(57)【要約】　　　（修正有）【課題】高純度のハイブリッドイネ種子の生産においては、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有する雄性不稔系統の種子純度を高く維持することが、極めて重要である。雄性不稔系統への正常細胞質を有する維持系統の混入は、核ゲノムの遺伝子型が同じであるため検出が困難である。【解決手段】本発明は、ミトコンドリアゲノムのＤＮＡマーカーを用いることにより、正常細胞質を検出し、ＢＴ型雄性不稔細胞質との判別を行うためのＤＮＡマーカーおよびそれを用いた手法を提供する。【効果】本発明の手法により、雄性不稔系統への維持系統個体の混入を簡便に検出することができ、高純度の雄性不稔系統種子、延いては高純度のハイブリッド種子の生産に利用される。さらに、ハイブリッド種子の純度検定効率を飛躍的に向上させることができる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質雄性不稔性に関して正常なイネのミトコンドリアゲノムに存在する機能不明な配列番号１で示されるＤＮＡ配列が、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネの系統のミトコンドリアゲノムにおいてはａｐｔ６遺伝子の一部と共に相同組み換えによってキメラ遺伝子ｕｒｆ−ｒｍｃを構成していることを利用して、配列番号１の塩基配列における配列番号２の塩基配列に相当する部位を含む領域を増幅するように設計したプライマー対によってイネＤＮＡを鋳型として増幅される、正常細胞質を有するイネの系統をＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネの系統と区別して検出するためのＤＮＡマーカー。
【請求項２】
プライマー対の一方が、配列番号３のＤＮＡ配列を有するプライマーであり、および他方が配列番号４から７のＤＮＡ配列を有するプライマーのグループから選ばれるプライマー対によって、正常細胞質を有するイネの系統のミトコンドリアゲノムをテンプレートとして増幅される請求項１に記載のＤＮＡマーカー。
【請求項３】
正常細胞質を有するイネの系統の種子を含む個体を検出するための、配列番号３から７のＤＮＡ配列からなるグループから選ばれるプライマー。
【請求項４】
種子を含むイネ個体の細胞質がＢＴ型雄性不稔細胞質か、正常細胞質かを判定するための方法であって、
（１）試料であるイネ個体から総ＤＮＡを抽出し、
（２）抽出した総ＤＮＡを鋳型として請求項１または２に記載のプライマー対を用いて核酸増幅反応を行い、
（３）核酸増幅産物としてのＤＮＡマーカーが検出された場合には、そのイネ個体は正常細胞質を有する系統であると判断し、または、ＤＮＡマーカーが検出されない場合にはそのイネ個体はＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統であると判断することからなる、
前記判定方法。
【請求項５】
イネ個体の総ＤＮＡが、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　ＳＤＳを含む抽出バッファーに試料となるイネの組織を浸漬した後、８０℃〜１００℃で３０〜１００分間の加熱処理を行い、その抽出液を直接ＰＣＲテンプレートとして供試する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統の二粒以上のイネ種子からなる試料について、請求項４または５に記載の方法を用いて、試料の中に正常細胞質保有系統の種子混入があるか否かを判定する方法。
【請求項７】
ＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統の二粒以上のイネ種子からなる試料について、請求項４または５に記載の方法を用いて得られるＤＮＡマーカーの量を定量または半定量することにより、試料の中に正常細胞質保有系統の種子混入の割合を推定することによる、イネ種子純度を検定または推定する方法。
【請求項８】
ＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統のイネ種子が雄性不稔系統の種子である請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統のイネ種子がハイブリッド種子である請求項６または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネの系統においてａｐｔ６遺伝子の一部と配列番号１に示す機能不明のミトコンドリア配列の一部は、共にキメラ遺伝子ｕｒｆ−ｒｍｃを構成しており、配列番号１に示す機能不明のミトコンドリア配列の原型配列は、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統には存在せず、正常細胞にのみ存在することを利用し、細胞質雄性不稔性に関して正常細胞質を有する系統（以降、正常細胞質と表記する）を検出するためのＤＮＡマーカー、および該ＤＮＡマーカーを用いてイネＢＴ型雄性不稔細胞質を保有する系統のイネと正常細胞質を保有する系統のイネを簡便に判別する方法に関する。また、本発明は、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統の複数の種子の中の、正常細胞質を有する系統の種子の混入を検出する方法に関し、さらには検出したＤＮＡマーカーの量を定量または半定量することによりＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統の種子純度を検定または推定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＢＴ型雄性不稔細胞質およびその稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）はハイブリッドイネ育成に利用されている。ＢＴ型雄性不稔細胞質を有する雄性不稔系統の種子純度を高く維持することが高純度のハイブリッド種子を生産する上で極めて重要である。雄性不稔系統の種子純度を低下させる要因は、主として、核ＤＮＡの遺伝子型が雄性不稔系統と同じであるが正常細胞質を有する、維持系統の混入であると考えられる。雄性不稔系統への維持系統などの正常細胞質系統の混入の程度は、主として対象種子の圃場栽培を行い、稔実個体の出現頻度を調べることにより推定されている。雄性不稔系統の個体からは種子を得ることができないので、種子が得られる個体の割合はすなわち他の系統の個体が混入している割合を意味する。しかしながらこの方法では、実際にイネを栽培するため、検定に多大な時間・場所および労力を要するという問題がある。また、種子稔性は環境要因の影響を受けやすいので、低温・日照不足などの不良環境で調査すれば、遺伝子型や細胞質の構成によらず不稔になる場合があり、正確に評価できないという問題もある。
【０００３】
一方、近年では遺伝子工学的技術により、その個体の形質に関与する遺伝子の有無を調べる手法が開発されている。この方法は、圃場試験と比較して格段に迅速であり、簡便な方法として注目されている。最近、ＰＣＲマーカーによりイネの正常細胞質を検出し、正常細胞質とＢＴ型雄性不稔細胞質とを判別する方法についての特許出願が公開された（特開平１０−２８６０９３）。さらに、当該特許明細書には、ＢＴ型雄性不稔細胞質系統の玄米９９粒に正常細胞質系統の玄米１粒が混入している場合でも、その混入を検出できると記載されている。しかしながら、その検定法には玄米からＣＴＡＢ法でＤＮＡを抽出するステップが含まれており、抽出に時間と労力がかかるといった潜在的な問題を持つ。さらに、本発明者が追試験を行ったところ、当該出願で正常細胞質を有するイネの系統から特異的に増幅産物を生じると記載されているマーカーが、一部のＢＴ型雄性不稔細胞質系統からも増幅産物を生じ、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネの系統と区別できない場合がある。また、一部のＰＣＲマーカーについては、当該出願に記載の内容が再現されないことが判明した。したがって、現時点ではＢＴ型雄性不稔細胞質と正常細胞質との識別に広く応用可能で、かつ効率的な種子純度検定を行う観点から必要とされる、ＢＴ型雄性不稔細胞質または正常細胞質を有するイネ系統特異的に増幅産物を生じるマーカーは事実上存在しなかったといえる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ＢＴ型雄性不稔細胞質と正常細胞質との識別に広く応用可能で、かつ効率的な種子純度検定を行うことのできる、正常細胞質を有するイネ系統を特異的に検出するＤＮＡマーカーを提供し、該マーカーを用いたＢＴ型雄性不稔細胞質と正常細胞質の識別方法、ならびに、種子純度検定法を提供する。
【０００５】
また、上記の方法を行う際に、時間を短縮することができる、イネ総ＤＮＡの簡易抽出法も提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、細胞質雄性不稔性に関して正常な細胞質（以降、正常細胞質と表記する）を有するイネ系統に特異的に存在するミトコンドリアゲノム配列を検出するＤＮＡマーカーにより、イネの正常細胞質とＢＴ型雄性不稔細胞質とを識別する方法を提供する。
【０００７】
