(57)【要約】【課題】迅速かつ安定に結合固定可能な反応性マイクロリアクター、該反応性マイクロリアクター内流路壁面に少なくとも一つの特異的結合パートナーの一員が結合固定されてなる生物学的素材結合マイクロリアクター、並びにそれらの製造方法及び利用方法を提供すること。【解決手段】特異的結合パートナーの一員と結合することができる下記式（１）で表される基が流路壁面の一部または全面に結合している、反応性マイクロリアクター。−Ｌ−ＳＯ２−Ｘ１　　　　（１）［式中、Ｘ１は、−ＣＲ１＝ＣＲ２Ｒ３または−ＣＨＲ１−ＣＲ２Ｒ３Ｙを表わし、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし、Ｙは、求核試薬によって置換される基、あるいは塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を表わす；そして、Ｌは連結基を表わす］。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的結合パートナーの一員と結合することができる下記式（１）で表される基が流路壁面の一部または全面に結合している、反応性マイクロリアクター。
−Ｌ−ＳＯ２−Ｘ１　　　　（１）
［式中、Ｘ１は、−ＣＲ１＝ＣＲ２Ｒ３または−ＣＨＲ１−ＣＲ２Ｒ３Ｙを表わし、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし、Ｙは、求核試薬によって置換される基、あるいは塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を表わす；そして、Ｌは連結基を表わす］。
【請求項２】
表面に反応性基が導入されたマイクロリアクターに、下記式（２）：
Ｘ１−ＳＯ２−Ｌ２−ＳＯ２−Ｘ２　　　（２）
［式中、Ｘ１およびＸ２は互いに独立に、−ＣＲ１＝ＣＲ２Ｒ３、または−ＣＨＲ１−ＣＲ２Ｒ３Ｙを表わし；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｙは、求核試薬によって置換される基、あるいは塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を表わす；そして、Ｌ２は連結基を表わす］
で表わされるジスルホン化合物を接触させることを含む、請求項１に記載の反応性マイクロリアクターの製造方法。
【請求項３】
特異的結合パートナーの一員の残基を有する下記式（３）で表される基が流路壁面の一部または全面に結合している、生物学的素材結合マイクロリアクター。
―Ｌ―ＳＯ２―Ｘ―Ａ　　　　　（３）
［式中、Ｌは、―ＳＯ２―Ｘ―Ａとマイクロリアクター内流路壁面とを結合する連結基を示し；Ｘは、―ＣＲ１１（Ｒ１２）―ＣＲ１３（Ｒ１４）−を表し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は互いに独立に、水素原子、炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数６乃至２０のアリール基、又は炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数７乃至２６のアラルキル基を表し；Ａは、特異的結合パートナーの一員の残基を示す。］
【請求項４】
請求項１に記載の反応性マイクロリアクターに、上記式（１）で表される基と反応して共有結合を形成する反応性基を有する少なくとも一つの特異的結合パートナーの一員を接触させることを含む、請求項３に記載の生物学的素材結合マイクロリアクターの製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の生物学的素材結合マイクロリアクターと、該マイクロリアクターの表面に担持された特異的結合パートナーの一員と特異的に結合する標的物質を含む検体とを接触させる工程；及び
該特異的結合パートナーの一員と該標的物質との間の相互の結合の形成を検出する工程；
を含む、標的物質を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、変異、多型等の解析やプロテオミクス解析などに非常に有用であるＤＮＡやタンパク質等の生物学的素材をマイクロリアクター流路壁面に固定化した生物学的素材結合マイクロリアクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
多彩な生物の遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が急速に進んでおり、それらのＤＮＡもしくはＤＮＡ断片の塩基配列を解析するために、いわゆるマイクロリアクターの壁面に多数のＤＮＡ断片あるいは合成オリゴヌクレオチドなどのヌクレオチド誘導体を固定しＤＮＡもしくはＤＮＡ断片の塩基配列を解析する手法が試みられてきている。
【０００３】
多種類のＤＮＡ（又はｍＲＮＡ）を同時に検出する方法としてＤＮＡチップが開発されている。ＤＮＡチップにおいては、ガラス板等の平板上にＤＮＡが固定されており、検体であるＤＮＡはこの平板上に展開されてハイブリダイゼーションが行わなければならない。そのため、検体は少なくともＤＮＡチップ全面を覆い尽くすだけの液量まで希釈される必要があり、例えば通常のＳｔａｎｆｏｒｄ型ＤＮＡマイクロアレイでは、少なくとも５０μｌの検体液量が必要である。また、平板上に展開された検体ＤＮＡは、拡散が遅いため反応に関与している検体ＤＮＡは数パーセントしかない。平板上に展開されたいわゆるＤＮＡチップでは、かかる問題点により、目的とする検出感度を得られないという欠点をもっている。一方、マイクロリアクター系においては、検体を数μｌまで濃縮可能であり、しかも液を流すことにより、固定されているすべてのＤＮＡと順次接触させることが可能であり、平板上のＤＮＡチップを凌駕する高感度の検出系を設計することが可能となっている。
【０００４】
マイクロリアクターは前述したようなＤＮＡ検出だけではなく、タンパク質、抗原、抗体、レセプター、リガンド、ＲＮＡなどの検出にも使用されようとしている。このような系においてはマイクロリアクター内に検体と特異的な結合をする物質が固定されなければならない。
【０００５】
このようなマイクロリアクターに特異的結合物質が固定された、いわゆる生物学的素材結合マイクロリアクターを実用化するためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチド、抗原、抗体などの特異的結合物質をマイクロリアクター内流路壁面に安定に結合させる技術が必要とされる。
【０００６】
予め調製用意したＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相担体表面に結合固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の種類に応じて下記の方法が知られている。
（１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）である場合には、ｃＤＮＡあるいはＰＣＲ産物を、ＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッタ装置により、ポリ陽イオン化合物（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理したガラスの表面に点着し、ＤＮＡ断片の持つ電荷を利用してガラス表面に静電結合させるのが一般的である。なお、ガラス表面の処理方法としては、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている。このシランカップリング剤を用いた表面処理では、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合によりガラス表面表面に固定されるため、ポリ陽イオン化合物による表面処理の場合と比較して、安定にガラス面表面に固定される。
