(57)【要約】【課題】被検試料中に存在するポリヌクレオチドを迅速且つ簡便に分析することができる分析方法を提供する。【解決手段】前記分析方法は、被検試料と、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーと、前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程、及び前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（ａ）分析対象ポリヌクレオチドを含有する可能性のある被検試料と、（ｂ）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｃ）前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程
を含む、前記分析対象ポリヌクレオチドの分析方法。
【請求項２】
前記分析工程における分析方法が、イムノクロマトグラフィー法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
（１）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）前記オリゴヌクレオチドプライマーとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップ
を含む、分析対象ポリヌクレオチドの分析用キット。
【請求項４】
（１）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）前記オリゴヌクレオチドプライマーとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液
を含む、分析対象ポリヌクレオチドの分析用キット。
【請求項５】
（１）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）前記オリゴヌクレオチドプライマーと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（３）前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液
を含む、分析対象ポリヌクレオチドの分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規の分析方法に関する。なお、本明細書における「分析」には、分析対象ポリヌクレオチドの存在の有無を判定する「検出」と、分析対象ポリヌクレオチドの存在量を決定する「定量」との両方が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
被検試料中の分析対象ポリヌクレオチドを分析することは、学術的分野、例えば、分子生物学又は生化学の研究分野において重要であるばかりでなく、実用的な分野、例えば、臨床検査又は環境分析の分野など、幅広い分野で重要なテーマである。例えば、臨床検査分野では、種々の疾病の原因菌を特定するために、患者由来の被検試料中に疾病原因菌の特定遺伝子が存在するか否かを、迅速且つ簡便に分析可能な方法が求められている。
【０００３】
このような分析方法の１つとして、原因菌の特定遺伝子又はその断片を特異的に増幅可能なプライマーセットを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が公知である〔「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，（米国），１９８８年，第２３９巻，ｐ．４８７−４９１（非特許文献１）〕。例えば、患者由来の被検試料から遺伝子を抽出し、原因菌に特異的な遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅し、その生成物を電気泳動した後、ＤＮＡのサイズを確認する方法や、標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることにより原因菌の同定が行なわれている。この場合、電気泳動を実施することが必要であるため、電気泳動のための装置が必要であり、更に、結果が出るまでに５〜６時間かかる。
【０００４】
【非特許文献１】
「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，（米国），１９８８年，第２３９巻，ｐ．４８７−４９１
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、被検試料中に存在するポリヌクレオチドを迅速且つ簡便に分析することができる手段を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、（１）（ａ）分析対象ポリヌクレオチドを含有する可能性のある被検試料と、（ｂ）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｃ）前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程
を含む、前記分析対象ポリヌクレオチドの分析方法により解決することができる。
また、本発明は、（１）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）前記オリゴヌクレオチドプライマーとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップ
を含む、分析対象ポリヌクレオチドの分析用キットに関する。
また、本発明は、（１）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）前記オリゴヌクレオチドプライマーとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液
を含む、分析対象ポリヌクレオチドの分析用キットに関する。
また、本発明は、（１）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）前記オリゴヌクレオチドプライマーと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（３）前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液
を含む、分析対象ポリヌクレオチドの分析用キットに関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の分析方法は、
（１）（ａ）分析対象ポリヌクレオチドを含有する可能性のある被検試料と、（ｂ）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｃ）前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程（ＤＮＡ増幅工程）；及び
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程（分析工程）
を含む。
【０００８】
本発明の分析方法で分析することのできる被検試料は、ポリヌクレオチドを含有する可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、細菌を含む可能性のある試料を挙げることができ、より具体的には、例えば、臨床材料（例えば、血液、尿、便、髄液、喀痰、又は咽頭拭い液など）、食品試料（例えば、飲料水、牛乳若しくは乳製品、卵若しくは卵製品、肉若しくは肉製品、魚介類若しくは魚介類製品、冷凍食品、日配食品、菓子類、又は香辛料等）、飼料若しくは飼料製品、工業用水、環境検査用試料、又は各種ふき取り検査試料を挙げることができる。
これらの被検試料を、そのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、ＤＮＡ増幅工程に用いることができる。
【０００９】
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれ、その塩基数の下限は、本発明の分析方法におけるＤＮＡ増幅工程においてＤＮＡ増幅が可能である限り、特に限定されるものではない。通常、塩基数が５０個以上であれば、ＰＣＲ法によりＤＮＡ増幅が可能である。
【００１０】
ＤＮＡ増幅工程は、プライマーセットとして、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーと、前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせを用いること以外は、例えば、通常のＰＣＲ法に従って実施することができる。
プライマーの塩基数は特に限定されるものではないが、例えば、通常、１５塩基〜４０塩基であることができ、１５塩基〜２０塩基であることが好ましい。
【００１１】
プライマーの５’末端を標識化する標識物質は、ＰＣＲに影響を与えることがなく、しかも、その標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、プライマーの標識化に一般的に用いられる公知の標識物質を使用することができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光物質〔例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン、ビオチン等を挙げることができる。
