(57)【要約】【課題】医薬として活性な抽出物および画分、ならびにAnoectochilus属の植物構成部分の組織から成分を抽出および画分することによってそれを調製する方法を提供すること。【解決手段】このような活性抽出物および画分は、腫瘍成長を予防または抑制するのに有用である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　Anoectochilus formosanusの植物組織をホモジナイズすること、そのホモジナイズした組織を、90〜100℃の水性媒質での抽出にかけて、粗抽出物とすること、およびその粗抽出物を有機溶媒による段階的勾配分別にかけて、1種または複数の画分とすること
　を含む抽出物の製造方法。
【請求項２】
　有機溶媒がエタノールである請求項1に記載の方法。
【請求項３】
　画分の1つがアデノシンおよびイソラムネチン3-O-β-D-グルコピラノシドを含む請求項2に記載の方法。
【請求項４】
　1種または複数の画分を1種または複数の有機溶媒で分配して、1種または複数の分配された亜画分を得ることをさらに含む請求項1に記載の方法。
【請求項５】
　1種または複数の画分の少なくとも1種を蒸発にかけて乾燥させ、水性溶媒中に再懸濁させ、酢酸エチルおよびn-ブタノールの少なくとも一方での抽出にかけて、1種または複数の亜画分を得る、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
　アデノシンおよびイソラムネチン3-O-β-D-グルコピラノシドを含む画分を蒸発にかけて乾燥させ、水性溶媒中に再懸濁させ、酢酸エチルでの抽出にかけて亜画分を得る請求項3に記載の方法。
【請求項７】
　亜画分がα-アミリンtrans-p-ヒロドキシシンナマートおよびイソラムネチンを含む請求項6に記載の方法。
【請求項８】
　腫瘍を有し、または腫瘍を有する危険のある生物体にAnoectochilus formosanus抽出物を含む組成物を有効量投与することを含む、前記生物体において腫瘍成長を制御する方法。
【請求項９】
　抽出物が、Anoectochilus formosanusを熱水での抽出にかけて粗抽出物とし、その粗抽出物を有機溶媒による段階的分別にかけて粗抽出物の画分とすることによって得た画分を含む請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
　有機溶媒がエタノールである請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
　画分が87.5%のエタノールに可溶であり、その画分がアデノシンおよびイソラムネチン3-O-β-D-グルコピラノシドを含む請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
　画分をさらに酢酸エチルでの抽出にかけて亜画分を生成し、前記投与組成物が前記亜画分を含む請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
　亜画分がα-アミリンtrans-p-ヒドロキシシンナマートおよびイソラムネチンを含む請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
　請求項11の画分を含む組成物。
【請求項１５】
　請求項13の亜画分を含む組成物。
【請求項１６】
　Anoectochilus formosanusの植物組織をホモジナイズすること、そのホモジナイズした組織を90〜100℃の水性媒質での抽出にかけて粗抽出物とすること、
　その粗抽出物をエタノールによる段階的勾配分配にかけて1種または複数の画分とすること、
　その1種または複数の画分を蒸発にかけて乾燥させること、その1種または複数の乾燥した画分を水性溶媒中に再懸濁させること、およびその再懸濁させた1種または複数の画分を、酢酸エチルおよびn-ブタノールの少なくとも一方での抽出にかけて少なくとも1種の亜画分を得ること
　を含む方法によって製造した組成物。
【請求項１７】
　腫瘍を有する生物体に有効量の請求項16の組成物を投与することを含む、前記生物体において腫瘍成長を制御する方法。
【請求項１８】
　Anoectochilus formosanusの植物組織をホモジナイズすること、そのホモジナイズした組織を 90〜100℃の水性媒質での抽出にかけて粗抽出物とすること、およびその粗抽出物をエタノールによる段階的勾配分別にかけて1種または複数の画分とすること
　を含む方法によって製造した組成物。
【請求項１９】
　腫瘍を有する生物体に有効量の請求項18の組成物を投与することを含む、前記生物体において腫瘍成長を制御する方法。
【請求項２０】
　Anoectochilus属植物の組織をホモジナイズすること、および
　そのホモジナイズした組織を1〜500分間沸騰湯での抽出にかけて抽出物を得ることを含む、Anoectochilus属植物の粗抽出物を得る方法。
【請求項２１】
　Anoectochilus属植物の組織をホモジナイズすること、そのホモジナイズした組織を1〜500分間沸騰湯での抽出にかけて抽出物を得ること、
　その抽出物をエタノールによる段階的勾配分配にかけて、効力が増強された1種または複数の画分とすることを含む、Anoectochilus属植物の抽出物の効力を増強する方法。
【請求項２２】
　組成物を、腫瘍内、腹腔内、または経口投与の1投与法によって生物体に投与する請求項8に記載の方法。
【請求項２３】
　組成物を、腫瘍内、腹腔内、または経口投与の1投与法によって生物体に投与する請求項17に記載の方法。
【請求項２４】
　組成物を、腫瘍内、腹腔内、または経口投与の1投与法によって生物体に投与する請求項19に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
　Anoectochilus formosanus(アノエクトチルス・ホルモサナス) Hayata(ラン科)は、台湾原産の重要な薬用植物であり、台湾および他のアジア諸国では、栄養剤的なハーブティーとして大衆に利用されてきた。この草本植物は、肝臓保護、癌予防、糖尿病、および心血管疾患の治療など、薬理学的効果が多様であるために、「王様の薬」とも呼ばれる(Kan、1986)。しかし、この草本のラン植物の生理活性、生理学的機能、および特定の臨床効力については、利用できる科学的に証明された情報が限られている。
【０００２】
　アポトーシスは、特定の刺激または様々な形の細胞損傷に応じて、進行が調節または活性化される、細胞死の機構的に推進される形である。多くの癌細胞が、正常なアポトーシス機構を逃れて、その自己崩壊を回避できることは、現在明らかである。これまでの多くの報告は、免疫防御機構を媒介とするアポトーシスの誘発(Williams、1991;Bursch et al.、1992)、または他の組織特異的な恒常性的制御(Raff、1992)が、新生腫瘍細胞の排除に重要な過程として寄与している可能性を示している。抗癌剤の作用方式の理解における最近の進歩は、抗癌剤の大部分が、その多様性にかかわらず、標的の試験腫瘍細胞中でアポトーシスを誘発し得ることを示唆している(Whllie et al.、1980;Jiang et al.、1996)。さらに、ある種の「抗アポトーシス」タンパク質(たとえば、Bel-2またはBolXＬ)が過剰発現すると、タキソール、ara-C、およびエトポシドを含む抗癌剤によって誘発されたアポトーシスが抑制される(Fang et al.、1998)。逆に、いくつかの知られている、または疑いのある腫瘍促進因子、たとえば酢酸ミリスチン酸ホルボール(PMA)、1,1-ビス(p-メゼレイン、ジエチルスチルベストロール(DDT)、サッカリン、アフラトキシンなどは、様々な試験細胞型においてアポトーシスへの耐性を誘発することが知られており、アポトーシスの抑制に及ぶ影響が、明らかに腫瘍促進機構に媒介されることを示唆している(Wright et al、1994)。したがって、癌の化学療法および予防的手法として、有糸分裂よりもアポトーシスにバランスを傾けることが有利となる。