【０００７】
上記のＤＮＡ断片の電荷を利用する方法の変法として、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩―クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスライドガラス表面に接触し、インキュベートした後、水素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行なう方法が報告されている。しかし、この固定方法では必ずしも充分なＤＮＡ断片の固定安定度が得られ難いという問題がある。
【０００８】
（２）固定するオリゴヌクレオチド（プローブ分子）が合成オリゴヌクレオチドである場合には、まず反応活性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、予め反応性基を形成させるように表面処理した固相担体表面に該オリゴヌクレオチドを接触して、該オリゴヌクレオチドを固相担体表面に共有結合により結合固定させる方法も知られている。例えば、表面にアミノ基を導入した固相担体に、ＰＤＣ（ｐ―フェニレンジイソチオシアネート）の存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られている。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡ断片の電荷を利用して静電結合により固定する方法と比べると、オリゴヌクレオチドが固相担体表面に安定に結合固定されるという利点がある。しかし、ＰＤＣを存在させる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチドとの反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを用いる方法では、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低い（従って、加水分解が起こり易い）という問題点がある。
【０００９】
一方、ゲノム解析もほぼ終わり、遺伝子情報の持つ意味を最終的に理解し、細胞の生命活動をシミュレートするために不可欠な情報を提供する「プロテオーム・プロテオミクス」研究が進められている。プロテロームとは、特定の細胞、器官、臓器の中で翻訳生産されているタンパク質の全セットを意味し、さらには化学構造、総量、発現時期、翻訳後修飾、集合体形成などの高次情報解析の研究分野のことを「プロテオミクス」と呼ぶ。
【００１０】
プロテオーム研究は、タンパク質のプロファイリング、タンパク質の同定・精密分析、相互作用ネットワーク解析、プロテオームデータベースの構築からなり、それを生命科学研究への応用していくという分野である。
このうち、相互作用ネットワーク解析法としては、酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法やファージディスプレイ法、アフィニティキャプチャーを利用した方法として免疫沈降法やＢＩＡ―ＭＳ法、カラムスイッチング―質量分析法などが行われている（非特許文献１）。以上に挙げた相互作用解析方法はいずれも、ハイスループット解析には至っていない。
【００１１】
Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒらにより、ハイスループットなタンパク質の相互作用解析のためのタンパク質マイクロアレイに関する報告がなされた（非特許文献２）。これは、アルデヒド基をもったスライドガラス上にタンパク質水溶液を点着し、ＢＳＡ溶液でブロッキング後、タンパク溶液と反応させ蛍光スキャナーで検出するものである。この場合はアルデヒド基とアミノ基との反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題点を有する。
【００１２】
このほかタンパク質を固相に固定化される方法として、特許文献１には、タンパク質の末端に疎水性のポリペプチドを導入して、固相に固定化する方法が記載されている。
特許文献２には、プロテインＡ分子膜による抗体タンパク質を固定化する方法が記載されている。
【００１３】
【非特許文献１】
プロテオーム解析法、１６３―２１１、羊土社、２０００
【００１４】
【非特許文献２】
Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９，１７６０―１７６３、２０００
【００１５】
【特許文献１】
特公平７―５３１０８号
【００１６】
【特許文献２】
特許２９２２０４０号
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、迅速かつ安定に結合固定可能な反応性マイクロリアクター、該反応性マイクロリアクター内流路壁面に少なくとも一つの特異的結合パートナーの一員が結合固定されてなる生物学的素材結合マイクロリアクター、並びにそれらの製造方法を提供することを解決すべき課題とする。さらに本発明は、上記した生物学的素材結合マイクロリアクターを用いた特異的結合パートナーの他の一員である標的物質の検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、スルホニル基を介した共有結合により少なくとも一つの特異的結合パートナーの一員をマイクロリアクター内流路壁面マイクロリアクター内流路壁面に結合した生物学的素材結合マイクロリアクターを作製した結果、迅速かつ安定に該特異的結合パートナーの一員をマイクロリアクター内流路壁面マイクロリアクター内流路壁面に結合でき、標的物質を効率的に感度よく検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１９】
本発明によれば、特異的結合パートナーの一員と結合することができる下記式（１）で表される基が流路壁面の一部または全面に結合している、反応性マイクロリアクターが提供される。
−Ｌ−ＳＯ２−Ｘ１　　　　（１）
［式中、Ｘ１は、−ＣＲ１＝ＣＲ２Ｒ３または−ＣＨＲ１−ＣＲ２Ｒ３Ｙを表わし、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし、Ｙは、求核試薬によって置換される基、あるいは塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を表わす；そして、Ｌは連結基を表わす］。
【００２０】
本発明の別の側面によれば、表面に反応性基が導入されたマイクロリアクターに、下記式（２）：
Ｘ１−ＳＯ２−Ｌ２−ＳＯ２−Ｘ２　　　（２）
［式中、Ｘ１およびＸ２は互いに独立に、−ＣＲ１＝ＣＲ２Ｒ３、または−ＣＨＲ１−ＣＲ２Ｒ３Ｙを表わし；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｙは、求核試薬によって置換される基、あるいは塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を表わす；そして、Ｌ２は連結基を表わす］
で表わされるジスルホン化合物を接触させることを含む、反応性マイクロリアクターの製造方法が提供される。
【００２１】
