(57)【要約】　　　（修正有）【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するマウスナノス様遺伝子及びこの遺伝子のノックアウトマウス。【効果】本発明の遺伝子はマウスにおける生殖細胞の形成に必須の遺伝子であることから、不妊治療薬としてまた不妊症の診断薬として用いることができる。また本発明のノックアウトマウスは不妊症モデルとして有用である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖、
（ｂ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ生殖細胞の移動又は分化に作用するマウス由来のポリヌクレオチド。
【請求項２】
次の（ｃ）又は（ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ｃ）配列番号１又は３で示される塩基配列又はそれらの相補鎖を有するポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１又は３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ生殖細胞の移動又は分化に作用するマウス由来のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１又は３で示される塩基配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１又は２記載の遺伝子の機能が欠損したマウス又はその子孫。
【請求項５】
請求項１又は２記載の遺伝子のいずれかの部位が欠失しているか、又はいずれかの部位に他の遺伝子が挿入されることにより該遺伝子の機能が欠損したものである請求項４記載のマウス又はその子孫。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生殖細胞の移動又は分化に作用するマウスナノス（ｎａｎｏｓ）様遺伝子及び当該遺伝子欠損マウスに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ショウジョウバエのナノス遺伝子は、始原生殖細胞の移動や分化に必須であることが知られている。しかし哺乳動物におけるナノス遺伝子は未だ確認されておらず、その機能も不明である。
従って本発明の目的は、哺乳類のナノス様遺伝子を単離し、その機能を解明することにある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、マウスにも生殖細胞形成過程において機能する新たな遺伝子が存在するという仮定のもとに探索した結果、２種類のナノス様遺伝子（ｍＮｏｓ２，　ｍＮｏｓ３）　の単離に成功した。それらのナノス様遺伝子の機能を欠損させたマウスを作製し、ナノス様遺伝子の機能を検討したところ、ｍＮｏｓ２ノックアウトマウスでは雄において胎児期に生殖細胞が消失し、成体精巣が縮小し、組織中に生殖細胞が存在しなかった。またｍＮｏｓ３ノックアウトマウスにおいては雄雌ともに生殖巣に生殖細胞が認められなかった。これらのことから、本発明者は、マウスナノス様遺伝子が生殖細胞の移動又は分化に作用していることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００４】
すなわち、本発明は、次の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子を提供するものである。
（ａ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖、
（ｂ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ生殖細胞の移動又は分化に作用するマウス由来のポリヌクレオチド。
【０００５】
また、本発明は、次の（ｃ）又は（ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子を提供するものである。
（ｃ）配列番号１又は３で示される塩基配列又はそれらの相補鎖を有するポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１又は３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ生殖細胞の移動又は分化に作用するマウス由来のポリヌクレオチド。
【０００６】
さらに本発明は、配列番号１又は３で示される塩基配列の少なくとも１５の連続するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供するものである。
さらにまた、本発明は、上記本発明遺伝子の機能が欠損したマウス又はその子孫を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明遺伝子の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドからなる遺伝子（以下、ｍＮｏｓ２という）と、配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドからなる遺伝子（以下、ｍＮｏｓ３という）が挙げられる。また、ｍＮｏｓ２としては配列番号１で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる遺伝子が挙げられる。ｍＮｏｓ３としては、配列番号３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる遺伝子が挙げられる。
