(57)【要約】【課題】藍藻類から色調の鮮やかなフィコシアニン色素を抽出する方法を提供すること。【解決手段】生の藍藻類をリン酸含有の水溶液に懸濁した懸濁液を用い、該懸濁液に含まれる藍藻類の細胞破砕を行って、藍藻類中のフィコシアニン色素が懸濁液中に抽出したフィコシアニン色素抽出液を得たのち、該抽出液にカルシウム塩を添加し、その後、該抽出液から藍藻類の残渣を分離することを特徴とする、藍藻類からのフィコシアニン色素の抽出方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィコシアニンの夾雑色素を含有する藍藻類由来のフィコシアニン色素液中の該夾雑色素を、凝集剤により凝集させたのち、該色素液から凝集物を除去することを特徴とする、フィコシアニン色素液の精製方法。
【請求項２】
凝集剤が、アルカリ土類金属のリン酸水素塩である、請求項１記載のフィコシアニン色素液の精製方法。
【請求項３】
凝集剤が、リン酸水素カルシウムである、請求項２記載のフィコシアニン色素液の精製方法。
【請求項４】
リン酸水素カルシウムが、フィコシアニン色素液中でリン酸塩とカルシウム塩とを反応させて得られたものである、請求項３記載のフィコシアニン色素液の精製方法。
【請求項５】
フィコシアニン色素液が、藍藻類の懸濁液に、塩基性化合物の添加および／または超音波照射処理を行って得られたものである、請求項１記載のフィコシアニン色素液の製造方法。
【請求項６】
フィコシアニン色素液が、藍藻類の懸濁液に、塩基性化合物を添加したのち超音波照射処理を行って得られたものである、請求項５記載のフィコシアニン色素液の精製方法。
【請求項７】
リン酸水素カルシウムが、フィコシアニン色素液としてカルシウム塩を含有するフィコシアニン色素液を用い、該色素液にリン酸塩を添加して、得られたものである、請求項３記載のフィコシアニン色素液の精製方法。
【請求項８】
リン酸水素カルシウムが、フィコシアニン色素液としてリン酸塩を含有するフィコシアニン色素液を用い、該色素液にカルシウム塩を添加して、得られたものである、請求項３記載のフィコシアニン色素液の精製方法。
【請求項９】
カルシウム塩を含有するフィコシアニン色素液が、カルシウム塩を含有する藍藻類の懸濁液に、塩基性化合物の添加および／または超音波照射処理を行って得られたものである、請求項７記載のフィコシアニン色素液の製造方法。
【請求項１０】
カルシウム塩を含有するフィコシアニン色素液が、カルシウム塩を含有する藍藻類の懸濁液に、塩基性化合物を添加したのち超音波照射処理を行って得られたものである、請求項７記載のフィコシアニン色素液の精製方法。
【請求項１１】
フィコシアニン色素液が、生のスピルリナを用いて得られたものである、請求項１〜１０のいずれか１項記載のフィコシアニン色素液の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フィコシアニン色素液の精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
スピルリナ等の藍藻類には、青色を呈するフィコシアニンが含まれていることが知られており、従来から食品用着色料として利用するために種々のフィコシアニンの抽出方法が提案されてきた。
【０００３】
藍藻類に含まれるフィコシアニンを抽出する方法としては、例えば、（１）生の藍藻類をカルシウム・イオンを含む第１水相と接触せしめる工程、（２）第１水相を藍藻類より分離する工程、（３）藍藻類を塩基性化合物含有の第２水相と接触せしめる工程、（４）前記（３）工程によりフィコシアニンを含有する第２水相を残存藍藻類より分離する工程からなる抽出方法が、特公昭６３−５５９２０号公報等に報告されている。