(57)【要約】　　　（修正有）【課題】雌性配偶体形成に関わる遺伝子ＭＡＡ３及びＭＡＡ３遺伝子を利用して雌性配偶体を致死性にする方法に関する。【解決手段】雌性配偶体形成に必須のタンパク質、より詳細には特定のアミノ酸配列を有するタンパク質、それをコードする遺伝子ＭＡＡ３、より詳細には特定の塩基配列を有する遺伝子、ＭＡＡ３遺伝子を利用することにより種子の数を減少させる方法、及びこの方法により得られた形質転換体に関する。【選択図】　なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質であって、雌性配偶体形成に必須なタンパク質。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
シロイヌナズナ由来である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡであって、雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項５】
シロイヌナズナ由来である請求項４に記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれかに記載の遺伝子もしくは当該遺伝子の一部を含むベクター。
【請求項７】
ベクターが相同組み換えを行うためのベクターである請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ベクターが発現プラスミドである請求項６に記載のベクター。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補配列を含むヌクレオチド。
【請求項１１】
雌性配偶体形成に必須のタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用するものである請求項１０に記載のヌクレオチド。
【請求項１２】
雌性配偶体形成に必須のタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用するものである請求項１０に記載のヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項３〜５のいずれかに記載の遺伝子の発現を抑制して、雌性配偶体を致死性にする方法。
【請求項１４】
請求項３〜５のいずれかに記載の遺伝子のアンチセンスを植物ゲノムのｎ箇所に挿入して、種子の数を２ｎの１にする方法。
【請求項１５】
請求項３〜５のいずれかに記載の遺伝子のアンチセンスを特定の対立遺伝子に連鎖するゲノム領域に挿入して、特定の対立遺伝子を含まない種子のみを形成させる方法。
【請求項１６】
特定の対立遺伝子が、他種由来の外来遺伝子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１６に記載の方法により形質の改変された、形質転換植物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法により、外来遺伝子を種子や胚乳に含まないトランスジェニック植物由来食品を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、雌性配偶体形成に必須のタンパク質、及びそれをコードする遺伝子ＭＡＡ３に関する。
また本発明は、ＭＡＡ３遺伝子を利用して種子の数を減少させる方法、及び外来遺伝子を含まない種子を生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の雌性配偶体は卵細胞と中央細胞を作る一方、花粉管を誘引し、重複受精が起こるという植物有性生殖の中心的な場である。１９世紀から形態学的・比較形態学的な研究の蓄積がある。
例えば、シロイヌナズナの有性生殖を図１に示す。胚珠では、減数分裂が起こり近位端の１細胞が生き残る、続いてｎのままで分裂が進み、７細胞８核の雌性配偶体となる。これは、卵細胞、中央細胞、２つの助細胞、３つの反足細胞からなる。雄ずいの葯では、減数分裂に続く体細胞分裂でｎの花粉（２または３細胞）が作られる。花粉は雌ずいの柱頭まで運ばれると、接着・発芽して花粉管を作る。２つの精細胞が、花粉管によって長い道のりを雌性配偶体まで運ばれ、重複受精する。つまり、雌性配偶体の卵細胞（ｎ）が受精して胚（２ｎ）が作られ、中央細胞（ｎ＋ｎ）が受精すると胚乳（３ｎ）が作られる。
【０００３】
観察の蓄積の一方で、遺伝子レベルの研究は非常に少ない。遺伝子レベルの研究には主に二つのアプローチが考えられる。まず、雌性配偶体に特異的に発現する遺伝子の単離が試みられた。しかしながら、雌性配偶体は雌しべ組織の内部にあるために、周りの組織を大量に含むライブラリーしか作れず、雌性配偶体を取り巻く細胞群の遺伝子ばかりが単離されてしまった（Ｂｅｗｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）。雌性配偶体の発生が同調し、多くの組織を得ることが出来るランを用いることで改善が図られているが、現在までに遺伝子機能の解析は進んでいない（Ｎａｄｅａｕ，１９９６）。もう一つのアプローチとして、雌性配偶体発生の突然変異体単離による遺伝学的な研究が考えられる。しかし、雌性配偶体は半数体であり、突然変異体はメンデル遺伝を示さないことなどにより、これまでに雌性配偶体の突然変異体の探索は行われていなかった。
【０００４】
シロイヌナズナで古典的に知られていた雌性配偶体変異体は、Ｒｅｄｅｉ（１９６５）の単離したｇｆ突然変異体のみであり、その他の植物ではトウモロコシに３例報告があるのみである（Ｓｈｅｒｉｄａｎ　ａｎｄ　Ｈｕａｎｇ，１９９７）。一方、シロイヌナズナで雌性配偶体と関係ない突然変異体として単離され、その後の解析によって雌性配偶体致死であることが遺伝学的に示されている突然変異体はいくつか報告がある。原因遺伝子がすでに単離されているものとしては、ｔｒｐ１、ｔｒｐ４二重突然変異体（Ｎｉｙｏｇｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）、ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｔｒｉｐｌｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ１（Ｋｉｅｂｅｒ　ａｎｄ　Ｅｃｋｅｒ，１９９４）、ｐｒｏｌｉｆｅｒａ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）である。しかしながら、これらの雌性配偶体表現型は報告されておらず、これらの遺伝子が雌性配偶体発生にどのように機能しているか不明である。
【０００５】
雌性配偶体発生に関する分子遺伝学的な研究により得られる知見は、種なし果実の作出に利用することが期待できる。
果実が商業的価値を持つために栽培される作物の分野では、種子のない果実を生育させうる植物には大きな需要がある。種なし果実の生産のためには、受粉しなくても果実が生育する単為結実を利用する方法が用いられてきた。
単為結実的生育を達成する方法としては、化学的活性成分を使用するか、その種に単為結実的生育性を付与する選抜された突然変異体を使用するか、染色体数の変化（すなわち倍数性）を利用することによっている。
