(57)【要約】【課題】デング熱ウイルスのヒト細胞への結合を阻害することのできる新規物質（変性エンドグリコシダーゼ）と、この物質を含有する抗デング熱ウイルス剤を提供する。【解決手段】エンドグリコシダーゼを熱およびドデシル硫酸ナトリウムで変性処理した物質であって、デング熱ウイルスのヒト細胞への結合を阻害することを特徴とする変性エンドグリコシダーゼ、この変性エンドグリコシダーゼを構成するアミノ酸配列の一部連続配列からなるペプチド、前記の変性エンドグリコシダーゼ、または請求項３のペプチド、もしくはそれらの塩を含有することを特徴とする抗デング熱ウイルス剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドグリコシダーゼを熱およびドデシル硫酸ナトリウムで変性処理した物質であって、デング熱ウイルスのヒト細胞への結合を阻害することを特徴とする変性エンドグリコシダーゼ。
【請求項２】
エンドグリコシダーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｉｃａｔｕｓ由来のエンドグリコシダーゼＨである請求項１の変性エンドグリコシダーゼ。
【請求項３】
請求項１または２の変性エンドグリコシダーゼを構成するアミノ酸配列の一部連続配列からなるペプチド。
【請求項４】
請求項１または２の変性エンドグリコシダーゼ、または請求項３のペプチド、もしくはそれらの塩を含有することを特徴とする抗デング熱ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、変性エンドグリコシダーゼと抗デング熱ウイルス剤に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、デング熱ウイルスに結合してその感染性を阻害することのできる変性エンドグリコシダーゼ、その一部アミノ酸配列からなるペプチド、並びにこれらを含有する抗デング熱ウイルス剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
デング熱（ｄｅｎｇｕｅ  ｆｅｖｅｒ）はデングウイルス（ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）の急性感染症で、その臨床的特徴から、予後良好な古典的デング熱（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｄｅｎｇｕｅ  ｆｅｖｅｒ：ＣＤＦ）、出血傾向を示すデング出血熱（ｄｅｎｇｕｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＤＨＦ）、最も重篤でショックを主徴とするデングショック症候群（ｄｅｎｇｕｅ  ｓｈｏｃｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＤＳＳ）に分類される（非特許文献１）。ＣＤＦは、３〜８日の潜伏期間のあと、４０℃前後の発熱、頭痛、腰背部痛、顔面紅潮、結膜充血などで突然発症し、全身の激しい関節痛と筋肉痛を呈する（非特許文献２）。やや遅れて、消化器症状やしばしば上気道炎症状も出現するが、自己限定的であり、自然経過で治療・回復する。ＤＨＦ／ＤＳＳもＣＤＦとほぼ同様に発症するが、２〜６日で出血傾向もしくはショック様症状が著明となり、虚脱感や全身衰弱が強く、状態は急速に悪化する（非特許文献３、４）。
【０００３】
デングウイルスは直径４０〜６０ｎｍでエンベロープをもち、約１１ｋｂのプラス極性の１本鎖ＲＮＡを有しており、ウイルス学的には黄熱ウイルスや日本脳炎ウイルスなどとともにフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）に属し、感染中和抗体の交叉性に基づいて１〜４型の４種の血清型に分類される（非特許文献５、６）。
【０００４】
デング熱は世界各地の熱帯地方に広く分布しており、感染力は極めて強く、流行時には人口の８０％が感染する。地球上の患者は２０００万人／年（ＷＨＯ）におよび、流行地域も患者数も年毎に拡大の一途をたどっている（非特許文献７）。またかつてはみられなかったＤＨＦ／ＤＳＳが近年各地で多発していることから、デング熱は再興感染症として位置付けられ、その対策は公衆衛生上極めて大きな問題となっている。
【０００５】
自然界のデングウイルスのベクターはシマカ類の蚊であり、中でも熱帯地方に幅広く生息するネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ｓｅｇｙｐｔｉ）が主要な媒介蚊となっている（非特許文献８）。都市部では、ウイルス保有蚊の刺咬によってヒトが感染し、逆にウイルス血症を呈している患者を、刺咬して蚊がウイルスを獲得するという、蚊−ヒト−蚊の生活環が成立しており、人口の疎らな森林地帯では蚊と、サル類によってサイクルが成立していると考えられている（特許文献９）。
【０００６】
デング出血熱は致死率４０％以上と高いにもかかわらず、感染における標的組織、感染初期過程の宿主・ウイルス相互作用に関する分子、遺伝子情報は極めて少ない。さらに、デング熱、デング出血熱に有効な薬は皆無であり、ワクチンも弱毒生ワクチンを始め、不活性化ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチン、ＤＮＡワクチンなどの開発が進められているが、有効性や、副反応の問題によりまだ実用化には達していないのが現実である（非特許文献１０）。また、この疾患はウイルス抗体により感染が助長される例が多く、抗原・抗体複合体、Ｆｃレセプターの関与なども考えられているが、詳細な機構は不明である。デング熱ウイルスの受容体研究の多くは、宿主固体、細胞レベルで行われているが、未だ分子、遺伝子レベルでは解明されていない。デング熱ウイルスのヒトにおける標的細胞は血球系に存在している（非特許文献１１）と予想されているが、受容体分子は未同定である。また、ウイルスに対する抗体Ｆｃ領域を介する血小板やマクロファージへの結合による二次感染の増強も知られている（非特許文献１２、１３）が、これも機構は未だ解明されていない。最近、デングウイルスの宿主細胞側のレセプターの一部としてヘバラン硫酸が初めて報告されたが（非特許文献１４）、この分子のみではデング熱ウイルスの宿主特異性を説明することができないことから、他のレセプター構成分子が存在しているものと予想されている。
