(57)【要約】【課題】　アルカリ性ホスファターゼの定量的測定法の標準として用いることができ、簡単な方法で再現可能に製造することができるアルカリ性ホスファターゼのコンジュゲートを提供すること。【解決手段】　グリコシル化されていない組織非特異的アルカリ性ホスファターゼ（tns-AP）と活性化されたデキストランとを水溶液中で反応させ、該反応を停止させ、tns-APとデキストランのコンジュゲートを該溶液から単離することにより得られることを特徴とする、tns-APとデキストランのコンジュゲート。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　グリコシル化されていない組織非特異的アルカリ性ホスファターゼ（tns-AP）と活性化されたデキストランとを水溶液中で反応させ、該反応を停止させ、tns-APとデキストランのコンジュゲートを該溶液から単離することにより得られることを特徴とする、tns-APとデキストランのコンジュゲート。
【請求項２】
　用いられるtns-APが、tns-APをコードする核酸の原核細胞での組換え発現により得られた非グリコシル化tns-APであることを特徴とする、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
　10〜500kDaの平均分子量を有するデキストランが用いられることを特徴とする、請求項１または２記載のコンジュゲート。
【請求項４】
　水溶液中でインキュベートすることにより非グリコシル化tns-APと活性化デキストランとを反応させ、該反応を停止させ、tns-APとデキストランのコンジュゲートを該溶液から単離することを特徴とする、上記コンジュゲートの製造方法。
【請求項５】
　tns-APをコードする核酸の原核細胞での組換え発現により得られた非グリコシル化tns-APを用いることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
　10〜500kDaの平均分子量を有するデキストランを用いることを特徴とする、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
　デキストランがCDAPまたはCNBrによって活性化されることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
　非グリコシル化tns-APおよび活性化デキストランを１：２から１：500の比で上記の反応に用いることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
　アルカリ性ホスファターゼの定量的測定法における標準としての、請求項１〜３のいずれか1項記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１０】
　非グリコシル化tns-APとデキストランのコンジュゲートを製造するための、非グリコシル化tns-APの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、組織非特異的アルカリ性ホスファターゼとデキストランのコンジュゲート、上記コンジュゲートの製造方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
　アルカリ性ホスファターゼ（AP, EC 3.1.3.1）は、無機リン酸の放出を伴うリン酸モノエステルの加水分解をアルカリ性条件下で触媒する、遍在性の二量体金属酵素のファミリーに属する（McCombら、(1979), 「アルカリ性ホスファターゼ」（Alkaline Phosphatases）, Plenum Press, New York）。ヒトでは４種類のイソ酵素、すなわち、i) 胎盤特異的AP、ii) 生殖細胞特異的（胎盤性）AP、iii) 腸APおよびiv) 組織非特異的AP (tns-AP)が識別されている（Harris, H., Clin. Chim. Acta 186 (1990) 133-150）。tns-APの生産は、肝臓(LAP)、腎臓(KAP)および骨(BAP)において最大であり（Moss, D. W., Clin. Chem. 38 (1992) 2486-2492）、また、血清中に最も多く見られるAPイソ型である（Mulivor, R. A. ら、J. Lab. Clin. Med. 105 (1985) 342-348）。LAP、KAPおよびBAPの間の差異は、翻訳後の異なるO-グリコシル化パターンに起因し（Miura, M.ら、Ann. Clin. Biochem. 31 (1994) 25-30）、これはまた異なる特異的活性の原因ともなっているが（Nosjean, O.,ら、Biochem. J. 321 (1997) 297-303）、これらのアミノ酸配列は本質的に同一である（Weiss, M. J.ら、J. Biol. Chem. 263 (1988) 12002-12010）。さらに、Nosjeanらは、tns-APのN-グリコシル化がその酵素活性に必須であることを示した。したがって、組織非特異的APは異なるグリコシル化APの混合物である。
【０００３】
