(57)【要約】【課題】ポリマ詰替方式のキャピラリ電気泳動装置を用いる変性条件の核酸電気泳動法において、高速化、高精度化、高分離化を実現する。【解決手段】緩衝剤としてトリス、グリシンを含み、電気伝導度が１ｍＳ／ｃｍ以下である泳動媒体、泳動バッファを使用する。【選択図】  図１
2004333190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子と、緩衝剤と、核酸の変性剤とを含有する泳動媒体が充填された１又は複数の流路を具備する電気泳動装置において、
前記緩衝剤としてメタナミン誘導体とアミノカルボン酸とを含むことを特徴とする電気泳動装置。
【請求項２】
請求項１記載の電気泳動装置において、前記緩衝剤として０．０１〜０．０５［Ｍ］のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び０．１〜０．４［Ｍ］のグリシンを含有することを特徴とする電気泳動装置。
【請求項３】
請求項１記載の電気泳動装置において、前記泳動媒体の平均の電気伝導度が１［ｍＳ／ｃｍ］以下であることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項４】
請求項１記載の電気泳動装置において、泳動電流が前記流路１本当たり８［μＡ］以下であることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項５】
請求項１記載の電気泳動装置において、単位長さの前記流路１本当りの泳動電流による仕事率が３［ｍＷ／ｃｍ］以下であることを特徴とする電気泳動装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡなどの遺伝子（核酸オリゴマー）の断片長を変性条件の電気泳動法により測定し、核酸の塩基配列や、ＶＮＴＲ多型などを解析する電気泳動装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸オリゴマーの断片長を手がかりとして、変性条件の電気泳動法により解析する方法として、非特許文献１（クリストフ・ヘラー著、エレクトロフォレシス、２１巻、５９３−６０２頁、２０００年）に記載されているキャピラリ電気泳動を利用する方法がある。この非特許文献１では、市販のシングルキャピラリ型のキャピラリ電気泳動装置を用い、キャピラリとして内径５０μｍ、外径３７５μｍのものを使用し、泳動媒体として市販のポリジメチルアクリルアミドに基づく再充填可能なポリマ、バッファとして１００ｍＭのＴＡＰＳバッファ（１００ｍＭ  Ｎ−ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＮａＯＨによりｐＨ８．０に調製、電気伝導度１２５０μＳ／ｃｍ）を使用している。泳動温度は５０℃、泳動電圧は電界強度で１５０Ｖ／ｃｍとしている。この非特許文献１の最適条件において、４００塩基の一本鎖ＤＮＡ断片について断片長が１塩基異なる断片同士を分離能０．５以上で分離するためには少なくとも１０ｃｍ、６００塩基の場合は少なくとも２０ｃｍ、８００塩基の場合は少なくとも３７ｃｍの有効長が必要であると結論している。これらの場合、４００塩基を１０ｃｍ、６００塩基を２０ｃｍ、８００塩基を３７ｃｍの有効長で分離する場合についてそれぞれ約３０分、６７分、１５０分を要する（図３より）。
【０００３】
しかしながら遺伝子情報の有用性に対する認識の高まりを反映して、より大量に、より迅速に核酸の塩基配列を決定するニーズが高まっている。そこで従来の分析速度をより高速化し、分析時間を短縮する試みが報告されている。例えば、電気泳動バッファの組成を変更することにより泳動速度を向上させる試みとして、非特許文献２（カレル・クレパルニクら著、エレクトロフォレシス、２２巻、７８３−７８８頁、２００１年）がある。非特許文献２では、バッファとして０．０４Ｍ  ＮａＯＨ、ポリマとして４ｗｔ％ＬＰＡ（直鎖状ポリアクリルアミド）を使用している。非特許文献２における電気泳動性能は、それ以前の方法（４％ＬＰＡ、７Ｍ尿素、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−０．１Ｍ  ＴＡＰＳ、ｐＨ８．３）と比較して約３倍高速と報告されている。しかし、下記の特別な工夫を行わない限り分離が悪く、例えば有効長１９．５ｃｍにおいて１８０塩基長の断片が全く分離しない（図４）。この問題は、試料注入直後にＰＥＧ−を注入することにより回避された。上記有効長の場合、１６３塩基長の断片を約１０分で分離でき、また６６８塩基長の断片の（分離は悪いものの）泳動時間は約２２分（図２、図１）、また有効長７ｃｍの場合の１６３塩基長の断片の（分離は悪いものの）泳動時間は約３．５分である（図３）。なお、非特許文献２においてはアルカリによるポリマの加水分解を防止するため、最初はポリマを０．０３ＭのＮａＣｌに溶解してキャピラリに充填した後、０．０４ＭのＮａＯＨからなる予備泳動バッファにキャピラリを浸して約５分間予備泳動することにより、泳動媒体のバッファを０．０４Ｍ  ＮａＯＨに交換している。
【０００４】
【非特許文献１】
クリストフ・ヘラー著、エレクトロフォレシス、２１巻、５９３−６０２頁、２０００年
【非特許文献２】
カレル・クレパルニクら著、エレクトロフォレシス、２２巻、７８３−７８８頁、２００１年
