(57)【要約】【課題】乳酸を培養することによる工業薬品として価格的に対応できる乳酸生成方法の提供する。【解決手段】糖類及び蛋白質を栄養源とする培養液中で乳酸菌を培養して乳酸を生成させる際に、培養液温度とｐＨとを所定の値に保持し、乳酸菌が好ましくは最高に増殖した時点で栄養源を追加する手段、および乳酸菌を培養し、増殖させた後乳酸菌を種菌として回収し、次回培養する際の乳酸菌の培養液中の濃度を可及的に高くする手段によって可及的に短い培養日数で乳酸をより多く生成させる。【選択図】　　　　図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖類及び蛋白質を栄養源として含有する培養液中で乳酸菌を培養することにより乳酸を生成させる方法であって、前記培養液の温度を所定温度範囲に保持し、且つ前記培養液のｐＨを所定の値に保持しながら前記乳酸菌を培養し、該乳酸菌の菌数が所定数に達すると、前記栄養源を追加して培養を継続させる乳酸菌による乳酸生成方法。
【請求項２】
前記糖類が実質的に消費された時点で前記栄養源を加えることからなる請求項１記載の乳酸菌による乳酸生成方法。
【請求項３】
前記乳酸菌の菌数が所定数に達した後、前記培養液から少なくとも一部の培養液を取り出し、該培養液中の固形分を除き、乳酸菌を回収し、以降の前記培養に使用する際の前記乳酸菌の割合を可及的に高い値として、培養時間を可及的に短縮するようにした乳酸菌による乳酸生成方法。
【請求項４】
前記固形分の除去後、凝集剤により乳酸菌を回収することからなる請求項３記載の乳酸菌による乳酸生成方法。
【請求項５】
前記培養液中の乳酸菌数が高まり、最高域に達した後、更に培養を続け、前記培養液中の乳酸菌の数、又は生成する乳酸の増加割合が少なくなった時点で培養を終了し、乳酸を回収することからなる請求項１、２、３又は４記載の乳酸菌による乳酸生成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳酸菌による乳酸生成方法に関し、更に詳細には、乳酸菌によって糖類から乳酸を効率よく生成させる方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌は糖類及び蛋白質を栄養源として含有する培養液中で培養すると乳酸が生成すること、その応用として発酵工業において大きな規模で乳酸が生産されていることは周知である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、食品としての乳酸菌の工業的利用に対する技術的蓄積が豊富であるのに対し、工業薬品製造として乳酸菌を利用するための技術蓄積は殆どなく、現状では化学工場で生産される価格に対抗するための技術は確立していない。
【０００４】
本発明は、以上の問題に着目して成されたものであり、乳酸菌をより短い日数でより多く乳酸を生成させることにより、工業薬品として価格的に有利に乳酸を得ることのできる乳酸菌による乳酸生成方法を提供することを目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための本発明の乳酸による乳酸生成方法は、糖類及び蛋白質を栄養源として含有する培養液中で乳酸菌を培養することにより乳酸を生成させる方法であって、前記培養液の温度を所定温度範囲に保持し、且つ前記培養液のｐＨを所定の値に保持しながら前記乳酸菌を培養し、該乳酸菌の菌数が所定数に達すると、前記栄養源を追加して培養を継続させるものである。
【０００６】
乳酸菌としては、発酵乳の製造に使用される各種の乳酸桿菌、乳酸球菌、ビフィズス菌などに属する乳酸菌を使用することができ、生成される化合物の面から見ると、乳酸のみ生成するホモ乳酸菌、乳酸とエタノールとを当モルづつ生成するヘテロ乳酸菌などがあり、更に光学的異性体であるＤ−乳酸、Ｌ−乳酸を生成するものもある。
【０００７】
前記培養温度は、一般に３０℃〜４５℃の温度が好ましく、培養液のｐＨ値は、乳酸の生成と共に酸性度が中性から酸性側に変化するが、一般には中和剤の使用によりｐＨ＝６〜７の間で培養することが好ましい。但し本発明は、これらの範囲に限定されるものではなく使用する乳酸に好適な温度範囲、ｐＨ範囲を使用すべきである。
