(57)【要約】【課題】液中での反応効率が高く特異的な核酸増幅が可能になる。また、操作が簡単ですぐに結果が出る実用性の高い核酸検出方法を提供する。【解決手段】化学的に修飾されたビーズにプライマーを付加させる工程、前記プライマーが付加されたビーズ上で核酸増幅反応を行う工程を有する核酸増幅方法、および核酸検出方法。【選択図】　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的に修飾されたビーズにプライマーを付加させる工程、前記プライマーが付加されたビーズ上で核酸増幅反応を行う工程を有する核酸増幅方法。
【請求項２】
前記化学的に修飾されたビーズは、ビーズ表面がカルボキシル基で被覆されたものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記核酸増幅反応は、プライマーを化学的に修飾されたビーズに結合させて行うことを特徴とする請求項１または２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
前記化学的に修飾されたビーズとプライマーとの結合は、カルボジイミドカップリング反応によるものであることを特徴とする請求項３に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
前記核酸増幅反応が、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法またはＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
前記核酸増幅反応の際に標識物質を取り込み、前記標識物質を検出する工程を有することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
前記標識物質が、Ｃｙ３、ビオチン、またはアミノアリルであることを特徴とする請求項７に記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の核酸増幅反応が、核酸変異検出に利用されることを特徴とする核酸変異検出方法。
【請求項１０】
前記核酸変異検出が１塩基多型（ＳＮＰｓ）検出であることを特徴とする請求項９に記載の核酸変異検出方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の核酸増幅反応が、臨床用として行われることを特徴とする核酸検出システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸増幅方法に関する。特に、複数の増幅領域があっても非特異的反応が生ずる恐れがなく、かつ臨床現場での適用可能性の高い核酸増幅方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、液中における核酸増幅反応は、１種類のサンプルをモニタリングするのに２本のプライマーを用いて、鋳型となる核酸に対してターゲット領域を１０万倍以上に増幅する。検出方法に関しては、タックマン（ＴａｑＭａｎ）ＰＣＲ法、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法、およびスナイパー（ＳｎｉＰｅｒ）法等で一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：以下ＳＮＰｓという）の検出が行われてきた。
【０００３】
一方、ビーズを核酸検出に用いることが行うことが知られている。また、特開２００２−８５０９７号公報には、ＤＮＡ断片をビーズに固定し、ＤＮＡ断片の他端にオリゴマーを付加させる反応が開示されている。しかし、特開２００２−８５０９７号公報は、ビーズを化学的に修飾することおよび増幅反応を行うことは開示していない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来のＳＮＰタイピングにおいては、▲１▼工程数が多い、▲２▼アレル特異的プローブの５’末端に蛍光物質が２種類必要である、および▲３▼ＳＮＰｓのタイピングの前に増幅反応を行う必要がある、▲４▼複数の増幅領域がある場合に非特異的な増幅が生じてしまうという欠点を持っている。（中村裕輔編集「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」中山書店ｐ．ｐ．９４〜１０５等）
一塩基多型の検出のために核酸増幅反応を行うときには、複数の増幅領域を同じ反応系で増幅させるため２種類以上のプライマーが必要となり、１塩基の違いを判別することができず、非特異的な増幅が生じてしまう（図４）。また、臨床現場での実現という観点から、複雑な検出機構の回避を行わなければならない。
【０００５】
臨床現場では、技師等が検査を行うことが多いため、複雑な操作を行うことは好ましくない。
よって、複数の増幅領域を有する場合でも非特異的増幅を阻害するとともに、操作が簡単で、すぐに結果が出る実用性の高い検出システムの開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ビーズ上で拡散増幅反応を行うことで上記課題を解決した。即ち、第１に本発明は、化学的に修飾されたビーズに合成オリゴヌクレオチドであるプライマーを付加させる工程、前記プライマーが付加されたビーズ上で核酸増幅反応を行う工程を有する核酸増幅方法である。
【０００７】
本発明で言うビーズとは、ポリスチレン、ガラス、セラミックス、磁性体製等の直径数ミクロン程度の微小粒子であり、マイクロスフィアとも呼ばれているものである。本発明では、ビーズは限定されず、ポリスチレン製が好ましく例示される。
【０００８】
前記核酸増幅反応は、プライマーを化学的に修飾されたビーズに結合させて行うことが好ましい。プライマーと化学的に修飾されたビーズを結合させる連結基は特に限定されないが、カルボジイミドカップリング反応によるものが好ましく例示される。この場合、具体的には、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）が好ましく用いられる。
【０００９】
前記核酸増幅反応としては限定されないが、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法やＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が好ましい。ＬＡＭＰ法はＰＣＲ法とは異なり常温で行うことができるので、ポリスチレン製のビーズを用いる場合でも、球形ビーズの変形を防止するという効果もある。
前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、特に変異したＤＮＡまたはＲＮＡであることができる。
【００１０】
第２に、本発明は、上記各工程に加えて、前記核酸増幅反応の際に標識物質を取り込み、前記標識物質を検出する工程を有することができる。ビーズを用い、蛍光発光を検出する方法は既に知られており、これら検出技術を本発明に適用することができる。前記標識物質は限定されないが、Ｃｙ３等の蛍光物質、またビオチン、またはアミノアリルを介して蛍光物質によって検出する方法が好ましく例示される。
【００１１】
