(57)【要約】【解決手段】ヒトアディポネクチン遺伝子の２７６番の１塩基多型を同定することを特徴とする２型糖尿病の診断又は検査方法。【効果】本発明によれば、日本人に特に多い２型糖尿病及びその発症リスクが的確に診断又は検査することができる。また、インスリン抵抗性を伴う２型糖尿病及びその発症リスクが的確に診断できることから、その治療手段の選択も容易となる。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアディポネクチン遺伝子の２７６番の１塩基多型を同定することを特徴とする２型糖尿病の診断又は検査方法。
【請求項２】
検体として遺伝子含有体液又は組織由来の遺伝子を用いるものである請求項１記載の診断又は検査方法。
【請求項３】
該２７６番の１塩基多型が、Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｔ又はＴ／Ｔである請求項１又は２記載の診断又は検査方法。
【請求項４】
ヒトアディポネクチン遺伝子の２７６番の１塩基多型を同定できる塩基長を有するポリヌクレオチドからなるプライマー。
【請求項５】
塩基長が少なくとも１２塩基以上である請求項４記載のプライマー。
【請求項６】
該２７６番の１塩基多型が、Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｔ又はＴ／Ｔである請求項４又は５記載のプライマー。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項記載のプライマーを含有することを特徴とする２型糖尿病診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトアディポネクチン遺伝子の１塩基多型を同定することによる２型糖尿病の診断又は検査方法及び診断薬に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
２型糖尿病は、遺伝的素因を背景にして、インスリン分泌異常やインスリン抵抗性を有するヒトに対して、高脂肪食の摂取、運動不足、ストレス、肥満等の発症因子がかかったときに発症する、いわゆる多因病である。このように２型糖尿病は、１型糖尿病とは原因が大きく異なり、その診断及び治療は極めて困難である。
【０００３】
特に我が国では、１型糖尿病に比べて２型糖尿病が多く、その診断法及び治療法の確立が望まれている。
従って、本発明は、２型糖尿病の新たな診断及び検査方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
最近の研究により、アディポネクチンの発現低下又は欠乏は、肥満インスリン抵抗性の原因であり、ひいては肥満及び２型糖尿病の原因であることが判明している（Ｔ．　Ｙａｍａｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　Ｖｏｌ．　７，　Ｎｏ．８（２００１））。しかし、アディポネクチン遺伝子の１塩基多型と２型糖尿病との関係に関しては未だ報告されていない。
【０００５】
そこで本発明者は、アディポネクチン遺伝子の１塩基多型に着目し、種々検討したところ、アディポネクチン遺伝子の２７６番の１塩基多型（ＳＮＰ２７６）が、２型糖尿病、インスリン抵抗性及び血中アディポネクチン値と高い相関性を有し、当該ＳＮＰ２７６を同定すれば２型糖尿病、特にインスリン抵抗性を伴う２型糖尿病の診断に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、ヒトアディポネクチン遺伝子の２７６番の１塩基多型を同定することを特徴とする２型糖尿病の診断又は検査方法を提供するものである。
【０００７】
また、本発明は、ヒトアディポネクチン遺伝子の２７６番の１塩基多型を同定できる塩基長を有するポリヌクレオチドからなるプライマーを提供するものである。
また、本発明は、当該プライマーを含有することを特徴とする２型糖尿病診断薬を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ヒトアディポネクチン遺伝子は、既にクローニングされており［Ｍａｅｄａ，　Ｋ　ｅｔ　ａｌ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２２１，　２８６−２９６（１９９６）、Ｎａｋａｎｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ，Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　（Ｔｏｋｙｏ）１２０，　８０２−８１２（１９９６）］、その塩基配列も知られている（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＴ−００５９６２）。
【０００９】
