(57)【要約】【課題】　本発明は、Ｂ細胞悪性疾患（例えば、リンパ腫および白血病）治療用の多価ワクチンを提供する。【解決手段】　単一の患者のＢ細胞リンパ腫細胞由来の免疫グロブリン分子の少なくとも２つの組換え可変領域を含有する多価ワクチンであって、前記細胞が少なくとも２つの異なる免疫グロブリン分子を発現するものであり、前記免疫グロブリン分子が少なくとも１つのイディオトープによって異なるものである、上記の多価ワクチン。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の患者のＢ細胞リンパ腫細胞由来の免疫グロブリン分子の少なくとも２つの組換え可変領域を含有する多価ワクチンであって、前記細胞が少なくとも２つの異なる免疫グロブリン分子を発現するものであり、前記免疫グロブリン分子が少なくとも１つのイディオトープによって異なるものである、上記の多価ワクチン。
【請求項２】
前記ワクチンが前記リンパ腫細胞由来の組換え可変領域を含む少なくとも２つの組換え免疫グロブリン分子を含有する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記組換え免疫グロブリン分子が免疫促進性サイトカインに共有結合で結合されている、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記サイトカインが顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン-2およびインターロイキン-4よりなる群から選択される、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
少なくとも１種の製剤学的に許容される賦形剤をさらに含有する、請求項１に記載の多価ワクチン。
【請求項６】
アジュバントをさらに含有する、請求項１に記載の多価ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は一般的に、細胞における組換え遺伝子の改良された増幅および発現方法に関する。増幅された細胞はリンパ腫および白血病を治療する免疫療法に適した組換えタンパク質を大量に供給することができる。
【背景技術】
【０００２】
　種々の有効なポリペプチド薬剤を発現させるために多数の遺伝子が単離・発現されるにつれて、こうした方法の効率性および経済性の向上が次第に必要になってきている。このようなポリペプチドは哺乳動物細胞から得ることが有利である。なぜならば、この種のポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば細菌細胞において発現されたタンパク質とは著しく対照的に、一般的に正確にフォールディングされ、適切に修飾され、完全に機能的であるからである。
【０００３】
　大量の産物を必要とする場合は、細胞増殖の間中ベクター配列が維持される（すなわち、保持される）細胞クローンを同定することが必要である。このような安定したベクターの維持は、宿主細胞のＤＮＡへのベクターの組込みの結果として、あるいはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）のようなウイルスレプリコンの使用により達成できる。
【０００４】
　大量の組換えタンパク質を発現する安定した細胞系を作製するためのＢＰＶ系ベクターなどのウイルスベクターの使用は、いくつかの場合に成功を収めている。しかし、ウイルスベクターはそれらを複製できる細胞型が制限されるという事実により、その使用が限定されている。さらに、ウイルスベクターの発現レベルおよびエピソーム維持はそのベクターに挿入されたＤＮＡ配列により影響を受けることがある。
【０００５】
　安定性を向上させるためにベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる場合、ベクター配列が宿主細胞のＤＮＡへの組込み後に増幅される細胞系を選択することにより、ベクターＤＮＡのコピー数およびそれに伴う発現産物の量を増加させることができる。
【０００６】
　そのような選択法を実施するための公知の方法は、既知の薬剤により阻害される酵素をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで宿主細胞を形質転換することである。このベクターは目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。あるいはまた、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第２のベクターを用いて宿主細胞を同時形質転換してもよい。
【０００７】
　その後、形質転換または同時形質転換した宿主細胞を、次第に増加する濃度の既知薬剤の存在下で培養して、薬剤耐性細胞を選択する。増加した濃度の毒性薬剤の存在下で生存できる突然変異細胞を出現させる一つの共通したメカニズムは、その薬剤により阻害される酵素の過剰生産であることが見いだされた。これは最も一般的にはその特定のｍＲＮＡのレベルの増加によりもたらされ、このｍＲＮＡレベルの増加はしばしばベクターＤＮＡの増幅、それゆえ遺伝子コピー数の増加により引き起こされる。
【０００８】
　さらに、薬剤耐性が阻害可能な酵素をコードするベクターＤＮＡのコピー数の増加により生ずる場合、宿主細胞のＤＮＡ中の目的のタンパク質をコードするベクターＤＮＡのコピー数も同時に増加していることが判明した。こうして、目的のタンパク質の生産レベルが増加する。
【０００９】
　このような同時増幅(co-amplification)のために汎用される系は、阻害可能な酵素としてジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を使用する。この酵素は薬剤メトトレキセート（ＭＴＸ）により阻害され得る。同時増幅を行うためには、ＤＨＦＲをコードする活性遺伝子を欠失している宿主細胞を、ＤＨＦＲおよび目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換するか、またはＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列を含むベクターと目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターで同時形質転換する。その後、形質転換または同時形質転換した宿主細胞を、次第に増加する濃度のＭＴＸの存在下で培養し、生き残った細胞系を選択する。
【００１０】
　現在利用可能な同時増幅系は多くの難点を抱えている。例えば、一般的に、阻害可能な酵素をコードする活性遺伝子を欠失している宿主細胞を使用しなければならない。このことは特定の同時増幅系と共に使用できる細胞系の数を制限することとなる。
【００１１】
　例えば、現在のところ、ＤＨＦＲをコードする遺伝子を欠失している細胞系はたった２種類にすぎず、これらの細胞系はどちらもＣＨＯ−Ｋ１細胞系の誘導体である。これらのＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞系はある種のタンパク質産物の高レベル発現に使用することができない。その理由は、ＣＨＯ細胞が特殊な翻訳後修飾経路をもち合わせていないからである。例えば、機能的なヒトプロテインＣの生産には、細胞がビタミンＫ依存性γカルボキシル化経路を保有する必要がある。ＣＨＯ細胞はヒトプロテインＣタンパク質を適切に修飾することができない[Wallsら, (1989) Gene 81:139] 。
【００１２】
　他の細胞系（すなわち、野生型レベルのＤＨＦＲを合成する細胞系）において優性選択マーカーとしてＤＨＦＲ遺伝子を使用する試みはうまくいかないことがわかった。例えば、ＭＴＸ耐性突然変異ＤＨＦＲ遺伝子または非常に強力なプロモーターの制御下にあるＤＨＦＲ遺伝子はいくつかの細胞型で優性選択マーカーとして働くことができるが、現在の方法論を用いた遺伝子増幅の選択によっては高コピー数を達成することができないような高濃度のＭＴＸを必要とする。
【００１３】
　ＤＨＦＲ+細胞系において優性選択マーカーとしてのＤＨＦＲの使用を可能にするもう一つのアプローチは、対象の遺伝子に加えて、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子のような選択マーカーをコードする遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子の両方を使用することである[Wallsら, (1989), 前掲] 。このアプローチは、ＭＴＸによる選択中の内因性ｄｈｆｒ遺伝子の増幅の問題を回避するために用いられる。細胞を３種の遺伝子をコードするＤＮＡでトランスフェクトし、最初にハイグロマイシンの存在下での増殖能について細胞を選択する。次に、次第に増加する濃度のＭＴＸの存在下での増殖能について細胞を選択する。このアプローチはｄｈｆｒ+細胞系での遺伝子の同時増幅を可能にするが、このプロトコールは、一連の増幅（すなわち、ＭＴＸ濃度の段階的増加）により対象の遺伝子よりも高度にｄｈｆｒ遺伝子を増幅することがわかった。例えば、いくつかの増幅クローンにおいて、ｄｈｆｒ遺伝子は約100コピーで存在したが、対象の遺伝子はたったの20コピーで存在したにすぎなかった。
【００１４】
　明らかに、当技術分野では、様々な細胞系において増幅可能なマーカーと対象遺伝子の同時増幅を一貫して提供する改良された方法が必要とされている。さらに、当技術分野では、効率がよく、再現性があり、しかも特殊な酵素欠損宿主細胞系の使用または限られた数の細胞系に限定されない対象ＤＮＡ配列の増幅手段が必要とされている。
【００１５】
　増幅可能なマーカーと対象遺伝子の同時増幅を一貫して提供する、効率がよく、再現性のある改良された方法は、患者の需要量に見合ったスケールでの特注(custom)の腫瘍特異的ワクチンの製造を可能にするだろう。Ｂ細胞リンパ腫治療用の特注の腫瘍ワクチンの現在の製造方法は、現在および予測される将来の需要量を満たすのに不十分である。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
　本発明は、組換えＤＮＡ配列の増幅コピーを含有する細胞系の作製方法を提供する。増幅細胞系は同等に増幅されるいくつかの異なる組換えＤＮＡ配列（例えば、増幅ベクター、１以上の発現ベクターおよび場合により選択ベクター）を含有するので、この細胞系はインプットまたは外因性ＤＮＡ配列を同時増幅するはずである。本発明の方法は、既存の増幅プロトコールと比べて大幅な時間の節約となり、所望の増幅細胞系を効率よく単離することができる。本発明の遺伝子増幅法は、免疫細胞腫瘍（例えば、リンパ腫および白血病）の治療に有用な多価ワクチンを含めた特注ワクチンの製造を可能にする。
【００１７】
　一つの実施態様において、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫細胞由来の免疫グロブリン分子の少なくとも２つの組換え可変領域を含む多価ワクチンを提供する。ただし、前記Ｂ細胞リンパ腫細胞は少なくとも１つのイディオトープによって異なる少なくとも２つの免疫グロブリン分子を発現するものである。本発明は組換え可変領域を利用する状況により制限されない。つまり、可変領域は完全な組換え免疫グロブリン（Ｉｇ）分子内に存在してもよいし、Ｆab、Ｆab’またはＦ(ab')2断片（組換えＩｇ分子の開裂により生成されるか、または分子生物学的手段により生産される）に存在してもよいし、一本鎖抗体（Ｆv）分子に存在してもよい。好ましい実施態様では、多価ワクチンはリンパ腫細胞由来の組換え可変領域を含む少なくとも２つの組換え免疫グロブリン分子を含有する。
【００１８】
　一つの実施態様では、患者のリンパ腫細胞由来の組換え可変領域を含む免疫グロブリン分子が免疫促進性サイトカインに共有結合で結合される。Ｉｇ分子へのサイトカインの結合は、従来のカップリング技術（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）、ＥＣＤＩなどの脱水剤によるカップリング）、スルフヒドリル基、アミノ基またはカルボキシル基を介してカップリング可能なリンカー(Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手可能）の使用、還元的アミノ化を含めて、当技術分野で公知の様々な手段により達成できる。さらに、この共有結合は分子生物学的手段（例えば、所望のサイトカインをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された組換えＩｇをコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを用いる融合タンパク質の生産）により達成できる。
【００１９】
　本発明は用いる免疫促進性サイトカインによって制限されない。好ましい実施態様において、前記サイトカインは顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン-2およびインターロイキン-4よりなる群から選択される。
【００２０】
　一つの実施態様において、本発明の多価ワクチンは少なくとも１種の製剤学的に許容される賦形剤を含有する。本発明は用いる賦形剤の種類により制限されない。本発明の医薬組成物は水溶液中に、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液または生理食塩水中に製剤化され得る。水性の注射用懸濁液はこの懸濁液の粘度を高める物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランを含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は適当な油性の注射用懸濁液としても調製することができる。適当な脂質親和性の溶剤またはビヒクルとして、ゴマ油のような脂肪油、オレイン酸エチルやトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。場合により、懸濁液は化合物の溶解度を高めて濃厚液の調製を可能にする剤または適当な安定剤を含んでいてもよい。
【００２１】
　好ましい実施態様において、多価ワクチンはさらにアジュバントを含有する。ワクチンをヒトに投与する場合は、ヒトへの使用が認められているアジュバントを用いる（例えば、ＳＡＦ-1、ミョウバンなど）。ヒトへの使用に適した追加のアジュバントとして、ＱＳ21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, MA)、OptivaxTM(Vaxcell Inc., Norcross, GA)およびRibi Immunochem Research, Inc. (Hamilton, MT) 製のアジュバントが挙げられるが、これらに限らない。多価ワクチンを構成する組換えＩｇタンパク質（Ｉｇタンパク質の断片を含む）はＫＬＨのような担体タンパク質にコンジュゲートさせてもよい。
【００２２】
　本発明はさらに増幅遺伝子をもつＴリンパ球系細胞系を含む組成物を提供し、前記増幅遺伝子は組み込まれた複数の外因性核酸から増幅され、前記外因性核酸は異種プロモーターに機能的に連結された阻害可能な酵素をコードする配列をもつ組換えオリゴヌクレオチドを含んでなる。本発明の組成物は組換えオリゴヌクレオチドによりコードされる阻害可能な酵素の種類により制限されない。好ましい実施態様では、阻害可能な酵素をコードする配列をもつ組換えオリゴヌクレオチドが活性ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする。
【００２３】
　もう一つの好ましい実施態様では、異種プロモーターに機能的に連結された阻害可能な酵素をコードする配列をもつ外因性（すなわち、インプット）組換えオリゴヌクレオチドの増幅コピーを含有するＴリンパ球系細胞系は、ＢＷ5147.G.1.4細胞系である。別の好ましい実施態様では、異種プロモーターに機能的に連結された阻害可能な酵素をコードする配列をもつ外因性（すなわち、インプット）組換えオリゴヌクレオチドの増幅コピーを含有するＴリンパ球系細胞系が、対象のタンパク質をコードする遺伝子を含む組み込まれた組換えオリゴヌクレオチド（すなわち、発現ベクター）をさらに含有する。さらに別の好ましい実施態様では、異種プロモーターに機能的に連結された阻害可能な酵素をコードする配列をもつ外因性（すなわち、インプット）組換えオリゴヌクレオチドの増幅コピーを含有するＴリンパ球系細胞系が、選択マーカーをコードする遺伝子を含む組み込まれた組換えオリゴヌクレオチド（すなわち、選択ベクター）をさらに含有する。
【００２４】
　本発明は、さらに、対象のタンパク質のアミノ酸配列をコードする配列をもつ第１の組換えオリゴヌクレオチドおよび異種プロモーターに機能的に連結された阻害可能な酵素をコードする配列をもつ第２の組換えオリゴヌクレオチドの同時増幅方法を提供する。前記方法は、ａ）i)対象のタンパク質のアミノ酸配列をコードする配列をもつ第１の組換えオリゴヌクレオチドを含有する１以上の発現ベクター、ii) 異種プロモーターに機能的に連結された第１の阻害可能な酵素をコードする配列をもつ第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有する増幅ベクター、およびiii)真核親細胞系を用意し、ｂ）400〜500マイクログラムの発現ベクター（すなわち、合計400〜500μg の発現ベクター）および20〜30マイクログラムの増幅ベクターを親細胞系に導入して形質転換細胞を作製し、ｃ）この形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害し得る阻害剤を含む第１の水性溶液に導入し（その際、第１の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに十分である）、そしてｄ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を同定する（その際、増殖可能な形質転換細胞は増幅コピー数の発現ベクターと増幅コピー数の増幅ベクターを含有する）ことを含んでなる。
【００２５】
　本発明の方法はベクターを親細胞系に導入するために用いる手段の種類により制限されない。当技術分野では、外因性ＤＮＡ配列の哺乳動物細胞への導入を可能にする方法が多数知られており、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム融合などが含まれるが、これらに限らない。好ましい実施態様では、ベクターがエレクトロポレーションにより親細胞系に導入される。
【００２６】
　本発明は親細胞系として選択された細胞系の種類により制限されない。ＣＨＯ細胞系とその変異型、マウスＬ細胞およびＢＷ5147細胞とこれらの変異型を含めて、種々の哺乳動物細胞系を使用することができる。選択された細胞系は付着依存的方法または付着非依存的方法のいずれかで増殖する。好ましい実施態様では、親細胞系はＴリンパ球系細胞系であり、特に好ましいＴリンパ球系細胞系はＢＷ5147.G.1.4細胞系である。
【００２７】
　好ましい実施態様において、親細胞系は第２の阻害可能な酵素をコードする内因性遺伝子を含有する。第１および第２の阻害可能な酵素は同一であってもよいが、同一である必要はない。別の実施態様において、第２の阻害可能な酵素はジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択される。別の好ましい実施態様では、第１の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度が親細胞系の増殖を防止するのに必要とされる濃度の４〜６倍である。
【００２８】
　好ましい実施態様において、前記方法はさらに、発現ベクターと増幅ベクターと共に親細胞系に導入される選択遺伝子産物をコードする選択ベクターを用意することを含む。この方法は選ばれた選択マーカーにより制限されない。好ましい実施態様では、選択ベクターがヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼを含む群から選択された活性酵素をコードする。選択ベクターが活性ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするときは、ヒポキサンチンとアザセリンを含む水性溶液中で形質転換細胞を増殖させることができる。
【００２９】
　別の好ましい実施態様において、前記方法は、選択、発現および増幅の各ベクターの導入後に、阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含む第１の水性溶液中に形質転換細胞を導入するに先立って、選択遺伝子産物の発現を要求する第２の水性溶液中に形質転換細胞を導入する追加の工程をさらに含む。親細胞系に導入する前に選択、発現および／または増幅ベクターを直線化することができる。
【００３０】
　前記方法は用いる増幅ベクターの種類により制限されない。好ましい実施態様において、増幅ベクターはジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択された活性酵素をコードする。別の好ましい実施態様では、阻害剤がメトトレキセート、2'- デオキシコフォルマイシン、メチオニンスルフォキシミン、アルビジン(albizziin)、およびβ-アスパルチルヒドロキサメートよりなる群から選択される。
【００３１】
　本発明はまた、ａ）i)対象のタンパク質のアミノ酸配列をコードする配列をもつ第１の組換えオリゴヌクレオチドを含有する１以上の発現ベクター、ii) 異種プロモーターに機能的に連結された第１の阻害可能な酵素をコードする配列をもつ第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有する増幅ベクター、およびiii)真核親細胞系を用意し、ｂ）発現ベクターおよび増幅ベクターを制限酵素で処理して、直線化発現ベクターおよび直線化増幅ベクターを生成し（すなわち、該ベクターの内部で１回切断しかつ増幅可能なマーカーまたは対象遺伝子をコードする転写単位の内部で切断しない制限酵素を用いて各ベクターを消化する；すなわち、切断部位はプラスミド骨格の内部にある）、ｃ）１以上の直線化発現ベクターおよび直線化増幅ベクターを親細胞系に導入して形質転換細胞を作製し、ｄ）該形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第１の水性溶液中に導入し（その際、第１の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに十分である）、そしてｅ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を同定する（その際、増殖可能な形質転換細胞は増幅コピー数の発現ベクターと増幅コピー数の増幅ベクターを含有する）ことを含んでなる方法を提供する。
【００３２】
　本発明の方法はベクターを親細胞系に導入するために用いる手段の種類により制限されない。好ましい実施態様では、ベクターがエレクトロポレーションにより親細胞系に導入される。
【００３３】
　本発明は親細胞系として選ばれた細胞系の種類により制限されない。ＣＨＯ細胞系とその変異型、マウスＬ細胞およびＢＷ5147細胞とこれらの変異型を含めて、種々の哺乳動物
細胞系を使用することができる。選択された細胞系は付着依存的方法または付着非依存的方法のいずれかで増殖する。好ましい実施態様では、親細胞系はＴリンパ球系細胞系であり、特に好ましいＴリンパ球系細胞系はＢＷ5147.G.1.4細胞系である。
【００３４】
　好ましい実施態様において、親細胞系は第２の阻害可能な酵素をコードする内因性遺伝子を含有する。第１および第２の阻害可能な酵素は同一であってもよいが、同一である必要はない。別の実施態様において、第２の阻害可能な酵素はジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択される。別の好ましい実施態様では、第１の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度が親細胞系の増殖を防止するのに必要とされる濃度の４〜６倍である。
【００３５】
　好ましい実施態様において、前記方法はさらに、発現ベクターと増幅ベクターと共に親細胞系に導入される選択遺伝子産物をコードする選択ベクターを用意することを含む。この方法は選ばれた選択マーカーにより制限されない。好ましい実施態様では、選択ベクターがヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼを含む群から選択された活性酵素をコードする。選択ベクターが活性ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするときは、ヒポキサンチンとアザセリンを含む水性溶液中で形質転換細胞を増殖させることができる。
【００３６】
　好ましい実施態様において、前記方法はさらに、発現ベクターと増幅ベクターと共に親細胞系に導入される選択遺伝子産物をコードする選択ベクターを用意することを含む。この方法は用いる選択ベクターにより制限されない。好ましい実施態様では、選択ベクターがヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼを含む群から選択された活性酵素をコードする。選択ベクターは親細胞系に導入するに先立って直線化することが好ましい。
【００３７】
　別の好ましい実施態様において、前記方法は、選択、発現および増幅の各ベクターの導入後に、第１の水性溶液中に形質転換細胞を導入するに先立って、形質転換細胞の増殖のために選択遺伝子産物の発現を要求する第２の水性溶液中に形質転換細胞を導入する追加の工程をさらに含む。
【００３８】
　前記方法は用いる増幅ベクターの種類により制限されない。好ましい実施態様において、増幅ベクターはジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択された活性酵素をコードする。別の好ましい実施態様では、阻害剤がメトトレキセート、2'- デオキシコフォルマイシン、メチオニンスルフォキシミン、アルビジン(albizziin)、およびβ-アスパルチルヒドロキサメートよりなる群から選択される。
【００３９】
　好ましい実施態様において、前記方法はさらに、ｆ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第３の水性溶液中に導入し（その際、第３の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる阻害剤の濃度の16〜36倍である）、そしてｇ）第３の水性溶液中で増殖可能な少なくとも１個の形質転換細胞を同定する、各工程を含んでなる。
【００４０】
　別の好ましい実施態様では、20〜30マイクログラムの増幅ベクターと合計400〜500マイクログラムの発現ベクターを親細胞系に導入する。別の好ましい実施態様では、10〜15マイクログラムの選択ベクター、20〜30マイクログラムの増幅ベクターおよび合計400〜50
0マイクログラムの発現ベクターを親細胞系に導入する。
【００４１】
　本発明はまた、ａ）i)対象のタンパク質のアミノ酸配列をコードする配列をもつ第１の組換えオリゴヌクレオチドを含有する１以上の発現ベクター、ii) 異種プロモーターに機能的に連結された第１の阻害可能な酵素をコードする配列をもつ第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有する増幅ベクター、およびiii)真核親細胞系を用意し、ｂ）発現ベクターおよび増幅ベクターを親細胞系に導入して形質転換細胞を作製し、ｃ）該形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第１の水性溶液中に導入し（その際、第１の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる阻害剤濃度の４〜６倍である）、そしてｄ）第１の水性溶液中で増殖可能な少なくとも１個の形質転換細胞を同定する（その際、増殖可能な形質転換細胞は増幅コピー数の発現ベクターと増幅コピー数の増幅ベクターを含有する）ことを含んでなる方法を提供する。本発明の前記方法はベクターを親細胞系に導入するために用いる手段の種類により制限されない。好ましい実施態様では、ベクターがエレクトロポレーションにより親細胞系に導入される。
【００４２】
　本発明は親細胞系として選択した細胞系の種類により制限されない。ＣＨＯ細胞系とその変異型、マウスＬ細胞およびＢＷ5147細胞とこれらの変異型を含めて、種々の哺乳動物細胞系を使用することができる。選択された細胞系は付着依存的方法または付着非依存的方法のいずれかで増殖する。好ましい実施態様では、親細胞系はＴリンパ球系細胞系であり、特に好ましいＴリンパ球系細胞系はＢＷ5147.G.1.4細胞系である。
【００４３】
　好ましい実施態様において、親細胞系は第２の阻害可能な酵素をコードする内因性遺伝子を含有する。第１および第２の阻害可能な酵素は同一であってもよいが、同一である必要はない。別の実施態様において、第２の阻害可能な酵素はジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択される。
【００４４】
　好ましい実施態様において、前記方法はさらに、発現ベクターと増幅ベクターと共に親細胞系に導入される選択遺伝子産物をコードする選択ベクターを用意することを含む。この方法は選ばれた選択マーカーにより制限されない。好ましい実施態様では、選択ベクターがヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼを含む群から選択された活性酵素をコードする。選択ベクターが活性ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするときは、ヒポキサンチンとアザセリンを含む水性溶液中で形質転換細胞を増殖させることができる。
【００４５】
　好ましい実施態様において、前記方法はさらに、発現ベクターと増幅ベクターと共に親細胞系に導入される選択遺伝子産物をコードする選択ベクターを用意することを含む。この方法は用いる選択ベクターにより制限されない。好ましい実施態様では、選択ベクターがヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼを含む群から選択された活性酵素をコードする。
【００４６】
　好ましい実施態様において、前記方法は、発現、増幅および選択の各ベクターの導入後に、第１の水性溶液中に形質転換細胞を導入するに先立って、形質転換細胞の増殖のために選択遺伝子産物の発現を要求する第２の水性溶液中に形質転換細胞を導入する追加の工程をさらに含む。
【００４７】
　前記方法は用いる増幅ベクターの種類により制限されない。好ましい実施態様において、増幅ベクターはジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択された活性酵素をコードする。別の好ましい実施態様では、阻害剤がメトトレキセート、2'- デオキシコフォルマイシン、メチオニンスルフォキシミン、アルビジン(albizziin)、およびβ-アスパルチルヒドロキサメートよりなる群から選択される。
【００４８】
　好ましい実施態様において、前記方法はさらに、ｅ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第３の水性溶液中に導入し（その際、第３の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる阻害剤の濃度の16〜36倍である）、そしてｆ）第３の水性溶液中で増殖可能な少なくとも１個の形質転換細胞を同定する、各工程を含んでなる。
【００４９】
　別の好ましい実施態様では、20〜30マイクログラムの増幅ベクターと合計400〜500マイクログラムの発現ベクターを親細胞系に導入する。別の好ましい実施態様では、10〜15マイクログラムの選択ベクター、20〜30マイクログラムの増幅ベクターおよび合計400〜500マイクログラムの発現ベクターを親細胞系に導入する。選択、発現および／または増幅の各ベクターは親細胞系に導入するに先立って直線化することが好ましい。
【００５０】
　本発明はさらに、ａ）i)対象のタンパク質のアミノ酸配列をコードする配列をもつ第１の組換えオリゴヌクレオチドを含有する１以上の発現ベクター、ii) 異種プロモーターに機能的に連結された第１の阻害可能な酵素をコードする配列をもつ第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有する増幅ベクター、iii)選択遺伝子産物をコードする配列をもつ第３の組換えオリゴヌクレオチドを含有する選択ベクター、およびiv) 真核親細胞系を用意し、ｂ）発現ベクター、増幅ベクターおよび選択ベクターを親細胞系に導入して形質転換細胞を作製し、ｃ）該形質転換細胞を、形質転換細胞の増殖のために選択遺伝子産物の発現を要求する第１の水性溶液中に導入し、ｄ）第１の水性溶液中で増殖可能な少なくとも１個の形質転換細胞を同定し、ｅ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第２の水性溶液中に導入し（その際、第２の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに十分である）、そしてｆ）第２の水性溶液中で増殖可能な少なくとも１個の形質転換細胞を同定する（その際、増殖可能な形質転換細胞は増幅コピー数の発現ベクターと増幅コピー数の増幅ベクターを含有する）ことを含んでなる方法を提供する。
【００５１】
　本発明の前記方法はベクターを親細胞系に導入するために用いる手段の種類により制限されない。好ましい実施態様では、ベクターがエレクトロポレーションにより親細胞系に導入される。本発明の方法は用いる親細胞系により制限されない。好ましい実施態様では、親細胞系はＴリンパ球系細胞系であり、最も好ましくはＢＷ5147.G.1.4細胞系である。選択、発現および／または増幅の各ベクターは親細胞系に導入するに先立って直線化することが好ましい。
【００５２】
　好ましい実施態様において、親細胞系は第２の阻害可能な酵素をコードする内因性遺伝子を含有する。第１および第２の阻害可能な酵素は同一であってもよいが、同一である必要はない。別の実施態様において、第２の阻害可能な酵素はジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択される。
【００５３】
　好ましい実施態様では、10〜15マイクログラムの選択ベクター、20〜30マイクログラムの増幅ベクターおよび合計400〜500マイクログラムの発現ベクターを親細胞系に導入する
。
【００５４】
　別の好ましい実施態様において、第２の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる濃度の４〜６倍である。好ましい実施態様では、前記方法はさらに、ｇ）第２の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第３の水性溶液中に導入し（その際、第３の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる阻害剤の濃度の16〜36倍である）、そしてｈ）第３の水性溶液中で増殖可能な少なくとも１個の形質転換細胞を同定する、各工程を含む。
【００５５】
　前記方法は用いる選択ベクターにより制限されない。好ましい実施態様では、選択ベクターがヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼを含む群から選択された活性酵素をコードする。
【００５６】
