(57)【要約】【課題】従来の宿主生物系又は無細胞翻訳系での組み換えタンパク質発現方法では活性型タンパク質の発現が困難であったタンパク質について、効率的にタンパク質を発現させることができ、精製も容易なタンパク質の生産方法、この方法により生産された融合タンパク質及びタンパク質を提供する。【解決手段】シャペロニン遺伝子と目的タンパク質遺伝子とを含む遺伝子を転写・翻訳することによって、目的タンパク質をシャペロニンとペプチド結合を介して連結させた融合タンパク質として発現させる目的タンパク質の生産方法であって、前記融合タンパク質において、前記シャペロニンはＮ回連結体（Ｎは１〜２０）であり、前記シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に同種又は異種の目的タンパク質が連結されているタンパク質の生産方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シャペロニン遺伝子と目的タンパク質遺伝子とを含む遺伝子を転写・翻訳することによって、目的タンパク質をシャペロニンとペプチド結合を介して連結させた融合タンパク質として発現させる目的タンパク質の生産方法であって、
前記融合タンパク質において、前記シャペロニンはＮ回連結体（Ｎは１〜２０）であり、前記シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に同種又は異種の目的タンパク質が連結されていることを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項２】
融合タンパク質において、シャペロニンはシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成していることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の生産方法。
【請求項３】
シャペロニンリングは、リング面又は側面を介して非共有結合的に会合し，繊維状構造を形成していることを特徴とする請求項２記載のタンパク質の生産方法。
【請求項４】
融合タンパク質は、目的タンパク質がシャペロニンリングの内部にシャペロニンとペプチド結合を介して結合されて封入されている構造であることを特徴とする請求項２又は３記載のタンパク質の生産方法。
【請求項５】
シャペロニンは、バクテリア、古細菌又は真核生物に由来することを特徴とする請求項１、２、３又は４記載のタンパク質の生産方法。
【請求項６】
目的タンパク質遺伝子は、ｃＤＮＡ又は６残基以上のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの部分遺伝子であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載のタンパク質の生産方法。
【請求項７】
シャペロニンと目的タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、シャペロニン又はシャペロニン連結体のみをコードする遺伝子とをポリシストロニックに連結したプラスミドを宿主内で共発現させることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載のタンパク質の生産方法。
【請求項８】
シャペロニンと目的タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、シャペロニン又はシャペロニン連結体のみをコードする遺伝子とを同一の宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドにそれぞれ導入し、同一の宿主内で共発現させることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載のタンパク質の生産方法。
【請求項９】
宿主は、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする請求項７又は８記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１０】
無細胞翻訳系で行うことを特徴とする請求項７又は８記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１１】
融合タンパク質は、シャペロニンと目的タンパク質の連結部に限定分解型プロテアーゼの切断配列を有するものであって、
前記目的タンパク質を前記限定分解型プロテアーゼにより融合タンパク質から切り出す工程を有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１２】
融合タンパク質は、シャペロニンと目的タンパク質の連結部にメチオニン残基を有するものであって、
前記目的タンパク質をＣＮＢｒにより融合タンパク質から切り出す工程を有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１３】
融合タンパク質は、シャペロニンサブユニット同士の連結部に限定分解型プロテアーゼの切断配列を有するものであって、
前記限定分解型プロテアーゼにより融合タンパク質のシャペロニンリング構造を分解する工程を有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１４】
目的タンパク質は、ホモ又はヘテロの形態で２量体又はそれ以上の四次構造を形成するものであることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１５】
目的タンパク質は、哺乳動物由来抗体の重鎖、軽鎖、及びＦｖ領域単鎖抗体（ｓｃＦｖ抗体）の全長又は６残基以上のペプチドであることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１６】
目的タンパク質は、ウィルス抗原、７回膜貫通型受容体タンパク質（Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質）又はサイトカイン類であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１７】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６記載のタンパク質の生産方法により生産された融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６記載のタンパク質の生産方法により生産されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、従来の宿主生物系又は無細胞翻訳系での組み換えタンパク質発現方法では活性型タンパク質の発現が困難であったタンパク質について、効率的にタンパク質を発現させることができ、精製も容易なタンパク質の生産方法、この方法により生産された融合タンパク質及びタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでにバクテリア、酵母、昆虫、動植物細胞、トランスジェニック動・植物等多くの宿主生物での組み換えタンパク質発現系及び無細胞翻訳系が確立されてきた。なかでも、哺乳類動物の培養細胞による組み換えタンパク質の生産方法は、適当な翻訳後修飾が施されることから治療薬製造の標準システムとなりつつある。
【０００３】
