(57)【要約】【課題】バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、結合部位に生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるＳＰＲ測定用バイオチップを得る。【解決手段】生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、分子量が２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−リジンを１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解しているｐＨ７．４のリン酸緩衝液を３０℃にてチップ表面に５分間接触させた後に、リン酸緩衝液で５分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するポリ−Ｌ−リジンによって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であるＳＰＲ測定用バイオチップ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、分子量が２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−リジンを１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解しているｐＨ７．４のリン酸緩衝液を３０℃にてチップ表面に５分間接触させた後に、リン酸緩衝液で５分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するポリ−Ｌ−リジンによって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であるＳＰＲ測定用バイオチップ
【請求項２】
固定化部位に導入されている官能基がカルボキシル基もしくはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基である請求項１に記載のバイオチップ
【請求項３】
バックグラウンド部に非イオン性物質が固定化されている請求項１もしくは２記載のバイオチップ
【請求項４】
金を蒸着した透明ガラスもしくは透明プラスチックを基板として用いる請求項１〜３のいずれかに記載のバイオチップ。
【請求項５】
表面プラズモン共鳴がＳＰＲイメージングである請求項１〜４のいずれかに記載のバイオチップ
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
表面プラズモン共鳴によって物質間の相互作用を評価できるバイオチップに関する。特には、生体分子内のアミノ基等の官能基等を利用して生体分子をバイオチップに固定化しすることにより、表面プラズモン共鳴を測定した際にバックグランドとの差が明白になるバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡや蛋白質などの生体分子の機能を調べるあるいは、発現遺伝子、蛋白質を明らかにする手段として、生体分子間の相互作用を評価する試みがなされている。その一つとして表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による相互作用解析法が挙げられる。ＳＰＲは分析体を固定化した金属薄膜に光を照射して反射光をモニターし、サンプルとの相互作用を共鳴角の変化で測定する方法である。
【０００３】
ＳＰＲの利点は、相互作用分析に蛍光やラジオアイソトープなどのラベル物質が不要な点とリアルタイムでの測定が可能な点である。ラベル物質を物質に導入するのは非常に煩雑かつ困難な場合があり、ラベル操作により物質の本来の機能、活性が失われる場合がある。
ＳＰＲで相互作用を観察するには分子を金属薄膜表面に固定化する必要がある。固相に生体分子を固定化する方法として、表面に導入した官能基を起点とし、共有結合、イオン結合によって固定化する手段などが挙げられる。
【０００４】
従来の技術では基板上の一点を測定するものがほとんどであるが、文献等にあるようにＳＰＲ技術を応用したＳＰＲイメージング法によって基板表面の局在部位におけるＳＰＲ変化を検出することが可能である（例えば、非特許文献１）。すなわち、基板上の異なる場所に複数の物質を固定化すれば、複数の物質の相互作用解析が同時に可能である。
【０００５】
ＳＰＲに用いられるチップも、基板全体に官能基を導入するものがほとんどであり、生体分子を固定化していない状態では固定化部位とバックグラウンド部の区別がない。そのため、ＳＰＲイメージング法に適用すると、バックグラウンド部に存在する官能基へサンプルが非特異的吸着するのを無視できない場合がある。また、微少量だけ特定の位置に生体分子溶液をスポットする技術も必須であり、高価なスポッティング装置が必要となる。
【０００６】
