(57)【要約】【課題】三次元培養組織の細胞分布を予測することができる。【解決手段】この増殖シミュレーションシステム５０では、まず、初期細胞配置部５１１が、三次元モデルをなす複数のキューブのうちの所定数のキューブの一つずつに所定数の仮想細胞を一つずつ配置する。その後、酸素量算出部５１２が各キューブ内の酸素量を算出し、分裂時期算出部５１３がその酸素量に基づいて仮想細胞の分裂時期を算出し、増殖細胞配置部５１４が分裂時期に至った仮想細胞が存在するキューブを取り囲むキューブのいずれかに予め定められた確率で新たな仮想細胞を配置する。この結果、初期の仮想細胞が分裂時期に至るごとに新たな仮想細胞が配置されていき、また、新たな仮想細胞が分裂時期に至るごとに更に新たな仮想細胞が配置されていく。出力制御部５１５は、三次元モデルに配置された仮想細胞の分布の様子をディスプレイ５２等に出力する。【選択図】　図６
2004024130.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
三次元培養組織の増殖をシミュレートする増殖シミュレーションシステムであって、
仮想細胞を配置可能なコンパートメントを複数有する三次元モデルに所定数の仮想細胞を配置するにあたり前記三次元モデルのうち前記所定数のコンパートメントの一つずつに前記所定数の仮想細胞を一つずつ配置する初期細胞配置手段と、
前記三次元モデルのうち前記仮想細胞が存在するコンパートメント内の酸素量を算出する酸素量算出手段と、
前記酸素量算出手段によって算出された前記酸素量に基づいて前記仮想細胞の分裂時期を算出する分裂時期算出手段と、
前記仮想細胞につき前記分裂時期算出手段によって算出された前記分裂時期に至るごとに前記仮想細胞が存在するコンパートメントを取り囲むコンパートメントのいずれかに予め定められた確率で新たな仮想細胞を配置する増殖細胞配置手段と、
前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力手段に出力する出力制御手段と
を備えた増殖シミュレーションシステム。
【請求項２】
前記コンパートメントはキューブであり、前記三次元モデルは該キューブを複数有する直方体モデルである
請求項１に記載の増殖シミュレーションシステム。
【請求項３】
前記コンパートメントはキューブであり、前記三次元モデルは該キューブを複数有する直方体モデルを種々組み合わせて所定の三次元形状に近似させたモデルである
請求項１に記載の増殖シミュレーションシステム。
【請求項４】
前記酸素量算出手段は、前記仮想細胞が存在するコンパートメント内の酸素量を算出するにあたり、前記コンパートメント内に存在する仮想細胞の酸素吸収量及び前記コンパートメントと該コンパートメントを取り囲むコンパートメントとの間の酸素移動量に基づいて算出する
請求項１〜３のいずれかに記載の増殖シミュレーションシステム。
【請求項５】
前記分裂時期算出手段は、前記仮想細胞が存在するコンパートメント内の酸素量に基づいて前記仮想細胞の倍加時間を算出し、該倍加時間に基づいて前記仮想細胞の分裂時期を算出する
請求項１〜４のいずれかに記載の増殖シミュレーションシステム。
【請求項６】
前記増殖細胞配置手段が前記新たな仮想細胞を配置する際に用いる確率は、前記仮想細胞が存在するコンパートメントからの距離に応じて定められている
請求項１〜５のいずれかに記載の増殖シミュレーションシステム。
【請求項７】
前記増殖細胞配置手段は、前記仮想細胞につき前記分裂時期算出手段によって算出された前記分裂時期に至ったときに前記仮想細胞が存在するコンパートメントを取り囲むコンパートメントのすべてに既に仮想細胞が配置済みの場合には新たな仮想細胞を配置しない
請求項１〜６のいずれかに記載の増殖シミュレーションシステム。
【請求項８】
請求項７に記載の増殖シミュレーションシステムであって、前記出力制御手段は、前記仮想細胞の分布の様子を出力するのに代えて又は加えて、前記分裂時期に達した仮想細胞の数と前記分裂時期に達した仮想細胞のうち新たな仮想細胞を配置することのできる仮想細胞の数との比をアグリゲートの大きさを表す指標（アグリゲート指標）として前記出力手段に出力する
を備えた増殖シミュレーションシステム。
【請求項９】
前記出力制御手段は、前記アグリゲート指標を出力する際、細胞密度とアグリゲート指標との関係を出力する
請求項８に記載の増殖シミュレーションシステム。
【請求項１０】
前記出力制御手段は、前記仮想細胞の分布の様子を出力するにあたり、各仮想細胞が発生してからの期間に応じて区別したうえで分布の様子を出力する
請求項１〜９のいずれかに記載の増殖シミュレーションシステム。
【請求項１１】
前記出力制御手段は、前記仮想細胞の分布の様子を出力するにあたり、初期設定時に設定した培養時間が経過したときに前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力する
請求項１〜１０のいずれかに記載の増殖シミュレーションシステム。
【請求項１２】
前記出力制御手段は、前記仮想細胞の分布の様子を出力するにあたり、所定のインターバル時間が経過するごとに前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力する
請求項１〜１１のいずれかに記載の増殖シミュレーションシステム。
【請求項１３】
前記出力制御手段は、前記仮想細胞の分布の様子を出力するにあたり、前記三次元モデルの細胞密度が所定値に達したときに前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力する
請求項１〜１２のいずれかに記載の増殖シミュレーションシステム。
【請求項１４】
三次元培養組織の増殖をシミュレートする増殖シミュレーション方法であって、
