(57)【要約】【課題】アルカリ性ホスファターゼ６の測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  と、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する免疫グロブリン部位認識物質とを反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質とアルカリ性ホスファターゼ  ６と免疫グロブリン部位認識物質との結合物のレベルからアルカリ性ホスファターゼ  ６  を測定することにより、検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  を特異的に正確に測定することができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法であって、検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  と、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する免疫グロブリン部位認識物質とを反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質とアルカリ性ホスファターゼ  ６  と免疫グロブリン部位認識物質との結合物のレベルからアルカリ性ホスファターゼ  ６  を測定することを特徴とする、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法。
【請求項２】
アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質がヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼと結合可能な物質である請求項１の測定方法。
【請求項３】
ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼと結合可能な物質が抗ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼモノクローナル抗体である請求項２の測定方法。
【請求項４】
免疫グロブリン部位認識物質が  ＩｇＧ１  と結合可能な物質である請求項１から３のいずれかの測定方法。
【請求項５】
ＩｇＧ１  と結合可能な物質が抗ヒト  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体である請求項４の測定方法。
【請求項６】
検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法であって、検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  とヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体とを抗原抗体反応させ、次いで、得られる抗原抗体反応物と、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する免疫グロブリン部位認識物質とを反応させ、得られるヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体とアルカリ性ホスファターゼ  ６  と免疫グロブリン部位認識物質との結合物のレベルからアルカリ性ホスファターゼ  ６  を測定することを特徴とする、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法。
【請求項７】
免疫グロブリン部位認識物質が  ＩｇＧ１  と結合可能な物質である請求項６の測定方法。
【請求項８】
ＩｇＧ１  と結合可能な物質が抗ヒト  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体である請求項７の測定方法。
【請求項９】
検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法であって、
ｉ）検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼをヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体と抗原抗体反応させ、次いで、抗原抗体反応したヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼを、アルカリ性ホスファターゼ用酵素基質と反応させ、反応した酵素活性のレベルから、検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ活性を求め、
ｉｉ）上記  ｉ）とは独立に、請求項６から８のいずれかの方法により検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  のレベルを求め、
ｉｉｉ）上記  ｉ）で得られるヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ活性値と上記  ｉｉ）で得られるアルカリ性ホスファターゼ  ６  のレベル値との乗法値を求め、その乗法値から検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  の量を求める、
ことを特徴とする、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法。
【請求項１０】
検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  を測定するためのキットであって、
ｉ）固相支持体、
ｉｉ）アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質、
ｉｉｉ）アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する、標識された免疫グロブリン部位認識物質、および
ｉｖ）標識を検出するための成分、
を含むキット。
【請求項１１】
アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質がヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼと結合可能な物質である請求項１０のキット。
【請求項１２】
ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼと結合可能な物質が抗ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼモノクローナル抗体である請求項１１のキット。
【請求項１３】
免疫グロブリン部位認識物質が  ＩｇＧ１  と結合可能な物質である請求項１０から１２のいずれかのキット。
【請求項１４】
ＩｇＧ１  と結合可能な物質が抗ヒト  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体である請求項１３のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、アルカリ性ホスファターゼ  ６（以下、ＡＬＰ  ６  と記載することもある）の測定方法およびそれに用いるキットに関する。更に詳細には、測定対象検体中にアルカリ性ホスファターゼ  ６  を含む場合、これまでのように電気泳動による煩雑な操作や視覚的判断を必要とせず、正確な定量値として  ＡＬＰ  ６  の値を知ることができる方法およびそれに用いるキットであり、肝疾患の状態把握、慢性関節リウマチ、悪性腫瘍、潰瘍性大腸炎などの臨床検査医学の分野において極めて有効となる。
【０００２】
【従来の技術】
