(57)【要約】【課題】ペプチドやタンパク質を含む試料の質量分析を高感度に分析でき、更にその配列解析ができる液体クロマトグラフ質量分析方法及び装置を提供する。【解決手段】ペプチド及び／又はタンパク質を含有する試料を水酸基、アミド基及びカルボキシル基からなる群より選ばれる１以上の官能基を有する分離基材を充填した分離カラムに注入した後、有機溶媒と水及び／又はアルコールとの混合液に酸を添加してなる溶離液を用いて順相液体クロマトグラフィー法によりペプチド及び／又はタンパク質を分離後、質量分析計に供することを特徴とするペプチド及び／又はタンパク質の分析法。【選択図】　　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド及び／又はタンパク質を含有する試料を水酸基、アミド基及びカルボキシル基からなる群より選ばれる１以上の官能基を有する充填材を充填した分離カラムに注入した後、有機溶媒と水及び／又はアルコールとの混合液に酸を添加してなる溶離液を用いて順相液体クロマトグラフィーを行い、分離されたペプチド及び／又はタンパク質を質量分析計により検出することを特徴とするペプチド及び／又はタンパク質の分析法。
【請求項２】
酸が、蟻酸又は酢酸である請求項１記載のペプチド及び／又はタンパク質の分析法。
【請求項３】
酸の含有量が溶離液全量の０．１〜１０％（体積基準）である請求項１又は請求項２記載のペプチド及び／又はタンパク質の分析法。
【請求項４】
有機溶媒がアセトニトリルであり、かつその濃度が溶離液全量の５０容積％以上である請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のペプチド及び／又はタンパク質の分析法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチド及び／又はタンパク質の分析に関するものであり、詳しくは順相クロマトグラフィーにおいて使用される充填材を充填した分離カラムと、有機溶媒と水及び／又はアルコールとの混合液に酸を添加した溶離液を用いて、ペプチドやタンパク質を含有する試料を分離し、それを質量分析計にて検出、更に配列解析するペプチド及び／又はタンパク質の分析法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
液体クロマトグラフィーを用いてペプチドやタンパク質を分離する手法としては、逆相クロマトグラフィーが一般的にあり、これはペプチドやタンパク質を分離する目的においては大変有用な方法であるが、その分離機構は試料中の各ペプチドやタンパク質と分離カラムの固定相との疎水的相互作用の違いを利用して行なうため、試料中の各ペプチドやタンパク質に疎水性が無い、あるいは疎水的相互作用の違いがあまり無い場合には分離することは困難であるという問題があった。
【０００３】
この問題を解決する方法として、例えば、特許文献１には、シリカや樹脂などのゲル基材にアミノ基、水酸基、アミド基といった極性基を結合させた化学結合型の充填材と、アセトニトリルなどの有機溶媒と水及び／又はアルコールの混合液に酸（トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））やアミン類を添加した溶離液とを用いる順相クロマトグラフィーにより、逆相クロマトグラフィーを用いた方法では分離できないような疎水性が無い、あるいは疎水的相互作用の違いがあまり無い試料中のペプチドやタンパク質を分離する方法が開示されている。
【０００４】
また、一般にペプチドやタンパク質の液体クロマトグラフィー用の検出手段としては、紫外吸収検出器が使用されており、上述の特許文献１においても検出手段には紫外吸収検出器が用いられているが、この検出器は定性能力に欠けることや感度が高くないことや溶離液に混合する酸によっては、分離された物質を検出できないこと等の問題点があった。
【０００５】
一方、液体クロマトグラフィー用の高感度な検出器としては、質量分析計が知られているが、ようやく近年になって安定して測定のできる検出器として完成しつつあり、更に、ペプチド及びタンパク質の配列解析も比較的容易に且つ正確に行えるようになってきた。
【０００６】