たとえばスイカを例にとると、現在実用化している種なしスイカの作出方法は，３倍性不稔を利用する方法である。しかし，この３倍体種なしスイカは２倍体の普通スイカに比べて品種育成に長い年月がかかること、種子の発芽率が低いこと、果実の品質が劣ること等の理由から広く普及していない。この他、種なしスイカを作出する方法としては植物ホルモンを利用する方法があるが、果実が小さく、また奇形になり易いこと等から実用化していない。この他に、Ｘ線照射によって不活化した花粉で雌花に人工授粉することにより、単為結実を誘導し果実を肥大させる方法なども開発されているが普及していない。
このため、受粉しても種子が形成されない雌性不稔植物の作出を分子遺伝学的メカニズムを利用して達成する方法は、商業的な果実生産のために広範な関心を引くものであった。
【０００６】
本発明者らは以前に、さやの中の種子数が半数になることを指標として雌性配偶体発生の突然変異体のスクリーニングを行った。これは次のような仮定に基づいている。
すなわち、雌性配偶体致死の突然変異をヘテロ接合体として持つ胞子体個体があったとする。減数分裂後、ある雌性配偶体が２つの対立遺伝子のうちどちらかを受け継ぐかはランダムに決まる。そこで、半数の雌性配偶体は野生型の対立遺伝子を受け継ぎ、正常に雌性配偶体発生を行い、重複受精して種子をつくる。一方、残りの半数の雌性配偶体は突然変異型の対立遺伝子を受け継ぎ、致死となるため、種子をつくれない。結果としてさや（つまり雌しべの成熟したもの）の中で、種子数が半数になる。
【０００７】
上記の仮定に基づき、シロイヌナズナのＴ−ＤＮＡ挿入変異体から、さやの中の種子数が半数になることを指標としてスクリーニングを行った。この結果、４つの雌性配偶体発生の突然変異株を単離することができた。雌しべの中で受精できないままに発生を停止している胚珠の形からｍａｇａｔａｍａ（ｍａａ）突然変異体と名付けた（Ｋｅｎｔａｒｏ　Ｋ．Ｓｈｉｍｉｚｕ　ａｎｄ　Ｋｉｙｏｔａｋａ　Ｏｋａｄａ、２０００、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２７、４５１１−４５１８）。
ｍａｇａｔａｍａ突然変異体の微分干渉顕微鏡による写真を図２に示す。図２Ａで示されるように雌性半数体の半分は発生が異常である。ｍａｇａｔａｍａ（ｍａａ）突然変異体の１つｍａａ３変異体は、図２Ｃに示されるように発生が遅れ、極核の融合が起きていない。
このｍａｇａｔａｍａ突然変異体の原因遺伝子を単離すれば、雌性配偶体形成の分子遺伝学的メカニズムが明らかになることが期待された。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、雌性配偶体致死のｍａｇａｔａｍａ突然変異体の原因遺伝子をクローニングすることを目的とする。また、ｍａｇａｔａｍａ突然変異体の原因遺伝子を利用して雌性配偶体を致死性にさせる方法、種子の数を減少させる方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
雌性配偶体致死のｍａｇａｔａｍａ突然変異体は、ｐＧＶ３８５０：ＨＰＴの挿入系統のスクリーニングから単離された。ｐＧＶ３８５０：ＨＰＴのＴ−ＤＮＡはハイグロマイシン耐性遺伝子を持つ。そこで、ハイグロマイシン耐性を利用して突然変異体がＴ−ＤＮＡと連鎖しているかどうかを調べた。その結果、４つのｍａｇａｔａｍａ突然変異体のうち、ｍａａ３変異体の突然変異形質がＴ−ＤＮＡと連鎖するものであった。
従って、ｍａａ３突然変異体の雌性配偶体致死性はＴ−ＤＮＡによる遺伝子破壊によるものであり、Ｔ−ＤＮＡを指標として雌性配偶体致死の原因遺伝子を単離できる。Ｔ−ＤＮＡの配列を利用したＰＣＲにより原因遺伝子を単離し、発明の課題を解決することとした。
【００１０】
Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーを用いたサザンハイブリダイゼーションの結果、ｍａａ３変異体では一座位にタンデムにＴ−ＤＮＡが挿入されていることが示された。
Ｔ−ＤＮＡのライトボーダー付近を用いたＴＡＩＬ−ＰＣＲを行ったが、近傍のシロイヌナズナゲノム配列は得られなかった。そこで、Ｔ−ＤＮＡのレフトボーダーの近傍配列をＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法を用いて単離することを考えた。
【００１１】
まず、レフトボーダー付近の配列を用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った。するとライトボーダーと同様にレフトボーダーもｍａａ３突然変異と連鎖していた。そこで、レフトボーダー付近の配列のプライマーを用いてＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを行い、一つのバンドを得た。このバンドをシークエンスしたところ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー付近の配列に引き続いて、シロイヌナズナ第４染色体のＡＴＦＣＡ４と呼ばれるコンティグ配列の６１４７４−６１５４５ｂｐと一致する配列が見られた。
これが、挿入されたＴ−ＤＮＡに隣接するシロイヌナズナゲノム配列だと考えられる。この領域にｍａａ３変異体の原因遺伝子が存在することをサザンハイブリダイゼーションにより確認した。
【００１２】
Ｔ−ＤＮＡ挿入部位付近は、ゲノムプロジェクトによるアノテーションによれば、ｄｌ３８２１ｗ遺伝子とｄｌ３８２５ｗ遺伝子の間に挟まれた領域であった（Ｂｅｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。
この遺伝子のｃＤＮＡをＰＣＲ法、５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法により単離したところ、２１エキソンからなり長さ２７０８ｂｐであった。アノテーションで予想されなかった第１エキソンがあり、結局Ｔ−ＤＮＡはこの遺伝子の第一イントロンに挿入されて遺伝子を分断していた。そこで、この遺伝子がｍａａ３突然変異の原因遺伝子であると結論づけた。これをＭＡＡ３遺伝子と名付けた。
ＭＡＡ３遺伝子の構造を図３に示す。
【００１３】
ＭＡＡ３遺伝子から予想されるタンパク質は、８１８アミノ酸からなる。この配列を用いて、ＢＬＡＳＴによるホモロジーサーチを行った。機能が知られているもののうちで最も相同性が高いのが出芽酵母のＳｅｎ１ｐであった。Ｓｅｎ１ｐはスーパーファミリーＩに属するヘリカーゼである。また、スーパーファミリーＩヘリカーゼの７つのコンセンサス配列全てがＭＡＡ３の後半に見られた。
ヘリカーゼはｔＲＮＡのスプライシングやｒＲＮＡ、ｍＲＮＡの成熟など様々なＲＮＡのプロセシングに必要な酵素である。
【００１４】
顕微鏡による観察の結果、ｍａａ３変異体は、雌性配偶体の発生が遅延し、また核小体が小さく内部構造が見られないという二つの異常がみられた。
核小体は、タンパク質とＲＮＡからなる核内の構造で、リボソームの合成部位である。このことからＭＡＡ３はｒＲＮＡのプロセシングに関わっており、雌性配偶体においてはＭＡＡ３遺伝子が欠損すると核小体が異常となり発生遅延も引き起こされ、正常な雌性配偶体発生ができないことが明らかになった。