アルカリ性ホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＡＬＰ）（ＥＣ．３．１．３．１）はリン酸モノエステルを加水分解する酵素のうちでアルカリ側に至適  ｐＨ  をもち、活性中心に亜鉛イオンを有する酵素の総称である。また生体中での機能は物質やエネルギー輸送、無機リン酸の供給、骨の石灰化に関与するものと考えられている。血清中においては主に肝型、骨型、小腸型、胎盤型や腫瘍型（Ｎａｇａｏ  型、Ｒｅａｇａｎ型、Ｋａｓａｈａｒａ  型、胎児小腸型など）など臓器特異性を示すアイソザイムが存在し、これまでも肝胆道系疾患、骨疾患、腫瘍などの診断に広く用いられてきた。しかし、血清中総  ＡＬＰ  活性が広く用いられて有効である一方で、測定結果単独では疾患の特定に結びつきづらい。それには先の血清中アイソザイムの問題がある。ＡＬＰ  の電気泳動をおこなうと  ６、７  本のバンドが分離されるが、抗血清を用いて蛋白質としての抗原性から  ＡＬＰ  を考察すると、臓器特異型（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＬＰ：ＴＳＡＬＰ）  と臓器非特異型  （Ｔｉｓｓｕｅ−Ｎｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＬＰ：ＴＮＳＡＬＰ）  の  ２  種類に大きく分類される。臓器特異型  （Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＬＰ：ＴＳＡＬＰ）  と呼ばれている胎盤型  （ＡＬＰ  ４）、小腸型  （ＡＬＰ  ５）、生殖細胞型の  ３  種については、２ｑ３４−３７に存在する遺伝子によって産生されていることがわかっている。次に臓器非特異型  （Ｔｉｓｓｕｅ−Ｎｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＬＰ：ＴＮＳＡＬＰ）  は肝、骨、腎、白血球に見られるタイプで同一のアミノ酸配列を有し、遺伝子  １ｐ３４−３６．１  から発現することが知られている。その中でも肝型と骨型では同一遺伝子から転写調節の違いで二種類の  ｍＲＮＡ  が作られるが、酵素の成熟にしたがってまた全く同一の配列を持つようになることが知られている（非特許文献１）。しかし、酵素に結合する糖鎖の違いからＮ  型糖鎖を  ３  本持つ肝型（ＡＬＰ  ２）と  Ｎ  型糖鎖  ２  本と  Ｏ  型糖鎖  １  本をもつ骨型（ＡＬＰ  ３）が電気泳動上で分けられると考えられる。さらに膜成分、ＧＰＩ  アンカーとの結合から  ＡＬＰ  １、そして免疫グロブリンの結合から  ＡＬＰ  ６  が分離確認される。そしてこの全てのアイソザイム活性の総和が血清中  ＡＬＰ  値として反映されるため、ＡＬＰ  高値が疾患と一対一対応しにくい現状である。
【０００３】
これらアイソザイムの総和としての  ＡＬＰ  測定では、使用される試薬の基質や緩衝液の種類、ｐＨ  などにおいて活性が異なるため、近年標準化が盛んに行われるようになり、現在では国際臨床化学連合（ＩＦＣＣ）や日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）から勧告法が提示されて総  ＡＬＰ  測定値の標準化が進んでいる。しかしながら依然としてアイソザイム自体の標準検出法は未だに無い状況にある（非特許文献２）。
アイソザイムの測定法としては、これまでに  Ｌ−フェニルアラニンによる肝型、骨型（ＡＬＰ  ２、３）の測定、Ｌ−ホモアルギニンによる胎盤型、小腸型（ＡＬＰ  ４、５）の測定など阻害アミノ酸を利用してアイソザイムを測定する方法や（非特許文献３）、加熱によって胎盤型  （ＡＬＰ  ４）  活性だけを残し、ＡＬＰ  ４  を特異的に測定する方法  （非特許文献４、非特許文献５）、先に述べた肝型、骨型  ＡＬＰ  糖鎖の差を利用してレクチンを利用し、肝型  （ＡＬＰ  ２）  や骨型  （ＡＬＰ  ３）を測定する方法  （非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）、骨型  ＡＬＰ  （ＡＬＰ  ３）  に対する特異的モノクローナル抗体を使用する方法（非特許文献１０）などが開発されていくつかのアイソザイムは測定が可能となっている。しかし、イムノグロブリン結合型である  ＡＬＰ  ６  は臨床的にも意義が唱えられながら依然その絶対値を知る方法がないために電気泳動法から存在の有無を知ることで臨床診断に使用されている状況にある。
【０００４】
はじめ、ＡＬＰ  ６  は  ＡＬＰ  結合型イムノグロブリン  （非特許文献１１）として  Ｎａｇａｍｉｎｅ  らによって、厚生労働省指定難治性疾患である潰瘍性大腸炎において発見された  （非特許文献１２）。その後加野らがこの  ＡＬＰ  ６  が病態を反映して増減することを報告し（非特許文献１３）、さらに  １９８１  年に菅野らが全国アンケートを行って病態解析をまとめた（非特許文献１４）。その結果、多くの症例が自己抗体であることがわかった。イムノグロブリンの結合するアイソザイム種については  Ｃｒｏｆｔｏｎ  らが  ＡＬＰ  ６  のイムノグロブリン結合  ＡＬＰ  はそのほとんどが  ＴＮＳＡＬＰ  であると報告している  （非特許文献１５）。イムノグロブリンについても最近  Ｏｗｅｎ  らはマクロ  ＡＬＰ  に  ＩｇＧ  のκ鎖が結合しているという報告をしている  （非特許文献１６）。今日では一般に健常人では上記高分子複合体である  ＡＬＰ  ６  発現は低頻度であるが、他方総  ＡＬＰ  活性が  １，０００  単位以上にもなるような高活性の  ＡＬＰ  を含む血清には高頻度に  ＡＬＰ  ６  が検出されるようになること、また慢性関節リウマチや腫瘍などでも  ＡＬＰ  ６  が高値となることがあることが知られている。このような状況において臨床的意義をより確立するために  ＡＬＰ  ６  の精密測定が行われることが強く望まれていた。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍ  １６８，９９３−１０００：１９９０
【非特許文献２】
臨床検査  ３７（９），  １０４１−１０４４：１９９３
【非特許文献３】
Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ．  １３，９４１−９５１：１９８１
【非特許文献４】
Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ．  １６，１０５１−１０５４：１９９６
【非特許文献５】
Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ．  ４９，３１３−２０３：１９９６
【非特許文献６】
Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  １９９２  ４５，６８−７１：１９９２
【非特許文献７】
Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．  ４０，１７４９−１７５６：１９９４
【非特許文献８】
Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．  ４２，１９７０−１９７４：１９９６
【非特許文献９】
Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．  ７１：５０８−５１８：２００２
【非特許文献１０】
Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４４，２１３９−２１４７：１９９８
【非特許文献１１】
Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ６５，３９−４６：１９７５
【非特許文献１２】
日消誌  ７３，１６２−１６８：１９７６
【非特許文献１３】
生物物理化学２０，３２５：１９７７
【非特許文献１４】
酵素結合性免疫グロブリンの我が国での発症頻度ならびに分布に関する研究報告：１９８１
【非特許文献１５】
Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  １１２，３３−４２：１９８１
【非特許文献１６】
Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３９，５２３−５：２００２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明で測定対象とする  ＡＬＰ  ６  はその精密測定が臨床的に有意な意義を持つと言われながら長く不可能であった。それにはどの  ＡＬＰ  アイソザイムに自己免疫的イムノグロブリンが結合しやすいのか、またどのクラスのイムノグロブリンが  ＡＬＰ  ６  として結合しているのかが不明であったことが原因であった。本発明はかかる問題に鑑み、例えば、まず  ＡＬＰ  と反応する一次抗体とその  ＡＬＰ  に自己免疫的に結合していたイムノグロブリンと反応する二次抗体を組み合わせて使用することで反応系中の他の  ＡＬＰ  の影響を除き、ＡＬＰ  ６  を特異的に精密測定する測定系の提供を目的とする。この方法で開発した  ＡＬＰ  ６  測定を臨床診断薬として利用可能であり、また自己抗体のメカニズムなど基礎医学の発展にも貢献し利用できるものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法であって、検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  と、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する免疫グロブリン部位認識物質とを反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質とアルカリ性ホスファターゼ  ６  と免疫グロブリン部位認識物質との結合物のレベルからアルカリ性ホスファターゼ  ６  を測定することを特徴とする、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法である。
