(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規ポリペプチド、レセプターおよびそのＤＮＡ等の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列で表されるタンパク質と結合する能力を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドのアンチセンスポリヌクレオチドまたは抗体、これらを用いる癌、肥満症などの予防・治療剤のスクリーニングなどの提供。【効果】本発明のポリペプチド、レセプター、ポリヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体などは、癌、肥満症などの予防・治療剤などとして有用であり、さらには、癌、肥満症などの予防・治療剤のスクリーニングなどにも有用である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩と結合する能力を有することを特徴とするポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項２】
配列番号：２２、配列番号：１４または配列番号：３１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項３】
配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４９、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：３６、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１または配列番号：３２で表されるアミノ酸配列を含有する請求項２記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項４】
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含有する請求項２記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項５】
標識した請求項４記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項６】
配列番号：１９、配列番号：２８または配列番号：６１で表されるアミノ酸配列を含有する請求項２記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
【請求項７】
請求項１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８または配列番号：５０で表される塩基配列を含有する請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号：１８、配列番号：２７または配列番号：６０で表される塩基配列を含有する請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ＤＮＡである請求項７〜９記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項７記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２記載の形質転換体を培養し、請求項１記載のポリペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の製造法。
【請求項１４】
請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１５】
請求項７記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項１６】
請求項７記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
【請求項１７】
肥満症の予防・治療剤である請求項１４または請求項１５記載の医薬。
【請求項１８】
肥満症の診断薬である請求項１６記載の診断薬。
【請求項１９】
請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。
【請求項２０】
請求項１９記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項２１】
請求項１９記載の抗体を含有してなる診断薬。
【請求項２２】
癌の予防・治療剤である請求項２０記載の医薬。
【請求項２３】
摂食促進剤である請求項２０記載の医薬。
【請求項２４】
癌の診断薬である請求項２１記載の診断薬。
【請求項２５】
請求項７記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチド。
【請求項２６】
ＤＮＡである請求項２５記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項２５記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項２８】
癌の予防・治療剤である請求項２７記載の医薬。
【請求項２９】
摂食促進剤である請求項２７記載の医薬。
【請求項３０】
請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項３１】
標識した請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる請求項３０記載のスクリーニング方法。
【請求項３２】
請求項５記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる請求項３０記載のスクリーニング方法。
【請求項３３】
さらに、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる請求項３０記載のスクリーニング方法。
【請求項３４】
さらに、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：７７、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：８３、配列番号：５１、配列番号：５５、配列番号：６９、配列番号：１０２または配列番号：１０４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる請求項３０記載のスクリーニング方法。
【請求項３５】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる請求項３３記載のスクリーニング方法。
【請求項３６】
標識した請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、および配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる請求項３０記載のスクリーニング方法。
【請求項３７】
請求項５記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、および配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる請求項３０記載のスクリーニング方法。
【請求項３８】
（ｉ）請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩とを接触させた場合と、
（ｉｉ）請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする請求項３０記載のスクリーニング方法。
【請求項３９】
（ｉ）請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞に接触させた場合と、
（ｉｉ）請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および試験化合物を、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞に接触させた場合における、該ポリペプチドの該細胞に対する結合量または細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする請求項３８記載のスクリーニング方法。
【請求項４０】
（ｉ）請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、
（ｉｉ）請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および試験化合物を、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、該ポリペプチドの該細胞の膜画分に対する結合量または細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする請求項３８記載のスクリーニング方法。
【請求項４１】
（ｉ）請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を、請求項１２記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現したタンパク質に接触させた場合と、
（ｉｉ）請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および試験化合物を、請求項１２記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現したタンパク質に接触させた場合における、該ポリペプチドの該タンパク質に対する結合量または細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする請求項３８記載のスクリーニング方法。
【請求項４２】
標識した請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる請求項３８〜４１記載のスクリーニング方法。
【請求項４３】
請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項４４】
標識した請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する請求項４３記載のスクリーニング用キット。
【請求項４５】
請求項５記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する請求項４３記載のスクリーニング用キット。
【請求項４６】
さらに、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する請求項４３記載のスクリーニング用キット。
【請求項４７】
さらに、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：７７、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：８３、配列番号：５１、配列番号：５５、配列番号：６９、配列番号：１０２または配列番号：１０４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する請求項４３記載のスクリーニング用キット。
【請求項４８】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する請求項４６記載のスクリーニング用キット。
【請求項４９】
標識した請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、および配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する請求項４３記載のスクリーニング用キット。
【請求項５０】
請求項５記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、および配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する請求項４３記載のスクリーニング用キット。
【請求項５１】
配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞を含有することを特徴とする請求項４６記載のスクリーニング用キット。
【請求項５２】
配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞の膜画分を含有することを特徴とする請求項４６記載のスクリーニング用キット。
【請求項５３】
請求項１２記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現したタンパク質を含有することを特徴とする請求項４６記載のスクリーニング用キット。
【請求項５４】
請求項３０記載のスクリーニング方法または請求項４３記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩。
【請求項５５】
請求項３０記載のスクリーニング方法または請求項４３記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩。
【請求項５６】
請求項５４記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項５７】
請求項５５記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項５８】
肥満症の予防・治療剤である請求項５６記載の医薬。
【請求項５９】
癌の予防・治療剤である請求項５７記載の医薬。
【請求項６０】
摂食促進剤である請求項５７記載の医薬。
【請求項６１】
配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：９５、配列番号：１０２または配列番号：１０４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
【請求項６２】
請求項６１記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項６３】
請求項６２記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項６４】
ＤＮＡである請求項６３記載のポリヌクレオチド。
【請求項６５】
配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：９６、配列番号：９９、配列番号：１００、配列番号：１０３または配列番号：１０５で表される塩基配列を含有する請求項６４記載のポリヌクレオチド。
【請求項６６】
配列番号：１０１で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
【請求項６７】
配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１または配列番号：９３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
【請求項６８】
請求項６７記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項６９】
請求項６７記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項７０】
ＤＮＡである請求項６９記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２または配列番号：９４で表される塩基配列を含有する請求項７０記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
配列番号：７５または配列番号：８３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
【請求項７３】
請求項７２記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項７４】
請求項７２記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項７５】
ＤＮＡである請求項７４記載のポリヌクレオチド。
【請求項７６】
配列番号：７６または配列番号：８４で表される塩基配列を含有する請求項７５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
請求項６３、請求項６９または請求項７４記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項７８】
請求項７０記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項７９】
請求項７８記載の形質転換体を培養し、請求項６１、請求項６７もしくは請求項７１記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする請求項６１、請求項６７もしくは請求項７１記載のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の製造法。
【請求項８０】
請求項６１、請求項６７もしくは請求項７１記載のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
【請求項８１】
請求項６３、請求項６６、請求項６９または請求項７４記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項８２】
請求項６３、請求項６６、請求項６９または請求項７４記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
【請求項８３】
肥満症の予防・治療剤である請求項８０または請求項８１記載の医薬。
【請求項８４】
肥満症の診断薬である請求項８２記載の診断薬。
【請求項８５】
配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩を含有してなる肥満症の予防・治療剤。
【請求項８６】
配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる肥満症の予防・治療剤。
【請求項８７】
配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる肥満症の診断薬。
【請求項８８】
請求項６１、請求項６７もしくは請求項７１記載のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
【請求項８９】
請求項８８記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項９０】
請求項８８記載の抗体を含有してなる診断薬。
【請求項９１】
癌の予防・治療剤である請求項８９記載の医薬。
【請求項９２】
摂食促進剤である請求項８９記載の医薬。
【請求項９３】
癌の診断薬である請求項９０記載の診断薬。
【請求項９４】
配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩に対する抗体を含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項９５】
配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩に対する抗体を含有してなる摂食促進剤。
【請求項９６】
配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩に対する抗体を含有してなる癌の診断薬。
【請求項９７】
請求項６３、請求項６６、請求項６９または請求項７４記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチド。
【請求項９８】
ＤＮＡである請求項９７記載のポリヌクレオチド。
【請求項９９】
請求項９７記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
【請求項１００】
癌の予防・治療剤である請求項９９記載の医薬。
【請求項１０１】
摂食促進剤である請求項９９記載の医薬。
【請求項１０２】
配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに、相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項１０３】
配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに、相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを含有してなる摂食促進剤。
【請求項１０４】
請求項７記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項１記載のポリペプチドの遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１０５】
請求項７記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする請求項１記載のポリペプチドの遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１０６】
請求項１０４記載のスクリーニング方法または請求項１０５記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる請求項１記載のポリペプチドの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩。
【請求項１０７】
請求項１０４記載のスクリーニング方法または請求項１０５記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる請求項１記載のポリペプチドの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩。
【請求項１０８】
請求項１０６記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１０９】
請求項１０７記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１１０】
肥満症の予防・治療剤である請求項１０８記載の医薬。
【請求項１１１】
癌の予防・治療剤である請求項１０９記載の医薬。
【請求項１１２】
摂食促進剤である請求項１０９記載の医薬。
【請求項１１３】
外来性の請求項１０記載のポリヌクレオチドまたはその変異ＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１１４】
非ヒト動物がゲッ歯動物である請求項１１３記載の動物。
【請求項１１５】
ゲッ歯動物がマウスまたはラットである請求項１１４記載の動物。
【請求項１１６】
外来性の請求項１０記載のポリヌクレオチドまたはその変異ＤＮＡを含有し、非ヒト動物において発現しうる組換えベクター。
【請求項１１７】
請求項１１３記載の動物を用いることを特徴とする請求項１０記載のポリヌクレオチドの欠損・損傷に起因する疾病に対して効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１１８】
請求項１０記載のポリヌクレオチドが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞。
【請求項１１９】
ポリヌクレオチドがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された請求項１１８記載の胚幹細胞。
【請求項１２０】
非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１１９記載の胚幹細胞。
【請求項１２１】
請求項１０記載のポリヌクレオチドが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物。
【請求項１２２】
ポリヌクレオチドがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が請求項１０記載のポリヌクレオチドに対するプロモーターの制御下で発現しうる請求項１２１記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１２３】
非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項１２１記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１２４】
ゲッ歯動物がマウスまたはラットである請求項１２３記載の動物。
【請求項１２５】
請求項１２２記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする請求項１０記載のポリヌクレオチドに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１２６】
請求項１２１記載の動物を用いることを特徴とする肥満の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１２７】
請求項６３、請求項６９または請求項７４記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項６１、請求項６７または請求項７２記載のタンパク質の遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１２８】
請求項６３、請求項６９または請求項７４記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする請求項６１、請求項６７または請求項７２記載のタンパク質の遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１２９】
請求項１２７記載のスクリーニング方法または請求項１２８記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる請求項６１、請求項６７または請求項７２記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩。
【請求項１３０】
請求項１２７記載のスクリーニング方法または請求項１２８記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる請求項６１、請求項６７または請求項７２記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩。
【請求項１３１】
請求項１２９記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１３２】
請求項１３０記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
【請求項１３３】
肥満症の予防・治療剤である請求項１３１記載の医薬。
【請求項１３４】
癌の予防・治療剤である請求項１３２記載の医薬。
【請求項１３５】
摂食促進剤である請求項１３２記載の医薬。
【請求項１３６】
外来性の請求項６４、請求項７０または請求項７５記載のポリヌクレオチドまたはその変異ＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１３７】
非ヒト動物がゲッ歯動物である請求項１３６記載の動物。
【請求項１３８】
ゲッ歯動物がマウスまたはラットである請求項１３７記載の動物。
【請求項１３９】
外来性の請求項６４、請求項７０または請求項７５記載のポリヌクレオチドまたはその変異ＤＮＡを含有し、非ヒト動物において発現しうる組換えベクター。
【請求項１４０】
請求項１３６記載の動物を用いることを特徴とする請求項６４、請求項７０または請求項７５記載のポリヌクレオチドの欠損・損傷に起因する疾病に対して効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１４１】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：７７、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９または配列番号：７５で表わされるアミノ酸配列の第１６０番目のＧｌｕの直前に一アミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
【請求項１４２】
一アミノ酸がアラニンである請求項１４１記載のタンパク質またはその塩。
【請求項１４３】
請求項１４１記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項１４４】
請求項１４１もしくは請求項１４２記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項１４５】
請求項１４１記載のタンパク質もしくはその部分ペプチド、またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項１４６】
配列番号：８３、配列番号：９１または配列番号：９３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチド、またはその塩を含有してなる請求項１４５記載の予防・治療剤。
【請求項１４７】
請求項１４４記載のポリヌクレオチドを含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項１４８】
哺乳動物に対して、請求項５４記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満症の予防・治療方法。
【請求項１４９】
哺乳動物に対して、請求項５５記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
【請求項１５０】
肥満症の予防・治療剤を製造するための請求項５４記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項１５１】
癌の予防・治療剤を製造するための請求項５５記載の化合物またはその塩の使用。
【請求項１５２】
請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満症の予防・治療剤。
【請求項１５３】
請求項１記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤、摂食促進剤またはアポトーシス誘導剤。
【請求項１５４】
（１）配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに、相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチド、（２）上記タンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩に対する抗体、（３）請求項１４１記載のタンパク質もしくはその部分ペプチド、またはその塩、または（４）請求項１４４記載のポリヌクレオチドを含有してなるアポトーシス誘導剤。
【請求項１５５】
アポトーシス誘導剤である請求項２０、請求項２７、請求項５７、請求項８９または請求項９９記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規ポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド、該新規ポリペプチドを用いた医薬のスクリーニング方法、該スクリーニングによって得られる化合物などに関する。さらには、該新規ポリペプチドが結合する新規なレセプターなどにも関する。さらには、癌の予防・治療剤、肥満の予防・治療剤などにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体のホメオスタシスの維持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器系、免疫系、消化器系、代謝系の調節、感覚受容などの重要な機能調節は、様々なホルモンや神経伝達物質のような内在性因子あるいは光や匂いなどの感覚刺激をこれらに対して生体が備えている細胞膜に存在する特異的なレセプターを介して細胞が受容し、それに応じた反応をすることによって行われている。このような機能調節に与るホルモンや神経伝達物質のレセプターの多くは　ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、Ｇタンパク質と略称する）と共役しており、このＧタンパク質の活性化によって細胞内にシグナルを伝達して様々な機能を発現させることを特徴とする。また、これらのレセプタータンパク質は共通して７個の膜貫通領域を有する。これらのことからこうしたレセプターはＧタンパク質共役型レセプターあるいは７回膜貫通型レセプターと総称される。このように生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質およびそれに対するレセプタータンパク質が存在して相互作用し、重要な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対するレセプターが存在するかどうかについてはいまだ不明なことが多い。
近年、ヒトゲノムＤＮＡあるいは各種ヒト組織由来のｃＤＮＡのランダムな配列決定による配列情報の蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によってヒトの遺伝子が加速度的に解明されてきている。それにともない、機能未知のタンパク質をコードすると予想される多くの遺伝子の存在が明らかになっている。Ｇタンパク質共役型レセプターは、７個の膜貫通領域を有するのみでなくその核酸あるいはアミノ酸に多くの共通配列が存在するためそのようなタンパク質の中から明確にＧタンパク質共役型レセプターとして区分することができる。一方でこうした構造の類似性を利用したポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ：以下、ＰＣＲと略称する）法によってもこうしたＧタンパク質共役型レセプター遺伝子が得られている。このようにしてこれまでに得られたＧタンパク質共役型レセプターのうちには既知のレセプターとの構造の相同性が高いサブタイプであって容易にそのリガンドを予測することが可能な場合もあるが、ほとんどの場合、その内在性リガンドは予測不能であり、これらのレセプターは対応するリガンドが見いだされていない。このことからこれらのレセプターはオーファンレセプターと呼ばれている。このようなオーファンレセプターの未同定の内在性リガンドは、リガンドが知られていなかったために十分な解析がなされていなかった生物現象に関与している可能性がある。そして、このようなリガンドが重要な生理作用や病態と関連している場合には、そのレセプター作動薬あるいは拮抗薬の開発が革新的な医薬品の創製に結びつくことが期待される（Ｓｔａｄｅｌ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．、ＴｉＰＳ、１８巻、４３０−４３７頁、１９９７年、Ｍａｒｃｈｅｓｅ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．、ＴｉＰＳ、２０巻、３７０−３７５頁、１９９９年、Ｃｉｖｅｌｌｉ，　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．、８４８巻、６３−６５頁、１９９９年）。しかし、これまで実際にオーファンＧタンパク質共役型レセプターのリガンドを同定した例はそれほど多くない。
【０００３】
最近、幾つかのグループによってこうしたオーファンレセプターのリガンド探索の試みがなされ、新たな生理活性ペプチドであるリガンドの単離・構造決定が報告されている。ＲｅｉｎｓｈｅｉｄらおよびＭｅｕｎｉｅｒらは独立に、動物細胞にオーファンＧタンパク質共役型レセプターＬＣ１３２あるいはＯＲＬ１をコードするｃＤＮＡを導入してレセプターを発現させ、その応答を指標としてｏｒｐｈａｎｉｎ　ＦＱあるいはｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎと名付けられた新規ペプチドをブタ脳あるいはラット脳の抽出物より単離し、配列を決定した（Ｒｅｉｎｓｈｅｉｄ，　Ｒ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻、７９２−７９４頁、１９９５年、Ｍｅｕｎｉｅｒ，　Ｊ．−Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３７７巻、５３２−５３５頁、１９９５年）。このペプチドは痛覚に関与していることが報告されたが、さらに、レセプターのノックアウトマウスの研究により記憶に関与していることが明らかにされた（Ｍａｎａｂｅ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９４巻、５７７−５８１頁、１９９８年）。
その後これまでに上記と同様な方法によりＰｒＲＰ（ｐｒｏｌａｃｔｉｎ　ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ）、ｏｒｅｘｉｎ、ａｐｅｌｉｎ、ｇｈｒｅｌｉｎ、ＧＡＬＰ（ｇａｌａｎｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ）およびｍｅｔａｓｔｉｎなどの新規ペプチドがオーファンＧタンパク質共役型レセプターのリガンドとして単離された（Ｈｉｎｕｍａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９３巻、２７２−２７６頁、１９９８年、Ｓａｋｕｒａｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｅｌｌ、９２巻、５７３−５８５頁、１９９８年、Ｔａｔｅｍｏｔｏ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２５１巻、４７１−４７６頁、１９９８年、Ｋｏｊｉｍａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０２巻、６５６−６６０頁、１９９９年、Ｏｈｔａｋｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７４巻、３７０４１−３７０４５頁、１９９９年、Ｏｈｔａｋｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４１１巻、６１３−６１７頁、２００１年）。これらの新規ペプチドのうち、これまでにｏｒｅｘｉｎは摂食および睡眠に関与すること（Ｓａｋｕｒａｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｅｌｌ、９２巻、５７３−５８５頁、１９９８年、Ｌｉｎ，　Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｅｌｌ、９８巻、３６５−３７６頁、１９９９年、Ｃｈｅｍｅｌｌｉ，　Ｒ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｅｌｌ、９８巻、４３７−４５１頁、１９９９年）、またｇｈｒｅｌｉｎは摂食亢進活性を示すことが報告された（Ｔｓｃｈｏｐ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０７巻、９０８−９１３頁、２０００年、Ｎａｋａｚａｔｏ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０９巻、１９４−１９８頁、２００１年）。さらに、ｍｅｔａｓｔｉｎはガン転移を抑制する可能性が示唆されている（Ｏｈｔａｋｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４１１巻、６１３−６１７頁、２００１年）。
一方、これまで明らかでなかった生理活性ペプチドのレセプターが同様な方法によって解明される場合もある。腸管収縮に関与するｍｏｔｉｌｉｎのレセプターがＧＰＲ３８であることが明らかにされた（Ｆｅｉｇｈｎｅｒ，　Ｓ．　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４巻、２１８４−２１８８頁、１９９９年）ほか、ＭＣＨのレセプターとしてＳＬＣ−１（ＭＣＨＲ１）（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４００巻、２６１−２６５頁、１９９９年、Ｓａｉｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４００巻、２６５−２６９頁、１９９９年、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２６１巻、６２２−６２６頁、１９９９年、Ｌｅｍｂｏ，　Ｐ．　Ｍ．　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、１巻、２６７−２７１頁、１９９９年、Ｂａｃｈｎｅｒ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．、４５７巻、５２２−５２４頁、１９９９年）およびＳＬＴ　（ＭＣＨＲ２）（Ｍｏｒｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２８３巻、１０１３−１０１８頁、２００１年、Ｈｉｌｌ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７６巻、２０１２５−２０１２９頁、２００１年、Ｓａｉｌｅｒ，　Ａ．　Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、９８巻、７５６４−７５６９頁、２００１年、Ａｎ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、９８巻、７５７６−７５８１頁、２００１年）が同定され、またＧＰＲ１４（ＳＥＮＲ）がｕｒｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩのレセプターであること（Ａｍｅｓ，　Ｒ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０１巻、２８２−２８６頁、１９９９年、Ｍｏｒｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２６５巻、１２３−１２９頁、１９９９年、Ｎｏｔｈａｃｋｅｒ，　Ｈ．−Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、１巻、３８３−３８５頁、１９９９年、Ｌｉｕ，　Ｑ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２６６巻、１７４−１７８頁、１９９９年）およびＦＭ３（ＧＰＲ６６）およびＦＭ４がｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ　Ｕのレセプターであること（Ｈｏｗａｒｄ，　Ａ．　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻、７０−７４頁、２０００年、Ｓｚｅｋｅｒｅｓ，　Ｐ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７５巻、２０２４７−２０２５０頁、２０００年、Ｆｕｊｉｉ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７５巻、２１０６８−２１０７４頁、２０００年、Ｈｏｓｏｙａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７５巻、２９５２８−２９５３２頁、２０００年、Ｒａｄｄａｔｚ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７５巻、３２４５２−３２４５９頁、２０００年、Ｓｈａｎ，　Ｌ．−Ｘ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７５巻、３９４８２−３９４８６頁、２０００年、Ｋｏｊｉｍａ，Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２７６巻、４３５−４３８頁、２０００年）が報告された。ＭＣＨはそのノックアウトマウスが羸痩の表現型を示すことから肥満に関与することが示されていたが（Ｓｈｉｍａｄａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９６巻、６７０−６７４頁、１９９９年）、そのレセプターが明らかにされたことにより抗肥満薬としての可能性を有するレセプター拮抗薬の探索が可能となった。また、ｕｒｏｔｅｎｓｉｎ　ＩＩはサルに静脈内投与することによって心虚血を惹起することから心循環系に強力な作用を示すことも報告されている（Ａｍｅｓ，　Ｒ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０１巻、２８２−２８６頁、１９９９年）。Ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ　Ｕは摂食抑制に機能することが示された（Ｈｏｗａｒｄ，　Ａ．　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻、７０−７４頁、２０００年、Ｋｏｊｉｍａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．、２７６巻、４３５−４３８頁、２０００年）。このように、オーファンレセプターおよびそのリガンドは新たな生理作用に関与する場合が多く、その解明は新たな医薬品開発に結びつくことが期待されるが、オーファンレセプターのリガンド探索においては多くの困難さが伴うことが知られている。例えば、細胞に発現させたオーファンレセプターがリガンドに応答した後にいかなる２次情報伝達系が作動するかは一般に不明であり、様々な応答系について検討する必要がある。また、リガンドの存在する組織は容易には予想されないため種々の組織抽出物を用意しなければならない。さらに、リガンドがペプチドである場合、レセプターを刺激するのに必要なリガンド量はごく低濃度で十分であるためにこのようなリガンドの生体内の存在量は極微量であることが多いことに加え、ペプチドはタンパク質分解酵素によって消化されて活性を失なったり、非特異的吸着によって精製過程において回収が悪かったりするために、生体より抽出して構造決定に必要な量を単離することは通常極めて困難である。これらの問題によって、これまでに数多くのオーファンレセプターの存在が明らかにされながらそのリガンドが明らかにされたレセプターはごく一部に過ぎない。
【０００４】
【特許文献１】
ＷＯ　０２／３１１４５号公報
【特許文献２】
ＷＯ　０１／４８１８８号公報
【特許文献３】
特開２００１−２４５６６６号公報
【特許文献４】
ＷＯ　０１／１８２０６号公報
【特許文献５】
ＷＯ　０１／４８０１５号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
新たなＧタンパク質共役型レセプターのリガンドを見出し、該リガンドを直接利用する、または該リガンドを用いた医薬のスクリーニング系を利用することによって今までにない全く新規な作用機序を有する医薬の開発が望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト結腸ガン由来の配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するオーファンＧタンパク質共役型レセプターと結合する内因性リガンドを見出し、精製することに成功した。さらに、この内因性リガンドが結合する新規なレセプターを取得した。これらの知見に基づいて、さらに研究を重ね発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩と結合する能力を有することを特徴とするポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（２）配列番号：２２、配列番号：１４または配列番号：３１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（３）配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：４９、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：３６、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１または配列番号：３２で表されるアミノ酸配列を含有する上記（２）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（４）配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含有する上記（２）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（５）標識した上記（４）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（６）配列番号：１９、配列番号：２８または配列番号：６１で表されるアミノ酸配列を含有する上記（２）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（７）上記（１）記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（８）配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８または配列番号：５０で表される塩基配列を含有する上記（７）記載のポリヌクレオチド、
（９）配列番号：１８、配列番号：２７または配列番号：６０で表される塩基配列を含有する上記（７）記載のポリヌクレオチド、
（１０）ＤＮＡである上記（７）〜（９）記載のポリヌクレオチド、
（１１）上記（７）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（１２）上記（１１）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１３）上記（１２）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載のポリペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の製造法、
（１４）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬、
（１５）上記（７）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１６）上記（７）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（１７）肥満症の予防・治療剤である上記（１４）または（１５）記載の医薬、
（１８）肥満症の診断薬である上記（１６）記載の診断薬、
（１９）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、
（２０）上記（１９）記載の抗体を含有してなる医薬、
（２１）上記（１９）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（２２）癌の予防・治療剤である上記（２０）記載の医薬、
（２３）摂食促進剤である上記（２０）記載の医薬、
（２４）癌の診断薬である上記（２１）記載の診断薬、
（２５）上記（７）記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチド、
（２６）ＤＮＡである上記（２５）記載のポリヌクレオチド、
（２７）上記（２５）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（２８）癌の予防・治療剤である上記（２７）記載の医薬、
（２９）摂食促進剤である上記（２７）記載の医薬、
（３０）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（３１）標識した上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる上記（３０）記載のスクリーニング方法、
（３２）上記（５）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる上記（３０）記載のスクリーニング方法、
（３３）さらに、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる上記（３０）記載のスクリーニング方法、
（３４）さらに、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：７７、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：８３、配列番号：５１、配列番号：５５、配列番号：６９、配列番号：１０２または配列番号：１０４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる上記（３０）記載のスクリーニング方法、
（３５）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる上記（３３）記載のスクリーニング方法、
（３６）標識した上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、および配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる上記（３０）記載のスクリーニング方法、
