(57)【要約】【課題】大豆タンパク質中のコレステロール低減化活性の高い領域のアミノ酸配列を明らかにすることにより、当該アミノ酸配列からなるペプチド、および当該ペプチドを有効成分として含むコレステロール低減化剤、コレステロール低減化活性を付与した飲食品、飼料、飲食品添加剤および飼料添加剤を提供する。【解決手段】大豆タンパク質Ａｌａサブユニット中のＩｌｅ１１４−Ａｒｇ１６１の領域を中心に種々の欠失変異体ペプチドを作成し、各々の胆汁酸との結合能および親和性を調べることにより、コレステロール低減化活性の高いアミノ酸配列Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒを明らかにした。本発明によれば、当該ペプチド、および当該ペプチドを有効成分として含むコレステロール低減化剤、コレステロール低減化活性を付与した飲食品、飼料、飲食品添加剤および飼料添加剤を提供することができる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
配列番号１で表わされるアミノ酸配列のＣ末端に配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から連続した１〜１１のアミノ酸が付加されたペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドのアミノ酸配列のＮ末端に１以上のアミノ酸が付加され、かつコレステロール低減化活性を有するペプチド。
【請求項４】
請求項１、２もしくは３に記載のペプチドまたはその薬理的に許容される塩を含有してなるコレステロール低減化剤。
【請求項５】
請求項１、２または３に記載のペプチドを含有してなる飲食品。
【請求項６】
請求項１、２または３に記載のペプチドを含有してなる飼料。
【請求項７】
請求項１、２または３に記載のペプチドを含有してなる飲食品添加剤。
【請求項８】
請求項１、２または３に記載のペプチドを含有してなる飼料添加剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ペプチドならびに該ペプチドを含有するコレステロール低減化剤、コレステロール低減化活性を有する飲食品、飼料、飲食品添加剤および飼料添加剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、成人病、中でも心臓血管系の疾患による死亡率が急増している。そして、その発症率と血中コレステロール濃度の相関が指摘されている。このような中、食品成分により血中コレステロール値を低減しようという試みがなされている。例えば、血中コレステロール値を低減するタンパク質として、大豆タンパク質（例えば、非特許文献１参照）、ホエータンパク質（例えば、非特許文献２参照）、乳清タンパク質（例えば、特許文献１参照）などが知られている。
【０００３】
特に大豆タンパク質は血中コレステロール低減効果が期待でき、更に安価に入手しやすいことから、食事療法の一環として、あるいは健康食品へ配合した形で近年広く使用されてきている。また、大豆タンパク質を酵素で加水分解して得られた分子量２００〜１，５００のオリゴペプチドの混合物に更に高い血中コレステロール低減作用があることが示されている（例えば、特許文献２参照）。
血中コレステロール低減効果を期待できる量を摂取するためには、飲食品中に多量に配合する必要がある。多量に配合すれば大豆特有の風味、あるいは加水分解により生じる苦味などが障害となることにより大豆タンパク質は十分には利用されていなかった。
【０００４】
また、これら大豆タンパク質において活性領域が明らかにされていないことは、高純度が要求される医薬品としての使用を妨げ、また共存する他のペプチドなどと区別することが要求される飲食品への使用を困難にしている。そこで、コレステロール低減化活性を有する公知のタンパク質あるいはペプチド混合物から活性領域を明らかにすることが課題となっている。
【０００５】
このような中、血中コレステロール低減作用と相関が高いとされている、胆汁酸との親和性を指標として大豆タンパク質中の活性画分について検討されている。胆汁酸との高い親和性を示すペプチドは、腸管内で胆汁酸の再吸収を阻害すること、あるいは胆汁酸混合ミセル中へのコレステロールの溶解性を低下させることによって、体内のコレステロールの低減効果を期待できることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。そして、大豆タンパク質のＡｌａサブユニット（以下単にＡｌａともいう）中において、胆汁酸との高い結合能を有するＩｌｅ１１４−Ａｒｇ１６１の領域が見出されている（例えば、非特許文献４参照）。
しかし、この領域も４８個のアミノ酸残基から構成される大きなペプチド断片であり、活性領域とは言えず、医薬や飲食品として応用するには依然として十分ではない。
