(57)【要約】【課題】感度が高く、かつ反応条件の穏やかな、選択的にタンパク質を染色する方法、特に抗体を染色する方法を提供する。【解決手段】水溶性タンパク質を選択的に染色する方法は、タンパク質を形成するアミノ酸からのカルボキシル基、アミノ基およびチオール基と反応してタンパク質に結合する反応性染料を一般的に用いる。染色すべき試料が抗体の場合には、酸性環境下で反応が起きるようにし、抗体のアミノ酸のカルボキシル基および抗体の定常領域に結合したオリゴ糖のカルボキシル基と反応性染料との反応を促進する。アルカリ溶液中で染色反応を行い、標識リガンドそちて抗体を用いることなく、タンパク質に対する染色強度を高める。タンパク質を反応性染料で染色した後、染料分子の未反応部を染色したタンパク質から分離する。染色タンパク質を精製し、さらに凍結乾燥する。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色反応を行うために反応性染料を水溶性タンパク質と反応させて水溶性タンパク質を染色する方法であって、前記方法が前記反応性染料が織物業界で使用されるトリアジン系反応性染料およびビニルスルホン系反応性染料からなる群から選択されるかまたはトリアジンおよびビニルスルホン官能基系反応性染料であり、前記染色反応が酸性またはアルカリ性環境下で行われ、前記水溶性タンパク質が抗体糖タンパク質である場合に前記染色反応が酸性環境下で行われて、染料分子がタンパク質のアミノ酸側鎖からの水酸基、抗体の定常領域からの水酸基、抗体の重鎖からの水酸基、オリゴ糖結合抗体からの水酸基と反応させる方法。
【請求項２】
抗体がミオグロビン抗体である場合染色反応がｐＨ４〜６の酸性環境下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
反応性染料と水溶性タンパク質との反応工程の後、カラム分離法、分子篩、濾過膜、透析または有機溶媒を使用して染色されたタンパク質から未反応のおよび加水分解された染料分子を分離することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記のようにして染色された水溶性分子は、全種類の組織学的、細胞学的、イムノアッセイ、全種類のブロッティング、全種類の電気泳動、または全種類の核酸プローブにて、色を使用して標的を位置づけることおよび定量化することに適用可能である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記のようにして染色された水溶性分子は、全種類の液クロマトグラフィー、バイオセンサー、またはタンパク質チップに適用可能である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
過ヨウ素酸塩活性化処理の後、選択的に抗体分子のオリゴ糖部位に、染料を結合した「担体」を結合するために、反応性染料を天然のまたは合成の水溶性ポリマーと反応させて、糖タンパク質特に抗体を選択的に染色する方法であって、
前記染色反応をアルカリ環境下で行い、前記結合反応を適当な共有結合形成環境下で行い、
前記水溶性分子が天然のまたは合成の水溶性ポリマーの場合前記染色反応をアルカリ環境下で行って、染料分子が天然のまたは合成の水溶性ポリマーからの水酸基またはアミノ基と反応し、その後、前記染色されたポリマーを適当な共有結合形成反応にて抗体分子の活性化オリゴ糖部位に結合させることが可能であり、
前記反応性染料が織物業界で使用されるトリアジン系反応性染料およびビニルスルホン系反応性染料からなる群から選択され、またはトリアジンおよびビニルスルホン官能基系反応性染料であり、
染色反応を天然のまたは合成の水溶性ポリマー担体に対して行い、その後抗体分子に結合させ、染色分子を、抗原−抗体反応を妨害することなく、操作可能な条件下で、染色強度すなわちイムノアッセイ感度を強化するために実現可能な回数で、天然のまたは合成の水溶性ポリマーにおける電子が豊富な官能基と反応させる方法。
【請求項７】
前記反応性染料を、酵素、蛍光体、または放射能核種、小さい分子抗原または核酸プローブのような分子プローブにより直接置換する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
オリゴ糖アプローチによる染色を行う場合、前記反応性染料を、蛍光または発光要素により直接置換する、請求項６記載の方法。
【請求項９】
電流、電導、または電圧信号のいずれかを生じる場合前記反応性染料を電気活性要素により直接置換する、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
染料を結合した「担体」と活性化糖タンパク質との結合工程の後、カラム分離法、分子篩、濾過膜、透析または有機溶媒を使用して結合タンパク質から未反応のおよび加水分解された染料分子を分離することをさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