本発明は、ヒトアディポネクチン遺伝子の２７６番の１塩基多型（以下、「ＳＮＰ２７６」という）を同定して、２型糖尿病を診断又は検査するものである。後記実施例に示すように、２型糖尿病患者及び糖代謝正常者由来のＤＮＡを用いてＳＮＰスクリーニングを行った結果、１０個の比較的頻度の高いＳＮＰを同定した（表１）。そのうち、ＳＮＰ２７６（Ｇ／Ｇ、Ｇ／Ｔ及びＴ／Ｔ）においては、ＳＮＰ２７６Ｇ／Ｇ遺伝子型保持者は、Ｔ／Ｔ型遺伝子保持者に比べて有意に２型糖尿病発症リストが高いこと、インスリン抵抗性が高いこと及び血中アディポネクチン値が低いことが判明した。従って、当該ＳＮＰ２７６を同定すれば、２型糖尿病が診断又は検査でき、インスリン抵抗性を伴う２型糖尿病であるか否かも診断又は検査できる。配列番号１にＳＮＰ２７６Ｇ型の１〜１４１０番の塩基配列を、配列番号２にＳＮＰ２７６Ｔ型の１〜１４１０番の塩基配列を示す。
【００１０】
本発明の診断又は検査方法に用いる検体としては、遺伝子含有体液又は組織であればよいが、血液、汗、尿、スワブ（口腔内、鼻腔内、咽喉内等）、毛髪、糞便等が挙げられ、特に血液が好ましい。
【００１１】
ＳＮＰ２７６の同定法としては、直接シーケンス法、プライマーエクステンション法、ＰＣＲ法が挙げられる。ＰＣＲ法としては、ＡＳＡ法（Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＰＡＳＡ法（ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｌｌｅｌｅｓ）、ＡＳＰ法（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＲＣＲ）、ＡＲＭＳ法（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）、ＡＳＯ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法、ＲＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等が挙げられるが、このうち特に直接シーケンス法が好ましい。
【００１２】
直接シーケンス法やＰＣＲ法を用いるＳＮＰ２７６の同定に用いられるプライマーとしては、当該ＳＮＰ２７６を含むポリヌクレオチドが増幅されるような塩基長、例えば１２塩基長以上、好ましくは１２〜３０塩基長のプライマーであればよいが、下記の配列を有するプライマーセットが望ましい。
【００１３】
５′−ＡＧＡＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＡＧＡＡＧＴ−３′（配列番号３）
５′−ＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＡＴＣＣ−３′（配列番号４）
【００１４】
本発明の診断薬には、上記プライマーを含み、所望によりＰＣＲに必要な緩衝液等が含まれる。
【００１５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１６】
Ａ．方法
（対象者）
▲１▼６０歳以上、▲２▼糖尿病の家族歴を持たない、▲３▼ＨｂＡｌｃが５．８％未満の３条件を満たす日本人糖代謝正常者４８０名並びに、ＷＨＯの基準に合致した日本人２型糖尿病患者３８４名から書面によるインフォームドコンセントを得て採血を行いＤＮＡを抽出した。また本研究は東京大学大学院医学系研究科ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理審査委員会の承認を受けている。
【００１７】
（ＳＮＰスクリーニング）
３０名の２型糖尿病患者由来のＤＮＡを利用し（８０％の件出力でアリル頻度が０．０２６以上のＳＮＰを同定可能）、直接シーケンス法によりアディポネクチン遺伝子を含む１６ｋｂの染色体領域についてＳＮＰのスクリーニングを行った。
【００１８】
（ＳＮＰタイピング）
同定したＳＮＰについて２型糖尿病３８４名、糖代謝正常者４８０名を対象に直接シーケンス法あるいはＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法によって遺伝子型を決定した。直接シーケンス法はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用い、ＰＲＩＳＭ　３１００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）によって泳動・検出を行った。Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法はＳｎａＰｓｈｏｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いＰＲＩＳＭ　３１００　ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）によって泳動・検出を行った。
【００１９】
（生化学的検討）
