(57)【要約】【課題】本発明は、単子葉植物と双子葉植物の両植物において有効に機能する、新規な感染誘導性プロモーターを提供することを目的とする。【解決手段】カシュウイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　ｂｕｌｂｉｆｅｒａ　Ｌ．）のフェニルアラニンアンモニアトランスフェラーゼ（ＰＡＬ）遺伝子を調節するプロモーター領域の単離、および該プロモーターを用いたトランスジェニック植物の作製。【選択図】　図１
2004049144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ配列で特定される、カシュウイモ由来の感染誘導性プロモーター。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ感染誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項２】
単子葉植物と双子葉植物の両方で有効に機能しうることを特徴とする、請求項１記載のプロモーター。
【請求項３】
請求項１または２記載のプロモーターを含有するベクター。
【請求項４】
請求項１または２記載のプロモーターを宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項５】
宿主が植物である、請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項１記載のプロモーターを導入することにより、感染誘導性耐病性を付与されたトランスジェニック植物。
【請求項７】
請求項１記載のプロモーターを導入することにより、植物に感染誘導性の耐病性を付与する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な感染誘導性プロモーターに関する。より詳細には、カシュウイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　ｂｕｌｂｉｆｅｒａ　Ｌ．）のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ：ＰＡＬ）遺伝子の調節領域に由来し、単子葉植物および双子葉植物の両植物で有効に機能しうる感染誘導性プロモーターおよびその利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、植物における遺伝子工学的手法の進歩により、外来遺伝子を植物体中で発現させる技術が確立した。こうした技術を利用して、抗菌性タンパク質遺伝子や耐病性付与遺伝子を導入した、種々の耐病性品種も開発されている。
【０００３】
いもち病はイネにおいて最も被害の大きい病害であり、その耐病性育種は水稲開発における重要な課題である。従来、形質転換系を用いたイネの耐病性育種では、プロモーターとして、ユビキチン１プロモーター、アクチン１プロモーター、およびＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターなどが用いられてきた。これらのプロモーターはイネの全組織において構成的発現性をもつため、非感染時にも定常的に耐病性関連遺伝子を発現させる。しかし、耐病性関連タンパク質が定常的に過剰発現することは植物の生育に好ましくないばかりか、収穫後の植物の利用においても問題を生じる場合がある。そのため、いもち病感染時にのみ耐病性関連遺伝子を発現させる、感染誘導性プロモーターが望まれるが、これまでイネ科において有効な感染誘導性プロモーターはほとんど単離されたことがなく、利用されていないのが現状である。
【０００４】
一方、灰色カビ病はタバコ植物をはじめとする双子葉植物にとって、深刻な病害である。従来、双子葉植物における形質転換系を用いた耐病性付与では、プロモーターとして、主にＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターが用いられてきた。しかし、このＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターは、前述のとおり構成的発現性を有するため、非感染時にも耐病性関連タンパク質の定常的な過剰発現をもたらすという問題があった。そして、双子葉植物においても、これまで有効な感染誘導性プロモーターはほとんど利用されていないのが現状である。
【０００５】
ところで、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、以下「ＰＡＬ」と記載する。）植物、酵母、菌類等において、フェニルアラニンを脱アミノ化し、ｔｒａｎｓ−ケイ皮酸を生成する酵素である。この酵素は、チロシンにもはたらき、同様にｔｒａｎｓ−クマル酸を生成する。フェニルアラニンやチロシンは、フラボノイド、リグニン、アルカロイド等の二次代謝物の原料として重要であり、ＰＡＬはこれらフェノール化合物の生合成の律速段階となっている。ＰＡＬの活性は、植物の種類、成長段階、期間組織によって異なり、エチレンなどの植物ホルモン処理、光照射、病傷害、エリシター処理によって著しく増大することが知られている。
ＰＡＬタンパク質やその遺伝子は、オオムギをはじめ、種々の植物や酵母等において、よく研究されている。しかし、これまでに、ＰＡＬやその調節遺伝子を植物の耐病性育種に利用したという報告はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、単子葉植物と双子葉植物の両植物において有効に機能しうる、新規な感染誘導性プロモーターを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、カシュウイモの病原菌感染時の全ＲＮＡから、ＰＡＬ遺伝子の発現調節を行うプロモーター領域を単離した。そして、当該プロモーター領域が単子葉植物と双子葉植物の双方において有効な感染誘導性プロモーターとして機能しうることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）を提供する。