上記の活性化糖タンパク質に結合した、染料を結合した「担体」が、全種類の組織学的、細胞学的、イムノアッセイ、全種類のブロッティング、全種類の電気泳動、または全種類の核酸プローブにて、色を使用して、標的に位置付けすることおよび定量化することに適用可能である、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
上記の活性化糖タンパク質を結合した染料を結合した「担体」が、全種類の液クロマトグラフィー、バイオセンサー、またはタンパク質チップに適用可能である、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
天然のまたは合成の水溶性ポリマーが、タンパク質、デキストラン、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリ乳酸、ポリアクリルアミド等である、請求項６記載の方法。
【請求項１４】
前記水溶性分子が、デキストランまたはポリリジンである場合前記染色反応がｐＨ１０〜１２のアルカリ環境下で行われる、請求項６記載の方法。
【請求項１５】
反応性染料と天然のまたは合成の水溶性タンパク質との反応工程の後、沈殿法、分子篩、濾過膜、透析または有機溶媒を使用して染色された天然のまたは合成の水溶性ポリマーから未反応のおよび加水分解された染料分子を分離することをさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項１６】
過ヨウ素酸塩酸化を行ってＮ−ヒドロキシコハク酸塩処理についてカルボキシル基を生成する場合酸化型「担体」およびアミノ化糖タンパク質間の結合を過酸化型形態にて置換し、さらにカルボジイミドの存在下で他の分子からのアミン官能基と縮合する、請求項６記載の方法。
【請求項１７】
結合反応をシッフ酸−塩基反応にて行う、請求項６記載の方法。
【請求項１８】
染色反応を行うために、織物業界で使用されるトリアジン系反応性染料およびビニルスルホン系染料からなる群から選択されるかまたはトリアジンおよびビニルスルホン官能基系反応性染料である反応性染料を水溶性タンパク質と反応させる、水溶性タンパク質を染色する方法であって、
前記染色反応が酸性またはアルカリ性環境下で行われ、前記水溶性タンパク質がアミノ基の保護を必要とする場合に前記染色反応が酸性環境下で行われて、染料分子が好ましくは水溶性タンパク質のアミノ酸側鎖からの水酸基、水溶性タンパク質に結合したオリゴ糖からの水酸基と反応することを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記アルカリ環境がｐＨ１０〜１２を有する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
アミノ基の保護を必要とする前記水溶性タンパク質がミオグロビン抗体である場合前記染色反応がｐＨ４〜６の酸性環境下で行われる、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
反応性染料と水溶性タンパク質との反応工程の後、カラム分離法、分子篩、濾過膜、透析または有機溶媒を使用して、染色されたタンパク質から未反応のおよび加水分解された染料分子を分離することをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
上記のようにして染色された水溶性分子は、全種類の組織学的、細胞学的、イムノアッセイ、全種類のブロッティング、全種類の電気泳動、または全種類の核酸プローブにて、色を使用して標的を位置付けすることおよび定量化することに適用可能である、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
上記のようにして染色された水溶性分子は、全種類の液クロマトグラフィー、バイオセンサー、またはタンパク質チップまたは分析に適用可能である、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質を染色するための方法に関する。特に、本発明は、異なる分析用途用に水溶性タンパク質を選択的及び非選択的に染色する標的タンパク質に担体が結合する前に、反応性染料を直接的に使用するか、担体分子の染色を経るがいずれかによってグリコシル化タンパク質を両方とも選択的に染色する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫学的検定として単に既知の免疫学的な分析は、異なる分野、例えば臨床診断、環境モニター、農産物分析、食品処理制御及び科学調査において実行的な用途として広く使用されている。免疫学的検定のタイプに関して，分析すべきテスト試験片における低分子有機化合物又はタンパク質分子など生物学的なポリマー、核酸分子又は試験片における多糖類分子は、通常、分析において質及び量的に標識することが必要とされる。例えば、試験片が抗原（Ａｇ）又は抗体（Ａｂ）であるとき、図１に説明したようなロジック分析設計を、同様に抗原及び抗体のコスト及び有用性に依存して，展開することができる。Ａｂ１及びＡｂ２は、２つの異なる特徴を示す試験片に対する抗体である一方、Ｌはマーカーリガンドである。