より具体的には、本発明は、検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法であって、検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  とヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体とを抗原抗体反応させ、次いで、得られる抗原抗体反応物と、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する免疫グロブリン部位認識物質とを反応させ、得られるヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体とアルカリ性ホスファターゼ  ６  と免疫グロブリン部位認識物質との結合物のレベルからアルカリ性ホスファターゼ  ６  を測定することを特徴とする、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法である。
【０００８】
更に本発明は、検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法であって、  ｉ）検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼをヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼに反応する抗体と抗原抗体反応させ、次いで、抗原抗体反応したヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼを、アルカリ性ホスファターゼ用酵素基質と反応させ、反応した酵素活性のレベルから、検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ活性を求め、
ｉｉ）上記  ｉ）とは独立に、上記の測定方法により検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  のレベルを求め、
ｉｉｉ）上記  ｉ）で得られるヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ活性値と上記  ｉｉ）で得られるアルカリ性ホスファターゼ  ６  のレベル値との乗法値を求め、その乗法値から検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  の量を求める、
ことを特徴とする、アルカリ性ホスファターゼ  ６  の測定方法である。
更に本発明は、検体中のアルカリ性ホスファターゼ  ６  を測定するためのキットであって、
ｉ）固相支持体、
ｉｉ）アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質、
ｉｉｉ）アルカリ性ホスファターゼ  ６  の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する、標識された免疫グロブリン部位認識物質、および
ｉｖ）標識を検出するための成分、
を含むキットである。
【０００９】
本発明の測定方法により、これまで使用されてきた電気泳動法よりも更に精密に  ＡＬＰ  ６  を測定することができる。例えば、ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）以外のアイソザイムと殆ど反応しない第一のモノクローナル抗体として、抗  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体を用い、第二のモノクローナル抗体として、ＡＬＰ  ６  の構成成分である免疫グロブリン部位と反応する標識抗ヒト  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体を利用することにより、またはこれら２種の抗体を組み合わせて利用することで、免疫グロブリン非結合血中アイソザイム（肝型、骨型、小腸型、胎盤型、他腫瘍型）の影響を殆ど受けず、ＡＬＰ  ６  のみを特異的に測定することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、検体とは、ＡＬＰ  ６  を含む可能性のある液体または混合物であれば特に限定しないが、通常、血液、血清、血漿、尿等の生体内試料が好適である。
本発明の  ＡＬＰ  ６  の測定方法においては、ＡＬＰ  ６  の構成成分であるアルカリ性ホスファターゼ部位を認識するアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、ＡＬＰ  ６  の構成成分である免疫グロブリン部位を認識する免疫グロブリン部位認識物質とを反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と  ＡＬＰ  ６  と免疫グロブリン部位認識物質との結合物のレベルから  ＡＬＰ  ６  を測定する。
【００１１】
本発明において、アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質とは、ＡＬＰ  ６  中のアルカリ性ホスファターゼ部位と結合可能な物質をいう。具体的には、肝臓由来  ＡＬＰ  、骨由来  ＡＬＰ  等のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）に結合可能な物質を例示できる。ヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）は、通常、遺伝子  １Ｐ３４−３６．１  から発現する蛋白質を指すが、一般的には、肝型  ＡＬＰ（ＡＬＰ  ２）、骨型  ＡＬＰ（ＡＬＰ  ３）、腎臓型  ＡＬＰ、白血球型  ＡＬＰ  を例示できる。ＴＮＳＡＬＰ  に結合可能な物質としては、ＴＮＳＡＬＰ  に対する抗体が好ましく挙げられる。抗体としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。
ＡＬＰ  ６  を正確に測定するためには、ＴＮＳＡＬＰ  に特異的なモノクローナル抗体であることが好ましい。具体的には、後述する参考例１に示すように、同じ酵素活性量の小腸型、胎盤型、肝臓型および骨型  ＡＬＰ  と反応させた時に、小腸型  ＡＬＰ  と反応する  ＡＬＰ  酵素活性値と胎盤型  ＡＬＰ  と反応する  ＡＬＰ  酵素活性値との和が、肝臓型  ＡＬＰ  と反応する  ＡＬＰ  酵素活性値と骨型  ＡＬＰ  と反応する  ＡＬＰ  酵素活性値との和の  １／１０  以下である抗ヒト  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体が好ましい。特に、骨型  ＡＬＰ  と反応する  ＡＬＰ  酵素活性値が、肝臓型  ＡＬＰ  と反応する  ＡＬＰ  酵素活性値の  ０．７  以下である抗ヒト  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体が更に好ましい。本発明に使用可能な抗ヒト  ＴＮＳＡＬＰ  抗体としては、本発明者が確立し製造法を後述する製造例１で示すモノクローナル抗体  ３−２９−３Ｒ、２Ｃ５−３２  および  １Ａ５−７  を例示でき、モノクローナル抗体  ３−２９−３Ｒ  および  ２Ｃ５−３２  が好ましい。また、ＨＬＭＳ―１、ＨＬＭＳ―２、ＨＬＭＳ―３、ＨＬＭＳ―４（以上、特開平２−３５０９８号公報  ）等のモノクローナル抗体も好ましく、それらと類似している既知の抗  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体も使用可能である。
【００１２】
本発明において、免疫グロブリン部位認識物質とは、ＡＬＰ  ６中の免疫グロブリン部位と結合可能な物質をいう。好ましくは  ＩｇＧ１  に結合可能な物質、具体的には、  ＩｇＧ１  に対する抗体である。抗体としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよいが、特に抗ヒト  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体が好ましい。また、ＩｇＧ１  に結合可能な物質として、プロテイン  Ｇ、プロテイン  Ａ  も例示できる。この場合、上記したアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質として抗体を用いるとき、あらかじめ、その抗体中の  ＣＨ２ＣＨ３  部位をブロックしておき、プロテイン  Ｇ  等がその抗体には結合しないようにしておくことはもちろん必要である。
【００１３】
以上に記載した、例えば  ＴＮＳＡＬＰ  あるいは  ＩｇＧ１  に対する抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体は、それ自体周知の方法により調製することができる。ＩｇＧ１  に対する抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体は、市販品を利用することもできる。以下に、ＴＮＳＡＬＰ  に対するモノクローナル抗体を例にとってその調製について詳細に説明する。
