(57)【要約】【課題】  種々の使用のために信頼性または十分な量であるＡＮＴを産生すること。ＡＮＴ融合タンパク質を含むＡＮＴタンパク質の産生を可能にする組成物および方法；新規なＡＮＴリガンド；ＡＮＴタンパク質を同定し、そして単離する方法；ならびにＡＮＴと相互作用する薬剤を同定し、そして単離すること。【解決手段】  第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物であって、該第１の核酸配列が動物のアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードし、ここで、該アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、該第２の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される、発現構築物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物であって、該第１の核酸配列が動物のアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードし、ここで、該アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、該第２の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される、発現構築物。
【請求項２】
前記第２の核酸配列のポリペプチド産物が酵素である、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項３】
前記融合タンパク質が膜に局在化する、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項４】
前記膜がミトコンドリア膜である、請求項３に記載の発現構築物。
【請求項５】
転写を調節する少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項６】
前記転写を調節するさらなる核酸配列が、前記プロモーターのリプレッサーをコードする、請求項５に記載の発現構築物。
【請求項７】
前記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含む、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項８】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ１である、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項９】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ２である、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項１０】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ３である、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項１１】
前記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、プロテアーゼにより切断可能なポリペプチドをコードする第２の核酸配列の少なくとも１つの産物との融合タンパク質として発現され、該アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、該プロテアーゼを用いる切断により該融合タンパク質から分離可能である、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組換え発現構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記真核生物細胞が、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターの少なくとも１つのアイソフォームを欠く、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターアイソフォームをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現が実質的に損傷している、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記発現構築物が、組換えウイルス発現構築物である、請求項１または請求項１のいずれかに記載の、組換え発現構築物。
【請求項２０】
組換えアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを生成する方法であって：
第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物を含む宿主細胞を培養する工程であって、該第１の核酸配列が動物のアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードし、ここで該アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、該第２の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される工程を包含する、方法。
【請求項２１】
組換えアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを生成する方法であって：
請求項１９に記載の組換えウイルス発現構築物で感染された宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２０から２１のいずれかに記載の方法により生成される、ＡＮＴポリペプチド。
【請求項２３】
単離されたヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチド。
【請求項２４】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、組換えＡＮＴ１またはその改変体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、組換えＡＮＴ２またはその改変体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、組換えＡＮＴ３またはその改変体またはそのフラグメントである、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合したアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含む、単離されたヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質。
【請求項２８】
前記１つのさらなるポリペプチド配列が、酵素配列またはその改変体またはそのフラグメントである、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
前記融合タンパク質が膜に局在化する、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
前記膜がミトコンドリア膜である、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
プロテアーゼにより切断可能な少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合したアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含み、該アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、該プロテアーゼを用いた切断により該融合タンパク質から分離可能である、単離されたヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質。
【請求項３２】
少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合した動物のアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドである、第１のポリペプチドを含む、単離されたアデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質。
【請求項３３】
前記１つのさらなるポリペプチド配列が、酵素配列またはその改変体またはそのフラグメントである、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
膜に局在化する、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記膜がミトコンドリア膜である、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
プロテアーゼにより切断可能な少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合したアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含み、該アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、該プロテアーゼを用いた切断により該融合タンパク質から分離可能である、単離された組換え動物アデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質。
【請求項３７】
前記さらなるポリペプチド配列が、リガンドに対する親和性を有するポリペプチドである、請求項２７または請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
生物学的試料中のＡＮＴポリペプチドの存在を決定する方法であって：
ＡＮＴポリペプチドを含むと疑われる生物学的試料を、ＡＮＴリガンドと、該ＡＮＴリガンドのＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にするに十分な条件下および時間の間接触させる工程；および
該ＡＮＴリガンドのＡＮＴポリペプチドへの結合を検出し、そしてそこから、該生物学的試料におけるＡＮＴポリペプチドの存在を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ１である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ２である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ３である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＡＮＴリガンドが、６’ヒドロキシルで置換されたアトラクチロシドを含み、アトラクチロシド誘導体を形成する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記アトラクチロシドが、６’ヒドロキシルで検出可能に置換され、検出可能なアトラクチロシド誘導体を形成する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、放射標識置換基を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記放射標識置換基が、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃおよび35Ｓからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、蛍光置換基を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＡＮＴリガンドが、前記アトラクチロシド誘導体に複合体化したＥｕ3+原子をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、共有結合したビオチンを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記アトラクチロシド分子が、６’ヒドロキシルにおいてアミンまたはアミン含有官能基で置換され、アミン改変アトラクチロシド誘導体を形成する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記アトラクチロシド分子が、６’ヒドロキシルで置換され、カルボキシアトラクチロシド誘導体であるアトラクチロシド誘導体を形成するカルボキシアトラクチロシド分子である、請求項４３から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
生物学的試料からＡＮＴを単離する方法であって：
ＡＮＴポリペプチドを含むと疑われる生物学的試料を、ＡＮＴリガンドと、該ＡＮＴリガンドのＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にするに十分な条件下および時間の間接触させる工程；および
該ＡＮＴポリペプチドを回収し、そしてそれによって生物学的試料からＡＮＴを単離する工程
を包含する、方法。
【請求項５３】
前記ＡＮＴリガンドが、固相に共有結合している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＡＮＴリガンドが、固相に非共有結合している、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を同定する方法であって：
候補薬剤を、少なくとも１つの組換えＡＮＴポリペプチドを発現する宿主細胞と、該薬剤の該組換えＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にするに十分な条件下および時間の間接触させる工程；および
該薬剤の該組換えＡＮＴへの結合を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項５６】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記原核生物細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項５６に記載の方法。
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記真核生物細胞が、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記宿主細胞が、内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターの少なくとも１つのアイソフォームを欠く、請求項５５から８０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターアイソフォームをコードする少なくとも１つの遺伝子の宿主細胞発現が実質的に損傷している、請求項５５から８０のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
ＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を同定する方法であって：
候補薬剤を、少なくとも１つの組換えＡＮＴポリペプチドを含む生物学的試料と、該薬剤の該ＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にするに十分な条件下および時間の間接触させる工程；および
該薬剤の該ＡＮＴポリペプチドへの結合を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項６４】
ＡＮＴポリペプチドと相互作用する薬剤を同定する方法であって：
組換えＡＮＴを含む生物学的試料を、候補薬剤の存在下で、検出可能なＡＮＴリガンドと接触させる工程；および
該薬剤の非存在下における該検出可能なＡＮＴリガンドの組換えＡＮＴへの結合を、該薬剤の存在下における該検出可能なＡＮＴリガンドの組換えＡＮＴへの結合と比較し、そしてそこからＡＮＴポリペプチドと相互作用する薬剤を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項６５】
６’ヒドロキシルで置換され、アトラクチロシド誘導体を形成するアトラクチロシドを含む、ＡＮＴリガンド。
【請求項６６】
前記アトラクチロシドが、６’ヒドロキシルで検出可能に置換され、検出可能なアトラクチロシド誘導体を形成する、請求項６５に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項６７】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、放射標識置換基を含む、請求項６６に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項６８】
前記放射標識置換基が、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃおよび35Ｓからなる群から選択される、請求項６７に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項６９】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、蛍光置換基を含む、請求項６６に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７０】
前記アトラクチロシド誘導体に複合体化したＥｕ3+原子をさらに含む、請求項６９に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７１】
前記検出可能なアトラクチロシド誘導体が、共有結合したビオチンを含む、請求項６６に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７２】
前記アトラクチロシド分子が、６’ヒドロキシルにおいてアミンまたはアミン含有官能基で置換され、アミン改変アトラクチロシド誘導体を形成する、請求項６５に記載のＡＮＴ誘導体。
【請求項７３】
前記アトラクチロシド分子が、６’ヒドロキシルで置換され、カルボキシアトラクチロシド誘導体であるアトラクチロシド誘導体を形成するカルボキシアトラクチロシド分子である、請求項６５から９２のいずれかに記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７４】
以下の構造を有するＡＮＴリガンド：
【化１】
2004154139.tif 000060
またはその立体異性体またはそれらの薬学的に受容可能な塩：
ここで、
Ｒ1はヒドロキシル、ハロゲン、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ4または−ＮＨＲ4であり；
Ｒ2は水素または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5であり；
Ｒ3は−ＣＨ3または＝ＣＨ2であり；
Ｒ4は−Ｘ−アリール、−Ｘ−置換アリール、−Ｘ−アリールアルキル、−Ｘ−置換アリールアルキル、Ｘ−ヘテロアリール、または−Ｘ−ヘテロアリールアルキルであり、
ここで、Ｘは随意のアミドまたはアルキルアミドリンカー部分であり；そして
Ｒ5はアルキルである。
【請求項７５】
Ｒ1がヒドロキシルである、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７６】
Ｒ1が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ4である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７７】
Ｒ1が−ＮＨＲ4である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７８】
Ｒ2が水素である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項７９】
Ｒ2が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項８０】
Ｒ3が−ＣＨ3である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項８１】
Ｒ3が＝ＣＨ2である、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項８２】
Ｒ4が−Ｘ−アリール、−Ｘ−置換アリール、−Ｘ−アリールアルキルまたは−Ｘ−置換アリールアルキルである、請求項７４に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項８３】
Ｒ5が−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2である、請求項７５に記載のＡＮＴリガンド。
【請求項８４】
少なくとも１つのＡＮＴポリペプチドに結合する候補薬剤の高スループットスクリーニングのためのアッセイプレートであって：
複数のウェルを有するアッセイプレートであって、該ウェルの各々が、少なくとも１つの固定化組換えＡＮＴポリペプチドまたはその改変体またはそのフラグメントをさらに含むアッセイプレートを備える、アッセイプレート。
【請求項８５】
請求項６５に記載のＡＮＴリガンドを含む、薬学的組成物。
【請求項８６】
請求項７４に記載のＡＮＴリガンドを含む、薬学的組成物。
【請求項８７】
請求項５５に従って同定されるＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を含む、薬学的組成物。
【請求項８８】
請求項６３に従って同定されるＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を含む、薬学的組成物。
【請求項８９】
請求項６４に従って同定されるＡＮＴポリペプチドと相互作用する薬剤を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、真核生物細胞のミトコンドリア中に見出されるアデニンヌクレオチドトランスロケータータンパク質に関する。より詳細には、本発明は、組換えＤＮＡ技術を使用する、ＡＮＴポリペプチドおよびＡＮＴ融合タンパク質の産生：ＡＮＴタンパク質に対する新規な標識リガンド；ならびにＡＮＴタンパク質を同定し、そして単離するため、ならびに高スループットスクリーニングを含む、ＡＮＴと相互作用する化合物をスクリーニングするために有用であるアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ミトコンドリアは、高等生物体の細胞中での主要なエネルギー供給源であり、これらの細胞小器官は、細胞呼吸、酸化プロセスおよび代謝プロセスの広範な整列の直接的および間接的な生化学調節を提供する。これらは、酸化的リン酸化がアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）の形態で代謝エネルギを産生することを駆動し、また細胞内カルシウムホメオスタシスにおける中心的なミトコンドリアの役割の基礎をなす、電子伝達鎖（ＥＴＣ）活性を含む。
【０００３】
ミトコンドリアの超微細構造の特徴は、細胞小器官と細胞質との間の界面として働く、ミトコンドリア外膜、複数の部位で外膜に対して付着を形成するようである、高度に折り畳まれたミトコンドリア内膜、ならびに２つのミトコンドリア膜の間の膜間間隙を明らかにする。このミトコンドリア内膜内のサブコンパートメントは、一般にミトコンドリアマトリックスと呼ばれる。（総説については、例えば、Ｅｒｎｓｔｅｒら、１９８１  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９１：２２７を参照のこと）。本来、ミトコンドリア内膜の折り込みとして生じると推定されるクリスタは、最近、三次元電子断層撮影法を使用して、網様構造を形成し得、そして開口、環状（直径３０ｎｍ）接合により内膜に結合され得る、管様の導管もまた含むと特徴付けられた（Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１９：２６０）。外膜は、約１０ｋＤａ未満の分子量を有するイオン性溶質および非イオン性溶質に対し自由に透過可能であるが、ミトコンドリア内膜は、特定のカチオンを含む多数の低分子に選択的および調節された透過性を示し、そして高分子（＞約１０ｋＤａ）に対し非透過性である。
【０００４】
ＥＴＣの任意の段階での不全を含むがこれらに限定されない、変化したかまたは欠損したミトコンドリア活性は、「透過性遷移」（ＰＴ）または「ミトコンドリア透過性遷移」（ＭＰＴ）と呼ばれている破局的なミトコンドリア崩壊を生じ得る。ミトコンドリア機能の一般に受け入れられる理論に従うと、適切なＥＴＣ呼吸活性は、共役した化学浸透機構によりミトコンドリア内膜における電気化学的ポテンシャル（ΔΨｍ）の維持を必要とする。変化したかまたは欠損したミトコンドリア活性は、この膜電位を分散し得、それによって、ＡＴＰ生合成を妨害し、そして生命の維持に重要な生化学的エネルギー供給源の産生を停止する。さらにシトクロムｃのようなミトコンドリアタンパク質は、透過性遷移後に、ミトコンドリアから漏出し得、そしてアポトーシスまたはプログラムされた細胞死（ＰＣＤ）として公知である遺伝的にプログラムされた細胞自殺の連鎖を誘導し得る。
【０００５】
ＭＰＴは、ミトコンドリア遺伝子、遺伝子産物もしくは関連する下流のメディエーター分子、および／またはミトコンドリア以外の遺伝子、遺伝子産物もしくは関連する下流のメディエーター、あるいは他の公知または未知の原因の直接的または間接的な効果から生じ得る。従って、ミトコンドリア電位の損失は、変性疾患を含む変化したミトコンドリア機能と関連する疾患の進行において重要な現象であり得る。
【０００６】
ミトコンドリアＤＮＡ中に存在する、分散したミトコンドリアゲノムおよび／またはミトコンドリア以外のゲノム（核染色体ＤＮＡおよび他のミトコンドリア以外のＤＮＡを含む）に関する欠損を含み得るミトコンドリア欠損は、変化したミトコンドリア機能と関連する疾患の病因に有意に寄与し得る。例えば、遺伝的因子および／または環境的因子に由来する変化、あるいは細胞の代償性機構に由来する変化を含む、ミトコンドリアＤＮＡおよびミトコンドリア以外のＤＮＡにより直接的または間接的にコードされるサブユニットから構成される、ミトコンドリア成分の構造的および／または機能的性質における変化は、変化したミトコンドリア機能と関連する任意の疾患の病因において役割を果たし得る。多数の変性疾患は、ミトコンドリア機能の変化によって生じるか、またはこの変化と関連すると考えられる。これらは、アルツハイマー病（ＡＤ）；糖尿病；パーキンソン病；ハンチントン病；失調症；レーバー遺伝性視神経萎縮；精神分裂病；ミトコンドリア性脳障害、乳酸アシドーシス、および発作（ＭＥＬＡＳ）；癌；乾癬；過増殖性障害；ミトコンドリア性糖尿病および難聴（ＭＩＤＤ）ならびにミオクローヌスてんかん不整赤筋線維症候群（ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ  ｅｉｌｅｐｓｙ
ｒａｇｇｅｄ  ｒｅｄ  ｆｉｂｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を含む。変化したミトコンドリア機能と関連したさらなる疾患の広範な列挙は、拡大しつづける。なぜなら、異常なミトコンドリアまたはＭｉｔｏｎｕｃｌｅａｒ活性が特定の疾患プロセスに関与するからである。
【０００７】
ＡＤおよび変化したミトコンドリア機能と関連した潜在的に他の疾患の顕著な病因は、増えつつある一連の証拠によれば、アポトーシス（「プログラムされた細胞死」またはＰＣＤとしても呼ばれる）から生じる、特定の影響された組織中の選択された細胞集団死である。ミトコンドリア機能障害は、種々の細胞型でアポトーシスを導く現象のカスケードにおいて重要であると考えられ（Ｋｒｏｅｍｃｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１２７７〜８７、１９９５）、そしてＡＤ脳のニューロンにおけるアポトーシス性細胞死の原因であり得る。変化したミトコンドリアの生理学は、ＰＣＤの最も初期の現象内であり得（Ｚａｍｚａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：３６７〜７７、１９９５；Ｚａｍｚａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１６６１〜７２、１９９５）、そしてこのような変化したミトコンドリア機能から生じる反応性酸素種（ＲＯＳ）レベルの上昇は、アポトーシスカスケードを開始し得る（Ａｕｓｓｅｒｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５０３２〜４２、１９９４）。
【０００８】
従って、増殖する細胞中のエネルギー産生におけるそれらの役割に加えて、ミトコンドリア（または、少なくともミトコンドリア成分）は、アポトーシスに関与する（Ｎｅｗｍｅｙｅｒら、１９９４、Ｃｅｌｌ  ７９：３５３〜３６４；Ｌｉｕら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８６：１４７〜１５７）。アポトーシスはまた、特に、神経系の正常な発達および免疫系の適切な機能に明らかに必要とされる。さらに、いくつかの疾患状態は、アポトーシスの不十分なレベル（例えば、癌、自己免疫疾患）または過剰レベル（例えば、発作損傷、ＡＤ関連神経変性）のいずれかと関連すると考えられる。アポトーシス、およびその疾患状態でのミトコンドリアの役割の一般的な総説については、ＧｒｅｅｎおよびＲｅｅｄ（１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９〜１３１２）、Ｇｒｅｅｎ（１９９８、Ｃｅｌｌ  ９４：６９５〜６９８）ならびにＫｒｏｍｅｒ（１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：６１４〜６２０）を参照のこと。従って、ミトコンドリア成分と関連する薬剤を含む、アポトーシス現象をもたらす薬剤は、種々の緩和的、予防的および治療的用途を有し得る。
【０００９】
ミトコンドリア内膜の主要な成分である核コードポリペプチド、アデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）は、ミトコンドリア内膜を横切ってＡＤＰおよびＡＴＰの輸送を媒介する原因である。例えば、ＡＮＴは、ミトコンドリア内膜を横切る化学量論的なＡＴＰ／プロトン交換を媒介すると考えられ、そしてＡＮＴインヒビター（例えば、アトラクチロシドまたはボンクレキン酸）は、特定の条件下でＭＰＴを誘導する。３つのヒトＡＮＴアイソフォームは、それらの組織発現パターンが異なると記載されており、そして他の哺乳動物ＡＮＴホモログが記載されている。（例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、１９９８，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ＆Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｂｅａｌ、Ｈｏｗｅｌｌ、およびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ、編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２８３〜３０７頁、ならびにそこで引用される参考文献）。ＡＮＴはまた、ミトコンドリア透過性遷移孔、すなわちＣａ2+調節性内膜チャネルの重要な分子成分と関与しており、これは、本明細書中で上記のように、アポトーシス性プロセスにおいて重要な調節役割を果たす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ミトコンドリア内膜タンパク質が複数の疎水性膜架橋ドメインを有すると考えられるように、ＡＮＴポリペプチドは、特に、乏しい細胞内可溶性、毒性蓄積および／または封入体の形成ならびにＡＮＴ生物学的活性のために宿主細胞内の呼吸ホメオスタシスに対する他の有害な効果を示し得る。結果として、当業者は、これまで、本明細書中で提供されるＡＮＴのように、種々の使用のために信頼性または十分な量であるＡＮＴを産生し得なかった。呼吸プロセス、代謝プロセスおよびアポトーシスプロセスに対するミトコンドリアの重要性のために、ならびにこれらおよび他のミトコンドリア活性におけるＡＮＴにより果たされる優れた効果を考慮して、ＡＮＴ融合タンパク質を含むＡＮＴタンパク質の産生を可能にする組成物および方法；新規なＡＮＴリガンド；ＡＮＴタンパク質を同定し、そして単離する方法；ならびにＡＮＴと相互作用する薬剤を同定し、そして単離することが明確に必要とされる。
【００１１】
本発明は、これらの必要性を満たし、そして他の関連する利点を提供する。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な記載および添付した図面の参照により明らかになる。さらに、より詳細に特定の手順または組成物（例えば、プラスミド、ベクターなど）を記載する種々の参考文献は、以下で記載され、従ってそれらの全体が参考として援用される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
その種々の局面および実施態様において、本発明は、以下に関する：
アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードする第１の核酸に作動可能に連結された少なくとも１つの調節されるプロモーターを含む組換え発現構築物であって；転写を調節する少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含み；ここで、上記転写を調節するさらなる核酸配列は、上記調節されるプロモーターのリプレッサーをコードし；ここで、上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含み；ここで、上記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、ＡＮＴ１であり；ここで、上記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、ＡＮＴ２であり；ここで、上記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、ＡＮＴ３であり；ここで、上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、第２の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現され；ここで、上記第２の核酸配列の上記ポリペプチド産物が酵素であり；ここで、上記融合タンパク質が膜に局在し；ここで、上記膜がミトコンドリア膜であり；ここで、上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、プロテアーゼにより切断可能なポリペプチドをコードする第２の核酸配列の少なくとも１つの産物との融合タンパク質として発現され、上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、プロテアーゼでの切断により融合タンパク質から分離されており；宿主細胞が提供されるような組換え発現構築物を含み；ここで、上記宿主細胞が原核生物細胞であり；ここで、上記宿主細胞が真核生物細胞であり；ここで、上記真核生物細胞は、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択され；ここで、上記昆虫細胞がＳｆ９細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞であり；内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターの少なくとも１つのアイソフォームを欠損しており；ここで、内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターアイソフォームをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現が実質的に損なわれている。
【００１３】
第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物であって、上記第１の核酸配列が動物のアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードし、ここで、上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、上記第２の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現され；ここで、上記第２の核酸配列のポリペプチド産物が酵素であり；ここで、上記融合タンパク質が膜に局在し；ここで、上記膜がミトコンドリア膜であり；転写を調節する少なくとも１つのさらなる核酸配列をさらに含み；ここで、上記転写を調節するさらなる核酸配列が上記プロモーターのリプレッサーをコードし；ここで、上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含み；ここで、ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ１であり；ここで、上記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ２であり；ここで、上記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがＡＮＴ３であり；ここで、上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが、プロテアーゼにより切断可能なポリペプチドをコードする第２の核酸配列の少なくとも１つの産物との融合タンパク質として発現され；上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドがプロテアーゼでの切断によって上記融合タンパク質から分離されており；宿主細胞は、ちょうど記載されるような組換え発現構築物を含み；ここで、上記宿主細胞が原核生物細胞であり；ここで、上記宿主細胞が真核生物細胞であり；ここで、上記真核生物細胞は、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞からなる群から選択され；ここで、上記昆虫細胞がＳｆ９細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞であり；これは、内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターの少なくとも１つのアイソフォームを欠損し；ここで、内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターアイソフォームをコードする少なくとも１つの遺伝子の発現が実質的に損なわれ；ここで、上記発現構築物が組換えウイルス発現構築物である。
【００１４】
組換えアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを産生する方法であって、アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードする第１の核酸に作動可能に連結した少なくとも１つの調節されたプロモーターを含む組換え発現構築物を含む宿主細胞を培養する工程を包含する方法；
組換えアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを産生する方法であって、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結した少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物を含む宿主細胞を培養する工程を含み、上記第１の核酸配列が、動物アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードし、ここで上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、上記第２の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される、方法；
組換えアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを産生する方法であって、上記に提供される上記組換えウイルス発現構築物に感染した宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【００１５】
すぐ上記の方法によって産生されたＡＮＴポリペプチド。
【００１６】
