(57)【要約】【課題】　絶対シグナルが標的核酸の塩基組成および配列により影響を受けない、FRETハイブリダイゼーションプローブの改善された設計を提供すること。【解決手段】　標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、FRETドナー実体またはFRETアクセプター実体のいずれかである蛍光実体、および該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体を各々が含有してなる、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対であって、該FRETハイブリダイゼーションプローブ対の２つのメンバーのスペーサー実体が互いに非共有結合相互作用を形成しうる、FRETハイブリダイゼーションプローブ対。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、
FRETドナー実体またはFRETアクセプター実体のいずれかである蛍光実体、および
該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体
を各々が含有してなる、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対であって、該FRETハイブリダイゼーションプローブ対の２つのメンバーのスペーサー実体が互いに非共有結合相互作用を形成しうる、FRETハイブリダイゼーションプローブ対。
【請求項２】
　非共有結合相互作用がヌクレオチド塩基対合相互作用であり、好ましくはA/T塩基対合相互作用である請求項１記載のFRETハイブリダイゼーションプローブ対。
【請求項３】
　標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、
FRETドナー実体またはFRETアクセプター実体のいずれかである蛍光実体および
該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体
を各々が含有してなる、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対であって、スペーサー実体の存在により、該FRETドナー実体からの蛍光発光の強度および該FRETアクセプター実体からの蛍光発光の強度が、該標的核酸の配列に存在するか、または該ハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列実体に存在するかのいずれかであるヌクレオチド残基のクエンチング活性に実質的に影響をうけない、FRETハイブリダイゼーションプローブ対。
【請求項４】
　標的配列にハイブリダイズした場合、前記FRETアクセプター実体からの蛍光発光の強度が、同一の標的DNAにハイブリダイズした比較可能なFRETハイブリダイゼーションプローブ対のFRETアクセプター実体の蛍光発光の強度と比較して検出可能に増大する請求項３記載のFRETハイブリダイゼーションプローブ対であって、該比較可能なFRETハイブリダイゼーションプローブ対は、該比較可能なハイブリダイゼーションプローブが前記ヌクレオチド配列実体と前記蛍光実体とを連結するスペーサーを含有しないということを除いては、該ハイブリダイゼーションプローブ対と同一である、FRETハイブリダイゼーションプローブ対。
【請求項５】
　核酸サンプルおよび請求項１〜４いずれか記載のハイブリダイゼーションプローブ対を含有してなる組成物。
【請求項６】
　請求項１〜４いずれか記載のハイブリダイゼーションプローブ対ならびに核酸増幅プライマー、テンプレート依存性核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸およびテンプレート依存性核酸増幅反応用バッファーからなる群より選ばれる少なくとも１つの他の成分を含有してなるキット。
【請求項７】
　生物学的サンプル中の核酸配列の定性検出または定量検出のための方法であって、該サンプル中に存在する核酸が請求項１〜４いずれか記載のFRETハイブリダイゼーションプローブ対とハイブリダイズする、方法。
【請求項８】
　前記サンプルに存在する、前記FRETハイブリダイゼーションプローブ対の配列に実質的に相補的である標的核酸配列を含有する核酸の一部が、核酸増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応により増幅される請求項７記載の方法。
【請求項９】
　FRETドナー実体の蛍光発光またはFRETアクセプター実体の発光がリアルタイムでモニターされる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
　蛍光発光が温度の関数として測定されることを特徴とする、標的核酸および請求項１〜４いずれか記載のFRETハイブリダイゼーションプローブ対からなるハイブリッドの融解プロフィールの決定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、リアルタイムPCRの分野に関する。より詳細には、本発明は、FRETハイブリダイゼーションプローブの改善された設計に関する。
【背景技術】
【０００２】
　動力学的リアルタイムPCRにおいて、PCR産物の形成は、PCRの各サイクルでモニターされる。増幅は、通常、増幅反応中に蛍光シグナルを測定するためのさらなるデバイスを有するサーモサイクラーにおいて測定される。この代表例は、Roche Diagnostics LightCycler（カタログ番号2 0110468）である。増幅産物は、例えば、標的核酸に結合した場合にのみ蛍光シグナルを発光する蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブにより、または特定の場合には、二本鎖DNAに結合する蛍光色素によっても検出される。規定のシグナル閾値は、解析対象の全ての反応について決定され、この閾値に達するのに必要なサイクル数Cpが、標的核酸についておよび参考核酸（例えば、標準またはハウスキーピング遺伝子）について決定される。標的分子の絶対コピー数または相対コピー数は、標的核酸および参考核酸について得られるCp値に基づいて決定され得る（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００３】
　リアルタイムPCRにおいて使用されうるFRETハイブリダイゼーションプローブ試験様式は、同時に使用され、かつ増幅される標的核酸の同じ鎖の隣接した部位に相補的な２つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブにより特徴付けられる。両プローブは異なる蛍光部分で標識される。適切な波長の光で励起されると、両ハイブリダイゼーションプローブが検出対象の標的分子の隣接した位置に結合している場合、第１の成分は、蛍光共鳴エネルギー転移の原理に従って吸収エネルギーを第２の成分に転移し、その結果、第２の成分の蛍光発光が測定されうる。あるいは、FRETドナー成分の蛍光減少がモニターされ得る。当該分野で公知の全ての検出様式の中でも、このFRETハイブリダイゼーションプローブ様式は、非常に感受性が高く、正確でかつ信頼性が高いことが判明している（例えば、特許文献１、特許文献２または特許文献３を参照）。適切なFRETハイブリダイゼーションプローブ配列の設計は、時には、検出対象の標的核酸配列の特殊な特徴により限定され得る。
【０００４】
　あるいは、蛍光標識プライマーおよび１つだけ標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することも可能である（例えば、非特許文献２を参照）。
【０００５】
　FRETハイブリダイゼーションプローブの別の応用は、融解曲線解析である。このようなアッセイにおいて、標的核酸は、適切な増幅プライマーを用いる典型的なPCR 反応で始めに増幅される。ハイブリダイゼーションプローブは、すでに増幅反応中に存在しているか、または続いて添加され得る。PCR反応の完了後、試料の温度が本質的に上昇され、ハイブリダイゼーションプローブが標的DNAに結合している限り蛍光は検出される。融解温度で、ハイブリダイゼーションプローブは、その標的から放出され、蛍光シグナルはバックグラウンドレベルまで速やかに減少する。この減少は、適切な蛍光対温度−時間プロットを用いてモニターされ、その結果、一次導関数が決定され、蛍光減少の最大値が観察される。
【０００６】
しかし、動力学的リアルタイムPCRのためおよび融解曲線解析のために、絶対的なシグナル強度における大きな差が、FRETハイブリダイゼーションプローブの異なる対について蛍光色素の同じカップルで標識されているにもかかわらず観察された、。さらに、この現象は、使用される蛍光色素のカップルに依存しない。
