(57)【要約】【課題】本来、熱ショック応答の制御に中心的な役割を演じるＨＳＦ１が、生理的に個体発生の過程でどのような機能を発揮するのかについて、さらに解析を行う必要がある。本発明は、ＨＳＦ１欠損マウスで、体重増加不良、胎盤形成異常、卵成熟異常以外の表現型を明らかにし、その分子機構を明らかにすることを課題とする。同時に、ＨＳＦ１を遺伝的に欠損した動物個体を提供することも課題としている。【解決手段】本発明は、前記の課題を解決するための手段として、（１）ＨＳＦ１をコードするゲノム遺伝子がその機能欠失型変異遺伝子に置換されている分化全能性細胞を発生させた非ヒト動物個体およびその子孫動物であるＨＳＦ１遺伝子欠損動物、  （２）  非ヒト動物が、マウスである前記発明（１）のＨＳＦ１遺伝子欠損動物、  （３）前記発明（１）または（２）の動物由来の組織または細胞、  （４）ＨＳＦ１をコードするゲノム遺伝子がその機能欠失型変異遺伝子に置換されているＥＳ細胞、（５）マウス由来である前記発明（４）のＥＳ細胞を提供する。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱ショック応答を制御する熱ショック転写因子ＨＳＦ１をコードするゲノム遺伝子が、機能欠失型変異遺伝子に置換されている分化全能性細胞を発生させて得られる非ヒト動物個体およびその子孫動物であるＨＳＦ１遺伝子欠損動物。
【請求項２】
非ヒト動物が哺乳類である、請求項１に記載のＨＳＦ１遺伝子欠損動物。
【請求項３】
非ヒト動物がマウスである、請求項１または２に記載のＨＳＦ１遺伝子欠損動物。
【請求項４】
ＨＳＦ１遺伝子欠損に起因する発生異常により、腎臓の糸球体と尿細管の異常、脾臓とＢリンパ球の分化異常、繊毛不動症候群に類似した脳室拡大および鼻腔の炎症を発症する、請求項１から３のいずれかに記載のＨＳＦ１遺伝子欠損動物。
【請求項５】
請求項４に記載の異常または症状を呈している、ＨＳＦ１遺伝子欠損動物由来の組織または細胞。
【請求項６】
熱ショック応答を制御する熱ショック転写因子ＨＳＦ１をコードするゲノム遺伝子が機能欠失型変異遺伝子に置換されている、非ヒト動物由来の分化全能性細胞。
【請求項７】
非ヒト動物が哺乳類由来である、請求項６に記載の分化全能性細胞。
【請求項８】
非ヒト動物がマウス由来である、請求項６または７に記載の分化全能性細胞。
【請求項９】
請求項１から６のいずれかに記載の動物、組織または細胞を用いる、薬物のスクリーニング方法。
【請求項１０】
腎臓の糸球体と尿細管の異常、脾臓とＢリンパ球の分化異常、繊毛不動症候群に類似した脳室拡大および鼻腔の炎症を対象とする、請求項９に記載の薬物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＳＦ１遺伝子欠損動物に関するものである。さらに詳しくは、ＨＳＦ遺伝子ファミリーに属し、熱ショック応答において最も重要な因子であるＨＳＦ１遺伝子が機能欠失型変異遺伝子に置換された遺伝子ノックアウト動物であって、体内において温熱ストレスによる熱ショック蛋白質遺伝子の転写活性化能力を持たない、またはその活性が低い遺伝子欠損動物と、この動物の作成に不可欠な分化全能性細胞に関するものである。この遺伝子欠損動物は、腎不全、免疫疾患、鼻疾患、神経変性疾患に対する医薬品開発等の分野において有用である。
【０００２】
【従来の技術】
熱ショック応答は、一群の熱ショック蛋白質の誘導を特徴とする生体防御機構の一つである。その応答を制御するのが熱ショック転写因子ファミリーで、鳥類ではＨＳＦ１、ＨＳＦ２そしてＨＳＦ３からなり、哺乳動物ではＨＳＦ１、ＨＳＦ２そしてＨＳＦ４で構成されている（非特許文献１、２）。温熱ストレスや毒物によるストレスにより、鳥類ではＨＳＦ１とＨＳＦ３が（非特許文献３）、哺乳動物ではＨＳＦ１とＨＳＦ４が（非特許文献４）活性化を受ける。そのなかでも熱ショック遺伝子の転写誘導に優位に働くのは、鳥類ではＨＳＦ３、哺乳動物ではＨＳＦ１であることがわかっている。
【０００３】
熱ショック応答の分子機構はかなり明らかになったが、外部からのストレスのない正常発生過程や正常の細胞増殖の過程における熱ショック転写因子ファミリーの役割については、未解決の部分が多い。これまでにＨＳＦ１遺伝子欠損マウスの作成と表現型の解析がなされている。ＨＳＦ１が欠損することで、体重増加不良を認め、胎盤形成異常と卵成熟異常が報告されている（非特許文献５、６）。しかしながら、それ以外の組織の発生の異常については明らかにされていない。また、胎盤形成異常や卵成熟異常がおこる分子機構については、何も明かにされていない。一方ＨＳＦ２の機能については、その発見以来、最近までほとんど謎のままであった。個体発生の過程でその発現に変動があることから、発生過程で特異的に機能する因子であることが推測されていた。