　ヒトtns-APの遺伝子は、1986年に既にクローン化されている（Weiss, M. J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1986) 7182-7186）。これは、17アミノ酸長のN-末端シグナル配列およびC-末端GPIアンカー配列を有する524アミノ酸からなるタンパク質をコードしており、このタンパク質はin vivoにおいて上記C-末端GPIアンカー配列により原形質膜の外側に固定されている（Hooper, N. M., Clin. Chim. Acta 266 (1997) 3-12）。ヒトtns-APのDNA配列はずっと以前から知られていたが、生物学的に活性な組換え酵素の発現については、COS-1（Fukushi, M.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 246 (1998) 613-618）、またはバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞（Oda, K.ら、J. Biochem. (Tokyo) 126 (1999) 694-699）のような真核細胞における例が以前に報告されているのみである。
【０００４】
　大腸菌（Escherichia coli）のような原核生物におけるタンパク質の異種発現は、安全で費用効率の高い組換えタンパク質の製造にしばしば用いられる技術である。原核生物での真核生物タンパク質の発現は２つの特徴を有する。すなわち、i) 大腸菌のような原核生物は、真核生物に典型的なグリコシル化のような、いくつかの翻訳後修飾をおこなわない点、およびii) 原核生物で発現された真核生物タンパク質はしばしば溶解性に乏しく生物学的に不活性なタンパク質凝集体（封入体、IB）の形で存在する点である（Makrides, S. C., Microbiol. Rev. 60 (1996) 512-538; Balbas, P., Mol. Biotechnol. 19 (2001) 251-267）。後者は公知の方法により酵素的に活性な形に戻すことができる（Lilie, H.ら、Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1998) 497-501）。この目的で、まず尿素のようなカオトロピック剤を加えることによりIBを溶解し、カオトロピック剤を含まない緩衝液に対して透析するかまたはその緩衝液で希釈することによって再生する。胎盤特異的アルカリ性ホスファターゼを再生する方法は先行技術に記載されている（米国特許第5,434,067号）。
【０００５】
　アルカリ性ホスファターゼの生理学的役割は大部分が未知であるが、その酵素活性の定量は臨床的な診断において日常的におこなわれている分析の１つである。血清中のAP活性の変化は、多くの臨床状態、たとえば、低ホスファターゼ血症および高ホスファターゼ症（Silve, C., Curr. Opin. Rheumatol. 6 (1994) 336-339）、肝臓、胆管の疾病および敗血症（Maldonado, O.ら、J. Clin. Gastroenterol. 27 (1998) 342-345; Wiwanitkit, V., BMC Fam. Pract. 2 (2001) 2）、また、骨の疾病（Romagnoli, E.ら、Clin, Chem. Lab. Med. 36 (1998) 163-168）の診断マーカーである。血清はさまざまな形のAPの不均一な混合物を含んでいる。上述したように、血清中のそれぞれの形のAPの比は個々の患者の病気のタイプおよび重症度により変化するので、一緒になってtns-APを形成するLAP、KAPおよびBAPの比もまた患者によって様々である。
【０００６】
　このような理由から、適当な対照標準および基準となるサンプルを提供することは困難である。正常なAP値および増大したAP値を有する患者から採取した血清を集めた血清プールが通常用いられるが、正常なLAPまたはBAPの標品もまた用いられる。ヒト血清または血漿中のアルカリ性ホスファターゼの定量に用いられる標準サンプルはまた、ウシやブタのような動物に由来する場合、またはヒト細胞系もしくはヒト胎盤に由来する場合もある。これはさまざまな不都合を伴う。すなわち、動物またはヒト組織からの酵素の単離は感染（HIV、BSE）の高い危険性を伴い、また、技術的に非常に煩雑である。代替方法がないために、国際臨床化学および実験医学連盟（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine）(IFCC)は、目下のところ、標準酵素としてブタ腎臓から単離したtns-APの使用を推奨している（Tietz, N. W.ら、J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21 (1983) 731-748）。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5, 434, 067号
【非特許文献１】Andersson, Aら、Int. J. Cancer 47 (1991) 439-444
