(57)【要約】【課題】組み換え微生物株を用いて製造するための発酵的方法でホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸又はアミノ酸誘導体の過剰生産を可能にする。【解決手段】ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の発酵的製造のために適当であり、出発株から製造できる微生物株において、該微生物が出発株に対して高められたｙｆｉＫ遺伝子産物の活性又はｙｆｉＫホモログの遺伝子産物の活性を有することを特徴とする微生物株を提供する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発株から製造可能な、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸又はその誘導体の発酵的製造のために適当な微生物株において、該微生物株が出発株に対して高められたｙｆｉＫ遺伝子産物の活性又はｙｆｉＫホモログの遺伝子産物の活性を有することを特徴とする微生物株。
【請求項２】
菌類、酵母又は細菌、有利には腸内細菌科の細菌、特に有利には種エシェリキア　コリである、請求項１記載の微生物株。
【請求項３】
微生物中でｙｆｉＫ遺伝子のコピー数が高められているか、又はｙｆｉＫ遺伝子の発現が適当なプロモーター又は翻訳シグナルの使用によって高められた、請求項１又は２記載の微生物株。
【請求項４】
プロモーターがｇａｐＡ遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨプロモーター、誘導可能なｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λプロモーター、ａｒａプロモーター及びｔｅｔプロモーターの群から選択される、請求項３記載の微生物株。
【請求項５】
ｙｆｉＫ遺伝子産物の高められた活性がｐＡＣＹＣ誘導体におけるｙｆｉＫ遺伝子のコピー数の増大に基づくエシェリキア　コリ株である、請求項１から４までのいずれか１項記載の微生物株。
【請求項６】
プラスミドにおいて、ｙｆｉＫ遺伝子をプロモーターと一緒に有することを特徴とするプラスミド。
【請求項７】
更にシステイン代謝の脱調節のための遺伝子エレメントを有する、請求項６記載のプラスミド。
【請求項８】
出発株に請求項６又は７記載のプラスミドを導入する、請求項１から５までのいずれか１項記載の微生物株の製造方法。
【請求項９】
ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法において、請求項１から５までのいずれか１項記載の微生物株を発酵において使用し、かつ製造されたアミノ酸を発酵バッチから分離することを特徴とするホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法。
【請求項１０】
微生物株を発酵槽において連続培養、回分培養又は有利には流加培養として培養する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
発酵の間にＣ源を連続的に供給する、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｃ源として糖、糖アルコール又は有機酸を用いる、請求項９から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
Ｃ源の供給を、発酵槽中のＣ源の含量が発酵の間に０．１〜５０ｇ／ｌ、特に有利には０．５〜１０ｇ／ｌの範囲内に保持されることを保証する形で実施する、請求項９から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
Ｎ源としてアンモニア、アンモニウム塩又はタンパク質加水分解物を使用する、請求項９から１３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
発酵を好気的増殖条件下に実施する、請求項９から１４までのいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸及びアミノ酸誘導体、例えばＯ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、ＬＬ−シスチン及びＬ−システイン誘導体を発酵によって製造するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
２０種の天然のタンパク質形成性のアミノ酸の製造は今日では微生物の発酵によって十分に実施される。その際に、微生物が天然アミノ酸の合成のための相応の生合成経路を有することを利用する。
【０００３】
しかしながらかかる生合成経路は野生型の株において、アミノ酸を細胞の必要量までだけを製造することを保証する厳密な制御下にある。効率的な製造過程のための重要な前提条件は従って、野生型の生物に対して劇的に増大された所望のアミノ酸の製造のための生産能力を有する適当な微生物を提供することである。
