(57)【要約】【課題】果樹類へ、外来遺伝子を導入して形質転換させるための新たな手段として、現実に使用できる方法を提供すること。【解決手段】本発明は、果樹類の潜在性ウイルス、その中でも特に、リンゴ小球型潜在ウイルス（Ａｐｐｌｅ　Ｌａｔｅｎｔ　Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ　Ｖｉｒｕｓ　；　ＡＬＳＶ）を、外来遺伝子を運搬する役割をもつウイルスベクターへと改変することによって作成された果樹類への外来遺伝子導入ベクターを提供する。また、当該外来遺伝子導入ベクターを用いて簡便に果樹類へ外来遺伝子を導入する方法を提供する。【選択図】　図２
2004065009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
果樹類の潜在性ウイルスのゲノムＲＮＡに対するＤＮＡを含む、果樹類への外来遺伝子導入ベクター。
【請求項２】
リンゴの潜在性ウイルスのゲノムＲＮＡに対するＤＮＡを含む、リンゴへの外来遺伝子導入ベクター。
【請求項３】
リンゴの潜在性ウイルスがコモウイルス科に所属するウイルスである、請求項２記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項４】
コモウイルス科に所属するウイルスがリンゴ小球形潜在ウイルスである、請求項３記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項５】
リンゴ小球潜在ウイルスのゲノムＲＮＡ１の完全長に対するＤＮＡを含むベクター、及びリンゴ小球潜在ウイルスのゲノムＲＮＡ２の完全長に対するＤＮＡを含むベクターから成る、請求項４記載のベクター。
【請求項６】
果樹類の潜在性ウイルスのゲノムＲＮＡに対するＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項７】
果樹類の潜在性ウイルスのゲノムＲＮＡの完全長に対するＤＮＡが含まれている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項８】
ポリＡ配列をコードする領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項９】
ゲノムＲＮＡに対するＤＮＡの上流に転写調節因子を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項１０】
転写調節因子がプロモーターを含む、請求９に記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項１１】
プロモーターが植物ウイルス由来プロモーターである、請求項１０に記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項１２】
プロモーターが３５Ｓプロモーターである、請求項１１に記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項１３】
新たに制限酵素部位が導入された、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項１４】
ゲノムＲＮＡ２におけるタンパク質をコードする塩基配列の間に制限酵素部位が導入された、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項１５】
細胞間移行タンパク質（ＭＰ）をコードする塩基配列と外被タンパク質（Ｖｐ２５）をコードする塩基配列の間に制限酵素部位を含む、請求項１４に記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項１６】
ゲノムＲＮＡ２におけるポリタンパク質中のプロテアーゼ切断部位をコードする塩基配列が反復され、その間に制限酵素部位を含む、請求項１１４又は１５記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項１７】
複数の制限酵素部位を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の外来遺伝子導入ベクター。
【請求項１８】
