(57)【要約】【課題】エンドセリン分泌抑制剤の提供。【解決手段】ウルソデオキシコール酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するエンドセリン分泌抑制剤、並びにウルソデオキシコール酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するエンドセリン過剰分泌に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウルソデオキシコール酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するエンドセリン分泌抑制剤。
【請求項２】
エンドセリンがエンドセリン−１である請求項１記載のエンドセリン分泌抑制剤。
【請求項３】
ウルソデオキシコール酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するエンドセリン過剰分泌に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。
【請求項４】
エンドセリン過剰分泌に起因する疾患が、高血圧症、動脈硬化症、バージャー病、高安病、急性腎不全、肝腎症候群及び門脈圧亢進症の群から選ばれる請求項３記載の予防及び／又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウルソデオキシコール酸又はその薬理学的に許容される塩（以下、「ＵＤＣ」と称することがある。）を有効成分として含有するエンドセリン分泌抑制剤、及びウルソデオキシコール酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するエンドセリン過剰分泌に起因する疾患の予防及び／又は治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンドセリン（以下、「ＥＴ」という。）は、血管内皮細胞の培養上清から単離され、その後、腎臓、心臓、肺、腸管、子宮、胎盤、中枢神経などに広く分布することが明らかとなった２１個のアミノ酸残基からなるポリペプチドであり、イソペプチドとして３種類（ＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３）が知られている。ＥＴは、血管平滑筋の受容体と結合して強い血管収縮作用、気管支収縮作用を示すことから、過剰産生・分泌によって強い昇圧を呈する。
このような作用を有することから、ＥＴは、高血圧症、腎不全などの疾患との関係が疑われていて、実際、高血圧症、動脈硬化症、バージャー病（Ｂｅｒｇｅｒ病）、高安病、急性腎不全に罹患した患者において、血中のＥＴ量が健常人に比べ有意に高いことが報告されている（丸茂ら，別冊・医学の歩み「腎疾患」５１〜５４頁，１９９２年７月１７日　医歯薬出版株式会社発行）。
また、急性腎不全のうち、重篤な肝疾患の患者に、他の原因がなく起こる急性腎不全は特に肝腎症候群と呼ばれている。
したがって、これらの疾患の予防・治療において、ＥＴの分泌を抑制する薬剤を投与することは有効であり、優れたＥＴ分泌抑制剤が求められていた。
また、門脈圧亢進症という病態は門脈の血液が肝臓に血液が入りにくくなり、門脈の血圧が高くなっているので、ＥＴ分泌抑制剤は門脈の血圧を低下させると期待され、門脈圧亢進症の予防及び／又は治療剤として有用であると考えられる。
これまでにも、ＥＴ分泌抑制ないし拮抗物質として多くのものが報告されてきたが（欧州特許公開第５１０５２６号公報など）、未だに実用には至っていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、新規なＥＴ分泌抑制剤、及びＥＴ過剰分泌に起因する疾患の予防及び／又は治療剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究の結果、ＵＤＣが、優れたＥＴ分泌抑制作用を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は次のとおりのものである。
【０００５】
（１）ウルソデオキシコール酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するエンドセリン分泌抑制剤。
（２）エンドセリンがエンドセリン−１である（１）記載のエンドセリン分泌抑制剤。
（３）ウルソデオキシコール酸又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するエンドセリン過剰分泌に起因する疾患の予防及び／又は治療剤。
（４）エンドセリン過剰分泌に起因する疾患が、高血圧症、動脈硬化症、バージャー病、高安病、急性腎不全、肝腎症候群及び門脈圧亢進症の群から選ばれる（３）記載の予防及び／又は治療剤。
【０００６】