【０００４】
かかるアミノ酸過剰生産性の微生物は古典的な突然変異法／選択法及び／又は近代の特定の組み換え技術（“代謝工学”）によって作成できる。後者の場合にはまず遺伝子又はアレルを同定し、これを改変、活性化又は不活性化によって過剰生産をもたらす。これらの遺伝子／アレルを次いで分子生物学的技術によって微生物株に最適な過剰生産が達成されるように導入するか又は不活性化させる。しかしながら、しばしば最初に複数の異なる措置の組合せが有用な効率的な生産をもたらす。
【０００５】
アミノ酸のホスホグリセレート−ファミリーは、その生合成が３−ホスホグリセリン酸から誘導されるアミノ酸であると定義される。代謝の天然の経路はまず中間段階を介して３−ホスホヒドロキシピルベート及び３−ホスホ−Ｌ−セリンをＬ−セリンに導く。Ｌ−セリンは更にグリシンに変換され、もしくはＯ−アセチル−Ｌ−セリンを介してＬ−システインに変換されうる。
【０００６】
ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸、特にＬ−セリン及びＬ−システインの発酵的製造のために、既に幾つかの遺伝子／アレルが従来の技術において公知であり、その使用がアミノ酸過剰生産を引き起こす：
−　ＥＰ０６２０８５３号Ｂ１又はＥＰ０９３１８３３号Ａ２に記載されるようなｓｅｒＡ−アレル
これらのｓｅｒＡ−アレルは、Ｌ−セリンによる低減されたフィードバック阻害の影響下にある３−ホスホグリセレート−デヒドロゲナーゼをコードする。それによって３−ヒドロキシピルベートの形成は十分に細胞のセリン濃度によって解除される。
【０００７】
−　ＷＯ９７／１５６７３号（参照することにより内容が記載されたものとする）又はＮａｋａｍｏｒｉ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６４：　１６０７−１６１１（参照することにより内容が記載されたものとする）又はＴａｋａｇｉ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４５２：　３２３−３２７に記載されるような、微生物に導入されるｃｙｓＥ−アレル
これらのｃｙｓＥ−アレルはＬ−システインによる低減されたフィードバック阻害の影響下にあるセリン−Ｏ−アセチル−トランスフェラーゼをコードする。それによってＯ−アセチル−Ｌ−セリンもしくはＬ−システインの形成は十分に細胞のシステイン濃度によって解除される。
【０００８】
−　ＥＰ０８８５９６２号Ａ１に記載されるような排出遺伝子
記載されるｏｒｆ−遺伝子は、抗生物質及び別の毒性物質の排出のために適当であり、かつＬ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチル−セリン及び／又はチアゾリジン誘導体の過剰生産に作用する排出系をおそらくコードしている。
【０００９】
−　ＤＥ１９９４９５７９号Ｃ１に記載されるようなｃｙｓＢ−遺伝子
ｃｙｓＢ−遺伝子は硫黄代謝の中心的遺伝子レギュレーターをコードし、かつ従ってシステイン生合成のためのスルフィドの調製において種々の役割を果たす。
【００１０】
従来の技術から同様に、挙げられる方法はまたシステイン誘導体に導きうることも公知である。ＬＬ−シスチンがＬ−システインの酸化生成物としてか、又は２−メチル−チアゾリジン−２，４−ジカルボン酸がＬ−システイン及びピルベートの縮合生成物として発酵の間に生じうる。Ｌ−システインは細胞の中心的な硫黄供与体であるので、前記の方法は非常に多様な硫黄含有の代謝物（例えばＬ−メチオニン、（＋）−ビオチン、チアミンなど）の製造のための出発点としても利用でき、これらは本願の範囲においてＬ−システイン誘導体として解釈される。
【００１１】
更に、適当な手順においてはアミノ酸のＮ−アセチル−Ｌ−セリン（ＥＰ−Ａ１−０８８５９６２号）もしくはＯ−アセチル−Ｌ−セリン（ＤＥ−Ａ−１０１０７００２号）を主要発酵生成物として形成できることが記載された。Ｌ−セリンはまたＤＥ−Ａ−１０２１９８５１号によれば比較的容易にＮ−アセチル−Ｌ−セリン含有発酵ブロスから得ることができる。
【００１２】
【特許文献１】
ＥＰ０６２０８５３号Ｂ１
【特許文献２】
ＥＰ０９３１８３３号Ａ２
【特許文献３】
ＷＯ９７／１５６７３号
【特許文献４】
ＥＰ０８８５９６２号Ａ１
【特許文献５】
ＤＥ１９９４９５７９号Ｃ１
【特許文献６】
ＥＰ−Ａ１−０８８５９６２号
【特許文献７】
ＤＥ−Ａ−１０１０７００２号
【特許文献８】
ＤＥ−Ａ−１０２１９８５１号
【非特許文献１】
Ｎａｋａｍｏｒｉ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６４：　１６０７−１６１１
【非特許文献２】
