(57)【要約】【課題】酵素Ｇ６ＰＤＨによる上記反応を停止させ、正確な定量を行える、生体物質の定量方法を提供する。【解決手段】第一反応として、検体にＧＬＤＨ、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）、Ｇ６ＰおよびＧ６ＰＤＨを添加混合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消去する第１ステップと、次いで第二反応として、炭素数３〜７の１価アルコールを添加し、Ｇ６ＰＤＨの反応を停止する第２ステップと、第２ステップと同時もしくはしかる後アンモニアを生成させる酵素を添加して、生成するアンモニアを測定する第３ステップとを含む。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一反応として、検体にＧＬＤＨ、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）、Ｇ６ＰおよびＧ６ＰＤＨを添加混合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消去する第１ステップと、
次いで第二反応として、炭素数３〜７の１価アルコールを添加し、Ｇ６ＰＤＨの反応を停止する第２ステップと、
前記第２ステップと同時もしくはしかる後アンモニアを生成させる酵素を添加して、生成するアンモニアを測定する第３ステップと
を含むことを特徴とする生体物質の定量方法。
【請求項２】
アンモニアを生成することができる生体物質を定量するための試薬セットであって、
ＧＬＤＨ、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）、Ｇ６ＰおよびＧ６ＰＤＨを含有する第一反応試薬と、
Ｇ６ＰＤＨの反応を停止するための炭素数３〜７の１価アルコールと、アンモニアを生成させるための酵素とを含有する第二反応試薬とを
具備することを特徴とする生体物質の定量試薬セット。
【請求項３】
前記アンモニアを生成することができる生体物質は、尿素である請求項２記載の生体物質の定量試薬セット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体物質の定量方法および定量試薬セットに関するものである。更に詳細には、本発明は、検体中にすでに存在するアンモニアを、あらかじめ消去し、アンモニアを生成することができる生体物質の量を、正確に測定する方法および定量試薬セットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
尿、血液等の検体には、尿素、クレアチニン、クレアチンなどのように、アンモニアを生成することができる生体物質が、存在する。
【０００３】
そして、このような生体物質そのものや、このような生体物質に関与する各種酵素の活性の測定は、普通に行われている。
【０００４】
従来の生体物質の定量方法では、アンモニアを生成させ、生成したアンモニアをＧＬＤＨ（グルタミン酸脱水素酵素）によってグルタミン酸に変換し、同時に起こる
ＮＡＤＨ→ＮＡＤ
（ここで、ＮＡＤＨ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレチオド、ＮＡＤ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）
または
ＮＡＤＰＨ→ＮＡＤＰ
（ここで、ＮＡＤＰＨ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレチオドリン酸、ＮＡＤＰ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）
の反応によって減少する、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量を、３４０ｎｍの吸光度減少を測定して定量していた。
【０００５】
しかしながら、このような反応系を用いると、検体中に、もともと存在するアンモニアが、測定値に含まれてしまい、正確な定量が困難になっていた。
【０００６】
これを避けるため、もともと検体中に存在するアンモニアを、ＧＬＤＨによってα−ＫＧ（α−ケトグルタル酸）と反応させて、グルタミン酸に変換させておけばよい。こうすれば、正確にアンモニアを定量できる。
【０００７】
ところで、このアンモニア→グルタミン酸の反応では、
ＮＡＤＨ→ＮＡＤ　または　ＮＡＤＰＨ→ＮＡＤＰ
の変化を伴う。
【０００８】
したがって、
ＮＡＤ→ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨ
の逆反応で、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに戻す必要がある。
【０００９】
即ち、検体中のアンモニアの消去が完了し、消費されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが復元された後、