米国特許では、固定化部位に生体分子を固定化し、バックグラウンド部に起点となる官能基あるいは結合分子が存在しない親水性高分子を固定化したアレイを作製する手段が開示されている例えば、特許文献１）。この発明では、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化する際にはバックグラウンド部は可逆性疎水性保護基が固定化されており、スポッティングが容易である。しかし、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化したのちに塩基性有機溶媒を用いて疎水性保護基を除去し、親水性高分子を固定化する操作が必要であり、非常に煩雑かつ、塩基性有機溶媒が生体分子もしくは生物分子集合体に悪影響を与えることが懸念される。また、親水性高分子を固定化する際に固定化した生体分子もしくは生物分子集合体に悪影響を与えることが懸念される。具体的には親水性高分子が固定化生体分子に結合し、生体分子の機能が損なわれる点である。
【０００７】
そこで、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、固定化部位に生体分子もしくは生物分子集合体を、活性を保ったまま固定化できるバイオチップが望まれている。
本発明はバックグラウンド部に非特異的吸着を抑制する物質が固定化され、固定化部位には固定化させるための起点となる陰性荷電をもつ官能基を有する物質が固定化されているバイオチップを得ることを可能とする。
【０００８】
【非特許文献１】
Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９７年，６９巻，１４４９−１４５６
【特許文献１】
米国特許６１２７１２９号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、バックグラウンド部には非特異的吸着がほとんどなく、結合部位に生体分子もしくは生物分子集合体の活性を保ったまま固定化できるＳＰＲ測定用バイオチップを得ることにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
【００１１】
１．生体分子もしくは生物分子集合体を固定化する部分（固定化部位）と固定化部位以外のバックグラウンド部を有する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用バイオチップであり、分子量が２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−リジンを１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解しているｐＨ７．４のリン酸緩衝液が３０℃にてチップ表面に接触させて１５分後に、固定化部位に結合するポリ−Ｌ−リジンによって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が３以上であるＳＰＲ測定用バイオチップ
【００１２】
２．固定化部位に導入されている官能基がカルボキシル基もしくはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基であることを特徴とする１に記載のバイオチップ
【００１３】
３．バックグラウンド部に非イオン性物質が固定化されていることを特徴とする１もしくは２記載のバイオチップ
【００１４】
４．金を蒸着した透明ガラスもしくは透明プラスチックを基板として用いることを特徴とする１〜３のいずれかに記載のバイオチップ。
【００１５】
５．表面プラズモン共鳴がＳＰＲイメージングであることを特徴とする１〜４のいずれかに記載のバイオチップ
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明はＳＰＲ測定用のバイオチップであり、生体分子もしくは生物分子集合体を表面に固定化し、相互作用解析や発現遺伝子、蛋白質などのスクリーニングに有効である。本発明では生体分子もしくは生物分子集合体の固定化部位と、固定化部位以外のバックグラウンド部は明確に区別されており、固定化部位には好ましくは固定化させるための起点となる陰性荷電をもつ官能基を有する物質が固定化されている。生体分子もしくは生物分子集合体は陰性荷電をもつ官能基を介して、共有結合、イオン結合などによって表面に固定化することができる。
【００１７】
本発明のバイオチップはＳＰＲイメージングなどの基板表面を解析する方法に適しており、複数の固定化部位に複数の物質を固定化し、同時に相互作用解析することが可能である。ＳＰＲで解析できるよう、基板は透明プラスチックあるいはガラスが好ましく、その表面には金属薄膜が形成されている。金属薄膜は特に金を蒸着した表面が好ましい。
【００１８】
陰性荷電をもつ官能基はカルボキシル基やＮＴＡ基などが挙げられ、導入する方法は特に限定されるものではないが、例えば、末端に陰性荷電をもつアルカンチオール物質を金蒸着表面に直接作用させ、金−硫黄結合によって直接的に陰性荷電をもつ物質を導入する方法が考えられる。
【００１９】
また、そのほかの方法としては、末端に陽性荷電をもつアルカンチオール物質を金蒸着表面に直接作用させ、金−硫黄結合によって陽性荷電を導入しておき、その後、陰性電荷部位を複数持つ化合物をイオン結合によって結合させ、陰性荷電物質を間接的に表面に導入する方法なども考えられる。