【０００６】
【特許文献１】
特開平５−１７６７１３号公報
【特許文献２】
特開昭６０−１１４２５号公報
【非特許文献１】
Ｐｒｏｃ．　Ｎｕｔｒ．　Ｓｏｃ．，　４１，　１９，　（１９８２）
【非特許文献２】
Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５５，　８１３　（１９９１）
【非特許文献３】
Ｊ．　Ｎｕｔｒ．，　１２９，　１７２５　（１９９９）
【非特許文献４】
Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５４，　５１１（１９９０）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規ペプチドを有効成分として含有するコレステロール低減化剤、コレステロール低減化活性を有する飲食品、飼料、食品添加剤および飼料添加剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決する手段】
本発明は、（１）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、（２）配列番号１で表わされるアミノ酸配列のＣ末端に、配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から連続した１〜１１のアミノ酸が付加されたペプチド、および（１）または（２）に記載のペプチドのアミノ酸配列のＮ末端に１以上のアミノ酸が付加され、かつコレステロール低減化活性を有するペプチドからなる群より選ばれるペプチド（以下、本発明のペプチドともいう）、ならびに本発明のポリペプチドを含有するコレステロール低減化剤、飲食品、飼料、食品添加剤および飼料添加剤に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、上記のとおりであるが、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。
また、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１で表わされるアミノ酸配列のＣ末端に配列番号２で表わされるアミノ酸配列のＮ末端から連続した１〜１１のアミノ酸が付加されたペプチドには、コレステロール低減化活性を有する限り、該ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端に更に１以上、好ましくは１〜数十個、さらに好ましくは１〜数個のアミノ酸配列が付加されていてもよい。該ペプチドのアミノ酸配列のＮ末端に付加される１以上のアミノ酸としては、例えば配列番号４で表わされるアミノ酸配列のＣ末端（Ｇｌｙ）から始まり、かつＮ末端（Ｐｈｅ）に向けて連続した１以上のアミノ酸があげられる。なお、配列番号４は、大豆タンパク質のＡｌａサブユニットのＰｈｅ１−Ｇｌｙ１２８の領域のアミノ酸配列である。
【００１０】
本発明のペプチドは、自然界に存在するタンパク質、特に大豆タンパク質から適当な酵素で分解後、分離精製したり（Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５４，　５１１（１９９０））、化学的手法により合成して（ペプチド合成，　丸善（１９７５））得ることができる。また、分子生物学的手法により、遺伝子鋳型情報をもとに構築したプラスミドを組み込み適当な宿主中で発現させて得ること等もできる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））。
【００１１】
本発明のペプチドを含有するコレステロール低減化剤（以下、本発明のコレステロール低減化剤ともいう）、ならびに該ペプチドを含有するコレステロール低減化活性を有する飲食品、飼料、飲食品添加剤および飼料添加剤（以下、それぞれ本発明の飲食品、飼料、飲食品添加剤および飼料添加剤ともいう）について、以下に示す。
【００１２】
本発明のコレステロール低減化剤は、本発明のペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含有し、必要に応じて薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体を含有していてもよい。また本発明のコレステロール低減化剤には、コレステロール低減化に有効な任意の他の成分が添加されていてもよい。
【００１３】