　前記方法は用いる増幅ベクターの種類により制限されない。増幅ベクターはジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択された活性酵素をコードする。別の好ましい実施態様では、阻害剤がメトトレキセート、2'- デオキシコフォルマイシン、メチオニンスルフォキシミン、アルビジン(albizziin)、およびβ-アスパルチルヒドロキサメートよりなる群から選択される。
【００５７】
　本発明はさらに、ａ）i)対象のタンパク質のアミノ酸配列をコードする配列をもつ第１の組換えオリゴヌクレオチドを含有する１以上の発現ベクター、ii) 異種プロモーターに機能的に連結された第１の阻害可能な酵素をコードする配列をもつ第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有する増幅ベクター、iii)選択遺伝子産物をコードする配列をもつ第３の組換えオリゴヌクレオチドを含有する選択ベクター、およびiv) 真核親細胞系を用意し、ｂ）発現ベクター、増幅ベクターおよび選択ベクターを親細胞系に導入して形質転換細胞を作製し、ｃ）該形質転換細胞を、形質転換細胞の増殖のために選択遺伝子産物の発現を要求する第１の水性溶液中に導入し、ｄ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞の少なくとも１個のクローンを同定し、ｅ）第１の水性溶液中で増殖可能な個々のクローンを、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第２の水性溶液中に導入し（その際、第２の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに十分である）、そしてｆ）第２の水性溶液中で増殖可能な少なくとも１個のクローンを同定する（その際、増殖可能なクローンは増幅コピー数の発現ベクターと増幅コピー数の増幅ベクターを含有する）ことを含んでなる方法を提供する。本発明の前記方法はベクターを親細胞系に導入するために用いる手段の種類により制限されない。好ましい実施態様では、ベクターがエレクトロポレーションにより親細胞系に導入される。選択、発現および／または増幅の各ベクターは親細胞系に導入するに先立って直線化することが好ましい。
【００５８】
　本発明は親細胞系として選択した細胞系の種類により制限されない。ＣＨＯ細胞系とその変異型、マウスＬ細胞およびＢＷ5147細胞とこれらの変異型を含めて、種々の哺乳動物細胞系を使用することができる。選択された細胞系は付着依存的方法または付着非依存的方法のいずれかで増殖する。好ましい実施態様では、親細胞系はＴリンパ球系細胞系であり、特に好ましいＴリンパ球系細胞系はＢＷ5147.G.1.4細胞系である。
【００５９】
　好ましい実施態様において、親細胞系は第２の阻害可能な酵素をコードする内因性遺伝子を含有する。第１および第２の阻害可能な酵素は同一であってもよいが、同一である必要はない。別の実施態様において、第２の阻害可能な酵素はジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択される。
【００６０】
　好ましい実施態様では、10〜15マイクログラムの選択ベクター、20〜30マイクログラムの増幅ベクターおよび合計400〜500マイクログラムの発現ベクターを親細胞系に導入する。
【００６１】
　別の好ましい実施態様において、第２の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる濃度の４〜６倍である。好ましい実施態様では、前記方法はさらに、ｇ）第２の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第３の水性溶液中に導入し（その際、第３の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる阻害剤の濃度の16〜36倍である）、そしてｈ）第３の水性溶液中で増殖可能な少なくとも１個の形質転換細胞を同定する、各工程を含む。
【００６２】
　前記方法は用いる選択ベクターにより制限されない。好ましい実施態様では、選択ベクターがヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼを含む群から選択された活性酵素をコードする。
【００６３】
　前記方法は用いる増幅ベクターの種類により制限されない。増幅ベクターはジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択された活性酵素をコードする。別の好ましい実施態様では、阻害剤がメトトレキセート、2'- デオキシコフォルマイシン、メチオニンスルフォキシミン、アルビジン(albizziin)、および
β-アスパルチルヒドロキサメートよりなる群から選択される。
【００６４】
　本発明は、ａ）i)対象のタンパク質のアミノ酸配列をコードする配列をもつ第１の組換えオリゴヌクレオチドを含有する１以上の発現ベクター、ii) 異種プロモーターに機能的に連結された第１の阻害可能な酵素をコードする配列をもつ第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有する増幅ベクター、およびiii)Ｔリンパ球系親細胞系を用意し、ｂ）発現ベクターと増幅ベクターをＴリンパ球系親細胞系に導入して形質転換細胞を作製し、ｃ）該形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第１の水性溶液中に導入し（その際、第１の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに十分である）、そしてｄ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を同定する（その際、増殖可能な形質転換細胞は増幅コピー数の発現ベクターと増幅コピー数の増幅ベクターを含有する）ことを含んでなる方法を提供する。本発明の前記方法はベクターを親細胞系に導入するために用いる手段の種類により制限されない。好ましい実施態様では、ベクターがエレクトロポレーションにより親細胞系に導入される。本発明の前記方法は用いるＴリンパ球系親細胞系により制限されない。好ましい実施態様では、Ｔリンパ球系細胞系がＢＷ5147.G.1.4細胞系である。
【００６５】
　好ましい実施態様において、親細胞系は第２の阻害可能な酵素をコードする内因性遺伝子を含有する。第１および第２の阻害可能な酵素は同一であってもよいが、同一である必要はない。別の実施態様において、第２の阻害可能な酵素はジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択される。
【００６６】
　別の好ましい実施態様において、第１の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる濃度の４〜６倍である。好ましい実施態様では、前記方法はさらに、ｅ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第３の水性溶液中に導入し（その際、第３の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる阻害剤の濃度の16〜36倍である）、そしてｆ）第３の水性溶液中で増殖可能な少なくとも１個の形質転換細胞を同定する、各工程を含む。
【００６７】
　好ましい実施態様において、前記方法はさらに、発現ベクターと増幅ベクターと共に親細胞系に導入される選択遺伝子産物をコードする選択ベクターを用意することを含む。この方法は用いる選択ベクターにより制限されない。好ましい実施態様では、選択ベクターがヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼを含む群から選択された活性酵素をコードする。
【００６８】
　別の好ましい実施態様において、前記方法はさらに、発現、増幅および選択の各ベクターの導入後に、第１の水性溶液中に形質転換細胞を導入するに先立って、形質転換細胞の増殖のために選択遺伝子産物の発現を要求する第２の水性溶液中に形質転換細胞を導入する追加の工程をさらに含む。
【００６９】
　前記方法は用いる増幅ベクターの種類により制限されない。好ましい実施態様において、増幅ベクターはジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択された活性酵素をコードする。別の好ましい実施態様では、阻害剤がメトトレキセート、2'- デオキシコフォルマイシン、メチオニンスルフォキシミン、アルビジン(albizziin)、およびβ-アスパルチルヒドロキサメートよりなる群から選択される。
【００７０】
　一つの好ましい実施態様では、20〜30マイクログラムの増幅ベクターと合計400 〜500マイクログラムの発現ベクターを親細胞系に導入する。別の好ましい実施態様では、10〜15マイクログラムの選択ベクター、20〜30マイクログラムの増幅ベクターおよび合計400〜500マイクログラムの発現ベクターを親細胞系に導入する。
【００７１】
　本発明はさらに、ａ）i)対象のタンパク質のアミノ酸配列をコードする配列をもつ第１の組換えオリゴヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド）および異種プロモーターに機能的に連結された第１の阻害可能な酵素をコードする配列をもつ第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有するベクター、およびii) Ｔリンパ球系親細胞系を用意し、ｂ）該ベクターをＴリンパ球系親細胞系に導入して形質転換細胞を作製し、ｃ）該形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第１の水性溶液中に導入し（その際、第１の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに十分である）、そしてｄ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を同定する（その際、増殖可能な形質転換細胞は増幅コピー数の前記ベクターを含有する）ことを含んでなる方法を提供する。増幅コピー数の前記ベクターを含有する細胞は増幅コピー数の完全なベクターを含んでいる必要はない。それどころか、形質転換細胞は増幅マーカーの発現にとって必要なベクターの部分（すなわち、異種プロモーターに機能的に連結された第１の阻害可能な酵素をコードする配列）および対象の遺伝子（すなわち、対象のタンパク質をコードする遺伝子）のみを増幅している必要がある。前記ベクターは対象のタンパク質をコードする組換えオリゴヌクレオチドを２以上含んでいてもよく、さらに選択マーカーを含んでいてもよい。
【００７２】
　本発明の前記方法はベクターを親細胞系に導入するために用いる手段の種類により制限されない。好ましい実施態様では、ベクターがエレクトロポレーションにより親細胞系に導入される。本発明の方法は用いるＴリンパ球系親細胞系により制限されない。好ましい実施態様では、Ｔリンパ球系細胞系がＢＷ5147.G.1.4細胞系である。
【００７３】
　好ましい実施態様において、親細胞系は第２の阻害可能な酵素をコードする内因性遺伝子を含有する。第１および第２の阻害可能な酵素は同一であってもよいが、同一である必要はない。別の実施態様において、第２の阻害可能な酵素はジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択される。
【００７４】
　別の好ましい実施態様において、第１の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる濃度の４〜６倍である。好ましい実施態様では、前記方法はさらに、ｅ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を、第１の阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第２の水性溶液中に導入し（その際、第２の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる阻害剤の濃度の16〜36倍である）、そしてｆ）第２の水性溶液中で増殖可能な少なくとも１個の形質転換細胞を同定する、各工程を含む。
【００７５】
　好ましい実施態様において、前記方法はさらに、第１および第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有するベクターと共に親細胞系に導入される選択遺伝子産物をコードする選択ベクターを用意することを含む。この方法は用いる選択ベクターにより制限されない。好ましい実施態様では、選択ベクターがヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼを含む群から選択された活性酵素をコードする。
【００７６】
　別の好ましい実施態様において、前記方法はさらに、第１および第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有するベクターおよび選択ベクターの導入後に、第１の水性溶液中に形質転換細胞を導入するに先立って、形質転換細胞の増殖のために選択遺伝子産物の発現を要求する第３の水性溶液中に形質転換細胞を導入する追加の工程をさらに含む。
【００７７】
　前記方法は用いる第２の組換えオリゴヌクレオチドの種類により制限されない。好ましい実施態様では、第２の組換えオリゴヌクレオチドはジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択される活性酵素をコードする。別の好ましい実施態様では、阻害剤がメトトレキセート、2'- デオキシコフォルマイシン、メチオニンスルフォキシミン、アルビジン(albizziin)、およびβ-アスパルチルヒドロキサメートよりなる群から選択される。
【００７８】
　一つの好ましい実施態様では、第１および第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有するベクター５〜30マイクログラムを親細胞系に導入する。別の好ましい実施態様では、10〜15マイクログラムの選択ベクター、および５〜30マイクログラムの第１および第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有するベクターを親細胞系に導入する。別の好ましい実施態様では、親細胞系に導入するに先立って、第１および第２の組換えオリゴヌクレオチドを含有するベクターを直線化する。また、選択ベクターを用いる場合は、それを親細胞系に導入するに先立って直線化してもよい。
【００７９】
　別の実施態様では、選択マーカーと対象の遺伝子（すなわち、第１の組換えオリゴヌクレオチド）が単一のベクター内に保持され、このベクター400〜500μｇを増幅ベクター５〜20μｇと共に使用する。
【００８０】
　本発明はさらに、Ｂ細胞リンパ腫治療用のワクチンの製造方法を提供する。この方法は、ａ）i)Ｂ細胞リンパ腫の患者から単離した悪性細胞、ii) 異種プロモーターに機能的に連結された第１の阻害可能な酵素をコードする配列をもつ組換えオリゴヌクレオチドを含有する増幅ベクター、およびiii)真核親細胞系を用意し、ｂ）前記悪性細胞から、悪性細胞により発現された免疫グロブリン分子に由来する少なくとも１つのＶH領域と少なくとも１つのＶL領域をコードするヌクレオチド配列を単離し、ｃ）ＶHおよびＶL領域をコードするヌクレオチド配列を少なくとも１つの発現ベクターに挿入し、ｄ）前記の発現ベクターと増幅ベクターを親細胞に導入して１個以上の形質転換細胞を作製し、ｅ）該形質転換細胞を、阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第１の水性溶液中に導入し（その際、第１の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに十分である）、そしてｆ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を同定する（その際、増殖可能な形質転換細胞はＶHおよびＶL領域を発現する）ことを含んでなる。好ましい実施態様において、第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞は増幅コピー数の発現ベクターと増幅コピー数の増幅ベクターを含有する。
【００８１】
　別の好ましい実施態様において、ＶHおよびＶL領域をコードするヌクレオチド配列は少なくとも２つのＶH領域と少なくとも２つのＶL領域を含む（この方法では、多価ワクチンが製造される）。別の実施態様では、形質転換（および増幅）された細胞により産生される、悪性細胞から発現された免疫グロブリン分子に由来するＶHおよびＶL領域を含む免疫グロブリンを細胞培養培地から単離（例えば、精製）する。
【００８２】
　本発明の方法はベクターを親細胞系に導入するために用いる手段の種類により制限されない。当技術分野では、外因性ＤＮＡ配列の哺乳動物細胞への導入を可能にする方法が多数知られており、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム融合などが含まれるが、これらに限らない。好ましい実施態様では、ベクターがエレクトロポレーションにより親細胞系に導入される。
【００８３】
　本発明は親細胞系として選択された細胞系の種類により制限されない。ＣＨＯ細胞系とその変異型、マウスＬ細胞およびＢＷ5147細胞とこれらの変異型を含めて、種々の哺乳動物細胞系を使用することができる。選択された細胞系は付着依存的方法または付着非依存的方法のいずれかで増殖する。好ましい実施態様では、親細胞系はＴリンパ球系細胞系であり、特に好ましいＴリンパ球系細胞系はＢＷ5147.G.1.4細胞系である。
【００８４】
　別の実施態様において、本発明の方法は第２の阻害可能な酵素をコードする内因性遺伝子を含有する親細胞系を使用する（例えば、親細胞系のゲノムが第２の阻害可能な酵素をコードするコード領域を含む内因性遺伝子を、該コード領域の天然のプロモーター（すなわち、この遺伝子の内因性プロモーター）に機能的に連結された状態で含有する）。第１の阻害可能な酵素をコードするインプットまたは外因性組換え配列と阻害可能な酵素をコードする内因性遺伝子とは著しく相違している。内因性遺伝子配列は内因性プロモーターの制御下で発現される。典型的には、増幅ベクターは異種（すなわち、内因性ではない）プロモーターに機能的に連結された阻害可能な酵素をコードする配列を含んでいる。第１および第２の阻害可能な酵素をコードする配列は同一の酵素をコードしていても、異なる酵素をコードしていてもよい。これら２つの配列（すなわち、組換え配列と内因性配列）が同一の酵素をコードする場合、これらの配列は同一または異なる供給源に由来するものであり得る（すなわち、組換え配列がマウス細胞から単離された酵素をコードし、同一酵素をコードする内因性遺伝子を含むマウス細胞系に導入される；あるいはまた、組換え配列が親細胞系と異なる種に由来する酵素をコードし、例えば、組換え配列がラットＤＨＦＲをコードし、マウスＤＨＦＲを発現する親マウス細胞系に導入される）。増幅遺伝子（またはマーカー）と選択マーカーとは同一のベクター上に存在しても、２つの別個のベクター上に存在してもよい。
【００８５】
　一つの実施態様において、親細胞系により発現される第２の阻害可能な酵素はジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択される。
【００８６】
　別の実施態様において、増幅コピー数の増幅ベクターと増幅コピー数の発現ベクターを含む形質転換細胞を同定するために用いられる、第１の水性溶液（例えば、組織培養培地）中に存在する阻害剤の濃度は、親細胞系の増殖を阻止するのに必要とされる濃度の４〜６倍である。当業者であれば、阻害可能な酵素および対象のタンパク質の発現のために必要とされる、それぞれ増幅ベクターおよび発現ベクター上に存在する配列のみを増幅する必要があることが十分に理解されよう。しかし、阻害可能な酵素または対象のタンパク質の発現のために必要とされる配列に連結されたベクター骨格の配列も同時増幅法において増幅され得る（典型的には、増幅される）ことが十分に理解されよう。
【００８７】
　さらに別の実施態様において、本発明の方法は、発現ベクターおよび増幅ベクターと共に親細胞系に導入される選択遺伝子産物（すなわち、選択マーカー）をコードする選択ベクターを用意することをさらに含む（あるいは、選択マーカーは増幅マーカーを含むベクターと同じベクター上に存在してもよい）。本発明は用いる選択遺伝子産物の種類により制限されない。用いる選択遺伝子産物はハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（例：ｈｙｇ遺伝子産物）、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（例：ｇｐｔ遺伝子産物）、およびアミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼ（例：ｎｅｏ遺伝子産物）を含むがこれらに限らない優性選択マーカーであり得る。あるいはまた、用いる選択マーカーはヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、またはカルバモイルリン酸シンテターゼ-アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ-ジヒドロオラターゼのような選択マーカーによりコードされる酵素活性を欠失している親細胞系の使用を必要とするかもしれない。特に好ましい実施態様では、選択ベクターが活性ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする。選択ベクターが活性ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするときは、この選択遺伝子産物の発現を要求する第２の水性溶液がヒポキサンチンとアザセリンを含有する。選択、発現および／または増幅の各ベクターは親細胞系への導入に先立って直線化することが好ましい。
【００８８】
　別の実施態様において、本発明の方法はさらに、各ベクター（すなわち、増幅、発現および選択ベクター）の導入後、阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含む第１の水性溶液中に形質転換細胞を導入するに先立って、選択遺伝子産物の発現を要求する第２の水性溶液中に形質転換細胞を導入する追加の工程を含む。
【００８９】
　本発明の方法は増幅ベクターによりコードされる阻害可能な酵素の種類により制限されない。当技術分野では多数の増幅マーカーが公知である。好ましい実施態様では、増幅ベクターがジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびアスパラギンシンテターゼよりなる群から選択される活性酵素をコードする。
【００９０】
　別の好ましい実施態様において、増幅ベクターによりコードされる阻害可能な酵素を発現する形質転換細胞を選択するために用いる阻害剤は、メトトレキセート、2'- デオキシコフォルマイシン、メチオニンスルフォキシミン、アルビジン(albizziin)、およびβ-アスパルチルヒドロキサメートよりなる群から選択される。
【００９１】
　本発明はさらに、Ｂ細胞リンパ腫の治療方法を提供する。この方法は、ａ）i)Ｂ細胞リ
ンパ腫の患者、およびii) 該患者のＢ細胞リンパ腫細胞由来の免疫グロブリン分子の少なくとも２つの組換え可変領域を含む多価ワクチン（ただし、前記細胞は少なくとも２つの異なる免疫グロブリン分子を発現し、これらの免疫グロブリン分子は少なくとも１つのイディオトープにより相違する）を用意し、ｂ）この多価ワクチンを該患者に投与する、ことを含んでなる。好ましい実施態様では、前記ワクチンがリンパ腫細胞由来の組換え可変領域を含む少なくとも２つの組換え免疫グロブリン分子を含有する。好ましい実施態様では、さらにアジュバントを含有する多価ワクチンを使用する。ワクチンをヒト患者に投与する場合は、ヒトへの使用が認められているアジュバントを用いる（例えば、ミョウバン）。好ましい実施態様では、アジュバントはSyntex adjuvant formulation 1 （ＳＡＦ−１）である。ヒトに使用するのに適したその他のアジュバントとして、ＱＳ２１(Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, MA)、OptivaxTM(Vaxcell Inc., Norcross, GA)およびRibi Immunochem Research, Inc. (Hamilton,MT) 製のアジュバントが挙げられるが、これらに限らない。多価ワクチンを構成する組換えＩｇタンパク質（Ｉｇタンパク質のフラグメントを含む）はＫＬＨのような担体タンパク質にコンジュゲートさせてもよい。
【００９２】
　本発明はさらに、ａ）i)Ｂ細胞リンパ腫の患者、ii) 該患者のＢ細胞リンパ腫細胞由来の免疫グロブリン分子の少なくとも２つの組換え可変領域を含む多価ワクチン（ただし、前記細胞は少なくとも２つの異なる免疫グロブリン分子を発現し、これらの免疫グロブリン分子は少なくとも１つのイディオトープにより相違する）、およびiii)該患者から単離した樹状細胞を用意し、ｂ）該樹状細胞をin vitroで該多価ワクチンと共にインキュベートして自己抗原パルス化樹状細胞を得、ｃ）該パルス化樹状細胞を前記患者に静脈内投与し、そしてｄ）該パルス化樹状細胞の投与後に、該患者に前記多価ワクチンを投与する、ことを含んでなるＢ細胞リンパ腫の治療方法を提供する。好ましい実施態様では、前記ワクチンが組換え可変領域を含む少なくとも２つの組換え免疫グロブリン分子を含有する。
【００９３】
　本発明はさらに、ａ）i)Ｂ細胞リンパ腫の患者、ii) 本発明の方法に従って製造したワクチンを用意し、そしてｂ）該ワクチンを該患者に投与する、ことを含んでなるＢ細胞リンパ腫の治療方法を提供する。
【００９４】
　さらに、本発明は免疫細胞腫瘍の患者の治療方法を提供し、この方法は、ａ）患者から単離した免疫細胞腫瘍細胞（ただし、該腫瘍細胞はその細胞膜上にイディオタイプタンパク質を発現している）、ii) 異種プロモーターに機能的に連結された第１の阻害可能な酵素をコードする配列をもつ第１の組換えオリゴヌクレオチドを含有する増幅ベクター、iii)真核親細胞系を用意し、ｂ）該腫瘍細胞の表面上に発現された少なくとも１つのイディオタイプタンパク質をコードするヌクレオチド配列を単離し、ｃ）イディオタイプタンパク質をコードするヌクレオチド配列を少なくとも１つのベクターに挿入して、イディオタイプタンパク質を発現できる少なくとも１つの発現ベクターを作り、ｄ）該発現ベクターを親細胞に導入して１個以上の形質転換細胞を作製し、ｅ）該形質転換細胞を、阻害可能な酵素を阻害しうる阻害剤を含有する第１の水性溶液中に導入し（その際、第１の水性溶液中に存在する阻害剤の濃度は親細胞系の増殖を阻止するのに十分である）、ｆ）第１の水性溶液中で増殖可能な形質転換細胞を同定し（その際、増殖可能な形質転換細胞は増幅コピー数の発現ベクターと増幅コピー数の増幅ベクターを含有し、かつ該発現ベクターによりコードされるイディオタイプタンパク質を産生する）、ｇ）該形質転換細胞により産生されたイディオタイプタンパク質を単離し、そしてｈ）単離したイディオタイプタンパク質を前記患者に投与する、ことを含んでなる。
【００９５】
　本発明の方法は腫瘍細胞の種類により制限されない。一つの実施態様では、腫瘍細胞がＴリンパ球系細胞であり、イディオタイプタンパク質がＴ細胞受容体またはその断片である。別の実施態様では、腫瘍細胞がＢリンパ球系細胞であり、イディオタイプタンパク質が免疫グロブリンまたはそのフラグメントである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９６】
定義
　本発明を理解しやすくするために、多くの用語を以下で定義する。
【００９７】
　本明細書中で用いる「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的手法を用いて一緒に結合されたＤＮＡセグメントから成るＤＮＡ分子をさす。
【００９８】
　本明細書中で用いる「機能的な結合状態の」または「機能的に連結された」とは、目的のタンパク質分子の合成を指令できる核酸分子が産生されるような方法での核酸配列の結合をさす。プロモーター配列がタンパク質をコードする配列に機能的に連結されると、該プロモーターはｍＲＮＡの発現を指令し、このｍＲＮＡが翻訳されてコード化タンパク質の機能性形態をもたらす。この用語はまた、機能性タンパク質が産生されるような方法でのアミノ酸配列の結合をも意味する。
【００９９】
　ＤＮＡ分子は「5'末端」および「3'末端」をもつと言われる。というのは、モノヌクレオチド同士が反応して、１個のモノヌクレオチドのペントース環の5'リン酸がホスホジエステル結合を介して一方向でその隣の3'酸素に結合されるような方法でオリゴヌクレオチドを形成するからである。それゆえ、オリゴヌクレオチドの末端は、その5'リン酸がモノヌクレオチドペントース環の3'酸素に結合されていないとき「5'末端」と呼ばれ、その3'酸素が後続のモノヌクレオチドペントース環の5'リン酸に結合されていないとき「3'末端」と呼ばれる。本明細書中では、核酸配列は、それがより大きなオリゴヌクレオチドの内部に存在するときでさえ、5'および3'末端をもつといえる。直鎖状または環状のいずれのＤＮＡ分子においても、別個のエレメントは「下流」または3'エレメントの「上流」または5'側にあるといわれる。この専門用語は、転写がＤＮＡ鎖に沿って5'から3'の方向に進行するという事実を反映している。連結された遺伝子の転写を指令するプロモーターおよびエンハンサーエレメントは一般にコード領域の5'側つまり上流に配置される（エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントおよびコード領域の3'側に存在するときでさえ、その効果を発揮できる）。転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルはコード領域の3'側つまり下流に位置づけられる。
【０１００】
　「遺伝子をコードするヌクレオチド配列をもつオリゴヌクレオチド」とは、遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ配列、言い換えると、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を意味する。このコード領域はｃＤＮＡの形で存在しても、ゲノムＤＮＡの形で存在してもよい。適当な制御エレメント、例えば、エンハンサー／プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどは、必要ならば、転写の適切な開始および／または一次ＲＮＡ転写産物の正確なプロセシングを可能にするために、遺伝子のコード領域にきわめて接近して配置される。あるいはまた、本発明の発現ベクター中で用いられるコード領域は内因性のエンハンサー／プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性と外因性の両方の制御エレメントの組合せを含んでいてもよい。
【０１０１】
　「組換えオリゴヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチド配列の制限酵素消化により生成された２以上のオリゴヌクレオチド配列の連結、オリゴヌクレオチドの合成（例えば、プライマーまたはオリゴヌクレオチドの合成）などを含むがこれらに限らない分子生物学的操作を用いて作製されたオリゴヌクレオチドをさす。　「異種プロモーターに機能的に連結されたタンパク質コード配列をもつ組換えオリゴヌクレオチド」または文字通り同等の用語は、タンパク質（例えば、酵素）をコードするコード領域が、生物のゲノム中で該コード領域と自然界で結合しているプロモーターではないプロモーターに結合している（すなわち、該コード領域が外因性のプロモーターに結合している）ことを示す。ゲノム中で
コード領域と自然界で結合しているプロモーターのことを、そのコード領域に対して「内因性のプロモーター」という。
【０１０２】
　本明細書中で用いる「転写単位」とは、転写の開始部位と終結部位の間のＤＮＡセグメントおよび効率的な開始および終結に必要な調節エレメントをさす。例えば、エンハンサー／プロモーター、コード領域、終結配列およびポリアデニル化配列を含むＤＮＡセグメントが転写単位を構成する。
【０１０３】
　本明細書中で用いる「調節エレメント」とは、核酸配列の発現のいくつかの面を制御する遺伝子エレメントをさす。例えば、プロモーターは機能的に連結されたコード領域の転写開始を促進する調節エレメントである。その他の調節エレメントは（以下で定義される）スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどである。
【０１０４】
　本明細書中で用いる「発現ベクター」とは、目的のコード配列および特定の宿主生物において機能的に連結された該コード配列を発現させるのに必要な核酸配列を含有する組換えＤＮＡ分子のことである。原核生物での発現に必要な核酸配列としては、プロモーター、場合によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、そして多分その他の配列が含まれる。真核生物はプロモーター、エンハンサー、終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【０１０５】
　真核生物における転写制御シグナルは「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは転写に関与する細胞性タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイ(array)から成る[Maniatisら, Science 236:1237 (1987)]。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは酵母、昆虫および哺乳動物細胞中の遺伝子を含めて様々な真核生物源ならびにウイルスから単離されている（類似の制御エレメント、すなわちプロモーター、は原核生物中にも存在する）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、対象のタンパク質を発現させるためにどの細胞型を用いるかによって決まる。ある種の真核生物プロモーターおよびエンハンサーは広い宿主域をもっているが、他のものは限られたサブセットの細胞型において機能する[Vossら, Trends Biochem. Sci.,11:287 (1986) およびManiatisら, 前掲(1987)を参照のこと] 。例えば、SV40初期遺伝子エンハンサーは多くの哺乳動物種由来の種々の細胞型において非常に活動的であり、哺乳動物細胞によるタンパク質発現のために汎用されている[Dijkemaら,EMBO J. 4:761 (1985)] 。広範な哺乳動物細胞型において活動するプロモーター／エンハンサーの他の二例は、ヒト延長因子1 α遺伝子由来のもの[Uetsukiら, J. Biol. Chem.,264:5791 (1989); Kimら, Gene 91:217 (1990)およびMizushima &Nagata, Nuc. Acids.Res., 18:5322 (1990)]およびラウス肉腫ウイルス[Gormanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)]とヒトサイトメガロウイルス[Boshartら, Cell 41:521 (1985)]の長い末端反復配列である。
