(57)【要約】　　　（修正有）【課題】洗浄剤配合酵素として有用な新規アルカリプロテアーゼを提供する。【解決手段】枯草菌由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、該アミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質；及び当該タンパク質をコードする遺伝子。【効果】本発明のアルカリプロテアーゼは、従来のズブチリシンとはアミノ酸配列において相同性の低い新規な酵素であり、衣料用洗浄剤をはじめその他の工業用途の酵素として有用。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子；
（ａ）配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗浄剤配合用酵素として有用な新規アルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテアーゼは、工業用酵素として最も生産量が多く、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化補助剤あるいは消炎剤といった様々な用途、分野で利用されている。中でも洗剤用のアルカリプロテアーゼは、洗浄力の向上に不可欠な一成分として特に重要な役割を果たしている。
【０００３】
現在用いられている洗剤用アルカリプロテアーゼには、サビナーゼ（登録商標；ノボザイム社製）、カンナーゼ（登録商標；ノボザイム社製）、デュラザイム（登録商標；ノボザイム社製）、マキサカル（登録商標；ジェネンコア社製）、ブラップ（登録商標；ヘンケル社製）及びＫＡＰ（花王社製）等があるが、これらはいずれもバチルス属細菌由来のものであり、ズブチリシンファミリーに属しており、相互のアミノ酸配列の相同性が非常に高いことが知られている。斯かるプロテアーゼは、例えば、Ｓｉｅｚｅｎら（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．，　４，　７１９−７３７，　１９９１）によりＣｌａｓｓ　Ｉ−Ｓ２に分類されている。
【０００４】
しかしながら、これらのアルカリプロテアーゼは、アルカリ耐性、界面活性剤耐性、酸化剤耐性、低温活性、耐熱性、洗浄性、低い基質特異性、キレート剤耐性、金属イオン耐性等において一長一短のあるものであり、洗浄用酵素としてより優れた性質を有するプロテアーゼが求められていた。
【０００５】
本発明は、従来のズブチリシンとはアミノ酸配列において相同性が低く、且つ有用な上記の性質を１以上有する、例えばアルカリ耐性に優れ、高アルカリ領域においても高い活性を有する新規なアルカリプロテアーゼ並びにこれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、好アルカリ性バチルス属細菌のゲノムＤＮＡから従来公知のズブチリシンとアミノ酸配列において相同性の低いアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を取得し、種々検討したところ、アルカリ耐性に優れ、高アルカリ領域においても高い活性を有する新規なアルカリプロテアーゼを生産することに成功した。
【０００７】
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、
当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質（以下、「アルカリプロテアーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【０００９】
ここで、（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてアルカリプロテアーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
尚、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット［Ｍｕｔａｎ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ　キット（Ｔａｋａｒａ）］等を用いて変異を導入すればよい。
【００１０】
本発明の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼと他の公知であるアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列と比較した場合、ズブチリシンＢＰＮ’と６６．５％、ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇとは７５．０％の中程度の相同性を示すにすぎない。さらに洗剤用酵素として用いられているサビナ−ゼとは６２．０％、エスペラーゼとは５８．４％、ＫＡＰ（Ｍ−プロテアーゼ）とは６１．３％の相同性を示すにすぎない。さらに他の公知のアルカリプロテアーゼとの相同性を検討すると、好アルカリ性バチルス属細菌ＬＧ１２株由来のズブチリシンＳｐｒＣ及びＳｐｒＤ（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　、６１、４４９０−４４９３、１９９５）と７８．５％、７２．５％の相同性を示した。これらの結果は、本発明のアルカリプロテアーゼが新規な酵素であることを示唆するものである。