【０００７】
観察される効果の理由は不明であるが、種々の系で以前に開示されているＧ残基のクエンチングまたは脱クエンチング効果によるものでありうると推測されうる（例えば、特許文献４または非特許文献３を参照）。
【０００８】
　ほとんどの場合、クエンチング効果を生じるＧ残基は、通常、それぞれの蛍光化合物に密接して空間的に近傍に位置する（例えば、特許文献５を参照）。さらに、この効果に基づいて、ある場合にはアッセイを設定することができ、ここで、未ハイブリダイズの標識プローブの蛍光発光は内部残基によりクエンチされ、ハイブリダイゼーションは、プローブが相補的な標的配列にハイブリダイズするとすぐに脱クエンチング効果が生じるためにモニターされうる（例えば、特許文献６を参照）。
【０００９】
　しかし、予測され得ない核酸の全体の構造のために、クエンチング効果を生じるＧ残基は、標的DNAならびにハイブリダイゼーションプローブそれ自身の種々の位置に位置しうる。
【００１０】
　いずれの場合でも、観察される効果は、特に、１つの反応容器内で、１つまたはそれより多くの標的配列が増幅され、２つまたは複数のFRETハイブリダイゼーションプローブ対を用いて定量的に解析されることを特徴とする、多重アッセイの設計に関して非常に不利である。従って、絶対シグナルが標的核酸の塩基組成および配列により影響を受けない、FRETハイブリダイゼーションプローブの改善された設計が当該分野で必要とされている。
【特許文献１】国際公開第97/46707号パンフレット
【特許文献２】国際公開第97/46712号パンフレット
【特許文献３】国際公開第97/46714号パンフレット
【特許文献４】国際公開第01/36668号パンフレット
【特許文献５】欧州特許第1 046 717号明細書
【特許文献６】国際公開第01/731118号パンフレット
【非特許文献１】Roche Diagnostics LightCyclerオペレーターマニュアル（カタログ番号2 0110468）
【非特許文献２】Bernard, P.S. ら、「Anal.Biochem」、1998年、第255 巻、p.101-7
【非特許文献３】Seidel, C.A.M.ら、J Phys Chem100 (1996) 5541-53, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
　従って、本発明は、絶対シグナルが標的核酸の塩基組成および配列により影響を受けない、FRETハイブリダイゼーションプローブの改善された設計を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
　この課題は、本発明によるFRETハイブリダイゼーションプローブにより解決される。
【００１３】
　本発明は、蛍光部分の発光シグナルが該蛍光部分の近傍のいかなるヌクレオチド残基のいかなるクエンチング活性によっても干渉されない標的核酸のFRETハイブリダイゼーションプローブ対に関する。
【００１４】
　より正確には、本発明は、
標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、
FRETドナー実体またはFRETアクセプター実体のいずれかである蛍光実体および
該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体
を各々が含有してなる、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対に関し、ここで該FRETハイブリダイゼーションプローブ対の２つのメンバーのスペーサー実体が互いに非共有結合相互作用を形成しうる。非共有結合相互作用は、例えば、ヌクレオチド塩基対合相互作用であり、好ましくはA/T塩基対合相互作用でありうる。
【００１５】
　別の様式で規定すると、本発明は、
標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、
FRETドナー実体またはFRETアクセプター実体のいずれかである蛍光実体および
該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体
を各々が含有してなる、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対に関する。
【００１６】
　実施例に示されるように、スペーサー実体の存在により、前記FRETドナー実体からの蛍光発光の強度および前記FRETアクセプター実体からの蛍光発光の強度は、前記標的核酸の配列中に存在するか、または前記ハイブリダイゼーションプローブ自身の前記ヌクレオチド配列実体に存在するかのいずれかであるヌクレオチド残基のいかなるクエンチング活性によっても実質的に影響されない。
【００１７】
すなわち、本発明の要旨は、
［１］　標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、
FRETドナー実体またはFRETアクセプター実体のいずれかである蛍光実体、および
該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体
を各々が含有してなる、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対であって、該FRETハイブリダイゼーションプローブ対の２つのメンバーのスペーサー実体が互いに非共有結合相互作用を形成しうる、FRETハイブリダイゼーションプローブ対、
［２］　非共有結合相互作用がヌクレオチド塩基対合相互作用であり、好ましくはA/T塩基対合相互作用である前記［１］記載のFRETハイブリダイゼーションプローブ対、
［３］　標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、
FRETドナー実体またはFRETアクセプター実体のいずれかである蛍光実体および
該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体
を各々が含有してなる、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対であって、スペーサー実体の存在により、該FRETドナー実体からの蛍光発光の強度および該FRETアクセプター実体からの蛍光発光の強度が、該標的核酸の配列に存在するか、または該ハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列実体に存在するかのいずれかであるヌクレオチド残基のクエンチング活性に実質的に影響をうけない、FRETハイブリダイゼーションプローブ対、
［４］　標的配列にハイブリダイズした場合、前記FRETアクセプター実体からの蛍光発光の強度が、同一の標的DNAにハイブリダイズした比較可能なFRETハイブリダイゼーションプローブ対のFRETアクセプター実体の蛍光発光の強度と比較して検出可能に増大する前記［３］記載のFRETハイブリダイゼーションプローブ対であって、該比較可能なFRETハイブリダイゼーションプローブ対は、該比較可能なハイブリダイゼーションプローブが前記ヌクレオチド配列実体と前記蛍光実体とを連結するスペーサーを含有しないということを除いては、該ハイブリダイゼーションプローブ対と同一である、FRETハイブリダイゼーションプローブ対、
［５］　核酸サンプルおよび前記［１］〜［４］いずれか記載のハイブリダイゼーションプローブ対を含有してなる組成物、
［６］　前記［１］〜［４］いずれか記載のハイブリダイゼーションプローブ対ならびに核酸増幅プライマー、テンプレート依存性核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸およびテンプレート依存性核酸増幅反応用バッファーからなる群より選ばれる少なくとも１つの他の成分を含有してなるキット、
［７］　生物学的サンプル中の核酸配列の定性検出または定量検出のための方法であって、該サンプル中に存在する核酸が前記［１］〜［４］いずれか記載のFRETハイブリダイゼーションプローブ対とハイブリダイズする、方法、
［８］　前記サンプルに存在する、前記FRETハイブリダイゼーションプローブ対の配列に実質的に相補的である標的核酸配列を含有する核酸の一部が、核酸増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応により増幅される前記［７］記載の方法、
［９］　FRETドナー実体の蛍光発光またはFRETアクセプター実体の発光がリアルタイムでモニターされる前記［８］記載の方法、および
［１０］　蛍光発光が温度の関数として測定されることを特徴とする、標的核酸および前記［１］〜［４］いずれか記載のFRETハイブリダイゼーションプローブ対からなるハイブリッドの融解プロフィールの決定方法
に関する。
【発明の効果】
【００１８】
