(57)【要約】【課題】哺乳類生物のＤＮＡ複製を特異的に阻害し、抗腫瘍・抗ウイルス効果を発揮する。【解決手段】ＯＲＣ１タンパク質のようなＤＮＡ複製開始に必要な複合体に対し、真核生物のＤＮＡ複製を特異的に阻害する物質としてアミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含む真核生物のタンパク質あるいはペプチド等のような複製を阻害する物質を結合させるようにした。これにより  ＡＬＦ−Ｃタンパク質の断片をＤＮＡ複製開始に必要なＯＲＣ１タンパク質サブユニットに結合させてこれを遮蔽することにより、ＯＲＣ本来の機能を失活させてＤＮＡの複製を停止させることが可能となり、優れた抗がん剤や抗ウイルス剤を提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ複製開始複合体が複製開始領域に結合することを阻害する哺乳類ＤＮＡ複製阻害方法。
【請求項２】
ＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣタンパク質であるところの請求項１に記載の哺乳類のＤＮＡ複製を特異的に阻害する方法。
【請求項３】
ＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣ１タンパク質であるところの請求項１に記載の哺乳類のＤＮＡ複製を特異的に阻害する方法。
【請求項４】
ＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣ１タンパク質中のアミノ酸配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するものであるところの請求項１に記載の哺乳類ＤＮＡの複製阻害方法。
【請求項５】
ＤＮＡ複製を阻害する物質が、アミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含む真核生物のタンパク質であるところの請求項１に記載の哺乳類ＤＮＡの複製阻害方法。
【請求項６】
ＤＮＡ複製を阻害する物質が、アミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列のペプチドであるところの請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳類ＤＮＡの複製阻害方法。
【請求項７】
ＤＮＡ複製開始領域に結合する制御因子（  ＡＬＦ−Ｃ）のｃＤＮＡが、ＤＮＡ塩基配列表の配列番号１に示すＤＮＡ塩基配列であるところの請求項１に記載の哺乳類ＤＮＡの複製阻害方法。
【請求項８】
ＯＲＣ１タンパク質が、アミノ酸配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列であるところの請求項１に記載の哺乳類ＤＮＡの複製阻害方法
【請求項９】
ＤＮＡ複製開始複合体に結合して哺乳類ＤＮＡの複製を阻害する物質。
【請求項１０】
ＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣタンパク質であるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質。
【請求項１１】
ＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣ１タンパク質であるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質。
【請求項１２】
ＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣ１タンパク質中のアミノ酸配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するものであるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質。
【請求項１３】
ＤＮＡ複製を阻害する物質が、アミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を含む真核生物のタンパク質であるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質。
【請求項１４】
ＤＮＡ複製を阻害する物質が、アミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列であるペプチドであるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質。
【請求項１５】
ＤＮＡ複製開始領域に結合する制御因子（  ＡＬＦ−Ｃ）のｃＤＮＡが、ＤＮＡ塩基配列表の配列番号１に示すＤＮＡ塩基配列であるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質。
【請求項１６】
ＯＲＣ１タンパク質が、アミノ酸配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列であるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、哺乳類のＤＮＡ複製開始に不可欠なタンパク質複合体に特異的に結合してＤＮＡ複製を阻害する方法およびその物質に関し、その方法・物質の使用により、とくにがん細胞やウイルスのＤＮＡ複製を阻止して増殖を抑えることを目的とする。
【０００２】
【従来の技術】
