(57)【要約】【課題】ダイオキシン類の代替物として免疫測定の際の固相化抗原として利用可能な化合物、および該化合物を用いた免疫測定法を提供すること。【解決手段】以下の式（ＩＩ）：【化１】2004292367.tif 000012（ここで、ｎは１から１０の整数を示し、Ｚは担体化合物または標識物質を表す）で表される２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体を競合免疫測定用の抗原として用いるダイオキシン類の免疫測定法を提供する。この化合物は、毒性を持たず、ダイオキシン類に特異的であり、広い範囲のダイオキシン類の異性体と結合し得るので、安全かつ簡易なダイオキシンの測定法が提供される。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
2004292367.tif 000010
（ここで、ｎは１から１０の整数を示す）で表される２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルカルボン酸。
【請求項２】
請求項１に記載の２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルカルボン酸を競合免疫測定用の抗原として用いることを特徴とする、ダイオキシン類の免疫測定法。
【請求項３】
以下の式（ＩＩ）：
【化２】
2004292367.tif 000011
（ここで、ｎは１から１０の整数を示し、Ｚは担体化合物または標識物質を表す）で表される２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体。
【請求項４】
請求項３に記載の２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体を競合免疫測定用の抗原として用いる、ダイオキシン類の免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体およびこれを用いるダイオキシン類の免疫測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ダイオキシン類とは、ポリ塩素化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（ｐｏｌｙｃｈｉｏｒｉｎａｔｅｄ  ｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎｓ；ＰＣＤＤｓ）、ポリ塩素化ジベンゾフラン類（ｐｏｌｙｃｈｉｏｒｉｎａｔｅｄ  ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｓ；ＰＣＤＦｓ）、およびコプラナーＰＣＢ（ｃｏｐｌａｎａｒ  ｐｏｌｙｃｈｉｏｒｉｎａｔｅｄ  ｂｉｐｈｅｎｙｌ：Ｃｏ−ＰＣＢｓ）の総称である。ＰＣＤＤｓおよびＰＣＤＦｓには、塩素の数と存在位置により、それぞれ７５種および１３５種もの非常に多くの異性体が存在し、異性体により毒性の強さが大きく異なる。特にＰＣＤＤｓおよびＰＣＤＦｓでは、２，３，７および８位に塩素が存在する異性体は強い毒性を有している。その毒性症状には、胸腺萎縮、肝臓肥大、消耗飢餓症状、塩素座そうなどがある。また、低濃度のダイオキシンであっても長期間の曝露により、晩発性皮膚ポルフィリン症などの慢性的な症状が現れ、催奇形性、発ガン性、助ガン性といった多種多様な毒性を示すことも知られている。
【０００３】
更に近年、ある種の化合物が生物の内分泌機能を撹乱する作用を有することがわかり、いわゆる「内分泌撹乱物質」として、世界的な環境問題としてクローズアップされている。ダイオキシン類もエストロゲン活性を有する内分泌撹乱物質の一つである疑いがあることも判明している。
【０００４】
このように様々な毒性を持つダイオキシン類が、除草剤や殺虫剤などの化学製品、ゴミ焼却場から出る排ガスやフライアッシュ、製紙工場からの排水中などに含まれていることが明らかとなってきた。このため、大都市周辺の河川や港湾の水や底質、大気、土壌などの環境に由来する試料のみならず、食品、血液、母乳、尿といった生体由来の試料からもダイオキシン類が検出されており、汚染が広範囲に広がっていることが問題視されている。このように環境中のダイオキシン類が大きな社会問題となっているため、環境中のダイオキシン類の存在量を把握することが急務である。
【０００５】
ダイオキシン類の測定は、精度の高い分析値が要求されるため、通常、公定分析法に従って測定が行われている。この分析法においては、抽出、濃縮、精製などに用いられる各種のクロマトグラフィー、高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計などの高価な分析装置を含む機器が用いられる。公定分析法は高感度で、複数の化合物を一度に同定、定量できる多成分分析が可能であるが、高価で特殊な機器、クリーンルームなどの設備が必要であり、分析にも熟練した技術が必要とされる。さらに、前処理の煩雑さのために結果を得るまでに時間がかかるといった問題を抱えている。このため、精度が高くかつ簡便な測定方法の開発が望まれており、このような問題を解決すべく、比較的安価で簡便な抗原抗体反応を利用した免疫測定法によるダイオキシン類の測定方法が求められている。
