(57)【要約】【課題】脆弱Ｘシンドロームの発症メカニズムにおけるｆｍｒ１遺伝子の機能を同定し、得られた知見を基に脆弱Ｘシンドロームの病態モデル動物を作出することを課題とする。さらに、これら病態動物を利用した脆弱Ｘシンドロームの治療薬候補のスクリーニング方法の提供も課題とする。【解決手段】本発明者らは、ショウジョウバエのｆｍｒ１遺伝子を破壊または人為的に改変すると、活動リズム（生物リズム・生物時計）が異常になることを見出した。即ち、この遺伝子は、正常な生物リズム形成に重要な役割を果たしている分子であることが明らかになった。生物リズム形成に限らず、ヒトとハエでは多くの遺伝子が共通しており、ショウジョウバエで解明された事実は、基本的にヒトにも当てはまるものと考えられる。従って、このショウジョウバエを病態モデルとして利用することにより、ヒトにおける脆弱Ｘシンドロームの治療薬候補のスクリーニングを行うことが可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脆弱Ｘ  シンドローム治療薬候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）  ｆｍｒ１遺伝子の発現または機能が人為的に改変され、恒暗条件における活動周期が正常個体と比較して改変されたショウジョウバエを提供する工程、
（ｂ）  工程（ａ）で提供されたショウジョバエに被検試料を投与する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）で被検化合物が投与されたショウジョウバエにおいて、恒暗条件における活動周期を測定する工程、
（ｄ）  工程（ｃ）で測定された活動周期を、正常個体の活動周期に近づける化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項２】
ｆｍｒ１遺伝子の発現が人為的に高められ、恒暗条件における活動周期が正常個体と比較して長期化または無周期化されたショウジョウバエを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｆｍｒ１遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列が人為的に改変され、恒暗条件における活動周期が正常個体と比較して長期化または無周期化されたショウジョウバエを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
改変されるアミノ酸配列がｆｍｒ１蛋白質のＫＨドメインのアミノ酸配列である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
改変されるアミノ酸配列が、２４４位または３０７位のイソロイシンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
改変後のアミノ酸配列がアスバラギンをコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ショウジョウバエのｆｍｒ１蛋白質のアミノ酸配列において、２４４位または３０７位のイソロイシンがアスパラギンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項９】
請求項７に記載のＤＮＡを発現する、遺伝子組み換えショウジョウバエ。
【請求項１０】
恒暗条件における活動周期が正常個体と比較して長期化または無周期化されている、請求項９に記載のショウジョウバエ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
遺伝子組換えショウジョウバエを用いた脆弱Ｘ  シンドローム治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脆弱Ｘシンドロームは、人種に関わらず２，０００〜４，０００人に１人という高い頻度で発症する遺伝病の一つで、身体的な異常のほか、精神遅滞や睡眠障害を引き起こす重大な疾病である。数年前に病原遺伝子（ｆｍｒ１遺伝子（非特許文献１））が同定されたが、どのようなメカニズムで病気を発症するのか、また、この遺伝子が本来持つ生理的機能が何なのかについてはこれまで全くわかっていない。単に形態異常や代謝異常を引き起こすような病気と違い、脆弱Ｘシンドロームは脳神経系を介して精神レベル、行動レベルで異常が発生する。したがって、病態発現にいたるまでの経路には数多くの分子が関与しており、発症過程の解明にはまだ至っていない。
