(57)【要約】【課題】溶液に浸漬させる免疫測定用プローブの長さを様々に変えることにより、高度な技術を必要とせず、複数種の抗体の固定・ブロック処理を行う。【解決手段】治具１は棒状のプローブ２を懸垂する懸垂部３、抗体溶液を注入した円筒状の容器４を収納する収納部５、プローブ２を保護する蓋部６から構成されている。懸垂部３にはプローブ２を懸垂するための孔部３ａ、段部３ｂが設けられ、プローブ２はその鍔部２ａによって位置が固定されている。懸垂部３の四隅には円柱状の支柱３ｃが設けられ、収納部５に設けられたガイド５ｂに挿し込むことにより、懸垂部３を収納部５上に正確に降下できる。懸垂部３には下方に向けてストッパ７が取り付けられており、プローブ２の所望の長さを容器４内の溶液に浸漬させることができる。【選択図】        図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫測定用プローブを懸垂するための懸垂部と、溶液を注入し上部を開放した容器を収納するための収納部とから成り、前記収納部上に前記懸垂部を降下して前記プローブを前記容器内の溶液に浸漬する際に、ストッパにより前記懸垂部を前記収納部に対して任意の位置で停止するようにしたことを特徴とする免疫測定用プローブの浸漬治具。
【請求項２】
免疫測定用プローブを懸垂するための懸垂部と溶液を注入し上部を開放した容器を収納するための収納部とから成る治具を用い、前記収納部に前記懸垂部を降下して前記免疫測定用プローブを前記容器内の溶液に浸漬させる場合において、懸垂部、収納部の何れかに設けたストッパにより前記懸垂部を前記収納部に対して任意の位置で停止させ、前記溶液に前記免疫測定用プローブを所望の位置まで浸漬させることを特徴とする免疫測定用プローブの処理方法。
【請求項３】
前記免疫測定用プローブは下端にファイバ部を備え、該ファイバ部を是容器内の溶液に浸漬させるようにした請求項２に記載の免疫測定用プローブの処理方法。
【請求項４】
前記溶液は抗体を含む溶液であり、前記免疫測定用プローブに前記抗体を固定する請求項２又は３に記載の免疫測定用プローブの処理方法。
【請求項５】
前記抗体は物理吸着により前記免疫測定用プローブに直接固定する請求項４に記載の免疫測定用プローブの処理方法。
【請求項６】
前記抗体はビオチンを結合し、前記免疫測定用プローブに結合したアビジン又はストレプトアビジンを介して前記免疫測定用プローブに固定する請求項４に記載の免疫測定用プローブの処理方法。
【請求項７】
前記溶液は抗体を固定した後に前記免疫測定用プローブの未反応部位への非特異的反応を防ぐブロック効果を有する成分を含み、抗体を固定した前記免疫測定用プローブにブロック処理を行う請求項２又は３に記載の免疫測定用プローブの処理方法。
【請求項８】
前記免疫測定用プローブの下端から順に任意の長さを異なる複数種類の抗体溶液に浸漬することにより、複数の区画に区切って異なる抗体を固定する請求項２〜７の何れか１つの請求項に記載の免疫測定用プローブの処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主に抗原抗体反応により免疫測定を行うセンサにおいて、免疫測定用プローブに抗体を固定する免疫測定用プローブの浸漬治具及び処理方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来において免疫測定を行う際には、例えば広く知られているＥＬＩＳＡ（酵素標識免疫測定法）のように、容器内に抗体を固定し抗原抗体反応を行わせる方法がある。このとき、容器はプローブを兼ねており、反応の場となる容器に抗体溶液を注入し抗体を固定する。目的の被加工物を液体に一部分だけ浸漬させて加工する装置としては、例えば特許文献１にめっきやコイルの先端を剥離させるための技術として提案されている。
【０００３】
また、プローブ形状としては、例えば特許文献２でポリスチレン樹脂で成形したファイバ長４０ｍｍのプローブが知られている。
【０００４】
【特許文献１】
特開平０７−０１０２６５号公報
【特許文献２】
米国特許６１３６６１１号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、免疫測定において高感度の測定を行うには、固定された抗体が安定した品質であることが重要である。固定に際して、温度や時間などが一定であることは勿論であるが、作業者によって行われる場合に、高度な技術が必要であったり、技術の習熟度に左右されるようなことがあると、個人差が品質の要因となることがある。
【０００６】
