(57)【要約】【課題】同種造血細胞移植後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又は同種造血細胞移植後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するのに有用なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープペプチドの提供。【解決手段】ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸残基数９〜１０個からなる部分ペプチドであって、かつ、ヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）と結合してＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識され得るマイナー組織適合性抗原（ｍＨＡ）エピトープペプチド。【選択図】　図１
2004099509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸残基数９〜１０個からなる部分ペプチドであって、かつ、ヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）と結合してＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識され得るマイナー組織適合性抗原（ｍＨＡ）エピトープペプチド。
【請求項２】
ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸残基数９〜１０個からなる部分ペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１９番目、第３９番目又は第８２番目のアミノ酸を含んでなる部分ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＨＬＡがＨＬＡ−Ａ２４である、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号３又は４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
ＨＬＡがＨＬＡ−Ｂ４４である、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドである、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
ＨＬＡがＨＬＡ−Ａ２である、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項８】
配列番号９〜１６で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドである、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
造血器腫瘍が白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫又は多発性骨髄腫である、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
固形腫瘍が腎細胞癌、悪性黒色腫、乳癌、胃癌、肺癌又は前立腺癌である、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチド又は該ペプチドをパルスした抗原提示細胞を有効成分として含む、同種造血細胞移植後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又は同種造血細胞移植後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するためのワクチン。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチド又は該ペプチドをパルスした抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、同種造血細胞移植後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又は同種造血細胞移植後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するための受動免疫療法剤。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに１項に記載のペプチドから調製した主要組織適合抗原複合体及び／又は主要組織適合抗原複合体−テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させ、該主要組織適合抗原複合体及び／又は主要組織適合抗原複合体−テトラマーにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、同種造血細胞移植後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又は同種造血細胞移植後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するための受動免疫療法剤。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチドから調製した主要組織適合抗原複合体−標識磁気ビーズと末梢血リンパ球とを反応させ、主要組織適合抗原複合体−標識磁気ビーズにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、同種造血細胞移植後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又は同種造血細胞移植後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するための受動免疫療法剤。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチドで末梢血を刺激してＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を得、該ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が産生するサイトカイン及び／又はケモカインを測定することを特徴とする、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチドから主要組織適合性複合体及び／又は主要組織適合性複合体−テトラマーを調製し、該主要組織適合性複合体及び／又は主要組織適合性複合体−テトラマーと末梢血とを反応させる、該末梢血中の造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法。
【請求項１８】
同種造血細胞移植におけるドナー及び患者由来のＤＮＡを配列番号２に示すｂｃｌ２Ａ１遺伝子の多型部位を含む領域の塩基配列を用いてＰＣＲ法により増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物についてドナー及び患者間の遺伝子タイピングを行うことを含む、同種造血細胞移植適合性診断方法。
【請求項１９】
配列番号２に示すｂｃｌ２Ａ１遺伝子の多型部位を含む領域の塩基配列が、請求項１に記載のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列である、請求項１８に記載の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸残基数９〜１０個からなる部分ペプチドであって、かつ、ヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）と結合してＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下、ＣＴＬと称する）によって認識され得るマイナー組織適合性抗原（ｍＨＡ）エピトープペプチド、該ペプチドを用いた同種造血細胞移植後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又は同種造血細胞移植後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するためのワクチン及び受動免疫療法剤、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法、並びに該ペプチドを用いた同種造血細胞移植適合性診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
同種造血細胞移植（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，　以下、ＨＣＴと称する）は、化学療法だけでは予後不良な白血病等の造血器腫瘍に治癒をもたらしうる治療法として確立されてきた。さらに最近になって、固形腫瘍に対してもミニ移植と称するＨＣＴが試みられるようになり、一部の固形腫瘍（例えば腎細胞癌、悪性黒色種等）で腫瘍縮小効果が見られつつある。実際、一部の固形腫瘍では、本来、造血器細胞に特異的な遺伝子が異常に発現しているという報告がある。例えば、ｂｃｌ２Ａ１遺伝子に関しては、胃癌細胞や悪性黒色種で異常発現し、ＨＡ−１遺伝子に関しては肺癌等で異常発現している（例えば、非特許文献１〜３参照）。しかし、進行期の造血器腫瘍や固形腫瘍は、ＨＣＴを行ったにもかかわらずしばしば再発し、必ずしも予後は良好ではない。
【０００３】
ＨＣＴは、ヒト主要組織適合抗原（以下、ＨＬＡと称する）が適合した造血幹細胞提供者（以下、ドナーと称する）から患者に造血幹細胞が提供されるが、ドナーと患者間でＨＬＡが一致していても、さまざまな遺伝子の多型に由来するマイナー組織適合性抗原（ｍｉｎｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｔｉｇｅｎ，　以下、ｍＨＡと称する）には多くの不一致が起こり、それが標的となってドナー由来のＴリンパ球を主体とする免疫反応が患者体内で起こる。この免疫反応が患者の造血器腫瘍又は固形腫瘍に対して抗腫瘍性効果を発揮すると原疾患の治癒をもたらすこととなり再発が回避される。これを移植片対腫瘍（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｔｕｍｏｒ，　以下、ＧＶＴと称する）効果と呼んでいる。
