(57)【要約】　　　（修正有）【課題】抗炎症剤、自己免疫疾患治療剤、免疫抑制剤、制ガン剤、殺真菌剤またはウィルス感染治療剤等の提供。【解決手段】式：2004099586.tif 000019［式中、環Ｚは、置換されてもよいピロール環等を、Ｗ２は、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキレン等を、Ａｒ２は、置換されてもよいアリール等を、Ｗ１およびＡｒ１は、下記（１）または（２）の意味を表す。（１）　Ｗ１が置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキレン等を表す場合には、Ａｒ１は、置換されてもよい１−４個の窒素原子を環構成原子として有する二環性ヘテロアリールを、（２）　Ｗ１が置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルキレン、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルケニレン等を表す場合には、Ａｒ１は、Ｗ１の結合位置に対しオルト位またはメタ位が、カルボキシル、アルコキシカルボニル等で置換されたアリールまたは単環性ヘテロアリールを表す。］で表される化合物またはそれらの薬学上許容される塩を含有するジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004099586.tif 000014
［式中、環Ｚは、置換されてもよいピロール環、置換されてもよいインドール環、置換されてもよいチオフェン環、置換されてもよいピラゾール環、置換されてもよいベンゼン環、置換されてもよいイミダゾール環、または置換されてもよいイソチアゾール環を表す。
Ｗ２は、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−ＣＯＮＲ−、置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキレンまたは置換されてもよいＣ２−Ｃ４アルケニレンを表す。Ｒは、水素原子またはアルキルを表す。
Ａｒ２は、置換されてもよいアリールまたは置換されてもよいヘテロアリールを表す。
Ｗ１およびＡｒ１は、下記（１）または（２）の意味を表す。
（１）　Ｗ１が置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキレンまたは置換されてもよいＣ２−Ｃ４アルケニレンを表す場合には、
Ａｒ１は、置換されてもよい１−４個の窒素原子を環構成原子として有する二環性ヘテロアリールを表す。
（２）　Ｗ１が置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルキレン、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルケニレン、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルキニレンまたは−Ｙ−Ｗ３−（Ｙは、酸素原子またはシクロアルカンジイルを表す。Ｗ３は、置換されてもよいＣ１−Ｃ５アルキレン、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルケニレン、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルキニレンを表す。）を表す場合には、
Ａｒ１は、Ｗ１の結合位置に対しオルト位またはメタ位が、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキルスルホニルカルバモイル、アリールスルホニルカルバモイル、アルキルスルホニル、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホニル、テトラゾリル、シアノ、アルコキシおよびアルキルスルホニルアミノから選択される基で置換されたアリールまたは単環性ヘテロアリールを表し、このアリールおよび単環性ヘテロアリールは、さらに置換されてもよい。］
で表される化合物、そのプロドラッグまたはそれらの薬学上許容される塩を含有するジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【請求項２】
環Ｚが、下記２価基（結合の方向はいずれであってもよい）のいずれかである請求項１記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【化２】
2004099586.tif 000015
［式中、Ｒ１は、１つあるいは複数あってもよく、独立して水素原子、ハロゲン原子または置換されてもよいアルキルを表す。］
【請求項３】
環Ｚが、置換されてもよいピロール環、置換されてもよいインドール環または置換されてもよいチオフェン環である請求項１または２記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【請求項４】
式：
【化３】
2004099586.tif 000016
［式中、Ｗ１、Ｗ２、Ａｒ１、Ａｒ２およびＲ１は、請求項１および２における意義と同義である。］
で表される請求項１記載の化合物、そのプロドラッグまたはそれらの薬学上許容される塩からなるジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【請求項５】
Ｗ２が、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−ＣＯＮＲ−、メチレンまたはヒドロキシメチレンである請求項１−４のいずれか記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【請求項６】
Ａｒ２が、置換フェニルである請求項１−５のいずれか記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【請求項７】
Ｗ１が、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルキレン、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルケニレンまたは置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルキニレンであり、Ａｒ１が、Ｗ１の結合位置に対しオルト位が、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキルスルホニルカルバモイル、アリールスルホニルカルバモイル、アルキルスルホニル、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホニル、テトラゾリル、シアノ、アルコキシおよびアルキルスルホニルアミノから選択される基で置換されたアリールを表し、このアリールは、さらに置換されてもよい請求項１−６のいずれか記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【請求項８】
Ｗ１が、置換されてもよいトランスＣ３−Ｃ４アルケニレンであり、Ａｒ１が、Ｗ１の結合位置に対しオルト位が、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキルスルホニルカルバモイル、アリールスルホニルカルバモイル、テトラゾリル、シアノ、アルコキシおよびアルキルスルホニルアミノから選択される基で置換されたアリールを表し、このアリールは、さらにハロゲン原子、シアノ、置換されてもよいアルコキシまたは置換されてもよいアルキルで置換されてもよい請求項１−６のいずれか記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【請求項９】
式：
【化４】
2004099586.tif 000017
［式中、Ｗ４は、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ−またはメチレンを表す。Ｒは請求項１における意義と同義である。
Ｒ２は、ハロゲン原子、シアノ、置換されてもよいアルコキシまたは置換されてもよいアルキルを表す。
Ｒ３は、水酸基、アルコキシ、アルキル置換されてもよいアミノ、環状アミノまたはアルキルスルホニルアミノを表す。
Ｒ４は、水素原子、ハロゲン原子またはアルキルを表す。