制限酵素部位に外来遺伝子が導入された請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の外来遺伝子導入ベクターを含む、果樹類への外来遺伝子導入ベクター組成物。
【請求項１９】
制限酵素部位に外来遺伝子が導入された請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の外来遺伝子導入ベクターを含む、リンゴへの外来遺伝子導入ベクター組成物。
【請求項２０】
請求項１８又は１９記載の外来遺伝子導入ベクター組成物を果樹類に接種することから成る、果樹類への外来遺伝子の導入方法。
【請求項２１】
請求項１８又は１９記載の外来遺伝子導入ベクター組成物を感染させた果樹類の葉を磨砕した後、得られた汁液を接種することから成る、請求項１９記載の果樹類への外来遺伝子の導入方法。
【請求項２２】
果樹類がりんごである、請求項２０又は２１記載の外来遺伝子の導入方法。
【請求項２３】
請求項１８又は１９記載の外来遺伝子導入ベクター組成物を果樹類に接種し、果樹類へ外来遺伝子を導入し、該外来遺伝子を果樹類において発現させる方法。
【請求項２４】
請求項１８又は１９記載の外来遺伝子導入ベクター組成物を感染させた果樹類の葉を磨砕した後、得られた汁液を接種し、果樹類へ外来遺伝子を導入し、該外来遺伝子を果樹類において発現させる方法。
【請求項２５】
外来遺伝子の発現する部位が接種した部位とは異なることを特徴とする、請求項２３又は２４記載の外来遺伝子の導入方法。
【請求項２６】
果樹類がりんごである、請求項２３、２４又は２５記載の外来遺伝子の導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、果樹類の潜在性ウイルスを、外来遺伝子を運ぶウイルスベクターに改変することによって作成された果樹類への外来遺伝子導入ベクター、及び、当該外来遺伝子導入ベクターを用いた簡便な果樹類の外来遺伝子導入法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、植物への外来遺伝子の導入法としては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いた形質転換法が一般に用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、リンゴなどの果樹類では成功例が少なく、外来遺伝子の簡便な導入法は確立していないのが現状である。
本発明者は、リンゴ樹に病気を起こすことなく潜在感染している潜在性ウイルス（ｌａｔｅｎｔ　ｖｉｒｕｓ）の一種である、径２５ｎｍ程度の球状ウイルス（ＡＬＳＶ、リンゴ小球型潜在ウイルス）から採取・精製した一本鎖ＲＮＡがコードするアミノ酸配列を決定し、一本鎖ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡの合成に成功した研究成果に基づき、このクローンを植物に接種して感染を確認し、さらに外来遺伝子をこのクローンのプロテアーゼ切断配列間に挿入し植物に接種して外来遺伝子を感染させ発現させることに成功し、本発明を完成した。
本発明の方法によれば、従来困難であった果樹類へ外来遺伝子を導入し形質転換させる新たな手段として現実に使用できる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、リンゴ等の果樹類の潜在性ウイルスのゲノムＲＮＡに対するＤＮＡを含む、果樹類への外来遺伝子導入ベクター、に係る。このベクターは果樹類に接種することで感染させることの出来る感染性ベクターである。
本発明は更に、該外来遺伝子導入ベクターに外来遺伝子を導入させて得られる、果樹類への外来遺伝子導入ベクター組成物、及び、該外来遺伝子導入ベクター組成物を果樹類に接種することから成る、果樹類への外来遺伝子の導入方法、に係る。また、本発明は、外来遺伝子導入ベクター組成物を果樹類に接種し、果樹類へ外来遺伝子を導入し、該外来遺伝子を果樹類の植物体（例えば、葉）において発現させる方法、にも係る。尚、植物体の接種した部位とは異なる部位で該外来遺伝子が発現することもある。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明において、ゲノムＲＮＡの由来となる果樹類の潜在性ウイルスに特に制限はなく、例えば、リンゴ小球形潜在ウイルスのようなコモウイルス科に所属するウイルスを挙げることできる。リンゴ小球形潜在ウイルスを使用する場合には、リンゴ小球潜在ウイルスのゲノムＲＮＡ１の完全長に対するＤＮＡを含むベクター、及びリンゴ小球潜在ウイルスのゲノムＲＮＡ２の完全長に対するＤＮＡを含むベクターを含むものが好ましい。