仮想細胞を配置可能なコンパートメントを複数有する三次元モデルに所定数の仮想細胞を配置するにあたり前記三次元モデルのうち前記所定数のコンパートメントの一つずつに前記所定数の仮想細胞を一つずつ配置する初期細胞配置ステップと、
前記三次元モデルのうち前記仮想細胞が存在するコンパートメント内の酸素量を算出する酸素量算出ステップと、
前記酸素量算出ステップで算出された前記酸素量に基づいて前記仮想細胞の分裂時期を算出する分裂時期算出ステップと、
前記仮想細胞につき前記分裂時期算出ステップで算出された前記分裂時期に至るごとに前記仮想細胞が存在するコンパートメントを取り囲むコンパートメントのいずれかに予め定められた確率で新たな仮想細胞を配置する増殖細胞配置ステップと、
前記三次元モデルに配置された前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力手段に出力する出力制御ステップと
を備えた増殖シミュレーション方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の増殖シミュレーション方法の各ステップをコンピュータに実現させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、増殖シミュレーションシステム、その方法及びそのプログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で細胞を培養し、再び生体に適用するといった再生医療技術が知られている。近年では、スキャホールド（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）を細胞増殖の足場とした三次元培養組織が多く研究されている。このようなものとしては、スポンジのような多孔体上での三次元培養や、ゲル状体での包埋三次元培養などが知られている。このような三次元培養では、培養の経過つまり細胞増殖の様子を逐次観察しつつ、所望する組織になった時点で製品化するのが一般的である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、細胞増殖の様子を逐次観察することはコンタミネーションのおそれがあることからできるだけ回避したいという要望があった。また、観察方法としては、培養組織切片を染色して細胞の分布を調べることが挙げられるが、同じ製造ロットのものを調べる必要があることから、検査用として多数の培養組織を用意しなければならなかった。なお、本発明者らは特開２００１−２２４３６６において培養細胞評価方法や培養細胞増殖予測方法を開示しているが、培養組織切片の細胞分布や三次元培養組織の増殖を予測するには至っていない。
【０００４】
本発明は上述した問題点を解決することを課題とするものであり、三次元培養組織の細胞分布を予測できる増殖シミュレーションシステム、その方法及びそのプログラムを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
本発明は上述した目的を達成するために以下の構成を採用した。
【０００６】
本発明の第１は、三次元培養組織の増殖をシミュレートする増殖シミュレーションシステムであって、
仮想細胞を配置可能なコンパートメントを複数有する三次元モデルに所定数の仮想細胞を配置するにあたり前記三次元モデルのうち前記所定数のコンパートメントの一つずつに前記所定数の仮想細胞を一つずつ配置する初期細胞配置手段と、
前記三次元モデルのうち前記仮想細胞が存在するコンパートメント内の酸素量を算出する酸素量算出手段と、
前記酸素量算出手段によって算出された前記酸素量に基づいて前記仮想細胞の分裂時期を算出する分裂時期算出手段と、
前記仮想細胞につき前記分裂時期算出手段によって算出された前記分裂時期に至るごとに前記仮想細胞が存在するコンパートメントを取り囲むコンパートメントのいずれかに予め定められた確率で新たな仮想細胞を配置する増殖細胞配置手段と、
前記三次元モデルに配置された前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力手段に出力する出力制御手段と
を備えたものである。
【０００７】
この増殖シミュレーションシステムでは、まず、三次元モデルに所定数の仮想細胞を配置するにあたり複数のコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）のうちの所定数のコンパートメントの一つずつに所定数の仮想細胞を一つずつ配置する。その後、仮想細胞が存在するコンパートメント内の酸素量を算出し、その酸素量に基づいて仮想細胞の分裂時期を算出し、仮想細胞が分裂時期に至るごとに仮想細胞が存在するコンパートメントを取り囲むコンパートメントのいずれかに予め定められた確率で新たな仮想細胞を配置する。この結果、初期の仮想細胞が分裂時期に至るごとに新たな仮想細胞が配置されていき、また、新たな仮想細胞が分裂時期に至るごとに更に新たな仮想細胞が配置されていく。そして、三次元モデルに配置された仮想細胞の分布の様子を三次元培養組織のシミュレート結果としてディスプレイやプリンタ等の出力手段に出力する。したがって、この増殖シミュレーションシステムによれば、三次元培養組織の切片を採取することなく、三次元培養組織の細胞分布を容易に予測することができる。
【０００８】
