(57)【要約】　　　（修正有）【課題】イネに病害抵抗性を付与することを目的とする。【解決手段】本発明は、植物病原細菌Ａｃｉｄｏｂｏｒａｘ　ａｖｅａｎｅ　Ｎ１１４１株由来の１１４１−ｆｌａ１遺伝子（フラジェリンをコードする）をカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターに接続し、イネに導入することでＴ０世代（形質転換当代）でフラジェリンが高レベルに蓄積したイネ個体を選抜し、その自殖後体Ｔ１世代のイネについて、いもち病菌（糸状菌）を接種し抵抗性の検定を行った。その結果、形質転換イネにおいては、いもち病菌に対する抵抗性が増強した。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列またはその一部分からなる、植物中でエリシター活性を有するタンパク質あるいはペプチドをコードする遺伝子を植物ゲノムに導入することにより、該植物に病害抵抗性を付与することからなる病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列またはその一部分からなる、植物中でエリシター活性を有するタンパク質あるいはペプチドをコードする遺伝子を植物ゲノムに導入することにより、該植物に病害抵抗性を付与することからなる請求項１に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその一部分からなる、植物中でエリシター活性を有するタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子を植物ゲノムに導入することにより、該植物に病害抵抗性を付与することからなる請求項１または２に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項４】
以下のアミノ酸配列またはその一部分を有し、植物中でエリシター活性を有するタンパク質またはペプチドコードする遺伝子を植物ゲノムに導入することにより、該植物に病害抵抗性を付与することからなる病害抵抗性植物の作出方法：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、または、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列。
【請求項５】
配列番号２のＤＮＡ配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するＤＮＡ配列からなる遺伝子またはその一部を有する遺伝子を、植物ゲノムに導入することにより、該植物に病害抵抗性を付与することからなる、病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項６】
配列番号２のＤＮＡ配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するＤＮＡ配列からなる遺伝子またはその一部を有する遺伝子を、植物ゲノムに導入することにより、該植物に病害抵抗性を付与することからなる、請求項５に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項７】
配列番号２のＤＮＡ配列を有する遺伝子またはその一部を有する遺伝子を、植物ゲノムに導入することにより、該植物に病害抵抗性を付与することからなる請求項５または請求項６に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項８】
以下のＤＮＡ配列からなる遺伝子、またはその一部からなる遺伝子を植物ゲノムに導入することにより、該植物に病害抵抗性を付与することからなる、病害抵抗性植物の作出方法：
（ａ）配列番号２のＤＮＡ配列、または、
（ｂ）配列番号２のＤＮＡ配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたＤＮＡ配列。
【請求項９】
配列番号２のＤＮＡ配列を有する核酸とストリンジェントな、またはマイルドな条件下でハイブリダイズする遺伝子またはその一部を有する遺伝子を、植物ゲノムに導入することにより、該植物に病害抵抗性を付与することからなる、病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項１０】
植物中でタンパク質性のエリシター活性を有するフラジェリンタンパク質をコードする遺伝子を植物ゲノムに導入することにより、該植物に病害抵抗性を付与することからなる病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項１１】
フラジェリンタンパク質がＡｃｉｄｏｂｏｒａｘ　ａｖｅａｎｅ　Ｎ１１４１株由来のフラジェリンタンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
植物中でエリシター活性を有するタンパク質あるいはペプチドをコードする遺伝子を植物で機能するプロモーターに接続して植物ゲノムに導入し、該植物に病害抵抗性を付与することからなる、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項１３】
プロモーターが構成的プロモーターである、請求項７に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項１４】
（ａ）請求項１１または１２に記載のプロモーターおよび、ターミネーターを用意し、
（ｂ）上記プロモーターの下流、および上記ターミネーターの上流の領域に請求項１から１０のいずれかに記載の遺伝子を接続した発現カセットを有するプラスミドを調製し、
（ｃ）アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、マイクロインジェクション法、またはパーティクルガン法により、上記発現カセットを植物のゲノムへ導入し、
（ｄ）形質転換された植物細胞を選択マーカーによりスクリーンニングし、
（ｅ）再生培地で完全な植物体（Ｔ０世代）になるまで培養して、病害抵抗性植物を得る；さらには、
（ｆ）上記Ｔ０世代より種子（Ｔ１世代）を得て、その種子を育成して病害抵抗性植物を得る；
ことからなる、病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項１５】
植物が単子葉植物である請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項１６】
植物がイネである請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項１７】
植物が双子葉植物である請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項１８】
病害が菌類病である請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項１９】
