(57)【要約】【課題】キクにおいて外来ＤＮＡを安定に発現させる方法を提供すること、並びに該方法により外来ＤＮＡが安定に発現されたキク細胞およびキク植物体を提供することを目的とする。【解決手段】タバコＢＹ２細胞において高発現している遺伝子を同定したところ、公知のＥＦ１α遺伝子と有意な相同性を示した。同定した遺伝子の５’上流領域を単離し、キク植物体におけるプロモーター活性を検討したところ、この５’上流領域が形質転換キク植物体において長期間安定的に高いプロモーター活性を示すことを見出した。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キク植物体において所望ＤＮＡを発現させる方法であって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に、該ＤＮＡの制御下で発現させる所望のＤＮＡが結合されているＤＮＡ構築物をキク細胞に導入し、該キク細胞からキク植物体を再生させることを含む方法。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、キク細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなり、キク細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に、該ＤＮＡの制御下で発現するように所望のＤＮＡに結合されているＤＮＡ構築物が導入された、キク細胞。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、キク細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなり、キク細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
【請求項３】
請求項２に記載のキク細胞を含むキク植物体。
【請求項４】
請求項３に記載のキク植物体の子孫またはクローンである、キク植物体。
【請求項５】
請求項３または４に記載のキク植物体の繁殖材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キクにおける外来ＤＮＡの発現のためのＥＦ１α遺伝子のプロモーターの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の植物分子生物学の発展に伴い、センス遺伝子やアンチセンス遺伝子あるいは２本鎖ＲＮＡを植物細胞内で発現させ、病虫害抵抗性、除草剤耐性、環境ストレス耐性、有用物質生産、新規な花色、新規な形態などの有用形質を備えた植物新品種等を分子育種することが可能となってきた。即ち、目的の形質の発現に関与する遺伝子を、植物で発現可能なプロモーターにセンス方向、アンチセンス方向、又は２本鎖ＲＮＡを形成するように連結してキメラ遺伝子を作成し、これをベクターを用い、あるいは直接、植物細胞の染色体に導入することにより、その目的形質の遺伝子を発現または、抑制するというものである。かかる手法を応用することにより、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ由来の殺虫性ＢＴ毒素遺伝子をセンス方向に導入した虫害抵抗性植物（Ｄ．Ａ．Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２３２：７３８、１９８７）や、トマト果実の登熟に関するポリガラクツロナーゼ遺伝子をアンチセンス方向に導入した日持ち良好なトマト（Ｃ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ等、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．３３４：７２４、１９８８）等が作出されている。
【０００３】
このような形質転換植物に導入される遺伝子のプロモーターとしては、多くの場合、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター（以下単に３５Ｓプロモーターという）が用いられている。この３５Ｓプロモーターは、多くの双子葉植物で遺伝子からＲＮＡを強力に転写する働きを有し、多くの組織で非常に強く発現することから形質転換植物において最も広く使われている。
【０００４】
しかしながら、以下のような問題がある。第一に、　単子葉植物においてはそれほど発現が強力でない。第二に、単子葉、双子葉を問わず、多くの植物で、後代においては、発現が見られなくなる場合がある。第三に、３５Ｓプロモーターには高頻度に組換えを引き起こす配列が含まれており（Ａ．ＫｏｈｌｉらＰｌａｎｔ　Ｊ　１９９９　Ｍａｒ；１７（６）：５９１−６０１）、プロモーター配列自体が染色体上で不安定である。
【０００５】
キクについても、３５Ｓプロモーターを用いて外来遺伝子の発現が試みられてきた。ところが、キクにおいては、３５Ｓプロモーターを用いた場合、外来遺伝子を発現する個体は得られにくく、発現が見られる個体が得られたとしてもその発現レベルは低く、しかも成長するにつれて発現が弱くなり、最終的には発現が見られなくなることが知られている（Ｙ．　ＴａｋａｔｓｕらＰｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　２０００，　１７　（３），　２４１−２４５）。すなわち、３５Ｓプロモーターはキクにおいて外来遺伝子を発現させる場合の安定性に問題があり、キクにおいて効率良く安定発現できるプロモーターの開発が望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、キクにおいて外来ＤＮＡを安定に発現させる方法を提供することにある。さらに、本発明は、該方法により外来ＤＮＡが安定に発現されたキク植物細胞およびキク植物体を提供することをも目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
