(57)【要約】【課題】転移性腫瘍等ヒトの遠隔腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示すなど、癌に対する免疫療法が可能な抗腫瘍免疫反応を誘導できる、きわめて安全性の高い抗腫瘍剤、腫瘍免疫誘導剤、Ｔ細胞活性化剤、樹状細胞活性化剤や、これらを用いた癌の治療方法等を提供すること。【解決手段】不活性化された単純ヘルペスウイルス（不活化ＨＳＶ）や単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤ（ＨＳＶｇＤ）等を抗腫瘍剤、腫瘍免疫誘導剤、Ｔ細胞活性化剤、樹状細胞活性化剤の有効成分とする。上記不活性化処理としては、２５４ｎｍの紫外光を用い４Ｊ／ｍ２、３０分間の紫外線照射処理と、５６℃、３０分間の加熱処理との併用を具体的に例示することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化処理を施した単純ヘルペスウイルス、又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項２】
不活性化処理が、紫外線処理及び熱処理により不活性化させた単純ヘルペスウイルスを主成分とすることを特徴とする請求項１記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
紫外線処理が、２５４ｎｍの紫外光を用い４Ｊ／ｍ２、３０分間の照射処理であることを特徴とする請求項２記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
熱処理が、５６℃、３０分間の加熱処理であることを特徴とする請求項２記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
単純ヘルペスウイルスグリコプロテインが単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤであることを特徴とする請求項１記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス１型のＫＯＳ株又は単純ヘルペスウイルス２型の１６９株であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の抗腫瘍剤を、腫瘍組織に直接投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか記載の抗腫瘍剤を、腫瘍組織に直接投与することを特徴とする転移性腫瘍等の遠隔腫瘍の治療方法。
【請求項９】
不活性化処理を施した単純ヘルペスウイルス、又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを有効成分とすることを特徴とする腫瘍免疫誘導剤。
【請求項１０】
不活性化処理が、紫外線処理及び熱処理により不活性化させた単純ヘルペスウイルスを主成分とすることを特徴とする請求項９記載の腫瘍免疫誘導剤。
【請求項１１】
紫外線処理が、２５４ｎｍの紫外光を用い４Ｊ／ｍ２、３０分間の照射処理であることを特徴とする請求項１０記載の腫瘍免疫誘導剤。
【請求項１２】
熱処理が、５６℃、３０分間の加熱処理であることを特徴とする請求項１０記載の腫瘍免疫誘導剤。
【請求項１３】
単純ヘルペスウイルスグリコプロテインが単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤであることを特徴とする請求項９記載の腫瘍免疫誘導剤。
【請求項１４】
単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス１型のＫＯＳ株又は単純ヘルペスウイルス２型の１６９株であることを特徴とする請求項９〜１３のいずれか記載の腫瘍免疫誘導剤。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか記載の腫瘍免疫誘導剤を、腫瘍組織に直接投与して細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）及び／又は抗体反応を誘導することを特徴とする腫瘍免疫の誘導方法。
【請求項１６】
請求項９〜１４のいずれか記載の腫瘍免疫誘導剤を、腫瘍組織に直接投与して細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）及び／又は抗体反応を誘導し、かかる誘導されたＣＴＬｓ及び／又は抗体を用いることを特徴とする腫瘍抗原の同定方法。
【請求項１７】
不活性化処理を施した単純ヘルペスウイルス、又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを有効成分とすることを特徴とするＴ細胞活性化剤。
【請求項１８】
不活性化処理が、紫外線処理及び熱処理により不活性化させた単純ヘルペスウイルスを主成分とすることを特徴とする請求項１７記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項１９】
紫外線処理が、２５４ｎｍの紫外光を用い４Ｊ／ｍ２、３０分間の照射処理であることを特徴とする請求項１８記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項２０】
熱処理が、５６℃、３０分間の加熱処理であることを特徴とする請求項１８記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項２１】
単純ヘルペスウイルスグリコプロテインが単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤであることを特徴とする請求項１７記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項２２】
単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス１型のＫＯＳ株又は単純ヘルペスウイルス２型の１６９株であることを特徴とする請求項１７〜２１のいずれか記載のＴ細胞活性化剤。
【請求項２３】
請求項１７〜２２のいずれか記載のＴ細胞活性化剤を用いることを特徴とするＴ細胞の活性化方法。
【請求項２４】
不活性化処理を施した単純ヘルペスウイルス、又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを有効成分とすることを特徴とする樹状細胞活性化剤。
【請求項２５】
不活性化処理が、紫外線処理及び熱処理により不活性化させた単純ヘルペスウイルスを主成分とすることを特徴とする請求項２４記載の樹状細胞活性化剤。
【請求項２６】
紫外線処理が、２５４ｎｍの紫外光を用い４Ｊ／ｍ２、３０分間の照射処理であることを特徴とする請求項２５記載の樹状細胞活性化剤。
