(57)【要約】【課題】バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、結合部位に生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるＳＰＲ測定用バイオチップを得る。【解決手段】生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化するためのバイオチップであり、該生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）には固定化させるための起点となる物質もしくは官能基を有する物質が固定化され、かつ固定化部位以外のバックグラウンド部には、親水性高分子が固定化されていることを特徴とするバイオチップ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化するためのバイオチップであり、該生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）には固定化させるための起点となる物質もしくは官能基を有する物質が固定化され、かつ固定化部位以外のバックグラウンド部には、親水性高分子が固定化されていることを特徴とするバイオチップ。
【請求項２】
固定化部位の大きさが２５００μｍ２以上であることを特徴とする請求項１記載のバイオチップ。
【請求項３】
金を蒸着した透明ガラスもしくは透明プラスチックを基板として用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオチップ。
【請求項４】
バイオチップが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を用いて、チップに固定化されている生体分子もしくは生物分子集合体への反応を解析するためのものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項５】
バイオチップが、チップに複数の生体分子もしくは生物分子集合体を固定化し、ＳＰＲイメージング法によって同時に複数の反応を解析するためのものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項６】
固定化部位の起点となる物質がビオチン、グルタチオン、ストレプトアビジン、アミロース、抗体よりなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項７】
固定化部位の起点となる官能基を有する物質の官能基がカルボキシル基、アミノ基、チオール基、マレイミド基、スクシンイミド基、ニトロソ三酢酸基よりなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１項１〜６のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項８】
バックグラウンド部に固定化される親水性高分子がポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１項１〜７のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項９】
ポリエチレングリコールの分子量が１０００以上であることを特徴とする請求項８記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
物質間の相互作用を評価できるバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡや蛋白質などの生体分子の機能を調べるあるいは、発現遺伝子、蛋白質を明らかにする手段として、生体分子間の相互作用を評価する試みがなされている。その一つとして分子を固体表面に固定化して測定する方法が知られている。固相に生体分子を固定化する方法として、表面に導入した官能基を起点とし、共有結合、イオン結合によって固定化する手段が挙げられる。あるいはビオチンやストレプトアビジンなどの特異性の高い結合相手をもつ分子を表面に固定化しておき、ペアとなる分子を導入した生体分子を表面に固定化する方法も挙げられる。
【０００３】
しかし、従来の技術ではチップ全体に官能基あるいは結合分子を導入するものがほとんどであり、生体分子を固定化していない状態では固定化部位とバックグラウンド部の区別がない。そのため、バックグラウンド部に存在する官能基や結合蛋白へ、サンプルが非特異的吸着するのを無視できない場合がある。また、微少量だけ特定の位置に生体分子溶液をスポットする技術も必須であり、高価なスポッティング装置が必要となる。
【０００４】
米国特許では、固定化部位に生体分子を固定化し、バックグラウンド部に起点となる官能基あるいは結合分子が存在しない親水性高分子を固定化したアレイを作製する手段が開示されている（例えば、特許文献１参照）。この発明では、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化する際にはバックグラウンド部は可逆性疎水性保護基が固定化されており、スポッティングが容易である。しかし、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化したのちに塩基性有機溶媒を用いて疎水性保護基を除去し、親水性高分子を固定化する操作が必要であり、非常に煩雑かつ、塩基性有機溶媒が生体分子もしくは生物分子集合体に悪影響を与えることが懸念される。また、親水性高分子を固定化する際に固定化した生体分子もしくは生物分子集合体に悪影響を与えることが懸念される。具体的には親水性高分子が固定化生体分子に結合し、生体分子の機能が損なわれる点である。
