(57)【要約】【課題】本発明の課題は、遺伝子組換え微生物菌体を閉鎖系外で利用する為、酵素活性を損なうことなく工業的に使用できるような、効率的な遺伝子組換え微生物菌体の殺菌方法を提供することを課題とするものである。【解決手段】本発明者らは、高濃度に存在する遺伝子組換え大腸菌菌体の効率的な殺菌方法に関して鋭意検討を行なってきたところ、該微生物菌体にニトリル類、アミド類またはその塩類をある濃度で加え、ある特定の温度範囲で保持することにより、その触媒能はほとんど失活することなく、効率的に殺菌し得ることを見出し、本発明を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物菌体を含む懸濁液を加熱殺菌する際に、ニトリル類、アミド類、その塩類から選ばれた少なくとも１種の化合物を添加することを特徴とする微生物菌体の殺菌方法。
【請求項２】
微生物菌体が遺伝子組換え微生物であることを特徴とする請求項１記載の微生物菌体の殺菌方法
【請求項３】
遺伝子組換え微生物が酵素を生産する微生物であることを特徴とする請求項２記載の微生物菌体の殺菌方法
【請求項４】
請求項３記載の酵素がニトリルヒドラターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、トリプトファンシンターゼであるところの請求項３記載の方法
【請求項５】
遺伝子組換え微生物が遺伝子組換え大腸菌であることを特徴とする請求項２￣４記載の微生物菌体の殺菌方法
【請求項６】
遺伝子組換え大腸菌の宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２由来Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）、同ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）、同ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３２２３）または同ＷＡ８０２株（ＡＴＣＣ３３５２６）株であることを特徴とする請求項５に記載の微生物菌体の殺菌方法。
【請求項７】
ニトリル類がアクリロニトリル及びメタクリロニトリルから選ばれる少なくとも１種であり、アミド類がアクリルアミド及びメタクリルアミドから選ばれる少なくとも１種である請求項１〜５のいずれかに記載の微生物菌体の殺菌方法。
【請求項８】
懸濁液中のニトリル類、アミド類またはその塩類の濃度が０．１〜１０．０重量％であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の微生物菌体の殺菌方法。
【請求項９】
懸濁液のｐＨが６．０〜８．０である請求項１〜８のいずれかに記載の微生物菌体の殺菌方法
【請求項１０】
加熱殺菌する際の温度が４５〜６０℃である請求項１〜９のいずれかに記載の微生物菌体の殺菌方法
【請求項１１】
加熱保持時間が１〜４時間である請求項１〜１０のいずれかに記載の微生物菌体の殺菌方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物菌体の殺菌方法に関するものであり、例えばニトリル化合物を水和する能力を持つニトリルヒドラターゼ等の、工業的に有用な酵素を生産する遺伝子組換え微生物菌体の殺菌方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、微生物菌体を利用した酵素の製造が一般的に行われている。たとえば、ある特定の酵素を触媒として用い、例えばニトリル化合物を原料としてアミド化合物を製造することが実用化されている。
【０００３】
しかし、微生物菌体を用いた酵素の製造においては、製造の各工程における菌体の漏洩の恐れがあり、微生物菌体による汚染をひきおこす可能性がある。さらに、微生物菌体に遺伝子組換え体を利用する場合には、死滅化されていない菌体の使用にあたっては、各種ガイドラインに従い、全ての遺伝子組換え微生物菌体を閉鎖設備内で取り扱う必要がある。　また、閉鎖系外で利用する場合、遺伝子組換え微生物菌体は完全に死滅していなければならない。
【０００４】
さらにこの微生物菌体を死滅させる時には、その微生物菌体のもつ酵素（例えばニトリルヒドラターゼ）の触媒としての活性を失活させることなく、殺菌することが望ましい。この際に、殺菌されたものの中の生菌数は検出されないことが好ましく、また殺菌工程の前後での酵素活性の低下度は２０％以下が好ましいとされ、さらに好ましくは限りなく０％に近いことが良いとされる（ここで言う活性とは、単位微生物菌体重量・単位時間あたりのアミド化合物の生成速度を指す。）。
【０００５】
しかしながら現在までのところ、殺菌方法として、装置的な工夫を施した方法としては、磁気的な殺菌方法（特開平３−２６７１９４）、マイクロ波による殺菌方法（特開平５−２２９５３０）等が知られているが、磁気的、マイクロ波による殺菌方法では大量の液を処理する場合、大掛かりな装置が必要になり、装置自体も高価になる。
