(57)【要約】      （修正有）【課題】高効率、高精度で試料被検試料の低減が可能であり、かつ迅速なマイクロアレイ解析が可能なプローブ固相化反応アレイ、並びに該アレイを用いた解析方法を提供する。【解決手段】支持体に独立して形成された第１から第ｎまでの複数の反応部を備え、反応部には、プローブが複数固定化され、複数列で配置されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイである。さらに、（１）プローブ固相化反応アレイに具備される第１から第ｎまでの反応部に対して被検試料を添加することと、（２）第１から第ｎまでの反応部における反応条件を、各反応部の至適反応条件に従って制御しながら、前記プローブ群と標的物質とを反応させることと、（３）プローブと標的物質との結合を検出することによって、被検試料中の標的物質を検出する方法である。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブが支持体に固相化されたプローブ固相化反応アレイであって、
前記支持体は、前記支持体に独立して形成された第１から第ｎまでの複数の反応部（ここでｎは２以上の整数である）を備え、
該反応部には、プローブが複数固定化されており、
該プローブの配置は複数列であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項２】
請求項１に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記複数列が２列以上２０列以下となっていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記反応部の任意の位置にスポットしたＤＮＡプローブ以外に、情報を知らせるマーカがスポットされていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項４】
請求項３に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記マーカは蛍光マーカであることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記反応部は、キャピラリ形状であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記反応部は、ウェル形状であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、ビーズに固定されたプローブにより間接的に支持体に固相化されているプローブ固相化反応アレイ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記反応部に固相化されたプローブは、核酸、タンパク質、抗体または抗原からなる群から選択される一以上のプローブであることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項９】
請求項８に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、核酸プローブであることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項１０】
請求項８に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、タンパク質プローブを含むことを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項１１】
請求項８に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、抗体を含むことを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項１２】
請求項８に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブには、抗原を含むことを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイを使用した標的物質の検出方法であって、
（１）請求項１に記載の前記プローブ固相化反応アレイに具備される前記第１から第ｎまでの反応部に対して被検試料を添加することと、
（２）前記第１から第ｎまでの反応部における反応条件を、各反応部の至適反応条件に従って制御しながら、前記プローブと標的物質とを反応させることと、
（３）前記プローブと標的物質との結合を検出することによって、被検試料中に標的物質が存在することを検出することと、
