(57)【要約】　　　（修正有）【課題】耐熱性ケラタナーゼをコードするＤＮＡ及びその用途を提供する。【解決手段】以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。（Ａ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来の特定のアミノ酸配列を含むポリペプチド。（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、以下の（イ）の性質を有するポリペプチド。（イ）ケラタン硫酸に作用して、そのＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解する。上記ＤＮＡを用いて耐熱性ケラタナーゼを製造することができる。また上記ＤＮＡまたはその一部は、耐熱性ケラタナーゼに対するハイブリダイゼーション用プローブとして使用できる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、下記（イ）の性質を有するポリペプチド。
（イ）ケラタン硫酸に作用して、そのＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解する。
【請求項２】
前記（Ｂ）のポリペプチドが、前記（イ）の性質に加えてさらに下記（ロ）の性質を有するものである、請求項１に記載のＤＮＡ。
（ロ）ケラタン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸ＩＩ及びケラタンポリ硫酸に作用し、主に硫酸化ケラタン硫酸二糖及び硫酸化ケラタン硫酸四糖を生成する。
【請求項３】
前記（Ｂ）のポリペプチドが、前記（ロ）の性質に加えてさらに下記（ハ）及び（ニ）の性質を有するものである、請求項２に記載のＤＮＡ。
（ハ）至適反応温度が５０〜６０℃である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１０分間反応）。
（ニ）少なくとも４５℃以下で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１時間放置）。
【請求項４】
前記（Ｂ）のポリペプチドが、前記（ハ）及び（ニ）の性質に加え、さらに下記（ホ）及び（ヘ）の性質を有することを特徴とする、請求項３に記載のＤＮＡ。
（ホ）至適反応ｐＨが４．５〜６である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃）。
（ヘ）ｐＨ６〜７で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃で１時間放置）。
【請求項５】
下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである、請求項１〜４いずれか１項に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１３に示すヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全部又は一部を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記（イ）の性質を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（イ）ケラタン硫酸に作用して、そのＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解する。
【請求項６】
前記（ｂ）のＤＮＡによってコードされるポリペプチドが、前記（イ）の性質に加えてさらに下記（ロ）の性質を有するものである、請求項５に記載のＤＮＡ。
（ロ）ケラタン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸ＩＩ及びケラタンポリ硫酸に作用し、主に硫酸化ケラタン硫酸二糖及び硫酸化ケラタン硫酸四糖を生成する。
【請求項７】
前記（ｂ）のＤＮＡによってコードされるポリペプチドが、前記（ロ）の性質に加えてさらに下記（ハ）及び（ニ）の性質を有するものである、請求項６に記載のＤＮＡ。
（ハ）至適反応温度が５０〜６０℃である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１０分間反応）。
（ニ）少なくとも４５℃以下で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１時間放置）。
【請求項８】
前記（ｂ）のＤＮＡによってコードされるポリペプチドが、前記（ハ）及び（ニ）の性質に加え、さらに下記（ホ）及び（ヘ）の性質を有することを特徴とする、請求項７に記載のＤＮＡ。
（ホ）至適反応ｐＨが４．５〜６である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃）。
（ヘ）ｐＨ６〜７で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃で１時間放置）。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡを保持するベクター。
【請求項１０】
発現ベクターである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のベクターによって宿主が形質転換された形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の形質転換体を生育させ、その生育物からケラタナーゼを採取することを特徴とする、ケラタナーゼの製造方法。
【請求項１３】
配列番号１３に示すヌクレオチド配列の全部又は一部と相補的なヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーション用プローブ。
【請求項１４】
配列番号１３に示すヌクレオチド配列の一部が、配列番号１３におけるヌクレオチド番号１４０１〜４０２３で示されるヌクレオチド配列である、請求項１３に記載のハイブリダイゼーション用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性ケラタナーゼをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを保持するベクター、このベクターによって形質転換された形質転換体、これを用いた耐熱性ケラタナーゼの製造方法、及び耐熱性ケラタナーゼに関するハイブリダイゼーション用プローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】