Ａｂ’は第一の動物種抗体に対する第二抗体である。リガンドは、ラジオ活性元素であるとき、当該リガンドを含む免疫分析は、ラジオイムノアッセイとして知られている（ＲＩＡ）。リガンドとして使用する酵素で、免疫学的検定は、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）として知られている。さらに、イムノアッセイは、リガンドとしてフルオロリン酸イムノアッセイ（ＦＩＡ）、又はルミネッセントイムノアッセイ（ＬＩＡ）と呼ばれる。一般に、異なるリガンドを用いたイムノアッセイは、異なる定量化方法を与え、それゆえ異なる名前が与えられる。にもかかわらず、上述したイムノアッセイは、共通に使用される主要なイムノアッセイ手法である。
【０００３】
ＲＩＡが５０年代広く実行されてきているので、それは、高感度で低コストなど利益をもたらすと認識された。しかしながら、安全に機能すること及び廃棄物処理に関する問題は、ＲＩＡのさらなる開発を制限した。そこで、７０年代初期に開発されたＥＩＡは、ＲＩＡから市場で大部分採用されてきた。不幸にも、ＥＩＡは低安定性及び感度、並びに長時間のインキュベーション時間に問題を有する。より高い感度用に知られるＦＩＡ及びＬＩＡは、ＲＩＡによって役割を代用するために開発された。しかし、一度両方のイムノアッセイ方法が、無バンド自動イムノアッセイ分析器の中へ組み込むために改良すると、修正されていない大型サイズ及び高コストは、当該イムノアッセイ技術を一般的社会、同様にポイント修正テスト（ＰＯＣＴ）、ポイント要求テスト（ＰＯＮＴ）から役立つものとすることに自然に制限するであろう。
【０００４】
８０年代には、人々は、抗体を吸収するマイクロからナノ範囲の粒子を作るための拡散染料を使用する試みがなされ、それによって、染料イムノアッセイ（ＤＩＡ）として知られる別のイムノアッセイ技術を開発した。しかし、このイムノアッセイは、粒子サイズの寄与を制御する困難性、拡散染料の同様のタンパク質に対する形状及び異なる結合能等のプロセス因子のために広く使用されなかった。このように準備されたＤＩＡは、一般に他のイムノアッセイより感度が低いと考えられる。さらに、Ａｂ吸収後の染色粒子の低い安定性は、その広い適用が賞賛される前に解決すべき問題を引き起こす。
【０００５】
活性染料としても知られる反応性染料は、１９５６年に開発され、綿繊維の水酸基（ＯＨ）に結合する共有電子対を通じて染料分子に結合するように設計される。一般に使用される反応性染料は、求核置換に関するトラジン系の反応性染料及び求核添加に関するスルホンビニルの反応性染料など基本的に２つのグループに分類される。染料の設計は、綿繊維を染色することを元来意図したが、上述した２つの求核反応のためにアミノ（−ＮＨ２）とチオール（−ＳＨ）基ので反応させることによってウール及びシルクを染色するのにも染料が使用された。典型的には、ウール、シルク及び綿などの材料を反応性染料を使用して染色したとき、反応は、通常、１０．５を超えるｐＨに、６０〜１００℃の温度、及び大量の塩に保持する。塩を添加する目的は、（１）色がより均一に寄与するように織物材料の膨張を促進させること（２）染色反応の速度を上げること、（３）環境配慮の要求を満足するための低廃棄物で高い染料収率を得ること、（４）アルカリ環境下で水酸基とチオール基からプロトンイオンを解離させること、を含む一方、アミノ基の電荷を中和して、アミノ酸のアミノ官能基からローンペアー電子の電気陰性度をかなり増加させる。その結果、染色分子の求電子的反応が改善される。タンパク質のアミノ酸官能基に対する反応染料の求電子的活性は、通常の繊維染料条件下で−ＮＨ２＞−ＳＨ＞−ＯＨとして評価される。
【０００６】
図１に示すように、反応性染料は、リガンドとして用い、それによって所望のイムノアッセイプロセス用に抗体及び抗原のいずれかを染色する。しかしながら、抗体分子のエピトープと結合する抗原は、タンパク質のアミノ末端である。したがって、もし抗体分子のエピトープに結合する抗原が、近接する染料分子を有するアミノ酸電子的官能基と反応又は立体傷害を受けるなら、抗原抗体結合親和性は、撤回及び／又は一部撤回される。これらの種類の反応が一旦生じると、反応性染料手法によって生産された染料抗体を使用してイムノアッセイの感度はかなり妨害される。
【０００７】
また、反応性染料で処理したとき繊維染色に対する過酷な反応条件は、もろい生物学的な分子変性を必然的に促進させる。
【０００８】
したがって、選択的タンパク染料、特に抗体染料方法は、方法を実用性あるものとするためにさらに感度を増加させるために開発された。また、タンパク質を染色するための分子反応条件は、図１に示されるようにマーカー分子として使用され、最適にすべきである。
【０００９】