最近、ＨＳＦ２遺伝子欠損マウスの表現型の解析もなされた。ＨＳＦ２が欠損することで、脳室の拡大、精子形成と卵子形成の軽度な異常を認めている（非特許文献７）。いずれも、その異常が生ずる分子機構については全く明らかにされていない。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，  Ｒ．Ｉ．  （１９９８）  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ：  ｃｒｏｓｓ  ｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆａｃｔｏｒｓ，  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ，  ａｎｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１２，  ３７８８−３７９６．
【非特許文献２】
Ｎａｋａｉ，  Ａ．  （１９９９）  Ｎｅｗ  ａｓｐｅｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ：  ＨＳＦ３  ａｎｄ  ＨＳＦ４．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ，４，８６−９３．
【非特許文献３】
Ｎａｋａｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｔ．  （２００１）  Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｔｒｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆａｃｔｏｒｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，  ２８８５−２８９５．
【非特許文献４】
Ｔａｎａｂｅ，  Ｍ．，  Ｓａｓａｉ，  Ｎ．，  Ｎａｇａｔａ，  Ｋ．，  Ｌｉｕ，  Ｘ．−Ｄ．，  Ｌｉｕ，  Ｐ．  Ｃ．  Ｃ．，  Ｔｈｉｅｌｅ，  Ｄ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｎａｋａｉ，  Ａ．  （１９９９）  Ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＨＳＦ４  ｇｅｎｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｂｏｔｈ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｎｄ  ａ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７４，２７８４５−２７８５６．
【非特許文献５】
Ｘｉａｏ，  Ｘ．，  Ｚｕｏ，  Ｘ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ａ．Ａ．，  ＭｃＭｉｌｌａｎ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｃｕｒｒｙ，  Ｂ．  Ｂ．，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  Ｉ．  Ｊ．  （１９９９）  ＨＳＦ１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａ−ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８，５９４３−５９５２．
【非特許文献６】
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ，  Ｅ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ａ．  Ａ．，  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｓ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  Ｉ．  Ｊ．  （２０００）Ｍａｔｅｒｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｈｓｆ１  ｏｎ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｓｕｃｃｅｓｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，４０７，６９３−６９４．
