(57)【要約】【課題】優れた活性を有するマンノースイソメラーゼを提供すること。【解決手段】サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）属の菌由来であって、マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質、およびそれをコードするポリヌクレオチドが提供される。これにより、マンノースイソメラーゼを安価に製造することが可能になる。【選択図】　図１
2004024199.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）属の菌由来であって、以下の（Ａ）および（Ｂ）の特性を有する、タンパク質：
（Ａ）　マンノースイソメラーゼ活性を有し、
（Ｂ）　ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した平均分子量が約４１０００である。
【請求項２】
以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の特性を有する、タンパク質：
（Ａ）　マンノースイソメラーゼ活性を有し、
（Ｂ）　ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した平均分子量が約４１０００であり、
（Ｃ）　Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号３で示される配列である。
【請求項３】
サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）属の菌由来である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
サーモビフィダ・エスピー（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．）ＭＢＬ１０００３（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６３２）株由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）　配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質、
（ｂ）　前記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有する、タンパク質、
（ｃ）　前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有する、タンパク質。
【請求項６】
前記（ｃ）における相同性が少なくとも８０％である、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）　配列番号２に示される塩基配列を含んでなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）　前記（ｉ）の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）　前記（ｉ）の塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドと少なくとも６０％の相同性を有する塩基配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記（ｉｉｉ）における相同性が少なくとも８０％である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主を培養し、得られる培養物からマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を採取することを含んでなる、目的タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、および請求項１２に記載の方法により生産されたタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質を含んでなる、マンノースイソメラーゼ酵素調製物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質、および請求項１２に記載の方法により生産されたタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質、または、請求項１３に記載の酵素調製物を用いて、フルクトース含有液中のフルクトースをマンノースに変換することを含んでなる、マンノースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、マンノースイソメラーゼ活性を有する新規なタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該タンパク質の製造方法、および該タンパク質を用いたマンノース製造方法に関する。
【０００２】
背景技術
マンノースイソメラーゼは、Ｄ−フルクトースとＤ−マンノースとを相互に変換する活性を有するタンパク質である。
マンノースイソメラーゼを生産する菌株としてはこれまでに、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（特開２０００−３１６５７２号公報、国際公開第ＷＯ００／６６７１９号）、サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属（特開平１１−７５８３６号公報）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属（特開平８−９９８６号公報）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（特許３００３００９号公報）、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属（発酵研究所報告　２８，８９−９４，１９６５）などが知られている。これらの菌に関する前記文献には、得られたマンノースイソメラーゼやその粗酵素液等を使用して、フルクトースからマンノースを生産する方法は開示されているが、マンノースイソメラーゼ酵素のアミノ酸配列は開示されておらず、また該酵素をコードするポリヌクレオチドの解析も行われていない。
【０００３】
この他のマンノースイソメラーゼを生産する菌株としては、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）（国際公開第ＷＯ０１／２５４４３）およびエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）（国際公開第ＷＯ００／６５０７２）が知られている。これらの菌に関する前記文献では、マンノースイソメラーゼをコードするポリヌクレオチドが単離されており、その配列も開示されている。
【０００４】
マンノースは、多糖（例えばマンナンなどのホモ多糖）として植物界に広く分布しているものであるが、最近では、鶏へのサルモネラ菌の感染を阻害することが知られている（Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　６８，１３５７，１９８９）。このため、鶏などの家禽または家畜への飼料添加物や、機能性食品素材として、マンノースの利用が検討されている。
【０００５】
現在までのところ、前記した文献に記載のマンノースイソメラーゼを利用したマンノース製造方法は、工業的レベルでの実用化には至っていない。これは、マンノースイソメラーゼ生産菌株における酵素の生産性が低いためであると推定される。
一般的に、菌株における生産性が低い酵素を工業的に用いるには、部分精製によって酵素比活性を高める必要がある。しかしながら、その操作に要する経費は少なくないため、最終製品のコストが増大することとなる。工業的な規模でのマンノースイソメラーゼを利用したマンノース生産には、マンノースイソメラーゼ生産菌の酵素生産性を向上させることが望まれる。
【０００６】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、土壌より採取され、工業的利用に適した特性を持つマンノースイソメラーゼを生産する特定の菌が、優れたマンノースイソメラーゼ活性を有する酵素を有することを見いだした。そしてこの酵素を単離し、その遺伝子を特定することにも本発明者らは成功した。このような情報に基づいて遺伝子工学的手法を用いることによって、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤やＵＶ照射を使用した酵素高生産変異株を取得する方法よりも確実に、酵素の生産性を向上させることができた。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【０００７】