を具備する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプローブ固相化反応アレイを使用した標的物質の検出方法であって、前記注入試薬または被検試料が蛍光標識されていることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のプローブ固相化反応アレイを使用した標的物質の検出方法であって、自動化装置によって解析を行うことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プローブ固相化反応アレイに関する。具体的には、核酸およびタンパク質などの解析に使用するためのプローブ固相化反応アレイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡマイクロアレイの基本原理は、多数の異なったＤＮＡターゲットをガラスなどの固相基盤上に高密度に固定する。その上に標識ＤＮＡをハイブリダイズさせ、各々のプローブからのシグナルを自動検出器で検出し、そのデータをコンピュータで大量解析する。ＤＮＡマイクロアレイでは、大量解析、検出感度の向上、マイクロ化によるサンプルの節約、データ取得の自動化、およびデータ処理による簡便化などが期待されている。このＤＮＡマイクロアレイは大きく分けてＤＮＡをガラス表面上で合成していくタイプ（ＤＮＡチップ）と（非特許文献１）、あらかじめ調製したＤＮＡを機械的に並べていくタイプ（ＤＮＡマイクロアレイ）がある（非特許文献２）。スライドガラスにＤＮＡを張り付けていくタイプのＤＮＡマイクロアレイは大がかりな半導体製造機を必要とせず、ＤＮＡアレイ機および検出機があればできる。張り付けるＤＮＡを任意に選べるのが利点であるが、その一方で、ＤＮＡのコレクションを調製しなければならない繁雑さがある。ピン先で物理的にスポットしていくのでＤＮＡの高密度化は光リソグラフ方式よりは劣るが、それでも、例えば直径１００μｍのスポットを１００μｍ間隔でスポットすると計算上１ｃｍ２に２５００スポットが可能であり、通常のスライドガラスｌ枚（有効面積は約４ｃｍ２）に約１万のＤＮＡを乗せることができる。
【０００３】
アレイ機は基本的に、高性能サーボモータを組み合わせ、コンピユータ制御下でピン先あるいはスライドホルダーをＸＹＺ軸方向に作動して、マイクロタイタープレートからスライドガラス表面上にＤＮＡサンプルを運ぶものである。ピン先の形状には多くの工夫がなされており、この技術の命であると言える。最も一般的なものはカラス口のように割れたペン先の形状で、そこにＤＮＡ溶液を溜めて、複数のスライドにスポットする方式である。洗浄・乾燥のサイクルをはさんで次のＤＮＡサンプルを乗せるという工程を繰り返す。理想的なアレイ機に求められる機能は、スポットのサイズや形状が均一で、しかも高速で再現性が良いことである。ピン先のロットの違いなどにより均一性やスピードに限界があるので、より高性能なものを求めてインクジェット方式やキャピラリー方式など、新しい技術の開発も進められている。
【０００４】
ＤＮＡ固定法に関しては、ガラスはメンブレンと比軟して有効固定面積が小さく電荷のチャージも少ないので種々のコーティングが試みられている。実用的にはポリＬリジンや、シラン化などが用いられている。ＤＮＡ末端をアミノ化してシラン化ガラスにクロスリンクする方法もある。
【０００５】
プローブＤＮＡは、通常、組織または細胞より抽出したｍＲＮＡもしくはｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する際に、Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰを用いてラベルする。オリゴｄＴプライマーまたはランダムプライマーおよび逆転写酵素を用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成する際にラベリングする場合が多い。現在行われている遺伝子発現解析の主流は、二蛍光標識法を用いたディファレンシャルな遺伝子発現を見る系である。その原理は、２つの異なったｍＲＮＡサンプル中での遺伝子発現の差を検出するためにそれぞれを異なる蛍光を標識し、アレイ上で競合的ハイブリダイゼーションを行って、両方の蛍光を測定し比較するというものである。
【０００６】
また、近年では複数のタンパク質やペプチドを固定したプロテインチップなるものが、開発されてきた。たとえば、非特許文献３ではＤＮＡプローブアレイ用のスポッターを用いて１万を越える蛋白を固定したチップを作成している。また、サイファージェン社ではプロテインチップと質量分析機を組み合わせた蛋白の構造解析、相互作用解析システムを開発した。
【０００７】
上記のように、ＤＮＡの解析においては多数の異なったＤＮＡプローブをガラスなどの固相基板上に高密度に固定し、その上に標識ＤＮＡをハイブリダイズさせ、各々のプローブからのシグナルを自動検出器で検出し、そのデータをコンピュータで大量解析する。これらは、以下の問題点がある。
【０００８】
