(57)【要約】【課題】単環式芳香族化合物の定量において、感度が１ｖ／ｖ　ｐｐｂと極めて高く、検体の前処理も必要としない特徴を有し多数の検体を測定対象とする自動分析装置へ容易に適用しうる測定法を提供する。【解決手段】単環式芳香族化合物（Ａｒ．）を含有する試料と、（Ａｒ．）の分解酵素系と、（Ａｒ．）＋（Ｘ）→（Ａｒ．）分解産物＋（Ｙ）であらわされる反応を起こす化合物（Ｘ）、代表的にはＮＡＤＨを反応させる工程と、（Ｙ）の増加又は（Ｘ）の減少の程度を測定する工程と、その測定結果に基づいて試料中の（Ａｒ．）量を定量する工程と、を有することを特徴とする（Ａｒ．）の高感度定量法、ならびにそれに用いられるキット。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単環式芳香族化合物を含有する試料と、該単環式芳香族化合物の分解酵素系と、
該分解酵素系による該単環式芳香族化合物の分解反応と共役する反応を起こす化合物（Ｘ）
とを反応させて、下記式
該単環式芳香族化合物＋（Ｘ）→該単環式芳香族化合物の分解産物＋（Ｙ）
（（Ｙ）は（Ｘ）により特定される化合物）
であらわされる反応を形成せしめる工程と、
該反応によって生成する化合物（Ｙ）の増加の程度、又は該反応によって消費される化合物（Ｘ）の減少の程度を測定する工程と、
その測定結果に基づいて試料中の該単環式芳香族化合物の量を定量する工程と、
を有することを特徴とする該単環式芳香族化合物の高感度定量法。
【請求項２】
前記単環式芳香族化合物がベンゼンまたはその１〜２置換体から選ばれた１つである請求項１に記載の高感度定量法。
【請求項３】
前記単環式芳香族化合物がベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、クレゾール各異性体から選ばれた１つである請求項１に記載の高感度定量法。
【請求項４】
前記化合物（Ｘ）が還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）であり、前記化合物（Ｙ）がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）である、請求項１〜３のいずれかに記載の高感度定量法。
【請求項５】
前記化合物（Ｘ）の減少の程度、又は前記化合物（Ｙ）の増加の程度を測定する工程が、
酵素的サイクリング反応による増幅を伴う、請求項１〜４のいずれかに記載の高感度定量法。
【請求項６】
前記分解酵素系が、バークホルデリア・セパシア　ＫＫ０１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４２３５）由来の可溶性画分として得られる酵素系であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の高感度定量法。
【請求項７】
前記分解酵素系が、Ｊ１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５１０２）由来の可溶性画分として得られる酵素系であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の高感度定量法。
【請求項８】
前記分解酵素系が、Ｊ１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５１０２）由来の可溶性画分のうち３０％飽和硫酸アンモニウム塩析操作によって分離される酵素系であることを特徴とする請求項７に記載の高感度定量法。
【請求項９】
前記分解酵素系が、ＪＭ１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５３５２）由来の可溶性画分のうち３０％飽和硫酸アンモニウム塩析操作によって分離される酵素系であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の高感度定量法。
【請求項１０】
単環式芳香族化合物の分解酵素系、および該分解酵素系による単環式芳香族化合物の分解反応と共役する反応を起こす化合物（Ｘ）を含んでなることを特徴とする単環式芳香族化合物の高感度定量用試薬キット。
【請求項１１】
前記単環式芳香族化合物がベンゼンまたはその１〜２置換体から選ばれた１つである請求項１０に記載の高感度定量用試薬キット。
【請求項１２】
前記単環式芳香族化合物がベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、クレゾール各異性体から選ばれた１つである請求項１０に記載の高感度定量用試薬キット。
【請求項１３】
前記化合物（Ｘ）が還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の高感度定量用試薬キット。
【請求項１４】