しかし、哺乳類動物の培養細胞による組み換えタンパク質の生産方法は、微生物を用いる系に比べてタンパク質の発現レベルが低く、より大きな培養槽を必要とすることから、新薬を手がけるバイオテクノロジー産業では今後、製造設備が不足すると考えられている（Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，１８４−１８５）。近年、生産効率の向上が図られているトランスジェニック動・植物を用いるタンパク質生産技術も、全幅の信頼を得られるには至っていない（Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，１８４−１８５）。
【０００４】
一方、これまでに開発された組み換えタンパク質発現系では、活性型タンパク質を大量に得ることが困難な場合が多々ある。
例えば、目的タンパク質が宿主生物に対するなんらかの毒性を有する場合には発現が抑制され発現量が低下する。
また、目的タンパク質が可溶性タンパク質として発現しても宿主プロテアーゼによって分解されてしまい生産量が極めて少なくなる場合もある。
更に、目的タンパク質が発現しても折り畳みがうまくいかず、可溶化が困難な封入体を形成してしまう場合もある。この場合、可溶化して再折り畳みを行っても最終的に得られる活性型タンパク質の量は極めて少なくなってしまう。特に無細胞翻訳系の場合には、生成したポリペプチドは互いに凝集してしまい、不溶化しやすくなる。このような封入体の生成に対しては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ　ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ６７，３１−４０）やチオレドキシン　（ＬａＶａｌｌｉｅ，Ｅ．Ｒ．ｅｔａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１，１８７−１９３）、マルトース結合タンパク質（Ｇｕａｎ，Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ６７，２１−３０）等との融合タンパク質として発現させる方法等が提案されているが、封入体の形成を高効率で解消することは困難であった。
【０００５】
このような従来の組み換えタンパク質発現系では活性型タンパク質が得にくいタンパク質としては、例えば、抗体等が挙げられる。
抗体は、医療・診断分野等での利用が近年非常に期待されているが、その組み換え体を得るために大腸菌等を宿主としてその細胞質内に発現しようとすると、ほとんどが不溶性の封入体として発現されることが知られている。抗体は４本のポリペプチド鎖からなる基本構造を持ち、これらがジスルフィド結合等を介して高次構造を形成している。抗体分子が大腸菌等の宿主細胞内で機能を持った形態で発現しにくい原因は、このポリペプチド鎖の折り畳み反応だけでなく、ポリペプチド鎖同士のアセンブリーが起こりにくいことに起因している（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９，５４５−，１９９１年）。また、近年の研究によると、抗体重鎖部分の宿主菌への毒性も指摘されている。
【０００６】
このように、従来のタンパク質発現系には宿主に対する毒性、宿主プロテアーゼによる分解及び封入体形成等の大きな問題点を回避するとともに、抗体や酵素等のように高次構造が重要となる場合には、そのアセンブリーをうまく制御する必要があった。そのため、従来はタンパク質ごとに発現条件を試行錯誤で検討する必要があり、上記問題点を根本的に解決する技術の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、従来の宿主生物系又は無細胞翻訳系での組み換えタンパク質発現方法では活性型タンパク質の発現が困難であったタンパク質について、効率的にタンパク質を発現させることができ、精製も容易なタンパク質の生産方法、この方法により生産された融合タンパク質及びタンパク質を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、シャペロニン遺伝子と目的タンパク質遺伝子とを含む遺伝子を転写・翻訳することによって、目的タンパク質をシャペロニンとペプチド結合を介して連結させた融合タンパク質として発現させる目的タンパク質の生産方法であって、前記融合タンパク質において、前記シャペロニンはＮ回連結体（Ｎは１〜２０）であり、前記シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に同種又は異種の目的タンパク質が連結されているタンパク質の生産方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明のタンパク質の生産方法は、目的タンパク質をシャペロニンとの融合タンパク質として発現させる方法である。
細胞に熱ショック等のストレスを与えると、分子シャペロンと呼ばれるタンパク質群の発現が誘導される。これらはエネルギー物質であるＡＴＰの存在下又は非存在下でタンパク質の折り畳みを支援したり、構造安定化に貢献したりする。
分子シャペロンの中でも、分子量が約６０ｋＤａのものはシャペロニンといわれ、バクテリア、古細菌及び真核生物の全ての生物に存在し、タンパク質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。
【００１０】
シャペロニンは、図１に示したように、１４〜１８個のシャペロニンサブユニットからなる２層のリング構造（以下、構造体をシャペロニン複合体、リングをシャペロニンリングという）を形成する。大腸菌シャペロニンの場合、シャペロニン複合体は内径４．５ｎｍ、高さ１４．５ｎｍの空洞（キャビティ）を有する。１層シャペロニンリングのキャビティは６０ｋＤａの球状タンパク質１つが充分に納まる空間を有する。シャペロニン複合体は、このキャビティに様々なタンパク質の折り畳み中間体や変性タンパク質を一時的に納める機能を有し、タンパク質の折り畳み構造が形成されるとＡＴＰの分解と共役して納めていたタンパク質をキャビティから放出させる。バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、遺伝子工学的に大腸菌細胞質可溶性画分にシャペロニン複合体として容易に大量生産させることが可能である。このことは、様々のシャペロニンが大腸菌でも自己集合し、１４〜１８量体からなる２層リング構造のシャペロニン複合体を形成できることを示している。
【００１１】
上記シャペロニン複合体のＸ線結晶構造解析によって明らかにされた立体構造は、シャペロニンのＮ末端及びＣ末端はともにキャビティ側に位置し、フレキシビリティの高い構造となっている。特にＣ末端の少なくとも２０アミノ酸はフレキシビリティの高い構造を示す（Ｇｅｏｒｇｅら、２０００、Ｃｅｌｌ、１００、Ｐ．５６１−５７３）。
【００１２】
上記シャペロニンとしては特に限定されないが、バクテリア、古細菌又は真核生物に由来することが好ましい。上記シャペロニン複合体の構造は由来生物によって異なった構造のものが形成される。例えば、バクテリア由来シャペロニンリングのシャペロニンサブユニットの構成数は７個であり、古細菌由来のそれは８〜９個、真核生物由来のものは８個である。本発明では、使用するシャペロニンの由来により、融合タンパク質におけるシャペロニンと目的タンパク質の数の比を選択することが好ましい。
【００１３】
本発明のタンパク質の生産方法では、目的とするタンパク質をシャペロニンとペプチド結合を介して連結させた融合タンパク質として発現させ、目的タンパク質を確実にシャペロニンリングのキャビティ内部に納めることにより、目的タンパク質の宿主への毒性、プロテアーゼによる分解及び封入体の形成を解消し、可溶性タンパク質として大量発現させることができる。
