(57)【要約】【課題】各種病型癌に特異的な遺伝子の利用方法を提供することを課題とする。【解決手段】３８例の肺癌由来細胞株および３例の正常繊維芽細胞株と４３例の肺癌臨床検体および６例の正常肺組織よりＲＮＡを調製、蛍光標識後７６８５種の遺伝子断片を固定化したスライドに対してハイブリダイゼーションを行った。通常行われる階層的クラスタリングを実施した結果、全ての細胞株と臨床検体とはそれぞれ異なるクラスターに分離された。培養細胞株あるいは臨床検体でそれぞれ共通して高発現あるいは発現低下している遺伝子を解析から除外する事により、各病型を反映した遺伝子発現プロファイルが得られるものと考え、これを可能とするフィルタリング法を新たに考え実施した。その結果、病型特異的な発現プロファイルを示す遺伝子を同定することができた。該遺伝子は、各種病型癌の診断および治療において有用であると考えられる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡまたは該ＤＮＡからコードされるポリペプチドの発現量を測定する工程を含む、癌の検査方法。
（ａ）配列番号：１〜１１９のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１〜１１９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
（ａ）被検者からポリペプチド試料を調製する工程
（ｂ）該ポリペプチド質試料に含まれる請求項１に記載のポリペプチドの量を測定する工程
（ｃ）測定されたポリペプチドの量を対照と比較する工程
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
（ａ）被検者からＲＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ＲＮＡ試料に含まれる請求項１に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたＲＮＡの量を対照と比較する工程
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
（ａ）被検者からｃＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ｃＤＮＡ試料に含まれる請求項１に記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する工程
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
（ａ）（ｉ）被検者から調製したｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料、および
（ｉｉ）請求項１に記載のＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料に含まれる請求項１に記載のＤＮＡの発現量を測定する工程
（ｄ）測定されたＤＮＡの発現量を対照と比較する工程
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡのうち複数のＤＮＡまたは該ＤＮＡからコードされるポリペプチドの発現量を測定する工程を含む、癌の検査方法。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項６に記載の検査方法。
（ａ）（ｉ）被検者から調製したｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料、および
（ｉｉ）請求項１に記載のＤＮＡのうち複数のＤＮＡとそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料に含まれる請求項１に記載のＤＮＡのうち複数のＤＮＡの発現量を測定する工程
（ｄ）測定された発現量を対照と比較する工程
【請求項８】
請求項１に記載のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、癌の検査薬。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドと結合する抗体を含む、癌の検査薬。
【請求項１０】
癌が肺癌である、請求項８または９に記載の検査薬。
【請求項１１】
肺癌が小細胞性肺癌である、請求項１０に記載の検査薬。
【請求項１２】
肺癌が扁平上皮癌、腺癌、または、カルチノイドである、請求項１０に記載の検査薬。
【請求項１３】
請求項１に記載のＤＮＡのプロモーター領域の３’側に細胞障害性タンパク質をコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項１５】
遺伝子治療用である、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項１７】
請求項１５に記載のベクターを投与する工程を含む、癌の治療方法。
【請求項１８】
被験試料における、抗癌活性の有無を評価する方法であって、
（ａ）癌細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）（ｉ）被験試料を接触させた癌細胞から調製したｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料、および
（ｉｉ）請求項１に記載のＤＮＡのうち複数のＤＮＡとそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｃ）工程（ａ）（ｉ）のｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｄ）該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料に含まれる請求項１に記載のＤＮＡのうち複数のＤＮＡの発現量を測定する工程
を含み、上記発現量が、被験試料を接触させないときに比べ、対照における該ＤＮＡの発現量まで回復している場合に、被験試料が抗癌活性を有すると判定される方法。
【請求項１９】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１８に記載の評価方法により、複数の被験試料における、抗癌活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する工程
【請求項２０】
請求項１９に記載の工程に、さらに抗癌活性を有すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、抗癌活性を有する医薬組成物の製造方法。
【請求項２１】
癌が肺癌である、請求項１〜７、１７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
肺癌が小細胞性肺癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
肺癌が扁平上皮癌、腺癌、または、カルチノイドである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、各種病型癌に特異的な遺伝子およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肺癌は全世界的に見て男女を問わず癌による死亡原因の第１位の位置を占めており、その数は増加の一途にある。また日本だけを見ても年間に５０，０００人の命が肺癌により失われている。肺癌は病理学的にはその形態から小細胞性肺癌（ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＣＬＣ）と非小細胞性肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＮＳＣＬＣ）に分類され、後者はさらに扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＳＣＣ）、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＡＣ）、大細胞性癌（ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ＬＣＣ）に分類されている。個々に分類された肺癌は悪性度、治療に対する反応性が異なる事から、正確な病型診断は治療指針を決定するうえで極めて重要である。特に小細胞性肺癌は診断が為された時点では多くの場合既に転移を伴っている理由から外科的摘除手術の対象とはならず、化学療法および放射線療法による治療が通常選択される。一般に、小細胞性肺癌の化学療法に対する反応性は良好で腫瘍の縮小効果を認めるが、多くの場合に再発を伴い、再発した癌細胞は多剤耐性を獲得して治療に抵抗性である。これに対して非小細胞性肺癌の場合は限局性で明らかな遠隔転移が存在しない場合には外科的摘除手術が専ら第１選択肢となり、術後の再発防止の目的で化学療法が行われる。特に腺癌の場合には形態的観察から異なる分化度のものが知られており、一般に低分化型のものは予後不良である。