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
非特許文献１の方法は、４００ｎｔの核酸オリゴマーの１塩基分離を０．５以上の分離能で行うためには約３０分と長い泳動時間を要する。非特許文献２の方法は従来例より３倍高速とのことであるが、１６３ｎｔの核酸オリゴマーの分離を泳動時間３．５分で行う場合は分離が悪く、またＰＥＧ−の追加注入や予備泳動など煩雑な操作が必要となる。特に、予備泳動は約５分と、本泳動よりも時間がかかる。即ち、従来の核酸電気泳動においては高分離と迅速性は背反関係にあり、十分な分離を得るためには長い時間を要する、逆に短い分析時間では十分な分離が得られない、という問題があった。
【０００６】
本発明の目的は、１又は複数の流路（キャピラリや、基板上に形成された溝など）を具備する電気泳動装置を用い、変性条件下において核酸の電気泳動を行いＤＮＡシーケンシングや核酸の断片長解析を行う際、簡単な構成で迅速かつ高い核酸分離を達成し、長い核酸でも解析可能とすることにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、本発明による電気泳動装置は、高分子と、緩衝剤と、核酸の変性剤とを含有する泳動媒体が充填された１又は複数の流路を具備し、緩衝剤として、水溶性一級アミンと両性電解質とを含むことを特徴とする。泳動媒体は、変性剤として尿素を含み、高分子として、アクリルアミド重合体、特に好ましくは（Ｎ−アルキル）アクリルアミド重合体を含む。高分子の濃度は好ましくは２〜８重量％、特に好ましくは４〜６重量％が好適に用いられ、測定毎に高分子を詰め替えて使用する。
【０００８】
緩衝剤が含有する水溶性一級アミンとしてはメタナミン誘導体、両性電解質としてはアミノカルボン酸を用いることができ、好ましくは水溶性一級アミンとしてトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、両性電解質としてグリシンを用いる。緩衝剤は、特に好ましくは０．０１〜０．０５［Ｍ］のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと、０．１〜０．４［Ｍ］のグリシンを含有する。
【０００９】
泳動媒体の平均の電気伝導度は１［ｍＳ／ｃｍ］以下が好ましく、特に好ましくは０．７［ｍＳ／ｃｍ］以下である。本発明では、泳動媒体中の泳動電流が好ましくは流路１本当たり８μＡ以下、特に好ましくは流路１本当たり５μＡ以下となる条件下で電気泳動を行う。また、単位長さの流路１本当りの泳動電流による仕事率が好ましくは３［ｍＷ／ｃｍ］以下、特に好ましくは２［ｍＷ／ｃｍ］以下となる条件下で電気泳動を行う。
【００１０】
流路の両端は泳動バッファを介して高圧電源に接続され、泳動バッファ中には、泳動媒体におけると同等の組成、濃度の緩衝剤を含有するのが好ましい。流路として、好ましくは内径が概ね２５μｍないし７５μｍ、特に好ましくは内径が約５０μｍのキャピラリを使用する。
以上の構成を採用することにより、簡単な方法で迅速、高分離、かつ再現性の良い核酸の電気泳動を達成した。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
〔実施の形態１〕
本発明の第１の実施形態を以下に説明する。電気泳動装置としては非特許文献１に記載のと同様のシングルキャピラリ型のキャピラリ電気泳動装置を使用した。本装置は泳動媒体の自動充填機構を備え、またオートサンプラによる複数試料の連続測定が可能である。またレーザ励起蛍光の原理に基づく検出器を備える。具体的な実験条件は以下の通りである。
【００１２】
試料溶液の調製条件は次のとおりである。
サイズスタンダード（アプライドバイオシステムズ社製ＧｅｎｅＳｃａｎ（Ｒ）  ５００  ＲＯＸ）０．５μＬ、ホルムアミド１２μＬを混合、９４℃で２分間熱変性後、氷冷した。
【００１３】
電気泳動条件は次のとおりである。
キャピラリ：ポリマイクロテクノロジーズ社製の内径５０μｍ、外径３６３μｍ、有効長３０ｃｍ、全長４１ｃｍの溶融石英キャピラリ。
【００１４】
泳動バッファ：非特許文献１に記載の１００ｍＭのＴＡＰＳバッファを従来の泳動バッファ（比較対象）として使用した。また本発明による泳動バッファとして、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（以下、トリスという）と、１９２ｍＭグリシンを緩衝剤として含む緩衝溶液（以下、ＴＧバッファという）を使用した。ＴＧバッファのｐＨは約８．８であり、ｐＨを調整せずそのまま使用した。
【００１５】
泳動媒体：非特許文献１に記載の市販のポリマと、変性剤と、緩衝剤としてＴＡＰＳバッファとを含む泳動媒体を従来の泳動媒体（比較対象）として使用した。以降、この従来の泳動媒体をＴＡＰＳ６と略記する。また本発明による泳動媒体として、上記の市販のポリマと、ＴＧバッファと、核酸の変性剤として７Ｍの尿素を含む泳動媒体を調合した。以降、この泳動媒体をＴＧ６と略記する。ＴＧ６の具体的な調合方法は、ＴＡＰＳ６中の低分子成分（緩衝剤など）を排除限界分子量３００００の限外ろ過膜を通して除去した後、上記ＴＧバッファ成分、尿素、純水を所定量加えて均一に混合した。非特許文献１によるとＴＡＰＳ６にはポリマとしてポリジメチルアクリルアミドが含有されるため、ＴＧ６もポリマとして同濃度のポリジメチルアクリルアミドを含有する。
