(57)【要約】【課題】ヒートショックファクター１および／または活性型ヒートショックファクター１を細胞内に導入することによって、副作用が少なく、全ての血管疾患に対して効果的な新しい遺伝子治療用物質を提供する。【解決手段】血管収縮作用および／または血液凝固作用を原因とする血管疾患に対する治療用物質であって、ヒートショックファクター１をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管収縮作用および／または血液凝固作用を原因とする血管疾患に対する治療用物質であって、ヒートショックファクター１をコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする遺伝子治療用物質。
【請求項２】
ヒートショックファクター１が、ポリペプチドである請求項１の遺伝子治療用物質。
【請求項３】
ヒートショックファクター１が、活性型ヒートショックファクター１である請求項１または２の遺伝子治療用物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、血管疾患の遺伝子治療用物質に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、抗血栓作用および抗凝固作用を有する正常型ヒートショックファクター１（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １：ＨＳＦ１）および／または活性型ヒートショックファクター１（活性型ＨＳＦ１）を利用した遺伝子治療用物質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒートショックファクター１（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １：以下、ＨＳＦ１とすることがある）は、ヒートショックタンパク質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、ＨＳＰとすることがある）の発現を誘導する転写因子である。ＨＳＰは熱刺激によって、発現が上昇するタンパク質として発見され、またＨＳＰは分子量によってＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ３２、ＨＳＰ２７等の種類が知られている。たとえば、ＨＳＰ７０は分子量が７０ｋＤａであることを意味する。ＨＳＰは不安定な状態のタンパク質と結合し、安定化（シャペロン作用）させることによって、細胞の保護作用を担っている。
【０００３】
近年、ＨＳＦ１に変異を施した変異型のＨＳＦ１（以下、ｍｕｔＨＳＦ１とすることがある）が、ＨＳＰの発現量を活性化するという報告がなされた（非特許文献１）。このｍｕｔＨＳＦ１は、正常型ヒトＨＳＦ１のＤＮＡ配列の一部が欠失されており、その結果ＨＳＦ１の機能が活性化し、ＨＳＰの発現が促進されたとしている。また実際に、変異型のＨＳＦ１を利用した治療方法（特許文献１）が提案されている。この提案された方法では、変異が施されたＨＳＦ１（ｍｕｔＨＳＦ１）を細胞内に導入し、ＨＳＰの発現を調節・変化（増幅または抑制）させて、ストレスや炎症、毒物、また腫瘍等から細胞を保護することができるとしている。さらに、この方法におけるｍｕｔＨＳＦ１は、約１８０〜約３１５の間のアミノ酸の欠失によって正作用を有するｍｕｔＨＳＦ１（ストレスの非存在下でもＨＳＰの発現を活性）および約２７７〜約５２９の間のアミノ酸の欠失によって負作用を有するｍｕｔＨＳＦ１（ストレスの存在下でもＨＳＰの発現を抑制）の２種類のｍｕｔＨＳＦ１があり、これらを使い分けることによって、前記のような悪影響から細胞を保護する作用を発揮することができるとしている。しかしながら、この提案では、血管収縮や血液凝固を原因とする血管の疾患に対しての効果が確認されていない。また、血管疾患の治療方法は、血管増殖因子等の投与が一般的であるが、ガン細胞の増殖の危険性等といった副作用が多い。そのため、副作用の少ない血管疾患の治療方法（遺伝子治療も含む）や治療用物質（遺伝子治療用物質も含む）の開発および実用化が期待されている。
【０００４】
その一方で、ＨＳＰが、血管機能維持にも関与しているという報告（非特許文献２）がされた。この報告によると、自然発症高血圧マウスは、血管の弛緩応答と血管のＨＳＰのレベルとが、月齢に比例して低下することが知られているが、この報告では、この自然発症高血圧マウスにビモクロモール（ストレス応答を促進させる薬剤の一種）を経口投与し、ＨＳＰの発現を促進させた結果、前記変化を阻害する結果が得られたとしている。すなわち血管内皮機能の保持が、ＨＳＰレベルの維持と関連することが示唆されたとしている。しかしながら、ビモクロモールの投与を行うことによって、人工的にストレスを発生させることによって、ＨＳＰの発現増幅させているため、他の細胞や組織等への悪影響の懸念が依然として残っている。また、ＨＳＰ自体を投与しても、血管収縮作用および／または血液凝固作用を原因とする血管疾患に対して、特異的に効果が得られることを期待するのは、困難である。