Ｔａｋａｇｉ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４５２：　３２３−３２７
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸又はアミノ酸誘導体の過剰生産を可能にする組み換え微生物株を提供することである。他の課題は、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸又はアミノ酸誘導体を組み換え微生物株を用いて製造するための発酵的方法を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の発酵的製造のために適当であり、出発株から製造できる微生物株において、該微生物が出発株に対して高められたｙｆｉＫ遺伝子産物の活性又はｙｆｉＫホモログの遺伝子産物の活性を有することを特徴とする微生物株によって解決される。
【００１５】
ｙｆｉＫ遺伝子産物の活性の向上は本発明の範囲においては、細胞中の遺伝子産物量の増大によって細胞中の高められた全活性を達成し、かつ従って遺伝子産物の比活性が不変に保持されるが、ｙｆｉＫ遺伝子産物の活性は細胞あたり高められている場合に与えられる。
【００１６】
エシェリキア　コリのｙｆｉＫ遺伝子はゲノム配列決定（Ｂｌａｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９９７，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７７：　１４５３−１４６２）の範囲においてオープンリーディングフレームとして同定され、かつ１９５個のアミノ酸を有するタンパク質をコードしていた。今まではｙｆｉＫ遺伝子に生理学的機能は割り当てられていなかった。また配列ホモロジーを有するタンパク質によるデータベース調査（ＧＣＧ　Ｉｓｃｏｎｓｉｎ　ｐａｃｋａｇｅのＦＡＳＴＡ−ａｌｇｏｒｉｔｈｍｕｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ　（ＧＬＧ）　Ｍａｄｉｓｏｎ，　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）も僅かな情報を提供するにすぎない。それというのも単にその機能が同様に未知であるタンパク質との類似性が示されているにすぎないからである。ｙｆｉＫ遺伝子産物の可能な活性のための唯一の根拠はＡｌｅｓｈｉｎ他（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌ．　Ｓｃｉ．，１９９９，　２４：　１３３−１３５）によって見出された。そこにはアミノ酸−排出−タンパク質のタンパク質ファミリーに特徴的であるべき構造モチーフが仮定される。この少ないコンセンサスモチーフはＹｆｉＫタンパク質中にも存在するので、ＹｆｉＫタンパク質はアミノ酸についての排出系でありうる。しかしながら当業者には、そこからＹｆｉＫタンパク質の具体的なアミノ酸基質の推論を引き出すことは不可能である。ＹｆｉＫ遺伝子産物がホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の生産において有益に寄与するという発見は従って特に意想外である。それというのもＹｄｅＤ遺伝子産物によって既にエシェリキア　コリにおいてホスホグリセレートファミリーのアミノ酸に関する排出タンパク質が特徴付けされており（Ｄａｓｓｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　２０００，　３６：　１１０１−１１１２）かつ第２の系の存在は完全に期待されていなかったからである。興味深いことに、ｙｆｉＫ遺伝子産物とｙｄｅＤ遺伝子産物の間に構造の類似性は存在しない。
【００１７】
ｙｆｉＫ遺伝子及びＹｆｉＫ遺伝子産物（ＹｆｉＫタンパク質）は配列番号１もしくは配列番号２の配列によって特徴付けられている。本発明の範囲においてｙｆｉＫ−ホモログとして、分析時にアルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ　（ＧＬＧ）　Ｍａｄｉｓｏｎ，　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって３０％を上回る配列同一性を有する遺伝子を表す。特に有利には配列同一性は７０％を上回る。
【００１８】
同様に３０％を上回る配列同一性（アルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ　（ＧＬＧ）　Ｍａｄｉｓｏｎ，　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））を有するタンパク質はＹｆｉＫ−ホモログとして解釈される。特に有利には７０％を上回る配列同一性である。
【００１９】
従ってｙｆｉＫ−ホモログとしてはｙｆｉＫ−遺伝子のアレル変異体、特に配列番号１に示される配列からヌクレオチドの欠失、挿入又は置換によって誘導されるが、その際、それぞれの遺伝子産物の酵素活性は保持される機能的変異体が表される。