【００１６】
泳動媒体のキャピラリへの充填時間：３．５分間。
試料の電界注入条件：印加電圧１５ｋＶ、時間５秒。
泳動電圧：１５ｋＶ。
【００１７】
恒温槽の設定温度：特記なき場合５０℃としたが、その他の温度条件も検討した。なお、試料は前述の通りホルムアミドと熱による変性を行い、泳動媒体中には変性剤である尿素を含み、泳動温度も５０℃と高い条件を採用した。つまり核酸を一本鎖とした状態、即ち変性条件において泳動を行った。
【００１８】
本発明の第１の実施の形態、即ち泳動媒体としてＴＧ６、泳動バッファとしてＴＧバッファを用いた場合の典型的な電気泳動パターン（エレクトロフェログラム）を図１（ａ）に示した。また従来例、即ち泳動媒体としてＴＡＰＳ６、泳動バッファとしてＴＡＰＳバッファを用いた場合の典型的な電気泳動パターンを図１（ｂ）に示した。横軸は装置単位の時間軸であり、１カウントの幅は０．２２秒に相当する。縦軸は特定の蛍光波長における蛍光信号の強度軸（任意目盛）であり、その波長で蛍光を発する色素で標識されたＤＮＡ断片の濃度に比例する。図１の縦軸は、ＧｅｎｅＳｃａｎ（Ｒ）  ５００  ＲＯＸ試料を標識している蛍光色素（この場合はＲＯＸ）の蛍光波長の信号強度を示す。以降のエレクトロフェログラムの意味も図１と同様である。
【００１９】
図１（ａ）、（ｂ）の最後のピーク（塩基長５００の断片に対応、以降５００ｎｔと表記する）の泳動時間はそれぞれ７３８２カウントと９２６４カウント、即ちそれぞれ２７．０分と３４．０分である。従って、従来のＴＡＰＳ６と比較して、本実施の形態によるＴＧ６は、泳動時間が約２割短い、換言すると泳動速度が約２５％速い。即ち、本発明の第１の実施の形態においては、従来例と比較して核酸の泳動速度が速い、という効果がある。
【００２０】
ここで、本発明の主要な課題であるＤＮＡのシーケンス解析、或いは断片長解析における解析可能な核酸断片の最大の長さに関する定量的取扱いについて詳述する。ＤＮＡのシーケンス解析法としては様々な方法が用いられるが、ここではダイターミネータ法を例にとって説明する。この方法は、解析対象のＤＮＡ断片をテンプレートとし、その配列の一部と相補的なプライマ、デオキシリボ核酸の単量体（ｄＮＴＰ）、４種類の塩基に対応してそれぞれ異なる蛍光色素で標識したダイデオキシリボ核酸の単量体（ｄｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝溶液を混合する。この混合液を用いていわゆるサイクルシーケンス反応等を行うことにより、プライマに対してデオキシリボ核酸が様々な長さで（テンプレートと相補的に）付加し、末端がテンプレートと相補的な蛍光標識ｄｄＮＴＰである核酸断片の混合物が得られる。この断片の混合物を変性条件の電気泳動により分析し、塩基長が１異なる断片を互いに分離検出し、それぞれの断片の蛍光色を解析し、対応する塩基の配列から、テンプレートとしたＤＮＡのシーケンスを決定する。
【００２１】
電気泳動を用いてサイクルシーケンス反応産物の測定を行う際は、電気泳動結果（エレクトロフェログラム）において、長さが１塩基異なる核酸断片に対応するピーク同士を正確に分離検出できるかどうかが重要である。一般に、断片長が短い場合は断片長が互いに１塩基異なる断片同士のピークの間隔（スペーシング）は広く、分離分析は容易であるが、断片長が長くなるとスペーシングが狭くなり、分離は困難となる。目的とする断片長のピークの半値幅（半値全幅）と比較してスペーシングが小さくなりすぎると、２つの隣接するピークが互いに重なり合い、分離できなくなる。横軸に塩基数、縦軸にスペーシングとピークの半値幅をプロットし、スペーシングがピークの半値幅と同等以下となる境界条件における核酸塩基数をシーケンス可能な核酸断片の長さの目安とした。この核酸塩基数を、以下、等幅長と表記する。なお上記等幅長と同じ目的に用いられる指標として読取り長（Ｒｅａｄ  Ｌｅｎｇｔｈ）がある。読取り長は、例えば非特許文献１に記載の通り、２ピークの分離能Ｒｓが０．５となる塩基数として定義される場合が多い。一方、等幅長におけるＲｓは定義より約０．５９であるため、上記定義による等幅長は上記読取り長よりも小さな数値となる。
【００２２】
図１（ａ）、（ｂ）のエレクトロフェログラムについて等幅長を求める計算過程を図２の（ａ）、（ｂ）にそれぞれ示した。図２の横軸は断片長、縦軸にスペーシングとピークの半値幅を示した。図中、四角形はスペーシングのプロットであり、菱形はピークの半値幅のプロットである。
【００２３】
本発明に基づくＴＧ６を用いた場合の図２（ａ）においては、菱形で示した半値幅は概ね０．４５ｍｍ未満であり、四角形で示したスペーシングが半値幅より狭くなるのは断片長が約４１２ｎｔより長い場合である。即ち、ＴＧ６における等幅長は４１２である。一方、従来のＴＡＰＳ６の場合、図２（ｂ）に示したとおり、半値幅はＴＧ６より０．０５〜０．１ｍｍ程度広い傾向があり、等幅長は３２５とＴＧ６よりも短かった。従って、本発明は従来例と比較して、より長い核酸断片まで正確にＤＮＡシーケンス解析が行える、という特長がある。
【００２４】