したがって、本発明は、マンノースイソメラーゼ活性を有する新規なタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該タンパク質の製造方法、および該タンパク質を用いたマンノース製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明の一つの態様によるタンパク質は、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）属の菌由来であって、以下の（Ａ）および（Ｂ）の特性を有するものである：
（Ａ）　マンノースイソメラーゼ活性を有し、
（Ｂ）　ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した平均分子量が約４１０００である。
【０００９】
本発明の別の態様によるタンパク質は、以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の特性を有するものである：
（Ａ）　マンノースイソメラーゼ活性を有し、
（Ｂ）　ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した平均分子量が約４１０００であり、
（Ｃ）　Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号３で示される配列である。
【００１０】
本発明のさらに別の態様によるタンパク質は、下記からなる群より選択されるものである：
（ａ）　配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）　前記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有する、タンパク質、
（ｃ）　前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有する、タンパク質。
【００１１】
また本発明の好ましい態様によれば、これらのタンパク質はサーモビフィダ・エスピー（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．）ＭＢＬ１０００３（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６３２）株由来である。
【００１２】
本発明によれば、該タンパク質の遺伝子も提供される。ここでこの遺伝子は、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１３】
本発明によるポリヌクレオチドは、下記からなる群より選択されるものである：
（ｉ）　配列番号２に示される塩基配列を含んでなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）　前記（ｉ）の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）　前記（ｉ）の塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドと少なくとも６０％の相同性を有する塩基配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【００１４】
本発明による発現ベクターは、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなるものである。
本発明による宿主は、本発明による発現ベクターにより形質転換されたものである。
【００１５】
本発明による目的タンパク質の製造方法は、前記の形質転換された宿主を培養し、得られる培養物からマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を採取することを含んでなる。
【００１６】
本発明によるマンノースの製造方法は、前記したタンパク質、および前記製造方法により生産されたタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質、または本発明による酵素調製物を用いて、フルクトース含有液中のフルクトースをマンノースに変換することを含んでなる。
【００１７】
本発明によれば、高活性なマンノースイソメラーゼを得ることができる。
また、本発明のマンノースイソメラーゼをコードするポリヌクレオチドにヒスチジンタグ等を付加することによって、遺伝子組換体からの高純度なマンノースイソメラーゼの精製を容易にすることも期待できる。さらに、例えば、本発明による高純度なマンノースイソメラーゼを固定化担体等に固定化した調製物を使用することによって、バッチ法での酵素回収が容易となって再利用も可能となるので、マンノース生産の生産コストを低減することも期待される。
このように、本発明によれば、マンノースイソメラーゼを安価で大量に製造することができ、またそれにより得られるマンノースイソメラーゼを用いることによって、マンノースの大量かつ効率的な製造が可能となる。
【００１８】
【発明の具体的説明】
微生物の寄託
サーモビフィダ・エスピーＭＢＬ１０００３株（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．　ＭＢＬ１０００３）は、平成９（１９９７）年５月２日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６３２である。なお、サーモビフィダ属は、近年サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属の再分類化により付与された分類である。
【００１９】
マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質
前記したように、本発明の一つの態様によれば、本発明のタンパク質は、マンノースイソメラーゼ活性を有する。
【００２０】
本発明において、「マンノースイソメラーゼ活性を有する」とは、当業者によりマンノースイソメラーゼ活性が認められたと評価される場合をいい、例えば、後述する実施例の「マンノースイソメラーゼ活性の測定」の項と同様の条件において測定した場合にマンノースイソメラーゼ活性が認められたと評価される場合を意味するものとする。
【００２１】
本発明において、「マンノースイソメラーゼ活性」とは、Ｄ−フルクトースとＤ−マンノースを相互に変換する活性のことをいい、すなわち、Ｄ−フルクトースをＤ−マンノースに変換する活性と、Ｄ−マンノースをＤ−フルクトースに変換する活性との双方を示すことをいう。このとき例えば、Ｄ−マンノースをＤ−フルクトースに変換する活性が高い場合には、もう一方のＤ−フルクトースをＤ−マンノースに変換する活性も高いものと理解される。
【００２２】
また、「相互に変換する」とは、例えば水溶液中にマンノースがフルクトースに比べて過剰にある場合、またはフルクトースがマンノースに比べて過剰にある場合に、マンノースイソメラーゼが働くと、水溶液中のマンノースとフルクトースとが所定の平衡状態の量になるまでそれぞれを変換することをいう。そのような平衡状態は、例えば、溶液の温度が５０℃で、ｐＨが７である場合、液中のマンノース：フルクトースの濃度比が２５：７５となる状態である。
【００２３】
また本発明の一つの態様によるタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により測定したその平均分子量が約４１０００である。ここで、この分子量は、慣用の方法を適用することにより当業者であれば容易に測定することができる。
【００２４】
本発明によるタンパク質は、典型的には、そのＮ末端のアミノ酸配列が配列番号３で示される配列である。
【００２５】
本発明によるタンパク質は、典型的には、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）属の放線菌由来のものであり、好ましくはサーモビフィダ・エスピー（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．）、より好ましくはサーモビフィダ・エスピー（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．）ＭＢＬ１０００３株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６３２）由来のものである。またこれらは、その変異株であってもよい。
【００２６】
本発明によるタンパク質は、例えば、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）属の菌の培養液からイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、および／またはゲルクロマトグラフィーを種々組み合わせて単離および精製を行うことによって得ることができる。具体的には、例えば、実施例の例１〜２に記載の方法に従って単離して得ることができる。
【００２７】
