(57)【要約】【課題】海洋石油汚染時における石油分解微生物群の菌相構造を評価する手法および海洋における石油汚染のモニタリング方法を提供する。【解決手段】2004024221.tif 000011領域を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片をｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＰＣＲで定量することを特徴とする、海洋性芳香族炭化水素分解菌サイクロクラスティカス属細菌の検出、定量化方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１及び２記載の配列を用いてＤＮＡジャイレースのβサブユニットをコードする遺伝子領域を増幅させることを特徴とするサイクロクラスティカス属細菌の検出・定量化方法
【請求項２】
請求項１記載の方法において、増幅されたＤＮＡジャイレースのβサブユニットをコードする遺伝子領域が、配列番号７記載の配列と７６％以上の相同性を示すことにより、サイクロクラスティカス属細菌を同定することを特徴とするサイクロクラスティカス属細菌の同定方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、検出する細菌の１６ＳｒＤＮＡが配列番号３〜６記載のいずれかの配列と９４％以上の相同性を有する場合の細菌の検出・定量化方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１６ＳｒＤＮＡあるいはＤＮＡジャイレースβサブユニットをＰＣＲ法で増幅させることにより、芳香族炭化水素資化能を有する海洋性石油分解細菌であるサイクロクラスティカス属細菌を特異的に検出、定量化する方法に関するものである。本発明により、海洋石油汚染時の石油分解微生物群の菌層構造評価を行うことができる。
【０００２】
【従来の技術】
海洋環境の石油汚染は近年特に増大している。特に船舶事故等による原油及び燃料油の流出は限定された地域に一度に多量の石油を流出せしめるため、海洋環境の大きな破壊をまねくとともに、養殖業等の水産業への甚大な経済的打撃を与えている。一方、流出した石油の海表面での移動速度はかなり早く、オイルフェンスの設置等を行う以前に汚染範囲は広がってしまう。原油中には生物に対する多くの有害物質が含まれており、特に多環芳香族炭化水素は一般に発ガン性を有することが知られており、食用海産生物体内への蓄積が食物連鎖を経て人間の体内に高濃度に蓄積されることより公衆衛生上非常に大きな問題となることも懸念される。流出した石油は蒸発及び揮散（ウェザリング）を受け、脂肪族炭化水素を中心とした軽質分、即ち易生分解成分は速やかに消失するが、ウェザリング後に残存するタール状成分は重質の脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素及び飽和環状炭化水素を中心とした難分解成分であり、長期に亙り漂着した海岸線に残存し、前述の公衆衛生上の問題と相まって問題は更に重大となっている。難生分解成分を構成する炭化水素の分解能を持ち天然から分離された微生物は非常に少なく、また分解能も低い。原油を基質として分離された土壌微生物においても、難分解性炭化水素分解能力は非常に低く、また内陸の土壌から分離された細菌であるため、塩化ナトリウム濃度の高い海洋環境中での生存及び分解能の発現には大きな疑問が持たれる。
【０００３】
一方、実際の海洋環境中での原油流出事故現場では、流出油等の炭化水素化合物の除去に際しては機械的な汲み上げ、高圧熱水と界面活性剤を併用しての浄化等、物理化学的な対策が講じられてきたが、いずれもコストがかかりすぎる等の問題点があり、有効な手段ではなかった。その結果、流出原油による海洋汚染処理の殆どは自然の自浄力に委ねているのが現状であった。近年、微生物を利用した環境修復、いわゆるバイオレメディエーションの流出油除去への適用が論じられるようになってきた。しかし、どのような微生物群落構造（コンソーシア）によって石油分解が行われているのかは、全くわかっておらず、石油によって汚染された海域でのバイオレメディエーション技術の確立のためには、石油分解に関わる細菌のポピュレーションサイズの変化を定量的に把握する必要がある。また、油流出事故が起きてしまった際、その周辺の海洋環境の石油汚染状況をモニタリングすること、あるいは、その後の浄化状況をモニタリングすることは極めて重要なことといえる。
【０００４】
従来、石油分解菌の菌数測定方法としては、油を含む寒天培地（プレート）を用い、そこに形成されるコロニー数を計測する方法が行われてきたが（Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｍ．，Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｋ．，Ａｓａｕｍｉ，Ｍ．，Ｇｏｔｏ，Ｍ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｅ．，Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，１９９５，Ｏｉｌ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｉｃｒｏｃｏｓｍｓ　ａｎｄ　ｍｅｓｏｃｏｓｍｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒ　ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ，ｐ１０１−１１０，ｅｄｕｔｅｄ　ｂｙ　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｅ．Ｈｉｎｃｈｅｅ，Ｆｒｅｄ　Ｊ．Ｂｒｏｃｋｍａｎ，Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ　Ｍ．Ｖｏｇｌｅ．）、この手法では、細菌群を系統学的に（属、種レベルで）分類し、計測することは不可能であった。また、寒天培地上でコロニーを形成できる細菌は、全生菌のわずか１％程度であるため、正確な菌層構造の把握は困難であり、コロニーの形成にも数日間を要するため、時間的にも不利な手法であった。