【０００７】
一方、エンドグリコシダーゼ（ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）は、特定の糖鎖を切断する細菌由来の酵素であり、例えば、抗菌剤の成分としての利用が知られている（特許文献１、２）。しかしながら、このエンドグリコシダーゼやその変性物とデング熱ウイルスとの関係（結合特性）については、従来、全く知られていない。
【０００８】
【特許文献１】
特開平０３−１６９８０６号公報
【特許文献２】
特開平０３−２４４６９７号公報
【非特許文献１】
Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ，  Ｙ．：  Ｄｅｎｇｕｅ  ｆｅｖｅｒ：  ｉｔｓ  ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ．  Ｒｙｏｉｋｉｂｅｔｓｕ  Ｓｈｏｋｏｇｕｎ  Ｓｈｉｒｉｚｕ  ２３，  Ｐｔ  １：  １４５−１４９，  １９９９
【非特許文献２】
Ｓａｂｉｎ，  ＡＢ：  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  ｄｅｎｇｕｅ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗａｒ  ＩＩ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｔｒｏｐ．  Ｍｅｄ．  Ｈｙｇ．  １：  ３０−５０，  １９５２
【非特許文献３】
Ｃｏｈｅｎ，  ＳＮ  ａｎｄ  Ｈａｌｓｔｅａｄ，  ＳＢ：  Ｓｈｏｃｋ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｎｇｕｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｉ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒｉｎ  Ｔｈａｉｌａｎｄ，  １９６４．  Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒ．  ６８：  ４４８−４５６，  １９６６
【非特許文献４】
Ｎｉｍｍａｎｎｉｔｙａ，  Ｓ，  Ｈａｌｓｔｅａｄ，  ＳＢ，  Ｃｏｈｅｎ，  ＳＮ，  ａｎｄ  Ｍａｒｇｉｏｔｔａ，  ＭＲ：  Ｄｅｎｇｕｅａｎｄ  ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｎ  ｉｎ  Ｔｈａｉｌａｎｄ，  １９６２−１９６４．  Ｉ．  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｔｒｏｐ．  Ｍｅｄ．  Ｈｙｇ．  １８  ：  ９５４−９７１，  １９６９
【非特許文献５】
Ｗｅｓｔａｗａｙ，  ＥＧ，  Ｂｒｉｎｔｏｎ，  ＭＡ，  Ｇａｉｄａｍｏｖｉｃｈ，  ＳＹａ，  Ｈｏｒｚｉｎｅｋ，  ＭＣ，  Ｉｇａｒａｓｈｉ，  Ａ，  Ｋａａｒｉａｉｎｅｎ，  Ｌ，  Ｌｖｏｖ，  ＤＫ，  Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ，  ＪＳ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ＰＫ，  ａｎｄ  Ｔｒｅｎｔ，  ＤＷ：  Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ．  Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４：  １８３−１９２，  １９８５
【非特許文献６】
Ｃｈａｍｂｅｒｓ，  ＴＪ，  Ｈａｈｎ，  ＣＳ，  Ｇａｌｌｅｒ，  Ｒ，  ａｎｄ  Ｒｉｃｅ  ＣＭ：  Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４４：  ６４９−６８８，  １９９０
【非特許文献７】Ｒｉｇａｕ−Ｐｅｒｅｚ，  ＪＧ，  Ｃｌａｒｋ，  ＧＧ，  Ｇｕｂｌｅｒ，  ＤＪ，  Ｒｅｉｔｅｒ，  Ｐ，  Ｓａｎｄｅｒｓ，  ＥＪ，  ａｎｄ  Ｖｏｒｎｄａｍ，  ＡＶ：  Ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３５２：  ９７１−９７７，  １９９８
【非特許文献８】
Ｂａｎｃｒｏｆｔ，  ＴＬ：  Ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｆｅｖｅｒ．  Ａｕｓｔ．  Ｍｅｄ．  Ｇａｚ．  ２５：
１７−１８，  １９０６
【非特許文献９】
Ｇｕｂｌｅｒ，  ＤＪ：  Ｄｅｎｇｕｅ．  Ｉｎ：  Ｔｈｅ  Ａｒｂｏｖｉｒｕｓｅｓ：  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．  ２  （ｅｄ．  ｂｙ  Ｍｏｎａｔｈ，  ＴＰ），  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ｐｐ．  ２２３−２６０，  １９８８
【非特許文献１０】
Ｃｈａｍｂｅｒｓ，  ＴＪ，  Ｔｓａｉ，  ＴＦ，  Ｐｅｒｖｉｋｏｖ，  Ｙ，  ａｎｄ  Ｍｏｎａｔｈ  ＴＰ：  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｄ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  Ｗｏｒｌｄ  ＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｅｔｉｎｇ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：  １４９４−１５０２，  １９９７