　本発明によれば、絶対シグナルが標的核酸の塩基組成および配列により影響を受けない、FRETハイブリダイゼーションプローブの改善された設計が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
　当該分野で公知であるように、FRETハイブリダイゼーションプローブ試験様式は、同時に使用され、かつ増幅された標的核酸の同じ鎖の隣接した部位に相補的である２つの単鎖ハイブリダイゼーションプローブにより特徴づけられる。両方のプローブは、異なる蛍光部分で標識されている。適切な波長の光で励起されると、両方のハイブリダイゼーションプローブが検出対象の標的分子の隣接位置に結合している場合、第１の成分は、蛍光共鳴エネルギー転移の原理に従って吸収したエネルギーを第２の成分に転移し、その結果、第２の成分の蛍光発光が測定され得る。
【００２０】
　本発明によれば、いかなるクエンチング効果をも阻止する所望の効果が、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対により達成され、各々のハイブリダイゼーションプローブは、
標的核酸の配列に実質的に相補的であるヌクレオチド配列実体、
FRETドナー実体またはFRETアクセプター実体のいずれかである蛍光実体、
該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体
を含有し、
ここで、該FRETハイブリダイゼーションプローブ対の２つのメンバーのスペーサー実体は互いに非共有結合相互作用を形成しうる。
【００２１】
　クエンチング効果の防止の所望の効果に加えて、このような本発明のFRETハイブリダイゼーションプローブ対は、さらなる利点を有する。まず、標的核酸およびハイブリダイゼーションプローブ対の２つのメンバーからなる三重複合体の形成の反応速度が、加速され得る。第２に、いくつかの場合FRETハイブリダイゼーションプローブの融解温度が、少なくともわずかに変化し得る。特定の場合において、このような調整が、多重アッセイの最適設計に必要であり得る。
【００２２】
　本発明の文脈において、用語「スペーサー実体」は、少なくとも300の分子量を有する化学リンカー構造である。
【００２３】
　好ましい態様において、このスペーサー実体は、標的核酸にハイブリダイズされる場合、第１のハイブリダイゼーションプローブのさらなる残基が、第２のハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド残基と塩基対合相互作用を形成してステム構造を形成し得ることに特徴を有するヌクレオチド残基である。
【００２４】
　蛍光化合物が、プローブ／標的ハイブリダイゼーション複合体を形成するヌクレオチドに近接するようになることに特徴を有する当該分野で公知の標準的FRETハイブリダイゼーションプローブとは対照的に、本発明のFRETハイブリダイゼーションプローブの設計は、蛍光化合物と、例えばプローブ／標的ハイブリダイゼーション複合体中に存在するＧ残基とのいかなる潜在的な干渉の発生をも防止する。
【００２５】
　本発明の文脈において、用語「実質的に相補的」とは、それぞれの配列が標準的アニーリング条件下で互いに特異的にハイブリダイズすることを意味する。標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体の長さは、１０〜４０ヌクレオチド残基の間で変化し得る。好ましくは、標的核酸のAT含有量に依存するが、この長さは、１５〜３０ヌクレオチド残基の間である。少なくとも、ハイブリッドを構成する８５％より多い残基間での完全なワトソンクリック塩基対合が必要である。さらに、10個連続したヌクレオチド残基のセグメントにわたる完全な相補性が必要である。
【００２６】
　本発明の文脈において、用語「隣接してハイブリダイズする」とは、２つのハイブリダイゼーションプローブが標的核酸にハイブリダイズされる場合、標的核酸配列に関する２つのプローブ間にギャップがないか、または０〜１０個、好ましくは１〜２個の相補的ヌクレオチド残基の範囲の小さなギャップのみが存在することを意味する。
【００２７】
　別の局面において、本発明は、標的核酸配列に隣接ハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対に関するように定義され、各ハイブリダイゼーションプローブは、
−標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体
−蛍光実体（該実体はFRETドナー実体またはFRETアクセプタ実体のいずれかである）
−該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体
を含み、
ここで、スペーサー実体の存在により、該FRETドナー実体からの蛍光発光の強度および該FRETアクセプタ実体からの蛍光発光の強度が、該標的核酸の配列または該ハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列実体のいずれかに存在するヌクレオチド残基のいずれのクエンチング活性によっても実質的に影響されない。
【００２８】
　本文脈において、用語「実質的に影響されない」とは、ハイブリダイゼーション複合体が形成されている場合に、当該分野で公知の従来の直接法または間接法のいずれを用いても、FRETアクセプタ実体の蛍光発光に関して、標的またはプローブに存在する任意のＧ残基による20％より大きなクエンチング効果を検出できないことを意味する。
【００２９】
　換言すれば、比較用FRETハイブリダイゼーションプローブ対がヌクレオチド配列実体と蛍光実体を連結するスペーサー実体を含まないことを除いて、該ハイブリダイゼーションプローブ対が本発明のFRETハイブリダイゼーション対と同一である場合、本発明のFRETハイブリダイゼーションプローブ対のFRETアクセプタ実体からの蛍光発光の強度は、その標的配列にハイブリダイズされる場合、同じ標的DNAにハイブリダイズされる比較用FRETハイブリダイゼーションプローブ対のFRETアクセプタ実体の蛍光発光の強度と比較して検出可能に増大する。
【００３０】
　本文脈において、用語「検出可能に増大する」は、２つの前記FRETハイブリダイゼーションプローブ対間の差異が従来のリアルタイムPCRアッセイ、例えば、LightCycler装置（Roche Applied Sciences製）においてモニターされ得ることを意味する。しかし、好ましくは、検出可能な差異が、20％より大きい。
【００３１】
　蛍光シグナル増大の程度は、標的核酸配列および使用されるFRET色素対に有意に依存する。特定の場合において、蛍光シグナル増大は、100％を上回り得る。クエンチング感受性色素を使用する場合、本発明のFRETハイブリダイゼーションプローブ対を標準的なFRETハイブリダイゼーション対と比較すると、５倍より大きなシグナル増大が観察され得る。蛍光シグナル増大は、従来のハイブリダイゼーションアッセイにおいてのみ観察されるわけではない。実施例に示されるように、リアルタイムPCR定量および溶解曲線分析においても検出可能である。
【００３２】
　一般的に、原則として蛍光部分に連結されるスペーサーを保有するヌクレオチド残基は、内部残基、5'末端残基または3'末端残基のいずれかであり得、オリゴヌクレオチド対が標的核酸にハイブリダイゼーションする限り、蛍光共鳴エネルギー転移は、大いに起こり得、ここで、両FRET実体は、空間的に近接されるようになり、その結果、FRETドナーの励起後に、FRETアクセプタからの蛍光発光がモニターされ得る。
【００３３】
　しかし、好ましくは、第１のスペーサーおよび第１のFRET実体を保有する１つのオリゴヌクレオチドは、その3'末端残基で標識され、第２のスペーサーおよび第２のFRET実体を保有する第２のオリゴヌクレオチドは、その5'末端残基で標識され、その結果、両オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズされる場合、両FRET実体の蛍光標識は、該末端残基が標的核酸内の隣接残基または少なくとも、さらに１、２または多くとも10残基未満だけ離れた残基に塩基対合されるという事実により互いに空間的に近接するようになる。
【００３４】
　本文脈において、オリゴヌクレオチドがFRETドナー部分を保有することおよびオリゴヌクレオチドがFRETアクセプタ部分を保有することは、任意に選択され得る。なぜならば、これらのエレメントは、当該分野で公知の方法によりオリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端の両方、いずれかに導入され得るからである。
【００３５】
　さらに、本発明はまた、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対に関するように定義され、各ハイブリダイゼーションプローブは、