【請求項２７】
熱処理が、５６℃、３０分間の加熱処理であることを特徴とする請求項２５記載の樹状細胞活性化剤。
【請求項２８】
単純ヘルペスウイルスグリコプロテインが単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤであることを特徴とする請求項２４記載の樹状細胞活性化剤。
【請求項２９】
単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス１型のＫＯＳ株又は単純ヘルペスウイルス２型の１６９株であることを特徴とする請求項２４〜２８のいずれか記載の樹状細胞活性化剤。
【請求項３０】
請求項２４〜２９のいずれか記載の樹状細胞活性化剤を、腫瘍組織に直接投与することを特徴とする樹状細胞の活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、転移性腫瘍等ヒトの遠隔腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示す、不活性化された単純ヘルペスウイルス（不活化ＨＳＶ）や単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤ（ＨＳＶｇＤ）等を有効成分とする抗腫瘍剤、腫瘍免疫誘導剤、Ｔ細胞活性化剤、樹状細胞活性化剤や、これらを用いた抗腫瘍効果の向上及び転移性腫瘍等の遠隔腫瘍の治療方法、腫瘍免疫の誘導方法、腫瘍抗原の同定方法、Ｔ細胞の活性化方法、樹状細胞の活性化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍特異的免疫誘導は、腫瘍再発を長期的に予防することができるが、このような免疫療法は、基本的に腫瘍特異的抗原の有無と、抗原を提示して腫瘍細胞を認識する細胞障害性免疫応答を誘導できるか否かに左右される。細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）は、共刺激分子と共に細胞表面に提示される細胞質タンパク質に由来するペプチドと複合するＭＨＣクラスＩ分子を認識する（非特許文献１参照）。腫瘍特異的抗原は、種々のヒト腫瘍から検出されている（非特許文献２，３参照）。癌ワクチンによる治療は、アジュバンド又はサイトカインと結合させて投与される不活性化させた腫瘍細胞、又はその溶解物の使用に焦点があてられてきた。最近、種々のサイトカイン、ＭＨＣ分子、共刺激分子又は腫瘍抗原を腫瘍細胞へ遺伝子導入することにより、免疫エフェクター細胞に対する腫瘍細胞の視覚感度（ｖｉｓｉｂｉｌｉｔｙ）が向上することが報告されている（非特許文献４参照）。ＨＳＶ等の腫瘍内への直接接種（インサイチュー癌ワクチン）により抗腫瘍免疫の誘導が可能になると、癌ワクチンを治療目的に使用する上での主要な問題点が克服される。すなわち、癌ワクチン作製のための患者の自家腫瘍細胞の採取、培養及び放射線照射などのインビトロ操作、或いは特異的腫瘍抗原の同定などの必要性が克服される。
【０００３】
ＨＳＶは２本鎖ＤＮＡウイルスで、核内で増殖するＤＮＡウイルスの中で最大長のゲノム（１５３ｋｂ）を有し、８４種のオープンリーディングフレームをコードする。ゲノムはＬ（ｌｏｎｇ）領域とＳ（ｓｈｏｒｔ）領域から構成され、各ユニーク配列をその両側に倒置反復配列が挟む形で存在する。ウイルスゲノムの全塩基配列が決定され、ほとんどのウイルス遺伝子の機能は解明されている。Ｍａｒｔｕｚａらは、γ３４．５遺伝子における欠失及びＩＣＰ６遺伝子へのｌａｃＺ遺伝子挿入により、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の多重遺伝子の変異体である変異ヘルペスウイルスＧ２０７を開発した（非特許文献５参照）。Ｇ２０７は他のウイルスベクター類よりも治療上の観点において優れている。Ｇ２０７は分裂細胞において複製され、その結果感染細胞は溶解して死に至るが、非分裂細胞ではその増殖は顕著に弱まっている。無胸腺症マウスに樹立された腫瘍内にＧ２０７を接種すると腫瘍選択的複製によって腫瘍増殖が抑制され、マウスが延命された（非特許文献６参照）。また、免疫応答性マウスにおいてはＧ２０７を腫瘍内接種することにより腫瘍特異的免疫応答が誘導され、Ｇ２０７を接種しなかった腫瘍の増殖をも抑制する（非特許文献７参照）。この場合、Ｇ２０７がインサイチュー癌ワクチンとして機能している（特許文献１参照）。現在まで、脳腫瘍を中心に変異ヘルペスウイルスＧ２０７を用いた遺伝子治療が行われ、米国で臨床応用も開始された（非特許文献８参照）。
【０００４】
マウス結腸直腸癌細胞株ＣＴ２６は低免疫原性であり、検出可能レベルの腫瘍特異的ＣＴＬｓを誘導することがなく、また免疫療法を研究する上で同系腫瘍モデルとして汎用されている（非特許文献９，１０参照）。ＣＴ２６における腫瘍特異抗原として、内因性マウス白血病ウイルスのｅｎｖｅｌｏｐタンパク（ｇｐ７０）由来でＭＨＣクラスＩのＡＨ１ペプチドが同定されている（非特許文献１０参照）。ペプチド特異的ＣＴＬｓを養子免疫細胞導入することによって樹立皮下ＣＴ２６腫瘍を治療することができ、腫瘍特異的ＣＴＬｓの誘導と抗腫瘍効果との間に相関関係があることが確認されている（非特許文献１０参照）。本発明者らは、これまでにもＨＳＶ−１変異体Ｇ２０７のインサイチュー癌ワクチンとしての有効性を調べるために、同定された腫瘍抗原を発現させる低免疫原性結腸直腸癌ＣＴ２６を用いている。さらに、Ｇ２０７の腫瘍内接種により誘導される抗腫瘍応答が一般的に利用できることを明らかにするため、Ｍ３マウスメラノーマ同系腫瘍モデルを使ってＧ２０７の有効性を評価している（非特許文献１１，１２参照）。
【０００５】
他方、ウイルスの不活性化方法としては、加熱処理（非特許文献１３参照）、紫外線照射（特許文献２参照）、γ線照射（特許文献３参照）、電子線照射（特許文献４，５参照）、加圧処理（特許文献６参照）、通電処理（特許文献７参照）などの物理的不活性化処理方法や、フェノール、ホルマリン、アルコールなどによる殺菌処理、アルカリ処理（特許文献８参照）、通常の酸素分子が電子的に励起されてエネルギー的に高い状態になった一重項酸素との接触（特許文献９参照）、ＤＮＡ分解酵素処理などの化学的不活性化処理方法や、これら物理的不活性化処理方法と化学的不活性化処理方法を併用する方法（特許文献１０，１１参照）が知られている。
【０００６】
また、ＨＳＶｇＤに関しては、ヘルペスウイルスに対するワクチンとして、組換えＨＳＶｇＤの製造法（特許文献１２参照）、組換えＨＳＶｇＤワクチン（特許文献１３参照）、ＨＳＶ−２ｇＤをコードする組換えＤＮＡ及びタンパク質（特許文献１４参照）、ＨＳＶｇＤと３−Ｄｅａｃｙｌａｔｅｄ　ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ　ｌｉｐｉｄ　Ａからなるワクチン製剤（特許文献１５参照）、昆虫細胞を用いた組替えＨＳＶｇＤの製造法（特許文献１６参照）、３００個のアミノ酸配列からなるＨＳＶｇＤ分子（特許文献１７参照）、ＨＳＶｇＤ及びＨＢＶ抗原等をアジュバントと一緒に含んだ併合ワクチン組成物（特許文献１８参照）、ＨＳＶｇＢポリペプチド及びＨＳＶｇＤとの融合蛋白（特許文献１９参照）等の関連文献があるが、ＨＳＶｇＤを癌ワクチンのために使用することは何ら知られていなかった。