（１）　以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ配列で特定される、カシュウイモ由来の感染誘導性プロモーター。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ感染誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡ。
（２）　単子葉植物と双子葉植物の両方で有効に機能しうることを特徴とする、上記（１）記載のプロモーター。
（３）　上記（１）または（２）記載のプロモーターを含有するベクター。
（４）　上記（１）または（２）記載のプロモーターを宿主に導入して得られる形質転換体。
（５）　宿主が植物である、上記（４）記載の形質転換体。
（６）　上記（１）記載のプロモーターを導入することにより、感染誘導性耐病性を付与されたトランスジェニック植物。
（７）　上記（１）記載のプロモーターを導入することにより、植物に感染誘導性の耐病性を付与する方法
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．　カシュウイモ由来の感染誘導性プロモーター
本発明は、カシュウイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　ｂｕｌｂｉｆｅｒａ　Ｌ．）のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ：　ＰＡＬ）遺伝子調節領域に由来する、新規な感染誘導性プロモーターを提供する。該プロモーターは、他の単子葉植物および双子葉植物においても、感染誘導性プロモーターとして有効に機能するという特徴を有する。
【００１０】
なお、本明細書中において、「感染誘導性」とは、病原菌の感染によって特異的に発現が誘導されることを意味する。たとえば、本発明のプロモーターは、イネに導入した場合はいもち病菌接種により誘導され、タバコに導入した場合は灰色カビ病菌接種により誘導され、病原菌の感染特異的にその下流に連結された遺伝子の発現を誘導する。
【００１１】
１．１　カシュウイモＰＡＬ遺伝子の単離
前述のとおり、ＰＡＬ遺伝子の発現は、エチレンなどの植物ホルモン処理、光照射、病傷害、エリシター処理によって著しく増大することが知られている。そこで、上記のような外的処理を行うことによってＰＡＬ遺伝子を誘導したカシュウイモ細胞からｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを調製し、これより既知のＰＡＬ遺伝子との相同性に基づき、カシュウイモのＰＡＬ遺伝子を単離することができる。
【００１２】
用いられるカシュウイモ細胞は特に限定されず、葉、茎、葉柄、花、根、塊茎のいずれの部位の細胞を用いてもよく、また樹立された培養細胞を用いてもよい。前記細胞は、予めエチレンなどの植物ホルモン処理、光照射、傷害付与、病原菌、エリシター処理（例えば、炭疽病菌エリシター処理）等を行ってＰＡＬ遺伝子を誘導しておく。
【００１３】
次に、公知の方法に基づき、前記植物組織をグアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して全　ＲＮＡを抽出する。必要であれば、オリゴ　ｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、若しくはＳｔｒａｉｇｈｔ　Ａ’ｓ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）などのキットにより、全ＲＮＡからさらにｍＲＮＡを調製してもよい。次いで、得られた全ＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）を鋳型として、オリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡを合成する。
【００１４】
次に、カシュウイモのｃＤＮＡから目的とするＰＡＬ遺伝子を検索する。まず、既知の高等植物ＰＡＬタンパク質の保存領域の塩基配列を基に、該保存領域を特異的に増幅するプライマーを設計する。このようなプライマーとしては、例えば、配列番号２〜４で示される塩基配列を有するプライマーを挙げることができる。
【００１５】
次いで、これらのプライマーを用いて、前述のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、推定ＰＡＬ領域を増幅する。得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片は、Ｅｃｏ　ＲＩアダプターなどの適切なアダプターを付加後、Ｕｎｉ−ＺＡＰ　ＸＲ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）やλｇｔ１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）などの適当なクローニングベクターに組み込んでクローン化する。クローン化した遺伝子は、既知のＰＡＬ遺伝子との相同性やその転写産物のＰＡＬ活性をみることにより、目的とするＰＡＬ遺伝子であることを確認することができる。
かくして、カシュウイモ由来のＰＡＬ遺伝子として、配列番号１１に示す塩基配列を有する遺伝子が単離された。以下、このカシュウイモ由来のＰＡＬ遺伝子をＤＢＰＡＬ１と呼ぶこととする。
【００１６】
１．２　プロモーター領域の単離
前項で得られたＤＢＰＡＬ１の塩基配列情報を基に、公知の方法にしたがい、ＤＢＰＡＬ１の発現を制御するプロモーター領域を単離する。