ここで、「仮想細胞」とは、三次元形状のスキャホールドに培養可能な細胞を想定したものであり、例えば、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵細胞、筋細胞又はこれらの前駆細胞を想定したものであってもよいし、間葉系幹細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を想定したものであってもよい。また、「三次元モデル」は、仮想細胞を配置可能なコンパートメントのみで構成されていてもよいし、仮想細胞を配置可能なコンパートメントと仮想細胞を配置不可能なコンパートメントとで構成されていてもよい。前者としては、例えば線維で分割されたゲルの一つ一つが仮想細胞を配置可能なコンパートメントであると仮定した三次元モデルなどが挙げられ、後者としては、例えばスポンジのような多孔体につき孔が仮想細胞を配置可能なコンパートメントであり孔以外の箇所が仮想細胞を配置不可能なコンパートメントと仮定した三次元モデルなどが挙げられる。更に、「取り囲むコンパートメント」とは、対象となるコンパートメントの周りに存在するコンパートメントという意であり、例えば対象となるコンパートメントから所定距離内に存在するコンパートメントであってもよいし、対象となるコンパートメントに隣接（例えば面接触、線接触又は点接触）するコンパートメントであってもよい。
【０００９】
本発明の増殖シミュレーションシステムにおいて、前記コンパートメントはキューブ（ｃｕｂｅ）であり、前記三次元モデルは該キューブを複数有する直方体モデルであってもよい。こうすれば、三次元培養組織の細胞分布をシミュレートしやすい。
【００１０】
本発明の増殖シミュレーションシステムにおいて、前記コンパートメントはキューブであり、前記三次元モデルは該キューブを複数有する直方体モデルを種々組み合わせて所定の三次元形状に近似させたモデルであってもよい。こうすれば、複雑な三次元形状のスキャホールドを用いて細胞を増殖させる場合のシミュレーションであっても、直方体モデルを種々組み合わせて近似させたモデルとして取り扱うため、計算処理にかかる負担が軽く済む。
【００１１】
本発明の増殖シミュレーションシステムにおいて、前記酸素量算出手段は、前記仮想細胞が存在するコンパートメント内の酸素量を算出するにあたり、前記コンパートメント内に存在する仮想細胞の酸素吸収量及び前記コンパートメントと該コンパートメントを取り囲むコンパートメントとの間の酸素移動量に基づいて算出してもよい。こうすれば、酸素量を適切に算出することができる。ここで、「取り囲むコンパートメント」とは、対象となるコンパートメントの周りに存在するコンパートメントという意であり、例えば対象となるコンパートメントから所定距離内に存在するコンパートメントであってもよいし、対象となるコンパートメントに隣接（例えば面接触、線接触又は点接触）するコンパートメントであってもよいが、対象となるコンパートメントに面接触するコンパートメントであることが好ましい。
【００１２】
本発明の増殖シミュレーションシステムにおいて、前記分裂時期算出手段は、前記仮想細胞が存在するコンパートメント内の酸素量に基づいて前記仮想細胞の倍加時間を算出し、該倍加時間に基づいて前記仮想細胞の分裂時期を算出してもよい。こうすれば、分裂時期を酸素量に基づいて適切に算出することができる。
【００１３】
本発明の増殖シミュレーションシステムにおいて、前記増殖細胞配置手段が前記新たな仮想細胞を配置する際に用いる確率は、前記仮想細胞が存在するコンパートメントからの距離に応じて定められていてもよい。例えば、距離が短いほど高確率となるようにしてもよい。こうすれば、仮想細胞の分裂を適切にシミュレートできる。
【００１４】
本発明の増殖シミュレーションシステムにおいて、前記増殖細胞配置手段は、前記仮想細胞につき前記分裂時期算出手段によって算出された前記分裂時期に至ったときに前記仮想細胞が存在するコンパートメントを取り囲むコンパートメントのすべてに既に仮想細胞が配置済みの場合には新たな仮想細胞を配置しないようにしてもよい。こうすれば、接触阻害による細胞分裂の停止を適切にシミュレートできる。
【００１５】
このとき、前記出力制御手段は、前記仮想細胞の分布の様子を出力するのに代えて又は加えて、前記分裂時期に達した仮想細胞の数と前記分裂時期に達した仮想細胞のうち新たな仮想細胞を配置することのできる仮想細胞の数との比をアグリゲート（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）の大きさを表す指標（アグリゲート指標）として前記出力手段に出力してもよく、こうすれば、仮想細胞の分布の様子を見なくてもアグリゲートの大きさを知ることができる。このとき、細胞密度とアグリゲート指標との関係を出力してもよい。こうすれば、初期設定値の異なる増殖シミュレーションを行ったあと、ある細胞密度に達したときのアグリゲート指標を比較することにより、アグリゲートのできやすさを知ることができる。ここで、「アグリゲート」とは、複数の仮想細胞で構成される集合体を示し、現実においては細胞集団（コロニー）に対応するものである。
【００１６】
本発明の増殖シミュレーションシステムにおいて、前記出力制御手段は、前記仮想細胞の分布の様子を出力するにあたり、各仮想細胞が発生してからの期間に応じて区別したうえで分布の様子を出力してもよい。こうすれば、出力された細胞分布をみれば、どの仮想細胞が長く生存しているかを知ることができるし、各仮想細胞につきその時点までの経時的な増殖の様子を簡易的に確認することができる。
【００１７】
本発明の増殖シミュレーションシステムにおいて、前記出力制御手段は、前記仮想細胞の分布の様子を出力するにあたり、初期に設定した培養時間が経過したときに前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力してもよい。こうすれば、三次元培養組織につき初期に予め設定した培養時間が経過するとどのような細胞分布のものが得られるかを知ることができる。
【００１８】
本発明の増殖シミュレーションシステムにおいて、前記出力制御手段は、前記仮想細胞の分布の様子を出力するにあたり、所定のインターバル時間が経過するごとに前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力してもよい。こうすれば、所定のインターバル時間ごとに細胞分布が出力されるため、刻々と変わる細胞分布の様子を知ることができる。
【００１９】