【０１０６】
　「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーターとエンハンサーの両機能を提供できる配列を含むＤＮＡセグメントをさす（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列はプロモーターとエンハンサーの両機能を含む）。プロモーター／エンハンサーは「内因性」または「外因性」つまり「異種」でありうる。内因性のプロモーター／エンハンサーはゲノム中で特定の遺伝子に自然界で結合されているものである。外因性（異種）のプロモーター／エンハンサーは遺伝子操作手段（すなわち、分子生物学的手法）により遺伝子に並置されているものである。
【０１０７】
　発現ベクターに「スプライシングシグナル」が存在すると、しばしば、組換え転写産物の高レベル発現が得られる。スプライシングシグナルは一次ＲＮＡ転写産物からのイントロンの除去を仲介し、スプライス供与および受容部位から成る[Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp. 16.7-16.8]。通常利用されるスプライス供与および受容部位はSV40の16S RNA由来のスプライス部位である。
【０１０８】
　真核細胞における組換えＤＮＡ配列の効率的な発現には、得られる転写産物の効率的な終結およびポリアデニル化を指令するシグナルが必要である。転写終結シグナルは一般的にポリアデニル化シグナルの下流に存在し、その長さは数100ヌクレオチドである。本明細書中で用いる「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は新生ＲＮＡ転写産物の終結とポリアデニル化の両方を指令するＤＮＡ配列をさす。ポリＡ尾部を欠失している転写産物は不安定で、急速に分解されるので、組換え転写産物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクター中で利用されるポリＡシグナルは「異種」であっても「内因性」であってもよい。内因性のポリＡシグナルは、自然界でゲノム中の特定遺伝子のコード領域の3'末端に見いだせるものである。異種のポリＡシグナルはある遺伝子から単離されて別の遺伝子の3'側に配置されるものである。通常利用される異種ポリＡシグナルはSV40のポリＡシグナルである。SV40ポリＡシグナルは237 bpのBamHI/BclI制限断片上に含まれ、終結とポリアデニル化のどちらも指令する[Sambrook,前掲, 16.6-16.7]。この237 bp断片は671 bpのBamHI/PstI制限断片内に含まれる。
【０１０９】
　「安定なトランスフェクション」または「安定してトランスフェクトされる」という用語は、トランスフェクト細胞のゲノムへの外来ＤＮＡの導入および組込みを意味する。「安定なトランスフェクタント」とは、外来または異種ＤＮＡがトランスフェクト細胞のゲノムＤＮＡに安定して組み込まれている細胞をさす。
【０１１０】
　本明細書中で用いる「選択マーカー」または「選択遺伝子産物」とは、選択マーカーを発現する細胞に抗生物質または薬剤に対する耐性を付与する酵素活性をコードする遺伝子の使用をさす。選択マーカーは「優性」でありうる。優性選択マーカーはどのように哺乳動物細胞系でも検出できる酵素活性をコードする。優性選択マーカーの例として、哺乳動物細胞において薬剤G418への耐性を付与する細菌のアミノグリコシド3'ホスホトランスェラーゼ遺伝子（neo遺伝子ともいう）、抗生物質ハイグロマイシン耐性を付与する細菌のハイグロマイシンＧホスホトランスェラーゼ（hyg）遺伝子、およびミコフェノール酸の存在下で増殖能を付与する細菌のキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（gpt遺伝子ともいう）がある。その他の選択マーカーは、その使用が関連酵素活性を欠く細胞系と一緒でなければならないという点で優性ではない。非優性選択マーカーの例としては、ＴＫ−細胞系と共に用いられるチミジンキナーゼ(tk)遺伝子、ＣＡＤ欠損細胞と共に用いられるカルバモイルリン酸シンテターゼ-アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ-ジヒドロオロターゼ（ＣＡＤ）遺伝子、およびＨＰＲＴ−細胞系と共に用いられる哺乳動物のヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(hprt)遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞系における選択マーカーの使用に関する概論は、Sambrookら, 前掲, pp. 16.9-16.15に示されている。一部の選択マーカーは増幅可能であり、それゆえ増幅マーカーとして使用できることに注目されたい（例えば、ＣＡＤ遺伝子）。
【０１１１】
　本明細書中で用いる「増幅」または「遺伝子増幅」とは、特定のＤＮＡ配列が不均衡に複製されて、その増幅遺伝子がゲノム中に最初に存在していたよりも高いコピー数で存在するようになるプロセスをさす。遺伝子増幅は両生類の卵母細胞中のリボソーム遺伝子の増幅のように自然界で発生中に特定の遺伝子で起こる。培養細胞を薬剤で処理することにより遺伝子増幅を誘導することができる。薬剤誘導増幅の例は哺乳動物細胞での内因性dhfr遺伝子のメトトレキセート誘導増幅である[Schmikeら, (1978) Science 202:1051]。薬剤（例えば、阻害可能な酵素の阻害剤）の存在下での増殖による細胞の選択は、この薬剤の存在下での増殖にとって必要とされる遺伝子産物をコードする内因性遺伝子の増幅もしくはこの遺伝子産物をコードする外因性（すなわち、インプット）配列の増幅、またはこれらの両方をもたらす。
【０１１２】
　本明細書中で用いる「同時増幅」とは、１個の細胞に増幅マーカーを他の遺伝子配列（発現ベクター内に含まれるような１以上の非選択遺伝子を含む）と共に導入し、その細胞が増幅マーカーと他の非選択遺伝子配列の両方を増幅するように適切な選択圧をかけることをいう。増幅マーカーを他の遺伝子配列と物理的に連結させることができ、あるいはまた、２つの別個のＤＮＡ鎖（一方は増幅マーカーを含み、他方は非選択マーカーを含む）を同一の細胞に導入することもできる。
【０１１３】
　「増幅マーカー」、「増幅遺伝子」または「増幅ベクター」という用語は、本明細書中では、適切な増殖条件下でその遺伝子の増幅を可能にする遺伝子または遺伝子をコードするベクターをさすために用いられる。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)遺伝子をコードするベクターを適当な細胞系（典型的には、dhfr−細胞）に導入し、次第に増加する濃度のＤＨＦＲ阻害剤メトトレキセートの存在下で増殖させて、dhfr遺伝子が増幅された細胞を選択することができる。同様の方法でアデノシンデアミナーゼ(ada)遺伝子を用いて、2'-デオキシコフォルマイシンのようなＡＤＡ阻害剤の存在下での増殖に対して選択された細胞においてada遺伝子配列を増幅することができた。哺乳動物細胞中で増幅マーカーとして使用できる他の遺伝子の例は、ＣＡＤ遺伝子（阻害剤：N-ホスホノアセチル-L-アスパラギン酸）、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子（阻害剤：プトレッシンを欠く培地中のジフルオロメチルオルニチン）、およびアスパラギンシンテターゼ遺伝子（阻害剤：アルビジンまたはアスパラギン不含培地中のβ-アスパルチルヒドロキサメート）[Kaufman, Methods in Enzymol., 185:537 (1990)を参照のこと] などである。
【０１１４】
　本明細書中で用いる「対象の遺伝子」とは、発現ベクターのポリリンカーに挿入された遺伝子をさし、該遺伝子の細胞における発現がトランスフェクト細胞に関する更なる研究を行う目的で望まれている遺伝子のことである。対象の遺伝子は、トランスフェクト細胞における高レベル発現が所望される、どのようなタンパク質をコードしてもよい。対象の遺伝子は本明細書中に示した具体例に制限されない。対象の遺伝子としては細胞表面タンパク質、分泌タンパク質、イオンチャンネル、細胞質タンパク質、核タンパク質（例：調節タンパク質）、ミトコンドリアタンパク質などが挙げられる。
【０１１５】
　「をコードする核酸分子」、「をコードするＤＮＡ配列」および「をコードするＤＮＡ」とは、デオキシリボ核酸鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列のことである。これらデオキシリボヌクレオチドの順序がポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。かくして、ＤＮＡ配列がアミノ酸配列をコードする。
【０１１６】
　脊椎動物の造血系はリンパ球系統および骨髄球系統の細胞を含む。骨髄球系統（または骨髄球−赤芽球系統）からは赤血球、好塩基球、好中球、マクロファージ、好酸球および血小板が発生する。リンパ球系統からはＢリンパ球（形質細胞を含む）およびＴリンパ球が生じる。
【０１１７】
　細胞系または細胞に関して用いる「リンパ球系」とは、その細胞系または細胞がリンパ球系統に由来し、Ｂリンパ球系統とＴリンパ球系統の両方を含むことを意味する。
【０１１８】
　本明細書中で用いる「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」は、Ｔ細胞の前駆細胞（Ｔ細胞受容体遺伝子の再編成を起こしていないThy1陽性細胞を含む）から成熟Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかについて単一陽性、表面ＴＣＲ陽性細胞）までのＴリンパ球系統に含まれるあらゆる細胞を包含する。
【０１１９】
　「Ｂリンパ球」および「Ｂ細胞」は、プレＢ細胞（ＩｇのＨ鎖遺伝子の再編成が始まっているＢ２２０+細胞）のようなＢ細胞の前駆細胞から成熟Ｂ細胞および形質細胞までのＢ細胞系統に含まれるあらゆる細胞を包含する。「ミエローマ」細胞または細胞系は悪性の形質細胞または細胞系である（したがって、Ｂ細胞系統に属し、Ｔ細胞系統ではない）。
【０１２０】
　「親細胞系」とは、外因性核酸の添加前の細胞系を意味する。
【０１２１】
　「形質転換細胞」とは、外因性ＤＮＡ（すなわち、細胞に導入された異種ＤＮＡ、例えば発現ベクターの導入）を含む細胞のことである。本明細書中では、「形質転換細胞」および「トランスフェクト細胞」が相互交換可能に用いられる。
【０１２２】
　細胞系増殖用の溶液に関して用いられる「水性溶液」とは、細胞の増殖を支援するのに必要とされる化合物類を含有する溶液をさし、塩類、緩衝剤、血清または合成血清代用品を含みうる。細胞系の増殖を支援できる水性溶液は「組織培養培地」（例えば、EMEM、DMEM、RMPI 1470 など）とも言う。
【０１２３】
　「選択遺伝子産物の発現を要求する水性溶液」とは、細胞が培地中で生き残れるように機能性または活性形態の選択遺伝子産物を細胞系に発現させる溶液または組織培養培地のことである（例えば、ヒポキサンチンとアザセリンを含有する培地中で増殖するには、細胞は機能性ＨＰＲＴを発現しなければならない）。細胞により発現された「阻害可能な酵素を阻害できる阻害剤を含む水性溶液」とは、阻害可能な酵素（例えば、ＤＨＦＲ）を阻害できる阻害剤（例えば、メトトレキセート）を含有する培地をさす。培地中の阻害剤の存在は、生き残るために阻害剤により阻害される機能性または活性形態の酵素を発現することを細胞に要求する。
【０１２４】
　「親細胞系の増殖を阻止するのに十分な阻害剤の濃度」とは、阻害剤含有培地中に親細胞をまいた後３〜５日以内に細胞の98％以上を死滅させるために培地中に存在しなければならない阻害剤の濃度をいう。
【０１２５】
　「増幅コピー数のベクター」とは、外因性または組換えベクターが組み込まれており、遺伝子増幅の過程によって細胞内に存在するベクターのコピー数が増加している細胞系をさす。
【０１２６】
　「増幅遺伝子」とは、遺伝子増幅のために細胞系中に多コピー数で存在する遺伝子のことである。
【０１２７】
　「阻害可能な酵素をコードする内因性遺伝子」を含む細胞とは、そのゲノムＤＮＡ中に阻害可能な酵素をコードする遺伝子を（組換えＤＮＡ操作によるのとは対照的に）もともと含んでいる細胞をさす。この遺伝子のコード領域はその内因性プロモーターに機能的に連結されており、かつそのプロモーターの制御下にあるだろう。
【０１２８】
　「活性酵素」とは、機能的な（すなわち、酵素機能を果たすことができる）酵素をさす。
【０１２９】
　免疫グロブリン分子はアミノ末端に高度に特異的な可変領域を含む重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖から成る。Ｈ鎖の可変（Ｖ）領域（ＶH）とＬ鎖の可変領域（ＶL）は一緒になって免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質のユニークな抗原認識または抗原結合部位を形成する。Ｉｇ分子の可変領域は抗原またはイディオタイプとして認識され得る決定基（すなわち、分子形状）を含む。
【０１３０】
　「イディオタイプ」とは、免疫グロブリンＶドメイン（すなわち、相補性決定領域またはＶHおよびＶL領域の会合により形成される抗原結合部位）の抗原またはエピトープ決定基（すなわち、イディオトープ）の群をさす。
【０１３１】
　「イディオトープ」は、免疫グロブリン分子のＶ領域の一部に沿って配置された単一のイディオタイプエピトープをさす。
【０１３２】
　「抗イディオタイプ抗体」または文字通り同等の用語は、Ｉｇタンパク質のＶ領域上のイディオトープ群に対する抗体を意味する。
【０１３３】
　イディオタイプタンパク質またはその断片（例えば、免疫グロブリン分子またはその可変領域、Ｔ細胞受容体タンパク質またはその可変領域）を含むワクチンに関して用いられる「多価ワクチン」とは、少なくとも１つのイディオトープによって相違する少なくとも２つのイディオタイプタンパク質を含むワクチンのことである。例えば、免疫グロブリン分子が少なくとも１つのイディオトープによって互いに相違する（例えば、これらの免疫グロブリンは互いの体細胞変異体である）Ｂ細胞リンパ腫由来の２以上の免疫グロブリン分子を含むワクチンは多価ワクチンである。
【０１３４】
　本明細書中で用いる「免疫グロブリン分子の組換え可変領域」とは、分子生物学的手段によって作製されたＩｇ分子の可変領域をさす。本明細書中に示すように、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変ドメインをリンパ腫細胞から分子クローニングして、宿主細胞において発現させる（例えば、発現ベクターに挿入した後その発現ベクターを宿主細胞内に導入することによる）。この方法で発現された可変ドメインが免疫グロブリン分子の組換え可変領域である。免疫グロブリン分子の組換え可変領域は、適当な定常領域（すなわち、ＣHまたはＣL）（この定常領域は組換え可変領域と自然界で結合されている定常領域を含む）に機能的に連結された組換え可変領域を含む免疫グロブリン分子として、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変ドメイン、Ｌ鎖の定常領域およびＨ鎖の定常領域の一部を含むＦab、Ｆ(ab') 2またはＦab'断片として（Ｆab、Ｆ(ab')2またはＦab'断片は組換え免疫グロブリン分子の消化により、あるいはまた、分子生物学的手段により得られる）、または一本鎖抗体もしくはＦvタンパク質として発現させることができる。
【０１３５】
　「一本鎖抗体」または「Ｆv」は、短いペプチドリンカーにより結合された抗体Ｌ鎖の可変ドメインまたは領域（ＶL）とＨ鎖の可変領域（ＶH）から成る。ペプチドリンカーはその構造が抗原と結合できるコンフォメーションをとることを可能にする[Birdら, (1988) Science 242:423およびHustonら, (1988) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85:5879]。
【０１３６】
　「リンパ腫細胞由来の組換え可変領域」とは、リンパ腫細胞より単離されたＲＮＡから分子クローニングされた可変領域をさす。この組換え可変ドメインは完全な免疫グロブリン分子として発現させても、Ｆv分子を含めて免疫グロブリン分子の断片として発現させてもよい。
【０１３７】
　「免疫促進性サイトカイン」とは、サイトカインをin situで生成させるか、哺乳動物宿主に投与するとき、免疫応答を促進し得るサイトカインのことである。免疫促進性サイトカインには、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）、インターロイキン-2（ＩＬ-2）、インターロイキン-3（ＩＬ-3）、インターロイキン-4（ＩＬ-4）およびインターロイキン-12（ＩＬ-12）が含まれるが、これらに限らない。
【０１３８】
　「アジュバント」とは、抗原と一緒に投与したとき免疫応答を促進または刺激する化合物のことである。
【０１３９】
　「Ｂリンパ腫の患者から単離された悪性細胞」とは、リンパ腫に特徴的な固形腫瘍（例えば、腫瘍細胞を含むリンパ節および脾臓）内に見られる悪性または病因性のＢ細胞をいう。
【０１４０】
発明の説明
　本発明は、培養細胞において組換えタンパク質をコードする遺伝子を発現および同時増幅させるためのベクターならびに改良された方法を提供する。本発明は次の小節に分割して説明される。すなわち、Ｉ）同時増幅法の概説、II）発現ベクター、III)増幅ベクター、IV）選択ベクター、Ｖ）細胞系および細胞培養、VI）細胞系の同時トランスフェクション、VII)選択および同時増幅、VIII) 前もって選択を行わない同時増幅、IX）増幅細胞系におけるインターロイキン10の高レベル発現、Ｘ）増幅細胞系におけるヒトクラスII MHC抗原およびＴ細胞受容体タンパク質の高レベル発現、およびXI) リンパ腫および白血病治療用の特注多価ワクチンの製造、である。
【０１４１】
Ｉ．同時増幅法の概説
　本発明は真核細胞系における選択遺伝子および非選択遺伝子の同時増幅のための改良された方法を提供する。本発明は、まず第一に、Ｔリンパ球系細胞系（例えば、ＢＷ5147.G.1.4細胞系）における組換え遺伝子配列の同時増幅を可能にする。
【０１４２】
　多くの理由のために、リンパ球系細胞系（ＴまたはＢリンパ球系）において遺伝子配列を増幅できることが望ましい。こうした理由として、組換え免疫グロブリンを分泌するこれら細胞の能力、および培養器内にて高バイオマスで増殖するこれらの浮遊細胞系の能力が挙げられる。これまでに、インプット遺伝子配列の増幅はＢリンパ球系細胞系（例えば、ミエローマ細胞系）において報告されているにすぎない。さらに、増幅マーカーとしてdhfr遺伝子を用いてミエローマ細胞系で遺伝子を増幅することには、ミエローマ細胞内の内因性ＤＨＦＲ活性のために問題があった。増幅を成功させるには、ＭＴＸ耐性dhfr遺伝子の使用および非常に高レベルのＭＴＸの使用が必要であると報告されている[Dorai &Moore (1987) J. Immunol. 139:4232] 。これに対して、本発明はＭＴＸ耐性dhfr遺伝子の使用を必要とせず、Ｔリンパ球系細胞系における遺伝子の増幅を可能にする。
【０１４３】
　グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子を用いる同時増幅スキームが記載されている [米国特許第5,122,464号（その開示内容を参考としてここに組み入れる）およびBebbingtonら, (1992) Bio/Technology 10:169] 。この同時増幅スキームは、一部には、ミエローマ細胞における遺伝子の同時増幅を達成するために非常に高レベルのＭＴＸおよびＭＴＸ耐性dhfr遺伝子を使用する必要性を回避する目的で開発されたものである。同時増幅スキームにおけるＧＳの使用にはいくつかの欠点がある。第一に、内因性ＧＳ遺伝子座がそのＧＳ遺伝子を使用可能にする頻度で増幅すると思われる細胞系の使用を排除するために、用いる細胞系中の内因性ＧＳ遺伝子座の性質を検討しなければならない。４種のミエローマまたはハイブリドーマ細胞系のうちの２種（50％）は、選択マーカーとしてＧＳを使用するには不適当な宿主細胞であることがわかった(Bebbingtonら, 前掲)。これら２種の不適当な細胞系のうちの一つ、ＳＰ2/0は内因性ＧＳ遺伝子座を増幅することが判明した。
【０１４４】
　選択および増幅マーカーとしてＧＳを使用することの第二の欠点は、高レベルの非選択遺伝子産物を産生する細胞系を単離するのに要する総時間である。１回の増幅および再クローニングには、ＧＳ選択に付されるミエローマ細胞系を用いて３ヵ月を要することが報告された(Bebbingtonら, 前掲)。同時増幅プロトコールにおいて用いられた他の選択マーカーはさらに長時間を必要とすると報告されており、選択マーカーとしてＤＨＦＲを用いる増幅ミエローマ細胞系の選択には６ヵ月もかかる[Dorai &Moore (1987) J. Immunol.
139:4232] 。
【０１４５】
　本発明は、既存の同時増幅プロトコールを用いた場合よりも短期間で所望の増幅細胞系を単離できる方法を提供する。本発明を用いると、多数の増幅ラウンドを約３ヵ月で行う
ことができる。宿主細胞系として急速な倍加時間をもつ細胞系を使用することで、部分的に、時間の節約が認められる。所望の増幅細胞系を作製するのに要する時間が短縮されるのに加えて、本方法を用いると、増幅遺伝子（例：dhfr遺伝子）のみならず対象の非選択遺伝子をも同時増幅した増幅細胞系が高頻度で得られる。
【０１４６】
　一般的に、本発明は次のステップを必要とする。
【０１４７】
　１．対象のタンパク質をコードする発現ベクター、増幅マーカー（例：dhfr遺伝子）をコードする増幅ベクター、および場合により、選択マーカー（例：ＨＰＲＴ）をコードする選択ベクターを含む線状プラスミドを宿主細胞系に導入する。あるいはまた、１以上の対象の遺伝子、増幅マーカーおよび場合により選択マーカーを含む単一のベクターを使用することもできる。宿主細胞系は12時間以下の倍加時間をもち、特に好ましい宿主細胞系はＢＷ5147.G.1.4細胞系である。線状ベクターを導入する前の宿主細胞を親細胞系という。ベクターＤＮＡを宿主細胞系に導入する好適な手段はエレクトロポレーションである。増幅ベクター、非選択発現ベクターおよび／または選択ベクターの比が重要である。１（選択ベクター）：２（増幅ベクター）：20〜25（１以上の発現ベクター）の比が用いられる。選択マーカーを用いない場合は、１（増幅ベクター）：10〜15（１以上の発現ベクター）の比を用いる。線状ベクターＤＮＡのエレクトロポレーションと共にこの比を用いることにより、低い割合で増幅遺伝子を含むトランスフェクトＤＮＡベクターのランダムコンカテマーが生成される。本発明はどのような特定の作用機序にも制限されないが、増幅遺伝子を低割合で含むこれらのランダムコンカテマーは、主に増幅マーカーから成る増幅単位をあまり生成しそうにないと思われる。主に発現ベクターを含む増幅単位を生成することが望ましい。なぜならば、これは１以上の対象のタンパク質を大量に発現している増幅細胞系をもたらすからである。
【０１４８】
　既存のトランスフェクション法（エレクトロポレーションプロトコールを含む）とは対照的に、本発明の方法は対象の遺伝子を含むＤＮＡ（すなわち、発現ベクター）を大量に使用する [最近のエレクトロポレーション法に関しては、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley &Sons, Inc., 9.3.1-9.3.6を参照のこと] 。本発明の方法を用いる場合は、発現ベクター、増幅ベクターおよび場合により選択ベクターを含むＤＮＡ合計約500〜750μgを全容量0.5 mlにてエレクトロポレーション緩衝液0.5 ml中の約２×107個の細胞に導入する（したがって、ＤＮＡの最終濃度は１〜1.5 mg/mlとなる）。大量の発現ベクターを用いると、外因性ＤＮＡによりコードされる遺伝子産物を発現する細胞クローンの分離頻度が増加する。本発明の方法を用いることにより、選択物（または選択ベクターを用いないときは一次増幅物）の約20〜25％が比較的高レベルで対象の遺伝子を発現する。これに対して、通常の量のＤＮＡ（細胞に単一の発現ベクターを導入するときは約20〜40μg）を用いる場合は、単離された選択物のたった１〜５％が比較的高レベルで対象の遺伝子を発現するにすぎない。
【０１４９】
　２．選択ベクターを用いる場合は、トランスフェクト細胞を普通の増殖培地で短時間（約36〜48時間）増殖させることで回収し、その後生き残るためには選択マーカーを発現することを細胞に要求する培地（選択培地）中にそれらを配置する。この選択培地の使用により、トランスフェクトＤＮＡを取り込んだ細胞の同定が促進される。選択培地中で増殖する細胞のコロニー（選択物）を増やし、対象のタンパク質を発現する能力について試験する。その後、対象のタンパク質を高レベルで発現する選択物クローンを増幅プロセスにかける。
【０１５０】
　３．増幅ベクターによりコードされる酵素を阻害する阻害剤への感受性レベルを調べるために、対象のタンパク質を高レベルで発現する選択物クローンを試験する。阻害剤に対する親細胞系の感受性も調べる。親細胞系を死滅させるのに要する濃度よりも最高６倍高
い濃度（典型的には４〜６倍）の阻害剤を含有する増殖培地中で生存する選択物をその後の操作（１回目の増幅）のために選択する。 [本発明の増幅プロトコールとの継続のためには、トランスフェクト増幅ベクター（例えば、ＤＨＦＲをコードするもの）を明らかに取り込んでいる一次トランスフェクタントが適している。トランスフェクト増幅ベクターの存在は、親細胞系を死滅させるのに要するレベルより高いレベルの阻害剤を含有する培地中で増殖する一次トランスフェクタントの能力により示される。] １回目の増幅物を、対象のタンパク質の発現について試験する。対象のタンパク質を低レベルで発現する細胞を捨てる（なぜならば、これは増幅遺伝子と対象遺伝子の同時増幅の欠如を示すからである）。親細胞系の増殖を阻止する阻害剤の濃度の６倍より高いの濃度の阻害剤を含有する培地中で増殖できる選択物を廃棄する。きわめて高レベルの阻害剤に対して耐性を示す選択物は、一般的に、対象のタンパク質を多量に発現する増幅細胞系をもたらさないことがわかった。本発明はどのような特定の作用機序にも制限されないが、１回目の増幅でのきわめて高レベルの阻害剤に対する耐性は、増幅遺伝子配列が大多数の他のインプットＤＮＡ配列（例えば、発現ベクター）から容易に分離して、主に増幅遺伝子配列を含む増幅単位の増幅をもたらす細胞系を表すと考えられる。
【０１５１】
　４．親細胞系を死滅させるのに要する濃度よりも４〜６倍高い濃度の阻害剤を含有する培地中で増殖できる１回目の増幅物を、このレベルの阻害剤を含有する培地中で２〜３週間増殖させる。次に、これらの細胞を約４〜６倍以上の阻害剤（すなわち、親細胞を死滅させる濃度の16〜36倍）を含有する培地中で増殖させて２回目の増幅物を得る。２回目の増幅物において対象のタンパク質の発現レベルを調べる。阻害剤に対する耐性の増加と一致する対象のタンパク質の発現増加を示さないクローンはすべて廃棄する。
【０１５２】
　５．培地中の阻害剤のレベルを各回の後続の増幅につき４〜６倍増加させることにより、増幅細胞系を後続の増幅ラウンドにかける。各回の増幅において、対象のタンパク質の発現を調べる。典型的には、阻害剤耐性レベルと対象のタンパク質の発現レベルとの不一致が２回目の増幅で見られる。本発明の方法を用いると、１回目の増幅物の60％以上が２回目の増幅において対象遺伝子と増幅遺伝子を同時増幅するだろう。２回目の増幅で対象遺伝子と増幅遺伝子を同時増幅したクローンはすべて、最大の発現レベルに到達するまで後続の全増幅ラウンドにおいてこれらの遺伝子配列を同調的に増幅し続けることが判明した。
【０１５３】
　以下の説明は本発明の同時増幅プロトコールにおいて採用される種々のステップおよび諸成分に関する更なる詳細を提供するものである。
【０１５４】
II．発現ベクター
　本発明の発現ベクターは、数多くの遺伝子エレメントを含むものである。即ち、Ａ）プラスミドバックボーン；Ｂ）真核細胞での効率的な遺伝子発現を可能にする調節エレメント（これらのエレメントには、エンハンサー／プロモーターエレメント、ポリＡシグナルおよびスプライス部位が含まれる）；Ｃ）遺伝子（選択マーカー遺伝子、増幅マーカー遺伝子または対象の遺伝子）の発現ベクターへの挿入を容易にするポリリンカー；Ｄ）遺伝子エレメントの可能な組み合わせを示す構築物。これらの遺伝子エレメントは、様々な立体配置および組み合わせで発現ベクター上に存在することができる。
【０１５５】
Ａ．プラスミドバックボーン
　発現ベクターには、原核細胞における該ベクターの増殖と選択を可能にするプラスミド配列が含まれる。これらのプラスミド配列をベクターのプラスミドバックボーンと呼ぶ。本発明は特定のプラスミドに限定されるものではないが、以下のプラスミドが好適である。細菌の複製起点（pMBlレプリコン）およびβ−ラクタマーゼまたはアンピシリン耐性遺伝子を含むpUC系プラスミドおよびその誘導体。pUC18(ATCC 37253)およびpUC19(ATCC 37254)等のpUCプラスミドは、細菌宿主にて高コピー数 (500〜700)で発現されるため特に好適である。pMBlレプリコン並びにアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含むpBR322およびその誘導体。pBR322は細菌細胞１個当たり15〜20コピーで発現される。pUCおよびpBR322プラスミドは多くの業者より市販されている（例えば、Gibco BRL、Gaithersburg，MD）。
【０１５６】
Ｂ．調節エレメント
i)エンハンサー／プロモーター
　各ｃＤＮＡの転写は、宿主細胞中での高レベル転写を可能にする遺伝子エレメントによって指令されている。各ｃＤＮＡはプロモーターおよび／またはエンハンサーの転写制御下にある。プロモーターおよびエンハンサーは、連結された遺伝子の転写を指令するＤＮＡの短いアレイ(array)である。本発明は特定のプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの使用に限定されるものではないが、以下のものが、広範囲の様々な細胞型において機能的に連結された遺伝子の高レベル発現を指令するため好適なプロモーター／エンハンサーエレメントである。ベクターをSV40Ｔ抗原を発現する宿主細胞にトランスフェクトする場合には、SV40およびSRαエンハンサー／プロモーターが特に好適である。なぜならば、これらのエンハンサー／プロモーター配列はSV40複製起点を含むからである。
【０１５７】
　ａ）SV40エンハンサー／プロモーターは、多くの哺乳動物種由来の広範囲の様々な細胞型において非常に活性である[Dijkema, Rら, EMBO J., 4:761(1985)]。
【０１５８】
　ｂ）SRαエンハンサー／プロモーターは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス-1(HTLV-1)のLTR由来のR-U5配列およびSV40エンハンサー／プロモーター由来の配列を含む[Takebe, Yら,
Mol. Cell. Biol., 8:466 (1988)]。HTLV-1配列は、SV40初期プロモーターのすぐ下流に位置する。これらのHTLV-1配列は転写開始部位の下流に位置し、ＲＮＡ転写産物上に５'非翻訳領域として存在する。HTLV-1配列の付加により、SV40エンハンサー／プロモーターからの発現が増強される。
【０１５９】
　ｃ）ヒトサイトメガロウイルス(CMV)主要前初期遺伝子(IE)エンハンサー／プロモーターは広範囲の細胞型で活性である[Boshartら、Cell 41:521(1985)]。アデノウイルス形質転換ヒト胚腎細胞系である293細胞系(ATCC CRL 1573)[J. Gen. Virol., 36:59 (1977), Virology 77:319 (1977)およびVirology 86:10 (1978)]は、アデノウイルスIE遺伝子産物がCMVエンハンサー／プロモーターからの転写レベルを増加させるため、CMVエンハンサー／プロモーターを含むベクター用の宿主細胞系として特に有利である。
【０１６０】
　ｄ）モロニー白血病ウイルスのLTR由来のエンハンサー／プロモーターは強力なプロモーターであり、広範囲の細胞型で活性である[Laiminsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6453 (1984)]。
【０１６１】
　ｅ）ヒト延長因子１α遺伝子由来のエンハンサー／プロモーターは非常に広範囲の細胞型で大量に転写される[Uetsukiら, J. Biol. Chem., 264:5791 (1989)並びにMizushimaおよびNagata, Nuc. Acids. Res. 18:5322 (1990)]。
【０１６２】
ii)ポリＡエレメント
　ｃＤＮＡコード領域の後にはポリアデニル化(ポリＡ)エレメントが続く。本発明の好適なポリＡエレメントは、効率的に転写を終結させてＲＮＡ転写産物をポリアデニル化する強力なシグナルである。好適な異種ポリＡエレメントはSV40ポリＡシグナルである（配列番号３参照）。別の好適な異種ポリＡエレメントは、ヒト延長因子１α(hEF1α)遺伝子由来のポリＡシグナルである（配列番号41参照）。本発明は、利用するポリＡエレメントによって限定されるものではない。挿入されたｃＤＮＡは、それ自体の内因性ポリＡエレメントが効率的な終結とポリアデニル化を可能にするものであれば、この内因性ポリＡエレメントを利用してもよい。
【０１６３】
iii)スプライス部位
　発現ベクターはスプライス部位配列も含んでいる。スプライシングシグナルは一次ＲＮＡ転写産物からのイントロンの除去を仲介するものであり、スプライス供与部位とスプライス受容部位とからなる。スプライシングシグナルが発現ベクター上に存在することにより、多くの場合組換え転写産物が高レベルに発現される。好適なスプライス部位はSV40の16S ＲＮＡ由来のスプライス部位である。別の好適なスプライス部位はhEF1α遺伝子由来のスプライス部位である。本発明は、特定のスプライス部位の使用によって限定されるものではない。任意のイントロン含有遺伝子由来のスプライス供与部位およびスプライス受容部位を利用することができる。
【０１６４】
Ｃ．ポリリンカー
　発現ベクターは、ＤＮＡセグメントのベクターへの挿入を容易にするポリリンカーを含む。ポリリンカーは、多数の制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を含有する短い合成ＤＮＡ断片である。制限部位の任意の所望のセットをポリリンカーに利用することができる。２つの好適なポリリンカー配列はSD5およびSD7ポリリンカー配列である。SD5ポリリンカーはSD5Aオリゴヌクレオチド（配列番号１）およびSD5Bオリゴヌクレオチド（配列番号２）によって形成され、XbaI、NotI、SfiI、SacIIおよびEcoRIに対する認識部位を含有する。SD7ポリリンカーはSD7Aオリゴヌクレオチド（配列番号４）およびSD7Bオリゴヌクレオチド（配列番号５）によって形成され、以下の制限部位を含有する：XbaI、EcoRI、MluI、StuI、SacII、SfiI、NotI、BssHIIおよびSphI。ポリリンカー配列はエンハンサー／プロモーター配列とスプライス部位配列の下流に位置し、ポリＡ配列の上流に位置する。ｃＤＮＡまたは他のコード領域（即ち、対象の遺伝子）をポリリンカーに挿入することにより、エンハンサー／プロモーターからの挿入コード領域の転写と、得られるＲＮＡ転写産物のポリアデニル化が可能になる。
【０１６５】
Ｄ．構築物