一般に固定された多数のＤＮＡプローブの反応条件は一定ではない。厳密には、ＤＮＡのハンブリダイゼーション反応条件は反応時に形成される２本鎖ＤＮＡの塩基配列と構成塩基に影響を受ける。２本鎖ＤＮＡが１本鎖に開裂する温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）と言われ、おおよそ水素結合の数と周囲のイオン濃度によって決まる。ＤＮＡの構成塩基に関してはＧＣ結合では水素結合が３カ所、ＡＴ結合では２カ所であるので、同じ長さのＤＮＡでもＧＣの含有量によってＴｍは変化する。また、溶液中の塩濃度を上げるとＴｍが上昇する。例えば塩濃度を１０倍変化させるとＴｍは１０数度変化する。
【０００９】
このような問題を鑑み、発明者等は反応領域を複数設け、反応条件毎にＤＮＡプローブをグループ分けして、それぞれに最適な反応条件で反応を行うことが出来るチップを考案した。しかし、固定するＤＮＡプローブに関しては、使用するスポッターの性能とスポットすべき支持体の形状、サイズ等の適用条件が最適化されているとはいえないので、プローブの数や密度が制限されてしまう。一方、より多くのＤＮＡプローブを固定したいというニーズもある。また、固相化ＤＮＡプローブ数の増加に伴い、反応後のデータ処理を間違いなく、かつ効率的に行うための識別マーカの重要性も増している。
【００１０】
【特許文献１】
特開２０００−１３５０８１号公報
【００１１】
【非特許文献１】
Ｐｅａｓｅ  ＡＣ，  Ｓｏｌａｓ  Ｄ，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＥＪ，  Ｃｒｏｎｉｎ  ＭＴ，  Ｈｏｌｍｅｓ  ＣＰ，  Ｆｏｄｏｒ  ＳＰ．、Ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．、“Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ”、（ＵＳＡ）、１９９４年、９１巻、ｐ．５０２２−５０２６
【００１２】
【非特許文献２】
Ｓｃｈｅｎａ  Ｍ，  Ｓｈａｌｏｎ  Ｄ，  Ｄａｖｉｓ  ＲＷ，  Ｂｒｏｗｎ  ＰＯ．、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、（ＵＳＡ）、１９９５年、２７０巻、ｐ．４６７−４７０
【００１３】
【非特許文献３】
Ｓｅｒｖｉｃｅ  ＲＦ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｒａｙｓ  ｓｔｅｐ  ｏｕｔ  ｏｆ  ＤＮＡ’ｓ  ｓｈａｄｏｗ．、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、（ＵＳＡ）、２０００年、２８９（５４８５）巻、ｐ．１６７３
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような状況に鑑み、本発明は、プローブ固相密度が向上されたプローブ固相化反応アレイ、反応後のデータ処理を間違えることなく効率的に行うことができるプローブ固相化反応アレイ、並びに該アレイを使用した解析方法の提供を目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
従来のキャピラリ形状などのプローブ固相化反応アレイでは、各反応部に固定化するプローブ数が制限されていた。そこで、１の反応部に複数列でプローブを固定化することによりプローブ密度の向上が可能であることに着目し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
また、ＤＮＡプローブを固相するためのスポッティング装置の改良が進み、小口径で基板上の任意の位置に精密にスポットする事が可能な装置が開発されており、このような装置を改良してフレキシブルなＤＮＡプローブ配置を可能にした。このような改良により、各反応部に複数配列でプローブを固定化することができ、また蛍光マーカをスポットすることができることに着目し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明の一つの態様において、プローブが支持体に固相化されたプローブ固相化反応アレイであって、
支持体は、該支持体に独立して形成された第１から第ｎまでの複数の反応部（ここでｎは２以上の整数である）を備え、
該反応部には、プローブが複数固定化されており、
該プローブの配置は複数列であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１８】