Ｒ５は、置換されてもよいアルコキシまたは置換されてもよいアルキルを表す。］
で表される請求項１記載の化合物、そのプロドラッグまたはそれらの薬学上許容される塩を含有するジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【請求項１０】
Ｗ４が−ＣＯ−であり、Ｒ２がハロゲン原子、シアノ、またはハロゲン原子もしくはアルコキシで置換されてもよいアルコキシ、またはハロゲン原子もしくはアルコキシで置換されてもよいアルキルであり、Ｒ４が水素原子またはアルキルであり、Ｒ５が、ハロゲン原子、アルコキシもしくはモルホリノで置換されてもよいアルコキシ、またはハロゲン原子、アルコキシもしくはモルホリノで置換されてもよいアルキルである請求項９記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【請求項１１】
式：
【化５】
2004099586.tif 000018
［式中、Ｒ３およびＲ５は、請求項９における意義と同義である。］
で表される請求項９または１０記載の化合物、そのプロドラッグまたはそれらの薬学上許容される塩からなるジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【請求項１２】
抗炎症剤、自己免疫疾患治療剤、免疫抑制剤、制ガン剤、殺真菌剤またはウィルス感染治療剤である請求項１〜１１のいずれか記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗炎症剤、自己免疫疾患治療剤、免疫抑制剤、制ガン剤、殺真菌剤またはウィルス感染治療剤等として有用な新規なジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ（Ｄｉｈｙｄｒｏｏｒｏｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）はピリミジン生合成における４番目の酵素である。本酵素の阻害剤としては、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、ブレキナール（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）、ジクロロアリルローソン（ｄｉｃｈｌｏｒｏａｌｌｙｌ　ｌａｗｓｏｎｅ）、６−フルオロ−２−（２’−フルオロ−１，１’−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−４−キノリンカルボン酸ナトリウム（ＮＳＣ　３６８３９０）、８−クロロ−４−（２−クロロ−４−フルオロフェノキシ）キノリン等が知られている。
レフルノミドは、炎症、自己免疫疾患（リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス等）、慢性対宿主移植片疾患等の治療剤として有用である（特開昭５５−８３７６７、特開昭６２−７２６１４）。また、レフルノミドは、ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼを阻害し、ＲＮＡ及びＤＮＡの合成に必要なピリミジン・ヌクレオチドの量を減少させ、更にはリン脂質の合成或いは糖タンパク質の合成に必要な各種のピリミジン代謝産物を減少させ、その結果としてリンパ球の増殖を抑制する（Ａｎｎ．　Ｒｈｅｕｍ．　Ｄｉｓ．，　５９，　８４１−８４９（２０００）。ブレキナールは、リンパ球増殖を抑え、免疫抑制作用を有する（“メルクインデックス”第１２版　メルク社刊（１９９６）　２２４ページ）。また、ブレキナールは、固形ガン治療剤として有用であり、レフルノミドと同様に、ＲＮＡ及びＤＮＡの合成に必要なピリミジン・ヌクレオチドの量を減少させ、その結果としてリンパ球の増殖を抑制する（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７３（３４），　２１６８２−２１６９１　（１９９８））。６−フルオロ−２−（２’−フルオロ−１，１’−ビフェニル−４−イル）−３−メチル−４−キノリンカルボン酸ナトリウムは、ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼを阻害し、ピリミジンの生合成を抑え、制ガン剤として有用である（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　４６，　５０１４−５０１９　（１９８６））。８−クロロ−４−（２−クロロ−４−フルオロフェノキシ）キノリン等のフェノキシキノリンは、ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼを阻害し、それによって潜在性植物用殺真菌剤として有用である（特開平６−１１３８８９）。
特許文献１には、本発明の化合物がＴＧＦ−βを阻害する作用を有しており、臓器または組織の線維化抑制剤等として有用であることが記載されている。しかし、本発明の化合物がジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼを阻害するか否かに関しては記載されていない。
【特許文献１】
国際公開第０２／１０１３１号パンフレット
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、抗炎症剤、自己免疫疾患治療剤、免疫抑制剤、制ガン剤、殺真菌剤またはウィルス感染治療剤等として有用な新規なジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、本発明の化合物がジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼを阻害することを見出し、本発明を完成した。
本発明は以下の通りである。
［１］　式（Ｉ）：
【化６】
2004099586.tif 000002
［式中、環Ｚは、置換されてもよいピロール環、置換されてもよいインドール環、置換されてもよいチオフェン環、置換されてもよいピラゾール環、置換されてもよいベンゼン環、置換されてもよいイミダゾール環、または置換されてもよいイソチアゾール環を表す。
Ｗ２は、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−ＣＯＮＲ−、置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキレンまたは置換されてもよいＣ２−Ｃ４アルケニレンを表す。Ｒは、水素原子またはアルキルを表す。
Ａｒ２は、置換されてもよいアリールまたは置換されてもよいヘテロアリールを表す。
Ｗ１およびＡｒ１は、下記（１）または（２）の意味を表す。
（１）　Ｗ１が置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキレンまたは置換されてもよいＣ２−Ｃ４アルケニレンを表す場合には、
Ａｒ１は、置換されてもよい１−４個の窒素原子を環構成原子として有する二環性ヘテロアリールを表す。
（２）　Ｗ１が置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルキレン、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルケニレン、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルキニレンまたは−Ｙ−Ｗ３−（Ｙは、酸素原子またはシクロアルカンジイルを表す。Ｗ３は、置換されてもよいＣ１−Ｃ５アルキレン、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルケニレン、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルキニレンを表す。）を表す場合には、
Ａｒ１は、Ｗ１の結合位置に対しオルト位またはメタ位が、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキルスルホニルカルバモイル、アリールスルホニルカルバモイル、アルキルスルホニル、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホニル、テトラゾリル、シアノ、アルコキシおよびアルキルスルホニルアミノから選択される基で置換されたアリールまたは単環性ヘテロアリールを表し、このアリールおよび単環性ヘテロアリールは、さらに置換されてもよい。］