【０００３】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｒａｇｉｌｅ  Ｘ  ｇｅｎｅ  ＦＭＲ１．  Ｖｅｒｋｅｒｋ，Ａ．Ｊ．，  ｄｅ  Ｇｒａａｆｆ，Ｅ．，  Ｄｅ  Ｂｏｕｌｌｅ，Ｋ．，  Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｅ．Ｅ．，Ｋｏｎｅｃｋｉ，Ｄ．Ｓ．，  Ｒｅｙｎｉｅｒｓ，Ｅ．，  Ｍａｎｃａ，Ａ．，  Ｐｏｕｓｔｋａ，Ａ．，  Ｗｉｌｌｅｍｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．  ｅｔ，ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２  （８），  １３４８  （１９９３）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、脆弱Ｘシンドロームの発症メカニズムにおけるｆｍｒ１遺伝子の機能を同定し、得られた知見を基に脆弱Ｘシンドロームの病態モデル動物を作出することを課題とする。さらに、本発明は、これら病態動物を利用した、脆弱Ｘシンドロームの治療薬候補のスクリーニング方法を提供することをも課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
地球上の生物の多くは、昼夜に同調して、約２４時間の活動リズム（生物リズム・生物時計）を持っている。本発明者は、ショウジョウバエを用いて研究を進めた結果、このｆｍｒ１遺伝子を破壊または人為的に改変すると、この活動リズムが異常になることを見出した。即ち、この遺伝子は、正常な生物リズム形成に重要な役割を果たしている分子であることが明らかになった。生物リズム形成に限らず、ヒトとハエでは多くの遺伝子が共通しており、ショウジョウバエで解明された事実は、基本的にヒトにも当てはまるものと考えられる。従って、このショウジョウバエを病態モデルとして利用することにより、ヒトにおける脆弱Ｘシンドロームの治療薬候補のスクリーニングを行うことが可能である。
【０００６】
即ち、本発明は、ｆｍｒ１遺伝子が改変されたショウジョウバエを利用した、脆弱Ｘシンドロームの治療薬候補のスクリーニングに関し、より詳しくは、
（１）  脆弱Ｘ  シンドローム治療薬候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）  ｆｍｒ１遺伝子の発現または機能が人為的に改変され、恒暗条件における活動周期が正常個体と比較して改変されたショウジョウバエを提供する工程、
（ｂ）  工程（ａ）で提供されたショウジョバエに被検試料を投与する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）で被検化合物が投与されたショウジョウバエにおいて、恒暗条件における活動周期を測定する工程、
（ｄ）  工程（ｃ）で測定された活動周期を、正常個体の活動周期に近づける化合物を選択する工程、を含む方法、
（２）    ｆｍｒ１遺伝子の発現が人為的に高められ、恒暗条件における活動周期が正常個体と比較して長期化または無周期化されたショウジョウバエを用いる、（１）に記載の方法、
（３）  ｆｍｒ１遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列が人為的に改変され、恒暗条件における活動周期が正常個体と比較して長期化または無周期化されたショウジョウバエを用いる、（１）に記載の方法、
（４）  改変されるアミノ酸配列がｆｍｒ１蛋白質のＫＨドメインのアミノ酸配列である、（３）に記載の方法、
（５）  改変されるアミノ酸配列が、２４４位または３０７位のイソロイシンである、（４）に記載の方法、
（６）  改変後のアミノ酸配列がアスバラギンをコードする、（５）に記載の方法、
（７）  ショウジョウバエのｆｍｒ１蛋白質のアミノ酸配列において、２４４位または３０７位のイソロイシンがアスパラギンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
（８）  （７）に記載のＤＮＡを含むベクター、
（９）  （７）に記載のＤＮＡを発現する、遺伝子組み換えショウジョウバエ、
（１０）  恒暗条件における活動周期が正常個体と比較して長期化または無周期化されている、（９）に記載のショウジョウバエ、を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のスクリーニングにおいては、ｆｍｒ１遺伝子の発現または機能が人為的に改変され、恒暗条件における活動周期が正常個体と比較して改変されたショウジョウバエを用いる。ここで「ｆｍｒ１遺伝子の発現または機能が人為的に改変されている」とは、生体内におけるｆｍｒ１遺伝子の発現量が野生型と比較して人為的に増加または減少させられている場合、ｆｍｒ１遺伝子の発現量自体は野生型と変わらないが、発現するｆｍｒ１蛋白質の活性が人為的に増加又減少させられている場合、およびこれら双方の場合を含む。