また、上記プローブ固相化反応アレイであって、複数列が２列以上２０列以下となっていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１９】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、反応部の任意の位置にスポットしたＤＮＡプローブ以外に、情報を知らせるマーカがスポットされていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００２０】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、マーカは蛍光マーカであることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００２１】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、反応部は、キャピラリ形状またはウェル形状であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００２２】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、プローブは、ビーズに固定されたプローブにより間接的に支持体に固相化されているプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００２３】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、反応部に固相化されたプローブは、核酸、タンパク質、抗体または抗原からなるプローブ群から選択される一以上のプローブであることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供するを提供する。
【００２４】
また、本発明のもう一つの態様において、上記プローブ固相化反応アレイを使用した標的物質の検出方法であって、
（１）上記プローブ固相化反応アレイに具備される第１から第ｎまでの反応部に対して被検試料を添加することと、
（２）第１から第ｎまでの反応部における反応条件を、各反応部の至適反応条件に従って制御しながら、プローブと標的物質とを反応させることと、
（３）プローブと標的物質との結合を検出することによって、被検試料中に標的物質が存在することを検出することと、
を具備する方法を提供する。
【００２５】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイを使用した標的物質の検出方法であって、注入試薬または被検試料が蛍光標識されていることを特徴とする方法を提供する。
【００２６】
さらに上記プローブ固相化反応アレイを使用した標的物質の検出方法であって、自動化装置によって解析を行うことを特徴とする方法を提供する。
【００２７】
かかる構造によれば、反応部毎、即ち、プローブ群毎に１つの至適反応条件を適用できるので、何れのプローブ群についても最良の反応結果を得ることが可能である。また、１つのプローブ群のプローブ数を従来のアレイよりも増大することが可能となり、プローブ固相化アレイの再現性のみならず反応効率が格段に向上する。
【００２８】
【発明の実施の形態】
ここで、本明細書において使用される「核酸」の語は、天然に存在する種々のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ−オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体などを指す。
【００２９】
本明細書において使用される「標的物質」の語は、プローブにより検出されるべき物質をいう。たとえば、核酸、タンパク質などが含まれ、より詳細には、ペプチド、抗原および抗体なども含まれる。一般的に、核酸プローブであれば、標的核酸に相補的な塩基配列を有するように設計される。また、標的物質が抗原であれば、該抗原に特異的に結合可能な抗体がプローブとして使用される。被検試料に含まれる被検核酸が標的配列が有する塩基配列を有している場合には、核酸プローブと標的配列の間にハイブリダイゼーションが生じる。したがって、このハイブリダイゼーションを検出することにより被検試料に含まれる核酸を解析することが可能である。ハイブリダイゼーションの検出はそれ自身公知の手段により行ってよい。標的核酸の標的になる塩基配列を「標的配列」と称す。
【００３０】
本明細書において使用される「被検試料」の語は、生物個体から採取した細胞、組織、臓器、血液、血清、リンパ液、組織、毛髪および耳垢などの生物試料を所望に応じて調製した試料や、人工的に合成または製造した物質を含む試験に供したい試料をいう。また、「被検試料」は必要に応じて、生物試料をホモジネートおよび抽出などの必要な任意の前処理を行って得た試料であってもよい。このような前処理は、対象となる生物試料に応じて当業者によって選択され得るであろう。
【００３１】