国際公開ＷＯ９６／１６１６６には、下記の理化学的性質を有するケラタン硫酸分解酵素（ケラタナーゼ）が開示されている。
（１）作用：ケラタン硫酸に作用し、そのＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解する。
（２）基質特異性：ケラタン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸ＩＩ及びケラタンポリ硫酸に作用して、主に硫酸化ケラタン硫酸二糖及び硫酸化ケラタン硫酸四糖を生成する。
（３）至適反応温度：５０〜６０℃（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１０分間反応）
（４）熱安定性：少なくとも４５℃以下で安定（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１時間放置）
（５）至適反応ｐＨ：４．５〜６（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃）
（６）ｐＨ安定性：６〜７（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃で１時間放置）
この酵素は熱安定性が高く、バッチ分解法や固定化酵素分解法で硫酸化ケラタン硫酸二糖や四糖を製造する際に好ましく用いることができるが、この酵素の調製はもっぱらこの酵素を産生する微生物（バチルス・サーキュランス）を培養し、その培養物から採取することに頼っていた。
【０００３】
この酵素をコードするＤＮＡが得られれば、そのＤＮＡをバチルス・サーキュランスよりもさらに取扱いが容易な宿主に導入することによって、この酵素をさらに容易、大量、かつ安価に生産・取得することができる。また、この酵素をコードするＤＮＡが得られれば、これを遺伝子工学的に改変して更に酵素活性を向上させた酵素を作製したり、この酵素の生産性を更に向上させる等の応用の可能性が広がることとなる。しかしこの酵素のクローニングは未だ報告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、硫酸化ケラタン硫酸二糖や四糖を製造に極めて有用な耐熱性ケラタナーゼをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを保持するベクター、このベクターによって形質転換された形質転換体、これを用いた耐熱性ケラタナーゼの製造方法、及び耐熱性ケラタナーゼに関するハイブリダイゼーション用プローブを提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は鋭意検討を重ねることにより、前記の耐熱性ケラタナーゼをコードするＤＮＡの取得に成功した。さらに、このＤＮＡを保持させたベクターを作製し、このベクターを用いて形質転換体を作製し、この形質転換体を用いて耐熱性ケラタナーゼを製造し、これにより製造された酵素が真にケラタナーゼ活性を有していることを確認して、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡともいう）。
（Ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、下記（イ）の性質を有するポリペプチド。
（イ）ケラタン硫酸に作用して、そのＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解する。
ここで、（Ｂ）のポリペプチドは、上記（イ）の性質に加えてさらに下記（ロ）の性質を有するものが好ましく、（イ）及び（ロ）の性質に加えてさらに下記（ハ）及び（ニ）の性質を有するものがより好ましく、（イ）〜（ニ）の性質に加えてさらに下記（ホ）及び（ヘ）の性質を有するものがさらに好ましい。
（ロ）ケラタン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸ＩＩ及びケラタンポリ硫酸に作用し、主に硫酸化ケラタン硫酸二糖及び硫酸化ケラタン硫酸四糖を生成する。
（ハ）至適反応温度が５０〜６０℃である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１０分間反応）。
（ニ）少なくとも４５℃以下で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１時間放置）。
（ホ）至適反応ｐＨが４．５〜６である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃）。
（ヘ）ｐＨ６〜７で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃で１時間放置）。
また本発明ＤＮＡは、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡであることがさらに好ましい。
（ａ）配列番号１３に示すヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全部又は一部を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記（イ）の性質を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（イ）ケラタン硫酸に作用して、そのＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解する。
ここで、前記（ｂ）のＤＮＡによってコードされるポリペプチドは、前記（イ）の性質に加えてさらに下記（ロ）の性質を有するものが好ましく、（イ）及び（ロ）の性質に加えてさらに下記（ハ）及び（ニ）の性質を有するものがより好ましく、（イ）〜（ニ）の性質に加えてさらに下記（ホ）及び（ヘ）の性質を有するものがさらに好ましい。
（ロ）ケラタン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸ＩＩ及びケラタンポリ硫酸に作用し、主に硫酸化ケラタン硫酸二糖及び硫酸化ケラタン硫酸四糖を生成する。