本発明によるタンパク質は、好ましくはその至適ｐＨが７〜１０の範囲であり、および／またはその至適温度が５０〜６０℃の範囲である。
【００２８】
前記したように、本発明の別の態様によれば、タンパク質は、下記からなる群より選択されるものである：
（ａ）　配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）　前記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有する、タンパク質、
（ｃ）　前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有する、タンパク質。
【００２９】
前記（ａ）のアミノ酸配列において、欠失、置換、挿入もしくは付加されてもよいアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜４個、最も好ましくは１個である。
【００３０】
本発明の別の好ましい態様によれば、前記（ｂ）のタンパク質は、前記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が、保存的置換されたアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質である。
【００３１】
ここで「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように、１もしくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような保存的置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。
極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００３２】
本発明の別の好ましい態様によれば、本発明によるタンパク質と、前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質との間の相同性は、少なくとも６０％であり、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９８％である。
なお、本明細書において示したこの相同性の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
【００３３】
本発明の別の態様によれば、本発明によるタンパク質は、例えば下記のようにして得ることもできる。
マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を含む生物を培養し、その培養液からマンノースイソメラーゼ活性を指標に、慣用の方法を適用して、該活性を有するタンパク質を単離して、精製する。得られた精製タンパク質のアミノ酸配列を既知の方法により解析して、これをコードするオリゴヌクレオチドの全部または一部を合成して、該生物のゲノムＤＮＡをテンペレートにＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い長鎖プローブを合成する。このプローブを用いてＰＣＲ、インバースＰＣＲ、またはＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ）法等を用いてマンノースイソメラーゼ酵素の翻訳領域の塩基配列を解析する。このようにして得られたマンノースイソメラーゼ酵素の翻訳領域を、発現に用いる宿主内で機能する制御配列に連結して、発現ベクターを得る。この発現ベクターを用いて、該宿主を形質転換して、この形質転換体を培養することによって、マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を効率的に得ることができる。
【００３４】
マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド本発明によるポリヌクレオチドは、前記したタンパク質をコードしてなるものである。
本発明によるポリヌクレオチドは、典型的には、前記したように、下記からなる群より選択されるものである：
（ｉ）　配列番号２に示される塩基配列を含んでなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）　前記（ｉ）の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）　前記（ｉ）の塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドと少なくとも６０％の相同性を有する塩基配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【００３５】
前記（ｉ）の塩基配列において、欠失、置換、挿入もしくは付加されてもよい塩基の数は、好ましくは１〜１２０個、より好ましくは１〜２４個、さらに好ましくは１〜１２個、最も好ましくは１〜３個である。
【００３６】
本発明のより好ましい態様によれば、該ポリヌクレオチドと、前記（ｉ）の塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドとの間の相同性は、少なくとも６０％であり、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９８％である。
【００３７】
前記（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドのような改変型の配列を有するポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発法やＰＣＲ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，　ｖｏｌ．１０，　ｐｐ６４８７　（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　１００，　ｐｐ４４８　（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ　Ｅｄｔ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）、ＰＣＲ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ２００　（１９９１））等の既知の方法を適用することにより、当業者が容易に作成することができる。このようにして得られたポリヌクレオチドが、所望の活性を有するか否かは、当業者に周知の方法を適用して、タンパク質を発現させ、これに例えば後述する実施例に記載の方法を適用することによって容易に判定できる。
【００３８】
本発明によるポリヌクレオチドは、例えば下記のようにして得ることができる。マンノースイソメラーゼ酵素生産菌の染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いて、配列番号１に示されるマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列の一部または全部に対応する塩基配列を合成し、これによって得られたプライマーを使用してＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施する。得られたＰＣＲ増幅断片からの情報を解析することによって本発明によるポリヌクレオチドを得ることができる。このとき、マンノースイソメラーゼ生産菌としては特に限定されないが、好ましくはサーモビフィダ属の菌、より好ましくはサーモビフィダ・エスピー、最も好ましくはサーモビフィダ・エスピーＭＢＬ１０００３株を用いることができる。本発明によるポリヌクレオチドを得る上では、ＰＣＲの反応条件の設定が重要となるが、具体的には、例えば後述する実施例の例４に記載の方法が挙げられる。
また、本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列を利用し、慣用の方法を適用して化学的に合成することによって得てもよい。
【００３９】
発現ベクターおよび宿主
本発明によれば、前記したポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターが提供される。本発明による発現ベクターは、宿主細胞内において複製可能で、かつ、本発明のマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を発現可能な状態で、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるものである。
本発明による発現ベクターの構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００４０】
