(57)【要約】【課題】本発明は、抗原提示細胞表面などに見られる主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質（以下ＭＨＣクラスＩＩと略す）の製造方法を提供する。【解決手段】主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質をコードする遺伝子を用いて微生物を形質転換することを特徴とする主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質をコードする遺伝子を用いて微生物を形質転換することを特徴とする主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質の製造方法。
【請求項２】
微生物が大腸菌、酵母菌および枯草菌から選ばれることを特徴とする請求項１記載の主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質の製造方法。
【請求項３】
主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させる際に不溶性蛋白質として発現させた後、可溶性蛋白質に改質することを特徴とする請求項１記載の主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗原提示細胞表面などに見られる主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質（以下ＭＨＣクラスＩＩと略す）の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＭＨＣクラスＩＩは、Ｂ細胞やマクロファージ、血管内皮細胞などの細胞表面に存在し、抗原提示の際に自己非自己を識別するために用いられる糖タンパク質である。近年になり、ＭＨＣクラスＩＩが細菌毒素等のスーパー抗原と称する一群の蛋白質に対する結合蛋白質であることが判明し、且つ自己免疫疾患においてＭＨＣクラスＩＩのサブクラスに偏りがみられることなどから、医学・免疫学的に重要視され始めている。
【０００３】
スーパー抗原とは、従来の抗原と異なり抗原提示細胞内におけるプロセッシング過程を経ることなく、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩに結合し、さらにはこのＭＨＣクラスＩＩとの複合体を形成することにより特定のＶ領域を有するＴ細胞を刺激し免疫系を異常に活性化させる一群の蛋白質である。
【０００４】
これまでに、黄色ブドウ球菌毒素や連鎖球菌毒素、エルシニア菌毒素、あるいはある種のウイルス蛋白質やヒートショック蛋白質が確認されているが、以後も特定化されていく可能性がある。
【０００５】
現在、ＭＨＣクラスＩＩを単離し入手するには、哺乳類細胞や昆虫細胞にＭＨＣクラスＩＩの遺伝子を導入し発現させるか、あるいは天然に存在するＭＨＣクラスＩＩをＢ細胞やマクロファージ、血管内皮細胞などの細胞膜中から精製してくる必要がある。
【０００６】
しかし、天然型ＭＨＣクラスＩＩを細胞膜中より大量に得る場合、膜表面の発現量が少ないために、大量の細胞を必要とし、培養細胞を用いたとしても多くの時間と費用を要する。
【０００７】
また、哺乳類細胞や昆虫細胞に遺伝子技術を用いて組換え型ＭＨＣクラスＩＩを産生させる場合にも、細胞の培養に費用と時間が多く必要である。
【０００８】
これまでに、主要組織適合性抗原クラスＩに関しては大腸菌を用いた発現系による大量発系が報告されている（Ｋ．Ｃ．パーカーら、モレキュラー　イミュノロジー、２９巻、３７１頁（１９９２））が、ＭＨＣクラスＩＩについては知られていなかった。
【０００９】
これまで、ＭＨＣクラスＩＩ固定化材料としては、ＭＨＣクラスＩＩを細胞表面上に発現させ、細胞ごとプレート上に吸着したものや、ＭＨＣクラスＩＩのサブユニットの部分アミノ酸配列を合成し、材料上に吸着固定した材料は報告されている（Ｊ．Ｋ．ラッセルら、バイオケミカル　アンド　バイオフィジカル　リサーチコミュニケーションズ、１６８巻、６９６頁（１９９０）。
【００１０】
