(57)【要約】【課題】塩基部分の保護を必要とせずに、ホスホロアミダイド法において収率の高いオリゴヌクレオチドの合成方法を提供する。【解決手段】合成促進剤として、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いる。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホロアミダイド法によるオリゴヌクレオチドの合成において、反応促進剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いることを特徴とするオリゴヌクレオチドの合成法。
【請求項２】
ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの塩基を保護しない請求項１記載の合成法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求項１または２記載の合成法。
【請求項４】
１−ヒドロキシベンゾトリアゾールからなるオリゴヌクレオチド合成反応促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、オリゴヌクレオチドの合成法およびこれに用いる反応促進剤に関する。更に詳しくは、塩基部を保護することなく、収率の高いオリゴヌクレオチドを合成する方法およびこれに用いる反応促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡなどのオリゴヌクレオチドの合成法としては、現在ホスホロアミダイド法がよく用いられている。このホスホロアミダイド法は、ヌクレオチドの亜リン酸アミドを用いて、順次ヌクレオチドを付加していく反応を行うものであるが、反応に用いる各ヌクレオチドの塩基部分を適当な保護基を用いて保護する必要がある。
しかし、これらの塩基の保護および、反応後にこれらの保護基をはずすことにより、操作が煩雑となり、収率低下の要因ともなる。
【０００３】
塩基の保護を必要としない反応としては、塩化ピリジニウムを促進剤として用いる方法や（非特許文献１参照）、イミダゾリニウムトリフレート（ＩＭＴ）を用いる方法が知られている（非特許文献２参照）。
しかし、この方法では、副反応としてＮ−リン酸化反応が起こり、これを分解する工程が必要であるという問題があった。
【０００４】
【非特許文献１】
グリャズノフ（Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．）、レチンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）著、「ジャーナル　オブ　アメリカン　ケミカル　ソサイエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ）（米国）、１９９１年、１１３巻、ｐ．５８７６−５８７７
【非特許文献２】
早川（Ｈａｙａｋａｗａ，Ｙ）、片岡（Ｋａｔａｏｋａ，Ｍ）著、「ジャーナル　オブ　アメリカン　ケミカル　ソサイエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ）（米国）、１９９８年、１２０巻、ｐ．１２３９５−１２４０１
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、塩基部分の保護を必要としない、収率の高いオリゴヌクレオチドの合成方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の反応促進剤を用いることにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、ホスホロアミダイド法によるオリゴヌクレオチドの合成において、反応促進剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いることを特徴とするオリゴヌクレオチドの合成法に関するものである。
また、本発明は、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの塩基を保護しない上記合成法に関するものである。
また、本発明は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールからなるオリゴヌクレオチド合成反応促進剤に関するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法においては、液相または固相の反応系において、第１剤のヌクレオシドと第２剤（伸長剤）のヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドとを１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下で反応させることによりカップリングさせて、第１剤の５’位と第２剤の３’位とをホスホジエステル結合により連結させる。次に、第２剤のヌクレオシドの５’位の保護基を除去した後に、上述と同様の工程により次のヌクレオシドをカップリングさせる。このようにして、オリゴヌクレオチド鎖を順次伸長させることができる。
【０００８】
本発明に用いるヌクレオシド骨格しては、特に制限はないが、例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、キサントシンなどのリボヌクレオシド、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、チミジン、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシキサントシンなどの２’−デオキシリボヌクレオシド、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルイノシン、２’−Ｏ−メチルキサントシン、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルグアノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルシチジン、２’−Ｏ−メトキシエチルウリジン、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルキサントシンなどの２’−Ｏ−メトキシアルキルリボヌクレオシドなどを挙げることができる。好ましいヌクレオシド骨格としては、デオキシリボヌクレオシドが挙げられる。即ち、本発明は、好ましくは、ＤＮＡの合成法として用いることができる。
