(57)【要約】【課題】担体に標的成分に対して結合親和力を有する分子を担持・固定化してなる構造体を利用して、標的成分の分離・回収、検出、スクリーニングを行う際、標的成分ならびに標的成分結合分子を、より生体条件に近い条件に維持して、標的成分の分離・回収、検出、スクリーニングを行うことを可能とする方法の提供。【解決手段】標的成分の分離・回収、検出、スクリーニングに利用する、標的成分結合分子４を固定する担体として、生体親和性の高い高分子材料である、ポリヒドロキシアルカノエート２で少なくとも担体基材１（磁性体）表面の一部を被覆したものを用いることで、より生体条件に近い条件に維持されている担体表面において、その表面に担持される標的成分結合分子と標的成分との結合がなされる方法となる。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれる標的成分を分離する方法であって、
前記標的成分に対して結合親和力を有する分子が、その表面に固定された担体を用意する工程と、
前記担体と前記検体とを混合する工程と、
前記混合工程において混合される、前記検体中に含まれる標的成分と、前記担体表面に固定されている前記結合親和力を有する分子とを結合させる工程と、
前記結合工程により、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記検体中から分離する工程とを有し、
前記担体は、ポリヒドロキシアルカノエートで少なくとも一部を被覆されていることを特徴とする標的成分の分離方法。
【請求項２】
前記担体は、磁性体を含んでなる担体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含有するポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記検体中から分離する工程において、
前記磁性体を含んでなる担体に対して、磁界を作用させて、前記検体より磁気的に分離する工程を有することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記標的成分に対して結合親和力を有する分子の、前記担体表面への固定は、
前記担体表面の少なくとも一部を被覆されている、前記ポリヒドロキシアルカノエートとして、エポキシ基、アミノ基、カルボキシ基、およびハロゲン分子からなる群から選択される官能基を一つ以上有するポリヒドロキシアルカノエートを用い、
前記ポリヒドロキシアルカノエートの有する官能基の少なくとも一つ以上を利用して、前記標的成分に対して結合親和力を有する分子を固定化することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記担体表面へに固定される、前記標的成分に対して結合親和力を有する分子は、
核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、脂質、低分子化合物、およびこれらの複合体からなる群より選択される一種類以上を含んでいる分子であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記検体中から分離される前記標的成分は、
核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、脂質、低分子化合物、およびこれらの複合体からなる群より選択される一種類以上を含んでいる成分であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記磁性体を含んでなる担体の形状は、粒状であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記磁性体を含んでなる担体の形状は、平板状またはフィルム状であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記磁性体を含んでなる担体中の磁性体は、磁性を有する金属または金属化合物からなる磁性体であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
検体中に含まれる標的成分を検出する方法であって、
前記標的成分に対して結合親和力を有する分子が、その表面に固定された担体を用意する工程と、
前記担体と前記検体とを混合する工程と、
前記混合工程において混合される、前記検体中に含まれる標的成分と、前記担体表面に固定されている前記結合親和力を有する分子とを結合させる工程と、
前記結合工程により、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分について、選択的に検出する工程とを有し、
前記担体は、ポリヒドロキシアルカノエートで少なくとも一部を被覆されていることを特徴とする標的成分の検出方法。
【請求項１２】
前記結合工程により、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分について、選択的に検出する工程は、
前記結合工程により、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記検体中から分離する工程と、
前記担体とともに前記検体中から分離される、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分について、選択的に検出する工程とを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記担体は、磁性体を含んでなる担体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記担体は、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含有するポリヒドロキシアルカノエートで少なくとも一部を被覆されている担体であることを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記検体中から分離する工程において、
前記磁性体を含んでなる担体に対して、磁界を作用させて、前記検体より磁気的に分離する工程を有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記担体に固定化された前記標的成分について、選択的に検出する工程において、
検出手法として、比色法、蛍光法、化学発光法、ラジオアイソトープ法からなる群から選択される一つの検出手法または、二つ以上の検出手法の組み合わせを用いることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記担体に固定化された前記標的成分について、選択的に検出する工程において、
検出手法として、核磁気共鳴スペクトロスコピー、マススペクトロスコピー、赤外吸収スペクトロスコピー、および紫外吸収スペクトロスコピーからなる群から選択される一つの検出手法または、二つ以上の検出手法の組み合わせを用いることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
媒体中に含まれる標的成分のスクリーニング方法であって、
前記スクリーニングは、前記標的成分を含んだ混合物が前記媒体中に含まれる混合試料を対象とし、
前記標的成分に対して結合親和力を有する分子が、その表面に固定された担体を用意する工程と、
前記担体と前記混合試料とを混合する工程と、
前記混合工程において混合される、前記混合試料中に含まれる標的成分と、前記担体表面に固定されている前記結合親和力を有する分子とを結合させる工程と、
前記結合工程により、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記混合試料中から分離する工程とを有し、
前記担体は、ポリヒドロキシアルカノエートで少なくとも一部を被覆されていることを特徴とする標的成分のスクリーニング方法。
【請求項１９】
前記担体は、磁性体を含んでなる担体であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含有するポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記混合試料中から分離する工程において、
前記磁性体を含んでなる担体に対して、磁界を作用させて、前記混合試料より磁気的に分離する工程を有することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体中に含有される、特定の標的成分を分離する方法、該標的成分を検出する方法、あるいは、特定の標的成分をスクリーニングする方法に関し、より具体的には、特定の標的成分に対する特異的な親和結合性を有する分子、例えば、天然由来の、あるいは人工的な改変を施さた核酸分子、タンパク質およびペプチド、糖鎖、脂質、低分子化合物、ならびにこれらの複合体を利用し、担体の表面上に前記特異的な親和結合性を有する分子を担持した構造体とした上で、該構造体と特定の標的成分との結合を行わせることによって、検体中に含有される特定の標的成分を選択的に分離する方法、検出する方法、または、スクリーニングする方法、さらには、前記方法の実施に専ら利用可能な装置に関する。
【０００２】
【背景技術】
検体試料中に含まれる標的成分、特には、医学的治療・診断に有効な、あるいは産業的に価値のある標的成分に関して、その分離・回収、検出、スクリーニングを行う際、例えば、プローブ分子等、標的成分に対して結合親和力を有する分子を担持する担体として、マイクロメートルサイズからナノメートルサイズの微小な微粒子を用いる分離・回収、検出、スクリーニング方法が様々に開発、利用されている。特に、前記担体として、磁性を有する微粒子（以下、磁性微粒子と称する）を利用する方法は、検体試料から担体を分離、回収する際、磁性微粒子は、磁力による分離、回収が容易に行える利点を有している。そのため、磁性微粒子を利用する方法における、多くの開発例を挙げることができる。
【０００３】
上記のプローブ分子等を担持する担体として利用される、磁性微粒子の多くは、その安定性の向上、磁性の制御等の目的で、表面を有機高分子により被覆された形で用いられる。
【０００４】
有機高分子により被覆された磁性微粒子の、担体への応用の一領域として、従来から、抗原抗体反応を利用した免疫検出・診断方法が開発されてきた。
【０００５】
その一例として、特開平０７−１５１７５５号公報には、担体として、ローヌプーラン社製  平均粒径０．７μｍの磁性体含有ポリスチレンラテックス粒子を用いて、免疫検出を行う方法が開示されている。
【０００６】
特開平１０−２２１３４１号公報には、日本ダイナル社製  トシル化磁性微粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０、平均粒径２．８μｍ）を用いた免疫測定方法が開示されている。同じく、特開平０９−２２９９３６号公報には、磁性微粒子  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ｕｎｃｏａｔｅｄ、ダイナル社製、粒径：４．５  μｍ、３％（ｗ／ｖ）を用いた免疫測定方法および装置が開示されている。
【０００７】
また、有機高分子により被覆された磁性微粒子の、担体への応用の更なる一領域として、ＤＮＡ等の核酸分子の検査・診断方法が挙げられる。
【０００８】
特開平０５−２８１２３０号公報には、担体用の磁性微粒子として、ディノ・インダストリア社（Ｄｙｎｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｒ  Ａ．  Ｓ．，Ｎｏｒｗａｙ）製ＸＰ−６００６を用い、抗原抗体反応に加え、ＤＮＡ等の核酸分子の検査診断方法が開示されている。
【０００９】
加えて、有機高分子により被覆された磁性微粒子の応用の更なる一領域として、標的成分の分離・回収方法も開発されてきている。
【００１０】
特開平０９−３０４３８５号公報には、ダイナビーズ  Ｍ−４５０  アンコーテッド  （ダイナル社：Ｄｙｎａｌ）（磁性微粒子自体の直径：４５μｍ）を用いた好塩基球の分離・回収方法および装置が開示されている。
【００１１】
特開平１０−０６８７３１号公報には、ローヌ−プーラン（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ）社製磁性微粒子を、免疫学的に活性な物質、または核酸との共有結合を形成させる磁性微粒子として用いて、液体中の被検成分を磁気的に分離する方法が開示されている。
【００１２】
また、米国特許第４，２３０，６８５号、同第３，９７０，５１８号、同第５，５０８，１６４号、同第５，５６７，３２６号および同第４，０１８，８８６号の米国特許公報においても、磁性微粒子を標的成分に結合せしめ、磁性微粒子と結合した標的成分を処理および分離するために用いる方法が開示されている。
【００１３】
米国特許第５，９００，４８１号には、コーティングを施した磁性微粒子を用いて、ＤＮＡを結合することにより、そのＤＮＡに操作を施すことが開示されている。
【００１４】
米国特許第５，８３４，１９７号には、コーティングを施した磁性微粒子を用いて、液体から一定種の菌株を捕捉する方法が開示されている。このビーズには、抗原に対する選択的親和力を備えている、標識抗体を添加して、対象の抗原を挟持させ、標識抗体と反応する抗原を容易に検出および回収できるように、磁性微粒子に検知可能な標識を結合させる方法が開示されている。
【００１５】
以上に述べた特許文献以外に、磁性微粒子に結合される様々な分子の操作に関する開示を含む非特許文献として、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６８（１３）：２１２２〜６（１９９６）およびＮｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ  ２３（１６）：３１２６〜３１（１９９５年）を挙げることができる。
【００１６】
加えて、上で述べた磁性微粒子以外にも、標的成分を検出・回収・スクリーニングする方法に用いる目的で既に市販されている磁性微粒子の例として、スフェロテック（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）社のフェロマグネティック・パーティクル（Ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ）、セラディン（Ｓｅｒａｄｙｎ）社のセラ−マグ（Ｓｅｒａ−Ｍａｇ）、バングス・ラボラトリー（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）社のエスタポール（Ｅｓｔｅａｐｏｒ）を挙げることができる。
【００１７】
【特許文献１】
特開平０７−１５１７５５号公報
【特許文献２】
特開平１０−２２１３４１号公報
【特許文献３】
特開平０９−２２９９３６号公報
【特許文献４】
特開平０５−２８１２３０号公報
【特許文献５】
特開平０９−３０４３８５号公報
【特許文献６】
特開平１０−０６８７３１号公報
【特許文献７】
米国特許第４，２３０，６８５号明細書
【特許文献８】
米国特許第３，９７０，５１８号明細書
【特許文献９】
米国特許第５，５０８，１６４号明細書
【特許文献１０】
米国特許第５，５６７，３２６号明細書
【特許文献１１】
米国特許第４，０１８，８８６号明細書
【特許文献１２】
米国特許第５，９００，４８１号明細書
【特許文献１３】
米国特許第５，８３４，１９７号明細書
【非特許文献１】
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８（１３）：２１２２〜６（１９９６）
【非特許文献２】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３（１６）：３１２６〜３１（１９９５年）
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
標的成分の分離・回収方法、検出方法、スクリーニング方法において、対象とする標的成分は、生理的活性を有するか、あるいは医療・診断に対し有効である場合が多く、そのためできるだけ生体条件に近く、生理条件を損なわないような環境中で操作を行うことが望ましい。しかし、上記する従来の磁性微粒子を含む担体に用いた方法では、該磁性微粒子の表面を被覆あるいはコーティングしている被覆層成分は、スチレン系、アクリル系、ビニル系等の合成高分子であるため、非特異吸着の課題や、合成高分子中の残留モノマー成分の漏出による機能の低下といった課題が依然として生じている。さらには、標的成分のみならず、磁性微粒子を含む担体上に担持・固定化される標的成分結合分子も、生体由来の成分かあるいは、その派生物質である場合が多く、該磁性微粒子を含む担体の被覆層に用いている、非天然の高分子表面がこれら標的成分結合分子の標的成分に対する結合機能に悪影響を及ぼしていないとは断言できない。
【００１９】
本発明は、前記の課題を解決するものであり、担体上に標的成分結合分子を担持・固定化してなる構造体を利用して、標的成分の分離・回収、検出、スクリーニングを行う際、対象とする標的成分、ならびに、担体上に担持・固定化されている標的成分結合分子を、より生体条件に近い条件に維持して、標的成分の分離・回収、検出、スクリーニングを行うことを可能とする方法を提供するものである。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく、鋭意研究を進めたところ、標的成分の分離・回収、検出、スクリーニングを行う際、利用する担体上に標的成分結合分子を担持・固定化してなる構造体について、その担体の表面に設ける高分子被覆層として、従前の非天然の高分子に代えて、生体親和性の高い高分子材料を用いることで、より生体条件に近い条件を維持可能であることを見出した。さらには、担体の表面に設ける高分子被覆層に利用する生体親和性の高い高分子材料として、微生物等の生物細胞内で酵素的に重合されるポリマーであるポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと略記する場合もある）を採用すると、より好ましい結果が得られることも見出した。
【００２１】
一方、本発明者らは既に、微生物等の生物細胞内で酵素的に重合されるポリマーであるポリヒドロキシアルカノエートについて、人工構造体上に固定・担持したＰＨＡ合成酵素に該ＰＨＡの前駆体モノマーである３−ヒドロキシアシルＣｏＡを接触させて酵素的に重合反応を行わせしむことにより、該人工構造体表面を良好に生成するＰＨＡで被覆せしめる方法を見出している（特開２００２−３２７０４６号公報、および特開２００３−１１３１２号公報参照）。
【００２２】
本発明者らは、この手法を、例えば、磁性体を含む担体に応用することにより、該磁性体を含む担体の表面を該ＰＨＡで被覆する構造体を調製することが可能であり、さらには、被覆層に用いるＰＨＡ自体は、生分解性および生体適合性に優れた材料であることから、この様なＰＨＡ被覆を施した磁性体を含む担体上に、所望の標的成分結合分子を担持・固定化してなる構造体は、生化学分野、診断分野、医療分野、創薬分野に利用価値の大きい標的成分を、良好に分離・回収、検出、スクリーニングし得ることを検証して、本発明を完成するに至った。
【００２３】
すなわち、本発明にかかる標的成分の分離方法は、
検体中に含まれる標的成分を分離する方法であって、
前記標的成分に対して結合親和力を有する分子が、その表面に固定された担体を用意する工程と、
前記担体と前記検体とを混合する工程と、
前記混合工程において混合される、前記検体中に含まれる標的成分と、前記担体表面に固定されている前記結合親和力を有する分子とを結合させる工程と、
前記結合工程により、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記検体中から分離する工程とを有し、
前記担体は、ポリヒドロキシアルカノエートで少なくとも一部を被覆されていることを特徴とする標的成分の分離方法である。
【００２４】
その際、前記担体として、磁性体を含んでなる担体を用いることができる。例えば、前記ポリヒドロキシアルカノエートとして、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含有するポリヒドロキシアルカノエートを好適に利用できる。磁性体を含んでなる担体を用いる際には、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記検体中から分離する工程において、
前記磁性体を含んでなる担体に対して、磁界を作用させて、前記検体より磁気的に分離する工程を採用することが好ましい。
【００２５】
一方、本発明にかかる標的成分の分離方法に利用する、前記標的成分に対して結合親和力を有する分子の、前記担体表面への固定は、
前記担体表面の少なくとも一部を被覆されている、前記ポリヒドロキシアルカノエートとして、エポキシ基、アミノ基、カルボキシ基、およびハロゲン分子からなる群から選択される官能基を一つ以上有するポリヒドロキシアルカノエートを用い、
前記ポリヒドロキシアルカノエートの有する官能基の少なくとも一つ以上を利用して、前記標的成分に対して結合親和力を有する分子を固定化することが好ましい。
【００２６】
また、本発明にかかる標的成分の分離方法は、前記担体表面へに固定される、前記標的成分に対して結合親和力を有する分子は、
核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、脂質、低分子化合物、およびこれらの複合体からなる群より選択される一種類以上を含んでいる分子である場合に、好適に適用できる。加えて、前記検体中から分離される前記標的成分は、
