(57)【要約】【課題】目的の単数または複数の抗原をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ転写ユニットを個体に導入することからなる個体免疫方法を提供すること。【解決手段】脊椎動物の治療、例えば、免疫化、避妊又は腫瘍治療に用いられる、プロモーター領域に有効に結合した、目的の治療剤をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ転写ユニットを含む生産物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　脊椎動物の治療、例えば、免疫化、避妊又は腫瘍治療に用いられる、プロモーター領域に有効に結合した、目的の治療剤をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ転写ユニットを含む生産物。
【請求項２】
　目的の抗原に対する体液性免疫応答、細胞性免疫応答又はその両方を誘導することにより、脊椎動物の免疫化に用いる薬剤を製造するための、プロモーター領域に有効に結合した、目的の抗原をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ転写ユニットの使用。
【請求項３】
　プロモーター領域に有効に結合した、目的の抗原をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ転写ユニットを脊椎動物へ投与し、それにより目的の抗原に対する体液性免疫応答、細胞性免疫応答又はその両方が誘導されることからなる脊椎動物の免疫化の方法。
【請求項４】
　目的の抗原が、感染源(infectious agent)に対して防御免疫応答を誘導する能力を有するものである請求項２記載の使用又は請求項３記載の方法。
【請求項５】
　薬剤が生理的に許容される担体を含有し、並びに粘膜内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内及び皮下から選ばれる経路によって投与できるものである請求項２又は４記載の使用。
【請求項６】
　生理的に許容される担体中にあるＤＮＡ転写ユニットが、鼻腔内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内及び皮下から選ばれる投与経路を通して脊椎動物に投与されるものである請求項３又は４記載の方法。
【請求項７】
　生理的に許容される担体中にあるＤＮＡ転写ユニットと脊椎動物の粘膜表面とが接触することにより、ＤＮＡ転写ユニットを脊椎動物に投与する請求項３又は４記載の方法。
【請求項８】
　プロモーター領域に有効に結合した、目的の抗原をコードするＤＮＡを含有する、生理的に許容される担体中にあるＤＮＡ転写ユニットを脊椎動物の（例えば鼻の）粘膜表面に投与し、それにより目的の抗原に対して体液性若しくは細胞性免疫応答、又はその両方が誘導され、それにより脊椎動物が感染源により引き起こされる疾患から防御されることからなる、感染源に対する脊椎動物の免疫化の方法。
【請求項９】
　ＤＮＡ転写ユニットが非レトロウイルス由来のものである上記請求項いずれか記載の生産物、使用又は方法。
【請求項１０】
　抗原がウイルス性のものである請求項２〜９いずれか記載の使用又は方法。
【請求項１１】
　ウイルスがインフルエンザウイルス、例えば、ウイルス血球凝集素である請求項１０記載の使用又は方法。
【請求項１２】
　脊椎動物が哺乳動物、例えば、ヒトである上記請求項いずれか記載の生産物、使用又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、ＤＮＡ転写ユニットの接種による免疫化に関する。
【背景技術】
【０００２】
　不活化または減弱化させた生物またはその産生物によるワクチン接種は、宿主の抵抗性を高める有効な方法であることが示されており、最終的に、ある種の普通かつ重要な感染症の撲滅につながった。ワクチン使用の根拠は、宿主内の特異的免疫応答を高めるか、あらかじめ形成させておいた抗体を移入することにある。ポリオなどある種の疾患のワクチン予防は、免疫学上最大の成果の一つである。