【０００７】
【特許文献１】
特表２００１−５１３５０８号公報
【特許文献２】
特公昭４５−９５５６号公報
【特許文献３】
特開平２−９３６７号公報
【特許文献４】
特開平４−２００３５３号公報
【特許文献５】
特開平４−９２６７１号公報
【特許文献６】
特開平６−１４２１９７号公報
【特許文献７】
特開２０００−１７５６８２号公報
【特許文献８】
特開平０９−１８７２７３号公報
【特許文献９】
特開平１１−１９９４９０号公報
【特許文献１０】
特開平６−３２１９９４号公報
【特許文献１１】
特表平８−５０４４０７号公報
【特許文献１２】
欧州特許第１０１６５５号明細書
【特許文献１３】
欧州特許出願公開第６２８６３３号明細書
【特許文献１４】
国際公開第９０／１３６５２号パンフレット
【特許文献１５】
米国特許第６０２７７３０号明細書
【特許文献１６】
欧州特許出願公開第５３１７２８号明細書
【特許文献１７】
米国特許第５６５４１７４号明細書
【特許文献１８】
特表２００２−５０６０４５号公報
【特許文献１９】
特許２９９９９６６号明細書
【非特許文献１】
Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　７，　４４５−４８０，　１９８９
【非特許文献２】
Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１２，　３３７−３６５，　１９９４
【非特許文献３】
Ａｄｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　５７，　２８１−３５１，　１９９４
【非特許文献４】
Ａｄｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　５８，　４１７−４５４，　１９９５
【非特許文献５】
Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　１，　９３８，　１９９５
【非特許文献６】
Ｃａｎｃｅｒ．　Ｒｅｓ．　５５，　４７５２，　１９９５
【非特許文献７】
Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．　９，　２１７７−２１８５，　１９９９
【非特許文献８】
Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．　７，　８６７−８７４，　２０００
【非特許文献９】
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　３５，　２９７５，　１９８８
【非特許文献１０】
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９３，　９７３０，　１９９６
【非特許文献１１】
Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．　１０，　３８５−３９３，　１９９９
【非特許文献１２】
Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１６０，　４４５７−４４６４，　１９９８
【非特許文献１３】
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２２，　２３３−２３８，　１９８１
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
癌の転移は極めて治療困難な病態であり、現在まで有効な治療法はなく、限られた一部の化学療法剤に有効なものも報告されているが、その副作用が問題視されている。近年、ウイルスベクターを用いた遺伝子治療技術が飛躍的に発展したが、現在なお安全性の面では大きな問題を残している。本発明の課題は、転移性腫瘍等ヒトの遠隔腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示すなど、癌に対する免疫療法が可能な抗腫瘍免疫反応を誘導できる、きわめて安全性の高い抗腫瘍剤、腫瘍免疫誘導剤、Ｔ細胞活性化剤、樹状細胞活性化剤や、これらを用いた抗腫瘍効果の向上及び転移性腫瘍等の遠隔腫瘍の治療方法、腫瘍免疫の誘導方法、腫瘍抗原の同定方法、Ｔ細胞の活性化方法、樹状細胞の活性化方法等を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、ウイルスベクターによる癌治療の実用化においては、その使用上の安全性が基本的な前提条件であることに鑑み、野生型ＨＳＶに対して紫外線照射処理と熱処理を施し、完全に感染力が失われかつウイルスＤＮＡも破壊された不活化ＨＳＶを調製し、かかる不活化したＨＳＶを腫瘍細胞株ＣＴ２６による悪性腫瘍組織に直接接種したところ腫瘍特異的免疫応答が誘導され悪性腫瘍が退縮し、また、直接接種しなかった遠隔悪性腫瘍に対してもその増殖を抑制することができることの他、不活化ＨＳＶがヒト樹状細胞を活性化することを見い出した。また、ＨＳＶｇＤを腫瘍細胞株ＣＴ２６による悪性腫瘍組織に直接接種したところ腫瘍特異的免疫応答が誘導され悪性腫瘍が退縮し、また、直接接種しなかった遠隔悪性腫瘍に対してもその増殖を抑制することができることの他、ＨＳＶｇＤがＴ細胞に対する共刺激因子としてＴ細胞の活性化に働くことや、ヒト樹状細胞を活性化することを見い出した。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち本発明は、不活性化処理を施した単純ヘルペスウイルス、又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを有効成分とすることを特徴とする抗腫瘍剤（請求項１）や、不活性化処理が、紫外線処理及び熱処理により不活性化させた単純ヘルペスウイルスを主成分とすることを特徴とする請求項１記載の抗腫瘍剤（請求項２）や、紫外線処理が、２５４ｎｍの紫外光を用い４Ｊ／ｍ２、３０分間の照射処理であることを特徴とする請求項２記載の抗腫瘍剤（請求項３）や、熱処理が、５６℃、３０分間の加熱処理であることを特徴とする請求項２記載の抗腫瘍剤（請求項４）や、単純ヘルペスウイルスグリコプロテインが単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤであることを特徴とする請求項１記載の抗腫瘍剤（請求項５）や、単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス１型のＫＯＳ株又は単純ヘルペスウイルス２型の１６９株であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の抗腫瘍剤（請求項６）や、請求項１〜６のいずれか記載の抗腫瘍剤を、腫瘍組織に直接投与することを特徴とする腫瘍の治療方法（請求項７）や、請求項１〜６のいずれか記載の抗腫瘍剤を、腫瘍組織に直接投与することを特徴とする転移性腫瘍等の遠隔腫瘍の治療方法（請求項８）や、不活性化処理を施した単純ヘルペスウイルス、又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを有効成分とすることを特徴とする腫瘍免疫誘導剤（請求項９）や、不活性化処理が、紫外線処理及び熱処理により不活性化させた単純ヘルペスウイルスを主成分とすることを特徴とする請求項９記載の腫瘍免疫誘導剤（請求項１０）や、紫外線処理が、２５４ｎｍの紫外光を用い４Ｊ／ｍ２、３０分間の照射処理であることを特徴とする請求項１０記載の腫瘍免疫誘導剤（請求項１１）や、熱処理が、５６℃、３０分間の加熱処理であることを特徴とする請求項１０記載の腫瘍免疫誘導剤（請求項１２）や、単純ヘルペスウイルスグリコプロテインが単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤであることを特徴とする請求項９記載の腫瘍免疫誘導剤（請求項１３）や、単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス１型のＫＯＳ株又は単純ヘルペスウイルス２型の１６９株であることを特徴とする請求項９〜１３のいずれか記載の腫瘍免疫誘導剤（請求項１４）や、請求項９〜１４のいずれか記載の腫瘍免疫誘導剤を、腫瘍組織に直接投与して細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）及び／又は抗体反応を誘導することを特徴とする腫瘍免疫の誘導方法（請求項１５）や、請求項９〜１４のいずれか記載の腫瘍免疫誘導剤を、腫瘍組織に直接投与して細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）及び／又は抗体反応を誘導し、かかる誘導されたＣＴＬｓ及び／又は抗体を用いることを特徴とする腫瘍抗原の同定方法（請求項１６）に関する。
【００１１】
また本発明は、不活性化処理を施した単純ヘルペスウイルス、又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを有効成分とすることを特徴とするＴ細胞活性化剤（請求項１７）や、不活性化処理が、紫外線処理及び熱処理により不活性化させた単純ヘルペスウイルスを主成分とすることを特徴とする請求項１７記載のＴ細胞活性化剤（請求項１８）や、紫外線処理が、２５４ｎｍの紫外光を用い４Ｊ／ｍ２、３０分間の照射処理であることを特徴とする請求項１８記載のＴ細胞活性化剤（請求項１９）や、熱処理が、５６℃、３０分間の加熱処理であることを特徴とする請求項１８記載のＴ細胞活性化剤（請求項２０）や、単純ヘルペスウイルスグリコプロテインが単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤであることを特徴とする請求項１７記載のＴ細胞活性化剤（請求項２１）や、単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス１型のＫＯＳ株又は単純ヘルペスウイルス２型の１６９株であることを特徴とする請求項１７〜２１のいずれか記載のＴ細胞活性化剤（請求項２２）や、請求項１７〜２２のいずれか記載のＴ細胞活性化剤を用いることを特徴とするＴ細胞の活性化方法（請求項２３）や、不活性化処理を施した単純ヘルペスウイルス、又は単純ヘルペスウイルスグリコプロテインを有効成分とすることを特徴とする樹状細胞活性化剤（請求項２４）や、不活性化処理が、紫外線処理及び熱処理により不活性化させた単純ヘルペスウイルスを主成分とすることを特徴とする請求項２４記載の樹状細胞活性化剤（請求項２５）や、紫外線処理が、２５４ｎｍの紫外光を用い４Ｊ／ｍ２、３０分間の照射処理であることを特徴とする請求項２５記載の樹状細胞活性化剤（請求項２６）や、熱処理が、５６℃、３０分間の加熱処理であることを特徴とする請求項２５記載の樹状細胞活性化剤（請求項２７）や、単純ヘルペスウイルスグリコプロテインが単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤであることを特徴とする請求項２４記載の樹状細胞活性化剤（請求項２８）や、単純ヘルペスウイルスが、単純ヘルペスウイルス１型のＫＯＳ株又は単純ヘルペスウイルス２型の１６９株であることを特徴とする請求項２４〜２８のいずれか記載の樹状細胞活性化剤（請求項２９）や、請求項２４〜２９のいずれか記載の樹状細胞活性化剤を、腫瘍組織に直接投与することを特徴とする樹状細胞の活性化方法（請求項３０）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の抗腫瘍剤、腫瘍免疫誘導剤、Ｔ細胞活性化剤、又は樹状細胞活性化剤としては、不活性化処理を施したＨＳＶや、単純ヘルペスウイルスグリコプロテインＤ（ＨＳＶｇＤ），Ｂ（ＨＳＶｇＢ），Ｃ（ＨＳＶｇＣ）等のＨＳＶグリコプロテインを有効成分とするものであれば、特に制限されるものではなく、上記抗腫瘍剤や腫瘍免疫誘導剤はインサイチュー癌ワクチンとしてきわめて有用である。ここでインサイチューとは悪性腫瘍組織に直接接種することがきわめて好ましいことを意味する。上記不活性化処理としては、公知のウイルス不活性化処理、例えば、加熱処理、紫外線照射、γ線照射、電子線照射、加圧処理、通電処理などの物理的不活性化処理方法や、フェノール、ホルマリン、アルコールなどの殺菌処理、アルカリ処理、ＤＮＡ分解酵素処理などの化学的不活性化処理方法や、界面活性剤の存在下での加熱処理など、これら物理的不活性化処理方法と化学的不活性化処理方法を併用する方法を挙げることができるが、ここでの不活性化処理には、遺伝子操作による変異処理は含まれない。
【００１３】
これらウイルスの不活性化処理の中でも、紫外線処理等のウイルスＤＮＡを破壊する処理と、熱処理等の感染力を喪失させるタンパク質の変性処理とを併用した不活性化処理が、癌ワクチンの安全性の面からして特に好ましい。かかる紫外線処理としては、生物の遺伝子に損傷を誘発する効果がある波長１９０〜３００ｎｍ遠紫外線、中でもＤＮＡ及びＲＮＡの塩基に吸収され、吸収された光量子エネルギーにより形成された、チミン−チミン、チミン−シトシン、シトシン−シトシン、ウラシル−ウラシル等の二量体により、細胞分裂の際の複製を停止させる２５４ｎｍの紫外線を用い、１〜１０Ｊ／ｍ２、好ましくは４Ｊ／ｍ２、５〜６０分間、好ましくは３０分間の照射処理を好適に例示することができ、また、熱処理としては、４５〜８０℃で５〜１０時間の加熱処理、好ましくは５６℃、３０分間の加熱処理を好適に例示することができる。