（ハ）至適反応温度が５０〜６０℃である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１０分間反応）。
（ニ）少なくとも４５℃以下で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１時間放置）。
（ホ）至適反応ｐＨが４．５〜６である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃）。
（ヘ）ｐＨ６〜７で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃で１時間放置）。
（２）本発明ＤＮＡを保持するベクター（以下、本発明ベクターともいう）。
本発明ベクターは、発現ベクターであることが好ましい。
（３）本発明ベクターによって宿主が形質転換された形質転換体（以下、本発明形質転換体ともいう）。
（４）本発明形質転換体を生育させ、その生育物からケラタナーゼを採取することを特徴とする、ケラタナーゼの製造方法（以下、本発明製造方法ともいう）。
（５）配列番号１３に示すヌクレオチド配列の全部又は一部と相補的なヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーション用プローブ（以下、本発明プローブともいう）。
ここで「配列番号１３に示すヌクレオチド配列の一部」は、配列番号１３におけるヌクレオチド番号１４０１〜４０２３で示されるヌクレオチド配列であることが好ましい。
【０００７】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明ＤＮＡ
本発明ＤＮＡは、下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
（Ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、下記（イ）の性質を有するポリペプチド。
（イ）ケラタン硫酸に作用して、そのＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解する。
【０００８】
ここで、配列番号１４に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列をコードするものとして、遺伝暗号の縮重による種々の異なった塩基配列を有するＤＮＡが存在することは、当業者であれば容易に理解されるところである。このような遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有するＤＮＡも、本発明ＤＮＡに包含される。
【０００９】
（Ａ）における「配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、「配列番号１４に示すアミノ酸配列のみから構成されるポリペプチド」だけでなく、このポリペプチドと、マーカーペプチド、シグナルペプチドなどのペプチドや、他の機能を有するポリペプチドとが融合したポリペプチド（融合ポリペプチド）であってもよい。例えばマーカーペプチドとの融合ポリペプチドは、本発明ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを精製等する場合には特に好ましい。このようなマーカーペプチドとしては例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばプロテインＡと融合させれば容易にアフィニティー精製することが可能となり、インスリンシグナル配列等と融合させれば酵素を細胞外（培地等）に分泌させることができる。また、他の機能を有するポリペプチドとの融合タンパク質とすることにより、本発明ＤＮＡによってコードされるポリペプチドが有するケラタナーゼとしての機能と、他のポリペプチドの機能とを併せ持ったポリペプチドとすることができる。
【００１０】
（Ｂ）において「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、下記（イ）の性質を有する」とは、前記（イ）の性質を実質的に害さない限りにおいて１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよいことを意味する。
【００１１】
天然に存在するポリペプチドには、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のポリペプチドの生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず、変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。前記の（Ｂ）は、このように構造的に若干の差異があってもその機能については大きな違いが認められないポリペプチドを包含させる趣旨であり、このようなポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含される。
【００１２】
また、ポリペプチドをコードするＤＮＡに人為的に上記のような変異を導入した場合も同様であって、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することができる。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリン残基に置換したポリペプチドが、ＩＬ−２活性を保持することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４））。また、ある種のポリペプチドは、活性には必要ないペプチド領域を有していることが知られている。例えば細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、または活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このようなポリペプチドは、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドであり、このようなポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明ＤＮＡに包含される。
【００１３】
なお、本明細書における「数個のアミノ酸」は、例えば８００アミノ酸からなるポリペプチドの場合、２〜４０程度、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜１０以下の数を示す。