【０００８】
本発明の遺伝子には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった１本鎖ＤＮＡが含まれる。また、本発明遺伝子には、前記ｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３と同様な作用を有するマウス由来のポリヌクレオチドが含まれる。ここでストリンジェントな条件とは、例えば０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃、または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件である。
【０００９】
このようなストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、前記アミノ酸配列や塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１０】
本発明遺伝子は、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｄ　Ｅｄ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）など参照〕。具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源、例えばマウスの雄の生殖巣などから、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望のクローンを選択することにより実施できる〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ．，　７８，　６６１３　（１９８１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２２２，　７７８　（１９８３）など〕。
【００１１】
ここで、ｃＤＮＡの起源としては、本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞などが例示される。また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）などより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。
【００１２】
本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えば目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せなどを例示できる。
【００１３】
ここで用いられるプローブとしては、本発明の遺伝子の塩基配列をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。また、本発明遺伝子の塩基配列に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００１４】
プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、配列番号１又は３に対応する部分ヌクレオチド配列であって、少なくとも１５個の連続した塩基、好ましくは２０個の連続した塩基、より好ましくは３０個の連続した塩基、最も好ましくは５０個の連続した塩基を有するものが含まれる。また前記配列を有する陽性クローンそれ自体をプローブとして用いることも出来る。
【００１５】
本発明遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３０，　１３５０　（１９８５）〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。特にライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ；実験医学、１２（６），　３５　（１９９４）〕、特に５’−ＲＡＣＥ法〔Ｍ．Ａ．　Ｆｒｏｈｍａｎ，　ｅｔａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ．，　８，　８９９８　（１９８８）〕などの採用が好適である。
【００１６】
かかるＰＣＲ法に使用されるプライマーは、本発明の遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよい。
【００１７】
また、上記で得られる本発明遺伝子或いは各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ．，　７４，　５４６３　（１９７７）〕やマキサム−ギルバート法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　６５，　４９９　（１９８０）〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００１８】
このようにして得られる本発明遺伝子の一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体又は各種組織における本発明遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。