高発現している遺伝子は強力なプロモーターの支配下にあると予想される。このため、植物において高発現している遺伝子のプロモーターを利用することで、キクにおいて外来遺伝子を安定的に発現させることができる可能性がある。本発明者は、このような考えに基づき、以下のようにして高発現遺伝子を検索し、その強力なプロモーターを単離した。
【０００８】
まず培養３日目のタバコＢＹ２細胞からｍＲＮＡを調製し、大腸菌宿主のプラスミドｃＤＮＡライブラリーを作製した。次にｍＲＮＡを鋳型にしてα−３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した一本鎖ｃＤＮＡプローブを作製し、大腸菌ライブラリー１，０００クローンについてコロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。蓄積ｍＲＮＡ量がシグナルの強弱に反映されると考え、強いシグナルを有するクローンを選択することにより、高発現遺伝子の単離を行った。一次スクリーニングで得られた５０クローンについて、ノザン・サザンハイブリダイゼーションを行い、蓄積ｍＲＮＡ量が多く、かつ染色体上のコピー数が少ない３種のクローン（クローン２７、クローン２９、クローン３８）を得た。塩基配列の決定および相同性検索を行った結果、以下の遺伝子、クローン２７：アラビドプシスｃＤＮＡクローン１０８Ｃ７（機能未知）、クローン２９：サツマイモＦ１−ＡＴＰａｓｅδサブユニット、クローン３８：タバコエロンゲーションファクター（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）１αと高い相同性を示した。このうち、クローン３８はタバコＥＦ１αと９２％の高い相同性を示したことから、タバコＥＦ１αと同定した。クローン３８のｃＤＮＡの５’上流領域を取得するため、ｃＤＮＡの５’末端領域をプローブとして約　１００万個のタバコＢＹ２細胞のファージゲノムライブラリーをスクリーニングした。得られた３個の陽性クローンについて、ファージのアームとＥＦ１αのｃＤＮＡの配列に基づいてプライマーを設計してＰＣＲを行い、増幅した約４　ｋｂのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８に導入した。クローン化したＤＮＡ断片内に存在するＨｉｎｄＩＩＩとベクターのＢａｍＨＩ部位で切断し、得られた１．７　ｋｂのＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ　（−）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ部位に導入した。次に塩基配列の決定を行いＥＦ１αのｃＤＮＡの５’上流領域のＤＮＡ断片であることを確認した。この組み換えプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで切断し、レポーターＧＵＳ遺伝子を有するｐＢＩ１０１．１のＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ部位に導入してプロモーター活性を測定する植物導入用プラスミドを構築し、ｐＢＩＥＦ１αと命名した。このプラスミドを用いてキク形質転換体を作出しＧＵＳ活性の測定を行った。その結果、タバコより単離したＥＦ１αプロモーターが形質転換キク植物体において長期間（少なくとも８ヶ月間）安定的に高発現できることを見出した。
【０００９】
ＥＦ１α遺伝子は、動物・植物の別を問わず恒常的に高発現することが知られている。しかしながら、グラジオラスにおいてアラビドプシスのＥＦ１αプロモーターの発現を調査した例では３５Ｓプロモーターよりも発現能力が低く、平均すると約３割程度の活性しか示さなかった（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１９９９；１８：８０９−８１５）。この事実は、ＥＦ１αプロモーターが植物において高い活性を示すか否かは予期できないことを意味する。本発明者らは、キクにおいて、初めて、ＥＦ１αプロモーターが外来ＤＮＡを安定的に高発現させる能力を有することを実証することに成功した。
【００１０】
即ち、本発明は、キクにおける外来ＤＮＡの発現のためのＥＦ１α遺伝子のプロモーターの利用に関し、より詳しくは、
（１）　キク植物体において所望ＤＮＡを発現させる方法であって、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に、該ＤＮＡの制御下で発現させる所望のＤＮＡが結合されているＤＮＡ構築物をキク細胞に導入し、該キク細胞からキク植物体を再生させることを含む方法、
