(57)【要約】【課題】本発明の目的は腹膜透析における腹膜劣化の防止に有用な薬剤を提供する。【解決手段】ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする腹膜劣化防止剤および該防止剤を投与することにより腹膜劣化を抑制でき、溶質除去不全を防止し、長期にわたる健全な腹膜透析を可能にする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする腹膜劣化防止剤。
【請求項２】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が、スタチン系薬剤であることを特徴とする請求項１に記載の腹膜劣化防止剤。
【請求項３】
前記スタチン系薬剤が、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチンおよびそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一つの薬剤である、請求項２に記載の腹膜劣化防止剤。
【請求項４】
前記スタチン系薬剤がシンバスタチンである請求項３に記載の腹膜劣化防止剤。
【請求項５】
前記腹膜劣化防止が、腹膜機能低下防止、腹膜透過性亢進抑制および／または腹膜限外濾過能低下防止である請求項１〜４のいずれかに記載の腹膜劣化防止剤。
【請求項６】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含有することを特徴とする腹膜透析液。
【請求項７】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含有することを特徴とする透析効率増強剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は腹膜透析における腹膜劣化防止剤に関する。また、本発明は腹膜透析に於ける腹膜機能低下の防止、腹膜透過性亢進の抑制もしくは限外濾過能低下防止に関する。さらに、本発明は、腹膜劣化防止剤を含む腹膜透析液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人工透析は、腎機能が低下もしくは喪失した患者に対し、本来腎臓が果たしている血液浄化作用を腎臓に代わって行う血液浄化療法であり、生体内から水を除去することによって体液の組成を一定に保つとともに、体液中の尿素等の老廃物といった溶質を除去することを主な目的としている。現在の人工透析には、主に血液透析療法と腹膜透析療法がある。
【０００３】
腹膜透析療法は、腹膜で囲まれた腹腔内に浸透圧の高い透析溶液を貯留することによって、生体内の余分な水と老廃物といった溶質を取り除くことを基本とする。即ち体液から腹腔内に貯留された透析溶液に水と溶質が移動することによって透析される。この時の水や溶質の移動は、微小血管を介して透析溶液と体液の間に生じた浸透圧格差によって起こる。透析溶液中の浸透圧調節物質はグルコースであり、腹膜透析のドライビングフォースの基である。即ち、腹膜機能を維持するためには、微小血管が正常に機能し、腹膜におけるグルコース等の生体への透過を防止することが重要である。
【０００４】
しかし透析溶液は高浸透圧で、細胞毒性の高いグルコース分解産物（以下ＧＤＰ  と略す）を含み、且つｐＨが低いため、透析溶液を反復して腹腔内に貯留することにより、腹膜が非生理的な状態にさらされ、腹膜は傷害を受けやすい。この場合、血管新生とともに腹膜筋線維芽細胞／線維芽細胞が異常増殖・  遊走して腹膜組織が破壊されることが多い。血管新生時には血管構成組織の再構築が起きるため、正常な血管組織とは異なり、血管の透過性が亢進する。  さらに血管内皮細胞が傷害を受けて、限外濾過能を有する腹膜微小血管が破綻する。この結果、透析液中の浸透圧調節物質であるグルコースの生体内への吸収が促進され、浸透圧が維持できなくなり、透析効率が低下する。即ち腹膜機能の低下がおき、限外濾過不全や溶質除去不全に陥る。
【０００５】
腹膜機能の低下が軽度の場合には、グルコース濃度が高い高浸透圧の腹膜透析液を使用することにより、腹膜透析を続行することが可能である。しかしこのような透析液にはＧＤＰ  も高濃度で含まれており、且つ高浸透圧のために腹膜への負担は増える為、一層の腹膜機能の低下を加速することが懸念される。著しく腹膜機能が低下し、溶質除去不全に陥った場合は、現在それに対する有効な治療剤や防止剤は存在しない為、腹膜透析療法の継続を断念しなくてはならない。
【０００６】