コレステロール低減化に有効な他の成分（以下、単に他の有効成分ともいう）としては、例えば、プラバスタチンナトリウム、シンバスタチン、フルバスタチンナトリウム、アトルバスタチンカルシウム水和物、クロフィブラート、クロフィブラートアルミニウム、クリノフィブラート、シンフィブラート、ベザフィブラート、フェノフィブラート、ニコモール、ニセリトロール、コレスチラミン、コレスチミド、プロブコール、デキストラン硫酸ナトリウムイオウ、ポリエンホスファチジルコリン、エラスターゼ、イコサペント酸エチル、ロバスタチン、モナコリンＫ、酪酸リボフラビン、植物ステロール、植物ステロールエステル、キトサン、デキストリン、低分子アルギン酸ナトリウム、サポニン等があげられる。これら成分は精製物であっても該成分含有物または抽出物であってもよい。
【００１４】
本発明のコレステロール低減化剤は、本発明のペプチド、好ましくは配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、またはその薬理学的に許容される塩を、必要に応じて他の有効成分と薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法（製剤学（改訂第２版），　南江堂（１９９５））により製造できる。
【００１５】
本発明のコレステロール低減化剤の投与経路は、例えば経口投与または、例えば静脈内投与などの非経口投与をあげることができる。
投与形態としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、液剤、エリキシル剤等があげられる。
【００１６】
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、スクロース、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類などの希釈剤、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、パラオキシ安息香酸メチル等のパラオキシ安息香酸誘導体、安息香酸ナトリウム等の保存剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどの香料などを使用して製造できる。
【００１７】
経口投与に適当な、錠剤、散剤および顆粒剤などは、乳糖、白糖、ブドウ糖、スクロース、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末などの植物末などの賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油などの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液などの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
【００１８】
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。
【００１９】
これら非経口製剤においても、経口製剤で例示した希釈剤、防腐剤、保存剤、香料、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種またはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
本発明のコレステロール低減化剤は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質または重篤度により異なるが、経口の場合、成人一人当り本発明のペプチドを乾燥重量として、通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．０５〜２ｇを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人一人当り本発明のペプチド乾燥重量として、通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．１〜２ｇを一日一回ないし数回投与する。
【００２０】
本発明のコレステロール低減化剤を継続的に投与することにより、体内のコレステロール値を低減することができる。
なお、本発明のコレステロール低減化剤は、ヒトだけでなく、ヒト以外の動物に対しても使用することができる。動物に使用する場合は、本発明のペプチドの乾燥重量として、通常０．０１〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５ｇ〜２ｇ／ｋｇを一日一回ないし数回投与する。
【００２１】
本発明の飲食品または飼料としては、本発明のペプチドをそのまま飲食品もしくは飼料としたもの、または該ペプチドを飲食品もしくは飼料に添加したものがあげられる。該飲食品または飼料はコレステロール低減化活性を有し、健康の維持、向上の目的で使用される。
【００２２】
