(57)【要約】【課題】動脈硬化予防剤として有効な血管平滑筋細胞の増殖抑制剤の提供を目的とする。【解決手段】藍藻類のスピルリナ属の熱水抽出物より単離された硫酸化多糖を有効成分とし、特に、ナトリウムを含む硫酸化多糖で分子量が１０〜３０万、或いは低分子化して分子量が１〜１０万のものが、有効に血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を成す。【選択図】　　　　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
藍藻類のスピルリナ属の熱水抽出物より単離された硫酸化多糖を有効成分とする血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【請求項２】
前記硫酸化多糖がナトリウムを含む硫酸化多糖である請求項１に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【請求項３】
前記硫酸化多糖の分子量が１０〜３０万である請求項１または請求項２に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【請求項４】
前記硫酸化多糖の分子量が１万〜１０万である請求項１または請求項２に記載の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、血管平滑筋細胞の増殖抑制剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動脈硬化は心筋梗塞や脳硬塞の基礎病変であるが、この病変は動脈中膜の血管平滑筋細胞が内膜へと遊走し活発に増殖することで形成されるので、血管平滑筋細胞の増殖を阻害することが、その防御及び予防に有効であることが知られている。しかし、血管平滑筋細胞の増殖を阻害して有効に抑制できる物質は多くの研究者により研究されているが（例えば、特許文献１参照。）、未だに有効な物質が見い出されていないのが現状である。
【０００３】
【特許文献１】
特開平７−１１２９３０号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来の問題点に鑑み、本発明は、動脈硬化予防剤として有効な血管平滑筋細胞の増殖抑制剤の提供を課題とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明者らは血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を有する物質について研究を重ね、本発明に至ったものであり、その第１の要旨は、藍藻類のスピルリナ属の熱水抽出物より単離された硫酸化多糖を有効成分とする血管平滑筋細胞の増殖抑制剤に存する。
また、第２の要旨は、前記硫酸化多糖がナトリウムを含む硫酸化多糖であることである。
また、第３の要旨は、前記硫酸化多糖の分子量が１０〜３０万であることである。
また、第４の要旨は、前記硫酸化多糖の分子量が１万〜１０万であることである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
発明者らは、藻類に着目し、藍藻類，緑藻類，褐藻類，紅藻類について、それぞれ熱水抽出物の作用を検討したが、その中でも藍藻類に特に注目し、この藍藻類には、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）　属、フィッシェレラ（Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ）　属、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎｅ）属、ネンジュモ（Ｎｏｓｔｏｃ）属、シネコキスチス（Ｃｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）　属、シネココッカス（Ｃｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）　属、トリポスリクス（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ）　属等があるが、これらのうち、特にスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）　属に着目して研究を重ねた。
即ち、藍藻類のスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）　属は、工業的規模で生産されており、、その安全性が確認されて、食用にも供されているため、原料としては好ましいものであった。
【０００７】