【０００５】
環境浄化微生物の属、種レベルでの、系統学的検出に関する最新の技術では、微生物を培養することなく、環境試料中より微生物遺伝子を抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ法」という）により、目的とする細菌の遺伝子を増幅、定量し、コンソーシアの解析を行おうという試みが、行われてきている（Ａｍａｎｎ，Ｒ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｗ．，Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｋ．，１９９５，Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｖｉｅｗｓ，ｖｏｌ．５９，Ｎｏ．１，ｐ１４３−１６９）。
【０００６】
発明者らは、サイクロクラスティカス属の石油分解菌が、石油汚染浄化に有効に作用することを発見しており、サイクロクラスティカス属の石油分解菌の特異的検出、定量化が可能になれば、石油分解微生物を用いた汚染環境浄化の有効な手段となると考えられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
石油分解菌サイクロクラスティカス属の細菌のｇｙｒＢ遺伝子配列に、特異的な配列を持つＰＣＲプライマーを開発し、環境試料から抽出したＤＮＡを鋳型として定量的競合ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ＰＣＲ）を行うことにより、検出対象菌の特異的検出、細胞数計測が可能になれば、微生物による石油汚染浄化技術を飛躍的に向上させることができる。また、本手法により、芳香族炭化水素のみを分解する特異的な石油分解菌の菌数を定量化することにより、海域の芳香族炭化水素汚染のモニタリングにも使用できる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、石油分解菌サイクロクラスティカス属に共通する、ＤＮＡジャイレースβサブユニット遺伝子（以下「ｇｙｒＢ遺伝子」という）配列領域を見いだし、プライマーを設計、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、石油分解菌サイクロクラスティカス属の細胞をＰＣＲ法で同定、定量する方法であって、石油分解菌サイクロクラスティカス属に共通する、ｇｙｒＢ遺伝子配列部位に対応するプライマーを作成し、環境サンプルより抽出したＤＮＡと混合しＰＣＲ増幅を行った後、アガロースゲル電気泳動で目的のバンドが増幅されているかどうかにより、石油分解菌の同定を行い、またＰＣＲ時に競合ＤＮＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）を混ぜＰＣＲ増幅を行った後、アガロースゲル電気泳動で目的のバンドの濃度とｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒのバンド濃度を比較することで、菌数計測を行うことを特徴とする石油分解菌サイクロクラスティカス属の検出方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明では、まず、石油分解菌サイクロクラスティカス属に属する菌株のｇｙｒＢ遺伝子配列より、これら菌株に共通な特異的塩基配列に対応する特異的ＰＣＲプライマーを作成する。次ぎに、ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒを宝酒造株式会社製のＤＮＡ　Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ作成用キット（Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．ＲＲ０１７）を用いて作成する。上記、ＰＣＲプライマー及び、ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒを培養した微生物や海水等の環境サンプルから抽出したＤＮＡと混合させた後、特異的なＰＣＲ増幅が起こる条件を設定する。このような設定をすることにより、検出対象の微生物の特定遺伝子のみを増幅することができる。増幅産物は、アガロースゲル電気泳動で目的のバンドとｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒのバンドに分離し、それぞれの濃度を比較することで、サイクロクラスティカス属の細菌を同定、定量することができる。
【００１２】
【実施例】
〔実施例１〕　サイクロクラスティカス属に属する微生物の系統解析
発明者らによって海水中より単離された、サイクロクラスティカスに近縁な２種の菌株（ｓｔｒａｉｎ　Ｅ２，Ｈ４）のｇｙｒＢ遺伝子配列を、遺伝子解析ソフトｃｌｕｓｔａｌ　ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ　Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．１９９４．ＣＬＵＳＴＡＬＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｔｈｒｏｕｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇａｐ　ｐｅｎａｌｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｗｉｇｈｔ　ｍａｔｒｉｘｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２２．４６７３−４６８０）を用いて、系統解析を行った。図１にＮＪ法を用いて解析した分子系統樹を示す。この結果、これらの菌株は、サイクロクラスティカス・プゲッティ（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ　ｐｕｇｅｔｔｉ）ＰＳ−１（Ｄｙｋｓｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｓ．Ｅ．，Ｊ．Ｐ．Ｇｒａｙ，Ｒ．Ｐ．Ｈｅｒｗｉｇ，Ｊ．Ｃ．Ｌａｒａ，ａｎｄ　Ｊ．Ｔ．Ｓｔａｌｅｙ．１９９５．Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ　ｐｕｇｅｔｉｉ　ｇｅｎ．ｅｔ　ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ　ａｒｏｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｏｍ　ｍａｒｉｎｅ　ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４５：１１６−１２３）を含む形でクラスターを形成することが分かった。この結果から、これらのクラスターを形成する菌株のｇｙｒＢ遺伝子配列の特異的部位を検索することにより、サイクロクラスティカス属に特異的なＰＣＲプライマーを設計できれば、競合ＰＣＲ法により、サイクロクラスティカス属の細菌を特異的に同定、定量化できると考えた。
【００１３】
〔実施例２〕　サイクロクラスティカス属に対応するＰＣＲプライマーの設計
サイクロクラスティカス・プゲッティ、Ｅ２株、Ｈ４株のアライメント後のｇｙｒＢ遺伝子配列を図２に示す。なお、図中には、特異的な配列を明確に示すため、サイクロクラスティカスには属さないが、サイクロクラスティカスと同様にプロテオバクテリア、ガンマサブクラスに属する細菌の（マリノスピリラム・ミヌツラムＡＴＣＣ１９１９３、マリノスピリラム・メガテリウムＪＣＭ１０１２９）配列もあわせて併記した。
【００１４】
上記配列より、２種類のＰＣＲプライマーｐＣＧ−ｆ（配列番号１）、ｐＣＧ−ｒ（配列番号２）を設計した。ＰＣＲプライマー配列を決定する際、現在、ｇｙｒＢ遺伝子配列が知られているすべての非検出対象細菌と、ＰＣＲプライマーの配列が相補的に一致しないこと、即ちその特異性を確認する必要がある。設計した、２種類のＰＣＲプライマーの特異性評価は、現在知られている他の細菌の遺伝子配列と比較することによって行った。即ち、これら２種のＰＣＲプライマーの使用により、サイクロクラスティカス属全体のポピュレーションサイズを評価できる。
【００１５】
〔実施例３〕ＰＣＲ条件
配列番号１及び配列番号２のＰＣＲプライマー使用して、油で汚染した海水から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、下記の通りである。その結果、３１８塩基のＤＮＡが増幅された。
【００１６】
９４℃　１０分　　　　　　　　　　　　　　　　　１サイクル
９４℃３０秒　６０℃　１分　７２℃　３０秒　　４０サイクル
７２℃　１０分　　　　　　　　　　　　　　　　　１サイクル
【００１７】
〔実施例４〕　ＰＣＲプライマーの石油分解微生物群の菌相構造解析への適応と、油汚染モニタリングへの応用
本発明により、開発されたＰＣＲプライマーによる、石油分解微生物群の菌相構造解析への適応性、また油汚染モニタリングの可能性を確認するために、海浜模擬装置を使用して実験的な油流出事故を起こし、７週間モニタリングを行った。なお、海水には石油分解菌の増殖促進のため栄養塩を添加した。石油添加前後の海水サンプルよりＤＮＡを抽出し、競合ＰＣＲにより、サイクロクラスティカス属の定量検出を行った。ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒは配列番号８及び配列番号９のＰＣＲプライマーを使用した場合に、２８６塩基のＤＮＡが増幅されるように設計した。競合ＰＣＲ用のｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒの作成には、宝酒造株式会社製のＤＮＡ　Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ作成用キット（Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．ＲＲ０１７）を用いた。比較例として、海水中の細菌数を、ＤＡＰＩを用いた蛍光色素法（ＴＤＣ）により計数した。結果を図３に示す。
【００１８】
石油添加前の海水では、サイクロクラスティカス属の細菌数は検出限界以下（１００　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下）であったが、石油添加直後１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで増加し、１４日目には５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで増加することが分かった。
【００１９】
【発明の効果】
本発明の石油分解菌サイクロクラスティカス属の検出、定量化法により、石油分解微生物群の菌相構造評価を行うことができる。効果的な微生物による石油分解（バイオレメディエーション）を行うためには、汚染部位に生息する分解微生物群の菌相構造を把握する必要があり、本発明は石油のバイオレメディエーションに極めて有益な知見をもたらすようになる。また、海域における油汚染調査への適応も可能になる。
【００２０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】サイクロクラスティカス属を含むガンマプロテオバクテリアの系統樹、ｇｙｒＢ　ＤＮＡ、ＮＪ法。
【図２】サイクロクラスティカス・プゲッティ、Ｅ２株、Ｈ４株、マリノスピリラム・メガテリウムのアライメント後のｇｙｒＢ　ＤＮＡ配列及び、開発したＰＣＲプライマーの塩基配列。
【図３】石油汚染海水中の全菌数とサイクロクラスティカス属細胞数
【図１】
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【図２】
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【図３】
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