病害がいもち病である請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項２０】
病害が細菌病である請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【請求項２１】
病害がウィルス病である請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の病害抵抗性植物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、病原体に抵抗性の植物を作出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
植物は、動物に見られるような免疫機構を保有していないが、植物に特有の機構で自らを病原体から防御している。高等植物の過敏感反応（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＨＲ）は、感染部位の植物細胞が速やかに自殺し病原体を局所的に封じ込めるという、病原体侵入に対する植物側の動的な抵抗性反応である。この反応は、非親和的な宿主―病原体相互作用、および非宿主―病原体相互作用の結果として生じる事が知られている。またここに見られる細胞の自殺は局所的なプログラム細胞死として捉えることが出来る（Ｄａｎｇｌら（１９９６）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　８：１７９３−１８０７）。ＨＲを引き起こす機構に加え、活性酸素種の生成、細胞壁の強化、ファイトアレキシンの生産、ＰＲタンパク質などの防御関連タンパク質の生合成といった、他の防御反応も誘導される（Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋ　ａｎｄ　Ｊｏｎｅｓ（１９９６）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　８：１７７３−１７９１）。この様な局所的な防御応答に加えて、多くの場合、植物の非感染部分にもＰＲタンパク質の蓄積などの防御反応が拡大し、結果として植物全体が抵抗性になる。これは全身獲得抵抗性（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＳＡＲ）と呼ばれ、数週間またはそれ以上持続し、植物全体が二次感染に対して抵抗性となる（Ｓｔｉｃｈｅｒ　ら（１９９７）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ　３５：２３５−２７０）。
【０００３】
以上のような高度に組織化された防御反応のスイッチをオンにする植物側の最初の反応は、侵入病原体から直接、あるいは間接的に生成される‘エリシター’と呼ばれる分子の認識である。そしてその後の急激な活性酸素種の生成や、可逆的なタンパク質リン酸化といった複雑なシグナルカスケードが防御応答の初期反応として重要であると考えられている（Ｙａｎｇら（１９９７）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　１１：１６２１−１６３９）。エリシターの種類は多岐に渡っており、多くの菌類の細胞壁成分であるキチン・キトサンやグルカンの分解産物であるオリゴ糖類、あるいは植物の細胞壁由来のオリゴガラクツロン酸などの、病原体の種類に依存しない、いわゆる非特異的エリシターと、ＡＶＲ９など病原菌側の非病原性遺伝子産物（Ａｖｒ遺伝子産物）などのに特異的で、病原体の種類に依存する特異的なエリシター、あるいはエリシチン、ハーピンなどその中間の特異性をもつタイプのエリシターがある（Ｂｏｌｌｅｒ（１９９５）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４６：１８９−２１４）。
【０００４】
フラジェリンは細菌鞭毛フラジェラの構成要素である。Ｆｅｌｉｘら（Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１８：２６５−２７６，１９９９）は、トマト培養細胞系を用い、培地のアルカリ化を抵抗性反応の指標として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ　ｐｖ　ｔｏｂａｃｉから、３２ｋＤａのタンパク質を精製した。アミノ酸配列からこのタンパク質はフラジェリンと同定した。さらに彼らは鞭毛細菌のフラジェリンのアミノ酸一次構造中で最も保存されたＮ末端側の１５ないし２２残基のペプチドが、トマトをはじめ、タバコ，アラビドプシスなど幾つかの植物種において同様の反応を誘導することを突き止めた。これらのペプチドは、オキシダティブバーストやエチレンの生成も誘導し，タンパク質性のエリシターとしては初めての非特異的エリシターであった。最近Ａｓａｉら（Ｎａｔｕｒｅ　４１５：９７７−９８３，２００２）は、上述の２２残基のペプチド（ｆｌｇ２２）が、フラジェリンレセプターＦＬＳ２（Ｇｏｍｅｚら、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　５：１００３−１０１１，２０００）依存的に活性化させる、ＭＡＰキナーゼカスケードを解明した。さらに、それらＭＡＰキナーゼ、および多くの防御関連遺伝子の転写因子であるＷＲＫＹ２９を、アラビドプシスで一過的に発現させると、細菌と糸状菌に対する抵抗性が増強されることを報告した。
【０００５】
Ｆｌｇ２２はイネの培養細胞に細胞外のアルカリ化は引き起こさない（Ｆｅｌｉｘら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１８：２６５−２７６，１９９９）。Ｃｈｅら（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７５：３２３４７−３２３５６，２０００）は、単子葉植物を宿主とする植物病原細菌Ａｃｉｄｏｂｏｒａｘ　ａｖｅａｎｅ　Ｎ１１４１株（シコクビエの褐条細菌病）から、イネの培養細胞に細胞死を誘導する５０ｋＤａのタンパク質を同定した。アミノ酸配列からこのタンパク質はフラジェリンであることを突き止めた。しかしながら、これまでに、フラジェリンそのものを植物に導入、形質転換体を解析した例はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、病害抵抗性を有する植物を創製することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、イネに過敏感細胞死を誘導するＡｃｉｄｏｂｏｒａｘ　ａｖｅａｎｅ　Ｎ１１４１株由来のフラジェリン（Ｎ１１４１フラジェリン）をコードする遺伝子をイネに導入、形質転換体を解析し、フラジェリンの蓄積した系統では、イネの最重要病害であるいもち病菌に対する抵抗性が増強されることを見いだした。本発明は、これを利用した病害抵抗性を有する植物を創製する方法に関する。
【０００８】
