(57)【要約】　　　（修正有）【課題】哺乳動物細胞の染色体分断と細胞死を促進する酵母蛋白質を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、哺乳動物細胞（ヒト癌細胞）の染色体分断と細胞死を促進する因子で、出芽酵母由来の「プロトタイプ的活性化細胞死（またはアポトーシス）」と名づけられているＣＩＡ１とこのＣＩＡ１をコードするポリヌクレオチド、これらのＣＩＡ１またはそのポリヌクレオチドを含有する制癌剤等の細胞死促進剤。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素配列番号２のアミノ酸配列を有し、哺乳動物細胞の染色体分断と細胞死を促進する酵母蛋白質ＣＩＡ１をコードする酵母遺伝子。
【請求項２】
ｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有する請求項１の酵母遺伝子。
【請求項３】
請求項１の酵母遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド、またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４の組換えベクターによる形質転換体細胞。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列を有し、哺乳動物細胞の細胞死を促進する精製酵母蛋白質ＣＩＡ１。
【請求項７】
請求項３のポリヌクレオチドの発現産物である請求項６の精製酵母蛋白質ＣＩＡ１。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列における一部連続配列からなるポリペプチド。
【請求項９】
請求項４の組換えベクターを含有する細胞死促進剤。
【請求項１０】
請求項６または７の精製酵母蛋白質ＣＩＡ１、もしくは請求項８のポリペプチドを含有する細胞死促進剤。
【請求項１１】
哺乳動物細胞の細胞死を促進する方法であって、請求項９または１０の細胞死促進剤を細胞に接触させる工程を含む方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞が、哺乳動物体内の細胞である請求項１１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、哺乳動物細胞の染色体分断と細胞死を促進する出芽酵母蛋白質ＣＩＡ１と、その利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
活性化細胞死（またはアポトーシス）は現在のところ多細胞的な概念として捉えられているが、徐々に単細胞的な概念としても受け取られつつある。しかしながらこのような細胞死に対して、多細胞および単細胞；有核細胞および原核細胞等の系統発生的に広汎な生物種における包括的な理解は欠けている。
【０００３】
このような細胞死に対する包括的な理解は、生命に対する基礎的な解明に役立つと共に、新しい癌治療の開発や新しいタイプの殺菌剤や抗真菌剤の創製などといった産業上有用な応用開発にとっても極めて重要である。
【０００４】
この出願の発明者らは、ヒストンのシャペロンとして機能する核因子　ＣＩＡ１の遺伝子を欠損したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が、核の断片化、染色質断片化および凝縮、ミトコンドリア膜電位の減少およびプロトンポンプ機能不全、チトクロームｃ放出、および細胞拡大などの表現型を示して死滅することを見出している（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　６，　１０４３−１０５４，　２００１）。この単細胞酵母における細胞死の表現型は大部分がアポトーシス的であり、わずかに壊死性であるため、この死は「プロトタイプ的活性化細胞死」と名付けられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の発明者らは、酵母のプロトタイプ的細胞死を促進する蛋白質ＣＩＡ１についてさらに研究を重ねた結果、このＣＩＡ１が哺乳動物細胞（ヒト癌細胞）の細胞死を促進することを見出した。
【０００６】
この出願の発明は以上のとおりに新規な知見に基づいてなされたものであって、哺乳動物細胞（ヒト癌細胞）の細胞死を促進する酵母蛋白質を提供することを課題としている。
【０００７】
またこの出願の発明は、この因子の利用発明を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１２）の発明を提供する。
（１）　　酵素配列番号２のアミノ酸配列を有し、哺乳動物細胞の染色体分断と細胞死を促進する酵母蛋白質ＣＩＡ１をコードする酵母遺伝子。
（２）　　ｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有する請求項１の酵母遺伝子。
（３）　　前記発明（１）の酵母遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド、またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチド。
（４）　　前記発明（３）のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