本発明の飲食品または飼料は、本発明のペプチドをそのまま、または必要に応じて他の有効成分を添加する以外は一般的な飲食品または飼料の製造方法を用いることにより、製造することができる。
また、該飲食品または飼料は一般の飲食品または飼料に用いられる成形・造粒等の加工方法で加工してもよい。加工方法としては、流動層造粒、攪拌造粒、押出造粒、転動造粒、気流造粒、圧縮成形造粒、解砕造粒、噴霧造粒、噴射造粒などの造粒方法、パンコーティング、流動層コーティング、ドライコーティングなどのコーティング方法、パフドライ、過剰水蒸気法、フォームマット方法、マイクロ波加熱方法などの膨化方法などがあげられる。
【００２３】
本発明の飲食品または飼料は本発明のペプチドを通常０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％含有するように添加される。
本発明の飲食品としては、例えば健康食品、健康飲料、ジュース類、清涼飲料水、スープ類、茶類、乳酸菌飲料、発酵乳、冷菓、バター、チーズ、ヨーグルト、加工乳、脱脂粉乳等の乳製品、ハム、ソーセージ、ハンバーグ等の食肉製品、魚肉錬り製品、だし巻き、卵豆腐等の卵製品、クッキー、ゼリー、スナック菓子、チューイングガム等の菓子類、パン類、麺類、漬け物類、薫製品、干物、佃煮、調味料等があげられる。
【００２４】
飲食品の形態としては、例えば粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等があげられる。
本発明の飲食品には、必要に応じて一般の飲食品に用いられる甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物などの添加物を添加してもよい。
【００２５】
甘味料としては、アスパルテーム、カンゾウ、ステビア、キシロース、ラカンカ、などがあげられる。
着色料としては、カロチノイド色素、ウコン色素、フラボノイド、カラメル色素、シコン色素、スピルリナ色素、葉緑素、ムラサキイモ色素、ムラサキヤマイモ色素、シソ色素、ブルーベリー色素などがあげられる。
【００２６】
保存料としては、亜硫酸ナトリウム、安息香酸類、ウド抽出物、エゴノキ抽出物、カワラヨモギ抽出物、ソルビン酸類、プロピオン酸類、などがあげられる。
増粘安定剤としては、アラビアガムやキサンタンガムなどのガム類、アルギン酸類、キチン、キトサン、キダチアロエ抽出物、グァーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、カゼインナトリウム、コーンスターチ、カルボキシメチルセルロース類、ゼラチン、寒天、デキストリン、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、微小繊維状セルロース、微結晶セルロース、海藻セルロース、ポリアクリル酸ソーダ、ポリリン酸ナトリウム、カラギーナン、酵母細胞壁、コンニャクイモ抽出物、ナタデココ、マンナンなどがあげられる。
【００２７】
酸化防止剤としては、ビタミンＣ、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸カルシウム、エリソルビン酸、オリザノール、カテキン、ケルセチン、クローブ抽出物、酵素処理ルチン、リンゴ抽出物、ゴマ油抽出物、ジブチルヒドロキシトルエン、ウイキョウ抽出物、セイヨウワサビ抽出物、セリ抽出物、チャ抽出物、テンペ抽出物、ドクダミ抽出物、トコトリエノール、トコフェロール類、ナタネ油抽出物、生コーヒー豆抽出物、ヒマワリ種子、フェルラ酸、ブチルヒドロキシアニソール、ブルーベリー葉抽出物、プロポリス抽出物、ヘゴ・イチョウ抽出物、ヘスペレチン、コショウ抽出物、ホウセンカ抽出物、没食子酸、ヤマモモ抽出物、ユーカリ抽出物、ローズマリー抽出物などがあげられる。
【００２８】
発色剤としては、亜硝酸ナトリウムなどがあげられる。
漂白剤としては、亜硫酸ナトリウムなどがあげられる。
防かび剤としては、オルトフェニルフェノールなどがあげられる。
ガムベースとしては、アセチルリシノール酸メチル、ウルシロウ、エステルガム、エレミ樹脂、オウリキュウリロウ、オゾケライト、オポパナックス樹脂、カウリガム、カルナウバロウ、グアヤク樹脂、グッタカチュウ、グッタハンカン、グッタペルカ、グリセリン脂肪酸エスエル、ゲイロウ、コパオババルサム、コーパル樹脂、ゴム、コメヌカロウ、サトウキビロウ、シェラック、ジェルトン、スクロース脂肪酸エステル、ソルバ、ソルビタン脂肪酸エステル、タルク、炭酸カルシウム、ダンマル樹脂、チクル、チルテ、ツヌー、低分子ゴム、パラフィンワックス、ファーバルサム、プロピレングリコール脂肪酸エステル、粉末パルプ、粉末モミガラ、ホホバロウ、ポリイソブチレン、ポリブテン、マイクロクリスタルワックス、マスチック、マッサランドバチョコレート、ミツロウ、りん酸カルシウム等があげられる。
【００２９】