単離されたヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチド；ここで、ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、組換えＡＮＴ１またはその改変体もしくはフラグメントであり；ここで上記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、組換えＡＮＴ２またはその改変体もしくはフラグメントであり；ここで、上記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、組換えＡＮＴ３またはその改変体もしくはフラグメントである；
少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合したアデニントランスロケーターポリペプチドを含む単離されたヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質；ここで、上記１つのさらなるポリペプチド配列が、酵素配列またはその改変体もしくはフラグメントであり；ここで、上記融合タンパク質は、膜に局在し；ここで、上記膜はミトコンドリア膜である；
プロテアーゼによって切断可能な少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合したアデニントランスロケーターポリペプチドを含む単離されたヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質であって、上記融合タンパク質からプロテアーゼでの切断により、上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドが分離可能である、タンパク質。
【００１７】
少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合した動物アデニントランスロケーターポリペプチドである第１のポリペプチドを含む単離されたアデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質であって；ここで上記１つのさらなるポリペプチド配列が、酵素配列であるか、またはその改変体もしくはフラグメントであり；これは膜に局在し；ここで、上記膜は、ミトコンドリア膜である。
【００１８】
プロテアーゼによって切断可能である少なくとも１つのさらなるポリペプチド配列に融合したアデニントランスロケーターポリペプチドを含む単離された組換え動物アデニンヌクレオチドトランスロケーター融合タンパク質であって、上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、プロテアーゼでの切断により上記融合タンパク質から分離可能であり；ここで、上記さらなるポリペプチド配列は、リガンドに対する親和性を有するポリペプチドである。
【００１９】
生物学的サンプルにおいてＡＮＴポリペプチドの存在を決定するための方法であって、上記方法は、ＡＮＴポリペプチドを含有するであろう生物学的サンプルをＡＮＴリガンドと、上記ＡＮＴリガンドがＡＮＴポリペプチドに結合することを可能にする十分な条件および時間接触させる工程；および、上記ＡＮＴリガンドのＡＮＴポリペプチドへの結合を検出し、そこから上記生物学的サンプルにおけるＡＮＴポリペプチドの存在を決定する工程を包含し；ここで、上記アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドを含み；ここで、上記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、ＡＮＴ１であり；ここで、上記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、ＡＮＴ２であり；ここで、上記ヒトアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドは、ＡＮＴ３であり；ここで、上記ＡＮＴリガンドは、６’ヒドロキシルで置換したアトラクチロシドを含み、アトラクチロシド誘導体を形成し；ここで、上記アトラクチロシドは、６’ヒドロキシルで検出可能に置換され、検出可能なアトラクチロシド誘導体を形成し、；ここで、上記検出可能なアトラクチロシド誘導体は、放射標識置換基を含み；ここで、上記放射標識置換基は、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、および35Ｓからなる群から選択され；ここで、上記検出可能なアトラクチロシド誘導体は、蛍光置換基を含み；ここで、上記ＡＮＴリガンドは、アトラクチロシド誘導体と複合体化したＥｕ3+原子をさらに含み；ここで、上記検出可能なアトラクチロシド誘導体は、共有結合したビオチンを含み；ここで、上記アトラクチロシド分子は、６’ヒドロキシルでアミンまたはアミン含有機能性と置換され、アミン改変型アトラクチロシド誘導体を形成し；ここで、上記アトラクチロシド分子は、６’ヒドロキシルで置換されてカルボキシアトラクチロシド誘導体であるアトラクチロシド誘導体を形成するカルボキシアトラクチロシド分子である。
【００２０】
ＡＮＴを生物学的サンプルから単離するための方法であって、上記方法は、ＡＮＴポリペプチドを含有すると予想される生物学的サンプルをＡＮＴリガンドと、上記ＡＮＴリガンドがＡＮＴポリペプチドに結合するのを可能にする条件下で、そして十分な時間で接触させる工程を包含し；そして上記ＡＮＴポリペプチドを回収し、それによりＡＮＴを生物学的サンプルから単離する工程を包含し；ここで、上記ＡＮＴリガンドは、固相に共有結合しており；ここで、上記ＡＮＴリガンドは、固相に非共有的に結合している。
【００２１】
ＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を同定するための方法であって、上記方法は、候補薬剤を、少なくとも１つの組換えＡＮＴポリペプチドを発現する宿主細胞と、上記薬剤が上記組換えＡＮＴポリペプチドに結合するのを可能にする条件下で、そして十分な時間で接触させる工程を包含し；ならびに上記薬剤の上記組換えＡＮＴへの結合を検出する工程を包含し；ここで、上記宿主細胞は、原核生物細胞であり；ここで、上記原核生物細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞であり；ここで、上記宿主細胞は、真核生物細胞であり；ここで、上記真核生物細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞からなる群から選択され；ここで、上記昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞であり；ここで、上記宿主細胞は、内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターの少なくとも１つのアイソフォームを欠失し；ここで、内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターアイソフォームをコードする少なくとも１つの遺伝子の宿主細胞発現は、実質的に損なわれている。
【００２２】
ＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を同定するための方法であって、上記方法は、候補薬剤を、少なくとも１つの組換えＡＮＴポリペプチドを含む生物学的サンプルと、上記薬剤の上記ＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にする条件下で、および十分な時間で接触させる工程を包含し；そして上記薬剤の上記組換えＡＮＴポリペプチドへの結合を検出する工程を包含する。
【００２３】
ＡＮＴポリペプチドと相互作用する薬剤を同定する方法であって、上記方法は、組換えＡＮＴを含む生物学的サンプルを検出可能なＡＮＴリガンドと、候補薬剤の存在下で接触させる工程；および上記薬剤の非存在下で上記検出可能なＡＮＴリガンドの組換えＡＮＴへの結合を、上記薬剤の存在下での上記検出可能なＡＮＴリガンドの組換えＡＮＴへの結合と比較し、そこからＡＮＴポリペプチドと相互作用する薬剤を同定する工程を包含する。
【００２４】
アトラクチロシド誘導体を形成するように、６’ヒドロキシルで置換したアトラクチロシドを含むＡＮＴリガンド；ここで、上記アトラクチロシドは、６’ヒドロキシルで検出可能に置換され、検出可能なアトラクチロシド誘導体を形成し；ここで、上記検出可能なアトラクチロシド誘導体は、放射標識置換基を含み；ここで、上記放射標識置換基は、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、および35Ｓからなる群から選択され；ここで、上記検出可能なアトラクチロシド誘導体は、蛍光置換基を含み；上記アトラクチロシド誘導体に複合体化したＥｕ3+原子をさらに含み；ここで、上記検出可能なアトラクチロシド誘導体は、共有結合したビオチンを含み；ここで、上記アトラクチロシド分子は、アミン改変型アトラクチロシド誘導体を形成するように、６’ヒドロキシルでアミンまたはアミン含有機能性で置換されており；ここで、上記アトラクチロシド分子は、カルボキシアトラクチロシド誘導体であるアトラクチロシド誘導体を形成するように６’ヒドロキシルで置換された、カルボキシアトラクチロシド分子である。
【００２５】
その立体異性体および薬学的に受容可能なそれらの塩を含む、以下の構造（Ｉ）を有するＡＮＴリガンド：
【００２６】
【化２】
2004154139.tif 000002
であって、ここでＲ1、Ｒ2、およびＲ3は、以下のように同定される。
【００２７】
少なくとも１つのＡＮＴポリペプチドに結合する候補薬剤の高スループットスクリーニングのためのアッセイプレートであって、複数のウェルを有するアッセイプレートを含み、上記ウェルの各々は、さらに少なくとも１つの固定化された組換えＡＮＴポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントを含む。
【００２８】
目的のポリペプチドをミトコンドリア膜に標的化する方法であって、上記方法は、宿主細胞において融合タンパク質をコードする組換え発現構築物を発現する工程を包含し、上記構築物は、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結した少なくとも１つの調節されたプロモーターを含み、上記第１の核酸配列は、上記第２の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現されるアデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードし、ここで、上記第２の核酸配列は、目的のポリペプチドをコードする。
【００２９】
目的のポリペプチドをミトコンドリア膜に標的化する方法であって、上記方法は、宿主細胞内で融合タンパク質をコードする組換え発現構築物を発現する工程を包含し、上記構築物は、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む核酸分子に作動可能に連結した少なくとも１つのプロモーターを包含し、上記第１の核酸配列は、上記第２の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される動物アデニンヌクレオチドトランスロケーターポリペプチドをコードし、ここで、上記第２の核酸配列は、目的のポリペプチドをコードし；上記のＡＮＴリガンドを含む薬学的組成物を含む。
【００３０】
ＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を含む薬学的組成物が上記のように同定された。ＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を含む薬学的組成物が上記のように同定された。ＡＮＴポリペプチドと相互作用する薬剤を含む薬学的組成物が上記のように同定された。被験体に上記の任意の１つ薬学的組成物を投与する工程を包含する処置方法。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般的に、アデノシンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）ポリぺプチドに関する。本明細書中に提供されるＡＮＴポリぺプチドは、以下の任意のＡＮＴアイソフォームを言及し得る；ＡＮＴをコードする核酸を含む発現構築物、ならびにＡＮＴと相互作用する天然および合成の低分子量の分子（ＡＮＴ結合リガンドを含む）。本発明は、細菌、昆虫、酵母または哺乳動物の発現系が、組換えヒトＡＮＴポリぺプチドの有意な数量での確実な産生のために設計され得るという、予想外の発見に部分的に関する。特定の局面において、本発明は、制御プロモーターを利用する組換えＡＮＴポリぺプチドを産生するための組成物および方法を提供する。そして、これらおよび別の特定の局面において、本発明は、ＡＮＴ融合タンパク質である組換えＡＮＴポリぺプチドを産生するための組成物および方法を提供する。特定の好ましい実施態様において、このような発現系の設計は、本明細書中に記載されるように、内因性のＡＮＴを欠く宿主細胞または内因性のＡＮＴ遺伝子の発現を実質的に損なう宿主細胞の使用を含む。
【００３２】
従って、本発明はまた、ヒトＡＮＴポリぺプチドを含む、組換えＡＮＴポリぺプチドを産生および単離する方法に部分的に関する。次いで、好ましい実施態様において、ヒトＡＮＴ３ポリぺプチドは、種々の結合アッセイおよびスクリーニングアッセイなどに使用され得る。組換えヒトＡＮＴポリぺプチドの発現が、これらのＡＮＴポリぺプチド産物のそのような使用を可能にするレベルで達成され得るという驚くべき観察ゆえに、本発明は、組換えヒトＡＮＴに結合する薬剤を同定するためのアッセイ（高生産性アッセイを含む）を提供する。従って、本発明は、さらに、新規のヒトＡＮＴリガンド、合成、選別および特徴付けに部分的に関する。結合アッセイの使用に必要とされる、発現された組換えＡＮＴポリぺプチドを提供することは従来不可能であった。本発明はまた、ＡＮＴに相互作用する薬剤（当該分野に公知の任意のＡＮＴ機能を増強または弱める薬剤を含むが、本明細書中に記載される薬剤に限定されない）に関し、そしてこのような薬剤の薬学的組成物への組込みおよび治療的方法におけるそれらの使用に関する。
【００３３】
上記で議論されたように、本発明は、組換えアデニン核酸ヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）ポリぺプチド（完全長のＡＮＴタンパク質およびポリヌクレオチド、それらのフラグメントおよび変異体を含み、そして本明細書中に提供されたようなＡＮＴ融合タンパク質をさらに含む）が、ＡＮＴをコードする核酸に作動可能に連結された調節核酸を有する組換え発現ベクターを使用することによって、有用な量を産生され得るという、予想外の発見に部分的に関する。特に、本発明は、調節プロモーターの使用を通じて、組換えＡＮＴポリぺプチドを産生するための組成物および方法を提供する；本発明はまた、ＡＮＴ融合タンパク質である組換えＡＮＴポリぺプチドを提供する。
【００３４】
本発明はまた、ＡＮＴポリぺプチドの存在を同定するためのならびに組換えＡＮＴを単離するための組成物および方法に関し、そしてさらに、ＡＮＴに相互作用する化合物についてのスクリーニングアッセイに関する。従って、本発明は、ミトコンドリアの機能の調節について特定の利点を提供する（特に、ミトコンドリアの透過「細孔」の制御）。背景のために、ＥＴＣ活性を媒介する５多サブユニットタンパク質複合体の４つ（複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ）は、ミトコンドリア内膜に局在され（これは細胞における生体膜の主要なタンパク質である（７．５％重量））；残りのＥＴＣ複合体（複合体ＩＩ）は、マトリックスに位置される。ＡＮＴは、ミトコンドリア内膜の最も大量に存在するタンパク質である。ＥＴＣにおいて生じることが公知の少なくとも３つの異なる化学反応において、正電荷水素イオンは、ミトコンドリアマトリックスから（ミトコンドリア内膜を横切って、膜間領域に移動される。この電荷種の不均衡は、「プロトン駆動力（ＰＭＦ）」といわれる約２２０ｍＶの電気化学的ポテンシャルを引き起こす。これはしばしば、記号ΔψまたはΔψｍで表され、そして電位の合計、およびミトコンドリア内膜を横切るｐＨ勾配を表す（例えば、Ｅｒｎｓｔｅｒら、１９８１  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１：２２７ならびにその中に引用される参照を参照のこと）。
【００３５】
この膜ポテンシャルは、ミトコンドリア内膜を横切って、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）のＡＮＴ媒介の化学量論的な交換を駆動し、そしてＡＤＰがＥＴＣ複合体Ｖによってリン酸化されＡＴＰを産生する場合の、リン酸結合作製に寄与するエネルギーを提供する（すなわち、水素イオンのマトリックスへの輸送に化学量論的に「共役（ｃｏｕｐｌｅｄ）」される過程）。ミトコンドリア膜ポテンシャル（Δψｍ）はまた、サイトゾルＣａ2+のミトコンドリアへの流入のための駆動力である。正常な代謝状態化では、内膜は、膜間領域からマトリックスへの水素イオン移動に対して不浸透性であり、唯一の手段としてのＥＴＣ複合体Ｖを残し、これによって、水素イオンはマトリックスに戻り得る。しかし、変質したミトコンドリア機能に関連する疾患を伴い得るＭＰＴの間に生じるようにミトコンドリア内膜の統合性が損なわれた場合、水素イオンは、ＡＴＰを産生することなく、複合体Ｖの溝をバイパスし得る。その結果、電子伝達および関連されるプロトンポンプはＡＴＰを産生しないため、「脱共役（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ）」呼吸を生じる。従って、ミトコンドリア透過性移動（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）は、ミトコンドリア膜「細孔（ｐｏｒｅ）」の開口に関与する。特に、ＥＴＣおよびＡＴＰ合成が共役される過程において、Δψｍは崩壊し、ミトコンドリア膜は、微小（例えば、Ｃａ2+イオン、Ｎａ+イオン、Ｋ+イオン、Ｈ+イオン）および巨大（例えば、タンパク質）の両方の溶質に対する透過性を選択的に調節する能力を失う。
【００３６】
理論にとらわれることは望まないが、ミトコンドリア膜において形成されるこの細孔が、生理学的に分散した溝であるか否か（例えば、特定のミトコンドリアおよび／またはサイトゾルタンパク質ならびに可能性のある他の分子の集合または凝集により）、あるいはこの「細孔」の開口が、ミトコンドリア膜の多孔性の一般的な増加を単純に説明し得るか否かは未解決のままである。
【００３７】
ＭＰＴはまた、１つ以上のミトコンドリア分子成分に結合する化合物によって誘導され得る。このような化合物としては、アトラクチロシドおよびボンクレキン酸（これらはＡＮＴに結合することが公知である）が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＰＴを誘導するこのような化合物の適切量を決定するための方法は、当該分野に公知である（例えば、Ｂｅｕｔｎｅｒら、１９９８  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６８：７；ＯｂａｔｏｍｉおよびＢａｃｈ，１９９６  Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．８９：１５５；ＧｒｅｅｎおよびＲｅｅｄ，１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９；Ｋｒｏｅｍｅｒら、１９９８  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０：６１９；およびそれらの中に引用される引用文献を参照のこと）。従って、特定のミトコンドリア分子成分（例えば、ＡＮＴ）は、ＭＰＴ機構に寄与し得る。上記したように、アデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）が、ミトコンドリア内膜を横切って、ＡＴＰ／プロトン交換を媒介し、そしてアトラクチロシドおよびボンクレキン酸のようなＡＮＴインヒビターが、特定の条件下でＭＰＴを誘導することが考えられる。それ故に、例えば、ＡＮＴと相互作用するＡＮＴリガンドおよび他の薬剤（これらはミトコンドリア細孔活性の治療的な管理に有用である）を提供する構造的および機能的なアッセイのために、十分量のＡＮＴを得ることが望まれる。米国特許第０９／１６１，１７２号、名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  Ａｌｔｅｒ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｐｏｒｅｓ」も参照のこと（これは本明細書中に参考として援用される）。
【００３８】
本発明の組成物および方法は、当業者に公知のＡＮＴのアミノ酸配列および／またはコードする核酸に対する、任意の原核生物または真核生物のＡＮＴ（植物および動物のＡＮＴ、さらに、例えば、酵母、脊椎動物、哺乳動物、げっ歯類、霊長類およびヒトのＡＮＴを含み得る）に適応され得る。記載されたヒトＡＮＴの３つのアイソフォームは、それらの組織における発現パターンが異なる。（Ｓｔｅｐｉｅｎら、１９９２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４５９２；Ｗａｌｌａｃｅら、１９９８  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ＆  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅａｌ，ＨｏｗｅｌｌおよびＢｏｄｉｓ−Ｗｏｌｌｎｅｒ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２８３−３０７頁、ならびにそれらの中に引用される参考文献も参照のこと。）これらの３つヒトＡＮＴアイソフォームをコードするｃＤＮＡに対する核酸配列は、報告されており（図１；ｈｕＡＮＴ１  ｃＤＮＡ［配列番号１］については、Ｎｅｃｋｅｌｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７５８０−７５８４（１９８７）；ｈｕＡＮＴ２  ｃＤＮＡ［配列番号２］については、Ｂａｔｔｉｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４３５５−４３５９（１９８７）、およびｈｕＡＮＴ３  ｃＤＮＡ［配列番号３］については、Ｃｏｚｅｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０６：２６１−２８０（１９８９）を参照のこと；ｈｕＡＮＴ１［配列番号３１］、ｈｕＡＮＴ２［配列番号３２］およびｈｕＡＮＴ３［配列番号３３］のアミノ酸配列については図２を参照のこと）、そしてＡＮＴ遺伝子配列は、多数の種について決定されている（例えば、ｈｕＡＮＴ１ゲノムＤＮＡについては、Ｌｉら、１９８９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３９９８；ｈｕＡＮＴ２については、Ｌｉｅｗら、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｎ８６７１０；ラットＡＮＴ遺伝子については、Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、１９９３  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５２：１９２を参照のこと；他の遺伝子配列については、例えば、Ｋｕら、１９９０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６０６０；Ａｄａｍｓら、１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６５１；および  ＷＯ  ９８／１９７１４もまた参照のこと）。哺乳動物の種間でのＡＮＴ配列は、高度に保存されている；例えば、アミノ酸レベルでは、マウスのＡＮＴ１およびＡＮＴ２は、ヒトＡＮＴ２と９８％の配列同一性を示す。現在までのところ、少なくとも２９のＡＮＴタンパク質の完全長アミノ酸配列（これらの多くは核酸配列から推定された）が、種々の動物種および植物種から報告されている。（Ｆｉｏｒｅら、１９９８  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８０：１３７−１５０）。
【００３９】
本発明は、さらに、これらの配列間で、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも９０％、およびさらに好ましくは、少なくとも９５％同一である場合、本明細書中に提供されるか、参考として引用されるか、または当業者に容易に明らかであるＡＮＴをコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸に関する。本発明は、特に、ストリンジェントな条件で、本明細書中で言及されるＡＮＴをコードする核酸にハイブリダイズする核酸に関する。本明細書中で使用されるように、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間において少なくとも９５％および好ましくは少なくとも９７％の同一性を有する場合のみ生じる。本明細書中で言及されるＡＮＴをコードする核酸にハイブリダイズする核酸は、好ましい実施態様において、実質的に、図１［配列番号１、２および３］のｃＤＮＡによってコードされるＡＮＴポリぺプチドとして同じ生物学的機能もしくは活性を保持するか、または寄託された発現構築物を保持するかのいずれかのポリぺプチドをコードする。
【００４０】
本明細書で使用されるように、特定のストリンジェントな条件下で「ハイブリダイズする」は、２本の一本鎖核酸分子間で形成されるハイブリッドの安定性を記載するために使用される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、代表的に、このようなハイブリッドがアニール化され、そして洗浄されるイオン強度および温度の条件下で発現される。代表的に、「高い」、「中間」および「低い」ストリンジェンシーは、以下の条件またはそれらに相当する条件を含む：高いストリンジェンシー：０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃；中間ストリンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃；および低いストリンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃。
【００４１】
本明細書中で言及される寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下で維持される。これらの寄託物は、当業者に対する便宜として提供されるに過ぎず、そして米国特許法第１１２条の下で寄託が必要とされることを承認したわけではない。これらの寄託物に含まれる核酸の配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の記載に誤りのある場合には参照されるべきである。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾は本明細書によって与えられるわけではない。
【００４２】
（核酸）
本発明の核酸は、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であり得、このＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖である場合、コード鎖または非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。本発明による使用のためのＡＮＴポリペプチドをコードするコード配列は、上記のように、そして例えば、図１においてヒトＡＮＴ１［配列番号１］、ヒトＡＮＴ２［配列番号２］、およびヒトＡＮＴ３［配列番号３］について示すように、任意の所定のＡＮＴについて当該分野で公知のコード配列と、もしくは任意の寄託されたクローンのコード配列と同一であり得るか、または、例えば、図１のｃＤＮＡもしくは寄託された発現構築物と同じＡＮＴポリペプチドをコードする、遺伝コードの冗長性もしくは縮重の結果として異なるコード配列であり得る。
【００４３】
ＡＮＴポリペプチド（例えば、図２［配列番号３１〜３３］のアミノ酸配列を有するヒトＡＮＴポリペプチドもしくは本発明による使用のための任意の他のＡＮＴポリペプチド）、または寄託された構築物によりコードされるＡＮＴポリペプチドをコードする核酸は、以下を含むがこれらに限定されない：ＡＮＴポリペプチドのコード配列のみ；ＡＮＴポリペプチドのコード配列およびさらなるコード配列；ＡＮＴポリペプチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イントロンまたはＡＮＴポリペプチドのコード配列の５’側および／もしくは３’側の非コード配列、これは、例えば、調節されるかもしくは調節可能なプロモーター、エンハンサー、他の転写調節配列、リプレッサー結合配列、翻訳調節配列、もしくは任意の他の調節核酸配列であり得る１以上の調節核酸配列をさらに含み得るがそれに限定される必要はない）。従って、用語「ＡＮＴポリペプチドをコードする核酸」は、このポリペプチドのコード配列のみを含む核酸、ならびにさらなるコード配列および／または非コード配列を含む核酸を包含する。
【００４４】
本発明はさらに、ＡＮＴポリペプチド、例えば、図２［配列番号３１〜３３］の推定アミノ酸配列を有するヒトＡＮＴ１ポリペプチド、ヒトＡＮＴ２ポリペプチド、およびヒトＡＮＴ３ポリペプチド、または任意のＡＮＴポリペプチド（寄託された発現構築物のｃＤＮＡによりコードされるＡＮＴポリペプチドを含む）のフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書記載される核酸の改変体に関する。ＡＮＴをコードする核酸の改変体は、核酸の天然に存在する対立遺伝子改変体または天然に存在しない改変体であり得る。当該分野で公知であるように、対立遺伝子改変体は、１以上のヌクレオチドの少なくとも１つの置換、欠失、または付加を有し得る核酸配列の代替形態であり、その任意のものは、コードされるＡＮＴポリペプチドの機能を実質的に改変しない。従って、例えば、本発明は、図２［配列番号３１〜３３］に示されるのと同じＡＮＴポリペプチド、または寄託された発現構築物のｃＤＮＡによりコードされる同じＡＮＴポリペプチドをコードする核酸、ならびにこのような核酸の改変体を含み、この改変体は、図２（配列番号２）のポリペプチドもしくは寄託された発現構築物のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドのいずれかのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードする。
【００４５】
ＡＮＴの改変体および誘導体は、ＡＮＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の変異により入手され得る。天然のアミノ酸配列の変更は、多数の従来の方法のいずれかにより達成され得る。変異は、天然の配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位と隣接した、変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座で導入され得る。連結後、得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有するアナログをコードする。
【００４６】
あるいは、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発手順を用いて、変化した遺伝子を提供し得、ここで、所定のコドンは、置換、欠失、または挿入により変更され得る。このような変更を行う例示的な方法は、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８５年１月，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；Ｋｕｎｋｅｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８，１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３６７，１９８７）；ならびに米国特許第４，５１８，５８４号および同第４，７３７，４６２号により開示される。
【００４７】
アミノ酸の残基もしくは配列の種々の付加物もしくは置換物、または生物学的活性に必要でない末端もしくは内部の残基もしくは配列の欠失物をコードする等価なＤＮＡ構築物もまた、本発明により包含される。例えば、生物学的活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする配列は、変更されてＣｙｓ残基が欠失されるかまたは他のアミノ酸で置換されるのを生じ得、再生の際に不正確な分子内ジスルフィド結合が形成されるのを防ぐ。他の等価物は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する、酵母系における発現を増強するために、隣接した二塩基性アミノ酸残基の改変により調製され得る。ＥＰ  ２１２，９１４は、タンパク質におけるＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活化するための部位特異的変異誘発の使用を開示する。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、残基を欠失、付加、または置換して、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、およびＬｙｓ−Ａｒｇ対を変更し、これらの隣接する塩基性残基の出現を排除することにより不活化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合は、ＫＥＸ２切断に対してかなり感受性が低く、そしてＡｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの転換は、ＫＥＸ２部位を不活化するための保存的かつ好ましいアプローチを表す。
【００４８】
（ポリペプチドおよび融合タンパク質）
本発明は、さらに、ＡＮＴポリペプチドに、より詳細には、ＡＮＴ発現構築物を含有する宿主細胞を培養することにより組換えＡＮＴポリペプチドを生成するための方法、および単離されたヒト組換えＡＮＴポリペプチド（例えば、図２［配列番号３１〜３３］の推定アミノ酸配列を有するかまたは寄託された組換え発現構築物によりコードされるアミノ酸配列を有する、ヒトＡＮＴ１ポリペプチド、ヒトＡＮＴ２ポリペプチド、およびヒトＡＮＴ３ポリペプチドを含む）ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。本発明のポリペプチドおよび核酸は、好ましくは単離された形態で提供され、そして特定の好ましい実施態様では、均質になるまで精製される。
【００４９】
ＡＮＴポリペプチドもしくは融合タンパク質を、または寄託された組換え発現構築物によりコードされるＡＮＴポリペプチドもしくは融合タンパク質を言及する場合の用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」とは、このようなポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を本質的に保持する、任意のＡＮＴポリペプチドまたは融合タンパク質をいう。従って、アナログは、プロタンパク質部分の切断によって活性されて活性なＡＮＴポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を含む。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得、そして好ましくは組換えポリペプチドである。
【００５０】
寄託された構築物のｃＤＮＡによりコードされるＡＮＴポリペプチドまたは融合タンパク質を含む、ＡＮＴポリペプチドまたは融合タンパク質のフラグメント、誘導体、またはアナログは、以下のいずれかであり得る：（ｉ）１以上のアミノ酸残基が保存的なアミノ酸残基または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよいしそうでなくともよいもの、あるいは（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）ＡＮＴポリペプチドが、このポリペプチドの半減期を増加させるための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されたもの、あるいは（ｉｖ）さらなるアミノ酸（ＡＮＴポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製のために用いられるアミノ酸を含む）がＡＮＴポリペプチドと融合されたものであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示より当業者の範囲内であると考えられる。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、ＡＮＴポリペプチド、および公知の配列と同一または類似するアミノ酸配列を有する融合タンパク質を含む。限定のためではなく、例示のために、図２［配列番号３１〜３３］のヒトＡＮＴ（「ｈｕＡＮＴ」）ポリペプチドは、図２のポリペプチド［配列番号３１〜３３］に対して少なくとも７０％類似性（好ましくは７０％同一性）、より好ましくは図２［配列番号３１〜３３］のポリペプチドに対して９０％類似性（より好ましくは９０％同一性）、そしてさらにより好ましくは図２［配列番号３１〜３３］のポリペプチドおよびこのようなポリペプチドの部分に対して９５％類似性（さらにより好ましくは９５％同一性）を有するポリペプチドと同様に、本発明に従って使用されることが意図され、ここで、ＡＮＴポリペプチドのこのような部分は、一般に、少なくとも３０アミノ酸を含み、そしてより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む。
【００５２】
当該分野で公知であるように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列およびそれに対する保存されたアミノ酸置換物を、第２のポリペプチドの配列に対して比較することにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成により、対応する全長ポリペプチドを生成するために用いられ得る；それゆえ、このフラグメントは、全長ポリペプチドを生成するための中間体として用いられ得る。本発明の核酸のフラグメントまたは部分を用いて、本発明の全長核酸を合成し得る。
【００５３】
用語「単離された」とは、そのもともとの環境（例えば、その物質が天然に存在する場合は、天然環境）から取り出された物質を意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然に存在する核酸またはポリペプチドは単離されていないが、天然の系の中で共存する物質の一部または全てから分離された同じ核酸またはポリペプチドは単離されている。このような核酸は、ベクターの一部であり得、そして／またはこのような核酸もしくはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてこのようなベクターもしくは組成物が天然の環境の一部ではないという点で依然として単離されている。
【００５４】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を生成することに関わるＤＮＡのセグメントを意味し、これは、コード領域に先行する領域および続く領域「リーダーおよびテイラー（ｔａｉｌｅｒ）」、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００５５】
本明細書中に記載されるように、本発明は、さらなる機能的ポリペプチド配列または非機能的ポリペプチド配列に融合されたＡＮＴポリペプチド配列の発現を提供するために、さらなるコード配列にインフレームに融合されたＡＮＴコード配列を有する核酸によりコードされる、ＡＮＴ融合タンパク質を提供する。このさらなる機能的ポリペプチド配列または非機能的ポリペプチド配列は、例えば、例示目的であり、制限目的ではないが、ＡＮＴ融合タンパク質の検出、単離、および／または精製を可能にする。このようなＡＮＴ融合タンパク質は、ＡＮＴ融合タンパク質の検出、単離および／または精製を可能にし得る。このことは、タンパク質−タンパク質親和性に基づくポリペプチド精製、金属親和性に基づくポリペプチド精製または電荷親和性に基づくポリペプチド精製により、あるいは、ＡＮＴポリペプチドが融合タンパク質から分離可能であるような、プロテアーゼにより切断可能な融合配列を含む融合タンパク質の特異的プロテアーゼ切断による。
【００５６】