【０００５】
そこで、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、固定化部位に生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるバイオチップが望まれている。
【０００６】
本発明はバックグラウンド部には非特異的吸着を抑制する親水性高分子を固定化し、固定化部位には固定化させるための起点となる物質もしくは官能基を有する物質が固定化されているバイオチップを得ることを可能とする。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許６１２７１２９号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、固定化部位に生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるバイオチップを得ることにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
【００１０】
１．生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化するためのバイオチップであり、該生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）には固定化させるための起点となる物質もしくは官能基を有する物質が固定化され、かつ固定化部位以外のバックグラウンド部には、親水性高分子が固定化されていることを特徴とするバイオチップ。
【００１１】
２．固定化部位の大きさが２５００μｍ２以上であることを特徴とする１記載のバイオチップ。
【００１２】
３．金を蒸着した透明ガラスもしくは透明プラスチックを基板として用いることを特徴とする１又は２に記載のバイオチップ。
【００１３】
４．バイオチップが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を用いて、チップに固定化されている生体分子もしくは生物分子集合体への反応を解析するためのものであることを特徴とする１〜３のいずれかに記載のバイオチップ。
【００１４】
５．バイオチップが、チップに複数の生体分子もしくは生物分子集合体を固定化し、ＳＰＲイメージング法によって同時に複数の反応を解析するためのものであることを特徴とする１〜４のいずれかに記載のバイオチップ。
【００１５】
６．固定化部位の起点となる物質がビオチン、グルタチオン、ストレプトアビジン、アミロース、抗体よりなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする１〜５のいずれかに記載のバイオチップ。
【００１６】
７．固定化部位の起点となる官能基を有する物質の官能基がカルボキシル基、アミノ基、チオール基、マレイミド基、スクシンイミド基、ニトロソ三酢酸基よりなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする１〜６のいずれかに記載のバイオチップ。
【００１７】
８．バックグラウンド部に固定化される親水性高分子がポリエチレングリコールであることを特徴とする１〜７のいずれかに記載のバイオチップ。
【００１８】
９．ポリエチレングリコールの分子量が１０００以上であることを特徴とする８記載のバイオチップ。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。バイオチップは生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化し、相互作用解析や発現遺伝子、蛋白質などのスクリーニングに有効である。本発明では生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と、固定化部位以外のバックグラウンド部は明確に区別されている。固定化部位には固定化させるための起点となる物質もしくは官能基を有する物質が固定化されている。生体分子もしくは生物分子集合体は起点物質あるいは官能基を介して水素結合、共有結合、イオン結合あるいは疎水結合によって表面に固定化される。バックグラウンド部には固定化部位に高密度で存在する起点物質もしくは官能基は基本的に存在せず、サンプル内に存在する物質の非特異的吸着を抑制するために親水性高分子が固定化されている。
【００２０】
固定化部位に導入される結合分子あるいは官能基は特に限定されるものではないが、結合の起点として容易に目的の生体分子あるいは生物分子集合体を結合し固定化できるものが好ましい。結合分子としてはビオチン、ストレプトアビジン、グルタチオン、アミロース、抗体が好ましい。ビオチンとストレプトアビジンはそれぞれが強固に結合することが知られている。グルタチオンにはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合蛋白、アミロースにはマルトース結合蛋白、抗体として抗マウス抗体を用いた場合、マウス由来の抗体を結合することができる。
【００２１】
固定化部位の起点となる官能基としてはカルボキシル基、アミノ基、チオール基、マレイミド基、スクシンイミド基、ニトロソ三酢酸基が好ましい。
【００２２】
固定化部位の起点となる結合分子もしくは官能基の導入方法は特に限定されるものではないが、金蒸着表面の場合はチオールを末端にもつ化合物を利用して、表面に直接あるいは間接に導入することができる。あるいはガラス表面の場合はシランカップリング剤を用いることで表面に物質を導入することができる。また、別の方法として結合分子あるいは官能基をもつ物質をスピンコートにより表面にコーティングすることも可能である。
