(57)【要約】【課題】微生物の迅速かつ簡便な検査方法を提供する【解決手段】蛍光基質、或いは発色基質を添加した培地に試料を接種した後、経時的に生成する信号を測定し、その信号を比較することにより検査を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物又はその分泌物の作用により生成する物質を検出することによる微生物の検出方法において、被検試料と信号を生成しうる物質とを接触させた後、生じる信号を経時的に少なくとも２回検出する工程を含み、検出された信号を経時的に比較することを特徴とする微生物の検査方法。
【請求項２】
発色物質及び／又は蛍光物質を生成しうる基質を培地中に含ませて生じる発色強度及び／又は蛍光強度を検出する請求項１記載の検査方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法に用いる装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は食品、臨床検査等における微生物の検査に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】食品や臨床検査試料中の微生物、とりわけ細菌類の検出には適当な培地中で微生物を培養し、形態学的及び生化学的な特性を基に分離・同定を行っている。培地においても液体培地、あるいは寒天培地等その目的に応じて種々の形態のものが用意されている。培地中に発色性基質や蛍光性基質を加えて、微生物の生化学的特性により発色、あるいは蛍光を検出することにより微生物を検出、同定する方法が開発されている。
しかしながら、これらの培地による検査では、試料を培地に接触させ、通常、１日〜数日間の培養を行った後、発色の度合い、蛍光強度等を観察することにより検査をおこなっているため、検査時間が長くなるという欠点がある。また、その操作は、食品を培地に添加して振とう培養した後、培養液を遠心分離又はフィルター処理し、これに蛍光基質を加えて反応させ、微生物が産生する酵素により蛍光基質から蛍光物質を遊離させ、反応液にアルカリを添加した後、再度遠心分離又はフィルター処理を行い、上澄液の蛍光を測定するというものである。しかしながら、この方法においては、遠心分離又はフィルター処理操作を行うなど操作が煩雑であるという問題があった。
このような欠点を改善する目的で、特開平５−３３６９９３では、プレートのＡ、Ｂ、Ｃの三ヶ所に培地と蛍光基質を入れ、Ａは試料を培養後、アルカリ液で培養を停止して蛍光強度を測定、ＢとＣには試料を培養する前にアルカリ液を入れてブランクとし、Ｂは蛍光物質そのものを入れて陽性コントロールとし、Ｃは何もいれずに陰性コントロールとして、Ａの蛍光強度をＢ及びＣの蛍光強度と比較することによって微生物を検出する方法が開示されている。この方法では、蛍光測定して、微生物を検出する際には、培養を停止しなければならず、ある一定時間後に検出する、従来の方法と大きな違いはない。
【０００３】
一方、微生物の培地中での増殖を経時的に検出する方法として、液体培地中での、微生物の増殖を濁度の変化として捉え、波長６６０ｎｍでの吸光度変化を指標とする方法がある。しかし、この方法は、その都度、培養液の一部を採取して計測しなければならなく、またその測定感度も低いため、もっぱら、大量培養時のモニターに利用されており、微生物の検査方法としては不向きである。寒天平板培地での検査では、そのような光学機器を用いた測定ができないため、発生してくるコロニーを肉眼で観察し、コロニー数及びその大きさ等を指標に検査を行っている。この平板培養では、コロニーが形成されるまでは検出できないため、検査に時間がかかるといった欠点がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は微生物の検査において、迅速かつ高感度な検査方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決する手段】本発明者ら発色性或いは蛍光性基質を添加した微生物の検査用培地で微生物を検査する時に、経時的に発生してくる信号を微生物の培養を停止させることなく検出し、その信号強度の比較を行うことにより、従来の方法よりも短時間にかつ簡便に微生物の検査を行えることを見出し発明を完成させた。
本発明は、以下の構成からなる。
１、微生物又はその分泌物の作用により生成する物質を検出することによる微生物の検出方法において、被検試料と信号を生成しうる物質とを接触させた後、生じる信号を経時的に少なくとも２回検出する工程を含み、検出された信号を経時的に比較することを特徴とする微生物の検査方法。
２、発色物質及び／又は蛍光物質を生成しうる基質を培地中に含ませて生じる発色強度及び／又は蛍光強度を検出する上記１記載の検査方法。
３、上記１又は２に記載の方法に用いる装置。
【０００６】
【本発明の実施態様】本発明をさらに詳細に説明するため、実施態様を例示して説明する。