また、強力なプロモーターによって発現が誘導されたときに見られるようにタンパク質の折り畳み中間体同士が多数会合することなく、個々にシャペロニンリングのキャビティ内に固定されるため、宿主生物を用いた発現及び無細胞翻訳系に見られる封入体形成も抑えられる。シャペロニンは宿主生物の細胞質あるいは体液等の可溶性画分へ発現するため、シャペロニンリングに格納されたタンパク質が膜結合性又は膜貫通性のタンパク質であっても膜へ移行し宿主生物の膜構造を破壊することもなく、宿主生物に対する毒性は発現しない。また、いかなるタンパク質も同一のシャペロニンリングに格納されているため、同一の精製条件で融合タンパク質として精製可能である。
【００１４】
上記融合タンパク質においては、シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に同種又は異種の目的タンパク質が連結されている。
タンパク質の多くは２量体又はそれ以上の四次構造を形成することにより初めて機能を発現するものであるが、従来の組み換えタンパク質発現系ではこのようなタンパク質の高次構造を制御することは困難であった。本発明のタンパク質の生産方法においては、シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に同種又は異種の目的タンパク質を連結することにより、目的タンパク質の各々のサブユニットはシャペロニンとの融合タンパク質として確実にシャペロニンリングのキャビティ内部に納められると同時に、個々のサブユニット同士が、キャビティ内部でアセンブリーされることにより、宿主生体内環境から保護され、プロテアーゼによる消化を受けにくくなり、可溶体として発現される。
なお、目的タンパク質が宿主に対する毒性が極めて高い、又は、宿主プロテアーゼによる消化を極めて受けやすい場合には、複数のシャペロニン連結間に配置されてもよい。
【００１５】
上記融合タンパク質は、例えば、シャペロニンサブユニットが１〜２０個、好ましくは１〜９個連結された複合体のＮ末端及びＣ末端の両末端に、目的タンパク質がシャペロニン複合体のキャビティ内に収められ封入された構造をとる。シャペロニン同士の連結間に目的タンパク質を配置することも可能である。
バクテリア由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：目的タンパク質の数比が７：２である融合タンパク質が好ましく、サブユニット構成数８個の古細菌由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：目的タンパク質の数比が２：１、２：２、４：２又は８：２のものが好ましい。
【００１６】
例えば、古細菌のシャペロニンを用い、そのサブユニットが８つ連結した複合体との融合体として目的タンパク質を発現させた場合、図２に示したように、８連複合体１分子でリング構造を形成し、そのキャビティ内部に目的タンパク質が格納される。シャペロニンのＮ末端及びＣ末端に結合した目的タンパク質同士がダイマーを形成する場合には、シャペロニンのキャビティ内でアセンブリーすることとなる。発現したシャペロニンリングは、更にリング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成し、安定化する。古細菌のシャペロニンサブユニット４つが連結した複合体との融合体として目的タンパク質を発現させた場合、図２に示したように４連複合体２分子でリング構造を形成し、そのキャビティ内部に目的タンパク質が格納される。但し、目的タンパク質の形状や分子量によっては上記以外の数比も適する可能性はある。例えば、大腸菌由来シャペロニンと目的タンパク質の比率が３：１である融合タンパク質であってもこれらが２又は３分子会合してリング構造を形成する可能性もある。
【００１７】
シャペロニン：目的タンパク質の比は１：２〜２０：１まで可能であるが、このましくは１：２〜１２：２である。この範囲を越える発現した融合タンパク質中の目的タンパク質の実質的な生産量が少なくなるとともに、リング構造の形成も困難となる可能性がある。本発明では、シャペロニンがそのリング構造への自己集合能が維持されていれば、野生型のみならずアミノ酸変異体も使用可能である。例えば、シャペロニンの各サブユニットの会合力が弱められた変異体である場合、格納された目的蛋白の回収はより容易となる。
【００１８】
シャペロニン複合体は単に、外部環境から仕切られたスペースを提供するだけでなく、タンパク質折り畳み機能を有するため、目的タンパク質の折り畳みも正常に行われ、かつ構造が安定することも期待できる。通常シャペロニン複合体のタンパク質折り畳み反応は基質タンパク質（シングルポリペプチドとして）と１：１で起こるため、本発明においてシャペロニンによる折り畳み機能を発現させるには、シャペロニンリング又はシャペロニン複合体に１個の目的タンパク質が格納されるよう融合タンパク質を設計することが好ましいが、目的タンパク質の分子量によっては２分子以上格納させても正常に折り畳まれる可能性はある。
【００１９】
Ｍｇ−ＡＴＰの存在化では、シャペロニンは高濃度（１ｍｇ／ｍＬ以上）の濃度でリング面又は側面を介して非共有結合的に会合し，繊維状構造を形成する場合がある（Ｔｒｅｎｔ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，５３８３−５３８８：Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２８３９９−２８４０７）。本発明では、上記融合タンパク質が生体内において高濃度で発現するため、繊維状構造が形成される可能性が有り、このことにより、目的タンパク質が宿主生物に毒性があってもシャペロニンリング内への格納が促進され、目的タンパク質の高度発現が達成される可能性がある。繊維状構造が形成されても希釈することによってシャペロニン二層リング構造に解離するので、目的タンパク質は回収可能である。
【００２０】
本発明のタンパク質の生産方法としては特に限定されないが、例えば、目的タンパク質遺伝子を制限酵素を用いる方法又はＰＣＲ法等の通常の遺伝子工学的方法により作製し、これとシャペロニン遺伝子とを組み合わせて設計した発現ベクターを宿主内で発現させる方法が好ましい。即ち、遺伝子工学的に調製した目的タンパク質に対応するｃＤＮＡ又は６残基以上のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの部分遺伝子を目的タンパク質をコードする遺伝子とし、これを別に調製したシャペロニン遺伝子と組み合わせて融合タンパク質をコードする遺伝子を調製する。そして、シャペロニンと目的タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、シャペロニン又はシャペロニン連結体のみをコードする遺伝子とをポリシストロニックに連結したプラスミドを作製し、これを宿主に導入して、宿主内で共発現させる。
【００２１】
ただし、一般的に大腸菌等では発現プラスミドは１０ｋｂ以上になるとコピー数が減少し、結果的に目的タンパク質の発現量が低下することがある。例えば、シャペロニンが８つ連結した融合タンパク質を生産する場合、発現プラスミドは１５ｋｂｐ以上になる。
これに対しては、シャペロニンと目的タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、シャペロニン又はシャペロニン連結体のみをコードする遺伝子とを同一の宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドにそれぞれ導入し、同一の宿主内で共発現させる方法が好ましい。この方法により、高発現をもたらすことが可能である。
例えばシャペロニンと目的タンパク質の数比が４：２である融合タンパク質を生産する場合において、１個又は２〜４個連結したシャペロニンのみを含むベクターを組み込んで共発現させることにより、シャペロニンと目的タンパク質の数比が８：２のシャペロニンリングを形成することが可能である。
【００２２】