【００１４】
また、本発明の抗腫瘍剤、腫瘍免疫誘導剤、Ｔ細胞活性化剤、又は樹状細胞活性化剤の製造において、不活性化処理されるＨＳＶとしては、ＨＳＶ−１及び単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）の野生株の他、遺伝子操作により変異処理を受けた変異株を挙げることができるが、不活性化処理後のＨＳＶが安全性において問題がないものが好ましく、具体的には、野生型のＨＳＶ、例えばＨＳＶ−１のＫＯＳ株又はＨＳＶ−２の１６９株を好適に挙げることができる。そしてまた、上記ＨＳＶｇＤ，ＨＳＶｇＢ，ＨＳＶｇＣ等のＨＳＶグリコプロテインとしては、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の野生株の他、遺伝子操作により変異処理を受けた変異株、不活性化処理株に由来するｇＤ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄ），ｇＢ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂ），ｇＣ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ）等のＨＳＶグリコプロテインを挙げることができる。これらＨＳＶグリコプロテインは、大腸菌等の細菌や酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞などを宿主細胞として用い、リコンビナント蛋白として好適に作製することができる。
【００１５】
本発明の抗腫瘍剤や腫瘍免疫誘導剤は、インサイチュー癌ワクチンとして悪性脳腫瘍をはじめとした癌の再発・転移予防薬・治療薬として、また、本発明のＴ細胞活性化剤や樹状細胞活性化剤は、悪性脳腫瘍をはじめとした癌の再発・転移予防薬・治療薬の他、Ｔ細胞の活性化や樹状細胞の活性化（抗原提示能力の増強等）が必要とされる各種疾病の予防薬・治療薬として有用であり、医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。また、これら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできるが、悪性腫瘍組織に直接接種することが、即答的な腫瘍特異的免疫応答を誘導しうる点で好ましい。
【００１６】
本発明の腫瘍の治療方法、好ましくは転移性腫瘍等の遠隔腫瘍の治療方法としては、本発明の抗腫瘍剤を、腫瘍組織に直接接種することにより投与する処理方法であれば特に制限されるものではなく、かかる治療方法により、悪性腫瘍の治療や再発・転移の予防が可能になる。本発明の腫瘍免疫の誘導方法としては、本発明の腫瘍免疫誘導剤を腫瘍組織に直接投与してＣＴＬｓ及び／又は抗体反応を誘導する方法であれば特に制限されるものではなく、本発明の腫瘍免疫の誘導方法を利用すると、マウス等の腫瘍モデルに直接接種して免疫応答誘導の作用機序、特に遠隔腫瘍に対する免疫応答誘導の作用機序を調べることができ、また、生体内にＣＴＬｓや抗体反応を誘導することができる。また、本発明の腫瘍抗原の同定方法としては、本発明の腫瘍免疫誘導剤をマウス等の腫瘍モデルに直接接種投与して生体内でＣＴＬｓ及び／又は抗体反応を誘導し、かかる誘導されたＣＴＬｓ及び／又は抗体を用いる方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、ｃＤＮＡライブラリーを細胞に遺伝子導入して、ｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現した哺乳動物細胞と誘導されたＣＴＬｓを共培養し、ＣＴＬｓが認識したペプチドに由来するタンパク質をコードするｃＤＮＡを解析することにより新たな腫瘍抗原の同定が可能となる。
【００１７】
本発明のＴ細胞の活性化方法としては、本発明のＴ細胞活性化剤を用いて、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）、エクスビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）でヒト等のＴ細胞を活性化する方法であれば特に制限されるものではないが、インビボでＴ細胞を活性化する場合、本発明のＴ細胞活性化剤を腫瘍組織に直接投与することが好ましい。また、本発明の樹状細胞の活性化方法としては、本発明の樹状細胞活性化剤を用いて、インビボ、インビトロ、エクスビボでヒト等の樹状細胞の活性化方法であれば特に制限されるものではないが、インビボで樹状細胞を活性化する場合、本発明の樹状細胞活性化剤を腫瘍組織に直接投与することが好ましい。これら本発明のＴ細胞の活性化方法や樹状細胞の活性化方法を用いることにより、Ｔ細胞の活性化や樹状細胞の活性化を必要とする疾病の治療や研究が可能となる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（ウイルス、細胞株、増殖）
ウイルスとして、ＨＳＶ−１のＫＯＳ株、ＨＳＶ−２の１６９株（瀬戸淑子博士より供与）を用いた。ＨＳＶの増殖には、アフリカミドリザル腎細胞株Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ社より購入）を用いた。Ｖｅｒｏ細胞は、１０％非働化牛胎児血清（ＩＦＣＳ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて培養し、ウイルス増殖時は１％　ＩＦＣＳ添加ＤＭＥＭを用いて培養した。ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞よりウイルスバッファー（１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、２０ｍＭ　トリス、ｐＨ７．５）中で凍結融解を繰り返し、超音波破砕後にバッファー上清より回収した。
【００１９】
実施例２（ＨＳＶの不活性化）
供試ＨＳＶに紫外線処理と熱処理による不活性化処理を行った。供試ＨＳＶとして、不活性化前の感染効率が２×１０８プラーク形成ｕｎｉｔ／ｍｌのものを使用した。紫外線による不活性化は　Ｄａｖｉｄ　Ｃ．Ｊ．ら（Ｊ．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　６２，　４６０５−４６１２，　１９８８）の方法を一部改変して、氷上で２５４ｎｍの紫外光を用い４Ｊ／ｍ２、３０分間の照射を行った。続いて、この紫外線処理を施したＨＳＶに熱処理を施した。熱処理による不活性化は　Ｈｉｔｓｕｍｏｔｏ　Ｙ．ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　２７，　７５７−７６５，　１９８３）の方法を一部改変して、５６℃、３０分間の熱変性処理を行った。
