(57)【要約】【課題】霊長類胎仔への安全な遺伝子導入方法及びそのための複合体を提供すること。【解決手段】リポソーム性ベクターと、霊長類胎仔へ導入すべき所望の遺伝子を含む核酸との複合体から成る、霊長類胎仔への遺伝子導入用複合体を提供した。【効果】本発明の方法により、霊長類の胎仔に所望の遺伝子を導入することが可能になったので、遺伝子治療や遺伝子ワクチンによる免疫付与への道が開かれた。また、実験動物用の霊長類、とりわけ、サル（特に旧世界ザル及び新世界ザル）はヒトに近い胎盤構造を持っていることから、サルに対して本発明の方法を適用することにより、ヒトにおいても、胎児に対する積極的な遺伝子治療やＤＮＡワクチンの効果等を研究することもできる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム性ベクターと、霊長類胎仔へ導入すべき所望の遺伝子を含む核酸との複合体から成る、霊長類胎仔への遺伝子導入用複合体。
【請求項２】
前記核酸が、プラスミドである請求項１記載の複合体。
【請求項３】
皮下投与用である請求項１又は２記載の複合体。
【請求項４】
静脈内投与用である請求項１又は２記載の複合体。
【請求項５】
妊娠末期の霊長類投与用である請求項１又は２記載の複合体。
【請求項６】
請求項１又は２記載の遺伝子導入用複合体を、妊娠霊長類（ヒトを除く）に投与することを含む、霊長類胎仔への遺伝子導入方法。
【請求項７】
皮下投与により投与する請求項６記載の方法。
【請求項８】
静脈内投与により投与する請求項６記載の方法。
【請求項９】
妊娠末期に投与する請求項６ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
サルに投与する請求項６ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サルは、旧世界ザル又は新世界ザルである請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、霊長類胎仔への遺伝子導入方法及びそのための複合体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子治療とは、正常な遺伝子を細胞に補い、あるいは遺伝子の欠陥を修復・修正することで疾患を治療する手法である。遺伝子疾患はすでに多数が知られ、また高血圧などの生活習慣病や癌、神経難病等も遺伝子の影響を受けることが解明されつつあり、そのような観点から、胎児への遺伝子導入は、遺伝子治療研究の最重要課題となっている。
【０００３】
その一方で、ヒトの妊娠時に遺伝子治療を施す場合の、胎児への影響という観点からの安全性についても、十分考慮する必要がある。
【０００４】
これまで動物胎仔への遺伝子導入実験（ウイルス性ベクターを含む）では、羊水内投与や臍帯内投与、胎仔腹腔内投与、胎仔気管内投与、胎仔心室内投与が試されているが、投与方法自体に困難が伴い、臨床で用いるには母体や胎児に対してあまりにも危険性が高すぎるという問題点があった。
【０００５】
胎盤は、母体胎仔間での酸素、炭酸ガスをはじめ種々の生体物質の交換や種々の生体機能物質・因子を産出する器官である。動物によりこの胎盤の形状や子宮内分布に違いが見られる。動物の胎盤は、母体血と胎仔血との間に存在する関門構造の特徴から、大まかに▲１▼上皮絨毛胎盤、▲２▼結合織絨毛胎盤、▲３▼内皮絨毛胎盤及び▲４▼血絨毛胎盤に区分けされる。霊長類（ただし原猿類は除く）、齧歯類は、いずれも、血絨毛胎盤のグループに属している。
【０００６】
物質の胎盤通過で問題になるのは、血絨毛胎盤の胎仔毛細血管内皮細胞層と母胎血との間に存在する胎仔側細胞層の数である。この胎仔側細胞層は、マウス、ラットでは、胎仔毛細血管内皮細胞層と母胎血との間に３層の栄養膜層が存在するが、ヒト、類人猿、旧世界ザル、新世界ザルでは１層である。すなわち、旧世界ザルや新世界ザルは、マウス、ラット等の汎用実験動物と比較すれば、よりヒトに近い胎盤関門を持っているということができる。したがって、マウス、ラットでは胎盤通過が認められなかった薬剤等が、霊長類の胎盤を通過する可能性が考えられる。
【０００７】
これまでに２つの研究グループがマウスを実験動物として用い、妊娠マウスに投与したプラスミドＤＮＡが胎盤経由で胎仔へ移行することを示している。
【０００８】
ＴｓｕｋａｍｏｔｏらはリポソームＤＮＡ複合体を投与した妊娠マウス９７匹全てにおいて導入遺伝子が胎仔へ移行したことを報告した（非特許文献１）。彼らはまた、発現プラスミドリポポリアミン複合体を妊娠マウスに１回静脈内投与し、導入遺伝子が胚へ移行すること、そして遺伝子発現が胎仔や出生後のマウスでも見られたことを報告している（非特許文献２）。Ｓｈｕｂｂｅｒｔらは、妊娠マウスにＭ１３ファージ或いはｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドを単に食べさせ、胎仔や新生仔の様々な臓器で導入遺伝子の断片は検出したが、導入遺伝子の発現は認めることができなかった（非特許文献３）。