ＢＴ型雄性不稔細胞質による雄性不稔は、ミトコンドリアゲノムにコードされているａｐｔ６遺伝子の異常によって引き起こされると考えられている。門脇ら（参考文献１）は、ＢＴ細胞質には２種類の異常型ａｐｔ６遺伝子が存在し、その一方は正常型ａｐｔ６遺伝子と機能不明のミトコンドリア配列（アクセッション番号Ｘ５２１６３）とのキメラ遺伝子（ｕｒｆ−ｒｍｃ）であることを明らかにした。また、このキメラ遺伝子ｕｒｆ−ｒｍｃはａｐｔ６遺伝子と機能不明のミトコンドリア配列と、５’−ＴＴＣＣＣＴＣ−３’を相同組み換え部位とする、相同組み換えにより生じるというモデルをたてた。本発明者は、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネ系統に特異的なキメラ遺伝子ｕｒｆ−ｒｍｃの生成についての門脇らのモデルを発展させ、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネ系統には、キメラ遺伝子ｕｒｆ−ｒｍｃは存在するが、もとの機能不明のミトコンドリア配列配列Ｘ５２１６３は存在しないという仮説を立てた。本発明においては、機能不明のミトコンドリア配列Ｘ５１２６３に対して、ＢＴ型雄性不稔細胞質の系統における相同組み換え部位５’−ＴＴＣＣＣＴＣ−３’を挟むようにプライマーを設計する。このように設計し、このプライマーを用いてイネ総ＤＮＡを鋳型にＤＮＡの増幅を行うことで、正常細胞質を有するイネ系統のＤＮＡからは増幅産物としてＤＮＡマーカーが得られるが、ＢＴ型雄性不稔細胞質からは増幅産物が得られないこととなる。実際に上記のようにプライマー対を設計し、そのプライマー対を用いて、雄性不稔系統（ＢＴ型雄性不稔細胞質を有する）および維持系統（正常細胞質を有する）の総ＤＮＡをテンプレートにＰＣＲ増幅を行ったところ、仮説の通り維持系統のみに増幅産物を観察することができた。このことから、本発明のＤＮＡマーカーにより、雄性不稔系統と維持系統とを識別できる。
【０００８】
本発明には、上記のように設計したプライマーの例として、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーとして配列番号３のＤＮＡ配列を有するプライマーを、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして、配列番号４から７のＤＮＡ配列を有するプライマーが含まれる。また、配列番号３のプライマーおよび配列番号４から７のプライマーのグループから選ばれるプライマー対によってイネＤＮＡを鋳型として増幅される、正常細胞質を有するイネ系統特異的に増幅産物として現れるＤＮＡマーカーが本発明の範囲に含まれる。
【０００９】
本発明の方法は、（１）試料であるイネ個体、望ましくは葉または種子から総ＤＮＡを抽出し、
（２）イネ個体の総ＤＮＡを鋳型として前述のプライマー対を用いて核酸増幅反応を行い、
（３）核酸増幅産物としてのＤＮＡマーカーが検出された場合には、そのイネ個体は正常細胞質を有する系統であると判断し、または、ＤＮＡマーカーが検出されない場合には、そのイネ個体はＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統であると判断することからなる、
イネ個体の細胞質がＢＴ型雄性不稔細胞質か、正常細胞質かを判定するための方法である。
【００１０】
本発明の一態様において、イネ個体からの総ＤＮＡを抽出する操作には、当業者に既知のＣＴＡＢ法（参考文献２）が含まれるが、さらに望ましくは、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　ＳＤＳを含む抽出バッファーに試料となるイネの組織を浸漬した後、８０℃〜１００℃で３０〜１００分間の加熱処理を行い、その抽出液を直接ＰＣＲテンプレートに供試する、簡易抽出法によって行われ、これは本発明の範囲に含まれる。
【００１１】
本発明の一態様において、（イネＤＮＡの）増幅とは、イネＤＮＡを鋳型として、前述のプライマーを用いてイネＤＮＡの一部を増幅することであり、ＰＣＲもこれに含まれる。
【００１２】
本発明の一態様において、ＤＮＡマーカーの検出には、ゲル電気泳動による増幅産物の分離とエチジウムブロマイドなどの検出用色素による染色により行ってもよいが、また、これらに限定されない。
【００１３】