−標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体
−蛍光実体（該実体はFRETドナー実体またはFRETアクセプタ実体のいずれかである）
−該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体
を
−スペーサー実体の存在により、該FRETドナー実体からの蛍光発光の強度および該FRETアクセプタ実体からの蛍光発光の強度が、該標的核酸の配列または該ハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列実体のいずれかに存在するヌクレオチド残基のいずれのクエンチング活性によっても実質的に影響されず、
−該FRETハイブリダイゼーションプローブ対の２つのメンバーのスペーサー実体が、互いに非共有結合相互作用を形成し得る、
という規定で
含む。
【００３６】
　特定の態様において、上記で開示されたような本発明のFRETハイブリダイゼーションプローブ対の２つのメンバー間の非共有結合相互作用は、ステム構造を形成するヌクレオチド塩基対合相互作用であり、好ましくは、A/T塩基対合相互作用である。
【００３７】
　ステム構造が等しい数のヌクレオチド残基を有する２つの相補的一本鎖からなる場合、有利であることが証明されているが、ヌクレオチド残基の数が等しくなくても、ハイブリダイゼーションする限りは、２つの蛍光部分は互いに近接するようになる可能性もある。これは、ヌクレオチド残基の数が１または２だけ異なっている場合、通常の場合である。さらに、塩基対合相互作用を生じるヌクレオチドにより形成されるステム構造が任意に単一のミスマッチおよび／またはヌクレオチドアナログおよび塩基性リンカーを含む場合も本発明の範囲内である。
【００３８】
　Ｇ残基のようなヌクレオチド残基によるクエンチングのいかなる効果をも防ぐために、各ステムは、少なくとも１〜３個のさらなる塩基対および好ましくはA/T塩基対を含むべきである。一方、各スペーサー実体への10個以上のさらなるヌクレオチド残基の導入は、効果の改善を全く生じないが、一方、標的核酸自体に結合せずに２つのオリゴヌクレオチド間に所望でない複合体形成を生じ得る。
【００３９】
　第１のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列実体（標的核酸の配列に実質的に相補的である）の3'に、スペーサー実体として作用する１〜10個、好ましくは３〜８個、最も好ましくは３〜５個のさらなるヌクレオチド残基が存在するように設計される。これらのさらなる残基の3'末端残基は、当該分野で公知の標準的プロトコールに従って第１のFRET実体で標識される。好ましくは、このさらなる残基は、ＡまたはＴ残基である。大いに好ましくは、さらなる残基の60％より多くがＡまたはＴ残基である。また、大いに好ましくは、２個またはいっそう良いのは３個の3'末端残基がＡまたはＴ残基である。
【００４０】
　相応じて、第２のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列実体（標的核酸の配列に実質的に相補的である）の5'に、スペーサー実体として作用すると同時に、第１のオリゴヌクレオチドのスペーサー実体にハイブリダイズし得る１〜10個、好ましくは３〜８個、最も好ましくは３〜５個のさらなるヌクレオチド残基が存在するように設計される。これらのさらなる残基の5'末端残基は、当該分野で公知の標準的プロトコールに従って第２のFRET実体で標識される。好ましくは、このさらなる残基は、ＡまたはＴ残基である。大いに好ましくは、さらなる残基の60％より多くがＡまたはＴ残基である。また、大いに好ましくは、２個またはいっそう良いのは３個の5'末端残基がＡまたはＴ残基である。
【００４１】
　さらに、塩基対合相互作用により生じるステムが１個、２個、３個または少なくとも５個未満のさらなるG/C塩基対を含む場合も、本発明の範囲内である。この場合、ステムのそれぞれのＧ残基がクエンチング効果を生じ得る可能性もあり得るが、異なるFRETハイブリダイゼーションプローブでクエンチングする程度と、類似するようになる。しかし、強い蛍光シグナル強度を得るためには、ステムを形成する少なくとも１個、２個またはいっそう良いのは３個の末端塩基対がA/T塩基対である場合が大いに好ましい。
【００４２】
　本発明の両オリゴヌクレオチドプローブが標的核酸にハイブリダイズされる場合、両FRET実体の蛍光標識は互いに近接するようになるが、一方、標的核酸内の任意の潜在Ｇ残基または標的核酸配列に実質的に相補的なハイブリダイゼーションプローブの一部内のＧ残基のいずれかから特定の距離にわたってなお離れている。
【００４３】
　一般的に、本発明のハイブリダイゼーションプローブが蛍光化合物の任意の組合わせに当てはまる設計の場合、その間で蛍光エネルギー転移が起こり得る。実例は、フルオレセイン/Cy5（Amersham社製）、フルオレセイン/LC-Red-640（Roche Applied Science社製）、フルオレセイン/LC-Red-750（Roche Applied Science社製）、およびフルオレセイン/JA286（EP 747 447）であるが、これにより本発明は全く限定されない。
【００４４】
　FRETアクセプタ実体が蛍光化合物とは異なるクエンチャー部分であり、その結果FRETドナー部分からの蛍光の減少がモニターされる場合も本発明の範囲内である。この点について使用され得るクエンチャー化合物の例は、Dabcyl（Kreuzer, K.A.ら、Clin Chem 47 (2001) 486-90）、いわゆるBlack Hole Quenchers（WO01/86001）である。
【００４５】
　通常、FRETハイブリダイゼーションプローブは、典型的な一本鎖DNA分子である。それにもかかわらず、任意の種類の変更が可能である。例えば、一本鎖DNAは、7-デアザ-プリン、ジアミノ-プリンまたはC-ヌクレオチドなどの非天然の塩基を含んでもよい。一本鎖DNAはまた、2-O-メチル、ホスホチオエート、または類似の任意物などの修飾された糖−リン酸骨格を有してもよい。
【００４６】
　FRETハイブリダイゼーションプローブとして作用するオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の方法により任意の位置で必要な蛍光実体を用いて標識され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド塩基またはリン酸部分で内的に標識され得る。
【００４７】
　しかし、好ましくは、１個のオリゴヌクレオチドは5'末端で標識され、第２のオリゴヌクレオチドは3'末端で標識される。オリゴヌクレオチドがFRETドナー部分を保有すること、およびオリゴヌクレオチドがFRETアクセプタ部分を保有することは、この点で任意に選択され得る。通常、5'標識は、蛍光化合物を保有する適切なホスホルアミデートを用いてオリゴヌクレオチド合成の終わりに導入され得る。あるいは、オリゴヌクレオチド合成の後、反応性アミノ基を保有するオリゴヌクレオチドは、NHSエステルとして活性化された蛍光化合物で標識され得る。オリゴヌクレオチドの3'標識化のために、蛍光化合物を有する三官能性スペーサー実体を含む市販の調節孔（controlled pore）ガラス粒子が、化学的オリゴヌクレオチド合成の開始用の固体支持体として使用される。
【００４８】
　本発明の範囲は、さらなるヌクレオチド残基から構成されるスペーサー実体に限定されない。本発明に応用され得る他の非共有結合相互作用についての例は、全ての種類の水素結合（例えば、ポリペプチド相互作用）、および全ての種類の疎水性相互作用（例えば、CF2基およびイオン性引力に基づく）である。従って、非共有結合相互作用を有するスペーサーは、全ての種類の水素結合（ペプチド／オリゴヌクレオチド内などの）および全ての種類の疎水性相互作用（アリール−アリール、アルキル−アルキル相互作用またはフッ素化炭化水素間の引力など）を含む。イオン性相互作用は、スペーサーのうちの１つが陰性に電荷し、別のスペーサーが陽性に電荷している場合に使用され得る。さらに、スペーサー部分が直線となる代わりに分枝されている可能性がある。
【００４９】