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、キク細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなり、キク細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（２）　下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡの下流に、該ＤＮＡの制御下で発現するように所望のＤＮＡに結合されているＤＮＡ構築物が導入された、キク細胞、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、キク細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなり、キク細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ
（３）　（２）に記載のキク細胞を含むキク植物体、
（４）　（３）に記載のキク植物体の子孫またはクローンである、キク植物体、
（５）　（３）または（４）に記載のキク植物体の繁殖材料、を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明におけるＥＦ１αプロモーターとしては、キク細胞内においてプロモーター活性を有するものであれば特に制限はない。配列番号：１に示す塩基配列を有するタバコ由来のＤＮＡが好適な一例であるが、他の植物から単離したものを用いることもできる。
【００１２】
配列番号：１に示す塩基配列を有するタバコ由来のＤＮＡに対応する他の植物のＤＮＡを単離する場合には、一般的なハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　ＥＭ．，Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　１９７５，　９８，　５０３．）、またはＰＣＲ技術（Ｓａｉｋｉ，　ＲＫ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９８５，　２３０，　１３５０．、Ｓａｉｋｉ，　ＲＫ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９８８，　２３９，　４８７．）を利用することができる。即ち、当業者であれば、配列番号：１に示すＤＮＡもしくはその一部をプローブとして、または、該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、所望の生物から上記タバコ由来のＤＮＡに対応するＤＮＡを単離することができる。このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、６Ｍ　尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件、または０．１％　ＳＤＳ（６０℃、０．３ｍｏｌ　ＮａＣｌ、０．０３Ｍ　クエン酸ソーダ）のハイブリダイゼーション条件、あるいはこれらと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できることが期待される。
【００１３】
このようにして単離されたＤＮＡはタバコ由来のＤＮＡと有意な相同性を有する。有意な相同性とは、塩基配列全体で好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば、９５，９６，９７，９８，９９％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｅｉ．　ＵＳＡ，　１９９０，　８７，　２２６４−２２６８．、Ｋａｒｌｉｎ，　Ｓ．　＆　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　ＳＦ．，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　９０，　５８７３．）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　ＳＦ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　１９９０，　２１５，　４０３．）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００１４】
また、本発明におけるＥＦ１αプロモーターとしては、キク細胞においてプロモーター活性を示す限り、配列番号：１に記載の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。このようなＤＮＡを調製するために当業者によく知られた方法としては、例えば、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｋｒａｍｅｒ，　Ｗ．　＆　Ｆｒｉｔｚ，　ＨＪ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，　１９８７，　１５４，　３５０．）による変異の導入を挙げることができる。また、ＤＮＡにおける塩基の変異は、自然界において生じることもある。
【００１５】
調製されたＤＮＡがプロモーター活性を有するか否かは、当業者においてはレポーター遺伝子を用いた周知のレポーターアッセイ等により検討することが可能である。レポーターアッセイにおいては、調製されたＤＮＡの下流にレポーター遺伝子が発現可能に結合されたＤＮＡ構築物を作製し、これをキク細胞に導入して、該細胞内のレポーター活性を測定する。レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ（以下、ＧＵＳ）遺伝子、およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、遺伝子の発現または該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を検出することが可能な遺伝子をレポーターとして、該遺伝子の発現、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を評価することにより、任意のＤＮＡがプロモーター活性を有するか否かを検討することも可能である。