また、スーパー抗原を吸着する材料としては、スーパー抗原に対する抗体を固定化した材料が既に報告されており、スーパー抗原の免疫学的測定等に用いられている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細菌類を用いることにより生産性・操作性を容易にしたことを特徴とするＭＨＣクラスＩＩの製造方法を提供するものである。
【００１２】
細菌類は昆虫や哺乳類由来の細胞と異なり、増殖速度も速く、かつ培地組成も牛胎児血清や増殖因子等の高価な組成を必要とせず、植え継ぎや培地交換などの操作を必要としない。
【００１３】
しかし、大腸菌などの細菌類中において哺乳類由来の蛋白質は細菌毒性等の問題により発現しない場合が多い。
【００１４】
本発明者らは、種々の発現ベクターを改良検討した結果、大腸菌や酵母菌、枯草菌等の細菌内においてＭＨＣクラスＩＩを発現させることに成功し、効率よく大量に蛋白質を製造することを可能とした。
【００１５】
本発明はまた、医学的にはスーパー抗原を含むＭＨＣクラスＩＩ親和性の、病因物質を対象とした血液浄化システムの開発を、また、免疫学的にはスーパー抗原を含むＭＨＣクラスＩＩ親和性の病因物質の単離精製や酵素免疫学的測定に用いる上記済因物質全般を結合できる材料を提供するものである。
【００１６】
ここで、上述したように、細胞ごと固定化した材料ではＭＨＣクラスＩＩ以外の蛋白質等も固定されてしまい、未知の活性を持つ可能性があり、また、固定化密度も任意に変えることには限界がある。ＭＨＣクラスＩＩのサブユニットの部分アミノ酸配列を合成し、材料上に吸着固定した材料は、緩衝液中から高濃度のスーパー抗原を検出する目的には使用できるが、血液中からのスーパー抗原の除去等の目的には吸着固定はリガンドの遊離が考えられ、使用できない。
【００１７】
また、部分配列のみではスーパー抗原に対する結合能が低く、スーパー抗原の検出および定量を行う場合に十分の性能が得られない。また、抗体固定化材料では、スーパー抗原１種類毎に異なった抗体を固定化した材料が各々必要になる。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、かかる従来技術の問題点を解消しようとするものであり、下記の構成を有する。
（１）主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質をコードする遺伝子を用いて微生物を形質転換することを特徴とする主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質の製造方法。
（２）微生物が大腸菌、酵母菌および枯草菌から選ばれることを特徴とする（１）記載の主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質の製造方法。
（３）主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させる際に不溶性蛋白質として発現させた後、可溶性蛋白質に改質することを特徴とする（１）記載の主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質の製造方法。
（４）主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質のαおよびβサブユニットを個別に作製した後に再構成することを特徴とする（１）記載の主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質の製造方法。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明に用いたＭＨＣクラスＩＩをコードする遺伝子は既に報告されているＤＮＡ配列（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．６８，ｐ４６５，（１９９２），　Ｄ．Ａ．Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，　ｖｏ１．１７４，Ｐ２１９，　（１９９１））をもとにＰＣＲ用のＤＮＡプライマーを作成しＢ細胞等の人細胞中より常法、例えば「遺伝子増幅ＰＣＲ法（蛋白質・核酸・酵素臨時増刊）　ｖｏｌ．３５　Ｎｏ．１７（１９９０）」に記載の方法、に従いＰＣＲ法により複製して得た。このＤＮＡのコードする蛋白質の調製法としては、遺伝子組換え技術を利用して大腸菌、酵母菌、昆虫細胞や哺乳類細胞内で発現させる方法が挙げられる。