（５）　　前記発明（４）の組換えベクターによる形質転換体細胞。
（６）　　配列番号２のアミノ酸配列を有し、哺乳動物細胞の細胞死を促進する精製酵母蛋白質ＣＩＡ１。
（７）　　前記発明（３）のポリヌクレオチドの発現産物である前記発明（６）の精製酵母蛋白質ＣＩＡ１。
（８）　　配列番号２のアミノ酸配列における一部連続配列からなるポリペプチド。
（９）　　前記発明（４）の組換えベクターを含有する細胞死促進剤。
（１０）　前記発明（６）または（７）の精製酵母蛋白質ＣＩＡ１、もしくは前記発明（８）のポリペプチドを含有する細胞死促進剤。
（１１）　哺乳動物細胞の細胞死を促進する方法であって、前記発明（９）または（１０）の細胞死促進剤を細胞に接触させる工程を含む方法。
（１２）　哺乳動物細胞が、哺乳動物体内の細胞である前記発明（１１）の方法。
【０００９】
以下、この出願の発明について、実施形態を詳しく説明する。なお、この出願において「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は特定塩基数の断片を意味するものでなく、一応の目安として１００ｂｐ以上の断片をポリヌクレオチド、１００ｂｐ未満の断片をオリゴヌクレオチドとするが、例外も存在する。同様に、ポリペプチドについても特定範囲のアミノ酸残基数に限定されるものではない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
発明（１）は、ＣＩＡ１蛋白質をコードする酵母遺伝子であり、この酵母遺伝子は、さらに具体的には、転写されるｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有している（発明（２））。
【００１１】
この発明（１）の遺伝子は、例えば、配列番号１の塩基配列またはその一部配列からなる精製ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとして酵母ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。得られたゲノム遺伝子は、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００１２】
発明（３）は、発明（１）のゲノム遺伝子やこの遺伝子が転写するｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡから精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片）である。例えば、ｃＤＮＡは酵母細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として、公知の方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２，　１６１−１７０，　１９８２；　Ｇｅｎｅ，　１５０，　２４３−２５０，　１９９４）を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−として、酵母細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。このようにして調製ｃＤＮＡは、具体的には配列番号１の塩基配列を有している。
【００１３】
発明（３）のポリヌクレオチドはまた、発明（１）のゲノム遺伝子やこの遺伝子が転写するｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡから精製されたポリヌクレオチドの一部連続配列からなるポリヌクレオチドである。すなわち、この部分ポリヌクレオチドの一態様は、配列番号１におけるコード領域（ＯＲＦ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００１４】
これらのポリヌクレオチドは、発明（４）の組換えベクターの形態で、例えばＣＩＡ１蛋白質の遺伝子工学的な製造に使用することができるほか、発明（９）の薬剤成分としても使用することもできる。
【００１５】
発明（４）の組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜なものを使用する。例えば、ｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域をインサートとしてこの発明のＣＩＡ１蛋白質を生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することができる。また、発明（１）のゲノム遺伝子ＤＮＡをインサートとする場合には、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターやコスミドベクター等を使用することもできる。
【００１６】
これらの組換えベクターは、例えばＣＩＡ１蛋白質の遺伝子工学的な製造に使用することができるほか、発明（９）の薬剤成分としても使用することもできる。
【００１７】
発明（５）の形質転換体細胞は、例えば、前記発明（４）の組換えベクターを用いてＣＩＡ１蛋白質を製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。また、アデノウイルス等に由来する形質転換細胞は、発明（９）の薬剤成分としても使用することができる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。