【０００６】
また、殺菌時に殺菌剤を加える方法として、塩化ベンザルコニウムを加える殺菌方法（特開昭６１−１５２２７６）、クロルヘキシジンを加える殺菌方法（特開平５−７５３９２）、イソチアン酸アリルを加える殺菌方法（特開平１１−３２２５２１）等が知られているが、これらの殺菌液を加える方法では、殺菌液が製品中に分散されこれを取り除くのは困難であり、不純物として残ってしまい酵素または殺菌済み微生物菌体を用いる反応生成物中まで残ってしまう可能性が強い。特に酵素反応生成物の重合を伴う反応（ポリ乳酸やポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等）に用いようとすると、これらの物質が還元剤や酸化剤として作用し重合品品質の悪化や重合条件の大幅な変更が必要になる可能性がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、微生物菌体を閉鎖系外で利用する為、酵素活性を損なうことなく工業的に使用できるような、効率的な微生物菌体の殺菌方法を提供することを課題とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高濃度に存在する微生物菌体の効率的な殺菌方法に関して鋭意検討を行なってきたところ、該微生物菌体にニトリル類、アミド類またはその塩類を加えること、特にある濃度で加え、ある特定の温度範囲で保持することにより、その触媒能はほとんど失活することなく、効率的に殺菌し得ることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
また、本発明において、アミド類を生産する場合には、生産物と同じアミド類もしくは原料ニトリル類を使用することにより不純物がまったく発生しなくなる。
【００１０】
すなわち、本発明は、微生物菌体を含む懸濁液を加熱殺菌する際に、ニトリル類、アミド類、その塩類から選ばれた少なくとも１種の化合物を添加する事を特徴とする微生物菌体の殺菌方法を提供することである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明で述べられている酵素とは、化学品等の製造に有用な物質のことである。具体的に本発明に述べる酵素としては、特に制限されるものではないが、例えばニトリルヒドラターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、トリプトファンシンターゼ等を挙げることができる。
【００１２】
本発明の微生物菌体としては、酵素を生産する微生物菌体であれば特に制限はないが、例えばニトリルヒドラターゼを産生する大腸菌を挙げることができる。
【００１３】
大腸菌の宿主の具体例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２由来Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）、同ＨＢ１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）、同ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３２２３）または同ＷＡ８０２株（ＡＴＣＣ３３５２６）株などがあげられる。
【００１４】
ニトリルヒドラターゼを産生する遺伝子組換え大腸菌の具体例としては、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が大腸菌に導入されているＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７８５、特開平１１−２５３１６８参照）等があげられる。
【００１５】
本発明の微生物菌体は通常、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において、公知の一般的な方法を利用して調製される。例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物菌体を植菌した後、適当な培養温度（一般的には３０〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい。）で生育させることにより得られる。
【００１６】
殺菌処理を実施する場合、ここでの懸濁液とは培養液、培養液から遠心分離等利用し回収した集菌液、さらに適当な緩衝液で洗浄した洗浄菌体、その処理物が挙げられる。処理物とは例えば、細胞膜の透過性向上や遺伝子組換え菌が生産する有用物質の安定性向上等の為に培養液、菌体、洗浄菌体を熱処理、薬剤処理をおこなったもの、破砕菌体処理したもの等が上げられる。さらに、薬剤処理、凍結処理等で部分的に死滅化した懸濁液と本殺菌法を併用することも可能である。
【００１７】
