(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ハイブリッドイネ育成に利用されているＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１遺伝子）の有無を検出する際にバルク法で種子純度を推定する方法を提供する。【解決手段】ＢＴ型雄性不稔細胞質およびその稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）は、ハイブリッドイネ育成に利用されている。本発明では、Ｒｆ−１遺伝子座近傍の塩基配列に着目することにより、Ｒｆ−１特異的マーカーおよびｒｆ−１特異的マーカーを開発した。【効果】これらのマーカーを利用してバルク検定を行うことにより、種子純度の管理を飛躍的に効率化できる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）を保有するイネ品種のＲｆ−１座周辺の配列番号１０の配列を有する塩基配列情報と、Ｒｆ−１遺伝子を保有しないイネ品種の対応する部位の塩基配列情報とを比較したときにみられる、Ｒｆ−１保有品種には存在するがＲｆ−１非保有品種においては欠失している領域の周辺の塩基配列情報に基づいて、Ｒｆ−１非保有品種において欠失している領域の外部の両品種に共通して存在する領域とハイブリダイズし、Ｒｆ−１保有品種特異的な塩基配列の領域を挟み込む一対のプライマーであって、そのプライマーの対によって増幅させようとする塩基配列が、Ｒｆ−１非保有品種のイネゲノムをテンプレートにしたときは増幅可能な長さであるが、Ｒｆ−１保有品種のイネゲノムをテンプレートにしたときは増幅効率が悪くなるため検出困難な長さであるように選択したプライマーの対を用いてイネゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物としてのＤＮＡマーカー（ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカー）が得られたイネ品種をＲｆ−１非保有品種であると同定することからなる、イネにおける稔性回復遺伝子の有無を識別する方法。
【請求項２】
（１）一粒以上のイネの種子からなるサンプルから、イネＤＮＡを抽出する工程、
（２）イネＤＮＡをテンプレートに請求項１に記載のように選択されるプライマーを用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行う工程、
（３）増幅産物としてのＤＮＡマーカーを検出する工程、および、
（４）ＤＮＡマーカーの存在の有無を評価する工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
イネ稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）を保有するイネ品種のＲｆ−１座周辺の配列番号１０および１１の配列を有する塩基配列情報と、Ｒｆ−１遺伝子を保有しないイネ品種の対応する部位の塩基配列情報とを比較したときにみられる、Ｒｆ−１保有品種にのみ特徴的に存在する塩基配列の領域の配列情報に基づいて、Ｒｆ−１保有品種にのみ特徴的に存在する領域内部の一部を特異的に増幅することができるように一対のプライマーを選択し、そのプライマーの対を用いてイネゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物としてのＤＮＡマーカー（Ｒｆ−１特異的マーカー）が得られたイネ品種をＲｆ−１保有品種であると同定することからなる、イネにおける稔性回復遺伝子の有無を識別する方法。
【請求項４】
（１）一粒以上のイネの種子からなるサンプルから、イネＤＮＡを抽出する工程、
（２）イネＤＮＡをテンプレートに請求項２に記載のように選択されるプライマーを用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行う工程、
（３）増幅産物としてのＤＮＡマーカーを検出する工程、および、
（４）ＤＮＡマーカーの存在の有無を評価する工程、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
二粒以上のイネ種子からなるサンプルからイネＤＮＡを抽出し、請求項１または２に記載の方法を用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行い、増幅産物としてのＤＮＡマーカー（ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカー）が存在するとき、サンプル中にＲｆ−１非保有品種のイネ種子が含まれると判断する、サンプル中に含まれている、または、混入しているＲｆ−１非保有品種の種子の有無を判別する方法。
【請求項６】
二粒以上のイネ種子からなるサンプルからイネＤＮＡを抽出し、請求項３または４に記載の方法を用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行い、増幅産物としてのＤＮＡマーカー（Ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカー）が存在するとき、サンプル中にＲｆ−１保有品種のイネ種子が含まれていると判断する、サンプル中に含まれている、または、混入しているＲｆ−１保有品種の種子の有無を判別する方法。
【請求項７】
請求項５および／または６に記載の方法によって増幅産物として生じたｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーおよび／またはＲｆ−１特異的マーカーの量を定量または半定量によって評価することで、二粒以上のイネ種子からなるサンプルの稔性回復遺伝子の有無に関する種子純度を検定または推定する方法。
【請求項８】
Ｒｆ−１遺伝子の有無を判別し、および／または種子純度を検定または推定するイネ種子が、ハイブリッドイネ種子作成に用いる雄性不稔系統（Ｒｆ−１非保有）である、請求項４から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｒｆ−１遺伝子の有無を判別し、および／または種子純度を検定または推定するイネ種子が、ハイブリッドイネ種子作成に用いる維持系統（Ｒｆ−１非保有）である、請求項５から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒｆ−１遺伝子の有無を判別し、および／または種子純度を検定または推定するイネ種子が、ハイブリッドイネ種子作成に用いる稔性回復系統（Ｒｆ−１保有）である、請求項５から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のように選択されるプライマーのうち少なくとも１つが、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡのグループから選ばれる、請求項１、２、５、および７から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項２に記載のように選択されるプライマーのうち少なくとも１つが、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡのグループから選ばれる、請求項３、４、および６から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のように選択されるプライマー。
