(57)【要約】【課題】カバノアナタケの菌糸体を短期間に、且つ大量に得ることのできる培養方法を提供することである。【解決手段】トレハロースやスクロースなどの非還元性二糖類、又はマンニトール、ソルビトール、マルチトールなどの糖アルコールを炭素源として含み、且つ初発ｐＨ（培養開始時の液体培地のｐＨ値）が３．５〜６．５の範囲に調整された液体培地を用いて培養するカバノアナタケ菌糸体の培養方法である。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源を含み、初発ｐＨが３．５〜６．５の範囲に調整された液体培地を用いたことを特徴とするカバノアナタケ菌糸体の培養方法。
【請求項２】
前記炭素源として、非還元性二糖類、糖アルコールの中から選択された１又は２以上を含む請求項１記載のカバノアナタケ菌糸体の培養方法。
【請求項３】
前記非還元性二糖類が、トレハロース及びスクロースから選択された１又は２以上である請求項２記載のカバノアナタケ菌糸体の培養方法。
【請求項４】
前記糖アルコールが、マンニトール、ソルビトール及びマルチトールなど６価の糖アルコールの中から選択された１又は２以上である請求項２記載のカバノアナタケ菌糸体の培養方法。
【請求項５】
前記炭素源が１．０〜６．０重量％含まれている請求項１乃至４のいずれか記載のカバノアナタケ菌糸体の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カバノアナタケの菌糸体を短期間で大量に得るための培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キノコはその優れた効能のために古くから薬効を持つものが多く知られており、民間療法や漢方薬として用いられてきた。近年、そのようなキノコの効能やその機能の解明が進められ、白樺などの樺類の立木樹幹に特異的に寄生するカバノアナタケ（Ｆｕｓｃｏｐｏｒｉａ　ｏｂｌｉｑｕａ）の菌核抽出成分に抗ガン活性（特開平１０−７３１１０）や抗エイズ活性（特開平９−１９１８９１）、病原性細菌類に対する抗菌活性（特開平１０−１２０５８９）などの生理活性を有することが報告されている。しかしながら、カバノアナタケが注目されるにつれ、原産地での乱獲を招き、天然のカバノアナタケを入手することは極めて困難になりつつあるのが現状である。
【０００３】
そこで、近年、カバノアナタケの菌糸体を人工的に培養する方法が提案されている。例えば、炭素源にグルコースや麦芽、窒素源にペプトン、酵母エキスを含有する合成液体培地を用いたカバノアナタケ菌糸体の培養方法（特開平１０−１９１７８３）が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来の培養方法では培養開始時の液体培地の初発ｐＨ（培養開始時の液体培地のｐＨ値）や炭素源などの各種栄養源の優位差を詳細に検討していないことから、得られる菌糸体の収量が必ずしも満足出来るものではなかった。
【０００５】
そこで本発明の目的は、液体培地の初発ｐＨや各種栄養源を詳細に検討することで、カバノアナタケ菌糸体を短期間に、且つ大量に得ることの出来る培養方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
一般にきのこ類は、液体培養において生育に最も適したｐＨ域を有することが知られている。培養初期の最適ｐＨ域に培地のｐＨを調整することで、菌糸の成長速度を上げることが可能と思われる。本発明者らは、液体培地の初発ｐＨを調整することで、菌糸体の成長や収量が飛躍的に向上することに着目した。そして、液体培地の初発ｐＨを調整することで、カバノアナタケ菌糸体の収量が増加することを見出した。
【０００７】
液体培養に用いられる炭素源は、その構造から還元糖類と非還元糖類に分類することが可能である。本発明者らは、非還元性二糖類のトレハロース、スクロース、還元性二糖類のマルトース、イソマルトース、ラクトース、セロビオースなど、糖類の有する非還元・還元構造と菌糸成長との相関関係に着目した。そして、トレハロースやスクロースなど分解酵素活性の高い非還元性二糖類を用いることで、カバノアナタケ菌糸体の収量が増加することを見出した。
【０００８】
また、冬虫夏草のように糖アルコール類を優位的に資化することが知られているきのこも存在する。本発明者らは、糖アルコール類をその構造から価数（糖アルコールの構造内に存在するアルコール性水酸基の数）により分類し、６価の糖アルコールであるマンニトールやソルビトール、マルチトール、５価のキシリトール、４価のエリトリトール、３価のグリセロールなど、糖アルコール類と菌糸成長との相関関係に着目した。そして、６価の糖アルコールであるマンニトールやソルビトール、マルチトール、すなわち、糖アルコールの価数が大きいほど効率的よく炭素源やエネルギー源として資化することが可能であり、このことがカバノアナタケ菌糸体の収量増加に寄与していることを見出した。