【非特許文献７】
Ｋａｌｌｉｏ，  Ｍ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｙ．，  Ｍａｎｕｅｌ，  Ｍ．，  Ａｌａｓｔａｌｏ，  Ｔ．Ｐ．，  Ｒａｌｌｕ，  Ｍ．，  Ｇｉｔｔｏｎ，  Ｙ．，  Ｐｉｒｋｋａｌａ，  Ｌ．，  Ｌｏｏｎｅｓ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｐａｓｌａｒｕ，  Ｌ．，  Ｌａｒｎｅｙ，  Ｓ．，  Ｈｉａｒｄ，  Ｓ．，  Ｍｏｒａｎｇｅ，  Ｍ．，  Ｓｉｓｔｏｎｅｎ，  Ｌ．，  Ｍｅｚｇｅｒ，  Ｖ．  （２００２）  Ｂｒａｉｎ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ，  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｅｉｏｔｉｃ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｓｙｎａｐｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｅｍａｌｅ  ｓｕｂｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＨＳＦ２  ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，２１，２５９１−２６０１．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本来、熱ショック応答の制御に中心的な役割を演じるＨＳＦ１が、生理的に個体発生の過程でどのような機能を発揮するのかについて、さらに解析を行う必要がある。この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものである。ＨＳＦ１欠損マウスで、体重増加不良、胎盤形成異常、卵成熟異常以外の表現型を明らかにし、その分子機構を明らかにすることを課題とする。同時に、ＨＳＦ１を遺伝的に欠損した動物個体を提供することも課題としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前記の課題を解決するための手段として、以下の（１）〜（５）の発明を提供する。  （１）ＨＳＦ１をコードするゲノム遺伝子がその機能欠失型変異遺伝子に置換されている分化全能性細胞を発生させた非ヒト動物個体およびその子孫動物であるＨＳＦ１遺伝子欠損動物、  （２）  非ヒト動物が、マウスである前記発明（１）のＨＳＦ１遺伝子欠損動物、  （３）前記発明（１）または（２）の動物由来の組織または細胞、  （４）  ＨＳＦ１をコードするゲノム遺伝子がその機能欠失型変異遺伝子に置換されている分化全能性細胞、（５）マウス由来である前記発明（４）の分化全能性細胞。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、上記の各発明について実施の形態を詳しく説明する。この出願によって提供される前記発明（１）のＨＳＦ１遺伝子欠損動物は、熱ショック応答に重要な役割を果たしている熱ショック転写因子ＨＳＦ１をコードするゲノム遺伝子が、その機能欠失型変異遺伝子に置換されている分化全能性細胞発生させた遺伝子ノックアウト非ヒト動物である。さらに詳しくは、この発明（１）のＨＳＦ１遺伝子欠損動物は、体細胞染色体のＨＳＦ１遺伝子がその変異配列に置換されているヘテロ接合体、あるいはホモ接合体として提供される。
【０００８】
この発明（１）のＨＳＦ１遺伝子欠損動物は、公知の標的遺伝子組換え法により作製することができる。この標的遺伝子組換え法では、分化全能性細胞としてＥＳ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ）細胞、ＥＧ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ）細胞等を使用する。ＥＳ細胞は、マウス、ラット、サル、ウサギで確立している。また、ブタについては、ＥＧ細胞が確立している。従って、この発明（１）のＨＳＦ１遺伝子欠損動物は、これらの動物種を対象に作製することができる。また、哺乳類を含む非ヒト動物においても、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞等の分化全能性細胞の利用は可能である。特に、遺伝子ノックアウト動物の作製に関して技術が整っているマウスが最適である。作製の具体的手続を、前記発明（２）のマウスを例にとって説明すれば、以下のとおりである。
【０００９】