【０００３】
従来、病型診断は生検標本の形態学的観察を中心に実施されてきた。しかし、形態学的観察は熟練者による判定を必要とし、判定に主観的要素が入り込む余地がある。また、癌は病型により治療方針が大きく異なる事から、正確かつ客観的な病型診断は極めて重要であるが、そのような診断方法は知られていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、各種病型癌に特異的な遺伝子を見出し、該遺伝子の利用方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは各種病型癌に特異的な遺伝子を見出す事を目的に各病型について遺伝子発現プロファイル解析を実施した。具体的には、３８例の肺癌由来細胞株および３例の正常繊維芽細胞株と４３例の肺癌臨床検体および６例の正常肺組織よりＲＮＡを調製、蛍光標識後７６８５種の遺伝子断片を固定化したスライドに対してハイブリダイゼーションを行った。通常行われるｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ（階層的）クラスタリングを実施した結果、全ての細胞株と臨床検体とはそれぞれ異なるクラスターに分離された。細胞株のクラスターは培養系に特有の要因により細胞株に共通した遺伝子発現により形成されたものと考えられ、一方臨床検体クラスターでは腫瘍検体に混在する正常組織の影響を強く受けているものと考えられた。そこで、これら培養細胞株あるいは臨床検体でそれぞれ共通して高発現あるいは発現低下している遺伝子を解析から除外する事により、各病型を反映した遺伝子発現プロファイルが得られるものと考え、これを可能とするフィルタリング法（Ｂｉｎａｒｙ　Ｓｔｒｉｎｇ　Ｓｅａｒｃｈ）を新たに考えた。該フィルタリング法により、細胞株あるいは臨床検体に共通して発現亢進している遺伝子を解析から除外することができ、病型特異的な発現プロファイルを示す遺伝子を同定することができた。同定された遺伝子は、各種病型癌の診断および治療において有用であると考えられる。
【０００６】
即ち、本発明は、
〔１〕以下の（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡまたは該ＤＮＡからコードされるポリペプチドの発現量を測定する工程を含む、癌の検査方法、
（ａ）配列番号：１〜１１９のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１〜１１９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
〔２〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者からポリペプチド試料を調製する工程
（ｂ）該ポリペプチド質試料に含まれる〔１〕に記載のポリペプチドの量を測定する工程
（ｃ）測定されたポリペプチドの量を対照と比較する工程
〔３〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者からＲＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ＲＮＡ試料に含まれる〔１〕に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたＲＮＡの量を対照と比較する工程
〔４〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者からｃＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ｃＤＮＡ試料に含まれる〔１〕に記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する工程
〔５〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１〕に記載の検査方法、
（ａ）（ｉ）被検者から調製したｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料、および
（ｉｉ）〔１〕に記載のＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料に含まれる〔１〕に記載のＤＮＡの発現量を測定する工程
（ｄ）測定されたＤＮＡの発現量を対照と比較する工程
〔６〕〔１〕に記載のＤＮＡのうち複数のＤＮＡまたは該ＤＮＡからコードされるポリペプチドの発現量を測定する工程を含む、癌の検査方法、
〔７〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔６〕に記載の検査方法、
（ａ）（ｉ）被検者から調製したｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料、および
（ｉｉ）〔１〕に記載のＤＮＡのうち複数のＤＮＡとそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｂ）工程（ａ）（ｉ）のｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｃ）該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料に含まれる〔１〕に記載のＤＮＡのうち複数のＤＮＡの発現量を測定する工程
（ｄ）測定された発現量を対照と比較する工程
〔８〕〔１〕に記載のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、癌の検査薬、
〔９〕〔１〕に記載のポリペプチドと結合する抗体を含む、癌の検査薬、
〔１０〕癌が肺癌である、〔８〕または〔９〕に記載の検査薬、
〔１１〕肺癌が小細胞性肺癌である、〔１０〕に記載の検査薬、
〔１２〕肺癌が扁平上皮癌、腺癌、または、カルチノイドである、〔１０〕に記載の検査薬、
〔１３〕〔１〕に記載のＤＮＡのプロモーター領域の３’側に細胞障害性タンパク質をコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡ、
〔１４〕〔１３〕に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
〔１５〕遺伝子治療用である、〔１４〕に記載のベクター、
〔１６〕〔１４〕または〔１５〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
〔１７〕〔１５〕に記載のベクターを投与する工程を含む、癌の治療方法、
〔１８〕被験試料における、抗癌活性の有無を評価する方法であって、
（ａ）癌細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）（ｉ）被験試料を接触させた癌細胞から調製したｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料、および
（ｉｉ）〔１〕に記載のＤＮＡのうち複数のＤＮＡとそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程
（ｃ）工程（ａ）（ｉ）のｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と工程（ａ）（ｉｉ）の基板を接触させる工程
（ｄ）該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料に含まれる〔１〕に記載のＤＮＡのうち複数のＤＮＡの発現量を測定する工程
を含み、上記発現量が、被験試料を接触させないときに比べ、対照における該ＤＮＡの発現量まで回復している場合に、被験試料が抗癌活性を有すると判定される方法、
〔１９〕以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法、
（ａ）〔１８〕に記載の評価方法により、複数の被験試料における、抗癌活性の有無を評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する工程〔２０〕〔１９〕に記載の工程に、さらに抗癌活性を有すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、抗癌活性を有する医薬組成物の製造方法、
〔２１〕癌が肺癌である、〔１〕〜〔７〕、〔１７〕〜〔２０〕のいずれかに記載の方法、
〔２２〕肺癌が小細胞性肺癌である、〔２１〕に記載の方法、
〔２３〕肺癌が扁平上皮癌、腺癌、または、カルチノイドである、〔２１〕に記載の方法、