で表される化合物、そのプロドラッグまたはそれらの薬学上許容される塩を含有するジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【０００５】
［２］　環Ｚが、下記２価基（結合の方向はいずれであってもよい）のいずれかである［１］記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【化７】
2004099586.tif 000003
［式中、Ｒ１は、１つあるいは複数あってもよく、独立して水素原子、ハロゲン原子または置換されてもよいアルキルを表す。］
［３］　環Ｚが、置換されてもよいピロール環、置換されてもよいインドール環または置換されてもよいチオフェン環である［１］または［２］記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【０００６】
［４］　式：
【化８】
2004099586.tif 000004
［式中、Ｗ１、Ｗ２、Ａｒ１、Ａｒ２およびＲ１は、前記と同義である。］
で表される［１］記載の化合物、そのプロドラッグまたはそれらの薬学上許容される塩を含有するジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
［５］　Ｗ２が、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−ＣＯＮＲ−、メチレンまたはヒドロキシメチレンである［１］−［４］のいずれか記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
［６］　Ａｒ２が、置換フェニルである［１］−［５］のいずれか記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
［７］　Ｗ１が、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルキレン、置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルケニレンまたは置換されてもよいＣ２−Ｃ５アルキニレンであり、Ａｒ１が、Ｗ１の結合位置に対しオルト位が、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキルスルホニルカルバモイル、アリールスルホニルカルバモイル、アルキルスルホニル、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホニル、テトラゾリル、シアノ、アルコキシおよびアルキルスルホニルアミノから選択される基で置換されたアリールを表し、このアリールは、さらに置換されてもよい［１］−［６］のいずれか記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
［８］　Ｗ１が、置換されてもよいトランスＣ３−Ｃ４アルケニレンであり、Ａｒ１が、Ｗ１の結合位置に対しオルト位が、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキルスルホニルカルバモイル、アリールスルホニルカルバモイル、テトラゾリル、シアノ、アルコキシおよびアルキルスルホニルアミノから選択される基で置換されたアリールを表し、このアリールは、さらにハロゲン原子、シアノ、置換されてもよいアルコキシまたは置換されてもよいアルキルで置換されてもよい［１］−［６］のいずれか記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【０００７】
［９］　式：
【化９】
2004099586.tif 000005
［式中、Ｗ４は、−ＣＯ−、−ＣＯＮＲ−またはメチレンを表す。Ｒは前記と同義である。
Ｒ２は、ハロゲン原子、シアノ、置換されてもよいアルコキシまたは置換されてもよいアルキルを表す。
Ｒ３は、水酸基、アルコキシ、アルキル置換されてもよいアミノ、環状アミノまたはアルキルスルホニルアミノを表す。
Ｒ４は、水素原子、ハロゲン原子またはアルキルを表す。
Ｒ５は、置換されてもよいアルコキシまたは置換されてもよいアルキルを表す。］
で表される［１］記載の化合物、そのプロドラッグまたはそれらの薬学上許容される塩を含有するジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
［１０］　Ｗ４が−ＣＯ−であり、Ｒ２がハロゲン原子、シアノ、またはハロゲン原子もしくはアルコキシで置換されてもよいアルコキシ、またはハロゲン原子もしくはアルコキシで置換されてもよいアルキルであり、Ｒ４が水素原子またはアルキルであり、Ｒ５が、ハロゲン原子、アルコキシもしくはモルホリノで置換されてもよいアルコキシ、またはハロゲン原子、アルコキシもしくはモルホリノで置換されてもよいアルキルである［９］記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【０００８】
［１１］　式：
【化１０】
2004099586.tif 000006
［式中、Ｒ３およびＲ５は、前記と同義である。］
で表される［９］または［１０］記載の化合物、そのプロドラッグまたはそれらの薬学上許容される塩を含有するジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
［１２］　抗炎症剤、免疫抑制剤、制ガン剤、自己免疫疾患治療剤、殺真菌剤またはウィルス感染治療剤である［１］〜［１１］のいずれか記載のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
「置換ピロール環」、「置換インドール環」、「置換チオフェン環」、「置換ピラゾール環」、「置換ベンゼン環」、「置換イミダゾール環」および「置換イソチアゾール環」における置換基としては、Ｒ１と同じ基（水素原子は除く）が挙げられ、１つあるいは複数（例えば、２または３個）あってもよい。Ｒ１と同じ基とは、ハロゲン原子または置換されてもよいアルキルを表す。
「アルキル」としては、例えば直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルキルが挙げられ、具体的にはメチル、エチル、プロピル、２−プロピル、２−メチル−１−プロピル、ブチル、２−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、３−メチル−２−ブチル、２−メチル−２−ブチル、ヘキシル等が挙げられる。好ましくは、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ４アルキルが挙げられる。
「Ｒ２およびＲ５における置換アルキル」の置換基としては、例えば、水酸基、アルカノイルオキシ、ハロゲン原子、シアノ、アルカノイル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシ、アルキル置換されてもよいアミノ、アルコキシアルキル置換されてもよいアミノ、環状アミノ、単環性ヘテロアリール、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホニル、アジド等が挙げられる。置換基は複数（例えば、２または３個）存在することができ、その場合は、同一または異なった置換基であってよい。Ｒ２における置換アルキルの好ましい置換基としては、ハロゲン原子、アルコキシ等が挙げられる。Ｒ５における置換アルキルの好ましい置換基としては、ハロゲン原子、アルコキシ、モルホリノ、水酸基等が挙げられる。
「Ｒ１における置換アルキル」の置換基としては、例えば、ハロゲン原子、アルコキシ、水酸基、オキソ等が挙げられる。置換基は複数（例えば、２または３個）存在することができ、その場合は、同一または異なった置換基であってよい。
【００１０】
「アルコキシ」としては、例えば直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルコキシが挙げられ、具体的には、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、２−プロピルオキシ、２−メチル−２−プロピルオキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等が挙げられる。好ましくは、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ４アルコキシが挙げられる。