【非特許文献１１】
Ｃｈｅｎ，  ＹＣ，  Ｗａｎｇ，  ＳＹ，  ａｎｄ  Ｋｉｎｇ，  ＣＣ：  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｖｉａ  ａ  ＣＤ１４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３：  ２６５０−２６５７，  １９９９
【非特許文献１２】
Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，  ＪＪ  ａｎｄ  Ｃｈａｐｍａｎ，  ＳＥ：  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＩｇＧ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦｃｇａｍｍａＲＩ  （ＣＤ６４）  ｏｎ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６０：  ８４−８８，  １９９９
【非特許文献１３】
Ｗａｎｇ，  Ｓ，  Ｈｅ，  Ｒ，  Ｐａｔａｒａｐｏｔｉｋｕｌ，  Ｊ，  Ｉｎｎｉｓ，  ＢＬ，  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｒ：  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ−２  ｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１３：  ２５４−２５７，  １９９５
【非特許文献１４】
Ｃｈｅｎ，  Ｙ，  Ｍａｇｕｉｒｅ，  Ｔ，  Ｈｉｌｅｍａｎ，  ＲＥ，  Ｆｒｏｍｍ，  ＪＲ，  Ｅｓｋｏ，  ＪＤ，  Ｌｉｎｈａｒｄｔ，  ＲＪ，  ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ，  ＲＭ：  Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８：  ８６６−８７１，  １９９７
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、デング熱ウイルス感染症に対する有効な治療薬は開発されていない。これは、デング熱ウイルスの標的細胞や標的受容体の構造が明らかにされておらず、宿主細胞内でのウイルス増殖サイクルに不明な点が多いためである。
【００１０】
この出願の発明者らは、デング熱ウイルスの受容体について検索および同定を行った結果、エンドグリコシダーゼＨの変性処理物中にデング熱ウイルスと強い結合性を有する物質を見出し、さらにこの物質がデング熱ウイルスのヒト細胞への感染を阻害することを見出した。
【００１１】
この発明は、発明者らによる以上のとおりの新規な知見に基づくものであり、デング熱ウイルスの感染阻害活性を有する新規な物質と、この物質を含有する抗デング熱ウイルス剤を提供することを課題としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この発明は、エンドグリコシダーゼを熱およびドデシル硫酸ナトリウムで変性処理した物質であって、デング熱ウイルスのヒト細胞への結合を阻害することを特徴とする変性エンドグリコシダーゼを提供する。
【００１３】
この変性エンドグリコシダーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｉｃａｔｕｓ由来のエンドグリコシダーゼＨを変性させたものであることを好ましい態様としている。
【００１４】
またこの発明は、前記の変性エンドグリコシダーゼを構成するアミノ酸配列の一部連続配列からなるペプチドを提供する。
【００１５】
またさらに、この発明は、前記の変性エンドグリコシダーゼ、またはペプチド、もしくはそれらの塩を含有することを特徴とする抗デング熱ウイルス剤を提供する。
【００１６】
なお、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｄ．  Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９９０、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５）等に記載されている。
【００１７】
以下、発明の実施形態を詳しく説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
この発明の変性エンドグリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼを加熱およびドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ：  ＳＤＳ）によって変性させたものである。
【００１９】
エンドグリコシダーゼは、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｌｙｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ：  Ｅｎｄｏ）、エンド−β−ガラクトシダーゼ（ｅｎｄｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ｅｎｄｏ−α−Ｎ−ａｘｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）等であり、それぞれ市販品を使用することができる。例えば、細菌由来のＥｎｄｏ  Ｈ、特にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｉｃａｔｕｓ由来のＥｎｄｏ  Ｈ（酵素番号：ＥＣ  ３．２．１．９６）はロッシュ社から商品名「ＥｎｄｏＨ」として販売されている。