核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、脂質、低分子化合物、およびこれらの複合体からなる群より選択される一種類以上を含んでいる成分である場合に、本発明にかかる標的成分の分離方法は、より好適な方法となる。
【００２７】
なお、本発明にかかる標的成分の分離方法では、利用する担体の形状は、任意に選択することが可能であり、例えば、前記磁性体を含んでなる担体の形状は、粒状であることが、一般に望ましいが、用途に応じて、前記磁性体を含んでなる担体の形状として、平板状またはフィルム状を選択することも可能である。なお、前記磁性体を含んでなる担体中の磁性体は、磁性を有する金属または金属化合物からなる磁性体であることが望ましい。
【００２８】
また、本発明にかかる標的成分の検出方法は、
検体中に含まれる標的成分を検出する方法であって、
前記標的成分に対して結合親和力を有する分子が、その表面に固定された担体を用意する工程と、
前記担体と前記検体とを混合する工程と、
前記混合工程において混合される、前記検体中に含まれる標的成分と、前記担体表面に固定されている前記結合親和力を有する分子とを結合させる工程と、
前記結合工程により、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分について、選択的に検出する工程とを有し、
前記担体は、ポリヒドロキシアルカノエートで少なくとも一部を被覆されていることを特徴とする標的成分の検出方法である。
【００２９】
その際、前記結合工程により、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分について、選択的に検出する工程は、
前記結合工程により、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記検体中から分離する工程と、
前記担体とともに前記検体中から分離される、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分について、選択的に検出する工程とを含む構成を採用することが好ましい。
【００３０】
本発明にかかる標的成分の検出方法でも、前記担体として、磁性体を含んでなる担体を用いることができる。例えば、前記ポリヒドロキシアルカノエートとして、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含有するポリヒドロキシアルカノエートを好適に利用できる。磁性体を含んでなる担体を用いる際には、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記検体中から分離する工程において、
前記磁性体を含んでなる担体に対して、磁界を作用させて、前記検体より磁気的に分離する工程を採用することが好ましい。
【００３１】
一方、本発明にかかる標的成分の検出方法では、標的成分の検出手段として、種々の分光学的な手法を採用することができ、例えば、前記担体に固定化された前記標的成分について、選択的に検出する工程において、
検出手法として、比色法、蛍光法、化学発光法、ラジオアイソトープ法からなる群から選択される一つの検出手法または、二つ以上の検出手法の組み合わせを用いることができる。あるいは、前記担体に固定化された前記標的成分について、選択的に検出する工程において、
検出手法として、核磁気共鳴スペクトロスコピー、マススペクトロスコピー、赤外吸収スペクトロスコピー、および紫外吸収スペクトロスコピーからなる群から選択される一つの検出手法または、二つ以上の検出手法の組み合わせを用いることもできる。
【００３２】
加えて、本発明にかかる標的成分のスクリーニング方法は、
媒体中に含まれる標的成分のスクリーニング方法であって、
前記スクリーニングは、前記標的成分を含んだ混合物が前記媒体中に含まれる混合試料を対象とし、
前記標的成分に対して結合親和力を有する分子が、その表面に固定された担体を用意する工程と、
前記担体と前記混合試料とを混合する工程と、
前記混合工程において混合される、前記混合試料中に含まれる標的成分と、前記担体表面に固定されている前記結合親和力を有する分子とを結合させる工程と、
前記結合工程により、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記混合試料中から分離する工程とを有し、
前記担体は、ポリヒドロキシアルカノエートで少なくとも一部を被覆されていることを特徴とする標的成分のスクリーニング方法である。
【００３３】
その際、前記担体として、磁性体を含んでなる担体を用いることができる。例えば、前記ポリヒドロキシアルカノエートとして、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含有するポリヒドロキシアルカノエートを好適に利用できる。磁性体を含んでなる担体を用いる際には、前記結合親和力を有する分子との結合を介して、前記担体に固定化された前記標的成分を、前記担体とともに前記混合試料中から分離する工程において、
前記磁性体を含んでなる担体に対して、磁界を作用させて、前記混合試料より磁気的に分離する工程を採用することが好ましい。
【００３４】
なお、本発明において、ポリヒドロキシアルカノエートとは、構成ユニットとして、ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを意味する。加えて、下記する本発明の実施の形態を説明する際、ポリヒドロキシアルカノエートとして、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを用いている形態を具体例に採用するが、本発明は、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを用いる形態に限定されることなく、一般に、前記の定義を満たすポリヒドロキシアルカノエートに包含される限り、いずれのポリヒドロキシアルカノエートも制限なく使用することができる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
まず、図１〜図３を参照して、本発明の特徴を概説する。
【００３６】
本発明にかかる標的成分の分離・回収方法、検出方法、スクリーニング方法は、標的成分を選択的に採取する手段として、標的成分に対して結合親和力を有する分子を用いるが、この標的成分に対して結合親和力を有する分子（標的成分結合分子）４は予め担体表面に担持・固定化して、標的成分結合分子担持構造体の形態で利用する。より具体的には、用いる担体は、担体基材の表面に、有機高分子材料からなる被覆層を設ける構造を選択し、その際、担体基材の表面に設ける有機高分子材料からなる被覆層として、図１に示すように、例えば、磁性体からなる基体を、担体基材１として用い、担体基材１の表面の少なくとも一部は、生体親和性の高い高分子材料である、ポリヒドロキシアルカノエート２によって被覆する形態としている。担体基材が、磁性体を含む際には、ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと記載する場合もある）の被覆を設けた磁性担体を、「ＰＨＡ磁性構造体」と表記することもある。このＰＨＡ磁性構造体のような、ポリヒドロキシアルカノエート２による被覆を有する担体上に、標的成分結合分子４を担持する際には、ポリヒドロキシアルカノエート２による被覆中の、標的成分に対して結合親和力を有する分子４に対する、選択的な担持可能な部位３を利用する。磁性体からなる基体を、担体基材１として用いると、このＰＨＡ磁性構造体上への標的成分結合分子４を担持する工程によって、標的成分結合分子担持ＰＨＡ磁性構造体が調製される。
【００３７】
次いで、標的成分結合分子担持ＰＨＡ被覆担体と、媒体中に溶解、または、分散されている標的成分５を含む液、具体的には、検体、あるいは、混合試料とを、混合する工程を設け、図２に示すように、担体上に担持されている標的成分結合分子４に、検体、あるいは、混合試料中に含まれる標的成分５を接触させ、標的成分結合分子４と標的成分５との結合をさせる工程を終えると、担体上に標的成分５を固定化することがなされる。一方、検体、あるいは、混合試料中に含まれる標的成分以外の成分６、７は、標的成分結合分子４との結合を起こさず、また、担体表面を被覆するＰＨＡに対する、標的成分以外の成分６、７の非選択的な付着も少なく、また、標的成分以外の成分６、７の非選択的な付着が生じたとしても、簡単な清浄操作を施すことで、非選択的な付着した標的成分以外の成分６、７を容易に除去することができる。
【００３８】
担体上に標的成分５を固定化した後、この担体とともに、例えば、固・液分離手段を利用して、担体を回収、分離すると、この回収、分離される担体群中には、標的成分５を固定化した担体も同様に回収、分離される。また、図３に例示するように、磁性体からなる基体を、担体基材１として用いる担体では、磁力を発揮する構造体８（永久磁石や電磁石等）により磁界を印加すると、磁性体からなる基体と磁力を発揮する構造体８との間の磁気的引力によって、担体は、磁力を発揮する構造体８（永久磁石や電磁石等）上に集積される。
【００３９】
本発明にかかる標的成分の分離・回収方法、検出方法、スクリーニング方法では、以上に説明するように、標的成分結合分子の担持は、生体親和性の高い高分子材料である、ポリヒドロキシアルカノエートで被覆される部分になされ、標的成分と標的成分結合分子との結合も、ポリヒドロキシアルカノエートで被覆される表面部分で起こるため、より生体条件に近い条件に維持して、標的成分の分離・回収、検出、スクリーニングを実施することができる。
【００４０】
なお、本発明にかかる標的成分の分離・回収方法、および標的成分の検出方法においては、検体中に標的成分以外の成分は存在しない場合もある。つまり、前記媒体中に標的成分が単独で存在しているものの、該標的成分が低濃度で広範囲にわたって存在している場合、担体上に標的成分を固定化した後、この担体とともに、回収すると、分離・回収される担体群中にで、該標的成分の存在比率は高く、濃縮がなされ、その検出をより容易なものとしている。
【００４１】
なお、ポリヒドロキシアルカノエート：１およびその担持部分：３については＜ポリヒドロキシアルカノエート＞および＜標的成分結合分子のＰＨＡ磁性構造体への担持＞の項で、磁性体：２については＜磁性体＞の項で、標的成分に対して結合親和力を有する分子：４および標的成分：５については＜標的成分および標的成分に対して結合親和力を有する分子＞の項で、磁気を発揮する構造体：８については＜標的成分結合磁性構造体の磁気分離および洗浄＞の項でそれぞれ詳細に後述する。
【００４２】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
【００４３】
＜ポリヒドロキシアルカノエート＞
本発明の方法で利用することができるポリヒドロキシアルカノエートは、そのモノマー・ユニットである３−ヒドロキシアルカン酸ユニットの炭素数が４または５である短鎖長ポリヒドロキシアルカノエート（ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ  ＰＨＡ：以下ｓｃｌ−ＰＨＡと略記する場合もある）；炭素数が４であるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、あるいは炭素数が５であるポリヒドロキシバレレート（ＰＨＶ）のみならず、炭素数が６から１２程度までの中鎖長（ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ：以下ｍｃｌと記載する場合もある）の３−ヒドロキシアルカン酸ユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート（以下、ｍｃｌ−ＰＨＡと略記する場合がある）が含まれる。さらには、上記の側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート（以下、ｕｓｕａｌ−ＰＨＡと略記する場合がある）以外にも、より広範囲な応用、例えば、機能性ポリマーとしての応用をも考慮して、アルキル基以外の、各種置換基（例えば、フェニル基、不飽和炭化水素基、エステル基、アリール基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素基、エポキシ基（−Ｏ−）など）を側鎖に導入したモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエート（以下、ｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡと略記する場合がある）、あるいはこれらのモノマーユニット複数を、任意のユニット比で含んでいるコポリマーをも、本発明の方法に用いることができる。
【００４４】
本発明の方法に用いるＰＨＡは、ＰＨＡ合成酵素によって合成可能なＰＨＡ（例えば、各種のｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡなど）であれば、特に限定はされない。前述の通り、ＰＨＡ合成酵素は、生物体内でのＰＨＡ合成反応系における最終段階を触媒する酵素であり、従って、生物体内において合成されることが判明しているＰＨＡは、いずれも、該合成酵素による触媒作用を受けて、生合成されていることになる。さらには、本発明においては、生物体内において生合成されることが確認されているＰＨＡの全て種類に関して、所望のＰＨＡに含まれるモノマーユニットに対応する３−ヒドロキシアシルＣｏＡを、磁性体に固定化された該ＰＨＡ合成酵素に作用させることによって、所望のＰＨＡを生成させて、磁性体の表面を被覆した構造体を作製することが可能である。
【００４５】
本発明における、所望のＰＨＡを生成させて、磁性体の表面を被覆した構造体を作製する工程で利用するＰＨＡ合成酵素は、合成するＰＨＡに応じて、該合成酵素を生産する微生物群から適宜選択された微生物、あるいは、それら微生物由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体により生産されたものを用いることができる。
【００４６】
ｓｃｌ−ＰＨＡの生合成は、ｓｃｌ−ＰＨＡ生産菌の体内で、種々の炭素源から、生体内の様々な代謝経路を経て生成された（Ｒ）−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡおよび（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡの少なくとも一種を基質とした、ＰＨＡ合成酵素による重合反応によって行われる。このｓｃｌ−ＰＨＡの重合反応を触媒する酵素を、本発明では、特に、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素と呼ぶことにする。ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素中でも、例えば、ＰＨＢの生合成を行うＰＨＡ合成酵素であれば、通常、ＰＨＢ合成酵素（ＰＨＢポリメラーゼ、ＰＨＢシンターゼとも呼ばれる）と呼ばれている。
【００４７】
本発明に用いるｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素は、該合成酵素を生産する微生物から適宜選択された微生物、あるいは、それら微生物由来のｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体により生産された、遺伝子組換え型ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を用いることができる。かかるｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物としては、例えば、ＰＨＢやＰＨＢ／Ｖ生産菌として知られている微生物を用いることができる。前記ＰＨＢやＰＨＢ／Ｖ生産性を有する微生物として、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、クロマチウム属（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｓｐ．）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）などが知られている。また、本発明者らにより、別途分離された菌株、バルクホルデリア・セパシア・ＫＫ０１株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  ＫＫ０１）、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ６４株（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏＳＣＬ−ＰＨＡ  ＴＢ６４）、アルカリゲネス属・ＴＬ２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．  ＴＬ２）などを用いることができる。なお、ＫＫ０１株は、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２３５として、ＴＢ６４株は、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９３３として、ＴＬ２株は、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９１３として、それぞれ、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約」に基づき、国際寄託機関である、独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧  経済産業省  産業技術総合研究所  生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）特許微生物寄託センター）に国際寄託されている。
【００４８】
また、上述するｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を生産する野生株以外に、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を生産するために、形質転換体を用いることもできる。野生株由来のｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製、および、遺伝子組換えによる形質転換体の創製は、常法に従って行うことができる。ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニングに関しては、既に、アルカリゲネス・ユートロファスのＰＨＢ合成酵素遺伝子（ｐｈｂＣ）がクローニングされ、報告されている。また、本発明者らは、バークホルデリア・セパシア  ＫＫ０１株のｐｈｂＣについて、クローニングを完了しており、また、ラルストーニャ・ユートロファ  ＴＢ６４株のｐｈｂＣについても、クローニングを完了している。ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を産生する形質転換体は、宿主微生物に、このｐｈｂＣ遺伝子を含むベクターを導入することによって創製できる。形質転換に利用する、ｐｈｂＣ遺伝子を含むベクターは、例えば、プラスミド・ベクター、ファージ・ベクター等にｐｈｂＣ遺伝子を挿入することによって調製される。宿主としては、例えば、大腸菌（エシェリチア・コリ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が広く利用されている。
【００４９】
ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の生産には、以上に挙げたようなｓｃｌ−ＰＨＡ生産菌は、単独で、あるいは必要に応じて２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５０】
また、前述のｓｃｌ−ＰＨＡ生産菌由来のｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いて、所望のｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を生産することも可能である。宿主として、大腸菌等の細菌を用いている形質転換体に付いては、その培養に用いる培地として、天然培地あるいは合成培地、例えば、ＬＢ培地，Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度を２５〜３７℃の範囲に選択し、好気的に８〜２７時間培養することにより、微生物の増殖を図る。その後、集菌して、菌体内に蓄積されたｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の回収を行うことができる。必要に応じて、培地には、発現ベクターに含まれるマーカー遺伝子、各種耐性遺伝子に応じて、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加してもよい。また、発現ベクターにおいて、挿入されるｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素遺伝子の転写用に、誘導性のプロモーターを採用している場合は、形質転換体を培養する際に、該プロモーターに対応する誘導物質を培地に添加して、発現を促してもよい。利用可能な誘導物質の例として、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン，インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等が挙げられる。