本発明に使用可能な抗  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体は、例えば、ヒト血液由来精製  ＡＬＰ  ６  を免疫原として使用することにより得ることができる。また、ＡＬＰ  ６は、その構造から  ＡＬＰ  部位と免疫グロブリン部位にわけられることから、ＡＬＰ  と免疫グロブリンそれぞれを抗原として用いることもできる。ＡＬＰ  抗原として培養骨芽細胞株による抗原により免疫を行なうことができるが、これに限らず、正常骨芽細胞などの  ＡＬＰ  も抗原として用いることができる。遺伝子工学的に作製された完全長の組換え体、変異体、部分抗原を用いることも常套手段であり、これは抗免疫グロブリン抗体作製についても全く同様であって利用されうるものである。
モノクローナル抗体は精製ヒト  ＡＬＰ  ６  単独に、または、ＡＬＰ  と免疫グロブリンとを別に、免疫原として動物を免疫し、その抗ヒト  ＡＬＰ  ６  抗体産生細胞、または抗  ＡＬＰ  抗体産生細胞もしくは抗免疫グロブリン抗体産生細胞と、骨髄腫瘍細胞とを融合させることによって得られるハイブリドーマによって産生される。
【００１４】
ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち上述したような例えば  ＡＬＰ  をフロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等既に公知のものを用いてともに混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に  １〜３  週間おきに腹腔内皮下、または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は  １μｇ〜１００  ｍｇ  の間とされているが、一般的には  ５０μｇ  程度が好ましい。免疫回数は  ２〜７  回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞を融合する。抗体産生細胞はマウス、ヌードマウス、ラットより得ることができる。
【００１５】
融合法としては既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることで融合できる。またセンダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。融合した細胞からヒト  ＡＬＰ  を認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、上記融合した細胞から限界希釈法によって  ＨＡＴ  培地及び  ＨＴ  培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。９６  穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にヒト  ＡＬＰ  に対する抗体が含まれている場合には、ヒト  ＡＬＰ  をプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウス免疫グロブリン−ＨＲＰ  標識抗体等、二次標識抗体を反応させる  ＥＬＩＳＡ  法により、ヒト  ＡＬＰ  に対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質には  ＨＲＰ  の他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤である  ＢＳＡ  のみを結合したアッセイプレートによる  ＥＬＩＳＡ  を同時に行うことでヒト  ＡＬＰ  特異的抗体のスクリーニングができる。つまりヒト  ＡＬＰ  プレートで陽性であり、ＢＳＡ  による  ＥＬＩＳＡ  で陰性のクローンを選択する。また、同時に抗マウス免疫グロブリン抗体をマイクロタイタープレートにまき、ここに融合細胞培養上清を加えて反応させ、更に精製  ＡＬＰ  を加えて活性酵素を結合させて免疫複合体を作製し、この結合酵素活性をフェニルリン酸のような発色基質を利用して測定することもできる。
【００１６】
本発明で使用可能な抗体を産生するハイブリドーマとしては、ヒト  ＡＬＰ  を特異的に認識するモノクローナル抗体のうち、特に活性型ヒト  ＴＮＳＡＬＰ  と反応し、かつヒト胎盤型  ＡＬＰ、ヒト小腸型  ＡＬＰ  と殆ど交差反応しないモノクローナル抗体が産生するものが好ましい。例えば本発明者が樹立したハイブリドーマ  ３−２９−３Ｒ  および  ２Ｃ５−３２  が挙げられる。ハイブリドーマ  ３−２９−３Ｒ  および  ２Ｃ５−３２  は、平成１５年４月１６日に工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれ、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３６０  および  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３５９  として寄託されている。
【００１７】
ハイブリドーマは、通常細胞培養に用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＳＦ、Ｓ−ｃｌｏｎｅ  などで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、常法を用いることができる。例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡなどによるアフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１８】
以上に説明したような抗  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体等のアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と、抗  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体等の免疫グロブリン部位認識物質とを、検体中の  ＡＬＰ  ６  と反応させ、得られるアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質と  ＡＬＰ  ６  と免疫グロブリン部位認識物質との結合物のレベルを求めることにより、検体中の  ＡＬＰ  ６  を測定することができる。より具体的には、、例えば  ＥＬＩＳＡ  法により、検体中の  ＡＬＰ  ６  と抗ヒト  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体とを抗原抗体反応させ、次いで、得られる抗原抗体反応物と抗  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体とを反応させ、得られる抗ヒト  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体と  ＡＬＰ  ６と抗  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体との結合物のレベルから検体中の  ＡＬＰ  ６  を測定することができる。
ＥＬＩＳＡ  法により、抗原抗体反応した結合物のレベルを求めるためには、抗  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体などの免疫グロブリン部位認識物質としては、標識された免疫グロブリン部位認識物質を用いることが好ましい。標識法としては、通常、免疫測定法で標識に使用できるものであれば、とくに限定しないが、ペルオキシダーゼ等の酵素、放射線同位元素、蛍光物質、磁性物質、コロイドなどでもよい。
【００１９】
本発明の測定方法として、サンドイッチアッセイ  ＥＬＩＳＡ  法により実施する具体例は、以下の通りである。まず一次抗体として、アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質である抗  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体を、固相支持体、例えば、プレートに吸着させ、血清などの検体中の  ＡＬＰ  ６  のアルカリ性ホスファターゼ部位と反応させ、固相支持体を洗浄する。次いで、吸着した  ＡＬＰ  ６  の免疫グロブリン部位と、二次抗体として、免疫グロブリン部位認識物質である、例えばビオチン化した抗  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体とを反応させ、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと反応させた後、ペルオキシダーゼ酵素反応、次いで、発色反応を行うことにより、ＡＬＰ  ６  を検出することができる。また、二次抗体として、直接、ＨＲＰ  等のペルオキシダーゼにより酵素標識した抗  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体を用いることにより、ＡＬＰと二次抗体と反応させた後、標識酵素に対する基質、例えば、ＯＰＤ（ｏ−フエニレンジアミン）、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）等と更に反応させて発色させることにより、ＡＬＰ  ６  を検出することもできる。また、二次標識抗体に結合させる標識物質は測定方法によって酵素に限られるものではなく、放射線同位元素、蛍光物質、磁性物質、コロイドなどでもよい。