本殺菌時の菌体濃度は、特に制限はない。加えるニトリル類としてはアクリロニトリル、メタクリロニトリル等が、加えるアミド類としてはアクリルアミド、メタクリルアミド等が挙げられる。加えるニトリル類、アミド類、またはその塩類の濃度は、０．１重量％〜１０．０重量％、より好ましくは、０．１重量％〜５．０重量％が望ましい。この範囲であると、十分な殺菌が行われ、且つ酵素活性も余り低下しない。
【００１８】
また、殺菌時の液温度は殺菌を実施する懸濁液で４５℃〜６０℃が望ましい。この範囲であると、十分な殺菌が行われ、且つ酵素活性も余り低下しない。その際の培養液、菌体等の懸濁液のｐＨは、遺伝子組換え微生物菌体が生産する酵素の変性、失活等がおこりにくいｐＨに設定することが望ましい。具体的には、ｐＨは、６．０から８．０が望ましい。この範囲であると、十分な殺菌が行われ、且つ酵素活性も余り低下しない。
【００１９】
さらに、殺菌時のホールド時間は、１時間〜４時間が望ましい。この範囲であると、十分な殺菌が行われ、且つ酵素活性も余り低下しない。
【００２０】
また、微生物菌体が生産する酵素の変性、失活等が起りにくいよう安定剤、例えば酵素であればその基質、生成物等を添加することも有効である。まれに、一回の殺菌操作で遺伝子組換え菌の完全な死滅化が実施されないことがあるが、その際には本殺菌法を複数回実施すれば完全な死滅化が達成される。
【００２１】
本発明で用いられる微生物菌体とは、特定の酵素を生産するように遺伝子組換えした微生物菌体であり、具体例としてニトリルヒドラターゼ活性を有する菌体が挙げられるが、これに限定するものではない。
【００２２】
ここでニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体とは、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５由来のニトリルヒドラターゼを酵素として有する菌体が代表例として挙げられ、菌体としては大腸菌の他、枯草菌、酵母や放線菌等が挙げられる。
【００２３】
上記した菌体は通常、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において、公知の一般的な方法を利用して調製される。例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物菌体を植菌した後、適当な培養温度（一般的には２０〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい。）で生育させ、続いて該微生物菌体を遠心分離等によって培養液より分離することにより得られる。
【００２４】
本殺菌法を実施する場合の懸濁液として培養液、培養液から遠心分離等利用し回収した集菌液、さらに適当な緩衝液で洗浄した洗浄菌体、その処理物が挙げられる。処理物とは、例えば、細胞膜の透過性向上、遺伝子組換え菌が生産する酵素の安定性向上等の為、培養液、菌体、洗浄菌体に薬剤処理をおこなったもの、破砕菌体処理したもの等が上げられる。さらに、薬剤処理、凍結処理等で部分的に死滅化した処理物と本殺菌方法を併用することも可能である。
【００２５】
以下、本発明における殺菌方法を簡単にまとめると、まず、培養槽や反応釜など加熱できる容器の中に入った該懸濁液にニトリル類、アミド類、その塩類などを加える。次に懸濁液を加温して、先述の温度範囲（４５〜６０℃）に保持する。
【００２６】
さらに、本発明では上記の範囲の温度に、先述のように一定時間保持（１時間〜４時間）する。その後、保持時間を過ぎたら速やかに冷却することによって、酵素活性の低下を最小限に留めることが出来る。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明の大腸菌の殺菌方法を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
本実施例に使用する酵素触媒はニトリルヒドラターゼ遺伝子が大腸菌ＨＢ１０１株に導入され、三井化学株式会社が寄託しているＭＴ−１０８２２株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７８５、特開平１１−２５３１６８参照）を用いた。
【００２９】
本菌株の培養は２ｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地５００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。
【００３０】
2004024059.tif 000002
【００３１】