本発明のさらに別の側面によれば、特異的結合パートナーの一員の残基を有する下記式（３）で表される基が流路壁面の一部または全面に結合している、生物学的素材結合マイクロリアクターが提供される。
―Ｌ―ＳＯ２―Ｘ―Ａ　　　　　（３）
［式中、Ｌは、―ＳＯ２―Ｘ―Ａとマイクロリアクター内流路壁面とを結合する連結基を示し；Ｘは、―ＣＲ１１（Ｒ１２）―ＣＲ１３（Ｒ１４）−を表し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は互いに独立に、水素原子、炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数６乃至２０のアリール基、又は炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数７乃至２６のアラルキル基を表し；Ａは、特異的結合パートナーの一員の残基を示す。］
【００２２】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の反応性マイクロリアクターに、上記式（１）で表される基と反応して共有結合を形成する反応性基を有する少なくとも一つの特異的結合パートナーの一員を接触させることを含む、生物学的素材結合マイクロリアクターの製造方法が提供される。
【００２３】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の生物学的素材結合マイクロリアクターと、該マイクロリアクターの表面に担持された特異的結合パートナーの一員と特異的に結合する標的物質を含む検体とを接触させる工程；及び
該特異的結合パートナーの一員と該標的物質との間の相互の結合の形成を検出する工程；
を含む、標的物質を検出する方法が提供される。
【００２４】
上記した本発明によるマイクロリアクターにおいて、好ましい態様としては以下の態様が挙げられる。
特異的結合パートナーがマイクロリアクターの流路壁面の一部分または全面に結合している態様；
複数の特異的結合パートナーがマイクロリアクターの流路壁面の異なる位置に結合している態様；
特異的結合パートナーが、生物学的な特異的結合を形成する構成員からなる態様；
特異的結合パートナーが、抗体もしくは抗体フラグメントとリガンドとの組み合わせ、抗体もしくは抗体フラグメントと抗原との組み合わせ、抗体もしくは抗体フラグメントとハプテンとの組み合わせ、あるいはレセプターとリガンドとの組み合わせである態様；
特異的結合パートナーが、アビジン類とビオチン類との組み合わせである態様；
アビジン類が、アビジン、ストレプトアビジン、またはビオチンと安定な複合体を形成しうるこれらの改変体である態様；
ビオチン類がビチオン、ビオシチン、デスチオビオチン、オキシビオチン、またはアビジンと安定な複合体を形成しうるこれらの誘導体である態様；
【００２５】
特異的結合パートナーが、核酸と核酸との組み合わせ、又は核酸と核酸結合物質との組み合わせである態様；
核酸が、ヌクレオチド誘導体、ペプチド核酸、又はＬＮＡである態様；
核酸結合物質が２本鎖ＤＮＡ認識物質である態様；
２本鎖ＤＮＡ認識物質が２本鎖ＤＮＡ認識抗体である態様；
２本鎖ＤＮＡ認識物質がＤＮＡ転写因子である態様；
２本鎖ＤＮＡ認識物質が、Ｚｎフィンガーモチーフまたはリングフィンガーモチーフをもつタンパク質である態様；
２本鎖ＤＮＡ認識物質がペプチド核酸である態様；
式（Ｉ）において、Ａがタンパク質の残基を示す態様；
【００２６】
マイクロリアクター内流路壁面がガラス、石英、プラスチック、シリコン樹脂、電極表面、又はセンサーチップ表面である態様；並びに
マイクロリアクター内流路壁面に少なくとも一つの特異的結合パートナーの一員を接触させた後に、表面にあるフリーの反応性基をアミノ酸、ペプチドもしくはタンパク質水溶液でブロッキング処理する態様；
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の反応性マイクロリアクター及びその製造方法
本発明におけるマイクロリアクターとは、等価直径１ｍｍ以下の流路（チャンネル）を有する装置のことである。マイクロリアクターは例えば固体基板上に微細加工技術により作成でき、また、固体基板上のパターンを鋳型にしてモルディング法等によっても作成することができる。
【００２８】
本発明でいう等価直径（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ｄｉａｍｅｔｅｒ）は、相当（直）径、とも呼ばれ、機械工学の分野で用いられる用語である。任意断面形状の配管（本発明では流路）に対し等価な円管を想定するとき、その等価円管の直径を等価直径といい、Ａ：配管の断面積、ｐ：配管のぬれぶち長さ（周長）を用いて、ｄｅｑ＝４Ａ／ｐと定義される。円管に適用した場合、この等価直径は円管直径に一致する。等価直径は等価円管のデータを基に、その配管の流動あるいは熱伝達特性を推定するのに用いられ、現象の空間的スケール（代表的長さ）を表す。等価直径は、一辺ａの正四角形管ではｄｅｑ＝４ａ２／４ａ＝ａ、一辺ａの正三角形管ではｄｅｑ＝ａ／、路高さｈの平行平板間の流れではｄｅｑ＝２ｈとなる（参照：（社）日本機械学会編「機械工学事典」１９９７年、丸善（株））。
【００２９】
このようなマイクロスケールの流路（チャンネル）を有する反応装置は、一般に「マイクロリアクター」と総称され、最近大きな発展を遂げている（Ｗ．Ｅｈｒｆｅｌｄ，　Ｖ．Ｈｅｓｓｅｌ，　Ｈ．Ｌｏｗｅ，　”Ｍｉｃｒｏｒｅａｃｔｏｒ”，　１Ｅｄ．（２０００），　ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ）。
【００３０】
本発明の流路は、固体基板上に微細加工技術により作成される。使用される材料の例をあげれば金属、シリコン、テフロン（登録商標）、ガラス、石英、シリコン樹脂、セラミックスまたはプラスチックなどである。耐熱、耐圧および耐溶剤性が必要な場合、好ましい材料は金属、シリコン、テフロン（登録商標）、ガラスまたはセラミックスであるが、特に好ましくは金属である。金属の例を挙げれば、ニッケル、アルミ、銀、金、白金、タンタル、ステンレス、ハステロイ（Ｎｉ−Ｆｅ系合金）またはチタンであるが、好ましくは耐腐食性の高いステンレス、ハステロイもしくはチタンである。
【００３１】
流路を作成するための微細加工技術として代表的なものを挙げれば、Ｘ線リソグラフィを用いるＬＩＧＡ技術、ＥＰＯＮ　ＳＵ−８を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マイクロ放電加工法（μ−ＥＤＭ）、Ｄｅｅｐ　ＲＩＥによるシリコンの高アスペクト比加工法、Ｈｏｔ　Ｅｍｂｏｓｓ加工法、光造形法、レーザー加工法、イオンビーム加工法、およびダイアモンドのような硬い材料で作られたマイクロ工具を用いる機械的マイクロ切削加工法などがある。これらの技術を単独で用いても良いし、組み合わせて用いても良い。好ましい微細加工技術は、Ｘ線リソグラフィを用いるＬＩＧＡ技術、ＥＰＯＮ　ＳＵ−８を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マイクロ放電加工法（μ−ＥＤＭ）、および機械的マイクロ切削加工法である。
【００３２】
本発明に用いられる流路は、シリコンウエファー上にフォトレジストを用いて形成したパターンを鋳型とし、これに樹脂を流しこみ固化させる（モールディング法）ことによっても作成することができる。モールディング法には、ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）またはその誘導体に代表されるシリコン樹脂を使用することができる。