【非特許文献２】Balbas, P., Mol. Biotechnol. 19 (2001) 251-267
【非特許文献３】Bradford, M. M., Analytical Biochemistry 72 (1976) 248-254
【非特許文献４】Bretaudiere & Spillmann, ((1984) 「酵素分析の方法」(Methods of Enzymatic Analysis), VCH, 75-82)
【非特許文献５】Fukushi, M.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 246 (1998) 613-618
【非特許文献６】Harris, J., Clin. Chim. Acta 186 (1990) 133-150
【非特許文献７】Holmberg, A.およびMeurling, L., Bioconjug. Chem.. 4 (1993) 570-573
【非特許文献８】Hooper, N. M., Clin. Chim. Acta 266 (1997) 3-12
【非特許文献９】Lilie, H.ら、Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1998) 497-501Lovqvist, A.ら、Cancer Biother. 8 (1993) 345-356
【非特許文献１０】Makrides, S. C., Microbiol. Rev. 60 (1996) 512-538
【非特許文献１１】Maldonado, O.ら、J. Clin. Gastroenterol. 27 (1998) 342-345
【非特許文献１２】McCombら、(1979) 「アルカリ性ホスファターゼ」（Alkaline Phosphatases）PlenumPress, New York
【非特許文献１３】Miura, M.ら、Ann. Clin. Biochem. 31(1994) 25-30
【非特許文献１４】Moss, D. W., Clin. Chem. 38 (1992) 2486-2492
【非特許文献１５】Mulivor, R. A.ら、J. Lab. Clin. Med. 105 (1985) 342-348
【非特許文献１６】Nosjean, O.ら、Biochem. J. 321 (1997) 297-303
【非特許文献１７】Oda, K.ら、J. Biochem. (Tokyo) 126 (1999) 694-699
【非特許文献１８】Olsson, P.ら、Int. J. Cancer 56 (1994) 529-537
【非特許文献１９】Reddy, S.ら、Biochemistry 34 (1995) 10872-10878)
【非特許文献２０】Romagnoli, E.ら、Clin. Chem. Lab. Med. 36 (1998) 163-168
【非特許文献２１】Sambrook, J.ら、「分子クローニング：実験室マニュアル」（“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”）J.Sambrook, E. F. FritschおよびT. Maniatis編、Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY
【非特許文献２２】Silve, C., Curr. Opin. Rheumatol. 6 (1994) 336-339
【非特許文献２３】Singh, R.ら、Diabetologia 44 (2001) 129-146
【非特許文献２４】Sjostrom, A.ら、Int. J. Cancer 70 (1997)383-389
【非特許文献２５】Thornalley, P. J.ら、Biochem. J. 344 (1999) 109-116
【非特許文献２６】Tietz, N. W.ら、J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21 (1983) 731-748
【非特許文献２７】Weiss, M. J.ら、J. Biol. Chem. 263 (1988) 12002-12010
【非特許文献２８】Weiss, M. J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7182-7186
【非特許文献２９】Wiwanitkit, V., BMC Fam. Pract. 2 (2001) 2
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
　本発明の目的は、臨床的な診断の対照標準として用いることができ、簡単な方法で再現可能に製造することができるアルカリ性ホスファターゼのコンジュゲートを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
　本発明は、組織非特異的アルカリ性ホスファターゼ(tns-AP)とデキストランのコンジュゲートに関し、上記コンジュゲートは、非グリコシル化tns-APと活性化デキストランとを水溶液中で反応させ、該反応を停止させて、該コンジュゲートを溶液から分離することにより得られる。