【請求項１４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡのグループから選ばれるプライマー。
【請求項１５】
ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーが、
（１）配列番号１および配列番号３の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行い、イネのＲｆ−１非保有品種について増幅産物として得られるＤＮＡマーカー；
（２）配列番号１および配列番号４の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行い、イネのＲｆ−１非保有品種について増幅産物として得られるＤＮＡマーカー；
（３）配列番号２および配列番号３の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行い、イネのＲｆ−１非保有品種について増幅産物として得られるＤＮＡマーカー；
（４）配列番号２および配列番号４の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行い、イネのＲｆ−１非保有品種について増幅産物として得られるＤＮＡマーカー；
からなるＤＮＡマーカーのグループから選ばれる、請求項１、２、５、および７から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーが、
（１）配列番号５および配列番号９の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行い、Ｒｆ−１遺伝子を有するイネの品種について増幅産物として得られるＤＮＡマーカー；
（２）配列番号６および配列番号９の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行い、Ｒｆ−１遺伝子を有するイネの品種について増幅産物として得られるＤＮＡマーカー；
（３）配列番号７および配列番号９の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行い、Ｒｆ−１遺伝子を有するイネの品種について増幅産物として得られるＤＮＡマーカー；
（４）配列番号８および配列番号９の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてイネゲノムＤＮＡの増幅を行い、Ｒｆ−１遺伝子を有するイネの品種について増幅産物として得られるＤＮＡマーカー；
からなるＤＮＡマーカーのグループから選ばれる、請求項３、４、および６から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載のｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカー。
【請求項１８】
請求項１６に記載のＲｆ−１特異的ＤＮＡマーカー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハイブリッドイネ育成に利用されているＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１遺伝子）の有無の検出によって、バルク法で種子純度を推定する方法に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明はＲｆ−１遺伝子座周辺の塩基配列情報に基づいてＲｆ−１特異的マーカーおよびｒｆ−１特異的マーカーを提供し、これらのマーカーを利用してバルク検定により種子純度を推定する方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
イネは自殖性植物であるため、品種間で交雑を行う場合には、まず自家受精を避けるためにイネの穎花が開花する直前に穎花内の雄しべをすべて取り除き、ついで交雑をする花粉親品種由来の花粉を用いて受精させる必要がある。しかしながら、このような手作業による交雑方法で商業規模での大量の雑種種子を生産することは不可能である。
【０００４】
そこで、ハイブリッドイネの生産には、細胞質雄性不稔を利用する三系法が利用されている。三系法とは、雄性不稔細胞質を保有する系統である不稔系統、Ｒｆ−１遺伝子を保有する系統である回復系統、および核遺伝子は不稔系統と同一であって不稔細胞質を保有しない系統である維持系統とを使用する方法をいう。これらの三系統を用いて、（ｉ）不稔系統に回復系統の花粉を受精させることによりハイブリッド種子を獲得することができ、（ｉｉ）一方、不稔系統に維持系統の花粉を受精させることにより不稔系統を維持することができる。
【０００５】
三系法でＢＴ型雄性不稔細胞質を利用するにあたっては、回復系統のイネを育成するために、育種における各過程で育成中のイネがＲｆ−１遺伝子を保有すること、また、最終段階ではＲｆ−１遺伝子をホモで保有することを確認する必要がある。また、三系法において、回復系統に使用する品種が確実にＲｆ−１遺伝子を保有することを調べたり、得られたハイブリッド種子が稔性を回復しているか確認するためにＲｆ−１遺伝子の存在を調べる必要が生じる場合もある。
【０００６】
従来、植物体中でのＲｆ−１遺伝子座の遺伝子型を推定するためには、まず、検定系統と交配を行った交配種子から植物体（Ｆ１）を形成し、ついでＦ１植物を自殖させてその種子の形成率が一定以上（例えば、７０〜８０％以上）である個体の出現頻度を調査する必要があった。なお、検定系統とは、維持系統、不稔系統、あるいは両系統のセットを指し、目的とする被検定個体の細胞質がＢＴ型か通常細胞質か、あるいは不明かにより適宜選択するものである。不稔系統を検定系統として用いる場合は母本として、維持系統を検定系統として用いる場合は父本としてそれぞれ被検定個体に交配する。
【０００７】
しかしながら、これらの方法を行うには、莫大な労力と時間を要する。また、種子稔性は、環境要因の影響を受けやすいので、低温・日照不足などの不良環境で調査すれば、遺伝子型の構成によらず不稔になる場合があり、Ｒｆ−１遺伝子座の遺伝子型の推定が正確に行えないという問題を有していた。
【０００８】