参考までに、配列番号２においてアミノ酸番号１から１０１番の間、即ちプレプロ配列と推定される領域における相同性は上記アルカリプロテアーゼのプレプロ配列あるいは他の公知であるアルカリプロテアーゼのプレプロ配列と比較した場合、２８−４７％の相同性を示すにすぎず、相同性の高い配列は見当たらない。すなわち、本発明においては、配列番号１に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、８０％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼを包含するものである。本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列における相同性が、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上あることが望ましい。
尚、ここでいう相同性の検索はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発）のサーチホモロジ−プログラムを用いて算出できる。
【００１１】
本発明の遺伝子は、上記の通り、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであればよいが、（ａ）配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子が好ましい。
【００１２】
ここで「ストリンジエントな条件下」とは、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　−　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件等が挙げられる。例えば、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ　塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％　ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１３】
本発明のタンパク質であるアルカリプロテアーゼは、例えばバチルス　エスピー　ＫＳＭ−ＬＤ１株の染色体ＤＮＡからクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。ＫＳＭ−ＬＤ１株の菌学的性質を以下に示す。
【００１４】
Ａ．形態学的性質
（ａ）細胞の形及び大きさ　　　：桿菌（０．７×２〜３．０μｍ）
（ｂ）細胞の多形性　　　　　　：なし
（ｃ）運動性　　　　　　　　　：なし
（ｄ）胞子　　　　　　　　　　：有（０．６〜０．７×１．０〜１．２μｍ）
（ｅ）グラム染色　　　　　　　：不定
【００１５】
Ｂ．各種培地での生育状態
（ａ）肉汁寒天培地での生育状態　　：円形、低凸状、全縁なめらかなコロニーを形成する。コロニーの表面は無光沢。クリーム色
（ｂ）肉汁液体培養　　　　　　　　：混濁する
（ｃ）肉汁ゼラチン穿刺培養　　　　：生育良好で液化する
（ｄ）リトマスミルク　　　　　　　：生育しない
（ｅ）卵黄培地　　　　　　　　　　：生育しない
（ｆ）チロシン寒天培地　　　　　　：生育しない
【００１６】
Ｃ．生理的性質
（ａ）硝酸塩の還元　　　　　　　　：陰性
（ｂ）ＭＲテスト　　　　　　　　　：陰性
（ｃ）ＶＰテスト　　　　　　　　　：陽性
（ｄ）硫化水素の生成　　　　　　　：陰性
（ｅ）インドールの産生　　　　　　：陰性
（ｆ）澱粉の加水分解　　　　　　　：陽性
（ｇ）クエン酸の利用　　　　　　　：利用しない
（ｈ）ウレアーゼ　　　　　　　　　：陰性
（ｉ）オキシダーゼ　　　　　　　　：陽性
（ｊ）β−ガラクトシダーゼ　　　　：陽性
（ｋ）アルギニンヒドラーゼ　　　　：陰性
（ｌ）リシンデカルボキシラーゼ　　：陰性
（ｍ）オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性
（ｎ）トリプトファンデアミナーゼ　：陰性
（ｏ）ゼラチナーゼ　　　　　　　　：陽性
（ｐ）カタラーゼ　　　　　　　　　：陽性
（ｑ）生育の温度範囲　　　　　　　：５〜４０℃で生育可能
（ｒ）生育のｐＨ範囲　　　　　　　　：ｐＨ７〜１０で生育良好
（ｓ）嫌気培養　　　　　　　　　　：嫌気的条件で生育不能
（ｔ）糖類からの酸の生成（＋；生成する、−；生成しない）
グリセロール　　　　　　　　：−
エリスリトール　　　　　　　：−
Ｄ−アラビノース　　　　　　：−
Ｌ−アラビノース　　　　　　：−
リボース　　　　　　　　　　：−
Ｄ−キシロース　　　　　　　：−
Ｌ−キシロース　　　　　　　：−
アドニトール　　　　　　　　：−
β−メチル−Ｄ−キシロース　：−
ガラクトース　　　　　　　　：−
グルコース　　　　　　　　　：＋
フラクトース　　　　　　　　：＋
マンノース　　　　　　　　　：＋
ソルボース　　　　　　　　　：−
ラムノース　　　　　　　　　：−
ズノシトール　　　　　　　　：−
イノシトール　　　　　　　　：−
マンニトール　　　　　　　　：＋
ソルビトール　　　　　　　　：−
α−メチル−Ｄ−マンノース　：−
α−メチル−Ｄ−グルコース　：−
Ｎ−アセチルグリコサミン　　：−
アミグダリン　　　　　　　　：−
アルブチン　　　　　　　　　：−
エスクリン　　　　　　　　　：＋
サリシン　　　　　　　　　　：＋
セロビオース　　　　　　　　：＋
マルトース　　　　　　　　　：＋
乳糖　　　　　　　　　　　　：−
メリビオース　　　　　　　　：−
白糖　　　　　　　　　　　　：＋
トレハロース　　　　　　　　：＋
イヌリン　　　　　　　　　　：−
メレチトース　　　　　　　　：−
ラフィノース　　　　　　　　：−
澱粉　　　　　　　　　　　　：＋
グリコーゲン　　　　　　　　：＋