【０００８】
また、「恒暗条件における活動周期が正常個体と比較して改変されている」には、活動周期が正常個体と比較して長期化または無周期化されている場合および短期化されている場合の双方を含む。ｆｍｒ１遺伝子の発現や機能が高められたショウジョウバエは、その恒暗条件下における活動周期が長期化または無周期化し、一方、ｆｍｒ１遺伝子の発現や機能が低下させられたショウジョウバエは、その恒暗条件下における活動周期が短期化すると考えられる。このように昼夜に同調した２４時間の活動周期が改変されたショウジョウバエは、ｆｍｒ１遺伝子の異常に起因する疾患、例えば、脆弱Ｘ  シンドローム病態モデル（罹患モデル動物）となる。このショウジョウバエを利用すれば、ヒト脆弱Ｘ  シンドロームに対して治療・改善効果を持つ薬剤のスクリーニングを行うことが可能となる。
【０００９】
ショウジョウバエモデルの作製において、生体内におけるｆｍｒ１遺伝子の発現を増加させる場合、通常、外来性ｆｍｒ１遺伝子をショウジョウバエに導入し、ショウジョバエ体内で外来性ｆｍｒ１遺伝子を発現させれる。上記外来性ｆｍｒ１遺伝子としては、ヒトｆｍｒ１（Ｖｅｒｋｅｒｋ，Ａ．Ｊ．，  ｄｅ  Ｇｒａａｆｆ，Ｅ．，  Ｄｅ  Ｂｏｕｌｌｅ，Ｋ．，  Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｅ．Ｅ．，Ｋｏｎｅｃｋｉ，Ｄ．Ｓ．，  Ｒｅｙｎｉｅｒｓ，Ｅ．，  Ｍａｎｃａ，Ａ．，  Ｐｏｕｓｔｋａ，Ａ．，  Ｗｉｌｌｅｍｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．  ｅｔ，ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２  （８），  １３４８  （１９９３）、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号  Ｓ６５７９１）、ショウジョウバエｆｍｒ１（Ｗａｎ，Ｌ．，  Ｄｏｃｋｅｎｄｏｒｆｆ，Ｔ．Ｃ．，  Ｊｏｎｇｅｎｓ，Ｔ．Ａ．  ａｎｄ  Ｄｒｅｙｆｕｓｓ，Ｇ．Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０  （２２），  ８５３６−８５４７  （２０００）、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号  ＮＭ＿１３７８０１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
外来ｆｍｒ１遺伝子としてはショウジョウバエの活動周期を改変しうる限り、その由来に制限はないが、ショウジョウバエ由来であることが好ましい。本発明のｆｍｒ１遺伝子には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、ショウジョウバエからゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、これを展開して、ｆｍｒ１遺伝子の配列情報を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで調製できる。また、ｆｍｒ１遺伝子の配列情報を基に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行って調製することも可能である。ｃＤＮＡは、例えば、ショウジョウバエから抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰなどのベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで、またＰＣＲを行うことにより調製できる。
【００１１】
生体内におけるｆｍｒ１遺伝子の発現の減少には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上：  新生化学実験講座２  核酸ＩＶ  遺伝子の複製と発現  （日本生化学会編，  東京化学同人）  ｐｐ．３１９−３４７，  １９９３）。
【００１２】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換されるショウジョウバエが持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００１３】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１  ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子：  蛋白質核酸酵素，  ３５：  ２１９１，  １９９０）。