【００２０】
エンドグリコシダーゼの変性処理は、適当な緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等）に０．１〜１０％、好ましくは０．５〜２％（Ｗ／Ｖ）程度のＳＤＳを加え、これにエンドグリコシダーゼを１０  ｍｇ／ｍｌ〜１０００  ｍｇ／ｍｌ程度混合して、１００℃で１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間程度、加熱することによって行うことができる。
【００２１】
この発明のペプチドは、前記の変性エンドグリコシダーゼを構成するアミノ酸配列の一部連続配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｉｃａｔｕｓ由来のＥｎｄｏ  Ｈ（ＥＣ  ３．２．１．９６）はその遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｋ０２１８２）およびアミノ酸配列が公知であり（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：  Ｐ５２０８１）、これらの配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術を利用した組換え体ペプチド合成法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５）あるいは公知の固相ペプチド合成法（例えばＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  Ｖｏｌｕｍｅｓ，  Ｇｉｌｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ）に基づいて作製することができる。
【００２２】
この発明のペプチドは、アミノ酸残基の個数として、２〜１０、１１〜２５、２６〜５０、５１〜８０、８１〜１５０等の範囲から適宜に選択することができる。
【００２３】
なお、この発明のペプチドは、アミド結合（ペプチド結合）によって直線的配列で互いに結合した２個以上のアミノ酸残基の直線的配列から構成された分子を意味する。あるいはまた、天然のアミド結合以外の残基連結からなるもの、あるいは天然アミノ酸残基の代わりの非天然残基からなるもの（以下、ペプチド模倣物と記載する）であってもよい。天然のアミド結合以外の残基連結は、例えばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、２官能マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の化学結合またはカップリング手段を例示することができる。また、ペプチド結合の代替となり得る連結基は、例えばケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−に対する−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、アミノメチレン（ＣＨ２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルを含む（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ  （１９８３）  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｖｏｌ．  ７，  ｐｐ  ２６７−３５７，  ”Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”  Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹを参照）。
【００２４】
一方、非天然のアミノ酸残基は、芳香族アミノ酸については、例えばＤ−またはＬ−ナフィルアラニン（ｎａｐｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−またはＬ−２チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−１，−２，３−または４−ピレネイルアラニン（ｐｙｒｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−３チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｋ−またはＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−２インドール（アルキル）アラニン；およびＤ−またはＬ−アルキルアラニン（ａｌｋｙｌａｌａｎｉｎｅ）であって、アルキルが置換されたかまたは未置換のメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソーブチル、２級−イソチル（ｉｓｏｔｙｌ）、イソーペンチル、または非酸性アミノ酸による置換によって生成することができる。非天然アミノ酸の芳香環は、例えば、チアゾイル、チオフェニル、ピラゾイル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、およびピリジル芳香環を含む。酸性アミノ酸の場合には、例えば負の電荷を維持している非カルボン酸塩アミノ酸；（ホスホノ）アラニン；硫酸化トレオニンによる置換によって生成することができる。カルボキシル側基（例えば、アスパルチルまたはグルタミル）もまた、例えば１−シクロヘキシル−３（２−モルフォリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメトールペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾することができる。アスパルチルまたはグルタミルもまた、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換可能である。塩基性アミノ酸としては、例えば（リシンおよびアルギニンに加えて）アミノ酸、オルニチン、シトルリン、または（グアニジノ）−酢酸、またはアルキルが前文に定義されている（グアニジノ）アルキル酢酸による置換によって生成することが可能である。ニトリル誘導体（例えば、ＣＯＯＨの代わりにＣＮ−部分を含んでいる）は、アスパラギンまたはグルタミン用に置換することが可能である。アスパラギニルおよびグルタミニル残基は、対応するアスパルチルまたはグルタミル残基に対して脱アミノ基を行うことが可能である。非天然のアルギニン残基は、アルギニルを、例えば１以上の、例えばフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンヂオン、またはニンヒドリンを含む試薬と、好ましくはアルカリ性の条件下に反応させることにより生成することができる。チロシン残基の場合は、チロシルを、例えば芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることにより生成することができる。Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンは、各々Ｏ−アセチルチロシル類および３−ニトロ誘導体を用いて形成することができる。非天然システイン残基は、システイニル残基を、２−クロロ酢酸などのα−ハロアセテート、またはクロロアセトアミドおよび相当するアミンと反応させ；カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じさせることにより生成することができる。非天然システイン残基はまた、システイニル残基を、例えばブロモートリフルオロ酢酸、α−ブロモ−β−（５−イミダゾイル）プロピオン酸；クロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド；メチル２−ピリジルスルフィド；ｐ−クロロメルクリ安息香酸；２−クロロメルクリ−４ニトロフェノール；または、クロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることにより生成することができる。非天然リジンは、リシニルを、例えば無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応させることにより生成する（またアミノ末端残基が変更される）ことができる。リジンおよび他のα−アミノ−含有残基模倣物はまた、メチルピコリンイミダート、ピリドキサールホスファート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンアスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４ペンタンジオンといったイミドエステルを用いた反応、およびトランスアミダーゼに触媒されるグリオキシラートを用いた反応により生成することができる。非天然メチオニンは、例えば、メチオニンスルホキシドを用いた反応により生成することができる。非天然プロリンは、例えばピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３−または４−ヒドロキシプロリン、デヒドロキシプロリン、３−または４−メチルプロリン、または３，３，−ジメチルプロリンを含む。非天然ヒスチジンは、ヒスチジルを、例えばジエチルプロカルボナートまたはパラーブロモフェナシルブロミドと反応させることにより生成することができる。他の非天然のアミノ酸残基は、例えば、プロリンおよびリジンの水酸化；セエリルまたはトレオニル残基の水酸基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのα−アミノ基のメチル化；Ｎ−末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化またはＮ−メチルアミノ酸による置換；またはＣ−末端のカルボキシル基のアミド化等を例示することができる。
【００２５】
この発明の抗デング熱ウイルス剤は、前記の変性エンドグリコシダーゼまたはそのペプチド、もしくはそれらの塩を有効成分として含有する。
【００２６】
塩は、例えば、製薬上許容される酸（無機酸または有機酸）付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息硝酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、トレエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等である。
【００２７】
この発明の薬剤は、実施的に前記の有効成分単独であってもよいが、疾患の程度や薬剤の投与形態に応じて、製薬上許容される担体と混合して調製することが好ましい。すなわち、この発明の薬剤は、非経口的または経口的な投与に適した剤型となるような担体と混合することができる。
【００２８】
非経口投与は、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈内注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注、直腸投与等であり、例えば注射剤としての製剤化する場合の担体としては、滅菌水、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物等を使用することができる。また緩衝剤ｐＨ調節剤（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤（塩化ナトリウム、グルコース等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、Ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル等））等の製薬補助剤を含有することもできる。このように製剤化した薬剤は、細菌保持フィルターを通す濾過、組成物への殺菌剤の混入、組成物の照射や加熱によって滅菌することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調製するようにしてもよい。