【００２０】
出発株に対して高められたｙｆｉＫ−遺伝子産物の活性を有する本発明による微生物は分子生物学の標準的な技術によって作成できる。
【００２１】
出発株としては、原則的にホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸のための生合成経路を有し、組み換え法が利用可能であり、かつ発酵によって培養可能な全ての生物が適当である。かかる微生物は菌類、酵母又は細菌であってよい。有利には真正細菌の系統群の細菌、有利には腸内細菌科の微生物及び、特にエシェリキア　コリの種である。
【００２２】
本発明による微生物におけるｙｆｉＫ−遺伝子産物の活性の増大は、例えばｙｆｉＫ−遺伝子の増強された発現によって達成される。この場合、微生物中のｙｆｉＫ遺伝子のコピー数が高められていてよく、かつ／又はｙｆｉＫ遺伝子の発現が適当なプロモーターによって高められていてよい。増強された発現とは、この場合有利にはｙｆｉＫ遺伝子が少なくとも出発株よりも２倍強く発現されることを意味する。
【００２３】
微生物中のｙｆｉＫ遺伝子のコピー数の増大は当業者に公知の方法によって実施できる。従って、例えばｙｆｉＫ遺伝子を細胞あたりに複数のコピー数を有するプラスミドベクター（例えばエシェリキア　コリについてはｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡ−ＣＹＣ１８４）中にクローニングし、かつ微生物中に導入してよい。選択的にｙｆｉＫ遺伝子は微生物中の染色体中に複数組み込まれてよい。組み込み法としては、溶原性細菌ファージ、組み込みプラスミド又は相同組み換えによる組み込みによる公知の系を用いてよい（例えばＨａｍｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８９，
Ｊ．　ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７１：　４６１７−４６２２）。
【００２４】
ｙｆｉＫ遺伝子をプロモーターのコントロール下にプラスミドベクターにクローニングすることによってコピー数を増大させることが有利である。ｙｆｉＫ遺伝子をｐＡＣＹＣ−誘導体、例えばｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ（ブタペスト条約によりドイツ細胞バンク（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｆｕｅｒ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）（ブラウンシュヴァイク）に１９９５年８月１８日にＤＳＭ１０１７２の番号で寄託された）にクローニングすることによってエシェリキア　コリのコピー数を増大させることが特に有利である。
【００２５】
プラスミドによってコードされたｙｆｉＫ遺伝子の発現のためのコントロール領域としては、遺伝子の天然のプロモーター領域及びオペレーター領域が用いられる。
【００２６】
しかしながらｙｆｉＫ遺伝子の増強された発現は、特に別のプロモーターによっても実施できる。例えばエシェリキア　コリでのような相応のプロモーター系、ｇａｐＡ遺伝子の構成的ＧＡＰＤＨプロモーター又は誘導可能なｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λプロモーター、ａｒａプロモーター又はｔｅｔプロモーターは当業者に公知である（Ｍａｋｒｉｄｅｓ　Ｓ．　Ｃ．，　１９９６，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｒｅｖ．　６０：　５１２−５３８）。かかる構築物は当業者に公知のようにプラスミド上で又は染色体に使用できる。
【００２７】
更に増強された発現は、翻訳開始シグナル、例えばリボソーム結合部位又は遺伝子の開始コドンがそれぞれの構築物に最適化された配列で存在するか、又は“コドン使用頻度”に従って稀なコドンを頻繁に存在するコドンと交換することによって達成することができる。
【００２８】
前記の改変は本発明の有利な実施形である。
【００２９】
プラスミドベクターへのｙｆｉＫ遺伝子のクローニングは、例えば全ｙｆｉＫ遺伝子を包含する特異的プライマーの使用下でのポリメラーゼ連鎖反応による特異的な増幅及び引き続いてのベクター−ＤＮＡ断片とのライゲーションによって実施される。
【００３０】
ｙｆｉＫ遺伝子のクローニングのために有利なベクターとしては、既に増強された発現のためのプロモーター、例えばエシェリキア　コリのｇａｐＡ遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨプロモーターを有するプラスミドが使用される。
【００３１】
従って本発明は、ｙｆｉＫ遺伝子とプロモーターとを有するプラスミドにも関する。