このように発明者らは最終的には藍藻類のスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）　属に的を絞り、このスピルリナ属からの熱水抽出物より単離された硫酸化多糖が、血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を備えていることを見い出した。
さらに、有効成分である硫酸化多糖としては、特にナトリウムを含む硫酸化多糖が優れた作用効果を発揮することを突き止め、また、硫酸化多糖の分子量としては１０万〜３０万が好ましく、さらには、これを低分子化した１万〜１０万のものも有効に作用することを突き止めたのである。
なお、以下において、ナトリウムを含む硫酸化多糖をナトリウムスピルラン（Ｎａ−ＳＰ）と称して説明する。
【０００８】
【実施例】
以下には、ナトリウムスピルラン（Ｎａ−ＳＰ）の調製方法及び性質について言及するとともに、血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を確認する薬理試験を列挙して、ナトリウムスピルラン（Ｎａ−ＳＰ）の血管平滑筋細胞に対する増殖抑制効果を立証する。
【０００９】
調製方法
藍藻類のスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）　を、例えば５〜１０倍量（重量比）の水に懸濁させ、８０℃以上の温度条件にて、１時間程度で熱水抽出し、得られた熱水抽出懸濁液を、好ましくは３０００×ｇ以上で、１０〜３０分間遠心分離を行い、その上澄み液を分離採取し、熱水抽出物を得る。
得られた熱水抽出物に、トリクロロ酢酸，クエン酸等の有機酸類、塩酸，硫酸等の無機酸類からなる除蛋白処理剤を、１〜２０％加えて再度遠心分離し（好ましくは３０００×ｇ以上で、１０〜３０分間）除蛋白処理する。
次いで除蛋白処理済みの遠心分離上清を透析して（好ましくは、５〜２０℃の温度条件下）、分子量分布１０万〜５０万の高分子画分を得る。
このようにして得られた高分子画分を更に純化する場合には、これをＤＥＡＥトヨパールカラムにかけて分画し、次いでＤＥＡＥトヨパールカラムにかけて再度分画を行うことが出来る。
【００１０】
ナトリウムスピルランの物理化学的性質は以下の通りである．
（ａ）比旋光度　　２４．５℃（Ｈ２　Ｏ）
（ｂ）分子量　　２．２×１０５　（ゲル濾過法）
（ｃ）構成中性糖　　ラムノース（５２．３％）、３・Ο・メチルラムノース（３２．５％）、２，３・ジ・Ο・メチルラムノース（４．４％）、
３・Ο・メチルキシロース（４．８％）
（ｄ）ウロン酸含量　　１６．５％（グルクロン酸、及びガラクツロン酸）
（ｅ）ＩＲスペクトル　　Ｓ＝Ｏ伸縮振動（１２６５ｃｍ−１）
（ｆ）Ｘ線分析　　ナトリウムおよびイオウの存在
【００１１】
薬理試験
（実験１）
１）培養血管平滑筋細胞を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験
ウシ大動脈血管平滑筋細胞はウシ大動脈よりＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，　９１，　２０７，　１９９１に記載の方法により単離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ　）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ製薬社製）中にて３７℃、９５％空気−５％二酸化炭素の雰囲気下で培養した。４〜１０回継代した培養細胞を２％トリプシンと０．０２％エチレンジアミン−テトラ酢酸２ナトリウムの混合物で１００ｍｍファルコン培養ペトリ皿から取り出し、１００×ｇ、４℃で１０分遠心分離して集めた。このウシ大動脈血管平滑筋細胞を２４穴培養プレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２　の密度で播種し、１０％　ＦＢＳ含有ダルベッコ変法イーグル培地中で２４時間上記と同じ条件下で培養後、新鮮な同培地中でＮａ−ＳＰ（２，５，１０ｏｒ２０μｇ／ｍｌ）存在下さらに７２時間培養し、培養終了時の細胞数を粒子計測機（ＣＤＡ−５００　）で測定した（表１）。
別に、１０μｇ／ｍｌのＮａ−ＳＰ存在下で２４，４８，７２，９６時間同様に培養し、細胞数を計測した（表２）。
データはそれぞれ検体の平均値±標準誤差で表し、結果についてはｔ検定による統計処理を行った。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
【表２】
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【００１４】
