(57)【要約】      （修正有）【課題】ケラチノサイト増殖抑制剤の提供。【解決手段】下記式化合物（１）〜（３）のゼアラレノン類を有効成分とするケラチノサイト増殖抑制剤。2004292314.tif 000006【効果】上記ケラチノサイト増殖抑制剤は、乾癬、免疫性皮膚疾患、アレルギー性皮膚疾患、炎症性皮膚疾患、又は慢性創傷等皮膚疾患等の治療剤又は予防剤として有効である。【選択図】  図１
2004292314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼアラレノン類を有効成分とするケラチノサイト増殖抑制剤。
【請求項２】
ゼアラレノン類を有効成分とする、ケラチノサイトの異常増殖を伴う皮膚疾患の治療剤または予防剤。
【請求項３】
皮膚疾患が、乾癬、免疫性皮膚疾患、アレルギー性皮膚疾患、炎症性皮膚疾患、または慢性創傷である請求項２記載の治療剤または予防剤。
【請求項４】
ゼアラレノン類が、下記の化合物（１）〜（３）
【化１】
2004292314.tif 000005
から選択される、請求項１〜３に記載の抑制剤、治療剤または予防剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ケラチノサイト増殖抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
通常の生理状態では皮膚上皮細胞であるケラチノサイトの増殖は厳密に制御されている。しかしながら、乾癬、免疫性・アレルギー性皮膚疾患、慢性創傷等の多くの皮膚疾患においては、ケラチノサイトの細胞増殖制御機構が破綻をきたし、皮膚上皮細胞の病的な異常増殖による皮膚の肥厚が認められる。上皮細胞増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）等の種々の増殖因子やインターロイキン１、４、６、８等のサイトカインの過剰産生が認められ、それに反応したケラチノサイトの細胞増殖の亢進が認められるが（  Ｇｅｎ．  Ｐｈａｒｍａｃ．，  （１９９８）  ５，  ６１９−６２２）、上述の疾患における詳細なケラチノサイト増殖メカニズムは不明である。従って、ケラチノサイトの病的な細胞増殖を抑制する物質が見出されれば、ケラチノサイトの異常増殖を特徴とする種々の皮膚疾患の治療薬としての利用が期待できる。さらに、線維芽細胞等の間質細胞の増殖には影響が無い物質であれば副作用の軽減の面でも有用性が期待される。
【０００３】
これまで種々の乾癬治療薬が報告されているが、その効果は満足できるものではなく、より有効な乾癬治療薬が望まれている。
ところで、ゼアラレノン類は、これまでに種々の化合物が報告されており、また、種々の作用、例えば、サイトカイン、特にＩＬ−１の産生抑制（特開平８−４０８９３号公報、欧州第６０６０４４Ａ号公報など）、チロシンキナーゼ阻害（ＷＯ９６／１３２５９号公報）、ＭＥＫ１キナーゼ阻害に基づくＴ細胞の活性化及び活性化に伴う増殖阻害（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３７；  ９５７９−９５８５，  １９９８）、ＪＮＫ／ｐ３８活性化の阻害（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２５７；１９−２３，  １９９９）、ＭＥＫ阻害（Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ５２；１０８６−１０９４，  １９９９）、ＬＰＳ刺激後のサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）産生阻害（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｉｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ２１；７９９−８１４，  １９９９）、  ＬＰＳ、ＩＦＮ−γ刺激後のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）産生抑制（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ８；７５１−７６１，  １９９６）など、についても報告されている。
【０００４】
しかし、これまで、ゼアラレノン類がケラチノサイトの増殖を抑制する作用を有することは知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ケラチノサイト増殖抑制剤を提供することである。本発明は、また、ケラチノサイトの増殖を伴う皮膚疾患の治療または予防剤を提供することも目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ある種のゼアラレノン類がケラチノサイト特異的な細胞増殖抑制作用を有することを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、ゼアラレノン類を有効成分とするケラチノサイト増殖抑制剤を提供する。また、本発明は、ゼアラレノン類を有効成分とする、ケラチノサイトの異常増殖を伴う皮膚疾患の治療剤または予防剤を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において、ゼアラレノン類には、例えば以下に示されるような、ゼアラレノンおよびその誘導体が含まれる：
【０００９】
【化２】
2004292314.tif 000003