次に、本発明に基づく電気泳動を行った際の泳動電流について説明する。本発明に基づくＴＧ６を用いた場合、泳動電流Ｉは初期３［μＡ］であり、泳動を継続するに従い減少し、５００ｎｔのピークが検出された２７分後の泳動電流は１［μＡ］であった。この泳動時間内における泳動電流の平均値は約２．３［μＡ］であった。電流がキャピラリ部分により規定されると仮定すると、泳動電圧Ｅが１５［ｋＶ］であったことから、キャピラリ部分の泳動媒体の抵抗Ｒは平均６．５［ＧΩ］である。またキャピラリの全長Ｌは４１［ｃｍ］、キャピラリの内径は５０［μｍ］で断面積Ｓは０．００００１９６［ｃｍ２］であるため、この泳動媒体の平均の電気伝導度はＬ／（ＲＳ）から平均約０．３２［ｍＳ／ｃｍ］と求められる。一方、従来のＴＡＰＳ６の泳動電流Ｉは初期１０［μＡ］、５００ｎｔのピークが検出された３４分後の泳動電流は９［μＡ］、泳動電流の平均値は約９．５［μＡ］であった。従って、ＴＡＰＳ６の電気伝導度も同様に平均約１．３３［ｍＳ／ｃｍ］と求められる。
【００２５】
即ち、本実施の形態による泳動媒体ＴＧ６は従来の泳動媒体と比較して、電流と、電気伝導度が平均約４分の１と低い。電流に伴うジュール熱は、温度が一定と仮定した場合、電流による仕事率（ＲＩ２）と時間の積から求められる。上記の本実施の形態と従来例について、単位長さのキャピラリあたりの仕事率を求めると、それぞれ平均で０．８４［ｍＷ／ｃｍ］と３．５［ｍＷ／ｃｍ］である。即ち、単位長さ当り、単位時間当りのジュール熱発生量は、本実施の形態の方が従来例の平均約４分の１と少ない。
【００２６】
ジュール熱は電気泳動における代表的な不安定要因であり、分離性能に悪影響を及ぼすと考えられている。上記の通り、本実施の形態において従来例と比較して分離性能が高かったのは、ジュール熱発生が少ないためと考えられる。また、ジュール熱が多い場合は熱暴走により泳動結果が全く得られない場合があり、熱暴走はキャピラリの損傷の原因となる場合がある。本発明はジュール熱が従来の約４分の１と少ないため、高分離な核酸電気泳動結果が安定に得られ、熱暴走が起きず、キャピラリが損傷しない、という効果がある。本実施の形態による泳動媒体、泳動バッファを用いると、前述の通り核酸の泳動速度が本来約２５％速いことに加え、電流や発熱が少ないため、本実施の形態の様に３６６［Ｖ／ｃｍ］とやや高い電界強度を採用しても良好な核酸分離が再現性良く得られる。従って、両要因の相乗効果により、核酸の測定が迅速に行えるという効果もある。
【００２７】
泳動時間と泳動電流の検討結果をバッファ組成の観点から整理すると、本発明で採用したＴＧバッファは、従来のバッファよりも泳動時間が短く、泳動電流が低く、また分離が高い。泳動電圧や泳動路長などの物理的条件を変更する場合は、泳動時間の短縮のためには泳動電流が増加し分離が低下する、泳動電流低減や高分離化のためには泳動時間が増加するなど、時間、電流、分離の３特性は一般に背反関係にある。従って３特性を同時に改善できるＴＧバッファは、従来のバッファと比較して予想外に好適な特徴を有することが理解される。以上の検討結果に基づき、本実施の形態ではＴＧバッファを採用した。
【００２８】
なお、本実施の形態では泳動バッファならびに泳動媒体中の緩衝剤としてトリスとグリシンとの組み合わせを使用したが、他の緩衝剤も同様に使用することができる。トリスと同様の性能を発揮する他の緩衝剤の例としては、各種のメタナミン誘導体などの水溶性一級アミンや、Ｇｏｏｄ’ｓ  Ｂｕｆｆｅｒと総称される一群の化合物がある。Ｇｏｏｄ’ｓ  Ｂｕｆｆｅｒの例としては、ＭＥＳ，  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ，  ＡＤＡ，  ＰＩＰＥＳ，  ＡＣＥＳ，  ＭＯＰＳＯ，  ＢＥＳ，  ＭＯＰＳ，  ＴＥＳ，  ＨＥＰＥＳ，  ＤＩＰＳＯ，  ＴＡＰＳＯ，  ＰＯＰＳＯ，  ＨＥＰＰＳＯ，  ＥＰＰＳ，  Ｔｒｉｃｉｎｅ，  Ｂｉｃｉｎｅ，  ＴＡＰＳ，  ＣＨＥＳ，  ＣＡＰＳＯ，  ＣＡＰＳなどがあり、これらは本発明において緩衝剤として好適に使用できる。グリシンについても、正負両荷電を分子内に有するいわゆる両性電解質を同様に使用することができる。例えば、アラニン、バリンなどの各種アミノカルボン酸、イミノカルボン酸、アミノスルホン酸類などである。また、上記のＧｏｏｄ’ｓ  Ｂｕｆｆｅｒのうち両性電解質であるものも、両荷電サイトに対応するそれぞれのｐＫａを上限、下限とするｐＨ範囲において、グリシン同様に使用することができる。
【００２９】
なお、本実施の形態では泳動バッファならびに泳動媒体中の緩衝剤としてトリスとグリシンをそれぞれ２５ｍＭ、１９２ｍＭ含有する系について検討したが、両者の濃度はこれに限定されない。低い方向での濃度の限界としては、それぞれ約１０ｍＭ、１００ｍＭにおいても良好な電気泳動結果が得られたが、さらに半減すると良好な泳動パターンが得られなかった。濃度が高い方向では２倍以上の濃度でも泳動パターンが得られるが、それ以上とすると本発明の低電流の特長が発揮されにくくなるため、それぞれ約５０ｍＭ、４００ｍＭが本発明の特長を良好に発揮出来る実質的な上限と考えられる。
【００３０】
〔実施の形態２〕
本発明の第２の実施の形態を以下に説明する。第２の実施の形態は基本的に上記第１の実施の形態と同じ実験条件を採用したが、核酸の泳動媒体としてＴＧ６ではなく、平均分子量（ＭＷ）約１００万のポリジメチルアクリルアミドに基づくものを使用した点が異なる。
【００３１】