（培地）微生物の増殖させうる培地であればその組成、形態は特に限定されることはなく、一般に市販されている培地を用いることができる。培地としては、検出しようとする微生物が生育できる培地であれば特に制限されないが、大腸菌群やＥ．ｃｏｌｉを対象とする場合は、特開平４−５１８９０号公報記載の大腸菌群増殖用培地、後記のＫＳ培地、ブレインハートインフュージョン培地、ハートインフュージョン培地、トリプトソーヤ培地、乾燥ブイヨン培地、ブリリアントグリーン乳糖ブイヨン培地（ＢＧＬＢと略す）、乳糖ブイヨン培地（ＬＢと略す）、ＥＣ培地（ＥＣと略す）等が挙げられるが、ＫＳ培地が特に好ましい。
【０００７】
（基質）上記の培地中に微生物自体又はその分泌物により発蛍光や発色しうる培地を添加して用いる。例えばβ−Ｄ−グルクロニダーゼの基質として、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧＬＲ、蛍光測定）、フェノールフタレイン−モノ−β−Ｄ−グルクロニド（ＰＨＥＧＬＲ、発色測定）、パラニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（ＰＮＰＧＬＲ、発色測定）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＸＧＬＲ、発色測定）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵＧＡＬ蛍光測定）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ、発色測定）、オルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧａｌ、発色測定）、パラニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧａｌ、発色測定）、６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＮＧａｌ）、６−ホスホ−β−Ｄ−ガラクトシド６−ホスホガラクトヒドラーゼの基質であるオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−６−リン酸（ＯＮＰＧＰ、発色測定）、α−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質として、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（蛍光測定）、β−Ｄ−グルコシダーゼの基質として４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシド（蛍光測定）、α−アミラーゼとα−ブルコシダーゼの両方を検出する基質として、オリゴマルトース（ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー等）のパラニトロフェイル誘導体（発色測定）、ノイラミニダーゼの基質として、４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（ＭＵＮＡＧ、蛍光測定）、エステラーゼの基質として、種々の脂肪酸の４−メチルウンベリフェリルエステル（蛍光測定）、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ、蛍光測定）、６−カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＤＡ、蛍光測定）、ホスフアターゼの基質としてはフェノールフタレイン、α−又はβ−ナフトール、パラニトロフェノール等のリン酸エステル（発色測定）や４−メチルウンベリフェリルリン酸（蛍光測定）、ペプチダーゼの基質としては、パラニトロアニリンのアミノ酸又はオリゴペプチド誘導体（発色測定）、７−アミノ−４メチルクマリンのアミノ酸又はオリゴペプチド誘導体（蛍光測定）等が利用される。さらに、ＤＮＡと結合することにより蛍光を発する色素、例えば４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール、臭化エチジウム、アクリジンオレンジ、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、ヘキスト色素３３２５８等も用いられる。培地の形態は液体培地或いは寒天平板培地等適当な形態が選択される。用いられる基質の量は、検体中の微生物量よりも過剰であれば特に制限されず、例えば培地に対し１×１０−２〜１×１０−４Ｍが好ましい。
【０００８】
（経時的信号検出）検査試料を上記の培地に接触させ、培地中で微生物の増殖を行う。
