(57)【要約】      （修正有）【課題】  商業的な量のＴ−２０またはＴ−１２４９組成物、あるいはＴ−２０またはＴ−１２４９のフラグメント組成物を調製するための改良された方法を提供する。【解決手段】一態様において、１以上のＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントを生成するために、任意にアミノ酸またはアミノ酸誘導体でロードされた、低ボイドスペース樹脂および／または表面官能化樹脂を用いる。もう一つの態様において、成長するペプチド鎖１当量当たり約１．５当量のアミノ酸を使用する。さらにもう一つ態様において、約１５分ないし約３０分の範囲のサイクル時間で、公知方法により得られるよりも高いアミノ酸のロード効率を得ることを含む。さらにもう一つの様態において、低ボイドスペース樹脂をリサイクルすることを含む。さらにもう一つの様態において、リカップルを全くまたは実質的に必要とせず、実質的に使用する試薬の量が少ないことからなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロトリチルクロリドリンカー樹脂を用いてＴ−２０またはＴ−１２４９組成物、あるいはＴ−２０またはＴ−１２４９のフラグメント組成物を製造するための改良された方法であって、前記改良が；
１以上のＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントを調製するために、任意にアミノ酸またはアミノ酸誘導体がロードされた低ボイドスペース樹脂を用いることを含む前記方法。
【請求項２】
成長するペプチド鎖１当量当たり１．５当量未満の前記アミノ酸が用いられる請求項１記載の方法。
【請求項３】
従来の方法よりも、約１５分から約３０分の範囲のサイクル時間の減少をもたらすことをさらに含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
従来の樹脂よりも約７．５％より多く増大したアミノ酸のロード効率を得ることをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記低ボイドスペース樹脂をリサイクルすることをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
約１０より多いアミノ酸を有するＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントを調製することをさらに含み、リカップルの必要がない請求項１記載の方法。
【請求項７】
約１５より多いアミノ酸を有するＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントを調製することをさらに含み、リカップルの必要がない請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記低ボイドスペース樹脂をリサイクルすることをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
Ｔ−２０またはＴ−１２４９の１以上のフラグメントが請求項１記載の方法により製造されるＴ−２０またはＴ−１２４９組成物。
【請求項１０】
クロロトリチルクロリドリンカー樹脂を用いて、Ｔ−２０またはＴ−１２４９組成物、Ｔ−２０またはＴ−１２４９のフラグメント組成物を製造するための改良された方法であって、前記改良点が：
前記樹脂の表面方向に偏って官能基を有する樹脂を用い、１以上のＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントを調製するために、前記樹脂に任意にアミノ酸またはアミノ酸誘導体がロードされることを含む前記方法。
【請求項１１】
前記樹脂をリサイクルすることをさらに含む請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ−２０またはＴ−１２４９の１以上のフラグメントが請求項１０記載の方法により製造されるＴ−２０またはＴ−１２４９組成物。
【請求項１３】
クロロトリチルクロリドリンカー樹脂を用いてＴ−２０またはＴ−１２４９組成物、Ｔ−２０またはＴ−１２４９のフラグメント組成物を製造するための改良された方法であって、前記改良点が：
低ボイドスペース樹脂の表面方向に偏って官能基を有する前記低ボイドスペース樹脂を用い、１以上のＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントを調製するために、前記低ボイドスペース樹脂に任意にアミノ酸またはアミノ酸誘導体がロードされることを含む前記方法。
【請求項１４】
Ｔ−２０またはＴ−１２４９の１以上のフラグメントが請求項１３記載の方法により製造されるＴ−２０またはＴ−１２４９組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相合成において支持体として有用な、官能化された低ボイドスペース（ｌｏｗ  ｖｏｉｄ  ｓｐａｃｅ）ポリマー樹脂を用いてＴ−２０、Ｔ−１２４９、Ｔ−２０様ペプチド、およびＴ−１２４９様ペプチドを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前記ペプチドを商業的規模で製造するための方法が当該技術分野において非常に必要とされている。様々な技術が実験室規模で有効であることが知られているが、これらの技術は多くの欠点を有する。これらの欠点としては、サイクル時間が長いこと、高価な試薬を無駄遣いすること、規模においての収率が低いこと、規模においてのローディング効率が低いこと、規模において高価な溶媒を多量に使用すること、リカップルが必要であること、および規模においての純度が低いことが挙げられる。さらに、サイクル時間および高価な試薬の余剰分を減少させようと試みると、生成物収率および純度が低下し、リカップリングの増大が必要になった。当該分野において見いだされた公知ＣＴＣ樹脂をリサイクルする試みがなされてきた（Ｈａｒｒｅら、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ４１（１９９９）１１１−１１４）。しかしながら、従来技術の樹脂に関しては深刻な問題があるのでこれらの試みは失敗に終わった。従来技術の樹脂は、ポリマーの物理的劣化の欠点がある。
【０００３】
【非特許文献１】Ｈａｒｒｅら、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ４１（１９９９）１１１−１１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
当該技術が直面するこれらおよび他の問題を解決し、商業的に有用な量のＴ−２０およびＴ−１２４９を製造できる方法を提供することが本発明の目的の１つである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、Ｔ−２０またはＴ−１２４９組成物、あるいはＴ−２０またはＴ−１２４９のフラグメント組成物を製造するための改良された方法に関する。改良点は、１以上のＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントを調製するためにアミノ酸またはアミノ酸誘導体が任意にロードされた低ボイドスペース樹脂を用いることを包含する。
【０００６】
もう一つの態様において、方法は、成長するペプチド鎖１当量当たり約１．５当量のアミノ酸を使用する。
【０００７】
さらにもう一つの態様において、Ｔ−２０またはＴ−１２４９組成物、あるいはＴ−２０またはＴ−１２４９のフラグメント組成物を調製するための改良された方法は、約１５分ないし約３０分の範囲のサイクル時間をもたらし、公知方法により得られるよりも高いアミノ酸のロード効率が得られることを含む。
【０００８】
さらにもう一つの態様において、方法は低ボイドスペース樹脂をリサイクルすることを含む。
【０００９】
さらにもう一つの態様において、本発明は、約１０または約１５以上のアミノ酸を有するＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントの調製法であって、リカップルを全くまたは実質的に必要とせず、実質的に使用する試薬の量が少ない方法を提供する。
【００１０】
さらにもう一つの態様において、本発明はＴ−２０またはＴ−１２４９組成物を提供し、ここにおいてＴ−２０またはＴ−１２４９の１以上のフラグメントは本明細書に記載する方法により調製される。
【００１１】
さらにもう一つの態様において、改良法は、樹脂の表面方向に偏って官能基を有する樹脂を使用することを含む。さらにもう一つの態様において、改良法は低ボイドスペース樹脂の表面方向に偏って官能基を有する低ボイドスペース樹脂を用いることを含む。
【００１２】
本発明のこれらおよび他の目的は、本発明の詳細な説明を包含するが、これに限定されない明細書の残りの部分において記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、Ｔ−２０またはＴ−１２４９組成物、あるいはＴ−２０またはＴ−１２４９のフラグメント組成物を調製する改良された方法を提供する。改良点は、低ボイドスペース樹脂および／または表面方向に偏って官能性を有する樹脂を使用することを含む。１以上のＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントを生成するために、樹脂には、任意にアミノ酸またはアミノ酸誘導体がロードされる。
【００１４】
本発明において記載される樹脂に関して用いることができ、本明細書において記載される樹脂にロードすることができる「アミノ酸」の例は、ＮＨ２−ＣＨＲ−ＣＯＯＨ（式中、ＲはＨ、脂肪族基、置換脂肪族基、芳香族基または置換芳香族基である）により表される化合物である。「天然に存在するアミノ酸」は自然界において見いだされる。例としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リシン、オルニチン、プロリン、ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニンおよびヒスチジンが挙げられる。Ｒはアミン酸の側鎖である。天然に存在するアミノ酸側鎖の例としては、メチル（アラニン）、イソプロピル（バリン）、ｓｅｃ−ブチル（イソロイシン）、−ＣＨ２ＣＨ（−ＣＨ３）２（ロイシン）、ベンジル（フェニルアラニン）、ｐ−ヒドロキシベンジル（チロシン）、−ＣＨ２ＯＨ（セリン）、ＣＨＯＨＣＨ３（スレオニン）、−ＣＨ２−３−インドイル（トリプトファン）、−ＣＨ２ＣＯＯＨ（アスパラギン酸）、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ（グルタミン酸）、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（アスパラギン）、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（グルタミン）、−ＣＨ２ＳＨ（システイン）、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３（メチオニン）、−（ＣＨ２）４ＮＨ２（リシン）、−（ＣＨ２）３ＮＨ２（オミチン）、−［（ＣＨ）２］３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２（アルギニン）および−ＣＨ２−３−イミダゾイル（ヒスチジン）が挙げられる。アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの側鎖は脂肪族であり、すなわち、炭素および水素のみを含み、本発明においてそれぞれ「天然に存在するアミノ酸の脂肪族側鎖」と呼ばれる。
【００１５】
本発明において用いることができる他の天然に存在するアミノ酸の側鎖としては、ヘテロ原子含有官能基、例えば、アルコール（セリン、チロシン、ヒドロキシプロリンおよびスレオニン）、アミン（リシン、オミチン、ヒスチジンおよびアルギニン）、チオール（システイン）またはカルボン酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）が挙げられる。ヘテロ原子含有官能基が保護基を含むように修飾される場合、側鎖はアミノ酸の「保護された側鎖」と呼ばれる。
【００１６】
適当な保護基の選択は、保護される官能基、保護基がさらされる条件、および分子中に存在し得る他の官能基によって変わる。前記官能基の適当な保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９１）（その全内容は本明細書に完全に記載されているものとして本出願の一部として参照される）に記載されている。当業者は、単に慣例の実験を用いるだけで、以下に記載する以外の保護基をはじめとする、開示された合成における使用に適当な保護基、ならびに保護基を適用し、除去するための条件を選択することができる。
【００１７】
適当なアルコール保護基の例としては、ベンジル、アリル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、アセテートなどが挙げられる。適当なアミノ保護基の例としては、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジルおよびフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が挙げられる。ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルはアミン保護基である。適当なカルボン酸保護基の例としては、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、メチル、メトキシルメチル、トリメチルシリル、ベンジルオキシメチル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルなどが挙げられる。ｔｅｒｔ−ブチルはカルボン酸保護基である。適当なチオール保護基の例としては、Ｓ−ベンジル、Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチル、Ｓ−アセチル、Ｓ−メトキシメチル、Ｓ−トリチルなどが挙げられる。
【００１８】
リシン、アスパルテートおよびスレオニンが本発明の一態様において好ましく保護されるアミノ酸側鎖の例である。脂肪族基は、完全に飽和しているか、または１以上の不飽和の単位を含む直鎖、分岐鎖Ｃ１−Ｃ８、または環状Ｃ３−Ｃ８炭化水素を含む。一例において、脂肪族基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基である。芳香族基は、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシルおよび２−アントラシルなどの炭素環式芳香族基、およびＮ−イミダゾリル、２−イミダゾール、２−チエニル、３−チエニル、２−フラニル、３−フラニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、２−ピラニル、３−ピラニル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル、５−ピラゾリル、２−ピラジニル、２−チアゾール、４−チアゾール、５−チアゾール、２−オキサゾリル、４−オキサゾリルおよび５−オキサゾリルなどの複素環式芳香族基を包含する。