従って、ＡＮＴ融合タンパク質は、ＡＮＴの検出および単離を容易にするために、ＡＮＴに付加されたポリペプチド配列を含み得る。このようなペプチドには、例えば、ポリＨｉｓ、または米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら（１９８８  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４）に記載された抗原性同定ペプチド、またはＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が挙げられる。親和性配列は、例えば、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＱＥ−９ベクターにより供給されるようなヘキサヒスチジンタグであり、細菌性宿主の場合、マーカーに融合された成熟ペプチドの精製を提供し得るか、あるいは、例えば、親和性配列は、哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合、赤血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。このＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）由来の、抗体に規定されるエピトープに対応する。
【００５７】
ＡＮＴ融合タンパク質は、ＡＮＴに付加された免疫グロブリン定常領域ポリペプチドをさらに含み、ＡＮＴの検出、単離、および／または局在化を容易にし得る。免疫グロブリン定常領域ポリペプチドは、好ましくは、ＡＮＴポリペプチドのＣ末端に融合される。抗体由来のポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の種々の部分に融合された異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の一般的調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５、１９９１）およびＢｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７、１９９０）により記載されている。ＡＮＴ：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合物は、適切な発現ベクターに挿入される。本発明の特定の実施態様において、ＡＮＴ：Ｆｃ融合物は、抗体分子のように多く集合することが可能であり得、そこで、鎖間のジスルフィド結合がＦｃポリペプチド間で形成し、二量体ＡＮＴ融合タンパク質を産生する。
【００５８】
ＡＮＴをコードする配列にインフレームに結合されたＤＮＡ配列によりコードされる免疫グロブリンＶ領域ドメインを含む融合ポリペプチドにより、予め選択された抗原に対して特異的結合親和性を有するＡＮＴ融合タンパク質もまた、本発明の範囲内であり、本明細書中に提供される改変体およびそのフラグメントを含む。免疫グロブリンＶ領域融合ポリペプチドを有する融合タンパク質の構築のための一般的ストラテジーは、例えば、ＥＰ第０３１８５５４号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；および米国特許第５，４７６，７８６号に開示される。
【００５９】
本発明の核酸はまた、所望の親和性特性を有する他のポリペプチド（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのような酵素）に融合されたＡＮＴポリペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。別の例として、ＡＮＴ融合タンパク質もまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓタンパク質に融合されたＡＮＴ融合ポリペプチドを含み得る。ポリペプチドすなわち、プロテインＡコード核酸、および免疫グロブリン定常領域に対する親和性を有する融合タンパク質の構築におけるそれらの使用は、例えば、米国特許第５，１００，７８８号に一般に記載される。ＡＮＴ融合タンパク質の構築のために有用な他の親和性ポリペプチドは、例えば、ＷＯ  ８９／０３４２２；米国特許第５，４８９，５２８号；米国特許第５，６７２，６９１号；ＷＯ  ９３/２４６３１；米国特許５，１６８，０４９号；米国特許第５，２７２，２５４号およびその他に記載されるようなストレプトアビジン融合タンパク質、ならびにアビジン融合タンパク質（ＥＰ  ５１１，７４７を参照のこと）を含み得る。本明細書中および引用文献において提供されるように、ＡＮＴポリペプチド配列は、完全長の融合ポリペプチドであり得、あるいは、改変体またはそのフラグメントであり得る、融合ポリペプチド配列に融合され得る。
【００６０】
本発明はまた、目的のポリペプチドを膜に、そして特定の実施態様において細胞膜に、そしてさらなる実施態様においてミトコンドリア膜に、標的化する方法を提供する。本発明のこの局面は、本明細書中で提供される特定の組換え発現構築物（この構築物は、ＡＮＴポリペプチドであって、かつ第２のポリペプチド配列を有する融合タンパク質として発現される、第１のポリペプチドをコードする核酸を含む）が、細胞膜に優先的に局在化し得る組換えＡＮＴ融合タンパク質を提供するという、予期されない観察に基づく。特定の実施態様において、細胞膜は、細菌の細胞膜（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ膜）のような原核生物膜である。他の実施態様において、細胞膜は、酵母細胞膜または哺乳動物細胞膜のような真核生物膜であり、例えば、本明細書中に意図される任意の真核生物細胞の膜である。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、細胞膜は、任意の細胞膜であり得、そして代表的には、細胞質ゾル構成成分に接触する膜をいい、上記のようなミトコンドリアの内膜および外膜のような、区画に結合された細胞内膜を含み、そしてまた、細胞内小胞、ＥＲ−ゴルジ成分、他の細胞小器官など、および原形質膜も含む。好ましい実施態様において、ＡＮＴ融合タンパク質は、ミトコンドリア膜に標的化され得る。他の好ましい実施態様において、例えば、本発明に従う組換え発現構築物は、ポリペプチド配列を含むＡＮＴ融合タンパク質をコードし得、このポリペプチド配列は、細胞質ゾルに保持されるように、小胞体（ＥＲ）の細胞内腔に存在するように、伝統的ＥＲ−ゴルジ分泌経路を介して細胞から分泌されるように、原形質膜に取り込まれるように、膜貫通細胞表面レセプターの細胞質ドメインを含む特定の細胞質成分と結合するように、または当業者に知られている、任意の種々の公知の細胞内タンパク質分類機構により特定の細胞下の位置に指向されるように、この融合タンパク質に指令する。従って、これらの実施様態および関連の実施態様は、目的のポリペプチドを、予め規定された細胞内の位置、膜の位置、または細胞外の位置に標的化するように指向された本発明の組成物および方法により包含される。
【００６２】
（ベクター）
本発明はまた、ベクターに関連し、そして本発明の核酸を含む構築物に関し、そして特に、上記で提供されるような本発明に従うＡＮＴポリペプチドをコードする任意の核酸を含む「組換え発現構築物」に関し；本発明のベクターおよび／または構築物で遺伝学的に操作された宿主細胞に関し、そして本発明のＡＮＴポリペプチドおよび融合タンパク質、またはフラグメントあるいはその改変体の、組換え技術による生成に関する。ＡＮＴタンパク質は、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、または他の細胞において、適切なプロモーターの制御下で発現され得る。細胞を用いない翻訳系もまた使用されて、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用して、このようなタンパク質を生成し得る。原核生物宿主および真核生物宿主を用いる使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）により記載される。
【００６３】
一般に、組換え発現ベクターは、複製の起点および、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＲＰ１遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指向するための、高度に発現された遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロン由来であり得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および終止配列と、適切な位相でアッセンブリされる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡単な精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００６４】
細菌の使用のための有用な発現構築物は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび終止シグナルとともに、機能的プロモーターと作動可能に読み取る位相で発現ベクターに挿入することにより構築される。この構築物は、１つ以上の表現型選択マーカーおよび、このベクター構築物の維持を確実にする、そして、もし所望ならば、宿主内での増幅を提供する複製起点を含み得る。形質転換のための適切な原核生物宿主には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種が挙げられるが、他もまた、選択できる材料として使用され得る。他の任意のプラスミドまたはベクターは、それらが宿主中で複製し得、かつ生存し得る限り、使用され得る。
【００６５】
代表目的であるが、非制限的例として、細菌使用のために有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝的エレメントを含む、市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌性複製起源を含み得る。このような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」部分は、適切なプロモーターおよび構造配列と組合せて発現される。
【００６６】
適切な宿主株の形質転換およびその宿主株の適切な細胞密度への増殖後、選択されたプロモーター（これが、本明細書中に提供されるような調節されたプロモーターである場合）は、適切な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）により誘導され、そして、細胞は、さらなる期間培養される。細胞は、代表的には、遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破壊され、そして得られた粗抽出物は、さらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結融解循環法、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の都合の良い方法（このような方法は、当業者に周知である）により破壊され得る。
【００６７】
従って、例えば、本明細書中に提供される本発明の核酸は、ＡＮＴポリペプチドを発現するための組換え発現構築物として、種々の発現ベクター構築物のいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターおよび構築物には、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病）の組合せに由来するベクターが挙げられる。しかし、他の任意のベクターが、宿主で複製され得、かつ生存し得る限り、組換え発現構築物の調製のために使用され得る。
【００６８】
適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によってベクターに挿入され得る。一般的には、ＤＮＡ配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に、当該分野で公知の手順によって挿入される。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応のための、クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための標準的な技術、ならびに様々な分離技術は公知であり、そして当業者によって通常使用される。多数の標準的な技術は、例えば以下に記載される：Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９３  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆Ｊｈｏｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）など。
【００６９】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えば、プロモーターまたは調節プロモーター）に作動可能に連結されて、ｍＲＮＡ合成を指向する。このような発現制御配列の例示的な例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃまたはｔｒｐ、λファージＰLプロモーター、および原核生物もしくは真核生物細胞またはウイルス中の遺伝子の発現を制御することが公知の他のプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを選択マーカーとともに使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特に指定される細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰR、ＰL、およびｔｒｐが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来ＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネインＩが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベル内で十分であり、そして特定の特に好ましい組換え発現構築物（少なくとも１つのプロモーターまたは（ＡＮＴポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された）調節プロモーターを含む）の調製は、本明細書中に記載される。
【００７０】
特定の好ましい実施態様において、発現制御配列は、「調節プロモーター」であり、これは本明細書中で提供されるようなプロモーターであり得、そしてまた、リプレッサー結合部位、アクチベーター結合部位、または本明細書中で提供されるような核酸配列の発現を制御する任意の他の調節配列であり得る。特定の特に好ましい実施態様において、調節プロモーターは、厳密に制御されるプロモーターであり、これは、特に誘導性であり、かつ誘導性シグナルの非存在下のその制御下で、核酸配列の転写をほとんどまたは全く許容しない。これらのことは、当業者に公知であり、そして例えば、以下に記載される：Ｇｕｚｍａｎら（１９９５  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：４１２１）、Ｃａｒｒａら（１９９３
ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：３５）、Ｍａｙｅｒ（１９９５  Ｇｅｎｅ  １６３：４１）、Ｈａｌｄｉｍａｎｎら（１９９８  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１２７７）、Ｌｕｔｚら（１９９７  Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．２５：１２０３）、Ａｌｌｇｏｏｄら（１９９７  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４７４）およびＭａｋｒｉｄｅｓ（１９９６  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：５１２）（これらの全てを本明細書中で参考として援用する）。本発明の他の好ましい実施態様において、誘導性であるが、厳密に調節され得ない調節プロモーターが存在する。特定の他の好ましい実施態様において、プロモーターは、調節されない本発明の組換え発現構築物に存在する；このようなプロモーターとしては、例えば、実施例に記載されるような昆虫ポリヘドリンプロモーターまたは酵母ホスホグリセレートキナーゼプロモーター（例えば、Ｇｉｒａｕｄら、１９９８  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８１：４０９を参照のこと）のような構成的プロモーターが挙げられ得る。この発現構築物はまた、翻訳開始および転写終結のためのリボソーム結合部位を含む。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。
【００７１】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加され得る。エンハンサーは、通常約１０〜３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、これはその転写を増加するようにプロモーターに作用する。実施例は、１００〜２７０ｂｐの複製起点の後ろ側（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。
【００７２】
上記のように、特定の実施態様において、ベクターは、レトロウイルスベクターのようなウイルスベクターであり得る。例えば、レトロウイルスプラスミドベクターが由来され得るレトロウイルスとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺癌ウイルス。
【００７３】
ウイルスベクターは、１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびＭｉｌｌｅｒら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０（１９８９））に記載されるヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または任意の他のプロモーター（例えば、ヒストン、ｐｏｌＩＩＩ、およびβアクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない真核生物細胞性プロモーターのような細胞性プロモーター）。使用され得る他のウイルスプロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーター。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から、当業者に理解され、そして調節プロモーターまたは上記のプロモーターのいずれかの中から由来し得る。
【００７４】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入するために使用されて、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＭｉｌｌｅｒ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１：５−１４（１９９０）、その全体を本明細書中で参考として援用する）に記載されるようなＤＡＮ細胞株。ベクターは、当該分野で公知の任意の手段によってパッケージング細胞を形質導入し得る。このような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられるがこれらに限定されない。１つの代替において、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソームに封入され得るか、または脂質に結合され得、次いで宿主に投与され得る。
【００７５】
プロデューサー細胞株は、感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。このベクター粒子は、ＡＮＴポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子は使用されて、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞は、ＡＮＴポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：胚性幹細胞、胚性癌細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支表皮細胞。
【００７６】
本発明の実施態様（ここで、ウイルスベクターが使用されて組換えＡＮＴ発現構築物が調製される）の別の例として、１つの好ましい実施態様において、ＡＮＴポリペプチドまたは融合タンパク質の発現を指向する組換えウイルス構築物によって形質導入される宿主細胞は、発現されたＡＮＴポリペプチドまたは融合タンパク質を含むウイルス粒子を産生し得、これらウイルスの発芽の間にウイルス粒子によって取り込まれる宿主細胞膜の部分に由来する。別の好ましい実施態様において、ＡＮＴをコードする核酸配列は、バキュロウイルスシャトルベクターにクローニングされる。このベクターは次いで、バキュロウイルスで組替えられて、組換えバキュロウイルス発現構築物を生成し、これを使用して、例えば、Ｓｆ９またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）宿主細胞を感染する。このことは、以下に記載される：Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第３９巻、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（編）、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５；Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」、第１６章の第２節、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｈｏｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２、１６−３２〜１６−４８頁。
【００７７】
（宿主細胞）
別の局面において、本発明は、上記の組換えＡＮＴ発現構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、本発明のベクターおよび／または発現構築物（これらは、例えば、クローニングベクター、シャトルベクターまたは発現構築物であり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入、形質転換またはトランスフェクト）される。このベクターまたは構築物は、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。この遺伝子操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、またはＡＮＴポリペプチドもしくはＡＮＴ融合タンパク質をコードする遺伝子のような特定の遺伝子を増幅するに適切なように改変された従来の栄養培地中で培養され得る。発現のために選択された特定の宿主細胞のための培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、当業者に容易に明らかである。
【００７８】
宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、もしくは下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。本発明に従う適切な宿主細胞の例示的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定される必要はない：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｖｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば、酵母）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＳｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳまたは２９３細胞）；アデノウイルス；植物細胞、またはインビトロでの増幅にすでに適合させたかまたは新規にそのように樹立された任意の適切な細胞。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であるとみなされる。
【００７９】
様々な哺乳動物細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために使用され得る。哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５（１９８１）によって記載される、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合するベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株）が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター、およびエンハンサーを含み、そしてまた、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに例えばＡＮＴ発現構築物の調製に関して本明細書中で記載されるような５’隣接非転写配列も含む。ＳＶ４０スプライス由来のＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用され得る。構築物の宿主細胞への導入は、当業者が精通する種々の方法によってもたらされ得、これには、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎに媒介されるトランスフェクション、またはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓら、１９８６  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）が挙げれらるが、これらに限定されない。
【００８０】
当業者に理解されるように、特定の状況において、所望のＡＮＴをコードする構築物の発現に関連する利点を提供するために、本発明の組成物を調整すること、および宿主細胞による内因性ＡＮＴ発現がし易い条件下で、本発明の方法を実施することが所望され得る。例えば、宿主細胞ゲノムによってコードされるものと非常に類似する特定のＡＮＴをコードする核酸配列またはＡＮＴポリペプチドの検出は、宿主細胞ＡＮＴ遺伝子発現を阻害することによって促進され得る。別の例として、外因的に導入された組換えＡＮＴポリペプチドの機能的活性が、宿主細胞または宿主細胞に由来する生物学的サンプルにおいて決定されるべきである場合、内因性宿主細胞ＡＮＴ遺伝子発現を阻害することもまた利点であり得る。
【００８１】
従って、本発明の特定の好ましい実施態様において、宿主細胞は、内因性ＡＮＴの少なくとも１つのアイソフォーム欠如し得、そして特定の好ましい実施態様において、この宿主細胞は、全ての内因性ＡＮＴアイソフォームを欠如し得る。例えば、Ｇｉｒａｕｄら（１９８８  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８１：４０９）によって記載される酵母系において、３つ全ての酵母ＡＮＴアイソフォームを欠如し、かつ嫌気性条件下で増殖し得ないＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ三重ヌル変異体が記載される。他の好ましい実施態様において、内因性ＡＮＴアイソフォームコードする少なくとも１つの遺伝子の宿主細胞における発現は、実質的に損なわれる。内因性ＡＮＴアイソフォーム発現の実質的な損失は、特定の遺伝子発現をブロックすることについて当該分野で周知の種々の方法のいずれかによって達成され得、この方法としては、上記の部位特異的もしくは部位指向性変異誘発、遺伝子発現のアンチセンス阻害、遺伝子発現のリボソーム媒介性阻害、およびミトコンドリアＤＮＡを枯渇した（ｐ0）細胞の生成が挙げられる。
【００８２】
アンチセンス薬剤、および遺伝子療法についての標的化送達のための遺伝子をコードするＤＮＡとして使用するためのオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの同定は、当該分野で周知の方法を含む。例えば、このようなオリゴヌクレオチドの所望の特性、長さ、および他の特徴は周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的には、以下のような結合を使用することによって、内因性の核溶解性酵素による分解に耐性であるように設計される：ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、サルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステル、および他のこのような結合（例えば、Ａｇｒｗａｌら、Ｔｅｔｒｅｈｅｄｏｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８：３５３９−３５４２（１９８７）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：６６５７−６６６５（１９７１）；Ｓｔｅｃら、Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２６：２１９１−２１９４（１９８５）；Ｍｏｏｄｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：４７６９−４７８２（１９８９）；Ｕｚｎａｎｓｋｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４０：１３７−１４３（１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：３６７−４０２（１９８５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１４：９７−１００（１９８９）；Ｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｈｅｎ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，９７−１１７頁（１９８９）；Ｊａｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：７２３７−７２４６（１９８８）を参照のこと。
【００８３】
アンチセンスヌクレオチドは、配列特異的な様式で、ｍＲＮＡまたはＤＮＡのような核酸に結合するオリゴヌクレオチドである。相補配列を有するｍＲＮＡに結合される場合、アンチセンスは、ｍＲＮＡの翻訳を防止する（例えば、Ａｌｔｍａｎらの米国特許第５，１６８，０５３号；Ｉｎｏｕｙｅの米国特許第５，１９０，９３１号；Ｂｕｒｃｈの米国特許第５，１３５，９１７号；Ｓｍｉｔｈの米国特許第５，０８７，６１７号、およびＣｌｕｓｅｌら（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：３４０５−３４１１（これは、亜鈴状アンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する）を参照のこと）。三重分子は、同一線形三重分子を形成する二重鎖ＤＮＡを結合して、それにより転写を防止する一本鎖ＤＮＡをいう（例えば、Ｈｏｇａｎらの米国特許第５，１７６，９９６号（これは、二重鎖ＤＮＡ上の標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドを作製するための方法を記載する）を参照のこと）。
【００８４】
本発明のこの実施態様に従って、特に有用なアンチセンスヌクレオチドおよび三重鎖分子は、内因性のＡＮＴ遺伝子の発現に関連するＡＮＴポリペプチドもしくは他の任意のプロセスを媒介するタンパク質をコードする、センス鎖ＤＮＡもしくはｍＲＮＡに相補的かまたはをそれらに結合する分子であり、その結果、ＡＮＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の阻害がもたらされる。
【００８５】
リボザイムは、ｍＲＮＡのようなＲＮＡ基質を特異的に切断するＲＮＡ分子であり、細胞性遺伝子発現で特異的に阻害または干渉を生じる。ＲＮＡ鎖の切断および／または連結に関与するリボザイムには、少なくとも５つの公知のクラスがある。リボザイムは、任意のＲＮＡ転写物に対して標的化され得、そしてこのような転写物を触媒的に切断し得る（例えば、米国特許第５，２７２，２６２号；同第５，１４４，０１９号；ならびにＣｅｃｈらに対する、同第５，１６８，０５３号、同第５，１８０，８１８号、同第５，１１６，７４２号および同第５，０９３，２４６号を参照のこと）。本発明の特定の実施態様に従って、例えば、任意のこのようなＡＮＴ  ｍＲＮＡ特異的リボザイムまたはこのようなリボザイムをコードする核酸は、宿主細胞に送達されてＡＮＴ遺伝子発現の阻害をもたらし得る。従って、リボザイムなどは、真核生物プロモーター（例えば、真核生物ウイルスプロモーター）に結合されるリボザイムをコードするＤＮＡによって宿主細胞に送達され得、その結果、核内への導入に際して、リボザイムは、直接的に転写される。
【００８６】
本明細書中で使用されるように、内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターアイソフォームをコードする遺伝子の発現は、細胞が内因性ＡＮＴアイソフォームをコードする機能的なＤＮＡまたは機能的なｍＲＮＡを、または関連のＡＮＴポリペプチドを実質的に欠乏するが、完全に欠乏する必要はない場合、任意の上記の阻害方法によって実質的に損なわれる。ＡＮＴアイソフォーム発現は、細胞が、好ましくは内因性ＡＮＴ（上記のような高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを使用して測定される場合）をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡを、またはＡＮＴポリペプチド（本明細書中で記載されるようなウエスタンイムノブロットによって測定される場合、また、例えば、Ｇｉｒａｕｄら、１９８８
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８１：４０９を参照のこと）を少なくとも５０％欠乏する；そしてより好ましくは、内因性ＡＮＴ  ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを少なくとも７５％欠乏する場合に、実質的に損なわれる。もっとも好ましくは、ＡＮＴアイソフォーム発現は、細胞が、これらの内因性ＡＮＴ  ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの＞９０％を欠乏する場合に、実質的に損なわれる。
【００８７】
あるいは、内因性アデニンヌクレオチドトランスロケーターアイソフォームをコードする遺伝子の発現は、ミトコンドリアＤＮＡが欠乏したρ0細胞（これは、ミトコンドリアの複製ができず、そしてそれゆえに機能的なＡＮＴポリペプチドを発現し続けないかもしれない）の使用によって、実質的に損なわれ得る。ρ0細胞を産生する方法は公知であり、そして例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０４０６３（これは、本明細書中で参考として援用される）に見出され得る。
【００８８】
（タンパク質の産生）
発現された組換えＡＮＴポリペプチドまたは融合タンパク質は、インタクトな宿主細胞において；インタクトなオルガネラ（例えば、ミトコンドリア、細胞膜、細胞内小胞、他の細胞性オルガネラ）において；あるいは細胞ホモジネートもしくは溶解産物、サブミトコンドリア粒子、単ラメラ小胞および多重ラメラ小胞または他の調製物を含むがこれらに限定されない、粉砕された細胞調製物において、有用であり得る。あるいは、発現された組換えＡＮＴポリペプチドまたは融合タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。タンパク質の再折り畳み工程は、必要であれば、成熟タンパク質の立体配置の完成において、使用され得る。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、最終的な精製工程のために使用され得る。
【００８９】
本発明のポリペプチドは、天然から精製された産物もしくは化学合成手順の産物であり得るか、または原核生物もしくは真核生物の宿主（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の細胞によって）から組換え技術によって産生され得る。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化されてもよいし、グリコシル化されなくともよい。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。
【００９０】
（サンプル）
「ミトコンドリアを含む生物学的サンプル」は、１以上の酸化可能な基質（例えば、グルコース、マレートまたはガラクトース）を供給した場合に膜電位を維持し得るインタクトなミトコンドリアが存在するかまたは存在すると考えられる、任意の組織または細胞調製物を包含し得る。ミトコンドリア膜電位は、蛍光指示薬、光学プローブならびに／または感受性ｐＨおよびイオン選択的電極（例えば、Ｅｒｎｓｔｅｒら、１９８１  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１：２２７ｓおよびそこに記載の参考文献を参照のこと；また、Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、２６６〜２７４頁および５８９〜５９４頁を参照のこと）のような検出可能な化合物の検出および／または測定を含むがこれらに限定されない、当業者が容易に知る方法に従って決定され得る。「電位を維持し得る」とは、このようなミトコンドリアが、特定の例において使用される検出可能な化合物（例えば、ＤＡＳＰＭＩ［２−，４−ジメチルアミノスチリル−Ｎ−メチルピリジニウム］、ＴＭＲＭ［テトラメチルローダミンメチルエステル］など）の蓄積を可能にするに十分な膜電位を有することを意味する。ミトコンドリアを含む生物学的サンプルは、例えば、正常な（すなわち健常な）個体に、または変化したミトコンドリアの機能に関連する疾患を有する個体に由来し得る。ミトコンドリアを含む生物学的サンプルは、被験体または生物学的供給源から血液サンプル、生検標本、組織外植片、器官培養物、または任意の他の組織もしくは細胞調製物を得ることによって提供され得る。被験体または生物学的供給源は、ヒトまたは非ヒト動物の、初代細胞培養物または培養に適応した細胞株（染色体に組み込まれたかまたはエピソーム性の組換え核酸配列を含み得る遺伝子操作された細胞株、不死化された細胞株または不死化可能な細胞株、体細胞ハイブリッドまたは細胞質ハイブリッド「サイブリッド（ｃｙｂｒｉｄ）」細胞株、分化された細胞株または分化可能な細胞株、形質転換された細胞株などを含むがこれらに限定されない）であり得る。
【００９１】
「生物学的サンプル」は、ミトコンドリアを含む生物学的サンプルについてまさに記載されるような任意の組織または細胞調製物を包含し得るが、インタクトなミトコンドリアの存在を必要としない。従って、「生物学的サンプル」は、任意の組織または細胞調製物を包含し得、そして「少なくとも１つの組換えＡＮＴポリペプチドを含む生物学的サンプル」は、本明細書中で提供されるような発現された組み換えＡＮＴポリペプチドまたは融合タンパク質が存在すると考えられる、任意の組織または細胞調製物を包含する。生物学的サンプルは、例えば、組換え細胞株またはトランスジェニック動物に由来し得る。組換えＡＮＴを含む生物学的サンプルは、被験体または生物学的供給源から血液サンプル、生検標本、組織外植片、器官培養物、または任意の他の組織もしくは細胞調製物を得ることによって提供され得る。被験体または生物学的供給源は、ヒトまたは非ヒト動物の、初代細胞培養物または培養に適応した細胞株（染色体に組み込まれたかまたはまたはエピソーム性の組換え核酸配列を含み得る遺伝子操作された細胞株、不死化された細胞株または不死化可能な細胞株、体細胞ハイブリッドまたは細胞質ハイブリッド「サイブリッド」細胞株、分化された細胞株または分化可能な細胞株、形質転換された細胞株などを含むがこれらに限定されない）であり得る。
【００９２】
（タンパク質）
本明細書中に記載されるように、本発明の方法に従って同定された薬剤が相互作用するミトコンドリア細孔成分またはミトコンドリア分子種の単離とは、例えば、その生物学的供給源からのそのような複合体の物理学的分離をいい、そして、本明細書中に、および引用される参考文献に記載される技術を含むがこれらに限定されない多くの任意の周知の技術によって、達成され得る。理論に束縛されることを望まないが、「ミトコンドリア成分を結合する」化合物は、ミトコンドリア分子成分に直接結合する必要はないが、ミトコンドリア分子成分に直接結合し得る、そして代替方法においてはミトコンドリア分子成分と結合する１以上のさらなる成分と相互作用することによってミトコンドリア分子と間接的に結合し得る、任意の分離した分子、薬剤化合物、物質の組成物などであり得る。化合物がミトコンドリア分子成分と結合および／または会合し得るこれらのまたは他の機構は、ミトコンドリア細孔成分の単離がまた、同定された薬剤に直接的または間接的に結合するミトコンドリア分子種の単離を生じる限り、本願方法の範囲内にある。従って、例えば、本明細書中で提供されるように、組換えＡＮＴポリペプチドおよび融合タンパク質を含む任意のＡＮＴポリペプチドは、ミトコンドリア分子成分および／またはミトコンドリア細孔成分であり得、そしてＡＮＴポリペプチドに結合する任意のＡＮＴリガンドまたは薬剤は、ミトコンドリア成分に結合する化合物、および／またはミトコンドリア細孔活性に影響を及ぼす薬剤であり得る。