このような問題を解消するために、近年、分子生物学的手法によりＲｆ−１遺伝子の存在を判別する方法も提案されている。それは、Ｒｆ−１遺伝子と連鎖する塩基配列（以下、ＤＮＡマーカーという）を検出することにより、Ｒｆ−１遺伝子の存在または不存在を調べる方法である。しかしながら、Ｒｆ−１遺伝子のＤＮＡ配列は未解読であったため、直接Ｒｆ−１遺伝子を検出することは、従来の技術では不可能であった。
【０００９】
例えば、イネのＲｆ−１遺伝子座は第１０染色体上に存在し、そして、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析に使用することができるＤＮＡマーカー（ＲＦＬＰマーカー）座Ｇ２９１とＧ１２７との間であることが報告されている（Ｆｕｋｕｔａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．，４２（ｓｕｐｌ．１）１６４−１６５）。このため、Ｒｆ−１遺伝子と連鎖するＤＮＡマーカー座Ｇ２９１およびＧ１２７の遺伝子型を調査することにより、Ｒｆ−１遺伝子座の遺伝子型を推定することが可能である。
【００１０】
しかし、これにはいくつかの問題が存在する。第一の問題はこの方法においては使用するマーカーがＲＦＬＰマーカーであり、これを検出するためにはサザンブロット解析を行う必要があるという点である。サザン部ロット解析を行うためには、被検定個体から数マイクログラム単位の精製されたＤＮＡを必要とし、さらに制限酵素処理、電気泳動、ブロッティング、プローブとのハイブリダイゼーション、及びシグナルの検出からなる一連の作業手順を行う必要があるため、多大な労力が必要である上に、検定結果を得るまでに１週間程度かかっていた。
【００１１】
第二の問題は、ＲＦＬＰマーカー座Ｇ２９１とＧ１２７の間の遺伝子地図距離は約３０ｃＭ（イネＤＮＡでは約９０００ｋｂｐに相当する）と長いため、二重組換えが起こる可能性が数％程度はあると考えられ、Ｒｆ−１遺伝子座の遺伝子型が必ずしも正確に推定できないことである。
【００１２】
このような問題を解決するため、Ｒｆ−１遺伝子座と連鎖する優性ＤＮＡマーカー（特開平７−２２２５８８）および共優性ＤＮＡマーカー（特開平９−３１３１８７）が開発されている。これらのマーカーは、Ｒｆ−１遺伝子座とそれぞれ、１．６±０．７ｃＭ（イネＤＮＡでは約４８０ｋｂｐに相当）および３．７±１．１ｃＭ（イネＤＮＡでは約１１１０ｋｂｐに相当）の遺伝的距離で連鎖しており、両座はＲｆ−１遺伝子座を挟む位置関係にある。そのため、優性ＰＣＲマーカー座および共優性ＰＣＲマーカー座はこれらが両方とも存在することを検出することにより、Ｒｆ−１遺伝子の存在を推定することができる。また、共優性ＰＣＲマーカーの使用は、Ｒｆ−１遺伝子座の遺伝子型がホモかヘテロかも推定することを可能にする。
【００１３】
しかしながら、これらのＰＣＲマーカーを使用する場合にも、依然としていくつかの問題がある。この共優性マーカーはＲｆ−１遺伝子座と３．７±１．１ｃＭの遺伝距離を有するため、Ｒｆ−１遺伝子座との間での組換えが起こりうるという問題が十分には解決されていない。その結果、共優性マーカー自体についてはホモ型またはヘテロ型まで正確に検出することができるが、共優性マーカー座とＲｆ−１遺伝子座との間で組換えが生じる場合に、Ｒｆ−１遺伝子座の遺伝子型の推定、特にホモ型またはヘテロ型までの推定を正確に実施できないという問題がある。一方、優性マーカーを使用してＲｆ−１遺伝子座の遺伝子型を推定する場合、優性マーカーではＲｆ−１遺伝子がホモの個体（Ｒｆ−１／Ｒｆ−１）およびヘテロの個体（Ｒｆ−１／ｒｆ−１）の両方を区別することなく検出してしまう。そのため、上記共優性マーカーと優性マーカーとを組み合わせて利用してＲｆ−１遺伝子座の遺伝子型を推定したとしても、Ｒｆ−１遺伝子に関するホモ型とヘテロ型とを正確に識別することはできない。また、優性マーカーを用いて行うＰＣＲでは、ＰＣＲ産物が得られなかった場合には、実験操作上の問題に起因する可能性も否定できない。
【００１４】
さらに、特開２０００−１３９４６５には、イネ第１０染色体のＲｆ−１遺伝子の近傍に座乗するＲＦＬＰマーカーの塩基配列に基づいて開発された、共優性ＰＣＲマーカーが記載されている。しかしながら、それらのＰＣＲマーカーは依然としてＲｆ−１遺伝子からの遺伝的距離が約１ｃＭより離れているという問題を有している。
【００１５】
本発明者らは、平成１２年８月１７日に特許出願を行った特願２０００−２４７２０４の中で、Ｒｆ−１遺伝子座の存在部分をイネ第１０染色体上に存在するＤＮＡマーカー座Ｓ１２５６４　Ｔｓｐ５０９Ｉ座とＣ１３６１　ＭｗｏＩ座との間の極めて狭い範囲（０．３ｃＭ）に座乗することを特定した。その結果に基づいて、Ｒｆ−１遺伝子の近傍に存在するＰＣＲマーカーを開発し、これらのＰＣＲマーカーの遺伝子型を調査し、Ｒｆ−１遺伝子の有無の調査を通じて、Ｒｆ−１遺伝子優性ホモ個体（Ｒｆ−１／Ｒｆ−１）、ヘテロ個体（Ｒｆ−１／ｒｆ−１）、劣性へテロ個体（ｒｆ−１／ｒｆ−１）を判別・検定する方法を提供した。この方法を、Ｒｆ−１遺伝子を持たない通常のジャポニカ品種に戻し交雑によりＲｆ−１遺伝子を導入することにより回復系統を育成する過程で用いることで、回復系統の育成が効率的に行えるようになった。
【００１６】
しかしながら、これらのＰＣＲマーカーによる検定法は、個体別に実施することを前提に開発されたため、多サンプルをひとまとめにして１サンプルとして扱う、バルク検定に応用することはできない。たとえば、１００粒の種子の中から異品種の混入の有無を調べる際にはバルク検定が不可欠であるが、先の特許出願で開発されたＰＣＲマーカーでは実現不可能であった。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ハイブリッドイネ育成に利用されているＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１遺伝子）の有無を検出する際にバルク法で種子純度を推定することができる方法を提供する。本発明は、また、Ｒｆ−１遺伝子座周辺の塩基配列情報に基づいて、Ｒｆ−１特異的マーカーおよびｒｆ−１特異的マーカーを開発し、これらのマーカーを利用することでバルク検定により種子純度を推定する方法を提供する。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）座周辺の塩基配列情報に基づいて開発されるＤＮＡマーカーを利用して、バルク検定により種子純度を推定する方法を提供する。
【００１９】
本発明者らは、平成１３年９月１９日に特許出願を行った特願２００１−２８５２４７の中で、Ｒｆ−１遺伝子座領域の染色体歩行と塩基配列解析を行った。その過程で、Ｒｆ−１保有品種であるインディカ品種ＩＲ２４のＲｆ−１座周辺塩基配列（配列番号１０）と、Ｒｆ−１非保有品種であるジャポニカ品種日本晴の同領域に対応すると考えられる塩基配列（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）とを比較した。その結果、ＩＲ２４のＲｆ−１座の下流で非常に近接した領域である、配列番号１０に記載の配列の５８１９９番目の塩基から６４４５９番目の塩基までの６２６１塩基に相当する配列が、ＡＣ０６８９２３配列では欠失（以下、第一の領域という）していることが明らかになった（概略は図１を参照）。