本発明は、二粒以上の種子からなるＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネの系統のサンプル中の、正常細胞質を有数するイネの系統の混入の検出にも用いることができる。本発明のプライマーを用いた方法においては、１９９粒のＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統の中に含まれる１粒の正常細胞質を有する系統を検出することができ、望ましくは２９９粒のＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統の中に含まれる１粒の正常細胞質を有する系統を検出することができ、さらに望ましくは４９９粒のＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統の中に含まれる１粒の正常細胞質を有する系統を検出することができる。
【００１４】
また、正常細胞質を有するイネの系統の、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネの系統への混入比率が予め既知のサンプルを対照として、目的のＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネ系統のサンプルにおいて生じたＤＮＡマーカーの量を、対照サンプルのものと比較し、定量（または半定量）することで、サンプル中に正常細胞質を有する系統のイネ個体混入の割合を、検定（または推定）することができる。したがって、本発明の方法により、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネの系統の純度を見積もることができ、これも本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
本発明において、純度の検定を行うＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネの系統の個体には雄性不稔系統の種子および、ハイブリッド種子が含まれるが、これらに限定されない。雄性不稔系統の純度検定では、雄性不稔系統への維持系統の個体の混入を簡便に検出できるようになる。一方、ハイブリッド種子の純度検定では、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有する回復系統および雄性不稔系統への一般品種花粉の他家受精で生じた種子によるコンタミネーションを無視した、概ねの種子純度を推定することができる。
【００１６】
【発明の効果】
本発明を利用することにより、正常細胞質を有する系統のイネとＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統のイネとを識別することができる。また、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有する系統のイネのサンプル中に混入している、正常細胞質を有する系統のイネを検出することができる。
【００１７】
本発明の方法は、特に、イネの雄性不稔系統への維持系統個体の混入の検出に利用される。この方法で基準値以上の種子純度の雄性不稔系統種子のみを、以後の増殖および、ハイブリッド生産に供試することにより、高純度の雄性不稔系統種子およびハイブリッド種子を効率的に生産することが可能になる。また、（１）ハイブリッド種子（稔性回復遺伝子座の遺伝子型はＲｆ−１／ｒｆ−１）はＢＴ型雄性不稔細胞質を有する、（２）他にＢＴ型雄性不稔細胞質を有するのは雄性不稔系統（稔性回復遺伝子座の遺伝子型はｒｆ−１／ｒｆ−１）および回復系統（稔性回復遺伝子座の遺伝子型はＲｆ−１／Ｒｆ−１）にほぼ限定できる、（３）雄性不稔系統は自殖種子が得られない、の理由により、ハイブリッド種子の細胞質がＢＴ細胞質か正常細胞質かを調べることにより、回復系統の自殖種子によるコンタミネーションおよび雄性不稔系統への一般品種花粉の他家受精で生じた種子によるコンタミネーションを無視した、概ねの種子純度を推定することができる。なお、本発明の手法以外の方法により、稔性回復遺伝子座の遺伝子型を同時に調べることにより、回復系統の自殖種子によるコンタミネーションを考慮した推定を行うことができる。
【００１８】
【実施例】
実施例１　ＢＴ細胞質と正常細胞質とを識別するＤＮＡマーカーの開発
（材料および方法）
門脇ら（１９９０）によると、ａｔｐ６遺伝子と機能不明配列（アクセッション番号Ｘ５２１６３）との相同組換えによりキメラ遺伝子ｕｒｆ−ｒｍｃが生じ（図１Ａ）、ｕｒｆ−ｒｍｃはＢＴ細胞質特異的に存在する。本発明において、ｕｒｆ−ｒｍｃ生成についての門脇らのモデルを発展させ、ＢＴ細胞質にはキメラ遺伝子は存在するが、もとの機能不明配列Ｘ５２１６３は存在しないとの仮説を立てた。この仮説が正しければ、Ｘ５２１６３に対して、ＢＴ細胞質での相同組換え部位（ＴＴＣＣＣＴＣ）を挟むようにプライマーを設計しＰＣＲ増幅を行うと、正常細胞質ＤＮＡからは増幅産物が得られるが、ＢＴ細胞質からは得られないと考えた。そこで、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーとして配列番号１、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５を設計し（図１Ｂ）、ＦｏｒｗａｒｄプライマーとＲｅｖｅｒｓｅプライマーを組合せて、いわた８号（正常細胞質を保有）およびＭＳいわた８号（ＢＴ細胞質を保有）の葉組織からＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　１９８０）で抽出した総ＤＮＡをテンプレートに用いて、ＰＣＲを行った。