ここで、「病害抵抗性」とは、ある病気にかかりづらくなることをいう。具体的には病斑数の減少、病斑サイズの減少、あるいは病徴の軽減などを挙げることができる。本発明においてはフラジェリン遺伝子を導入した個体とそうでない個体を比較した場合に、遺伝子を導入した個体の方が、上記に例示される病気にかかりづらくすることをいう。
【０００９】
本発明の広範な態様において、本発明は植物に、植物中でエリシター活性を有するフラジェリンまたはその一部を構成するペプチドをコードする遺伝子（以下、フラジェリン遺伝子と総称する）を導入することにより、病害抵抗性を付与し、病害抵抗性植物を作出する方法を提供する。別の広範な態様において、本発明の方法により植物に導入されるフラジェリン遺伝子は植物細胞ではたらくプロモーターと接続されている。
【００１０】
本発明の一態様において、植物に導入するフラジェリン遺伝子は、植物病原細菌（Ａｃｉｄｏｂｏｒａｘ　ａｖｅａｎｅ　Ｎ１１４１株）由来のフラジェリンをコードする遺伝子であり、そのフラジェリンタンパク質は配列番号１のアミノ酸配列を有する。したがって一態様において、植物に導入するフラジェリン遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子である。望ましい態様において、植物に導入する遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。さらに望ましい態様において、植物に導入する遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列とすくなくとも７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。別の態様において、植物に導入する遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
【００１１】
ここで、上記アミノ酸の「一部」とは、Ａ．ａｖｅｎａｅのフラジェリンのアミノ酸配列またはその遺伝子のＤＮＡ配列と相同性のある分子の一部をいう。ＦｅｌｉｘらのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのフラジェリンの論文では、最小で１５残基のペプチドが、外から与えたときにエリシター活性を持つということから、上記アミノ酸配列の１５アミノ酸以上をいう。さらに具体的には、配列番号１の第３７〜５１番目の１５アミノ酸を挙げることができる。
【００１２】
また、配列番号２のＤＮＡ配列は、植物病原細菌（Ａｃｉｄｏｂｏｒａｘ　ａｖｅａｎｅ　Ｎ１１４１株）由来のフラジェリン（アミノ酸配列は配列番号１に示す）をコードする遺伝子を示す。本発明の方法において、配列番号２のＤＮＡ配列を有する遺伝子を植物に導入してもよく、望ましくは、配列番号２のＤＮＡ配列と９０％以上の相同性、さらに望ましくは７０％以上の相同性を有するＤＮＡ配列を有する遺伝子を導入してもよい。別の態様において植物に導入する遺伝子は、配列番号２のＤＮＡ配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたＤＮＡ配列からなる遺伝子である。
【００１３】
ここで、上記ＤＮＡの「一部」とは、Ａ．ａｖｅｎａｅのフラジェリンのアミノ酸配列またはその遺伝子のＤＮＡ配列そのものの一部をいう。ＦｅｌｉｘらのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのフラジェリンの論文では、最小で１５残基のペプチドが、外から与えたときにエリシター活性を持つということから、上記ＤＮＡの４５塩基以上をいう。さらに具体的には、配列番号２では、第１０９〜１５３番目の４５塩基を挙げることができる。
【００１４】
また、「置換、欠失、挿入、付加」において一回の実験でできる数値は１０個以下である。これらは、部位特異的突然変異誘発法により、変換できる（例えばＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００、１９８２）。さらに、「欠失」とは、塩基配列の端から塩基を欠失したもの及び塩基配列の途中の塩基が欠失したものも含まれる。
【００１５】
また、配列番号２記載のＤＮＡとストリンジェント（Ｈｉｇｈ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）な条件でハイブリダイズさせるには、５×ｄｅｎｈａｒｄｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ又は０．１％ＳＤＳといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて３２〜６８℃で、好ましくは５０℃と６０℃の２段階、又は５０℃、５５℃、６０℃、６５℃の４段階で反応を行えばよい。この条件はホルムアミドが存在する場合は、ホルムアミドが存在しない場合よりも若干温度を下げて行うことができる。また、マイルド（ｌｏｗ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）な条件でハイブリダイズさせるには、３０％　ｄｅｉｏｎｉｚｅｄｆｏｒｍａｍｉｄｅ、０．６　Ｍ　ＮａＣｌ、０．０４　Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ　７．４）、２．５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％　ＳＤＳで反応を行えばよい。さらに、ハイブリダイズしたものを洗浄するときの条件は、０．２又は２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、温度２０−６８℃で行うことができる。ストリンジェント（ｈｉｇｈ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）な条件にするかマイルド（ｌｏｗ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）な条件にするかは、Ｗａｓｈ時の塩濃度又は温度で差を設けることができる。塩濃度でハイブリダイズの差を設ける場合には、ｈｉｇｈ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒとして０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、ｌｏｗ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒとして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行うことができる。また、温度でハイブリダイズの差を設ける場合には、ｈｉｇｈ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙの場合は６８℃、Ｍｏｄｅｒａｔｅ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙの場合は４２℃、ｌｏｗ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙの場合は室温（２０−２５℃）でいずれの場合も０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行えばよい。