【００１２】
２個１組のプライマーセットに対して用いる標識物質の種類は、同種（すなわち、１種類）であることもできるし、あるいは、異種（すなわち、２種類）であることもできる。標識物質として同種又は異種の標識物質を用いるかは、後述の分析工程の説明の際に詳述するように、分析工程において利用する分析手法により、適宜決定することができる。
例えば、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法又はサンドイッチ法を利用する場合には、同種の標識物質を用いることもできるし、あるいは、異種の標識物質を用いることもできる。一方、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を利用する場合には、その実施形態により、利用可能な標識物質の種類が制限されることがあり、異種の標識物質を用いることが必要な場合がある。
【００１３】
これらの標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を挙げることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。
【００１４】
前記分析工程では、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する。反応生成物の分析方法としては、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いる限り、特に限定されるものではなく、例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法などを挙げることができる。なお、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物は、そのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、分析工程にかけることができる。
【００１５】
以下、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、及びサンドイッチ法を利用する各態様について、この順序に従って説明する。
本発明の分析方法において、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を用いる場合には、例えば、イムノクロマトグラフ用ストリップとして、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子（すなわち、着色粒子コンジュゲート）を、固相担体に保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが、前記固相担体に固定化（すなわち、固相化）されているイムノクロマトグラフ用ストリップを使用することができる。
【００１６】
前記固相担体としては、例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、又はガラス繊維フィルター等を用いることができる。
前記着色粒子としては、例えば、金属コロイド（例えば、金コロイド等）、非金属コロイド（例えば、ポリスチレンコロイド等）、又はリポゾーム等を用いることができる。
標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、例えば、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を用いることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。以下、固相担体に固定化させる前記パートナーを「固定化用パートナー」と称し、着色粒子に結合させ、着色粒子コンジュゲートとして固相担体に保持させる前記パートナーを「保持用パートナー」と称する。
【００１７】
本発明の分析方法で用いることのできる前記イムノクロマトグラフ用ストリップでは、被検試料の展開方向に関して、上流側に、着色粒子コンジュゲートの保持領域（例えば、塗布領域）を設け、下流側に、固定化用パートナーの固定領域を設ける。固定化用パートナー（例えば、抗体）の固相への結合は、例えば、約１μｇ／ｍＬの抗体溶液を固相担体に加え、室温放置することにより行なうことができる。タンパク質の非特異的吸着をブロックするために、例えば、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングすることが好ましい。
なお、陰性コントロールとして、例えば、マウスＩｇＧ又はウサギＩｇＧを固定する領域は、固定化用パートナーの固定領域の更に下流側に設けることもできるし、設けないでおくこともできるが、検査を正確にするためには設ける方が好ましい。
【００１８】
イムノクロマトグラフ法を用いる本発明の分析方法では、固相担体に固定化された固定化用パートナーと、固相担体に保持された着色粒子コンジュゲートとを介して、ＤＮＡ増幅工程で増幅した二重標識ＤＮＡ生成物を検出する。担体の役割は、被検出物（二重標識ＤＮＡ生成物）と着色粒子コンジュゲートとを展開し、固定化された固定化用パートナーと反応させ、更に、未反応物を分離することにある。
【００１９】
より具体的には、クロマトグラフ用ストリップの着色粒子コンジュゲートを塗布した側の端に、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）が接触すると、この水溶液はクロマトグラフ用ストリップに吸収及び展開され、先端に向かって浸透する。前記接触方法としては、例えば、被検試料滴下部位に滴下する方法、あるいは、容器（例えば、ウェル）内の被検試料を吸着する方法などを挙げることができる。着色粒子コンジュゲートを塗布した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、保持用パートナーを介して着色粒子コンジュゲートと結合し、更にクロマトグラフ用ストリップ上を移動する。そして、この二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、この固定化用パートナーに結合し、トラップされる。その結果、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体は、この領域で停止し、これ以上移動しない。
【００２０】
イムノクロマトグラフ法を利用する本発明の分析方法では、この着色粒子の担体上での集積を目視により観察することにより、ＤＮＡ増幅工程において目的の遺伝子断片が生成したか否かを決定することができる。更には、前記目的遺伝子が特定菌（例えば、疾病原因菌）に由来するものである場合には、目的遺伝子断片の生成が確認されれば、被検試料中に前記特定菌が存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００２１】
なお、このように、着色粒子コンジュゲートを保持し、しかも、固定化用パートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップを用いる場合には、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いることが必要である。仮に、両プライマーが同種の標識物質で標識化されていると、二重標識ＤＮＡ生成物が着色粒子コンジュゲート保持領域を通過し、両者の複合体を形成した際に、二重標識ＤＮＡ生成物におけるパートナー結合部位が、全て、着色粒子コンジュゲートとの結合に使用されてしまい、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達しても、固定化用パートナーとの結合部位が残っていないことがあるからである。
【００２２】
従って、イムノクロマトグラフ法を利用し、しかも、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として同種の標識物質を用いた場合には、例えば、固定化用パートナーが固定化されているが、着色粒子コンジュゲートを保持しないイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物を展開する第１工程を実施した後、着色粒子コンジュゲートを展開する第２工程を実施する必要がある。この場合、第１工程が終了した時点で、ストリップ上の固定化用パートナー固定化領域に、一方の標識物質が未反応の状態で二重標識ＤＮＡ生成物が結合し、第２工程において、その未反応の標識物質に、着色粒子コンジュゲートが結合することができる。
【００２３】
本発明の分析方法において、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物と接触させるラテックス懸濁液として、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を用いること以外は、通常のラテックス凝集法をそのまま適用して実施することができる。