その時に例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを含む培地で、培養した場合には、遊離してくる４−メチルウンベリフェロンを蛍光測定により検出する。
寒天平板培地を採用資した場合には、平板の上部又は底面に励起光を照射し、発生する蛍光強度を測定する。このような平板の場合には、上部から励起光を照射するならば、発生してくる上部蛍光をハーフミラーを用いた蛍光測定法で測定する方法が採用される。この方法は、通常トップトゥトップ法として良く知られた方法である。
さらに、市販の落射型の蛍光顕微鏡を用いても検出可能である。また、発色測定であれば、反射光測定により平板上の発色を測定することができる。
さらに、これら光の検出には、通常の写真カメラ、或いは光電管やＣＣＤカメラにより検出し、変換された電気信号はそれぞれ適当な信号処理がなされて、データとして出力することも可能である。上記の概念図を図１に示した。
【０００９】
（信号の処理）検査試料を培地に接触させた後の、適当な時点で発生してくる信号（発色或いは蛍光等）を測定し、その後一定時間経過した後に信号を測定する。その信号の強度を、前に測定した信号の強度と比較して、微生物の増殖を判定する。また微生物の種に特異的に分解されうる基質を培地中に添加しておくことにより、微生物の分類も可能になる。
【００１０】
（検査対象試料）本発明方法に用いられる検体としては、食品、医薬、農薬、化粧品、飲料水、尿等微生物混入の有無を検出する必要のあるものが用いられるが、肉類、魚介類、野菜類、果物類等の生鮮食料品を用いるのが好ましい。
【００１１】
（微生物）本発明方法の検出対象である微生物としては、種々の細菌、真菌等が挙げられるが、食品を検体とした場合には大腸菌群が重要である。ここで大腸菌群とは、ラクトース分解酵素を産生する能力を有する一群の微生物で、エシェリシア属、サイトロバクター属、クレブシエラ属、エンテロバクター属等に属するものである。
【００１２】
【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。
【実施例１】（培地の調製）以下の組成の培地を調製した。
ペプトン　５ｇ／Ｌ
食塩　５ｇ／Ｌ
リン酸１ナトリウム　　２．２ｇ／Ｌ
リン酸２ナトリウム　　２．７ｇ／Ｌ
ピルビン酸ナトリウム　１．０ｇ／Ｌ
トリプトファン　　　　１．０ｇ／Ｌ
寒天　　　　　　　　１０．０ｇ／Ｌ
ソルビトール　　　　　１．０ｇ／Ｌ
４−ＭＵグルクロニド　０．０５ｇ／Ｌ
Ｘ−グルクロニド　　　０．２ｇ／Ｌ
上記の組成の培地を１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、２４穴のプレートウエルに１ｍＬずつ分注し、寒天平板培地として用いた。
【００１３】
【実施例２】（微生物の検出）大腸菌を含む試料検体を実施例１で調製した寒天平板培地に接種し、３７℃で培養した。試料を接種した寒天平板培地をそのまま市販のデンシトメーターを用いて、励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで経時的に蛍光測定した。同時に反射光測定により波長６６０ｎｍの反射率を測定した。また同時に肉眼によりコロニーの形成を観察し、それぞれの結果を表１に示した。
2004053570.tif 000002
以上の結果、肉眼でコロニー形成を観察する方法では２４時間経過後でなければ観察されなかったのに対して、経時的に蛍光或いは発色を測定する本発明の方法では３〜６時間の培養で既に信号の変化を捉えることができ、迅速に微生物を検査できることが判った。
【００１４】
【実施例３】（蛍光顕微鏡による検出）
実施例２と同様に操作して、寒天平板上に大腸菌を接種し、臭化エチジウム及び６−カルボキフルオレセインジアセテート（ＣＦＤＡ）をそれぞれ寒天平板上に添加して、培養を行った。経時的に蛍光顕微鏡で観察したところ、肉眼ではコロニーが観察されない６時間経過時点で明らかな蛍光信号を観察することができた。エチジウムブロミドでは赤味をおびた蛍光が観察され、一方ＣＦＤＡでは黄緑色の蛍光が観察された。
その１例の写真を図２に示した。
このように、本発明の方法により、迅速に微生物を検査できることが判った。
【発明の効果】
本発明によれば、微生物の検査を従来よりも格段に迅速かつ簡便に行うことが可能である。
【００１５】
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光測定の概念図を示したものである。
【図１】
2004053570.tif 000003
【図２】
2004053570.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成14年10月2日(2002.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光測定の概念図を示したものである。
【図２】ＣＦＤＡ及び臭化エチジウムでの蛍光顕微鏡写真である。