【００２０】
本発明の測定方法では、上記した測定方法により検体中の  ＡＬＰ  ６  のレベルを求め、他方それとは独立に、検体中のヒト臓器非特異型アルカリ性ホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）活性を求め、検体中の  ＡＬＰ  ６  のレベル値と検体中のヒト  ＴＮＳＡＬＰ  活性値との乗法値を求め、その乗法値から検体中の  ＡＬＰ  ６  の量を求めることもできる。この乗法値を利用する方法の場合には、上記した測定方法により検体中の  ＡＬＰ  ６  のレベルを求める際に実施する、検体中の  ＡＬＰ  ６  と一次抗体であるヒト  ＴＮＳＡＬＰ  に対する抗体との抗原抗体反応において、検体中に存在する  ＡＬＰ  ６  以外の他の  ＡＬＰ  との競争反応の影響を考慮することができ、従って上記の乗法値は、検体中の  ＡＬＰ  ６  の実際の存在量をより反映した値となる。
この乗法値を利用する測定方法において、検体中のヒト  ＴＮＳＡＬＰ  活性を求めるには、検体中のヒト  ＴＮＳＡＬＰ  をヒト  ＴＮＳＡＬＰ  に反応する抗体と抗原抗体反応させ、次いで、抗原抗体反応したヒト  ＴＮＳＡＬＰ  を、アルカリ性ホスファターゼ用酵素基質と反応させ、反応した酵素活性のレベルから、検体中のヒト  ＴＮＳＡＬＰ  活性を求めることにより実施できる。アルカリ性ホスファターゼ用酵素基質としては、通常用いられる基質を用いることができる。例えば、フェニルリン酸などの発色基質を、抗原抗体反応したヒト  ＴＮＳＡＬＰ  と酵素反応させて発色させ、吸光度を測定すことにより、検体中のヒト  ＴＮＳＡＬＰ  を求めることができる。
【００２１】
本発明において、上記したように、例えば  ＥＬＩＳＡ  法により検体中の  ＡＬＰ  ６  の測定を行うときは、ＥＬＩＳＡ  用のキットを用いて実施することができる。ＥＬＩＳＡ  法で本発明の測定方法を実施するときは、例えば、ＡＬＰ  ６  を測定するためのキットであって、ｉ）  固相支持体、ｉｉ）  ＴＮＳＡＬＰ  に対するモノクローナル抗体等のアルカリ性ホスファターゼ部位認識物質、ｉｉｉ）  抗  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体等の標識された免疫グロブリン部位認識物質及び  ｉｖ）標識を検出するための成分を含むキットを用いることによって、効率良く  ＡＬＰ  ６  を測定することができる。
標識を検出するための成分とは、抗体が標識されたものを測定するための成分で、標識がビオチンの場合、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ酵素基質、及び過酸化水素水を含む試薬であり、標識がペルオキシダーゼの場合、ＯＰＤ  （ｏ−フエニレンジアミン）、ＤＡＢ（ジアミノベンジジン）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）等のペルオキシダーゼ基質を含む試薬である。このキットには、必要に応じ、洗浄剤液含んでもよい。本発明において、このキットを使用するときは、検体中の  ＡＬＰ  ６  を一次抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、ＥＤＴＡ・２Ｎａ  等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を製造例、参考例および実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に何ら限定されるものではない。
製造例１
抗ヒト  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体の製造
（１）モノクローナル抗体作製用抗原の選択と準備
本発明者達は抗ヒト  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体作成のための抗原として、ＴＮＳＡＬＰ  を発現していることが知られているヒト骨芽細胞株  Ｓａｏｓ−２  由来の  ＡＬＰ  を精製した。以下に精製法を述べる。
Ｓａｏｓ−２（ＨＴＢ−８５）は  ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手し、１０％  牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むα−ＭＥＭ（大日本製薬）にて培養した。８０％  程度細胞がコンフルーエントになったら、５０  ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ  ７．５）にて  ３  回デイッシュを洗浄し、０．５％  アデカトール  ＳＯ−１３５  を含む  ５０  ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ  ７．５）を加えた。ラバーポリスマンを使用して上記細胞を回収し、氷上にて超音波ホモジナイザーにて  １  分間ホモジナイズした。その細胞破砕液を遠心分離（２２，０００  ｒｐｍ  ３０  ｍｉｎ  ＲＴ）操作してその上清を４０％  硫安分画した。遠心分離（１０，０００  ｒｐｍ  ３０  ｍｉｎ  ＲＴ）を行って、その上清に硫安を追加溶解して  ６０％  硫安となるように調整し再分画を行った。この  ４０−６０％  硫安分画沈殿を  ５０  ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ  ７．５）に再溶解して  ５０  ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ  ７．５）に対して透析した。透析済みサンプルを  ＤＥＡＥ  カラム（アマシャム  バイオサイエンス社）にアプライし、吸着したタンパク質は  ＮａＣｌ  を含む上記トリス緩衝液の直線濃度勾配（０−０．５  Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出した。
ピークの  ＡＬＰ  活性は日立  ７１５０  自動分析装置を使用して、Ｎ−アッセイ  ＡＬＰ−ＬＳ  試薬（日東紡）を用いて測定した。活性のあったフラクションは限外ろ過法によって濃縮し、Ｓ−３００  カラム（アマシャム  バイオサイエンス）によって精製した。この活性フラクションを先の  ＤＥＡＥ  と同様に濃縮して  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  により確認するとほぼ  ＴＮＳＡＬＰ  がメジャーになっており、これを免疫用抗原として使用した。
【００２３】
（２）免疫
精製  ＴＮＳＡＬＰ  を  １  ｍｇ／ｍｌ  となるように  ５０  ｍＭ  トリス酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）で希釈し、５０μｇ（５０μｌ）をとってフロインド完全アジュバンド（ＷＡＫＯ）５０μｌ  と乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液を  Ｂａｌｂ／ｃ  ６週齢  雌マウス（日本クレアー）にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。２  週間後には同量の  ＴＮＳＡＬＰ  （５０μｇ／ｍｌ）をフロインド不完全アジュバンド（和光純薬）と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降  ２  週間後に同様の操作を行い、４  回目には最終免疫として  ＴＮＳＡＬＰ  ５０μｇ／ｍｌ  を  ５０  ｍＭ  トリス酸緩衝液（ｐＨ  ７．５）で調製しマウス尾静脈注射により投与した。
【００２４】
（３）ハイブリドーマの確立
最終免疫より  ３  日後に  ＴＮＳＡＬＰ  により感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ．  ２５６，  ４９５．  １９７５）に従って行われ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ４０００）（メルク社）を用いて脾細胞と骨髄腫細胞  Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１  （Ｐ３Ｕ１）  を融合した。その融合比率は脾臓細胞数  １０×１０７  個に対して骨髄腫細胞  Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１  （Ｐ３Ｕ１）  ２×１０７  個で、  ５：１  であった。  融合細胞は  １０％  ＦＣＳ（インビトロジェン）α−ＭＥＭ（アーバイン）ＨＡＴ（コスモバイオ）培地に分散し  ９６  穴マイクロタイターカルチャープレート（住友ベークライト）に分注して  ３７  ℃、５％  ＣＯ２  条件にて培養した。