【００１６】
レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、ＧＵＳ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【００１７】
本発明におけるＥＦ１αプロモーターは、ゲノムＤＮＡであっても、化学合成ＤＮＡであってもよい。ゲノムＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、植物細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作製し、配列番号：１に記載のタバコ由来のＤＮＡまたは他の植物由来の対応するＤＮＡを基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、あるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、これらＤＮＡに特異的なプライマーを作成し、植物細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。
【００１８】
このようにして調製されたＥＦ１αプロモーターを利用してキク植物体において所望ＤＮＡを発現させるには、該ＥＦ１αプロモーターの３’側下流に、その制御下で発現する所望のＤＮＡが結合されているＤＮＡ構築物を作製し、これをキク細胞に導入し、該キク細胞からキク植物体を再生させる。ＤＮＡ構築物においては、構造遺伝子の第一イントロンを含む一部を連結することで、プロモーター活性をさらに向上させることができる。
【００１９】
ＥＦ１αプロモーターの下流に連結するＤＮＡとしては、特に制限はなく、キク細胞内で発現させたい所望のＤＮＡである。ＥＦ１αプロモーターを利用して、β−グルクロニダーゼ遺伝子のみならず、他の様々なタンパク質をコードする遺伝子、アンチセンス遺伝子、２本鎖ＲＮＡ又はリボザイムＲＮＡ等の発現を制御することができる。ＥＦ１αプロモーターの下流に連結するＤＮＡとしては、目的に応じて、例えば、以下のものが考えられるが、これらに限られない。農業的に優れた形質を付与する遺伝子としては、例えば、耐病性、耐虫性、耐ウイルス性、細菌抵抗性、カビ抵抗性、ストレス耐性、花色関連遺伝子、形態形成に関与する遺伝子、生理活性物質の生合成系遺伝子、有用物質生産遺伝子等がある。医薬産業等において有用な物質の生産に関与する遺伝子としては、ワクチン遺伝子、抗体遺伝子、医薬原料生産遺伝子等が挙げられる。化学工業等においては、有用な物質の生産に関与する遺伝子、例えば、油脂の生合成系遺伝子、工業用酵素遺伝子等が考えられる。研究目的では、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子等が考えられる。これらは自然界の生物からクローン化した遺伝子、化学合成遺伝子、あるいはそれらの組み合わせやそれらの改変遺伝子でも良い。また、導入する遺伝子の数も１個に限らず複数でもよい。
【００２０】
このようにして作製されたＤＮＡ構築物のキク細胞への導入は、当業者に公知の方法により実施することができる。即ち、このＤＮＡ構築物を用い、植物に感染する細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメファシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネシス等を媒介として植物細胞への遺伝子導入を行うこともでき、また、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、リポソーム融合法、遺伝子銃等の物理的・化学的手法により、直接的にキク細胞への遺伝子導入を行うこともできる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：２０５、１９９１）。しかし、これらの方法に限られない。
【００２１】
上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばＮａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ．　６７：　３２５，　１９９０）が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により植物細胞に導入する。通常、ＥＦ１αプロモータの下流には、該プロモーターにより制御されるＤＮＡが位置し、さらに該ＤＮＡの下流にはターミネーターが位置する。また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するターミネーターであれば、これらに限定されない。
【００２２】
上記ＤＮＡ構築物を導入するキク細胞としては、植物体へ再生可能な形態である限り、特に制限はない。例えば、葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。ＤＮＡ構築物は、形質転換された植物細胞を効率的に選択するために、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。ＤＮＡ構築物を導入したキク細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換されたキク培養細胞を得ることができる。