ウルソデオキシコール酸は、胆汁酸の一種であり、市販品として入手可能である。また、その薬理学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどの有機塩基との塩などが挙げられる。これらの塩は公知の方法、例えば特開２００１−２６１６９６号公報などに記載の方法により得ることができる。
ＵＤＣは、従来から、細胞保護作用、抗炎症作用、免疫調節作用、利胆作用などを有する物質として知られ、胆石症、肝硬変などの治療薬として使用されている。
しかし、後述の実施例に示すようにＵＤＣが内皮細胞におけるＥＴの分泌を抑制することに関しては、本発明者の知る限り、これまで一切知られていない。
【０００７】
ＥＴは、前記のとおり、血管を収縮させる作用物質であり、過剰分泌によって血圧を上昇させることから、ＥＴが過剰に分泌される病態においてＵＤＣを投与することは、ＥＴの過剰分泌による障害を直接的に阻止するばかりでなく、過剰分泌の原因となる疾患の予防・治療に有効である。
ＥＴの過剰分泌に起因する疾患としては、高血圧症、動脈硬化症、バージャー病、高安病、急性腎不全、肝腎症候群及び門脈圧亢進症などが知られている。
高血圧症には、本態性高血圧のほか各種疾患に併発する二次的高血圧があり、動脈硬化症には、粥状硬化（アテローム性動脈硬化）、中膜硬化（メンケベルグ動脈硬化）及び小・細動脈硬化があるが、ＥＴの投与はそのいずれにも適応する。
バージャー病は閉塞性血栓血管炎、高安病は大動脈炎症候群（脈なし病）、肝腎症候群は胆汁性ネフローゼ、フリント症候群、ヘイド（Ｈｅｙｄ）症候群とも呼称される。
【０００８】
本発明の予防及び／又は治療剤は、散剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、貼付剤、坐剤などの固形製剤、あるいは、注射剤、吸入剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などとして製剤化する。
本発明の予防及び／又は治療剤は、製剤上の必要に応じて、適宜の薬理学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤などを配合して製剤化される。必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、香味料などの添加剤を配合することもできる。
【０００９】
薬理学的に許容される担体や添加剤の具体例としては、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成もしくは天然ガム、結晶セルロースなどの賦形剤、ゼラチン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール６０００などの崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムなどの滑沢剤等を挙げることができる。
【００１０】
投与量は、疾患の種類、投与方法、病態、患者の年令などによっても異なるが、通常、成人に対し１日当り、経口で３０〜３０００ｍｇ、好ましくは１５０〜１２００ｍｇ、静注で５〜４００ｍｇ、好ましくは５０〜２００ｍｇであり、これを１〜６回、好ましくは１〜３回に分割して投与する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に実施例を示して詳細に説明するが、本発明はこれらの記載によって限定されるものではない。
【００１２】
【実施例】
実施例１
ｉ）材料
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）はＢｉｏ　Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．より購入し、０．１％ｈＥＧＦ、０．１％ヒドロコルチゾン、０．１％ＧＡ−１０００、０．４％ＢＢＥ、２．０％ウシ胎仔血清を補充したＥＧＭ（登録商標）（内皮成長培地）中、５％ＣＯ２及び９５％空気からなる雰囲気の下、３７℃で、２５ｃｍ２フラスコ中で培養した。集密に際して、細胞を０．０２％ＥＤＴＡ中の０．２５％トリプシンを使用して分離した後、これらを１：３に分割した。培地を週に二度交換した。最初の培養を確立してから３週間以内でかつ３〜５継代時点で集密細胞を使用した。
ｉｉ）エンドセリン−１（ＥＴ−１）の濃度の測定
ＥＬＩＳＡキット（ＴＥＣＨＮＥ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して培養培地中のＥＴ−１濃度を測定することによって、ＨＵＶＥＣにより産生されたＥＴ−１量を定量した。