ラテックス凝集法を用いる場合には、２個１組のプライマーセットに対して用いる標識物質の種類は、同種（すなわち、１種類）であることもできるし、あるいは、異種（すなわち、２種類）であることもできる。同種であると、競合が生じて凝集度に影響を与える可能性があるため、異種の標識物質を用いることが好ましい。
【００２４】
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いる場合には、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナー（すなわち、一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナー）を担持したラテックス懸濁液を使用する。一方、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を使用する。
【００２５】
ラテックスとしては、通常の免疫分析用試薬に使用可能なラテックスである限り、特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレン、又はスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体などを挙げることができる。ラテックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．０５〜０．５μｍであることができる。
２種類のパートナーを用いる場合には、それらをラテックス上に担持させる形態としては、例えば、２種類のパートナーを混合した状態で、同一のラテックス上に担持させることもできるし、あるいは、２種類のパートナーを、それぞれ、別々のラテックス上に担持させることもできる。
パートナーを担持するラテックス懸濁液は、公知方法、例えば、物理的又は化学的結合により感作させることにより、調製することができる。
【００２６】
ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）と、前記ラテックス懸濁液とを接触させると、前記反応生成物中に二重標識ＤＮＡ生成物が存在する場合には、特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により凝集が生じる。
例えば、抗原抗体反応の条件は、通常の免疫学的ラテックス比濁分析方法の実施条件と同様であることができ、例えば、反応のｐＨは、６〜８．５で実施することができる。反応温度は０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。反応時間は、適宜決定することができ、例えば、汎用自動分析機では１０〜１５分間で測定を完了することができる。
【００２７】
特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により生じた凝集の程度は、公知の分析方法、例えば、光学的分析方法により分析することができる。前記光学的分析方法としては、例えば、反応液に光を照射して散乱光又は透過光を分析する方法を挙げることができ、より具体的には、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて分析を行なうことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。前記光学機器を用いた分析では、公知の方法に従って、用いるラテックス粒子の大きさ及び／又は濃度の選択、並びに反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより実施することができる。また、これらの方法を併用することも可能である。ラテックス凝集法を利用する本発明の分析方法では、ラテックスの凝集の程度を観察することにより、ＤＮＡ増幅工程において目的の遺伝子断片が生成したか否かを決定することができる。更には、前記目的遺伝子が特定菌（例えば、疾病原因菌）に由来するものである場合には、目的遺伝子断片の生成が確認されれば、被検試料中に前記特定菌が存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００２８】
本発明の分析方法において、分析工程における分析手法として、サンドイッチ法を用いる場合には、分析対象化合物に対する抗体の代わりに、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、通常のサンドイッチ法をそのまま適用して実施することができる。
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いる場合には、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナーを使用する。一方、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを使用する。
【００２９】
具体的には、例えば、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能な第１のパートナーを、適当な不溶性担体に固定化する。次に、不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤〔例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等〕で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（１次反応）。続いて、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質の残る一方に特異的に結合可能な第２のパートナーに標識物質を付した標識化第２パートナーを加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識化第２パートナーの量を定量する。その値から、ＤＮＡ増幅工程において目的の遺伝子断片が生成したか否かを決定することができる。更には、前記目的遺伝子が特定菌（例えば、疾病原因菌）に由来するものである場合には、目的遺伝子断片の生成が確認されれば、被検試料中に前記特定菌が存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、前記第１及び第２パートナーに代えて、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、同様にして実施することができる。また、１次反応と２次反応とを同時に行なうことも可能である。
【００３０】
前記不溶性担体としては、例えば、高分子（例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、又はポリサッカライド等）、ニトロセルロース、紙、若しくはアガロース、又はこれらの組み合わせ等を例示することができる。
第２パートナーに付す標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、又は発光物質を挙げることができる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル又はルシフェリン等を使用することができる。
【００３１】
本発明の分析用キットには、分析工程における分析手法としてイムノクロマトグラフ法を利用する本発明の分析方法に用いることのできる分析用キット（以下、イムノクロマトグラフ型分析用キットと称する）と、分析工程における分析手法としてラテックス凝集法を利用する本発明の分析方法に用いることのできる分析用キット（以下、ラテックス凝集型分析用キットと称する）とが含まれる。
【００３２】
本発明のイムノクロマトグラフ型分析用キットは、
（１）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップ
を含む。
【００３３】
本発明のラテックス凝集型分析用キットは、
（１）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；（２）前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液
を含むか、あるいは、
（１）標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；
（２）前記オリゴヌクレオチドとは同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（３）前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液
を含む。
【００３４】
本発明の分析用キット（イムノクロマトグラフ型分析用キット及びラテックス凝集型分析用キットの両方を含む）に含まれる、前記の各オリゴヌクレオチドプライマーの塩基長及び塩基配列は、分析対象ポリヌクレオチド又はその断片を増幅することができる限り、特に限定されるものではなく、増幅対象に応じて適宜決定することができる。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング》