【００２３】
本発明では固定化部位に固定化される生体分子もしくは生物分子集合体を結合して固定化することが容易であるが、バックグラウンド部には固定化部位に存在する起点物質もしくは官能基が基本的に存在しないため、生体分子もしくは生物分子集合体が固定化できない。固定化部位とバックグラウンド部が明確にすることによって、より精密な解析が可能となる。固定化部位とバックグラウンド部を分ける手段としては光照射によるパターン化技術や、スタンプ技術などが挙げられる。
【００２４】
バイオチップの素材としてはガラスあるいは透明プラスチックが好ましい。金を蒸着したガラスや透明プラスチックは金−硫黄結合によって官能基や結合分子を導入することが容易であり特に好ましい。結合分子や官能基を末端にもつアルカンチオールを金表面に結合させることができる。あるいは、ベースとなる官能基や結合分子を末端にもつアルカンチオールを金表面に結合させ、導入するべき結合分子もしくは官能基をもつ化合物を表面に存在する結合分子あるいは官能基に結合させて固定化する方法、あるいは複数のステップで架橋剤などを用いて結合分子もしくは官能基を導入する手段などが考えられる。
【００２５】
また、光を照射してパターン化する手法は金表面に応用することができ、紫外線により金−硫黄結合を酸化して洗浄除去し、新たにアルカンチオールを金表面に結合させることができる。
【００２６】
非特異的吸着を抑制する親水性高分子は非イオン性であることが好ましい。イオン結合による非特異吸着を抑制するためである。具体的にはポリエチレングリコールやポリビニルアルコールなどの合成高分子、デキストランなどの糖類が挙げられるが、ポリエチレングリコールが特に好ましい。さらに分子量１０００以上の方が非特異的吸着を抑制する効果があり好ましい。固定化する方法は表面に直接あるいは間接でもよい。金表面に直接固定化する場合、チオール基末端の親水性高分子を固定化する方法などが挙げられる。金表面に間接的に固定化する場合、一旦、末端に官能基をもつアルカンチオールを金表面に固定化し、その次にアルカンチオールが有する官能基を起点として親水性高分子を固定化することができる。あるいは親水性高分子を表面にコーティングする方法も可能である。
【００２７】
透明基板上に金薄層を蒸着したチップは、一般的な蛍光やラジオアイソトープなどによるラベル化で相互作用解析が可能であるだけでなく、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による検出が可能である。ＳＰＲはラベルフリーかつリアルタイムに相互作用解析が可能な技術でありＳＰＲ共鳴角付近で光の反射光をモニターする。
【００２８】
特にＳＰＲイメージングはチップ全体に光を当て、その反射光をＣＣＤカメラで撮影する手法であり、本発明のチップを用いて複数の生体分子あるいは生物分子集合体を固定化し、複数の相互作用を同時に解析することが可能である。
【００２９】
ＳＰＲイメージングで観察するためには固定化部位の大きさは２５００μｍ２以上が好ましい。それ以下であると像がはっきりせず、観察が困難なためである。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３１】
［実施例］
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム１ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，　Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。
【００３２】
分子量２０００のスクシンイミド基末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ，Ｓｈｅａｗａｔｅｒ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）をリン酸緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させ、ＰＥＧを表面に固定化した。水晶上にクロムでパターンを描いたフォトマスクを基板上に置き、Ｏｒｉｅｌ社製１０００Ｗキセノンアークランプにて一時間照射してパターン化を行った。フォトマスクのパターンは５００μｍ×５００μｍの四角形が１００個並んだものである。
【００３３】
照射後、ミリＱ水とエタノールで洗浄したのち、７−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−Ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ（７−ＣＨＴ、同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、光を照射した部分に７−ＣＨＴの自己組織化表面を形成させた。次に０．２Ｍ水溶性カルボジイミド（ナカライテスク社製）、０．０５Ｍ　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）をリン酸緩衝液に溶解させ、１５分間反応させ、７−ＣＨＴのカルボキシル基を活性化させた。すぐに１ｍＭのＡＢ−ＮＴＡ（同仁化学研究所製）を３０分反応させ、ニトロソ三酢酸（ＮＴＡ）基を固定化部位に導入した。未反応のスクシンイミド基は１Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ８．５）でブロッキングした。こうして得られたバイオチップは固定化部位にＮＴＡ基を有し、バックグラウンドは親水性高分子であるポリエチレングリコールが固定化されている。
【００３４】