【００１９】
芳香族基はさらに、炭素環式芳香環またはヘテロアリール環が１以上の他のヘテロアリール環と縮合した縮合多環式芳香族環系を含む。例としては、２−ベンゾチエニル、３−ベンゾチエニル、２−ベンゾフラニル、３−ベンゾフラニル、２−インドリル、３−インドリル、２−キノリニル、３−キノリニル、２−ベンゾチアゾール、２−ベンゾオキサゾール、２−ベンズイミダゾール、２−キノリニル、３−キノリニル、１−イソキノリニル、３−キノリニル、１−イソインドリル、３−イソインドリル、およびアクリジンチルが挙げられる。
【００２０】
アリール基および脂肪族基の適当な置換基は、開示された反応と適合性である、すなわち、反応の収率を著しく低下させず、著しい量の副反応を引き起こさないものである。適当な置換基は、一般に、脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基（例えば、トリハロメチル）、ニトロ、ニトリル、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＮ（Ｒ）２、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ（ここにおいて、各Ｒは独立して、脂肪族基、またはアリール基である）を包含する。ある官能基は１以上の開示された反応と適合性でないが、これらの官能基は保護された形態で存在し得る。保護基を次いで除去して、元の官能基を再生することができる。当業者は、単に慣例の実験を用いるだけで、開示された反応に適合性の保護基を選択することができる。
【００２１】
ペプチド模倣物、またはその成分も本発明において用いるか、本明細書において記載したように樹脂上にロードされるか、または本明細書において記載したプロセスにより製造することができる。ペプチド模倣物は、ペプチドの所望の特性が模倣物により保持されるようにペプチドと十分な構造的類似性を有する化合物である。例えば、ＨＩＶ感染症を治療するためにプロテアーゼ阻害剤として用いられるペプチド模倣物は、Ｔｕｎｇら、ＷＯ９４／０５６３９、Ｖａｚｑｕｅｚら、ＷＯ９４／０４４９１、Ｖａｚｑｕｅｚら、ＷＯ９４／１０１３４およびＶａｑｕｅｚら、ＷＯ９４／０４４９３に開示されている。これらの開示の関連する教唆全体は本発明の一部として参照される。薬剤として有用であるためには、ペプチド模倣物はペプチドの生物学的活性を保持するだけでなく、模倣されるペプチドと比較して向上された１以上の特性を有しているべきである。例えば、あるペプチド模倣物は、インビボでの加水分解または分解に対して耐性である。ペプチド模倣物を調製するための一戦略は、ペプチド中の１以上のアミノ酸残基を、置換されるアミノ酸残基と構造的に関連し、ペプチド結合を形成することができる基と置換することである。ペプチド中のアミノ酸残基を置換するために用いることができる新規アミノ酸誘導体の開発は、新規ペプチド模倣薬剤の開発を進展させる。
【００２２】
ペプチド模倣物の例は、米国特許出願番号２００２０１８８１３５（Ｇａｂｒｉｅｌ、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｌ．ら、２００２年１２月１２日提出、標題「アミノ酸誘導体およびその製造法」）に記載されている。この特許は、完全に記載されているものとして本発明の一部として参照される。これらの化合物の生理学的に許容される塩もまた本発明において有用である。アミンまたは他の塩基性基を含有する化合物の塩は、例えば、適当な有機または無機酸、例えば、塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などと反応させることにより得ることができる。第四アンモニウム基を有する化合物も、塩素、臭素、ヨウ素、酢酸塩、過塩素酸塩などのカウンターアニオンを含む。カルボン酸または他の酸性官能基を含有する化合物の塩は、適当な塩基、例えば、水酸化物塩基と反応させることにより調製することができる。酸性官能基の塩は、ナトリウム、カリウムなどのカウンターカチオンを含む。
【００２３】
本発明は、１以上のペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド模倣物をビルディングブロックまたはその構成成分として有する治療薬および生物学的に活性な物質の生成および製造においても有用である。末端がエステル官能基である化合物または化合物のフラグメントも本発明により生成できる。本発明を用いて製造または生成できる治療薬は、組成物の目的に関して広範囲に及びうる。薬剤は、単一の物質または複数の物質の組み合わせとして処方することができる。デリバリーシステムは、放出速度が制御されたデリバリーシステムをもたらすために、水溶性が高い治療薬ならびに水溶性が低い治療薬に関して使用されるように設計される。「治療薬」および「生物学的に活性な物質」なる用語は、制限なく、医薬；ビタミン；ミネラルサプリメント；治療、予防、診断に使用される物質を包含する。
【００２４】
樹脂製造例
本発明の一態様は、クロロトリチルクロリドリンカー樹脂を用いて、Ｔ−２０またはＴ−１２４９組成物、Ｔ−２０またはＴ−１２４９のフラグメント組成物を調製するための改良された方法を包含する。ＣＴＣ樹脂は、樹脂の表面方向に偏って官能基を有する樹脂である。官能基が表面に偏っているために、リンカー基が樹脂の表面に近くなり、成長するペプチド鎖へ接近しやすくなることができる。表面への偏りは、制御された膨潤条件下で、樹脂にリンカーをロードすることにより生じる。官能化試薬を完全に膨潤していない状態の樹脂と接触させることにより、リンカーはビーズのさらに立体的に接近可能な部分に置かれる。このプロセスは、米国仮特許出願（Ｂｏｈｌｉｎｇら、２００２年８月１６日提出、番号６０／４０４，０４４、標題：固相合成のための樹脂（ＤＮ  Ａ０１４０７）（全体として本発明の一部として参照される）にさらに詳細に記載されている。樹脂は、任意にアミノ酸またはアミノ酸誘導体をロードして、１以上のＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントを生成することができる。
【００２５】
例として、本発明は架橋したポリマービーズを使用し、これは：（ｉ）２−クロロトリチルクロリド基で官能化された場合；（ｉｉ）Ｌｅｕと０．６５ミリモル／ｇにカップリングされた場合；および（ｉｉｉ）Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）とカップリングした場合に；１．５当量のＨＯＢＴ、１．５当量のＤＩＥＡおよび１．５当量のＨＢＴＵの存在下で、１．５当量でのＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−ＯＨのカップリングが３５分以内で完了する（Ｋａｉｓｅｒ試験により確認される）ことを可能にする。
【００２６】
本発明は、（ａ）ビーズを第一の溶媒または溶媒混合物中で、その乾燥時の体積の２００％から３１０％の体積まで膨潤させる工程；および（ｂ）ビーズをその乾燥時の体積の２００％から３１０％の体積に膨潤させることができる第二の溶媒または溶媒混合物中で官能化試薬とビーズを接触させる工程を含む方法により製造される、官能化された架橋ポリマービーズを使用する。
【００２７】
本発明は、その乾燥時の体積の１００％〜２００％のビーズを、ビーズをその乾燥時の体積の２００％から４００％の体積に膨潤させることができる溶媒または溶媒混合物中で官能化試薬と接触させることにより製造される官能化架橋ポリマービーズを使用する。官能化された樹脂は反応のおわりまでに７００％まで膨潤し得る。
【００２８】
百分率は、特に記載しない限り重量百分率である。本発明において使用される場合、「（メタ）アクリル」なる用語は、アクリルまたはメタクリルを意味する。「ビニルモノマー」なる用語は、付加重合に適し、一つの重合可能な炭素−炭素二重結合を含むモノマーを意味する。「スチレンポリマー」なる用語は、合計モノマー重量に基づいて少なくとも５０重量％のスチレンモノマーを、少なくとも１つの架橋剤と共に含有する、ビニルモノマーまたはビニルモノマーの混合物から重合されるコポリマーを指す。好ましくは、スチレンポリマーは、少なくとも７５％のスチレン、さらに好ましくは少なくとも９０％のスチレン、最も好ましくは本質的にスチレンと少なくとも１つのビニル芳香族架橋剤からなるモノマーの混合物からなる。本発明において出発物質として使用されるポリマービーズは、１つの共重合可能な炭素−炭素二重結合を有する少なくとも１つのモノマーと少なくとも１つの架橋剤からのモノマー残基を含有する。架橋剤に由来するモノマー残基は、全てのモノマー残基の合計基準で０．５モル％から１．５モル％である。好ましくは、架橋剤の量は０．７〜１．３モル％、さらに好ましくは０．７〜１．２モル％、最も好ましくは０．８から１．２モル％である。
【００２９】
本発明において出発物質として用いられるポリマービーズは、好ましくは、２００ミクロン（μｍ）以下、好ましくは１７０μｍ以下、さらに好ましくは１５０μｍ以下、さらに好ましくは１２５μｍ以下、最も好ましくは１００μｍ以下の粒子直径を有する球状コポリマービーズである。好ましくは、ビーズは３μｍより大きい直径を有するボイドスペースを有さず、さらに好ましくは２μｍより大きい直径を有するボイドスペースを有さず、最も好ましくは１μｍより大きい直径を有するボイドスペースを有さない。典型的には、ボイドスペースは光学顕微鏡などの技術によりビーズの表面を調べることにより容易に明らかになる。
【００３０】
本発明において出発物質として使用されるポリマービーズは、好ましくは懸濁重合により製造される。典型的なビーズの調製法は、例えば、分散剤、保護コロイドおよび緩衝剤などの典型的な懸濁助剤を含む連続水性相溶液の調製を包含する。好ましくは、比較的小さなビーズの製造に役立つためには、界面活性剤、好ましくはアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤を水性溶液中に配合し、重合プロセス中激しい撹拌を続ける。水性溶液を、少なくとも１つのビニルモノマー、少なくとも１つの架橋剤および少なくとも１つのフリーラジカル開始剤を含有するモノマー混合物と合わせる。好ましくは、開始剤の合計量は、合計モノマーチャージに基づいて０．２５モル％から２モル％、好ましくは０．４モル％から１．５モル％、さらに好ましくは０．４モル％から１モル％、最も好ましくは０．５モル％から０．８モル％である。モノマーの混合物を次いで高温で重合させる。好ましくは、未反応ビニルモノマー含量を出発物質量の１％未満にまで減少させるために十分な時間、重合を続ける。結果として得られるビーズを次いで公知手段、例えば脱水、非プロトン性有機溶媒での洗浄、および乾燥により単離する。
【００３１】
架橋剤は、１分子当たり２以上の共重合可能な炭素−炭素二重結合を有するモノマー、例えば：ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、トリビニルベンゼン、トリビニルシクロヘキサン、ジビニルナフタレン、トリビニルナフタレン、ジエチレングリコールジビニルエーテル、エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、アリルメタクリレート、１，５−ヘキサジエン、１，７−オクタジエンまたは１，４−ビス（４−ビニルフェノキシ）ブタンであり；前記架橋剤のそれぞれの様々な位置異性体が好適であると理解される。好ましい架橋剤は、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、トリビニルベンゼンまたは１，４−ビス（４−ビニルフェノキシ）ブタンである。最も好ましい架橋剤はジビニルベンゼンである。
【００３２】
本発明において出発物質として用いられるビーズの調製において用いることができる適当な一不飽和ビニル芳香族モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル置換スチレンおよびビニルナフタレンが挙げられ；好ましくは、１以上の一不飽和ビニル芳香族モノマーは、スチレンおよび（Ｃ１−Ｃ４）アルキル置換スチレンからなる群から選択される。好適な（Ｃ１−Ｃ４）アルキル置換スチレンには、例えば、エチルビニルベンゼン、ビニルトルエン、ジエチルスチレン、エチルメチルスチレン、ジメチルスチレンおよびビニルベンジルクロリドの異性体が含まれ；前記ビニル芳香族モノマーのそれぞれの様々な位置異性体が好適であると理解される。
【００３３】
任意に、非芳香族ビニルモノマー、例えば、脂肪族不飽和モノマー、例えば、アクリロニトリル、グリシジルメタクリレート、（メタ）アクリル酸および（メタ）アクリル酸のアミドまたはＣ１−Ｃ６アルキルエステルもビニル芳香族モノマーに加えて用いることができる。使用される場合、非芳香族ビニルモノマーは、典型的には、コポリマーを形成するために使用される全モノマー重量に基づいて、重合単位として０〜２０％、好ましくは０〜１０％、さらに好ましくは０〜５％のコポリマーを含む。
【００３４】
好ましくは、ビニルモノマーはビニル芳香族モノマーであり；さらに好ましくはスチレン、ビニルベンジルクロリドの異性体、およびα−メチルスチレンである。最も好ましいビニルモノマーはスチレンである。
【００３５】
本発明において有用な重合開始剤としては、モノマー可溶性開始剤、例えば、ペルオキシド、ヒドロペルオキシド、ペルオキシエステルおよび関連する開始剤；例えば、ベンゾイルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンペルオキシド、テトラリンペルオキシド、アセチルペルオキシド、カプロイルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルオクトエート（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエートともいう）、ｔｅｒｔ−アミルペルオクトエート、ｔｅｒｔ−ブチルペルベンゾエート、ｔｅｒｔ−ブチルジペルフタレート、ジシクロヘキシルペルオキシジカーボネート、ジ（４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル）ペルオキシジカーボネートおよびメチルエチルケトンペルオキシドが挙げられる。アゾ開始剤、例えば、アゾジイソブチロニトリル、アゾジイソブチルアミド、２，２’−アゾ−ビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾ−ビス（α−メチル−ブチロニトリル）およびジメチル−、ジエチル−またはジブチルアゾ−ビス（メチルバレレート）も有用である。好ましいペルオキシド開始剤は、ジアシルペルオキシド、例えば、ベンゾイルペルオキシド、およびペルオキシエステル、例えばｔｅｒｔ−ブチルペルオクトエートおよびｔｅｒｔ−ブチルペルベンゾエートである。