　上記エレメントは、多数の組み合わせおよび立体配置にて配列させて本発明の発現ベクターとすることができる。遺伝子エレメントは、当業者に公知の分子生物学の標準的な技術を用いて操作する[Sambrook, J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)]。適切な組換えＤＮＡベクターが構築されたら、このベクターを所望の宿主細胞へ導入する。標準的なプロトコールを用いてＤＮＡ分子を原核宿主へトランスフェクトする。簡単には、塩化カルシウム溶液で処理することにより宿主細胞をコンピテントにする（コンピテント細菌細胞は市販されており、研究室内で容易に作製される）。この処理により、ＤＮＡを細菌細胞に取り込ませることができる。ＤＮＡを細菌細胞へ導入する別の手段はエレクトロポレーションであり、電気パルスを使用してＤＮＡを細菌細胞へ取り込ませることができる。
【０１６６】
　ＤＮＡを宿主細胞へ導入した後、選択圧をかけてＤＮＡを取り込んだ細胞を単離することができる。原核生物ベクター（プラスミド）には、アンピシリン、カナマイシンまたはテトラサイクリン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が含まれている。好適なpUCプラスミドにはアンピシリン耐性遺伝子が含まれている。適当な抗生物質の存在下での増殖は、ベクターＤＮＡが存在することの指標となる。
【０１６７】
　構築されたプラスミド中に正しい配列が含まれているかの確認を行う分析では、ライゲーション混合物を使用してE.coliの適切な株を形質転換させればよい。通常使用されるE.coli株の例としては、HB101株（Gibco BRL）、TG1およびTG2（JM101株より誘導されたもの）、DH10B株（Gibco BRL）またはK12株294（ATCC No.31446）が挙げられる。この形質転換体由来のプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼでの消化により分析し、および／またはMessingら，Nuc. Acids Res., 9:309 (1981)の方法による配列決定を行う。
【０１６８】
　大量調製用の取扱説明書に従って、Qiagen Plasmid Kitカラム(Qiagen, Chatsworth, CA)でのクロマトグラフィーによってプラスミドＤＮＡを細菌溶菌液から精製する。
【０１６９】
　プラスミドＤＮＡの少量調製（即ち、ミニプレップ(miniprep)）は、アルカリ溶菌によって行う[Birnboim, H.C.およびDoly, J., Nuc. Acids. Res., 7:1513 (1979)]。簡単には、プラスミドを含んでいる細菌を、適当な抗生物質（pUC系プラスミドの場合にはアンピシリンを60μg/mlで使用）の存在下で一晩37℃で振盪しながら増殖させる。この一夜培養物1.5 mlを1.5 mlのミクロ遠心管へ移す。ミクロ遠心分離機にて12,000ｇで30秒遠心分離し、細菌ペレットを得る。上清を吸引除去する。細菌ペレットを100μlの氷冷した溶液I(50 mMグルコース、25 mM Tris-HCl、pH 8.0および10 mM EDTA、pH 8.0)に再懸濁する。200μlの溶液II(0.2Ｎ NaOHおよび１％SDS)を加え、遠心管を逆さにして内容物を混合する。150μlの氷冷した溶液III(氷酢酸でpH 4.8に調整した３Ｍ酢酸ナトリウム)を加え、遠心管をボルテックスして内容物を混合する。次いで遠心管を氷上に３〜５分静置する。次いで遠心管をミクロ遠心分離機にて12,000ｇで５分間遠心分離し、上清を新しい遠心管へ移す。プラスミドＤＮＡをエタノールを２倍容量用いて室温で沈澱させ、室温（約25℃）で２分間インキュベートする。ミクロ遠心分離機にて12,000ｇで５分間遠心分離し、ＤＮＡペレットを得る。上清を吸引除去し、ＤＮＡペレットをTE緩衝液（10 mM Tris-HCl、pH 7.6、１mM EDTA、pH8.0）等の適切な緩衝液に再懸濁する。
【０１７０】
　Qiagenカラムでのクロマトグラフィーまたはアルカリ溶菌ミニプレップ法のいずれかにて精製した発現ベクターＤＮＡは、トランスフェクション実験での使用に適している。
【０１７１】
III．増幅ベクター
　構造遺伝子をコードするベクターであって、該構造遺伝子をコードするベクターの複数のコピーまたは「増幅された」コピーを含む細胞の選択を可能にするベクターを、増幅ベクターと呼ぶ。増幅遺伝子は、増幅によって阻害剤または必須代謝産物の欠失のいずれかに応答して発現産物（即ち、該増幅遺伝子でコードされているタンパク質の発現）を増加させることが可能である。この増幅遺伝子は、栄養要求性の宿主を補うことができるという特徴を有する。例えば、DHFRをコードする遺伝子を、機能的なDHFR酵素を発現する能力に欠ける細胞と組み合わせて増幅マーカーとして使用することが可能である。しかしながら、栄養要求性の宿主細胞を用いることは必ずしも必要ではない。好適な態様では、宿主細胞は増幅マーカーについて栄養要求性ではない。
【０１７２】
　本発明は、特定の増幅遺伝子を用いることで限定されるものではない。DHFRを発現する遺伝子、CAD遺伝子、メタロチオネインを発現する遺伝子、アスパラギンシンセターゼを発現する遺伝子、グルタミンシンセターゼを発現する遺伝子および薬剤耐性を付与する表面膜タンパク質を発現する遺伝子といった各種遺伝子を用いることが可能である。細胞における代謝プロセスを、酵素阻害剤（例えば、DHFRの場合にはメトトレキセート）もしくは金属等の細胞傷害性物質、メタロチオネイン遺伝子で阻害することにより、または必須代謝産物の濃度を低くもしくはゼロに保つことにより、細胞の応答として、特定の遺伝子およびフランキング配列が増幅されるようになる[KaufmanおよびSharp (1982) J. Mol. Biol.159:601]。遺伝子増幅の過程によって増幅マーカーおよびその周囲のＤＮＡ配列が増幅されるため、増幅マーカーをコードする遺伝子以外の遺伝子配列を同時増幅することが可能である[Lattら, (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1750]。対象の遺伝子をコードする配列の増幅は、対象の遺伝子をコードする配列と増幅マーカーを同一の宿主細胞へ同時導入することによって達成される。
【０１７３】
　適当な調節シグナルを有するコード領域を両方ともシグナルベクター上に置くことにより、対象のタンパク質をコードする遺伝子を増幅マーカーに物理的に連結させることができる。（さらに、適当な調節シグナルを有する適当なコード領域を両方とも単一のベクター上に置くことにより、対象のタンパク質をコードする遺伝子を増幅マーカーと選択マーカーの両方に物理的に連結させることができる）。しかしながら、コード領域を両方とも物理的に同一のベクター上へ配置することは必ずしも必要ではない。小さなベクター分子は操作が容易であり、細菌宿主中で増殖させた際に高収率をもたらすことから、対象の遺伝子と増幅マーカー遺伝子を二つの別々のプラスミドベクターへ配置するのが好ましい。
増幅マーカーと対象の遺伝子を同一のベクタープラスミド上へコードさせる場合でも、または別のベクタープラスミド上へコードさせる場合でも、ベクターＤＮＡを宿主細胞へ導入する前に制限酵素で消化してベクター分子を線状にする。使用する制限酵素には、ベクターのプラスミドバックボーンを切断するが調節シグナルまたは増幅マーカーのコード領域または対象の遺伝子は切断しないものを選択する。
【０１７４】
　発現ベクター上に存在する調節エレメントによって増幅遺伝子の産物の発現が指令されるよう増幅マーカーをコードする所望の構造遺伝子を発現ベクターへ配置することにより、増幅ベクターを構築する。本発明は、増幅マーカーとしてDHFRをコードする構造遺伝子の使用を例として説明を行う。DHFRコード領域がSV40エンハンサー／プロモーターの転写制御下に置かれるようDHFRコード配列を発現ベクターpSSD7のポリリンカー領域へ配置する。本発明は、増幅ベクターを構築する際に特定のベクターを選択することで限定されるものではない。任意の適切な発現ベクターを用いることが可能である。特に好適な発現ベクターとしては、pSSD5、pSSD7、pSRαSD5、pSRαSD7、pMSD5およびpMSD7が挙げられる。これらの発現ベクターは、広範囲の様々な細胞型において挿入した遺伝子の高レベル発現を可能にする調節シグナルを利用するものである。
【０１７５】
IV．選択ベクター
　選択マーカー遺伝子をコードする発現ベクターは選択ベクターと呼ばれる。選択マーカーは優性選択マーカー(dominant selectable marker)であってもよい。優性選択マーカーとしては、neo遺伝子、hyg遺伝子およびgpt遺伝子が挙げられる。選択マーカーは、選択マーカーでコードされている産物を発現する能力に欠ける宿主細胞の使用が必要な場合がある。このような非優性マーカーの例としては、tk遺伝子、CAD遺伝子およびhprt遺伝子が挙げられる。
【０１７６】
　本発明は特定の選択マーカーの使用に限定されるものではなく、また選択マーカー（増幅マーカーを除く）を使用することに限定されるものでもない。好適な態様では、使用する宿主細胞はHPRT-欠損細胞系であり、使用する増幅マーカーはDHFRである。
【０１７７】
　HPRT-欠損細胞系を使用し、この細胞系によって機能的なDHFR酵素が産生される場合には、HPRT酵素をコードする選択マーカーを使用することができる。宿主細胞を、選択マーカー(HPRT)、増幅マーカー(DHFR)および１つ以上の対象のタンパク質を含有するプラスミドで同時トランスフェクトする。次いでトランスフェクトした細胞を、まず、該細胞によるHPRTの発現が要求されるHxAz培地（ヒポキサンチンおよびアザセリン）中での増殖能力について選択する。HxAz培地中で増殖する能力を有する細胞は、少なくともHPRTをコードする選択ベクターが導入されたものである。ベクターＤＮＡは線状にされ、エレクトロポレーション(後述)によって宿主細胞に導入されるため、HPRTベクターを取り込んだ細胞は、おそらくDHFRをコードするベクターと対象のタンパク質をコードするベクターも取り込んでいる。これは、線状にされたベクターが、単一ユニットとして非常に高頻度で宿主の染色体ＤＮＡ中に組み込まれる長鎖コンカテマーまたは縦列配列(tamdem array)を形成するためである[Toneguzzoら, (1988) Nucl. Acid Res. 16:5515]。
【０１７８】
　HPRTを発現するトランスフェクト細胞を選択することができるため、DHFR-欠損ではない細胞系において増幅マーカーとしてDHFRを用いることが容易になる。選択マーカーの使用によって、宿主細胞の内因性DHFR遺伝子の増幅という問題が回避可能となる[Walls, J.D.ら, (1989) 前掲]。しかしながら、以下で述べるように、本発明は、DHFR-欠損ではない細胞系を用いる場合には、増幅ベクターの他に選択マーカーを用いなくても実施することができる。
【０１７９】
　本発明は、選択マーカーを用いずに行ってもよい。増幅マーカーがグルタミンシンセターゼ遺伝子等の優性増幅マーカーである場合、または宿主細胞系が増幅マーカーの発現能に欠ける場合（例えば、DHFR-細胞系）では、選択マーカーを用いる必要はない。
【０１８０】
　選択マーカーを用いる場合には、該選択マーカーを、１）別のベクター（即ち、選択ベクター）に付与するか、または２）対象の遺伝子と増幅マーカーとを含有するベクターに存在させるか、３）増幅マーカーを含有するベクターに付与する(増幅／選択ベクター)か、または４）対象の遺伝子を含有するベクターに付与する。
【０１８１】
Ｖ．細胞系および細胞培養
　本発明の方法に従って、様々な哺乳動物細胞系を組換えタンパク質の発現に用いることが可能である。具体的な細胞系の例としては、CHO細胞系[例えば、CHO-K1細胞(ATCC CC1 61；ATCC CRL 9618)およびDHFR- CHO-KI細胞系（例えば、CHO/dhFr-；ATCC CRL 9096）等のCHO-K1細胞から誘導される細胞]、マウスL細胞、BW5147細胞およびこれらの変異体[例えば、BW5147.3（ATCC TIB 47）およびBW5147.G.1.4細胞（ATCC TIB 48）]が挙げられる。用いる細胞系は、組織培養容器に付着して増殖するもの (即ち、付着依存性)でもよいし、懸濁液中で増殖するもの（即ち、付着非依存性）でもよい。
【０１８２】
　本発明の実施には、BW5147.G.1.4細胞が特に好適である。BW5147.G.1.4細胞は倍加時間が非常に短い[即ち、10％ Fetal CloneI(Hyclone)を含むPRMI 1640培地中で増殖させると、倍加時間は約12時間である]。倍加時間または世代時間とは、培養物中に存在する細胞数を２倍に増加させるのに細胞系が必要とする時間の長さのことである。一方、CHO-K1細胞系（現在入手可能なdhfr-CHO-K1細胞系は、この細胞系より誘導されている）を10％ Fetal CloneII(Hyclone)を含むDMEM中または10％ Fetal CloneIIを含むハムF-12培地中で増殖させた場合、その倍加時間は約21時間である。
【０１８３】
　倍加時間が短いことは有利である。なぜならば、細胞系がより迅速に倍加するにつれて増幅された細胞系の変異体がより迅速に現れ、増幅マーカーの発現を必要とする培地中で増殖させた場合、より迅速にコロニーが形成される。細胞系間における倍加時間のわずかな差（即ち、１〜２時間）が、非選択遺伝子産物を高レベルに発現する有用な増幅レベルを有する細胞系の選択に要する時間の長さに換算した場合、大きな違いとなりかねない。高発現細胞系を単離することができる速度は、特定の状況では重要である。例えば、臨床用途で使用されるタンパク質の産生（例えば、癌患者を免疫するのに使用される腫瘍関連タンパク質の産生）には、対象のタンパク質が利用可能な量でできるだけ早く発現されることが必要であり、その結果、患者に対して最大の利益が認められるのである。
【０１８４】
　さらに、BW5147.G.1.4細胞では、非常に高い頻度で非選択遺伝子（この遺伝子は、対象のタンパク質をコードする）の増幅が可能である。本発明の方法を使用すれば、選択培地（例えば、HxAz培地）中で生き延びて増殖するBW5147.G.1.4細胞の約80％が、増幅マーカーと対象のタンパク質をコードするＤＮＡを含むインプットＤＮＡを増幅させるであろう（このことは、該細胞がMTXを含む培地中で生存する能力と、対象のタンパク質がより多く産生されることによって判断する）。即ち、選択培地中で生き延びて増殖する該細胞の80％が、増幅マーカーの発現を必要とする培地中で生き延びて増殖するであろう。増幅マーカーの発現を必要とする化合物を含む培地中で細胞を増殖させた場合（例えば、MTXの存在下での増殖にはDHFRの発現が必要である）、生き延びた細胞を「一回増幅された」と言う。初回増幅または第一次増幅の後、増幅マーカーの発現を必要とする化合物の濃度を高めた培地に該細胞を入れる。このより高い濃度の培地中で生き延びて増殖する細胞を「第二次増幅で生き延びた」と言う。増幅マーカーの発現を必要とする化合物の濃度をさらに高めた培地中での選択を第三次増幅と呼ぶ。
【０１８５】
　第一次増幅で増幅する（より高濃度のMTX中で生存する能力と、対象のタンパク質がより多く産生されることによって判断する）トランスフェクトされたBW5147.G.1.4クローンのうち約2/3は、第二次増幅においても増幅遺伝子並びに対象のタンパク質をコードする
遺伝子を同等に増幅する。第二次増幅において増幅マーカーと対象のタンパク質をコードする遺伝子を同等に増幅したクローンは全て、後続の増幅次数全てにおいて両遺伝子を同等に増幅することが判明している。
【０１８６】
　BW5147.G.1.4細胞を用いる別の利点は、これらの細胞が非常に丈夫であるという事実である。細胞系は、様々な培養条件下でも充分に増殖し得ることが判明した場合、および一定量の異常な処理(mal-treatment)に抵抗し得る（即ち、緩衝能力を失ったまたは特定の栄養分を消耗した培地中に放置した後でも生き返る能力を有する）場合に、丈夫であると言う。丈夫であることは、細胞系の取扱が容易であり、該細胞系が逞しく増殖することを意味する。組織培養の当業者であれば、特定の細胞系が他の細胞系よりも丈夫であることは容易に判るであろう。BW5147.G.1.4細胞は特に丈夫な細胞である。
【０１８７】
　BW5147.G.1.4細胞は、10％ FBS含有DMEMまたは10％ Fetal CloneI含有RPMI 1640培地
中で増殖させることにより維持することが可能である。CHO-K1細胞(ATCC CCl 61, ATCC CRL 9618)は、10％ Fetal CloneII (Hyclone) 含有DMEM、10％ Fetal CloneII含有ハムF12培地または10％ FBS含有ハムF12培地中で維持することが可能であり、CHO/dhFr-細胞(CRL 9096)は0.1mMヒポキサンチン、0.01 mMチミジンおよび10％ FBSを含むイスコフ改質ダルベッコ培地中で維持することが可能である。これらの細胞系は、５％ CO2を含む加湿雰囲気中、温度37℃にて培養する。
【０１８８】
　本発明は、特定の宿主細胞系を選ぶことで限定されるものではない。いずれの細胞系でも本発明の方法に用いることができる。増殖速度が速いかまたは倍加時間が短く（即ち、倍加時間が15時間以下の）、妥当な速度で増幅マーカーを増幅可能であって、内因性の遺伝子座を同等の速度またはより速い速度で増幅することのない細胞系が好適である。内因性の遺伝子座が増幅される速度よりも速い速度で増幅マーカーを増幅する能力を有する細胞系は、阻害剤（即ち、生き延びるために細胞が増幅マーカーを発現する必要がある化合物）の濃度を高くしても増殖する能力が、増幅マーカーのコピー数の増加と相関することを見出すことで同定される（このことは、サザンブロッティングによって増幅マーカーのコピー数の増加を示すことにより直接判定が可能であり、また、ノーザンブロッティングによって増幅マーカーから産生されるｍＲＮＡの量の増加を示すことにより間接的に判定が可能である）。
【０１８９】
VI．細胞系の同時トランスフェクション
　ベクターＤＮＡを所定の細胞系へ導入する前に、ベクター配列内で１回切断するが、コードされたタンパク質の発現に必要な制御またはコード領域内では切断しない制限酵素を用いてベクターＤＮＡを線状にする。ＤＮＡを線状にすると、ベクターＤＮＡが宿主細胞系の染色体ＤＮＡへ組み込まれ易くなるため、有利である（ＤＮＡの自由末端は組換えに適している(recombinogenic)）。さらに、宿主細胞のゲノムＤＮＡへ組み込むために、ベクターＤＮＡを切断(break)しなければならない。線状にすることによりこの切断が起こる場所を制御することができ、この切断をベクターの必須ではない領域に割り当てることで機能的なベクター配列の喪失を防ぐことができる。さらに、線状ＤＮＡ分子には、ランダムな頭−尾コンカテマーとして宿主細胞のゲノムＤＮＡへ組み込まれる傾向がある（注目すべき点は、環状ＤＮＡも頭−尾コンカテマーとして組み込まれる傾向があるが、上述したように、環状ＤＮＡは組み込む前に切断しなければならないことである）。これにより、選択遺伝子、増幅遺伝子および対象の遺伝子を含む一個の大きなベクターを構築する必要がなくなる。代わりに、複数の小さなベクターを同時トランスフェクトさせることが可能であり、その結果ベクターが必須領域で切断される可能性が本質的になくなる。
【０１９０】
　所望のタンパク質を大量に発現する安定な細胞系を作製するには、以下のベクターを線状ＤＮＡとして導入する：１）pMSD5-HPRT等の選択ベクター；２）pSSD7-DHFR等の増幅ベクター；および３）対象の遺伝子をコードする１種以上のベクター。これにより、コンカテマーにおける増幅マーカー遺伝子に対する対象の発現遺伝子のコピーの比率もさらに高くなる。選択ベクター、増幅ベクターおよび対象のタンパク質をコードするベクターの比率は、１:２:20〜50である。一つの細胞で複数のタンパク質を発現するのが望ましい場合には、対象のタンパク質を別々にコードする複数のベクターを使用する。これは、対象のタンパク質が多鎖タンパク質(multi-chain protein)の場合である。例えば、免疫グロブリンは、２つの重鎖と２つの軽鎖が会合して形成され、重鎖と軽鎖は別々の遺伝子でコードされている。機能的な免疫グロブリンの発現には、トランスフェクトされた細胞が重鎖および軽鎖の遺伝子の両方を発現することが必要である。所定の細胞系をトランスフェクトするのに、最大６個までの非選択／増幅プラスミド（即ち、対象の遺伝子をコードしている）を用いることが可能である。
【０１９１】
　大量の発現ベクターを増幅および選択ベクターと共に細胞へ導入する。典型的には、選択ベクター（例えば、pMSD5-HPRT）10〜15μg、増幅ベクター（例えば、pSSD7-DHFR）20〜30μgおよび発現ベクター合計400〜500μg。例えば、２つの発現ベクターを用いる場合、選択ベクターおよび増幅ベクターの他に、２つの発現ベクター（即ち、対象の遺伝子をコードするプラスミド）の各々を200〜250μg使用する。本明細書中で使用する条件下においてエレクトロポレーションが可能なＤＮＡの最大量は、約500〜750μgのＤＮＡである（即ち、全ベクターＤＮＡの合計量または総量）。選択ベクターおよび増幅ベクターの他に６個の別々の発現ベクターを細胞へ導入する場合、以下の量のＤＮＡを使用する：選択ベクター7.5μg、増幅ベクター15μgおよび６個の発現ベクターの各々約121μg（従って、ＤＮＡの合計量は、１×HBS(EP) 0.5 ml中２×107細胞/mlを用いるエレクトロポレーション当たり約750μgである）。
【０１９２】
　対象の遺伝子と増幅マーカーとを含むベクターを用いる場合には、この種のベクターを５〜30μg用いる。発現ベクターの他に増幅マーカーと選択マーカーの両方を含むベクター（即ち、増幅／選択ベクター）を用いる場合には、以下の量のＤＮＡを使用する：増幅／選択ベクター５〜30μgおよび発現ベクター合計400〜500μg。１つ以上の対象の遺伝子、増幅マーカーおよび選択マーカーを含むベクターを用いる場合には、この種のベクターを５〜30μg用いる。
【０１９３】
　細胞へ同時トランスフェクトさせるベクターを、同一の反応管内にて適当な制限酵素（即ち、プラスミドバックボーン内のみを切断する酵素）を用いて線状にする。適当な制限酵素による消化の後、エタノールを用いてＤＮＡを沈澱させ、0.5 mlの１×HBS(EP)(20 mM HEPES, pH 7.0; 0.75 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7.0; 137 mM NaCl; 5 mM KClおよび１gm/リットル デキストロース)に再懸濁する。
【０１９４】
　線状にしたベクターＤＮＡは、好ましくはエレクトロポレーションによって宿主細胞へ導入する。あるいは、線状にしたベクターＤＮＡを当業界で公知の技術を用いてマイクロインジェクションにより宿主細胞へ導入してもよい。エレクトロポレーションの利用は、以下の様々な理由でＤＮＡを細胞へ導入する他の方法よりも好適である：１）トランスフェクションの効率。多くの興味ある細胞系（例えば、事実上任意のリンパ系細胞系）は、他のいずれの方法（例えば、DEAE-デキストラン介在型トランスフェクションまたはリン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈）でも形質転換させにくい。これらの細胞系のエレクトロポレーションでは、適度に必要とされるだけの独立した形質転換体を容易に単離することが可能である。２）エレクトロポレーションはトランスフェクトされたＤＮＡの完全性(integrity)を保存する。他の方法（DEAE-デキストランまたはCaPO4）で導入したＤＮＡは、観察可能な頻度で観察可能な突然変異を獲得することが判明しており、これらの種類のトランスフェクション群から誘導した治療に使用されるタンパク質に対して懸念の声が上がっている[例えば、M. P. Calosら, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3015; KopchickおよびStacey (1984) Mol. Cell. Biol. 4:240; Wakeら, (1984) Mol.Cell. Biol. 4:387およびLebkowskiら, (1984) Mol. Cell. Biol. 4:1951参照]。Lebkowskiら（前掲）には、内因性の突然変異頻度よりも４桁大きい化学的に導入されたＤＮＡの突然変異頻度が報告されている。これとは対照的に、エレクトロポレーションによって細胞に導入されたＤＮＡは、細胞のバックグラウンド突然変異の頻度に等しい突然変異頻度を有することが見出された[DrinkwaterおよびKlinedinst (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3402]。３）複数の連結していないＤＮＡ分子の同時形質転換が、エレクトロポレーションを用いると容易に達成される。本明細書中で示すように、最小限４つの連結していないＤＮＡをエレクトロポレーションによって細胞へ同時トランスフェクトすることができ、選択マーカーを発現する細胞の効率が高いことから他の全ての遺伝子も発現されるであろう。４）エレクトロポレーションは実施が容易である。ＤＮＡのマイクロインジェクションでは、ＤＮＡの化学的導入を用いた場合に観察される突然変異頻度の増加は回避されるものの、体細胞のマイクロインジェクションは技術的に難しく、高価な設備の利用が必要である。これとは対照的に、エレクトロポレーションはあまり高価ではない設備を用いて行うことができ、該設備は自分達で組み立てるか、または市販品を購入してもよい。
【０１９５】
　リンパ系細胞系は、CaPO4-介在型共沈でのトランスフェクトが非常に難しかったが、やっと達成された[RiceおよびBaltimore (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7862並びにOiら, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:825]。これとは対照的に、エレクトロポレーションでは、数多くのリンパ系細胞系のトランスフェクションが許容可能な高形質転換頻度にて達成されている[Potterら, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:7161; Boggsら, (1986) Exp. Hematol. 14:988; Toneguzzoら, (1986) Mol. Cell. Biol. 6:703並びにToneguzzoおよびKeating (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3496]。Oiら(前掲)には、CaPO4-介在型共沈と107細胞当たり１個のgpt-発現プラスミドを用いた場合のBW5147細胞の形質転換効率が報告されている。Toneguzzoら(前掲)には、エレクトロポレーションと104細胞当たり3.6個のgpt-発現プラスミドを用いた場合のBW5147細胞の形質転換効率が報告されている（CaPO4-介在型共沈を用いて得られた効率よりも3000倍以上も高い効率）。
【０１９６】
　宿主細胞（典型的にはBW5147.G.1.4細胞）を氷冷した１×HBS(EP)で２回洗浄し、２×107細胞/mlで0.5 mlの１×HBS(EP)へ再懸濁する。次いで細胞を、線状にしたＤＮＡを含む１mlキュベット(#67.746, Sarstedt, Inc., Princeton, NJ)へ入れる。キュベットを氷上に置く。ISCOモデル493電力供給機(ISCO)を用い、エレクトロポレーションを225ボルトにて行う。エレクトロポレーション装置は、Chu, Gら, Nucl. Acids Res. 15:1311 (1987)に記載されている通りに組み立てる。エレクトロポレーション装置を、2Xセッティング（即ち、コンデンサーを両方とも使用する）にて一定の電圧(225Ｖ)に設定する。あるいは、市販のエレクトロポレーション装置を使用することも可能である[例えば、960μFDに設定したCapacitance Extenderを備えたGene PulserTM (BioRad, Hercules, CA)]。エレクトロポレーション後、氷上で５〜15分間、典型的には10分間インキュベートし、細胞を回復させる。
【０１９７】
VII．選択および同時増幅
　次いで、エレクトロポレーションを行った細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS; HyClone）および50μg/mlのゲンタマイシン(Sigma)を補足した30 mlのRPMI 1640培地（Irvine Scientific）を含有するT75フラスコ(Falcon)へ移す。次いで細胞を、５％ CO2を含む加湿雰囲気にて37℃で36〜48時間インキュベートする。次いで細胞を、ウェル当たり１×104〜１×105細胞となるように選択培地の入った48ウェルプレート(Costar)へ移す。選択培地の使用により、トランスフェクトされたＤＮＡを取り込んだ細胞の同定が容易になる。選択培地中で増殖させる際には、付着依存的にまたは付着非依存的に増殖する細胞をマルチウェルプレート内でプレートする。
【０１９８】
　優性選択マーカーおよび所定の酵素を欠く細胞系の使用を必要とするマーカーの両方を
含む様々な選択マーカーの使用が可能である。例えば、酵素HPRTを欠く細胞系を、hprt遺伝子を発現するベクターと組み合わせて用いることができる。次いでトランスフェクトした細胞を、ヒポキサンチンおよびアザセリンの存在下(HxAz培地)にて増殖させる。酵素欠損細胞系の使用を必要としない優性選択マーカーの例としては、neo遺伝子、hyg遺伝子およびgpt遺伝子が挙げられる。
【０１９９】
　pMSD5-HPRTを選択マーカーとして使用する場合には、選択培地は10％ FCS、100μMヒポキサンチン(Hx)(Sigma)および２μg/mlアザセリン(Az)(Sigma)を含有するRPMI 1640培地を含む。約11日後には、陽性ウェル（即ち、選択培地中で増殖可能な細胞を含むウェル）を目視で確認できるようになり、コロニーを24ウェルプレートへ移す。選択培地の添加後約11日〜約３週間目の48ウェルプレートから陽性コロニーを採取する。
【０２００】
　48ウェルプレートから取り出した陽性コロニーを、10％透析済みFCS(HyClone)と100μM Hxを含有するRPMI 1640培地を含む24ウェルプレート(Costar)へ入れる。この時点で透析済み血清を使用することにより、トランスフェクタントにおけるインプットＤＮＡの同時増幅の速度と頻度が増加する。アザセリンが毒性を示さない濃度に希釈されるまで、ヒポキサンチンは培養培地中に維持したまま数回継代する。
【０２０１】
　次いで選択培地中で生き延びて増殖したトランスフェクト細胞が対象の遺伝子を発現するかどうかを確認する。これは、細胞表面染色、活性測定用のバイオアッセイ、ELISAまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動に続く免疫沈降といった任意の適切なアッセイにて行うことが可能である。例えば、対象の遺伝子が細胞表面分子をコードするのであれば、ベクターでコードされた細胞表面分子に対して特異的な抗体を用いる染色によってトランスフェクト細胞を分析する。トランスフェクト細胞の表面上に抗体が存在するかどうかは、蛍光顕微鏡法で検出する（特異抗体を直接蛍光色素へコンジュゲートさせるか、または蛍光標識(fluorescienated)二次抗体を使用する）。次いで最も発現が良好なクローンを確認し、そのMTXに対する感受性レベルを測定する。典型的には６〜18、好ましくは12のクローンを調べる。
【０２０２】
　親（即ち、トランスフェクトしていない）BW5147.G.1.4細胞は、10 nM MTXの存在下ではほとんど増殖しない。プレーティング後３〜５日目の目視での検分より、20 nM MTXを含有する培地２mlを入れた24ウェルプレートへ１×104細胞を入れた場合には、親BW5147.G.1.4細胞の約98％よりも多くが死滅する（このMTXのレベルは、親BW5147.G.1.4細胞系に対する増殖カットオフと呼ばれる）。30 nM MTXでは、BW5147.G.1.4細胞のコロニーは10-7未満の頻度で見られる。
【０２０３】
　トランスフェクトして選択した細胞（「選択物(selectant)」）を10〜100 nMのMTX濃度範囲でプレートする。該細胞は、24ウェルプレート(Costar)のウェル当たり１〜５×104の密度でプレートする。該選択物は、約98％よりも多くの親細胞が死滅するMTXレベルを測定するのに使用したのと同一の密度でプレートする。この操作を行う理由は、MTXがDHFRに不可逆的に結合するため、所定の容量中に存在する細胞数が細胞を死滅させるのに必要なMTXの濃度に影響を与えるためである。即ち、細胞密度が高いほど、細胞の約98％を死滅させるのに高濃度のMTXが必要となるのである。（例えば、親細胞をウェル当たり１×104細胞／２ml培地の密度で24ウェルプレート中にてプレートする場合、３〜５日のアッセイでは、98％よりも多くの細胞を死滅させるのに20 nMのMTXで充分である。密度を２倍（１×104細胞/ml培地）に増やすと、98％よりも多く死滅させるのに25 nMのMTXが必要である。ウェル当たり２mlの培地を入れた24ウェルプレートに５×104細胞を入れる場合には、98％よりも多く死滅させるのに30 nMのMTXが必要である。）
【０２０４】
　選択物のクローンは、典型的には30〜60 nM MTXの増殖カットオフを示す（即ち、30〜60 nM MTXを含む培地へ入れ、このレベルのMTXを含む培地中でプレートした３〜５日後に
プレートを目視で検分した場合に、約98％よりも多くの選択物が死滅する）。親BW5147.G.1.4よりも高いMTX耐性（例えば、親よりも20〜30 nM MTX高い耐性）を示す対象の各選択物由来の細胞を、48ウェルプレート(Costar)のウェル当たり104細胞にて10％透析済みFCSおよびMTXを含むPRMI 1640（以下、「培地-MTX」という）0.5 ml中にプレートする。各クローンのMTX耐性の上限よりも20 nM、40 nMおよび60 nM高い数種類のMTX濃度を用いる（即ち、MTX耐性の上限が30 nMの場合には、以下の濃度を使用すればよい：50 nM、70 nMおよび90 nM）。MTXのこれらのレベルは、典型的には約98％よりも多くの親細胞を死滅させるのに必要なMTXレベルの４〜６倍である。90 nMよりも高濃度のMTXを含む培地中で増殖可能な選択物はいずれも廃棄する。このような高レベルのMTX中で増殖可能な選択物は、発現ベクターを犠牲にして優先的に増幅ベクターを増幅する傾向があることが観察されている。
【０２０５】
　７〜10日後に、ウェルに0.5 mlの培地-MTXを加える。第一次増幅物(amplificant)を、培地-MTX中でのプレーティング後２〜６週間（典型的には３〜５週間）の間に採取する。次いで、適切なアッセイ（即ち、細胞表面発現に対する抗体を用いる染色、ELISA、活性測定用のバイオアッセイ、免疫沈降およびPAGE等）を用い、対象の遺伝子の発現についてクローンを再度分析する。
【０２０６】
　典型的には、HPRT+クローンを50〜80 nMのMTX濃度でプレートする（これは、第一次増幅に相当する）。クローンを２〜３週間増殖させ、次いでMTXのレベルを200 nM〜480 nMに増加させる（４倍に増加；これは、第二次増幅に相当する）。さらに２〜４週間後に、MTXのレベルを１〜２μM MTXに増加させる（さらに４〜６倍に増加；これは、第三次増幅に相当する）。対象の遺伝子の発現が増加せずにMTXに対する耐性が増加したクローンはいずれも廃棄する。典型的には、対象の遺伝子の発現と耐性との不一致はいずれも第二次増幅において見られ、このようなクローンは不安定であることが判明しており、望ましくない。