【００１５】
すなわち本発明は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質であって、雌性配偶体形成に必須のタンパク質を提供する。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００１６】
また、本発明の遺伝子は、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡであって、雌性配偶体形成に必須のタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００１７】
本発明は、雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子ＭＡＡ３を含むベクター、及びそのベクターにより形質転換された形質転換体を提供する。
またＭＡＡ３遺伝子の塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補配列を含むヌクレオチドを提供する。
本発明は、雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子ＭＡＡ３の発現を抑制して雌性配偶体を致死性にする方法、ＭＡＡ３遺伝子のアンチセンスを植物ゲノムのｎ箇所に挿入して種子の数を２ｎ分の１にする方法を提供する。
また、ＭＡＡ３遺伝子のアンチセンスを特定の対立遺伝子に連鎖するゲノム領域に挿入して、特定の対立遺伝子を含まない種子のみを形成させる方法を提供する。さらに本発明はこれらの方法により得られた形質転換体を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子、及びその利用法を提供するものである。
本発明の遺伝子は、その遺伝子発現を抑制することにより雌性配偶体を致死性にすることができ、種子の数を減少させたり、特定の対立遺伝子を持つ種子を致死させることに利用できるものである。
【００１９】
（Ｉ）本発明のタンパク質、すなわち第１発明及び第２発明のタンパク質は、雌性配偶体形成に必須なタンパク質であり、後記配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
また、この他に後記配列表の配列番号１で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、雌性配偶体形成に必須な機能が失われない程度であればよく、通常１〜約１６４個、好ましくは１〜約８２個である。このようなタンパク質は、配列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
第２発明のタンパク質は、第１発明のタンパク質のうちシロイヌナズナ由来のものである。
【００２０】
本発明のタンパク質は、それをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、ＭＡＡ３をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、酵母を用いることが好ましい。
本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを得る方法は、下記の第２発明及び第３発明の項に記載する。
【００２１】
（ＩＩ）本発明の遺伝子、すなわち第３発明、第４発明及び第５発明の遺伝子は、雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子であり、後記配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するものが挙げられる。
また、この他に後記配列表の配列番号２で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質が雌性配偶体形成に必須な機能を有するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号２で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
【００２２】
本発明の遺伝子は、適当な植物の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。植物としては本発明の遺伝子を有するものであれば特に限定されず、例えば、アブラナ科、イネ科、キク科、アカザ科の植物などを挙げることができる。
遺伝子のスクリーニング及び単離は、ホモロジークローニング法などにより好適に実施できる。
植物の地上部を遺伝子源として用い、これからｍＲＮＡを調製する。これからｃＤＮＡライブラリーを構築し、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）　データベースの検索によって得られるＭＡＡ３類似配列に相当するプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、雌性配偶体形成に必須なタンパク質のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
得られたｃＤＮＡについては常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定することができる
【００２３】
得られたＭＡＡ３遺伝子のｃＤＮＡから調製した、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を用いて、インビトロ翻訳法［Ｈｅｄｉｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ、第１０６４巻、３６０項、１９９１年］により、ＭＡＡ３タンパク質を合成し、電気泳動によりタンパク質のサイズ、糖付加の有無等を検討することができる。
【００２４】
得られたＭＡＡ３遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号２に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することができる。
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．著、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓより１９８９に発刊］に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
【００２５】
本発明の遺伝子としては、上記のｃＤＮＡの配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｍａｒｋ，　Ｄ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２項（１９８４年）］　等によって実施できる。
【００２６】
あるＤＮＡが雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードするかどうかは相補性検定により判断できる。すなわち、そのＤＮＡを内在ＭＡＡ３遺伝子の発現が抑制された植物（例えばシロイヌナズナのｍａａ３変異体）に導入し、それにより雌性不稔が回復するかどうかを調べることにより判断できる。