【００１６】
フラジェリンは、鞭毛細菌に広く分布するタンパク質であり、先述のＡｃｉｄｏｂｏｒａｘ　ａｖｅａｎｅ　Ｎ１１４１株由来のフラジェリン以外にも、たとえば、シュードモナス　シリンガエ　ｐｖ　タバチ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ　ｐｖ　ｔａｂａｃｉ）、シュードモナス　アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、ヘリコバクター　ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ）、カンピロバクター　コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ）、ビブリオ　パラハエモリト（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔ）、セラチア　マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、プロテウス　ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、バシルス　スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のフラジェリンタンパク質が存在する。これらのフラジェリンタンパク質をコードする遺伝子の本発明の方法への使用も本発明の範囲内である。
【００１７】
本発明において、フラジェリン遺伝子を植物細胞で機能するプロモーターに接続して植物に導入する。本発明では、フラジェリン遺伝子を植物細胞で機能するプロモーターに接続することで、その植物が　病害抵抗性になることを初めて示した。後述の実施例においては、植物細胞で機能するプロモーターとして、構成的発現をするカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを用いたが、これに限定されない。構成的プロモーター（病害やストレス応答性が低く、組織・時期特異性が高くないプロモーター）とフラジェリンの組み合わせによる病害抵抗性の付与技術が開示されれば、以下に述べる実施例に示したカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター以外の構成的プロモーター、例えば、ユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２３：５６７−５８１）、アクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　２：１６３−１７１）、アルファチューブリンプロモーター（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２１：９３７−９４２）、Ｓｃプロモーター（Ｓｃｈｅｎｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ３９：１２２１−１２３０）等の構成的プロモーター、あるいは、ＰＰＤＫ（Ｍａｔｓｕｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９０：９５８６−９５９０）やＰＥＰＣ（Ｙａｎａｇｉｓａｗａ　ａｎｄ　Ｉｚｕｉ（１９８９）Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１０６：９８２−９８７，Ｍａｔｓｕｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ　Ｊ　６：３１１−３１９）、Ｒｕｂｉｓｃｏ（Ｍａｔｓｕｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ　Ｊ　６：３１１−３１９）等の光合成関連遺伝子の緑色器官で高発現するプロモーターとフラジェリン遺伝子との組み合わせにおいても病害抵抗性の付与が期待される。また、病害誘導性プロモーター、例えば、ＰＡＬプロモーター（Ｚｈｕ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２９：５３５−５５０）、Ｐｒｐ１プロモーター（特表平１０−５００３１２）、ｈｓｒ２０３Ｊプロモーター（Ｐｏｎｔｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ　Ｊ　５：５０７−５２１）、ＥＡＳ４プロモーター（Ｙｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１１５：４３７−４５１）、　ＰＲ１ｂ１プロモーター（Ｔｏｒｎｅｒｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ　１０：６２４−６３４）、ｔａｐ１プロモーター（Ｍｏｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２２：４７５−４９０）、ＡｏＰＲ１プロモーター（Ｗａｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ　Ｊ　３：１９１−２０１）等のプロモーターと、フラジェリン遺伝子との組み合わせにおいても病害抵抗性の付与が期待される。このような組み合わせを用いた方法も本発明に含まれるものである。
【００１８】
本発明の方法は、以下の過程を含む。
（ａ）フラジェリン遺伝子を、先述のプロモーターの下流、およびターミネーターの上流に接続して、発現カセットを構築し、
（ｂ）上記の発現カセット、および選択マーカー遺伝子を有するプラスミドを構築し、
（ｃ）これを植物ゲノム中に導入して植物の形質転換を行い、
（ｄ）形質転換された植物細胞を選択マーカーによりスクリーニングし、
（ｅ）再生培地で完全な植物体（Ｔ０世代）になるまで培養して、病害抵抗性植物を得る、さらには、
（ｆ）上記Ｔ０世代より種子（Ｔ１世代）を得て、その種子を育成して病害抵抗性植物を得る。
【００１９】
ここで、フラジェリン遺伝子を植物ゲノムに導入するにあたっては、当業者に既知の形質転換法、たとえば、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、マイクロインジェクション法、またはパーティクルガン法などにより形質転換を行ってもよい。望ましくは、アグロバクテリウム法による形質転換法を用いる。
【００２０】
また、ここで用いられる選択マーカー遺伝子は当業者に既知の選択マーカー遺伝子、たとえば、ハイグロマイシン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子などを用いてもよい。
【００２１】