【００１８】
発明（６）のＣＩＡ１蛋白質は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、酵母と同様に哺乳動物細胞の細胞死を促進する。
【００１９】
このＣＩＡ１蛋白質は、酵母細胞から単離する方法、配列番号２のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法等によって得ることができるが、好ましくは、前記発明（３）のポリヌクレオチドを用いて遺伝子工学的に製造することができる。すなわち、インビトロ転写翻訳系や、発明（５）の形質転換細胞の培養物から単離精製されるＣＩＡ１蛋白質（発明（７））である。
【００２０】
例えば、ＣＩＡ１蛋白質をインビトロ転写翻訳系で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作製する。このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ転写翻訳系に添加すれば、目的とするＣＩＡ１蛋白質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７　１８、ｐＴ７／３　１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩなどが例示できる。
【００２１】
ＣＩＡ１蛋白質を、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、目的の酵素を発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的蛋白質を大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００２２】
さらに、ＣＩＡ１蛋白質を真核細胞で発現させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成する。このベクターを真核細胞内に導入して培養すれば、目的とする蛋白質を発現する形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３Ｔ、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２３】
形質転換細胞で発現させたＣＩＡ１蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２４】
なお、細胞で発現した蛋白質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾された蛋白質もこの発明の酵素蛋白質の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、メチル化などである。
【００２５】
発明（８）は、配列番号２のアミノ酸配列における一部連続配列からなるポリペプチドである。すなわち、このポリペプチドは、ＣＩＡ１蛋白質の活性部分を構成する任意領域に対応する蛋白質断片と同一のアミノ酸配列からなり、例えば、化学合成によってペプチドを合成する方法や、部分ポリヌクレオチドを用いて遺伝子工学的に作成する方法、あるいは前記発明（６）または（７）のＣＩＡ１蛋白質を適当なプロテアーゼで消化する方法等によって作成することができる。
【００２６】
以上の発明（６）〜（８）のＣＩＡ１蛋白質またはポリペプチドは、発明（１０）の薬剤成分等として使用することができる。
【００２７】
発明（９）は、前記発明（４）の組換えベクターを含有する細胞死促進剤である。また、発明（１０）は、前記発明（６）〜（８）のＣＩＡ１蛋白質またはポリペプチドを含有する細胞死促進剤である。これらの細胞死促進剤は、例えば制癌剤として使用することができる。すなわち、癌細胞は正常な調節経路に異常が生じていることによって細胞死を免れ、異常に増殖していると考えられる。ＣＩＡ１蛋白質はその哺乳動物細胞（ヒト癌細胞）に対する細胞死促進作用によって癌細胞を死滅させることから、制癌効果が期待できる。
【００２８】
発明（９）の細胞死促進剤は、ＣＩＡ１蛋白質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを、生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等に組み込んで製剤化することができる。
【００２９】
また、発明（１０）の細胞死促進剤は、例えばＣＩＡ１蛋白質と薬理学的に許容される担体溶液とを混合して製剤化することができる。
【００３０】
そして、これらの細胞死促進剤は、発明（１１）および発明（１２）の方法において使用することができる。すなわち、発明（１１）の方法はこれらの細胞死促進剤を哺乳動物細胞に接触させる工程を含む哺乳動物細胞の細胞死促進方法である。この方法は、例えば培養条件下にある細胞、または哺乳動物の体内（好ましくは人体内）にある細胞を対象とするものであり、具体的には体内の癌細胞に対する抗癌剤として使用する。
【００３１】
