(57)【要約】　　　（修正有）【課題】改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳを提供すること。このＭａｚｕｓ　ＣＨＳは、Ｍａｚｕｓ　ＣＨＳの１６５番目のアミノ酸でシステインの代わりにアラニンを有し、かつＭａｚｕｓ　ＣＨＳの１３８番目のアミノ酸でメチオニンの代わりにグリシンまたはリジンのいずれかを有する、改変されたカルコンシンターゼをコードする。植物体における減少したアントシアニンの含有量によって特徴付けられる表現型を付与する改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳを発現するトランスジェニック植物体を提供すること。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するカルコンシンターゼをコードする、単離された特定の塩基配列を有するＭａｚｕｓカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）核酸。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルコンシンターゼ（配列番号２）をコードする、単離されたＭａｚｕｓカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）核酸（配列番号１）。
【請求項２】
請求項１に記載のカルコンシンターゼをコードするための改変されたカルコンシンターゼ核酸であり、ここで、任意のアミノ酸が、Ｍａｚｕｓ　ＣＨＳの１６５番目のシステイン残基および１３８番目のメチオニン残基を置換し得る、改変されたカルコンシンターゼ核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の改変されたカルコンシンターゼ（配列番号４）をコードするための前記改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳ核酸（配列番号３）であり、ここで、前記残基で、アラニンがシステインを置換し、かつグリシンがメチオニンを置換する、改変されたカルコンシンターゼ核酸。
【請求項４】
請求項２に記載の改変されたカルコンシンターゼ（配列番号６）をコードするための前記改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳ核酸（配列番号５）であり、ここで、前記残基で、アラニンがシステインを置換し、かつリジンがメチオニンを置換する、改変されたカルコンシンターゼ核酸。
【請求項５】
植物細胞中に形質転換されるためのベクターであって、請求項２に記載の前記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含む植物において、アントシアニンの含有量を減少させる、ベクター。
【請求項６】
植物細胞中に形質転換されるためのベクターであって、請求項３に記載の前記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含む植物において、アントシアニンの含有量を減少させる、ベクター。
【請求項７】
植物細胞中に形質転換されるためのベクターであって、請求項４に記載の前記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含む植物において、アントシアニンの含有量を減少させる、ベクター。
【請求項８】
請求項２に記載の前記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターで形質転換された細胞の少なくとも１つを含むトランスジェニック被子植物であって、ここで、該植物が、減少した量のアントシアニンを有する、被子植物。
【請求項９】
請求項３に記載の前記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターで形質転換された細胞の少なくとも１つを含むトランスジェニック被子植物であって、ここで、該植物が、減少した量のアントシアニンを有する、被子植物。
【請求項１０】
請求項４に記載の前記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターで形質転換された細胞の少なくとも１つを含むトランスジェニック被子植物であって、ここで、該植物が、減少した量のアントシアニンを有する、被子植物。
【請求項１１】
減少したアントシアニンの含有量によって特徴付けられる表現型を有するトランスジェニック植物を生成するための方法であって、以下の工程：
ｉ）前記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターで植物細胞を形質転換する工程；
ｉｉ）該形質転換された植物細胞の１つ以上から植物を再生する工程；およびｉｉｉ）減少した含有量のアントシアニンを有する少なくとも１つの植物を選択する工程、の少なくとも１つを含む、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法に従って生成された、トランスジェニック被子植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（発明の分野）
本発明は、ＣＨＳをドミナントネガティブに阻害する改変されたＣＨＳ酵素をコードする改変されたＭａｚｕｓＣＨＳ核酸、および植物を遺伝的に変更して植物体中のアントシアニンの含有量を減少させるためのこの核酸の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（発明の背景）