【００３２】
更に、その使用によりホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の過剰生産がもたらされる遺伝子／アレル、例えばｃｙｓＥＸ−遺伝子（ＷＯ９７／１５６７３号）を有するベクターが特に有利である。かかるベクターは、高いアミノ酸過剰生産を伴う本発明による微生物株を任意の微生物株から直接的に製造することを可能にする。それというのもかかるプラスミドは微生物においてシステイン代謝のフィードバック阻害の低下をもたらすからである。
【００３３】
従って本発明は、システイン代謝の脱調節のための遺伝子エレメント並びにｙｆｉＫ遺伝子をプロモーターと一緒に有することを特徴とするプラスミドにも関する。
【００３４】
通常の形質転換法（例えばエレクトロポレーション）によってｙｆｉＫを有するプラスミドを微生物中に導入し、かつ例えば抗生物質耐性を用いてプラスミドを有するクローンに対して選択する。
【００３５】
従って本発明は出発株に本発明によるプラスミドを導入することを特徴とする本発明による微生物株の製造方法にも関する。
【００３６】
ホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸を本発明による微生物株によって製造することは自体公知の方法により発酵槽中で実施される。
【００３７】
従って本発明は、本発明による微生物株を発酵において使用し、かつ生産されたアミノ酸を発酵バッチから分離することを特徴とするホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法にも関する。
【００３８】
発酵槽における微生物株の培養は、連続培養として、回分培養として又は流加培養としても行われる。特に有利には発酵の間に連続的にＣ源を供給する。
【００３９】
Ｃ源としては、有利には糖、糖アルコール又は有機酸が用いられる。特に有利には、本発明による方法においてＣ源としてはグルコース、ラクトース又はグリセリンが使用される。
【００４０】
発酵の間に発酵槽中にＣ源の含量が０．１〜５０ｇ／ｌの範囲に保持されることを保証する形でＣ源を供給することが有利である。０．５〜１０ｇ／ｌの範囲が特に有利である。
【００４１】
Ｎ源としては、本発明による方法において有利にはアンモニア、アンモニウム塩又はタンパク質加水分解物が使用される。ｐＨ安定化のための校正剤としてのアンモニアの使用により発酵の間に均一にＮ源が後供給される。
【００４２】
他の培地添加物として、元素のリン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄の塩を、かつ微量に（すなわちμＭの濃度で）元素のモリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛及びニッケルの塩を添加してよい。
【００４３】
更に、有機酸（例えば酢酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えばイソロイシン）及びビタミン（例えばＢ１、Ｂ６）を培地に添加してよい。
【００４４】
天然栄養源としては、例えば酵母エキス、コーンスティープリカー、ダイズ粉又は麦芽エキスを使用してよい。
【００４５】
中温微生物のためのインキュベーション温度は、有利には１５〜４５℃、特に有利には３０〜３７℃である。
【００４６】
発酵は、有利には好気的増殖条件下に実施される。発酵槽への酸素供給は圧縮空気又は純粋酸素によって実施される。
【００４７】
発酵培地のｐＨ値は発酵の間は、有利には５．０〜８．５、特に有利には７．０である。本発明によるＯ−アセチル−Ｌ−セリンの製造が望ましいのであれば、特に有利なｐＨ領域は５．５〜６．５である。
【００４８】
Ｌ−システイン及びＬ−システイン誘導体の製造のために発酵の間に硫黄源を給餌しなければならない。有利にはこの場合、硫酸塩又はチオ硫酸塩が使用される。
【００４９】
前記の方法により発酵を行う微生物は回分法又は流加法で増殖期の後に１０〜１５０時間でホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸を高い効率で培養培地中に分泌する。
【００５０】
以下の実施例を本発明の更なる説明に用いる。
【００５１】
【配列表】
【００５２】
【外１】
2004049237.tif 000002
【００５３】
【外２】
2004049237.tif 000003
【００５４】
【外３】
2004049237.tif 000004
【００５５】
【外４】
2004049237.tif 000005
【００５６】
【実施例】
例１：
エシェリキア　コリ株Ｗ３１１０からのｙｆｉＫ遺伝子をプロテアーゼ連鎖反応を用いて増幅させた。特異的プライマーとしてオリゴヌクレオチド
ｙｆｉＫ−ｆｗ：（配列番号３）
【００５７】
【外５】
2004049237.tif 000006