　別の局面において、本発明はまた、上記で開示された本発明のFRETハイブリダイゼーションプローブを含む組成物に関する。より正確には、本発明の組成物は、核酸サンプルおよびFRETハイブリダイゼーションプローブ対を含み、ここで、該FRETハイブリダイゼーションプローブ対は、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズし、各ハイブリダイゼーションプローブは、(i)標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、(ii)蛍光実体（該実体は、FRETドナー実体またはFRETアクセプタ実体のいずれかである）、ならびに(iii)該ヌクレオチド配列実体および該蛍光実体を連結するスペーサー実体を含み、ここで、スペーサー実体の存在により、該FRETドナー実体からの蛍光発光の強度および該FRETアクセプタ実体からの蛍光発光の強度は、該標的核酸の配列または該ハイブリダイゼーションプローブの該ヌクレオチド配列実体のいずれかに存在するヌクレオチド残基のいずれのクエンチング活性によっても実質的に影響されない。
【００５０】
　本発明はまた、上記で開示された本発明のオリゴヌクレオチド対および組成物を使用する種々の方法および応用に関する。より正確には、本発明は、核酸サンプル中の核酸配列の定性または定量検出のための方法に関し、ここで、該核酸サンプルはFRETハイブリダイゼーションプローブ対でハイブリダイズされ、該FRETハイブリダイゼーションプローブ対は標的核酸配列に隣接してハイブリダイズし、各ハイブリダイゼーションプローブが(i)標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、(ii)蛍光実体（該実体はFRETドナー実体またはFRETアクセプタ実体のいずれかである）、ならびに(iii)該ヌクレオチド配列実体および該蛍光実体を連結するスペーサー実体を含み、ここで、スペーサー実体の存在により、該FRETドナー実体からの蛍光発光の強度および該FRETアクセプタ実体からの蛍光発光の強度は、該標的核酸の配列または該ハイブリダイゼーションプローブの該ヌクレオチド配列実体のいずれかに存在するヌクレオチド残基のいずれのクエンチング活性によっても実質的に影響されない。
【００５１】
　１つの態様において、このような方法は、典型的なハイブリダイゼーションアッセイであり得る。ハイブリダイゼーションは、溶液中で、あるいは標的核酸またはFRETハイブリダイゼーションプローブ対の内１つのメンバーのいずれかが固体支持体上にすでに固定されている場合は、固体支持体上で起こり得る。固体支持体自体は、例えば、ハイブリダイゼーション膜、磁性ガラスビーズ、核酸を固定するためのマイクロアレイまたは当該分野で公知の任意の他の材料であり得る。
【００５２】
　別の好ましい態様において、サンプルに存在する核酸の一部は、ハイブリダイゼーション手順前または中に核酸増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR））に供される。必要条件として、標的核酸は、使用されるハイブリダイゼーションプローブの配列に実質的に相補的または相同性の配列を含む。換言すると、使用されるハイブリダイゼーションプローブは、増幅対象の標的核酸の一部に特異的にハイブリダイズする必要がある。
【００５３】
　さらに、本発明は、本発明のFRETハイブリダイゼーションプローブ対がリアルタイムで標的核酸の増幅をモニターするために使用される方法を提供する。当該分野で公知のように、リアルタイムモニタリングは、動力学的データの作成を可能にし、定量分析を容易にする。従って、本発明はまた、増幅反応自身の間に、FRETアクセプタ実体の蛍光発光における増大をモニターすること、またはFRETドナー実体の蛍光発光における減少をモニターすることのいずれかにより標的核酸の増幅をモニターする方法に関する。
【００５４】
　さらなる局面において、本発明は、溶解曲線分析のための上記で開示されたFRETハイブリダイゼーションプローブの使用に関し、ここで、標的核酸とハイブリダイゼーションプローブとの間の複合体の解離のモニタリングは、単一のヌクレオチド多型などの小さな配列バリアントの検出を可能にする。
【００５５】
　より正確には、本発明は、標的核酸および本発明のFRETハイブリダイゼーションプローブ対からなるハイブリッドの溶解プロフィールの決定のための方法に関し、まず、標的核酸および２つのハイブリダイゼーションプローブ間の三重ハイブリッド複合体が形成されることに特徴を有する。次に、温度が増加され、三重複合体の熱解離がリアルタイムで蛍光をモニタリングすることにより決定される。換言すれば、新規発明はまた、蛍光発光が温度の関数として決定されることを特徴とする、標的核酸および上記開示されたFRETハイブリダイゼーションプローブ対からなるハイブリッドの融解プロフィールの決定方法に関する。
【００５６】
　さらに、２つのFRETハイブリダイゼーションプローブ間の非共有結合相互作用の設計および特にA/T塩基対合相互作用の数の選択が、独特の溶解温度を有するFRETハイブリダイゼーションプローブ対を得るために使用され得ることが力説される。これは、互いを明白に識別し得る溶解ピークを生じるための複数のハイブリダイゼーションプローブ対を含む多重アッセイの開発のために大いに有利である。
【００５７】
　最後の局面において、本発明は、本発明のハイブリダイゼーションプローブ対を含むキットに関する。このようなキットは、上記開示された本発明のFRETハイブリダイゼーションプローブ対を含み得る。さらに、それは核酸増幅反応のためのプライマー対として作用し得るオリゴヌクレオチドも含み得る。
【００５８】
　正確には、キットは、FRETドナー実体を保有する第１のオリゴヌクレオチドおよびFRETアクセプタ実体を保有する第２のオリゴヌクレオチドからなるFRETハイブリダイゼーションプローブ対を含み、ここで、該FRETハイブリダイゼーションプローブ対は標的核酸配列に隣接してハイブリダイズし、各ハイブリダイゼーションプローブが(i)標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、(ii)蛍光実体（該実体はFRETドナー実体またはFRETアクセプタ実体のいずれかである）、ならびに(iii)該ヌクレオチド配列実体および該蛍光実体を連結するスペーサー実体を含み、ここで、スペーサー実体の存在により、該FRETドナー実体からの蛍光発光の強度および該FRETアクセプタ実体からの蛍光発光の強度は、該標的核酸の配列または該ハイブリダイゼーションプローブの該ヌクレオチド配列実体のいずれかに存在するヌクレオチド残基のいずれのクエンチング活性によっても実質的に影響されない。
【００５９】
　さらに、本発明のキットは、核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸またはそれぞれのアナログ、およびPCRなどの鋳型依存核酸増幅反応のために使用され得る適切な緩衝液などの少なくとも１つのさらなる成分を含み得る。さらに、このキットはまた、相対的または絶対的核酸定量実験の定量分析のためのコンピュータープログラムを保有するコンパクトディスクなどのソフトウェアツールを含み得る。
【００６０】
　以下の実施例、参考文献、配列表および図面は、本発明の理解を助けるために提供されるのであり、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく示される手順において変更がなされ得ることが、理解される。
【実施例１】
【００６１】
PCR プライマーおよびプローブの調製
　プライマーを、市販の標準的ホスホロアミダイト（DMTr ibu G、DMTr bzA；DMTr bz C およびDMTr T）および対応するCPG 支持体を用いてABI394シンセサイザー上で１μmol スケールで合成した。標準的合成用の化学物質を、Glen Research から得た。固体支持体からのオリゴヌクレオチドの除去および脱保護を、33％NH3 を用いて55℃にて８時間実施した。合成をトリチル中で行った。精製を、Perseptive Biosystems 製RP 18 Oligo R3 4.6×50mmカラムで行った。緩衝液Ａ：0.1M酢酸トリエチルアンモニウム含有水pH7.0 /MeCN 95:5、緩衝液Ｂ：MeCN。勾配３分20％Ｂ；12分12〜40％Ｂ、流速1ml/分、検出260nm 。続いて、濃縮オリゴヌクレオチド溶液を、5'DMTr保護基を除去するため室温にて５分間80％酢酸で処理した。その後、オリゴヌクレオチドを、RP 18 カラムで脱塩し、Speed Vac で凍結乾燥した。
【００６２】
　5'標識オリゴヌクレオチド（JA 286/ LC Red64）合成を１μmol レンジで行なった。
市販の標準ホスホロアミダイト（DMTr ibu G、DMTr bzA；DMTr bz C およびDMTr T）および標準的合成用の化学物質をGlen Research から得た。5'アミノ基を、市販の5'アミノ修飾物質（Glen Research(カタログ番号10-1916-90) ）を使用することにより誘導した。固体支持体として3'ホスフェートCPG （Glen Research(20-2900-01）を使用した。固体支持体からのオリゴヌクレオチドの除去および脱保護を、33％NH3 を用いて55℃にて８時間実施した。溶液を減圧下でエバポレートした。残渣を600 μl の二重蒸留水に溶解し、60μl の酢酸ナトリウム緩衝液のマイクロ遠心管に移した（3M、ph8.5 を添加した）。1.8ml の氷冷エタノールの添加の際に、混合物を−15℃で３時間保管した。溶液を 10000×g で15分間遠心分離した。上清をデカントした。ペレットを 200μl の氷冷エタノールで洗浄する。遠心分離後、上清をデカントした。ペレットを400 μl のホウ酸ナトリウム緩衝液(0.1M 、pH8.5)に溶解し、標準手順により標識した。