本実施例では、市販のキット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）を用いてポルフィロモナス・ジンジバリスの菌体からゲノムＤＮＡを単離した後、２種類のプライマーとして配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法で１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを得た。このＰＣＲ産物をプラスミドｐＺＥｒＯ−１のＥｃｏＲＶ  サイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。各工程の手順は、以下に示す通りである。
【００３６】
（１）ポルフィロモナス・ジンジバリスの培養
ＧＡＭ寒天培地（日水製薬製）にビタミンＫ及びヘミンを添加し、嫌気バッグ（ダイアヤトロン社）を用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ  ３３２７７株の培養を４８時間行なった。
【００３７】
（２）合成ＤＮＡの作成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、４種類のプライマーＤＮＡ（配列番号１〜配列番号４）を合成した。配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、ＦＩＴＣ標識ｄＡＴＰを用い、配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、ビオチン標識ｄＧＴＰを用いて合成した。
ユニバーサルプライマー１（配列番号１）及びユニバーサルプライマー２（配列番号２）の各塩基配列は、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌のゲノムＤＮＡの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するものである。従って、プライマー１とプライマー２を用いてＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ生成物（Ｉ）は、１，５００塩基対である。
【００３８】
なお、前記ユニバーサルプライマー（配列番号１及び配列番号２）は、参考文献〔Ｌａｎｅ，  Ｄ．Ｊ．  （１９９１）．  １６Ｓ／２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ．  Ｅ．  Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，  ｅｄｓ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ：  １１５−１７５〕のプライマー２７ｆ及びプライマー１４９２ｆを引用したものである。
また、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ  ３３２７７）の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｌ１６４９２（１４７４ｂｐ）から引用した。配列番号３で表される塩基配列は、その第８４１番〜第８５８番であり、配列番号４で表される塩基配列は、第１００２番〜第１０１９番である。また、配列番号１で表される塩基配列は、第８番〜第２７番であるが、配列番号２で表される塩基配列は、この中には含まれていない。
【００３９】
（３）遺伝子の増幅
実施例１（１）で培養したポルフィロモナス・ジンジバリス菌から調製したゲノムＤＮＡと、実施例１（２）で合成したプライマー１及びプライマー２とを用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号１及び２）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で１分３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００４０】
（４）組み換えプラスミドの作製
クローニングベクターとして、ｐＺＥｒＯ−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いた。実施例１（３）で得られたＤＮＡ生成物（Ｉ）とｐＺＥｒＯ−１ベクターのＥｃｏＲＶサイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。
具体的には、ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動で分離し、約１，５００ｂｐのバンドを切り取り、市販のカラム（ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＡＧＡＲＯＳＥ  ＳＰＩＮ  ＣＯＬＵＭＮ；ＳＩＧＭＡ社）で精製した。ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、ＤＮＡ（Ｉ）３μＬとｐＺＥｒＯ−１ベクター（制限酵素ＥｃｏＲＶで処理したもの）１μＬとを加え、更にライゲーション溶液Ｉ（酵素液）４μＬを加えて１６℃で３０分間反応させ、ライゲーションを行ない、プラスミドＤＮＡ（ＩＩ）を作製した。
【００４１】
（５）形質転換
実施例１（４）で得られた組み換えＤＮＡを用いて、常法により形質転換を行なった。すなわち、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２処理して作製したコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α株）にプラスミドＤＮＡを導入した。
【００４２】
（６）形質転換体に含まれる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の単離
実施例１（５）で得られた形質転換体であるコロニーを、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＹＴ−ブロスに接種し、３７℃で一夜培養を行なった。この培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブに入れ、遠心分離で菌体を集め、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離した。
【００４３】
（７）塩基配列の決定
実施例１（６）で得られたＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８  ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
【００４４】
【実施例２】
《１７９ｂｐ  ＤＮＡ遺伝子の増幅》
本実施例では、実施例１で作製したポルフィロモナス・ジンジバリスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローンからＤＮＡを単離し、２種類のプライマーとして配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行ない、そのＰＣＲ生成物量及び塩基配列を確認した。
【００４５】
（１）遺伝子の増幅
実施例１で作製した１．５ｋｂｐのｒＲＮＡ遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡと、実施例１（２）で合成した２種類の標識プライマー、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）を用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号３及び４）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクル数による二重標識ＰＣＲ生成物量を確認するため、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応を行なった。
【００４６】
結果を図１に示す。図１は、ＰＣＲ生成物の０．８％アガロースゲル電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。各レーンは、下記のとおりである：
レーン１：ＤＮＡマーカー（１２３ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製）；
レーン２：ＤＮＡマーカー（ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ  ＶＩＩＩ；ベーリンガー・マンハイム製）；
レーン３：ＰＣＲのサイクル数１０回の生成物；
レーン４：ＰＣＲのサイクル数１５回の生成物；
レーン５：ＰＣＲのサイクル数２０回の生成物；
レーン６：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物；
レーン７：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を１０倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；