真核生物の細胞は、その増殖の際にＧ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍという４つの時期を正確にまわる。  これを細胞周期とよぶ。  真核生物が膨大な遺伝情報を正確に子孫に伝えるためには、遺伝子であるＤＮＡの複製は上記した４つの時期のうち、Ｓ期（細胞周期のＤＮＡ合成期）における１回の細胞分裂において完全にかつ一度だけ行われなければならず、その破綻は遺伝情報の欠落や過剰を起こし、細胞死あるいは異常増殖、癌化につながる可能性がある。
【０００３】
真核生物においては、ゲノムＤＮＡは複数の染色体に分割されており、ＤＮＡ複製は、それらの上の多数の複製開始点から行われる。  これは、進化において必要であった多大な遺伝情報を効率よく複製するためには有利であるが、一方で正確な複製を保証するための調節メカニズムは極めて巧妙、複雑になった。  このＤＮＡ複製調節メカニズムに関する知識の多くは、基本的に単純な真核生物である酵母における所見に帰依しており、高等哺乳類細胞における研究はその複雑性ゆえに遥かに遅れている。
【０００４】
真核生物のＤＮＡ複製開始は、染色体上の特異的部位である複製開始点からおこる。  複製開始複合体を形成するのに不可欠な蛋白質は「ｏｒｉｇｉｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘ」（以下、単に「ＯＲＣ」と略す）であり、この複合体は、ＯＲＣ１、ＯＲＣ２、ＯＲＣ３、ＯＲＣ４、ＯＲＣ５、ＯＲＣ６と呼ばれる６つのタンパク質からなる。  ＯＲＣは酵母から、植物、ヒトに至るまで保存されている。  上記した６種のＯＲＣがそれぞれ機能しないとＤＮＡの複製がおこらず、細胞分裂が停止する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ヒトなど哺乳類では、ＯＲＣが直接ＤＮＡに結合するという報告はなく、なぜ、特異領域から複製が始まるのか、またＤＮＡに対して６種のＯＲＣのうち、いずれのものが特に結合に関係するのか等について、未だに詳細はつかめておらず、世界的に盛んに研究が進められている。  このような複製のメカニズムを解明することは生命科学の知識として重要であるのみならず、細胞の癌化やウイルスの増殖機構を解明し、抗がん剤、抗感染症剤の画期的な開発に繋がる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記したように、ヒトなど哺乳類のＤＮＡ複製のメカニズムが今だ解明されていないことから、本発明においてはこれらメカニズムを解明し、がん細胞やウイルスの複製を阻害することができるならば抗腫瘍剤として、あるいは抗感染症剤その他の先端医療開発に画期的な福音をもたらすことはいうまでもない。
【０００７】
そこで我々はＤＮＡ複製開始に必要なＯＲＣ、とくに前記した６種のＯＲＣのいずれに対して強力な影響力を有しているとみられるＯＲＣ１を、適当なタンパク質の断片で遮蔽することによりＤＮＡ複製開始を阻害できるのではないか、と考えた。  このような真核生物のＤＮＡ複製を阻害する物質の発見のため、種々の研究と実験を重ねた。  その結果、ＯＲＣ複製開始領域に結合して遮蔽することができる新規蛋白質  Ａｌｄｏｌａｓｅ  Ｂ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ  Ｃ  （アルドラーゼ  Ｂ遺伝子プロモーターのサイトＣに作用する転写制御因子；以下単に「ＡＬＦ−Ｃ」と略す）を発見するとともに、またその構造決定にも成功した。
【０００８】
さらに、このＡＬＦ−Ｃ  が哺乳類ＤＮＡの複製開始に関わると推測し、ヒトＯＲＣとの結合を解析したところ、ＡＬＦ−Ｃ  の結合に必要なＯＲＣ１の結合部位のアミノ酸配列（〜２０アミノ酸）を突き止めた。  また逆に、ＯＲＣ１の結合に必要なＡＬＦ−Ｃ  の結合部位のアミノ酸配列（〜２０アミノ酸）も決定した。  これら、ＡＬＦ−Ｃ  の結合に必要なヒトＯＲＣ１の結合部位のアミノ酸配列、およびヒトＯＲＣ１の結合に必要なＡＬＦ−Ｃ  の結合部位のアミノ酸配列は我々によって初めて見出されたものである。
【０００９】
本発明は、真核生物のＤＮＡ複製を特異的に阻害する方法およびその物質に関する。  具体的には請求項１の発明は、ＤＮＡ複製開始複合体に複製を阻害する物質を結合させるようにした哺乳類ＤＮＡ複製阻害方法に関する。  また請求項２の発明はＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣタンパク質であるところの請求項１に記載の哺乳類のＤＮＡ複製を特異的に阻害する方法に関する。
【００１０】
さらに請求項３の発明は、ＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣ１タンパク質であるところの請求項１に記載の哺乳類のＤＮＡ複製を特異的に阻害する方法に関する。  さらに請求項４の発明は、ＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣ１タンパク質中のアミノ酸配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列（Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ）を有するものであるところの請求項１に記載の哺乳類ＤＮＡの複製阻害方法に関する。
【００１１】
さらに請求項５の発明は、ＤＮＡ複製を阻害する物質が、アミノ酸配列表の配列番号２に示す塩基アミノ酸配列（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  ）を含む真核生物のタンパク質であるところの請求項１に記載の哺乳類ＤＮＡの複製阻害方法に関する。  さらに請求項６の発明は、ＤＮＡ複製を阻害する物質が、アミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  ）のペプチドであるところの請求項１〜５のいずれか１に記載の哺乳類ＤＮＡの複製阻害方法に関する。