【０００８】
前記培養液の中性を維持する手段としては、例えば水酸化ナトリウム、アンモニアなど、中和生成物が水溶性となるアルカリ成分を使用することが重要である。なお前記化合物の例示は、本発明を限定するものではない。
【０００９】
前記のとおり乳酸菌の培養において、糖類が残存する間は乳酸が増殖し、糖類が消費されると、それ以後は培養液中の乳酸菌が互に共食いにより菌数を減少させながら、一定数（乳酸菌の場合１ミリリットル（以下ｍｌ）中の菌数がほぼ３０００個程度）になるまで乳酸の生成が継続される。この状態が使用した糖類を最大限乳酸に転換したことになる。
【００１０】
使用しうる糖類源としては特に限定は無いが、古古米、こんにゃく飛粉、パン屑、芋類などであり、栄養源含有量は少ないが資源回収を兼ねる場合には生ゴミを使用することができる。また培養液の増量を可及的に少なくして糖類濃度を増加させたい場合などには、ショ糖、果糖などを使用することができる。なおデンプン質を使用する場合にはジアスターゼ（アミラーゼ）を添加することが好ましい。
【００１１】
使用しうる蛋白源としては、食肉獣の解体屑、魚のあら（粗）などの外、前記古古米、生ゴミなどは蛋白質源としても使用することができる。また培養液の増量を可及的に少なくして蛋白質濃度を増加させたい場合には硝酸アンモニウムなどの窒素含有化合物を使用することができる。
【００１２】
培養液中の糖類と蛋白質との重量構成比（以下Ｃ／Ｎ比）は、一般に大凡１６／１であるとされる。しかしながら経験的には、古古米を用いる場合は大凡１０／１であるが、このままで培養液として十分使用でき、いわゆる生ゴミを使用し、糖類が不足する場合にはこんにゃく飛粉、パン屑等で補給し、蛋白質の補給には魚のあらなどを使用し、Ｃ／Ｎ比を大凡２０／１とすることが好ましい。
【００１３】
Ｃ／Ｎ比のＮの比率が大きくなると悪臭を発するアンモニアやメルカプタンが発生し易くなり、Ｃの比率が大きくなると微生物反応が阻害ないし停止する。
【００１４】
本発明は、前記したように、培養開始後、培養が進み菌数が増加した時点、好ましくは栄養源として加えた糖類が実質的に消費された時点で、再び栄養源を加えるものである。このようにすると、再度栄養源を加えた時点では高い活性の乳酸菌による乳酸生成が行われるので実質的に乳酸の生成速度を速めることができる。
【００１５】
前記栄養源として生ゴミはもとより、古古米、芋などを使用した場合には、培養液中に繊維質その他、乳酸菌の栄養源とならない固形分が存在する。従って前記栄養源を追加する際は、培養液中の固形分を分離した後に栄養源を追加することで培養液量の増量を可及的に少なくすることができる。
【００１６】
乳酸菌を培養すると培養液中の乳酸菌の菌数は増加する。その数が所定数に達した後、前記培養液の少なくとも一部を取り出し、固形分を除去後、凝集剤により乳酸菌を回収することができる。前記培養液を一部取り出す菌数は、好ましくは添加した糖類が消費され、菌数が最大域に達した時点が最も好ましい。
【００１７】
本発明の培養は、乳酸を生成することが目的であるから、糖類が消費された後も乳酸菌の共食いによる培養を続け、乳酸を生成させることができる。即ち、培養液中の乳酸菌数が高まり、最高域に達した後も更に培養を続け、前記培養液中の乳酸菌の数、又は生成する乳酸の増加割合が少なくなった時点で培養を終了し、乳酸を回収することができる。
【００１８】
しかしながらこの段階まで培養を継続すると、次回培養に使用する乳酸　菌（以下種菌という）が少なくなるという問題がある。そこで本発明は、乳酸菌が培養過程で次回培養に使用するため培養液の少なくとも一部を取り出すようにした。取り出す時期は、糖類が培養液中に残存する間は、例え取り出した培養液を次回の培養に使用するとしても、明らかに不経済である。
【００１９】
したがって、回収するため培養液の少なくとも一部を取り出す時点は、乳酸菌が糖類を実質的に消費し、菌数が最大となった時点以降、菌の共食いにより菌数が減少し、必要量が確保できなくなるまでの間に行なえばよい。一般的には糖類濃度が実質的にゼロになり、菌数が最大になった時点で取り出すのが、扱う液量が最も少なくなり好ましいと考えられる。