かかる検出は常法に従って行うことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；　Ｅ．Ｓ．　Ｋａｗａｓａｋｉ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡ．　Ｉｎ　ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，　２１−２７　（１９９１）〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロッティング解析〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　（１９８９）〕、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ＲＴ−ＰＣＲ〔Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　２１，　３１５９−３１６６　（１９９３）〕や　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳＢＡ法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，　Ｎａｔｕｒｅ，　３５０，　９１−９２　（１９９１）〕およびその他の各種方法を挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる検出法を挙げることができる。
【００１９】
尚、ここでＰＣＲ法を採用する場合に用いられるプライマーとしては、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限はなく、本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。通常プライマーとして１０〜３５程度のヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度の長さを有する本発明遺伝子の部分配列を有するものを挙げることができる。
【００２０】
このように、本発明の遺伝子には、ｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３を検出するための特異プライマーおよび／または特異プローブとして使用されるＤＮＡ断片もまた包含される。
【００２１】
本発明遺伝子は、後記実施例に記載のように、胎児期の生殖巣において一過的に発現しており生殖細胞の形成過程に機能している遺伝子である。また、本発明遺伝子のノックアウトマウスでは、成体精巣が、またｍＮｏｓ３ノックアウトマウスにおいては卵巣も小さくなっており、本発明遺伝子が生殖細胞の形成に必須の遺伝子であることが確認された。
【００２２】
本発明は、前記ｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３の機能が欠損したマウス又はその子孫を提供するものである。
【００２３】
本発明において、「遺伝子の機能が欠損した」とは、該遺伝子の遺伝子産物であるｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３が正常に産生されないことをいい、ｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３自体が産生されないこと及び一部を欠損するなどして機能を発現し得ないｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３様タンパク質を産生することが含まれる。
【００２４】
本発明遺伝子の機能欠損マウスを得るためには、インビトロで該遺伝子の機能を欠損させた後に、該欠損遺伝子を動物に戻して染色体上の本発明遺伝子との間で相同組換えを起こさせ、染色体上の本発明遺伝子を破壊し、そのマウス自体又はその子孫の該遺伝子の機能を欠損させるという方法が一般的に用いられる。
【００２５】
遺伝子の機能を欠損させる方法としては、遺伝子に人為的に変異を加えて該遺伝子を破壊する方法が挙げられ、例えばプロモーター領域及び／又はコード領域の少なくとも一部の欠失や、他の遺伝子を挿入又は置換することが挙げられる。
【００２６】
マウスに遺伝子を導入してそのマウスの個体又は子孫にその遺伝子を発現させる手法としては、従来からトランスジェニックマウスの作成に常用されている公知の手法を挙げることができ、例えば遺伝子ＤＮＡを受精卵の前核期胚に注入する方法、組換えレトロウイルスを初期胚に感染させる方法、相同組換えを起こさせた胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を胚盤胞又は８細胞期胚に注入する方法等によって得られた宿主胚をマウスに移植して産仔を得、これを他の個体と交配し、Ｆ１ヘテロ変異マウス、さらにはＦ２ホモ又はヘミ変異マウスを作成する方法が挙げられる。
このうち、ＥＳ細胞を用いる遺伝子導入の方法は、相同組換えにより遺伝子を破壊（ノックアウト）するのに適しており、ＥＳ細胞に遺伝子を導入する工程とキメラマウスを作出する工程とを分けて行えるという利点を有しているので好ましい。ＥＳ細胞を用いる遺伝子導入の方法は、公知の方法に準じて行えばよい。
【００２７】
以下、ＥＳ細胞を用いた遺伝子の導入の方法について、具体的に説明する。
ｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３の遺伝子機能の欠損には、プロモーター領域及び／又はコード領域の少なくとも一部を欠失させるか、いずれかの部位に他の遺伝子を挿入すればよい。また、ｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３遺伝子の機能を欠損させることができる限り、欠失又は他の遺伝子を挿入する部位は、イントロンであってもよい。