【００１２】
さらに請求項７の発明は、ＤＮＡ複製開始領域に結合する制御因子（  ＡＬＦ−Ｃ）のｃＤＮＡが、ＤＮＡ塩基配列表の配列番号１に示すＤＮＡ塩基配列であるところの請求項１に記載の哺乳類ＤＮＡの複製阻害方法に関する。  さらに請求項８の発明は、ＯＲＣ１タンパク質が、アミノ酸配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列であるところの請求項１に記載の哺乳類ＤＮＡの複製阻害方法に関する。
【００１３】
さらに請求項９の発明は、ＤＮＡ複製開始複合体に結合して哺乳類ＤＮＡの複製を阻害する物質に関する。  さらに請求項１０の発明は、ＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣタンパク質であるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質に関する。  さらに請求項１１の発明は、ＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣ１タンパク質であるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質に関する。
【００１４】
さらに請求項１２の発明は、ＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣ１タンパク質中のアミノ酸配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列（Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ）を有するものであるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質に関する。
【００１５】
さらに請求項１３の発明は、ＤＮＡ複製を阻害する物質が、アミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  ）を含む真核生物のタンパク質であるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質に関する。  請求項１４の発明は、ＤＮＡ複製を阻害する物質が、アミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  ）であるペプチドであるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質に関する。
【００１６】
さらに請求項１５の発明は、ＤＮＡ複製開始領域に結合する制御因子（  ＡＬＦ−Ｃ）のｃＤＮＡが、ＤＮＡ塩基配列表の配列番号１に示すＤＮＡ塩基配列であるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質に関する。  さらに請求項１６の発明は、ＯＲＣ１タンパク質が、アミノ酸配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列であるところの請求項９に記載のＤＮＡ複製を阻害する物質に関する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下において本発明の具体的な内容を説明すると、本発明は哺乳類のＤＮＡ複製に必要な複製開始複合体に複製を阻害する物質を結合させることにより哺乳類ＤＮＡの複製を阻害する手法およびその物質を要旨とするものである。  さらに哺乳類のＤＮＡ複製に必要な複製開始複合体としては、ＯＲＣタンパク質、とりわけてＯＲＣ１タンパク質が複製阻害物質の結合に特異的に優れている。
【００１８】
さらにこの場合のＤＮＡ複製開始複合体がＯＲＣ１タンパク質中のアミノ酸配列表の配列番号４に示す塩基アミノ酸配列（Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ）を有するものであることを突き止めた。
【００１９】
またこの場合の、ＤＮＡ複製を阻害する物質が、アミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  ）を含む真核生物のタンパク質、あるいはアミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  ）のペプチドであることも確認した。
【００２０】
【実施例】
〔ＡＬＦ−Ｃのクローニング〕
肝細胞で特異的に発現するラットのアルドラーゼＢ遺伝子の転写調節を研究していたところ、転写調節領域（プロモーター）がＤＮＡ複製開始領域としても機能することを見いだした。  ＡＬＦ−Ｃ  は、この遺伝子領域に結合する制御因子として、発現ベクターλｇｔ１１を用いたクローニングで単離した。  その後、このタンパク質は転写抑制因子であること、およびヒトやラットの複製開始因子（ＯＲＣ）と結合することなどを明らかにした。
【００２１】
具体的に、ＡＬＦ−Ｃ  のクローニングは以下のように行った。