【００５１】
本発明では、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素として、微生物の菌体破砕液や、菌体破砕液から、タンパク質成分を硫酸アンモニウム等により沈澱・回収した硫安塩析物などの粗酵素を用いてもよい。さらには、各種方法で精製した精製酵素を用いてもよい。該ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素は、必要に応じて、金属塩、グリセリン、ジチオトレイトール、ＥＤＴＡ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの安定化剤、付活剤を適宜添加して、用いることができる。
【００５２】
培養された微生物菌体から、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素を分離・精製する工程では、ｓｃｌ−ＰＨＡ合成酵素の酵素活性が保持される方法であれば、いかなる分離・精製方法をも用いることができる。例えば、培養後、集菌して得られた微生物菌体を、フレンチプレス，超音波破砕機，リゾチームや各種界面活性剤等を用いて破砕する。微生物の菌体破砕液を遠心分離して、上清として得られる粗酵素液、あるいは、粗酵素液から調製した硫安塩析物に対して、アフィニティ・クロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等の精製手段を、単独または適宜組み合わせて、適用することによって、精製酵素を得ることができる。特に、遺伝子組換えタンパク質では、Ｎ末端やＣ末端にヒスチジン残基等の「タグ」を結合した融合タンパク質の形で発現させ、目的の融合タンパク質を選択的に、このタグを介して親和性樹脂に結合させる手法を利用することによって、より簡便に精製することができる。融合タンパク質を選択的に結合している親和性樹脂から、目的の酵素タンパク質を分離するには、トロンビン、血液凝固因子  Ｘａ等のプロテアーゼで「タグ」部分を切断する、ｐＨを低下せしめる、結合競合剤として、高濃度のイミダゾールを添加する等の方法を用いるとよい。また、ｐＴＹＢ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎ  Ｂｉｏｌａｂ社製）などの発現ベクターを用いる場合など、タグを介した親和性樹脂との結合に「インテイン」を含む場合には、ジチオトレイトールなどの還元性物質を添加して還元条件とすることで、切断する。アフィニティ・クロマトグラフィーによる精製を可能とする、融合タンパク質の融合パートナーの例は、ヒスチジン・タグの他に、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、あるいはチオレドキシン（ＴＲＸ）等も公知である。例えば、ＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ親和性レジンによって精製することができる。
【００５３】
また、ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物としては、例えば、ｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの生産菌を用いることができる。このようなｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡ産生能を有する微生物として、前述のシュードモナス・オレオボランス、シュードモナス・レジノボランス、シュードモナス属  ６１−３株，シュードモナス・プチダ・ＫＴ２４４２株，シュードモナス・アエルギノーサなど、さらには、本発明者らにより分離された、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｐ９１），シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  Ｈ４５），シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  ＹＮ２），シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｊｅｓｓｅｎｉｉ  Ｐ１６１）等のシュードモナス属微生物や、特開２００１−７８７５３号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＯＫ３、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３７０），特開２００１−６９９６８号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＯＫ４、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３７１）などのバークホルデリア属微生物を用いることができる。加えて、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｓｐ．）などに属し、ｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【００５４】
なお、Ｐ９１株は、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７３として、Ｈ４５株は、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７４として、ＹＮ２株は、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７５として、Ｐ１６１株は、寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７６として、それぞれ、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約」に基づき、国際寄託機関である、独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧  経済産業省  産業技術総合研究所  生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）特許微生物寄託センター）に国際寄託されている。
【００５５】
また、これらＰＨＡ生産微生物、ならびに、該ＰＨＡ生産微生物由来のＰＨＡ合成酵素に関しては、特開２００２−３２７０４６号公報、および特開２００３−１１３１２号公報に詳細に記載されているので参考にされたい。
【００５６】
本発明の方法で利用する、磁性複合体において、その表面を被覆しているＰＨＡの具体的な例として、下記化学式［１］〜化学式［１０］で表されるモノマーユニットを少なくとも含むＰＨＡを例示することができる。
【００５７】
化学式［１］：
【００５８】
【化１】
2004333232.tif 000003
【００５９】
（式中、Ｒ１およびａは、下記するＲ１とａとの組み合わせからなる群より選択されるいずれか一つの組み合わせで表される：
Ｒ１は、水素原子（Ｈ）であり、ａは、３〜１０の整数のいずれかである；
Ｒ１は、ハロゲン原子であり、ａは、１〜１０の整数のいずれかである；
Ｒ１は、発色団であり、ａは、１〜１０の整数のいずれかである；
Ｒ１は、カルボキシ基あるいはその塩であり、ａは、１〜１０の整数のいずれかである；あるいは、
Ｒ１は、下記：
【００６０】
【化２】
2004333232.tif 000004
【００６１】
１，２−エポキシエチル基であり、ａは、１〜７の整数のいずれかである。）
化学式［１］：
【００６２】
【化３】
2004333232.tif 000005
【００６３】
（式中、
ｂは、０〜７の整数のいずれかを表し、
Ｒ２は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７からなる群から選択されるいずれか一つを表す。）
化学式［３］：
【００６４】
【化４】
2004333232.tif 000006
【００６５】
（式中、
ｃは、１〜８の整数のいずれかを表し、
Ｒ３は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７からなる群から選択されるいずれか一つを表す。）
化学式［４］：
【００６６】
【化５】
2004333232.tif 000007
【００６７】
（式中、
ｄは、０〜７の整数のいずれかを表し、
Ｒ４は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７からなる群から選択されるいずれか一つを表す。）
化学式［５］：
【００６８】
【化６】
2004333232.tif 000008
【００６９】
（式中、
ｅは、１〜８の整数のいずれかを表し、
Ｒ５は、
水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７からなる群から選択されるいずれか一つを表す。）
化学式［６］：
【００７０】
【化７】
2004333232.tif 000009
【００７１】
（式中、ｆは、０〜７の整数のいずれかを表す。）
化学式［７］：
【００７２】
【化８】
2004333232.tif 000010
【００７３】
（式中、ｇは、１〜８の整数のいずれかを表す。）
化学式［８］：
【００７４】
【化９】
2004333232.tif 000011
【００７５】
（式中、
ｈは、１〜７の整数のいずれかを表し、
Ｒ６は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’、−ＳＯ２Ｒ”、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選択されるいずれか一つを表し、
ここで、
Ｒ’は、水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５からなる群から選択されるいずれか一つであり、
Ｒ”は、−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５からなる群から選択されるいずれか一つである。）
化学式［９］：
【００７６】
【化１０】
2004333232.tif 000012
【００７７】
（式中、
ｉは、１〜７の整数のいずれかを表し、
Ｒ７は、水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’、−ＳＯ２Ｒ”からなる群から選択されるいずれか一つを表し、
ここで、
Ｒ’は、水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５からなる群から選択されるいずれか一つであり、
Ｒ”は、−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５からなる群から選択されるいずれか一つである。）
化学式［１０］：
【００７８】
【化１１】
2004333232.tif 000013
【００７９】
（式中、ｊは、１〜９の整数のいずれかを表す。）
なお、前記ハロゲン原子の具体例として、フッ素、塩素、臭素などを挙げることができる。また、前記発色団は、化学式［１］で示されるモノマーユニットに対応する、３−ヒドロキシアシルＣｏＡ体が、ＰＨＡ合成酵素の触媒作用を受け得るものである限り、特に限定はされないが、ＰＨＡ合成酵素による高分子合成時における立体障害などを考慮すると、３−ヒドロキシアシルＣｏＡ  分子内において、ＣｏＡと結合するカルボキシ基と発色団との間の離反を保つ上では、側鎖として、炭素数１〜５のアルキレン鎖、例えば、直鎖のアルキレン鎖を有する方が望ましい。一方、該発色団の光吸収波長が可視域にあれば、かかるＰＨＡを被覆してなる磁性複合体は、着色したものが得られ、また、該発色団の光吸収波長が可視域以外にあっても、かかるＰＨＡは、種々の電子材料としての利用に供することができる。上記化学式［１］で示されるモノマーユニットにおける発色団の例として、ニトロソ、ニトロ、アゾ、ジアリールメタン、トリアリールメタン、キサンテン、アクリジン、キノリン、メチン、チアゾール、インダミン、インドフェノール、ラクトン、アミノケトン、ヒドロキシケトン、スチルベン、アジン、オカサジン、チアジン、アントラキノン、フタロシアニン、インジゴイドなどを挙げることができる。
【００８０】
本発明の方法で利用する、磁性複合体において、その表面を被覆しているＰＨＡの具体的な例として、さらに、下記化学式［１１］〜化学式［１８］で表されるモノマーユニットを少なくとも含むＰＨＡを例示することができる。
【００８１】
化学式［１１］：
【００８２】
【化１２】
2004333232.tif 000014
【００８３】
（式中、
Ｒ１は、ビニル基であり、
ａは、１〜１０の整数のいずれかである。）
化学式［１２］：
【００８４】
【化１３】
2004333232.tif 000015
【００８５】
（式中、
ｂは、０〜７の整数のいずれかを表し、
Ｒ２は、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ビニル基、１，２−エポキシエチル基、ＣＯＯＲ２１（ここで、Ｒ２１は、Ｈ原子、Ｎａ原子、Ｋ原子のいずれか一つを表す）からなる群から選択されるいずれか一つを表す。
なお、ＰＨＡ中に、化学式［１２］で示されるモノマーユニット複数種が存在する場合、各モノマーユニット毎に、そのｂとＲ２とは、独立して上記の意味を表す。）
化学式［１３］：
【００８６】
【化１４】
2004333232.tif 000016
【００８７】
（式中、
ｃは、１〜８の整数のいずれかを表し、
Ｒ３は、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＳＣＨ３基からなる群から選択されるいずれか一つを表す。
なお、ＰＨＡ中に、化学式［１３］で示されるモノマーユニット複数種が存在する場合、各モノマーユニット毎に、そのｃとＲ３とは、独立して上記の意味を表す。）
化学式［１４］：
【００８８】
【化１５】
2004333232.tif 000017
【００８９】
（式中、
ｄは、０〜８の整数のいずれかを表し、
Ｒ４は、
ｄが０の場合、Ｈ原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ハロゲン原子、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、ＣＦ３基、Ｃ２Ｆ５基またはＣ３Ｆ７基からなる群から選択されるいずれか一つを表し、
ｄが１〜８の場合、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基からなる群から選択されるいずれか一つを表す。
なお、ＰＨＡ中に、化学式［１４］で示されるモノマーユニット複数種が存在する場合、各モノマーユニット毎に、そのｄとＲ４とは、独立して上記の意味を表す。）
化学式［１５］：
【００９０】
【化１６】
2004333232.tif 000018
【００９１】
（式中、ｅは、１〜８の整数のいずれかを表す。）
化学式［１６］：
【００９２】
【化１７】
2004333232.tif 000019
【００９３】
（式中、
ｆは、１〜８の整数のいずれかを表し、
Ｒ６は、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、（ＣＨ３）２−ＣＨ基または（ＣＨ３）３−Ｃ基からなる群から選択されるいずれか一つを表す。
なお、ＰＨＡ中に、化学式［１６］で示されるモノマーユニット複数種が存在する場合、各モノマーユニット毎に、そのｆとＲ６とは、独立して上記の意味を表す。）
化学式［１７］：
【００９４】
【化１８】
2004333232.tif 000020
【００９５】
（式中、
ｇは、１〜８の整数のいずれかを表し、
Ｒ７は、Ｈ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＯＯＲ７１（ここで、Ｒ７１は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５のいずれかを表す）、ＳＯ２Ｒ７２（ここで、Ｒ７２は、−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５のいずれかを表す）、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、（ＣＨ３）２−ＣＨ基または（ＣＨ３）３−Ｃ基からなる群から選択されるいずれか一つを表す。
なお、ＰＨＡ中に、化学式［１７］で示されるモノマーユニット複数種が存在する場合、各モノマーユニット毎に、そのｇとＲ７とは、独立して上記の意味を表す。）
化学式［１８］：
【００９６】
【化１９】
2004333232.tif 000021
【００９７】
（式中、
ｇは、１〜８の整数のいずれかを表し、
Ｒ７は、Ｈ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ２基、ＣＯＯＲ７１（ここで、Ｒ７１は、Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５のいずれかを表す）、ＳＯ２Ｒ７２（ここで、Ｒ７２は、−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３、−ＯＣ２Ｈ５のいずれかを表す）、ＣＨ３基、Ｃ２Ｈ５基、Ｃ３Ｈ７基、（ＣＨ３）２−ＣＨ基または（ＣＨ３）３−Ｃ基からなる群から選択されるいずれか一つを表す。
なお、ＰＨＡ中に、化学式［１８］で示されるモノマーユニット複数種が存在する場合、各モノマーユニット毎に、そのｇとＲ７とは、独立して上記の意味を表す。）
本発明において利用されるＰＨＡとして、上記する化学式［１］〜化学式［１８］で示されるモノマーユニットを複数種含むランダム共重合体やブロック共重合体を用いることも可能であり、かかる複数種のモノマーユニットを含むＰＨＡでは、各モノマーユニットや含まれる官能基の特性を利用したＰＨＡの物性制御や複数の機能の付与、官能基間の相互作用を利用した新たな機能の発現等が可能となる。
【００９８】
さらには、例えば、磁性微粒子の表面にＰＨＡの被覆を行う際、ＰＨＡ合成酵素の基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡの種類や濃度などを経時的に変化させることによって、作製されるＰＨＡの組成も経時的に変化させることができる。従って、構造体の形状が粒状であれば、表面のＰＨＡ被覆は、内側から外側に向かう方向に、また、構造体の形状が平面状であれば、表面のＰＨＡ被覆は、その平面と垂直な方向に、被覆されているＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることも可能である。
【００９９】
例えば、最終的に作製される構造体の形態を、核となる磁性体に対して、その構造体の最表面には、該磁性体と親和性の低いＰＨＡによる被覆がなされているものにする必要がある際には、先ず、核となる磁性体の表面を、該磁性体と親和性の高いＰＨＡで被覆して、次いで、その磁性体と親和性の高いＰＨＡのモノマーユニット組成から、目的とするＰＨＡのモノマーユニット組成へと、内側から外側に向かう方向、あるいは、垂直方向に、組成が変化する構造、例えば、多層構造あるいはグラディエント構造とすることで、核となる磁性体と、その表面を被覆するＰＨＡ層との結合を強固にしたＰＨＡ被膜を形成することが可能となる。
【０１００】
また、３−ヒドロキシプロピオン酸ユニット、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニット、３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニット、４−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニット、さらには、炭素数６〜１４のヒドロキシアルカン酸ユニットからなるホモポリマー、あるいはこれらの複数のユニットからなるコポリマーなども、本発明の方法において利用可能である。さらには、必要に応じて、一旦ＰＨＡを酵素合成した後、あるいは、酵素合成中に、さらに化学修飾等を施してもよい。
【０１０１】
また、被覆に用いるＰＨＡの分子量制御、および得られるＰＨＡ被覆膜の親水性向上という観点から、反応溶液中に水酸基を有する化合物を適宜添加してもよい。
【０１０２】
本発明の方法において、前記の目的で反応溶液中に添加する水酸基を有する化合物は、アルコール類、ジオール類、トリオール類、アルキレングリコール類、ポリエチレングリコール類、ポリエチレンオキサイド類、アルキレングリコールモノエステル類、ポリエチレングリコールモノエステル類、ポリエチレンオキサイドモノエステル類化合物から選ばれる少なくとも１種類であるが、さらに詳しく述べると以下の通りである。すなわち、好適に利用できるアルコール類、ジオール類およびトリオール類化合物は、炭素数３〜１４の直鎖状または分岐のアルコール、ジオール、トリオールである。好適に利用できるアルキレングリコール類およびアルキレングリコールモノエステル類化合物は、そのアルキレングリコールの炭素鎖は、炭素数２〜１０の直鎖状または分岐状構造を有している化合物である。また、好適に利用できるポリエチレングリコール類、ポリエチレンオキサイド類、ポリエチレングリコールモノエステル類、ポリエチレンオキサイドモノエステル類化合物は、その数平均分子量が１００〜２０，０００の範囲であるものである。