【００２０】
さらに、配列番号１１に含まれる領域において、Ｒｆ−１座近傍の周辺塩基配列において、Ｒｆ−１保有品種に特異的な塩基配列（以下、第二の領域という）が存在することも見いだした。
【００２１】
本発明では、上記の差異を利用して、Ｒｆ−１非保有品種特異的なＤＮＡマーカー（以下、ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーという）およびＲｆ−１保有品種特異的なＤＮＡマーカー（以下、Ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーという）を開発する。ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーの開発においては、Ｒｆ−１非保有品種において欠失している塩基配列領域の外部の上流側、下流側の塩基配列に基づくプライマーをデザインする。ここで、Ｒｆ−１非保有品種において欠失している塩基配列領域は、Ｒｆ−１保有品種のイネゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて設計したプライマーによって増幅を行っても、その増幅産物が検出できないほど増幅効率が著しく悪化する程度に長いことが望ましい。上記の第一の領域はこの条件を満たしている。このような条件の下で、欠失領域の上流側、下流側とハイブリダイズするプライマーを対で用いて、検定するイネのゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行えば、増幅産物の存在はＲｆ−１非保有品種を検定するマーカーとなる。一方、Ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーの開発においては、Ｒｆ−１保有品種に特異的な塩基配列に基づくプライマーをデザインする。このプライマーはＲｆ−１保有品種のイネゲノムＤＮＡ特異的にハイブリダイズするので、検定するイネゲノムＤＮＡを鋳型として増幅反応を行えば、増幅産物の存在はＲｆ−１保有品種を検定するマーカーとなる。
【００２２】
本発明において、増幅（ＤＮＡの）とは、本発明の方法に基づいて設計されたプライマーおよび本発明のプライマーを用いてイネゲノムＤＮＡを増幅することであり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはその他の方法でもよい。
【００２３】
本発明の方法は、（１）一粒以上のイネの種子からなるサンプルからＤＮＡを抽出する工程、（２）イネＤＮＡをテンプレートにイネ稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１）座周辺の塩基配列情報に基づいて開発されるＤＮＡマーカーを生じるプライマーを用いてイネゲノムＤＮＡを増幅する工程、（３）増幅産物であるＤＮＡマーカーを検出する工程、および（４）増幅産物の有無および／または量を評価する工程、を含む。
【００２４】
ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーを用いるイネ種子の純度検定
以下に第一の領域の相違（欠失）に基づく方法を例にして説明するが、その他の領域における同様の相違（欠失）を利用しても同様に行うことが可能である。Ｒｆ−１非保有品種を検出するためのＦｏｒｗａｒｄプライマーおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマーを用いたイネＤＮＡのＰＣＲ産物長はＲｆ−１非保有品種で数百ｂｐであり、かつＲｆ−１保有品種では期待される産物長が、ＰＣＲが効率よく進まない数ｋｂｐ以上であるＰＣＲプライマーを設計する。このように設計することで、Ｒｆ−１保有品種のＤＮＡをテンプレートとした際には、ＰＣＲの効率が悪く、ＰＣＲ産物が得られないようにする。したがって、Ｒｆ−１非保有品種のＤＮＡをテンプレートに用いたときにのみ、ＰＣＲ産物のバンド、すなわち、ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーを検出でき、Ｒｆ−１非保有品種の存在を検出することができる。
【００２５】
ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の検出は以下のように行う。イネのＲｆ−１保有品種および非保有品種の一部、望ましくは葉組織および精米から、ゲノムＤＮＡを抽出するには、例えば、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，（１９８０），８，４３２１−４３２５）による抽出、または、抽出バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ，２５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％　ＳＤＳ）を加えたサンプルを加熱（望ましくは８５℃、６０分間）し、撹拌した後、遠心（望ましくは１５０００ｒｐｍ、５分間）してＤＮＡを上清として得る簡易抽出、によることができる。得られたＤＮＡをテンプレートとしてＲｆ−１非保有品種を検出するためのプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ後、増幅断片のサイズを評価し、量を定量または半定量する。望ましくは、反応液をゲル電気泳動、さらに望ましくはアガロースゲル電気泳動、に供試し、ゲルを染色して増幅断片を検出する。
【００２６】
本発明のＲｆ−１非保有品種を検出する態様において、Ｒｆ−１非保有品種を検出するためのＦｏｒｗａｒｄプライマーには配列番号１および２のプライマーが含まれ、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーには配列番号３および４のプライマーが含まれる（概略は図１を参照）。サンプル中にＲｆ−１非保有品種が含まれ，これに由来するＤＮＡをテンプレートとして用いる場合、（１）配列番号１および配列番号３の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うとＰＣＲ産物として約４３０ｂｐのｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーが得られ、（２）配列番号１および配列番号４の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うとＰＣＲ産物として約４６０ｂｐのｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーが得られ、（３）配列番号２および配列番号３の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うとＰＣＲ産物として約２８０ｂｐのｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーが得られ、（４）配列番号２および配列番号４の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うとＰＣＲ産物として約３１０ｂｐのｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーが得られる。