前記分解酵素系が、請求項６〜９のいずれかの方法で分離されたものである、請求項１０〜１３のいずれかに記載の高感度定量用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境計測、環境修復等の分野で有用なベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、クレゾールなどの単環式芳香族化合物の高感度定量法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ベンゼン、トルエン及びエチルベンゼンは揮発性の芳香族炭化水素で、原油やガソリンのような石油製品に含まれている。また溶剤や様々な化成品の出発原料物質として広く用いられている。そのため、長年の間に、これらの芳香族炭化水素のかなりの量が、使用中に誤って外部に流出したり、或いは廃棄されたりして、地層及び地下水を汚染している。このため工業排水・排気中、あるいは地層及び地下水中におけるトルエン及びエチルベンゼン濃度の測定は、環境計測、環境修復等の分野で検査の対象となっている。
【０００３】
従来ベンゼンの分析方法は、ＪＩＳ　Ｋ００８８の方法によることが一般的である。即ち、燃焼、化学反応などに伴なって発生する排ガスを煙道、煙突またはダクトなどで採取し、吸光光度法及びガスクロマトグラフ法により分析するものである。
【０００４】
また、トルエンについては特開平０９−１８８６３３号公報や特開平１０−０３６２９５号公報、さらには特開平０５−０４５２６１号公報に、エチルベンゼンについては特開平０７−１７８３９１号公報や特開平０７−９５８７９号公報に示された様に、ＦＩＤ検出器付きのガスクロマトグラフ法によることが一般的である。
【０００５】
一方、近年の著しい科学技術の進歩においては人工的な化学物質や化成品などが新しく大量に生産されているが、その一方でこれらの一部は環境に漏洩放出したり、またはその大部分は年月を経て大量の廃棄物となって環境中に蓄積しつつある。環境中に漏洩蓄積したこれら化学物質や化成品は自然環境を破壊する大きな原因となるとともに、人類の負の遺産として早急に解決すべき重要な課題となっている。
【０００６】
トリクロロエチレンやテトラクロロエチレンなどの有機塩素化合物は精密部品の洗浄やドライクリーニングにおいてかつて大量に使用され、その漏洩による土壌や地下水の大規模な汚染の実体も明らかになりつつある。さらに、これら有機塩素化合物の催奇性や発がん性が指摘されており、汚染源の遮断と汚染された土壌や地下水の浄化は早急に解決すべき課題となっている。
【０００７】
これら汚染物質で汚染された土壌の浄化方法として、汚染物質を分解し無毒化する微生物を利用して浄化する方法は汚染土壌を掘削する必要がないため建造物下の浄化が可能であり、経済的で効率的な土壌浄化方法として近年注目されている。この場合、栄養素濃度や酸素濃度、インデューサ濃度などを制御して微生物の分解活性を最大限に引き出すことにより、最も効率的な土壌浄化が達成される。
【０００８】
クレゾールはトリクロロエチレン分解菌の分解活性発現のためのインデューサとして用いられる。このためリアクター内や汚染現場に導入されるクレゾールの濃度を知ることが、環境計測、環境修復事業等の分野で重要である。
【０００９】
従来クレゾールの分析方法は、ｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸吸光光度法（ＪＩＳ　Ｋ１０２−１９９３、２８．２）に記載されたように、吸光光度法によることが一般的である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従来の吸光光度法による定量範囲は、ベンゼン、トルエンまたはエチルベンゼンにおいては、試料ガス採取量１０リットルの場合、試料ガス中の濃度が約２〜２０ｖ／ｖ　ｐｐｍであり、ガスクロマトグラフ法の定量範囲は、捕集びんによる場合は１〜１０００ｖ／ｖ　ｐｐｍ、常温吸着法による場合は０．１〜１０００ｖ／ｖ　ｐｐｍである。また、クレゾールの場合、ｐ−クレゾールを例にとると、ｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸吸光光度法による定量範囲は１０〜１５０μｇである。
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、異性体等の種類によらず感度が１ｖ／ｖ　ｐｐｂと極めて高く、検体の前処理も必要としない特徴を有し、多数の検体を測定対象とする自動分析装置へ容易に適用しうる測定法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ベンゼン、あるいはその１〜２置換体であるトルエン、エチルベンゼン、クレゾール各異性体などの単環式芳香族化合物を高感度に定量する方法について鋭意研究を重ねた結果、これらの単環式芳香族化合物を含有する試料と、該単環式芳香族化合物の分解酵素系と、