【発明の効果】
【００１０】
　驚くべきことに、本発明のコンジュゲートは酵素的に活性であって、tns-APの特性を有しており、そのため、AP試験の標準品として特に適していることが見出された。さらに、IFCC（Tietzら、前掲）により推奨される試薬中で測定された本発明のコンジュゲートのAP活性は、緩衝液の濃度にあまり左右されない。
【００１１】
IFCC試薬および反応条件
2004049240.tif 000002
【００１２】
　驚くべきことに、IFCC試験において0.35〜0.90mol/lの範囲の緩衝液で、本発明の標準に対して同じ活性が測定された。他の特性に関しては、本発明の標準はIFCC試験において対照の血清と同様に挙動する。これとは対照的に、比較実験によれば、非グリコシル化tns-APとグルコースのコンジュゲート（グルコシル化tns-AP）は標準として適当ではないことが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
　組織非特異的アルカリ性ホスファターゼ（tns-AP）は、本発明によれば、ヒト肝臓、骨または腎臓からグリコシル化された形で単離することができるアルカリ性ホスファターゼ（EC 3.1.3.1）であると理解される。tns-APのヌクレオチド配列は、上記のWeissらの文献（1986）に記載されている。上記のNosjeanらの文献によれば、肝臓、骨および腎臓由来のtns-APは、これらのグリコシル化に関して差異があるのみで、これらのアミノ酸配列に関しては差異がない。
【００１４】
　好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートを製造するために用いられるtns-APは、tns-APをコードする核酸を原核細胞（好ましくは大腸菌）において組換えにより発現させ、必要に応じてその後再生することにより得ることができる非グリコシル化tns-APである。このような原核生物で組換えタンパク質を生産する方法は、先行技術により公知である（Lilieら、前掲）。
【００１５】
　また、10〜500kDaの平均分子量を有するデキストランをコンジュゲートに使用することが好ましい。しかしながら、使用するデキストランの分子量は本発明のコンジュゲートの特性に対してごくわずかな影響しか与えないことが明らかになった。デキストランは公知の方法によりtns-APとカップリングさせることができる。このために、まず、好ましくはデキストランの過ヨウ素酸酸化、CNBrによるシアニル化(cyanylation)、またはCDAP（1-シアノ-ジメチルアミノピリジニウム テトラフルオロボレート）による活性化により、デキストランを活性化する。次いで、好ましくは室温でインキュベートすることによりカップリングをおこなう（たとえば、Andersson, A.ら、Int. J. Cancer 47 (1991) 439-444; Holmberg, A.およびMeurling, L., Bioconjug. Chem. 4 (1993) 570-573; Lovqvist, A.ら、Cancer Biother. 8 (1993) 345-356; Olsson, P.ら、Int. J. Cancer 56 (1994) 529-537; Sjostrom, A.ら、Int. J. Cancer 70 (1997) 383-389参照）。この反応を好ましくはアミン試薬により停止させた後、コンジュゲートをクロマトグラフィー法のような公知の精製方法により単離することができる。この方法により、デキストランが非グリコシル化tns-APにランダムな位置で共有結合して、デキストランとtns-APのコンジュゲートの不均一な混合物が得られる。本発明のコンジュゲートの適合性は、製造に際して、温度、活性化試薬、活性化試薬とデキストランの比、非グリコシル化tns-APと活性化デキストランの比、デキストランの平均分子量、インキュベーション時間および反応停止試薬に関して、再現性のある条件が守られることにより確実になる。しかしながら、本発明による好ましい反応条件は広い範囲で変えることができ、決定的なものではない。
【００１６】
　好ましくは、反応は室温で約１時間おこなう。好ましくは活性化試薬としてCDAPまたはCNBrを用いる。活性化試薬とデキストランの重量比は１：２から１：20とすることが好ましい。
【００１７】
　本発明のコンジュゲートを製造するために、活性化デキストランを過剰に、好ましくは1：2から1：500のモル比で、特に好ましくは１：10から１：500（非グリコシル化tns-AP対デキストラン）のモル比で用いることが好ましい。
【００１８】
　本発明のもう１つの主題は、非グリコシル化tns-APと活性化デキストランとを水溶液中でインキュベーションをおこなうことにより反応させ、この反応を停止させて、コンジュゲートを溶液から単離することによる、コンジュゲートの製造方法である。インキュベーション時間は好ましくは約１時間とする。この反応はエタノールアミンのようなアミン試薬を加えて停止させることが好ましい。
【００１９】