上記宿主としては特に限定されず、例えば大腸菌等のバクテリア、その他の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物培養細胞、植物培養細胞及びトランスジェニック動・植物等が挙げられる。なかでも、培養コストが安価である点、培養日数が短い点、培養操作が簡便な点から、大腸菌等のバクテリア又は酵母が好ましい。またバクテリア、真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ１１，２６５６−２６６４：Ｆａｌｃｏｎｅ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，２６５６−２６６４）にて、上記融合タンパク質を可溶性タンパク質として発現させることも可能である。
【００２３】
本発明のタンパク質の生産方法により生産される上記融合タンパク質は、分子量が約６５〜６００ｋＤａと巨大分子であるため、転写されたｍＲＮＡの特定のリボヌクレアーゼによる分解、翻訳された融合タンパク質のプロテアーゼによる２段階の切断を受ける可能性がある。これに対しては、例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｍＲＮＡの分解に関与するリボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＥ遺伝子を欠損させた宿主を用いることでｍＲＮＡの分解は抑制可能である（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ，Ｍ．，１９９９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．，３３，１９３−２２７）。また、翻訳後にプロテーゼによる分解を抑制するためには、１５〜２５℃の低温で発現させたり、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ　（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ　ｅｔ　ａｌ．１９８４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９，２８３−２８７）、Ｃｌｐ、ＨｓｌＶＵ（Ｋａｎｅｍｏｒｉ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，７２１９）のようなプロテアーゼの構造遺伝子を欠損させた大腸菌を宿主として用いることが好ましい。
【００２４】
本発明のタンパク質の生産方法では、例えば、上述の方法により宿主内で融合タンパク質を発現させた後、細胞を回収し破砕し、上清を回収する。シャペロニン複合体は分子量が約８４０〜９６０ＫＤａの巨大タンパク質であるため、４０％飽和程度の硫酸アンモニウムを用いた塩析によって沈殿させることができる。沈殿タンパク質を回収した後、適当な緩衝液に溶解し、疎水クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーによって融合タンパク質の存在するフラクションを回収する。これらを限外ろ過によって濃縮した後、濃縮液を５〜５０ｍＭ程度の塩化マグネシウム及び５０〜３００ｍＭ程度の塩化ナトリウム又は塩化カリウムが含有された緩衝液を展開液としてゲルろ過を行い、排除限界直後のピークを回収することによって融合タンパク質の発現を確認し、精製することができる。
【００２５】
あらかじめ、融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に６〜１０個のヒスチジンが並んだタッグを連結させた場合には、ニッケル等の金属キレートカラムを用いれば、融合タンパク質の回収はより簡便で効率的である。また、用いるシャペロニンに対する抗体を用いて、免疫沈降又はアフィニティクロマトグラフィーによっても迅速・簡便に精製することも可能である。しかしながら、リング構造を形成した融合タンパク質のみを回収するためには、これらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過を組み合わせることが好ましい。シャペロニンが耐熱性のものである場合、大腸菌の抽出液を６０〜８０℃で熱処理することによって大部分の大腸菌由来タンパク質は沈殿してしまい、融合タンパク質の精製をより簡略化させることができる。目的タンパク質自身が耐熱性のものでなくとも、シャペロニンの空洞内部に保持されているので、変性することはない。
上記いずれの方法によっても融合タンパク質の形態は透過型電子顕微鏡によって観察可能である。目的タンパク質がシャペロニンリングに格納されている場合、外径１４〜１６ｎｍ程度のシャペロニン特有のリング構造が観察される。融合タンパク質のリング構造が不安定な場合は、精製の過程でマグネシウム及びＡＴＰを存在させておくことで、リング構造である融合タンパク質を効率的に回収することが可能である。
なお、目的タンパク質の回収のみが目的である場合は、融合タンパク質は必ずしも均一に精製する必要はなく、粗精製サンプルにＥＤＴＡ処理を施した後、プロテアーゼを作用させ、目的タンパク質に応じた精製操作を施せば良い。
【００２６】
生成した融合タンパク質から目的タンパク質を回収する方法としては特に限定されず従来公知の方法を用いることができる。
多くのシャペロニンのサブユニット間の会合は、マグネシウムイオン及びＡＴＰによって安定化されている。従って得られた融合タンパク質から目的タンパク質のみを分離する場合には、上記のようにして回収した画分をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理した後、マグネシウム及びＡＴＰが入っていない緩衝液に対して透析を行いマグネシウム及びＡＴＰを取り除く。これによってシャペロニンサブユニット間の相互作用は解除され立体構造は壊れ、目的タンパク質が露出する。また、あらかじめシャペロニンサブユニット同士の連結部にトロンビン、エンテロカイネース、活性型血液凝固第１０因子等の限定分解型プロテアーゼの切断配列を有するように融合タンパク質を設計した場合には、該限定分解型プロテアーゼにより融合タンパク質のシャペロニンリング構造を容易に分解することができ好ましい。
【００２７】
また、あらかじめ、シャペロニンと目的タンパク質の連結部にトロンビン、エンテロカイネース、活性型血液凝固第１０因子等の限定分解型プロテアーゼの切断配列を有するように融合タンパク質を設計した場合には、目的タンパク質を該限定分解型プロテアーゼにより容易に融合タンパク質から切り出すことができ好ましい。この場合、透析内液に限定分解型プロテアーゼを作用させ、目的タンパク質とシャペロニンの切断を行う。この反応液をイオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィー又は抗体を用いるアフィニィティクロマトグラフィーに供することによって容易に高純度の目的タンパク質を回収することが可能である。
また、シャペロニンと目的タンパク質の連結部にメチオニン残基を有する場合には、目的タンパク質をＣＮＢｒにより融合タンパク質から切り出すことができる。
なお、本発明の融合タンパク質を目的に応じてそのまま用いる場合は、プロテアーゼ等の切断配列を介在させる必要はない。
【００２８】
目的タンパク質が膜結合性又は膜貫通性タンパク質である場合には、目的タンパク質とシャペロニンの切断によって不溶化することもあるが、不溶化物のみを遠心分離によって回収した後、疎水性アルキル鎖がオクチル（Ｃ８）からドデシル（Ｃ１２）程度の長さである非イオン性界面活性剤等を用いると、ミセルの直径がほぼ生体膜の厚さに相応し、可溶化しやすい。このような非イオン性界面活性剤としては、例えば、β−オクチルグルコシド、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ２０等が挙げられる。