レーン８：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を５０倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；
レーン９：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を１００倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；
レーン１０：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を２００倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；及び
レーン１１：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を５００倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの。
【００４７】
（２）１７９ｂｐＤＮＡの精製
実施例２（１）で得られたポルフィロモナス・ジンジバリスのＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（１２３ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製）から判断し、１７９ｂｐバンドに相応するバンドを切り取り、市販のキット（ＤＮＡ  Ｐｒｅｐ；ダイアヤトロン社）を用いてＤＮＡを精製した。
【００４８】
（３）塩基配列の決定
実施例２（２）で得られたポルフィロモナス・ジンジバリスのＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８  ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
【００４９】
【実施例３】
《各種菌体から単離したゲノムを用いたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅》
本実施例では、実施例１で作製したポルフィロモナス・ジンジバリスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローン、及び各種菌体（ポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノバチルス・アクチノミセテコミタンス、プレボテラ・インテルメディア、及び大腸菌の培養菌株）からＤＮＡを単離し、２種類の標識プライマーとして配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行なった。
【００５０】
（１）ＤＮＡの分離
寒天平板上の各種培養菌株のコロニーから少量つま楊枝で採取し、市販のＤＮＡ調製キット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）により調製した。
【００５１】
（２）遺伝子の増幅
実施例３（１）で得たＤＮＡと、実施例１（２）で合成した２種類の標識プライマー、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）を用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号３及び４）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００５２】
（３）１７９ｂｐＤＮＡの確認
実施例３（２）で得られたＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（１２３ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製）を指標として  １７９ｂｐバンドの有無を確認した。
【００５３】
【実施例４】
《イムノクロマトグラフ用ストリップの作製》
本実施例では、ＰＣＲ生成物捕捉用抗体としてモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ＺＹＭＥＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ＺＹＭＥＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を、金コロイド標識物としてストレプトアビジン（ＴＲＩＮＡ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ製）を用いて、ＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。
【００５４】
（１）イムノクロマトグラフ用メンブレンの作製
ポリアミド（ナイロン６６）製メンブレン（Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ  ＡＢＣ，孔径＝３．０μｍ；Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×２０ｍｍのサイズに裁断した。
メンブレンの上流側の一端から８ｍｍの位置に、ＰＣＲ生成物の検出ゾーンとして、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液〔各々濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈〕を幅１ｍｍの線状に塗布した。
また、メンブレンの上流側の一端から１３ｍｍの位置に、陰性コントロールゾーンとして、マウスＩｇＧ溶液〔濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈〕を、幅１ｍｍの線状に塗布した。
室温下で１時間、３７℃下で３０分間静置し、各々の抗体を固相化した。メンブレンを０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸し、室温及び相対湿度２０％以下の条件下で３０分間緩やかに振とうし、ブロッキングした。メンブレンの過剰のブロッキング液を除き、室温下で一夜静置し、乾燥させ、二重標識ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用抗体固相化メンブレンとした。
【００５５】
（２）金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液の作製
ストレプトアビジン（濃度１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを２ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｎａ２Ｂ４Ｏ７緩衝液（ｐＨ６．５）（以下、Ｂｏｒａｘ緩衝液と称する）３，０００ｍＬ中で４℃下で一夜透析した。ストレプトアビジン溶液は、４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した後、その上清を、１００，０００×ｇで１時間遠心分離したＢｏｒａｘ緩衝液で１００μｇ／ｍＬとなるように希釈した。金コロイド液（ＧＯＬＤ  ＣＯＬＬＯＩＤ  ２０ｎｍ；Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＢｉｏＣｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）１００ｍＬを、０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｋ２ＣＯ３溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ３ＰＯ４溶液でｐＨ６．５に調整した。金コロイド液２０ｍＬを撹拌しながら、希釈したストレプトアビジン溶液２ｍＬを徐々に滴下し、室温下で３０分間撹拌した。更に、撹拌しながら１０％ＢＳＡ溶液（ｐＨ９．０；４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した上清）２．５ｍＬを滴下した後、室温下で３０分間撹拌した。１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。更に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。最後に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）（０．４５μｍフィルター濾過）に再懸濁させた後、波長５２０ｎｍにおける吸光度が約１０になるように濃度調整し、表面をシリコン処理したガラス試験管に移し、密栓し、４℃下に保存し、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液とした。
【００５６】