　好ましい実施形態においては、本発明のコンジュゲートを製造するために、tns-APをコードする核酸を原核細胞において組換えにより発現させて得られた非グリコシル化tns-APが用いられる。
【００２０】
　特に好ましくは、10〜100kDaの平均分子量を有するデキストランを使用し、このデキストランをCDAPにより活性化し、非グリコシル化tns-APおよび活性化デキストランを１：10から１：500のモル比で上記の反応に用いる。
【００２１】
　本発明の別の主題は、非グリコシル化tns-APおよびデキストランからなる本発明のコンジュゲートを製造するために、非グリコシル化tns-APを使用することである。
【００２２】
　本発明の別の主題は、アルカリ性ホスファターゼの定量的測定法における標準として、本発明のコンジュゲートを使用することである。このような方法はたとえば上記のTietzらの文献に記載されている。
【００２３】
　以下の実施例、刊行物、配列表および図面は本発明をさらに説明するものであり、その保護の範囲は特許請求の範囲から導かれる。開示した方法は、変更を加えられた後でさえも、本発明の主題を説明する例として理解されるべきである。
【実施例１】
【００２４】
ヒトtns-AP遺伝子のクローニング
　この実施例には、ヒトtns-APの遺伝子の単離およびクローニング、ならびに大腸菌での発現に適したPelBシグナル配列を有する融合遺伝子の構築について記載する。このために用いるすべてのDNA増幅およびクローニング技術は当業者に公知であり、Sambrook, J.ら、「分子クローニング：実験室マニュアル」（“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”）(1989), J. Sambrook, E. F. FritschおよびT. Maniatis編、Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NYに記載されている。
【００２５】
　まず、ヒトtns-APの完全な遺伝子配列および直接隣接する5’および3’領域を、オリゴヌクレオチドプライマーapNup（配列番号１）およびapCdw（配列番号２）を用いて、いわゆるポリメラーゼ連鎖反応（配列番号３および４、図１）によりヒト肝臓cDNAバンクから単離した。次いで、PCR産物を制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびBamHIで消化して、同じ酵素で切断した発現ベクターに連結させた。得られたプラスミドを図２に示す（pBKShuap11）。
【００２６】
　次に、発現に用いられる融合遺伝子を以下の３段階により構築した。すなわち、
　[I] tns-AP遺伝子をコードする領域の一部（配列番号３の位置102−503）にPelBシグナル配列をコードする領域を融合する遺伝子合成により、合成遺伝子を構築した。この合成は、20bpずつオーバーラップする８つのオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５〜12）を用いた３段階のPCR反応により実施した。この第１段階では、プライマー対uppel/dwpel（断片１）、apn1_up/apn1_dw（断片２）、apn2_up/apn2_dw（断片３）およびapn3_up/apn3_dw（断片４）の遺伝子セグメントを調製した。第２段階では、プライマーとしてオリゴヌクレオチドuppelおよびapn1_dwを、鋳型として断片１および２を用いて断片５を合成し、また、プライマーとしてオリゴヌクレオチドapn2_upおよびapn3_dwを、鋳型として断片３および４を用いて断片６を調製した。第３段階では、プライマーとしてオリゴヌクレオチドuppelおよびapn3-dwを、鋳型として断片5および6を用いて最終合成遺伝子pelB-AP_N（配列番号13、図３）を合成した。上記合成の３つの段階のそれぞれにおいて、同一の量のプライマーおよび断片を合成に用いた。
【００２７】
　[II] プライマーとしてオリゴヌクレオチドmhuapQEup（配列番号14）およびmhuapQEdw（配列番号15）を、鋳型として図２のプラスミドを用いてポリメラーゼ連鎖反応によりhtns-AP遺伝子の部分（配列番号３のbp102-1561）を増幅した。オリゴヌクレオチドmhuapQEdwは、htns-APの最後の20アミノ酸をコードする配列を除去し、そして配列AGATCTTAGTAAGGATCCAGAT（配列番号18）をこの遺伝子の3’末端に付加する。
【００２８】
　[III] 合成遺伝子pelB-AP_Nを制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびBstEIIで消化し、段階[II]からの遺伝子セグメントを制限エンドヌクレアーゼBstEIIおよびBamHIで消化し、そして制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびBamHIで消化しておいたプラスミドpQE60（Qiagen, Hilden, ドイツ）と連結させた。この連結反応には等量のDNA断片を使用した。得られた融合遺伝子または融合タンパク質はpelB-tns-AP-deltaGPI（配列番号16および17）と名づけられた。得られた発現プラスミドにおいてはpelB-tns-AP融合タンパク質の発現がIPTG誘導性T5プロモーターの制御下にあり、この発現プラスミドはpQEpelBAP（図４）と名づけられた。
【実施例２】
【００２９】
pelB-tns-AP遺伝子の大腸菌での発現
　大腸菌K12株を実施例１から得られた発現プラスミドpQEpelBAPにより形質転換し、得られた菌株をアンピシリン含有LB培地中で培養した。対数増殖期の中期にIPTGを加えた後、pelB-tns-AP融合タンパク質が発現された。適当な発現期（3〜12時間）の後に遠心分離により細胞を回収する。
【実施例３】
【００３０】
封入体(IB)の単離、可溶化および再生
　緩衝液１：　10mM Tris-HCl、pH8.0
　緩衝液２：　8M尿素、10mM DTT、100mM Tris-HCl、pH8.0
　緩衝液３：　200mM Tris-HCl、40mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、9mM GSH、4mM GSSG、
　　　　　　　40% (w/v) グリセロール、pH8.0
（DDT：ジチオトレイトール、GSH：還元型グルタチオン、GSSG：酸化型グルタチオン）
【００３１】
　IBの単離：
　tns-AP融合タンパク質は細胞内で次の２つの形態で形成される。すなわち、i) 小割合（＞５％）は、可溶性の、生物学的に活性な酵素として存在し、その活性はBretaudiere & Spillmann (1984)「酵素分析法」(Methods of Enzymatic Analysis), VCH, 75-82) に記載される方法により測定可能である；ii) 主割合は酵素的に不活性なIBの形態で生産される。これらのIBは、単離した後に、タンパク質の可溶化、再生、精製および修飾をおこなう必要がある。このために、細胞を緩衝液１中に取り、高圧分散により溶菌する。その後、数回の遠心分離および洗浄ステップ（緩衝液１中でおこなう）によりIBを単離する。
【００３２】
　可溶化：
　25mg/mlのIB（湿った状態での重さ）を含有する緩衝液２中で、室温で２時間連続して撹拌することによりIBを可溶化した。次に、可溶化されていないタンパク質を遠心分離により除去して透明な可溶化物を得る。
【００３３】
　再生：
　タンパク質を緩衝液３の中で再生させる。このために、9.6μg/mlの最終濃度を有する透明な可溶化物（Bradford, M. M., Analytical Biochemistry 72 (1976) 248-245に従ってタンパク質を定量した）を、絶えず撹拌しながら緩衝液３の中に滴下する。このプロセス（パルシング）を、24時間間隔で12回繰り返す。再生混合物における酵素活性を、基質としてリン酸p-ニトロフェニルを用いてBretaudiere & Spillmann ((1984) 「酵素分析法」（Methods of Enzymatic Analysis）、VCH, 75-82) の方法に従って、それぞれの場合に透明な可溶化物を加えた24時間後に測定する。典型的な再生反応の結果を図５に示す。不溶性のタンパク質凝集体を除去するために、最後に透明な可溶化物を加えた24時間後に再生混合物を遠心分離すると、それ以後は、活性のあるtns-APが上清に存在する。
【実施例４】
【００３４】
pelB-tns-AP融合タンパク質の精製およびデキストラン化
　緩衝液４：　20mM Tris-HCl、pH8.0
　　　　　　　2mM MgCl2
　　　　　　　0.1mM ZnCl2
　　　　　　　100mM NaCl
【００３５】
　まず、活性tns-APを含む実施例３からの上清を、10kDaの排除サイズを有する再生セルロース製の限外濾過膜を用いる限外濾過により濃縮する。膜への非特異的結合によるtns-APの損失を防ぐために、最初にこれを1%ウシ血清アルブミン溶液中で24時間インキュベーションしてもよい。
【００３６】
　次に、この混合物を緩衝液４に対する流動透析により24時間透析する。透析緩衝液の伝導率を13.2mS/cmに調節し、緩衝液４の流速を20リットル/時間とする。透析の後に生成するタンパク質凝集体を遠心分離により除去する。
【００３７】
　次に、透析物を上記の限外濾過により当初の容量の約1/10にまで濃縮する。次いで、この溶液のタンパク質含有量およびtns-APの活性を上記のように測定する。この方法で前処理されたタンパク質は、次にデキストランと反応させることにより、化学的に修飾することができる。
【００３８】
　このために、1gのデキストランT-40（平均分子量40kDa）を20mlの蒸留水に溶かして4℃に冷却する。この溶液に200mgの臭化CDAPを加えた後、800μlの0.6Mトリエタノールアミン溶液を滴下する。この溶液を1M KH2PO4によりpH８に調節する（溶液５）。
【００３９】