たとえば、ＤＢＰＡＬ１領域の塩基配列情報にＴＡＩＬ−ＰＣＲ　法を適用して、カシュウイモのゲノムライブラリーよりＤＢＰＡＬ１上流に隣接する領域を単離することができる。なお、ＴＡＩＬ（Ｔｈｅｒｍａｌ　ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ）−ＰＣＲ法とは、ゲノムＤＮＡを鋳型に特異的プライマーと任意プライマーを用いて、ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行い、特異的プライマーに隣接した未知領域を単離する方法である。ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法は、たとえば、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２５：６７４−６８１；Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２６３：５５４−５６０等の記載に基づいて実施することができる。
【００１７】
本発明で用いられる、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ特異的プライマーとしては、たとえば、配列番号５〜９で示される塩基配列を有するプライマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また任意プライマーとしては、たとえば、配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーが挙げられるが、これに限定されるものではない。こうして、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法により、約１４００ｂｐからなる、ＤＢＰＡＬ１上流域のＤＮＡ断片が回収された。
【００１８】
１．３　プロモーター領域の塩基配列の決定
ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法によって得られたＤＢＰＡＬ１上流領域を含むゲノムＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　社製）、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等の適切なベクターにサブクローニングした後、塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、またはＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等、公知の手法により行うことができるが、自動塩基配列解析装置（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製　：ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　等）を用いる方法が簡便で好ましい。
こうして決定されたＤＢＰＡＬ１プロモーター領域の塩基配列を配列番号１に示す。該領域は、図１に示すように、ＴＡＴＡ　ｂｏｘ、６箇所のＭＲＥ配列を含んでいる。
【００１９】
しかし、本発明にかかるプロモーターは、上記配列に限定されず、配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる他のポリヌクレオチドも、それが本発明の感染誘導性プロモーター活性を有する限り、本発明のプロモーターに含まれる。なお、ストリンジェントな条件下とは、たとえば、ナトリウム濃度が３０ｍＭかつ温度が６５℃、好ましくはナトリウム濃度が１０ｍＭかつ温度が６５℃の条件下を言う。
【００２０】
かくして、一旦本発明のプロモーター領域とその塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、またはゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、さらに本発明のプロモーターを得ることができる。
【００２１】
１．４　プロモーター活性の確認
次に、得られたＤＮＡ断片（配列番号１）の感染誘導性プロモーター活性の確認を行う。活性の確認は、たとえば、当該ＤＮＡ断片の下流に適当なレポーター遺伝子を連結して（図２）他の植物に導入し、病原菌感染下と非感染下でのレポーター活性を比較することにより確かめることができる。
【００２２】
用いられるレポーター遺伝子としては、たとえば、ＬＵＣ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、ＧＵＳ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＡＴ（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　ａｃｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）等を挙げることができる。また、植物へのＤＮＡ断片の導入法としては、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法等を挙げることができる。なかでも、操作の簡便性、再現性の高さからアグロバクテリウム法が好ましい。
【００２３】
周知のとおり、単子葉植物と双子葉植物は植物の進化上遠い位置にあるため、単子葉植物で有効な遺伝子が必ずしも双子葉植物で有効に機能するとは限らない。しかしながら、本発明の感染誘導性プロモーターは、単子葉植物と双子葉植物の両方において有効に機能するという、優れた特徴を有する。
【００２４】
２．　感染誘導性プロモーターを含むベクター