【００２７】
本発明のＲｆ−１非保有品種を検出する態様においては、ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーを検出することにより、検定する個体がＲｆ−１非保有品種であるかどうかを判定することができ、または、Ｒｆ−１保有品種のサンプル中に非常に少量含まれるＲｆ−１非保有品種の存在を検出することができる。後者の場合は、多サンプル（２粒以上の種子からなるサンプル）を１サンプルとして扱い、先に記載したようにＣＴＡＢ法あるいは、簡易抽出法によりイネＤＮＡを抽出した溶液をテンプレートとしてｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーを生じるプライマーと共にＰＣＲに供試する。本発明のｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーを用いることにより、１００粒のイネ種子の中に含まれる１粒以上のＲｆ−１非保有品種を検出することができ、望ましくは３００粒のイネ種子の中に含まれる１粒以上のＲｆ−１非保有品種を検出することができ、さらに望ましくは１０００粒のイネ種子の中に含まれる１粒以上のＲｆ−１非保有品種を検出することができる。このような検出または検定は本明細書中でバルク検定という。
【００２８】
本発明の一つの態様においては、Ｒｆ−１非保有品種の含有量が既知のサンプルを対照とし、対照サンプルとＲｆ−１非保有品種の含有量を検定したいサンプルについて本発明のｒｆ−１特異的マーカーにより増幅されたＤＮＡ断片の量の相対的な比率から、検定したいサンプルのＲｆ−１非保有品種の含有量を推定することができる。
【００２９】
Ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーを用いるイネ種子の純度検定
以下に、第二の領域のＲｆ−１保有／非保有品種間の相違に基づく方法を例にして説明するが、他のＲｆ−１保有品種に特異的な領域の塩基配列を利用しても同様に行うことが可能である。
【００３０】
本発明では、第二の領域の相違に関して、Ｒｆ−１保有品種に特異的な塩基配列を利用し、Ｒｆ−１保有品種のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを設計することで、Ｒｆ−１保有品種特異的にバンドが観察される優性ＰＣＲマーカー（Ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカー）を開発する。
【００３１】
ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の検出は以下のように行う。イネのＲｆ−１保有品種および非保有品種の一部、望ましくは葉組織及び精米から前記同様に、例えば、ＣＴＡＢ法、または簡易抽出によりＤＮＡを得る。得られたＤＮＡをテンプレートとしてＲｆ−１保有品種を検出するためのプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物のサイズの評価および、その量の定量または半定量を行う。望ましくは反応液をゲル電気泳動、さらに望ましくはアガロースゲル電気泳動に供試し、ゲルを染色して増幅断片を検出する。
【００３２】
本発明のＲｆ−１保有品種を検出するための態様において、Ｒｆ−１保有品種を検出するためのプライマーにより増幅されるＤＮＡ断片、すなわちＲｆ−１特異的ＤＮＡマーカーはＲｆ−１保有品種に特異的に現れる。しかし、上記のプライマーを用いてＲｆ−１非保有品種に供試した場合では、プライマーがハイブリダイズし、かつ増幅されるべき配列を持たない、または、プライマーがハイブリダイズしても増幅されるＰＣＲ産物長が長く、効率よくＰＣＲがおこらないため、ＰＣＲ産物は得られない。本発明のプライマーは、例えば、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーとして配列番号５、配列番号６、配列番号７，および配列番号８のプライマーが含まれ、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーとしては配列番号９のプライマーが含まれる（概略は図５を参照）。サンプル中にＲｆ−１保有品種が含まれ，これに由来するＤＮＡをテンプレートとして用いる場合、（１）配列番号５および配列番号９の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うとＰＣＲ産物として約６４０ｂｐのｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーが得られ、（２）配列番号６および配列番号９の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うとＰＣＲ産物として約５９０ｂｐのｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーが得られ、（３）配列番号７および配列番号９の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うとＰＣＲ産物として約５２０ｂｐのｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーが得られ、（４）配列番号８および配列番号９の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うとＰＣＲ産物として約４９０ｂｐのｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーが得られる。
【００３３】
本発明のＲｆ−１保有品種を検出するための態様においては、Ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーを検出することにより、検定する個体がＲｆ−１保有品種であるかどうかを判定することができ、または、Ｒｆ−１非保有品種のサンプル中に非常に少量含まれるＲｆ−１保有品種の存在を検出することができる。後者の場合は、多サンプル（２粒以上の種子からなるサンプル）を１サンプルとして扱い（すなわちバルク検定）、先に記載したようにＣＴＡＢ法あるいは、簡易抽出法によりイネＤＮＡを抽出した溶液をテンプレートとしてＲｆ−１特異的ＤＮＡマーカーと共にＰＣＲに供試する。本発明のＲｆ−１特異的ＤＮＡマーカーを用いることにより１００粒のイネ種子の中に含まれる１粒以上のＲｆ−１保有品種を検出することができ、望ましくは、３００粒のイネ種子の中に含まれる１粒以上のＲｆ−１保有品種を検出することができ、さらに望ましくは１０００粒以上のイネ種子の中に含まれる１粒以上のＲｆ−１保有品種を検出することができる。