【００１４】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ：  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ２２８：  ２２８，  １９８８）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（ＫｏｉｚｕｍｉＭ，  ｅｔ  ａｌ：  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２３９：  ２８５，  １９８８、小泉誠および大塚栄子：  蛋白質核酸酵素  ３５：  ２１９１，  １９９０、  Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：  ７０５９，  １９８９）。例えば、ｆｍｒ１タンパク質をコードするＤＮＡ中には、標的となり得る部位が複数存在する。
【００１５】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ  ＪＭ：  Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：  ３４９，  １９８６）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｙ  ＆Ｓａｓａｋｉ  Ｎ：  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：  ６７５１，  １９９１、菊池洋：  化学と生物  ３０：  １１２，  １９９２）。
【００１６】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ３：７３３，  １９９０、Ｄｚｉａｎｏｔｔ  ＡＭ  ＆  Ｂｕｊａｒｓｋｉ  ＪＪ：  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：  ４８２３，  １９８９、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ  ＣＡ  ＆  Ｃｅｃｈ  ＴＲ：  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：３８７５，  １９９１、Ｔａｉｒａ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：  ５１２５，  １９９１）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １８６：  １２７１，  １９９２）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００１７】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ（ＲＮＡｉ）によっても行うことができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ＲＮＡｉの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖ＲＮＡが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。ショウジョウバエにおけるｆｍｒ１遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制するためには、ｆｍｒ１タンパク質をコードするＤＮＡまたはこれと類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを目的のショウジョウバエへ導入し、得られたショウジョウバエから野生型と比較して活動リズムが短期化下ショウジョウバエを選択すればよい。ＲＮＡｉに用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８７：２２６４−２２６８，  １９９０、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３，  １９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：  ４０３，  １９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００１８】