また、生産上コストを低く抑えることも求められ、例えばＥＬＩＳＡの場合には容器がプローブを兼ねており、容器に抗体溶液を注入し所定の温度・時間で固定した後に抗体溶液を回収する。このときに使用する抗体溶液は、容器の容量によって決められ、回収・廃棄される抗体溶液には未反応の抗体が含まれる。また、複数のものを同時に浸漬処理する際には、全ての被処理物が納まる容量の液槽に、必要十分な量の溶液を用意することが一般的であるが、抗体には稀少であったり高価なものもあり、抗体溶液の使用量を最小限に抑えることが必須とされている。
【０００７】
また、免疫測定がよく利用される食品や医療の分野では、安全性への期待から多種に渡る検査・分析を迅速に行うことが求められており、汎用性の高いセンサが必要となってくる。例えば、光ファイバの先端面を使用するセンサにおいては、反応に用いる面積は小さいため、複数種類の抗体を固定する方法は確立されておらず、１個のセンサに対し１種類の免疫測定とならざるを得ない。複数種類の抗体を固定した免疫測定用プローブであれば、センサの汎用性が広がる可能性がある。
【０００８】
本発明の目的は、上述の問題点を解消し、高品質のプローブを安定してかつ低コストで供給するために、必要量の溶液が注入された容器にプローブを浸漬させるための免疫測定用プローブの浸漬治具及び処理方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための本発明に係る免疫測定用プローブの浸漬治具は、免疫測定用プローブを懸垂するための懸垂部と、溶液を注入し上部を開放した容器を収納するための収納部とから成り、前記収納部上に前記懸垂部を降下して前記プローブを前記容器内の溶液に浸漬する際に、ストッパにより前記懸垂部を前記収納部に対して任意の位置で停止するようにしたことを特徴とする。
【００１０】
また、本発明に係る免疫測定用プローブの処理方法は、免疫測定用プローブを懸垂するための懸垂部と溶液を注入し上部を開放した容器を収納するための収納部とから成る治具を用い、前記収納部に前記懸垂部を降下して前記免疫測定用プローブを前記容器内の溶液に浸漬させる場合において、懸垂部、収納部の何れかに設けたストッパにより前記懸垂部を前記収納部に対して任意の位置で停止させ、前記溶液に前記免疫測定用プローブを所望の位置まで浸漬させることを特徴とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明を図示の実施の形態に基づいて詳細に説明する。
図１は治具の構成図を示し、図２は治具を使用して抗体を固定する場合の断面図である。抗体を固定させるための治具１は、主として、棒状の免疫測定用プローブ２を懸垂する懸垂部３、抗体溶液を必要量注入し上部を開放した円筒状の容器４を収納する収納部５、懸垂部３の上に被着し塵や埃の付着からプローブ２を保護する蓋部６から構成されている。
【００１２】
懸垂部３には、プローブ２を懸垂するための複数の孔部３ａが収納部５の容器４上に位置するように設けられており、これらの孔部３ａの周囲には、プローブ２がその鍔部２ａによって位置を固定できるように段部３ｂが設けられており、プローブ２を収納部５の孔部５ａに取り付けた容器４の中心線に正確に一致させるようになっている。
【００１３】
懸垂部３の四隅には円柱状の支柱３ｃが設けられ、これらの支柱３ｃを収納部５に設けられた円筒状のガイド５ｂに挿し込むことにより、懸垂部３は収納部５上に降下することができる。ガイド５ｂとしては、内部のローラにより円滑に昇降できるローラガイドを用いることが好ましい。また、懸垂部３には下方に向けて１個又は複数個のストッパ７が取り付けられており、このストッパ７は例えばねじにより適宜に長さを変え得るようにされている。このストッパ７により、懸垂部３を収納部５に重ねた場合に、プローブ２を容器４の底部まで挿し込まずに、途中の任意の位置で停止することができ、プローブ２の所望の長さを容器４内の溶液に浸漬させることが可能となる。
【００１４】
プローブ２の形状の１つとして、鍔部２ａ上に設け光を導入するためのレンズ２ｂ、レンズ２ｂに対して下方の垂直方向に配されたファイバ部２ｃが設けられている。プローブ２の材質には、透明度が高く耐水性に優れ、成型加工が容易かつ安価なポリスチレン、メタクリル樹脂、ポリカーボネート、或いはこれらを混合したものが好適である。
【００１５】
抗体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７（大腸菌Ｏ１５７）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（サルモネラ菌）等の細菌に対する抗体、カゼイン、ヒスタミン等の化学物質に対する抗体、エンテロトキシン等の毒素に対する抗体を用いることができる。
【００１６】