本発明において使用できる発現ベクターとしては、宿主染色体ＤＮＡに組込まれるものや、自己複製可能な自律的複製配列を有するベクターを宿主細胞内でプラスミド状態で存在させるものが挙げられる。例えば、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１１８等）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ＋等）、およびｐＢＲ３２２等のプラスミドが挙げられる。宿主細胞内に存在するポリヌクレオチドのコピー数は、１コピーでも複数であっても良い。
【００４１】
本発明による発現ベクターは、これを宿主に導入して本発明のタンパク質を発現させるために、本発明のポリヌクレオチドの他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等をさらに含んでいてもよい。
【００４２】
発現を制御するＤＮＡ配列としては、宿主で機能する制御配列であれば特に制限はなく、例えばプロモーター、ターミネーター、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列等が含まれる。
制御配列への連結は、例えば、常法に従い、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（目的遺伝子）の翻訳領域をプロモーターの下流に順方向に挿入することによって行うことができる。この場合、目的遺伝子を他のタンパク質の翻訳領域をコードする外来遺伝子と連結させて融合タンパク質として発現させることもできる。
【００４３】
遺伝子マーカーとしては、形質転換体の選択手法に応じて適宜選択できる。例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、デストマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ビアラフォス、ブラストサイジンＳ、フレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン等の薬剤に対する遺伝子が挙げられる。栄養要求性を相補する遺伝子としては、例えば、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３等の遺伝子が挙げられる。
【００４４】
これらのＤＮＡ配列および遺伝子マーカーは、本発明による発現ベクター中にそれぞれが機能し得る形で連結される。
【００４５】
本発明によれば、前記発現ベクターにより形質転換された宿主が提供される。本発明において使用する宿主−ベクター系はマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを正しく転写および翻訳することができるものであれば特に限定されず、例えば宿主として大腸菌、放線菌、糸状菌等の微生物を用いる系が挙げられる。好ましくは大腸菌を用いる系が挙げられる。
本発明の発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、遺伝子工学の分野で慣用されている方法に従って実施することができる。そのような方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リチウム法または塩化カルシウム法等が挙げられ、宿主にとって効率の良い手法が選択される。
【００４６】
形質転換体（形質転換された宿主）の培養は、常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができ、典型的には、形質転換体の培地および培養条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。
【００４７】
タンパク質の製造方法
本発明によれば、前記したように、前記の形質転換された宿主を培養し、得られる宿主を含む培養物からマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を採取することを含んでなる目的タンパク質の製造方法が提供される。
培養物から目的タンパク質の取得は、当該技術分野において慣用されている方法にしたがって行うことができ、例えば、培養物からの抽出（磨砕処理、加圧破砕等）、回収（ろ過、遠心分離等）、および／または精製（塩析法、溶媒沈殿法等）等の手段を適宜組みあわせて行うことができる。また、これらの過程において、必要に応じてフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ベンズアミジンまたはロイペプチン等のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。
【００４８】
マンノースイソメラーゼ酵素調製物
本発明によればまた、マンノースイソメラーゼ酵素調製物が提供される。このマンノースイソメラーゼ酵素調製物は、前記したマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を少なくとも１種含んでなるものであり、必要に応じて、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、防腐剤等をさらに含んでなるものである。
このマンノースイソメラーゼ酵素調製物の形態は、特に制限はなく、粉末状であっても液体状であってもよい。例えば、粉剤、粒剤、顆粒剤、非粉塵化顆粒、液体製剤等の形態をとっていてもよい。また、マンノースイソメラーゼ酵素調製物は、本発明によるタンパク質を市販の陽イオンまたは陰イオン交換樹脂または吸着樹脂に固定化した固定化酵素の形態であってもよい。
【００４９】
マンノースの製造方法
本発明によれば、前記したように、前記したタンパク質、および前記製造方法により生産されたタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質を用いて、フルクトース含有液中のフルクトースをマンノースに変換することを含んでなる、マンノースの製造方法が提供される。
【００５０】
該方法において、フルクトース含有液に該タンパク質を用いて、タンパク質をフルクトースに作用させる場合の反応条件は、適宜選択することができる。例えば、反応液温は、一般的には２５〜７０℃であり、好ましくは３０〜６０℃である。また、反応ｐＨは、一般的にはｐＨ５〜１１であり、好ましくは６〜１０である。反応時間は、使用する酵素量や基質濃度に依存するため、それらに応じて適宜設定することができるが、３〜４８時間の間に設定するのが好ましい。
該方法において、フルクトース含有液は、フルクトースを１０％（Ｗ／Ｖ）以上含んでなることが望ましく、通常は、反応に用いたフルクトースの約２５％（Ｗ／Ｗ）がマンノースに異性化される。
【００５１】
本発明の好ましい態様によれば、この製造方法は、フルクトース含有液中のフルクトースをマンノースに変換させて得られるマンノース含有液から、マンノースを分離し、必要に応じて精製することをさらに含んでなる。
【００５２】
酵素反応により得られたマンノース含有液からのマンノースの分離回収は、慣用の方法を適用することにより実施可能である。例えば、濾過や遠心分離等により不純物を取り除いた後、イオン交換樹脂や活性炭カラム等によるクロマトグラフィーによってマンノースを精製することができる。効率的な精製を行うために、クロマトグラフィー装置として好ましくは擬似移動層クロマトグラフィー装置を用いてもよい。イオン交換樹脂は、好ましくは強酸性陽イオン交換樹脂を当業者で慣用の方法によりＣａ型として使用することができる。
【００５３】
さらに、得られたマンノースに対しては、慣用の方法、例えば減圧濃縮や膜濃縮等によって濃縮し、アルコールや水系での晶析を行うことができる。得られた結晶を遠心分離や濾過等で回収することにより、高純度のマンノース結晶を得ることができる。
【００５４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００５５】
マンノースイソメラーゼ活性の測定
マンノースイソメラーゼ活性の測定は、以下に示す方法に従って行った。
基質液（０．２Ｍマンノース−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液）１ｍｌと酵素液１ｍｌを５０℃で３０分間反応させ、ここに０．５Ｍ過塩素酸２ｍｌを加えて酵素を失活させた後、遠心分離（３，０００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間）して反応液上清を得た。得られた該上清中の生成フルクトース量を、システイン−カルバゾール硫酸法（「生物化学実験法１−還元糖の定量法」、第７０〜７２頁、福井作蔵著、学会出版センター）に従って測定し、これにより、マンノースイソメラーゼ活性を決定した。
【００５６】
なおここで、被検タンパク質とマンノースを一定時間インキュベーションした後に生成されるフルクトースを測定した場合に、１分間に１μＭのフルクトースを生成する酵素量は１単位（１Ｕ）と定義する。
【００５７】
例１：　３０Ｌジャーによるマンノースイソメラーゼ生産菌の培養
