(57)【要約】　　　（修正有）【課題】チョウザメのウィルス感染症の診断などへの利用が期待される新規な株化細胞を提供すること。【解決手段】チョウザメ眼球由来の株化細胞であり、具体的には、ＳＴＩＰ−１細胞（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９０９）とＳＴＩＰ−３細胞（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９１０）が挙げられる。【効果】チョウザメのウィルス感染症の診断への利用が期待される他、チョウザメのウィルス感染症に対して有効なワクチンを製造する際や、化学物質や重金属などの細胞毒性試験を行う際などにおいても価値が高いものとなりうるチョウザメ眼球由来の株化細胞が提供される。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チョウザメ眼球由来の株化細胞。
【請求項２】
チョウザメがベステルである請求項１記載の株化細胞。
【請求項３】
眼球上皮細胞由来である請求項１記載の株化細胞。
【請求項４】
虹彩色素上皮細胞由来である請求項１記載の株化細胞。
【請求項５】
細胞外基質を添加することなしに継代培養が可能な請求項１乃至４のいずれかに記載の株化細胞。
【請求項６】
５０回以上の継代培養が可能な請求項１乃至５のいずれかに記載の株化細胞。
【請求項７】
２０℃での培養開始後２日目〜６日目のダブリングタイムが５０時間未満である請求項１乃至６のいずれかに記載の株化細胞。
【請求項８】
培養皿に添加してから接着するまでの着定率が１時間後に７５％以上である請求項１乃至７のいずれかに記載の株化細胞。
【請求項９】
チョウザメ眼球由来の株化細胞であるＳＴＩＰ−１細胞（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９０９）。
【請求項１０】
チョウザメ眼球由来の株化細胞であるＳＴＩＰ−３細胞（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９１０）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、チョウザメのウィルス感染症の診断などへの利用が期待される新規な株化細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、水産養殖技術は、養殖可能な魚類の広汎化や供給安定性の向上などの点において目覚しい発展を続けているが、その反面において、細菌やウィルスなどの感染症による養殖魚の斃死も問題となっている。特に、ウィルス感染症は、大量斃死を伴うことが多いにもかかわらず有効な対策がないのが実情である。従って、ウィルス感染症に対しては、いかに早期に診断を行うかということが重要となる。
ウィルス感染症の診断を行うためには、ウィルスが感染する魚類の当該ウィルスに感受性を有する株化細胞が必要不可欠である。魚類由来の株化細胞は、ニジマス卵巣由来の線維芽性株化細胞であるＲＴＧ−２細胞が樹立されて以来、数多くの株化細胞が報告されている。しかしながら、その多くはサケ科魚類やコイ科魚類などの限られた魚類から分離培養して樹立された線維芽性のものであり、また、上皮性のものは少ない。従って、種々の魚類において、そのウィルス感染症の診断やウィルス自体の分離などが必ずしも円滑に行えているとはいえないのが現状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、チョウザメ（ｓｔｕｒｇｅｏｎ）は、およそ３億年前から生存していた古代種であるが、その卵はキャビアとして珍重されているほか、チョウザメの肉も食用として利用価値が高いことから、今後の養殖対象魚類として期待されている。このような状況下においては、チョウザメのウィルス感染症の診断を行うための株化細胞が必要不可欠となる。しかしながら、例えば、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　１２０：５２８−５３４，１９９１には、Ａｃｉｐｅｎｓｅｒ属に属する白チョウザメの株化細胞が報告されているが、チョウザメの株化細胞に関する報告はさほど多くはない。従って、チョウザメのウィルス感染症の診断などへの利用が期待される新規な株化細胞を樹立することは大変意義深いことであり、新規な株化細胞が樹立できれば、その株化細胞は、チョウザメのウィルス感染症に対して有効なワクチンを製造する際や、化学物質や重金属などの細胞毒性試験を行う際などにおいても価値が高いものとなりうる。
そこで本発明は、チョウザメのウィルス感染症の診断などへの利用が期待される新規な株化細胞を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記の点に鑑みてなされた本発明は、請求項１記載の通り、チョウザメ眼球由来の株化細胞である。
また、請求項２記載の株化細胞は、チョウザメがベステルである。
また、請求項３記載の株化細胞は、眼球上皮細胞由来である。
また、請求項４記載の株化細胞は、虹彩色素上皮細胞由来である。
また、請求項５記載の株化細胞は、細胞外基質を添加することなしに継代培養が可能なものである。