しかしながら、該抽出方法では、クロロフィル等のフィコシアニンに対する夾雑色素が除去できず、フィコシアニン本来の強く、鮮やかな青みを有するフィコシアニンが得られない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、強く、鮮やかな青みを有するフィコシアニン色素液が得られるフィコシアニン色素液の精製方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、種々の製造方法により得られた夾雑色素含有フィコシアニン色素液に、該夾雑色素に対する凝集剤を加えることにより該夾雑色素が凝集した凝集物が形成されること、該凝集物は遠心分離法、濾過法等により除去できること、得られるフィコシアニン色素液は、強く、鮮やかな青みを有すること等を見出し、本発明をなすに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、フィコシアニンの夾雑色素を含有する藍藻類由来のフィコシアニン色素液と、該夾雑色素を凝集する凝集剤との反応により、該夾雑色素を凝集させたのち、色素液から凝集物を除去することを特徴とする、フィコシアニン色素液の精製方法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明について、詳細に説明する。
本発明で用いるフィコシアニン色素液は、藍藻類由来で、かつ、フィコシアニンに対する夾雑色素を含有していれば、藍藻類の種類や製造方法等に制限はない。藍藻類としては、例えば、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、フィッシェレラ（Ｆｉｓｈｅｒｅｌｌａ）属、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、ネンジュモ（Ｎｏｓｔｏｃ）属、シネコキスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリポスリクス（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ）属、スイゼンジノリ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ）属、マスティゴクラディス（Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｕｓ）属、プルロカプサ（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ）属等が挙げられるが、工業的規模で生産され、その安全性が確認されているスピルリナ属に属するものが望ましい。
【０００８】
藍藻類は、生の状態のものや、生の藍藻を乾燥したもの等が入手できるが、生の藍藻類が、青みが強く色調も良好なフィコシアニン色素液が得られることから好ましい。生の藍藻類は、例えば、水中で培養された藻を遠心分離、濾過等の方法により収穫され、通常水分を７０〜９０重量％含有している。藍藻類は、通常水中で自然光、又は人工光により培養されるが、光が照射され光合成を行っている状態の藍藻を収穫するのが好ましい。特に自然光下の屋外培養槽で培養されている藍藻においては、夜間若しくは光照射が始まった直後に収穫された藍藻よりは、光合成が継続して行われ、水温も上昇してくる午前１０時以降から日没までに収穫された藍藻がより好ましい。
【０００９】
乾燥処理した藍藻類としては、例えば、前記の方法で収穫した生の藍藻類を、凍結乾燥処理したものや、スプレー乾燥処理したもの等が挙げられる。
【００１０】
フィコシアニン色素液は、その製造方法には制限は無く、製造方法としては、例えば、
▲１▼藍藻類が懸濁した懸濁液を、特公昭６３−５５９２０号公報に記載されている様な塩基性化合物等の化学的手段で処理し、フィコシアニン色素液を得る方法、
▲２▼藍藻類が懸濁した懸濁液を、超音波照射処理等の機械的手段で処理し、フィコシアニン色素液を得る方法、
▲３▼藍藻類が懸濁した懸濁液を、化学的手段および機械的手段で処理し、フィコシアニン色素液を得る方法、
等が挙げられる。
【００１１】
フィコシアニン色素液の製造方法は、機械的手段による処理を用いた製造方法が好ましく、なかでも、機械的手段による処理と化学的手段による処理を併用する製造方法がより好ましい。
【００１２】
前記藍藻類が懸濁した懸濁液は、懸濁液中の藍藻類の濃度が乾燥固形分として０．１〜２０．０重量％となる範囲で懸濁したものが好ましく、２．０〜８．０重量％となる範囲がより好ましい。
【００１３】
前記藍藻類の懸濁液には、後述する凝集剤の形成成分として使用することができること、藍藻類の細胞壁に作用し、フィコシアニンが抽出され易くなること、食品に使用できることから、カルシウム塩を添加しておくのが好ましく、または、凝集剤の形成成分として使用できることに加え、懸濁液のｐＨを安定させる緩衝効果があること、食品に使用できることから、リン酸塩を添加するのが好ましい。