【００２９】
経口投与剤は胃腸器官による吸収に適した剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉末剤、または懸濁剤やシロップ剤のような経口液体調製物等）に製剤化する。担体としては、常用の製薬補助剤、例えば結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、賦形剤（ラクトース、シュガー、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビット、グリシン等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）を使用することができる。ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加することもできる。また錠剤は常法によりコーティングすることができる。経口液剤は水溶液またはドライプロダクトにすることができる。そのような経口液剤は常用の添加剤、例えば保存剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン酸等）を包含していてもよい。
【００３０】
有効成分の含有量は疾患の程度やその投与形態に応じて適宜とすることができるが、通常は５〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは１０〜６０％（ｗ／ｗ）の範囲とすることができる。
【００３１】
この発明の薬剤の投与量は、患者の年齢や体重、症状、投与経路等によって異なるが、有効成分量として１００〜１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ程度とすることができる。
【００３２】
以下、デング熱ウイルスの細胞結合に対する変性エンドグリコシダーゼの作用等に関する実施例を示してこの発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１：Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法を用いたｅｎｄｏ−β−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｈ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）に対するウイルスの反応性の検討
１−１：  実験方法
Ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルの作製
１２％分離ゲル：１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．８）  １．２５ｍｌ、３０％  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ２．０ｍｌ、１０％  ＳＤＳ  ０．０５ｍｌ、１０％過硫酸アンモニウム０．０５ｍｌ、精製水１．６５ｍｌを順次加え、最後にＮ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）を５μｌ加えよく懸濁し、全量５ｍｌとした。これを４．２ｍｌゲル作製装置に入れ、水を張り、重合化させた。
【００３３】
濃縮ゲル：０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５〜６．８）１．２５ｍｌ、３０％  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ０．７５ｍｌ、１０％  ＳＤＳ  ０．０５ｍｌ、１０％過硫酸アンモニウム０．０５ｍｌ、精製水２．９ｍｌを順次加え、最後にＮ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）を５μｌ加えよく懸濁し、全量５ｍｌとした。この分離ゲルの上に重層した。
Ｂ：ｂｌｏｔｔｉｎｇ
ｅｎｄｏ−β−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｈ（Ｅｎｄｏ  Ｈ，  ロシュ社）８μｌ（１μｇ）、あるいはタンパク質分子量マーカー（Ｐｒｅａｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，  ＧＩＢＣＯ社）５μｌをそれぞれ精製水で全量２０μｌに調製した後、ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ［６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），  ＳＤＳ，  ２％（ｗ／ｖ）；ｂｒｏｍｏｐｈｏｎｏｌ  ｂｌｕｅ，  ０．００５％（ｗ／ｖ）；ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ７％（ｖ／ｖ）；β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（和光純薬株式会社）１０μｌ］をそれぞれ５μｌ加え、５分間煮沸した。これをゲルにアプライした後、ゲル１枚あたり０．３アンペアで約６０分間泳動した。ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒは、ゲルを取り出した後、ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ［ＭｅＯＨ，  １０％；ＳＤＳ，  ０．０１％；ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ  ５８．２ｇ，  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ２９．３ｇ，／ｌｉｔｅｒ），  １０％］を用いて、メンブレン１枚あたり０．３アンペアで３０分間行った。
