(57)【要約】【課題】多種の微生物が存在する環境試料中の特定の微生物を検出する方法の提供。【解決手段】環境試料中の特定の微生物を検出する方法であって、工程Ａ：検出対象微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する工程、または、検出対象微生物の１８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する工程、及び工程Ｂ：増幅された遺伝子の塩基配列と検出対象微生物のスペーサー領域の塩基配列との差異を検出する工程を含むことを特徴とする、環境試料中の特定の微生物を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境試料中の特定の微生物を検出する方法であって、
工程Ａ：検出対象微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する工程、または、検出対象微生物の１８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する工程、
及び
工程Ｂ：増幅された遺伝子の塩基配列と検出対象微生物のスペーサー領域の塩基配列との差異を検出する工程
を含むことを特徴とする、環境試料中の特定の微生物を検出する方法。
【請求項２】
工程Ｂが、変性濃度勾配ゲル電気泳動法、変性高速液体クロマトグラフィー法、温度勾配ゲル電気泳動法のいずれかを使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程Ｂが、変性濃度勾配ゲル電気泳動法を使用することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
検出対象微生物が真正細菌であって、工程Ａが、検出対象微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する工程であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
特定の微生物が、ロドコッカス属に属する微生物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の微生物を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
土壌、地下水、河川・湖沼、住環境、製造設備・施設などには多種類の微生物が存在する。このため、特定の性質を有する微生物をスクリーニングする場合には、微生物を分離するための分離源試料として土壌、地下水、河川・湖沼、住環境、製造設備・施設から採取した環境試料が多く用いられている。
【０００３】
一方、環境試料中には有用な或いは有害な微生物も存在しており、これらの微生物が試料中に、または、採取した土壌・場所・施設などにどのように分布しているか確認することは、環境問題の点から重要である。例えば、微生物農薬などの微生物剤を散布した場合に、散布土壌、散布した地域の下流域にある土壌または地下水、散布土壌付近の環境水等の中に散布された土壌または地下水中に、散布した特定の微生物がどのように分布しているかを確認することは、散布場所或いはその下流域に住む住人に対する影響、土壌の微生物相に対する影響等を評価（アセスメント）する上で非常に重要である。また、例えば、石油輸送タンカー等からの石油流出事故時に石油被害を受けた土壌、海水に、土壌から分離された油分分解微生物を播いて、石油を処理する方法が検討されており、この場合にもその処理方法の有効性、環境に与える影響を評価するために、処理地点又はその周辺に存在する油分分解微生物の分布を知ることが重要となってくる。
【０００４】
このように環境試料中に存在する特定の微生物を検出することは重要である。この特定の微生物を検出する方法としては、例えば環境試料が土壌の場合、土壌を懸濁した懸濁液を寒天培地に播いて数日から数十日間培養した後、被検出微生物の存在を確認する方法（培養法）が一般的に行われている。しかしながら、土壌には多種・多量の微生物が存在するため、このような培養による分析方法では、特定の微生物以外の他の微生物の存在数が特定の微生物よりも多い場合には解析が困難であることや、分析に日数がかかるという問題があった。この問題は、環境水（海、河川、湖沼、池、井戸等の水）中に存在する微生物を、培養により検出する方法でも同様であった。
【０００５】