【００２９】
本発明のタンパク質の生産方法の対象となる目的タンパク質としては特に限定されないが、本発明は特に目的タンパク質が２量体又はそれ以上の四次構造を形成して機能を発揮するタンパク質である場合に有効である。このようなタンパク質としては、例えば、哺乳動物由来の抗体の重鎖、軽鎖等が挙げられる。
抗体は重鎖と軽鎖が正しいアセンブリーが起こらないと機能を発揮しない。本発明のタンパク質の生産方法では、シャペロニン内部で重鎖と軽鎖とを正しくアセンブリーさせることで、凝集体を形成することなく発現させることができる。
これ以外のタンパク質としては、例えば、抗体の部分断片やこれまで発現が困難であったＢ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、インフルエンザ等の病原性ウィルスゲノムにコードされるタンパク質（外被タンパク質、コアタンパク質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ等）、７回膜貫通型受容体（Ｇタンパク質共役型受容体）、血小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子等の成長因子に属するもの、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミン、ヒト成長ホルモン等に属するものが挙げられる。その他、ヒト、マウス等高等動物由来の疾病関連遺伝子産物の全てが、本発明の発現系の対象タンパク質となり得る。また、化学プロセス食品加工、その他の産業分野に有効な酵素、タンパク質も本発明の対象である。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１）
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ＫＳ−１株シャペロニンβサブユニット連結体の発現）
配列１に示されたシャペロニンβサブユニット（ＴＣＰβ）遺伝子をＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ＫＳ−１株ゲノムを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によってクローニングした。ＴＣＰβ遺伝子が一方向に４又は８回連結した遺伝子断片が挿入されたＴ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴＤ２（ＴＣＰβ）ｎ（ｎは４又は８）を構築した（図３）。
各発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入しカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で３０℃で２４時間培養し、シャペロニン連結体を発現させた。培養終了後、細胞を回収し超音波で破砕した。遠心分離で上清を回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、（ＴＣＰβ）ｎ（ｎは４又は８）が可溶性画分に大量発現していることが確認できた。
【００３２】
（実施例２）
（ＴＣＰβ連結体の透過型電子顕微鏡による観察）
ｐＥＴＤ２（ＴＣＰβ）ｎ（ｎは４又は８）をＳｐｅＩで切断後、セルフライゲーションさせることによってＴＣＰβ８量体のＣ末端に６残基のヒスチジンが付加された組み換えタンパク質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）４及びｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）８を得た（図３）。得られたベクターを用いて
ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件でシャペロニン連結体を発現させ、大腸菌抽出液を得た。
得られた菌体抽出液を５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で７５℃で３０分間加熱処理を行い、大腸菌由来タンパク質の大部分を変性沈殿させた。遠心分離によって上清を回収し、ニッケルキレートセファロースカラムにアプライした。１ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で充分に洗浄後、１００ｍＭイミダゾールを含有する同緩衝液でニッケルキレートセファロースに吸着した画分を溶出した。
溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果、ＴＣＰβ８量体が回収されていることがわかった。得られた画分を５ｍＭＭｇＣｌ２を含む２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、透析内液をＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラム（トーソー社製）によるアニオン交換クロマトグラフィーによって分離し、ＴＣＰβ８量体をそれぞれ均一に精製した。
精製標品それぞれを０．２％酢酸ウラニルによるネガティブ染色法によって透過型電子顕微鏡による形態観察を行った。結果を図４に示した。図４から、ＴＣＰβはサブユニット間を連結させても各分子が集合し、シャペロニン特有のリング構造を形成することがわかった。
【００３３】
（実施例３）
（ＴＣＰβ８量体とＨＢｓの融合タンパク質の発現）
配列２に示されるＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓ）遺伝子をＰＣＲ法によって、５’末端にＳｐｅＩサイトを３’末端にＨｐａＩサイトを設けた断片と、５’末端にＥｃｏＩを３’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを設けた断片とをそれぞれ増幅し、順次ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理、ＥｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）ｎ　（ｎは４又は８）に導入し、ＴＣＰβ４量体及びＴＣＰβ８量体のＮ末端及びＣ末端にＨＢｓ（Ｃ末端に６残基のヒスチジンが導入される）が融合した融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）ｎ・ＨＢｓ（ｎは４又は８）を構築した。
得られたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）８・ＨＢｓを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合タンパク質を発現させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合タンパク質に相当するサイズのバンドが検出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写した後、抗ＨＢｓ抗原ポリクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ８量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合タンパク質の場合のみ、そのサイズ相当（約５３０ＫＤａ）の陽性バンドが検出された。このことからＨＢｓ抗原がＴＣＰβ８量体との融合タンパク質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＨＢｓ抗原単独での発現実験では、大腸菌の可溶性画分にも沈殿画分にも同様のウエスターンブロッティングで陰性であった。