そして、ｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３遺伝子との間で相同組換えを行うにあたり、このように遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ（ターゲティングベクター）を作製する。
【００２８】
挿入する遺伝子としては、ｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３遺伝子の欠損を検出するためのマーカー遺伝子として機能する遺伝子を用いることが好ましく、そのような遺伝子としては、ポジティブ選別に用いるマーカー遺伝子として、例えばネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子が、ネガティブ選別に用いるマーカー遺伝子として、例えばチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子やジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子等が用いられる。尚、ネオマイシン耐性遺伝子は、ネオマイシン類似体であるＧ４１８を用いることにより目的遺伝子の選別を可能にする。
【００２９】
次に、こうして得られたターゲティングベクターと、ＥＳ細胞中のｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３遺伝子との間で相同組換えを行う。相同組換え用ＤＮＡのＥＳ細胞への導入は、例えば常用のエレクトロポレーションにより行うことができる。この相同組換えにおいては、ＥＳ細胞中のｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３遺伝子のＤＮＡと相同組換え用ＤＮＡの対応する領域との間で組換えが生じ、相同組換え用ＤＮＡ中に挿入されていたマーカー遺伝子がＥＳ細胞のゲノムのｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３遺伝子に挿入される。この結果、ＥＳ細胞は、ｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３遺伝子の機能を欠損し、同時にマーカー遺伝子を含むことになる。このマーカー遺伝子の選別機能に基づいて、ｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３遺伝子の機能を欠損したＥＳ細胞を選別することができる。
【００３０】
次に、このＥＳ細胞をマウスの胚盤胞等の宿主胚に注入し、得られた胚を偽妊娠マウスの子宮角に移植してキメラマウスを得る。このキメラマウスを適当な系統のマウスと交配することによりＦ１へテロ型の産仔を得る。キメラマウスの生殖細胞が相同組換え体、すなわちｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３遺伝子が破壊されているＥＳ細胞に由来していれば、ｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３遺伝子の機能が欠損したマウスを得ることができる。また、得られたヘテロ欠損動物同士を交配させ、その産仔の中からホモ欠損動物を得ることができる。
【００３１】
かくして得られた本発明ノックアウトマウスは、生殖精巣が小さくなっており、生殖細胞が全く存在しない。従って、このノックアウトマウスは、不妊症モデルマウスとして有用である。
【００３２】
このようにｍＮｏｓ２又はｍＮｏｓ３は、生殖細胞の移動又は分化に必須の遺伝子であるから、本発明遺伝子は不妊治療薬として有用である。また、本発明遺伝子の有無を検査することにより、不妊症の診断も可能である。
【００３３】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００３４】
実施例１（遺伝子の単離と解析）
（１）遺伝子の単離
アフリカツメガエルのナノスホモログ（Ｘｃａｔ−２）のｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｍｏｔｉｆをもとに、ＢＬＡＳＴ　ｓｅａｒｃｈを行った結果、ｍＮｏｓのヒトホモログとは異なるふたつのナノスホモログをヒトゲノム上に見い出した。そこで、ふたつのヒトナノスホモログと思われる遺伝子の配列上にｐｒｉｍｅｒを設定し、マウスのゲノムを鋳型として、ＰＣＲを行った。その結果、マウスのナノスホモログと思われるＤＮＡ断片を得、塩基配列を調べたところ、ｍＮｏｓ１とは別のマウスナノスホモログであることが分かり、ｍＮｏｓ２、ｍＮｏｓ３と名付けた。
【００３５】
（２）ｃＤＮＡの全長単離
ＰＣＲにより得られた断片の塩基配列からｐｒｉｍｅｒを設定しなおした。胎児期の生殖腺から単離したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを使って、５’ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡ　ｅｎｄ）、３’ＲＡＣＥを行い、ｍＮｏｓ２、ｍＮｏｓ３ともに完全長のｃＤＮＡを単離した。
【００３６】
得られたｍＮｏｓ２の塩基配列を配列番号１に示し、その推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。ｍＮｏｓ３の塩基配列を配列番号３に示し、その推定アミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００３７】