さらに、近年は、培養法においての日数がかかる問題点を解消するため、微生物の遺伝子を利用した微生物の検出方法が検討されている。すなわち、環境試料中の微生物の構成を解析することを目的として、微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ法による方法が論文等において報告されてきた。微生物間で相同性の高い部分をプライマーとしたＰＣＲ法により増幅した１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をプラスミドにクローニングして大腸菌に導入し、大腸菌クローン株ごとのプラスミドを解析する方法や、増幅した１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を変性濃度勾配ゲル電気泳動法により分析する方法がとられてきた。しかしながら１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の分析では、類似する種属の微生物を区別できなかった。このため、同種の微生物であっても区別可能な微生物の検出方法の開発が望まれていた。
【０００６】
一方、微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域の遺伝子をＰＣＲで増幅し、増幅された遺伝子の配列を決定することにより同じ種に属する微生物を別々に検出する方法も報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００７】
この方法は、ビール製造工程に存在する汚染微生物を検出する方法であり、ビール製造ラインという特殊な状況では有効であった。即ち、この方法は、試料中の微生物としては、ビール酵母がほとんどを占め、数種の汚染微生物が少量存在するといった状況で、特定の微生物を検出する方法であった。
【０００８】
しかしながら、土壌、地下水、河川・湖沼、住環境、建築物から採取した環境試料中には種々雑多な微生物が存在するため、この方法を適用すると、存在する微生物種の数だけ遺伝子配列決定を繰り返す必要がある。遺伝子配列の決定は未だ簡便とはいえないため、この方法は、環境試料中の微生物を検出する方法としては現実的ではなかった。
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−１０６８８１号公報（第３−４頁）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、多種の微生物が存在する環境試料中の特定の微生物を検出する方法の提供を目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記従来技術の問題点に鑑み鋭意検討を重ねた結果、リボソームＲＮＡ遺伝子の間の遺伝子領域（スペーサー領域）、特に、真正細菌に関しては、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列をＰＣＲで増幅し、増幅された遺伝子の塩基配列の差異を検出することによって、検出対象菌株を検出可能であることを確認し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、下記の微生物を検出する方法を提供するものである。
【００１３】
項１．環境試料中の特定の微生物を検出する方法であって、
工程Ａ：検出対象微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する工程、または、
検出対象微生物の１８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する工程、
及び
工程Ｂ：増幅された遺伝子の塩基配列と検出対象微生物のスペーサー領域の塩基配列との差異を検出する工程
を含むことを特徴とする、環境試料中の特定の微生物を検出する方法。
【００１４】
項２．工程Ｂが、変性濃度勾配ゲル電気泳動法、変性高速液体クロマトグラフィー法、温度勾配ゲル電気泳動法のいずれかを使用することを特徴とする項１に記載の方法。
【００１５】
項３．工程Ｂが、変性濃度勾配ゲル電気泳動法を使用することを特徴とする項１又は２に記載の方法。
【００１６】
項４．検出対象微生物が真正細菌であって、工程Ａが、検出対象微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する工程であることを特徴とする項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００１７】
項５．特定の微生物が、ロドコッカス属に属する微生物であることを特徴とする項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、環境試料中の特定の微生物を検出する方法に関し、
工程Ａ：検出対象微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する工程、または、
検出対象微生物の１８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する工程、
及び
工程Ｂ：増幅された遺伝子の塩基配列と検出対象微生物のスペーサー領域の塩基配列との差異を検出する工程
を含むことを特徴とする。
【００１９】
（１）環境試料