【０００３】
　家畜およびヒトの疾患を引き起こす感染源のうち比較的少数のものに対してしか、効果的なワクチンは開発されていない。このことは、病原体の有毒種の増殖と減弱に関して技術的問題があることを意味する。最近、サブユニットワクチン（病原体から選ばれた抗原だけを宿主に提示するワクチン）の開発が試みられている。サブユニットワクチンは、副作用を事実上伴わないで高度の生体防御をもたらす可能性がある。サブユニットワクチンは安定で、投与しやすく、普及をみるのに十分安価であるワクチンを開発する機会をも提供するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
　本発明の課題は、目的の単数または複数の抗原をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ転写ユニットを個体に導入することからなる個体免疫方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
　本発明は、目的の単数または複数の抗原をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ転写ユニットを個体に導入することからなる個体免疫方法に関する。宿主細胞によってこのＤＮＡ転写ユニットが取り込まれると、目的の単数または複数の抗原が発現され、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の一方または両方が誘導される。誘導された体液性免疫応答と細胞性免疫応答は、病原体感染の予防、抗腫瘍応答、または避妊をもたらす。宿主は、ヒトを含むいかなる脊椎動物、鳥類、哺乳類であってもよい。
【０００６】
　本発明は、個体の粘膜表面を目的の単数または複数の抗原を発現する能力のあるＤＮＡ転写ユニットと接触させることによってその個体を免疫する方法の特殊な態様に関する。
【０００７】
　本方法によって導入されるＤＮＡ転写ユニットは、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫などの感染源(infectious agent)によってコードされるいかなる抗原の発現にも使用でき、また同様に病原体による感染から個体を効果的に免疫することが実験的にわかっている抗原性断片およびペプチドの発現にも使用することができる。上記のように、ＤＮＡ転写ユニットは避妊目的や抗ガン療法にも使用することができる。
【０００８】
　発現しようとする目的の抗原は、免疫原として使用される抗原の内部型、表面型、分泌型、又は出芽型、および組み合わせ型が得られるように設計することができる。
【０００９】
　ＤＮＡを免疫化に使用すると多くの利点がある。たとえば、ＤＮＡによってコードされるいかなる抗原についても、免疫化が可能である。さらに、ＤＮＡコード化抗原は、自然の状態で「純粋な」抗原として発現され、正常な宿主細胞修飾を受けている。また、ＤＮＡは操作が容易かつ安価に行なえ、広い温度範囲で乾燥品または溶液状態で安定である。したがって、本技術は非常に有効性の高いサブユニットワクチンの開発に価値がある。
【発明の効果】
【００１０】
　宿主細胞によって本発明のＤＮＡ転写ユニットが取り込まれると、目的の単数または複数の抗原が発現され、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の一方または両方が誘導される。誘導された体液性免疫応答と細胞性免疫応答は、病原体感染の予防、抗腫瘍応答、または避妊をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
　本発明は、病原体または感染源に対して脊椎動物、とくにヒトを含む哺乳類を免疫化し、それによって感染源の拡大や増殖を制限し、その後の病原体または感染源によるチャレンジに対する防御をもたらす体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を惹起する方法に関する。
【００１２】