また、容器４に注入する溶液は抗体溶液に限らず、アビジン又はストレプトアビジンを介してビオチンを結合した抗体を固定する際に、プローブ２にアビジン又はストレプトアビジンを付着させるために使用してもよい。また、抗体を固定した後に、プローブ２の未反応部位への非特異的反応を防止するブロック処理を行うためのブロック溶液を注入して使用することもできる。ブロック溶液としては、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミンを緩衝液に溶解したものが好適である。
【００１７】
容器４の容量は特に限定されないが、プローブ２に固定される抗体又はブロックが十分足りる量であればよく、１００〜４００μｌ程度でよい。溶液の性状によっては容器４が大きくなることもあるが、品質確認に基づいて数回使用してもよく、また容器４に溶液を注入する際には市販の分注機を使用することもできる。
【００１８】
更に、プローブ２の下端から順に任意の長さで、異なる抗体をそれぞれ固定した後にブロック処理を行えば、複数種類の抗体が１つの区画に混在することなく、１個のプローブ２で複数種の抗体を固定することができ、つまり１個のセンサを用いるのみで、複数の抗原を対象とした免疫測定を行うことが可能となる。
【００１９】
上述した抗体を固定するための動作が非常に簡便であることも、本実施の形態の治具１を用いる大きな特徴である。調製された溶液を容器４に定量注入して、容器４を収納部５の孔部５ａに挿入し、収納部５に懸垂部３を重ねるだけで、特別な技術は必要とせず、個人差なく簡単に抗体の固定やブロック処理が行える。
【００２０】
一般に、本実施の形態で用いるような小さいプローブ２を、細く容量の小さい容器４に納める場合に、プローブ２を容器４の内壁に接触させてしまう虞れがあるばかりか、それらの作業を大量に手作業で行うことは負担も大きい。しかし、本実施の形態の治具１を用いれば、プローブ２を孔部３ａに挿通し、鍔部２ａによって位置決めが正確になされるので、プローブ２を容器４の内壁に接触させることなく、容器４の中心線に合わせて浸漬させることができる。
【００２１】
また本実施の形態の治具１は小型化が可能で、市販の密閉箱内に納めることができるため、固定やブロック処理に長時間を要する際にも、乾燥による液面の低下に対して比較的寛容であり、オーバーフロー装置を取り付ける必要もない。
【００２２】
このようにして抗体を固定し、ブロック処理を行ったプローブ２をセンサとして用いる一例として、図３に示すように励起光の導入と蛍光の収集を併せて行う免疫測定装置により、免疫測定を行うことができる。即ち、レーザー光源１１からの光束をビームスプリッタ１２で反射させてプローブ２のレンズ２ｂに向けて照射し、プローブ２からの反射光をビームスプリッタ１２を透過させて検出器１３により測定する。
【００２３】
プローブ２上では、抗原抗体反応により抗体と抗原が結合し、更に抗原は蛍光色素で標識された抗体と結合する。ここに、レーザー光源１１からのレーザー光を導入すると、蛍光色素が励起されて蛍光を得るので、この蛍光を検出器１３により測定する。
【００２４】
以下に、浸漬させるプローブ２の長さにより抗体の固定長を変える場合に、免疫測定における信号応答の変化を実験例を説明する。
【００２５】
［実験例１］  米国特許６１３６６１１号公報に記載のものと同様の形状に、ポリスチレン樹脂で成形したファイバ長４０ｍｍのプローブ２を懸垂した懸垂部３を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で調製した濃度１００μｇ／ｍｌのストレプトアビジン溶液を満たした内容量４００μｌの容器４を納めた収納部５に降下し、アビジンの付着長４０ｍｍとなるようにプローブ２を浸漬し、３７℃において３０分保持した後に、４℃で１６時間保持しストレプトアビジンの付着を行った。
【００２６】
所定時間経過の後に懸垂部３を引き上げ、ビオチン結合された濃度５μｇ／ｍｌの抗Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（サルモネラ）精製抗体（ウサギ）を満たした内容量４００μｌの容器４を納めた別の収納部５に降下させ、固定長４０ｍｍとなるように浸漬し、４℃で１６時間保持し抗体を固定した。
【００２７】
更に、所定時間経過後に懸垂部３を引き上げ、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で調製した濃度１％のウシ血清アルブミン溶液を満たした内容量４００μｌの容器を納めた別の容器４を納めた更に別の収納部５に降下させ、ブロック長４０ｍｍとなるようにプローブ２を浸漬し、室温で１時間保持しブロックを行った。
【００２８】
図３に示す免疫測定装置において免疫測定を行い、プローブ２に抗体が固定されていることを確認するために、アマシャムバイオサイエンス社製  蛍光色素Ｃｙ５  ｂｉｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅにより標識された濃度５μｇ／ｍｌの抗ウサギ抗体を反応させ、レーザー光源１１から出射したレーザー光により蛍光色素を励起させて検出器１３により電気信号を得た。