本発明の方法において使用される環境試料は、多くの種類の微生物が存在する試料をいう。例えば、土壌、環境水（海、河川、湖沼、池、井戸等の水）、衣類、建築物、空気、廃水処理設備、廃棄物処理設備、下水道施設などから採取される多種類の微生物を含む試料をいう。好ましくは、土壌、環境水、廃棄物処理設備から採取される微生物を含む試料である。
【００２０】
環境試料中に含まれる特定の微生物、即ち検出対象微生物は、本発明の方法で検出される限り特に制限されないが、ロドコッカス属に属する微生物が好ましい。
【００２１】
（２）工程Ａ
本発明では、工程Ａにおいて、検出対象微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する工程、または、検出対象微生物の１８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の少なくとも１部の遺伝子配列を増幅可能なプライマーを使用して遺伝子を増幅する。
【００２２】
検出対象微生物が真正細菌である場合、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列を利用し、検出対象微生物が糸状菌や酵母、藍藻などの真核細胞の微生物であれば、１８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２８ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列を利用する。
【００２３】
プライマーにより増幅される遺伝子配列は、スペーサー領域の遺伝子配列の少なくとも１部、好ましくは５００〜２００塩基対、より好ましくは４００〜２００塩基対、より一層好ましくは３５０〜２００塩基対を含む。
また、増幅される遺伝子配列がスペーサー領域の５’末端の塩基を含むときは、１６ＳｒＲＮＡ又は１８ＳｒＲＮＡ領域の３’末端の塩基を含んだ１６ＳｒＲＮＡ又は１８ＳｒＲＮＡの下流域の遺伝子配列を含んでいても良い。同様に、増幅される遺伝子配列がスペーサー領域の３’末端の塩基を含むときは、２３ＳｒＲＮＡ又は２８ＳｒＲＮＡ領域の５’末端の塩基を含んだ２３ＳｒＲＮＡ又は２８ＳｒＲＮＡ下流域の遺伝子配列を含んでいても良い。
【００２４】
プライマー長は、１５〜３５塩基程度、好ましくは２０〜３０塩基である。なお、プライマーに用いるオリゴヌクレオチドは化学合成されたものも天然のものも使用できる。
【００２５】
プライマーを遺伝子増幅に使用する。遺伝子を増幅する方法としては、好適にはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が採用されるがこれに限定されない。ＰＣＲ法は、検体中の遺伝子が少ない場合であっても、２つのプライマーが挟む標的ヌクレオチドを増幅することが可能である。また、ＰＣＲ法では、検体中に存在する菌から核酸成分を遊離させる必要があるが、加熱煮沸処理や溶菌酵素や界面活性剤を使用した簡便な前処理だけでそれが可能であるため、非常に簡便である。ＰＣＲ法は一般的に知られた方法である。熱変性温度は１００〜９０℃程度、アニーリング温度は３０〜７０℃程度、ＤＮＡ伸張温度は７０〜８０℃程度が好ましく、熱変性、アニーリング及びＤＮＡ伸張を１サイクルとし、これを２０〜４０サイクル行うことが好ましい。
【００２６】
（３）工程Ｂ
本発明では、工程Ａにより増幅された遺伝子の塩基配列と検出対象微生物のスペーサー領域の塩基配列との差異を検出する。検出のための手段は、両塩基配列の塩基の違いに基づき分離・検出できる手段である。また、遺伝子配列決定（塩基配列決定）では、試料中の全ての種類の微生物の遺伝子配列を決定しないと検出対象微生物を検出できないため、現実的な手段ではなく、これは包含しない。
【００２７】
両塩基配列の塩基の違いに基づき分離・検出できる手段としては、変性濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）、変性高速液体クロマトグラフィー法（変性ＨＰＬＣ法）、  温度勾配ゲル電気泳動法（ＴＧＧＥ法）、変性勾配が敷設されたキャピラリー電気泳動等が例示される。好ましくはＤＧＧＥ法またはＴＧＧＥ法である。より好ましくはＤＧＧＥ法である。
【００２８】
ＤＧＧＥ法は、平板ゲルを使用することにより、一度に多くの検体を分析できるため、非常に有利である。また、必要に応じて、分析後、着目するべきＤＮＡバンドをゲルから抽出して遺伝子配列解析を実施できる。ＤＧＧＥ法において、変性剤としては尿素が好ましく、ゲルとしてはアクリルアミドが好ましい。
【００２９】
（４）ロドコッカス属に属する微生物
本発明の微生物検出方法は、ロドコッカス属に属する微生物の検出に適している。特に、ロドコッカス属に属する微生物の中でも油分分解性を有する微生物の検出に適している。
【００３０】
本発明のロドコッカス属に属する微生物を検出する方法では、検出対象微生物は土壌微生物に限定されず、例えば環境水、空気、人工物（衣服等）であっても良い。
【００３１】