花色は、重要な園芸形質であり、そして主にフラボノイド色素である、アントシアニンによって生成される。花粉提供者を魅了するために主に生成されるが、フラボノイドはまた、ＵＶ損傷、害虫、病原体から植物体およびその生殖器を保護する（ＢｒｏｕｉｌｌａｒｄおよびＣｈｅｍｉｎａｔ、１９８８；Ｇｒｏｎｑｕｉｓｔら、２００１）。古典的な品種方法が、色およびその強度の両方において異なる花を有する品種の開発に広く使用されてきた。生物化学的レベルおよび分子レベルでの花の着色についての最近の知識の進歩は、遺伝子操作によってこれを達成することを可能にした（Ｔａｎａｋａら、１９９８）。
【０００３】
３つの異なる分類のアントシアニンが、多くの被子植物において、花色の主な色調を担う：ペラルゴニジン（オレンジ〜赤レンガ）、シアニジン（赤〜ピンク）、およびデルフィニジン（紫〜青）。アントシアニンの生合成経路が十分確立され、そして合成に関与する酵素のほとんどが同定された（図１）（ＨｏｌｔｏｎおよびＣｏｒｎｉｓｈ、１９９５；Ｗｉｎｋｅｌ−Ｓｈｉｒｌｅｙ、２００１）。これは、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）による４−クマロイル（ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡの濃縮に始まり、テトラヒドロキシカルコンを生成する。これは、カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）およびフラバノン３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３Ｈ）の連続する作用によって、ジヒドロフラボノールに変換される。第一に生成されるジヒドロフラボノールは、ジヒドロケンペロール（ＤＨＫ）である。次いで、ＤＨＫは、フラボノールシンターゼ（ＦＬＳ）によってケンペロールか、またはジヒドロフラボノール４−レダクターゼ（ＤＦＲ）によってロイコペラルゴニジンのいずれかに変換される。あるいは、ＤＨＫは、フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’Ｈ）またはフラボノイド３’５’−ヒドロキシラ−ゼ（Ｆ３’５’Ｈ）によってジヒドロケルセチン（ＤＨＱ）またはジヒドロミリセチン（ＤＨＭ）に、ヒドロキシル化される。ＤＨＱおよびＤＨＭはさらに、ＦＬＳによってこれらのそれぞれのフラボノール（ケルセチンおよびミリセチン）に変換されるかまたは、ＤＦＲによって還元されてロイコアントシアニジン（ロイコシアニジンおよびロイコデルフィニジン）を生じ得る。アントシアニジンシンターゼ（ＡＮＳ）によってロイコシアニジンから合成されるアントシアニジンは、次いで、フラボノイド３−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ（３ＧＴ）によってグリコシル化されてアントシアニンを生成する。ラムノシル化、メチル化、またはアシル化によるさらなる改変は、広範な種々のアントシアニンを生じる（Ｋｒｏｏｎら、１９９４；Ｒｏｎｃｈｉら、１９９５；Ｆｕｊｉｗａｒａら、１９９７；Ｙｏｓｈｉｄａら、２０００；Ｙａｂｕｙａら、２００１）。花色におけるスペクトルの差異は主に、異なる分類のアントシアニンの比率および他の因子（例えば、液胞のｐＨ、共同色素沈着（ｃｏ−ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、金属イオンの錯体化および分子のスタッキング）によって決定される（Ｈｏｌｔｏｎら、１９９３；ＭａｒｋｈａｍおよびＯｆｍａｎ、１９９３；Ｍｏｌら、１９９８；Ｔａｎａｋａら、１９９８；Ａｉｄａら、２０００）。最終的な色調は、上皮細胞の形状またはクリームのような感じを与えるデンプンの存在を含む種々の因子によってさらに変更され得る（ＭａｒｋｈａｍおよびＯｆｍａｎ、１９９３；Ｎｏｄａら、１９９４；Ｍｏｌら、１９９８；ｖａｎ　Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇｅｎら、１９９８）。
【０００４】
花色を変更するための遺伝子操作は、種々の遺伝子を使用して試みられてきた。この経路における生合成遺伝子の不在または酵素の基質特異性に起因して、いくつかの種は、特定の色を欠く。例えば、カーネーションはＦ３’５’Ｈの非存在に起因して、青／紫色の花を欠き、一方でペチュニアは、ＤＨＫを還元するそのＤＦＲの不能に起因してオレンジおよび赤レンガの花を欠く（Ｇｅｒａｔｓら、１９８２；ＦｏｒｋｍａｎおよびＲｕｈｎａｕ、１９８７）。青／紫色のカーネーションの遺伝子操作は、ペチュニアのＦ３’５’Ｈ遺伝子の導入によって達成され、そしてオレンジ色のペチュニアは、他種からＤＦＲを導入することによって開発された（Ｍｅｙｅｒら、１９８７；Ｂｒｕｇｌｉｅｒａら、２０００；Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００１）。色の強度の調節は、遺伝子操作の別の標的となってきた。センス方向またはアンチセンス方向でのＣＨＳ、Ｆ３ＨおよびＤＦＲのような生合成遺伝子の発現は、最も活用された方法である（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌら、１９９０；Ｃｏｕｒｔｎｅｙ−Ｇｕｔｔｅｒｓｏｎら、１９９４；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、１９９６；Ｔａｎａｋａら、１９９８）。得られたセンス抑制またはアンチセンス阻害は、集合的に、転写後の遺伝子サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）（ＰＴＧＳ）と呼ばれる。これらのアプローチは、色素合成のダウンレギュレーションにおいてかなり成功したが、特定の種または近縁の種から目的の遺伝子をクローニングする必要性が、主な欠点である。