【００１４】
前記（イ）の性質の有無は、例えば国際公開ＷＯ９６／１６１６６に記載された方法によって調べることができる。よって当業者であれば、Ｎ−アセチルグルコサミニド結合の加水分解活性の有無を指標として、前記（イ）の性質を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を容易に検出し、選択することができる。
【００１５】
前記（イ）の性質を実質的に害さない１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を引き起こすようなヌクレオチドの変異は、自然条件下でも起こりうる。また、前記（イ）の性質を実質的に害さないようなアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を引き起こすために、人工的にヌクレオチドを置換、欠失、挿入又は転位させることもできる。
【００１６】
このような、ＤＮＡ中のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は転位は、「導入すべき変異点を中心とする両側の配列を含み、かつ制限酵素切断末端を両端に有するＤＮＡ断片」を合成し、これを未変異のＤＮＡにおける対応する部分と入れ換えることによってＤＮＡに導入することができる。また、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．　ａｎｄ　Ｆｒｉｔｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔｈ．　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１５４，　３５０（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈ．　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））などの方法によってもヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は転位を導入することができる。
【００１７】
また、ある種のポリペプチドでは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、または活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このようなポリペプチドは、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドとして上記（Ｂ）のポリペプチドが挙げられる。
【００１８】
（Ｂ）のポリペプチドは、前記（イ）の性質に加えてさらに下記（ロ）の性質を有するものが好ましい。
（ロ）ケラタン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸ＩＩ及びケラタンポリ硫酸に作用し、主に硫酸化ケラタン硫酸二糖及び硫酸化ケラタン硫酸四糖を生成する。
【００１９】
ケラタン硫酸には、動物の角膜中に存在するケラタン硫酸Ｉと、軟骨などの組織に含まれるケラタン硫酸ＩＩ及びケラタンポリ硫酸とがあり、いずれも「ガラクトースとＮ−アセチルグルコサミンの二糖を構成単位とするコポリマーであるが、前者がＮ−アセチルグルコサミンの６位の炭素原子に結合したヒドロキシル基が多いのに対し、後者はＮ−アセチルグルコサミンの６位及びガラクトースの６位の両方の炭素原子に結合したヒドロキシル基が硫酸化された「二硫酸２糖」成分の占める割合が高い。
【００２０】
前記（ロ）の性質の有無は、例えば国際公開ＷＯ９６／１６１６６に記載された方法や、後記実施例に示すゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）を用いた方法等によって調べることができる。よって当業者であれば、ケラタン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸ＩＩ及びケラタンポリ硫酸に作用させた場合の生成物の組成を指標として、前記（ロ）の性質を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を容易に検出し、選択することができる。
【００２１】
（Ｂ）のポリペプチドは、前記（ロ）の性質に加えてさらに下記（ハ）及び（ニ）の性質を有するものが好ましい。
（ハ）至適反応温度が５０〜６０℃である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１０分間反応）。
（ニ）少なくとも４５℃以下で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１時間放置）。
【００２２】
前記（ハ）及び（ニ）の性質の有無は、例えば国際公開ＷＯ９６／１６１６６に記載された方法によって調べることができる。よって当業者であれば、このような至適反応温度や熱安定性を指標として、前記（ハ）及び（ロ）の性質を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を容易に検出し、選択することができる。
【００２３】
（Ｂ）のポリペプチドは、前記（ハ）及び（ニ）の性質に加え、さらに下記（ホ）及び（ヘ）の性質を有するものが好ましい。
（ホ）至適反応ｐＨが４．５〜６である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃）。
（ヘ）ｐＨ６〜７で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃で１時間放置）。
【００２４】
前記（ホ）及び（ヘ）の性質の有無は、例えば国際公開ＷＯ９６／１６１６６に記載された方法によって調べることができる。よって当業者であれば、このような至適反応ｐＨやｐＨ安定性を指標として、前記（ホ）及び（ヘ）の性質を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を容易に検出し、選択することができる。
これらの中でも、（Ａ）のポリペプチドをコードするＤＮＡが好ましい。
【００２５】
本発明ＤＮＡは、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡであることがさらに好ましい。