【００９３】
本明細書中に記載されるように、ミトコンドリア透過性転移「細孔」は、別々の組立て複合体または複数のサブユニットの複合体でないかもしれず、従って、この用語は、内膜選択的透過性を調節する任意のミトコンドリア分子成分（例えば、それ自体がミトコンドリア膜を含む）を代わりにいう。ここで、このような調節される機能は、ＭＰＴの間に損なわれる。本明細書中で使用されるように、ミトコンドリアは、「ミトコンドリア分子成分」から構成され、これは、任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸またはそれらの誘導体；任意の脂質、脂肪酸など、またはそれらの誘導体など；任意の炭水化物、糖類など、またはそれらの誘導体、任意の核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン、ピリミジン、もしくは関連分子、またはそれらの誘導体；あるいはミトコンドリアの構成要素である任意の他の生体分子であり得る。「ミトコンドリア分子成分」は、「ミトコンドリア細孔成分」を含むが、これに限定されない。「ミトコンドリア細孔成分」は、上記のようなミトコンドリア膜の選択的透過性の特徴を調節する任意のミトコンドリア分子成分であり、ΔΨｍを確証する原因であるもの、およびＭＰＴの間に機能的に変更されるものを含む。
【００９４】
ミトコンドリア細孔活性に影響を及ぼす薬剤が相互作用するミトコンドリア細孔成分（単数または複数）の単離、ならびに必要に応じて、同定および／または特徴付けはまた、所望され、そして本発明の範囲内であり得る。一旦薬剤が、本明細書および米国０９／１６１，１７２において提供される方法に従ってＭＰＴを変化させることが示されると、当業者は、このような薬剤によって特異的に認識され、そしてＭＰＴの調節に関与する分子種を単離するために慣用的に使用され得る種々のアプローチに精通する。ここで、本明細書において使用されるような「単離」するとは、天然の生物学的環境からのこのような分子種の分離をいう。従って、例えば、一旦ＡＮＴリガンドが本明細書で提供される方法に従って調製されると、このようなアプローチは、ＡＮＴポリペプチドを単離するために慣用的に使用され得る。ＡＮＴポリペプチドのようなミトコンドリア細孔成分または融合タンパク質を単離するための技術は、その生物学的供給源からの複合体を分離するために有用な、任意の生物学的および／または生化学的方法を含み得、そして引き続く特徴付けは、標準的な生化学的および分子生物学的手順に従って実施され得る。当業者は、生物学的出発物質および他の因子に依存して適切な方法を選択し得る。このような方法は、生物学的サンプル中の細胞およびミトコンドリア成分の放射性標識またはそうでなければ検出可能な標識、細胞の分画、密度沈降、微分抽出、塩析、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、電気泳動、アフィニティー技術またはミトコンドリア細孔成分が相互作用する薬剤を用いる使用について適用され得る任意の他の適切な分離方法を含み得るが、これらに限定される必要はない。部分的に精製された成分に対する抗体は、当該分野で公知の方法に従って開発され得、そしてこのような成分を検出および／または単離するために使用され得る。
【００９５】
アフィニティー技術は、本発明の状況において特に有用であり得、そしてミトコンドリア細孔成分と、細孔成分と相互作用する本発明によって同定される薬剤との間の特異的結合相互作用を利用する任意の方法を含み得る。例えば、本明細書中で提供されるようなＡＮＴリガンドおよびＭＰＴに影響を与える他の薬剤は、固相マトリックス上で固定化され得るので、細孔成分の単離のためのアフィニティー結合技術が、特に有用であり得る。あるいは、公知のＭＰＴ活性剤または本明細書中で提供されるような新規のＡＮＴリガンドが反応性部分を用いて改変され得る、生体分子のアフィニティー標識方法は周知であり、そして、細孔成分中に検出可能なおよび／または回収可能な標識部分を導入する目的のために、薬剤と細孔成分との間の相互作用に対して容易に適応され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ；Ｓｃｏｐｅｓ、Ｒ．Ｋ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、１９８７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｇ．Ｔ．ら、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；アフィニティー技術を含む、生体分子の単離および特徴付けのための技術に関した詳細について、参照のこと）。
【００９６】
上記されるようなＭＰＴ−活性剤アフィニティ−技術または他の生化学的方法によって単離される、ミトコンドリア孔成分の分子種の特徴付けは、分光吸光度、分子サイズおよび／または電荷、可溶性、ペプチドマッピング、配列分析などのような孔成分の物理化学的性質を使用して達成され得る（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、前出、を参照のこと）。生体分子についてのさらなる分離工程は、ミトコンドリア孔成分と同時精製される分子種をさらに分離および同定するために、必要に応じて使用され得る。これらは当該分野において周知であり、そしてタンパク質、脂質、核酸、または炭水化物の単離のための任意の分離方法を含み得る。これらは、代表的には複合体の新たに同定された成分の物理化学的性質に基づく。そのような方法の例として、ＲＰ−ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ネイティブおよび／または変性した一次元電気泳動および二次元電気泳動、限界濾過、キャピラリー電気泳動、基質アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、または他の有用な分離方法が挙げられる。好ましくは培養細胞の抽出物が、そして特に好ましい実施態様においては生物学的組織または器官の抽出物が、ＡＮＴポリペプチドを含むミトコンドリア分子成分の供給源であり得る。好ましい供給源には、血液、脳、線維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、または他の細胞型が挙げられ得る。
【００９７】
（ＡＮＴリガンド）
上記のように、アデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）の結合は、ミトコンドリア内膜を通過するＡＤＰおよびＡＴＰの輸送を媒介することを担う。ＡＮＴはまた、ミトコンドリアの透過性移行孔（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｐｏｒｅ）であるＣａ2+調節内膜チャネル（これは、アポトーシス工程において重要な調節の役割を担う）の重要な成分として関連付けられている。さらに、ＡＮＴ活性は、ＡＮＴに結合し得る薬剤を使用した研究（Ｂｌｏｃｋら、１９８６  Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２５：６５８）によって証拠付けられるように、ミトコンドリア膜内でのＡＮＴポリペプチド立体配座における変化に関連するようである。従って、ＡＮＴに結合する薬剤（この薬剤は本明細書中でまた、ＡＮＴリガンドと呼ばれる）を生産および同定するための組成物ならびに方法を提供することは、本発明の別の局面である。
【００９８】
ＡＮＴと種々の低分子との間の結合相互作用は当業者に公知である。例えば、これらの相互作用には、アトラクチロシド、カルボキシアトラクチロシド、パルミトイル−コンカナバリンＡ、ボンクレキン酸、サイロキシン、エオシンＹおよびエリトロシンＢによるＡＮＴへの結合が含まれる（例えば、Ｓｔｕｂｂｓ、１９７９  Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．７：３２９；Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇら、１９７８  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５０３：１９３；Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、１９８６  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１９：２９２；Ｍａｊｉｍａら、１９９８  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：４２４；Ｂｌｏｃｋら、１９８６  Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２５：６５８を参照のこと；エリトロシンＢおよびさらなるＡＮＴインヒビターについては、Ｂｅａｖｉｓら、１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：９９７；Ｐｏｗｅｒｓら、１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０６１４を参照のこと）。
【００９９】
本発明のＡＮＴリガンドは、新規のアトラクチロシド誘導体を表す。アトラクチロシド（ＡＴＲ）およびその公知の誘導体（カルボキシアトラクチロシド（ＣＡＴＲ）、ナフトイル−ＡＴＲ、ＭＡＮＴ−ＡＴＲおよび他のＡＴＲ誘導体を含む（例えば、Ｂｏｕｌａｙら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２８；３２３−３３０，１９８３；Ｒｏｕｘら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３４：３１−３７、１９９６；Ｌａｕｑｕｉｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６７：３０６−３１１、１９７６；およびＧｏｔｔｉｋｈら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２６：４４１９−４４３３，１９７０を参照のこと；他の公知のＡＴＲ誘導体については、例えば、Ｂｌｏｃｋら、１９８６  Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２５：６５８を参照のこと））は、アデニンヌクレオチドトランスロケーターの構造およびその作用機構の解明において、非常に貴重であることが証明されている。本発明のＡＮＴリガンドに従って、ＡＮＴへのＡＴＲの結合様式は、ＡＮＴに対するＡＴＲ結合親和性を有意に変えることなくＡＴＲ  ６’−ヒドロキシル機能性の改変を可能にする。従って、本明細書中に提供されるようなＡＮＴリガンドは、６’ヒドロキシル位置で化学的置換により改変されたＡＴＲ誘導体であり得る。特に、本明細書中に提供されるような新規のＡＮＴリガンドは、６’位置に長いリンカー部分をさらに含む。このリンカーは６’−アミンリンカーを含み得、それによって、当業者に理解されるようにそして限定されない実施例において図解されるように、ＡＮＴリガンドへのさらなる化学的改変を可能にする。また、実施例６−１１に示されるように、本明細書に提供されるようなリンカーは、２〜２０の炭素原子の炭素鎖骨格を有し得、そして好ましい実施態様においては２〜６の炭素原子の炭素鎖骨格を有し得る。
【０１００】
従って、本発明は、さらなるＡＴＲ誘導体（これは、本発明の範囲内にあるＡＮＴリガンドである）を産生するための種々のさらなる化学的部分への結合についての媒介物であり得るＡＮＴリガンドを提供する。これらは、125Ｉが穏和な反応条件下で共有結合的に結合し得るＡＮＴリガンドを含み；本発明はまた、反応性アミン基が共有結合的に連結され得るＡＮＴリガンドを含む。次いで、アミン含有ＡＴＲ誘導体のようなＡＮＴリガンドは、種々の発蛍光団、ならびに例えば反応性イソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、無水物、および他の有用な機能性を保有するハプテンと反応して、例えば、チオ尿素、アミドまたは他の結合を有する誘導体を含む安定なＡＴＲ誘導体を産生し得る。
【０１０１】
従って、本明細書中に提供されるＡＮＴリガンドはまた、６’位置で誘導された置換基によって検出され得るＡＴＲ誘導体を含む。従って、本明細書中に提供されるような検出可能なＡＴＲ誘導体には、６’ヒドロキシル置換基（これは、例えば125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、または35Ｓの放射性標識された置換基を含む）を有するＡＴＲ誘導体が挙げられる。検出可能なＡＴＲ誘導体である他のＡＮＴリガンドは、蛍光性の置換基を含み得る。これは、ＡＮＴに結合する薬剤を同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイにおける有用性を有する発蛍光団およびハプテンのようなレポーター分子で適切に標識された置換基を含む。より詳細には、好ましい実施態様において、蛍光性の置換基を含む本発明に従ったＡＮＴリガンドは、消衰係数≧１０，０００Ｍ-1（表１を参照のこと）を有し；さらに、この特性は、本明細書に提供される方法に従うようなＡＮＴリガンドの使用についての、および特にハイスループットスクリーニングアッセイにおける使用についての利点を提供する。さらに、本発明のＡＮＴリガンドは、ＡＮＴに高い親和性を示し、そして好ましい実施態様において、ナノモル濃度の範囲の結合定数を有する。
【０１０２】
本発明の特定の実施態様において、ＡＮＴリガンドは、ＡＴＲ−ランタニドキレート剤（これは、時間分解（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光検出、例えば、Ｅｕ3+、Ｔｂ3+、Ｓｍ3+およびＤｙ3+のようなランタニドイオンに複合形成化したこれらの化合物の検出において有用性を有する）のようなＡＴＲ誘導体であり得る。さらに、ＡＮＴリガンドは、高い蛍光部分のような容易に検出可能な置換基に結合したＡＴＲを含み得る。これは例えば、例示の目的のために、シアニンおよびクマリン誘導体を含み得るが、これらに限定されない。これらおよび他の高度な蛍光性の置換基は、本発明の方法に従って、非常に高感度で検出可能なＡＮＴリガンドの合成を可能にする。当業者は、使用され得るさらなる蛍光性の置換基（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲに開示されるような蛍光性の置換基）を承知する。他の実施態様において、本発明は、ビオチン−ＮＨＳエステルと本明細書中に開示されるＡＴＲ誘導体とのカップリングにより産生される検出可能なＡＮＴリガンドを提供する；本発明の方法に従って同様に産生されるこれらおよび他のＡＮＴリガンドは、例えば、比色定量、蛍光、または化学発光技術を使用する市販の酵素−アビジン結合体で検出され得る。
【０１０３】
１つの実施態様において、本発明のＡＮＴリガンドは、以下の構造（Ｉ）を有する：
【０１０４】
【化３】
2004154139.tif 000003
これは、その立体異性体および薬学的に受容可能な塩を含み、
ここで、
Ｒ1はヒドロキシル、ハロゲン、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ4または−ＮＨＲ4；
Ｒ2は、水素、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5；
Ｒ3は、−ＣＨ3または＝ＣＨ2；
Ｒ4は、−Ｘ−アリール、−Ｘ−置換されたアリール、−Ｘ−アリールアルキル、−Ｘ−置換されたアリールアルキル、Ｘ−ヘテロアリール、または−Ｘ−ヘテロアリールアルキルであり、ここでＸは任意のアミドまたはアルキルアミドリンカー部分であり；そして
Ｒ5は、アルキルである。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、上記の用語は、以下に述べられる意味を有する。
【０１０６】
「アミド」は、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−を意味する。
【０１０７】
「アルキルアミド」は、−（アルキル）−ＮＨＣ（＝Ｏ）−または−（アルキル）−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、例えば−ＣＨ2ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ2ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−などを意味する。
【０１０８】
「アルキル」は、１〜８の炭素原子を含む直鎖状または分枝の、非環状または環状の、不飽和または飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが含まれ；一方、飽和分枝アルキルには、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどが含まれる。代表的な飽和環状アルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれ；一方、不飽和環状アルキルには、シクロペンテニル（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｅｎｙｌ）、およびシクロヘキセニル（ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｙｌ）などが含まれる。不飽和アルキルは、少なくとも１つの二重結合または三重結合を隣接する炭素原子間に含む（それぞれ、「アルケニル」または「アルキニル」と呼ばれる）。代表的な直鎖アルケニルおよび分枝したアルケニルには、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが含まれ；一方、代表的な直鎖アルキニルおよび分枝したアルキニルには、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニルなどが含まれる。
【０１０９】
「アリール」は、フェニルまたはナフチル（すなわち、１−ナフチルまたは２−ナフチル）のような芳香族炭素環部分を意味する。
【０１１０】
「アリールアルキル」は、アリール部分と置換された少なくとも１つのアルキル水素原子を有するアルキルを意味し、例えばベンジル、−（ＣＨ2）2フェニル、−（ＣＨ2）3フェニルなどを意味する。
【０１１１】
「ヘテロアリール」は、５〜１０員の芳香族ヘテロ環を意味し、そしてこれは、窒素、酸素、および硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロアトムを有し、そして少なくとも１つの炭素原子（モノ−および二環式系の両方を含む）を含有する。代表的なヘテロアリールには、ピリジル、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、ピロリル、インドリル、オキサゾリル、ベンズオキサゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタルアジニル（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、およびキナゾリニルである。
【０１１２】
「ヘテロアリールアルキル」は、ヘテロアリール部分と置換された少なくとも１つのアルキル水素原子を有するアルキルを意味し、例えば、−ＣＨ2ピリジニル、−ＣＨ2ピリミジニルなどを意味する。
【０１１３】
「ヘテロ環」は、５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式、飽和、不飽和、もしくは芳香族のいずれかのヘテロ環を意味し、そしてこれは窒素、酸素および硫黄から独立に選択される１〜４のヘテロアトムを含む。ここで窒素および硫黄へテロアトムは、必要に応じて酸化され得、そして窒素へテロアトムは必要に応じてクオーターナイズ（ｑｕａｔｅｒｎｉｚｅ）され得、二環式環を含む（ここで、任意の上記のヘテロ環がベンゼン環に融合される）。ヘテロ環は任意のヘテロアトムまたは炭素原子を通して接着され得る。ヘテロ環には、上記のようなヘテロアリールを含む。従って、上記に列挙されたヘテロアリールに加えて、ヘテロ環はまた、モルフォニリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロールアクタミル（ｖａｌｅｒｏｌａｃｔａｍｙｌ）、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが含まれる。
【０１１４】
「ヘテロ環アルキル」は、ヘテロ環と置換された少なくとも１つのアルキル水素原子を有するアルキルを意味し、例えば、−ＣＨ2モルフォニリルなどを意味する。
【０１１５】
本明細書中で使用される用語「置換された」は、任意の上記の基（すなわち、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロ環、およびヘテロ環アルキル）を意味し、ここで少なくとも１つの水素原子が置換基で置換される。ケト置換基（「Ｃ（＝Ｏ）」）の場合、２つの水素原子が置換されている。置換基には、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、ハロアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、ヘテロ環、置換されたヘテロ環、ヘテロ環アルキル、または置換されたヘテロ環アルキルを含む。
【０１１６】
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
【０１１７】
「ハロアルキル」は、ハロゲンと置換された少なくとも１つの水素原子を有するアルキルを意味し、例えば、トリフルオロメチルなどを意味する。
【０１１８】
「アルコキシ」は、酸素ブリッジ（すなわち、−Ｏ−アルキル）を通して結合されたアルキル部分を意味し、例えば、メトキシ、エトキシなどを意味する。
【０１１９】
１つの実施態様において、Ｒ2は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｒ3は＝ＣＨ2であり、そしてＡＮＴリガンドは、以下の式（ＩＩ）を有するアトラクチロシド誘導体である：
【０１２０】
【化４】
2004154139.tif 000004
ここで、Ｒ1は，上記に規定される。
【０１２１】
別の実施態様において、Ｒ2は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、Ｒ3は−ＣＨ3であり、そしてＡＮＴリガンドは、以下の式（ＩＩＩ）を有するジヒドロアトラクチロシド誘導体である：
【０１２２】
【化５】
2004154139.tif 000005
ここで、Ｒ1は，上記に規定される。
【０１２３】
なおさらなる実施態様において、Ｒ2は−ＯＨであり、Ｒ3は＝ＣＨ2であり、そしてＡＮＴリガンドは、以下の構造（ＩＶ）を有するアポアトラクチロシド（ａｐｏａｔｒａｃｔｙｌｏｓｉｄｅ）誘導体である：
【０１２４】
【化６】
2004154139.tif 000006
ここで、Ｒ1は上記に規定されるとおりである。
【０１２５】
構造（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）のより特定の実施態様において、Ｒ1は以下である：−ＯＣ（＝Ｏ）（アリール）、−ＯＣ（＝Ｏ）（置換アリール）、−ＯＣ（＝Ｏ）（アリールアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（置換アリールアルキル）、−ＮＨ（ＣＨ2）2ＮＨＣ（＝Ｏ）（アリールアルキル）、−ＮＨ（ＣＨ2）2ＮＨＣ（＝Ｏ）（置換アリールアルキル）。この点における代表的なＲ1部分には以下が挙げられる：−ＯＣ（＝Ｏ）（フェニル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（１−ナフチル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（置換フェニル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（置換１−ナフチル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ2）1〜3（フェニル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（ＣＨ2）1〜3（置換フェニル）、−ＮＨ（ＣＨ2）2ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ2）1〜3（フェニル）、−ＮＨ（ＣＨ2）2ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ2）1〜3（置換フェニル）。この状況において、代表的な置換フェニル部分には、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：４−ヒドロキシフェニル、３−ヨード−４−ヒドロキシフェニル、３，５−ヨード−４−ヒドロキシフェニル、４−（４−ヒドロキシフェニル）フェニル、４−（３−ヨード−４−ヒドロキシフェニル）フェニル、３−メチル−４−ヒドロキシフェニル、および３−メチル−４−ヒドロキシ−５−ヨードフェニル。
【０１２６】
構造（Ｉ）のＡＮＴリガンドは、有機化学分野の当業者によって、そしてより詳細には実施例６〜１１において開示される技術によって、容易に作製され得る。
【０１２７】
本発明の化合物は、一般に、遊離塩基として利用され得る。あるいは、本発明の化合物は、酸付加塩の形態で使用され得る。本発明の遊離のアミノ化合物の酸付加塩は、当該分野において周知の方法によって調製され得、そして有機酸および無機酸から形成され得る。適切な有機酸には以下が挙げられる：マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、マンデル酸、ケイ皮酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、グリコール酸、グルタミン酸、およびベンゼンスルホン酸。適切な無機酸には以下が挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸。従って、構造（Ｉ）の用語「薬学的に受容可能な塩」は、任意の、そしてすべての受容可能な塩形態を含むことが意図される。
【０１２８】
立体異性体に関して、構造（Ｉ）の化合物は、キラル中心を有し得、そしてラセミ体、ラセミ混合物として、および個々のエナンチオマーまたはジアステレオマーとして生じ得る。すべてのそのような異性体形態は、本発明に含まれ、その混合物を含む。さらに、構造（Ｉ）の化合物の結晶形態のいくつかは、多形相として存在し得、これは本発明に含まれる。さらに、構造（Ｉ）の化合物のいくつかはまた、水または他の有機溶媒と溶媒和物を形成し得る。そのような溶媒和物は、同様に、本発明の範囲内に含まれる。
【０１２９】
ＡＮＴリガンドの活性は、代表的には、単離もしくは精製されたポリペプチドとして、または単離されたミトコンドリアもしくは亜ミトコンドリア粒子（ＳＭＰ）を含む調製物の成分として存在し得るＡＮＴ分子由来の検出可能な（すなわち、検出可能に標識された、例えば放射能標識された）リガンドの５０％を置換するに必要な化合物の濃度としてのＩＣ50から、確立されたリガンド結合アッセイもしくはその改変体を使用して算定される。例えば、ＡＮＴリガンドは、放射能標識されたＡＴＲ、または本明細書中に提供されるような化合物２４のような放射能標識されたＡＴＲ誘導体と、単離されたＡＮＴポリペプチドまたは単離されたミトコンドリアまたはＳＭＰ中に存在するＡＮＴへの結合について競合する能力について試験され得る。
【０１３０】
別の例として、本明細書中において提供されるような種々のＡＮＴリガンドののＡＮＴについての相対的親和性は、化合物２２（実施例１１、これは、３１２ｎｍで蛍光励起ピーク、そして４００ｎｍで発光ピークを有するＡＮＴリガンドであるナフトイル−ＡＴＲ誘導体である）の蛍光特性を利用する蛍光アッセイによって決定され得る。化合物２２がＡＮＴに結合する場合、蛍光はクエンチされる。しかし、化合物２２が、既知の濃度のＡＴＲまたはＡＮＴリガンドであるＡＴＲ誘導体によってＡＮＴから置換される場合、発蛍光団の置換から生じる蛍光脱クエンチングは、リアルタイムで測定され得る。
【０１３１】
手短には、ミトコンドリア調製物（例えば、実施例１３を参照のこと）は、洗浄され、化合物２２の存在下で適切な緩衝液中に再懸濁され（例えば、１ｍｇのミトコンドリアタンパク質あたり、３．６ｎｍｏｌｅの化合物２２を含む、１０ｍＭのＴｒｉｓ−１２０ｍＭ  ＫＣｌ、室温にて１０分）、結合していない発蛍光団を除去するために洗浄され、そして光源および発蛍光団に適切なフィルターセットを備え付けられた蛍光光度計に置かれる。蛍光強度は、時間の関数としてモニタリングされ、次いで候補ＡＮＴリガンドは添加され、検出可能な相対的蛍光強度単位における変化によって証明されるように、ＡＮＴへの結合について化合物２２と競合する能力を決定される。蛍光シグナルが安定化した後、ＡＮＴに結合したままである任意のさらなる化合物２２は、競合インヒビターとしての過剰（例えば、μＭ量）のＡＴＲを添加することにより置き換えられ、最大のシグナル強度を決定され、それから候補ＡＮＴリガンドによって置き換えられた化合物２２の比率を計算される。当業者は、改変および変更が、上記に例示され、そして候補ＡＮＴリガンドのＩＣ50値を決定するための実施例において記載され、そして限定することを意図されないアッセイのようなＡＮＴ結合アッセイに対してなされ得ることを理解する。
【０１３２】
各ＡＮＴリガンドの活性は、以下の等式によって算定される「Ｋi」値として報告される：
【０１３３】
【数１】
2004154139.tif 000007
ここで、Ｌ＝放射リガンド、そしてＫD＝レセプターに対する放射リガンドの親和性である（ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９、１９７３）。本発明のＡＮＴリガンドは、１００μＭ以下のＫiを有する。本発明の好ましい実施態様において、ＡＮＴリガンドは、１０μＭ未満、そしてより好ましくは１μＭ未満のＫiを有する。この目的のために、１００μＭ未満のＫiを有する本発明のＡＮＴリガンドには以下が挙げられる：化合物５（実施例７）、化合物６（実施例８）、ならびに化合物２２、２３、２４、２６、２９、３３、３５、３７、および３８（実施例１１）。１０μＭ未満のＫiを有する好ましいＡＮＴリガンドには、化合物６、２２、２３、２４、２９、３３、３５、および３８が挙げられ、そして１μＭ未満のＫiを有するより好ましいＡＮＴリガンドには、化合物６、２４、３３、および３８、ならびにＡＴＲが挙げられる。
【０１３４】
（アッセイ）
本発明の別の局面は、ＡＮＴポリペプチドの存在の決定のための組成物および方法、ならびにＡＮＴポリペプチドに結合するか、またはそれと相互作用する薬剤の同定のための組成物および方法を提供することである。そのような組成物および方法は、診断目的および予後判定目的のために、例えば、上記のような、正常な状態および疾患状態の両方を伴い得る改変されたミトコンドリア機能の存在の決定において有用である。これらの組成物および方法はまた、ミトコンドリア活性におけるＡＮＴの役割（例えば、以下が例示のために挙げられるが、それらに限定されない：ミトコンドリア膜電圧の維持、ＡＴＰ生合成、アポトーシスの誘導、ＭＰＴ、および他のミトコンドリア機能）に基づくミトコンドリアの機能を改変または調節する薬剤の同定のために有用である。特定の好ましい実施態様において、これらの組成物および方法は、高スループットスクリーニングアッセイとして有用である。
【０１３５】
特定の局面において、本発明は、生物学的サンプル中のＡＮＴポリペプチドの存在を決定するための方法を提供し、この方法は、ＡＮＴリガンドのＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にするに十分な条件および時間で、ＡＮＴリガンドと、ＡＮＴポリペプチドを含むと疑われるサンプルとを接触させる工程、およびそのような結合を検出する工程を包含する。本発明のこれらの局面による「ＡＮＴリガンド」は、本明細書中に提供されるような、任意の新規なＡＮＴリガンドを含み得る。これらの方法によるヒトＡＮＴ１、ＡＮＴ２、およびＡＮＴ３の使用は、特に好ましい実施態様を示す。他の好ましい実施態様は、本明細書中に提供される、任意のＡＮＴポリペプチドまたはＡＮＴ融合タンパク質の使用を含む。従って、サンプルにおけるＡＮＴポリペプチドの存在を決定するための本方法は、本明細書中に提供されるＡＮＴコード構築物の発現をモニタリングするために有用である。いくつかの好ましい実施態様において、ＧＳＴ融合タンパク質であるＡＮＴ融合タンパク質が使用され、そして他の好ましい実施態様において、ＡＮＴ融合タンパク質はＨｉｓタグ化融合タンパク質である。本明細書中に提供されるように、生物学的サンプルは、細胞、ミトコンドリア、亜ミトコンドリア粒子、細胞膜（本明細書中に記載されるような任意の細胞膜を含む）、細胞抽出物、細胞馴化培地、組織ホモジネート、または単離されたＡＮＴであり得る。
【０１３６】
他の局面において、本発明は、ＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を同定するための方法を提供し、この方法は、薬剤のＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にするに十分な条件および時間で、候補薬剤と少なくとも１つの組換えＡＮＴポリペプチドを発現する宿主細胞とを接触させる工程、およびそのような結合を検出する工程を包含する。種々の好ましい実施態様において、宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。特定の他の好ましい実施態様において、宿主細胞は、例えば、１つ以上の内因性ＡＮＴコード遺伝子における変異に起因して、内因性ＡＮＴの少なくとも１つのイソ型を欠失し得る。特定の他の実施態様において、内因性ＡＮＴイソ型をコードする少なくとも１つの遺伝子の宿主細胞発現は、実質的に、例えば、本明細書中に提供されるようなＡＮＴ核酸特異的リボザイムまたはアンチセンス構築物の使用を介して、あるいはまた本明細書中に提供されるようなρ0細胞の使用を介して低減される。本発明のこの局面の他の実施態様によって、インタクトな細胞、または透過性にされた細胞を使用することが好ましくあり得る。当業者は、細胞を透過性にするための方法に精通しており、例えば、以下が例示のために挙げられるが、それらに限定されない：界面活性剤、洗剤、リン脂質、リン脂質結合タンパク質、酵素、ウイルス膜融合タンパク質などの使用；浸透圧活性剤の使用を介して；化学架橋剤を使用することによって；エレクトロポレーションなどを含む物理化学的方法によって、または他の透過性方法論によって。
【０１３７】
他の局面において、本発明は、ＡＮＴポリペプチドに結合する薬剤を同定するための方法を提供し、この方法は、薬剤のＡＮＴポリペプチドへの結合を可能にするに十分な条件および時間で、候補薬剤と、少なくとも１つの組換えＡＮＴポリペプチドを含む生物学的サンプルとを接触させる工程、およびそのような結合を検出する工程を包含する。これらの方法によるヒトＡＮＴ１、ＡＮＴ２、およびＡＮＴ３の使用は、特に好ましい実施態様を示す。他の好ましい実施態様は、本明細書中に提供される任意のＡＮＴポリペプチドまたはＡＮＴ融合タンパク質の使用を含む。いくつかの好ましい実施態様において、ＧＳＴ融合タンパク質であるＡＮＴ融合タンパク質が使用され、そして他の好ましい実施態様において、ＡＮＴ融合タンパク質はＨｉｓタグ化融合タンパク質である。本明細書中に提供されるように、生物学的サンプルは、細胞、ミトコンドリア、亜ミトコンドリア粒子、細胞膜（本明細書中に記載されるような任意の細胞膜を含む）、細胞抽出物、細胞馴化培地、組換えウイルス粒子、組織ホモジネート、または単離されたＡＮＴであり得る。結合の検出は、種々の方法のいずれかによってであり得、そしてスクリーニングされている候補薬剤の性質に依存する。例えば、特定の候補薬剤が、物理化学的特性（例えば、当業者に明らかであるもの、分光学的特性、発色特性、蛍光特性、溶解特性、疎水性特性、親水性特性、電気安定性荷電、分子量、または他の物理化学的特性を含む）の結果として固有に検出可能である。別の例として、特定の候補薬剤は、当該分野において周知であるような、容易に検出可能な放射性核種で放射性標識され得る。特定の候補薬剤はまた、ＡＮＴタンパク質アフィニティー方法論によって（例えば、ＡＮＴ特異的抗体のＡＮＴへの結合を妨害する能力によって；またはＡＮＴ融合タンパク質の一部分として存在する融合ポリペプチドに結合するタンパク質アフィニティー試薬を使用するアッセイ溶液から除去可能であることによって）、直接的または間接的に検出可能であり得る。ＡＮＴポリペプチドに結合する候補薬剤は、関連分子の検出、同定、または特徴付けについて公知の任意の方法（分光光度技術、質量分析技術、クロマトグラフィー技術、電気泳動分析、発色分析、または任意の他の適切な分析技術を含む）により検出され得る。
【０１３８】
別の局面において、本発明は、ＡＮＴポリペプチドと相互作用する薬剤を同定するための方法を提供し、この方法は、候補薬剤の存在下で、検出可能なＡＮＴリガンド（またはＡＮＴに結合し得る公知の検出可能な分子）と、組換えＡＮＴを含む生物学的サンプルとを接触させる工程、および薬剤の非存在下での組換えＡＮＴへの検出可能なＡＮＴリガンド（または、公知の検出可能なＡＮＴ結合分子）の結合と、薬剤の存在下での組換えＡＮＴへの検出可能なＡＮＴリガンド（または、公知の検出可能なＡＮＴ結合分子）の結合とを比較する工程、およびそれからＡＮＴポリペプチドと相互作用する薬剤を同定する工程を包含する。特定の好ましい実施態様において、この局面は、本明細書中上記に提供される新規なＡＮＴリガンドが有用である競合結合アッセイを提供することが理解される。しかし、本発明のこの局面は、それほど限定される必要はなく、そして公知の検出可能なＡＮＴ結合分子を使用するように改変され得る。その場合、生物学的サンプルおよび／または本発明によって提供される組換えＡＮＴの選択は、当該分野において以前に知られていない予測しない利点を提供することに注意されるべきである。公知の検出可能なＡＮＴ結合分子の例には、以下が挙げられる：適切に標識されたＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＴＲ、ＣＡＴＲ、パルミトイル−ＣｏＡ、ボンクレキン酸、チロキシン、エオシンＹ、およびエリトロシンＢ、または当該分野において公知の他のＡＮＴ結合分子（例えば、Ｂｌｏｃｋら、１９８６、Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２５：６５８を参照のこと）。これらの方法によるヒトＡＮＴ１、ＡＮＴ２、およびＡＮＴ３の使用は、特に好ましい実施態様を示す。他の好ましい実施態様は、本明細書中に提供される任意のＡＮＴポリペプチドまたはＡＮＴ融合タンパク質の使用を含む。いくつかの好ましい実施態様において、ＧＳＴ融合タンパク質であるＡＮＴ融合タンパク質が使用され、そして他の好ましい実施態様において、ＡＮＴ融合タンパク質はＨｉｓタグ化融合タンパク質である。本明細書中に提供されるように、生物学的サンプルは、細胞、ミトコンドリア、亜ミトコンドリア粒子、細胞膜（本明細書中に記載されるような任意の細胞膜を含む）、細胞抽出物、細胞馴化培地、組換えウイルス粒子、組織ホモジネート、または単離されたＡＮＴであり得る。
【０１３９】
ＡＮＴリガンド化合物は、本発明の方法において使用される場合、好ましくは、薬学的組成物の一部である。薬学的組成物は、１つ以上のＡＮＴリガンドに加えて、少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤、および必要に応じて、他の成分を含む。
【０１４０】
治療的用途のための「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的分野において周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。例えば、生理的ｐＨでの滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝化生理食塩水が、使用され得る。保存剤、安定剤、色素、および矯味矯臭薬でさえ、薬学的組成物中に提供され得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが、保存剤として添加され得る（同書、１４４９）。さらに、酸化防止剤および懸濁化剤が使用され得る（同書）。
【０１４１】
「薬学的に受容可能な塩」は、このような化合物と有機酸もしくは無機酸（酸付加塩）、または有機塩基もしくは無機塩基（塩基付加塩）の組み合わせに由来する本発明の化合物の塩をいう。本発明の化合物は、遊離塩基または塩の形態のいずれかで使用され得、両形態とも、本発明の範囲内であるとみなされる。