さらに、ＰＴＧＳを特定の組織に限定することは困難である（Ｐａｌａｕｑｕｉら、１９９７；ＶｏｉｎｎｅｔおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ、１９９７；Ｖｏｉｎｎｅｔら、１９９８；ＦａｇａｒｄおよびＶａｕｃｈｅｒｅｔ、２０００；Ｃｒｅｔｅら、２００１；Ｖａｕｃｈｅｒｅｔら、２００１）。あるいは、アントシアニン生合成遺伝子の転写を活性化し得るかまたは抑制し得るかのいずれかである転写因子は、モデル植物（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、タバコ、およびＰｅｔｕｎｉａ）における色の強度の調節において有用であることが示されている（Ｌｌｏｙｄら、１９９２；Ｍｏｌら、１９９８；Ｂｏｒｅｖｉｔｚら、２０００；Ａｈａｒｏｎｉら、２００１）。しかし、転写因子の過剰発現は、一般的に多くの遺伝子の発現を変更し、従って、これらのトランスジェニック花の商業的な実行可能性は、いまだ決定されなければならない（Ｌｌｏｙｄら、１９９４；Ｂｒｕｃｅら、２０００）。
【０００５】
ＣＨＳの生物化学的特徴および構造的特徴は、花色の強度を調節するために使用され得るドミナントネガティブなＣＨＳを設計する可能性を示唆する。ＣＨＳは、アントシアニンを含む種々のフラボノイドの合成における最初の酵素である。ＣＨＳは、ホモ二量体として機能し、そして単一の活性部位で一連の反応を実行する（Ｔｒｏｐｆら、１９９５）。この酵素は、４−クマロイル−ＣｏＡの分子と３つのマロニル−ＣｏＡを濃縮し、テトラケチド（ｔｅｔａｒｋｅｔｉｄｅ）中間体を芳香環構造に折りたたむ（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ、１９９９）。部位特異的な変異誘発およびインヒビターの研究は、ＣＨＳの触媒機能に重要な保存されたシステイン残基およびヒスチジン残基を同定した（Ｌａｎｚら、１９９１；Ｓｕｈら、２０００）。アルファルファＣＨＳの結晶構造は、保存されたＣｙｓ１６４、Ｐｈｅ２１５、Ｈｉｓ３０３およびＡｓｎ３３６が触媒活性部位を形成することを示す（Ｆｅｒｒｅｒら、１９９９）。さらに、この結晶構造はまた、隣接する単量体由来のＭｅｔ１３７が、ＣＨＳの環化ポケット中に伸びていることを示す。このことは、ＣＨＳ単量体が、その活性のために隣接する単量体由来のメチオニンを必要とすることを示唆する。この構造的な情報に基づいて、本発明者らは、活性部位でシステインの代わりにアラニンを有し、かつメチオニンの代わりにグリシンまたはリジンのいずれかを有するＣＨＳを生成した。システインのアラニンへの変異は、ＣＨＳの不活化形態を生じるが、メチオニンのグリシンまたはリジンへの変異は、結晶構造によって示唆されるようにメチオニンが本当に重要である場合、隣接するＣＨＳの機能を不活化する。トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを使用して、本発明者らは、変異したＣＨＳが本当にドミナントネガティブであることを実証する。本発明者らの結果は、メチオニン残基の重要性を確認し、そして、遠縁の種においてさえも、ドミナントネガティブＣＨＳの、花色の強度の調節における有用性を実証する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳを提供することであり、このＭａｚｕｓ　ＣＨＳは、Ｍａｚｕｓ　ＣＨＳの１６５番目のアミノ酸でシステインの代わりにアラニンを有し、かつＭａｚｕｓ　ＣＨＳの１３８番目のアミノ酸でメチオニンの代わりにグリシンまたはリジンのいずれかを有する、改変されたカルコンシンターゼをコードする。
【０００７】
本明細書中の目的はまた、植物体における減少したアントシアニンの含有量によって特徴付けられる表現型を付与する改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳを発現するトランスジェニック植物体を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、カルコンシンターゼ（配列番号２）をコードする、単離されたＭａｚｕｓカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）核酸（配列番号１）を提供する。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態では、上記のカルコンシンターゼをコードするための改変されたカルコンシンターゼ核酸であり、ここで、任意のアミノ酸が、Ｍａｚｕｓ　ＣＨＳの１６５番目のシステイン残基および１３８番目のメチオニン残基を置換し得る、改変されたカルコンシンターゼ核酸を提供する。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態では、上記の改変されたカルコンシンターゼ（配列番号４）をコードするための上記改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳ核酸（配列番号３）であり、ここで、上記残基で、アラニンがシステインを置換し、かつグリシンがメチオニンを置換する、改変されたカルコンシンターゼ核酸を提供する。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態では、上記の改変されたカルコンシンターゼ（配列番号６）をコードするための上記改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳ核酸（配列番号５）であり、ここで、上記残基で、アラニンがシステインを置換し、かつリジンがメチオニンを置換する、改変されたカルコンシンターゼ核酸を提供する。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態では、植物細胞中に形質転換されるためのベクターであって、上記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含む植物において、アントシアニンの含有量を減少させる、ベクターを提供する。