ｆｍｒ１遺伝子の機能の改変は、ｆｍｒ１遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列の改変により行うことができる。アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ  ＆  Ｆｒｉｔｚ  Ｈ−Ｊ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：  ３５０，  １９８７）が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得る。このように、野生型ｆｍｒ１タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されることにより、野生型ｆｍｒ１蛋白質と比較して活性が改変された蛋白質を調製することができる。脆弱Ｘシンドロームのショウジョウバエモデルの作製においては、改変されるアミノ酸配列がｆｍｒ１蛋白質のＫＨドメインのアミノ酸配列であることが好ましい。より好ましくは、改変されるアミノ酸配列が、２４４位または３０７位のイソロイシンである。また、改変後のアミノ酸配列はアスバラギンであることが好ましい。ＫＨドメインとはＲＮＡとの結合活性をもつ領域で、ｆｍｒ１タンパク質ではリボソーム相互作用ドメインの上流に２個並列して存在している（Ｓｉｏｍｉ  Ｈ，  Ｃｈｏｉ  Ｍ，  Ｓｉｏｍｉ  ＭＣ，  Ｎｕｓｓｂａｕｍ  ＲＬ，  Ｄｒｅｙｆｕｓｓ  Ｇ．Ｃｅｌｌ  １９９４  Ａｐｒ  ８；７７（１）：３３−９）。このようなＫＨドメインの改変が、ｆｍｒ１蛋白質の活性に与える影響は、改変後の蛋白質のＲＮＡ結合活性を測定することにより評価することができる。ＲＮＡ結合活性の測定は、ｐｏｌｙ  Ｇ  またはｐｏｌｙ  Ｕに対する結合能を測定することにより行うことができる（Ｓｉｏｍｉ，  Ｈ．，  Ｓｉｏｍｉ，  ＭＣ．，  Ｎｕｓｓｂａｕｍ，  ＲＬ．  ａｎｄＤｒｅｙｆｕｓｓ，  Ｇ．  １９９３．  Ｃｅｌｌ  ７４：２９１−２９８）。ｆｍｒ１蛋白質のＫＨドメインが改変された蛋白質の発現により、恒暗条件下における活動周期が長期化または無周期化された個体は、脆弱Ｘ  シンドロームの好適なモデルである。
【００１９】
このようにして調製された遺伝子をショウジョウバエにおいて発現させる場合、通常、ショウジョウバエにおいて遺伝子発現を保証するベクターに該遺伝子を挿入し、該ベクターをショウジョウバエに導入する。このようなベクターとしては、例えば、ｐＵＡＳＴベクター（Ｂｒａｎｄ，  Ａ．Ｈ．，  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，  Ｎ．  （１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：  ４０１−４１５．）、ＣａＳｐｅＲベクター（Ｋｌｅｍｅｎｚ  Ｒ，  Ｗｅｂｅｒ  Ｕ，  Ｇｅｈｒｉｎｇ  ＷＪ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９８７  Ｍａｙ  ２６；１５（１０）：３９４７−５９）を例示することができる。ショウジョウバエへのベクターの導入は、初期発生卵への注入の方法を利用することができる。これにより得られる恒暗条件における活動周期が正常個体と比較して改変されたショウジョウバエは、本発明のスクリーニングに好適に利用することができる。
【００２０】
スクリーニングにおける「被検試料」としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製ポリペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。ショウジョウバエへの被検試料の投与は、餌に添加して食べさせる、脱脂綿などにしみ込ませて吸わせる、腹部に注射するなどの方法で行うことができる。
【００２１】
被検化合物が投与されたショウジョウバエにおいて、恒暗条件における活動周期を測定する場合、あらかじめこのショウジョウバエを光周条件（例えば、１２時間明と１２時間暗の条件）に数日間置いておき、その後、恒暗条件に移し、活動リズムを好ましくは７〜１４日間測定する（Ｐｒｉｃｅ，  Ｊ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｃｅｌｌ  ９４：  ８３−９５．）。活動リズムの測定には、例えば、赤外線感知器を使った活動モニター（米国・Ｔｒｉｋｉｎｅｔｉｃｓ社製）を使用することができる（Ｈａｍｂｌｅｍ−Ｃｏｙｌｅ，  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）    Ｊ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｅｈａｖ．  ５：  ４１７−４４６．）。活動リズムの測定データは、ＣＬＯＣＫＬＡＢ（米国・Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ社製）などのソフトウエアを用いて周期性の統計学的な検定を行うことができる。
