(57)【要約】【課題】これまで生体用接着剤や心臓弁などの医療用デバイス処理に用いられている架橋剤や縮合剤は、人工的に合成された非天然のものであり、生体内で代謝されず生体に対して毒性を示すことが指摘されている。そのため、医療現場で用いる際には用途や使用量が制限されている。【構成】生体低分子のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、又はこれらの誘導体によって修飾した生体低分子誘導体とこの誘導体で種々の高分子を架橋することにより得られる高分子架橋体を提供する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、又はこれらの誘導体によって少なくとも１つ以上修飾したことを特徴とする生体低分子誘導体。
【請求項２】
２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子がクエン酸回路に存在する低分子およびその誘導体であることを特徴とする請求項１記載の生体低分子誘導体。
【請求項３】
２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子が、リンゴ酸、オキサル酢酸、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、２−ケトグルタル酸、又はこれらの誘導体であることを特徴とする請求項１記載の生体低分子誘導体。
【請求項４】
請求項１記載の生体低分子誘導体を用いて高分子を架橋することにより得られたことを特徴とする高分子架橋体。
【請求項５】
高分子がタンパク質、グリコサミノグリカン、キトサン、ポリアミノ酸、ポリアルコール、又はこれらの２つ又はそれ以上組み合わせであることを特徴とする請求項４記載の高分子架橋体。
【請求項６】
高分子がコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、又はこれらの誘導体からなるグリコサミノグリカンであることを特徴とする請求項４記載の高分子架橋体。
【請求項７】
高分子がコラーゲン、アテロコラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、血清アルブミン、卵白アルブミン、ヘモグロビン、カゼインおよびグロブリン、フィブリノーゲン、又はこれらの誘導体からなるタンパク質であることを特徴とする請求項４記載の高分子架橋体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、又はこれらの誘導体によって修飾した生体低分子誘導体と該誘導体により合成された高分子架橋体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、生体接着剤や生体由来の医療用デバイスの処理（例えば、ブタ由来心臓弁）には、人工的に化学合成されたグルタルアルデヒドなどのアルデヒドを有する架橋剤や１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの縮合剤等が用いられていた（例えば、特許文献１〜６、非特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平７−１６３６５０号公報
【特許文献２】
特開平９−２４９７５１号公報
【特許文献３】
特開平１０−７１１９９号公報
【特許文献４】
特表２０００−５０２３８０号公報
【特許文献５】
特開平８−５３５４８号公報
【特許文献６】
特表平８−５０２０８２号公報
【０００４】
【非特許文献１】
Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７巻，７６５頁，（１９９６）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
これまで医療用デバイスの処理等に用いられている架橋剤や縮合剤は、主に人工的に合成された非天然のものであり、生体内で代謝されず生体に対して毒性を示すことが指摘されている。そのため、医療現場で用いる際には用途や使用量が制限されている。このような問題点を解決するため、生体由来の架橋剤の開発が求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、又はこれらの誘導体によって修飾した生体低分子誘導体とこの誘導体を用いることにより得られた高分子架橋体を提供する。
【０００７】
すなわち、本発明は、２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、又はこれらの誘導体によって少なくとも１つ以上修飾した生体低分子誘導体である。かかる生体低分子誘導体は、人体に対し無害であり、反応基（−ＣＯＯＨ基）を２個以上有するために迅速な反応が可能である。
【０００８】
また、本発明は、２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、又はこれらの誘導体によって少なくとも１つ以上修飾した生体低分子誘導体を用いて高分子を架橋することにより得られた高分子架橋体である。
かかる高分子架橋体は生体内に適用後は生体内で代謝され、一定期間経過すると吸収、消失する特性があり、体内に異物として残存することがない。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で使用する２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子は、クエン酸回路に存在するトリ又はジカルボン酸低分子、例えば、リンゴ酸、オキサル酢酸、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、２−ケトグルタル酸、又はこれらの誘導体である。
【００１０】