【０００３】
　最近では、アポトーシスは、ミトコンドリア膜の完全性が崩壊するものであり、これによってミトコンドリアから細胞質ゾルにチトクロムcが放出されること、ならびにこの因果的連鎖が細胞死の過程の決め手となることが示されている(Liu et al.、1996;Yang et al.、1997)。標的分子のスペクトルが多様な、数種の抗腫瘍薬、たとえばタキソールおよびエトポシドが、ミトコンドリア成分を放出させ、その結果として細胞質ゾル中にチトクロムcが蓄積されることも示されている(Fang et al、1998)。アポトーシスの過程に関与することが知られている細胞機構は、カスパーゼと呼ばれるシステインプロテアーゼファミリーの生化学活性の調節である。
【０００４】
　生理活性に基づく評価原理を備えた、異なるタイプの癌疾患に対応したヒト腫瘍細胞系パネルを使用するin vitro腫瘍抑制スクリーニング系を、テトラゾリウム(MTT)アッセイおよびタンパク質結合染料(スルホローダミンB)アッセイと合体させたものが、米国国立がん研究所(NCI)の研究班によって開発された(Monks et al.、1991)。このようなアッセイの本質は、腫瘍細胞生存度、成長、および細胞の生化学的挙動を測定するものである。米国NCIのMonksおよびその共同研究者等と、他の班は、様々なパイロットスクリーニング研究に従い、毎週400種の化合物というスクリーニング速度を実現した。これまでにスクリーニングされた少なくとも8000種の単一化合物の中で、有意であり、再現性があり、かつ説得力のあるin vitro抗腫瘍細胞活性を示したのは、限られた数の試験サンプル(約30件)だけであった。その限られた数の化合物の約8〜10種だけが、過度の毒性なしに、in vivo抗腫瘍活性を示し、ヒトでの臨床治験でさらに試験された。この課題およびその結果は、癌治療薬の送達について単一の化合物をスクリーニングする大きな難しさを示すものであった。
【０００５】
　現在では、コンビナトリアル化学および高スループットの系を利用する、薬物スクリーニング向けのずっと速い体系的な戦略が工業的に利用可能であり、いくつかの製薬会社によって新薬発見のために活用されている。また、癌治療薬の発見については「それほど直接的である必要はない」とされ、化合物の組合せまたは「反応混液」が問題とされている(Dr.G.CraggiのInternational Conference on Traditional Chinese Medicine、2000年8月30日〜9月2日、米メリーランド州)。粗製または部分的に精製した二次的な植物代謝産物/植物化学物質(phytochemical)を化合物の混合物として使用する、薬物の発見、栄養補助食品、栄養剤のためのこの戦略は、米国で最近設立された国立代用医薬品研究所(NCCAM)の主要な政策であり、方向性である。我々の研究および本発明は、この新しい戦略および方向性を考慮して考案されている。腫瘍予防および抑制活性に薬用植物を利用するこの手法の最も新しい組織的な取り組みでは、緑茶およびそれに由来する活性化合物、すなわちエピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)についても研究されている(Lin et al.、1999;Ahmad et al、1997)。
【非特許文献１】Al-Rubeai,M.(ed.)(1998) Apoptosis,Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
　本発明は、粗製であるが規定された植物抽出物として、または生物有機化学的に分別された植物代謝化合物として調製された、植物のAnoechtochilus属、特にAnoectochilus formosanus(「A.formosanus」)の草本植物抽出物、その調製方法、そのような抽出物を含有する組成物、ならびに化学防御、または様々なヒト悪性疾患の補足的/代替的制御のためのその使用にある。
【０００７】
　アジア諸国では、Anoectochilusの他の種、たとえば、A.koshunensis、または中国、アメリカ、またはベトナムからの栽培変種も、A.formosanusの代用として生薬または栄養剤向けに使用されることが増えている。このようなAnoectochilus植物の植物抽出物およびその誘導体も、同様の抗腫瘍活性または腫瘍予防活性を有することがあり、したがって、特定の薬剤または栄養剤として潜在的に有用であるといえる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　本発明は、このような抽出物およびその植物化学物質誘導体の、腫瘍予防もしくは腫瘍抑制医薬または栄養剤としての使用を含む。黒色腫、乳癌、および肝細胞腫の腫瘍に対して特に強力であると思われる効果的な腫瘍細胞抑制活性の定義を、ここでは、固形腫瘍成長を予防、制御、または抑制することであるとし、この活性は、正常な個体のためにも、癌患者のためにもなり得る。兆候のないヒト、または癌患者としてのヒトへの草本植物抽出物の投与は、部分的に精製した植物抽出物の経口的送達(液体の飲用)、腫瘍内(皮内)注射、腹腔内注射、局所適用、またはさらに静脈内注射によって行えばよい。
【０００９】
　本発明の別の態様は、本発明の抽出物を、粗抽出物、粗抽出物由来の画分、または亜画分として得る方法を含む。これらの抽出物は、ある特定の溶媒を使用する1または複数の抽出ステップによって、かつ/または指定の抽出期間の間に得られる。
【００１０】
　他の実施形態では、抽出物または画分を、その後加工して、より精製された形態にする。
【００１１】
　本発明では、特定かつ一定の温室条件下で植物材料を栽培する。特定の条件下で植物組織を収穫し、細かくホモジナイズし、水などの水性媒質での抽出にかけてから、段階的な勾配による分別にかける。画分をさらに分配することによって、有用な指標化合物が特定されるが、これは、IR、質量、およびNMRの分光測定分析によって特徴付けができる。そこで、特定の植物抽出液またはそれに由来する生物有機化学溶媒画分の成分/化合物組成およびプロファイリングについて、指標化合物のレベルを基準化することによって、ロット毎に様々な植物抽出液の一貫性および質をモニタし、調製し、標準化し、または制御することができる。生理活性のある粗植物抽出物またはそれに由来する有機画分の調製物を得たならば、このような基準化/標準化および品質管理/品質分析(QC/QA)によって測定してから、腫瘍成長および同類の悪性病変を予防/制御するための栄養剤または医薬としての使用に向け、規定および系統分類することができる。
【００１２】
　MTTおよび３H-チミジン取込みアッセイを使用するin vitro(細胞培養物)細胞毒性実験において、植物抽出液およびそれに由来する画分を使用すると、ヒトまたはマウス腫瘍由来の、MCF-7細胞(ヒト乳腺癌)、B16細胞(マウス黒色腫)、ヒト肝細胞腫HepG2に対して、細胞増殖活性に有効な抑制効果がもたらされる。in vitro細胞毒性研究から得られた結果は、腫瘍細胞増殖の抑制動力学が用量依存的な効果であることを実証している。
【００１３】
　本発明は、マウスB16黒色腫細胞/C57黒色マウスを標的腫瘍/動物モデル系として使用して、in vivo腫瘍成長を抑制する効果も示している。A.formosanus抽出物を腫瘍内注射すると、in vivoでのB16腫瘍成長が有効に抑制され、A.formosanus抽出物を腹腔内投与した場合では、腫瘍成長の縮小について非常に有意な効果が検出された。試験マウスの経口強制投与によっても、検出可能な効果が観察されている。
