(57)【要約】【課題】哺乳類および魚類に、経口投与する方法で、免疫力を高めることのできる組成物を、酵母菌体から簡単に創出し、安価な免疫増強組成物を配合した飼料を提供する。【解決手段】酵母を自己消化するかまたは自己消化をするとき、プロテアーゼおよびβ−１，３グルカナーゼを含む酵素を、同時に添加するか、または、自己消化した後に添加することにより、酵母の免疫賦活活性を高めることができるのである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母菌体を自己消化処理するか、または、自己消化処理とプロテアーゼおよびエンド−β−１，３グルカナーゼ、もしくは少なくともエンド−β−１，３グルカナーゼを含む酵素とを併用して調製することを特徴とする免疫増強組成物。
【請求項２】
請求項１に記載した免疫増強組成物を配合した哺乳類および魚類用飼料。
【請求項３】
請求項２記載の哺乳類および魚類用飼料が、請求項１に記載した免疫増強組成物を０．１〜１０．０重量％混合せしめることを特徴とする飼料。
【請求項４】
酵母菌体が、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属に属する酵母の内、１種類または、２種類以上から選ばれる請求項１記載の免疫増強組成物。
【請求項５】
請求項４に記載した酵母がそれぞれハンセヌラ・アノマラ（Ｈ．ａｎｏｍａｌａ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・ウチルス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）およびロドトルラ・グルチニス（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）である免疫増強組成物。
【請求項６】
請求項５に記載したＨ．ａｎｏｍａｌａが、Ｈ．ａｎｏｍａｌａＳＢ１０２０（ＦＥＲＭＰ−１８０７５）である免疫増強組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母菌体を自己消化処理を行うか、自己消化と酵素反応を組み合わせて調製した免疫増強組成物に関する。さらに詳述すれば、本発明は、哺乳類および魚類に経口投与することにより、免疫活性を高め抗病性を向上させる免疫増強組成物の製造方法、および、これを配合した哺乳類および魚類の飼料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に哺乳類や魚類には、外部から侵入する病原菌に対する免疫機能を備えているが、特に畜産業界や養殖業界では高密度飼育がおこなわれ、免疫力の低下などにより細菌やウイルスなどの病原体に感染し易くなる。このような疾病が発生すると、非常に蔓延し易い環境状態にあるため、経済的に大きな損失となることが社会的な問題となっている。現在、これらの疾病予防、治療には抗生物質の他種々の薬剤が使用されているが、十分な効果が得られていない上、耐性菌の出現、食品中への残留などが問題視されている。
上記問題を解決するため、抗生物質や薬剤を使用せず、生体の免疫を増強させる物質、すなはち、生体の免疫系を刺激して活性化させる物質の開発が試みられている。このような免疫増強組成物としては、酵母、キノコなどの細胞壁構成成分であるβ−グルカンなどの多糖が知られている。（Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６）３２，２３５−２７５），（農化（１９８９）６３，８６３−８６５）
【０００３】
一般に酵母細胞壁は極めて強固であるために消化性が悪く、酵母菌体をそのまま投与しても免疫増強効果は期待できないと考えられ、多くの処理方法が提案されている。酵母菌体をアルカリ処理したアルカリ不溶性グルカン（特開平４−２５３７０３）、熱アルカリ可溶性グルカン（特公昭４７−１５７１２），（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（２００１）６５，８３７−８４１）、また、酵母細胞壁をβ−１，６グルカナーゼ処理した可溶化グルカン（特開平７−５２８０９３）、さらに、プロテアーゼ活性の低い酵母細胞壁溶解酵素を用いて細胞壁を消化し、免疫増強活性を有する分子量のタンパク質を得る方法（特開平８−２８３１７５）などが知られている。
【０００４】
本発明者らは、ハンセヌラ、ロドトルラ、カンジダ属に属する酵母の少なくとも１種類の酵母菌体もしくは自己消化処理した酵母菌体成分が、サケ目魚類の疾病予防、特にアユ冷水病に対する著しい予防効果を見い出した。（特願２００１−２３５３４０）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、哺乳類および魚類に、経口投与する方法で、免疫力を高めることのできる組成物を、酵母菌体から簡単に創出し、安価な免疫増強組成物を配合した飼料を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべくさらに鋭意研究を重ねた結果、酵母を自己消化処理するとにより、酵母細胞壁のアルカリ不溶性多糖が著しく減少することを見い出した。さらに、自己消化処理した酵母は、β−１，３グルカナーゼなどの酵素の反応性が高まり、可溶性糖類が増加することを見い出した。かかる観点から酵母を自己消化処理するとき、プロテアーゼおよびエンド−β−１，３グルカナーゼを含む酵素、または、少なくともエンド−β−１，３グルカナーゼを含む酵素を同時に添加するか、酵母を自己消化した後に上記酵素を適時作用せしめて得られた成分には、哺乳類、魚類に経口的に投与しても、優れた免疫増強効果を発現することを見い出し、本発明を完成させたのである。