【０００５】
【特許文献１】
特表２００１−５１１００６号公報
【非特許文献１】
Ｚｕｏ，  Ｊ．およびＶｏｅｌｌｍｙ，  Ｒ著、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．  １５、Ｎｏ．  １８、ｐ４３１９−４３３０、１９９５年
【非特許文献２】
Ｊｅｄｎａｋｏｖｉｔｓ，  Ａ．ら著、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、６７（１４）、ｐ１７９１−７、Ａｕｇ．  ２５、２０００年
【非特許文献３】
Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，  Ｓ．  Ｋ．ら著、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８（１６）、ｐ６９０６−６９１０、１９９１年
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこでこの出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、従来の問題点を解消し、ＨＳＦ１および／または活性型ＨＳＦ１を細胞内に導入することによって、副作用の少ない血管疾患に対する新しい遺伝子治療用物質を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決する手段として、第１には、血管収縮作用および／または血液凝固作用を原因とする血管疾患に対する治療用組成物であって、ヒートショックファクター１をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態導入可能な形態を有することを特徴とする遺伝子治療用物質を提供し、第２には、ヒートショックファクター１が、ポリペプチドである遺伝子治療用物質を、そして、第３には、ヒートショックファクター１が、活性型ヒートショックファクター１である遺伝子治療用物質を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
【０００９】
この出願の発明における、ヒートショックファクター１（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １：ＨＳＦ１）をコードするポリヌクレオチド、もしくは、その産物であるポリペプチド（タンパク質）は、ヒトをはじめとする、各種の哺乳類動物から公知の方法でクローニングすることができるが、ヒトの遺伝子治療用物質という特性から、ヒト由来であることが望ましい。たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ（Ａｃｃ．  Ｎｏ．：ＮＭ＿００５５２６６）のデータベースや公知の文献（たとえば、非特許文献３）等に基づき作製したオリゴポリヌクレオチドプローブを用いて既存のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法や、オリゴポリヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ等の公知の方法によって取得することができる。また活性型ヒートショックファクター１（活性型ＨＳＦ１）は、ＰＣＲ法等の公知の方法を用いて、前記のＨＳＦ１に変異を施すことによって取得できる。この出願の発明における「ヒートショックファクター１（ＨＳＦ１）」の塩基配列およびアミノ酸配列は前記のとおり、公知（たとえば、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿００５５２６６、また非特許文献３等）である。「活性型ヒートショックファクター１（活性型ＨＳＦ１）」とは、前記のＨＳＦ１の変異型であり、正常型のＨＳＦ１におけるアミノ酸配列の１８６〜２０２の間のアミノ酸残基が欠失しているものをいう。
【００１０】
この出願の発明は、血管収縮作用および／または血液凝固作用を原因とする血管疾患に対する治療用組成物であって、ＨＳＦ１をコードするポリヌクレオチド、もしくはその産物であるポリペプチド（タンパク質）を細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする遺伝子治療用物質である。細胞内に導入可能な形態としては、たとえば、発現ベクター、生理食塩水や緩衝液、金粒子等が挙げられる。