【００１３】
本発明は、植物細胞中に形質転換されるためのベクターであって、上記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含む植物において、アントシアニンの含有量を減少させる、ベクターを提供する。
【００１４】
本発明は、植物細胞中に形質転換されるためのベクターであって、上記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含む植物において、アントシアニンの含有量を減少させる、ベクターを提供する。
【００１５】
本発明は、上記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターで形質転換された細胞の少なくとも１つを含むトランスジェニック被子植物であって、ここで、この植物が、減少した量のアントシアニンを有する、被子植物、を提供する。
【００１６】
本発明は、上記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターで形質転換された細胞の少なくとも１つを含むトランスジェニック被子植物であって、ここで、この植物が、減少した量のアントシアニンを有する、被子植物を提供する。
【００１７】
本発明は、上記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターで形質転換された細胞の少なくとも１つを含むトランスジェニック被子植物であって、ここで、この植物が、減少した量のアントシアニンを有する、被子植物を提供する。
【００１８】
本発明は、減少したアントシアニンの含有量によって特徴付けられる表現型を有するトランスジェニック植物を生成するための方法であって、以下の工程：
ｉ）上記改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターで植物細胞を形質転換する工程；
ｉｉ）この形質転換された植物細胞の１つ以上から植物を再生する工程；および
ｉｉｉ）減少した含有量のアントシアニンを有する少なくとも１つの植物を選択する工程、の少なくとも１つを含む、方法を提供する。
【００１９】
本発明は、上記の方法に従って生成された、トランスジェニック被子植物を提供する。
【００２０】
（発明の要旨）
これらの目的に従って、本発明は、Ｍａｚｕｓ　ＣＨＳの１６５番目のアミノ酸でシステインの代わりにアラニンを有し、かつＭａｚｕｓ　ＣＨＳの１３８番目のアミノ酸でメチオニンの代わりにグリシンまたはリジンのいずれかを有する、改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳをコードする、改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳ核酸を含む。改変されたＣＨＳの特性は、ＣＨＳをドミナントネガティブに阻害するその能力によって特徴付けられる。
【００２１】
本発明はまた、改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターで形質転換された細胞の少なくとも１つを有する植物体を含む。このような植物体は、減少したアントシアニンの含有量によって特徴付けられる表現型を有する。
【００２２】
本発明はまた、植物細胞を形質転換させてアントシアニンの含有量を減少させ得るベクターを含む。
【００２３】
本発明はまた、減少したアントシアニンの含有量を有する植物体を生成するための方法を含む。この方法は、改変されたＣＨＳ遺伝子を含むベクターで植物細胞を形質転換する工程；形質転換された細胞から植物体を再生する工程、および減少したアントシアニンの含有量を有する植物を選択する工程を包含する。
【００２４】
【発明の実施の形態】
（発明の詳細な説明）
（Ｍａｚｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ＣＨＳのクローニングおよび機能的特徴付け）
推定のＣＨＳを、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅに属する一般的な園芸植物である、Ｍａｚｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓからクローニングした（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ１３１３２８）。Ｍａｚｕｓは、ラベンダーがかった花筒を有する白い花を、両側に対称的に有する。本発明者らは、Ｍａｚｕｓ由来の全てのアントシアニン生合成遺伝子のクローニングの一部として、推定ＣＨＳ遺伝子をクローニングした。系統発生的な分析は、Ｍａｚｕｓ由来の推定ＣＨＳが、他の公知のＣＨＳ酵素、特に、同様にＳｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅに属するキンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　ｍａｊｕｓ）およびトレニア（Ｔｏｒｅｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）のＣＨＳ酵素に、非常に類似する（図２）。おそらくこの遺伝子は、真のＣＨＳをコードするが、系統樹においてスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）および他のＣＨＳ様酵素は別々に分岐しないので、さらなる実験的証拠が必要とされた（Ｔｒｏｐｆら、１９９４）。