インスリン抵抗性の評価はＨＯＭＡ（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ｍｏｄｅｌ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）の指標（インスリン抵抗性指標＝（（空腹時血糖値（ｍｍｏｌ／Ｌ）×空腹時インスリン値（μＵ／ｍＬ））／２２．５）を使用した。
【００２０】
（統計学的検討）
ハプロタイプの頻度推定はＥＨソフトウェア（ｆｔｐ：／／ｌｉｎｋａｇｅ．　ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．　ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｅｈ）を使用した。各ＳＮＰの遺伝子型あるいはアリル頻度についてχ２検定によって糖尿病群と非糖尿病群で差があるか検定を行った。
【００２１】
Ｂ．結果
（１）アディポネクチン遺伝子新規ＳＮＰの同定
計１０個の比較的頻度の高い多型を同定した。全てのＳＮＰについてＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡にあった。また、頻度の低い（アリル頻度が１％以下）Ｇ８４Ｒ、Ｉ１６４Ｔ、Ｒ２２１Ｓ、Ｈ２４１Ｐを同定した。頻度の高い多型は、次のとおりである。
ＳＮＰ−１１４１４（Ａ−Ｇ）、ＳＮＰ−１１３７９（Ｇ−Ａ）、ＳＮＰ−１１３６５（Ｃ−Ｇ）、ＳＮＰ−４０３４（Ａ−Ｃ）、ＳＮＰ−３９６４（Ａ−Ｇ）、ＳＰＮ４５（Ｔ−Ｇ）、ＳＮＰ２７６（Ｇ−Ｔ）、ＳＮＰ３４９（Ａ−Ｇ）、ＳＮＰ７１２（Ａ−Ｇ）、ＳＮＰ２０１９（Ａ欠損−Ａ挿入）。
アディポネクチン遺伝子におけるこれらの多型の存在部位を図１に示す。
【００２２】
（２）アディポネクチン遺伝子ＳＮＰと２型糖尿病との相関
結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
2004049033.tif 000002
【００２４】
新規に同定した比較的頻度の高い１０個のＳＮＰのうちＳＮＰ４５（ｐ＝０．０１）及びＳＮＰ２７６（ｐ＝０．００７）と２型糖尿病との間に有意な相関を認めた。ＳＮＰ４５についてはＧ／Ｇ、Ｇ／Ｔ遺伝子型保持者はＴ／Ｔ遺伝子型保持者に比してそれぞれオッズ比で１．４１（９５％信頼区間１．０６−１．８８）、１．７０（９５％信頼区間１．０９−２．６５）、ＳＮＰ２７６に関してはＧ／Ｇ遺伝子型保持者はＴ／Ｔ遺伝子型保持者に比して２．１６（９５％信頼区間１．２２−３．９５）と２型糖尿病発症リスクの有意な上昇を認めた。
【００２５】
（３）アディポネクチン遺伝子ＳＮＰとインスリン抵抗性との相関
アディポネクチンはインスリン感受性物質であることからインスリン抵抗性とＳＮＰとの関連を検討した。２型糖尿病発症リスクが上昇しているＳＮＰ２７６Ｇ／Ｇ遺伝子型保持者はＴ／Ｔ遺伝子型保持者に比してＨＯＭＡの指標が有意に高値（Ｇ／Ｇ：１．６１±０．０５，　Ｇ／Ｔ：１．４５±０．０５，　Ｔ／Ｔ：１．１９±０．１２，　Ｐ＝０．００２）でインスリン抵抗性が上昇していた（図２）。ＳＮＰ４５とインスリン抵抗性指標との間には相関を認めなかった（Ｇ／Ｇ：１．５６±０．１１，　Ｇ／Ｔ：１．４８±０．０６，　Ｔ／Ｔ：１．５２±０．０５，　Ｐ＝０．７８７）。
【００２６】
（４）アディポネクチン遺伝子ＳＮＰと血中アディポネクチン値との相関
ＳＮＰ２７６の遺伝子型によってアディポネクチン遺伝子の発現が変化し血中アディポネクチン値に差があるかどうか検討を行った。これまでアディポネクチン値は肥満によって低下することが報告されているため、ＢＭＩによって３群に層別化した後ＳＮＰ２７６と血中アディポネクチン値との相関を検討した。ＢＭＩが２６．７以上の群において、２型糖尿病発症リスクが上昇しインスリン抵抗性が高いＧ／Ｇ遺伝子型保持者はＴ／Ｔ遺伝子型保持者に比して血中アディポネクチン値が有意に低いことが明らかとなった（Ｇ／Ｇ：１０．４±０．８５，　Ｇ／Ｔ：１３．７±０．８７，　Ｔ／Ｔ：１６．６±２．２４μｇ／ｍＬ，　Ｐ＝０．０１）（図３）。
【００２７】
以上よりＳＮＰ２７６はアディポネクチン低値を介してインスリン抵抗性を惹起し２型糖尿病の発症リスクを上昇させていると考えられた。
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、日本人に特に多い２型糖尿病及びその発症リスクが的確に診断又は検査することができる。また、インスリン抵抗性を伴う２型糖尿病及びその発症リスクが的確に診断できることから、その治療手段の選択も容易となる。
【００２９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】アディポネクチン遺伝子のゲノム構造と多型の存在位置を示す図である。
【図２】ＳＮＰ２７６遺伝子型とインスリン抵抗性との関係を示す図である。
【図３】ＢＭＩの群別におけるＳＮＰ遺伝子型と血中アディポネクチン値との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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