３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ）（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素は肝臓でコレステロールが合成される時の律速酵素であり、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する。コレステロールの合成を阻害する、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤としてシンバスタチン等のスタチン系薬剤が知られている。スタチンはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を拮抗的に阻害し、血中のＬＤＬ−コレステロールを低下させる作用を有する。  従来スタチンはこの脂質代謝抑制作用により、冠動脈性心疾患や脳血管疾患等の心血管イベント抑制剤として使用されてきた。しかし食事制限等で血中コレステロールを下げるよりも、スタチンの方が強い動脈硬化抑制効果が認められたり、スタチン投与による総コレステロールの低下率と炎症マーカーであるＣＲＰ  （Ｃ反応性蛋白質）の低下に相関がみられないことがわかってきた。このことは、スタチンが脂質代謝以外の作用、いわゆるｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  （多面）作用で心血管イベントを防止していることを示唆している。
【０００７】
スタチンのｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  作用として、例えば、平滑筋細胞増殖抑制効果（Ｎｅｇｕｒｅ−Ａｍｉｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ａｃｔａ．  １３４５：  ２５９−２６８，  １９９７  ）、単球の血管内皮細胞への接着抑制作用（Ｍｅｒｏｎｉ  ＰＬ，  Ｒａｓｃｈｉ  Ｅ，  Ｔｅｓｔｏｎｉ  Ｃ，  Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ，  Ｂａｌｅｓｔｒｉｅｒｉ  Ｇ，  Ｍｏｌｔｅｎｉ  Ｒ，  Ｋｈａｍａｓｈｔａ  ＭＡ，  Ｔｒｅｍｏｌｉ  Ｅ，  Ｃａｍｅｒａ  Ｍ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４４（１２）：２８７０−８，  ２００１）  、マトリックスメタロプロテイナーゼの産生抑制（Ａｉｋａｗａ  Ｍ，  Ｒａｂｋｉｎ  Ｅ，  Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｓ，  Ｖｏｇｌｉｃ  ＳＪ，  Ｆｕｋｕｍｏｔｏ  Ｙ，  Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｙ，  Ｓｈｉｏｍｉ  Ｍ，  Ｓｃｈｏｅｎ  ＦＪ，  Ｌｉｂｂｙ  Ｐ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３（２）：２７６−２８３，  ２００１  ）、酸化ストレスの低減（Ｇｉｒｏｕｘ  ＬＭ，  Ｄａｖｉｇｎｏｎ  Ｊ，  Ｎａｒｕｓｚｅｗｉｃｚ  Ｍ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １１６５（３）：３３５−８，  １９９３  ）、抗炎症作用（Ｋｉｅｎｅｒ  ＰＡ，  Ｄａｖｉｓ  ＰＭ，  Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ，  Ｙｏｕｓｓｅｆ  Ｓ，  Ｒａｎｋｉｎ  ＢＭ，  Ｋｏｗａｌａ  Ｍ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １（１）：１０５−１８，  ２００１  ）等の効果が、報告されている。
【０００８】
またスタチンは、内皮細胞の機能を改善すると同時に、一酸化窒素（ＮＯ）の産性を促進すること（Ｌａｕｆｓ  Ｕ，  Ｌａ  Ｆａｔａ  Ｖ，  Ｐｌｕｔｚｋｙ  Ｊ，  Ｌｉａｏ  ＪＫ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７（１２）：１１２９−３５，  １９９８）も報告されている。ＮＯ産生は、内皮細胞の最も重要な機能であるだけでなく、逆にＮＯは障害をうけた内皮細胞の機能を改善したり、内皮細胞が脱落した血管壁の内皮化を促進する。また、ＮＯは平滑筋細胞の増殖・  遊走も阻害するため、血管壁の肥厚を防止する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、腹膜透析において腹膜機能の低下の防止に有用な薬剤を提供することを目的とする。腹膜機能の低下を抑制し、溶質除去不全を防止する薬剤を発明することが、長期にわたる健全な腹膜透析を可能にすると期待されていたが、このような機能をもつ薬剤は知られていない。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の腹膜透析への適応を試みた結果、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は腹膜機能の低下を抑制する効果を有することを知見した。従って本発明は、腹膜劣化を予防して腹膜透過性の亢進を抑制し、溶質除去不全を防止することにより、長期の健全な腹膜透析の施行を可能にすることを目的とする腹膜機能低下防止剤を提供しようとするものである。
本発明は下記（１）〜（１０）により達成される。
（１）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする腹膜劣化防止剤。