を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、各種病型癌において特異的に発現するＤＮＡを指標とした癌の検査方法（診断方法）を提供する。各種病型癌において特異的に発現するＤＮＡの一例を、配列番号：１〜１１９に記載する。
【０００８】
本発明における各種病型癌において特異的に発現するＤＮＡには、上記ＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるＤＮＡからコードされるポリペプチドが、配列番号：１〜１１９のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡからコードされるポリペプチドと同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。
【０００９】
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，　９．４７−９．５８，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　ｐｒｅｓｓ，　１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者においては、配列番号：１〜１１９のいずれかに記載の塩基配列もしくはその一部を利用して、これと相同性の高いＤＮＡを単離することは、周知の技術である。
【００１０】
本発明において、配列番号：１〜１１９のいずれかに記載のＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡとしては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなど由来の変異体、アレル、バリアント、ホモログ等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００１１】
配列番号：１〜１１９のいずれかに記載のＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、５×ＳＳＣ　、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１２】
また、配列番号：１〜１１９のいずれかに記載の塩基配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して、配列番号：１〜１１９のいずれかに記載のＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡを単離することも可能である。
【００１３】
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離される、配列番号：１〜１１９のいずれかに記載のＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡは、通常、アミノ酸配列レベルにおいて高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。
【００１４】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：５８７３−５８７７，　１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，　１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ　＝　１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ　＝　１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ　＝　５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ　＝　３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００１５】
このようなＤＮＡの発現を指標とすることで癌（好ましくは肺癌）を検査することが可能である。例えば、配列番号：１〜１７のいずれかに記載のＤＮＡ（実施例の表４に記載のＤＮＡ）もしくは該ＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡの発現低下、または、配列番号：１８〜１１９のいずれかに記載のＤＮＡ（実施例の表５〜８に記載のＤＮＡ）もしくは該ＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡの発現上昇を指標として、肺癌の判定を行うことが可能である。また、配列番号：１８〜６１のいずれかに記載のＤＮＡ（実施例の表５に記載のＤＮＡ）もしくは該ＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡの発現上昇を指標として小細胞性肺癌の判定を行うことが可能である。また、配列番号：６２〜１０７のいずれかに記載のＤＮＡ（実施例の表６に記載のＤＮＡ）もしくは該ＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡの発現上昇を指標として扁平上皮癌の判定を行うことが可能である。また、配列番号：１０８〜１１７のいずれかに記載のＤＮＡ（実施例の表７に記載のＤＮＡ）もしくは該ＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡの発現上昇を指標としてカルチノイドの判定を行うことが可能である。また、配列番号：１１８または１１９に記載のＤＮＡ（実施例の表８に記載のＤＮＡ）もしくは該ＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡの発現上昇を指標として腺癌の判定を行うことが可能である。
【００１６】
本発明における検査方法としては、上記の本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡからコードされるポリペプチドの発現量を測定する工程を含む検査方法、または、本発明のＤＮＡのうち複数のＤＮＡまたは該ＤＮＡからコードされるポリペプチドの発現量を測定する工程を含む検査方法、が挙げられる。このような検査方法は、癌治療効果のモニタリングにおいてもまた使用することができる。ここで、上記ＤＮＡの発現量とは、通常、該ＤＮＡからコードされるＲＮＡの発現量を意味するが、該ＲＮＡから変換されたｃＤＮＡやｃＲＮＡの量もまた上記「ＤＮＡの発現量」に包含される。
【００１７】
以下に本発明の検査方法の具体的な態様を記載するが、本発明の検査方法は、それらの方法に限定されるものではない。なお、本発明の検査において、対照とは、癌の非罹患者を意味する。
【００１８】
本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡからコードされるポリペプチドの発現量を測定する工程を含む検査方法の一つの態様としては、まず、被検者からポリペプチド試料を調製する。本発明において、被検者からのポリペプチド試料としては、例えば、被検者の血液、尿、唾液、生検や手術により採取した組織または細胞から、当業者に周知の方法で調製したポリペプチド試料が挙げられる。
【００１９】
本発明の方法においては、次いで、該ポリペプチド試料に含まれる本発明のＤＮＡからコードされるポリペプチドの量を測定する。次いで、測定されたポリペプチドの量を対照と比較する。
【００２０】
このような方法としては、当業者に周知の方法、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法（米国特許第４，３７６，１１０号）、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法（Ｗｉｄｅら、Ｋｉｒｋｈａｍ及びＨｕｎｔｅｒ編集、「ラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ｅ．　ａｎｄ　Ｓ．　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、エジンバラ、（１９７０））、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法（蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ．４７　Ｎｏ．５（２００２）、蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ．４７　Ｎｏ．８（２００２））、２次元電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法が挙げられるが、上記検査方法は、これらに限定されない。
【００２１】
