(57)【要約】【課題】本発明は、発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有し、かつその発現可能なオリゴヌクレオチドがランダムコドン配列の所望の偏りを有する、複数の原核細胞を提供することを目的とする。【解決手段】発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが、所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１および第２オリゴヌクレオチド前駆体の集団のランダムな結合から生成された所望の偏りのランダムコドン配列を有する、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが、所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１および第２オリゴヌクレオチド前駆体の集団のランダムな結合から生成された所望の偏りのランダムコドン配列を有する、組成物。
【請求項２】
所望の偏りのランダムコドン配列を有する結合された第１および第２オリゴヌクレオチド由来のランダムペプチドの多様な集団の発現に有用なベクターの調製のためのキットであって、２つのベクター：該第１オリゴヌクレオチドのためのクローン化部位、および第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとを作動可能に結合させるための一対の制限部位を有する第１ベクター；ならびに該第２オリゴヌクレオチドのためのクローン化部位、および該第１ベクター上にそれらと相補的な一対の制限部位を有する第２ベクター、を有するキットであり、１つまたは両方のベクターが該結合された第１および第２オリゴヌクレオチドに作動可能に結合され得る発現要素を含有する、キット。
【請求項３】
所望の偏りのランダムコドン配列を有する結合された第１および第２オリゴヌクレオチドの多様な集団からランダムペプチドを発現させるためのクローン化系であって、所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を有する第１ベクターのセット、および所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を有する第２ベクターのセットを含有し、該第１および第２ベクターはそれぞれ、第１および第２オリゴヌクレオチドを作動可能に結合させて所望の偏りのランダムコドン配列を有する隣接オリゴヌクレオチドにするための一対の制限部位を有している、クローン化系。
【請求項４】
発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが所望の偏りのランダムコドン配列を有する、組成物。
【請求項５】
所望の偏りのランダムコドン配列を有する発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する、複数のベクター。
【請求項６】
所望の偏りのランダムコドン配列を有する２つ以上のオリゴヌクレオチド前駆体の集団のランダムな結合から生成された、所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する、物質の組成物。
【請求項７】
ランダムペプチドとして前記結合されたオリゴヌクレオチドを発現し得る所望の偏りのランダムコドン配列を有する、結合された第１および第２オリゴヌクレオチドを有するベクターの多様な集団を構築する方法であって：
（ａ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団由来の配列を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ｂ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団由来の配列を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；および
（ｃ）該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が、発現され得る結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程（ａ）および（ｂ）のベクター生成物を結合する工程；
を包含する、方法。
【請求項８】
ランダムペプチドの集団由来のリガンド結合タンパク質により結合され得るペプチドを選択する方法であって：
（ａ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ｂ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ｃ）該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が、結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程（ａ）および（ｂ）のベクター生成物を結合する工程；
（ｄ）該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該結合されたベクターの集団を和合性宿主に導入する工程；および
（ｅ）該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項９】
ランダムペプチドの集団から選択されるリガンド結合タンパク質により結合され得るペプチドをコードする核酸配列を決定する方法であって：
（ａ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ｂ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ｃ）該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程（ａ）および（ｂ）のベクター生成物を結合する工程；
（ｄ）該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該結合されたベクターの集団を和合性宿主に導入する工程；
（ｅ）該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程；
（ｆ）該ペプチドをコードする核酸を単離する工程；および
（ｇ）該核酸の配列を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１０】
所望の偏りのランダムコドン配列を有する発現可能なオリゴヌクレオチドを含有するベクターの多様な集団を構築する方法であって、所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程を包含する、方法。
【請求項１１】
ランダムペプチドの集団由来の結合タンパク質により結合され得るペプチドを選択する方法であって：
（ａ）所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程；
（ｂ）該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該ベクターの集団を和合性宿主に導入する工程；および
（ｃ）該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１２】
ランダムペプチドの集団から選択されるリガンド結合タンパク質により結合され得るペプチドをコードする核酸配列を決定する方法であって：
（ａ）所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程；
（ｂ）該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該ベクターの集団を和合性宿主に導入する工程；
（ｃ）該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程；
（ｄ）該ペプチドをコードする核酸を単離する工程；および
（ｅ）該核酸の配列を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１３】
繊維状バクテリオファージコートタンパク質をコードする遺伝子の２つのコピーを含有するベクターであって、両コピーは実質的に同じアミノ酸配列をコードするが、異なるヌクレオチド配列を有する、ベクター。
【請求項１４】
繊維状バクテリオファージコートタンパク質をコードする遺伝子の２つのコピーを含有するベクターであって、該遺伝子の１つのコピーがオリゴヌクレオチドに作動可能に結合され得、該オリゴヌクレオチドが、該繊維状バクテリオファージの表面に融合タンパク質として、または可溶性ペプチドとして発現され得る、ベクター。
【請求項１５】
発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが、偏らないアミノ酸をコードする第１および第２オリゴヌクレオチド前駆体の集団のランダムな結合から生成された完全にランダムなアミノ酸をコードする、組成物。
【請求項１６】
発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが、完全にランダムなアミノ酸をコードする、組成物。
【請求項１７】
完全にランダムなアミノ酸をコードする発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する複数のベクターを含有する物質の、組成物。
【請求項１８】
完全にランダムなコドン配列をコードする発現可能なオリゴヌクレオチドを含有するベクターの多様な集団を構築する方法であって、完全にランダムなコドン配列をコードするオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程を包含する、方法。
【請求項１９】
ランダムペプチドの集団由来の結合タンパク質により結合され得るペプチドを選択する方法であって：
（ａ）完全にランダムなコドン配列をコードするオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程；
（ｂ）該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該ベクターの集団を和合性宿主に導入する工程；および
（ｃ）該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２０】
ランダムペプチドの集団から選択されるリガンド結合タンパク質により結合され得るペプチドをコードする核酸配列を決定する方法であって：請求項１９の方法に従ってペプチドを選択する工程を包含し、さらに以下：
（ａ）該ペプチドをコードする核酸を単離する工程；および
（ｂ）該核酸の配列を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドが細胞の表面上に融合タンパク質として発現される、請求項１５、１６または１７に記載の物質の組成物。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが細胞の表面上に融合タンパク質として発現される、請求項１８、１９または２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般にオリゴヌクレオチドを合成しおよび発現させる方法に関し、さらに詳しくはランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドを発現させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オリゴヌクレオチドの合成は、段階適反応で個々のモノマーが線状結合することによって進行する。この反応は、一般に、まず、第１モノマーの３’末端を支持体に結合することによって、固相支持体上で行われる。第２モノマーが第１モノマーの５’末端に、縮合反応で付加して、固体支持体に結合したジヌクレオチドが得られる。各結合反応の終わりに、副生成物および未反応の遊離モノマーを洗浄して除去し、合成の次の段階の出発物質を、支持体に結合した純粋なオリゴヌクレオチドとする。この反応計画では、個々のモノマーが、オリゴヌクレオチドの単一の伸長末端に段階的に付加されるので、所望の配列の正確な合成が保証される。さらに、２つのオリゴヌクレオチドの縮合が高い生成物収率で起こるような好ましくない副反応が排除される。
【０００３】
場合によっては、合成オリゴヌクレオチドがランダムヌクレオチド配列を有することが所望されることがある。この結果は、モノマー結合反応において、４種のヌクレオチド全部を等比率で添加し、すべてのヌクレオチドをランダムに組み込み、そしてランダム配列を有するオリゴヌクレオチドの集団を得ることによって達成できる。起こり得るすべての組み合わせのヌクレオチド配列が上記集団の中に示されるので、起こり得るすべてのコドントリプレットもまた示されている。目的が、最終的にランダムペプチド生成物を生成することであれば、この方法には厳しい限界がある。というのは、合成されたランダムコドンは、細胞によるそのＤＮＡのポリペプチドへの翻訳中に組み込まれるアミノ酸を偏らせるからである。
【０００４】
この偏りは遺伝暗号の重複性が原因である。６４種の生じる可能性のあるトリプレットコドンをもたらす、４種のヌクレオチドモノマーがある。２０種のアミノ酸だけを指定しても、多くのアミノ酸が多重コドンによってコードされる。それ故に、ランダム集団由来のモノマーを連続付加することによって合成されるオリゴヌクレオチドの集団は、２０種の異なるアミノ酸の起こり得るすべての組み合わせを等しい比率で示すアミノ酸配列を有するペプチドをコードしない。すなわち、ポリペプチドに組み込まれるアミノ酸の頻度は、多重コドンが指定するこれらのアミノ酸配列に偏らされる。
【０００５】
遺伝暗号の重複性によるアミノ酸の偏りを軽減するために、オリゴヌクレオチドはヌクレオチドトリプレットから合成され得る。この場合、２０種の各アミノ酸をコードするトリプレットは、個々のモノマーから合成される。これらのトリプレットは、まず合成されてから、個々のモノマーの代わりに結合反応に使用される。等比率のトリプレットを混合することによって、ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドの合成を達成し得る。しかし、このようなトリプレットから合成する場合の費用は、トリプレットが市販されていないので、個々のモノマーから合成する場合の費用をはるかに超える。
【０００６】
しかし、縮重コドン配列ＮＮＫ（但しＮは４種のヌクレオチドすべての混合物であり、そしてＫはグアニンおよびチミンのヌクレオチドの混合物である）を合成することによって、アミノ酸の偏りを減らすことができる。このコドン配列を有するオリゴヌクレオチド内の各位置は、合計３２のコドンを含有している（アミノ酸をコードする１２種のコドンが１回現れ、５種のコドンが２回現れ、３種のコドンが３回現れおよび１種のコドンは終止コドンである）。このような縮重コドン配列で発現されるオリゴヌクレオチドは、２回以上現れるそれらのアミノ酸に対して偏った配列を有するペプチド生成物を生成する。従って完全にランダムな配列を有するペプチドの集団は、縮重配列から合成されたオリゴヌクレオチドからは得ることができない。
【０００７】
従って、遺伝重複性を軽減する、完全にランダムかまたは所望により偏った配列を有するオリゴヌクレオチドを発現させる方法が要望されている。本発明はこれらの要望を満たし、さらに別の利点を提供する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有し、かつその発現可能なオリゴヌクレオチドがランダムコドン配列の所望の偏りを有する、複数の原核細胞を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
１．発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが、所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１および第２オリゴヌクレオチド前駆体の集団のランダムな結合から生成された所望の偏りのランダムコドン配列を有する、組成物。
【００１０】
２．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、項目１に記載の組成物。
【００１１】
３．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が予め決められた配列に対して偏っている、項目１に記載の組成物。
【００１２】
４．前記ランダムコドン配列を有する前記第１および第２オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、項目１に記載の組成物。
【００１３】
５．前記細胞が原核生物である、項目１に記載の組成物。
【００１４】
６．前記細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項目１に記載の組成物。
【００１５】
７．所望の偏りのランダムコドン配列を有する結合された第１および第２オリゴヌクレオチド由来のランダムペプチドの多様な集団の発現に有用なベクターの調製のためのキットであって、２つのベクター：該第１オリゴヌクレオチドのためのクローン化部位、および第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとを作動可能に結合させるための一対の制限部位を有する第１ベクター；ならびに該第２オリゴヌクレオチドのためのクローン化部位、および該第１ベクター上にそれらと相補的な一対の制限部位を有する第２ベクター、を有するキットであり、１つまたは両方のベクターが該結合された第１および第２オリゴヌクレオチドに作動可能に結合され得る発現要素を含有する、キット。
【００１６】
８．前記ベクターが繊維状バクテリオファージ中にある、項目７に記載のキット。
【００１７】
９．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３である、項目８に記載のキット。
【００１８】
１０．前記ベクターがプラスミドである、項目７に記載のキット。
【００１９】
１１．前記ベクターがファージミドである、項目７に記載のキット。
【００２０】
１２．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、項目７に記載のキット。
【００２１】
１３．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、項目７に記載のキット。
【００２２】
１４．所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記第１および第２オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、項目７に記載のキット。
【００２３】
１５．前記一対の制限部位がＦｏｋ　Ｉである、項目７に記載のキット。
【００２４】
１６．所望の偏りのランダムコドン配列を有する結合された第１および第２オリゴヌクレオチドの多様な集団からランダムペプチドを発現させるためのクローン化系であって、所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を有する第１ベクターのセット、および所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を有する第２ベクターのセットを含有し、該第１および第２ベクターはそれぞれ、第１および第２オリゴヌクレオチドを作動可能に結合させて所望の偏りのランダムコドン配列を有する隣接オリゴヌクレオチドにするための一対の制限部位を有している、クローン化系。
【００２５】
１７．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、項目１６に記載のクローン化系。
【００２６】
１８．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、項目１６に記載のクローン化系。
【００２７】
１９．所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記第１および第２オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、項目１６に記載のクローン化系。
【００２８】
２０．前記結合された第１および第２ベクターが一対の制限部位を介して結合している、項目１６に記載のクローン化系。
【００２９】
２１．前記一対の制限部位がＦｏｋ　Ｉである、項目１６に記載のクローン化系。
【００３０】
２２．発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を有する複数の細胞を含有する物質の組成物であって、該発現可能なオリゴヌクレオチドが所望の偏りのランダムコドン配列を有する、組成物。
【００３１】