【００２５】
（４）スクリーニング
約  ２  週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリーニングの実施法を以下に述べる。
スクリーニング用プレートを作製するために上記（１）にて精製した  ＴＮＳＡＬＰ  を  ５０  ｍＭ  トリス酸緩衝液中に溶解し、０．５  μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌ  となるように  ９６  穴ウエル（ヌンク社）に分注した。プレートを  ４℃  で  ２  晩静置した後に  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  を含むトリス緩衝液で  ３  回洗浄し、非特異的反応を抑えるために  １．５％  ＢＳＡ  溶液を  ２００μｌ  分注して、更に  ４℃  で  １  晩静置した。完成したプレートを  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  を含むトリス緩衝液で  ３  回洗浄した後に培養上清  １００μｌを反応させ、更に洗浄を行った後に二次抗体である  ＨＲＰ  標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ザイメッド社）  を加えて反応させた。洗浄後に  ＨＲＰ  の発色基質である  ３  ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フェニレンジアミン  （ＯＰＤ）  （ナカライテスク社）クエン酸発色溶液を  １００μｌ  加えて一定時間の発色後、１  Ｎ  硫酸を停止液として更に  １００μｌ  添加し、測定波長  ４９２  ｎｍ  にて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チェックした。
【００２６】
（５）抗体の確認
ＥＬＩＳＡ  によって精製  ＴＮＳＡＬＰ  との反応性を確認し、発明者達はクローン  ３−２９−３Ｒ、２Ｃ５−３２、１Ａ５−７  の  ３  種類が  ＴＮＳＡＬＰ  を認識したものとして選択した。得られた抗体をモノクローナル抗体タイピングキット（アマシャム  バイオサイエンス社）にて検定した結果を以下の表１に示す。
【００２７】
【表１】
2004333385.tif 000002
【００２８】
（６）モノクローナル抗体の作製及び精製
上記（５）で得られたハイブリドーマ  ３−２９−３Ｒ、２Ｃ５−３２、１Ａ５−７  細胞  １×１０７細胞個をプリスタン（アルドリッチ社）０．５  ｍｌ  投与後  ２  週間の  Ｂａｌｂ／ｃ  マウス（日本クレアー社）、１０  週齢、雌性に腹腔内投与し、約  ２  週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジエチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。スクリーニングで行った  ＥＬＩＳＡ  法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安  ４０％  で処理し、ＰＢＳ  に透析した後、３−２９−３Ｒ、１Ａ５−７  はプロテイン  Ｇ  カラム（アマシャム  バイオサイエンス社）により精製して  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  により確認した。２Ｃ５−３２  は  Ｓ−３００  を用いて精製した。その結果  ３−２９−３Ｒ、１Ａ５−７  は非還元では分子量約  １５０，０００  に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約  ５０，０００  のバンドと  ２５，０００  の  ２  本のバンドが確認された。２Ｃ５−３２  は非還元では分子量約  ９００，０００  に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約  ７０，０００  のバンドと  ２５，０００  の  ２  本のバンドが確認された。精製されたモノクローナル抗体  ３−２９−３Ｒ、１Ａ５−７、２Ｃ５−３２  ともにマウス１匹あたりそれぞれ約  １０ｍｇ  以上であって工業的利用を行うには十分量であった。
【００２９】
参考例１
抗ヒト  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体の特異性検定
モノクローナル抗体  ３−２９−３Ｒ、２Ｃ５−３２、１Ａ５−７  の特異性を調べるためにさまざまなアイソザイム（Ｓａｏｓ−２  由来  ＴＮＳＡＬＰ、肝型  ＡＬＰ  （常光）、骨型  ＡＬＰ  （常光）、小腸型  ＡＬＰ  （常光）、胎盤型  ＡＬＰ（シグマ社）を用いて下記の実験を行った。測定方法は以下のとおりである。
固層プレート（ヌンク社）上に精製したモノクローナル抗体を  ２μｇ／１００μＬ  ＰＢＳ／ｗｅｌｌ  になるように分注し、４℃で  ２  日間静置した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  を含む  ２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ  ７．０）洗浄液にて  ３  回洗浄した後、１．５％  ＢＳＡ  トリス緩衝液（ｐＨ  ７．０）を  ２００μｌ  加えて  ４℃で一晩ブロッキングした。このようにして作製したプレートを先の洗浄液で  １  回洗浄して、各種アイソザイムを反応させた。アイソザイムの酵素活性は  Ｋｉｎｄ−Ｋｉｎｇ  変法（ホルマザン法，日東紡  Ｎ−テスト  ＡＬＰ  Ｋ−Ｋ  キット使用）試薬を用いて測定し、全て  ２５ＩＵ／Ｌ  にあわせてその  １００μｌ  を抗体結合プレート上に加えた。室温で  ２  時間反応させ、反応終了後、前出の洗浄液にて  ３  回洗浄して  Ｋｉｎｄ−Ｋｉｎｇ  変法（ホルマザン法）に従い酵素活性を測定した。すなわち、抗体プレートに結合した  ＡＬＰ  に、１００μｌ  の基質溶液（フェニルリン酸二ナトリウムと  ４−アミノアンチピリン溶液とを含む溶液）を加えて、３７℃、１  時間反応させて、抗体が捕らえた  ＡＬＰ  酵素と合成基質とで酵素反応させ、ついで、得られる混合物に発色試薬（メタ過ヨウ素酸ナトリウムを含む溶液）を加えて発色させ、４９２ｎｍ  で吸光度を測定した。このときのデータを表２に示す。なお、このとき、ＡＬＰ  を入れないで同様に操作して得られるブランク値を求め、各測定値からブランク値を差し引いた値が抗体に対する各  ＡＬＰ  の活性値となる。
【００３０】
【表２】
2004333385.tif 000003
【００３１】
表２から分かるように、抗体  ３−２９−３Ｒ、２Ｃ５−３２  は  Ｓａｏｓ−２  由来  ＴＮＳＡＬＰ、肝型、骨型としか反応せず、他アイソザイムとの交差反応性を殆ど示さないことからヒト  ＴＮＳＡＬＰ  に特異性の高いモノクローナル抗体であることがわかった。すなわち、抗体  ３−２９−３Ｒ、２Ｃ５−３２  は、ＴＮＳＡＬＰ  に特異的、例えば、小腸型  ＡＬＰ  活性値と胎盤型  ＡＬＰ  活性値との和が、肝臓型  ＡＬＰ  活性値と骨型  ＡＬＰ  活性値との和の  １／１０  以下であることが判明した。
また、１Ａ５−７  は  Ｓａｏｓ−２  由来  ＴＮＳＡＬＰ  をはじめ全てのアイソザイムとよく反応した。つまり  １Ａ５−７  はあらゆる  ＡＬＰ  アイソザイムと反応することがわかった。尚、２  つのモノクローナル抗体の  ２５  ＩＵ／Ｌ  における肝型、骨型反応比率（肝：骨  反応比率）はそれぞれ  ３−２９−３Ｒ  が  １：０．５０  であり、２Ｃ５−３２  が  １：０．９３  であった。ところで、高  ＡＬＰ  検体の電気泳動結果で一般的に骨型よりも肝型が強くなった場合に  ＡＬＰ  ６  が現れやすい。そのため、抗体  ３−２９−３Ｒ  では、骨型  ＡＬＰ  活性が肝型  ＡＬＰ  活性の  ０．７  以下なので、本発明に用いると、より有効である。
【００３２】
参考例２
モノクローナル抗体を用いた血清中  ＡＬＰ  ６  の精製、およびその構造決定
（１）アフィニティーカラム作製
ＡＬＰ  ６  を構成する  ＡＬＰ  はほとんどが  ＴＮＳＡＬＰ  と考えられることから、実際に抗  ＴＮＳＡＬＰ  モノクローナル抗体である  ３−２９−３Ｒ  を利用して  ＡＬＰ  ６  の精製を試みた。
はじめに血清中から  ＴＮＳＡＬＰ  だけを精製するために  ＴＮＳＡＬＰ  に対して反応することが確認されたクローン  ３−２９−３Ｒ  を腹腔内投与したマウスの腹水から精製されたモノクローナル抗体をプレパックカラムである  ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ（アマシャム  バイオサイエンス社）に結合させ、抗ヒト  ＴＮＳＡＬＰ  カラムを作製した。以下、簡単に実験方法を示す。