【００６３】
　NHS-活性化LC-Red-640およびJA286 を使用した。NHS-LC-Red-640は、Roche Applied Science(カタログ番号：2 015 161)から入手できる。EP 0747 447 、実施例１により、NHS 活性化JA286 を合成した。
【００６４】
　 1mgの色素NHS エステルのDMF 溶液を添加し、15時間反応させた。標識オリゴヌクレオチドを、Oligo R3 4.6×50mmカラムを用いる逆相により精製した。クロマトグラフィー：緩衝液Ａ：0.1M酢酸トリエチルアンモニウム含有水pH7.0 、緩衝液Ｂ：0.1M酢酸トリエチルアンモニウム含有水/MeCN 1:1 。勾配２分0 ％Ｂ、45分で100 ％Ｂ（この勾配は生成物が溶出し始めた場合停止した）。非標識オリゴヌクレオチドを20〜25％Ｂで溶出する；所望の標識オリゴヌクレオチドを60〜65％Ｂで溶出する；色素を100 ％Ｂで溶出する；流速を1ml/分、260nm で検出した。標識オリゴヌクレオチドピーク由来の画分を収集し、溶媒を減圧遠心機を用いて除去した。残渣を二重蒸留水に溶解し、次いで再び減圧遠心機でエバポレートした。この手順を３回繰り返した。ペレットを水に溶解し、凍結乾燥した。
【００６５】
　3'フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドを、市販のLightCycler フルオレセインCPG （Roche Applied Science カタログ番号3138178 ）のパック折込に従って合成し、精製した。
【実施例２】
【００６６】
フルオレセイン／JA286 で標識したFRETハイブリダイゼーションプローブ対を使用する第Ｖ因子DNA の定量リアルタイムPCR 
　第Ｖ因子DNA フラグメントの増幅のため、20μl リアルタイムPCR 反応混合物を、以下のように設定した：
【００６７】
　１０6 または１０4 　第Ｖ因子遺伝子を含むプラスミドのコピー
　　　　　　　　　　　（Gene Bank 受託番号：M ＿014335）
　１３ｍＭ　　　　　　MgCl2
　各５００ｎＭ　　　　配列番号：１および２のプライマー
　各２００ｎＭ　　　　それぞれ配列番号：３および４、または配列番号：５および６の
　　　　　　　　　　　FRETハイブリダイゼーションプローブ
　LightCycler DNA マスターハイブリダイゼーションプローブキットのPCR 成分（Roche Applied Science カタログ番号2158825 ）。
【００６８】
　プライマーおよびプローブは、以下のものを使用した。
配列番号:1
フォワードプライマー:
5‘ GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A
配列番号:2
リバースプライマー
5‘ TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
配列番号:3
FRETドナープローブ
5‘ AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC-フルオレセイン
配列番号:4
FRETアクセプタープローブ
5‘ JA286-AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT
配列番号:5
FRETドナープローブ
5‘ AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCA AAA A-フルオレセイン
配列番号:6
FRETアクセプタープローブ
5‘ JA286-TTT  TTA  GGG ATC TGC TCT TAC AGA TTA GAA GTA GTC CTA TT
【００６９】
　配列番号：３および５のプローブを、実施例１のフルオレセインで3'末端標識した。配列番号：４および６のプローブを、実施例１のFRETアクセプターとしてのJA286 で5'末端標識した。配列番号：５は、3'末端オリゴ-Aペンタマーを含有し、配列番号：６は、5'末端オリゴ-Tペンタマーを含有するので、それぞれのFRETハイブリダイゼーションプローブ対は、本発明のハイブリダイゼーションプローブ対を構成する。
【００７０】
　増幅を以下のサーモサイクルプロトコールに従いLightCycler 装置（Roche Applied Science ）中で実施した：
【００７１】
【表１】
2004065262.tif 000002
【００７２】
　リアルタイムモニタリングを、JA286 発光(710nm) に特異的な検出チャネルにおいて蛍光シグナルを測定し、初期蛍光バックグラウンド強度の標準化に対する算術バックグラウンド補正を使用することにより、45サイクルにわたって二次導関数閾値法を用いて実施した。
【００７３】
　結果を図１に示す。図でわかるように、試験した標的DNA の両コピー数（図1.a：106 コピー、図1.b：104 コピー）について、本発明のATステムを含有するFRETハイブリダイゼーションプローブの使用は、有意に増大した増幅シグナルを生じた。
【実施例３】
【００７４】
フルオレセイン／JA286 で標識したFRETハイブリダイゼーションプローブ対を使用する第Ｖ因子DNA の融解曲線解析
　実施例２に開示した反応に続き、試料を、以下の温度移動プロトコールを使用してLightCycler マニュアル（Roche Applied Sciences）の使用説明書に従い融解曲線解析に供した：
【００７５】
【表２】
2004065262.tif 000003
【００７６】
　フルオレセインモニタリングを、710nm のJA286 チャネルで得られた絶対シグナル値を測定し、続く一次導関数の計算により実施した。
【００７７】
　結果を図２に示す。図でわかるように、試験した標的DNA の両コピー数（図2.a：106 コピー、図2.b：104 コピー）について、本発明のATステムを含有するFRETハイブリダイゼーションプローブの使用は、有意に増大した融解ピークを生じた。
【実施例４】
【００７８】
フルオレセイン／LC-Red-640で標識したFRETハイブリダイゼーションプローブ対を使用する第Ｖ因子DNA の定量リアルタイムPCR 
　第Ｖ因子DNA フラグメントの増幅を、配列番号：４および６のハイブリダイゼーションプローブの5'末端標識に対するFRETアクセプター部分として、JA286 の代わりにLC-Red 640を使用した以外は、実施例２と同様に実施した：
【００７９】
配列番号:1
フォワードプライマー:
5‘ GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A
配列番号:2
リバースプライマー
5‘ TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
配列番号:3
FRETドナープローブ
5‘ AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC-フルオレセイン
配列番号:4
FRETアクセプタープローブ
5‘ LCRED640-AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT
配列番号:5
FRETドナープローブ
5‘ AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCA AAA A-フルオレセイン
配列番号:6
FRETアクセプタープローブ
5‘ LCRED640-TTT TTA GGG ATC TGC TCT TAC AGA TTA GAA GTA GTC CTA TT
【００８０】
　結果を図３に示す。図でわかるように、試験した標的DNA の両コピー数（図3.a：106 コピー、図3.b：104 コピー）について、本発明のATステムを含有するFRETハイブリダイゼーションプローブを使用する（配列番号：５および６のFRET対を使用することによる）増大した増幅シグナルの効果がまた、種々のFRET対を用いて観察されうる。本発明のポジティブな効果は、実際に使用される色素対のタイプから独立していると結論づけられうる。
【実施例５】
【００８１】
フルオレセイン／LC-Red-640で標識したFRETハイブリダイゼーションプローブ対を使用する第Ｖ因子DNA の融解曲線解析