本発明の果樹類の潜在性ウイルスのゲノムＲＮＡに対するＤＮＡは、当該ウイルスゲノム情報に基づいて、当業者であれば、当該技術分野における周知技術を用いて、容易に調製することが出来る。例えば、逆転転写酵素を使用して得られるｃＤＮＡとして容易に調製することが出来る。或いは、化学合成法によって、合成ＤＮＡとして調整することも可能である。
このようにして調製される外来遺伝子導入ベクターは、果樹類の潜在性ウイルスのゲノムＲＮＡの少なくとも一部をふくむものであるが、果樹類への高い感染性を確保するためには、ゲノムＲＮＡの完全長に対するＤＮＡを含むことが好ましい。従って、このような場合には、ウイルスゲノムＲＮＡに見られる適当な長さ（例えば、数十〜数百個）のポリＡ配列も含まれる。
【０００６】
更に、本発明の外来遺伝子導入ベクターにおいて、ゲノムＲＮＡに対するＤＮＡの上流にプロモーター、エンハンサー等の当業者に公知の適当な各種の転写調節因子を含むことが好ましい。
例えば、プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓプロモーター等の適当な植物ウイルス由来の各種プロモーターを挙げることが出来る。
【０００７】
更に、本発明の外来遺伝子導入ベクターにおいては、外来遺伝子の挿入部位として、新たに制限酵素部位を導入することが好ましい。このような制限酵素部位は、本発明の外来遺伝子導入ベクターの果樹類への感染性を損なわない限り、任意の場所に導入することが出来る。即ち、ウイルスゲノムＲＡＮＡにおいて、各タンパク質をコードする塩基配列の間に制限酵素部位が導入されることが好ましい。
例えば、リンゴ小球形潜在ウイルスの場合には、ゲノムＲＮＡ２における細胞間移行タンパク質（ＭＰ）をコードする塩基配列と外被タンパク質（Ｖｐ２５）をコードする塩基配列の間に制限酵素部位が導入される。
このような制限酵素部位は当業者には周知の適当な方法によって導入することが出来る。例えば、ゲノムＲＮＡ２におけるポリタンパク質中のプロテアーゼ切断部位をコードする塩基配列が反復され、その間に制限酵素部位が導入される。尚、外来遺伝子の挿入を容易にするために、複数の異なる制限酵素部位が導入されることが好ましい。
【０００８】
本発明の、果樹類への外来遺伝子導入ベクター組成物は、制限酵素部位に所望の外来遺伝子が導入された外来遺伝子導入ベクターを含むものである。この外来遺伝子導入ベクター組成物には、感染方法、及び感染対象等に応じて、その他の成分、例えば、適当な緩衝成分を適宜含むことが出来る。
該組成物中の、外来遺伝子導入ベクターの含有量は、感染方法及び、感染対象等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。例えば、ＤＮＡ濃度として０．０１〜数μｇ／μｌの範囲の外来遺伝子導入ベクターをトリス−ＥＤＴＡ等の緩衝液中に含有させることが出来る。
【０００９】
本発明の外来遺伝子導入ベクター組成物は、外来遺伝子が有意に果樹類に導入される限り、当業者に公知の任意の方法で果樹類の適用な部位へ接種することが出来る。例えば、果樹類に１葉当たり数μｌ〜数十μｌ程度の外来遺伝子導入ベクター組成物を、一般的な方法であるカーボンランダム法によって接種することが出来る。あるいは、本発明の外来遺伝子導入ベクター組成物で予め感染させた果樹類の一部、例えば、葉を磨砕等の適当な手段で処理した後、得られた汁液を接種することも可能である。
【００１０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００１１】
実施例１
コモウイルス科所属の新規ウイルスであるリンゴ小球形潜在ウイルスのゲノム構造
本発明で使用した小球形ウイルス（リンゴ小球形潜在ウイルス、Ａｐｐｌｅ　ＬａｔｅｎｔＳｐｈｅｒｉｃａｌ　Ｖｉｒｕｓ　；　「ＡＬＳＶ」と仮称）は輪状さび果病に罹病したリンゴ樹から小金沢ら（１９８５）により分離されたウイルスである。その後の研究により、ＡＬＳＶは輪状さび果病の病原ではなく、リンゴに潜在感染するウイルスであることが明らかにされた。