該分解酵素系による該単環式芳香族化合物の分解反応と共役する反応を起こす化合物（Ｘ）
とを反応させて、下記式
該単環式芳香族化合物＋（Ｘ）→該単環式芳香族化合物の分解産物＋（Ｙ）
（（Ｙ）は（Ｘ）により特定される化合物）
であらわされる反応を形成せしめる工程と、
該反応によって生成する化合物（Ｙ）の増加の程度、又は該反応によって消費される化合物（Ｘ）の減少の程度を測定する工程と、
その測定結果に基づいて試料中の該単環式芳香族化合物の量を定量する工程と、
を有することを特徴とする該単環式芳香族化合物の高感度定量法を見出した。
【００１３】
前記化合物（Ｘ）は代表的には還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）であり、それに対応する前記化合物（Ｙ）はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）である。
【００１４】
また、前記化合物（Ｘ）の減少の程度、又は前記化合物（Ｙ）の増加の程度を測定する工程が、酵素的サイクリング反応による増幅を伴うことが好ましい。
【００１５】
さらに、前記分解酵素系は、バークホルデリア・セパシア　ＫＫ０１株（ＦＥＲＭＢＰ−４２３５）、Ｊ１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５１０２）、ＪＭ１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５３５２）由来の可溶性画分、またはそれらを３０％飽和硫酸アンモニウム塩析操作によって分離することで得られる酵素系であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、単環式芳香族化合物の分解酵素系、および該分解酵素系による単環式芳香族化合物の分解反応と共役する反応を起こす化合物（Ｘ）を含んでなることを特徴とする、単環式芳香族化合物の高感度定量用試薬キットであり、前記化合物（Ｘ）が還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）であること、さらに前記分解酵素系が、前記のいずれかの方法で分離されたものであること、が好ましい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられる単環式芳香族化合物の分解酵素系は従来の単環式芳香族化合物の分解活性を有する細菌のうち、該単環式芳香族化合物の酵素的分解と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の酸化とが共役したものであればどのようなもので良く、特に限定されない。
【００１８】
従来から知られているベンゼン分解活性を有する細菌としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ．（特開平０５−３７８５号公報）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（８），４００９−４０１６（１９９６））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，５１７４−５１７９（１９８７））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＭＬ２（Ｇｅｎｅ１３０（１），３３−３９（１９９３））、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ　ＫＫ０１（特開平０６−２２７７６９号公報）、Ｊ１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５１０２）、ＪＭ１株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５３５２）等；
従来から知られているトルエン分解活性を有する細菌としては、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ　Ｇ４（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９９５　Ｏｃｔ　３１；３４（４３）：１４０６６−７６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｆ１　（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　１９８５　Ｆｅｂ　２５；２６０（４）：２３５５−６３）、前記ＫＫ０１株、前記Ｊ１株、前記ＪＭ１株等；