【００１４】
　蛍光顕微鏡観察およびフローサイトメトリー分析では、A.formosanus抽出物が試験腫瘍細胞にもたらした、観察された細胞死滅効果が明らかにプログラム細胞死(いわゆる「アポトーシス」)の過程を媒介としていることが示されている。我々は本発明において、MCF-7細胞のアポトーシスが、Fasリガンド(FasL)情報伝達経路の発現を媒介としていることを実証した。知られているアポトーシス経路に関与する様々な情報伝達タンパク質のウエスタンブロット分析によって、発動型カスパーゼ(apical caspases)(たとえば、カスパーゼ8および9)、作動型カスパーゼ(effecter caspases)(たとえば、カスパーゼ7)、チトクロムc、およびポリ-ADPリボースポリメラーゼ(PARP)タンパク質分子の発現レベルが、MCF-7ヒト乳腺腫瘍細胞をA.formosanus植物抽出物で処理した場合、有意かつ特異的な影響を受けることが示された。A.formosanusの植物抽出物によって誘発される、MCF-7腫瘍細胞のアポトーシス機構として考えられるものも、本発明において提示する。B16黒色腫細胞の死滅と見事に関連して、活性の有意なゆらぎ、すなわちカスパーゼ3様活性およびカスパーゼ8活性の増大およびその後の低下が、A.formosanus抽出物で処理した時間に相関して検出されている。これらの結果は、観察されたA.formosanusの抗腫瘍細胞効果の原因が、一般の「細胞中毒」でない、特殊なタイプの生物学的な細胞内機構または経路であることを強く示唆するものである。
【００１５】
　本発明の他の有益な態様は、
　沸騰湯を0.1〜500分間使用して水および生物有機化学(bio-organic)抽出を行う本質的に非化学的な技術または手順(すなわち、人工化合物、緩衝剤、および有毒な有機溶媒を用いないもの)、
　エタノールによる簡単な段階的勾配(50〜87.5%、v/v)抽出手順を使用して、生物学的により強力な亜画分、すなわちAH-sup画分を得ること、
　AH-supをさらに酢酸エチルおよびブタノールでの生物有機化学抽出にかけて、有意で、かつ粗抽出物全体からのものより高い抗腫瘍活性レベルをもたらし得る、より精製または濃縮された代謝化合物群を得ること、
　in vitroのマウスB16黒色腫、MCF-7ヒト乳癌、およびHepG2ヒト肝細胞腫細胞において、他の画分(AF-Hot、AH-I、AH-II、およびAH-III画分)から得られた活性よりも高い細胞毒性レベルを示す画分(AH-sup)を、水性粗抽出物全体(AF-Hot)から得る調製法、
　AH-sup画分をさらに生物有機化学的に分別して、MTTアッセイにおいてAH-sup、BuOH、および水画分から得たもの中でEA画分が最も有意な抗腫瘍細胞効果を有することを示す3の亜画分(EA、BuOH、および水の画分と呼ぶ)を得ること
　を含む。
【００１６】
　本発明の植物抽出物は、次のように腫瘍成長抑制能を示す。
　a)MTTアッセイおよびフローサイトメトリー分析において、A.formosanusのAH-sup、BuOH、およびEA画分が、3種の試験細胞系間で様々に変化する、異なるレベルの抗腫瘍細胞増殖効果を示し、A.formosanus植物抽出物が、格差のある抗腫瘍活性または腫瘍予防活性で機能することが示唆され、
　b)HepG2ヒト肝細胞腫細胞の場合では、HepG2細胞を分別した植物抽出物、特にEA画分で処理すると、非常に有意な細胞死滅効果が観察され、よって、A.formosanusの粗抽出物は、肝細胞への毒性を最小限に抑えて使用でき、他の形の腫瘍を治療する場合にはより強力となり得る、
　c)B16黒色腫腫瘍を有するC57BL/6JマウスにA.formosanusの植物抽出物(AH-sup)をin situで腫瘍内、腹腔内、または経口投与して処置した場合のAH-supまたは粗植物抽出物の抗腫瘍細胞効果、すなわちマウスにおけるB16腫瘍の成長が有効に抑制できる。
【００１７】
　in vivoの動物モデル研究では、腫瘍内、腹腔内、および経口強制投与(feeding/drinking)法によって動物にA.formosanus植物抽出物を送達すると、腫瘍成長の抑制がかなりのレベルになり、したがってある特定の癌の治療または予防に有用である見込みが示された。
【００１８】
　本発明の特性となる様々な目新しい特徴は、添付され、かつこの開示の一部分をなす特許請求の範囲において詳細に指摘する。本発明、その機能上の有利点、およびこれを利用することによって実現される特定の目的の理解を深めるために、以下の図面および本発明の好ましい実施形態の記述を参照すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
　我々は、腫瘍細胞へのA.formosanus植物抽出物による特定の細胞毒性を評価することを第1の目的として、NCIで開発された抗腫瘍薬物スクリーニング戦略(Monks et al.、1991)に若干の変更を加え、適合させた。また、規定され、かつ再現可能な「生理活性指針分別戦略およびプロトコル」(bioactivity-guided fractionation strategy and protocol)を使用して、A.formosanus植物抽出物全体および生物有機化学的に誘導されたその画分の潜在的な抗腫瘍細胞効果を評価した。フローサイトメトリー、ウエスタンブロット分析、およびカスパーゼ活性アッセイを使用して評価したところでは、特定のA.formosanus植物抽出物から得られた、腫瘍細胞への機構特異的な細胞毒性活性が、明らかにアポトーシスの誘発に関与している。このような発見は、特定の抗癌薬によって誘発されたアポトーシス効果を実証する、発表されている様々な研究と非常に類似している。たとえば、発表されている研究のWhllie el al.、1980およびJiang et al.、1996を参照されたい。
【００２０】
　1.抗細胞増殖アッセイ
　10%のウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを補充物PPMI 1640として含むATCC推奨培地において、B16、MCF-7、およびHepG2細胞を成長させた。B16およびMCF-7細胞は、RPMI 1640(Gibco BRL、米国)を使用して成長させ、HepG2細胞には最小必須培地(MEM、Gibco BRL、米国)を使用した。
【００２１】
　A.formosanus植物抽出物およびそれに由来する画分が標的腫瘍細胞の成長にもたらす効果は、主に、他の場所で記載されているような(Mosmann、1983)MTT比色アッセイを多少変更したものを使用して評価した。(黄色を付与する)MTTのテトラゾリウム環は、生きている細胞ではミトコンドリアの脱水素酵素によって切断され、これによって、褐色のホルマザン沈殿物が生じる。そこで、570nmで相対吸光度の変化を測定する。MTTアッセイについては、96穴タイタープレートにおいて、標的腫瘍細胞(5×10３〜1×10４)を植物抽出物と共に、または単独で1〜3日間インキュベートした。インキュベートした後、粘着性の細胞を新鮮な培地で一度洗浄し、次いで上述の対応する細胞培地にMTT染料(PBS中0.5mg/ml)を加え、37℃で4時間反応させた。次いで、不溶性の反応産物を遠心分離によって収集し、100μLのDMSOに溶解させ、37℃で2時間インキュベートした。アッセイはすべて、4組の細胞群で実施した。細胞増殖抑制効果は、マイクロプレートリーダー(Labsystems MultiskanMS、フィンランド)を使用して、570nmの相対吸光度として示した。植物抽出物で処理した後の細胞生存百分率は、次の式、すなわち、生存可能細胞数(%)OD５７０(処理した細胞培養物)/OD５７０(対照(未処理)細胞培養物)×100%を使用して算出した。ある特定の試験細胞については、SeufferleinおよびRozengurt(1995年)が記載しているような厳密な実験プロトコルに従うことによって３H-チミジン取込みアッセイも使用して、A.formosanusの植物抽出物の抗細胞増殖活性を決定した。