【０１４２】
１つ以上のＡＮＴ基質／リガンド化合物を含む薬学的組成物は、組成物が患者に投与されることを可能にする任意の形態であり得る。例えば、組成物は、固体、液体、または気体（エアロゾル）の形態であり得る。代表的な投与経路としては、経口投与、局所投与、非経口投与（例えば、舌下または経頬）、舌下投与、直腸投与、膣内投与、および鼻内投与が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される用語「非経口」には、皮下注射、静脈内、筋内、胸骨下、海綿内、道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）、尿管間の注射または注入技術が含まれる。薬学的組成物は、その中に含有される活性成分を、患者への組成物の投与の際に生体利用可能にするように処方される。患者に投与される組成物は、1つ以上の投与単位の形態をとり、この場合、例えば、錠剤は、単回投与単位であり得、そしてエアロゾル形態で本発明の１つ以上の化合物を含むコンテナーは、複数の投与単位を保持し得る。
【０１４３】
経口投与のために、賦形剤および／または結合剤が、存在し得る。例は、スクロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、およびエチルセルロースである。着色剤および／または矯味矯臭薬が存在し得る。コーティング殻が用いられ得る。
【０１４４】
組成物は、液体の形態（例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルジョン、または懸濁液）であり得る。脂質は、２つの例として、経口投与のため、または注射による送達のためであり得る。経口投与が意図された場合、好ましい組成物は、１つ以上のＡＮＴ基質／リガンド化合物に加えて、１つ以上の甘味剤、保存剤、色素／着色剤および矯味矯臭薬を含有する。注射により投与されることが意図された組成物には、１つ以上の界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝液、安定剤、および等張剤が含まれ得る。
【０１４５】
本明細書中で使用される液体薬学的組成物は、溶液、懸濁液または他の同様の形態のいずれの形態であれ、以下のアジュバントの１つ以上を含み得る：滅菌希釈液（例えば、注射用水）、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンガー溶液、等張性塩化ナトリウム、不揮発性油（例えば、合成モノグリセリドまたはジグリセリド（これは、溶媒または懸濁媒体として作用し得る））、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；抗細菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩）；および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または多回投与バイアルに封入され得る。生理食塩水が好ましいアジュバントである。注射用薬学的組成物は、好ましくは滅菌である。
【０１４６】
非経口または経口投与のいずれかが意図される液体組成物は、適切な投薬量が得られるような量のＡＮＴ基質／リガンド化合物を含むべきである。代表的には、この量は、組成物中において少なくとも０．０１重量％のＡＮＴ基質／リガンド化合物である。経口投与が意図される場合、この量は、組成物の重量の０．１〜約７０％の範囲を変動し得る。好ましい経口組成物は、約４％〜約５０％のＡＮＴ基質／リガンド化合物を含む。好ましい組成物および調製物は、非経口投与単位が活性化合物の重量の０．０１〜１％を含むように調製される。
【０１４７】
薬学的組成物は、キャリアが溶液、エマルジョン、軟膏、またゲル基剤を適切に含み得る場合、局所投与が意図され得る。基剤は、例えば、以下の１つ以上を含み得る：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜ろう、鉱油、希釈剤（例えば、水およびアルコール）、ならびに乳化剤および安定剤を含み得る。局所投与のために、薬学的組成物中に、濃厚剤が存在し得る。経皮投与が意図される場合、組成物は、経皮パッチまたはイオン導入デバイスを含み得る。局所処方物は、約０．１％〜約１０％ｗ／ｖ（単位容量あたりの重量）の濃度のＡＮＴ基質／リガンド化合物を含み得る。
【０１４８】
組成物は、例えば、腸で融解し、そして薬物を放出する座剤の形態では、直腸投与が意図され得る。直腸投与のための組成物は、適切な非灌注賦形剤として、油性基剤を含有し得る。このような基剤としては、ラノリン、カカオ脂、およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
本発明の方法において、ＡＮＴ基質／リガンド化合物は、挿入物、ビーズ、時間放出処方物、パッチ、または迅速放出処方物の使用によって投与され得る。
【０１５０】
ＡＮＴ基質／リガンド化合物の至適投薬量は患者の体重および身体状態；処置される身体状態の重度および寿命；活性成分の特定の形態；投与様式、ならびに用いられる組成に依存し得ることは、当業者に明らかである。化学療法におけるＡＮＴ基質／リガンド化合物の使用は、この化合物の送達を補助する薬剤（例えば、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、タンパク質、またはリポソーム）に結合されるような化合物を包含し得ることが理解されるべきである。
【実施例】
【０１５１】
以下の実施例は、例示のために提供されるのであって、限定のためではない。
【０１５２】
（実施例１：細菌におけるＨｉｓタグ化ヒトＡＮＴタンパク質のクローン化および発現）
（Ａ．ＡＮＴ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅）
全ヒト脳から調製した総細胞ＲＮＡを、市販源（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手した。ＲＮＡを、ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，前Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．０、６ｍＭ塩化マグネシウム、および２ｍＭ塩化カルシウムを含有する緩衝液中に１μｌのＤＮａｓｅＩ（１０ｕ／μｌ）を使用して、３７℃で３０分間処理することにより精製した。この処理の後、２回のフェノール／クロロホルム抽出、１回のクロロホルム抽出、および酢酸ナトリウム存在下でのエタノール沈殿を行った。ＲＮＡペレットを、遠心分離によって採集し、７０％エタノールで洗浄し、風乾し、そしてＲＮａｓｅ非含有滅菌水中に再懸濁した。このＲＮＡを、ＲＮａｓｅ  Ｈ−欠損逆転写酵素（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴTM；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて逆転写させて、ｃＤＮＡを生成した。
【０１５３】
ＡＮＴ  ｃＤＮＡを、以下のプライマー（ＡＭＰＬＩＴＡＱTM  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））ならびにＧＥＮＥＡＭＰTM  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）において供給された試薬および緩衝液を製造者の指示書に従って使用して、熱サイクラー中で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＰＣＲプライマーの以下の例示において、下線を引いたヌクレオチドは、ＡＮＴ  ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に相補的な配列を示し、そして二重下線を引いたヌクレオチドは、制限酵素ＸｈｏＩ（認識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）およびＡｓｐ７１８（認識配列：５’−ＧＧＴＡＣＣ）の認識配列を示す。
【０１５４】
ヒトＡＮＴ１（ｈｕＡＮＴ１；配列番号１）について、以下のプライマーを使用した：
順方向（センス）：
【０１５５】
【化７】
2004154139.tif 000008
配列番号４
および逆方向（アンチセンス）：
【０１５６】
【化８】
2004154139.tif 000009
配列番号５。
【０１５７】
ヒトＡＮＴ２（ｈｕＡＮＴ２；配列番号２）について、以下のプライマーを使用した：
順方向（センス）：
【０１５８】
【化９】
2004154139.tif 000010
配列番号６
および逆方向（アンチセンス）：
【０１５９】
【化１０】
2004154139.tif 000011
配列番号７。
【０１６０】
ヒトＡＮＴ３（ｈｕＡＮＴ３；配列番号３）について、以下のプライマーを使用した：
順方向（センス）：
【０１６１】
【化１１】
2004154139.tif 000012
配列番号８
および逆方向（アンチセンス）：
【０１６２】
【化１２】
2004154139.tif 000013
配列番号９。
【０１６３】
（Ｂ．ＡＮＴ発現構築物の生成）
ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８（両酵素ともＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手）で、製造者によって供給される反応緩衝液を用いて製造者の推奨に従って消化した。制限されたＤＮＡを、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ  ＢｉｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｌａｎａ  Ｂｅａｃｈ、ＣＡ）を使用して、水平アガロースゲル電気泳動およびバンド抽出によって精製した。
【０１６４】
発現ベクターｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（「Ｂ」誘導体；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用した。このベクターは、５’から３’方向に作動可能に連結された以下のエレメントを含む：誘導可能であるが強く調節可能なａｒａＢＡＤプロモーター；至適化されたＥ．ｃｏｌｉ翻訳開始シグナル；アミノ末端ポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ）コード配列（「Ｈｉｓタグ」とも呼ばれる）；ＸＰＲＥＳＳTMエピトープコード配列；エンテロキナーゼ開裂部位（それが所望されれば、タンパク質精製後に、前のＮ末端アミノ酸を除去するために使用され得る）；多重クローン化部位；およびインフレーム終結コドン。
【０１６５】
プラスミドｐＢＡＤ／Ｈｉｓ  ＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８で、製造者の指示書に従って消化し、そしてＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、水平アガロースゲル電気泳動およびバンド抽出に供することによって調製した。制限されたＡＮＴ  ｃＤＮＡを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、製造者の反応緩衝液を使用し、そして製造者の指示書に従って、制限発現ベクターＤＮＡを用いて線状化プラスミドに連結した。コンピテントなｒｅｃＡ１  ｈｓｄＲ  ｅｎｄＡ１Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＴＯＰ１０Ｆ’株；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｃ３０３０−０３）を、製造者の指示書に従って、原核生物ベクター構築物を含有する連結混合物で形質転換した。単コロニーを選択し、そして５０μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有する３〜５ｍｌのＬＢブロス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９）中で増殖させた。プラスミドＤＮＡを、ＷＩＺＡＲＤTM  Ｐｌｕｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  ９６００  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して細菌培養物から単離した。
【０１６６】
発現構築物中に存在する組換えｈｕＡＮＴヌクレオチド配列を決定し、そしてその真正性を、公開されたＡＮＴ配列（図１；ｈｕＡＮＴ１について、Ｎｅｃｋｅｌｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７５８０−７５８４（１９８７）；ｈｕＡＮＴ２について、Ｂａｔｔｉｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４３５５−４３５９（１９８７）、およびｈｕＡＮＴ３について、Ｃｏｚｅｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０６：２６１−２８０（１９８９）を参照のこと）に対して、ＰＲＩＳＭTM  Ｒｅａｄｙ  ＢＩＧ  ＤＹＥTM  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ（Ｔｈｅ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）ならびに以下の配列決定プライマー５’−ＴＡＴＧＣＣＡＴＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣ（配列番号１０）および５’−ＣＧＣＣＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴ（配列番号１１）を使用してＤＮＡ配列決定することによって確認した。各ヒトＡＮＴ配列について、両プライマーを、ＤＮＡ挿入に近接したベクター配列の内側に置く。配列データをＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＮＡＶＩＧＡＴＯＲTM分析ソフトウェアパッケージ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して分析した。このｈｕＡＮＴ３発現構築物をｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３と名付けた。
【０１６７】
Ｈｉｓタグ化ヒトＡＮＴ１、ＡＮＴ２、およびＡＮＴ３をコードする発現プラスミドを、本明細書中では、以下のように呼ぶ：ヒトＡＮＴ１について、「ｐＭＫ１（Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ１）」または「ｐＭＫ１」；ヒトＡＮＴ２について、「ｐＭＫ２（Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ２）」または「ｐＭＫ２」；ヒトＡＮＴ３について、「ｐＭＫ３Ａ（Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３）」または「ｐＭＫ３Ａ」；以下に詳述するように外因性リンカーＮ末端アミノ酸が欠失されたヒトＡＮＴ３について、「ｐＭＫ３Ｂ（Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３、短縮型エピトープリンカー）」または「ｐＭＫ３Ｂ」。プラスミドｐＭＫ１、ｐＭＫ２、およびｐＭＫ３Ａは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に１９９８年１１月３日に寄託され、そしてそれぞれ受託番号ＡＴＣＣ９８９６９、ＡＴＣＣ９８９７０、およびＡＴＣＣ９８９７１を授与された。
【０１６８】
ヒトＡＮＴ１（ｐＭＫ１−ｈｕＡＮＴ１）およびヒトＡＮＴ２（ｐＭＫ２−ｈｕＡＮＴ２）をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を制限マッピングし、それらの構造を確認した。プラスミドｐＭＫ１−ｈｕＡＮＴ１およびｐＭＫ２−ｈｕＡＮＴ２のヌクレオチド配列を、上記の方法およびプライマー（配列番号１０および１１）を用いて決定する。
【０１６９】
エンテロキナーゼを有するｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３より発現される組換えｈｕＡＮＴ３タンパク質の処理は、ｈｕＡＮＴ３タンパク質からＨｉｓ−Ｔａｇ／ＸＰＲＥＳＳTMエピトープポリペプチドを遊離する；しかし、生じたｈｕＡＮＴ３タンパク質は、いくつかの外来Ｎ末端アミノ酸（すなわち、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ、ここで、「Ｍｅｔ」は、ｈｕＡＮＴ３の翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸を示す）を含む。外来アミノ酸は、おそらく組換えｈｕＡＮＴ３タンパク質に対してほとんどまたは全く効果がないが、この外来アミノ酸をコードするヌクレオチド配列が除去される誘導性発現構築物は、以下の様式において調製され得る。
【０１７０】
ＱＵＩＫ−ＣＨＡＮＧＥTM部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）は製造者の指示に基本的に従う。簡単に言うと、精製されたｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３  ＤＮＡ、変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＧＧＡＧＡＴＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＴＣ（配列番号１２；下線の配列は、ｈｕＡＮＴ３リーディングフレームの５’末端の逆相補体である）、および５’−ＧＡＴＣＴＧＴＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＣ（配列番号１３；下線の配列は、ｈｕＡＮＴ３リーディングフレームの５’末端に対応する）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに製造者によって供給された反応緩衝液中のｄＮＴＰを含む反応混合物を調製した。変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーは過剰に存在し、そしてＤＮＡ合成のサイクルが製造者のプロトコルに従ってサーマルサイクラーにおいて実行された。反応産物を制限酵素ＤｐｎＩ（メチル化ＤＮＡおよびヘミメチル化ＤＮＡを切断するが、非メチル化ＤＮＡを（すなわち、反応産物のアニール化）インタクトなままにする）で処理し、そしてＥＰＩＣＵＲＥＡＮ  ＣＯＬＩTMＸＬ−１−Ｂｌｕｅ
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換するために使用した。プラスミドＤＮＡを、無作為に選択した１２の形質転換体から調製し、そしてマルチクローニング部位カセットを含む領域のヌクレオチド配列を上記の方法に従って決定した。１２のプラスミドのうち、たった１つがｐＭＫ−ｈｕＡＮＴ３に見い出される本来の配列を保有し、かつ３つの所望されない点変異を含んだ。８つの「正確な」プラスミドのうち１つを選択し、そしてｐＭＫ３Ｂ−ｈｕＡＮＴ３と名付けた。
【０１７１】
（Ｃ．Ｈｉｓ−タグ化ｈｕＡＮＴ３の発現）
ｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞の培養物を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で、対数増殖期の中間（ＯＤ600〜０．５）まで増殖させ、そしてＬ−アラビノースの用量を増加させながら（すなわち、０．００００２％、０．０００２％、０．００２％、０．０２％、および０．２％）３〜４時間誘導した。各培養物の１ｍｌを４℃で１０分間、５，０００×ｇで遠心分離し、細胞をペレット化した。細胞ペレットを再懸濁し、そして１％  コール酸塩、１％  ｎ−ドデシルマルトシド、および０．１％  ２−メルカプトエタノールを含む１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）を添加することによりこの細胞を溶解した（先の文章および本願を通じて、他に明記されない限り、全ての化学薬品は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより入手する）。この溶解物中の全タンパク質含量をＢＣＡ（ビシンコニン酸；Ｓｍｉｔｈら、１９８５、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：７６−８５）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して決定した。１レーンあたり全タンパク質の１０μｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動し、そしてニトロセルロース膜（ＨＹＢＯＮＤTMＥＣＬニトロセルロース膜、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，以前のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に転写した。ヒトＡＮＴ３融合タンパク質を、製造者の指示に従ってＡＮＴＩ−ＸＰＲＥＳＳTM抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してウェスタンブロットにおいて検出した。
【０１７２】
この結果を図３に示す。図の左から右の順に、以下のサンプルを示す：レーン「Ｍ」は分子量マーカー；レーン「０」は非形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞；レーン「ｏ／ｎ」は誘導なしで一晩増殖させたｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３を含むＥ．ｃｏｌｉ；レーン「１」〜「５」はＬ−アラビノースの用量を増加させて（それぞれ、０．００００２％、０．０００２％、０．００２％、０．０２％、および０．２％）誘導し増殖させたｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３を含むＥ．ｃｏｌｉである。予想されるように、非形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ（レーン０）および非誘導化Ｅ．ｃｏｌｉ（レーンｏ／ｎ）は、ＸＰＲＥＳＳTM−ｈｕＡＮＴ３物質を示さなかった。しかし、分子量３６．６ｋＤを有する組換えＡＮＴ３融合タンパク質の発現は、レーン３および４（それぞれ、０．００２％および０．０２％Ｌ−アラビノース）で観察された。レーン１およびレーン２（それぞれ、０．００００２％および０．０００２％アラビノース）において、ＸＰＲＥＳＳTM−ｈｕＡＮＴ３物質は検出されなかった。このことは、これらの条件下では誘導の程度が十分でなかったことを示す。
【０１７３】
最も高い濃度のＬ−アラビノース（０．２％、レーン５）の存在下で増殖させた細胞は、収穫時前に溶解し始め、そして死滅した；結果的に、組換えタンパク質は検出されなかった。このことは、細菌において異種タンパク質の過剰発現中に時々起こるように、Ｅ，ｃｏｌｉにおける組換えｈｕＡＮＴの非常に高い発現が細胞死を引き起こすことを示した。
【０１７４】
（Ｄ．組換えｈｕＡＮＴ３は細菌の膜に局在する）
発現されるヒトＡＮＴ３をＥ．ｃｏｌｉ細胞内に配置するために、細胞を培養中で増殖させ、そして上記のようにアラビノースを用いて誘導し、次いで、異なる区画（例えば、膜、封入体、およびサイトゾル）へ分画した。細菌を４℃で１０分間、５，０００×ｇで遠心分離することによってペレット化した。この細胞ペレットを１／１０容量の細胞緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌリゾチーム、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中に再懸濁し、そして回転式振とう器で３０℃、１５分間でインキュベートした。この細胞混合物を２分間超音波処理し、そして４℃、１５分間、１２，０００×ｇで遠心分離して膜をペレット化した。膜および封入体を含むペレット（図４、レーン３）の一部分と同様に、上清（主にサイトゾル）を分析のための除去した（図４、レーン４）。ペレットの残りの部分を細胞緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて２回洗浄し、そして４℃で１５分間、１２，０００×ｇで遠心分離した。このペレットを細胞緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、および６Ｍ  塩酸グアニジン）中に再懸濁し、そして室温で１時間インキュベートした。次いで、溶液を４℃で１５分間、１２，０００×ｇで遠心分離した。上清（可溶化した封入体を含む；図４、レーン１）およびペレット（不溶性封入体を含む；図４、レーン２）を、上記のようにウェスタンブロットによって分析した。
【０１７５】
その結果を図４に示す。組換えｈｕＡＮＴ３（分子量３６．６ｋＤ）をレーン２、３および４、ならびに陽性コントロールレーン（＋）において検出した（上記のように、全細胞溶解物を、ウェスタンイムノブロット分析によりＡＮＴ３タンパク質の存在について以前に試験した）。最も多量の組換えｈｕＡＴＮ３は、レーン３（これは膜画分を表す）において検出された。これは、多量のｈｕＡＮＴ３融合タンパク質がＥ．ｃｏｌｉ細胞膜へ組込まれたことを示す。より小さなタンパク質シグナルがレーン２または４で見られた。これは、組込まれたＡＮＴ３を有するいくつかの膜を含み得る不溶性封入体画分、およびタンパク質合成が行われるサイトゾル画分を表す。レーン１の可溶性封入体画分において、タンパク質は検出されなかった。このことは、細菌におけるＡＮＴ３の制御された発現は、封入体の形成を生じなかったことを示し、これは、細菌におけるいくつかの異種タンパク質の過剰発現の望ましくない結果である。
【０１７６】
（Ｅ．ＡＮＴタンパク質の精製）
本明細書中に記載される発現系によって生成されるＡＮＴタンパク質およびＡＮＴ融合タンパク質は、種々の方法を使用して精製される。本実施例において、ＡＮＴタンパク質（特にヒトＡＮＴタンパク質）の精製を記載する。
【０１７７】
以下のタンパク質の精製方法のどれが使用されるか、または本発明の開示に由来し得る他のものにかかわらず、細菌細胞が溶解するとき（またはその後すぐ）、いくつかの細菌溶解物に付随する粘性を除去するために、十分な量のＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを添加することが重要である（代表的には、各酵素１０μｇ／ｍＬ；両方ともＲｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより）。粘性が最小化し、かつＡＮＴ溶解性が最適化される代替の手段またはさらなる手段は、標準的な超音波処理とは全く異なって、溶解物の激しい超音波処理（ｖｉｇｏｒｏｕｓ
ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）である。用語「激しい超音波処理」とは、例えば、先細フラットチップ化プローブを使用して、５０％ｄｕｔｙサイクルおよび８０％アウトプットで、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（４５０型）２×（各時間３０秒）を用いた超音波処理をいう（カップおよびホーン装置を用いた超音波処理とは対照的である）。いずれの型の超音波処理も十分であるが、より良い収量は、代表的には激しい超音波処理が使用される場合に観察される。
【０１７８】
さらに、使用されている種々のＡＮＴ精製方法において、最大の溶解可能な量のＡＮＴタンパク質を可溶化するために、不溶物を高速（すなわち、約１００，０００ｇ）回転で除去した後、少なくとも１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで溶解物を生成することが、しばしば所望された。代表的には、プロテアーゼインヒビター（例えば、ペプスタチン、ロイペプチン、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および／またはアプロチニン（全てＳｉｇｍａより））が、調製の間有効レベル（代表的には、１０μｇ／ｍＬ）で存在する。単離される特定のＡＮＴタンパク質またはＡＮＴ融合タンパク質に基づいて、４つ全てのプロテアーゼインヒビターまたはそれらの任意の有効な組み合せが使用される。例えば、ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質の調製において、４つ全てのプロテアーゼインヒビターを使用した場合に最良の結果がみられたが、受容可能な結果は、ロイペプチンおよびペプスタチンのみが使用される場合得られる。
【０１７９】
１つの方法は、非ヒト哺乳動物（すなわち、ウシ心臓組織およびラット）由来のＡＮＴタンパク質の精製のためのみに以前に使用されたいくつかの技術と新規の方法とを組み合わせる（Ａｑｕｉｌａら、１９８２、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６３：３４５−３４９；およびＳｔｅｒｌｉｎｇ，１９８６，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １１９：２９２−２９５）。簡潔に言うと、ＧＳＴ−ＡＮＴ３融合タンパク質を発現する細菌細胞をリゾチーム処置によって溶解した。そして14Ｃ−パルミチル−ＣｏＡ（Ｓｉｇｍａ）をＥ．ｃｏｌｉ１グラムあたり５０ｎｍｏｌの濃度で添加した。14Ｃ−パルミチル−ＣｏＡは、ＡＮＴタンパク質と会合するので、続く精製工程においてＡＮＴタンパク質を追跡するために使用され得る、放射性標識トレーサーとして働く。次いで、この溶解物を超音波処理し、そして６％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を作製し、そして４℃で１時間インキュベートして物質を溶解させた。高速回転を、不溶性物質を除去するために使用し、そして生じた溶質を（１）小規模調製のために、ヒドロキシアパタイトビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、または（２）より大きな規模での調製の場合（すなわち、≧１リッターの細菌培養物）、ヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のいずれかに、基本的に製造者の指示に従ってアプライした。他の膜内ミトコンドリアタンパク質と異なり、ＡＮＴは、ヒドロキシアパタイトに対して低い親和性を有する（Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇら、１９７８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５０３：１９３−２１０）。ヒドロキシアパタイトカラムをカラム緩衝液Ａ（１０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、９．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）を用いて溶出した。そして、カラム緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、４００ｍＭ  リン酸ナトリウム）を用いて洗浄した。非ヒト種由来の非組換えＡＮＴタンパク質は、カラム緩衝液Ａを用いてボイド容量に溶出され、そしてＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質は、同じようにボイド容量に存在すると予想された；ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質が異なって挙動する場合において、カラムを洗浄するためにカラム緩衝液Ｂを使用した。最終濃度３０ｍＭのオクチルグルコシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（活性に対し最小の効果でＡＮＴタンパク質の可溶化を補助する非イオン性洗浄剤）を有するような様式でサンプルを収集した（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、１９８６、Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌ．１１９：２９２−２９５）。ビース抽出した上清またはカラム溶出液を採集し、そして基本的に製造者の指示に従ってＥＸＴＲＡＣＴＩ−ＧＥＬTMアフィニティーマトリックス（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、そこからＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を除去した（Ｂｅｒｍａｎら、１９８５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：７１４０−７１４７もまた参照のこと）。
【０１８０】
上記の様式で調製された種々の量のＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３を、ＰＡＧＥに供し、そしてそのゲルをコロイダルブルータンパク質染色（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して染色した。この染色されたゲルは、融合タンパク質について予測された分子量に対応する分子量を有する単一のバンドを示した。種々の容量のサンプル由来のバンドの強度、ならびに既知の調製物量および染色の最低感度に基づき、１００ｍＬの細菌培養物からの収量を約５０μｇと見積もった。ゲルのレーンの１つにおいて、約５００ｎｇのタンパク質をロードし、そして混入しているバンドは検出されなかった；このことは、ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３タンパク質が、少なくとも純度約９０％〜少なくとも純度約９５％であったことを示す。
【０１８１】
ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質（前出の実施例を参照のこと）は、この方法によって精製され、そして他のＡＮＴ融合タンパク質（Ｈｉｓ−タグ化ｈｕＡＮＴ３および他のＨｉｓ−タグ化ＡＮＴタンパク質を含む）は、同様の様式で精製される。精製されたｈｕＡＮＴ融合タンパク質は、以下のように精製されたヒトＡＮＴタンパク質を生成するために使用される。
【０１８２】
ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ融合タンパク質は、基本的に製造者の指示に従って、グルタチオンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を介してさらに精製される。簡単に言うと、ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ融合タンパク質を含む溶液をグルタチオンアガロースビーズと接触させ、そしてそのビーズを洗浄して、所望されない混入物を放出させる。次に、この［ビーズ：ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ］複合体を適切な酵素（すなわち、この融合タンパク質の残余物からｈｕＡＮＴポリペプチドを分離するもの）で処理する。本明細書中に記載のＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ融合タンパク質（すなわち、ｐＭＫ３Ｃによりコードされるもの）の場合、トロンビン（Ｓｉｇｍａ）が、２つのポリペプチド：ＧＳＴ部分に対応する第１のポリペプチド、およびそのＮ末端に存在する、さらなる６つのアミノ酸（すなわち、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ）を有するヒトＡＮＴ３に対応する第２のポリペプチドを生成するような様式で融合タンパク質を切断する。
【０１８３】
Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ融合タンパク質をさらに、実質的に製造業者の指示に従い、ニッケルコートした樹脂（例えば、ＰＲＯＢＯＮＤTM  Ｎｉ2+を充填したアガロース樹脂；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって精製する。手短には、Ｈｉｓタグ化したｈｕＡＮＴ融合タンパク質を含む溶液を、ニッケルコートした樹脂と接触させ、そしてこの樹脂を洗浄して所望されない挟雑物を放出する。次に、この［樹脂：Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ］複合体を適切な酵素（すなわち、融合タンパク質の残りからｈｕＡＮＴポリペプチドを分離する酵素）で処理する。本明細書に記載されるＨｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質の場合、エンテロキナーゼ（ＳＩＧＭＡ、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＥＫＭＡＸTMを使用し得る）は、２つのポリペプチド（ＨｉｓタグおよびＸＰＲＥＳＳTMエピトープ部分を含む第１のポリペプチド、およびヒトＡＮＴ３に対応する第２のポリペプチド）を生成するような様式において融合タンパク質を切断する。使用される発現構築物がｐＭＫ３Ａの場合、生じる精製されたヒトＡＮＴ３タンパク質は、さらなる４つのアミノ酸（すなわち、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）をそのＮ末端に有する。ｐＭＫ３Ｂが、Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３を単離する細胞中に存在する発現構築物である場合、生じる精製されたヒトＡＮＴ３タンパク質は、天然のｈｕＡＮＴ３（すなわち、配列番号３）の配列を有する。
【０１８４】
上記の両方の精製工程において、固体支持体に結合するＡＮＴ融合タンパク質を、固体支持体に結合したままである融合タンパク質の残りからＡＮＴタンパク質を遊離する酵素（すなわち、トロンビンまたはエンテロキナーゼ）で処理する。ＡＮＴタンパク質を液層に放出し、次に液層を収集し、ＡＮＴタンパク質およびいくらかの量の遊離酵素を含有する溶液を生成する。この処理は性質が触媒的であるため、必要とされる遊離酵素の量は最小限である；そうであるにもかかわらず、いくらかの酵素は調製物中に残る。所望される場合、酵素分子は、当該分野において公知の任意の種々の手段を使用して、調製物より除去され得る。例えば、酵素に対して高い親和性を有するリガンドが結合した樹脂と溶液を接触させることにより、酵素を溶液より除去し得る。エンテロキナーゼの場合、そのような樹脂の１つは、エンテロキナーゼに対して高い親和性を有するダイズトリプシンインヒビターを含むＥＫ−ＡＷＡＹTM樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。トロンビンを用いてＧＳＴ融合タンパク質を処理し、そして所望の組換えタンパク質を精製する方法は、以前に記載されている（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＣｏｒｃｏｒａｎ、Ｕｎｉｔ１６．７、１６章、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、１６−２８〜１６−３１頁）。しかし、一般的に、任意の所定のＡＮＴタンパク質から遊離する酵素を分離するための任意の適切な手段が、使用され得る。
【０１８５】
（実施例２：ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質の発現）
（Ａ．ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３発現構築物の産生）
ヒトＡＮＴ３  ｃＤＮＡを、以下のプライマーを使用する以外は、実施例１のようにＰＣＲによってｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３から増幅した。ＰＣＲプライマーの以下の表示において、下線のヌクレオチドは、ＡＮＴ  ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に相補的な配列を示し、２重下線のヌクレオチドは、制限酵素ＸｈｏＩ（認識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）またはＥｃｏＲＩ（認識配列：５’−ＧＡＡＴＴＣ）の認識配列を示す。
【０１８６】
ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーは：
正方向（センス）：
【０１８７】
【化１３】
2004154139.tif 000014
配列番号１４、
および逆方向（アンチセンス）：
【０１８８】