【００３４】
（組み換えＨＢｓ抗原の精製）
実施例２と同様にニッケルキレートカラムによって融合タンパク質を回収し、透析によってイミダゾールを除いた後、５ｍＭＭｇＣｌ２を含む展開液を用いるＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィーによってＴＣＰβ８量体とＨＢｓとの融合タンパク質を精製した。また、抗ＨＢｓポリクローナル抗体を用いるウエスターンブロッティングによってＨＢｓが存在することを確認した。
得られた融合タンパク質を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が観察された。このことから融合タンパク質がリング構造を形成するものと考えられた。
回収された画分を１ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム）存在下でインキュベーションした後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）を作用させ、４℃で一昼夜インキュベーションした。生成した不溶物を遠心分離によって回収後、１．０％β―オクチルグルコシドに溶解した。得られた可溶化物中のＨＢｓ抗原をＨＢｓ抗原測定用ＥＩＡキット「エンザイグノスト−ＨＢｓＡｇ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ」（ヘキスト・ベーリングダイアグノスティック社製）を用いて検出した。また、ウエスターンブロッティンッグによって分析した結果約２５ｋＤａのＨＢｓ抗原に相当する分子量のバンドが特異的に検出された。
以上のことから組み換えＨＢｓはシャペロニンから限定分解型プロテアーゼによって切り出しが可能であることがわかった。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約４０ｍｇのＨＢｓが可溶性画分に発現していると推定できた。
【００３５】
（実施例４）
（シャペロニンとＨＢｓの数比が４：２の融合タンパク質とシャペロニン２回連結体の共発現）
実施例１、２と同様の方法でＴＣＰβ遺伝子が一方向に２回連結した遺伝子断片が挿入されたＴ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴＤ２（ＴＣＢβ）２を構築した。この発現ベクターから、ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩによる切断によってＴ７プロモーターを含む（ＴＣＰＮ）２の発現ユニットを回収した。これをｐＡＣＹＣ１８４プラスミド（日本ジーン社製）にクローン化し、ｐＡＴＨ（ＴＣＰＮβ）２（クロラムフェニコール耐性）を構築した。
得られたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰＮβ）４とｐＡＴＨ（ＴＣＰＮβ）２で、大腸菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍＬ）含むＬＢ寒天培地にて形質転換し、生育してきた１０コロニーを２ＸＹＴ液体培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス　１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）に接種し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）の存在下３０℃で培養し一昼夜培養した。
得られた菌体からＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質発現の確認を行った結果、約３００ｋＤａの融合タンパク質と約１２０ｋＤａのシャペロニン２量体が発現していることが確認できた。また、抗ＨＢｓポリクローナル抗体を用いるウエスターンブロッティングによって３００ＫＤａ相当のバンドのみが検出された。大腸菌抽出液から、実施例２と同様の方法によりニッケルキレートカラムによって融合タンパク質が含まれるシャペロニン複合体を回収した。更に透析によってイミダゾールを除いた後、ＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィーを行い、シャペロニン複合体を精製した。得られたシャペロニン複合体を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造を形成していた。以上のことから、シャペロニンとＨＢｓの数比が４：２の融合タンパク質とシャペロニン２回連結体は互いに集合することによってリング構造を形成し、ＨＢｓをキャビティ内部に格納することによってＨＢｓを大量発現させることがわかった。本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約７０ｍｇのＨＢｓが可溶性画分に発現していると推定できた。
【００３６】
（実施例５）
（ＴＣＰβ８量体とＨＣＶコア抗原の融合タンパク質の発現）
配列３に示されるＣ型肝炎ウィルスコア抗原（ＨＣＶｃ）遺伝子をＰＣＲ法によって、５’末端にＳｐｅＩサイトを３’末端にＨｐａＩサイトを設けた断片と、５’末端にＥｃｏＩサイトを３’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを設けた断片とをそれぞれ増幅し、順次ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理、ＥｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）８に導入し、ＴＣＰβ８量体のＮ末端及びＣ末端にＨＣＶｃが融合した融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）８・ＨＣＶｃを構築した。
得られたベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合タンパク質を発現させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合タンパク質に相当するサイズのバンドが検出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写した後、抗ＨＣＶコア抗原モノクロナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ４量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合タンパク質の場合のみ相当サイズ（約５２０ＫＤａ）の陽性バンドが検出された。このことからＨＣＶｃ抗原がＴＣＰβ８量体との融合タンパク質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＨＣＶコア抗原単独での発現実験をコントロールとして行った結果、大腸菌の沈殿画分では同様のウエスターンブロッティングで陽性であったが、可溶性画分は陰性であった。このことからＨＣＶコア抗原は単独では全てが封入体として発現するが、シャペロニン８量体との融合タンパク質として可溶性画分に発現させることができることがわかった。
【００３７】
実施例３と同様の方法により、ニッケルキレートカラム及びＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによって融合タンパク質を精製した。得られた融合タンパク質を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造を形成していた。このことから融合タンパク質が２分子集合してリング構造を形成するものと考えられた。