キシリトール　　　　　　　　：−
ゲンチオビオース　　　　　　：−
Ｄ−ツラノース　　　　　　　：−
Ｄ−リキソース　　　　　　　：−
Ｄ−タガトース　　　　　　　：−
Ｄ−フコース　　　　　　　　：−
Ｌ−フコース　　　　　　　　：−
Ｄ−アラビトール　　　　　　：−
Ｌ−アラビトール　　　　　　：−
グルコネート　　　　　　　　：−
２−ケトグルコン酸　　　　　：−
５−ケトグルコン酸　　　　　：＋
【００１７】
上記ＫＳＭ−ＬＤ１株は、その形態学及び生理学的性質について、「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ社、１９８４年）の記載に順じ検討したところ、バチルス属に属させることが妥当であるが、種については、既知のバチルス属の種の諸性質とは完全に一致しないため、新規な微生物として、本菌株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにバチルス　エスピー　ＫＳＭ−ＬＤ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＫＳＭ−ＬＤ１；ＦＥＲＭ　１８５７６）として寄託した。
【００１８】
本発明の遺伝子は、上述したアルカリプロテアーゼ産生菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＫＳＭ−ＬＤ１株（ＦＥＲＭ　１８５７６）等から、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いることよりクローニングすることができる。
【００１９】
本発明遺伝子を用いてアルカリプロテアーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリプロテアーゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリプロテアーゼを採取すればよい。
培養は微生物が資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００２０】
かくして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離または濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液または乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００２１】
本発明のアルカリプロテアーゼの特徴としては、次のような性質が好ましい。すなわち、分子量約２８，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、最適反応ｐＨを１１．０（ホウ酸緩衝液）〜１２．９５（塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液）、最適温度を５５℃付近に有し、熱やｐＨに対する安定化にカルシウムイオンを必要としていることが望ましく、段落〔００２８〕〜〔００３２〕に示す性質を有していることがより好ましい。
【００２２】
【実施例】
実施例１　　　遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定
枯草菌が産生するセリンプロテアーゼファミリーにおいて高度に保存されている領域である６４番目のＨｉｓ周辺および２２１番目のＳｅｒ周辺のアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ及びＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙに対して、これらの領域間を増幅させるように設計したプライマー１（配列番号３：５’−ＣＡＹＧＧＮＡＣＮＣＡＹＧＴＮＧＣＮＧＧ−３’）、プライマー２（配列番号４：５’−ＣＣＮＧＣＮＡＣＲＴＧＮＧＧＮＧＮＮＧＣＣＡＴＮＧＡＮＧＴＮＣＣ−３’）、プライマー３（配列番号５：５’−ＣＣＮＧＣＮＡＣＲＴＧＮＧＧＮＧＮＮＧＣＣＡＴＲＣＴＮＧＴＮＣＣ−３’）を合成した。なお、アミノ酸番号はＢＰＮ’のアミノ酸配列を基準に示したものである。
【００２３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＫＳＭ−ＬＤ１株を３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％魚肉エキス、０．１％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、０．５％炭酸ナトリウム（別滅菌）から成る培地にて３０℃、２４時間、好気的に振盪培養を行い、遠心分離により菌体を集めた。得られた菌体から斎藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　７２，　６１９−６２９，　１９６３）に準じ、ゲノムＤＮＡを調製し、プライマー１と２、プライマー１と３の組合せを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件はゲノムＤＮＡ１０〜１００ｎｇを鋳型に２０ｎｍｏｌのプライマー及びＰｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ）から成る反応液（５０μＬ）に対し、Ｂｉｏｍｅｔｒａ：Ｔ−Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ワットマン）にて９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、４０〜６０℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ断片をＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　キット（ロッシュ）にて精製し、ＳｍａＩにて消化したｐＵＣ１８に連結し、大腸菌ＨＢ１０１株に導入した。