　本明細書で使用する場合、「免疫化」という用語は、感染源によって引き起こされる感染発現（すなわち疾患）から脊椎動物を（部分的にまたは完全に）防御する免疫応答を作り出すことをいう。したがって、本発明によって免疫された脊椎動物は感染を受けないか、免疫化しない場合に予想されるより感染の程度が低くなる。
【００１３】
　ＤＮＡ転写ユニットとは、少なくとも２つの成分、すなわち抗原コード化ＤＮＡ成分と転写プロモーター成分とを含むポリヌクレオチド配列のことである。ＤＮＡ転写ユニットは、エンハンサー成分、スプライシングシグナル、終止およびポリアデニル化シグナル、ウイルスレプリコン、および細菌プラスミド配列などさらに別の配列を任意に含んでいてもよい。
【００１４】
　上記ＤＮＡ転写ユニットは、いくつかの公知の方法によって製造することができる。たとえば、公知の方法を用いて、目的の抗原をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入してＤＮＡ転写ユニットを構築することができる［マニアチスら(Maniatis et al.）、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照］。
【００１５】
　上記ＤＮＡ転写ユニットは、ＤＮＡ取り込みを促進したり接種部位に免疫系細胞を補充する能力を有するアジュバントまたはその他の物質の存在下、個体に投与または接種することができる。ＤＮＡ転写ユニット自体は宿主細胞側の因子によって発現されることはいうまでもない。
【００１６】
　「目的の抗原」は、感染源によって発現されるいかなる抗原、または感染源に対する防御応答を惹起する能力を有することが判明しているいかなる抗原であってもよい。これらの抗原は、上記感染源の構造成分であってもよいし、そうでなくてもよい。該コードされた抗原は、翻訳生成物やポリペプチドであってもよい。該ポリペプチドは、様々な長さのものであってよい。ポリペプチドは、グリコシル化、ミリストイル化(myristoylation)、リン酸化などの通常の宿主細胞修飾を起こしうる。また、ポリペプチドは、細胞内、細胞外、または細胞表面発現を起こすよう設計することができる。さらに、ポリペプチドは会合および細胞からの放出を起こすよう設計することができる。
【００１７】
　上記ＤＮＡ転写ユニットの使用の可能性のある病原体としては、あらゆるウイルス、クラミジア、マイコプラズマ、細菌、寄生虫、または真菌由来のＤＮＡコード性抗原などが挙げられる。ウイルスとしては、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、ライノウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブニアウイルス、風疹ウイルス、レオウイルス、ヘパドナウイルス、およびヒト免疫不全ウイルスを含むレトロウイルスなどが挙げられる。細菌としては、マイコバクテリア、スピロヘータ、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマなどが挙げられる。真菌としては、酵母、糸状菌などが挙げられる。寄生虫としては、マラリアなどが挙げられる。本リストは、本明細書に説明する方法によって作り出すことができる防御免疫応答に対抗する、可能性のある病原体をすべて含むものではないと理解されるものである。
【００１８】
　いかなる非経口経路でも個体に接種することができる。たとえば、鼻内、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、または筋肉内投与法によって個体に接種することができる。本発明の特定の態様においては、生理的に適合する媒体を介して目的のＤＮＡ転写ユニットと個体の粘膜表面を接触させることによって、その個体にワクチン接種することができる。該ＤＮＡ転写ユニットは、ＤＮＡを含有する点鼻剤、吸入剤、および座薬をはじめとする様々な方法によって粘膜表面に投与することができる。
【００１９】
　食塩水など適当な生理的適合媒体はいかなるものでも、上記ＤＮＡ転写ユニットを個体に導入するのに適している。
【００２０】
　以下の実施例により、トリとネズミのインフルエンザウイルスモデルの両者において使用するよう設計された直接ＤＮＡ接種法を用いたワクチン接種試験について説明する。これらのモデルはいずれも、免疫化されていない動物ではチャレンジにより１〜２週以内に死亡する致死的チャレンジに対する防御免疫の迅速測定が可能である。