また、請求項６記載の株化細胞は、５０回以上の継代培養が可能なものである。
また、請求項７記載の株化細胞は、２０℃での培養開始後２日目〜６日目のダブリングタイムが５０時間未満であるものである。
また、請求項８記載の株化細胞は、培養皿に添加してから接着するまでの着定率が１時間後に７５％以上であるものである。
また、請求項９記載の株化細胞は、チョウザメ眼球由来の株化細胞であるＳＴＩＰ−１細胞（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９０９）である。
また、請求項１０記載の株化細胞は、チョウザメ眼球由来の株化細胞であるＳＴＩＰ−３細胞（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９１０）である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の株化細胞の由来となるチョウザメとしては、例えば、Ｈｕｓｏ属や前掲のＡｃｉｐｅｎｓｅｒ属に属するものが挙げられるが、好適にはＨｕｓｏ属に属するベルーガ（Ｈ．Ｈｕｓｏ）の雌とＡｃｉｐｅｎｓｅｒ属に属するステールリヤチ（Ａ．ｒｕｔｈｅｎｕｓ）の雄から作出された品種改良種であるベステル（Ｂｅｓｔｅｒ）が挙げられる。ベステルは交雑種であるため、ベステル由来の株化細胞は、各種のウィルスに対する感受性に関してＨｕｓｏ属チョウザメの細胞とＡｃｉｐｅｎｓｅｒ属チョウザメの細胞の双方の特性を兼ね備えていることが期待されるからである。
【０００６】
本発明の株化細胞は眼球由来の株化細胞である。一般に、魚類細胞を分離培養する場合、腎臓や卵巣を由来とする細胞を用いるが、これらの組織から上皮細胞のみを選択して分離培養するためには多大な時間と労力を必要とする。しかしながら、眼球由来の細胞を用いることにより、上皮細胞由来の株化細胞の樹立が容易となる。
【０００７】
次に、本発明の株化細胞を、眼球のどの組織の上皮細胞から樹立するかであるが、この点については、外界と非接触の状態で存在する虹彩色素上皮細胞や網膜色素上皮細胞などから樹立することが望ましい。腎臓や卵巣を由来とする細胞は微生物汚染の可能性が否定できないが、虹彩色素上皮細胞や網膜色素上皮細胞などは元来、微生物汚染の可能性がないので、無菌的に細胞を取出せば、その後の作業を無菌的に行うことで株化細胞の微生物汚染を確実に防ぐことができるからである。
【０００８】
株化細胞の樹立方法は、公知の方法に従って、初代培養細胞を継代培養することで行えばよい。培地は、魚類細胞の培養に通常用いられるＬ１５培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えたようなものでよい。
【０００９】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明する。
【００１０】
実施例１：チョウザメ眼球由来の株化細胞の樹立
１．ベステル眼球からの虹彩色素上皮細胞の分離
体長約１５ｃｍのベステル３０尾から眼球を摘出して７０％エタノール中で殺菌処理した後、殺菌処理した眼球をペニシリンとストレプトマイシンを添加したＰＢＳ（−）中でよく洗浄した。その後、眼球から角膜とレンズを取り除いて虹彩を切り出した。こうして得られた虹彩を０．０５％ＥＤＴＡで約４０分間処理し、虹彩色素上皮細胞と、虹彩のストローマや強膜などの結合組織との分離を容易にした後、これらの結合組織を取り除き、分離したシート状の虹彩色素上皮細胞を０．１２５％トリプシンで酵素処理してシングルセル状態の細胞（初代細胞）を得た。
【００１１】
２．初代培養
上記のようにして得られた初代細胞を、直径３．５ｃｍプラスチックディシュ（培養皿）に加えた、Ｌｅｉｂｏｖｉｔ’ｓ　Ｌ１５培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製の牛胎児血清）とペニシリン（１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）とストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した培地を用い、２０℃のＣＯ２インキュベータ内（但し大気雰囲気）で培養した。初代細胞の中から増殖性の優れた細胞を選択し、継代培養を繰り返した。
【００１２】
３．継代培養
培養皿が細胞で集密的（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な状態になったら、０．０５％ＥＤＴＡと０．１２５％トリプシンを含有する溶液で細胞を培養皿から剥離し遠心分離により細胞を回収し、別の培養皿に移し、上記の培地を用いて培養を継続した。これを繰り返すことによって、長期間培養可能な２種類の株化細胞（ＳＴＩＰ−１細胞とＳＴＩＰ−３細胞）を得た。いずれの株化細胞も、継代培養の際、コラーゲンなどの細胞外基質を培養皿底面にコーティングするといったような添加をしなくても培養皿に着定した。なお、上記の２種類の株化細胞は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、それらの受託番号は、ＳＴＩＰ−１細胞がＦＥＲＭ　Ｐ−１８９０９、ＳＴＩＰ−３細胞がＦＥＲＭ　Ｐ−１８９１０である。この特許出願の時点において、株化細胞ＳＴＩＰ−１の継代培養回数は１４０回を超え、株化細胞ＳＴＩＰ−３の継代培養回数は８０回を超える。