（ａ）配列番号１３に示すヌクレオチド配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全部又は一部を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記（イ）の性質を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（イ）ケラタン硫酸に作用して、そのＮ−アセチルグルコサミニド結合を加水分解する。
【００２６】
上記（ｂ）のＤＮＡは、（ａ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質と一次構造的には異なるが、同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを包含せしめる趣旨である。（ｂ）において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液、５０℃下で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
【００２７】
そして、このようなストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡの中から（イ）の性質を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを選択することによって、（ｂ）のＤＮＡを取得することができる。ＤＮＡにコードされているポリペプチドにおける（イ）の性質の有無は、前記と同様の方法で調べることができる。
【００２８】
（ｂ）のＤＮＡにコードされているポリペプチドは、前記（イ）の性質に加えてさらに下記（ロ）の性質を有するものが好ましい。
（ロ）ケラタン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸ＩＩ及びケラタンポリ硫酸に作用し、主に硫酸化ケラタン硫酸二糖及び硫酸化ケラタン硫酸四糖を生成する。
ＤＮＡにコードされているポリペプチドにおける（ロ）の性質の有無は、前記と同様の方法で調べることができる。
【００２９】
（ｂ）のＤＮＡにコードされているポリペプチドは、前記（ロ）の性質に加えてさらに下記（ハ）及び（ニ）の性質を有するものが好ましい。
（ハ）至適反応温度が５０〜６０℃である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１０分間反応）。
（ニ）少なくとも４５℃以下で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液（ｐＨ　６．０）中で１時間放置）。
【００３０】
ＤＮＡにコードされているポリペプチドにおける（ハ）及び（ニ）の性質の有無は、前記と同様の方法で調べることができる。
【００３１】
（ｂ）のＤＮＡにコードされているポリペプチドは、前記（ハ）及び（ニ）の性質に加えてさらに下記（ホ）及び（ヘ）の性質を有するものが好ましい。
（ホ）至適反応ｐＨが４．５〜６である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃）。
（ヘ）ｐＨ６〜７で安定である（測定条件：０．１Ｍ　酢酸緩衝液及び１０ｍＭ　トリス−酢酸緩衝液中、３７℃で１時間放置）。
【００３２】
ＤＮＡにコードされているポリペプチドにおける（ホ）及び（ヘ）の性質の有無は、前記と同様の方法で調べることができる。
これらの中でも、（ａ）のＤＮＡが好ましい。
【００３３】
本発明ＤＮＡには、本発明ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はＲＮＡも包含される。さらに本発明ＤＮＡは、ポリペプチドをコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、この一本鎖およびこれと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖からなる二本鎖であってもよい。
また本発明ＤＮＡと、ある機能を有する又は他のポリペプチド等をコードするＤＮＡとを連結させたＤＮＡも、本発明ＤＮＡが保持されている限りにおいて、本発明ＤＮＡに包含される。
【００３４】
本発明ＤＮＡは、もともとバチルス・サーキュランスから取得されたものであるが、遺伝子工学的手法や化学合成等により製造されたＤＮＡも当然に本発明ＤＮＡに包含される。
本発明ＤＮＡの製造方法も特に限定されない。例えば、天然物（バチルス・サーキュランスなど）から単離することにより製造してもよく、遺伝子工学的手法や化学合成等によって製造してもよい。
【００３５】
本発明ＤＮＡの中でも特に好ましい前記（Ａ）及び（ａ）のＤＮＡは、以下の遺伝子工学的手法によって初めて取得され、塩基配列決定されたものである。
【００３６】
（１）精製された耐熱性ケラタナーゼ（国際公開ＷＯ９６／１６１６６参照）の内部アミノ酸配列を解析し、これに基づいてＰＣＲプライマーを作製する。
【００３７】
（２）（１）で取得したプライマーを用い、バチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株の染色体ＤＮＡを鋳型としてｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ＰＣＲを行って、耐熱性ケラタナーゼをコードするｃＤＮＡの部分断片を取得する。
【００３８】
（３）（２）で取得した部分断片の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用い、染色体ＤＮＡの制限酵素処理物のセルフライゲートを鋳型としてＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを行い、このＰＣＲ産物の両端及び内部の塩基配列を決定する。決定された塩基配列に基づいて新たにプライマーを作製し、同様にＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲと塩基配列決定を繰り返す。決定された塩基配列を繋ぎ合わせることによって、耐熱性ケラタナーゼの全ＤＮＡ配列を決定する。
【００３９】