本発明は、ｉ）糖化部位および抗体分子のアミノ酸の水酸基またはグリコシル化タンパク質のアミノ酸の水酸基を、反応性染料を直接使用して選択的に染色する方法、ｉｉ）天然のまたは合成の水溶性ポリマー「担体」を先ず染色し、次に糖化部位および抗体のアミノ酸の水酸基またはグリコシル化タンパク質のアミノ酸の水酸基に選択的に結合させる方法を提供する。両方法は、イムノアッセイのプロトコルに適用する際コストおよび感度の点で有利である。これらのおよび他の利点を達成するために、本発明の目的に応じて、具体的におよび広く記載したように、本発明はタンパク質求核官能基を用いて求電子反応を行う反応性染料を使用する抗体活性染色法を提供する。「直接」染色反応では、反応性染料は、適当な反応条件下で抗体を構成するアミノ酸の中でチオールおよびアミノ側鎖官能基よりも好ましくは水酸基と反応することにより抗体に結合できる。タンパク質を反応性染料を用いて染色した後、反応しない前記染料分子を染色したタンパク質から分離する。その後、染色したタンパク質を精製して、より高純度を得ることができる。一方、染色タンパク質は貯蔵性を高めるためにさらに凍結乾燥することができる。「担体」アプローチでは、生物学的に不活性な巨大分子を選択して高度に染色してその後グリコシル化分子の過ヨウ素酸塩活性化オリゴ糖部位と反応させる。両アプローチは、抗体分子のアミノ末端に位置する抗原結合エピトープ位置およびその近傍のアミノ基を用いて染料分子の反応を選択的に緩和し、かつ染色抗体がアッセイプロトコルにおいて使用される場合イムノアッセイの特異性および感受性を増加する。
【００１０】
また、本発明は織物業界で通常使用するこれらの反応性染料を使用して拮抗的プロトコルにおいて試料中の検体としてとらえた場合、オリゴ糖含有タンパク質および通常のタンパク質を染色する方法を提供する。
【００１１】
直接染色する試料が抗体である場合、反応はある塩濃度の下で、酸性環境下で起こるように調製され、反応性染料が抗体を構成するアミノ酸からの水酸基および抗体の定常領域に結合したオリゴ糖からの水酸基との反応を促進させる。しかし、染色される試料が非抗体タンパク質または非グリコシル化タンパク質である場合染色反応は最適なアルカリ溶液中で生じ、より良好なイムノアッセイ感度についてタンパク質をより強く染色する。
【００１２】
前記一般的な説明および以下の詳細な説明は例示であり、請求の範囲の発明をさらに説明するためのものである。
【００１３】
添付図面は、本発明をさらに理解するための与えられるものであることを意図するものであり、明細書の一部に組み込まれ、構成される。図面は、本発明の実施態様を説明し、詳細な説明とともに本発明の原理を説明するものとして役立つ。
【００１４】
図において、図１は、異なるイムノアッセイプロトコールのフローチャートを示す例証されるダイアグラムである。
【００１５】
図２は、アガロース基板上の非染色ウサギ抗ミオグロビン抗体に対するアミドブラックで染色した連続希釈ミオグロビンから生成された抗体−抗原沈降株を示すダブル免疫拡散ダイアグラムである。（ａ）アミドブラック，２Ｘ、４Ｘ、８Ｘ、１６Ｘ、３２Ｘ及び６４Ｘで染色したウサギ抗ミオグロビンに対するミオグロビン。（ｂ）アミドブラック、１２８Ｘ、２５６Ｘ、５１２Ｘ、１０２４Ｘ、２０４８Ｘ、４０９６Ｘで染色したウサギ抗ミオグロビンに対するミオグロビン。
【００１６】
図３は、アガロース基板上のミオグロビンに対するプロシオンレッドＭＸ−８Ｒで染色した連続希釈ウサギ抗ミオグロビンポリクローナル抗体の抗体抗原調節株を示すダブル免疫拡散ダイアグラムである。（ａ）染料結合「担体」染色抗体、セファデックスＧ−１５０精製、（ｂ）「直接的」酸染色抗体、セファデックスＧ‐２５精製、（ｃ）　非染色置換「直接的」酸染色ウサギ抗ミオグロビン抗体及びプロシオンレッドＭＸ−８Ｒ置換ミオグロビン、（ｄ）　２，４，８，１６、３２及び６４の希釈系において非染色ウサギ抗ミオグロビン抗体とプロシオンレッドＭＸ−８Ｒ。
【００１７】
図４は、セファデックスＧ−２５カラムで精製し、反応性染料プロシオンレッドＭＸ−８Ｒで染色したウシアルブミンの分光写真である。
【００１８】
図５は、サンドイッチ型の免疫クロマトグラフにおいて「直接」酸染色ミオグロビン抗体を使用したとき、ミオグロビンに対するキャリブレーション曲線である。
【００１９】
【好適な実施態様の説明】
本発明の目下の好適な態様、添付した図において描かれた実施例について詳細に論述されるであろう。図と同様又は類似の部分に言及している記述において、可能なときにはいつでも同じ参照番号が使用される。
【００２０】
典型的なイムノアッセイにおいて、タンパク質は重要な役割を果たしていることが知られている。特に免疫グロブリンはその上に定常領域（Ｆｃ領域）と可変領域（Ｆｖ領域）を有し、免疫グロブリンＧの全分子量の２〜３％を占めるオリゴサッカライド分子は、その分子の定常領域上に主として広がっている。ところが、抗体の重鎖と軽鎖の両者に由来するアミノ基は、抗原結合エピトープであるＦｖ領域の主要部分を構成する。染色反応は無作為に起こることができるが、色素分子に結合するこのアミノ基は、その抗原結合活性を緩めるであろう。染色性色素が抗原結合エピトープの近くの電子豊富な原子（アミノ酸側鎖を含むプロトン）と反応するときでも、色素分子由来の立体障害はなお抗原結合へのバイアスを作るかもしれない。
【００２１】