【００３３】
マイクロリアクターの温度制御は、装置全体を温度制御された容器中に入れることにより制御しても良いし、金属抵抗線や、ポリシリコンなどのヒーター構造を装置内に作り込み、加熱についてはこれを使用し、冷却については自然冷却でサーマルサイクルを行ってもよい。温度のセンシングは、金属抵抗線ではヒーターと同じ抵抗線をもう一つ作り込んでおき、その抵抗値の変化に基づいて温度検出を行い、ポリシリコンについては熱電対を用いて検出を行う。また、ペルチェ素子をリアクターに接触させることによって外部から加熱、冷却を行っても良い。どの方法を用いるかは用途やリアクター本体の材料などに合わせて選択される。
【００３４】
マイクロリアクターの流路壁面には、ジビニルスルホン化合物などの二官能反応性化合物を共有結合により結合固定するために、ポリ陽イオン化合物（例えば、ポリ−Ｌ−リシン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等であることが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンであることがさらに好ましい）などのアミノ基を側鎖に有するポリマーによって被覆処理（この場合、マイクロリアクターの表面へ導入される反応性基は、アミノ基である）することができる。あるいは、マイクロリアクターの流路壁面は、シランカップリング剤などのマイクロリアクター表面と反応する反応性基と、そして別にアミノ基などの反応性基を有する表面処理剤によって接触処理することができる。
【００３５】
マイクロリアクターの流路壁面は、ポリ陽イオン化合物による被覆処理の場合には、アミノ基もしくはメルカプト基がポリマー化合物とマイクロリアクターの流路壁面との静電結合によってマイクロリアクターの流路壁面に導入されるのに対して、シランカップリング剤による流路壁面処理の場合には、マイクロリアクターの流路壁面に共有結合によって結合固定されるため、アミノ基もしくはメルカプト基がマイクロリアクターの流路壁面に安定に存在する。アミノ基およびメルカプト基の他に、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、あるいは水酸基も好ましく導入することができる。
【００３６】
アミノ基を有するシランカップリング剤としては、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシランあるいはＮ−β（アミノエチル）−γ−アミノプロピルメチルジメトキシシランを用いることが好ましく、γ−アミノプロピルトリエトキシシランを用いることが特に好ましい。
【００３７】
ポリ陽イオン化合物を用いる処理に、シランカップリング剤による処理を組み合わせて行ってもよい。この方法により、疎水性、あるいは親水性の低いマイクロリアクターとＤＮＡ断片との静電的相互作用を促進することができる。ポリ陽イオン化合物による処理がされたマイクロリアクターの流路壁面上に、さらに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって、ポリ陽イオン化合物による処理がされたマイクロリアクターの凹凸を軽減することができる。マイクロリアクターの種類によっては、その中に親水性高分子等を含有させることも可能であり、このような処理を施したマイクロリアクターを用いることもできる。
【００３８】
反応性基を備えたマイクロリアクターは、ジビニルスルホン化合物などの二官能性反応性化合物と接触することによって、その反応性基と二官能性反応性化合物とが反応し、共有結合が形成され、マイクロリアクターの反応性基部分が延長され、その先端もしくは先端附近にビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基を持つ反応性鎖が形成され、これにより本発明の反応性マイクロリアクターが生成する。
【００３９】
本発明の反応性マイクロリアクターにおいて、その流路壁面に導入されるビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基と連結基との連結体は、下記の式（１）により表わされる。
【００４０】
−Ｌ−ＳＯ２−Ｘ１　　　　（１）
【００４１】
式（１）において、Ｘ１は、−ＣＲ１＝ＣＲ２Ｒ３または−ＣＨＲ１−ＣＲ２Ｒ３Ｙ（反応性前駆体基）を表わす。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基を表わす。
【００４２】
炭素原子数が１乃至６のアルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、及びｎ−ヘキシル基を挙げることができ、メチル基であることが特に好ましい。炭素原子数が６乃至２０のアリール基としては、フェニル基及びナフチル基を挙げることができる。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は共に水素原子であることが好ましい。
【００４３】
炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基の例としては、上記した炭素原子数が１乃至６のアルキル基の例と炭素原子数が６乃至２０のアリール基の例とを組み合わせたものが挙げられる。
【００４４】
Ｙは、−ＯＨ、−ＯＲ０、−ＳＨ、ＮＨ３、ＮＨ２Ｒ０（但し、Ｒ０は、水素原子を除く、アルキル基などの基である）などの求核試薬によって置換される基、あるいは塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を表わし、その例としては、ハロゲン原子、−ＯＳＯ２Ｒ２１、−ＯＣＯＲ２２、−ＯＳＯ３Ｍ、あるいは四級ピリジニウム基（Ｒ２１は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基を表わし；Ｒ２２は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基あるいは炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子あるいはアンモニウム基を表わす）を挙げることができる。
【００４５】
式（１）において、Ｌは、マイクロリアクターもしくはマイクロリアクターに結合している連結基と、上記−ＳＯ２−Ｘ１基とを連結している二価もしくはそれ以上の連結基を表わす。ただし、Ｌは単結合であってもよい。二価の連結基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキレン基、炭素原子数が３乃至１６の脂肪族環基、炭素原子数が６乃至２０のアリーレン基、Ｎ、ＳおよびＰからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至３個含む炭素原子数が２乃至２０の複素環基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ３−、−ＮＲ２３−、−ＣＯ−およびこれらの組み合わせから群より選ばれる基を一つあるいは複数個組み合わせてなる基であることが好ましい。Ｒ２３は、水素原子、炭素原子数が１乃至１５のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２１のアラルキル基であることが好ましく、水素原子もしくは炭素原子数が１乃至６のアルキル基であることがさらに好ましく、水素原子、メチル基もしくはエチル基であることが特に好ましい。
【００４６】