金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液は、波長５２０ｎｍにおける吸光度が３．０になるように、５．０％ショ糖を含む２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈した後、その７μＬを、吸収パッドアキュウィックＡＷ１４−２０Ｔ４（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×５ｍｍのサイズに裁断したものに塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≦５０ｍｍＨｇ）乾燥したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジンパッドとした。
【００５７】
（３）イムノクロマトグラフ法用吸収パッドの作製
グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｂ；Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×１８ｍｍのサイズに裁断したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用試料添加パッドとした。グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｅ；Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに裁断したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用吸収パッドとした。
【００５８】
（４）イムノクロマトグラフ用ストリップ
５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに裁断したプラスティック粘着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、上流側より、試料添加パッド、金コロイド標識ストレプトアビジンパッド、抗体固相化メンブレン、及び吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ重ね合わせて貼付し、ＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップとした。
【００５９】
【実施例５】
《イムノクロマトグラフ法によるＰＣＲ生成物の測定》
本実施例では、実施例４で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法を実施した。
【００６０】
（１）ＰＣＲ法のサイクル回数別によるＰＣＲ生成物の検出
実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマーを用い、ＰＣＲ法のサイクル回数として、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応をそれぞれ行なった。これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００６１】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表１に示す。表１において、「−」は陰性、「＋」は陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
今回行なったＰＣＲ法では、ＰＣＲのサイクル回数１０回では二重標識ＰＣＲ生成物が、まだ、あまり産生されておらず、イムノクロマトグラフ用ストリップで測定することができなかった。ＰＣＲのサイクル回数が１５回、２０回、及び３０回では、二重標識ＰＣＲ生成物をイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて測定することができた。
【００６２】
2004154075.tif 000002
【００６３】
（２）ＰＣＲ生成物の希釈溶液の測定
実施例５（１）においてＰＣＲ法のサイクル回数として３０回を行なった反応液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、及び１０００倍にそれぞれ希釈した溶液、並びに２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）の各１００μＬを水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００６４】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。
図２に、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの結果を示す。
表２に、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。また、表３に、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。表２及び表３において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
【００６５】
図２において、レーン１は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μＬをアプライした結果であり、レーン２は、ビオチン結合抗ＩｇＧ抗体溶液１００μＬをアプライした結果であり、レーン３〜レーン８は、ＰＣＲ生成物を１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、及び１０００倍にそれぞれ希釈した溶液１００μＬをアプライした結果であり、レーン９は、希釈用緩衝液（すなわち、リン酸塩緩衝液）１００μＬをアプライした結果である。図２において、展開方向は、下から上へ向かう方向（すなわち、下方が試料添加パッド側であり、上方が吸収パッド側である）である。また、レーン１及び２に共通して観察される上方のバンドは、陰性コントロールとしてのマウスＩｇＧを塗布したゾーンであり、レーン２のバンドはマウスＩｇＧの検出ゾーンであり、レーン１のバンドは非特異反応で生じたものである。
【００６６】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化抗体に用いたＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を５００倍希釈したものまで検出可能であり、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を１，０００倍希釈したものまで検出可能であった。
【００６７】
2004154075.tif 000003
【００６８】
2004154075.tif 000004
【００６９】
（３）培養菌株を用いたＰＣＲ生成物の測定
実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）〕を用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、アクチノバチルス・アクチノマイセテコミタンス（Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｃｏｍｉｔａｎｓ）、プレボテーラ・インテルメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養菌株を用いて、同一のＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【００７０】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表４に示す。表４において、「−」は陰性、「＋＋」は中陽性であることを示す。このイムノクロマトグラフ用ストリップでポルフィロモナス・ジンジバリスのみに特異的に反応する結果が得られた。
【００７１】
《表４》
2004154075.tif 000005
【００７２】
（４）患者試料から得られたＰＣＲ生成物の測定
歯周病患者試料を用いて、実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）〕を用いて、ＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【００７３】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでの患者検体を用いたＰＣＲ生成物の測定結果を表５に示す。表５において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性であることを示す。
【００７４】
2004154075.tif 000006
【００７５】
【実施例６】
《マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング》
本実施例では、市販のキット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）を用いてマイコバクテリウム・ツベルクローシスの菌体からゲノムＤＮＡを単離した後、２種類のプライマーとして配列番号６及び配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法で１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを得た。このＰＣＲ産物をプラスミドｐＺＥｒＯ−１のＥｃｏＲＶ  サイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。各工程の手順は、以下に示す通りである。