【０００９】
これとは対照的に、Ｇａｅｎｓｌｅｒらは妊娠ラットに陽イオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体を静脈内投与し、胎仔組織においてレポーター遺伝子の発現を認めることができなかった（非特許文献４）。齧歯類においてさえも、リポソーム形成ＤＮＡが胎盤を通過し胎仔へ移行するかどうかは定まっていない。母体−胎仔移行は胎盤構造に依存し、その胎盤構造は霊長類と齧歯類とでは異なっている。そのため、霊長類モデルにおけるリポソーム−ＤＮＡ複合体の胎盤通過に関する研究が必要とされる。しかしながら、今日まで霊長類においては、このような複合体の母体−胎仔に関する知見の蓄積が全くなかった。
【００１０】
【非特許文献１】
Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ　Ｍ，　Ｏｃｈｉｙａ　Ｔ，　Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎｐｒｏｇｅｎｙ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ＤＮＡ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ｐｒｅｇｎａｎｔ　ｍｉｃｅ．　Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ　１９９５；　９：　２４３−２４８．
【非特許文献２】
Ｏｃｈｉｙａ　Ｔ，　Ｔａｋａｈａｍａ　Ｙ，　Ｂａｂａ−Ｔｏｒｉｙａｍａ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｔｉｏｎｉｃ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎｔｏ　ｐｒｅｇｎａｎｔ　ａｎｉｍａｌｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　１９９９；　２５８：　３５８−３６５．
【非特許文献３】
Ｓｃｈｕｂｂｅｒｔ　Ｒ，　Ｈｏｈｌｗｅｇ　Ｕ，　Ｒｅｎｚ　Ｄ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｏｎ　ｔｈｅ　ｆａｔｅ　ｏｆ　ｏｒａｌｌｙ　ｉｎｇｅｓｔｅｄ　ｆｏｒｅｉｇｎ　ＤＮＡ　ｉｎ　ｍｉｃｅ：　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｌａｃｅｎｔａｌ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｔｏｔｈｅ　ｆｅｔｕｓ．　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　１９９８；　２５９：　５６９−５７６．
【非特許文献４】
Ｇａｅｎｓｌｅｒ　ＫＭＬ，　Ｔｕ　Ｇ，　Ｂｒｕｃｈ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｆｅｔａｌ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｂｙ　ｔｒａｎｓｕｔｅｒｉｎｅ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｔｉｏｎｉｃ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ＤＮＡ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．　Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１９９９；　１７：　１１８８−１１９２．
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、霊長類胎仔への安全な遺伝子導入方法及びそのための複合体を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、リポソーム性ベクターと、霊長類胎仔に導入すべき所望の遺伝子を含む核酸との複合体を、妊娠霊長類に投与することにより、霊長類胎仔に前記所望の遺伝子を安全に導入することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、リポソーム性ベクターと、霊長類胎仔へ導入すべき所望の遺伝子を含む核酸との複合体から成る、霊長類胎仔への遺伝子導入用複合体を提供する。また、本発明は、上記本発明の遺伝子導入用複合体を、妊娠霊長類（ヒトを除く）に投与することを含む、霊長類胎仔への遺伝子導入方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の霊長類胎仔への遺伝子導入用複合体は、リポソーム性ベクターと、霊長類胎仔へ導入すべき所望の遺伝子を含む核酸との複合体から成る。