【００２７】
（ＩＩＩ）第６発明は、本発明の遺伝子を含む遺伝子もしくは当該遺伝子の一部を含むベクターを提供する。第７発明は、ＭＡＡ３遺伝子相同組み換えのためのベクターを提供する。第８発明は、ＭＡＡ３遺伝子発現のためのベクターを提供する。第９発明は、これらのベクターで形質転換された形質転換体をそれぞれ提供する。
これらの発明の用いられるベクターは、宿主及び目的に応じて選択することができ、市販のもの又はそれを改良したものを使用することが出来る。形質転換法は宿主及びベクターに応じて好適な方法を選択することが出来る。
【００２８】
第７発明のＭＡＡ３遺伝子相同組み換えのためのベクターは、例えばＭＡＡ３遺伝子が破壊された雌性不稔性植物の作製に用いることができる。本発明のＤＮＡまたはその一部を薬剤耐性遺伝子などのマーカーと結合した後ベクターに組み込み、ＭＡＡ３遺伝子を破壊するためのベクターとすることができる。ベクター及び宿主への形質転換法は、宿主に応じて適したものが選択される。マーカーとしてはカナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられ、形質転換方法としてはエレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。
相同組み換えを行うための本発明のＤＮＡとは、ＭＡＡ３タンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち細胞内で、ゲノム上のＭＡＡ３遺伝子と相同組み換えを起こすことができ、それによってＭＡＡ３遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性があげられる。また、ＭＡＡ３遺伝子のエクソン部分と相同性を有するＤＮＡを必ず含む必要はなく、ＭＡＡ３のゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡであればよい。また相同組み換えを行うためのＤＮＡは本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
【００２９】
（ＩＶ）第１０発明、第１１発明、第１２発明は、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上、好ましくは２０塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを提供するものである。
本発明のヌクレオチドは、雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用することができ、また、当該タンパク質をコードする遺伝子やそれと相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子などを入手する際のプライマーとして使用することができ、さらに、そのアンチセンス鎖などにより雌性配偶体形成に必須なタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用することもできる。
【００３０】
（Ｖ）第１３発明は、本発明の遺伝子ＭＡＡ３を利用して雌性配偶体を致死性にする方法を提供する。
植物の有するＭＡＡ３遺伝子の発現を抑制する方法としては、例えば以下のアンチセンス法、ジーンターゲッティング法、遺伝子破壊型タギング法などを利用する方法が挙げられる。
【００３１】
アンチセンス法による本発明の方法は、適当なプロモーターとその下流に配置された逆向きのＭＡＡ３遺伝子（アンチセンスＤＮＡ）とを含むベクターを構築し、それを植物に導入することによりＭＡＡ３遺伝子の発現を抑制する方法である。ここで用いるプロモーターとしては特に限定されず、雌性配偶体においてもプロモーター活性を有するものであればよい。
【００３２】
ジーンターゲッティング法による本発明の方法は、相同組み換えにより本発明の遺伝子ＭＡＡ３の一部に他のＤＮＡを挿入し、ＭＡＡ３遺伝子をノックアウトすることによるＭＡＡ３遺伝子の発現を抑制する方法である。この方法には、第７発明のベクターが利用できる。
また、このような特定の遺伝子をノックアウトする方法としては、例えば、Ｋｅｍｐｉｎらの方法（Ｋｅｍｐｉｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　３８９：　８０２−８０３．　１９９７）に従って行うことができる。すなわち、ＭＡＡ３遺伝子からなるＤＮＡ内にカナマイシン耐性遺伝子などを挿入したターゲッティングベクターを作製し、これを植物に導入し、相同組み替えを起こさせ、植物の有するＭＡＡ３遺伝子をノックアウトする。相同組み換えが起こったかどうかは、ＰＣＲやサザンハイブリダイゼーションにより確認することが出来る。
【００３３】
遺伝子破壊型タギング法による本発明の方法は、Ｔ−ＤＮＡやトランスポゾンをゲノム中にランダムに挿入させ、ＰＣＲを利用してＭＡＡ３遺伝子破壊株をスクリーニングする方法である。
Ｔ−ＤＮＡタギングに用いるベクターは、特に限定されず、例えば、ｐＢＩＨ１−ＩＧを使用することができる。また、トランスポゾンタギングに使用するトランスポゾンについては、特に限定されず、例えばＡｃ−Ｄｓ系等のＤＮＡ型トランスポゾンや、レトロトランスポゾンを使用することが出来る。
【００３４】
第１４発明は、ＭＡＡ３遺伝子のアンチセンスを植物のｎ箇所に挿入して、種子の数を２ｎ分の１にする方法を提供する。
植物のゲノムの１カ所にＭＡＡ３遺伝子のアンチセンスを挿入した場合には、減数分裂により雌性配偶体の半数がＭＡＡ３アンチセンスを持ち致死性となる。
植物のｎ箇所に挿入すれば、植物の種子数が約２ｎ分の１に減少させることができる。挿入されたｎ箇所のアンチセンスがゲノム内で連鎖していない場合に２ｎ分の１であり、連鎖している場合にはやや増減がある。
種なし果実は商品価値を有するものであるが、種子が全くないと果実の成熟が正常ではなく品質が低下することが知られている。本発明の方法により、種子の数を任意に制御することが可能となり、種子が少なく品質の高い商品作物を容易に作出することを可能とするものである。
【００３５】
第１５発明、第１６発明、第１８発明は、特定の遺伝子に連鎖するゲノム領域にアンチセンスを挿入して特定の遺伝子を含まない種子のみを形成させる方法を提供する。
トランスジェニック植物において、導入された外来遺伝子は種子発生以前の段階においてさまざまな利用価値、例えば耐病性や耐寒性などを付与するものである。しかしながら、外来遺伝子が種子内で発現すると種子や胚乳の品質に悪影響を与えることがある。また、現在のところトランスジェニック食品に対する抵抗感があり、食用となる種子（胚乳）に外来遺伝子が含まれないことが望ましい。本発明は、導入された外来遺伝子の近傍のゲノム領域にＭＡＡ３遺伝子のアンチセンスを挿入することにより、減数分裂時に外来遺伝子とＭＡＡ３アンチセンスを連鎖させて、外来遺伝子を有する雌性配偶体を致死にすることを可能とするものである。この方法は、例えば外来遺伝子を導入するときにＭＡＡ３アンチセンスも同じコンストラクトに含めて導入することにより可能となる。この方法により外来遺伝子を種子や胚乳に含まないトランスジェニック植物由来食品を生産することが可能となる。