【０００９】
これらのヌクレオシド骨格は、反応の目的にあわせて、５’位および３’位を適宜保護または活性化して用いられる。
即ち、液相反応において第１剤として用いる場合は、例えば、３’位をＯ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＯｔＢＤＭＳ）化し、固相反応において第１剤として用いる場合は、例えば、３’位をＯ−固体担体に結合するなどする。また、液相、固相いずれの反応においても、第２剤（伸長剤）として用いる場合は、例えば、３’位をＯ−ホスホルアミダイド化し、　５’位をジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）化して用いる。
【００１０】
本発明に用いられる反応促進剤は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）であり、以下の構造のものであるが、本発明の効果を妨げない範囲であれば、置換基を有していても差し支えない。
【００１１】
【化１】
2004099532.tif 000002
【００１２】
本発明の合成法は、液相反応、固相反応のいずれにも用いることができる。
液相反応に用いる場合は、第１剤１当量に対して、第２剤（伸長剤）は一般的に０．５〜１０当量、好ましくは１〜５当量、より好ましくは１〜２当量、さらに好ましくは１．１〜１．３当量が用いられ、ＨＯＢｔは一般的に０．５〜５当量、好ましくは１〜３当量、より好ましくは１．５〜２．８当量、さらに好ましくは２〜２．５当量が用いられる。また、反応溶媒としては、通常用いられるものであれば、特に限定はないが、例えばアクリロニトリルなどを挙げることができる。また、伸長反応の後、ヨウ素等で酸化することにより、ホスホトリエステルとすることができる。
【００１３】
固相反応に用いる場合は、第１剤１当量に対して、第２剤（伸長剤）は一般的に０．５〜３０当量、好ましくは２〜２０当量、より好ましくは５〜１５、さらに好ましくは８〜１２当量、ＨＯＢｔは一般的に０．５〜４０当量、好ましくは５〜３５当量、より好ましくは１０〜３０当量、さらに好ましくは１５〜２５当量が用いられる。
【００１４】
また、固相反応の伸長反応では、トリクロロ酢酸等による脱トリチル化、ジクロロメタン、アセトニトリル等による洗浄、ＨＯＢｔ存在下でのカップリング、アセトニトリル等による洗浄、ヨウ素等による酸化、ピリジン等による洗浄の工程を行う。ここで反応収率をあげるために、カップリングとその後の洗浄の工程を複数回、好ましくは２回行うことが望ましい。
【００１５】
本発明の方法は、塩基部に保護基を必要とせずにオリゴヌクレオチドを合成できるものであるが、塩基部に保護基を導入して本方法を用いることも、本発明の範囲に含まれるものである。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
【００１７】
＜実施例１＞　Ｎ−無保護による　ｄ［ＴｐＡ］誘導体４の液相合成
図１に示すように、チミジン３’−Ｏ−ホスホロアミダイド誘導体１（２６７ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）および３’−Ｏ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）デオキシアデノシン２（１０９ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）の混合物を乾燥ピリジン（ｘ３）、乾燥トルエン（ｘ３）、乾燥ＣＨ２ＣＣｌ２（ｘ３）により共沸を繰り返して無水物とし、乾燥ＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）に溶解した。この混合物にＨＯＢｔ（９７ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加した。室温で５分間撹拌し、Ｉ２（ピリジン−水、９：１、ｖ／ｖ、３ｍＬ）の１Ｍ溶液を混合物に添加した。室温で２分間撹拌した後、混合物をＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）と５％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（３０ｍＬ）に分けた。有機相を集めて、５％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（３０ｍＬ）で２回洗浄してろ過し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲルカラム（１０ｇ）で、１％ピリジン含有ヘキサン−ＣＨＣｌ３（５０：５０−０：１００，ｖ／ｖ）、その後１％ピリジン含有ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１００：０−９７：３，ｖ／ｖ）でクロマトグラフし、誘導体４を含む分画を得た。