そこで、もしタンパク質が抗体であるならば、直接的な染色反応が酸性環境下で行われるように設計され、それは一つの色素分子が、抗体のアミノ酸側鎖由来のヒドロキシ基、および抗体と結合したオリゴサッカライド上のヒドロキシ基と、アミノ側鎖よりも好適に反応するというようなものである。または、天然又は合成の、水溶性の重合体「担体」を導入して色素分子を結合し、そして染色された「担体」を、抗体のオリゴサッカライド部分に、好ましくは定常領域中のオリゴサッカライドに結合させる。
【００２２】
イムノアッセイに適用可能な正常な非抗体タンパク質上で染色反応を行うときは、図４に示されるように、抗原−抗体結合親和性が緩む懸念は少ないであろう。しかしそれでも、結合する色素分子によって蛋白抗原上の抗体結合エピトープの阻害される可能性を最小化するために、注意を払わなければならない。
【００２３】
抗体を染色する方法と、本発明において具現化されたイムノアッセイへの応用は、織物産業由来の反応性色素の使用と関係している。反応性色素の例には、染色試料と求核置換反応する対象であるトリアジンシリーズ色素、そして染色試料と求核付加反応する対象であるビニルスルフォンシリーズ色素がある。好ましくは、反応性色素は６００〜８００ダルトン（ＤＡ）の分子量（ＭＷ）を有する。
【００２４】
トリアジンシリーズの反応性色素は下記の化学式を有し、下記の化学式においてＡはアルキル又は塩素又はフッ素のようなハロゲンであり、ＺはＣｌ又はＦであり、Ｄｙｅは色素分子の発色団である。
【化１】
2004125750.tif 000002
【００２５】
抗体又は抗原上のアミノ酸のヒドロキシ基、アミノ基およびチオール基と反応することにより、トリアジンシリーズの反応性色素分子がタンパク質に結合するとき、下記の化学式を有する化合物が生成する。
【化２】
2004125750.tif 000003
【００２６】
ここでＡはアルキル又は塩素のようなハロゲンであり、Ｄｙｅは色素分子の発色団であり、そしてＢはＮＨＲ、ＯＲ又はＳＲであって、ここでＲは抗体又は抗原の一部分である。
【００２７】
ビニルスルフォンシリーズの色素は下記の化学式を有する。
【化３】
2004125750.tif 000004
ここで、Ｄｙｅは色素分子の発色団である。
【００２８】
抗体又は抗原中のアミノ酸のヒドロキシ基、アミノ基およびチオール基と反応することによって、ビニルスルフォンシリーズの反応性色素分子がタンパク質に結合するとき、下記の化学式の化合物が生成する。
【化４】
2004125750.tif 000005
ここでＤｙｅは色素分子の発色団であり、ＲはＮＨＲ、ＯＲ又はＳＲであって、ここでＲは抗体又は抗原の一部分である。
【００２９】
ｐＨ値を制御して塩を選択することにより、反応性色素の求電子的な反応は、主として抗体由来の水酸基上と抗体に結合するオリゴサッカライド由来のヒドロキシ基上で起こり、そして残された抗原結合エピトープはそのままである。Ｆｃ領域のオリゴサッカライド上に染色された担体巨大分子を結合させると共に、元の価数（ｖａｌｅｎｃｅ）と免疫学的特性の染色された抗体を維持する。染色されたタンパク質を精製し、そして反応しなかった色素分子を分離して除去した後に、それをイムノアッセイにおいて異なった目的で適用することができる。そこで、その方法は結合色素イムノアッセイ（ＣＤＩＡ）として知られる新規な色素イムノアッセイとなり、それはイムノアッセイより便利である。また、その方法は酵素イムノアッセイに比べてより安定、より効果的であってかつ鋭敏であり、一方それはＦＩＡ　又はＬＩＡと比べてコストがかからない。
【００３０】
例えばウサギ抗ヒトミオグロブリン抗体とウシ血清アルブミンのような、グリコシル化したタンパク質のための染色反応、および関連した試験結果を下記に述べる。
【００３１】
（ａ）ミオグロブリン抗体のための「直接的」染色反応
【００３２】
最初に、ヒトミオグロブリンに対するウサギ抗体１０ｍｇを、ｐＨ４．８の０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液中に溶解した。５ｍｇのプロシオンレッドＭＸ−８Ｒを添加すると共に、その溶液混合物を冷却した水浴中で暗所で攪拌した。２４時間反応した後に、反応した溶液混合物を、３０　ｘ　１．１ｃｍの容積のセファデックスＧ−２５カラムに注入した。そして、ｐＨ６．８の０．０５Ｍリン酸緩衝液を用いて、毎時２０ｍｌの流速でカラムを溶出した。そのカラムからの溶出液を、各チューブ中に１ｍｌを採取する、段階別のチューブ（ｇｒａｄｅｄ　ｔｕｂｅ）を用いて採取した。色素分子と共有結合を形成することによりミオグロビン抗体を染色するため、それは大きな容積を有し、セファデックスＧ−２５カラム中の分子ゲルビーズの孔に入ることが防止される。そこで、染色されたミオグロビン抗体は最初に溶出する。一方、反応も凝集もしない色素分子は微細孔ゲルビーズの孔に入って後に洗浄される。そこで、染色されたミオグロブリン抗体のチューブは特徴的な赤色を示し、採取されて、更に研究する目的のために保存される前に凍結乾燥される。
【００３３】
（ｂ）「担体」の染色、及びミオグロブリン抗体のオリゴサッカライド部分への色素を結合した「担体」の結合