また、本発明者が先に単離したマウスナノス様遺伝子であるｍＮｏｓ１の塩基配列を配列番号５に、その推定アミノ酸配列を配列番号６に示す。ｍＮｏｓ１が神経系に発現が強く、初期の生殖細胞での発現がみられなかったのに対し、ｍＮｏｓ２及びｍＮｏｓ３は初期の生殖細胞で発現することから、ｍＮｏｓ１と、ｍＮｏｓ２及びｍＮｏｓ３とは機能が相違すると考えられる。
【００３８】
（３）ホモロジー検索
ｍＮｏｓ１、ｍＮｏｓ２及びｍＮｏｓ３の一次構造の比較を図１に示す。
ｍＮｏｓ１、ｍＮｏｓ２及びｍＮｏｓ３ともにナノスタンパクに特徴的なチンクフィンガーモチーフ（ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｍｏｔｉｆ）を有し、このモチーフにおいて非常に高いホモロジーを示す。しかしこのモチーフ以外のホモロジーは低い。
【００３９】
マウスナノス様遺伝子の構造を図２に示す。図２から明らかなように、ｍＮｏｓ１とｍＮｏｓ２は非常に長い３’ＵＴＲを有するのに対し、ｍＮｏｓ３は短い。図２には、発現解析で用いたプローブ（ｐｒｏｂｅ　ｆｏｒ　ｉｎ　ｓｉｔｕ）の位置を示してある。
【００４０】
実施例２（発現解析）
（１）ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる発現解析方法
発現を調べたい遺伝子のｃＤＮＡ（ここでは、ｍＮｏｓ１、２、３）をベクターに挿入し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　転写により、ｍＲＮＡの相補鎖のＲＮＡプローブを合成する。マウスの組織を固定・脱水・プロテアーゼ処理を行った後、組織中のｍＲＮＡとプローブをハイブリダイズさせる。洗浄・抗体反応などを経て、発色基質を加えて発色させ、個体または組織での遺伝子の発現部位を検出する。
【００４１】
（２）ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析方法
胎児期や成体の組織から、ｔｏｔｏａｌ　ＲＮＡを抽出する。抽出した　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型として、ｏｌｉｇｏ　ｄＴを使って逆転写を行う。次に、この反応によって得られた１本鎖のｃＤＮＡを鋳型として、発現を調べたい遺伝子に特異的なｐｒｉｍｅｒを使ってＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応産物を電気泳動し、検出されたバンドによりその遺伝子の発現を調べる。
【００４２】
（３）生殖巣における発現解析結果
雄の生殖巣におけるｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を図３及び４に示す。図３及び４から明らかなように、ｍＮｏｓ２及びｍＮｏｓ３は、雄の生殖巣にＥ１２．５〜１５．５（受精後の日数（当日を含む）を示す。以下同じ。）で発現し、Ｅ１３．５でピークを示した。雌の生殖巣では、いずれの遺伝子も発現は見られなかった。また、このことを確かめるためにＲＴ−ＰＣＲを行った結果を図５に示す。図５から明らかに、ｍＮｏｓ２及びｍＮｏｓ３はＥ１２．５〜１５．５で発現がみられた。また加えてｍＮｏｓ３の雌における発現が検出された。なお、ｍＮｏｓ１は、雄の生殖巣では発現しなかった。
【００４３】
（４）卵母細胞及び受精卵における発現解析結果
ｍＮｏｓ１は、卵母細胞（図６参照）及び神経系で発現する。これに対し、ｍＮｏｓ２とｍＮｏｓ３が卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅｓ）と受精卵（ｅｍｂｒｙｏｓ）で発現するか否かをｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検討した。その結果を図７及び８に示す。その結果、ｍＮｏｓ２は卵母細胞から１細胞期にかけて母性由来の発現が観察されたのに対し、ｍＮｏｓ３の発現はみられなかった。また、この結果はＲＴ−ＰＣＲでも確認された。
【００４４】
（５）成体組織における発現解析結果
脳、精巣、卵巣、腎臓、肝臓における発現を調べるために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果を図９に示す。ｍＮｏｓ１は脳に発現が強かった。卵巣でのｍＮｏｓ１、２の発現は卵母細胞での発現の結果と一致した。ｍＮｏｓ３は脳や卵巣に発現は見られないが、精巣で発現していた。
【００４５】
実施例３（ノックアウトマウスの作製）
（１）ターゲティングベクターの構築（図１０及び１１）
図１０にｍＮｏｓ２ターゲティングストラテジーを、図１１にｍＮｏｓ３ターゲティングストラテジーを示す。図１０及び図１１のストテラジーに従って、ｌａｃＺ遺伝子をノックインし、ｌａｃＺ染色によりその発現を解析できるようにデザインした。またＣｒｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅによりネオマイシン耐性遺伝子を除く。
【００４６】
（２）構築したターゲティングゲクターをエレクトロポーレーション法により、ＥＳ細胞に導入する。ネオマイシン（Ｇ４１８）存在下で８日間ほど培養すると、ネオマイシン耐性のＥＳ細胞がコロニーをつくる。このコロニーをピックアップし、ＰＣＲやゲノミックサザンにより遺伝子型を調べる。調べた結果、ターゲティングに成功したＥＳ細胞クローンを別の系統のマウスの８細胞期胚とアグリゲーション法により凝集させ、翌日まで培養する。胚盤胞まで発生した卵を里親マウスに子宮移植する。産まれたキメラマウスと野生型のマウスをかけあわせ、ＥＳ細胞由来のアリルをもつヘテロマウスを得る。さらにヘテロマウスどうしを交配させることにより、ホモマウスを得る。