【００２０】
培養液に占める水分の割合は、一般に攪拌可能な限り少ない方が良い。更に一般的には培養液を予め加熱処理するなどの処置が好ましい。
【００２１】
乳酸菌は、好ましい条件の下では、１個の微生物が約２０分で２個に分裂するといわれている。したがって、順調に増殖させることができれば幾何級数的に個体数が増加するので、現象的には、培養開始濃度が高いほど見かけ培養速度を速めることができる。
【００２２】
したがって、取り出した培養液中の粗大固形物をフィルターで除去した後、乳酸菌（菌の径はほぼ２ミクロン）を高濃度で取り出し、培養液中の乳酸菌の割合を高濃度として培養することにより、培養時間を可及的に短くすることができる。
【００２３】
また乳酸菌の回収を凝集剤によって行うことができる。使用する凝集剤としては、本出願人の特許発明に関わる特許３，　０７４，　４８９号明細書に記載するペーパースラッジ灰を用いた凝集剤を使用することが好ましい。この場合、培養液のｐＨを６．５〜６．８とするのがよく、ほぼ９８％の菌を回収することができる。
【００２４】
前記培養液中で増殖する乳酸菌の数が最大域に達したことの検出方法としては、特に限定されないが、培養液中の単位体積当たりの微生物数を数えるか、糖類濃度を分析することによって知ることができる。
【００２５】
更に、前記乳酸菌の菌数が所定数に達した後、培養液から少なくとも一部の培養液を取り出し、該培養液中の固形分を除き、乳酸菌を回収し、以降の培養に使用する際の乳酸菌の割合を可及的に高い値として、培養時間を可及的に短縮することができる。
【００２６】
前記のとおり反応の終了は、培養液中の微生物数が最小になった時点であり、以後微生物の活動は停止し、生産された乳酸の濃度が最大になる。また残存する乳酸の多くは胞子として休眠する。
【００２７】
以上説明したように、本発明の乳酸による乳酸生成方法は、培養液中に存在する乳酸菌を計数をする必要があるが、これに代えて培養液中の糖類量を定量しても知ることができる。また共食いにより生成する乳酸が極限　（最大値）に達した時点は、乳酸菌の計数または乳酸の定量によって知ることができる。
【００２８】
培養液中の菌数の計数手段には特に限定はないが，　工程管理上の手段として採用するには迅速性が重要になる。
【００２９】
培養液中の糖類の定量法としては特に限定はないが、例えばグルコースセンサー、液体クロマトグラフなどを使用することができる。
【００３０】
培養液中の乳酸の定量法としては、乳酸に従来から使用されている定量法を適宜使用できる。例えば液体クロマトグラフなどを使用することができる。
【００３１】
生成された乳酸を培養液から回収するには、本出願人の特許出願に関わる特願２００１−２５４４９５号明細書に記載の方法を援用することができる。即ち、細目フィルターで微細固形分を除去した後、強陰イオン交換樹脂で塩酸を吸着し、次いで弱陰イオン交換樹脂で乳酸を吸着して水を分離したのち、水酸化ナトリウムにより高い濃度で乳酸を離脱させ、陽イオン交換樹脂により濃縮した遊離乳酸を取得し、加熱濃縮して乳酸を回収する方法を用いることができる。但し本発明はこの方法に限定されない。なおヘテロ乳酸菌による乳酸の製造の場合には、乳酸回収の前にエタノールを蒸留により分離する必要がある。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下添付の図面を参照する一実施の形態により本発明を具体的に説明する。
〔装置の説明〕
図１に示す装置は、本発明の一実施の形態によるベンチスケール規模の乳酸生成装置１の要部である培養槽２の概要説明図である。図１において、培養槽２は、漏斗状に形成した底部に内容物を取り出す排出バルブ３と、培養液４を緩く攪拌する攪拌機５とを備えたものを使用した。
【００３３】
培養液４の酸性度を中性付近に保つ制御は、ｐＨ計６、制御装置７及び中和剤注入装置８により構成した。ｐＨ計６は、センサ部６ａを培養液４中に伸び出させ、検出したｐＨ値を制御装置７に与え、また中和装置８は、中和剤貯槽８ａ及びポンプ８ｂによって構成した。