【００２５】
Ｍａｚｕｓから単離された推定ＣＨＳが、機能的なＣＨＳをコードするか否かを決定するため、本発明者らは、野生型のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｌｅｒ）およびｃｈｓ変異体（ｔｔ４）両方のバックグラウンドで、この遺伝子を発現させた。いくつかの独立したホモ接合体系統を確立し、各々３つの系統をさらなる分析のために無作為に選択した。推定ＣＨＳがｔｔ４変異を補完し得るか否かを決定するため、本発明者らは、３％のショ糖を含む水寒天プレート上で実生を生育させた。図３Ａに示したように、推定ＣＨＳを発現する野生型の植物および３つ全てのトランスジェニック系統が、紫の子葉を示したが、ｔｔ４は黄色がかった子葉を示した。一致して、野生型種子およびトランスジェニック種子の両方は、ｔｔ４変異体の黄色い種皮色とは異なった、茶色の種皮色を示した（図３Ａ　挿入図）。トランスジェニック系統におけるアントシアニン生成の回復は、Ｍａｚｕｓ由来の推定ＣＨＳが、機能的ＣＨＳをコードすることを示した。従って、本発明者らは、この遺伝子をＭｊＣＨＳという。
【００２６】
トウモロコシＣＨＳのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける過剰発現は、アントシアニンの生成を増大させなかった（Ｄｏｎｇら、２００１）。ＭｊＣＨＳの過剰発現がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてアントシアニンを増大させ得るか否かを試験するため、本発明者らは、２％ショ糖を含むＭＳ寒天プレート上で野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物体およびトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物体の両方を生育させ、そして分光光度計を使用してアントシアニン含有量を定量した。ＬｅｒバックグラウンドにおいてＭｊＣＨＳを発現する無作為に選択された３つのホモ接合体系統のうち２つが、より多いアントシアニンを蓄積した（図３Ｂ）。この増大がＭｊＣＨＳの発現を反映するか否かを調査するため、本発明者らは、ノーザン分析を行った。図３Ｃに見られるように、より高いアントシアニンの量を示した２つの系統がＭｊＣＨＳを発現したが、野生型と類似の量を示した第三の系統は、トランスジーンを発現しなかった。この結果は、ＭｊＣＨＳの過剰発現がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいてアントシアニンレベルを増大させ得ることを示す。トウモロコシＣＨＳの過剰発現からの対照的な結果は、２つのＣＨＳ酵素における僅かな差異または本実験に使用された異なるアッセイ条件に起因し得た。
【００２７】
（２つのドミナントネガティブＭｊＣＨＳの開発）
アルファルファＣＨＳの結晶構造は、単量体由来の保存されたメチオニンが、隣接する単量体の機能にとって必要であることを示唆した（Ｆｅｒｒｅｒら、１９９９）。このメチオニンが機能的に重要である場合、メチオニンの他のアミノ酸への変更は、隣接するＣＨＳの機能を阻害し、従ってこの変異は、ドミナントネガティブである。これを試験するため、本発明者らは、部位特異的変異誘発によって２つの変異ＭｊＣＨＳ遺伝子を生成した（図４Ａ）。１つの変異ＭｊＣＨＳ（ｍＣＨＳＧ）は、１３８番目の残基でメチオニンの代わりにグリシンを有する。グリシンはメチオニンの側鎖と比較してより小さな側鎖を有することから、隣接する単量体の基質結合ポケットは、変更される。他の変異ＭｊＣＨＳ（ｍＣＨＳＫ）は、１３８番目の残基でメチオニンの代わりにリジンを有する。リジンは、正に荷電しているため、隣接する単量体の基質結合ポケットの電気化学的な特性は、変更される。変異ＭｊＣＨＳの触媒活性を排除するため、本発明者らはまた、触媒的に重要な１６５番目のシステインをアラニンに変化させた。このシステインのセリンまたはアラニンのいずれかへの変異は、ＣＨＳを不活性化することが示されている（Ｌａｎｚら、１９９１；Ｔｒｏｐｆら、１９９５；Ｊｅｚら、２０００）。
【００２８】
変異ＭｊＣＨＳ酵素が、ドミナントネガティブな様式で挙動するか否かを決定するため、本発明者らは、変異ｍＣＨＳＧおよびｍＣＨＳＫを発現するいくつかのトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを作製し、そしてさらなる分析のために３つのホモ接合体を無作為に選択した。この分析のために、野生型およびトランスジェニック系統を、２％のショ糖を含むＭＳ寒天プレート上で生育させた。アントシアニン含有量を、分光光度計によって定量した（図４Ｂ）。ｍＣＨＳＧトランスジェニック系統およびｍＣＨＳＫトランスジェニック系統の両方が、アントシアニンの減少したレベルを示した。この減少は、トランスジェニック系統における内在性のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＣＨＳの、より低い発現に起因しない（図４Ｃ）。
【００２９】
ＣＨＳ二量体中の各単量体は、独立して機能し得、そしてシステイン残基の変異による単量体の不活性化は、隣接する単量体の活性に影響しない（Ｔｒｏｐｆら、１９９５）。従って、ｍＣＨＳＧトランスジェニック系統およびｍＣＨＳＫトランスジェニック系統における減少したアントシアニンレベルは、変異ＭｊＣＨＳ酵素がドミナントネガティブに挙動することを示す。必然的に、二量体化パートナーの環化ポケットへのメチオニンの伸長は、隣接する単量体の活性にとって機能的に重要である。ｍＣＨＳＧおよびｍＣＨＳＫの両方のドミナントネガティブな作用は、側鎖の長さの変化または電気化学的特性の変化のいずれかによる基質結合ポケットの変更が、ＣＨＳ活性を阻害し得ることをさらに示唆する。