【０１０３】
上記目的で反応溶液中に添加する、水酸基を有する化合物の添加濃度は、ＰＨＡ合成酵素による３−ヒドロキシアシルＣｏＡの重合反応が阻害されない濃度であれば、特に制限はないが、好ましくは、ＰＨＡ合成酵素と３−ヒドロキシアシルＣｏＡとを含む反応溶液に対して、０．０１％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲、さらに好ましくは、０．０２％〜５％（ｗ／ｖ）の範囲で添加することがよく、その添加方法は、反応初期に一括して添加する方法、反応時間内に、数回に分けて反応溶液中に添加する方法のいずれでもよい。
【０１０４】
なお、化学式［１２］で示されるモノマーユニットにおいて、Ｒ２として、カルボキシ基（ＣＯＯＲ２１）を含むモノマーユニットは、この化学式［１２］で示され、Ｒ２がビニル基である、すなわち、側鎖末端にビニルフェニル基を有するモノマーユニットから、そのビニル基の二重結合部分を選択的に酸化開裂することで、カルボキシ基へ変換することで製造することができ、結果として、化学式［１２］で示されるモノマーユニットの側鎖末端にカルボキシフェニル基を有するユニットを含むＰＨＡが得られる。
【０１０５】
前記のビニル基をカルボキシ基へと変換する方法、すなわち、炭素−炭素の二重結合を酸化剤を用いて、酸化開裂してカルボン酸を得る方法としては、例えば、過マンガン酸塩を用いる方法（Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  Ｐｅｒｋｉｎ．  Ｔｒａｎｓ．  １，  ８０６  （１９７３））、重クロム酸塩を用いる方法（Ｏｒｇ．  Ｓｙｎｔｈ．，  ４，  ６９８  （１９６３））、過ヨウ素酸塩を用いる方法（Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ４６，  １９  （１９８１））、硝酸を用いる方法（特開昭５９−１９０９４５号広報）、オゾンを用いる方法（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８１，  ４２７３  （１９５９））等が知られており、さらに、ＰＨＡに関しては、前述のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４，  ２８９−２９３  （２００１）に、ＰＨＡの側鎖末端の炭素−炭素二重結合を、酸化剤として過マンガン酸カリウムを用いて、反応を酸性条件下で行うことで、カルボン酸を得る方法が報告されており、本発明において、前記ビニル基をカルボキシ基へと変換する反応を行う際、これらの酸化開裂方法を参考とすることができる。
【０１０６】
前記ビニル基をカルボキシ基へと変換する反応に際して、酸化剤として用いる前記過マンガン酸塩としては、過マンガン酸カリウムが一般的である。過マンガン酸塩の使用量は、酸化開裂反応が化学量論的反応であるため、Ｒ２としてビニル基を有する化学式［１２］で示されるモノマーユニット１モルに対して、通常１モル当量以上、好ましくは、２〜４モル当量使用するのがよい。
【０１０７】
酸化剤として過マンガン酸カリウムを用いる、酸化開裂反応において、反応系を酸性条件下にするためには、通常、硫酸、塩酸、酢酸、硝酸などの各種の無機酸や有機酸が用いられる。しかしながら、硫酸、硝酸、塩酸などの酸を用いた場合、ＰＨＡの主鎖のエステル結合が切断され、分子量低下を引き起こす恐れがある。そのため、酸性条件下にする際、酢酸を用いることが好ましい。反応系に添加される、酸の添加量は、Ｒ２としてビニル基を有する化学式［１２］で示されるモノマーユニット１モルに対して、通常、０．２〜２００モル当量、好ましくは、０．４〜１００モル当量の範囲に選択する。反応系に添加される、酸の添加量が０．２モル当量に満たない場合には、酸化開裂反応は低収率となり、２００モル当量を超える場合には、添加した酸による分解物が副生するため、いずれの場合も好ましくない。また、酸化開裂反応を促進する目的で、クラウン−エーテルを用いることができる。この場合、クラウン−エーテルと過マンガン酸塩とが、錯体を形成する結果、その反応活性が増大する効果が得られる。前記目的で利用可能なクラウン−エーテルとして、ジベンゾ−１８−クラウン−６−エーテル、ジシクロ−１８−クラウン−６−エーテル、１８−クラウン−６−エーテルが、一般的に用いられる。反応系へのクラウン−エーテルの添加量は、過マンガン塩１モルに対して、通常、１．０〜２．０モル当量の範囲、好ましくは、１．０〜１．５モル当量の範囲に選択することが望ましい。
【０１０８】
本発明において、前記酸化反応を行う際、Ｒ２としてビニル基を有する化学式［１２］で示すユニットを含むＰＨＡで被覆された構造体、および過マンガン酸塩と酸を、一括して最初からともに仕込んで反応させてもよく、あるいは、それぞれ、連続的に、もしくは、断続的に反応系内に加えながら、反応させてもよい。あるいは、過マンガン酸塩のみを先に反応系に溶解、もしくは懸濁させておき、続いて、ＰＨＡで被覆された構造体と酸とを、連続的に、もしくは、断続的に反応系内に加えて反応させてもよく、ＰＨＡで被覆された構造体のみを先に反応系に懸濁させておき、続いて、過マンガン酸塩と酸とを、連続的に、もしくは断続的に反応系内に加えて反応させてもよい。さらには、ＰＨＡで被覆された構造体と酸を先に仕込んでおき、続いて、過マンガン酸塩を連続的に、もしくは断続的に反応系内に加えて反応させてもよく、過マンガン酸塩と酸を先に仕込んでおき、続いて、ＰＨＡで被覆された構造体を連続的に、もしくは断続的に反応系内に加えて反応させてもよく、ＰＨＡで被覆された構造体と過マンガン酸塩を先に仕込んでおき、続いて、酸を連続的に、もしくは断続的に反応系内に加えて反応させてもよい。
【０１０９】
Ｒ２としてビニル基を有する化学式［１２］で示すユニットを含むＰＨＡで被覆された構造体を対象とする、酸化剤として過マンガン酸カリウムを用いる、酸化開裂反応では、反応温度は、通常、−２０〜４０℃の範囲、好ましくは、０〜３０℃の範囲に選択するのがよい。反応速度は、Ｒ２としてビニル基を有する化学式［１２］で示すユニットと過マンガン酸塩との量論比、ならびに反応温度に依存し、加えて、前記ビニル基をカルボキシ基へと変換する目標比率に応じて、反応時間は選択されるものであるが、かかる目標比率を概ね１００％と選択する際には、反応時間を、通常、２〜４８時間とするのがよい。
【０１１０】
同様の酸化開裂反応を、Ｒ１がビニル基である化学式［１１］で示すユニットに適用すると、側鎖末端のビニル基をカルボキシ基へと変換することも可能である。
【０１１１】
また、化学式［１７］で示されるモノマーユニット、あるいは化学式［１８］で示されるモノマーユニットを含むＰＨＡは、一旦化学式［８］で示されるモノマーユニットを含むＰＨＡを作製した後、そのスルファニル基（−Ｓ−）を選択的に酸化して、スルフィニル基（−ＳＯ−）、あるいはスルホニル基（−ＳＯ２−）へと変換することで製造することができる。かかるスルファニル基（−Ｓ−）の選択的な酸化は、例えば、過酸化化合物による酸化処理を施すことで達成でき、その際、スルファニル基（−Ｓ−）の酸化に寄与し得るものであれば、いかなる種類の過酸化化合物をも用いることが可能である。なお、酸化効率、ＰＨＡ主鎖骨格ならびにＰＨＡに含まれる他のモノマーユニットへの影響、処理の簡便さ等を考慮した場合、特に、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、メタクロロ過安息香酸、過蟻酸、過酢酸からなる群から選択される過酸化化合物を用いることが好ましい。
【０１１２】
例えば、スルファニル基（−Ｓ−）の酸化に利用する過酸化化合物として、メタクロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）を用いると、化学式［８］で示されるモノマーユニット中のスルファニル基（−Ｓ−）に対する酸化は、化学量論的に進行するため、化学式［１７］で示されるモノマーユニット、あるいは化学式［１８］で示されるモノマーユニットの含有比率の制御がし易い。また、その反応条件が温和であるため、ＰＨＡ主鎖骨格の切断や活性部位の架橋反応等、不要な副次反応が起こり難い。
【０１１３】
一般的な反応条件として、スルファニル基（−Ｓ−）をスルフィニル基（−ＳＯ−）まで選択的に酸化するためには、ＰＨＡ中に含有されるスルファニル基（−Ｓ−）を含む化学式［８］で示されるモノマーユニットのユニットモル量、１モルに対して、ＭＣＰＢＡを若干過剰量、具体的には、１．１〜１．４モル量の範囲に選択し、クロロホルム中、温度を０℃〜３０℃の範囲に選択して、反応を行う。前記の反応条件範囲においては、反応時間を１０時間程度とすると、理論値のほぼ９０％、２０時間程度とすると、理論値のほぼ１００％まで、スルフィニル基（−ＳＯ−）へと酸化を進行させることができる。また、スルファニル基（−Ｓ−）を全てスルホニル基（−ＳＯ２−）まで酸化するためには、ＰＨＡ中に含有されるスルファニル基（−Ｓ−）を含む化学式［８］で示されるモノマーユニットのユニットモル量、１モルに対して、ＭＣＰＢＡを２モルより若干過剰量、具体的には、２．１〜２．４モル量の範囲に選択し、前記と同様の溶媒、温度、時間条件を選択して、反応を行えばよい。かかる過酸化化合物として、ＭＣＰＢＡを用いる酸化処理では、スルファニル基（−Ｓ−）にＭＣＰＢＡ１分子が作用して、スルフィニル基（−ＳＯ−）へと変換し、さらに、ＭＣＰＢＡ１分子が作用して、スルホニル基（−ＳＯ２−）へと段階的に酸化が進行するが、スルファニル基（−Ｓ−）からスルフィニル基（−ＳＯ−）への変換は、スルフィニル基（−ＳＯ−）からスルホニル基（−ＳＯ２−）への変換より、より高い反応性を示す。
【０１１４】
また、Ｒ２として１，２−エポキシエチル基を有する化学式［１２］で示すユニットは、Ｒ２としてビニル基を有する化学式［１２］で示すユニットに対して、側鎖末端ビニルフェニル基中のビニル基の二重結合部分を選択的に部分酸化して、エポキシ基の導入を行うことで製造することができる。すなわち、Ｒ２としてビニル基を有する化学式［１２］で示すユニットを含むＰＨＡに対して、ビニル基に選択的な酸化処理を施すことで、Ｒ２として１，２−エポキシエチル基を有する化学式［１２］で示すユニットを含むＰＨＡが得られる。
【０１１５】
前記ビニル基から１，２−エポキシエチル基へとエポキシ化を行う酸化処理についても、例えば、過酸化化合物を利用することができ、ビニル基の選択的な部分酸化に寄与し得るものであれば、いかなる種類の過酸化化合物をも用いることが可能である。その際、酸化効率、ＰＨＡ主鎖骨格ならびにＰＨＡに含まれる他のモノマーユニットへの影響、処理の簡便さ等を考慮した場合、特に、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、メタクロロ過安息香酸、過蟻酸、過酢酸からなる群から選択される過酸化化合物を用いることが好ましい。ビニル基から１，２−エポキシエチル基へとエポキシ化を行う酸化処理に過酸化化合物を用いる場合、その反応条件は、過酸化化合物による前記スルファニル基の選択的な部分酸化処理における反応条件を参考とすることができる。
【０１１６】
本発明の方法で利用されるポリヒドロキシアルカノエートの分子量は、数平均分子量として、１，０００から１０，０００，０００程度とするのが望ましい。
【０１１７】
なお、本発明において、ＰＨＡ被覆された構造体の作製工程に利用される、ＰＨＡ合成酵素により合成されるＰＨＡは、一般に、Ｒ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【０１１８】
本発明の方法で利用される、磁性体を核とする構造体に含有される磁性体の量は、１〜８０重量％の範囲、好ましくは５〜７０重量％の範囲、さらに好ましくは１０〜６０重量％の範囲に選択する。構造体中の磁性体含有量が１重量％より少ないと、磁気性能が不足して磁性体含有構造体としての性能が不十分となる恐れがあり、また、磁性体含量が８０重量％を超えると、核とする磁性体に対して、その表面を被覆するＰＨＡの含有比率が相対的に低下するため、表面に十分なＰＨＡ被覆層を設けることで達成される、かかる構造体本来の機能が損なわれ、実用性能の面で満足できなくなる恐れがある。
【０１１９】
本発明の方法に利用される、粒状構造体の粒子径は、その個別的な用途等に応じて適宜選定されるが、通常、０．０２〜１００μｍの範囲、好ましくは０．０５〜２０μｍの範囲に選択する。
【０１２０】
＜標的成分、ならびに標的成分に対して結合親和力を有する分子＞
本発明の方法が対象とする「標的成分」は、生理学的に有用であり、多くの場合、検体試料中では、その他の物質と混在しているか、あるいは、他の物質の混在がない、単一体であっても、広範囲に低濃度で存在しているものである。従って、検体試料中に含有されている、「標的成分」のみを、分離・回収、検出、およびスクリーニングする手段・方法が求められている。
【０１２１】
本発明の方法では、前記目的のために、「標的成分」のみを捕捉する上で好適に利用可能な、「標的成分に対して結合親和力を有する分子（以下、「標的成分結合分子」と記載する場合もある）」を用いる。
【０１２２】
本発明の方法が対象とする「標的成分」ならびに「標的成分に対して結合親和力を有する分子」の具体的な例として、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、脂質、および低分子化合物、あるいはこれらの複合体、さらには、これらの分子を部分的に含んでなる物質を挙げることができる。
【０１２３】
ここで、「核酸」は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、リボザイム等を包括する。
【０１２４】
ここで、「タンパク質」は、糖タンパク質、リポタンパク質、膜タンパク質、および標識タンパク質、ならびに低分子量ペプチドなどの天然および人工的に誘導された異形分子を包括する。
【０１２５】
当該タンパク質が免疫反応体であれば、例えば、抗体、抗原、ハプテン、あるいはこれらの錯体が可能であり、特に、「抗体」の場合、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、組換えタンパク質型抗体または天然型抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体混合物（単数あるいは複数）、単鎖抗体提示ファージ抗体（単鎖抗体を提示しているファージ全体を含む）、ならびに抗体およびタンパク質の融合体、あるいはこれらのハイブリッド混合物も包含される。当該タンパク質が触媒反応体の場合は、天然酵素、遺伝子改変により作製された変異酵素、ポリエチレングリコール等の合成分子と複合化された半人工酵素、非天然アミノ酸が導入された半人工酵素等を包括する。
【０１２６】
前記「抗体」として、通常、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ、あるいはイムノグロブリンＧ）が挙げられるが、ペプシン、パパインなどの消化酵素、あるいはジチオトレイトール、２−スルファニルエタノール（２−メルカプトエタノール）などの還元剤を用いて、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖなどの低分子化処理が施されたものであってもよい。また、ＩｇＧだけでなく、ＩｇＭ、あるいは前記ＩｇＧと同様の処理で低分子化したＩｇＭ由来のフラグメントであってもよい。また、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも、本発明における「標的成分結合分子」として適用できる。「標的成分結合分子」として、モノクロール抗体を用いる際には、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のように繰り返し構造を有するタンパク質や、ＣＡ１９−９抗原のように分子内に複数のエピトープが存在する抗原に対しては、各エピトープに対する反応性を示すモノクローナル抗体複数種を併用することもできる。また、認識エピトープの異なるものを２種類以上組み合わせても使用できる。
【０１２７】
一方、「抗原」としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂質、花粉、遺伝子工学的に産生された組換えタンパク質、薬物など種々のものが挙げられる。すなわち、本発明において対象とする「抗原」は、人、あるいは動物に対して、抗体産生を惹起する能力のある全ての物質のうち、例えば、診断等特別の目的の下に選択された単一あるいは複数の物質、ないしはそれらを含有する混合物である。
【０１２８】
「ペプチド」は、主に、本発明においては、その分子量とは無関係にタンパク質の断片を指す。
【０１２９】
「低分子化合物」は、受容体に認知可能である低分子量の、好ましくは有機分子である。通常、低分子化合物は、タンパク質に対する特異結合化合物であり、その多くは、生理活性物質あるいは薬剤候補物質あって、特に、抗原性の低分子化合物は、「ハプテン」と称される場合もある。
【０１３０】
「糖鎖」としては、グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、ガラクトース、グルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、シアル酸から選択される単糖ユニットが複数（数個から数十個）連なった、直鎖および分岐のオリゴマーおよびポリマーを挙げることができる。また、本発明の方法では、これらの糖鎖とタンパク質の複合体である糖タンパク質、脂質との複合体である糖脂質、さらには、これら糖鎖が生体細胞表面に提示されている場合は、細胞膜表面に糖鎖を提示している細胞そのもの、あるいは細胞膜断片も含まれる。
【０１３１】
「脂質」としては、生物の神経組織、形質膜、ミトコンドリア、ミクロソーム、細胞核等細胞内オルガネラの膜として存在する複合脂質、組織境界脂質膜等の天然脂質（アシルグリセロール）や、タンパク質との複合体であるリポタンパク質、レシチン（ホスファジチルコリン）のようなリン脂質やその脂質二重膜カプセルとしてのリポソーム等を挙げることができる。
【０１３２】
＜磁性体＞
本発明の方法において、構造体の核として用いる磁性体としては、その表面にＰＨＡ合成酵素を固定化することのできるものであれば、磁性材料の種類、形状、大きさに関しては、その個別的な用途に応じて、適宜選択して用いることができる。すなわち、ＰＨＡ合成酵素の固定化方法や、作製した構造体の応用の形態等に応じて、磁性体の種類や構造を適宜選択して用いることができる。
【０１３３】
本発明の方法で利用する、構造体を構成する磁性体の例として、例えば、磁性を有する金属または金属化合物が挙げられ、さらに具体的には、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、ＭｎＺｎフェライト、ＮｉＺｎフェライト、ＹＦｅガーネット、ＧａＦｅガーネット、Ｂａフェライト、Ｓｒフェライト等各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル、クロムなどの金属、鉄、マンガン、コバルト、ニッケルなどの合金を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。ここで、例えば、磁性複合体上に生体物質を固定する場合、あるいは、磁性複合体を生体内に投与する場合には、生体に対する適合性の良好なマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）のほか、必要に応じて、マグネタイトの金属元素の一部を少なくとも１種類の他の金属元素で置換した各種フェライト組成などが好適に適用可能である。これら磁性体の形状は、生成条件によって変化し、多面体、８面体、６面体、球状、棒状、鱗片状等などがあるが、異方性の少ない構造が、構造体とした際、その表面を被覆するＰＨＡ層が示す機能の安定発現のためにはより好ましい。本発明の構造体を構成する磁性体の一次粒子の粒子径は、その用途に応じて適宜選択可能であるが、例えば、０．００１〜１０μｍの範囲内の粒径を有する粒子を用いるとよい。
【０１３４】
また、本発明の方法で利用する、構造体を構成する磁性体として、超常磁性を有するものについても好ましく用いることができる。例えば、フェライトの粒子径が２０ｎｍ程度以下と小さい場合には、フェライトは熱擾乱影響を受け超常磁性を示すようになり、残留磁化や保磁力を持たなくなる。超常磁性であっても、外部磁界を印加することにより、磁気的操作が可能であり、また、超常磁性であれば、残留磁化や保磁力を持たないので、外部磁界が印加されていない際に、残留磁化に起因する磁気的な凝集の生じる恐れもない。
【０１３５】
さらには、本発明の方法で利用する磁性体は、金属または金属化合物を含むマトリックスなどのような複合材料であってもよく、そのマトリックスは、有機または無機の各種材料から構成されるものである。フェライトめっきのような手法で、有機高分子表面を磁性体により被覆した材料、有機高分子中に磁性体が分散した材料等も、その表面の一部に磁性体が露出した形態であれば、利用可能である。
【０１３６】
なお、本発明の方法に用いる磁性体は、粒子状、平板状、フィルム状として、用いることができるが、本発明の方法における、磁気的操作による分離の具体的な手法を考慮する場合、粒子状が好ましく、さらには、液体試料中への分散を想定すると、その粒子径は、０．００１〜１０μｍ程度の微粒子であることがより好ましい。