【００２０】
このうち、増殖速度の速さなどの生産効率の高さ・培養条件等の操作性の良さから考えると大腸菌や酵母菌あるいは枯草菌を用いることがより好ましい。発現方法としては、本蛋白質をコードするＤＮＡあるいはその一部に蛋白質合成開始信号と終結信号、また、菌体外へ分泌させるときは分泌信号を付加した後、種々の公知の発現ベクターに結合させ、直接本発明の蛋白質あるいはその一部を発現させる方法、また、他のペプチド、例えば、インターロイキン２、マルトース結合蛋白質、βガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ蛋白質等との融合蛋白質として発現させる方法がある。また、発現後の蛋白質の精製のしやすさを考慮して、ＭＨＣクラスＩＩの活性が保たれるならば、ヒスチジンの６量体等を付加しても良い。
【００２１】
ＭＨＣクラスＩＩの細菌に対する毒性を考慮すると、発現の際に融合蛋白質などの形で不溶性の顆粒体を形成させるか、Ｔ７リボヌクレアーゼ・プロモーターやヒートショックプロモーター等の転写開始制御能の高いプロモーターを用いることが好ましい。ここで、融合蛋白質とＭＨＣクラスＩＩの間にプロテアーゼ（例えば活性化血液凝固第十因子（ＦａｃｔｏｒＸａ）、ＩｇＡプロテアーゼ　）の認識サイトや化学試薬（例えばシアノゲンブロマイド）による切断部位を導入することにより、発現後にプロテアーゼや化学試薬を用いて消化・分離することも可能である。発現後のＭＨＣクラスＩＩあるいはその一部の精製には公知の手法が用いられ、例えば、硫安沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー等が挙げられ、また、メソッドイン　エンザイモロジー（アカデミックプレス社　１８９０）に記載の方法が適応できる。また、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、チオレトキシン、プロチオニン、グルタチオンやβメルカプトエタノールなどを添加しサブユニットのジスルフィド結合を矯正してもよい。
【００２２】
また、αサブユニットおよびβサブユニットを別々に発現させた後に再構成するには、両サブユニットを等モル量ずつを混合し４℃〜６０℃より好ましくは２０℃〜４０℃の温度で５分以上より好ましくは６０分以上放置する。
【００２３】
また、混合するときに若干の変性剤（例えば１Ｍ尿素、１０％アセトニトリル等）を添加し、前述の温度範囲内で透析しつつ再構成することも可能である。
【００２４】
本発明におけるＭＨＣクラスＩＩを固定化した材料は、生体膜中より得られる天然型ＭＨＣクラスＩＩあるいはそのαおよび／またはβサブユニットあるいはそれらの一部分、あるいは細胞や細菌を形質転換し得られる組換え型ＭＨＣクラスＩＩあるいはそのαおよび／またはβサブユニットあるいはそれらの一部分をビーズ、繊維、中空糸、織物、プレート、チューブなどの材料上に共有結合を用いて結合することにより得られる。
【００２５】
この中で、ＭＨＣクラスＩＩは、大量に効率よく入手できることから、組換え型、特に大腸菌あるいは酵母菌により産生されたものがより好ましい。
【００２６】
このように、ＭＨＣクラスＩＩの発現、固定化法、担体の検討を進めることによりＭＨＣクラスＩＩの活性を損なわない固定化材の開発に成功し本発明に至った。
【００２７】
以下に詳細を説明する。
（１）ＭＨＣクラスＩＩ
ＭＨＣクラスＩＩは、Ｂ細胞・単核球などの抗原提示細胞をそのままあるいはガンマーインターフェロン等により刺激したものの細胞膜上から直接単離精製した天然型ＭＨＣクラスＩＩあるいはＣＨＯ細胞、Ｌ細胞等の哺乳類由来の細胞や昆虫細胞を形質転換して得られるＭＨＣクラスＩＩ産生細胞より精製する組換え型ＭＨＣクラスＩＩを用いることができる。この中で、大量に効率よく入手できることから、組換え型、特に大腸菌や酵母菌あるいは枯草菌により産生されたものがより好ましい。また、ＭＨＣクラスＩＩのサブユニットのみ、あるいはその部分配列の固定でも結合能はあるが、結合の強さから考えると、アミノ酸４０残基以上の分子量を有することが好ましく、より好ましくはαβ複合体を用いる。
（２）固定化法