また、特定の対立遺伝子の近傍のゲノム領域にＭＡＡ３アンチセンスを導入する方法としては、標的となる対立遺伝子の近傍の塩基配列を特定し、相同組み換えを利用してＭＡＡ３アンチセンスを挿入する方法などが可能である。この方法により種子や胚乳の品質に悪影響を及ぼす遺伝子を、種子や胚乳から取り除くことが可能となる。
【００３６】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
実施例１：　ｍａｇａｔａｍａ突然変異体のスクリーニング
雌性配偶体発生の突然変異の単離法として、さやの中の種子数が半数になることを指標として一次スクリーニングする方法を考えた。
ＷＳ系統とＣｏｌ系統のＴ−ＤＮＡ挿入変異体約５５０ファミリーのスクリーニングを行った。さやで種子数が半数になり、分離比が１対１に近く、また雌性配偶体が１核期に発生し、花粉が正常であるという指標を用いてスクリーニングを行った。その結果、４つの雌性配偶体発生の突然変異体を単離することが出来た。雌しべの中で受精できないままに発生を停止している胚珠の形から、ｍａｇａｔａｍａ（ｍａａ）突然変異体と名付けた。本発明ではｍａａ１、ｍａａ２、ｍａａ３のうち、突然変異とＴ−ＤＮＡが連鎖していたｍａａ３突然変異体について解析を行った。突然変異とＴ−ＤＮＡの連鎖の検定方法は実施例３に記載する。
【００３８】
［植物の栽培方法］
シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　（Ｌ．）　Ｈｅｙｎｈ．のＷＳ，Ｃｏｌ，Ｌｅｒ野生型を用いた。バーミキュライトに少量のパーライトを混合したものをポットに入れ、表面を細粒のパーライトで覆ってその上に種子を蒔いた。２日間温度４℃においたのち、温度２２℃、湿度５０％前後、５０〜１００μＥ／ｍ２／ｓｅｃの照明の植物栽培室で育てた。肥料にはハイポネクックス５−１０−５（ハイポネックスジャパン）の１０００倍希釈液を与えた。
［突然変異体のスクリーニング］
基礎生物学研究所遺伝子第一部門で作製された　ＷＳのＴ−ＤＮＡ挿入ラインのＴ２の３５６ファミリーをそれぞれ約１５個体ずつ。ここから単離されたｖｗ３８６，ｖｗ４１３，ｖｗ４３８をそれぞれｍａａ１，ｍａａ２，ｍａａ３と名付けた。ｍａａ１はＭＰ５−１ベクター、ｍａａ２とｍａａ３はｐＧＶ３８５０：ＨＰＴベクターを用いて作製されたラインから単離された。
・荒木崇博士によってｐＧＶ３８５０：１００３を用いて作製されたＣｏｌのＴ−ＤＮＡ挿入ラインのＴ２の約１００ファミリー。ここから．ｍａａ４突然変異体が単離された。
【００３９】
実施例２：　ｍａａ３変異体の顕微鏡観察。
ｍａａ３突然変異体は雌性配偶体致死であるため、ホモ接合体は全く得られなかった。以下、ｍａａ３突然変異体とはへテロ接合体を指す。へテロ接合体内の雌性配偶体のうち、半数がｍａａ３雌性配偶体、半数が野生型雌性配偶体である。
ＷＳ野生型とのｍａａ３突然変異体の雌性配偶体を、透明化して微分干渉顕微鏡で観察した。雌性配偶体の発生ステージは、本研究の途中で発表されたＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９７）の核の数に基づいたシステムに従った。雌性配偶体の各細胞の核は、周りの細胞の核よりも非常に大きい核小体を一つだけ持つことが知られている。核小体は円形の構造として観察され、微分干渉顕微鏡でも明瞭に見分けられる（Ｗｉｌｌｅｍｓｅ　ａｎｄ　ｖａｎ　Ｗｅｎｔ，１９８４；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。
ｍａａ３から受粉直後の雌しべを採取し、内部の雌性配偶体を観察した。すると、野生型表現型の雌性配偶体に混ざって、異常な雌性配偶体が観察された。まず、中央細胞の２つの極核が融合していない。これは、発生ステージとしてはステージＦＧ５に当たる。また、各細胞の核小体が小型である。特に、中央細胞の核小体は融合前後共に、野生型では内部に円い構造が見られるのに対し、ｍａａ３には見られない。ヒマワリなどで中央細胞の核小体には、機能はわからないものの、１，２個の大きな液胞と多数の小さな液胞があることが知られており（Ｎｅｗｃｏｍｂ，１９７３；総説　Ｗｉｌｌｅｍｓｅ　ａｎｄｖａｎ　Ｗｅｎｔ，１９８４）、これに対応するのではないかと思われる。野生型では融合前の二つの核小体のサイズはほぼ同じだが、ｍａａ３ではしばしば大きさに差がある。
図２に微分干渉顕微鏡により撮影された写真を示す。
図２Ａ：雌ずいの中で半数の雌性配偶体は野生型であり、受精して胚発生が進んでいるため肥大化している（ｗｔ）、残りの半数は、雌性配偶体の発生異常のため、コンマ型のステージで停止している（ｍｕ）。（ｅｍ）は発達中の胚を示す。
図２Ｂ：野生型の雌性配偶体を示す。
図２Ｃ：ｍａａ３突然変異体の雌性配偶体を示す。発生が遅れ極核の融合が起こっていない。他の核は焦点外。ａ：反足細胞、ｃ：中央細胞核、ｅ：卵細胞核、ｐ：極核、ｓ：助細胞核、スケールバーは５０μｍ。
【００４０】
［微分干渉顕微鏡による観察］
採集した花をまずエタノール９：酢酸１の溶液につけ、３０分間脱気したのち一晩固定した。９０％エタノール、７０％エタノールに２０分以上ずつつけたのち、Ｈｏｙｅｒ溶液（アラビアゴム７．５ｇ、抱水クロラール１００ｇ、グリセロール５ｍｌを水３０ｍｌに溶かす）にしばらく浸けて透明化した。そして、Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＳＺＨ実体顕微鏡をもちいて雌しべをダイセクトして胚珠を取り出した。ノマルスキー装置の入ったＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏ　ｐｈｏｔ２顕微鏡で微分干渉像を観察し、ＤＡＴＡＢＡＣＫ　Ｄ４カメラで写真を撮影した。または、ノマルスキー装置の入ったＯｌｙｍｐｕｓ　ＡＸ７０顕微鏡で微分干渉像を観察し、Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＰＭ‐Ｃ５３ＤＸカメラで写真を撮影した。
【００４１】
実施例３：　ｍａａ３突然変異体の分子遺伝学的解析
（１）ｍａａ３突然変異とＴ−ＤＮＡの連鎖
ｍａａ３突然変異体は、ｐＧＶ３８５０：ＨＰＴの挿入系統のスクリーニングから単離された。ｐＧＶ３８５０：ＨＰＴのＴ−ＤＮＡはハイグロマイシン耐性遺伝子を持つ。そこで、ｍａａ３突然変異がＴ−ＤＮＡと連鎖しているかどうかを調べるため、ハイグロマイシン耐性を利用した。ｍａａ３へテロ接合体からの次世代の植物５１個体から葉を一枚ずつ採り、ハイグロマイシンを含む培地上に３日間置いた。ｍａａ３突然変異体表現型を示した２３個体から採った葉は、全て緑色のままであった。これはハイグロマイシン耐性であることを示している。一方、野生型の２８個体は全て白色となり、ハイグロマイシン感受性であった。この結果は、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＴ−ＤＮＡが、ｍａａ３突然変異と連鎖しており、かつハイグロマイシン耐性遺伝子がゲノム中の一座位にのみ挿入されていることを示唆する。