【００２３】
さらに、これらの方法等により形質転換されたキク細胞からは、適当な条件下で培養することにより、植物体を再分化させることもできる（Ｇ．Ｒ．　Ｒｏｕｔ　ａｎｄ　Ｐ．Ｄａｓ、Ｓｃｉｅｎｔｉａ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ、６９：２３９、１９９７）。また、茎頂に導入することにより、特に再分化技術を用いることなく、形質転換植物を得ることもできる。このようにして得られたキク細胞、キク植物体は、外来ＤＮＡを安定に発現することができる。
【００２４】
一旦、染色体内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば種子、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００２５】
【実施例】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］
タバコ全ＲＮＡの調製は塩酸グアニジン法（Ｊ．　Ｌｏｇｅｍａｎｎ．　ｅｔ　ａｌ，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１６３，　１６−２０，　１９８７）を用いて行った。タバコＢＹ２細胞を遠心分離（３，０００　回転、１０　分、０℃）し、上清を除いたのち液体窒素中で凍結させ、冷却した乳鉢と乳棒で粉末状になるまで破砕した。この細胞３　ｇを１５　ｍｌ　のグアニジン溶液の入った遠心管に入れてよく混合し、遠心分離（１０，０００　回転、１０　分、０℃）した。上清を別の遠心管に移し、フェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を等量加え、遠心分離（１０，０００　回転、３０　分、室温）した。水層を別の遠心管に移し、７／１０倍量の１００％エタノール、１／５倍量の１　Ｍ　酢酸を加え、−８０℃に１時間静置した。その後、遠心分離（１５，０００　回転、３０　分、０℃）により核酸を沈殿させた。沈殿を１　ｍｌ　の３　Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．２）によく懸濁し、遠心分離（１０，０００　回転、５　分、室温）を行った。この操作を　２　回繰り返し、得られた沈殿を　７０％エタノールでリンスし減圧乾固後、５０　μｌのＲＮａｓｅフリーの滅菌水に溶解した。
【００２６】
ポリ（Ａ）ＲＮＡの調製は、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｔｙｐｅ７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、以下　Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ）を用いた。　Ｏｌｉｇｏ−ｄＴ　５０　ｍｇを１．５　ｍｌチューブに入れ、ＲＮａｓｅフリーの滅菌水を１　ｍｌ加えてよく撹拌し、１〜２　分静置したのち上層を取り除いた。再度同様の操作を行い、ＲＮａｓｅフリーの滅菌水を１　ｍｌ加えて撹拌しパスツールピペットを用いてＰｏｌｙ　Ｐｒｅｐ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｃｏｌｕｍｎｓ　（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製、以下　カラム）に充填した。カラムに２　ｍｌの０．１　Ｎ　ＮａＯＨ／５　ｍＭ　ＥＤＴＡを加えて洗浄した。この操作を３回繰り返した後、ＲＮａｓｅフリーの滅菌水を加えて溶出液のｐＨを８．０以下としてから７　ｍｌの１×ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．４，　０．５　Ｍ　ＮａＣｌ，　５　ｍＭ　ＥＤＴＡ）で洗浄した。３．０　μｇの全ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーの滅菌水に溶かし等量の２×ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．４，　１　Ｍ　ＮａＣｌ，　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ）を加え、６５℃で２　分加熱し氷上で急冷後、カラムに加えた。全ＲＮＡが流れ切ったのち３００μｌの１×　ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒを加えた。さらに、カラムに全　ＲＮＡを加えてからの溶出液を回収し、６５℃で　５　分加熱し氷上で急冷後、カラムに加えた。次にカラムに３　ｍｌの１×ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒを加え洗浄した。この操作を３回繰り返したのち、ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．４，　５　ｍＭ　ＥＤＴＡ）を各１５０　μｌ加えて溶出させ、それぞれ別々の１．５　ｍｌチューブ（フラクション　１〜５）に回収した。