固定化方法としては、共有結合、イオン結合、配位結合、疎水結合あるいは包括法を用いて結合あるいは吸着することにより得られるが、固定した蛋白質の遊離を防ぐためには共有結合がより好ましい。
【００２８】
また、蛋白質の固定にはタンパク質のアミノ基、カルボキシル基、スルフィド基を用いる方法が一般的であるが、ＭＨＣクラスＩＩのＮ末端側にスーパー抗原の結合部位があることを考慮すると、カルボキシル基を用いた固定化方法がより好ましい。
【００２９】
（３）固定化担体
ＭＨＣクラスＩＩを固定化する担体はポリメチルメタアクリレート、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコールあるいはそれらの誘導体等の合成高分子やセルロース、キトサンあるいはそれら誘導体等のような天然高分子、セラミックスや金属などの無機材料、で構成されるビーズ、繊維、中空糸、プレート、チューブなどを用いることができる。このうち、固定化材料としては官能基の挿入が容易な高分子化合物を用いることがより好ましく、形態としては操作性や表面積の大きさから中空系、ビーズ、繊維、織物等がより好ましい。
【００３０】
このようにしてにして得られるＭＨＣクラスＩＩ固定化材料において、ＭＨＣクラスＩＩの活性を最大に用いることの出来得る結合法を検討した結果、血液中に置いてもスーパー抗原を特異的に捕捉結合し得る血液浄化モジュールを確立し、本発明の成功に至った。
【００３１】
また、スーパー抗原を検出定量する方法としてＭＨＣクラスＩＩあるいはＭＨＣクラスＩＩαサブユニットあるいはβサブユニットあるいはそれらの部分配列ペプチドを用いることにより１種類の固定化材料で、スーパー抗原全てを捕捉できることが可能となった。
【００３２】
スーパー抗原に対する結合性は蛋白質の３次構造に影響されるため、スーパー抗原をより強く結合させるためにはアミノ酸残基数３０ｍｅｒ以上より好ましくは４０ｍｅｒ以上より好ましくはサブユニット全配列さらに好ましくはαおよびβサブユニットより構成されたＭＨＣクラスＩＩが良い。
【００３３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明が実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
ＭＨＣクラスＩＩαサブユニットの大腸菌内での発現
ＭＨＣクラスＩＩのαサブユニットは以下のように作製した。
【００３５】
ヒートショックプロモーターを有し、βガラクトシダーゼおよび血液凝固因子のＦａｃｔｏｒＸａの認識部位をコードする配列を持つｐＵＥＦのＥｃｏＲＩ　サイトとＸｂａＩサイトの問にＭＨＣクラスＩＩαサブユニット遺伝子を挿入した。（図１）このベクターを用いて大腸菌を形質転換し、Ｌ培地中で３０℃、８時間培養後培地温度を４２℃に上昇させ１５分間誘導をかける。誘導後培地温度を３７℃にしさらに２時間培養した後培養液より大腸菌を回収した。
【００３６】
また、βガラクトシダーゼとの融合蛋白質にすることでパラアミノフェニル１−チオβ−　Ｄ−　ガラクトピラノシド固定化カラムを用いて精製可能であり、βガラクトシダーゼとＭＨＣクラスＩＩの間にＦａｃｌｏｒＸａの認識部位が存在するので、蛋白質発現後にＦａｃｔｏｒＸａにより消化することで保護蛋白質であるβカラクトシダーゼを含まないＭＨＣクラスＩＩαサブユニットを得ることができる。
【００３７】
実施例２
ＭＨＣクラスＩＩのβサブユニットの不溶性蛋白質としての発現
ＭＨＣクラスＩＩのβサブユニットは以下のように作製した。
【００３８】
トリプトファンプロモーターを有し、ｔｒｐＥ蛋白質およびＩｇＡプロテアーゼの認識部位をコードする配列を持つｐ　ＴＩベクターのＥｃｏＲＩ　サイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間にＭＨＣクラスＩＩβサブユニット遺伝子を挿入した（図２）。このベクターを用いて大腸菌を形質転換し、Ｍ９培地中で３７℃、８時間培養後インドールアクリル酸を用いて誘導をかける。誘導後、２時間培養した後培養液より大腸菌を回収した。
【００３９】