上記方法のうちＥＬＩＳＡ法の具体的な態様を以下に述べるが、本発明は、この方法に限定されるものではない。ＥＬＩＳＡ法においては、対象となる融合タンパク質が、マイクロタイターウェルの表面に吸着される。その後表面上の残余のタンパク質−結合部位が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、熱失活した正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、又はＢＬＯＴＴＯ（保存剤、塩及び消泡剤を含む脂肪非含有乾燥ミルクの緩衝液）などの適当な物質でブロッキングされる。その後ウェルを、特異的抗体を含むことが疑わしい試料と共にインキュベーションする。試料は、希釈せずに適用するか、もしくはより頻繁には通常ＢＳＡ、ＮＧＳ、又はＢＬＯＴＴＯのようなタンパク質を少量（０．１〜５．０質量％）含有する緩衝液中に希釈することができる。特異的結合が生じるのに十分な時間インキュベーションした後、ウェルを洗浄し、非結合のタンパク質を除去し、かつ次にレポーター基で標識した抗−種（ａｎｔｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）特異的免疫グロブリン抗体と共にインキュベーションする。このレポーター基は様々な酵素から選択することができ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びグルコースオキシダーゼがある。特異的結合が生じるのに十分な時間経過後、次にウェルを再度洗浄し、非結合の複合体を除去し、かつ該酵素の基質を添加する。色を発色させ、ウェルの内容物の光学密度を、肉眼で又は装置により決定する。
【００２２】
本発明においては、上記方法により、例えば、扁平上皮癌で高発現している４つの分泌タンパク質、Ｗ４９６７２　（ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ　ＭＭＴＶ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　ｆａｍｉｌｙ，　ｍｅｍｂｅｒ　５Ａ　（ＷＮＴ５Ａ））、Ｔ６２０７５　（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ）、ＡＡ１２５８７２　（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ　２　（ＡＮＧＰＴ２））、ＡＡ９３６７５７　（ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＨＢＰ１７））を検出することで、肺扁平上皮癌の早期検査を行うことができる。
【００２３】
本発明の検査方法の別の態様としては、まず、被検者からＲＮＡ試料を調製する。次いで、該ＲＮＡ試料に含まれる本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡの量を測定する。次いで、測定されたＲＮＡの量を対照と比較する。その他の態様としては、まず、被検者からｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、該ｃＤＮＡ試料に含まれる本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの量を測定する。次いで、測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する。このような方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法等を挙げることができる。
【００２４】
本発明の検査方法の別の態様としては、まず、被検者から調製したｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料、および、本発明のＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する。次いで、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板を接触させる。次いで、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料に含まれる本発明のＤＮＡの発現量を測定する。さらに、測定されたＤＮＡの発現量を対照と比較する。このような方法としては、マイクロアレイ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５）が例示できる。
【００２５】
被検者からのｃＲＮＡ試料やｃＤＮＡ試料の調製は、例えば、被検者の生検から抽出したｍＲＮＡを鋳型にして、当業者に周知の方法で行うことができる。例えば被検者の癌罹患部などから、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７９）　１８，　５２９４−５２９９）　、ＡＧＰＣ法　（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，　Ｎ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　（１９８７）　１６２，　１５６−１５９）　等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）　等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）　を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　（生化学工業社）等を用いて行うこともできる。また、ｃＲＮＡの合成は、実施例に記載の方法で行うことができる。調製したｃＲＮＡ試料やｃＤＮＡ試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。
【００２６】
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。
【００２７】
一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−　ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
【００２８】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、このような技術を本発明の基板の作製に利用することもできる。
【００２９】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、本発明のＤＮＡと特異的にハイブリダイズするものであれば特に制限されない。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、本発明のＤＮＡ　以外のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、検出するＤＮＡの塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【００３０】
また、本発明のヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドやｃＤＮＡなどが含まれる。基板に結合するヌクレオチドプローブの長さは、通常ｃＤＮＡを固定する場合１００〜４０００ベースであり、好ましくは２００〜４０００ベースであり、さらに好ましくは５００〜４０００ベースである。オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１５〜５００ベースであり、好ましくは３０〜２００ベースであり、さらに好ましくは５０〜２００ベースである。
【００３１】
本発明において、該ｃＲＮＡ試料やｃＤＮＡ試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無または強度を検出する方法としては、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。
【００３２】
上記の方法においては、本発明のＤＮＡの発現量が対照と比較して有意に上昇または減少している場合、被検者は、癌を今後発症する疑いがある（危険性が高い）、もしくは癌に罹患していると判定される。
【００３３】