回収された画分を１ｍＭＥＤＴＡ−Ｎａ存在下でインキュベーションした後、５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。透析内液にＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）を作用させ、４℃で一昼夜インキュベーションした。その後、反応液をＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによって分画した。各フラクションのタンパク質を９６穴マイクロタイタープレートにコートした後、牛血清アルブミンでブロッキングを施し、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（１０　ｍＭＮａ−リン酸緩衝液ｐＨ７．５／０．８％塩化ナトリウム／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次にＰＢＳ−Ｔ緩衝液で希釈したヒト陽性又は陰性血清を加え反応させた。ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ抗体を作用させた。反応終了後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で４回洗浄し、基質発色液（フェニルジアミン及び過酸化水素を含む）を加え反応させた。４Ｎ硫酸添加によって反応を止めた後、４９０ｎｍにおける吸収を測定した。検出されたＨＣＶｃ抗原陽性フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した結果、ほぼ均一な約２２ｋＤａのＨＣＶｃ抗原が精製されたことがわかった。以上のことから組み換えＨＣＶｃはシャペロニンから限定分解型プロテアーゼによって切り出しが可能であることがわかった。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約８０ｍｇのＨＣＶｃが可溶性画分に発現していると推定できた。
【００３８】
（実施例６）
（ＴＣＰβ８量体と抗リゾチームｓｃＦＶ抗体の融合タンパク質の発現）
配列４に示されるマウス由来抗ニワトリリゾチーム単鎖抗体（抗ＨＥＬ−ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ抗体：ＨｓｃＦＶ）遺伝子をＰＣＲ法によって、５’末端にＳｐｅＩサイトを３’末端にＨｐａＩサイトを設けた断片と、５’末端にＥｃｏＩサイトを３’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを設けた断片とをそれぞれ増幅し、順次ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理、ＥｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）８に導入し、ＴＣＰβ８量体のＮ末端及びＣ末端にＨｓｃＦＶの融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）８・ＨｓｃＦＶを構築した。
得られたベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合タンパク質を発現させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合タンパク質に相当するサイズのバンドが検出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写した後、抗６Ｈｉｓモノクロナル抗体（６残基のヒスチジン残基を認識する抗体）を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ８量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合タンパク質の場合のみ相当サイズ（約５４０ＫＤａ）の陽性バンドが検出された。このことからＨｓｃＦＶがＴＣＰβ８量体との融合タンパク質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＨｓｃＦＶ単独での発現実験をコントロールとして行った結果、大腸菌の沈殿画分では同様のウエスターンブロッティングで陽性であったが、可溶性画分は陰性であった。このことからＨｓｃＦＶは単独では全てが封入体として発現するが、シャペロニン８量体との融合タンパク質として可溶性画分に発現させることができることがわかった。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約７５ｍｇのＨｓｃＦＶが可溶性画分に発現していると推定できた。
【００３９】
（実施例７）
（ＴＣＰβ８量体とヒト抗体重鎖定常領域の融合タンパク質の発現）
配列５に示されるヒト由来抗体重鎖定常領域（ＡｂＨＣ）遺伝子をＰＣＲ法によって、５’末端にＳｐｅＩサイトを３’末端にＨｐａＩサイトを設けた断片と、５’末端にＥｃｏＩサイトを３’末端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを設けた断片とをそれぞれ増幅し、順次ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理、ＥｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）８に導入し、ＴＣＰβ８量体のＮ末端及びＣ末端にＡｂＨＣが融合した融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＥＴＤＨ２（ＴＣＰβ）８・ＡｂＨＣを構築した。
得られたベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合タンパク質を発現させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合タンパク質に相当するサイズのバンドが検出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写した後、抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（抗体Ｆｃ領域を認識する抗体）を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ８量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合タンパク質の場合のみ相当サイズ（約５２０ＫＤａ）の陽性バンドが検出された。このことからＡｂＨＣがＴＣＰβ８量体との融合タンパク質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＡｂＨＣ単独での発現実験をコントロールとして行った結果、大腸菌の可溶性画分及び沈殿画分で、同様のウエスターンブロッティングで陰性であった。このことからはＡｂＨＣ単独では大腸菌ではほとんど発現しないが、シャペロニン８量体との融合タンパク質として可溶性画分に発現させることができることがわかった。抗体重鎖定常領域は、２分子がアセンブリーして安定性が保たれることから、シャペロニン８両体のＮ末端及びＣ末端に発現した重鎖定常領域は、シャペロニンリング内でアセンブリーしていることが示唆された。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約７５ｍｇのＡｂＨＣが可溶性画分に発現していると推定できた。
【００４０】
（実施例８）
（大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ連結体の発現）