また、ｔｒｐＥ蛋白質と融合蛋白質にすることで目的の蛋白質は不溶性画分に沈澱してくる。不溶性画分を２Ｍ尿素を含むトリス緩衝液で洗浄後、８Ｍ尿素を含むトリス緩衝液を用いて目的の融合蛋白質を可溶化する。可溶化の際に、還元剤として１ｍＭジチオスレイトールや２％βメルカプトエタノールを添加すると回収率が向上しより好ましい。可溶化後直ちに、ゲルろ過法により分子量分画を行い、混入している脂質や他の不溶性の強い蛋白質と分離した後に、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４　）、５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液中で透析する。透析後も沈澱物は得られず、融合蛋白質は１００％回収可能である。ここで、分子量分画を行わずに透析しても可溶化成分に目的蛋白質は得られるが、その大半は透析後に不溶性画分に沈澱してくる。
【００４０】
得られた可溶性画分をｌｇＡ　プロテアーゼ消化後、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、等の方法により、保護蛋白質であるｔｒｐＥ蛋白質を含まないＭＨＣクラスＩＩβサブユニットを得ることができる。疎水クロマトグラフやイオン交換クロマトグラフによる目的蛋白質を精製のプロテアーゼ消化前に行うことも可能である。
【００４１】
実施例３
ＭＨＣクラスＩＩのα及びβサブユニットからの再構成
実施例１及び２で作成したＭＨＣクラスＩＩのα及びβサブユニットをそれぞれの濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように、８Ｍ尿素、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解する。溶解後、蛋白質溶液を４℃で１Ｍ尿素を含む１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で透析する。透析後さらに３０℃で尿素を含まない１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で透析することによりＭＨＣクラスＩＩ複合体を得ることが出来る。
【００４２】
実施例４
大腸菌を用いて産生したＭＨＣクラスＩＩをビーズ上に固定化した。固定化はＭＨＣクラスＩＩを１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように５０ｍＭ　ほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌで溶解した水溶液中にスクシンイミド基を有するキトサンビーズを１ｍｌ加え、４℃で８時間反応させた。反応後、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌにより、未反応の官能基の不活化と未反応蛋白質の洗浄を行った。固定化ビーズのアミノ酸分析の結果より固定化量はビーズ１ｍｌ当り２．３ｍｇ蛋白であった。このようにして作成したＭＨＣクラスＩＩ固定化ビーズおよびトリス塩酸緩衝液とのみ反応させたスクシンイミド基を有するキトサンビーズを各々０．５ｍｌずつを１ｎｇ／ｍ１　の濃度で黄色ブドウ球菌外毒素（ＴＳＳＴ−１）を含む水溶液中に添加したところ図３に示すように、ＭＨＣクラスＩＩ固定化ビーズにおいてのみ毒素の吸着が観察され、ＭＨＣクラスＩＩが毒素との結合活性を有したまま材料上に共有結合により固定化されたことが示された。図３中、白丸印はＭＨＣクラスＩＩ固定化ビーズ、黒丸印は未反応ビーズを示す。ＭＨＣクラスＩＩ固定化ビーズにおいてのみＴＳＳＴ−１濃度の低下が観察された。
【００４３】
実施例５
大腸菌を用いて産生したＭＨＣクラスＩＩを中空糸膜上に固定化した。固定化はＭＨＣクラスＩＩを１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌで溶解した水溶液中にアミノ基を有するポリスルホン中空糸を１ｇを加え、４℃で８時間反応させた。
【００４４】
反応には触媒としてカルボシイミドを添加した。固定化中空糸のアミノ酸分析の結果より固定化量は中空糸１ｇ当り２．０ｍｇ蛋白であった。このようにして作成したＭＨＣクラスＩＩ固定化中空糸および未反応中空糸各々０．５ｇずつを用いてモジュールを作製し１ｎｇ／ｍｌ　の濃度で黄色ブドウ球菌外毒素（ＴＳＳＴ−１）を含む血清を循環させたところ図４に示すように、ＭＨＣクラスＩＩ固定化中空糸においてのみ毒素の吸着が観察され、ＭＨＣクラスＩＩ固定化中空糸により毒素の血液中からの除去が可能なことが示された。図４中、白丸印はＭＨＣクラスＩＩ固定化中空糸、黒丸印は未反応中空糸を示す。ＭＨＣクラスＩＩ固定化中空糸においてのみＴＳＳＴ−１の濃度低下が観察された。