２３．前記細胞が原核生物である、項目２２に記載の組成物。
【００３２】
２４．前記発現可能なオリゴヌクレオチドが繊維状バクテリオファージの表面にペプチド融合タンパク質として発現される、項目２２に記載の組成物。
【００３３】
２５．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３である、項目２２に記載の組成物。
【００３４】
２６．前記融合タンパク質が遺伝子ＶＩＩＩの生成物を含有する、項目２２に記載の組成物。
【００３５】
２７．所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの前記多様な集団が、所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１および第２オリゴヌクレオチドの多様な集団の結合から生成される、項目２２に記載の組成物。
【００３６】
２８．前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、項目２２に記載の組成物。
【００３７】
２９．前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、項目２２に記載の組成物。
【００３８】
３０．所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、項目２２に記載の組成物。
【００３９】
３１．所望の偏りのランダムコドン配列を有する発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する、複数のベクター。
【００４０】
３２．前記オリゴヌクレオチドが繊維状バクテリオファージの表面に融合タンパク質として発現可能である、項目３１に記載のベクター。
【００４１】
３３．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３である、項目３１に記載のベクター。
【００４２】
３４．前記融合タンパク質が遺伝子ＶＩＩＩの生成物を含有する、項目３１に記載のベクター。
【００４３】
３５．前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、項目３１に記載のベクター。
【００４４】
３６．前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、項目３１に記載のベクター。
【００４５】
３７．所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、項目３１に記載のベクター。
【００４６】
３８．所望の偏りのランダムコドン配列を有する２つ以上のオリゴヌクレオチド前駆体の集団のランダムな結合から生成された、所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する、物質の組成物。
【００４７】
３９．ランダムペプチドとして前記結合されたオリゴヌクレオチドを発現し得る所望の偏りのランダムコドン配列を有する、結合された第１および第２オリゴヌクレオチドを有するベクターの多様な集団を構築する方法であって：
（ａ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団由来の配列を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ｂ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団由来の配列を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；および
（ｃ）該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が、発現され得る結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程（ａ）および（ｂ）のベクター生成物を結合する工程；
を包含する、方法。
【００４８】
４０．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、項目３９に記載の方法。
【００４９】
４１．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、項目３９に記載の方法。
【００５０】
４２．所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記第１および第２オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、項目３９に記載の方法。
【００５１】
４３．前記（ａ）から（ｃ）の工程が２回以上繰り返される、項目３８に記載の方法。
【００５２】
４４．ランダムペプチドの集団由来のリガンド結合タンパク質により結合され得るペプチドを選択する方法であって：
（ａ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ｂ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ｃ）該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が、結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程（ａ）および（ｂ）のベクター生成物を結合する工程；
（ｄ）該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該結合されたベクターの集団を和合性宿主に導入する工程；および
（ｅ）該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程；
を包含する、方法。
【００５３】
４５．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、項目４４に記載の方法。
【００５４】
４６．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、項目４４に記載の方法。
【００５５】
４７．所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記第１および第２オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、項目４４に記載の方法。
【００５６】
４８．前記（ａ）から（ｃ）の工程が２回以上繰り返される、項目４４に記載の方法。
【００５７】
４９．ランダムペプチドの集団から選択されるリガンド結合タンパク質により結合され得るペプチドをコードする核酸配列を決定する方法であって：
（ａ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ｂ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ｃ）該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程（ａ）および（ｂ）のベクター生成物を結合する工程；
（ｄ）該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該結合されたベクターの集団を和合性宿主に導入する工程；
（ｅ）該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程；
（ｆ）該ペプチドをコードする核酸を単離する工程；および
（ｇ）該核酸の配列を決定する工程；
を包含する、方法。
【００５８】
５０．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、項目４９に記載の方法。
【００５９】
５１．前記第１および第２オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、項目４９に記載の方法。
【００６０】
５２．所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記第１および第２オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、項目４９に記載の方法。
【００６１】
５３．前記（ａ）から（ｃ）の工程が２回以上繰り返される、項目４９に記載の方法。
【００６２】
５４．所望の偏りのランダムコドン配列を有する発現可能なオリゴヌクレオチドを含有するベクターの多様な集団を構築する方法であって、所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程を包含する、方法。
【００６３】
５５．前記オリゴヌクレオチドが繊維状バクテリオファージの表面に融合タンパク質として発現可能である、項目５４に記載の方法。
【００６４】
５６．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３である、項目５４に記載の方法。
【００６５】
５７．前記融合タンパク質が遺伝子ＶＩＩＩの生成物を含有する、項目５４に記載の方法。
【００６６】
５８．前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、項目５４に記載の方法。
【００６７】
５９．前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、項目５４に記載の方法。
【００６８】
６０．所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、項目５４に記載の方法。
【００６９】
６１．項目５４に記載の方法であって、前記作動可能に結合させる工程が、
（ａ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ｂ）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；および
（ｃ）該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程（ａ）および（ｂ）のベクター生成物を結合する工程；
をさらに包含する、方法。
【００７０】
６２．前記（ａ）から（ｃ）の工程が２回以上繰り返される、項目６１に記載の方法。
【００７１】
６３．ランダムペプチドの集団由来の結合タンパク質により結合され得るペプチドを選択する方法であって：
（ａ）所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程；
（ｂ）該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該ベクターの集団を和合性宿主に導入する工程；および
（ｃ）該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程；
を包含する、方法。
【００７２】
６４．前記ランダムペプチドの集団が繊維状バクテリオファージの表面に融合タンパク質として発現される、項目６３に記載の方法。
【００７３】
６５．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３である、項目６３に記載の方法。
【００７４】
６６．前記融合タンパク質が遺伝子ＶＩＩＩの生成物を含有する、項目６３に記載の方法。
【００７５】
６７．前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、項目６３に記載の方法。
【００７６】
６８．前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、項目６３に記載の方法。
【００７７】
６９．所望の偏りのランダムコドン配列を有する前記オリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、項目６３に記載の方法。
【００７８】
７０．項目６３に記載の方法であって、前記工程（ａ）が、
（ａ１）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ａ２）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；および
（ａ３）該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が、結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程（ａ）および（ｂ）のベクター生成物を結合する工程；
をさらに包含する、方法。
【００７９】
７１．前記（ａ１）から（ａ３）の工程が２回以上繰り返される、項目７０に記載の方法。
【００８０】
７２．ランダムペプチドの集団から選択されるリガンド結合タンパク質により結合され得るペプチドをコードする核酸配列を決定する方法であって：
（ａ）所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの多様な集団を発現要素に作動可能に結合させる工程；
（ｂ）該ランダムペプチドの集団を発現させるに充分な条件下で、該ベクターの集団を和合性宿主に導入する工程；
（ｃ）該リガンド結合タンパク質に結合するペプチドを決定する工程；
（ｄ）該ペプチドをコードする核酸を単離する工程；および
（ｅ）該核酸の配列を決定する工程；
を包含する、方法。
【００８１】
７３．前記ランダムペプチドの集団が繊維状バクテリオファージの表面に融合タンパク質として発現される、項目７２に記載の方法。
【００８２】
７４．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３である、項目７２に記載の方法。
【００８３】
７５．前記融合タンパク質が遺伝子ＶＩＩＩの生成物を含有する、項目７２に記載の方法。
【００８４】
７６．前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が偏らない、項目７２に記載の方法。
【００８５】
７７．前記オリゴヌクレオチドの所望の偏りのランダムコドン配列が、多様であるが予め決められた配列に対して偏っている、項目７２に記載の方法。
【００８６】
７８．前記所望の偏りのランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドが、予め決められた位置に少なくとも１つの指定されたコドンを有する、項目７２に記載の方法。
【００８７】
７９．項目７２に記載の方法であって、前記工程（ａ）が、
（ａ１）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第１オリゴヌクレオチドの多様な集団を第１ベクターに作動可能に結合させる工程；
（ａ２）所望の偏りのランダムコドン配列を有する第２オリゴヌクレオチドの多様な集団を第２ベクターに作動可能に結合させる工程；および
（ａ３）該第１および第２オリゴヌクレオチドの集団が結合されたベクターの集団に結合される条件下で、工程（ａ）および（ｂ）のベクター生成物を結合する工程；
をさらに包含する、方法。
【００８８】
８０．前記（ａ１）から（ａ３）の工程が２回以上繰り返される、項目７８に記載の方法。
【００８９】
８１．繊維状バクテリオファージコートタンパク質をコードする遺伝子の２つのコピーを含有するベクターであって、両コピーは実質的に同じアミノ酸配列をコードするが、異なるヌクレオチド配列を有する、ベクター。
【００９０】
８２．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３である、項目８１に記載のベクター。
【００９１】
８３．前記遺伝子が遺伝子ＶＩＩＩである、項目８１に記載のベクター。
【００９２】
８４．前記ベクターが実質的に図５（図５Ａ〜Ｂ）に示す配列（ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１）を有する、項目８１に記載のベクター。
【００９３】
８５．繊維状バクテリオファージコートタンパク質をコードする遺伝子の２つのコピーを含有するベクターであって、該遺伝子の１つのコピーがオリゴヌクレオチドに作動可能に結合され得、該オリゴヌクレオチドが、該繊維状バクテリオファージの表面に融合タンパク質として、または可溶性ペプチドとして発現され得る、ベクター。
【００９４】
８６．前記遺伝子の前記１つのコピーが、前記繊維状バクテリオファージの表面に発現される、項目８４に記載のベクター。
【００９５】
８７．前記バクテリオファージコートタンパク質がＭ１３遺伝子ＶＩＩＩである、項目８４に記載のベクター。
【００９６】
【発明の実施の形態】
（発明の詳細な説明）
本発明は、個々のモノマーを用いて、所望の偏りのランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを合成しおよび発現させる簡単で安価な方法に関する。この方法は、個々のモノマーをトリプレットの代わりに使い、単に全トリプレットの非縮重サブセットだけを合成することによって、コドン重複性が軽減されるという点で有利である。従って、合成されたオリゴヌクレオチドは、生じ得るランダムトリプレット配列を大きな比率で得ることができることを示す。得られたオリゴヌクレオチドは、例えば、ファージの生存度を変えないか、または所定のペプチド配列に対して生物学的選択を課することができない形態の繊維状バクテリオファージの表面に発現させることができる。それ故に生成したオリゴヌクレオチドは、薬理学および研究用の生成物を無限の数で生成させるのに有用である。
【００９７】
１つの実施態様において、本発明は、モノマーを逐次結合して、所望の偏りのランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを生成する。遺伝暗号のアミノ酸を指定する２０種のコドンをランダム化する結合反応は１０の異なる反応容器で実施される。各反応容器は、２つの異なるコドンのモノマーが３つの連続反応で結合される支持体が入っている。これらの反応の１つが２種のモノマーの等しい混合物を結合し、その結果、最終生成物は２種の異なるコドン配列を有する。これらのコドンは、支持体を反応容器から取り出してそれらを混合し、特定の位置に２０種の全コドンを含有する支持体の単一バッチを生成させることによってランダム化される。次のコドン位置での合成は、予め１０の反応容器に支持体の前記混合バッチを等しく分割し、モノマーをコドンの各対に連続して結合させることによって進行させる。支持体を再び混合して、コドンを正に合成される位置でランダム化する。結合、混合および分割のサイクルは、所望の数のコドン位置がランダム化されるまで続ける。最後の位置がランダム化されてから、ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを支持体から切断する。次いでそのランダムオリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子ＶＩＩＩ−ペプチド融合タンパク質のような繊維状バクテリオファージの表面に発現させることができる。他の遺伝子もまた使用することができる。
【００９８】
その最も広い形態で、本発明は、細胞内で発現できるように、ベクター中に含有されている合成オリゴヌクレオチドの多様な集団を提供する。多様なオリグヌクレオチドのような集団は、少なくとも１つの部位で、コドンをランダムに変化させることができる限り、１つ以上のコドン部位で充分ランダムであるか、または１つ以上の部位で充分規定され得る。オリゴヌクレオチドの集団は、Ｍ１３のような繊維状バクテリオファージの表面タンパク質を遺伝子ＶＩＩＩと結合させた融合生成物として発現され得る。そのベクターは、例えば原核生物のＥ．　ｃｏｌｉのような細胞の複数にトランスフェクトされ得る。
【００９９】
オリゴヌクレオチドの多様な集団は、第１と第２の前駆体集団（これらの各集団は、所望の偏りのランダムコドン配列を有している）をランダムに結合することによって製造され得る。発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を合成しおよび発現させる方法もまた提供される。
【０１００】
好ましい実施態様では、ランダムオリゴヌクレオチドの２つの集団が合成される。各集団内のオリゴヌクレオチドは、発現されるべき最後のオリゴヌクレオチドの一部分をコードする。１つの集団内のオリゴヌクレオチドは、発現されるオリゴヌクレオチドのカルボキシ末端部分をコードする。これらのオリゴヌクレオチドは、遺伝子ＶＩＩＩ（ｇＶＩＩＩ）配列とインフレームでクローン化され、その結果その配列が翻訳されてペプチド融合タンパク質が生成する。オリゴヌクレオチドの第２の集団は別のベクターにクローン化される。この集団内の各オリゴヌクレオチドは、発現されるオリゴヌクレオチドのアミノ末端部分のアンチセンスをコードする。このベクターもまた発現に必要な要素を含有している。ランダムオリゴヌクレオチドを含有する２つのベクターは結合され、その結果２つの前駆体オリゴヌクレオチド部分がランダムに結合されて、２つの小さな部分から誘導された大きなオリゴヌクレオチドの集団を形成する。上記のベクターは、２つのオリゴヌクレオチド集団を結合する際に最大の効率を保証するために選択可能なマーカーを含有している。ライブラリーの構築およびスクリーニング中にｇＶＩＩＩ−ペプチド融合タンパク質の発現を制御する機構もまた存在する。