Ｌが−ＮＲ２３−、−ＳＯＮＲ２３−、−ＣＯＮＲ２３−、−ＮＲ２３ＣＯＯ−、および−ＮＲ２３ＣＯＮＲ２３−からなる群より選ばれる基を二個以上組み合わせてなる基である場合には、それらのＲ２３同士が結合して環を形成していてもよい。
【００４７】
Ｒ２１のアルキル基、Ｒ２１のアリール基、およびＲ２１のアラルキル基は、置換基を持っていてもよい。このような置換基としては、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアルケニル基、炭素原子数が２乃至７のカルバモイル基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が７乃至１６のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、スルファモイル基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、スルホ基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、カルボン酸基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、ハロゲン原子、炭素原子数が１乃至６のアルケニレン基、炭素原子数が６乃至２０のアリーレン基、スルホニル基、およびこれらの組み合わせからなる群より選ばれる原子もしくは基を挙げることができる。
【００４８】
上記「−Ｘ１」基の好ましい具体例を以下に示す。また、「−Ｌ−ＳＯ２−Ｘ１」として使用できる基の例についても、その後に示す。
【００４９】
【化１】
2004125406.tif 000002
【００５０】
【化２】
2004125406.tif 000003
【００５１】
「−Ｘ１」は、上記具体例中、（Ｘ１）、（Ｘ２）、（Ｘ３）、（Ｘ４）、（Ｘ７）、（Ｘ８）、（Ｘ１３）あるいは（Ｘ１４）であることが好ましく、（Ｘ１）あるいは（Ｘ２）であることがさらに好ましい。特に好ましいのは、（Ｘ１）で表わされるビニル基である。
【００５２】
Ｌの好ましい具体例を以下に示す。但し、ａは、１乃至６の整数であり、１もしくは２であることが好ましく、１であることが特に好ましい。ｂは、０乃至６の整数であり、２もしくは３であることが好ましい。
【００５３】
【化３】
2004125406.tif 000004
【００５４】
Ｌとしては、上記記載の二価の連結基の他に、上記式のアルキレン基の水素原子が−ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２基によって置換されてなる基も好ましい。
【００５５】
前記の式（１）で表わされるビニルスルホニル基もしくは反応性前駆体基が共有結合により固定されたマイクロリアクターを得るために利用される二官能反応性化合物としては、下記の式（２）で表わされるジスルホン化合物が有利に利用できる。
【００５６】
Ｘ１−ＳＯ２−Ｌ２−ＳＯ２−Ｘ２　　　（２）
【００５７】
式（２）において、Ｘ１およびＸ２は互いに独立に、−ＣＲ１＝ＣＲ２Ｒ３、または−ＣＨＲ１−ＣＲ２Ｒ３Ｙを表わし；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｙは、求核試薬によって置換される基、あるいは塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を表わす；Ｌ２は連結基を表わす。式（２）における各置換基の具体例は、式（１）における各置換基の具体例と同様である。
【００５８】
式（２）で表わされるジスルホン化合物を、前記のマイクロリアクターと、例えば水性雰囲気にて、接触させることによって、本発明の反応性マイクロリアクターを容易に製造することができる。
【００５９】
本発明で好ましく用いるジスルホン化合物の代表例を下記に示す。なお、ジスルホン化合物は、二種類以上を混合して用いてもよい。
【００６０】
【化４】
2004125406.tif 000005
【００６１】
【化５】
2004125406.tif 000006
【００６２】
式（２）で表わされるジスルホン化合物の代表的な例としては、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン［上記のＳ１に相当する］を挙げることができる。
【００６３】
本発明で用いるジスルホン化合物の合成法については、たとえば、特公昭４７−２４２９号、同５０−３５８０７号、特開昭４９−２４４３５号、同５３−４１５５１号、同５９−１８９４４号等の各種公報に詳細が記載されている。
【００６４】
２．本発明の生物学的素材結合マイクロリアクター及びその製造方法
本発明の生物学的素材結合マイクロリアクターにおいては、特異的結合パートナーの一員の残基を有する下記式（３）で表される基がマイクロリアクター内流路壁面上に結合している。
―Ｌ―ＳＯ２―Ｘ―Ａ　　　　　（３）
［式中、Ｌは、―ＳＯ２―Ｘ―Ａとマイクロリアクター内流路壁面とを結合する連結基を示し；Ｘは、―ＣＲ１１（Ｒ１２）―ＣＲ１３（Ｒ１４）−を表し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は互いに独立に、水素原子、炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数６乃至２０のアリール基、又は炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数７乃至２６のアラルキル基を表し；Ａは、特異的結合パートナーの一員の残基を示す。］
【００６５】
本発明における特異的結合パートナーは、生物学的な特異的結合を形成する結合パートナーを意味し、その種類は特に限定されるものでないが、抗体もしくは抗体フラグメント／リガンド、抗体もしくは抗体フラグメント／抗原、抗体もしくは抗体フラグメント／ハプテンなどの抗原決定基をもつもの、レセプター／リガンド、アビジン類／ビオチン類、核酸／核酸、核酸／核酸結合タンパク質等の組み合わせが挙げられる。本発明に従って作製されるＤＮＡの固定化された固体支持体をＤＮＡチップとして使用する場合には、一定の結合強度を有するためその後のハイブリダイゼーション操作に精度よく反復使用できるものである。
【００６６】
ビオチン類としては、ビオチン、ビオシチン、デスチオビオチン、オキシビオチンまたはアビジンと安定な複合体を形成しうるこれらの誘導体が挙げられる。かような安定な複合体を形成しうるとは、ビオチン−アビジン複合体の解離定数（１０−１５Ｍ）に近似する解離定数を有する複合体を形成することができることを意味する。一方、アビジン類としては、アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチンと安定な複合体を形成しうるこれらの改変体が挙げられる。ここにいう、「安定な複合体」の意味も、上記、ビオチン類について定義したのと同義である。また改変体とは、天然由来のアビジンまたはストレプトアビジンの修飾体もしくは断片、あるいはそれらの組換え体を意味する。
【００６７】