サーモビフィダ・エスピー（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．）ＭＢＬ１０００３株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６３２）を、下記構成成分からなる寒天培地ａを用いて調製したスラント上において、５０℃、７２時間培養した。
寒天培地ａの構成成分：
グルコース０．５％（Ｗ／Ｖ）、マンノース１．０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．４％（Ｗ／Ｖ）、ポリペプトン０．１％（Ｗ／Ｖ）、リン酸水素２カリウム０．２％（Ｗ／Ｖ）、硝酸アンモニウム０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（Ｗ／Ｖ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０．５％（Ｗ／Ｖ）、炭酸ナトリウム０．５％（Ｗ／Ｖ）、および寒天２．０％（Ｗ／Ｖ）。
【００５８】
培養された菌体１エーゼを、前記の寒天培地ａから寒天を除いた液体培地ａ３０ｍｌを入れた２５０ｍｌ容バッフルつき三角フラスコに植菌し、これを、５０℃、４８時間で振とう培養した。
得られた培養液を、下記構成成分からなる液体培地ｂを３００ｍｌ入れた１Ｌ容三角フラスコ中に２％（Ｖ／Ｖ）添加し、これを５０℃で４８時間培養した。
液体培地ｂの構成成分：
マンノース１．０％（Ｗ／Ｖ）、グルコース０．５％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．４％（Ｗ／Ｖ）、ポリペプトン０．１％（Ｗ／Ｖ）、硝酸アンモニウム０．５％（Ｗ／Ｖ）、リン酸水素２カリウム０．２％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム０．０５％（Ｗ／Ｖ）、ポテトデキストロースブロス１．０％（Ｗ／Ｖ）、カルボキシメチルセルロース０．５％（Ｗ／Ｖ）、および炭酸ナトリウム０．５％（Ｗ／Ｖ）。
【００５９】
得られた培養液をさらに、前記液体培地ｂを１５Ｌ入れた３０Ｌ容培養槽中に２％（Ｖ／Ｖ）添加し、これを５０℃で４８時間培養した。
得られた培養液を遠心分離（９０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間）して菌体を回収した。
該菌体は凍結乾燥法によって乾燥し、凍結乾燥菌体３００ｇが得られた。
【００６０】
例２：　マンノースイソメラーゼの単離および精製
例２−１：菌体からのマンノースイソメラーゼ抽出
例１で得られた凍結乾燥菌体３００ｇを、菌体重量の１０倍量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理によって菌体を破砕した。この超音波処理液を遠心分離して沈澱を除き、得られた上澄み液を０．４５μｍメンブランフィルターにて濾過し、さらに分画分子量１万のＵＦ膜（ミリポア社製、Ｂｉｏｍａｘ）にて液量が１／１０になるまで濃縮した。
この濃縮液を粗酵素液としてさらなる精製処理に用いた。
【００６１】
例２−２：陰イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ）による精製
得られた粗酵素液３００ｍｌを、８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍｌと混合し、ｐＨ７．０に調整した。陰イオン交換カラムＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（アマシャムファルマシア社製、１０ｃｍ×１５ｃｍ）に、調整した前記粗酵素液（８００ｍｌ）を供し、樹脂に粗酵素液中のタンパク質を吸着させた。
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中のＮａＣｌ濃度を段階的に０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍと増加させた溶離液を順次用いて、吸着タンパク質を溶出させた。
マンノースイソメラーゼ活性は、ＮａＣｌ濃度が０．３Ｍである場合において、その溶出ピークで検出された。このピークを回収し、分画分子量１万のＵＦ膜（ミリポア社製、Ｂｉｏｍａｘ）にて濃縮し脱塩した。
【００６２】
例２−３：疎水クロマトグラフィー（カラム：Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ＩＳＯ）による精製
例２−２で得られたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ溶出画分３００ｍｌに、最終濃度が１Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、疎水クロマトカラムＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＩＳＯ（アマシャムファルマシア社製、３０ｍｍ×１５ｃｍ）に全量を供して、前記液中のタンパク質を吸着させた。次いで、１Ｍの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を溶離液として流して、カラムから非吸着タンパク質を除いた。
吸着タンパク質は脱イオン水を流すことにより溶出させた。マンノースイソメラーゼ活性は、脱イオン水溶出画分に検出された。
【００６３】
例２−４：疎水クロマトグラフィー（カラム：Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ＰＨＥ）による精製
例２−３で得られた脱イオン水溶出画分３００ｍｌに、最終濃度が１Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、疎水クロマトカラムＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＰＨＥ（アマシャムファルマシア社製、３０ｍｍ×１５ｃｍ）に全量を供して、液中のタンパク質を吸着させた。溶離液において、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の硫酸アンモニウム濃度を連続的に減少させることによって、吸着タンパク質を溶出させた。
マンノースイソメラーゼ活性を有する画分は、溶出液中の硫酸アンモニウム濃度が０．１５Ｍ〜０Ｍであるときに溶出された。溶出液は分画分子量１万のＵＦ膜（ミリポア社製、Ｂｉｏｍａｘ）にて濃縮して脱塩を行い、４４．５ｍｇのタンパク質を得た。タンパク質濃度は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質とした検量線から、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓｅｙ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社製）によって求めた。
【００６４】
例２−５：陰イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＤＥＡＥ−ＣＯＳＭＯｇｅｌ）による精製
例２−４で得られた濃縮液１ｍｌを、陰イオン交換クロマトカラムＣＯＳＭＯＧＥＬ−ＤＥＡＥ（ナカライテスク，８ｍｍ×０．７５ｃｍ）に供して、液中のタンパク質を吸着させた。溶離液において、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中のＮａＣｌ濃度を連続的に増加させることによって、吸着タンパク質を溶出させた。
マンノースイソメラーゼ活性を有する画分は、溶出液中のＮａＣｌ濃度が０．１５Ｍ付近であるときに溶出された。
【００６５】
例２−６：ゲルクロマトグラフィー（カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ）による精製
例２−５で得られた溶出液０．７ｍｌを、ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０）に供し、該液中のタンパク質を吸着させた。０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液を溶離液とし、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎで該ゲルカラムに流した。溶出されたマンノースイソメラーゼ活性画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、目的タンパク質を特定した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽　ＡＥ−６５３０Ｍ／ＡＥ−６５３０Ｐ（ＡＴＴＯ社製）を用いて実施し、１０％アクリルアミドゲルおよび泳動用バッファーは前記の製品取扱説明書を参照して調製した。なお、分子量スタンダードは、１０ｋＤａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｄｄｅｒ（商品名：ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬＲ、ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いた。
得られたマンノースイソメラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル上で単一バンドにまで精製され、４１０００の平均分子量を示していた。
【００６６】
例３：　マンノースイソメラーゼのＮ末端と消化断片のアミノ酸配列解析
例２で精製されたマンノースイソメラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のバンドをＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にブロッティングし、ペプチドシークエンサー（１００５Ａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　Ｃｏ．）にかけてＮ末端アミノ酸２９配列（配列番号３）を解析した。配列は以下に示したとおりであった。
ＴＬＷＴＡＲＡＡＨＲＡＷＬＤＡＥＡＲＲＬＶＤＦＡＡＡＡＤＨ（配列番号３）
【００６７】
また、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄの方法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２５２，１１０２−１１０６，１９７７）にしたがってゲル上でＥｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｇｌｕ−Ｃにより消化した断片も同様の方法でブロッティングし、ペプチドシークエンサーにかけてアミノ酸１６配列（配列番号４）を解析した。配列は以下に示したとおりであった。
ＳＷＤＡＡＷＨＡＤＥＰＹＲＧＡＮ　（配列番号４）
【００６８】
例４：　マンノースイソメラーゼ遺伝子のクローニング
例４−１：マンノースイソメラーゼの部分塩基配列の決定
本発明によるマンノースイソメラーゼは、放線菌由来でありＧＣ含量が高い（７０％以上）ため、通常のＰＣＲ法では増幅された遺伝子断片を得ることができなかった。そこで、プライマーのデザイン、温度条件、ポリメラーゼ等のような細部にわたって条件の検討を行った。以下に、部分塩基配列の決定に用いた条件を示した。
【００６９】
マンノースイソメラーゼのＮ末端および消化断片のアミノ酸配列からコドン縮重の少ない領域を選び出し、フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号５）とリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号６）をデザインして、化学合成した。
フォワート゛フ゜ライマー：５’−　ＩＧＣＩＭＧＩＧＣＩＧＣＩＣＡＹＭＧＩＧＣＮＴＧＧ　−３’（配列番号５）
リハ゛ースフ゜ライマー　：５’−　ＣＩＣＫＲＴＡＩＧＧＹＴＣＲＴＣＩＧＣＲＴＧＣＣＡ　−３’（配列番号６）
【００７０】
例１の寒天培地ａから寒天を除いた液体培地ａ　３０ｍｌで、サーモビフィダ・エスピー（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．）ＭＢＬ１０００３株を、５０℃で４８時間培養し、放線菌ゲノム抽出法（Ｈｕｎｔｅｒらの方法、Ｉ．Ｓ．　Ｈｕｎｔｅｒ（１９８５），　Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．　Ｉｎ　Ｇｌｏｖｅｒ　Ｄ．Ｍ．（ｅｄ）　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｖｏｌ．１．Ａ，　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ．　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，　ＤＣ，　ｐｐ１９−４４）によってゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号５および配列番号６に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、４５３ｂｐのマンノースイソメラーゼ遺伝子断片を得た。該ＰＣＲの条件は表１に示されるとおりであった。
【００７１】
【表１】
2004024199.tif 000003
【００７２】
得られた遺伝子断片を、ＴＯＰＯ　ＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用してＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込み、このベクターをエレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０株に取り込ませた。この株を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で培養を行なった。
生育したコロニーのうち白色あるいは薄青色を選び出し、定法にてプラスミドを単離した。
さらに、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　ＢｉｇＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（パーキンエルマー社製）を用いて、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０　Ｇｎｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ，　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）にてＤＮＡ塩基配列を解読した。
【００７３】
得られた塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、例３で得られた２つのアミノ酸配列と一致し、マンノースイソメラーゼ遺伝子の一部であることが判明した。得られたマンノースイソメラーゼ遺伝子断片のＤＮＡ塩基配列は、以下に示されるとおりであった。
ＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＡＣＣＣＣＧＡＧＣＡＣＧＧＴＴＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＴＧＡＣＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＣＧＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＣＣＣＧＣＧＧＣＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＡＣＴＣＧＣＧＣＡＡＡＧＡＧＧＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＣＧＣＧＴＴＣＧＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＧＣＧＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＴＧＡＴＣＧＡＡＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＴＧＣＣＧＣＧ　（配列番号７）
【００７４】
例４−２：マンノースイソメラーゼの５’および３’側未知領域の塩基配列の決定
例４−１と同様に、マンノースイソメラーゼはＧＣ含量が高いため、通常のＰＣＲ条件では目的物を得ることができなかった。そこで、前記と同様にプライマーのデザイン、温度条件、ポリメラーゼ等のような細部にわたって条件の検討を行った。以下に５’および３’側未知領域の塩基配列の決定に用いた条件を示した。
【００７５】
５’および３’側未知領域の塩基配列の解析を目的としてＴＡＩＬ−ＰＣＲ法（ｔｈｅｒｍａｌ　ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ−ＰＣＲ）（Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　，８（３），４５７−４６３，１９９５，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２５，６７４−６８１，１９９５）を実施するために、例４−１で得られたマンノースイソメラーゼ遺伝子の遺伝子断片４５３ｂｐの塩基配列（配列番号７）より、以下の６個のプライマー（ｌｏｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ：配列番号８〜１３）を化学合成した。