本発明における生体低分子誘導体は、２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子のカルボキシル基にカルボジイミドの併用下に細胞毒性の低いＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、又はこれらの誘導体を反応させ、活性エステルを導入したものである。
【００１１】
かかる反応物は、生体低分子０．００１〜１０重量％に対し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、又はこれらの誘導体を０．００１〜１０重量％、カルボジイミド（ＥＤＣ）を０．００１〜２０重量％の割合で用い、反応温度０〜１００℃、反応時間１〜４８時間の適宜の条件を選択して得られる。
【００１２】
なお、カルボジイミドとしては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド・メト−ｐ−トルエンスルホン酸塩、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いることができる。なお、反応溶媒には、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いることができる。
【００１３】
図１は、クエン酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドをＥＤＣ存在下の反応により得られたクエン酸誘導体の核磁気共鳴スペクトルのチャートである。ａのピークは、クエン酸のメチレンプロトンを示し、ｂのピークはスクシンイミジル基のメチレンプロトンに由来するものである。残りの２つのピークは、溶媒（重ＤＭＳＯ）である。
【００１４】
架橋体を調製する際に用いるタンパク質は、コラーゲン（数１０種類のタイプによらない）、アテロコラーゲン（数１０種類のタイプによらない）、アルカリ可溶化コラーゲン（数１０種類のタイプによらない）、ゼラチン、ケラチン、血清アルブミン、卵白アルブミン、ヘモグロビン、カゼインおよびグロブリン、フィブリノーゲン等アミノ基を有する高分子が含まれる。これらのタンパク質は、由来する生物によらない。
【００１５】
架橋体を調製する際に用いるグリコサミノグリカンには、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、又はこれらの誘導体がふくまれる。これらのグリコサミノグリカンは、分子量、由来する生物によらない。
【００１６】
また、その他の高分子としてキトサン（脱アセチル化度、分子量によらない）、ポリアミノ酸（アミノ酸の種類、分子量によらない）、ポリアルコール（種類、分子量によらない）が含まれる。
【００１７】
生体低分子誘導体と高分子との架橋反応は、高分子０．１〜５０重量％に対し、生体低分子誘導体０．０１〜５０重量％、好ましくは、３０〜５０℃で反応させる。なお、両者の配合に際しては、均一な架橋体を得やすいことから双方適宜濃度の溶液として混合するのが好ましい。なお、かかる溶液を作成するための溶媒としては、蒸留水のほか、生理食塩水、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸、リン酸等の緩衝液、有機溶媒（ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、エタノール）等、毒性のないものを用いることができる。
【００１８】
以上のようにゲル化する生体高分子は、架橋反応を直接患部で行い、生体用接着剤、止血剤、血管塞栓材、動脈瘤の封止剤のいずれかに適用させる。また、一旦架橋反応させた後用いることにより、癒着防止剤、組織再生用足場材料、薬物担体として好適に用いられる。
【００１９】
【実施例】
実施例１−１
クエン酸のＤＭＦ溶液（５重量％）中に室温にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを３．２当量分とＥＤＣを３．１当量分加え、２４時間撹拌した。続いて、反応溶液中の有機溶媒であるＤＭＦのみを減圧留去した。得られた残渣をアセトン−ｎ−ヘキサンの展開溶媒を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、クエン酸の３つのカルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに修飾された誘導体を合成した。
【００２０】
実施例１−２
以下、実施例１−１で合成したクエン酸誘導体を用いて下記の反応により得られるコラーゲンゲルの合成について説明する。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
合成したクエン酸誘導体２４μｌをジメチルスルホキシド溶液９７６μｌで溶解させ、その溶液中より１００μｌ計り取り、１．２５重量％のＩＩ型コラーゲンりん酸緩衝溶液４００μｌ中に加え、撹拌した。室温にて２４時間静置し、架橋剤濃度０．４〜４０ｍＭのコラーゲンゲルを合成した。それぞれのゲルの重量を測定した後、凍結乾燥機にて乾燥後、再度ゲルの重量を測定し、ゲルの含水率を調べた。それぞれのゲルの含水率は、表１に示す。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
実施例２−１
２−ケトグルタル酸のＤＭＦ溶液（５重量％）中に室温にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを２．２当量分とＥＤＣを２．１当量分加え、２４時間撹拌した。続いて、反応溶液中の有機溶媒であるＤＭＦのみを減圧留去した。得られた残渣をアセトン−ｎ−ヘキサンの展開溶媒を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、２−ケトグルタル酸の２つのカルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに修飾された誘導体を合成した。
【００２５】