ロドコッカス属に属する油分分解性微生物としては、Ｃ２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５０９）、Ｃ４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５１０）、Ｃ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５１１）、Ｃ１２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５１３）、Ｃ１５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５１４）が例示される。本発明者らは、これら例示の微生物に関する情報を特願２００１−３０１９７９号明細書において詳細に記述しており、本明細書においてはその記述が参照される。
【００３２】
なお、油分とは、一般には、ｎ−ヘキサンや四塩化炭素等で抽出される炭化水素、炭化水素誘導体をいうが、ここではさらに広義の、原油、重油、軽油、灯油、ガソリン等の燃料油、エンジンオイル、潤滑油等の鉱物油、ラード、サラダ油等の食品の動植物油等に由来する脂肪族炭化水素や脂環式炭化水素、芳香族炭化水素、多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨｓ）等の炭化水素及び炭化水素誘導体等も含まれる。
【００３３】
また、油分の分解とは、油分が酸化的分解、または加水分解等により、より低分子の化合物に分解され、好適には二酸化炭素まで分解されることであり、油膜を形成せず、油臭気がなくなり、または／かつ、ガスクロマトグラフィーまたは、機器分析（ＩＲ、ＨＰＬＣ、質量分析装置など）またはバイオ的分析（抗体など）によって検出される油分が、油分分解前と比較して、減少している事が確認できること、または、検出されなくなる事であり、または／かつ、重量として、油分分解前と比較して、減少する事である。
【００３４】
上記油分は、どのような場所に存在してもよい、例えば、土壌、環境水（排水、地下水、河川水、湖沼水、海水、井戸水など）、廃棄物（産業廃棄物や一般家庭廃棄物（生ゴミ等）など）、工場排水等に含有される油分や、燃料油や鉱物油自体の分解処分に加え、油分精製施設や貯留施設の施設稼動に伴う漏洩や、施設老朽化に伴う漏洩、使用済みエンジンオイルの漏洩、大型タンカーの海難事故や油田事故、各種工業プラントの事故等の産業活動により汚染された土壌、海岸や水（地下水、淡水、海水等の環境水）に含まれる油分や、家庭から排出される排水や生ゴミに含まれる食物残渣中の油分などである。
【００３５】
Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ１２及びＣ１５は、上記油分に対して顕著な分解活性を有する。また、塩分濃度が高い状況でも高い油分分解性を保持することができる。具体的には塩分濃度が２重量％以上でも油分分解性を保持することができる。好ましくは塩分濃度は０〜５重量％、さらに好ましくは０〜４重量％である。この高塩分濃度での油分分解能は、特に臨海工業地帯などの土地で海水に起因する高塩分の土壌における油分分解に効果を発揮する。
【００３６】
【発明の効果】
本発明によれば、環境試料中に存在する多種類の微生物の中から検出対象の微生物を検出する際に、環境試料中に存在する他種類の微生物の遺伝子配列を決定することなく簡便に検出対象微生物を菌株レベルで迅速に検出することができる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３８】
実施例１：スペーサー領域遺伝子の配列決定
（１）    スペーサー領域遺伝子増幅のためのプライマー設計
以下に記載の微生物（真正細菌）は、その１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列が公知である（インターネット上のデータベースＧｅｎＢａｎｋ  またはＥＭＢＬ）。
【００３９】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉａｎｓ
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＩＧＴＳ８
その他の微生物
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｄｏｓｕｓ
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｅｒｎｈｏｆｅｒｉ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ
これら微生物間の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性を解析し、相同性の高い配列を検索した。そして、相同性の高い以下の４種の配列をプライマー配列とした。なお、プライマー１〜４の遺伝子配列はそれぞれ配列番号１〜４としても示される。