本発明の増殖シミュレーションシステムにおいて、前記出力制御手段は、前記仮想細胞の分布の様子を出力するにあたり、前記三次元モデルの細胞密度が所定値に達したときに前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力してもよい。こうすれば、三次元モデルの細胞密度が所定値に達したときにどのような細胞分布のものが得られるかを知ることができる。
【００２０】
本発明の第２は、三次元培養組織の増殖をシミュレートする増殖シミュレーション方法であって、
仮想細胞を配置可能なコンパートメントを複数有する三次元モデルに所定数の仮想細胞を配置するにあたり前記三次元モデルのうち前記所定数のコンパートメントの一つずつに前記所定数の仮想細胞を一つずつ配置する初期細胞配置ステップと、
前記三次元モデルのうち前記仮想細胞が存在するコンパートメント内の酸素量を算出する酸素量算出ステップと、
前記酸素量算出ステップで算出された前記酸素量に基づいて前記仮想細胞の分裂時期を算出する分裂時期算出ステップと、
前記仮想細胞につき前記分裂時期算出ステップで算出された前記分裂時期に至るごとに前記仮想細胞が存在するコンパートメントを取り囲むコンパートメントのいずれかに予め定められた確率で新たな仮想細胞を配置する増殖細胞配置ステップと、
前記三次元モデルに配置された前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力手段に出力する出力制御ステップと
を含むものである。
【００２１】
この増殖シミュレーション方法によれば、三次元培養組織の切片を採取することなく、三次元培養組織の細胞分布を容易に予測することができる。なお、この増殖シミュレーション方法において、前記三次元モデルは、前記コンパートメントを複数有する直方体モデルであってもよいし、前記コンパートメントを複数有する直方体モデルを種々組み合わせて所定の三次元形状に近似させたモデルであってもよい。また、前記酸素量算出ステップでは、前記仮想細胞が存在するコンパートメント内の酸素量を算出するにあたり、前記コンパートメント内に存在する仮想細胞の酸素吸収量及び前記コンパートメントと該コンパートメントを取り囲むコンパートメントとの間の酸素移動量に基づいて算出してもよい。また、前記分裂時期算出ステップでは、前記仮想細胞が存在するコンパートメント内の酸素量に基づいて前記仮想細胞の倍加時間を算出し、該倍加時間に基づいて前記仮想細胞の分裂時期を算出してもよい。また、前記増殖細胞配置ステップで前記新たな仮想細胞を配置する際に用いる確率は、前記仮想細胞が存在するコンパートメントからの距離に応じて定められていてもよい。また、前記増殖細胞配置ステップでは、前記仮想細胞につき前記分裂時期算出手段によって算出された前記分裂時期に至ったときに前記仮想細胞が存在するコンパートメントを取り囲むコンパートメントのすべてに既に仮想細胞が配置済みの場合には新たな仮想細胞を配置しないようにしてもよい。このとき、前記出力制御ステップでは、前記仮想細胞の分布の様子を出力するのに代えて又は加えて、前記分裂時期に達した仮想細胞の数と前記分裂時期に達した仮想細胞のうち新たな仮想細胞を配置することのできる仮想細胞の数との比をアグリゲートの大きさを表す指標として出力してもよい。また、前記出力制御ステップでは、前記仮想細胞の分布の様子を出力するにあたり、各仮想細胞が発生してからの期間に応じて区別したうえで分布の様子を出力してもよいし、あるいは、初期に設定した培養時間が経過したときに前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力してもよいし、あるいは、所定のインターバル時間が経過するごとに前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力してもよいし、あるいは、前記三次元モデルの細胞密度が所定値に達したときに前記仮想細胞の分布の様子を前記三次元培養組織のシミュレート結果として出力してもよい。
【００２２】
本発明の第３は、本発明の第２の増殖シミュレーション方法の各ステップをコンピュータに実現させるためのプログラムである。このプログラムをコンピュータに実行させれば、三次元培養組織の切片を採取することなく、三次元培養組織の細胞分布を容易に予測することができる。なお、このプログラムは、コンピュータが読み取り可能な記憶媒体（例えばハードディスク、ＲＯＭ、ＦＤ、ＣＤ、ＤＶＤなど）に記録されていてもよいし、伝送媒体（インターネットやＬＡＮなどの通信網）を介して配信されてもよいし、その他どのような形で授受されてもよい。
【００２３】
【発明の実施の形態】
１．初期設定時の細胞配置
ここでは、アテロコラーゲンゲルをスキャホールドとして用いた軟骨細胞の包埋培養をシミュレートする場合について例示する。まず、図１に示す三次元モデル１０を構築する。この三次元モデル１０は、コラーゲン線維１２によりゲル１４を複数のキューブ２０，２０，…に分割したものであり、全体形状が直方体状のモデルである。この三次元モデル１０の各キューブ２０には、１つの仮想細胞を配置できると仮定し、仮想細胞が配置されていない場合には培地が満たされていると仮定する。初期設定時には、予め設定された細胞播種密度に基づいて三次元モデルに配置する細胞数を決定し、その細胞数と同数のキューブを任意に選択し、各キューブに仮想細胞一つずつを配置していく。
【００２４】
２．酸素量の算出
三次元モデル１０の各キューブ２０内の酸素量は、そのキューブ２０内に存在する仮想細胞の酸素吸収量及び隣り合うキューブ間の酸素移動量に基づいて酸素濃度として算出する。具体的には、図２に示す式（１）〜（４）を利用して算出する。式（１）の左辺は、酸素濃度の時間微分量を表す。また、式（１）の右辺第１項は、隣接するキューブとの酸素移動量、右辺第２項はキューブ内での酸素消費量（キューブ内に仮想細胞が存在しないときにはゼロとなる）を表す。
【００２５】