【００３４】
本発明の一つの態様においては、Ｒｆ−１保有品種の含有量が既知のサンプルを対照とし、対照サンプルとＲｆ−１保有品種の含有量を検定したいサンプルについて本発明のＲｆ−１特異的マーカーにより増幅されたＤＮＡ断片の量の相対的な比率から、検定したいサンプルのＲｆ−１保有品種の含有量を推定することができる。
【００３５】
マーカーおよびプライマー
本発明は上記の検定において使用するプライマーおよび検出対象となるＤＮＡマーカーにも関するものである。
【００３６】
本発明において、Ｒｆ−１座周辺の塩基配列情報に基づいて開発されるＤＮＡマーカーは、望ましくはＲｆ−１保有品種またはＲｆ−１非保有品種をそれぞれ特異的に検出するためのＤＮＡマーカーであって、バルク検定によりそれら品種の存在および／または存在比率を推定するのに用いることができる。本発明の方法によりイネの種子純度を推定することができ、望ましくは、ハイブリッド種子作製に用いる雄性不稔系統、維持系統、および稔性回復系統の種子純度を推定する方法を提供する。本発明の方法を用いて、純度の検定を行いたいサンプル中の大多数を占める品種の検出から種子純度を推定してもよく、および／または、少量の混入品種の検出から種子純度を推定してもよい。
【００３７】
本発明の方法で検出されるＤＮＡマーカーは、（１）配列番号１および配列番号３の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、Ｒｆ−１遺伝子を有しないイネの品種について得られるＤＮＡマーカー；
（２）配列番号１および配列番号４の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、Ｒｆ−１遺伝子を有しないイネの品種について得られるＤＮＡマーカー；
（３）配列番号２および配列番号３の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、Ｒｆ−１遺伝子を有しないイネの品種について得られるＤＮＡマーカー；
（４）配列番号２および配列番号４の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、Ｒｆ−１遺伝子を有しないイネの品種について得られるＤＮＡマーカー；
（５）配列番号５および配列番号９の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、Ｒｆ−１遺伝子を有するイネの品種について得られるＤＮＡマーカー；
（６）配列番号６および配列番号９の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、Ｒｆ−１遺伝子を有するイネの品種について得られるＤＮＡマーカー；
（７）配列番号７および配列番号９の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、Ｒｆ−１遺伝子を有するイネの品種について得られるＤＮＡマーカー；
（８）配列番号８および配列番号９の配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてゲノミックＰＣＲを行い、Ｒｆ−１遺伝子を有するイネの品種について得られるＤＮＡマーカー；
からなるＤＮＡマーカーのグループから選ばれるＤＮＡマーカーの少なくとも一つである。（１）から（４）のＤＮＡマーカーはＲｆ−１非保有品種特異的ＤＮＡマーカーであり、（５）から（８）のＤＮＡマーカーはＲｆ−１保有品種特異的ＤＮＡマーカーである。
【００３８】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡのグループから選ばれるプライマーを少なくとも一つ用いて、種子純度を推定する方法を提供する。望ましくは、上記の種子純度を検定する方法はバルク検定による。本発明には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡのグループから選ばれるプライマーが含まれる。
【００３９】
【発明の効果】
本発明の方法を用いることで、、ハイブリッドイネ育成に利用されているＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子（Ｒｆ−１遺伝子）の有無を、Ｒｆ−１遺伝子座近傍の塩基配列情報に基づいて開発されるＤＮＡマーカーの有無から検出することによって、バルク検定で種子純度を推定する事ができる。また、本発明は、Ｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーおよびｒｆ−１特異的ＤＮＡマーカーを提供することができる。さらに、ＤＮＡマーカーの開発に用いたプライマーを検定に用いるプライマーとして利用することができる。本発明により、ハイブリッドイネ種子作製に用いる雄性不稔系統、維持系統、および稔性回復系統の種子純度を推定することが可能である。したがって、本発明は種子純度の管理を飛躍的に効率化することに貢献できる。
【００４０】
以下の実施例は本発明を実施するにあたっての参考となる具体例として示したものであり、本発明を限定するものではない。
【００４１】
【実施例】
実施例１　ｒｆ−１特異的マーカーの開発
（材料および方法）
イネのインディカ品種ＩＲ２４のＲｆ−１座周辺塩基配列（特願２００１−２８５２４７の配列番号２７）と、同領域に対応すると考えられる日本晴塩基配列（アクセッション番号ＡＣ０６８９２３）とを比較した。その結果、特願２００１−２８５２４７の配列番号２７に記載の５８１９９番目の塩基から６４４５９番目の塩基までの６２６１塩基に相当する配列が、ＡＣ０６８９２３配列では欠失していることが明らかになった。そこで、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーとして配列番号１および配列番号２、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして配列番号３および配列番号４を設計し（図１）、ＦｏｒｗａｒｄプライマーとＲｅｖｅｒｓｅプライマーを組合せて、コシヒカリ（Ｒｆ−１非保有）およびＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１保有）の葉組織からＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｇ．　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，（１９８０），Ｒａｐｉｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｐｌａｎｔ　ＤＮＡ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，８，ｐ．４３２１−４３２５）で抽出したトータルＤＮＡをテンプレートに用いて、ＰＣＲを行った。なお、ＦＲコシヒカリとは、ＩＲ８に由来するＲｆ−１遺伝子領域を連続戻し交雑によりコシヒカリに導入した系統である。