【００３０】
ドミナントネガティブ性の程度は、ドミナントネガティブなタンパク質の量に依存する。従って、トランスジェニック植物体におけるアントシアニン含有量は、変異ＭｊＣＨＳ酵素の発現レベルに逆に相関すると予想される。この仮説を試験するために、本発明者らは、ＭｊＣＨＳ　ＲＮＡのノーザン分析を行った。しかし、図４Ｃに示したように、相関は検出されなかった。アントシアニンレベルにおける多様性は、翻訳された変異タンパク質の実際の量に寄与され得る。あるいは、異なったトランスジェニック系統がＭｊＣＨＳの異なった組織発現プロフィールを有し得るので、アントシアニンの大半が生成されるトランスジェニック実生の頸部（ｎｅｃｋ）および子葉領域における異なった変異ＭｊＣＨＳ発現レベルが、総ＭｊＣＨＳメッセージによってマスクされる可能性がある。
【００３１】
（ドミナントネガティブなＭｊＣＨＳによる、花色の調節）
異種の系において、ドミナントネガティブＭｊＣＨＳを使用して、花色の強度を調節し得るか否かをさらに試験するため、本発明者らは、Ｐｅｔｕｎｉａ　ｘｈｙｂｒｉｄａ　ｃｖ　Ｂｌｕｅを、ｍＣＨＳＫで形質転換した。いくつかの形質転換体が得られ、その全てが類似の表現型を示した。図５に示されるように、ｍＣＨＳＫを発現するペチュニア形質転換体は、野生型に比べて減少した花色強度を示し、これは、変異ＭｊＣＨＳがまた、ペチュニアのＣＨＳを阻害し得ることを示す。センス抑制系統またはアンチセンス阻害系統において観察された種々の色のパターンとは異なり、ドミナントネガティブＣＨＳを発現する全てのトランスジェニックペチュニア系統は、さらなる花色の強度の減少を示した。変異ＭｊＣＨＳ酵素のドミナントネガティブ作用は、内在性のＣＨＳ酵素とヘテロ二量体化するその能力に依存する。アントシアニン生成の阻害は、ＭｊＣＨＳがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＣＨＳおよびペチュニアのＣＨＳの両方とヘテロ二量体化し得ることを示した。２つの異なる種においてアントシアニン生成を調節する能力は、多くの園芸種において花色強度を調節するためのドミナントネガティブＭｊＣＨＳのさらなる有用性を示唆する。
【００３２】
本発明はまた、改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターで形質転換された細胞を有する植物を提供する。このような植物は、改変されたＣＨＳによって特定化される、減少したアントシアニン含有量によって特徴付けられる表現型を有する。好ましい実施形態において、本発明は、改変されたカルコンシンターゼをコードする、改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターで形質転換された細胞を有する植物を提供する。このような植物は、減少したアントシアニン含有量によって特徴付けられる表現型を有する。本発明を実施するために使用され得る植物は、被子植物（Ｍａｇｎｏｌｉｐｈｙｔａ）門の植物、すなわち、双子葉植物および単子葉植物を含む被子植物を含む。改変されたＣＨＳ核酸の広い適用可能性は、分岐した植物分類における、アントシアニンの生合成におけるＣＨＳ酵素の普遍的な機能に基づく。本発明を実施するために使用され得る親植物は、野生型の改変体、変異誘発によって作製された変異体、または組換え技術によって作製されたトランスジェニック系統であり得る。
【００３３】
本発明はまた、改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含む、植物形質転換ベクターを提供する。
【００３４】
植物の形質転換は、植物分子生物学の分野の当業者に公知の、任意の種々の形質転換方法によって、本発明に従って実行され得る。形質転換のための特定の方法としては、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコール、エレクトロポレーション、またはマイクロボンバードメント（ｍｉｃｒｏｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）による植物細胞への核酸の移入が挙げられる。あるいは、植物細胞は、改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含む、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ保有ベクターによって形質転換され得る。
【００３５】
形質転換された細胞からの植物体の再生は、当業者に公知の任意の方法によって実行され得る。例えば、前出のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ　１１８；およびＫｌｅｅら、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　３８：４６７−４８６を参照のこと。形質転換された細胞または植物体は、抗生物質のような特定の化学物質に対するその耐性に基づいて、あるいは減少したアントシアニン含有量によって特徴付けられるその表現型に基づいて選択される。形質転換された植物体は、自家受精されるかまたは他の植物体と交配され得る。受精後に、改変されたＣＨＳ核酸の少なくとも一部を発現する植物体は、抗生物質のような特定の化学物質に対するその耐性に基づいて、あるいは減少したアントシアニン含有量によって特徴付けられるその表現型に基づいて選択され得る。あるいは、形質転換された細胞または形質転換された植物体の一部は、他の植物体に移植され得る。
【００３６】
【実施例】