【０２０７】
　本発明の方法は、BW5147細胞においてトランスフェクトしたＤＮＡ配列の同時増幅を初めて可能にしたものである。さらに、本発明の方法は、細胞系においてＤＮＡ配列を同時増幅させるための改良方法を提供する。対象の遺伝子を発現する選択物のうち、全部ではないとしてもその大部分（即ち、80％よりも多く）が、第一次増幅において増幅マーカー（例えば、MTXに対する耐性を付与するdhfr遺伝子）と対象の遺伝子とを同時増幅するであろう。第一次増幅物の60％よりも多くが、第二次増幅においてdhfr遺伝子配列の他に対象の遺伝子を同時増幅するであろう。本発明の方法を使用すると、現在までのところ、最大発現レベルに到達するまで後続の増幅次数の全てにおいて同等に増幅し続けることのできない対象の遺伝子を、第二次増幅において増幅するクローンは得られていない。従って、本発明の方法では、単一のクローンを試験した場合に、Wallsら(1989) Gene 81:139またはKaufmanら(1985) Mol. Cell. Biol. 5:1750に報告されているような他の同時増幅法について報告されているよりも、遺伝子配列の同等な同時増幅の頻度がさらに高くなる。また、本発明の方法は、遺伝子配列の非常に高頻度の同等な同時増幅を達成する手段を提供するだけでなく、現在の方法よりも著しく短時間で所望の増幅物を産生する方法も提供する。本発明の方法は、１回増幅させた一次形質転換体のプールの中から対象のタンパク質を高レベルで発現するわずかのクローンを見つけ出すのに該プールを検索するという時間のかかる工程を回避するものである。
【０２０８】
　上述の増幅プロトコールに対する以下の改変は、第一次増幅に必要な時間を２〜３週間短縮することが判明した。第一に、100μM Hx、２μg/ml Azおよび10％透析済みFCSを含有するPRMI 1640培地中で増幅させることにより、元となるトランスフェクタントを選択する。第二に、エレクトロポレーション後約10日目に、元となるトランスフェクタントに10％透析済みFCS、100μM Hxおよび10 nM MTXを含有するRPMI 1640培地を48ウェルプレー
トのウェル当たり0.5 ml加え、48ウェルプレートの各ウェルにて最終濃度を５nM MTXとする。透析済みFCSおよび５nM MTXを含む培地中でトランスフェクト細胞を増殖させることの最終的な効果は、増幅させた細胞に選択有利性(selective advantage)を付与することである。
【０２０９】
VIII．前もって選択を行わない同時増幅
　本発明の増幅細胞系は、発現ベクターの他に増幅ベクターのみを用いて作製することが可能である（即ち、選択ベクターの使用を必要としない）。増幅ベクターでコードされている酵素に対応する機能的な遺伝子産物を欠いておらず、かつ増幅マーカーの他に選択マーカーを用いなくても充分に使用可能な細胞系とは、内因性遺伝子（例えば、DHFRを増幅マーカーとして用いる場合には、内因性dhfr遺伝子）の増幅バックグラウンドレベルが、インプット増幅遺伝子（即ち、増幅ベクター）の増幅が優先的に起こるくらい充分に低い細胞系のことである。
【０２１０】
　選択工程を使用しないのが望ましい場合には、上述のプロトコールを以下のように改変する。増幅ベクターと発現ベクターを線状にし、親細胞系に１:10〜15（増幅ベクター：発現ベクター）の比率でエレクトロポレーションさせる。再び、好ましくはエレクトロポレーションによって大量のＤＮＡを該細胞へ導入する。典型的には、増幅ベクターを20μg使用し、２つの発現ベクターを各々200〜250μg（または一つの発現ベクターを400〜500μg）使用する。対象の遺伝子と増幅マーカーの両方を含むベクターを用いる場合には、この種のベクターを５〜30μg、より好ましくは５〜10μg使用する。
【０２１１】
　エレクトロポレーション後、トランスフェクトした細胞を上述したように36〜48時間回復させる。次いで、形質転換細胞を、親細胞の増殖を防ぐのに必要な濃度の４倍〜６倍の濃度の阻害剤を含有する培地を入れた48ウェルプレートへウェル当たり１×106細胞以下の密度で移す。BW5147.G.1.4細胞系を使用する場合には、親BW5147.G.1.4細胞の増殖を防ぐのに必要な阻害剤レベルの４〜６倍のレベルを有する培地中で増殖可能な第一次増幅物の単離を可能にするインプット増幅遺伝子の充分なコピーを含む一次形質転換体が産生される予測頻度は、およそ108細胞に１回〜1010細胞に１回である。従って、複数の第一次増幅物の単離を可能にするためには、少なくとも５×108〜１×1011細胞を阻害剤レベルを上げた培地中でプレートしなければならない。親細胞の増殖を防ぐのに必要な阻害剤レベルの４〜６倍のレベルで増殖可能な細胞を、対象のタンパク質を発現する能力について試験する。対象のタンパク質を高レベルに発現するこれらのクローンを、上述したように後続の増幅次数でさらに増幅させる。いずれの増幅工程においても対象のタンパク質の発現レベルと阻害剤に対する耐性レベルが同等に増加しないクローンは、いずれも廃棄する。
【０２１２】
　選択ベクターを用いる必要がなく増幅細胞系を作製できるため、所望の増幅細胞系を作製するのに必要な時間が短縮される。しかしながら、特に、増幅ベクター上に存在する増幅遺伝子に対応する内因性遺伝子座の増幅のバックグラウンド頻度が高い細胞系を取り扱う場合には、選択ベクターと初期選択工程を用いるのが有利である。内因性遺伝子の増幅のバックグラウンドレベルが高くない細胞系を扱う場合でも、対象の遺伝子を高レベルに発現する一次選択物のみを取り扱うことが可能になるため、選択ベクターと初期選択工程を用いるのが有利である。これにより、対象のタンパク質を非常に高レベルで発現する増幅細胞系を作製するのに要する時間と労力が節減される。
【０２１３】
IX．増幅細胞系におけるインターロイキン10の高レベル発現
　本発明の方法を使用して、大量のインターロイキン10（IL-10）を発現する細胞系を単離した。IL-10は、TH2細胞（タイプ２ヘルパーＴ細胞）、マクロファージ／単球、および若干のＢ細胞によって産生されるサイトカインである。IL-10は、活性化TH1細胞、活性化マクロファージおよびナチュラルキラー細胞によるサイトカインの合成を抑制するように作用する[Mosmann (1993) Ann. Rev. Immunol. 11:165およびMosmann (1994) Advances 
in Immunol. 56:1]。研究によって、IL-10の発現が移植時の移植成果(graft outcome)と明らかに相関することが判明している[Bromberg (1995) Curr. Op. Immunol. 7:639]。従って、IL-10を治療に用いることに関心が持たれている。IL-10を治療に使用するためには、大量のIL-10を産生する能力が当然必要である。
【０２１４】
　現在、マウスIL-10の販売元は２つある。Genzyme Diagnostics (Cambridge, MA)はE.coliにて産生した５mgのIL-10を295.00ドルで販売している(カタログ番号2488-01，〜2500ユニット)。Biosource International (Camarillo，CA)はE.coliにて産生した５mgのIL-10を245.00ドルで販売している(カタログ番号PMC-0104，〜2500ユニット)。本発明の方法を使用して、培養上清１ml当たり約75,000ユニットのIL-10を産生する細胞系を単離した。販売価格の安い方のIL-10を使用すると、これらの細胞から、静置培養物１リットル当たり約7,350,000.00ドルの価値のIL-10が産生される。これらの増幅細胞系から、静置培養物１リットル当たり約150 mgのIL-10タンパク質が得られる。従って、これらの増幅細胞系から得られる未精製培養上清は、現在市販さている製品よりも遥かに純度の高いIL-10源を提供する。
【０２１５】
X．増幅細胞系におけるヒトクラスII MHC抗原およびＴ細胞受容体タンパク質の高レベル発現
　ヒトクラスII MHC抗原であるHLA-DR、およびそれらの対応するマウス類似体であるIa抗原は、Ｔリンパ球による非自己分子（即ち、抗原）の認識を仲介する細胞表面膜糖タンパク質である。クラスII分子は、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球および活性化Ｔリンパ球等の抗原提示細胞の表面上に外来抗原の断片を提示する。MHC拘束性抗原特異的Ｔリンパ球が抗原に結合したクラスII分子を有する抗原提示細胞と相互作用する場合に、免疫応答が起こる。
【０２１６】
　クラスII抗原は２本の鎖、即ちα鎖とβ鎖からなる。クラスII分子が細胞の表面へ輸送されるためには、両方の鎖とも同一の細胞で発現されなければならない。β鎖は非常に多型で、この多型性は免疫応答性において遺伝的差違をもたらすものである。特定のクラスII MHC分子（例えば、マウスIA、ヒトDQおよびDP）では、α鎖も非常に多型である。クラスII分子が免疫応答において果たす主要な役割（例えば、移植組織の拒絶や自己免疫疾患に対する遺伝的感受性(heritable susceptibility)）が判明したことより、クラスII分子と外来抗原との相互作用およびクラスII分子とＴリンパ球との相互作用の研究が始まった。これらのクラスII分子と抗原との物理化学的な相互作用の研究には、精製された可溶性クラスII分子が大量に入手できることが要求される。さらに、自己免疫疾患の治療に対して、特異的なペプチドと複合体化したクラスII分子を用いることが示唆されている[Sharm
aら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11465]。
【０２１７】
　このような試薬を提供するために、本発明の選択増幅方法を用いて増幅細胞系の表面上にキメラのヒトDR分子を高レベルで発現させた。キメラDR分子上に存在するホスファチジルイノシトール結合またはトロンビン部位のいずれかを切断することができる酵素で処理することにより、DR分子を細胞表面から切り離して可溶性DR分子とする。
【０２１８】
　同様のアプローチで、可溶性Ｔ細胞受容体(TCR)分子または免疫グロブリン(Ig)分子を大量に産生させることが可能である。同様に、クラスII分子、TCRおよびIg分子はヘテロ
ダイマーからなる。（即ち、２本の異なる鎖が会合して、細胞表面上に提示されるTCRまたはIg分子を形成する。注目すべきことは、Ig分子の細胞表面での形態と可溶性の形態はいずれも天然に存在し、患者を免疫すると可溶性Igが産生されることである。）本発明の方法は、大量の可溶性形態のクラスII MHC分子とTCRを迅速に産生させることが可能となる。これにより、リンパ腫および白血病患者を治療するための可溶性TCRを含む特注腫瘍細胞ワクチンの製造、並びに自己免疫疾患を治療するための可溶性クラスII MHC分子の製造が可能となる。
【０２１９】
XI．リンパ腫および白血病治療用の特注多価ワクチンの製造
　Ｂ細胞リンパ腫およびＢ細胞白血病のワクチン接種に対する現在のアプローチ（即ち、能動免疫療法）には、Ｂ細胞腫瘍の表面上に最も大量に発現される抗体分子に対応する自己由来の免疫グロブリンイディオタイプを含む特注ワクチンの製造が必要である。Ｔ細胞リンパ腫およびＴ細胞白血病を治療するための類似のアプローチには、Ｔ細胞腫瘍の表面上に最も大量に発現されるTCR分子に対応する自己由来のＴ細胞受容体(TCR)イディオタイプを含む特注ワクチンの製造が必要である。
【０２２０】
　Ｂ細胞では、抗原刺激(Ig)に続いて、再編成された免疫グロブリン(Ig)遺伝子の可変領域に点突然変異が蓄積されることが知られている。このプロセスは、体細胞突然変異または体細胞超突然変異として知られているが、液性免疫応答の親和性成熟を誘導するものである[Tonegawa (1983) Nature 302:575,Teillaudら(1983) Science 222:721, Griffithsら(1984) Nature 312:272およびClarkeら(1985) J. Exp. Med. 161:687]。親和性成熟の際には、免疫応答が進行するにつれて（即ち、一次応答から二次応答へ、そして三次応答へと進むにつれて）、親和性の高い抗体が産生される。免疫応答の際に産生される抗体を比較することにより、一次応答の最終段階以降に突然変異が蓄積することが判る。これらの突然変異は、Ig分子の第二相補性決定領域(CDR2)（即ち、抗原結合部位の超可変領域内）に集中している。体細胞突然変異はＴ細胞では起こらない。
【０２２１】
　体細胞変異体は、特定のＢ細胞腫瘍（例えば、軽度の濾胞性Ｂ細胞リンパ腫）を含む細胞集団中に存在することが知られている。従って、これらの腫瘍はIg遺伝子再編成レベル（V-D-J結合部位におけるヌクレオチド配列を含む）ではクローン性であるが、実際には、その重鎖Ｖ領域のヌクレオチドまたはアミノ酸配列については準クローン性である[Cleary MLら(1986), Cell 44:97およびLevy Sら(1988) J. Exp. Med. 168:475]。Ｂ細胞腫瘍を起こす形質転換の発生後に、体細胞突然変異が持続すると考えられる。Ｂ細胞リンパ腫の分析より、腫瘍のうち約１〜５％の細胞が体細胞突然変異を含むことが判っている。
【０２２２】
　体細胞変異体がＢ細胞腫瘍中に存在するという事実は、これらの腫瘍の免疫療法に対して密接な関係を有している。例えば、Ｂ細胞リンパ腫を抗イディオタイプ抗体で治療することにより、患者に初期の部分応答が引き起こされることが判っているが、イディオタイプ変異体腫瘍細胞（イディオタイプ陰性）は元の腫瘍部位に現れる[Cleary MLら(1986)前掲； Bahler DWおよびLevy R (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6770; Zelenetz ADら(1992) J. Exp. Med. 176:1137;およびZhu Dら(1994) Brit. J.Haematol. 86:505]。これらのイディオタイプ変異体腫瘍細胞は、モノクローナル抗イディオタイプ抗体で治療する前に既に存在しており、イディオタイプ陽性腫瘍細胞が選択的に除去された後に増殖してくるものと考えられる。これらの臨床試験より、腫瘍細胞上の単一のエピトープを標的とすることの欠点が明らかになった。
【０２２３】
　Ｂ細胞腫瘍の免疫療法を改善するために、自己由来の腫瘍から誘導したIgまたはIgサブ断片を用いる能動免疫が利用されている。IgまたはIgサブ断片を免疫原として用いることで、Ｔ細胞応答と腫瘍特異的Igに見出される多数の異なるエピトープに対する抗体が誘導されるものと期待されている。この種の治療では、患者の腫瘍細胞のIg（またはIgのイディオタイプ断片）が発現される。このアプローチは、複数のエピトープが標的になるという利点を有するものの、単一のIg（またはサブ断片）を免疫原として用いており、そのため、優勢な（predominant）Igの体細胞変異体を発現する腫瘍細胞が免れて増殖する可能性があるという事実を依然として欠点としている。現在の方法論によって免疫感作に使用する腫瘍Ig-イディオタイプタンパク質を産生させるには、外科的生検によって摘出したリンパ腫細胞を、内因性のIgを分泌する能力のないヘテロハイブリドーマ細胞系 K6H6/B5と融合させる。腫瘍サンプルの免疫表現型(immunophenotype)に対応するIgを分泌するハ
イブリッド細胞を拡大増殖させ、分泌されたIgを精製してワクチンとして使用する[Kwakら(1992)前掲]。この技術は「レスキューフュージョン(rescue fusion)」と呼ばれる。レスキューフュージョンによって産生されるIgは、患者の腫瘍から誘導される単一Igを表す。このIgはおそらく腫瘍によって発現される優勢なIgである。従って、レスキューフュージョンによって製造されるワクチンは一価であり、体細胞変異体を含む腫瘍によって発現されるIgのコンプレキシティを完全に表すものではない。
【０２２４】
　レスキューフュージョンによって産生されるIg-イディオタイプタンパク質を使用してＢ細胞リンパ腫患者にワクチン接種を行う臨床試験は現在進行中である。これらの試験は、従来の療法（例えば、化学療法）では本質的に治る見込みのないこれらの腫瘍に対して臨床上画期的な改善を示している。この特注ワクチン療法は、従来の化学療法（腫瘍負荷(tumore burden)を軽減するために使用する）を一通り行った後に利用する。臨床上の改善は、従来の化学療法のみで治療した患者と化学療法の後に特注ワクチンを受けた患者とを比較した際に見られる。特注ワクチンで治療し、長期間（約８年）にわたって経過を観察した患者のうち、一人が最近再発した。現時点では確認されていないが、この再発は、ワクチンに使用された腫瘍Ig-イディオタイプタンパク質の体細胞変異体を含む腫瘍細胞の増殖が原因である。
【０２２５】
　レスキューフュージョン技術は、患者の腫瘍中に存在する全てのIg変異体を表す多価ワクチンを提供できないだけでなく、その他にも欠点を有する。この技術には、患者の肥大リンパ節の外科的生検によって得られる多数の腫瘍細胞が必要である。Ｂ細胞リンパ腫患者の中には外科的生検に適した肥大リンパ節を示さない場合もあり、従ってこのような場合には、レスキューフュージョン技術によって産生されるワクチンを使用する治療を行うことができない。さらに、患者のIgを分泌する各々の特注ヘテロハイブリドーマ細胞系を作製するには、２〜８ヶ月（平均４ヶ月）かかり、多大な労力を要する。レスキューフュージョン技術について幅広い経験を有する研究所でも、ワクチンの製造速度は技術者一人当たり年間約25特注ワクチンである。この特注ワクチンの製造速度は、現在のおよび増え続ける患者の要求に充分に見合うものではない。
【０２２６】
　理想的には、特注腫瘍特異的ワクチンを製造する方法は、より少ない数の細胞（即ち、細針生検(fine needle biopsy)で得られる細胞）で行うことができ、患者の腫瘍のコンプレキシティを完全に表す多価ワクチンを製造するものであり、一人の技術者が年に少なくとも100の特注ワクチンを製造できるように速く（平均２〜３ヶ月）かつ現在の方法よりも労力が少なくて済むものである。
【０２２７】
　本明細書中に記載する方法（実施例９および10）は、多価ワクチンを含む特注ワクチンを少数の細胞から迅速かつ効率的に製造する手段を提供するものである。サンプルが少量で済むため、外科的生検に適した肥大リンパ節を持たない患者に対する特注ワクチンの製造が可能となる。特注ワクチンで治療できる患者の範囲が広がるだけでなく、細針生検材料を使えるため、リンパ腫患者全員を手術する必要がなくなる（少なくとも、特注ワクチン製造用の細胞を収集することに関しては）。
【実施例１】
【０２２８】
実施例
　以下の実施例は、本発明の特定の好ましい具体例および態様の説明に役立つものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０２２９】
　以下の実施例の開示において、以下の略語が適用される。M（モル濃度）；mM（ミリモル濃度）；μM（マイクロモル濃度）；nM（ナノモル濃度）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；gm（グラム）；mg（ミリグラム）；
μg（マイクログラム）；pg（ピコグラム）；L（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；℃（摂氏の度）；AMP（アデノシン５′-一リン酸）；ｃＤＮＡ（コピーまたは相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；PBS（リン酸緩衝化食塩水）；ｇ（重力）；OD（光学濃度）；HEPES（N-［2-ヒドロキシエチル］ピペラジン-N-［2-エタンスルホン酸］）；HBS（HEPES緩衝化食塩水）；SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）；Tris-HCl（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン-ハイドロクロライド）；Klenow（ＤＮＡポリメラーゼＩラージ(Klenow)フラグメント）；rpm（分当たりの回転数）；EGTA（エチレングリコール-ビス（β-アミノエチルエーテル）N,N,N',N'-四酢酸）；EDTA（エチレンジアミン四酢酸）；bla（β-ラクタマーゼまたはアンピシリン耐性遺伝子）；ORI（プラスミドの複製起点）；lacI（lacリプレッサー）；Amicon（Amicon Corp., Beverly, MA）；ATCC（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Rockville, MD）；Becton Dickinson （Becton Dickinson Immunocytometry Division, San Jose CA）；Costar (Costar, Cambridge, MA)；Falcon（Becton Dickinson Labwareの一部門, Lincoln Park, NJ）；FMC（FMC Bioproducts, Rockland, ME）；Gibco/BRL（Gibco/BRL, Grand Island, NY）；HyClone (HyClone, Logan, UT）；Sigma （Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）；NEB (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）；Operon (Operon Technologies, Alameda, CA）；Perkin-Elmer（Perkin-Elmer, Norwalk, CT）；Pharmacia（Pharmacia Biotech, Pisacataway, NJ）；Promega（Promega Corp., Madison, WI）；Sarstedt（Sarstedt, Newton, NC）；Stratagene（Stratagene, LaJolla, CA）；U.S. Biochemicals（United States Biochemical, Cleveland, OH）；およびVector（Vector Laboratories, Burlingame, CA）。
【０２３０】
実施例１
発現ベクターの構築
　本発明の発現ベクターを構築するために、まず最初に幾つかの中間ベクターを構築した。
pSSD5およびpSSD7の構築
　pSSD5およびpSSD7は、SV40由来の以下のエレメントを含む：エンハンサー／プロモーター領域、16Sスプライス供与部位および受容部位、並びにポリＡ部位。SV40エンハンサー／プロモーター配列はSV40複製起点を含むので、SV40エンハンサー／プロモーター配列を含むベクターはSV40ラージＴ抗原を発現する細胞系において染色体外で複製をする。
【０２３１】
　幾つかの制限酵素に対する認識配列を含むポリリンカーは、スプライス受容部位とポリＡ配列との間に位置する。このポリリンカーは、対象遺伝子の容易な挿入を可能にする。対象遺伝子は、SV40エンハンサー／プロモーターの転写調節下にある。pSSD5およびpSSD7は、ポリリンカーの配列（以下に示す配列）だけが異なる。pSSD5のポリリンカーは以下の制限部位を含む：XbaI、NotI、SfiI、SacIIおよびEcoRI。pSSD7のポリリンカーは以下の制限部位を含む：XbaI、EcoRI、MluI、StuI、SacII、SfiI、NotI、BssHIIおよびSphI。
【０２３２】
　pSSD5は、プラスミドpL1[OkayamaおよびBerg, Mol. Cell. Biol., 3:280 (1983)]をPstIおよびHindIIIで消化することにより構築した。全ての制限酵素はNew England Biolabsから入手したものであり、製造業者の説明書に従って使用した。プラスミドpcDV1［OkayamaおよびBerg, 前掲］をHindIIIおよびBamHIで消化した。双方の消化物を0.8％低融点アガロースゲル（SeaPlaque, FMC）で電気泳動した。SV40エンハンサー／プロモーターと16Sスプライス部位とを含むpL1消化物からの535bpのＤＮＡ断片をゲルから切出した。SV40ポリアデニル化シグナルとpBR322バックボーンとを含むpcDV1消化物からの2.57kbのＤＮＡ断片をゲルから切出した。これら２つのゲルのスライスをミクロ遠心管内で混合し、アガロースをβ-Agarase I（NEB）で消化することにより除去した後、製造業者の説明書に従ってイソプロパノール沈殿を行った。ＤＮＡペレットを乾燥し、20μlのＴＥに再懸濁
した。
【０２３３】
　２つの合成オリゴヌクレオチド(Operon)であるＳＤ５Ａ［5'-TCTAGAGCGG CCGCGGAGGCCGAATTCG-3'（配列番号１）］およびＳＤ５Ｂ［5'-GATCCGAA TTCGGCCTCCGCGGCCGCTCTAGATGCA-3'（配列番号２）］を等モル量で上記の再懸濁したＤＮＡ断片に添加した。連結反応用緩衝液（10×濃縮物、NEB）を１×濃度になるまで添加し、80ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、連結反応物を14℃で一夜放置した。この連結反応混合物を用いてコンピテントな大腸菌(E. coli)細胞を形質転換し、pL1およびpcDV1由来のＤＮＡ断片並びにこれらの断片を連結している新規なポリリンカーからなるプラスミドを単離した。こうして得られたプラスミドをpSSDと命名した。
【０２３４】
　SV40ポリＡ配列を含む670bp程度のBamHI／PstI断片（SV40マップユニット2533〜3204；配列番号３）をSV40 ＤＮＡから取り出し、BamHIおよびPstIで消化したpUC19にクローニングした。次に、得られたプラスミドをBclIで消化した（SV40マップユニット2770に相当する）。末端をKlenow酵素(NEB)およびdNTPで処理して平滑末端を作製した。この平滑末端に非リン酸化PvuIIリンカー（NEB）を連結しプラスミドを環化してpUCSSDを作製した。SV40ポリＡ配列は、pUCSSDからBamHI／PvuII断片として取り出すことができる。
【０２３５】
　pSSD5は、以下の３つの断片を共に連結することにより構築した：（１）pUC19由来の1873bpのSspI／PvuII断片（これは、プラスミドバックボーンを付与する）；（２）pSSD由来のSV40エンハンサー／プロモーターと16S スプライス部位とポリリンカーとを含む562bpの断片（この断片は、pSSDをSspIで消化し、BamHIで部分消化した後で、上記のように低融点アガロースで単離し回収することにより得た）；および（３）pUCSSD由来の245bpのBamHI／PvuII断片（この断片は、SV40ポリＡ配列を含む）。これら３つの断片を一緒に混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(NEB)を用いて連結して、pSSD5を作製した。pSSD5のマップを図1に示す。
【０２３６】
　pSSD7を作製するために、pSSD5をXbaIおよびEcoRIで消化した。合成オリゴヌクレオチド対であるＳＤ７ＡおよびＳＤ７Ｂ（Operon）を切断したpSSD5に連結することにより、ＳＤ７ポリリンカーを得た。ＳＤ７Ａの配列は5'-CTAGAATT CACGCGTAGGCCTCCGCGGCCGCGCGCATGC-3'（配列番号４）である。ＳＤ７Ｂの配列は5'-AATTGCATGCGCGCGGCCGCGGAGGCCTACGCGTGAATT-3'（配列番号５）である。pSSD7のマップを図２に示す。
【０２３７】
pSRαSD5およびpSRαSD7の構築
　pSRαSD5およびpSRαSD7は、ＳＲαエンハンサー／プロモーターを含み、その後にSV40の16Sスプライス部位並びにＳＤ５Ａ／ＳＤ５ＢまたはＳＤ７Ａ／ＳＤ７Ｂのオリゴヌクレオチド対により形成されるポリリンカーが存在している。このポリリンカーの後ろにSV40ポリＡ配列が存在している。対象の遺伝子はこのポリリンカーに挿入することができ、挿入した遺伝子の発現はヒトＳＲαエンハンサー／プロモーターの調節下にある。ＳＲαエンハンサー／プロモーターは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１の５′側非翻訳配列およびSV40エンハンサーを含んでなるハイブリッド型のエンハンサー／プロモーターである［Takebeら, Mol. Cell. Biol., 8:466 (1988)］。ＳＲαエンハンサー／プロモーターは、宿主細胞内でSV40エンハンサー／プロモーターからの発現を10倍増大させることが報告されている。このエンハンサー／プロモーターは広範囲の細胞型において活性である。ＳＲαエンハンサー／プロモーターを含有するベクターは、SV40複製起点がＳＲαエンハンサー／プロモーター配列内に存在しているので、SV40ラージＴ抗原を発現する細胞内で複製する。
【０２３８】
　ＳＲαエンハンサー／プロモーターはpcDL−SR(296からHindIIIおよびXhoIで消化することにより取り出した。約640bpのHindIII／XhoI断片（配列番号６）を上記のように低融点アガロースゲルから回収した。この約640bpの断片を、HindIIIおよびXhoIで消化したp
SSD5またはpSSD7（これにより、SV40エンハンサー／プロモーターがpSSD5またはpSSD7から除去される）に挿入した。pSRαSD5のマップを図３に示す。pSRαSD7のマップを図４に示す。
【０２３９】
pMSD5およびpMSD7の構築
　pMSD5およびpMSD7は、モロニーマウス白血病ウイルス由来の長い末端反復配列(LTR)を含み、その後にSV40の16Sスプライス部位並びにオリゴヌクレオチド対ＳＤ５Ａ／ＳＤ５ＢまたはＳＤ７Ａ／ＳＤ７Ｂにより形成されるポリリンカーが存在する。このポリリンカーの後には、SV40ポリＡ配列が存在する。遺伝子はこのポリリンカーに挿入することができ、挿入された遺伝子の発現はモロニーLTRの調節下にある。
【０２４０】
　モロニーLTRは、モロニーマウス白血病ウイルスＤＮＡを含有するプラスミド［Shinnickら, Nature 293:543 (1981)］から、該プラスミドをClaIで消化することにより取り出した（モロニー・マップユニット7674に相当する）。末端はKlenowおよびdNTPと共にインキュベートすることにより平滑にした。この平滑末端に非リン酸化HindIIIリンカー（NEB）を連結した。この処理により、ClaI部位が破壊されてHindIII部位で置き換えられた。次に、このプラスミドをSmaIで消化し（モロニー・マップユニット8292に相当する）、その末端に非リン酸化XhoIリンカーを連結させた。こうして得られたプラスミドは、モロニー・マップユニット8292においてSmaI部位の代わりにXhoI部位を、そしてモロニー・マップユニット7674においてClaI部位の代わりにHindIII部位を含んでいる。次に、このプラスミドをXhoIおよびHindIIIで消化した。こうして得られたモロニーLTRを含むXhoI／HindIII断片（配列番号７）を、XhoIおよびHindIIIで消化したpSSD5（これにより、SV40エンハンサー／プロモーターおよび16Sスプライス部位がpSSD5から取り除かれる）に挿入して、pMSD5を得た。pMSD5のマップを図５に示す。
【０２４１】
　pMSD7を作製するために、XhoI／HindIII断片上のモロニーLTRを、XhoIおよびHindIIIで消化したpSSD7に挿入した。pMSD7のマップを図６に示す。
【０２４２】
ヒト延長因子１αエンハンサー／プロモーターを含むベクターの構築
　ヒト延長因子１αエンハンサー／プロモーターは、非常に広範囲の細胞型において豊富に転写される。この活性なエンハンサー／プロモーターの２種のバージョンを含むベクターを構築した。これらのバージョンとは、（１）開始コドンの上流に位置しかつ第１のイントロンを介して連続してスプライス部位を付与する約1.45kbの配列を含む長いバージョン；および（２）開始コドンの上流にある475bpの配列を含む短いバージョンである。短いバージョンのプロモーターを「Ａ」バージョンと呼び、長いバージョンを「Ｂ」バージョンと呼ぶ。
【０２４３】
Ａ．pHEF1αASD5およびpHEF1αASD7の構築
　pHEF1αASD5およびpHEF1αASD7は、ヒト延長因子１αエンハンサー／プロモーターの短いバージョンを含む［Uetsukiら, J. Biol. Chem. 264:5791 (1989)、並びにMizushimaおよびNagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322 (1990)］。ヒト延長因子１αエンハンサー／プロモーターは、L929、HeLa、CHU-2およびCOS細胞を含む非常に広範囲な細胞型において豊富に転写される。
【０２４４】
　ヒト延長因子１αエンハンサー／プロモーター（ヒト延長因子１α遺伝子のヌクレオチド125〜600；配列番号８）は、ヒトゲノムＤＮＡから以下のようにして単離した。つまり、ゲノムＤＮＡをMOU細胞系（GM 08605、NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, NJ）から標準的な技法［Sambrookら, 前掲, 9.16〜9.23頁］を用いて単離した。このMOU細胞系は、エプスタイン−バーウイルスで形質転換したヒトＢ細胞系である。
【０２４５】
　２つの合成オリゴヌクレオチドプライマー（Operon）を用いて、ヒト延長因子１αエンハンサー／プロモーターを含む約475bpの断片（配列番号８）を単離するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を開始(prime)した。米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号
および同第4,965,188号はＰＣＲの方法論について記載しており、これらを参考として本明細書に組み入れるものとする。
【０２４６】
　５′プライマー（HEF1αL5と命名）は、配列：5'-AAGCTTTGGAGCTAA GCCAGCAAT-3'（配列番号９）を含む。３′プライマー（HEF1αL3Aと命名）は、配列：5'-CTCGAGGCGGCAAACCCGTTGCG-3'（配列番号10）を含む。ＰＣＲの条件はSaikiら, Science 239:487 (1988)に報告されているとおりにした。簡単に説明すると、10μgのMOUゲノムＤＮＡおよび最終濃度１μMの各プライマーを400μlのＰＣＲ反応で用いた。反応条件は、94℃で１分、60℃で１分、72℃で1.5分を30サイクルとした。Taq ＤＮＡポリメラーゼはPerkin-Elmerから入手した。上記のプライマー対により、５′末端にHindIII部位および３′末端にXhoI部位を有する475bpの断片が得られる。ＰＣＲ反応の産物を低融点アガロースゲルで電気泳動し、上記のようにして475bpの断片を回収した。回収した断片をHindIIIおよびXhoIで消化し、HindIIIおよびXhoIで消化したpSSD5またはpSSD7に挿入して、それぞれpHEF1αASD5およびpHEF1αASD7を得た。pHEF1αASD5およびpHEF1αASD7のマップをそれぞれ図７および８に示す。
【０２４７】
Ｂ．pHEF1αBSD5およびpHEF1αBSD7の構築