（３７）上記（５）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、および配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる上記（３０）記載のスクリーニング方法、
（３８）（ｉ）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩とを接触させた場合と、
（ｉｉ）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩と、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記（３０）記載のスクリーニング方法、
（３９）（ｉ）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞に接触させた場合と、
（ｉｉ）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および試験化合物を、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞に接触させた場合における、該ポリペプチドの該細胞に対する結合量または細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記（３８）記載のスクリーニング方法、
（４０）（ｉ）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、
（ｉｉ）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および試験化合物を、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞の膜画分に接触させた場合における、該ポリペプチドの該細胞の膜画分に対する結合量または細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記（３８）記載のスクリーニング方法、
（４１）（ｉ）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を、上記（１２）記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現したタンパク質に接触させた場合と、
（ｉｉ）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩および試験化合物を、上記（１２）記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現したタンパク質に接触させた場合における、該ポリペプチドの該タンパク質に対する結合量または細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする上記（３８）記載のスクリーニング方法、
（４２）標識した上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いる上記（３８）〜（４１）記載のスクリーニング方法、
（４３）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（４４）標識した上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する上記（４３）記載のスクリーニング用キット、
（４５）上記（５）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する上記（４３）記載のスクリーニング用キット、
（４６）さらに、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する上記（４３）記載のスクリーニング用キット、
（４７）さらに、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：７７、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：８３、配列番号：５１、配列番号：５５、配列番号：６９、配列番号：１０２または配列番号：１０４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する上記（４３）記載のスクリーニング用キット、
（４８）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する上記（４６）記載のスクリーニング用キット、
（４９）標識した上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、および配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する上記（４３）記載のスクリーニング用キット、
（５０）上記（５）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、および配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する上記（４３）記載のスクリーニング用キット、
（５１）配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞を含有することを特徴とする上記（４６）記載のスクリーニング用キット、
（５２）配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、その部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する細胞の膜画分を含有することを特徴とする上記（４６）記載のスクリーニング用キット、
（５３）上記（１２）記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現したタンパク質を含有することを特徴とする上記（４６）記載のスクリーニング用キット、
（５４）上記（３０）記載のスクリーニング方法または上記（４３）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、
（５５）上記（３０）記載のスクリーニング方法または上記（４３）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、
（５６）上記（５４）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（５７）上記（５５）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（５８）肥満症の予防・治療剤である上記（５６）記載の医薬、
（５９）癌の予防・治療剤である上記（５７）記載の医薬、
（６０）摂食促進剤である上記（５７）記載の医薬、
（６１）配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：９５、配列番号：１０２または配列番号：１０４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（６２）上記（６１）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（６３）上記（６２）記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（６４）ＤＮＡである上記（６３）記載のポリヌクレオチド、
（６５）配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：９６、配列番号：９９、配列番号：１００、配列番号：１０３または配列番号：１０５で表される塩基配列を含有する上記（６４）記載のポリヌクレオチド、
（６６）配列番号：１０１で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（６７）配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１または配列番号：９３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（６８）上記（６７）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（６９）上記（６７）記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（７０）ＤＮＡである上記（６９）記載のポリヌクレオチド、
（７１）配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２または配列番号：９４で表される塩基配列を含有する上記（７０）記載のポリヌクレオチド、
（７２）配列番号：７５または配列番号：８３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（７３）上記（７２）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（７４）上記（７２）記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（７５）ＤＮＡである上記（７４）記載のポリヌクレオチド、
（７６）配列番号：７６または配列番号：８４で表される塩基配列を含有する上記（７５）記載のポリヌクレオチド、
（７７）上記（６３）、（６９）または（７４）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（７８）上記（７０）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（７９）上記（７８）記載の形質転換体を培養し、上記（６１）、（６７）もしくは（７１）記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする上記（６１）、（６７）もしくは（７１）記載のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（８０）上記（６１）、（６７）もしくは（７１）記載のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（８１）上記（６３）、（６６）、（６９）または（７４）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（８２）上記（６３）、（６６）、（６９）または（７４）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（８３）肥満症の予防・治療剤である上記（８０）または（８１）記載の医薬、
（８４）肥満症の診断薬である上記（８２）記載の診断薬、
（８５）配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩を含有してなる肥満症の予防・治療剤、
（８６）配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる肥満症の予防・治療剤、
（８７）配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる肥満症の診断薬、
（８８）上記（６１）、（６７）もしくは（７１）記載のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（８９）上記（８８）記載の抗体を含有してなる医薬、
（９０）上記（８８）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（９１）癌の予防・治療剤である上記（８９）記載の医薬、
（９２）摂食促進剤である上記（８９）記載の医薬、
（９３）癌の診断薬である上記（９０）記載の診断薬、
（９４）配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩に対する抗体を含有してなる癌の予防・治療剤、
（９５）配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩に対する抗体を含有してなる摂食促進剤、
（９６）配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩に対する抗体を含有してなる癌の診断薬、
（９７）上記（６３）、（６６）、（６９）または（７４）記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチド、
（９８）ＤＮＡである上記（９７）記載のポリヌクレオチド、
（９９）上記（９７）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１００）癌の予防・治療剤である上記（９９）記載の医薬、
（１０１）摂食促進剤である上記（９９）記載の医薬、
（１０２）配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに、相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを含有してなる癌の予防・治療剤、
（１０３）配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに、相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチドを含有してなる摂食促進剤、
（１０４）上記（７）記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする上記（１）記載のポリペプチドの遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１０５）上記（７）記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする上記（１）記載のポリペプチドの遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１０６）上記（１０４）記載のスクリーニング方法または上記（１０５）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる上記（１）記載のポリペプチドの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、
（１０７）上記（１０４）記載のスクリーニング方法または上記（１０５）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる上記（１）記載のポリペプチドの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、
（１０８）上記（１０６）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１０９）上記（１０７）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１１０）肥満症の予防・治療剤である上記（１０８）記載の医薬、
（１１１）癌の予防・治療剤である上記（１０９）記載の医薬、
（１１２）摂食促進剤である上記（１０９）記載の医薬、
（１１３）外来性の上記（１０）記載のポリヌクレオチドまたはその変異ＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（１１４）非ヒト動物がゲッ歯動物である上記（１１３）記載の動物、
（１１５）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（１１４）記載の動物、
（１１６）外来性の上記（１０）記載のポリヌクレオチドまたはその変異ＤＮＡを含有し、非ヒト動物において発現しうる組換えベクター、
（１１７）上記（１１３）記載の動物を用いることを特徴とする上記（１０）記載のポリヌクレオチドの欠損・損傷に起因する疾病に対して効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１１８）上記（１０）記載のポリヌクレオチドが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（１１９）ポリヌクレオチドがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化された上記（１１８）記載の胚幹細胞、
（１２０）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１１９）記載の胚幹細胞、
（１２１）上記（１０）記載のポリヌクレオチドが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（１２２）ポリヌクレオチドがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が上記（１０）記載のポリヌクレオチドに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（１２１）記載の非ヒト哺乳動物、
（１２３）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１２１）記載の非ヒト哺乳動物、
（１２４）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（１２３）記載の動物、
（１２５）上記（１２２）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする上記（１０）記載のポリヌクレオチドに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１２６）上記（１２１）記載の動物を用いることを特徴とする肥満の予防・治療剤のスクリーニング方法、
（１２７）上記（６３）、（６９）または（７４）記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする上記（６１）、（６７）または（７２）記載のタンパク質の遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１２８）上記（６３）、（６９）または（７４）記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする上記（６１）、（６７）または（７２）記載のタンパク質の遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１２９）上記（１２７）記載のスクリーニング方法または上記（１２８）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる上記（６１）、（６７）または（７２）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現を促進する化合物またはその塩、
（１３０）上記（１２７）記載のスクリーニング方法または上記（１２８）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる上記（６１）、（６７）または（７２）記載のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する化合物またはその塩、
（１３１）上記（１２９）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１３２）上記（１３０）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（１３３）肥満症の予防・治療剤である上記（１３１）記載の医薬、
（１３４）癌の予防・治療剤である上記（１３２）記載の医薬、
（１３５）摂食促進剤である上記（１３２）記載の医薬、
（１３６）外来性の上記（６４）、（７０）または（７５）記載のポリヌクレオチドまたはその変異ＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物、
（１３７）非ヒト動物がゲッ歯動物である上記（１３６）記載の動物、
（１３８）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（１３７）記載の動物、
（１３９）外来性の上記（６４）、（７０）または（７５）記載のポリヌクレオチドまたはその変異ＤＮＡを含有し、非ヒト動物において発現しうる組換えベクター、
（１４０）上記（１３６）記載の動物を用いることを特徴とする上記（６４）、（７０）または（７５）記載のポリヌクレオチドの欠損・損傷に起因する疾病に対して効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１４１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：７７、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９または配列番号：７５で表わされるアミノ酸配列の第１６０番目のＧｌｕの直前に一アミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（１４２）一アミノ酸がアラニンである（１４１）記載のタンパク質またはその塩、
（１４３）上記（１４１）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（１４４）上記（１４１）もしくは（１４２）記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（１４５）上記（１４１）記載のタンパク質もしくはその部分ペプチド、またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤、
（１４６）配列番号：８３、配列番号：９１または配列番号：９３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはその部分ペプチド、またはその塩を含有してなる上記（１４５）記載の予防・治療剤、
（１４７）上記（１４４）記載のポリヌクレオチドを含有してなる癌の予防・治療剤、
（１４８）哺乳動物に対して、上記（５４）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする肥満症の予防・治療方法、
（１４９）哺乳動物に対して、上記（５５）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法、
（１５０）肥満症の予防・治療剤を製造するための上記（５４）記載の化合物またはその塩の使用、
（１５１）癌の予防・治療剤を製造するための上記（５５）記載の化合物またはその塩の使用、
（１５２）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満症の予防・治療剤、
（１５３）上記（１）記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤または摂食促進剤、
（１５４）（１）配列番号：１もしくは配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５１、配列番号：５５もしくは配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドに、相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチド、（２）上記タンパク質、もしくはその部分ペプチド、またはその塩に対する抗体、（３）上記（１４１）記載のタンパク質もしくはその部分ペプチド、またはその塩、または（４）上記（１４４）記載のポリヌクレオチドを含有してなるアポトーシス誘導剤、
（１５５）アポトーシス誘導剤である上記（２０）、（２７）、（５７）、（８９）または（９９）記載の医薬などに関する。
【０００７】
さらに、本発明は、
（Ｉ）配列番号：２２、配列番号：１４または配列番号：３１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：２２、配列番号：１４または配列番号：３１で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である上記（２）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（ＩＩ）配列番号：２２、配列番号：１４または配列番号：３１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、（ｉ）配列番号：２２、配列番号：１４または配列番号：３１で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：２２、配列番号：１４または配列番号：３１で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２２、配列番号：１４または配列番号：３１で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：２２、配列番号：１４または配列番号：３１で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列である上記（２）記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
（ＩＩＩ）上記（７）記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ＩＶ）上記（６３）、（６９）または（７４）記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドなども提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の「配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩と結合する能力を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩」としては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩（以下、本発明のレセプターと称する場合がある）と結合する能力を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩との結合の解離定数が、１ｎＭ以下、好ましくは２００ｐＭ以下、さらに好ましくは１００ｐＭ以下、特に好ましくは８０ｐＭ以下、最も好ましくは５０ｐＭ以下であるポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などが挙げられる。
【０００９】
本発明の配列番号：２２、配列番号：１４または配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドと称する場合がある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはこれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するポリペプチドであってもよく、合成ポリペプチドであってもよい。
【００１０】
配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、（ｉ）　配列番号：２２で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：２２で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：２２で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：２２で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などもあげられる。
配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性、例えば、後述の疾患の予防・治療活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、または微小管結合タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）、摂食抑制活性、癌増殖活性などがあげられる。実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：４９または配列番号：６２で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
【００１１】
配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、（ｉ）　配列番号：１４で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：１４で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：１４で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：１４で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などもあげられる。
配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性、例えば、後述の疾患の予防・治療活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、または微小管結合タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）、摂食抑制活性、癌増殖活性などがあげられる。実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：１２、配列番号：１３または配列番号：３６で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
【００１２】
配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、（ｉ）　配列番号：３１で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：３１で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：３１で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：３１で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などもあげられる。
配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性、例えば、後述の疾患の予防・治療活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、または微小管結合タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性、食抑制活性、癌増殖活性などがあげられる。実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
配列番号：３１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：２９、配列番号：３０または配列番号：３２で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
【００１３】
本発明のポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：３１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：３２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどの、本発明のレセプターと特異的に結合する能力を有するポリペプチドがあげられる。
【００１４】
また、本発明のポリペプチドは、後述の本発明のレセプターとの結合活性、本発明のレセプター発現細胞に対する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、または微小管結合タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）などを有するポリペプチドのみならず、該結合活性または細胞刺激活性を有するポリペプチドの前駆体ポリペプチドをも包含する意味で用いられる。
該結合活性または細胞刺激活性を有するポリペプチドの前駆体ポリペプチドの具体例としては、例えば、（ｉ）配列番号：１９で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（ｉｉ）配列番号：２８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号：６１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどがあげられる。
【００１５】
具体的には、（ｉ）配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：２８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２８で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：６１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：６１で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、（ｉ）　配列番号：１９で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：１９で表されるアミノ酸配列に１〜１００個（好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：１９で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：１９で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：２８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、（ｉ）　配列番号：２８で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：２８で表されるアミノ酸配列に１〜１００個（好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：２８で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：２８で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：６１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、（ｉ）　配列番号：６１で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：６１で表されるアミノ酸配列に１〜１００個（好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：６１で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：６１で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
上記前駆体ポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列番号：６１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどがあげられる。
【００１６】
本発明のポリペプチドに対するレセプターとしては、種々のレセプターのうち、本発明のポリペプチドと結合活性を有し、本発明のポリプチドにより該レセプター発現細胞の細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、または微小管結合タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）が観察されるものなどがあげられ、これらを本発明のレセプターと称する。
具体例としては、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩などがあげられる（図３，図４）。該タンパク質は、バソトシンレセプター、メソトシンレセプター、イソトシンレセプターまたはオキシトシンレセプターにアミノ酸配列レベルで、約３２〜３６％程度の相同性が認められる新規７回膜貫通型レセプタータンパク質である。さらには、配列番号：５１で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（ＷＯ　０１／１８２０６）、配列番号：５３で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（ＷＯ　０１／４８１８８）、配列番号：５５で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（ＷＯ　０１／４８０１５）、配列番号：６７で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（特開２００１−２４５６６６）、配列番号：６９で表されるアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（ＷＯ　０１／９６４００）なども、本発明のポリペプチドに対するレセプターとして用いられる。
また、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：７７、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９または配列番号：７５で表わされるアミノ酸配列の第１６０番目のＧｌｕの直前に一アミノ酸（好ましくはＡｌａ）が挿入されたアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩（以下、本発明のレセプターＡと略称することもある）なども本発明のレセプターとして用いられる。
本発明のレセプターは、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞〔例えば、網膜細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、白血球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞（例、乳癌細胞株（ＧＩ−１０１など）、結腸癌細胞株（ＣＸ−１、ＧＩ−１１２、ＣＯＬＯ　２０５、ＬｏＶｏ、ＣＯＬＯ　２０１、ＳＷ　４０３、ＳＮＵ−Ｃ１、ＨＴ−２９、ＬＳ　１７４Ｔ、ＬＳ　１８０、ＳＫ−ＣＯ１など）、胃癌細胞株（ＫＡＴＯＩＩＩなど）、肺癌細胞株（ＬＸ−１、ＧＩ−１１７など）、卵巣癌細胞株（ＧＩ−１０２など）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３など）など）、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【００１７】
配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、なかでも好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。具体的には、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：７７、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：７１、配列番号：７５、または配列番号：８３で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、
（１）（ｉ）　配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列、および
（２）（ｉ）　配列番号：６３または配列番号：６５で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）　配列番号：６３または配列番号：６５で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）　配列番号：６３または配列番号：６５で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）　配列番号：６３または配列番号：６５で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、および
（ｖ）　上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
本発明のレセプターの具体例としては、（ｉ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｉ）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｉｉ）配列番号：６３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｖ）配列番号：６５で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｖ）配列番号：５１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｖｉ）配列番号：５５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｖｉｉ）配列番号：６９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｖｉｉｉ）配列番号：９５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｉｘ）配列番号：９７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘ）配列番号：７７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘｉ）配列番号：８５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘｉｉ）配列番号：８７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘｉｉｉ）配列番号：８９で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘｉｖ）配列番号：９１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘｖ）配列番号：９３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘｖｉ）配列番号：７１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘｖｉｉ）配列番号：７５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘｖｉｉｉ）配列番号：８３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘｉｘ）配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｘｘ）配列番号：１０４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが挙げられる。
【００１８】
本発明のレセプターの部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと称する場合がある）としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであってもよく、好ましくは、本発明のポリペプチドに対する結合能を有する部分ペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含有する部分ペプチド等が用いられる。
具体的には、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列中、５０番目（Ｔｈｒ）〜３３５番目（Ｓｅｒ）で表される部分アミノ酸配列から選択される１または２以上の部分アミノ酸配列を含有する部分ペプチドなどがあげられる。
【００１９】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００２０】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドは、公知の方法で標識化されていてもよく、具体的にはアイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたもの、または酵素標識されたものなどがあげられる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドは、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや温血動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００２１】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチド（それらのアミド体、それらの塩も含む）の合成には、通常市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、レセプター、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００２２】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２３】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００２４】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチド、レセプターまたは部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチド、レセプターまたは部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望のポリペプチド、レセプターまたは部分ペプチドのエステル体を得ることができる。
【００２５】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはレセプターの部分ペプチドについては、レセプターを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法があげられる。
（ｉ）Ｍ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　および　Ｍ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座　１、　タンパク質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチド、レセプターまたはその部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチド、レセプターまたは部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するもの（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）であればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
【００２６】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば
（ｉ）配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８または配列番号：５０で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８または配列番号：５０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）配列番号：１８、配列番号：２７または配列番号：６０で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または
（ｉｖ）配列番号：１８、配列番号：２７または配列番号：６０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８または配列番号：５０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８または配列番号：５０で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
配列番号：１８、配列番号：２７または配列番号：６０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１８、配列番号：２７または配列番号：６０で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００２７】
具体的には、（ｉ）　配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４１で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｉｉ）　配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４２で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｉｉｉ）　配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４３で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｉｖ）　配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４４で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｖ）　配列番号：４９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：５０で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｖｉ）　配列番号：１２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：３７で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｖｉｉ）　配列番号：１３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：３８で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｖｉｉｉ）　配列番号：１４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：３９で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｉｘ）　配列番号：３６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４０で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｘ）　配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４５で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｘｉ）　配列番号：３０で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４６で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｘｉｉ）　配列番号：３１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４７で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｘｉｉｉ）　配列番号：３２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４８で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｘｉｖ）　配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｘｖ）　配列番号：２８で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：２７で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｘｖｉ）　配列番号：６１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：６０で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