（２）前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤がスタチン系薬剤であることを特徴とする上記（１）の腹膜劣化防止剤。
（３）前記スタチン系薬剤が、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン、ロバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチンおよびプラバスタチンおよびそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一つの薬剤である上記（２）の腹膜劣化防止剤。
【００１１】
（４）前記スタチン系薬剤がシンバスタチンである上記（３）の腹膜劣化防止剤。
（５）前記腹膜劣化防止が、腹膜機能低下防止、腹膜透過性亢進抑制および／または腹膜限外濾過能低下防止である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の腹膜劣化防止剤。
（６）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含有することを特徴とする腹膜透析液。
（７）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含有することを特徴とする透析効率増強剤。
（８）腹膜劣化防止剤を製造するためのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の使用。
（９）予防および／または治療有効量の有効量の上記（１）を宿主に投与することからなる、腹膜劣化の予防および／または治療方法。
（１０）有効量の上記（１）を宿主に投与することからなる、腹膜機能低下、腹膜透過性亢進の抑制および／または腹膜限外濾過能低下の予防および／または防止方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分として含有する腹膜劣化防止剤を提供する。「腹膜劣化」とは、腹膜の機能が低下することにより腹膜機能の低下、腹膜透過性の亢進または限外濾過量の低下などが生じた状態を意味する。したがって、「腹膜劣化の防止」とは腹膜機能の低下、腹膜透過性の亢進、腹膜限外濾過量の低下などの少なくとも一つの進行が一時的にまたは継続的に遅くなったり、停止したりあるいは改善したりすることをいう。
【００１３】
「腹膜機能」とは、腹膜における溶質の透過性や限外濾過機能をいう。「腹膜における透過性（腹膜透過性）」とは、腹膜を介して溶質が透過することを意味する。したがって、「腹膜透過性の亢進抑制」とは、腹膜を介した溶質の透過速度を一時的または継続的に遅くすることでもよいし、透過速度をゼロにすることでもよい。さらに、腹膜透過性を低下させることにより、腹膜透析における透析効率を改善することも含む。
「腹膜限外濾過量」とは、腹膜を通過する水分量とリンパ管から再吸収される水分量の差であり、一定時間腹腔内に透析液を貯留した後の排液量を調べることにより、判定することができる。  したがって、「腹膜限外濾過量の低下防止」とは、腹膜を介した限外濾過量の低下を一時的または継続的に遅くすることでもよいし、限外濾過量の低下をゼロにすることでもよい。さらに、腹膜限外濾過能を改善することも含む。
【００１４】
本発明の腹膜劣化防止剤は、本発明において「防止剤」と略して表現される。さらに、本発明の「防止剤」は、上記の作用を有することから腹膜の劣化や損傷の予防および／または治療に使用することができる。ここで予防とは、腹膜透析を行う際に腹膜機能の低下が認められない状態で本発明の防止剤を使用し、そのことにより腹膜機能の低下が防止される状態を包含する。
本発明で使用される「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」とは、酢酸からコレステロールが合成される過程のメバロン酸代謝経路において、ＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸に変換される時の反応触媒酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の拮抗阻害剤である。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤としては、特に限定されないが、スタチン系薬剤が挙げられる。
【００１５】
本発明で使用されるスタチン系薬剤としては、腹膜透析において腹膜機能低下防止効果および／または腹膜透過性亢進抑制効果を有する限り特に限定されないが、シンバスタチン（和光純薬）、セリバスタチン（武田薬品、バイエル）、ピタバスタチン（三共）、ロバスタチン（和光純薬）、アトルバスタチン（ファイザー）、フルバスタチン（和光純薬）、プラバスタチン（和光純薬）およびそれらのナトリウム塩  （プラバスタチンＮａ）  、カルシウム塩（アルトバスタチンＣａ）等の塩が挙げられ、特にシンバスタチンが好ましい。さらに他のスタチン系薬剤も上記の効果を有する限り、スタチン系薬剤の化合物の構造に限定はない。すなわち、上記の効果を有するスタチン系薬剤であるならば、その構造の一部の官能基を修飾して、他の官能基に置換しておよび／または官能基を付して同様の効果を示す誘導体も包含する。かかる理由から、本明細書におけるスタチン系薬剤とは、その全部もしくはその一部、或いはその改変体、誘導体、変異体、アナログ等をすべて含みＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害活性を有する化合物である。