「Ｒ２およびＲ５における置換アルコキシ」の置換基としては、例えば、水酸基、アルカノイルオキシ、ハロゲン原子、シアノ、アルカノイル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシ、アルキル置換されてもよいアミノ、アルコキシアルキル置換されてもよいアミノ、環状アミノ、単環性ヘテロアリール、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホニル、アジド等が挙げられる。置換基は複数（例えば、２または３個）存在することができ、その場合は、同一または異なった置換基であってよい。Ｒ２における置換アルコキシの好ましい置換基としては、ハロゲン原子、アルコキシ等が挙げられる。Ｒ５における置換アルコキシの好ましい置換基としては、ハロゲン原子、アルコキシ、モルホリノ、水酸基等が挙げられ、特に好ましい置換アルコキシとして、２−モルホリノエトキシ等が挙げられる。
「アルカノイル」としては、例えば直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルカノイルが挙げられ、具体的には、ホルミル、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、イソブタノイル、ペンタノイル、ヘキセノイル等が挙げられる。好ましくは、直鎖または分枝鎖のＣ２−Ｃ５アルカノイルが挙げられる。
「アルケニル」としては、例えば、直鎖または分枝鎖のＣ２−Ｃ６アルケニルが挙げられ、具体的にはビニル、アリル、イソプロペニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−ペンテニル、３−ヘキセニル等が挙げられる。好ましくは、直鎖または分枝鎖のＣ２−Ｃ４アルケニルが挙げられる。
「アルケニルオキシ」としては、例えば直鎖または分枝鎖のＣ３−Ｃ６アルケニルオキシが挙げられ、具体的には、アリルオキシ、３−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ等が挙げられる。好ましくは、直鎖または分枝鎖のＣ３−Ｃ４アルケニルオキシが挙げられる。
「アルキニル」としては、例えば、直鎖または分枝鎖のＣ２−Ｃ６アルキニルが挙げられ、具体的にはエチニル、２−プロピニル、１−プロピニル、３−ブチニル、２−ブチニル、２−ペンチニル、３−ヘキシニル等が挙げられる。好ましくは、直鎖または分枝鎖のＣ２−Ｃ４アルキニルが挙げられる。
「アルキニルオキシ」としては、例えば直鎖または分枝鎖のＣ３−Ｃ６アルキニルオキシが挙げられ、具体的には、アリルオキシ、３−ブチニルオキシ、２−ブチニルオキシ、３−ペンチニルオキシ等が挙げられる。好ましくは、直鎖または分枝鎖のＣ３−Ｃ４アルキニルオキシが挙げられる。
【００１１】
「アルキレン」としては、例えば各アルキレンの炭素数の範囲に応じた直鎖のアルキレンが挙げられる。具体的には、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン等が挙げられる。
「Ｗ２におけるＣ１−Ｃ４アルキレン」の好ましい例としては、メチレン、エチレンが挙げられ、特に好ましくはメチレンが挙げられる。
「Ａｒ１が置換されてもよい１−４個の窒素原子を環構成原子として有する二環性ヘテロアリールである場合のＷ１におけるＣ１−Ｃ４アルキレン」の好ましい例としては、メチレン等が挙げられる。
「Ａｒ１が、Ｗ１の結合位置に対しオルト位またはメタ位が、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキルスルホニルカルバモイル、アリールスルホニルカルバモイル、アルキルスルホニル、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホニル、テトラゾリル、シアノ、アルコキシおよびアルキルスルホニルアミノから選択される基で置換されたアリールまたは単環ヘテロアリールを表し、このアリールおよび単環ヘテロアリールは、さらに置換されてもよい場合のＷ１におけるＣ２−Ｃ５アルキレン」の好ましい例としては、トリメチレン、テトラメチレン等が挙げられる。
「Ｗ３におけるＣ１−Ｃ５アルキレン」の好ましい例としては、メチレン、エチレン等が挙げられる。
「置換アルキレン」における置換基としては、例えばアルキル、アルコキシ、水酸基、アルカノイルオキシ、ハロゲン原子等が挙げられ、独立して１または２個置換することができる。
【００１２】
「アルケニレン」としては、例えば各アルケニレンの炭素数の範囲に応じた直鎖のアルケニレンが挙げられる。具体的にはビニレン、１−プロペニレン、２−プロペニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、３−ブテニレン、１−ペンテニレン、２−ペンテニレン、３−ペンテニレン、４−ペンテニレン、２，４−ペンタジエニレン等が挙げられ、二重結合における立体化学としては、シス、トランスいずれであってもよい。好ましい立体化学としては、トランスが挙げられる。
「Ａｒ１が、Ｗ１の結合位置に対しオルト位またはメタ位が、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキルスルホニルカルバモイル、アリールスルホニルカルバモイル、アルキルスルホニル、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホニル、テトラゾリル、シアノ、アルコキシおよびアルキルスルホニルアミノから選択される基で置換されたアリールまたは単環ヘテロアリールを表し、このアリールおよび単環ヘテロアリールは、さらに置換されてもよい」場合のＷ１におけるＣ２−Ｃ５アルケニレンの好ましい例としては、直鎖のトランスＣ３−Ｃ４アルケニレンが挙げられ、特に好ましくは、トランス−２−プロペニレンが挙げられる。
「Ｃ２−Ｃ５アルキニレン」としては、例えば直鎖のＣ２−Ｃ５アルキニレンが挙げられ、具体的にはエチニレン、２−プロピニレン、２−ブチニレン、３−ブチニレン、２−ペンチニレン、３−ペンチニレン等が挙げられる。
「置換アルケニレン」および「置換アルキニレン」における置換基としては、例えば、アルキル等が挙げられ、独立して１または２個置換することができる。
【００１３】
「アリール」としては、例えばＣ６−Ｃ１０アリールが挙げられ、具体的には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル等が挙げられる。好ましくはフェニルが挙げられる。
「ヘテロアリール」としては、例えば、窒素原子、酸素原子、硫黄原子からなる群から任意に選ばれる１から３個のヘテロ原子を含む単環性または二環性のヘテロアリールが挙げられる。具体的には、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、オキサゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール等の単環性５員ヘテロアリール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、トリアジン等の単環性６員ヘテロアリール、インドール、イソインドール、インドリジン、インダゾール、プリン、４−Ｈ−キノリジン、キノリン、イソキノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、ベンズチアゾール、ベンズオキサゾール、ベンズイソチアゾール、ベンズイソオキサゾール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン等の二環性ヘテロアリール等が挙げられる。
「単環性ヘテロアリール」としては、ヘテロアリールのうち単環性のヘテロアリールを挙げることができる。
「Ａｒ１における単環性ヘテロアリール」の好ましい例としては、塩基性の低い（ｐＫｂ＜７）単環性ヘテロアリールが挙げられ、さらに好ましくは硫黄原子または酸素原子を含む単環性５員ヘテロアリールが挙げられ、特に好ましくはチオフェン、フラン、チアゾール、オキサゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール等が挙げられる。