【００２２】
本実施例において正常なハエ（野生型）を恒暗条件におくと平均２３．５時間の活動周期を示したが、ｆｍｒ１遺伝子の発現や機能の変化は、この活動周期を変化させる。被検試料投与後のショウジョバエモデルにおける活動周期が、野生型（約２３．５時間）に近づけば、当該被検試料は、一定の治療効果を示したと判定され、脆弱Ｘ  シンドロームなどｆｍｒ１遺伝子の異常に起因する疾患の治療薬候補となる。
【００２３】
【実施例】
遺伝子やタンパク質の機能を調べる方法の一つに、遺伝子を過剰に発現させて作用を調べる方法がある。そこで本発明者らは、ショウジョウバエの正常型ｆｍｒ１遺伝子を脳内に過剰に発現させて、活動リズムに与える影響を調べた。
［実施例１］  ＵＡＳ−ｄｆｍｒ１を組み込んだトランスジェニックハエの作製方法
ｄｆｍｒ１遺伝子のｃＤＮＡをｐＵＡＳＴベクター（Ｂｒａｎｄ，  Ａ．Ｈ．，  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，  Ｎ．  （１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：  ４０１−４１５．）のマルチクローニングサイトに組み込んだプラスミドを、トランスポゾン遺伝子をコードするヘルパープラスミドｐπ２５．１ｗｃ（Ｋａｒｅｓｓ，Ｒ．Ｅ．，  Ｒｕｂｉｎ，  Ｇ．Ｍ．  （１９８４）  Ｃｅｌｌ  ３８：  １３５−１４６．）とともにショウジョウバエの初期発生卵に導入した。リン酸緩衝液に、ｄｆｍｒ１／ｐＵＡＳＴ、ｐπ２５．７ｗｃの各プラスミドをそれぞれ５００μｇ／μｌ、１００μｇ／μｌ濃度に溶解し、ＲｕｂｉｎとＳｐｒａｄｌｉｎｇの方法（Ｒｕｂｉｎ，  Ｇ．Ｍ．，  Ｓｐｒａｄｌｉｎｇ，  Ａ．Ｃ．  （１９８２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１８：  ３４８−３５３．）に従って初期発生卵に注射した。羽化した成虫を白眼ハエ（ｙｗ）と交雑し、次世代で遺伝子の導入されたハエ（目がオレンジ又は赤色）を選抜し、系統化した。３０７番目のアミノ酸のイソロイシン（Ｉ）をアスバラギン（Ｎ）に置換したタンパク質（Ｉ３０７Ｎ）および２４４番目を置換したタンパク質（Ｉ２４４Ｎ）についても、各ｃＤＮＡをｐＵＡＳＴベクターに組み込み、同様の方法でトランスジェニックハエを作製した。
【００２４】
［実施例２］  ｄｆｍｒ１遺伝子過剰発現系統の作製方法
タイムレス遺伝子の上流領域をｐＧａＴＢベクター（Ｂｒａｎｄ，  Ａ．Ｈ．，  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，  Ｎ．  （１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：  ４０１−４１５．）にサブクローニングし、ヘルパープラスミドｐπ２５．１ｗｃとともにショウジョウバエの初期発生卵に注射してトランスジェニック個体（ｔｉｍ−ｇａｌ４系統）を作製した。同様の方法で、アルマジロ遺伝子の上流領域を導入したａｒｍ−ｇａｌ４系統を作製した。これらのｇａｌ４系統とＵＡＳ−ｄｆｍｒ１を組み込んだトランスジェニックハエを交雑し、次世代において過剰発現系統ｔｉｍ−ｇａｌ４：  ＵＡＳ−ｄｆｍｒ１またはａｒｍ−ｇａｌ４：  ＵＡＳ−ｄｆｍｒ１を得た。アミノ酸を置換したＵＡＳ−Ｉ３０７Ｎ，ＵＡＳ−Ｉ２４４Ｎについてもｇａｌ４系統と交雑し、同様の方法で過剰発現系統を得た。
【００２５】
［実施例３］  ショウジョウバエの活動リズムの測定方法：
活動リズムの測定に使う細いガラス管にハエの人工飼料を詰め、低融点パラフィンで塞いだ。ガラス管の別の側から測定するハエを一頭入れ、逃げないように脱脂綿で口を塞いた。これらのハエはあらかじめ１２時間明：１２時間暗の光周条件に数日間置いておき、ガラス管に詰めた後、恒暗条件に移して活動リズムを７〜１４日間測定した（Ｐｒｉｃｅ，  Ｊ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｃｅｌｌ  ９４：  ８３−９５．）。活動リズムの測定には赤外線感知器を使った活動モニター（米国・Ｔｒｉｋｉｎｅｔｉｃｓ社製）を使用した（Ｈａｍｂｌｅｍ−Ｃｏｙｌｅ，  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）    Ｊ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｅｈａｖ．  ５：  ４１７−４４６．）。活動リズムの測定データは、ＣＬＯＣＫＬＡＢ（米国・Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ社製）などのソフトウエアを用いて周期性の統計学的な検定を行った。