【００７６】
（１）マイコバクテリウム・ツベルクローシスの培養
結核菌マイコバクテリウム・ツベルクローシスは、小川培地（極東製薬製）を用いて３〜４週間培養を行なった。
【００７７】
（２）合成ＤＮＡの作成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、６種類のプライマーＤＮＡ（配列番号６〜配列番号１１）を合成した。配列番号８又は１０で表される各塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、各々ＦＩＴＣ標識ｄＧＴＰ又はＦＩＴＣ標識ｄＡＴＰを用い、配列番号９又は１１で表される各塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、ビオチン標識ｄＣＴＰを用いて合成した。
ユニバーサルプライマー６（配列番号６）及びユニバーサルプライマー７（配列番号７）の各塩基配列は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌のゲノムＤＮＡの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するものである。従って、プライマー６とプライマー７を用いてＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ生成物（ＩＩＩ）は、１，５００塩基対である。
【００７８】
なお、前記ユニバーサルプライマー（配列番号６及び配列番号７）は、参考文献〔Ｌａｎｅ，  Ｄ．Ｊ．  （１９９１）．  １６Ｓ／２３Ｓ  ｒＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ．  Ｅ．  Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，  ｅｄｓ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ：  １１５−１７５〕のプライマー２７ｆ及びプライマー１４９２ｆを引用したものである。
また、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列としては、英国サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）研究所が公開している結核菌ゲノムの情報のＥＮＴＲＹ：ＭＴＵｒＲＮＡ０１で１６Ｓ  ｒＲＮＡ（１４７１８４４−１４７３３８０）の１５３７塩基が掲載されているのを使用した。配列番号８で表される塩基配列は、その第７６番〜第９１番（１４７１９１９〜１４７１９３４）であり、配列番号９で表される塩基配列は、第２０５番〜第２１９番（１４７２０４８〜１４７２０６２）であり、配列番号１０で表される塩基配列は、その第１２７１番〜第１２８５番（１４７３１１４〜１４７３１２８）であり、配列番号１１で表される塩基配列は、第１４３７番〜第１４５１番（１４７３２８０〜１４７３２９４）である。また、配列番号６で表される塩基配列は、第１１番〜第３０番（１４７１８５４〜１４７１８７３）であり、配列番号７で表される塩基配列は、第１４８５番〜第１５０６番（１４７３３２８〜１４７３３４９）である。
【００７９】
（３）遺伝子の増幅
実施例６（１）で培養したマイコバクテリウム・ツベルクローシス菌から調製したゲノムＤＮＡと、実施例６（２）で合成したプライマー６及びプライマー７とを用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号６及び７）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で１分３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００８０】
（４）組み換えプラスミドの作製
クローニングベクターとして、ｐＺＥｒＯ−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いた。実施例６（３）で得られたＤＮＡ生成物（ＩＩＩ）とｐＺＥｒＯ−１ベクターのＥｃｏＲＶサイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。
具体的には、ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動で分離し、約１，５００ｂｐのバンドを切り取り、市販のカラム（ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＡＧＡＲＯＳＥ  ＳＰＩＮ  ＣＯＬＵＭＮ；ＳＩＧＭＡ社）で精製した。ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、ＤＮＡ（ＩＩＩ）３μＬとｐＺＥｒＯ−１ベクター（制限酵素ＥｃｏＲＶで処理したもの）１μＬとを加え、更にライゲーション溶液Ｉ（酵素液）４μＬを加えて１６℃で３０分間反応させ、ライゲーションを行ない、プラスミドＤＮＡ（ＩＶ）を作製した。
【００８１】
（５）形質転換
実施例６（４）で得られた組み換えＤＮＡを用いて、常法により形質転換を行なった。すなわち、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２処理して作製したコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α株）にプラスミドＤＮＡを導入した。
【００８２】
（６）形質転換体に含まれる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の単離
実施例６（５）で得られた形質転換体であるコロニーを、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＹＴ−ブロスに接種し、３７℃で一夜培養を行なった。この培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブに入れ、遠心分離で菌体を集め、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離した。
【００８３】
（７）塩基配列の決定
実施例６（６）で得られたＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８  ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
【００８４】
【実施例７】
《１４４ｂｐ及び１８０ｂｐの各ＤＮＡ遺伝子の増幅》
本実施例では、実施例６で作製したマイコバクテリウム・ツベルクローシスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローンからＤＮＡを単離し、２種類のプライマーセットとして、配列番号８及び配列番号９で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセット、並びに配列番号１０及び配列番号１１で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行ない、そのＰＣＲ生成物量及び塩基配列を確認した。
【００８５】
（１）遺伝子の増幅
実施例６で作製した１．５ｋｂｐのｒＲＮＡ遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡと、実施例６（２）で合成した２種類の標識プライマーセット、すなわち、プライマー８（配列番号８）及びプライマー９（配列番号９）との組み合わせ、又はプライマー１０（配列番号１０）及びプライマー１１（配列番号１１）との組み合わせをそれぞれ用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号８及び９）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクル数による二重標識ＰＣＲ生成物量を確認するため、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応を行なった。
【００８６】
（２）１４４ｂｐ及び１８０ｂｐの各ＤＮＡの精製
実施例７（１）で得られたマイコバクテリウム・ツベルクローシスのＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ  Ｄｉｇｅｓｔ；東洋紡）から判断し、１４４ｂｐバンド及び１８０ｂｐバンドに相応する各バンドを切り取り、市販のキット（ＤＮＡ  Ｐｒｅｐ；ダイアヤトロン社）を用いてＤＮＡを精製した。
【００８７】
（３）塩基配列の決定
実施例７（２）で得られたマイコバクテリウム・ツベルクローシスのＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８  ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