【０００７】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
本発明に使用できる酵母には、ハンセヌラ、サッカロミセス、カンジダ、ロドトルラ属に属する酵母などが挙げられる。さらに、具体的には、ハンセヌラ・アノマラ、サッカロミセス・セレビシエ、カンジダ・ウチルス、ロドトルラ・グルチニスなどが挙げられるが、特にハンセヌラ・アノマラＳＢ１０２０は有用な菌株の一つである。しかしながら、本発明に使用できる酵母はこれらの属に属する酵母に限定されるものではない。
【０００８】
【参考例１】酵母の培養
酵母を培養する培地は、通常市販されている培地、酵母が利用することのできる糖類や生育に必要な窒素源、ミネラル類、その他微量金属類、必要に応じて酵母エキスなどを配合した合成培地など、培地の種類は、酵母が生育できる培地であれば使用できる。本発明に例示される酵母菌体は、安価な糖源であるシトラスモラセス（柑橘類の搾汁）を炭素源（Ｂｒｉｘ．１２〜１６）とし、塩化アンモニウム　１．２％、第一リン酸カリウム　０．１％、第ニリン酸カリウム　０．１％および、酵母エキス０．１％添加した培地を用いて培養した。また、培養方法は、通気撹拌培養（温度２８〜３０℃、通気量　１ＶＶＭ）で行った。
【０００９】
【参考例２】酵母の自己消化処理
酵母の自己消化処理は、生菌体の水懸濁液を４５〜５０℃の水槽中に静置して行った。本発明での酵母の自己消化処理は、一種類の酵母でも、また、別々に培養した二種類以上の酵母を混合するか、酵母を混合培養する方法でも実施することができる。これらの方法の一部は、特開２００２−１８６４２９に開示している。
本発明で表示する自己消化率とは、初期吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）および処理後吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）の測定値から次式で表示される。
自己消化率＝［（初期吸光度−処理後吸光度）／初期吸光度］×１００
【００１０】
【参考例３】酵母の自己消化処理によるアルカリ不溶性成分の変化
前項に記載した方法で酵母を自己消化処理すると、自己消化開始前に比べ、アルカリ不溶性成分の量が著しく減少することを見い出した。その結果を表１に示す。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
アルカリ不溶性成分の測定は、酵母菌体を１規定苛性ソーダ溶液に懸濁し、沸騰水浴中で３０分間加熱し、冷却後、濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）を測定した。自己消化処理後の懸濁液を同一の方法で測定し、濁度の減少率で表示した。
【００１３】
【参考例４】酵母の自己消化処理による酵素の反応性の向上
自己消化処理を行った酵母菌体懸濁を８０℃以上の温度で加熱し、自己消化反応を停止させ、遠沈、洗浄した沈澱区分（水不溶性区分）にプロテアーゼおよびエンド−β−１，３グルカナーゼを含む酵素（例えば、ＸＰ−４１５（株）ナガセケムテックス社製）を添加して、３５℃で反応させたところ、自己消化処理時間に対応して可溶性糖類の生成量が増加することが判明した。その一例を次に示した。
ハンセヌラ　アノマラＳＢ１０２０を常法により培養して、遠沈、洗浄した生菌体を得た。これを０〜２７時間オートリシス処理を行った。各サンプルを加熱処理して自己消化反応を停止させ、さらに、水可溶性成分を除去した。この水不溶性区分にＸＰ−４１５を作用させ、生成糖をＨＰＬＣ（日立Ｌ−７２００）を用いて蛍光法で測定した結果を図１に示す。
【００１４】
【図１】
【００１５】
使用した酵素は、リゾプス　デレマー（Ｒｈｉ．ｄｅｌｅｍｅｒ）由来の酵素剤であるが、少なくとも、エンド−β−１，３グルカナーゼを含む酵素であればこの目的は達せられ、この酵素に限定されるものではない。
【００１６】
【参考例５】酵母の自己消化処理と酵素の併用
一種類の酵母または二種類以上の酵母を混合して自己消化処理を行う時、同時に上記酵素を添加すると、自己消化率はさらに向上する。その一例を次に挙げて説明する。２リットル容ジャーファーメンターを用いて、ハンセヌラ　アノマラおよびロドトルラ　グルチニスを通気、撹拌培養し、遠心分離、蒸留水で洗浄した生菌体を、それぞれ単独または、これらの生菌体を混合して、上記酵素を添加して常法により自己消化処理を行うと、さらに自己消化が促進された。その結果を表２に示す。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