【００２６】
［実施例４］  ｄｆｍｒ１遺伝子過剰発現系統の活動リズム（実験結果）
実験の結果を表１にまとめた。
【００２７】
【表１】
2004154025.tif 000002
なお、表中の記号とその意味は次の通りである。
ａｒｍ−ＧＡＬ４：  アルマジロ遺伝子プロモーターを連結したｇａｌ４遺伝子
ｔｉｍ−（ＵＡＳ）−ＧＡＬ４  ：  タイムレス遺伝子プロモーターを連結したＵＡＳ−ｇａｌ４遺伝子
ＵＡＳ−ｄｆｍｒ１  ：  ＵＡＳを連結したｄｆｍｒ１遺伝子
ＵＡＳ−Ｉ３０７Ｎ  ：  ＵＡＳを連結したｄｆｍｒ１遺伝子（３０７番アミノ酸を置換）
ＵＡＳ−Ｉ２４４Ｎ  ：  ＵＡＳを連結したｄｆｍｒ１遺伝子（２４４番アミノ酸を置換）
τ  ±  ＳＤ  ：  活動周期の長さ（ｈｒ）
％  ＡＲ    ：  無周期の個体（％）
Ｎ  ：  測定個体数
【００２８】
正常なハエ（野生型）を恒暗条件におくと平均２３．５時間の活動周期を示したのに対して、アルマジロ遺伝子プロモーターを用いて脳全体に遺伝子の過剰発現を誘導したハエでは、それより１時間長い２４．５時間の活動周期を示した。さらに時計遺伝子であるタイムレス遺伝子のプロモーターを用いて、脳内の時計細胞等に限定して過剰発現を誘導したハエでは、活動周期が２５．７時間とより長くなった。同時に、統計学的に有意な周期性を示さず、活動リズムを失ったと考えられる個体の割合がそれぞれ３８％、６４％と増加した。これらの結果からｄｆｍｒ１遺伝子は生物時計と関与することが示された。
【００２９】
また、ヒトの脆弱Ｘ患者に認められる２番目のＫＨドメイン内のアミノ酸置換（Ｉ３０７Ｎ）をハエのｄｆｍｒ１遺伝子に施し、アルマジロ遺伝子プロモーターおよびタイムレス遺伝子プロモーターをもちいて過剰発現を誘導したところ、２４．４時間、２５．５時間の長周期を示した。また、１番目のＫＨドメインに同様の置換（Ｉ２４４Ｎ）を施し、時計細胞特異的に過剰発現させたところ、やはり２４．１時間の長周期を示した。これらのアミノ酸置換実験では、正常型ｆｍｒ１遺伝子を過剰発現させた場合と比較して周期がより正常に近かった。また、正常型ｆｍｒ１遺伝子を過剰発現させた場合には６４％の個体の活動リズムが消失したのに対し、アミノ酸置換を施すと、その割合は１３％、２７％と大幅に減少した。このように過剰発現による障害（周期を長くする作用）がアミノ酸置換により減衰したことから、ＫＨドメインのＲＮＡ結合活性がｆｍｒ１の機能発現に重要であることが明らかになった。
【００３０】
【発明の効果】
従来、病態モデルとしてマウスを薬剤スクリーニングに用いられることが多いが、この方法では膨大な設備、コスト、時間を要する。また、マウスでは脆弱Ｘシンドロームの疾患モデルとして、１９９４年にｆｍｒ１遺伝子を破壊したノックアウトマウスが作製されたものの、脆弱Ｘシンドローム患者に観察される睡眠異常や活動リズム障害はノックアウトマウスでは発症しなかった（Ｔｈｅ  Ｄｕｔｃｈ−Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｆｒａｇｉｌｅ  Ｘ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．  Ｃｅｌｌ  １９９４  Ｊｕｌ  １５；７８（１）：２３−３３）。これに対してショウジョウバエを用いる方法では、数千〜数万規模の薬剤スクリーニングを容易に達成することができ、コスト、時間ともにはるかに効率的である。本発明のｆｍｒ１遺伝子が改変されたショウジョウバエモデルは、脆弱Ｘ  シンドロームの病態モデルとなり、大量飼育や活動リズムの測定が容易であることから治療薬のスクリーニング系として好適である。このモデルに、種々の化学物質（薬剤）を与え、成虫の活動リズムを測定し、その活動リズムの周期性が正常に回復又は改善するか否かを判定基準に、脆弱Ｘ  シンドロームの治療薬の候補物質の選抜を効率的に行うことができる。また、この病態モデルを利用すれば、高度な遺伝学的・分子生物学的アプローチが可能になり、脆弱Ｘシンドローム研究が急速に進むものと期待される。病態発現にいたるメカニズムの解明が進むことで、この遺伝病に対する理解が深まり、有効な治療法の開発につながると考えられる。