本明細書において使用される「個体」の語は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む任意の哺乳動物、並びに植物および昆虫など哺乳動物以外の生物を示す。
【００３２】
以下、本発明のプローブ固相化反応アレイについて、反応部がキャピラリ形状のアレイを例にして説明する（図１）。
【００３３】
図１（Ａ）は、本発明のプローブ固相化反応アレイを上面から見た平面図である。また、図１（Ｂ）は、本態様であるプローブ固相化反応アレイ１をキャピラリ４に沿って切断した断面図である。
【００３４】
プローブ固相化反応アレイ１は、透明なガラス製の基板３４とシリコン基板３５を用いて製造されたプローブ固相化反応アレイの例である。
【００３５】
プローブ固相化反応アレイ１の基板の内部には複数のキャピラリ２、３、４、５、６、７、８および９が、同一平面上に並列して平行に形成されている。それぞれのキャピラリは互いに独立して形成されるので、他のキャピラリに含まれる流体と互いに混じり合うことはない。また、それぞれのキャピラリの両端には、開口部が形成されている。具体的には、キャピラリ２、３、４、５、６、７、８および９には、それぞれ試料注入口１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５と、試料排出口２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２および３３が形成されている。キャピラリ２、３、４、５、６、７、８および９の内部には、それぞれの解析項目に応じて適切なプローブ群１０〜プローブ群１７が固定されている。
【００３６】
各アレイは、複数のプローブが固定化されている。これらプローブの配置は、複数列となっている。たとえば、キャピラリ４に複数列でプローブを固定化した例を図２または３に示す。図２は、プローブを３列に固定化した例である。また、図３は、プローブを４列に固定化した例である。プローブを１列おきに同じ配置で４列に固相化した。
【００３７】
１つの反応部には、何列でプローブを固相化してもよい。しかし、列数は、スポット径、キャピラリの太さなどによる制限を受けてしまう。たとえば、試料注入、洗浄液などの交換の容易性を考慮すると、実用的には反応部の幅は数ミリ以内が好ましい。また、プローブを２０列配置するためには、反応部の幅が約５ｍｍ程度必要である。したがって、配列数は、２列以上２０列以下が好ましい。
【００３８】
複数の反応部を有するプローブ固相化反応アレイは、既に開発されているが、１つの反応部に複数列で同種のプローブが固相化されたアレイは、従来技術にはみられなかった。このように１つの反応部に複数列でプローブを固定化することにより、固定化を行う支持体の形状およびサイズに応じてプローブ密度を向上することができるだけでなく、測定項目数に対して配列数を調整して、それぞれのキャピラリ毎に独自のアレイデザインが可能となるので、多様な反応条件を得ることができるようになる。
【００３９】
一方、アレイには、プローブの代わりにマーカを固定化することもできる。マーカは、単なるスポットでもよいが、複数列でアレイにスポットすることにより、記号、数字、文字またはバーコード等を記入するで情報量を増大することもできる。たとえば、図４では、ＯＬＹＭＰＵＳというアルファベットの文字列をキャピラリ内にスポットした。また、マーカは、アレイの反応部にスポットしてもよく、反応部位外の部分にスポットしてもよい。図４のＧＭＢというアルファベットの文字列は、基板上にスポットした例である。
【００４０】
このようなマーカにより、各反応部およびアレイの識別が容易となる。また、マーカとして蛍光マーカを使用することにより、該マーカを蛍光標識された被検試料と共に蛍光イメージ上で確認することができる。また、着色されたマーカを使用すれば、アレイの外見上から識別することもできる。特に、キャピラリ内壁にマーカを付与した場合には、データを測定するときと同様の測定機器または測定操作によってアレイ毎の識別が可能となる。場合によっては、同一の固定化すべき支持体に、プローブの種類と同数のマーカを各プローブ近傍にそれぞれ固定化することにより、同一アレイ上の多数のデータを識別することも可能である。
【００４１】
上記マーカは、蛍光色素を使用することが好ましいが、検出方法に応じて種々のマーカを使用することができる。たとえば、蛍光を検出するのであればＣｙ３、ＦＩＴＣおよびＣｙ５等の蛍光色素を使用すればよい。
【００４２】
このようなマーカを使用することにより、データ処理時のミスを減少し、効率を向上することができる。
【００４３】