【０００９】
即ち、本発明に係るカバノアナタケ菌糸体の培養方法は、炭素源を含む液体培地の初発ｐＨを調整することを特徴とし、特に炭素源として非還元性二糖類であるトレハロースや６価の糖アルコールなどを含む液体培地を用いて培養することを特徴とする。このような条件の中でカバノアナタケ菌糸体を液体培養することによって、菌糸体の成長が促進され、収量が飛躍的に増加することが明らかとなった。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。本発明において、液体培地の初発ｐＨを調整するための調整剤としては、食品添加物として認められているものを用いることができる。例えば、塩酸や酢酸、乳酸などの有機酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩基性アミノ酸などを使用することができる。菌糸体の収量を高めると共に初発ｐＨによる菌糸体の増殖を早めるためには、培地の初発ｐＨは３．５〜６．５、特にｐＨ４．０〜５．０が望ましい。
【００１１】
また、培地に添加される炭素源は食品添加物として認められているものを用いることができる。例えば、非還元性二糖類としてはトレハロース、糖アルコールとしてはラクチトール、マルチトール、グリセロール、エリトリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールなどが挙げられる。また、培地の中に添加する量は０．１〜７．０重量％、好ましくは１．０〜４．０重量％である。添加量が少ないと菌糸の成長が阻害される一方、多すぎると栄養を取り込むために適正とされる浸透圧の範囲を外れてしまうからである。
【００１２】
本発明における液体培地は、上記の炭素源の他に、窒素源や無機塩類など菌糸体を培養する際の生育に必要な栄養素を含む。窒素源としては、酵母エキスや麦芽エキス、ペプトン、カシトン、カザミノ酸などの有機体窒素、塩化アンモニウムなどのアンモニア体窒素、硝酸カリウムなどの硝酸体窒素などを利用することができ、無機塩類としては、塩化カルシウムや硫酸マグネシウムなどを利用することができる。なお、その他にもビタミン類（チアミン、ビオミン、葉酸など）やミネラルも適宜含む。上述の炭素源やその他の必要栄養成分を所定量の水に分散させたのち、オートクレーブ滅菌することによって液体培地を得ることができる。
【００１３】
本発明では、上記の条件の液体培地を用いることによって、従来の液体培養物よりも多くの菌糸体を短期間で得ることができる。
【００１４】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。培養及び操作方法は無菌的に行った。
【００１５】
実施例１：液体培地における初発ｐＨの効果試験
【００１６】
継代培養しているカバノアナタケ保存菌株（ウクライナ産のカバノアナタケ菌核より組織分離した菌株）の一部をＰＤＡ培地（ポテトエキス４．０ｇ、ぶどう糖２０．０ｇ、寒天１５．０ｇ、水１Ｌ）（ＤＩＦＣＯ社製）上で４週間平面培養する。これを種菌として用いた。
【００１７】
スクロース１．０％、ペプトン０．６％、リン酸二水素カリウム０．１％、リン酸水素二ナトリウム十二水和物０．１％を１Ｌの水に添加し、初発ｐＨ５．５に調整した基本の液体培地を調製した。また、前記初発ｐＨが２．０〜８．５の範囲で０．５間隔になるように調整した液体培地を調製した。これらの液体培地を１００ｍＬ容首長三角フラスコに７０ｍＬずつ分注後、オートクレーブを用いて高圧殺菌した。
【００１８】
上述の液体培地を室温まで放冷した後、内径４ｍｍのコルクボーラーで切り取ったディスク片を接種した。接種後は室温２５〜２８℃、湿度６０％の暗期条件下で振盪培養を行った。
【００１９】
培養開始後１４日で液体培地に蔓延した球状の菌糸体を濾過してから集菌し、これを水でよく洗浄し、６０〜８０℃で送風乾燥した。
【００２０】
上記集菌した菌糸体の成長比を図１に示す。成長比は初発ｐＨを５．５に調整した基本の液体培地で培養した時の収量を１．０とし、それに対する比計算によって算出した。
【００２１】
図１に示したように、初発ｐＨの違いによってカバノアナタケの菌糸成長が大きく異なることがわかった。初発ｐＨを４．５に調整した時のカバノアナタケの菌糸成長が最も良好であり、また、初発ｐＨが３．０〜６．０の範囲で菌糸成長が概ね良好であった。
【００２２】
実施例２：液体培地に添加する各種還元糖類および非還元糖類の効果試験
【００２３】