　pHEF1αBSD5およびpHEF1αBSD7は、pHEF1αASD5およびpHEF1αASD7について上記したようにして構築した。但し、HEF1αL3Aプライマーの代わりにHEF1αL3BプライマーをHEF1αL5プライマーと共に用いて、ヒト延長因子１αエンハンサー／プロモーターとヒト延長因子１α遺伝子由来のスプライス供与部位および受容部位とを含む約1.45kbの断片を得た点が異なる。この約1.45kbの断片は、ヒト延長因子１α遺伝子のマップユニット125〜1567（配列番号11）に相当する。HEF1αL3Bの配列は5'-TCTAGAGTTTTCACGACACC TGA-3'（配列番号12）である。HEF1αL3Bプライマーにより、この約1.45kbの断片の３′末端にXbaI部位が生じる。この断片をHindIIIおよびXbaIで消化し、HindIIIおよびXbaIで消化したpSSD5またはpSSD7に挿入して、それぞれpHEF1αBSD5およびpHEF1αBSD7を得た。pSSD5およびpSSD7をHindIIIおよびXbaIで消化することにより、SV40エンハンサー／プロモーターおよびSV40の16Sスプライス部位が取り除かれる。これらのSV40の配列は、ヒト延長因子１αエンハンサー／プロモーターとヒト延長因子１α遺伝子由来のスプライス供与部位および受容部位とに置き換わる。pHEF1αBSD5およびpHEF1αBSD7のマップをそれぞれ図９および10に示す。
【０２４８】
実施例２
選択ベクターpMSD5-HPRTの構築
　pMSD5-HPRTは、モロニーLTRの転写調節下でマウスＨＰＲＴ酵素をコードする全長ｃＤＮＡクローンを含む。モロニーLTRは、広範囲の細胞型において活性な強力なエンハンサー／プロモーターを含む［Laiminsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6453 (1984)］。pMSD5-HPRT発現ベクターが選択プラスミド（または、選択マーカー）として用いられるのは、安定な形質転換体を作製するための受容細胞系としてＨＰＲＴ-細胞系（例えば、ＢＷ5147.G.1.A）が用いられる場合、。ＨＰＲＴ-細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンもしくはアザセリン、およびチミジンを含有する培地（HAT培地）では増殖できない。遺伝子導入によって機能的ＨＰＲＴ遺伝子を付加することにより、ＨＰＲＴ遺伝子をコードするベクターＤＮＡが組込まれている細胞がHAT培地で増殖できるようになる。
【０２４９】
ａ．全長マウスＨＰＲＴ ｃＤＮＡの単離
　ｃＤＮＡライブラリーの作製は、C6VL細胞［Allisonら, J. Immunol. 129:2293 (1982)］から単離したポリＡ+ｍＲＮＡから標準的な技法［Sambrookら, 前掲, 7.26〜7.29頁］を用いて行った。ｃＤＮＡをｍＲＮＡから作製し、標準的な技法［Huynhら, DNA Cloning: A Practical Approach (D.M. Glover編), 第1巻, IRL Press Oxford (1985), 49〜78頁]を用いて発現ベクターλgt10に挿入した。プローブとして約1.4kbのPstI-BamHI制限断片を含む全長ヒトＨＰＲＴ ｃＤＮＡクローンを用いて、全長マウスＨＰＲＴ ｃＤＮＡを単離した［pcD-HPRT; Jollyら (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:477］。この全長ｃＤＮＡクローンをNotIおよびEcoRIで消化して、ＨＰＲＴのコード領域を含む1.3kbの断片
を得た（マウスＨＰＲＴのコード領域を配列番号13に示し、配列番号13内でコードされるアミノ酸配列を配列番号14に示す）。
【０２５０】
　pMSD5（実施例１に記載）をNotIおよびEcoRIで消化し、マウスＨＰＲＴ ｃＤＮＡを含む1.3kbのNotI／EcoRI断片を挿入して、pMSD5-HPRTを得た。pMSD5-HPRTのマップを図11に示す。
【０２５１】
実施例３
増幅ベクターpSSD7-DHFRの構築
　pSSD7-DHFRは、SV40エンハンサー／プロモーターの転写調節下にあるマウスＤＨＦＲ ｃＤＮＡの全長コピーを含む。このエンハンサー／プロモーターは、多くの哺乳動物種に由来する広範囲の細胞型において活性である［Dijkemaら, EMBO J., 4:761 (1985)］。pSSD7-DHFRを増幅マーカー(amplifiable marker)と呼ぶ。その理由は、このベクターを用いれば、ＭＴＸの濃度を次第に高めても増殖できる細胞を選択することにより、このベクターの配列を増幅している細胞系の選択が可能になるからである。
【０２５２】
　マウスＤＨＦＲ ｃＤＮＡは、肝臓ＲＮＡから得た二本鎖ｃＤＮＡからＰＣＲを用いて以下のようにして単離した。すなわち、（Balb/c x C57B1/6）F1マウスの肝臓から標準的な技法を用いてポリＡ+ＲＮＡを単離した。１本目のｃＤＮＡを、このポリＡ+ＲＮＡから最終反応容量100μlでｃＤＮＡを合成した。以下の試薬を順々に添加した：35.6μlのH2O、５μlのポリA+RNA（１μg）および1.4μlのSBNSSdTプライマー（１μg）。SBNSSdTプライマーの配列は5'-GCATGCGCGCGGCCGCGGAGGC- TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'（配列番号15）である。水、プライマーおよびＲＮＡを60℃で２分間加熱し、次に氷上に静置した。40μlの全4種のdNTP（それぞれ、５mM）、10μlの10×逆転写酵素塩（1.0M Tris-HCl、pH 8.3、0.5MKCl、0.1M MgCl2、0.1M DTT）、２μlのRNasin（Promega）、および５μlのAMV逆転写酵素（MolecularGenetic Resources, Tampa, FL）。反応は41℃で３時間行った。65℃で10分間インキュベートすることにより反応を停止させた。
【０２５３】
　反応成分をCentricon 100試験管(Amicon)に移し、2.1mlの5mM Tris-HCl（pH 8.3）を添加した。この試験管を300rpm（約700g）で10℃にて４分間遠心分離した。2.2mlのTris-HCl（pH 8.3）を添加し、上記のようにして再度遠心分離した。この洗浄工程を繰り返し、次に該試験管を反転させ、2500rpmで10℃にて５分間遠心分離し、１本目のｃＤＮＡを回収した（容量：約50μl）。２本目のｃＤＮＡは以下のようにして合成した。すなわち、96μlのH2Oおよび20μlの10×rTth RTase緩衝液（900mM KCl、100mM Tris-HCl、pH 8.3）を１本目のｃＤＮＡに添加した。別の試験管に以下の成分を混合した：20μlの10mM MnCl2、４μlの4種のdNTPの各々（10mM）および10μlのrTth逆転写酵素（Perkin-Elmer）。両方の混合物を60℃に加熱し、第2の混合物をｃＤＮＡ混合物に添加した。反応は60℃で10分間行った。25μlのキレート緩衝液［50%グリセロール(v/v)、1mM KCl、100mM Tris-HCl(pH 8.3)、7.5mM EGTA、0.5% Tween 20］を添加することにより反応を停止させ、その混合物を氷上に静置した。
【０２５４】
　次に反応混合物をCentricon 100試験管に移し、2.1mlの5mM Tris-HCl（pH 7.5）を添加した。この試験管を5500rpmで10℃にて30分間遠心分離した。2.2mlのTris-HCl（pH 7.5）を添加し、その試験管を上記のように再度遠心分離した。この洗浄工程を繰り返し、次にその試験管を反転させ、2500rpmで10℃にて５分間遠心分離して、二本鎖のｃＤＮＡを回収した（容量：約50μl）。このｃＤＮＡをエタノールで沈殿させ、無菌H2Oに再懸濁し、260nmおよび280nmでの吸収により定量した。
【０２５５】
　200pgの二本鎖ｃＤＮＡを400μlのＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲを開始するのに用いたプライマーの組は、muDHFR.A：5'-CGGCAACGCGTGCCATCATGG TTCGAC-3'（配列番号16）とmuDHFR.B：5'-CGGCAGCGGCCGCATAGATCT AAAGCCAGC-3'（配列番号17）であった。ＰＣＲ反応
の条件は、Saikiら、Science 239:487 (1988)に報告されているとおりとした。簡単に説明すると、反応は、94℃で１分、55℃で１分、72℃で1.5分実施し、30サイクル行った。Taq ＤＮＡポリメラーゼはPerkin-Elmerから入手し、用いた反応緩衝液は製造業者が推奨するものとした。このプライマー対により、５′末端にMluI部位および３′末端にNotI部位を有する671bpの断片（配列番号18；配列番号18でコードされるアミノ酸配列を配列番号19に示す）が得られる。このＰＣＲ反応産物をMluIおよびNotIで消化し、低融点アガロースゲル（SeaPlaque, FMC）で電気泳動した。その671bpの断片をゲルから切出し、β-Agarase I(NEB)で消化することによりアガロースを取り除き、次に製造業者の説明書に従ってイソプロパノール沈殿を行った。
【０２５６】
　この671bpの断片を、MluIおよびNotIで消化したｐSSD7に挿入して、pSSD7-DHFRを得た。pSSD7-DHFRのマップを図12に示す。
【０２５７】
実施例４
　発現ベクターpJFE 14ΔIL10の構築
pJFE 14ΔIL10は、ＳＲαエンハンサー／プロモーターの転写調節下でマウス・インターロイキン10（IL-10）タンパク質をコードする全長ｃＤＮＡクローンを含む。上記で述べたように、ＳＲαエンハンサー／プロモーターは広範囲の細胞型において活性である。pJFE 14ΔIL10を用いて、トランスフェクト細胞でのIL-10遺伝子の発現を指令する（すなわち、pJFE 14ΔIL10は対象の遺伝子としてIL-10を発現する）。
【０２５８】
ａ．pJFE 14ΔIL10の構築
　プラスミドpJFE14［Elliottら (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6363］の構築は、プラスミドpSSD、pcDL-SRα296［Takebeら, (1988), Mol. Cell. Biol. 8:466］およびpCDM8［Seed (1987) Nature 329:840］に由来するＤＮＡ断片を組合せて行った。すなわち、pSSDをHindIIIおよびXhoIで切断し、アガロースゲルから2.77kbの断片を単離した。pcD-SRα296をHindIIIおよびXhoIで切断し、アガロースゲルから約640bpの断片を単離した。これら２つのゲル精製ＤＮＡ断片を共に連結させて、プラスミドpSRαSDを得た。pSRαSDをXbaIおよびNotIで切断し、アガロースゲルから3.4kbの断片を単離した。pCMD8をXbaIおよびNotIで切断し、440bpの断片を単離した。これらの3.4kbおよび440bpのXbaI／NotI断片を共に連結させて、pJFL14を得た。pJFE14の該略図を図13に示す。
【０２５９】
　全長マウスｃＤＮＡクローンF115［Mooreら, (1990) Science 248:1230］からＰＣＲを用いてΔIL10ｃＤＮＡを得た。pcDSRα-F115クローンをBamHIで線状にし、ここからｃＤＮＡインサートを切出した。ＰＣＲ反応は、AmpliTaqTMＤＮＡ Polymerase（Perkin Elmer）および製造業者から彼らの提案する条件に従って提供される緩衝液を用いて行った。このＰＣＲで用いたプライマーはIL10Δ-5'［5'-ATATATCTAGACCACCATGCCTGGCTCAGCACTG-3'（配列番号20）］およびIL10Δ-3'［5'-ATTATTGCGGCCGCTTAGCTTTTCATTTTGAT CAT-3'（配列番号21）］であった。ＰＣＲ反応は94℃で１分、72℃で１分、46℃で１分を30サイクル行った。このＰＣＲで得られたＤＮＡは本質的に全ての非コード配列が欠如しており、最適なKozak配列がIL-10遺伝子配列のイニシエーターATGのすぐ５′側に位置している。ＰＣＲで得られたＤＮＡをフェノール：CHCl3（１：１）で抽出し、次にCHCl3で抽出した。このＤＮＡをエタノール沈殿させ、ミクロ遠心分離機でペレット化し、TEに再懸濁した。このＤＮＡをXbaIおよびNotIで切断した。pJFE14をXbaIおよびNotIで切断した。両方の消化混合物を低融点アガロースゲルに流した。ゲルから550bpのΔIL10バンドおよび3.4kbのpJFE14バンドを切出し、試験管中で混合した。これらのＤＮＡをアガロースから同時抽出し、共に連結し、細菌DH5αに形質転換した。コロニーを拾い、クローンpJFE14-ΔIL10を同定した。pJFE14-ΔIL10の概略マップを図14に示す。
【０２６０】
実施例５
pSRαSD5-DRα-DAFの構築
　pSRαSD5-DRα-DAFは、キメラマウスＤＲα遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンを含む。このキメラタンパク質では、ＤＲαタンパク質の細胞外ドメインが崩壊促進因子(Ｄ
ＡＦ)遺伝子から誘導される配列に連結している。このＤＡＦ配列はグリコホスファチジルイノシトール結合を付与するものであり、このグリコホスファチジルイノシトール結合は、ホスホリパーゼＣで細胞を処理することにより該キメラタンパク質が細胞表面から切断できるようにする（細胞表面発現には、同一細胞内でのＤＲβ鎖の発現が必要とされる）。
【０２６１】
ａ．ファージミドベクターpDAF20の構築
　pSRαSD5-DRα-DAFおよびpSRαSD5-DRβ1-DAF（実施例６）を作製するために、グリコホスファチジルイノシトール結合を介して崩壊促進因子(ＤＡＦ)を細胞表面に固定するＤＡＦの一部をコードする配列を含むベクターを構築した。pDAF20の構築は以下のようにして行った。
【０２６２】
　２μgのpBluescript KS(-)（Stratagene）をEcoRV（NEB）で切断した。TE緩衝液を添加して、最終容量を200μlにした。スペルミンを最終濃度1.4mMとなるように添加し、ＤＮＡを氷上で20分間沈殿させた。次に、沈殿したＤＮＡをミクロ遠心分離機で10分間遠心分離することによりペレット化し、記載［HoopesおよびMcClure(1988) Nucleic Acids Res. 9:5493］のようにして該ペレットからスペルミンを完全に洗い出した。簡単に説明すると、ペレットをボルテックス処理により抽出緩衝液［75% EtOH、１×緩衝液２（0.3M酢酸ナトリウム、0.01M酢酸マグネシウム）］に分散させ、次に分散させたペレットを氷上に１時間放置した。ミクロ遠心分離機で10分間遠心分離することにより該ペレットを回収した。ペレットを室温で乾燥させ、14μlのH2O中に再懸濁した。氷上で、再懸濁したＤＮＡに、非リン酸化オリゴヌクレオチドＤＡＦa（配列番号22）およびＤＡＦb（配列番号23）の各250ngを添加した。次に、このＤＮＡ−オリゴヌクレオチド混合物を、最終反応容量20μl中、最終濃度で50mM Tris-HCl（pH 7.5）、10mM MgCl2、10mM DTTおよび１mM rATPとなるようにした。80ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（NEB）を添加し、この連結混合物を14℃にて一夜静置した。次に、連結混合物を65℃に10分間加熱した。NaClを最終濃度50mMとなるように添加し、ＤＮＡをEcoRV（NEB）で消化した。次に、このＤＮＡのアリコートを用いてコンピテントなHB101を形質転換した。
【０２６３】
　クローンを拾い、制限酵素消化によりミニプレップＤＮＡを調べた。ＤＡＦ20と命名したクローンを単離した。このクローンは、pBluescript KS(-)のEcoRV部位にクローニングされているＤＡＦ配列を有しており、このＤＡＦ配列の一方の端部にはポリリンカーのEcoRI部位と隣接しかつポリリンカーのHindIII部位から離れてXbaIが存在している。ＤＡＦインサートを含むpDAF20ポリリンカー領域の配列を配列番号24に示す。
【０２６４】
　こうして得られたプラスミドpDAF20は、グリコホスファチジルイノシトール（PI）結合により細胞表面に繋ぎ止められた状態のＤＡＦの最後の37個のアミノ酸をコードするＤＮＡを含む[Carasら, (1987)Nature 325:545]。これら37個のアミノ酸をＣ末端に含むキメラタンパク質は、このPIアンカーと共に、哺乳動物（および昆虫）細胞の細胞表面で発現され得る。このアンカーは容易に切断することができ、タンパク質は、ホスファチジルイノシトール-特異的ホスホリパーゼＣを用いて細胞表面から溶解(solubilize)した［Carasら, (1987) Science 238:1280］。
【０２６５】
　ホスファチジルイノシトール-特異的ホスホリパーゼＣはBacillus thuringiensis（ATCC 10792）から厳密に記載［Kupkeら, (1989) Eur. J. Biochem. 185:151］のとおりに精製した。ホスファチジルイノシトール-特異的ホスホリパーゼＣは市販されている（例えば、Sigmaより販売）。
【０２６６】
　特定のペプチドと複合化した可溶性クラスII分子の使用は、自己免疫疾患の治療用として提案されている［Sharmaら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11465］。そのような治療には、アンプル量の可溶性クラスII分子が入手可能であることが要件となる。本
発明によれば、大量の可溶性クラスII分子がクラスII分子を発現する細胞から該細胞表面上で産生できるようになり、該細胞表面上では、該分子がPIアンカー（ＤＡＦ由来の配列によりもたらされる）を介して該細胞に固定されている。あるいはまた、可溶性の形態の細胞表面タンパク質の産生は、本発明の方法に従い、クラスIIヘテロダイマーを含む各鎖の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にトロンビン開裂部位を含むキメラ・クラスII分子をコードするＤＮＡ配列を用いることにより可能となる。
【０２６７】
ｂ．全長ＨＬＡ ＤＲα ｃＤＮＡの単離
　ｃＤＮＡライブラリーの作製は、IBw4細胞（GM03104B, NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository at the Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ）から単離したポリＡ+ｍＲＮＡから標準的な技法［Sambroolら, 前掲, 7.26-7.29］を用いて行った。ｃＤＮＡをｍＲＮＡから作製し、標準的な技法［Huynhら, DNA Cloning: A Practical Approach(D.M. Glover編), 第１巻, IRL Press Oxford (1985), 49〜78頁］を用いてクローニングベクターλgt10に挿入した。そのライブラリーからプローブとして部分ＤＲα
ｃＤＮＡを用いて全長ＤＲα ｃＤＮＡを単離した。この部分ＤＲα ｃＤＮＡはpDRα1［Stetlerら, (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5966］に含まれるものであった。こうして得られた全長ＤＲαｃＤＮＡは1.2kbのNotI／EcoRI断片上に含まれていた。
【０２６８】
ｃ．SRαSD5-DRα-DAFの構築
　ＤＲαの細胞外コード配列とＤＡＦ配列とのインフレーム(in-frame)連結は、位置指定in vitro欠失突然変異誘発［Kunkelら, (1987) Methods in Enzymology 154:367］を用いて行った。この突然変異による架橋オリゴヌクレオチドは所望の連結をコードする。
【０２６９】
　全長ＤＲα ｃＤＮＡを、NotI-EcoRI断片としてpDAF20（上記ａ節）にサブクローニングした。pDAF20-DRαを単離し、細菌ＢＷ313［Kunkelら, (1987)前掲］に形質転換した。次に、コロニーを100μg/mlアンピシリンを含有するLBにて一夜増殖させた。この一夜培養物を１：10に希釈して最終容量を６mlとし、37℃で増殖させた。1時間後、約１×1011pfu/mlの力価を有するヘルパーファージR408［Russelら,(1986) Gene 45:333］のストック400μlを該培養物に添加し、この培養物を37℃で約８時間増殖させた。次に、培養物の1.4mlのアリコートを４本のミクロ遠心管に入れ、ミクロ遠心分離機で４℃にて５分間回転させた。1.1mlの各上清を、150μlの20％PEG(6000)、2.5M NaClを含有する新たなミクロ遠心管に移した。これらの遠心管の内容物を混合し、室温で少なくとも20分間放置した。ファージ粒子を含む沈殿したｓｓＤＮＡを４℃で５分間ミクロ遠心分離機にかけてペレット化した。ペレットからPEG含有上清を全部除去するように注意する。４つのペレットを全量200μlの300mM NaOAc（pH７）に再懸濁し、同容量のフェノール：CHCl3（１：１）で２回抽出し、次にCHCl3で１回抽出した。この上清に２倍量のエタノールを添加し、−20℃に冷却した。ｓｓＤＮＡを４℃で20分間ミクロ遠心分離機にかけてペレット化した。ペレットを乾燥し、10μlのTE緩衝液に再懸濁した。
【０２７０】
　架橋オリゴヌクレオチドを、50mM Tris-HCl (pH 7.4)、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM rATPおよび65ngのＲＡＤＡＦ２オリゴヌクレオチド（配列番号25）を含有する20μlの容量中で、８ユニットのＴ４ ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（Pharmacia）を用いて、37℃で１時間リン酸化した。架橋オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡ鋳型とアニーリングさせるために、1.1μlの上記のリン酸化ＲＡＤＡＦ２オリゴヌクレオチド(配列番号25)および５μlのｓｓＤＮＡプレップ(prep)を、40mM Trsi-HCl（pH 7.5）、20mM MgCl2および50mM NaClを含む最終容量15μlとして混合し、70℃に加熱し、ベンチトップ上で室温まで冷却した。反応試験管内で、緩衝液の濃度（最終容量95μｌ中）は、16.8mM Tris-HCl(pH 7.5)、11.6mM MgCl2、7.9mM NaCl、10.5mM DTTおよび1.1mM rATPとなるように調整した。４ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ(NEB)および3.8ユニットのSequenase（US Biochemicals）を反応物に添加し、これを室温で５分間インキュベートし、さらに37℃で１時間インキュベートした。反応物を58mM NaClとなるように調整し、65℃で10分間加熱した。反応試験管を37℃に冷却し、ＤＮＡをEcoRIおよびXbaIで切断した。ＤＮＡのアリコートを大腸菌TG
2株に形質転換し、アンピシリン含有プレートに展開した。目的とするＤＲα配列とＤＡＦ配列との連結の間に適切なＤＮＡ欠失を示すクローンを単離した。このクローンを標準的な技法を用いて配列決定して目的の配列の存在を確認した。ＤＲα-ＤＡＦタンパク質のコード領域を配列番号26に示し、配列番号26によってコードされるアミノ酸配列を配列番号27に示す。
【０２７１】
　正しいＤＲα-ＤＡＦ構築物を含むプラスミドをHindIIIで切断した。このHindIII消化により生じた末端をKlenow酵素で平滑にし、非リン酸化EcoRIリンカーを標準的な技法を用いてその平滑末端に連結した。ＤＮＡをコンピテントな大腸菌に形質転換し、ＤＲα-ＤＡＦ配列をNotI-EcoRI断片として含むクローンを単離した。次に、ＤＲα-ＤＡＦ ＤＮＡをNotI-RcoRI断片としてpSRαSD5プラスミドにサブクローニングして、pSRαSD5-DRα-DAFを得た。pSRαSD5-DRα-DAFのマップを図15に示す。
【０２７２】
実施例６
pSRαSD5-DRβ1-DAFの構築
　pSRαSD5-DRβ1-DAFは、キメラマウスＤＲβ１-ＤＡＦ遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンを含む。このキメラタンパク質では、ＤＲβ１タンパク質の細胞外ドメインがＤＡＦ遺伝子から誘導される配列に結合している。このＤＡＦ配列はグリコホスファチジルイノシトール結合をもたらし、この結合により、該キメラタンパク質が、細胞のホスホリパーゼＣ処理により細胞の表面（細胞表面での発現には、同じ細胞内でのＤＲα鎖の発現が必要である）から切り離されるようになる。
【０２７３】
ａ．全長ＤＲβ１ ｃＤＮＡの単離
　ｃＤＮＡライブラリーの作製は、IBw4細胞（GM03104B, NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository at the Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ）から単離したポリＡ+ｍＲＮＡから標準的な技法［Sambroolら, 前掲, 7.26-7.29］を用いて行った。ｃＤＮＡをｍＲＮＡから作製し、標準的な技法［Huynhら, DNA Cloning: A Practical Approach(D.M. Glover編), 第１巻, IRL Press Oxford (1985), 49〜78頁］を用いてクローニングベクターλgt10に挿入した。そのライブラリーから全長ＤＲβ ｃＤＮＡプローブを用いて全長ＤＲβ１ ｃＤＮＡを単離した。この全長ＤＲβ ｃＤＮＡプローブはプラスミドp2918.4［Bellら, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3405］に含まれるものであった。こうして得られた全長ＤＲβ1クローンは1.2kbのNotI／EcoRI断片上に含まれていた。
【０２７４】
ｃ．pSRαSD5-DRβ1-DAFの構築
　ＤＲβの細胞外コード配列とＤＡＦ配列とのインフレーム連結は、実施例５ｃに記載のように位置指定in vitro欠失突然変異誘発［Kunkelら, (1987), 前掲］を用いて行った。
【０２７５】
　全長ＤＲβ１ ｃＤＮＡ（上記a節）を、NotI-EcoRI断片としてpDAF20（実施例５ａ）にサブクローニングして、pDAF20-DRβ1を得た。pDAF20-DRβ1 ＤＮＡを単離し、大腸菌ＢＷ313株に形質転換した。次に、コロニーを100μg/mlアンピシリンを含有するLBにて一夜増殖させた。この一夜培養物を実施例５ｃに記載のようにして希釈しヘルパーファージと共にインキュベートして、一本鎖pDAF20-DRβ1 ＤＮＡを得た。ｓｓＤＮＡを実施例５ｃに記載のようにして沈殿させＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０２７６】
　架橋オリゴヌクレオチドＲＱＢＤＡＦ２（配列番号28）を実施例５ｃに記載のようにしてリン酸化した。架橋オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡ鋳型とアニーリングさせるために、実施例５ｃに記載のようにして1.1μlのリン酸化ＲＡＤＡＦ２および５μlのｓｓＤＮＡプレップを混合し、加熱し、冷却した。反応混合物を、95μｌの最終容量中で、16.8mM Trsi-HCl（pH 7.5）、11.6mM MgCl2、7.9mM NaCl、10.5mM DTTおよび1.1mM rATPの濃度となるように調整した。４ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ(NEB)および3.8ユニットのSequenase（US Biochemicals）を反応物に添加し、これを室温で５分間インキュベートし、さらに37℃で１時間インキュベートした。反応物を58mM NaClとなるように調整し、65℃で10分間加熱した。反応試験管を37℃に冷却し、ＤＮＡをEcoRIおよびXbaIで消化した。消化したＤＮＡのアリコートを用いて大腸菌TG2株を形質転換した。形質転換した細胞をアンピシリン含有プレートに展開した。目的とするＤＲβ１配列とＤＡＦ配列との結合の間に適切なＤＮＡ欠失を示すクローンを単離した。目的の配列の存在は、標準的な技法を用いてＤＮＡ配列決定により確認した。ＤＲβ１-ＤＡＦタンパク質のコード領域を配列番号29に示し、配列番号29によってコードされるアミノ酸配列を配列番号30に示す。
【０２７７】
　正しいＤＲβ１-ＤＡＦ構築物を含むプラスミドをHindIIIで切断した。このＤＮＡをKlenow酵素で平滑にし、その平滑末端に標準的な方法を用いてEcoRIリンカーを付加した。このＤＮＡを細菌に形質転換し、ＤＲβ１-ＤＡＦをNotI-EcoRI断片として含むものを単離した。ＤＲβ１-ＤＡＦ ＤＮＡをNotI-EcoRI断片としてpSRαSD5にサブクローニングして、pSRαSD5-DRβ1-DAFを得た。pSRαSD5-DRβ1-DAFのマップを図16に示す。
【０２７８】
実施例７
リンパ系細胞での組換えIL-10の高レベル発現
　高レベルのIL-10の発現は、以下の３つのプラスミドの同時増幅によりＢＷ5147.G.1.4細胞（Ｔリンパ系細胞系の一つ）にて行った：（１）マウスIL-10をコードする発現ベクターpJFE 14ΔIL10；（２）ＨＰＲＴ酵素をコードする選択ベクターpMSD5-HPRT；および（３）マウスＤＨＦＲ酵素をコードする増幅ベクターpSSD7-DHFR。これらのプラスミドをエレクトロポレーションによりＢＷ5147.G.1.4細胞に導入した。プラスミドＤＮＡを細菌細胞からCsCl密度勾配遠心分離を用いて単離した。
【０２７９】
　プラスミドはエレクトロポレーションのために以下のようにして調製した。まず、プラスミドを同じ反応試験管内で線状化した。200μgのpJFE 14ΔIL10をSalIで消化した。10μgのpMSD5-HPRTをSalIで消化した。20μgのpSSD7-DHFRをSalIで消化した。SalIはNew England BioLabsから入手し、製造業者の説明書に従って制限消化を行った。次に、線状にしたプラスミドをエタノールで沈殿させ、0.5mlの１×HBS(EP)緩衝液［20mM HEPES（pH 7.0）；0.75mM Na2HPO4/NaH2PO4（pH 7.0）；137mM NaCl；5mM KClおよび１gm/lのデキトロース］に再懸濁した。
【０２８０】
　ＢＷ5147.G.1.4細胞を、10％FCS(HyClone)および50μg/mlのゲンタマイシン（Sigma）を含有するRPMI1640培地(Gibco/BRL)で増殖させた。エレクトロポレーションに先立って、細胞を氷冷１×HBS（EP）緩衝液中で２回洗浄し、0.5mlの１×HBS（EP）中に２×107細胞／mlで再懸濁した。次に、細胞を、線状化ＤＮＡを含有する0.5mlの１×HBS（EP）が入っている１ml容のキュベット(Sarstedt)に入れた。このキュベットを氷上に静置した。エレクトロポレーションは、ISCO Model 493電源装置を用いて225ボルトにて行った。エレクトロポレーションの機器は記載［Chu, G.ら, (1987) Nucl. Acids Res. 15:1311］のとおりに正確に組立てた。エレクトロポレーションの装置は、２×のセッティングで一定電圧（225V）に設定した（すなわち、両方のコンデンサーを用いた）。エレクトロポレーションを行った後、氷上で15分間インキュベートすることにより細胞を回復させた。
【０２８１】
　次に、エレクトロポレーションした細胞を、10％FCSおよび50μg/mlゲンタマイシンを含有する30mlのRPMI 1640培地が入っているT75フラスコ(Falcon)に移した。細胞を、５％CO2を含有する加湿雰囲気中に37℃で36時間放置した。次に、細胞を、24ウエルプレート（Falcon, Lincoln Park, NJ）に、選択培地［10％FCS、100μMヒポキサンチン(Sigma)および２μg/mlアザセリン(Sigma)を含むRPMI 1640］中１×104細胞／ウエルの密度で入れた。各ウエルには0.5mlの選択培地が含まれていた。細胞を24ウエルプレートに展開した１週間後、0.5mlの新鮮な選択培地を添加した。
【０２８２】
　約10日後、ＨＰＲＴ+コロニー（すなわち、増殖細胞が入っているウエルまたは陽性のウエル）が見えるようになった。13日目（エレクトロポレーションを行った日を０日目と
した）、100μlの培養上清を取り出し、記載［Mosmannら, (1990) J. Immunol. 145:2938］のようにして行われるELISAアッセイを用いて、マウスIL-10の存在の有無をアッセイした。モノクローナル抗体（mcab）SXC1（PharMingen, San Diego, CA）を捕捉抗体(capture antibody)として用い、ビオチン化mcab SXC2［SXC2の代わりにmcab JESS-2A5（PharMingen）を用いてもよい］を検出抗体として用いた。簡単に説明すると、20μlのmcab SXC1（PBS中、２μg/mlの濃度）を、37℃で30分〜３時間インキュベートすることにより軟質ビニル製96ウエルプレート(Falcon)のウエルに結合させた。次に、過剰なタンパク質結合部位は、200μl／ウエルのPBS、10％FCSを添加することによりブロックした。37℃でブロッキングした30分間後に、プレートをPBS、0.1％Tween20（ICN Biochemicals, Aurora, OH）で洗浄した。被検サンプルを50μl／ウエルで添加し、37℃で１時間インキュベートした。プレートをPBS、0.1％Tween20で洗浄し、20μl／ウエルのPBS、0.1％Tween20、１μg/mlのビオチン化mcab SXC2を添加した。プレートを37℃で30分間インキュベートした。上清を取り除き、プレートをPBS、0.1％Tween 20で洗浄した。１／5000の希釈度のストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ・コンジュゲート（Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA）（PBS、0.1％ Tween 20、0.1％BSA中）を50μl／ウエルで添加し、37℃で30分間インキュベートした。次に、プレートをPBS、0.1％Tween 20で徹底的に洗浄し、100μl／ウエルの44mM NaH2PO4、28mM クエン酸、0.003％ H2O2、１mg/ml 2,2'アジノ-ビス（3-エチルべンゾチアゾリン-6-スルホン酸）(Sigma)を添加した。1時間後に、ウエルの光学濃度(OD)を、VMAXマイクロプレート・リーダー（Molecular Devices, Menlo Park, CA）を用いて試験波長405nmおよび基準波長490nmで測定した。
【０２８３】
　１〜３個の目で確認できるクローンを含みかつ100ユニット/ml以上のIL-10を含むウエルからの細胞を、限界希釈法により標準的な技法［Cloning by Limiting Dilution, Current Protocols in Immunology (J.E. Coliganら,編) Jone Wiley &Sons, New York, 第2.5.10節］を用いてクローニングした。限界希釈クローニングでは、細胞を選択培地中で96ウエルプレート(Falcon)に２または４個／ウエルで展開し、各細胞密度につき１枚の96ウエルプレートを用意した（２または４個／ウエル）。全部で16の独立したコロニーを限界希釈法でクローニングした。