【００１４】
カルシウム塩としては、例えば、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム等の水溶性のカルシウム塩が挙げられるが、中でも、塩化カルシウムが好ましい。
【００１５】
カルシウム塩の懸濁液中のカルシウム塩の濃度は、０．０１〜２．０モル／リットルが好ましく、０．１〜０．５モル／リットルがより好ましい。
【００１６】
リン酸塩としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム等のリン酸ナトリウム；リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸カリウム；リン酸マグネシウム；リン酸二水素アンモニウム等の水溶性無機塩が挙げられるが、中でも、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムが好ましく、リン酸ナトリウムが特に好ましい。更に、リン酸塩は、リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムを併用することが、後述する範囲に懸濁液のｐＨを調節しやすいので好ましい。
【００１７】
リン酸塩の水溶液中のリン酸塩の濃度は、０．００１〜０．５モル／リットルが好ましく、０．０１〜０．１モル／リットルがより好ましい。また、リン酸塩の水溶液のｐＨは、５．０〜８．０の範囲が好ましく、５．２〜６．６がより好ましい。
【００１８】
懸濁液の調製は、懸濁液の温度が４〜４５℃となる範囲で行うのが好ましく、１５〜３５℃がより好ましい。
【００１９】
懸濁液は、調製後すぐに次の工程に用いることができるが、調製後静置するのが好ましい。静置時間は、５分〜８時間が好ましく、１０分〜１時間がより好ましい。
【００２０】
次に、懸濁液に対して、前記▲２▼の製造方法においては機械的処理を、▲３▼の製造方法においては化学的処理と機械的処理とを行う。
【００２１】
前記▲３▼の製造方法における化学的処理と機械的処理の順序は制限は無く、機械的処理を行った後に化学的処理を行っても良いし、化学的処理を行った後に機械的処理を行っても良いが、化学的処理を行った後に機械的処理を行うのが好ましい。
【００２２】
化学的処理を行う化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等のアルカリ化合物；炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸リチウム等のアルカリ金属の炭酸塩；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素リチウム等のアルカリ金属の炭酸水素塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム等のアルカリ金属の酢酸塩等の塩基性化合物が好ましく使用できる。
【００２３】
懸濁液を塩基性化合物を添加して処理するには、塩基性化合物の水溶液とした上で懸濁液に加えても良いし、固体の塩基性化合物を直接懸濁液に加えても良いが、塩基性化合物の水溶液とした上で懸濁液に加えるのが好ましい。塩基性化合物の水溶液のｐＨは、８．０〜１２．０の範囲が好ましく、９．０〜１１．０がより好ましい。塩基性化合物としては、炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムが好ましく、炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムを両方用いるのがより好ましい。炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの使用割合（炭酸ナトリウム：炭酸水素ナトリウム）は、１：９０〜１１０：１が好ましく、１：８〜１３：１がより好ましい。
【００２４】
上記懸濁液に塩基性化合物を混合する際は、懸濁液中の塩基性化合物の濃度が０．００１〜０．１モル／リットルとなる様に混合するのが好ましく、０．００５〜０．０５モル／リットルがより好ましい。塩基性化合物を添加した直後の懸濁液のｐＨは、７．５〜１０．０の範囲が好ましく、８．５〜９．５がより好ましい。
【００２５】