【００２８】
本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表される塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のレセプターと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、例えば、それぞれ配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。例えば、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：９９、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７８、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８４、配列番号：１０３または配列番号：１０５で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドで表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、
（ｉ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号：５４で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号：６８で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｉｉ）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号：１０１で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｉｉｉ）配列番号：６３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：６４で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｉｖ）配列番号：６５で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：６６で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｖ）配列番号：９５で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：９６で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号：９９で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、配列番号：１００で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｖｉ）配列番号：９７で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：９８で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｖｉｉ）配列番号：５１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：５２で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｖｉｉｉ）配列番号：５５で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：５６で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｉｘ）配列番号：６９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：７０で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｘ）配列番号：７７で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：７８で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｘｉ）配列番号：８５で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：８６で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｘｉｉ）配列番号：８７で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：８８で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｘｉｉｉ）配列番号：８９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：９０で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｘｉｖ）配列番号：９１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：９２で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｘｖ）配列番号：９３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：９４で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｘｖｉ）配列番号：７１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：７２で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｘｖｉｉ）配列番号：７５で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：７６で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドが、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号：８３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：８４で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｘｉｘ）配列番号：１０２で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：１０３で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが、
（ｘｘ）配列番号：１０４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：１０５で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
【００２９】
本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドの部分塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のレセプターと実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの部分塩基配列を有するポリヌクレオチドなどが用いられる。
配列番号：２または配列番号：４で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるポリヌクレオチドは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
また、本発明のレセプターの部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしてより具体的には、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列中、５０番目（Ｔｈｒ）〜３３５番目（Ｓｅｒ）で表される部分アミノ酸配列から選択される１または２以上の部分アミノ酸配列を含有する部分ペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、またはこれらとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどがあげられる。
【００３０】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の方法で標識化されていてもよく、具体的にはアイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチド（以下、これらポリペプチドなどをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらポリペプチドなどを単に本発明のポリペプチドと略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の置換は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ　ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
【００３１】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどがあげられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ　細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎ　Ｖｉｖｏ，１３，　２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００３２】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　６，　４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００３３】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｋ．　Ｌ．　ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｇ．　Ａ．　ら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，　Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ　１６４０培地〔Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，　１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明のポリペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００３４】
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００３５】
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターに対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター（その部分ペプチド、それらのアミドもしくはそれらのエステルまたはその塩を含む）に対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のレセプターに対する抗体としては、レセプターのシグナル伝達を不活性化する抗体、レセプターのシグナル伝達を活性化する抗体などが挙げられる。
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターに対する抗体は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターは、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５　（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ポリペプチド（タンパク質）抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３６】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ポリペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００３７】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、該ポリヌクレオチドに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチド）であってもよい。
具体的には、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）が挙げられ、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のポリペプチドのＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００３８】
具体的には、配列番号：２、４、１８、２７、３７〜４８、５０、５２、５４〜５６、６０、６４、６６、６８、７０、７２、７６、７８、８４、８６、８８〜９０、９２、９４、９６、９８〜１０１、１０３または１０５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：２、４、１８、２７、３７〜４８、５０、５２、５４〜５６、６０、６４、６６、６８、７０、７２、７６、７８、８４、８６、８８〜９０、９２、９４、９６、９８〜１０１、１０３または１０５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のレセプターまたはポリペプチド遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは配列が決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のレセプターまたはポリペプチド遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のレセプターまたはポリペプチド関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のレセプターまたはポリペプチド遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のレセプターまたはポリペプチド関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のレセプターまたはポリペプチド関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のレセプターまたはポリペプチド遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。本発明のレセプターまたはポリペプチド遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳終止コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、本発明のレセプターまたはポリペプチド遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係、あるいは対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質、核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば公知の標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００３９】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば　Ｊ．　Ｋａｗａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ　Ｔｅｃｈ　Ｊａｐａｎ，　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．２４７，　１９９２；　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．３９５，　１９９２；　Ｓ．　Ｔ．　Ｃｒｏｏｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　ｅｄ．，　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９３　などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するのに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００４０】
以下に、（ｉ）本発明のポリペプチドおよび本発明のレセプター、（ｉｉ）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド）、（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターに対する抗体（本発明の抗体）および（ｉｖ）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターのアンチセンスポリヌクレオチド（例、本発明のアンチセンスＤＮＡ）などの用途を説明する。
（１）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターが関与する各種疾病の予防・治療剤
本発明のポリペプチドは、本発明のレセプターへの結合活性、本発明のレセプター発現細胞の細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、または微小管結合タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）を有し、本発明のレセプターの内因性リガンドである。
本発明のレセプターが本発明のポリペプチドに応答すると、摂食行動が抑制され、腫瘍が増殖する。
従って本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に異常があったり、欠損している場合、または本発明のレセプターまたは該レセプターをコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合には、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症となる可能性が高い。従って、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、例えば、肥満症、摂食亢進症などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として使用することができる。さらには、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明のポリヌクレオチドに異常があったり、欠損している場合には、例えば、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの種々の疾病が発症する可能性もある。よって、本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明のポリヌクレオチドは、例えば、これら種々の疾病の予防・治療剤などの医薬として使用することもできる。中でも、好ましくは、肥満症の予防・治療剤である。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明のポリヌクレオチドは、例えば、生体内において本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本発明のポリヌクレオチドを該患者に投与し、生体内で本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のポリヌクレオチドを挿入し、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合は、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００４１】
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、または水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）が挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、肥満症の治療目的で本発明のポリペプチドを経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該ポリペプチドを約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該ポリペプチドまたは該レセプターの１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満症の治療目的で本発明のポリペプチドを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該ポリペプチドまたは該レセプターを約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のレセプターＡは、本発明のレセプターと共発現することにより、ドミナントネガティブ作用を示す。従って、本発明のレセプターＡまたは本発明のレセプターＡをコードするポリヌクレオチドは、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤などの低毒性で安全な医薬としても使用することができる。本発明のレセプターＡまたは本発明のレセプターＡをコードするポリヌクレオチドの製剤化、投与方法または投与量などは上記に準じる。
【００４２】
（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のポリペプチドは、本発明のレセプターへの結合活性、本発明のレセプター発現細胞の細胞刺激活性を有し、本発明のレセプターの内因性リガンドである。本発明のレセプターが本発明のポリペプチドに応答すると、摂食行動が抑制され、腫瘍が増殖する。
これより、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性または機能を促進する化合物またはその塩は、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用できる。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬としても使用できる。中でも、好ましくは、肥満症の予防・治療剤である。
一方、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性または機能を阻害する化合物またはその塩は、例えば、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、拒食症の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として有用である。中でも好ましくは、癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、摂食促進剤などである。
該スクリーニングは、本発明のポリペプチドを用いるか、または組換え型本発明のポリペプチドの発現系、あるいは本発明のレセプターを用いるか、または組換え型本発明のレセプターの発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物（例、本発明のポリペプチドとレセプターとの結合性を変化させる化合物など）またはその塩（例、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）をスクリーニングすることができる。このような化合物には、本発明のレセプターを介して細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、または微小管結合タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）を有する化合物（アゴニスト）、該細胞刺激活性を有しない化合物（アンタゴニスト）、本発明のポリペプチドとレセプターとの結合力を増強する化合物、または本発明のポリペプチドとレセプターとの結合力を減少させる化合物などが含まれる。
本発明は、本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、（ｉ）本発明のレセプターまたは本発明の部分ペプチド（以下、これらを単に本発明のレセプターと略称する場合がある）に、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ｉｉ）本発明のレセプターに、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物（本発明のポリペプチドと本発明のレセプターの結合性を変化させる化合物）またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）本発明のレセプターに、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ｉｉ）本発明のレセプターに、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば該本発明のレセプターに対する本発明のポリペプチドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法の具体例としては、
▲１▼（ｉ）本発明のポリペプチド（好ましくは標識した本発明のポリペプチド）を、本発明のレセプターに接触させた場合と、（ｉｉ）本発明のポリペプチド（好ましくは標識した本発明のポリペプチド）および試験化合物を、本発明のレセプターに接触させた場合における、本発明のポリペプチド（好ましくは標識した本発明のポリペプチド）の本発明のレセプターに対する結合量を測定し、比較する本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物（本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物）またはその塩のスクリーニング方法が挙げられ、好ましくは、
▲２▼（ｉ）本発明のポリペプチド（好ましくは標識した本発明のポリペプチド）を、本発明のレセプターを含有する細胞（好ましくは本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体）または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（ｉｉ）本発明のポリペプチド（好ましくは標識した本発明のポリペプチド）および試験化合物を、本発明のレセプターを含有する細胞（好ましくは本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体）または該細胞の膜画分に接触させた場合における、本発明のポリペプチド（好ましくは標識した本発明のポリペプチド）の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物（本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
▲３▼（ｉ）本発明のポリペプチド（好ましくは標識した本発明のポリペプチド）を、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプターに接触させた場合と、（ｉｉ）本発明のポリペプチド（好ましくは標識した本発明のポリペプチド）および試験化合物を、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプターに接触させた場合における、本発明のポリペプチド（好ましくは標識した本発明のポリペプチド）の本発明のレセプターに対する結合量を測定し、比較する本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物（本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
▲４▼（ｉ）本発明のレセプターを活性化する物質（例えば、本発明のポリペプチド）を、本発明のレセプターを含有する細胞に接触させた場合と、（ｉｉ）本発明のレセプターを活性化する物質および試験化合物を、本発明のレセプターを含有する細胞に接触させた場合における、本発明のレセプターを介した細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、または微小管結合タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）を測定し、比較する本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物（本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物）またはその塩のスクリーニング方法、および
▲５▼（ｉ）本発明のレセプターを活性化する物質（例えば、本発明のポリペプチドなど）を、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプターに接触させた場合と、（ｉｉ）本発明のレセプターを活性化する物質および試験化合物を、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプターに接触させた場合における、本発明のレセプターを介する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、または微小管結合タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）を測定し、比較する本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物（本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物）またはその塩のスクリーニング方法などが挙げられる。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプターとしては、本発明のポリペプチドをリガンドとして認識するものであれば何れのものであってもよく、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適である。しかしながら、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明のレセプターなどが適している。
本発明のスクリーニング方法において、本発明のレセプターを含有する細胞または該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
本発明のレセプターを含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行うことができる。
本発明のレセプターを含有する細胞としては、本発明のレセプターを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。また、本発明のレセプターを発現した宿主細胞は、前述の本発明のポリペプチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体の製造方法と同様の方法などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明のレセプターと細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
本発明のレセプターを含有する細胞や膜画分中の本発明のレセプターの量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００４５】
前記▲１▼〜▲３▼のスクリーニング方法を実施するためには、適当な本発明のレセプター画分と、標識した本発明のポリペプチドなどが用いられる。本発明のレセプター画分としては、天然型の本発明のレセプター画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明のレセプター画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識した本発明のポリペプチドとしては、標識した本発明のポリペプチド、標識した本発明のポリペプチドアナログ化合物などが用いられる。
標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
例えば放射性同位元素で標識された本発明のポリペプチドなどが好ましく利用することができる。このうち好ましくは、〔１２５Ｉ〕で標識された本発明のポリペプチドである。さらに好ましくは、〔１２５Ｉ〕で標識された配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドなどが用いられる。
具体的には、まず本発明のレセプターを含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのポリペプチドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明のレセプターや本発明のポリペプチドの分解を抑える目的で、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい。０．０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のポリペプチドを添加し、同時に１０−１０〜１０−７Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のポリペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００４６】
前記▲４▼〜▲５▼のスクリーニング方法を実施するためには、本発明のレセプターを介する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ生成抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、または微小管結合タンパク質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットなどを用いて測定する。
具体的には、まず、本発明のレセプターを含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ生成抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する生成抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明のレセプターを発現した細胞を用いるのが好ましい。本発明のレセプターを発現した細胞としては、前述の本発明のレセプター発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【００４７】
本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物（本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる化合物）またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明のレセプター（本発明のレセプターの部分ペプチドも含む）、本発明のレセプターを含有する細胞または本発明のレセプターを含有する細胞の膜画分、および本発明のポリペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（ｉ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（ｉｉ）本発明のレセプター標品
本発明のレセプターを発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（ｉｉｉ）本発明のポリペプチド
〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識した本発明のポリペプチドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
（ｉｖ）本発明のポリペプチド標準液
本発明のポリペプチドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００４８】
２．測定法
（ｉ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプターを発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｉｉ）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のペプチドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るために試験化合物の代わりに１０−３Ｍの本発明のポリペプチドを５μｌ加えておく。
（ｉｉｉ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識された本発明のポリペプチドを０．２Ｎ　ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｉｖ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ　　：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０　　：最大結合量
【００４９】
上記本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物（本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合を変化させる化合物）（結合を阻害または促進する化合物）であり、具体的には、本発明のレセプターを介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆる本発明のレセプターアゴニスト）、または該刺激活性を有しない化合物（いわゆる本発明のレセプターアンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記本発明のレセプターアゴニストであるかレセプターアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ａ）または（ｂ）に従えばよい。
（ｉ）前記▲１▼〜▲３▼のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のポリペプチドと本発明のレセプターとの結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明のレセプターを介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明のレセプターアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩は本発明のレセプターアンタゴニストである。
（ｉｉ）（ａ）試験化合物を本発明のレセプターを含有する細胞に接触させ、本発明のレセプターを介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明のレセプターアゴニストである。
（ｂ）　本発明のレセプターを活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターアゴニストなど）を本発明のレセプターを含有する細胞に接触させた場合と、本発明のレセプターを活性化する化合物および試験化合物を本発明のレセプターを含有する細胞に接触させた場合における、本発明のレセプターを介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明のレセプターを活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明のレセプターアンタゴニストである。
本発明のレセプターアゴニストは、本発明のレセプターに対する本発明のポリペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターと同様に、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用できる。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬としても使用できる。好ましくは、肥満症の予防・治療剤である。
本発明のレセプターアンタゴニストは、本発明のレセプターに対する本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターが有する生理活性を抑制することができるので、例えば、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、拒食症の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として有用である。好ましくは、癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、摂食促進剤などである。
【００５０】
また、本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターをコードする本発明のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法なども提供する。
具体的には、（ｉ）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｉｉ）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行い、本発明のポリペプチドの遺伝子または本発明のレセプターの遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の場合における、本発明のポリペプチドの遺伝子または本発明のレセプターの遺伝子の発現量（具体的には、本発明のポリペプチド量、本発明のレセプター量、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ量または本発明のレセプターをコードするｍＲＮＡ量など）を測定して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明ポリペプチドまたは本発明のレセプターを産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターをコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）などが用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを細胞膜上に発現させた形質転換体などが好ましく用いられる。
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターのタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明の抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記ポリペプチドまたはレセプターを、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現量は、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやＲｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＡＢＩ社製、ＴａｑＭａｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を促進（発現量を増加）する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターと同様に、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用できる。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬としても使用できる。中でも好ましくは、肥満症の予防・治療剤である。
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、本発明のレセプターに対する本発明のポリペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、例えば、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、拒食症の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として有用である。好ましくは、癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、摂食促進剤などである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性または機能を促進または阻害する化合物、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を促進または阻害（発現量を増加または減少）する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
上記化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、肥満症の治療の目的で本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性または機能を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満症の治療の目的で本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性または機能を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
例えば、癌の治療の目的で本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性または機能を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、癌の治療の目的で本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性または機能を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
例えば、肥満症の治療の目的で本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肥満症の治療の目的で本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
例えば、癌の治療の目的で本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、癌の治療の目的で本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５２】
（３）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの定量
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターに対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの定量法を提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターのＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターに対するモノクローナル抗体を用いて本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００５３】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量または本発明のレセプター量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００５４】
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江　寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江　寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．　７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、同書　Ｖｏｌ．　７３（ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、同書　Ｖｏｌ．　７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、同書　Ｖｏｌ．　８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ　：　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書　Ｖｏｌ．　９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ　：　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書　Ｖｏｌ．　１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ　：　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを感度良く定量することができる。
【００５５】
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの濃度を定量することによって、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの濃度の増加が検出された場合、例えば、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）、拒食症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの濃度の減少が検出された場合には、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを検出するために使用することができる。また、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの検出、被検細胞内における本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの挙動の分析などのために使用することができる。
【００５６】
（４）遺伝子診断薬
本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）は、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトや温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現過多が検出された場合は、例えば、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）、拒食症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子の発現減少が検出された場合は、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００５７】
（５）アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に相補的に結合し、該ポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができるアンチセンスポリヌクレオチド（例、アンチセンスＤＮＡ）は、癌細胞のアポトーシス誘導作用などを有し、例えば、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、拒食症の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として有用である。中でも好ましくは、癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、摂食促進剤などである。