【００１０】
【化３】
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【００１１】
化合物（１）〜（１４）は、自体公知の化合物であり、文献（例えば、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｉｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ２１：７９９−８１４，  １９９９；Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ４３：  ２３３９−２３４３，  １９７８；Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ４１：３７３−３７５，  １９９３；Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ５２：１０７７−１０８５，  １９９９；Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２５７：１９−２３，  １９９９；Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，  ８：７５１−７６１，  １９９６；Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ７：３０１−３０８，  １９９６；日本特許公開平８−４０８９３号公報；欧州特許公開第６０６０４４Ａ号公報；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３７：  ９５７９−９５８５，
１９９８など）に記載の方法により調製することができる。
【００１２】
ゼアラレノン類としては、化合物（１）〜（３）が好ましく、化合物（１）が特に好ましい。
【００１３】
ケラチノサイトの異常増殖を伴う皮膚疾患には、ケラチノサイトの細胞増殖制御機構が破綻をきたすことにより、皮膚上皮細胞の病的な異常増殖により皮膚の肥厚が認められる各種の疾患などが含まれる。このような皮膚疾患の非限定的具体例としては、乾癬、免役性皮膚疾患、アレルギー性皮膚疾患、炎症性皮膚疾患、慢性創傷などが挙げられ、これら皮膚疾患のいずれに対しても本発明のケラチノサイト増殖抑制剤が治療剤もしくは予防剤として有効であることが期待される。
【００１４】
本発明のケラチノサイト増殖抑制剤を含む医薬の投与形態は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよく、また、全身投与でも局所投与でもよい。本発明の医薬は、一般的には、非経口的に投与することができ、スプレー剤、クリーム、ローション、軟膏などとして経皮的に投与することや、注射剤として静脈内、筋肉内または皮下に投与することができる。
【００１５】
投与量は、患者の体型、年齢、体調、疾患の種類や度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができる。
【００１６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００１７】
【実施例】
（実施例１）正常ヒトケラチノサイトの細胞増殖への本発明化合物の効果
新生児由来の正常ヒトケラチノサイト（三光純薬社製）を１ウエル当たり２×１０３個となるように９６穴プレートにＫＧＭ−２培地を用いて播種し、細胞が接着した後に化合物（１）を最終濃度１０−９〜１０−５  ｍｏｌ／Ｌになるように添加した。３日間培養後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ＷＳＴ−８，  ナカライテスク社製）を培地の１／１０量添加し、３７℃で１時間培養後、０．１  ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを培地の１／１０量添加して反応を停止した。その後、直ちにマイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（参照波長：６５５ｎｍ）の吸光度を測定した。細胞を含有しない培地に同様の処置を施したものをバックグラウンドとし、測定値からバックグラウンドを引いた値を算出した。
【００１８】
結果を図１に示す。図１において、各プロットは、ｍｅａｎ±ＳＤ  （ｎ＝４）を示す。＊＊＊は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較（コントロール群との比較）においてｐ＜０．００１であることを示す。
【００１９】
化合物（１）は１０−７〜１０−５  ｍｏｌ／Ｌの濃度でヒトケラチノサイトの増殖を有意に抑制し（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較，  ｐ＜０．００１）、そのＩＣ５０値は、４．８×１０−８  ｍｏｌ／Ｌであった。
【００２０】
続いて、正常ヒトケラチノサイトの増殖抑制効果を［３Ｈ］チミジンの取り込みにより評価した。すなわち、新生児由来正常ヒトケラチノサイト１ウエル当たり２×１０３個となるように９６穴プレートにＫＧＭ−２培地を用いて播種し、細胞が接着した後に化合物（１）を最終濃度１０−９〜１０−５  ｍｏｌ／Ｌになるように添加した。３日間培養後、［３Ｈ］チミジン（アマシャム・ファルマシア社製）を添加して更に一晩培養し、［３Ｈ］チミジンの細胞への取り込みを液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００２１】