本発明者等はＡＬＳＶの分類学的所属を明らかにする目的で、ＡＬＳＶの理化学的性質およびゲノム構造等の解析を行い、ＡＬＳＶの分類所属を明らかにした（Ｌｉ，　Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（２０００），　８１，　５４１−５４７）。結果は以下のように要約される。
【００１２】
ＡＬＳＶの理化学的性質
（１）ＡＬＳＶ感染Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ　ｑｕｉｎｏａから小金沢らの方法によりウイルスの精製を行ったところ、ショ糖密度勾配遠心後に単一ピークの成分として粒子が精製された。精製標品は２５９ｎｍに最大吸収、２４０ｎｍに最小吸収をもつ典型的な核タンパク質の紫外部吸収曲線を示し、Ａ２６０／２８０は１．８５〜１．９０であった。また、精製ウイルス標品の電子顕微鏡観察では径２５ｎｍの小球形ウイルスが多数観察された。精製ウイルス収量は１００ｇの感染葉から０．４〜０．６ｍｇであった。
（２）精製ウイルス標品を塩化セシウム平衡密度勾配遠心分離したところ、浮遊密度１．４１ｇ／ｃｍ３と１．４３ｇ／ｃｍ３の２つのピークに分かれ、ＡＬＳＶが２粒子成分からなることが明らかになった。
（３）ＡＬＳＶの外被タンパク質（ＣＰ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析したとこと、分子量２５キロダルトン（ＫＤａ）、２４ＫＤａ、２０ＫＤａの３本のバンドが検出された。ウエスタンブロット分析において、これらのタンパク質は小金沢らにより作製された抗血清と反応した。以上の結果から、ＡＬＳＶは３種類のＣＰ（Ｖｐ２５、Ｖｐ２４、Ｖｐ２０）から構成されていることが明らかになった。
（４）炭酸アンモニウム緩衝液とプロテアーゼＫを用いて精製ウイルスから核酸を抽出し、ホルムアミド変性下で１％アガロースゲル電気泳動したところ、約６８００塩基と３６００塩基の２本のバンドが検出された。これらの核酸は２ＸＳＳＣおよび０．１ＸＳＳＣの条件下でＲＮＡ分解酵素により完全に消化された。以上の結果より、ＡＬＳＶのゲノムは２分節の一本鎖ＲＮＡ［ＲＮＡ１（６８００塩基）とＲＮＡ２（３６００塩基）］からなると結論された。
【００１３】
ＡＬＳＶのゲノム構造
（１）ＡＬＳＶゲノムのクローニング
精製ウイルスから抽出したＲＮＡを鋳型として、オリゴ（ｄＴ）およびランダムプライマーを用いて常法によりｃＤＮＡを合成し、大腸菌でクローニングした。その結果、ＲＮＡ１およびＲＮＡ２のほぼ全長を含むクローンが得られた。（２）ＡＬＳＶゲノムの塩基配列の解析
ダイデオキシ法を用いてｃＤＮＡの塩基配列を解析した。またゲノムの５’末端領域の配列は５’−ＲＡＣＥ法を用いてｃＤＮＡを合成後決定した。その結果、３’末端のポリ（Ａ）を除いてＲＮＡ１は６８１５塩基、ＲＮＡ２は３３８４塩基からなることが明らかになった。
尚、これらの塩基配列は、ＤＤＢＪのＡＢ０３０９４０（ＲＮＡ１）及びＡＢ０３０９４１（ＲＮＡ２）に記載されている。
（３）ＡＬＳＶゲノムにコードされたタンパク質
解析した塩基配列の中のタンパク質コード領域（ＯＲＦ）を検索したところ、ＲＮＡ１には、塩基番号６８１５番目のＡＵＧで始まり、２３ＫＤａのタンパク質をコードするＯＲＦ１と塩基番号３８８のＡＵＧで始まり、ほぼ全長におよぶＯＲＦ２（２３５ＫＤａのタンパク質をコードする）が存在していた。２３５ＫＤａタンパク質にはＮ−末端側からプロテアーゼｃｏｆａｃｔｏｒ、ＮＴＰ結合ヘリカーゼ、プロテアーゼおよびＲＮＡポリメラーゼの保存配列が認められた。これらのゲノム編成はコモウイルス科に所属するウイルスのゲノム編成と一致した。
ＲＮＡ２には３１２番目のＡＵＧで始まる分子量１０８ＫＤａのポリタンパク質がコードされていた。このタンパク質のＮ−末端側には細胞間移行タンパク質（ＭＰ）と推定されるタンパク質がコードされていた。
（４）ＡＬＳＶの外被タンパク質コード領域