苦味料としては、イソアルファー苦味酸、カフェイン、カワラタケ抽出物、キナ抽出物、キハダ抽出物、ゲンチアナ抽出物、香辛料抽出物、酵素処理ナリンジン、ジャマイカカッシア抽出物、デオブロミン、ナリンジン、ニガキ抽出物、ニガヨモギ抽出物、ヒキオコシ抽出物、ヒメマツタケ抽出物、ボラペット、メチルチオアデノシン、レイシ抽出物、オリーブ茶、ダイダイ抽出物、ホップ抽出物、ヨモギ抽出物等があげられる。
【００３０】
酵素または酵素源としては、アミラーゼ、トリプシン、レンネット、乳酸菌等があげられる。
光沢剤としては、ウルシロウ、モクロウ等があげられる。
酸味料としては、アジピン酸、イタコン酸、クエン酸類、コハク酸類、酢酸ナトリウム、酒石酸類、二酸化炭素、乳酸、フィチン酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸等があげられる。
【００３１】
調味料としては、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アラニン、イソロイシン、グリシン、セリン、シスチン、チロシン、ロイシン、プロリンなどのアミノ酸、イノシン酸ナトリウム、ウリジル酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウム、シチジル酸ナトリウム、リボヌクレオチドカルシウム、リボヌクレオチドナトリウムなどの核酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、塩化カリウム、塩水湖水低塩ナトリウム液、粗製海水塩化カリウム、ホエイソルト、りん酸三カリウム、りん酸水素ニカリウム、りん酸ニ水素カリウム、りん酸水素ニナトリウム、りん酸ニ水素ナトリウム、りん酸三ナトリウム、クロレラ抽出物等があげられる。
【００３２】
乳化剤としては、脂肪酸モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル等があげられる。
強化剤としては、亜鉛塩類、ビタミンＣ、各種アミノ酸、５−アデニル酸、塩化鉄、ヘスペリジン、各種焼成カルシウム、各種未焼成カルシウム、ジベンゾイルチアミン、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、チアミン塩酸塩、デュナリエラカロチン、トコフェロール、ニコチン酸、ニンジンカロチン、パーム油カロチン、パントテン酸カルシウム、ビタミンＡ、ヒドロキシプロリン、ピロリン酸ニ水素カルシウム、ピロリン酸第一鉄、ピロリン酸第二鉄、フェリチン、ヘム鉄、メナキノン、葉酸、リボフラビン等があげられる。
【００３３】
製造用剤としては、アセトン、イオン交換樹脂などの加工助剤、イチジク葉抽出物、イナワラ灰抽出物、カオリン、グリセリン脂肪酸エステル、クワ抽出物、骨灰、シソ抽出物、ショウガ抽出物、各種タンニン、ファフィア抽出物、ブドウ種子抽出物、エタノール等があげられる。
【００３４】
香料としては、前述の香料等があげられる。
香辛料抽出物としては、唐辛子抽出物、ニンニク抽出物等があげられる。
本発明の飲食品の摂取量は、成人に対し一日あたり本発明のペプチド乾燥重量として、通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．０５〜２ｇである。但し、この摂取量はあくまでも目安であり、摂取者の症状の程度や年齢、体重等に応じて適宜好適な範囲に調整することができる。
【００３５】
本発明の飲食品は、１日に１回ないし数回摂取する。該飲食品を継続的に摂取することにより、体内のコレステロールを低減化することができる。
本発明のペプチドを添加してなる飼料は、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類等の動物、好ましくは哺乳類に対する飼料として用いられる。例えば、本発明の飼料はイヌ、ネコ、ネズミ等のペット用飼料、ウシ、ブタ等の家畜用飼料、ニワトリ、七面鳥等の家禽用飼料、タイ、ハマチ等の養殖魚用飼料等として用いられ、好ましくは、ペット用飼料または家畜用飼料として用いられる。
【００３６】
本発明の飼料は、飼料原料に本発明のペプチドを適宜配合して製造することができる。飼料原料としては、穀物類、そうこう類、植物性油かす類、動物性飼料原料、その他飼料原料、精製品等があげられる。
穀物類としては、例えばマイロ、小麦、大麦、えん麦、らい麦、玄米、そば、あわ、きび、ひえ、とうもろこし、大豆等があげられる。
【００３７】
そうこう類としては、例えば米ぬか、脱脂米ぬか、ふすま、末粉、小麦胚芽、麦ぬか、トウモロコシぬか、トウモロコシ胚芽等があげられる。
植物性油かす類としては、例えば大豆油かす、きな粉、あまに油かす、綿実油かす、落花生油かす、サフラワー油かす、やし油かす、パーム油かす、ごま油かす、ひまわり油かす、なたね油かす、カポック油かす、からし油かす等があげられる。