またさらには、反応性基を持つチオール物質を金蒸着表面に直接作用させ、金−硫黄結合によって反応性基を導入しておき、その後、反応性基と反応可能な基を持ちかつ陰性電荷を持つ化合物を反応させ、陰性荷電物質を表面に導入する方法なども考えられる。この際のチオール物質の反応性基と陰性電荷をもつ化合物の反応可能な基としては、水酸基、アミノ基、カルボン酸基、チオール基。グリシジル基、酸無水物基、イソシアネート基、ビニル基等があり、これらを適宜組み合わせて用いる。
【００２０】
このようにして導入されたバイオチップ表面上のカルボキシル基やＮＴＡ基等の陰性荷電をもつ官能基と生体分子もしくは生物分子集合体を結合させる方法は特に限定するものではないが、アミンカップリング法やニッケルキレートヒスチジンタグ法、架橋剤によって生体分子もしくは生物分子集合体を表面に導入することができる。架橋剤によって導入する例としては、例えば、表面のカルボキシル基をカルボジイミドで活性化して生体分子内のアミノ基と反応、あるいはエポキシ系の架橋剤などを使って生体分子を固定化することができる。
【００２１】
バックグラウンドは非特異的吸着を抑制するため非イオン性物質が固定化されることが好ましい。例えば末端に水酸基あるいはポリエチレングリコールなどの親水性高分子をもつアルカンチオールを直接金表面に固定化する方法が挙げられる。また、官能基を末端にもつアルカンチオールを導入しておき、該官能基を利用して間接的に非イオン性物質を表面に固定化する方法も挙げられる。
【００２２】
固定化部位とバックグラウンド部を分ける手段としては光照射によるパターン化技術や、スタンプ技術などが挙げられる。例えば、光を照射してパターン化する手法では、紫外線により金−硫黄結合を酸化して洗浄除去し、新たにアルカンチオールを金表面に結合させることができる。
【００２３】
バイオチップはＳＰＲ装置にセットされ、緩衝液中にて観察される。緩衝液の屈折率によってＳＰＲ共鳴角が変化するため、測定は同一の緩衝液で実施される。緩衝液を導入した段階で、撮影する角度が設定される。バイオチップがＳＰＲ共鳴を起こし、反射光強度が極小となる入射角（ＳＰＲ共鳴角）から０．５度から１度小さい角度にて測定は実施されることが好ましい。本発明のバイオチップに対して、１ｍｇ／ｍｌの濃度でｐＨ７．４のリン酸緩衝液に溶解した分子量２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−リジンを３０℃にてチップ表面に接触させると、イオン結合によってポリ−Ｌ−リジンが固定化部位に結合し、ＳＰＲ共鳴角が広角側にシフトするため、反射光強度が増大する。ここでいうリン酸緩衝液は１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを使用する。バックグラウンド部には非イオン性物質が固定化されているため、陽性荷電をもつ高分子の吸着は少ない。
【００２４】
ＳＰＲ装置にはスライド表面の解析が可能である白色光源を用いたＳＰＲイメージング装置を使用する。スライドからの反射像はＣＣＤカメラによって撮影するＳＰＲイメージングにより、経時的に画像が取り込まれる。取り込まれた画像から高分子を接触させる前の画像の差を演算処理によって得ることができる。分子量が２０００以上２００００以下のポリ−Ｌ−リジンを１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解しているｐＨ７．４のリン酸緩衝液が３０℃にてチップ表面に５分間接触させた後に、リン酸緩衝液で５分間洗浄した場合において、固定化部位に結合するポリ−Ｌ−リジンによって得られるＳＰＲによるシグナル増加と、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナル増加を比較する。比較対照はポリ−Ｌ−リジンを接触させる前の画像となる。この操作によって、ポリ−Ｌ−リジンを接触させる前と、５分間接触させ後に５分間洗い流した後のシグナル変化を比較することができる。固定化部位に結合するポリ−Ｌ−リジンによって得られるＳＰＲによるシグナルと、固定化部位以外のバックグラウンド部への非特異吸着によるシグナルのシグナル比が２以上であると、固定化部位に生体分子もしくは生物分子集合体を導入するのが容易となるため好ましい。また、このシグナル比は３以上あることが好ましい。なお、シグナル比を得る場合、比較される固定化部位とバックグラウンド部は基板上１ｍｍ以上離れないように設定する。画像をコンピュータで解析する方法として、例えば画像処理ソフトＶ＋＋（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｏｐｔｉｃｓ社）を用いてリアルタイムでシグナル変化を捉えることができる。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２６】
［実施例］
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム１ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，　Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。
【００２７】