Ｅｄｍａｎ法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＶｐ２５、Ｖｐ２４及びＶｐ２０の３種のＣＰのＮ−末端側アミノ酸配列を決定した。その結果、これら３種のＣＰのＮ末端１５アミノ酸の配列は、ＲＮＡ２がコードする１０８ＫＤａタンパク質上の３７７〜３９１番目（Ｖｐ２５）、７７０〜７８４番目（Ｖｐ２０）、及び５９４〜６０８番目（Ｖｐ２４）の配列と一致した。以上の結果から、ＡＬＳＶの外被タンパク質はＲＮＡ２にコードされる１０８ＫＤａポリタンパク質のＣ末端側に存在し、プロテアーゼによる切断部位はＱ−Ｇ（ＭＰ／Ｖｐ２５）、Ｑ−Ｇ　（Ｖｐ２５／Ｖｐ２０）およびＥ−Ｇ（Ｖｐ２０／Ｖｐ２４）であることが明らかになった。
【００１４】
ＡＬＳＶの分類学的所属
このように明らかにしたＡＬＳＶの理化学的性質およびゲノム編成から、ＡＬＳＶはコモウイルス科に所属するウイルスと考えられた。現在、コモウイルス科にはコモウイルス属、ネポウイルス属、ファバウイルス属の３属が設立されている。ＡＬＳＶ粒子は３種類のＣＰから構成されている点でこれら３属のウイルスとは異なっており、さらにＲＮＡ１にコードされる２３５ＫＤａタンパク質のポリメラーゼ領域のアミノ酸配列に基づいた系統解析では、ＡＬＳＶは上記３属とは異なるクラスターを形成することが明らかになった。以上の結果から、ＡＬＳＶはコモウイルス科に分類されるが、既設のいずれの属のウイルスとは異なり、今後新属を設立する必要があると結論された。
【００１５】
実施例２
リンゴ小球形潜在ウイルス（ＡＬＳＶ）のベクターへの応用
リンゴ小球形潜在ウイルス（ＡＬＳＶ）は、リンゴに病気を起こさないで潜在感染する径約２５ｎｍの小球形ウイルスである。本ウイルスのゲノムは２種類の一本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ１，　６８１５塩基；ＲＮＡ２，　３３８４塩基）からなり、ＲＮＡ１は２３５キロダルトン（Ｋ）のポリタンパク質、ＲＮＡ２は１０８Ｋのポリタンパク質をコードしている（図１）。
本課題の目的は、リンゴなどの果樹類への簡便な遺伝子導入のためにＡＬＳＶをウイルスベクターとして利用しようとするものである。そのために、１）ＡＬＳＶゲノムの感染性ｃＤＮＡの構築、２）感染性ｃＤＮＡクローンのウイルスベクターへの改変、３）改変したベクターへの外来遺伝子の導入と植物体での発現を以下のように行った。
【００１６】
１．　　ＡＬＳＶゲノムの感染性クローン（ｐＥＡＬＳＲ１とｐＥＡＬＳＲ２）の構築
ＡＬＳＶのＲＮＡ１およびＲＮＡ２の感染性クローンは以下のようにして構築した。
精製したウイルスからＲＮＡを抽出して、逆転写酵素によりＲＮＡ１およびＲＮＡ２に対するｃＤＮＡを合成した。続いて、ＲＮａｓｅ　ＨとＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを合成し、大腸菌プラスミドでクローニングした。ウイルスゲノムＲＮＡの５’末端および３’末端については、塩基配列を基に合成したプライマーとＥｘＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲにより合成した。これらのＤＮＡを３５Ｓプロモーター（Ｅｌ２３５Ｓ、農水省旧生物研大橋裕子博士より分譲）の下流に正確に連結し、ＲＮＡ１に対する完全長ｃＤＮＡクローン（ｐＥＡＬＳＲ１）とＲＮＡ２に対する完全長ｃＤＮＡクローン（ｐＥＡＬＳＲ２）を構築した（図２）。ｐＥＡＬＳＲ１から転写されるＲＮＡ１の３’末端に１０２個のポリＡ配列が、またｐＥＡＬＳＲ２から転写されるＲＮＡ２の３’末端には６５個のポリＡ配列が存在することになる。
こうして調製された、本発明の外来遺伝子導入ベクターであるｐＥＡＬＳＲ１とｐＥＡＬＳＲ２で大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換後、大量培養した。大腸菌からのプラスミド抽出キット（キアゲン社）を用いて両プラスミドＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ濃度が２μｇ／μｌになるように、トリス−ＥＤＴＡ　（ＴＥ）緩衝液に懸濁後、以下の接種実験に用いた。