【００３６】
本発明において有用な分散剤および懸濁剤は、ヒドロキシアルキルセルロース主鎖、１から２４、平均１〜８、好ましくは１〜５の炭素原子を含有する疎水性アルキル側鎖、ヒドロキシアルキル−セルロース主鎖の各繰り返し単位を置換するエチレンオキシド基を有し、該アルキル側鎖が、ヒドロキシアルキルセルロース主鎖における１００の繰り返し単位あたり０．１〜１０アルキル基の量で存在する、非イオン性界面活性剤である。ヒドロキシアルキルセルロース中のアルキル基は、１〜２４個の炭素を含み、直鎖、分岐鎖または環状であってよい。さらに好ましいのは、１００の無水グルコース単位あたり０．１〜１０（Ｃ１６）アルキル側鎖および各無水グルコース単位を置換する約２．５〜４のエチレンオキシド基を含有するヒドロキシエチルセルロースである。分散剤の典型的な使用量は、全水性相重量に基づいて約０．０１〜約４％である。有用な分散剤の一例はＣｕｌｍｉｎａｌ  ＭＨＥＣ８０００であり、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ｏｆ  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅから商業的に入手可能である。
【００３７】
任意に、ビーズの調製は、ポリマー表面から重合中使用された分散剤および懸濁剤の残留物を除去するための酵素処理を含んでもよい。酵素処理は典型的には、ポリマー相を酵素物質（１以上のセルロース分解酵素およびタンパク質分解酵素から選択される）と重合中、重合後またはポリマーを単離した後に接触させることを含む。ポリマー樹脂の調製中の酵素の使用に関するさらに一般的および具体的な詳細については、日本国特願昭６１−１４１７０４および５７−９８５０４が参照される。適当な酵素としては、例えば、セルロースベースの分散剤系に関しては、β−１，４−グルカン−４−グルカノ−ヒドラーゼ、β−１，４−グルカン−４−グルカンヒドロラーゼ、β−１，４−グルカン−４−グルコヒドラーゼおよびβ−１，４−グルカン−４−セロビオヒドラーゼなどのセルロース分解酵素；ゼラチンベースの分散剤系に関しては、ウロキナーゼ、エラスターゼおよびエンテロキナーゼなどのタンパク質分解酵素が挙げられる。典型的には、ポリマーに対して用いられる酵素の量は、ポリマーの全重量基準で、２〜３５％、好ましくは５〜２５％、さらに好ましくは１０〜２０％である。
【００３８】
本発明の一方法において、架橋したポリマービーズの膨潤は、官能化中にビーズが部分的に膨潤するように制御される。理論に限定されることを望まないが、部分的に膨潤したビーズを官能化する効果は、結合した官能基の位置をビーズの表面に比較的近い領域に限定することである。好ましくは、官能化が起こる場合、ビーズはその乾燥時の体積の少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも２１０％、さらに好ましくは少なくとも２２０％、さらに好ましくは少なくとも２３０％、最も好ましくは少なくとも２４０％に膨潤する。好ましくは、ビーズはその乾燥時の体積の３１０％以下、さらに好ましくは３００％以下、さらに好ましくは２９０％以下、最も好ましくは２８０％以下に膨潤する。官能化中の所望の膨潤度を達成するためには異なる手段が存在する。
【００３９】
本発明の一態様において、あらかじめ膨潤していないビーズ（すなわち、その乾燥時の体積の１００％）、またはその乾燥時の体積の２００％以下にあらかじめ膨潤させたビーズを、ビーズをその乾燥時の体積の少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも２１０％、さらに好ましくは少なくとも２２０％、さらに好ましくは少なくとも２３０％、最も好ましくは少なくとも２４０％に膨潤させることができる溶媒または溶媒混合物中で官能化試薬と接触させる。好ましくは、溶媒または溶媒混合物は、ビーズをその乾燥時の体積の４００％以下、さらに好ましくは３７０％以下、さらに好ましくは３４０％以下、最も好ましくは３２０％以下に膨潤させることができる。好ましくは、ビーズは１５０％以下、さらに好ましくは１００％以下、さらに好ましくは８０％以下、さらに好ましくは６０％以下、最も好ましくは４０％以下にあらかじめ膨潤させる。一態様において、ビーズはあらかじめ膨潤させることなく、乾燥状態において使用される。樹脂は反応完了までに７００％より大きく膨潤させることができる。
【００４０】
本発明のもう一つの態様において、ビーズをその乾燥時の体積の少なくとも２００％、さらに好ましくは少なくとも２１０％、さらに好ましくは少なくとも２２０％、さらに好ましくは少なくとも２３０％、最も好ましくは少なくとも２４０％まで膨潤させる溶媒または溶媒混合物中でビーズをあらかじめ膨潤させる。好ましくは、ビーズはその乾燥時の体積の３１０％以下、さらに好ましくは３００％以下、さらに好ましくは２９０％、最も好ましくは２８０％以下に膨潤させる。あらかじめ膨潤させた後、ビーズを前記範囲内に膨潤させることができる溶媒または溶媒混合物中でビーズを官能化試薬と接触させる。予備膨潤および官能化に使用される溶媒または溶媒混合物は同一であるのが最も好ましい。
【００４１】
官能化試薬は、官能基をビーズを含むポリマーと共有結合させるものである。固相合成の支持体としてのビーズの有用性を最大にするためには官能基をさらに処理する必要がある場合がある。しかしながら、官能基のはじめの結合により、官能化されるビーズの領域が決まり、従って、ビーズが固相合成の基体と反応し、合成生成物の回収を許容する能力が制御される傾向にある。スチレンポリマーについては、官能化は典型的には芳香環上のフリーデルクラフツ置換であり、好ましくはアシル化、ブロム化、またはハロメチル化である。典型的にはその後に元の官能基を処理する。例えば、アロイルハライドによるアシル化に続いてしばしばアリールリチウムを生成物のカルボニル基に付加して、ターシャリーカルビノール官能基を得、これを次いでハロゲン化して、ターシャリーハライド官能基を得る。本発明の好ましい一態様において、２−クロロベンゾイルクロリド、続いてフェニルリチウム、次いでチオニルクロリドにより、２−クロロトリチルクロリド官能基を得る。ブロム化に続いて典型的にはアルキルリチウム試薬で処理し、アリールリチウム生成物を様々な試薬と反応させて、異なる官能基を得る。ハロメチル基はさらに、様々な試薬と反応して、異なる官能基を得る。
【００４２】
ビーズを部分的に膨潤させることができる溶媒としては、例えば、Ｃ１−Ｃ６ニトロアルカン、および比較的非膨潤性の溶媒たとえばニトロアルカンとニトロベンゼンまたは塩素化炭化水素との混合物を包含する。フリーデル・クラフツ反応を用いた官能化については、Ｃ３−Ｃ６ニトロアルカン、および比較的非膨潤性溶媒、例えばアルカンとニトロベンゼンの混合物が好ましい。
【００４３】
本発明において記載される表面官能化されたビーズは、例えば、固相有機合成、固相ペプチド合成、および反応副生成物の除去に有用である。典型的には、溶液中での表面官能化されたビーズと試薬間のカップリング反応は、公知官能化ポリマービーズを用いるよりも速く起こる。例えば、本発明において記載される表面官能化ビーズ上の２−クロロトリチル−クロリド官能基は、所定の濃度の保護されたアミノ酸試薬と、ペプチド合成において使用される典型的なカップリング試薬の存在下で反応する場合、以下の実施例８および表４に示すように、反応は典型的には公知官能化ビーズについて観察されるのと同じかまたは短い時間で完了する。本発明の表面官能化ビーズの、保護されたアミノ酸残基との反応のカップリング効率は、実施例６および表２におけるビーズの重量増加、および実施例７および表３における開裂したアミノ酸のＨＰＬＣ測定により示されるように、公知ビーズのそれよりも高い。
【００４４】
本発明の表面官能化ビーズ上へのアミノ酸の典型的なローディングは、ペプチド合成において周知の典型的な保護基の有無に関わらず、ロードされていないビーズの重量に基づいて０．２ｍｅｑ／ｇから１．０ｍｅｑ／ｇである。本発明の一態様において、好ましくは少なくとも０．２５ｍｅｑ／ｇがロードされ、さらに好ましくは少なくとも０．３ｍｅｑ／ｇ、さらに好ましくは少なくとも０．５ｍｅｑ／ｇ、最も好ましくは少なくとも０．６ｍｅｑ／ｇがロードされる。好ましくは、ローディングは０．９ｍｅｑ／ｇ以下、さらに好ましくは０．８ｍｅｑ／ｇ以下、最も好ましくは０．７ｍｅｑ／ｇ以下である。本発明のさらにもう一つの態様において、好ましくは少なくとも０．６ｍｅｑ／ｇ、さらに好ましくは少なくとも０．７ｍｅｑ／ｇ、さらに好ましくは少なくとも０．８ｍｅｑ／ｇ、最も好ましくは少なくとも０．９ｍｅｑ／ｇがロードされる。好ましくは、ローディングは１．２ｍｅｑ／ｇ以下、さらに好ましくは１．１ｍｅｑ／ｇ以下、最も好ましくは１．０ｍｅｑ／ｇ以下である。
【実施例】
【００４５】
比較例：あらかじめ膨潤させた架橋ポリスチレンビーズの内部および表面官能化
オーバーヘッドスターラー、上流に圧力除去装置を備えたＮ２インレット、および熱電対を備えた１Ｌ丸底フラスコに、若干正圧の窒素をパージした（添加しながら、オープンストッパーに対してスイープ）。ニトロベンゼン（４００ｍＬ）を導入し、室温に保持した。ポリスチレン樹脂（４０ｇ、０．３７９モル）を窒素スイープに逆らって添加し、１／２時間撹拌した。クロロベンゾイルクロリド（２４．８９ｇ、０．１４２モル）をフラスコに導入し、１５分間撹拌した。窒素で満たしたグローブバッグの内部で、塩化アルミニウム（１８．９６ｇ、０．１４２モル）を密封されたビン中に量り取り、これを次に窒素スイープに逆らって反応フラスコ中に入れた。フラスコの内容物を３０℃に加熱し、４時間保持した。反応混合物をブフナー漏斗中に注ぎ、反応フラスコを少量のニトロベンゼンで洗浄して、完全に移した。フィルターを樹脂レベルまでドレインし、ニトロベンゼン（２８０ｍＬ、１ベッド体積）を添加し、フィルターを再びドレインした。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２ベッド体積）を樹脂床の頂部に添加し、これをドレインさせた。ＴＨＦがニトロベンゼンと置換するにしたがって、色が消えた。１ベッド体積の４：１のＴＨＦ：Ｈ２Ｏを添加し、樹脂を再懸濁させ、次いでフィルターを樹脂レベルまでドレインし、１ベッド体積のＴＨＦを樹脂の頂部に添加した。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のＴＨＦを添加し、樹脂を再懸濁させ、次いでフィルターを樹脂レベルまでドレインし、１ベッド体積のＴＨＦを樹脂の頂部に添加した。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のメタノールが樹脂の頂部に添加された。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のメタノールが添加され、樹脂は再懸濁され、次いでフィルターは樹脂レベルまでドレインされ、１ベッド体積のメタノールが樹脂の頂部に添加された。最小の真空を適用して、過剰の溶媒を除去した。樹脂を３５℃真空オーブン中で一定重量まで乾燥させた。
【００４６】
実施例：未膨潤ビーズの官能化による架橋ポリスチレンビーズの表面官能化
オーバーヘッドスターラー、上流に圧力除去装置を備えたＮ２インレット、および熱電対を備えた１Ｌ丸底フラスコに、若干正圧の窒素をパージした（添加しながら、オープンストッパーに対してスイープ）。ニトロベンゼン（４００ｍＬ）を添加し、室温に保持した。窒素で満たしたグローブバッグの内部で、塩化アルミニウム（１８．９６ｇ、０．１４２モル）を密封されたビン中に量り取り、これを次に窒素スイープに逆らって反応フラスコ中に入れた。塩化アルミニウムを溶解させた後（約５分）、クロロベンゾイルクロリド（２４．８９ｇ、０．１４２モル）をフラスコに添加し、５分間撹拌した。ポリスチレン樹脂（４０ｇ、０．３７９モル）を窒素スイープに逆らって添加し、１／２時間撹拌した。フラスコの内容物を３０℃に加熱し、さらに３．５時間保持した。反応混合物をブフナー漏斗中に注ぎ、反応フラスコを少量のニトロベンゼンで洗浄して、完全に移した。フィルターを樹脂レベルまでドレインし、ニトロベンゼン（２８０ｍＬ、１ベッド体積）を添加し、フィルターを再びドレインした。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２ベッド体積）を樹脂床の頂部に添加し、これをドレインさせた。ＴＨＦがニトロベンゼンと置換すると、色が消えた。１ベッド体積の４：１のＴＨＦ：Ｈ２Ｏを添加し、樹脂を再懸濁させ、次いでフィルターを樹脂レベルまでドレインし、１ベッド体積のＴＨＦを樹脂の頂部に添加した。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のＴＨＦを添加し、樹脂を再懸濁させ、次いでフィルターは樹脂レベルまでドレインされ、１ベッド体積のＴＨＦが樹脂の頂部に添加された。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のメタノールが樹脂の頂部に添加された。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のメタノールを添加し、樹脂を再懸濁させ、次いでフィルターを樹脂レベルまでドレインし、１ベッド体積のメタノールを樹脂の頂部に添加した。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。最小の真空を適用して、過剰の溶媒を除去した。樹脂を３５℃真空オーブン中で一定重量まで乾燥させた。
【００４７】
実施例：官能化溶媒の選択による架橋ポリスチレンビーズの表面官能化