【化１４】
2004154139.tif 000015
配列番号１５である。
【０１８９】
発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を使用して、酵素的ポリペプチドおよびＡＮＴポリペプチドを含有するｈｕＡＮＴ３融合タンパク質を産生した。このベクターは、ｌａｃＩq（リプレッサー）遺伝子、およびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に作動可能に連結されたｔａｃプロモーターを含む（Ｓｍｉｔｈら、１９８８、Ｇｅｎｅ  ６７：３１〜４０）。ＧＳＴ遺伝子のコード配列は、多重クローニング部位のすぐ５’に、トロンビン切断部位をコードするヌクレオチド配列を含むように改変されている。ＧＳＴ融合タンパク質を、抗ＧＳＴを用いるウエスタンブロットによるか、または比色アッセイを使用することにより検出し得る；後者のアッセイは、ＧＳＴの基質としてグルタチオンおよび１−クロロ−２−４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）を使用して、３４０ｎｍで検出可能な黄色の産物を生じる（Ｈａｂｉｇら、１９７４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：７１３０〜７１３９）。この発現ベクターに由来する発現構築物から産生されるＧＳＴ融合タンパク質は、例えば、グルタチオン親和性クロマトグラフィーによって精製され得、そして所望のポリペプチドは、トロンビンによって融合産物から放出される。従って、この発現ベクターは、融合タンパク質の迅速な精製、および（生じる組換え産生されたタンパク質はアミノ末端に２つのさらなるアミノ酸（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を含むが）比較的少数の外来のＮ末端アミノ酸を有するタンパク質の放出を提供する。ｔａｃプロモーターは、培養細胞に、例えば、１〜５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ｆｌｕｋａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）の添加によって誘導され得、高レベルの発現を提供する。
【０１９０】
プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−２を製造業者の指示に従い、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し、そして水平アガロースゲル電気泳動、およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するバンド抽出に供することにより調製した。制限化したＡＮＴ  ｃＤＮＡを、上記の実施例に記載するように、制限化した発現ベクターＤＮＡに連結した。５０μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有する３〜５ｍｌのＬＢブロス中での増殖のために、単一のコロニーを選択し、そしてＷＩＺＡＲＤTM  Ｐｌｕｓシリーズ９６００  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細菌培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。そのＤＮＡが正しいことを確認するために、ｐＧＥＸ誘導プラスミド中に存在する組換えｈｕＡＮＴヌクレオチド配列を、上記に記載したオリゴヌクレオチドプライマーならびに５’および３’ＰＧＥＸ配列決定プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用する上記の実施例に記載されるように、決定した。
【０１９１】
生じるＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３発現構築物を、ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３と命名した（本明細書においてまたｐＭＫ３Ｃともいう）。プラスミドｐＭＫ３Ｃを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に、１９９８年１１月３日に寄託し、そして登録番号ＡＴＣＣ９８９７３を得た。トロンビン処理した、ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３発現構築物により産生された組換えｈｕＡＮＴ３タンパク質は、いくつかの外来Ｎ末端アミノ酸（すなわち、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ、ここで「Ｍｅｔ」は、ｈｕＡＮＴ３の翻訳開始コドンによってコードされるアミノ酸を示す）を含む。しかし、外来の６つのアミノ末端アミノ酸が、生じる組換えｈｕＡＮＴ３タンパク質に影響を有するという証拠は、ない。
【０１９２】
ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質の発現を確認するために、以下の実験を行った。８つの独立に単離したｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３形質転換体および１つのコントロール（ベクター形質転換体）の単離物をＬＢアンピシリン中で一晩増殖し、次に２ｍｌの新鮮な培地中で１：２０に希釈した。３７℃で３時間の増殖の後、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭまで添加した。細胞増殖を２時間続け、その後、１．５の細胞を微量遠心チューブに移し、ペレット化し、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む冷ＰＢＳ  ３００μＬ中に再懸濁し、８秒間で２度超音波処理した。超音波処理物を４℃で５分間遠心し、上清を新鮮な微量遠心チューブに移し、５０μＬのグルタチオンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を添加し５０％のスラリーを生成した。周囲温度での５分間のインキュベーションの後、このビーズを遠心し、そして１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。この洗浄したペレットをＳＤＳｓｐｌ緩衝液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、２％  ＳＤＳ、１０％  グリセロール、５％  β−メルカプトエタノール、および可視的な着色を提供するのに十分なブロモフェノールブルー）に再懸濁し、そして各調製物の３０μＬ（培養物の１５μＬと同等）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。このゲルを、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｇ−２５０）染色キット（Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して染色した。ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質の予想分子量のバンドは、ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３形質転換体の８つのそれぞれの調製物において、同一の強度で、容易に明らかであった；このバンドは、コントロール調製物中には存在しなかった。
【０１９３】
（Ｂ．ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質の発現のウエスタンブロット分析）
（１）ｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３（ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ−ｈｕＡＮＴ３発現構築物）または（２）ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３（ｐＧＥＸ／ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３発現構築物）のいずれかで形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、リゾチウム（１００μｇ／μｌ；Ｓｉｇｍａ）を室温で２０分間添加し、続いて凍結／融解の１サイクルにより溶解した。前者の形質転換体についてネガティブコントロールは、アラビノース誘導を受けない形質転換細胞の並行培養物であった。後者の形質転換体についてコントロールは、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２ベクターのみで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの並行培養物であった。
【０１９４】
各溶解物の全タンパク質濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を使用して決定し、そして各溶解物の調製物からの全タンパク質の等量を、等容量の２×Ｌａｅｍｍｌｉ電気泳動緩衝液と混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。このタンパク質を電気泳動的にニトロセルロースに移し、次にこのニトロセルロースを各ベクターに含まれる適切なエピトープに対する抗体（すなわち、ｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３についてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＡＮＴＩ−ＸＰＲＥＳＳTM、およびｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３についてＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（以前は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｌｃおよびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ  Ｉｎｃ．と呼ばれていた）からのポリクローナルヤギ抗ＧＳＴ抗体）と接触した。
【０１９５】
別の実験において、ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３形質転換体由来の細菌溶解物を、製造業者の指示に従い、アガロースグルタチオンビーズ（Ｓｉｇｍａ）とインキュベーションした（上記の章およびＳｍｉｔｈら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｕｎｉｔ１６．７、１６章：Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、１６−２８〜１６−３１頁を参照のこと）。このビーズを、上記のように、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中に懸濁し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウエスタン分析に供した。おそらく融合タンパク質が細菌膜中に挿入されるために、ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３の収量は低かったが、実験に十分な量の物質が回収された。
【０１９６】
結果（図５）は、予想された分子量（Ｈｉｓ−タグ＋エンテロキナーゼ部位＋抗原部位＋ｈｕＡＮＴ３＝３８ｋＤａ）の特異的なバンドがｐＢＡＤ／ｈｉｓ−ｈｕＡＮＴ３ベクターで形質転換された、アラビノースで誘導されたＥ．ｃｏｌｉにおいて観察されるが、非誘導コントロール培養物中には存在しなかったことを、示す。同様に、ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３に対応するバンドが、ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉにおいて観察されたが、変化しないＧＳＴバンドのみが、発現ベクターで形質転換されたコントロールＥ．ｃｏｌｉにおいて観察された。アガロースＧＳＨビーズを使用するＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質の精製は、ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ形質転換細菌の粗溶解物において観察されたのと同一のサイズのバンドを生成した。
【０１９７】
（実施例３）
（昆虫細胞におけるＡＮＴ３の発現）
（Ａ．バキュロウイルス発現構築物の生成）
ｈｕＡＮＴ３をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを、以下のプライマーを使用して、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）全体からＰＣＲにより増幅した。以下のＰＣＲプライマーの表示において、下線のヌクレオチドは、ＡＮＴ  ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に相補的な配列を示し、二重下線のヌクレオチドは、制限酵素ＢａｍＨＩ（認識配列：５’−ＧＧＡＴＣＣ）またはＥｃｏＲＩ（認識配列：５’−ＧＡＡＴＴＣ）の認識配列を示す。
【０１９８】
使用したＰＣＲプライマーは、以下：
順方向（センス）：
【０１９９】
【化１５】
2004154139.tif 000016
配列番号１６、
および逆方向（アンチセンス）：
【０２００】
【化１６】
2004154139.tif 000017
配列番号１７であった。
【０２０１】
ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、製造者の指示に従って使用して、消化した。続いて、水平アガロースゲル電気泳動およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ  Ｂｉｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用するバンド抽出により、精製を行った。
【０２０２】
バキュロウイルス転移ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｂバージョン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、５’から３’の方向で、構成的なポリヘドリンプロモーターを含み、このプロモーターに、（１）翻訳開始配列、（２）Ｎ末端ポリヒスチジン配列、（３）組換えタンパク質の検出および精製のためのＸＰＲＥＳＳTMエピトープタグ、および（４）エンテロキナーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結する、続いてｃＤＮＡを挿入可能なマルチクローニング部位。
【０２０３】
転移ベクターｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを、製造者の指示に従って使用して消化することによって調製し、そしてその制限ＤＮＡを、水平アガロースゲル電気泳動およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用するバンド抽出に供した。制限ＰＣＲ産物を、前述の実施例と同様に、制限発現ベクターＤＮＡと連結した。
【０２０４】
コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の説明書に従って、連結反応物で形質転換した。単一コロニーを選択して、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む、３〜５ｍｌのＬＢブロス中で増殖させた。プラスミドＤＮＡを細菌培養物から、ＷＩＺＡＲＤTM  Ｐｌｕｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  ９６００  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して単離した。
【０２０５】
組換えＡＮＴ遺伝子配列を決定し、そしてその確実性（配列番号１、２、および３は、それぞれヒトＡＮＴ１、２、および３に対応する）を、Ｐｒｉｓｍ  Ｒｅａｄｙ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，カタログ＃４０２０８０）および以下に示すプライマーを使用する、ＤＮＡ配列決定により確かめた：ポリヘドリン順方向配列決定開始部位、５’−ＡＡＡＴＧＡＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＧＣ（配列番号１８）；バキュロウイルス逆方向配列決定開始部位、５’−ＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＣＣ（配列番号１９）；ＡＮＴ３コード配列の内部プライマー（センス鎖）、５’−ＡＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＧＧＡＴＡ（配列番号２０）；および５’−ＴＡＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＡＴＴＣＴ（配列番号２１）；ＡＮＴ３コード配列の内部プライマー（アンチセンス鎖）、５’−ＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴ（配列番号２２）；および５’−ＡＴＧＣＣＧＧＴＴＣＣＣＧＴＡＣＧＡ（配列番号２３）。配列データを、ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＮＡＶＩＧＡＴＯＲTM分析ソフトウェアパッケージ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して分析した。正確な配列を有する、単離されたプラスミドをｐＭＫ４Ａ−ｈｕＡＮＴ３と名付けた。
【０２０６】
ｐＭＫ４Ａ−ｈｕＡＮＴ３は、確実なｈｕＡＮＴ３コード配列を含むが、ＡＮＴ３の読み枠は、発現ベクターのＨｉｓ−Ｔａｇ／ＸＰＲＥＳＳTMエピトープの読み枠に同調的でない。従って、ｐＭＫ４Ａ−ｈｕＡＮＴ３は、組換えＡＮＴタンパク質を産生することが期待されないが、それを保持する細胞は、コントロールとして使用し得る。
【０２０７】
ｐＭＫ４Ａ−ｈｕＡＮＴ３のインフレームな誘導体を生成するために、そのプラスミドを、ＱＵＩＫ−ＣＨＡＮＧＥTM  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、実施例１のように、変異誘発した。この場合、使用した変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧ（配列番号２４；下線部配列は、ｈｕＡＮＴ３の読み枠の５’末端の逆方向相補体である）、および５’−ＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＡＴＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣ（配列番号２５；下線部配列は、ｈｕＡＮＴ３の読み枠の５’末端に対応する）。いくつかの形質転換体を単離して、そこからプラスミドＤＮＡを精製した。そのプラスミドＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、「正しい」配列を有する１つを同定して、ｐＭＫ４Ｂ−ｈｕＡＮＴ３と名付けた。
【０２０８】
ヒトＡＮＴ３をコードする、バキュロウイルス発現プラスミドを、「ｐＭＫ４Ａ（バキュロウイルスシャトル、フレーム外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ）ｈｕＡＮＴ３）」または「ｐＭＫ４Ａ」；および「ｐＭＫ４Ｂ（バキュロウイルスシャトル、インフレームｈｕＡＮＴ３）」または「ｐＭＫ４Ｂ」という。プラスミドｐＭ４Ｂは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に、１９９８年１１月３日に寄託され、受託番号ＡＴＣＣ９８９７２を与えられた。
【０２０９】
ｈｕＡＮＴ３タンパク質（および関連する調節配列）をコードする配列を、バキュロウイルスゲノム内に挿入するために、昆虫細胞（ＭＡＸＢＡＣTM  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、バキュロウイルス転移構築物ｐＭＫ４Ｂ−ｈｕＡＮＴ３、およびｌａｃＺ遺伝子のプロモーター欠損３’フラグメント（ＢＡＣ−Ｎ−ＢＬＵＥTM、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むように操作した直鎖バキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面体ウイルス、ＡｃＭＮＰＶ）ＤＮＡを用いて、ＢＡＣ−Ｎ−ＢＬＵＥTMＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して、同時トランスフェクトした。組換えバキュロウイルスプラークは、機能的なβ−ガラクトシダーゼを発現し、そしてＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）の存在下で、青色プラークとして同定した。以下の実験で示されるように、これらの組換えウイルスは、昆虫細胞内でヒトＡＮＴ３ポリペプチドを発現する、発現構築物である。
【０２１０】
（Ｂ．バキュロウイルス発現系のウエスタンブロット分析）
高力価のウイルスストックを作製し、組換えタンパク質を、感染Ｓｆ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＴ．ｎｉ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）細胞内で、製造者の説明書に従って発現させた（Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ
Ｖｅｃｔｏｒｓ、第１６章の第２節：Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２、１６−３２頁〜１６−４８頁；Ｋｉｔｔｓ、第７章：Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３９巻、Ｃ．Ｒ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔａｗａ，ＮＪ，１９９５、１２９〜１４２頁もまた参照のこと）。
【０２１１】
トランスフェクトしたＳｆ９細胞を、遠心分離によりペレット化し、そして１００μｌのＭＳＢ緩衝液（２１０ｍＭ  マンニトール（Ｓｉｇｍａ）、７０ｍＭ
スクロース（Ｆｌｕｋａ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加して、３回の凍結−解凍サイクルを行うことにより、溶解した。全細胞画分、細胞質ゾル化区分、亜ミトコンドリア粒子画分（ＳＭＰ）、ミトコンドリア画分、および原形質膜画分を、以下のように調製した。細胞溶解物を、４℃で、１０分間、６００ｇで遠心分離して、原形質膜ペレットを調製した。上清を除去して、取っておいた。原形質膜ペレットを１００μｌのＭＳＢで洗浄して、４℃で、１０分間、６００ｇで遠心分離して、分析用に使用した。上清を除去して、最初の上清と合わせて混合した。上清の半分を使用して、ミトコンドリア画分および細胞質ゾル画分を、４℃で、１５分間、１４，０００ｇの遠心分離により調製した；そのペレットは、ミトコンドリア画分を表し、そしてその上清は、細胞質ゾルを表す。上清の残り半分を、４℃で、１５分間、１４，０００ｇで遠心分離して、ミトコンドリア含有ペレットを調製した。そのペレットを、ＭＳＢ中に再懸濁して、０．２５ｍｇ／ｍｌのジギトニン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，以前のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）とともに、２分間インキュベートして、そしてカップホーン超音波処理器において、５０％負荷サイクルで、３分間超音波処理し、亜ミトコンドリア粒子（ＳＭＰ）を作製した。（トランスフェクトＴ．ｎｉ細胞からのミトコンドリアの調製に関しての詳細については、実施例１３を参照のこと）。
【０２１２】
各画分についてのタンパク質含量を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を使用して決定し、そして全タンパク質の８μｇを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で１レーンあたりにロードして、電気泳動して、そしてＨＹＢＯＮＤTM  ＥＣＬ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に転写した。融合タンパク質を、ＡＮＴＩ−ＸＰＲＥＳＳTM  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃Ｒ９１０−２５）および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を、製造者の説明書に従って使用する、ウエスタンブロットで検出した。
【０２１３】
ウエスタン分析の結果を、図６に示す。組換えＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質（分子量３６．６ｋＤ）を、全細胞、ミトコンドリア、亜ミトコンドリア粒子、および原形質膜において検出した。そのシグナルは、ミトコンドリアおよび亜ミトコンドリア粒子において最も強かったが、一方細胞質ゾル画分においては、バンドを検出することが出来なかった。これらのデータは、ヒト組換えｈｕＡＮＴ３融合タンパク質が、原形質膜内より、さらにより効率的にミトコンドリア膜に取り込まれることを示唆する。さらに、細胞質ゾル画分には、シグナルが検出されなかったことから、全ての組換えタンパク質は、膜に取りこまれた。オートラジオグラムの最後のレーンは、Ｎｉを結合した磁気アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の説明書に従って使用して、細胞溶解物から単離したＨｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３を示す。
【０２１４】
このように、Ｅ．ｃｏｌｉ内でのように、ｈｕＡＮＴ３は、バキュロウイルス／Ｓｆ９系内で発現される。さらに、組換え的に作製した６×Ｈｉｓタグ化、およびエピトープタグ化ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質は、３５を超える外来性Ｎ末端アミノ酸の存在にもかかわらず、おおよそが、Ｓｆ９細胞のミトコンドリアに局在し、そしてそれらを、細胞性画分から、Ｈｉｓ−Ｔａｇ成分の金属（例えば、ニッケル）に対する親和性を利用する方法により、単離し得る。
【０２１５】
（実施例４）
（酵母におけるＡＮＴ３の発現）
（Ａ．発現構築物および宿主細胞）
ヒトＡＮＴ３  ｃＤＮＡを、以下のプライマーを使用して実施例１のようにＰＣＲにより増幅した。以下のＰＣＲプライマーの表示において、下線のヌクレオチドは、ＡＮＴ  ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に相補的な配列を示し、二重下線のヌクレオチドは、制限酵素ＸｈｏＩ（認識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）またはＡｓｐ７１８（認識配列：５’−ＧＧＴＡＣＣ）の認識配列を示す。
【０２１６】
ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは、以下：
順方向（センス；配列番号２８）：
【０２１７】
【化１７】
2004154139.tif 000018
および逆方向（アンチセンス；配列番号２９）：
【０２１８】
【化１８】
2004154139.tif 000019
であった。
【０２１９】
ＰＣＲ産物、および発現ベクターＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８（両酵素とも、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、製造者に供給される反応緩衝液を使用する製造者の指示に従って、消化した。発現ベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。このベクターは、誘導性のＧＡＬ１プロモーター、ならびに２ｕの複製起点およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３遺伝子（それぞれ、高コピーの維持およびｕｒａ３酵母細胞における選択のため）からすぐ下流に位置する、マルチクローニング部位を含む。
【０２２０】
その制限ＤＮＡを、前述の実施例のように、水平アガロースゲル電気泳動およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＧｅｌＳｐｉｎキット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するバンド抽出により精製し、互いに連結して、そしてＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換するために使用した。プラスミドＤＮＡを、いくつかの形質転換体から単離し、そして挿入ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定して、ｈｕＡＮＴ３の配列であることを確認した。１つの確認したプラスミドを選択して、以下の研究に使用し、そしてそれをｐＭＫ５Ａ（ｈｕＡＮＴ３）と命名した。
【０２２１】
第二の酵母ｈｕＡＮＴ３発現ベクター、ｐＭＫ５Ｂを、以下のように構築した。プラスミドｐＭＫ５ＡおよびｐＹＥＳＴｒｐ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、制限酵素ＢｇｌＩおよびＰｖｕＩＩ（両酵素とも、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて消化し、ゲル精製し、連結して、上記のようにＥ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。発現ベクターｐＹＥＳ２Ｔｒｐは、ＴＲＰ１選択マーカーを有する以外でｐＹＥＳ２に類似する。プラスミドＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、制限地図を作成し、予期される発現構築物の構造を確認した。１つの確認したプラスミドを選択して、以下の研究に使用し、そしてそれをｐＭＫ５Ｂ（ｈｕＡＮＴ３）と命名した。
【０２２２】
第三の酵母ｈｕＡＮＴ３発現ベクター、ｐＭＫ５Ｃを、発現ベクターｐＹＰＧＥ２を使用して構築した。このｐＹＰＧＥ２は、ＴＲＰ１選択マーカーおよび強力なＰＧＫプロモーターを、マルチクローニング部位の上流に含む（ＢｒｕｎｅｌｌｉおよびＰａｌｌ、１９９３  Ｙｅａｓｔ  ９：１２９９−１３０８）。プラスミドｐＹＰＧＥ２  ＤＮＡを、ＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８を用いて消化し、ゲル精製して、実施例１のＸｈｏ１およびＡｓｐ７１８制限ｈｕＡＮＴ３  ＰＣＲ産物と連結した。その連結混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換して、プラスミドＤＮＡをいくつかの形質転換体から単離し、制限地図を作成し、予期される発現構築物の構造を確認した。１つの確認したプラスミドを選択して、以下の研究に使用し、そしてそれをｐＭＫ５Ｃ（ｈｕＡＮＴ３）と命名した。
【０２２３】
酵母発現系を生成するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＩＮＶＳｃ１（ＭＡＴα、ｈｉｓ３Δｌ、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１−２８９、ｕｒａ３−５２）を、精製ｐＭＫ５Ａ、ｐＭＫ５Ｂ、およびｐＭＫ５Ｃ  ＤＮＡで、Ｓ．ｃ．ＥＡＳＹＣＯＭＰTM  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、形質転換した。第二のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株、ＪΔ１Δ３（ＭＡＴα、ａｄｅ２−１、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ｔｒｐ１−１、ｕｒａ３−１、ｃａｎ１−１００、ＡＡＣ１：：ＬＥＵ２、ＡＡＣ２：：ＨＩＳ３、ＡＡＣ３：：ＵＲＡ３）をまた、発現構築物で、形質転換した。ＡＡＣ遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのミトコンドリアＡＤＰ／ＡＴＰトランスロケーターの３つのアイソフォームをコードし、ＪΔ１Δ３株内で破壊されている（Ｇｉｒａｕｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８１：４０９−４１８（１９９８））。従って、外来性ＡＮＴ（ＡＡＣ）タンパク質の発現が不可能な、ＪΔ１Δ３の形質転換体は、それらを形質転換させた発現構築物によりコードされるヒトＡＮＴタンパク質のみを発現することが期待される。
【０２２４】
（Ｂ．酵母発現系のノーザンブロット分析）
ＪΔ１Δ３株におけるｈｕＡＮＴ３  ｍＲＮＡ産生のレベルを試験するために、ｐＭＫ５ＢおよびｐＭＫ５Ｃを用いて形質転換した細胞のノーザン分析を、当該分野で公知の方法に従って行った。手短に言えば、形質転換した細胞およびコントロール（非形質転換）細胞を、対数増殖期の中間まで増殖させ、収集し、そして溶菌した。ＲＮＡを溶解物から抽出し、電気泳動し、そしてニトロセルロースフィルターに転写した（Ｔｒｅｃｏ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  ＲＮＡ、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、１３：４４〜４６、１３章の単元１３．１２、およびＳｅｌｄｏｎ、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｙ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、同上、４：２３〜２５、第４章の単元４．９を参照のこと）。実施例１のＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８制限ｈｕＡＮＴ３  ＰＣＲ産物を放射性標識し、そしてプローブとして使用し、そしてヒト脾臓組織由来のＲＮＡ調製物を、陽性コントロールとして使用した。
【０２２５】
結果（図１０）は、適切な大きさのＡＮＴ３特異的ＲＮＡがヒト脾臓、およびいずれかの発現ベクターを用いて形質転換された酵母細胞において産生されるが、非形質転換酵母細胞においては産生されないことを実証する。ｐＹＰＧＥ２由来の発現構築物ｐＭＫ５Ｃ（ＰＧＫプロモーターからのＡＮＴ３発現を方向付ける）は、明確に、ｐＹＥＳ２Ｔｒｐ由来の構築物ｐＭＫ５Ｂ（ここではＡＮＴ３発現は、ＧＡＬ１プロモーターによって駆動される）よりも、より多くのＡＮＴ３  ＲＮＡを生じる。しかし、いずれの場合においても、ｈｕＡＮＴ３特異的ＲＮＡの有意なレベルが、いかなる内在性のアデノシンヌクレオチド移行タンパク質をも欠いている酵母バックグラウンド中に産生された。
【０２２６】
（Ｃ．酵母発現系のウェスタン分析）
（１．ｈｕＡＮＴ３に対する抗体の産生）
酵母発現構築物から産生されたｈｕＡＮＴ３はエピトープタグを欠くので、そのタンパク質の組換え産生を評価するために、ｈｕＡＮＴ３に対する抗体を産生することが必要であった。ｈｕＡＮＴ３に特異的なｍｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ（抗ペプチド）抗体を、以下のように調製した。
【０２２７】
カルボキシ末端の近くに配置し、そしてＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ指標（Ｗｏｌｆら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１８７〜１９１（１９８８））に従って高い抗原性を有すると予測したｈｕＡＮＴ３の部分に対応する合成ポリペプチドを、Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）による公知の手段を用いて合成し、そしてＨＰＬＣおよびＭＳ分析によって、少なくとも約７０％純粋であり、好ましくは少なくとも約９０％純粋であると決定した。合成ポリペプチドの配列（配列番号３０）は以下である：
Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ。
【０２２８】
合成ポリペプチドを、ＭＳＢ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いて、キャリア分子であるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させ、そして結合物を使用して、公知の手段（ＣｏｌｌａｗｎおよびＰａｔｅｒｓｏｎ、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）１１：３７〜４１、１１章の単元１１．１４および１１．１５）に従って、数匹のウサギを免疫した。そのウサギを、接種後０（免疫前、２ｍＬ）、７、９、１１、１３（各々の採血あたり１５ｍＬ）または１５週間後（５０ｍＬ）に採血した（する）。アジ化ナトリウム（０．１％）を、採血した血液に保存剤として添加した（する）。
【０２２９】
（２．ウェスタン分析）
酵母発現系のウェスタン分析を、細菌細胞または昆虫細胞とは対照的に、異なる方法を酵母細胞からタンパク質調製物を調製するために使用すること以外は、本質的に先の実施例において記載されたように行った。酵母からタンパク質を単離するこのような方法は、当該分野で公知である（例えば、ＤｕｎｎおよびＷｏｂｂｅ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｙｅａｓｔ、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）１３：４６〜５０、１３章の単元１３．１３を参照のこと）。例えば、膜またはミトコンドリア画分におけるｈｕＡＮＴ３の細胞内分布は、先の実施例におけるように決定される。
【０２３０】
（実施例５）
（哺乳動物細胞におけるＡＮＴ３の発現）
先の実施例は、ＡＮＴおよびＡＮＴ融合タンパク質を種々の系で組換え的に産生し得る種々の手段を記載する。このようなＡＮＴタンパク質は、種々のアッセイ（下を参照のこと）において使用され得るが、哺乳動物細胞から大量のネイティブなＡＮＴタンパク質を単離することが所望され得る。特に、本実施例に記載されるように、ＡＮＴタンパク質がウイルスエンベロープ中に提示される組換えウイルス粒子を産生することが所望され得る。このようなＡＮＴ提示ウイルス粒子は、例えば、ＡＮＴタンパク質へ結合する化合物がスクリーニングされ、そして同定されるアッセイを含む、種々のアッセイにおいて非常に安定でありかつ有用であることが予想される。
【０２３１】
哺乳動物発現系の別の有用な結果は、ヒトミトコンドリアの生成および単離であり、ここで特定のＡＮＴアイソフォームを、このようなアイソフォームの特異的な生物学的役割を決定するために過剰発現させる。例えば、ＡＮＴ３は明らかにヒト組織中に偏在的に発現されるが、一方、ＡＮＴ１は主として心臓および骨格筋で発現される（Ｓｔｅｐｉｅｎら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４５９２〜１４５９７）。培養された心臓細胞または筋肉細胞中での方向付けられたｈｕＡＮＴの過剰発現は、ＡＮＴ１アイソフォームを大部分含むミトコンドリアを生じることが期待される。このような「ＡＮＴアイソフォーム富化」ミトコンドリアは、単離され、そして種々のミトコンドリア機能について試験され得る。
【０２３２】
哺乳動物細胞においてＡＮＴタンパク質を発現する構築物を、段階的なプロセスにおいて調製する。第１に、ＡＮＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター（および付随する調節配列）を含む発現カセットを、細菌プラスミドに基づく系に構築する；これらの発現カセットを含む構築物を、それらを用いて一過性にトランスフェクトする哺乳動物細胞におけるそれらのＡＮＴ産生能について、評価および最適化する。第２に、ＡＮＴ発現カセットを、溶菌性のウイルス（例えば、ＳＶ４０、ＢＰＶ、ＥＢＶ、アデノウイルス；以下を参照のこと）の増殖の間に、または安定に哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれ得、かつ哺乳動物細胞ゲノムを形質導入し得るウイルスから、組換えタンパク質を産生するウイルス系（例えば、レトロウイルス発現構築物）に移入させる。