【００４０】
プライマー１（１６ＳｒＲＮＡ側）：  ５’−ＧＧＡＲＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＲＧＡ−３’
プライマー２（１６ＳｒＲＮＡ側）：  ５’−ＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴ−３’
プライマー３（２３ＳｒＲＮＡ側）：  ５’−ＧＴＧＧＡＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＣＹＡＧＧＡ−３’
プライマー４（２３ＳｒＲＮＡ側）：  ５’−ＴＣＣＧＡＡＴＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＳＣＡ−３’
（２）    スペーサー領域遺伝子のＰＣＲ増幅
６菌株（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ９（バチルス属微生物（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５１２））、Ｃ１２およびＣ１５株）の染色体遺伝子を鋳型ＤＮＡとし、先に合成した４種類のプライマーを用いて、上流側（１６ＳｒＲＮＡ側）のプライマーと下流側（２３ＳｒＲＮＡ側）のプライマーとの組み合わせ（プライマー１とプライマー３、プライマー１とプライマー４、プライマー２とプライマー３、及びプライマー２とプライマー４）にてＰＣＲ法によりスペーサー領域遺伝子の増幅を行った。なお、染色体遺伝子は、培養菌体を回収して、その菌体を超純水でけん濁し、１００℃３分間加熱処理を行なう方法で調製した。ＰＣＲ反応条件としては、変性（９４℃で１分間）、アニーリング（６０℃で１分間）及びＤＮＡ伸長（７２℃で１分間）の反応工程を２０サイクル行った。ＰＣＲ反応試料を１．５％ゲル濃度のアガロースゲル電気泳動法により増幅を確認した。その結果、すべての鋳型ＤＮＡ、すべてのプライマーの組み合わせにおいて、ＰＣＲ法による遺伝子増幅が観察された。電気泳動結果を図１に示す。図１に示されるように、バチルス属菌株であるＣ９の増幅断片は、ロドコッカス属菌株である他の菌株よりも短い増幅断片であった。その他のロドコッカス属菌株については、同様の鎖長のＰＣＲ増幅産物が観察された。
【００４１】
（３）    スペーサー領域遺伝子のクローニング及び塩基配列決定
増幅したＤＮＡ断片の遺伝子クローニング操作を以下の手順にて行った。
１．クローニングベクター（ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ）と増幅して得たＤＮＡ断片（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子）との結合酵素反応により組換えベクターの作製を行った。結合反応の酵素は、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）の酵素を用いた。酵素反応温度は１６℃、反応時間は１．５時間であった。
２．反応終了後、結合反応液（５μｌ）を形質転換用の大腸菌（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｈｉｇｈ  ＤＨ５α）（５０μｌ）に添加混合し、形質転換操作（結合反応液を添加した大腸菌を氷上に１０分間、４２℃水槽中で１分間、氷上に２０分間の温度ショックを与えて、大腸菌培養培地（ＳＯＣ溶液を）１００μｌ加え、３７℃で３０分間、振盪培養し、その培養液を寒天平板に塗布する）を行い、３７℃の温度条件で１６時間の静置により、抗生物質を含む寒天平板に形質転換大腸菌のコロニーを形成させた。なお、組換えベクターを大腸菌菌内に取りこんだ大腸菌は、抗生物質に対する抵抗性を獲得しているため、形質転換できた大腸菌のみが抗生物質を含む寒天平板にコロニーを形成する。
３．寒天平板培地のコロニーの菌株を液体培養培地（ＬＢ培地）に植菌して形質転換した大腸菌を培養した。培養した形質転換大腸菌から組換えベクターを抽出回収した。すなわち、アルカリＳＤＳ法と呼ばれる方法（形質転換大腸菌に菌溶解酵素を作用させたうえで、水酸化ナトリウム溶液および界面活性剤（ＳＤＳ）を添加して、形質転換大腸菌を溶菌させた。酢酸カリウムを添加してｐＨを中和し、大腸菌の染色体遺伝子や菌体を不溶化させて除去し、組換えベクターを回収する方法）により組換えベクターを得た。この組換えベクターを遺伝子配列解析のための鋳型ＤＮＡとした。
４．遺伝子配列解析
上記の３．の手順に従い回収した組換えベクターを制限酵素処理を行い、その酵素処理試料をアガロースゲル電気泳動で分析することにより、組換えベクターに目的とする１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が挿入されていることを確認し、次の手順にて、遺伝配列解析を行った。