オーバーヘッドスターラー、上流に圧力除去装置を備えたＮ２インレット、および熱電対を備えた１Ｌ丸底フラスコに、若干正圧の窒素をパージした（添加しながら、オープンストッパーに対してスイープ）。ニトロベンゼン（４００ｍＬ）を添加し、室温に保持した。ポリスチレン樹脂（４０ｇ、０．３７９モル）を窒素スイープに逆らって添加し、１／２時間撹拌した。クロロベンゾイルクロリド（２４．８９ｇ、０．１４２モル）をフラスコに添加し、１５分間撹拌した。窒素で満たしたグローブバッグの内部で、塩化アルミニウム（１８．９６ｇ、０．１４２モル）を密封されたビン中に量り取り、これを次に窒素スイープに逆らって反応フラスコ中に入れた。フラスコの内容物を３０℃に加熱し、さらに３．７５時間保持した。反応混合物をブフナー漏斗中に注ぎ、反応フラスコを少量のニトロベンゼンで洗浄して、完全に移した。フィルターを樹脂レベルまでドレインし、ニトロベンゼン（２８０ｍＬ、１ベッド体積）を添加し、フィルターを再びドレインした。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２ベッド体積）を樹脂床の頂部に添加し、これをドレインさせた。ＴＨＦがニトロベンゼンと置換すると、色が消えた。１ベッド体積の４：１のＴＨＦ：Ｈ２Ｏを添加し、樹脂を再懸濁させ、次いでフィルターを樹脂レベルまでドレインし、１ベッド体積のＴＨＦを樹脂の頂部に添加した。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のＴＨＦを添加し、樹脂を再懸濁させ、次いでフィルターを樹脂レベルまでドレインし、１ベッド体積のＴＨＦを樹脂の頂部に添加した。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のメタノールが樹脂の頂部に添加された。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のメタノールを添加し、樹脂を再懸濁し、次いでフィルターを樹脂レベルまでドレインし、１ベッド体積のメタノールを樹脂の頂部に添加した。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。最小の真空を適用して、過剰の溶媒を除去した。樹脂を３５℃真空オーブン中で一定重量まで乾燥させた。
【００４８】
実施例：混合官能化溶媒の使用による架橋ポリスチレンビーズの表面官能化
オーバーヘッドスターラー、上流に圧力除去装置を備えたＮ２インレット、および熱電対を備えた１Ｌ丸底フラスコに、若干正圧の窒素をパージした（添加しながら、オープンストッパーに対してスイープ）。ニトロベンゼン（６０ｍＬ）およびヘプタン（４４０ｍＬ）を添加し、室温に保持した。ポリスチレン樹脂（４０ｇ、０．３７９モル）を窒素スイープに逆らって添加し、１／２時間撹拌した。クロロベンゾイルクロリド（２４．８９ｇ、０．１４２モル）をフラスコに添加し、１５分間撹拌した。窒素で満たしたグローブバッグの内部で、塩化アルミニウム（１８．９６ｇ、０．１４２モル）を密封されたビン中に量り取り、これを次に窒素スイープに逆らって反応フラスコ中に入れた。フラスコの内容物を３０℃に加熱し、さらに４時間保持した。反応混合物をブフナー漏斗中に注ぎ、反応フラスコを少量のニトロベンゼンで洗浄して、完全に移した。フィルターを樹脂レベルまでドレインし、ニトロベンゼン（２８０ｍＬ、１ベッド体積）を添加し、フィルターを再びドレインした。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２ベッド体積）を樹脂床の頂部に添加し、これをドレインさせた。ＴＨＦがニトロベンゼンと置換すると、色が消えた。１ベッド体積の４：１ＴＨＦ：Ｈ２Ｏを添加し、樹脂を再懸濁させ、次いでフィルターを樹脂レベルまでドレインし、１ベッド体積のＴＨＦを樹脂の頂部に添加した。フィルターを樹脂レベルまでドレインした。１ベッド体積のＴＨＦを添加し、樹脂を再懸濁させ、次いでフィルターを樹脂レベルまでドレインさせ、１ベッド体積のＴＨＦを樹脂の頂部に添加した。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のメタノールが樹脂の頂部に添加された。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のメタノールを添加し、樹脂を再懸濁し、次いでフィルターを樹脂レベルまでドレインし、１ベッド体積のメタノールを樹脂の頂部に添加した。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。１ベッド体積のメタノールを樹脂の頂部に添加した。フィルターを樹脂レベルまでドレインさせた。最小の真空を適用して、過剰の溶媒を除去した。樹脂を３５℃真空オーブン中で一定重量まで乾燥させた。
【００４９】
実施例：架橋ビーズの最終官能化の一般法
オーブン乾燥させた四口丸底フラスコ（スターラー、コンデンサーｗ／窒素バブラー、温度コントローラー、および隔壁を備える）中に、ＴＨＦおよび前実施例のいずれかから得られた乾燥ビーズを入れた（１０：１、体積：重量）。混合物を１５分間撹拌した。フェニルリチウム（１．２５当量）を１０分にわたって滴下した。氷／水浴により温度を３０℃より低く維持した。反応混合物を次に周囲温度で１時間撹拌した。反応温度を３０℃より低く保ちながら１０％水性ＨＣｌを滴下することによりクエンチングした。混合物を１時間撹拌した。内容物を次いで焼成ガラス漏斗に移し、ベッド高さまでドレインした。樹脂を次に１ベッド体積の４：１  ＴＨＦ／１０％ＨＣｌ（ｖ／ｖ）中に再懸濁させ、ゆっくりとベッド高さまでドレインさせた。樹脂を１ベッド体積の４：１ＴＨＦ／水を用いて再懸濁させ、ドレインさせた。ベッドを次に再懸濁させ、１ベッド体積のＴＨＦで３回ドレインし、続いて１ベッド体積のメタノールを用いて再懸濁／ドレインを３回繰り返した。１ベッド体積のメタノールで最後のベッドのリンスを行った。真空を適用して過剰の溶媒を除去し、次にビーズを３５℃の真空オーブン中で乾燥した。
【００５０】
オーブン乾燥した四口丸底フラスコ（スターラー、温度コントローラー、コンデンサーｗ／窒素バブラー、およびストッパーを装備）中に、塩化メチレンおよび前記工程から得られる乾燥ビーズ（１０：１）を添加した。塩化チオニル（５当量）、続いてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（塩化チオニルに基づいて５モル％）を滴下した。混合物を還流温度（３７℃）まで４時間暖めた。周囲温度に冷却した後、反応混合物を窒素パージされた焼成ガラス漏斗に移し、ベッドの高さまでドレインした。ベッドを次に再懸濁し、１ベッド体積の塩化メチレンを用いて２回ドレインした。次に１ベッド体積の無水ヘキサンで再懸濁／ドレインを３回行うことによりさらに洗浄した。ベッドを通して窒素をパージして過剰の溶媒を除去し、次にビーズを周囲温度の真空オーブン中に入れた。この調製法により得られるトリチルクロリド官能化ビーズは、例えば、固相ペプチド合成において有用である。
【００５１】
実施例：様々な溶媒中での架橋ポリスチレンビーズの膨潤
１％および約１．５％ジビニルベンゼンを架橋剤として使用し、乾燥時に１．６５ｍＬ／ｇの体積を有する架橋ポリスチレンビーズを溶媒中で膨潤させ、その結果を以下の表１にｍＬ／ｇで表す。溶媒比は体積：体積である。
【００５２】
【表１】
2004269524.tif 000002
【００５３】
実施例：表面官能化された架橋ビーズのＦｍｏｃ−Ｌ−ロイシンでのローディング
実施例４にしたがって製造された２−クロロトリチルクロリド樹脂に、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシンをロードし、メタノールで処理して残存する反応性クロリドを除去し、乾燥した。ローディングを定量化するために重量増加を用いた。樹脂は１．３ミリモル／ｇの容量を有すると仮定した。メトキシエンドキャッピングの比較的小さな分子量効果を無視した。樹脂を１％ＴＦＡ／ＤＣＭで開裂させ、アミノ酸の開裂量（ｃｌｅａｖｅｄ  ｙｉｅｌｄ）（回収率）を決定するためにＨＰＬＣにより溶液を分析した。
【００５４】
樹脂の各サンプル（１．００００±０．０５ｇ）を、サイドポートおよび着脱可能なディスクを有する６０ｍＬガラス製合成容器中に秤取した。合成器中の樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）であらかじめ膨潤させた。ＤＣＭをドレインさせ、各合成器にＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の１０ｍｌ  ＤＣＭ中溶液を添加した。ゆっくりした窒素撹拌を開始した。本発明の５つの樹脂について、サンプルごとのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨの量（グラム）はそれぞれ（３．１８１、０．５９７、０．３５８、０．２９９、０．２３９）であり、ＤＩＥＡの量（ｍＬ）はそれぞれ（１．５６８、０．２９４、０．１７７、０．１４７、０．１１８）であった。各混合物を周囲温度で２時間反応させ、次に溶液をドレインし、メタノール（９ｍＬ）中ＤＩＥＡ（１ｍＬ）で少なくとも３０分間処理することにより、任意の残存するトリチルクロリド末端基をキャップした。樹脂の各サンプルを５×１０ｍＬのＤＣＭで洗浄し、風袋を測定した３０ｍＬガラス濾過器に移し、次いでさらに２×１０ｍＬのＤＣＭで洗浄した。各ロードされた樹脂を次いで４×１０ｍＬのイソプロパノール（ＩＰＡ）で脱膨潤させ、フィルターケーキを通して真空で空気を吸引することにより部分的に乾燥させ、次いでフィルターおよび樹脂を真空オーブン中３０℃で一夜乾燥した。フィルターおよび樹脂を次いで再度秤量し、質量の差を計算した。Ｌｅｕの質量＝最終重量−（フィルターの風袋＋１．０００ｇ樹脂）。ローディング効率＝（樹脂上のＬｅｕの重量／導入されたＬｅｕの重量）＊１００。本発明の５つの樹脂（ＲＨ１〜ＲＨ５）およびこの実施例において記載された方法に従って処理された３つの比較樹脂（ＣＭ１〜ＣＭ３）についての重量増加およびローディング効率を表２に記載する。同じ樹脂についての開裂量を表３に記載する。アミノ酸（ＡＡ）の量はミリモルで記載し、重量増加（増加（ｇａｉｎ））はミリモルで記載し、ローディング効率（効率（ｅｆｆ．））は％で記載する。
【００５５】
本発明の５つの樹脂は表２のどの比較樹脂よりも高いローディング効率を有する。この高いローディング効率は表２の公知樹脂よりも約７．５〜約２８％の範囲の改善である。
【００５６】
【表２】
2004269524.tif 000003
ＣＭ２はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００〜２００メッシュ）の名称で、１％ＤＶＢ；カタログ番号０１−６４−０１１４で入手可能である。
ＣＭ３はＰｏｌｙｍｅｒ  ＬａｂｓからＣｌ−Ｔｒｔ−Ｃｌ樹脂（７５〜１５０ミクロン）の名称で、１％ＤＶＢ、パート番号３４７３−２７９９で入手可能である。
【００５７】
実施例：表面官能化ビーズからのＦｍｏｃ−Ｌ−ロイシンの開裂
樹脂の各サンプル（１．００００±０．０５ｇ）を、ガラス製濾過器中に秤取した。漏斗をＤＣＭ（１０ｍＬ）と共に撹拌することにより樹脂をあらかじめ膨潤させ、ＤＣＭをドレインし、樹脂を３×１０ｍｌのＤＣＭで洗浄した。９×１０ｍｌの１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（ｖ：ｖ）と共に撹拌し、１００ｍＬのメスフラスコ中にドレインし、目盛りまでＤＣＭで満たすことにより、樹脂と結合したＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨを開裂させた。フラスコの内容物を撹拌して、ＨＰＬＣにより分析されるサンプル溶液を提供する。
【００５８】
二元溶媒勾配を生成でき、サンプルインジェクター、さまざまな波長検出器および電子データ獲得システム（ＨＰ１０９０とＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（商標）ソフトウェア）を備えた液体クロマトグラフィーシステム中にサンプル溶液を注入した。カラム：ＹＭＣ  ＯＤＳ−ＡＱ、Ｓ−３、１２０Ａ、５０ｍｍ×４ｍｍ  ＩＤカラムカタログ番号ＡＱ１２Ｓ０３０５０４ＷＴ
条件
流速：１．５ｍｌ／分
プログラム：４０％Ｂ、保持１０．０分
２．５分にわたって４０％Ｂ〜９０％Ｂ、１分保持
２分にわたって９０％Ｂ、次の注入まで１０分保持
注入体積：１０ｕＬ
検出：フォトダイオードアレー検出器２６５ｎｍバンド幅１６ｍｍ、ｒｅｆ：３５０ｎｍ、ｂｗ１００ｎｍ、または可変波長ＵＶ検出器２６５ｎｍ
標準的調製法：
約５．０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ参考標準を２５ｍＬのメスフラスコに量りとった。標準を約１０ｍＬのアセトニトリル（しばしば超音波処理を必要とする）中に溶解させた。水（１２ｍＬ）を添加し、内容物を混合し、フラスコを周囲温度にした。フラスコを目盛りまで水で満たし、内容物を混合した。
サンプル調製：
サンプル溶液（５．００ｍＬ）を２５ｍＬのメスフラスコ中に量り取り、穏やかに窒素を流しながら周囲温度で蒸発乾固させた。残留物を１０ｍＬのアセトニトリル中に溶解させた（しばしば超音波処理を必要とする）。水（１２ｍＬ）を添加し、内容物をよく混合し、フラスコを周囲温度にした。フラスコを目盛りまで水で満たし、撹拌した。
ブランク（水：アセトニトリル３：２）を注入し、勾配プログラムを開始した。
付随して、サンプルおよび標準を注入した。
樹脂上のＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕのローディングを：
サンプルフラスコ中のＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ＝（サンプル面積／標準の面積）×（標準の重量×標準の純度／２５．０ｍＬ）×（２５．０ｍＬ／５．０ｍＬ）
樹脂ローディング（ミリモル／ｇ乾燥樹脂）＝サンプルフラスコ中のＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨの量／（ロードされた樹脂の重量ｇ×３５３．４）［３５３．４はＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨの分子量である］
まずＲＨ１からＲＨ５およびＣＭ１材料について樹脂をロードするために使用したアミノ酸のそれぞれの量についての開裂したＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨの量（ミリモル）についての結果を表３に記載する。ロード効率も記載し、開裂した量は樹脂に結合した量に等しいと仮定する。
【００５９】
【表３】
2004269524.tif 000004
本発明の樹脂についての開裂したアミノ酸収量は、公知樹脂よりも５〜２０％多い。開裂したペプチドフラグメント収量は、同じフラグメントが比較樹脂から開裂した場合よりも高いと考えられる。
【００６０】
実施例：ペプチド構築速度効率の比較
この実施例は、１７〜２６のアミノ酸を含有する、Ｔ−２０（米国特許第６，０１５，８８１号（表１）にペプチドＮｏ．１１として記載されている）と呼ばれるペプチドの９−ペプチドフラグメントの調製を記載する。反応の速度は、カップリング中および未反応の第一アミンの存在を確認するためのＫａｉｓｅｒ試験を行っている間に定期的に樹脂をサンプリングすることにより追跡する。樹脂を２つの競合関係にある樹脂（一方はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから得られるものであり、他方はＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ．から得られるものである）と比較する。
【００６１】