本発明はまた、本発明の感染誘導性プロモーターを含むベクターを提供する。前記ベクターは、さらに本発明の感染誘導性プロモーターの下流域に他の構造遺伝子を機能しうる態様で含んでいてもよい。そのような構造遺伝子としては、たとえば、抗菌性タンパク質をコードする遺伝子、感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）等の植物に耐病性を付与する遺伝子を挙げることができる。なお、「機能しうる態様」とは、発現させたい遺伝子に対し、本発明のプロモーターがプロモーター活性を発揮し得る態様で連結されていることを意味する。
【００２５】
本発明のベクターにおいて、前項で得られた本発明の感染誘導性プロモーターＤＮＡ（たとえば、配列番号１）はそのまま、または適当な制限酵素で消化し、あるいは、適当なリンカーに連結して使用することができる。用いられるベクターとしては、　ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９　等の　ｐＵＣ　系ベクター、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２　等のバイナリーベクター等を挙げることができる。
【００２６】
特に、アグロバクテリウムのバイナリーベクターを用いる場合は、該バイナリーベクターの境界配列（ＬＢ，　ＲＢ）間に外来遺伝子（本発明のプロモーター等）を挿入し、この組換えベクターを大腸菌内で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス　ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ　等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等を用いて導入し、これを植物の形質転換体作出用として用いる。
【００２７】
本発明のベクターは、上記以外に適当なターミネーター配列を含んでいても良い。該ターミネーター配列としては、たとえばカリフラワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター配列等が挙げられる。また、必要に応じてプロモーター配列と構造遺伝子の間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列を含んでいてもよい。
【００２８】
さらに、目的の形質転換体を効率的に選抜するために、本発明のベクターは適当な選抜マーカー遺伝子を含んでいても良い。該選抜マーカーとしては、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子およびビアラフォスに対する抵抗性を植物に付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等を挙げることができる。
【００２９】
３．　感染誘導性プロモーターを含む形質転換体
本発明はまた、本発明の感染誘導性プロモーターを適当な宿主に導入して得られる形質転換体を提供する。
３．１　宿主
本発明の形質転換体において、宿主は特に限定されないが、植物であることが好ましい。なお、本明細書中において、宿主植物は、本発明のプロモーターの導入が可能なものであれば、特に限定されず、イネ等の単子葉植物であっても、タバコ等の双子葉植物であってもよい。また、遺伝子導入に用いられる外植片は、宿主植物の全体、器官（たとえば葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、組織（たとえば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）または培養細胞のいずれであってもよい。
【００３０】
３．２　宿主の形質転換
宿主植物の外植片として、宿主植物の全体、器官、組織、培養細胞を用いて遺伝子導入する場合は、採取した植物外植片に、本発明のベクターをアグロバクテリウムのバイナリーベクター法、パーティクルガン法、またはポリエチレングリコール法等を用いて導入することができる。あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法で導入することもできる。
【００３１】
なお、パーティクルガン法等による直接遺伝子導入法では、選抜マーカー遺伝子を含むベクターと本発明のプロモーターを含有するベクターとを混合して同時に植物の細胞に撃ち込む、いわゆる　ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　法により行うこともできる。かくして、本発明のプロモーターが導入された形質転換体（植物）が作出される。
【００３２】
３．３　形質転換体の再生
本発明の感染誘導性プロモーターが導入された植物細胞は、選抜マーカーによるスクリーニング、またはプロモーター支配下で発現する産物の発現解析により、選抜することが可能である。形質転換の結果得られるシュート、毛状根などは細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用いて、適当な濃度の植物ホルモンの投与などによって、さらに植物体に再生させることができる。得られた植物体は、土壌またはバーミキュライトを詰めたポットで栽培し、株分けすることにより増殖させることが可能である。このように増殖させた植物やその種子も本発明の形質転換体の範囲に含まれる。
【００３３】
４．　感染誘導性耐病性を付与されたトランスジェニック植物
上記のとおり、本発明のプロモーターを宿主植物に導入することにより、植物病原糸状菌および植物病原細菌に対して抵抗性を有するトランスジェニック植物を作製することができる。しかも、本発明のプロモーターは感染誘導性プロモーターであるため、形質転換された植物は、病原菌感染時のみ特異的にその下流に連結された耐病性関連遺伝子の発現を誘導する。したがって、従来の構成的発現性を有するプロモーターによる、耐病性関連遺伝子の定常的発現による問題、例えば感染特異的タンパク質の過剰発現によるアレルギー等の問題、を解消することができる。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、核酸を扱う基本的な方法は、Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓらの「　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　」（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）　にしたがって行った。