結果を図２に示す。図２において、  各プロットは、ｍｅａｎ±ＳＤ  （ｎ＝５）を示す。＊＊＊は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較（０  ｍｏｌ／Ｌ濃度の化合物（１）の  群との比較）においてｐ＜０．００１であることを示す。
【００２２】
その結果、化合物（１）は１０−７〜１０−５  ｍｏｌ／Ｌの濃度でヒトケラチノサイトの［３Ｈ］チミジンの取り込みを有意に抑制し（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較，  ｐ＜０．００１）、そのＩＣ５０値は、３．２×１０−８  ｍｏｌ／Ｌであった。同様に化合物（２）および化合物（３）について実験したところ、ＩＣ５０値は、それぞれ、２．９×１０−７  ｍｏｌ／Ｌ、および２．６×１０−６  ｍｏｌ／Ｌであった。
（実施例２）正常ヒトケラチノサイトにおける本発明化合物の細胞毒性の検討化合物（１）の細胞毒性は細胞外に漏出したＬＤＨ量を測定することで評価した。すなわち、正常ヒトケラチノサイトを１ウエル当たり２×１０３個となるように９６穴プレートにＫＧＭ−２培地を用いて播種し、細胞が接着した後に化合物（１）を最終濃度１０−９〜１０−５  ｍｏｌ／Ｌになるように添加した。３日間培養後、培養上清２００μＬのうちの５０μＬを用いて、ＬＤＨ−細胞毒性テスト  ワコー（和光純薬社製）により、培地中に漏出してくるＬＤＨ活性を測定した。なお、ポジティブコントロールとして、コントロールに最終濃度  ０．１％となるようＴｗｅｅｎ  ２０を添加し、３７℃で１５分間処理したものを用いた。細胞を含有しない培地のみのＬＤＨ活性をバックグラウンドとし、測定値からバックグラウンドを引いた値を算出した。
【００２３】
結果を図３に示す。図３において、  各プロットは、ｍｅａｎ±ＳＤ  （各群ｎ＝５。但し、Ｔｗｅｅｎ  ２０群は  ｎ＝１）を示す。＊＊＊は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較（コントロール群との比較）においてｐ＜０．００１であることを示す。
その結果、化合物（１）は、１０−５  ｍｏｌ／Ｌの濃度でヒトケラチノサイトに対し細胞毒性を示した（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較，  ｐ＜０．００１）が、ケラチノサイト細胞増殖をほぼ完全に抑制した濃度（１０−７〜１０−６  ｍｏｌ／Ｌ）では、細胞毒性は認められなかった。
（実施例３）正常ヒト線維芽細胞の細胞増殖に対する本発明化合物の影響の検討
ヒト線維芽細胞株ＷＩ−３８細胞（ＡＴＣＣ）を１ウエル当たり２  ｘ  １０３個となる様に９６穴マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて播種した。終夜培養し細胞を接着させた後、化合物（１）を１０−９〜１０−６  ｍｏｌ／Ｌとなるように、または対照としてＤＭＳＯを終濃度１％となるように添加した。３日間培養した後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ＷＳＴ−８、ナカライテスク社製）を培地の１／１０量添加した。３７℃で１時間培養した後、４５０  ｎｍ（参照波長：６２０  ｎｍ）の吸光度を測定し、細胞を含有しない培地に同様の処置を施したものをバックグラウンドとし、対照の吸光度を１００とした相対値を算出した。統計処理は、  Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較により行った。
【００２４】
結果を図４に示す。図４において、各プロットは、ｍｅａｎ±ＳＤ  （各群ｎ＝６。但し、コントロール群は  ｎ＝４）を示す。
その結果、化合物（１）を１  ｘ  １０−６  ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した条件下でのみ約２５％程度の吸光度の減少が認められたが、その他の条件では全くＷＩ−３８細胞の増殖に影響は認められず、ケラチノサイトの増殖抑制作用のような顕著な作用が認められなかった。従って、化合物（１）の細胞増殖抑制作用がケラチノサイト特異的であることが確認された。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、ケラチノサイトの細胞増殖作用を特異的に抑制する活性を有するので、ケラチノサイトの異常増殖を特徴とする各種疾病（例えば、乾癬、炎症性・アレルギー性皮膚疾患、慢性創傷等）の治療または予防剤として有用であることが期待される。また、繊維芽細胞等の間質細胞の増殖に実質的に影響を及ぼさないので、副作用の少ない、上記疾病の治療または予防剤として有用であることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】化合物（１）のヒトケラチノサイト増殖抑制作用を示すグラフである。
【図２】化合物（１）のヒトケラチノサイト増殖抑制作用を示すグラフである。
【図３】化合物（１）のヒトケラチノサイトに対する細胞毒性を示すグラフである。
【図４】化合物（１）のヒト線維芽細胞の細胞増殖に対する影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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