また、本発明のＤＮＡうち複数のＤＮＡまたは該ＤＮＡからコードされるポリペプチドの発現量を測定する工程を含む検査方法の一つの態様としては、マイクロアレイ法を利用して、本発明のＤＮＡのうち複数のＤＮＡの発現プロファイルを解析する方法が挙げられる。まず、被検者から調製したｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料、および、本発明のＤＮＡのうち複数のＤＮＡとそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する。次いで、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板を接触させる。次いで、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料に含まれる本発明のＤＮＡのうち複数のＤＮＡの発現量を測定する。さらに、測定された発現量を対照と比較する。
【００３４】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、本発明のうち複数のＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドであれば特に制限はない。また、基板に固定するヌクレオチドプローブは、本発明においてその発現を検出したい本発明のＤＮＡに応じて、その種類の数が決定される。例えば、本発明のＤＮＡとして１０個の発現を検出したい場合、１０個それぞれのＤＮＡと特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブを基板に固定する。その際、それぞれのＤＮＡに対応したヌクレオチドプローブは必ずしも１種類に限定される必要はなく、検出したい本発明のＤＮＡの任意の領域と相補性を有する複数種のヌクレオチドプローブの混合物であってもよい。
【００３５】
上記の方法においては、本発明のＤＮＡうち複数のＤＮＡの発現量（発現プロファイル）が対照と比較して有意に変化している場合、被検者は、癌を今後発症する疑いがある（危険性が高い）、もしくは癌に罹患していると判定される。
【００３６】
本発明はまた、本発明の癌の検査方法に用いるための検査薬を提供する。このような検査薬としては、本発明のＤＮＡからコードされるポリペプチドに結合する抗体を含む検査薬が例示できる。
【００３７】
上記ポリペプチドに結合する抗体を作成するには、まず、本発明のＤＮＡを公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から本発明のＤＮＡからコードされるポリペプチド又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。
【００３８】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
【００３９】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。次いで、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
【００４０】
本発明のＤＮＡからコードされるポリペプチドに対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明の蛋白質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明の蛋白質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
【００４１】
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
【００４２】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，　Ｇ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｃ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８１）　７３，　３−４６）等に準じて行うことができる。
【００４３】
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
【００４４】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで蛋白質、蛋白質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、蛋白質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
【００４５】
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のＤＮＡからコードされるポリペプチドをカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。
【００４６】
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，　Ｃ．　Ａ．　Ｋ．ａｎｄ　Ｌａｒｒｉｃｋ，　Ｊ．　Ｗ．，　ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅＵｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ　ｂｙ　ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ　ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ　ＬＴＤ，　１９９０　参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。
【００４７】
さらに、上記抗体は、本発明のＤＮＡからコードされるポリペプチドに結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）　（Ｈｕｓｔｏｎ，　Ｊ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　（１９８８）　８５，　５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，　Ｍ．　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　（１９９４）　１５２，　２９６８−２９７６　；　Ｂｅｔｔｅｒ，　Ｍ．　ａｎｄ　Ｈｏｒｗｉｔｚ，　Ａ．　Ｈ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８９）　１７８，　４７６−４９６　；　Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．　ａｎｄ　Ｓｋｅｒｒａ，　Ａ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８９）　１７８，　４９７−５１５　；　Ｌａｍｏｙｉ，　Ｅ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８６）　１２１，　６５２−６６３　；　Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　（１９８６）　１２１，　６６３−６６９　；　Ｂｉｒｄ，　Ｒ．　Ｅ．　ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ，　Ｂ．　Ｗ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　（１９９１）　９，　１３２−１３７参照）。
【００４８】
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
【００４９】
また、本発明のＤＮＡからコードされるポリペプチドに対する抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
【００５０】
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　１９８８）　が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
【００５１】
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ　Ｄ，　ＰＯＲＯＳ，　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ．　Ｆ．　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
【００５２】
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｅｄ　Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．　Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【００５３】