【００２１】
　本明細書で説明する免疫化は、インフルエンザウイルス血球凝集素糖タンパク質を発現するＤＮＡ転写ユニット（すなわちベクター）を用いて達成されたものである。このタンパク質は、ウイルスの吸着と侵入を媒介しており、抗体中和の主要標的の一つである。インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質には１４種類の血清サブタイプがある。トリのモデルでは、Ｈ７サブタイプのＤＮＡ発現ベクター（Ｈ７サブタイプ血球凝集素をコードするＤＮＡ転写ユニットからなる）を用いて、Ｈ７Ｎ７ウイルスのチャレンジに対する防御をもたらしている。ネズミモデルでは、Ｈ１血球凝集素を発現するＤＮＡ転写ユニットを用いて、Ｈ１Ｎ１ウイルスに対抗する免疫化を行なった。
【実施例】
【００２２】
実施例１：インフルエンザウイルスに対抗するニワトリの免疫化
手順
　インフルエンザウイルス血球凝集素７型（Ｈ７）遺伝子を発現する、複製能を有するトリ白血病ウイルス(avian leukosis virus)をコードするｐＰ１／Ｈ７というＤＮＡ転写ユニット（図１）を既報［ハントら(Hunt et al.）、J. of Virology, 62(8):3014-3019 (1988)］に従い構築した。ｐＰ１／Ｈ７からＸｂａＩ断片を欠失させることによって、Ｈ７を発現するがトリウイルスベクターポリメラーゼとエンベロープタンパク質を欠損している複製欠損ｐＰ１／Ｈ７誘導体をコードするＤＮＡユニットｐ１８８（図２）を構築した。トリ白血病ウイルスベクターをコードし、かつインフルエンザウイルス挿入断片を有しないＤＮＡユニットｐＲＣＡＳ（図３）を既報［フーゲスら(Hughes et al.）、J. of Virology, 61:3004 (1987)］に従い構築した。ＤＮＡユニットは０．２ｍｌあたり１００μｇの濃度で食塩水に希釈して、接種に使用した。
【００２３】
　致死的インフルエンザウイルスチャレンジに対抗する、接種したＤＮＡの防御能力を調べるために、複数群の３週齢ヒヨコにｐＰ１／Ｈ７、ｐ１８８、またはｐＲＣＡＳのＤＮＡを接種した。トリ白血病ウイルスを含まない群として維持される特定病原体フリーのヒヨコ（SPAFAS、 Norwich 、 CT) を接種に用いた。各ヒヨコに、１００μｇのＤＮＡ（〜１ｘ１０13分子）を静脈内投与（ｉｖ）、１００μｇを腹腔内投与（ｉｐ）、および１００μｇを皮下投与（ｓｃ）した。４週後、ヒヨコから採血し、３００μｇのＤＮＡ（１００μｇ　ｉｖ、１００μｇ　ｉｐ、１００μｇ　ｓｃ）を追加免役した。追加免疫後１週間目に、ヒヨコから採血し１００倍致死量（１ｘ１０4 卵感染用量(egg infectious doses)) の高度病原性Ｈ７型トリインフルエンザウイルス、Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１／８５（Ｈ７Ｎ７）（Ｃｋ／Ｖｉｃ／８５）による経鼻的チャレンジを行なった。ニワトリは１０日間毎日疾患徴候を観察した。チャレンジ後１．５週目に、生存トリから血清を採取した。これらの血清と追加免疫前後の血清を用いて、血球凝集阻害抗体（ＨＩ）の分析を行なった。
【００２４】
　血清は、既報［パーマーら(Palmer et al.）、Advanced Laboratory Techniques for Influenza Diagnosis, p. 51-52, Immunology series no. 6, U.S. Department of Health, Education, and Welfare, Washington, D.C. (1975) 」に従い、受容体破壊酵素処理血清を用いてマイクロタイタープレート上で分析した。
【００２５】
結果
　Ｈ７発現ＤＮＡ転写ユニットは、ｐＰ１／Ｈ７またはｐ１８８を接種した各ニワトリを防御した（表１）。一方、対照ＤＮＡであるｐＲＣＡＳを接種すると、ニワトリを致死的ウイルスチャレンジから防御することができなかった。対照群のトリは、チャレンジ後２日目から疾患徴候を示しはじめた。３日目までに、６羽の対照のトリのうちの３羽が死亡し、５日目までにすべての対照のトリが死亡した。血球凝集素発現ＤＮＡを接種されたトリは全く疾患徴候を示さなかった。チャレンジ後１．５週目までに、これら２群いずれにも高レベルのＨＩ抗体が現われた。