【００３４】
（ｉ）「担体」の染色
【００３５】
反応性色素染色のためのタンパク質「担体」としてウシアルブミンを無作為に選択し、そして反応性色素はデキストランやポリリジンのような天然又は合成の水溶性重合体であった。ウシアルブミンの活性色素染色条件をセクション（ｆ）において述べる。そして、これらのバイオポリマーための染色条件はｐＨ１０．５から１２に変動し、プロシオンレッドＭＸ−８Ｒを用いて、室温で１時間から３時間インキュベートした。水酸化アンモニウムを用いて反応を停止し、その混合液を、前の実験と異なった容積（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）を有するセファデックスＧ−２５カラムにかけた。ｐＨ５．５の０．０１Ｍ酢酸緩衝液を用いて、毎時３０ｍｌの流速でカラムを溶出した。溶出液をカラムから採取し、その後、貯蔵するために凍結乾燥にかけるか、あるいは下記の抗体結合実験において直接的に使用した。
【００３６】
（ｉｉ）抗体オリゴサッカライド部分の過ヨウ素酸塩活性化と、活性化したミオグロブリン抗体への染色した「担体」の結合
【００３７】
反応緩衝液中で再平衡化された抗体（０．１Ｍ酢酸ナトリウム中２．２６ｍｇ／ｍｌ，　ｐＨ５．５，　２ｍＭβ−メルカプトエタノール）を、脱イオン水中で調製された過ヨウ素酸ナトリウムの貯蔵溶液を添加して、過ヨウ素酸塩の最終濃度を５ｍＭとすることにより酸化し、暗所の低温室で３０分間反応させ、８０ｍＭの亜硫酸ナトリウムを１０μｌ添加することにより終了させた。抗体のような糖タンパク質を限定された過ヨウ素酸塩で処理すると、糖タンパク質糖部分のアリル水酸基がアルデヒド基に変換される結果となるが、それは色素が結合したタンパク質とポリリジン由来のアミノ基によって、更にシフ酸―塩基反応が起こることによる。０．０１％（ｗ／ｖ）のシアノボロハイドライドナトリウム存在下で、これに５ｍｌの色素結合した「担体」溶液を５ｍｌ添加した。色素結合デキストラン（分子量およそ１０，０００、臨床的なグレード）を「担体」として使用した時、更にｐＨ５．６で酸化された抗体を、０．２ｍｌの　０．０５Ｍエチレンジアミンで処理した。エチレンジアミンを有さない還元的にアミノ化された抗体を色素結合デキストランと結合し、その色素結合デキストランもまた、前と同様の条件下で抗体酸化と同様にやはり過ヨウ素酸塩酸化した。そのように調製された色素結合デキストラン抗体混合液の１ｍｌの画分を、３５　ｘ　１．１ｃｍのセファデックスＧ−１５０カラム上にかけて、結合していない色素結合デキストランをコンジュゲートから分離した。
【００３８】
これらの染色された、「直接的」であって「担体」が結合したミオグロビン抗体を凍結乾燥し、そして必要なときに推定された濃度で再構成し、そして更なる活性試験にかけた。
【００３９】
（ｃ）ミオグロビン抗体の価数を測定するためのアッセイ
【００４０】
ｐＨ８．２の０．０５Ｍバルビタール緩衝液中１％アガロースゲルを調製することにより、この方法を開始する。ゲルを５０℃で溶解して、二重拡散イムノアッセイ用の、一列の穴を開けたオクタロニー双方向免疫拡散ゲルフィルムを調製する。次いで、オクタロニーアガロースゲルの中央の穴に、濃度２．１ｍｇ／ｍｌのヒトミオグロビンを１５μｌ配置する。そして、未染色ミオグロビン抗体（１．４３ｍｇ／ｍｌ）を２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４、２０４８および４０９６倍に連続希釈し、オクタロニーアガロースゲルの中央穴を取り囲む周辺の穴にそれぞれピペットを用いて１５μｌずつ入れた。ゲルを室温で６時間インキュベーションしたところ、中央穴のミオグロビンと希釈した抗体調製品との間に沈降線の出現が観察された。このゲルをさらに６時間インキュベーションしたが、それ以上の沈降線は観察されなかった。次いで、アミドブラックを用いてゲルを染色し、メタノール／酢酸溶液中で脱染した。ミオグロビンと係数２〜６４で希釈した未染色抗体との間の凝集線は、図２のａおよびｂで示される、アミノブラックで染色した抗原−抗体沈降線であった。
【００４１】
染色した抗体を用いて、オクタロニー双方向免疫拡散を繰り返した。濃度が１．３２ｍｇ／ｍｌおよび０．９６ｍｇ／ｍｌと推定される、染料結合「直接」染色結合抗体および染料結合デキストラン「担体」結合抗体を係数２、４、８、１６、３２および６４で希釈するとともに、１．４３ｍｇ／ｍｌの未染色抗体を前記と同様に希釈して調製した。「担体」抗体、「直接」染色抗体および未染色抗体の抗原−抗体沈降線をそれぞれ図３のａ、ｂ、ｃおよびｄに示す。この調製条件下において、「担体」抗体は、「直接」染色抗体よりも感度が高いことが分かる。アミドブラック染色の無い場合には、中央穴のミオグロビンと係数２〜１６で希釈した未染色ミオグロビン抗体との間には、図３のｃに示すように、曖昧な沈降線しか発現しない。
【００４２】
前記の観察から、「直接」染色としてｐＨ４．８の環境下で反応性染料と反応し、および「担体」としてデキストランを用いる場合には、染料結合「担体」と反応し、結合ミオグロビン抗体を形成した後には、未染色抗体と比較して、ミオグロビン抗体はその活性を維持するだけでなく、その価数も維持することが分かる。