【０００４】
ＨＣＴ後再発を来す患者においては、このＧＶＴ効果が不十分であると考えられる。
このため、ドナー由来のＴリンパ球の作用を強め、ＧＶＴ効果を高めることを目的として、拒絶予防に用いる免疫抑制剤を減量する治療を行うことがあるが、その場合、ドナー由来のＴリンパ球が患者の身体中の細胞を非自己とみなし強く排除するようになり、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ　ｄｉｓｅａｓｅ，　以下、ＧＶＨＤと称する）と呼ばれる致死的な合併症がしばしば起こる。このためＧＶＨＤを回避しつつ、ＧＶＴ効果のみを積極的に取り出して利用しようとするような有効な治療法が望まれている。
【０００５】
ＨＣＴ後の造血器腫瘍又は固形腫瘍の再発を制御している主な免疫担当細胞は、ドナーのＴリンパ球由来のＣＤ８＋ＣＴＬである。ドナー由来ＣＤ８＋ＣＴＬは、患者体内で残存する造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を発見するとそれを非自己と認識して破壊する能力を持っている。従って、ＣＤ８＋ＣＴＬのその傷害機能を有効に活性化すれば、ＧＶＴ効果が高まるとともにＧＶＨＤの発症を回避することができ、新たな造血器腫瘍又は固形腫瘍の再発予防法や再発時の治療法の開発につながる可能性が高い。
【０００６】
ＣＤ８＋ＣＴＬが造血器腫瘍細胞や固形腫瘍細胞を認識する際、以下のような特徴がある。
（１）　　ＣＴＬはドナーのＴリンパ球由来である。
（２）　　ＣＴＬは、個人に固有な遺伝子多型を有する遺伝子によってコードされる患者の造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞内の各種タンパク質（以下、ｍＨＡタンパク質と称する）の部分ペプチド（以下、ｍＨＡエピトープペプチドと称する）、例えば、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質中のドナーと患者間で異なる個人に固有な遺伝子多型を有する遺伝子によってコードされる９〜１０個のアミノ酸からなるペプチドを認識して、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害（破壊）する。
（３）　　このｍＨＡエピトープペプチドは、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞の表面にあるＨＬＡに結合してＣＴＬに提示されることによって認識される。
（４）　　ＨＬＡは人種間、個人間によって異なり、ＨＬＡが異なるとｍＨＡエピトープとなるペプチドが異なるため、ＣＴＬへの提示そのものが出来なくなることがある。
【０００７】
以上の（１）から（４）で述べたことから明らかなように、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋ＣＴＬのｍＨＡエピトープペプチドとなり得るペプチドを含むｍＨＡタンパク質を同定し、該エピトープペプチドのアミノ酸配列を過不足なく決定することは、そのドナーがＨＣＴを受ける患者又は受けた患者に有効なＧＶＴ効果をもたらし得るか否かを診断し、さらには、特異的免疫治療法を施す際の必須の確認事項となり得る。
【０００８】
しかしながら、日本人の多くが保有するＨＬＡ　型（ＨＬＡ−Ａ２４型、６４％；ＨＬＡ−Ａ３３型、２５％；ＨＬＡ−Ａ１１型、２２％；ＨＬＡ−Ａ２．１型、２１％；ＨＬＡ−Ａ３１型、１８％；ＨＬＡ−Ｂ４４型、２４％；ＨＬＡ−Ｂ５２型、２０％；ＨＬＡ−Ｂ３５型、１５％；ＨＬＡ−Ｂ５４型、１４％；ＨＬＡ−Ｃｗ１型、３４％；ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４型、２４％；ＨＬＡ−Ｃｗ＊０３０４型、２２％；ＨＬＡ−Ｃｗ＊０７０２型、２２％；ＨＬＡ−Ｃｗ＊０８０１、２１％；ＨＬＡ−Ｃｗ＊１２０２、２１％等）について、特にＨＬＡ−Ａ２４型、ＨＬＡ−Ｂ４４型等については、ＣＤ８＋ＣＴＬが認識するｍＨＡエピトープペプチドの報告は極めて少なく、ＨＣＴ後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又はＨＣＴ後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するのに有用なｍＨＡエピトープペプチドの開発が求められている。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｃｈｏｉ　ら著、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ誌　第１１巻９号、１６９３−８頁、１９９５年
【非特許文献２】
Ｋｅｎｎｙ　ら著、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ誌　第１４巻８号、９９７−１００１頁、１９９７年
【非特許文献３】
Ｆｕｊｉｉら著、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ誌　第７３巻７号、１１３７−１１４１頁、２００２年
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸残基数９〜１０個からなる部分ペプチドであって、かつ、ＨＬＡと結合してＣＤ８＋ＣＴＬによって認識され得るｍＨＡエピトープペプチド、該ペプチドを用いた同種造血細胞移植後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又は同種造血細胞移植後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するためのワクチン及び受動免疫療法剤、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋ＣＴＬの定量方法、並びに該ペプチドを用いた同種造血細胞移植適合性診断方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋ＣＴＬが認識し得るｍＨＡエピトープペプチドを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１９）を提供する。
（１）　　ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸残基数９〜１０個からなる部分ペプチドであって、かつ、ヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）と結合してＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識され得るマイナー組織適合性抗原（ｍＨＡ）エピトープペプチド。
（２）　ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸残基数９〜１０個からなる部分ペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１９番目、第３９番目又は第８２番目のアミノ酸を含んでなる部分ペプチドである、（１）に記載のペプチド。
（３）　ＨＬＡがＨＬＡ−Ａ２４である、（１）又は（２）に記載のペプチド。
（４）　配列番号３又は４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドである、（３）に記載のペプチド。
（５）　ＨＬＡがＨＬＡ−Ｂ４４である、（１）又は（２）に記載のペプチド。
【００１３】
（６）　配列番号５〜８で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドである、（５）に記載のペプチド。
（７）　ＨＬＡがＨＬＡ−Ａ２である、（１）又は（２）に記載のペプチド。
（８）　配列番号９〜１６で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドである、（７）に記載のペプチド。
（９）　ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するものである、（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチド。
（１０）　造血器腫瘍が白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫又は多発性骨髄腫である、（９）に記載のペプチド。
【００１４】
（１１）　固形腫瘍が腎細胞癌、悪性黒色腫、乳癌、胃癌、肺癌又は前立腺癌である、（９）に記載のペプチド。
（１２）　　（１）〜（１１）のいずれかに記載のペプチド又は該ペプチドをパルスした抗原提示細胞を有効成分として含む、同種造血細胞移植後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又は同種造血細胞移植後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するためのワクチン。
（１３）　（１）〜（１１）のいずれかに記載のペプチド又は該ペプチドをパルスした抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、同種造血細胞移植後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又は同種造血細胞移植後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するための受動免疫療法剤。
（１４）　　（１）〜（１１）のいずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合抗原複合体及び／又は主要組織適合抗原複合体−テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させ、該主要組織適合抗原複合体及び／又は主要組織適合抗原複合体−テトラマーにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、同種造血細胞移植後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又は同種造血細胞移植後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するための受動免疫療法剤。