先ず、ＨＳＦ１遺伝子のゲノムＤＮＡ断片を単離し、そのＤＮＡ断片を試験管内にて遺伝子操作し、ＨＳＦ１遺伝子のＤＮＡ結合ドメインを含むＤＮＡ断片に対して改変を施すなどの、ＨＳＦ１遺伝子の機能を欠失させるような変異ＤＮＡ断片を作製する。ＨＳＦ１ゲノムＤＮＡの単離は、ＨＳＦ１  ｃＤＮＡを用いてマウスゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。また、マウス以外の動物を対象とする場合にも、前記のｃＤＮＡをプローブとする前記の方法により、各動物のＨＳＦ１遺伝子を単離することができる。
【００１０】
上記のような方法によって得られたマウスＨＳＦ１遺伝子のゲノムＤＮＡの一部を改変し、分化全能性細胞（ＥＳ細胞）のＨＳＦ１遺伝子に変異を導入するためのターゲティングベクターを、公知の方法に準じて作製する。例えば、ＨＳＦ１遺伝子のゲノムＤＮＡの一部をＧ４１８等の細胞毒に対する耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）に置換することにより、もしくは細胞毒に対する耐性遺伝子をＨＳＦ１遺伝子のゲノムＤＮＡの一部に挿入することで、ＨＳＦ１のゲノムＤＮＡと相同な配列を両端に有する変異遺伝子を保有する組換えプラスミドＤＮＡ、すなわちターゲティングベクターを作製する。なお、細胞毒に対する耐性遺伝子には、その発現を制御するためのＰＧＫ１プロモーター等の配列およびＰＧＫ１ポリアデニレーションシグナル等を連結することもできる。また、細胞毒に対する耐性遺伝子により置換または挿入されるＨＳＦ１遺伝子のゲノムＤＮＡ部位は、ＤＮＡ結合ドメインを含んだエクソン領域を含むゲノムＤＮＡ領域であることが好ましい。
【００１１】
上記ＨＳＦ１遺伝子のゲノムＤＮＡの一部に変異を導入するためのターゲティングベクターには、ＨＳＦ１遺伝子のゲノムＤＮＡに相同な配列を有すること以外には特に制限はなく、他の薬剤耐性遺伝子や、細胞選択用遺伝子（例えば、ジフテリア毒素Ａ遺伝子やヘルペスウイルスのサイミジンキナーゼ遺伝子）、プロモーター、エンハンサー等の配列を適宜に組み合わせて使用することができる。
【００１２】
次に、このターゲティングベクターを、公知の方法に準じてマウスＥＳ細胞に導入する。このような遺伝子導入法としては、公知の電気パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等も利用できるが、導入遺伝子の相同遺伝子組換え効率を勘案した場合、ＥＳ細胞への電気パルス法が好ましい。
【００１３】
遺伝子導入された各ＥＳ細胞のＤＮＡを抽出し、サザンブロット分析やＰＣＲアッセイ等により、染色体上に存在する野生型ＨＳＦ１遺伝子と導入したＨＳＦ１変異遺伝子断片の間で正しく相同遺伝子組換えが起こり、染色体上のＨＳＦ１遺伝子に変異が移った細胞を選択する。
【００１４】
こうして得た変異遺伝子を持つＥＳ細胞を野生型マウスのブラストシストに注入し、つづいてこのキメラ胚を仮親の子宮に移植する。出生した動物を里親につけて飼育させた後、ＨＳＦ１変異遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ動物を選別する。選別は毛色の違い、または体の一部（例えば尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザンブロット分析やＰＣＲアッセイ等により行う。ＨＳＦ１変異遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ動物と野生型動物の交配により得られる子孫について、さらに体の一部（例えば尾部先端）からの抽出ＤＮＡを材料としたサザンブロット分析やＰＣＲアッセイ等を行い、ＨＳＦ１変異遺伝子が導入されたヘテロ接合体を同定する。作出されたＨＳＦ１変異遺伝子を保有するヘテロ接合体は、生殖細胞および体細胞のすべてに安定的にＨＳＦ１遺伝子変異を保有しており、交配等により効率よくその変異を子孫動物に伝達することができる。
【００１５】
なお、この発明（１）のＨＳＦ１遺伝子欠損動物には、胎児および出生後の個体が含まれる。特に、ホモ接合体（＋／＋）は一部が流産するが、出産された個体は生体になるまで生育するので、ＨＳＦ１の完全な欠損の影響を調べることができる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例を示して、この発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１７】