２）結果の説明
表１
培養血管平滑筋細胞の増殖は、Ｎａ−ＳＰ添加群による７２時間の培養で無添加群に比較して有意に阻害され、その阻害作用は用量依存的であった。また、阻害効果は２μｇ／ｍｌですでに認められ、５μｇ／ｍｌ以上で約６０％の阻害が観察された。
表２
また１０μｇ／ｍｌのＮａ−ＳＰを添加して９６時間まで培養した場合、２４時間以上の培養時間において培養血管平滑筋細胞の増殖は有意に阻害された。
【００１５】
（実験２）
１）［　３　Ｈ］ラベルしたチミジン、［　１４Ｃ］ラベルしたロイシンの取込みの試験
ウシ大動脈血管平滑筋細胞を６穴培養プレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２　の密度で播種し、１０％牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地中で２４時間培養後、新鮮な同培地中でＮａ−ＳＰ（１０μｇ／ｍｌ）存在下さらに７２時間培養し、培養終了前６時間にＤＮＡ　の合成を調べるために、２０ｋＢｑ／ｍｌの［３Ｈ］　ラベルしたチミジン（ＮＥＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　社製）、タンパク質の合成を調べるために、１０　ｋＢｑ／ｍｌ　の［１４　Ｃ］　ラベルしたロイシン（ＮＥＮ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　社製）を添加した。培養終了後、培地を捨て、細胞をカルシウムおよびマグネシウム不含リン酸緩衝液で洗った。細胞を新鮮な同緩衝液存在下ゴムベラ（ラバ−　ポリスマン）でかきとって回収後、超音波処理によって細胞を破砕した。この細胞破砕液について５％トリクロロ酢酸不溶性画分への放射活性の取込みを液体シンチレーションカウンターで測定した。別に細胞破砕液中のＤＮＡ　量を蛍光分析法で測定した。データはそれぞれ４回の試験結果の平均値±標準誤差で表し、結果についてはｔ検定による統計処理を行った。
【００１６】
２）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ　）の活性測定
（実験１）で示されたＮａ−ＳＰによる血管平滑筋細胞数の減少は細胞増殖が阻害されたことを強く示唆するものであるが、Ｎａ−ＳＰが細胞毒性を発現して血管平滑筋細胞の死滅を加速した結果細胞数を減少させた可能性がある。死滅した細胞は溶解してしまうので、その数を計測することは事実上不可能であるが、培養液中のＬＨＤ　の活性を測定することにより死滅した細胞数を間接的に知ることができる。即ち、ＬＤＨ　は細胞質中に存在する酵素であるが、細胞が生きているうちはそこに留まっている。しかしながら、細胞が死に至ると細胞膜が崩壊し、ＬＤＨ　は細胞の中から培養液中に漏出してくる。そこで、以下のように培地中のＬＤＨ　活性を測定し、Ｎａ−ＳＰによって細胞死が加速された可能性を検討した。
【００１７】
ウシ大動脈血管平滑筋細胞を２４穴培養プレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２　の密度で播種し、１０％牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地中で２４時間培養後、新鮮な同培地中でＮａ−ＳＰ（１０μｇ／ｍｌ）存在下さらに７２時間培養後培地を回収し、その中に含まれるＬＤＨ　活性をキット（和光純薬）を用いて測定した。
【００１８】
【表３】
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【００１９】
３）結果の説明
培養血管平滑筋細胞のＤＮＡ合成は、Ｎａ−ＳＰ添加により抑制（Ｎａ−ＳＰ無添加群の８．４２６×１０−４ｄｐｍ　に対して、Ｎａ−ＳＰの１　０μｇ　添加群で１．９９１×１０−４ｄｐｍ　）されているが、アミノ酸の消費量は抑制されず（Ｎａ−　ＳＰ無添加群の２．２１２×１０−３ｄｐｍ　に対して、Ｎａ−ＳＰの１　０μｇ　添加群で１．８９６×１０−３ｄｐｍ　）、また培養血管平滑筋細胞からＬＤＨの漏出も増加していない（Ｎａ−ＳＰ無添加群の１３．６０　±０．１８ＩＵ／Ｉに対して、Ｎａ−ＳＰの１０μｇ　添加群で１１．９１　±０．０９ＩＵ／Ｉ）。このことから、Ｎａ−ＳＰ添加による培養血管平滑筋細胞の増殖阻害作用は、Ｎａ−ＳＰの平滑筋細胞のＤＮＡ合成阻害によるものであり、細胞の蛋白質合成阻害あるいは、細胞死（細胞毒性）によるものではないことを示唆している。
【００２０】
（実験３）
１）ナトリウムイオンの除去，　脱硫酸化
Ｎａ−ＳＰをＤｏｗｅｘ５０Ｗｘ８イオン交換樹脂（Ｈ型）のカラムにかけて蒸留水で溶出し、ナトリウムイオンを除去した。