【００１１】
この出願の発明は、従来より知られているＨＳＦ１が増殖因子としての機能を有していない（ガン細胞の増殖促進の心配が少ない）ことに加えて、発明者らの鋭意研究の結果、ＨＳＦ１が血管拡張因子である内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の発現を促進させ、その一方で血管収縮作用を有するエンドセリンおよび血液凝固作用を有するプラスノミノーゲンアクチベーター阻害因子１（ＰＡＩ−１）の発現を抑制することを新たに見出したことに基づいたものである。また、この出願の発明のＨＳＦ１が、ＨＳＦ１に変異を施した活性型ヒートショックファクター１（活性型ＨＳＦ１）であることが好ましい。この活性型ＨＳＦ１は、ＨＳＰの発現促進のみならず、前記のｅＮＯＳにおいても発現の促進効果を高めることができ、エンドセリンおよびＰＡＩ−１においては、その抑制効果を高めることができる。さらにまた、ＨＳＦ１および／または活性型ＨＳＦ１とともに脂質低下や抗炎症作用による動脈硬化および脳卒中の予防として期待されているスタチン（ＨＳＰ７０の発現を誘導し、この機序としてＨＳＦ１を介する転写活性に関与している）を併せて導入することによって、この発明の効果は増強されることを期待することができる。
【００１２】
この出願の発明における効果は、血管内皮細胞の改善に対して大きく奏し、また血管内皮細胞は全ての血管（たとえば、動脈、静脈、血管平滑筋を有さない小血管や毛細血管等）に存在することから、全ての血管に対して効果が発揮することができると期待される。この出願の発明における「血管疾患」とは、血管収縮や血液凝固を病因とする血管の疾患であって、たとえば、狭心症、心筋梗塞や脳梗塞等の動脈硬化症、動脈閉塞症等のような血栓を病因とする疾患、また、血管炎等のような血液凝固能の亢進を病因とする疾患等が挙げられる。
【００１３】
この出願の発明は、ＨＳＦ１および／または活性型ＨＳＦ１をコードするポリヌクレオチド、もしくは、その産物であるポリペプチド（タンパク質）を細胞内に導入（すなわち、遺伝子導入）可能な形態とすることを特徴としているものである。遺伝子導入の方法には、たとえば、遺伝子銃法やマイクロインジェクション法等の直接注入法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、リガンド−ＤＮＡ複合体法、またウイルス等を担体とするウイルスベクター法等が挙げられる。これら各種の遺伝子導入の方法は、細胞や器官等の大きさ、種類等によって適宜に採択することができる。特にポリヌクレオチドとして導入する場合には、知見が多く、技術も確立し、導入効率も高いウイルス等を担体とする導入方法を採択することが好ましい。たとえば、このポリヌクレオチドを真核細胞用の発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを、たとえばウイルスベクターや生体認識分子を具備した中空ナノ粒子等に組み込むようにして、いわゆる遺伝子治療用ベクターとして、遺伝子治療の手法により生体内の標的細胞等に導入することができる（たとえば、市販されているストラタジーン製：ＡｄＥａｓｙＴＭ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ等を利用することができる）。また、その際にＨＳＦ１および／または活性型ＨＳＦ１のポリヌクレオチドに核移行シグナルをさらに付加させることによって、核移行の作用が増強され、ＨＳＦ１および／または活性型ＨＳＦ１の機能が、より効果的に発揮できることが期待できる。
【００１４】
上記の「遺伝子治療用ベクター」とは、特に遺伝子治療を目的に安全性を高めたベクターのことである。この遺伝子治療用ベクターを用いて、導入対象となる生体内の細胞や器官、組織等にポリヌクレオチドを導入する。遺伝子治療用ベクターは、このポリヌクレオチドを導入することができて、かつ、安全性が高いものであればよく、遺伝子治療用ベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡ／ＤＮＡ−リピッド、免疫抗体および中空ナノ粒子等が例示でき、細胞や器官等の大きさ、種類等によって適宜に採択することができる。特に導入効率が高く、また研究や知見が進んでいるウイルス由来のベクターを採択することが好ましい。ウイルス由来のベクターデザインは（たとえば、遺伝子治療用ベクターとして最もよく利用されるレトロウイルス等）、導入遺伝子を組込んだウイルス粒子になれないウイルス遺伝子を、ベクターのパッケージング、逆転写、組み込みに必要な各遺伝子をｃｉｓに有し、またウイルスタンパクのほとんど、もしくはすべてをコードする領域を欠失するようデザインすることが重要である。そして、エンベロープ等をコードする遺伝子が導入されたパッケージング細胞より、空のウイルス粒子を形成・産生し、前記のウイルス遺伝子とウイルス粒子をプロデューサー細胞に導入することによって、導入遺伝子を組込んだ増殖能を有さないウイルス粒子（すなわち、遺伝子治療用ベクター）が得ることができる。