【００２９】
［実験例２］  実験例１と同様にして、固定長２０ｍｍとなるようにストレプトアビジンを介してビオチン結合された抗Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（サルモネラ）抗体を固定し、ブロック長４０ｍｍとなるようにブロックを行ったものを作製し、蛍光色素により標識された濃度５μｇ／ｍｌの抗ウサギ抗体を反応させ、レーザー光により蛍光色素を励起させ検出器１３から電気信号を得た。
【００３０】
［実験例３］  実験例１の工程において抗体の固定を行わず、ブロック長４０ｍｍとなるようにブロックのみを行ったものを作製し、蛍光色素により標識された濃度５μｇ／ｍｌの抗ウサギ抗体を反応させ、レーザー光により蛍光色素を励起させ検出器１３により電気信号を得た。
【００３１】
図４は実験例１〜３において得られた検出器１３の電気信号について、蛍光色素により標識された抗ウサギ抗体を反応させる前のレーザー光導入時の電気信号を初期値として、初期値からの増加分をプロットしたグラフ図である。固定長０ｍｍは実験例３の抗体の固定を行わなかったものである。抗体の固定長の範囲において、定量性のある信号の応答が得られた。
【００３２】
［実験例４］  この実験例４には、本実施の形態の治具１を用いて１度に複数個のプローブ２を作製したときの免疫測定における安定性を評価した例である。実験例１と同様にして、ストレプトアビジンを付着させた６４本のプローブ２に固定長４０ｍｍとなるように、ビオチン結合されたＫｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂ社製  抗Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７（大腸菌）抗体を固定し、更にウシ血清アルブミン溶液によりブロック処理を行った。このとき、１３ｃｍ角に６４個の容器４を納めた高さ５ｃｍの治具１を密閉箱に納めた。
【００３３】
この方法により作製したプローブ２８本を用いて、図３の免疫測定装置により免疫測定を行った。菌数４×１０３ＣＦＵ／ｍｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７（大腸菌Ｏ１５７）抗原を反応させ、更にアマシャムバイオサイエンス社製  蛍光色素Ｃｙ５  ｂｉｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅにより標識された濃度２μｇ／ｍｌの抗Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７（大腸菌Ｏ１５７）抗体を反応させ、レーザー光により蛍光色素を励起させて検出器１３から電気信号を得た。抗原及び標識された抗体を反応させる前のレーザー光導入時の電気信号を初期値として、抗原抗体反応による初期値からの増加分は全て２０〜３０ｐＡであった。
【００３４】
本実施の形態のように、容器４が異なる複数の収納部５を交換してプローブ２を所定長だけ浸漬するには、ストッパ７は懸垂部３に取り付けた方がよいが、溶液の種類ごとに浸漬長を変えるような場合には、ストッパ７は収納部５に固定してもよい。
【００３５】
【発明の効果】
以上説明したように本発明に係る免疫測定用プローブの浸漬治具及び処理方法は、高度な技術を必要とせず、個人差がなく簡便に抗体の固定やブロック処理を安定して行うことができる。また、プローブを懸垂する懸垂部を容器を納める収納部に降下させてプローブを溶液に浸漬させる際に、ストッパにより所望の位置まで浸漬させることにより、位置を様々に変えて複数種の抗体の固定・ブロック処理を行えるため、１個のプローブで複数種の抗体を固定する、つまり１個のセンサを用いるのみで複数の抗原を対象とした免疫測定を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】治具の構成図である。
【図２】抗体を固定する場合の断面図である。
【図３】測定装置の光学系の構成図である。
【図４】実験例により得られる蛍光の信号強度の増加分のグラフ図である。
【符号の説明】
１  治具
２  免疫測定用プローブ
３  懸垂部
４  容器
５  収納部
６  蓋部
７  ストッパ
１１  光源
１２  ビームスプリッタ
１３  検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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