しかし、質量分析計を用いる液体クロマトグラフィー測定においては、一般に、液体クロマトグラフィーに用いる溶離液に、不揮発性の塩やＴＦＡは使用し難い場合があるため、特許文献１に使用されているＴＦＡを用いた溶離液を、そのまま質量分析計に適用することはできない場合があった。
【０００７】
【特許文献１】
特開平１１−２３５５８号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような背景のもとに、本発明の目的は、ペプチドやタンパク質を含む試料を分離するに際し、ペプチドやタンパク質を順相クロマトグラフィー法にて分離でき、それを質量分析計を用いて検出、定量できる方法を提供し、さらに質量分析計にて配列解析できる方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ペプチド及び／又はタンパク質を含有する試料を水酸基、アミド基及びカルボキシル基からなる群より選ばれる１以上の官能基を有する充填材を充填した分離カラムに注入した後、有機溶媒と水及び／又はアルコールとの混合液に酸を添加してなる溶離液を用いて順相液体クロマトグラフィーを行い、分離されたペプチド及び／又はタンパク質を質量分析計により検出することを特徴とするペプチド及び／又はタンパク質の分析法を見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
尚、本明細書においては、「ペプチド」という語は、その構成するアミノ酸をも含む意味で用いられる。
【００１２】
本発明によるペプチド及び／又はタンパク質の順相クロマトグラフィーとは、極性を有するカラムを充填したカラムを用い、溶離液の極性が低い場においてペプチド及び／又はタンパク質をカラムに保持させ、次に、溶離液の極性を増加させることによってペプチド及び／又はタンパク質をカラムから脱離させるクロマトグラフィーのことを言う。
【００１３】
本発明に使用される充填材用の分離基材としては、化学結合型で順相クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されるものではないが、無機系シリカ、アルミナ、有機高分子系樹脂などが好ましく用いられ、特に分離能、耐久性などの面から無機系シリカが好ましく用いられる。
【００１４】
また、このような分離基材に結合される官能基としては、順相クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されるものではないが、アミド基（カルバモイル基）、水酸基、カルボキシル基が結合したものが好ましく用いられ、特に、分離能、耐久性などの面からアミド基（カルバモイル基）を結合させたものが好ましく用いられる。また、これらの官能基が２種以上あってもよい。
【００１５】
さらに具体的には、上記記載のアミド基を分離基材に結合した、商品名「ＴＳＫｇｅｌ　Ａｍｉｄｅ−８０」（東ソー株式会社製）や、水酸基を分離基材に共有結合させた充填材を充填した、商品名「ＴＳＫｇｅｌ　ＯＨ−１２０」（東ソー株式会社製）、一般的に順相法で良く用いられる、商品名「ＴＳＫｇｅｌ　Ｓｉｌｉｃａ−６０」（東ソー株式会社製）、分離機構にプロトン供与、受容に関与するイオン交換カラムである、商品名「ＴＳＫｇｅｌ　ＣＭ−２ＳＷ」（東ソー株式会社製）などを挙げることができる。
【００１６】
本発明に使用する溶離液として用いる有機溶媒としては、特に限定されないがプロトンの供与、受容にあまり関与せず、水又はアルコールと混和できることが必要となる。このような有機溶媒としては、シアン化炭化水素等が好ましく用いられ、さらにアセトニトリルが好ましく用いられる。その濃度としては、特に限定されないが分離能の面から、５０容積％以上が好ましい。
【００１７】
また、水としては、上記記載の検出器に影響を与えないものであれば特に限定されず、冷水、温水のいずれも用いることができる。さらに、水の代わりに用いられることのあるアルコールとしては、有機溶媒と混和できるものであれば特に限定されないが、分離する際に有機溶媒と完全に混和でき、また、分離の対象とする試料中のペプチドやタンパク質が劣化しないようなものであればよい。例えば、メチルアルコール、エチルアルコール等が例示できる。さらに、水とアルコールとを併用することもできる。