【００２２】
　2.腫瘍細胞の蛍光顕微鏡観察分析およびフローサイトメトリー分析
　Apoalert Annexin V-EGFP法(CLONTECH、米カリフォルニア州パロアルト)を使用して、試験細胞のアポトーシスを評価した(Zhang et al.、1997)。MCF-7腫瘍細胞を、EA画分(1mg/ml)または溶媒(0.1%DMSO)で4時間かけて処理し、固定液で洗浄し、暗所においてAnnexinV-EGFPおよび/またはヨウ化プロピジウムで15分間かけて染色した。ニコン製ECLIPSE E800倒立型蛍光顕微鏡を使用して細胞を眺めた。
【００２３】
　評価中の植物抽出物もしくはそれに由来する植物化学物質を用いて処理した、または未処理の試験腫瘍細胞(1×10６細胞)を収集し、4℃の氷冷70%エタノール1mlで2時間かけて固定した。細胞のDNAを、暗所において、PBS緩衝液中に50μg/mlのヨウ化プロピジウム(PI)および100μg/mlのRNaseAを含むPI染色液で30分間かけて染色した。Coulter EPICS XLフローサイトメーター(ベックマン・コールター、米国)を使用して、全DNAに対するsub-G1DNA含有量の細胞百分率をアポトーシス細胞集団の尺度として得た。データは、アッセイ毎に少なくとも細胞10,000個を有するサンプルから割り出し、DNA MultiCycleプログラム(ベックマン・コールター、米国)で解析した。
【００２４】
　3.MCF7細胞でのFasL発現の誘発およびFasL発現のフリーサイトメトリ分析
　6穴平底プレートにおいて、10%の加熱不活化ウシ胎児血清を補給したRPMI1640培地で1×10６/mlの細胞のアリコートを一晩培養した。次いで、成長培地にEA植物抽出物(1mg/ml)または0.4%DMSOを加え、5、8、または16時間培養した。処理後、0.5ml/ウェルのトリプシン/EDTAを使用して細胞を収集し、pH7.2のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2度洗浄した。
【００２５】
　各PBSの最終体積を100μlとした細胞5×10５個のアリコートを、マウス抗ヒトFasL IgG1であるクローンNOK-1(Pharmingen、米国)1μgと共に20℃で30分間インキュベートし、1度洗浄し、100μlのPBS中に再懸濁させた。マウスIgG1であるクローンMOPC-21(Pharmingen、米国)をアイソタイプ対照として使用した。二次的な染色については、暗所において、細胞を、FITC結合ラット抗マウスIgGであるクローンLO-MG1-15(Biosource、米カリフォルニア)1μgと共に20℃で30分間インキュベートし、PBSで2度洗浄してから、ExpoXL4Cytometerソフトウェアを使用して、CoulterEPICS XLフローサイトメーター(ベックマン・コールター、米国)による分析にかけた。
【００２６】
　4.ウエスタンブロット分析
　試験細胞(2×10６個)をPBSで1度洗浄し、氷上で、100μLの溶解緩衝液(pH7.0、20mMのPIPES、10mMのNaCl、1mMのEDTA、0.1%のCHAPS、10%のスクロース、10mMのDTT、5mMのHEPES、0.05%(v/v)のTritonX-100、1mMのMgCl２、2.5mMのEGTA、および0.438%(w/v)のβ-グリセロールリン酸)および2μLのプロテアーゼ阻害剤反応混液セットIII(Calbiochem Co.、米国)中に20分間かけて溶解させ、5分間毎にボルテックス混合した。PIPES、CHAPS、およびHEPESの化学薬品は、Sigma Chemical Co.(米ミズーリ州)から購入した。遠心分離にかけた後、ウシ血清アルブミンを標準として使用して、Bradford(1976年)が記載しているとおりに上清中のタンパク質濃縮物の決定を行った。5〜20%の勾配の小型SDSポリアクリルアミドゲル(Laemmli、1970)上で40μgのタンパク質のアリコートを分離し、次いでPVDF膜(Millipore)上に移した。PVDFフィルターの非特異的結合をTBS緩衝液(10mMのTris、pH7.5、および100mMのNaCl)中の3%の無脂肪乾燥乳でブロックし、4℃のブロッキング溶液中で、攪拌しながら、終夜特異的な一次抗体を探索した。ウサギ抗アクチン(Oncogene Research Products)、マウス抗PARP(Related Products)、マウス抗チトクロムc(Pharmingen)、ウサギ抗NF-κB(Oncogene Research Products)、マウス抗ポルカスパーゼ(porcaspase)2、7、および9、ならびに抗ポルカスパーゼ8(BD Research Products)を一次抗体として使用した。TBST緩衝液(TBS緩衝液中Tween 20　0.1%)で洗浄した後、ブロッティング膜を、室温においてアルカリホスファターゼ結合二次抗体で3時間かけて処理した。反応したタンパク質バンドを比色法または強化化学発光系(ECL、Amersham Pharmacia Biotech Co.、英国)によって可視化して、Kodak BiomaxMSフィルム(Eastman Kodak Company、米国)での画像解析に備えた。
【００２７】
　5.C57BL/6JマウスにおけるB16腫瘍成長の抑制
　使用した動物腫瘍系は、マウスB-16黒色腫細胞を有する、しばしばC57もしくはB6マウス系とも呼ばれるマウス系統C57BL/6Jであった。Anoectochilus formosanus植物抽出物が腫瘍成長にもたらすと考えられるin vivo効果は、2〜3カ月齢の試験マウスに接種し、そこで成長させた中程度の腫瘍細胞負荷のB16黒色腫細胞を使用して、in vivoで評価した。
【００２８】
　試験グループ毎7匹の5グループのマウスを使用した。0日目に、50μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に懸濁させた合計1×10５個のB-16腫瘍細胞を各マウスの右腹部皮膚組織に(皮内)移植した。抗腫瘍効果を試験するために、3組のマウスを、試験植物抽出物の腹腔内(i.p.)もしくは腫瘍内(i.t.)注射、または強制投与(f.f.)方式によって、AH-sup処置について試験した。具体的には、2日目以降、グループ1の試験マウスには、PBSのみをi.p.注射によって与え(対照1)、グループ2のマウスは、同時の強制投与およびi.p.注射によってPBSのみで処置した(対照2)。グループ3、4、および5のマウスは、それぞれi.t.注射、i.p.注射、および経口強制投与によってAH-sup溶液で処置した。
【００２９】
　各試験マウスに与える注射投与量は、1日あたり100μlのPBS中1mgのAH-supとし、強制投与マウスには、1日あたり200μl中2mgを経口的に与えた。腫瘍細胞接種後、7日間連続で両方の試験グループに処置を施した。8日目から初めて、21日目までマウスを2日毎に処置することによって、処置頻度をよりゆっくりとしたペースに変更した。強制投与では、マウスで試験したハーブの投与量を比較すると、50kgのヒトが、約30gの乾燥A.formosanus植物からできた即席ハーブティー粉末2人分(ティーバッグ2袋)を飲用する摂取または取込みと同等である。
【００３０】
　6.代謝産物のプロファイリング、ならびにAnoectochilus formosanusのAH-supおよびEA画分の指標もしくは組成化合物分析