実施例４に従って製造された２−クロロトリチルクロリド樹脂にＦｍｏｃ−Ｌ−ロイシンをロードし、メタノールで処理して、残留する反応性クロリドを除去し、乾燥した。樹脂のサンプル（１．０ｇ）を、サイドポートおよび着脱可能なディスクを有する６０ｍＬのガラス合成容器中に量りとった。ＤＣＭ（１０ｍＬ）を容器に入れ、窒素とともに３０分間撹拌し、次いでドレインした。次に、１０ｍＬのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中ピペリジンの２５％溶液を入れ、１０分間撹拌し、ドレインし、もう１回繰り返すことにより、ロイシン誘導化樹脂を脱保護した。７×１０ｍＬ体積のＮＭＰで洗浄することにより、脱保護残留物を除去した。１．５当量のアミノ酸（この配列において、Ｆｍｏｃ−ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨをまず添加した。装填量および式量は表を参照）、１．５当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（０．１４９ｇ）および１．５当量のＤＩＥＡ（０．１２６ｇ）を７．５ｍＬのＮＭＰ中に室温で溶解させることにより、配列における次のアミノ酸の活性化エステルを調製した。溶液を次いで冷却し、１．５当量のＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（０．３７０ｇ）を添加し、３０分間撹拌した。ＤＣＭ（２．５ｍＬ）を次いで溶液に添加し、３０分間静置した。活性化されたアミノ酸溶液を次いでドレインした樹脂に添加し、窒素と共に撹拌した。サンプルを得、それぞれ１５分分析し（Ｋａｉｓｅｒ試験）、結果を記録した。反応が完了すると、樹脂をドレインし、ＮＭＰで洗浄した（３×１０ｍＬ）。このプロセスを次いで、配列中のアミノ酸の残りについてピペリジンでの脱保護から繰り返す。（Ｇｌｕ（ｔＢｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ａｓｎ（ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ｔＢｕ）、ｌｅｕ、ｌｅｕ、）。
【００６２】
３つの樹脂についての結果を以下の表４に記載し、時間はＫａｉｓｅｒ試験が陰性になるまでの時間として表す。
【表４】
2004269524.tif 000005
本発明のビーズ上で成長する鎖に添加される各アミノ酸との反応を完了させるのに要する時間は、公知ビーズについてと同じかまたは短い。
【００６３】
【表５】
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【００６４】
【表６】
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【表７】
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【００６５】
改良されたアクセス可能性は、さらに効率のよいカップリングおよび洗浄につながり、商業的規模での溶媒の使用量が減少すると考えられる。例として、ＮＭＰ使用量の１０％減少は、ペプチド生成物１００ｋｇあたり１５５００Ｌ減少させる。
【００６６】
付表３  Ｋａｉｓｅｒ試験法
Ｋａｉｓｅｒ試験は、第一アミンのための試験であり、ペプチドカップリングの程度を決定するために用いられる。ロードされた樹脂のサンプル（３〜２０ｍｇ）を試験管中に入れ、蒸発乾固させる。樹脂をついでエタノールで３回洗浄する。試薬１（ピリジン中ＫＣＮ）５滴を試薬２（ニンヒドリン溶液）３滴および試薬３（エタノール中フェノール）３滴とともに添加する。溶液を０．５ｍＬに希釈し、次いで７５℃に１０分間加熱する。１０分後、試験管を冷水浴中で冷却する。ビーズを次いで白色背景の前で観察する。溶液が黄色であり、ビーズが透明であるならば、試験結果は陰性である。青または紫色は遊離アミンの存在および不完全なカップリングを示す。
【００６７】
さらにもう一つの態様において、本発明は、１以上のＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントを生成するために、任意にアミノ酸またアミノ酸誘導体がロードされた低ボイド体積樹脂を用いてＴ−２０またはＴ−１２４９組成物、あるいはＴ−２０またはＴ−１２４０９のフラグメント組成物を製造するための改良法を提供する。
【００６８】
本発明は、非制限的例としては、０．５モル％〜２モル％の架橋剤を有するポリマーを含む架橋されたポリマービーズを使用し、ここにおいてビーズは２００μｍ以下の直径、約５μｍより大きい直径を有するボイドスペースを有さず、５重量％未満の有機抽出物を有する。
【００６９】
本発明の樹脂は、次の例示的方法により調製することができる。該方法は：（ａ）（ｉ）少なくとも１つのビニルモノマーと少なくとも１つの架橋剤を含むモノマー混合物；および（ｉｉ）０．２５モル％〜１．５モル％の少なくとも１つのフリーラジカル開始剤を含む懸濁重合混合物を容器中で調製し；（ｂ）容器中に５％以下の酸素を含む雰囲気を生じるために十分な時間、不活性気体を導入することにより容器から酸素を除去し；（ｃ）モノマー混合物を重合させ；さらに（ｄ）ビーズを非プロトン性有機溶媒で洗浄する工程を含む。もちろん、低ボイドスペース樹脂である性質を有する本発明において使用される樹脂を得るために他の方法も用いることができると理解される。
【００７０】
本発明において使用される場合、「（メタ）アクリル」なる用語は、アクリルまたはメタクリルを意味する。「ビニルモノマー」なる用語は、付加重合に適し、一つの重合可能な炭素−炭素二重結合を含むモノマーを意味する。「スチレンポリマー」なる用語は、合計モノマー重量に基づいて少なくとも５０重量％のスチレンモノマーを、少なくとも１つの架橋剤と共に含有する、ビニルモノマーまたはビニルモノマーの混合物から重合されるコポリマーの混合物を指す。好ましくは、スチレンポリマーは、少なくとも７５％のスチレン、さらに好ましくは少なくとも９０％のスチレン、最も好ましくは本質的にスチレンと少なくとも１つのビニル芳香族架橋剤からなるモノマーの混合物から製造される。わずかに架橋された本発明のポリマービーズは、１つの共重合可能な炭素−炭素二重結合を有する少なくとも一つのモノマーと少なくとも１つの架橋剤からのモノマー残基を含有する。架橋剤から誘導されるモノマー残基は、全てのモノマー残基の合計基準で０．５モル％から２モル％である。
【００７１】
「有機抽出物」なる用語は、ビーズを膨潤させる有機溶媒中で洗浄することによりポリマービーズから除去される低分子量有機物質を意味する。有機抽出物の例としては、例えば、未反応モノマーまたは架橋剤、あるいは低分子量オリゴマーが挙げられる。好ましくは、有機抽出物の量は、テトラヒドロフランまたはジクロロメタン中２時間ビーズを懸濁し、ビーズの１体積当たり５体積の溶媒でカラムをリンスし、乾燥し、ビーズの重量損失を測定することにより測定される。
【００７２】
好ましくは、有機抽出物は、非プロトン性有機溶媒、好ましくは例えばハロゲン化炭化水素、環状エーテル、ケトンおよび芳香族炭化水素などの脂肪族炭化水素でないものでの処理により本発明のビーズから除去される。特に好ましい溶媒としては、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、アセトン、キシレンおよびトルエンが挙げられる。好ましくは、本発明のビーズは４重量％未満、さらに好ましくは３重量％未満、さらに好ましくは２重量％未満、さらに好ましくは１重量％未満の有機抽出物を含み、最も好ましくはビーズは実質的に有機抽出物を含まない。本発明の一態様において、ビーズは３重量％未満、さらに好ましくは２重量％未満、さらに好ましくは１重量％未満の未反応モノマーを含み、最も好ましくはビーズは実質的に未反応モノマーを含まない。典型的には、ビーズは非プロトン性有機溶媒で洗浄する前でさえも、抽出可能な物と未反応モノマーは少量である。ポリマーがジビニルベンゼン（ＤＶＢ）で架橋したスチレンポリマーである場合、未反応モノマーは、商業的なジビニルベンゼンにおける一般的な不純物である未重合エチルビニルベンゼン（ＥＶＢ）、およびおそらくは未反応スチレンも含み得る。商業的なジビニルベンゼンは典型的には５５％から８０％の純度を有し、残りは主にエチルビニルベンゼンからなる。好ましくは、少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％の純度を有するジビニルベンゼンが用いられる。
【００７３】
本発明において用いられるポリマービーズは、一般に、２００ミクロン（μｍ）以下、好ましくは１７０μｍｎ以下、さらに好ましくは１５０μｍ以下、さらに好ましくは１２５μｍ以下、最も好ましくは１００μｍ以下の粒子直径を有する球状コポリマービーズである。好ましくは、ビーズは３μｍより大きな直径を有するボイドスペース、さらに好ましくは２μｍより大きな直径を有するボイドスペース、最も好ましくは１μｍより大きな直径を有するボイドスペースを有しない。典型的には、ボイドスペースは、光学顕微鏡などの技術によりビーズの表面を観察することにより容易に明らかになる。
【００７４】
本発明において使用されるポリマービーズは、好ましくは懸濁重合により製造される。典型的なビーズの調製法は、例えば、分散剤、保護コロイドおよび緩衝剤などの典型的な懸濁助剤を含む連続水性相溶液の調製を包含しうる。好ましくは、本発明の比較的小さなビーズの製造に役立つためには、界面活性剤、好ましくはアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤を水性溶液中に配合し、重合プロセス中激しい撹拌を維持する。水性溶液を、少なくとも１つのビニルモノマー、少なくとも１つの架橋剤および少なくとも１つのフリーラジカル開始剤を含有するモノマー混合物と合わせる。好ましくは、開始剤の合計量は、合計モノマーチャージに基づいて０．２５モル％から１．５モル％、好ましくは０．４モル％から１モル％、さらに好ましくは０．４モル％から０．８モル％、最も好ましくは０．５モル％から０．７モル％である。反応容器中の雰囲気（ヘッドスペース）中の酸素量が５％未満、好ましくは３％未満、さらに好ましくは２％未満、最も好ましくは１％未満になるまで不活性気体を導入することにより、混合物は酸素の大部分をパージされる。好ましくは、不活性ガスは水性溶液及びモノマー混合物、並びにヘッドスペースに導入される。モノマーの混合物を次いで高温で重合させる。好ましくは、未反応ビニルモノマー含量を出発物質量の１％未満にまで減少させるために十分な時間、重合を続ける。結果として得られるビーズを次いで公知手段、例えば脱水、非プロトン性有機溶媒での洗浄、および乾燥により単離する。
【００７５】
１以上のモノマーがフェノール系重合禁止剤を含む場合、懸濁重合混合物の水性相は、できるだけ多くモノマー相からフェノール系禁止剤を抽出するために、９〜１１．５のｐＨに維持される。好ましくは、水性相のｐＨは９．５〜１１である。
【００７６】
架橋剤は、一分子当たり２以上の共重合可能な炭素−炭素二重結合を有するモノマー、例えば：ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、トリビニルベンゼン、トリビニルシクロヘキサン、ジビニルナフタレン、トリビニルナフタレン、ジエチレングリコールジビニルエーテル、エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、アリルメタクリレート、１，５−ヘキサジエン、１，７−オクタジエンまたは１，４−ビス（４−ビニルフェノキシ）ブタンであり；前記架橋剤のそれぞれの様々な位置異性体が好適であると理解される。好ましい架橋剤は、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、トリビニルベンゼンまたは１，４−ビス（４−ビニルフェノキシ）ブタンである。最も好ましい架橋剤はジビニルベンゼンである。
【００７７】
本発明において用いられるビーズの調製において用いることができる適当な一不飽和ビニル芳香族モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル置換スチレンおよびビニルナフタレンが挙げられ；好ましくは、１以上の一不飽和ビニル芳香族モノマーは、スチレンおよび（Ｃ１−Ｃ４）アルキル置換スチレンからなる群から選択される。好適な（Ｃ１−Ｃ４）アルキル置換スチレンは、例えば、エチルビニルベンゼン、ビニルトルエン、ジエチルスチレン、エチルメチルスチレン、ジメチルスチレンおよびビニルベンジルクロリドの異性体であり；前記ビニル芳香族モノマーのそれぞれの様々な位置異性体が好適であると理解される。
【００７８】
任意に、非芳香族ビニルモノマー、例えば、脂肪族不飽和モノマー、例えば、アクリロニトリル、グリシジルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、および（メタ）アクリル酸のアミドまたは（メタ）アクリル酸のＣ１−Ｃ６アルキルエステルもビニル芳香族モノマーに加えて用いることができる。使用される場合、非芳香族ビニルモノマーは、典型的には、コポリマーを形成するために使用される全モノマー重量に基づいて、重合単位として０〜２０％、好ましくは０〜１０％、さらに好ましくは０〜５％のコポリマーを含む。
【００７９】
好ましくは、ビニルモノマーはビニル芳香族モノマーであり；さらに好ましくはスチレン、ビニルベンジルクロリドの異性体、およびα−メチルスチレンである。最も好ましいビニルモノマーはスチレンである。
【００８０】
本発明において用いられるビーズの調製に有用な重合開始剤としては、モノマー可溶性開始剤、例えば、ペルオキシド、ヒドロペルオキシド、ペルオキシエステルおよび関連する開始剤；例えば、ベンゾイルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンペルオキシド、テトラリンペルオキシド、アセチルペルオキシド、カプロイルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルオクトエート（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエートとしても知られる）、ｔｅｒｔ−アミルペルオクトエート、ｔｅｒｔ−ブチルペルベンゾエート、ｔｅｒｔ−ブチルジペルフタレート、ジシクロヘキシルペルオキシジカーボネート、ジ（４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル）ペルオキシジカーボネートおよびメチルエチルケトンペルオキシドが挙げられる。アゾ開始剤、例えば、アゾジイソブチロニトリル、アゾジイソブチルアミド、２，２’−アゾ−ビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾ−ビス（α−メチル−ブチロニトリル）およびジメチル−、ジエチル−またはジブチルアゾ−ビス（メチルバレレート）も有用である。好ましいペルオキシド開始剤は、ジアシルペルオキシド、例えば、ベンゾイルペルオキシド、およびペルオキシエステル、例えばｔｅｒｔ−ブチルペルオクトエートおよびｔｅｒｔ−ブチルパーベンゾエートである。