【００３４】
制御装置７のｐＨ制御動作は、ｐＨ計６の検出酸性度が高くなり、ｐＨ値が６になるとポンプ・オン信号をポンプ８ｂに与え、中和液８ｃを培養液４中に一定割合で注入し、ｐＨ７になるとポンプ・オフ信号を出力する。
【００３５】
培養液の温度制御は、熱電式温度制御器９によってオン・オフ制御を行なうようにした。即ち温度制御器９の熱電対からなるセンサ部９ａが検出する温度信号が設定値まで低下すると電源オン信号を交流電力調整器（以下ＡＰＲと表示する）９ｃに与えてヒーター９ｂを電源Ｅに接続し、上限設定値まで上昇するとＡＰＲ９ｃに電源オフ信号を出力すると共に、前記温度検出信号を制御装置７に与え、温度情報を表示器７ａに表示させるようにした。
【００３６】
なお本実施の形態の乳酸生成装置１に使用した前記制御装置７は、プログラマブルロジックコントローラ（以下ＰＬＣ）（富士統合コントローラＭＩＣＲＥＸ−ＳＸ　シリーズ　”ＳＰＨ”富士電機株式会社製）であり、前記ＡＰＲ９ｃは交流電力調整器（ＭＸシリーズ　富士電機株式会社製）を使用し、表示器７ａ（富士プログラマブル操作表示器　ＰＯＤ　ＵＧシリーズ　富士電機株式会社製）のタッチパネルを操作して培養槽２の攪拌機５と排出バルブ３とを制御するようにした。なお、図１に示す符号１０は攪拌機５を駆動する電動機であり、１１は電動機１０の回転速度制御用のインバータであり、１２は培養液および乳酸菌を培養槽２に投与する配管である。
〔実施例〕
乳酸生成装置１を使用し、以下の態様により乳酸を製造した。
培養液：古古米を粉末にしたものにジアスターゼを加え水に分散させて培養液を調整した。
【００３７】
乳酸菌：ホモ乳酸菌（使用した乳酸菌の数は、測定の結果培養液１ｍｌ当り約４７００個であった）
培養液温度制御範囲：３０〜４５℃
培養液ｐＨ制御範囲：ｐＨ＝６〜７
分析：培養液中の菌数の定量：コロニーカウント法
糖類の定量：高速液体クロマトグラフ法
乳酸の定量：高速液体クロマトグラフ法
以上の条件で培養した結果を図２に示す。図２において培養開始時点で乳酸菌数が約３０００個／ｍｌであったものが、１０日後には糖類濃度がゼロとなると共に、菌数がほぼ６．　４億個／ｍｌに増殖した。この間、菌の増加割合は糖類が消費されると共に徐々に低下するため、最大数に達するまでの菌数の増加曲線は、僅かに上に凸状となる。
【００３８】
この間培養液のｐＨは乳酸の生成と共に低下する。したがって制御装置７は中和剤注入装置８を作動させて中和操作を開始する。その中和操作によるｐＨの変化の一例を図４に示す。図４において、培養開始時の培養液のｐＨは７（中性）であり、菌の増殖と共に乳酸の生成によるｐＨの低下が起こる。そしてｐＨが６となった時点で中和制御が開始され、ほぼ６時間でｐＨが７に回復し中和制御が停止する。
【００３９】
すると再びｐＨは低下し始めるが、前記図２による説明のとおり、菌の増加割合は徐々に低下するため、ｐＨの上昇及び低下割合は前回より減少し、より緩い勾配の曲線となる。この傾向は中和回数が進む毎に中和に要する時間Ｔが延び、Ｔ１　＜Ｔ２　＜Ｔ３　の関係が得られる。
【００４０】
菌数が最大となった時点（培養開始後ほぼ１０日目）で、培養液の１／２量を取り出し、ペーパースラッジ灰を主成分とする凝集剤を使用して乳酸菌（固形分）を凝集沈殿させ、遠心分離機により濃縮した乳酸菌を回収した。
【００４１】
培養液から分離回収した乳酸菌を、前記と同様に調整した培養液（したがって培養開始時の糖類濃度は実施例１と同じ）に１ｍｌ当りの菌数がほぼ３億個／ｍｌとなるように添加し、前記と同様に培養した。その結果糖類濃度が前記と同じであるから、最大菌数も図２の場合と同じ数になるが、４日（培養開始からほぼ７日）で菌数がほぼ最大数（約５．９億個）に達した。
【００４２】
この状態に達した時点で、培養開始時と同じ培養液を培養温度に暖め、培養開始時と同量添加したところ、添加から３日（最初から７日）過ぎた時点で菌数がほぼ最大値（９．１億個／ｍｌ）に達し、培養液中の糖類がほぼゼロとなった。
【００４３】