核酸としては特に限定されるものではないが、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が挙げられる。代表例としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、そしてペプチド核酸を挙げることができる。これらのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、天然起源のもの（ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ、あるいはＲＮＡ断片など）であってもよく、あるいは合成化合物であってもよい。また、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、その糖単位部分に架橋基を有するＬＮＡと呼ばれる化合物（Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１９９８，　１２０，　１３２５２−１３２５３に記載）などの各種の類縁化合物が含まれる。
【００６８】
核酸結合物質として特に限定されるものではないが、二本鎖ＤＮＡ認識物質が挙げられる。二本鎖ＤＮＡ認識物質としては、二本鎖ＤＮＡを認識し、特異的に結合する物質を示す。二本鎖ＤＮＡ認識物質の具体例としては、ＤＮＡ転写因子、ミスマッチ修復タンパク質、二本鎖ＤＮＡ認識抗体、又はペプチド核酸などを挙げることができる。二本鎖認識物質としては、Ｚｎフィンガーモチーフまたはリングフィンガーモチーフを持つものが挙げられる。
【００６９】
ＤＮＡ転写因子は、遺伝子上のプロモーター領域に結合して、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を制御する物質である（田村隆明著：転写因子（羊土社　１９９５年））。従って、転写因子は特定の配列の２本鎖ＤＮＡに特異的に結合することが知られている。
【００７０】
多数ある転写因子のうち、Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ　ＰｒｏｔｅｉｎつまりＺｉｎｃ　ＦｉｎｇｅｒやＲｉｎｇ　Ｆｉｎｇｅｒモチーフをもつ転写因子群は、真核生物における出現率は非常に高く、ゲノム中の１％はこれをコードしているらしい。Ｐａｂｏ等はＺｉｎｃ　Ｆｉｇｅｒモチーフの３次構造を解析、ＤＮＡと結合するメカニズムの解明した（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，　８０９（１９９１））。さらに、Ｃｈｏｏ等は、遺伝子組換法により、特定の配列に結合する自然界にはないＺｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ群を作製することに成功している（Ｎａｔｕｒｅ　３７２，６４２［１９９４］，ＰＮＡＳ９１，１１１６３（１９９４））。さらに、Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのグループはＰｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙにより新規なＺｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ群の作製に成功している（ＰＮＡＳ９５，２８１２，［１９９８］：９６，２７５８（１９９９））。このように、Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎに代表されるＤＮＡ転写因子群は、本来２本鎖ＤＮＡと結合する性質をもっており、かつ近年の研究によれば、任意のＤＮＡ配列を認識する組換体の作製も可能となってきている。このような、タンパク質を固定化することにより、２本鎖ＤＮＡを効率良く支持体上に捕捉することが可能である。
【００７１】
その他、核酸結合物質としてヘリックス・ループ・ヘリックスタンパク質やＥｔｓドメインを持つものも挙げられる。
【００７２】
マイクロリアクター内流路壁面に固定する特異的結合パートナーの一員がタンパク質類である場合は、その内在するアミノ基もしくはメルカプト基、タンパク質にアミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、メルカプト基、もしくはカルボキシイミド基などを導入し、スルホニル基を介した反応性基と共有結合を形成する。
【００７３】
上記のタンパク質である特異的結合パートナーの一員（例えば、抗体やアビジン類、核酸結合物質）が固定されたマイクロリアクター内流路壁面マイクロリアクター内流路壁面は、水性媒体の存在下、該結合パートナーと特異的に反応する結合パートナーの他の一員（例えばリガンドやビオチン類、核酸）と接触させて、その結合性パートナーを固定することができる。固定すべき特異的結合性の結合パートナーの他の一員（例えばリガンドやビオチン類、核酸）はその固定を外部から検知することが可能なように検知可能な標識（例、蛍光標識、酵素標識など）が結合していることが望ましい。
【００７４】
マイクロリアクター内流路壁面に固定されるのが核酸の場合のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の代表的な例としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸およびＬＮＡを挙げることができる。これらのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、その分子の一方の端部もしくは端部附近に、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボキシイミド基、メルカプト基などの、ビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基と反応する共有結合を形成する反応性基を持つものが利用される。
【００７５】
上記のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定されたマイクロリアクター内流路壁面は、水性媒体の存在下、該固定ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体に対して相補性を示すオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはその断片、あるいはＲＮＡもしくはその断片）を接触させて、ハイブリダイゼーションを発生させることにより、その相補性オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを固定することができる。固定すべき相補性のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドは、その固定を外部から検知することが可能なように、検知可能な標識（例、蛍光標識）が結合していることが望ましい。
【００７６】
本発明においては、生物学的素材結合マイクロリアクターの特異的結合パートナーの一員（下記の式（３）においては、Ａで表される残基）は、下記式（３）で示す通りスルホニル基を介した共有結合により、マイクロリアクター内流路壁面に結合されている。
―Ｌ―ＳＯ２―Ｘ―Ａ　　　　　（３）
［式中、Ｌは、―ＳＯ２―Ｘ―Ａとマイクロリアクター内流路壁面とを結合する連結基を示し；Ｘは、―ＣＲ１（Ｒ２）―ＣＲ３（Ｒ４）−を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は互いに独立に、水素原子、炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数６乃至２０のアリール基、又は炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数７乃至２６のアラルキル基を表し；Ａは、特異的結合パートナーの一員の残基を示す。］
【００７７】