本実施の形態の比較対象（従来例）として、文献（クリストフ・ヘラー著、エレクトロフォレシス、２０巻、１９６２−１９７７頁、１９９９年）に記載されている方法で合成した平均分子量（ＭＷ）約１００万のポリジメチルアクリルアミドを、重量濃度５％となるように、７Ｍ尿素を含むＴＡＰＳバッファに溶解したものを泳動媒体として用いた。以降、この従来の泳動媒体をＴＡＰＳ７と略記する。また、比較例の泳動バッファとして、実施の形態１における従来例と同じＴＡＰＳバッファを使用した。
【００３２】
一方、本実施の形態による泳動媒体として、上記ポリジメチルアクリルアミドを、重量濃度５％で含有し、第１の実施の形態と同じＴＧバッファを含み、さらに核酸の変性剤として７Ｍの尿素を含む泳動媒体を調合した。以降、この泳動媒体をＴＧ７と略記する。また、本実施の形態においては泳動バッファとして、第１の実施の形態と同じくＴＧバッファを使用した。
【００３３】
本発明によるＴＧ７、並びに従来のＴＡＰＳ７を用いた場合の、典型的な電気泳動パターン（エレクトロフェログラム）の一例をそれぞれ図３（ａ）、（ｂ）に示した。図３（ａ）、（ｂ）の最後（塩基長５００ｎｔ）のピークの泳動時間はそれぞれ２６２５カウントと３９７７カウント、即ちそれぞれ９．６分と１４．６分である。従って、従来のＴＡＰＳ７と比較して、本実施の形態のＴＧ７は、泳動時間が約３．５割短い、換言すると泳動速度が約５２％速い。即ち、本発明の第２の実施の形態においても、従来例と比較して核酸の泳動速度が速い、という効果がある。
【００３４】
図３（ａ）、（ｂ）のエレクトロフェログラムについて等幅長を求める計算過程を図４の（ａ）、（ｂ）にそれぞれ示した。図４（ａ）、（ｂ）の横軸は断片長、縦軸はスペーシング及びピークの半値幅である。図中、四角形はスペーシングのプロットであり、菱形はピークの半値幅のプロットである。
【００３５】
本発明に基づくＴＧ７を用いた図４（ａ）の場合、ピークの半値幅は概ね０．３〜０．４ｍｍであり、等幅長は約４３９ｎｔである。一方、従来のＴＡＰＳ７の場合、図４（ｂ）に示したとおり、ピークの半値幅は３００ｎｔ以上で０．５〜０．６ｍｍとＴＧ７より約０．１〜０．２ｍｍ広い傾向があり、等幅長は３２６ｎｔとＴＧ７よりも１００塩基以上短かった。従って、本発明の第２の実施の形態においても、従来例と比較してより長い断片長まで正確にＤＮＡシーケンス解析が行える、という特長がある。
【００３６】
次に、泳動電流について説明する。本発明に基づくＴＧ７を用いた場合、泳動電流Ｉは初期５［μＡ］であり、最終時点の泳動電流は４［μＡ］、泳動電流の平均値は約４．４［μＡ］であった。第１の実施の形態と同様の計算により、泳動媒体の抵抗Ｒは平均３．４［ＧΩ］、電気伝導度は約０．６１［ｍＳ／ｃｍ］である。一方、従来のＴＡＰＳ７の泳動電流は初期１１［μＡ］、最終時点の泳動電流は１０［μＡ］、泳動電流の平均値は約１０．０［μＡ］であった。従って、ＴＡＰＳ７の電気伝導度は約１．４［ｍＳ／ｃｍ］と求められる。即ち、本実施の形態による泳動媒体ＴＧ７は対応する従来の泳動媒体と比較して、電流と電気伝導度が約２．２分の１と低い。
【００３７】
本実施の形態と従来例について、単位長さのキャピラリあたりの仕事率を求めると、それぞれ平均で１．６［ｍＷ／ｃｍ］、３．７［ｍＷ／ｃｍ］である。つまり、単位長さ当り、単位時間当りのジュール熱発生量は、本実施の形態の方が従来例の平均約２．２分の１と少ない。従って、本実施の形態においても、核酸の電気泳動結果が高分離かつ安定に得られる、という効果がある。
【００３８】
本実施の形態による泳動媒体、泳動バッファを用いると、前述の通り泳動速度が本来約５２％速いことに加え、電流や発熱が少ないため、本実施の形態の様に３６６［Ｖ／ｃｍ］とやや高い電界強度を採用しても良好な核酸分離が再現性良く得られる。従って、両者の相乗効果により、迅速な核酸測定が可能であるという効果がある。
【００３９】
〔実施の形態３〕
本発明の第３の実施の形態を以下に説明する。第３の実施の形態は、電気泳動装置として、穴沢ら著、アナリティカルケミストリ、６８巻、２６９９頁、１９９６年に記載された装置と同じ原理に基づく、複数本のキャピラリを用いるキャピラリアレイ型装置を使用した点が異なるが、他の点は上記第１、第２の実施の形態と同様である。
【００４０】
図５は、本実施の形態で使用したキャピラリアレイ電気泳動装置の概略構成図である。この装置の特徴は、電気泳動用のキャピラリを複数本備えたキャピラリアレイを採用し、検出法として横入射オンカラム検出法（マルチフォーカス法）を用いたことである。
【００４１】
以下、本装置の構成を説明する。泳動バッファ３内にキャピラリアレイ４の一端と白金製の陰極５がセットされ、またキャピラリアレイ４の他端は束ねられた後、ポンプブロック６の流路７に接続されている。ポンプブロック６にはシリンジ８，８’、電磁弁９、逆止弁１０、流路１１が接続又は内蔵され、泳動バッファ３’内には白金製の陽極５’が設置されている。即ち陰極５と陽極５’の間には泳動バッファ３、キャピラリアレイ４、ポンプブロック６の流路７、電磁弁９、流路１１、泳動バッファ３’が設けられ、これらが電気泳動路を形成する。陰極５と陽極５’は高圧電源１２に接続されている。シリンジ８，８’はそれぞれシリンジ駆動機構（図示省略）に接続されており、シリンジ８，８’には泳動媒体１３，１３’が充填される。キャピラリアレイ４の両端を除くほとんどの部分は温度調節器１４に内包されており、特にそのポリマブロックに近い一部は検出器１５に接している。検出器１５には光源１６，１６’（レーザ）と受光器（分光器とＣＣＤカメラなどを含む、図示省略）が含まれる。泳動バッファ３はオートサンプラ１７に保持され、オートサンプラ１７の上には泳動バッファ３の他、洗浄液１８、試料溶液１９などが保持される。試料溶液１９中にはＤＮＡ断片などの陰イオン性の測定対象物質が含まれ、これらは蛍光色素で標識されている。装置全体は計測制御装置（図示省略）と接続されている。