【００３５】
実施例１：カシュウイモＰＡＬ１遺伝子ｃＤＮＡの単離
カシュウイモ懸濁培養細胞を炭疸病菌エリシターで処理し、４時間後に細胞を採取し、ＳＤＳ−フェノール法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：３６０６−３６１５）にしたがって全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを鋳型に、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡを鋳型として、高等植物のＰＡＬタンパク質の保存的塩基配列を基に以下の３種類のデジェネレートプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。
2004049144.tif 000003
【００３６】
ＰＣＲは、第一回目のＰＣＲをプライマー組Ｘ０とＸ２でおこない、そのＰＣＲ産物を鋳型として第二回目のＰＣＲをＸ０とＸ３で実施した。その結果、約８００塩基対のＰＣＲ断片が得られ、これをプラスミドにクローン化して塩基配列を決定したところ、既知のＰＡＬ配列と高い相同性を示したので、この遺伝子をカシュウイモ由来のＰＡＬ遺伝子としてＤＢＰＡＬ１と命名した。ＤＢＰＡＬ１の配列を配列番号１１に示す。
【００３７】
実施例２：ＤＢＰＡＬ１プロモーター配列導入用アグロバクテリウムの作製
１．　ＤＢＰＡＬ１プロモーター配列の単離
ＤＢＰＡＬ１遺伝子のｃＤＮＡ配列　（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．　［１９９９］　１８：６０１−６０６）をもとにＴＡＩＬ−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２５：６７４−６８１；Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２６３：５５４−５６０）によって５’−上流配列を単離した。
【００３８】
まず、ＤＢＰＡＬ１遺伝子ｃＤＮＡ配列のアミノ末端付近の配列をもとに、５’−上流方向に向けて以下の５種類のプライマーを設計した。
2004049144.tif 000004
またＴＡＩＬ−ＰＣＲに用いる任意配列プライマーとしては、以下のＡＰＸプライマーを用いた。
2004049144.tif 000005
【００３９】
第一回目のＰＣＲはＰＡＬ−ＡとＡＰＸのプライマー組でおこない、そのＰＣＲ産物を鋳型として第二回目のＰＣＲはＰＡＬ−ＢとＡＰＸのプライマー組でおこない、さらにそのＰＣＲ産物を鋳型として第三回目のＰＣＲ　はＰＡＬ−Ｃ１とＡＰＸ、ＰＡＬ−Ｃ２とＡＰＸ、ＰＡＬ−Ｃ３とＡＰＸの３種類のプライマー組でおこなった。
【００４０】
第三回目のＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動したところ、ＰＡＬ−Ｃ１、ＰＡＬ−Ｃ２、ＰＡＬ−Ｃ３のプライマー位置に対応する約１４００塩基対のＰＣＲ産物が得られたので、これをゲルから回収してプラスミドにクローン化して塩基配列を決定した。
【００４１】
この塩基配列の一部はＤＢＰＡＬ１遺伝子の配列と完全に一致したので、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法によって回収された約１４００塩基対の断片がＤＢＰＡＬ１遺伝子の５’−領域を含むことは明らかである。この約１４００塩基対の断片のうちＤＢＰＡＬ１遺伝子構造領域を除いた領域（１０１４塩基対）には、ＴＡＴＡ−ｂｏｘ相同配列および６箇所のＭｙｂ−Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ−Ｅｌｅｍｅｎｔ　（ＭＲＥ：Ｇ（Ｇ／Ｔ）Ｔ（Ａ／Ｔ）Ｇ−（Ｇ／Ｔ）Ｔ−３’相同配列が存在することが確認された（Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ　２６３：５５４−５６０；　図１）。
【００４２】
２．　植物細胞での発現ベクターの構築
前項で得られたＤＢＰＡＬ１のプロモーター配列を、ＧＵＳ遺伝子を含むｐＲＴ１０１−ｇｕｓプラスミド（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　２１７：６６−７８）のＣａＭＶ３５Ｓプロモータと置換し、キメラ遺伝子ｐＲＧ１０８を構築した。次いで、このｐＲＧ１０８を制限酵素ＳａｃＩで線状化した後、同様にＳａｃＩで線状化したバイナリーベクターｐＢＥＣＫＳ２０００（ｐＢＥＣＫＳ２０００は、植物での選抜用にカナマイシンおよびハイグロマイシン抵抗性遺伝子、細菌での選抜用にスペクチノマイシンとアンピシリン抵抗性遺伝子を含む：Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　２６１：２２６−２３５）とライゲートしてｐＲＴ１００５を作製した。ＧＵＳ遺伝子を含むバイナリーベクター：ｐＲＴ１００５の構造を図２に示す。
【００４３】
３．　アグロバクテリウムへのバイナリーベクターの導入
４０μｌずつ分注して−８０℃でストックしておいたアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（Ｔｒａｎｓ．　Ｒｅｓ．　２：２０８−２１８）を氷中で溶解し、前項で作製したＧＵＳ遺伝子を含むバイナリーベクター（ｐＲＴ１００５）ＤＮＡの溶液（０．１ｎｇ／μｌ）を２μｌ加え、静かにピペッテイングして氷中に５分間放置した。その後氷中で、ＢｉｏＲａｄ社のＧｎｅＰｕｌｓｅｒ用キュベットに移し、２５μＦ、２００オーム、２．５ｋＶの設定において４．３秒間パルスを与えた。