【０１０１】
「モノマー」または「ヌクレオチドモノマー」という用語は本願で用いる場合、オリゴヌクレオチドの化学合成に用いられる個々のヌクレオチドを意味する。使用できるモノマーには、５種の各標準ヌクレオチド（塩基であるアデニン（それぞれＡもしくはｄＡ）、グアニン（ＧもしくはｄＧ）、シトシン（ＣもしくはｄＣ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）から誘導される）のリボ型およびデオキシリボ型の両方が含まれる。ポリペプチドの生合成を支持できるイノシンのような塩基の誘導体および前駆体もまたモノマーに含まれる。また、化学的に修飾されたヌクレオチド、例えば、モノマーのプリンもしくはピリミジンの塩基、リボースもしくはデオキシリボースの糖、またはリン酸もしくはヒドロキシルの部分の任意の位置に結合した可逆的ブロッキング剤を有するものも含まれる。このようなブロッキング剤には、例えばジメトキシトリチル、ベンゾイル、イソブチリル、β−シアノエチルおよびジイソプロピルアミンの各基があるが、ヒドロキシル、環外のアミンおよびリン酸部分を保護するのに用いられる。他のブロッキング剤もまた用いられ得るが、当業者に公知である。
【０１０２】
「チュプレット」という用語は、本願で用いる場合、定義可能な大きさの要素の基を意味する。本願で用いるチュプレットの要素は、ヌクレオチドモノマーである。例えばチュプレットは、ジヌクレオチド、トリヌクレオチドまたは４量体以上のヌクレオチドであり得る。
【０１０３】
「コドン」または「トリプレット」という用語は、本願で用いる場合、ポリペプチドの生合成で見出される２０種の天然に生成するアミノ酸の１つを指定する３つの隣接ヌクレオチドモノマーで構成されているチュプレットを意味する。また、どのアミノ酸も指定しないナンセンスコドンもしくは終止コドンもこの用語に含まれる。
【０１０４】
「ランダムコドン」または「ランダム化コドン」は、本願で用いる場合、オリゴヌクレオチド集合物内の１つの位置における２種以上のコドンを意味する。異なるコドンの数は、任意の特定の位置において２から２０であってもよい。「ランダム化オリゴヌクレオチド」は、本願で用いる場合、１つ以上の位置にランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドの集合物を意味する。「ランダムコドン配列」は、本願で用いる場合、ランダム化オリゴヌクレオチド内の２つ以上のコドンの位置がランダムコドンを含有していることを意味する。例えば、ランダム化ヌクレオチドが６ヌクレオチドの長さ（すなわち２つのコドン）であり、かつ第１および第２のコドンの位置がランダム化されて２０種全てのアミノ酸をコードしている場合、第１および第２の位置で２０のトリプレットの可能性があるあらゆる組み合わせでランダムコドン配列を有するオリゴヌクレオチドの集団が、ランダム化オリゴヌクレオチドの上記集団を形成する。可能性があるコドンの組み合わせの数は２０２である。同様に、２０種の全アミノ酸をコードする全ての位置にランダムコドン配列を有する、１５のヌクレオチドの長さのランダム化オリゴヌクレオチドが合成された場合、２０種の各アミノ酸をコードする全トリプレットはあらゆる位置において等比率で見出される。ランダム化オリゴヌクレオチドを構築する集団は、オリゴヌクレオチドの可能性がある異なる種を２０１５持っている。「ランダムチュプレット」または「ランダム化チュプレット」は同様に定義される。
【０１０５】
「偏り」という用語は、本願で用いる場合、優先選択（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を意味する。特定のアミノ酸をコードするコドン配列に対してある程度の優先選択または偏りがあることがわかっている。例えば、コドン配列が特定のアミノ酸を優先的にコードしていないヌクレオチドは、偏りがないので完全にランダムである。またオリゴヌクレオチドのコドン配列を予め決めたコドン配列またはコドン頻度に偏らせることもまた可能であるが、依然として多様およびランダムであるとはいえ、限定されたまたは優先された配列に偏ったコドン配列を示す。「所望の偏りのランダムコドン配列」という用語は、本願で用いる場合、全体的にランダムなものから、全体的ではないが本質的に限定された（優先された）ものまでの中から選択され得る予め決定された程度の偏りを意味する。しかし、種々のものである、少なくとも１つのコドンの位置がなければならない。
【０１０６】
「支持体」という用語は、本願で用いる場合、化学合成のためにモノマーを結合させる固相物質を意味する。そのような支持体は通常、コントロールポアガラスのビーズのような物質から構成されるが、当業者に公知の他の物質でも良い。この用語はまた、別のオリゴヌクレオチド合成反応のために支持体に結合される１つ以上のモノマーを含むことも意図される。
【０１０７】
「結合」または「縮合」という用語は、本願で用いる場合、１つのモノマーを第二のモノマーまたは固相に結合させるための化学反応を意味する。そのような反応は、当業者に公知であり、ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｃｙｃｌｏｎｅ　Ｐｌｕｓ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒのような自動ＤＮＡ合成機を製造業者に推奨された手順で使用することによって、典型的に行われ得る。「連続的な結合」という用語は、本願で用いる場合、モノマーの段階的な付加を意味する。　個々のモノマーを使用してのランダムチュプレットを有するオリゴヌクレオチドの合成方法が説明される。この方法は、いくつかのステップからなり、その第一は、ランダム化される各チュプレットのためのヌクレオチドチュプレットの合成である。以下に説明されるように、ヌクレオチドチュプレット（即ち、コドン）は、チュプレットの特殊な例として使用される。いかなる大きさのチュプレットも、本願に開示される方法を使用して機能し、当業者は、あらゆる大きさのランダム化チュプレットを使用する方法を知っている。
【０１０８】
２０種全てのアミノ酸を特定するコドンのランダム化が１つの位置で望まれる場合、２０種の異なるコドンが合成される。同様に、１０種のコドンのみを特定の位置で望む場合は、それらの１０種のコドンが合成される。２から６４までの種のコドンのランダム化が、各所望のトリプレットを合成することによって、達成され得る。遺伝子コードの縮重性のために、好ましくは、２から２０種のコドンのランダム化が、あらゆる１つの位置で使用される。１つの位置で選択されるコドンは、次の位置で選択されるのと同じコドンである必要はない。さらに、センスまたはアンチセンス配列のオリゴヌクレオチドが、合成され得る。従って、この方法により、いかなる数のコドンをも、いかなる所望のコドンの位置でも、ランダム化が行われる。
【０１０９】
ランダム化されるべきコドンは、各コドンの第一モノマーを別の支持体に結合することによって、連続的に合成される。各コドンの合成のための支持体は例えば、１つの反応容器が１つのコドンのためのモノマー結合反応に対応するように、異なる反応容器中に入れられることができる。この場合および以下の場合に用いる場合、２０種のコドンをランダム化するときには、２０の反応容器が、各コドンの最初の２０種モノマーについて、独立した結合反応で用いることができる。第１モノマーに各コドンの第２モノマーを連続して結合させて、二量体を生成させ、上記の合成された各二量体に、続いて、各コドンの第３モノマーを結合させて三量体を生成させることによって合成が進行する（図１のステップ１において、Ｍ１、Ｍ２およびＭ３はそれぞれ、ランダム化すべき各コドンに対する第１、第２および第３のモノマーを示す）。
【０１１０】
個々のモノマーから第１コドンを合成した後、ランダム化すべき個々のコドンが入っている２０の全反応容器からの支持体を混合することによってランダム化が達成される。その固相支持体をその容器から取り出して混合し、集団内に、全コドンの種のランダム分布を達成することができる（図１、ステップ２）。支持体の混合集団は、全コドン種を構成しているが、次に、これを２０の独立した反応容器に再分配する（図１のステップ３）。その結果すべての容器は同一で、固相支持体に結合された２０種の全コドンを等比率で含有する。
【０１１１】
第２の位置のコドンをランダム化するために、ステップ１の縮合基質のようにステップ３で作製された２０の各反応容器中で、２０種の付加コドンの合成が行われる（図１のステップ４）。それ故に、ステップ１および４が、コドンを合成する前のサイクル（ステップ１〜３）で製造された支持体を使い、一方ステップ１がオリゴヌクレオチドの第１コドンの最初の合成であることを除いて、ステップ１と４は同一である。ステップ４から得られる支持体には各々２つのコドン（すなわちヘキサヌクレオチド）が結合しており、第１位置のコドンは、２０種の生じ得るコドンの任意の１種であり（すなわちランダム）、かつ第２位置のコドンは、２０種の生じ得るコドンの１種である。
【０１１２】
第２位置のコドンのランダム化と第３位置のコドンの合成を行うために、ステップ２〜４を繰返す。このプロセスによって、各容器内にコドンのオリゴヌクレオチド（すなわち９ヌクレオチド）が得られ、コドン位置１および２がランダム化され、位置３は２０種の生じ得るコドンの１種を含有している。ステップ２〜４を繰り返して、第３位置のコドンをランダム化し、次の位置にコドンを合成する。このプロセスは所望の長さのオリゴヌクレオチドが得られるまで続けられる。最後のランダム化ステップを終ってから、オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、当業者に公知の方法で単離することができる。あるいは、そのオリゴヌクレオチドは、プローブハイブリダイゼーションを利用する方法に使うために支持体上に残しておくことができる。
【０１１３】
コドン配列の多様性、すなわち各種の生じ得るオリゴヌクレオチドの数は、本発明の方法を使うことによって得ることができるが、極めて大きく、利用できる物質の物理的特性によってのみ限定される。例えば、直径が約１００μｍのビーズで構成された支持体は、２５ｍｇのビーズが入っている１μＭの反応容器を用いて、約１０，０００ビーズ／反応容器に限定される。この大きさのビーズは、１ビーズ当り約１×１０７　のオリゴヌクレオチドを支持し得る。２０種の各アミノ酸に対して別個の反応容器を用いる合成法によって、個々のビーズに結合した全オリゴヌクレオチドが同一であるビーズが製造される。これらの条件下で得ることができる多様性は、１０，０００×２０すなわち２００，０００の異なるランダムオリゴヌクレオチドの約１０７　のコピーである。しかしこの多様性は、本願に開示された基本的方法から逸脱することなく、いくつもの方法で増大させることができる。例えば、生じ得る配列の数は、支持体を構成する個々のビーズの大きさを小さくすることによって増大させることができる。直径が約３０μｍのビーズによって、１反応器当りのビーズの数が増大し、その結果、合成されるオリゴヌクレオチドの数が増大する。ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドの多様性を増大する別の方法は、反応容器の容積を増大することである。例えば、同じ大きさのビーズを用いる場合、容積の大きい容器は小容積の容器よりも多数のビーズを入れることができるので、より多数のオリゴヌクレオチドの合成を支持する。また単一の反応容器内で支持体に連結されるコドンの数を増やすと、ランダムオリゴヌクレオチドの多様性が増大する。全多様性は、合成されるコドン位置の数に、一容器あたり結合されたコドンの数を累乗した数である。例えば、１０の反応容器を用いて、各々が２種のコドンを合成して合計２０のコドンをランダム化することによって、１つの１００μｍビーズ当り、１０コドンの長さを有する異なるオリゴヌクレオチドの数を増やすことができ、各ビーズは、１種の代わりに、約２１０　すなわち１×１０３　の異なる配列を有する。当業者には、かようなパラメータを修飾して、ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドの多様性を増大させる方法は公知である。
【０１１４】
反応容器の数をランダム化すべきコドンの数より少なくして、個々のモノマーを用いて各位置にランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを合成する方法について説明する。例えば、２０種のコドンを、オリゴヌクレオチド集団内の各位置にランダム化する場合、１０の反応容器を使うことができる。各位置にランダム化すべきコドンの数より少ない数の反応容器を使う方が好ましい。なぜなら、反応容器の数が少ない方が操作が容易であり、その結果、合成される可能性のあるオリゴヌクレオチドの数が増大するからである。
【０１１５】
オリゴヌクレオチド内の所望の位置に、２０種のコドンをランダム合成するのに使用する反応容器の数を減らすことは、各反応容器が２以上のコドンの合成生成物を入れることができることを除いて、２０の反応容器を用いる上記の方法に類似している。例えば１０の反応容器を用いるステップ１の合成は、１０の各反応容器に入っている支持体に約２の異なるコドンを結合させることによって進行する。この方法は図２に示すが、異なる支持体に結合させる２つの各コドンは、以下の配列で構成されている。すなわち、（１）ＰｈｅとＶａｌに対する（Ｔ／Ｇ）ＴＴ；（２）ＳｅｒとＰｒｏに対する（Ｔ／Ｃ）ＣＴ；（３）ＴｙｒとＨｉｓに対する（Ｔ／Ｃ）ＡＴ；（４）ＣｙｓとＡｒｇに対する（Ｔ／Ｃ）ＧＴ；（５）ＬｅｕとＭｅｔに対する（Ｃ／Ａ）ＴＧ；（６）ＧｌｎとＧｌｕに対する（Ｃ／Ｇ）ＡＧ；（７）ＴｈｒとＡｌａに対する（Ａ／Ｇ）ＣＴ；（８）ＡｓｎとＡｓｐに対する（Ａ／Ｇ）ＡＴ；（９）ＴｒｐとＧｌｙに対する（Ｔ／Ｇ）ＧＧ；および（１０）ＩｌｅとＣｙｓに対するＡ（Ｔ／Ａ）Ａである。スラッシュ（／）は、スラッシュの各側に示すモノマーの混合物が、指定の結合ステップであたかも単一のモノマーであるように使用される。上記の各コドンのアンチセンス配列は、相補性配列を合成することによって生成させることができる。例えばＰｈｅおよびＶａｌに対するアンチセンスはＡＡ（Ｃ／Ａ）である。上記の配列対の各々でコードされるアミノ酸は、標準の３文字命名法で示される。
【０１１６】
この方法でモノマーを結合させると、１０の反応容器内の支持体に結合させた２０種の天然産アミノ酸をすべて指定するコドンが得られる。しかし使用される個々の反応容器の数は、所望の位置にランダム化すべきコドンの数によって決まるので当業者が決定できる。例えば、１０のコドンをランダム化する場合、５の反応容器を結合に使用できる。上記のコドン配列はこの合成法にも使用できる。また、そのコドンの配列も、遺伝暗号を構成する追加の４４種のコドンのどれかを組込むか、またはどれかで置換することにより変更することもできる。
【０１１７】
少ない数の反応容器を用いて、ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを合成する残りのステップは、混合と分割のステップを約半分の数の反応容器から得た支持体で実施することを除いて、２０の反応容器を用いる合成法について先に述べたのと同じである。これらの残りのステップは図２に示してある（ステップ２〜４）。
【０１１８】
予め決められた位置に少なくとも１つの指定のチュプレットを有し、残りの位置はランダムチュプレットを有するオリゴヌクレオチドも、本願に記載する方法を用いて合成することができる。その合成ステップは、指定のコドン位置の合成を行う前に、異なるコドンを合成するため支持体を別の反応容器に分割することを省略することを除いて、２０以下の反応容器を用いる上記のステップに類似している。例えばオリゴヌクレオチドの第２の位置のコドンが指定される場合は、第１位置におけるランダムコドンの合成と支持体の混合を行ってから、混合された支持体を新たな反応容器に分割せず、代わりに、単一の反応容器に入れて指定のコドンを合成する。指定されたコドンは、前記と同様にして、個々のモノマーから逐次合成される。このようにして、反応容器の数を、各ステップで増減させて、指定の１つのコドンまたは所望の数のランダムコドンの合成を行わせることができる。
【０１１９】
コドンの合成に続いて、混合された支持体は、ランダム化すべき次のコドンを合成するために個々の反応容器に分割するか（図１、ステップ３）、または引続いて指定のコドンを合成するために分割せずに用いることができる。予め決められていたかまたはランダム化されたコドンを有する所望の数の位置が得られるまで、各コドンを付加する合成のラウンドを繰り返し行う。
【０１２０】
第１の位置のコドンが指定されているオリゴヌクレオチドの合成も上記の方法を用いて合成することができる。この場合、第１位置のコドンは、適切なモノマーから合成される。支持体は、第２の位置にランダムコドンを合成するのに要する反応容器の必要数に分割し、次に合成、混合および分割のラウンドを上記と同様にして実施する。
【０１２１】
多様であるが予め決められた配列に偏ったチュプレットを有するオリゴヌクレオチドの合成法についてもここで述べる。この方法には２つの反応容器を用いる。すなわち、一方の容器は予め決められた配列の合成に用い、第２の容器はランダム配列の合成に用いる。この方法は、例えばかなりの数のコドン位置が指定配列であるときに使用するのが有利である。というのは、この方法は多数の反応容器の使用を少なくするからである。代わりに、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンのヌクレオチドのような４種の異なるモノマーの混合物が、コドン中の第１と第２のモノマーとして使用される。そのコドンは、グアニンとチミンまたはシトシンとアデニンのヌクレオチドのモノマーの対の混合物を、第３のモノマーの位置に結合することによって完成される。第２の容器では、ヌクレオチドモノマーを逐次結合させて予め決められたコドン配列が得られる。２つの支持体を混合することによって、所望の位置に、予め決められたコドンとランダムコドンの両方を含有するオリゴヌクレオチドの集団が得られる。単一の反応容器内の支持体の上記の混合物を用いて、例えば追加の予め決められたコドンを結合させるか、またはさらに２つの反応容器に混合物を分割して追加のランダムコドンを合成することによって、合成を進行させることができる。
【０１２２】
上記の２反応容器法は、ランダム化すべき所望のコドン位置で、支持体混合物を２つの部分に分割することによって、予め決められたチュプレット配列を有するオリゴヌクレオチド内にコドンを合成するのに利用することができる。さらに、この方法で、ランダム化の程度を調節することができる。例えば２つの支持体を非等量で混合もしくは分割すると、所望の位置における、ランダムコドンに対する予め決められた配列を有するコドンの比率が変化する。支持体の非等量の混合と分割は、より長いかまたはより短い長さのオリゴヌクレオチド中の有意の数の位置にランダムコドンを合成する必要がある場合に有用である。
【０１２３】
ランダム化の程度を、ランダムコドン位置の第１、第２および第３のモノマーを結合するステップにモノマーの非等量混合物を用いることによって調節することができる。非等量の混合物を、任意のもしくはすべての結合ステップに用いて、モノマーの比率を反映して数を増大したコドンの集団を配列中に得ることができる。
【０１２４】
ランダム化されたオリゴヌクレオチドの合成は、当業者に公知の方法を用いて実施することができる。モノマーの線状結合は、例えば、ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｃｙｃｌｏｎｅ　Ｐｌｕｓ自動合成機を製造業者（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチューセッツ州、バーリントン）が説明しているように使用し、ホスホルアミダイト化学法を利用して実施できる。その他の化学的方法と自動合成機も同様に利用することができ、当業者に公知である。
【０１２５】
多重コドンの合成は、個々のセットの反応でコドンを別個に合成することによって、合成機を改変することなしに実施することができる。あるいは、コドンを多数の反応容器中で同時に合成するために、自動ＤＮＡ合成機を改変することができる。
【０１２６】
１つの実施態様において、本発明は、発現要素に作動可能に連結された発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有する複数の原核細胞を提供するものである。この発現可能なオリゴヌクレオチドは、所望の偏りのランダム配列を有する第１と第２のオリゴヌクレオチドの多様な組合せから製造される所望の偏りのランダムコドン配列を有する。本発明はまた、かような複数の原核細胞を構築する方法も提供するものである。
【０１２７】