　Waters600制御装置、Waters Delta600ポンプ、および2487Duelλ吸光度検出装置を装備したWaters HPLC systemを使用して、分析用高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分析を行った。AH-sup画分の分析には、メタノール-水(90:10、v/v)(A)およびメタノール(B)の2種の溶媒系を用い、5μmのC-18カラム(250×10nm、メルク、ドイツ)を使用した。溶離条件は、以下のとおり、すなわち、0〜5分間、80%A対B(無勾配);5〜30分間、80〜0%A対B(直線勾配);30〜60分間、100%B(無勾配)で実施した。検出装置の波長は、254nmに設定した。EA活性画分については、n-ヘキサン(A)および酢酸エチル(B)の2種の溶媒系を用い、5μmのSi-60カラム(250×10nm、メルク、ドイツ)を使用した。溶離の勾配プロフィールは、以下のとおり、すなわち、0〜5分間、70%A対B(無勾配);5〜15分間、70〜30%A対B(直線勾配);15〜20分間、30%A対B(無勾配);20〜30分間、30%〜0%A対Bで行い、流速は5ml/分とし、検出装置の波長は280nmに設定した。次いで、AH-sup画分の化合物1〜8、およびEA画分の化合物1〜6の構造を、様々な分光分析を利用して解明した。試験化合物のUVスペクトルは、JascoV-550分光計で記録し、IRスペクトルは、Bio-Rad FTS-40分光光度計から得た。電子衝撃質量分析(ELMS)および高分解能電子衝撃質量分析(HREIMS)のデータは、FinniganMAT-958質量分析計で収集し、NMRスペクトルは、Bruker Avance製500および300MHz用ET-NMR分光計を用い、500MHz(１H)および75MHz(１３C)で記録した。
【００３１】
　EA画分中の指標化合物含有量の数量化は、EA画分の既知の濃度を利用するHPLC分析によって行った。EA画分のHPLCプロフィール(代謝産物プロフィール)の中の指標化合物に対応する個々のピーク面積は、観察した最大吸光度をOD２８０として決定した。化合物の0.05〜1mg/mlの範囲の標準検量線(ピーク面積対濃度)は、良好な直線性およびR２値(>0.98)を示した。EA画分の既知の濃度を使用するHPLC分析によって、EA画分中の指標化合物含有量を数量化し、次いで特定の化合物のピーク面積を決定し、標準検量線に基づいて、抽出物中のその含有量を調べた。
【００３２】
　7.A.formosanus植物抽出物の調製および分別
　信頼できるAnoectochilus Cultural Stationから新鮮なA.formosanus植物を購入し、花の特有の形態学的および解剖学的特徴によってその植物の同一性および確実性を確認した(Lin et al.、1978)。
【００３３】
　葉、茎、および根の組織を含むA.formosanusの新鮮(1000g)もしくは乾燥(100g)全植物を、モーターおよび内筒で粉砕することによってホモジナイズし、3容の蒸留水でゆっくりかつ間断なく1時間煮沸(約100℃)加工することによって抽出を行った。次いで上述の抽出手順を1度繰り返した。この2回の抽出から得られた上清を、25℃で20分間、24,000×gでの遠心分離にかけて収集し、次いで凍結乾燥装置(LABCONCO、米国)を使用して、凍結乾燥して乾燥させた。この調製によって全AF-Hot粗抽出物(乾燥重量で約49g)が得られた。このAF-Hot抽出物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解させ、標的腫瘍細胞における抗細胞増殖活性に利用した。A.formosanusのAF-Hotの更なる分別には、図1に記載し、上で論じたような規定された「生理活性誘導式分別戦略およびプロトコル」を採用した。
【００３４】
　段階的なエタノール分別手順を使用して、AF-Hot粗抽出物から種々の亜画分を得た。AH-I、II、およびIII画分は、AF-Hotサンプルに由来する、エタノールによって沈殿した材料であり、それぞれ50%、75%、および87.5%(v/v)のエタノールで逐次有機的に抽出したものとし、AH-supは、87.5%のエタノールで処理した、AF-Hotサンプルの残りの可溶性形態/画分とした。要約すると、AF-Hot粗抽出物に等しい体積の無水エタノールを攪拌しながらゆっくりと加え、室温で30分間静置した。4℃で20分間、24,000×gで遠心分離することによって、ペレットからAH-I画分(乾燥重量で約17.6%)を収集し、次いで、AH-I画分の調製で記載したのと同じ手順を利用することによって、上清にさらに無水エタノールを加えて、最終エタノール濃度を75%(v/v)とした。この段階において、AH-II画分(乾燥重量で最初の植物材料の約4.4%)が得られた。87.5%(v/v)のエタノールの沈殿物および可溶性画分からそれぞれ、AH-III(乾燥重量で約1.7%)およびAH-sup(乾燥重量で約23%)画分が得られた。次いで、AH-sup(19.3g)のさらなる分別手順では、酢酸エチル(EA)、次いでブタノール(BuOH)を使用する、異なる溶媒による分配にかけると、それぞれEA(約1.2g)、BuOH(約3.4g)、および水(14.4g)亜画分が得られた(図1)。有機溶媒によるこれらの分別段階では、等しい体積(1:1)の酢酸エチルとAF-supを激しく混合し、分離するまで室温で静置させ、透明な有機EA層および水相を得た。次いでEA画分を収集し、水層を再度酢酸エチルでの抽出にかけた。2種のEA画分をプールし、回転式蒸発装置(rotavaper)を使用する蒸発にかけて乾燥させた。次いで、酢酸エチルでの抽出を行ったのと同じ手順を使用して、水層をさらにブタノールでの抽出にかけて、BuOHおよび水の亜画分を得た。こうして得たAF-Hot、AH-I、AH-II、AH-III、およびAH-sup画分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解させ、EA、BuOH、および水画分はジメチルスルホキシド(DMSO)溶媒に溶解させて、以下の実験でのその後の使用に備えた。
【００３５】
　細胞毒性分析
　抗腫瘍細胞活性の評価には、MTT(テトラゾリウム)アッセイ(Mosmamn、1983)、すなわち生細胞ミトコンドリア中の種々の脱水素酵素活性を測定するための比色分析、および生細胞中のDNA合成を測定するための３H-チミジン取込みアッセイを利用した。同じまたは平行する試験において3種の典型的な腫瘍細胞系、すなわちヒト乳腺腫瘍(MCF-7)、マウス黒色腫(B16)、およびヒト肝細胞腫(HepG2)を使用した。
【００３６】
　図2は、試験腫瘍細胞培養物の成長培地中にウシ胎児血清が存在する場合、または存在しない場合において、AF-HotがMCF-7、HepG2、およびB16腫瘍細胞にもたらす細胞毒性効果を示している。全植物抽出物のAF-Hotについては、培地にウシ胎児血清が補充されているか否かにかかわらず、非常に類似したレベルの抗腫瘍細胞効果が観察された。このことは、ウシ胎児血清の成分と試験植物抽出物の間に働くかもしれない干渉が、A.formosanusの植物抽出物によって付与されるものに限り、明らかに抗腫瘍細胞増殖活性において役割をもたないことを実証するものであり、有用かつ重要な基礎情報である。試験腫瘍細胞に類似または比較できるような細胞毒性効果を付与するために、2種の異なる組の出発植物材料から調製した全粗抽出物(AH-Hot)を観察した(データ非表示)。MTTアッセイでは、AF-Hot全植物抽出物から得たAH-I、AH-II、およびAH-III画分によって個々にもたらされたものと比べて、AH-supサンプルが示した、MCF-7、B16、およびHepG2細胞への細胞毒性または抗増殖効果が最も有意であった。1.5mg/mlの用量のAH-supで48時間処理した場合、MCF-7、HepG2、およびB16腫瘍細胞については、45〜55%未満の試験細胞が生存可能であると検出された。これに対して、3種の腫瘍細胞系すべてを同じ用量のAH-I、AH-II、またはAH-III画分で処理した場合、80%を超える生存腫瘍細胞が観察された。試験腫瘍細胞を３Hチミジン取込みアッセイによって評価しても、AF-HotおよびAH-supの細胞毒性効果が同様な傾向で観察された。MTTアッセイを使用して、全粗抽出物(AH-Hot)、AH-sup、EA、BuOH、および水画分が細胞毒性(または抗腫瘍細胞活性)に及ぼす相対的効果をさらに特徴付け、比較した。