【００５８】
及び
ｙｆｉＫ−ｒｅｖ：（配列番号４）
【００５９】
【外６】
2004049237.tif 000007
【００６０】
を用いる。
【００６１】
得られるＤＮＡ断片を制限酵素ＡｓｎＩ及びＰａｃＩによって消化し、アガロースゲル電気泳動によって純化し、かつ単離した（Ｑｉａｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　Ｑｉａｇｅｎ，　Ｈｉｌｄｅｎ，　Ｄ）。クローニングは、ＥＰ０８８５９６２号Ａ１に詳細に記載されているＮｄｅＩ／ＰａｃＩで切断したベクターｐＡＣＹＣ１８４−ｃｙｓＥＸ−ＧＡＰＤＨとのライゲーションによって実施した。該ベクターはＬ−システインによる低減されたフィードバック阻害を有するセリンアセチルトランスフェラーゼをコードし、かつその３′側にｇａｐＡ遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨプロモーターを有するｃｙｓＥＸ遺伝子を有する。前記の挙動によってｙｆｉＫ遺伝子は、そこから転写が開始できるようにＧＡＰＤＨプロモーターの後方に配置されている。得られるベクターはｐＧ１３という名称を有し、かつ図１に見取り図として示されている。構築物の検証の後に、エシェリキア　コリ株Ｗ３１１０を形質転換させ、かつ相応の形質転換体をテトラサイクリンで選択した。細菌株のエシェリキア　コリＷ３１１０／ｐＧ１３はＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｆｕｅｒ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ，Ｄ−３８１４２　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）でＤＳＭ１５０９５の番号でブタペスト条約により寄託され、かつ以下の実施例でホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造のための生産株として用いた。高められたｙｆｉＫ遺伝子の発現の効果の証明のための比較株として、同様にＥＰ０８８５９６２号Ａ１に詳細に記載されているが、ｐＧ１３に対してＧＡＰＤＨ−プロモーター−ｙｆｉｋ−配列を有さないＷ３１１０／ｐＡＣＹＣ１８４−ｃｙｓＥＸを選択した。
【００６２】
例２：生産株の前培養
発酵のための前培養として、付加的に１５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを含有する２０ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのＮａＣｌ）にＷ３１１０／ｐＧ１３もしくはＷ３１１０／ｐＡＣＹＣ１８４−ｃｙｓＥＸを接種し、かつ３０℃及び１５０ｒｐｍで振盪器中でインキュベートした。６時間後にバッチ全体を、５ｇ／ｌのグルコース；０．５ｍｇ／ｌのビタミンＢ１及び１５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを補った１００ｍｌのＳＭ１培地（１２ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４；３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４；５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；０．３ｇ／ｌのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ；０．０１５ｇ／ｌのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ；０．００２ｇ／ｌのＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ；１ｇ／ｌのＮａ３クエン酸塩×２Ｈ２Ｏ；０．１ｇ／ｌのＮａＣｌ；０．１５ｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ；２．５ｇ／ｌのＮａ３ＢＯ３；０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ；０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ；１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ；０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏからなる１ｍｌ／ｌの微量元素溶液）に移した。更なるインキュベーションを３０℃で１５０ｒｐｍにおいて１７時間実施した。
【００６３】
例３：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵的製造