本発明の遺伝子導入用複合体に含まれる核酸は、霊長類胎仔へ導入すべき所望の　遺伝子を含むものである。ここで、導入すべき所望の遺伝子は、何ら限定されるものではなく、遺伝病の治療のための遺伝子や遺伝子ワクチンを挙げることができる。導入すべき所望の遺伝子の具体例としては、例えば、血友病や免疫異常症等の先天的遺伝子異常疾患治療のための遺伝子並びにサルＢウイルスやヒトヘルペスウイルス感染症に対する遺伝子ワクチン（主要ウイルス抗原の糖蛋白質−Ｄをコードする遺伝子）、および花粉症・喘息などアレルギー症治療のための遺伝子ワクチンを挙げることができる。あるいは、機能不明の遺伝子を実験用霊長動物（ヒトは含まない）に導入して、その遺伝子の機能を解明するために本発明を適用することも可能である。この場合には、導入すべき所望の遺伝子は、機能を解明しようとする遺伝子である。導入すべき所望の遺伝子は、哺乳動物細胞用の発現ベクターのクローニング部位に挿入されて組換えベクター中に含まれることが好ましい。哺乳動物細胞用の発現ベクターは、周知であり、種々のものが市販されている。これらの市販の発現ベクターを用いることができる。なお、哺乳動物細胞用の発現ベクターには、ウイルス由来の領域を主体とするウイルスベクターと、プラスミド由来の領域を主体とするプラスミドベクターがあるが、安全性の観点から、プラスミドベクターが好ましい。
【００１５】
本発明の遺伝子導入用複合体に用いられるリポソーム性ベクターは、霊長類の胎盤を介して胎仔に遺伝子を導入できるものであれば限定されないが、生きた霊長類に安全に遺伝子を導入する観点から、少なくとも陽イオン性脂質（カチオニックリピッド）を含む混合ハイブリッドリポソームベクターを用いることが好ましい。リポソームベクターを形成するためのカチオニックリピッド自体は、この分野において周知であり、市販もされている。例えば、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から市販されているＤＯＴＡＰ（物質名：Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート）等の市販のカチオニックリピッドを好ましく用いることができる。リポソームベクターは、上記核酸及びカチオニックリピッドに加え、例えば、バーキットストロマウイルス−Ｇタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（Ａｂｅ，　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ，　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．，　７２：　６１５９−６１６３　（１９９８））のような他のタンパク質及びポリブレン（ヘキサジメトリンブロミド）のようなポリカチオンをさらに混合することが好ましい。ＶＳＶ−Ｇのようなタンパク質を加える目的は、ＶＳＶ−Ｇが遺伝子導入する細胞・組織の細胞膜を構成するリン脂質（特に、ホスファティジールセリン）と強く結合して、細胞内への遺伝子導入効率を高めるためであり、ポリブレンのようなポリカチオンを加える目的は、遺伝子導入する細胞・組織の細胞表層に存在するヘパリン様ペプチドグリカン類の荷電状態を中和して、遺伝子・ＤＮＡの細胞表層への結合効率ひいては細胞内への遺伝子導入効率を高めるためである。なお、上記核酸、カチオニックリピッド、ＶＳＶ−Ｇのようなタンパク質、及びポリブレンの混合比率（重量比）は、特に限定されないが、通常、核酸を１とした場合、カチオニックリピッドが１／５〜２．０、ＶＳＶ−Ｇのような他のタンパク質が１／４０〜１／１０、ポリブレンのようなポリカチオンが１／１０〜１／２が適当である。これらを混合することにより、上記核酸と混合ハイブリッドリポソームベクターの複合体が形成され、効率的な遺伝子導入が可能になる。
【００１６】
本発明の遺伝子導入用複合体は、霊長類であればいずれの動物に投与することも可能である。例えば、ヒト；マカク類（ニホンザル、アカゲザル、カニクイザル等）やヒヒ類等の旧世界ザル；キヌザル、マーモセット、ヨザル、オマキザル、クモザル等の新世界ザル；メガネザル、キツネザル、ロリス等の原猿類；チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、テナガザル等の類人猿等を挙げることができる。
【００１７】