天然物から本発明ＤＮＡを製造する場合の採取原は、耐熱性ケラタナーゼを保持するものである限りにおいて特に制限されないが、例えば、本出願人によって平成６年９月５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現　独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター）に微生物受託番号ＦＥＲＭＰ−１４５１６として寄託され、平成７年１１月６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された、バチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ−５２８５）を用いることができる。
【００４０】
＜２＞本発明ベクター
本発明ベクターは、本発明ＤＮＡを保持するベクターである。本発明ベクターによって保持される本発明ＤＮＡについては、前記「＜１＞本発明ＤＮＡ」で説明した通りである。よって、本発明ベクターによって保持されることが最も好ましい本発明ＤＮＡは、前記（Ａ）又は（ａ）のＤＮＡである。
【００４１】
また、本発明ベクターは後述する本発明製造方法に好ましく用いられることから、発現ベクターであることが好ましい。
本発明ベクターは、本発明ＤＮＡを公知のベクターに導入することによって製造することができる。
【００４２】
本発明ＤＮＡを導入するベクターとしては、例えば、導入したＤＮＡを発現させることが可能な適当な（好ましくは、プロモーター等の調節配列を含む）発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）を使用することができ、本発明ベクターを組み込む宿主細胞で上記ＤＮＡを発現することが可能なベクターを適宜選択する。このような宿主−ベクター系としては、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）と、ｐＥＴ（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア　バイオテック社製）、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア　バイオテック社製）、ｐＫＫ２３３−３（ファルマシア　バイオテック社製）、ｐＥＺＺＺ１８（ファルマシア　バイオテック社製）、ｐＣＨ１１０（ファルマシア　バイオテック社製）、ｐＢＡＤ（インビトロゲン社製）、ｐＲＳＥＴ（インビトロゲン社製）、及びｐＳＥ４２０（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせや、ＣＯＳ細胞、３ＬＬ−ＨＫ４６細胞などの哺乳類細胞と、ｐＧＩＲ２０１（Ｋｉｔａｇａｗａ，　Ｈ．，　ａｎｄ　Ｐａｕｌｓｏｎ，　Ｊ．　Ｃ．　（１９９４）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９，　１３９４−１４０１）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｎａｇａｔａ，　Ｓ．　（１９９０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　１８，　５３２２）、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａ，　Ｈ．，　Ｙａｍａｎｕｒａ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｍｉｙａｚａｋｉ，　Ｊ．　（１９９１）　Ｇｅｎｅ　１０８，　１９３−２００）、ｐＣＭＶ−２（イーストマン　コダック（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ）製）、ｐＣＥＶ１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら，Ｍｅｄ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　２０，　２７（１９９０））又はｐＳＶＬ（ファルマシア　バイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターとの組み合わせの他、宿主細胞として昆虫細胞、酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。上述の宿主−ベクター系の中でも特に大腸菌とｐＥＴとの組み合わせが好ましい。
【００４３】
また、上記ＤＮＡを組み込むベクターは、組み込んだＤＮＡがコードするタンパク質とマーカーペプチドやシグナルペプチドとの融合タンパク質を発現するように構築されたものを用いることもでき、本発明ベクターを用いて発現されるケラタナーゼを精製等する場合には特に好ましい。上記ペプチドとしては例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えば、プロテインＡと融合させれば容易にアフィニティー精製することが可能となる。
【００４４】
いずれのベクターを用いる場合であっても常法に従って、上記ＤＮＡとベクターとを連結することが可能なように制限酵素などによって処理し、必要に応じて平滑化や粘着末端の連結を行った後、前記ＤＮＡとベクターとの連結をすることができる。
【００４５】
＜３＞本発明形質転換体
本発明形質転換体は、本発明ベクターによって宿主が形質転換された形質転換体である。
ここでいう「宿主」は、本発明ベクターによる組換えが可能なものであればよいが、本発明ベクターの保持するＤＮＡ又はそのＤＮＡを組み込んだ組換えベクターの機能を発揮できるものが好ましい。宿主としては、微生物細胞（菌体）、植物細胞、動物細胞等を用いることができ、大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）、酵母、枯草菌、昆虫細胞、哺乳類細胞（ＣＯＳ細胞、３ＬＬ−ＨＫ４６細胞など）が例示される。宿主は、本発明ベクターにあわせて適宜選択することができるが、例えばｐＥＴをベースとする本発明ベクターを用いる場合には大腸菌を選択することが好ましい。
【００４６】
宿主の本発明ベクターによる形質転換は、常法によって行うことができる。例えば、市販のトランスフェクション用試薬を用いる方法や、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法等によって本発明ベクターを宿主に導入し、形質転換を行うことができる。
このようにして得られる本発明形質転換体は、後述する通り、ケラタナーゼの製造等に用いることができる。
【００４７】
＜４＞本発明製造方法