上記プローブ固相化反応アレイ１は、たとえば、次のように製造することが可能である。同じ大きさのガラス基板とシリコン基板を用意し、基板３４と基板３５とする。基板３５にエッチングによって溝を形成する。解析項目に応じて所望のプローブを予め準備しておき、これらのプローブを各反応部の溝の底部に対してスポッティングすることによって固定すればよい。一方、基板３４には、基板３５の溝の両端に対応する部分に対して貫通穴が空けられる。次に、基板３４と基板３５を接合する。それぞれの開口部に所望の長さのガラス管を接着することにより連結部３７ａおよび３７ｂを形成する。該連結部は、使用する装置に応じて、ガラス管が接着されていなくてもよく、単に開口部を有するだけであってもよい。キャピラリ形状の空間のサイズは、用途に合わせて種々の大きさに設定することができるが、実用的には幅が１０μｍ〜数ｍｍ、深さ１μｍ〜５００μｍ、長さ数ｍｍ〜１００ｍｍ、キャピラリ間隔１０μｍ〜数ｍｍ程度で充分である。ただし、反応の効率性を考えると、測定対象となるｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから合成または逆転写したｃＤＮＡなどの核酸の拡散速度は毎秒数μｍと遅いので、キャピラリ形状の空間の断面形状は、幅を広くしても深さは浅くするような扁平構造をとることにより、反応時間の短縮、試料の微量化、観察視野の増加等が期待できる。
【００４４】
上記の例では、基板３５に溝を形成したが、基板３４でもよいし基板３４と基板３５の両方に形成されていてもよい。また、支持体の材料として、蓋として用いる基板にはガラス製基板を使用し、溝を形成する基板にはシリコン基板を使用したが、これに限定されるものではなく、蓋として用いる基板にシリコン基板を使用し、溝を形成する基板にガラス製基板を使用してもよい。また、使用される２枚の基板を同じ材質としてもよい。また、観察の方向に透過性部材が配置されるように、使用する部材を決定してもよい。あるいは、プラスチック樹脂やゴムなどで形成された支持体を使用してもよい。また、これらの材質、ガラス、シリコン、プラスチック樹脂およびゴムなどの材質で形成された支持体を組み合わせて使用してもよい。また、上記の例では支持体として板状の基板を使用しているが、これに限定されるものではない。
【００４５】
ガラスやシリコンウエハ様の基板では、たとえば、フォトリソ−エッチングなどの技術により溝および貫通穴を形成することが可能である。また、プラスチック樹脂やゴムなどの場合には機械加工やモールド加工などにより溝および貫通穴を形成することが可能である。
【００４６】
また、２枚の基板の接合は、それ自身公知の手段により、プローブの固定の前または固定後に行われればよい。たとえば、核酸プローブを固定前に接合した場合には、光固相化法（たとえば特表平６−５０４９９７参照）を適用して核酸プローブを固定化するのが好ましい。たとえば、シリコン−石英ガラスの場合には、接着剤をスクリーン印刷機により印刷して接着すればよい。たとえば、シリコン−パイレックスガラスの場合には、半導体プロセスで使用される陽極接合法により、高温および高電圧の下で接合を行えばよい。
【００４７】
上記の例では、基板３５の溝の底部にプローブを固定したが、基板３４にそれを固定してもよく、また、各反応部の側面にそれを固定してもよい。基板には、プローブを固相化するために適切な表面処理、たとえば、ポリＬリジン処理、アミノシラン処理および酸化膜処理等の表面処理を行うことが可能である。
【００４８】
プローブの固定手段は、それ自身公知の何れかの手段を使用してもよい。たとえば、核酸プローブの固定化であれば、スポッティング法および光固相化法などを使用してもよい。たとえば、スポッティング法を使用する場合、インクジェット方式スポッターを使用して固定化することができる。反応部の数に応じてインクジェット方式スポッターを自作してもよく、図１のアレイを作製するときであれば８連のインクジェットノズルのものを使用することにより、迅速にスポットすることができる。このような自作のスポット装置を使用することにより、プローブ配置を自在に行うことができる。たとえば、所望の配列数、スポット径、スポットのパターン等に変更可能に設計されたスポッターを使用することにより、最適なスポット数および密度で固定化することができる。
【００４９】
さらに、固定化するプローブは、ビーズにあらかじめ固定化されたプローブを使用してもよい。この場合、プローブが固定化されたビーズを基板に固定化することとなる。このようなビーズに所望の核酸プローブを固相するためのプローブ供給手段は、基体の材料により、それ自身公知の何れかの手段を使用することができる。公知の手段を、立体状基体または粒状基体の曲面、特に球面に適用し得るように改良することも可能である。たとえば、曲面体に加工を施した基体上に核酸プローブを配するためには、光固相方式および点着方式の２つの手法を適宜組み合わせて用いることによって曲面の部分領域に対して定量的に核酸プローブを固相することが可能となる。
【００５０】
上記ビーズを基板に固定化するには、たとえばそれ自体公知のいずれの手段を使用してもよい。たとえば、ビーズが磁性粒子であれば、あらかじめキャピラリの内部または外方の所望の位置に磁石を固定化しておくことにより、磁力でビーズを固定することも可能である。