【００２６】
実施例２：インフルエンザウイルスに対抗する免疫化は再現性がある
　複製能を欠くＨ７発現ＤＮＡによる免疫化で惹起された防御の再現性を評価するために、ｐ１８８およびｐＲＣＡＳのＤＮＡだけを接種に用いて、実施例１に説明する実験を３回反復した。この反復実験の結果、Ｈ７発現ｐ１８８ＤＮＡは致死的チャレンジに対する防御をもたらしうることが確認された（表２）。ｐ１８８接種ニワトリのすべてが致死的チャレンジに耐えて生存した最初の実験とは対照的に、第２、第３、および第４の実験における免疫化では、部分的な防御しか得られず、ワクチン接種を受けたトリのうち２８〜８３％だけが生存した。さらに、ワクチン接種を受けたトリが疾患徴候を示さなかった第１の実験とは対照的に、反復実験に耐えて生存したトリは、ほとんどのものがチャレンジ後に一時的な疾患徴候を示した。最初の実験の場合と同様、対照ＤＮＡは防御をもたらさなかった。４つの実験をまとめると、ｐ１８８ワクチン接種を受けた５６羽のトリのうち２８羽が生存したのに対し、５５羽の対照ＤＮＡ接種トリのうちの１羽だけしか生存しなかった。したがって、変動があるにせよ、十分な免疫が達成されたといえる。
【００２７】
実施例３：免疫化は複数の接種経路で達成可能である
手順
　ｐ１８８−Ｈ７をコードするＤＮＡおよび対照ＤＮＡの、致死的インフルエンザウイルスチャレンジに対抗する防御をもたらす能力を再び調べた。本実験では、３種類の接種経路（すなわちｉｐ、ｉｖ及びｓｃ）でワクチン接種と追加免疫を行なう１群、同様に３つの接種経路でワクチン接種するが追加免疫は行なわない１群、１つの接種経路だけでワクチン接種と追加免疫を行なう複数の小さな群、および抗インフルエンザウイルス薬である塩酸アマンタジン(amantadine-HCL)で処理する対照群を設けた。最後の群は、ワクチン接種ニワトリと非接種ニワトリにおける、チャレンジウイルスに対する抗体反応を比較することができるように設けたものであった。アマンタジン処理されたトリには、チャレンジ８時間後から飲料水に０．０１％のアマンタジンを混入させたものを与え、チャレンジ後２４時間目と４８時間目に１．０ｍｌの０．１％アマンタジンをｉｐ注射した。
【００２８】
結果
　本実験の結果、複製能を欠くＨ７発現ＤＮＡ（ｐ１８８）は致死的ウイルスチャレンジに対する防御をもたらすことが確認された（表３）。ｐ１８８で免疫化したトリは、チャレンジ後に一時的な疾患徴候を示した。先の実験の場合と同様、対照ＤＮＡは防御をもたらさなかった。５羽のアマンタジン処理対照トリはいずれも発病した。これらのうちの４羽はチャレンジに耐えて生存し、免疫化されたニワトリおよび免疫化されていないニワトリにおける、抗インフルエンザウイルス反応の経時変化と特異性を比較するのに使用することができる血清が提供された（以下の実施例５参照）。
【００２９】
実施例４：免疫化は複数の接種経路で達成可能である
手順
　異なる免疫化経路の有効性を評価するために、試験群のトリの数を増やして、第３の実験を開始した。本実験では、１２羽のヒヨコにｉｖ、ｉｐ、およびｓｃ経路で１００μｇのｐ１８８を接種し、８羽にはｉｖだけ、別の８羽にはｉｐだけで接種した。対照として、１２羽のヒヨコにｐＲＣＡＳを接種し、別の１２羽には接種しなかった。いずれの免疫化の場合も、最初の接種後４週目に追加免疫を行なった。追加免疫には、ワクチン接種の場合と同じＤＮＡ量と接種部位を使用した。追加免疫後１〜２週目に対照動物および免疫化動物に対し、ｃｋ／ｖｉｃ／８５によるチャレンジを行なった。１〜２週以内に完全に１００％の致死率が得られるよう、高いチャレンジ投与量を用いた。
【００３０】
結果
　ここで得られた結果でも、ｐ１８８による防御が証明された（表４）。１２羽のｐ１８８免疫化トリのうち８羽が生存したが、対照ｐＲＣＡＳニワトリは１２羽すべてが死亡した。未処理対照群の１２羽も生存したものはなかった。ｉｖだけでｐ１８８接種を受けた８羽のニワトリのうちの６羽は生存したが、ｉｐだけで接種を受けた８羽のニワトリはいずれも生存しなかった。