ＮＡＤ→ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨ
の反応が完全に停止されねばならず、この条件が満たされて、はじめて生体成分を分解して得たアンモニアを、正確に定量できる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、特開昭６１−２４７４００号公報、特開昭６１−２４７９６３号公報、特開昭６２−６６９９号公報および特開昭６２−６７００号公報には、イソクエン酸を基質として、ｉＣＤＨとマグネシウムイオンまたはマンガンイオンなどの金属イオンによって、
ＮＡＤ→ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨ
の共役反応を生起させ、ＡＴＰ又は／およびキレート剤の添付によって、
ＮＡＤ→ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨ
の反応を停止させる方法が、開示されている。
【００１１】
しかしながら、これらの方法を用いるためには、ｉＣＤＨという特殊な酵素を用いることが必須であり、この特殊な酵素が入手できない場合には、これらの方法は、実施できない。そこで、より一般的な酵素により、正確な定量を行える方法が求められている。
【００１２】
ところで、一般に用いられている酵素である、Ｇ６ＰＤＨ（グルコース６リン酸脱水素酵素）によって、Ｇ６Ｐ（グルコース６リン酸）を基質として、
Ｇ６Ｐ＋ＮＡＤ→６ＧＰ＋ＮＡＤＨ　または　Ｇ６Ｐ＋ＮＡＤＰ→６ＧＰ＋ＮＡＤＰＨ
の反応を生起させることができることは一般に知られている。
【００１３】
また、Ｇ６ＰＤＨの阻害剤としては、ＦｅＣｌ３、ＦｅＳＯ４、ピリドキサル５−リン酸、ＺｎＳＯ４、Ｂｒｉｊ３５、ＳＤＳ、ＡＴＰ、無機リン酸などが知られている。
【００１４】
しかし、ＦｅＣｌ３、ＦｅＳＯ４、ピリドキサル５−リン酸では、３４０ｎｍ付近に吸収があり、３４０ｎｍの吸光度がレンジオーバーとなり、測定できない。
【００１５】
また、本発明者の実験によれば、ＺｎＳＯ４、Ｂｒｉｊ３５、ＳＤＳ、ＡＴＰ、無機リン酸などでは、Ｇ６ＰＤＨによる反応を、完全に停止させることはできなかった。
【００１６】
そこで本発明者は、一般に用いられている酵素であるＧ６ＰＤＨによる
Ｇ６Ｐ＋ＮＡＤ→６ＧＰ＋ＮＡＤＨ　または
Ｇ６Ｐ＋ＮＡＤＰ→６ＧＰ＋ＮＡＤＰＨ
の反応を完全に停止させようと、鋭意研究し、本発明を完成するに至ったものである。
【００１７】
即ち、本発明は、酵素Ｇ６ＰＤＨによる上記反応を停止させ、正確な定量を行える、生体物質の定量方法及びその関連技術を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決する手段】
本発明者は、Ｇ６ＰＤＨによるＧ６Ｐ＋ＮＡＤ→６ＧＰ＋ＮＡＤＨまたはＧ６Ｐ＋ＮＡＤＰ→６ＧＰ＋ＮＡＤＰＨの反応を完全に停止させ、アンモニアを生成することができる生体物質を正確に測定する方法を求めて鋭意研究した。
【００１９】
その結果、炭素数３〜７の１価アルコールを添加することによって、
Ｇ６Ｐ＋ＮＡＤ→６ＧＰ＋ＮＡＤＨ　または
Ｇ６Ｐ＋ＮＡＤＰ→６ＧＰ＋ＮＡＤＰＨ
の反応を完全に停止させることに成功した。
【００２０】
請求項１記載の生体物質の定量方法は、第一反応として、検体にＧＬＤＨ、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）、Ｇ６ＰおよびＧ６ＰＤＨを添加混合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消去する第１ステップと、次いで第二反応として、炭素数３〜７の１価アルコールを添加し、Ｇ６ＰＤＨの反応を停止する第２ステップと、第２ステップと同時もしくはしかる後アンモニアを生成させる酵素を添加して、生成するアンモニアを測定する第３ステップとを含む。
【００２１】
請求項２記載の試薬セットは、アンモニアを生成することができる生体物質を定量するための試薬セットであり、
ＧＬＤＨ、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）、Ｇ６ＰおよびＧ６ＰＤＨを含有する第一反応試薬と、Ｇ６ＰＤＨの反応を停止するための炭素数３〜７の１価アルコールと、アンモニアを生成させるための酵素とを含有する第二反応試薬とを具備する。
【００２２】
請求項３記載の生体物質の定量試薬セットでは、アンモニアを生成することができる生体物質は、尿素である。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。
まず、要点を述べると、次のとおりである。即ち、本形態では、ＧＬＤＨ、α−ＫＧ、およびＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）によって、検体中のアンモニアを完全に消去すると同時に、Ｇ６ＰとＧ６ＰＤＨにより消費されたＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）を復元し、アンモニアの完全消去ののち反応系に炭素数３〜７の１価アルコールを添加し、Ｇ６ＰＤＨの反応を停止させるものである。