【０１３７】
＜ＰＨＡ磁性構造体の作製＞
本発明の方法で利用するＰＨＡ磁性構造体の製造方法は、磁性体にＰＨＡ合成酵素を固定化する工程と、該固定化ＰＨＡ合成酵素を用いて、３−ヒドロキシアシルＣｏＡに対する酵素反応により、ＰＨＡを合成する工程とを含むものである。
【０１３８】
磁性体にＰＨＡ合成酵素を固定化する方法としては、該ＰＨＡ合成酵素の活性が保持され得るものであり、かつ、目的とする磁性体に対して適用可能なものであれば、通常行われている酵素固定化方法の中から、任意に選択される方法を用いることができる。例えば、ＰＨＡ合成酵素を固定化する方法として、共有結合法、イオン吸着法、疎水吸着法、物理的吸着法、アフィニティ吸着法、架橋法、格子型包括法などを例示することができるが、特に、イオン吸着や疎水吸着を利用した固定化方法を用いると、簡便である。
【０１３９】
一般に、ＰＨＡ合成酵素などの酵素タンパク質は、アミノ酸が多数結合したポリペプチドであり、リシン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの側鎖上にイオン性基を有するアミノ酸残基によって、イオン吸着体としての性質を示し、また、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリンなどの側鎖として疎水性基を有するアミノ酸残基によって、あるいは、全体として、有機高分子であるという点で、疎水吸着体としての性質を有している。従って、程度の差はあるが、イオン性や疎水性、もしくはイオン性と疎水性の両方の性質を有する固体表面に吸着させることが可能である。
【０１４０】
主にイオン吸着法によってＰＨＡ合成酵素を固定化する方法を適用する際、その核には、イオン性官能基を表面に発現しているコアを用いればよく、例えば、カオリナイト，ベントナイト、タルク、雲母等の粘土鉱物、アルミナ、二酸化チタン等の金属酸化物、シリカゲル、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムゲル等の不溶性無機塩などをコアとして用いることができる。また、これらを主要な成分とする無機顔料、イオン交換樹脂、キトサン、ポリアミノポリスチレン等の、イオン性官能基を有する重合体も、イオン吸着性コアとして用いることができる。
【０１４１】
本発明に利用するＰＨＡ磁性構造体において、基材が磁性体の場合、例えば、フェライトなどの金属酸化物においては、その表面に水酸基が存在しており、ＰＨＡ合成酵素表面のカルボキシ基との水素結合による固定化法などが好適に用いうる。
【０１４２】
一方、主に疎水吸着によってＰＨＡ合成酵素を固定化する方法を適用する際、その核には、表面が非極性であるコアを用いればよく、例えば、スチレン系ポリマー、アクリル系ポリマー、メタクリル系ポリマー、ビニルエステル類、ビニル系ポリマーなど、イオン性官能基を表面に発現していない、もしくは疎水性官能基を表面に発現している多くの重合体をコアとして用いることができる。具体的には、芳香環を複数有するアゾ顔料や縮合多環のフタロシアニン系顔料、アントラキノン系顔料等の有機顔料、カーボンブラックなどは疎水吸着性である。また、疎水吸着法は、親油化処理を施した磁性体にも適用することが可能である。
【０１４３】
イオン吸着法または疎水吸着法によるＰＨＡ合成酵素のコアへの固定化は、該ＰＨＡ合成酵素とコアとを所定の反応液中で混合することによって達成される。このとき、該ＰＨＡ合成酵素がコアの表面に均等に吸着されるよう、反応容器を適当な強度で振盪あるいは攪拌することが望ましい。
【０１４４】
反応液のｐＨや塩濃度、温度によって、コアおよびＰＨＡ合成酵素の表面電荷の正負や電荷量、疎水性が変化するので、用いるコアの性質に合わせて、酵素活性上許容される範囲内で溶液の調整を行うことが望ましい。例えば、コアが主にイオン吸着性である場合には、塩濃度を下げることにより、コアとＰＨＡ合成酵素との吸着に寄与する電荷量を増やすことができる。また、ｐＨを調整する事により、両者の反対電荷を増やすことができる。コアが主に疎水吸着性である場合には、塩濃度を上げることによって、両者の疎水性を増やすことができる。また、予め電気泳動やぬれ角等を測定し、コアやＰＨＡ合成酵素の荷電状態や疎水性を調べることで、吸着に適した溶液条件の設定をすることもできる。さらに、コアとＰＨＡ合成酵素との吸着量を直接測定して条件を求めることもできる。吸着量の測定は、例えば、コアが分散された溶液に濃度既知のＰＨＡ合成酵素溶液を添加し、吸着処理を行った後、溶液中のＰＨＡ合成酵素濃度を測定し、差し引き法により吸着酵素量を求める等の方法を用いればよい。
【０１４５】
イオン吸着法や疎水吸着法では酵素を固定化し難いコア材質の場合には、操作の煩雑さや酵素の失活の可能性を考慮した上で、共有結合法によってもかまわない。例えば、芳香族アミノ基を有するコア材質（固体粒子）をジアゾ化し、これに酵素をジアゾカップリングする方法や、カルボキシ基、アミノ基を有するコア材質（固体粒子）とＰＨＡ合成酵素の間にペプチド結合を形成させる方法、ハロゲン基（ハロゲノアルキル基）を有するコア材質（固体粒子）とＰＨＡ合成酵素のアミノ基等との間でアルキル化する方法、臭化シアンで活性化した多糖類コア粒子とＰＨＡ合成酵素のアミノ基を反応させる方法、コア材質（固体粒子）のアミノ基と酵素のアミノ基との間を架橋する方法、アルデヒド基またはケトン基を有する化合物とイソシアニド化合物の存在下、カルボキシ基，アミノ基を有するコア材質（固体粒子）とＰＨＡ合成酵素とを反応させる方法、ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を有するコア材質（固体粒子）とＰＨＡ合成酵素のスルファニル基（−ＳＨ）との間で交換反応させる方法などがある。
【０１４６】
また、アフィニティ吸着によって、コア材質（固体粒子）の表面にＰＨＡ合成酵素を吸着してもよい。アフィニティ吸着とは、生体高分子とそれに特異的な親和力を示す、リガンドと呼ばれる特定物質との間の生物学的吸着で、例えば、酵素と基質、抗体と抗原、レセプターとアセチルコリン等の情報物質、ｍＲＮＡとｔＲＮＡなどがある。一般に、アフィニティ吸着を利用して、酵素タンパク質を固定化する方法では、酵素の基質や反応生成物、拮抗阻害剤、補酵素、アロステリックエフェクター等をリガンドとして固体表面に結合させ、このリガンドと添加した酵素タンパク質との結合を介して、固体表面にアフィニティ吸着させる方法を採用する。しかしながら、ＰＨＡ合成酵素に対しては、例えば、基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡをリガンドとして用いた場合、該ＰＨＡ合成酵素中のＰＨＡ合成を触媒する活性部位がリガンドとの結合により塞がれてしまうため、ＰＨＡを合成できなくなるという問題を生じる。しかしながら、他の生体高分子をＰＨＡ合成酵素に予め融合させ、該生体高分子のリガンドを利用して、アフィニティ吸着法を適用することによって、アフィニティ吸着による固定化後も、ＰＨＡ合成酵素自体のＰＨＡ合成活性を維持することができる。なお、ＰＨＡ合成酵素と生体高分子との融合は遺伝子工学的手法によって行ってもよく、また、生体高分子をＰＨＡ合成酵素に化学的に結合させてもよい。用いる生体高分子としては、生体高分子に対するリガンドの入手容易で、そのリガンドがコアに容易に結合できるものであればいかなるものでも構わないが、遺伝子組換えによって融合物を発現させる場合には、融合させる生体高分子はタンパク質であることが好ましい。具体的には、形質転換によって、融合パートナーのＧＳＴを発現する遺伝子配列にＰＨＡ合成酵素の遺伝子配列を繋げた遺伝子を導入した大腸菌を用いて、ＧＳＴとＰＨＡ合成酵素との融合タンパク質を生産し、この融合タンパク質をＧＳＴのリガンドであるグルタチオンを結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅに添加することで、融合タンパク質型のＰＨＡ合成酵素をＳｅｐｈａｒｏｓｅ上にアフィニティ吸着させることができる。
【０１４７】
また、磁性体に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むペプチドをＰＨＡ合成酵素に融合して提示させ、該磁性体に対して結合能を有するアミノ酸配列のペプチド部分と、磁性体との結合性に基づいて、該磁性体表面にＰＨＡ合成酵素を固定化することもできる。
【０１４８】
磁性体に対する結合能を有するアミノ酸配列は、例えば、ランダム・ペプチド・ライブラリーのスクリーニングによって決定することができる。特に、例えば、Ｍ１３系ファージの表面蛋白質（例えば。ｇｅｎｅＩＩＩ蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結して調製されたファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリーを好適に用いることができるが、その場合、磁性体に対する結合能を有するアミノ酸配列を決定するには、次のような手順をとる。すなわち、磁性体あるいは該磁性体を構成する少なくとも一成分に対して、ファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリーを添加することによって接触させ、その後、洗浄により結合ファージと非結合ファージを分離する。磁性体結合ファージを酸などにより溶出し、緩衝液で中和した後、大腸菌に感染させ、磁性体結合ファージを増幅する。この選別を複数回繰り返すと、目的の磁性体に高い結合能を示す複数のクローンが濃縮される。ここで、単一なクローンを得るため、再度大腸菌に感染させた状態で培地プレート上にコロニーを作らせる。それぞれの単一コロニーを液体培地で培養した後、培地上清中に存在するファージをポリエチレングリコール等で沈澱精製し、そのクローンが有する合成遺伝子の塩基配列を解析すれば、磁性体に対する結合能を有するペプチドの構造（アミノ酸配列）を知ることができる。
【０１４９】
上記スクリーニング方法により選別される、磁性体に対する結合能を有するペプチドのアミノ酸配列をコードする合成遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素の遺伝子に融合して利用される。磁性体に対する結合能を有するペプチドは、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端あるいはＣ末端に連結して発現することができる。また、適当なスペーサー配列を挿入して発現することもできる。スペーサー配列としては、約３〜約４００アミノ酸が好ましく、また、スペーサー配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペーサー配列は、ＰＨＡ合成酵素の機能を妨害せず、また、前記磁性体に対する結合能を有するペプチドを介して、融合タンパク質型ＰＨＡ合成酵素が磁性体に結合する際、結合能を有するペプチドによる結合を妨害しないものである。
【０１５０】
上記方法により作製された固定化ＰＨＡ合成酵素は、そのままでも用いることができるが、さらに、凍結乾燥等を施した上で保存し、その都度、酵素反応液用媒体に添加して、使用することもできる。
【０１５１】
固定化ＰＨＡ合成酵素による３−ヒドロキシアシルＣｏＡの重合によって、ＰＨＡが合成される反応において放出されるＣｏＡ量が、１分間に１μｍｏｌとなるＰＨＡ合成酵素量を１単位（Ｕ）としたとき、磁性体に固定するＰＨＡ合成酵素の量は、例えば、磁性体がカプセル構造体のコアである場合、磁性体１  ｇ当たり、１０  単位（Ｕ）〜１，０００単位（Ｕ）の範囲、望ましくは、５０  単位（Ｕ）〜５００単位（Ｕ）の範囲内に設定するとよい。
【０１５２】
前記の固定化ＰＨＡ合成酵素は、所望のＰＨＡの原料となる３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む水系反応液中に添加され、磁性体表面に固定化したＰＨＡ合成酵素によってＰＨＡを合成することにより、磁性体の表面が合成されるＰＨＡにより被覆された構造体を形成する。その際、水系反応液は、固定化ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る条件に調整された反応系に構成するべきであり、例えば、通常、ｐＨ５．５〜ｐＨ９．０の範囲、好ましくは、ｐＨ７．０〜ｐＨ  ８．５の範囲となるよう、緩衝液によりｐＨ調整を行う。ただし、使用する固定化ＰＨＡ合成酵素の至適ｐＨやｐＨ安定性によっては、上記のｐＨ範囲以外に条件を設定することも除外されない。緩衝液の種類は、使用する固定化ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば、設定するｐＨ領域等に応じて、適宜選択して用いることができるが、例えば、一般の生化学反応に用いられる緩衝液、具体的には、酢酸バッファー、リン酸バッファー、リン酸カリウムバッファー、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）バッファー、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳ）バッファー、トリス塩酸バッファー、グリシンバッファー、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（ＣＨＥＳ）バッファーなどを用いるとよい。緩衝液の濃度も、使用する固定化ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば、特に限定はされないが、通常、５．０  ｍＭ〜１．０  Ｍの範囲、好ましくは０．１  Ｍ〜０．２  Ｍの濃度のものを使用するとよい。反応温度は、使用するＰＨＡ合成酵素の特性に応じて、適宜設定するものであるが、通常、４℃〜５０℃の範囲、好ましくは、２０℃〜４０℃の範囲に設定するとよい。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適温度や耐熱性によっては、上記の範囲以外に条件を設定することも除外されない。反応時間は、合成すべきＰＨＡの被覆層の厚さに応じて、選択すべきものであり、また、使用するＰＨＡ合成酵素の安定性等にもよるが、通常、１分間〜２４時間の範囲、好ましくは、３０分間〜３時間の範囲内で適宜選択して設定する。反応液中の基質３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度は、合成すべきＰＨＡの被覆層の組成、厚さに応じて、適宜選択するべきものであり、また、使用する固定化ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る範囲内で、適宜設定するものであるが、通常、０．１  ｍＭ〜１．０  Ｍ、好ましくは０．２  ｍＭ〜０．２  Ｍの範囲内で設定するとよい。なお、反応液中における基質３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度が高い場合、一般に、反応系のｐＨが低下する傾向にあるため、基質３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度を高く設定する場合は、ｐＨの変動を抑制するため、前記の緩衝液濃度も高めに設定することが好ましい。
【０１５３】
また、上記工程において、水系反応液中の基質３−ヒドロキシアシルＣｏＡの種類や濃度などの組成を経時的に変化させることによって、形成される構造体の形状が粒状であれば内側から外側に向かう方向に、構造体の形状が平面状であれば垂直方向に、磁性体表面を被覆するＰＨＡの膜厚方向におけるモノマーユニット組成を変化させることができる。
【０１５４】
このＰＨＡのモノマーユニット組成の変化した構造体の形態として、例えば、ＰＨＡ被膜の組成変化が連続的で、内側から外側に向かう方向、もしくは垂直方向に組成の勾配を形成した１層のＰＨＡが磁性体を被覆した形態を挙げることができる。組成の勾配を形成した１層のＰＨＡの製造方法としては、例えば、ＰＨＡを合成しながら、反応液中に別組成の基質３−ヒドロキシアシルＣｏＡを添加するなどの方法によればよい。
【０１５５】
また別の形態として、ＰＨＡ被膜の組成変化が段階的で、組成の異なるＰＨＡが磁性体を多層に被覆した形態を挙げることができる。この組成の異なるＰＨＡ多層被覆を製造方法としては、ある３−ヒドロキシアシルＣｏＡの組成でＰＨＡを合成した後、遠心分離などによって調製中の構造体を反応液から一旦回収し、回収された調製中の構造体表面に、異なる３−ヒドロキシアシルＣｏＡの組成からなる反応液を再度添加して、組成の異なるＰＨＡを積層するなどの方法を適用よればよい。
【０１５６】
＜標的成分結合分子のＰＨＡ磁性構造体への担持＞
ＰＨＡ磁性構造体の表面に、標的成分に対して結合親和力を有する分子（以下、標的成分結合分子と記載する。）を担持する方法としては、該表面を被覆するＰＨＡと標的成分結合分子との疎水性、イオン性、ファンデルワールス力等の物理的親和力による物理吸着によることもできるが、再現性や安定性を考慮すると、該ＰＨＡ側鎖の官能基と、標的成分結合分子の有する官能基とを、そのまま、あるいは変換・修飾・活性化試薬の存在下に結合させて、不可逆的な共有結合を介在させることがより望ましい。
【０１５７】
本発明の方法に用いるＰＨＡ磁性構造体の一形態として、該表面を被覆するＰＨＡの側鎖上にエポキシ基を有するＰＨＡ磁性構造体を用いることができる。該エポキシ基は、標的成分結合分子が有するアミノ基（−ＮＨ２）あるいはスルファニル基（−ＳＨ）と直接的に共有結合を形成することができる。結合形成に試薬を必要とせず、共有結合の形成が可能であることから、用いる標的成分結合分子として、酵素タンパク質等の変性を起こし易いタンパク質や、Ａタンパク質、Ｇタンパク質といった抗体（Ｆｃ）受容体タンパク質等の担持に有効である。さらには、該表面を被覆するＰＨＡ上にイミノ二酢酸（ＩＤＡ）を担持し、Ｎｉ２＋等の金属イオンを添加することにより、ヒスタグ化された標的タンパク質の効率的回収に利用することが可能である。本エポキシ基との反応を利用して、共有結合を形成する方法は、標的成分結合分子が薬剤候補物質のような低分子化学物質である場合にも、該低分子化学物質がアミノ基（−ＮＨ２）あるいはスルファニル基（−ＳＨ）を有していれば、勿論応用することができる。
【０１５８】
該エポキシ基含有ＰＨＡ磁性構造体は、エポキシ基に対して、１０〜１００倍モル量の水酸化アンモニウム、あるいはヘキサメチレンジアミン塩酸塩等を用いて、アルカリ条件下で反応させることにより、アミノ基を有するＰＨＡ磁性構造体に変換することができる。該アミノ基は、標的成分結合分子がタンパク質やペプチドの場合は、その主鎖カルボキシ末端やアスパラギン酸、グルタミン酸といった、該タンパク質やペプチドが有するアミノ酸残基の側鎖カルボキシ基との間で、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）等の架橋化剤によりアミド結合を形成させることができる。その場合、標的成分結合分子側のカルボキシ基をＮＨＳ処理により活性化エステルとする必要があるので、ＮＨＳ処理を施した際、標的成分結合分子の機能が十分保持されるか否かを、予め確認しておく必要がある。本アミド結合形成を利用する担持方法は、標的成分結合分子が薬剤候補物質のような低分子化学物質である場合にも、該低分子化学物質がカルボキシ基を有していれば、勿論応用することができる。
【０１５９】
さらに、該アミノ基は、標的成分結合分子が、糖鎖やレクチン等の糖タンパク質、リポ多糖等の糖脂質の場合には、その糖鎖中のアルデヒド構造（ホルミル基：−ＣＨＯ）との間で、シッフ塩基（−ＣＨ＝Ｎ−）形成および還元的アミネーションによる安定な結合を形成することができる。本糖鎖とアミノ基との反応を利用する共有結合の形成方法は、糖鎖中にアルデヒド構造を導入する、糖鎖部分の部分的酸化により促進され、また、そのＦｃ部分に糖鎖を有するＩｇＧ等の抗体分子の担持にも応用可能である。本アミノ基とアルデヒド構造（ホルミル基：−ＣＨＯ）との方法は標的成分結合分子が薬剤候補物質のような低分子化学物質である場合にも、該低分子化学物質がアルデヒド構造（ホルミル基：−ＣＨＯ）を有しているか、部分的酸化によりアルデヒド構造（ホルミル基：−ＣＨＯ）を導入することが可能であれば、勿論応用することができる。
【０１６０】
さらに、該アミノ基は、マレイミド誘導体、ピリジルジチオ化合物、ヨウ素／臭素アセチル化合物の存在下で、スルファニル基（−ＳＨ）を有する標的成分結合分子と結合させることができる。このアミノ基とスルファニル基（−ＳＨ）との反応の条件は、マレイミド誘導体を用いる場合は、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５−７．５）中で、４℃から室温で２−４時間、ピリジルジチオ化合物を用いる場合は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で、室温にて１５−２０時間程度、ヨウ素／臭素アセチル化合物を用いる場合には、０．０５Ｍホウ酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．３）中で、遮光下に室温にて、１時間の反応が基本的な反応条件となるが、該反応条件は、標的成分結合分子の種類、その後の目的に応じて適宜変更することも可能である。
【０１６１】