従来から知られているエチルベンゼン分解活性を有する細菌としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　３９／Ｄ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＮＣＩＢ　１０６４３、前記ＫＫ０１株、前記Ｊ１株、前記ＪＭ１株等；
従来から知られているクレゾール分解活性を有する細菌としては、前記Ｇ４株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ＮＣＩＢ　９８６７、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＮＣＩＢ　９８６９、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ　ＰＫＯ１（Ｊ　Ｉｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１９９７Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１９（５−６）：３６０−８）、前記ＫＫ０１株、前記Ｊ１株、前記ＪＭ１株等がそれぞれ挙げられる。
【００１９】
このうちＫＫ０１株、ＪＭ１株あるいはＪ１株由来の酵素は化合物の種類や異性体の別によらず反応速度が速く、迅速な単環式芳香族化合物の測定のためには好適である。
【００２０】
上記単環式芳香族化合物分解菌の多くは分解酵素誘導のためにインデューサーが必要であり、使用する酵素系を取得しようとする際には、このようなインデューサーを添加して培養された細菌を用いる必要がある。この点、ＪＭ１株はインデューサーが不要で、酵素系の簡便な取得のためには好適である。
【００２１】
尚、ＪＭ１株は芳香族化合物や塩素化エチレン化合物を、誘導物質を用いることで分解できる特定の微生物であるＪ１株（ブタペスト条約に基づく国際寄託の番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−５１０２）を、変異源を用いた変異操作によって変異させて取得した、誘導物質を用いることなく有機化合物を分解することができる変異株であるＪＭ１株（特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき上記の国際寄託当局にＦＥＲＭ　ＢＰ−５３５２／識別のための表示：コリネバクテリウム・スピーシズＪＭ１株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．ＪＭ１））として寄託したものである。なお、本菌株は当初、コリネバクテリウム属に属しているものとして「コリネバクテリウム・スピーシズＪＭ１株」と表示したが、後の検討により本菌株が“コリネバクテリウム属に属さない”と認められたため、識別の表示を「ＪＭ１株」と変更した。
【００２２】
Ｊ１株およびＪＭ１株の単環式芳香族化合物の分解酵素系の可溶性画分は細菌の培養液を遠心分離し細菌をペレットとして採集し、これを適当な緩衝液に再懸濁し、懸濁液を超音波処理あるいはフレンチプレス処理することによって菌体を破砕し、破砕液を遠心分離して未破砕の菌体を除去することによって無細胞抽出液を調製し、さらに得られた無細胞抽出液を超遠心分離することによって可溶性画分を調製することができる。得られた可溶性画分はさらに細菌懸濁液に対して透析することが必要である。
【００２３】
酵素系調製のための細菌懸濁液の組成はｐＨが５．０〜９．０に緩衝させたものが望ましく、菌体破砕操作中の分解活性維持のために硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４）あるいはモール塩（Ｆｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ）のような＋２価の鉄イオンを１０〜５００μｍｏｌ／Ｌの濃度で、さらにグリセリンを２０％（ｖ／ｖ）の濃度で添加しておくことが望ましい。
【００２４】
可溶性画分の透析操作は持ち込みのＮＡＤおよびＮＡＤＨ、さらにＮＡＤＨ酸化基質およびＮＡＤ還元基質を除去するために必要で、前記細菌懸濁液の組成に類似した溶液を透析外液として用いることが望ましい。
【００２５】
このようにして得られた可溶性画分に硫酸アンモニウムを３０％飽和に成るように添加し、析出してくる成分を遠心分離操作によって除去することによって、さらに比活性の高い単環式芳香族化合物の分解酵素系を得ることができる。こうして得られる３０％飽和硫酸アンモニウム塩析操作によって分離される酵素系は前記細菌懸濁液の組成に類似した溶液に対して透析操作を施す等して硫酸アンモニウムを除去した後に単環式芳香族化合物の定量用試薬として供されることが望ましい。
【００２６】