３．分裂時期の算出
三次元モデルに配置されている各仮想細胞の分裂時期は、各仮想細胞が存在するキューブ内の酸素量に基づいて算出する。具体的には、仮想細胞が存在するキューブ内の酸素濃度ＣＯ２に基づいてその仮想細胞の倍加時間ｔｄを算出し、その倍加時間ｔｄに基づいて前記仮想細胞の分裂時期を算出する。倍加時間ｔｄは、図３に示す式（５）及び式（６）に基づいて算出し、この倍加時間ｔｄが経過した時点を分裂時期とする。なお、式（６）において、最大比増殖速度μｍや飽和定数ＫＯは予備実験により予め算出した値を用い、酸素濃度ＣＯ２は前出の式（１）より求めた値を用いる。
【００２６】
４．増殖細胞の配置
図４は、三次元モデルに仮想細胞を配置していく過程を表した説明図、図５は、仮想細胞を配置する確率の説明図である。仮想細胞（母細胞ＭＣ）が分裂時期に至ったときには、その母細胞ＭＣが配置されているキューブ２０ａ（元キューブ）に隣接する２６個のキューブのうちのいずれか１つに、その母細胞ＭＣから分裂した仮想細胞（娘細胞ＤＣ）が所定の確率でもって配置されると仮定した。具体的には、元キューブ２０ａに隣接する２６個のキューブのうち、元キューブ２０ａと面接触（面を共有）している６個のキューブ２０ｂ，２０ｂ，…に対しては、それぞれ４／５６の確率で娘細胞が配置され、元キューブ２０ａと線接触（辺を共有）している１２個のキューブ２０ｃ，２０ｃ，…に対してはそれぞれ２／５６の確率で娘細胞が配置され、元キューブ２０と点接触（頂点を共有）している８個のキューブ２０ｄ，２０ｄ，…に対してはそれぞれ１／５６の確率で娘細胞が配置されると仮定した。つまり、元キューブ２０ａからの距離が長ければ低確率、短ければ高確率で配置されると仮定した。但し、隣接する２６個のキューブのうち既に仮想細胞が配置されているキューブについては新たな仮想細胞を配置できないものとした。この場合、元キューブ２０ａを取り囲む２６個のキューブのうち、空キューブ（娘細胞の配置可能なキューブ）の数に基づいて所定の確率を算出し、この確率に基づいて娘細胞の配置を決定した方が効率よく配置することができる。具体的には、キューブ２０ｂの空キューブの数をＳｂ、キューブ２０ｃの空キューブの数をＳｃ、キューブ２０ｄの空キューブの数をＳｄとすれば、娘細胞がキューブ２０ｂの空キューブに配置される確率は４／Ｓ（但し、Ｓ＝（４×Ｓｂ）＋（２×Ｓｃ）＋（１×Ｓｄ））、キューブ２０ｃの空キューブに配置される確率は２／Ｓ、キューブ２０ｄの空キューブに配置される確率は１／Ｓとなる。そして、元キューブ２０ａに隣接する２６個のキューブのすべてに仮想細胞が配置された時点で、元キューブ２０ａに存在する母細胞ＭＣは接触阻害によって細胞分裂を停止する、つまり、その母細胞ＭＣが分裂時期に至ったとしてもその母細胞ＭＣに基づいて新たな仮想細胞を配置しないこととした。また、娘細胞ＤＣも自ら母細胞ＭＣとなって分裂時期に至るごとに同様にして隣接するキューブに仮想細胞が配置されていくと仮定した。
【００２７】
５．細胞分布等の出力
上述した酸素量の算出、分裂時期の算出、増殖細胞の配置をこの順に繰り返し行い、例えば所定の培養時間が経過した時点あるいは所定の細胞密度に達した時点で、仮想細胞の分布の様子をシミュレート結果としてディスプレイやプリンタに出力する。仮想細胞の分布の様子は、例えば三次元モデルの断面をグラフのＸＹ平面に表し、三次元モデルに仮想細胞が存在するキューブの位置を所定のマーク（例えば○印）で表示する。このとき、生存期間が長いほど濃くなるようにマークを表示してもよいし、色分けして表示してもよい。また、分裂時期に達した仮想細胞の数Ｎｄａと、分裂時期に達し実際に分裂した仮想細胞の数Ｎｄとの比、Ｎｄ／Ｎｄａをアグリゲートの指標として算出し、培養時間に対するＮｄ／Ｎｄａの変化の様子をグラフで表示してもよい。さらに、計算領域に存在するすべての仮想細胞同士の距離（例えば重心間距離）をアグリゲートの指標として算出し、その距離の分布をグラフで表示してもよい。例えば、大きなアグリゲートが存在する細胞分布の場合、多くの仮想細胞によってアグリゲートが形成されるため、仮想細胞同士の距離は短くなり、バラツキが少なく標準偏差が小さくなる傾向があると予想される。逆に、小さなアグリゲートしか存在しない細胞分布の場合、仮想細胞が計算領域全域に分散して配置されていると考えられるので、仮想細胞同士の距離は長くなり、バラツキが多く標準偏差が大きくなる傾向があると予想される。したがって、所定の細胞密度に至った時点における仮想細胞同士の距離はアグリゲート指標として有効に利用することができる。
【００２８】
６．増殖シミュレーションシステム
図６は、本発明の一例としての増殖シミュレーションシステム５０の概略構成を表すブロック図である。増殖シミュレーションシステム５０は、コンピュータ本体５１、ディスプレイ５２、キーボード５３（マウスを含む）及びプリンタ５４を備えている。コンピュータ本体５１は、周知のＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭなどを含んで構成された汎用コンピュータ装置であり、機能ブロックで示せば、初期細胞配置部５１１、酸素量算出部５１２、分裂時期算出部５１３、増殖細胞配置部５１４、出力制御部５１５となる。このコンピュータ本体５１は、キーボード５３から初期設定値等の情報が入力されると、その入力情報に基づいて各種演算を行い、その演算結果を必要に応じてディスプレイ５２やプリンタ５４に出力する。このコンピュータ本体５１の初期細胞配置部５１１は、初期設定時には、予め設定された細胞播種密度と三次元モデル（直方体モデル）の体積とに基づいて三次元モデルに配置する細胞数を決定し、その細胞数と同数のキューブを任意に選択し、各キューブに仮想細胞を一つずつ配置する。また、酸素量算出部５１２は、三次元モデルのうち仮想細胞が存在するキューブ内の酸素濃度ＣＯ２を算出し、分裂時期算出部５１３は、その酸素濃度ＣＯ２に基づいて仮想細胞の倍加時間ｔｄつまり分裂時期を算出し、増殖細胞配置部５１４は、仮想細胞が分裂時期に至るごとに仮想細胞が存在するキューブを取り囲むキューブのいずれかに予め定められた確率で新たな仮想細胞を配置する。そして、出力制御部５１５は、所定の培養時間が経過したときに三次元モデルに配置された仮想細胞の分布の様子を三次元培養組織のシミュレート結果としてディスプレイ５２やプリンタ５４に出力する。