はじめに未使用カラムを開封し  ５  ｍＬ  の氷冷した  １  ｍＭ  塩酸溶液を流速  １  ｍＬ／ｍｉｎ  で送液した。次に  １  ｍＬ  のモノクローナル抗体溶液（１５  ｍｇ／ｍＬ）を送液し、ドムナットで密閉して  ４℃、４  時間静置した。放置後、カップリングバッファー（０．２  Ｍ  炭酸水素ナトリウム緩衝液  ０．５  Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ８．３）を  ３  ｍＬ  流して、６  ｍＬ  のブロッキングバッファー（０．５  Ｍ  モノエタノールアミン溶液  ０．５  Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ８．３）にてブロッキングした。６ｍＬ  の洗浄液（０．１  Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液  ０．５  Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ４．０）にて洗浄後、再び  ６  ｍＬ  のブロッキングバッファー（０．５  Ｍ  モノエタノールアミン溶液  ０．５  Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ８．３）を通して、室温にて  ３０  分間放置した。その後  ６  ｍＬ  の洗浄液、ブロッキング液、洗浄液と交互に流して最後に  ２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  緩衝液  ｐＨ  ８．０  にてカラムを平衡化した。
【００３３】
（２）アフィニティーカラムによる血清中  ＴＮＳＡＬＰ  の精製
完成した  ３−２９−３Ｒ  の  ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ  カラムを用いて血清中反応物を精製した。はじめにボランティアより得た成人血清  ４０  ｍＬ  を  ４℃、流速  ０．２  ｍＬ／ｍｉｎ  で一晩、カラムに環流させた。その後  ２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  緩衝液  ｐＨ  ８．０  にてカラムを洗浄し、１００  ｍＭ  グリシン緩衝液  ｐＨ  ２．７  で溶出させた。また、全く同様にインフォームド・コンセントを行って得た  ７００  ＩＵ／Ｌ  以上の  ＡＬＰ  高値検体プール  ４０  ｍＬ  を環流しつづけた後、同様に溶出フラクションを回収した。回収フラクションには  １／１０  量の  １  Ｍ  Ｔｒｉｓ  緩衝液  ｐＨ  ９．０  を加えておき、回収後即座に中和した。
【００３４】
（３）アフィニティーカラム溶出分画からの  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  カラムによる  ＡＬＰ  ６  の精製
この  ３−２９−３Ｒ  アフィニティーカラム溶出フラクションを健常人、ＡＬＰ  高値にわけて解析した。方法は製造例１の（６）でおこなった抗体精製と同様である。簡単には、３−２９−３Ｒ  カラム溶出フラクションを更に  ５  ｍＬ  のＨｉＴｒａｐ  プロテイン  Ｇ  カラム（アマシャム  バイオサイエンス）にかけて精製を行った。まず、３−２９−３Ｒ  アフィニティーカラム溶出フラクションピークを  ５  ｍＬ  にあわせてカラムへ充填し、４℃で一晩反応させた。その後  １００  ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ  ８．０）で洗浄し、はじめのスルー画分を予備に  ５  ｍＬ  集めた後続いて比色計にて  Ａ２８０  がブランクと同値になるまで洗浄した。続いて  １００  ｍＭ  グリシン緩衝液（ｐＨ  ２．０）にて溶出させ、直ちにフラクションを  １  Ｍ  トリス緩衝液（ｐＨ  ９．０）で中和した。すると  ＡＬＰ  高値検体からのフラクションのみに特に高い濃度の蛋白質の溶出が認められた。健常人検体からは殆ど溶出が認められなかった。
【００３５】
（４）電気泳動及びウエスタン・ブロッティング
この高  ＡＬＰ  患者検体フラクション及び健常人検体フラクションを電気泳動法、ウエスタン・ブロッティングにより解析した。溶出フラクション蛋白質を  ２０μｇ／Ｌａｎｅ  にあわせて  １０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  をおこなった。ゲルは  ＰＡＧ  ミニ「第一」４／２０％  グラジエントゲル（第一化学薬品）である。泳動終了後一部を切り取りクマシーブリリアントブルー染色による蛋白質染色を実施した。残りのゲルはウエットブロットによりウエスタン・ブロッティングを行った。ブロッテイングが終了したら、ブロックエース（大日本製薬）を用いて  ４℃、一晩ブロッキングをした。翌日、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  を含む  ５０  ｍＭトリス溶液（ｐＨ  ７．５）にて膜を軽く洗浄し、室温、２  時間、抗体を反応させた。ウエスタン・ブロッティングの反応抗体は  １／５００  希釈抗  ＩｇＧ１−ＨＲＰ（大日本製薬）と  １／３００  希釈抗  ３−２９−３Ｒ−ＨＲＰ  標識である。反応後  １０  分づつ  ３  回  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  を含む  ５０  ｍＭ  トリス溶液（ｐＨ  ７．５）にて膜を洗浄し、ＨＲＰ  用発色試薬（和光純薬）を用いて発色した。
【００３６】
結果を図１に示した。図１の結果から  ＡＬＰ  高値検体のサンプル中に分子量約  ２２０  ｋＤａ  と  ３００  ｋＤａ  近い巨大分子が存在することがわかった。この分子はウエスタン・ブロッティングによって  ＩｇＧ１  とも  ＴＮＳＡＬＰ  とも反応し、同じ位置に反応バンドが検出されることから一量体  ＡＬＰ  （６８  ｋＤａ）  と  ＩｇＧ１  （１５０  ｋＤａ）  の結合した  ＡＬＰ  ６  （２１８  ｋＤａ）  と二量体  ＡＬＰ  （１３６  ｋＤａ）  と  ＩｇＧ１  が結合した  ＡＬＰ  ６  （２８６  ｋＤａ）  と考えられた。一方、健常人フラクションは全く反応しなかった。上記実験から以下のことが言える。
１）抗  ３−２９−３Ｒ  アフィニティークロマトグラフィーで  ＡＬＰ  ６  が  ＴＮＳＡＬＰ  を抗原部位としてカラムに結合し、その際溶出に使用するグリシン緩衝液（ｐＨ  ２．０）によって、ＡＬＰ  とイムノグロブリンの結合を解除しながらフラクションサンプルとなった。
２）１）で分離した  ＴＮＳＡＬＰ  とイムノグロブリンは中和操作によって再び  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  において高分子化  ＡＬＰ  複合体となった。これは  ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ  によるウエスタン・ブロッティングにて高分子量域に  ＡＬＰ、ＩｇＧ  どちらとも反応するバンドがあることで証明された。よって抗体  ３−２９−３Ｒ  は  ＩｇＧ  の結合、非結合に関係なく  ＴＮＳＡＬＰ  を認識して結合させ、この  ＴＮＳＡＬＰ  に自己免疫的に結合していた  ＩｇＧを認識する標識二次抗体が結合する反応系によって  ＡＬＰ  ６  が測定可能であることが示された。
【００３７】
参考例３
免疫酵素活性測定法による血清中の  ＴＮＳＡＬＰ  値の測定
上記方法によって作製、精製されたモノクローナル抗体  ３−２９−３Ｒ  、１Ａ５−７  を参考例１と全く同様の方法で  Ｎｕｎｃ  社製プレートに  ２μｇ／１００μＬ  ＰＢＳで分注、ブロッキングして抗体結合プレートを作製した。使用前にそのプレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  を含む  １００  ｍＭ  トリス緩衝液  （ｐＨ  ７．５）  ２００  μＬ  で  １  回洗浄し、ここにインフォームド・コンセントを行ったボランティア及び患者検体  １０  μＬ  と  １００  ｍＭ  トリス緩衝液  （ｐＨ  ７．５）  ９０μＬ  を加えて室温、１  時間反応させた。反応終了後、そのプレートを  ０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  を含む  １００  ｍＭ  トリス緩衝液  （ｐＨ  ７．５）  ２００  μＬ  で  ３  回洗浄した。次いで、そのプレートに  １００  μｌ  の  Ｎ  テスト  ＡＬＰ  Ｋｉｎｄ−Ｋｉｎｇ  試薬  （日東紡）  の基質溶液、すなわち、フェニルリン酸二ナトリウムと４−アミノアンチピリンを含む溶液）  を加えて更に  ３７℃、ｐＨ  １０  で  １  時間、酵素反応させた。さらに、その反応液に、発色試薬（メタ過ヨウ素酸ナトリウムを含む溶液）  １００  μＬ  を添加してその発色値を  ４９２  ｎｍ  にて比色することにより  ＴＮＳＡＬＰ  値を求めた。測定範囲を超える高値検体については希釈して再測定をした。