【００３１】
実施例５：ワクチン接種動物および非接種動物におけるチャレンジウイルスに対する抗体　　　　　反応の分析
手順
　ワクチン接種ニワトリと非接種ニワトリにおける、チャレンジウイルスに対する抗体反応の比較を可能とするために、実施例２（表２）の実験２に、抗インフルエンザＡ型ウイルス薬である塩酸アマンタジンにより救われた非ワクチン接種群を加えた（表２）［ウエブスターら(Webster, R.G., et al.）、J. Virol. 55:173-176 (1985) ］。５羽のアマンタジン処理されたトリはいずれも発病した。これらのうちの４羽が生存し、免疫化ニワトリと非免疫化ニワトリにおける抗体反応の比較に使うことができる血清が得られた（表６）。
【００３２】
　第２の実験でｐ１８８接種とアマンタジン処理を受けたトリから採取した血清について、Ｈ７およびその他のインフルエンザウイルスタンパク質に対する抗体反応の経時変化を調べた（表６）。Ｈ７に対する抗体反応は、血球凝集阻害ならびに抗体のウイルス中和および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量した。ウイルス複製検出のために細胞病理学と血球凝集素を利用して、ＴＣＩＤ50値の２００倍量のウイルスとともにヒヨコ胚繊維芽細胞培養物中で中和抗体を測定した。
【００３３】
結果
　ワクチン接種とアマンタジンによって救われたトリにおける抗体反応の分析で、ｐ１８８接種はＨ７に対する抗体反応を誘導することが証明された（表６）。実験１の場合と同様（表１）、ＤＮＡワクチン接種および追加免疫は、低いＨ７抗体力価しか誘導しなかったが、チャレンジ１週間以内に、ＤＮＡ免疫化群は高いＨＩ力価とＨ７中和活性を示した。これらの力価は、翌週には例えあるにしても殆ど上昇しなかった。さらに、ワクチン接種されたトリにおけるチャレンジ後抗体のほとんどがＨ７を標的とするものであった。この特異性は、Ｈ７ウイルス（免疫血球凝集素タイプ）およびＨ５ウイルス（トリに投与していない血球凝集素タイプ）のＥＬＩＳＡ抗体力価を比較することで示された。上記チャレンジ後血清は、Ｈ５ウイルスの場合よりＨ７の場合の方が２０倍高いＥＬＩＳＡ抗体価を示した（表６）。一方、アマンタジンに救われた群では、チャレンジ後２週目までは抗体は現われなかった。この反応のほとんどはＨ７特異的ではなかった。このことは、Ｈ５インフルエンザウイルスとＨ７インフルエンザウイルスのいずれの場合もＥＬＩＳＡ抗体価が同等である、アマンタジンによって救われたトリから採取したチャレンジ後血清によって証明された（表６）。
【００３４】
実施例６：非レトロウイルス転写ユニットを用いるニワトリおよびマウスの免疫化
手順
　レトロウイルスＤＮＡを欠くＤＮＡ転写ユニットは本明細書で説明する方法によってニワトリとマウスのいずれにおいても防御免疫反応を作り出す目的に効果的に使うことができることを証明するために本実験を実施した。本実験でニワトリとマウスのワクチン接種に使用したベクターを図４Ａ〜４Ｃに示した。図４Ａは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモーター(immediate early promoter)の転写制御下にインフルエンザウイルスＨ７サブタイプ血球凝集素を発現する能力を有するプラスミドであるｐＣＭＶ−Ｈ７の概略図である。図４Ｂは、ＣＭＶ即時型初期プロモーターの転写制御下にインフルエンザウイルスＨ１サブタイプ血球凝集素を発現する能力を有するプラスミドであるｐＣＭＶ−Ｈ１の概略図である。このものが、マウス実験で使用したＤＮＡ転写ユニットである。図４Ｃは、インフルエンザ抗原発現能力を有しない対照プラスミドであるｐＣＭＶを示す。これらのプラスミドは、ブライアン−クレン博士（Dr. Brian Cullen, Duke University, Durham, North Carolina ）のｐＢＣ１２／ＣＭＶベクターの誘導体である。
【００３５】