　デキストラン化のために、1.5mgのtns-APに300μlの溶液５を加えて室温で1時間インキュベートする。次いで12.5μlの1Mエタノールアミン溶液を加えて反応を停止させ、室温で30分間再度インキュベートする。次に、緩衝液4を用いて24時間透析する。得られたデキストラン化の結果を、TSKG 5000 PWXLカラム（Tosohaas）でのゲルクロマトグラフィーにより、移動相緩衝液として200mM燐酸カリウム緩衝液pH8.0を用いてチェックする。デキストラン化の前および後のtns-APの典型的な溶出プロファイルを図６に示す。デキストラン化後のtns-APの酵素活性は、デキストラン化前の活性の約70〜90%である。
【００４０】
　同様の方法で、tns-APを40kDa、60kDa、188kDaおよび400kDaの平均分子量を有するデキストランとカップリングさせる。
【実施例５】
【００４１】
臨床活性試験によるデキストラン化tns-APの評価
　再生され、デキストラン化されたタンパク質を、国際臨床科学および実験医学連盟（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine）(IFCC) (Tietz, N. W.ら、J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21 (1983) 731-748) により発表された緩衝系のうち2つにおける方法の比較により、その標準酵素としての適性について評価する。この試験は、基質としてリン酸p-ニトロフェニルを用いて37℃で実施する。この方法の比較において、ヒト血清中のAP活性は正確にx/y図の二等分線上に位置する（横座標：350mM AMP、pH10.5における活性；縦座標：900mM AMP、pH10.44）。すなわち、血清中に存在するAP混合物は両方の緩衝系において同一の酵素特異的活性を有する。標準酵素として適しているためには理想的には同じ特性を有していなければならない。
【００４２】
　評価は、上記方法の比較による、実施例４から得られたデキストラン化tns-APの活性、ヒト血清中のAP活性、および市販の対照血清（PNU、PPU、Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、ドイツ）中のAP活性を試験することからなり、これらはRoche/Hitachiアナライザー（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, ドイツ）を用いて評価された。典型的な評価プロファイルを図７および８に示す。デキストラン化tns-APの活性プロファイルはヒト血清のそれと同一であって、x/y図の二等分線上に位置する。すなわち、両方のサンプルは両方の緩衝液中で同じ活性を有する。したがって、デキストラン化tns-APは理想的な対照酵素の必要条件を満たしている。この場合、デキストランの分子量は明らかに活性プロファイルに影響を与えない（図８参照）。これに対して、上記の対照血清中のAP活性は二等分線の下方に位置する（図７）。
【実施例６】
【００４３】
tns-APのグルコシル化
　実施例３に従ってtns-APを調製し、実施例４に従って精製した。このタンパク質を過剰な1-α-D-グルコピラノシドの存在下でインキュベートすることにより非酵素的にグルコースで誘導体化（グルコシル化）した。タンパク質の非酵素的グルコシル化は、いわゆるMaillard反応により、還元糖の存在下、タンパク質の遊離アミノ基上でおこなわれる（Reddy, S.ら、Biochemistry 34 (1995) 10872-10878; Thornalley, P. J.ら、Biochem. J. 344 (1999) 109-116; Singh, R.ら、Diabetologia 44 (2001) 129-146）。このために、1.6および9.1μmolの組換えアルカリ性ホスファターゼを50mM HEPES緩衝液、pH8.0中に入れて、1000倍過剰の1-α-D-グルコピラノシドの存在下に4℃で24時間インキュベートする。アルカリ性ホスファターゼのグルコシル化は、その結果生じるタンパク質の分子量の増加をMALDI-TOFで検出することにより示される。実施例３に記載した方法を用いて酵素活性を測定すると、この酵素は非酵素的グルコシル化後に当初の活性の90〜98％をまだ有していることが示される。次に、この方法により調製された酵素標品を、実施例５に記載した臨床活性試験に用いて、評価する。
【００４４】
　本発明のデキストラン化されたAPは、正確に二等分線上に位置する。これに対して、デキストラン化されていないAP、グルコシル化されたAPおよび市販の対照血清に含まれるtns-APは二等分線の下方に位置する（図９）。デキストラン化されたtns-APと異なり、試験した他のすべてのAPは理想的な検定標準の必要条件を満たしていない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ヒトtns-APの制限地図を示した図である。
【図２】pBKShuap11のプラスミド地図を示した図である。
【図３】pelB-APNの制限地図を示した図である。
【図４】pQ Epel BAPのプラスミド地図を示した図である。
【図５】非グリコシル化tns-APの再生速度を示した図である。
【図６】デキストラン化tns-APの溶出プロファイルを示した図である。この図には、デキストラン化AP（40kDaのデキストラン）の溶出プロファイルが天然APと比較して示されている。