【００４２】
次に、本装置の動作の概略を図５を用いて説明する。シリンジ８内の補充用泳動媒体１３の一部を、ポンプブロック６の流路７、流路１１に充填しておく。恒温槽１４によりキャピラリアレイ４の温度を一定に保持する。電磁弁９を閉じた後、シリンジ８と８’の操作により、シリンジ８内の泳動媒体１３の一部を流路７、逆止弁１０を経由してシリンジ８’内部の注入用泳動媒体１３’へ移し替える。オートサンプラ１７を動作させ、キャピラリアレイの先端を洗浄液１８に浸す。シリンジ８’を一定圧力で一定容量駆動することにより、ポンプブロック６内部の流路７を経由して、キャピラリアレイ４に泳動媒体１３’を注入する。電磁弁９を開ける。オートサンプラ１７を動作させ、キャピラリアレイの先端を試料溶液１９に浸す。高電圧電源１２を動作させ、試料中の荷電成分をキャピラリアレイに電界注入する。オートサンプラ１７を動作させ、キャピラリアレイの先端を泳動バッファ３に浸す。高電圧電源を動作させ、キャピラリアレイ４の中の試料中成分を、検出器１５の方向に電気泳動を行う。
【００４３】
光源１６，１６’を連続駆動し、キャピラリアレイ４の両側面から照射する。各キャピラリのレンズ効果により、外側から中央のキャピラリに向かってレーザ光がキャピラリ内部を順次透過し、試料を励起する（横入射オンカラム検出法、別称マルチフォーカス法）。試料中成分の蛍光スペクトルを検出器１５により分光計測することにより、蛍光標識された試料成分の電気泳動スペクトルを取得する。複数の試料を異なる蛍光色素により標識して同時に泳動する場合でも、互いの分光干渉を補正し、それぞれの試料を独立に同時に計測する。サイズスタンダードを同時に測定し、泳動時間を規格化する。１つの試料セットの測定終了後、引き続き別の試料セットを測定する場合は、泳動媒体１３を１３’に移し替える所から繰り返す。以上の全ての動作はオペレータの指示に基づき、計測制御装置が自動的に執り行う。
【００４４】
次に、本装置の使用条件の概略を説明する。本実施の形態においては、上記装置をＤＮＡの断片長解析のために使用した。そのための条件は、基本的に実施の形態１に記載のシングルキャピラリ装置におけるものと同じとした。主な変更点は下記の通りである。キャピラリアレイとして、内径５０μｍ、外径３６５μｍ、有効長２２ｃｍ、全長３３ｃｍのキャピラリ９６本を有するキャピラリアレイ４を使用した。試料の電界注入条件は印加電圧１０ｋＶ、時間８秒であり、泳動電圧は１５ｋＶである。泳動媒体、泳動バッファとして、実施の形態１と同じくＴＧ６、ＴＧバッファの組合せを使用した。
【００４５】
本実施の形態の実験条件を検討する過程において、実施の形態１に記載の従来の泳動媒体、泳動バッファの組合せを用いると正常なエレクトロフェログラムが得られない場合があり、また一般に分離が悪い、また場合によってはポンプブロック部分が発熱により損傷するという課題があった。上記泳動条件（電界強度４５５Ｖ／ｃｍ）では泳動電流が約１１３０μＡ（キャピラリ１本当たり約１１．８μＡ）と高かった。従来の泳動媒体、泳動バッファの組合せを用いて安定な泳動結果を得るためには、電界強度を約３１３Ｖ／ｃｍ以下とする必要があった。
【００４６】
一方、本実施の形態では実施の形態１と同じくＴＧバッファと、それに基づく泳動媒体を採用した結果、上記従来例におけるごとき問題は発生せず、一本キャピラリの場合と同等の正常かつ高分離の核酸電気泳動パターンが全キャピラリについて得られた。本実施の形態における泳動電流は約２７０μＡ（キャピラリ１本当たり約２．８μＡ）と低かった。本実施の形態と従来例について、単位長さのキャピラリ１本あたりの仕事率を求めると、それぞれ平均で１．３［ｍＷ／ｃｍ］、５．４［ｍＷ／ｃｍ］である。即ち、キャピラリ１本あたり、単位長さ当り、単位時間当りのジュール熱発生量は、本実施の形態の方が従来例の平均約４分の１と少ない。
【００４７】
従来例においてはジュール熱が大きく、本装置の様に特に検出器の近傍の様に多数のキャピラリが密集して配置される部分において温度上昇、分離低下、再現性低下、熱暴走、キャピラリ損傷、キャピラリ保持具の損傷などの問題が起きやすいのに対し、本実施の形態では、ジュール熱が従来例の約４分の１と低いため、これらの悪影響の発生を防止でき、良好な結果が得られたと考えられる。従って、本発明で採用したＴＧバッファ並びにそれに基づく泳動媒体は、本実施の形態のごとき多数のキャピラリが密集する部分を有する装置構成において、特に核酸泳動結果の再現性が高まり高信頼性が得られる効果がある。また、４５５［Ｖ／ｃｍ］という高い電界強度を採用できるため、核酸泳動時間が短いという効果がある。
【００４８】