形質転換体よりＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　キット（ロッシュ）を用いてプラスミドを調製し、ＥｃｏＲ　Ｉ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで消化後１．２％アガロースゲル電気泳動により挿入断片の有無と大きさを確認した。挿入断片の大きさが２００ｂｐ〜１５００ｂｐのものに対してＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（パーキンエルマー）及びＤＮＡシークエンサー（３７７型：アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を決定した。なお、プライマーは、ＢｃａＢＥＳＴ　ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＰｒｉｍｅｒ　ＲＶ−ＭまたはＢｃａＢＥＳＴ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍ１３−４７（Ｔａｋａｒａ）を用いた。次にＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＫＳＭ−ＬＤ１株のゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲ　ＩまたはＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化し、ＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｔａｋａｒａ）中のＥｃｏＲ　ＩまたはＨｉｎｄ　ＩＩＩカセットに上記ＥｃｏＲ　ＩまたはＨｉｎｄ　ＩＩＩ分解断片をそれぞれ連結させ、各々上流および下流領域を読むために合成した外側プライマーと付属のプライマーＣ１にてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件はカセットに連結されたＤＮＡ断片０．１〜１．０ｎｇを鋳型にプライマー１０〜２０ｐｍｏｌを用い、５０μｌ反応系にて９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。その後、増幅ＤＮＡ断片を各々の内側プライマーと付属のプライマーＣ２でＰＣＲを行ない増幅させた。この際のＰＣＲ条件は先に得られた増幅ＤＮＡ断片を１００００倍希釈したもの１μｌを鋳型に１０〜２０ｐｍｏｌのプライマーを用い（５０μＬ）、９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし３０サイクルにて行なった。増幅した断片の塩基配列を先と同様に決定した。新たに得られた塩基配列情報をもとに上流域、下流域の���基配列を決定するためのプライマーを合成し、同様の手法によりプロテアーゼをコードする領域およびその上流、下流領域の全塩基配列を決定した。
【００２４】
実施例２　枯草菌形質転換体による新規アルカリプロテアーゼの生産
実施例１にて決定したアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子をプライマー４（配列番号６：５’−ＧＴＧＴＴＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴＣＧＡＣＡＡＴＴＡＣＧ−３、下線部は新たに付加したＢｇｌ　ＩＩサイトを示す）及びプライマー５（配列番号７：５’−ＧＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴＴＡＡＴＡＡＡＡＧＣＧ−３、下線部は新たに付加したＸｂａ　Ｉサイトを示す）各２０ｐｍｏｌを用い、０．１〜１．０ｎｇのＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＫＳＭ−ＬＤ１株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ増幅断片をＨｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　キットにて精製し、Ｂｇｌ　ＩＩ、Ｘｂａ　Ｉにて分解した後、同様に処理したベクターｐＡＳＰ６４（特開２０００−２８７６８７）に導入し、組換えプラスミドを調製した。これを用いてプロトプラスト法によりＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＩＳＷ１２１４株を形質転換した。得られた形質転換株を３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％魚肉エキス、０．１％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、３％マルトース（別滅菌）から成る培地にて３０℃、７２時間好気的に振盪培養を行なったところ、培養液当たりのアルカリプロテアーゼ生産量は５−１０ＰＵ／Ｌであった。
【００２５】
実施例３　プロテアーゼの調製法