「Ａｒ２におけるヘテロアリール」の好ましい例としては、塩基性の低い（ｐＫｂ＜７）ヘテロアリールが挙げられ、さらに好ましくは硫黄原子または酸素原子を含む単環性５員ヘテロアリール、および二環性ヘテロアリールが挙げられ、特に好ましくはチオフェン、フラン、チアゾール、オキサゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、インドール、イソインドール、ベンズチアゾール、ベンズオキサゾール、ベンズイソチアゾール、ベンズイソオキサゾール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン等が挙げられる。
「１−４個の窒素原子を環構成原子として有する二環性ヘテロアリール」としては、例えば、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、インダゾリル、プリル、４−Ｈ−キノリジニル、キノリニル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチリジル、キノキサリル、キナゾリル等の二環性ヘテロアリール等が挙げられる。好ましいものとして、キノリル、キノキサリル、ナフチリジル等が挙げられ、特に好ましくは３−キノリル、２−キノキサリル、３−ナフチリジル等が挙げられる。
【００１４】
「置換アリール」、「置換フェニル」、「置換ヘテロアリール」および「置換された１−４個の窒素原子を環構成原子として有する二環性ヘテロアリール」における置換基、並びに「Ａｒ１における置換アリールおよび置換単環性ヘテロアリール」における他の置換基としては、例えば、以下のものが挙げられる。置換基は複数（例えば、２または３個）存在することができ、その場合は、同一または異なった置換基であってよい。
・置換されてもよいアルキル
（本置換アルキルにおける置換基としては、例えば、水酸基、アルカノイルオキシ、ハロゲン原子、シアノ、アルカノイル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシ、アルキル置換されてもよいアミノ、アルコキシアルキル置換されてもよいアミノ、環状アミノ、単環性ヘテロアリール、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホニル、アジド等が挙げられる。置換基は複数（例えば、２または３個）存在することができ、その場合は、同一または異なった置換基であってよい。）
・置換されてもよいアルコキシ
（本置換アルコキシにおける置換基としては、例えば、水酸基、アルカノイルオキシ、ハロゲン原子、シアノ、アルカノイル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシ、アルキル置換されてもよいアミノ、アルコキシアルキル置換されてもよいアミノ、環状アミノ、単環性ヘテロアリール、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホニル、アジド等が挙げられる。置換基は複数（例えば、２または３個）存在することができ、その場合は、同一または異なった置換基であってよい。）
・置換されてもよいアルケニル、置換されてもよいアルキニル
（本置換アルケニルおよび本置換アルキニルにおける置換基としては、例えばアルコキシ、アルコキシカルボニル、アルカノイル、水酸基、アルカノイルオキシ、ハロゲン原子、シアノ、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、カルボキシ、アルキル置換されてもよいアミノ、環状アミノ、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホニル等が挙げられる。置換基は複数（例えば、２または３個）存在することができ、その場合は、同一または異なった置換基であってよい。）
・アルケニルオキシ、水酸基、アルカノイル、アルカノイルオキシ、ハロゲン原子、アルキルスルホニル、アルキル置換されてもよいアミノ、環状アミノ、アルキル置換されてもよいカルバモイル、環状アミノカルボニル、アルキル置換されてもよいスルファモイル、環状アミノスルホン、シアノ、メチレンジオキシ、ヘテロアリール、１，３−ジオキサン−２−イル等
【００１５】
「Ａｒ２における置換アリール」、「Ａｒ２における置換フェニル」および「Ａｒ２における置換ヘテロアリール」における置換基の好ましい例としては、例えば、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアルコキシ、水酸基、モルホリノ等が挙げられる。さらに好ましくは、置換されてもよいアルキル（置換アルキルの置換基がハロゲン原子、アルコキシ、モルホリノ、水酸基等である）、置換アルコキシ（置換アルコキシの置換基がハロゲン原子、アルコキシ、モルホリノ、水酸基等である）、水酸基等が挙げられ、特に好ましくは、メチル、メトキシ、２−モルホリノエトキシ、水酸基等が挙げられる。Ａｒ２が置換フェニルである場合、それらの置換基の置換位置としては、Ｗ２の結合位置に対しパラ位が好ましい。
「Ａｒ１における置換された１−４個の窒素原子を環構成原子として有する二環性ヘテロアリール」の置換基、および「Ａｒ１における置換アリールおよび置換単環性ヘテロアリール」における他の置換基の好ましい例としては、例えば、ハロゲン原子、シアノ、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアルコキシ等が挙げられる。さらに好ましくは、ハロゲン原子、置換されてもよいアルキル（置換アルキルの置換基がハロゲン原子、アルコキシ等である）、置換アルコキシ（置換アルコキシの置換基がハロゲン原子、アルコキシ等である）、シアノ等が挙げられ、特に好ましくは、ハロゲン原子、アルキル、アルコキシ、シアノ等が挙げられ、さらに特に好ましくは、塩素原子、メチル、シアノ等が挙げられる。Ａｒ１が置換フェニルである場合、それらの置換基の置換位置としては、Ｗ１の結合位置に対しパラ位が好ましい。
【００１６】
Ａｒ１におけるアリールまたは単環性ヘテロアリールで、Ｗ１の結合位置に対しオルト位およびメタ位とは、Ｗ１の結合位置に隣接する位置およびそのさらに隣接する位置のことを言う。例えば、Ａｒ１がフェニルの場合、オルト位、メタ位、パラ位は下記の位置を表す。
【化１１】
2004099586.tif 000007
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。
「シクロアルカンジイル」としては、例えば、Ｃ３−Ｃ６シクロアルカンジイルが挙げられ、具体的には１，２−シクロプロパンジイル、１，２−シクロブタンジイル、１，２−シクロペンタンジイル、１，２−シクロヘキサンジイル、１，３−シクロヘキサンジイル、１，４−シクロヘキサンジイル等が挙げられる。
「アルキル置換されてもよいアミノ」、「アルコキシアルキル置換されてもよいアミノ」、「アルキル置換されてもよいカルバモイル」および「アルキル置換されてもよいスルファモイル」において、アルキルまたはアルコキシアルキルが置換する場合は、１または２個の同一または異なるアルキルまたはアルコキシアルキルが置換することができる。
「環状アミノ」としては、例えば環構成原子として酸素原子、硫黄原子または窒素原子を含んでもよい５〜７員環状のアミノが挙げられ、この環状アミノはさらにアルキル、水酸基等で置換されてもよい。具体的にはピロリジノ、ピペリジノ、ピペラジニル、４−メチルピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノ、４−ヒドロキシピペリジノ等が挙げられる。特に好ましい環状アミノとして、モルホリノが挙げられる。
【００１７】
「プロドラッグ」としては、生体内で化学的または生化学的に加水分解されて本発明の化合物を再生するものを言う。例えば、本発明の化合物がカルボキシル基を有する場合には、そのカルボキシル基が適当なエステルに変換された化合物が挙げられる。このエステルの具体例としては、ピバロイルオキシメチルエステル、アセチルオキシメチルエステル、シクロヘキシルアセチルオキシメチルエステル、１−メチルシクロヘキシルカルボニルオキシメチルエステル、エチルオキシカルボニルオキシ−１−エチルエステル、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ−１−エチルエステル等が挙げられる。