【０２８４】
　限界希釈クローニングを開始してから８日後、単離したコロニーを限界希釈プレートの各々から拾った。これらのコロニーを96ウエルプレートに移した。各ウエルは、10％透析FCS（HyClone）および100μMヒポキサンチンを含有する５mlのRPMI1640を含んでいた。ここで透析血清を用いることにより、トランスフェクタントの増幅の速度および頻度が増大する。数回の継代の細胞の増殖にはアザセリンのレベルが無視できる濃度に希釈されるまでヒポキサンチンが必要とされるので、ヒポキサンチンはこの時点で培地に添加する。
【０２８５】
　２日後、100μlの培養上清を、上記のようにELISAを用いてIL-10の存在について調べた。さらに操作を行うために、最初のウエル（例えば、24ウエルプレート）の各々からの２個の最良産生クローンを選択した。全部で19個のクローン（これらのクローンは選択培地で生存増殖しているが、メトトレキセート存在下での増殖による増幅には供していないので、「選択物(selectant)」と呼ぶ）を選択した。
【０２８６】
　単離したコロニー（限界希釈によりクローニングしたもの）を96ウエルプレートに移してから５日後に、それらのコロニーを24ウエルプレートに移し、拡大増殖(expand)させた。次に、拡大増殖させたコロニーを、10％透析FCSを含有する５mlのRPMI1640培地が入っている５ml容フラスコ（Falcon）に移した。これらのクローンは100〜200ユニット/mlのIL-10を産生した。
【０２８７】
　次に、選択したクローンを、メトトレキセート存在下で細胞を増殖させることにより増幅させた。19のクローンのそれぞれについて、メトトレキセート(ＭＴＸ)に対する感受性
を調べた。各クローンからの５×104個の細胞を一連の24ウエルプレートのウエルに入れた。10％透析FCSと３nM、10nM、30nM、60nMまたは90nMのＭＴＸとを含有するRPMI1640培地の存在下でコロニーを増殖させた。６つのクローンが30nM以上のＭＴＸの存在下で増殖することができ、これらのクローンをとっておいた。
【０２８８】
　30nM以上のＭＴＸに耐性であったこれら６つのクローンを、10％透析FCSと90nM、150nMまたは210nMのＭＴＸとを含有する５mlのRPMI1640培地が入っているT25フラスコ（Falcon）にプレートした。各クローン当たり３本のフラスコを用意した。クローンをこれら３種のＭＴＸ濃度にて15日間増殖させ、次に各フラスコから上清を採取し、上記のようにELISAを用いてIL-10産生についてアッセイした。90nMまたは150nMのＭＴＸが入っているフラスコからの全てのクローンは、800〜1200ユニット/mlのIL-10を産生した。6つの最初のＭＴＸrクローンの各々から最良産生クローンを選択した（１つは90nM ＭＴＸのフラスコからのものであり、それ以外は150nM ＭＴＸのフラスコからのもの）。次に、これらのクローンを、適切な濃度のＭＴＸを含有する培地中で５mlまで拡大増殖させた（６日間）。次に、クローンを、450nM、750nMまたは1050nMのＭＴＸを含有する培地に移した。16日後、1050nM ＭＴＸの存在下で増殖しているクローンからの上清をIL-10産生についてアッセイした。これらのクローンは12,000〜76,000ユニット/mlのIL-10を産生することが判明した（１つのクローンが12,000u/ml産生し、１つのクローンが15,000u/ml産生し、８つのクローンが50,000〜76,000u/mlの範囲で産生した）。
【０２８９】
　最高レベルのIL-10を産生する２つのクローンを選択した。これらのクローンを9-2および11-2と命名した。次に、クローン9-2および11-2を５μM ＭＴＸの存在下で３週間増殖させ、拡大させ、凍結した。培養物は以下のようにして凍結した。細胞を６〜10×105個／mlの密度で含む30mlの培地を50ml容の円錐形試験管(conical tube)（Falcon）中で500×ｇで５分間遠心分離してペレット化した。上清を捨て、細胞を7.5mlのFreezing Media（40%FCS、53％RPMI1640、７％DMSO）に再懸濁し、5本の凍結用バイアル(Nunc, Naperville, IL)に入れた。細胞を−70℃の冷凍庫に24〜96時間静置し、次に長期保存のために液体窒素に移した。
【０２９０】
　約２ヵ月後に各クローンのアリコートを解凍し、IL-10産生について再試験し、続けて５μM ＭＴＸの存在下で増殖させた。これら２つのクローン（9-2および11-2）は64,000〜86,000ユニット/mlのIL-10を産生し続けた。
【０２９１】
　IL-10の発現レベルは、細胞を１μMまたは５μMのＭＴＸで増殖させた場合にはほぼ同等であった（１μMでの76,000と５μMでの64,000〜86,000とを比較せよ）。５μMより高いＭＴＸ濃度を用いると、細胞の増殖がより遅くなり、そのためにタンパク質の総収量は１〜５μM ＭＴＸの存在下で細胞を増殖させた場合よりも低くなるようであった。
【０２９２】
　注目すべき点は、細胞をIL-10の発現損失がないＭＴＸ含有培地に移した後は、ＨＰＲＴタンパク質の発現（すなわち、ヒポキサンチンおよびアザセリンを含有する培地の存在下での増殖）を維持するための選択圧は用いなかったことである。さらに、IL-10のレベルはＭＴＸ濃度の増加に伴って上昇するので、内因性ＤＨＦＲ遺伝子はおそらくＭＴＸr細胞内では増幅しないであろう。すなわち、ＭＴＸ耐性の増大は、増幅ベクターpSSD7-DHFR上に存在する外因性ＤＨＦＲ遺伝子の増幅に起因する。
【０２９３】
実施例８
リンパ系細胞におけるＤＲクラスII ＭＨＣの高レベル発現
　高レベルのＤＲクラスII ＭＨＣ分子を、ＢＷ5147.G.1.4細胞の表面で以下の4つのプラスミドの同時増幅により発現させた。（１）ＤＡＦ尾部に連結されたヒトＤＲ分子のα鎖をコードする発現ベクターpSRαSD5-DRα-DAF；（２）ＤＡＦ尾部に連結されたヒトＤＲ分子のβ鎖をコードする発現ベクターpSRαSD5-DRβ1-DAF；（３）ＨＰＲＴ酵素をコード
する選択ベクターpMSD5-HPRT；および（４）マウスＤＨＦＲ酵素をコードする増幅ベクターpSSD7-DHFR。これらのプラスミドをエレクトロポレーションによりＢＷ5147.G.1.4細胞に導入した。プラスミドＤＮＡを細菌細胞からCsCl密度勾配遠心分離の標準的な技法を用いて単離した。
【０２９４】
　単離したプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションのために以下のように調製した。まず、プラスミドを同じ反応試験管内で線状化した。４つのプラスミド全部をSalIで線状化した。以下の量のプラスミドを用いた：200μgのpSRαSD5-DRα-DAF；200μgのpSRαSD5-DRβ1-DAF；10μgのpMSD5-HPRT；および25μgのpSSD7-DHFR。次に、線状にしたプラスミドをエタノールで沈殿させ、0.5mlの１×HBS（EP）緩衝液に再懸濁した。
【０２９５】
　ＢＷ5147.G.1.4細胞を、10％FCSおよび50μg/mlのゲンタマイシンを含有するRPMI-1640培地で増殖させた。エレクトロポレーションに先立って、細胞を氷冷１×HBS（EP）緩衝液中で２回洗浄し、0.5mlの１×HBS（EP）中に２×107個/mlの密度で再懸濁した。次に、これらの細胞を、上記の線状化ＤＮＡを含む0.5mlの１×HBS（EP）が入っている１ml容のキュベット(Sarstedt)に入れた。このキュベットを氷上に静置した。エレクトロポレーションを上記のようにして行った。
【０２９６】
　エレクトロポレーションを行った後、細胞を氷上でインキュベートすることにより回復させ、次に10％FCSおよび50μg/mlのゲンタマイシンを含有する30mlのRPMI-1640培地が入っているT75フラスコ（Falcon）に入れた。細胞を５％ CO2を含む加湿雰囲気中に37℃で静置し、バルク培養（bulk culture）で36時間増殖させた。次に、細胞を４枚の48ウエルプレート（Costar）に0.5mlの選択培地［10％FCS、100μMヒポキサンチン（Sigma）および２μg/mlアザセリン(Sigma)を含有するRPMI 1640］中104個／ウエルの密度でプレートした。１×104個／ウエルの細胞密度を用いることにより、生じる全てのコロニーが単一細胞から誘導されるのが確実になる。すなわち、この密度は限界希釈クローニングをもたらすのである。残りの細胞は全て、0.5mlの選択培地中１×105個／ウエルの密度でプレートした。48ウエルプレートにプレートした１週間後に、追加の0.5mlの選択培地を添加した。
【０２９７】
　選択培地での増殖能を有するクローン（選択物）を含むウエルは８日後に目で確認できるようになった。選択培地を適用した10〜12日後に、陽性のコロニー（すなわち、選択培地での増殖が陽性のもの）を拾って、10％透析FCS（HyClone）および100μMヒポキサンチンを含有する４mlのRPMI1640が入っている12ウエルプレート（Coster）に入れた。ここで透析した血清を用いることにより、選択物の増幅の速度および頻度が増大する。ヒポキサンチンは、数回の継代の細胞の増殖ではアザセリンのレベルが無視できる濃度に希釈されるまで必要とされるので、ここで培地に添加する。細胞を12ウエルプレートで３〜４日間増殖させた。
【０２９８】
　ヒポキサンチンおよびアザセリンの存在下で増殖したコロニー（選択物）を、細胞をモノクローナル抗体L243で染色することにより、細胞表面でＤＲ分子を発現する能力について確認した。L243は、ヒトＨＬＡ-ＤＲ抗原に特異的に結合する［LampsonおよびLevy, J. Immunol., 125:293(1980)］。
【０２９９】
　この抗体は以下のようにして調製した。すなわち、ハイブリドーマL243を増殖させ、培養上清を標準的な技法［HarlowおよびLane編, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Press, New York (1988), 272,276頁］を用いて回収した。このハイブリドーマ上清からモノクローナル抗体を精製した。L243をProtein A−Sepharoseカラム（Pharmacia）で製造業者の供給するプロトコールを用いて精製した。次に、精製したモノクローナル抗体を標準的な技法［Antibodies: A Laboratory Manual, 前掲,341頁］を用い
てビオチン化した。ビオチンはVectorから入手した。ビオチン化L243は１：200の希釈度で用いた。
【０３００】
　細胞を以下のようにして染色した。すなわち、12ウエルプレートのウエルの内容物を、培地をピペッティングすることにより穏やかに混合した。１〜2mlの細胞懸濁液取り出した。このサンプル量は１〜３×106個の細胞を含む。細胞を1000rpmで４℃にて４分間遠心分離することによりペレット化した。染色培地［10mM HEPES（pH 7.0）、５％ウシ血清、４mMアジ化ナトリウム（ハンクスの平衡塩類溶液中）］に希釈したL243 100μlを添加した。細胞を氷上で20分間インキュベートした。次に、細胞を１mlの染色培地を添加することにより洗浄した後、細胞の上に１mlのウシ血清を重した。細胞を血清ごと1000rpmで４℃にて４分間遠心分離することによりペレット化した。上清を吸引により除去した。次に、細胞を100μlのフルオレセインイソチオシアネート（FITC）−コンジュゲート化アビジン（Vector、１：50の希釈度で使用）に懸濁した。細胞を氷上で20分間インキュベートした。次に、細胞を上記のようにして洗浄した。
【０３０１】
　上清を除去し、細胞を２μg/mlのヨウ化プロピジウムを含有する200μlの染色培地に懸濁した。ヨウ化プロピジウムは生細胞からは排出されるが、死細胞または死滅しかかっている細胞には取り込まれる。ヨウ化プロピジウムの添加により、死細胞（ヨウ化プロピジウムで明るく光る細胞）が分析から排除されるようになる。細胞は、FACScanTM（Becton-Dickinson）での分析に先立って、ナイロンスクリーン（Nitexナイロンモノフィラメント、48ミクロンメッシュ、Fairmont Fabrics, Hercules, CA）でろ過した。親ＢＷ5147.G.1.4細胞（すなわち、トランスフェクトされていないもの）のアリコートを上記のように染色して、ネガティブな対照とした。
【０３０２】
　図17は、代表的な選択物クローンであるクローン５並びにL243の染色結果を示すものである。図17は、サンプル中の相対的細胞数に対してプロットしたフルオレセインの対数（ｘ軸）を示すヒストグラムである。ＢＷ5147.G.1.4細胞の表面でＤＲ分子を発現する細胞は、細胞表面がビオチン化L243で染色され続いてFITC−アビジンで染色されるために、フルオレセインで明るく光る細胞として出現する。図17に示すように、クローン５の細胞は全て、トランスフェクトしたＤＲ分子を発現する。ＤＲ分子の表面での発現が見られるという事実から、α鎖およびβ鎖の双方のＤＲ構築物がクローン５内部で発現されることが示される。
【０３０３】
　最高のＤＲ発現レベルを有する８つの選択物クローンを、さらなる操作のために選択した。次に、これら８つの選択物クローンをＭＴＸに対する感受性について調べた。各クローンを24ウエルプレートに２×104個／ウエルの密度でプレートした。各ウエルには、RPMI-1640、10％透析FCSおよびＭＴＸを含有する１mlの培地を入れた。クローンを３nM、10nM、30nM、60nMまたは90nMのいずれかのＭＴＸの存在下で増殖させた。対照として、非トランスフェクトＢＷ5147.G.1.4細胞も上記の範囲のＭＴＸで増殖させた。親ＢＷ5147.G.1.4により許容(tolerate)されたレベル（典型的には、10nM以下のＭＴＸ）よりも少なくとも２〜３倍高いＭＴＸレベルで増殖したクローンをさらなる分析のために選択した。選択物クローンのうち４つが30nM以上のＭＴＸで増殖し、これらをとっておいた。これらのクローンは増幅用に選択された一次トランスフェクタントである。30nMを越えるＭＴＸで増殖した４つのクローン全部を、表面でＤＲ分子を発現する能力についてELISAにより分析した。細胞表面ELISAは以下のようにして行った。
【０３０４】
　５〜20×104個／ウエルの細胞を丸底96ウエルプレートに入れた。細胞を遠心分離機でプレートキャリアを用いて1000rpmで４℃にて３分間処理してペレット化した。上清をウエルからフリック(flick)して除去し、タッピング(tapping)により細胞をペレットから分散させて、プレートを氷上に静置した。１／200の希釈度のビオチン化mcab L243（Becto
n-Dickinson）を含む染色培地［ハンクスの基本的塩類溶液(Hank's Basic Salt Solution)（Irvine Scientific）、10mM HEPES(pH ７)、５％ウシ血清］50μlを各ウエルに添加した。細胞をビオチン化mcabと共に氷上で20分間インキュベートした。氷冷染色培地を添加して最終容量を200μl／ウエルとした。上記のようにして、細胞をペレット化し、上清をフリックして除去し、ペレットを分散させた。細胞を200μl／ウエルの氷冷染色培地で２回以上洗浄した。ウエル当たり50μlの１／1000希釈度の西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲート化アビジン（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を添加し、氷上で20分間インキュベートした。氷冷染色培地を添加して最終容量を200μl／ウエルとした。上記のようにして、細胞をペレット化し、上清をフリックして除去し、ペレットを分散させた。細胞を200μl／ウエルの氷冷染色培地で３回以上洗浄した。最後の洗浄が終わった後、プレートを再度タッピングして細胞ペレットを分散させ、各ウエルに200μlの新たに作製したOPD基質溶液［16mMクエン酸、34mMクエン酸ナトリウム、0.01％H2O2、１mg/ml 二塩酸O-フェニレンジアミン(Sigma)］を添加した。プレートを室温で10〜20分間静置した。次に、細胞を1000rpmで４℃にて３分間処理してペレット化した。各ウエルから得た100μlの上清を新らしい平底96ウエルプレート（Coster）に移し、プレートをVMAXマイクロプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo Park, CA）で450nmの波長で読み取った。
【０３０５】
　ELISA分析により判定したところ、４つのクローン全部がＤＲ分子を発現した。これら４つのクローンの各々が最大のＭＴＸレベルで増殖し、そこにおいて、上記のＭＴＸ感受性についての試験により判定したところ、依然として明らかな増殖が起こっており、そのレベルは30nM〜80nM MXTの範囲であった。次に、クローンを、上記のL243染色およびFACS分析により、細胞表面でＤＲを発現する能力について再度確認した。４つの第1ラウンド増幅物のうちの１つ（クローン５）は、増大したＭＴＸ耐性およびそれに最も良く対応するＤＲ発現の増大の双方を示した（４つのクローン全部が増大したＤＲ発現を示した）。80nMのＭＴＸで増殖したクローン５からの細胞のヒストグラムを図18に示す。図18において、フルオレセインの対数（ｘ軸）は、サンプル中の相対的細胞数に対してプロットしたものである。80nMのＭＴＸにおける増殖は、クローン５の第1ラウンドの増幅を示す。
【０３０６】
　高レベルのＭＴＸで増殖したがそれと同調して生ずるはずのＤＲ発現の高い増大は示さなかった３つのクローンを廃棄処分した。クローン５はとっておき、ＭＴＸの濃度を高めながら増殖させることによりさらなるラウンドの増幅に供した。図19および20は、それぞれ320nMおよび１μMのＭＴＸで増殖したクローン５からの細胞のヒストグラムを示すものである。細胞を上記のようにしてL243で染色しFACScanで分析した。図19および20に示すように、クローン５は同調して起こるはずのＤＲ発現の増大とＭＴＸ耐性の増大を示さなかった。図17〜20の各々からのフルオレセインのピークの下の面積を積分することにより、クローン５が初期の選択物の段階と第3ラウンドの増幅との間で30倍のＤＲ発現の増大を達成したことが示された（１μMのＭＴＸr）。
【０３０７】
　クローン５を続けて分析したところ、クローン５が極めて安定であることが実証された。１μMのＭＴＸで増殖したクローン５（クローン５の１μM ＭＴＸ増幅物と呼ぶ）は、ＭＴＸを含まない培地で２〜３週間増殖でき、明らかなＤＲ発現低下を示さない（細胞表面ELISAアッセイにより判定）。
【０３０８】
実施例９
大量の可溶性Ｔ細胞受容体およびクラスII ＭＨＣ分子の産生
　Ｂ細胞およびＴ細胞の腫瘍（すなわち、リンパ腫および白血病）は本来クローンを発生させることが多く、したがって、腫瘍細胞の表面に担持されるＩｇまたはＴＣＲは腫瘍-特異的抗原として役立ち得る。可溶性形態の腫瘍-特異的Ｉｇが患者を免疫して腫瘍細胞に対する免疫応答を引き起こすのに用いられてきた［Kwakら, (1992) N. Engl. J. Med.
327:1209およびHsuら, (1996) Nature Med. 2:52］。可溶性形態の患者の腫瘍-特異的抗
原を治療目的で用いるには、患者の免疫化が迅速に（すなわち、患者の疾患が治療する意味がなくなるまで進行する前に）行えるように大量の可溶性抗原が短期間に生産されることが要件となっている。特定のペプチドと複合体形成している可溶性クラスII ＭＨＣ分子を用いた自己免疫疾患の治療を可能にするには、大量の可溶性クラスII ＭＨＣ分子が必要とされる［Sharmaら, 前掲］。
【０３０９】
　本発明の方法により、大量の可溶性形態のクラスII ＭＨＣ分子およびＴＣＲが迅速な様式で生産できるようになる。これらの方法は、リンパ腫および白血病の患者を治療するための可溶性ＴＣＲを含んでなる特注の腫瘍細胞ワクチンの製造、並びに自己免疫疾患を治療するための可溶性クラスII ＭＨＣ分子の生産を可能にする。患者の腫瘍細胞により発現されるＴＣＲまたはクラスII ＭＨＣ分子の細胞外ドメインを含む鎖をコードするＤＮＡ配列はＰＣＲを用いてクローニングされる。これらの配列は、トロンビン開裂部位並びにその後に存在する哺乳動物クラスII ＭＨＣヘテロダイマーのα鎖またはβ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列と繋がっている。キメラのＴＣＲまたはクラスII ＭＨＣ分子の各鎖をコードする配列（すなわち、対象の遺伝子）は、本明細書に記載のＳＤ７ベクターのいずれか（例えば、pSRαSD7；実施例１）に挿入され、得られたベクターは増幅ベクター（例えば、pSSD7-DHFR；実施例３）および（所望により）選択ベクター（例えば、pMSD5-HPRT；実施例２）と共にＢＷ5147.G.1.4細胞に同時トランスフェクトする。このトランスフェクト細胞はキメラのＴＣＲまたはクラスII ＭＨＣ分子をその細胞表面上で発現する。トランスフェクト細胞を選択および／または増幅に供して、大量のキメラＴＣＲまたはクラスII ＭＨＣ分子を細胞表面上で発現する増幅された細胞系を得る。これらのキメラタンパク質は、可溶性のＴＣＲまたはクラスII ＭＨＣ分子を得るために、トロンビンで消化することにより細胞表面から切り離すことができる。
【０３１０】
　以下の議論は、増幅された細胞系を用いた可溶性ＴＣＲまたはクラスII ＭＨＣタンパク質の生産を説明するものである。同様のアプローチを用いて、可溶性形態の任意の多重鎖細胞表面タンパク質を生産させることが可能である。
ａ．キメラＴＣＲ鎖をコードするベクターの構築
　ＴＣＲのキメラα鎖をコードする配列を構築する。この配列は、（アミノ末端からカルボキシル末端に向かって）ＴＣＲのα鎖の細胞外ドメイン、その後にトロンビン開裂部位を含むトロンビン受容体から誘導される21個のアミノ酸、その後にクラスII ＭＨＣ分子ＤＲαの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む41個のアミノ酸を含んでいる。同様の構築物を用いて、（アミノ末端からカルボキシル末端に向かって）ＴＣＲのβ鎖の細胞外ドメイン、その後にトロンビン開裂部位を含むトロンビン受容体から誘導される21個のアミノ酸、その後にクラスII ＭＨＣ分子ＤＲβ１の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む42個のアミノ酸を含むＴＣＲのキメラβ鎖を構築する。任意の哺乳動物のクラスII ＭＨＣ αβ対を用いて、キメラＴＣＲ鎖の会合(association)を可能にするＭＨＣ分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列を得ることができる。クラスII ＭＨＣ分子のα鎖とβ鎖との膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むアミノ酸残基の数は１個違っており、一方、双方のＭＨＣの連結点(junction)は、膜貫通ドメインの始点から３番目のアミノ酸残基にある。この配置によってα鎖からのグルタミン酸残基およびβ鎖からのリシン残基が保存され、これらの残基は、クラスII ＭＨＣ分子のヘテロダイマー形成に対して正の効果を有することが示されている［CossonおよびBonifacino (1992) Science 258:659］。
【０３１１】
　トロンビンをコードする配列およびクラスII ＭＨＣ配列を含むベクターは、配列番号31および配列番号33に示すＤＮＡ配列を合成することにより構築する。配列番号31によりコードされるアミノ酸配列を配列番号32に示し、配列番号33によりコードされるアミノ酸配列を配列番号34に示す。
【０３１２】
　配列番号31はトロンビン部位−ＤＲαキメラ配列をコードし、配列番号33はトロンビン部位−ＤＲβ１キメラ配列をコードする。これらの配列を調べることにより、トロンビン部位をコードする５′末端の配列が以下の制限酵素に対する認識部位を含んでいることが示される：BamHI、PvuIおよびFspI。NotI部位は、トロンビン部位−ＤＲβ１キメラ配列の３′末端に位置している。この合成ＤＮＡを好適なベクター（例えば、pUC18またはpUC19）にBamHI−NotI断片として挿入する。これらの配列によってコードされるトロンビン部位はトロンビンにより非常に効率的に切断される。これは、トロンビン開裂部位の後ろにあるヒルジン様ドメインの存在によるものである［Vuら, (1991) Cell 64: 1057およびVuら, (1991) Nature 353:674］。
【０３１３】
　ＴＣＲ鎖をコードするＤＮＡ配列を、細胞系または患者の腫瘍から得られる二本鎖ｃＤＮＡから単離する（二本鎖ｃＤＮＡは、実施例３に記載のプロトコールを用いて作製することができる： SBNSSdTプライマーの代わりにオリゴd(T)を用いて1本目のｃＤＮＡの合成を開始してもよい）。次に、この二本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲに用いるが、この二本鎖は、ヒトＴＣＲのα鎖またはβ鎖を増幅するように設計されたプライマー対を含む。ＰＣＲは、１ユニット/100μlの反応Pfuポリメラーゼ（Stratagene）を含む反応緩衝液（Stratageneより提供されたもの）、細胞系または腫瘍から単離したポリＡ+ＲＮＡから誘導した５ng/100μlのクローン化鋳型または25ng/100μlのｄｓ−ｃＤＮＡ、４種のdNTPの各0.1mM、および0.5μMの各プライマーを用いて行う。ＰＣＲは94℃で15秒、60℃で30秒、続いて75℃で２分を21サイクル行う。
【０３１４】
　ＴＣＲ配列を増幅させるのに用いる５′プライマーは、該プライマーの５′末端にXbaI、EcoRIおよびMluIの制限部位を含んでおり、その後にヒトＴＣＲのＶ領域由来の共通配列を含む18〜21個のヌクレオチドが存在する。したがって、この５′プライマーは、以下の配列を有する縮重プライマーの組を含む：5'-TCTAGAATTCACG CGT(N)18-21-3'（配列番号81）（但し、配列中、Nは任意のヌクレオチドであり、18〜21個のヌクレオチドの伸長は共通Ｖ領域配列に該当する）。以下の３′プライマーを上記共通５′プライマーと連結させて用いて、ヒトＴＣＲα鎖の細胞外ドメインを増幅させた：5′-CGATCGTGGATCCAAGT
TTAGGTTCGTAT CTGTTTCAAA-3'（配列番号35）。ＴＣＲα鎖についての３′側の連結は、α鎖の定常（Ｃ）領域の110位に存在するアスパラギンの後ろで行われる。以下の３′プライマーを上記共通５′プライマーと連結させて用いて、ヒトＴＣＲβ鎖の細胞外ドメインを増幅させた：5'-CGATCGAGGATCCAAGATGGTGGCAGACAGGACC-3'（配列番号36）。ＴＣＲα鎖についての３′の連結は、β鎖のＣ領域の147位に存在するイソロイシンの後ろで行われる。これらの３′プライマーの設計は、双方の場合において（すなわち、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の双方について）ＴＣＲの細胞外ドメインとトロンビン部位との連結が、ＴＣＲ鎖のそれぞれの膜貫通領域の明らかな始点から４番目のアミノ酸残基で行われるようにして行う。双方の３′プライマーはPvuIおよびBamHIの認識部位をそれらの５′末端に含む。これらのプライマーの５′末端に位置する制限部位のために、結果として得られるＴＣＲ鎖を含むＰＣＲ産物が、XbaIまたはEcoRIまたはMluI（５′末端）−BamHIまたはPvuI（３′末端）断片として取り出せるようになり、［BamHIまたはPvuI（５′末端）−NotI（３′末端）断片として］適切なトロンビン−膜貫通ＤＮＡ配列と結合し、しかもいずれのＳＤ７ベクター（例えば、pSR(SD7）にも挿入されるようになる。得られた発現ベクター（キメラＴＣＲのα鎖およびβ鎖の各々について１つ）を、エレクトロポレーションを用いて、増幅ベクターpSSD7-DHFR（実施例３）および選択ベクターpMSD5-HPRT（実施例２）と共にＢＷ5147.G.1.4細胞に同時トランスフェクトする。各プラスミドＤＮＡの使用量（これらのプラスミドはエレクトロポレーションの前に線状にしておく）、エレクトロポレーションの条件、選択および増幅の条件は、上記のとおりとした。得られた増幅された細胞系は、該細胞の表面上でキメラＴＣＲヘテロダイマーを発現する。ＴＣＲは、細胞をトロンビンで消化することにより可溶化させる。トロンビンで可溶化させた細胞外ドメインは、３（ＴＣＲβ）または４（ＴＣＲα）の新規なアミノ酸をＣ末端に有する。
【０３１５】
ｂ．キメラ・クラスII ＭＨＣ鎖をコードするベクターの構築
　クラスII ＭＨＣタンパク質のキメラα鎖をコードする配列を構築する。このキメラα鎖は、（アミノ末端からカルボキシル末端に向って）ＤＲαのα鎖の細胞外ドメイン、その後にトロンビン開裂部位を含むトロンビン受容体に由来する21個のアミノ酸、その後にクラスII ＭＨＣ分子ＤＲαの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む41個のアミノ酸を含んでいる。同様の構築物を用いてクラスII ＭＨＣタンパク質のキメラβ鎖を構築する。このキメラβ鎖は、（アミノ末端からカルボキシル末端に向って）ＤＲβ1のβ鎖の細胞外ドメイン、その後にトロンビン開裂部位を含むトロンビン受容体に由来する21個のアミノ酸、その後にクラスII ＭＨＣ分子ＤＲβ1の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む42個のアミノ酸を含んでいる。
【０３１６】
　クラスII ＭＨＣヘテロダイマーのα鎖およびβ鎖の細胞外ドメインをコードする配列は、ＰＣＲを用いて上記のようにして単離する。但し、ＰＣＲで以下のプライマー対を用いた点が異なる。すなわち、ＤＲαの細胞外ドメインをコードする配列は、5'-ACGCGTCCACCATGGCCATAAGTGGAGTCCCT-3'（配列番号37）（このプライマーは５′末端にMluI部位を含む）および5'-GGATCCAA CTCTGTAGTCTCTGGGAGAG-3'（配列番号38）（このプライマーは５′末端にBamHI部位を含む）を用いて増幅する。これらのプライマーを用いれば、成熟（すなわち、シグナル配列を除去した後の）ＤＲαタンパク質のアミノ酸番号191であるグルタミン酸残基の後でＤＲαの細胞外ドメインとトロンビン部位−膜貫通配列（上記）とが連結できるようになる。
【０３１７】
　ＤＲβ1の細胞外ドメインをコードする配列は、5'-ACGCGTCCACCATGGT GTGTCTGAAGCTCCTG-3'（配列番号39）（このプライマーは５′末端にMluI部位を含む）および5'-GGATCCAACTTGCTCTGTGCAGATTCAGA-3'（配列番号40）（このプライマーは５′末端にBamHI部位を含む）を用いて増幅する。これらのプライマーを用いれば、成熟ＤＲβタンパク質のアミノ酸番号198であるリシン残基の後でＤＲβの細胞外ドメインとトロンビン部位−膜貫通配列（上記）とが連結できるようになる。
【０３１８】
　これらのプライマーの５′末端に位置する制限部位によって、結果として得られるクラスII ＭＨＣ鎖を含むＰＣＲ産物をMluI（５′末端）−BamHI（３′末端）断片として取り出し、適切なトロンビン−膜貫通ＤＮＡ配列［BamHI（５′末端）−NotI（３′末端）断片として］に繋いで、任意のＳＤ７ベクター（例えば、pSR(SD7）に挿入することができるようになる。こうして得られた発現ベクター（キメラ・クラスII ＭＨＣタンパク質のα鎖またはβ鎖の各々についてのもの）を、エレクトロポレーションを用いて、増幅ベクターpSSD7-DHFR（実施例３）および選択ベクターpMSD5-HPRT（実施例２）と共にＢＷ5147.G.1.4細胞に同時トランスフェクトする。各プラスミドＤＮＡの使用量（プラスミドはエレクトロポレーションを行う前に線状化する）、エレクトロポレーションの条件、選択および増幅の条件は上記のとおりとした。得られた増幅された細胞系は、細胞表面でキメラ・クラスIIヘテロダイマーを発現する。クラスII ＭＨＣヘテロダイマーは、細胞をトロンビンで消化することにより可溶化する。
【０３１９】
実施例10
リンパ腫および白血病を治療するための特注多価ワクチンの製造
　B細胞リンパ腫および白血病のワクチン接種（すなわち、能動免疫療法）の既存のアプローチには、B細胞腫瘍の表面で発現される最も多い抗体分子に対応する自己免疫グロブリンのイディオタイプを含んでなる特注ワクチンの作製が含まれる。Ｔ細胞リンパ腫および白血病を治療するための同様のアプローチには、Ｂ細胞腫瘍の表面で発現される最も多いＴＣＲ分子に対応する自己Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）イディオタイプを含んでなる特注ワクチンの作製が含まれるであろう。
【０３２０】
　Ｂ細胞リンパ腫の治療用の特注ワクチンを製造するための既存の方法では、「レスキュ
ーフュージョン(rescue fusion)」法が用いられる。このレスキューフュージョン法には、外科的生検によるリンパ腫細胞の摘出が含まれる。次に、腫瘍細胞を、内在性Ｉｇの分泌能を喪失させたヘテロハイブリドーマ細胞系K6H6/B5と融合させる。腫瘍サンプルの免疫表現型に対応するＩｇを分泌するハイブリッド細胞を拡大増殖させ、分泌されたＩｇをワクチンとしての使用のために精製する［Kwakら (1992), 前掲］。レスキューフュージョンにより作製したこのＩｇは、患者の腫瘍に由来する単一のＩｇに該当する。このＩｇはおそらく腫瘍により発現された優性のＩｇである。したがって、レスキューフュージョンにより作製されるワクチンは一価であり、体細胞の変異体(variant)を含む腫瘍によって発現されるＩｇの全てのコンプレキシティー（複雑度）を提示してはいない。
【０３２１】
　少数の細胞から多価の特注ワクチンを迅速かつ効率的に製造するために、先の実施例に記載した遺伝子増幅技術を用いる。本実施例では、Ｂ細胞リンパ腫の患者に由来する腫瘍-特異的Ｉｇを作製する方法を提供する。しかしながら、ここで概説する一般的なアプローチは、一般的に、腫瘍-特異的タンパク質の作製（すなわち、Ｔ細胞腫瘍の治療用の可溶性ＴＣＲの作製、Ｂ細胞白血病の治療用のＩｇの作製、など）にも適用できる。
【０３２２】
　この新規なアプローチでは、患者のＩｇに対応する可変領域（ＶHおよびＶL）を分子クローニングし、発現ベクターに含まれる適切な定常領域遺伝子と結合させる。Ｃγ３配列またはＣγ４配列のいずれか一方と結合させた患者のＶH領域を含む発現プラスミドおよびＣκ配列またはＣλ２配列のいずれか一方と結合させた患者のＶL領域を含む発現プラスミドを、選択および増幅マーカーpM-HPRT-SSD9-DHFRと共に所望の細胞系（例えば、ＢＷ5147.G.1.4）に（エレクトロポレーションにより）同時トランスフェクトする。次に、このトランスフェクト細胞を先の実施例に記載のようにして選択および増幅に供する。以下に概説する方法は、患者の腫瘍内で見出される体細胞の変異(variation)の程度を反映する多価ワクチンの製造を可能にするものである。これらの新規な多価ワクチン製剤は、B細胞リンパ腫を治療するための優れたワクチンを提供するものであり、現行の一価のワクチンを用いた場合に観察される再発率を低下させるはずである。
【０３２３】
ａ）発現および選択／増殖プラスミドの構築
　以下の構築物では、特に明記しない限り、全ての酵素はNew England Biolabs (NEB)から入手し、製造業者の推奨する緩衝液および反応条件と共に用いる。
【０３２４】
ｉ）pSRαSD9の構築