懸濁液に塩基性化合物を添加した後は、攪拌等により均質にする。懸濁液の温度は、４〜４５℃の範囲が好ましく、１５〜３５℃の範囲がより好ましい。懸濁液へ塩基性化合物を添加した後は、更に攪拌または静置するのが、フィコシアニンが藍藻細胞から懸濁液と塩基性化合物の混合液中に移行しやすくなるので好ましい。攪拌、静置の時間は、１０分間〜８時間で良く、２〜５時間が好ましい。
【００２６】
懸濁液の機械的処理は、藍藻の細胞を破砕し、細胞中のフィコシアニンが懸濁液に移行できる方法であれば制限はないが、細胞内に含まれるフィコシアニン以外の夾雑成分の懸濁液への移行が少なく、且つフィコシアニンの懸濁液への移行が多い方法が好ましい。細胞破砕法としては、例えば、超音波照射処理法、プロペラ型高速ホモゲナイザー法、湿式ボールミル法、高圧ホモゲナイザー法等が挙げられる。細胞破砕は、藍藻に特徴的な細胞内構造であるガス胞を破壊し、ガス胞に由来する気泡を細胞外へ排出することにより、分離工程での浮上性藻による分離不良を防止することができること、藍藻のチラコイド膜上の会合体（フィコビリゾーム）として存在しているフィコシアニンを懸濁液へ優先的に可溶化させ、細胞からのフィコシアニンの懸濁液への移行を促進することから超音波照射処理により行うことが好ましい。
【００２７】
超音波照射処理を行う際の照射方法は、藍藻類の細胞を破壊し、フィコシアニンを懸濁液中に抽出させることができれば制限はなく、バッチ式や連続式等が挙げられるが、なかでも、連続的に超音波を照射する連続式が好ましい。連続式の超音波照射処理装置としては、例えば（株）日本精機製作所の生産用多連式超音波分散装置等が挙げられる。
【００２８】
超音波照射処理は、懸濁液中の藍藻類からフィコシアニンを抽出させることができるような条件で行えば良いが、前記▲２▼の機械的処理のみを行う時の超音波照射により懸濁液に与えられる仕事量としては、懸濁液１リットルに対して、１００〜３０００ｋＪが好ましく、２００〜２０００ｋＪがより好ましく、３００〜１０００ｋＪが特に好ましい。
【００２９】
超音波照射処理の条件としては出力、周波数、照射時間等が挙げられる。超音波の周波数は１０〜１００ｋＨｚの領域で行うことが好ましく、１５〜５０ｋＨｚの領域がより好ましく、１５〜３０ｋＨｚの領域が特に好ましい。超音波照射装置の出力は、１００〜３０００Ｗが好ましく、２００〜２０００Ｗがより好ましく、３００〜１０００Ｗが特に好ましい。
【００３０】
前記仕事量を与える超音波照射処理を行うには、出力と照射時間とを適宜調整すればよいが、懸濁液１リットルを超音波処理する時には、例えば、周波数２０ｋＨｚにおいて、出力が１００Ｗの時は、１７〜５００分の照射時間が好ましく、３５〜３４０分がより好ましく、５０〜１７０分が特に好ましい。出力が６００Ｗの時は、３〜８５分の照射時間が好ましく、５分３０秒〜６０分がより好ましく、８分３０秒〜３０分が特に好ましい。出力が１０００Ｗの時は、２〜５０分の照射時間が好ましく、３分３０秒〜３４分がより好ましく、５分〜１７分が特に好ましい。具体的には、例えば、後述する実施例２に示すように、周波数が１９．５ｋＨｚ、超音波照射部の容積が２０ｍＬ、出力が６００Ｗの連続式超音波破砕装置を用いて破砕処理するには、懸濁液を３ｍＬ／秒の速度で超音波照射部に送り破砕処理を行う工程を２回行えば良い。
【００３１】
前記▲３▼の機械的処理および化学的処理を行う時の超音波照射により懸濁液に与えられる仕事量としては、懸濁液１リットルに対して、１〜３００ｋＪが好ましく、５〜２００ｋＪがより好ましく、１０〜１００ｋＪが特に好ましい。
【００３２】
超音波照射処理の条件としては出力、周波数、照射時間等が挙げられる。超音波の周波数としては、１０〜１００ｋＨｚが好ましく、１０〜５０ｋＨｚがより好ましく、１５〜３０ｋＨｚが特に好ましい。超音波照射の出力は、５０〜６００Ｗが好ましく、１００〜４００Ｗがより好ましく、２００〜４００Ｗが特に好ましくい。
【００３３】
前記仕事量を与える超音波照射処理を行うには、出力と照射時間とを適宜調整すればよいが、懸濁液１リットルを超音波処理する時には、例えば、周波数２０ｋＨｚにおいて、出力が５０Ｗの時は、２０秒〜１００分の照射時間が好ましく、２分〜７０分がより好ましく、３分３０秒〜３５分が特に好ましい。出力が３００Ｗの時は、３秒〜２０分の照射時間が好ましく、２０秒〜１２分がより好ましく、３０秒〜７分が特に好ましい。出力が５００Ｗの時は、２秒〜１０分の照射時間が好ましく、１０秒〜７分がより好ましく、２０秒〜４分が特に好ましい。具体的には、例えば、後述する実施例１に示すように、周波数が１９．５ｋＨｚ、超音波照射部の容積が１０ｍＬ、出力が３００Ｗの連続式超音波破砕装置を用いて破砕処理するには、懸濁液を５ｍＬ／秒の速度で超音波照射部に送り破砕処理すればよい。