上記の方法で合成されるオリゴヌクレオチドは、偏りがないか、多様であるが予め決められた配列に対して偏っているか、または予め決められた位置に少なくとも１つの指定のコドンを有する複数のランダムペプチドを発現するのに利用できる。必要性は、ランダムペプチドの生成集団を得るためにどちらの種類のオリゴヌクレオチドを発現すべきかを決定し、当業者に公知である。発現は任意の和合性のベクター／宿主系で実施することができる。このような系には、例えばＥ．ｃｏｌｉのような原核生物、酵母系および哺乳動物の細胞のような他の真核系のプラスミドまたはファージミドが含まれるが、本明細書中では本願の好ましい実施態様、例えば繊維状バクテリオファージの表面での発現が述べられている。繊維状バクテリオファージは例えばＭ１３、ｆ１およびｆｄであり得る。このようなファージは円形の一本鎖ゲノムと二本鎖の複製ＤＮＡ型をもっている。さらに、ペプチドは、必要性および使用されるベクトル／宿主系に応じて、可溶性形態もしくは分泌形態で発現することができる。
【０１２８】
Ｍ１３の表面上でのランダムペプチドの発現は、例えば図３に示すベクター系を用いて達成することができる。当業者が作ることができるベクターの構築は、実施例ＩとＩＩに明示してある。完全なヌクレオチド配列は図５、６および７（それぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，２　および３）に示してある。この系は、別のベクターに含有されている２つの小さいオリゴヌクレオチド部分を結合して単一のベクターとすることによって、発現要素とｇＶＩＩＩに機能的に連結されたランダムオリゴヌクレオチドを生成する。この系または本願に記載の他の系によって得られるオリゴヌクレオチド種の多様性は５×１０７　以上にすることができる。５×１０７　より小さい多様性も得ることができ、発現すべきランダムペプチドの必要性と種類によって決まる。２つの前駆体部分をランダム結合してより大きいオリゴヌクレオチドにすると、集合体の多様性が数倍も増大するので、標準の方法で合成することができるものよりも大きいオリゴヌクレオチドを生成するという利点が加わる。さらに、相関関係は知られていないが、オリゴヌクレオチドが本願に記載のような合成中にとることができる可能な経路の数がビーズの数より大きい場合、合成経路と得られる配列の間に相関関係がある。個別に合成されるオリゴヌクレオチド集団を結合することによって、この相関関係は破壊されるであろう。これ故に、合成手順に固有の偏りは、２つの前駆体部分を結合して、連続したランダムオリゴヌクレオチドにすることによって軽減される。
【０１２９】
結合されて発現可能な形態となる前駆体オリゴヌクレオチドの集団は各々個別のベクター中にクローン化される。結合されたオリゴヌクレオチドを構成する２つの前駆体部分は、発現されるペプチドのカルボキシ末端とアミノ末端の部分に対応する。各前駆体オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスをコードすることができ、発現要素の配列およびタンパク質の融合部分をコードする遺伝子ならびに２つの前駆体オリゴヌクレオチドを結合するのに使用される機構に依存している。図３に示すベクターについては、ペプチドのカルボキシ末端部分に対応する前駆体オリゴヌクレオチドはセンス鎖をコードする。アミノ末端に対応する前駆体オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖をコードする。オリゴヌクレオチド集団は、Ｍ１３ＩＸ２２とＭ１３ＩＸ４２のＥｃｏ　ＲＩとＳａｃ　Ｉの制限酵素部位の間に挿入されている（図３ＡとＢ）。Ｍ１３ＩＸ４２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）はセンス鎖の前駆体オリゴヌクレオチド部分に用いられるベクターであり、Ｍ１３ＩＸ２２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）はアンチセンス前駆体部分に用いられる。
【０１３０】
ベクターに挿入されたランダム化オリゴヌクレオチドの集団は、ランダムコドン配列の反対側の末端に隣接するＥｃｏ　ＲＩとＳａｃ　Ｉ　認識配列で合成される。上記の部位によって、これらの一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールしてＥｃｏ　ＲＩとＳａｃ　Ｉで制限消化された二本鎖オリゴヌクレオチドに連結することができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドは標準の変異誘発法によってベクターに挿入することができる。この後者の方法では、一本鎖のベクターＤＮＡはファジーから単離され、ベクター配列に相補的な公知の配列を有するランダムオリゴヌクレオチドとアニールされる。そのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによって延長され、ランダム化オリゴヌクレオチドを含有する二本鎖ベクターを生成する。
【０１３１】
センス鎖オリゴヌクレオチド部分のために使用されるベクターであるＭ１３ＩＸ４２（図３Ｂ）は、Ｅｃｏ　ＲＩとＳａｃ　Ｉ　制限部位の下流およびインフレームにプソイド−野生型ｇＶＩＩＩ生成物をコードする配列を含有している。この遺伝子は野生型Ｍ１３　ｇＶＩＩＩアミノ酸配列をコードするが、同じベクター内に含まれている野生型ｇＶＩＩＩとの相同組換えを減らすためにヌクレオチドレベルで変更されている。この野生型ｇＶＩＩＩは、少なくともいくつかの機能性で非融合のコートタンパク質が生成されるのを保証するために存在している。それ故に野生型ｇＶＩＩＩの含有は、生育不能のファージの生成およびある種のペプチド融合タンパク質に対する生物学的選択の可能性を低下させる。２つの遺伝子の分化調節性も、プソイド型と野生型のタンパク質の相対比を制御するのに使用できる。
【０１３２】
また、アンバー終止停止コドンが、Ｅｃｏ　ＲＩとＳａｃ　Ｉの制御部位の下流およびインフレームにある。その突起変異はＳａｃ　Ｉから６コドン下流に位置しているので、挿入されたオリゴヌクレオチドとｇＶＩＩＩ配列の間に位置している。野生型ｇＶＩＩＩの機能のように、アンバー終止コドンと、前駆体部分が結合して発現可能なオリゴヌクレオチドを生成するときに生物学的選択を減少させる。これは非サプレッサー（Ｓｕｐ　Ｏ）宿主菌株を用いて達成される。なぜならば、非サプレッサーの菌株は、オリゴヌクレオチド配列の後であるがプイソドｇＶＩＩＩ　配列の前で発現を停止させるからである。これ故、プイソドｇＶＩＩＩ　はこれらの環境下でファージの表面では決して発現されることはない。代わりに、可溶性のペプチドだけが産生される。非サプレッサー菌株中での発現は、可溶性ペプチドの大きな集団を製造したいときに有利に利用できる。オパールおよびオーカーのようなアンバー以外の終止コドン、または誘導リプレッサー要素のような分子スイッチも、表面発現からペプチド発現をアンリンク（ｕｎｌｉｎｋ）するのに利用できる。別の制御も存在するが、以下に説明する。
【０１３３】
アンチセンス鎖オリゴヌクレオチド部分に対して用いられるベクターであるＭ１３ＩＸ２２（図３Ａ）は、ペプチド融合タンパク質に対する発現要素を含有している。このベクター中の、Ｓａｃ　ＩとＥｃｏ　ＲＩ部位の上流およびインフレームに、表面発現のためのリーダー配列がある。ペプチド融合タンパク質の複製と翻訳のためのリボソーム結合部位とＬａｃ　Ｚプロモーター／オペレーター要素が存在する。
【０１３４】
両方のベクターは、２つの前駆体オリゴヌクレオチド部分とそのベクターの配列とを連結するための一対のＦｏｋ　Ｉ制限酵素部位（図３Ａと３Ｂ）を含有している。一方の部位は、連結される各前駆体オリゴヌクレオチドの未端に位置している。ベクター中の第２のＦｏｋ　Ｉ部位は、結合されるベクター配列の末端に位置している。この第２のＦｏｋ　Ｉ部位の５’オーバーハングは、オリゴヌクレオチド部分内の第一Ｆｏｋ　Ｉ部位で産生されるオーバーハングには見出されない配列をコードするように変化させた。その２つの部位によって、各円形ベクターを２つの部分に切断し、次に各ベクター内の必須要素を連結して、２つのオリゴヌクレオチド前駆体部分が隣接配列を形成している単一の円形ベクターにすることができる（図３Ｃ）。２つのＦｏｋ　Ｉ部位で産生される非和合性のオーバーハングは、２つのベクター部分を結合するコンカターマイゼーション（ｃｏｎｃａｔｅｒｍｉｚａｔｉｏｎ）反応またはサーキュラリゼーション（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）反応を実施するための最適の条件を選択することができる。条件のこのような選択は、反応順序を支配するのに利用することができるので、結合の効率が増大する。
【０１３５】
Ｆｏｋ　Ｉは、その認識配列が切断より遠位である制限酵素である。切断点に対して、認識配列の位置を遠位に配置することは重要である。というのは、２つが、結合されるオリゴヌクレオチド部分内で重なった場合には結合部位に非変異のコドン配列をもたらすからである。結合部に非変異コドンが形成するのを少なくするためにＦｏｋ　Ｉ認識配列をランダムコドン配列の外側に位置してもよく、ランダム配列内で制限するのにもなお使用される。続いてＦｏｋ　Ｉによって形成された一本鎖オーバーハングのアニーリングと、２つのオリゴヌクレオチド前駆体部分との連結によって、結合部分を形成することができる。各種の制限酵素がこの機構によってＤＮＡを制限するのでＦｏｋ　Ｉの代わりに用いて、前駆体オリゴヌクレオチドを非変異のコドン配列を生成することなしに結合することができる。このような酵素としては、例えば、Ａｌｗ　Ｉ，Ｂｂｕ　Ｉ，ＢｓｐＭＩ，Ｈｇａ　Ｉ，Ｈｐｈ　Ｉ，Ｍｂｏ　ＩＩ，Ｍｎｌ　Ｉ，Ｐｌｅ　ＩおよびＳｆａ　ＮＩがある。当業者であれば、上記のような別の酵素認識配列でＦｏｋ　Ｉ認識配列を置換する方法を知っており、適切な酵素を使って前駆体オリゴヌクレオチド部分を連結する。
【０１３６】
前駆体オリゴヌクレオチドの配列はランダムであり、切断後アニールするのに充分に相補的な配列である２つの前駆体集団内にオリゴヌクレオチドを常にもっているけれども、アニーリングの効率は、一方の前駆体集団内の一本鎖オーバーハングが、第２の前駆体集団内に相補的な配列をもっていることを保証することによって、増大させることができる。これは、２０種の各アミノ酸をコードする、Ｆｏｋ　Ｉ切断部位において公知の配列の非縮重シリーズを合成することによって達成することができる。Ｆｏｋ　Ｉ切断部位は４塩基のオーバーハングを含有するので、２０種の全アミノ酸をランダムにコードするためには４０種の異なる配列が必要である。例えば、１０コドンの長さの２つの前駆体集団を結合する場合は、９番目のコドン位置が合成された後、支持体の混合集団を、各集団について４０の反応容器に分割し、対応する各反応容器について、集団間の相補性配列を独立に合成する。その配列を実施例Ｉの表ＩＩＩとＶＩに示すが、カラム１Ｒ〜４０Ｒのオリゴヌクレオチドは、一度切断された対応するカラムＩＬ〜４０Ｌ上のオリゴヌクレオチドと相補性のオーバーハングを形成する。表ＶＩ中の縮重Ｘ位置は、前駆体オリゴヌクレオチド部分が結合される場合に読取枠を維持するのに必要である。しかし、平滑末端を生成するＭｎｌ　Ｉのような制限酵素は、読取り枠を維持する際に導入される縮重を減らすために、Ｆｏｋ　Ｉの代わりに使用され得る。
【０１３７】
各ベクターが示す最後の特徴は、結合中に失われるベクター部分内の必須のコーディング配列中に位置するアンバー終止コドンである（図３Ｃ）。アンバー終止コドンは、生存可能なファージを選択をするために存在する。このファージは、前駆体オリゴヌクレオチドとそのベクター配列を単一のベクター種に適切に結合することのみで生成される。他の意味のない突然変異または選択マーカーも同様に作用し得る。
【０１３８】
この結合工程によって、２つの集団内の異なる前駆体オリゴヌクレオチドを、ランダムに結合させて単一ベクター（図３Ｃ，Ｍ１３ＩＸ）とする。各々独立したベクターであるＭ１３ＩＸ２２およびＭ１３ＩＸ４２　が与えるベクター配列は、生存可能なファージを産生するのに必要である。また、発現要素がＭ１３ＩＸ２２に含有され、およびｇＶＩＩＩ配列がＭ１３ＩＸ４２に含有されるで、機能性ｇＶＩＩＩ−ペプチド融合タンパク質は、その配列がＭ１３ＩＸに示すように結合されるまで発現され得ない。
【０１３９】
結合工程は、ランダム化オリゴヌクレオチドを含有するベクターの各々の集団をＦｏｋ　Ｉで制限し、混合し、結合することによって実施される（図３Ｃ）。アンバー終止コドンを含有する、いづれの生成ベクターも、非サプレッサー菌株に導入されたときには、生存可能なファージを産生しない（図３Ｄ）。それ故に、アンバー終止コドンを含まない配列のみが、ライブラリーに含有されるベクターの最終集団を形成する。これらのベクター配列は、ランダム化ペプチドを表面発現させるのに必要な配列である。類似の方法によって、３以上のベクター部分を結合を、ランダムペプチドを発現する単一のベクターに結合し得る。
【０１４０】
本発明は、ランダムペプチドの集団由来のリガンド結合タンパク質で捕捉できるペプチドを選択する方法であって；
（ａ）ランダムコドン配列の所望の偏りを有する第１オリゴヌクレオチドの多様集団を第１ベクターとして使用し得るように結合し；（ｂ）ランダムコドン配列の所望の偏りを有する第２オリゴヌクレオチドの多様集団を第２ベクターとして使用し得るように結合し；（ｃ）工程（ａ）と（ｂ）でのベクター生成物を、第１と第２のオリゴヌクレオチドの前記の集団が互いに結合して結合ベクターの１つの集団になる条件下で結合させ；（ｄ）前記の結合ベクターの集団を前記のランダムペプチドの集団を発現するのに充分な条件下で、和合性宿主内に導入し；および（ｅ）前記の結合タンパク質に結合するペプチドを決定する方法。本発明は、また、このようなペプチドのコーディング核酸配列も決定する。
【０１４１】
ランダムペプチドライブラリーの表面発現は、アンバーサプレッサー菌株内で実施される。上に記載したようにランダムコドン配列とｇＶＩＩＩ配列の間のアンバー終止コドンは、非サプレッサー菌株中、２つの要素をアンリンクする。非サプレッサー菌株から産生されたファージを単離し、サプレッサー菌株を感染させて、発現中にランダムコドン配列をｇＶＩＩＩ配列に結合させる（図３Ｅ）。感染後に、サプレッサー菌株を培養することにより、ライブラリー内のすべてのペプチドの種はｇＶＩＩＩ−ペプチド融合タンパク質として発現する。または、そのＤＮＡを非サプレッサー菌株から単離し、サプレッサー菌株に導入して同じ目的を達成し得る。
【０１４２】
ｇＶＩＩＩ−ペプチド融合タンパク質の発現のレベルは、さらに、転写のレベルで制限され得る。ｇＶＩＩＩ−ペプチド融合タンパク質は、Ｌａｃ　Ｚプロモーター／オペレーター系の誘導制御下にある。他の誘導プロモーターも同様に作用し、当業者には公知である。高水準に表面発現を行うために、サプレッサーライブラリーを、イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）のようなＬａｃ　Ｚプロモーターの誘導物質中で培養する。誘導制御は有利である。その理由は、非機能性ｇＶＩＩＩ−ペプチド融合タンパク質を除く生物学的選択を、非発現条件下でのライブラリーの培養によって最小化し得るからである。発現はスクリーニング時にのみ誘導され、ライブラリー内のオリゴヌクレオチドの全集団がファージ表面に正確に発現されることが保証され得る。また、これは、ファージ表面上のペプチドの原子価の制御に用いられ得る。
【０１４３】
標準的なアフィニティー単離法により、リガンド結合タンパク質を捕捉する特異的ペプチドについて表面発現ライブラリーをスクリーニングする。そのような方法としては、例えばパニング法（ｐａｎｎｉｎｇ）、アフィニティークロマトグラフィー、および固相ブロッティング法がある。ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ，　Ｇｅｎｅ　７３：３０５−３１８　（１９９８）に記載されたパニング法（この文献を本発明に援用する）が好ましい。理由は、高力価のファージが、容易かつ迅速に小容積でスクリーニングされ得るからである。さらに、この方法により、外の方法では検出できないかつ実質的に均一な集団に拡張された集団内での少ないペプチド種を選別し得る。選別されたペプチド配列は、そのファージ集団を増幅させた後、このようなペプチドをコードする核酸の配列の決定より決定され得る。
【０１４４】
本発明は、使用され得るように発現配列に連続されたランダムコドン配列の望ましい偏りを有するオリゴヌクレオチドの多様集団を含有する複数の原核細胞を提供する。また、本発明は、このような細胞集団の構築方法を提供する。
【０１４５】
前に記載した方法で合成されたランダムオリゴヌクレオチドは、前駆体オリゴヌクレオチドを互いに結合することなく、例えばＭ１３のような繊維状バクテリオファージの表面で発現させ得る。図４に示すようなベクターＭ１３ＩＸ３０も使用され得る。このベクターは、ｇＶＩＩＩ−ペプチド融合タンパク質の表面発現について、図３Ｃに示す結合ベクターの機能的特徴のすべてを示す。Ｍ１３ＩＸ３０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）の完全ヌクレオチド配列を図７に示す。
【０１４６】
Ｍ１３ＩＸ３０　は、ファージ生存のための野生型ｇＶＩＩＩおよびペプチド融合のためのプソイドｇＶＩＩＩ配列を含有する。このベクターは、また、フレーム中に、ランダムペプチドをクローン化するための制限部位を含有する。ベクター中のクローン化部位は、Ｘｈｏ　Ｉ、Ｓｔｕ　Ｉ、およびＳｐｅ　Ｉである。従って、アニーリングおよび連続または挿入突然変異誘発を行なうのに適する相補性末端を有するオリゴヌクレオチドが合成される。あるいは適切な末端は、ＰＣＲで生成され得る。制限部位とプソイドｇＶＩＩＩ配列の間に、フレーム内アンバー終止コドンがあり、ライブラリーを構築および操作する間、ファージが完全に生存することを保証する。発現とスクリーニングは、前駆体部分から生成されるオリゴヌクレオチドの表面発現ライブラリーについて上に記載したようにして実施する。
【０１４７】
このように、本発明は、リガンド結合タンパク質によって捕捉し得るペプチドを、ランダムペプチドの集団化から選別する以下の方法を提供する；（ａ）ランダムコドン配列の所望の偏りを有するオリゴヌクレオチドの多様集団を発現要素に使用し得るように結合し；（ｂ）前記のランダムペプチドの集団を発現するのに充分な条件で、前記のベクターの集団を和合性宿主内に導入し；次いで（ｃ）前記結合タンパク質に結合するペプチドを決定する方法。また、このよう選別されたペプチドをコードする核酸配列を決定する方法を提供する。
【０１４８】
以下の実施例は例示を目的とし、本発明を限定するものではない。
【０１４９】
【実施例】
実施例Ｉ
右半分および左半分のランダムオリゴヌクレオチドから生成されるペプチドリガンドの単離と特性の決定
この実施例は、ランダムオリゴヌクレオチドの合成およびコードされたランダム化ペプチドの表面発現ライブラリーの発現を示す。この実施例のランダムペプチドは、２種のランダムオリゴヌクレオチドを混合し、結合させることによって生成される。ペプチドリガンドの単離および特性決定および特異的結合タンパク質に対応するヌクレオチド配列もまた示される。
【０１５０】
ランダムオリゴヌクレオチドの合成
２つのランダム化オリゴヌクレオチドの合成を以下に示す。これらのランダム化オリゴヌクレオチドは、長い方のランダム化オリゴヌクレオチドの短い部分に対応する。２つの短い部分の各々が長いオリゴヌクレオチドの半分を構成する。各々の半分を構成するランダム化オリゴヌクレオチドの集団を、右半分および左半分と命名する。右半分および左半分の各々の集団は、１０コドンの長さであり、各位置に２０種のランダムコドンを含有する。右半分は、ランダム化オリゴヌクレオチドのセンス配列に対応し、発現されるペプチドのカルボキシ末端側の半分をコードする。左半分は、ランダム化オリゴヌクレオチドのアンチセンス配列に対応し、発現されるペプチドのアミノ末端側の半分をコードする。ランダム化オリゴヌクレオチド集団の右半分および左半分は、別々のベクター種にクローン化され、次いで混合され結合された。その結果、右半分および左半分はともにランダム結合し、２０コドンの長さのランダム化オリゴヌクレオチドの集団を含有する単一の発現ベクターを生成する。ベクター集団を適する宿主にエレクトロポーレーション法で導入して、ランダムペプチドを表面で発現する繊維状バクテリオファージを生成させる。
【０１５１】
オリゴヌクレオチド合成用の反応容器は、自動合成機のメーカー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、マサチューセッツ州、バーリントン；ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｃｙｃｌｏｎｅ　Ｐｌｕｓ　Ｓｙｓｔｈｅｓｉｚｅｒ　のメーカー）から入手した。容器は、空の反応カラム（１　μｍｏｌｅ）、フリット、クリンプ、およびプラグ（ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，カタログ　＃　ＧＥＮ　８６０４５８）を含むパッケージとして販売された。誘導体化および非誘導体化された調整微細孔ガラス、ホスホルアミダイトヌクレオチド、および合成試薬もＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈから入手した。クリンパーおよびデクリンパーの工具は、米国、ペンシルベニア州、ピッツバーグ、Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ．から入手した（カタログ番号は、各々０６−４０６−２０および０６−４０６−２５Ａである。）