【００４２】
組換えベクター試料を鋳型ＤＮＡとして、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の酵素を用いて、ＤＮＡ配列分析のための酵素反応を行った。酵素反応試料を遺伝子配列分析装置（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０）にかけて、遺伝子配列を決定した。
【００４３】
得られたＣ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ１２、Ｃ１５及びＣ９のスペーサー領域遺伝子の配列をそれぞれ配列番号５〜１０に示す。
【００４４】
実施例２：ＰＣＲ及びＤＧＧＥによるスペーサー領域遺伝子の分析
（１）    プライマーの設計
スペーサー領域の上流（１６ＳｒＲＮＡ側）に存在する塩基配列であって、実施例１（１）にて示した種々の微生物間で相同性の高い配列をプライマー５とした。プライマー５の塩基配列は配列番号１１に示される。
次に、スペーサー領域の下流に存在する塩基配列であって、ロドコッカス属菌株Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ１２及びＣ１５に共通する配列をプライマー６とした。プライマー６の塩基配列は配列番号１２に示される。
さらに、Ｃ２スペーサー領域に特異的な塩基配列をプライマー７とした。プライマー７の塩基配列は配列番号１３に示される。
【００４５】
プライマー５〜７の塩基配列を以下に示す。
【００４６】
プライマー５：５’−ＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣ−３’
プライマー６：５’−ＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＧＣＧＡ−３’
プライマー７：５’−ＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧ−３’
プライマー５とプライマー６との組み合わせによりロドコッカス属細菌のスペーサー領域を増幅でき、プライマー５とプライマー７との組み合わせによりＣ２に特有のスペーサー領域を増幅できる。
【００４７】
（２）    プライマー５及び６を用いたＰＣＲ増幅及び変性濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）
プライマーとしてプライマー５及び６を用い、鋳型ＤＮＡとして、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ１２およびＣ１５株から、それぞれ回収した染色体ＤＮＡを用いて、遺伝子増幅（ＰＣＲ反応）を行なった。ＰＣＲ反応条件としては、変性（９７℃で１分間）、アニーリング（５２℃で１分間）及びＤＮＡ伸長（７２℃で１分間）の反応工程を３２サイクル行った。ＰＣＲ反応試料を１．５％ゲル濃度のＤＧＧＥ法で分析した。
【００４８】
変性濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）操作の電気泳動装置はＤｃｏｄｅシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製品）を使用した。ＤＧＧＥ操作の手順を以下に示す。
【００４９】
ゲル中の変性剤の濃度勾配は、変性剤の含有濃度の異なる２つのアクリルアミドモノマー溶液の混合により作製する。変性剤の低濃度含有するアクリルアミドモノマー溶液と変性剤を高濃度含有するアクリルアミドモノマー溶液を用意し、装置専用の２液混合装置（ゲルメーカー）を用いて、２つの溶液の混合比率を変えて混合し、アクリルアミドモノマーを重合させる処理を行う。変性剤としては、尿素を用いた。ゲル作製の工程は下記の通り。
１．変性剤濃度低濃度側および高濃度側のアクリルアミド溶液を各２０ｍｌ用意し、高濃度側のものにはゲル作製用色素液１００μｌを添加し濃度勾配が視覚的に確認できるようにした。
２．各アクリルアミド溶液にゲル架橋剤（アンモニウム過硫酸：ＡＰＳ）を以下の条件で添加した。また、重合開始剤であるＴＥＭＥＤを少量添加した。
【００５０】
低濃度溶液  １０％ＡＰＳ    １１０μｌ    ＴＥＭＥＤ  １１μｌ
高濃度溶液  １０％ＡＰＳ    １５０μｌ    ＴＥＭＥＤ  １５μｌ
３．ゲル架橋剤および重合開始剤を添加し、直ちにゲルメーカーにセットし、上記の各溶液１６ｍｌの混合比率を連続的に変化させて変性剤の濃度勾配を形成させたゲルを完成させた（約１時間で重合終了）。
４．上記手順にて作製したゲルを０．５×ＴＡＥ緩衝液を充填した電気泳動槽に投入し、さらに、泳動用色素液を加えたＰＣＲ産物を、ゲルの試料溝（ウエル）に注入した。電気泳動（電圧７０Ｖ、泳動時間１６時間）は、５８℃の恒温条件で行い、電気泳動を完了したゲルを１０，０００倍希釈したＳＹＢＲ溶液（ＴＡＥ緩衝液）に浸漬（約３０分）してＤＮＡを蛍光色素により染色した。染色処理後、蛍光色素が励起する紫外線を照射し、蛍光色素により視覚化されたＤＮＡ断片の撮影を行った。写真は感度の高い白黒のインスタントファイルム（富士フィルム製）を用いた。