ピリジンの最後のトレースを取り除くため、分画を集め、減圧下で蒸発させ、最後にトルエンおよびＣＨ２Ｃｌ２でそれぞれ３回共沸させ、誘導体４を得た（２８０ｍｇ、９１％）。３１ＰＮＭＲおよびＨＰＬＣにより、Ｎ−リン酸化の副生成物が生成していないことを確認した。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．１１（ｓ、６Ｈ），０．９０（ｓ，６Ｈ），１．４０（ｓ，３Ｈ），２．３０−２．９５（ｍ，６Ｈ），３．２８−３．４７（ｍ，２Ｈ），３．７６（ｓ，６Ｈ），４．０１−４．３０（ｍ，６Ｈ），４．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），５．１１（ｓ，１Ｈ），６．３３−６．５２（ｍ、４Ｈ），６．８０（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．２３−７．３３（ｍ、９Ｈ），８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），８．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５９Ｈｚ）：３１ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ−２．１９、−１．８４：１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ−４．７、−４．５、１１．７、１１．８、１７．９、１９．１、１９．４、１９．５、１９．６、２５．７、３９．８、３９．９、５５．２、６２．０、６２．１、６２．３、６３．１、７１．５、７１．７、７７．２、７９．１、７９．４、８３．８、８３．９、８４．２、８４．４、８５．１、８６．９、８７．０、１１１．４、１１１．５、１１３．２、１１５．９、１１６．２、１１９．４、１１９．６、１２５．１、１２７．０、１２７．８、１２８．０、１２８．９、１２９．９、１３４．９、１３９．３、１３９．５、１４３．８、１４３．９、１４８．９、１５１．１、１５１．３、１５２．６、１５５．７、１５８．５、１６４．５、１６４．７：ＭＳ　ｍ／ｚ　Ｍ＋Ｈの計算値；１０２５．３９９４、測定値；１０２５．３９８７。
【００１８】
＜実施例２＞　Ｎ−無保護による　ｄ［ＴｐＣ］誘導体５の液相合成
同じく図１に示すように、チミジン３’−Ｏ−ホスホロアミダイド誘導体１（３００ｍｇ、０．４０３ｍｍｏｌ）および３’−Ｏ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）デオキシシチジン３（１１６ｍｇ、０．３３６ｍｍｏｌ）の混合物を乾燥ピリジン（ｘ３）、乾燥トルエン（ｘ３）、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（ｘ３）により共沸を繰り返して無水物とし、乾燥ＣＨ３ＣＮ（５ｍＬ）に溶解した。この混合物にＨＯＢｔ（１０８ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を添加した。室温で５分間撹拌し、Ｉ２（ピリジン−水、９：１、ｖ／ｖ、３ｍＬ）の１Ｍ溶液を混合物に添加した。室温で２分間撹拌した後、混合物をＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）と５％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（３０ｍＬ）に分けた。有機相を集めて、５％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（３０ｍＬ）で２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥してろ過し、減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲルカラム（１０ｇ）で、１％ピリジン含有ヘキサン−ＣＨＣｌ３（５０：５０−０：１００，ｖ／ｖ）、その後１％ピリジン含有ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１００：０−９７：３，ｖ／ｖ）でクロマトグラフし、誘導体５を含む分画を得た。ピリジンの最後のトレースを取り除くため、分画を集め、減圧下で蒸発させ、最後にトルエンおよびＣＨ２Ｃｌ２でそれぞれ３回共沸させ、誘導体５を得た（３０９ｍｇ、９２％）。３１ＰＮＭＲおよびＨＰＬＣにより、Ｎ−リン酸化の副生成物が生成していないことを確認した。
１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ−０．１１（ｓ、６Ｈ），０．８６（ｓ，９Ｈ），１．２９（ｓ，３Ｈ），２．１１−２．７１（ｍ，６Ｈ），３．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），３．４５（ｄ、１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），３．６７（ｓ，６Ｈ），３．９２（ｓ，１Ｈ），４．１３−４．２３（ｍ，５Ｈ），５．１０−５．２２（ｍ，１Ｈ），５．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ），６．１５（ｍ，１Ｈ），６．３６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），６．７７（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．２３−７．３３（ｍ，９Ｈ），７．４７（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）；３１ＰＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ−１．６７、−１．５８：１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ−４．８、−４．６、１１．８、１７．９、１９．６、１９．７、１９．８、２５．７、３９．０、４１．２、５５．３、６２．５、６２．６、６３．３、７０．０、７０．４、７７．２、７９．９、８４．２、８４．４、８６．１、９４．９、１１１．８、１１３．２、１１６．２、１１６．４、１２３．６、１２７．１、１２７．９、１２８．０、１２８．９、１２９．９、１３４．８、１３４．９、１３５．８、１４０．３、１４３．８、１４９．６、１５０．６、１５０．７、１５５．３、１５８．６、１６３．７、１６３．８、１６５．５：ＭＳ　ｍ／ｚ　Ｍ＋Ｈの計算値；１００１．３８８２、測定値；１００１．３８７６。