　実施例４に開示した反応に続き、試料を、実施例３で開示した条件と同一の融解曲線解析に供した。
【００８２】
　結果を図４に示す。図でわかるように、試験した標的DNA の両コピー数（図4.a：106 コピー、図4.b：104 コピー）について、本発明のATステムを含有するFRETハイブリダイゼーションプローブの使用は、融解ピークの有意な増大を再び生じた。したがって、本発明の改良された融解曲線解析は、使用される色素対のタイプから独立していると結論づけられうる。
【実施例６】
【００８３】
フルオレセイン／JA286 で標識したFRETハイブリダイゼーションプローブ対を使用するG6PDH DNA の定量的リアルタイムPCR 
　G6PDH DNA(Gene Bank 受託番号：XM＿013149) フラグメントの増幅のため、条件を実施例２に開示されたものと同一にして、以下のプライマーおよびプローブを用いて104 コピーの標的DNA を増幅した：
【００８４】
配列番号:7
フォワードプライマー
GGG TGC ATC GGG TGA CCT G
配列番号:8
リバースプライマー
AGC CAC TGT GAG GCG GGA
配列番号:9
FRETドナープローブ
5‘ GGT GTT TTC GGG CAG AAG GCC ATC C-フルオレセイン
配列番号:10
FRETアクセプタープローブ
5‘ JA286-AAC AGC CAC CAG ATG GTG GGG TAG ATC TT
配列番号:11
FRETドナープローブ
5‘ GGT GTT TTC GGG CAG AAG GCC ATC CAA AAA-フルオレセイン
配列番号:12
FRETアクセプタープローブ
5‘ JA286-TTT TTA ACA GCC ACC AGA TGG TGG GGT AGA TCT T
【００８５】
　詳細には、配列番号：７および８のプライマー（各々）500nM 、ならびにそれぞれ配列番号：９および11、または配列番号：10および12のFRETハイブリダイゼーションプローブ（各々）200nM を使用した。
【００８６】
　配列番号：９および11のプローブを、実施例１のフルオレセインで3'末端標識した。配列番号：10および12のプローブを、JA286 で5'末端標識した。配列番号：11は、3'末端オリゴ-Aペンタマーを含有し、配列番号：12は、5'末端オリゴ-Tペンタマーを含有するので、それぞれのFRETハイブリダイゼーションプローブ対は、本発明のハイブリダイゼーションプローブ対を構成する。
【００８７】
　増幅を以下のサーモサイクルプロトコールに従いLightCycler 装置（Roche Applied Science ）中で実施した：
【００８８】
【表３】
2004065262.tif 000004
【００８９】
　結果を図５に示す。図でわかるように、試験した標的DNA の両コピー数（図5.a：108 コピー、図5.b：103 コピー）について、本発明のATステムを含有するFRETハイブリダイゼーションプローブの使用はまた、他方の標的DNA フラグメントが増幅された場合、有意に増大した増幅シグナルを生じた。したがって、新規発明は、増幅対象の標的DNA のタイプから独立して増大した増幅シグナルを付与するFRETハイブリダイゼーションプローブを提供すると結論づけられうる。
【実施例７】
【００９０】
種々の A/Tステムを含有するフルオレセイン／JA286 で標識したFRETハイブリダイゼーションプローブを使用する第Ｖ因子DNA の定量リアルタイムPCR 
　0 、1 、3 または5 個のA/T 塩基対ステムを有するハイブリダイゼーションプローブを試験するという改変を加えて、実験を実施例２に開示されたように実施した。
【００９１】
　したがって、プライマーおよびプローブは、以下のものを使用した：
配列番号:1
フォワードプライマー:
5‘ GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A
配列番号:2
リバースプライマー
5‘ TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA
配列番号:3
FRETドナープローブ
5‘ AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC-フルオレセイン
配列番号:4
FRETアクセプタープローブ
5‘ JA286-AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT
配列番号:13
FRETドナープローブ 1A
5‘ AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCA-フルオレセイン
配列番号:14
FRETアクセプタープローブ 1T
5‘ JA286-TAG GGA TCT GCT CTT ACA GAT TAG AAG TAG TCC TAT T
配列番号:15
FRETドナープローブ 3A
5‘ AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCA AA-フルオレセイン
配列番号:16
FRETアクセプタープローブ 3T
5‘ JA286-TTT AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT 
配列番号:5 
FRETドナープローブ 5A
5‘ AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCA AAA A-フルオレセイン
配列番号:6 
FRETアクセプタープローブ 5T
5‘ JA286-TTT  TTA  GGG ATC TGC TCT TAC AGA TTA GAA GTA GTC CTA TT
【００９２】
　結果を図６に示す。図でわかるように、１個のみのA/T 塩基対からなり、そのヌクレオチド残基が標的DNA にハイブリダイズしないA/T ステムを用いて、改良された増幅シグナルがすでに得られる。さらに、この効果は、３または５個のA/T ステムからなるA/T ステムを用いて有意に増大した。したがって、本発明のA/T ステムの最適な長さは、３〜５塩基対であるようである。
【実施例８】
【００９３】
種々の A/Tステムを含有するフルオレセイン／JA286 で標識したハイブリダイゼーションプローブを使用する第Ｖ因子DNA の融解曲線解析
　実施例７に開示した反応に続き、試料を、実施例３に開示したような融解曲線解析に供した。
【００９４】
　結果を図７に示す。図でわかるように、本発明のA/T ステムを含有する全てのFRETハイブリダイゼーションプローブは、たとえA/T ステムが１個の塩基対のみからなっていたとしても、有意に増大した融解ピークを生じた。
【００９５】
参考文献のリスト
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WO0173118
WO0186001
WO9746707
WO9746712
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１．ａ】図１．ａは、FactorVアンプリコンを検出するためにFluorescein/JA286FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例２に開示されるリアルタイムPCR実験の蛍光対サイクル数のプロットである。＋Stem: 本発明のステムを保有するFRETハイブリダイゼーションプローブ−Stem: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブａ）106コピーの標的DNA。
【図１．ｂ】図１．ｂは、FactorVアンプリコンを検出するためにFluorescein/JA286FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例２に開示されるリアルタイムPCR実験の蛍光対サイクル数のプロットである。＋Stem: 本発明のステムを保有するFRETハイブリダイゼーションプローブ−Stem: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブｂ）104コピーの標的DNA。
【図２．ａ】図２．ａは、Fluorescein/JA286 FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例３に開示される実験の融解曲線解析を示す蛍光対温度の一次導関数のプロットである。＋Stem: 本発明のステムを保有するFRETハイブリダイゼーションプローブ−Stem: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブａ）106コピーの標的DNA。