Ｎａ−ＳＰをＤｏｗｅｘ５０Ｗｘ８イオン交換樹脂（ピリジン型）のカラムにかけて、これを１０％メタノール／ＤＭＳＯに溶解し、環流しながら８０℃で５時間加熱した。反応液を蒸留水に対して透析後，凍結乾燥することで脱硫酸化ＳＰを得た。
２）Ｎａ−ＳＰを添加してからの培養時間
（実験１）と同様の方法で、血管平滑筋細胞をＮａ−ＳＰ，Ｈ−ＳＰおよび脱硫酸化ＳＰで７２時間処理し、処理後の細胞数を計測した。
【００２１】
【表４】
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【００２２】
３）結果の説明
無添加対照群と比較して、Ｎａ−ＳＰの１０μｇ　添加群では細胞増殖が５０．７％阻害されたのに対して、Ｎａ−ＳＰからナトリウムイオンを除去したＨ−ＳＰの１０μｇ　添加群では阻害率が５．２％と細胞増殖はほとんど阻害されなかった。またＮａ−ＳＰから硫酸基を除去することによって、ナトリウムイオンを結合できなくした脱硫酸化ＳＰでは、その阻害率が１４．２％と対照群に比較して僅かに細胞増殖を阻害した。これらの結果から、Ｎａ−ＳＰの血管平滑筋細胞増殖の阻害活性には、硫酸基に結合したナトリウムイオンが必須であることが分かる。
【００２３】
（実験４）
１）Ｎａ−ＳＰの低分子化
５％過酸化水素水／１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、４５℃で３０分〜１２時間インキュベートした。反応液を蒸留水に対して透析後、凍結乾燥した。生じた低分子量体をＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ　　ＧＭＰＷＸＬカラム、溶離液０．２Ｍ　　ＮａＣｌ）で分析したところ、分子量的には均一であることが認められた。例を挙げると、３０分間反応させると分子量約２２万の低分子化Ｎａ−ＳＰが分子量約１１万に、１１時間反応させると分子量約２１，０００の低分子化Ｎａ−ＳＰにまで低分子化した。イオウの元素分析、及びＸ線マイクロアナリシスの結果から、いずれの低分子化Ｎａ−ＳＰにも硫酸基、及びナトリウムイオンの存在は確認された。
【００２４】
２）培養
（実験１）と同様の方法で、血管平滑筋細胞をＮａ−ＳＰおよびその低分子化体で７２時間処理し、処理後の細胞数を計測した。
【００２５】
【表５】
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【００２６】
３）結果の説明
低分子Ｎａ−ＳＰ添加群における血管平滑筋細胞増殖阻害率は、分子量約２００，０００の低分子化前のＮａ−ＳＰ添加で２４．８％、分子量約１００，０００の低分子Ｎａ−ＳＰ添加で２６．５％、分子量約５０，０００の低分子Ｎａ−ＳＰ添加で３６．８％、分子量２０，０００の低分子Ｎａ−ＳＰ添加で４３．２％、分子量約１５，０００の低分子Ｎａ−ＳＰ添加で３５．２％といずれの分子量においても、無添加群に比較して、阻害活性を示した。このことからＮａ−ＳＰの培養血管平滑筋細胞に対する増殖阻害活性は、低分子化することによっても失活しないことが判る。
【００２７】
製剤化例
ナトリウムスピルラン（Ｎａ−ＳＰ）は、医薬品原料または医薬品として用いることができるが、各種の医薬品として経口または非経口的に投与する場合には、エアゾール剤、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、眼軟膏剤、懸濁剤・乳剤、坐剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、浸剤・煎剤、注射剤、貼付剤、チンキ剤、点眼剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、リニメント剤、リモナーデ剤、流エキス剤、ローション剤等の剤型が挙げられる。
【００２８】
これらの医薬品の製剤化の際には、医薬品添加物として使用できる溶剤、浸出剤、賦形剤、コーティング基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、界面活性剤、安定剤、保存剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、乳化剤、吸収促進剤等が添加されるが、その例としては、精製水、注射用水、生理食塩液、エタノール、アセトン、エーテル、デンプン、白糖、乳糖、ブドウ糖、マンニトール、リン酸カルシウム、カゼイン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルロース、酢酸フタル酸セルロース、デンプン糊液、ゼラチン溶液、アラビアゴム、カルメロース、アルギン酸ナトリウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