【００４２】
ＰＣＲは、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、３０μｌの反応量で行った。反応液３０μｌ中には、１５ｎｇＤＮＡ、０．６Ｕ　ＴａＫａＲａ　ＴａｑＴＭ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ、６ｎｍｏｌｅ　各ｄＮＴＰ、６ｐｍｏｌｅ各プライマー、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２が含まれる。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間の熱変性、６５℃で３０秒間のアニ−リング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理することとした。ＰＣＲ反応後、１５μｌを３％　Ａｇａｒｏｓｅ２１（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）ゲルに泳動した。
【００４３】
泳動結果を図２に示す。コシヒカリのトータルＤＮＡをテンプレートに用いた場合には、配列番号１と配列番号３とのプライマー組合せでは約４３０ｂｐの増幅産物、配列番号１と配列番号４とのプライマー組合せでは約４６０ｂｐの増幅産物、配列番号２と配列番号３とのプライマー組合せでは約２８０ｂｐの増幅産物、配列番号１と配列番号４とのプライマー組合せでは約３１０ｂｐの増幅産物が観察された。一方、ＦＲコシヒカリのトータルＤＮＡをテンプレートに用いた場合には、いずれのプライマー組合せでも増幅産物は観察されなかった。
【００４４】
この結果から、本実験で調査した４種のプライマー組合せのいずれによっても、ｒｆ−１特異的に期待していた大きさのバンドが観察されることが示された。なお、ＦＲコシヒカリのトータルＤＮＡをテンプレートにした場合に、いずれのプライマー組合せでもバンドが観察されないのは、期待されるＰＣＲ産物長が６ｋｂ以上であるためＰＣＲ反応がうまく進まないことが原因であると考えられる。
【００４５】
実施例２　簡易ＤＮＡ抽出法によるｒｆ−１特異的マーカーの検出
コシヒカリおよびＦＲコシヒカリの水洗した精米から、以下の方法でＤＮＡを抽出した。１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　ＳＤＳを含む抽出バッファー１５ｍｌに精米１００粒を加え、８５℃で６０分間加熱した。攪拌後、遠心処理（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）を行い、上清３μｌをテンプレートに用いて、３０μｌ反応量でＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡ以外のＰＣＲ条件および使用したプライマーは、実施例１に記載したとおりである。
【００４６】
ＰＣＲ反応後、１５μｌを３％　Ａｇａｒｏｓｅ２１（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）ゲルに泳動した。
泳動結果を図３に示す。コシヒカリの粗抽出ＤＮＡ溶液をテンプレートに用いた場合には、いずれのプライマー組合せでも実施例１と同様の増幅産物が観察された。一方、ＦＲコシヒカリの粗抽出ＤＮＡ溶液をテンプレートに用いた場合には、いずれのプライマー組合せでも増幅産物は観察されなかった。
【００４７】
この結果から、実施例１でＲｆ−１保有品種とＲｆ−１非保有品種とを識別できることが示された４個のマーカーすべてについて、精米からの簡易抽出により調整したＤＮＡ溶液をテンプレートに用いて検定できることが示された。
【００４８】
実施例３　ｒｆ−１特異的マーカーの検出感度
コシヒカリおよびＦＲコシヒカリの水洗した精米を、以下の粒数混合した。
（１）コシヒカリの精米５粒およびＦＲコシヒカリの精米９５粒
（２）コシヒカリの精米１粒およびＦＲコシヒカリの精米９９粒
（３）ＦＲコシヒカリの精米１００粒
実施例２に記載した抽出バッファーを１５ｍｌ加えた後、８５℃で６０分間加熱した。攪拌後、遠心処理（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）を行い、各上清を以下のように混合した。
Ｉ液．　（１）溶液のみ
ＩＩ液．　（２）溶液のみ
ＩＩＩ液．　（３）溶液１００μｌ＋（３）溶液２００μｌ（コシヒカリの精米１粒およびＦＲコシヒカリの精米２９９粒の混合に相当）
ＩＶ液．　（２）溶液１００μｌ＋（３）溶液９００μｌ（コシヒカリの精米１粒およびＦＲコシヒカリの精米９９９粒の混合に相当）
Ｖ液．　（３）溶液のみ
Ｉ〜Ｖの各液３μｌをテンプレートに用いて、配列番号１と配列番号３とのプライマー組合せにより３０μｌ反応量でＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡ以外のＰＣＲ条件は、実施例１に記載したとおりである。ただし、サイクル数は、４０回とした。
【００４９】
ＰＣＲ反応後、１５μｌを３％　Ａｇａｒｏｓｅ２１（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）ゲルに泳動した。
泳動結果を図４に示す。Ｉ液、ＩＩ液、ＩＩＩ液およびＩＶ液をテンプレートに用いた場合には、実施例１と同様の増幅産物が観察された。一方、Ｖ液をテンプレートに用いた場合には、増幅産物は観察されなかった。
【００５０】
以上の結果から、本プライマー組合せで、精米からの簡易抽出により調整したＤＮＡ溶液をテンプレートに用いて検定することにより、１０００粒中に１粒の割合で異品種の精米が混入している場合でも、その混入を検出できることが示された。
【００５１】
実施例４　Ｒｆ−１特異的マーカーの開発
イネのインディカ品種ＩＲ２４のＲｆ−１座周辺塩基配列（特願２００１−２８５２４７、配列番号２７）を染色体歩行によって明らかにする過程で、該配列番号２７の塩基配列には包含されないが、Ｒｆ−１座近傍に位置するゲノムクローンが得られた。このクローンの塩基配列の一部は、Ｒｆ−１保有品種に特異的であることが示された。そこで、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーとして配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして配列番号９を設計し（概略図は図５を参照）、ＦｏｒｗａｒｄプライマーとＲｅｖｅｒｓｅプライマーを組合せて、コシヒカリ（Ｒｆ−１非保有）およびＦＲコシヒカリ（Ｒｆ−１保有）の葉組織からＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，（１９８０），Ｒａｐｉｄ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｐｌａｎｔ　ＤＮＡ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，８，ｐ．４３２１−４３２５）で抽出したトータルＤＮＡをテンプレートに用いて、ＰＣＲを行った。