【００３７】
　図3に示すように、EA画分が、A.formosanus抽出物のAF-Hotまたは他の有機亜画分と比較して、試験した細胞系すべてに最も高いレベルの細胞毒性効果をもたらした。表1は、MCF-7、M16、およびHepG2細胞について、4種の異なる生物有機化学的亜画分(AH-sup、EA、BuOH、および水)の、細胞増殖を50%阻害する有効用量(ED５０)をまとめて示すものである。MCF-7ヒト乳腺癌細胞についてのEA画分のED５０は、0.08mg/mlで検出されたが、これは、AH-sup亜画分について得られたものの10分の1である。
【００３８】
【表１】
2004035568.tif 000002
【００３９】
　試験腫瘍細胞の形態および培養物挙動の光学および蛍光顕微鏡分析
　光学顕微鏡分析によって、A.formosanusの植物抽出物で処理した後、培養物中のMCF-7細胞の形態が有意に変化したことが示された。1mg/mlの用量では、AH-supおよびAF-Hotでの処置に比べて、EA画分がMCF-7細胞の形態学的変化に最も有意な影響を及ぼすことが示された(図4)。HepG2およびB16腫瘍細胞についても、同様の結果が観察された(データ非表示)。これらの観察は、表Iで示した、これら抽出物画分について観察されたED５０値と十分に整合性がある。処置したMCF-7細胞がアポトーシスへと進行しているかをさらに確認するために、Annexin V-GFPおよびヨウ化プロピジウム染色を使用して、蛍光顕微鏡分析を行った。図5は、EA画分で1時間処理した後のMCF-7細胞において、原形質膜ホスファチジルセリンの早期の再分布が容易に検出されたことを示している。この結果は、EA画分によって、MCF-7細胞にアポトーシスが有効に誘発されることを示すものである。
【００４０】
　フローサイトメトリー分析
　図6は、EA画分での処置によるMCF-7細胞のDNA含有量および細胞周期挙動の変化をフローサイトメトリーによってプロファイリングしたものを時間に応じて示している。EA画分(0.25〜1mg/ml)で48時間処理した後のMCF-7細胞では、(sub-G1ピークから決定した)アポトーシスDNAレベルの約48%のレベルが得られ、このアポトーシスDNAレベルは、処置後72時間で71%に増大した。同じ実験条件下において、MCF-7細胞と同様のDNAプロフィールがHepG2細胞で検出され、B16細胞では、処置後48時間ですでに約72%のアポトーシスDNAレベルが検出されていた。A.formosanusのAH-sup画分(6mg/ml)も、MCF-7およびB16細胞のDNA含有量および細胞周期挙動に同様の影響を及ぼした(データ非表示)。これらの結果は、A.formosanusが試験腫瘍細胞にもたらす細胞毒性効果がプログラム細胞死またはアポトーシスを媒介としている見込みを示すものである(Williams、1991)。
【００４１】
　EA抽出物は、MCF-7細胞でのFasLの発現を誘発する
　Fasリガンド(FasL)が発現すると、これが同属の受容体Fasに結合することによってアポトーシスが媒介されることは知られている(Naujokat et al.、1999)。この研究では、フルオロフォア(FITC)と結合させた特定の抗ヒトFasL IgG1を使用するフローサイトメトリー分析を利用して、A.formosanusのEA抽出物によって誘発された、観察されたMCF-7のアポトーシスが、FasLの発現によって引き起こされたのであるかを評価した。図7に示すように、培養中に腫瘍細胞をEA画分で5時間〜16時間処理すると、FasLタンパク質の発現が、未処置の対照MCF-7細胞の10%から76%へと劇的に増大した(図7AおよびB)。
【００４２】
　ウエスタンブロット分析
　タキソールおよびエトポシドを含む、抗腫瘍活性を示すいくつかの単一化合物薬は、ミトコンドリアの損傷および内容物の放出を引き起こし、その結果、細胞質ゾルにチトクロムcが蓄積することが実証されている(Fang et al.、1998)。我々は、ミトコンドリアからの試験腫瘍細胞細胞質ゾルへのチトクロムcの放出に、A.formosanus植物抽出物がもたらし得る効果を評価した。図8は、MCF-7細胞における細胞質ゾルのチトクロムcレベルが、A.formosanus植物抽出物のEA(またはAH-sup)画分で処理した場合に有意に増加したことを示している。カスパーゼプロテアーゼは、決定的な細胞タンパク質をアスパラギン酸残基の後ろで特異的かつ単独に切断することによってアポトーシスのシグナル伝達およびその遂行を促進することが示されている(Wolf and Green、1999)。カスパーゼは、潜在性のチモーゲンとして存在するが、アポトーシスシグナルによって一度活性化すると、このプロカスパーゼがタンパク質分解によって切断され、作用し始める。次に、活性化したアポトーシス発動因子(カスパーゼ8および9)によって実行カスパーゼ(カスパーゼ3、6、および7)が活性化される。我々の研究では、プロカスパーゼ8(約55kDa)が、EA抽出物で処理後約16時間以内に、MCF-7細胞中でタンパク質分解によって切断されていたことが判明している(図8A)。カスパーゼ7前駆体タンパク質については、EA抽出物によって、処理後24〜32時間で、カスパーゼ7のタンパク質分解によるプロセシングが誘発されたことが検出された。初期の活性化カスケードに関与することが知られているカスパーゼ9も、EAで処理したMCF-7細胞において活性化された。MCF-7細胞をEA抽出物で処理しても、28kDaが蓄積され、それに伴って116kDaの全長分子が消失しており、アポトーシスの別の特徴であるポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)がタンパク質分解によって時間依存的に切断されていた(図8B)。in vitroのHeLa細胞、すなわち子宮頚癌細胞形において、NF-κBの活性化がTNF-α誘発性アポトーシスに対する保護になり得ることが、これまでに報告されている(Bursch et al.、1992)。NF-κBのRelAサブユニット(p65)は、アポトーシスの抑制に直接に関与していることが知られている(Liu et al.、1996)。この研究では、EAでの処理後、MCF-7細胞中のRelAタンパク質レベルの抑制について効果が検出された(図8A)。マウスB16黒色腫におけるRelAサブユニットの発現は、A.formosanusのAH-sup(6mg/ml)またはEA画分(0.25〜1.0mg/ml)で処理した時間に応じて、有意に抑制された(データ非表示)。B16黒色腫細胞では、AH-supによる処理の時間に応じたカスパーゼ3活性の変遷、すなわち4時間から24時間へと増大し、次いで24時間から48時間へと減少したことが観察された(データ非表示)。これらの結果は、一般の不特定の化学的毒性化(toxification)または死滅を除き、観察された標的腫瘍細胞系の死滅に、特定のアポトーシス機構が関与していることを示唆するものである。我々は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット分析、およびカスパーゼ活性アッセイに基づき、A.formosanusの植物抽出物によって引き起こされた、MCF-7腫瘍細胞におけるアポトーシスの考えられる機構を提示した(図11)。