本発明の方法に用いるＰＨＡ磁性構造体への担持の別の一形態として、該ＰＨＡの側鎖にカルボキシ基を有するＰＨＡ磁性構造体を利用するものを挙げることができる。該カルボキシ基は、標的成分結合分子が、タンパク質やペプチドの場合は、その主鎖アミノ末端や、リジン、アルギニンといった該タンパク質やペプチドが有するアミノ酸残基側鎖上のアミノ基との間で、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）等の架橋化剤によって、アミド結合を形成することができる。このアミド結合形成反応は、ＰＨＡのカルボキシ基をＮＨＳ処理により予め活性化エステルとすることにより、アミド結合の形成速度・頻度を向上したものである。また、本ＰＨＡ側鎖のカルボキシ基を利用するアミド結合の形成方法は、標的成分結合分子がＤＮＡやオリゴヌクレオチドである場合には、通常の既知の方法で、その末端をアミノ化したＤＮＡ、オリゴヌクレオチドを用いることで、上記の反応方法によって、ＰＨＡ上に担持することができる。本ＰＨＡ側鎖のカルボキシ基を利用するアミド結合の形成方法は、標的成分結合分子が薬剤候補物質のような低分子化学物質である場合にも、該低分子化学物質がアミノ基を有していれば、勿論応用することができる。
【０１６２】
本発明の方法に用いるＰＨＡ磁性構造体への担持の別の一形態として、該ＰＨＡの側鎖にクロロ基（−Ｃｌ）、ブロモ基（−Ｂｒ）、フルオロ基（−Ｆ）といったハロゲンを有するＰＨＡ磁性構造体を利用するものを挙げることができる。該ハロゲンがクロロ基やブロモ基の場合、スルファニル基（−ＳＨ）を有する標的成分結合分子との間で、温和な条件により、スルフィド結合（−Ｓ−）を形成することができる。
【０１６３】
その他、上記の活性官能基を用いて、表面にＰＨＡを被覆した構造体に担持したい「標的成分結合分子」と特異的に結合する物質（例えば、「標的成分結合分子」が抗体の場合には、プロテインＡやプロテインＧなど）を、その表面に結合させた後、「標的成分結合分子」と特異的に結合する物質に対して、目的の「標的成分結合分子」を特異的に結合させることにより、構造体上に担持する方法も挙げられるし、「標的成分結合分子」を、さらに修飾した後、同様の方法で担持することも可能である。後者の例としては、カルボキシ型ＰＨＡ磁性構造体の表面に、試薬ＮＨＳ−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ製）を用いて、ビオチンを担持し、一方、アビジンあるいはストレプトアビジンで修飾した標的成分結合分子をビオチンに特異的に結合させることで、構造体上に担持する方法が挙げられる。利用可能な親和性結合対の例として、他に、レクチンと糖、ハプテンと抗体、タンパク質ＡあるいはＧと抗体Ｆｃ、他の特異結合タンパク質対、フェニルボロン酸とサリチルヒドロキサム酸、あるいは、互いに反応はするが、一般に、タンパク質とは反応しないその他の化学的部分対が挙げられる。
【０１６４】
構造体上への非特異吸着を防止するため、担持される標的成分結合分子の活性を損失しないような「ブロッキング剤」で、担持がなされていない構造体表面部分をコーティングすると好ましい。この「ブロッキング処理」に適したブロッキング剤として、コラーゲン、ゼラチン（特に、冷水魚皮ゼラチン）、スキムミルク、ＢＳＡ等の血清タンパク質および、タンパク質とは反応しない疎水性部分およびも親水性部分を含む数多くの化合物が挙げられる。
【０１６５】
＜標的成分結合分子担持ＰＨＡ磁性構造体と標的成分との接触および結合＞
本発明の方法における、ＰＨＡ磁性構造体上に担持された標的成分結合分子と標的成分との接触は、通常、水性媒体中で行われるが、標的成分がある種の薬剤候補物質のような難水溶性分子である場合には、アルコールやアセトン、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）やＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）といった極性溶媒や、ＴｗｅｅｎやＴｒｉｔｏｎ、ＳＤＳといった界面活性剤を添加し、さらには、トルエンやキシレン、ヘキサンのような非極性溶媒を加えて、エマルジョン系で接触を行い、結合反応を促進してもよい。但し、これらの溶媒、界面活性剤を用いる場合には、その添加濃度は、担持されている標的成分結合分子の親和結合機能が損なわれないような濃度範囲に選択することが必要である。
【０１６６】
本発明の方法における、ＰＨＡ磁性構造体上に担持された標的成分結合分子と標的成分との接触、結合を促進するために、標的成分結合分子の親和結合機能が損なわれない程度において、加熱手段や攪拌手段を用いることも可能であり、その際、超音波等の手段を用いることも可能である。
【０１６７】
また、本発明の方法で利用する構造体は、特には、磁性構造体であるので、その表面に担持された標的成分結合分子と標的成分との接触、結合を促進する手段として、磁力による操作を利用することも可能である。磁力による操作を施す場合、磁力を発揮する構造体（永久磁石や電磁石等：以下まとめて磁石と記載する場合もある）を用い、磁力の発揮、解放を繰り返す操作を施すことができる。電磁石を用いる場合、スイッチ切換えにより、電磁石に対する通電と遮断を反復して、磁性構造体の捕捉および解放を行う。磁石を用いた操作の一例としては、プローブ状の電磁石を反応容器内に挿入し、スイッチの切換え、電源のオン・オフ等により電磁石に対する通電と遮断を反復して、磁性構造体の捕捉・解放を繰り返す方法がある。また、別の一例として、磁石を容器側部の外側に配置して、スイッチの切換え、電源のオン・オフ、あるいは磁石自身の反応容器との距離の調節により、印加される磁場強度を反復的に変動させ、磁性構造体の捕捉・解放を繰り返す方法がある。
【０１６８】
なお、本発明の方法でいう標的成分と標的成分結合分子との「結合」は、結合対の要素、すなわち、化学的あるいは物理的作用により一方の分子が他方の分子に特異的に結合することである。周知の抗原・抗体反応による、抗原と抗体間の結合はもとより、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、核酸・ヌクレオチドの相補配列間、作動体と受容体分子、酵素補助因子と酵素、酵素抑制剤と酵素、ペプチド配列とその配列あるいはタンパク質全体に特異な抗体、ポリマーの酸と塩基、色素とタンパク質バインダー、ペプチドと特異タンパク質バインダー（リボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチドおよびリボヌクレアーゼＳ−タンパク質）、糖とホウ酸、および結合アッセイにおける分子会合を可能とする親和力を備えた同様の分子対の間における結合が挙げられるが、これに限定するものではない。さらに、結合対として、組換え技術あるいは分子工学により製造される分析物類似体あるいは結合要素など、元の結合要素の類似体である要素を挙げることができる。結合要素が免疫反応体であれば、例えば、抗体、抗原、ハプテンあるいはこれらの錯体が可能であり、「抗体」を用いる場合、単クローン抗体あるいはポリクローナル抗体、組換えタンパク質型抗体あるいは天然型抗体、キメラ抗体、混合物（単数あるいは複数）、単鎖抗体提示ファージ抗体（ファージ全体を含む）、単鎖抗体を提示するその断片（単数あるいは複数）、ならびに抗体およびタンパク質の結合要素の混合物でよい。
【０１６９】
近年、進化分子工学の発達により、ランダムなオリゴヌクレオチド・ライブラリーから蛋白質等の標的分子に対して高いアフィニティーを有する核酸分子、すなわちアプタマー（核酸抗体と称される場合もある）をスクリーニングする技術（“ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ”；  ＳＥＬＥＸ  ｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）が開発された。このアプタマーを用いるスクリーニング方法を用いて、抗体よりも迅速且つ容易な高アフィニティー・リガンドの調製が数多く報告されている（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，  ３５５：  ５６４  （１９９２）  、国際特許出願ＷＯ９２／１４８４３号公報、特開平８−２５２１００号公報、特開平９−２１６８９５号公報等）。
【０１７０】
あるいは、タンパク質である核酸の転写因子と、ある特定の塩基配列を含む核酸との結合に関しても、疾病発生の原因究明や、さらには、効果的な診断・治療への応用も期待されている。
【０１７１】
本発明の方法が対象とする「結合」には、勿論、このような核酸−タンパク質間の親和性結合も包含される。
【０１７２】
また、本発明の方法が対象とする「結合」には、永久的あるいは一次的を問わず、あらゆる物理的付着あるいは化学的付着、あるいは密接な特異的・選択的な会合を含む。一般に、イオン結合の相互作用、水素結合、疎水力、ファンデルワールス力などにより、対象のリガンド分子と受容体との間を物理的に付着させることができる。「結合」の相互作用は、結合により化学変化が起こる場合のように短い可能性がある。これは、結合成分が酵素であり、その分析物「標的成分結合分子」が酵素用基質である場合に一般的である。さらには、化学的連結が、永久的あるいは可逆的結合である可能性もある。結合は、特に異なる条件下において、特異的となる可能性がある。
【０１７３】
実際に、本発明の方法における、ＰＨＡ磁性構造体上に担持された標的成分結合分子と標的成分との接触および結合工程の一例としては、標的成分結合分子を担持するＰＨＡ磁性構造体を、組織や細胞ホモジェネートあるいは血清などの流体といった天然タンパク質を含む生物学的試料に接触させて、その天然タンパク質をＰＨＡ磁性構造体表面に担持する標的成分結合分子に特異的に吸着・結合させる工程である。
【０１７４】
また、該工程の別の一例としては、周知のファージ・ディスプレイ抗体選択法で用いられているように、標的成分結合分子であるタンパク質を担持する磁性構造体を用いて、適したバクテリオファージの表面に提示される抗体部分を選択的に結合することができる。
【０１７５】
また、該工程の別の一例としては、ハイブリドーマ上澄み液、ファージ・ディスプレイなどの流体など、受容体を含有した生物学的試料に接触させて、生物学的試料中に含まれる受容体を、特異的にＰＨＡ磁性構造体上に担持された標的成分結合分子に吸着させる工程も考え得る。
【０１７６】
＜標的成分結合磁性複合体の磁気分離および洗浄＞
磁性複合体（標的成分結合分子が担持されている磁性構造体）に標的成分を結合させた後、標的成分結合磁性複合体を分離および洗浄する方法においては、磁力を発揮する構造体（永久磁石や電磁石等）を用い、磁力の発揮、解放を繰り返すことにより、磁気分離の操作を施す。電磁石を用いる場合、スイッチ切換えにより、電磁石に対する通電と遮断を行って、標的成分結合磁性複合体の捕捉および解放を行う。
【０１７７】
実施形態の一例としては、プローブ型磁石を用いて、容器内で標的成分結合磁性複合体を捕捉した後、残余する液体を容器から除去する。洗浄液をその容器内に投入して、プローブ上にまだ捕捉されている標的成分結合磁性複合体を洗浄する。あるいは、標的成分結合磁性複合体が捕捉されたプローブ型磁石を反応溶液から取り出し、洗浄液へと移動させ、洗浄操作を行うこともできる。
【０１７８】
別の方法として、磁石を容器側部の外側に配置して、液体の交換時に標的成分結合磁性複合体を容器内側部に付着させておくこともできる。この外部磁石を取り除くと、標的成分結合磁性複合体は解放され、交換された液体（洗浄液）と混ざり合うことで洗浄が行われる。
【０１７９】
なお、本磁気分離の操作には、磁性微粒子を操作する用途で市販されている、数多くの磁選機を利用することも可能である。市販されている磁選機の例としては、ＤＹＮＡＬ社製  ＤＹＮＡＬ  ＭＣＰ、  Ｓｅｒｏｎｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製  ＭＡＩＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ、  宝酒造社製Ｍａｇｎｅｔｉｇｈｔ  Ｓａｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄ、  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社製  ＢｉｏＭａｇ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ、等が挙げられる。
【０１８０】
＜標的成分の磁性構造体からの溶離・遊離＞
本発明の方法においては、その必要に応じて、標的成分結合磁性複合体を単離した後、結合している標的成分を標的成分結合分子から溶離・遊離することもできる。標的成分結合分子と標的成分とが、タンパク質−タンパク質の組み合わせである場合は、通常の解離条件（ｐＨ２、４Ｍグアニジン、２Ｍチオシアン酸アンモニウム、あるいは１％ＳＤＳなど）で遊離することができるが、その際、遊離する標的成分タンパク質は変性を受けていることが多い。遊離した標的成分タンパク質が仮に変性していても、電気泳動やＨＰＬＣで精製を施す場合は、特に問題はないが、標的成分タンパク質本来の立体構造等を検証したい場合には、透析等の復元工程が必要な場合がある。
【０１８１】
＜標的成分の検出＞
本発明の方法で用いる、標的成分の検出方法として、通常の比色法、蛍光法、化学発光法、ラジオアイソトープ法等、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション・アッセイで用いることのできる如何なる方法も、採用することが可能である。さらには、標的成分結合分子から上記の方法で溶離・遊離された標的成分は、同様の方法を用いて分析することもできるし、さらに、標的成分がＤＮＡである場合は、ＰＣＲ等の手法で増幅した上で、シーケンサー等で塩基配列を検証することも可能であるし、標的成分がタンパク質である場合は、酵素分解した後、その酵素消化断片を、二次元電気泳動やＨＰＬＣにより分離した後、エレクトロスプレイ・イオン化法−ＭＳ分析を行うことも可能であるし、また、標的成分タンパク質について、直接あるいは酵素分解した後、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ  ＴｏＦ−ＭＳ）で分析することも可能である。
【０１８２】
勿論、核磁気共鳴スペクトロスコピー（ＮＭＲ）や赤外吸収スペクトロスコピー（ＩＲ）、紫外吸収スペクトロスコピー（ＵＶ）のような、その他のスペクトル分析を単独で、あるいは組み合わせて、標的成分の検出を行うことも可能である。
【０１８３】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１８４】
参考例１．  ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製
ＹＮ２株を１００  ｍｌのＬＢ培地（１％ポリペプトン（日本製薬（株）製）、０．５％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中で３０℃、一晩培養した後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られたＹＮ２株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで完全分解した。クローニング・ベクターには、ｐＵＣ１８を使用し、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断した。末端の脱リン酸処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、  １、  ５７２、  （１９８９）；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  出版）の後、ＤＮＡライゲーション・キット  Ｖｅｒ．  ＩＩ（宝酒造（株）製）を用いて、ベクターの切断部位（クローニング・サイト）と染色体ＤＮＡのＨｉｎｄ  ＩＩＩ完全分解断片とを連結した。この染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド・ベクターを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を形質転換し、ＹＮ２株のＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１８５】
次に、ＹＮ２株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号：２および配列番号：３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株））、このオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅されてきたＤＮＡ断片を、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販の標識酵素系ＡｌｋＰｈｏｓ・Ｄｉｒｅｃｔ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）を利用して行った。得られた標識化プローブを用いて、ＹＮ２株の染色体ＤＮＡライブラリーからコロニー・ハイブリダイゼーション法によって、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。
【０１８６】
選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＹＮ２株由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。ここで取得した遺伝子ＤＮＡ断片を、不和合性グループであるＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ、あるいはＩｎｃＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターｐＢＢＲ１２２（Ｍｏ  ＢｉＴｅｃ）に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株（ＰＨＡ合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により挿入して、形質転換したところ、ＹＮ２ｍｌ株のＰＨＡ合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ断片は、シュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【０１８７】
この遺伝子ＤＮＡ断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド鎖をコードする、配列番号：４および配列番号：５で示される塩基配列が存在することが確認された。これらのＰＨＡ合成酵素遺伝子について、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。すなわち、配列番号：４で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：６）および下流側プライマー（配列番号：７）と、配列番号：５で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：８）および下流側プライマー（配列番号：９）とを、それぞれ合成した（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株））。
【０１８８】
これらのプライマー対を用いて、配列番号：４ならびに配列番号：５で示される塩基配列のそれぞれについて、ＰＣＲ増幅を行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造（株）製）。次に、得られたＰＣＲ増幅断片および発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断し、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  １巻，  ５７２頁，  １９８９年；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）した後、この発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーション・キット  Ｖｅｒ．  ＩＩ（宝酒造（株）製）を用いて連結した。
【０１８９】
得られた組換えプラスミドで、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１：宝酒造）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドをそれぞれ回収した。配列番号：４の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドを、ｐＹＮ２−Ｃ１、配列番号：５の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドを、ｐＹＮ２−Ｃ２とした。ｐＹＮ２−Ｃ１、ｐＹＮ２−Ｃ２で、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１ｆＢ  ｆａｄＢ欠損株）を塩化カルシウム法により形質転換し、それぞれの組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株、ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株、ｐＹＮ２−Ｃ２組換え株を得た。