【００２４】
Ｇ６ＰＤＨの反応を停止させた後は、炭素数３〜７の１価アルコールの添加と同時もしくはその後で検体中にアンモニアを生成させる酵素もしくは酵素群を添加し、アンモニアからグルタミン酸への共役反応としてＮＡＤＨ→ＮＡＤまたはＮＡＤＰＨ→ＮＡＤＰの反応にともなう３４０ｎｍの吸光度の減少によってそれぞれの物質を定量する。
【００２５】
アンモニアを生成させる酵素の反応としては、尿素とウレアーゼ、クレアチニンとクレアチニンデイミナーゼ、クレアチンとクレアチナーゼ・ウレアーゼの組合せなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
阻害剤は、炭素数３〜７の１価アルコールであればよく、例えば、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、１−ペンタノールなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
なお、本発明者の実験によれば、炭素数１および２のメタノールおよびエタノールでは、Ｇ６ＰＤＨの反応を完全には停止することができないことが明らかとなった。したがって、炭素数１および２のメタノールおよびエタノールを、阻害剤として使用することはできない。
【００２８】
また、本発明者は、その実験により、１，２−プロパンジオール、１，３−ブタンジオールなどの２価アルコールでは、Ｇ６ＰＤＨの反応を阻害しないことを確認している。
【００２９】
また、炭素数３〜７の１価アルコールによるＧ６ＰＤＨの反応の停止は、他の反応を阻害しないので、そのままで、
ＮＡＤＨ→ＮＡＤ　または
ＮＡＤＰＨ→ＮＡＤＰ
の反応を用い各種反応が行える。
【００３０】
図１には１−プロパノール、図２には１−ブタノール、図３には１−ペンタノール、図４にはエタノール、図５にはＢｒｉｊ３５のそれぞれの添加濃度でのＧ６ＰＤＨ相対活性（％）の変化を示す。
【００３１】
Ｇ６ＰＤＨの相対活性（％）が０でない場合、
ＮＡＤＨ→ＮＡＤ　または
ＮＡＤＰＨ→ＮＡＤＰ
の反応により消費されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが、Ｇ６ＰＤＨの作用による、
ＮＡＤ→ＮＡＤＨ　または
ＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨ
の反応で復元されるため、アンモニアを生成することができる生体物質を測定することができない。
【００３２】
したがって、阻害剤を添加した後のＧ６ＰＤＨの相対活性（％）は０となる必要がある。
【００３３】
図１〜３に示すように、反応系に対する１価アルコールの添加量は、Ｇ６ＰＤＨの相対活性（％）から最終濃度で、プロパノールでは７５０ｍＭ以上、ブタノールでは３００ｍＭ以上、ペンタノールでは１８０ｍＭ以上であれば、上記の条件を満たし、使用できる。
【００３４】
なお、図４〜５に示すように、エタノールおよびＢｒｉｊ３５は、Ｇ６ＰＤＨの相対活性（％）を０にすることはできないので、使用できない。
【００３５】
次に、本発明の実施例を示す。
（実施例１）
１５０ｍＭアンモニアを含む様々な濃度に調整した尿素含有検体（尿素窒素として０〜６００ｍｇ／ｄｌ）２０μｌに、α−ＫＧ　１４ｍＭ、ＮＡＤＰＨ　０．３１ｍＭ、ＧＬＤＨ　７Ｕ／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨ　１．２５Ｕ／ｍｌ、グルコース６リン酸　６．６ｍＭ、ＫＣｌ　４０ｍＭ、１，２−プロパンジオール　１．３６Ｍ、ノイゲン　ＥＴ１３５　５％を含有する５０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ８．３）２．７ｍｌを添加した。
【００３６】
それぞれ３７℃で５分間加温したのち、ウレアーゼ６０ｍＵ／ｍｌ、α−ＫＧ１４ｍＭ、１，２−プロパンジオール　２．７２Ｍ、１−プロパノール　３．２Ｍ、ＫＣｌ　４０ｍＭ、ノイゲン　ＥＴ１３５　５％を含有する５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）０．９ｍｌを加え、１分後、分光光度計により３７℃での３４０ｎｍの１分間における吸収度の減少から検体中の尿素窒素を測定した。測定結果は、次のとおりである。
2004024088.tif 000003
【００３７】
以上の測定結果から、アンモニアの影響を受けることなく、検体中の尿素の定量が可能であることを、確認できる。
【００３８】
（実施例２）
１５０ｍＭアンモニアを含む様々な濃度に調整した尿素含有検体（尿素窒素として０〜６００ｍｇ／ｄｌ）２０μｌに、、α−ＫＧ　１４ｍＭ、ＮＡＤＰＨ　０．３１ｍＭ、ＧＬＤＨ　７Ｕ／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨ　１．２５Ｕ／ｍｌ、グルコース６リン酸　６．６ｍＭ、ＫＣｌ　４０ｍＭ、１，２−プロパンジオール　１．３６Ｍ、ノイゲン　ＥＴ１３５　５％を含有する５０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ８．３）２．７ｍｌを添加した。