【００１９】
ＰＣＲは、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　９６００　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、３０μｌの反応量で行った。反応液３０μｌ中には、１５ｎｇ　ＤＮＡ、０．６Ｕ　ＴａＫａＲａ　ＴａｑＴＭ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ、６ｎｍｏｌｅ　各ｄＮＴＰ、６ｐｍｏｌｅ各プライマー、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２が含まれる。ＰＣＲ条件は、９４（Ｃ　で２分間処理した後、　９４（Ｃ　で３０秒間の熱変性、６０（Ｃ　で３０秒間のアニ−リング、７２（Ｃ　で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３０回繰り返し、最後に７２（Ｃ　で２分間処理することとした。ＰＣＲ反応後、１５μｌを３％　Ａｇａｒｏｓｅ２１　（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）　ゲルに泳動した。
【００２０】
（結果および考察）
泳動結果を図２に示す。いわた８号の総ＤＮＡをテンプレートに用いた場合には、配列番号１と配列番号２とのプライマー組合せでは２３２ｂｐの増幅産物、配列番号１と配列番号３とのプライマー組合せでは２６８ｂｐの増幅産物、配列番号１と配列番号４とのプライマー組合せでは２９３ｂｐの増幅産物、配列番号１と配列番号５とのプライマー組合せでは３３２ｂｐの増幅産物が観察された。一方、ＭＳいわた８号の総ＤＮＡをテンプレートに用いた場合には、いずれのプライマー組合せでも増幅産物は観察されなかった。
【００２１】
この結果から、本実験で調査した４種のプライマー組合せのいずれによっても、正常細胞質個体とＢＴ細胞質個体とを識別できることが明らかとなった。
【００２２】
実施例２
（材料および方法）
いわた１０号（正常細胞質を保有）およびＭＳいわた１０号（ＢＴ型雄性不稔細胞質を保有）の水洗した精米から、以下の方法でＤＮＡを抽出した。１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　ＳＤＳ　を含む抽出バッファー１５ｍｌに精米１００粒を加え、８５（Ｃで６０分間加熱した。攪拌後、遠心処理（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）を行い、上清３μｌをテンプレートに用いて、３０μｌ反応量でＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡ以外のＰＣＲ条件および使用したプライマーは、実施例１に記載したとおりである。
【００２３】
ＰＣＲ反応後、１５μｌを３％　Ａｇａｒｏｓｅ２１　（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）　ゲルに泳動した。
【００２４】
（結果および考察）
泳動結果を図３に示す。いわた１０号の粗抽出ＤＮＡ溶液をテンプレートに用いた場合には、配列番号１と配列番号２とのプライマー組合せでは２３２ｂｐの増幅産物、配列番号１と配列番号３とのプライマー組合せでは２６８ｂｐの増幅産物、配列番号１と配列番号４とのプライマー組合せでは２９３ｂｐの増幅産物、配列番号１と配列番号５とのプライマー組合せでは３３２ｂｐの増幅産物が観察された。一方、ＭＳいわた８号の粗抽出ＤＮＡ溶液をテンプレートに用いた場合には、いずれのプライマー組合せでも増幅産物は観察されなかった。
【００２５】
この結果から、実施例１で正常細胞質個体とＢＴ細胞質個体とを識別できることが明らかとなった４個のマーカーすべてについて、精米からの簡易抽出により調整したＤＮＡ溶液をテンプレートに用いて検定できることが示された。
【００２６】
実施例３
（材料および方法）
いわた１０号およびＭＳいわた１０号の水洗した精米を、以下の粒数混合した。
（１）いわた１０号の精米５粒およびＭＳいわた１０号の精米９５粒