例えば、上記アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００５８】
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターをコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムなども、本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制することができ、生体内における本発明のポリペプチド、本発明のレセプターまたは本発明のポリヌクレオチドの機能を抑制することができるので、例えば、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、拒食症の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として有用である。中でも好ましくは、癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、摂食促進剤などである。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，　４１１巻，　４９４頁，　２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　７巻，　２２１頁，　２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターをコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明の本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターをコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
【００５９】
（６）本発明の抗体を含有する医薬
本発明のポリペプチドの抗体は、例えば、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、拒食症の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として有用である。中でも好ましくは、癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、摂食促進剤などである。
本発明のレセプターを中和する作用を有する（シグナル伝達を不活性化する）本発明の抗体は、例えば、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、拒食症の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として有用である。中でも好ましくは、癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、摂食促進剤などである。
本発明のレセプターのシグナル伝達を活性化する本発明の抗体は、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用できる。好ましくは、肥満症の予防・治療剤である。
【００６０】
本発明の抗体を含有する上記医薬は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトや温血動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の癌の患者の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体（例、本発明のポリペプチドの抗体）を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【００６１】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００６２】
（７）ＤＮＡ導入動物
本発明は、外来性の本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターをコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ導入動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを導入することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ導入動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００６３】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの機能を抑制するポリペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に導入するにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを導入する場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ導入哺乳動物を作出することができる。
【００６４】
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリホスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００６５】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域はＤＮＡ導入動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを導入した非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００６６】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの機能亢進症や、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを導入した哺乳動物は、遊離した本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターに関連する疾患（例、肥満症、癌など）に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００６７】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドまたは本発明の異常レセプターによる正常ポリペプチドまたはレセプターの機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを導入した哺乳動物は、遊離した本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ導入動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ導入動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチドまたはレセプター組織を分析することによる、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターにより特異的に発現あるいは活性化するポリペプチドまたはレセプターとの関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異ポリペプチドまたはレセプターを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの機能不活性型不応症などを含む、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターに関連する疾患（例、癌、肥満症など）の臨床症状を調べることができ、また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ導入動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ導入細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの機能不活性型不応症を含む、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ導入動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００６８】
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）上記（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００６９】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００７０】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１−０．５％トリプシン／０．１−５ｍＭ　ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．　Ｊ．　Ｅｖａｎｓ及びＭ．　Ｈ．　Ｋａｕｆｍａｎ，　Ｎａｔｕｒｅ　第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．　Ｒ．　Ｍａｒｔｉｎ　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．　Ｃ．　Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ　ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの細胞生物学的検討において有用である。
【００７１】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知の方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターのヘテロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターのホモ発現不全個体を得ることができる。
【００７２】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００７３】
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などに対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００７４】
例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などに対して予防・治療効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血糖値および体重変化などを経時的に測定する。該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の癌転移が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上低下した場合、該試験化合物を肥満症に対して予防・治療効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などに対して予防・治療効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の癌の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７５】
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリホスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のｌａｃＺで置換している場合、本来、本発明のポリペプチドの発現する組織で、本発明のポリペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００７６】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの発現を促進し、該ポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性または機能を促進することができるので、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。あるいは、例えば、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの医薬として有用である。中でも好ましくは、肥満症の予防・治療剤などである。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの発現を阻害し、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性または機能を阻害することができるので、例えば、癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、拒食症の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。あるいは、中枢疾患（例、アルツハイマー病、痴呆、摂食障害など）、内分泌疾患（例、高血圧症、性腺機能異常、甲状腺機能異常、下垂体機能異常など）、代謝疾患（例、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症など）などの安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として有用である。好ましくは、癌の予防・治療剤、摂食促進剤などである。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００７７】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のスクリーニング方法で得られる化合物またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の肥満症の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の肥満症の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の癌の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の癌の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のポリペプチドのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターそのものの体内での産生能力を特異的に促進または阻害（抑制）する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００７８】
（９）本発明の「本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満症の予防・治療剤」および「本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤」について
「本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物」は、本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物であればいかなるものでもよく、例えば肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）の予防・治療剤などとして用いられる。
「本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物」は、本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物であればいかなるものでもよく、例えば癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
該予防・治療剤は、上記（２）などと同様にして製造される。
【００７９】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
Ａ　　　　　　：アデニン
Ｔ　　　　　　：チミン
Ｇ　　　　　　：グアニン
Ｃ　　　　　　：シトシン
Ｉ　　　　　　　　　　　　：イノシン
Ｒ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ　　　　　　　　　　　　：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）
Ｍ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｋ　　　　　　　　　　　　：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｓ　　　　　　　　　　　　：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｂ　　　　　　　　　　　　：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｄ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｖ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｎ　　　　　　　　　　　　：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしく
はチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基
ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＨＡ　　　　　：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ　　　：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ　　　　　：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｂｚｌ　　　　　：ベンジル
Ｂｏｍ　　　　　：ベンジルオキシメチル
Ｂｏｃ　　　　　：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ　　　　　：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ　　　　：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ　　　　　：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ　　　　　：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ　　　　：ジイソプロピルエチルアミン
ＢＳＡ　　　　　：ウシ血清アルブミン
ＣＨＡＰＳ　　　：３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスホナート
Ｇｌｙ又はＧ　　：グリシン
Ａｌａ又はＡ　　　：アラニン
Ｖａｌ又はＶ　　　：バリン
Ｌｅｕ又はＬ　　　：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ　　　：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ　　　　：セリン
Ｔｈｒ又はＴ　　　　：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ　　　　：システイン
Ｍｅｔ又はＭ　　　　：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ　　　　：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ　　　　：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ　　　　：リジン
Ａｒｇ又はＲ　　　　：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ　　　　：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ　　　　：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ　　　　：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ　　　　：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ　　　　：プロリン
Ａｓｎ又はＮ　　　　：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ　　　　：グルタミン
ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
Ｔｙｒ（Ｉ）　　：３−ヨードチロシン
ＤＭＦ　　　　　：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ　　　　：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ　　　　　：トリチル
Ｐｂｆ　　　　　：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
Ｃｌｔ　　　　　：２−クロロトリチル
Ｂｕｔ　　　　　　：ｔ−ブチル
Ｍｅｔ（Ｏ）　　：メチオニンスルフォキシド
ＰＡＭ　　　　　：フェニルアセトアミドメチル
ＤＩＰＣＩ　　　：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
Ｃｌ−Ｚ　　　　：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル
ＨＯＡｔ　　　　：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＰｙＡｏｐ　　　：７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリスピロリジノホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェイト
ＤＩＰＣＤＩ　　：１，３−ジイソプロピルカルボジイミド
Ｎｌｅ　　　　　：ノルロイシン（２−アミノヘキサン酸）
ＰＭＳＦ　　　　：フェニルメタンスルホニルフルオライド
Ｃｌ−Ｚ　　　　　：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ　　　　：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ：
（４Ｓ，５Ｒ）−３−（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２，２，５−トリメチル−オキサゾリジン−４−カルボン酸
［（４Ｓ，５Ｒ）−３−（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２，２，５−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ
ａｃｉｄ　）］
【００８０】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−１（ヒトＴＧＲ２３−１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−２（ヒトＴＧＲ２３−２）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
以下の参考例１、実施例２８、実施例３２および実施例３３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
以下の参考例１、実施例２８、実施例３２および実施例３３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
以下の実施例１および実施例１５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
以下の実施例１および実施例１５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
以下の実施例２、実施例１６、参考例２、実施例３１、実施例３９および実施例４７で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
以下の実施例２、実施例１６、参考例２、実施例３１、実施例３９および実施例４７で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
以下の実施例２、実施例１６、参考例２、実施例３１、実施例３９および実施例４７で使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１５）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１４）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
以下の実施例１１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
以下の実施例１１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
以下の実施例１１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド前駆体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。〔配列番号：１９〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２０〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２１〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１５）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１４）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
以下の実施例１２におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
以下の実施例１２におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
以下の実施例１２におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
マウスＴＧＲ２３−２リガンド前駆体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
マウスＴＧＲ２３−２リガンド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２９〕
マウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３０〕
マウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−１５）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３１〕
マウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−１４）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３２〕
マウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３３〕
以下の実施例１３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
ラットＴＧＲ２３−２リガンド前駆体の一部をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
ラットＴＧＲ２３−２リガンド前駆体の一部のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３６〕
ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３７〕
配列番号：１２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
配列番号：３６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
【００８１】
〔配列番号：４１〕
配列番号：２０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
配列番号：２１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
配列番号：２９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
配列番号：３０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４７〕
配列番号：３１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
配列番号：３２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４９〕
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１６）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５０〕
配列番号：４９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：５１〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５２〕
配列番号：５１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：５３〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５４〕
配列番号：５３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：５５〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５６〕
配列番号：５５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：５７〕
以下の実施例１４におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５８〕
以下の実施例１４におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
以下の実施例１４におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：６０〕
ラットＴＧＲ２３−２リガンド前駆体をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕
ラットＴＧＲ２３−２リガンド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６２〕
［Ｎｌｅ１０，Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６３〕
新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−１Ａ（ヒトＴＧＲ２３−１Ａ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６４〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＡをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６５〕
新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−１Ｂ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６６〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＢをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６７〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６８〕
配列番号：６７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：６９〕
ヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７０〕
配列番号：６９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：７１〕
マウス由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−Ａ（マウスＴＧＲ２３−Ａと称することもある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７２〕
マウス由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−ＡをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７３〕
以下の参考例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７４〕
以下の参考例３におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：７５〕
マウス由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−Ｂ（マウスＴＧＲ２３−Ｂと称することもある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７６〕
マウス由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−ＢをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７７〕
ラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−１（ラットＴＧＲ２３−１と称することもある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７８〕
ラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７９〕
以下の参考例４および実施例３０におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８０〕
以下の参考例４および実施例３０におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
【００８２】
〔配列番号：８１〕
以下の実施例２９におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８２〕
以下の実施例２９におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：８３〕
本発明のマウス由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−Ｃ（マウスＴＧＲ２３−Ｃと称することもある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８４〕
本発明のマウス由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−ＣをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８５〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−２（ラットＴＧＲ２３−２と称することもある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８６〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８７〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−３（ラットＴＧＲ２３−３と称することもある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８８〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−３をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８９〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−４（ラットＴＧＲ２３−４と称することもある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９０〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−４をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９１〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−５（ラットＴＧＲ２３−５と称することもある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９２〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９３〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−６（ラットＴＧＲ２３−２と称することもある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９４〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−６をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９５〕
ヒト結腸癌細胞ＬＳ　１７４Ｔより得られた新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−１Ｃ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９６〕
配列番号：９５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９７〕
ヒト結腸癌細胞ＬＳ　１８０より得られた新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−１Ｄ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｄ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９８〕
配列番号：９７をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９９〕
ヒト胃癌細胞ＫＡＴＯＩＩＩより得られた新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−１Ｃ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１００〕
配列番号：９５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０１〕
配列番号：３をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０２〕
新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−１Ｅ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｅ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０３〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＥをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０４〕
新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２３−１Ｆ（ヒトＴＧＲ２３−１Ｆ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０５〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＦをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０６〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＡをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０７〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＡをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０８〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＣをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０９〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＣをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１０〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＤをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１１〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＤをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１２〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＢをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１３〕
ヒトＴＧＲ２３−１ＢをコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１４〕
実施例３９においてヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡを増幅するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１５〕
実施例３９においてヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡを増幅するために用いたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１６〕
ラットＴＧＲ２３−５をコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマー配列を示す。
〔配列番号：１１７〕
ラットＴＧＲ２３−５をコードするＤＮＡを作製するために用いたプライマー配列を示す。
〔配列番号：１１８〕
実施例４３においてラットＴＧＲ２３−１部分ＤＮＡを増幅するために用いたプライマー配列を示す。
〔配列番号：１１９〕
実施例４３においてラットＴＧＲ２３−１部分ＤＮＡを増幅するために用いたプライマー配列を示す。
〔配列番号：１２０〕
実施例４３において使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２１〕
実施例４３において使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２２〕
実施例４３において使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２３〕
実施例４６および実施例４７で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２４〕
実施例４６および実施例４７で用いられたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【００８３】
後述の参考例１で得られた形質転換体大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＴＢ２１７３は、２０００年１０月２４日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６４８３として、２０００年１１月１日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（旧ＮＩＢＨ）に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３４６としてそれぞれ寄託されている。
後述の参考例１で得られた形質転換体大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＴＢ２１７４は、２０００年１０月２４日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６４８４として、２０００年１１月１日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（旧ＮＩＢＨ）に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３４７としてそれぞれ寄託されている。
後述の実施例１１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＧＥＭ−Ｔ　ＥａｓｙＨｕｍａｎ　ＴＧＲ２３（２）　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒは、２００１年１０月１２日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６７１４として、２００１年１０月２２日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７７８１としてそれぞれ寄託されている。
後述の実施例１２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＧＥＭ−Ｔ　ＥａｓｙＭｏｕｓｅ　ＴＧＲ２３（２）　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒは、２００１年１０月１２日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６７１５として、２００１年１０月２２日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７７８３としてそれぞれ寄託されている。
後述の実施例１４で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＧＥＭ−Ｔ　ＥａｓｙＲａｔ　ＴＧＲ２３（２）　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒは、２００１年１０月１２日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６７１６として、２００１年１０月２２日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７７８２としてそれぞれ寄託されている。
後述の実施例２９で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＴＧＲ２３−Ｂは、２００２年６月１８日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０７８として寄託されている。
後述の参考例４で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−１は、２００２年６月１８日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０７９として寄託されている。
後述の実施例３６で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ｈＴＧＲ２３−１Ａは、２００２年６月２７日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９２として寄託されている。
後述の実施例３７で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ｈＴＧＲ２３−１Ｂは、２００２年６月２７日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９３として寄託されている。
後述の実施例３６で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ｈＴＧＲ２３−１Ｃは、２００２年６月２７日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９４として寄託されている。
後述の実施例３６で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ｈＴＧＲ２３−１Ｄは、２００２年６月２７日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０９５として寄託されている。
後述の実施例４１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ｒＴＧＲ２３−５は、２００２年９月６日から茨城県つくば市東１−１−１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８１７８として寄託されている。
【００８４】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
以下で取得されたヒトＴＧＲ２３−１、ヒトＴＧＲ２３−２、ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１ＤをヒトＴＧＲ２３と略すこともある。ヒトＴＧＲ２３には、上記タンパク質の変異体も含まれることもある。また、これらヒトＴＧＲ２３をコードする遺伝子をヒトＴＧＲ２３遺伝子と称する。
参考例１
ヒト結腸癌由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト結腸癌（ＣＸ−１）ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：５）およびプライマー２（配列番号：６）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ　５μｌを鋳型として使用し、Ｐｆｕ　Ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）２．５Ｕ、プライマー１（配列番号：５）およびプライマー２（配列番号：６）を各１．０μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および酵素に２ＸＧＣ　ＢｕｆｆｅｒＩ（ＴａＫａＲａ社）を２５μｌ加え、５０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・１分、６０℃・１分、７２℃・１．５分のサイクルを３８回繰り返し最後に７２℃・１０分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、ｃＤＮＡを持つクローンをカナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：２および配列番号：４）を得た。配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を有するプラスミドをｐＴＢ２１７３と、配列番号：４で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を有するプラスミドをｐＴＢ２１７４と名付けた。これらのＤＮＡの塩基配列（配列番号：２および配列番号：４）がコードするアミノ酸配列（配列番号：１および配列番号：３）を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をＴＧＲ２３−１（ヒトＴＧＲ２３−１）およびＴＧＲ２３−２（ヒトＴＧＲ２３−２）とそれぞれ命名した。さらに、プラスミドｐＴＢ２１７３およびｐＴＢ２１７４が導入された形質転換体を、それぞれ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＴＢ２１７３およびＴＯＰ１０／ｐＴＢ２１７４と命名した。