【００１８】
有機溶媒と水及び／又はアルコールとの混合比率としては、分離能の点から、（水又はアルコール）／（有機溶媒）が０．０１〜０．７となる範囲（体積基準）であることが好ましい。尚、ここでいう混合比率とは、ペプチド及び／又はタンパク質を含む試料を分離する際に実質的に使用される場合のことをいう。
【００１９】
さらに、試料であるペプチド等が分離基材にイオン的に強く吸着して、その分析値に誤差を生じさせないために、換言すればペプチド等を含む試料の回収率を向上させるために、溶離液に酸を添加することが必須である。酸の種類としては、ＴＦＡ、蟻酸、酢酸などの有機酸を使用することができるが、質量分析計が感度低下を起こし難い点から、特に蟻酸又は酢酸が好ましく、更に好ましくは蟻酸が用いられる。しかしながら、酸は分離基材に修飾された極性基（官能基）を脱離させるため、また、質量分析計の腐食を防止するために、添加する酸の量はできるだけ少ない方が良い。本件の場合、質量分析計および分離への影響を鋭意検討を行なった結果、含有させる酸の量は溶離液全量に対して、体積基準で０．１〜１０％、好ましくは０．２〜５％の範囲で用いることが最適であることがわかった。
【００２０】
また、アミン類も酸と一緒に用いることができる。用いられるアミンの種類としては、アンモニアが好ましく用いられる。その含有比率としては、全溶離液に対して、体積基準で０．１〜１０％の範囲で添加することが出来る。
【００２１】
本発明に使用する質量分析計としては、カラムから溶出してくる試料を含む溶離液を連続的に供給しながら、分離の対象とする試料中のペプチド及び／又はタンパク質を連続的にイオン化できるイオン源であればＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化法）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化法）どちらでも使用できる。また、質量分析計は、二重収束型、四重極型、イオントラップ型のいずれであっても良い。
【００２２】
また、質量分析計による配列解析については、１つの質量分析計を用いて行うこともできるが、質量分析計を２台以上連結したものでも行うことができる。
【００２３】
図１は本発明の順相クロマトグラフィーによる方法を用いたペプチド及び／又はタンパク質の分離を実施し、質量分析計で検出する装置の一例を示すものであるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
図１において、第１溶離液瓶１と第２溶離液瓶２は溶離液（本明細書においては、移動相ということもある）を貯蔵するための瓶であり、それぞれ、溶離液１、溶離液２が貯蔵されている。これらの貯蔵されている溶離液１及び溶離液２はその中の有機溶媒の濃度が両者で異なる。また、瓶の大きさ、形状、材質は特に限定されるものではなく、大きさとしては、分離や精製するために必要な溶離液を越える量貯蔵できればよく、形状も次に示す送液ポンプ３により、その貯蔵されている溶液が送液できるものであればよい。材質としても溶離液を貯蔵した場合に安定的にその溶液が貯蔵できれば良く、例えば、ガラスや高分子樹脂などが例示できる。
【００２５】
送液ポンプ３は、第１溶離液１と第２溶離液２とを勾配的に送液するためものである。送液の条件としては、特に限定はなく、試料中のペプチド及び／又はタンパク質を分析するような小規模のシステムにより実施する場合には、分離カラムの大きさにより異なるが、通常１．５ｍｌ／分以下の流速により実施される。さらに具体的には、カラムの内径が４．６ｍｍ程度の場合には、０．７〜１．０ｍｌ／分の範囲の流速が、カラムの内径が２．０ｍｍ程度の場合には、０．１〜０．２ｍｌ／分の範囲の流速が好ましく用いられ、このような流速を達成できる送液ポンプであればよい。
【００２６】
尚、第１溶離液１と第２溶離液２とを勾配的に送液する必要がない場合には、第１溶離液１又は第２溶離液２のいずれかのみを用いればよい。
【００２７】