例えば、体内に存在する細胞に対して使用する場合、発明（９）の細胞死促進剤は、遺伝子治療の手法により体内に導入することができる。その場合に、ＣＩＡ１蛋白質をコードするポリヌクレオチドの血中濃度が約０．１μＭ〜約１０μＭに達するように、十分な量を投与することが好ましい。また発明（１０）の細胞死促進剤は、例えばマイクロインジェクション法により癌組織に局所注入することができる。あるいは、最近開発された脂質による細胞内導入法（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）、Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｆ社、米国）等）を採用することによっても癌組織に蛋白質またはポリペプチドを導入することができる。このような注入形態において、蛋白質またはポリペプチドの含有量は、担体溶液１ｍｌに対して、１ｎｇ〜１０ｍｇ程度とすることができる。また、特に人体内への投与を対象とする発明（１０）の細胞死促進剤の場合には、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻孔内、気管内、または直腸内等の経路によって投与するために製剤化することができる。また、製剤化のための担体は、これらの投与経路に依存するが、例えば、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、およびこの技術分野で公知のその他の材料を含む。また、「薬剤的に許容される」という用語は、細胞、細胞培養、組織、または生体のような生物学的システムに適合し、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害しないような非毒性材料を意味する。薬剤的に許容される製剤化の調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　１８ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　ｅｄ．　Ａ．　Ｇｅｎｎａｒｏ，　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，　Ｅａｓｔｏｎ，　ＰＡ，　１９９０に記載されている。
【００３２】
以下、この発明の蛋白質機能解析のために行った実験を示す。
（１）　　クローニング
ＣＩＡ１蛋白質をコードするｃＤＮＡは、出芽酵母データベースの情報を参考にゲノムＰＣＲを行い、全長ＯＲＦを含む断片を単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（−）にサブクローニングして配列を決定した。配列番号１にＣＩＡ１　ｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号２にＣＩＡ１蛋白質のアミノ酸配列を示す。
（２）　　出芽酵母細胞の操作
Ｗ３０３株に由来する出芽酵母細胞を使用した。また、ＣＩＡ１欠損細胞は、以下の方法によって作製した。
【００３３】
組み換えＤＮＡ技術を用いて、配列番号１を全て含むＣＩＡ１遺伝子全長フラグメントのうち、制限酵素ＮｄｅＩとＡｃｃＩで切り出される約０．７ｋｂの遺伝子断片部位を約１．１ｋｂのＵＲＡ３遺伝子断片（制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで切り出される遺伝子断片）で置き換えた。次に、この組み換え遺伝子断片のうち、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切り出される約１．１ｋｂの遺伝子断片をＷ３０３　ＭＡＴ　ａｌｐｈａ／ａの遺伝型で示されるＷ３０３株由来の２倍体細胞に形質転換し、ウラシルを含まない培地で生育する株を得た。この株のＣＩＡ１遺伝子座で遺伝子組み換えが起こっていることはゲノムＰＣＲ解析で確認した。胞子形成条件下でこの２倍体の胞子を取得し、ウラシルを含まない培地で生育し、かつＣＩＡ１遺伝子座にＵＲＡ３遺伝子断片が挿入された１倍体を分離した。この株は機能的なＣＩＡ１遺伝子を欠損した１倍体酵母株であり、ＣＩＡ１欠損酵母細胞と呼称する。また、ＣＩＡ１遺伝子座にＵＲＡ３遺伝子断片を組み込んでいない株を野生型酵母細胞と呼称する。
（３）　　哺乳動物細胞の操作
ＨｅＬａおよびＣＯＳ７細胞を使用した。細胞は５％　ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（Ｎｉｓｓｕｉ）中で３７℃、５％　ＣＯ２存在下、４８時間で前培養した。前記のＣＩＡ１　ｃＤＮＡを動物細胞導入用の蛋白質非結合ベクター（ｐＳＧ−５）にクローニングし、細胞をこのベクターの存在下で培養を行うことにより形質転換させた。動物細胞導入用の蛋白質非結合ベクター（ｐＳＧ−５）に組み込んだ出芽酵母蛋白質ＣＩＡ１を培養後２４時間のＣＯＳ７細胞（アカゲザル腎細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頚部癌細胞）ともに３７（Ｃ、５％−ＣＯ２存在下で４８時間培養した後、染色解析に用いた。
（４）　　顕微鏡検査法
酵母および哺乳動物細胞の分析には、文献（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　６，　１０４３−１０５４，　２００１）の記載に従い、差分干渉対照（ＤＩＣ）補助を受けた光学、蛍光、共焦点レーザースキャニング、および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いた。