【００３４】
前記のようにして得られたフィコシアニン色素液は、そのままでも用いることができるが、色素液中の藍藻類の残渣を分離除去して使用しても良い。残渣を分離除去する手段としては、固液分離できる手段であれば制限は無く、例えば、ろ紙やろ布等のろ材を用いたろ過方法や、上澄を回収するデカンテーション法、フィルタープレス法、遠心分離方法等が挙げられる。なかでも、工業的に大量処理の可能な遠心分離法、フィルタープレス法等の上澄を回収する方法が好ましく、特に遠心分離法が好ましい。
【００３５】
遠心分離は、懸濁液から残渣を除去できる条件であれば良いが、重力加速度が１，０００〜３０，０００Ｇで１０秒〜２時間の条件が好ましく、重力加速度が３，０００〜１５，０００Ｇで１〜３０分間の条件がより好ましい。遠心分離機としては、ディスラッジ型遠心分離機、アルファ型遠心分離機、シャープレス型遠心分離機があるが、作業性が向上することから、ディスラッジ型遠心分離機とアルファ型遠心分離機の組み合わせによる連続遠心分離が好ましい。
【００３６】
次に、凝集剤について説明する。
本発明の精製方法で用いる凝集剤としては、フィコシアニン色素の夾雑色素を凝集させることができるものであれば特に制限無く使用することができる。フィコシアニン色素液への凝集剤の添加方法としては、例えば、フィコシアニン色素液に添加する時点で夾雑色素に対して凝集作用を有する凝集剤を添加しても良いし、フィコシアニン色素液に凝集剤の原料となる化合物を添加し、該色素液中で凝集剤としても良い。なかでも、フィコシアニン色素液に凝集剤の原料となる化合物を添加し、該色素液中で凝集剤とするのが、凝集剤が形成される際に夾雑色素の巻き込みが起こり、夾雑色素の凝集効果が増加するので好ましい。
【００３７】
凝集剤としては、例えば、２価若しくは３価の電荷を有する金属イオンのリン酸塩及びリン酸水素塩があり、特にアルカリ土類のリン酸塩やアルカリ土類のリン酸水素塩が好ましく使用できる。アルカリ土類のリン酸塩としては、リン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、リン酸バリウム等が挙げられ、アルカリ土類のリン酸水素塩としては、例えば、リン酸水素マグネシウム、リン酸二水素マグネシウム等のリン酸水素マグネシウム；リン酸水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム等のリン酸水素カルシウム；リン酸水素バリウム、リン酸二水素バリウム等のリン酸水素バリウム等のアルカリ土類のリン酸水素塩が挙げられる。凝集剤としては、なかでも、リン酸水素カルシウム、リン酸二水素カルシウムが好ましい。
【００３８】
凝集剤の添加量は、夾雑色素を凝集させるに十分な量を適宜添加すればよいが、フィコシアニン色素液１００重量部に対して、０．１〜１０重量部が好ましく、１．〜５重量部がより好ましい。フィコシアニン色素液への凝集剤の添加時期としては、例えば、得られたフィコシアニン色素液に凝集剤を加えても良いし、フィコシアニン色素液の製造中に凝集剤を加えても良い。凝集剤は固体の状態で加えても良いし、凝集剤を溶液とした上で加えても良い。
【００３９】
フィコシアニン色素液に凝集剤の原料となる化合物を添加し、該色素液中で凝集剤とするには、例えば、アルカリ土類の金属塩とリン酸塩等の原料を該色素液に添加すれば良い。
【００４０】
リン酸塩としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム等のリン酸ナトリウム；リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等のリン酸カリウム；リン酸マグネシウム；リン酸二水素アンモニウム等の水溶性無機塩が挙げられる。なかでも、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムが好ましく、リン酸ナトリウムが特に好ましい。リン酸塩は、固体の状態で用いても良いし、水溶液とした状態で用いても良い。