「薬学上許容される塩」としては、本発明の化合物またはその薬学上許容される塩が酸性基を有する場合は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土金属塩、亜鉛塩等の無機金属塩、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、トリヒドロキシメチルアミノメタン、アミノ酸等有機塩基塩等が挙げられる。本発明の化合物またはその薬学上許容される塩が塩基性基を有する場合は、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。
【００１８】
本発明の化合物はＷＯ０２／１０１３１に記載されており、当該公報に記載の方法に従って製造することができる。
【００１９】
本発明の化合物は、ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害活性を有しており、ピリミジン生合成を阻害する。
リンパ球が活性化すると、増殖のために多くの核酸代謝体を必要とする。活性化Ｔ細胞では、核酸代謝体を供給するために、プリン生合成は２倍増加するのに対して、ピリミジン生合成は８倍増加する（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７０（５０），　２９６８２−２９６８９　（１９９５））。リン脂質・糖タンパク質は細胞の構成成分であるほか、リンパ球の活性化に至る情報伝達にも関与している。そのため、リン脂質の合成或いは糖タンパク質の合成に必要な各種のピリミジン代謝産物の生合成が阻害されれば、リンパ球の活性化抑制に寄与すると考えられる（Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　４７，　２７３−２８９，　（２０００））。従って、本酵素を阻害することによって、Ｔ細胞の過剰な増殖に伴う疾患、例えば自己免疫疾患、宿主移植片疾患等を治療することができる。
ピリミジン生合成は増殖する全ての細胞・ウィルス・寄生虫に必須である。従って、本酵素を阻害する化合物は、異常増殖するガン細胞・ウィスル・寄生虫に対して増殖抑制効果を示す。ガン細胞のうちで、特に増殖抑制効果が高いものとして、例えば白血病細胞、大腸ガン細胞等が挙げられる。また、眠り病の原因となっているトリパノゾーマ・ブルセイは、外部からピリミジン代謝産物を取り込んで利用する経路を持たないため、ピリミジン生合成が阻害されると宿主より敏感に（選択的に）増殖が抑制される（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　９８（１１），　６４１２−６４１６，　（２００１））。
従って、本発明の化合物は、炎症、自己免疫疾患（リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス等）、慢性対宿主移植片疾患、ガン、真菌・ウィルス・寄生虫感染等に対する治療剤として有用である。
【００２０】
本発明の化合物の投与量、投与回数は、疾患、年齢、体重、投与形態等によって異なる。例えば、経口的に投与する場合は、通常、成人（６０Ｋｇ）に対し１日あたり約１〜約５００ｍｇ、好ましくは約３〜約３００ｍｇ、特に好ましくは約５〜約１００ｍｇを１回または数回に分けて投与することができる。注射剤として投与する場合は、成人（６０Ｋｇ）に対し１日あたり約０．１〜約３００ｍｇ、好ましくは約１〜約１００ｍｇを１回または数回に分けて、あるいは継続的に投与することができる。
また、本発明の化合物は、他のジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤、抗炎症剤、自己免疫疾患治療剤、免疫抑制剤、制ガン剤、殺真菌剤またはウィルス感染治療剤等と併用することもできる。
【００２１】
本発明の化合物、そのプロドラッグおよびそれらの薬学上許容される塩は、経口的または非経口的に投与することができる。経口的に投与するための剤型としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、カシェ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口的に投与するための剤型としては、注射剤（静脈内投与用、筋肉内投与用等）、経皮剤（クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、パッチ剤、マトリクス剤等）、経鼻剤、直腸投与剤（坐剤等）等が挙げられる。
これらの製剤は、通常の方法に従って製造することができる。
錠剤等の経口固体製剤は、例えば、本発明の化合物を、賦形剤（乳糖、Ｄ−マンニトール、ショ糖、トウモロコシ澱粉、セルロース、リン酸水素カルシウム等）、崩壊剤（カルメロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウムや澱粉グリコール酸ナトリウム等）、結合剤（ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドキシプルピルメチルセルロース、メチルセルロース等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム等）、矯味矯臭剤、安定化剤、着色剤等と混合し、常法により、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とすることができる。
経口液剤は、例えば、本発明の化合物を水に加え、着色剤、香料、安定化剤、甘味剤、溶解剤、増粘剤等を必要に応じて加え製造することができる。増粘剤としては、例えば、薬学的に許容される天然または合成ガム、レジン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたは公知の懸濁化剤等が挙げられる。
注射剤は、例えば、本発明の化合物を、水、生理食塩水、油、ブドウ糖水溶液などの生理的に許容しうる担体に溶解または懸濁し、さらに補助剤としてｐＨ調製剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、乳化剤等を必要に応じて加えることで製造することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例においては、ＷＯ０２／１０１３１記載の製法に従って製造された下記ピロール化合物（Ａ）およびピロール化合物（Ｂ）を、本発明化合物の代表化合物として使用した。
ピロール化合物（Ａ）
【化１２】
2004099586.tif 000008
ピロール化合物（Ｂ）
【化１３】
2004099586.tif 000009
【００２３】
実施例１
培養細胞の増殖抑制とピリミジン代謝産物による増殖抑制の解除（Ｉ）
ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）より購入したラット腎臓由来線維芽細胞株ＮＲＫ−４９Ｆを用いた。ＮＲＫ−４９Ｆは１０％　ＦＣＳ（牛胎児血清；ギブコ）を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ）で継代した。９６穴のプレート（コーニング）に１×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度として１００μｌ植え込み、１日培養した後に、培地を吸引除去した。次に、被検化合物としてピロール化合物（Ａ）、増殖因子としてＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子、ゲンザイムテクネ）５０ｎｇ／ｍｌ、及び培地添加物としてウリジン（和光純薬）１００μＭ、アデノシン（和光純薬）１００μＭを含む０．１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地を加えた。血清濃度を落とした理由は血清中に核酸代謝産物が含まれ、実験に影響を及ぼすからである。２日培養した後に、Ｐｒｅｍｉｘ　ＷＳＴ−１　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（宝酒造）により細胞数を推定した。試薬の使用方法に従って、細胞数を反映する吸光度を測定し、無処理のウェルの吸光度を１００として、相対値を計算した。その結果を表１に示す。
【表１】
2004099586.tif 000010