１０の反応カラムを使用し、長さが１０コドンのランダムオリゴヌクレオチドの右半分を合成した。オリゴヌクレオチドは、配列の３’末端に５つのモノマー５’ＧＡＧＣＴ３’を有し、配列の５’末端に８つのモノマー５’ＡＡＴＴＣＣＡＴ３’を有する。合成機に、チミンヌクレオチドで誘導体化されたカラム（Ｔ−カラム、ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　＃　０６１５．５０）を取り付け、そして、独立の反応セット中で１０の各カラムについて表Ｉに示しす配列を合成するように合成機にプログラムした。最後の３つのモノマーの配列（合成は３’から５’へ進むので右から左へ）は、指定のアミノ酸をコードする：
【０１５２】
【表１】
2004024262.tif 000002
表中、括弧内の２つのモノマーは、コドン中の単一モノマーの位置を示し、各モノマーの等量混合物を結合するために反応中に添加することを示す。１０の各カラムのモノマー結合反応は、メーカーが推薦する通りにして実施した（アミダイト・バージョン　Ｓ１．０６，　＃　８４００−０５０９９０，　尺度１μＭ）。最後の結合反応の後、カラムをアセトニトリルで洗浄し、凍結乾燥して乾固した。
【０１５３】
合成が終了した後、デクリンパーを用いてプラグを各カラムから外し、反応生成物を単一秤量ボート（ｓｉｎｇｌｅ　ｗｅｉｇｈ　ｂｏａｔ）に注入した。最初、ビーズの重量がモノマーの重量のために増加するが、合成の最後の一課程において原料は消失する。いずれの場合でも、原料は、非誘導体化された調整微細孔ガラスによって均等化され、十分に混合されて、２０種の全コドン種のランダム分布が得られた。次に、一度に物質を２５ｍｇずつ取り出し、別々の反応カラムに入れて、反応生成物を新しい１０の反応カラムに分割した。或いは、ビーズを分散させて保持するのに十分な高密度を有する液体、好ましくは密度がビーズに等しい液体に、ビーズを分散させ、次いでその分散液の等容積づつを別々の反応カラムに分割することによっても、反応生成物を分割し得る。フリットが乗っているカラムの内側のリップは、シリンジと２５　Ｇの針で真空吸引を利用して原料が除去された。新しいフリットをリップの上に置き、プラグをカラムに取り付け、クリンパーを用いて所定の位置にクリンプした。
【０１５４】
第２コドン位置の合成には、第１コドンの合成からの反応生成物のランダム混合物を含有する、上記の１０のカラムを用いた。第２コドン位置のためのモノマー結合反応を表ＩＩに示す。第１位置のＡは、いかなるモノマーも合成機にプログラムされ得ることを意味する。その位置において、第１モノマー位置は合成機によって結合は行われない。その理由は、ソフトウェアがモノマーはすでにカラムに結合すると見なすからである。またＡは、前のコドン合成からのカラムを、現在の合成課程で用いるために合成機に装着するべきことを示す。さらに、表ＩＩに示すように各カラムについて反応を逐次繰り返し、次いで反応生成物を上記のように洗浄して乾燥した。
【０１５５】
【表２】
2004024262.tif 000003
第２コドン位置のランダム化は、反応生成物を各カラムから取り出し、その物質を十分に混合することによって行った。その物質を新しい反応カラムに分割し、上記のようにモノマー結合反応のために準備した。
【０１５６】
次の７つのコドン（３〜９の位置）のランダム合成は、第２コドン位置について、先に述べたサイクルと同様にして行い、再度、表ＩＩのモノマー配列を使用した。前のコドン位置の合成からの反応生成物としてランダム混合物を含有するカラムであって、新しくリパックされた各々のカラムを、次のコドン位置の合成に用いた。第９位のコドンの合成と反応生成物の混合を行った後、その物質を分割し、４０の異なるカラムにリパックし、表ＩＩＩに示すモノマー配列を、独立した反応で、４０の各カラムに結合させた。４０の各カラムからのオリゴヌクレオチドをもう一度混合し、メーカーが推奨するようにして、調整微細孔ガラスから切り離した。
【０１５７】
【表３】
2004024262.tif 000004
2004024262.tif 000005
ランダムオリゴヌクレオチドの左半分の合成は、右半分の合成と同様にして行った。オリゴヌクレオチドのこの半分は、コードされたランダム化ペプチドのアンチセンス配列に対応する。従って、表Ｉ〜表ＩＩＩのコドンの相補性配列が合成される。左半分のオリゴヌクレオチドも配列の３’末端に５つのモノマー５’ＧＡＧＣＴ３’を有し、配列の５’末端に８つのモノマー５’ＡＡＴＴＣＣＡＴ３’を持つ。合成、洗浄、乾燥、混合、および分割の一課程は、上に記載しものと同様である。
【０１５８】
第１コドン位置について、合成機にＴ−カラムを取り付け、独立の反応セットで１０の各カラムについて表ＩＶに示す配列を合成するようにプログラムした。右半分の合成の場合と同様に、最後の３つのモノマー配列（右から左へ）は指定のアミノ酸をコードする。
【０１５９】
【表４】
2004024262.tif 000006
洗浄および乾燥の後に、各カラムのプラグを取り外し、混合し、上に記載したように１０の新しい反応カラムに分割した。第２コドン位置の合成は、第１コドン合成からの反応生成物のランダム混合物を含有する、これらの１０のカラムを用いて実施した。第２コドン位置のためのモノマー結合反応を表Ｖに示す。
【０１６０】
【表５】
2004024262.tif 000007
反応生成物の各カラムからの取外しおよび充分なビーズの混合を行なうことによって、再度、第２コドン位置のランダム化を実施した。そのビーズを１０の新しい反応カラムにリパックした。
【０１６１】
次の７つのコドン位置のランダム合成は、第２コドン位置について、先に述べたサイクルと同様に実施し、再度、表Ｖのモノマー配列を用いた。第９位のコドンの合成および反応生成物の混合の後に、物質を４０の異なるカラムに分割し、リパックし、次いで表ＶＩに示すモノマー配列を、独立の反応で４０の各カラムに結合させた。
【０１６２】
【表６】
2004024262.tif 000008
2004024262.tif 000009
「Ｘ」で示される２つの第１モノマーは、その位置における４つすべてのヌクレオチドの等しい混合物を表す。これは、右半分および左半分のオリゴヌクレオチドとの結合部で比較的偏っていないコドン配列を保持するのに必要である。上記の右半分および左半分のランダムオリゴヌクレオチドを、支持体から切り離して精製し、下記の表面発現ライブラリーの構築に用いた。
ベクターの構築
２つのＭ１３ベースのベクターのＭ１３ＩＸ４２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）とＭ１３ＩＸ２２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）の各々を、ランダムオリゴヌクレオチドの右半分および左半分の集団をクローン化し、増幅させるために構築した。ベクターは、特に、右半分および左半分のオリゴヌクレオチド集団のランダム結合と逐次発現を容易に行なうために構築された。その集団内の各々のベクターは、ともに結合した集団からの１つの右半分オリゴヌクレオチドと１つの左半分オリゴヌクレオチドを含有し、２２のコドンの長さのランダムコドンを有する単一の連続オリゴヌクレオチドを形成する。生成したベクター集団は、表面発現ライブラリーの構築のために用いられる。
【０１６３】
Ｍ１３ＩＸ４２または右半分のベクターは、ランダム化オリゴヌクレオチドの右半分集団を保持するために構築された。Ｍ１３ｍｐ１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、米国、ニュージャージー州、ピスカチウエイ）が出発ベクターであった。このベクターを遺伝子工学的に修飾し、ベクター内にすでに存在し、コードされた野生型Ｍ１３遺伝子ＶＩＩＩに加えて、次のものを含有させた：（１）終止コドン（アンバー）を有するプソイド野生形Ｍ１３遺伝子ＶＩＩＩ配列（これは、ランダム化オリゴヌクレオチドのＥｃｏ　ＲＩ−Ｓａｃ　Ｉクローン化部位との間に配置される）；（２）Ｍ１３ＩＸ２２すなわち左半分のベクターとの結合に用いられる一対のＦｏｋ　Ｉ部位；（３）このベクターの、左半分ベクターと結合される部分に対して反対側に配置された第２のアンバー終止コドン；および（４）重複制限部位を除くための他の突然変異部およびＬａｃ　Ｚのアミノ末端部。
【０１６４】
プソイド野生形Ｍ１３遺伝子ＶＩＩＩを、ランダムペプチドの表面発現に用いた。このプソイド野生型遺伝子は、野生型遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードする。しかしそのヌクレオチド配列は改変されており、この遺伝子とコードされた野生型遺伝子ＶＩＩＩとの同一性は６３％にすぎない。表面発現のために用いられる遺伝子ＶＩＩＩのヌクレオチド配列の修飾によって、該ベクターに含有されている野生型遺伝子ＶＩＩＩによる相同的組換えの可能性が減少する。さらに、野生型Ｍ１３遺伝子ＶＩＩＩは、該ベクター中に保持され、少なくともある種の機能性で非融合のコードタンパク質が生成することを保証する。従って、野生型遺伝子ＶＩＩＩの含有によって、ランダムペプチド融合遺伝子から非生存性のファージが生成する可能性が減少する。
【０１６５】
プソイド野生型遺伝子ＶＩＩＩは、遺伝子の両方のストランドをコードする一連のオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって構築された。そのオリゴヌクレオチドを表ＶＩＩ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７〜１６）に示す。
【０１６６】
【表７】
2004024262.tif 000010
末端オリゴヌクレオチドＶＩＩＩ　０３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７）とＶＩＩＩ　０８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）を除いて、上記のオリゴヌクレオチド［オリゴヌクレオチドＶＩＩＩ　０４〜ＶＩＩＩ　０７および０９〜１２（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：８〜１１および１３〜１６）］を、１０μｌの最終容積中、各々２００ｎｇづつ混合し、１ｍＭ　ＡＴＰ　を用い、３７℃で１時間、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、米国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）でリン酸化した。この反応を６５℃にて５分間保持してから停止させた。末端オリゴヌクレオチドを混合物に添加し、次いで６５℃で５分間加熱し、アニールして二本鎖形とした。次いで、３０分間かけて室温まで冷却した。アニールさせたオリゴヌクレオチドを、１．０ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を用いて互いに結合した。オリゴヌクレオチドをアニールし結合することによって、その５’末端にＢａｍ　ＨＩ部位が隣接され、その３’末端にＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位が隣接された二本鎖ＤＮＡを得た。翻訳終止コドン（アンバー）がＢａｍ　ＨＩ部位に続く。遺伝子ＶＩＩＩ配列は、終止コドンに対して２コドン３’側のコドンＧＡＡ（Ｇｌｕ）で始まる。二本鎖挿入断片を、Ｔ４　ＤＮＡキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、米国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）とＡＴＰ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）を用いてリン酸化し、次いで、Ｍ１３ポリリンカー内のＲｃｏ　ＲＩおよびＳａｃ　Ｉ部位のフレーム中にクローン化した。これを行うために、Ｍ１３ｍｐ１８をＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、米国、マサチューセッツ州、ベバリー）とＨｉｎｄ　ＩＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、１：１０モル比で二重鎖挿入断片と結合させた。この結合は、１．０ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する１メリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）中、１６℃で一夜行われた。結合混合物において宿主を形質転換し、該技術分野の標準方法によって正のクローンをスクリーニングした。
【０１６７】
いくつかの突然変異を右半分ベクター内に発生させ、機能性のＭ１３ＩＸ４２を得た。この突然変異は、Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５４：３６７−３８２　（１９８７）の方法（部位特異的変異誘発法）によって発生させた。この文献を本発明に援用する。試薬、菌株、およびプロトコルは、Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ、カリフォルニア州、リッチモンド）から入手し、変異誘発はメーカーによって推奨されたようにして行った。
【０１６８】
右半分および左半分の結合に用いられるＦｏｋ　Ｉ部位は、オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７）が用いられ、ユニークＥｃｏ　ＲＩ部位に対して８ヌクレオチド５’側に生成させた。ベクターに保持される第２のＦｏｋ　Ｉ部位は、自然に３５４７位にコードされる。しかしオーバーハング内の配列は、ＣＴＴＣをコードするように変化られた。Ｍ１３ｍｐ１８の２３９と７２４４の位置にある２つのＦｏｋ　Ｉおよびプソイド遺伝子ＶＩＩＩ配列の末端にあるＨｉｎｄＩＩＩ部位をベクターから取り出した。取り出しには、突然変異オリゴヌクレオチド５’−ＣＡＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＡＧＡ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８）および５’−ＴＡＧＣＡＴＴＡＡＣＧＴＣＣＡＡＴＡ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９）を用いた。新しいＨｉｎｄ　ＩＩＩとＭｌｕ　Ｉの部位を、またＭ１３ＩＸ４２の３９１９および３９５１の位置に導入した。この変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、各々、５’−ＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＴ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０）および５’−ＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＧＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１）の配列を有した。Ｌａｃ　Ｚのアミノ末端部位は、突然変異オリゴヌクレオチド５’−ＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＡＡＧＡＡＧＣＣＴＴＧＣＴ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２）が用いられ、オリゴヌクレオチド゛特異的変異誘発法によって欠失された。この欠失によって、Ｍ１３ｍｐ１８由来のＦｏｋ　Ｉ部位の１／３が除かれた。スペーサ配列を挿入することによって、Ｅｃｏ　ＲＩ部位およびＳａｃ　Ｉ部位との間の距離が増大され、完全な二重消化が保証された。そのスペーサ配列は、オリゴヌクレオチド５’−ＴＴＣＡＧＣＣＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＴＧＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＣＡＴＣＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３）を用いて挿入した。最後にアンバー終止コドンを突然変異オリゴヌクレオチド５−ＴＧＧＡＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＡ　ＡＡＴＡＡＴＧＧＡ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４）を用いて４４９２位に配置した。このアンバー終止コドンは、生物学的選択として用いられる。これによって、ベクター配列を適正に組替え、ランダム化オリゴヌクレオチドの右半分および左半分の結合が保証される。上記の突然変異を行う際に、Ｍ１３のコーディング領域内でなされる全ての変化は、そのようなアミノ酸配列が変化することなく残るように行われた。Ｍ１３ｍｐ１８内にはいくつかの突然変異が見い出され、これらは発表された配列とは異なることに留意すべきである。これらの配列の差異が、見つかった場合には、見出された通りにその差異を本発明に記載したので、Ｍ１３ｍｐ１８の発表された配列とは正確には一致しない。
【０１６９】
得られたベクターＭ１３ＩＸ４２の配列を図５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）に示す。図３Ａはまた、Ｍ１３ＩＸ４２を示す。このＭ１３ＩＸ４２は右半分および左半分のランダム化オリゴヌクレオチド間に表面発現ライブラリーを生成するのに必要な各々の要素にマーク付けされる。矢印で示される２つのＦｏｋ　Ｉ部位の間の配列は、Ｍ１３ＩＸ４２の部分である。この部分は、左半分のベクターの部分と結合され、遺伝子ＶＩＩＩの融合タンパク質としてランダムオリゴヌクレオチドを生成する。
【０１７０】
Ｍ１３ＩＸ２２または左半分のべクターは、ランダム化オリゴヌクレオチドの左半分集団を保持させるために構築された。このベクターは、Ｍ１３ｍｐ１９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、米国、ニュージャージー州、ビスカタウエイ）　から構築し、以下のものを含有する：（１）Ｍ１３ＩＸ４２と混合し、ランダム化オリゴヌクレオチドの左半分および右半分を結合させる２つのＦｏｋ　Ｉ部位；（２）プロモーター、シグナル配列、および翻訳開始シグナルのような発現に必要な配列；（３）ランダム化オリゴヌクレオチドのＥｃｏ　ＲＩ−Ｓａｃ　Ｉクローン化部位；および（４）左半分および右半分のオリゴヌクレオチドを結合させる際の生物学的選択としてのアンバー終止コドン。
【０１７１】
Ｍ１３ＩＸ２２をＭ１３ＩＸ４２と混合するために使用いられる２つのＦｏｋ　Ｉ部位のうちの１つは、Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９（３５４７位）の中に自然にコードされる。Ｍ１３ＩＸ４２の場合、この自然に存在するＦｏｋ　Ｉ部位内のオーバーハングをＣＴＴＣに変えた。他方のＦｏｋ　Ｉ部位は、翻訳開始シグナルの構築の後に、オリゴヌクレオチドの５’−ＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＴ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）を用い、部位特異的変異誘発法によって導入した。
【０１７２】
翻訳開始シグナルは、先に述べたように、オーバーラップするオリゴヌクレオチドをアニールし、５’　Ｅｃｏ　ＲＩ部位および３’　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ部位を含有する二本鎖挿入断片を生成させることによって構築した。オーバーラップするオリゴヌクレオチドを表ＶＩＩＩ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６〜３４）に示す。このオリゴヌクレオチド、プソイド遺伝子ＶＩＩＩ挿入断片に関して記述したようにＭ１３ｍｐ１８のＥｃｏ　ＲＩ部位およびＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位との間に、二本鎖挿入断片として結合された。リボソーム結合部位（ＡＧＧＡＧＡＣ）は、オリゴヌクレオチド０１５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）内に位置し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）はオリゴヌクレオチド０１６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）の最初の３つのヌクレオチドである。