【００４１】
リン酸塩は、リン酸塩の濃度が色素液中で０．００１〜０．５モル／リットルの濃度になるよう添加するのが好ましく、０．０１〜０．１モル／リットルがより好ましい。また、リン酸塩を加えた後の色素液のｐＨが、５．０〜８．０の範囲に入るようリン酸塩を加えるのが好ましく、５．３〜７．０の範囲がより好ましい。
【００４２】
アルカリ土類金属塩としては、例えば、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム等のカルシウム塩、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化バリウム、硝酸バリウム等のバリウム塩等が挙げられる。アルカリ土類金属塩は、カルシウム塩が好ましく、なかでも、塩化カルシウムが好ましい。また、アルカリ土類金属塩は固体の状態で用いても良いし、水溶液とした状態で用いても良い。
【００４３】
アルカリ土類金属塩は、色素液中で濃度が、０．０１〜２．０モル／リットルになる様に使用するのが好ましく、０．１〜０．５モル／リットルがより好ましい。
【００４４】
フィコシアニン色素液に凝集剤の原料となる化合物、例えば、リン酸塩とアルカリ金属塩好ましくはカルシウム塩とを添加し、該色素液中で凝集剤とするには、例えば、（１）フィコシアニン色素液を製造中にリン酸塩とカルシウム塩を添加しても良いし、（２）フィコシアニン色素液を製造後にリン酸塩とカルシウム塩を添加しても良いし、（３）フィコシアニン色素液を製造中にカルシウム塩を添加しておき、製造後リン酸を添加しても良いし、（４）フィコシアニン色素液を製造中にリン酸塩を添加しておき、製造後カルシウム塩を添加しても良いが、（３）の方法が、夾雑色素の凝集効果が高いこと、カルシウム塩が藍藻類の細胞壁に作用し、フィコシアニンが抽出されやすくなることから好ましく、（４）の方法が、夾雑色素の凝集効果が高いこと、リン酸塩が、製造中の液のｐＨを安定させる緩衝作用を有することから好ましい。
【００４５】
（３）または（４）の方法において、フィコシアニン色素液を調製後にリン酸塩またはアルカリ金属塩、好ましくはカルシウム塩を添加した後は、すぐ次の工程に進めるが、攪拌または攪拌後静置するのが好ましい。静置時間は、５分〜２４時間が好ましく、３０分〜２０時間がより好ましい。また、色素液の温度は、４〜４５℃が好ましく、４〜２５℃がより好ましい
【００４６】
（３）または（４）の方法において、フィコシアニン色素液を調製後にリン酸塩またはアルカリ金属塩を添加した後のｐＨは、ｐＨは５．０〜７．０が好ましい。リン酸塩とカルシウム塩を含有した後は、色素液中でリン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム及び水素イオンを生じ、その結果、抽出液のｐＨが５．０未満に低下することがある。ｐＨが５．０未満になると、フィコシアニンの回収率が低下することがあることから、この段階でさらにリン酸塩を加えて抽出液のｐＨを５．０〜７．０に調整するのが好ましい。
【００４７】
次に、色素液中の凝集物の分離処理を行い、フィコシアニン色素液中に含まれる夾雑色素の凝集物や、藍藻類の残渣を分離除去する。分離処理を行う手段としては、種々の方法が挙げられ、例えば、ろ紙やろ布等のろ材を用いたろ過方法や、沈殿から上澄を回収することにより行うデカンテーション法、遠心分離方法等が挙げられる。なかでも、遠心分離による分離が好ましい。
【００４８】
遠心分離は、抽出液から残渣を除去できる条件であれば良いが、重力加速度が１，０００〜３０，０００Ｇで１０秒〜２時間の遠心分離条件が好ましく、重力加速度が３，０００〜１０，０００Ｇで１〜３０分間の遠心分離条件が、より好ましい。遠心分離機としては、ディスラッジ型遠心分離機、アルファ型遠心分離機、シャープレス型遠心分離機があるが、作業性が向上することから、ディスラッジ型遠心分離機とアルファ型遠心分離機の組み合わせによる連続遠心分離が好ましい。
【００４９】
分離処理により得られたフィコシアニン抽出液は、この状態で使用に供することも可能であるが、更に、濃縮しても良い。濃縮方法としては、溶液に夾雑している低分子性色素、有機不純物、及び無機イオン含量を低下させ、精製度を向上させるため、限外濾過による濃縮が好ましい。限外濾過に用いる限外濾過膜は、分画分子量が１，０００〜３０，０００のものが好ましく、５，０００〜２０，０００のものがより好ましい。