マルトース１．０％、ペプトン０．６％、リン酸二水素カリウム０．１％、リン酸水素二ナトリウム十二水和物０．１％を１Ｌの水に添加し、初発ｐＨを４．５に調整した基本の液体培地を調製した。また、基本培地のマルトースの代わりに非還元性二糖類のトレハロース、スクロース、還元性二糖類のイソマルトース、ラクトース、セロビオースを１．０％となる液体培地を調整した。これらの液体培地を１００ｍＬ容首長三角フラスコに各７０ｍＬ分注後、オートクレーブを用いて高圧殺菌した。
【００２４】
上述の実施例１と同様の方法で接種、培養、菌糸体の集菌、乾燥を行った。
【００２５】
上記集菌した菌糸体の成長比を図２に示す。成長比は還元性二糖類であるマルトースを用いた基本の液体培地で培養した時の収量を１．０とし、それに対する比計算によって算出した。
【００２６】
図２に示したように、基準として用いた還元性二糖類であるマルトースと比較すると、炭素源として非還元性二糖類であるトレハロースやスクロースを添加した時の方がカバノアナタケの菌糸成長が良好であることがわかった。特に、トレハロースを用いた場合には基準のマルトースと比較して約３倍の成長が見られた。還元性二糖類であるイソマルトースやラクトース、セロビオースを添加した場合は、マルトースには少し劣るがほぼ同等の成長が見られた。
【００２７】
実施例３：液体培地に添加する各種糖アルコールの効果試験
【００２８】
キシリトール１．０％、ペプトン０．６％、リン酸二水素カリウム０．１％、リン酸水素二ナトリウム十二水和物０．１％を１Ｌの水に添加し、初発ｐＨを４．５に調整した基本の液体培地を調製した。また、基本培地のキシリトールの代わりに３価の糖アルコールであるグリセロール、４価の糖アルコールであるエリトリトール、６価の糖アルコールであるマルチトール、ソルビトール、マンニトールを１．０％添加して液体培地を調整した。これらの液体培地を１００ｍＬ容首長三角フラスコに各７０ｍＬずつ分注後、オートクレーブを用いて高圧殺菌した。
【００２９】
上述の実施例１と同様の方法で接種、培養、菌糸体の集菌、乾燥を行った。
【００３０】
上記集菌した菌糸体の成長比を図３に示す。成長比は５価の糖アルコールであるキシリトールを用いた基本の液体培地で培養した時の収量を１．０とし、それに対する比計算によって算出した。
【００３１】
図３に示したように、６価の糖アルコールであるマルチトール、ソルビトール、マンニトールを添加した時のカバノアナタケの菌糸成長が良好であった。また、糖アルコールの価数が大きいほど資化されやすい傾向にあった。
【００３２】
実施例４：液体培地に添加する炭素源濃度の効果試験
【００３３】
スクロース１．０％、酵母エキス０．６％、リン酸二水素カリウム０．１％、リン酸水素二ナトリウム十二水和物０．１％を１Ｌの水に添加し、初発ｐＨ４．５に調整した基本の液体培地を調製した。また、前記のスクロース１．０％の代わり２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％、７．０％となる液体培地を調製した。同様にトレハロースについても各濃度の液体培地を調製し、これらの液体培地を１００ｍＬ容首長三角フラスコに７０ｍＬずつ分注後、オートクレーブを用いて高圧殺菌した。
【００３４】
上述の実施例１と同様の方法で、接種、培養、菌糸体の集菌、乾燥を行った。
【００３５】
上記集菌した菌糸体の成長比を図４に示す。成長比は炭素源にスクロース１．０％の基本の液体培地で培養した時の収量を１．０とし、それに対する比計算によって算出した。
【００３６】
図４に示したように、炭素源の添加濃度が３．０重量％付近でカバノアナタケの菌糸成長が最も良好であった。また、スクロース及びトレハロースともに、１．０〜６．０重量％の範囲でカバノアナタケの菌糸成長が良好であった。
【００３７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によるカバノアナタケ菌糸体の培養方法によれば、液体培地の初発ｐＨを調整することによって、カバノアナタケ菌糸体を多量に培養することが可能となった。特に、炭素源として非還元性二糖類であるトレハロースや、６価の糖アルコールであるマンニトールやソルビトール、マルチトールなどを用いることにより、より効果的にカバノアナタケ菌糸体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】液体培地における初発ｐＨによる菌糸体の成長比を示すグラフである。
【図２】液体培地に添加した各種還元糖類および非還元糖類の種類による菌糸体の成長比を示すグラフである。
【図３】液体培地に添加した各種糖アルコールの種類による菌糸体の成長比を示すグラフである。
【図４】炭素源の添加濃度による菌糸体の成長比を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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