（５）　　染色技術
細胞の生存度の決定は、酵母細胞についてはＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｙｅａｓｔ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｋｉｔ（ＦＵＮ−１、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒｅ　ｗｈｉｔｅ　Ｍ２Ｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を、哺乳類細胞についてはＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｒｅｄｕｃｅｄ　Ｂｉｏｈａｚａｒｄ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ　Ｋｉｔ（ＳＹＴＯ　１０、ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて行った。酵母と哺乳類細胞の核および染色体の形態変化は、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）（Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　６，　１０４３−１０５４，　２００１）を用いて同定した。
【００３４】
ＤＮＡ断片化の同定は、ＴＵＮＥＬ染色をｉｎ　ｓｉｔｕ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ＫｉｔのＰＯＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）およびＳｔａｂｌｅＤＡＢ（ＫＰＬ）と共に用いることにより行った。細胞膜転座の同定は、アネキシンＶ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４複合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を用いたアネキシンＶ染色により行った。これらの染色手順はいずれも製造業者の指示に従って行った。酵母の染色を行う前に、文献（Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，　１３９，　７２９−７３４，　１９９７）の記載に従い、細胞壁をβ−ｇｌｕｓｕｌａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）およびｌｙｔｉｃａｓｅ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｌｕｔｅｕｓ　ｓｐ．，　Ｓｉｇｍａ）を用いて処理した。（６）　　ＣＩＡ１発現哺乳動物細胞の細胞死の解析
ＣＩＡ１を発現した哺乳動物細胞を３７（Ｃ、５％−ＣＯ２存在下で４８時間培養し、特異的染色法（すなわちＤＡＰＩおよびＴＵＮＥＬ）を実施することにより、核・染色体ＤＮＡの分断化などのアポトーシスの特徴を調べた。結果は図１（ＤＡＰＩ染色：ＣＯＳ７細胞）、図２（ＴＵＮＥＬ染色：ＣＯＳ７細胞）および図３（ＴＵＮＥＬ染色：ＨｅＬａ細胞）に示したとおりである。哺乳動物細胞はいずれの染色においても強い陽性を示し、広範囲の核分断化と染色体ＤＮＡの分断化が確認された。このことから、酵母蛋白質ＣＩＡ１を哺乳動物細胞に発現させることによって、その細胞に自発的な細胞死（アポトーシス）をもたらす効果が確認された。また、酵母蛋白質ＣＩＡ１をヒト癌細胞に発現させることで特異的な細胞死がもたらされたことから、この発明の制癌効果が検証された。
（７）　　ＣＩＡ１欠損酵母細胞の細胞死の解析
ＣＩＡ１を欠損した出芽酵母細胞を３０（Ｃで７２時間培養し、特異的染色法（すなわちＴＵＮＥＬおよびアネキシンＶ）を実施し、ＤＮＡ断片化や細胞膜転座などアポトーシス特徴を調べた。結果は図４（ＴＵＮＥＬ染色）および図５（アネキシンＶ染色）に示したとおりである。ＣＩＡ１を欠損した出芽酵母細胞はいずれの染色においても強い陽性を示し、広範囲のＤＮＡ分断化と細胞膜の転座が確認された。このことから、酵母蛋白質ＣＩＡ１を酵母（真菌類）から欠損させることによって、その細胞に自発的な細胞死（哺乳類アポトーシスに類似した細胞死）をもたらす効果が確認された。
【００３５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、哺乳動物細胞の細胞死を促進する酵母因子が提供される。また、この因子を有効成分とする制癌剤等の細胞死促進薬剤が提供される。
【００３６】
【配列表】
2004049147.tif 000002
2004049147.tif 000003
2004049147.tif 000004
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2004049147.tif 000006