【００４５】
実施例６
Ｂ細胞より抽出したＭＨＣクラスＩＩ及び大腸菌により発現したＭＨＣクラスＩＩβサブユニット及びペプチド合成機により合成したＭＨＣクラスＩＩのβサブユニットの部分アミノ酸配列（スーパー抗原との結合性があるとされる３０アミノ酸残基部分）を１０μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に溶解した後、アミノ基を有する９６穴のマイクロプレートの各ウェルに０．１ｍｌずつ入れ、触媒としてカルボジイミドを添加し、４℃で１晩放置し蛋白質の固定化を行った。０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ溶液でブロッキングを行い、その後各ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した。
【００４６】
このＭＨＣクラスＩＩ固定化プレートに黄色ブドウ球菌外毒素であり、スーパー抗原であるＳＥＡを反応させた。対照として、ＢＳＡのみを固定化したプレートを用いて同様にＳＥＡを反応させた。その後、抗ＳＥＡモノクローナル抗体（ビオチン標識）、アビジン化ペルオキシダーゼ、３，３’，　５，５’　・テトラメチルベンジジンを順次反応させ、その発色を測定した結果を図５に示した。ＢＳＡを固定化したプレートでは発色がほとんど認められなかったが、ＭＨＣクラスＩＩ（約４００アミノ酸残基長　）、βサブユニット（約２００アミノ酸残基長　）、βサブユニットの部分配列ペプチド（５０アミノ酸残基と３０アミノ酸残基長）において発色が認められ、ＳＥＡの結合が確認された。白丸印はＭＨＣクラスＩＩ固定化プレート、白三角印はβサブユニット固定化プレート、　黒丸印はβサブユニット部分配列（５０アミノ酸残基）、　黒三角印はβサブユニット部分配列（３０アミノ酸残基）、　黒四角印はコントロール（ＢＳＡプレート）を示す。
【００４７】
また、アミノ酸残基数の増加に従って検出感度も向上し、５０ｍｅｒ以上では１μｇ／ｍｌのＳＥＡが検出可能になる。ＭＨＣクラスＩＩを固定化したプレートにおいてはＳＥＡ濃度が０〜１μｇ／ｍｌの範囲において、また、ＭＨＣクラスＩＩβサブユニットを固定化したプレートではＳＥＡ濃度が１０３〜１０６ｎｇ／ｍ１の範囲において、発色とＳＥＡ濃度の間に良好な直線性を示し、ＳＥＡの定量も可能であることが示された。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、これまでは哺乳類細胞や昆虫細胞を利用して製造していた主要組織適合性抗原クラスＩＩ蛋白質を細菌を用いることで効率よく且つ安価に大量調整できるようになった。
【００４９】
本発明はまた、ＭＨＣクラスＩＩに親和性のある物質、例えば黄色ブドウ球菌外毒素などのスーパー抗原などを水溶液や血液、尿などの体液、食料品、飲料物中などから吸着、分離、検出、定量する際に、有効な材料を提供するものであり、医学・免疫学・生化学の研究や臨床、例えば、敗血症や自己免疫疾患等における治療システムを構築するうえで有効に活用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＨＣクラスＩＩαサブユニットを大陽菌内で発現させるための発現用ベクターの概略図を示す。
【図２】ＭＨＣクラスＩＩβサブユニットを大腸菌内で発現させるための発現用ベクターの概略図を示す。
【図３】ＭＨＣクラスＩＩ固定化ビーズによるＴＳＳＴ−１の緩衝溶液中からの除去量と、反応時間との関係を示す図面である。
【図４】ＭＨＣクラスＩＩを固定化した中空糸を用いた場合における、血清中からのＴＳＳＴ−１の除去量と、反応時間との関係を示す。
【図５】ＭＨＣクラスＩＩ、ＭＨＣクラスＩＩβサブユニットおよびβサブユニットの部分配列ペプチドを固定化したプレートを用いた酵素免疫測定（サンドイッチ法）におけるＳＥＡ濃度と４５０ｎｍの吸光度との関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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