配列６に示された大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ遺伝子を大腸菌Ｋ１２株ゲノムを鋳型とするＰＣＲ法によってクローニングした。ＧｒｏＥＬ遺伝子が一方向に７回連結した遺伝子断片が挿入されたｔｒｃプロモーターを有する発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７を構築した（図５）。各発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入しカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で２５℃で２４時間培養し、シャペロニン連結体を発現させた。培養終了後、細胞を回収し超音波で破砕した。遠心分離で上清を回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した結果、（ＧｒｏＥ）７が可溶性画分に大量発現していることが確認できた。組み換え（ＧｒｏＥ）７を発現させた大腸菌抽出液からＤＥＡＥ−セファロース及、ＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ及びゲルろ過によって精製した。得られた精製標品を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が観察された。このことから、大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬは全てのサブユニットを連結しても７回回転対称構造は維持されることがわかった。
【００４１】
（実施例９）
（大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ７回連結体とヒトインターフェロンの融合タンパク質の発現）
配列７に示されたヒトインターフェロンα２ｂ（ＩＮＦ）遺伝子をＰＣＲ法によって、５’末端にＮｈｅＩサイトを３’末端にＸｈｏＩサイトを設けた断片と、５’末端にＮａｅＩサイトを３’末端にＳｍａＩサイトを設けた断片とをそれぞれ増幅し、順次ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ処理、ＮａｅＩ及びＳｍａＩ処理が施されたｐＴｒ２（ＧｒｏＥ）７に導入し、ＧｒｏＥＬ７回連結体のＮ末端及びＣ末端にＩＮＦが融合した融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＴｒ２（ＧｒｏＥ）７・ＩＮＦを構築した。
得られた発現ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例８と同様の条件で融合タンパク質の発現を行った。コントロールとしてｐＴｒ２（ＧｒｏＥ）７を用いた発現及びＩＮＦ単独の発現も行った。
各大腸菌抽出液の上清と沈澱画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ブロッティングメンブランに転写し、抗ＩＮＦポリクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った。その結果、ｐＴｒ２（ＧｒｏＥ）７・ＩＮＦ保持の大腸菌抽出液サンプルのみが可溶性画分に融合タンパク質の分子量相当（約３００ＫＤａ）の位置に強くバンドが検出された。ＩＮＦ単独での発現では大部分が不溶性画分に生産されていることがわかった。以上のことから、ＩＮＦは大腸菌ＧｒｏＥＬ７回連結体との融合蛋白として発現させることで、可溶性蛋白として発現することがわかった。
ｐＴｒ２（ＧｒｏＥ）７・ＩＮＦ保持の大腸菌抽出液から塩析、ＤＥＡＥ−セファロース及びＴＳＫｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｏｓｅ６（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）によるゲルろ過によって融合タンパク質を精製した。精製標品を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が観察された。以上のことから、ＩＮＦはＧｒｏＥＬのキャビティ内部に２分子ごとに格納されることによって可溶性画分に発現したと考えられる。
【００４２】
（実施例１０）
（無細胞翻訳系による（ＴＣＰβ）８とＨＢｓの融合タンパク質の合成）
無細胞翻訳系発現ベクターｐＩＶＥＸ２．３（ロシュダイアグノスティックス社）にＴＣＰβ８回連結体のＮ末端及びＣ末端にＨＢｓ２分子が結合した融合タンパク質をコードする遺伝子を導入しｐＩＶ２（ＴＣＰβ）８・ＨＢｓを構築した。この発現ベクターを用いてＲａｐｉｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ＳｙｓｙｔｅｍＲＴＳ　５００（ロシュダイアグノスティックス社製）を用いてタンパク質合成を行った。反応方法は本無細胞翻訳システムのＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｖｅｒｓｉｏｎ　１，Ｊｕｎｅ２０００）に従った。
反応終了後、反応液からニッケルキレートクロマトグラフィー及び、Ｔｓｋ　ｇｅｌ　ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによって融合タンパク質を精製した。
精製された融合タンパク質を透過型電子顕微鏡で観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が見られた。精製された融合タンパク質より実施例３と同様の方法によりＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅａｓｅで切り出した後、遠心分離によって不溶性ＨＢｓをβ―オクチルグルコシドによって可溶化させた。本サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ＨＢｓポリクローナル抗体によるウエスターンブロッティングすると分子量相当の約２５ＫＤａのバンドが検出された。ＨＢｓ単独で発現させた場合は、同様に不溶性画分にＨＢｓは蓄積したが、β―オクチルグルコシドによる可溶化は困難であった。以上のように、融合タンパク質は無細胞翻訳系において発現することができた。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、従来の宿主生物系又は無細胞翻訳系での組み換えタンパク質発現方法では活性型タンパク質の発現が困難であったタンパク質について、効率的にタンパク質を発現させることができ、精製も容易なタンパク質の生産方法、この方法により生産された融合タンパク質及びタンパク質を提供できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌シャペロニン（ＧｒｏＥＬ）複合体の立体構造を模式的に表す図である。
【図２】サブユニット構成数４又は８個の古細菌由来のシャペロニンと目的タンパク質からなる融合タンパク質の設計例を示す図である。
【図３】サブユニット構成数４又は８個の古細菌由来のシャペロニンと目的タンパク質を発現させるベクターの構成例を示す図である。
【図４】サブユニット構成数８個の古細菌由来のシャペロニンの透過型電子顕微鏡による形態観察結果を示す図である。
【図５】サブユニット構成数７個の大腸菌由来のシャペロニンと目的タンパク質を発現させるベクターの構成例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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