【０００６】
免疫測定法とは、抗体が抗原を特異的に認識する能力を用いて微量の抗原を検出する方法であり、抗体の抗原に対する高い親和性と高い特異性により抗原を高感度に測定することができる。試料の前処理も簡便であるため、多検体の測定を簡易かつ迅速に行なうことができ、測定に要するコストが低いという種々のメリットを有する。そのため、医学、生化学、薬学、農学など広い分野で利用されている。
【０００７】
免疫測定法において測定対象物質を検出するには、抗体または抗原を認識する必要があり、種々の標識が利用されている。免疫測定法としては、標識の種類により、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）などが挙げられる。これらの免疫測定法のいずれにおいても、測定対象の化合物と同じ化合物を用いて検体と同様に測定して標準曲線を得、この標準曲線を用いて検体中の化合物濃度を算出する。
【０００８】
一般に、臨床検査や生化学分野での測定においては、これらの方法のうち測定の簡便さからＥＩＡが利用されており、ダイオキシン類の測定にもＥＩＡの利用が試みられている。しかしながら、ダイオキシン類としては、上述のように特定の基本骨格を有する３種のタイプが存在し、さらに塩素置換数の異なる多くの異性体が存在する。そのため、どの化合物を指標にするかが問題となる。例えば、これまでに開発されたダイオキシン類のＥＩＡ測定系の多くは、最も毒性が高い２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，３，７，８−ＴｅＣＤＤ）を測定対象物としており、これを標準品として測定を行っている（非特許文献１）。
【０００９】
しかし、この方法では、毒性の強いダイオキシンをハプテンとした標識抗原または固相化抗原を用いるため、これらの取扱い並びに廃棄の問題から、使用を制限される可能性がある。
【００１０】
そこで、毒性化合物以外の化合物を用いてこれを抗原とすることができれば、取扱いが簡便となり、ダイオキシンの安全かつ迅速な測定法が提供される。特許文献１および２には、ＰＣＢの代替化合物が提案されているが、ダイオキシンに特異的な化合物は未だ提供されていない。
【００１１】
【特許文献１】
特開２００２−１２８７３１号公報
【特許文献２】
特開２００２−１３１３１６号公報
【非特許文献１】
Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０、ｐｐ．１０９２−１０９９
【非特許文献２】
Ｋｕｎ  Ｃｈａｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ．，  ２５，  １２０７〜１２０９  （１９７７）；Ｓｉｍｏｎａ  Ｇ．  Ｍｅｒｉｃａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．，  ７３，  ８２６〜８３４  （１９９５）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上記課題を解決することにあり、環境試料中のダイオキシン類を簡便に測定できる免疫測定用抗原となり得る化合物を提供すること、およびこの化合物を抗原として用いるダイオキシン類の免疫測定法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意検討した結果、２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルカルボン酸がダイオキシン類のＥＩＡ測定系における競合免疫測定用の抗原として有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
（本発明の化合物）
本発明は、以下の式（Ｉ）：
【００１５】
【化３】
2004292367.tif 000002
【００１６】
（ここで、ｎは１から１０の整数を示す）で表される２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルカルボン酸を提供する。
【００１７】
また、本発明は、２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルカルボン酸を競合免疫測定用の抗原として用いることを特徴とする、ダイオキシン類の免疫測定法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、以下の式（ＩＩ）：
【００１９】
【化４】
2004292367.tif 000003
【００２０】