【０２３３】
（Ａ．一過性発現）
第１の工程に関して、哺乳動物細胞において機能するプロモーターを含み、かつＡＮＴコード配列に作動可能に連結され得る、市販されている「シャトル」（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉおよび哺乳動物細胞の両方において複製を可能にする）ベクターは、ＳＶ４０後期プロモーター発現ベクター（例えば、ｐＳＶＬ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、糖質コルチコイド誘導性プロモーター発現ベクター（例えば、ｐＭＳＧ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ラウス肉腫エンハンサー−プロモーター発現ベクター（例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＣＭＶ初期プロモーター発現ベクターを含むが、これらに限定されない。これらは、例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはＺＥＯＣＩＮTMのような薬剤に対する選択マーカーを有するそれらの誘導体を含む（例えば、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、およびｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。一般的に、ＡＮＴ遺伝子についての好ましいシャトルベクターは、選択マーカー（形質転換した細胞の単離および維持の容易さのために）、および誘導性の、従って調節可能なプロモーター（ＡＮＴ遺伝子の過剰発現が毒性効果を有し得る場合）を有するベクターである。
【０２３４】
哺乳動物細胞をトランスフェクトするための方法は、当該分野で公知である（Ｋｉｎｇｓｔｏｎら、「Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、９−３〜９−１６頁、第９章、第１節）。コントロールプラスミド（例えば、ｐＣＨ１１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を、試験されるＡＮＴ発現構築物とともに同時トランスフェクションし得、その結果、ＡＮＴのレベルは、コントロールプラスミドから発現される遺伝子産物に規準化され得る。
【０２３５】
哺乳動物発現系のウェスタン分析を、異なった方法を使用して、細菌細胞、昆虫細胞、または酵母細胞とは対照的に哺乳動物細胞由来のタンパク質調製物を調製する以外は、本質的に先の実施例に記載されたように行う。酵母からのタンパク質を単離するこのような方法は、当該分野で公知である（例えば、ＫｉｎｇｓｔｏｎおよびＳｈｅｅｎ、第９章の単元９．６ＡおよびＢｒａｓｉｅｒ、第９章の単元９．６Ｂ、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、９−１７〜９−２３頁を参照のこと）。実質的に、プロモーターおよび目的のＡＮＴ遺伝子に作動可能に連結された付随する調節配列からなる好ましい発現カセットは、所定のＡＮＴ発現カセットを含むベクターを用いて一過性に形質転換した細胞が、そうするように誘導された場合に、高レベルのＡＮＴタンパク質を発現する能力によって同定される；これらの発現カセットは、ウイルス発現ベクターに組み込まれる。
【０２３６】
（Ｂ．ウイルス発現）
好ましい発現カセットを含む核酸、好ましくはＤＮＡを、それらが調製され、特徴付けられ、そして最適化される一過性の発現構築物から単離する（先の節を参照のこと）。このような発現カセットを単離する好ましい方法は、ＰＣＲによる増幅によるが、他の方法も使用され得る（例えば、適切な制限酵素を用いる消化）。好ましい発現カセットは、以下の様式で、ウイルス発現ベクター、好ましくはレトロウイルス発現ベクターに導入される。
【０２３７】
好ましい発現カセットを含むＤＮＡ分子は、連結によってレトロウイルス移入ベクターに導入される（先の実施例を参照のこと）。２つのタイプのレトロウイルス移入ベクターが、当該分野で公知である：複製インコンピテントおよび複製コンピテントである。複製インコンピテントベクターは、感染性の粒子を産生するために必要なウイルス遺伝子を欠くが、ウイルス伝達のために必要なシス作動性ウイルス配列を保持する。このようなシス作動性配列は、Ψパッケージング配列、逆転写および組込みのためのシグナル、ならびにウイルスプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化、および他の調節配列を含む。複製コンピテントベクターは、これらのすべてのエレメントならびにビリオン構造タンパク質（代表的には、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖと名付けられた遺伝子によってコードされるタンパク質）をコードする遺伝子を保持し、従って種々の細胞株における感染性粒子を形成し得る。対照的に、これらの機能は、パッケージング細胞株（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子をコードするｍＲＮＡを産生するが、Ψパッケージング配列を欠く細胞株）中の複製インコンピテントベクターにトランスで提供される。一般的には、Ｃｅｐｋｏ、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、９−３０〜９−３５頁、第９章の単元９．１０を参照のこと。
【０２３８】
ＡＮＴ発現カセットを含むレトロウイルス構築物は、カセット配列およびΨパッケージング配列を含むＲＮＡ分子を産生する。これらのＲＮＡ分子は、適切な細胞株中にウイルス構造タンパク質によってカプセル化されるウイルスゲノムに対応する（「適切な」によって、例えば、パッケージング細胞株は、複製インコンピテントなレトロウイルスベクターに基づく構築物のために使用されなければならないことが意味される）。次いで、感染性ウイルス粒子が産生され、そして細胞膜から出芽する（ｂｕｄｄｉｎｇ）ことによって、培養上清に放出される。ＡＮＴ発現カセットを含むウイルスＲＮＡゲノムを含む感染性粒子を、公知の方法に従って調製および濃縮する。所望でないヘルパーウイルス、すなわちＡＮＴ発現カセットを含まないウイルス粒子をモニタリングすることが所望され得る。一般的には、Ｃｅｐｋｏ、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、９−３６〜９−４５頁、第９章の単元９．１１、９．１２、および９．１３を参照のこと。
【０２３９】
ＡＮＴ発現カセットを含むウイルス粒子を使用して、インビトロ（例えば、培養細胞）またはインビボ（例えば、動物全体の一部である、齧歯動物の細胞、またはトリ種の細胞）で感染させる。組織移植片または培養した胚もまた、当該分野で公知の方法に従って感染され得る。一般的には、Ｃｅｐｋｏ、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２、９−４５〜９−４８頁、第９章の単元９．１４を参照のこと。使用する細胞の型に関わらず、ＡＮＴタンパク質の産生は、組換えウイルスゲノムによって方向付けられる。
【０２４０】
好ましい実施態様において、組換え的に産生されたＡＮＴタンパク質は、培養細胞の細胞膜中に挿入される。レトロウイルス発現構築物は、細胞膜から出芽すること（ｂｕｄｄｉｎｇ）によってウイルス粒子を産生するので、培養上清に送達される、結果として生じるウイルス粒子は、それらの莢膜中に、好ましくは粒子の表面に、組み込まれたＡＮＴタンパク質を有する。このようなＡＮＴ提示ウイルス粒子は、ＡＮＴタンパク質についての安定な様式を提供することが期待され、従ってＡＮＴタンパク質を使用するアッセイにおいて、直接的に、またはＡＮＴがさらに精製され得る供給源の物質として有用であることが期待される。ミトコンドリア膜へ挿入されるＡＮＴタンパク質の量を最小化することが所望される場合、ミトコンドリアをほとんど欠くか、または完全に欠くような様式で処理されたρ0細胞を、宿主細胞として使用する。
【０２４１】
（Ｃ．ｐＣＤＮＡ−ＡＮＴ３発現構築物の調製および発現）
ＡＮＴ３ｃＤＮＡを、以下のプライマー、ＡＭＰＬＩＴＡＱTMＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ならびにＧＥＮＥＡＭＰTM  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ）で供給される試薬および緩衝液を用いて、製造業者の使用説明書に従い、サーマルサイクラー中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。以下のＰＣＲプライマーの代表において、下線を付したヌクレオチドは、ＡＴＮ３  ｃＤＮＡの５’末端および３’末端に相補的な配列を示し、二重下線を付したヌクレオチドは、制限酵素ＸｈｏＩ（認識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）およびＡｓｐ７１８（認識配列：５’−ＧＧＴＡＣＣ）の認識配列を示し、そしてＡＮＴ３開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドン（ＴＡＡ）の逆方向の相補体を太字で示す。
【０２４２】
ＡＮＴ３発現構築物（ｐＭＫ３Ａ−ｈｕＡＮＴ３，ａ．ｋ．ａ．ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ−ＡＮＴ３）由来のヒトＡＮＴ３（ｈｕＡＮＴ３；配列番号３）の増幅に使用したプライマーは以下であった：
正方向（センス）：
【０２４３】
【化１９】
2004154139.tif 000020
配列番号３４、
および逆方向（アンチセンス）：
【０２４４】
【化２０】
2004154139.tif 000021
配列番号３５。
【０２４５】
ＰＣＲ産物を、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＡｓｐ１７８（両方の酵素は、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより入手）で、製造業者の供給した反応緩衝液を用いて、製造業者の推奨に従って消化した。制限消化したＤＮＡを、水平アガロースゲル電気泳動、そしてＵｌｔｒａＣｌｅａｎTMＧｅｌＳｐｉｎ  キット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｓｏｌａｎａ  Ｂｅａｃｈ，ＣＡ）を用いるバンド抽出によって精製した。
【０２４６】
発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用した。このベクターは、５’から３’方向に作動可能に連結された以下のエレメントを含む：サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター（ＰCMV）；いくつかの制限酵素の認識配列を含むマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）；ならびにｍＲＮＡの安定性を増強する、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび翻訳終結配列。この発現ベクターはまた、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における形質転換のポジティブ選択のためのアンピシリン耐性遺伝子、および哺乳動物細胞における形質転換のポジティブ選択のためのネオマイシン耐性遺伝子、ならびに細菌細胞および哺乳動物細胞についての複製起点（それぞれ、ＣｏｌＥ１およびＳＶ−４０由来）を含む。このＳＶ４０複製起点は、発現構築物のエピソームの複製、ならびにＳＶ４０のラージＴ抗原を発現する細胞（すなわち、ＣＯＳ−１細胞またはＣＯＳ−７細胞それぞれ、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１６５０およびＣＲＬ−１６５１）における単純ベクターレスキュー（ｓｉｍｐｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｒｅｓｃｕｅ）を可能にする。
【０２４７】
プラスミドｐｃＤＮＡ３を、製造業者の使用説明書に従って、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＡｓｐ１７８で消化して、水平アガロースゲル電気泳動に供し、そしてＵｌｔｒａＣｌｅａｎTMＧｅｌＳｐｉｎ  キット（Ｍｏ  Ｂｉｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いるバンド抽出によって調製した。制限酵素で消化したＡＮＴ  ｃＤＮＡを、製造業者の反応緩衝液および以下の製造業者の使用説明書を使用する、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して、同じように消化したｐｃＤＮＡ３発現ベクターＤＮＡ中へライゲーションした。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨ５α株；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、製造業者の使用説明書に従ってライゲーション混合物で形質転換した。単一のコロニーを選択し、そして５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む３〜５ｍｌのＬＢブロス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，１９８９）中で増殖させた。プラスミドＤＮＡを、ＷＩＺＡＲＤTMＰｌｕｓ
Ｓｅｒｉｅｓ  ９６００  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて細菌培養物から単離した。ｐｃＤＮＡ３由来のＡＮＴ３発現ベクター構築物のいくつかの単離物は、制限マッピングされ、それらの構造が確認された。予測された制限地図を有するｐｃＤＮＡ３−ＡＮＴ３発現構築物の１つの単離物を、さらなる実験のために選択し、「ｐＭＫ６−ＡＮＴ３」と命名した。
【０２４８】
（Ｄ．ＡＮＴ３−ＧＦＰ融合タンパク質発現構築物の調製）
この節では、異なる２つのＡＮＴ−ＧＦＰ融合タンパク質発現構築物の調製および構造を記載する。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、シフトした発光スペクトルおよび／またはネイティブのタンパク質よりも強く蛍光を発する能力を有するＧＦＰ誘導体を生成するために、広範囲な遺伝的操作をされている天然に存在する蛍光タンパク質である（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：２１６−２２４，１９９８、およびその中で引用される参考文献を参照のこと）。本明細書で使用される用語「グリーン蛍光タンパク質」は、野生型のグリーン蛍光タンパク質（野生型ＧＦＰ）、ならびにブルーシフト化、シアンシフト化、レッドシフト化およびイエローシフト化した野生型ＧＦＰの誘導体（それぞれ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＲＦＰ、およびＹＦＰと命名される；公開されたＰＣＴ出願  ＷＯ９８／０６７３７を参照のこと）、およびさらなる機能性ポリペプチド配列を含む他のＧＦＰ誘導体を含む。
【０２４９】
（１．アミノ末端融合（ＹＦＰ−ＡＮＴ）タンパク質の調製）
実施例２に詳細に記載されるように、（本明細書でｐＭＫ３Ｃとも言及される）ｐＭＫ３Ｃ−ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３は、ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３融合タンパク質（ＧＳＴ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）をコードする配列を含み、かつそれを発現するｐＧＥＸ−４Ｔ−２から誘導される発現構築物である。プラスミドｐＭＫ３Ｃを、ＧＳＴをコードする配列、またはｐＭＫ３Ｃ中のＧＳＴとＡＮＴ３を連結するトロンビン切断部位を欠くが、ＡＮＴ３をコードする配列を含む制限フラグメントを遊離するために、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した。
【０２５０】
この発現ベクターｐＥＹＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩで制限酵素消化した。（ｐＥＹＦＰ−Ｃ１ベクターにおける）ＢｇｌＩＩおよび（ＡＮＴ３フラグメントにおける）ＢａｍＨＩは、同一の認識部位を有さないが、これらの制限酵素は、配列５’−ＧＡＴＣを有する適合性の付着末端を生成する。同様に、（ｐＥＹＦＰ−Ｃ１ベクターにおける）ＳａｌＩおよび（ＡＮＴ３フラグメントにおける）ＸｈｏＩは、同一の認識部位を有さないが、これらの制限酵素は、配列５’−ＴＣＧＡを有する適合性の付着末端を生成する。前述の制限フラグメントから形成される所望されたライゲーション産物において、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１におけるＢｇｌＩＩ部位は、ＡＮＴ３をコードするフラグメントにおけるＢａｍＨＩ部位と連結され、ＡＮＴ３をコードするフラグメントにおけるＸｈｏＩ部位は、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１におけるＳａｌＩ部位と連結され、そして結果として生じたプラスミドは、ＹＦＰ−ＡＮＴ３融合タンパク質をコードする。用語「ＹＦＰ−ＡＮＴ３融合タンパク質」は、（１）５１３ｎｍに励起極大、および５２７ｎｍに発光ピークを有する、機能強化されたイエロー蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）に対応するアミノ末端ポリペプチド部分、および（２）ｈｕＡＮＴ３に対応するカルボキシ末端ポリペプチド部分を有する単一の連続したポリペプチド鎖を示す。
【０２５１】
この制限酵素消化したＤＮＡを、当該分野で公知の標準的条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して互いにライゲーションした。コンピテントｒｅｃＡ１  ｈｓｄＲ  ｅｎｄＡ１  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ＴＯＰ１０Ｆ’株；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、製造業者の使用説明書に従ってライゲーション混合物で形質転換した。単一のコロニーを選択し、３〜５ｍｌのＬＢブロス中で増殖し、そしてプラスミドＤＮＡを、ＷＩＺＡＲＤTMＰｌｕｓ  Ｓｅｒｉｅｓ
９６００  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて細菌培養から単離し、制限マッピングした。予測された制限酵素地図を有するＹＦＰ−ＡＮＴ３発現構築物の１つの単離物を、さらなる実験のために選択し、「ｐＭＫ７−ＹＦＰ（Ｎ）−ＡＮＴ３」と命名した。
【０２５２】
（２．カルボキシ末端融合（ＡＮＴ−ＹＦＰ）タンパク質）の調製
プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｈｕＡＮＴ３（ｐＭＫ６−ＡＮＴ３）を、（ｈｕＡＮＴ３インサートの３’末端で）ＸｈｏＩおよび（ＭＣＳ中のＸｈｏＩ部位から３’側で）ＸｂａＩを用いて制限酵素消化した。ＥＹＦＰをコードする配列を含むインフレームのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ制限フラグメントを、以下のように調製した。ＤＮＡを、以下のプライマー、プラスミド、基質としてｐＥＹＦＰ−Ｃ１、ＡＭＰＬＩＴＡＱTMＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ならびにＧＥＮＥＡＭＰTM  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ
Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ）で供給される試薬および緩衝液を用いて、製造業者の使用説明書に従い、サーマルサイクラー中でＰＣＲによって増幅した。以下のＰＣＲプライマーの代表において、一重下線を付したヌクレオチドは、ＥＹＦＰをコードするＤＮＡの５’末端および３’末端に相補的な配列を示し、二重下線を付したヌクレオチドは、制限酵素ＸｈｏＩ（認識配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ）およびＸｂａＩ（認識配列：５’−ＴＣＴＡＧＡ）の認識配列を示し、そしてＹＦＰ開始コドン（ＡＴＧ）およびＹＦＰ終止コドン（ＴＡＧ）の逆方向の相補体を太字で示す。
【０２５３】
使用したプライマーは以下のヌクレオチド配列を有した：
正方向（センス）：
【０２５４】
【化２１】
2004154139.tif 000022
配列番号３６、
および逆方向（アンチセンス）：
【０２５５】
【化２２】
2004154139.tif 000023
配列番号３７。
【０２５６】
制限酵素消化したＰＣＲおよびプラスミドＤＮＡを、水平アガロースゲル電気泳動、そしてＵｌｔｒａＣｌｅａｎTMＧｅｌＳｐｉｎ  キット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いるバンド抽出によって精製した。精製したＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用してともにライゲーションし、これを用いてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨ５α株；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、製造業者の使用説明書に従って形質転換した。単一のコロニーを選択し、そして５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３〜５ｍｌのＬＢブロス中で増殖させた。プラスミドＤＮＡを上記実施例のように細菌培養物から単離し、そして制限マッピングした。予測された制限地図を有するＡＮＴ３−ＹＦＰ発現構築物の１つの単離物を、さらなる実験のために選択し、「ｐＭＫ８−ＡＮＴ３−ＹＦＰ（Ｃ）」と命名した。ｐＭＫ８−ＡＮＴ３−ＹＦＰ（Ｃ）中のＡＮＴ３−ＹＦＰコード領域のヌクレオチド配列を、標準的な方法を用いて確認した。ｐＭＫ８−ＡＮＴ３−ＹＦＰ（Ｃ）の構造に起因して、発現構築物は（１）アミノ末端のｈｕＡＮＴ３ポリペプチドおよび（２）５１３ｎｍでの励起極大および５２７ｎｍでの発光ピークを有する、カルボキシ末端の機能強化されたイエロー蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）を有するタンパク質の産成を指示する。
【０２５７】
（Ｅ．ＡＮＴ３−ＹＦＰ融合タンパク質の発現および細胞内局在）
直前の節に記載した２つのＡＮＴ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現および細胞内局在を、いくつかの方法で試験した。初めに、蛍光顕微鏡を用いて、ｐＭＫ７−ＹＦＰ（Ｎ）−ＡＮＴ３またはｐＭＫ８−ＡＮＴ３−ＹＦＰ（Ｃ）のいずれかで形質転換した２９３個の細胞を可視化した。ｐＭＫ７−ＹＦＰ（Ｎ）−ＡＮＴ３の場合、観察された免疫蛍光は、サイトゾルの隅々まで拡散および分散された。対照的に、ｐＭＫ８−ＡＮＴ３−ＹＦＰ（Ｃ）で形質転換した細胞において、免疫蛍光はミトコンドリアに限られて観察された。同様の結果を、他の細胞型（すなわち、ＡＮＴ３−ＧＦＰ発現構築物で形質転換したＣＯＳ−１およびＳＩＩ−ＳＹ５Ｙ）で観察した。
【０２５８】
ＡＮＴ３−ＧＦＰ融合タンパク質のミトコンドリアの局在をさらに試験するために、細胞内画分のウェスタン分析を以下のように実行した。トランスフェクトした２９３個の細胞を、遠心分離によりペレット化し、そして１００μｌのＭＳＢ緩衝液（２１０ｍＭマンニトール（Ｓｉｇｍａ）、７０ｍＭショ糖（Ｆｌｕｋａ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、凍結−解凍を３回行うことによって溶解した。細胞画分の全部サイトゾル画分、亜ミトコンドリア粒子画分、ミトコンドリア画分および原形質膜画分を、以下のように調製した。細胞溶解液を、６００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、原形質膜ペレットを調製した。上清を取り出し、そして取っておいた。原形質膜ペレットを、１００μｌのＭＳＢで洗浄し、６００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、そして分析のために用いた。この上清を取り出し、初めの上清と組み合わせて混合し、これを用いてミトコンドリア画分およびサイトゾル画分を１２，０００〜１４，０００×ｇ、４℃で１５分間の遠心分離によって調製した；このペレットは、ミトコンドリアの画分を表し、そして上清はサイトゾルを表す。
【０２５９】
各画分についてのタンパク質含量は、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて決定し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の１レーンあたり等量の総タンパク質（１０μｇ）をロードし、電気泳動し、そしてＨＹＢＯＮＤTM  ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に転写した。ＡＮＴ３−ＧＦＰ融合タンパク質を全てのＧＦＰ誘導体を認識し、かつセイヨウワサビペルオキシダーゼへの結合を介して直接標識されている抗体（ｔｈｅ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｏｌｏｒ（登録商標）ペプチド抗体，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、本質的には製造業者の説明書に従って、ウェスタンブロッティングで検出した。ウェスタン分析の結果によって、ｐＭＫ８−ＡＮＴ３−ＹＦＰ（Ｃ）から発現されたタンパク質（ここで、ＹＦＰコード配列は、ＡＮＴ３−ＧＦＰ融合タンパク質のカルボキシ末端側にある）がもっぱらミトコンドリアに位置していることが確認される。
【０２６０】
（実施例６：代表的なＡＴＲ誘導体の合成および特性）
多くのアトラクチロシド（ＡＴＲ）誘導体を、高スループットスクリーニングアッセイの状況でアデニンヌクレオチド輸送体についてのリガンドとしての使用のために調製した。これらの化合物は、ＡＮＴに高親和性で（すなわち、ｎＭ範囲で）結合するため、（イソ型にもかかわらず）ＡＮＴに対して高親和性を有する分子についての化学化合物のスクリーニングライブラリーのために有用である。ＡＴＲの構造を、化合物（１）として示す。化合物（３）および（４）は、ＡＴＲの新規の蛍光誘導体を示す。その一方で、化合物（２）は、穏和な条件下で125Ｉの導入を可能にするＡＴＲ誘導体である。
【０２６１】
【化２３】
2004154139.tif 000024
（精製）
化合物２、３、および４を、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ（７５：２５：１）を溶出溶液として使用してシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。検出を、Ｈ3ＰＯ4／Ｈ2Ｏ（１／１）中のバニリンの０．５％溶液で染色して行った。さらなる精製を、Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ８カラム（２５０×１０ｍｍ）を使用して、逆相ＨＰＬＣによって行った。カラムをメタノール／酢酸／１Ｍ酢酸アンモニウムが９８：１：１（「溶媒Ｂ」）とＨ2Ｏ／酢酸／１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液９８：１：１（「溶媒Ａ」）の直線勾配で流速２．０ｍＬ／分で溶出した。溶出液を２５４ｎｍの吸光度でモニターした。化合物含有画分をプールし、エバポレートし、そして繰り返しメタノールを添加して共にエバポレートした（３×５ｍｌ）。
【０２６２】
（化合物２の合成）
アトラクチロシド１（０．１０ｍｍｏｌ）をピリミジンを添加して繰り返しエバポレートすることによって乾燥させ（３×５ｍｌ）、そして得られたガム状の残渣をピリジン（５ｍｌ）に溶解した。得られた溶液に、０．２０ｍｍｏｌのトルエンスルホニルクロリドを添加した。反応混合物を周囲温度で１．５時間撹拌した。次いで、トルエンスルホニルクロリドの別の部分（０．２０ｍｍｏｌ）を添加して、さらに反応物を１．５時間撹拌したままにした。１ｍｌのメタノールを反応混合物に添加して、次いで、これを、０．５時間攪拌し、その後、溶媒をエバポレートすることによって取り除いた。残ったピリジンをさらなるメタノール（５×１０ｍｌ）のエバポレートによって取り除いた。シリカゲルクロマトグラフィー、次いで、溶媒Ａにおいて溶媒Ｂの５０〜８０％、３０分間の直線勾配を使用して逆相ＨＰＬＣを行い、その結果、６８％溶媒Ｂで化合物２が得られた。収率：４．３ｍｇ，４．９％。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ−Ｈ）実測値：８７９、理論値：８７９。
【０２６３】
（化合物３および４の合成）
７−ジエチルアミノ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−３−カルボン酸または０．２０ｍｍｏｌの１−ピレン酪酸および１ｍｌのジメチルホルムアミド中の０．６０ｍｍｏｌの１，１’−カルボニルジイミダゾールを１５分間反応させた。活性化したカルボン酸を、Ｈ2Ｏ（４ｍｌ）中のアトラクチロシド１の溶液に添加し、そして得られた反応混合物を周囲温度で１６時間攪拌した。エバポレーションしてガム状の残渣を得、これをシリカゲルクロマトグラフィー、次いで、逆相ＨＰＬＣによって精製した。溶媒Ａにおいて溶媒Ｂの１０〜８０％、５０分間の直線勾配（化合物３について）または溶媒Ａにおいて溶媒Ｂの５０〜１００％、５０分間の直線勾配（化合物４について）を使用して７５％Ｂで溶出する化合物３を得、そして８２％Ｂで溶出する化合物４を得た。収率：化合物３、３．１ｍｇ、８．０％；化合物４、１．３ｍｇ、３．６％。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ−Ｈ）化合物３、実測値９６８、理論値９６８；化合物４、実測値９９５、理論値９９５。
【０２６４】
（代表的なＡＴＲ誘導体の特性）
以下の表１にまとめられるように、化合物３および４は、Ｂｏｕｌａｙら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２８：３２３−３３０，１９８３；Ｒｏｕｘら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３４：３１−３７，１９９６；およびＬａｕｑｕｉｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６７：３０６−３１１，１９７６によって報告されたように、既存のＡＴＲ誘導体であるナフトイル−ＡＴＲおよびＭＡＮＴ−ＡＴＲと比較して、蛍光特性および感受性という点でより有利であることを見いだした。
【０２６５】
【表１】
2004154139.tif 000025
（実施例７：代表的なＡＴＲ誘導体の合成）
さらなる代表的なＡＴＲ誘導体である化合物５を以下に記載される手順によって調製した。
【０２６６】
【化２４】
2004154139.tif 000026
（化合物５の合成）
アトラクチル酸ジカリウム（０．１０ｍｍｏｌ）を５０％エタノール水溶液（５ｍｌ）に溶解し、そして活性炭担持パラジウム（ｐａｌｌａｄｉｕｍ  ｏｎ  ｃｈａｒｃｏａｌ）（１０％、１７ｍｇ）を反応混合物に添加した。水素で系をフラッシュした後、反応混合物を水素ガスの雰囲気下で３時間撹拌した。セライトを通した濾過によって触媒を除去した後、５０％エタノール水溶液（１０ｍｌ）で洗浄し、そして溶媒をエバポレートし、白色固体を得た。高減圧下で乾燥させた後の収率は、７８．３ｍｇ（９７．３％）であった。ＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ−２Ｈ＋Ｋ）実測値：７６５、理論値：７６５。1Ｈ−ＮＭＲ分析によって、アルケニックプロトンの非存在を確認した：ＤＭＳＯ−ｄ6）δ０．８８（ｄ，３Ｈ）、０．８９（ｄ、３Ｈ）、１．０２（ｄ、３Ｈ）。
【０２６７】
（実施例８：代表的なヨウ素化ＡＴＲ誘導体の合成）
実施例６の化合物２を、種々の化学部分の結合体化のための中間体として使用して、さらなるＡＴＲ誘導体を得た。この実施例では、化合物２を用いて、穏和な条件下で125Ｉを導入し、以下の化合物６を得る。
【０２６８】
【化２５】
2004154139.tif 000027
（化合物６の合成）
５μｌの０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ５）を２１μｌのＮａ125Ｉ（９．２５ｍＣｉ）をその運送用容器中で合わせた（比活性、２１００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）。１０μｌ（２００μｇ、２１２ｎｍｏｌ）の実施例１の化合物２を、混合物に添加した。ｐＨをリトマス試験紙でチェックし、ｐＨ５より上がっていないことを確認した。この混合物を周囲温度で一晩（１７．５時間）放置し、放射性標識された化合物６を得た。（放射活性ではないヨウ素化ＡＴＲ誘導体は、結合研究において「コールド」競合物としての使用のために、非標識ヨウ素を使用して同じ様式で調製し得る）。ヨウ素化誘導体を、ランニング緩衝液（１％トリエチルアンモニウムアセテート，ｐＨ４．５）中の２５％〜５５％アセトニトリル勾配を用いて、Ｃ１８分析用カラム（４×６×２５０ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で精製した。１ｍｌ／分の流速を用いて３０分にわたる勾配をかけた。所望の生成物は、２５分で溶出された。ＥＳＩ−ＭＳ：８３５（Ｍ−Ｈ）、７０７（ｍ−２Ｈ−Ｉ）。
【０２６９】
（実施例９：代表的なＡＴＲ誘導体の合成）
カルボニルジイミダゾールでのカルボン酸の活性化およびＡＴＲとのそれらの反応は、種々の６’−Ｏアシル誘導体の合成のために選択した方法であった。ＡＴＲの６’−ヒドロキシルは比較的反応性が低く、そしてアグリコンおよび硫酸化グルコース部分にアリルの二級ヒドロキシルが存在することが、これらのアシル化反応の有効性に対するネガティブな影響を有する全ての因子である。従って、収率は、一般的に乏しく、そしてこのアプローチは、大過剰のアシル化試薬を必要とする。
【０２７０】
ＡＴＲ系にアミン官能性を導入するための２つのストラテジーを以下に記載する。これは、広範囲のＡＴＲ誘導体の合成を可能にする。第１のストラテジーは、スキーム１に示されるように、化合物２の第一級トシレートをアジドで置換し、次いで、還元し、対応する６’−アミン（化合物７）を得る。あるいは、アミン基をスペーサーの一部として導入し得る。スペーサーによってより立体的な要求をする官能基部分の導入を可能にする。従って、６’−Ｏ−スクシノイル誘導体（化合物８；Ｂｒａｎｄｏｌｉｎら，１９７４  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６：１４９を参照のこと）と１つが保護された（ｍｏｎｏｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）ジアミンとの反応させ、次いで脱保護することによって、反応スキーム２に例示される化合物９を得る。
【０２７１】
【化２６】
2004154139.tif 000028
次いで、アミン含有ＡＴＲ誘導体７および９を、反応性のイソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、および無水物機能性を有する種々の発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）およびハプテンと反応させて、チオ尿素およびアミド結合を有する安定なＡＴＲ誘導体を生じさせ得る。代表的な調製されたＡＴＲ誘導体は、Ｅｕ3+に対して錯体形成されたこれらの化合物の時間消滅蛍光検出のための有用性を有するＡＴＲ−ランタニドキレート化剤（化合物１０，１１，１２，１３，２０および２１）を含む。さらに、ＡＴＲを、極めて高感度に蛍光によって検出可能である、シアニン（化合物１４および１５）およびフルオレセインアナログ（化合物１６および１７）に結合させた。ビオチン−ＮＨＳエステルと化合物７および９のＡＴＲ誘導体との結合は、比色技術、蛍光性技術または化学発光技術を用いて、市販されている酵素−アビジン結合体で検出され得る、ＡＴＲ−ビオチン結合体（化合物１８および１９）を提供した。
【０２７２】
より詳細には、ＤＭＦ中の化合物２の溶液を８０℃で８時間アジドイオンで処理して、６’−アジド−ＡＴＲを得、これを、１％酢酸を補充したＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ溶媒系を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。室温で４時間ＴＨＦ／Ｈ2Ｏ中で、１．５当量のトリフェニルホスフィンを用いるシュタウジンガー還元が化合物７のアミンを生じ、これをシリカゲルクロマトグラフィー精製後に単離した。
【０２７３】
より立体的に要求される機能性部分を供給するために、６’−Ｏ−スクシノイル−ＡＴＲを、ＡＴＲ−モノ−保護化アミン誘導体を生成するために、市販されているモノ保護化されたジアミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と縮合させ得る。従って、ＤＭＦ中で１．１当量のモノ保護化されたＦＭＯＣジアミンと６’−Ｏ−スクシノイル−ＡＴＲとのＥＤＣ媒介結合は、アセトニトリル中でピペリジンまたは１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）を用いて脱保護したアミドを生じ、化合物９のＡＴＲ誘導体を供給した。このアミンを、上述のようにシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
【０２７４】
化合物７および９のＡＴＲアミン誘導体を、水性ＤＭＦ中のイソチオシアネート、無水物およびＮＨＳエステルのようなアミン反応機能性を含む、種々の発蛍光団、キレートおよびハプテンと結合させ、化合物１０〜１９のＡＴＲ誘導体を生成した：これらの化合物を、０．１〜１％酢酸を含むＣＨ3ＯＨ／Ｈ2Ｏ勾配を用いるＣ−８カラム上のシリカゲルクロマトグラフィーおよび分離用の逆相クロマトグラフィーの組み合わせにより精製した。
【０２７５】
【化２７】
2004154139.tif 000029
（実施例１０）
（代表的なＡＴＲ誘導体およびそれらの中間体の合成）
（アトラクチロシドまたはジヒドロアトラクチロシドの有機酸への結合の一般的な手順）
【０２７６】
【化２８】
2004154139.tif 000030
カルボン酸（２００μｍｏｌ）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（７００μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）中に溶解し、そして１５分間攪拌した。活性型の酸へ、ＤＭＦ：Ｈ2Ｏ（１：２、６ｍＬ）中のアトラクチロシド（ＡＴＲ）（１００μｍｏｌ、８５ｍｇ）またはジヒドロアトラクチロシド（１００μｍｏｌ）の溶液を、添加した（１ｍＬずつを約３０秒かけて）。反応混合物を、室温で６０分間攪拌し、その後溶媒を、温度を４０℃より下に保った水浴でロータリーエバポレーターにより取り除いた。残渣から、添加したＥｔＯＨ：Ｈ2Ｏ（１：１、３×２０ｍＬ）の反復したエバポレーションによりＤＭＦの痕跡を除去した。次いで、残渣を、ＭｅＯＨ：Ｈ2Ｏ（１：１、１０ｍＬ）中に入れ、もし必要であれば超音波処理し、そして０．４５μｍのフィルターで濾過した。エバポレーションし、約１．３ｍＬの緩衝液中に再溶解し、そして逆相ＨＰＬＣにより精製し、所望の６’−Ｏ−アシル−ＡＴＲを５〜１５％の収率で得た。
【０２７７】
（アトラクチロシド誘導体の精製のための逆相ＨＰＬＣ条件）
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による精製を、Ｈ2Ｏ：ＡｃＯＨ：１Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃ（緩衝液Ａ、９８：１：１）中のＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ：１Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃ（緩衝液Ｂ、９８：１：１）の勾配を用いて、１０×２５０ｍｍのＣ−８カラム中で行なった。代表的には、３０分にわたる５０〜８０％のＡ中のＢの勾配を用いた。さらに親油性の誘導体のために、勾配は、同じ時間で、６０〜９０％または７０〜１００％のＢであった。
【０２７８】
（ジヒドロアトラクチロシドの合成）
【０２７９】
【化２９】
2004154139.tif 000031