【００４３】
（ｄ）反応性染料と共役結合を形成する、抗体上の結合領域を決定する方法
【００４４】
（ｉ）ノイラミダーゼサンプルの前処理
【００４５】
ｐＨ５．６の０．０５Ｍ酢酸緩衝液中でノイラミダーゼを４℃で一晩透析した後、フェチュインで固定化した５ｍｌのセファロース４Ｂカラムに適用した。次いで、２１０ｎｍにおける吸光度が０．０５に減少するまで、これを緩衝溶液で洗浄した。最後に、炭酸緩衝液を用いて、ノイラミダーゼを溶離する。ノイラミダーゼを中和すると、酢酸緩衝液中で再び透析する準備が整う。
【００４６】
（ｉｉ）ミオグロビン抗体のオリゴ糖の除去
【００４７】
タンパク質分解酵素フリーの前処理したノイラミダーゼの０．２ｍｌ、タチナタマメ（ｊａｃｋ　ｂｅａｎ）α−マンノシダーゼの５単位、β−ガラクトシダーゼの２単位、および子ウシ肝臓α−グルコシダーゼの１０単位を、濃度１．４６ｍｇ／ｍｌのミオグロビン抗体５ｍｌと混合した後、ストレプトマイシンをさらに加え、最終濃度を０．０５％とする。前記の混合物を４０℃で４８時間インキュベーションし、処理したノイラミダーゼサンプルの５ｍｌを、４５×１．１ｃｍの大きさのセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１５０カラム上に適用する。カラムを毎時１０ｍｌの速さで溶出すると、各チューブにミオグロビンを表す赤色物が捕集される。硫酸アンモニウムが沈殿し、遠心分離された後、次の反応性染料染色反応のために再溶解ミオグロビン抗体を調製した。
【００４８】
（ｅ）ミオグロビン抗体のオリゴ糖の染色反応、および未変性抗体と脱グリコシル抗体の染色結果の比較
【００４９】
未変性前処理抗体および脱グリコシル前処理抗体の濃度を１．０ｍｇ／ｍｌに調整し、他の染色工程は、ウシアルブミン染色に関する（ｆ）で説明する工程と同様にして行う。
【００５０】
Ｇ−２５フラクションの後、プロシオンレッドＭＸ−８Ｒで染色した抗体を含む、赤色のブレークスルーフラクションが得られた。ベックマンＤＵ−６５分光光度計を用いて、それぞれの希釈サンプルの吸光度を測定した。結果を次の表１に示す。
【００５１】
【表１】
オリゴ糖部分を除去した抗体および除去していない抗体の吸光度
2004125750.tif 000006
【００５２】
表１に示すとおり、ミオグロビン抗体のオリゴ糖部分と共役結合を形成することにより、プロシオンレッドＭＸ−８Ｒの少なくとも一部が結合されていることが明確に示されている。ノイラミダーゼと酵素の混合物により抗体の定常領域および重鎖部からオリゴ糖を部分切除すると、表１に示す結果と比較して、酸性環境下における、反応性染料分子の、脱グリコシル前処理抗体の水酸基に対する反応性が低下する。
【００５３】
（ｆ）ウシアルブミンに対する反応性染料染色調製品
【００５４】
濃度７．８ｍｇ／ｍｌのコーンＶ等級ウシアルブミンを、染色反応、評判および入手可能性で選択した。この染色反応は、アミノ末端基が染料分子に占有され、抗原に対する抗体の結合反応性に影響を与えることを懸念する必要がないので、反応ｐＨをアルカリ領域に調整して、変性アルブミンの不存在下で染色を最大にする。ｐＨを約１０．５に調整して、タンパク質を形成するアミノ酸のアミノ基、チオール基および水酸基との反応を確実にすることが好ましい。したがって、これにより、競合イムノアッセイの標識抗原として適用すると、染色効率および感度が向上する。他の染色工程および精製工程は（ａ）で説明した工程と同様である。図４は、セファデックスＧ−２５精製染料染色ウシアルブミンに対して、分光光度計の走査結果から得られたスペクトルの可視領域における吸光度を示す。
【００５５】
（ｇ）サンドイッチ型免疫クロマトグラフィーへの「直接」酸染色ミオグロビン抗体の使用
【００５６】
（ｂ）で説明したように、１０ｍｇのミオグロビン抗体を染色および精製した。セファデックスＧ−２５精製フラクションを凍結乾燥し、ｐＨ８．０リン酸緩衝液中で、適当な推定濃度で再構成し、免疫クロマトグラフィー片の結合パッド上に取り付けた。再構成した血清サンプル中の種々の濃度のミオグロビンを用いて、校正曲線の試験および作成を行った。
【００５７】
図５は、サンドイッチ型イムノアッセイ中の「直接」染色抗体を用いた場合の、ミオグロビンの免疫クロマトグラフィーの結果を示す。
【００５８】
上記の実験および試験より、染色反応は非抗体タンパク質中で起こること、および高温、塩または電解質を必要とせずアルカリ環境下で反応を起こすことができることが分かる。このような操作の容易な条件下で、アミノ酸側鎖上のアミノ基、チオール基および水酸基は全て電子過剰状態となり、染料分子の求核反応を促進する。この結果、共役結合染色タンパク質が形成され、タンパク質に対する染色強度が高くなり、かつ未変性構造を保持する。しかし、抗体上で染色反応が起きる場合には、酸環境下で選択的に反応が起き、染料分子は、アミノ酸側鎖からの水酸基および定常領域および重鎖からの水酸基と反応する。このため、抗体のアミノ基が染料分子と結合しないので、アミノ基を介した抗体の抗原結合能力が保護される。したがって、イムノアッセイの感度が顕著に向上する。