４は試料注入装置であり、用いられる試料の容量は任意の量に変えることができ、又、注入に際しては、手動によりもしくは自動的に注入できる。試料の注入量としては、小規模の分析に用いる場合と大規模の精製に用いる場合とではその容量は異なり、適宜必要な試料容量を注入できる試料注入装置を用いればよい。
【００２８】
５は分離カラム、６は恒温槽であり、分離カラム５は恒温槽６に入った状態にて一定の温度に保たれる。又は、温度調整を必要としない場合には、分離カラム５は恒温槽にて温度の調整を行わなくとも良い。
【００２９】
恒温槽６は、分離カラム５の温度を一定に保つために用いられ、空気等のガスや水等の液体などを媒体として、加熱及び／又は冷却の機構によりその温度を一定に保つ機能を有するものである。ここで、恒温槽の保つことができる温度としては、分離の対象、目的にも左右されるため、一概にはいえないが、１０〜７０℃の温度範囲が好ましく、さらに３０〜５０℃の温度範囲が好ましい。
【００３０】
７は検出器であるが、分離の対象とする試料中のペプチド及び／又はタンパク質が検出でき、溶離液による妨害を受けない原理によるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、紫外吸収検出器、可視吸収検出器、蛍光検出器、発光検出器等の公知手段を用いることができ、検出波長についても公知の条件にて行えばよい。本発明において、この検出器７は省略してもよく、また、ペプチド及び／又はタンパク質の溶出状態のモニタリングのために設けておいてもよい。
【００３１】
８は質量分析計であるが、上述の通り、ペプチド及び／又はタンパク質を検出、または配列解析できるものであれば特に限定されるものではない。
【００３２】
また、上記記載の１〜７の各部との間を接続する送液管については、耐圧性があれば、その材質、内径、外径、長さ等には特に限定されることはなく、通常、ステンレス等の金属や、高分子樹脂などが好ましく用いられる。
【００３３】
本発明の方法により解析できる対象試料としては、ペプチド及び／又はタンパク質を１以上含む試料であればよく、例えば、血清、血漿、尿等の体液成分や、微生物等によるペプチド、タンパク質等の製造に使用される溶液、廃液などあらゆる試料を対象とすることができる。
【００３４】
さらに、本発明の方法によれば、試料中のペプチド及び／又はタンパク質がカラムとの水素結合相互作用及び双極子相互作用に依存して溶出されるため、その分離により、ピークの高さや面積を求めることで定量が可能であり、また質量分析計より得られる前駆イオン及び生成イオンの質量数から定性も可能である。
【００３５】
【実施例】
最初に、溶離液に添加した酸による、質量分析計および分離への影響を検討するために、溶離液に種々の酸を添加した。
【００３６】
アセトニトリル：水＝８０：２０（体積基準）からなる移動相に、それぞれ１％酢酸、０．５％酢酸と０．５％蟻酸との混酸、１％蟻酸、０．１％ＴＦＡ、１０ｍＭ蟻酸アンモニウムまたは１０ｍＭ酢酸アンモニウムを添加し、メチオニンエンケファリン（ペプチド）の分離挙動を観察した。なお、蟻酸アンモニウム、酢酸アンモニウムは、従来の質量分析方法において通常用いられる移動相成分である。分離カラムとしては、アミド基（カルバモイル基）を分離基材に共有結合させた、商品名「ＴＳＫｇｅｌ　Ａｍｉｄｅ−８０」（東ソー株式会社製）を用いた。いずれの移動相を用いた場合もメチオニンエンケファリンのピークはテーリングすることなく良好な分離が得られた。
【００３７】
質量分析計で測定した結果を、１％酢酸を移動相に添加した場合の感度を１００として表１に示した。ＴＦＡを用いた場合は著しい感度の低下が見られ、１０ｍＭ蟻酸アンモニウム、１０ｍＭ酢酸アンモニウムを用いた場合の感度は、酢酸を用いた時の約半分であった。
【００３８】
【表１】
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これらの結果から、質量分析計を用いて本順相液体クロマトグラフィーを行う場合、移動相には酢酸または蟻酸、もしくはこれらの混酸の添加が望ましいことが分かった。
【００３９】
続いて、ペプチドおよび／またはタンパク質を含む試料の分析を行った。図１に示すようなクロマトグラフ装置を用い、第１溶離液瓶１はアセトニトリル：水＝９０：１０（体積基準）の割合で混合した溶液に１％の蟻酸を添加したものを用いた。