ＴＧＲ２３−２のアミノ酸配列では、ＴＧＲ２３−１のアミノ酸配列の１０７番目のＡｓｎがＩｌｅに、３４４番目のＧｌｎがＡｒｇにそれぞれ置換されている。また、ＴＧＲ２３−２をコードするＤＮＡの塩基配列では、ＴＧＲ２３−１をコードするＤＮＡの塩基配列の３２０番目のＡがＴに、６４８番目のＣがＴに、１０３１番目のＡがＧに、１０７１番目のＴがＣにそれぞれ置換されている。ＴＧＲ２３−１の疎水性プロット図を図１に、ＴＧＲ２３−２の疎水性プロット図を図２にそれぞれ示す。
【００８５】
参考例２
ヒトＴＧＲ２３−１およびヒトＴＧＲ２３−２の癌細胞株での発現検討
癌細胞株ＳＷ６２０（ヒト結腸癌由来）、ＬＳ１２３（ヒト結腸癌由来）、ＣＯＬＯ２０５（ヒト結腸癌由来）、ＤＵ１４５（ヒト前立腺癌由来）、ＺＲ７５−１（ヒト乳癌由来）、ＮＣＩ−Ｈ３５８（ヒト気管支肺胞腺癌由来）（いずれもアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ））を用いてヒトＴＧＲ２３−１およびＴＧＲ２３−２の発現量の検討を行った。ＳＷ６２０はＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ１５培地（ＳＩＧＭＡ社、カタログ番号Ｌ５５２０）、ＬＳ１２３はＥＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号１１０９０−０８１）、ＣＯＬＯ２０５、ＺＲ７５−１、ＮＣＩ−Ｈ３５８は１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ社）、１ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号１１８７５−０９３）、ＤＵ１４５は０．１ｍＭ　ＭＥＭ　非必須アミノ酸溶液、１ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を含むＥＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社、カタログ番号１１０９５−０８０）にいずれの培地も、それぞれ１０％　ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社）、０．１ｇ／ｌのカナマイシン（ＧＩＢＣＯ社）になるようにそれらを加え、培養を行った。細胞培養は１０ｃｍ−ｄｉｓｈにておこないＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡの２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を算出し、それぞれ５ｎｇを用いＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて逆転写反応を行った。得られた逆転写産物１ｎｇ相当もしくは逆転写反応を行っていないＲＮＡ　１ｎｇを鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：９）、プライマー２（配列番号：１０）およびプローブ１（配列番号：１１）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記逆転写反応産物１ｎｇ相当もしくは逆転写反応を行っていないＲＮＡ　１ｎｇを鋳型として使用し、プライマー１（配列番号：９）およびプライマー２（配列番号：１０）を各０．５μＭ、プローブ１（配列番号：１１）を０．１μＭ、およびＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）１２．５μｌを加え、２５μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ７７００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返し行った。同様に逆転写産物０．２５ｎｇ相当もしくは逆転写反応を行っていないＲＮＡ０．２５ｎｇを鋳型として使用し、ＴａｑＭａｎ　β−ａｃｔｉｎ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記逆転写産物０．２５ｎｇ相当もしくは逆転写反応を行っていないＲＮＡ０．２５ｎｇを鋳型として使用し、ＴａｑＭａｎ　β−ａｃｔｉｎ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓに含まれるβ−ａｃｔｉｎ　Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒおよびβ−ａｃｔｉｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒを各０．４μＭ、β−ａｃｔｉｎ　Ｐｒｏｂｅを０．５μＭ、およびＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉ��ｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）１２．５μｌを加え、２５μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ７７００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６２℃・１分のサイクルを４０回繰り返し行った。実施例２と同様に解析を行い、逆転写反応産物の解析より得られた値から逆転写反応を行わずに得られた値を差し引き、発現量を決定した。さらにヒトＴＧＲ２３−１およびＴＧＲ２３−２の発現量の値はβ−アクチンに対しての発現量として求めた。このとき得られた値が０以下を示した場合、その値を０として置き換えた。その結果、β−アクチンに対するヒトＴＧＲ２３−１およびＴＧＲ２３−２の発現量はＳＷ６２０では、０．００２１％、ＬＳ１２３では０．０％、ＣＯＬＯ２０５では２．１％、ＤＵ１４５では０．０００２９％、ＺＲ７５−１では０．００１２％、ＮＣＩ−Ｈ３５８では０．０％であった。
これより、ヒトＴＧＲ２３−１およびヒトＴＧＲ２３−２は、ＣＯＬＯ２０５において非常に発現が増強していたことがわかる。
ヒトＴＧＲ２３−１およびヒトＴＧＲ２３−２の癌細胞株における発現量のグラフを図１９に示す。
【００８６】
参考例３
マウス脳由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
マウスＭａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：７３）およびプライマー２（配列番号：７４）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ　１μｌを鋳型として使用し、Ｐｆｕ　Ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）２．５Ｕ、プライマー１（配列番号：７３）およびプライマー２（配列番号：７４）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および酵素に２ＸＧＣ　ＢｕｆｆｅｒＩ（ＴａＫａＲａ社）を２５μｌ加え、５０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・１分、６０℃・１分、７２℃・１．５分のサイクルを３８回繰り返し、最後に７２℃・５分の伸長反応を行った。次にアガロースゲル電気泳動を行い、Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて該ＰＣＲ反応産物を精製した。これをＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲ　クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０に導入し、ｃＤＮＡを持つクローンをカナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：７２）を得た。このＤＮＡの塩基配列（配列番号：７２）がコードするアミノ酸配列（配列番号：７１）を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をマウスＴＧＲ２３−Ａと命名した。
配列番号：７２で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を有するプラスミドをｐＴＢ２２３７と名付け、プラスミドｐＴＢ２２３７を導入された形質転換体を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＴＢ２２３７と命名した。
【００８７】
参考例４
ラット脳由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ラットＭａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：７９）およびプライマー２（配列番号：８０）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ２．５μｌを鋳型として使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μｌ、プライマー１（配列番号：７９）およびプライマー２（配列番号：８０）を各０．２μＭ、ｄＮＴＰｓを８００μＭ、および酵素にＤＭＳＯを２μｌ加え、５０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・３０秒、７２℃・４分のサイクルを５回、９５℃・３０秒、７０℃・４分のサイクルを５回、９５℃・３０秒、６８℃・４分のサイクルを３０回繰り返し、最後に６８℃・３分の伸長反応を行った。次にアガロースゲル電気泳動を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　ＳＰＩＮ　Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社）を用いて該ＰＣＲ反応産物を精製した。これを　ＴＯＰＯ　ＴＡ　クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＤＨ５αに導入し、ｃＤＮＡを持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：７８）を得た。このＤＮＡの塩基配列（配列番号：７８）がコードするアミノ酸配列（配列番号：７７）を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をラットＴＧＲ２３−１と命名した。
配列番号：７８で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を有するプラスミドをｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−１と名付け、プラスミドｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３が導入された形質転換体を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−１と命名した。
【００８８】
実施例１
ＴＧＲ２３−２発現（以下、ヒトＴＧＲ２３−２を、単にＴＧＲ２３−２と称することもある）ＣＨＯ細胞の作成
参考例１で得られたプラスミドｐＴＢ２１７４を鋳型とし、Ｓａｌ　Ｉ認識配列を付加したプライマー１（配列番号：７）およびＳｐｅ　Ｉ認識配列を付加したプライマー２（配列番号：８）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記プラスミド１０　ｎｇを鋳型として使用し、Ｐｆｕ　Ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）２．５　Ｕ、プライマー１（配列番号：７）およびプライマー２（配列番号：８）を各１．０μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および反応液に２　Ｘ　ＧＣ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｉ（宝酒造）を２５μｌ加え、５０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・６０秒の後、９５℃・６０秒、５５℃・６０秒、７２℃・７０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・１０分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲクローニングキット（インビトロジェン社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ　ＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）へサブクローニングした。これをＥ．　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０（インビトロジェン社）に導入し、ｐＴＢ２１７４に含まれるＴＧＲ２３−２のｃＤＮＡを持つクローンをカナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。ここで得られた、５’側および３’側にＳａｌ　ＩおよびＳｐｅ　Ｉがそれぞれ認識する配列を付加したＴＧＲ２３−２が導入されたプラスミドによって形質転換されたＥ．　ｃｏｌｉのクローンよりＰｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素Ｓａｌ　Ｉ　およびＳｐｅ　Ｉで切断してインサート部分を切り出した。インサートＤＮＡは電気泳動後、アガロースゲルより切り出し、次にＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて回収した。このインサートＤＮＡをＳａｌ　Ｉ　およびＳｐｅ　Ｉで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｈｉｎｕｍａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　Ｖｏｌ．　１２１９，ｐｐ．　２５１−２５９　（１９９４）記載のｐＡＫＫＯ１．１１Ｈと同一のベクタープラスミド）に加え、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いてライゲーションを行ない、蛋白発現用プラスミドｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−２を構築した。このｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−２で形質転換したＥ．　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０を培養後、Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いてｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−２のプラスミドＤＮＡを調製した。ハムスターＣＨＯ／ｄｈｆｒ−　細胞を１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ｗｉｔｈ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．　Ｎｏ．　１２５７１）でファルコンディッシュ（径３．５　ｃｍ）に１　ｘ　１０５個播種し、５％　ＣＯ２インキュベーターで３７℃一晩培養した。上記発現プラスミドｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−２ＤＮＡ　２μｇをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＦｕＧＥＮＥ　６　（Ｒｏｃｈｅ社）を用い、添付説明書記載の方法に従ってトランスフェクトし、１８時間培養後新鮮な増殖培地に交換した。さらに１０時間培養を続けたのち、トランスフェクトした細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理により集め、選択培地（１０％　透析牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ｗｉｔｈｏｕｔ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．　Ｎｏ．　１２５６１））を用いて平底９６穴プレート１０枚に播種した。３−４日ごとに選択培地を交換しながら培養を続け、２−３週間後にコロニー状に増殖してきたＤＨＦＲ＋　細胞クローンを７９個取得した。
【００８９】
実施例２
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞株のＴＧＲ２３−２発現量の定量
実施例１で得たＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞株７９クローンを、９６ウェルプレートに培養し、ＲＮｅａｓｙ　９６　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　　５０〜２００　ｎｇを　ＴａｑＭａｎ　Ｇｏｌｄ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ　（ＰＥバイオシステムズ社）を用いて、逆転写反応を行なった。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　　５〜２０　ｎｇ相当の逆転写産物、または後に述べるようにして作製した標準ｃＤＮＡ、１ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズ社）、配列番号：９で表されるプライマーおよび配列番号：１０で表されるプライマー各５００　ｎＭ、および配列番号：１１（Ｆａｍ−ａｃｃｔｇｇｔｔｔｇｃｃｇａｇｔｇｇｔｃ　ｃｇｃｔａｔｔｔ−Ｔａｍｒａ；配列中、Ｆａｍは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、Ｔａｍｒａは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　をそれぞれ示す）で表されるＴａｑＭａｎプローブ　１００　ｎＭを含む反応混合液２５μｌについてＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５℃・１０分で処理後、９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。
標準ｃＤＮＡは、参考例で得られたプラスミドｐＴＢ２１７４の２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を算出し、正確なコピー数を算出した後、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で希釈し、２コピーから２ｘ１０６コピーの標準ｃＤＮＡ溶液を調製した。また、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用プローブおよびプライマーはＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０）（ＰＥバイオシステムズ社）により設計した。
発現量はＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、標準ｃＤＮＡの初期濃度の対数値を横軸にとり、標準曲線を作成した。標準曲線より各逆転写産物の初期濃度を算出し、各クローンのｔｏｔａｌ　ＲＮＡ当たりのＴＧＲ２３−２遺伝子発現量を求めた。その結果、ＴＧＲ２３−２の発現が高かったＣＨＯ細胞株２１個を選択し２４ウェルプレートに培養した。これらの細胞について、ＴＧＲ２３−２の発現量を再検した。ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した後、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮａｓｅ処理をした。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、上記と同様に逆転写反応し、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法で各クローンのｔｏｔａｌ　ＲＮＡ当たりのＴＧＲ２３−２遺伝子発現量を求めた。その結果、ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞株クローン５３と５８が高い発現量を示すことがわかった。
以後の実施例では、これら２つのクローンの発現細胞を用いた。
【００９０】
実施例３
ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ産生促進／抑制活性の測定
実施例１で作製し、実施例２で選択したＣＨＯ／ＴＧＲ２３−２細胞を２４穴プレートに７　ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養した。細胞を０．２　ｍＭ　３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％　ＢＳＡと２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むαＭＥＭ培地（ｐＨ　７．５）で洗浄した（以下、０．２　ｍＭ　３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％　ＢＳＡと２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むαＭＥＭ培地（ｐＨ　７．５）を反応用バッファーと記す）。その後０．５　ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温した。反応用バッファーを除き、新たに０．２５　ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、試料と２μＭフォルスコリンを含む０．２５　ｍｌの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で３０分間反応させた。反応液を除き、ｃＡＭＰ　ＥＩＡキット（アプライドバイオシステム）付属の細胞溶解液を０．５　ｍｌ添加して細胞内のｃＡＭＰを抽出した。抽出液中のｃＡＭＰ量は、同キットを用いて定量した。この測定値をもとにして、産生促進／抑制活性を以下に示した式で計算し、％ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌで表した。試料添加群の活性はそれぞれのプレート毎に設置した対照の値を用いて算出した。
％　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　＝　（Ｘ−Ｃ）／（Ｔ−Ｃ）ｘ１００
Ｘ：試料添加群のｃＡＭＰ量
Ｔ：正対照（試料無添加、フォルスコリン刺激あり）の３　ｗｅｌｌのｃＡＭＰ量の平均値
Ｃ：負対照（試料無添加、フォルスコリン刺激なし）の２　ｗｅｌｌのｃＡＭＰ量の平均値
【００９１】
実施例４
ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞を用いたアラキドン酸代謝産物遊離促進活性の測定
実施例１で作製し、実施例２で選択したＣＨＯ／ＴＧＲ２３−２細胞を２４穴プレートに５　ｘ１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。培地を除去し、０．５μＣｉ／ｍｌ　［３Ｈ］−アラキドン酸と１０％　透析ＦＢＳと２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳと０．５％　ＢＳＡを添加したαＭＥＭ培地（ｐＨ　７．４）を５００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、培養器で１６時間保温した。［３Ｈ］−アラキドン酸を含む培養液を除き、２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳと０．５％　ＢＳＡを添加したαＭＥＭ培地（ｐＨ　７．４）を５００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、培養器で４時間保温した。培養液を除き、０．０５％　ＢＳＡと２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　を添加したハンクス氏液（ｐＨ　７．４）を用い、７５０μｌ／ｗｅｌｌで２回洗浄した（以下、０．０５％　ＢＳＡと２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　を添加したハンクス氏液（ｐＨ　７．４）を反応用バッファーと記す）。洗浄後、７５０μｌ／ｗｅｌｌの反応用バッファーを細胞に加え、培養器で４０分間保温した。反応用バッファーを除き、新たに２５０μｌの反応用バッファーを添加した後、試料と２５０μｌの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で４０分間反応させた。反応後、上清３５０μｌを分取し、液体シンチレーターを３　ｍｌ加えて放射活性を測定した。この測定値をもとにしてアラキドン酸代謝産物遊離促進活性を以下に示した式で計算し、％　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌで表した。試料添加群の活性はそれぞれのプレート毎に設置した対照の値を用いて算出した。
％　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　＝　（Ｘ／Ｃ）ｘ１００
Ｘ：試料添加群の放射活性
Ｃ：対照（試料無添加）の４　ｗｅｌｌの放射活性の平均値
【００９２】
実施例５
ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内Ｃａ２＋放出促進活性の測定
細胞内Ｃａ２＋放出促進活性はＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社）を用いて測定した。実施例１で作製し、実施例２で選択したＣＨＯ／ＴＧＲ２３−２細胞を９６穴プレートに３ｘ　１０４　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。２．５　ｍＭプロベネシドと２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むハンクス氏液（ｐＨ　７．４）（以下、２．５　ｍＭプロベネシドと２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むハンクス氏液（ｐＨ　７．４）を洗浄用バッファーと記す）１０　ｍｌにＦｌｕｏ　３−ＡＭ　１バイアル分を添加し、ローディングバッファーを作成した。培養プレートの培養液を除き、ローディングバッファーを１００μｌ／ｗｅｌｌ添加して培養器で６０分間保温した。培養プレートのローディングバッファーを除き、洗浄用バッファーで洗浄してから、ＦＬＩＰＲの所定の位置に設置した。試料は凍結乾燥品にサンプルバッファー（洗浄用バッファーにＢＳＡを２　ｍｇ／ｍｌ、ＣＨＡＰＳを１　ｍｇ／ｍｌ添加したもの）を添加し、攪拌後、超音波処理を３０分間行なってから９６穴サンプルプレートに移し替えた。このサンプルプレートも設置し、測定を行なった。細胞内Ｃａ２＋放出促進活性は、試料添加によって惹起された蛍光強度の増加として計測した。
【００９３】
実施例６
ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質のラット全脳抽出物からの精製
ＴＧＲ２３−２に特異的なリガンド活性を示す物質を、ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対するｃＡＭＰ産生促進活性を指標として、ラット全脳から精製した。
ラット全脳抽出物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）フラクションを以下に述べる方法で調製した。日本チャールズリバー（株）より購入したオス８週齢のウィスターラットの全脳４００　ｇ（２００頭分）を順次摘出直後、２５頭ずつ沸騰した蒸留水（３００　ｍｌ）に投じて１０分間煮沸した。煮沸後、直ちに氷冷し、２００頭分を合わせて（２．４　Ｌ）酢酸　１８０　ｍｌを加えて終濃度１．０　Ｍとし、低温下ポリトロン（１０，０００　ｒｐｍ、２分間）を用いて破砕した。破砕液を遠心（８，０００　ｒｐｍ、３０分）して上清を取り、沈殿には１．０　Ｍ酢酸２．４　Ｌ　を加えて再度ポリトロンによって破砕し、一晩攪拌した後、遠心（８，０００　ｒｐｍ、３０分）して上清を得た。各遠心で得られた上清は、２倍量（４．８　Ｌ）の冷アセトンを４℃でゆっくり滴下した後、１回目の遠心により得られた上清については一晩攪拌し、２回目の遠心により得られた上清については４時間攪拌した。アセトンを加えた抽出液は遠心（８，０００　ｒｐｍ、３０分）して沈殿を除き、得られた上清については減圧下エバポレーターにてアセトンを留去した。アセトンを留去した抽出液に等量のジエチルエーテルを加え、分液ロートを使って脂質を含むエーテル層を分離して水層を回収した。エーテル脱脂した抽出液はエバポレーターにて減圧下濃縮しエーテルを完全に除去した。濃縮液をガラス繊維濾紙（アドバンテック、ＤＰ７０　（９０　ｍｍφ））で濾過し、濾液をガラス製カラム（３０φ　ｘ　２４０　ｍｍ）に充填したＯＤＳカラム（ダイソー、Ｄａｉｓｏｇｅｌ　ＩＲ−１２０−ＯＤＳ−Ａ　６３／２１０　ｕｍ）に付した。カラムを１．０　Ｍ酢酸　４００　ｍｌで洗浄後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む６０％アセトニトリル５００　ｍｌで溶出した。溶出液を減圧下濃縮して溶媒を留去した後、濃縮液を凍結乾燥した。得られた白色粉末１．２　ｇを３０　ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルに溶解し、１２．５　ｍｌずつをＯＤＳカラム（東ソー、ＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ−８０Ｔｓ　（２１．５φ　ｘ　３００　ｍｍ））を用いた１０％から６０％の０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度勾配溶出法による分取ＨＰＬＣに付した。ＨＰＬＣは２回に分けて行い、溶出液は２分毎に６０分画にし、２回分の溶出液をまとめた。各分画を減圧下に濃縮・乾固し、残渣に０．４　ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加後ボルテックスミキサー、および超音波洗浄機を用いて完全に溶解した。
上記によって得られたＨＰＬＣフラクションのＤＭＳＯ溶液を実施例３に示した方法に従いＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に投与し、細胞内ｃＡＭＰ産生量の測定を行なった結果、分画番号１８、２０および２２〜２３に顕著なｃＡＭＰ産生促進活性が認められた。また同様の試料について実施例４に示した方法に従いアラキドン酸代謝物遊離活性を調べた結果、顕著な活性が確認された。
これらの活性は他のレセプター発現細胞では認められなかったことより、ラット全脳抽出物にＴＧＲ２３−２に特異的なリガンド活性物質が存在することが示された。得られた３つの活性画分をそれぞれ以下の（ａ）〜（ｃ）の方法によりさらに精製した。また、いずれの活性分画についても、以下に述べる最初の陽イオン交換カラムを用いた精製工程において得られたｃＡＭＰ産生促進活性が認められた分画には、同時に実施例５に記載したＦＬＩＰＲによってレセプター特異的な細胞内カルシウム遊離活性が認められた。そこで、それ以降の精製工程における活性の確認には、ＦＬＩＰＲによる細胞内カルシウム遊離活性を指標として用い、活性を示した分画がｃＡＭＰ産生促進活性を示すことについては適宜確認した。
（ａ）分画番号１８
分画番号１８については、１０％アセトニトリルを含む１０　ｍＭギ酸アンモニウム１０　ｍｌに溶解し、陽イオン交換カラム（東ソー、ＴＳＫｇｅｌ　ＳＰ−５ＰＷ　（２０　ｍｍφ　ｘ　１５０　ｍｍ））に付した後、１０％アセトニトリルを含む１０　ｍＭから１．０　Ｍのギ酸アンモニウムの濃度勾配により溶出した。活性はギ酸アンモニウム０．４　Ｍ付近に回収された。活性分画を凍結乾燥後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリル０．８　ｍｌに溶解し、ＯＤＳカラム（東ソー、ＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ−８０Ｔｓ　（４．６φ　ｘ　２５０　ｍｍ））に付した後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％から２５％のアセトニトリルの濃度勾配により溶出した結果、アセトニトリル１３％付近に活性が認められた。得られた活性分画を凍結乾燥後、０．１　ｍｌのＤＭＳＯで溶解し、さらに０．７　ｍｌの０．１％ヘプタフルオロ酪酸を含む１０％アセトニトリルを加えてＯＤＳカラム（和光純薬、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　３Ｃ１８ＨＧ　（２．０　ｍｍφｘ　１５０　ｍｍ））に付した後、０．１％ヘプタフルオロ酪酸を含む１０％から３７．５％のアセトニトリルの濃度勾配により溶出し、ピーク毎に手動で分取した。活性はアセトニトリル２６％付近に認められた。活性画分には、さらに０．７　ｍｌの０．１％を含むトリフルオロ酢酸１０％アセトニトリルを加え、ＯＤＳカラム（和光純薬、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　３Ｃ１８ＨＧ）に付した後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％から２０％のアセトニトリルの濃度勾配によって溶出し、溶出液はピーク毎に手動で分取した。活性はアセトニトリル１１％付近に単一ピークとして得られた（図７）。この分画に含まれる活性物質は、以下の実施例１０に示すようにして構造決定した。
（ｂ）分画番号２０
分画番号２０については、１０％アセトニトリルを含む１０　ｍＭギ酸アンモニウム１０　ｍｌに溶解し、陽イオン交換カラム（東ソー、ＴＳＫｇｅｌ　ＳＰ−５ＰＷ　（２０　ｍｍφ　ｘ　１５０　ｍｍ））に付した後、１０％アセトニトリルを含む１０　ｍＭから１．０　Ｍのギ酸アンモニウムの濃度勾配により溶出した。活性はギ酸アンモニウム０．６　Ｍ付近に回収された。活性分画を凍結乾燥後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリル０．８　ｍｌに溶解し、ＣＮカラム（野村化学、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＣＮ−ＵＧ−５　（４．６　ｍｍφｘ　２５０　ｍｍ））に付した後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％から２５％のアセトニトリルの濃度勾配によって溶出した結果、アセトニトリル１２％付近に活性が認められた。得られた活性分画を凍結乾燥後、０．１　ｍｌのＤＭＳＯで溶解し、さらに０．７　ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルを加えてＯＤＳカラム（和光純薬、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　３Ｃ１８ＨＧ　（２．０　ｍｍφｘ　１５０　ｍｍ））に付した後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％から２０％のアセトニトリルの濃度勾配により溶出し、溶出液はピーク毎に手動で分取した。活性はアセトニトリル１５％付近に単一ピークとして得られた（図５）。この分画に含まれる活性物質を以下の実施例８に示すようにして構造決定した。
（ｃ）分画番号２２〜２３
分画番号２２〜２３については、１０％アセトニトリルを含む１０　ｍＭギ酸アンモニウム１０　ｍｌに溶解し、陽イオン交換カラム（東ソー、ＴＳＫｇｅｌ　ＳＰ−５ＰＷ　（２０　ｍｍφ　ｘ　１５０　ｍｍ））に付した後、１０％アセトニトリルを含む１０　ｍＭから１．０　Ｍのギ酸アンモニウムの濃度勾配により溶出した。活性はギ酸アンモニウム０．４　Ｍ付近に回収された。活性分画を凍結乾燥後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリル０．８　ｍｌに溶解し、ＣＮカラム（野村化学、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＣＮ−ＵＧ−５　（４．６　ｍｍφｘ　２５０　ｍｍ））に付した後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％から２５％のアセトニトリルの濃度勾配によって溶出した結果、アセトニトリル１３％付近に活性が認められた。得られた活性分画を凍結乾燥後、０．１　ｍｌのＤＭＳＯで溶解し、さらに０．７　ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルを加えてＯＤＳカラム（和光純薬、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　３Ｃ１８ＨＧ　（２．０　ｍｍφｘ　１５０　ｍｍ））に付した後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％から２０％のアセトニトリルの濃度勾配により溶出し、ピーク毎に手動で分取した。活性はアセトニトリル１６％付近に認められた。活性分画には、さらに０．７　ｍｌの０．１％ヘプタフルオロ酪酸を含む１０％アセトニトリルを加え、ＯＤＳカラム（和光純薬、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　３Ｃ１８ＨＧ）に付した後、０．１％ヘプタフルオロ酪酸を含む１０％から３７．５％のアセトニトリルの濃度勾配によって溶出し、溶出液はピーク毎に手動で分取した。活性はアセトニトリル２８％付近に単一ピークとして得られた（図６）。この分画に含まれる活性物質は、以下の実施例９に示すようにして構造決定した。
【００９４】
実施例７
ラット全脳抽出物中のＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的に細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質のプロナーゼによる失活
実施例６でＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性を示したＨＰＬＣ分画１８、２０および２２〜２３を、タンパク質分解酵素であるプロナーゼ（Ｓｉｇｍａ，　ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｔｙｐｅ　ＸＩＶ　（Ｐ５１４７））で処理し、活性物質が蛋白性であるか否かを調べた。上記ラット全脳抽出物ＨＰＬＣ活性分画（分画番号１８、２０および２２〜２３）各４　μｌを０．２　Ｍ酢酸アンモニウム１００　μｌに加え、これにプロナーゼ３　μｇを添加して３７℃で２時間インキュベートした後、沸騰水中で１０分間加熱して添加したプロナーゼを失活させた。これにＢＳＡ　０．０５ｍｇおよびＣＨＡＰＳ　０．０５　ｍｇを含む蒸留水１ｍｌを加え凍結乾燥した。凍結乾燥した試料を、実施例３に示す方法に従いＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に添加して細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性を測定した。
その結果、いずれの分画の活性もプロナーゼ処理によって完全に消失した。
従って、ラット全脳抽出物中のＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質は、いずれもタンパク質またはペプチドであることが明らかとなった。
【００９５】
実施例８
ラット全脳抽出物の分画番号２０から得られたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質のアミノ酸配列の決定
実施例７に示したようにラット全脳抽出物の３つの分画に含まれるＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質は、いずれもタンパク性であることが予想されたので、以下のようにそれぞれについてアミノ酸配列解析を行なった。
実施例６に示すようにしてラット全脳抽出物の分画番号２０から得られたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質のアミノ酸配列解析および質量分析を行なった。活性ピークを含む溶出液を用いてＰｒｏｃｉｓｅ　４９１ｃＬＣプロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム）によるアミノ末端アミノ酸配列分析を行なったところ、Ｎ末端から１８残基までにＳＦＲＮＧＶＧＳＧＶＫＫＴＳＦＲＲＡ（配列番号：１２）のアミノ酸配列が得られた。同様の溶出液を用いてナノスプレーイオン源（プロタナ）を装着したＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｎｎｉｇａｎ　ＬＣＱイオントラップ質量分析計（サーモクエスト）による質量分析を行なった結果、配列番号：１２のアミノ酸配列から計算される質量値が得られた（実測値：１９５４．９、　計算値：１９５４．２）。これより、ラット全脳抽出物の分画番号２０から得られたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質は、配列番号：１２に示すアミノ酸配列を有するものであると決定された。
【００９６】
実施例９
ラット全脳抽出物の分画番号２２〜２３から得られたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質のアミノ酸配列の決定
実施例６に示すようにしてラット全脳抽出物の分画番号２２〜２３から得られたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質のアミノ酸配列解析および質量分析を行なった。活性ピークを含む溶出液を用いてＰｒｏｃｉｓｅ　４９１ｃＬＣプロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム）によるアミノ末端アミノ酸配列分析を行なったところ、Ｎ末端から１５残基までにＳＦＲＮＧＶＧＳＧＶＫＫＴＳＦ（配列番号：１３）のアミノ酸配列が得られた。同様の溶出液を用いてナノスプレーイオン源（プロタナ）を装着したＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｎｎｉｇａｎ　ＬＣＱイオントラップ質量分析計（サーモクエスト）による質量分析を行なった結果、配列番号：１３のアミノ酸配列から計算される質量値が得られた（実測値：１５７０．８、　計算値：１５７０．８）。これより、ラット全脳抽出物の分画番号２２〜２３から得られたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質は、配列番号：１３に示すアミノ酸配列を有するものであると決定された。
【００９７】
実施例１０
ラット全脳抽出物の分画番号１８から得られたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質のアミノ酸配列の決定
実施例６に示すようにしてラット全脳抽出物の分画番号１８から得られたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質のアミノ酸配列解析および質量分析を行なった。活性ピークを含む溶出液を用いてＰｒｏｃｉｓｅ　４９１ｃＬＣプロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム）によるアミノ末端アミノ酸配列分析を行なったところ、Ｎ末端から１４残基までにＳＦＲＮＧＶＧＳＧＶＫＫＴＳ（配列番号：１４）のアミノ酸配列が得られた。同様の溶出液を用いてナノスプレーイオン源（プロタナ）を装着したＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｎｎｉｇａｎ　ＬＣＱイオントラップ質量分析計（サーモクエスト）による質量分析を行なった結果、配列番号：１４のアミノ酸配列から計算される質量値が得られた（実測値：１４２４．１、　計算値：１４２３．６）。
これより、ラット全脳抽出物の分画番号１８から得られたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性物質は、配列番号：１４に示すアミノ酸配列を有するものであると決定された。
【００９８】
実施例１１
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド前駆体をコードするｃＤＮＡのクローニング
ラット全脳抽出物から得られたＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対して特異的にｃＡＭＰ産生促進活性を示す活性ペプチド（本明細書中、ラットＴＧＲ２３−２リガンドと記載することがある）のヒトホモログ（本明細書中、ヒトＴＧＲ２３−２リガンドと記載することがある）の前駆体をコードするｃＤＮＡをクローニングするため、ヒト視床下部由来のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行なった。
以下の合成ＤＮＡプライマーを用い、ヒト視床下部由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による増幅を行なった。反応液の組成は、ヒト視床下部Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．８μｌ、配列番号：１５および配列番号：１６の合成ＤＮＡプライマー各１．０μＭ、０．２　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＥｘＴａｑ（タカラ）０．１μｌおよび酵素に付属のＥｘＴａｑバッファーで、総反応量は２０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・３００秒の加熱の後、９４℃・１０秒、５５℃・３０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。次に、ＤＮａｓｅ　、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅの蒸留水で５０倍希釈したＰＣＲ反応液２μｌ、配列番号：１５および配列番号：１７の合成ＤＮＡプライマー各１．０μＭ、０．２　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラ）０．１μｌおよび酵素に付属のＥｘＴａｑバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・３００秒の加熱の後、９４℃・１０秒、５５℃・３０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。増幅したＤＮＡを２．０％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、バンドの部分をカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。このＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　（プロメガ）のプロトコールに従ってｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙベクターへ、クローニングした。これを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０９　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（タカラ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。この形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｈｕｍａｎ　ＴＧＲ２３（２）　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒと命名した。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：１８に示すＤＮＡ配列を得た。
配列番号：１８で表されるＤＮＡの塩基配列には、配列番号：１２、配列番号：１３および配列番号：１４で表されるラット全脳から得られたラットＴＧＲ２３−２リガンドのアミノ酸配列に極めて類似したアミノ酸配列をコードするようなフレームが存在したことからヒトＴＧＲ２３−２リガンドの前駆体あるいはその一部をコードするｃＤＮＡであると推定された。
ヒトＴＧＲ２３−２リガンドと考えられるアミノ酸配列をコードするようなフレームで配列番号：１８から翻訳されるアミノ酸配列の５’上流側には蛋白翻訳の開始コドンであると予想されるＡＴＧが２ヶ所存在するが、疎水性プロットを行なったところ、より５’上流側のＡＴＧから翻訳した場合にのみシグナル配列と推定される疎水性の高い領域が出現したのでこのＡＴＧが開始コドンであると推定した。３’側にはヒトＴＧＲ２３−２リガンドをコードすると考えられる配列の下流に終止コドンが存在した。以上により推定されたヒトＴＧＲ２３−２リガンド前駆体のアミノ酸配列を配列番号：１９に示す。この配列において、ヒトＴＧＲ２３−２リガンドに相当すると考えられるアミノ酸配列のＮ末側には、通常生理活性ペプチドがその前駆体から切り出されるとされるＬｙｓ−Ａｒｇの配列（Ｓｅｉｄａｈ，　Ｎ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．、Ａｎｎ．　Ｎ．　Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．、８３９巻、９−２４頁、１９９８年）が存在した。一方、Ｃ末側には終止コドンが存在したが、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有するラットＴＧＲ２３−２リガンドに対応する配列との間にさらに２残基が存在した。
これより、ヒトＴＧＲ２３−２リガンドのアミノ酸配列は、ラット全脳抽出物より得られたラットＴＧＲ２３−２リガンドのアミノ酸配列；配列番号：１２〔ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）〕、配列番号：１３〔ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１５）〕および配列番号：１４〔ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１４）〕にそれぞれ対応する、配列番号：２０〔ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）〕、配列番号：２１〔ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１５）〕および配列番号：２２〔ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１４）〕で表されるアミノ酸配列、およびさらに配列番号：２０のＣ末側に２残基延長された配列番号：２３で表されるアミノ酸配列〔ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）〕であると推定された。さらに、ヒトＴＧＲ２３−２リガンドの配列は、マウスＴＧＲ２３−２リガンドおよびラットＴＧＲ２３−２リガンドの配列と異なり、その配列中にＡｒｇ−Ａｒｇ配列ではなくＧｌｎ−Ａｒｇ配列を有することから、配列番号：４９に示された１６残基のアミノ酸配列〔ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−１６）〕もまたリガンドの配列であると推定された。
【００９９】
実施例１２
マウスＴＧＲ２３−２リガンド前駆体をコードするｃＤＮＡのクローニング
ラット全脳抽出物から得られたラットＴＧＲ２３−２リガンドのマウスホモログ（本明細書中、マウスＴＧＲ２３−２リガンドと記載することがある）の前駆体をコードするｃＤＮＡをクローニングするため、マウス全脳由来のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行なった。