フォワート゛フ゜ライマー１：５’−　ＣＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴ　−３’（配列番号８）
フォワート゛フ゜ライマー２：５’−　ＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＡＣ　−３’（配列番号９）
フォワート゛フ゜ライマー３：５’−　ＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＴ　−３’（配列番号１０）
リハ゛ースフ゜ライマー１　：５’−　ＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＡＡＣＧＣＧＴＧＣＴ　−３’（配列番号１１）
リハ゛ースフ゜ライマー２　：５’−　ＣＧＧＣＣＡＣＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＣＡＧＧＴ　−３’（配列番号１２）
リハ゛ースフ゜ライマー３　：５’−　ＧＧＧＴＧＧＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＡＧＴ　−３’（配列番号１３）
【００７６】
また、未知領域に特異的に結合する３個の混合プライマー（ｓｈｏｒｔ　ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒ）を化学合成した。
混合プライマー１：５’−　ＴＣＴＮＴＧＮＡＷＣＴＮＣＡＣＷ　−３’（配列番号１４）
混合プライマー２：５’−　ＮＧＴＣＧＡＳＷＧＡＮＡＷＧＡＡ　−３’（配列番号１５）
混合プライマー３：５’−　ＧＴＮＣＧＡＳＷＣＡＮＡＷＧＴＴ　−３’（配列番号１６）
【００７７】
次に、５’側未知領域の塩基配列を解析するため、例４−１で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとし、リバースプライマー１（配列番号１１）と混合プライマー１（配列番号１４）を用いて１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。続いて、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとし、リバースプライマー２（配列番号１２）と混合プライマー１（配列番号１４）を用いて２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。さらに、２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとし、リバースプライマー３（配列番号１３）と混合プライマー１（配列番号１４）を用いて３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ（条件：３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ−１）を行い、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列（２２７ｂｐ：配列番号１７）を解読した。
【００７８】
この塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、例３で得られたＮ末端側アミノ酸配列（配列番号３）が存在していた。このことから、マンノースイソメラーゼ遺伝子の５’上流部分であることが判明した。以下に、得られた５’上流部分の塩基配列を示した。
ＧＴＧＣＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＴＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＴＣＮＣＡＣＣＧＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＣＡＣＡＣＧＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＧＣＣＡＣＣＧＡＴＧＡＣＣＴＴＧＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧ　（配列番号１７）
【００７９】
次に、３’側未知領域の塩基配列を解析するため、例４−１で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、フォワードプライマー１（配列番号８）と混合プライマー２（配列番号１５）を用いて１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。続いて、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとして、フォワードプライマー２（配列番号９）と混合プライマー２（配列番号１５）を用いて２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。さらに、２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとして、フォワードプライマー３（配列番号１０）と混合プライマー２（配列番号１５）を用いて３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ（条件：３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ−２）を行い、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列（５８６ｂｐ：配列番号１８）を解読した。
【００８０】
この塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、例３で得られた消化断片のアミノ酸配列（配列番号４）の一部が存在していた。このことから、マンノースイソメラーゼ遺伝子の３’下流部分であることが判明した。以下に、得られた３’下流部分の塩基配列を示した。
ＧＣＣＧＣＧＴＧＧＣＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＡＣＣＣＴＡＣＣＧＣＧＧＣＧＣＴＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＡＧＡＡＧＣＧＴＴＣＣＴＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＣＧＴＧＣＧＣＴＧＣＧＧＡＴＣＧＣＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＣＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＣＣＣＧＡＣＴＧＧＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＣＣＣＡＣＣＣＧＴＴＣＣＧＣＣＣＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＧＣＣＧＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＴＧＴＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＧＧＡＡＣＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＡＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＴＡＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＧＴＡＴＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡ　（配列番号１８）
【００８１】
配列番号１８の塩基配列には終止コドンが含まれていなかった。そこで、さらに３’側未知領域の塩基配列を解析するためＴＡＩＬ−ＰＣＲを続けた。
まず、配列番号１８の塩基配列からフォワードプライマー４（配列番号１９）を化学合成した。
フォワート゛フ゜ライマー４：５’−　ＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＴＡＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣ　−３’（配列番号１９）
【００８２】