【００５２】
ＰＣＲは、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、３０μｌの反応量で行った。反応液３０μｌ中には、１５ｎｇＤＮＡ、０．６Ｕ　ＴａＫａＲａ　ＴａｑＴＭ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ、６ｎｍｏｌｅ　各ｄＮＴＰ、６ｐｍｏｌｅ各プライマー、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２が含まれる。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間処理した後、　９４℃で３０秒間の熱変性、６５℃で３０秒間のアニ−リング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理することとした。ＰＣＲ反応後、１５μｌを３％　Ａｇａｒｏｓｅ２１（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）ゲルに泳動した。
【００５３】
泳動結果を図６に示す。ＦＲコシヒカリのトータルＤＮＡをテンプレートに用いた場合には、配列番号５と配列番号９とのプライマー組合せでは約６４０ｂｐの増幅産物、配列番号６と配列番号９とのプライマー組合せでは約５９０ｂｐの増幅産物、配列番号７と配列番号９とのプライマー組合せでは約５２０ｂｐの増幅産物、配列番号８と配列番号９とのプライマー組合せでは約４９０ｂｐの増幅産物が観察された。一方、コシヒカリのトータルＤＮＡをテンプレートに用いた場合には、いずれのプライマー組合せでも増幅産物は観察されなかった。
【００５４】
この結果から、本実験で調査した４種のプライマー組合せのいずれによっても、Ｒｆ−１特異的に期待していた大きさのバンドが観察されることが示された。
実施例５　簡易ＤＮＡ抽出法によるＲｆ−１特異的マーカーの検出
コシヒカリおよびＦＲコシヒカリの水洗した精米から、実施例２に記載した方法でＤＮＡを抽出した。抽出後の上清３μｌをテンプレートに用いて、３０μｌ反応量でＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡ以外のＰＣＲ条件および使用したプライマーは、実施例４に記載したとおりである。
【００５５】
ＰＣＲ反応後、１５μｌを３％　Ａｇａｒｏｓｅ２１　（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）　ゲルに泳動した。
泳動結果を図７に示す。ＦＲコシヒカリの粗抽出ＤＮＡ溶液をテンプレートに用いた場合には、いずれのプライマー組合せでも実施例４と同様の増幅産物が観察された。一方、コシヒカリの粗抽出ＤＮＡ溶液をテンプレートに用いた場合には、いずれのプライマー組合せでも増幅産物は観察されなかった。
【００５６】
この結果から、実施例４でＲｆ−１保有品種とＲｆ−１非保有品種とを識別できることが示された４個のマーカーすべてについて、精米からの簡易抽出により調整したＤＮＡ溶液をテンプレートに用いて検定できることが示された。
【００５７】
実施例６　Ｒｆ−１特異的マーカーの検出感度
コシヒカリおよびＦＲコシヒカリの水洗した精米を、以下の粒数混合した。
（１）コシヒカリの精米９５粒およびＦＲコシヒカリの精米５粒
（２）コシヒカリの精米９９粒およびＦＲコシヒカリの精米１粒
（３）コシヒカリの精米１００粒
実施例２に記載した抽出バッファーを１５ｍｌ加えた後、８５℃で６０分間加熱した。攪拌後、遠心処理（１５０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）を行い、各上清を以下のように混合した。
Ｉ液．　（１）溶液のみ
ＩＩ液．　（２）溶液のみ
ＩＩＩ液．　（２）溶液１００μｌ＋（３）溶液２００μｌ（コシヒカリの精米２９９粒およびＦＲコシヒカリの精米１粒の混合に相当）
ＩＶ液．　（２）溶液１００μｌ＋（３）溶液９００μｌ（コシヒカリの精米９９９粒およびＦＲコシヒカリの精米１粒の混合に相当）
Ｖ液．　（３）溶液のみ
Ｉ〜Ｖの各液３μｌをテンプレートに用いて、配列番号７と配列番号９とのプライマー組合せにより３０μｌ反応量でＰＣＲを行った。テンプレートＤＮＡ以外のＰＣＲ条件は、実施例４に記載したとおりである。ただし、サイクル数は、４０回とした。
【００５８】
ＰＣＲ反応後、１５μｌを３％　Ａｇａｒｏｓｅ２１（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）ゲルに泳動した。
泳動結果を図８に示す。Ｉ液、ＩＩ液、ＩＩＩ液およびＩＶ液をテンプレートに用いた場合には、実施例４と同様の増幅産物が観察された。一方、Ｖ液をテンプレートに用いた場合には、増幅産物は観察されなかった。
【００５９】
以上の結果から、本プライマー組合せで、精米からの簡易抽出により調整したＤＮＡ溶液をテンプレートに用いて検定することにより、１０００粒中に１粒の割合で異品種の精米が混入している場合でも、その混入を検出できることが示された。
【００６０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｒｆ−１特異的マーカーの開発に用いたプライマーのイネゲノム中の位置を示した概略図である。
【図２】図２は、精製ＤＮＡを用いてのｒｆ−１特異的マーカーのＰＣＲ増幅性試験の結果を示す電気泳動の写真である。
【図３】図３は、簡易抽出ＤＮＡを用いてのｒｆ−１特異的マーカーのＰＣＲ増幅試験の結果を示す電気泳動の写真である。
【図４】図４は、簡易抽出ＤＮＡを用いてのｒｆ−１特異的マーカーの検定感度試験の結果を示す電気泳動の写真である。
【図５】図５は、Ｒｆ−１特異的マーカーの開発に用いたプライマーのイネゲノムとの位置関係を示した概略図である。
【図６】図６は、精製ＤＮＡを用いてのＲｆ−１特異的マーカーのＰＣＲ増幅性試験の結果を示す電気泳動の写真である。
【図７】図７は、簡易抽出ＤＮＡを用いてのＲｆ−１特異的マーカーのＰＣＲ増幅試験の結果を示す電気泳動の写真である。
【図８】図８は、簡易抽出ＤＮＡを用いてのＲｆ−１特異的マーカーの検定感度試験の結果を示す電気泳動の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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