　ｐＣＭＶ−Ｈ７およびｐＣＭＶ−Ｈ１のＤＮＡ（非レトロウイルス由来ＤＮＡ転写ユニット）を用いて免疫反応を誘導するニワトリおよびマウスの実験で、１００μｇのＤＮＡを静脈内、腹腔内、および筋肉内接種した。いずれのワクチン接種後も、４週後に追加免疫を行なった。追加免疫は、ワクチン接種の場合と同じＤＮＡ投与量と接種部位を使用した。追加免疫後１〜２週目にチャレンジを行なった。１〜２週以内に完全に１００％の致死率が得られるよう、高いチャレンジ投与量を用いた。
【００３６】
結果
　ワクチン接種用非レトロウイルス由来ベクター（ｐＣＭＶ−Ｈ７）を用いる５つのニワトリ試験において（図４Ａ）、約６０％のニワトリが防御免疫を獲得した。１つのマウス試験では、６匹のワクチン接種マウスのうちの６匹全部、および６匹の対照マウスのうちの１匹だけが生存した。したがって、非レトロウイルスＤＮＡ発現ベクター（ウイルス抗原をコードするＤＮＡ転写ユニットを含有）を用いて動物をワクチン接種することによってかなりの防御が達成された。例えば表５参照。
【００３７】
　ニワトリの実験では、防御反応は、チャレンジ後の急速なＨ７特異的抗体出現と関連していた［ロビンソンら(Robinson et al.）、1993］。ワクチン接種および追加免疫後の血清は低レベルないし検出不可能なレベルの抗Ｈ７抗体を含んでいた。最初のマウスの実験は、接種を受けたマウスもチャレンジ前に低い抗血球凝集素活性値を示したという点でニワトリの実験と似ていたが、ニワトリの実験の場合と同様、チャレンジ後に高い抗体力価が示された。この抗体のほとんどはＩｇＧであった。
【００３８】
実施例７：非レトロウイルス転写ユニットを用いてのワクチン接種によるマウスの免疫化　　　　　：様々な接種経路の分析
手順
　マウス適応(mouse adapted) Ａ／ＰＲ／８／３４　Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスによる致死的チャレンジに対抗する免疫化をマウスに行なうために、ｐＣＭＶ−Ｈ１（図４Ｂに示す）というＤＮＡ転写ユニットを使用し、好成績を得た。この転写ユニットは、ＣＭＶ即時型初期プロモーターの転写支配下にインフルエンザＨ１型血球凝集素をコードする。本構築物中で使用したＨ１インフルエンザウイルス血球凝集素遺伝子については、既報［ウインタースら（Winters et al.）、Nature 292;72 (1981) ］に詳細な説明がある。
【００３９】
　最初の実験は、ｉｖ、ｉｐ、ｉｍという３つの経路のそれぞれにより、１００μｇのｐＣＭＶ−Ｈ１　ＤＮＡを６〜８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスに接種することによって実施した。第２、第３、第４の実験は、それぞれｉｖ、ｉｐ及びｉｍで接種されたマウスの１群、ならびに異なる接種経路に相当するその他の群を設けた（表７と図５にデータをまとめた）。
【００４０】
　表７の番号は、接種を受けたマウスの数に対する生存マウスの数の比を示す。各試験ごとの接種経路（ｉｖ、静脈内；ｉｐ、腹腔内；ｉｍ、筋肉内；ｓｃ、皮下；ｉｎ、鼻腔内；ｉｄ、皮内）を示した。ほとんどの場合、注射１回あたり１００μｇのＤＮＡを投与した。筋肉内（ｉｍ）接種は、１００μｇのＤＮＡを各臀筋に注射することによって行なった。静脈内（ｉｖ）接種は、尾静脈への注射によって行なった。ＤＮＡおよびチャレンジの鼻腔内（ｉｎ）投与は、メトファン麻酔(Metofane-anesthetized) 動物（Pitman-Moore）に対して行なった（これらの動物は呼吸が深い）。皮内（ｉｄ）接種は、ＤＮＡ５０μｇだけを使って足裏部に行なった。実験２と実験３の対照群には食塩水を与えた。実験１の対照は、対照ＤＮＡ（抗原をコードする挿入断片を持たないベクター）をｉｖ、ｉｐ、ｉｍで投与した。実験４の対照群は、対照ＤＮＡをｉｍ、ｉｎ、ｉｄで投与した。一部マウスはインフルエンザチャレンジに対して抵抗性を示す。実験２の鼻腔内投与群の生存動物のうちの１匹、実験１の対照群の１匹の生存動物、および実験４の対照群の１匹の生存動物は、上記抵抗性マウスであった。すべての群は、チャレンジ後に疾患徴候を示した。体重減少に関するデータも集め、図５に示した。この体重減少データは、異なる実験群における疾患の程度の量的目安となる。
【００４１】
結果