　２μgのpSRαSD7（実施例10）をSalIおよびHindIIIで切断する（NEBの酵素、緩衝液および条件）。このプラスミドをスペルミン沈殿させ（実施例５）、34μlのH2Oおよび４μlの10×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液に再懸濁する。等モル量（それぞれ6.3ng）の非リン酸化オリゴヌクレオチドSXAPH5（配列番号42）およびSXAPH3（配列番号43）を添加する。反応物を氷上で冷却し、400ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、試験管を14℃で一夜静置する。この連結物を細菌に形質転換し、追加されたAscIおよびPacI制限部位の存在に基づいてクローンをスクリーニングする。このようにして得られたプラスミドをpSRαSD9と命名する。pSRαSD9の概略的マップを図21に示す。
【０３２５】
ii）pSRαSD9CG3C、pSRαSD9CG4C、pSRαSD9CKCおよびpSRαSD9CL2Cの構築
　プラスミドpSRαSD9CG3C、pSRαSD9CG4C、pSRαSD9CKCおよびpSRαSD9CL2Cは、それぞれＣγ３、Ｃγ４、ＣκまたはＣλ２定常領域をコードする配列を含む。これらの発現ベクターに含まれる該定常領域は、天然のタンパク質に見出されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡ配列によりコードされる。しかしながら、これらのＤＮＡ配列は、高度に発現された哺乳動物のタンパク質に最も頻繁に見出されるコドンを利用するように修飾されているものである［Haasら (1996) Curr. Biol. 6:315およびZolotukhinら (1996) J. Virol. 70:4646］。Ｃγ３領域をコードするＤＮＡ配列を配列番号44に示し、配列番号44でコードされるアミノ酸配列を配列番号45に示す。Ｃγ４領域をコードするＤＮＡ配列を配列番号46に示し、配列番号46でコードされるアミノ酸配列を配列番号47に示す。Ｃκ領域をコードするＤＮＡ配列を配列番号48に示し、配列番号48でコードさ
れるアミノ酸配列を配列番号49に示す。Ｃλ２領域をコードするＤＮＡ配列を配列番号50に示し、配列番号50でコードされるアミノ酸配列を配列番号51に示す。
【０３２６】
　配列番号44、46、48および50に対応する二本鎖ＤＮＡを合成する（Operon Technologies）。それぞれの合成ＤＮＡ配列をNotIおよびBglIIで切断し、0.8％SeaPlacqueアガロースゲル（FMC）に流し、β-アガラーゼを用いて以下のようにして回収する。それぞれのＣ領域配列を、pSRαSD9から得た２つのＤＮＡ制限断片に以下のようにして連結する。２μgのアリコートのpSRαSD9をHindIIIおよびBamHIで切断し、2314bpのバンドを単離する。第2の２μgのアリコートのpSRαSD9をHindIIIおよびNotIで切断し、854bpのバンドを単離する。これらの断片を、それぞれの消化物を0.8％のSeaPlacqueアガロース（FMC）に流すことにより単離し、適切なバンドを切出し、マイクロフュージ管中で混合する。アガロースをβ-アガラーゼ（NEB）消化により除去し、ＤＮＡをイソプロパノール沈殿によりNEBが指示するとおりに回収する。
【０３２７】
　配列番号44（NotIおよびBglIIで消化したもの）と上記のpSRαSD9の断片とを連結してpSRαSD9CG3C（図22に示すマップ）を得る。配列番号45（NotIおよびBglIIで消化したもの）と上記のpSRαSD9の断片とを連結してpSRαSD9CG4C（図23に示すマップ）を得る。配列番号46（NotIおよびBglIIで消化したもの）と上記のpSRαSD9の断片とを連結してpSRαSD9CKC（図24に示すマップ）を得る。配列番号47（NotIおよびBglIIで消化したもの）と上記のpSRαSD9の断片とを連結してpSRαSD9CL2C（図25に示すマップ）を得る。
【０３２８】
iii）pM-HPRT-SSD9-DHFRの構築
　pM-HPRT-SSD9-DHFRは、モロニー・エンハンサー／プロモーターの制御下にあるhprt遺伝子およびSV40エンハンサー／プロモーターの制御下にあるdhfr遺伝子を含む。pM-HPRT-SSD9-DHFRを構築するには、まず、ＨＰＲＴ ｃＤＮＡ（実施例２）をpMSD8（以下に記載）にサブクローニングしてpMSD8-HPRTを作製する。次に、pMSD8-HPRTのSalI部位とHindIII部位との間に位置する小さなＤＮＡ断片を、以下のようにしてAscI部位およびPacI部位を含む配列と置き換える。PMSD8-HPRTをSalIおよびHindIIIで消化し、SXAPH5およびSAXPH3オリゴヌクレオチド（配列番号42および43）を、消化したpMSD8-HPRT（上記ｉ節に記載）の末端に連結させて、pMSD9-HPRTを作製する。AscI部位およびPacI部位、モロニー・エンハンサー／プロモーター、ＨＰＲＴ ｃＤＮＡおよびＥＦ１αポリＡ領域を含む約2450bpのSalI−ClaI断片を、pSSD7-DHFR（実施例 ）のSalI部位とClaI部位との間に挿入して、pM-HPRT-SSD9-DHFRを得る。pM-HPRT-SSD9-DHFRのマップを図26に示す。
【０３２９】
　pMSD8はpMSD5と類似しているが、ヒト延長因子１α遺伝子由来のポリＡ部位を含んでいる。pMSD8は以下のようにして構築した。すなわち、ヒト延長因子１α遺伝子由来のポリＡ部位を含む292bpの断片（配列番号78）をＭＯＵ細胞（GM08605、NIGMS Human Genetic
Mutant Cell Repository, Camden, NJ）ゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いて単離した。ＭＯＵゲノムＤＮＡは慣用の技法を用いて単離した。ＰＣＲは、400μlの反応物中、10μgのＭＯＵゲノムＤＮＡおよび最終濃度１μMの各プライマーを用いて行った。反応条件は、94℃で１分、60℃で１分、72℃で1.5分を30サイクルとした。Taq ＤＮＡポリメラーゼはPerkin-Elmerから入手した。以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを開始した：5EF1αポリＡ：5'-GAATTCTTTTTTGCGTGTGGCAG-3'（配列番号79）および3EF1αポリＡ：5'-ATCGATATTCCTTCCCCTTCC-3'（配列番号80）。3EF1αポリＡオリゴヌクレオチドはポリＡ部位の３′末端にClaI部位を生じ、5EF1αポリＡオリゴヌクレオチドはポリＡ部位の５′末端にEcoRI部位を生じる。このＰＣＲ産物をEcoRIおよびClaIで消化することにより292bpのEcoRI/ClaI断片が得られる。
【０３３０】
　pSSD5（実施例１）をPvuIIで消化し、そのPvuII末端にClaIリンカー（NEB、非リン酸化物）を連結して、SV40ポリＡ部位の３′末端に位置するPvuII部位をClaI部位に変換した。次に、得られた構築物をSalIおよびClaIで消化し、プラスミドバックボーン（例えば、AmpR遺伝子およびプラスミドORI）を含む約2.1kbの断片を単離し、ヒト延長因子１α遺伝子のポリＡ部位を含む292bpのEcoRI/ClaI断片と共に、pMSD5（実施例１）から単離したモロニー・エンハンサー／プロモーター、スプライス供与部位／受容部位およびポリリンカーを含む約870bpのSalI/EcoRI断片と連結して、pMSD8を得た。
【０３３１】
ｂ）腫瘍細胞の採取
　細胞は、肥大したリンパ節の外科的生検または罹患(effected)リンパ節の細針生検のいずれかにより採取する。生検サンプルはドライアイス上で急速冷凍する。
【０３３２】
ｃ）腫瘍細胞からのＲＮＡの単離
　ＲＮＡの単離は、上記の生検サンプルから各種の標準的技法または市販のキットを用いて行う。例えば、組織サンプルからのＲＮＡの単離を可能にするキットはQiagen, Inc. （Chatsworth, CA）およびStratagene（LaJolla, CA）からそれぞれ入手可能である。全ＲＮＡが組織および腫瘍から当業者に公知の多くの方法により単離でき、その単離を容易にするために市販のキットが利用可能である。例えば、RNeasy（登録商標）キット（Qiagen Inc., Chatsworth, CA）にはプロトコール、試薬およびプラスチック用品が備わっていて、製造業者の説明書に何の改良を加えてなくとも約20分間で全ＲＮＡが組織、培養細胞または細菌から単離できるようになっている。ｍＲＮＡの場合にはさらに濃縮することが望ましいはずであり、その混合物中に含まれるポリアデニル化ＲＮＡは、Oligotex（登録商標）キット（Qiagen）のようなキットを使用することにより、オリゴ-デオキシチミジン・マトリックスに結合させることで特異的に単離できる。これらの工程の両方のための同様の単離キットは多くの業者から入手可能である。
【０３３３】
　さらに、ＲＮＡは、生検試料などのサンプルから、ホモジネートした組織を0.22M NaCl、0.75mM MgCl2、0.1M Tris-HCl（pH 8.0）、12.5mM EDTA、0.25％ NP40、１％ SDS、0.5mM DTT、500u/ml胎盤RNAseインヒビターおよび200μg/ml プロティナーゼＫを含有する緩衝液中に溶解させることにより簡便に抽出してもよい。37℃で30分間インキュベートした後で、ＲＮＡをフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿によりＲＮＡを回収する。
【０３３４】
　全細胞性ＲＮＡを患者の腫瘍サンプルから単離するための特に好ましい方法は、RNAzol法（Teltest,Inc., Friendswood, TX）であり、この方法は製造業者の説明書にしたがって行う。
【０３３５】
ｄ）腫瘍細胞からのＩｇ遺伝子のクローニング
　再編成した免疫グロブリン遺伝子の第1および第3の相補性決定領域（ＣＤＲ）は保存配列で挟まれているので、その特異的抗体のヌクレオチド配列について特別な知識がなくとも、Ｉｇ発現性腫瘍細胞に由来するｍＲＮＡから可変領域のｃＤＮＡを増幅することができるＰＣＲプライマーを設計することが可能である。患者の腫瘍から可変領域を単離するのに適するプライマーは以下のようにして得られる。
【０３３６】
　腫瘍から単離した全細胞性ＲＮＡを用いて、実施例３に記載のようにして二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを作製する。但し、ポリＡ+ＲＮＡの代わりに20μgの全細胞性ＲＮＡを用いる点が異なる。それぞれのＰＣＲ反応について、５％のｄｓ ｃＤＮＡ調製物を用いる。［あるいはまた、ｄｓ ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）の技法を用いて作製してもよい。使用者が組織から始めてＰＣＲ産物を得られるようにするキットはPerkin-Elmer（Norwalk, CT）およびStratagene（LaJolla, CA）から入手可能である。ＲＴ−ＰＣＲ法では、ＲＮＡの逆転写を用いることにより、遺伝子のコード領域の選択されたセグメントに対応する一本鎖ｃＤＮＡが得られる。次に、この一本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲでの鋳型として用いる。］
　ＰＣＲ反応は最終容量50μlで行い、１×Pfu緩衝液（Stratagene）、全4種類のdNTPをそれぞれ100μM、プライマーをそれぞれ0.5μM、Pfuポリメラーゼ（Stratagene）および５％の上記ｄｓ ｃＤＮＡ調製物を含む。反応物を以下の熱的サイクルにかける：94℃で
15秒、60℃で30秒、75℃で1.5分を15〜30サイクル。15サイクル、20サイクル、25サイクルおよび30サイクル後にアリコート（５μl）を取り出して、一次ＰＣＲ産物の出現を調べる。次に、クローニングを行う目的で、正しいＶ領域プライマーを用いた200μlの分取反応（preparative reaction）を行う。
【０３３７】
　患者の腫瘍からのＩｇ配列を得るためのＰＣＲ反応を行う前に、市販の抗体を用いて腫瘍を免疫表現型に分類して、重鎖および軽鎖のイソ型を判定する。これにより、ＰＣＲの回数を最少に抑えることができる。例えば、患者の腫瘍により発現されるＩｇがμ重鎖およびκ軽鎖を利用するならば、ＣγプライマーおよびＣλプライマーを含む以下に記載のＰＣＲ反応を行う必要がなくなる。しかし、（免疫表現型の結果によれば）患者の腫瘍により利用されない重鎖および軽鎖のイソ型に対応するＰＣＲプライマーを用いることは、免疫表現型の結果を確認するための簡便な手段として役立つ。
【０３３８】
　患者の腫瘍に特異的なＩｇの可変領域をクローニングするのに用いるＰＣＲプライマーを表１〜３に示す。
【０３３９】
【表１】
2004035562.tif 000002
【０３４０】
【表２】
2004035562.tif 000003
【０３４１】
【表３】
2004035562.tif 000004
　VH1-6Lプライマーは、５′末端にXbaI、EcoRIおよびMluIの認識部位を含んでいる。３つのJHプライマーは、５′末端にApaIおよびSalIの認識部位を含んでいる。７つのＶκプライマーは、５′末端にXbaI、EcoRIおよびMluIの認識部位を含んでいる。Ｃκプライマーは、５′末端にBspEIおよびAflIIIの認識部位を含んでいる。６つのＶＬプライマーは、５′末端にXbaI、EcoRIおよびMluIの認識部位を含んでいる。Ｃλプライマーは、５′末端にKasIおよびAvrIIの認識部位を含んでいる。
【０３４２】
　各腫瘍サンプルについて、５つのVHＰＣＲ反応を行う。それぞれのＶH反応は、ＣμプライマーおよびＣγプライマーを含む。Ｃμプライマー(配列番号59)は、ＩｇＭ陽性腫瘍で発現される重鎖Ｖ（ＶH）領域についての約590bpの産物を生ずるはずである。Ｃγプライマー（配列番号58）はＩｇＧ陽性腫瘍で発現される重鎖Ｖ領域についての約480bpの産物を生ずるはずである。ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ４プライマー（それぞれ、配列番号52〜55）は別々のＰＣＲ反応に用い、ＶＨ５およびＶＨ６プライマー（それぞれ、配列番号56および57）は一緒に同じ反応で用いる。ＶHプライマーは、ＣH領域プライマーと一緒に用いた場合には、予想どおりのサイズのＰＣＲ産物を生じ、次にこれをJH1245、JH3またはJH6プライマー（それぞれ、配列番号60〜62）のいずれかを含む３つの別個のＰＣＲ反応に用いて、患者の腫瘍により発現されるＩｇ中に存在する可変（Ｖ）領域、多様性（Ｄ）領域および結合（Ｊ）領域に対応するＰＣＲ産物を得る。次に、このＶＤＪ反応産物を５′XbaI、EcoRIまたはMluI部位および３′SalIまたはApaI部位を用いてpSRαSD9CG3CベクターまたはpSRαSD9CG4Cベクターにサブクローニングして、γ３またはγ４定常ドメインに連結された患者の重鎖可変ドメインをコードする発現ベクターを得る。当業者であれば理解されるように、このＰＣＲ産物を、該ＰＣＲ産物の内部（すなわち、Ｉｇ配列の内部）に部位が存在していない制限酵素を用いて発現ベクターにサブクローニングする。このＰＣＲ産物は、所望の発現ベクターにサブクローニングするに先立って、ＰＣＲプライマーの内部に部位が存在している制限酵素で消化して、該ＰＣＲ産物に所与の制限酵素に対する内部部位が存在していないことを確認する。MluI部位がゲノム中に非常に頻繁に見出されると仮定した場合、それぞれのＰＣＲ産物について５′MluI部位が利用できると予想される。しかしながら、ある特定のＰＣＲ産物に内部MluI部位が含まれる場合、５′プライマーはまたXbaIおよびEcoRI部位も含む。以下の制限酵素（上記の３′ＰＣＲプライマー中に認識部位を有するもの）を、まず、下記ＰＣＲ産物に対して内部を切断する能力がないことについて調べる。つまり、SalIは重鎖ＰＣＲ産物について；AflIIはκ軽鎖ＰＣＲ産物について；AvrIIはλ軽鎖ＰＣＲ産物について調べる。上記で述べたように、それぞれの３′ＰＣＲプライマーは別の制限酵素部位を付与する。
【０３４３】
　発現ベクターの選択に関しては、pSRαSD9CG3Cベクターが始めに選択される。その理由は、Cγ３がヒトにおいて最も低い頻度で用いられるイソ型であり（Ｃγ４が次に低い頻度で用いられるイソ型であり、Ｃγ１およびＣγ２が最も高い頻度で用いられるイソ型である）、そのために、Cγ３を含んでなるワクチンを用いる免疫化に後続して行われるELISAは実施が容易であり、患者の抗-イディオタイプ応答が主にγ１およびγ２イソ型に存すると判断されるからである。しかしながら、所与のCγ３構築物が、精製の際に溶液から析出(fall out)する傾向のあるＩｇタンパク質を産生する場合には、Ｃγ３よりもCγ４を選択してもよい。
【０３４４】
　各腫瘍サンプルについて、５つのＶκ ＰＣＲ反応を行う。それぞれのＶκ ＰＣＲ反応は、Ｃκプライマー（配列番号70）を含む。ＶκＩ、ＶκIIおよびVκIIIプライマー（それぞれ、配列番号63〜65）は別々の反応で行う。VκIVおよびVκＶプライマー（それぞれ、配列番号66および67）は１つのＰＣＲ反応物に組合せて用い、ＶκVIaおよびVκVIbプライマー（それぞれ、配列番号68および69）は別のＰＣＲ反応に組合せて用いる。予想どおりのサイズ（約480bp）のＰＣＲ産物を生ずるＰＣＲ反応を、患者Ｉｇの軽鎖に由来する可変ドメインをコードするＤＮＡの供給源として用いる。陽性の反応産物を、５′XbaI、EcoRIまたはMluI部位および３′AflIIまたはBspEI部位を用いてpSRαSD9CKCベクターにサブクローニングする。
【０３４５】
　各腫瘍サンプルについて、６つのVλ ＰＣＲ反応を実験する。それぞれのＶκＰＣＲ反応は、Ｃλプライマー（配列番号77）を含む。ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ６およびＶＬ８プライマー（それぞれ、配列番号71〜76）は別々の反応で使用する。予想どおりのサイズ（約420bp）のＰＣＲ産物を生ずるＰＣＲ反応物を、患者Ｉｇの軽鎖に由来する可変ドメインをコードするＤＮＡの供給源として用いる。陽性の反応産物を、５′XbaI、EcoRIまたはMluI部位および３′AvrIIまたはKasI部位を用いてpSRαSD9CL2Cベクターにサブクローニングする。当業者であれば、腫瘍細胞がκ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかを発現することを理解するであろう。したがって、ＰＣＲ産物は、ＶκまたはＶλ ＰＣＲのいずれか一方から回収されるものであり、それらの双方から回収されるものではないことが予想される。
【０３４６】
ｅ）哺乳動物細胞での腫瘍-特異的Ｉｇの発現および増幅
　患者の腫瘍で見出される重鎖および軽鎖の可変領域に由来する配列を含む発現ベクターが構築されたら、これらのプラスミドを用いて、慣用の技法を用いて大腸菌を形質転換する。各サブクローニングから得られる18〜24個のコロニーを、ミニプレップＤＮＡ（１〜1.5mlの培養物）の制限酵素分析により重鎖および軽鎖のインサートについて適宜スクリーニングする。等しいアリコートの陽性サブクローンを用いて大量培養物（約250ml）に接種し、そこから、エレクトロポレーション用のＤＮＡを調製する。これにより、腫瘍の集団中の体細胞の変異体が単離され、その結果、これらの体細胞変異体を発現するトランスフェクタント（例えば、ＢＷ5147.G.1.4トランスフェクタント）が得られるようになる。
【０３４７】
　さらに体細胞の変異体の存在を判定するために、約100pgの各ミニプレップＤＮＡおよび適切なＶ領域プライマーおよびＣ領域プライマーを用いて20μlのＰＣＲ反応を行う。得られたＰＣＲ産物を４個の塩基を認識する幾つかの制限酵素で消化することにより、体
細胞の変異体が識別できるようになる。さらに、個々のサブクローンについてＤＮＡ配列決定を行って、クローニングした重鎖および軽鎖可変領域を含むサブクローンのプール中での体細胞の変異体の存在を実証することができる。
【０３４８】
　患者Ｉｇ由来のキメラ重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを、以下のようにして、pM-HPRT-SSD9-DHFRと共にＢＷ5147.G.1.4細胞にエレクトロポレーションする。すなわち、Ｉｇ発現プラスミド（腫瘍Ｉｇ内で見出される体細胞の変異体を含むベクターの混合物を含むもの）をAscIまたはPacIで消化することにより線状にする。pM-HPRT-SSD9-DHFRをAscIまたはPacIで線状にする。pM-HPRT-SSD9-DHFRおよびＩｇ発現プラスミドを１：20〜50の比率で用いる。約15μgのpM-HPRT-SSD9-DHFR（10〜20μg）を用い、全部で約500μgの発現ベクターを用いる。線状にしたプラスミドを実施例７で記載したようにして消化し、沈殿させ、0.5mlのエレクトロポレーション用緩衝液［すなわち、１×HBS(EP)］に再懸濁する。線状化プラスミドを含む0.5mlのエレクトロポレーション用緩衝液を２×107個の細胞（例えば、ＢＷ5147.G.1.4）を含む0.5mlのエレクトロポレーション用緩衝液と混合し、実施例７で記載したようにしてエレクトロポレーションする。次に、細胞を実施例７および８で記載したようにして選択培地で増殖させ、続いてＭＴＸ含有培地で増殖させる。選択培地で増殖したクローンを、標準的な技法（例えば、ELISA）を用いてクローン化Ｉｇタンパク質の発現能について確認する。次に、高レベルのクローン化Ｉｇタンパク質を発現する一次選択物を、実施例７および８に記載したようにしてＭＴＸ含有培地で増殖させて、トランスフェクト遺伝子を増幅させる。単一のＤＮＡ片（すなわち、pM-HPRT-SSD9-DHFR）上に選択および増幅マーカーが存在していれば、対象の遺伝子（すなわち、Ｉｇタンパク質）を高レベルで発現する一次トランスフェクタント（すなわち、ＨｘおよびＡｚを含有する培地で増殖可能な細胞）がＤＨＦＲ遺伝子を組込んでいないことを懸念しなくてもよい。
【０３４９】
ｆ）増幅した細胞系からの腫瘍-特異的Ｉｇの精製
　増幅した細胞系により（pSRαSD9CG3CまたはpSRαSD9CG4Cベクターのいずれかを用いて）発現される腫瘍-特異的Ｉｇの精製は、培養上清をプロテインＧ Sepharose（Pharmacia）でクロマトグラフィーすることにより行う。プロテインＧはＩｇＧ3およびＩｇＧ4の双方と結合する。このクロマトグラフィーは製造業者の説明書に従って行う。腫瘍-特異的ＩｇがpSRαSD9CG4Cベクターを用いて産生される場合には、プロテインＡ Sepharose（Pharmacia）もまた精製に用い得る。
【０３５０】
ｇ）腫瘍-特異的Ｉｇ（多価ワクチン）の投与
　精製した腫瘍免疫グロブリン-イディオタイプ・タンパク質は、患者に投与するに先立って、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Calbiochem, San Diego, CA）のようなタンパク質担体とコンジュゲートを形成していてもよい。免疫グロブリン-イディオタイプ・タンパク質をＫＬＨとコンジュゲート形成させる場合には、当業界で公知の方法［Kwakら (1992), 前掲］を用いてＫＬＨを内毒素が全くない状態にする。例えば、ＫＬＨをQAE Zeta Prep 15ディクス（LKB, Broma, Sweeden）に塗布して、1000ユニット／ml未満の内毒素を含有するＫＬＨの調製物を作製する。等容量のフィルター滅菌した精製ＫＬＨおよび精製免疫グロブリン-イディオタイプ・タンパク質（それぞれ、１mg/mlの濃度）を共に混合する。無菌グルタルアルデヒドを最終濃度が0.1％となるように添加する。次に、Ｉｇ−ＫＬＨコンジュゲートを生理的食塩水で徹底的に透析して、過剰なグルタルアルデヒドを取り除く。
【０３５１】
　精製した（コンジュゲート化または非コンジュゲート化）免疫グロブリン-イディオタイプ・タンパク質をＳＡＦ−１（Syntex aduvantformulation １；Roche）のような免疫アジュバントまたはヒトへの投与が現在承認されている、または次に承認されるであろう他のアジュバント［例えば、QS-21（PerImmune, Inc., Rockville, MD）］と混合する。精製した免疫グロブリン-イディオタイプ・タンパク質を所望のアジュバントと乳化させ、０週間目、２週間目、６週間目、10週間目および14週間目に皮下注射する。24週間および28時間後に追加免疫注射を行ってもよい。各注射剤は、0.5mgの精製した腫瘍-特異的イディオタイプ免疫グロブリン（ＫＬＨと１：１でコンジュゲートを形成していてもよい）を含有する。
【０３５２】
　免疫グロブリンイディオタイプ・タンパク質に対する免疫応答を追加刺激(boost)するために外来性担体タンパク質としてＫＬＨを使用する代わりに、イディオタイプ・タンパク質とサイトカイン（例えば、GM-CSF、IL-2またはIL-4）とを含んでなる融合タンパク質を用いてもよい［PCT国際出願PCT/US93/09895、公開WO94/08601号、TaoおよびLevy (1993) Nature 362:755 並びにChenら(1994) J. Immunol. 153:4775］。これらの融合タンパク質では、所望のサイトカインをコードする配列を、免疫グロブリン・イディオタイプ・タンパク質をコードする配列の３′末端に付加する。本発明は、B細胞リンパ腫を治療するためのイディオタイプ−サイトカイン融合タンパク質の使用を意図するものである。患者の免疫グロブリン・タンパク質の重鎖をコードする配列は、上記のようにしてクローニングし、所望のサイトカインをコードする配列を含む発現ベクターに挿入して、融合タンパク質が（アミノ末端からカルボキシル末端に向って）患者の腫瘍-特異的免疫グロブリンの重鎖および該所望のサイトカインを含むようにする。
【０３５３】
　外来性担体タンパク質、サイトカインまたは免疫アジュバントを使用する代わりに、精製した免疫グロブリン-イディオタイプ・タンパク質でパルスした自己樹状細胞を用いてもよい［例えば、Hsuら (1996), 前掲およびPCT国際出願PCT/US91/1683、公開WO91/13632号を参照］。ヒト樹状細胞を末梢血から単離する方法は当業界では公知である［Mehtaら(1994) J. Immunol. 153:996およびTakamizawaら (1995) J. Clin. Invest. 95:296］。簡単に説明すると、患者を細胞分離装置（COBE）を用いて白血球搬出する。末梢血単核細胞（PBMC）をFicoll-Hypaque（Pharmacia）で分離することにより回収する。次に、単球を不連続Percoll（Pharmacia）勾配で遠心分離することにより除去する。次に、単球を除去したＰＢＭＣをイディオタイプ・タンパク質（２μg/ml）を含む培地（患者の自己血清を10％含むRPMI 1640）に入れる。10％CO2を含む加湿雰囲気中で37℃で24時間インキュベートした後、15％および14％（wt/vol）のメトリザマイド勾配で逐次遠心分離を行うことにより樹状細胞をリンパ球から分ける。次に、この調製物を50μg/mlのイディオタイプ・タンパク質を含む培地中で14〜18時間インキュベートする。次に、細胞を洗浄して遊離の抗原（すなわち、イディオタイプ・タンパク質）を取り出し、５％自己血清を含む無菌食塩水に入れ、静脈内投与する。
【０３５４】
　続いて各患者について、イディオタイプ-特異的抗体の産生を測定する。処置した患者から単離したＰＢＭＣのin vitroでの増殖的応答［５日間のin vitro培養物中でミリリットル当たり０〜100μgの可溶性タンパク質を用いて、ＫＬＨ、ならびに（もしも用いられるとしたら）免疫グロブリン・イディオタイプに対する応答］を測定してもよい。これらのアッセイは、それぞれの免疫化の直前および最後の免疫化の１〜2ヶ月後に行われる。患者を、物理的試験、ルーチンな実験室研究およびルーチンな放射線写真研究により疾患活性についてモニターする。リンパ節または皮膚リンパ腫塊の退縮をコンピューター連動断層撮影（ＣＴ）で確認してもよい。さらに、Hsuら(1996), 前掲に記載のようにして腫瘍-特異的ＣＤＲ３分析を用いて残りの疾患を測定することができる。
【０３５５】
ｈ）Ｔ細胞腫瘍の治療
　患者のＴ細胞腫瘍（すなわち、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫）から誘導される可溶性T細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質を含むワクチンは、実施例９に記載の方法を用いて製造する。但し、上記の個々の選択および増幅ベクターの代わりにpM-HPRT-SSD9-DHFRを用いる点が異なる。トロンビン可溶化ＴＣＲタンパク質を、ヒトαβＴＣＲ上の同一構造性の（monomorphic）決定基［例えば、mcab T10B9.1A-31（Pharmingen, San Diego, CA）；mcab BMA031（Immunotech, Westbrook, ME）；mcab BW242/412.8A3または3A8（Serotec, Washington, DC）］に対するモノクローナル抗体（mcab）を含む樹脂でのクロマトグラフィーにより精製する。ＴＣＲ上の同一構造性の（すなわち、インバリアントな）決定基に対する抗体は、全てのαβ ＴＣＲを認識する。
【０３５６】
　精製した腫瘍-特異的イディオタイプＴＣＲタンパク質は、精製した腫瘍-特異的イディオタイプＩｇタンパク質について上記したようにして（すなわち、免疫アジュバントとの混合、タンパク質担体とのコンジュゲート形成、ＴＣＲ−サイトカイン融合タンパク質の使用、ＳＡＦ−１のような精製ＴＣＲタンパク質でパルスした樹状細胞の使用、など）投与する。続いて、患者を、上記のようにしてイディオタイプ-特異的抗体の産生について測定する。患者を、物理的試験、ルーチンな実験室研究およびルーチンな放射線写真研究により疾患活性についてモニターする。
【０３５７】
　上記から、本発明が細胞内で組換え遺伝子を増幅および発現させるための改善された方法を提供することは明らかである。そのようにして得られる増幅された細胞系は、組換えタンパク質を短時間のうちに大量に提供する。大量の組換えタンパク質を短時間のうちに生産する能力は、患者の腫瘍に特有のタンパク質をワクチン接種のような治療目的で用いる場合に特に有利である。
【０３５８】
　上記明細書中に記載される全ての刊行物および特許は、参考として本明細書に組み入れるものとする。記載の方法および系の様々な修正および改変は、本発明の範囲および精神を逸脱することなしに当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施態様にからめて記載されているが、請求する発明はそのような特定の実施態様に不当に限定されるべきではないと理解すべきである。事実、本発明を実施するための記載の態様の、分子生物学または関連の分野に習熟する者にとって明らかな種々の修正は、以下のクレームの範囲内であるとされる。
【図面の簡単な説明】
【０３５９】
【図１】図１は、発現ベクターpSSD5の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図２】図２は、発現ベクターpSSD7の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図３】図３は、発現ベクターpSRαSD5の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図４】図４は、発現ベクターpSRαSD7の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図５】図５は、発現ベクターpMSD5の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図６】図６は、発現ベクターpMSD7の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図７】図７は、発現ベクターpHEF1αASD5の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図８】図８は、発現ベクターpHEF1αASD7の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図９】図９は、発現ベクターpHEF1αBSD5の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図１０】図10は、発現ベクターpHEF1αBSD7の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図１１】図11は、発現ベクターpMSD5-HPRTの地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図１２】図12は、発現ベクターpSSD7-DHFRの地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図１３】図13は、発現ベクターpJFE 14の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図１４】図14は、発現ベクターpJFE 14ΔIL10の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図１５】図15は、発現ベクターpSRαSD-DRα-DAFの地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図１６】図16は、発現ベクターpSRαSD-DRβ1-DAFの地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図１７】図17は、L243モノクローナル抗体で染色された、ヒポキサンチンおよびアザセリン中での増殖に関して選ばれたクローン５細胞を示すヒストグラムである。
【図１８】図18は、L243モノクローナル抗体で染色された、80 nMのＭＴＸ中での増殖に関して選ばれたクローン５細胞を示すヒストグラムである。
【図１９】図19は、L243モノクローナル抗体で染色された、320 nMのＭＴＸ中での増殖に関して選ばれたクローン５細胞を示すヒストグラムである。
【図２０】図20は、L243モノクローナル抗体で染色された、１μMのＭＴＸ中での増殖に関して選ばれたクローン５細胞を示すヒストグラムである。
【図２１】図21は、発現ベクターpSRαSD9の地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図２２】図22は、発現ベクターpSRαSD9CG3Cの地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図２３】図23は、発現ベクターpSRαSD9CG4Cの地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図２４】図24は、発現ベクターpSRαSDCKCの地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図２５】図25は、発現ベクターpSRαSDCL2Cの地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図２６】図26は、選択および増幅ベクターpM-HPRT-SSD9-DHFR地図を示す。所定の制限酵素部位を示してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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