本発明において使用される単環式芳香族化合物の分解酵素系の反応液中の濃度は、特に限定されないが、通常０．０１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０５〜５０Ｕ／ｍｌの範囲から適宜選択される。
【００２７】
本発明に供される単環式芳香族化合物を含有する試料は、捕集した排ガス、水溶液または水抽出液等いずれも適用できるが、同時に既知量の単環式芳香族化合物を同じ媒質に溶解させ、または含有させた一連のスタンダードを用意することが望ましい。また多量の単環式芳香族化合物を含有するものは適宜希釈され供される必要がある。単環式芳香族化合物を含む排ガス試料は分解酵素系と共に密封したバイアル内で気液分配平衡により反応させることが望ましい。
【００２８】
本発明で使用される還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の反応液中の濃度は０．０１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲から適宜選択される。
【００２９】
本発明の定量法において用いられる試薬中には、前記単環式芳香族化合物の分解酵素系、ＮＡＤＨ、以外に通常この分野で用いられる試薬類、例えば、緩衝剤、反応促進剤、酵素活性賦活剤、防腐剤等が含まれていても良いことは言うまでもない。
【００３０】
例えば、反応ｐＨを一定に保つための緩衝剤としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸、リン酸塩、グッド緩衝剤等一般にこの分野で汎用されているものが使用できる。本発明の定量法を実施する際のｐＨ範囲は５〜１１、好ましくは７〜９であり、また、反応温度については特に制限はないが、一般に酵素反応を行なうのに適した温度、例えば１５〜４０℃が好ましい。
【００３１】
本発明の定量法における単環式芳香族化合物の酵素的分解反応の結果生成する単環式芳香族化合物分解産物は、使用する酵素系に応じて変化する。このため単環式芳香族化合物分解量とＮＡＤＨの酸化量との化学量論比も使用する酵素系に応じて変化する。従って既知量の単環式芳香族化合物を含有する一連のスタンダードを用意し、使用する分解酵素系による単環式芳香族化合物分解量とＮＡＤＨ酸化量との化学量論比を予め決定しておくことが望ましい。
【００３２】
本発明の定量法による単環式芳香族化合物の定量は具体的には例えば以下のように行なえば良い。
【００３３】
単環式芳香族化合物を含有する検体と、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、および緩衝剤を含む単環式芳香族化合物の分解酵素系とを混合し、上記した如き反応条件で反応を行ない、反応液中に生成するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の量を単位時間当たりの吸光度（３４０ｎｍ付近）の減少量として測定し、得られた測定値を、予め単環式芳香族化合物濃度既知の検体により得られた単環式芳香族化合物濃度と単位時間当たりの吸光度変化量との関係を示す検量線にあてはめることにより、目的の検体中の単環式芳香族化合物の濃度を求めることができる。
【００３４】
尚、本発明の方法による単環式芳香族化合物の測定法としては、上記した如き反応を行ない、反応開始一定時間後に反応停止剤（例えばタンパク質変性剤等）の添加により反応を停止し、その後に、反応液中に生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の量あるいは反応により消費された還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の量に由来する吸光度変化（３４０ｎｍ付近）や蛍光変化を測定し、その測定値を利用する所謂レイトアンドエンド法等によっても測定可能である。
【００３５】
また、ＮＡＤまたはＮＡＤＨを高感度に検出する測定法として、酵素的サイクリングによるシグナル増幅系が知られており（Ｃ．Ｂｅｒｎｏｆｓｋｙ他、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５２巻、第４５２〜４５８頁、１９７３年：Ｃ．Ｈ．Ｓｅｌｆ他、ＣｌｉｎｉｃａｌＡｃｔａ、第１４８巻、第１１９〜１２４頁、１９８５年）、これを利用することによって、高感度の単環式芳香族化合物定量を実現できる。
【００３６】
このＮＡＤまたはＮＡＤＨの高感度測定法は、ＮＡＤまたはＮＡＤＨの酸化環元反応に伴って発色するシグナルを、その反応の繰り返し（酵素的サイクリング）によって増幅させるものである。すなわち、反応式
エタノール＋ＮＡＤ→アセトアルデヒド＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋
テトラゾリウム＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋→ホルマザン（発色）＋ＮＡＤ
に示したように、ＮＡＤは、アルコールデヒドロゲナーゼとその基質であるエタノール存在下で、アルコールデヒドロゲナーゼによるエタノールからアセトアルデヒドへの酸化反応に補酵素として作用し、その際にＮＡＤＨへと還元する。
【００３７】
さらにこのＮＡＤＨは、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレットやニトロブルーテトラゾリウム、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等のテトラゾリウム系色素とその環元酵素ジアホラーゼ存在下で再びＮＡＤへと酸化するが、同時にテトラゾリウム系色素が環元されてホルマザンが生じ、発色シグナルが得られる。
【００３８】
ＮＡＤは、このような条件下で酸化還元を繰り返すため、シグナル強度は徐々に大きくなる。ＮＡＤＨが検体中に存在する場合も同じ原理で発色し、その強度を増幅させる。
【００３９】
本発明の単環式芳香族化合物の定量方法に適用できる酵素的サイクリングによるシグナル増幅系としては、この＜アルコールデヒドロゲナーゼ／ジアホラーゼ／エタノール／テトラゾリウム系＞以外にも、＜アルコールデヒドロゲナーゼ／リンゴ酸脱水素酵素／エタノール／オキサロ酢酸系＞や、＜Ｌ−アミノ酸脱水素酵素／Ｌ−アミノ酸酸化酵素／Ｌ−アミノ酸／２−ケト酸系＞、＜Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素／Ｌ−グルタミン酸酸化酵素／２−ケトグルタル酸／Ｌ−グルタミン酸＞、＜Ｌ−乳酸脱水素酵素／Ｌ−乳酸酸化酵素／Ｌ−乳酸／ピルビン酸＞等、が例示できる。
【００４０】
酵素サイクリング法は感度が極めて高く（〜１０−１４ｍｏｌ）、検体前処理も必要としない特長を有し多数の検体を測定対象とする自動分析装置へ容易に適用しうる。
【００４１】
本発明の試薬キットは、上記単環式芳香族化合物の高感度定量法を実施するために使用されるもので、単環式芳香族化合物の分解酵素系、および該分解酵素系による単環式芳香族化合物の分解反応と共役する反応を起こす化合物、代表的には還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を含んでなるものであり、夫々の構成要素の好ましい態様、具体例等については上で述べた通りである。
【００４２】
【実施例】
以下に実施例を挙げる。
【００４３】
［実施例１］
＜試薬＞
Ｒ１：バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｃｅｐａｃｉａ）ＫＫ０１株（独立行政法人産業技術総合研究所（旧経済産業省工業技術院）生命工学工業技術研究所、受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−４２３５、受託日：平成４年３月１１日）の菌体１０ｇを１００μｍｏｌ／Ｌの硫酸第一鉄および２０％（ｖ／ｖ）グリセリンを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＯＰ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し４０ｍＬとし、フレンチプレス処理することにより菌体を破砕し、破砕液を遠心分離することにより未破砕の菌体を除去し、得られた無細胞抽出液をさらに超遠心分離することによって可溶性画分を調製し、これを２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＯＰ緩衝液ｐＨ７．５に対して透析した。
【００４４】
Ｒ２：β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド二ナトリウム還元型（和光純薬工業（株）製）を２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＯＰ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、１００ｍｍｏｌ／Ｌとした。
【００４５】
＜操作方法＞
ベンゼン標準液（関東化学社製）を蒸留水で希釈して１〜５０μｇ／Ｌの一連の濃度のベンゼンを含有する試料を調製した。
【００４６】
夫々のベンゼンを含有する試料５μＬにＲ１を９８５μＬ、Ｒ２を１０μＬ添加し、３０℃で５０分間加温した後、１ｍｏｌ／Ｌ（１Ｎ）塩酸１００μＬ加えて、酵素反応を停止し、未反応のＮＡＤＨを破壊した。
【００４７】
続いて生成したＮＡＤ量を測定するために、＜アルコールデヒドロゲナーゼ／ジアホラーゼ／エタノール／テトラゾリウム系＞からなるＮＡＤサイクリング反応を行ない、生成ＮＡＤを増幅検出した。