【００４７】
（３）ヘテロ及びホモ変異マウスの解析
ノックインしたｌａｃＺ遺伝子によりｍＮｏｓ２ヘテロ変異マウスでのｌａｃＺ染色を行い、その発現を観察したところ、ｉｎ　ｓｉｔｕの結果と同様、雄の生殖巣での発現を示した。ヘテロ変異マウスの交配により得られたｍＮｏｓ２ホモ変異マウスは野生型やヘテロ変異マウスに比べて成体精巣が小さくなっており（図１２（Ａ））、その組織を観察すると、生殖細胞が全くなくなっていた（図１２（Ｂ））。さらに胎児期の生殖巣をみると、Ｅ１７．５〜１８．５で生殖細胞がなくなり始めることが分かった。ｍＮｏｓ３のホモ変異マウスでは雄、雌両性の生殖巣の形成が著しく阻害されており、生殖細胞が完全に消失していることがわかった（図１３、図１４、図１５）。
【００４８】
【発明の効果】
本発明の遺伝子はマウスにおける生殖細胞の形成に必須の遺伝子であることから、雄及び雌の不妊治療薬としてまた不妊症の診断薬として用いることができる。また本発明のノックアウトマウスは不妊症モデルとして有用である。
【００４９】
【配列表】
2004065040.tif 000002
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｍＮｏｓ１、ｍＮｏｓ２及びｍＮｏｓ３の一次構造の比較を示す図である。図中黒部分はＺｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　　ｍｏｔｉｆを示す。
【図２】ｍＮｏｓ１、ｍＮｏｓ２及びｍＮｏｓ３の構造の比較を示す図である。図中、ｐｒｏｂｅ　ｆｏｒ　ｉｎｓｉｔｕはｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション中用いたプローブの位置を示す。黒部分はＺｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　　ｍｏｔｉｆを示す。
【図３】胎仔に対するｍＮｏｓ２のｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【図４】胎仔に対するｍＮｏｓ３のｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション結果を示す図である。
【図５】胎仔に対するｍＮｏｓ１、ｍＮｏｓ２及びｍＮｏｓ３のＰＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図６】卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅｓ）のＧＶ期（ＧＶ　ｓｔａｇｅ）とＭ１１期（Ｍ１１　ｓｔａｇｅ）及び受精卵（ｅｍｂｒｙｏｓ）の１細胞期（１ｃｅｌｌ）、２細胞期（２ｃｅｌｌ）と桑実胚期（Ｍｏｒｕｌａ　ｓｔａｇｅ）におけるｍＮｏｓ１のｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図７】卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅｓ）のＧＶ期（ＧＶ　ｓｔａｇｅ）とＭ１１期（Ｍ１１　ｓｔａｇｅ）及び受精卵（ｅｍｂｒｙｏｓ）の１細胞期（１ｃｅｌｌ）、２細胞期（２ｃｅｌｌ）と桑実胚期（Ｍｏｒｕｌａ　ｓｔａｇｅ）におけるｍＮｏｓ２のｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図８】卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅｓ）のＧＶ期（ＧＶ　ｓｔａｇｅ）とＭ１１期（Ｍ１１　ｓｔａｇｅ）及び受精卵（ｅｍｂｒｙｏｓ）の１細胞期（１ｃｅｌｌ）、２細胞期（２ｃｅｌｌ）と桑実胚期（Ｍｏｒｕｌａ　ｓｔａｇｅ）におけるｍＮｏｓ３のｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図９】ｍＮｏｓ１、ｍＮｏｓ２及びｍＮｏｓ３の成体脳（ｂｒａｉｎ）、精巣（ｔｅｓｔｉｓ）、卵巣（ｏｖａｒｙ）、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）及び肝臓（ｌｉｖｅｒ）におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図１０】ｍＮｏｓ２のターゲティングストラテジーを示す図である。
【図１１】ｍＮｏｓ３のターゲティングストラテジーを示す図である。
【図１２】ｍＮｏｓ２ノックアウトマウスの４週齢の精巣のサイズの比較（Ａ）及び精巣切片のＨＥ染色結果（Ｂ）を示す図である（＋／−はヘテロ変異マウス、−／−はホモ変異マウス）。
【図１３】ｍＮｏｓ３ノックアウトマウスの４週齢の雄の精巣のサイズの比較（Ａ）精巣切片のＨＥ染色結果（Ｂ）及び４週齢の雌の卵巣（Ｃ）を示す図である（＋／−はヘテロ変異マウス、−／−はホモ変異マウス）。
【図１４】ｍＮｏｓ３ノックアウトマウスの６週齢の雌の卵巣のサイズの比較を示す図である（＋／−はヘテロ変異マウス、−／−はホモ変異マウス）。
【図１５】ｍＮｏｓ３ノックアウトマウスの６週齢の雌の卵巣切片を示す図である（＋／−はヘテロ変異マウス、−／−はホモ変異マウス）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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