本実施の形態では９６本のキャピラリを有するキャピラリアレイを用いたが、本発明はこの構成に限定されるものではなく、９６本より多い、あるいは９６本より少ない複数のキャピラリを有する装置構成においても同様に適用可能である。より多くのキャピラリを用いる場合、従来法においては上記発熱による問題がより顕著になるため、本発明の効果がより顕著になる。また本実施の形態においては泳動媒体の保持にキャピラリアレイを用いる場合について説明したが、基板に設けた溝に泳動媒体を保持する、いわゆるチップ電気泳動装置を用いる場合であっても、本発明は同様に適用可能であり、特に多数の泳動路を用いて同時に核酸電気泳動を行う高スループットな用途において、本発明は極めて優れた効果を発揮する。
【００４９】
本実施の形態特有の効果は、複数のキャピラリを同時に用いることにより、並列処理が可能となり、スループットが高いこと、核酸泳動速度が従来より約２５％速いことに加え、電流や発熱が少ないため、マルチキャピラリ装置においても４５５Ｖ／ｃｍと従来より４５％高い電界強度を採用可能であること、高分離の核酸電気泳動結果が再現性良く安定に得られること、これらの相乗効果により、迅速かつ高精度な核酸測定が可能なこと、である。
【００５０】
次に、本発明の効果について説明する。
本発明と対比して比較検討した従来例は、各実施の形態中に記載したとおりである。即ち、本発明の各実施の形態における特徴事項である泳動媒体と泳動バッファを、従来技術によるそれに置き換え、その他の条件を本発明の各実施の形態に揃えたものである。具体的には、第１の従来例は、非特許文献１に記載の市販の電気泳動装置、泳動媒体、泳動バッファを用いてＤＮＡの断片長解析を行う方法であり、具体的には電気泳動装置としてシングルキャピラリ型のキャピラリ電気泳動装置、キャピラリとして有効長３０ｃｍのキャピラリ、泳動媒体としてＴＡＰＳ６、泳動バッファとして１００ｍＭのＴＡＰＳバッファを用いた。第２の従来例は、非特許文献１に記載の市販の電気泳動装置、並びに非特許文献２に記載の方法で合成したポリマに基づく泳動媒体、泳動バッファを用いて核酸の断片長解析を行う方法であり、具体的には電気泳動装置としてシングルキャピラリ型のキャピラリ電気泳動装置、キャピラリとして有効長３０ｃｍのキャピラリ、泳動媒体としてＴＡＰＳ７、泳動バッファとしてＴＡＰＳバッファを用いた。第３の従来例は、マルチキャピラリ型の電気泳動装置と、非特許文献１に記載の市販の泳動媒体、泳動バッファを用いてＤＮＡの断片長解析を行う方法であり、具体的には電気泳動装置として実施の形態３に記載のマルチキャピラリ型の電気泳動装置、キャピラリとして有効長２２ｃｍの９６本のキャピラリを備えるキャピラリアレイ、泳動媒体としてＴＡＰＳ６、泳動バッファとして１００ｍＭのＴＡＰＳバッファを用いた。
つまり、本発明は主に泳動媒体と泳動バッファにおける緩衝剤としてトリス−グリシンを用いる点が、ＴＡＰＳを用いる従来例と異なる。
【００５１】
従来例と本発明の比較結果の一例を図６に示した。図６は、本発明の各実施の形態並びに対応する各従来例について、電気泳動を行い、その結果の代表的な特性を比較した結果である。検討した特性は、分離特性（等幅長）、泳動時間、泳動電流、である。なお、第３の実施の形態に対応する従来例は第３の実施の形態と同じ条件下で比較を行うと良好な結果が得られない場合が多かった。良好な結果が得られた場合の特性値を図中に（  ）＊の印を付けて表記したが、これはこの条件における最良の結果を表し、多くの場合、これよりも低い結果、もしくは何も結果が得られないこともあった。従って、第３の従来例の変形例として、確実に泳動結果が得られた条件、即ち泳動電圧を（標準条件として採用した１５ｋＶから）１０ｋＶに低下させた場合の結果も併記した。
【００５２】
図６から明らかな通り、本発明の各実施の形態は、同じ条件の従来例と比較して、等幅長が長く、泳動電流が少なく、核酸泳動時間が短い、という特長を有する。また、第３の実施の形態に関しては、同一条件では本実施の形態の方が従来例より再現性良く核酸電気泳動が行えるという特長を有する。また、条件が異なる従来例３の変形例と比較すると泳動電流が少なく、核酸泳動時間が短い、という特長を有する。また単位時間当たりの等幅長は実施の形態３が１３．７［ｎｔ／分］、従来例３の変形例が８．７［ｎｔ／分］と、単位時間当たりの解析塩基長が長い、という特長を有する。
【００５３】
キャピラリ１本当たりの平均泳動電流について詳細に比較すると、前述の通り実施の形態１，２，３はそれぞれ約２．３［μＡ］、４．４［μＡ］、２．８［μＡ］であるのに対し、従来例１，２，３はそれぞれ約９．５［μＡ］、１０［μＡ］、１１．８［μＡ］である。即ち、本発明各実施の形態と従来例との間には明確な差異があり、本発明各実施の形態は５［μＡ］以下、従来例は８［μＡ］を越えている。発熱や分離、泳動安定性などの項目において本発明が従来例と比較して良好な特性が得られたのは、キャピラリ１本（即ち流路１本）当たりの平均泳動電流が従来例と比較して格段に低いことが大きな要因と考えられる。即ち、従来例ではキャピラリ１本当たりの平均泳動電流が８［μＡ］より大となる泳動条件を採用したため、高発熱、低分離、泳動の安定性低下などの課題があった。一方本発明はキャピラリ１本当たりの平均泳動電流が８［μＡ］以下、特に好ましくは５［μＡ］以下となる泳動条件を採用することにより、従来例と比較して低発熱、高分離、泳動の高安定性などの優れた効果を得た。
【００５４】