（ここで、ｎは１から１０の整数を示し、Ｚは担体化合物または標識物質を表す）で表される２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体を提供する。
【００２１】
さらに本発明は、前記２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体を競合免疫測定用の抗原として用いるダイオキシン類の免疫測定法を提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルカルボン酸は以下の式（Ｉ）で表される：
【００２３】
【化５】
2004292367.tif 000004
【００２４】
ｎは１から１０の整数である。以下、この物質を化合物（Ｉ）と記載する場合がある。ｎは３〜８が好ましく、５〜７であることがさらに好ましい。この化合物（Ｉ）は、後述のようにスクシンイミジル化され、キャリアー蛋白質（例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）など）と結合され、競合免疫測定用の抗原として用いられる。
【００２５】
本発明の２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体は、以下の式（ＩＩ）で表される：
【００２６】
【化６】
2004292367.tif 000005
【００２７】
ｎは１から１０の整数を示し、Ｚは担体化合物または標識物質を表す。以下、この物質を化合物（ＩＩ）と記載する場合がある。ｎは３〜８が好ましく、５〜７であることがさらに好ましい。この化合物（ＩＩ）は、化合物（Ｉ）から誘導され得る。Ｚの担体化合物としては、例えば、アミノ酸あるいはタンパク質が挙げられる。このアミノ酸あるいはタンパク質の残基を介して、化合物（ＩＩ）が固相に固定される。標識物質としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）などが挙げられる。
【００２８】
（本発明の化合物（Ｉ）および（ＩＩ）の合成）
化合物（Ｉ）および（ＩＩ）は、例えば、次の方法により合成される。
【００２９】
【化７】
2004292367.tif 000006
【００３０】
まず、２，４，５−トリクロロフェノール（ＩＩＩ）にハロゲン化脂肪酸アルキルエステルを反応させて、２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルカルボン酸アルキルエステル（ＩＶ）を形成させる。次いで、アルカリでケン化することによって化合物（Ｉ）が得られる。得られた化合物（Ｉ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとを反応させて、式（Ｖ）で示される活性化エステルを合成し、次いでこれをアミノ酸（グリシンなど）、ペプチドなどのアミノ基を含有する化合物と反応させることによって、化合物（ＩＩ）が得られる。
【００３１】
なお、上記スキームにおいて、ハロゲン化脂肪酸アルキルエステルは、Ｘ−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ１で示され（Ｘはハロゲン、Ｒ１はアルキル基、ｎは１〜１０の整数である）、上記アミノ酸、ペプチドなどのアミノ基を含有する化合物は、ＺＨで示されている。
【００３２】
（免疫測定法）
本発明のダイオキシン類の免疫測定法においては、２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体（ＩＩ）を競合抗原として用いる。測定の手法は、通常の免疫測定法と同様である。免疫測定法には酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）などが挙げられるが、特に限定されない。これらの免疫測定法においては、競合型測定法、非競合型測定法、均質法などの手法により測定が行われる。ダイオキシン類は低分子化合物であるため、一般には競合法により行なう。競合法には主にマイクロプレートのウェルやチューブに抗原を固定化する間接競合法と、ウェルやチューブに抗体を固定化する直接競合法とがある。
【００３３】
上記免疫測定法のうち、測定の簡便さからＥＩＡを用いることが望ましい。以下に、ＥＩＡを利用して、間接競合法および直接競合法によりダイオキシン類を測定する場合を各々例に挙げて、本発明を説明する。
【００３４】
間接競合法による測定の例を次に示す。まず、上記２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体（ＩＩ）（化合物（ＩＩ））を抗原として、Ｚ部分を介して、マイクロタイタープレートのウェルなどの固相に固定する。次いで化合物（ＩＩ）が結合していない固相表面を、牛血清アルブミン、カゼインなどの市販のブロッキング剤でブロックする。
【００３５】