プロモーター、ターミネーターは植物細胞で機能するものであれば特に限定されないが、構成的発現をするプロモーターとしては、上記ベクターに予め組み込まれている３５Ｓプロモーターの他に、アクチン、ユビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。しかしながら、より好適には誘導性のプロモーターを組み入れて用いてもよい。これらのプロモーターの下流に開始コドン、終始コドン、ターミネーター及び複製可能単位等を所望により導入することが好ましい。
【００２２】
また、形質転換を行うにあたりアグロバクテリウム菌を用いる場合の培地、菌の濃度、感染時間、培養時間等は、ＷＯ９４／００９７７、ＷＯ９５／０６７２２、ＷＯ９８／１７８１３に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明のＤＮＡ断片を用いて病害抵抗性植物を作出する目的においては、植物形質転換用ベクターが有用である。植物用ベクターとしては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１（以上Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物の形質転換には、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＴＯＫ２３３（以上Ｈｉｅｉら、ＰｌａｎｔＪ．、６、２７１−２８２（１９９４））、ｐＳＢ４２４（Ｋｏｍａｒｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．、１０、１６５−１７４（１９９６））などが例示される。
【００２４】
さらに、本発明の方法により病害抵抗性を付与する植物は、たとえばイネであってもよいが、その他の植物として、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム、ダイズ、アズキ、タマネギ、およびニンニクなどの単子葉植物、ワタ、ヒマワリ、ピーナッツ、トマト、ジャガイモ、サツマイモ、エンドウ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、ニンジン、ナス、カボチャ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、イチゴ、ブドウ、タバコ、シロイヌナズナ、ペチュニア、キク、カーネーション、セントポーリア、およびヒャクニチソウなどの双子葉植物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明において、フラジェリン遺伝子の導入により植物に付与された病害抵抗性は、たとえば、イネいもち病に対しての抵抗性であるが、他の病害として、紋枯れ病（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ，　ＡＧ−１），ばか苗病（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ　ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ），ごま葉枯病（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓｌｅｅｒｓｉａｅ），こうじ病（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ　ｖｉｒｅｎｓ）などの菌類病、白葉枯病（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ）、褐条病（Ａｃｉｄｏｂｏｒａｘ　ａｖｅａｎｅ）、もみ枯細菌病（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｇｌｕｍａｅ），苗立枯細菌病（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｌａｎｔａｒｉｉ）などの細菌病、縞葉枯病（ｒｉｃｅ　ｓｔｒｉｐｅ　ｖｉｒｕｓ）、萎縮病（ｒｉｃｅ　ｄｗａｒｆ　ｖｉｒｕｓ）、黄葉病（ｒｉｃｅ　ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ　ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ）などのウイルス病などを含む、種々の病害に抵抗性である。
【００２６】
本発明の一態様として植物病原細菌（Ａｃｉｄｏｂｏｒａｘ　ａｖｅａｎｅ　Ｎ１１４１株）由来のフラジェリンをコードする１１４１−ｆｌａ１遺伝子（配列番号２）を、構成的発現をするカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターに接続したコンストラクト３５Ｓ−１１４１−ｆｌａ１を構築し、当業者に既知の遺伝子導入技術であるアグロバクテリウム法でイネ品種コシヒカリに該コンストラクトを導入する。再生個体におけるフラジェリンの発現は抗フラジェリン血清を用いたウエスタン分析によって確認できる。再生個体においては、フラジェリンを総可溶性タンパク質あたり、０．００５〜０．１５％蓄積する個体が得られる。また、これら再生個体のうち、フラジェリンの発現する個体の種子稔性はほとんどのもので正常であり、それら再生個体から種子を得ることができる。
【００２７】
従来は、構成的発現をするプロモーターを用いてタンパク質性エリシターを植物ゲノムへの導入することは、植物の過敏感反応（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎｃｅ：ＨＲ）を常に引き起こすことになり、これはつまり、植物細胞をプログラム細胞死へと導くこととなるため、植物の発育に重大な問題を生じるであろうと考えられていた。そのため、タンパク質性エリシターの植物ゲノムへの導入による抵抗性植物の作出には、誘導発現をするプロモーターを用いなければ困難であろうと考えられていた。しかしながら、本発明においては、フラジェリン遺伝子の導入に当たって構成的発現をするプロモーターを用いて、フラジェリンタンパク質を発現するイネの作出に成功した。このフラジェリン発現個体の葉には発育に伴い白い斑点が現れ、また多くの個体に多少の草丈の低下がみられたが、種子稔性は正常であった。したがって、本発明の方法においては、誘導発現をするプロモーターに限定されることなく、構成的発現をするプロモーターであっても使用できる。すなわち、植物細胞で働く全てのプロモーターが本発明の方法において使用できる。
【００２８】
フラジェリンを高いレベルに蓄積した個体では、ＰＡＬ遺伝子の発現量は、フラジェリンを蓄積していない組み換え体に比べて高くなる。ＰＡＬ遺伝子は障害や病原菌の細胞壁由来のエリシターなどによって、転写が誘導される（Ｚｈｕら、（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２９：５３５−５５０）、防御関連遺伝子のひとつである。したがって、フラジェリン導入によって形質転換イネには防御機構の少なくとも一部が作動していることが示唆される。