３５ｍｍの皿で培養した集密単層をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で二度洗浄し、次いで、種々の濃度のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣ）、及び結合型胆汁酸（タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）及びグリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣ））を補充したか、または補充していないＥＧＭ培地２ｍＬを添加した。２時間後、培養培地の１．５ｍＬのアリコートを収集し、２分間１２，０００×ｇで遠心分離して上清を得た。ここで用いたＵＤＣ、ＴＵＤＣ、ＧＵＤＣは市販のものを使用した。
１００μＬの希釈した結合体（西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗ＥＴ−１抗体；市販品）を、各ＥＴ−１抗体を予めコートしたウェルに添加し、次いで、１００μＬの上記上清又は標準溶液を十分に撹拌しながら各ウェルに添加し、次いで室温で３０分間インキュベートした。その後、各ウェル由来の内容物を吸引し、洗浄緩衝液（緩衝化界面活性剤）で洗浄した。１００μＬの基質（テトラメチルベンジジン）を各ウェルに添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。次いで、１００μＬの停止溶液（酸溶液）を各ウェルに添加した。各ウェルの光学密度を、４５０ｎｍに設定するとともに校正波長を６２０ｎｍに設定したｂｉｏｌｕｍｉｎ　９６０マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ　日本、東京）を使用して定量した。上記ＥＧＭ培地中で調製した０〜１５０ｐｇ／ｍＬのＥＴ−１を含有する標準溶液と比較することによって、ＥＴ−１濃度を算出した。
ｉｉｉ）タンパク質定量法
３５ｍｍの皿中でＨＵＶＥＣを集密に増殖させた後、この細胞をＨＥＰＥＳ緩衝食塩水中で三度洗浄し、次いで０．５Ｍ　ＮａＯＨに溶解した。この全細胞の細胞溶解物のタンパク質含量をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質定量法で測定した。
ｉｖ）統計解析
データを平均±ＳＤとして表した。統計解析をＦｉｓｈｅｒの多重範囲検定を用いて行い、Ｐ＜０．０５未満を統計学的に有意とした。
【００１３】
ｖ）結果
ＨＵＶＥＣにおけるＥＴ（ＥＴ−１）産生に対するウルソデオキシコール酸（ＵＤＣ）添加の影響
図１はＨＵＶＥＣにおけるＥＴ−１産生に対するＵＤＣ添加の影響を示す。図１Ａは、コントロール条件の下、種々の濃度のＵＤＣ（３０〜１０００μＭ）の存在下に、２時間の間に培養培地中にＨＵＶＥＣから放出されたＥＴ−１量（ｐｇ／ｍｌ）を示し、図ｌＢはこれをウェル中の全細胞のタンパク質含量により調整したものを示す。コントロール溶液と比較したところ、ＵＤＣは培養培地でのＥＴ−１産生を濃度依存的に減少させた。有意のＵＤＣ産生抑制効果が３０μＭを超える濃度で観察された。
図２は、ＨＵＶＥＣにおけるＥＴ−１産生に対するＵＤＣ、ＴＵＤＣ及びＧＵＤＣ添加の影響を比較したものである。ＵＤＣはＥＴ−１産生を有意に抑制したが、ＴＵＤＣ及びＧＵＤＣはわずかに抑制したにすぎなかった。
【００１４】
実施例２
インスリンによって刺激されたＥＴ−１産生におけるＵＤＣ添加の影響
ＥＴ−１は種々のアゴニスト（例えば、インスリン）の存在の下に、ＨＵＶＥＣ中で産生されることが知られている。そこで、本発明者らは、インスリン（１μＭ）で予め処理（２時間）したＨＵＶＥＣにおけるＥＴ−１産生に対するＵＤＣ（３０〜１０００μＭ）の添加効果を調べた。結果は図３に示すとおりであり、インスリンの添加は、コントロールにおけるＥＴ−１産生を増加させたが、培養培地中へのＵＤＣの添加によって、ＥＴ−１産生は有意に減少した。
【００１５】
【発明の効果】
ＥＴの過剰分泌と多くの疾患との関連が報告され、その分泌を抑制する薬剤、あるいは拮抗する薬剤に対する必要性が高まる中で、本発明のＥＴ分泌抑制剤は、その有効成分であるＵＤＣが治療薬としての使用実績があり、低毒性で副作用が少ないため、実用上極めて有用である。
また、本発明のＥＴ分泌抑制剤は、ＥＴの過剰分泌を伴う、あるいはＥＴの過剰分泌に起因する疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における基礎状態でのＥＴ−１産生に与えるＵＤＣの影響を示す図である。
【図２】図２は、ＥＴ−ｌ産生におけるＵＤＣ、ＴＵＤＣ及びＧＵＤＣの影響を示す図である。
【図３】図３は、インスリンにより刺激されたＥＴ−１産生におけるＵＤＣの影響を示す図である。
【図１】
2004035503.tif 000002
【図２】
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【図３】
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