【０１７３】
【表８】
2004024262.tif 000011
オリゴヌクレオチド０１７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）は、ＡＴＧ　コドンから６７ヌクレオチド下流にＳａＣ　Ｉ制限部位を含有する。自然に存在するＥｃｏ　ＲＩ部位を除去し、新しい部位をＳａｃ　Ｉから２５のヌクレオチド下流に導入した。各々の突然変異を生じさせるために、オリゴヌクレオチドとして、各々、５’−ＴＧＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５）および５’−ＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＴ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６）を用いた。アンバー終止コドンを、また、Ｍ１３ｍｐ１８の３２６３位置に導入した。この導入には、オリゴヌクレオチド５’−ＣＡＡＴＴＴＴＡＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７）を用いた。
【０１７４】
上記の突然変異に加えて、各種の他の修飾を行ない、ある種の配列および重複制限部位を除いた。ＬＡＣ　Ｚリボソーム結合部位は、Ｍ１３ｍｐ１８中のもとのＥｃｏ　ＲＩ部位を突然変移させたときに除去された。またＭ１３ｍｐ１８の２３９、６３６１および７２４４位置にあるＦｏｋ　Ｉ部位は同様に、それぞれ突然変異オリゴヌクレオチドの５’−ＣＡＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＡＧＡ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３８）、５’−ＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＧＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９）および５’−ＴＡＧＣＡＴＴＡＡＣＧＴＣＣＡＡＴＡ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０）とともに、それぞれ除去された。やはり、コーディング領域内の突然変異によってアミノ酸配列は変化しなかった。
【０１７５】
得られたベクターＭ１３ＩＸ２２は、７３２０塩基対の長さを有し、その配列は図６（図６Ａ〜Ｂ）に示す（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２），　Ｓａｃ　ＩとＥｃｏ　ＲＩのクローン化部位はそれぞれ６２９０と６３１４の位置にある。図３ＡもＭ１３ＩＸ２２を示すが、右半分と左半分のランダム化オリゴヌクレオチド間の表面発現ライブラリーを生成するのに必要な各要素にはマークがつけてある。
ライブラリーの構築
カラム１Ｒ〜４０Ｒとカラム１Ｌ〜４０Ｌ由来の右半分と左半分のランダム化オリゴヌクレオチドの各集団をそれぞれ、別々にＭ１３ＩＸ４２とＭ１３ＩＸ２２にクローン化して、右半分と左半分のランダム化オリゴヌクレオチドのサブライブラリーを作製する。それ故に、合計８０のサブライブラリーを生成させる。右半分と左半分のオリゴヌクレオチドのアニーリングの効率を確実に最大にするために、ランダム化オリゴヌクレオチドの各集団は最終のスクリーニングのステップが実施されるまで、別個に保管される。効率が高い程、得ることができるランダム化オリゴヌクレオチド合計数が増大する。あるいは、右半分のオリゴヌクレオチドの４０の集団全体（カラム１Ｒ〜４０Ｒ）を混合し、１つの集団にし、左半分のオリゴヌクレオチドの４０の集団全体（カラム１Ｌ〜４０Ｌ）を混合して第２の集団にして、各々について１つのサブライブラリーを作ることができる。
【０１７６】
サブライブラリーを作るために、ランダム化オリゴヌクレオチドの上記の各集団を、適切なベクターに、別々にクローン化する。右半分のオリゴヌクレオチドをＭ１３ＩＸ４２にクローン化して、サブライブラリーＭ１３ＩＸ４２．１Ｒ〜Ｍ１３ＩＸ４２．４０Ｒを生成させる。左半分のオリゴヌクレオチドを同様に、Ｍ１３ＩＸ２２にクローン化して、サブライブラリーＭ１３ＩＸ２２．ＩＬ〜Ｍ１３ＩＸ２２．４０Ｌを生成させる。各ベクターは、消化したときにそれぞれ５’と３’の一本鎖オーバーハングを生成する、ユニークＥｃｏ　ＲＩ制限酵素部位とユニークＳａｃ　Ｉ制限酵素部位を含有している。その一本鎖オーバーハングは、相補的一本鎖ランダムオリゴヌクレオチドをアニーリングし連結するのに用いられる。
【０１７７】
ランダム化オリゴヌクレオチド集団は、逐次消化と連結のステップによって、Ｅｃｏ　ＲＩ部位とＳａｃ　Ｉ部位の間にクローン化される。各ベクターは、３７℃で２時間、過剰のＥｃｏ　ＲＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）で処理し、次いで４〜２４単位の仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社，　インディアナ州，　インディアナポリス）を添加する。反応をフェノール／クロロホルム抽出で停止させ、エタノールで沈澱させた。得られたペレットを、蒸留水もしくは脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）の適切な量に再懸濁させる。約１０ｐｍｏｌのベクターを、１．０　ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ社，　メリーランド州，　ゲイサーズバーグ）を含有する１Ｘリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ　トリス−　ＨＣｌ，　ｐＨ７．８，　１０ｍＭＭｇＣｌ２，　２０ｍＭ　ＤＴＴ，　１ｍＭ　ＡＴＰ，　５０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）の１０μｌ中のランダム化オリゴヌクレオチドの各集団の５０００倍過剰モルと混合した。得られた連結液を１６℃で１６時間インキュベートする。反応は７５℃で１５分加熱することによって停止させ、ＤＮＡを過剰のＳａｃＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社）で２時間消化する。Ｓａｃ　Ｉを７５℃で１５分間加熱することによって不活性化し、次にその反応混合物の容積を、適当量の１０Ｘリガーゼ緩衝液およびｄＨ２Ｏによって３００μｌに調節する。１単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ社）を添加し、生成した混合物を１６℃で一夜インキュベートする。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，　ｐＨ８．０，　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。各連結液からのＤＮＡを、エレクトロポレーションでＸＬ１　ＢｌｕｅＴＭ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社，　カリフォルニア州，　ラ・ジョラ）中に、下記のようにして導入してサブライブラリーを生成させた。
【０１７８】
Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＸＬ１　ＢｌｕｅＴＭは、Ｓｍｉｔｈら、Ｆｏｃｕｓ，　１２巻，　３８〜４０頁，　１９９０年に記載されているのと同様にして、エレクトロポレーションに付す。尚、この文献は本願に参考として援用するものとする。その細胞は、マグネシウムなしのＳＯＢ（２０ｇのバクト−トリプトン、５ｇのバクト−酵母エキス、０．５８４ｇ　ＮａＣｌ、０．１８６ｇ　ＫＣｌ、ｄＨ２Ｏで１０００ｍｌとする）の５ｍｌにＸＬ１の新しいコロニーを接種することによって作製し、激しく通気しながら３７℃で一夜増殖させる。マグネシウムなしのＳＯＢ（５００ｍｌ）に１：１０００の比率で上記の一夜培養物を接種し、ＯＤ５５０が０．８になるまで（約２〜３時間）３７℃で激しく通気しながら増殖させる。ＧＳ３ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ社，　コネチカット州，　ニュータウン）を用い、４℃にて１０分間、５，０００ｒｐｍ（２，６００　ｘ　ｇ）で遠心分離して細胞を収穫し、その細胞を氷冷１０％（Ｖ／Ｖ）滅菌グリセリンの５００ｍｌ中に再懸濁させ、遠心分離し、同じ方式で第２回目の再懸濁を行った。第３回目の遠心分離を行った後、細胞を最終容積約２ｍｌの１０％滅菌グリセリン中に再懸濁させる。その結果、懸濁液のＯＤ５５０は２００〜３００になる。通常、再懸濁液は上澄み液を除去して底に残る１０％グリセリン液で行われる。細胞は、微量遠心分離管中に４０μｌずつ入れて、ドライアイス−エタノール浴を用いて凍結し、−７０℃で凍結貯蔵する。
【０１７９】
凍結細胞を、使用する前に氷上で徐々に解凍し、細胞懸濁液４０μｌ当り約１０ｐｇ〜５００ｎｇのベクターと混合することによってエレクトロポレーションに付す。４０μｌずつを、０．１ｃｍのエレクトロポレーションチャンバー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社，　カリフォルニア州，　リッチモンド）中に入れ、次に、２００Ω並列抵抗器２５μＦ，　１．８８ＫＶを用いて０℃で１回パルスする（この抵抗器は約４ｍｓのパルス幅（ｒ）を与える）。パルスされた細胞の１０μｌずつを、１２×７５ｍｍ培養管に入れた１ｍｌ　ＳＯＣ（９８ｍｌ　ＳＯＢ　プラス１　ｍｌの２Ｍ　ＭｇＣｌ２および１　ｍｌの２Ｍグリコース）で希釈し、その培養物は、３７℃で１時間振盪した後、選択培地で培養される（以下参照）。
【０１８０】
８０のサブライブラリーを各々、当業者に公知の方法を用いて培養する。このような方法は、Ｓａｎｂｒｏｏｋら，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，１９８９年，　およびＡｕｓｕｂｅｌら，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８９年に記載されている。両文献はともに本願に参考として援用するものとする。簡単に述べれば、上記のサブライブラリーの培養物１ｍｌを、２ＸＹＴ培地（１６ｇ　トリプトン，　１０ｇ酵母エキス，　５ｇ　ＮａＣｌ）で５０倍希釈し、次に３７℃にて５〜８時間培養して増殖させた。１０，０００　ｘ　ｇで遠心分離して細菌をペレットにした。ファージを含有する上澄み液を滅菌試験管に移し、４℃で保存した。
【０１８１】
右半分と左半分のランダム化オリゴヌクレオチド挿入断片を含有する二本鎖ベクターＤＮＡを、各サブライブラリーの細胞ペレットから単離した。簡単に述べれば、該ペレットをＴＥ（１０ｍＭ　トリス、ｐＨ８．０，　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で洗浄し、Ｓｏｒｖａｌ遠心分離器（コネチカット州，　ニュータウン）で５’について７，０００ｒｐｍで遠心分離して再度収集した。ペレットを、１０％スクロース，　５０ｍＭ　トリス，　ｐＨ８．０含有液６ｍｌに再懸濁させる。１０ｍｇ／μｌのリゾチン液３．０ｍｌを添加し、氷上で２０分間インキュベートする。０．２Ｍ　ＮａＯＨ，　１％　ＳＤＳの液１２ｍｌを添加し、１０分間氷上でインキュベートする。生成した懸濁液に３Ｍ　ＮａＯＡｃ，　ｐＨ４．６の液７．５ｍｌを添加した後、２０分間氷上でインキュベートする。得られた試料を４℃にて、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。ＲＮアーゼで処理し、フェノール／クロロホルムで抽出し、次にエタノールで沈澱させる。ペレットを再懸濁させ、秤量し、次いで同重量のＣｓＣｌ２を各試験管内で溶解して密度を１．６０ｇ／ｍｌとする。ＥｔＢｒを６００μｇ／ｍｌになるまで添加し、ＴＶ−１６６５ローター（Ｓｏｒｖａｌ）を用い、５０，０００ｒｐｍで６時間平衡遠心分離を行って二本鎖ＤＮＡを単離する。右半分と左半分の各ライブラリーから得たこれらのＤＮＡを使用して、ランダム化オリゴヌクレオチドの右半分と左半分がランダムに結合している４０のライブラリーを生成させる。
【０１８２】
４０の各サブライブラリーは、１つの右半分サブライブラリーと１つの左半分のサブライブラリーを結合させて作製する。結合させた２つのサブライブラリーは、右半分と左半分のランダムオリゴヌクレオチドの合成のための同じカラム番号に相当する。例えば、サブライブラリーＭ１３ＩＸ４２．１ＲはＭ１３ＩＸ２２．１Ｌと結合させて、表面発現ライブラリーＭ１３ＩＸ．１ＲＬを作製する。右半分の全合成と左半分の全合成の集団を混合して、２つだけのサブライブラリーが得られる別の状態の場合には、１つだけの表面発現ライブラリーが生成する。
【０１８３】
右半分と左半分のオリゴヌクレオチド集団をランダム結合させて、単一の表面発現ベクター種とするために、各サブライブラリーから単離したＤＮＡを、過剰のＦｏｋ　Ｉ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化する。反応をフェノール／クロロホルム抽出で停止させ、次いでエタノールで沈澱させる。ペレットをｄＨ２Ｏ中に再懸濁させる。対応する右半分と左半分のサブライブラリーから単離し、ＦｏＫ　Ｉで消化したＤＮＡの等モル量（５〜１０ｐｍｏｌ）を、１．０　ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，　メリーランド州，　ガイサーズバーグ）　を含有する１Ｘリガーゼ緩衝液１０μｌ中で連結することによって、各表面発現ライブラリーを生成させる。この連結は１６℃で一夜行われ、次いでＸＬ１細胞について先に記載したのと同様にして、エレクトロポレーションに付してｓｕｐＯ菌株　ＭＫ３０−３（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社（ＢＭＢ），インディアナ州，　インディアナポリス）中に導入する。ＭＫ３０−３はｓｕｐ　Ｏであるから、導入されるランダム化オリゴヌクレオチドをコードするベクター部分だけが生存可能なファージを生成する。
表面発現ライブラリーのスクリーニング
４℃で貯蔵されたファージの貯蔵品から１０のｍ．ｏ．ｉ．で感染させたＸＬ１　ＢｌｕｅＴＭ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の液体培養物５０ｍｌから、精製ファージを作製する。その培養物は２ｍＭ　ＩＰＴＧによって誘導される。全培養物の上澄み液を合わせ、２回遠心分離に付して透明にし、次いで１／７．５容積のＰＥＧ溶液（２５％　ＰＥＧ−８０００，　２．５Ｍ　ＮａＣｌ）を添加することによってファージを沈澱させ、次いで４℃にて一夜インキュベートする。生成した沈澱を１０，０００×ｇで９０分間遠心分離することによって回収する。ファージのペレットを、０．０１Ｍ　トリス−ＨＣｌ，　ｐＨ７．６，　１．０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％　Ｓａｒｋｏｓｙｌを含有する液２５ｍｌ中に再懸濁させ、室温下３０分間、ゆっくりと振盪する。生成した溶液を、０．５Ｍ　ＮａＣｌに調節し、５％ポリエチレングリコールの最終濃度にする。４℃で２時間保存した後、ファージを含有する沈澱を、１５，０００×ｇで１時間遠心分離を行って回収する。得られた沈澱を１０ｍｌのＮＥＴ緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ，　１．０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．０１Ｍ　トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．６）中に再懸濁させ、十分に混合し、次いで１７０，０００×ｇで３時間遠心分離してファージを再ペレット化する。ファージのペレットを続いて、２ｍｌのＮＥＴ緩衝液中に一夜再懸濁させ、次に１１０，０００×ｇで１８時間塩化セシウム遠心分離に付す（１０ｍｌの緩衝液中３．８６ｇの塩化セシウム含有）。ファージのバンドを収集し、ＮＥＴ緩衝液で７倍に希釈し、１７０，０００×ｇで３時間再度遠心分離し、再懸濁し、０．１ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＮＥＴ緩衝液０．３ｍｌ中、４℃にて貯蔵する。
【０１８４】
ストレプタビジンでコートした皿上でパニングを行うのに用いるリガンド結合タンパク質を、まずビオチニル化し、次にＵＶで不活性化されたブロッキングファージに対して吸収させる（以下参照）。ビオチニル化試薬をジメチルホルムアミドに次の比率で溶解する。すなわち２．４ｍｇの固体のＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン〔スルフォスクシンイミジル　２−（ビオチンアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオナート；Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州、ロッククォード〕：１ｍｌの溶媒の比率である。得られた溶液をメーカーの推奨するとおりに使用する。小規模の反応は、滅菌重炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６）で希釈したリガンド結合タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）の４３μｌを、１μｌの溶解された試薬と混合することによって行う。２５℃で２時間経過後、残留ビオチニル化試薬を、５００μｌの１Ｍエタノールアミン（ＨＣｌでｐＨを９に調節する）と、さらに２時間反応させる。全試料を、１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡを含有するＴＢＳの１ｍｌで希釈し、次いでＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０　ｕｌｔｒａ　ｆｉｌｔｅｒ　（Ａｍｉｃｏｎ社）で約５０μｌまで濃縮し、そのフィルター上で、２ｍｌ　ＴＢＳで３回、０．０２％　ＮａＮ３と７×１０１２のＵＶで不活性化されたブロッキングファージ（以下参照）を含有するＴＢＳの１ｍｌで１回洗浄し、最終の残留液（６０〜８０μｌ）を４℃で貯蔵する。ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン試薬でビオチニル化したリガンド結合タンパク質を、ジスルフィド含有連鎖によってビオチニンに連結させる。
【０１８５】
偶然に繊維状ファージを捕捉する結合タンパク質をブロックするために、一般にＵＶ照射したＭ１３ファージを使用した。Ｍ１３ｍｐ８（ＭｅｓｓｉｎｇおよびＶｉｅｉｒａ，　Ｇｅｎｅ，１９巻、２６２〜２７６頁、１９８２年；この文献は本願に参考として援用するものとする）を選択した。というのはＭ１３ｍｐ８は２つのアンバー終止コドンをもっており、これらのコドンは、表面発現ライブラリーを滴定するのに用いられるｓｕｐ　０菌株中に少数のファージを生存させる照射が生じないことを保証するからである。５×１０１３のＭ１３ｍｐ８ファージを含有する５ｍｌの試料を、先に述べたのと同様にして精製し、小ペトリ皿に入れ、２フィートの距離をおいて７分間、殺菌灯の光を照射した（フラックス　１５０μＷ／ｃｍ２）。ＮａＮ３を０．０２％になるまで添加し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０−ｋＤａウルトラフィルター（Ａｍｉｃｏｎ社）上でファージ粒子を１０１４粒子／ｍｌまで濃縮した。
【０１８６】
パニングを行うために、ポリスチレン製ペトリ皿（６０×１５　ｍｍ、Ｆａｌｃｏｎ；　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州、リンカーンパーク）を、１　ｍｇ／ｍｌのストレプタビジン（ＢＭＢ）を含有する０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６−０．０２％　ＮａＮ３の１ｍｌ　とともに、小さな気密性プラスチックボックス内で、冷室中で一夜インキュベートする。翌日ストレプタビジンを除き、少なくとも１０ｍｌのブロッキング溶液（２９ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ；３μｇ／ｍｌのストレプタビジン；０．１Ｍ　ＮＡＨＣＯ３　ｐＨ８．６−０．０２％　ＮａＮ３）で置換し、少なくとも１時間室温でインキュベートする。ブロッキング溶液を除去し、プレートを０．５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ−０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０）で３回迅速に洗浄する。