各フラクション２μｌと２０μｌのエチジウムブロマイド（１μｇ／ｍｌ）を混合しＵＶトランスイルミネーター上で観察し、ポリ（Ａ）ＲＮＡの溶出フラクションを決定した。ポリ（Ａ）ＲＮＡの溶出フラクションを一本の１．５　ｍｌチューブにまとめ、２　Ｍ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅと２　Ｍ　ＮａＣｌをそれぞれ１／１０倍量、そして２倍量の１００％エタノールを加えてよく混合し−２０℃で一晩静置した。遠心分離（１５，０００　回転、２０　分、０℃）して沈殿を７０％エタノールで洗浄、乾燥し２０μｌのＲＮａｓｅフリーの滅菌水に溶解した。このｍＲＮＡを鋳型にＴｉｍｅ　Ｓａｖｅｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、ｐＴ７Ｔ３Ｄ／ＥｃｏＲＩ，　ＮｏｔＩ，　ＢＡＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に連結した。大腸菌ＤＨ５αにエレクトロポレーション法（１０％グリセロール中、電気パルスとして２．５　ＫＶ、２５μＦを付与。ＢｉｏＲａｄ社製ＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲＩＩを使用）を用いて導入し、１×１０６　ｃｆｕ／μｇのプラスミドｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００２７】
タバコからのゲノムＤＮＡの抽出はＣＴＡＢ法（Ｈ，　Ｆｒｏｍｍ，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　４，　２９１−２９５，　１９８７）を用いて行った。タバコＢＹ２細胞を遠心分離（３，０００　回転、１０　分、０℃）し、上清を除いたのち液体窒素中で凍結させ、冷却した乳鉢と乳棒で粉末状になるまで破砕した。この細胞１５　ｇをあらかじめ７０℃に保温した１５　ｍｌの２×ＣＴＡＢ（２％　ＣＴＡＢ，　０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０，　１．４　Ｍ　ＮａＣｌ，　１％　ＰＶＰ）に加え混合した。６０℃で時々反転混和させながら１０分間保温し、その後１５ｍｌのクロロフォルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加え、１０分間穏やかに反転混和して遠心分離（２８００回転、１０分、室温）を行った。上清を回収し、同様にクロロフォルム抽出を行い、１．５　ｍｌの１０％　ＣＴＡＢ（１０％　ＣＴＡＢ，　０．７　Ｍ　ＮａＣｌ）を加えてよく混合した。再度、同様にクロロフォルム抽出を行い、上清を回収した。次に１５　ｍｌのイソプロパノールを加え、穏やかに混合し、糸状に析出した　ゲノムＤＮＡを滅菌したガラス棒に巻き付け、５ｍｌのＮａＣｌ／ＴＥ（１　Ｍ　ＮａＣｌ，　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）に移し溶解した。等量のイソプロパノールを加えたのち、析出したゲノムＤＮＡをガラス棒で８０％エタノールに移し、洗浄した。再び、ガラス棒を用いて、１　ｍｌのＴＥ（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）に移し溶解した。次に１０　ｍｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅを１０μｌ加え、３７℃、１時間保温した。調製したゲノムＤＮＡを用いてＳａｕ３ＡＩによる部分消化を行い、約２０　ｋｂ程度のＤＮＡ断片が得られるような条件を決定した。この条件を用いて部分消化したＤＮＡ　１５０μｇを、１０〜４０％ショ糖密度勾配中に加え、３３，０００回転、２０時間、２２℃で超遠心を行った。その後、２５０μｌずつ分画し、その内　２０μｌについてアガロースゲル電気泳動を行い、１５〜２０　ｋｂのＤＮＡ断片を含む分画を集めエタノール沈殿し濃縮した。このＤＮＡとＥＭＢＬ３／ＢａｍＨＩ　ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を連結し、Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてパッケージングを行った。その結果、１×１０６ｐｆｕ／μｇのゲノムライブラリーを作製した。
【００２８】
スクリーニングによって得られたＥＦ１αのｃＤＮＡの５’上流領域を保持すると考えられるファージについてＰＣＲを行い、５’上流領域のＤＮＡ断片の単離を行った。ファージのライトアームおよびレフトアームの配列から２種のプライマー、５’−ＧＣＣＡＣＡＣＡＴＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＧ−３’（配列番号：２）、５’−ＴＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＣ−３’　（配列番号：３）を設計した。またＥＦ１αの推定開始コドンの３’下流６３　ｂｐに位置するプライマー、５’−ＣＧＡＣＴＴＴＣＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＴＧＧＣＣ−３’（配列番号：４）を設計した。これらのプライマーを用いてＰＣＲ（（９８℃２０　秒→６８℃１５　分）Ｘ３０サイクル）を行った。ライトアームおよびＥＦ１αのプライマーセットを用いて増幅した約４　ｋｂのＤＮＡ断片をＢＫＬ　Ｋｉｔ（宝社製）を使用してｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩ部位に導入した。