　この一連の実験で得られた生存率データ、体重減データ、および初期血清データから、多くの接種経路が防御免疫をもたらしうることがわかる。また、これらのデータは、鼻腔内接種（ＤＮＡ点鼻剤をメトファン麻酔マウスに投与）は、致死的ウイルスチャレンジに対する防御免疫をもたらしうることを証明するものである。したがって、本明細書で説明する方法は粘膜免疫刺激手段(means of stimulating mucosal immunity) を提供する（表７および図５）。最後に、これらのデータは、一部の接種経路は他の経路より防御免疫反応を作り出す効果が高いことを証明するものである（表８）。
【００４２】
実施例８：非レトロウイルスＤＮＡ転写ユニットをワクチン接種した動物におけるチャレ　　　　　ンジウイルスに対する抗体反応
　ｐＣＭＶ−Ｈ７ワクチン接種ニワトリにおける血清反応を分析する実験を実施例４と同様にして行なった。ｐＣＭＶ−Ｈ７免疫化は抗体反応を誘導し、Ｈ７に対する高い抗体力価がチャレンジ後に現われた（表９）。
【００４３】
【表１】
2004099603.tif 000002
【００４４】
【表２】
2004099603.tif 000003
【００４５】
【表３】
2004099603.tif 000004
【００４６】
【表４】
2004099603.tif 000005
【００４７】
【表５】
2004099603.tif 000006
【００４８】
【表６】
2004099603.tif 000007
【００４９】
【表７】
2004099603.tif 000008
【００５０】
【表８】
2004099603.tif 000009
【００５１】
【表９】
2004099603.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００５２】
　本発明により、目的の単数または複数の抗原をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ転写ユニットを個体に導入することからなる個体免疫方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、複製能を有するレトロウイルスベクターによって発現されるインフルエンザウイルス血球凝集素７型（Ｈ７）遺伝子からなるＤＮＡ転写ユニットを含有する細菌プラスミド（以下ｐＰ１／Ｈ７という）を示す。
【図２】図２は、複製能を欠くレトロウイルスベクターによって発現されるインフルエンザウイルス血球凝集素７型（Ｈ７）遺伝子からなるＤＮＡ転写ユニットを含有する細菌プラスミド（ｐ１８８）を示す。
【図３】図３は、対照として用いた、Ｈ７挿入断片を有しないレトロウイルスベクターからなる細菌プラスミド（ｐＲＣＡＳ）を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、サブタイプＨ７血球凝集素をコードするインフルエンザウイルス抗原ＤＮＡ転写ユニットからなる非レトロウイルスベクターの概略図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、サブタイプＨ１血球凝集素をコードするインフルエンザウイルス抗原ＤＮＡ転写ユニットからなる非レトロウイルスベクターの概略図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、インフルエンザウイルス抗原をコードしない対照ＤＮＡ転写ユニットからなる非レトロウイルスベクターの概略図である。
【図５】図５は、実験４、表７のＤＮＡワクチン接種マウスにおける最大中央体重減値を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月27日(2003.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　プロモーター領域に有効に結合した、目的の抗原をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ転写ユニットを脊椎動物へ投与し、それにより目的の抗原に対する体液性免疫応答、細胞性免疫応答又はその両方が誘導されることからなる脊椎動物の免疫化の方法。