式（３）において、Ｌは、―ＳＯ２―Ｘ―Ａとマイクロリアクター内流路壁面とを結合する二価もしくはそれ以上の連結基を示す。−Ｌ−の具体例としては、式（１）における−Ｌ−の具体例と同義である。
【００７８】
式（３）において、炭素原子数１乃至６のアルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、及びｎ−ヘキシル基を挙げることができ、メチル基であることが特に好ましい。炭素原子数６乃至２０のアリール基の具体例としては、フェニル基及びナフチル基を挙げることができる。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は共に水素原子であることが好ましい。
炭素原子数１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数７乃至２６のアラルキル基の例としては、上記した炭素原子数１乃至６のアルキル基の例と炭素原子数６乃至２０のアリール基の例とを組み合わせたものが挙げられる。
【００７９】
本発明の生物学的素材結合マイクロリアクターは、前記式（１）で表されるビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基を表面に持つマイクロリアクター内流路壁面上に、該ビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基と反応して共有結合を形成する反応性基を有する少なくとも一つの特異的結合パートナーの一員を接触させることにより製造することができる。
【００８０】
本発明のマイクロリアクターの流路壁面に共有結合を介して結合されたビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基は、加水分解に対して高い抵抗性を有しているため、容易に安定に保存することができ、また、アミノ基などの反応性基を予め備えているか、あるいはアミノ基などの反応性基が導入されている特異的結合パートナーの一員と迅速に反応して、安定な共有結合を形成することができる。
【００８１】
オリゴヌクレオチドやＤＮＡ断片などのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の一方の末端には、前記のビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基と反応して共有結合を形成する反応性基を導入する。このような反応性基は、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボキシイミド基、メルカプト基であることが好ましく、アミノ基であることが特に好ましい。オリゴヌクレオチドやＤＮＡ断片には、通常、クロスリンカーを介してこれらの反応性基が結合される。クロスリンカーとしては、たとえば、アルキレン基あるいはＮ―アルキルアミノ―アルキレン基が利用されるが、ヘキシレン基あるいはＮ―メチルアミノ―ヘキシレン基であることが好ましく、ヘキシレン基であることが特に好ましい。なお、ペプチド核酸（ＰＮＡ）はアミノ基を有しているため、通常は、改めて別に反応性基を導入する必要はない。
【００８２】
同様にタンパク質もアミノ基またはメルカプト基を有しているため通常は改めて別に反応性基を導入する必要はない。しかしながら、タンパク質の３次元構造はその機能に大きく関与しているので、タンパク質の活性が低下する場合は活性とは関係のない特定の位置に反応基を導入することが好ましい。
【００８３】
また、同じ目的のために、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体、タンパク質などを接触させたまま該マイクロリアクターを、９０％以上の湿度および２５乃至５０℃（タンパク質の場合は３７℃まで）の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【００８４】
タンパク質、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体などの生物学的素材（即ち、特異的結合パートナーの一員）の固定量（数）は、マイクロリアクター内流路壁面表面に対して、１乃至１０７種類／ｃｍ２の範囲にあることが好ましい。
【００８５】
（３）試料中の標的物質の検出方法
本発明はさらに、（ａ）特異的結合パートナーの一員の残基を有する上記式（３）で表される基がマイクロリアクター内流路壁面上に結合していることを特徴とする生物学的素材結合マイクロリアクターと、該マイクロリアクターの表面に担持された特異的結合パートナーの一員と特異的に結合する標的物質（即ち、前記特異的結合パートナーの他の一員である標的物質）を含む検体とを接触させる工程；及び
（ｂ）該特異的結合パートナーの一員と該標的物質との間の相互の結合の形成を検出する工程；
を含む、標的物質を検出する方法に関する。
【００８６】
本発明で用いる「標的物質を含む検体」の種類は特に制限されず、例えば、末梢静脈血のような血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他核酸を含有する任意の試料を用いることができる。試料は上記のような組織細胞などの試料をそのまま使用してもよいが、好ましくは、試料中の細胞を破壊して核酸、リガンドなどを遊離させたものを試料として使用する。試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア―ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。核酸抽出溶液を用いて核酸を溶出する場合には、３７℃以上の温度でインキュベートすることにより反応を促進することができる。
【００８７】
本発明の代表的な態様であるタンパク質チップは、タンパク質相互作用解析、タンパク質発現解析、創薬研究に利用される。さらに、タンパク質が核酸結合タンパク質の場合は、その認識核酸配列によっては変異解析や多型解析に利用することができる。
【００８８】
検出原理は標識されたリガンドや核酸との反応である。標識方法としてはＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、化学発光法等）とが知られているが、とくに限定されるものではない。例えば蛍光法の場合、蛍光標識に利用される蛍光物質としては、核酸の塩基部分やタンパク質アミノ酸残基と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、市販のＣｙ　ＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ―アセトキシ―Ｎ２―アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。
【００８９】
検体中の標的核酸は、ＰＣＲ法などで増幅することなく直接検出するのが好ましいが、予め増幅したのちに検出してもよい。標的核酸またはその増幅体は、予め標識しておくことにより容易に検出可能である。核酸を標識するには、酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＲＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅなど）を用いる方法がよく用いられるが、化学反応により、直接標識物質を結合させてもよい。このような標識方法については、公知の技術として成書に記載されている（野村慎太郎著　脱アイソトープ実験プロトコール１、秀潤社１９９４年、脱アイソトープ実験プロトコール２、秀潤社１９９８年、村松正明著　ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法標識物質　秀潤社２０００年）。標識物質は、検出可能なシグナルを作ることの可能な物質であることが好ましい。標識物質が、酵素や触媒のような、シグナルの増幅能力のある物質である場合、ＤＮＡの検出感度は大きく向上する