以下の合成ＤＮＡプライマーを用い、マウス全脳由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による増幅を行なった。反応液の組成は、マウス全脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．８μｌ、配列番号：２４および配列番号：２５の合成ＤＮＡプライマー各１．０μＭ、０．２　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＥｘＴａｑ（タカラ）０．１μｌおよび酵素に付属のＥｘＴａｑバッファーで、総反応量は２０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・１０秒、６５℃・３０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。次に、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅの蒸留水で１００倍希釈したＰＣＲ反応液２μｌ、配列番号：２４および配列番号：２６の合成ＤＮＡプライマー各１．０μＭ、０．２　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラ）０．１μｌおよび酵素に付属のＥｘＴａｑバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・１０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。増幅したＤＮＡを２．０％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約４４０塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。このＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　（プロメガ）のプロトコールに従ってｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙベクターへ、クローニングした。これを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０９　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（タカラ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。この形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｍｏｕｓｅ　ＴＧＲ２３（２）　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒと命名した。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：２７で表されるＤＮＡ配列を得た。
配列番号：２７で表されるＤＮＡの塩基配列には、配列番号：１２、配列番号：１３および配列番号：１４で表されるラット全脳から得られたラットＴＧＲ２３−２リガンドのアミノ酸配列に極めて類似したアミノ酸配列をコードするようなフレームが存在したことからマウスＴＧＲ２３−２リガンドの前駆体あるいはその一部をコードするｃＤＮＡであると推定された。
マウスＴＧＲ２３−２リガンドと考えられるアミノ酸配列をコードするようなフレームで配列番号：２７から翻訳されるアミノ酸配列の５’上流側には蛋白翻訳の開始コドンであると予想されるＡＴＧが２ヶ所存在するが、疎水性プロットを行なったところ、より５’上流側のＡＴＧから翻訳した場合にのみシグナル配列と推定される疎水性の高い領域が出現したのでこのＡＴＧが開始コドンであると推定した。このＡＴＧコドンのさらに５’上流側には同じフレームで終止コドンが出現した。３’側にはマウスＴＧＲ２３−２リガンドをコードすると考えられる配列の下流に終止コドンが存在した。以上により推定されたマウスＴＧＲ２３−２リガンド前駆体のアミノ酸配列を配列番号：２８に示す。この配列において、マウスＴＧＲ２３−２リガンドに相当すると考えられるアミノ酸配列のＮ末側には、通常生理活性ペプチドがその前駆体から切り出されるとされるＬｙｓ−Ａｒｇの配列（Ｓｅｉｄａｈ，　Ｎ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．、Ａｎｎ．　Ｎ．　Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．、８３９巻、９−２４頁、１９９８年）が存在した。一方、Ｃ末側には終止コドンが存在したが、配列番号：１２のラットＴＧＲ２３−２リガンドに対応する配列との間にさらに２残基が存在した。
これより、マウスＴＧＲ２３−２リガンドのアミノ酸配列は、ラット全脳抽出物より得られたラットＴＧＲ２３−２リガンドのアミノ酸配列；配列番号：１２〔ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）〕、配列番号：１３〔ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１５）〕および配列番号：１４〔ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１４）〕それぞれに対応する、配列番号：２９〔マウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）〕、配列番号：３０〔マウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−１５）〕および配列番号：３１〔マウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−１４）〕で表されるアミノ酸配列、およびさらに配列番号：２９のＣ末側に２残基延長された配列番号：３２で表されるアミノ酸配列〔マウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）〕であると推定された。
【０１００】
実施例１３
ラットＴＧＲ２３−２リガンド前駆体の一部をコードするｃＤＮＡのクローニング
ラットＴＧＲ２３−２リガンドの前駆体をコードするｃＤＮＡをクローニングするためラット全脳由来のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行なった。
以下の合成ＤＮＡプライマーを用い、ラット全脳由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による増幅を行なった。反応液の組成は、ラット全脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．８μｌ、配列番号：３３および配列番号：２５の合成ＤＮＡプライマー各１．０μＭ、０．２　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＥｘＴａｑ（タカラ）０．１μｌおよび酵素に付属のＥｘＴａｑバッファーで、総反応量は２０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・１０秒、６５℃・３０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。次に、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅの蒸留水で１００倍希釈したＰＣＲ反応液２μｌ、配列番号：３３のプライマー１．０μＭ、配列番号：２６の合成ＤＮＡプライマー０．２μＭ、０．２　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラ）０．１μｌおよび酵素に付属のＥｘＴａｑバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・１０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。増幅したＤＮＡを２．０％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約２００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。このＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　（プロメガ）のプロトコールに従ってｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙベクターへ、クローニングした。これを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０９　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（タカラ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：３４で表されるＤＮＡ配列を得た。
配列番号：３４で表されるＤＮＡの塩基配列には、配列番号：１２、配列番号：１３および配列番号：１４で表されるラット全脳から得られたラットＴＧＲ２３−２リガンドのアミノ酸配列をコードするフレームが存在した。このフレームを読み取り枠としてＤＮＡ配列を翻訳したところ、配列番号：３５で表されるアミノ酸配列が得られた。この配列を実施例１２で得られたマウスＴＧＲ２３−２リガンド前駆体のアミノ酸配列（配列番号：２７）と比較することにより、本配列がラットＴＧＲ２３−２リガンド前駆体の一部であるＣ末側の５４アミノ酸からなる配列に相当することが推定された。３’側にはラットＴＧＲ２３−２リガンドをコードする配列の下流に終止コドンが存在した。この配列において、ラットＴＧＲ２３−２リガンドのアミノ酸配列のＮ末側には、通常生理活性ペプチドがその前駆体から切り出されるとされるＬｙｓ−Ａｒｇの配列（Ｓｅｉｄａｈ，　Ｎ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．、Ａｎｎ．　Ｎ．　Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．、８３９巻、９−２４頁、１９９８年）が存在した。一方、Ｃ末側には終止コドンが存在したが、配列番号：１２のラットＴＧＲ２３−２リガンドの配列との間にさらに２残基が存在した。
これより、ラットＴＧＲ２３−２リガンドのアミノ酸配列は、ラット全脳抽出物より得られた配列番号：１２〔ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）〕、配列番号：１３〔ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１５）〕および配列番号：１４〔ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１４）〕で表されるアミノ酸配列、およびさらに配列番号：１２のＣ末側に２残基延長された配列番号：３６で表されるアミノ酸配列〔ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）〕であると推定された。
【０１０１】
実施例１４
ラットＴＧＲ２３−２リガンド前駆体をコードするｃＤＮＡのクローニング
ラットＴＧＲ２３−２リガンドの前駆体をコードするｃＤＮＡをクローニングするためラット全脳由来のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行なった。
以下の合成ＤＮＡプライマーを用い、ラット全脳由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法による増幅を行なった。反応液の組成は、ラット全脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．８μｌ、配列番号：５７および配列番号：５８の合成ＤＮＡプライマー各１．０μＭ、０．２　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＥｘＴａｑ（タカラ）０．１μｌおよび酵素に付属のＥｘＴａｑバッファーで、総反応量は２０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・１０秒、６５℃・３０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。次に、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅの蒸留水で５０倍希釈したＰＣＲ反応液２μｌ、配列番号：５９のプライマー１．０μＭ、配列番号：５８の合成ＤＮＡプライマー０．２μＭ、０．２　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラ）０．１μｌおよび酵素に付属のＥｘＴａｑバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・５分間の加熱の後、９４℃・１０秒、６５℃・３０秒、７２℃・３０秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温した。増幅したＤＮＡを２．０％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約３５０塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。このＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）のプロトコールに従ってｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙベクターへクローニングした。これを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０９　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（タカラ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。この形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｒａｔ　ＴＧＲ２３（２）　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒと命名した。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調整した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：６０で表されるＤＮＡ配列を得た。
配列番号：６０で表されるｃＤＮＡの塩基配列は、実施例１３で得たラットＴＧＲ２３−２リガンド前駆体の一部をコードするＤＮＡ配列（配列番号：３４）がさらに５’側に延長された配列であった。本配列を、配列番号：１２、配列番号：１３または配列番号：１４で表されるラット全脳から得られたラットＴＧＲ２３−２リガンドのアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列をコードするようなフレームを読み取り枠として翻訳したところ、５’上流側には、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド前駆体およびマウスＴＧＲ２３−２リガンド前駆体をコードすると推定されるｃＤＮＡ（配列番号：１８および配列番号：２７）に存在する蛋白翻訳の開始コドンであると予想されるＡＴＧに対応する位置に、ＡＴＧが１ヶ所存在した。また、このＡＴＧコドンのさらに５’上流側には同じフレームで終止コドンが出現した。３’側にはマウスＴＧＲ２３−２リガンドをコードすると考えられる配列の下流に終止コドンが存在した。これより、配列番号：６０で表される配列は、ラットＴＧＲ２３−２リガンド前駆体をコードするｃＤＮＡ配列であると推定された。配列番号：６０で表されるｃＤＮＡの塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列を配列番号：６１に示す。
【０１０２】
実施例１５
ＴＧＲ２３−１（以下、ヒトＴＧＲ２３−１を、単にＴＧＲ２３−１と称することもある）発現ＣＨＯ細胞の作成
参考例１で得られたプラスミドｐＴＢ２１７３を鋳型とし、Ｓａｌ　Ｉ認識配列を付加したプライマー１（配列番号：７）およびＳｐｅ　Ｉ認識配列を付加したプライマー２（配列番号：８）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記プラスミド１０　ｎｇを鋳型として使用し、Ｐｆｕ　Ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）２．５　Ｕ、プライマー１（配列番号：７）およびプライマー２（配列番号：８）を各１．０μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および反応液に２　Ｘ　ＧＣ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｉ（宝酒造）を２５μｌ加え、５０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・６０秒の後、９５℃・６０秒、５５℃・６０秒、７２℃・７０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・１０分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　ＰＣＲクローニングキット（インビトロジェン社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）へサブクローニングした。これをＥ．　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０（インビトロジェン社）に導入し、ｐＴＢ２１７３に含まれるＴＧＲ２３−１のｃＤＮＡを持つクローンを、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。ここで得られた、５’側および３’側にＳａｌ　ＩおよびＳｐｅ　Ｉがそれぞれ認識する配列を付加したＴＧＲ２３−１が導入されたプラスミドによって形質転換されたＥ．　ｃｏｌｉのクローンよりＰｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いてプラスミドを調製し、制限酵素Ｓａｌ　Ｉ　およびＳｐｅ　Ｉで切断してインサート部分を切り出した。インサートＤＮＡは電気泳動後、アガロースゲルより切り出し、次にＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて回収した。このインサートＤＮＡをＳａｌ　Ｉ　およびＳｐｅ　Ｉで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｈｉｎｕｍａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　Ｖｏｌ．　１２１９，ｐｐ．　２５１−２５９　（１９９４）記載のｐＡＫＫＯ１．１１Ｈと同一のベクタープラスミド）に加え、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いてライゲーションを行ない、蛋白発現用プラスミドｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１を構築した。このｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１で形質転換したＥ．　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０を培養後、Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（バイオラッド社）を用いてｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１のプラスミドＤＮＡを調製した。
ハムスターＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ｗｉｔｈ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．　Ｎｏ．　１２５７１）でファルコンディッシュ（径３．５　ｃｍ）に１　ｘ　１０５　個播種し、５％　ＣＯ２インキュベーターで３７℃一晩培養した。上記発現プラスミドｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１　ＤＮＡ　２μｇをＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ＲｅａｇｅｎｔＦｕＧＥＮＥ　６　（Ｒｏｃｈｅ社）を用い、添付説明書記載の方法に従ってトランスフェクトし、１８時間培養後、新鮮な増殖培地に交換した。さらに１０時間培養を続けたのち、トランスフェクトした細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ処理により集め、選択培地（１０％　透析牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ｗｉｔｈｏｕｔ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ、ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ．　Ｎｏ．　１２５６１））を用いて平底９６穴プレート１０枚に播種した。３−４日ごとに選択培地を交換しながら培養を続け、２−３週間後にコロニー状に増殖してきたＤＨＦＲ＋　細胞クローンを８１個取得した。
【０１０３】
実施例１６
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いたＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞株のＴＧＲ２３−１発現量の定量
実施例１５で得たＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞株８１クローンを、９６ウェルプレートに培養し、ＲＮｅａｓｙ　９６　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　　５０〜２００　ｎｇを　ＴａｑＭａｎ　Ｇｏｌｄ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ　（ＰＥバイオシステムズ社）を用いて、逆転写反応を行なった。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　　５〜２０　ｎｇ相当の逆転写産物、または後に述べるようにして作製した標準ｃＤＮＡ、１ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズ社）、配列番号：９で表されるプライマーおよび配列番号：１０で表されるプライマー各５００　ｎＭ、および配列番号：１１（Ｆａｍ−ａｃｃｔｇｇｔｔｔｇ　ｃｃｇａｇｔｇｇｔｃ　ｃｇｃｔａｔｔｔ−Ｔａｍｒａ；配列中、Ｆａｍは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、Ｔａｍｒａは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　をそれぞれ示す）で表されるＴａｑＭａｎプローブ　１００　ｎＭを含む反応混合液２５μｌについてＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５℃・１０分で処理後、９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。
標準ｃＤＮＡは、参考例１で得られたプラスミドｐＴＢ２１７４の２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を算出し、正確なコピー数を算出した後、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で希釈し、２コピーから２ｘ１０６コピーの標準ｃＤＮＡ溶液を調製した。また、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用プローブおよびプライマーはＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０）（ＰＥバイオシステムズ社）により設計した。
発現量はＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、標準ｃＤＮＡの初期濃度の対数値を横軸にとり、標準曲線を作成した。標準曲線より各逆転写産物の初期濃度を算出し、各クローンのｔｏｔａｌ　ＲＮＡ当たりのＴＧＲ２３−１遺伝子発現量を求めた。その結果、ＴＧＲ２３−１の発現が高かったＣＨＯ細胞株１１個を選択し２４ウェルプレートに培養した。これらの細胞について、ＴＧＲ２３−１の発現量を再検した。ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した後、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮａｓｅ処理をした。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、上記と同様に逆転写反応し、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法で各クローンのｔｏｔａｌ　ＲＮＡ当たりのＴＧＲ２３−１遺伝子発現量を求めた。その結果、ＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞株クローン４９および５２が高い発現量を示すことがわかった。
以後の実施例では、これら２つのクローンの発現細胞を用いた。
【０１０４】
実施例１７
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号：２３）の製造市販のＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＣＨ２−ＰＡＭ樹脂を、ペプチド合成機ＡＣＴ９０の反応槽に入れ、ＤＣＭで膨潤後ＴＦＡでＢｏｃを除去し、ＤＩＥＡで中和した。この樹脂をＮＭＰに懸濁し、ＨＯＢｔ−ＤＩＰＣＩでＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）を縮合した。反応後ニンヒドリンテストで遊離のアミノ基の有無を調べ、ニンヒドリンテストがプラスの時には同じアミノ酸を再度縮合した。再縮合後においてもニンヒドリンテストがプラスの時には無水酢酸でアセチル化した。このサイクルを繰り返しＢｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＬ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）を配列順に縮合し、所望の保護ペプチド樹脂０．２４ｇを得た。この樹脂をｐ−クレゾール１．５　ｍｌとともにフッ化水素約１５　ｍｌ中、０℃で６０分攪拌した後フッ化水素を減圧留去し、残留物にジエチルエーテルを加えて濾過した。濾過物に水と酢酸を加えペプチドを抽出し、樹脂と分離した。抽出液を濃縮し５０％酢酸で充填したセファデックス（商標）Ｇ−２５カラム（２．０　ｘ　８０　ｃｍ）に付し、同溶媒で展開、主要画分を集め凍結乾燥した。その一部（４５　ｍｇ）をＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ（商標）ＲＰ−１８を充填した逆相クロマトカラム（２．６　ｘ　６０ｃｍ）に付け、０．１％　ＴＦＡ水　２００ｍｌで洗浄、０．１％　ＴＦＡ　水　３００ｍｌと０．１％　ＴＦＡ含有　２５％アセトニトリル水　３００ｍｌを用いた線型勾配溶出を行い、主要画分を集め凍結乾燥し目的とするペプチド１２．７　ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：分子量ＭＷ　２１８８．０（理論値　２１８７．５）
ＨＰＬＣ溶出時間　１０．６分
カラム条件：
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ　５Ｃ１８Ｔ　　４．６　ｘ　１００ｍｍ
溶離液：Ａ液−０．１％　ＴＦＡ水、Ｂ液−０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い　Ａ／Ｂ　：　９５／５〜４５／５５へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：１．０　ｍｌ　／　分
【０１０５】
実施例１８
ＦＬＩＰＲを用いたヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定
実施例１７で得られたヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を種々の濃度で、実施例５に記載した方法に従って、ＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に投与し、細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性をＦＬＩＰＲを用いて測定したところ、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は、濃度依存的にＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇を促進した。結果を図８および図９に示す。
これより、配列番号：２３で表されるアミノ配列を有するポリペプチド〔ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）〕が、ＴＧＲ２３−１およびＴＧＲ２３−２に対する細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を有することが明らかである。
【０１０６】
実施例１９
ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号：１２）の製造市販の２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ、１．３３　ｍｍｏｌ／ｇ）　にＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを導入したＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｏ−Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ　（０．６３８　ｍｍｏｌ／ｇ）　０．２５　ｍｍｏｌ分をペプチド合成機ＡＢＩ４３３Ａの反応槽に入れ、Ｆｍｏｃ／ＤＣＣ／ＨＯＢｔ法を用い、固相合成を行なった。Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護基はＡｒｇにはＰｂｆ基、ＳｅｒにはＢｕｔ基、ＬｙｓにはＢｏｃ基、ＡｓｎにはＴｒｔ基を用いた。他のアミノ酸は側鎖無保護のものを用い、上記に示す配列の１７位ＡｒｇからＮ末端方向へ順に１４位Ｓｅｒまでペプチド鎖を導入した。得られたＦｍｏｃ−ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１４−１８）−Ｏ−Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ　（０．２５　ｍｍｏｌ）をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ　（ＮＯＶＡ社製，　製品番号０５−２０−１１１６）　３８１．１　ｍｇ　（０．６２５　ｍｍｏｌ）、ＰｙＡＯＰ　３２６．１　ｍｇ　（０．６２５　ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ　８５．１　ｍｇ　（０．６２５　ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ　４３５．５　ｍｌ　（２．５　ｍｍｏｌ）で処理することで１２位Ｌｙｓ、１３位Ｔｈｒを導入した。続いて得られたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）１３］−ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１２−１８）−Ｏ−Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ　を用いてペプチド合成機による固相合成を再開、１１位ＬｙｓからＮ末端方向へ順に１位Ｓｅｒまでペプチド鎖を導入し、目的の保護ペプチド樹脂５７３．５　ｍｇを得た。
この樹脂の全て（０．２５　ｍｍｏｌ）をＴＦＡ、ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ、ｍ−ｃｒｅｓｏｌ、水、ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ、ｅｔｈａｎｄｉｔｈｉｏｌ　（８０：５：５：５：２．５：２．５）の混合液９　ｍｌ中で室温、９０分間攪拌した後、反応溶液にエーテルを加え、白色粉末を析出させ遠心分離後、上清を除く操作を３回繰り返した。残渣を水で抽出後、凍結乾燥し白色粉末を２１９．４　ｍｇ得た。得られた粗ペプチドをＹＭＣ　Ｐａｃｋ　Ｒ＆Ｄ−ＯＤＳ−５−Ｂ　Ｓ−５，　１２０Ａカラム　（３０　ｘ　２５０　ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣで、Ａ液：　０．１％　ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％　ＴＦＡ含有アセトニトリルによるＡ／Ｂ：　９０／１０〜７０／３０への直線型濃度勾配溶出（６０分）を行ない、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末を得た。
得られた粉末を全て水に溶解、混合したあと、溶液にＢＩＯ−ＲＡＤ社製イオン交換樹脂ＡＧ１　ｘ　８　１００−２００　ｍｅｓｈ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｆｏｒｍを酢酸塩化した樹脂を３　ｍｌ分加え、２０分撹拌後濾過により樹脂と不純物を除いた後、凍結乾燥して酢酸塩として白色粉末１０７．０　ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｍ＋　１９５４．２　（理論値　１９５４．２）
ＨＰＬＣ溶出時間：１５．２分
溶出条件
カラム：ＹＭＣ　ＡＭ　３０１　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液：Ａ液：　０．１％　ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％　ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：　１００／０〜５０／５０へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：１．０　ｍｌ／分
【０１０７】
実施例２０
マウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ（配列番号：３２）の製造市販　２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ、１．１２　ｍｍｏｌ／ｇ）　にＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ　を導入したＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｏ−Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ　（０．４０８　ｍｍｏｌ／ｇ）　０．２５　ｍｍｏｌ分を用い、実施例１９に記載したラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）の製造と同様に固相合成を行ない、目的の保護ペプチド樹脂３２４．７　ｍｇを得た。
この樹脂１００　ｍｇを実施例１９と同様に処理し、白色粉末を５０．０　ｍｇ得た。得られた粗ペプチドをＹＭＣ　ＳＨ−３４３−５　Ｓ−５、１２０Ａカラム　（２０　ｘ　２５０　ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣで、Ａ液：　０．１％　ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％　ＴＦＡ含有アセトニトリルによるＡ／Ｂ：　９２／８〜７２／２８への直線型濃度勾配溶出（６０分）を行ない、目的物を含む分画を集めて凍結乾燥し、白色粉末２２．６　ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｍ＋　２１８２．８　（理論値　２１８２．５）
ＨＰＬＣ溶出時間：１４．１分
溶出条件
カラム：ＹＭＣ　ＡＭ　３０１　（４．６　ｘ　１００　ｍｍ）
溶離液：Ａ液：　０．１％　ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％　ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：　１００／０〜５０／５０へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：１．０　ｍｌ／分
【０１０８】
実施例２１
ＦＬＩＰＲを用いたラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）およびマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定
実施例１９に記載した方法で製造したラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）および実施例２０に記載した方法で製造したマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を種々の濃度で実施例５に記載した方法でＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に投与し、細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性をＦＬＩＰＲを用いて測定した。結果を図１０および図１１に示した。明らかにラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）およびマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は濃度依存的にＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇を促進し、配列番号：１２および配列番号：３２の構造を有するペプチドがＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２体発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示すことが明らかとなった。
【０１０９】
実施例２２
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）およびラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）によるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性の測定実施例１７に記載した方法で製造したヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を種々の濃度で実施例３に記載した方法でＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に投与し、細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性を測定した。結果を図１２に示す。
明らかにヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は濃度依存的にＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内ｃＡＭＰ産生を促進した。
また、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）および実施例１９に記載した方法で製造したラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）を種々の濃度でＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に投与し、上記と同様の測定をフォルスコリン無添加の条件下で実施した。ただし、産生促進活性は以下に示した式で計算し、％　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌで表した。
％　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　＝　Ｘ／Ｃ　ｘ　１００
Ｘ：試料添加群のｃＡＭＰ量
Ｃ：対照（試料無添加、フォルスコリン刺激なし）の２　ｗｅｌｌのｃＡＭＰ量の平均値結果を、図１３および図１４に示した。明らかに、フォルスコリン無添加の条件下において、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）およびラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）は濃度依存的にＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内ｃＡＭＰ産生を促進した。
【０１１０】
実施例２３
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）およびラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）によるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞のアラキドン酸代謝産物遊離促進活性の測定
実施例１７に記載した方法で製造したヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）および実施例１９に記載した方法で製造したラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）を種々の濃度で実施例４に記載した方法でＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に投与し、アラキドン酸代謝産物遊離促進活性を測定した。結果を図１５および図１６に示す。
明らかにヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）およびラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）は濃度依存的にＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞のアラキドン酸代謝産物遊離を促進した。
【０１１１】
実施例２４
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）、ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）およびマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性の測定
ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分に対する　［３５Ｓ］−Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅの結合促進活性を以下の方法により測定した。最初に膜画分の調整法を記載する。８　ｘ　１０７個のＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に２０　ｍｌのホモジネートバッファー（１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ　７．３）、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５２　ｍＭ　ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、８μｇ／ｍｌ　Ｅ６４、２０μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）添加し、ポリトロン（１２，０００　ｒｐｍ、３０秒　ｘ　３回）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心（１，０００　ｇ、１５分間）して上清を得た。次にこの上清を超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｔｙｐｅ　３０ローター、３０，０００　ｒｐｍ、１時間）し、得られた沈殿物をＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分とした。
ＧＴＰγＳ結合活性の測定は以下の通りである。ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分を膜希釈緩衝液（５０　ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ　７．４）、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０３％　ＮａＮ３、０．１％　ＢＳＡ、１μＭ　ＧＤＰ）で希釈して、タンパク質濃度３０　ｍｇ／ｍｌのアッセイ用細胞膜画分溶液をつくる。アッセイ用膜画分溶液２００μｌに、５０　ｎＭの濃度の［３５Ｓ］−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＥＮ社）を２μｌと試料を添加し、この混合液を２５℃で一時間保温した。混合液をフィルター濾過し、さらにフィルターを洗浄用バッファー（５０　ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ　７．４）、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０３％　ＮａＮ３、０．１％　ＢＳＡ）１．５ｍｌで２回洗浄した後、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
実施例１７に記載した方法で製造したヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）、実施例１９に記載した方法で製造したラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）および実施例２０に記載した方法で製造したマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を種々の濃度で上に記載した方法でＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞より調製した膜画分に投与し、ＧＴＰγＳ結合活性を測定した。結果を図１７に示した。明らかにヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）、ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）およびマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は濃度依存的にＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞より調製した膜画分のＧＴＰγＳ結合活性を促進した。
【０１１２】
実施例２５
［Ｎｌｅ１０，　Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）：Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｎｌｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号：６２）の製造
市販のＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＣＨ２−ＰＡＭ樹脂をペプチド合成機ＡＣＴ９０の反応槽に入れてＤＣＭで膨潤した後、ＴＦＡでＢｏｃを除去し、ＤＩＥＡで中和した。この樹脂をＮＭＰに懸濁し、ＨＯＢｔ−ＤＩＰＣＩでＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）を縮合した。反応後ニンヒドリンテストで遊離のアミノ基の有無を調べ、ニンヒドリンテストがプラスの時には同じアミノ酸を再度縮合した。再縮合後においてもニンヒドリンテストがプラスの時には無水酢酸でアセチル化した。このサイクルを繰り返し、Ｂｏｃ−Ａｌａ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｂｏｃ−Ｎｌｅ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）を配列順に縮合して所望の保護ペプチド樹脂０．１４　ｇを得た。この樹脂をｐ−クレゾール２．０　ｍｌとともにフッ化水素約１５　ｍｌ中、０℃で６０分攪拌した後、フッ化水素を減圧留去し、残留物にジエチルエーテルを加えて濾過した。濾過物に水と酢酸を加えペプチドを抽出し、樹脂と分離した。抽出液を濃縮し、５０％酢酸で充填したセファデックス（登録商標）Ｇ−２５カラム（２．０　ｘ　８０　ｃｍ）に付して同溶媒で展開し、主要画分を集めて凍結乾燥した。その一部（１０．３　ｍｇ）をＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ（登録商標）ＲＰ−１８を充填した逆相クロマトカラム（２．６　ｘ　６０　ｃｍ）に付けて０．１％　ＴＦＡ水２００　ｍｌで洗浄し、０．１％　ＴＦＡ水３００　ｍｌと０．１％　ＴＦＡ含有２５％アセトニトリル水３００　ｍｌを用いた線型勾配溶出を行ない、主要画分を集め凍結乾燥し目的とするペプチド３．９６　ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｍ＋　２１８６．１　（理論値　２１８５．５）
ＨＰＬＣ溶出時間：１０．４分
カラム条件
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８ＨＧ　（４．６　ｘ　１００　ｍｍ）
溶離液：Ａ液：　０．１％　ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％　ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：　９５／５〜５５／４５へ直線型濃度勾配溶出（２５分）
流速：１．０　ｍｌ／分
【０１１３】
実施例２６
ラクトパーオキシダーゼ法を用いた［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の作製
ＤＭＳＯ　１０μｌに溶かした［Ｎｌｅ１０，　Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）（配列番号：６２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）１　ｎｍｏｌを０．１　Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ　７）に溶かした０．０００３％過酸化水素水１０μｌ、０．１　Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ　７）に溶かしたラクトパーオキシダーゼ　（シグマ社）　１０μｇ／ｍｌを１０μｌおよび［１２５Ｉ］ＮａＩ　３７　ＭＢｑ（パーキンエルマーライフサイエンス社）１０μｌと混合して室温で１５分間反応させた後、生成した［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を以下の条件のＨＰＬＣにより分取した。
用いたカラムは、ＯＤＳ−８０ＴＭ　（４．６　ｍｍ　ｘ　１５　ｃｍ）（トーソー社）、溶出液Ａとして１０％アセトニトリル／０．１％　ＴＦＡ、溶出液Ｂとして６０％アセトニトリル／０．１％　ＴＦＡを用い、５−５　（２　ｍｉｎ）、５−２９　（４０　ｍｉｎ）　％Ｂ／Ａ＋Ｂのグラディエント溶出法を行なった。流速は１　ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃、検出は２２０ｎｍとした。このＨＰＬＣ条件では、［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は２４分付近に溶出した。
【０１１４】
実施例２７
［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を用いたレセプター結合実験
実施例２６に記載した方法によって作製した［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）および実施例２４に記載した方法によってＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞から調製したＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の代わりにＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞を用いることにより実施例２４に記載した方法と同様の方法によって調製したＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いてレセプター結合実験を行なった。
ＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分をアッセイ用バッファー（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％　ＢＳＡ、０．５　ｍＭ　ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、４μｇ／ｍｌ　Ｅ−６４、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、ｐＨ　７．４）で各種濃度に希釈後、ポリプロピレン製試験管（Ｆａｌｃｏｎ　２０５３）に２００μｌずつ分注した。最大結合量を測定するために２μｌのＤＭＳＯと１０　ｎＭの［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）２μｌを膜画分溶液に添加した。また、非特異的結合を測定するために１μＭ　［Ｎｌｅ１０，　Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のＤＭＳＯ溶液２μｌと１０ｎＭの［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）２μｌを膜画分溶液に添加した。２５　℃で９０分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（ＧＦ−Ｆ）を用いて反応液を吸引ろ過した。ろ過後、γ−カウンターを用いて濾紙上に残った放射活性を測定し、最大結合量から非特異的結合量を引いて特異的結合量を見積もった。膜画分の濃度を変化させると膜画分の濃度に依存した［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の特異的な結合が認められた。被験試料のＴＧＲ２３−１レセプターあるいはＴＧＲ２３−２レセプターに対する結合阻害活性（阻害率（％））は、最大結合量（ＴＢ）から被検試料および［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を加えたときに濾紙上に残った放射活性（Ｘ）を減じた値の特異的結合量（ＳＢ）に対する比率（（ＴＢ−Ｘ）／ＳＢ　ｘ　１００　（％））で示される。
ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞から調製した膜画分について膜画分濃度を１μｇ／ｍｌに設定して阻害率からヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）、ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）およびマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出したところ、ＩＣ５０値はそれぞれ１０５　ｐＭ（ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０））、９２．８　ｐＭ（ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８））および２４．５　ｐＭ（マウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０））であった。
種々の濃度におけるヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）、ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）およびマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の結合阻害活性を、図１８に示す。
【０１１５】
実施例２８
ヒト結腸癌細胞ＣＯＬＯ　２０５由来のＴＧＲ２３遺伝子のクローニング
ＡＴＣＣより入手したＣＯＬＯ　２０５細胞を７５　ｃｍ２フラスコに培養し、増殖した細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡ画分を調製した。ＣＯＬＯ　２０５細胞のｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　０．５μｇを鋳型に、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　−α−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、添付のマニュアルにしたがってランダムプライマーを用いて逆転写を行ない、ｃＤＮＡを作製した。作製したＣＯＬＯ　２０５細胞のｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列番号：５）およびプライマー２（配列番号：６）を用いてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応の液量は５０μｌとし、組成は、鋳型としてｃＤＮＡ調製液を１２．５　ｎｇ　ｍＲＮＡ相当分、プライマー各０．２μＭ、ｄＮＴＰ　０．２ｍ　Ｍ、ＧＣ−Ｍｅｌｔ　０．５Ｍ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｍｉｘ（クロンテック社）１／５０　ｖｏｌｕｍｅおよび５倍濃縮Ｂｕｆｆｅｒ　１／５　ｖｏｌｕｍｅとした。反応は、９６℃で２分保温した後、９６℃・３０秒、５４℃・３０秒、７２℃・１分のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃で１０分保温して行なった。得られた反応液を用い、ＴＯＰＯ　ＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１へ導入した。生じた形質転換体からＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｕｌｔｒａ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。塩基配列決定のための反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（パーキンエルマー社）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。
その結果、配列番号：６４で表される塩基配列および配列番号：６６で表される塩基配列がそれぞれ得られた。
配列番号：６４および配列番号：６６の塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＧＡに至る翻訳枠が存在した。この翻訳枠から翻訳される蛋白のアミノ酸配列を配列番号：６３および配列番号：６５にそれぞれ示す。配列番号：６３および配列番号：６５で表されるアミノ酸配列を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をＴＧＲ２３−１ＡおよびＴＧＲ２３−１Ｂとそれぞれ命名した。
配列番号：６４で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列の（ＴＧＲ２３−１）の第７２３番目のＣがＧに置換されている。
配列番号：６６で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列（ＴＧＲ２３−１）の第３２０番目のＡがＴに、第７２３番目のＣがＧにそれぞれ置換されている。
配列番号：６３で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列（ＴＧＲ２３−１）の第２４１番目のＳｅｒがＡｒｇに置換されている。
配列番号：６５で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列（ＴＧＲ２３−１）の第１０７番目のＡｓｎがＩｌｅに、第２４１番目のＳｅｒがＡｒｇにそれぞれ置換されている。
【０１１６】
実施例２９
マウス脳由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
マウスＭａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：８１）およびプライマー２（配列番号：８２）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ２．５μｌを鋳型として使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μｌ、プライマー１（配列番号：８１）およびプライマー２（配列番号：８２）を各０．２μＭ、ｄＮＴＰｓを８００μＭ加え、５０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・３０秒、７２℃・４分のサイクルを３回、９５℃・３０秒、７０℃・４分のサイクルを３回、９５℃・３０秒、６８℃・４分のサイクルを３０回繰り返し、最後に６８℃・４分の伸長反応を行った。次にアガロースゲル電気泳動を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　ＳＰＩＮ　Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社）を用いて該ＰＣＲ反応産物を精製した。これを　ＴＯＰＯ　ＴＡ　クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＤＨ５αに導入し、ｃＤＮＡを持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：７６）を得た（ＷＯ　０２／３１１４５に記載の配列番号：１５）。このＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：７５）を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をマウスＴＧＲ２３−Ｂと命名した（ＷＯ　０２／３１１４５に記載の配列番号：１４）。
マウスＴＧＲ２３−Ｂは、参考例３に記載のマウスＴＧＲ２３−Ａと比較すると、マウスＴＧＲ２３−Ａの２８０番目のＧのあとに５４塩基が挿入されている形になり、アミノ酸としても１８残基が挿入されることになる。
また、同時にマウスＴＧＲ２３−Ｂの変異型レセプターをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：８４）も得られた。この配列では、マウスＴＧＲ２３−ＢのＤＮＡ配列の４７８番目のＧの直後にＣＡＧの３塩基が挿入されており、アミノ酸配列の１６０番目のＧｌｕの直前にＡｌａが挿入されていた。この配列（配列番号：８４）がコードする、１６０番目のＧｌｕの直前にＡｌａが挿入されたアミノ酸配列（配列番号：８３）を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をマウスＴＧＲ２３−Ｃと命名した。
配列番号：７６で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を有するプラスミドをｐＣＲ２．１−ｍＴＧＲ２３−Ｂと名付け、プラスミドｐＣＲ２．１−ｍＴＧＲ２３−Ｂが導入された形質転換体を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＴＧＲ２３−Ｂと命名した。
【０１１７】
実施例３０
ラット脳由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ラットＭａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：７９）およびプライマー２（配列番号：８０）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ２．５μｌを鋳型として使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μｌ、プライマー１（配列番号：７９）およびプライマー２（配列番号：８０）を各０．２μＭ、ｄＮＴＰｓを８００μＭ、および酵素にＤＭＳＯを２μｌ加え、５０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・３０秒、７２℃・４分のサイクルを５回、９５℃・３０秒、７０℃・４分のサイクルを５回、９５℃・３０秒、６８℃・４分のサイクルを３０回繰り返し、最後に６８℃・３分の伸長反応を行った。次にアガロースゲル電気泳動を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　ＳＰＩＮ　Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社）を用いて該ＰＣＲ反応産物を精製した。これを　ＴＯＰＯ　ＴＡ　クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＤＨ５αに導入し、ｃＤＮＡを持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、参考例４に記載のラットＴＧＲ２３−１（配列番号：７７）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：７８）のほかに、５種のラットＴＧＲ２３変異型レセプターをコードするｃＤＮＡ配列を得た。すなわち、それらは、ラットＴＧＲ２３−１と比較して、塩基配列の１０３１番目のＡがＧに置換したもの（配列番号：８６）、塩基配列の７７２番目のＴがＣに置換したもの（配列番号：８８）、塩基配列の６５３番目のＴがＣに置換したもの（配列番号：９０）、塩基配列の４７８番目のＧの直後にＣＡＧの３塩基が挿入されたもの（配列番号：９２）および塩基配列の４７８番目のＧの直後にＣＡＧの３塩基が挿入され、かつ、塩基配列の１０３１番目のＡがＧに置換したもの（配列番号：９４）であった。
これらのＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を、それぞれ、ラットＴＧＲ２３−２（配列番号：８５）、ラットＴＧＲ２３−３（配列番号：８７）、ラットＴＧＲ２３−４（配列番号：８９）、ラットＴＧＲ２３−５（配列番号：９１）、ラットＴＧＲ２３−６（配列番号：９３）と命名した。
それぞれの変異体のアミノ酸配列はラットＴＧＲ２３−１と比較して、ラットＴＧＲ２３−２ではアミノ酸配列の３４４番目のＧｌｎがＡｒｇに置換され、ラットＴＧＲ２３−３ではアミノ酸配列の２５８番目のＣｙｓがＡｒｇに置換され、ラットＴＧＲ２３−４ではアミノ酸配列の２１８番目のＶａｌがＡｌａに置換され、ラットＴＧＲ２３−５ではアミノ酸配列の１６０番目のＧｌｕの直前にＡｌａが挿入され、ラットＴＧＲ２３−６ではアミノ酸配列の１６０番目のＧｌｕの直前にＡｌａが挿入されてさらにアミノ酸配列の３４４番目のＧｌｎがＡｒｇに置換されている。
配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２および配列番号：９４でそれぞれ表される塩基配列を有するＤＮＡ断片を有するプラスミドを、それぞれｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−２、ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−３、ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−４、ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−５およびｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−６と名付け、それらのプラスミドが導入された形質転換体大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を、それぞれ、大腸菌ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−２、大腸菌ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−３、大腸菌ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−４、大腸菌ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−５、および大腸菌ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−６と命名した。
【０１１８】
実施例３１
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いたヒト結腸癌細胞株およびヒト胃癌細胞株のヒトＴＧＲ２３遺伝子発現量の定量
ヒト結腸癌細胞株ＤＬＤ−１、ＨＣＴ　１１６、ＣＯＬＯ　３２０ＤＭ、ＣＯＬＯ　２０１、ＣＯＬＯ　２０５、ＬｏＶｏ、ＳＷ　４０３、ＳＷ　４８、ＳＷ　９４８、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ−２９、ＳＫ−ＣＯ−１、Ｔ８４、ＳＮＵ−Ｃ１はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手した。ヒト結腸癌細胞株ＣＯＬＯ　３２０ＨＳＲ、ＨＣＴ−１５、ＬＳ　１７４Ｔ、ＬＳ　１８０、ＳＷ　４８０、ＳＷ　１１１６、ＳＷ　１４１７、ＷｉＤｒおよびヒト胃癌細胞株ＡＧＳ、ＫＡＴＯＩＩＩは大日本製薬社より入手した。各々の細胞を７５　ｃｍ２フラスコに培養し、増殖した細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡ画分を調製した。各々の細胞のｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　０．５μｇを鋳型に、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　−α−　（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、添付のマニュアルにしたがってランダムプライマーを用いて逆転写を行ない、ｃＤＮＡを作製した。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　　２５　ｎｇ相当の逆転写産物、または後に述べるようにして作製した標準ｃＤＮＡ、１ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズ社）、配列番号：９で表されるプライマーおよび配列番号：１０で表されるプライマー各５００　ｎＭ、および配列番号：１１（Ｆａｍ−ａｃｃｔｇｇｔｔｔｇｃｃｇａｇｔｇｇｔｃ　ｃｇｃｔａｔｔｔ−Ｔａｍｒａ；配列中、Ｆａｍは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、Ｔａｍｒａは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　をそれぞれ示す）で表されるＴａｑＭａｎプローブ　１００　ｎＭを含む反応混合液２５μｌについてＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５℃・１０分で処理後、９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。
標準ｃＤＮＡは、参考例１で得られたプラスミドｐＴＢ２１７４の２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を算出し、正確なコピー数を算出した後、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で希釈し、１コピーから１ｘ１０６コピーの標準ｃＤＮＡ溶液を調製した。また、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用プローブおよびプライマーはＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０）（ＰＥバイオシステムズ社）により設計した。
発現量はＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、標準ｃＤＮＡの初期濃度の対数値を横軸にとり、標準曲線を作成した。標準曲線より各逆転写産物の初期濃度を算出し、各クローンのｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　２５　ｎｇ当たりのヒトＴＧＲ２３遺伝子発現量を求めた。さらに各々のサンプルのＧＡＰＤＨ発現量をＧＡＰＤＨ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥバイオシステムズ社）を用いて同様のＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法により求め、ヒトＴＧＲ２３遺伝子発現量の補正を行なった。
その結果、ＧＡＰＤＨに対するヒトＴＧＲ２３の発現量は、ＤＬＤ−１では０．００００２２％，　ＨＣＴ　１１６では０．００１３％，　ＣＯＬＯ　３２０ＤＭでは０．００１７％，　ＣＯＬＯ　２０１では１．０％，　ＣＯＬＯ　２０５では３．７％，　ＬｏＶｏでは０．０３１％，　ＳＷ　４０３では０．９５％，　ＳＷ　４８では０．０００３１％，　ＳＷ　９４８では０．０００１％，　Ｃａｃｏ−２では０．０００１％，　ＨＴ−２９では０．０３４％，　ＳＫ−ＣＯ−１では０．５１％，　Ｔ８４では０．００２７％、ＳＮＵ−Ｃ１では０．２６％、ＣＯＬＯ　３２０ＨＳＲでは０．０００１％，　ＨＣＴ−１５では０．０００１％，　ＬＳ　１７４Ｔでは１．０％，　ＬＳ　１８０では０．８５％，　ＳＷ　４８０では０．０００１％，　ＳＷ　１１１６では０．００１８％，　ＳＷ　１４１７では０．００５５％，　ＷｉＤｒでは０．０００８２％、ＡＧＳでは０．０００２％，　ＫＡＴＯＩＩＩでは１．２％であった。これによりヒトＴＧＲ２３は、結腸癌細胞であるＣＯＬＯ　２０１、ＣＯＬＯ　２０５、ＬｏＶｏ、ＳＷ　４０３、ＨＴ−２９、ＳＫ−ＣＯ−１、ＳＮＵ−Ｃ１、ＬＳ　１７４Ｔ、ＬＳ　１８０および胃癌細胞であるＫＡＴＯＩＩＩにおいて特に発現が亢進していることがわかった。
ヒトＴＧＲ２３の癌細胞株における発現量のグラフを〔図２０〕に示す。
なお、ヒト結腸癌由来癌細胞株ＣＯＬＯ２０５は参考例２においてもそのＴＧＲ２３の発現量を測定し、高い発現を示すことを認めている。β−アクチンに対する発現量は２．１％であった。
【０１１９】
実施例３２
ヒト結腸癌細胞ＬＳ　１７４Ｔ，　ＬＳ　１８０，　ＳＷ　４０３、およびヒト胃癌細胞ＫＡＴＯＩＩＩ由来のヒトＴＧＲ２３遺伝子のクローニング
大日本製薬社より入手したＬＳ　１７４Ｔ細胞を７５　ｃｍ２フラスコに培養し、増殖した細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡ画分を調製した。ＬＳ　１７４Ｔ細胞のｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　０．５μｇを鋳型に、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　−α−　（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、添付のマニュアルにしたがってランダムプライマーを用いて逆転写を行ない、ｃＤＮＡを作製した。作製したＬＳ　１７４Ｔ細胞のｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列番号：５）およびプライマー２（配列番号：６）を用いてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応の液量は５０μｌとし、組成は、鋳型としてｃＤＮＡ調製液を１２．５　ｎｇ　ｍＲＮＡ相当分、プライマー各０．２μＭ、ｄＮＴＰ　０．２ｍ　Ｍ、ＧＣ−Ｍｅｌｔ　０．５Ｍ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｍｉｘ（クロンテック社）１／５０　ｖｏｌｕｍｅおよび５倍濃縮Ｂｕｆｆｅｒ　１／５　ｖｏｌｕｍｅとした。反応は、９６℃で２分保温した後、９６℃・３０秒、５４℃・３０秒、７２℃・１分のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃で１０分保温して行なった。得られたＰＣＲ反応液を電気泳動後、目的のバンドをＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。得られた反応液をＴＯＰＯ　ＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１へ導入した。生じた形質転換体からＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｕｌｔｒａ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。塩基配列決定のための反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（パーキンエルマー社）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。
その結果、配列番号：２で表される塩基配列および配列番号：９６で表される塩基配列がそれぞれ得られた。配列番号：９６で表される塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＧＡに至る翻訳枠が存在した。この翻訳枠から翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：９５に示す。
配列番号：９６で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列（ＴＧＲ２３−１）の第３２０番目のＡがＴに置換されている。
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列（ＴＧＲ２３−１）の第１０７番目のＡｓｎがＩｌｅに置換されている。
配列番号：９５で表されるアミノ酸配列を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃと命名した。
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手したＳＷ　４０３細胞についても同様にしてヒトＴＧＲ２３遺伝子のクローニングを行ない、配列を解読したところ、配列番号：２で表される塩基配列が得られた。
大日本製薬社より入手したＬＳ　１８０細胞とＫＡＴＯＩＩＩ細胞についても同様にしてヒトＴＧＲ２３遺伝子のクローニングを行ない、配列を解読したところ、ＬＳ　１８０細胞からは配列番号：９８で表される塩基配列が、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞からは配列番号：９９で表される塩基配列がそれぞれ得られた。なおＰＣＲ反応の組成は、鋳型としてｃＤＮＡ調製液を１２．５　ｎｇ　ｍＲＮＡ相当分、プライマー各０．２μＭ、ｄＮＴＰ　０．２ｍ　Ｍ、ＭｇＣｌ２　２ｍＭ、Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）１．２５ｕｎｉｔｓおよび１０倍濃縮Ｂｕｆｆｅｒ　１／１０　ｖｏｌｕｍｅとした。
配列番号：９８で表される塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＧＡに至る翻訳枠が存在し、この翻訳枠から翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：９７に示す。
配列番号：９９で表される塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＧＡに至る翻訳枠が存在し、この翻訳枠から翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：９５に示す。
配列番号：９８で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列（ＴＧＲ２３−１）の第１０３１番目のＡがＧに、第１０７１番目のＴがＣにそれぞれ置換されている。
配列番号：９９で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列（ＴＧＲ２３−１）の第３２０番目のＡがＴに、第６４８番目のＣがＴにそれぞれ置換されている。
配列番号：９７で表されるアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列（ＴＧＲ２３−１）の第３４４番目のＧｌｎがＡｒｇに置換されている。
配列番号：９７で表されるアミノ酸配列を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質を、ヒトＴＧＲ２３−１Ｄと命名した。
【０１２０】
実施例３３
ヒト視床下部のＴＧＲ２３遺伝子のクローニング
ヒト視床下部Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型とし、プライマー１（配列番号：５）およびプライマー２（配列番号：６）を用いてＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応の液量は５０μｌとし、組成は、ｃＤＮＡ溶液を　１／１０　ｖｏｌｕｍｅ、プライマー各０．２μＭ、ｄＮＴＰ　０．２ｍ　Ｍ、ＭｇＣｌ２　２ｍＭ、Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）１．２５ｕｎｉｔｓおよび１０倍濃縮Ｂｕｆｆｅｒ　１／１０　ｖｏｌｕｍｅとした。反応は、９６℃で２分保温した後、９６℃・３０秒、５４℃・３０秒、７２℃・１分のサイクルを３５回繰り返した後、７２℃で１０分保温して行なった。得られたＰＣＲ反応液を電気泳動後、目的のバンドをＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。得られた反応液をＴＯＰＯＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへサブクローニングし、大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１へ導入した。生じた形質転換体からＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｕｌｔｒａ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。塩基配列決定のための反応は、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（パーキンエルマー社）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。
その結果、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：９８、配列番号：１００および配列番号：１０１で表される５種類の塩基配列がそれぞれ得られた。
配列番号：１００で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列の第３２０番目のＡがＴに、第３９６番目のＣがＧにそれぞれ置換されている。
配列番号：１０１で表される塩基配列は、配列番号：２で表される塩基配列の第３２０番目のＡがＴに、第１０３１番目のＡがＧに、第１０７１番目のＴがＣにそれぞれ置換されている。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：９８、配列番号：１００および配列番号：１０１の塩基配列には、開始コドンであるＡＴＧから終止コドンであるＴＧＡに至る翻訳枠が存在した。この翻訳枠から翻訳されるタンパク質は、それぞれ、この順にヒトＴＧＲ２３−１（配列番号：１）、ヒトＴＧＲ２３−２（配列番号：３）、ヒトＴＧＲ２３−１Ｄ（配列番号：９７）、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ（配列番号：９５）およびヒトＴＧＲ２３−２（配列番号：３）である。
【０１２１】
実施例３４
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のラット側脳室内投与による摂餌量に及ぼす影響を検討した。
ラットは、照明時間を８時から２０時、室温２５℃において飼育した。８週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（手術時体重２６０〜２８０ｇ）をペントバルビタール５０　ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与にて麻酔し、ラット脳定位固定装置に固定した。切歯用バーはインターオーラルラインから３．３　ｍｍ低くした。頭蓋骨を露出し、側脳室にガイドカニューレＡＧ−８（内径０．４　ｍｍ、外径０．５　ｍｍ、エイコム）を埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴を開けた。また、その周囲３箇所にアンカービスを埋めた。ステンレス製ガイドカニューレ、ＡＧ−８を、その先端が側脳室の上部に位置するように挿入した。定位座標は、ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎ（１９９８）のアトラスに従い、ブレグマより、ＡＰ：　−０．８　ｍｍ、Ｌ：１．５　ｍｍ、Ｈ：−４．５ｍｍとした。ガイドカニューレは歯科用セメントおよびアンカービスで頭蓋骨に固定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダミーカニューレ、ＡＤ−８（外径　０．３５　ｍｍ、エイコム社）を挿入し、キャプナット（エイコム社）で固定した。術後、ラットは個別のケージで飼育し、粉末飼料へ１週間馴化させた。
ガイドカニューレを埋め込んでから約１週間飼育して術後の回復および粉末飼料への馴化を待ち、ラットの頭蓋骨に装着したキャップナットとダミーカニューレを取り外し、代わりにＰＴＦＥ（ポリ四フッ化エチレン）チューブ（長さ５０　ｃｍ、内径０．１　ｍｍ、外径０．３５　ｍｍ、エイコム社）につないだステンレス製マイクロインジェクションカニューレＡＭＩ−９（内径０．１７　ｍｍ、外径０．３５　ｍｍ、エイコム社）を挿入した。マイクロインジェクションカニューレの長さは、その先端１　ｍｍがガイドカニューレから露出するように調節しておいた。ＰＴＦＥチューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、大塚蒸留水、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を溶解させた蒸留水を５μｌ／分の流速で計１０μｌ（１０　ｎｍｏｌ／ｒａｔ）を側脳室に注入した。注入終了後２分待ってからマイクロインジェクションカニューレを取り外し、再びダミーカニューレをキャップナットで固定した。注入は、１９時から２０時の間に行ない、その後の摂餌量を摂餌量測定措置Ｆｅｅｄ−Ｓｃａｌｅ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ社）を用いて３０分毎に投与４時間後まで経時的に測定した。
結果を〔図２１〕に示す。これより、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）投与群は対象群に比し、投与１．５および２時間後において有意（ｐ＜０．０５）な摂餌量の減少が認められた。
【０１２２】
実施例３５
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のヒト結腸癌細胞株ＬＳ　１７４Ｔのヌードマウスでの腫瘍増殖に及ぼす影響を検討した。
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓａｌｉｎｅ　（ＰＢＳ）に溶解したＬＳ　１７４Ｔを４　ｘ　１０６　ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｍｏｕｓｅの割合で雌性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ−ｎｕ，　６週齢）の左腹部皮下に投与した。投与３時間後に、大塚蒸留水に２　ｍＭ濃度に溶解したヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）または大塚蒸留水１００μｌをＭＩＣＲＯ−ＯＳＭＯＴＩＣ　ＰＵＭＰ（ａｌｚａ社、ｍｏｄｅｌ　１００２）に充填し、エーテル麻酔下でマウス背部皮下に埋め込んだ（各群　ｎ＝１０）。この日より、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は、４８　ｎｍｏｌ／ｄａｙで１４日間持続的に放出されることになる。投与３日後より腫瘍のスケールを測定し、腫瘍体積は（長径）ｘ（短径）２／２で算出した。
結果を〔図２２〕に示す。これより、投与１１日目から２０日目まで、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）投与群においてＬＳ　１７４Ｔの腫瘍体積の増大傾向が観察された。
【０１２３】
実施例３６
ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ベクターの構築
ヒトＴＧＲ２３−１Ａ（配列番号：６３）、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ（配列番号：９５）およびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ（配列番号：９７）をコードするＤＮＡをＱｕｉｃｋ　ｃｈａｎｇｅ　ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてヒトＴＧＲ２３−１のＤＮＡより調製した。ヒトＴＧＲ２３−１のＤＮＡに以下のようにしてＰＣＲ法により部位特異的変異を導入した。ＰＣＲ反応液は、５　ｎｇの実施例１５に記載のｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１、２　ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．４μＭの変異導入用フォワードプライマーおよび変異導入用リバースプライマー〔ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ａ作製用フォワードプライマー（配列番号：１０６）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ａ作製用リバースプライマー（配列番号：１０７）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｃ作製用フォワードプライマー（配列番号：１０８）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｃ作製用リバースプライマー（配列番号：１０９）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｄ作製用フォワードプライマー（配列番号：１１０）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｄ作製用リバースプライマー（配列番号：１１１）〕、２．５　ｕｎｉｔのｐｆｕポリメラーゼにキットに添付のＰＣＲ反応用バッファーを加え、全容量を５０μｌとした。この反応液を、９５℃で３０秒間保温し、その後９５℃・３０秒、５５℃・６０秒、６８℃・１４分を１２回繰り返す反応に供した。ＰＣＲ反応の後、鋳型ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１を分解するため、１μｌのＤｐｎ　Ｉ　（１０　ｕｎｉｔ／μｌ）を反応液に添加し、３７℃で１時間保温した。コンピーテント細胞であるＴＯＰ１０　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１μｌのＤｐｎ　Ｉ反応液でヒートショック法により形質転換した。これらの形質転換大腸菌からプラスミドＤＮＡをＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｕｌｔｒａ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて取得した。塩基配列の決定のための反応は、ＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、次に、各ＤＮＡの塩基配列をＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析して変異が導入されていることを確認した。
ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ベクターは、動物細胞発現ベクターであるｐＡＫＫＯのＳａｌ　ＩサイトとＳｐｅ　Ｉサイトに、変異の導入が確認されたヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１Ｄをライゲーションすることにより構築した。ＤＮＡ配列解析から変異の導入が確認されたプラスミドＤＮＡをＳａｌ　ＩとＳｐｅ　Ｉで消化し、ＤＮＡ溶液を１．５％　アガロースゲルで電気泳動して５’末端に　Ｓａｌ　Ｉ切断端を、また３’末端にＳｐｅ　Ｉ切断端を持つヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１ＤのＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲルからＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収した。このＤＮＡ断片をｐＡＫＫＯのＳａｌ　ＩとＳｐｅ　ＩサイトにＴａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖｅｒ．２　（Ｔａｋａｒａ）　を用いて結合させた。コンピーテント細胞である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ）をライゲーション反応液により形質転換して形質転換体を作製し、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ａ、大腸菌ＤＨ５（／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｃおよび大腸菌ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｄと命名した。
【０１２４】
実施例３７
ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現ベクターの構築
ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ（配列番号：６５）をコードするＤＮＡをＱｕｉｃｋ　ｃｈａｎｇｅ　ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて調製した。ヒトＴＧＲ２３−１ＣのＤＮＡに以下のようにしてＰＣＲ法により部位特異的変異を導入した。ＰＣＲ反応液は、５　ｎｇのｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｃ（実施例３６で得られたプラスミド）、２　ｍＭのｄＮＴＰｓ、　０．４μＭの変異導入用フォワードプライマーと変異導入用リバースプライマー〔ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｂ作製用フォワードプライマー（配列番号：１１２）、ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｂ作製用リバースプライマー（配列番号：１１３）〕、２．５　ｕｎｉｔのｐｆｕポリメラーゼにキットに添付のＰＣＲ反応用バッファーを加え、全容量を５０μｌとした。この反応液を、９５℃で３０秒間保温し、その後９５℃・３０秒、５５℃・６０秒、６８℃・１４分を１２回繰り返す反応に供した。ＰＣＲ反応の後、鋳型ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｃを分解するため、１μｌのＤｐｎ　Ｉ　（１０　ｕｎｉｔ／μｌ）を反応液に添加し、３７℃で１時間保温した。コンピーテント細胞であるＴＯＰ１０　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１μｌのＤｐｎ　Ｉ反応液でヒートショック法により形質転換した。これらの形質転換大腸菌からプラスミドＤＮＡをＱＩＡｗｅｌｌ　８　ＵｌｔｒａＰｌａｓｍｉｄ　ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて取得した。塩基配列の決定のための反応はＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、次に、ヒトＴＧＲ２３−１ＢのＤＮＡの塩基配列をＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析して変異が導入されていることを確認した。
ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現ベクターは、動物細胞発現ベクターであるｐＡＫＫＯのＳａｌ　ＩサイトとＳｐｅ　Ｉサイトに、変異の導入が確認されたヒトＴＧＲ２３−１Ｂをライゲーションすることにより構築した。ＤＮＡ配列解析から変異の導入が確認されたプラスミドＤＮＡをＳａｌ　ＩとＳｐｅ　Ｉで消化し、ＤＮＡ溶液を１．５％　アガロースゲルで電気泳動して５’末端に　Ｓａｌ　Ｉ切断端を、また３’末端にＳｐｅ　Ｉ切断端を持つＴＧＲ２３−１Ｂ　ＤＮＡ断片をアガロースゲルからＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収した。このＤＮＡ断片をｐＡＫＫＯのＳａｌ　ＩとＳｐｅ　ＩサイトにＴａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖｅｒ．２　（タカラ）を用いて結合させた。コンピーテント細胞である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をライゲーション反応液により形質転換して形質転換体を作製し、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｂと命名した。
【０１２５】
実施例３８
ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞株の作製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｂ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１ＣおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ＴＧＲ２３−１Ｄを培養し、これら大腸菌体からＰｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。これらのプラスミドＤＮＡをＥｆｆｅｃｔｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて添付のプロトコールに従ってＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に導入した。２μｇのプラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬との混合液を４８時間前に１　ｘ　１０６個のＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を播種した直径１０ｃｍシャーレに添加した。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地である１０％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地中に増殖してくるヒトＴＧＲ２３−１Ａ発現細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ発現細胞およびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現細胞のコロニーを、それぞれ最大で４０個選択した。
【０１２６】
実施例３９
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いたヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣおよびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞株における導入遺伝子発現量の測定
実施例３８で作製したヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣまたはヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞株をそれぞれ２５　ｃｍ２フラスコに培養し、増殖した細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｐｒｏｔｅｃｔ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成反応液は、０．５μｇのｔｏｔａｌ　ＲＮＡ、２５　ｐｍｏｌのランダムノナマー（Ｔａｋａｒａ）、１　ｍＭのｄＮＴＰｓ、１μｌのＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　（Ｔｏｙｏｂｏ）およびキットに付属の反応バッファーからなり、全容量は２０μｌである。逆転写反応はサーマルサイクラー（Ｔａｋａｒａ）を用いて、３０℃・１０　ｍｉｎ、次に４２℃・６０　ｍｉｎ、最後に９９℃・５　ｍｉｎの条件で行なった。
標準ヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡは、全長ヒトＴＧＲ２３−２のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅ＤＮＡを精製することにより調製した。ＰＣＲ反応液は、１０　ｎｇのｐＴＢ２１７４（参考例１）、１μＭの合成ＤＮＡフォワードプライマー（配列番号：１１４）、１μＭの合成ＤＮＡリバースプライマー（配列番号：１１５）、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２．５　ＵのＰｆｕ　Ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および２　（　ＧＣ　ｂｕｆｆｅｒＩ　（ＴａＫａＲａ）　２５μｌからなり、全容量を５０μｌとした。増幅のための反応はサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９５℃・６０秒の加熱の後、９５℃・６０秒、５５℃・６０秒、７２℃・７０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・１０分間保温した。ＰＣＲ増幅ＤＮＡはアガロースゲルにて電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収した。該ＰＣＲ反応産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）　に導入し、ＴＧＲ２３−２のｃＤＮＡを持つ形質転換体をカナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。ここで得られたヒトＴＧＲ２３−２のｃＤＮＡを持つ大腸菌よりＱｕａｎｔｕｍ　Ｐｒｅｐ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてプラスミドを回収し、２６０　ｎｍの吸収から計算されたＤＮＡ量とＤＮＡ塩基組成からこのＤＮＡ溶液に含まれるヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡのコピー数を算出した。ＤＮＡコピー数が明らかとなったヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡを標準ヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡとして、定量を目的としたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲに用いた。
ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣまたはヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現細胞株の導入遺伝子発現コピー数をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法により決定した。ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ反応液は、２μｌの逆転写ｃＤＮＡ溶液または１μｌの各種濃度の標準ヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡ、０．２μＭの合成ＤＮＡフォワードプライマー（配列番号：９）、０．２μＭの合成ＤＮＡリバースプライマー（配列番号：１０）、０．２μＭのＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：１１）とＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなり、全容量は２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、５０℃・２分、９５℃・１０分で保温し、次に９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。ヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣまたはヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現細胞株の導入遺伝子発現量はＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、種々の標準ヒトＴＧＲ２３−２部分ＤＮＡのコピー数の対数値を横軸にとって標準曲線を作成した。標準曲線から逆転写ｃＤＮＡに含まれる導入遺伝子の発現コピー数を算出し、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　１ｎｇ当たりの導入遺伝子発現量を決定した。ヒトＴＧＲ２３−１Ａ遺伝子高発現細胞株としてクローンＮｏ．　６０を、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ遺伝子高発現細胞株としてクローンＮｏ．　５９を、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ遺伝子高発現細胞株としてクローンＮｏ．　９を、ヒトＴＧＲ２３−１Ｄ遺伝子高発現細胞株としてクローンＮｏ．　１２をそれぞれ選択した。