【００１５】
一方で、ＨＳＦ１および／または活性型ＨＳＦ１をポリペプチドとして、細胞内に導入する場合には、前記のとおり、遺伝子銃法やマイクロインジェクション法、電気穿孔法、リポソーム法、赤血球ゴースト法、リン酸カルシウム法等の方法が採択することができる。
【００１６】
なお、臨床的には、経皮的血管形成術のバルーンに上記のベクター類を塗布して、血管内皮細胞に発現させることができる。
【００１７】
以下に実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細、かつ、具体的に説明する。もちろん、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００１８】
【実施例】
（実施例１）  実験材料
血管内皮細胞培養用培地（ＲＰＭＩ１６４０）、ウシ胎児血清はインビトロジェン社より購入した。ＲＮＡ抽出には、日本ジーン社ＲＮＡ抽出キット使用、タンパク質の発現に関してはアマシャムファルマシア社の検出液、感光フィルムを使用した。ウエスタンブロットに用いた抗体はサンタクルズ社の抗体を使用した。ＲＮＡのハイブリダイゼーションのプローブ製作にはロッシュ社のランダムプライムキットを用いた。ラベリングにはアマシャムファルマシア社の［α−３２Ｐ］  ｄＣＴＰ  （３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用いた。
【００１９】
培養血管内皮細胞としては、ウシ胸部大動脈血管内皮（ウシ胸部大動脈から血管内皮をメス刃を使って機械的に剥がし、培養液（ＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ウシ胎児血清で培養）の入った培養ディッシュに剥がした内皮細胞を入れる。血管平滑筋が含まれていない血管内皮細胞のみの培養ディッシュのみ使用。３日から５日で培養細胞の継代を行い、実験には３世代から５世代のものを使用した。
【００２０】
（実施例２）  実験方法
１．  ＲＮＡ抽出とノーザンブロット法：
ＲＮＡ抽出には、日本ジーン社ＲＮＡ抽出キット（ＩＳＯＧＥＮ）を使用した。等量のＲＮＡを２５ｍｍｏｌ／ＬのＭＯＰＳバファー（ｐＨ  ７．０）、１  ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡおよび２．２  ｍｍｏｌ／Ｌ−ホルマリンを含んだ、１．２％アガロースで電気泳動し、アマシャムファルマシア社のナイロンメンブランに転写した。摂氏４２度で［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベリングした特異的なｃＤＮＡでハイブリダイゼーションを行った。
２．  タンパク質抽出とウエスタンブロット法：
タンパク質抽出はラミニバッファー（３％  ＳＤＳ、１０％グリセリン、６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ  ６．８および１００ｍＭＤＴＴ）を用いて抽出したタンパク質は、１０％  ＳＤＳアクリルアミドゲルで泳動し、ニトロセルロースメンブランに転写し、アマシャムファルマシア社の検出キットに従って、トロンボモジュリン（ＴＭ）各タンパク質の発現量の影響を調べた。
【００２１】
（実施例３）  ウイルス感染および細胞の回収
１０ｃｍ培養ディッシュに上記のように単離した培養ウシ血管内皮細胞を播き、細胞の密集率が約７０％になったところで、ＨＳＦ１発現アデノウイルス、活性型ＨＳＦ１アデノウイルス、コントロールウイルスとしてＬｚアデノウイルスを細胞数に対して１倍（１ｍｏｉ）、５倍（５ｍｏｉ）、または１０倍（１０ｍｏｉ）の量のウイルスを加えて感染させた。感染２時間後培養液で２回洗浄し、３日後に回収して、各量における感染効果を確認した。
【００２２】
（実施例４）  結果
結果は、図１から図９に示したとおりである。
【００２３】