【００８１】
本発明において有用な分散剤および懸濁化剤は、ヒドロキシアルキルセルロース主鎖、１から２４、平均１〜８、好ましくは１〜５の炭素原子を含有する疎水性アルキル側鎖、ヒドロキシアルキル−セルロース主鎖の各繰り返し単位を置換するエチレンオキシド基を有する非イオン性界面活性剤であり、該アルキル側鎖は、ヒドロキシアルキルセルロース主鎖における１００の繰り返し単位あたり０．１〜１０アルキル基の量で存在する。ヒドロキシアルキルセルロース中のアルキル基は、１〜２４個の炭素を含むことができ、直鎖、分岐鎖または環状であってよい。さらに好ましいのは、１００無水グルコースあたり０．１〜１０（Ｃ１６）アルキル側鎖を含有するヒドロキシエチルセルロースであり、約２．５〜４エチレンオキシド基は各無水グルコース単位を置換する。分散剤の典型的な使用量は、全水性相重量に基づいて約０．０１〜約４％である。
【００８２】
任意に、ビーズの調製は、重合中使用された分散剤および懸濁剤をポリマー表面から除去するための酵素処理を含んでもよい。酵素処理は典型的には、ポリマー相を酵素物質（１以上のセルロース分解酵素およびタンパク質分解酵素から選択される）と重合中、重合後またはポリマーを単離した後に接触させることを含む。ポリマー樹脂の調製中の酵素の使用に関するさらに一般的および具体的な詳細については、日本国特願昭６１−１４１７０４および５７−９８５０４が参照できる。適当な酵素としては、例えば、セルロースベースの分散剤系に関しては、β−１，４−グルカン−４−グルカノ−ヒドラーゼ、β−１，４−グルカン−４−グルカンヒドロラーゼ、β−１，４−グルカン−４−グルコヒドラーゼおよびβ−１，４−グルカン−４−セロビヒドラーゼなどのセルロース分解酵素；ゼラチンベースの分散剤系に関しては、ウロキナーゼ、エラスターゼおよびエンテロキナーゼなどのタンパク質分解酵素が挙げられる。典型的には、ポリマーに対して用いられる酵素の量は、ポリマーの全重量基準で、２〜３５％、好ましくは５〜２５％、さらに好ましくは１０〜２０％である。
【００８３】
好ましい態様において、本発明において用いられるビーズは、５μｍより大きな直径を有するボイドスペースを有さないわずかに架橋されたポリマービーズであり；該ビーズは（ａ）容器中で、（ｉ）少なくとも１つのビニルモノマーと少なくとも１つの架橋剤を含むモノマー混合物；および（ｉｉ）０．２５モル％から１．５モル％の少なくとも１つのフリーラジカル開始剤を含む懸濁重合混合物を調製する工程；および（ｂ）容器中に５％以下の酸素を含有する雰囲気が生じるために十分な時間不活性気体を導入することにより懸濁重合混合物および容器から酸素を除去する工程；（ｃ）モノマー混合物を重合させる工程；および（ｄ）ビーズを非プロトン性有機溶媒で洗浄する工程を含む方法により製造される。好ましくは、このプロセスにしたがって調製されるビーズは、４μｍより大きな直径を有するボイドスペース、さらに好ましくは３μｍより大きな直径を有するボイドスペース、最も好ましくは１μｍより大きな直径を有するボイドスペースを有さない。好ましくは、ビーズは５％未満、さらに好ましくは３％未満、さらに好ましくは２％未満、最も好ましくは１％未満の有機抽出物を有する。好ましくは、ビーズは４％未満、さらに好ましくは３％未満、さらに好ましくは２％未満、最も好ましくは１％未満の残留モノマーを有する。
【００８４】
理論に限定されることを望まないが、本発明のプロセスは以前の公知プロセスよりも、より完全な重合を促進し、従ってビーズ中に存在する抽出可能な有機物質の量を減少させ、従って非プロトン性有機溶媒で洗浄した後にビーズにおけるボイドスペースの形成も減少させる。
【００８５】
樹脂調製例
脱イオン（ＤＩ）水を丸底フラスコに入れ、１５０ｒｐｍで撹拌し、窒素スイープ下で８０℃に加熱した。該温度に達したら、フラスコにゆっくりと４．４０ｇのＱＰ−３００（ヒドロキシエチルセルロース分散剤、Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｃｏ．，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＷＶから入手）を入れた。温度を８０℃に６０分間維持し、その後、水性溶液を２５℃〜３０℃に冷却した。次のものをフラスコに入れた：２００ｇのＤＩ水および０．９５ｇのＭａｒａｓｐｅｒｓｅ  Ｎ−２２（ナトリウムリグノスルフェート分散剤、Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ  ＬｉｇｎｏＴｅｃｈ，Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ，ＷＩから入手）の溶液、２．４ｇの５０％ＮａＯＨ、２．５ｇのホウ酸、０．０３６ｇのラウリル硫酸ナトリウムおよび０．１ｇの亜硝酸ナトリウム。フラスコの内容物を３０分間撹拌した。もう一つの実施例において、Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ＭＨＥＣ８０００（ヒドロキシエチルセルロース分散剤、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから入手）をＱＰ−３００、Ｍａｒａｓｐｅｒｓｅ  Ｎ−２２および塩と置換することができる。
【００８６】
次のものを入れることにより別のビーカー中でモノマー混合物を調製した：６．５５ｇの８０％ＤＶＢ（ジビニルベンゼン）、４４０．０ｇのスチレン、５．８ｇのＴｒｉｇｏｎｏｘ２１（ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、Ｎｏｕｒｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｕｒｔ，ＮＹから入手）。混合物を添加漏斗に移し、窒素を４０分間スパージした。
【００８７】
モノマー混合物をフラスコに入れる前に、水性相を含む丸底フラスコ中のアジテーターの速度を２７５ｒｐｍに調節した。アジテーターを停止し、モノマー溶液に空気を導入しないよう添加漏斗の位置に気をつけながらモノマー混合物を水性溶液に入れた。モノマー混合物を入れた後、撹拌を再開し、２５℃で３０分間続けた。温度を１時間かけて８４℃に上昇させ、この温度で１２時間保持した。
【００８８】
バッチを４５℃に冷却し、ｐＨをＨＣｌ（３７％）で５．０に調節した。セルラーゼ４０００（１９．０５ｇ）（セルラーゼ酵素、Ｖａｌｌｅｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ，ＩＮから入手）をバッチに入れ、４５℃で２時間撹拌した。２時間保持した後、二回目のセルラーゼ４０００を添加し、温度を４５℃に２時間保持した。保持期間の最後に、バッチを室温に冷却し、フラスコから取り出し、ＤＩ水で洗浄した。
【００８９】
典型的には、ポリマービーズの収率は約９０％であり、アジテーターへの付着または水性相中への分散のために一部のポリマーは失われた。残存するモノマーの量は、表に示すように、窒素での不活化の完全性、ＤＶＢの純度、および開始剤レベルを含むいくつかのパラメーターによって変わる。反応物質または反応容器の不活化は記載した以外は行わなかった。
【００９０】
【表８】
2004269524.tif 000009
【００９１】
典型的には、ポリマーを以下の手順にしたがって洗浄する。直径４．４ｃｍ、長さ５０ｃｍのカラムに１００ｍＬのコポリマーをロードする。コポリマーを８ベッド体積の非プロトン性有機溶媒で０．５ベッド体積／時の流速で下向きの流れで洗浄する。ベッドを４ベッド体積のメタノールまたは水で０．５ベッド体積／時の流速で、下向きの流れで洗浄する。ベッドを窒素の気流中で乾燥し、４５℃で１８時間真空下で乾燥する。
【００９２】
本発明の一態様において、使用した樹脂は、０．５モル％から２モル％の架橋剤を有するポリマーを有する架橋したポリマービーズを含む。ビーズは２００μｍ以下の直径を有し、５μｍより大きな直径を有するボイドスペースはなく、５重量％未満の有機抽出物を有する。もう一つの態様において、ポリマーは０．５％から１．６％の架橋剤を有し、ビーズは１７０μｍ以下の直径を有する。本発明の一態様において、ポリマーはジビニルベンゼン架橋剤を有するスチレンポリマーである。ポリマーは０．７モル％から１．２モル％の架橋剤を有し、ビーズは３μｍより大きな直径を有するボイドスペースを有さず、３重量％未満の有機抽出物を有しうる。例として、架橋したポリマービーズは１５０μｍ以下の直径を有する。
【００９３】
本発明において使用される樹脂を製造するもう一つの例は、次の方法を使用する：（ａ）容器中で懸濁重合混合物を調製する。混合物は：（ｉ）少なくとも１つのビニルモノマーと少なくとも１つの架橋剤を含むモノマー混合物；および（ｉｉ）０．２５モル％〜１．５モル％の少なくとも１つのフリーラジカル開始剤を含む。方法は次に、容器中に５％以下の酸素を含む雰囲気を生じるために十分な時間不活性ガスを導入することにより、懸濁重合混合物および容器から酸素を除去し；モノマー混合物を重合させ；ビーズを非プロトン性有機溶媒で洗浄することを含む。モノマー混合物は任意に０．５モル％〜２モル％の少なくとも１つの架橋剤を含み、容器中の雰囲気は任意に２％以下の酸素を含む。
【００９４】
任意に、一態様において、ビーズは、少なくとも９０モル％のスチレンを有する少なくとも１つのビニルモノマーを含む。架橋剤はジビニルベンゼンを含み、ビーズは２００μｍ以下の直径を有する。
【００９５】
Ｔ−２０例
この実施例は、米国特許第６．０１５，８８１号、表１にペプチドＮｏ．７として記載されている、アミノ酸１８〜３５を含むＴ−２０と呼ばれるペプチドの９アミノ酸フラグメントの調製を説明する。米国特許第６，０１５，８８１号は完全に記載されているものとして本発明の一部として参照される。反応速度は、カップリングおよび任意の未反応第一アミンの存在を確認するためのＫａｉｓｅｒ試験中、樹脂を定期的にサンプリングすることにより追跡される。前記の樹脂は、ロードされた樹脂の生成において、また次にペプチドの構築において使用される。以下の実施例は、ペプチド構築物の例を示す。この実施例の結果を表４に示す。ペプチド構築物の様々な組み合わせは本明細書に記載された技術を用いて構築できると理解される。
【００９６】
本明細書に記載される方法は、非常に低コストで効率のよいペプチド、特にＴ−２０、Ｔ−２０様ペプチドの合成のために使用できる。このような方法は、特定のペプチドフラグメント群を合成し、組み合わせて、目的のペプチドを得るために、固相および液相合成法を利用する。もう一つの態様において、目的のペプチド（例えば、Ｔ−２０）の合成において中間体として作用する個々のペプチドフラグメントも生成される。さらにもう一つの態様において、本発明は、完全長Ｔ−２０およびＴ−２０様ペプチドを産生するために一緒に利用できるこのようなペプチド中間体フラグメント群を生成する。当業者は、多くのさらに小さなフラグメントの集合を含むＴ−２０を含むがこれに限定されないペプチドを産生するためのサイクル時間も、凝集体において実質的に減少することを理解するであろう。サイクル時間が減少するためでなく、廃棄物も大幅に減少し、効率は大きく増大する。
【００９７】
もう一つの態様において、本明細書において記載されるプロセスにより生成されるペプチドまたはペプチドのフラグメントが精製され、および／または対象となるペプチドの合成において中間体として作用する個々のペプチドフラグメントも精製される。
【００９８】
さらに、本発明は融合に関連する事象を阻害する能力を示し、重要なことには有効な抗ウイルス活性も示すペプチドおよびペプチドフラグメントを生成するためにも使用できる。これらのペプチドおよびペプチドフラグメントは米国特許第５，４６４，９３３号；第５，６５６，４８０号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１９４９５（本発明の一部として参照される）に記載されている。本発明は、大きなスケール量においてこれらの治療薬を生成する方法を提供する。
【００９９】
Ｔ−２０およびＴ−２０フラグメントは、特定のペプチドフラグメント群を合成し、組み合わせて、目的のペプチドを得るために、固相および液相合成法を用いて調製される。一般に、本発明の方法は、本明細書に記載された本発明により調製された固体支持体上でＴ−２０またはＴ−２０様ペプチドの特定の側鎖保護されたペプチドフラグメント中間体を合成し、保護されたフラグメントを溶液中でカップリングして、保護されたＴ−２０またはＴ−２０様ペプチドを形成し、続いて側鎖を脱保護して、最終Ｔ−２０またはＴ−２０様ペプチド得ることを含む。本発明の方法の好ましい具体例は、米国特許第６，０１５，８８１号（’８８１特許）におていて示されるようなアミノ酸配列を有するＴ−２０ペプチドの合成を含む。
【０１００】
本発明はさらに、目的のペプチド（例えば、Ｔ−２０）の合成において中間体として作用する個々のペプチドフラグメントにも関する。本発明のペプチドフラグメントは、これらに限定されないが、‘８８１特許に記載されるようなアミノ酸配列を有するものを含む。
【０１０１】
本発明は、ＣＴＣ樹脂を使用する公知技術を用いて、１以上のペプチドフラグメントを形成し、本発明者らの特許出願（Ｂｏｈｌｉｎｇらにより２００３年２月１２日提出、標題「アミノ酸ロードされたトリチルアルコール樹脂、アミノ酸ロードされたトリチルアルコール樹脂の製造法、およびこれにより製造される生物学的に活性な物質および治療薬」、整理番号ＤＮ  Ａ０１４８５）に記載されるようなアルコールベースの樹脂を使用し、本明細書に記載される技術を用いて１以上のペプチドフラグメントを形成することもできると理解される。結果として得られるペプチドをその後組み合わせて、Ｔ−２０ペプチドまたはＴ−２０様ペプチドを得ることができる。
【０１０２】
本発明の方法、フラグメントおよびフラグメント群ならびにフラグメントおよびフラグメント群を選択するために用いられる技術は、Ｔ−２０に加えてＴ−２０様フラグメントを合成するために用いることができる。本発明において用いられる「Ｔ−２０様」なる用語は、米国特許第５，４６４，９３３号；第５，６５６，４８０号またはＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１９４９５（それぞれは全体として本発明の一部として参照される）に記載されている任意のＨＩＶまたは非ＨＩＶペプチドを意味する。
【０１０３】
本発明に記載されているＴ−２０およびＴ−２０様ペプチドに加えて、本発明の方法、本発明のフラグメントおよびフラグメント群を、修飾されたアミノおよび／またはカルボキシル末端を有するペプチドを合成するために用いることができる。
【０１０４】