１５ｍｌのＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏ（１：１）中のアトラクチロシド、ジカリウム塩（２５４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、触媒として活性型のパラジウム／炭素（１０％）を５１ｍｇ用いて、３時間大気圧下で水素付加した。触媒をセライトを通して濾過して取り除き、そしてセライト床を、１５ｍｌのＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏで洗浄した。濾過物を、ロータリーエバポレーションにより濃縮し、続いて、一晩高い真空条件下で乾燥させ、生成物を白色固体（２３６ｍｇ）として得た。これは、ＮＭＲにより純粋であった。
【０２８０】
（６’−トシル−アトラクチロシド）
【０２８１】
【化３０】
2004154139.tif 000032
アトラクチロシド．３Ｈ2Ｏ（２５５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、乾燥ピリジン（３×５ｍｌ）と共に、共エバポレートすることにより乾燥させ、次いで、１６時間、高真空条件下に保った。乾燥したアトラクチロシドを、１５ｍｌの乾燥ピリジン中に溶解し、そして１１４ｍｇの塩化トシル（０．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を２時間２３℃で攪拌し、次いでさらに、１１４ｍｇの塩化トシルを添加し、そして反応をさらに１．５時間続けた。メタノール（１ｍｌ）を、過剰な塩化トシルを除去するために反応混合物に添加し、そして混合物を数分間攪拌した。混合物を乾燥させるためにエバポレートし、そして残ったピリジンをメタノール（２×３０ｍｌ）を添加して、エバポレートすることにより取り除いた。粗生成物を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより部分精製した（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ、３：１、１％ＡｃＯＨを伴う）。生成物を含んだ画分を、３ｍｌのＨ2Ｏ：ＭｅＯＨ：１Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃ：ＨＯＡｃ（４９：４９：１：１）に溶解し、そしてＨ2Ｏ：ＡｃＯＨ：１Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃ（緩衝液Ａ、９８：１：１）中のＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ：１Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃ（緩衝液Ｂ、９８：１：１）の５０〜８０％の勾配を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含んだ画分を、プールし、エバポレートし、そして３×１０ｍｌのＭｅＯＨのさらなる共エバポレーションを行なった。トシル−アトラクチロシドを、秤量６０ｍｇのガラス質の物質として得た。
【０２８２】
（４−ヒドロキシフェニル誘導体のラクトペルオキシダーゼ−触媒されたヨウ素化のための一般的な手順）
【０２８３】
【化３１】
2004154139.tif 000033
Ｈ2Ｏ（１２０μＬ）中の４’−ヒドロキシ−ビフェニル−４−カルボン酸アトラクチロシド−６’イルエステル（１．０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ラクトペルオキシダーゼ（５０μＬ、２００ＩＵ／ｍＬ）、ＮａＩ（１０μＬ、１００ｍＭ）およびＨ2Ｏ2（２０μＬ、１００ｍＭ）の水溶液を添加した。反応を室温で１時間放置し、その後−２０℃で凍結した。翌日（約２０時間後）、反応混合物を、解凍し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣを行なった。３つの主なピークを溶出し、そしてエレクトロスプレーイオン化−質量分光測定（ＥＳＩ−ＭＳ）分析で、それらの正体が、未反応の出発物質、そしてモノヨウ素化されたアトラクチロシド誘導体、そしてジヨウ素化されたアトラクチロシド誘導体であることが確認された。
【０２８４】
これらの条件は、ＮａＩおよび／または酵素のさらなるアリコートを用いてモノおよびジ−ヨウ素化形態に完全に反応を駆動するように改変され得る。
【０２８５】
（ヨードフェノールの合成に関する概論）
【０２８６】
【化３２】
2004154139.tif 000034
Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ、Ｓｃａｎｄ．１２、１８８（１９５８）に記載されるヨウ素化の手順を、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、４’−ヒドロキシ−４−ビフェニルカルボン酸、および４−ヒドロキシ安息香酸のモノ−ヨウ素化に用いた。この方法はまた、３−（４−メトキシフェニル）−プロピオン酸のモノ−ヨウ素化および３−（３−ヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸のジ−ヨウ素化に適用できる。
【０２８７】
従って、２０ｍｌのＨ2Ｏ中のＫＩ（１．９９ｇ、１２ｍｍｏｌ）およびヨウ素（１．２２ｇ、４．８ｍｍｏｌ）の溶液を、滴下様式で、２０分にわたって、１００ｍｌの濃アンモニア水溶液中の３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（０．８３ｇ、５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物をさらに４０分間攪拌し、次いで真空にし、アンモニアを取り除いた。この混合物を、ロータリーエバポレーションによりさらに乾燥させ、油性の残渣を得た。粗生成物を、２Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍｌ）とエーテル（２×５０ｍｌ）との間で分配し、そしてエーテル層を合わせそして濃縮し、黄色がかった固体の残渣を得た。溶離液（ｅｌｕａｎｔ）として９５：５のＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨを用いるフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーを行ない、生成物を含む画分を濃縮し、そして１：１のベンゼン  ヘキサン中で再結晶化することにより、７９０ｍｇの３−ヨード−４−ヒドロキシフェニルプロピオン酸を得た。
【０２８８】
３−（３，５−ジヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸を、５．２当量のＫＩおよび２．１当量のＩ2を用いて同様の様式で調製した。トルエンからの結晶化に続いて、ジ−ヨード誘導体を７７％の収率で得た。
【０２８９】
（５−ヨード−６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸）
【０２９０】
【化３３】
2004154139.tif 000035
６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸および４−ヒドロキシ安息香酸のモノ−ヨウ素化を、ＥｄｇａｒおよびＦａｌｌｉｎｇ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５、５２８７、１９９０）に従って行なった。従って、０．７５ｇ（４．３４ｍｍｏｌ）を１９ｍｌのＭｅＯＨに溶解し、そして１．０４ｇのＮａＩ（および０．２７ｇのＮａＯＨ）を添加した。この溶液を０℃に冷却し、そしてＮａＯＣｌ水溶液（４％溶液、１２．９ｍｌ）を７５分にわたって滴下した。得られた混合物を、１時間０℃で攪拌し、次いで７ｍｌの１０％メタ亜硫酸水素ナトリウム水溶液で処理した。この混合物を、５％のＨＣｌを用いてｐＨ７に調整し、そして４０ｍｌのエーテルで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、そしてＭｇＳＯ4で乾燥させた。溶液をオフホワイトの固体に濃縮し、これをトルエン／ＣＨ3ＯＨから再結晶化して０．４２ｇの５−ヨード−６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を得た。
【０２９１】
（６’−トシルアトラクチロシドと１，２−エチレンジアミンの反応）
【０２９２】
【化３４】
2004154139.tif 000036
６’−トシル−アトラクチロシド（２５ｍｇ）を、２ｍｌの１，２−エチレンジアミンに溶解し、そして混合物を２３℃で一晩攪拌した。１，２−エチレンジアミンを、真空で取り除き、残渣をＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ（２：１）中に溶解し、そして１０．６ｍｇの生成物を上述の条件を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣにより単離した。プロトンｎｍｒおよび質量スペクトルが、イソバレリル（ｉｓｏｖａｌｅｒｙｌ）基の欠失を示した。
【０２９３】
（Ｎ−（６−デオキシ−アポ−アトラクチロシル（ａｔｒａｃｔｙｌｏｓｙｌ）−エタンジアミンとＢｏｌｔｏｎ  Ｈｕｎｔｅｒ試薬との反応）
２．７５ｍｌ中のＤＭＦ／ＤＭＳＯ（８：３）中のＮ−（６−デオキシ−アポ−アトラクチロシル）−エタンジアミン（１０．６ｍｇ）を、６０ｍｇの４−ヒドロキシフェニルプロピオニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Ｂｏｌｔｏｎ  Ｈｕｎｔｅｒ試薬）と、２３℃で１６時間反応させた。溶液を水で希釈し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、９．１ｍｇの所望の化合物を得た。
【０２９４】
【化３５】
2004154139.tif 000037
ラクトペルオキシダーゼが触媒した化合物のヨウ素化は、ジ−ヨード−アポ−アトラクチロシド誘導体への量的な変換に至る。
【０２９５】
（アトラクチロシドと無水コハク酸との反応）
【０２９６】
【化３６】
2004154139.tif 000038
アトラクチロシド．３Ｈ2Ｏ（２５５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、乾燥ピリジン（３×５ｍｌ）と共に共エバポレートすることにより乾燥させ、次いで、高い真空下に１６時間保った。乾燥させたアトラクチロシドを、６ｍｌの乾燥ピリジン中に溶解し、そして６０ｍｇの無水コハク酸（０．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、３０分間８０℃に保ち、別の６０ｍｇの無水コハク酸（０．６ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物をさらに３時間攪拌した。ピリジンを真空下で取り除き、そして残渣を１０ｍｌのＭｅＯＨで摩砕した。６’−Ｏ−スクシニル−ＡＴＲ誘導体を、濾過により白色の固体として収集し、ＭｅＯＨで洗浄し、そしてＰ2Ｏ5で一晩乾燥させた。
【０２９７】
（６’−Ｏ−スクシニルアトラクチロシドとチラミンとの反応およびヨウ素化）
【０２９８】
【化３７】
2004154139.tif 000039
６’−Ｏ−スクシニルアトラクチロシド（８５ｍｇ）を、２ｍｌのＤＭＦ中に溶解し、そして２８ｍｇのチラミンおよび１００ｍｇのＰｙＢＯＰを添加した。混合物を、２３℃で１６時間攪拌した。粗混合物を、ＲＰ−ＨＰＬＣにかけ、そして所望のアミドを、１９．７ｍｇ単離した。上述の標準的な条件を用いる、生成物のラクトペルオキシダーゼ触媒ヨウ素化は、モノおよびジ−ヨウ素化された生成物を提供した。
【０２９９】
（４−（４−ヒドロキシ−３−メチル）酪酸の合成）
【０３００】
【化３８】
2004154139.tif 000040
０℃で５０ｍｌの１，２−ジクロロエタン中の４ｇ（３０ｍｍｏｌ）のＡｌＣｌ3に２．７ｇ（２７ｍｍｏｌ）の無水コハク酸を添加し、そして混合物を２０分間攪拌した。２−メチルアニソール（３．１ｍｌ、２５ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの反応混合物を２３℃に温め、１２時間攪拌した。この混合物を３００ｍｌの氷冷水に注ぎ、そして沈殿物をろ過した。この沈殿物を３００ｍｌの水で２回洗浄し、白色固体を生じた。この固体物質を真空下で乾燥し、次の反応で使用する３．５１ｇの産物を生じた。
【０３０１】
３−（４−メトキシ−３−メチルベンゾイル）プロピオン酸（４．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）および４．４９ｇのＫＯＨペレット（８０ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのエチレングリコール中に溶解し、そして３．８８ｍｌのヒドラジン水和物（８０ｍｍｏｌ）を４容の攪拌溶液中に添加した。この得られた反応混合物を油浴中で２４時間、１５５℃で加熱した。冷却後、反応混合物を１００ｍｌのベンゼン中で処理し、そして１０％クエン酸水溶液で洗浄する。有機層を別の部分のクエン酸で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空で濃縮し、静置下で結晶化する油状残査を生じた。この物質を加熱ヘキサンで粉砕し、そしてこの溶媒を蒸発させ、溶出溶媒として、ヘキサン／酢酸エチル（８：２）を使用した、シリカゲルｔｌｃで均一な３．５５ｇの結晶固体を生じた。
【０３０２】
４−（４−メトキシ−３−メチルフェニル）酪酸（３．１２ｇ）を１２０ｍｌの４８％ＨＢｒ水溶液／酢酸の１：１混合物中で２４時間、１５５℃で加熱した。この反応混合物を室温に冷却し、そして２００ｍｌのベンゼン／エーテル（１：１）で抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、そして濃縮し、明褐色固体残査を生じた。この反応産物を溶出溶媒としてヘキサン／酢酸エチル（３：１）を使用した、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで分離し、明黄色固体として０．８６ｍｇの４−（４−ヒドロキシ−３−メチル）−酪酸を提供した。
【０３０３】
（アトラクチロシド誘導体の代表的な合成）
１０ｍｌ中の無水ＤＭＦ中の３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（ＨＰＰ）（０．４９８ｇ、３．０ｍｍｏｌ）の溶液にカルボニルジイミダゾール（０．４８６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で３０分間攪拌し、１ｍｌの無水ＤＭＦ中のアトラクチロシド（ＡＴＲ）（０．０８６ｇ、０．１ｍｍｏｌ）溶液に一部ずつ（２ｍｌ／時間）加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌し、そして１ｍｌの水でクエンチした。この溶媒を真空下で蒸発させ、残査を酢酸エチル（７５ｍｌ）および水（５０ｍｌ）中で溶解した。水層を分離し、酢酸エチル（７５ｍｌ、３回）で抽出し、真空下で濃縮した。この残査を１．５ｍｌのメタノール／水（１／１）で溶解し、０．２ｍｍのフィルターを通してろ過し、そして調製用Ｃ−８カラム（ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ、１０×２５０ｍｍ）を有するＨＰＬＣを使用し、流速２．０ｍｌ／分で３０〜６０％の溶媒Ｂの直線勾配溶出（溶媒Ａ：水／酢酸／酢酸アンモニウム（１．０Ｍ水溶液）：（１０００／１／１）；溶媒Ｂ：メタノール／酢酸／酢酸アンモニウム（１．０Ｍ水溶液）：（１０００／１／１））を使用して精製した。表記の化合物（以下の実施例１１の化合物３６）を白色フィルム（６．２ｍｇ）として得た。
【０３０４】
（実施例１１）
（さらなる代表的なＡＴＲ誘導体）
実施例１０に示す手順に従って、以下のＡＴＲ誘導体を調製した。
【０３０５】
（アトラクチロシド誘導体）
【０３０６】
【化３９】
2004154139.tif 000041
2004154139.tif 000042
2004154139.tif 000043
（ジヒドロアクトラクチロシド誘導体）
【０３０７】
【化４０】
2004154139.tif 000044
（アポアクトラクチロシド誘導体）
【０３０８】
【化４１】
2004154139.tif 000045
（実施例１２）
（組換えＨｕａｎｔ３を使用した結合アッセイ）
（Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉ中で組換え産生されたＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３）
アラビノース誘導の後、形質転換または偽形質転換（ベクターのみ）されたＥ．ｃｏｌｉを２０００ｇ、１０分間の遠心分離で回収した。この細菌ペレットをＭＳＢ中に再懸濁し、これにリゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）を加えた。室温で２０分後、溶解物を１回の凍結融解サイクルに供し、次いで上記のように超音波処理した。得られた膜調製物を結合アッセイのために使用した。
【０３０９】
最大の結合およびｈｕＡＮＴ３の過剰発現の程度を見積もるために、２５μｇの膜タンパク質を結合緩衝液（１２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、  １ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））中で２時間、室温で異なる量の［32Ｐ］ＡＴＰ（１−５００μＭ）と共にインキュベートした。結合ＡＴＰを有する膜を５０００ｇ、５分間遠心分離によって沈殿させ、そして結合緩衝液で１回洗浄した。次いで、膜ペレットを５ｍｌのシンチレーション反応混液と共に混合し、計数した。この結果を表２に示す。
【０３１０】
【表２】
2004154139.tif 000046
表２に示したデータは、ＡＴＰ結合の親和力が約６μＭであったことを示す。ＡＴＰ結合は、このアッセイにアトラクチロシド（１０μＭ）を添加することによって完全に消滅した。これらの結果は、ＡＴＰ結合が組換え産生されたＡＮＴ３タンパク質に対して優先的に測定されるという論点を支持する。
【０３１１】
アガロースグルタチオンビーズを可溶化した細菌溶解物（ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して；実施例１、セクションＤを参照のこと）と共にインキュベートし（実施例２を参照のこと）、そして結合アッセイにおいてＥ．ｃｏｌｉ膜と置換した。ビーズをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、０．１％）と共にプレインキュベートした場合、最良の結果（すなわち、さらに特異的な結合）を認めた。特異的ＡＴＰ結合（１，０７０ｃｐｍ）もまたこの実験において観察した（１０ｍＭの非放射標識ＡＴＰの存在下での２７９ｃｐｍの非特異的結合と比較する）。
【０３１２】
（Ｂ．Ｓｆ９／バキュロウイルス発現系からのｈｕＡＮＴ３）
ｈｕＡＮＴ３を発現するＳｆ９細胞をスピナーフラスコ中で増殖させた。この細胞を２０００ｇ、５分間の遠心分離で収穫した。この細胞ペレットをＭＳＢ中に再懸濁し、そして３回の凍結融解サイクルに供した。細胞膜および細片を６００ｇ、５分間の遠心分離で除去した；ミトコンドリアを２０，０００ｇ、１５分間上清を遠心分離することにより回収した。このミトコンドリアペレットをＭＳＢ中に懸濁し、そして上記のように結合アッセイのために使用した。［32Ｐ］ＡＴＰ結合の相同的競合をアッセイ当たり２５μｇのミトコンドリアタンパク質を使用して行った。
【０３１３】
図７に例示されるように、ＡＴＰは、ＡＮＴに対するＡＴＰ結合と同じ値である、Ｋｄ＝１３μＭでミトコンドリアに結合した。さらに、ＡＴＰ結合を低濃度のアトラクチロシドによって置換した（図８）。［125Ｉ］アトラクチロシドを使用した相同的競合結合アッセイは、Ｋｄ＝１２ｎＭを有する特異的結合を示した（図９）。これらの知見は、ミトコンドリア調製物における機能的ｈｕＡＮＴ３の存在と一致する。
【０３１４】
Ｈｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３タンパク質をＮｉ−アガロース磁性ビーズを使用してバキュロウイルス感染Ｓｆ９可溶化細胞溶解物から精製した；感染しなかったＳｆ９細胞をネガティブコントロールとして使用した。このビーズを２時間、［32Ｐ］ＡＴＰ（１または１００μＭ）と共にインキュベートした。ビーズを洗浄し、次いで結合ＡＴＰ量を決定するために計数した。表３に示すように、この［32Ｐ］ＡＴＰ結合は、コントロールよりも感染細胞から回収された物質において有意により高かった。結合飽和は、本質的に１μＭ  ＡＴＰで達成された。
【０３１５】
【表３】
2004154139.tif 000047
（実施例１３）
（競合的結合アッセイ）
アトラクチロシドアナログ（実施例６；表１；実施例７−９も参照のこと）をＳｆ９／ｈｕＡＮＴ３ミトコンドリアを使用した偽−相同的競合結合アッセイで使用した。ミトコンドリア（実施例１２参照、２５μｇ／チューブ）を上記のように（図７−９）、０．５ｎＭ［125Ｉ］アトラクチロシド、および異なる濃度の非放射標識アトラクチロシドまたは蛍光性アトラクチロシド誘導体と共にインキュベートした。
【０３１６】
この結果（表４）は、３つのアトラクチロシド誘導体（ＭＡＮＴ−、ピレン−、およびクマリン−アトラクチロシド）が真正なアトラクチロシドと同じ相対的結合親和力（アトラクチロシドに関して、ＩＣ50＜５００ｍＭ）を有したことを示す。これらの各誘導体は蛍光性であり、従って、結合アッセイの検出リガンドとして有用であり得る。
【０３１７】
【表４】
2004154139.tif 000048
省略形および記号：
ＡＴＲ、アトラクチロシド。
【０３１８】
ＣＯＵ−ＡＴＲ、クマリン−アトラクチロシド（表１、化合物３）。
【０３１９】
ＰＹＲ−ＡＴＲ、ピレン−アトラクチロシド（表１、化合物４）。
【０３２０】
ＮＡＮＴ−ＡＴＲ、ＭＡＮＴ−アトラクチロシド（表１、Ｒｏｕｘら、１９９６  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ．２３４：３１）
−−−、検出せず。
【０３２１】
アトラクチロシドアナログ（実施例６；表１；また実施例７〜９を参照のこと）はまた、Ｔ．ｎｉ／ｈｕＡＮＴ３のミトコンドリアまたはウシのミトコンドリアを用いる偽ホモログ競合結合アッセイにおいて用いられた。非感染のＴ．ｎｉ細胞、またはｈｕＡＮＴ３を発現するバキュロウイルスで感染されたＴ．ｎｉ細胞に由来するミトコンドリアを以下のように調製した（実施例３を参照のこと）：Ｔ．ｎｉ細胞は、１チューブあたり約２５０ｍｇの細胞の部分として、サブコントラクター（ｓｕｂｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により調製された。それぞれの部分をプロテアーゼインヒビターとともに１ｍｌのＭＳＢに懸濁した（ロイペプチン，最終濃度、１０μｇ／ｍｌ；ペプスタチン、最終濃度１０μｇ／ｍｌ；アプロチニン、最終濃度、２μｇ／ｍｌ；フェニルメチルスルホニルフルオライド［ＰＭＳＦ］、最終濃度、１００μＭ；すべてＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより）。この再懸濁した細胞懸濁液を２回、凍結および融解し、次いで、回転テフロン（登録商標）コートプローブおよび密着ガラス容器を用いてホモジナイズした（１０回通過）。細胞のホモジネートを４℃で５分間遠心分離した（３，７００ｒｐｍ、約１，５００×ｇ）；初回の遠心から上清を保管した。このペレット約５００μｌのＭＳＢでプロテアーゼインヒビターとともに洗浄し、４℃で５分間遠心分離（３，８００ｒｐｍ、約１，６００×ｇ）し、そしてこの遠心からの上清を最初の遠心からの上清と混合した。混合した上清を４℃で１５分間遠心分離し（１４，０００ｒｐｍ、約２０，８００×ｇ）、そしてペレットを（ａ）２０ｍＭのＭＯＰＳおよび（ｂ）ＭＳＢの１：１の溶液の３００μｌに再懸濁した。ここで、(ａ）および（ｂ）の両方は、前記したプロテアーゼインヒビターを含む。得られた上清を３回凍結および融解した。
【０３２２】
ウシのミトコンドリアは以下のように調製した：実質的に、閉塞した動脈の脂肪およびコレステロールのすべてを２つのウシの心臓から除去し、次いでこれを１インチの立方体に切り分けた。この立方体を微細な調節を用いて肉グラインダーで破砕した。破砕した心臓の３００グラムの部分を秤りわけ、そしてそれぞれに４００ｍｌの単離緩衝液（ＩＢ；２５０ｍＭショ糖、１ｍＭのコハク酸ナトリウム、０．２ｍＭのＫ+ＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、ｐＨ７．８）を添加した。（すべての緩衝液は、濾過滅菌し、そしてカラム緩衝液を脱気し、そして、別記しない限り、すべての工程を氷上で０〜４℃で、または事前冷却したローターおよび遠心機で行った。）この調製物を高設定で１５秒間、２回、ミキサー（ブレンダー）で混合した。混合の間と後にｐＨを２ＭのＴｒｉｓ塩基で調節した。このホモジネートを１，２００×ｇで２０分間遠心した、そしてこの上清をチーズクロスの２つの層を通して注ぎ、そして２ＭのＴｒｉｓ塩基でｐＨ７．８に調節した。次いで、この上清を１１，０００×ｇで３０分間遠心分離した。この上清をデカントし、そして淡黄褐色の外側のペレットを約１０ｍｌのＩＢで取り除き、廃棄した。褐色の内側のペレット（重いミトコンドリア）をＩＢ（１ペレット約１０ｍｌ）に再懸濁した。このペレットをガラステフロン（登録商標）ホモジナイザー中でホモジナイズした（高い回転速度で２回）。サンプルを組み合わせ、そして１１，０００×ｇで３０分間遠心分離した。この上清をデカントし、ペレットを破砕した心臓９００グラムあたり６０ｍｌのＩＢに再懸濁した。この遠心分離工程を繰り返し、そして最後にペレットをＩＢ（破砕した心臓の９００グラムあたり６０ｍｌ）に再懸濁した。ウシの心臓１キログラムは、代表的に約１グラムのミトコンドリアを生じた。
【０３２３】
ミトコンドリア調製物をアリコートに分け（代表的に、Ｔ．ｎｉミトコンドリアについては５０μｌ、またはウシミトコンドリアについては２０μｌ）、次いで、アッセイに直接用いるか、または急速冷凍して−８０℃保管のいずれかをした。ミトコンドリア調製物中の総タンパク質含有量は、バイシンコニン（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ）酸（ＢＣＡ）アッセイの増強プロトコル（６０℃で３０分；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｕｆ．ｒｉｃｅ．ｅｄｕ／〜ｂｉｏｓｌａｂｓ／ｍｅｔｈｏｄｓ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＢＣＡ．ｈｔｍｌを参照のこと）を用いて決定した（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬからのキット形態で利用可能）。
【０３２４】
「チューブアッセイ」において、ミトコンドリア（約１〜１０μｇの総タンパク質）を、０．１％のＢＳＡを含む１００μｌのＴｒｉｓ−ＫＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁した。125Ｉ標識化合物２４（実施例１１）を０．５ｎＭの最終濃度に添加した。用いた場合、競合物をこれらの濃度範囲で添加した：標識していないアトラクチロシドまたは化合物２４、最終濃度５ｎＭ〜１０μＭ：標識していないＡＤＰ（親和性のより低い競合物）を５００ｎＭ〜１ｍＭの濃度で添加した。
【０３２５】
この反応混合物を６０分間、氷上でインキュベートし、次いで４℃で１１分間遠心分離（約１６，０００×ｇ）によりペレットを得た。非結合の125Ｉ化合物２４を吸引により除去した。このペレットをＴｒｉｓ−ＫＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で接触洗浄し、そして再度、遠心分離した。得られたペレットを吸引し、それぞれにおける放射活性（ｄｐｍ）をガンマ計測により決定した。
【０３２６】
代表的な結果を図１１〜１８に示す。図１１および１２に示されるデータは、ウシの心臓（図１１）およびｈｕＡＮＴ３発現をするＴ．ｎｉ細胞（図１２）の両方に由来するミトコンドリア（５μｇのタンパク質／チューブ）が、非標識化合物２４の濃度の上昇により阻害される様式で、125Ｉ化合物２４に特異的に結合するが、ミトコンドリアが反応混合物から除外される場合、期待されるように、結合がわずかにかまたは全くみられないことを示す。
【０３２７】
図１３および１４は、ウシの心臓（図１３）およびｈｕＡＮＴ３発現をするＴ．ｎｉ細胞（図１４）の両方に由来するミトコンドリア（１μｇのタンパク質／チューブ）への125Ｉ化合物２４の結合の、検出可能に標識されていない化合物２４（非標識アトラクチロシド（ＡＴＲ）、および非標識アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ））による競合阻害を示す。両方の場合において、ＡＴＲおよび化合物２４は、匹敵する競合曲線を生じるが、ＡＴＲは、化合物２４よりわずかにより高い親和性を有するようである。しかし、ＡＴＲおよび化合物２４の両方は、低親和性ＡＮＴリガンドＡＤＰよりかなり高い（約１，０００倍）親和性で結合する。
【０３２８】
図１５は、ｈｕＡＮＴ３発現をするＴ．ｎｉ細胞およびコントロールのＴ．ｎｉ細胞（すなわち、未感染Ｔ．ｎｉ細胞）に由来するミトコンドリア（１μｇのタンパク質／チューブ）への125Ｉ化合物２４の結合の、非標識ＡＴＲによる競合阻害を示す。図１５に示すように、より高い濃度のＡＴＲによる、コントロール（形質転換されてない）のミトコンドリアへの125Ｉ化合物２４の結合のわずかな阻害が存在する。対照的に、ｈｕＡＮＴ３発現をするＴ．ｎｉ細胞に由来するミトコンドリアへの125Ｉ化合物２４の結合は、ＡＴＲのより高い濃度により漸増的に阻害される。
【０３２９】
図１６は、ウシ心臓由来のミトコンドリア（１μｇのタンパク質／チューブ）への125Ｉ化合物２４の結合の、非標識化合物２４による、およびｂｏｎｇｋｒｅｋｉｃ酸（ＢＫＡ）による競合阻害を示す。ＢＫＡは、非標識化合物２４よりわずかに低い親和性にもかかわらず、標識化化合物を有効的に置換した。図１７は、ＡＴＲ誘導体、化合物２３（実施例１１を参照のこと）および化合物２８（実施例１１を参照のこと）のいずれかによる、ウシ心臓由来のミトコンドリアへの125Ｉ化合物２４の結合の競合阻害を示す。図１７に示したように、ＡＴＲは、約４４ｎＭのＩＣ50、化合物２３で約１０５ｎＭのＩＣ50、そして化合物２８で約６９５ｎＭのＩＣ50、を示した。
【０３３０】
図１８では、データは、ウシ心臓ミトコンドリアへの125Ｉ化合物２４結合の、ＡＴＲ誘導化合物５（実施例７を参照のこと）による競合阻害を示す。図１８に示すように、化合物５についてのＩＣ50は、約３．３μＭである。
【０３３１】
競合結合アッセイをまた、ミトコンドリアの代わりにＮｉビーズ（図１９）に固定した組み換えＨｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３（実施例３参照のこと）を用いて、実行した。ビーズ固定化ｈｕＡＮＴ３を調製するために、ｈｕＡＮＴ３発現バキュロウイルスで感染したＴ．ｎｉ細胞由来のミトコンドリア（実施例３参照のこと）を、０．５ｎＭの125Ｉ化合物２４、Ｎｉアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、および非標識競合物としての種々の濃度のＡＴＲまたはＢＫＡの存在下で０．５％Ｏ−グルコピラノシドで溶解した。４℃での１時間後、このビーズを洗浄し、そしてビーズと会合して残った放射活性をカウントした。（Ｈｉｓタグ化のｈｕＡＮＴ３の非存在下でＮｉアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）への［125Ｉ］化合物２４結合のバックグラウンドは、約７００〜８００ｃｐｍであり、図１９に示される放射活性から除算しなかった。）この結果（図１９）は、ＡＴＲおよびＢＫＡの両方が、インタクトのミトコンドリアを用いるアッセイにおいて観察された様式と類似の様式で化合物２４と効果的に競合することを示す（図１４および１５を参照のこと）。
【０３３２】
（実施例１４：ＡＮＴタンパク質およびポリペプチドに対して標的化された化合物についての高スループットスクリーニングアッセイ）
本明細書において記載される組換え的に産生されたＡＮＴタンパク質、ＡＮＴ融合タンパク質および検出可能に標識されたＡＮＴリガンドは、自動化されたアッセイシステムに組み込まれた。このような自動化システムは、ＡＮＴ結合化合物候補またはこのような化合物を含む化学的ライブラリーの高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）のために有用である。このような化合物は、１つ以上のＡＮＴタンパク質の過剰発現もしくは機能障害から、またはＡＮＴタンパク質をポジティブに調節もしくは刺激する因子の過剰発現もしくは機能不全から生じる疾患もしくは障害を予防、処置もしくは治療するために有用な薬物の候補物および薬物として、さらに特徴付けられ、そして開発され得る。
【０３３３】
多くの自動化されたアッセイ系の好ましいエレメントは、９６穴プレートへの標的分子（この場合、ＡＮＴタンパク質）の組み込みである。この形式は、自動化された多様な標識検出系における使用のために容易に適合され得る。ＨＴＳアッセイのためには、ロボットの標識検出系が好ましい。
【０３３４】
本明細書において記載されるエレメントを含むＨＴＳの１つの例として、実施例２の融合タンパク質ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３を、ＲＥＡＣＴＩ−ＢＩＮＤTMグルタチオンコート９６穴プレート（Ｐｉｅｒｃｅ）と接触する。グルタチオンコートされたストリップウェルプレートは、好ましくは、放射標識されたＡＮＴリガンド（例えば、ヨード化アトラクチロシド誘導体；実施例７参照）を含むアッセイのために用いられ、一方、黒色不透明のグルタチオンコートされた９６穴プレートは、蛍光性ＡＮＴリガンド（例えば、実施例６〜９の記載される）を含むアッセイのために好ましい；グルタチオンコートされたプレートの両方のタイプは、市販されている（Ｐｉｅｒｃｅ）。
【０３３５】
代表的なアッセイにおいて、１〜５０μｇのＧＳＴ−ｈｕＡＮＴ３タンパク質（すなわち、実施例２のように調製された総可溶化タンパク質）を、９６穴プレートのそれぞれのウェルへ、グルタチオンコートされた１ウェルあたりに添加する。ヨード化アトラクチロシド誘導体（125Ｉ−ＡＴＲ）をウェルに添加する（０．５ｎｍｏｌ／ウェル）。コントロールの実験において、標識されてないアトラクチロシド（ＡＴＲ；Ｓｉｇｍａ）は、約１〜約１０，０００ｎＭの濃度で「偽の（ｍｏｃｋ）」薬物として用いられる。つまり、非標識化ＡＴＲが、標識化アトラクチロシド誘導体（例えば、125Ｉ−ＡＴＲ）の替わりに用いられるということである。従って、非標識ＡＴＲは、種々の化合物が標識化ＡＮＴリガンドを置換し得る能力についてスクリーニングされるＨＴＳについての陽性コントロールとして作用する。
【０３３６】
実施例のＨＴＳアッセイに用いた自動化された標識検出系の例としては、アッセイの検出可能に標識されたＡＮＴリガンドが125Ｉ−ＡＴＲである場合、自動化ガンマカウンターが用いられる。あるいは、125Ｉ−ＡＴＲを、シンチレーション近似（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）アッセイ（ＳＰＡ）に使用し得る。例えば、融合タンパク質ＧＳＴ−ｈｕＡＮＴを、グルタチオンでコートされたＳｃｉｎｔｉＳｔｒｉｐ９６穴プレート（ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃ）と接触させる。これらのプレートのポリスチレンは、近接するガンマ放射物により励起された場合、β放射線を放射するシンチレーティング剤を含む。次いで、このβ放射線は、任意の適切な自動化ベータカウンターにより検出される。蛍光性ＡＮＴリガンドがＨＴＳアッセイにおいて用いられる場合、自動化蛍光カウンターが用いられ、そして例えば、ＦＬＵＯＲＯＣＯＵＮＴTMＣｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）であり得る。
【産業上の利用可能性】
【０３３７】
種々の使用のために信頼性または十分な量であるＡＮＴが産生されることにより、呼吸プロセス、代謝プロセスおよびアポトーシスプロセスに対するミトコンドリアの重要性のために、ならびにこれらおよび他のミトコンドリア活性におけるＡＮＴにより果たされる優れた効果を考慮して、ＡＮＴ融合タンパク質を含むＡＮＴタンパク質の産生を可能にする組成物および方法；新規なＡＮＴリガンド；ＡＮＴタンパク質を同定し、そして単離する方法；ならびにＡＮＴと相互作用する薬剤を同定し、そして単離することができる。
【図面の簡単な説明】
【０３３８】
【図１Ａ】図１は、ヒトＡＮＴ１（「ＡＮＴ１ｍ」）、ヒトＡＮＴ２（「ＡＮＴ２ｍ」）、およびヒトＡＮＴ３（「ＡＮＴ３ｍ」）のコード領域のヌクレオチド配列を示す。
【図１Ｂ】図１は、ヒトＡＮＴ１（「ＡＮＴ１ｍ」）、ヒトＡＮＴ２（「ＡＮＴ２ｍ」）、およびヒトＡＮＴ３（「ＡＮＴ３ｍ」）のコード領域のヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、ヒトＡＮＴ１（「ＡＮＴ１ｐ」）、ヒトＡＮＴ２（「ＡＮＴ２ｐ」）、およびヒトＡＮＴ３（「ＡＮＴ３ｐ」）のポリペプチド配列を示す。
【図３】図３は、ウェスタン分析によって決定された、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨｉｓ−タグ化、ＸＰＲＥＳＳTM−エピトープ含有ｈｕＡＮＴ３タンパク質の誘導を示す。
【図４】図４は、ウェスタン分析によって決定された、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨｉｓ−タグ化、ＸＰＲＥＳＳTM−エピトープ含有ｈｕＡＮＴ３タンパク質の局在化を示す。
【図５】図５は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系におけるヒトＡＮＴ３（ｈｕＡＮＴ３）の発現を示す。
【図６】図６は、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞におけるｈｕＡＮＴ３の発現を示す。
【図７】図７は、Ｓｆ９／ｈｕＡＮＴ３ミトコンドリアへの［32Ｐ］ＡＴＰ結合を示す。
【図８】図８は、ＡＴＰおよびアトラクチロシドが、Ｓｆ９／ｈｕＡＮＴ３ミトコンドリアへ競合して結合することを示す。
【図９】図９は、アトラクチロシドのＳｆ９／ｈｕＡＮＴ３ミトコンドリアへの高親和性結合を示す。
【図１０】図１０は、酵母発現系において検出された、ｈｕＡＮＴ３転写物のノーザンブロット分析を示す。レーンの内容物：レーン「Ｍ」、分子量マーカー（１．４、２．４、４．４、７．５、および９．５キロベースマーカーの位置を示す）；レーン１〜３、モック形質転換ＡＡＣ-酵母の３つの独立した単離物からの１０μｇのＲＮＡ；レーン４〜６、ｐＭＫ５Ｃ（ｐＹＰＧＥ２−ｈＡＮＴ３）で形質転換したＡＡＣ-酵母の３つの独立した単離物からの１０μｇのＲＮＡ；レーン７〜９、ｐＭＫ５Ｂ（ｐＹＥＳＴｒｐ２−ｈＡＮＴ３）で形質転換したＡＡＣ-酵母の３つの独立した単離物からの１０μｇのＲＮＡ；レーン１０および１１、ヒト脾臓のサンプルから調製された０．２（レーン１０）μｇおよび０．８（レーン１１）μｇのＲＮＡ。
【図１１】図１１は、125Ｉ−化合物２４のウシミトコンドリアへの結合を示す。シンボル：（-）、ウシミトコンドリア；（U）、コントロール（ミトコンドリアなし）。
【図１２】図１２は、125Ｉ化合物２４の組換えｈｕＡＮＴ３を含むミトコンドリアへの結合を示す。シンボル：（-）、ｈｕＡＮＴ３を発現するＴ．ｎｉ細胞由来のミトコンドリア；（U）、コントロール（ミトコンドリアなし）。
【図１３】図１３は、未標識化合物２４（-）、ＡＴＲ（U）およびＡＤＰ（-）による、125Ｉ−化合物２４のウシミトコンドリアへの結合の競合を示す。
【図１４】図１４は、未標識化合物２４（-、破線）、ＡＴＲ（U、実線）、およびＡＤＰ（-）による、125Ｉ−化合物２４の、ｈｕＡＮＴ３を発現するＴ．ｎｉ細胞由来のミトコンドリアへの結合の競合を示す。
【図１５】図１５は、未標識ＡＴＲによる、125Ｉ−化合物２４のｈｕＡＮＴ３（-）を発現するＴ．ｎｉ細胞およびコントロール（非形質転換）Ｔ．ｎｉ細胞（-）由来のミトコンドリアへの結合の競合を示す。
【図１６】図１６は、（U）ＢＫＡおよび（下向き黒三角）非標識化合物２４による、125Ｉ−化合物２４のウシ心臓ミトコンドリアへの結合の競合を示す。
【図１７】図１７は、化合物２３（下向き黒三角）、化合物２８（-）、およびＡＴＲ（U）による、125Ｉ−化合物２４のウシ心臓ミトコンドリアへの結合の競合を示す。
【図１８】図１８は、化合物５（-）およびＡＴＲ（U）による、125Ｉ−化合物２４のウシ心臓ミトコンドリアへの結合の競合を示す。
【図１９】図１９は、ＢＫＡ（上向き黒三角）およびＡＴＲ（U）による、125Ｉ−化合物２４の、Ｎｉビーズ上に固定化された組換えＨｉｓタグ化ｈｕＡＮＴ３への競合を示す。
【０３３９】
（配列表）
【表５】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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