さらに連鎖を確認するため、Ｔ−ＤＮＡのライトボーダー付近をプロープとして、ｍａａ３突然変異体４個体由来のＤＮＡに対してサザンハイプリダイゼーションを行った。その結果を図４に示す。すると、４個体全てにおいて、同じバンドパターンが見られた。これは、ｍａａ３突然変異とＴ−ＤＮＡが連鎖していることを示す。また、２本のバンドが見られたことから、一座位にタンデムにＴ−ＤＮＡが挿入されていることが示された。
［ハイグロマイシン耐性の検定］
培地は、１×ガンボーグＢ５塩、ショ糖２％、Ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ（ＤＩＦＣＯ）０．８％、ハイグロマイシンＢを５０μｇ／ｍｌ含み、ＫＯＨでｐＨ５．７〜５．８に調製した。植物体の葉を切り取り、培地上に３日間置いた。白色になったものをハイグロマイシン感受性、緑色を維持したものをハイグロマイシン耐性と判定した。
【００４２】
（２）ｍａａ３原因遺伝子の単離
ｍａａ３突然変異がＴ−ＤＮＡと連鎖していることに基づき、Ｔ−ＤＮＡの近傍配列を単離することでｍａａ３遺伝子を単離することを計画した。まず、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法を用いた。レフトボーダー付近を用いた場合、ＰＣＲ産物の増幅が全く見られなかった。ライトボーダー付近を用いた場合、任意プライマーにＡＤ２を用いた場合に、バンドの増幅が見られた。このバンドをシークエンスしたところ、これはシロイヌナズナのゲノム配列ではなく、バイナリーベクターのレフトボーダー近くのＴ−ＤＮＡ外の配列であった。Ｔ−ＤＮＡがタンデムに挿入されているという前節の結果も合わせると、Ｔ−ＤＮＡは、近傍のＴ−ＤＮＡ外の配列も含めて複雑に挿入されていると考えられる。
このために、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法では、Ｔ−ＤＮＡに近接するシロイヌナズナゲノム配列が単離できなかったと考えられる。
この結果は、Ｔ−ＤＮＡのライトボーダーの少なくとも一つがシロイヌナズナゲノム配列と接していないことを示した。そこで、レフトボーダーの近傍配列をｌｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法を用いて単離することを考えた。まず、レフトボーダー付近の配列を用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った。すると、ライトボーダーと同様に、レフトボーダーもｍａａ３突然変異と連鎖していた。そこで、レフトボーダー付近の配列のプライマーを用いてＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを行い、一つのバンドを得た。このバンドをシークエンスしたところ、Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー付近の配列に引き続いて、シロイヌナズナ第４染色体のＡＴＦＣＡ４と呼ばれるコンティグ配列の６１４７４−６１５４５ｂｐと一致する配列が見られた（図５）。これが、Ｔ−ＤＮＡに隣接するシロイヌナズナゲノム配列だと考えられる。一方、Ｔ−ＤＮＡのレフトボーダーは、末端から３８ｂｐを欠失しており、この欠失にはＴＡＩＬ−ＰＣＲで用いたプライマーの配列が含まれることから、これがＴＡＩＬ−ＰＣＲで増幅しなかった理由だと考えられる。
【００４３】
単離した領域にＭＡＡ３遺伝子が存在することを確認するため、サザンハイブリダイゼーションを行った。プローブには、Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲで単離した配列付近にあるＡＴＦＣＡ４の６０４２９−６１２５５ｂｐの配列を用い、ＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＷＳ野生型ＤＮＡでは、１．３ｋｂのバンドのみが見られたのに対し、ｍａａ３突然変異体（ヘテロ接合体）ＤＮＡでは、１．３ｋｂに加えて５ｋｂのバンドが見られた。これは、この領域にＴ−ＤＮＡが挿入されていることを示す。
また、上記のプローブは、Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲで単離されたゲノム配列に対して、Ｔ−ＤＮＡを挟んで反対側に設計したものである。このブローブで突然変異体に特有なバンドが見られたことにより、Ｔ−ＤＮＡの反対側に大きなＤＮＡ欠失がないことが示された。
Ｔ−ＤＮＡ挿入部位付近は、ゲノムプロジェクトによるアノテーションによれば、ｄ１３８２１ｗ遺伝子とｄ１３８２５ｗ遺伝子の間に挟まれた領域であった（Ｂｅｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。アノテーンョンが間違っている可能性を検討するため、ＡＴＦＣＡ４コンティグの６０００１−７００００ｂｐの１０ｋｂをＧＥＮＥＳＣＡＮプログラムにかけて遺伝子構造の予測を行った。すると、Ｔ−ＤＮＡ挿入部位の２１４ｂｐ下流の６１６８８位に開始コドンがあり１８エキソンからなる遺伝子が予想された（図３）。この後半はｄ１３８２５ｗ遺伝子と一致した。ＮｅｔＰｌａｎｔＧｅｎｅ，ＧＲＡＩＬによる予測も基本的に一致した。そこで、この遺伝子のｃＤＮＡをＰＣＲ法、５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法により単離したところ、２１エキソンからなり長さ２７０８ｂｐであった。プログラムで予想されなかった第一エキソンがあり、結局Ｔ‐ＤＮＡはこの遺伝子の第一イントロンに挿入されて遺伝子を分断していた。そこで、この遺伝子がｍａａ３突然変異の原因遺伝子であると結論づけた。これ以降、ＭＡＡ３遺伝子と表す。
【００４４】
［分子生物学的解析］
一般の試薬類はおもに和研薬、もしくはナカライテスクから購入した。酵素類は主にＴａＫａＲａから購入した。アイソトープ標識した［α‐３２Ｐ］ｄＣＴＰはＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。
酵素反応、ＤＮＡプロット、ＰＣＲの方法は、一般的なプロトコールに従った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ａｎｄ　Ｒｕｓｓｅｌ，２００１）。ＰＣＲには特に記さない限りＴａＫａＲａ　ＥｘＴａｑを用いた。ＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ　Ｐ１ａｎｔＭｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。ＤＮＡシークエンシングは、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔｓ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いてシークエンス反応をした後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ）、ＡＢＩＰＲＩＳＭ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ）、ＡＢＩＰＲＩＳＭ　３１００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ）で配列を決定した。シークエンスデータはＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｖｅｒ．３．０（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ）を用いて解析した。