【００９０】
しかしながら、前述の標識操作は、一般的に煩雑であるので、さらに好ましい検出方法としては、検体中の核酸を予め標識せずに測定する方法を挙げることができる。これには、例えば２本鎖ＤＮＡを認識するＤＮＡ挿入剤、いわゆるＤＮＡインターカレーターを用いることができる。ＤＮＡインターカレーターの使用により、検出操作が簡単になるだけではなく、検出感度も向上する。例えば、１０００ｂｐのＤＮＡを検出する場合、いわゆる標識法は多くとも数個の標識物質しか導入できないのであるが、インターカレーターを使用する場合は１００個以上の標識物質を導入することが可能である。
【００９１】
ＤＮＡインターカレーターは、そのもの自体が検出可能なシグナルを形成できる物質であってもよいが、その側鎖にシグナル形成物質を結合していたり、ビオチン―アビジン、抗原―抗体、ハプテン―抗体のような特異結合対を介してインターカレーターに結合していてもよい。本発明における、検出可能なシグナルは、例えば、蛍光検出、発光検出、化学発光検出、生物発光検出、電気化学発光検出、放射能検出、電気化学検出、比色検出により検出可能なシグナルであることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
リガンドが標的である場合は、内在しているアミノ基にシアニン色素（例えば、市販のＣｙ　ＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ―アセトキシ―Ｎ２―アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）のサクシンイミド体を反応させたものを使用することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００９３】
【実施例】
（１）石英マイクロリアクターの作成：
石英ガラスの表面に幅１００μｍの流路パターンを、Ａｕ／Ｃｒのフォトリソグラフィにより形成し、そのパターンをマスクとしてフッ酸でエッチング処理を行い溝を形成した。これに、フッ酸接合法により石英ガラスを張り合わせることにより、溝部分を流路とした石英マイクロリアクターを作成した。
【００９４】
（２）流路壁面にビニルスルホニル基が導入されたマイクロリアクター（▲１▼）の作成
２質量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業（株）製）のエタノール溶液を、（１）のマイクロリアクター流路に注入したのち１０分間放置した。流路にエタノールを注入洗浄した後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化合物被覆スライドを作成した。次に、このシラン化合物被覆スライドの流路に、５質量％の１，２―ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液を注入、１時間放置した、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧下乾燥し、壁面にビニルスルホニル基が導入されたマイクロリアクターを作成した。
【００９５】
（３）表面にビニルスルホニル基が導入された平板石英ガラスの作成（コントロール）
実施例（２）と同様の方法により、表面にビニルスルホニル基が導入された平板石英（▲２▼）を作成した。
【００９６】
（４）抗体固定化スライドによるリガンドの検出
（４−１）抗体の固定
Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｈ＋Ｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳにて希釈し（１００ｎｇ／μＬ　）、０．５μｌを上記実施例（２）にて作製した壁面にビニルスルホニル基が導入されたマイクロリアクター（▲１▼）の流路に注入した。３時間放置した後、３％カゼイン／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０―ＰＢＳ（ＰＢＳ―Ｔ）を注入し１時間放置後、ＰＢＳにより洗浄し、抗体固定マイクロリアクターを得た。
【００９７】
また、同様に　２μｌのＧｏａｔ　Ａｎｔｉ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｈ＋Ｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を希釈液を平板石英ガラスの作成（コントロール）に点着、３時間放置後、３％カゼイン／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０―ＰＢＳ（ＰＢＳ―Ｔ）を注入し１時間放置し、ブロッキングを行った。
【００９８】
（４−２）　ＨｕｍａｎＩｇＧの検出
上記（４−１）で作成した抗体固定マイクロリアクター（▲１▼）に、ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）　０．５μｌを注入１５分間放置後、ＰＢＳを注入することによりで洗浄した。次に０．１％カゼイン入りＰＢＳで１０００倍に希釈されたＧｏａｔ　Ａｎｔｉ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆｃｓｐｅｃｉｆｉｃ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）０．１μｌを注入１５分間放置後、　ＰＢＳを注入することによりで洗浄した。さらに、ＥＣＬ発光基質（アマシャム社製）０．５μｌを注入後ＬＡＳ１０００（富士フィルム社製）により発光強度を測定した
【００９９】
同様に、抗体固定平板石英（▲２▼）をヒトＩｇＧ　ＰＢＳ溶液２ｍｌに浸漬　１５分間放置後、ＰＢＳにて洗浄し、０．１％カゼイン入りＰＢＳで１０００倍に希釈されたＧｏａｔ　Ａｎｔｉ　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆｃ　　　ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）２ｍｌに１５分間浸漬した。さらにＥＣＬ発光基質（アマシャム社製）１ｍｌに浸漬後、ＬＡＳ１０００（富士フィルム社製）により発光強度を測定した。結果を以下の表１に示す。
【０１００】
【表１】
2004125406.tif 000007
【０１０１】
この結果より、本発明のマイクロリアクターにおいては抗体が効率よく結合していることが明らかである。また、対照となる平板リアクターよりも、必要とする試薬液量が少なくかつ、Ｓ／Ｎも高いことが明らかである。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明により、迅速かつ安定に結合固定可能な反応性マイクロリアクター、該反応性マイクロリアクター内流路壁面に少なくとも一つの特異的結合パートナーの一員が結合固定されてなる生物学的素材結合マイクロリアクター、並びにそれらの製造方法及び利用方法を提供することが可能になった。本発明のマイクロリアクターは、必要とする試薬液量が少なく、かつＳ／Ｎも高いという利点を有する。