【００４８】
増幅反応液の組成は、１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍｍｏｌ／Ｌエタノール、１ｍｍｏｌ／Ｌテトラゾリウム系色素（ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット）、１５．８ｕｎｉｔｓ／ｍＬアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）、３．６ｕｎｉｔｓ／ｍＬジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）とした。４９０ｎｍにおける吸光度変化を経時的に測定し、ホルマザンの生成をモニターした。
【００４９】
ホルマザン発色量とベンゼン濃度の間には、図１に示すように比例関係が成立し、この比例係数を用いてホルマザン発色量からベンゼンを定量することができた。また増幅反応時間を適宜変更することによって、広い濃度範囲のベンゼンを検出・定量できることが分かった。
【００５０】
［実施例２］
＜試薬＞
実施例１で調製したのと同じＲ１、Ｒ２を用意した。
【００５１】
＜操作方法＞
実施例１のベンゼン標準液の代わりにトルエン標準液（関東化学社製）を用いた他は、実施例１と全く同様の操作を行なった。
【００５２】
ホルマザン発色量とベンゼン濃度の間には、図２に示すように比例関係が成立し、この比例係数を用いてホルマザン発色量からベンゼンを定量することができた。また増幅反応時間を適宜変更することによって、広い濃度範囲のベンゼンを検出・定量できることが分かった。
【００５３】
［実施例３］
＜試薬＞
実施例１で調製したのと同じＲ１、Ｒ２を用意した。
【００５４】
＜操作方法＞
実施例１のベンゼン標準液の代わりにエチルベンゼン標準液（関東化学社製）を用いた他は、実施例１と全く同様の操作を行なった。
【００５５】
ホルマザン発色量とエチルベンゼン濃度の間には、図３に示すように比例関係が成立し、この比例係数を用いてホルマザン発色量からエチルベンゼンを定量することができた。また増幅反応時間を適宜変更することによって、広い濃度範囲のエチルベンゼンを検出・定量できることが分かった。
【００５６】
［実施例４］
＜試薬＞
実施例１で調製したのと同じＲ１、Ｒ２を用意した。
【００５７】
＜操作方法＞
実施例１のベンゼン標準液の代わりにｏ−クレゾール標準液　（関東化学社製ｏ−クレゾールを使用直前に蒸留水で希釈して１〜５０μｇ／Ｌの一連の濃度としたもの）を用いた他は、実施例１と全く同様の操作を行なった。
【００５８】
ホルマザン発色量とｏ−クレゾール濃度の間には、図４に示すように比例関係が成立し、この比例係数を用いてホルマザン発色量からｏ−クレゾールを定量することができた。また増幅反応時間を適宜変更することによって、広い濃度範囲のｏ−クレゾールを検出・定量できることが分かった。
【００５９】
［実施例５］
＜試薬＞
Ｒ１：ＪＭ１株（独立行政法人産業技術総合研究所（旧経済産業省工業技術院）生命工学工業技術研究所、受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−５３５２、受託日：平成７年１月１０日）の菌体１０ｇを１００μｍｏｌ／Ｌ　の硫酸第一鉄および２０％（ｖ／ｖ）グリセリンを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＯＰ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し４０ｍＬとし、フレンチプレス処理することにより菌体を破砕し、破砕液を遠心分離することにより未破砕の菌体を除去し、得られた無細胞抽出液をさらに超遠心分離することによって可溶性画分を調製し、これを２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＯＰ緩衝液ｐＨ７．５に対して透析した。
【００６０】
次に可溶性画分に硫酸アンモニウムを３０％飽和になるように添加し、析出成分を遠心分離して除いた。さらに得られた上清を細菌懸濁液に対して透析して硫酸アンモニウムを除去した。
【００６１】
Ｒ２：β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド二ナトリウム還元型（和光純薬工業（株）製）を２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＯＰ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、１００ｍｍｏｌ／Ｌ　とした。
【００６２】
＜操作方法＞
ベンゼン標準液（関東化学社製）を蒸留水で希釈して１〜５０μｇ／Ｌの一連の濃度のベンゼンを含有する試料を調製した。
【００６３】