【００３８】
動物性飼料原料としては、例えば魚粉（北洋ミール、輸入ミール、ホールミール、沿岸ミール等）、フィッシュソルブル、肉粉、肉骨粉、血粉、分解毛、骨粉、家畜用処理副産物、フェザーミール、蚕よう、脱脂粉乳、カゼイン、乾燥ホエー等があげられる。
【００３９】
その他飼料原料としては、植物茎葉類（アルファルファ、ヘイキューブ、アルファルファリーフミール、ニセアカシア粉末等）、トウモロコシ加工工業副産物（コーングルテン、ミール、コーングルテンフィード、コーンステープリカー等）、でんぷん加工品、砂糖、発酵工業産物（酵母、ビールかす、麦芽根、アルコールかす、しょう油かす等）、農産製造副産物（柑橘加工かす、豆腐かす、コーヒーかす、ココアかす等）、その他（キャッサバ、そら豆、グアミール、海藻、オキアミ、スピルリナ、クロレラ、鉱物等）等があげられる。
【００４０】
精製品としては、タンパク質（カゼイン、アルブミン等）、アミノ酸、糖質（スターチ、セルロース、スクロース、グルコース等）、ミネラル、ビタミン等があげられる。
本発明の飼料の動物への摂取量は、本発明ペプチド乾燥重量として、動物の体重１ｋｇ、１日あたり通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．０５〜２ｇである。但し、この摂取量はあくまでも目安であり、摂取動物の種類、年齢、体重等に応じて適宜好適な範囲に調整することができる。
【００４１】
本発明の飼料を動物に継続的に摂取させることにより、体内のコレステロールを低減することができる。
本発明の飲食品添加剤または飼料添加剤は、本発明のペプチド、好ましくは配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドを含有し、必要に応じて前述の飲食品に例示した甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物などの添加物を添加してもよい。また、経口製剤で例示した希釈剤、防腐剤、保存剤、香料、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種またはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
【００４２】
本発明の飲食品添加剤は、成人に対し一日あたり、本発明のペプチドを乾燥重量として、通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．０５〜２ｇ摂取する。但し、この摂取量はあくまでも目安であり、摂取者の症状の程度や年齢、体重等に応じて適宜好適な範囲に調整することができる。
【００４３】
本発明の飲食品添加剤は、通常０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％の割合で飲食品に添加する。
本発明の飲食品添加剤は、飲食品に添加して１日に１回ないし数回摂取する。本発明の飲食品添加剤を含有する飲食品を継続的に摂取することにより、体内のコレステロールを低減することができる。
【００４４】
本発明の飼料添加剤は、本発明のペプチドを乾燥重量として、動物の体重１ｋｇ、１日あたり通常０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．０５〜２ｇ摂取させる。但し、この摂取量はあくまでも目安であり、摂取動物の種類、年齢、体重等に応じて適宜好適な範囲に調整することができる。
【００４５】
本発明の飼料添加物を飼料に添加して動物に継続的に摂取させることにより、体内のコレステロールを低減することができる。
本発明の飼料添加剤の飼料への添加量は、通常０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％である。
以下に実施例を記載して本発明を更に具体的に説明する。
【実施例】
【００４６】
実施例１　高い胆汁酸結合能を有するペプチド領域の探索
配列番号３で表わされるアミノ酸配列を有する大豆タンパク質のＡｌａサブユニットのうち、胆汁酸結合能を有することが確認されている配列番号５で表わされるＩｌｅ１１４−Ａｒｇ１６１の領域（Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５４，　５１１　（１９９０））に着目し、以下に記す方法により当該領域中に含まれる活性画分を明らかにした。
【００４７】