このようにして得られた抗体は、上記の検査方法に使用することができるだけでなく、本発明のＤＮＡからコードされるポリペプチドを標的としたイメージングを行うことを特徴とする、癌の検査方法にも利用することができる。該方法の１つの態様としては、上記ポリペプチドに結合する抗体を作成する。次いで、該抗体をポジトロン放出同位元素で標識する。次いで、標識が付された抗体を被検者に投与する。次いで、ポジトロン放出断層撮影法で放射能を検出する。次いで、検出された放射能を対照と比較する。
【００５４】
特に、微小転移巣の検出、癌の浸潤度の判定は非小細胞性肺癌の手術適用時に重要な要素であり、特異的な細胞表面マーカーを標的としたイメージングにより実施可能である。このようなイメージング技術は、小細胞性肺癌を含めた治療への応答性評価の目的にも利用可能である。
【００５５】
また、本発明の検査薬には、本発明のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査薬もまた含まれる。該オリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
【００５６】
本発明のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査薬としては、上記本発明の検査方法に使用しうるプローブ（該プローブが固定された基板の形態であってもよい）やプライマーが挙げられる。上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、本発明のＤＮＡの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００５７】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００６０】
本発明の検査薬には、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【００６１】
また、本発明においては、本発明のＤＮＡのプロモーター領域の３’側に細胞障害性タンパク質をコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを提供する。このようなＤＮＡは抗癌剤として使用できる有用なＤＮＡである。
【００６２】
本発明において、「機能的に結合した」とは、本発明のＤＮＡのプロモータ―領域に転写因子が結合することにより、細胞障害性タンパク質をコードするＤＮＡの発現が誘導されるように、本発明のＤＮＡのプロモータ―領域と細胞障害性タンパク質をコードするＤＮＡとが結合していることをいう。従って、細胞障害性タンパク質をコードするＤＮＡが他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、本発明のＤＮＡのプロモータ―領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【００６３】
本発明における細胞障害性タンパク質としては、ジフテリア毒素、ＨＳＶ由来チミジンキナーゼなどが例示できるが、これらに限定されず、直接的または間接的に細胞に障害を与え、致死的影響を及ぼすタンパク質であれば、本発明における細胞障害性タンパク質に含まれる。
【００６４】
本発明のＤＮＡのプロモーター領域は、例えば公開されているゲノム配列データより抽出し、ＰＣＲにて対応する領域（例えばｍＲＮＡの５’末端より約３ｋｂの領域が挙げられるが、これに限定されない）を増幅することで得ることができる。得られたプロモーター領域の３’側に、当業者に周知の方法で、細胞障害性タンパク質をコードするＤＮＡを連結することにより、本発明のＤＮＡのプロモーター領域の３’側に細胞障害性タンパク質をコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを構築することができる。また、構築されたＤＮＡを、適当なベクターに組み込み、大腸菌等の宿主細胞で増幅することが可能である。
【００６５】
ヒトを含む動物の生体内において、本発明のＤＮＡのプロモーター領域の３’側に細胞障害性タンパク質をコードするＤＮＡが機能的に結合したＤＮＡを発現させる方法としては、該ＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、癌の遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ　ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ　ｖｉｖｏ法であってもよい。
【００６６】
本発明は、被験試料における抗癌活性の有無を評価する方法および抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法を提供する。
【００６７】
被験試料における抗癌活性の有無を評価する方法は、本発明のＤＮＡのうち複数のＤＮＡの発現プロファイルを指標とする方法である。このような方法としては、まず、癌細胞に被験試料を接触させる。次いで、被験試料を接触させた癌細胞から調製したｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料、および、本発明のＤＮＡのうち複数のＤＮＡとそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する。次いで、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板を接触させる。次いで、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＲＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料に含まれる本発明のＤＮＡのうち複数のＤＮＡの発現量を測定する。
【００６８】
本発明の方法における「被検試料」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、「複数の被験試料」としては、特に制限はなく、例えば、上記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
【００６９】
本発明の方法において癌細胞としては、癌組織における細胞、癌組織から採取した細胞を培養した培養細胞株などが挙げられる。また、本発明の方法における癌細胞としては、ヒトの癌の治療薬を同定することに適している生物由来の癌細胞であれば特に制限されない。このような生物としては、好ましくは哺乳動物（例えば、ラットやマウスなどのヒト疾患のモデル哺乳動物、ヒト癌が移植されたモデル哺乳動物）であり、最も好ましくはヒトである。
【００７０】
本発明において「癌細胞に被験試料を接触させる」方法としては、癌細胞に被験試料を直接的に接触させる場合だけでなく、癌細胞に被験試料を間接的に接触させる場合（この場合、例えば被験試料を接種した生物由来の細胞を使用する）の双方を含む意である。
【００７１】
癌細胞の被験試料での処理は、例えば、単離細胞であれば、Ｓｃｈｅｒｆら（Ｕ　Ｓｃｈｅｒｆ，　Ｄ　Ｔ　Ｒｏｓｓ，　Ｍ　Ｗａｌｔｈａｍ，　Ｌ　Ｈ　Ｓｍｉｔｈ，　Ｊ　Ｋ　Ｌｅｅ，　Ｌ　Ｔａｎａｂｅ，　Ｋ　Ｗ　Ｋｏｈｎ，　Ｗ　Ｃ　Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，　Ｔ　Ｇ　Ｍｙｅｒｓ，　Ｄ　Ｔ　Ａｎｄｒｅｗｓ，　Ｄ　Ａ　Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，　Ｍ　Ｂ　Ｅｉｓｅｎ，　Ｅ　Ａ　Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ，　Ｙ　Ｐｏｍｍｉｅｒ，　Ｄ　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，　Ｐ　Ｏ　Ｂｒｏｗｎ　＆　Ｊ　Ｎ　Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，　Ａ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ．　Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．　２０００，　２４．　２３６−２４４）の文献に記載の方法によって行うことができる。また、生物個体であれば、化合物を経口的または非経口的に投与することにより行うことができる。
【００７２】
本発明においては、被験試料を処理した場合の本発明のＤＮＡのうち複数のＤＮＡの発現量が、対照における該ＤＮＡの発現量まで回復している（癌細胞特異的な発現プロファイルから癌化していない正常細胞の発現プロファイルへ転換している）場合に、被験試料が抗癌活性を有すると判定される。
【００７３】