ラット培養肝ガン細胞  ＦＴＯ−２Ｂ（  Ｋｉｌｌａｒｙ，Ａ．Ｍ．，Ｌｕｇｏ，Ｔ．Ｇ．，Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｒ．Ｅ．Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｇｅｎｅｔ．２２，２０１−２１３．１９８４）を培養し、１×１０７  個回収した。  回収した細胞から総細胞ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、添付の操作手順通りに行い総細胞ＲＮＡを抽出した。  さらに抽出した総細胞ＲＮＡからオリゴ  ｄＴ−セルロース（ＴＯＹＯＢＯ社製）クロマトグラフィーによりｍＲＮＡを精製した。
【００２２】
精製したｍＲＮＡのうち１μｇから、ｃＤＮＡ合成キット（  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｔｉｍｅ  ＳａｖｅｒＴＭ    ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ／ファルマシア社製）を用いて添付の操作手順にしたがって２重鎖のｃＤＮＡを合成した。  合成したｃＤＮＡの１０分の１量をλｇｔ１１ベクター（製品番号  ＃２３４２１１／Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に添付の操作手順通りに組み込み、さらにＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ  （  ＃２００２０１，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて添付の操作手順通りに感染可能な形にパッケージしたのち、大腸菌  Ｙ１０９０ｒ−（  ＃２００２８１，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に添付の操作手順通りに感染させ、タンパク質発現ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
【００２３】
〔ＡＬＦ−Ｃのスクリーニング〕
つぎに、このタンパク質発現ｃＤＮＡライブラリーをつぎのようにスクリーニングした。  つまり、ラットのアルドラゼＢ遺伝子の転写および複製開始制御に関与する領域にある制御エレメントであるサイトＣの塩基配列の一部である  ５’−ＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＴＧＧＣＴ−３’の  ５’末端を３２Ｐラベルし、これをプローブにしてスクリーニングを行い、このプローブに結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡとしてＡＬＦ−Ｃ  ｃＤＮＡをクローニングした。
【００２４】
〔  ＡＬＦ−ＣのＤＮＡ配列・アミノ酸配列の決定〕
この  ＡＬＦ−ＣのｃＤＮＡの塩基配列（アルドラーゼＢ遺伝子プロモーターのサイトｃＤＮＡに結合するｃＤＮＡクローン）をＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｒｅｋｉｔ（製品番号Ｒ０１８  タカラ社製）とＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ：ＡＢＩ社製）を用いて配列表の配列番号１の通り決定した。
【００２５】
さらにこの決定したｃＤＮＡの塩基配列からアミノ酸配列を決定したところ、ＡＬＦ−Ｃ  は配列表の配列番号２に示したように、２８４アミノ酸からなる新規のタンパク質をコードしていることが判明した。
【００２６】
〔ＡＬＦ−Ｃ  の一部アミノ酸配列（１−８９番目）をコードするタンパク質の作製〕
つぎに、配列表の配列番号２に示すＡＬＦ−Ｃ  タンパク質の１番目から８９番目までのアミノ酸をコードするタンパク質（以下、単にＡＬＦ−Ｃ  （１−８９）と略す）の作成をおこなった。
【００２７】
つまりＡＬＦ−Ｃ  タンパク質の１番目から８９番目までのアミノ酸をコードするタンパク質に対応するｃＤＮＡを配列表の配列番号１に示すＤＮＡ配列より作製し、発現ベクター  ｐＧＥＸ−６Ｐ−３（２７−４５９９−０１、アマシャムバイオサイエンス社製）に、添付の操作手順どおりに組み込み、大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（６９３８８−３，Ｎｏｖａｇｅｎ社製）内でＡＬＦ−Ｃ（１−８９）とグルタチオンＳトランスフェラーゼ（以下単にＧＳＴと略す）の融合タンパク質として作製した。
【００２８】
つぎに、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（１７−０７７５６−０１、アマシャムバイオサイエンス社）を用いて添付の操作手順どおりに  ＡＬＦ−Ｃ（１−８９）とＧＳＴの融合タンパク質を精製した。  さらに精製された８ｍｇのＡＬＦ−Ｃ（１−８９）とＧＳＴの融合タンパク質を１ｍＬの消化バッファー（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），  ２０  ％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ２０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．１  ｍＭ  ＰＭＳＦ，  ０．２  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １  ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、さらに１０ユニットの  ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（  ２７−０８４３−０１、アマシャムバイオサイエンス社製）を加え、４℃で約１２時間程消化反応を行い  ＡＬＦ−Ｃ（１−８９）とＧＳＴの融合タンパク質をそれぞれ  ＡＬＦ−Ｃ（１−８９）タンパク質とＧＳＴタンパク質とに切断した。