第３に、本発明は、上記核酸増幅反応を利用した核酸配列決定方法であり、第４に、核酸変異検出方法である。特に、前記核酸変異検出が１塩基多型（ＳＮＰｓ）であり、遺伝子診断に用いられると効果的である。
【００１２】
第５に、本発明は、上記核酸増幅反応が、臨床用として行われることを特徴とする核酸検出システムである。
【００１３】
本発明によれば、一方のプライマーをビーズ上に固定し、目的の遺伝子だけを特異的に増幅させることが可能である。また、ビーズはＤＮＡマイクロアレイまたはＤＮＡチップなどの固体表面と異なり、反応液中に浮遊するので反応効率が高いという利点がある。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の実施例以下に示す。
本実施例において、ビーズは、ポリスチレン製、カルボキシル基で被膜された直径５．５μｍのビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製）を用いた。結合するＤＮＡは、５’末端を炭素スペーサー（Ｃ６）を介してアミノ化した。このＣ６スペーサーと、プライマー配列の間の塩基によるスペーサーは任意である。このＤＮＡを、カップリング剤にＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いてカルボジイミドカップリング反応によって、ビーズ上に共有結合させた。
【００１５】
検出は、ＰＣＲ反応の際に、Ｃｙ３−ｄＵＴＰもしくはビオチン−ｄＵＴＰもしくはアミノアリル−ｄＵＴＰを取り込むことによりＣｙ３またはフィコエリスリンの蛍光を検出する。
【００１６】
ビーズへのプライマーの結合は以下の通りとした。
［１］２００μｌのビーズ（２．５×１０６個／ｍｌ）をチューブに移す。
［２］ビーズを１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄みを取り除く。
［３］５０μｌの０．１Ｍ　ＭＥＳ　ｐＨ４．５（２［Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ；ＭＥＳ　０．９７６ｇ，　５Ｎ　ＮａＣｌ）と合成オリゴヌクレオチド　Ｐｒｉｍｅｒ１（１ｍＭ，　１μｌ）を加える。
［４］２．５ｕｌのＥＤＣ（ＥＤＣ　０．０１ｇ，　滅菌蒸留水　１ｍｌ）溶液をビーズのサンプルに加える。
［５］暗室で３０分間インキュベートする。
［６］ＥＤＣ溶液を再調節し、［４］〜［５］を繰り返す。
［７］ビーズを１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上澄みを取り除く。
［８］ビーズに１ｍｌのＴｗｅｅｎ２０（０．０２％ｖ／ｖ）を加える。
［９］混合液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心して上澄みを取り除く。
［１０］１ｍｌのＳＤＳ　０．１％ｗ／ｖ（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｄｏｄｅｃｙｌ　Ｓｕｌｐｈａｔｅ）を加える。
【００１７】
次にＬｕｍｉｎｅｘ１００システムによって結合確認を行った。検出のためのハイブリダイゼーションは以下の通りとした（図１）。
［１］１種類のビーズ当り５，０００個になるようにＴＭＡＣ（ＴｅｔｒａＭｅｔｈｙｌＡｍｍｏｎｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　：ＴＭＡＣ　５０ｍｌ；５Ｍ　ＴＭＡＣ　３０ｍｌ，　　２０％　Ｓａｒｃｏｓｙｌ　（ｓｏｄｉｕｍ　Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌ−ｓａｒｃｏｓｉｎｅ）　２５０μｌ，　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０　２．５ｍｌ，　０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ＥｔｈｙｌｅｎｅＤｉａｍｉｎｏＴｅｔｒａ−Ａｃｅｔａｔｅ）ｐＨ８．０　４００μｌ）３０μｌにビーズを溶かし、５５℃でインキュベートする。
［２］１μＭのビーズに結合させたオリゴヌクレオチドＰｒｉｍｅｒ１と相補的な配列で、５’末端をビオチン化されたオリゴヌクレオチド１μＭ，１μｌと蒸留水４９μｌを［１］に加え、５５℃で２０分インキュベートする。
［３］ＴＭＡＣ１００μｌあたりＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，　Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を１μｌ加えて５５℃でインキュベートする。
［４］［２］に［３］を１０μｌ加え、さらに５５℃で５分間インキュベートする。
［５］Ｌｕｍｉｎｅｘ１００システムで蛍光強度を測定する（図２）。
【００１８】
次に、ビーズ上でのＤＮＡ増幅確認をＰＣＲ反応にて行った。ＰＣＲ反応液の組成を表１に示す。
【表１】
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【００１９】
反応条件を表２に示す。これを２４サイクル行った。
【表２】
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【００２０】
ＰＣＲ反応の結果を電気泳動によって検出した（図３）。レーン１では、濃度が５μＭであるビーズ未結合のプライマー（フリープライマー）だけでＰＣＲ反応を行った。レーン２〜７では、ビーズに結合したプライマーと、濃度が５μＭであるフリープライマーを添加してＰＣＲ反応を行った。レーン８では、ビーズに結合したプライマーだけを用いた。レーン９はポジティブコントロールであり、ビーズが未添加で２本のプライマー濃度がそれぞれ２０μＭの高濃度である。
【００２１】
検出の際には、表３のＰＣＲ反応液の組成でＰＣＲ反応を行った。
【表３】
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ＰＣＲ産物を直接、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００システムまたはフローサイトメトリーにて検出した。
【００２２】
【発明の効果】
ビーズ上の核酸増幅を行うことで、液中での反応効率が高く特異的な核酸増幅が可能になる。また、操作が簡単ですぐに結果が出る実用性の高い核酸検出システムが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ビーズへのオリゴヌクレオチドの結合確認検出の模式図を示す。
【図２】ビーズへのオリゴヌクレオチド結合確認の結果を示す。
【図３】ＰＣＲ幅反応後の２％アガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図４】従来のマルチプレックス増幅反応とビーズ上で行うマルチプレクス増幅反応のイメージ図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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