さらに、本発明は、抗癌活性を有する試料を効率的にスクリーニングする方法を提供する。該方法においては、上記評価方法を利用して、複数の被験試料について、抗癌活性の有無を評価し、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する。
【００７４】
さらに、本発明においては、抗癌活性を有する医薬組成物の製造方法を提供する。該製造方法においては、上記スクリーニング方法によって抗癌活性を有すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する。該担体としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００７５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］　アレイスライドの作成
スライドグラスに貼り付ける７６８５遺伝子のうち６７３４はＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社より購入したＩＭＡＧＥクローン、６９９は癌への関与が知られた、あるいは想定される中外所有のクローンに由来し、残る２５２は陰性コントロールとして加えた（Ａｌｕ配列、ルシフェラーゼ等）ものでデータ解析からは除外した。スライド作成はＨｅｇｄｅ，Ｐ．等の方法（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　（２００１）　６１：　７７９２−７７９７）に準じて行い、Ｍｉｃｒｏｇｒｉｄ　ＩＩ　（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ社製）を用いて１枚のスライドに７６８５遺伝子をｄｕｐｌｉｃａｔｅで貼り付けた。
【００７６】
［実施例２］　プローブの調製、ハイブリダイゼーション及び測定
３８株のヒト肺癌由来細胞株、３株の正常ヒト繊維芽細胞株（表１）、４３例の各種病型肺癌臨床検体および６例の正常肺組織（表２）を材料とした。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
【表２】
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【００７９】
臨床検体は（財）癌研究会癌研究所にて患者のｉｎｆｏｒｍｅｄ　ｃｏｎｓｅｎｔおよび倫理委員会の承認のもとで外科的摘除時に採取したものである。レファレンスサンプルとしては可能な限り多くの遺伝子について情報が得られる事を考慮して、２０％の正常肺組織にＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＥＫＶＸ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ｌｕ−１３４Ａ、ＭＲＣ５、ＳＱ５、Ｈ２３、ＰＣ１４、ＭＳ１の１０種の細胞株を夫々８％ずつ加えたものを用いた。全ての細胞株はＲＮＡｌａｔｅｒ　（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて細胞浮遊液とした。臨床検体はＲＮＡの分解を最小限にすべく採取後液体窒素にて瞬時に凍結せしめた。Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを抽出後、Ｌｕｏ，　Ｌ．等の方法（Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　（１９９９）　５　：　１１７−１２２）に従ってｃＲＮＡ合成を行った。プローブ合成はＨｕｇｈｅｓ，　ＴＲ等の方法（Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）　１９　：　３４２−３４７）に従って２ｕｇのｃＲＮＡを鋳型として行った。レファレンスサンプルはＣｙ３にてテストサンプルはＣｙ５にて蛍光標識した。ハイブリダイゼーションとその後の洗浄はＨｅｇｄｅ，　Ｐ．等の方法（前出）に従った。ハイブリダイズしたシグナルの測定と定量はＳｃａｎｎａｒｒａｙ　４０００スキャナーとＱｕａｎｔａｒｒａｙ　（何れもＰａｃｋａｒｄ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行った。
【００８０】
［実施例３］　データ解析
全てのｃＲＮＡサンプルはｄｕｐｌｉｃａｔｅにて蛍光標識を行った。標識後のプローブを７６８５個のＤＮＡスポットがｄｕｐｌｉｃａｔｅで貼り付けてあるスライドにハイブリダイズさせる事により、個々の遺伝子について４回の独立した測定を行った。スポットした７６８５　ｅｌｅｍｅｎｔ中２５２はｃｏｎｔｒｏｌとして加えたもの（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、Ａｌｕ等）で残る７４３３のうち６３８４は５６２２個のＵｎｉＧｅｎｅクラスターに相当し、１０４９はＵｎｉＧｅｎｅクラスターに一致しない事から全体で６６７１個のユニークな遺伝子がスポットされている事になる。さらに初期の検討結果から、このうち２８５は全ての臨床検体・細胞株を含めた異なる検体間で同様な発現パターンを示した事から以後の解析から除外した。この初期フィルタリングの結果、６３８６のユニークな遺伝子が以下の解析の対象として残った（図１）。１回のアレイ実験内でのデータの標準化はｌｏｗｅｓｓ　ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　（２００２），　３０　：　ｅ１５）に準拠し、標準化されたシグナル強度をレファレンスサンプルのシグナル強度で割る事により値を得た後に、Ｔｓｅｎｇ等のプログラム（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．（２００１），　２９　：　２５４９−２５５７）を用いてＣＶ値が９６％信頼区間から外れるデータをｏｕｔｌｉｅｒとして以後の解析から除外した。得られたデータセットはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いてクラスター解析、視覚化を行った（図２）。腫瘍臨床検体と細胞株のデータの直接比較をした場合に異なる病型に関わらず臨床検体に共通して高い発現を示す遺伝子、逆に細胞株に共通して高い発現を示す遺伝子が認められた。これらの遺伝子を選別する目的でＢｉｎａｒｙ　Ｓｅａｒｃｈ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを新たに考えた。すなはち、個々の遺伝子について全てのサンプルでのシグナルの平均値を求めこれより高い値を示すものに”１”、低い値を示すものに”０”の値を与える事により個々のサンプルのプロファイルをＢｉｎａｒｙ　Ｓｔｒｉｎｇｓとして表現した。これをｉｄｅａｌ　ｓｔａｔｅ（臨床検体で全て”１”／細胞株で全て”０”あるいはその逆）のｓｔｒｉｎｇと比較して６６％以上のサンプルで”１”の場合、”ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ”、６６％以上のサンプルで”０”の場合、”ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ”とした。この処理により６３８６のユニークな遺伝子中２２１８が臨床検体で細胞株と比較して発現が高い（１３１３）あるいは低い（９０５）ものとして選別された（図３）。さらにこれら２２１８遺伝子のクラスタリングの結果を目で見て確認した結果、２９９の遺伝子は臨床検体と細胞株間で際立った発現の差を認めなかった事から残る１９１９を以下の検討からは除去する事とした（図４）。全てのフィルタリングの結果最終的に４２４０の遺伝子が解析の対象として残った。Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇの結果（図５、図６）、９０の検体（肺癌臨床検体４３、正常肺臨床検体６、肺癌細胞株３８、正常胎児繊維芽細胞株３）は４つの大きなｂｒａｎｃｈに分かれた（表３）。
【００８１】
【表３】
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ＳＣＬＣは小細胞性肺癌、ＳＣＣは扁平上皮癌、ＮＳＣＬＣは非小細胞性肺癌、ＡＣは腺癌、ＬＣＣは大細胞性癌を示す。また、＊は、非小細胞性肺癌由来細胞株（病型分類不明）を示す。
【００８２】