【００２９】
次に、増殖シミュレーションシステム５０の動作について、図７のフローチャートに基づいて説明する。オペレータがキーボード５３を介してコンピュータ本体５１の図示しないＨＤＤから増殖シミュレーションプログラムを呼び出し、初期設定条件として細胞播種密度Ｄ、培養時間Ｔ、細胞生存率α、馴化時間ｔＬ、インターバル時間ｔｉをキーボード５３を介して入力したうえで図示しないシミュレート開始ボタンをオンする。すると、コンピュータ本体５１は増殖シミュレートのプログラムを実行する。ここでは、コンピュータ本体５１につき、便宜上、初期細胞配置部５１１、酸素量算出部５１２、分裂時期算出部５１３、増殖細胞配置部５１４、出力制御部５１５に分けることなく説明する。なお、細胞生存率αは、細胞をゲルに包埋すると一部死滅することから、予備実験を行って馴化前の生存細胞数を播種した細胞数で除して求めた値であり、馴化時間ｔＬは、細胞が増殖し始めるまでの誘導期長さであり、これも予備実験を行って求めた値である。また、培養時間Ｔはシミュレート結果を得たい所望の時間であって、馴化時間ｔＬよりも長いことを想定している。なぜなら、培養時間Ｔが馴化時間ｔＬよりも短い場合、仮想細胞の初期配置の様子からの変化はないので、シミュレートすることなく仮想細胞の分布を出力すればよいからである。
【００３０】
コンピュータ本体５１は、シミュレート開始ボタンがオンされると、まず、初期設定条件である細胞播種密度Ｄ、培養時間Ｔ、細胞生存率α、馴化時間ｔＬ、インターバル時間ｔｉを取り込み、細胞播種密度Ｄと細胞生存率αと三次元モデルの体積とに基づいて計算領域に配置する細胞数Ｎを求める（ステップＳ１００）。続いて、三次元モデルの複数のキューブの中からその細胞数Ｎと同数のキューブをランダムに選択し、選択した各キューブに仮想細胞を一つずつ配置する（ステップＳ１１０）。なお、各キューブの位置は三次元座標（ｘ，ｙ，ｚ）で表される。次いで、時間カウンタの値ｔに初期値ゼロをセットする（ステップＳ１２０）。ここでは、時間カウンタの値ｔの単位は特に限定されず、例えば分（ｍｉｎ．）であっても時（ｈｒ．）であってもよい。そして、ｔが馴化時間ｔＬ以上か否かを判定し（ステップＳ１３０）、ｔが馴化時間ｔＬ未満のときにはステップＳ１４０に進んでｔをインターバル時間ｔｉだけインクリメントしたあと、再びステップＳ１３０に進む。一方、ｔが馴化時間ｔＬ以上になったときには細胞数カウンタの値ｎに初期値１をセットすると共に今回増殖した仮想細胞を数えるための増殖数カウンタの値Ｎｄｉｖに初期値ゼロをセットする（ステップＳ１５０）。その後、三次元モデルの各キューブの酸素濃度ＣＯ２を前出の式（１）（図２参照）に基づいて算出する（ステップＳ１６０）。
【００３１】
次いで、細胞数カウンタの値ｎが全細胞数Ｎを越えたか否かを判定し（ステップＳ１７０）、越えていないときには第ｎ番目の仮想細胞Ｃｅｌｌｎの倍加時間ｔｄを前出の式（５）に基づいて算出し（ステップＳ１８０）、更にその仮想細胞Ｃｅｌｌｎにつき接触阻害の有無を判定して判定結果を記憶する（ステップＳ１９０）。接触阻害の有無については、判定の対象となる仮想細胞が配置されているキューブに隣接している２６個のキューブのすべてに仮想細胞が配置されたときに接触阻害ありと判定してｎ番目（ｎは細胞数カウンタの値）の仮想細胞Ｃｅｌｌｎについて接触阻害フラグＦを「１」とし、隣接する２６個のキューブのうち仮想細胞が配置されていないキューブが存在するときに接触阻害なしと判定し、ｎ番目の仮想細胞Ｃｅｌｌｎについて接触阻害フラグＦを「０」とする。次いで、その仮想細胞Ｃｅｌｌｎが分裂時期に至ったか否かをステップＳ１８０で求めた倍加時間ｔｄに基づいて判定し（ステップＳ２００）、分裂時期に至ったときにはその仮想細胞Ｃｅｌｌｎの接触阻害フラグＦが「０」か否かを判定し（ステップＳ２１０）、「０」のときには接触阻害が生じていないから、その第ｎ番目の仮想細胞Ｃｅｌｌｎが配置されているキューブに隣接する２６個のキューブのうち空いているキューブについて所定の確率（図５参照）でもって新たな仮想細胞（娘細胞）を配置する（ステップＳ２２０）。これにより仮想細胞が１つ増えたため、増殖数カウンタの値Ｎｄｉｖを１インクリメントし（ステップＳ２３０）、その仮想細胞を第（Ｎ＋Ｎｄｉｖ）番目の仮想細胞ＣｅｌｌＮ＋Ｎｄｉｖとする（ステップＳ２４０）。そして、このステップＳ２４０のあと、又は、ステップＳ２００で第ｎ番目の仮想細胞Ｃｅｌｌｎが分裂時期に至っていないとき、又は、ステップＳ２１０で第ｎ番目の仮想細胞Ｃｅｌｌｎの接触阻害フラグＦが「１」のときには、細胞数カウンタの値ｎを１インクリメントし（ステップＳ２５０）、再びステップＳ１７０に戻る。
【００３２】
そして、ステップＳ１７０で細胞数カウンタの値ｎが全細胞数Ｎを越えたときには、これまでの全細胞数Ｎに増殖数カウンタの値Ｎｄｉｖを加えた値を新たな全細胞数Ｎとし（ステップＳ２６０）、時間カウンタの値ｔが初期設定時の培養時間Ｔ以上になったか否かを判定し（ステップＳ２７０）、ｔがＴ未満のときにはステップＳ２７５でインターバル時間ｔｉだけインクリメントしたあとステップＳ１５０以降の処理を行い、ｔがＴ以上になったときには三次元モデルの断面における仮想細胞の分布の様子をディスプレイに表示して（ステップＳ２８０）、このプログラムを終了する。
【００３３】