【００２９】
さらに切断したタンパク質を８０℃で１０分間加熱処理することにより、ＧＳＴタンパク質のみを凝縮させ、さらに遠心分離機により１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清中の  ＡＬＦ−Ｃ（１−８９）タンパク質を回収した。
【００３０】
〔ＡＬＦ−Ｃ  （１−８９）タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製〕
上記の  ＡＬＦ−Ｃ（１−８９）タンパク質をウサギに免疫してポリクローナル抗体を作成した。  すなわち、日本白色種のメスウサギ１匹に対し、初回免疫は、上記操作で作製した  ＡＬＦ−Ｃ（１−８９）タンパク質０．２ｍｇ、５ｍｇのＰｏｌｙＡ・ＰｏｌｙＵおよびフロイントコンプリートアジュバント溶液を混合し、エマルジョンを作成後、皮下投与し免疫した。
【００３１】
２、３回目の免疫は、上記操作で作製したＡＬＦ−Ｃ（１−８９）タンパク質０．２ｍｇ、５ｍｇの  ＰｏｌｙＡ・ＰｏｌｙＵ  およびフロイントインコンプリートアジュバント溶液を混合し、エマルジョンを作成後、皮下投与し免疫した。  ４から６回目の免疫は、上記操作で作製したＡＬＦ−Ｃ（１−８９）タンパク質０．２ｍｇとフロイントインコンプリートアジュバント溶液を混合し、エマルジョンを作成後、皮下投与し免疫した。  初回免疫以降、６回目の免疫までの投与は全て２週間間隔で行った。  ６回目の免疫（最終免疫）後、１週間目に全採血を行い、  ＡＬＦ−Ｃ（１−８９）タンパク質に対するポリクローナル抗体を含むウサギ抗血清を回収した。
【００３２】
〔作製した  ＡＬＦ−Ｃ（１−８９）タンパク質に対するポリクローナル抗体のウエスタンブロッティング法による解析〕
上記により回収したポリクローナル抗体がＡＬＦ−Ｃ  タンパク質と反応することを、ウエスタンブロッティング法に基づく解析により確認した。  つまり、ラット培養細胞ｄＲＬｈ８４全抽出蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、電気泳動したタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写し、上記方法で作製したＡＬＦ−Ｃ  （１−８９）タンパク質に対するポリクローナル抗体を含むウサギ抗血清を１０００倍希釈した抗血清を用いて１次反応を行い、さらにパーオキシデース標識抗ウサギ抗体を用いて２次反応を行った。
【００３３】
さらにシグナルの検出を  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｒ  ｋｉｔ（ＲＰＮ２１０８、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行った。  その結果、転写したＰＶＤＦ膜上に、反応するバンドが出現したことから、ＡＬＦ−Ｃ  （１−８９）タンパク質に対するポリクローナル抗体を含むウサギ抗血清を用いたウエスタンブロッティング法で、ＡＬＦ−Ｃタンパク質がラットの生体内に存在することがわかった。
【００３４】
〔ＡＬＦ−ＣとＯＲＣ１の結合について〕
つぎに、ＡＬＦ−ＣとＯＲＣ１が特異的に結合する実験の具体的な方法と結果を以下に示す。
【００３５】
＜ＡＬＦ−ＣとＧＳＴの融合タンパク質の作製＞
まず、配列表の配列番号２に示すＡＬＦ−Ｃ  タンパク質のアミノ酸をコードするＡＬＦ−Ｃ  タンパク質の作成を行った。  つまりＡＬＦ−Ｃ  タンパク質に対応する配列表の配列番号１に示すＤＮＡ塩基配列を発現ベクター  ｐＧＥＸ−６Ｐ−３（２７−４５９９−０１、アマシャムバイオサイエンス社製）に、添付の操作手順どおりに組み込み、大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（  ６９３８８−３、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）内でＡＬＦ−ＣとＧＳＴの融合タンパク質として作製した。
【００３６】
＜ヒトＯＲＣ１タンパク質の作製＞
配列表の配列番号３に示すＯＲＣ１のＤＮＡ塩基配列を合成し、ｐｃＤＮＡ３．１ＨｉｓＡベクター（インビトロゲン社製）に添付の操作手順所どおりに組み込み、ウサギ網状赤血球の転写・翻訳共役システム（ＴＮＴ  Ｔ７  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ、プロメガ社製）を用いて添付の操作手順どおりに  ｃＤＮＡを翻訳してＴ７ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたＯＲＣ１タンパク質として合成した。
【００３７】
＜ＡＬＦ−ＣとＯＲＣ１の結合の確認＞
上記で作製したＡＬＦ−ＣとＧＳＴの融合タンパク質１０  μｇ  をグルタチオンを結合させた２５  μｌの樹脂ビーズ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、アマーシャム−ファルマシア製）に結合させ、さらに、１０  μｌの上記  Ｔ７ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたＯＲＣ１タンパク質を反応させた。
【００３８】