次に、抗ダイオキシン類抗体を準備する。この抗体は、公知の方法に従ってダイオキシンをハプテン化し、牛血清アルブミンなどのキャリアタンパク質に結合させたコンジュゲートを免疫用抗原として哺乳動物に免疫することにより作製することができる（非特許文献２）。この抗ダイオキシン類抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよいが、均一性を考慮すると、モノクローナル抗体であることが望ましい。
【００３６】
次に、該化合物（ＩＩ）が固定化された固相に、一次抗体である抗ダイオキシン類抗体および検体を接触させて、該検体中のダイオキシン類と固相化抗原（化合物（ＩＩ））を一次抗体に対して競合反応させる。次いで、固相を洗浄して、検体および結合しなかった一次抗体などを除去した後、標識された抗免疫グロブリン抗体（標識化二次抗体）を加えて、固相に結合した一次抗体に結合させる。次いで固相を洗浄し、固相に結合した酵素標識を検出する。予め、化合物（ＩＩ）の濃度を種々変えて、一次抗体、および標識化二次抗体を用いて作成した検量線に基づいて、この測定値から、検体中のダイオキシン濃度が算出される。
【００３７】
他方、直接競合法による測定は次のように行われる。まず、抗ダイオキシン類抗体をウェルなどの固相に固相化し、ブロッキングを行う。これに、標識された化合物（ＩＩ）と検体とを付与し、該固相化抗体と、検体および標識された化合物（ＩＩ）とを競合反応させる。固相を洗浄後、上記間接競合法の場合と同様に標識を検出する。予め、標識された化合物（ＩＩ）と標識されていない化合物（ＩＩ）の割合を種々変え、固相化された抗ダイオキシン類抗体に対して競合させて作成した検量線に基づいて、この測定値から、検体中のダイオキシン濃度が算出される。
【００３８】
間接競合法では、一次抗体を標識し、直接競合法では抗原（化合物（ＩＩ））を標識する。標識としては、例えば、ＨＲＰ、ＡＬＰなどの酵素、ローダミンなどの蛍光物質、または化学発光物質が挙げられる。化合物（ＩＩ）の標識化は、当業者が通常用いる方法、例えば、化合物（ＩＩ）と標識物質とを緩衝液中で接触させることにより、行われる。ＥＩＡ、ＲＩＡ、およびＦＩＡの各方法においては、これらの標識に応じて、通常の手法により検出が行われる。
【００３９】
２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体（ＩＩ）は、毒性係数を持たず、かつ抗ダイオキシン抗体と反応する特性を有するため、これを競合免疫測定の競合抗原として用いることにより、毒性の高いダイオキシン自体を使用する必要がなくなり、測定者の作業時の安全性が確保される。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４１】
実施例１  ６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸（Ｉａ）の調製
２，４，５‐トリクロロフェノール（ＩＩＩ）９８７ｍｇ（５ｍｍｏｌ）および無水炭酸カリウム１．０４ｇ（７．５ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド８ｍｌに加えて攪拌し、これに６−ブロモヘキサン酸エチルエステル１．６７ｇ（７．５ｍｍｏ１）を加え、６０℃で１６時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下濃縮し、残渣をジクロロメタンで抽出し、水で洗浄後、減圧下濃縮乾固させた。残渣をジオキサン１０ｍ１とメタノール１２．５ｍ１の混液に溶解し、攪拌下、１０Ｎ水酸化ナトリウム２．５ｍｌを加え、室温で６時間攪拌した。反応終了後、水を５ｍ１加えてから、６Ｎ塩酸で中和した。溶媒を減圧下留去し、残渣に１Ｎ塩酸を加え、クロロホルムで抽出し、水で洗浄後、減圧下濃縮乾固させ、ヘキサン−エーテルの混液を用いて粉末化し、６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸（Ｉａ）（以下、化合物（Ｉａ）ということがある）を１．３２ｇ（収率８５％）得た。
【００４２】
得られた６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸（Ｉａ）の物性データ（ＮＭＲ）を、図１に示す。
【００４３】
実施例２  ６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸アミド誘導体（ＩＩａ）の調製