投与経路は、特に限定されないが、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与等の非経口投与が好ましく、とりわけ、皮下投与及び静脈内投与、特に皮下投与が好ましい。投与量は、特に限定されず、遺伝子導入の目的や、導入効率等に応じて適宜設定されるが、通常、体重１ｋｇ当たり、複合体の投与量で５０μｇ〜５００μｇ程度が適当である。本発明の複合体は、通常、液状であるので、そのまま注射することもできるし、生理緩衝液等の緩衝液に懸濁又は乳濁させたものを投与してもよい。
【００１８】
投与の時期は、妊娠中であれば、特に限定されないが、遺伝子導入の効率の観点から妊娠末期、すなわち、全妊娠期間の最後の２０％以内の期間に投与することが好ましい。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２０】
動物
コモンマーモセットは通常２卵性の双子を産することがよく知られている。３．５〜５．０歳，体重３１０〜４６０ｇの３頭のコモンマーモセットメス（妊娠メス２頭，非妊娠メス２頭）を用いた。これらは京都大学霊長類研究所（ＫＵＰＲＩ）で繁殖したもので，新世界ザル用固形飼料ＳＰＳ（オリエンタル酵母社製）と適宜果物を与えた。３頭中２頭は妊娠しており，交尾からの日数及び触診により妊娠末期であると判断した。融合性リポソーム−ＤＮＡ複合体投与や採血は０．０１ｍｇ／ｇのケタミン麻酔下で行った。組織採集のためのサルの安楽死は，ＫＵＰＲＩ動物の飼育と使用のためのガイドラインに従って行われた。研究プロトコールは文部省，ＫＵＰＲＩバイオハザード委員会，動物福祉／動物飼育委員会により認証された。実験はＫＵＰＲＩバイオセーフティレベル２施設内で行われた。
【００２１】
プラスミドＤＮＡの投与
哺乳動物用レポータープラスミド，ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｊａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）をＤＨ５ａ（ｒｅｃＡ１　ｅｎｄＡ１）株　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉで増幅し，エンドトキシンフリープラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ　Ｋ．　Ｋ．，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を用い精製した。
【００２２】
プラスミドＤＮＡの質及び量はＵＶスペクトロフォトメトリー，アガロースゲル電気泳動によって調べた。プラスミドＤＮＡ（２５　μｇ）に１２．５μｌのＮ−［１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ；　Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を混合した。トランスフェクションを促進するため，これに５μｇの陽イオン　ヘキサジメトリンブロミド（ポリブレン；　Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｊａｐａｎ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を加えた（Ａｒｃａｓｏｙ　ＳＭ　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１９９７，　４：　３２３８；　Ａｎｄｒｅａｄｉｓ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　１９９７；　１０：　２８５２９１．）。更に１．２５　μｇのリコンビナント水疱性口内炎ウィルスＧタンパク質　（ＶＳＶ−Ｇ；　恵美宣彦博士（名大・医）より提供）を，トランスフェクション効率を上げる目的で加えた（Ａｂｅ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　１９９８；　７２：　６１５９６１６３）。このように融合性ＤＯＴＡＰ／ポリブレン／　ＶＳＶ−Ｇ　リポソームに複合させたプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１（最終量：　１５０　μｌ）を妊娠マーモセット背部３箇所に皮内注射した。なお、追加実験では，非妊娠マーモセットに３００　μｇ／　個体のｐＥＧＦＰ−Ｃ１を静脈内注射した。
【００２３】
ｅｇｆｐ　遺伝子の検出