このバイオチップを２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）のリン酸緩衝液溶液に一時間浸漬し、ＮＴＡ−Ｎｉキレートを形成させたのち、Ｈｉｓタグ付きＭｙｃペプチドとＨｉｓタグ付きＦｌａｇペプチド、Ｈｉｓタグ付き不活性化チロシンヒドロキシナーゼ（ＴＨ）を図１に示すパターンでチップの中央に４箇所ならべてスポッティングし、５分後ただちにＳＰＲイメージング機器（ＳＰＲＩｍａｇｅｒ：ＧＷＣ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットした。観察は１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．００５％ノニデットＰ−４０、ｐＨ７．２の緩衝液中で実施した。１μｇ／ｍｌの抗Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社製）を入れる前と入れて１５分後の写真を撮影し、前後の画像の差をとった結果を図２に示す（図内の点線枠はスポット位置）。また、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を入れる前と入れた後の画像の差を図３（図内の点線枠はスポット位置）に示す。抗Ｍｙｃ抗体がＭｙｃペプチドに、抗Ｆｌａｇ抗体がＦｌａｇ抗体に選択的に結合しているのを観察することができた。
【００３５】
［比較例１］
実施例と同様の金蒸着基板を７−ＣＨＴの１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、全面に７−ＣＨＴの自己組織化表面を形成させた。次に０．２Ｍ水溶性カルボジイミド、０．０５Ｍ　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをリン酸緩衝液に溶解させ、１５分間反応させ、７−ＣＨＴのカルボキシル基を活性化させた。すぐに１ｍＭのＡＢ−ＮＴＡを３０分反応させ、ＮＴＡ基を固定化部位に導入した。未反応のスクシンイミド基は１Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ８．５）でブロッキングした。こうして得られたバイオチップは基板全面にＮＴＡ基を有している。
【００３６】
このバイオチップを２．５ｍＭ塩化ニッケル（ＩＩ）のリン酸緩衝液溶液に一時間浸漬し、ＮＴＡ−Ｎｉキレートを形成させたのち、ヒスチジンタグ付き蛋白をスポッティングした。しかし、スポット形状は一定でなく観察しにくい。また、蛋白が結合していない部分にもＮＴＡ−Ｎｉキレートが形成されているため、バックグラウンド部がブランクとして機能せず、データが取りづらい。
【００３７】
［比較例２］
実施例と同様の金蒸着基板を８−ＡＯＴの１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。１ｍｇのＦｍｏｃ−ＯＳｕ（Ｎｏｖａ　Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）をＤＭＳＯ３００μｌに溶解し、ｐＨ７の１００ｍＭ　ＴＥＡ緩衝液２００μｌ加え、基板上で反応させ、表面をＦｍｏｃで覆った。実施例と同様にフォトマスクを用いて一時間照射しパターン化を行った。照射後、ミリＱ水とエタノールで洗浄したのち、８−ＡＯＴの１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、光を照射した部分に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。次にＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）をリン酸緩衝液に溶解させ、スポッティングを行って１５分間反応させ、スポット部の表面をマレイミド基とした。
【００３８】
次に５‘チオール末端ＤＮＡを１６時間反応させて、ＤＮＡを固定化した。０．９ｍｌのＴｒｉｓ（２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）Ａｍｉｎｅと５．１ｍｌのＤｉｍｅｔｈｙｌ　Ｆｏｒｍａｍｉｄｅを混合した塩基性有機溶媒を基板上に与え、バックグラウンド部のＦｍｏｃを除去した。最後に分子量２０００のスクシンイミド基末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ，ＳｈｅａｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ社製）をリン酸緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させ、ＰＥＧを表面に固定化した。この方法は非常に手間がかかるだけでなく、固定化した物質に負担がかかる。Ｆｍｏｃを除去する際の有機溶媒の固定化物質への影響、ＰＥＧの固定化物質への反応性が問題となる。特に蛋白質を表面に固定化する場合に適応するのは困難である。
【００３９】
【発明の効果】
本発明のＳＰＲ用バイオチップは、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、固定化部位に生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例のＳＰＲ用バイオチップのＭｙｃ、Ｆｌａｇ、ＴＨスポッティングパターンを示す図
【図２】抗Ｍｙｃ抗体を入れる前と入れた後の画像の差をとった結果図
【図３】抗Ｆｌａｇ抗体を入れる前と入れた後の画像の差をとった結果図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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