同様にして生菌体を調製し、あらかじめ常法により自己消化処理した後、加熱処理して自己消化を停止させ、水可溶性区分を遠心分離、水洗浄して取り除いた水不溶性区分に上記酵素を添加して更に反応させると、生成した水可溶性区分には著量の糖質（単糖、オリゴ糖も含む）が生成されていることを認めた。その結果を図２に示す。この方法を用いて調製した酵母由来の成分も、全て本発明の免疫増強組成物として応用することができる。
【００１９】
【図２】
【００２０】
【参考例６】免疫活性測定法
マクロファージの貪色能の測定は、屠殺当日無菌的に腹腔マクロファージを採取して、蛍光ビーズ（ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、（株）和光純薬製）を用いて測定した。カテプシンＬ，Ｂ活性およびＮＯ産生量の測定は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ，１０μｇ／ｍｌ）を添加した培地で２４時間炭酸ガスインキュベーター（３７℃、炭酸ガス９５％）にて培養して細胞および培地をサンプルとして得た。
これを０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ａｑにて細胞を破砕し、カテプシン活性は蛍光基質を用いた反応液をＭＵＬＴＩ　ＬＡＢＥＬ　ＣＯＵＮＴＥＲ（３５５／４６０ｎｍ，１．０ｓｅｃ）で測定した。また、ＮＯ産生能の測定はＧｒｉｅｓｓ法を用いて行った。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下に実施例を挙げて、酵母から調製した免疫増強組成物の効果を説明する。
【００２２】
【実施例１】
７週齢のｄｄＹ系雌性マウスを用いて、自己消化および酵素処理酵母の免疫増強効果を測定した。供試酵母は、ハンセヌラ　アノマラＳＢ１０２０およびロドトルラグルチニスを常法により培養し、洗浄、濃縮後それぞれ単独酵母および、これらの酵母を等量混合した生菌体に、ＸＰ−４１５（培養液１Ｌあたり０．２５ｇ）を添加して自己消化処理した。これを遠心分離洗浄して水不溶性区分を凍結乾燥して試験に供した。これを次に示した組成の飼料に配合して、コントロール食および酵母食とした。
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【００２３】
試験区は、各群３匹のマウスを用い、試験食は１３日間自由摂取させた。試験開始後１１日目に滅菌１０％プロテオースペプトン水溶液１．５ｍｌを腹腔内注射した。また、免疫増強作用の指標として、コントロール食で飼育したマウスにリポポリサッカライド（０．４ｍｇ／ＫＧ　Ｂ．Ｗ）を腹腔内に注射し、ＬＰＳ投与群とした。１５日後に屠殺し、免疫活性を測定した。その結果を図３に示す。
【００２４】
【図３】
【００２５】
これらの結果から、上記の方法で調製した酵母試料は、貪色能、カテプシン活性、ＮＯ産生能ともコントロール食で飼育したマウスに比べて極めて高い活性を示し、ＬＰＳ投与群と同等もしくはそれ以上の免疫増強効果を示した。
【００２６】
【実施例２】
平均体重１３ｇのマダイ稚魚を４００リットル容のポリ塩化ビニル製角形水槽に収容し、各試験区に次に示す所定の試験飼料を１日２回１週間に６日間飽食給与して５６日間飼育した。なお酵母添加区（ＣＨＰ）は、ハンセヌラ　アノマラとカンジダ　ウチルスを混合培養した後オートリシス処理を行った。試験飼料投与４２日後に各試験区から任意に選抜した１０尾のマダイにビブリオ・アンギュラムＲＨ８１０１株を１．９×１０７ｃｆｕ／ｇ腹腔内摂取し、その後の生存率を観察した。
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【００２７】
この結果、酵母飼料無添加区（１区）では、４８時間後に全魚体が死滅した。しかし、４区（ＣＨＰ４％添加区）でもっとも著しい抗菌性を示し、１７０時間後でも生存率９０％であった。その効果を図４に示す。
【００２８】
【図４】
【００２９】
【発明の効果】
哺乳類および魚類に経口投与することによって、免疫活性を高め抗菌力を増強する酵母由来の免疫増強組成物を安価に提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】自己消化による酵素の反応性の向上を表した図である。
【図２】酵素反応により得られた可溶性糖のＨＰＬＣ分析を表した図である。
【図３】マウスにおける酵母サンプルの免疫活性向上効果を表す。詳細には、図３−１はマクロファージ貧食能活性を、図３−２はカテプシン活性を、図３−３はＮＯ産生能を表した図である。
【図４】マダイにおける酵母サンプルの抗菌性効果を表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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