夫々のベンゼンを含有する試料５μＬにＲ１を９８５μＬ、Ｒ２を１０μＬ添加し、３０℃で４０分間加温した後、１ｍｏｌ／Ｌ（１Ｎ）塩酸１００μＬ加えて、酵素反応を停止し、未反応のＮＡＤＨを破壊した。
【００６４】
続いて生成したＮＡＤ量を測定するために、＜アルコールデヒドロゲナーゼ／ジアホラーゼ／エタノール／テトラゾリウム系＞からなるＮＡＤサイクリング反応を行ない、生成ＮＡＤを増幅検出した。
【００６５】
増幅反応液の組成は、１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍｍｏｌ／Ｌエタノール、１ｍｍｏｌ／Ｌテトラゾリウム系色素（ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット）、１５．８ｕｎｉｔｓ／ｍＬアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）、３．６ｕｎｉｔｓ／ｍＬジアホラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）とした。４９０ｎｍにおける吸光度変化を経時的に測定し、ホルマザンの生成をモニターした。
【００６６】
ホルマザン発色量とベンゼン濃度の間には、図５に示すように比例関係が成立し、この比例係数を用いてホルマザン発色量からベンゼンを定量することができた。また増幅反応時間を適宜変更することによって、広い濃度範囲のベンゼンを検出・定量できることが分かった。
【００６７】
［実施例６］
＜試薬＞
実施例５で調製したのと同じＲ１、Ｒ２を用意した。
【００６８】
＜操作方法＞
実施例５のベンゼン標準液の代わりにトルエン標準液（関東化学社製）を用いた他は、実施例５と全く同様の操作を行なった。
【００６９】
ホルマザン発色量とトルエン濃度の間には、図６に示すように比例関係が成立し、この比例係数を用いてホルマザン発色量からトルエンを定量することができた。また増幅反応時間を適宜変更することによって、広い濃度範囲のトルエンを検出・定量できることが分かった。
【００７０】
［実施例７］
＜試薬＞
実施例５で調製したのと同じＲ１、Ｒ２を用意した。
【００７１】
＜操作方法＞
実施例５のベンゼン標準液の代わりにエチルベンゼン標準液（関東化学社製）を用いた他は、実施例５と全く同様の操作を行なった。
【００７２】
ホルマザン発色量とエチルベンゼン濃度の間には、図７に示すように比例関係が成立し、この比例係数を用いてホルマザン発色量からエチルベンゼンを定量することができた。また増幅反応時間を適宜変更することによって、広い濃度範囲のエチルベンゼンを検出・定量できることが分かった。
【００７３】
［実施例８］
＜試薬＞
実施例５で調製したのと同じＲ１、Ｒ２を用意した。
【００７４】
＜操作方法＞
実施例５のベンゼン標準液の代わりにｐ−クレゾール標準液　（関東化学社製ｐ−クレゾールを使用直前に蒸留水で希釈して１〜５０μｇ／Ｌの一連の濃度としたもの）を用いた他は、実施例５と全く同様の操作を行なった。
【００７５】
ホルマザン発色量とｐ−クレゾール濃度の間には、図８に示すように比例関係が成立し、この比例係数を用いてホルマザン発色量からｐ−クレゾールを定量することができた。また増幅反応時間を適宜変更することによって、広い濃度範囲のｐ−クレゾールを検出・定量できることが分かった。
【００７６】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明は単環式芳香族化合物の分解酵素系を用い、さらに酵素サイクリング反応を利用することによる微量の単環式芳香族化合物の定量法を提供するものであり、本発明を利用することにより、従来法に比較して微量の単環式芳香族化合物を精度良く高感度に定量でき、且つ自動分析装置への適用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるベンゼン濃度とホルマザン発色量の関係を示すグラフ。
【図２】実施例２におけるトルエン濃度とホルマザン発色量の関係を示すグラフ。
【図３】実施例３におけるエチルベンゼン濃度とホルマザン発色量の関係を示すグラフ。
【図４】実施例４におけるｏ−クレゾール濃度とホルマザン発色量の関係を示すグラフ。
【図５】実施例５におけるベンゼン濃度とホルマザン発色量の関係を示すグラフ。
【図６】実施例６におけるトルエン濃度とホルマザン発色量の関係を示すグラフ。
【図７】実施例７におけるエチルベンゼン濃度とホルマザン発色量の関係を示すグラフ。
【図８】実施例８におけるｐ−クレゾール濃度とホルマザン発色量の関係を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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