【００３９】
それぞれ３７℃で５分間加温したのち、ウレアーゼ６０ｍＵ／ｍｌ、α−ＫＧ１４ｍＭ、１，２−プロパンジオール　５．４５Ｍ、１−ペンタノール　０．９５Ｍ、ＫＣｌ　４０ｍＭ、ノイゲン　ＥＴ１３５　５％を含有する５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）０．９ｍｌを加え、１分後、分光光度計により３７℃での３４０ｎｍの１分間における吸収度の減少から検体中の尿素窒素を測定した。
【００４０】
測定結果は、次のとおりである。
2004024088.tif 000004
【００４１】
以上の測定結果から、アンモニアの影響を受けることなく、検体中の尿素の定量が可能であることを、確認できる。
【００４２】
（実施例３）
１５０ｍＭアンモニアを含む様々な濃度に調整した尿素含有検体（尿素窒素として０〜６００ｍｇ／ｄｌ）２０μｌに、、α−ＫＧ　１４ｍＭ、ＮＡＤＨ　０．３１ｍＭ、ＧＬＤＨ　１０Ｕ／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨ　１Ｕ／ｍｌ、グルコース６リン酸　６．６ｍＭ、ＫＣｌ　４０ｍＭ、１，２−プロパンジオール　１．３６Ｍ、ノイゲン　ＥＴ１３５　５％を含有する５０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ８．３）２．７ｍｌを添加した。
【００４３】
それぞれ３７℃で５分間加温したのち、ウレアーゼ６０ｍＵ／ｍｌ、α−ＫＧ１４ｍＭ、１，２−プロパンジオール　４．７７Ｍ、１−ブタノール　１．６Ｍ、ＫＣｌ　４０ｍＭ、ノイゲン　ＥＴ１３５　５％を含有する５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）０．９ｍｌを加え、１分後、分光光度計により３７℃での３４０ｎｍの１分間における吸収度の減少から検体中の尿素窒素を測定した。
【００４４】
測定結果は、次のとおりである。
2004024088.tif 000005
【００４５】
以上の測定結果から、アンモニアの影響を受けることなく、検体中の尿素の定量が可能であることを、確認できる。
【００４６】
（実施例４）
５０ｍＭアンモニアを含む様々な濃度に調整したクレアチニン含有検体（クレアチニン０〜１４０ｍｇ／ｄｌ）１００μｌに、、α−ＫＧ　１４ｍＭ、ＮＡＤＰＨ　０．３１ｍＭ、ＧＬＤＨ　７Ｕ／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨ　１．２５Ｕ／ｍｌ、グルコース６リン酸　６．６ｍＭ、ＫＣｌ　４０ｍＭ、１，２−プロパンジオール　１．３６Ｍ、ノイゲン　ＥＴ１３５　５％を含有する５０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ８．３）２．７ｍｌを添加した。
【００４７】
それぞれ３７℃で５分間加温したのち、クレアチニンデアミナーゼ　４Ｕ／ｍｌ、α−ＫＧ　１４ｍＭ、１，２−プロパンジオール　４．７７Ｍ、１−ブタノール　１．６Ｍ、ＫＣｌ　４０ｍＭ、ノイゲン　ＥＴ１３５　５％を含有する５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）０．９ｍｌを加え、１分目から分光光度計により３７℃での３４０ｎｍの２分間における吸収度の変化量から検体中のクレアチニンを測定した。
【００４８】
測定結果は、次のとおりである。
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【００４９】
以上の測定結果から、アンモニアの影響を受けることなく、検体中のクレアチニンの定量が可能であることを、確認できる。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、一般に用いられている酵素であるＧ６ＰＤＨを用いて、検体中にすでに存在するアンモニアの影響を受けずに、生体中のアンモニアを生成することができる、生体物質を測定できる。即ち、ｉＣＤＨという特殊な酵素に依存しないので、測定コストを削減でき、測定条件を緩和できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の１−プロパノール濃度の違いによるＧ６ＰＤＨ相対活性の変化をみた図
【図２】本発明の１−ブタノール濃度の違いによるＧ６ＰＤＨ相対活性の変化をみた図
【図３】本発明の１−ペンタノール濃度の違いによるＧ６ＰＤＨ相対活性の変化をみた図
【図４】本発明のエタノール濃度の違いによるＧ６ＰＤＨ相対活性の変化をみた図
【図５】本発明のＢｒｉｊ３５濃度の違いによるＧ６ＰＤＨ相対活性の変化をみた図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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