Ｉｌｅ１１４−Ａｒｇ１６１の部分を中心として、大豆タンパク質のＡｌａサブユニットのＣ末端から順次にアミノ酸残基を欠失させた図１に示す各種欠失変異体ペプチド（デレーションミュータント）を設計した。各変異体は、それらの遺伝子鋳型情報をもとにＰＣＲ法（改訂ＰＣＲ　Ｔｉｐｓ可能性を広げるコツとヒント，　秀潤社（１９９９））により調製し、発現プラスミドに組み込んで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）中で発現させた。該大腸菌を超音波破砕した後に、沈殿画分を０．２ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭ（ｐ−アミジノフェニル）−メチルスルフォニルフルオライド、１μＭペプスタチンＡおよび２μＭロイペプチンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄し、６Ｍ尿素液に溶かして評価に供する試料とした。以下に記すような方法により得られるコール酸固定化カラムを用い、溶出速度を指標として胆汁酸との結合強度を測定した。
【００４８】
ＥＡＨセファロース４Ｂ（アマーシャム　ファルマシア社製）に、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを用いてコール酸（和光純薬工業社製）を結合させ、これをＨＲ１０／１０カラム（アマーシャム　ファルマシア社製）に充填することにより、コール酸固定化カラムを作成した。尿素液に溶解した各欠失変異体ペプチド（試料）を上記のように作製したコール酸固定化カラムに供した後、まず、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび０．０２％　ＮａＮ３を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でカラムを洗浄した。１Ｍ　ＮａＣｌを含む同緩衝液で再度洗浄した後、カラムに吸着した試料をコール酸ナトリウムを含む上記緩衝液においてコール酸ナトリウム濃度を０から７０ｍＭの濃度勾配をかけて溶出させ分画した。各画分中のタンパク質量を測定し、溶出速度を求めた。
結果を第１表に示す。
【００４９】
【表１】
2004099447.tif 000002
【００５０】
Ａｌａは分画番号２３の位置に溶出した。Δ［２５０−２９１］（配列番号３で表わされるアミノ酸配列のうち２５０〜２９１番目のアミノ酸残基を欠失させたデレーションミュータント）、Δ［１８２−２９１］およびΔ［１６２−２９１］は、Ａｌａとほぼ同じ位置に溶出したのに対し、Δ［１３８−２９１］はＡｌａより遅く溶出した。Δ［１３０−２９１］、Δ［１２２−２９１］およびΔ［１１４−２９１］はコール酸固定化カラムで、流出画分に溶出した。流出画分に溶出したものはコール酸との結合能を有さないものと考えられた。
【００５１】
以上の結果から、大豆タンパク質のＡｌａサブユニットのコール酸に対する結合には１３０〜１４５番目のアミノ酸残基が関係しており、特に１３０〜１３７番目のアミノ酸残基が重要であると考えられた。
更に、大豆タンパク質のＡｌａサブユニットのアミノ酸配列の中で１３０〜１３７番目の領域は疎水性残基に富んでいることから、配列番号３で表わされるアミノ酸配列のうち１２９〜１３４番目のアミノ酸残基、すなわち配列番号１で表わされるアミノ酸配列を欠失させたデレーションミュータントであるΔ［１２９−１３４］を調製し、解析に供した。
第１表に示すように、Δ［１２９−１３４］はＡｌａと比較して、コール酸固定化カラムにおいてかなり遅い分画番号の位置に溶出された。
【００５２】
実施例２　胆汁酸との高い親和性を有するペプチド領域の探索
実施例１と同様にして試料を作成し、以下の試験に供した。
本試験においては、各欠失変異体ペプチドのコール酸に対する親和性を以下に示す蛍光分析により求めたＫｄ値で比較した。
【００５３】
コール酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、２Ｍ尿素、５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび０．０２％　ＮａＮ３を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に各試料を溶解させ、コール酸濃度を変化させた場合の蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定は、分光蛍光強度計Ｆ−３０００（日立製作所社製）を用いて行った。励起波長；　２８０ｎｍ、蛍光波長；　３３０および３３７ｎｍで測定し、その比をもとに各試料のコール酸ナトリウムに対する解離定数（Ｋｄ値）を求めた。
結果を第２表に示す。
【００５４】
【表２】
2004099447.tif 000003
【００５５】
Δ［２５０−２９１］、Δ［１８２−２９１］、Δ［１６２−２９１］、Δ［１５４−２９１］およびΔ［１４６−２９１］のコール酸に対するＫｄ値は、Ａｌａのコール酸に対するＫｄ値３３ｍＭと比べてほとんど差は認められなかった。