（１５）　　（１）〜（１１）のいずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合抗原複合体−標識磁気ビーズと末梢血リンパ球とを反応させ、主要組織適合抗原複合体−標識磁気ビーズにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、同種造血細胞移植後に残存又は再発した造血器腫瘍あるいは固形腫瘍を治療するか、又は同種造血細胞移植後の造血器腫瘍あるいは固形腫瘍の再発を予防するための受動免疫療法剤。
【００１５】
（１６）　（１）〜（１１）のいずれかに記載のペプチドで末梢血を刺激してＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を得、該ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球が産生するサイトカイン及び／又はケモカインを測定することを特徴とする、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法。
（１７）　　（１）〜（１１）のいずれかに記載のペプチドから主要組織適合性複合体及び／又は主要組織適合性複合体−テトラマーを調製し、該主要組織適合性複合体及び／又は主要組織適合性複合体−テトラマーと末梢血とを反応させる、該末梢血中の造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の定量方法。
（１８）　　同種造血細胞移植におけるドナー及び患者由来のＤＮＡを配列番号２に示すｂｃｌ２Ａ１遺伝子の多型部位を含む領域の塩基配列を用いてＰＣＲ法により増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物についてドナー及び患者間の遺伝子タイピングを行うことを含む、同種造血細胞移植適合性診断方法。
（１９）　配列番号２に示すｂｃｌ２Ａ１遺伝子の多型部位を含む領域の塩基配列が、（１）に記載のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列である、（１８）に記載の診断方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明についてさらに詳細に説明する。
１．ＣＤ８＋ＣＴＬによって認識され得るｍＨＡエピトープペプチド
本発明におけるペプチドとは、生理活性を有し、隣接するアミノ酸残基のα−アミノ基とカルボキシル基間のペプチド結合により相互に結合した線状のアミノ酸の分子鎖を意味する。ペプチドは特定長のものを意味するものではなく、種々の長さであり得る。また、無電荷又は塩の形態であってもよく、場合によっては、グリコシル化、アミド化、ホスホリル化、カルボキシル化、リン酸化等により修飾されていてもよい。さらには、本発明のエピトープの生理活性及び免疫活性を実質的に改変せず、投与した場合に有害な活性を有するものでない限り、１個又は数個（例えば、１〜８個、好ましくは１〜３個）のアミノ酸の挿入、付加、置換等が生じたペプチドも本発明に含まれる。例えば、ペプチドのＮ末端又はＣ末端に付加的アミノ酸配列が介在するものも含まれる。また、本発明のペプチドは、糖類、ポリエチレングリコール、脂質等が付加された複合体、放射性同位元素等による誘導体、あるいは重合体等の形態として用いることができる。
【００１７】
また、本発明におけるＣＤ８＋ＣＴＬによって認識され得るｍＨＡエピトープペプチドとは、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞の表面にあるＨＬＡに結合して提示され、ドナー由来のＣＤ８＋ＣＴＬのＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）と結合することによってＣＤ８＋ＣＴＬに認識され得る、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞内に存在するｍＨＡタンパク質の部分ペプチドであって、個人に固有な遺伝子多型を有する遺伝子によってコードされる、多型部位を含む９〜１０個のアミノ酸からなるペプチドを意味する。従って、該ペプチドは、ｍＨＡタンパク質を発現するＨＬＡの特定の型の造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を直接に傷害（破壊）し、排除し得る、ＣＤ８＋ＣＴＬの細胞性免疫機構を活性化する抗原基である。なお、ＣＤ８＋ＣＴＬとは、ヒトリンパ球上に存在する表面抗原分子の一つであるＣＤ８を発現しているＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を意味する。図１にその機構を示す。
【００１８】
本発明において、造血器腫瘍には、白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、等の造血関係の組織又は細胞に発生した腫瘍が含まれる。また、本発明において、固形腫瘍とはｂｃｌ２Ａ１遺伝子を異常発現する固形腫瘍であればいかなる固形腫瘍をも含むが、具体的には、腎細胞癌、悪性黒色腫、乳癌、胃癌、肺癌、前立腺癌などが挙げられる。
【００１９】
ｍＨＡタンパク質の候補になりうるものは、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞内にのみ存在し、かつ個人に固有な遺伝子多型を有する遺伝子によってコードされる各種タンパク質である。このうち、１遺伝子の中に３つもの多型部位を有し、かつ造血関係の細胞及び一部の固形腫瘍においてのみその遺伝子が発現されることから、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質が本発明のｍＨＡエピトープペプチドの特定に特に有用である。
【００２０】
ｂｃｌ２Ａ１タンパク質は、造血関係の細胞がＴｉｓｓｕｅ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒなどのサイトカインで活性化されたときに強く誘導され、これらの細胞がアポトーシスという自殺過程をたどって死滅するのを予防する機能を持っている。最初はリンパ腫で過剰発現しているｂｃｌ２遺伝子に類似した遺伝子として同定された（Ｌｉｎら著、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ誌、第１５１巻４号、１９７９−１９８８頁、１９９３年）。造血関係の細胞はターンオーバーのため比較的短期間で死んでいく運命にあるが、細胞が完全に分化するまで細胞を生かしておいたり（Ｌｉｎら著、Ｂｌｏｏｄ誌　第８７巻、９８３−９９２頁、１９９６年）、組織の炎症時に放出されるＴｉｓｓｕｅ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒで必要以上に活性化されて死滅するのを防ぐためｂｃｌ２Ａ１タンパク質が細胞を守っている（Ｋａｒｓａｎら著、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌、第２７１巻４４号、２７２０１−２７２０４頁、１９９６年）。こうした機能から、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質が過剰に発現する造血器腫瘍では、細胞が増殖しやすい環境が作られていると想像される。また固形腫瘍でも同様な機序が考えられる（Ｃｈｏｉ　ら著、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ誌　第１１巻９号、１６９３−８頁、１９９５年）。
【００２１】
なお、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）及び該タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｖａｌ＝Ｕ２９６８０．１に報告されている。
【００２２】
また、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸配列の第１９番目と第３９番目の各々の多型（配列番号１）については、米国のＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）のＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｒｅｆ．ｃｇｉ？ｔｙｐｅ＝ｒｓ＆ｒｓ＝１１３８３５７で確認することができる。
【００２３】
なお、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸配列の第８２番目の多型（配列番号１）は、下記の実施例１に記載するように、患者から樹立したＨＬＡ−Ｂ４４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬを用いてｂｃｌ２Ａ１遺伝子を特定した際、ＨＬＡ−Ｂ４４を発現する１０種類の標的細胞に対するＣＤ８＋ＣＴＬの細胞傷害活性の有無を確認し、ｂｃｌ２Ａ１全遺伝子塩基配列との比較を検討したところ、細胞傷害性のパターンと完全一致する多型性部位が新たに第８２番目に存在することが見いだされて同定されたものであり、本発明者らが初めて確認したものである。
【００２４】
従って、本発明のｍＨＡエピトープペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１９番目、第３９番目又は第８２番目のアミノ酸を含んでなる部分ペプチドである。
【００２５】
なお、個人に固有な遺伝子多型とは、多数の個人（例えば５０人）から得たＤＮＡに対し、ｂｃｌ２Ａ１遺伝子につき塩基配列決定をして、各個人間で配列に差があるか否かを調べ、各個人間で配列に差があった場合には、それが複数の個人で見つかる普遍的なものかどうかを決定し、人口の何％に各多型が存在するかを推測することによって検索することができる個人に固有の遺伝子多型である。
【００２６】
本発明のｍＨＡエピトープペプチドは、ＨＬＡの型によって好適なものが異なるため、各ＨＬＡの型において結合し得るペプチドをスクリーニングすることによって同定することができる。具体的には、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸配列において、第１９番目、第３９番目又は第８２番目のアミノ酸を含んでなる部分ペプチドについて、ＨＬＡの各型（例えば、ＨＬＡ−Ａ２４、Ｂ４４、Ａ２等）の結合モチーフを有する、９〜１０個のアミノ酸よりなるエピトープペプチドを検索し得る照合媒体、例えば、インターネット上に公開されているＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　＆　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｅｃｔｉｏｎ　（ＢＩＭＡＳ）のＨＬＡ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ　（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によって照合し、ｍＨＡエピトープペプチドとなり得るペプチド（以下、ｍＨＡエピトープ候補ペプチドと称する）をスクリーニングすることができる。