【００４４】
次に、速やかにＳＯＣ液体培地を１ｍｌ加え、薬剤耐性遺伝子の発現のために２８℃で１時間培養した。培養後のアグロバクテリウムを、カナマイシン５０ｐｐｍ、スペクチノマイシン５０ｐｐｍ、を含むＡＢ寒天固形培地に塗布し、２５℃３日間培養し、ｐＲＴ１００５プラスミドが導入されたアグロバクテリウムのみを増殖させた。
【００４５】
得られたアグロバクテリウムを、ＡＢ寒天固形培地に塗布し、２５℃、３日間培養した。増殖したアグロバクテリウムを薬匙でかきとり、アセトシリンゴン入りＡＡ培地（ＡＡ無機塩、アミノ酸、Ｂ５ビタミン、ショ糖　（２０ｇ／Ｌ）、２，４−Ｄ　（２ｍｇ／Ｌ）、カイネチン　（０．２ｍｇ／Ｌ）、アセトシリンゴン　（１０ｍｇ／Ｌ）；Ｍｕｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９７８）に懸濁させて、波長６００ｎｍにおける吸光度が０．１５〜０．２０となるように調整した。
【００４６】
実施例３：イネへのＤＢＰＡＬ１プロモーター配列の導入
１．　イネ培養細胞への発現ベクターの導入
調整した懸濁液に、前記で得た胚様体カルスを、軽く振盪しながら１．５〜２分間浸漬することによって、胚様体カルスにアグロバクテリウムを感染させた。浸漬後の胚様体カルスは、滅菌したペーパータオル等で余分な水分を除去し、Ｎ６ＣＯ寒天固形培地（ＫＮＯ３　（２８３０ｍｇ／Ｌ），　　（ＮＨ４）２ＳＯ４　（４６３ｍｇ／Ｌ），　　ＫＨ２ＰＯ４　（４００ｍｇ／Ｌ），　　ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ　（１６６ｍｇ／Ｌ），　　ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１８５ｍｇ／Ｌ），　　ＭｎＳＯ４／４Ｈ２Ｏ（４．４ｍｇ／Ｌ），　　Ｈ３ＢＯ３（１．６ｍｇ／Ｌ），　　ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１．５ｍｇ／Ｌ），ＫＩ　（０．８ｍｇ／Ｌ），　　ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（２７．８ｍｇ／Ｌ），　　Ｎａ２ＥＤＴＡ　（３７．３ｍｇ／Ｌ），　　グリシン（２．０ｍｇ／Ｌ），　　ニコチン酸　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　ピリドキシン塩酸塩　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　チアミン　塩酸塩　（１．０ｍｇ／Ｌ），　　ミオイノシトール　（１００ｍｇ／Ｌ），　　ショ糖　（２０ｇ／Ｌ），　　２，４−Ｄ　（２ｍｇ／Ｌ），　　アセトシリンゴン　（１０ｍｇ／Ｌ），　　０．２％ゲルライト）に置床させ、２５〜２８℃の暗所で３日間培養した。これにより、胚様体カルスのゲノム中に、ＧＵＳ遺伝子および選抜マーカー遺伝子（ハイグロマイシン抵抗性遺伝子とカナマイシン抵抗性遺伝子）を組み込むことができた。
【００４７】
２．　胚様体カルスからの植物体の再生
上記で培養した胚様体カルスから、残存するアグロバクテリウムを除去するため、クラフォラン（５００ｍｇ／Ｌ）入り滅菌水で洗浄した。洗浄したカルスは滅菌したペーパータオル等で余分な水分を除去し、ハイグロマイシン等の選抜用マーカー薬剤を含んだＮ６ＳＥ寒天固形培地（ＫＮＯ３　（２８３０ｍｇ／Ｌ），　　（ＮＨ４）２ＳＯ４　（４６３ｍｇ／Ｌ），　　ＫＨ２ＰＯ４　（４００ｍｇ／Ｌ），　　ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ　（１６６ｍｇ／Ｌ），　　ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１８５ｍｇ／Ｌ），　　ＭｎＳＯ４／４Ｈ２Ｏ　（４．４ｍｇ／Ｌ），　　Ｈ３ＢＯ３　（１．６ｍｇ／Ｌ），　　ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１．５ｍｇ／Ｌ），ＫＩ　（０．８ｍｇ／Ｌ），　　ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（２７．８ｍｇ／Ｌ），　　Ｎａ２ＥＤＴＡ　（３７．３ｍｇ／Ｌ），　　グリシン（２．０ｍｇ／Ｌ），　　ニコチン酸　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　ピリドキシン塩酸塩　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　チアミン　塩酸塩　（１．０ｍｇ／Ｌ），ミオイノシトール　（１００ｍｇ／Ｌ），　　ショ糖　（２０ｇ／Ｌ），　　２，４−Ｄ　（２ｍｇ／Ｌ），　　アセトシリンゴン　（１０ｍｇ／Ｌ），　　０．２％ゲルライト，　　クラフォラン　（５００ｍｇ／Ｌ），　　ハイグロマイシン　（５０ｍｇ／Ｌ））に置床させた。置床後３週間、２５℃、暗所で培養し、増殖する薬剤耐性カルスを得ることができた。なお、この間、アグロバクテリウムが増殖してくるようであれば、クラフォラン　（５００ｍｇ／Ｌ）入り滅菌水で再度洗浄して、Ｎ６ＳＥ寒天固形培地での培養を継続する。
【００４８】