分子量２０００のスクシンイミド基末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ，Ｓｈｅａｗａｔｅｒ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）をリン酸緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させ、ＰＥＧを表面に固定化した。水晶上にクロムでパターンを描いたフォトマスクを基板上に置き、Ｏｒｉｅｌ社製１０００Ｗキセノンアークランプにて一時間照射してパターン化を行った。フォトマスクのパターンは５００μｍ×５００μｍの四角形が１００個並んだものである。照射後、ミリＱ水とエタノールで洗浄したのち、７−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−Ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ（７−ＣＨＴ、同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、光を照射した部分に７−ＣＨＴの自己組織化表面を形成させた。こうして作製したバイオチップは固定化部位にカルボキシル基をもち、バックグラウンド部に非イオン性のＰＥＧが固定化されている。
【００２８】
このバイオチップをＳＰＲイメージング機器（ＳＰＲＩｍａｇｅｒ：ＧＷＣ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットし、固定化部位のＳＰＲ共鳴角から１度入射角が小さい角度で観察した。観察は１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３０℃で実施した。１ｍｇ／ｍｌの分子量４０００−１５０００のポリ−Ｌ−リジン（シグマ社製）を溶解させたｐＨ７．４のリン酸緩衝液を接触させる前と接触させてから５分、前記の緩衝液を５分流した後の写真を連続的に５秒おきに撮影し、固定化部位とバックグラウンドのシグナル変化を解析した結果を図１に示す。６点の反射光強度の経時変化を求め、３点でシグナル比を得た。結果は５．５１、５．５６、４．０６であり、平均で５．０４であり、２を上回っていた。
なお、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液は１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを用い、バイオチップとの接触はこの溶液中に３０℃で５分間接触させ、その後、同じｐＨ７．４のリン酸緩衝液で３０℃５分間洗い流した。
【００２９】
バイオチップとの接触・洗浄はフローセルを用い、フローセルはＰＯＭ製で図４で示したものを用いた。具体的にはフローセルの溝部に線径１．５ｍｍ、内径１５．５ｍｍのシリコンゴム製Ｏリングをセットし、さらにこの上にバイオチップを金蒸着面がフローセルと向き合うようにして重ね、フーローセル−バイオチップの間隔が２００μ程度になるようにして固定した。フローセルの注入部および排出部にチューブを接続し、緩衝液ポンプにてポリ−Ｌ−グルタミン酸溶液および緩衝液を導入した。導入流量はいずれも２００μｌ／ｍｉｎで行った。
測定温度は２５℃で行った。
【００３０】
また、ポリ−Ｌ−リジン接触前と緩衝液流入後の画像の差をとった結果を図２（概略図）に示す。色が濃くなっている部分は反射光強度が上がっていることを示す。
この画像の差の濃淡を、点線で観察したグラフを図３に示す。この図からもバックグラウンド部のシグナルと固定化部位のシグナルのシグナル比が２以上であることを察することができる。
【００３１】
［比較例］
実施例と同様の金蒸着基板を７−ＣＨＴの１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、全面に７−ＣＨＴの自己組織化表面を形成させ、基板全体にカルボキシル基を導入した。この表面に実施例と同様に１ｍｇ／ｍｌの分子量４０００−１５０００のポリ−Ｌ−リジン（シグマ社製）を接触させたところ、ポリ−Ｌ−リジンは基板全体に結合するため、シグナルの比は１．００となる。この場合のバイオチップは固定化部位とバックグラウンド部の区別がない。
【００３２】
【発明の効果】
本発明のＳＰＲ用バイオチップは生体分子もしくは生物分子集合体がバックグラウンド部には非特異的吸着することががほとんどなく、効率よく活性を保ったまま結合部位には吸着し、ＳＰＲを測定した際にバックグランドとの差が明白になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で得られた、ＳＰＲにて固定化部位とバックグラウンドのシグナル変化を解析した結果の図
【図２】実施例でのポリ−Ｌ−リジン接触前と緩衝液流入後の画像の差をとった結果図
【図３】図２の画像の差の濃淡を点線部で観察したグラフ
【図４】実施例で用いたフローセルの上面および断面（上面図の点線部分の断面）図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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