【００１６】
本発明において、有効成分であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤やスタチン系薬剤は一種または二種以上の複数の化合物を組合せて使用してもよい。
本発明で使用されるスタチン系化合物は医薬品として問題が無い純度が得られれば、合成および／または調製方法は特に限定するものではない。スタチン系薬剤は、その多くが微生物の発酵によって合成されるが、一部は微生物によって合成された天然物質から誘導する半化学合成、もしくは完全な化学合成により製造される。各々のスタチンの製造方法は以下の公知の方法に従い、容易に製造することができる。シンバスタチン：特開昭５６−１２２３７５号（ＵＳＰ４４４４７８４）、セリバスタチン：特開平４−３０８５７３号（ＥＰ４９１２２６）、ピタバスタチン：特開平１−２７９８６６号（ＵＳＰ５８５４２５９及びＵＳＰ５８５６３３６）、ロバスタチン：特開昭５７−１６３３７４号（ＵＳＰ４２３１９３８）、アトルバスタチン：特開平３−５８９６７号（ＵＳＰ５２７３９９５）、フルバスタチン：特表昭６０−５０００１５号（ＵＳＰ４７３９０７３）、プラバスタチン：特開昭５７−２２４０号（ＵＳＰ４３４６２２７）。それらの腹膜機能低下防止効果、腹膜透過性亢進抑制効果および／または腹膜限外濾過能低下効果などの腹膜劣化防止効果は、実施例に記載の動物モデルを用いることにより確認できる。その後、通常用いられる方法により単離、精製することで本発明に供することができる。
【００１７】
本発明の「防止剤」の調製方法としては、特に限定されないが、適当な溶液に溶解後、フィルター等で濾過滅菌してそのまま無菌の容器に封入して「防止剤」として用いることができる。本発明の「防止剤」は、投与経路次第で医薬的に許容される添加物を共に含むものであってもよい。添加剤としては特に限定されないが、担体、賦形剤、防腐剤、安定剤、結合剤、酸化防止剤、膨化剤、等張剤、溶解補助剤、保存剤、緩衝剤、希釈剤等が挙げられる。使用し得る添加剤は、特に限定されないが、例えば、水、生理食塩水、医薬的に許容される有機溶媒、ゼラチン、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ＰＢＳ、非イオン性界面活性剤、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される界面活性剤あるいは生体内で許容し得る生理的ｐＨの緩衝液などが挙げられる。使用される担体は、使用部位に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の「防止剤」の保存方法としては、特に限定されないが、適当な容器に封入した後、凍結乾燥してもよい。凍結乾燥にすることにより、長期保存が可能になる。また乾燥させた後、成形して錠剤にしてもよい。
【００１８】
本発明において、「防止」とは、腹膜透析を行う際に腹膜機能の低下が認められる状態で本発明の防止剤を使用し、そのことにより腹膜機能のさらなる低下が防止される状態を包含する。また、「防止剤」はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を有効成分として含有する。「防止剤」は腹膜劣化の防止のために使用される。したがって、本発明の「防止剤」は、腹膜劣化の低下の予防および／または防止ならびに治療を目的として、また、腹膜機能低下、腹膜透過性亢進の抑制および／または腹膜限外濾過能低下の予防および／または防止を目的として、その有効量を宿主（患者）に投与することができる。投与対象の宿主としては、特に限定されないが、哺乳動物、好ましくはヒト、サル、ネズミ、家畜等が挙げられる。本発明の「防止剤」は、腹膜患部で効率良く本発明の効果が発現する限り投与経路に制限はなく、経口的にまたは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。投与経路として、腹腔内投与、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。これらのうち、腹腔内投与、静脈内投与および経口投与が好ましい。
【００１９】
直接腹腔に投与する方法として、腹膜透析液に混ぜて腹膜透析時に腹腔内に投与したり、または腹膜透析用カテーテルを介して腹膜透析液に混ぜずに直接投与することができる。静脈注射により投与すれば、透析用カテーテルを介さずに投与することもできる。また経口投与を行えば、特別な器具がなくても摂取可能である。これらの方法をもちいれば、患者に対して低侵襲に且つ効率良く「防止剤」を患部にデリバリーすることが可能である。「防止剤」は、腹腔内に投与すれば、患部である腹膜に直接投与することになり、経口や静脈注射のように有効成分が投与後に患部に到達するまでのロスが無い。この為、本発明の有効成分の濃度は、腹膜で有効な最小限の至適濃度で調剤することができる。すなわち必要最小限の濃度で患部に直接投与できるので、副作用が少ないといった特色を持つ。
