−Ｈ）−イオン（ｍ／ｚ＝１３４）を指標としてイメージングした結果である。（ウラシル−Ｈ）−イオンを含む他の塩基由来のフラグメントイオンは検出されなかった。これらより、作製したＤＮＡチップには企図したとおり、アデニル酸のみからなるＤＮＡプローブがドット状に形成されていることがわかる。
【００３０】
図２はＵの４０量体とハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップを（ウラシル−Ｈ）−イオン（ｍ／ｚ＝１１０）を指標として分析した結果である。ドットの部分にウラシルが含まれていることがわかる。これらのドット部分からは上記のＰＯ２−（ｍ／ｚ＝６３）、（アデニン−Ｈ）−イオンも検出されており、この結果からチップのＤＮＡと標的ＲＮＡがハイブリッドを形成していることがわかる。
実施例３（Ｕ４０プローブによるＲＮＡチップの作製、ハイブリダイゼーション、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによる分析）
配列３
５’　ＨＳ−（ＣＨ２）６−Ｏ−ＰＯ２−Ｏ−ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ　　ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ　　ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ　　ＵＵＵＵＵＵＵＵＵＵ　　３’
配列４
５’　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡ　　３’
合成業者から入手した配列３（Ｕ４０量体）のＲＮＡを用いて実施例１と同様な方法でＲＮＡチップを作製した。このＲＮＡチップと、同じく合成業者から入手した配列４（ｄＡ４０量体）の標的ＤＮＡを実施例２と同様な方法によりハイブリダイゼーションを行ない、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより分析した。結果として、ハイブリダイゼーションを行ったチップのドット部分からのみ（アデニン−Ｈ）−イオンが検出された。この結果からチップのＲＮＡと標的ＤＮＡがハイブリッドを形成していることがわかる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、ラジオアイソトープ法や蛍光法の問題点が解決された、遺伝子情報の取得が可能となった。
【００３２】
【配列表】
2004024203.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２のイメージング結果を示す図であり、（１）はＰＯ２−イオン、（２）は（アデニン−Ｈ）−イオンを示す。
【図２】実施例２のイメージング結果を示す図であり、（ウラシル−Ｈ）−イオンを示す。
【図１】
2004024203.tif 000003
【図２】
2004024203.tif 000004