ピロール化合物（Ａ）は濃度依存的にＮＲＫ−４９Ｆ細胞の増殖を抑制した。ウリジンはピロール化合物（Ａ）による増殖抑制を解除した。一方、アデノシンには抑制解除の効果は認められなかった。ＰＤＧＦのかわりにＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）等のＮＲＫ−４９Ｆの増殖を促進する因子を用いても結果は変わらなかった。増殖因子を加えないとＮＲＫ−４９Ｆの増殖は起こらないが、その条件下でのＮＲＫ−４９Ｆの生存に対してピロール化合物（Ａ）は影響を与えなかった。また、ウリジンの他にウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、チミジン、チミジン三リン酸を（ＴＴＰ）、アデノシンの代わりにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を用いても効果は変わらなかった。
【００２４】
実施例２
培養細胞の増殖抑制とピリミジン代謝産物による増殖抑制の解除（ＩＩ）
ＮＲＫ−４９Ｆを用いた増殖試験は実施例１と同様に行った。被検化合物として、ピロール化合物（Ａ）（２μＭ）、およびピリミジン生合成に関与するジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼを阻害することが知られているＡ７７　１７２６（レフルノミドの活性代謝体、カルビオケムより購入）（１μＭ）およびＵＭＰ合成酵素を阻害する６−アザウリジン（シグマ）（２０μＭ）を用いた。培地添加物としてカルバミルリン酸（関東化学）、ジヒドロオロチン酸（シグマ）、オロチン酸（和光純薬）等のピリミジン生合成の中間体を用いた。その結果を表２に示す。
【表２】
2004099586.tif 000011
ピロール化合物（Ａ）及びＡ７７　１７２６による増殖抑制はカルバミルリン酸、ジヒドロオロチン酸では解除されないが、オロチン酸で弱く、ウリジンで強く解除された。６−アザウリジンの場合は、オロチン酸での弱い解除効果が認められなかった。このことから、ピロール化合物（Ａ）がＡ７７　１７２６と同じ作用点を有する可能性が示唆された。
【００２５】
実施例３
細胞内核酸代謝産物の分析（Ｉ）
外径１５ｃｍの培養シャーレ（ファルコン）にＮＲＫ−４９Ｆ細胞をコンフルエントになる直前まで増殖させ、ＰＤＧＦ　５０ｎｇ／ｍｌ及び被検化合物を溶解した０．５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地と交換し、その後６時間培養を継続した後に、文献（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ．，６４，　３５７−６７　（１９９９））を参考にして、細胞内の核酸代謝産物の定量を行った。操作は可能な限り氷冷下で行った。冷やしたＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ギブコ）で細胞を洗浄した後に、冷やした０．５Ｍ過塩素酸を１．２ｍｌ添加し、氷上に３分間放置した後に、遠心（２，０００ｇ×２ｍｉｎ）を行い、上清を回収した。２．５　Ｍ水酸化カリウム・１．５Ｍリン酸二カリウムを加えて、ｐＨを６．５に調整し、氷上に２ｍｉｎ放置した。遠心（２，０００ｇ×２ｍｉｎ）して、上清を回収し、０．４５μｍの限外濾過膜で処理した後、−８０℃で保存した。
分析にはＨＰＬＣシステム（Ｉｎｔｅｇｒａｌ，　ＰＥバイオシステムズ）、Ｃ１８逆相カラム（Ｍｏｎｉｔｏｒ　Ｃ１８Ｍ　５μｍ，　２５０×２ｍｍ、カラムエンジニアリング）、Ａバッファー組成（１００ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４　／ＫＨ２ＰＯ４　ｗｉｔｈ　８　ｍＭ　ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，　ｐＨ　５．３）、Ｂバッファー組成（Ａに３０％メタノールを添加し、ｐＨ　５．９に調整）、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎ、測定波長２５４ｎｍを用いた。サンプルを添加後、以下の条件で溶出した。１００％のＡで４　分、２０分で直線的にＢの割合を４０％に増加し、次の２分で１００％まで増加し、１００％で８分流した後に、２分で０％に下げ、更に１８分間流した。ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＡＴＰ（ギブコ）、ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（和光純薬）、ＵＤＰ−Ｎ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（カルビオケム）をスタンダードとして溶出位置を確認した。細胞内の主要な核酸代謝産物であるＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＡＴＰのピーク面積値を求め、それらの総和に対する各面積値の割合を表３に示した。
【表３】
2004099586.tif 000012
ＰＤＧＦ刺激による核酸代謝産物の組成は大きく変動しなかった。ピロール化合物（Ａ）を添加するとピリミジン代謝産物であるＣＴＰ、ＵＴＰの量を著しく低下させた。プリン代謝産物であるＧＴＰ、ＡＴＰには影響しないと考えられた。ピリミジン生合成の阻害はＰＤＧＦ刺激がない場合も同様に認められた。
【００２６】
実施例４
細胞内核酸代謝産物の分析（ＩＩ）
薬剤がピリミジン合成系の阻害作用を示すのであれば、作用点である酵素の基質は増加することが予想される。そこで、文献（Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．，　２７５，　１０４３−１０４９　（１９９５））に従って、最も可能性の高いジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼの基質であるジヒドロオロチン酸が蓄積するかどうかを検討した。
実施例３と同様にＮＲＫ−４９Ｆ細胞を処理した。冷やしたＰＢＳで洗浄後、冷やした７０％　エタノールを２ｍｌ添加し、細胞をセルスクレーパーでかき取って、２ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。氷冷下で超音波処理をし、−８０℃で保存した。
分析にはＨＰＬＣシステム（Ｉｎｔｅｇｒａｌ，　ＰＥバイオシステムズ）、強イオン交換カラム（Ｐａｒｔｉｓｉｌ−１０　ＳＡＸ　ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｏｌｕｍｎ，　１０μｍ，　２５０×２ｍｍ　Ｉ．Ｄ．、ワットマン）、Ａバッファー組成（８ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４，　ｐＨ　３．０）、Ｂバッファー組成（Ａに０．７５Ｍ　ＫＣｌを追加）、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、測定波長２１０ｎｍと２５４ｎｍを用いた。測定の直前に解凍したサンプルを遠心処理し（１１，０００ｒｐｍｇ×１５ｍｉｎ）上清をカラムに添加後、以下の条件で溶出した。１００％のＡで１０分、１０分で直線的にＢの割合を１００％に増加し、次の１００％で８分流した後に、１分で０％に下げ、更に１２分間流した。オロチン酸（和光純薬）、ジヒドロオロチン酸（シグマ）をスタンダードとして溶出位置を確認した。
結果を図１に示した。スタンダードとしたジヒドロオロチン酸は１５分に溶出し、オロチン酸はその後に溶出した。ジヒドロオロチン酸は２５４ｎｍの吸収がなく、２１０ｎｍで検出された。オロチン酸は２５４ｎｍ、２１０ｎｍ共に吸収を示した。ピロール化合物（Ａ）を処理すると、非常に小さなピークではあるがジヒドロオロチン酸の溶出位置にピークが認められた。２５４ｎｍの吸収は認められなかった。Ａ７７　１７２６処理によっても同様のピークが検出された。
【００２７】
実施例５
リコンビナント・ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害活性
１）リコンビナント・ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼの発現