【図７】デキストラン化tns-AP（40kDaのデキストラン）の活性プロファイルを示した図である。×: 血清サンプルを用いて得られた結果；△：本発明の標準を用いて得られた結果；▽：対照血清を用いて得られた結果（PNU=Precinorm U、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim、PPU=Precipath U、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim）
【図８】血清サンプル（＝ヒト血清）および対照血清（PNU=Precinorm U、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim、PPU=Precipath U、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim=対照）と比較した、デキストラン化tns-AP（10kDa、40kDa、60kDa、188kDa、400kDaのデキストラン＝AP 1 10000等）の活性プロファイルを示した図である。
【図９】血清サンプル、グルコシル化tns-AP、対照血清（PNU、PPU）および非修飾非グリコシル化tns-AP（天然AP）と比較した、デキストラン化tns-AP（40kDa）の活性プロファイルを示した図である。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号１：人工配列の説明：プライマー apNup
配列番号２：人工配列の説明：プライマー apCdw
配列番号３：ヒトtns-AP、PCR産物
配列番号４：ヒトtns-AP、タンパク質
配列番号５：人工配列の説明：プライマー APN1 up
配列番号６：人工配列の説明：プライマー APN2 up
配列番号７：人工配列の説明：プライマー APN3 up
配列番号８：人工配列の説明：プライマー APN1 dw
配列番号９：人工配列の説明：プライマー APN2 dw
配列番号１０：人工配列の説明：プライマー APN3 dw
配列番号１１：人工配列の説明：プライマー uppel
配列番号１２：人工配列の説明：プライマー dwpel
配列番号１３：人工配列の説明：プライマー pelB-AP N
配列番号１４：人工配列の説明：プライマー mhuapQEup
配列番号１５：人工配列の説明：プライマー mhuapQEdw
配列番号１６：人工配列の説明：融合遺伝子 pelB-tns-AP-deltaGPI
配列番号１７：人工配列の説明：タンパク質 pelB-tns-AP-deltaGPI
配列番号１８：人工配列の説明：オリゴヌクレオチド
【図１】
2004049240.tif 000003
【図２】
2004049240.tif 000004
【図３】
2004049240.tif 000005
【図４】
2004049240.tif 000006
【図５】
2004049240.tif 000007
【図６】
2004049240.tif 000008
【図７】
2004049240.tif 000009
【図８】
2004049240.tif 000010
【図９】
2004049240.tif 000011
【配列表】
2004049240000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月18日(2003.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　グリコシル化されていない組織非特異的アルカリ性ホスファターゼ（tns-AP）と活性化されたデキストランとを水溶液中で反応させ、該反応を停止させ、tns-APとデキストランのコンジュゲートを該溶液から単離することにより得られることを特徴とする、tns-APとデキストランのコンジュゲート。
【請求項２】
　用いられるtns-APが、tns-APをコードする核酸の原核細胞での組換え発現により得られた非グリコシル化tns-APであることを特徴とする、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項３】
　水溶液中でインキュベートすることにより非グリコシル化tns-APと活性化デキストランとを反応させ、該反応を停止させ、tns-APとデキストランのコンジュゲートを該溶液から単離することを特徴とする、上記コンジュゲートの製造方法。
【請求項４】
　10〜500kDaの平均分子量を有するデキストランを用いることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
　非グリコシル化tns-APおよび活性化デキストランを１：２から１：500の比で上記の反応に用いることを特徴とする、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
　アルカリ性ホスファターゼの定量的測定法における標準としての、請求項１または２記載のコンジュゲートの使用。
【請求項７】
　非グリコシル化tns-APとデキストランのコンジュゲートを製造するための、非グリコシル化tns-APの使用。