【０１９０】
参考例２．  ＰＨＡ合成酵素の生産１
ｐＹＮ２−Ｃ１に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１０）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１１）をそれぞれ設計・合成した（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株））。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＹＮ２−Ｃ１をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造（株）製）。
【０１９１】
同様に、ｐＹＮ２−Ｃ２に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１２）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１３）をそれぞれ設計・合成した（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株））。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＹＮ２−Ｃ２をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造（株）製）。
【０１９２】
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて、大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。発現用菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて、大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片によって行った。得られた菌株を、ＬＢ−Ａｍｐ培地１０  ｍｌで一晩プレ・カルチャーした後、その培養物０．１  ｍｌを、１０  ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０  ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後、ＩＰＴＧを添加（終濃度  １  ｍＭ）し、３７℃で４〜１２時間培養を続けた。
【０１９３】
ＩＰＴＧ誘導した大腸菌を集菌（８，０００×ｇ，  ２分、４℃）し、１／１０量の４℃リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；８  ｇ  ＮａＣｌ，１．４４  ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４，０．２４  ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，０．２  ｇ  ＫＣｌ，１，０００  ｍｌ精製水）に再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（８，０００×ｇ，  １０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製）で精製した。使用するグルタチオン・セファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオン・セファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８，０００×ｇ、  １分、４℃）した後、４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを同量加えて、４℃で１時間処理した。処理後、同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオン・セファロース  ４０μｌを、無細胞抽出液１  ｍｌに添加し、４℃で静かに攪拌した。前記の手順で、融合タンパク質ＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ１および融合タンパク質ＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ２をグルタチオン・セファロースに吸着させた。吸着後、遠心（８，０００×ｇ、１分、４℃）してグルタチオン・セファロースを回収し、４００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０  ｍＭグルタチオン４０μｌを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心（８，０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後、ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＧＳＴ融合タンパク質由来のシングル・バンドを確認した。
【０１９４】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（株）製、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴとを除去した。フロー・スルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１およびＹＮ２−Ｃ２の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、それぞれ６０．８ｋＤａ、および６１．５ｋＤａのシングル・バンドを確認した。
【０１９５】
該組換え型酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくん  ＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０  Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。なお、各精製酵素活性は、前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。表１に、各精製酵素の活性測定の結果を示す。
【０１９６】
【表１】
2004333232.tif 000022
【０１９７】
参考例３．Ｐ  ＨＡ合成酵素の生産２
Ｐ９１株、Ｈ４５株、ＹＮ２株またはＰ１６１株を、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、オクタン酸０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌに植菌して、３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）によって回収し、０．１Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）  ２００  ｍｌに再懸濁して、再度遠心分離することによって洗浄した。洗浄後の菌体を、０．１Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）２．０  ｍｌに再懸濁し、超音波破砕機にて破砕した後、遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃、１０分間）して上清を回収して粗酵素を得た。
各精製酵素活性は前述の方法で測定し、表２に測定結果を示す。
【０１９８】
【表２】
2004333232.tif 000023
【０１９９】
参考例４．  磁性体の調製
硫酸第一鉄水溶液中に、鉄イオンに対してｌ．０〜１．１当量の苛性ソーダ溶液を混合し、水酸化第一鉄を含む水溶液を調製した。この水溶液のｐＨを８前後に維持しながら、空気を吹き込み、８０〜９０℃で酸化反応を行い、種晶を生成させるスラリー液を調製した。
【０２００】
次いで、このスラリー液に、当初のアルカリ量（苛性ソーダのナトリウム成分）に対して、０．９〜１．２当量となるよう硫酸第一鉄水溶液を加えた後、スラリー液をｐＨ８前後に維持して、空気を吹き込みながら酸化反応を進める。酸化反応後に、生成した磁性酸化鉄粒子を洗浄、濾過、乾燥し、凝集している粒子を解砕し、平均粒径が０．１μｍの粒状の磁性体１を得た。
【０２０１】
参考例５．  エポキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子の作製１
ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液（１０  Ｕ／ｍｌ）１０質量部に、参考例４で作製した磁性体を１質量部、ＰＢＳ  ３９質量部を添加し、３０℃にて３０分間緩やかに振盪して、ＰＨＡ合成酵素を磁性体表面に吸着させた。これを遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）し、沈澱をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）して固定化ＰＨＡ合成酵素を得た。
【０２０２】
前記固定化ＰＨＡ合成酵素を０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ（３−フェノキシプロパナールとブロモ酢酸エチルとのＲｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応で得られた３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸を得た後、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）０．８質量部、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡ（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，  １２，  ８５−９１（１９９０）に記載の方法で合成した３−ヒドロキシ−７−オクテン酸の不飽和部分を３−クロロ安息香酸でエポキシ化したのち、  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）０．２質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪して、ＰＨＡ磁性構造体微粒子を得た。
【０２０３】
上記の試料１０μｌをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液１０μｌを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（３３０〜３８０  ｎｍ励起フィルタ、４２０  ｎｍロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、いずれの試料においても、ＰＨＡ磁性構造体微粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該ＰＨＡ磁性構造体微粒子は、確かにＰＨＡにより表面を被覆されていることが示された。
【０２０４】
さらに、試料の一部を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）により回収し、真空乾燥した後、クロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して、外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行った（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ，使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））。その結果、該ＰＨＡ磁性構造体微粒子の外被ＰＨＡの組成およびユニット％は、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニット：７５％，３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸ユニット：２５％であることが確認された。
【０２０５】
参考例６．  ビニルフェニル型ＰＨＡ磁性構造体微粒子の作製
ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液（１０  Ｕ／ｍｌ）１０質量部に湿式法で合成した粒子径０．３μｍのマグネタイト微粒子「マグネタイトＥＰＴ５００」（戸田工業（株）製）を１質量部、ＰＢＳ  ３９質量部を添加し、３０℃にて３０分間緩やかに振盪して、ＰＨＡ合成酵素を微粒子表面に吸着させた。これを遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）し、沈澱をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）して、固定化ＰＨＡ合成酵素を得た。
【０２０６】
上記固定化ＰＨＡ合成酵素を０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）０．８質量部、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）バレリルＣｏＡ（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）０．２質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪して、ＰＨＡ磁性構造体微粒子を得た。
【０２０７】
上記の試料１０μｌをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液１０μｌを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（３３０〜３８０  ｎｍ励起フィルタ、４２０  ｎｍロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、ＰＨＡ磁性構造体微粒子の表面が蛍光を発していることが確認され、該ＰＨＡ磁性構造体微粒子は、確かにＰＨＡにより表面を被覆されていることが判った。
【０２０８】
さらに、試料の一部を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）により回収し、真空乾燥した後、クロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行った（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ，使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））。その結果、該ＰＨＡ磁性構造体微粒子の外被ＰＨＡの組成およびユニット％は、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニット：８３％，３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニット：１７％であることが確認された。
【０２０９】
参考例７．  エポキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子の作製２
参考例６で製造したビニルフェニル型ＰＨＡ磁性構造体微粒子について、そのビニル基のエポキシ化反応を行った。ビニルフェニル型ＰＨＡ磁性構造体微粒子の１質量部を四つ口丸底フラスコに加え、蒸留水６質量部を加えて攪拌した。フラスコ内を４０℃に加温し、これに過酢酸３０％のヘキサン溶液１質量部を連続的に滴下し、攪拌下４０℃で５時間反応させた。反応は、ＰＨＡ磁性構造体微粒子同士が凝集することなく進行した。反応終了後、室温まで冷却し、反応液をろ過することで、ＰＨＡ磁性構造体微粒子を回収した。この回収したＰＨＡ磁性構造体微粒子は蒸留水に再懸濁した後、遠心分離（３０００×ｇ、４℃、３０分間）した。分離した後、ＰＨＡ磁性構造体微粒子を蒸留水に再懸濁し、再度遠心分離を行って洗浄した。さらに、この洗浄操作を３回繰り返した。その後、真空乾燥することで、下記組成のＰＨＡ磁性構造体微粒子を得た。
【０２１０】
さらに、試料の一部を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）により回収し、真空乾燥した後、クロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して、外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行った（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ，使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））。この測定結果から計算した、外被ＰＨＡに含まれる各側鎖ユニットのユニット％は、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニット：８５％、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニット：１１％、３−ヒドロキシ−５−（４−（１，２−エポキシエチル）フェニル）吉草酸ユニット：４％であった。この反応系が不均一反応であるため、微粒子表面のＰＨＡはエポキシ化され、被覆内部では、未反応ＰＨＡのままに残されていると考えられる。
【０２１１】
参考例８．  カルボキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子の作製
参考例６で製造したビニルフェニル型ＰＨＡ磁性構造体微粒子について、そのビニル基の酸化開裂反応を行った。ビニルフェニル型ＰＨＡ磁性構造体微粒子の１０質量部を三つ口フラスコに移して、過酸化水素５０ｐｐｍを添加した３００重量部の蒸留水を加えた。オゾンを１重量部／時間の割りで吹き込み、３時間室温で攪拌した。反応は、磁性構造体微粒子同士が凝集することなく進行した。反応終了後、反応液をろ過することで、ＰＨＡ磁性構造体微粒子を回収した。ＰＨＡ磁性構造体微粒子は、蒸留水に再懸濁した後、遠心分離（３０００×ｇ、４℃、３０分間）を行って、残余する過酸化水素水を洗浄した。さらに、この洗浄操作を２回繰り返した。その後、真空乾燥することで、下記する組成のＰＨＡ磁性構造体微粒子を得た。
【０２１２】
さらに、試料の一部を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）により回収し、真空乾燥した後、クロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行った（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ，使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））。この測定結果から計算した外被ＰＨＡに含まれる各側鎖ユニットのユニット％は、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニット：８４％、３−ヒドロキシ−５−（４−ビニルフェニル）吉草酸ユニット：１１％、３−ヒドロキシ−５−（４−カルボキシフェニル）吉草酸ユニット：５％であった。この反応系が不均一反応であるため、微粒子表面のＰＨＡはエポキシ化され、被覆内部では、未反応ＰＨＡのままに残されていると考えられる。
【０２１３】
参考例９．  ブロモ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子の作製
ＹＮ２−Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液（１０  Ｕ／ｍｌ）１０質量部に、参考例４で作製した磁性体を１質量部、ＰＢＳ  ３９質量部を添加し、３０℃にて３０分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を磁性体表面に吸着させた。これを遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）し、沈澱をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）して、固定化ＰＨＡ合成酵素を得た。
【０２１４】
上記固定化ＰＨＡ合成酵素を０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）４８質量部に懸濁し、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ（３−フェノキシプロパナールとブロモ酢酸エチルとのＲｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応で得られた３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸を得た後、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）０．８質量部、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタノイルＣｏＡ（Ｅｕｒ  ．Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９（  １９９７）  に記載の方法で調製）０．２質量部、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１質量部を添加し、３０℃で２時間緩やかに振盪して、ＰＨＡ磁性構造体微粒子を得た。