次に、クローン化したＤＮＡ断片内に存在するＨｉｎｄＩＩＩとベクターのＢａｍＨＩ部位で切断し、得られた１．７　ｋｂのＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ　（−）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ部位に導入し塩基配列を決定した。その結果、用いたＥＦ１αのプライマーの配列を含み、かつ、すでに得ていたＥＦ１αのｃＤＮＡの５’末端の配列と一致したため、得られたＤＮＡ断片はＥＦ１αのプロモーターを含む上流領域と同定した。次にこの組み換えプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩで切断し、ｐＢＩ１０１．１のＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ部位に導入した（ｐＢＩＥＦ１α）。なお、ＥＦ１αの開始コドンを含む形で導入するため、ＥＦ１α由来の２１アミノ酸およびベクターのマルチクローニング部位由来の１０アミノ酸がＧＵＳタンパク質のＮ末端に付加されている。
【００２９】
次いで、ｐＢＩＥＦ１αをアグロバクテリウム法により、キク（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ　ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ　（Ｒａｍａｔ．）　Ｋｉｔａｍｕｒａ，　品種　セイマリン）に導入した。即ち、ｐＢＩＥＦ１αをエレクトロポレーション法によりＡ．ツメファシエンスＥＨＡ１０５に導入した（１０％グリセロール中、電気パルスとして２５００Ｖ、２５μＦを付与。バイオラッド社製　ＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲＩＩ　を使用。）後、このＡ．ツメファシエンスをカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地（トリプトン１％、食塩０．５％、酵母エキス０．５％）で２８℃、２日間培養することにより選抜し、これをカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地で終夜液体培養したものを無菌培養したキクの葉に感染させた。
【００３０】
キクの形質転換は以下の手順で行った。キク品種‘セイマリン’の無菌植物の葉を５ｍｍ角程度に切り外植片とした。葉切片をアグロバクテリウム懸濁液に約３０分つけた後、余分な菌液をろ紙で除いて共存培養培地（ムラシゲ・スクーグ基本培地（以下、ＭＳと略す。）、３％しょ糖、０．８％寒天、２ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１ｍｇ／ｌベンジルアデニン、１ｇ／ｌ　カザミノ酸、１００μＭ　アセトシリンゴン）に葉の裏側を上向きにして置き、２２℃・暗黒下で２日間共存培養した。共存培養終了時には、外植片をカルベニシリン　３００ｍｇ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ　２０　１％を含む１０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液中で、２５℃１時間振とうして除菌した。次に、外植片を、選抜培地Ａ（ＭＳ、３％しょ糖、０．８％寒天、２ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１ｍｇ／ｌベンジルアデニン、３００ｍｇ／ｌ　カルベニシリン、２５ｍｇ／ｌ　パロモマイシン）に移し、２０℃、低照度（７μｍｏｌ／ｓ／ｍ２）で培養した。２週間後、新しい選抜培地Ａに移し、さらに２週間後、選抜培地Ｂ（ＭＳ、３％しょ糖、０．８％寒天、０．０２ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１ｍｇ／ｌベンジルアデニン、１０．０ｍｇ／ｌ　ジベレリン酸、３００ｍｇ／ｌ　カルベニシリン、２５ｍｇ／ｌ　パロモマイシン）に移した。次いで、２週間ごとに新しい選抜培地Ｂに移し、シュートが２−３ｍｍ長になった時点でシュートをかきとり伸長培地（無機塩濃度が１／２のＭＳ、３００ｍｇ／ｌカルベニシリン）に移した。さらに、伸長培地上で伸長したシュートの葉を５ｍｍ角に切り選抜培地Ａで培養して抗生物質抵抗性を確認した。
【００３１】
得られたｐＢＩＥＦ１α導入キク植物、即ちタバコＥＦ１αプロモーター−ＧＵＳ融合遺伝子を有するキクについて、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．　（ＥＭＢＯ　Ｊ．　１９８７，　６，　３９０１　−　３９０７）の方法に基づき、ＧＵＳ遺伝子の発現試験を行った。定量的分析には、再分化から１（培養葉１）ないし２ヶ月（培養葉２）経過した培養植物の葉、および、８ないし１０ヶ月経過した隔離温室で育成した植物の葉（温室葉）と花弁（温室花弁）を材料とし、４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ　（ＭＵＧ）　を基質として用いた。葉片をすりつぶして得た抽出液を、５０　ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ　７．