【００５０】
本発明の抽出方法で得られるフィコシアニン抽出液は、糖類、塩類等、例えばグリセロール、クエン酸ナトリウム等を加えて安定化させ溶液状の色素液として提供可能である。さらにこのフィコシアニン濃縮液は、乾燥工程を経ることにより、乾燥粉末にすることもできる。乾燥方法は、フィコシアニンが変性劣化しない条件であれば何れでも良いが、熱風噴霧乾燥、凍結乾燥が特に好ましく用いられる。
【００５１】
本発明の抽出方法は、工業的にフィコシアニンを大量生産できる方法であり、得られるフィコシアニンは、従来にない鮮やかな青色を有する色素である。例えば色差計を使用した色調測定においても、従来の工業的抽出方法で得られた色素と明確に区別することが出来る。
【００５２】
【実施例】
次に実施例、比較例により本発明を具体的に説明する。例中において、「部」「％」は特に断りのない限り、重量基準である。
【００５３】
実施例１
人工光を使用し、７日間連続光照射下の培養槽でスピルリナを培養生産し、収穫した。得られた生の藻体１ｋｇ（固形分量１８．０％）を１％塩化カルシウム溶液６Ｌ（０．０９モル／リットル）に加え、攪拌機により２０℃で４５分間攪拌を行いスピルリナ懸濁液を得た。炭酸ナトリウム３ｇと炭酸水素ナトリウム３ｇを５０ｍｌの水に溶解し、スピルリナ懸濁液に添加（懸濁液中の塩基性化合物の濃度は、０．０１モル／リットル）した。この懸濁液を２分間攪拌後、２０℃で５時間、静置した。この懸濁液を連続式超音波破砕装置〔（株）日本精機製作所ＲＵＳ−３００ＴＣＶＰ型、周波数１９．５ｋＨｚ、超音波照射部の容積１０ｍＬ、出力３００Ｗ〕に導き、懸濁液を５ｍＬ／秒の速度で超音波照射部に送り超音波処理を行い、抽出液を得た。得られた抽出液にリン酸二水素ナトリウムが６．８ｇ／リットル、リン酸水素二ナトリウムが２．２ｇ／リットルの濃度になる様に加え、攪拌後、遠心分離機に導き、重力加速度が１０，０００Ｇで、１５分間の遠心分離を行った。得られたフィコシアニンの抽出液は、分画分子量１５，０００の分離膜を使用した限外濾過により低分子成分及び塩類を除去した後、凍結乾燥を行い、フィコシアニン色素乾燥物を４５ｇを得た。これを、フィコシアニン色素１とする。
【００５４】
フィコシアニン色素１の０．１ｇを１００ｍｌの水に溶解したフィコシアニン色素液を調製し、下記に示す測定方法に従い吸光度と色調を測定した。吸光度と色調の測定結果を、藻類乾燥重量１００ｇあたり得られた色素乾燥物の重量と共に、第１表に示す。
【００５５】
（吸光度の測定）
フィコシアニン色素液を水で１０倍希釈し、６１８ｎｍ（フィコシアニンの吸収極大波長）と２８０ｎｍ（タンパク質の吸収極大波長）における吸光度を測定し、更に、波長６１８ｎｍの吸光度（Ａａｔ６１８ｎｍ）の１００倍値から、色素乾燥物１％溶液の色価（Ｅ１％）を求めた。波長６１８ｎｍの吸光度及びこの色価が、波長６１８ｎｍの吸光度（Ａａｔ６１８ｎｍ）の測定値が高いほど色素乾燥物中のフィコシアニン含有量が高いことを示す。また、Ａａｔ２８０ｎｍとＡａｔ６１８ｎｍとの比（Ａａｔ２８０ｎｍ／Ａａｔ６１８ｎｍ）は、色素乾燥物中のフィコシアニン単位量当たりのタンパク質含有量を示し、この値が小さい程、夾雑タンパク質が除かれ純度の高いフィコシアニンが得られていることを示す。尚、吸光度の測定は、（株）島津製作所製のＵＶ２２００型を用いて行った。
【００５６】
（色調の測定）
色調の測定には、波長６１８ｎｍの吸光度が０．６になる様にフィコシアニン色素液を水で希釈したものを用いた。色調は、ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）の表色法に従い、ａ値とｂ値とを測定し、これらの値から（ａ２＋ｂ２）１／２値を算出した。ｂ値は青色の強さを表し、−ｂ値が大きいほど、青みが強いことを示す。（ａ２＋ｂ２）１／２は彩度を表し、この値が大きいほど、色合いが鮮やかであることを示す。尚、色調の測定は、日本電色工業（株）製ＳＺ−Σ９０型を用いて行った。
実施例２