【００２７】
ｍＨＡエピトープ候補ペプチドは、通常の化学合成により得ることができる。例えば、固相ペプチド合成法等の有機化学的合成法、あるいは、ペプチドをコードするＤＮＡを調製し、組換えＤＮＡ技術を用いて調製することも可能である。また、市販の化学合成装置（例えば、アプライドバイオシステムズ社の　ペプチド合成装置）による合成も可能である。
【００２８】
得られたｍＨＡエピトープ候補ペプチドについて、例えば、以下に示すようないずれかの方法を実施することによって、ＣＤ８＋ＣＴＬによって認識され得るｍＨＡエピトープペプチドであるか否かを決定することができる。
【００２９】
（１）ｍＨＡエピトープペプチド決定方法１
１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０６／ｍｌ　の細胞濃度で、予めｂｃｌ２Ａ１遺伝子多型を検索しておいた成人から分離したリンパ球を浮遊させ、該リンパ球を同じ人からあらかじめ分離培養しておいた樹状細胞（１×１０５／ｍｌ）あるいは活性化Ｂ細胞（１×１０６／ｍｌ）と混合し、これにｍＨＡエピトープ候補ペプチドの中の任意の１種を１μｇ／ｍｌの濃度で加える。炭酸ガス恒温槽にて３７℃で１０日間培養する。１０日目にＩＬ−２を添加し、以後、前記候補ペプチドとＩＬ−２による刺激を週に１度くり返すことにより、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質多型部位に特異的なＣＤ８＋ＣＴＬを誘導する。このようにして誘導したＣＤ８＋ＣＴＬに対してｍＨＡエピトープ候補ペプチドが刺激するか否かについて、エリスポットアッセイ等で判定する。エリスポットアッセイは、Ｍｉｙａｈｉｒａ　Ｙ，　他著、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１８１巻：４５−５４頁、１９９５等で報告されている。判定により、誘導したＣＤ８＋ＣＴＬに対して刺激が認められた候補ペプチドを本発明のｍＨＡエピトープペプチドとして決定する。
【００３０】
（２）ｍＨＡエピトープペプチド決定方法２
ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸配列において、第１９番目、第３９番目又は第８２番目のアミノ酸を含む、９〜１０個のアミノ酸よりなる部分ペプチドのペプチドライブラリーを常法により合成する。合成したペプチドに対して、エリスポット法や細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量法によりＣＤ８＋ＣＴＬが反応するようなｍＨＡエピトープペプチドを選択して本発明のエピトープペプチドとする。
【００３１】
本発明の配列番号３〜１６のアミノ酸配列を有するペプチドは、上記のようなスクリーニング及び決定方法の結果、ｍＨＡエピトープペプチドとして確認されたものである。本発明の配列番号３〜１６に示されるｍＨＡエピトープペプチドは、従来の各種のペプチド合成方法によって調製され得る。
【００３２】
２．ワクチン
本発明のｍＨＡエピトープペプチドは、能動免疫ペプチドワクチン療法においてワクチンとして用いることができる。すなわち、本発明のｍＨＡエピトープペプチドを含んでなるワクチンをＨＣＴ後の患者に投与することによって、該ペプチドを認識するＣＤ８＋ＣＴＬを体内で増殖させ、造血器腫瘍又は固形腫瘍の予防及び治療に役立てることができる。使用するｍＨＡ　エピトープペプチドは、患者のＨＬＡ及びｍＨＡの型に対応するペプチドを１種若しくは２種以上使用してもよく、また、組み合わせ、混合して使用することができる。例えば、ｍＨＡエピトープペプチドを提示しうるようなＨＬＡが複数存在する場合、２種以上のペプチドを組み合わせて使用することができる。また、例えば、ＨＬＡの特定の型に結合するペプチドとして、２種以上の異なるｍＨＡエピトープペプチド（第１９番目アミノ酸を含む部分ペプチドと第３９番目アミノ酸を含む部分ペプチド等）が存在する場合、それらの２種以上のペプチドを組み合わせて使用することができる。
【００３３】
また、抗原提示細胞（例えば、樹状突起細胞、Ｂ細胞、マクロファージ等）に本発明のｍＨＡエピトープペプチドをパルスしたもの（以下、ｍＨＡエピトープペプチドパルス細胞と称する）を含むワクチンも使用することができる。ここで、抗原提示細胞とは、該ペプチドが結合し得るＨＬＡをその表面上に発現する細胞の中でＣＤ８＋ＣＴＬ刺激能を有するものを意味し、パルスするとは、例えば、適当な培養液中で、抗原提示細胞と該ペプチドを３０分から１時間程度混合することを意味する。
【００３４】
本発明のｍＨＡエピトープペプチド又はｍＨＡエピトープペプチドパルス細胞を含んでなるワクチンは、当分野において公知の方法を用いて調製することができる。
例えば、かかるワクチンとしては、本発明のｍＨＡエピトープペプチド又はｍＨＡエピトープペプチドパルス細胞を有効成分として含有する注射剤又は固形剤等がある。ｍＨＡエピトープペプチドは、中性又は塩の形態で処方することができ、例えば、薬学上許容され得る塩としては、塩酸、リン酸などの無機塩、又は、酢酸、酒石酸などの有機酸が挙げられる。また、本発明のｍＨＡエピトープペプチド又はｍＨＡエピトープペプチドパルス細胞は、製薬上許容され、該ペプチド又は該細胞の活性と相容性を有する賦形剤、例えば、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、ＤＭＳＯ、及びその他のアジュバント等、又はこれらの組み合わせと混合して用いることができる。さらに、必要に応じて、アルブミン、湿潤剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。
【００３５】
本発明のワクチンは、非経口投与及び経口投与により投与することができるが、一般には非経口投与が好ましい。非経口投与としては皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射等の注射剤、座薬等がある。また、経口投与としては、スターチ、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、セルロース等の賦形剤との混合物として調製することができる。
【００３６】
本発明のワクチンは、治療上有効な量で投与する。投与される量は、治療対象、免疫系に依存し、必要とする投与量は臨床医の判断により決定される。通常、適当な投与量は、患者一人当たり、ｍＨＡエピトープペプチドでは１　〜１００ｍｇ、ｍＨＡエピトープペプチドパルス細胞では１０６〜１０９個の含有量とする。また、投与間隔は、対象、目的により設定することができる。
【００３７】
３．受動免疫療法剤
本発明のｍＨＡエピトープペプチドは、ＨＣＴ後の造血器腫瘍の再発に対する予防的または治療的受動免疫治療剤の調製に用いることができる。すなわち、１）末梢血リンパ球を該ペプチドで刺激して得られるＣＤ８＋ＣＴＬ、２）末梢血リンパ球を該ペプチドから調製した主要組織適合抗原複合体（ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ、以下、ＭＨＣと称する）又はＭＨＣ−テトラマーと反応させ、ＭＨＣ又はＭＨＣ−テトラマーにＣＤ８＋ＣＴＬが結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋ＣＴＬ、又は、３）末梢血リンパ球を該ペプチドから調製したＭＨＣ−テトラマー−標識磁気ビーズと反応させ、ＭＨＣ−テトラマー−標識磁気ビーズにＣＤ８＋ＣＴＬが結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られるＣＤ８＋ＣＴＬ、を含む、受動免疫療法剤を得ることができる。　ｍＨＡエピトープペプチドを使用したＭＨＣ及びＭＨＣ−テトラマーは、例えば、以下のように調製することができる。タンパク質発現用の大腸菌から精製したＨＬＡ重鎖、β２ミクログロブリン及び本発明のｍＨＡエピトープペプチドの複合体であるＭＨＣをバッファー内で形成させる。組換えＨＬＡ重鎖タンパク質のＣ末端には予めビオチン結合部位を付加しておき、ＭＨＣ形成後、この部位にビオチンを付加する。市販の標識色素ストレプトアビジンとビオチン化ＭＨＣをモル比１：４で混合することによってＭＨＣ−テトラマーを作製する。図２及び図３に得られたＭＨＣ−テトラマーとその反応機構をそれぞれ示す。なお、各ステップにおいて、ゲル濾過によるタンパク質精製を行うのが好ましい。
【００３８】
受動免疫療法剤に含まれる、本発明のｍＨＡエピトープペプチドを認識し得るＣＤ８＋ＣＴＬは、以下のような調製方法によって得ることができる。
（１）ＣＤ８＋ＣＴＬ調製方法１
リンパ球をＨＣＴ後の患者又はＨＣＴドナーの末梢血から分離し、これを、上記のようにして調製した適当な濃度のＭＨＣ又はＭＨＣ−テトラマーと３７℃、１５分間反応させる。ＭＨＣ又はＭＨＣ−テトラマー中のｍＨＡエピトープペプチドと結合したＣＤ８＋ＣＴＬは標識色素により染色されるので、フローサイトメーターなどを用いて染色されたＣＤ８＋ＣＴＬのみを単離する。あるいは、予め無菌プレートなどに固相化したＭＨＣ及び／又はＭＨＣ−テトラマーに反応させることもできる。プレートに固相化されたＭＨＣ及び／又はＭＨＣ−テトラマー中のｍＨＡエピトープペプチドに結合したＣＤ８＋ＣＴＬを単離するためには、結合せずに浮遊している他の細胞を洗い流した後に、プレート上に残ったＣＤ８＋ＣＴＬだけを新しい培養液に懸濁する。このようにして単離されたＣＤ８＋ＣＴＬは造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害し得るので、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する（図６を参照）。
【００３９】
（２）ＣＤ８＋ＣＴＬ調製方法２