以下は、実施例として示され、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。
【００３７】
（実施例）
（Ｍａｚｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ由来のＣＨＳのクローニングおよび特徴付け）
推定ＣＨＳ遺伝子のフラグメントを、変性されたプライマー
【００３８】
【化１】
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を使用して、Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ科に属する一般的な園芸植物、Ｍａｚｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓからクローニングした。全長のＣＨＳ遺伝子を、Ｍａｒａｔｈｏｎ　ＲＡＣＥキットを使用して、特定のプライマー
【００３９】
【化２】
2004065209.tif 000003
および製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって提供されたＡＰ２プライマーでクローニングした。
【００４０】
推定ＣＨＳ遺伝子が機能的ＣＨＳをコードするか否かを決定するため、この遺伝子を、プライマー
【００４１】
【化３】
2004065209.tif 000004
で増幅し、そしてＸｂａＩで切断したこの増幅産物を、ＧＵＳ−欠失ｐＢＩ１２１ベクターのＸｂａＩ部位にクローニングした。このベクターにクローニングされた遺伝子を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＧＶ３１０１に導入し、そしてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ　ｅｒｅｃｔａ（Ｌｅｒ）またはｔｔ４変異体中に形質転換した。確立されたいくつかの独立なホモ接合体株のうち３つの株を、さらなる分析のために無作為に選択した。
【００４２】
ｔｔ４変異を補完する推定ＣＨＳの能力を決定するため、本発明者らは、３％のショ糖を含む水寒天プレート（０．０５％のＭＥＳ、０．８％の植物寒天（ｐｈｙｔｏａｇａｒ）、３％のショ糖、ｐＨ５．７）上で、５日間トランスジェニックｔｔ４株を生育させた。
【００４３】
（ドミナントネガティブＣＨＳの構築および特徴付け）
全長ＭｊＣＨＳを、ｐＴＯＰＯＩＩベクターにクローニングした。１６５番目の残基でシステインをアラニンに変異させるために（Ｃｙｓ１６５Ａｌａ）、本発明者らは、ｐＴＯＰＯＩＩ中のＭｊＣＨＳを、適切なプライマーセット
【００４４】
【化４】
2004065209.tif 000005
を使用して、Ｐｆｕポリメラーゼで増幅した。この増幅産物を、ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結した。この連結産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換した。この変異クローンを、配列決定によって確認した。Ｃｙｓ１６５Ａｌａ変異と共に、１３８番目のメチオニンをリジン（ｍＣＨＳＫ）またはグリシン（ｍＣＨＳＧ）のいずれかに変異させるために、本発明者らは、ｐＴＯＰＯＩＩ中のＣｙｓ１６５Ａｌａ変異ＣＨＳクローンを、Ｋ−プライマーセット
【００４５】
【化５】
2004065209.tif 000006
またはＧ−プライマーセット
【００４６】
【化６】
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のいずれかで増幅した。この増幅産物を、ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結した。この変異遺伝子を、変異を確認するために配列決定した。変異全長ＭｊＣＨＳ遺伝子を、二つのベクターにクローニングし、そしてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに導入した。アントシアニンの定量の後に、ホモ接合体株に再び番号を付けた。
【００４７】
（アントシアニンの定量）
トランスジェニック植物体におけるアントシアニンレベルを決定するために、冷却−吸水種子を、２％のショ糖を含むＭＳ寒天プレート（１Ｘ　ＭＳ塩、０．０５％のＭＥＳ、０．８％の植物寒天、２％のショ糖、ｐＨ５．７）上に蒔き、そして連続的な白色光（２ｍＷ／ｃｍ２）の下で５日間生育させた。定量は、前に記載のように行った（Ｓｈｉｒｌｅｙら、１９９５）。簡単に言うと、５０個の実生を選定し、そして０．５ｍｌの抽出溶液（１００％のメタノール＋０．５％のＨＣｌ）に、４℃で一晩浸した。次の朝、これらのサンプルを、短時間遠心分離し、そしてこの溶液を分光光度アッセイのために使用した。アントシアニンを、ＯＤ５３０での吸光度によって定量した。アントシアニンの含有量の指示として、サンプルのＯＤ５３０の値から、ｔｔ４のＯＤ５３０の値を引いた。この実験を、三連で行った。
【００４８】
（ノーザン分析）
ノーザン分析を、以前に記載されたように行った（Ｓｈｉｎら、２００２）。簡単に言うと、２％のショ糖を含むＭＳ寒天上で連続的な白色光の下で、アントシアニン抽出についてと同様に生育させた５日齢の実生から、総ＲＮＡを抽出した。１５μｇの総ＲＮＡを、各レーンにロードし、そしてナイロン膜に移した。この膜を、３２Ｐ−標識したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの全長ＣＨＳまたはＭａｚｕｓの全長ＣＨＳでプローブした。
【００４９】
（ペチュニアの形質転換）
ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｘ　ｈｙｂｒｉｄａ　ｃｖ　Ｂｌｕｅ）を、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９）によって記載されたように、ｍＣＨＳＫ遺伝子を含むベクターで形質転換した。形質転換体を、開花するまで土壌で生育させた。コントロールとして、ベクターのみを有する形質転換体を作製し、そして隣合わせで生育させた。
【００５０】
本発明は、改変されたＭａｚｕｓカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）核酸を含み、この核酸は、Ｍａｚｕｓ　ＣＨＳの１６５番目のアミノ酸でシステインの代わりにアラニンを有し、そしてＭａｚｕｓ　ＣＨＳの１３８番目のアミノ酸でメチオニンの代わりにグリシンまたはリジンのいずれかを有する、改変されたカルコンシンターゼをコードする。コードされた改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳの特性は、そのドミナントネガティブなＣＨＳの阻害によって特徴付けられる。本発明はまた、この改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳを発現する少なくとも１つの細胞を有する植物体を含む。このような植物体は、アントシアニンの減少した含有量によって特徴付けられる。本発明はまた、この改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳ核酸の少なくとも一部を含むベクターを含む。本発明はまた、アントシアニンの減少した含有量を有する植物を生成するために、このようなベクターを使用する方法を含む。
【００５１】
【発明の効果】
本発明は、改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳを提供する。このＭａｚｕｓ　ＣＨＳは、Ｍａｚｕｓ　ＣＨＳの１６５番目のアミノ酸でシステインの代わりにアラニンを有し、かつＭａｚｕｓ　ＣＨＳの１３８番目のアミノ酸でメチオニンの代わりにグリシンまたはリジンのいずれかを有する、改変されたカルコンシンターゼをコードする。
【００５２】
本発明はまた、植物体における減少したアントシアニンの含有量によって特徴付けられる表現型を付与する改変されたＭａｚｕｓ　ＣＨＳを発現するトランスジェニック植物体を提供する。
【００５３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、主要な酵素を示す、一般的なアントシアニン生合成経路である。ＰＡＬ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ；Ｃ４Ｈ、桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ；４ＣＬ、４−クマル酸補酵素Ａリガーゼ；ＣＨＳ、カルコンシンターゼ；ＣＨＩ、カルコンイソメラーゼ；Ｆ３Ｈ、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ；ＦＬＳ、フラボノールシンターゼ；Ｆ３’Ｈ、フラボノイド３’ヒドロキシラーゼ；Ｆ３’５’Ｈ、フラボノイド３’５’ヒドロキシラーゼ；ＤＦＲ、ジヒドロフラボノール４−レダクターゼ；ＡＮＳ、アントシアニジンシンターゼ；３ＧＴ、３−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ。
【図２】図２は、Ｍａｚｕｓ由来のＣＨＳと他の種由来のＣＨＳとの間の相同性を示す、系統樹である。ｇｅｒ　ｐｓ１、ガーベラピロンシンターゼ　１；ｓｔｓ　１、スチルベンシンターゼ　１。
【図３】図３は、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＭｊＣＨＳの機能分析である。（Ａ）ＭｊＣＨＳは、ＣＨＳ変異体ｔｔ４の黄色い子葉および種子（挿入図）の色をレスキューし得る。ｔＣ１、２、および３は、Ｍａｚｕｓ由来のＣＨＳを発現する、独立したｔｔ４のホモ接合体性系統である。（Ｂ）Ｍａｚｕｓ由来のＣＨＳを発現する実生における、アントシアニンのレベル。ＬＣ１、２および３は、独立したホモ接合体性トランスジェニック系統を示す。（Ｃ）過剰発現系統における、ＭｊＣＨＳ発現の分析。ＭｊＣＨＳは、ＡｔＣＨＳとクロスハイブリダイスせず、そしてＬＣ３における発現の欠如は、アントシアニンのレベルに対応する。
【図４】図４は、ドミナントネガティブ系統の分析である。（Ａ）隣接する単量体の機能に重要であると予測された四角で囲んだ残基Ｍｅｔ１３８、および触媒性システインであることが示されたＣｙｓ１６５を示す、ＣＨＳのアミノ酸アラインメント。番号付けは、Ｍａｚｕｓの配列に基づく。ｍＣＨＳＧおよびｍＣＨＳＫは、誘導された変異を示す。ａｌｆ、アルファルファ；ａｒａｂ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；ｐｅｔ、ペチュニア；ｓｎａｐ、キンギョソウ；ｔｏｒ、トレニア。（Ｂ）ドミナントネガティブのＭｊＣＨＳを発現するＬｅｒの実生における、アントシアニンの蓄積。（Ｃ）Ｌｅｒおよびドミナントネガティブ系統における、内在性ＣＨＳ（ＡｔＣＨＳ）（上のパネル）およびトランスジーン（ＭｊＣＨＳ）（中のパネル）の発現。下のパネルは、リボソームＲＮＡを示す。
【図５】図５は、ドミナントネガティブＭｊＣＨＳ（ｍＣＨＳＫ）を発現するトランスジェニックペチュニア系統における花色の強度。ＴＲ１およびＴＲ２は、独立したトランスジェニック系統を示す。ＷＴ、野生型。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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