本発明製造方法は、本発明形質転換体を生育させ、その生育物からケラタナーゼを採取することを特徴とする、ケラタナーゼの製造方法である。
【００４８】
ここで「生育」とは、本発明形質転換体である微生物や細胞自体の増殖、本発明形質転換体である細胞を組み込んだ動物、昆虫等の生育を含む概念である。また、ここでいう「生育物」とは、本発明形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）及び培養された宿主細胞、分泌物、排出物等を包含する概念である。生育の条件（培地や培養条件等）は、用いる宿主に合わせて適宜選択される。
【００４９】
例えば宿主細胞として大腸菌を用いる場合は、ＬＢ培地等を主成分として適宜調製した培地を用いることができる。また例えば、宿主細胞としてＣＯＳ−７細胞を用いる場合には、２％程度のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培地を用い、３７℃条件下で培養することができる。
本発明製造方法によれば、用いる形質転換体に応じて種々の形態のケラタナーゼを産生させることができる。
【００５０】
例えば、マーカーペプチドやシグナルペプチド等の他のペプチドとの融合タンパク質を発現するように構築された発現ベクターによって形質転換された形質転換体を生育させれば、上記他のペプチドと融合したケラタナーゼが産生される。
生育物からのケラタナーゼの採取は、産生されるケラタナーゼの形態に応じて、公知のタンパク質の抽出・精製方法によって行うことができる。
【００５１】
例えばケラタナーゼが、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのままケラタナーゼとして用いてもよい。またケラタナーゼが細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、またはこれらの組み合わせ等の処理操作によってケラタナーゼを抽出することができ、抽出物をそのままケラタナーゼとして用いてもよい。
【００５２】
これらの培地や抽出物から、ケラタナーゼをさらに精製することもでき、かつ好ましい。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、ケラタナーゼの使用目的等に応じて適宜選択することができる。
【００５３】
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外ろ過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００５４】
例えば、ケラタナーゼをプロテインＡとの融合タンパク質として産生させれば、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Ｈｉｓとの融合タンパク質として産生させれば、磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができ、ＦＬＡＧとの融合タンパク質として産生させれば抗ＦＬＡＧ抗体を結合させた固相を用いることができる。
【００５５】
製造されたポリペプチドを精製し、そのアミノ酸配列や前記（イ）〜（ヘ）の性質の有無等を分析することによって、所望のケラタナーゼが製造されたか否か確認することができる。
後述の実施例により、本発明形質転換体を適当な条件下で生育させることによって酵素活性を有するケラタナーゼが発現されることが確認された。よって本発明製造方法は、酵素活性を有するケラタナーゼの大量調製に利用することができる。
【００５６】
＜５＞本発明プローブ
本発明プローブは、本発明配列番号１３に示すヌクレオチド配列の全部又は一部と相補的なヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーション用プローブである。
【００５７】
ここで「配列番号１３に示すヌクレオチド配列の一部」は、配列番号１３におけるヌクレオチド番号１４０１〜４０２３で示されるヌクレオチド配列であることが好ましい。
【００５８】
本発明プローブは、配列番号１３に示すヌクレオチド配列の全部又は一部と相補的な配列を有するポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドを作成し、これをハイブリダイゼーションに適した標識（例えば、放射性同位体）で標識することによって得ることができる。
ポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドの長さは、本発明プローブを用いるハイブリダイゼーションの条件によって適宜選定される。
【００５９】
本発明プローブは、耐熱性ケラタナーゼをコードするＤＮＡやＲＮＡの検出や定量に用いることができ、ケラタナーゼの生物学的機能を調べる有用な道具となることが期待される。
【００６０】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１　ケラタナーゼをコードするＤＮＡのクローニング
（１）バチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株の産生するケラタナーゼの内部アミノ酸配列の解析
バチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５２８５）から、国際公開ＷＯ９６／１６１６６号に記載の方法でケラタナーゼを単離精製した。精製した溶液の酵素活性は１．４Ｕ／ｍｌであった。
この溶液の１５０μｌを４％アガロースゲルに付し、５０μｌをポリアクリルアミドゲルに付して、それぞれドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）電気泳動を行った。
泳動後、それぞれのゲルについてクマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）染色及び亜鉛染色を行い、分子量２００Ｋｄａ付近に出現したメインのバンドを切り出した。
【００６１】
アガロースゲルから切り出したバンドを含むゲルを、蒸留水中で１５分間振とう撹拌しながら洗浄した。この洗浄を３回繰り返した後、ゲルの終濃度が０．５％となるように抽出バッファー（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５％　ＳＤＳ）を添加し、７５℃でゲルを完全に溶解させた。溶解後、試料を氷上で３０分間静置し、さらに−８０℃で２時間凍結させた後、氷上で溶解させた。次いでこの試料を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して上清（１．５ｍｌ）を回収し、０．４μｇのリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社）を用いて、３７℃で一晩酵素消化した。