図１から５は、コントロールウイルスベクター（Ｌｚアデノウイルス）および野生型ＨＳＦ１、または活性型ＨＳＦ１を含有したウイルスベクターによるＨＳＰ７０、ｅＮＯＳ、トロンボモジュリン（ＴＭ）、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、そしてＰＡＩ−１に対するＲＮＡ発現を確認した結果およびその相対値を示したグラフ図である。活性型ＨＳＦ１は、細胞保護作用のあるＨＳＰ７０の発現を増加させ、血管内皮細胞において血管拡張作用のあるｅＮＯＳのＲＮＡの発現増加、また、抗凝固作用のあるトロンボモジュリン（ＴＭ）のＲＮＡの発現の増加作用も有し、血管収縮作用のあるエンドセリン−１（ＥＴ−１）のＲＮＡの発現の抑制および凝固作用のあるＰＡＩ−１のＲＮＡの発現が抑制されることが確認した。そして、この作用は、活性型ＨＳＦ１は、野生型ＨＳＦ１より強く制御されることがそれぞれ確認された。
【００２４】
図１では、細胞保護作用のあるＨＳＰ７０のＲＮＡの発現では、活性型ＨＳＦ１は野生型ＨＳＦ１に比して１．８倍強く発現されることが確認された。図２では、活性型ＨＳＦ１は血管拡張因子であるｅＮＯＳのＲＮＡの発現を野生型のＨＳＦ１に比して２．２５倍強く発現することを示し、図３では、血管収縮因子であるＥＴ−１のＲＮＡの発現が野生型ＨＳＦ１に比して１０倍強く抑制することを示した。また、図４では、抗凝固作用のあるＴＭのＲＮＡの発現が野生型ＨＳＦ１に比して１．３倍強く発現させ、さらに図５では、凝固作用のあるＰＡＩ−１のＲＮＡの発現が野生型ＨＳＦ１に比して２倍強く抑制することも確認された。これらの結果から、ＨＳＦ１および／または活性型ＨＳＦ１は、ウイルスベクターによって、導入され、またウイルス量に比例してその効果を発揮することが確認された。
【００２５】
図６から図９では、コントロール（何も加えない）、コントロールウイルスベクター（Ｌｚアデノウイルス）、野生型ＨＳＦ１または活性型ＨＳＦ１を含有するウイルスベクターによるＨＳＰ７０、ｅＮＯＳ、ＴＭ、そしてＰＡＩ−１の各タンパク質の発現への影響を調べた結果およびその相対値を示したグラフ図である。活性型ＨＳＦ１は、血管内皮細胞において血管拡張作用のあるｅＮＯＳのタンパク質の発現を増加させ、抗凝固作用のあるＴＭのタンパク質の発現増強、また凝固作用のあるＰＡＩ−１のタンパク質の発現抑制することが確認された。この作用は、活性型ＨＳＦ１の方が、野生型ＨＳＦ１よりも強く制御される。
【００２６】
図６では、細胞保護作用のあるＨＳＰ７０のタンパク質の発現では、野生型ＨＳＦ１に比して１．９倍強く発現させることが確認された。図７では、活性型ＨＳＦ１は血管拡張因子であるｅＮＯＳのタンパク質の発現を野生型ＨＳＦ１に比して１．９倍強く発現させることを示した。また図８に示したとおり、抗凝固作用のあるＴＭのタンパク質発現では、活性型ＨＳＦ１は野生型のＨＳＦ１に比して１．３倍強く発現することが確認できた。図９では、凝固作用のあるＰＡＩ−１のタンパク質発現が、野生型ＨＳＦ１に比して１２倍強く抑制することが確認された。
【００２７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ＨＳＦ１および／または活性型ＨＳＦ１をコードするポリヌクレオチド、もしくは、その産物であるポリペプチドを標的血管に遺伝子導入することによって、副作用が少なく、安全性の高い血管疾患に対する新しい遺伝子治療用物質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種のウイルスベクターによるＨＳＰ７０に対するＲＮＡ発現を確認した結果を示した図およびその相対値を示したグラフ図である。
【図２】各種のウイルスベクターによるｅＮＯＳに対するＲＮＡ発現を確認した結果を示した図およびその相対値を示したグラフ図である。
【図３】各種のウイルスベクターによるＴＭに対するＲＮＡ発現を確認した結果を示した図およびその相対値を示したグラフ図である。
【図４】各種のウイルスベクターによるＥＴ−１に対するＲＮＡ発現を確認した結果を示した図およびその相対値を示したグラフ図である。
【図５】各種のウイルスベクターによるＰＡＩ−１に対するＲＮＡ発現を確認した結果を示した図およびその相対値を示したグラフ図である。
【図６】各種のウイルスベクターによるＨＳＰ７０に対するタンパク質発現の影響を確認した結果を示した図およびその相対値を示したグラフ図である。
【図７】各種のウイルスベクターによるｅＮＯＳに対するタンパク質発現の影響を確認した結果を示した図およびその相対値を示したグラフ図である。
【図８】各種のウイルスベクターによるＴＭに対するタンパク質発現の影響を確認した結果を示した図およびその相対値を示したグラフ図である。
【図９】各種のウイルスベクターによるＰＡＩ−１に対するタンパク質発現の影響を確認した結果を示した図およびその相対値を示したグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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