好ましい態様において、本発明の方法は、Ｘがアセチル基であり、Ｚがアミド基である式を有するペプチドを合成するために使用される。好ましい方法において、Ｔ−２０およびＴ−２０様ペプチドおよび中間体は、これらに限定されないが、ジルコニウムベースのパッキング、ポリスチレン、ポリアクリルまたは高い（７より高い）ｐＨ範囲で安定な他のポリマーベースのパッキングを包含する非シリカベースのカラムパッキング（ローディング容量を最大にするために）を用いて精製することができる。例えば、広いｐＨ範囲を示す非シリカ負荷カラムパッキングの中でも、これよりも高いｐＨ値を含むものがＴｏｓｏｈａｕｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）により販売されている。かかる物質で充填されているカラムは、低、中または高圧クロマトグラフィーにかけることができる。
【０１０５】
本発明はさらに、‘８８１特許の前記表１に記載されているような特定のアミノ酸配列を有するＴ−２０およびＴ−２０様ペプチドのペプチドフラグメント中間体、および‘８８１特許の表２に記載されているペプチドフラグメント中間体群の大規模の有効な製造法を提供する。かかるペプチド中間体、特に’８８１特許の表２に記載されている群は、Ｔ−２０およびＴ−２０様ペプチドを製造するために用いられる。
【０１０６】
ペプチドフラグメントのアミノ酸残基の任意の１以上の側鎖は、標準的保護基、例えば、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、トリチル（ｔｒｔ）およびｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護することができる。ｔ−Ｂｕ基はアミノ酸残基Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）およびＡｓｐ（Ｄ）の好ましい側鎖保護基であり；ｔｒｔ基はアミノ酸残基Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、およびＡｓｎ（Ｎ）の好ましい側鎖保護基であり；Ｂｏｃ基はアミノ酸残基Ｌｙｓ（Ｋ）およびＴｒｐ（Ｗ）の好ましい側鎖保護基である。
【０１０７】
フラグメントの合成中、ヒスチジン残基の側鎖は、好ましくはトリチル（ｔｒｔ）保護基で保護される。保護されないならば、樹脂からペプチドフラグメントを開裂させるために用いられる酸は、ヒスチジン残基と不利益な反応をし、ペプチドフラグメントの分解を引き起こしうる。
【０１０８】
本発明のペプチドフラグメントのグルタミン残基はトリチル（ｔｒｔ）基で保護される。しかしながら、あるフラグメントのカルボキシ末端でグルタミン残基を保護しないことも可能である。本発明の各ペプチドフラグメントの全てのアスパラギン残基は保護することができる。加えて、トリプトファン残基はＢｏｃ基で保護することができる。個々のペプチドフラグメントは本明細書に記載される固相合成技術を用いて調製できるものもあれば、任意に固相および溶液相合成技術の組み合わせを用いて製造することができるものもある。本発明のペプチドは別法として、ペプチドのアミノ酸残基を連結する１以上の結合が非ペプチド結合であるように合成することができる。これらの別の非ペプチド結合は、当業者に周知の反応を用いることにより形成することができ、これらに限定されないが数例を挙げると、イミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジド、およびアゾ結合が挙げられる。
【０１０９】
本発明のさらにもう一つの具体例において、例えば、ペプチドの安定性、反応性および／または溶解性が向上されるように、そのアミノおよび／またはカルボキシ末端にさらなる化学基が存在する前記の配列を含むＴ−２０およびＴ−２０様ペプチドを合成することができる。例えば、カルボベンズオキシル、ダンシル、アセチルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル基などの疎水性基をペプチドのアミノ末端に付加することができる。同様に、アセチル基または９−フルオレニルメトキシメトキシ−カルボニル基をペプチドのアミノ末端におくことができる。さらに、疎水性基、ｔ−ブチルオキシカルボニル、またはアミド基をペプチドのカルボキシ末端に付加することができる。同様に、パラ−ニトロベンジルエステル基をペプチドのカルボキシ末端におくことができる。
【０１１０】
さらに、その立体構造が変更されるようにＴ−２０およびＴ−２０様ペプチドを合成することができる。たとえば、通常のＬ−異性体ではなく、ペプチドの１以上のアミノ酸残基のＤ−異性体を用いることができる。
【０１１１】
さらに、本発明のペプチドの少なくとも一つのアミノ酸残基を周知の天然に存在しないアミノ酸残基の一つにより置換することができる。これらのような変更は、本発明のペプチドの安定性、反応性および／または溶解性を増大させる働きをしうる。
【０１１２】
好ましくは、本発明の１以上のペプチドフラグメントは、本明細書に記載されている固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）技術により標準的ＦＭＯＣプロトコルを用いて合成される。たとえば、Ｃａｒｐｉｎｏら、１９７０、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９２（１９）：５７４８−５７４９；Ｃａｒｐｉｎｏら、１９７２、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３７（２２）：３４０４−３４０９参照。
【０１１３】
公知技術を用いた樹脂の製造およびローディングのための一般法を、本明細書に記載した新規技術に加えて、またはこれと組み合わせて用いることができる。いくつかのフラグメントは、たとえば以下の技術により行われる樹脂ローディングを用いて調製することができる：樹脂、好ましくは超酸感受性樹脂、たとえば、２−クロロトリチル樹脂を反応チャンバーに入れる。樹脂を塩素化溶媒、たとえばジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗浄する。ベッドをドレインし、１．５当量のアミノ酸および２．７当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の８〜１０体積のジクロロエタン（ＤＣＥ）中溶液を添加する。アミノ酸のＮ−末端は、好ましくはＦｍｏｃで保護すべきであり、アミノ酸の側鎖は必要または適当ならば保護すべきである。窒素をバブリングしながら混合物を２時間攪拌する。攪拌後、ベッドをドレインし、ＤＣＭで洗浄する。樹脂上の活性部位を９：１ＭｅＯＨ：ＤＩＥＡ溶液で約２０〜３０分間エンドキャップする。ベッドをドレインし、ＤＣＭで４回洗浄し、窒素パージで乾燥して、ロードされた樹脂を得る。次いで標準的洗浄、脱保護、カップリングおよび開裂プロトコルに従ってフラグメントを構築する。他のフラグメントは、本明細書に記載する新規技術を用いて調製される。様々な技術により調製されるフラグメントを次いで記載されるように組み合わせる。
【０１１４】
Ｆｍｏｃはアミノ酸のＮ−末端の好ましい保護基である。どのアミノ酸がロードされるかによって、その側鎖を保護してもよいし、保護しなくてもよい。例えば、Ｔｒｐがロードされる場合、その側鎖はＢｏｃで保護するべきである。同様に、Ｇｌｎの側鎖はｔｒｔで保護することができる。しかしながら、Ｇｌｎが１〜１６ペプチドフラグメントの合成のための調製においてロードされる場合、その側鎖は保護するべきでない。Ｌｅｕの側鎖を保護する必要はない。
【０１１５】
樹脂のローディングおよびペプチド合成において用いられるＦｍｏｃ−保護されたアミノ酸は、必要に応じて側鎖保護基の有無にかかわらず、ＳｅｎｎまたはＧｅｎｚｙｍｅから入手可能である。米国特許第６，２８１，３３１号（完全に記載されているものとして本発明の一部として参照される）において記載されるペプチドおよびフラグメントの他の例は、本明細書に記載された新規技術を、単独または他の通常の技術と組み合わせて用いて製造することができる。
【０１１６】
Ｔ−１２４９例
本明細書に記載されるプロセスおよび基体はまた、米国特許第６，４６９，１３６号（’１３６特許）（本発明の一部として参照される）に記載されているポリペプチドを構築するためにも用いることができる。特に、本発明においてＴ−１２４９およびＴ−１２４９様ペプチドと称するペプチドは、本明細書に記載される新規方法を、単独または本明細書に記載される公知方法と組み合わせて用いることができる。これらの方法は、目的のペプチドを得るために特定のペプチドフラグメント群を合成し、組み合わせるために、固相および液相合成法を利用する。
【０１１７】
ペプチド、特に本発明においてＴ−１２４９およびＴ−１２４９様ペプチドと称するペプチドを合成するための新規方法を本明細書において記載する。これらの方法は、目的のペプチドを得るために特定のペプチドフラグメント群を合成し、組み合わせるために、固相および液相合成法を利用する。一般に、方法は、Ｔ−１２４９またはＴ−１２４９様ペプチドの特定の側鎖が保護されたペプチドフラグメント中間体を固体支持体上で合成し、溶液中で、保護されたフラグメントをカップリングさせて、保護されたＴ−１２４９またはＴ−１２４９様ペプチドを形成することを含み、続いて側鎖を脱保護して、最終Ｔ−１２４９またはＴ−１２４９様ペプチドを得る。本発明の方法の好ましい具体例は、‘１３６特許に記載されているようなアミノ酸配列を有するＴ−１２４９ペプチドの合成を含む。
【０１１８】
本発明はさらに、目的のペプチド（例えば、Ｔ−１２４９）の合成において、中間体として作用する個々のペプチドフラグメントを構築するための、低コストで、効率の高い方法を提供する。本発明のペプチドフラグメントは、これらに限定されないが、‘１３６特許の表１に記載されるアミノ酸配列を有するものを包含する。本発明において記載される固相液相合成反応の組み合わせは、高純度のＴ−１２４９およびＴ−１２４９様ペプチドを大規模に、当該分野において記載されているものよりも高いスループットと高い収率で製造することを可能にする。Ｔ−１２４９およびＴ−１２４９様ペプチドは、１キログラム以上のスケールで合成することができる。
【０１１９】
完全長ペプチドの調製
本発明は、Ｔ−１２４９と呼ばれるペプチドを合成するために用いられる。Ｔ−１２４９は、その配列が、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ  ｇｐ４１ウイルスポリペプチド配列由来である３９アミノ酸残基ポリペプチドである。本発明の方法、フラグメントおよびフラグメント群ならびにフラグメントおよびフラグメント群を選択するために用いられる技術をＴ−１２４９に加えてＴ−１２４９様フラグメントを合成するために用いることができると理解される。本発明において用いられる「Ｔ−１２４９様」なる用語は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１１２１９（１９９９年５月２０日提出）、国際特許公開番号ＷＯ９９／５９６１５（１９９９年１１月２５日公開）（その全体は本発明の一部として参照される）に記載されている任意のＨＩＶまたは非ＨＩＶペプチドを意味する。
【０１２０】
前記のＴ−１２４９およびＴ−１２４９様ペプチドに加えて、本発明の方法、フラグメントおよびフラグメント群を、修飾されたアミノおよび／またはカルボキシル末端を有するペプチドまたは高および低ｐＨ範囲で安定な他のポリマーベースパッキングを合成するために用いることができる。
【０１２１】
ペプチド中間体
‘１３６特許の表１に記載される特定のアミノ酸配列を有するＴ−１２４９およびＴ−１２４９様ペプチドの１以上のペプチドフラグメント中間体、および‘１３６特許の表２に記載される１以上のペプチドフラグメント中間体群も、本明細書に記載される新規プロセスを単独または他の技術プロセスと組み合わせて用いて調製される。
【０１２２】
ペプチド合成
個々のペプチドフラグメントは好ましくは固相合成技術を用いて調製されるが、本発明の他のペプチドは、任意に固相および溶液相合成技術の組み合わせを用いて調製してもよい。該合成法によりＴ−１２４９またはＴ−１２４９様ペプチドが製造される。
【０１２３】
本発明のペプチドは別法として、ペプチドのアミノ酸残基を結合する１以上の結合が非ペプチド結合であるように合成することができる。これらの別の非ペプチド結合は、当業者に周知の反応を利用して形成することができ、これらに限定されないが、数例を挙げると、イミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジド、およびアゾ結合を包含する。さらに、Ｔ−１２４９およびＴ−１２４９様ペプチドは、その立体配置が変更されるように合成することができる。例えば、通常のＬ−異性体でなく、ペプチドの１以上のアミノ酸残基のＤ−異性体を用いることができる。さらに、本発明のペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１つは、周知の天然に存在しないアミノ酸残基の一つで置換することができる。これらのような別法は、本発明のペプチドの安定性、反応性および／または溶解度を増大させる働きをしうる。任意のＴ−１２４９またはＴ−１２４９様ペプチドは、そのアミノおよび／またはカルボキシ末端と共有結合する巨大分子キャリア基をさらに有するように合成することができる。このような巨大分子キャリア基は、例えば、脂質−脂肪酸接合体、ポリエチレングリコール、炭水化物またはさらなるペプチドを包含する。
【０１２４】
アミノ酸がロードされた樹脂は、本明細書に記載される新規技術を用いて調製される。撹拌後、ベッドをドレインし、ＤＣＭで洗浄する。ベッドをドレインし、ＤＣＭで４回洗浄し、窒素パージで乾燥して、ロードされた樹脂を得る。
【０１２５】
Ｆｍｏｃはアミノ酸のＮ−末端について好ましい保護基である。ロードされるアミノ酸に応じて、その側鎖は保護してもよいし、保護しなくてもよい。たとえば、トリプトファン（Ｔｒｐ）がロードされる場合、その側鎖はＢｏｃで保護されるべきである。しかしながら、ロイシン（Ｌｅｕ）の側鎖は保護する必要がない。好ましくは、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、スレオニン（Ｔｈｒ）およびセリン（Ｓｅｒ）はｔ−ブチルエーテルまたはｔ−ブチルエステルとして保護され、トリプトファン（Ｔｒｐ）およびリシンはｔ−ブトキシカルボニルカーバメート（Ｂｏｃ）として保護される。アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）のアミド側鎖はトリチル基で保護してもよいし、保護しなくてもよい。
【０１２６】
一方、樹脂に添加される配列の次のアミノ酸は、そのカルボキシ末端で反応について活性化される。各アミノ酸のアミン末端はＦｍｏｃで保護されるべきである。どのアミノ酸が付加されるかにより、その側鎖は保護してもよいし、保護しなくてもよい。好ましくは、ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｇｌｕ（Ｅ）およびＡｓｐ（Ｐ）の側鎖は、ｔ−Ｂｕで保護され、Ｇｌｎ（Ｑ）およびＡｓｎ（Ｎ）の側鎖はｔｒｔで保護され、Ｌｙｓ（Ｋ）およびＴｒｐ（ｗ）の側鎖はＢｏｃで保護される。ＬｅｕまたはＩｌｅの側鎖を保護する必要はない。