人工光を使用し、７日間連続光照射下の培養槽でスピルリナを培養生産し、収穫した。得られた藻体１ｋｇ（固形分量１８．０％）をｐＨ６．５の０．０１モル／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液６Ｌに加え、攪拌機により２０℃で３０分間攪拌を行い、スピルリナ懸濁液を得た。この懸濁液を連続式超音波破砕装置（（株）日本精機製作所ＲＵＳ−６００ＴＣＶＰ型、周波数１９．５ｋＨｚ、超音波照射部の容積２０ｍＬ、出力６００Ｗ）に導き、懸濁液を３ｍＬ／秒の速度で超音波照射部に送り超音波処理を行った。この超音波処理をさらにもう１回行った。超音波処理後、得られた抽出液に塩化カルシウムを、０．０９モル／Ｌになる様に加え、攪拌後、１５℃で１２時間静置した。静置後、遠心分離機に導き、重力加速度が１０，０００Ｇで、２０分間の遠心分離を行った。遠心分離後、上澄みを回収し、抽出液を得た。得られたフィコシアニンの抽出液は、分画分子量１５，０００の分離膜を用いた膜分離装置を使用して低分子成分及び塩類を除去した後、凍結乾燥を行い、フィコシアニン色素乾燥物４７ｇを得た。これを、フィコシアニン色素２とする。実施例１と同様にして、フィコシアニン色素液を調製し、吸光度と色調を測定した。結果を第１表に示す。
【００５７】
実施例３
実施例１で用いた生のスピルリナ藻体１ｋｇを１％塩化カルシウム水溶液６Ｌ（０．０９モル／リットル）に加え、攪拌機により２０℃で４５分間攪拌を行いスピルリナ懸濁液を得た。スピルリナ懸濁液からスピルリナを濾布により濾過分離し、該スピルリナを炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムをそれぞれ０．５ｇ／Ｌ濃度で含有する水溶液６Ｌ（水溶液中の塩基性化合物の濃度は０．０１モル／リットル）に懸濁した。懸濁後、リン酸二水素ナトリウムが６．８ｇ／リットル、リン酸水素二ナトリウムが２．２ｇ／リットルの濃度になる様に加え、２０℃で２時間攪拌後、次いで１時間放置した。この懸濁液を傾斜して上清を回収し回収液を得ると共に、残存藻類に、該残存藻類の乾燥重量に対し５重量％の割合で濾過助剤として硫酸アルミナを添加した後、減圧濾過を行い回収液を得た。これらの回収液を合わせた液を、遠心分離機に導き、重力加速度が１０，０００Ｇで、１５分間の遠心分離を行った。得られたフィコシアニンの抽出液は、限外濾過処理及び凍結乾燥を実施例１と同様に行い、フィコシアニン色素乾燥物３８ｇを得た。これをフィコシアニン３とする。実施例１と同様にして、フィコシアニン色素液を調製し、吸光度と色調を測定した。結果を第１表に示す。
【００５８】
比較例１
リン酸二水素ナトリウムと、リン酸水素二ナトリウムとを添加しなかった以外は実施例１と同様にして、フィコシアニン色素乾燥物３５ｇを得た。これを、比較対照用フィコシアニン色素１´とする。実施例１と同様にして、比較対照用フィコシアニン色素液を調製し、吸光度と色調を測定した。結果を第２表に示す。
【００５９】
比較例２
塩化カルシウムを添加しながった以外は実施例２と同様にして、フィコシアニン色素乾燥物４８ｇを得た。これを、比較対照用フィコシアニン色素２´とする。実施例１と同様にして、比較対照用フィコシアニン色素液を調製し、吸光度と色調を測定した。結果を第２表に示す。
【００６０】
比較例３
リン酸二水素ナトリウムと、リン酸水素二ナトリウムとを添加しなかった以外は実施例３と同様にして、フィコシアニン色素乾燥物５９ｇを得た。これを、比較対照用フィコシアニン色素３´とする。実施例１と同様にして、比較対照用フィコシアニン色素液を調製し、吸光度と色調を測定した。結果を第２表に示す。
【００６１】
【表１】
2004027041.tif 000002
【００６２】
【表２】
2004027041.tif 000003
【００６３】
実施例１〜３で得られたフィコシアニン色素は２８０ｎｍと６１８ｎｍの吸光度比（２８０ｎｍの吸光度／６１８ｎｍの吸光度）が、比較例１〜３で得られた色素と比較して小さな値を示し、夾雑タンパク質が除かれフィコシアニンの純度が高いことが示された。
【００６４】
また、実施例１〜３で得られたフィコシアニン色素は、鮮やかな青色を呈した。色差計による色調の測定値では、実施例１〜３で得られたフィコシアニン色素は、比較例１〜３で得られたフィコシアニン色素と比較して、青色の強さを示す−ｂ値がより大きな値を示し、色の鮮やかさを示す（ａ２＋ｂ２）１／２も大きな値を示した。
【００６５】
【発明の効果】
本発明は、藍藻類、特にスピルリナから青みが深く、色調の鮮やかなフィコシアニンを高純度で、かつ、大量安価に生産できる。