前述のように調製したビオチン化ＭＨＣをストレプトアビジン標識磁気ビーズと結合させ、結合体（以下、ＭＨＣ−磁気ビーズと称する）を作製する。ＭＨＣ−磁気ビーズを図４に示す。リンパ球をＨＣＴ後の患者又はＨＣＴドナーの末梢血等から分離し、適当な濃度の前記ＭＨＣ−磁気ビーズをリンパ球：ビーズ比、１：１０で反応させる。ＭＨＣ−磁気ビーズ中のＭＨＣ／ｍＨＡエピトープペプチドに結合したＣＤ８＋ＣＴＬと結合したＣＤ８＋ＣＴＬの入った試験管を磁場におくと、ビーズと結合したＣＤ８＋ＣＴＬは磁石のある側の試験管内壁に寄せられる。その機構を図５に示す。その後、それ以外の細胞を洗い流した後に、試験管を磁場からはずし、試験管内壁に残った抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬだけを新しい培養液に懸濁する。このように単離されたＣＤ８＋ＣＴＬは造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害し得るので、抗ＣＤ３抗体、ＰＨＡ、ＩＬ−２等のＴ細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する（図６を参照）。
【００４０】
（３）ＣＤ８＋ＣＴＬ調製方法３
ＨＣＴ後の患者又はＨＣＴドナーの末梢血から分離したリンパ球を本発明のｍＨＡエピトープペプチドで直接刺激するか、該ペプチドをパルスした抗原提示細胞（例えば、樹状突起細胞、Ｂ細胞、マクロファージ等）で刺激する。刺激によって誘導されたＣＤ８＋ＣＴＬを炭酸ガス恒温槽にて３７℃で７〜１０日培養する。その後ＩＬ−２を添加し、ｍＨＡエピトープペプチドとＩＬ−２、又は該抗原提示細胞とＩＬ−２による刺激を週に１度くり返すことによって受動免疫療法に必要な細胞数のＣＤ８＋ＣＴＬを確保する（図６を参照）。
【００４１】
上記のようにして得られたＣＤ８＋ＣＴＬは造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害し得るので、ヒトアルブミン含有ＰＢＳ等に懸濁させて、ＨＣＴ後の造血器腫瘍又は固形腫瘍の再発に対するに対する予防的または治療的受動免疫療法剤とすることができる。
【００４２】
４．ＣＤ８＋ＣＴＬの定量
本発明のｍＨＡエピトープペプチドを認識し得るＣＤ８＋ＣＴＬが、ＨＣＴ後の造血器腫瘍又は固形腫瘍の再発ハイリスクの患者（原疾患である造血器腫瘍又は固形腫瘍の悪性度が高く、ＨＣＴ後に強力な免疫抑制剤の投与を受けている患者）のＨＣＴ後の末梢血に存在するか否かを知ることは、免疫抑制剤の適正な使用量の決定や再発リスクの予測を含め、ＨＣＴ後の患者管理の上で重要な情報である。本発明のｍＨＡエピトープペプチドを認識し、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害し得るＣＤ８＋ＣＴＬの定量は、本発明のｍＨＡエピトープペプチドを用いた以下の２つの方法によって行うことができる。
【００４３】
第１の定量方法は、ＨＣＴ患者の移植後の末梢血から分離されたリンパ球を本発明のｍＨＡエピトープペプチドで刺激することによって誘導されるＣＤ８＋ＣＴＬが産生するインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン等のサイトカイン及び／又はケモカインを定量する方法である。以下にＩＦＮγを例にとり具体的に方法を示す。
【００４４】
（１）サイトカイン定量による方法１（細胞内ＩＦＮγ産生細胞定量）；
ＨＣＴ後の患者あるいはＨＣＴドナーの末梢血から分離したリンパ球を１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０６／ｍｌの細胞濃度で浮遊させ、本発明のｍＨＡエピトープペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で加える。さらに細胞内蛋白輸送阻止剤であるＢｒｅｆｅｌｄｉｎ　Ａ等を加え、炭酸ガス恒温槽にて３７℃で５〜６時間培養する。培養後、細胞を固定、膜透過処理を行い、色素標識抗ＩＦＮγ抗体、抗ＣＤ８抗体と反応させる。フローサイトメーター等を用いて、ＣＤ８＋リンパ球中のＩＦＮγ陽性細胞％を定量する。
【００４５】
（２）サイトカイン定量による方法２（エリスポットアッセイ）；
９６穴ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＡプレート（Ｍｉ１１ｉｐｏｒｅ）を抗ＩＦＮγモノクローナル抗体で一晩、４℃でコーティングし各穴をＰＢＳで洗浄した後、ＨＣＴ後の患者あるいはＨＣＴドナーの末梢血から分離したリンパ球を各穴にまく。ｍＨＡエピトープペプチドを各穴に入れ３７℃の５％　ＣＯ２培養器にて２０時間培養する。翌日、０．０５％Ｔｗｅｅｎ‐２０添加ＰＢＳでプレートを洗浄した後、抗ＩＦＮγウサギ血清、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ血清の順で各々９０分ずつ室温で反応させる。さらに３−ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｓｏｌｅ　（Ｓｉｇｍａ）と０．０１５％のＨ２Ｏ２を含む０．１Ｍ　酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ　５．０）を各穴に入れ、室温で４０分反応させる。ＩＦＮγスポットを可視化し、実体顕微鏡でカウントする。
【００４６】
（３）サイトカイン定量による方法３（培養上清中に分泌されたＩＦＮγを定量する方法）；
末梢血から分離したＨＣＴ後の患者あるいはＨＣＴドナーの末梢血を１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０６／ｍｌの細胞濃度で浮遊させ、本発明のｍＨＡエピトープペプチドを１μｇ／ｍｌの濃度で加える。炭酸ガス恒温槽にて３７℃で２４−４８時間培養する。培養後、上清を回収し、その中に含まれるＩＦＮγ濃度を市販のＥＬＩＳＡ　キット（例えばＥＮＤＯＧＥＮ社のＨＵＭＡＮ　ＩＦＮ　ｇａｍｍａ　ＥＬＩＳＡ）を使用して定量する。
【００４７】
第２の定量方法としては、本発明のｍＨＡエピトープペプチドを使用して作製したＭＨＣ−テトラマーを用いて、ｍＨＡエピトープペプチドを認識し、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害し得るＣＤ８＋ＣＴＬを定量することができる。ＭＨＣ−テトラマーの調製は前述のとおりである。定量は、例えば、以下のようにして実施することができる。ＨＣＴ後の患者あるいはＨＣＴドナーの末梢血からリンパ球を分離し、適当な濃度のＭＨＣ−テトラマーと３７℃、１５分反応させる。該テトラマーと結合したＣＤ８＋ＣＴＬは標識色素により染色されるので、フローサイトメーター等を用いてカウントする。
【００４８】
５．適合性の遺伝子診断
ｂｃｌ２Ａ１遺伝子の多型部位を含む領域を利用し、公知のＰＣＲ法を実施することによって、ＨＣＴ療法におけるドナーと患者の適合性を遺伝学的に診断し、ＧＶＴを強化する免疫療法に有用な組み合わせか否かの診断を行うことができる。なお、ＰＣＲ法で用いる少なくとも一方のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブの塩基配列は、ｂｃｌ２Ａ１遺伝子の多型部位を含み、かつドナーと患者が保有する該多型部位がＰＣＲ法によって確認され得る限り、そのオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブの塩基数は、一般的に用いられる１８〜３０ｍｅｒの範囲内において適宜設定することができる。そのようなオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブの塩基配列として利用し得る塩基配列の一例に、本発明のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列が含まれる。診断には、以下のような方法が挙げられる。
【００４９】
（１）ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲによる方法
ｂｃｌ２Ａ１遺伝子の各多型部位を挟む領域を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計する。また、ｂｃｌ２Ａ１遺伝子の各多型部位を含む領域の塩基配列に特異的なプローブに異なった蛍光物質（ＦＡＭやＶＩＣ等の蛍光レポーター色素）及び消光物質を結合したものを準備し、前記ＰＣＲプライマーと共に試料ＤＮＡ（患者およびドナーの末梢血約１ｍｌから市販のＤＮＡ抽出キット（例えば、キアゲン社のＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ）等を用いてＤＮＡを分離精製したもの）に対しＰＣＲ反応を行うと、該当する塩基配列が存在する場合のみ対応するプローブが分解されて蛍光を発生するようになる。なお、ＰＣＲ反応は、試料ＤＮＡの塩基配列とプローブの塩基配列間で１個のミスマッチが存在する場合にハイブリダイズしないストリンジェンシー条件を用いて両配列をハイブリダイズさせる。ストリンジェンシー条件は、実施されるハイブリダイゼーションの条件によって異なるが、当業者であればハイブリダイゼーションのプロトコルに基づいて、温度、塩濃度、界面活性剤濃度等の溶媒組成等の条件を適宜設定することができる。発生した蛍光を測定することで、ドナー及び患者のｂｃｌ２Ａ１タンパク質の第１９番目、第３９番目又は第８２番目のアミノ酸のパターンを判読する。ドナーと患者間でタイピングを施行することにより、該ｍＨＡエピトープペプチドが適合であるか、あるいは不適合であるかを確認し、不適合である場合にはＧＶＴを強化する免疫療法に有用な組み合わせであるか否かを診断することが可能となる。
【００５０】
（２）アリル特異的ＰＣＲによる方法
ＰＣＲプライマーの一方の３’側がｂｃｌ２Ａ１遺伝子の各多型部位を含む領域の各塩基配列に特異的となるようにプライマーを設計する。他方のプライマーは両アリル共通とする。ＰＣＲ反応を上記のようにして調製した試料ＤＮＡに対して個々に行うと、ｂｃｌ２Ａ１遺伝子の各多型部位を含む領域の塩基配列に適合するプライマーが存在する場合のみＰＣＲ反応で増幅が起こるため、ＨＣＴ療法におけるドナーと患者の適合性の判定が可能となる。
【００５１】
（３）ＰＣＲ−ＲＦＬＰによる方法
ｂｃｌ２Ａ１遺伝子の各多型部位を含む領域を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計する。ＰＣＲ反応を上記のように調製した試料ＤＮＡに対して個々に行った後に、各ｂｃｌ２Ａ１遺伝子の各多型部位を含む領域の塩基配列を特異的に認識するような制限酵素を用いて消化した後ゲル上で電気泳動して、切断の有無により試料中のｂｃｌ２Ａ１遺伝子の各多型部位を含む領域の有無を確認し、ＨＣＴ療法におけるドナーと患者の適合性を判定する。