Ｃ：ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ
ｂｌｏｔしたメンブレンを適当な大きさに切り取り、ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを行った。メンブレンをＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  （１％卵白アルブミン、１％  ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ含有ＰＢＳ）中で室温にて１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。反応後、ｖｉｒｕｓ（＋）  にはＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  を用いて１０００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌに調製したＤｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ（Ｄ２Ｔ７株）懸濁液を１．５  ｍｌ加え、ｖｉｒｕｓ（−）  にはＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａのみを同量加え４℃に一晩静置した。メンブレンをＰＢＳ（−）で３分間、３回洗浄した。次にＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａで１０００倍希釈したヒト抗ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  抗血清（ロット＃１）を２  ｍｌ加えて室温、１時間反応させた。メンブレンをＰＢＳ（−）で３分間、３回洗浄した後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭ  （Ｈ＋Ｌ）  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  社）  ２  ｍｌを加え、室温で１時間反応させた。反応後、メンブレンをＰＢＳ（−）で３分間、３回洗浄した。最後に２．５  ｍｌの発色基質溶液〔０．１  Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ  ６．０  （２．５  ｍｌ），  ０．１１  Ｍ  ４−ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌｉｎ  ＣＨ３ＣＮ  （５０μｌ），  ０．０６  Ｍ  ＤＥＰＤＡ  ｉｎ  ＣＨ３ＣＮ  （５０μｌ），  ３０％  Ｈ２Ｏ２  （５μｌ）〕と反応させ、結合したウイルス粒子を検出した。
１−２：  実験結果
Ｅｎｄｏ  Ｈに対するデング熱ウイルスの結合性を検討した。Ｅｎｄｏ  Ｈにおけるｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙでは、宿主細胞であるＫ５６２細胞から調製したタンパク質画分（上清２）に比して、Ｅｎｄｏ  Ｈに対して強いウイルスの結合性が観察された（図１）。今回行ったサンプル調製、電気泳動の条件下では、Ｅｎｄｏ  ＨはＳＤＳ、メルカプトエタノール、熱の作用により、そのタンパク質高次構造は完全に変性を受けている。したがって、観察されたウイルスとの相互作用にはこのタンパク質に結合している糖鎖が関与している可能性、あるいは、高次構造をとらない特定のアミノ酸配列のみが関与している可能性等が考えられる。しかしながら今回用いたＥｎｄｏ  Ｈは大腸菌で発現させた組換え体酵素であることから、その分子内には糖鎖の付加を受けていない。以上より、この酵素の特定のアミノ酸配列がウイルスとの結合に関与していることが示された。
実施例２：Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いたデング熱ウイルスのＫ５６２細胞表面への結合ａｓｓａｙ法の確立
２−１：  実験方法
２−１−１：  Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  濃度の検討
Ｋ５６２細胞をコンフルエントまで培養した後、２  Ｘ  １０５ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌになるようにマイクロチューブに分取した。これを４℃、１０，０００  ｒｐｍで２分間遠心後、得られた細胞のペレットを０．１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ  １  ｍｌで１回洗浄した。４℃、１０，０００  ｒｐｍで２分遠心した後、Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ原液を、それぞれ５０００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，  ２０００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，  １０００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，  ５００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈して、それぞれＫ５６２細胞に１００μｌずつ加え、４℃で１時間反応させた。なお、ｖｉｒｕｓ  （−）として、０．１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳのみを同量加えた。