投与１８時間後に，妊娠マーモセットをケタミン，ペントバルビタールナトリウムで麻酔し，子宮全摘出した。摘出された子宮は，母親の血液を除去するために生理食塩水で洗浄し，摘出したのとは別の実験者に渡された。子宮漿膜を切開し，胎仔表面を汚染しないように細心の注意を払い２匹の胎仔を取り出した。胎仔体重は２４〜２９　ｇ　であった。心臓穿刺で胎仔血（０．８〜１．５　ｍｌ）を採取し，胎仔臓器を摘出した。血液サンプル中のＤＮＡは，Ｂｌｏｏｄ　Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて精製した。胎仔臓器は液体窒素で凍結し，破砕した。得られた組織粉末を２０　ｍｇ／ｍｌのＲｎａｓｅ　Ａ　及び１００　ｍｇ／ｍｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ　を含む抽出バッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，　ｐＨ　８．０，　０．１Ｍ　ＥＤＴＡ，　ｐＨ　８．０，　０．５％　ＳＤＳ）中に散開させ，５６℃で２時間，３７℃一晩インキュベートした。これより，飽和−Ｔｒｉｓ　フェノール抽出１回，フェノール　／クロロホルム　／　イソアミルアルコール抽出３回，クロロホルム　／　イソアミルアルコール抽出１回を行い，ＤＮＡを精製し，エタノール沈殿させ回収した。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１中のｅｇｆｐ遺伝子２７０ｂｐを増幅するため，センスプライマー（５’−ｃａｇｃｃａｃａａｃｇｔｃｔａｔａｔｃａｔｇｇ−３’），アンチセンスプライマー（５’−ａｇｃｔｃｇｔｃｃａｔｇｃｃｇ　ａｇａｔｇ−３’）を用い，初回変性９４℃１０分，［９４℃２０秒，６２℃３０秒，７２℃１分］３５サイクル，最終エクステンション７２℃７分の条件でＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し，ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　（宝酒造社製）で染色した。得られたＰＣＲ産物の信頼性はシークエンシングにより確証した。
【００２４】
ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　タンパク質　（ＧＦＰ）の検出
プラスミド　ｐＥＧＦＰ−Ｃ１　は改変型クラゲＧＦＰをコードしており，このＥＧＦＰは５０７ｎｍを主波長とした蛍光を発する。摘出した胎仔臓器（心臓，腎臓，肝臓，肺等）はＯＣＴコンパウンドに包埋し，液体窒素中で急速凍結した。凍結切片（４　ｍｌ）中のＧＦＰをＦｌｕｏＶｉｅｗ　ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を用い，共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＢＸ５０，　Ｏｌｙｍｐｕｓ）で直接観察した。また，抗ＧＦＰマウスモノクローナル抗体（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ，　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用い，免疫組織化学的にＧＦＰを検出した。組織切片を　０．５　ｍｇ／ｍｌ　の抗ＧＦＰモノクローナル抗体と４℃で一晩インキュベートし，結合した抗体を市販のアルカリフォスファターゼ　／　抗アルカリフォスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）法キット（ＤＡＫＯ　Ｊａｐａｎ，　Ｋｙｏｔｏ，　Ｊａｐａｎ）で検出した。簡潔には，抗ＧＦＰモノクローナル抗体と反応させた切片を，ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体と，更にＡＰＡＡＰ複合体と反応させ，Ｆａｓｔ　Ｒｅｄ　ＴＲ　塩で染色した。また、対照染色にはヘマトキシリンを用いた。
【００２５】
結果
胎仔サンプルｅｇｆｐ遺伝子の検出
第１実験では，　２５　μｇのプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１を含むＤＯＴＡＰ　／　ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ　／　ＶＳＶ−Ｇ　融合性リポソームを妊娠マーモセットに皮内投与した。投与翌日，２匹の胎仔から心臓と肝臓を摘出した。その臓器よりＤＮＡを抽出し，ＰＣＲ法の対象とした。母親血液より抽出したＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ法を行うと，２７０ｂｐ　の断片が増幅された。さらに，胎仔肝臓，心臓から抽出したＤＮＡでも　２７０−ｂｐ　のＰＣＲ産物が得られた。薄いバンドではあるが，これらは胎仔臓器に検出可能なレベルのｅｇｆｐ遺伝子が含まれていることを示しており，ネガティブコントロールの水をテンプレートとした場合には，ＰＣＲ産物は見られなかった。
【００２６】