【００２０】
実施例３（不活化ＨＳＶを用いたマウス両側皮下腫瘍モデルにおけるインサイチュー癌ワクチン）
メス６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを麻酔（０．２５ｍｌ麻酔液；８４％生理食塩水、１０％ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｍｌ）、６％エタノール）後、５×１０５個／１００μｌのＣＴ２６をマウス両側腹部皮下に移植した。腫瘍径が約５ｍｍに達した時点で治療を開始した。コントロールとして、ウイルス調製に使用したＶｅｒｏ細胞の抽出液を紫外線照射及び熱処理したもの（以下、ｍｏｃｋ）を用いた。不活化ＨＳＶあるいはｍｏｃｋを治療開始後０日目及び３日目に右側腫瘍内にのみ投与し、以後、両側腫瘍体積を経時的に計測した。体積は長径×（短径）２÷２として計算した。直接投与（接種）した右側腫瘍（Ｒｔ）の腫瘍体積の経時変化の結果を図１に、遠隔腫瘍である左側腫瘍（Ｌｔ）の腫瘍体積の経時変化の結果を図２に示す。図１からわかるように、不活化ＨＳＶ−１ＫＯＳ株投与群（ｎ＝７）又は不活化ＨＳＶ−２　１６９株投与群（ｎ＝７）においては、投与開始１５日後、ＣＴ２６腫瘍の増殖がｍｏｃｋ投与群（ｎ＝６）に比較して統計学上有意に抑制されていた。また、図２からわかるように、直接投与していない左側の遠隔腫瘍についても、不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳ株投与群又は不活化ＨＳＶ−２　１６９株投与群においては、投与開始１５日後、ＣＴ２６による腫瘍の増殖がｍｏｃｋ投与群に比較して統計学上有意に抑制されており、本発明のインサイチュー癌ワクチンが遠隔腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。
【００２１】
実施例４（不活化ＨＳＶによる細胞障害性Ｔ細胞活性試験）
治療開始後１０日目に、インサイチュー癌ワクチン（不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳ株）を投与したマウスより、脾細胞を摘出し、ＣＴ２６細胞との共培養を行った。７日間の共培養の後、５１Ｃｒ放出試験を行った。ターゲット細胞として、５０μＣｉの５１ＣｒをとりこませたＣＴ２６細胞又はＭｅｔｈ　Ａ細胞を用いた。９６穴プレート１穴あたり、２．５×１０３個のターゲット細胞と、エフェクター細胞としてそれぞれ４．０×１０４個、１．３×１０４個、４．３×１０３個の脾細胞を５％二酸化炭素存在下、３７℃で４時間培養し、培養上清中に放出された５１Ｃｒをガンマカウンターにより測定した。種々のエフェクター細胞／ターゲット細胞比（Ｅ／Ｔ　ｒａｔｉｏ）におけるＣＴ２６細胞（ｎ＝３）の溶解率の結果を図３に、Ｍｅｔｈ　Ａ細胞（ｎ＝３）の溶解率の結果を図４に示す。図３からわかるように、インサイチュー癌ワクチン投与群では抗腫瘍ＣＴＬ活性がｍｏｃｋ群に比べて大きく、またＥ／Ｔ　ｒａｔｉｏが大きいほどｍｏｃｋとの差が拡大していた。これに対して、Ｍｅｔｈ　Ａ細胞については、図４に示されているように、インサイチュー癌ワクチン投与群及びｍｏｃｋ群ともに、ＣＴＬ活性が誘導されておらず、この結果は、本発明のインサイチュー癌ワクチンが特異的な抗腫瘍ＣＴＬ活性を誘導することを裏付けている。
【００２２】
実施例５（不活化ＨＳＶによるヒト樹状細胞の抗原提示能力の増強効果）
ヒト末梢血から免疫磁気ビーズ法にてＣＤ１４陽性のサブセットを分離・培養することにより未成熟樹状細胞を得た。具体的には、ＣＤ１４抗原に対する磁気ビーズ結合モノクローナル抗体（２０μｌ／１０７細胞；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ　社製）を４℃にて、１５分間反応させ、磁気細胞分離システムＭＡＣＳを用いて、ビーズ結合細胞を磁気により分離することにより、ＣＤ１４陽性分画を分離して、１×１０６個／ｗｅｌｌの濃度で、ＧＭ−ＣＳＦ（免疫生物研究所製）濃度が１００ｎｇ／ｍｌ及びＩＬ−４（免疫生物研究所製）濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように調製した１０％ＦＢＳ（胎仔血清）を含むＲＰＭＩ培地で６〜７日培養を行い、未成熟樹状細胞を得た。フローサイトメーターにて未成熟樹状細胞としての表面抗原の発現（ＣＤ１ａ＋，ＣＤ１４−，ＣＤ８０＋，ＣＤ８６＋）を確認した後、実施例２記載の方法で調製した不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳ株を不活化前のＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．１，１，１０ＰＦＵ（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）／ｃｅｌｌｓの濃度で、あるいはｍｏｃｋを添加して、１時間後さらに成熟化因子であるＴＮＦ−α（免疫生物研究所社製）濃度が１０ｎｇ／ｍｌ及びＩＦＮ−γ（免疫生物研究所社製）濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した後、一晩培養した。翌日、フローサイトメーターにて成熟樹状細胞としての表面抗原ＣＤ８３（未成熟樹状細胞では陰性）の発現を確認した。
【００２３】
次いで、この不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳ株を添加して誘導された成熟樹状細胞のアロリンパ球を活性化する能力を検討した。コントロールとして、ｍｏｃｋ及び不活化ＨＳＶを加えずに、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）とＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍｌ）のみ添加して誘導された成熟樹状細胞を用いた。アロリンパ球（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として６×１０４個のＣＤ１４陰性分画の末梢血と、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとして放射線照射（１５Ｇｙ）して増殖を止めた成熟樹状細胞（ＤＣ）との混合培養（ＤＣとｒｅｓｐｏｎｄｅｒの比率は１：２０あるいは１：４０）を３日間行い、培養リンパ球を０．０２７Ｍｂｑ／穴の　３Ｈ−チミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）で約１２時間標識化して、取り込まれた　３Ｈ−チミジンの量（ＣＰＭ：ｃｏｕｎｔｅｒ　ｐｅｒ　ｍｉｎｕｔｅ）をトップカウンターにて測定した。成熟樹状細胞との混合培養後、リンパ球により取り込まれた　３Ｈ−チミジン量のコントロールとの比を図５に示す。その結果、不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳ株を添加した成熟樹状細胞はコントロールや不活化処理したｍｏｃｋと比較して、より高いリンパ球を活性化する能力があることが示された。これらの結果から、不活化ＨＳＶは、ヒト樹状細胞の抗原提示能力を増強させる作用を有することが明らかになった。