上記で得た耐性カルスを、ＭＳＲＥ寒天固形培地（ＭＳ無機塩，ＭＳビタミン，ＫＮＯ３　（２８３０ｍｇ／Ｌ），　　（ＮＨ４）２ＳＯ４　（４６３ｍｇ／Ｌ），　　ＫＨ２ＰＯ４　（４００ｍｇ／Ｌ），　　ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ　（１６６ｍｇ／Ｌ），ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１８５ｍｇ／Ｌ），　　ＭｎＳＯ４／４Ｈ２Ｏ　（４．４ｍｇ／Ｌ），　　Ｈ３ＢＯ３　（１．６ｍｇ／Ｌ），　　ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１．５ｍｇ／Ｌ），ＫＩ　（０．８ｍｇ／Ｌ），　　ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（２７．８ｍｇ／Ｌ），　　Ｎａ２ＥＤＴＡ　（３７．３ｍｇ／Ｌ），　　グリシン（２．０ｍｇ／Ｌ），　　ニコチン酸　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　ピリドキシン塩酸塩　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　チアミン　塩酸塩　（１．０ｍｇ／Ｌ），　　ミオイノシトール　（１００ｍｇ／Ｌ），　　ショ糖　（２０ｇ／Ｌ），　　ソルビトール　（３０ｇ／Ｌ），　カザミノ酸　（２ｇ／Ｌ），　　ＮＡＡ　（１ｍｇ／Ｌ），　　２，４−Ｄ　（２ｍｇ／Ｌ），　　アセトシリンゴン　（１０ｍｇ／Ｌ），　　０．２％ゲルライト，　　クラフォラン　（５００ｍｇ／Ｌ），　　ハイグロマイシン　（５０ｍｇ／Ｌ））に置床させ、２５℃、明所で培養し、再分化を誘導した。再分化したシュートは、ＭＳＨＦ寒天固形培地（ＭＳ無機塩、ＭＳビタミン、ショ糖（３０ｇ／Ｌ）、ハイグロマイシン　（５０ｍｇ／Ｌ）、寒天　（８ｇ／Ｌ））に移して発根を促し、組換え植物体を育成した。
【００４９】
実施例４：タバコ植物体へのＤＢＰＡＬ１プロモーターの導入
１．　タバコ細胞への発現ベクターの導入
タバコ（ＳＲ１系統）の葉を濾紙を敷いたシャーレ上に置き、葉脈に傷をつけ、主脈と葉の外縁部を除去して３−５ｍｍのリーフデイスクを得た後、滅菌水に浸漬したものにアグロバクテリウムを感染させた。実施例２で作製したアグロバクテリウム溶液１０ｍＬをプラスチックシャーレに移し、リーフデイスクを４分間浸漬させた。その後、リーフデイスクを濾紙上に置き、余分な水分を除去した。タバコ用共存培地ＭＳ２（ＭＳ＋ＢＡＰ　２ｍｇ／Ｌ　＋ＮＡＡ　０．１ｍｇ）上に濾紙を敷き、その上に感染後のリーフデイスクを置床させ、２日間共存培養を行った。その後アグロバクテリウムを除菌するために、リーフデイスクをタバコ用除菌培地ＭＳ３（ＭＳ＋ＢＡＰ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋５００ｍｇ／Ｌ　Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）に移植し、７日間培養した。
【００５０】
２．　リーフディスクからの植物体の再生
さらにリーフデイスクをタバコ用再分化培地ＭＳ４（ＭＳ＋ＢＡＰ　２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．１ｍｇ／Ｌ＋５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン＋２００ｍｇ／Ｌ　カナマイシン）に移植し、シュート原基が形成されるまで３週間培養した。形成されたシュート原基を含むカルス部位をリーフデイスクから切除し、同ＭＳ４でシュートが成長するまで培養した。さらにシュートの基部で切り出し、発根培地ＭＳ５（ＭＳ＋ＮＡＡ　０．１ｍｇ／Ｌ＋カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）に差し込んで培養し、十分発根した植物体を順化して成長させた。
【００５１】
実施例５：形質転換植物におけるＤＢＰＡＬ１プロモータの効果
１．　イネ切葉試験
再分化したＧＵＳ遺伝子形質転換水稲を土壌に移植し、閉鎖系温室内で育成した。移植後３０日前後の３から５葉期の植物体を試験に用いた。植物体から７ｍｍ　ｘ７ｍｍ大の葉片を切りとり、以下の（１）〜（３）のいずれかの処理を行った。（１）そのまま液体窒素による凍結処理（無処理）、（２）マイクロタイタープレート内の蒸留水に浮かべて、３時間、６時間、１０時間、２４時間後に回収後凍結処理、（３）マイクロタイタープレート内のいもち病菌細胞壁粗画分入り蒸留水に浮かべて、３時間、６時間、１０時間、２４時間後に回収後凍結処理。その後、各サンプルからタンパク質を抽出し、ＧＵＳ活性試験に供した。
【００５２】
２．　タバコ切葉試験
再分化したＧＵＳ遺伝子形質転換水稲を土壌に移植し、閉鎖系温室内で育成した。移植後３０日前後の植物体を試験に用いた。植物体から８ｍｍ径の葉片をコルクボーラーで切りとり、以下の（１）〜（３）のいずれかの処理を行った。（１）そのまま液体窒素による凍結処理（無処理）、（２）マイクロタイタープレート内の蒸留水に浮かべて、３時間、６時間、１０時間、２４時間後に回収後凍結処理、（３）マイクロタイタープレート内の０．５％酵母エキス入り蒸留水に浮かべて、３時間、６時間、１０時間、２４時間後に回収後凍結処理。その後各サンプルからタンパク質を抽出し、ＧＵＳ活性試験に供した。
【００５３】
３．　イネのいもち病菌接種試験
再分化したＧＵＳ遺伝子形質転換水稲を土壌に移植し、閉鎖系温室内で育成した。移植後３０日前後の３から５葉期の植物体を接種試験に用いた。ササニシキに対して親和性のいもち病菌系統である００７．０を接種試験に用いた。いもち病菌は１ｍＬあたり５ｘ１０５個の胞子濃度の０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む胞子懸濁液を植物体に散布し、その後湿度１００％で２５℃の加湿条件にて放置し、病斑進展後１週間の試料を採集しＧＵＳ活性試験に供した。
【００５４】
４．　タバコの灰色カビ病菌接種試験
再分化したＧＵＳ遺伝子形質転換タバコを土壌に移植し、閉鎖系温室内で育成した。移植後３０日前後の植物体を接種試験に用いた。灰色カビ病菌は１ｍＬあたり５ｘ１０５個の胞子濃度を含むＰＳ培地（２００ｇ／Ｌジャガイモ塊茎、２０ｇ／Ｌショ糖の煮沸上清）を植物体から切除したタバコ葉上に静置し、２日間その後湿度１００％で２５℃の加湿条件にて放置した後、ＧＵＳ活性試験に供した。