（２）いわた１０号の精米１粒およびＭＳいわた１０号の精米９９粒
（３）ＭＳいわた１０号の精米１００粒
実施例２に記載した抽出バッファーを１５ｍｌ加えた後、８５（Ｃで６０分間加熱した。攪拌後、遠心処理（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）を行い、各上清を以下のように混合した。
Ｉ液．（１）溶液のみ
ＩＩ液．（２）溶液のみ
ＩＩＩ液．（２）溶液１００μｌ＋（３）溶液１００μｌ（いわた１０号の精米１粒およびＭＳいわた１０号の精米１９９粒の混合に相当）
ＩＶ液．（２）溶液１００μｌ＋（３）溶液２００μｌ（いわた１０号の精米１粒およびＭＳいわた１０号の精米２９９粒の混合に相当）
Ｖ液．（２）溶液１００μｌ＋（３）溶液４００μｌ（いわた１０号の精米１粒およびＭＳいわた１０号の精米４９９粒の混合に相当）
ＶＩ液．（３）溶液のみ
Ｉ〜ＶＩの各液３μｌをテンプレートに用いて、３０μｌ反応量でＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡ以外のＰＣＲ条件および使用したプライマーは、実施例１に記載したとおりである。
【００２７】
ＰＣＲ反応後、１５μｌを３％　Ａｇａｒｏｓｅ２１　（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）　ゲルに泳動した。
【００２８】
（結果および考察）
泳動結果を図４に示す。Ｉ液、ＩＩ液、ＩＩＩ液、ＩＶ液およびＶ液をテンプレートに用いた場合には、配列番号１と配列番号２とのプライマー組合せでは２３２ｂｐの増幅産物、配列番号１と配列番号３とのプライマー組合せでは２６８ｂｐの増幅産物、配列番号１と配列番号４とのプライマー組合せでは２９３ｂｐの増幅産物、配列番号１と配列番号５とのプライマー組合せでは３３２ｂｐの増幅産物が観察された。いわた１０号の混入割合が低くなるにつれ、バンド強度は低下したが、Ｖ液をテンプレートに用いた場合でもバンドの存在は明確に認識できた。一方、ＶＩ液をテンプレートに用いた場合には、いずれのプライマー組合せでも増幅産物は観察されなかった。
【００２９】
以上の結果から、実施例１で正常細胞質個体とＢＴ細胞質個体とを識別できることが明らかとなった４個のマーカーすべてについて、精米からの簡易抽出により調整したＤＮＡ溶液をテンプレートに用いて検定することにより、５００粒中に１粒の割合で異品種の精米が混入している場合でも、その混入を検出できることが示された。
【００３０】
（参考文献）
１．Ｋａｄｏｗａｋｉ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．ａｎｄ　Ｋａｚａｍａ，Ｓ．，（１９９０），Ａ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　５’ｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｔｐ６　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｍａｌｅ−ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｒｉｃｅ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２４：１０−１６．
２．Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，（１９８０），Ｒａｐｉｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ　ｐｌａｎｔ　ＤＮＡ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，８：４３２１−４３２５．
【００３１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＢＴ型雄性不稔細胞質を有するイネ系統に特異的なキメラ遺伝子ｕｒｆ−ｒｍｃ生成に関するモデルと、本発明で使用したプライマーの位置関係を示した概略図である。
【図２】図２は、ＣＴＡＢ法による精製イネＤＮＡを用いてのＰＣＲ増幅性試験の結果を示した図である。
【図３】図３は、簡易抽出法により抽出したイネＤＮＡを用いてのＰＣＲ増幅性試験の結果を示した図である。
【図４】図４は、本発明のプライマーによる検定感度試験の結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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