同様に電気伝導度の観点で比較を行うと、前述の通り実施の形態１，３で使用したＴＧ６は平均約０．３２［ｍＳ／ｃｍ］、実施の形態２で使用したＴＧ７は平均約０．６１［ｍＳ／ｃｍ］であるのに対し、従来例１，３で使用したＴＡＰＳ６は平均約１．３３［ｍＳ／ｃｍ］、ＴＡＰＳ７は平均約１．４［ｍＳ／ｃｍ］である。即ち、本発明各実施の形態と従来例との間には明確な差異があり、本発明各実施の形態は０．７［ｍＳ／ｃｍ］以下であるのに対し、従来例は１［ｍＳ／ｃｍ］より大きい。発熱や分離、泳動安定性などの項目において本発明が従来例と比較して良好な特性が得られたのは、電気伝導度が従来例と比較して格段に低いことが大きな要因と考えられる。即ち、従来例では電気伝導度が１［ｍＳ／ｃｍ］より大となる泳動条件を採用したため、高発熱、低分離、泳動の安定性低下などの課題があった。一方、本発明は電気伝導度が１［ｍＳ／ｃｍ］以下、特に好ましくは０．７［μＡ］以下となる泳動条件を採用することにより、従来例と比較して低発熱、高分離、泳動の高安定性などの優れた効果を得た。
【００５５】
同様に、キャピラリ１本当たりの単位長さ当たりの仕事率の観点で比較を行うと、前述の通り実施の形態１，２，３はそれぞれ約０．３２［ｍＷ／ｃｍ］、０．６１［ｍＷ／ｃｍ］、１．３［ｍＷ／ｃｍ］であるのに対し、従来例１，２，３はそれぞれ約３．５［ｍＷ／ｃｍ］、３．７［ｍＷ／ｃｍ］、５．４［ｍＷ／ｃｍ］である。即ち、本発明各実施の形態と従来例との間には明確な差異があり、本発明各実施の形態は２［ｍＷ／ｃｍ］以下、従来例は３［ｍＷ／ｃｍ］より大である。発熱や分離、泳動安定性などの項目において本発明が従来例と比較して良好な特性が得られたのは、キャピラリ１本当たりの単位長さ当たりの仕事率が従来例と比較して低いことが大きな要因と考えられる。即ち、従来例ではキャピラリ１本当たりの単位長さ当たりの仕事率が３［ｍＷ／ｃｍ］より大となる泳動条件を採用したため、高発熱、低分離、泳動の安定性低下などの課題があった。一方、本発明はキャピラリ１本当たりの単位長さ当たりの仕事率が３［ｍＷ／ｃｍ］以下、特に好ましくは２［ｍＷ／ｃｍ］以下となる泳動条件を採用することにより、従来例と比較して低発熱、高分離、泳動の高安定性などの優れた効果を得た。
【００５６】
非特許文献２に記載の方法と本発明の各実施の形態との直接の比較実験は行わなかったが、非特許文献２の記載によると、十分な分離が得られる有効長１９．５ｃｍにおいて１６３塩基長の断片の泳動時間は約１０分である。一方、本発明の第２の実施の形態では有効長３０ｃｍにおいて５００塩基長の核酸断片の泳動時間は９．５分で分離できることから、非特許文献２よりも泳動が高速である。また、非特許文献２においてはアルカリによるポリマの加水分解を防止するため、最初はポリマを０．０３ＭのＮａＣｌに溶解してキャピラリに充填した後、０．０４ＭのＮａＯＨからなる予備泳動バッファにキャピラリを浸して約５分間予備泳動することにより、ポリマのバッファを０．０４Ｍ  ＮａＯＨに交換した。即ち、この予備泳動の時間が試料の電気泳動時間に加えて必要となることから、泳動時間の合計は本発明の方が短いことは明らかである。従って、本発明は非特許文献２の方法と比較して、簡便かつ迅速な方法であるという特長を有する。
【００５７】
以上説明したように、本発明は従来の技術と比較して高速、高精度、かつ高分離な核酸の電気泳動装置を提供可能で、解析できる核酸塩基数が長いという特長がある。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によれば、キャピラリ電気泳動装置において、簡単な構成で迅速かつ高い核酸分離を達成し、長い核酸でも解析できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】キャピラリ電気泳動装置を用いてサイズスタンダードを測定した結果（エレクトロフェログラム）の一例を示す図であり、（ａ）はＴＧ６に基づく本発明の第１の実施の形態のエレクトロフェログラム、（ｂ）はＴＡＰＳ６に基づく従来例のエレクトロフェログラムである。
【図２】図１のエレクトロフェログラムについて、等幅長を求める計算過程を示す図であり、（ａ）は本発明の第１の実施の形態に対応し、（ｂ）は従来例に対応する。
【図３】キャピラリ電気泳動装置を用いてサイズスタンダードを測定した結果（エレクトロフェログラム）の一例を示す図であり、（ａ）はＴＧ７に基づく本発明の第２の実施の形態のエレクトロフェログラム、（ｂ）はＴＡＰＳ７に基づく従来例のエレクトロフェログラムである。
【図４】図３のエレクトロフェログラムについて、等幅長を求める計算過程を示す図であり、（ａ）は本発明の第２の実施の形態に対応し、（ｂ）は従来例に対応する。
【図５】本発明によるキャピラリアレイ電気泳動装置の概略構成図である。
【図６】本発明と従来例による電気泳動特性の比較を示す図である。
【符号の説明】
３，３’…泳動バッファ、４…キャピラリアレイ、５…陰極、５’…陽極、６…ポンプブロック、７…流路、８，８’…シリンジ、９…電磁弁、１０…逆止弁、１１…流路、１２…高圧電源、１３，１３’…泳動ポリマ、１４…温度調節器、１５…検出器、１６，１６’…光源、１７…オートサンプラ、１８…洗浄液、１９…試料溶液。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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