培養液中の糖類含有量が実質ゼロとなった後も培養を続けたところ、乳酸菌の共食いによる乳酸の生成が継続し、培養開始から１３日経過した後、菌数が約３０００個／ｍｌとなり乳酸の増加は急速に低下することが予想されたので、この時点で培養を終了させた。終了後培養液中の乳酸濃度は約１８％であった。
【００４４】
なお、以上の菌数変遷、特に培養当初の菌数変化は菌の状態により一定しない。例えば休眠（胞子）状態の菌が多い場合には乳酸の生成量の立ち上がりが後れるようになる。但し最終的乳酸は、適正なＣ／Ｎ比の下に適正に管理して培養する限り、添加した糖類量に依存した量が生産される。
【００４５】
培養液中の乳酸菌数が最小になった時点で、表示器７ａのタッチパネルを操作してヒーター９ｂ及び攪拌機５の電源を切り培養を停止し、タッチパネルを操作して排出バルブ３から培養液４を別の容器に移し、生成した乳酸の回収を行った。
〔反応管理〕
以上の説明から理解されるように、本発明による乳酸菌による乳酸の生産は、種菌を取出すために糖類が消費され、菌の増殖による最大数となる時点と、共食いにより菌数が減少し、乳酸生成量が最大値となる時点とを掴むことが重要となる。これに対し菌数の計数はもとより、糖類及び乳酸の定量にも一定の時間が必要である。これに対し図２及び３から予想されるように、前記各時点を、前記分析値・測定値を使用したから、実験式や図から推定が可能であることが理解されよう。
【００４６】
凝集剤を使い乳酸菌を取り除いた培養液を中性にする調整と、温度調整とを行い、更に微小固形分を除去し、塩酸をイオン交換樹脂で除いた後、清浄な水性液にしてイオン交換樹脂で大量の水と乳酸とを分離し、ナトリウム、アンモニアをイオン交換樹脂で更に除去して乳酸を回収した。
【００４７】
以下図２について補足説明をする。前記実施例は乳酸菌数が最大域に達した時点で培養液を２分し、半分の培養液から乳酸菌を回収したが、図２に示すグラフはそのまま培養を続けた場合の乳酸菌数の変遷と生成した乳酸の濃度変化とを示したものである。
【００４８】
この状態（栄養源が無い状態）で更に培養を続けたところ菌数が急速に減少　（共食いによる）し、培養開始後１５日後にほぼ３０００個／ｍｌに低下した。この間、乳酸（乳酸）濃度は増え続け、１３日目には最大値に達した。
【００４９】
図２の場合には１５日で乳酸濃度が１４％であったのに対し、図３の２段培養は１３日で遥かに乳酸収量を増加させることができる。２段目の培養液液量は可及的に少なくすることが望ましい場合は、不純物がより少ない栄養源を使用することが好ましい。
【００５０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の乳酸による乳酸生成方法は、培養途中で培養液を追加することで、短い培養日数で乳酸収量を増加させることができ、しかも乳酸菌増殖数が高くなった時点で乳酸菌を種菌として１部回収し、それ以外の培養液中の菌を共食いさせて乳酸の増収を図ることにより、一定量の糖類に対し、より短い培養時間で乳酸の確保しながら、より大量の乳酸を生産することを可能にすることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の位置実施の形態による乳酸の生産装置の要部装置の概要説明図である。
【図２】図１の装置を用いて乳酸を培養した場合の、培養液中の糖類濃度の変化と、培養による菌数の変化及び乳酸生成量の変化、並びに培養開始時の単位容積あたりの菌数と培養時間との関係を説明するためのグラフ図である。
【図３】図１の装置を用い培養開始後、菌数が最大域に達したときに、再度培養液を追加して培養を行った場合の単位容量当りの菌数と培養時間との関係を説明するためのグラフ図である。
【図４】図２に示す曲線を描く培養工程において、中和剤を一定割合で注入した際のｐＨの変化を示すグラフ図である。
【符号の説明】
１　乳酸生成装置
２　培養槽
４　培養液
６　ｐＨ計
７　制御装置
８　中和剤注入装置
９　熱電式温度制御器
９ｂ　ヒーター
【図１】
2004065142.tif 000002
【図２】
2004065142.tif 000003
【図３】
2004065142.tif 000004
【図４】
2004065142.tif 000005