この培地に終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、上記菌株を一白金耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。また、この際、培養開始約１５時間後にＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度１００μｍｏｌ／ｌになるよう添加し培養する（以下、培養液と略）。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、分離した液に流動性を持たせるため固形分率が約１５重量％となるように集菌時の上澄み液を加えて湿菌体を得た（以下、集菌液と略）。これらの一部をサンプリングし下記方法にて酵素活性測定した。
【００３２】
その後、集菌液にアクリルアミド（以下、ＡＡＭと略）を０．１重量％になるように加え、加熱温度５０℃、ホールド時間３ｈで殺菌処理を実施し、殺菌処理後のサンプルをサンプリングしその活性を測定した。
【００３３】
次式、活性残存率（％）＝（殺菌後の活性／殺菌前の活性）×１００にて活性残存率を求めた。
【００３４】
生菌数は、市販のマッコンキー寒天培地「ダイゴ」（日本製薬製）に殺菌前と殺菌後の菌体液を適切に希釈し、１００μｌ播き、寒天培地上にコンラージ棒でよく広げた後、３０℃で２日間培養して、生育してきたコロニー数を数えて求めた。結果を表１に示す。
（酵素活性測定方法）
サンプリングした菌体液それぞれの、酵素活性を以下の手順で測定する。
各画分液を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）により適当に希釈し、これに１重量％のアクリロニトリルを添加して１０℃で１０分間反応させる。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度を高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略）分析により測定する。ＨＰＬＣカラムはＵＬＴＲＯＮ　８０ＨＧ（５０×８φｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用する。アクリルアミドは２２０ｎｍの吸光度により検出する。
【００３５】
（実施例２〜５、比較例１）
集菌液に加えるアクリルアミド濃度を表１のようにかえたこと以外は前記実施例１と同様の方法で殺菌処理を行った後、同様の方法で生菌数と残存活性を測定した。その結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2004024059.tif 000003
【００３７】
なお、アクリルアミドをメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルまたは、その塩類に変えても同様の結果が得られた。
さらに、集菌液を培養液に変えても同様の結果が得られた。
【００３８】
（実施例６〜９）
殺菌時の処理温度を変えた事以外は前記実施例３と同様の方法で殺菌処理を行った後、同様の方法で生菌数と残存活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
2004024059.tif 000004
【００４０】
なお、アクリルアミドをメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルまたは、その塩類に変えても同様の結果が得られた。
さらに、集菌液を培養液に変えても同様の結果が得られた。
【００４１】
（実施例１０〜１２）
集菌液のｐＨを変えたこと以外は前記実施例３と同様の方法で殺菌処理を行った後、同様の方法で生菌数と残存活性を測定した。
【００４２】
なお、集菌液のｐＨは水酸化ナトリウム溶液もしくは、硫酸を使って調整した。
その結果、表３のような結果が得られた。
【００４３】
【表３】
2004024059.tif 000005
【００４４】
なお、アクリルアミドをメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルまたは、その塩類に変えても同様の結果が得られた。
さらに、集菌液を培養液に変えても同様の結果が得られた。
【００４５】
（実施例１３〜１５）
殺菌時のホールド時間を変えた事以外は前記実施例３と同様の方法で殺菌処理を行った後、同様の方法で生菌数と残存活性を測定した。その結果を表４に示す。
【００４６】
【表４】
2004024059.tif 000006
【００４７】
なお、アクリルアミドをメタクリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルまたは、その塩類に変えても同様の結果が得られた。
さらに、集菌液を培養液に変えても同様の結果が得られた。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、遺伝子組換え微生物菌体にアクリルアミド類もしくはニトリル類、その塩類などを加え、一定温、一定時間で殺菌することにより酵素や有用な物質を変性、失活させることなく完全に死滅化することが可能である。