【００２０】
「防止剤」の有効投与量は、特に限定されないが、患者あたり１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。有効成分がスタチン系薬剤の場合、特に限定されないが、１Ｅ−４Ｍ  〜１Ｅ−１０Ｍが好ましく、１Ｅ−５Ｍ  〜１Ｅ−７Ｍ  がさらに好ましい。なお、「Ｅ」とは、指数表示であり、「１０」をマイナスに乗じた数を意味する。例えば、「１Ｅ−４」は「１０−４」を、「１Ｅ−１０  」は「１０−１０  」を意味する。なお、「Ｍ  」は「ｍｏｌ／Ｌ  」を意味する。したがって、スタチン系薬剤の濃度は細胞毒性が認められる１Ｅ−４Ｍ  より低濃度で、ｅＮＯＳ遺伝子発現亢進が認められる１Ｅ−１０Ｍ以上が好ましい。さらには細胞毒性が認められない１Ｅ−５Ｍ  以下で、ｅＮＯＳ遺伝子発現亢進が認められ且つＶＥＧＦ、ＦＬＴ１、ｃ−Ｍｅｔ  遺伝子の発現が抑制される１Ｅ−７Ｍ  以上がさらに好ましい。
【００２１】
本発明の「防止剤」は、対象患者の症状を治癒するかまたは少なくとも部分的に治癒するために使用される。本発明の「防止剤」は、症状が生じてから治療目的に使用することができ、また発症が予測される時に発症時の症状緩和のために予防目的に使用することができる。
【００２２】
本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含有することを特徴とする腹膜透析液を提供する。腹膜透析液は腹腔内に貯留される浸透圧の高い溶液であり、生体内の余分な水と老廃物等の溶質を取り除くことを目的とする。本発明の腹膜透析液において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は腹膜透析液の目的を妨げないことを前提として、腹膜透析液に含有される。腹膜透析液中に含まれる有効成分の量は、特に限定されないが、１Ｅ−４Ｍ  〜１Ｅ−１０Ｍが好ましく、１Ｅ−５Ｍ  〜１Ｅ−７Ｍ  がさらに好ましい。腹膜透析液の組成は、特に限定されず、通常知られているものが使用できる。例えば、１３５ｍＥｑ／Ｌ  Ｎａ  、２．５ｍＥｑ／Ｌ（もしくは４ｍＥｑ／Ｌ）Ｃａ、０．５ｍＥｑ／Ｌ  Ｍｇ  、９８ｍＥｑ／Ｌ  Ｃｌ、４０ｍＥｑ／Ｌ  乳酸、２．５ｇ／ｄｌ  （もしくは１．３５ｇ／ｄｌまたは４ｇ／ｄｌ  ）Ｇｌｕｃｏｓｅ  の透析溶液（ｐＨ６．３  〜７．３  ）を使用することができる。製造は、Ｇｌｕｃｏｓｅ  と乳酸ナトリウムを混合した溶液（ｐＨ５．０  ）と、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２  、乳酸ナトリウムを混合した液（ｐＨはＮａＣｌでｐＨ９．０  に調整）  をそれぞれ高圧蒸気加熱滅菌した後、使用直前に４：１の割合で混合して使用するが、本発明の腹膜透析液では、混合方法は限定されないが、例えばＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を、１Ｅ−４Ｍ  〜１Ｅ−１０Ｍの濃度で使用直前の両液の混合時に混合してもよいし、一方の溶液に予め混合しておいてもよい。
【００２３】
本発明は、また、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含有することを特徴とする透析効率の作用増強剤を提供する。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は透析時に透析液に含有されることにより、腹膜の劣化や損傷の予防および／または治療、あるいは腹膜機能低下、腹膜透過性亢進の抑制および／または腹膜限外濾過能低下の予防および／または防止の効果を発揮し、それによって透析効率の作用を増強する。本発明の作用増強剤は、本明細書に開示された量のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を、患者に適宜直接投与したり、腹膜透析液に含有させることにより使用される。
【００２４】
【実施例】
以下に本発明の具体例である実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１  ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤血管内皮細胞毒性試験
血管内皮細胞に対する毒性は、培養上清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ  ）濃度を測定することにより検討した。すなわち、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が血管内皮細胞に毒性を示す場合、細胞の生存に必須なＬＤＨ  が細胞内から培養外に放出され、培養上清中のＬＤＨ  濃度が上昇する。