例４−１で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、フォワードプライマー１（配列番号８）と混合プライマー３（配列番号１６）を用いて１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。続いて、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとして、フォワードプライマー２（配列番号９）と混合プライマー３（配列番号１６）を用いて２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。さらに、２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとしてフォワードプライマー４（配列番号１９）と混合プライマー３（配列番号１６）を用いて３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ（条件：３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ−２）を行い、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列（３５４ｂｐ：配列番号２０）を解読した。
【００８３】
この塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先のＴＡＩＬ−ＰＣＲで得られた塩基配列（配列番号１８）にコードされるアミノ酸配列の一部（配列番号１における３３１〜３５７番目のアミノ酸）および終止コドン（ＴＧＡ）が存在していた。このことから、マンノースイソメラーゼ遺伝子の３’下流部分であることが判明した。以下に、終止コドンを含む３’下流部分の塩基配列を示した。
ＧＴＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＧＴＡＴＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＣＧＡＧＣＴＣＧＡＣＣＣＧＡＣＧＣＴＣＧＣＴＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＧＴＴＴＡＣＣＡＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＧＣＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＴＣＧＣＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＧＧＧＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＧＣＡＧＧＣＣＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＣＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＧＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＣＣＧＮＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＧＣＧＧＧＣＴＣＧＧＣＣＣＧ　（配列番号２０）
【００８４】
なお、ここでおこなったＴＡＩＬ−ＰＣＲの条件（Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　，８（３），４５７−４６３，１９９５，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２５，６７４−６８１，１９９５の方法を改変した）は、表２に示したとおりであった。
【００８５】
【表２】
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2004024199.tif 000005
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【００８６】
例４−３：マンノースイソメラーゼ遺伝子の全塩基配列の決定
ＴＡＩＬ−ＰＣＲにより明らかになった上流、下流の塩基配列より、以下に示すフォワードプライマー（配列番号２１）、リバースプライマー（配列番号２２）を化学合成した。
フォワート゛フ゜ライマー：５’−ＣＣＴＣＣＡＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＴＣ　−３’（配列番号２１）
リハ゛ースフ゜ライマー　：５’−ＣＣＡＴＴＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＣＧＧ　−３’（配列番号２２）
例４−１で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２１、配列番号２２の二つのプライマーを用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、その塩基配列を解読して、最終的にマンノースイソメラーゼ遺伝子の全塩基配列（配列番号２３）を決定した。
【００８７】
なお、ここでおこなったＰＣＲの条件は、表３に示したとおりであった。
【００８８】
【表３】
2004024199.tif 000008
【００８９】
例５：　マンノースイソメラーゼ遺伝子の大腸菌における発現
例５−１：発現ベクターの構築と形質転換
マンノースイソメラーゼのＤＮＡ全長の両端にＮｃｏＩとＸｈｏＩサイトを付加するために、マンノースイソメラーゼ遺伝子の全塩基配列を基に以下に示したフォワードプライマー（配列番号２４）、リバースプライマー（配列番号２５）を化学合成した。
フォワート゛フ゜ライマー：５’−　ＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧ　−３’（配列番号２４）
リハ゛ースフ゜ライマー：５’−　ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧＧ　−３’（配列番号２５）
【００９０】
例４−１で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとし、配列番号２４、配列番号２５の二つのプライマーを用いてＰＣＲを行った。
なお、ここでおこなったＰＣＲの条件は、表４に示したとおりであった。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
増幅された遺伝子断片を、ＴＯＰＯ　ＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングした。クローニングは前記キットの取扱説明書に記載の条件にしたがって実施し、プラスミドを単離した。
クローニングしたプラスミドとｐＥＴ３０ａ（＋）ｐｌａｓｍｉｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで分解し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ）（ＴＯＹＯＢＯ　Ｃｏ．　Ｌｔｄ．）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎ反応を行って発現用プラスミドを調製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応は、ベクターとインサートのモル比を１対４とし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈはベクター＋インサートと同容量とし、これらの混合物を１６℃で１６時間反応させた。
得られたプラスミド（ｐＥＴ−３０ａ（＋）ＭＩ）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１Ｇｏｌｄ）を形質転換した。
【００９３】
例５−２：マンノースイソメラーゼの大腸菌での発現
構築したベクターを導入して形質転換した大腸菌を、カナマイシンを含むＬＢ培地にて３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．５に達したところで０．１ｍＭ　ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で発現を誘導して、さらに２０℃で２１時間振とう培養した。
遠心分離によって菌体を回収して２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、懸濁液を冷却しながら菌体を超音波破砕し、さらに遠心分離して上澄み液を得た。
【００９４】
上澄み液中のマンノースイソメラーゼ活性を測定したところ、培養によって得られた菌体（湿重量）１ｇあたりの酵素活性は７５５０Ｕであった。
同様の操作で測定した、野生株の菌体（湿重量）１ｇあたりの酵素活性は約１０Ｕであり、形質転換した大腸菌での酵素活性は約７５０倍に増加していた。
【００９５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のプラスミドｐＥＴ−３０ａ（＋）ＭＩを示した図である。
【図１】
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