【００４３】
　C57BL/6Jマウスモデルにおけるin vivoでのB16腫瘍成長の抑制
　CS7BI/6Jマウス腫瘍モデルにおける、A.formosanus植物抽出物によるin vivoでの腫瘍成長の抑制または延引も、本発明の別の態様として実証した。この研究では、腫瘍内注射(グループ3)、腹腔内注射(グループ4)、および経口的強制投与(グループ5)を含む、一般に使用されている薬物投与方法を平行して実行した。図9は、実験結果をまとめて示すものである。in vivo腫瘍成長の初期段階(処置後6〜10日の間)で認められるように、3例すべてにおいて、AH-sup画分で処置した試験マウスは、腫瘍成長が有意に遅れた(図9)。腫瘍細胞移植後8と16日の間に腫瘍成長の最も強い抑制効果が観察された。17日目では、腫瘍内注射、腹腔内注射、および強制投与群を含む、この実験の試験グループはどれも、1グループにつき4〜7匹の群の測定腫瘍サイズが直径12mmのままであった。対照的に、AH-supで処理していない対照1および対照2のグループでは、腫瘍サイズが12mm未満であったのが、それぞれ3および2匹のマウスだけであり、対照2グループの3匹のマウスは、腫瘍が多すぎたために死亡した(図9)。21日では、両方の対象グループの生存マウスすべてが、腫瘍直径が15mmになる決定的な極限サイズを有効に超える、すなわちAnimal Room取締り規則に従う試験マウスであるとして犠牲にすることを法的に主張できる腫瘍成長を伴っていた。対照的に、処置後21日の同じ実験段階において、まだ腫瘍のあるままであるグループ3の4匹、グループ4の2匹、およびグループ5の1匹のマウスは、その腫瘍サイズが直径15mmより小さいままであった(データ非表示)。これらの結果は、試験を行った、草本抽出物を送達する3種の投与方法がどれも、かなりのレベルの抗腫瘍効果をもたらすことを示唆しており、A.formosanusのAH-sup画分を腹腔内注射したグループ3のマウスから最も顕著な結果が得られた。具体的には、試験マウスにA.formosanusの植物抽出物を腫瘍内投与した場合、その動物の腫瘍成長の抑制が70%を上回っていた。これらの実験の結果は、本発明の実験条件下、部分的に精製したA.formosanus植物抽出物を投与することによって、C57BL/6JマウスにおけるB16黒色腫のin vivoでの成長が有効かつ容易に抑制できることを示唆するものである。
【００４４】
　化学的フィンガープリント分析および指標化合物の特定および数量化
　Waters600制御装置、Waters Delta600ポンプ、および2487Duelλ吸光度検出装置を装備したWaters HPLCシステムを使用して、分析用高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による分析を行った。Anoectochilus formosanusからのAH-sup植物抽出物の3件のクロマトグラムは、C-18逆相HPLC系から得た。指標化合物は、ここでは、比較的粗製である植物抽出質もしくは植物化学物質の混合物の化学組成および/または特性が規定されたものを表すものとする。AH-supの場合では、8候補の指標化合物、すなわち、化合物1:ニコチン酸アミド、2:アデノシン、2:シトシン、4:イソラムネチン3,4'-O-β-D-ジグルコピラノシド、5:イソラムネチン3-O-β-D-グルコピラノシド、6:カフェイン酸、7:(6R,9S)-ヒドロキシ-メガスチマ-4,7-ジエン-3-オン-9-O-β-D-グルコピラノシド、および8:キンセノン(Kinsenone)が、IR、質量、およびNMRによる分光測定分析を利用して特定されている(図10A)。
【００４５】
　MSおよびNMR分析の結果に従い、文献(Wang et al、2002;Ali et al.、1997)の分光データと比較することによって、A.formosanusのEAから単離された6種の化合物が、長鎖脂肪酸(1、保持時間(RT)=6.0分)、α-アミリンtrans-p-ヒドロキシシンナマート(2、RT=8.9分)、α-アミリンcis-p-ヒドロキシシンナマート(3、RT=9.7分)、イソラムネチン(4、RT=13.5分)、キンセノン(5、RT=14.6分)、p-ヒドロキシベンジルアルコール(6、RT=18.0分)であると特定した(図10B)。
【００４６】
　AH-sup画分中の候補指標化合物2(アデノシン)および5(イソラムネチン3-O-β-D-グルコピラノシド)とEA画分中の候補指標化合物2(α-アミリンtrans-p-ヒドロキシシンナマート)および4(イソラムネチン)の含有量の定量では、分析用HPLCによる特徴付けを行った。AH-supおよびEA画分のHPLCプロフィールにおいて、候補指標化合物の最大UV吸光度のピーク面積を個別にモニタし、決定した。α-アミリンtrans-p-ヒドロキシシンナマートおよびイソラムネチン標準物質の、0.05〜1mg/mlの範囲の検量線(ピーク面積対濃度)が良好な直線性およびR２値(>0.98)を示した(データ非表示)。HPLC分析に使用した特定画分の既知の濃度を基にしてAH-supおよびEA画分中の候補指標化合物の数量化を行うと、算出された候補化合物の総ピーク面積が、我々のHPLCプロファイリング分析によって示された化合物とよく一致していた。A.formosanusのAH-sup画分は、1グラムあたりそれぞれ0.72mg(0.072%)および3.4mg(0.34%)のアデノシンおよびイソラムネチン3-O-β-D-グルコピラノシドを含有する。A.formosanusのEA抽出物は、抽出物1グラム中にそれぞれ4.9mg(0.49%)および52.3mg(5.23%)のα-アミリンtrans-p-ヒドロキシシンナマートおよびイソラムネチンを含有することが判明した。
【００４７】
　アデノシンおよびイソラムネチン3-O-β-D-グルコピラノシド、α-アミリンtrans-p-ヒドロキシシンナマート、およびイソラムネチンの分光データを以下にまとめて示す。
　アデノシン
　無色の針状結晶、mp234〜235℃、C１０H１３N５O４に対するEIMS実測値274.2、
【００４８】
【数１】
2004035568.tif 000003
【００４９】
　イソラムネチン3-O-β-D-グルコピラノシド
　黄色非結晶、mp162℃、C２１H２０O１２に対するEIMS実測値464.38、
【００５０】
【数２】
2004035568.tif 000004
【００５１】
　α-アミリンtrans-p-ヒドロキシシンナマート:
　白色固体、mp105〜106℃、C２９H５６O３に対するEIMS実測値572.43、
【００５２】
【数３】
2004035568.tif 000005
【００５３】
　イソラムネチン:
　黄色非結晶、C１６H１２O７に対するEIMS実測値312.6、
【００５４】
【数４】
2004035568.tif 000006
【００５５】
「参考文献」
2004035568.tif 000007
2004035568.tif 000008
2004035568.tif 000009
2004035568.tif 000010
【００５６】
　用いた用語および表現は、限定するものでなく、記述する用語として使用するものであり、このような用語および表現を使用する際に表示および記載された特徴またはその部分の任意の等価物が除外されるものではなく、本発明の範囲内で様々な変更が可能であるとみなされる。ここで言及した参照文献の全体を参照により組み込む。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】A.formosanusの全および分別植物抽出物を調製するための抽出プロトコルを示す図である。　このプロトコルは、原則として、A.formosanus(AF)の有効な抽出および分別手順の流れ図に従って抗腫瘍関連生理活性実験系を実施する「生理活性誘導式分別戦略」に準じた。