2004049147.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】出芽酵母ＣＩＡ１を発現した哺乳類細胞ＣＯＳ７（サル培養細胞）のＤＡＰＩ染色像である。動物細胞導入用の蛋白質非結合ベクター（ｐＳＧ−５）に組み込んだ出芽酵母蛋白質ＣＩＡ１を培養後２４時間のＣＯＳ７細胞（アカゲザル腎細胞）に導入し、３７（Ｃ、５％−ＣＯ２存在下で４８時間培養した細胞を核染色蛍光色素ＤＡＰＩにより染色した。対照細胞としては遺伝子を含まないベクターを導入した細胞を用い、同様の染色を行なった。ＤＡＰＩ染色は細胞内のＤＮＡを染色する法で、これにより細胞の核・染色体の形状が観察できる。その結果、上図に示すようにＣＩＡ１発現細胞では対照株（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べ明らかな染色体の分断が観察された。これは、アポトーシスと呼ばれる自発的な細胞死の特徴である。ＣＩＡ１蛋白質は、哺乳類細胞の核・染色体を分断させるアポトーシス誘因活性を持つことがわかる。
【図２】出芽酵母ＣＩＡ１を発現した哺乳類細胞ＣＯＳ７（サル培養細胞）のＴＵＮＥＬ染色像である。図１と同様に、酵母核内因子ＣＩＡ１を発現したＣＯＳ７細胞を３７（Ｃ、５％−ＣＯ２存在下で４８時間培養し、２．５％グルタールアルデヒドで固定したのち２重鎖ＤＮＡ断片を特異的に標識するＴＵＮＥＬ法により染色した。対照細胞は遺伝子を含まないベクターを導入したもので、ＣＩＡ１発現細胞と同様の染色を行なった。ＴＵＮＥＬ染色は、ＤＮＡの断裂部位を検出する染色方法で、染色体ＤＮＡが核内で分断しているかどうかが確認できる。その結果、左図に示すようにＣＩＡ１発現細胞では茶色（濃色）に標識された細胞が多く観察された。これは、細胞内で染色体ＤＮＡが分断化していることを示唆する現象であり、自発的細胞死（アポトーシス）の特徴の一つである。右図は対照細胞で、ＴＵＮＥＬ染色を行ってもほとんど着色は観察されなかった。このようにＣＩＡ１発現培養細胞では染色体ＤＮＡの分断が特異的に起こったことから、ＣＩＡ１蛋白質が、哺乳類細胞の染色体ＤＮＡを分断させるアポトーシス誘因活性を持つことがわかる。
【図３】出芽酵母ＣＩＡ１を発現した哺乳類細胞ＨｅＬａ（ヒト子宮頚部癌細胞）のＴＵＮＥＬ染色像である。図２と同様に、ＨｅＬａ細胞に酵母核内因子ＣＩＡ１を発現され３７（Ｃ、５％−ＣＯ２存在下で４８時間培養したのち、２．５％グルタールアルデヒドで固定してＴＵＮＥＬ法を行なった（左図）。右図は遺伝子を含まないベクターを導入した細胞を対照として、同様の染色を行なった結果である。ＴＵＮＥＬ染色解析の結果、左図に示すようにＣＯＳ７細胞同様にＣＩＡ１発現ＨｅＬａ細胞でも茶色（濃色）に標識された細胞が多く観察され、対照細胞ではほとんど見られなかった。このことから培養細胞の種類によらず、ＣＩＡ１蛋白質は哺乳動物細胞においてアポトーシス誘因活性を持つことがわかる。
【図４】出芽酵母ＣＩＡ１を欠損した出芽酵母細胞のＴＵＮＥＬ染色像である。酵母導入用のＦｌａｇ−ｔａｇ　ｖｅｃｔｏｒ（ｐＡＫ０２１）に組み込んだ酵母核内因子ＣＩＡ１を出芽酵母Ｗ３０３−１ａに発現させ、３０（Ｃで７２時間培養したのち２．５％グルタールアルデヒドで固定しＴＵＮＥＬ法により染色した（上図）。実験対照として、遺伝子を含まないベクターを導入し、同様の染色を行なった（下図）。その結果、ＣＩＡ１発現出芽酵母では茶色（濃色）に標識された細胞が多く観察されたが、対照株ではそうした着色はほとんど見られなかった。ＣＩＡ１蛋白質が存在しないと、出芽酵母の染色体ＤＮＡが分断することがわかる。このことからＣＩＡ１蛋白質は、出芽酵母においてアポトーシス様の細胞死を内在的に制御する活性を持っていることが示唆された。なお、下図に示す野生型株（ＣＩＡ１遺伝子を欠損していない細胞）ではＴＵＮＥＬ染色で着色が認められなかったことから、染色体ＤＮＡは分断していないことが確認される。
【図５】出芽酵母ＣＩＡ１を欠損した出芽酵母細胞のＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ染色像である。図４と同様に、ＣＩＡ１発現出芽酵母を３０（Ｃで７２時間培養し、２．５％グルタールアルデヒドで固定したのちＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖにより細胞膜反転の有無を検出した（上図）。下図には、遺伝子を含まないベクターを導入した株（対照株）を同様にＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ染色した結果を示す。Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖは、細胞膜の反転により露出するフォスファチジルセリンを特異的に染色する。このような細胞膜の反転は、アポトーシスの初期に見られる現象であり、細胞死が自発的であるかどうかを検出する指標となっている。出芽酵母ＣＩＡ１遺伝子を欠損させた出芽酵母細胞の多くはＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖでリング様に細胞膜が縁取られ、細胞膜が反転した細胞が顕著に出現することが判明した。即ち、ＣＩＡ１蛋白質は出芽酵母においてアポトーシス様の細胞死を内在的に制御する活性を持っていることが示唆される。なお、下図に示す野生型株（ＣＩＡ１遺伝子を欠損していない細胞）では細胞膜は反転していないことが確認できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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