発酵槽として、２ｌの最大培養容量を有するブラウンビオテック（Ｂｒａｕｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）社（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，　Ｄ）のビオスタット（Ｂｉｏｓｔａｔ）Ｍ装置を用いた。例２に記載される前培養（６００ｎｍでの光学密度は約３）を、１５ｇ／ｌのグルコース、０．１ｇ／ｌのトリプトン、０．０５ｇ／ｌの酵母エキス、０．５ｍｇ／ｌのビタミンＢ１及び１５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを補った９００ｍｌのＳＭ１培地を有する発酵槽に接種した。発酵の間に３２℃の温度に調整し、かつｐＨ値を２５％のアンモニアの供給によって６．０の値で一定に保持した。該培養を滅菌された圧縮空気によって１．５容量／容量／分でガス処理し、かつ撹拌回転速度２００ｒｐｍで撹拌した。５０％の値への酸素飽和の低減の後に、制御装置を介して回転数を１２００ｒｐｍの値にまで高めて、５０％の酸素飽和が保持した（ｐＯ２プローブによって測定し、９００ｒｐｍで１００％の飽和に校正した）発酵槽中のグルコース含量が当初の１５ｇ／ｌから約５〜１０ｇ／ｌに低下したらすぐに、５６％のグルコース溶液の供給を実施した。給餌は６〜１２ｍｌ／時間の流速で実施し、その際、発酵槽中のグルコース濃度は０．５〜１０ｇ／ｌで一定に保持した。グルコース測定をＹＳＩ社のグルコース分析器（Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉｎｇｓ，　Ｏｈｉｏ，　ＵＳＡ）を用いて実施した。発酵時間は２８時間であった。この時間の後に試料を採取し、かつこれらの細胞を遠心分離によって培養培地から分離した。得られる培養上清をＬＵＮＡ　５μ　Ｃ１８（２）−カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，　Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，　Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）で流速０．５ｍｌ／分で逆相ＨＰＬＣによって分析した。溶出剤として希釈されたリン酸（０．１ｍｌの濃リン酸／ｌ）を用いた。第１表は培養上清中の主要代謝産物の達成された含量を示している。これらは、中性ないしアルカリ性の条件でＯ−アセチル−Ｌ−セリンから異性体化によって増大して生じるＯ−アセチル−Ｌ−セリン及びＮ−アセチル−Ｌ−セリンである。
【００６４】
第１表：
【００６５】
【表１】
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【００６６】
例４：Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵的製造
Ｎ−アセチル−Ｎ−セリンの製造のために例２及び３におけるのと同様に行った。発酵槽中のｐＨ値を７．０の値に調整したに過ぎない。それによってＯ−アセチル−Ｌ−セリンのＮ−アセチル−Ｌ−セリンへの異性体化は促進され、かつ主要生成物としてＮ−アセチル−Ｌ−セリンが得られた。発酵時間は４８時間であった。
【００６７】
第２表：
【００６８】
【表２】
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【００６９】
例５：Ｌ−システイン及びＬ−システイン誘導体の発酵的製造
Ｌ−システインの製造のために例２及び３におけるのと同様に行った。発酵槽中のｐＨ値を７．０の値に調整し、チオ硫酸塩の給餌を行ったに過ぎない。更に、２時間後に３０％のＮａチオ硫酸塩溶液の供給を３ｍｌ／時間の速度で行った。発酵時間は４８時間であった。Ｌ−システインの生産を比色的にガイトンデ（Ｇａｉｔｏｎｄｅ）による試験（Ｇａｉｔｏｎｄｅ，　Ｍ．　Ｋ．　（１９６７），　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　１０４，　６２７−６３３）によって調査した。この場合に、該試験はＬ−システイン及びＥＰ０８８５９６２号Ａ１に記載されるＬ−システイン及びピルベートの縮合生成物（２−メチル−チアゾリジン−２，４−ジカルボン酸）の間を区別できないことを顧慮すべきである。Ｌ−システインの酸化によって生じるＬＬ−システインは前記試験においてジチオトレイトール（ＤＴＴ）による還元によりｐＨ８．０の希釈された溶液中で同様にＬ−システインとして検出される。
【００７０】
第３表
【００７１】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はプラスミドｐＧ１３の構造を示している。
【図１】
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