【０１２７】
アミノ酸は次のようにして活性化することができる。Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸（１．５当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）（１．５当量）、およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１．５当量）を、極性非プロトン性溶媒、例えば、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）（約７．５体積）中に室温で溶解させる。溶液を０〜５℃に冷却し、次いでＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）またはＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−テトラメチルテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）（１．５当量）を添加し、続いて５〜１５分間撹拌して溶解させる。アミノ酸のラセミ化を最小限に抑えるために、活性化を０〜５℃で行うのが重要である。活性化およびラセミ化はＨＢＴＵの非存在下で起こり得ないので、ＨＢＴＵは冷溶液に最後に添加される試薬である。
【０１２８】
活性化されたアミノ酸の溶液を、ドレインした樹脂に添加し、ＤＣＭ（約２．５体積）で洗浄する。アミノ酸の活性化は、ＨＢＴＵがＤＣＭ中に溶解しないために、ＮＭＰ中で行われる。しかしながら、ＤＣＭは樹脂ビーズの適当な膨潤を維持するためにこの時点で反応に添加される。約１時間２０〜３０℃でＮ２をバブリングしながら反応物を撹拌する。
【０１２９】
樹脂がカップリングサイクル間で一夜貯蔵されるならば、樹脂ベッドをドレインし、窒素ブランケット下で、ＮＭＰで覆うことができる。別法として、ベッドをドレインし、窒素ブランケット下で貯蔵し、次いで次のカップリングサイクルに進む前にＤＣＭ洗浄で調整することができる。完成したフラグメントが開裂前に一夜貯蔵されるならば、著しいＦｍｏｃ脱保護がＮＭＰ中で起こり得るので、樹脂ベッドをＩＰＡで洗浄してＮＭＰを除去されるべきである。
【０１３０】
カップリングが完了したと判断された後、樹脂をドレインし、３回のＮＭＰ（約１０体積）で洗浄する。サイクルをペプチドフラグメントの次の単位（すなわち、アミノ酸）について繰り返す。最終カップリング反応後、樹脂を４回のＮＭＰ（約１０体積）、次いで２回の（約１０体積）ＤＣＭで、２回のＩＰＡで洗浄する。樹脂と結合したペプチドを窒素パージまたはオーブン中で乾燥させることができる。
【０１３１】
固相合成技術により合成されたペプチドを、例えば以下の非制限的技術に従って開裂させ、単離することができる：ペプチドは、当業者に周知の技術を用いて樹脂から開裂させることができる。例えば、ペプチドを開裂させるために、１％または２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のＤＣＭ中溶液または１％および２％ＤＣＭ中ＴＦＡ溶液の組み合わせを用いることができる。酢酸（ＨＯＡＣ）、塩酸（ＨＣｌ）または蟻酸もペプチドを開裂させるために用いることができる。開裂に必要な特定の開裂試薬、溶媒および時間は、開裂される特定のペプチドによって変わる。開裂後、開裂フラクションは、標準的ワークアップ手順にかけて、ペプチドを単離する。典型的には、組み合わされた開裂フラクションを真空下で濃縮し、続いて極性非プロトン性または極性非プロトン性溶媒、例えば、エタノール（ＥｔＯＨ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、アセトン、アセトニトリル（ＡＣＮ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ＮＭＤ、ＤＭＡＣ、ＤＣＭなどで再構築し、続いて非溶媒、例えば、水またはヘキサンで沈殿または結晶化させ、真空濾過により集める。別法として、ペプチドの単離後、生成物を有機溶媒または水で磨砕してもよい。
【０１３２】
完全長Ｔ−１２４９ペプチドを合成するために、ペプチド中間体を一緒にカップリングさせて、Ｔ−１２４９ペプチドを得ることができる。例えば、本明細書に記載された１以上の方法を用いて、前記ペプチド中間体群を一緒にカップリングさせて、Ｔ−１２４９完全長ペプチドを製造することができる。
【０１３３】
一態様において、Ｔ−１２４９を合成するための３フラグメントアプローチを行うことができる。「３フラグメントアプローチ」合成とは、３つのＴ−１２４９中間体ペプチドフラグメントから出発するＴ−１２４９合成スキームを意味し、このフラグメントは固相および液相合成技術を用いて合成され、カップリングされて、完全長Ｔ−１２４９ペプチドになる。
【０１３４】
固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）；一般的手順
ＳＰＰＳチャンバーにＦｍｏｃＬｅｕ樹脂（１当量）を添加する。樹脂を５％ピペリジンＤＣＭ（７．５体積）中で窒素をパージしながら１５〜３０分間調整する。溶媒をドレインし、樹脂は２０％のＮＭＰ中ピペリジン（５体積）で３０分間処理を２回されて、Ｆｍｏｃ保護基を除去する。２回目の２０％ピペリジン／ＮＭＰ処理後、樹脂を５〜７回ＮＭＰ（５体積）で洗浄し、コラニル（ｃｈｏｒａｎｉｌ）試験が陰性になる。
【０１３５】
一方、次のアミノ酸（１．５当量）、ＨＯＢＴ（１．５当量）およびＤＩＥＡ（１．５当量）を３：１ＮＭＰ／ＤＣＭ（１０体積）中で組み合わせ、室温で完全に溶解させ、０℃に冷却する。ＨＢＴＵを添加し、溶液を１０〜１５分間撹拌して、固体を溶解させ、次いで樹脂に添加する。懸濁液を窒素雰囲気下でかき混ぜながら１〜３時間撹拌する。定性的ニンヒドリン試験でカップリングの完了をモニターする。反応が３時間後で不完全である（ニンヒドリン試験陽性が存続する）ならば、反応器をドレインし、活性化されたアミノ酸の新しい溶液（０．５当量）でリカップリングを行うべきである。通常３０分〜１時間のリカップリング後、ニンヒドリン試験が陰性になる。このサイクルをフラグメント中の残りのアミノ酸について繰り返す。フラグメントが構築されると、洗浄において用いられる溶媒体積は必然的に５体積から増大しうる。最終カップリング後、樹脂を３回５〜８体積のＮＭＰで、次いで２回１０体積のＤＣＭで洗浄し、４０℃の真空オーブン中で一定重量になるまで乾燥する。
【０１３６】
樹脂からペプチドを開裂させるための好ましい方法
以下の方法は、ペプチドＡｃＡＡ１−１２ＯＨの樹脂からの開裂を説明する。しかしながら、同じ方法を、本発明の他のペプチドフラグメントの開裂に用いることができる。
【０１３７】
方法Ａ：ＨＯＡｃの使用
樹脂（１ｇ、０．３７０ミリモル）を、窒素とともに撹拌しながら１．５時間ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（５：１：４、２０体積、２０ｍＬ）の混合物で処理し、溶液を丸底フラスコに移し、撹拌し、水（２０体積）で処理した。結果として得られる白色スラリーを濃縮して（ｒｏｔａｖａｐ、４０℃浴）、ＤＣＭを除去し、生成物を濾過により集めた。一定重量まで乾燥して、０．６９ｇ（７４％）のＡｃＡＡ１−１２ＯＨを８７Ａ％純度で得る。前記のような樹脂の第二の処理により、さらに０．０８ｇ（８．５％）の純度の低い（８３面積％）ＡｃＡＡ１−１２ＯＨを得、このことは、所望の反応時間は１．５時間より若干長めであることを示唆する。
【０１３８】
方法Ｂ：ＴＦＡの使用
樹脂（１重量、２０ｇ）を５〜６回１．７体積の１％ＴＦＡのＤＣＭ中溶液で洗浄する（各回３〜５分）。１％ＴＦＡ／ＤＣＭ洗浄液を、ピリジンを含むフラスコ中に集める（洗浄液中ＴＦＡと１：１の体積比）。生成物を含む洗浄液を合わせ（６００ｍＬ、３０体積）、最少ポット体積（もとの体積のほぼ１／３）まで蒸留することによりＤＣＭを除去する。１５〜２５℃のポット温度を維持するために真空を調節する。エタノール（６．５体積）を添加し、ＤＣＭが除去されるまで（蒸留液の温度の上昇により決められる）蒸留を続ける。再び、１５〜２０℃のポット温度を維持するために真空を調節する。最終ポット体積は約８〜９体積であるべきである。溶液を５〜１０℃に冷却し、水（６．５体積）を３０分かけて添加して、ＡｃＡＡ１−１２ＯＨを沈殿させる。固体を真空濾過により集め、水（２〜３体積）で洗浄する。スラリーを０〜５℃で３０分間撹拌し、固体を真空濾過により集め、一定重量になるまで乾燥して、１６．８０ｇのＡｃＡＡ１−１２ＯＨを９０％の収率および８４面積％（Ａ％）純度で得る。
【０１３９】
ＦｍｏｃＡＡ２７−３８ＯＨのＳＰＰＳおよび樹脂からの開裂
ＦｍｏｃＡＡ２７−３８ＯＨのＳＰＰＳを、０．７５ミリモル／ｇでロードされた１０ｇのＦｍｏｃＴｒｐ（Ｂｏｃ）ＯＲで出発して前記のようにして行った。開裂法Ｂを用いた（１６９／１２０／１、収率７８％、８７．９Ａ％）。
【０１４０】
ＨＰＬＣ条件：Ｖｙｄａｃ  Ｃ８、カタログ番号２０８ＴＰ５４、５ｕ、３００Ａ、０．９ｍＬ／分、２８０ｎｍ。Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ：８０％Ｉ−ＰｒＯＨ／２０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの混合物。６０〜８０％  Ｂ／３０分。典型的なサンプル調製法：１ｍｇを０．１０ｍＬのＮＭＰ中に溶解し、１ｍＬのアセトニトリルで希釈する。２０μＬを２０μＬループ中に注入する。
【０１４１】
ＡＡ等価物例の使用量の低減
本明細書に記載されたプロセスは、予想外に公知方法よりも試薬が少ない。様々なアミノ酸を含む試薬のコストは高いと理解される。本発明は、公知技術よりも試薬の使用量が著しく少なく、従ってスケールアップ時に著しいコスト節約になる。一態様において、成長するペプチド鎖１当量あたり約１．５当量未満のアミノ酸が使用される。一態様において、成長するペプチド鎖１当量あたり約１．４当量未満のアミノ酸が使用される。さらにもう一つの態様において、成長するペプチド鎖１当量あたり約１．３当量未満のアミノ酸が使用される。さらに異なる態様において、成長するペプチド１当量あたり約１．２当量未満のアミノ酸が使用される。さらにもう一つの態様において、成長するペプチド１当量あたり約１．１当量未満のアミノ酸が使用される。
【０１４２】
本発明のローディング効率を、本発明の樹脂に‘８８１特許のプロセスに従ってアミノ酸をローディングすることにより‘８８１特許において見いだされるものと比較した。導入されたアミノ酸の量がロードされた量と比較され、そして効率を計算した。
【０１４３】
【表９】
2004269524.tif 000010
【０１４４】
３つのアミノ酸のそれぞれについて、’８８１特許において記載されるものと比較して本発明を用いてローディング効率は実質的に増大した。カップリング時間の減少およびローディング効率の増大はまた、ペプチドフラグメントの形成中の試薬の使用量の減少と相関しうる。商業的スケールで試薬の使用量が減少した結果、著しくコストが削減される。
【０１４５】
軽減されたリカップリングの例
本発明において用いられるプロセスのもう一つの予想外の結果は、リカップルが大幅に軽減されるかまたはひとまとめにして除かれる。公知方法の結果、約９アミノ酸よりも多いアミノ酸フラグメントについては、リカップルが必要となる。本発明において用いられるプロセスは、約１０アミノ酸よりも多く有するＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントがリカップルを必要としないという予想外の結果であった。規模において、これはさらに本明細書に記載されるプロセスの重大な利点であり、著しい再加工の軽減になる。もう一つの態様において、約１５より多くのアミノ酸を有するＴ−２０またはＴ−１２４９フラグメントは、リカップルなしに製造された。
【０１４６】
減少したサイクル時間の例
本発明は公知方法よりもサイクル時間が著しく減少する。規模において、この特徴により、キャパシティーが限定された施設でアミノ酸ロードおよびペプチド構築のサイクル時間を減少させることが可能になる。これにより、サイクルまたはシフトあたりのスループットを増大させる能力を有する製造施設が可能になる。例として、サイクル時間を公知方法の５０％まで減少させることができる。本発明の一態様において、サイクル当たり約１５分から約３０分の範囲のサイクル時間の減少が達成される。デカマーなどの大きなペプチドフラグメントが合成される場合、サイクル時間はだいたい１５０分から３００分減少させることができる。さらに大きなペプチドが合成される場合に実質的にサイクル時間が削減されると理解される。
【０１４７】
【表１０】
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【０１４８】
リサイクリング例
標準的条件を用いてペプチドを除去することにより本発明において記載される樹脂をリサイクルし、次いで水酸化ナトリウムでクロロトリチルアルコール樹脂に変換する。クロロトリチルアルコール樹脂を次いで、チオニルクロリドおよびトルエン中触媒量のジメチルホルムアミドでの処理によりＣＴＣに変換する。低ボイドスペース樹脂の耐久性が増大することは、当該分野において現在見られる樹脂と比較して、リサイクルされた樹脂の完全なビーズ数および処理可能性が著しく増大することにつながる。
【０１４９】
アミノ酸収率比較例
請求項１記載の方法は、ＣＴＣ樹脂の１グラムあたり１０ｍＬのジクロロメタン中、１当量（ＣＴＣ１グラムあたり）のＦＭＯＣ−Ｌｅｕおよび１．３５当量（ＦＭＯＣ  Ｌｅｕ１モル当量あたり）のジイソプロピルエチルアミンについては約７５％より高い、またはＣＴＣ樹脂の１グラムあたり１０ｍＬのジクロロメタン中、１当量（ＣＴＣ１グラムあたり）のＦＭＯＣ−Ｔｒｐ（ｂｏｃ）および１．３５当量（ＦＭＯＣ−Ｔｒｐ（ｂｏｃ）１モル当量あたり）のジイソプロピルエチルアミンについては６０％より高い、およびＣＴＣ樹脂の１グラムあたり１０ｍＬのジクロロメタン中、１当量（ＣＴＣ１グラムあたり）ＦＭＯＣ−Ｇｌｎおよび１．３５当量（ＦＭＯＣ  Ｇｌｎ１モル当量あたり）のジイソプロピルエチルアミンについては７５％より高い、アミノ酸のロード効率を得ることをさらに含む。
【０１５０】
本発明のわずかな好ましい具体例を記載したが、当業者らはこの具体例は本発明の主な精神および範囲から逸脱することなく修飾でき、変更できることは理解するであろう。従って、前記の好ましい具体例は、あらゆる点において例示的であって、制限的でないと考えるべきであり、本発明の範囲は、前記載事項ではなく、添付の請求の範囲により示され、請求の範囲の意味および同等のものの範囲内にある全ての変更は本発明の包含されるものである。
【外国語明細書】
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2004269524000002.pdf
2004269524000003.pdf