構築クローンの感染性試験にはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ　ｑｕｉｎｏａを供試した。ガラス温室で育成したＣ．ｑｕｉｎｏａの十分に展開した４枚の葉にカーボランダム法により、１葉あたり１０μｌのｐＥＡＬＳＲ１とｐＥＡＬＳＲ２混合液（終濃度がいずれも０．５μｇ／μｌ）を接種した。その結果、接種９−１２日後から上葉に退緑斑が現れ、その後モザイクとなった。この病徴はウイルスを接種した植物での病徴と同じであった。この感染葉を磨砕後、再びＣ．ｑｕｉｎｏａに汁液接種すると、４−５日後に接種葉に退緑斑が現れ、その後上葉にはモザイクが生じた。また、ＡＬＳＶ抗血清（農水省果樹試験場リンゴ部より入手）を用いてウエスタンブロット分析したところ、ＡＬＳＶの３種類の外被たんぱく質が検出された（図３）。以上の結果から、構築したｐＥＡＬＳＲ１とｐＥＡＬＳＲ２は感染性を有していることが明らかになった。
プラスミドＤＮＡの濃度と感染率の関係を調べるため、ｐＥＡＬＳＲ１とｐＥＡＬＳＲ２の濃度を５段階（０．５μｇ／μｌ，０．２μｇ／μｌ，　０．１μｇ／μｌ，　０．０４μｇ／μｌ，０．０２μｇ／μｌ）に希釈し、Ｃ．ｑｕｉｎｏａに接種した。その結果、０．０４μｇ／μｌの濃度以上で感染が認められた（図３）。
【００１７】
２．　　感染性ｃＤＮＡクローン　（ｐＥＡＬＳＲ２）の改変
ＡＬＳＶ−ＲＮＡ２は１０８Ｋの１種類のポリタンパク質をコードしているが、この中にはＮ末端側から４２Ｋの細胞間移行タンパク質（ＭＰ）と３種類の外被タンパク質（Ｖｐ２５、Ｖｐ２０、Ｖｐ２４）が含まれる。この１０８Ｋポリタンパク質は翻訳後にＲＮＡ１がコードするプロテアーゼにより切断されて、各タンパク質が生じる。ベクターへの改変の第一段階として、ｐＥＡＬＳＲ２のＭＰとＶｐ２５のプロテアーゼ切断配列（Ｑ／Ｇ）を２反復し、その間に３種類の制限酵素部位（ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ）を含むプラスミド（ｐＥＡＬＳＲ２ＸＢ）を構築した。制限酵素部位を導入したことにより、外来遺伝子を簡単に連結することができるようになった、本発明の外来遺伝子導入ベクターが得られた（図４）。
ｐＥＡＬＳＲ２ＸＢをｐＥＡＬＳＲ１と混合して（終濃度１μｇ／μｌ）、５個体のＣ．ｑｕｉｎｏａに接種したところ、９−１２日後にすべてのＣ．ｑｕｉｎｏａの上葉に病徴が現れた。この感染葉からフェノール法によって全ＲＮＡを抽出して、ゲノムＲＮＡ２の全長のＲＴ−ＰＣＲを行った後、その産物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した。野生型（ｐＥＡＬＳＲ２）の感染葉のＲＴ−ＰＣＲ産物がこれら酵素では切断されないのに対して、ｐＥＡＬＳＲ２ＸＢ感染葉の産物は切断されたことにより、ｐＥＡＬＳＲ２ＸＢは感染性を有し、かつ増殖したウイルスゲノムには制限酵素切断部位（ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ）が存在していることが明らかになった（図５）。
【００１８】
３．改変ベクターを用いた外来遺伝子（ＧＦＰ）の植物体での発現
図６に示したように、ｐＥＡＬＳＲ２ＸＢのＸｈｏＩとＢａｍＨＩ切断部位にグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を導入したクローン（ｐＥＡＬＳＲ２ＧＦＰ）を作出した。ｐＥＧＦＰ−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型として、制限酵素切断配列を含む＋鎖プライマーＸｈｏＧＦＰ（＋）［５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ−３’］と−鎖プライマーＢａｍＨＧＦＰ（−）［５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴ　ＣＧＴＣＣＡ−３’］（アンダーラインは制限酵素切断配列を示す）を用いてＫＯＤ−ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（ＴＯＹＯＢＯ）によってＧＦＰ遺伝子を増幅した。これを、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで処理後、同じ制限酵素で切断したｐＥＡＬＳＲ２ＸＢとライゲーションした。得られたプラスミドをｐＥＡＬＳＲ２ＧＦＰとした。