【０１８７】
リガンド結合タンパク質で捕捉されたファージ発現ペプチドの選択は、各ライブラリーの５０μｌ部分と反応させた、ブロックされかつビオチニル化されたリガンド結合タンパク質の５μｌ（２．７μｇのリガンド結合タンパク質）で行う。各混合物を一夜４℃でインキュベートし、１ｍｌのＴＢＳ−０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０で希釈し、上記のようにして作製したストレプタビジンでコートしたペトリ皿に移す。１０分間室温で振盪させた後、未結合のファージを除去し、プレートをＴＢＳ−０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０で１０回、３０〜９０分間洗浄する。結合したファージを、８００μｌの滅菌溶離緩衝液（１　ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、０．１Ｍ　ＨＣｌ、グリセリンでｐＨを２．２に調節する）　を用いて１５分間プレートから溶離し、溶出液を４８μｌの２Ｍトリス（ｐＨは調節しない）で中和する。各溶出液の２０μｌずつを、ＭＫ３０−３濃度細胞について、インプットしたファージを希釈し滴定する。
【０１８８】
パニングの第２ラウンドは、各ライブラリーからの最初の溶出液７５０μｌを５ｍＭ　ＤＴＴで１０分間処理して、ビオチミン基を残留ビオチニル化結合タンパク質に連結するジスルフィド結合を切断することによって行う。処理された溶出液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０　ウルトラフィルター（Ａｍｉｃｏｎ社）で濃縮し、ＴＢＳ−０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、最終容積約５０μｌまで濃縮する。最終残留物を、５．０μｌ（２．７μｇのリガンド結合タンパク質）のブロックされかつビオチニル化されたリガンド結合タンパク質が入っている試験管に移し入れ、一夜インキュベートする。生成した溶液を１　ｍｌのＴＢＳ−０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０で希釈しパニングを行い、先に述べたのと同様にして、新しいストレプタビジン被覆ペトリ皿上に溶出させる。第２の溶出液全体（８００μｌ）を４８μｌの２Ｍトリスで中和し、その２０μｌを、第１溶出液とインプットファージの希釈液で同時に滴定する。
【０１８９】
個々のファージ集団を２〜３ラウンドのプラーク精製法で精製する。簡単に述べれば、第２溶出液の滴定プレートをニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ．　Ｉｎｃ．、ニューハンプシャー州、キーン）でリフトし、ＴＢＳ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ　Ｎａｃｌ）中で１５分間洗浄することによって処理し、続いて、５％の脱脂乾燥牛乳を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−５％ＮＤＭ）を０．５ｍｌ／ｃｍ２で用いてさらに１時間３７℃で振盪しながらインキュベートする。洗浄液は排棄し、リガンド結合タンパク質を１ｎＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１〜１００μＭ含有する新しいＴＢＳ−５％　ＮＤＭを添加する（０．１ｍｌ／ｃｍ２）。インキュベーションはすべてヒートシールが可能なパウチ（Ｓｅａｒｓ社）中で行う。リガンド結合タンパク質とともに行うインキュベーションは、振盪しながら４℃で１２〜１６時間実施する。フィルターをバッグから取り出し、０．１％のＮＤＭと０．２％のＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州、セントルイス）を含有するＴＢＳの１５０ｍｌで３回３０分ずつ室温で洗浄する。次にフィルターを、ＴＢＳ−０．５％　ＮＤＭで適切に希釈した、リガンド結合タンパク質に対する抗血清中で、室温にて２時間インキュベートし、上記のように、０．１％　ＮＤＭと０．２％　ＮＰ−４０を含有するＴＢＳを３回変えて洗浄し、１×１０６ｃｐｍの１２５Ｉ標識プロテインＡ（比活性＝２．１×１０７ｃｐｍ／μｇ）とともに０．１％　ＮＤＭと０．２％　ＮＰ−４０を含有するＴＢＳ中でインキュベートする。先に述べたのと同様にして０．１％　ＮＤＭと０．２％　ＮＰ−４０を含有するＴＢＳで洗浄した後、そのフィルターをサランラップで包み、Ｄｕｐｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｐｌｕｓ　Ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ　Ｓｃｒｅｅｎｓ（Ｄｕｐｏｎｔ社、デラウェア州、ウィルミントン）を用いて、−７０℃で１−１２時間、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍａｔ　Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ社、ニューヨーク州、ロチェスター）に暴露させる。
【０１９０】
同定された正のプラークをパスツールピペットの大きい端部でコア（ｃｏｒｅ）して、１ｍｌのＳＭ（５．８ｇのＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｌの１Ｍ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍｌの２％ゼラチン、ｄＨ２Ｏで１０００ｍｌとする）プラス１〜３滴のＣＨＣｌ３中に入れて、３７℃で２〜３時間または４℃で一夜インキュベートする。ファージをＳＭで１：５００の比率で希釈し、その２μｌを、３００μｌのＸＬ１細胞プラス３ｍｌの軟寒天／１００ｍ２プレートに添加する。ＸＬ１細胞は、１００μｌの２０％マルトース液と１００μｌの１Ｍ　ＭｇＳＯ４溶液を含有する１０ｍｌのＬＢ（１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇのバクト−酵母エキス、１０ｇのＮａＣｌ、１０００ｍｌのｄＨ２Ｏ）中で１コロニーを一夜増殖させることによってプレーティング用に作製する。２０００×ｇで１０分間遠心分離することによって細菌をペレット化し、そのペレットを、１０ｍｌの１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４溶液にゆるやかに再懸濁させる。その懸濁液に３０ｍｌの１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４溶液を添加して４倍に希釈して、ＯＤ６００を約０．５にする。第２と第３のラウンドのスクリーンは、プラークをパスツールピペットの小末端でコアして０．５ｍｌのＳＭプラス１滴のＣＨＣｌ３中に入れて、インキュベーション後１〜５μｌのファージを希釈せずにプレーティングに用いることを除いて、前に述べたのと同一である。精製の第３ラウンドが終わってから、個々のプラークを拾い上げて、配列決定のための鋳型を作成する。
鋳型の製造および配列の決定
ＸＬ１を個々のプラークとともに一夜培養したものの１：１００希釈物を含有する２ＸＹＴの培養物１ｍｌを接種することによって、配列決定用の鋳型を作製する。滅菌トゥースピックを用いてプラークを拾い集める。その培養物を、３７℃で５〜６時間振盪しながらインキュベートし、次に１．５ｍｌのミクロフュージ管に移す。２００μｌのＰＥＧ溶液を添加し、次いで撹拌し、氷上に１０分間置く。ミクロフュージ管中で１２，０００　ｘ　ｇにて５分間遠心分離することによってファージの沈澱を回収する。上澄み液を廃棄し、イエローピペットチップでゆっくりピペッティングを行うことによって、ペレットを２３０μｌのＴＥ（１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁させる。フェノール（２００μｌ）を添加し、続いて軽く撹拌し、ミクロフュージして相を分離する。水相を別の管に移し、フェノール抽出について先に述べたのと同様にして、２００μｌのフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出する。０．１容積の３Ｍ　ＮａＯＡｃを添加し、次に２．５容積のエタノールを添加して、−２０℃で２０分間沈澱させる。沈澱させた鋳型を、マイクロフュージ管中で、１２，０００　ｘ　ｇにて８分間遠心分離することによって回収する。得られたペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、２５μｌのＴＥに再懸濁させる。配列決定は、メーカー（Ｕ．Ｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社、オハイオ州、クリーブランド）が提供するプロトコルに従って、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ配列決定キットを用いて行った。
【０１９１】
実施例ＩＩ
２つの予め決められた位置にランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドから生成させたペプチドリガンドの単離および特性決定
この実施例は、ランダム化コドンを有するオリゴヌクレオチドの集団由来の表面発現ライブラリーの生成について示す。そのオリゴヌクレオチドは１０のコドンの長さを有し、Ｍ１３遺伝子ＶＩＩＩベースの表面発現ライブラリーを生成させるために、単一のベクター種にクローン化する。この実施例はまた、リガンド結合タンパク質のペプチドの選択およびそのコードされた核酸配列の特性決定についても述べる。
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを実施例Ｉに記載されたようにして合成した。合成器を、表ＩＸ　に示す配列を合成するようにプログラムした。これらの配列は、ベクターのリーダー配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの合成された第１ランダムコドン位置および３’フランキング配列に相当する。相補性配列は、オリゴヌクレオチドの合成された集団の挿入突然変異誘発に用いられる。
【０１９２】
【表９】
2004024262.tif 000012
次の８つのランダムコドン位置は、実施例Ｉの表Ｖに記載されたのと同様にして合成した。９番目の位置の合成をした後、反応生成物をもう１度結合して混合し、新しい１０のカラムに再分配した。最後のランダムコドン位置および５’フランキング配列の合成を表Ｘに示す。
【０１９３】
【表１０】
2004024262.tif 000013
反応生成物を再度混合し、オリゴヌクレオチドをメーカーが推奨するとおりに切断および精製した。オリゴヌクレオチドの精製された集団は、以下に述べるようにして表面発現ライブラリーを生成させるのに使用した。
ベクターの構築
単一のオリゴヌクレオチド集団から（すなわち右半分および左半分のオリゴヌクレオチドを結合させることなしに）表面発現ライブラリーを生成させるのに使用されるベクターについて以下に説明する。このベクターは、遺伝子ＶＩＩＩ−ペプチド融合タンパク質の合成を誘導するＭ１３ベースの発現ベクター（図４）である。このベクターは、実施例Ｉの右半分および左半分のベクターを結合したものが示すすべての機能を示す。
【０１９４】
ランダムオリゴヌクレオチドの集団のクローン化および表面発現を行うためのＭ１３−ベースのベクターを構築した（図４，Ｍ１３ＩＸ３０）。Ｍ１３ｍｐ１９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）が出発ベクターであった。このベクターは、修飾した結果、コードされた野生型Ｍ１３遺伝子ＶＩＩＩに加えて：（１）プソイド野生型遺伝子、すなわちアンバー終止コドンを有する遺伝子ＶＩＩＩ配列（該終止コドンは、遺伝子ＶＩＩＩ配列とオリゴヌクレオチドをクローン化するための制限部位との間に位置している）；（２）オリゴヌクレオチドをクローン化するための、プソイド野生型ｇＶＩＩＩのフレーム中のＳｔｕ　Ｉ、Ｓｐｅ　ＩおよびＸｈｏ　Ｉ制限部位；（３）プロモーター、シグナル配列および翻訳開始シグナルのような発現に必要な配列；（４）重複制限部位を除くための他の各種の変異部分およびＬａｃ　Ｚのアミノ末端部分、を含有している。
【０１９５】
Ｍ１３ＩＸ３０の構築を４つのステップで実施した。第１ステップでは、プソイド遺伝子ＶＩＩＩおよび他の各種の突然変異部分を含有している前駆体ベクターＭ１３ＩＸ０１Ｆを構築した。第２ステップでは、別個のＭ１３ｍｐ１８ベクター中に小さなクローン化部位を構築してＭ１３４ＩＸ０３を得た。第３ステップでは、発現配列およびクローン化部位をＭ１３ＩＸＯ３内に構築して中間ベクターＭ１３ＩＸＯ４Ｂを生成させた。第４ステップでは、中間ベクターから新しく構築した配列をＭ１３ＩＸＯ１Ｆに組み込んでＭ１３ＩＸ３Ｏを得た。これらの配列を組み込んでそれらをプソイド遺伝子ＶＩＩＩを連結した。
【０１９６】
前駆体ベクターＭ１３ＩＸＯ１Ｆの構築は、下記の特徴を除いて実施例Ｉに記載のＭ１３ＩＸ４２の構築と同様であった。その特徴は、（１）Ｍ１３ｍｐ１９が出発ベクターとして使用された；（２）ユニークＥｃｏ　ＲＩ部位に対し５’側のＦｏｋ　Ｉ部位は組み込まれておらず、かつ３５４７位置における自然に存在しているＦｏｋ　Ｉ部位のオーバーハングは５’−ＣＴＴＣ−３’に変化させなかった；（３）Ｅｃｏ　ＲＩ部位とＳａｃ　Ｉ部位との間にスペーサー配列は組み込まなかった；および（４）４４９２位置のアンバーコドンは組み込まなかった；ことである。
【０１９７】
第２ステップにおいて、Ｍ１３ｍｐ１８は突然変異によって、ＬａｃＺの５’末端をＬａｃ　ｉ結合部位まで除かれ、Ｌａｃ　Ｚリボソーム結合部位および出発コドンを有している。さらに、ポリリンカーを除去しＭｌｕ　Ｉ部位をＬａｃＺのコーディング領域に導入した。単一オリゴヌクレオチドを、これらの変異誘発に用いたが、それは配列５’−ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１）を有した。Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　およびＥｃｏ　ＲＩの制限酵素部位を、オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＧＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２）を用いて、Ｍｉｕ　Ｉ部位の下流に導入した。Ｍ１３ｍｐ１８をこのように修飾することによってベクターＭ１３ＩＸ０３を得た。
【０１９８】
発現配列およびクローン化部位は、所望の配列の両方のストランドをコードする一連のオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによってＭ１３ＩＸ０３に導入した。そのオリゴヌクレオチドを表ＸＩに示す（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３〜５０）。
【０１９９】
【表１１】
2004024262.tif 000014
表ＸＩの末端オリゴヌクレオチド０８４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３）および０８５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７）を除いて、上記のオリゴヌクレオチドを、実施例Ｉに記載されているのと同様にして、混合し、リン酸化し、アニールし、そして連結して二本鎖挿入断片を形成した。しかし、中間ベクターに直接クローン化する代わりに、挿入断片は、まず、末端オリゴヌクレオチド０８４（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：４３）および０８５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７）をプライマーとして用いて、ＰＣＲによって増幅される。末端オリゴヌクレオチド０８４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３）は、その５’末端に対して内側に１０のヌクレオチドの位置にＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位を有する。オリゴヌクレオチド０８５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７）はその５’末端にＥｃｏ　ＲＩ部位を有する。増幅してから、生成物を、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩとＥｃｏ　ＲＩで制限し、実施例Ｉに記載したのと同様にして、同じ２つの酵素で消化したＭ１３ｍｐ１８のポリリンカーに連結した。生成した二本鎖挿入断片は、リボース結合部位、翻訳開始コドン、このコドンに続くリーダー配列、およびランダムオリゴヌクレオチドをクローン化するための３つの制限酵素部位（ＸｈｏＩ、ＳｔｕＩ、Ｓｐｅ　Ｉ）を含有している。このベクターはＭ１３ＩＸＯ４と命名した。
【０２００】
上記二本鎖挿入断片のクローン化中に、オリゴヌクレオチド０２８中のＧＣＣコドンの１つと０３１中のその補体とが欠失することが見いだされた。この欠失は機能に影響がなかったので、最終の構造は２つのＧＣＣコドンのうち１つが失われている。さらにオリゴヌクレオチド０３２は、ＧＡＧコドンが必要な場所にＧＴＧコドンをもっていた。変異誘発を、オリゴヌクレオチド５’−ＴＡＡＣＧＧＴＡＡＧＡＧＴＧＣＣＡＧＴＧＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１）を用いて行い、該コドンを所望の配列に変換した。得られた中間ベクターは、Ｍ１３ＩＸ０４Ｂと命名した。
【０２０１】
Ｍ１３ＩＸ３０を構築する第４ステップには、Ｍ１３ＩＸ０４Ｂ由来の発現とクローニングの配列を、Ｍ１３ＩＸ０１Ｆ中、プソイド野生型ｇＶＩＩＩの上流に挿入するステップが含まれている。これは、Ｍ１３ＩＸ０４ＢをＤｒａ　ＩＩＩとＢａｎ　ＨＩで消化し、目標の配列を含有する７００塩基対の挿入断片をゲル単離することによって行った。Ｍ１３ＩＸ０１Ｆを同様にＤｒａ　ＩＩＩとＢａｍ　ＨＩで消化した。挿入断片を３：１のモル比で二重消化ベクターと混合し、実施例Ｉに記載したベクターの修飾はすべて配列分析によって確認されていることに留意すべきである。最終構造体Ｍ１３ＩＸ３０の配列を図７（図７Ａ〜Ｂ）に示す（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）。図４もＭ１３ＩＸ３０を示すが、ランダム化オリゴヌクレオチドの表面発現に必要な各要素にはマークをつけてある。
コードされたオリゴヌクレオチドのライブラリーの構築、　スクリーニングと特性の決定
Ｍ１３ＩＸ３０表面発現ライブラリーの構築は、上記のオリゴヌクレオチドを、連結法によらずに変異誘発法でＭ１３ＩＸ３０に挿入することを除いて、サブライブラリー構築について実施例Ｉに記載したのと同じにして行う。このライブラリーは、ＭＫ３０−３（ＢＭＢ）上に構築して増殖させ、次にＸＬＩ細胞の感染およびスクリーニングに用いるファージのストックを製造する。表面発現ライブラリーをスクリーニングし、次いで実施例Ｉに記載したのと同様にして、コードしているオリゴヌクレオチドの特性を決定する。
【０２０２】
実施例ＩＩＩ
右半分と左半分の縮重オリゴヌクレオチドから生成させたペプチドリガンドの単離と特性決定
この実施例は、縮重オリゴヌクレオチドの表面発現ライブラリーの構築と発現を示す。この実施例のコードされたペプチドは、２つの別個のオリゴヌクレオチド集団を混合し、結合させることによって生成する。またペプチドリガンドの単離と特性決定および特定の結合タンパク質に対するそれらの対応するヌクレオチド配列も説明する。
オリゴヌクレオチド集団の合成
左半分の縮重オリゴヌクレオチドと右半分の縮重オリゴヌクレオチドの集団を、実施例Ｉに記載した標準の自動化した方法を用いて合成した。
【０２０３】
オリゴヌクレオチドの各集団の縮重コドン配列は、トリプレットＮＮＧ／Ｔ（Ｎは４つのヌクレオチドすべての等量混合物）を逐次合成することによって生成させた。オリゴヌクレオチドの各集団に対するアンチセンス配列を合成したが、各集団は、ベクター配列の相補的な５’および３’のフランキング配列を有していた。相補的末端は、オリゴヌクレオチドの各集団を、標準の変異誘発法で、それぞれのベクターに組み込むのに使った。このような方法は、先に実施例Ｉと詳細な説明の項に記載されている。一本鎖形のベクターはセンス鎖としてしか得られないので、各集団のアンチセンス配列を合成する必要があった。
【０２０４】
次の配列：５’−ＡＧＣＴＣＣＣＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＴＧ（Ａ／ＣＮＮ）９ＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣＡＧＧＧＧ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２）　を有する左半分オリゴヌクレオチド集団を合成した。次の配列：５’−ＣＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣ（Ａ／ＣＮＮ）１０ＡＴＧ（Ａ／Ｃ）ＧＡＡＴ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３）を有する右半分オリゴヌクレオチド集団を合成した。これらの２つのオリゴヌクレオチド集団は、そのそれぞれのベクターに組み込んでともに連結したとき、１９の縮重位置を有する２０コドンのオリゴヌクレオチドおよび予め決められた内部コドン配列をコードする。
ベクターの構築
先に記載したベクターの修飾形を、右半分と左半分のサブライブラリーを構築するのに使用した。左半分のサブライブラリーの構築は、Ｍ１３ＥＤ０３と命名されるＭ１３ベースのベクター中で行った。このベクターは先に述べたＭ１３ＩＸ３０ベクターの修飾形であり、Ｍ１３ＩＸ３０とＭ１３ＩＸ２２の両者の必須の特徴をすべてもっている。Ｍ１３ＥＤ０３は、野生型とプソイド野生型の遺伝子ＶＩＩＩに加えて、発現に必要な配列、および右半分のオリゴヌクレオチドサブライブラリーと結合するための２つのＦＯＫ　Ｉ部位をもっている。それ故に、このベクターは、単一オリゴヌクレオチド集団からの表面発現ライブラリーの生成と発現を行うのに使用できるか、または１つのサブライブラリーと結合して、右半分と左半分のオリゴヌクレオチドの集団と結合して１つの表面発現ライブラリーとすることができる点で、先に述べた両方のベクターの利点を兼ね備えている。
【０２０５】
Ｍ１３ＥＤ０３は、２つのステップでＭ１３ＩＸ３０から構築した。第１ステップでは、Ｍ１３ＩＸ３０を修飾して、重複配列を除き、ヒトβ−エンドルフィンの８つのアミノ末端残基をコードする配列を組み込んだ。リーダ配列も変異させて、産生物の分泌を増大させた。
【０２０６】
Ｍ１３ＩＸ０４（実施例ＩＩに記載されているＭ１３ＩＸ３０に対する中間ベクター）を構築中、６ヌクレオチドの配列が、オリゴヌクレオチド０２７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４）およびその補体０３２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９）中に重複した。この配列、５’−ＴＴＡＣＣＧ−３’は、Ｍ１３ＩＸ３０の構築時に変異誘発法で欠失させた。その変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、５’−ＧＧＴＡＡＡＣＡＧＴＡＡＣＧＧＴＡＡＧＡＧＴＧＣＣＡＧ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４）であった。リーダー配列中の突然変異は、オリゴヌクレオチド：５’−ＧＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣＡＧＧＧＧＴ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５）を用いて起こさせた。この変異誘発によって、Ｍ１３ＩＸ３０の６３５３位のＡ残基がＧ残基に変化した。得られたベクターはＭ１３ＩＸ３２と命名した。
【０２０７】
Ｍ１３ＥＤ０１を生成させるために、β−エンドルフィンをコードするヌクレオチド配列（β−エンドルフィン＋３つのエキストラアミノ酸残基の８つのアミノ酸残基）を変異誘発法によってリーダー配列の後に組み込んだ。使用したオリゴヌクレオチドは次の配列：５’−ＡＧＧＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＴＡＡＡＣＣＣＣＣＣＡＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５６）をもっていた。またこの突然変異誘発によって、ＳｐｅＩ部位の下流の配列のいくつかが除去された。
【０２０８】
Ｍ１３ＥＤ０３構築の第２ステップでは、β−エンドルフィンの配列を下流のプソイド遺伝子ＶＩＩＩの配列のフレーム中に入れるベクターの変化と、右半分のオリゴヌクレオチドのサブライブラリーと結合するためのＦＯＫ　Ｉ部位の組み込みを行った。このベィターは、コードされたβ−エンドルフィン配列に隣接もしくはオーバーラップしている配列に相補的な配列を用いて変異誘発法でオリゴヌクレオチド集団を組み込むよう設計した。それ故に、変異誘発を行った後、β−エンドルフィンの発現がない場合は、変異誘発の頻度を測定するのに利用できる。上記のベクターの変化に加えて、またＭ１３ＥＤ０３は、右半分と左半分のサブライブラリーを結合中に生物学的選択を行うために、３２６２位にアンバーコドンを含有するよう修飾した。
【０２０９】
突然変異は実施例Ｉに記載した標準の変異誘発法を用いて組み込んだ。上記のフレームシフトの変更とＦＯＫ　Ｉ部位は、オリゴヌクレオチド：５’−ＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＡＣＣＣＣＣＣＡＴＡＧＧＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７）を用いて生成させた。アンバーコドンはオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＡＴＴＴＴＡＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８）を用いて生成させた。得られたベクターＭ１３ＥＤ０３の全配列は図８（図８Ａ〜Ｂ）（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．４）に示す。
【０２１０】
右半分のオリゴヌクレオチドサブライブラリーの構築は、Ｍ１３ＩＸ４２ベクターの修飾形で行った。この新しいベクターＭ１３ＩＸ４２１は、Ｅｃｏ　ＲＩ−ＳａｃＩクローン化部位間のアンバーコドンとプソイド遺伝子ＶＩＩＩ配列とが除去されたことを除いてＭ１３ＩＸ４２と同じである。この変化に依って、Ｌａｃ　Ｚプロモーターのすべての発現オフがペプチド遺伝子ＶＩＩＩ融合タンパク質を確実に生成させる。アンバーコドンの除去は、下記のオリゴヌクレオチド：５’−ＧＣＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５９）　を用いて変異誘発法で実施した。Ｍ１３ＩＸ４２１の全配列を図９（図９Ａ〜Ｂ）に示す（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）。
コードされたオリゴヌクレオチドのライブラリー構築、スクリーニングおよび特性決定
サブライブラリーを、オリゴヌクレオチドの縮重集団の先に記載したものの各々について構築した。オリゴヌクレオチドの左半分の集団をＭ１３ＥＤ０３．Ｌに組み込んでサブライブラリーＭ１３ＩＸ４２１．Ｒを生成させた。各オリゴヌクレオチド集団を、実施例Ｉに記載した部位特異的変異誘発法を用いてそれぞれのベクターに組み込んだ。簡単に述べれば、縮重コドン配列に隣接するヌクレオチド配列は、組み込み部位においてベクターと相補的であった。ヌクレオチドの集団は、一本鎖のＭ１３ＥＤ０３ベクターまたはＭ１３ＩＸ４２１ベクターとハイブリダイズし、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼによって延長し、二本鎖環状ベクターを生成した。変異体の鋳型は、Ｋｕｎｋｅｌらの前記文献に記載されているのと同様にして生体内ウリジン選択法で得た。各ベクター集団は、実施例Ｉに記載されているようにして、エレクトロポレーションに付して宿主細胞に導入し、増殖させた。
【０２１１】
右半分と左半分のサブライブラリーをランダム結合させて単一表面発現ライブラリーにすることは、各ベクター集団をＦｏｋ　Ｉで消化する前に、まず各ベクターの不必要な部分を切断する酵素で消化することを除いて、実施例Ｉに記載されているとおりに実施した。簡単に述べれば、Ｍ１３ＥＤ０３．ＬをＢｇｌ　ＩＩ（７０９４位を切断）で消化し、およびＭ１３ＩＸ４２１．ＲをＨｉｎｄ　ＩＩＩ（３９１９位を切断）で消化した。消化された各集団は、さらにアルカリホスファターゼで処理して、末端が再結合しないよう保証し、次いで過剰のＦｏｋＩで消化した。連結、エレクトロポレーション、および生成したライブラリーの増殖を、実施例Ｉに記載したのと同様に行った。
【０２１２】
表面発現ライブラリーを、修飾パニング法を用いて、リガンド結合タンパク質についてスクリーニングを行った。簡単に述べれば、１　ｍｌのライブラリーすなわち約１０１２のファージ粒子を、１〜５μｇのリガンド結合タンパク質に添加した。そのリガンド結合タンパク質は、抗体または受容体グロブリン（Ｒｇ）の分子であった（Ａｒｕｆｆｏら，　Ｃｅｌｌ，　６１巻，　１３０３−１３１３頁，　１９９０年）。この文献は本願に参考として援用するものとする。ファージは、アフィニティーリガンドとともに、室温にて、１〜３時間、振盪しながらインキュベートし、次いでヤギ−抗マウスＩｇＧでコートしたラテックスビーズ（Ｂｉｏｓｉｔｅ社，　カリフォルニア州，　サンディエゴ）の２００μｌを添加した。この混合物を、振盪しながらさらに１〜２時間、室温でインキュベートした。マイクロフュージで２分間遠心分離することによってビーズをペレット化し、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含有していてもよいＴＢＳで洗浄した。３回追加の洗浄を行ったが、最後の洗浄液はＴｗｅｅｎ　２０を含有していなかった。捕捉されたファージは、２００μｌの０．１Ｍグリセリン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２で１５分間溶離し、ビーズを遠心分離で分離させた。ファージを含有する上澄み液（溶出液）を取り出し、リガンド結合タンパク質に対して結合性を示すファージを、パニングのサイクルをさらに１〜２回行うことによって濃縮した。第１溶出液の一般的な収量は約１×１０６〜５×１０６ｐｆｕであった。第２および第３の溶出液の収量はそれぞれ一般に、約５×１０６〜２×１０７ｐｆｕおよび５×１０７〜１×１０１０ｐｆｕであった。
【０２１３】
第２もしくは第３の溶出液を、プラーク同定スクリーニングおよび正のクローンの配列決定のため適切な密度でプレートした（すなわち、希有クローンに対しては集密的にプレートし、純清のプラークが必要なときは２００〜５００プラーク／プレートでプレートする）。簡単に述べれば、プラークを３７℃で約６時間増殖させ、２ｍＭ　ＩＰＴＧに予め浸漬したニトロセルロースフィルターをかぶせて簡単に乾燥させる。このフィルターは室温で一夜プラークの上に置き、取り外し、ブロッキング溶液中に１〜２時間入れた。ブロッキングを行った後、１μｇ／ｍｌのリガンド結合タンパク質を含有するブロッキング溶液中で、室温にて１〜２時間インキュベートした。ヤギ抗マウスＩｇを結合させたアルカリホスファターゼ（Ｆｉｓｈｅｒ社）を１：１０００希釈比率で添加し、フィルターを、ガラス製減圧フィルター上で、１０ｍｌのＴＢＳもしくはブロック溶液で迅速に洗浄した。検出のためアルカリホスファターゼで展開した後、正のプラークを同定した。
【０２１４】
縮重オリゴヌクレオチドライブラリーをいくつかの異なるリガンド結合タンパク質でスクリーニングして、各リガンドに結合したペプチド配列を同定した。例えば、β−エンドルフィンに対する抗体でスクリーニングして、抗体と相互作用することが知られているコアアミノ酸配列を本来もっている約３０〜４０の異なるクローンが検出された。コア配列に隣接する配列は異なっていたが、このことは、この配列が独立して誘導され、同じクローンの複製物ではないことを示している。５７として知られている抗体によるスクリーニングは類似の結果を生じた（すなわち、コアの共通配列は同定されたが、クローン間の隣接配列は異なっていた）。
【０２１５】
実施例ＩＶ
左半分のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーの生成
この実施例は、左半分のランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーの合成と構築を示す。
【０２１６】
５’末端と３’末端に異なる配列を合成して、変異誘発法でベクターに容易に挿入できるようにしたことを除いて、実施例Ｉに記載したのと同様にして、９つのコドンの長さのランダムオリゴヌクレオチドの集団を合成した。また、反応生成物のランダム分布を起こさせる混合と分割のステップは、等容積のビーズ懸濁液を分配する他の方法で行った。ビーズを分散したままに保持するのに十分に高密度の液体として選択されたのは、１００％アセトニトリルであった。
【０２１７】
簡単に述べれば、各カラムは、４８μｍｏｌ／ｇ容量のビーズ（Ｇｅｎｔａ社，　カリフォルニア州，　サン・ディエゴ）の２２ｍｇ（１μｍｏｌｅ）を０．５ｍｌの１００％アセトニトリル中に懸濁させることによって、第１結合反応用に作製した。これらのビーズは実施例Ｉに記載したビーズより小さく、かつグアニンヌクレオチドで誘導体化されている。またこのビーズは大きさは調整されていない。次にビーズ懸濁液を空の反応カラムに移した。懸濁液は、移す間にゆっくりピペットで採取することによって、比較的分散状態が保持されるようにした。カラムに栓をして、モノマー結合反応を表ＸＩＩに示すようにした。
【０２１８】
【表１２】
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最後のモノマーを結合させた後、先に記載したようにカラムの栓を外し、その内容物を１．５ｍｌのマイクロフュージ管に注入した。カラムを１００％アセトニトリルですすぎ、残っているビーズを回収した。すすぎに使う容積は、ビーズが分配されている新しい各反応カラムについて、全ビーズ懸濁液の最終容積が約１００μｌになるように決定した。混合物をゆっくりと撹拌して均一に分散した懸濁液を生成させ、次に混合物を一定量ずつピペット採取して等容積に分割した。次にビーズの各混合物を空の反応カラムに移した。空の管を少容積の１００％アセトニトリルで洗浄してそれぞれのカラムに移した。次に実施例Ｉに記載したようにして、この場合、混合と分割のステップは１００％アセトニトリルへの懸濁液を用いて、ランダムコドン位置２〜９の合成を行った。コドン位置２〜９の結合反応を表ＸＩＩＩに示す。
【０２１９】
【表１３】
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第９のコドン位置に対して最後のモノマーを結合させた後、反応生成物を混合し、一部分を空の反応カラムに移した。カラムに栓をして次のモノマーのカップリング反応を行った。
【０２２０】
５’−ＣＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＣＣＣＸＸＡ−３’　（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：６０）
得られたランダムオリゴヌクレオチドの集団を精製して変異誘発法によって左半分のベクターＭ１３ＥＤ０４に組み込んだ。
【０２２１】
Ｍ１３ＥＤ０４は実施例ＩＩＩに記載したＭ１３ＥＤ０３ベクターを修飾したものである。従ってそのベクターの全ての特徴と有している。Ｍ１３ＥＤ０３とＭ１３ＥＤ０４との差は、Ｍ１３ＥＤ０４が、抗−β−エンドルフィン抗体が認識する５つのアミノ酸の配列（Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ）を含有していないということである。上記の配列は、オリゴヌクレオチド　５’−ＣＧＧＡＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣＡＧＧ（ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：６１）を用いて変異誘発法で欠失させた。このベクターの全ヌクレオチド配列を図１０（図１０Ａ〜Ｂ）に示す（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）。
【０２２２】
本発明は、本発明の好ましい実施態様を引用して記載したが、種々の改変は本発明の思想から逸脱することなく行うことができると解すべきである。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【０２２３】
【発明の効果】
本発明は、発現要素に作動可能に結合させた発現可能なオリゴヌクレオチドの多様な集団を含有し、かつその発現可能なオリゴヌクレオチドがランダムコドン配列の所望の偏りを有する、複数の原核細胞を提供する。
【０２２４】
【配列表】
【０２２５】
【表１４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、２０の反応容器を用いて、各位置に、ランダムチュプレット（ｔｕｐｌｅｔ）を有するヌクレオチドモノマーからオリゴヌクレオチドを合成する場合の概略説明図である。
【図２】図２は、１０の反応容器を用いて、各位置にランダムチュプレットを有するヌクレオチドモノマーからオリゴヌクレオチドを合成する場合の概略説明図である。
【図３】図３は、前駆体オリゴヌクレオチド部分からサブライブラリーおよびライブラリーを作るのに使用される２種のベクターの概略図である。Ｍ１３ＩＸ２２（図３Ａ）は、アンチセンス前駆体部分（ハッチングを施した箱枠部分）をクローン化するのに用いられるベクターである。一方向矢印はＬａｃ　ｐ／ｏ発現配列を示し、二方向矢印は、Ｍ１３ＩＸ４２と結合されるＭ１３ＩＸ２２の結合部分である。生物学的選択のためのアンバー終止コドンおよび関連制限部位もまた示してある。Ｍ１３ＩＸ４２（図３Ｂ）は、センス前駆体部分（白箱枠部分）をクローン化するのに用いられるベクターである。太線は、プソイド野生型（ΨｇＶＩＩＩ）と野生型（ｇＶＩＩＩ）の遺伝子ＶＩＩＩ配列を示す。二方向矢印は、Ｍ１３ＩＸ２２と結合されるＭ１３ＩＸ４２の部分を示す。２つのアンバー終止コドンおよび関連制限部位もまた示してある。図３Ｃは、サブライブラリー由来のベクター集団を結合して機能性表面発現ベクターＭ１３ＩＸを製造する工程を示す。図３Ｄは、非サプレッサー菌株中に表面発現ライブラリーが生成し、次いで、ファージが生成するのを示す。生成したファージを表面発現のためのサプレッサー菌株（図３Ｅ）に感染させて、ライブラリーをスクリーニングするのに用いられる。
【図４】図４は、ランダムオリゴヌクレオチド集団（Ｍ１３ＩＸ３０）から表面発現ライブラリーを生成させるのに使用されるベクターの概略図である。その記号は図３に示したのと同じである。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｍ１３ＩＸ４２のヌクレオチド配列である（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａの続きである。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｍ１３ＩＸ２２のヌクレオチド配列である（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａの続きである。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｍ１３ＩＸ３０のヌクレオチド配列である（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａの続きである。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｍ１３ＥＤ０３のヌクレオチド配列である（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａの続きである。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｍ１３ＩＸ４２１のヌクレオチド配列である（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　５）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの続きである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｍ１３ＥＤ０４のヌクレオチド配列である（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　６）。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａの続きである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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