２番目の実験では，別の妊娠ザルにプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１を投与し，２匹の胎仔より胎仔血液，心臓，腎臓，肝臓，肺を採集した。母親のサンプルでは，投与前の血液ＤＮＡからは産物が得られず，一方投与後の血液，胎盤より精製したＤＮＡから２７０ｂｐの産物が得られた。両方の胎仔血液ＤＮＡより　２７０ｂｐ　のＰＣＲ産物が得られ，胎仔循環血中のｅｇｆｐ遺伝子の存在が示された。バンドの強度は一方の胎仔（ｆｅｔｕｓ　１）の方が，他方の胎仔（ｆｅｔｕｓ　２）のものよりも弱かった。Ｆｅｔｕｓ　２　から得られた臓器ＤＮＡサンプルはポジティブである一方で，ｆｅｔｕｓ　１　からのものはネガティブであった。これらの結果は，母親から両方の胎仔へｅｇｆｐ遺伝子が移行したが，その量に胎仔での違いがあったことを示唆している。
【００２７】
胎仔肺におけるＧＦＰの検出
マーモセット胎仔でｅｇｆｐ遺伝子が発現しているかどうかを調べるため，２番目の実験では，凍結組織切片を共焦点レーザー走査顕微鏡で直接観察した。Ｆｅｔｕｓ　２　の肺血管周囲の細胞で明らかな緑色蛍光が観察された。しかしながら，この胎仔の心臓，腎臓，肝臓切片では，不明瞭なバックグラウンド蛍光があるのみで，明確な蛍光は見られなかった。これらのサンプルのバックグラウンド蛍光は同様に弱いものであった。次に，抗原性のあるＧＦＰポリペプチドが発現しているかどうかを調べるために，切片を抗ＧＦＰモノクローナル抗体で染色した。Ｆｅｔｕｓ　２　の肺で，特に血管内皮細胞において赤い沈積が観察され，抗ＧＦＰ抗体の存在が認められた。抗ＧＦＰモノクローナル抗体の替わりに，ノーマルマウスＩｇＧを用いたコントロール切片では赤い沈積は見られなかった。これらの結果は，ｆｅｔｕｓ　２　の肺血管内皮細胞でＧＦＰが産生されたことを強く示唆している。同時に肺実質細胞で見られる弱いバックグラウンド蛍光はＧＦＰによるシグナルではないことも示唆している。Ｆｅｔｕｓ　２　の心臓，腎臓，肝臓では，不明瞭なバックグラウンド蛍光しか見られず，また免疫染色でもＧＦＰは検出できなかった。
【００２８】
静脈内投与による導入遺伝子発現
上記２つの実験では，母体に投与したプラスミドが胎盤を経由して胎仔へ移行したと思われる。これは胎仔へ静脈内投与したのと同様な状況である。そのため，我々は，成体マーモセットに静脈内投与した場合に肺でＧＦＰが発現するかどうか調べる追加実験を行った。３００　μｇのプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１を含むＤＯＴＡＰ　／　ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ　／　ＶＳＶ−Ｇ複合体を非妊娠マーモセットの静脈内に投与した。ＰＣＲ法で分析した結果，投与前の血液ＤＮＡはネガティブであり，投与１８時間後の血液，肺，子宮から抽出したＤＮＡは検出可能なレベルのｅｇｆｐ遺伝子を含んでいることが示された。更に肺組織切片を抗ＧＦＰモノクローナル抗体で免疫染色し，肺の内皮細胞でＧＦＰが発現していることを認めた。これは２番目の実験のｆｅｔｕｓ　２　で得られた結果と一致するものである。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１を投与した非妊娠マーモセットでは，肺に加え，卵巣でもＧＦＰが発現していた。その他の臓器（小脳，大脳，心臓，腎臓，肝臓，脾臓；データ不掲載）では特異的な染色像は得られなかった。
【００２９】
以上のように、本発明により、妊娠末期でマーモセット母体に投与したＤＮＡプラスミドが胎仔へ移行すること，調べた４つの胎仔臓器の中でも特に肺で導入遺伝子がエンコードするタンパク質が発現していることが示された。また，プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１を非妊娠マーモセットに静脈内投与し，肺の内皮細胞でＧＦＰが発現することを認めた。すなわち、本発明は初めて導入遺伝子が，霊長類において肺に選択的に発現することを示唆したものである。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、霊長類胎仔への安全な遺伝子導入方法及びそのための複合体が初めて提供された。本発明の方法により、霊長類の胎仔に所望の遺伝子を導入することが可能になったので、遺伝子治療や遺伝子ワクチンによる免疫付与への道が開かれた。また、実験動物用の霊長類、とりわけ、サル（特に旧世界ザル及び新世界ザル）はヒトに近い胎盤構造を持っていることから、サルに対して本発明の方法を適用することにより、ヒトにおいても、胎児に対する積極的な遺伝子治療やＤＮＡワクチンの効果等を研究することもできる。また、ヒト妊娠時において遺伝仔投与を受けた際の胎児への影響を研究することができるなど、ヒトでの胎児遺伝子治療・遺伝子ワクチンなど臨床応用の研究を行うこともできる。さらに、機能が未知の遺伝子を導入することにより、霊長類における該遺伝子の機能を調べることも可能である。
【００３１】
【配列表】
2004049227.tif 000002
【００３２】
2004049227.tif 000003
【００３３】
2004049227.tif 000004