［植物個体からのＤＮＡの抽出］
本葉２枚程度または花序茎頂部数個を徴量遠心管にとり、２００μｌのＣＴＡＢバッファー［３％臭化セチルトリメチルアンモニウム、１．４Ｍ塩化ナトリウム、０．２％２−メルカプトエタノール、２０μＭ　ＥＤＴＡ、１００μＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）］を加えた。乳棒（Ｋｏｎｔｅｓ）をｌｕｃｈｉ　ｄｉｇｉｔａｌ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて高速回転させ、徴量遠心管中の植物組織を十分にすりつぶした。さらに３００μｌのＣＴＡＢバッファーを加えて、６０℃で３０分間保温した。５００μｌのクロロホルムを加え、静かに混合し、５０００ｒｐｍで５分間室温で遠心したのち、水層を新しい微量遠心管に移した。３３３μｌのイソプロパノールを加えて静かに混合した後、室温で１５分間静置し、５０００ｒｐｍで５分間遠心した。上澄みを捨て、７０％エタノールでべレットをリンスし、１００μｌのＴＥ−ＲＮａｓｅ［１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅＡ］を加えてペレットを溶かした。ＳＳＬＰ法では、これをＤＮＡ溶液として用いた。他の用途の際には、さらにフェノール抽出とクロロホルム抽出とエタノール沈殿を行い、ＴＥに溶解した。
【００４５】
［ゲノムサザン解析］
Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー付近のプローブには、次の二つのプライマーで増幅したＰＣＲ断片をＲａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｒ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を使って［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。
ＬＢ７１：５’　ＡＴＧＴＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧ　３’
ＬＢ１４４０：５’　ＣＣＴＣＡＴＴＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣ　３’
Ｔ‐ＤＮＡライトボーダー付近のプロープの作製には、同様に次の二つのプライマーを用いた。
ＲＢ４６１：５’　ＡＧＴＣＧＣＣＴＡＡＧＧＴＣＡＣＴＡＴＣ　３’
ＲＢ２２６０：５’　ＧＡＣＧＡＡＴＴＡＧＴＧＧＧＡＡＴＡＧＣ　３’
ゲノムコンティグＡＴＦＣＡ４の６０４２９−６１２５５ｂｐの配列のプローブには、同様に次の二つのプライマーを用いた。
ｍａａ３ＲＢ１：５’　ＡＡＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＣＧＡＧ　３’
ｍａａ３ＲＢ２：５’　ＡＡＡＡＣＧＧＣＧＧＴＧＴＡＧＣＴＧＴＡＡＣ　３’
［ＴＡＩＬ−ＰＣＲ］
Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５），劉（１９９７）の方法に従った。
［Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ］
石黒（１９９４）、井沢（１９９７）の方法に基づいた。ＨｉｎｄＩＩＩで消化したゲノムＤＮＡを用いたサザンハイブリダイゼーションでは、レフトボーダー付近のプローブで５ｋｂ，４ｋｂのバンドが、ライトボーダー付近のプロープで５ｋｂ，４．５ｋｂのバンドが見られていたことから、共通している５ｋｂのバンドはしフトボーダーとライトボーダーが向かい合っていてゲノム配列に隣接していない可能性が考えられた。このバンドを排除してゲノム配列に隣接したボーダー配列のみを得るため、ｍａａ３突然変異体のゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲルで泳動して４ｋｂ付近を切り出した。セルフライゲーションし、ＳｐｈＩ消化により線状ＤＮＡにした後、レフトボーダー付近に設計した二つのプライマーによるＰＣＲを行い、増幅したバンドを単離した。
ＬＢ１：５’　ＣＡＣＧＣＣＡＴＣＧＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＣＡＴＴＡＧＡＴＴＧＴ　３’
ＬＢ２：５’　ＧＡＧＣＴＡＴＴＧＧＣＡＣＡＣＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴ　３’
［ｃＤＮＡ塩基配列の決定］
Ｃｏｌ野生型の栄養期茎頂から作製したｃＤＮＡをテンブレートにして、次の二組のプライマー対で増幅したバンドのシークエンスを決定した。
ｌｅｆ１６８０：５’　ＡＧＣＧＴＧＴＡＡＴＧＧＣＧＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＡＡＧＣ　３’
ｐｙｒｏｒＢａｍＨＩ：５’　ＧＧＡＧＴＴＧＣＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣＴＡＣＣＴＧ　３’
このプライマー対でｃＤＮＡの５’側半分が増幅された。
ｐｙｒｏｆｌＢａｍＨＩ：５’　ＧＣＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＴＡＡＡＴＣＴＡＡＣＣＧＴＧ　３’
ｌａｓｔｅｒ７５０６：５’　ＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＣ　３’
このブライマー対で、ｃＤＮＡの３’側半分が増幅された。ｃＤＮＡの５’末端と３’末端は、５’／３’ＲＡＣＥ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて増幅し、配列を決定した。
【００４６】
（３）ＭＡＡ３タンパク質の予想
ＭＡＡ３遺伝子から予想されるタンパク質は、８１８アミノ酸からなる。この配列を用いて、ＢＬＡＳＴによるホモロジーサーチを行った。機能が知られているもののうちで最も相同性が高いのが出芽酵母のＳｅｎｌｐであった。Ｓｅｎｌｐは、スーパーファミリーＩに属するヘリカーゼである。ｔＲＮＡのスプライシングやｒＲＮＡ、ｍＲＮＡの成熟など様々なＲＮＡのプロセシングに必要であり、Ｓｅｎ１遺伝子は出芽酵母の生存に必須である（ＤｅＭａｒｉａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）。