実施例２で得られた培養液３０ｍＬを１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したスーパーＱトヨパールカラム（東ソー：２．５×８ｃｍ）に添着し、非吸着のプロテアーゼ活性画分を集めた。この画分を限外濾過にて加水濃縮し（アミコン：ＹＭ３メンブレン）、予め１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化しておいたＣＭ―Ｂｉｏ−ＧｅｌＡカラム（バイオラッド：２．５×７ｃｍ）に添着し、０から１００ｍＭの塩化カリウムを用いた濃度勾配法により吸着したプロテアーゼ活性画分を溶出した。活性画分を限外濾過にて加水濃縮し（ＹＭ３メンブレン）、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った結果、分子量約２８，０００の均一なタンパク質であることを確認した。尚、タンパク質量は牛血清アルブミンを標準とし、ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド）を用いて測定した。
【００２６】
実施例４　ＫＳＭ−ＬＤ１株由来アルカリプロテアーゼの酵素学的性質
実施例３で得られた精製アルカリプロテアーゼの活性測定法はカゼインを基質とした以下の方法により行った。
【００２７】
［カゼイン法］
０．６％（ｗ／ｖ）カゼイン（メルク）を含む５０ｍＭ緩衝液１ｍＬを３０℃で５分間保温した後、０．１ｍＬの酵素溶液を添加し、３０℃で１５分間反応を行った。ＴＣＡ溶液（０．１１ｍＭトリクロロ酢酸：０．２２ｍＭ酢酸ナトリウム：０．３３ｍＭ酢酸）２ｍＬを添加して反応を停止し、室温で１０分間放置した後、酸変性タンパク質を濾過（Ｎｏ．２濾紙：ワットマン）した。濾液０．５ｍＬにアルカリ性銅試薬［１％（ｗ／ｖ））酒石酸カリウム・ナトリウム：１％（ｗ／ｖ）硫酸銅：２％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム／０．１ｍＭ水酸化ナトリウム＝１：１：１００（ｖ／ｖ）］２．５ｍＬを添加し、３０℃、１０分間恒温した。フェノール試薬［フェノール試薬（関東化学）を脱イオン水で２倍希釈したもの］０．２５ｍＬを加え、３０℃、３０分間恒温した後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクは、酵素反応液に反応停止液を加えた後、酵素溶液を添加し同様に処理したものを用意した。酵素１単位（Ｐ．Ｕ）は、上記の反応条件において１分間に１ｍｍｏＬのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離する酵素量とした。
【００２８】
（１）最適反応ｐＨ
基質として０．６％カゼインを含む各種緩衝液中（ｐＨ７〜１２．９５）で３０℃、１５分間反応させ、酵素活性を測定した。本発明のプロテアーゼは、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ１１．４）において最も高い活性を示した。さらにｐＨ１２．６（リン酸緩衝液）、ｐＨ１２．９５（塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液）においても、最大活性値の９５％以上の分解活性を有し、高アルカリ領域において優れた分解力を示した。
【００２９】
（２）ｐＨ安定性
２ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭの各緩衝液中（ｐＨ４〜１２．５）に酵素を添加し、４０℃、３０分間の処理を行った。氷冷後、カゼイン法により残存活性を測定した結果、本発明のプロテアーゼは、ｐＨ７〜１２．５の広範囲で安定であった。カルシウムイオンは酵素の安定性に効果的であった。
【００３０】
（３）最適温度
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）を用いて、３０〜８５℃までの各温度でカゼイン法により活性測定を行った。その結果、本発明プロテアーゼの最適温度は５５℃であった。また５ｍＭ塩化カルシウムを添加した場合、最適温度は７０℃にシフトした。
【００３１】
（４）耐熱性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に酵素を加え、３０〜７５℃の各温度で１５分間熱処理を行った後、氷水中で急冷した。残存活性をカゼイン法にて測定した結果、発明のプロテアーゼは、５ｍＭ塩化カルシウムを添加した場合、６０℃まで、塩化カルシウム無添加の場合、５０℃まで安定であった。
【００３２】
（５）基質特異性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）にヘモグロビン、エラスチン、ケラチン、卵黄、ゼラチン（０．２５％）を溶解／懸濁させ、酵素反応を行った。カゼインに対する分解活性を１００％とした場合、それぞれ５６％、２．８％、７．１％、５．６％並びに１５６％の相対活性を示した。
【００３３】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼは、従来のズブチリシンとはアミノ酸配列において相同性の低い新規な酵素であり、アルカリ耐性に優れ、高アルカリ領域においても高い活性を有することから、衣料用洗浄剤をはじめその他の工業用途の酵素として有用である。
【００３４】
【配列表】
2004065171.tif 000002
2004065171.tif 000003
2004065171.tif 000004
2004065171.tif 000005
2004065171.tif 000006
2004065171.tif 000007
2004065171.tif 000008
2004065171.tif 000009