ヒト血管内皮細胞を、９６ｗｅｌｌプレート（ファルコン、ＵＳＡ  ）に７０％コンフルエントになるように蒔き（９０００  ｃｅｌｌｓ／  ｗｅｌｌ  、ｎ＝３）、ＣＯ２  インキュベーター（ＥＳＰＥＣ  ＢＮＡ−１２１Ｄ：ＴＡＢＡＩ  社）中で３７℃、５％  ＣＯ２存在条件下で５％牛胎児血清／ＥＧＭ−２ＭＶ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ，  ＵＳＡ）中で２４時間培養した。  培養終了後１％牛胎児血清／ＥＧＭ−２ＭＶ  Ｍｅｄｉｕｍ  で細胞を洗浄した後、１Ｅ−４〜１Ｅ−１１Ｍのシンバスタチン（和光純薬製）を含む１％牛胎児血清／ＥＧＭ−２ＭＶ  Ｍｅｄｉｕｍ  培地（１００  μｌ  ）を細胞に添加し、２４時間培養した。培養終了後、培養上清を採取し、遠心分離により細胞を除去して上清を回収した。８０μｌの上清に等量のＬＤＨ  試験液（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＬＤＨ）、ロッシュ社）を加え、約３０分間発色反応を行った後、１Ｎ塩酸で発色反応を停止させ、４９２／６２０  ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、１Ｅ−４Ｍ  以上の濃度のシンバスタチンで血管内皮細胞に対して毒性があることが明らかとなった。スタチンによる血管内皮細胞に対する細胞毒性の評価結果を図１に示す。この結果から、該当薬剤の濃度が１Ｅ−４Ｍ  未満になるようにコントロールすることが望ましい。
【００２６】
実施例２    ＲＴ−ＰＣＲ  法による血管内皮細胞の遺伝子発現解析
シンバスタチンのＮＯ産生誘導作用を調べるため、ＮＯ合成酵素であるｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＮＯ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  （ｅＮＯＳ）遺伝子発現に対する影響を検討した。  また、シンバスタチンの血管透過性亢進作用および血管新生作用を調べる為、血管新生因子であるｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）とそのレセプターであるｆｌｋ−１  、ｆｌｔ−１  、およびｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ  ）のレセプターであるｃ−ｍｅｔ  の遺伝子発現に対する影響を検討した。
【００２７】
ヒト血管内皮細胞を、１２ｗｅｌｌプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  ＮＪ，  ＵＳＡ  ）に８０％コンフルエントになるように蒔き、ＣＯ２  インキュベーター中で３７℃、５％  ＣＯ２存在条件下で２４時間培養した。  シンバスタチン（１Ｅ−４〜１Ｅ−１３Ｍ）を含む培地に交換してさらに２４時間培養した後、内皮細胞の遺伝子発現を解析した。
培養上清を取捨した後、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  を調製した。分離したＲＮＡ  の濃度はＧｅｎｅＱｕａｎｔ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｃａｌｉｃｕｌａｔｏｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  ＵＫ）により測定した。  ＲＮＡ（５μｇ）は  ２００  ｕｎｉｔｓの  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ    （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）により逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡはＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）により、サーマルサイクラー  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＵＳＡ）でＰｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲ  の条件は以下の通りである。予備熱変性：９４℃、５分、熱変性：９４℃、１分、アニーリング：６０℃、１分、伸長反応：７２℃、１分。ＰＣＲ  プライマー配列及びＰＣＲ  の好適サイクル数を以下に示した。
【００２８】
ｅＮＯＳ  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１  ）  （配列番号１）
ｅＮＯＳ  ａｎｔｉｓｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒ；  ３２ｃｙｃｌｅｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２  ）  （配列番号２）