【００１３】
実施例２：ＳＴＩＰ−１細胞とＳＴＩＰ−３細胞の特性
１．細胞の形態
ＳＴＩＰ−１細胞は細長い細胞であるが上皮性の細胞であった（図１参照：培養開始後８日目の倍率１００倍の顕微鏡写真）。一方、ＳＴＩＰ−３細胞は典型的な敷石状の上皮性の細胞であった（図２参照：培養開始後１４日目の倍率１００倍の顕微鏡写真）。
【００１４】
２．細胞の温度特性
図３に示したように、ＳＴＩＰ−１細胞は１５℃〜３２℃の広い温度範囲で良好な増殖性を示し、特に２０℃での増殖性が優れていた。２０℃での培養開始後２日目〜６日目の細胞のダブリングタイム（指数関数的に細胞が増殖する時間）は３８．９時間であり、ＲＴＧ−２細胞と比較して約２倍の増殖速度を有していた。一方、図４に示したように、ＳＴＩＰ−３細胞は１５℃〜２０℃で良好な増殖性を示したが、３０度以上ではその増殖性は阻害された。２０℃での培養開始後２日目〜６日目の細胞のダブリングタイムは７４．９時間であった。
【００１５】
３．細胞増殖に対するＦＢＳの影響
図５に示したように、ＳＴＩＰ−１細胞を増殖せしめるために必要なＬ１５培地に添加されるＦＢＳの濃度は４％で足りた。また、図６に示したように、ＳＴＩＰ−３細胞を増殖せしめるために必要なＬ１５培地に添加されるＦＢＳの濃度も４％で足りた。よって、これらの株化細胞を増殖せしめるために必要なＦＢＳは少量であることから、これらの株化細胞の大量培養は経済的に有利であることがわかった。
【００１６】
４．細胞の染色体数
ＳＴＩＰ−１細胞とＳＴＩＰ−３細胞の染色体数を、継代培養８０回目の細胞について、培養６日目の対数増殖期の細胞にコルヒチン処理を行う常法にて調べた。具体的には、細胞に最終濃度が０．２０μｇ／ｍｌになるようにコルヒチンを加え、１８時間培養した後に培地を取り除いてから細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した。次に、０．０５％ＥＤＴＡと０．１２５％トリプシンを含有する溶液で細胞を培養皿から剥離し遠心分離により細胞を回収した。こうして回収した細胞に０．０７５ＭのＫＣｌを添加して室温にて２０分間静置して低張処理を行った。低張処理した細胞懸濁液はカルノア液を用いて２０分間氷中で固定した後、フレームドライ法によって染色体標本とした。これをギムザ染色し、顕微鏡（倍率１０００倍）で染色体を計数した。その結果、ＳＴＩＰ−１細胞の染色体数は２ｎ＝１６６±７．６本、ＳＴＩＰ−３細胞の染色体数は２ｎ＝１２１±６．１本となり、いずれの細胞もベステルの染色体数である２ｎ＝１１７本と比較して増加していた（図７参照）。この結果は、いずれの細胞も株化細胞であることを特徴付けるものである。染色体を分類すると、いずれの細胞も基本的には２倍体であるが、ランダムに異数性を示していた。２ｎ＝１７３本のＳＴＩＰ−１細胞の一例の染色体標本を図８に、２ｎ＝１２６本のＳＴＩＰ−３細胞の一例の染色体標本を図９に示す。
【００１７】
５．細胞の接着性
ＳＴＩＰ−１細胞の培養皿への接着性を、細胞を培養皿に添加してから接着するまでの時間（着定率：Ｐｌａｔｉｎｇ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：一定時間後に培養皿に定着した細胞数を細胞皿に添加した全細胞数で割った値を百分率で表したもの）により調べた。結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、ＳＴＩＰ−１細胞は細胞を培養皿に添加してから５分後には５１．４％の着定率を示し、１時間後には８３．５％、２４時間後には９４．８％と極めて高い数値を示した。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、チョウザメのウィルス感染症の診断への利用が期待される他、チョウザメのウィルス感染症に対して有効なワクチンを製造する際や、化学物質や重金属などの細胞毒性試験を行う際などにおいても価値が高いものとなりうるチョウザメ眼球由来の株化細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＴＩＰ−１細胞の顕微鏡写真。
【図２】ＳＴＩＰ−３細胞の顕微鏡写真。
【図３】各温度におけるＳＴＩＰ−１細胞の増殖曲線。
【図４】各温度におけるＳＴＩＰ−３細胞の増殖曲線。
【図５】ＳＴＩＰ−１細胞の増殖に対するＦＢＳの影響を示すグラフ。
【図６】ＳＴＩＰ−３細胞の増殖に対するＦＢＳの影響を示すグラフ。
【図７】ＳＴＩＰ−１細胞とＳＴＩＰ−３細胞の染色体数を示すグラフ。
【図８】ＳＴＩＰ−１細胞の染色体標本。
【図９】ＳＴＩＰ−３細胞の染色体標本。
【図１０】ＳＴＩＰ−１細胞の培養皿への接着性を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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