【００２９】
Ｔ０世代（形質転換当代）で、フラジェリンタンパク質が蓄積したイネ個体を選抜し、その自殖後体（Ｔ１）の種子を得てもよい。Ｔ１世代の形質転換体について、病害の一態様としてイネいもち病菌（糸状菌）を接種し、抵抗性の検定を行ってもよい。形質転換イネにおいてはフラジェリン１１４１−ｆｌａ１が発現した大半の系統において、いもち病接種後のいもち病の病斑数または病斑面積率をフラジェリンが発現していないコシヒカリなどの原型品種と比較して統計的に有意に低減させることができる。一方Ｔ０世代でフラジェリンの発現のみられなかった１系統ではこのような低減は認められない。病原接種後の病斑の確認は、接種６日後以内、もしくは、接種１６日後以内に行ってもよい。Ｔ１世代の個体別にウエスタン分析を行ったところ、フラジェリン発現量と抵抗性には正の相関が見られる。したがって、フラジェリンの発現によってイネの病害抵抗性を増強することができる。
【００３０】
【実施例】
実施例１．遺伝子構築と植物の形質転換
翻訳開始コドンの直上流にＸｈｏＩ部位が、翻訳終止コドンの直下流に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位が付加された、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ　ａｖｅｎａｅ　Ｎ１１４１系統のフラジェリン遺伝子（Ｎ１１４１−ｆｌａ１、１４７９ｂｐ、Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０４０１３９、配列表の配列番号１）が組み込まれたプラスミドベクター（Ｃｈｅら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（２０００）２７５：３２３４７−３２３５６）を、制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社）で二重消化し、およそ１．５ｋｂのＮ１１４１−ｆｌａ１遺伝子を切り出し、Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ（宝酒造社）により平滑末端化した。一方スーパーバイナリ―ベクターｐＳＢ２１（３５Ｓ　ｐｒｏ−ＧＵＳ−ＮＯＳ　ｔｅｒ，Ｋｏｍａｒｉら（１９９６）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　１０：１６５−１７４）を制限酵素ＸｂａＩ、ＳａｃＩで消化、ＧＵＳ遺伝子を除去し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）で平滑末端化した。ＣＩＡＰ（ベーリンガー社）処理を行い、末端部を脱リン酸化した。ここへ上述のＮ１１４１−ｆｌａ１遺伝子を組み込み、ｐ３５１１Ｆｌａを得た。
【００３１】
ｐＳＢ１１（Ｋｏｍａｒｉら、上述）を基にハイグロマイシン耐性遺伝子カセットをもつ中間ベクターｐＫＹ２１１を作成した。トウモロコシユビキチンプロモーターとユビキチンイントロン（Ｕｂｉ　ｐｒｏ−Ｕｂｉ　ｉｎ）に、ノパリン合成酵素のターミネーター（ＮＯＳ　ｔｅｒ）を接続した。このコンストラクト（Ｕｂｉ　ｐｒｏ−Ｕｂｉ　ｉｎ−ＮＯＳ　ｔｅｒ）のＵｂｉ　ｉｎとＮＯＳｔｅｒの間にハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩＩ）を挿入し、Ｕｂｉ　ｐｒｏ−Ｕｂｉ　ｉｎ−ｈｐｔＩＩ−ＮＯＳ　ｔｅｒを作成した。さらにこのコンストラクトをｐＳＢ１１のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入することによりｐＫＹ２０５を得た。最後にＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ　ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてｐＫＹ２０５のＥｃｏＲＩ部位の直上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を挿入し、ｐＫＹ２１１を得た。
【００３２】
ｐ３５１１ＦｌａをＨｉｎｄＩＩＩ消化、脱リン酸化後、ｐＫＹ２１１由来３．３ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ユビキチンプロモーター−ｈｐｔＩＩ−ＮＯＳ）をライゲーションし、選択マーカー遺伝子（ｈｐｔＩＩ、ハイグロマイシン耐性遺伝子）を組み込んだ。以上の手順で、コンストラクトｐ３５１１ＦｌａＨｐｔ（３５Ｓ　ｐｒｏ−１１４１−ｆｌａ１−ＮＯＳｔｅｒ　＋　Ｕｂｉ　ｐｒｏ−Ｕｂｉ　ｉｎ−ｈｐｔＩＩ−ＮＯＳ　ｔｅｒ）を構築した。カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターは構成的な高発現プロモーターであり、本コンストラクトで形質転換されたイネは全身にフラジェリンを蓄積することが予想される。本コンストラクトを含む大腸菌ＬＢ３９２株と、アクセプターベクターｐＳＢ１（Ｋｏｍａｒｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１０：１６５−７４．）を含むアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株、さらにヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を含む大腸菌ＨＢ１０１株を混合し、三菌系接合によりフラジェリンを含むコンストラクトをアグロバクテリウムへ導入した。イネの形質転換はＨｉｅｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）（Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　１９９４　６：２７１−２８２）の方法に従い、アグロバクテリウムを用いて水稲品種コシヒカリの未熟胚由来カルスを形質転換した。
【００３３】
実施例２．形質転換体の解析
ａ）ウェスタン分析によるフラジェリン発現の確認