反応終了後、冷ＰＢＳ（−）  １  ｍｌで細胞を３回洗浄し、一次抗体としてヒト抗ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  抗血清（ロット＃１）を２００倍希釈して１００μｌずつ加え、よく懸濁した後４℃で３０分間反応させた。冷ＰＢＳ（−）  １  ｍｌで細胞を３回洗浄し、二次抗体としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社）を５０倍希釈して、１００μｌずつ加え、遮光した後４℃で３０分間反応させた。反応終了後、冷ＰＢＳ（−）  １  ｍｌで細胞を３回洗浄し、得られたペレットに対して０．５  ｍｌの冷ＰＢＳ（−）を加えよく懸濁し、フローサイトメーター（Ｅｐｉｃｓ，  ＵＳＡ）で測定した。以後の実験ではｖｉｒｕｓの濃度を１０００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌに設定した。
２−１−２    １次抗体希釈濃度の検討
３−１−１よりＤｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓの濃度を１０００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌに設定してｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを行った。ここでは一次抗体の濃度を、２００倍、４００倍、８００倍、１６００倍に冷ＰＢＳ（−）で希釈した。なお、ｖｉｒｕｓ（−）には２００倍希釈した一次抗体を用いた。実験方法は３−１−１に準じた。一次抗体の希釈濃度を、以後の実験において２００倍希釈とした。
２−２：実験結果
このａｓｓａｙの適切なｖｉｒｕｓ  ｔｉｔｅｒ，  および一次抗体濃度を決定した（図２、３）。図２よりｖｉｒｕｓは１０００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌで十分にＫ５６２細胞への結合性を示し、それ以上濃度をあげても結合量に大きな変化は認められなかったことから、以後反応に用いるｖｉｒｕｓ濃度は１０００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌに決定した。また図３より一次抗体の濃度に依存して結合量が変化していることから、至適抗体濃度は２００倍希釈と決定した。
実施例３：ｅｎｄｏ−β−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｈ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）に対するデング熱ウイルス結合性の検索
３−１：  実験方法
実施例２で確立した結合ａｓｓａｙ法を用いて実験を行なった。デング熱ウイルス（１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）１００μｌに、変性Ｅｎｄｏ  Ｈ（１６μｌ、８μｌ、４μｌ）または未処理Ｅｎｄｏ  Ｈ（８μｌ）を加え、全量１１６μｌになるようにＰＢＳ（−）で調製した。変性Ｅｎｄｏ  Ｈ、未変性Ｅｎｄｏ  ＨともにＰＢＳ（−）に対して透析を行い、予め緩衝液をＰＢＳ（−）に置換しておいた。なお、ウイルス（−）にはＰＢＳ（−）１１６μｌを加えた。これらをよく懸濁し４℃で３０分間プレインキュベートした。一方、Ｋ５６２細胞をコンフルエントまで培養した後、２×１０６ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌになるようにマイクロチューブに分取した。これを、４℃下で１００００ｒｐｍ、２分間遠心し、得られた細胞ペレットにＥｎｄｏ  Ｈ処理したウイルス液を加え、４℃で１時間反応させ、１−１  Ｃに準じてｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを行った。
３−２：  実験結果
実施例３では熱およびＳＤＳ処理されたＥｎｄｏ  Ｈがウイルスと結合性を示すことが観察されたことから、この変性Ｅｎｄｏ  Ｈを用いて、デング熱ウイルスのＫ５６２細胞への結合性を阻止できるかを調べた。その結果、変性Ｅｎｄｏ  Ｈによるウイルス結合性に対する有意な阻害作用が認められた（図４）。
【００３４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、デング熱ウイルスのヒト細胞への結合を阻害することのできる新規物質（変性エンドグリコシダーゼ）と、この物質を含有する抗デング熱ウイルス剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｋ５６２細胞から調製したＴｘ−１００不溶性タンパク質画分と変性Ｅｎｄｏ  Ｈに対するウイルス結合性を検討した結果である。ＭＷはタンパク質分子量マーカーである。
【図２】異なるウイルス濃度におけるデング熱ウイルスのＫ５６２細胞への結合性の変化を、フローサイトメーターを用いて検討した結果である。縦軸はＫ５６２細胞数、横軸は蛍光強度を示す。
【図３】異なる濃度の１次抗体を用いて、Ｋ５６２細胞表面に結合したデング熱ウイルスをフローサイトメーターを用いて検出した結果である。縦軸はＫ５６２細胞数、横軸は蛍光強度を示す。
【図４】変性Ｅｎｄｏ  Ｈ前処理したＫ５６２細胞へのウイルス結合性を、フローサイトメーターを用いて検討した結果である。縦軸はＫ５６２細胞数、横軸は蛍光強度を示す。右下のグラフにおいて、ウイルスと結合していないＫ５６２細胞のピークと、ウイルスと結合したＫ５６２細胞のピークが生じた。これらのピークは、それぞれ上左グラフおよび上右グラフのピークより小さくなっていることに注目。また未変性Ｅｎｄｏ  Ｈ（上中グラフ）はウイルス結合性に全く効果を示さないことも確認された。
【図１】
2004154069.tif 000002
【図２】
2004154069.tif 000003
【図３】
2004154069.tif 000004
【図４】
2004154069.tif 000005