【００５１】
また、本発明のアレイに固定化されるプローブは、核酸、タンパク質、抗体、抗原または細胞からなる群から選択されるが、好ましくは核酸プローブである。
【００５２】
本実施の形態では、プローブ固相化反応アレイ１に含まれる反応部の形状をキャピラリとしたが、この形状に限定されるものではない。たとえば、反応部の形状は、底面が角型、円または楕円であるようなウェル形状であってもよい。
【００５３】
また、本発明のプローブ固相化反応アレイは、上記キャピラリ形状およびウェル形状の他に、物理的に互いに隔離された反応部が形成されたデバイス構造の種々の構造であってもよい。上記例では、プローブ固相化反応アレイ１に含まれる反応部を８つとし、反応部のそれぞれに試料注入口および／または試料排出口として使用できる１以上の開口部を形成したが、この数に限定されるものではなく、複数の反応部を具備すればよい。すなわち、互いに独立した反応部を有していればよく、たとえば、凹部または凸部により仕切られた領域に開口部を有する蓋または底部を配置し、有効容積のある反応部を形成すればよい。
【００５４】
また、基板内部に反応部を形成した閉鎖系の反応アレイのみでなく、単に凹部または凸部により仕切られた容器に対しても、または平面からなる特に仕切のない領域であっても、互いに独立し、かつ任意の方向に並列して複数の反応部を支持体に備え、充分に離間しているかあるいは多数の垂直孔によって液の拡散が妨げられていれば本発明の態様に使用することが可能である。このような装置およびその使用も本発明の範囲に含まれる。
【００５５】
また、本実施の形態では、ヒータが本発明に従う反応アレイと別体である１例を示したが、ヒータおよびセンサ並びに必要な配線等が反応アレイ中に組み込まれていてもよく、これを具備していない反応アレイであってもよい。
【００５６】
次に、本発明に従うプローブ固相化アレイを用いて、個体における標的物質に関する情報を得る方法も提供される。
【００５７】
そのような方法は、たとえば、以下のように行うことが可能である。まず、それ自身公知の手段により個体から被検試料を得る。次に、本発明に従うプローブ固相化反応アレイに具備される反応部の所望する数の反応部、または所望する数の複数のプローブ固相化反応アレイに対して被検試料を添加する。被検試料は、後で検出できるように追跡可能な光学的または物理的標識が行われていることが望ましい。したがって、上記追跡可能な標識物、たとえば、蛍光色素、発光色素等を使用して、あらかじめ被検試料を標識しておくことが好ましい。標的核酸を含む被検試料の標識は、たとえば、標的物質が核酸であれば、蛍光標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＵＴＰ）を取り込みながら標識を行う方法を使用するか、またはあらかじめ蛍光標識されたプライマーにより増幅を行って、標識物を導入する方法を使用することができる。その他にも、増幅後に色素を結合させる方法などを使用することができるが、これらに限定されない。使用可能な標識としては、Ｃｙ３、ＦＩＴＣおよびＣｙ５等があるが、これらに限定されるものではない。たとえば、ハイブリダイゼーションの検出方法として、ハイブリダイゼーション後の偏光性の変化を検出する方法を使用可能する場合等には、非標識のまま標的核酸を使用することもできる。
【００５８】
標的核酸として１種類の標的核酸だけでなく、２種類以上の標的核酸を混合させて行うことも可能である。この場合は、数種類の標識で標的核酸を標識してもよい。また、各反応部毎に標識の種類を変更して反応を行ってもよい。
【００５９】
次いで、被検試料を添加した反応部における反応条件を、各反応部に具備されるプローブ群の各々の至適反応条件となるように反応条件の制御を行いながら、プローブと標的物質とを反応させる。
【００６０】
至適反応条件は、当業者であれば容易に制御可能であろう。たとえば、図１のプローブ固相化反応アレイ１において、それぞれのキャピラリに具備されるプローブをプローブのＴｍによって分類した場合、それぞれのキャピラリ毎に温度を制御する。至適温度の条件は、各キャピラリ毎にヒータにより調節することもできる。
【００６１】
また、全ての反応部を一定の温度に維持してイオン濃度および塩濃度により至適反応条件を得てもよい。たとえば、至適反応温度の異なる全ての反応部について一定温度でハイブリダイズさせる場合には、ハイブリダイゼーション時に使用する反応液を調節すればよい。すなわち、核酸ハイブリダイゼーションを行う場合に、各反応部の至適濃度が異なっているときであっても、標的核酸を含む被検試料の溶液として使用する緩衝液等の塩濃度を反応部毎に調節することによって達成することが可能である。
【００６２】
続いて、プローブと標的物質の結合を検出することによって、被検試料中に標的物質が存在することを検出する。この検出は、使用する標識物質に応じたそれ自身公知の手段により行うことが可能である。