ビーズを十分洗浄したのち、ビーズに結合したタンパク質をＳＤＳ化させて解離させた。  解離させたタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、電気泳動したタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写し、抗Ｔ７ペプチド抗体（  Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて１次反応を行い、パーオキシデース標識抗マウスＩｇ抗体を用いて２次反応を行った。
【００３９】
さらにシグナルの検出をＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｒ  ｋｉｔ  （ＲＰＮ２１０８、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行った。  その結果、転写したＰＶＤＦ膜上に、反応するバンドが出現したことから、Ｔ７ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたＯＲＣ１タンパク質とＡＬＦ−ＣとＧＳＴの融合タンパク質が結合していること、つまりＡＬＦ−Ｃタンパク質とＯＲＣ１タンパク質が特異的に反応することを確認した。
【００４０】
〔ＡＬＦ−Ｃの結合に必用なＯＲＣ１のタンパク質部分断片の解析〕
つぎにＯＲＣ１に対するＡＬＦ−Ｃの結合・遮蔽に必用なＯＲＣ１のタンパク質部分断片の解析をおこなった結果を以下に示す。
【００４１】
＜ヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質の作製＞
つぎに、ヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質の作製について、（〜２０数アミノ酸を決定した具体的な方法とそのアミノ酸配列を中心に説明する。
【００４２】
配列表の配列番号３に示すＯＲＣ１タンパク質をコードするｃＤＮＡ断片を制限酵素消化により種々作成し、ｐｃＤＮＡ３．１ＨｉｓＡベクター（インビトロゲン社）に添付の操作手順所どおりに組み込んだ。  つぎに種々のＯＲＣ１遺伝子欠失体のＤＮＡ配列をＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ（製品番号Ｒ０１８  タカラ社製）とＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＲ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ：ＡＢＩ社製）を用いて決定したところ、ＯＲＣ１タンパク質のＮ末端側から数えて、ａ：１〜８６２（全長），ｂ：１〜２０８，ｃ：１〜２３９，ｄ：１〜２７８，ｅ：２１０〜５１０，ｆ：５１２〜８６２のアミノ酸をコードするそれぞれの変異体が作成できた。
【００４３】
さらに、ウサギ網状赤血球の転写・翻訳共役システム（ＴＮＴ  Ｔ７  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ、プロメガ社製）を用いて添付の操作手順どおりに  ｃＤＮＡを翻訳してＴ７ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質として上記のａ〜ｆそれぞれのタンパク質を合成した。
【００４４】
＜ＡＬＦ−Ｃタンパク質とヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質の結合の確認＞
上記で作製したＡＬＦ−ＣとＧＳＴの融合タンパク質  １０μｇ  をグルタチオンを結合させた２５  μｌの樹脂ビーズ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、アマーシャム−ファルマシア社製）に結合させ、さらに、１０μｌ  の  上記Ｔ７ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質をそれぞれ反応させた。
【００４５】
ビーズを十分洗浄したのち、ビーズに結合したタンパク質をＳＤＳ化させて解離させた。  解離させたタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、電気泳動したタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写し、抗Ｔ７ペプチド抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ  社製）を用いて１次反応を行い、さらにパーオキシデース標識抗マウスＩｇ抗体を用いて２次反応を行った。
【００４６】
さらにシグナルの検出を  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｒ  ｋｉｔ（ＲＰＮ２１０８、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行った。  その結果、転写したＰＶＤＦ膜上に、前記ｂ、ｆ、のヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質を反応させた場合、バンドが出現せず、また前記ａ、ｃ、ｄ、ｅ、のヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質を反応させた場合に、バンドが出現したことから、ＡＬＦ−Ｃ  タンパク質に結合するヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質の最小のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列のうちの下線部分（Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  ）であることがわかった。
【００４７】