【００５１】
ＤＧＧＥによる電気泳動の結果を図２に示す。Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ１２及びＣ１５は同属の近縁菌株であるが、相互に異なる複数の増幅バンドパターンを示しており、このパターンの違いにより菌株の識別・検出ができる。
【００５２】
（３）    プライマー５及び７を用いたＰＣＲ増幅及び変性濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法）
プライマーとしてプライマー５及び７を用い、Ｃ２染色体ＤＮＡ、Ｃ４染色体ＤＮＡ、Ｃ１２染色体ＤＮＡ及びＣ１５染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法による増幅を行った。ＰＣＲ反応条件は、上記（２）におけるＰＣＲ反応条件と同じである。ＰＣＲ反応試料を１．５％ゲル濃度のＤＧＧＥで分析した。ＤＧＧＥの実験条件は上記（２）におけるＤＧＧＥの場合と同じである。
【００５３】
ＤＧＧＥによる電気泳動の結果を図３に示す。Ｃ２のＤＮＡバンドは他の菌株のＤＮＡバンドとは異なる泳動位置に現れることが確認される。このため、Ｃ２のスペーサー領域に特異的なプライマー（プライマー７）により、Ｃ２を特異的に識別することが可能である。
【００５４】
実施例３：土壌試料中の特定の微生物（Ｃ２）の検出
様々な微生物が混在する土壌試料を市街地や耕作地から採取し、その土壌試料にＣ２を添加して調製した試料を作成し、該試料が含む微生物中からＣ２の検出を行う。
【００５５】
土壌中に内在する混在微生物の密度は、土壌１ｇ当り１０７細胞程度であった。この土壌１ｇに対して検出対象微生物であるＣ２を１０９細胞を添加し、土壌試料とした。
【００５６】
土壌試料を土壌試料専用の破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ（ＢＩＯ−１０１社製）を用いて、破砕と土壌中の微生物の遺伝子の抽出操作を行なった。即ち、土壌試料を専用の使い捨てチューブ（破砕ミル入り）に入れ、緩衝液を添加して破砕操作とＤＮＡ抽出操作を行った。
【００５７】
抽出したＤＮＡ試料をプライマー５とプライマー７の組み合わせにて実施例２と同様の方法及び条件にて、遺伝子増幅処理（ＰＣＲ反応）及びＤＧＧＥ分析を行った。
【００５８】
ＤＧＧＥの結果を図４に示す。Ｃ２株のＤＮＡバンドのパターンが確認できた。
【００５９】
実施例４：微量の特定微生物（Ｃ２）の検出
市街地（汚染土壌）や耕作地に内在する微生物の密度（細胞数）が高く、検出するべき特定の微生物の細胞数よりも内在微生物の細胞数の方が多数存在する場合を想定して、市街地土壌や耕作地土壌に栄養成分（ＬＢ培地）を添加して培養し、内在する微生物数を増加させた土壌試料を準備した。この土壌試料を土壌試料専用の破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ（ＢＩＯ−１０１社製）を用いて、破砕と土壌中の微生物の遺伝子の抽出操作を行なった。即ち、土壌試料を専用の使い捨てチューブ（破砕ミル入り）に入れ、緩衝液を添加して破砕操作とＤＮＡ抽出操作を行ない、微生物数１０８細胞に相当するＤＮＡ溶液を得た。ここに特定菌株Ｃ２を細胞数１０６細胞、または、１０５細胞、または、１０４細胞に相当するＤＮＡ試料を添加・混合して、プライマー５および７を用いてＣ２の検出を検討した。遺伝子増幅条件およびＤＧＧＥ分析条件は実施例２と同様であった。
【００６０】
ＤＧＧＥの結果を図５に示す。図５に示すとおり、土壌試料１ｇ中に、内在する微生物が１０８細胞、検出対象微生物Ｃ２が１０４細胞存在する条件（存在比率１万対１）においても十分にＣ２を検出できた。このため、検出感度はそれ以上であると考えられる。
【００６１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲによるスペーサー領域の増幅産物のアガロース電気泳動写真
【図２】ＰＣＲによるスペーサー領域の増幅産物のＤＧＧＥ電気泳動写真
【図３】Ｃ２株のスペーサー領域に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ産物のＤＧＧＥ電気泳動写真
【図４】Ｃ２株を添加した土壌試料の分析結果（ＰＣＲ産物のＤＧＧＥ電気泳動写真）
【図５】土壌微生物とＣ２株の各存在比率条件でのＤＧＧＥ電気泳動写真
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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