【００５２】
（４）直接塩基配列決定による方法
ｂｃｌ２Ａ１遺伝子の各多型部位を含む領域を増幅するようにＰＣＲプライマーを設定し、ＰＣＲ反応を上記のように調製した試料ＤＮＡに対して個々に行う。ＰＣＲ増幅産物を精製後鋳型として用い、ＰＣＲに使用したプライマーを使って直接塩基配列決定を行い、ｂｃｌ２Ａ１遺伝子の各多型部位を含む領域の増幅部分の塩基配列を直接読みとる。その配列の結果をもとに、ＨＣＴ療法におけるドナーと患者の適合性を判定する。
【００５３】
以上のようなＰＣＲを用いた各種方法による結果によって、ＨＣＴ療法におけるドナー及び患者由来のｂｃｌ２Ａ１タンパク質の多型部位及び／又はｂｃｌ２Ａ１タンパク質のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列を確認してＨＣＴ療法におけるドナーと患者の適合性を判定し、ＧＶＴを強化する免疫療法に有用な組み合わせか否かの診断を行うことができる。以下に、得られたＰＣＲ増幅産物についてドナー及び患者間の遺伝子タイピングを行った結果に基づいた判定の一例を示す。ただし、これに限定されるものではない。
【００５４】
ＨＬＡ−Ａ２４を有するドナー及び患者間において、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質の適合性を確認し、患者のＧＶＴを強化する免疫療法が有効であるかを判定する有用なｂｃｌ２Ａ１遺伝子の多型部位を含む領域としては、一例として、配列番号３及び／又は配列番号４のｍＨＡエピトープペプチドが利用可能である。
【００５５】
例えば、前記各種ＰＣＲ法による結果、（１）ドナーから調製したＤＮＡ試料中に配列番号３のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする塩基配列が存在し、（２）患者から調製したＤＮＡ試料中に配列番号４のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする塩基配列が存在する場合は、両者のｂｃｌ２Ａ１タンパク質が不適合であり、この場合、ドナー由来のＣＤ８＋ＣＴＬは患者のＧＶＴを強化し得る。
【００５６】
また、逆に、（１）ドナーから調製したＤＮＡ試料中に配列番号４のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする塩基配列が存在し、（２）患者から調製したＤＮＡ試料中に、配列番号３のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする塩基配列が存在する場合にも、両者のｂｃｌ２Ａ１タンパク質は不適合であり、ドナー由来のＣＤ８＋ＣＴＬは患者のＧＶＴを強化し得る。
【００５７】
さらに、（１）ドナーから調製したＤＮＡ試料中に配列番号３または４のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする塩基配列が存在し（すなわちドナーが配列番号３または４の塩基配列のホモ接合である場合）、（２）患者から調製したＤＮＡ試料中に、配列番号３および４のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする塩基配列が存在する場合（すなわち患者が配列番号３および４の塩基配列のヘテロ接合である場合）にも、両者のｂｃｌ２Ａ１タンパク質は不適合であり、ドナー由来のＣＤ８＋ＣＴＬは患者のＧＶＴを強化し得る。
【００５８】
しかしながら、ドナーから調製したＤＮＡ試料及び患者から調製したＤＮＡ試料に、配列番号３又は４（すなわち配列番号３又は４の塩基配列のホモ接合である場合）あるいは３及び４（すなわち配列番号３及び４の塩基配列のヘテロ接合である場合）の同じ配列番号のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列がハイブリダイズする塩基配列が存在する場合には、両者のｂｃｌ２Ａ１タンパク質は適合しており、ドナー由来のＣＤ８＋ＣＴＬは患者のＧＶＴを強化するのに適当ではない。
【００５９】
また、ＨＬＡ−Ｂ４４を有するドナー及び患者間において、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質の適合性を確認し、患者のＧＶＴを強化する免疫療法が有効であるかを判定する有用なｂｃｌ２Ａ１遺伝子の多型部位を含む領域としては、一例として、配列番号５及び／又は配列番号６のｍＨＡエピトープペプチドが利用可能である。
【００６０】
例えば、前記各種ＰＣＲ法による結果、（１）ドナーから調製したＤＮＡ試料中に配列番号５のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする配列が存在し、（２）患者から調製したＤＮＡ試料中に配列番号６のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする配列が存在する場合は、両者のｂｃｌ２Ａ１タンパク質が不適合であり、この場合、ドナー由来のＣＤ８＋ＣＴＬは患者のＧＶＴを強化し得る。
【００６１】
また、逆に、（１）ドナーから調製したＤＮＡ試料中に配列番号６のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする配列が存在し、（２）患者から調製したＤＮＡ試料中に配列番号５のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする配列が存在する場合にも、両者のｂｃｌ２Ａ１タンパク質は不適合であり、ドナー由来のＣＤ８＋ＣＴＬは患者のＧＶＴを強化し得る。
【００６２】
さらに、（１）ドナーから調製したＤＮＡ試料中に配列番号５又は６のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする塩基配列が存在し（すなわちドナーが配列番号５又は６の塩基配列のホモ接合である場合）、（２）患者から調製したＤＮＡ試料中に、配列番号５及び６のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする塩基配列が存在する場合（すなわち患者が配列番号５及び６の塩基配列のヘテロ接合である場合）にも、両者のｂｃｌ２Ａ１タンパク質は不適合であり、ドナー由来のＣＤ８＋ＣＴＬは患者のＧＶＴを強化し得る。
【００６３】
しかしながら、ドナーから調製したＤＮＡ試料及び患者から調製したＤＮＡ試料に、配列番号５又は６、あるいは５及び６の同じ配列番号のｍＨＡエピトープペプチドをコードする塩基配列とハイブリダイズする配列が存在する場合には、両者のｂｃｌ２Ａ１タンパク質は適合しており、ドナー由来のＣＤ８＋ＣＴＬは患者のＧＶＴを強化するのに適当ではない。
【００６４】
なお、これらの組み合わせのペプチドをコードする塩基配列のうち、いずれかのペプチドをコードする塩基配列の単独使用によりＰＣＲ法を実施することもできるが、判定の結果の精度を高め、ＤＮＡ断片の由来を確実に確認するために、これらのペプチドをコードする塩基配列は組み合わせて使用することが望ましい。
【００６５】
一方、ＧＶＴ反応の反対の反応が宿主対移植片反応であり、これはＨＣＴの際に輸注したドナーの造血細胞の拒絶に結びつく危険な反応であるが、輸血歴の長い再生不良性貧血や骨髄異形成症候群の患者において比較的発生しやすい移植造血細胞の拒絶リスクの予測にも本発明のペプチドを利用できる可能性がある。
【００６６】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］　　造血器腫瘍細胞を傷害し得るＣＤ８＋ＣＴＬエピトープペプチドの同定
１．各種材料の調製
（１）血液の入手
造血器腫瘍である白血病（２症例：急性骨髄性白血病（ＨＬＡ−Ａ２４）、慢性骨髄性白血病（ＨＬＡ−Ｂ４４））に対しＨＬＡ一致同胞からＨＣＴを受ける患者の移植前および移植後末梢血及びＨＣＴドナーの末梢血から単核球細胞を分離した。ＨＬＡ型は血清法を用いて測定した。
【００６７】
（２）ＥＢＶ感染Ｂ細胞株
ＨＣＴドナーおよび移植前の患者末梢血単核球細胞にＥＢＶ産生細胞株であるＢ９５−８細胞の上清（生ＥＢＶウイルスを含む）を感染させて、ＥＢＶ感染Ｂ細胞株（Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ、以下、ＥＢＶ感染ＬＣＬと称する）を樹立した。
また、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ｂ４４を持った健常人の末梢血単核球細胞に、同様にＥＢＶ産生細胞株であるＢ９５−８細胞の上清を感染させて、ＥＢＶ感染ＬＣＬを樹立した。
【００６８】
２．ｍＨＡエピトープペプチドに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬの培養樹立
（１）　　　ｍＨＡエピトープペプチドに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬ
前記１．（１）で取得したＨＣＴ後の患者末梢血単核球細胞を、細胞致死量の放射線を照射しておいたＨＣＴ前の患者末梢血単核球細胞とともにフラスコ内で混合培養した。ドナーと患者間にはｍＨＡエピトープペプチドの不適合があり、患者のｍＨＡエピトープペプチド（抗原）に反応したドナーリンパ球由来のＣＤ８＋ＣＴＬが増殖を開始した。ＣＤ８＋ＣＴＬの増殖を助けるために、培養液にはＩＬ−２を添加した。
【００６９】
（２）　　患者のｍＨＡエピトープペプチドに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬクローンの樹立と細胞傷害性試験
２．（１）で増殖した２症例より得た２つのＣＤ８＋ＣＴＬ株から、限界希釈法を用いてＣＤ８＋ＣＴＬクローンを樹立した。各々のＣＤ８＋ＣＴＬ株から複数のＣＴＬクローンが得られたが、健常人より作成したＥＢＶ感染ＬＣＬに対する反応パターンが同等であったので、同一の細胞に起源する娘クローンと考えられた。従って、各々のＣＤ８＋ＣＴＬ株より増殖の良好なＣＴＬクローンを１つずつ選び、以下の実験に供した。選択された２種類のＣＴＬクローンは、５１Ｃｒ遊離法を用いた細胞傷害性試験において、ＨＣＴドナーのＥＢＶ感染ＬＣＬ　は傷害しないが、患者のＥＢＶ感染ＬＣＬ　は傷害したため、患者のｍＨＡエピトープペプチドに特異的と考えられた。またＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ｂ４４を持った健常人より作成しておいた複数のＥＢＶ感染ＬＣＬに対する反応性から、２種類のＣＤ８＋ＣＴＬクローンは、各々、ＨＬＡ−Ａ２４及びＨＬＡ−Ｂ４４によって提示されるｍＨＡエピトープペプチドを認識していることが判明した（以下、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローン、ＨＬＡ−Ｂ４４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンと称する）。