【００１９】
＜実施例３＞Ｎ−無保護によるｄ［ＡｐＴ］，ｄ［ＣｐＴ］，ｄ［ＧｐＴ］，ＴｐＴの固相合成
図２に概略を示すが、おのおのの鎖長の伸長反応は、次のように行った。
脱トリチル化：ＣＨ２Ｃｌ２中の３％トリクロロ酢酸、２ｍＬ，１分間
洗浄：ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬで３回）、ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬで３回）
カップリング：ＣＨ３ＣＮ（２００μＬ）中の各ヌクレオチドのホスホルアミダイド（２０μｍｏｌ）、ＣＨ３ＣＮ（２００μＬ）中のＨＯＢｔ（１２．５ｍｈ、４０μｍｏｌ）で１分間
洗浄：ＣＨ２ＣＮ（１ｍＬで３回）
カップリング：ＣＨ３ＣＮ（２００μＬ）中の各ヌクレオチドのホスホルアミダイド（２０μｍｏｌ）、ＣＨ３ＣＮ（２００μＬ）中のＨＯＢｔ（１２．５ｍｈ、４０μｍｏｌ）で１分間
洗浄：ＣＨ２ＣＮ（１ｍＬで３回）
酸化：０．１ＭのＩ２、ピリジン−水（９／１，ｖ／ｖ）、２分間
洗浄：ピリジン（１ｍＬで３回）、ＣＨ２ＣＮ（１ｍＬで３回）、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬで３回）
鎖長の伸長反応の後、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中の３％トリクロロ酢酸で１分間処理することにより、ＤＭＴｒ基を除去し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬで３回）、ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬで３回）で洗浄した。オリゴマーは、濃ＮＨ３水溶液（５００μＬ）で４０分間処理し、脱保護とポリマー担体からの脱離を行った。ポリマー担体はろ過により取り除き、ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬで３回）で洗浄した。ろ液を蒸発させ、逆相ＨＰＬＣまたは陰イオン交換ＨＰＬＣにより精製した。
ｄ［ＡｐＴ］，ｄ［ＣｐＴ］，ｄ［ＧｐＴ］，ＴｐＴの収率は、それぞれ、９２％、９４％、９０％、９２％であった。
また、ＭＳによる結果は、以下の通りであり、計算値とほぼ一致した。
ｄ［ＡｐＴ］；計算値（Ｍ＋Ｈ）５５６．１５５８、測定値５５６．１５２２
ｄ［ＣｐＴ］；計算値（Ｍ＋Ｈ）５３２．１４４５、測定値５３２．１４４３
ｄ［ＧｐＴ］；計算値（Ｍ＋Ｈ）５７２．１５０７、測定値５７２．１４９４
ＴｐＴ；計算値（Ｍ＋Ｈ）５７２．１４４１、測定値５４７．１４３９
また、図３のｃ〜ｆに示すように、Ｎ−リン酸化誘導体の副生成物は生成しなかった。
【００２０】
＜比較例１＞ＩＭＴを用いたｄ［ＡｐＴ］およびｄ［ＣｐＴ］の固相合成。
実施例３と同様にＨＯＢｔのかわりにＩＭＴを用いて合成を行ったところ、図３のａ，ｂに示すように、デオキシアデノシンおよびデオキシシチジンのＮ−リン酸化誘導体が１１％および８％の収率で生成した。
【００２１】
＜実施例４＞オリゴヌクレオチドの固相合成
実施例３と同様にして、ｄ［ＡＡＡＡＡＡＴ］（７量体）、ｄ［ＣＣＣＣＣＣＴ］（７量体）、ｄ［ＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴ］（１２量体）を合成した。収率は、それぞれ、４８％、６７％、３６％であり、これまでのものに比較して高い収率であった。
また、ＭＳによる結果は、以下の通りであり、計算値とほぼ一致した。
ｄ［ＡＡＡＡＡＡＴ］；計算値（Ｍ−Ｈ）２１１９．４３、測定値２１１９．１２
ｄ［ＣＣＣＣＣＣＴ］；計算値（Ｍ−Ｈ）１９７５．３６、測定値１９７５．２２
ｄ［ＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴ］；計算値（Ｍ−Ｈ）３６４３．６５、測定値３６４２．６２
さらに、得られたオリゴヌクレオチドを酵素により分解し、逆相ＨＰＬＣにより各ヌクレオチド量を測定した結果は以下の通りであり、適性割合でヌクレオチドを有していることがわかった。
ｄ［ＡＡＡＡＡＡＴ］；ｄＡ：Ｔ＝６．００：０．９７
ｄ［ＣＣＣＣＣＣＴ］；ｄＣ：Ｔ＝６．００：１．０３
ｄ［ＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴ］；ｄＡ：ｄＧ：ｄＣ：Ｔ＝１．００：１．２０：０．９５：０．９４
また、図４に示すようにＮ−リン酸化副生成物の生成が抑えられていることがわかった。
【００２２】
【発明の効果】
本発明により、Ｎ−保護を必要とせずに、収率の高いオリゴヌクレオチド合成が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、液相反応における本発明の例である。
【図２】図２は、固相反応における本発明の例である。
【図３】図３は、実施例３、比較例１の結果を示すＨＰＬＣチャートである。
【図４】図４は、実施例４の結果を示すＨＰＬＣチャートである。
【図１】
2004099532.tif 000003
【図２】
2004099532.tif 000004
【図３】
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【図４】
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