【００５９】
本発明によれば、染色したタンパク質を標識リガンドとして、酵素結合イムノアッセイ、組織学的、細胞学的、ブロット法、全種類の免疫凝集、全種類の電気泳動、全種類の免疫クロマトグラフィー、全種類の液クロマトグラフィー、バイオセンサー、バイオチップ、および全種類の核酸プローブまたは他の化学分析に色を用いた標的の位置決めおよび定量をする方法に適用する。
【００６０】
本実施態様では、未反応染料分子を染色したタンパク質分子から分離する例として、カラム分離法を用いて説明を行ったが、分子篩、濾過膜、透析または有機溶媒等の他の分離法を用いて、反応性染料でタンパク質を染色した後に、分離した染料分子を染色したタンパク質分子から分離することができることは、当業者には理解できよう。反応性染料でタンパク質を染色した後、タンパク質と反応しなかった染料分子は、前記の分離法を用いて除去することができる。次に、種々の染色タンパク質を精製すると、貯蔵性を向上するために真空中で凍結乾燥する間の安定性が高くなる。
【００６１】
本発明の重要性を図１に示す。リガンドＬを放射性同位体、酵素、蛍光元素、または発光元素とすれば、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＦＩＡ法またはＬＩＡ法といった用途が生まれる。同様にして、リガンドＬを本発明の反応性染料分子で置換すれば、ＥＩＡ、他の従来のイムノアッセイ、化学的生物化学的分析を置換する、結合染料イムノアッセイ（ＣＤＩＡ）が開発されるであろう。なぜなら、結合染料分析（ＣＤＡ）は、以下に述べるような潜在的利点および用途を有するからである。
【００６２】
（１）染料分子をポリマー吸収度を有するよう設計および選択しているので、酵素イムノアッセイよりも感度が高い。
【００６３】
（２）酵素基質培養における時間の無駄を緩和するので、ＥＩＡよりもイムノアッセイの所要時間が短い。
【００６４】
（３）共役結合で染料分子に結合した後は、タンパク質はより安定となるが、タンパク質分子を過剰に負荷することにより、抗原−抗体反応性を失わないよう注意しなければならない。
【００６５】
（４）手順が単純であり、大量生産が容易であり、抗原−抗体相互反応のための有用な染色タンパク質を得るのに、単純な分離および精製とｐＨの制御のみが必要である。
【００６６】
（５）反応性染料は織物業界において大量に消費されており、通常トン単位で販売されている。したがって、イムノアッセイ用の他の全てのリガンドよりも低コストとなる。
【００６７】
（６）染料の色を広範に選択することができるので、生化学分析の分野において、染色タンパク質の適応性が非常に広がり得る。
【００６８】
（７）「直接」酸染色および染料結合「担体」染色の双方の材料および工程を最適化すれば、ＣＤＩＡの感度が大幅に向上する。
【００６９】
（８）染料および小有機分子抗原の双方を、天然または合成水溶性ポリマー担体上に「結合」した場合に、染料結合「担体」という概念は、小分子抗原競合イムノアッセイおよび多くの異なる用途の他のイムノアッセイにまで当然に及ぶ。
【００７０】
（９）染料および特定の分子プローブの双方を、天然または合成水溶性ポリマー担体上に結合した場合に、染料結合「担体」と全く同じ概念は、分子プローブ用途にまで当然に及ぶ。
【００７１】
本発明の範囲または精神を逸脱することなく、本発明の構成を種々に変更および変形することが可能であることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、併記の特許請求の範囲およびその均等物の範囲に含まれる変更および変形をも網羅するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】異なるイムノアッセイプロトコールのフローチャートを示す例証されるダイアグラムである。
【図２】アガロース基板上の非染色ウサギ抗ミオグロビン抗体に対するアミドブラックで染色した連続希釈ミオグロビンから生成された抗体−抗原沈降株を示すダブル免疫拡散ダイアグラムである。
【図３】アガロース基板上のミオグロビンに対するプロシオンレッドＭＸ−８Ｒで染色した連続希釈ウサギ抗ミオグロビンポリクローナル抗体の抗体抗原調節株を示すダブル免疫拡散ダイアグラムである。
【図４】セファデックスＧ−２５カラムで精製し、反応性染料プロシオンレッドＭＸ−８Ｒで染色したウシアルブミンの分光写真である。
【図５】サンドイッチ型の免疫クロマトグラフにおいて「直接」酸染色ミオグロビン抗体を使用したとき、ミオグロビンに対するキャリブレーション曲線である。
【図１】
2004125750.tif 000007
【図２】
2004125750.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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