【００７０】
さらに、図７に示すように４例の造血器腫瘍患者（２例の急性骨髄性白血病ＦＡＢ分類Ｍ２型、１例の急性骨髄性白血病ＦＡＢ分類Ｍ６型、１例の慢性骨髄単球性白血病ＣＭＭｏＬ）から初発時の白血病細胞を採取し、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンの細胞傷害性を検討したところ、同じ患者より樹立したＥＢＶ感染ＬＣＬのみならず急性骨髄性白血病細胞を強く傷害したことより、造血器腫瘍細胞を実際に傷害することが示された。なお、ＣＭＭｏＬ細胞は強く傷害されなかったが、同患者より樹立したＥＢＶ感染ＬＣＬも強く傷害されず、本例ではもともとｂｃｌ２Ａ１遺伝子の発現が弱い可能性が示唆された。
【００７１】
３．リンケージ解析によるｍＨＡをコードする遺伝子の同定
（１）　　細胞パネルの作成と細胞傷害性試験
国際組織適合ワークショップよりＣＥＰＨ（Ｃｅｎｔｒｅ　ｄ’Ｅｔｕｄｅ　ｄｕ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ　Ｈｕｍａｉｎ）家系のＥＢＶ感染ＬＣＬを入手し、これら各ＥＢＶ感染ＬＣＬにＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ｂ４４遺伝子を各々導入して、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ｂ４４を細胞表面に発現する各細胞パネルを作成した。これらを標的細胞とし、２．　（２）で得られたＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローン及びＨＬＡ−Ｂ４４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンを用いて５１Ｃｒ遊離法を用いた細胞傷害性試験を行い、どのＥＢＶ感染ＬＣＬに、造血器腫瘍患者と同じ多型性を持つｍＨＡエピトープペプチドが存在しているか検討した。その結果、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローン及びＨＬＡ−Ｂ４４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンに全く同一の細胞傷害性パターンが示された。ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローン及びＨＬＡ−Ｂ４４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンの結果を図８に示す。
【００７２】
（２）　　２点連鎖解析
インターネット上に公開されているＦＡＳＴＬＩＮＫソフトウエアおよびＣＥＰＨ家系の遺伝子解析データベースを、それぞれｆｔｐ：／／ｆａｓｔｌｉｎｋ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ｆａｓｔｌｉｎｋおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｐｈｂ．ｆｒ／ｃｅｐｈｄｂ／より入手し、３．（１）で得た細胞傷害性試験の成績と組み合わせ、２　（１）で得られたＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローン及びＨＬＡ−Ｂ４４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンが認識している遺伝子座を特定したところ、第１５番染色体長腕２４．３付近と判明した。この遺伝子座にある３２種類の遺伝子のうち、２箇所以上の多型性部位を有し、ＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ｂ４４の双方に提示される複数のｍＨＡエピトープペプチドをコードし得る遺伝子はｂｃｌ２Ａ１のみであった。
【００７３】
４．ＨＬＡ−Ａ２又はＨＬＡ−Ｂ４４に結合し得るｍＨＡエピトープペプチドの同定
配列番号１に示すｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸配列について、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ｂ４４の結合モチーフを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるエピトープペプチドを検索し得る、インターネット上に公開されているＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　＆　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｅｃｔｉｏｎ　（ＢＩＭＡＳ）のＨＬＡ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．）によって照合し、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ｂ４４の結合モチーフを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるｍＨＡエピトープ候補ペプチドを多数スクリーニングし、６種のｍＨＡエピトープ候補ペプチドを合成した。
これを５１Ｃｒで放射線ラベルしておいたｍＨＡ陰性のＨＣＴドナーの細胞に添加して３０分室温で静置した後、適当な数の２．（２）で得られたＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローン又はＨＬＡ−Ｂ４４拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬクローンと混合し、細胞傷害性試験を行った。
【００７４】
また、ＣＤ８＋ＣＴＬ　ｍＨＡエピトープペプチドが内因性にプロセスされていることを確認するためにｂｃｌ２Ａ１遺伝子の各多型部位をコードするミニ遺伝子を作成し、ｍＨＡ陰性のドナーのＥＢＶ感染ＬＣＬに導入し、これを抗原提示細胞とした５１Ｃｒ遊離試験を同様に行った。ここで、内因性にプロセスされているとは、ミニ遺伝子導入細胞内で新規に作られたｂｃｌ２Ａ１タンパク質が、細胞が本来持つ抗原処理機構により正しい長さの抗原ペプチドに切断され、ＨＬＡ重鎖とβ２ミクログロブリンと複合体を形成しｂｃｌ２Ａ１ミニ遺伝子導入細胞表面に提示されている状態のことを意味する。
【００７５】
上記の試験方法に従って、ＣＤ８＋ＣＴＬ、またそのＣＤ８＋ＣＴＬクローンが反応した、以下の配列番号３〜８で表されるｍＨＡエピトープペプチドを得た。これらのペプチドのうち配列番号３及び４は、ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有するペプチド配列であり、配列番号５〜８はＨＬＡ−Ｂ４４結合モチーフを有するペプチド配列である。
【００７６】
また、配列番号３及び４のｍＨＡエピトープペプチドは配列番号１で表されるｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸配列において、第１９番目のアミノ酸を含んでなる部分ペプチドであり、配列番号５〜８のｍＨＡエピトープペプチドは配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第８２番目のアミノ酸を含んでなる部分ペプチドである。
Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ（配列番号３）
Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ（配列番号４）
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ（配列番号５）
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ（配列番号６）
Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ（配列番号７）
Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ（配列番号８）
【００７７】
［実施例２］　　ＨＬＡ−Ａ２に結合し得るｍＨＡエピトープペプチドの同定
前記の配列番号３〜８に示されるペプチドは、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質の第１９番目のアミノ酸又は第８２番目のアミノ酸を各々含む部分ペプチドであって、かつ、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ｂ４４に結合するｍＨＡエピトープペプチドであったが、さらに、ＨＬＡ−Ａ２に結合し得るｍＨＡエピトープペプチドを検討するために、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸配列について、インターネット上に公開されているＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　＆　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）のＨＬＡ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．）によって照合した結果、ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有する９〜１０個のアミノ酸よりなるｍＨＡエピトープが存在することが判明し、次の８種のエピトープ候補ペプチドを同定した。
【００７８】
これらの配列のうち、配列番号９から１２で表されるペプチドは、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸配列において、第１９番目アミノ酸を含む部分ペプチドであり、配列番号１３〜１６で表されるペプチドは、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸配列において、第３９番目アミノ酸を含む部分ペプチドである。
Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ（配列番号９）
Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ（配列番号１０）
Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ（配列番号１１）
Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ（配列番号１２）
Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ（配列番号１３）
Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ（配列番号１４）
Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ（配列番号１５）
Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ（配列番号１６）
【００７９】
［実施例３］ワクチン注射剤
ＤＭＳＯに、配列番号３〜１６のペプチドを最終濃度２０ｍｇ／ｍｌとなるように各々溶解し、ろ過滅菌した。得られたペプチド含有溶液を滅菌バイアル瓶に１ｍｌずつ分注密栓し、ワクチン注射剤とした。
【００８０】
［実施例４］ｍＨＡエピトープペプチドから調製したＭＨＣ−テトラマーを用いてＨＣＴ後患者末梢血中の造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋ＣＴＬを定量する方法
１．ＭＨＣ−テトラマーの調製
（１）ＭＨＣの調製
大腸菌による組換蛋白発現系を用いてＨＬＡ　Ａ＊２４０２重鎖およびβ２ミクログロブリンを大量に作成、精製した。なお、ＨＬＡ　Ａ＊２４０２重鎖Ｃ末端には、ビオチンリガーゼが認識するアミノ酸配列を予め付加しておいた。精製ＨＬＡ　Ａ＊２４０２重鎖およびβ２ミクログロブリンをそれぞれ８Ｍ尿素に溶解した。　２００　ｍｌ　の　ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ８．０　；　１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　４００　ｍＭ　Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ＨＣｌ，　２　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．５　ｍＭ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，　５　ｍＭ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）内に、配列番号４のペプチド１２ｍｇ、ＨＬＡ　Ａ＊２４０２重鎖１８．６ｍｇ、β２ミクログロブリン１３．２ｍｇそれぞれを２７ゲージ針の付いた注射器を用いて注射した。　１０℃恒温槽において４８〜７２時間撹拌し、ＭＨＣの形成を促した後、ＭＨＣを含むｒｅｆｏｌｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを１．８Ｌの蒸留水に対して２４時間、４℃恒温槽において透析し、透析後のｒｅｆｏｌｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒをセントリプレップ１０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，　Ｂｅｄｆｏｒｄ，　ＭＡ）を用いて２ｍｌに濃縮した。　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ＨＲ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＢ，　Ｕｐｐｓａｌａ，　Ｓｗｅｄｅｎ）カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量４５ＫＤあたりに流出するＭＨＣを単離した。
【００８１】
（２）ビオチン化ＭＨＣの調製
ビオチンリガーゼ（ＡＶＩＤＩＴＹ，　Ｄｅｎｖｅｒ，　ＣＯ）を用いて、ＨＬＡ　Ａ＊２４０２重鎖Ｃ末端の特異的部位にビオチンを結合させた。　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ＨＲ　カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにてビオチンを付加したＭＨＣを精製した。
【００８２】
（３）ＭＨＣ−テトラマーの調製
ＰＥ標識ストレプトアビジン　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ，　Ｅｕｇｅｎｅ，　ＯＲ）と精製ビオチン化ＭＨＣをモル比１：４で混合した。　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ＨＲ　カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにて分子量４８０ＫＤあたりに流出する配列番号４のペプチドを含むＭＨＣ−テトラマーを単離した。セントリコン１０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて約３ｍｇ／ｍｌに濃縮し、４℃に保存した。保存剤としては、Ｎａ−Ａｚｉｄｅ、ＥＤＴＡ、　Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、　Ｐｅｐｓｔａｔｉｎを添加した。
【００８３】
２．ＭＨＣ−テトラマーを用いた造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋ＣＴＬ　の定量
ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のＨＬＡ−Ａ２４で提示されるｍＨＡエピトープペプチドが不適合なドナーとのＨＣＴを受けたＨＬＡ−Ａ２４を有する患者からＨＣＴ後４３日目に分離した末梢血リンパ球（１×１０６）、あるいは前記患者の末梢血リンパ球を配列番号４に示すペプチドで２週間刺激した後増殖してきたリンパ球（１×１０６）を１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内で５０μＬの２％ＦＣＳ含有ＰＢＳに懸濁した。これに、配列番号４のペプチドを含むＭＨＣ−テトラマー、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体（ＣＡＬＴＡＧ，　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，　ＣＡ）を各１μＬずつ添加し、３７℃恒温槽に１５分静置し反応させた。反応後の細胞を２％　ＦＣＳ含有ＰＢＳ　１ｍｌで３回洗浄し、次いで、０．５％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（１ｍｌ）に懸濁した。前記ＭＨＣ−テトラマーと結合したＣＤ８＋ＣＴＬは標識色素により染色され、ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・デイッキンソン）を用いてＦＩＴＣ−ＣＤ８＋Ｔ細胞中のテトラマー陽性細胞をカウントし、その割合を計算した。
【００８４】
解析の結果を図９に示す。ＭＨＣ−テトラマーに結合した、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋ＣＴＬは染色されるので右に移動する。図中、ＡはＨＣＴドナーの末梢血を染色したもの（陰性コントロール）であり、Ｂは配列番号４のペプチドに結合するＣＤ８＋ＣＴＬクローン（陽性コントロール）である。Ｃはｂｃｌ２Ａ１タンパク質のｍＨＡエピトープペプチドの不適合ＨＣＴを受けた患者の移植後４３日目の末梢血（図Ｃの右上の点の集団がテトラマー陽性細胞）、Ｄはさらに配列番号４のペプチドでＣにおいて用いた患者末梢血を２回、２週間刺激した後に増殖してきたリンパ球である。この結果から、前記ＭＨＣ−テトラマーが配列番号４のｍＨＡエピトープペプチドで刺激されて増殖してきたＣＤ８＋ＣＴＬを特異的に染色していることが明らかである。
【００８５】
【発明の効果】
本発明により、ｂｃｌ２Ａ１タンパク質のアミノ酸残基数９〜１０個からなる部分ペプチドであって、かつ、ヒト主要組織適合性抗原（ＨＬＡ）と結合してＣＤ８＋ＣＴＬによって認識され得るｍＨＡエピトープペプチドを提供することができる。また、該ペプチドを用いて、ＨＣＴを受けた患者の造血器腫瘍又は固形腫瘍を治療又は予防することができる。さらに、ＨＣＴ後の患者体内の造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋ＣＴＬを定量することができる。また、該ペプチドを用いた同種造血細胞移植適合性診断方法を提供することが可能である。
【００８６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＤ８＋ＣＴＬによる造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞の認識機構を示す図である。
【図２】ＭＨＣ−テトラマーの調製方法を示す図である。
【図３】ＭＨＣ−テトラマーとＣＤ８＋ＣＴＬの結合を示す図である。
【図４】ＭＨＣ−磁気ビーズの調製方法を示す図である。
【図５】ＭＨＣ−磁気ビーズによるＣＤ８＋ＣＴＬの単離を示す図である。
【図６】ｍＨＡエピトープペプチド、及びその後の抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２による刺激による、ＣＤ８＋ＣＴＬの増殖を示す図である。
【図７】ＨＬＡ−Ａ２４拘束性クローンと結合するＣＤ８＋ＣＴＬによる種々の白血病細胞の細胞傷害性を示す図である。
【図８】ＨＬＡ−Ａ２４拘束性クローン、ＨＬＡ−Ｂ４４拘束性クローンが、ＣＥＰＨ家系より樹立したＥＢＶ感染ＬＣＬに各々ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ｂ４４を発現させたものに対して、全く同様なパターンで傷害するのを示す図である。
【図９】本発明の配列番号４のペプチドにより調製したテトラマーによる、造血器腫瘍細胞又は固形腫瘍細胞を傷害するＣＤ８＋ＣＴＬの同定と定量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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