実施例１で得られた化合物（Ｉａ）を用い、以下に示す活性エステル法により競合測定用抗原として用いられる６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸アミド誘導体を作製した。化合物（Ｉａ）３１２ｍｇ（１ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１３８ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン１５２ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド４ｍｌに溶解し、１−エチル−３−（３’−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩２８８ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）を加えた後、室温下で１６時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下留去し、残渣をクロロホルムで抽出し、水で洗浄後、有機層を減圧下、濃縮乾固させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：酢酸エチル＝４：１で溶出）にて精製し、スクシンイミジル６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサノエート（Ｖａ）（以下、化合物（Ｖａ）ということがある）を３６０ｍｇ（収率８８％）得た。
【００４４】
スクシンイミジル６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサノエート（Ｖａ）の物性データ（ＮＭＲ）を、図２に示す。
【００４５】
得られた化合物（Ｖａ）とキャリアー蛋白質である牛血清アルブミン（ＢＳＡ）とを以下に示す手段で結合させて、６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸アミド誘導体（ＩＩａ）を調製した。
【００４６】
まず、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した牛血清アルブミンの溶液１ｍｌ（ＢＳＡ１５ｍｇ相当分：２．２７×１０−７ｍｏｌ）を氷冷攪拌下、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５４５．５μｌ加え、その後、化合物（Ｖａ）の２０ｍＭジメチルスルホキシド溶液４５４．５μｌ（４０当量：９．０９×１０−６ｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間反応させた。反応液を予め１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）で平衡化したゲルろ過カラムＰＤ−１０（アマシャムバイオサイエンス社製）にロードしてＰＢＳで溶出させ、３．５ｍｌから５．０ｍｌの間の溶出画分１．５ｍｌを集めた。この画分をＰＢＳで２．０ｍｌに希釈し、約５ｍｇ／ｍｌ濃度の化合物（Ｖａ）とＢＳＡとの結合物（化合物（ＩＩａ））を得た。得られた化合物（ＩＩａ）は、競合免疫測定用の抗原として用いられる。
【００４７】
実施例３  モノクローナル抗体を用いる、本発明の化合物のダイオキシン類異性体に対する特異性評価
種々のモノクローナル抗体について、ダイオキシン類異性体に対する特異性を検討した。モノクローナル抗体は、プリスタン前投与マウスの腹腔に抗体産生細胞株を移植し、細胞の増殖と共に腹腔内に溜まった腹水を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を担体としたアフィニティークロマトグラフィーにより調製した。３種類の抗体産生細胞（クローン）Ｃ−１、Ｃ−２、およびＣ−３を用い、それぞれ、モノクローナル抗体を調製した。なお、クローンＣ−１、Ｃ−２およびＣ−３は、それぞれ、２，３，７，８位に塩素が置換されたジベンゾダイオキシンに対するモノクローナル抗体を産生する。
【００４８】
特異性評価は、以下の原理により行った。遊離しているモノクローナル抗体（抗ダイオキシン抗体）に対し、固相化抗原（コンペティター）と遊離のダイオキシン類（リガンド）とを競合させた場合、モノクローナル抗体とダイオキシン類との反応性が、モノクローナル抗体と固相化抗原との反応性よりも高ければ（すなわち、抗体とダイオキシン類との特異性が高ければ）、固相化抗原へのダイオキシン類の結合が低下し、発色の程度が減少することを利用する。
【００４９】
まず、免疫用抗原あるいは実施例２で作製したＢＳＡと結合した化合物（ＩＩａ）をＰＢＳで１μｇ／ｍｌになるように希釈し、それぞれ、５０μｌづつ、９６穴アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．３５９０）の各ウェルに分注し、プレートをシールして室温で１時間静置した。Ｔｗｅｅｎ２０を０．００５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、蒸留水で２５％濃度に希釈調製したブロックエース（雪印乳業製）３００μｌを各ウエルに分注し、プレートをシールして、３７℃で２時間静置した。各ウェルを、Ｔｗｅｅｎ２０を０．００５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＴｒｉｔｏｎＸ１００を０．０１％含む２０％ＤＭＳＯ（希釈溶媒）で最終濃度５×１０−７Ｍに希釈したダイオキシン類化合物を２５μｌづつ各ウエルに添加した。対照として、希釈溶媒を２５μｌづつ各ウエルに添加した。その後、直ちに、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した抗体溶液を各ウエルに２５μｌづつ添加し、プレートを軽く振とう攪拌し、室温で１時間静置した。