また、出芽酵母のＵｐｆ１ｐとも全長にわたって相同性を示した。Ｕｐｆ２ｐもスーパーファミリーＩに属するヘリカーゼであり、停止コドンが遺伝子中途に入ったｍＲＮＡを分解する経路（ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍＲＮＡ　ｄｅｃａｙ）で機能している。ただし、ＵｐｆｌｐがＵｐｆ２ｐとの結合ドメインであるシステインリッチ領域をＮ末端に持つのに対し、ＭＡＡ３には存在しない（Ｌｅｅｄｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２；Ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎ，１９９９）。
シロイヌナズナのデータベースに対し、ＢＬＡＳＴＰ，ＴＢＬＡＳＴＮでサーチを行うと、ＭＡＡ３全長にわたって高い相同性を示す機能未知のｐｕｔａｔｉｖｅ　ｇｅｎｅが４つ見つかった。機能が知られているものでは、ＳＤＥ３が全長にわたってやや弱いながらも相同性を示した。ＳＤＥ３は、ＰＴＧＳの異常な突然変異体のみの原因遺伝子として単離されたものである。また、植物のタンパク質としては他に、イネに高い相同性を示すものが一つ見つかった。
これらの配列のアライメントを行った（図６〜８）。ＭＡＡ３はＮ末から７５５番目のアミノ酸までほぼ全長にわたってＳｅｎｌｐなどと相同性を示した。ただ、Ｍ４Ａ３はその他のスーパーファミリーＩへリカーゼに比べ、Ｎ末が短い。スーパーファミリーＩへリカーゼの７つのコンセンサス配列全てがＭＡＡ３の後半に見られた。近隣結合法により、系統樹をＭＡＡ３の４８４番目から７５５番目のアミノ酸に当たる部分を用いて作成した。その結果、ＭＡＡ３は出芽酵母Ｓｅｎｌｐのシロイヌナズナにおける相同タンパク質の一つであることが高いブーツストラップの値で支持された。シロイヌナズナにはさらに３つのＳｅｎｌｐ相同タンパク質がある。
（４）ＭＡＡ３遺伝子の発現解析
ＲＴ−ＰＣＲ法によりＭＡＡ３遺伝子の発現を解析した。花、果実、栄養期茎頂、葉、根と、全ての調べた組織おいて、同じレベルで発現していた。
［ＲＴ−ＰＣＲ］
各組織のＲＮＡ０．４μｇに対し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を用いて、ＤＮａｓｅ処理しオリゴｄＴプライマーでｃＤＮＡを合成した。２０μｌのうち、０．５μｌと次の二つのプライマーを用い、９４℃３分（９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分）×３５のサイクルでＰＣＲを行った。
ＰｙｒｏｆＢａｍＨＩ‐２：５’　ＧＴＡＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧ　３’
ｌａｓｔｅｒ７５０６：５’　ＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＣ　３’
ポジティブコントロール反応には、ＡＣＴ８を用いた（Ａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６；Ａｉｄａ　ｅｔ
ａｌ．，１９９７）。
プライマーは次の二つである。
ＡＣＴ８ｆ：５’　ＡＴＧＡＡＧＡＴＴＡＡＧＧＴＣＧＴＧＧＣＡ　３’
ＡＣＴ８ｒ：５’　ＴＣＣＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧＣＴＡＣ　３’
【００４７】
【発明の効果】
本発明の遺伝子ＭＡＡ３を利用することにより、雌性配偶体を致死性にすることができる。
また、本発明の遺伝子を利用することにより、果実などの種子数を減少させることができる。また、トランスジェニック作物などで外来遺伝子を含まない種子（胚乳）のみを形成させる技術を可能にする。
【００４８】
【配列表】
2004024106.tif 000002
2004024106.tif 000003
2004024106.tif 000004
2004024106.tif 000005
2004024106.tif 000006
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2004024106.tif 000008
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2004024106.tif 000010
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2004024106.tif 000012
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2004024106.tif 000020
2004024106.tif 000021
2004024106.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【図１】シロイヌナズナの有性生殖を示す。胚珠では、減数分裂が起こり近位端の１細胞が生き残る、続いてｎのままで分裂が進み、７細胞８核の雌性配偶体となる。これは、卵細胞、中央細胞、２つの助細胞、３つの反足細胞からなる。雄ずいの葯では、減数分裂に続く体細胞分裂でｎの花粉（２または３細胞）が作られる。花粉は雌ずいの柱頭まで運ばれると、接着・発芽して花粉管を作る。２つの精細胞が、花粉管によって長い道のりを雌性配偶体まで運ばれ、重複受精する。つまり、雌性配偶体の卵細胞（ｎ）が受精して胚（２ｎ）が作られ、中央細胞（ｎ＋ｎ）が受精すると胚乳（３ｎ）が作られる。
【図２】微分干渉顕微鏡により撮影された写真を示す。
図２Ａ：雌ずいの中で半数の雌性配偶体は野生型であり、受精して胚発生が進んでいるため肥大化している（ｗｔ）、残りの半数は、雌性配偶体の発生異常のため、コンマ型のステージで停止している（ｍａ）。（ｅｍ）は発達中の胚を示す。
図２Ｂ：野生型の雌性配偶体を示す。
図２Ｃ：ｍａａ３突然変異体の雌性配偶体を示す。発生が遅れ極核の融合が起こっていない。他の核は焦点外。ａ：反足細胞、ｃ：中央細胞核、ｅ：卵細胞核、ｐ：極核、ｓ：助細胞核、スケールバーは５０μｍ。
【図３】ＭＡＡ３の遺伝子構造を示す。Ｔ−ＤＮＡ挿入部位の２１４ｂｐ下流に開始コドンがあり１８エキソンからなる遺伝子である。
【図４】Ｔ−ＤＮＡのライトボーダー付近をプロープとして、ｍａａ３突然変異体４個体由来のＤＮＡに対してサザンハイプリダイゼーションを行った結果を示す。すると、４個体全てにおいて、同じバンドパターンが見られた。これは、ｍａａ３突然変異とＴ−ＤＮＡが連鎖していることを示す。また、２本のバンドが見られたことから、一座位にタンデムにＴ−ＤＮＡが挿入されていることが示された。
【図５】Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲにより得られたバンドをシークエンスした結果を示す。Ｔ−ＤＮＡレフトボーダー付近の配列に引き続いて、シロイヌナズナ第４染色体のＡＴＦＣＡ４と呼ばれるコンティグ配列の６１４７４−６１５４５ｂｐと一致する配列が見られた。
【図６】ＭＡＡ３タンパク質、Ｓｅｎｌｐ、その他のスーパーファミリーＩへリカーゼのアミノ酸配列の比較をしたアラインメントを示す。
【図７】図６のつづきを示す（２ページ目）。
【図８】図６のつづきを示す（３ページ目）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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