０）、１０　ｍＭ　メルカプトエタノール、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１　％　Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、０．１　％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２０　％　メタノール、１　ｍＭ　ＭＵＧの反応液中で３７℃、３０分間処理した。処理後、反応液中に存在する４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ　（４−ＭＵ）の量を分光蛍光光度計によって定量的に測定した。ＧＵＳ活性は、葉片抽出液中のタンパク質１　ｍｇ当りに生成された４−ＭＵの量（ｐｍｏｌ　４−ＭＵ／ｍｉｎ／　ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）で表した。なお、タンパク質の濃度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，　ＵＳＡ）を用いて定量した。また、組織化学的分析には、培養器内で育成した再分化から８ないし１０ヶ月経過した形質転換体の全体を材料とし、５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−　ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　（Ｘ−ＧＬＵＣ）を基質として用いた。植物材料を、１００　ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ　７．０）、０．５　ｍＭ　フェロシアン化カリウム、０．５　ｍＭ　フェリシアン化カリウム、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１　％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２０　％　メタノール、１　ｍＭ　Ｘ−ＧＬＵＣの反応液に浸漬し、３７℃条件下に１６時間置いた。反応処理後、７０％エタノール溶液に浸して葉緑素を脱色しＧＵＳ活性を示す濃青色の部分の分布を調査した。定量的分析の結果、キク形質転換体において、タバコＥＦ１αプロモーターは３５Ｓプロモーターに比べて強いＧＵＳ発現の個体が多いことが示された（表１（キク形質転換体におけるタバコ　ＥＦ１ａプロモータの効果））。
【００３２】
【表１】
2004065096.tif 000002
ＧＵＳ活性；ｐｍｏｌ　４ＭＵ／ｍｉｎ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ
【００３３】
ＥＦ１αプロモーター／ＧＵＳを導入した形質転換体のうち１０００　ｐｍｏｌ　４−ＭＵ／ｍｉｎ／　ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ以上のＧＵＳ活性を示した個体は４１個体中１０個体（約２４％）であり、３５Ｓプロモーター／ＧＵＳの６９個体中６個体（約９％）よりも明らかに高率であった。すなわち、タバコＥＦ１αプロモーターの機能は、これが本来プロモーターとして作用する構造遺伝子とは全く異なるＧＵＳ構造遺伝子のプロモーターとして用いた場合でも、発揮されることが示された。キク形質転換体における生育ステージ及び部位別のＧＵＳ活性を表２に示す。
【００３４】
【表２】
2004065096.tif 000003
【００３５】
タバコＥＦ１αプロモーターは、生育ステージに関わらず、また、葉と花弁の両方で発現活性を有することが示された。
【００３６】
以上の結果より、タバコＥＦ１αプロモーターは、キク形質転換体において、これが本来プロモーターとして作用する構造遺伝子とは全く異なる構造遺伝子に対しても、発現を促進できることが明らかとなった。
【００３７】
【発明の効果】
タバコＥＦ１αプロモーターをキクにおける外来遺伝子発現のために用いることで、その制御下に置かれた構造遺伝子を、３５Ｓプロモーターを用いた場合よりも安定的かつ強力に発現させることが可能である。しかも、このプロモーターは、使用できる構造遺伝子の種類を問わない。
【００３８】
従って、目的に応じて適切なＤＮＡ配列を選択し、これをタバコＥＦ１αプロモーターの下流に配置したベクターを作成し、このベクターを用いてキクの形質転換を行えば、キクにおいてそのＤＮＡ配列由来のＲＮＡを安定的かつ強力に発現させることができる。これにより目的とする形質をキクに付与することが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＢＩＥＦ１αのＴ−領域の構造を示す図である。図中の記号の意味は次の通りである。
Ｂ：ＢａｍＨＩ，　Ｅ：ＥｃｏＲＩ，　Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ，　Ｓｃ：ＳａｃＩ，　ｐｎｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、ｔｎｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター、ＢＲ：右境界配列、ＢＬ：左境界配列、ＮＰＴＩＩ：ネオマイシン・フォスフォトランスフェラーゼＩＩ、ＥＦ１α：エロンゲーションファクター遺伝子プロモーター、ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼ遺伝子。
【図１】
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