【００５０】
Ｔｗｅｅｎ２０を０．００５％含むＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ブロックエースで２０００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ標識抗体（アフイニティー精製）５０μｌを分注した。プレートを室温で１時間静置した後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．００５％含むＰＢＳで３回洗浄し、各ウエルにＨＲＰ基質であるＴＭＢ（ＫＰＬ社製）５０μｌを分注し、５〜１０分間室温で静置した。各ウェルに５μｌづつ１Ｍリン酸溶液を添加し、マイクロタイター用分光光度計で波長４５５ｎｍ（対照６５５ｎｍ）の吸光度を測定した。反応性評価は、対照（希釈溶媒）である  各ダイオキシン類化合物非添加時の吸光度（Ｂ０）と、各ダイオキシン類化合物添加時の吸光度（Ｂ）を求めて、以下の式により阻害率を測定した。
阻害率＝｛（Ｂ０−Ｂ）／Ｂ０｝×１００（％）
この阻害率が大きいほど、抗ダイオキシン抗体とダイオキシン化合物との特異性が高いと評価した。結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
2004292367.tif 000007
【００５２】
なお、表１における免疫原１〜３は、それぞれ、免疫用抗原である２，３，７，８位に塩素が置換されたジベンゾダイオキシンのハプテン化物を示し、＊は６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸アミド誘導体（ＩＩａ）のハプテン化合物を示す。
【００５３】
表１の結果から、本発明の化合物である２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルカルボン酸、およびその誘導体である２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体を固相化抗原として用いることにより、免疫用抗原を固相化抗原として用いる場合に比べ、はるかに高感度の測定系を提供できることが示された。
【００５４】
実施例４  塩素含有有機化合物に対する特異性評価
抗体として１，２，３，７，８−ＰｅＣＤＦに対する抗ダイオキシン抗体（モノクローナル抗体）を用い、この抗ダイオキシン抗体に対して固相化抗原６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸アミド誘導体（ＩＩａ）のハプテン化物および表２並びに表３に記載の塩素含有有機化合物とを競合させて、実施例３と同様に競合反応を行わせ、交差反応性を検討した。用いたダイオキシン類は、それぞれ、表２に記載の毒性等価係数（ＴＥＦ値）を有している。結果を表２および表３に示す。
【００５５】
【表２】
2004292367.tif 000008
【００５６】
【表３】
2004292367.tif 000009
【００５７】
これらの結果から、本発明の化合物は、ダイオキシン類に特異的に、かつ広い範囲のダイオキシン異性体と反応し得ることがわかる。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によれば、新規な２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルカルボン酸（化合物（Ｉ））および２，４，５−トリクロロフェノキシアルキルアミド誘導体（化合物（ＩＩ）が提供される。化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）は、免疫測定法による抗原として用いられる。特に、化合物（ＩＩ）は、間接免疫測定法の固相化抗原として用いられ、広範囲なダイオキシン類異性体を特異的に検出および測定することができる。本発明の免疫測定法を用いることにより、大気、排ガス、土壌、河川、燃焼灰などの環境試料中のダイオキシン類の分析に広く応用することができ、さらに、食品、母乳、血液、尿などの生体試料の分析においても有用である。この測定法を採用することにより、毒性の高いダイオキシン類自体を使用する必要がなくなるため、測定作業時の安全性が大幅に向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサン酸（Ｉａ）の物性データ（ＮＭＲ）を示す図である。
【図２】スクシンイミジル６−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）ヘキサノエート（Ｖａ）の物性データ（ＮＭＲ）を示す図である。
【図１】
2004292367.tif 000013
【図２】
2004292367.tif 000014