なお、図８に示すように、ステップＳ２００で肯定判定した後にステップＳ２０５として分裂時期に至った仮想細胞の数即ち分裂時期到来数Ｎｄａを１インクリメントし、ステップＳ２１０で肯定判定した後にステップＳ２１５として実際に分裂可能な細胞の数即ち実分裂数Ｎｄを１インクリメントし、ステップＳ２７０で否定判定された後にそのときの細胞密度（細胞数Ｎから換算）とＮｄ／Ｎｄａ（アグリゲート指標）との関係をＲＡＭ等の内部メモリに記憶し（ステップＳ２７１）、その後ステップＳ２７５からステップＳ１５０に戻るようにし、最終的にステップＳ２７０で肯定判定されステップＳ２８０に進んだとき、細胞分布を出力する代わりに又は出力すると共に、横軸を細胞密度、縦軸をＮｄ／Ｎｄａとするグラフを表示してもよい。なお、このＮｄａ及びＮｄは共にステップＳ１５０でゼロにリセットされる。また、アグリゲートの指標として利用可能な各仮想細胞間の重心間距離を算出する場合には、ステップＳ２００の前に重心間距離を算出するステップを設け、他のすべての仮想細胞との重心間距離が得られるまで繰り返せばよい。重心間距離は各仮想細胞の座標（ｘ，ｙ，ｚ）に基づいて容易に算出することができる。
【００３４】
以上詳述した増殖シミュレーションシステム５０によれば、三次元培養組織の切片を採取することなく、三次元培養組織の細胞分布を容易に予測することができる。また、キューブを複数有する直方体モデルを三次元モデルにしたため、三次元培養組織の細胞分布をシミュレートしやすい。更に、分裂時期に至った仮想細胞から生じる新たな仮想細胞をどのキューブに配置するかを定める確率は、仮想細胞が存在するキューブからの距離に応じて定められているため、仮想細胞の分裂を適切にシミュレートできる。このとき、分裂時期に至った仮想細胞が存在するキューブを取り囲むキューブのすべてに既に仮想細胞が配置されている場合には新たな仮想細胞を配置しないようにしたため、接触阻害による細胞分裂の停止を適切にシミュレートできる。更にまた、細胞分布を出力する際に各仮想細胞が発生してからの期間に応じて濃淡や色を区別したうえで分布の様子を出力してもよく、こうすれば、どの仮想細胞が長く生存しているかを知ることができる。そしてまた、図８のフローチャートでは、アグリゲート指標（Ｎｄ／Ｎｄａ）を出力するため、仮想細胞の分布の様子を見なくてもアグリゲートの大きさを知ることができる。このアグリゲート指標は０以上１以下の範囲の数値となるが、０に近いほど、接触阻害によって細胞分裂が停止した細胞の数が多く大きなアグリゲートが形成されており、１に近いほど、接触阻害によって細胞分裂が停止した細胞の数が少なくアグリゲートが形成されていたとしても小さなものであるといえる。同様に、アグリゲートの大きさを示す指標として、仮想細胞の重心間距離を利用することもできる。
【００３５】
この増殖シミュレーションシステム５０を利用すれば、これから増殖実験を行う細胞につき、所定の培養時間後あるいは所定の細胞密度に達した後にどのような細胞分布になるかをシミュレートして予測し、そのシミュレート結果に応じて細胞播種密度や培養時間を決めて実際の増殖実験を行うことができる。あるいは、ある細胞を標準細胞と定めてその細胞分布を標準分布として出力し、他の細胞の細胞分布をその標準分布と比べることにより細胞の増殖能を評価することもできる。
【００３６】
【実施例】
本実施例では、アテロコラーゲンゲル内をスキャホールドとして用いたウサギ関節軟骨細胞の包埋培養につき、実際に包埋培養した実験（実験例１）と、本発明の増殖シミュレーションによる結果（実験例２）とが良好に一致する点について説明する。
【００３７】
［実験例１］実際に包埋培養した実験
ウサギ関節軟骨細胞（初代）と５重量％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭとを混合して細胞懸濁液を作製し、この細胞懸濁液と３重量％アテロコラーゲン溶液とを１：４の割合で混合し（アテロコラーゲン最終濃度２．４重量％）、これを体積０．１ｃｍ３のドーム状にして、３７℃、５％ＣＯ２含有エア内で包埋培養した。細胞播種密度は、２×１０６，２×１０５，２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３の３種類を調製した。そして、培養時間が３３６時間、５０４時間になったときに組織切片を切り出し、その組織切片をアルシアンブルーで染色したあと細胞分布を観察した。その様子を図１２及び図１３の右側に示す。
【００３８】
［実験例２］増殖シミュレーション
実験例１で述べたように実際の組織生産において調製されるアテロコラーゲンゲルの形状はドーム状であることから、図９に示すように、ドーム状のアテロコラーゲンゲルを同心円の円柱群と近似し、各円柱の上面からゲルの底面に至る高さを持つ多種類の直方体モデルを切り出し、それらの直方体モデルをシミュレーションの計算領域とした。酸素供給面は直方体モデルの上面のみとした。その計算領域と、直方体モデルをなす複数のキューブの大きさについては、図１０のテーブルに示すとおりである。なお、最も背の高い直方体モデルのみをシミュレーションの対象とし、そのシミュレーション結果を他の直方体モデルに適用した。適用するにあたり、上面からの深さに応じて底面側をカットした。
【００３９】
前出の増殖シミュレーションシステム５０を用いて、初期設定時の細胞数Ｎ、培養時間Ｔ、細胞生存率α、馴化時間ｔＬ、インターバル時間ｔｉをセットしてプログラムを実行した。細胞数Ｎは、細胞播種密度が２．０×１０６，２．０×１０５，２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３という３つの場合についてそれぞれ算出した。培養時間Ｔは、３３６時間、５０４時間をセットした。細胞生存率α及び馴化時間ｔＬは予備実験結果からそれぞれ０．２，３日（７２時間）にセットし、インターバル時間ｔｉは１時間とした。また、図７のフローチャートのステップＳ１６０における各キューブ２０内の酸素濃度は、前出の式（１）〜（４）に図１０のテーブルに示すパラメータを代入することにより算出した。なお、拡散距離δはキューブの一辺の長さＬｃと同じとした。