５０個体の再分化植物を得た。形質転換当代（Ｔ０）でウェスタン分析を実施した。５−６葉期の形質転換イネの葉（長さ３−４ｃｍ）を、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．５バッファー中で乳鉢を用いてすり潰した。１５０００ｘｇで１０分間遠心した後の上清をタンパクサンプルとした。タンパク質の定量はＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）により行なった。およそ３０（ｇのタンパク質をＬａｅｍｍｎｉ（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５の方法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分画した。ゲルは１２．５％　ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社）を使用した。泳動後、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。ＰＶＤＦ膜は０．５％スキムミルクを含む１ｘＴＢＳバッファー中で３０分間処理した後、１１４１フラジェリン抗体（Ｃｈｅら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（２０００）２７５：３２３４７−３２３５６）を１／１０００（ｖ／ｖ）含む同バッファー中で室温で一晩振とうした。二次抗体としては、ヤギ抗ウサギＩｇＧコンジュゲートペルオキシダーゼ標識（ＭＢＬ社）もしくはヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリフォスファターゼコンジュゲート（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を１／１０００（ｖ／ｖ）の濃度で使用した。発色系は、それぞれＨＲＰ　Ｃｏｌｏｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）、ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｋｉｔ　ＩＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いた。発現タンパク量は、濃度の分かっている大腸菌発現フラジェリンタンパクサンプル（Ｃｈｅら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（２０００）　２７５：３２３４７−３２３５６）の発色度合いと、デンシトメーター（モデルＧＳ−６７０、ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて比較することにより算出した。Ｔ０世代のウェスタン分析結果を表１にまとめ、具体例を図１に示した。
【００３４】
【表１】
2004024160.tif 000002
【００３５】
およそ２／３の形質転換体で明らかなフラジェリンタンパク質の蓄積が検出された。これらフラジェリン発現個体の葉には発育に伴い白い斑点が現れた。また多くの個体に多少の草丈の低下が見られたが、種子稔性は正常であったので、フラジェリン発現個体のＴ１種子を得ることが出来た。一部の個体に関しては１１４１−ｆｌａ１遺伝子（ＸｈｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ　１．５ｋｂ断片）をプローブとしたゲノミックサザン分析により、導入したフラジェリン遺伝子のコピー数を推定した。
【００３６】
ｂ）ノーザン分析による防御関連遺伝子の発現分析
フラジェリンを発現した形質転換体において、防御関連遺伝子の発現が誘導されているか否かを調べるため、フラジェリンの発現した形質転換体４系統（Ｄ／１１−２０−２、Ｄ／１１−２４−３、Ｄ／１１−２７−１、Ｄ／１１−２７−２）、およびｐＳＢ２４（３５Ｓ　ｐｒｏ−ＩＧＵＳ−ＮＯＳ　ｔｅｒ、Ｋｏｍａｒｉ　ら（１９９６）Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　１０：１６５−１７４）を導入した対照組換え体２系統（Ｑ１、Ｑ２）の葉から、フェノール−ＳＤＳ法によってＲＮＡを抽出し、ＰＡＬ遺伝子をプローブとしたノーザン分析を行なった。ＰＡＬ遺伝子は以下のようにクローニングした。ＯＳＰＡＬ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｘ１６０９９）の配列を基にｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎの全長を伸ばすプライマーを設計し、Ｏｃ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．　Ｃ５９２４（Ｂａｂａ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７，４６３−　４７２））から、ＲＴ−ＰＣＲによりＰＡＬ遺伝子をクローニングした。塩基配列の解析を行いその遺伝子がＰＡＬであることを確認した。ＰＡＬ遺伝子は傷害や、病原菌の細胞壁由来のエリシターなどによって、転写が誘導されることが報告されている（Ｚｈｕ　ｅｔａｌ．１９９５　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２９：５３５−５５０）。
【００３７】
形質転換体および対照系統から抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ（１５（ｇ）を１ｘ　ＭＯＰＳ　ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　ＭＯＰＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．０、５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ，ａｎｄ　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で、ホルムアルデヒドを含む１．５％アガロースゲルで電気泳動したのち、ナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ　Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写した。ＰＡＬ遺伝子プローブは上述のＰＣＲ産物をｍｉｃｒｏｃｏｎ　ＹＭ−３０　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製した後、［３２Ｐ］−ｄＣＴＰでラベルしたものを使用した。
【００３８】
その結果、調査した４系統全てにおいて、対照と比較してＰＡＬ遺伝子の転写物の蓄積量が多かった（図２）。このことから、フラジェリン導入によって形質転換イネには防御機構の少なくとも一部が作動していることが示唆された。
【００３９】
ｃ）Ｔ１世代におけるフラジェリン発現イネのいもち病抵抗性試験