【００２４】
実施例６（ＨＳＶｇＤを用いたマウス両側皮下腫瘍モデルにおけるインサイチュー癌ワクチン）
メス６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを麻酔（０．２５ｍｌ麻酔液；８４％生理食塩水、１０％ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｍｌ）、６％エタノール）後、５×１０５個／１００μｌのＣＴ２６をマウス両側腹部皮下に移植し、腫瘍径が約５ｍｍに達した時点で治療を開始した。コントロールとして、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を用いた。ＨＳＶタイプ１（ＨＳＶ−１）のｇＤ蛋白質（ｖｉｒｏｓｔａｔ社製）の生理食塩水溶液あるいは生理食塩水を治療開始後０，３，６，９及び１２日目に右側腫瘍内にのみそれぞれ３０μｌずつ投与し、以後、両側腫瘍体積を経時的に計測した。体積は長径×（短径）２÷２として計算した。直接投与（接種）した右側腫瘍（Ｒ）の腫瘍体積の経時変化、及び遠隔腫瘍である左側腫瘍（Ｌ）の腫瘍体積の経時変化の結果を図６に示す。図６（右）からわかるように、ＨＳＶｇＤ総投与量３０ｎｇ投与群（ｎ＝７）においては、投与開始２４日後、投与側のＣＴ２６腫瘍の増殖が生理食塩水投与群（ｎ＝３）に比較して統計学上有意に抑制されていた。また、図６（左）からわかるように、直接投与していない左側の遠隔腫瘍についても、ＨＳＶｇＤ３ｎｇ投与群又はＨＳＶｇＤ３０ｎｇ投与群においては、投与開始２４日後、ＣＴ２６による腫瘍の増殖が生理食塩水投与群に比較して統計学上有意に抑制されており、本発明のインサイチュー癌ワクチンが遠隔腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示すことが明らかとなった。また、ＨＳＶｇＤの抗腫瘍効果は投与量に依存する傾向が認められた。
【００２５】
上記ＨＳＶｇＤを用いたインサイチュー癌ワクチンにおける抗腫瘍効果を再確認するために、ネガティブコントロールとしてＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）、ポジティブコントロールとして実施例２と同様に調製した不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳ株を用いた。生理食塩水に溶解したＨＳＶｇＤとＢＳＡを治療開始後０，３及び６日目に右側腫瘍内にのみそれぞれ３０μｌずつ投与し、以後、両側腫瘍体積を経時的に計測した。不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳ株は治療開始後０及び３日目に右側腫瘍内にのみ５０μｌ投与した。直接投与（接種）した右側腫瘍（Ｒ）の腫瘍体積の経時変化、及び遠隔腫瘍である左側腫瘍（Ｌ）の腫瘍体積の経時変化の結果を図７に示す。図７（右）からわかるように、ＨＳＶｇＤ総投与量３０ｎｇ投与群（ｎ＝７）は、ＫＯＳ投与群（不活性化前の感染効率が２×１０７ＰＦＵ）（ｎ＝７）と同様の挙動を示し、投与開始１８日後、投与側のＣＴ２６腫瘍の増殖がＢＳＡ総投与量３００ｎｇ投与群（ｎ＝６）に比較して抑制されていた。また図７（左）からわかるように、直接投与していない左側の遠隔腫瘍についても、ＨＳＶｇＤ３０ｎｇ投与群（ｎ＝８）は、ＫＯＳ投与群（ｎ＝７）と同様の挙動を示し、投与開始１８日後、ＣＴ２６腫瘍の増殖がＢＳＡ総投与量３００ｎｇ（ｎ＝７）投与群に比較して統計学上有意に抑制されており、本発明のインサイチュー癌ワクチンが遠隔腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示すことを再確認した。
【００２６】
実施例７（ＨＳＶｇＤのＴ細胞に対する作用）
６週齢メスのＣ５７ＢＬ／６マウスのリンパ節から免疫磁気ビーズ法にてＴ細胞を得た。具体的には、ＣＤ９０，ＣＤ４５Ｒ，ＭＨＣ　ＣｌａｓｓＩＩ，ＣＤ１１ｃに対する磁気ビーズ結合モノクローナル抗体（各１０μｌ／１０７細胞；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を４℃にて、１５分間反応させ、磁気細胞分離システムＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、ビーズ結合細胞を磁気により分離することにより、Ｔ細胞画分を分離して、（ＣＤ９０＋，ＣＤ４５Ｒ−，ＭＨＣ　ＣｌａｓｓＩＩ−，ＣＤ１１ｃ−）の画分をＴ細胞として分離した。６×１０４個／ｗｅｌｌのＴ細胞に、抗ＣＤ３抗体（０．０１ｎｇ／ｍｌ）とＨＳＶ−１のｇＤ蛋白質（０．０５ｎｇ／ｍｌ；ｖｉｒｏｓｔａｔ社製）とのそれぞれ存在下、非存在下に５日間培養を行った。培養リンパ球を　３Ｈ−チミジンで約１２時間標識化した後、取り込まれた　３Ｈ−チミジンの量（ＣＰＭ）をトップカウンターにて測定した。結果を図８に示す。図８から、Ｔ細胞レセプターを刺激する抗ＣＤ３抗体あるいはＨＶＥＭ（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｅｎｔｒｙ　ｍｅｄｉａｔｏｒ）のリガンドであるＨＳＶ−１のｇＤ単独では活性されず、両者の刺激により初めてＴ細胞が活性化されることが明らかになった。ＴＮＦサイトカインファミリーであるＬＩＧＨＴは共刺激因子としてＨＶＥＭを介して、Ｔ細胞を活性化することが明らかにされている（Ｎａｔ　Ｍｅｄ　６，　２８３−２８９，　２０００）。ＨＳＶｇＤはＨＶＥＭのリガンドであることから、ＨＳＶｇＤはＴ細胞に対する共刺激因子として、Ｔ細胞の活性化に働くことが明らかになった。
【００２７】
実施例８（ＨＶＥＭを介してのＨＳＶｇＤによるＴ細胞の活性化）
実施例７と同じ方法を用いてマウスＴ細胞を分離した。６×１０４個／ｗｅｌｌでＴ細胞をまき、ＨＳＶ−１のｇＤ（０．２ｎｇ又は０．４ｎｇ）及び／又は抗ＨＶＥＭモノクローナル抗体（０．０１ｎｇ／ｍｌ；Ｄｒ　Ｐａｔｒｉｃｉａ　Ｇ．　Ｓｐｅａｒ、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　ＵＳＡ　より供与）の存在下あるいは非存在下（ｃｏｎｔｒｏｌ）に５日間培養を行った。培養リンパ球を　３Ｈ−チミジンで約２４時間標識化した後、取り込まれた　３Ｈ−チミジンの量（ＣＰＭ）をトップカウンターにて測定した。結果を図９に示す。図９から、ＨＳＶｇＤ　０．４ｎｇを加えたＴ細胞は活性化されたが、ＨＳＶｇＤ　０．４ｎｇにＨＳＶｇＤの受容体であると考えられるＨＶＥＭをブロックする抗ＨＶＥＭモノクローナル抗体を加えることで、Ｔ細胞の活性化が阻害された。この実験から、ＨＳＶｇＤによるＴ細胞の活性化はＨＶＥＭ受容体を介したシグナルによるものであることが証明された。