【図２．ｂ】図２．ｂは、Fluorescein/JA286 FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例３に開示される実験の融解曲線解析を示す蛍光対温度の一次導関数のプロットである。＋Stem: 本発明のステムを保有するFRETハイブリダイゼーションプローブ−Stem: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブｂ）104コピーの標的DNA。
【図３．ａ】図３．ａは、FactorVアンプリコンを検出するためにFluorescein/LC-Red-640 FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例４に開示されるリアルタイムPCR実験の蛍光対サイクル数のプロットである。＋Stem: 本発明のステムを保有するFRETハイブリダイゼーションプローブ−Stem: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブａ）106コピーの標的DNA、ｂ）104コピーの標的DNA。
【図３．ｂ】図３．ｂは、FactorVアンプリコンを検出するためにFluorescein/LC-Red-640 FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例４に開示されるリアルタイムPCR実験の蛍光対サイクル数のプロットである。＋Stem: 本発明のステムを保有するFRETハイブリダイゼーションプローブ−Stem: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブａ）106コピーの標的DNA、ｂ）104コピーの標的DNA。
【図４．ａ】図４．ａは、Fluorescein/LC-Red-640 FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例５に開示される実験の融解曲線解析を示す蛍光対温度の一次導関数のプロットである。＋Stem: 本発明のステムを保有するFRETハイブリダイゼーションプローブ−Stem: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブａ）106コピーの標的DNA。
【図４．ｂ】図４．ｂは、Fluorescein/LC-Red-640 FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例５に開示される実験の融解曲線解析を示す蛍光対温度の一次導関数のプロットである。＋Stem: 本発明のステムを保有するFRETハイブリダイゼーションプローブ−Stem: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブｂ）104コピーの標的DNA。
【図５．ａ】図５．ａは、G6PDHアンプリコンを検出するためにFluorescein/JA286FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例６に開示されるリアルタイムPCR実験の蛍光対サイクル数のプロットである。＋Stem: 本発明のステムを保有するFRETハイブリダイゼーションプローブ−Stem: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブａ）108コピーの標的DNA。
【図５．ｂ】図５．ｂは、G6PDHアンプリコンを検出するためにFluorescein/JA286FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例６に開示されるリアルタイムPCR実験の蛍光対サイクル数のプロットである。＋Stem: 本発明のステムを保有するFRETハイブリダイゼーションプローブ−Stem: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブｂ）103コピーの標的DNA。
【図６】図６は、種々のA/Tステムを含有するFactorVアンプリコンを検出するためにFluorescein/JA286 FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例７に開示されるリアルタイムPCR実験の蛍光対サイクル数のプロットである。without: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブ、1A/T: １塩基対A/Tステムを有するFRETハイブリダイゼーションプローブ3A/T: ３塩基対A/Tステムを有するFRETハイブリダイゼーションプローブ5A/T: ５塩基対A/Tステムを有するFRETハイブリダイゼーションプローブ。
【図７】図７は、種々のA/Tステムを含有するFluorescein/JA286FRETハイブリダイゼーションプローブを用いた実施例８に開示される実験の融解曲線解析を示す蛍光対温度の一次導関数のプロットである。without: ステムを有さないFRETハイブリダイゼーションプローブ、1A/T: １塩基対A/Tステムを有するFRETハイブリダイゼーションプローブ3A/T: ３塩基対A/Tステムを有するFRETハイブリダイゼーションプローブ5A/T: ５塩基対A/Tステムを有するFRETハイブリダイゼーションプローブ。
【図１．ａ】
2004065262.tif 000005
【図１．ｂ】
2004065262.tif 000006
【図２．ａ】
2004065262.tif 000007
【図２．ｂ】
2004065262.tif 000008
【図３．ａ】
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【図３．ｂ】
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【図４．ａ】
2004065262.tif 000011
【図４．ｂ】
2004065262.tif 000012
【図５．ａ】
2004065262.tif 000013
【図５．ｂ】
2004065262.tif 000014
【図６】
2004065262.tif 000015
【図７】
2004065262.tif 000016
【配列表】
2004065262000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月29日(2003.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、
FRETドナー実体またはFRETアクセプター実体のいずれかである蛍光実体、および
該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体
を各々が含有してなる、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対であって、該FRETハイブリダイゼーションプローブ対の２つのメンバーのスペーサー実体が互いに非共有結合相互作用を形成することができる、FRETハイブリダイゼーションプローブ対。　
【請求項２】
　標的核酸の配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列実体、
FRETドナー実体またはFRETアクセプター実体のいずれかである蛍光実体および
該ヌクレオチド配列実体と該蛍光実体とを連結するスペーサー実体
を各々が含有してなる、標的核酸配列に隣接してハイブリダイズするFRETハイブリダイゼーションプローブ対であって、スペーサー実体の存在により、該FRETドナー実体からの蛍光発光の強度および該FRETアクセプター実体からの蛍光発光の強度が、該標的核酸の配列に存在するか、または該ハイブリダイゼーションプローブのヌクレオチド配列実体に存在するかのいずれかであるヌクレオチド残基のクエンチング活性に実質的に影響をうけない、FRETハイブリダイゼーションプローブ対。　
【請求項３】
　請求項１または２記載のハイブリダイゼーションプローブ対、ならびに核酸増幅プライマー、テンプレート依存性核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸およびテンプレート依存性核酸増幅反応用バッファーからなる群より選ばれる少なくとも１つの他の成分を含有してなるキット。
【請求項４】
　生物学的サンプル中の核酸配列の定性検出または定量検出のための方法であって、該サンプル中に存在する核酸が請求項１または２記載のFRETハイブリダイゼーションプローブ対とハイブリダイズする、方法。　
【請求項５】
　蛍光発光が温度の関数として測定されることを特徴とする、標的核酸および請求項１または２記載のFRETハイブリダイゼーションプローブ対からなるハイブリッドの融解プロフィールの決定方法。