【００４０】
また、ウサギ関節軟骨細胞の最大比増殖速度μｍと飽和定数ＫＯは以下の予備実験により求めた。即ち、ウサギ関節軟骨細胞（初代）と培地である５重量％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭとを混合して細胞懸濁液を作製し、この細胞懸濁液と３重量％アテロコラーゲン溶液とを１：４の割合で混合し（アテロコラーゲン最終濃度２．４重量％、細胞播種密度は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３）、包埋培養物をカルチャーチャンバーインターセル（クラボウ製）のメンブラン上に厚さ３００μｍに調製し、２４ウェルプレート内に包埋培養物が位置するようにインターセルを設置し、種々の溶存酸素濃度ＣＯ２に対する比増殖速度μを求め、グラフ化した（図１１参照）。なお、比増殖速度μは、増殖期における時刻ｔ１，ｔ２で実測した細胞数Ｎ１，Ｎ２に基づいて、μ＝（ｌｎＮ２−ｌｎＮ１）／（ｔ２−ｔ１）より算出した。そして、図１１のグラフを前出の式（６）でフィッティングすることにより、最大比増殖速度μｍ＝２．１×１０−２ｈ−１、及び飽和定数ＫＯ＝２．３×１０−２ｍｏｌ／ｍ３を得た。
【００４１】
以上の条件を初期設定値として入力し、前出の増殖シミュレーションシステム５０によりシミュレーションした。図１２及び図１３は、細胞播種密度２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３における、それぞれ培養３３６時間、培養５０４時間でのシミュレーション結果（細胞分布、各図の中央）と実際の組織断面切片像（各図の右側）とを比較した比較対照図である。横軸は水平方向距離、縦軸はゲル表層からの深さを表す。各図には、左側に溶存酸素分布も併せて示した。図１２及び図１３から、組織内の細胞は、組織深さに対する溶存酸素濃度分布を反映した分布を形成し、また、実際の組織断面切片像の細胞分布とシミュレーション結果とが良好に一致していることが明らかになった。
【００４２】
なお、図１２及び図１３におけるシミュレーション結果（細胞分布）では、色の濃い細胞は発生してから長時間経過しており、色の薄い細胞は発生してから短時間しか経過していないことを示している。また、図示しないが、培養時間に対する細胞密度の変化の様子についても、実験データとシミュレーション結果とで良好に一致していた。
【００４３】
図１４及び図１５は、それぞれ細胞密度が８．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３、２．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３に達したときの、各細胞播種濃度ごとのシミュレーション結果（細胞分布）を比較した比較対照図である。図１６は、各細胞播種濃度ごとのシミュレーション結果（細胞密度とアグリゲート指標との関係）を比較した比較対照図である。これらの図から、同じ細胞密度に達したときでも、細胞播種濃度が異なることによりアグリゲートの大きさに差が生じることが明らかになった。具体的には、細胞播種濃度が小さいときには、細胞播種濃度が大きいときに比べてアグリゲートが大きくなりやすく、接触阻害が発生して細胞分裂が起こりにくくなることが明らかになった。また、アグリゲート指標が１に近いほどアグリゲートが小さく、０に近いほどアグリゲートが大きいことから、細胞分布を見なくてもアグリゲートの大きさを知ることができることが明らかになった。更に、ウサギ関節軟骨細胞を増殖させたときにどのような細胞分布を持つ組織が得られるのかがわかるため、どの細胞分布を持つ組織が好ましいのかを判断し、その細胞分布が得られる条件で実際に増殖実験を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】三次元モデル１０の概略斜視図である。
【図２】三次元モデル１０の各キューブ２０内の溶存酸素濃度を求める式である。
【図３】倍加時間ｔｄを算出するための式である。
【図４】三次元モデルに仮想細胞を配置していく過程を表した説明図である。
【図５】仮想細胞を配置する確率の説明図である。
【図６】増殖シミュレーションシステム５０の概略構成を表すブロック図である。
【図７】増殖シミュレートのフローチャートである。
【図８】増殖シミュレートのフローチャートである。
【図９】ドーム状のアテロコラーゲンゲルの近似方法を表す説明図である。
【図１０】各種パラメータに関するテーブルである。
【図１１】溶存酸素濃度ＣＯ２と比増殖速度μとの関係を表すグラフである。
【図１２】培養３３６時間でのシミュレーション結果（細胞分布）と実際の組織断面切片像とを比較した比較対照図である。
【図１３】培養５０４時間でのシミュレーション結果（細胞分布）と実際の組織断面切片像とを比較した比較対照図である。
【図１４】各細胞播種濃度ごとのシミュレーション結果（細胞分布）を比較した比較対照図である。
【図１５】各細胞播種濃度ごとのシミュレーション結果（細胞分布）を比較した比較対照図である。
【図１６】各細胞播種濃度ごとのシミュレーション結果（細胞密度とアグリゲート指標との関係）を比較した比較対照図である。
【符号の説明】
１０…三次元モデル、１２…コラーゲン線維、１４…ゲル、２０…キューブ、２０ａ〜ｄ…キューブ、５０…増殖シミュレーションシステム、５１…コンピュータ本体、５２…ディスプレイ、５３…キーボード、５４…プリンタ、５１１…初期細胞配置部、５１２…酸素量算出部、５１３…分裂時期算出部、５１４…増殖細胞配置部、５１５…出力制御部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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