、デンプン、炭酸カルシウム、結晶セルロース、安息香酸ナトリウム、エチレンジアミン、ヨウ化カリウム、ベントナイト、トラガント、ゼラチン、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ピロ亜硫酸ナトリウム、ｌ−アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、安息香酸、安息香酸エステル、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ソルベート、クエン酸、ハッカ油、芳香エッセンス、ブリリアントブルー、エリスロシン、食塩等が挙げられる。
【００２９】
またナトリウムスピルラン（Ｎａ−ＳＰ）は、原料の抽出段階で得られる中間品を用いて機能性食品としての応用も可能である。例えば、スピルリナを熱水で抽出し、その抽出液を凍結乾燥させ、これにトリクロロ酢酸を加えて除蛋白後、水に対して透析を行うことでトリクロロ酢酸を除き、再度凍結乾燥して粗精製物を得ることができるが、この場合、ナトリウムスピルランが約９％含まれる。この粗精製物を動脈硬化の予防を目的とした機能性食品として応用する。
機能性食品として利用する場合の形態は、通常の食品として流通している形態であれば良いが、例えば炭酸飲料、清涼飲料水、粉末清涼飲料、テーブルシュガー、ゼリー、クッキー、ビスケット、チョコレート、ガム、飴、即席麺、スナック麺、カプセル状食品、錠剤状食品等のように、長期間の安定性を保てる形態であればなお良い。その他、発酵乳、乳酸菌飲料、シリアル、とうふ、ソーセージに添加したり、食品以外にも食用調理油、粉末スープに添加することもできる。
【００３０】
ナトリウムスピルラン（Ｎａ−ＳＰ）の医薬品としての投与量は、投与方法、投与期間、年齢、体重等により異なるが、経口もしくは非経口投与により、通常成人１日当り０．２５〜０．７５ｍｇ／ｋｇ　である。以下に、医薬品としての実施例を挙げる。
【００３１】
例えばスピルリナのスプレー乾燥粉末を４〜２０倍量（重量比）、好ましくは５〜１０倍量（重量比）の水に懸濁させ、８０℃以上、好ましくは還流温度の温度条件にて、３０分以上、好ましくは１時間程度熱水抽出する。次に得られた熱水抽出懸濁液を、好ましくは３０００×ｇ以上で、１０〜３０分間遠心分離を行い、その上澄み液を分離採取し、熱水抽出物を得る。得られた熱水抽出物を常法に従い除蛋白処理する。即ち熱水抽出物に除蛋白処理剤を加えて再度遠心分離する（好ましくは３０００×ｇ以上で、１０〜３０分間）。除蛋白処理剤としては、トリクロロ酢酸，クエン酸等の有機酸類、塩酸，硫酸等の無機酸類が使用される。除蛋白処理剤の添加量としては、処理液に対し、１〜２０％が適している。次いで除蛋白処理済みの遠心分離上清を透析して（好ましくは、５〜２０℃の　温度条件下）、分子量分布１０万〜５０万の高分子画分を得る。このようにして得られた高分子画分を下記に示すような担体を用いて、製剤化することが出来る。さらには該高分子画分をＤＥＡＥトヨパールカラムにかけて分画し、次いでＤＥＡＥトヨパールカラムにかけて再度分画を行い純化したものを、下記に示すような担体を用いて、製剤化することも出来る。
【００３２】
（例１）
ナトリウムスピルラン（Ｎａ−ＳＰ）１３．２ｇ、結晶セルロース８．１ｋｇ、カルメロースカルシウム４．０ｋｇ、沈降炭酸カルシウム１．０ｋｇ、クロスカルメロースナトリウム３．０ｋｇ、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム０．４ｋｇを混合機で３分間混合し、混合末を４０＃で篩過する。さらに混合機で３分間混合し、ステアリン酸マグネシウム０．４ｇを加え３０秒混合した後、４０＃で篩過し、さらに混合機で３０秒間混合し、打錠用顆粒とする。次いで常法により、１錠中（３２０ｍｇ）　にナトリウムスピルラン（Ｎａ−ＳＰ）０．２５ｍｇを含有する９ｍｍ径の錠剤とする。
【００３３】
（例２）
ナトリウムスピルラン（Ｎａ−ＳＰ）３．２ｇ、乳糖３０．６５ｋｇ、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム０．５ｋｇ、ステアリン酸マグネシウム０．２５ｋｇを混合機で混合した後、常法により１包中２．５ｇにナトリウムスピルラン（Ｎａ−ＳＰ）０．２５ｍｇを含有する顆粒剤とする。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の血管平滑筋細胞の増殖抑制剤は、藍藻類のスピルリナ属の熱水抽出物より単離された硫酸化多糖を有効成分とするものであり、血管平滑筋細胞のＤＮＡ合成を阻害して、毒性を生じることなく、有効に血管平滑筋細胞の増殖を阻害し抑制することができる効果を有する。