１１４１−ｆｌａ１遺伝子が導入されたＴ０世代の形質転換体のうちフラジェリンが蓄積した４系統（Ｄ／１１−２０−１、Ｄ／１１−２０−２、Ｄ／１１−２０−３、Ｄ／１１−２４−３）、およびウェスタン分析ではフラジェリン蓄積が検出限界以下であった１系統（Ｄ／１１−３１−１）を選び、それらのＴ１世代におけるイネいもち病に対する罹病度を調査した。選抜された５つの高発現個体の種子稔性は正常で、多くの自殖種子を得ることが出来た。なお対照として、いもち病に対する圃場抵抗性が極弱の水稲品種コシヒカリ（形質転換実験の原系統）、いもち病圃場抵抗性が弱〜中の日本晴、いもち病圃場抵抗性が極強の銀河を用いた。培土を入れたシードリングケースに種子を８粒×２列で撒き、温室内で栽培し、４．８〜５．２葉期に病害検定に供試した。イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ）はレース００７を用いた。接種にはいもち菌をオートミール・スクロース寒天培地上で培養（２８℃暗条件）し、菌叢成長後、２５℃で３日間近紫外光照射して形成させた分生胞子を用いた。いもち菌の接種は、０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０で２×１０５個の分生胞子／ｍｌに調整した懸濁液をシードリングケース３つ当たり３０ｍｌ噴霧接種することにより行なった。噴霧接種を行なったイネは接種後２４時間加湿恒温器（ＳＬＰＨ−５５０−ＲＤＳ、日本医化器械製作所製）内で２５℃、１００％湿度条件下に保持した後、温室内へ移した。温室の設定条件は、明条件２５℃−１６時間、暗条件２２℃−８時間とした。病害抵抗性の評価は、接種６日後における接種時の最上位展開葉（第５葉）の進展性病斑数を目視で数え、病徴指数（図３）により評価した。さらに接種１６日後における接種時の最上位展開葉（第５葉）の進展性病斑面積率を、病徴レベル（図５）として評価した。結果についてはコシヒカリとの有意差検定（全群比較、Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ検定）を行った。
接種６日後の結果を図４に示した。フラジェリンの発現していない系統Ｄ／１１−３１−１の病徴指数の分布は、原系統であるコシヒカリ（いもち抵抗性弱）と非常によく似ていた。病徴指数の中央値はともに６（一葉当り病斑数は多く、計測不能）であり、レンジはともに４（７−３）であった。いもち抵抗性弱〜中の日本晴においては病徴指数の中央値は５（一葉当り病斑数が２５−５０個）であり、フラジェリン蓄積系統Ｄ／１１−２０−３、Ｄ／１１−２４−３の中央値も５であったが、日本晴の病徴指数のレンジが３であったのに対し、これらフラジェリン蓄積系統のそれは４であり、病徴程度の低い、抵抗性の増強が示唆される個体の割合が多かった。いもち病圃場抵抗性が強の銀河においては、病徴指数の中央値は４（一葉当り病斑数が１０−３０個）であり、指数が３（一葉当り病斑数が３−１５個）と４のものが多く、今回供試した系統の中では最も強い抵抗性を示した。フラジェリン蓄積系統Ｄ／１１−２０−１、Ｄ／１１−２０−２の病徴指数の中央値も４、３．５であり、病徴程度の低い、抵抗性の増強が示唆される個体の割合が多かった。特にＤ／１１−２０−２の分布は銀河のそれと良く似ていた。コシヒカリに対する病徴指数の分布のノンパラメトリックな有意差検定の結果、銀河と、フラジェリンが蓄積した４系統のうち３系統（Ｄ／１１−２０−２、Ｄ／１１−２０−３、Ｄ／１１−２４−３）において、危険率１％で、コシヒカリの病徴指数分布に対する有意差が検出された。
一方接種１６日後の結果（図５）では、原系統のコシヒカリでは供試した３１個体の全個体が枯死した。日本晴とＤ／１１−３１−１、Ｄ／１１−２０−１もコシヒカリと同様な分布を示し、殆どの個体の病徴レベルが９（病斑面積率１００％）であった。これに対し、銀河では半数以上の個体が病徴レベル５以下（病斑面積率２０％以下）であった。接種６日後でコシヒカリとの有意差が見られた３系統Ｄ／１１−２０−２、Ｄ／１１−２０−３、Ｄ／１１−２４−３においては、病徴レベルの低い個体が見られ、これらの系統の病徴レベルの分布図は、統計的にはコシヒカリのそれと１％の危険率で有意な差異が検出された。以上の結果からフラジェリン導入により、イネの病害抵抗性を増強させることが出来ることが示された。
接種１６日後の各個体からタンパク質を抽出、フラジェリンタンパク質の蓄積量をウェスタン分析により解析した。さらにフラジェリン発現量といもち病抵抗性の強さとの関係を調べるため、各個体のフラジェリンの発現量と、その個体の接種６日後のいもち病病徴指数（図３）との関連を図６に示した。ウイルコクソンの順位和検定の結果、フラジェリンを発現する（＋）、しない（−）間で、いもち病病徴指数の分布に５％の危険率で有意な差が得られた。この結果は、いもち病抵抗性の増強が、フラジェリンの発現によってもたらされたことを示すものである。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
【発明の効果】
本発明により、フラジェリンをコードする遺伝子を構成的プロモーターに接続して、植物に導入することにより、その植物に病害抵抗性を付与できることが初めて明らかとなった。このフラジェリン導入植物は、タンパク質性エリシターであるフラジェリンの作用機作を解明する上で、また局部、全身獲得抵抗性の機構を解明する上で役立つと考えられる。また、誘導性のプロモーターを用いなければ困難であろうと従来考えられていたタンパク質性エリシター導入による抵抗性植物の作出を、構成的プロモーターを用いても十分適用可能であることを示し、本アプローチの適用範囲の拡大を示すことができた。フラジェリンをコードするＤＮＡ配列を、植物細胞の中で機能しうる適当な構成的、器官・時期特異性、あるいはストレスや病害虫、または化学物質で誘導されるプロモーター配列と植物細胞で機能しうるターミネーター配列の発現カセットに組み込み、植物細胞に導入、再生個体を得ることにより、病害抵抗性植物を作出するという方法は、遺伝子工学的に可能かつ有効なアプローチであることを本発明は示した。
【００４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｔ０世代の形質転換イネにおけるウエスタン分析によるフラジェリンタンパク質の蓄積の検出例を示す図である。ＰＣは対照とした大腸菌発現フラジェリン（３０ｎｇ）を、Ｔは形質転換体（総可溶性タンパク質３０μｇ）を、Ｃは原系統のコシヒカリ（総可溶性タンパク質３０μｇ）をそれぞれ示す。発現量の評価は表１に記載の通りである。
【図２】図２は、Ｔ０世代の形質転換イネにおけるノーザンブロットによるＰＡＬ遺伝子の発現を示した図である。Ｄ／１１は形質転換体を示す。対照はＧＵＳ遺伝子導入個体を用いた。
【図３】図３は、接種６〜７日後のいもち病病徴指数の模式図である。
【図４】図４は、Ｔ１世代の形質転換イネにおける接種６日後のいもち病検定結果を示したグラフである。病徴指数の評価は図３に記載の通りである。
【図５】図５は、Ｔ１世代の形質転換イネにおける接種１６日後のいもち病検定結果を示したグラフである。各病徴レベルにおける病斑面積率は、レベル０が０％、レベル１が１％、レベル２が２％、レベル３が５％、レベル４が１０％、レベル５が２０％、レベル６が４０％、レベル７が６０％、レベル８が８０％、レベル９が１００％である。
【図６】図６は、Ｔ１世代の形質転換イネにおける接種６日後のいもち病抵抗性の程度とフラジェリン発現レベルの関連を示した図である。病徴指数の評価は図３に、発現量の評価は表１に記載の通りである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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