【００６３】
次に、検出により得られた結果から、個体における標的物質に関する情報を得ることによって、個体における標的物質に関する情報を得る。
【００６４】
このような方法により得られる情報は、対象となる個体の遺伝子発現に関する情報、ゲノムに関する情報、蛋白質発現に関する情報、抗原抗体などに関する免疫情報、並びに感染や疾病に関する情報などであるが、これに限定されるものではない。所望する情報を得るためのプローブは、予め設計または選択しておけばよい。
【００６５】
上記方法の実施の際に、上記マーカを固定化したアレイを使用すれば、その使用態様により、反応後のデータ処理をとり間違えることなく効率的に行うことができる。
【００６６】
また、自動化装置によれば、上記方法を自動で実施することもできる。
【００６７】
上記方法は、たとえば、特願２００２−０３４１９７に記載の処理装置にしたがって実施することもできる。
【００６８】
従来の方法では、１つの反応部に固定されるプローブ数が制限されていたが、本発明のプローブ固相化反応アレイを使用することにより、より多くのプローブについて解析可能な方法が提供される。
【００６９】
【実施例】
（実施の様態１）
図１は本発明の実施例である。本実施例ではスポットの状態がよくわかるように蛍光色素を試料としてスポットした。スポットに用いた装置は自作の８連のインクジェット方式スポッターである。この装置は２５μｍの位置精度で任意の位置にスポット可能でかつ、８連のインクジェットノズルは独立にスポット動作する。スポット配置は、制御用コンピュータ上で望みのスポット数および配置パターンでアレイデザインが出来るようになっている。また、本実施例の装置は、スポット径を８０μｍまで縮小可能である。試料をスポットした後、市販の蛍光スキャナー（Ｓｃａｎ  ａｒｒａｙ  ４０００）で蛍光イメージを読みとった。このようなスポッターの改良は、たとえば特願２００２−１３５２８４の記載にしたがって製造することができる。
【００７０】
図１−ａは、大きく８本のＤＮＡプローブ配列を固定化した模式図である。この８本がＤＮＡキャピラリの溝構造に相当し、おのおの独立した反応部となる。各反応部は、３列にＤＮＡプローブが配置されている。また、図の上端にはＧＭＢ、左から８本目のキャピラリに相当する位置にはＯＬＹＭＰＵＳとアルファベットでスポットした。
【００７１】
この図から分かるように、自作のスポット装置を使用することによりＤＮＡプローブの配置を自在に行うことが出きる。また、１本のキャピラリ中に複数列でプローブを配置することができる。
【００７２】
【発明の効果】
本発明のアレイによれば、プローブの種類毎に至適な反応条件を適用し、それぞれの反応に応じたターゲットを使用してハイブリダイゼーションを行う場合にも、多数のプローブについて解析を行うことができる。
【００７３】
これまでのマイクロアレイ解析では、複数項目の解析を同時に行うことが困難であったが、本発明により、省資源化、低コスト化が図られ、迅速に精度良く、遺伝子発現頻度および遺伝子多型解析等のハイブリダイゼーションを基本とした解析を行うことが可能となる。従来別々のアレイ上で行っていた検査について、一度に解析が可能となり、たとえば、検査の効率化が図れるとともに、解析時における個人データの取り扱いについてミスが少なくなるであろう。
【００７４】
また、キャピラリアレイでは、反応自動化装置を使用することにより、多数キャピラリでの反応を自動で行うことが可能である。したがって、多量検体の解析もハイスループットで行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に係るプローブ固相化反応アレイを示す図。
【図２】本発明のプローブ固相化反応アレイの反応部の拡大図。
【図３】本発明のプローブ固相化反応アレイの反応部の拡大図。
【図４】本発明の一実施形態に係るプローブ固相化反応アレイを示す図。
【符号の説明】
１  プローブ固相化反応アレイ
２，３，４，５，６，７，８，９  キャピラリ（反応部）
１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７  プローブ群
１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５  試料注入口
２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３  試料排出口
３４，３５  基板
３６  ヒータ
３７ａ、３７ｂ  連結部
【図１】
2004333255.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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