【０２１５】
上記のＰＨＡ磁性構造体微粒子の１０μｌをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液１０μｌを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡（３３０〜３８０  ｎｍ励起フィルタ、４２０  ｎｍロングパス吸収フィルタ、（株）ニコン製）観察を行った。その結果、磁性構造体の粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該ＰＨＡ磁性構造体微粒子は、確かにＰＨＡにより表面を被覆されていること示された。
【０２１６】
さらに、該ＰＨＡ磁性構造体微粒子の一部を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）により回収し、真空乾燥した後、クロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して、外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行った（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ，使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））。この測定結果から計算した外被ＰＨＡに含まれる各側鎖ユニットのユニット％は、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニット：８９％、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸ユニット：１１％であった。
【０２１７】
実施例１．  エポキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子上に担持された抗ＡＦＰ抗体によるＡＦＰの免疫検出
１．  エポキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子への抗体の担持
リン酸緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ７．４）中に、参考例５において作製されたエポキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子を均一に分散させ（理論濃度５−１０×１０８個／ｍＬ）、同様のリン酸緩衝液に溶解した抗ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）抗体を、前記ＰＨＡ磁性構造体微粒子と抗体の最終比率が５−１０μｇ／１０７となるよう加え、ピペッティングにより穏やかに攪拌した。
【０２１８】
ロータリー・シェーカーで３０℃１時間反応させた後、ブロッキングのためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を最終濃度０．３％になるように加え、さらに、１５時間反応を行うことにより、エポキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子表面に担持された抗体を得た。
【０２１９】
２．標的成分（抗原：ＡＦＰ）との反応
５ｍＬ容エッペンドルフチューブ（ＢＳＡ処理）中、１で作製した抗ＡＦＰ抗体担持エポキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子の分散液５００μＬに、濃度１μｇ／ｍＬのＡＦＰ溶液２０μＬを混合し、３７℃で３０分間反応させた。このチューブを磁石に接して、磁性構造体微粒子を捕捉し、上清をデカンテーションにより除去した。その後、チューブ中に０．０４％ＮａＣｌ溶液２ｍＬを加え攪拌した。前記と同様に、磁石により磁性構造体微粒子を捕捉し、上清をデカンテーションにより除去した。この洗浄操作を３回繰り返した。
【０２２０】
３．酵素標識二次抗体との反応
Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，  ４，  ２０９（１９８３）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １１（１２），  ２２９１  （１９７２）に記載の方法に従って、アルカリ・ホスファターゼ標識抗ＡＦＰ抗体Ｆａｂ’を作製し、最終濃度濃度０．１μｇ／ｍＬになるように、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（２％  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２  含有；ｐＨ７．５）と混合・溶解し、その５００μＬを３．で得られた抗原ＡＦＰ結合磁性複合体微粒子に加え、３７℃１０分間、反応させた。その後、２．と同様の方法により、酵素標識二次抗体を反応させた抗原ＡＦＰ結合磁性複合体微粒子の洗浄を行った。
【０２２１】
４．検出
３．で得られた酵素標識二次抗体を反応させた抗原ＡＦＰ結合磁性複合体微粒子を含むチューブに、５００μＬのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（０．１Ｍ：ｐＨ１０．３：ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）および卵白アルブミン（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む）を加え、３７℃で５分間反応させた後、４−ニトロフェニルリン酸（最終濃度５．５ｍＭ）を含む前記緩衝液５００μｌを加え、３７℃で６０分間反応させた。反応終了後、１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液５００μＬを加えて、反応を停止し、紫外・可視吸光度を測定した。その結果、標識酵素アルカリ・ホスファターゼによる反応産物に由来する４０５ｎｍの吸収が検出され、実際に、抗原ＡＦＰが回収されていることが確認された。
【０２２２】
実施例２．  セロペンタオース担持アミノ化ＰＨＡ磁性構造体微粒子を用いたコンカナバリンＡの回収
１．エポキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子のアミノ化
参考例７で作製されたエポキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子に、２，２’−（エチレンジオキシ）−ジメチルアミンを加え、３０℃で１５時間反応を行いアミノ化を行った。反応終了後、ビス−２−メトキシエチルエーテルで５回洗浄し、残留アミンを除去した後、蒸留水でさらに３回洗浄することにより、アミノ化ＰＨＡ磁性構造体微粒子を得た。
【０２２３】
２．アミノ化ＰＨＡ磁性構造体微粒子へのセロペンタオースの担持
工程１．で得られたアミノ化ＰＨＡ磁性構造体微粒子を、実施例１と同様にリン酸緩衝液中に均一に分散させ、セロペンタオース（Ｄ−（＋）−Ｃｅｌｌｏｐｅｎｔａｏｓｅ：Ｓｉｇｍａ社製）を予め過ヨウ素酸ナトリウムで非還元末端を酸化することにより、アルデヒド構造（−ＣＨＯ：ホルミル基）を生成させたものと３０℃で３０時間攪拌し、セロペンタオースをアミノ化ＰＨＡ磁性構造体微粒子上への担持を行った。その後、微粒子表面に残留する余剰のアミノ基を保護するため、無水ブタンジエン酸を加えて反応させ、蒸留水で３回洗浄することにより、セロペンタオース担持アミノ化ＰＨＡ磁性構造体微粒子を得た。
【０２２４】
３．コンカナバリンＡの回収
前記リン酸緩衝液にコンカナバリンＡ（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ：Ｓｉｇｍａ社製）とＢＳＡを溶解させ、２．で得られたセロペンタオース担持アミノ化ＰＨＡ磁性構造体微粒子を加えて、３０℃で１５時間反応した後、磁力により微粒子を回収した。回収した微粒子を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で処理し、溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ったところ、１０４ｋＤａにほぼ単一のバンドが見られ、コンカナバリンＡが回収されたことが示された。
【０２２５】
実施例３．カルボキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子を用いたＤＮＡ断片のスクリーニング
１．モデル核酸Ｍ１３ｐ１８ｓｓＤＮＡの合成とアミノ化
配列番号：１４に示す、大腸菌Ｍ１３ファージｍｐ１８一本鎖ＤＮＡに相補的な塩基配列を有する２０量体オリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成機（ＡＢＩ社製３８１Ａ）で合成した。
配列番号：１４：  ５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’
その後、通常のアミダイド試薬に変わり、アミノ基を導入したデオキシウリジル酸誘導体モノマー（化合物［１９］）を用いて、上記２０量体オリゴヌクレオチドの５’側にアミノ基（−ＮＨ２）を導入した（化合物［２０］）。常法により、ＣＰＧサポートからの切り出し、脱保護基、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製を行った。
【０２２６】
【化２０】
2004333232.tif 000024
【０２２７】
【化２１】
2004333232.tif 000025
【０２２８】
２．アミノ化プローブ・オリゴヌクレオチドのカルボキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子への担持
参考例８で得られたカルボキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子を、予め０．０１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で洗浄し、得られた微粒子に対し、理論上カルボキシ基の２モル倍程度のＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジエチルアミノプロピル）−カルボジイミド−塩酸）および式［２０］に示すアミノ化オリゴヌクレオチドを加えて、４℃で１８時間反応を行い、プローブ・オリゴヌクレオチドを担持したＰＨＡ磁性構造体微粒子を得た。
【０２２９】
３．ターゲット・モデルオリゴヌクレオチドの合成と標識化
上記配列番号：１４のオリゴヌクレオチドに対して、完全相補的な２０量体オリゴヌクレオチド（配列番号：１５）、１塩基ミスマッチの（配列番号：１６）、２塩基ミスマッチの（配列番号：１７）オリゴヌクレオチドを、それぞれ自動合成機で合成し、常法により精製した。
配列番号１５：  ５’−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣ−３’
配列番号１６：  ５’−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＣＴＴＴＴＡＣＡＡＣ−３’
配列番号１７：  ５’−ＡＣＴＧＧＣＧＧＴＣＧＴＴＡＴＡＣＡＡＣ−３’
精製したモデルオリゴヌクレオチド三種を、それぞれ工程１と同様の方法で、デオキシウリジル酸誘導体モノマー（化合物［１９］）を用いて、５’末端をアミノ化した。
【０２３０】
これとは別に、特許第０３３６８０１１号公報に開示の方法に従って、シアニン色素（化合物［２１］）１７０ｍｇを５ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、これに乾燥ピリジン５０μｌを加えた。さらに、ＤＳＣ（ジスクシイミジルカーボネート）１２８ｍｇを加えた後、暗所、室温で２０時間攪拌した。反応混液にジエチルエーテル１５０ｍｌを加え、析出した沈澱を集め、ジエチルエーテルで洗った後乾燥させた。得られた活性エステル体（化合物［２２］）を、そのままターゲット・モデルオリゴヌクレオチド（完全相補：配列番号１５）の標識に用いた。
【０２３１】
【化２２】
2004333232.tif 000026
【０２３２】
【化２３】
2004333232.tif 000027
【０２３３】
また、同様の方法でアズレン色素活性エステルである化合物［２３］で、上記の１塩基ミスマッチの（配列番号：１６）、２塩基ミスマッチの（配列番号：１７）オリゴヌクレオチドのアミノ化物を標識した（化合物［２４］）。
【０２３４】
【化２４】
2004333232.tif 000028
【０２３５】
【化２５】
2004333232.tif 000029
【０２３６】
４．完全相補オリゴヌクレオチドのスクリーニング
工程２で得られたプローブ・オリゴヌクレオチド担持ＰＨＡ磁性構造体微粒子と、工程３で得られた標識化ターゲット・オリゴヌクレオチドを、プローブ／ターゲット量比が理論上１／１０になるよう調整し、８０℃で２分間保持した後、時間をかけて室温に戻した（ハイブリダイゼーション条件）。
【０２３７】
磁力により微粒子を分離し、７８０ｎｍのレーザーで励起して、蛍光光度計で測定したところ、化学式［２１］の化合物に由来する、８２０ｎｍ付近にピークを持つ蛍光が見られ、配列番号：１５のターゲットＤＮＡが、選択的に回収されていることが確認された。
【０２３８】
実施例４．抗アルキルフェノール抗体担持カルボキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子を用いたノニルフェノールの回収
１．抗アルキルフェノール抗体のカルボキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子への担持
参考例８で作製したカルボキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子のＰＨＡ側鎖上のカルボキシ基を、常法に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し、理論上２倍量の抗アルキルフェノール抗体（和光純薬製）を反応させて、抗アルキルフェノール抗体を担持したＰＨＡ磁性構造体微粒子を得た。
【０２３９】
２．ノニルフェノールの回収、検出
和光純薬製「アルキルフェノールＥＬＩＳＡキット」の手法に準じ、ノニルフェノール標準原液と抗原酵素複合体溶解液を混合し、工程１で得られた抗アルキルフェノール抗体担持ＰＨＡ磁性構造体微粒子を加えて、容器の外側から密着させた電磁石のスイッチ切換えにより、反応を促進した。本操作を３０℃で３０分間行った後、電磁石のスイッチをオンにした状態で微粒子を容器内壁面に捕捉し、反応液を除去した。次いで、容器に洗浄液を加え、電磁石のスイッチ切換えにより、洗浄を促進した。本洗浄工程を、洗浄液を置換して５分ずつ３回行った後、発色基質溶液を加えて、吸光度を測定したところ４５０ｎｍに強い吸収が見られ、本方法により、ノニルフェノールが回収され、その検出が行えることが示された。
【０２４０】
実施例５．長鎖アルカン担持ブロモ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子を用いたリポソームの分離・回収
１．ドデカンチオールを用いたブロモ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子へのドデカン担持
１−ドデカンチオールをヘキサンに溶解し、ヨウ化ナトリウム、炭酸カリウムおよびジエチルアミンを加えて、参考例９で作製したブロモ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子と混合し、室温で２０時間攪拌することで、スルフィド結合（−Ｓ−）を介したドデカン担持ＰＨＡ磁性構造体微粒子を得た。
【０２４１】
２．蛍光リポソームの回収・検出
Ｓｉｇｍａ社が製造販売している「Ｌｉｏｐｓｏｍｅ  Ｋｉｔ」を用い、そのプロトコルに従って、内部にＦＩＴＣを含んだリポソームを作製し、工程１で得られたドデカン担持ＰＨＡ磁性構造体微粒子と攪拌・混合した。混合１５分後、プローブ型電磁石を容器内に装入し、プローブ型電磁石用電源スイッチをオンにして、微粒子をプローブ型電磁石上に捕捉し、次いで、反応容器より洗浄液の入った容器へ移し、電源スイッチをオフにして微粒子を解放し、１５分攪拌した。この洗浄操作を３回繰り返した後、蛍光光度計で測定したところ、ＦＩＴＣに基づく５２０ｎｍに極大を有する蛍光が確認され、本方法により、リポソームが効率よく回収され、検出できることが示された。
【０２４２】
実施例６．コンセンサス結合配列遺伝子断片担持カルボキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子を用いた転写因子タンパク質の分離・回収
塩基性のロイシンジッパーを持った転写因子であるＡＴＦ−２とそのコンセンサス結合配列との親和性を利用して、ＡＴＦ−２の分離・回収を試みた。
【０２４３】
１．末端チオール型ＡＴＦ−２コンセンサス結合配列ＤＮＡ断片の合成
ＤＮＡ自動合成機を用いて、配列番号：１８の一本鎖核酸を合成した。なお、配列番号：１８の一本鎖ＤＮＡの５’末端には、ＤＮＡ自動合成機での合成時にチオール・モディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いることによって、スルファニル基（−ＳＨ）を導入した（化合物［２５］）。続いて、通常の脱保護によりＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた。
配列番号：１８：  ５’−ＴＧＡＣＡＴＣＡ−３’
【０２４４】
【化２６】
2004333232.tif 000030
【０２４５】
２．末端チオール化ＤＮＡ断片のカルボキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子への担持
参考例８で作製したカルボキシ型ＰＨＡ磁性構造体微粒子のＰＨＡ側鎖上のカルボキシ基を、常法に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５：ＮａＯＨにて調整）に溶解した２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン（ＰＤＥＡ）により、チオールに対して活性化した後、工程１で得られた末端チオール化ＤＮＡ断片を加えて、担持を行った。なお、反応終了後、ＰＨＡ磁性構造体微粒子上に残留する活性基は、システイン−ＮａＣｌで不活性化した。
【０２４６】
３．結合反応、標識化
クロンテック社のプロトコルに従い、ＡＦＴ−２のＰＢＳ溶液中に工程２で得られたＤＮＡ断片担持ＰＨＡ磁性構造体微粒子を導入し、実施例４と同様の方法で、磁石によりＤＮＡ断片とＡＦＴ−２の親和性に起因する結合反応を促進した。反応終了後、実施例４と同様の方法で洗浄し、常法によりＦＩＴＣ標識された抗ＡＦＴ−２抗体（ポリクローナル）溶液中で、抗原・抗体反応を行った。
【０２４７】
４．洗浄および検出
抗原・抗体反応終了後、実施例４の方法で、磁石を用いた操作により洗浄を行い、蛍光検出を行ったところ、標識ＦＩＴＣに基づく５２０ｎｍに極大を有する蛍光が確認され、本方法により、転写因子タンパク質−コンセンサス配列ＤＮＡ断片の親和性結合に基づいた回収がなされ、検出できることが示された。
【０２４８】
【発明の効果】
本発明では、担体表面を被覆する高分子材料層として、生体親和性の高いポリマー材料である、ポリヒドロキシアルカノエート、例えば、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含有するポリヒドロキシアルカノエートを用いることにより、より生体条件に近い条件で、検体中の標的物質の分離、検出を効率よく行うことができる。
【０２４９】
【配列表】
2004333232.tif 000031
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において利用される、担体（磁性体）表面を被覆するＰＨＡ上に標的成分に対して結合親和力を有する分子を担持した、標的成分結合分子担持ＰＨＡ構造体の構成を模式的に示す図である。
【図２】本発明における、標的成分結合分子担持ＰＨＡ構造体に対する、標的成分と標的成分結合分子との選択的な結合形成過程を模式的に示す図である。
【図３】本発明における、標的成分との選択的な結合を形成した標的成分結合分子担持ＰＨＡ磁性構造体の、磁力を発揮する構造体を利用した磁気的分離過程を模式的に示す図である。
【符号の説明】
１  担体基体（磁性体）
２  ポリヒドロキシアルカノエート被覆層
３  ポリヒドロキシアルカノエート中の標的成分に対して結合親和力を有する分子を選択的に担持する部位
４  標的成分に対して結合親和力を有する分子
５  標的成分
６、７  標的成分以外の混在成分
８  磁力を発揮する構造体（永久磁石や電磁石等）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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