表３に、モノクローナル抗体  ３−２９−３Ｒ、１Ａ５−７  を用いて得られる  ＴＮＳＡＬＰ  値の結果を示す。これらの結果を、Ｔｏｔａｌ  ＡＬＰ  活性値  （ＪＳＣＣ  準拠値）  と比較した。
【００３８】
【表３】
2004333385.tif 000004
【００３９】
モノクローナル抗体  ３−２９−３Ｒ  を用いて得られる  ＴＮＳＡＬＰ  値と  Ｔｏｔａｌ  ＡＬＰ  活性値とは、検体  １５  のデータにおいて強く乖離している。一方、モノクローナル抗体  １Ａ５−７  を用いて得られる  ＴＮＳＡＬＰ  値と、Ｔｏｔａｌ  ＡＬＰ  活性値（ＪＳＣＣ  準拠値）とは、検体  １５  のデータも含め、両値に相関関係が強くみられる。つまり、抗体  ３−２９−３Ｒ  を用いて得られる  ＴＮＳＡＬＰ  活性値は、胎盤型  ＡＬＰ  や小腸型  ＡＬＰ  の活性値は含まれない点で  Ｔｏｔａｌ  ＡＬＰ  活性値とは異なり、妊娠、腫瘍からくる胎盤型（ＡＬＰ）の上昇や血液型  Ｏ、Ｂ  型の食後における小腸型分泌（ＡＬＰ）による  ＡＬＰ  上昇などの原因で  ＡＬＰ  値が上昇するのを排除できている。したがって、一次抗体として抗体  ３−２９−３Ｒ  を用いることは、ＡＬＰ  ６  を  ＥＬＩＳＡ  法で測定する際にさらに有利と考えられる。
【００４０】
実施例１
種々の二次抗体を用いた  ＥＬＩＳＡ  法による  ＡＬＰ  ６  の測定
ＡＬＰ  ６  内の免疫グロブリンに対する各種抗体の親和性を調査するため、二次抗体として各種抗体を用い、ＥＬＩＳＡ  法により  ＡＬＰ  ６  を測定した。その結果、二次抗体としてヒト  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体を用いると最良の結果を得た。以下に詳述する。
一次抗体として二種類の抗体  ３−２９−３Ｒ  、１Ａ５−７  プレートを用い、二次抗体として、（１）免疫グロブリン結合物質として  ２００  倍希釈  ＨＲＰ  標識抗ヒト  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体（大日本製薬）、（２）  ２００  倍希釈  ＨＲＰ  標識抗ヒト  ＩｇＭ  モノクローナル抗体（第日本製薬）、（３）  １／２００  希釈  ＨＲＰ  標識抗  ＩｇＡ  モノクローナル抗体（ザイメッド社）、（４）  ２５０  倍希釈  ＨＲＰ  標識抗ヒトイムノグロブリンポリクローナル抗体（ダコ社）、（５）  ５００  倍希釈  ＨＲＰ  標識抗ヒトイムノグロブリンポリクローナル抗体（ダコ社）を用いた。検体としては、参考例３と同一検体を用いた。まず、抗体  ３−２９−３Ｒ  または  １Ａ５−７  プレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  を含む  １００  ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ  ７．５）２００μＬ  で  １  回洗浄した。次いで、これらのプレートに、インフォームド・コンセントを行った健常人ボランティア及び患者検体  ３０  μＬ  と１００  ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ  ７．５）７０μＬ  を加えて室温、１  時間反応させた。一次抗体反応終了後、そのプレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  を含む  １００  ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ  ７．５）２００μＬ  で  ３  回洗浄し、１００μｌ  の上記  （１）〜（５）の各種二次標識抗体を加えて更に  ３７℃、１  時間反応させた。１  時間後に洗浄を行い、標識  ＨＲＰ  に対する基質溶液（ＯＰＤ  溶液）を反応させ、一定時間後に発色停止試薬  １  Ｎ  硫酸  １００μＬ  を添加してその発色値を  ４９２  ｎｍ  にて比色し  ＥＬＩＳＡ  法による  ＡＬＰ  ６  値を求めた。
【００４１】
結果として一次抗体が  ３−２９−３Ｒ、１Ａ５−７  のどちらであっても、免疫グロブリン部位認識物質に関しては、ほぼ同様の結果が得られた。つまり二次抗体として抗  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体を使用した時には電気泳動法の結果とよく相関する結果を得た（実施例２で結果を詳述する）。一方、抗  ＩｇＭ  抗体、抗  ＩｇＡ  抗体ではほとんど発色せずブランクと変わらなかった。更に、二次抗体として、イムノグロブリンのポリクローナル抗体を用いた実験区では全て吸光度それぞれ  １．５、２．６  程度に高くなってしまい、結果が不明瞭になった。なお、以上のことから、ＡＬＰ  に結合している自己免疫様イムノグロブリンはほとんどが  ＩｇＧ１  であり、ＩｇＭ、ＩｇＡ  はあまり結合していないと判明した。したがって、二次抗体として  ＩｇＧ１  と結合可能な抗体を用いると特に良好な結果をもたらすことが判明した。
【００４２】
実施例２
ＥＬＩＳＡ  法、乗法値法による  ＡＬＰ６  値と電気泳動検出法との比較
一次抗体として抗体  ３−２９−３Ｒ、抗体  １Ａ５−７  を用い、かつ、二次抗体として抗  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ  法による  ＡＬＰ  ６  値、また、乗法値による  ＡＬＰ  ６  値を求めた。ＥＬＩＳＡ  法による  ＡＬＰ  ６  値は、実施例１と同様な方法により求めた。また、乗法値による  ＡＬＰ  ６  値は、「ＥＬＩＳＡ  法による  ＡＬＰ  ６  値」と「表３に示される  ＴＮＳＡＬＰ  値」との乗法値を計算して求めた。また、比較のため、キャピラリー等電点電気泳動法による  ＡＬＰ  ６  の判定、ＴＮＳＡＬＰ  の肝型と骨型との優勢判定を行った。これらの結果を表４及び図２に示す。そのうち特に、検体９から１２について電気泳動の実際の結果を図３に示す。
【００４３】
【表４】
2004333385.tif 000005
【００４４】
表４の結果より、ＡＬＰ  ６  値を測定する際、乗法値法の方が  ＥＬＩＳＡ  法より、電気泳動の結果によく一致することが判明した。また、一次抗体として抗体  ３−２９−３Ｒを用いたときは、ＡＬＰ  ６  の  ＥＬＩＳＡ  値や乗法値は、特に電気泳動の結果に良く相関していた。このことは、本発明において、アルカリ性ホスファターゼ部位認識物質として、ＴＮＳＡＬＰ  を特異的に結合するモノクローナル抗体を用いることが特に好ましい結果をもたらすことを示している。また、電気泳動の  ＴＮＳＡＬＰ  の判定では、肝型  ＡＬＰ  が骨型  ＡＬＰ  優勢のときと本発明の  ＡＬＰ  ６  値は高い傾向を示し、そのとき、電気泳動の  ＡＬＰ  ６  は陽性になりやすいことが判明した。
よって抗体  ３−２９−３Ｒ  は  ＩｇＧ  の結合、非結合に関係なく  ＴＮＳＡＬＰ  を認識して結合させ、この  ＴＮＳＡＬＰ  に自己免疫的に結合していた  ＩｇＧ  を認識する標識二次抗体が結合する反応系によって  ＡＬＰ  ６  が特に正確に測定可能であることが示された。
以上の結果から本発明の反応系例（一次抗体：ヒト  ＴＮＳＡＬＰ  認識モノクローナル抗体、二次標識抗体：ＨＲＰ  標識抗ヒト  ＩｇＧ１  モノクローナル抗体）を用いて  ＡＬＰ  ６  精密測定を行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウエスタン・ブロッティング及び  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  の結果を示す。矢印に  ＡＬＰ  ６  のバンドが確認できる。二量体  ＡＬＰ  （１３６  ｋＤａ）  と  ＩｇＧ  （１５０  ｋＤａ）  の結合した分子は約  ２８６  ｋＤａに、一量体  ＡＬＰ  （６８  ｋＤａ）  と  ＩｇＧ  の結合分子は  ２１８  ｋＤａ  に確認できる。
【図２】本発明の乗法値法による  ＡＬＰ  ６  値と電気泳動法の判定を比較している。結果として  ＴＮＳＡＬＰ  認識抗体  ３−２９−３Ｒ  と二次抗体ＨＲＰ  標識抗  ＩｇＧ１  の組み合わせ結果が電気泳動の結果とも特によく相関していた。
【図３】キャピラリー電気泳動法の結果を示す。検体  ９、１０、１１  は肝型が強く、１２  は骨型が強い。ＡＬＰ  ６  は検体  Ｎｏ．１０、１１  で強陽性であり、Ｎｏ．９  は陽性、Ｎｏ．  １２  では  ＡＬＰ  ６  がほとんど認められなかった。
【図１】
2004333385.tif 000006
【図２】
2004333385.tif 000007
【図３】
2004333385.tif 000008