【００５５】
５．　ＧＵＳ活性試験
上記各試験サンプルについて、以下の方法でＧＵＳ活性の定量解析を行った。また、３および４の各試験サンプルについては、ＧＵＳ活性の組織化学的解析をおこなった。
（１）ＧＵＳ活性の定量解析
ＧＵＳ活性の定量解析は、Ｇｕｓ−ｌｉｇｈｔ　ＧＵＳ検出キット（Ｔｒｏｐｉｘ社）とルミノメータ（ＡＴＴＯ社）を利用して計測した。また、タンパク質量はＢｒａｄｆｏｒｄ（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　７２：２４８−２５４）にしたがって行った。
【００５６】
（２）ＧＵＳ活性の組織化学的解析
ＧＵＳ活性の組織化学的検出についてはＪｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法（ＥＭＢＯ．　Ｊ．　６：　３９０１，　１９８７）に基づいておこなった。すなわち、クロロフィルをメタノールにより除去した組織切片を　５０ｍＭ　ＮａＰＯ４　（ｐＨ７．０），　０．２　ｍＭ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−グルクロニド　（Ｘ−Ｇｌｕｃ），　０．１　ｍＭ−フェロシアン化カリウム、０．１　ｍＭ−フェリシアン化カリウムとの混合物中で処理して観察した。
【００５７】
６．　試験結果
（１）イネ切葉試験
イネ切葉試験の結果、ＤＢＰＡＬ１プロモータに連結したＧＵＳ遺伝子の活性は、水処理（傷処理）によって経時的に増加した。またいもち病菌細胞壁粗画分によって処理後２４時間後には傷処理の２倍以上の活性化が観察された（図３）。
【００５８】
（２）タバコ切葉試験
タバコ切葉試験の結果、ＤＢＰＡＬ１プロモータに連結したＧＵＳ遺伝子の活性は、水処理（傷処理）によって経時的に増加した。また０．５％酵母エキスによって処理後２４時間後には傷処理の４倍程度の活性化が観察された（図４）。
ＤＢＰＡＬ１プロモータの活性化程度をイネとタバコで比較した場合、傷処理による活性化では、イネにおいてタバコの１０倍程度高い活性化が見られた。
【００５９】
（３）イネのいもち病菌接種試験
形質転換イネへのいもち病菌接種試験をおこなった結果、無処理のイネ葉においてはＧＵＳ活性が低いものであったが、いもち病菌胞子噴霧接種葉においては、いもち病斑部位においてＧＵＳ活性が顕著に上昇していることが確認された（図５）。
【００６０】
（４）タバコの灰色カビ病菌接種試験
また無処理のタバコ葉においてはＧＵＳ活性が低いものであったが、灰色カビ病菌胞子接種葉においては、接種部位周辺においてＧＵＳ活性が顕著に上昇していることが確認された（図６）。
【００６１】
７．　結論
本研究の結果、ＤＢＰＡＬ１遺伝子プロモーターは通常の葉での発現レベルは低く、傷処理により若干の活性化がおこり、イネにおいてはいもち病菌細胞壁粗画分によって、タバコにおいては酵母エキスによって一層の活性化がみられることが確認された。さらに、ＤＢＰＬ１遺伝子プロモーター活性は、病原菌（イネにおいてはいもち病菌、タバコにおいては灰色カビ病菌）感染により活性化されることが確認された。以上より、本研究で得られたプロモーター配列は、単子葉植物および双子葉植物の両植物において、病原菌への感染特異的にその支配下の遺伝子発現を制御しうることが確認された。
【００６２】
【発明の効果】
本発明のカシュウイモ由来プロモーターは、単子葉植物および双子葉植物において病原菌感染特異的に、その下流に連結した遺伝子の発現をさせることができる。したがって、本発明のプロモーターを利用すれば、安全かつ優れた耐病性トランスジェニック植物を作出することが可能になる。
【００６３】
【配列表】
2004049144.tif 000006
2004049144.tif 000007
2004049144.tif 000008
2004049144.tif 000009
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2004049144.tif 000011
【００６４】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
”ｉ”はイノシンを示す。
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
”ｉ”はイノシンを示す。
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＤＢＰＡＬ１を調節するプロモーター領域付近の塩基配列を示す。
【図２】図２は、本発明のプロモーターをＧＵＳ遺伝子に連結させたバイナリーベクターｐＲＴ１００５の構造を示す。
【図３】図３は、イネ切葉試験の結果を示すグラフである。すなわち、形質転換イネ切葉を水、いもち病菌細胞壁粗画分に浮かべたときの、ＧＵＳ活性の経時変化を示す。
【図４】図４は、タバコ切葉試験の結果を示すグラフである。すなわち、形質転換タバコ切葉を水、酵母エキスに浮かべたときの、ＧＵＳ活性の経時変化を示す。
【図５】図５は、いもち病菌胞子接種試験の結果を示す。図５ＡはＧＵＳ活性の組織化学的検出結果を、図５ＢはＧＵＳ活性の定量解析結果を示す（Ｃ：バッファーのみを噴霧した個体、ＭＧ／ＮＬ：いもち病菌接種後病斑が進展していない部分、　ＭＧ／Ｌｅｓｉｏｎ：いもち病菌接種後病斑が進展した部分）。
【図６】図６は、灰色カビ病菌胞子接種試験の結果を示す。図６ＡはＧＵＳ活性の組織化学的検出結果、図６ＢはＧＵＳ活性の定量解析結果を示す（Ｃ：　ＰＳ培養液のみ、ＢＣ：ＰＳ培養液に懸濁した胞子、ＮＴ５−１とＮＴ５−２は独立に得られた２系統の形質転換体の番号）。
【図１】
2004049144.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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