プライマー８（配列番号８）及びプライマー９（配列番号９）との組み合わせから得られた１４４ｂｐのＤＮＡバンドからは、配列番号１２で表される塩基配列が得られ、プライマー１０（配列番号１０）及びプライマー１１（配列番号１１）との組み合わせから得られた１８０ｂｐのＤＮＡバンドからは、配列番号１３で表される塩基配列が得られた。
【００８８】
【実施例８】
《各種菌体から単離したゲノムを用いたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅》
本実施例では、実施例６で作製したマイコバクテリウム・ツベルクローシスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローン、及び各種菌体（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイ、及び大腸菌の培養菌株）からＤＮＡを単離し、２種類のプライマーセットとして、配列番号８及び配列番号９で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセット、並びに配列番号１０及び配列番号１１で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセットを用いてＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行なった。
【００８９】
（１）ＤＮＡの分離
小川培地上に生育した抗酸菌株（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、及びマイコバクテリウム・カンサシイ）のコロニーを坂口フラスコに取り、ガラスビーズで菌体をほぐした後、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した検体から、市販のＤＮＡ調製キット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００９０】
（２）遺伝子の増幅
実施例８（１）で得たＤＮＡと、実施例６（２）で合成した２種類の標識プライマーセット、すなわち、プライマー８（配列番号８）及びプライマー９（配列番号９）との組み合わせ、又はプライマー１０（配列番号１０）及びプライマー１１（配列番号１１）との組み合わせをそれぞれ用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号８及び９）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００９１】
（３）１４４ｂｐＤＮＡ及び１８０ｂｐＤＮＡの確認
実施例８（２）で得られたＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ  Ｄｉｇｅｓｔ；東洋紡）を指標として、１４４ｂｐのバンド及び１８０ｂｐのバンドの有無を確認した。
【００９２】
【実施例９】
《イムノクロマトグラフ法によるＰＣＲ生成物の測定》
本実施例では、実施例４で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法を実施した。
【００９３】
（１）ＰＣＲ法のサイクル回数別によるＰＣＲ生成物の検出
実施例７（１）で使用した２種類の標識プライマー、すなわち、プライマー８（配列番号８）及びプライマー９（配列番号９）との組み合わせを用い、ＰＣＲ法のサイクル回数として、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応をそれぞれ行なった。これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００９４】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表６に示す。表６において、「−」は陰性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
今回行なったＰＣＲ法では、ＰＣＲのサイクル回数１０回では二重標識ＰＣＲ生成物が、まだ、あまり産生されておらず、イムノクロマトグラフ用ストリップで測定することができなかった。ＰＣＲのサイクル回数が１５回、２０回、及び３０回では、二重標識ＰＣＲ生成物をイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて測定することができた。
【００９５】
2004154075.tif 000007
【００９６】
（２）ＰＣＲ生成物の希釈溶液の測定
実施例９（１）においてＰＣＲ法のサイクル回数として３０回を行なった反応液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、及び１０００倍にそれぞれ希釈した溶液、並びに２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）の各１００μＬを水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００９７】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。
表７に、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。また、表８に、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。表２及び表３において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化抗体に用いたＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を５００倍希釈したものまで検出可能であり、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を１，０００倍希釈したものまで検出可能であった。
【００９８】
2004154075.tif 000008
【００９９】
2004154075.tif 000009
【０１００】
（３）培養菌株を用いたＰＣＲ生成物の測定
実施例７（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー８（配列番号８）及びプライマー９（配列番号９）〕を用いて、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養菌株を用いて、同一のＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【０１０１】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表９に示す。表９において、「−」は陰性、「＋＋」は陽性であることを示す。このイムノクロマトグラフ用ストリップでマイコバクテリウム・ツベルクローシスのみに特異的に反応する結果が得られた。
【０１０２】
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【０１０３】
（４）患者試料から得られたＰＣＲ生成物の測定
結核菌患者試料を用いて、実施例７（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー８（配列番号８）及びプライマー９（配列番号９）〕を用いて、ＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【０１０４】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでの患者検体を用いたＰＣＲ生成物の測定結果を表１０に示す。表１０において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性であることを示す。
【０１０５】
2004154075.tif 000011
【０１０６】
【発明の効果】
本発明の分析方法によれば、被検試料中に存在するポリヌクレオチドを、電気泳動法を用いることなく、迅速且つ簡便に分析することができる。また、前記分析対象ポリペプチドが特定菌（例えば、疾病原因菌）に由来するものである場合には、前記ポリペプチド又はその断片の生成が確認されれば、被検試料中に前記特定菌が存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を、迅速且つ簡便に判定することができる。
【０１０７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲ生成物の電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】ＰＣＲ生成物のイムノクロマト法の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図１】
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【図２】
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