ＶＥＧＦ  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３  ）  （配列番号３）
ＶＥＧＦ  ａｎｔｉｓｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒ；  ３５ｃｙｃｌｅｓ，  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４  ）  （配列番号４）
ＦＬＫ−１  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５  ）  （配列番号５）
ＦＬＫ−１  ａｎｔｉｓｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒ；  ２５ｃｙｃｌｅｓ，（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６  ）  （配列番号６）
ＦＬＴ−１  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７  ）  （配列番号７）
ＦＬＴ−１  ａｎｔｉｓｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒ；  ３１ｃｙｃｌｅｓ，    （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８  ）  （配列番号８）
Ｃ−Ｍｅｔ  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９  ）  （配列番号９）
Ｃ−Ｍｅｔ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；  ２８ｃｙｃｌｅｓ，（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）  （配列番号１０）
Ｇ３ＰＤＨ  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）  （配列番号１１）
Ｇ３ＰＤＨ  ａｎｔｉｓｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒ；  ２２  ｃｙｃｌｅｓ．  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）  （配列番号１２）
【００２９】
内部標準マーカーはｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  （Ｇ３ＰＤＨ）を使用した。ＰＣＲ  産物は  ＴＡＥ緩衝液（０．０４Ｍ  Ｔｒｉｓ，  ０．０４Ｍ  ｇｌａｃｉａｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，  ０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）を用いて１．５％アガロースゲル中でサブマリン電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルをエチジウムブロマイド溶液に浸して約１０分間振盪し、ゲル中のＰＣＲ  産物を染色して解析した。
この結果を表１に示す。  ＮＯ合成酵素であるｅＮＯＳは、シンバスタチンの濃度が１Ｅ−１０Ｍ以上で遺伝子発現が亢進し、ＶＥＧＦおよびｆｌｔ−１  、ｃ−ｍｅｔ  の遺伝子発現は１Ｅ−７Ｍ  以上の濃度で抑制された。  ｆｌｋ−１  に関しては、シンバスタチンの効果は認められなかった。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
内皮細胞の最も重要な機能の一つとしてＮＯ産生がある。  ＮＯは内皮細胞の機能改善や血管拡張機能、血小板凝集阻害、血栓形成抑制、単球をはじめとする炎症細胞の血管壁内への浸潤抑制機能を有する。特に血管拡張機能は血流量の増加をもたらし、透析効率のアップに繋がる。従ってＮＯ産生の亢進によって腹膜機能低下の防止が期待される。  今回、ＮＯ合成酵素であるｅＮＯＳが、１Ｅ−１０Ｍ以上のシンバスタチンで遺伝子発現が亢進したことから、この濃度領域で腹膜機能低下防止効果が期待された。
【００３２】