【００５６】
また、実施例１に記したようにコール酸固定化カラムで、Ａｌａより遅く溶出されたΔ［１３８−２９１］のコール酸に対するＫｄ値は７４ｍＭであり、コール酸への親和性の減少が、蛍光の測定でも観察された。
一方、第１表において、コール酸固定化カラムに結合しなかったΔ［１３０−２９１］、Δ［１２２−２９１］およびΔ［１１４−２９１］は、コール酸に対して非常に低い親和性を示した。
【００５７】
また、Δ［１２９−１３４］のＫｄ値は１３０ｍＭであり、ＡｌａのＫｄ値と比較して４倍低い値を示した。
以上の実施例１および２の結果から、大豆タンパク質のＡｌａサブユニットのコール酸に対する結合においては、１２９〜１４５番目のアミノ酸残基、すなわち配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端に、さらに配列番号２のＮ末端から連続した１１のアミノ酸が付加されたペプチドが重要であり、特に１２９〜１３４番目の疎水性残基、すなわち配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドが重要な役割を担っている活性部分であることが明らかになった。
【００５８】
これらの結果は、配列番号１で表わされるペプチドがコレステロール低減化活性の有効成分であることを示しており、これを含む本発明ペプチドが本発明のコレステロール低減化剤、飲食品、飼料、飲食品添加剤、および飼料添加剤がヒトおよび動物のコレステロール低減化に有用であることが期待できる。
【００５９】
実施例３
次の配合によりハンバーグ（２人前）を製造する。
たまねぎ　：　１／２個
ひき肉　　：　１００ｇ
水　　　　：　２９．２ｇ
ラード　　：　１１．８ｇ
配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド　：　１００ｍｇ
卵　　　　：　１個
パン粉　　：　少量
調味料　　：　少量
【００６０】
実施例４
次の配合によりクッキー（３０個分）を製造する。
薄力粉　　：　１００ｇ
澱粉　　　：　　７４ｇ
水　　　　：　　１４ｇ
配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド　：　１００ｍｇ
ベーキングパウダー　：　小さじ２
塩　　　　：　小さじ１／２
卵　　　　：　１個
バター　　：　　８０ｇ
牛乳　　　：　大さじ２
ハチミツ　：　少量
【００６１】
実施例５
次の配合により粉末飲料を製造する。
配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド　：　５００ｍｇ
カゼインナトリウム　：　１７．５ｇ
Ｌ−バリン　：　０．５ｇ
ピロリン酸第二鉄（鉄源）　　：　０．１ｇ
ホスカルＥＦＣ（カルシウム源；日興ファインプロダクツ社）　　：　１ｇ
ビタミンミックス（メルク社）　　：　１ｇ
飲料にする場合には、本品４ｇを水１８０ｍｌに分散させる。
【００６２】
実施例６
次の配合により粉末飲料を製造する。
配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド　：　５００ｍｇ
カゼインナトリウム　：　１７．５ｇ
Ｌ−バリン　：　０．５ｇ
ピロリン酸第二鉄（鉄源）　　：　０．１ｇ
ホスカルＥＦＣ（カルシウム源；日興ファインプロダクツ社）　　：　１ｇ
ビタミンミックス（メルク社）　　：　１ｇ
飲料にする場合には、本品４ｇを水１８０ｍｌに分散させる。
【００６３】
実施例７
次の配合により錠剤（タブレット）を製造する。
配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド　：　１００ｍｇ
粉糖　　　：　２．６ｇ
アスコルビン酸　：　１５０ｍｇ
クエン酸　：　０．１ｇ
ショ糖ステアリン酸エステル　：　１５０ｍｇ
香料　　　：　１５ｍｇ
【００６４】
実施例８
次の配合により錠剤（タブレット）を製造する。
配列番号７で表わされるアミノ酸からなるペプチド　：　１００ｍｇ
粉糖　　　：　２．６ｇ
アスコルビン酸　：　１５０ｍｇ
クエン酸　：　０．１ｇ
ショ糖ステアリン酸エステル　：　１５０ｍｇ
香料　　　：　１５ｍｇ
【００６５】
【発明の効果】
本発明によれば、新規ペプチドを有効成分として含有するコレステロール低減化剤、コレステロール低下能を有する飲食品、飼料、飲食品添加剤および飼料添加剤が提供される。
【００６６】
【配列表】
2004099447.tif 000004
【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１および２において使用したデレーションミュータント。
【図１】
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