Ｂｒａｎｃｈ　１は殆ど全ての小細胞性肺癌由来細胞株と全ての小細胞性肺癌とカルチノイドの臨床検体を含む。Ｂｒａｎｃｈ　２には扁平上皮癌の臨床検体と細胞株が多く含まれ、Ｂｒａｎｃｈ　３は細胞株のｂｒａｎｃｈで胎児由来正常繊維芽細胞株は全てこのｂｒａｎｃｈに含まれる。Ｂｒａｎｃｈ　４には全ての腺癌、大細胞癌と正常肺の臨床検体が含まれる。２株の非小細胞性肺癌由来細胞株（病型分類不明）は上記４つのｂｒａｎｃｈからは独立したｂｒａｎｃｈを形成している。Ｂｉｎａｒｙ　Ｓｅａｒｃｈ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを適用して、細胞株全般に固有の遺伝子発現プロファイルおよび臨床検体全般に固有の遺伝子発現プロファイルを除去する事により、それまで困難であった臨床検体と細胞株を直接比較する事が可能となった。特に小細胞性肺癌由来細胞株の大部分（１１／１３）と扁平上皮癌由来細胞株の一部（４／８）は夫々の細胞株が由来する病型の臨床検体クラスターに帰属された事からこれらの細胞株はもとの腫瘍の形質をよく保持していると考えられた。腺癌については今回実施したフィルタリング・クラスタリングでは正常肺組織との分離が不充分でかつ腺癌由来細胞株の帰属は得られなかった（０／１１）。この理由として、腺癌臨床検体が異なる分化度の症例からなっており、正常肺組織の混入度が高い為正常肺組織とのクラスター分離が不充分であったと考えられる一方、腺癌由来細胞株は由来する癌組織中の最も未分化な細胞が株化の過程で選択された事によると考えられた。
【００８３】
以下に、各種病型肺癌で病型特異的に発現変化を示す遺伝子一覧を示す。
（１）正常肺組織で高発現していて癌化で低下するもの（順に配列番号：１〜１７に示す）
【表４】
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【００８４】
（２）小細胞性肺癌で高発現を示すもの（順に配列番号：１８〜６１に示す）
【表５】
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【００８５】
（３）扁平上皮癌で高発現を示すもの（順に配列番号：６２〜１０７に示す）
【表６】
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【００８６】
（４）カルチノイドで高発現を示すもの（順に配列番号：１０８〜１１７に示す）
【表７】
2004049122.tif 000008
【００８７】
（５）腺癌および正常肺組織で高発現を示すもの（順に配列番号：１１８〜１２９に示す）
【表８】
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【００８８】
【発明の効果】
本発明によって、病型特異的な癌の検査や治療が可能になるものと期待される。例えば、本発明者らが見出した各種病型癌に特異的なＤＮＡを利用することで、癌の早期検査や病型検査が可能になる。また、該ＤＮＡのプロモーターを利用することで、病型特異的な癌の遺伝子治療が可能になる。さらに、該ＤＮＡの発現プロファイルを指標として抗癌活性を有する試料のスクリーニングが可能になる。
【００８９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】６３８６の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。タイプに応じて着色された標本が、左側に示され、赤はＡＣ、緑はＳＣＣ、紫は正常、青はＳＣＬＣ、黒はＬＣＣ；　オレンジ色はカルチノイド、茶色は線維芽細胞、ピンクはＮＳＬＣを表わしている。各欄は、特定の遺伝子を表わす。正方形は、４つの複製にわたる対数平均発現比率に従って着色されている。基準標本との関係において、赤は１より大きい発現比率（過剰発現）、緑は１未満（過小発現）、黒はほぼ１に等しい比率（発現変化無し）を表わしている。
【図２】本文中に記述されているように統計的にろ過することによって得られた細胞系統中の５２５５の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。タイプに応じて着色された標本が左側に示され、赤はＡＣ、緑はＳＣＣ、青はＳＣＬＣ、茶色は線維芽細胞、ピンクはＮＳＬＣを表わしている。各欄は、特定の遺伝子を表わす。正方形は４つの複製にわたる対数平均発現比率に従って着色されている。基準標本との関係において、赤は１より大きい発現比率（過剰発現）、緑は１未満（過小発現）、黒はほぼ１に等しい比率（発現変化無し）を表わしている。
【図３】腫瘍及び細胞系統の間で示差的に調節された遺伝子の同定を示す図および写真である。（Ａ）新鮮な標本に比べ細胞系統標本内で一般に過剰発現された９０５の遺伝子及び（Ｂ）新鮮な標本に比べて細胞系統標本中で一般に過小発現された１３１３の遺伝子についての全ての標本にわたる発現変化。（Ｃ）新鮮な標本と細胞系統標本の間で示差的に調節されている１９１９の遺伝子の２次元階層的クラスター化。左側の樹状図は、細胞系統標本と新鮮な標本のクラスター化を示す。分岐色は、図１に示されたとおりである。上部樹状図は、遺伝子のクラスター化を示している。
【図４】新鮮な標本と細胞系統標本の間で示差的に調節されるＢｉｎａｒｙ　Ｓｅａｒｃｈ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍによって選択され２２１８の遺伝子の２次元階層的クラスター化の樹状図を示す写真である。左側の樹状図は、細胞系統標本と新鮮な標本のクラスター化を示す。上部樹状図は、遺伝子のクラスター化を示す。新鮮な標本中でアップレギュレートされた遺伝子は右に向かってクラスター化している状態で示され、細胞系統標本中でアップレギュレートされた遺伝子は、左に向かってクラスター化している状態で示されている。主要データセットに内含させるのに、新鮮な標本と細胞系統標本の間で著しい対比を示さない遺伝子分岐（合計２９９）が選定された。
【図５】新鮮な標本又は細胞系統標本内の一般的に調節された遺伝子についてろ過した後の４２４０の遺伝子の削減されたデータセットの樹状図を示す写真である。標本は、図１の場合と同様に着色されている。左側に示されたグループは、特定の癌腫タイプの全く異なるクラスターを表わす。ｃｌ：細胞系統標本；　ｆｒ：新鮮な腫瘍標本。
【図６】全く異なる発現パターンを示す、図５からの８つの選択された遺伝子クラスターの全ての標本にわたる発現プロファイルを示す写真である。図５からの樹状図及び強調されたクラスターは、参考として底部に沿って及び個々の遺伝子クラスターの間に示されている。（Ａ）カルチノイド内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｂ）正常組織内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｃ）ＡＣ及びＬＣＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｄ〜Ｅ）ＳＣＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。（Ｆ〜Ｈ）ＳＣＬＣ内でアップレギュレートされた遺伝子。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年9月26日(2002.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
臨床検体は（財）癌研究会にて患者のｉｎｆｏｒｍｅｄ　ｃｏｎｓｅｎｔおよび倫理委員会の承認のもとで外科的摘除時に採取したものである。レファレンスサンプルとしては可能な限り多くの遺伝子について情報が得られる事を考慮して、２０％の正常肺組織にＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＥＫＶＸ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、Ｌｕ−１３４Ａ、ＭＲＣ５、ＳＱ５、Ｈ２３、ＰＣ１４、ＭＳ１の１０種の細胞株を夫々８％ずつ加えたものを用いた。全ての細胞株はＲＮＡｌａｔｅｒ　（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて細胞浮遊液とした。臨床検体はＲＮＡの分解を最小限にすべく採取後液体窒素にて瞬時に凍結せしめた。Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを抽出後、Ｌｕｏ，　Ｌ．等の方法（Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　（１９９９）　５　：　１１７−１２２）に従ってｃＲＮＡ合成を行った。プローブ合成はＨｕｇｈｅｓ，　ＴＲ等の方法（Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　（２００１）　１９　：　３４２−３４７）に従って２ｕｇのｃＲＮＡを鋳型として行った。レファレンスサンプルはＣｙ３にてテストサンプルはＣｙ５にて蛍光標識した。ハイブリダイゼーションとその後の洗浄はＨｅｇｄｅ，　Ｐ．等の方法（前出）に従った。ハイブリダイズしたシグナルの測定と定量はＳｃａｎｎａｒｒａｙ　４０００スキャナーとＱｕａｎｔａｒｒａｙ　（何れもＰａｃｋａｒｄ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行った。