【０１２７】
実施例４０
ＦＬＩＰＲを用いたヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるヒトＴＧＲ２３−１Ａ、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ、ヒトＴＧＲ２３−１ＣまたはヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定
ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を種々の濃度で実施例５に記載した方法にしたがって、ヒトＴＧＲ２３−１Ａ発現ＣＨＯ細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現ＣＨＯ細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ発現ＣＨＯ細胞およびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞にそれぞれ投与し、細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性をＦＬＩＰＲを用いて測定した。結果を図２３、図２４、図２５および図２６に示す。
明らかに、ヒトＴＧＲ２３−１Ａ発現ＣＨＯ細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現ＣＨＯ細胞、ヒトＴＧＲ２３−１Ｃ発現ＣＨＯ細胞およびヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞は、ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）に応答し、またこのリガンド濃度依存的な細胞内カルシウム量の上昇を示した。
【０１２８】
実施例４１
ラットＴＧＲ２３−１およびラットＴＧＲ２３−５発現ベクターの構築
ラットＴＧＲ２３−５（配列番号：９１）をコードするＤＮＡをＱｕｉｃｋ　ｃｈａｎｇｅ　ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて調製した。ラットＴＧＲ２３−１のＤＮＡに以下のようにしてＰＣＲ法により部位特異的変異を導入した。ＰＣＲ反応液は、５　ｎｇの参考例４に記載のｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−１、２　ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．４μＭの変異導入用フォワードプライマーと変異導入用リバースプライマー〔ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−５作製用フォワードプライマー（配列番号：１１６）、ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−５作製用リバースプライマー（配列番号：１１７）〕、２．５　ｕｎｉｔのｐｆｕポリメラーゼにキットに添付のＰＣＲ反応用バッファーを加え、全容量を５０μｌとした。この反応液を、９５℃で３０秒間保温し、その後９５℃・３０秒、５５℃・６０秒、６８℃・１０分を１８回繰り返す反応に供した。ＰＣＲ反応の後、鋳型ｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−１を分解するため、１μｌのＤｐｎ　Ｉ　（１０　ｕｎｉｔ／μｌ）を反応液に添加し、３７℃で１時間保温した。コンピーテント細胞であるＴＯＰ１０　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１μｌのＤｐｎ　Ｉ反応液でヒートショック法により形質転換した。この形質転換大腸菌からプラスミドＤＮＡをＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｕｌｔｒａ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて取得した。塩基配列の決定のための反応はＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、次に、ＤＮＡの塩基配列をＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析して変異が導入されていることを確認した。
ラットＴＧＲ２３−５発現ベクターは、動物細胞発現ベクターｐＡＫＫＯのＳａｌ　ＩサイトとＳｐｅ　Ｉサイトに変異の導入が確認されたラットＴＧＲ２３−５をライゲーションすることにより構築した。ＤＮＡ配列解析から変異の導入が確認されたプラスミドＤＮＡをＳａｌ　ＩとＳｐｅ　Ｉで消化し、ＤＮＡ溶液を１．５％　アガロースゲルで電気泳動して５’末端にＳａｌ　Ｉ切断端を、また３’末端にＳｐｅ　Ｉ切断端を持つラットＴＧＲ２３−５のＤＮＡ断片をアガロースゲルからＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＡＫＫＯのＳａｌ　ＩとＳｐｅ　ＩサイトにＴａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖｅｒ．２　（タカラ）を用いて結合させた。コンピーテント細胞である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（トーヨーボー）をライゲーション反応液により形質転換して形質転換体を作製し、大腸菌ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ｒＴＧＲ２３−５と命名した。
ラットＴＧＲ２３−１発現ベクターは、プラスミドｐＣＲ２．１−ｒＴＧＲ２３−１をＳａｌ　ＩとＳｐｅ　Ｉで消化した後、上述のラットＴＧＲ２３−５と同様にして動物発現ベクターｐＡＫＫＯのＳａｌ　ＩサイトとＳｐｅ　Ｉサイトにライゲーションすることによって構築し、コンピーテント細胞である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（トーヨーボー）を形質転換して大腸菌ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ｒＴＧＲ２３−１を得た。
【０１２９】
実施例４２
ラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞株およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞株の作製
大腸菌ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ｒＴＧＲ２３−１および大腸菌ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ｒＴＧＲ２３−５を培養し、これらの大腸菌体からＰｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。これらのプラスミドＤＮＡをＥｆｆｅｃｔｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて添付のプロトコールに従ってＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に導入した。２μｇのプラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬との混合液を４８時間前に１　ｘ　１０６個のＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を播種した直径１０　ｃｍシャーレに添加した。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地である１０％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地中に増殖してくるラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞のコロニーをそれぞれ３０個選択した。
【０１３０】
実施例４３
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いたラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞株およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞株における導入遺伝子発現量の測定
実施例４２で作製したラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞株およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞株をそれぞれ２５　ｃｍ２フラスコに培養し、増殖した細胞からＲＮｅａｓｙ　ＰｒｏｔｅｃｔＫｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　を鋳型としたｃＤＮＡ合成反応液は、０．５μｇのｔｏｔａｌ　ＲＮＡ、２５　ｐｍｏｌのランダムノナマー（Ｔａｋａｒａ）、１　ｍＭのｄＮＴＰｓ、１μｌのＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　（ＴＯＹＯＢＯ）およびキットに付属の反応バッファーからなり、全容量は２０μｌとした。逆転写反応はサーマルサイクラー（Ｔａｋａｒａ）を用いて、３０℃・１０分、次に４２℃・６０分、最後に９９℃・５分の条件で行なった。
標準ラットＴＧＲ２３−１部分ＤＮＡを、全長ラットＴＧＲ２３−１　ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅ＤＮＡを精製することにより調製した。ＰＣＲ反応液は、６８０　ｐｇのｐＣＲ２．１−ＴＧＲ２３−１（参考例４）、０．２μＭの合成ＤＮＡフォワードプライマー（配列番号：１１８）、０．２μＭの合成ＤＮＡリバースプライマー（配列番号：１１９）、０．８　ｍＭのｄＮＴＰｓ、２μｌの　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＩＩポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および酵素に付属のバッファーからなり、全容量を１００μｌとした。増幅のための反応はサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９５℃・６０秒の加熱の後、９５℃・２０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを５回、９５℃・２０秒、７０℃・１２０秒のサイクルを５回、９５℃・２０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に６８℃・３分間保温した。ＰＣＲ増幅ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収した。この増幅ラットＴＧＲ２３−１部分ＤＮＡ溶液の２６０　ｎｍの吸収から計算したＤＮＡ量と増幅ラットＴＧＲ２３−１部分ＤＮＡ塩基組成からこのＤＮＡ溶液に含まれるラットＴＧＲ２３−１部分ＤＮＡのコピー数を算出した。ＤＮＡコピー数が明らかとなったラットＴＧＲ２３−１部分ＤＮＡを標準ラットＴＧＲ２３−１部分ＤＮＡとして定量を目的としたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲに用いた。
ラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞株およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞株の導入遺伝子発現コピー数をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法により決定した。ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ反応液は、２μｌの逆転写ｃＤＮＡ溶液または１μｌの各種濃度の標準ラットＴＧＲ２３−１部分ＤＮＡ、０．２μＭの合成ＤＮＡフォワードプライマー（配列番号：１２０）、０．２　μＭの合成ＤＮＡリバースプライマー（配列番号：１２１）、０．２μＭのラットＴＧＲ２３　ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：１２２、Ｆａｍ−ｔｔｇｇａｇｔｔａｔ　ｃｃｇｇｔｃｃｔｃｔ　ｃｔｔｃｃａａｇ−Ｔａｍｒａ；配列中、Ｆａｍは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、Ｔａｍｒａは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　をそれぞれ示す）とＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなり、全容量は２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、５０℃・２分、９５℃・１０分で保温し、次に９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。ラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞株およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞株の導入遺伝子発現量は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、種々の標準ラットＴＧＲ２３−１部分ＤＮＡのコピー数の対数値を横軸にとって標準曲線を作成した。標準曲線から逆転写ｃＤＮＡに含まれる導入遺伝子の発現コピー数を算出し、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　１ｎｇ当たりの導入遺伝子発現量を決定した。ラットＴＧＲ２３−１遺伝子高発現細胞株としてクローンＮｏ．　３４を、また、ラットＴＧＲ２３−５遺伝子高発現細胞株としてクローンＮｏ．　２９を選択した。
【０１３１】
実施例４４
ＦＬＩＰＲを用いたラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）によるラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定
ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）を種々の濃度で実施例５に記載した方法にしたがってラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞またはラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞に投与し、細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性をＦＬＩＰＲを用いて測定した。結果を図２７および図２８に示す。明らかにラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞はラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）に応答し、またこのリガンド濃度依存的な細胞内カルシウム量の上昇を示した。図２７および図２８のグラフから算出した細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性におけるラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）のラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞に対するＥＣ５０値は、それぞれ０．１９　ｎＭ（ラットＴＧＲ２３−１）および１４　ｎＭ（ラットＴＧＲ２３−５）であった。
【０１３２】
実施例４５
飽和結合実験による［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のラットＴＧＲ２３−１とラットＴＧＲ２３−５への結合親和性の比較
ラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞またはラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞から調製したそれぞれの細胞膜画分の［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）に対する結合親和性を以下のようにして測定した。
初めにラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞から膜画分を調製した。ラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞を培養し、この細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗った後、細胞をフラスコからはがして細胞塊を遠心操作により集めた。この細胞塊を細胞破砕バッファー（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　７．４）、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５　ｍＭ　ＰＭＳＦ、　０．１μｇ／ｍｌ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、２０μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅおよび　４μｇ／ｍｌ　Ｅ−６４）に縣濁し、ポリトロンホモジナイザーで破砕した。この細胞破砕液を遠心（４℃、１０００　（　ｇ、５分間）に供し、遠心上清を回収した。次に、この遠心上清を超遠心（４℃、３００００　（　ｇ、６０分間）に供し、沈殿物を膜画分として回収した。この膜画分を細胞破砕バッファーに縣濁して縣濁液のタンパク質濃度を決定した後、この膜画分を実験に使用するまで−８０℃で保存した。
上記のようにして調製したラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞膜画分およびラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞膜画分を結合バッファー（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　７．４）、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１　％　ＢＳＡ、０．５　ｍＭ　ＰＭＳＦ、０．１μｇ／ｍｌ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、２０μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅおよび４μｇ／ｍｌ　Ｅ−６４）に縣濁して、それぞれ１０μｇ／ｍｌ濃度に調製し、飽和結合実験用膜画分溶液として用いた。これらの膜画分への実施例２６に記載の方法により調製した［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の総結合は、以下の方法によって得た。
２００μｌの飽和結合実験用膜画分溶液に２μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　と２μｌの種々の濃度の［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を添加してよく混合した後、２５℃にて９０分間　保温した。この膜画分に結合した［Ｎｌｅ１０，１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の反応液をグラスフィルターでろ過することにより非結合［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）から分離した。すなわち、反応液を、あらかじめ０．３％　のポリエチレンイミンを含む２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　７．４）バッファーに浸したＧＦ／Ｆフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）上でろ過し、さらにこのグラスフィルターを１．５　ｍｌの氷冷した結合バッファーで３回洗浄した。このグラスフィルター上に捕捉された［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の放射活性をγ−カウンターにより測定し、この値を総結合とした。一方、これらの膜画分への［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の非特異的結合は、総結合の反応系において２μｌのＤＭＳＯの代りに２μｌの１００μＭヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）（配列番号：２３）を用いることにより得た。ある［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）濃度における特異的結合は、その［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）濃度における総結合から非特異的結合を減じた値である。
上記の飽和結合実験における［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞膜画分またはラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞膜画分への結合様式をスキャチャード法により解析した。横軸には、添加したある［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）濃度における１　ｍｇタンパク質量の膜画分あたりの　［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）特異的結合量の値をとり、また縦軸には、その時の１　ｍｇタンパク質量の膜画分あたりの［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）特異的結合量の値を膜画分に結合しない反応液中の［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）濃度で除した値をとってプロットした。図２９および図３０に示すように、［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞膜画分またはラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞膜画分への飽和結合実験においてプロットされた点は直線で近似された。このことはラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞膜画分またはラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞膜画分に単一の［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）結合部位がそれぞれ存在することを示した。この実験における、ラットＴＧＲ２３−１と［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の解離定数は１４１±８．７１　（ｐＭ）、またラットＴＧＲ２３−１の最大［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）結合部位数は１．４１±０．０４　ｐｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであった。一方、ラットＴＧＲ２３−５と［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の解離定数は１２５±８．３６　（ｐＭ）、またラットＴＧＲ２３−１の最大［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）結合部位数は０．９３±０．０３　ｐｍｏｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであった。［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）は、ほとんど同じ親和性をもってラットＴＧＲ２３−１とラットＴＧＲ２３−５に結合した。
表１にラットＴＧＲ２３−１およびラットＴＧＲ２３−５のＴＧＲ２３−２リガンドに対する親和性およびそれぞれの受容体発現細胞のＴＧＲ２３−２リガンドによる細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示した。
ラットＴＧＲ２３−５は、ＴＧＲ２３−２リガンドに対してラットＴＧＲ２３−１とほぼ同程度の高い親和性を有しているにもかかわらず、ＴＧＲ２３−２リガンドに対する応答性は１／１００程度であった。このことは、ラットＴＧＲ２３−５を、ラットＴＧＲ２３−１、マウスＴＧＲ２３−ＢまたはヒトＴＧＲ２３と同一細胞に共存させることにより、ラットＴＧＲ２３−１、マウスＴＧＲ２３−ＢまたはヒトＴＧＲ２３のＴＧＲ２３−２リガンドに対する応答性を減弱させることが可能であることを示唆した。
【表１】
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【０１３３】
実施例４６
ＴＧＲ２３遺伝子発現の抑制による、ヒト結腸がん細胞株のアポトーシス誘発検討
ＡＴＣＣより購入したヒト結腸がん細胞株ＣＯＬＯ２０５を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＲＰＭＩ−１６４０培地（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ含有）に牛胎仔血清（ＡＴＣＣ）を１０％加えた培地で懸濁し、１ウェル当たり４０００個の細胞密度で９６穴コラーゲンタイプＩコートプレート（ＩＷＡＫＩ社）に播種した。同様にＡＴＣＣより購入したヒト結腸がん細胞株ＬＳ１７４ＴをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＥａｒｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地に牛胎仔血清（ＡＴＣＣ）を１０％加えた培地で懸濁し、１ウェル当たり３０００個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。ヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ　１１６（ＡＴＣＣ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＤ−ＭＥＭ培地（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ含有）に牛胎仔血清（ＡＴＣＣ）を１０％加えた培地で懸濁し、１ウェル当たり３０００個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
ＴＧＲ２３遺伝子の翻訳領域配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：１２３）を設計後、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して導入実験に用いた（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチドと略する）。コントロールとしては、配列番号：１２３で示される塩基配列のリバース配列（配列番号：１２４）を同様にｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化し、ＨＰＬＣ精製して用いた（以下、コントロールオリゴヌクレオチドと略する）。具体的には、ＣＯＬＯ２０５はＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で１６７倍に希釈したＦｕＧＥＮＥＴＭ６　　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを加え、混合したオリゴヌクレオチド溶液を、１ウェル当たり６５μＬの割合でプレートに添加した。オリゴヌクレオチドの終濃度は２００ｎＭとなるよう調製した。ＬＳ１７４ＴはＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３２倍に希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを１：１で加え、混合したオリゴヌクレオチド溶液を、１ウェル当たり５０μＬの割合でプレートに添加した。オリゴヌクレオチドの終濃度は３３ｎＭとなるよう調製した。ＨＣＴ　１１６はＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で５倍に希釈したＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＯｐｔｉ−ＭＥＭ　Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを３：８で加え、混合したオリゴヌクレオチド溶液を、１ウェル当たり４０μＬの割合でプレートに添加した。オリゴヌクレオチドの終濃度は５２０ｎＭとなるよう調製した。
上記の条件で更に３日間培養した後、Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて添付プロトコールに従い、上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１２３）は陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１２４）に比べてＣＯＬＯ２０５、ＬＳ１７４Ｔでそれぞれ約１．６倍、約１．３倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（ＣＯＬＯ２０５ではＰ≦０．０５、ＬＳ１７４ＴではＰ≦０．０１）を示した（表２、３）。また、ＴＧＲ２３を発現していないＨＣＴ　１１６では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べて有意なアポトーシス誘導活性を示さなかった（表４）。
【０１３４】
【表２】
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【表３】
2004065232.tif 000004
【表４】
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【０１３５】
実施例４７
アンチセンスオリゴヌクレオチド投与によるＴＧＲ２３遺伝子の発現量低下の検討
実施例４６で用いたヒト結腸がん細胞株ＣＯＬＯ２０５およびＬＳ１７４Ｔを実施例４６と同様の培地に懸濁し、１ウェル当たりＣＯＬＯ２０５は２４，０００個の細胞密度で２４穴コラーゲンタイプＩコートプレート（ＩＷＡＫＩ社）に、ＬＳ１７４Ｔは１８，０００個の細胞密度で２４穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、実施例４６の方法に準じて、実施例４６で使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロールオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。但し、オリゴヌクレオチド溶液の添加量は１ウェル当たり、ＣＯＬＯ２０５は３９０μＬ、ＬＳ１７４Ｔは３００μＬとした。トランスフェクション後、５％炭酸ガス気流中、３７℃で２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ここで得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。次に、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡにして１．５ｎｇ〜３ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、２種類のプライマー（配列番号：９および配列番号：１０）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したプローブ（配列番号：１１）を１００ｎＭになるように加え、ＴＧＲ２３遺伝子の発現コピー数を測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒、６０℃１分のサイクルを４０回繰り返した。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロールオリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合にはＴＧＲ２３遺伝子発現量はｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　１ｎｇ当りＣＯＬＯ２０５では６２０コピー、ＬＳ１７４Ｔでは２９０コピーであったのに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド投与群ではＣＯＬＯ２０５で２１０コピー、ＬＳ１７４Ｔでは１５０コピーであり統計学的に有意（ＣＯＬＯ２０５ではＰ≦０．０１、ＬＳ１７４ＴではＰ≦０．０５）な発現量低下が認められた。一方、陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド投与群ではＣＯＬＯ２０５で５９０コピー、ＬＳ１７４Ｔでは２８０コピーであり非トランスフェクション群と比べて統計学的に有意な発現量低下は認められなかった。
この結果より、ＴＧＲ２３遺伝子発現量の低下により、ヒト結腸がん細胞株のアポトーシスが誘発されたことが示された。
【０１３６】
実施例４８
［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）およびヒトＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いたヒトＴＧＲ２３−２に結合する化合物のスクリーニング法
実施例２６に記載した方法によって作製した［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）および実施例２４に記載した方法によってヒトＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞から調製したヒトＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いたヒトＴＧＲ２３に結合する化合物のスクリーニングを以下のようにして実施する。
ヒトＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を膜画分濃度が１μｇ／ｍｌとなるようアッセイ用バッファー（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％　ＢＳＡ、０．５　ｍＭＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、４μｇ／ｍｌ　Ｅ−６４、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、ｐＨ　７．４）で希釈後、ポリプロピレン製試験管（Ｆａｌｃｏｎ　２０５３）に２００μｌずつ分注する。最大結合量（ＴＢ）を測定するために、２μｌのＤＭＳＯと１０　ｎＭの［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）２μｌを膜画分溶液に添加する。また、非特異的結合を測定するために、１μＭの［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のＤＭＳＯ溶液２μｌと１０　ｎＭの［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）２μｌを膜画分溶液に添加する。さらに、試験化合物のヒトＴＧＲ２３に対する結合活性を調べるために種々の濃度の試験化合物のＤＭＳＯ溶液２μｌと１０　ｎＭの［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）２μｌを膜画分溶液に添加する。２５　℃で９０分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（ＧＦ−Ｆ）を用いて反応液を吸引ろ過する。ろ過後、γ−カウンターを用いて濾紙上に残った放射活性を測定する。最大結合量から非特異的結合量を引いた値を特異的結合量（ＳＢ）として見積もる。試験化合物のヒトＴＧＲ２３−２に対する結合阻害活性（阻害率（％））は、最大結合量から試験化合物および［Ｎｌｅ１０，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）を加えたときに濾紙上に残った放射活性（Ｘ）を減じた値の特異的結合量に対する比率（（ＴＢ−Ｘ）／ＳＢ　ｘ　１００　（％））で示される。種々の濃度における試験化合物の結合阻害率を比較することによってより低濃度で強い結合阻害活性を示す化合物をヒトＴＧＲ２３に結合する能力の高い化合物として選択する。
上記のようにして選択されたヒトＴＧＲ２３に結合する化合物について、実施例３、実施例４または実施例５に記載した方法でＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性（実施例３）、アラキドン酸代謝産物遊離促進活性（実施例４）または細胞内Ｃａ２＋放出促進活性（実施例５）を測定し、いずれかの活性を示す化合物をＴＧＲ２３アゴニストであると判定する。また、いずれの活性も示さなかった化合物については、ＴＧＲ２３−２リガンドと共存させて上記の実施例３、実施例４または実施例５に記載した活性測定を実施し、ＴＧＲ２３−２リガンドの示す活性に対して阻害活性を示した化合物をＴＧＲ２３アンタゴニストであると判定する。
【０１３７】
【発明の効果】
本発明のポリペプチド、本発明のレセプター、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターをコードする本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターに対する本発明の抗体、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの本発明のアンチセンスポリヌクレオチドなどは、（ｉ）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターが関与する各種疾病の治療・予防剤、（ｉｉ）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性を促進または阻害する化合物（例、本発明のタンパク質との結合性を変化させる化合物）、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの発現を促進または阻害する化合物、またはその塩のスクリーニング、（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの定量、（ｉｖ）本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの遺伝子診断薬、（ｖ）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬、（ｖｉ）本発明の抗体を含有する医薬、（ｖｉｉ）本発明のＤＮＡを含有する非ヒト動物の作出、（ｖｉｉｉ）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト動物の作出、（ｉｘ）構造的に類似したリガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザインなどの実施のために有用である。
本発明のポリペプチド、本発明のレセプター、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性を促進する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの発現を促進する化合物またはその塩は、例えば肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食亢進症などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプターの発現を促進する化合物またはその塩、本発明の抗体（中和抗体）、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば癌（例、大腸癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、子宮頸部癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤、拒食症の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
【０１３８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＧＲ２３−１の疎水性プロット図である。
【図２】ＴＧＲ２３−２の疎水性プロット図である。
【図３】一文字表記によるＴＧＲ２３−１のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】一文字表記によるＴＧＲ２３−２のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　３Ｃ１８ＨＧカラムを用いたラットＴＧＲ２３−２リガンドの最終段階の精製におけるＨＰＬＣのＵＶ吸収と各ピークのｃＡＭＰ産生促進活性を示す。活性は矢印に示すピークに回収された（分画番号２０）。
【図６】Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　３Ｃ１８ＨＧカラムを用いたラットＴＧＲ２３−２リガンドの最終段階の精製におけるＨＰＬＣのＵＶ吸収と各ピークのｃＡＭＰ産生促進活性を示す。活性は矢印に示すピークに回収された（分画番号２２〜２３）。
【図７】Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　３Ｃ１８ＨＧカラムを用いたラットＴＧＲ２３−２リガンドの最終段階の精製におけるＨＰＬＣのＵＶ吸収と各ピークのｃＡＭＰ産生促進活性を示す。活性は矢印に示すピークに回収された（分画番号１８）。
【図８】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図９】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図１０】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）のＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。図中、−○−はＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞および−□−はＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性をそれぞれ示す。
【図１１】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。図中、−○−はＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞および−□−はＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性をそれぞれ示す。
【図１２】種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のフォルスコリン刺激したＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性を示す。図中、−○−はＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞および−□−はＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性をそれぞれ示す。
【図１３】種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のフォルスコリン無添加の条件下におけるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性を示す。図中、−○−はＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞および−□−はＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性をそれぞれ示す。
【図１４】種々の濃度のラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）のフォルスコリン無添加の条件下におけるＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性を示す。図中、−○−はＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞および−□−はＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生促進活性をそれぞれ示す。
【図１５】種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対するアラキドン酸代謝物遊離活性を示す。図中、−○−はＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞および−□−はＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対するアラキドン酸代謝物遊離活性をそれぞれ示す。
【図１６】種々の濃度のラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）のＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞およびＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対するアラキドン酸代謝物遊離活性を示す。図中、−○−はＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞および−□−はＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞に対するアラキドン酸代謝物遊離活性をそれぞれ示す。
【図１７】種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）、ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）およびマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を示す。図中、−○−はヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）、−□−はラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）および−△−はマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のＧＴＰγＳ結合促進活性をそれぞれ示す。
【図１８】ＴＧＲ２３−２発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いた、［Ｎｌｅ１０，１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）に対するヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）、ラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）およびマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の結合阻害活性を示す。図中、−○−はヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）、−□−はラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）および−△−はマウスＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）の結合阻害活性活性をそれぞれ示す。
【図１９】ヒトＴＧＲ２３−１およびヒトＴＧＲ２３−２の癌細胞における発現量のグラフである。
【図２０】ヒトＴＧＲ２３の癌細胞における発現量のグラフである。
【図２１】ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）または蒸留水をラット側脳室内に投与後４時間までの３０分ごとの摂餌量の経時的変動を示す。図中、−●−はヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）投与群を、−○−は蒸留水投与群を示す。値は平均値±標準誤差　（ｎ＝８）　で示す。＊は蒸留水投与群に対して有意な（ｐ＜０．０５）差であることを示す。
【図２２】ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）または蒸留水をＭＩＣＲＯ−ＯＳＭＯＴＩＣ　ＰＵＭＰを用いて持続投与した際のヌードマウスでのＬＳ１７４Ｔの腫瘍サイズ経時的変動を示す。図中、−●−はヒトＴＧＲ２３　−２リガンド（１−２０）投与群を、−○−は蒸留水投与群を示す。値は平均値±標準誤差　（ｎ＝１０）を示す。
【図２３】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるヒトＴＧＲ２３−１Ａ発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図２４】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるヒトＴＧＲ２３−１Ｂ発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図２５】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるヒトＴＧＲ２３−１Ｃ発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図２６】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）によるヒトＴＧＲ２３−１Ｄ発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図２７】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）によるラットＴＧＲ２３−１発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図２８】ＦＬＩＰＲを用いて測定した種々の濃度のラットＴＧＲ２３−２リガンド（１−１８）によるラットＴＧＲ２３−５発現ＣＨＯ細胞の細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を示す。
【図２９】［Ｎｌｅ１０，１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のラットＴＧＲ２３−１に対する解離定数を求めるためのスキャチャードプロットの図である。
【図３０】［Ｎｌｅ１０，１２５Ｉ−Ｔｙｒ１５］ヒトＴＧＲ２３−２リガンド（１−２０）のラットＴＧＲ２３−５に対する解離定数を求めるためのスキャチャードプロットの図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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