ヒトＨＳＦ１のｃＤＮＡ（Ｎａｋａｉ，Ａ．，  Ｔａｎａｂｅ，Ｍ．，  Ｋａｗａｚｏｅ，Ｙ．，  Ｉｎａｚａｗａ，Ｊ．，  Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｒ．  Ｉ．  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｋ．  （１９９７）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，１７，  ４６９−４８１）をプローベとして、１２９ＳＶＪマウスのゲノムライブラリーλＦＩＸＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングし、ＨＳＦ１ゲノム遺伝子を単離した。
【００１８】
ＨＳＦ１欠損マウスの産出法を以下に示す。ターゲッティングベクターはＨＳＦ１遺伝子のエクソン２の途中からエクソン４の途中までをｎｅｏ耐性遺伝子に置き換えるよう構築し、チミジンキナーゼ（ｔｋ）をｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎに使用した。ＥＳ細胞ＴＴ２にエレクトロポレーションし、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｅを用いて薬剤選択を行った。薬剤耐性コロニーを、短い方の相同遺伝子領域をはさむＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲスクリーニングをおこない、さらにエキソン７から９にまたがるゲノムＤＮＡとｎｅｏ耐性遺伝子のｃＤＮＡプローブを用いてサザン解析を行い、相同組換えを起こしたクローンを決定した。相同組換えを起こしたＥＳ細胞はマウスＩＣＲの胚盤胞に注入し、偽妊娠マウスの子宮に移植を行いキメラマウスを作成した。キメラマウスはＩＣＲマウスと交配し、ヘテロマウスを得、さらにヘテロ同士の交配によりＨＳＦ１欠損マウスを得た。遺伝子型の決定は、ｍＨＳＦ１ｇ７とｍＨＳＦ１ｇ８のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った（図１）。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡ反応液を９８℃、２０秒で変性、６８℃、２０分でプライマーの結合とＤＮＡの合成を行い、この反応を１４回繰り返した。さらに、この反応を１６回繰り返したが、後者の反応は毎回１５秒ずつ延長した。ＰＣＲ産物は、１％  ａｇａｒｏｓｅゲルで電気泳動した。
【００１９】
ノーザンブロット解析は、各組織からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、一部をアガロースゲルへ電気泳動してＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  （ＮＥＮ社）にトランスファーした。
それを用いて各種熱ショック遺伝子のｃＤＮＡをプローベとしてハイブリダイゼーションを行った。
【００２０】
組織学的解析と免疫染色について以下に示す。マウスを４％パラフォルムアルデヒドにて乾溜固定した後に、３時間から一晩、同じ液に４℃で浸した。その後エタノールに置換し、パラフィンに包埋した。５ミクロンのパラフィン切片を作成して、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。免疫染色を行うためには、パラフィン切片を脱パラフィンし、水洗した後に４％過酸化水素水で１時間処理した。
１０％  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍにてブロッキングを行った後、１％  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍに  １００倍希釈したウサギ抗Ｈｓｐ９０血清、あるいはウサギ抗アデニル酸キナーゼ血清で１時間処理した。次に、２次抗体としてパーオキサイドを結合させたｇｏａｔ抗ウサギＩｇＧ抗体で処理した。発色は、ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ  （Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）  を用いて行った。
【００２１】