〔ＯＲＣ１の結合に必用なＡＬＦ−Ｃタンパク質部分断片の解析〕
つぎにＯＲＣ１の結合に必用な  ＡＬＦ−Ｃタンパク質部分断片の解析をおこなった結果を以下に示す。
【００４８】
＜ヒトＡＬＦ−Ｃ遺伝子欠失タンパク質の作製＞
ヒト  ＡＬＦ−Ｃ遺伝子欠失タンパク質の作製について、以下（〜２０数アミノ酸）を決定した具体的な方法とそのアミノ酸配列を中心に説明する。  まず配列表の配列番号１にあらわした  ＡＬＦ−Ｃ  タンパク質をコードする  ｃＤＮＡ断片を制限酵素消化により種々作成し、これを発現ベクター  ｐＧＥＸ−６Ｐ−３（２７−４５９９−０１、アマシャムバイオサイエンス社製）に、添付の操作手順どおりに組み込んだ。
【００４９】
次に種々のＡＬＦ−Ｃ遺伝子欠失体のＤＮＡ配列を  ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ  ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ（製品番号Ｒ０１８  タカラ社製）とＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ：ＡＢＩ社製）を用いて決定したところ、ａ：１〜２０６，ｂ：２０７〜２８４，ｃ：２４０〜２８４，ｄ：２４９〜２８４，ｅ：２６４〜２８４，ｆ：２０７〜２７２，ｇ：２０７〜２６３，ｈ：２０７〜２３８のアミノ酸をコードするそれぞれの変異体が作成できた。
【００５０】
さらに、大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（６９３８８−３、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）内でＡＬＦ−Ｃ遺伝子欠失タンパク質とＧＳＴタンパク質の融合タンパク質として前記ａ〜ｈそれぞれのタンパク質を合成した。
【００５１】
＜ＡＬＦ−Ｃ遺伝子欠失タンパク質とヒトＯＲＣ１タンパク質の結合の確認＞
上記で作製したａ〜ｈそれぞれの  ＡＬＦ−Ｃ遺伝子欠失とＧＳＴの融合タンパク質１０  μｇをグルタチオンを結合させた２５  μｌの樹脂ビーズ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、アマーシャム−ファルマシア社製）に結合させ、さらに、１０  μｌの上記Ｔ７ペプチド抗体認識部位をＮ末に融合させたヒトＯＲＣ１タンパク質を反応させた。
【００５２】
ビーズを十分洗浄したのち、ビーズに結合したタンパク質をＳＤＳ化させて解離させた。  解離させたタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、電気泳動したタンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写し、抗Ｔ７ペプチド抗体（  Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて１次反応を行い、さらにパーオキシデース標識抗マウスｌｇ抗体を用いて２次反応を行った。
【００５３】
さらにシグナルの検出を  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｒ  ｋｉｔ（ＲＰＮ２１０８、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行った。  その結果、転写したＰＶＤＦ膜上に、前記ａ、ｅ、ｈ、のヒトＯＲＣ１遺伝子欠失タンパク質を反応させた場合には、バンドが出現しなかった。
【００５４】
さらに前記ｂ、ｃ、ｄ、ｆ、ｇの各ヒトｏｒｃ１遺伝子欠失タンパク質を反応させた場合には、バンドが出現したことから、ヒトＯＲＣ１タンパク質に結合する  ＡＬＦ−Ｃ遺伝子欠失タンパク質の最小のアミノ酸配列は配列表の配列番号２にあらわした１５アミノ酸配列の中の下線部分（  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  ＡｒｇＧｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ）であることがわかった。
【００５５】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明はＯＲＣ１タンパク質のようなＤＮＡ複製開始に必要な複合体に対し、真核生物のＤＮＡ複製を特異的に阻害する物質としてアミノ酸配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列（Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  ）を含む真核生物のタンパク質あるいはペプチド等のような複製を阻害する物質を結合させるようにしたために、ＡＬＦ−Ｃ  タンパク質の断片をＤＮＡ複製開始に必要なＯＲＣ１タンパク質サブユニットに結合させてこれを遮蔽することにより、ＯＲＣ本来の機能を失活させてＤＮＡの複製を停止させることが可能となる。
【００５６】
その結果、この原理を利用することにより、優れた抗がん剤や抗ウイルス剤を提供することができる。  また本発明のＤＮＡ複製阻害物質は、とくにヒトＤＮＡ複製の阻害に適するが、このほかにもウシ、ブタ、イヌ等の家畜やペット等をはじめとした哺乳類細胞の複製阻害にも広く適用できることは勿論である。  またさらに、本願の発明におけるＤＮＡ複製阻害物質はアミノ酸の低分子化した化合物（ミミック）への応用、あるいは遺伝子治療への応用も可能である。
【００５７】
【配列表】
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