リコンビナント・ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼは文献（Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２００１；２６８（６）：１８６１−８．）を参考にして発現した。ヒト型・ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ遺伝子については、膜貫通ドメインおよび終始コドンを除いた全長を二種類のプライマー（ｈＤＨＯＭ；　５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＡＴＧＡＧＣＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＴＧＡＡ−３’、ｈＤＨＯＲ；　５’−ＧＡＡＴＴＣＣＣＴＣＣＧＡＴＧＡＴＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＣＡＴＣＴＧ−３’）を用い、Ｉｎｃｙｔｅ社より購入したヒト型ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ遺伝子を鋳型としてポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）により増幅した。増幅した遺伝子はｐＥＮＴＲ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングした。同様にラット型ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ遺伝子については、ＮＲＫ−４９Ｆ細胞より抽出したＲＮＡを逆転写して得たｃＤＮＡを鋳型として二種類のプライマー（ｒＤＨＯＭ；　５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＧＧＡＴＧＡＣＣＡＴＴＴＣＴＡＴＧＣＴＧＡＧ−３’，　ｒＤＨＯＲ；　５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴＣＣＧＡＴＧＡＴＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧＧＣＡＴＣＴＧ−３’）を用いて遺伝子を増幅し、インビトロジェン社の説明書に従ってＧＡＴＥＷＡＹ　ＢＲ反応によりｐＤＯＮ２０１ベクター（インビトロジェン）に組み込んだ。　得られたクローンの塩基配列を確認し、正しい配列のクローンをそれぞれｐＥＮＴＲｈＤＨ　，　ｐＥＮＴＲｒＤＨと命名した。コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞蛋白質合成システム（ＰＲＯＴＥＩＯＳ；東洋紡）を利用するために、上記クローンとデスティネーションベクターｐＥＵ３Ｈ（東洋紡）によりＧＡＴＥＷＡＹ　ＬＲ反応を行い、得られたクローンの塩基配列を確認した後、それぞれｐＥＵ３ＨｈＤＨ、ｐＥＵ３ＨｒＤＨと命名した。　これらのクローンから調製したプラスミドＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを調製し、ＰＲＯＴＥＩＯＳシステムによりジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ蛋白質を合成した。反応系にはジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼの補酵素であるフラビンモノヌクレオチド（和光純薬）を１００μＭの濃度で添加した。また、可溶性の蛋白として発現するために、界面活性剤ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３５；シグマ）を０．０２〜０．１％の濃度で添加した。　１０，０００ｇで１５分遠心した上清を蒸留水で５倍希釈し、ＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌｅｔｉｎｇカラム（アマシャムバイオサイエンス）に通液した。２０ｍＭ　イミダゾール（ナカライテスク）にて洗浄し、４００ｍＭ　イミダゾールにて溶出される画分を、リン酸緩衝生理食塩水（ギブコ）に対して透析し、ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ精製標品を得た。活性の回収率を上げるため、精製に使用したバッファーには全て０．０２％のＢｒｉｊ３５を添加した。透析画分のタンパク濃度を測定し、この段階での比活性を算出した。ヒト型　１．８４Ｕ／ｍｇ、ラット型　０．２７Ｕ／���ｇとなった。
２）ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）の活性測定
標準的な反応液の組成は１００μＭのコエンザイムＱ１０（シグマ）、１ｍＭのジヒドロオロチン酸（シグマ）、４０μＭの２，６−ジクロロインドフェノール（メルク）、０．１％のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；バイオラッド）、１５０ｍＭの塩化カリウム（ナカライテスク）、５０ｍＭのトリス（ｐＨ　８．０）（ナカライテスク）、０．１ｍＵのジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼである。反応液量は２００μｌで、酵素を加えて反応を開始し、６００ｎｍの吸光度の変化を経時的に測定し、酵素の初速を求めた。
阻害活性を求めるために、標準的な反応液に各種の濃度の化合物を添加して同様に初速を測定した。阻害剤を加えない時の初速を１００として相対活性を求めた。
ラット型ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼに関する阻害活性測定結果を図２に、ヒト型ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼに関する阻害活性測定結果を図３に示す。ビロール化合物（Ａ）及びピロール化合物（Ｂ）はラット型ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼを用量依存的に阻害した。両者の作用濃度はレフルノミドの代謝活性体であるＡ７７　１７２６に匹敵するものであった。ヒト型ジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼに対する阻害活性はＡ７７　１７２６と同様にラット型に比べて弱い傾向を示した。ヒト型に対してはピロール化合物（Ｂ）の方がピロール化合物（Ａ）よりも強い阻害活性を示した。
【００２８】
実施例６
アジュバント関節炎の抑制
実験動物としてＬｅｗｉｓ系雄性ラットを用いた。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍの死菌菌体を０．５％の濃度になるよう流動パラフィンに懸濁した液をラットの右側後肢足蹠皮下に注入した。１７日後に左側後肢にも明確な二次炎症の発症が認められた動物を選び、０．５％メチルセルロース溶液に懸濁させたピロール化合物（Ａ）を５日間連続経口投与し、投与終了から５時間後の後肢容積を投与開始時の後肢容積と比較し、この差により腫脹抑制作用の評価を行なった。その結果を表４に示す。
【表４】
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【００２９】
【発明の効果】
本発明によって、抗炎症剤、自己免疫疾患治療剤、免疫抑制剤、制ガン剤、殺真菌剤またはウィルス感染治療剤等として新規なジヒドロオロテート　デヒドロゲナーゼ阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ピロール化合物（Ａ）およびＡ７７　１７２６でＮＲＫ−４９Ｆ細胞を処理し、その細胞内のオロチン酸およびジヒドロオロチン酸の量をＨＰＬＣで分析した図である。図中の実線は２１０ｎｍの吸収を、点線は２５４ｎｍの吸収を表す。
【図２】各種の濃度の化合物存在下でラット型ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼの酵素活性を測定し、化合物非存在下での酵素活性に対する相対値で示した図である。
【図３】各種の濃度の化合物存在下でヒト型ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼの酵素活性を測定し、化合物非存在下での酵素活性に対する相対値で示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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