ＨＳＦ１＋／−  ＥＳ細胞をマウスの胚盤胞へ注入してキメラマウスを作成し、雄のキメラマウスを雌のＩＣＲと交配し、ＨＳＦ１のヘテロマウスを得た。ヘテロ同士を交配し、その交配より得た６週令のマウスの遺伝型をＰＣＲで調べた。その結果、＋／＋：  ＋／−：  −／−の割合が１．０：２．１：０．６となり、−／−マウスの比率が低いことがわかった（図１）。胎生期Ｅ１５．５から１７．５について調べたところその比が１．０：１．３：１．０となり、この時期では−／−マウスは生存していることが推測された。また出生後は、すべてのゲノタイプで大人となる６週間まではマウスは生存していた。体重の増加を比較すると、出生後から６週間まで、どの時期をとっても−／−マウスで体重が低いことがわかった。以上の２つの表現型についてはすでに報告がなされている（Ｘｉａｏ，  Ｘ．，  Ｚｕｏ，  Ｘ．，  Ｄａｖｉｓ，  Ａ．Ａ．，  ＭｃＭｉｌｌａｎ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｃｕｒｒｙ，  Ｂ．  Ｂ．，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  Ｉ．  Ｊ．  （１９９９）  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８，５９４３−５９５２）。
【００２２】
次に６週令のマウスにおいて、各組織の熱ショック遺伝子の発現を調べてみた。ノーザンブロット解析を行ってＨＳＦ１−／−マウスでの発現をＨＳＦ１＋／＋マウスと比較したところ、Ｈｓｐ１１０は解析したすべての組織で発現低下を認めた（図２）。また、Ｈｓｐ９０ａの発現低下を腎臓、肝臓と脾臓で認めた。腎臓ではＨｓｐ９０ｂの低下もある。そのほかに、心臓ではｈｓｐ２７の著明な減少を認めた。Ｈｓｐ７０とＨｓｐ４０のｍＲＮＡ発現量は低いために比較が困難であった。そのためウエスタンブロットにより蛋白量を比較してみた。その結果、肺組織でＨｓｐ７０とＨｓｐ４０の著明な減少を認めたが、その他の組織ではＨＳＦ１−／−マウスで変動はなかった。
【００２３】
すべての組織で６週令のマウスの解析を行った。まず、ＨＳＦ１−／−の腎臓に異常を認めた（図３）。腎臓は、大きさを含めて肉眼的には大きな変化はないが、組織学的に、近位および遠位ともに尿細管の上皮細胞の扁平化にともなう内腔の拡張、ボウマンの袋の細胞の扁平化、たこ足細胞（糸球体上皮細胞）の扁平化の異常を認めた。腎臓はＨｓｐ９０の発現の低下が認められる組織であるので、Ｈｓｐ９０の免疫染色を行ってみた。その結果、尿細管、ボウマンの袋、そしてたこ足細胞すべてのＨｓｐ９０の発現の低下を認めた（図３）。発生異常がどの時期に生じるかを調べたところ、糸球体の大きさの異常は生後２０日頃に認められるが、尿細管の異常はそれ以降であることがわかった（図４）。また、糸球体機能異常はさらに後になって見られ、生後１３週でアルブミン尿を認めた（図４）。
【００２４】
脾臓も腎臓と同様に、ＨＳＦ１−／−マウスでＨｓｐ９０ａの発現が低下していた（図２）。その重量を比較すると、胸腺では差がないのに対して、脾臓においてはＨＳＦ１−／−マウスの方が有意に軽いことがわかった（図５）。脾臓の組織抽出液を電気泳動してクマシーブルー染色すると、主要な約５５  ｋＤａのバンドがＨＳＦ１−／−マウスの脾臓で低下していることがわかった。その分子サイズから免疫グロブリンであることが予測されたので、ウエスタンブロットにて確認してみた。その結果、ＩｇＭの量に違いはないが、ＩｇＧの量が著しく異なることがわかった（図５）。以上のことから、脾臓におけるＢ細胞の成熟分化に障害があることが示唆された。さらに、血清学的検査により、血清免疫グロブリンの量もＨＳＦ１−／−マウスで低下していることが確かめられた（表１）。
【００２５】
【表１】
2004154093.tif 000003
【００２６】
脳の大きさに大きな違いはないが、切片にて脳室の拡大を認めた（図６）。側脳室、第３、第４脳室がすべて拡張していた。脳脊髄液を産生する脈絡叢の細胞には異常はないし、またその吸収を司るくも膜下層の肥厚などの基質的な異常は認めなかった。脳室の拡大の兆候は、胎生期Ｅ１５．５の時期でも認められた。脳全体としてはＨｓｐ９０の発現に大きな変化はないが、免疫染色を行ってみると、脳室上衣細胞に特徴的な変化を認めた。野生型マウスでは、上衣細胞にＨｓｐ９０の発現が特異的に高いことが確認された（図７）。一方、ＨＳＦ１−／−マウスの上衣細胞はＨｓｐ９０の発現が著明に減少していることがわかった。Ｈｓｐ９０は線毛に多く局在しており、ダイニンと結合し、線毛の運動に必要であることが示唆されている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，  Ｒ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｌｅｍｉｅｕｘ，  Ｎ．Ａ．  （１９９９）  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，４４，２７４−２８３．）。従って、ＨＳＦ１欠損によるＨｓｐ９０の減少は、線毛運動の異常を示している。
【００２７】