実施例２−２
以下、実施例２−１で合成した２−ケトグルタル酸誘導体を用いて下記の反応により得られるコラーゲンゲルの合成について説明する。
【００２６】
【化２】
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【００２７】
合成した２−ケトグルタル酸誘導体１４μｌをジメチルスルホキシド溶液９８６μｌで溶解させ、その溶液中より１００μｌ計り取り、１．２５重量％のＩＩ型コラーゲンりん酸緩衝溶液４００μｌ中に加え、撹拌した。室温にて２４時間静置し、架橋剤濃度０．６〜１０ｍＭのコラーゲンゲルを合成した。それぞれのゲルの重量を測定した後、凍結乾燥機にて乾燥後、再度ゲルの重量を測定し、ゲルの含水率を調べた。それぞれのゲルの含水率は、表２に示す。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
実施例３−１
ｃｉｓ−アコニット酸のＤＭＦ溶液（５重量％）中に室温にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを３．２当量分とＥＤＣを３．１当量分加え、２４時間撹拌した。続いて、反応溶液中の有機溶媒であるＤＭＦのみを減圧留去した。得られた残渣をアセトン−ｎ−ヘキサンの展開溶媒を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、ｃｉｓ−アコニット酸の３つのカルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに修飾された誘導体を合成した。
【００３０】
実施例３−２
以下、実施例３−１で合成したｃｉｓ−アコニット酸誘導体を用いて下記の反応により得られるコラーゲンゲルの合成について説明する。
【００３１】
【化３】
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【００３２】
合成したｃｉｓ−アコニット酸誘導体４６μｌをジメチルスルホキシド溶液９５４μｌで溶解させ、その溶液中より１００μｌ計り取り、１．２５重量％のＩＩ型コラーゲンりん酸緩衝溶液４００μｌ中に加え、撹拌した。室温で２４時間静置し、架橋剤濃度１〜３０ｍＭのコラーゲンゲルを合成した。それぞれのゲルの重量を測定した後、凍結乾燥機にて乾燥後、再度ゲルの重量を測定し、ゲルの含水率を調べた。それぞれのゲルの含水率は、表３に示す。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
実施例４−１
リンゴ酸のＤＭＦ溶液（５重量％）中に室温にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを２．２当量分とＥＤＣを２．１当量分加え、２４時間撹拌した。続いて、反応溶液中の有機溶媒であるＤＭＦのみを減圧留去した。得られた残渣をアセトン−ｎ−ヘキサンの展開溶媒を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、リンゴ酸の２つのカルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに修飾された誘導体を合成した。
【００３５】
以下、実施例４−１で合成したリンゴ酸誘導体を用いて下記の反応により得られるコラーゲンゲルの合成について説明する。
【００３６】
【化４】
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【００３７】
合成したリンゴ酸誘導体３２μｌをジメチルスルホキシド溶液９６８μｌで溶解させ、その溶液中より１００μｌ計り取り、１．２５重量％のＩＩ型コラーゲンりん酸緩衝溶液４００μｌ中に加え、撹拌した。室温で２４時間静置すると架橋剤濃度３〜５０ｍＭのコラーゲンゲルを合成した。それぞれのゲルの重量を測定した後、凍結乾燥機にて乾燥後、再度ゲルの重量を測定し、ゲルの含水率を調べた。それぞれのゲルの含水率は、表４に示す。
【００３８】
【表４】
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【００３９】
実施例５−１
オキサル酢酸のＤＭＦ溶液（５重量％）中に室温にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを２．２当量分とＥＤＣを２．１当量分加え、２４時間撹拌した。続いて、反応溶液中の有機溶媒であるＤＭＦのみを減圧留去した。得られた残渣をアセトン−ｎ−ヘキサンの展開溶媒を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、オキサル酢酸の２つのカルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに修飾された誘導体を合成した。
【００４０】
実施例５−２
以下、実施例５−１で合成したオキサル酢酸誘導体を用いて下記の反応により得られるコラーゲンゲルの合成について説明する。
【００４１】
【化５】
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【００４２】
合成したオキサル酢酸誘導体１６μｌをジメチルスルホキシド溶液９８４μｌで溶解させ、その溶液中より１００μｌ計り取り、１．２５重量％のＩＩ型コラーゲンりん酸緩衝溶液４００μｌ中に加え、撹拌した。室温で２４時間静置し、架橋剤濃度２〜４０ｍＭのコラーゲンゲルを合成した。それぞれのゲルの重量を測定した後、凍結乾燥機にて乾燥後、再度ゲルの重量を測定し、ゲルの含水率を調べた。それぞれのゲルの含水率は、表５に示す。
【００４３】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、クエン酸誘導体の核磁気共鳴スペクトルのチャートである。
【図１】
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