【図２】ウシ胎児血清含有または非含有成長培地において、A.formosanusのAF-Hot抽出物が、MCF-7ヒト乳腺癌、HepG2ヒト肝細胞腫、およびマウスB16黒色腫細胞系にもたらした抗腫瘍細胞増殖効果を示すグラフである。　MTTアッセイを利用して、ウシ胎児血清の存在下、またはこれなしで、表示した様々な用量の粗抽出物(AF-Hot)で試験細胞を処理後48時間目に細胞生存度を測定した。各データの点は、少なくとも3件の試験サンプルの平均から得た。
【図３】A.formosanusの全植物抽出物および生物有機化学的に分別した抽出物が、MCF-7乳腺、HepG2肝細胞腫、およびB16黒色腫細胞系にもたらした抗細胞増殖効果を示すグラフである。　MTTアッセイを利用して、様々な用量の粗抽出物(AF-Hot)およびそれに由来する画分(それぞれ、AH-sup、EA、BuOH、および水画分)で試験細胞を処理後48時間目に、細胞生存度を測定した。各データの点は、少なくとも3件のサンプルの平均から得た。
【図４】未処理のMCF-7細胞(A)、A.formosanusの全粗抽出物(AF-Hot)(B)、AH-sup画分(C)、およびEA画分(D)で処理したMCF-7細胞の細胞形態の光学顕微鏡分析を示す図である。　リン酸緩衝生理食塩水を添加(A、対照)し、または表示したA.formosanus植物抽出物1mg/mlで処理したRPMI1640培地において、MCF-7細胞を48時間インキュベートした。それぞれの顕微鏡写真は、拡大率200倍のオリンパスCK40顕微鏡を据え付けたオリンパスPM-30カメラで撮影した。
【図５】Annexin-Vおよびヨウ化プロピジウム(PI)で染色した、正常またはアポトーシスMCF-7細胞の細胞レベルでの顕微鏡分析を示す図である。　MCF-7細胞をEA画分(1mg/ml)で4時間かけて処理し、次いでPIおよびAnnexin-V(A)またはAnnexin-Vのみ(B)で染色した。CおよびDは、溶媒(0.4%のDMSO)で処理し、PIおよびAnnexin-Vで染色した対照細胞とした。A、B、およびDは、B-2Aフィルター(Ex450〜490)を使用して、拡大率200倍のニコンECLIPSE E800顕微鏡を据え付けたオリンパスPM-30カメラで撮影した蛍光顕微鏡写真とし、Cは、Dの明視野の写真とした。
【図６】正常およびアポトーシスMCF-7細胞におけるDNA含有量のフローサイトメトリー分析を処理時間に応じて示すグラフである。　MCF-7細胞を、0.4%のDMSO(溶媒)または1mg/mlのA.formosanusのEA画分を添加したRPMI1640培地でインキュベートし、次いで表示した時間に収集した。M1は、アポトーシスのピーク、および画像解析装置によって出されたアポトーシス細胞の百分率を意味する。
【図７】MCF7細胞の細胞表面でのFasL活性の発現を誘発することについて、A.formosanusのEA画分がもたらす効果を示すグラフである。MCF7細胞に、1mg/mlのEA抽出物または0.4%のDMSO溶液(溶媒対照)をそれぞれ5、8、または16時間作用させた。　FasLの発現は、マウス抗ヒトFasL IgGであるクローンNOK-1もしくはアイソタイプ対照のマウスIgGであるMOPC-21、および二次的な染色用のFITC結合ラット抗マウスIgGを使用して、フローサイトメトリー分析によって決定した。Expo XL4 Cytometerソフトウェアを使用して、CoulterEPICS XLフローサイトメーター(ベックマン・コールター、米国)によって結果を解析した。
【図８Ａ】未処理(対照)、またはA.formosanusのEA画分で処理したMCF-7細胞における、カスパーゼ7、8、および9、チトクロムc、NF-κB、アクチンのタンパク質発現プロフィールを示すグラフまたは図である。　植物抽出物で処理した、または未処理のMCF-7腫瘍細胞タンパク質40μgを含有する、比較できる細胞可溶化液のアリコートを、5〜20%SDS勾配ゲル電気泳動にかけた。SDSゲル中のタンパク質をPVDF膜に電気トランスブロットした後、特定のタンパク質バンドを試験一次抗体と反応させ、次いで室温で1時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体で処理した。反応したタンパク質バンドを比色法によって可視化した。
【図８Ｂ】未処理(対照)、またはA.formosanusのEA画分で処理したMCF-7細胞における、ポリADP-リボース-ポリメラーゼ(PARP)のタンパク質発現プロフィールを示すグラフまたは図である。　植物抽出物で処理した、または未処理のMCF-7腫瘍細胞タンパク質40μgを含有する、比較できる細胞可溶化液のアリコートを、5〜20%SDS勾配ゲル電気泳動にかけた。SDSゲル中のタンパク質をPVDF膜に電気トランスブロットした後、特定のタンパク質バンドを試験一次抗体と反応させ、次いで室温で1時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体で処理した。反応したタンパク質バンドを比色法によって可視化した。
【図９】CS7BL/6JマウスモデルにおけるA.formosanusの植物抽出物(AH-sup)によるin vivoでのB16黒色腫の腫瘍成長の抑制を示すグラフである。　この実験には、腹腔内(i.p.)、腫瘍内(i.t.)、および経口強制投与を含む、植物抽出物を試験マウスに投与する様々な方法を利用した。リン酸緩衝液のみをi.p.注射によって(対照1)、または同時の強制投与およびi.p.注射によって(対照2)投与したマウスを対照として使用した。各実験に1グループ毎7匹のマウスを使用した。
【図１０Ａ】A.formosanusのAH-supの化学的フィンガープリントおよび候補指標化合物を示す図である。　パネルA:Anoectochilus formosanus植物から得たAH-sup画分の3種の異なる調製物の代謝産物プロファイリングを示す図である。3例のクロマトグラムは、C-18逆相HPLC系から得たものであり、植物化合物混合物の組成プロファイリングのための指標化合物8種の構造および同一性は、IR、質量、およびNMRの分光測定分析を利用して確認した。化合物1:ニコチン酸アミド、2:アデノシン、3:シトシン、4:イソラムネチン3,4'-O-β-D-ジグルコピラノシド、5:イソラムネチン3-O-β-D-グルコピラノシド、6:カフェイン酸、7:(6R,9S)-ヒドロキシ-メガスチマ-4,7-ジエン-3-オン-9-O-β-D-グルコピラノシド、および8:キンセノン。
【図１０Ｂ】A.formosanusのEA画分の化学的フィンガープリントおよび候補指標化合物を示す図である。　パネルBは、Si-60HPLC系から得た、Anoectochilus formosanus植物抽出物由来のEA画分のクロマトグラムを表す図である。EA画分において指標または参照符として役立つ候補化合物は、1:長鎖脂肪酸、2:α-アミリンtrans-p-ヒドロキシシンナマート、3:α-アミリンcis-p-ヒドロキシシンナマート、4:イソラムネチン、5:キンセノン、6:p-ヒドロキシベンジルアルコールである。
【図１１Ａ】A.formosanusの植物抽出物によって誘発される、MCF7腫瘍およびヒト乳腺腫瘍細胞のアポトーシス情報伝達経路を提示する図である。
【図１１Ｂ】A.formosanusの植物抽出物によって誘発される、MCF7腫瘍およびヒト乳腺腫瘍細胞のアポトーシス情報伝達経路を提示する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【外国語明細書】
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