ｐＥＡＬＳＲ２ＧＦＰとｐＥＡＬＳＲ１を混合して（各０．５μｇ／μｌ）、本発明の外来遺伝子導入ベクター組成物を調製し、Ｃ．ｑｕｉｎｏａに接種した。一週間後の上葉を実体蛍光顕微鏡で観察したところ、接種葉の一部の葉脈にＧＦＰの蛍光が観察された（図６）。さらに接種後９日には増殖したウイルスが直接接種した葉の上葉に移行して、その上葉全体にＧＦＰの蛍光が葉脈に沿って観察された（図７）。これらの感染葉を磨砕後、Ｃ．ｑｕｉｎｏａに汁液接種したところ、種葉にはリング状の蛍光が大量に観察された。感染葉からフェノール法によりＲＮＡを抽出後、逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）とＥｘＴａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでゲノムＲＮＡ２の全長を増幅した。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩによって処理後、１％アガロースの電気泳動分析したところ、ＧＦＰ遺伝子断片の存在が確認された（図８）。
このことから、本研究で構築したＧＦＰ遺伝子を含むウイルスベクターは、Ｃ．ｑｕｉｎｏａの接種葉で複製し、上葉に移行すると同時に外来遺伝子（ＧＦＰ）を植物体で発現することが確認された。
【００１９】
【発明の効果】
本発明によって、非常に困難な技術である果樹類（例えば、リンゴ）への外来遺伝子導入及びその植物体での該外来遺伝子の発現が簡便で効率的に可能となった。
又、本発明方法は、リンゴ等に感染するウイルスベクターを作り外来遺伝子を果樹類へ導入し、形質転換を実現し、品種改良や新品種作出に使用することのできる新しい手法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、リンゴ小球形潜在ウイルス（ＡＬＳＶ）のゲノム構成（上）、及び、リンゴ小球形潜在ウイルスの電子顕微鏡写真（約２５万倍）（下）を示す。
【図２】図２は、本発明の感染性ｃＤＮＡクローンである、ＲＮＡ１に対する完全長ｃＤＮＡクローン（ｐＥＡＬＳＲ１）とＲＮＡ２に対するクローン（ｐＥＡＬＳＲ２）の構成、及び制限酵素地図を示す。
【図３】図３は、ｐＥＡＬＳＲ１ｐＥＡＬＳＲ２を含む本発明の外来遺伝子導入ベクターを用いた機械的接種によるＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ　ｑｕｉｎｏａでの感染性を示す、ＡＬＳＶ抗血清を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す（下）。プラスミドＤＮＡ濃度と感染率との関係を示す（上）。
【図４】図４は、本発明の外来遺伝子導入ベクターである感染性ｃＤＮＡクローン　（ｐＥＡＬＳＲ２）の改変の様子を示す。
【図５】図５は、本発明の外来遺伝子導入ベクターであるｐＥＡＬＳＲ２ＸＢが感染性を有し、かつ増殖したウイルスゲノムには制限酵素切断部位（ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ）が存在していることを示す、模式図及び電気泳動の写真である。
【図６】図６は、本発明の外来遺伝子導入ベクター組成物である、ｐＥＡＬＳＲ２ＧＦＰとｐＥＡＬＳＲ１の混合物をＣ．ｑｕｉｎｏａに接種し、一週間後に実体蛍光顕微鏡で観察した結果、接種葉の一部の葉脈にＧＦＰの蛍光が観察された様子を示す写真である（約２５万倍）。
【図７】図７は、本発明の外来遺伝子導入ベクター組成物である、ｐＥＡＬＳＲ２ＧＦＰとｐＥＡＬＳＲ１の混合物をＣ．ｑｕｉｎｏａに接種し、９日後に実体蛍光顕微鏡で観察した結果、ウイルスを直接接種した葉ではない上葉全体にＧＦＰの蛍光が葉脈に沿って観察された様子を示す写真である（約２５万倍）。
【図８】図８は、本発明の外来遺伝子導入ベクター組成物であるｐＥＡＬＳＲ２ＧＦＰとｐＥＡＬＳＲ１の混合物による感染葉からフェノール法によりＲＮＡを抽出後、逆転写酵素でゲノムＲＮＡ２の全長を増幅し、このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩによって処理後、１％アガロースの電気泳動分析したところ、ＧＦＰ遺伝子断片の存在が確認されたことを示す、模式図及び写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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