血管新生時には血管組織の再構築が起きるため、血管での透過性が亢進し、浸透圧調節物質であるグルコースの生体への吸収が促進され、腹膜機能の低下が生じると考えられる。  血管新生因子としてＶａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＶＥＧＦ）  とＨｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＨＧＦ）が知られている。このうちＨＧＦ  は内皮細胞から産生されないので、ＶＥＧＦとそのレセプターであるｆｌｔ−１  、ｆｌｋ−１  、およびＨＧＦ  のレセプターであるｃ−ｍｅｔ  の発現に対するシンバスタチンの効果を解析した。  この結果、シンバスタチンはｆｌｋ−１  の発現に対する作用は認められなかったが、ＶＥＧＦ、ｆｌｔ−１  、ｃ−ｍｅｔ  の発現を抑制した。  ＶＥＧＦは転写因子であるＮＦ−κＢ  の活性化により産生が誘導される。ＮＯはＮＦ−κＢ  の活性を抑制するという報告も有り、シンバスタチンによるＶＥＧＦの発現抑制はＮＯによるＮＦ−κＢ  抑制を介して行われていると考えられる。ＶＥＧＦは血管新生を促進するだけでなく、エンドセリンの発現を促進する。  エンドセリンは内皮障害や平滑筋細胞の増殖を促し、血管の狭窄を引き起こし、腹膜機能の低下を誘導すると考えられる。また、ＶＥＧＦは血管の透過性を亢進する作用も有している。  これらの点を考慮すると、シンバスタチンが、１Ｅ−７Ｍ  以上の濃度でＶＥＧＦおよびｆｌｔ−１  、ｃ−ｍｅｔ  の遺伝子発現を抑制したことから、シンバスタチンが１Ｅ−７Ｍ  以上の濃度で、血管新生抑制やエンドセリン発現抑制、血管透過性の抑制を介して腹膜機能低下防止効果を発揮すると期待された。
【００３３】
実施例３  腹膜機能低下動物モデルの作成
動物はラット（ＳＤ、５週齡、ｎ＝４  、オス）  を用いた。本実験中、ラットには餌および水を十分量供給し、衛生環境にも十分留意し、細菌感染による腹膜炎が起きないように注意した。コントロール群にはｐＨ５．０  に調整した２．５  ％グルコース含有透析溶液ミッドペリックＬ２５０（テルモ社）を１  回／  日、１００ｍｌ／ｋｇずつ１５日間投与した。ＭＧＯ  群（メチルグリオキサール投与群）には、ｐＨ５．０  に調整したミッドペリックＬ２５０（テルモ社）に６．６ｍＭ  メチルグリオキサールを添加したものを１  回／日、１００ｍｌ／ｋｇずつ１５日間投与した。スタチン投与群にはｐＨ５．０  に調整したミッドペリックＬ２５０（テルモ社）に６．６ｍＭ  メチルグリオキサールおよびシンバスタチンを添加したものを１回／日、１００ｍｌ／ｋｇずつ１５日間投与した。上記検体の投与はエーテル痲酔させた状態で行い、なるべくラットに苦痛を与えない様に配慮した。
【００３４】
実施例４  腹膜機能低下動物モデルにおける限外濾過能試験
腹膜機能低下動物モデルの限外濾過能を解析する為、ラットに対して実験開始後１６日目に限外濾過能試験を行った。即ち、ラットに対し体重あたり５０ｍｌ／ｋｇ  の２．５  ％グルコース含有透析溶液（ミッドペリックＬ２５０、テルモ社）を腹腔内に注液し、９０分後に排液量を測定した。  排液量はラットの体重で除して体重あたりの排液量を算出した。  この結果を図２に示した。  体重あたりの排液量は、コントロール群に比べＭＧＯ  群で体重あたりの排液量が減少し、スタチン投与によって排液量の減少が防止されることがわかった。以上の結果から、スタチンは限外濾過能の低下を防止することが明らかになった。
【００３５】
実施例５  腹膜機能低下動物モデルにおける腹膜透過性試験
腹膜機能低下動物モデルに対して、腹膜透過性を解析する為、実験開始後１６日目に腹膜透過性試験を行った。腹膜における透過性試験は腹膜におけるグルコース透過性、即ちＤ／Ｄ０グルコース値にて評価した。
Ｄ／Ｄ０グルコース値は以下のようにして求めた。ラットに対し体重あたり５０ｍｌ／ｋｇ  の２．５  ％グルコース含有透析溶液（ミッドペリックＬ２５０、テルモ社）を腹腔内に注液し、９０分後に腹腔内残液を採取した。各透析排液のグルコース濃度（Ｄ）  を求め、投与時の透析溶液中のグルコース濃度（Ｄ０）  で除することによりＤ／Ｄ０グルコース値を算出した。この結果、ＭＧＯ  群はコントロール群に比べて著しくＤ／Ｄ０値が低下し、浸透圧調整物質であるグルコースの生体側への透過性が亢進されたが、スタチン投与により腹膜機能が改善されることが明らかになった。スタチン濃度は１Ｅ−５Ｍ  より１Ｅ−７Ｍ  の方が透過性亢進防止作用が高かった。  この結果を図３に示した。以上の結果より、スタチンは腹膜における透過性の亢進を防止することが明らかになった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の製剤は、腹膜透析における腹膜劣化の防止効果を有する。さらに詳しくは腹膜の機能低下の防止、腹膜における透過性亢進の抑制および腹膜限外濾過能低下の防止効果を有する。本発明により、腹膜劣化の低下を抑制、防止して溶質除去不全を防止し、長期にわたる健全な腹膜透析の施行が可能となる。
【００３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の腹膜機能低下防止剤の血管内皮細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。
【図２】本発明の腹膜機能低下防止剤の腹膜機能低下動物モデルにおける限外濾過能低下防止効果を示すグラフである。
【図３】本発明の腹膜機能低下防止剤の腹膜機能低下動物モデルにおける腹膜透過性亢進抑制効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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