発明者はさらに、鼻腔の異常を見いだした。鼻腔は、粘液の貯留と鼻甲介の発達異常があった（図８）。組織学的に、鼻甲介の壁が薄くなっているが、嗅細胞層の発達はそれほど悪くなく、粘膜下層と軟骨組織が薄くなっていた。ここでもＨｓｐ９０の免疫染色を行ってみた。Ｈｓｐ９０は、嗅線毛と支持細胞の微絨毛からなる粘膜層で非常に高い染色を示した（図９）。ところが、ＨＳＦ１−／−マウスではＨｓｐ９０の著明な低下を認めた。アデニル酸キナーゼＡＫ１に対する抗体で染色すると、嗅細胞、嗅線毛そして軸索では強い染色を示すが、粘膜層直下の支持細胞は染色されなかった。ＡＫ１染色では確かにＨＳＦ１−／−細胞でも粘膜層の染色は見られるのが、Ｈｓｐ９０染色とは対照的である。
【００２８】
これまでに、ＴＣＰ−１やＨｓｐ７０と共にＨｓｐ９０が線毛に局在していること、Ｈｓｐ９０はダイニンに結合することが報告されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｎ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｅｎ，  Ｅ．Ｍ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１０，１６６５−１６７２  ；  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，  Ｒ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｌｅｍｉｅｕｘ，  Ｎ．Ａ．  （１９９９）  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，４４，２７４−２８３）。この結果から、線毛あるいは微絨毛でのＨｓｐ９０の発現の低下から、それらのダイニンを介する運動異常が起こることが示唆される。実際に、脳室拡大と鼻炎は線毛不動症候群の症状として知られている。以上の結果から、生理的にＨＳＦ１がＨｓｐ９０の発現を介して線毛運動を制御していることが、強く示唆された。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によって、熱ショック応答に主要な役割を担うＨＳＦ１を遺伝的に欠損した動物個体が提供される。また、その組織の発達異常はターゲット遺伝子Ｈｓｐ９０を主に介するものであることがうかがえる。本動物は、腎不全の発症、抗体産生異常、あるいは線毛不動症候群の診断やその治療法、治療薬等の開発に有用である。また、神経変性疾患などの蛋白質の構造異常に伴う疾患の治療法、治療薬等の開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】上段は、ＨＳＦ１遺伝子のジーンターゲティングの戦略と実際のＰＣＲのバンドである。下段左は、生後と胎生期でのゲノタイプ（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）の比率を見たものである。また、下段右は、発達に伴う体重の増加を調べたものである。
【図２】上段は、６週令での野生型とＨＳＦ１−／−マウスの各組織での熱ショック遺伝子の発現を調べたものである。太枠で囲ったものが大きく変動したもの。下段は、Ｈｓｐ７０とＨｓｐ４０の蛋白質量の比較をウエスタンブロットで調べたものである。
【図３】６週令マウスの腎臓の組織学的解析の結果であり、ａからｃとｅからｇはＨＥ染色、ｄとｈはＨｓｐ９０抗体による免疫染色を行った。
【図４】各週令での腎臓の組織学的解析結果を示す図である。上段はパラフィン切片をＨＥ染色したもの。下段は、糸球体障害の指標として血清蛋白質のアルブミンを、電気泳動後にクマシーブルー染色にて検出した。
【図５】６週令マウスの脾臓の異常を示す図である。左は、膵臓と胸腺の重量を体重で補正した後、野生型とＨＳＦ１−／−マウスで比較した。中の図は、脾臓の組織抽出液を電気泳動してクマシーブルーで染色した。右の図は、組織抽出液を用いてＩｇＧ、ＩｇＭ、そしてアクチンに対する抗体でウエスタンブロットを行った。
【図６】６週令マウスの脳の縦断面と横断面を示した図である。
【図７】６週令マウスの脳のパラフィン切片をＨｓｐ９０抗体で染色したものであり、中脳水道の脳室上衣細胞が、Ｈｓｐ９０抗体で強く染まることを示している。
【図８】６週令マウスの鼻腔の組織学的解析の結果であり、上段は鼻腔の横断面を示している。下段は、鼻中隔上部（上段で四角で囲った部分）の組織像である。
【図９】６週令マウスの鼻腔の免疫染色の結果であり、鼻腔のパラフィン切片をＨｓｐ９０抗体（上のパネル）とＡＫ１（下のパネル）で染色したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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