【００２８】
実施例９（ＨＳＶｇＤによるヒト樹状細胞の抗原提示能力の増強効果）
基本的に実施例５と同様な方法でヒト末梢血から培養７日目に未成熟樹状細胞を得て、培地（コントロール）、ＨＳＶｇＤ（０．２ｎｇ／ｍｌ，０．４ｎｇ／ｍｌ）、又はｍｏｃｋを添加した。本実験ではＨＳＶｇＤ（０．２ｎｇ又は０．４ｎｇ）を添加された未成熟樹状細胞によるアロリンパ球を活性化する能力を検討した。アロリンパ球（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として６×１０４個のＣＤ１４陰性分画の末梢血と、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとして放射線照射（１５Ｇｙ）して増殖を止めた樹状細胞（ＤＣ）との混合培養（ＤＣとｒｅｓｐｏｎｄｅｒの比率は１：２０あるいは１：４０）を５日間行い、培養リンパ球を０．０２７Ｍｂｑ／穴の　３Ｈ−チミジンで約１２時間標識化して、取り込まれた　３Ｈ−チミジンの量（ＣＰＭ）をトップカウンターにて測定した。樹状細胞と混合培養後、リンパ球により取り込まれた　３Ｈ−チミジン量のコントロールとの比を図１０に示す。その結果、ＨＳＶｇＤを添加した樹状細胞は、コントロールやｍｏｃｋと比較して、より高いリンパ球を活性化する能力があることが示された。これらの結果から、ＨＳＶｇＤは、ヒト樹状細胞の抗原提示能力を増強させる作用を有することが明らかになった。
【００２９】
実施例１０（ＨＳＶｇＤによるヒトリンパ球の活性化）
ヒト末梢血から免疫磁気ビーズ法にてＣＤ１４陽性のサブセットを分離・除去することによりＣＤ１４陰性分画の末梢血を得た。具体的には、ＣＤ１４抗原に対する磁気ビーズ結合モノクローナル抗体（２０μｌ／１０７細胞）を４℃にて、１５分間反応させ、磁気細胞分離システムＭＡＣＳを用いて、ビーズ結合細胞を磁気により分離・除去することにより、ＣＤ１４陰性分画の末梢血を得た。この末梢血中のリンパ球をアロリンパ球（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として６×１０４個／ｗｅｌｌでまき、各ｗｅｌｌにＴ細胞レセプターの刺激分子としてＯＫＴ３（０又は１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、さらに共刺激分子として不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳ株（不活性化前の感染効率　２×１０６ＰＦＵ）もしくはｇＤ（０．２ｎｇ／ｍｌ）又はｍｏｃｋ（１０μｌ）を加え培養を行った。培養６日目に培養リンパ球を０．０２７Ｍｂｑ／穴の　３Ｈ−チミジンで約１２時間標識化して、取り込まれた　３Ｈ−チミジンの量（ＣＰＭ）をトップカウンターにて測定した。結果を図１１に示す。これらの結果から、抗ＣＤ３モノクローナル抗体であるＯＫＴ３の非存在下ではＴ細胞が活性化されず、ｇＤ及びＯＫＴ３（１０ｎｇ／ｍｌ）共存在下では、ヒトリンパ球を活性化し得ることが示された。以上のことから、マウスの実験（実施例７）同様に、ヒトにおいてもＨＳＶｇＤは共刺激因子としてＴ細胞を活性化しうると考えられる。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によると、転移性腫瘍等ヒトの遠隔腫瘍に対しても抗腫瘍効果を示すなど、癌に対する免疫療法が可能な抗腫瘍免疫反応を誘導できる、きわめて安全性の高い抗腫瘍剤、腫瘍免疫誘導剤、Ｔ細胞活性化剤、樹状細胞活性化剤を提供することができる。これらの抗腫瘍剤、腫瘍免疫誘導剤等は、広く癌治療への応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳ及び不活化ＨＳＶ−２　１６９の腫瘍内接種により、ｍｏｃｋ接種の対照群と比較して、接種腫瘍（右側腫瘍：Ｒｔ）の増殖が抑制されることを示す図である。（縦軸：腫瘍体積、横軸：ワクチン治療開始後の日数）
【図２】不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳ及び不活化ＨＳＶ−２　１６９の腫瘍内接種により、ｍｏｃｋ接種の対象群と比較して、遠隔腫瘍（左側腫瘍：Ｌｔ）の増殖が抑制されることを示す図である。（縦軸：腫瘍体積、横軸：ワクチン治療開始後の日数）
【図３】ＣＴ２６細胞に対する、不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳの腫瘍内接種による細胞障害性Ｔ細胞誘導活性の結果を示す図である。
【図４】Ｍｅｔｈ　Ａ細胞に対する、不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳの腫瘍内接種による細胞障害性Ｔ細胞誘導活性の結果を示す図である。
【図５】不活化ＨＳＶによるヒト樹状細胞の抗原提示能力の増強効果を示す図である。図中、ＨＳＶ０．１はＭＯＩ＝０．１のＨＳＶを不活化したものであり、ＨＳＶ１はＭＯＩ＝１のＨＳＶを不活化したものであり、ＨＳＶ１０はＭＯＩ＝１０のＨＳＶを不活化したものであり、ＤＣ：Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒは成熟樹状細胞とアロリンパ球の比率を示す。
【図６】ＨＳＶ−１ｇＤの腫瘍内接種により、生理食塩水接種の対照群と比較して、接種腫瘍（右側腫瘍：Ｒ）及び遠隔腫瘍（左側腫瘍：Ｌ）の増殖が抑制されることを示す図である。
【図７】ＨＳＶ−１ｇＤの腫瘍内接種により、生理食塩水接種の対照群と比較して、不活化ＨＳＶ−１　ＫＯＳの腫瘍内接種と同様に、接種腫瘍（右側腫瘍：Ｒ）及び遠隔腫瘍（左側腫瘍：Ｌ）の増殖が抑制されることを示す図である。
【図８】抗ＣＤ３抗体とＨＳＶ−１ｇＤの共刺激によるＴ細胞の活性化の結果を示す図である。
【図９】ＨＳＶ−１ｇＤによるＴ細胞の活性化作用が、抗ＨＶＥＭモノクローナル抗体により阻害される結果を示す図である。
【図１０】ＨＳＶ−１ｇＤによるヒト樹状細胞の抗原提示能力の増強効果を示す図である。
図中、ＤＣ／Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒは樹状細胞とアロリンパ球の比率を示す。
【図１１】ＨＳＶｇＤによるヒトリンパ球の活性化の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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