【００４０】
第２溶離液瓶２に貯蔵する溶離液として、アセトニトリル：水＝６０：４０の割合で混合した溶液に、ここでは１％の蟻酸を添加したものを用いた。
【００４１】
分離カラムとしては、その一例としてアミド基（カルバモイル基）を分離基材に共有結合させた、商品名「ＴＳＫｇｅｌ　Ａｍｉｄｅ−８０」（東ソー株式会社製）を用いた。
【００４２】
吸着されたペプチド及び／又はタンパク質を含む試料は、試料注入後まもなく溶離液液２を送液ポンプ３によって溶離液中の水もしくはアルコールの濃度を勾配的に増加させることによって溶出させた。
【００４３】
【表２】
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このようにして分離カラムから溶出されてきたペプチド、タンパク質は、紫外吸収検出器そして質量分析計の順に検出される。図２（Ａ）は吸収波長２８０ｎｍの紫外吸収検出器により検出したクロマトグラムであり、図２（Ｂ）は質量分析計によって検出されたマススペクトラムである。試料の容量は５μｌ、分離温度は４０℃である。ペプチド試料には、９：Ｐｈｅ−Ｔｙｒ，１０：Ｇｌｙ−Ｔｒｐ，１１：Ｈｉｓ−Ｌｅｕ，１２：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓの４種類の混合物を用いた。（Ａ）の吸収波長２８０ｎｍによる吸光度検出器においては、９及び１０は検出されるが、１１及び１２は検出されなかった。一方、（Ｂ）の質量分析計においては、４種類全てのペプチドが検出された。
【００４４】
図３は、質量分析計８として、Ｗａｔｅｒｓ社の四重極型の質量分析計、ＺＱ２０００マス検出器を用い、分離カラムから溶出してきた９のペプチドを含む溶離液から溶離液を除去した後、当該検出器に供給して、配列解析を行った結果である。図３において、（Ｃ）はイオン源のコーン電圧１０Ｖで測定した結果であり、ペプチド９の前駆イオンである質量数３２９が観察されている。（Ｄ）はイオン源のコーン電圧５０Ｖで測定した結果であり、ペプチド９の生成イオンである質量数１８２が観察されている。この結果より、ペプチド９の配列はＰｈｅ−Ｔｙｒであると決定した。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、試料中のペプチド及び／又はタンパク質を順相液体クロマトグラフィーによって分離し、それを質量分析計にて検出、更に配列解析することができるため、有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施態様を示すクロマトグラフィー装置である。
【図２】実施例として示される（Ａ）クロマトグラムと（Ｂ）マススペクトラムである。図において、Ｘ軸（横軸）は保持時間（分）を示し、Ｙ軸（縦軸）は（Ａ）２８０ｎｍにおける吸光度、（Ｂ）質量分析計から出力される信号強度である。
【図３】実施例として示されるマススペクトラムである。図において、Ｘ軸（横軸）は質量数（ｄａｌｔｏｎ）を示し、Ｙ軸（縦軸）は質量分析計から出力される信号強度である。
【符号の説明】
１：図１において、クロマトグラフィー装置の第１溶離液用の瓶であり、その中に溶離液１が入っている。
２：図１において、クロマトグラフィー装置の第２溶離液用の瓶であり、その中に溶離液２が入っている。
３：図１において、クロマトグラフィー装置の送液ポンプである。
４：図１において、クロマトグラフィー装置の試料注入装置である。
５：図１において、クロマトグラフィー装置の分離カラムである。
６：図１において、クロマトグラフィー装置の恒温槽である。
７：図１において、クロマトグラフィー装置の紫外吸収検出器である。
８：図１において、クロマトグラフィー装置の質量分析計である。
９：図２において示されるペプチド、Ｐｈｅ−Ｔｙｒである。
１０：図２において示されるペプチド、Ｇｌｙ−Ｔｒｐである。
１１：図２において示されるペプチド、Ｈｉｓ−Ｌｅｕである。
１２：図２において示されるペプチド、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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