【００６２】
ポリアクリルアミドゲルから切り出したバンドを含むゲルについては、当該ゲルに等量（０．２ｍｌ）の抽出バッファー（２００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５），　０．２％　ＳＤＳ）を添加し、撹拌することによってゲル内にバッファーを浸透させた。次いで１μｇのリシルエンドペプチダーゼを用いて、３７℃で１６時間酵素消化した。
次いで、リシルエンドペプチダーゼ処理した溶液の全量を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液（Ａ液）で平衡化したＤＥＡＥ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー株式会社：４．６×１５０ｍｍ）（ガードカラムＯＤＳ８０Ｔｓ（２×２５０ｍｍ；東ソー株式会社））にアプライした。カラム温度を４０℃に保持し、０．０８％　ＴＦＡ含有７０％アセトニトリル溶液（Ｂ液）を用いて各ペプチド断片を分離溶出した。なお溶出は流速０．１８ｍｌ／分で行い、かつ、２７５分後のＢ液濃度が１００％となるように直線的に濃度勾配をかけた。２１５ｎｍのＵＶ吸収によってペプチドを検出し、そのピークを分取することによって分画した。
【００６３】
得られた各フラクションを、減圧濃縮機を用いて乾固させた。乾固した試料を４μｌの７０％メタノールに溶解後、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（５×５ｍｍ；ミリポア社）に添加して減圧条件下で乾燥させた。乾燥後のＰＶＤＦ膜に４μｌのバイオブレン試薬　（０．０２ｍｇ／μｌバイオブレン（ＰＥバイオシステムズ社）、０．０１％　ＴＦＡ及び７０％メタノールを含有する）　を加えて、再度減圧条件下で乾燥させることによってペプチド断片を膜に固定した。その後、プロテインシークエンサー（モデル４７３Ａ　；ＰＥバイオシステムズ社）を用いてアミノ酸配列の解析を行った。この解析によって得られたバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株由来のケラタナーゼに由来するペプチド断片のアミノ酸配列（当該酵素の内部アミノ酸配列）を以下に示す（配列番号１〜３）。
【００６４】
ペプチド１：ＤＱＬＡＮＶＱＮ（配列番号１）
ペプチド２：ＱＰＡＬＩＰＴＩＶＤＡ（配列番号２）
ペプチド３：ＱＧＰＡＤＰＰＶＴＥＰ（配列番号３）
【００６５】
（２）バチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株の染色体ＤＮＡの調製
バチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２菌株を、白金耳を用いて５００ｍｌの培地（１％　ペプトン（極東製薬工業株式会社）、０．５％　ビール酵母エキスＤ−３（日本製薬株式会社）、０．２５％　エルリッヒ肉エキス（極東製薬工業株式会社）、０．５％　Ｋ２ＨＰＯ４、０．０２％　ＭｇＳＯ４（７Ｈ２Ｏ）、０．１％　ＮａＣｌ（ナカライテスク株式会社）及び０．５％　サメ軟骨由来のケラタンポリ硫酸（生化学工業株式会社製）を含有する。ｐＨ７．５）に接種し３７℃で一晩撹拌培養した。培養液を二分して、それぞれについて以下の通り処理を行った。
【００６６】
培養液を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、２０分）して集菌し、９ｍｌのＴＥ（１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）緩衝液）に懸濁させた。この菌体懸濁液に２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム（シグマ社）を０．５ｍｌ添加した後、室温で２０分間静置して溶菌させた。次いで０．５ｍｌの１０％　ＳＤＳ及び１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ　（ベーリンガー・マンハイム社；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を添加して５５℃で１．５時間処理した。その後１０ｍｌのＴＥ飽和フェノールを添加して５分間緩やかに撹拌し、遠心分離（１，７００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。
【００６７】
遠心分離によって生じた水層を回収してプールし、これと等量のＴＥ飽和フェノールを添加した。緩やかに撹拌した後、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１５分）することによって再度水層を回収した（１２ｍｌ）。この水層に０．１ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅＡ　（シグマ社）を添加して３７℃で１５分間処理した。処理後の溶液にこれと同量のＰＣＩ溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）を加えて５分間攪拌し、遠心分離（３８００ｒｐｍ、１５分）することによって水層を回収した（９ｍｌ）。
【００６８】
この水層に１ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加した後、２４ｍｌのエタノールを添加して、緩やかに混和することによって染色体ＤＮＡを沈殿させた。遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）によって沈殿を回収し、この沈殿を３０ｍｌの７０％エタノールで洗浄した。次いで同様に遠心分離することによって沈殿を回収して風乾させた。風乾した沈殿を１ｍｌのＴＥに懸濁させ、４℃で一晩静置して完全に溶解させて、染色体ＤＮＡ溶液とした（ＤＮＡ濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）。
【００６９】
（３）ケラタナーゼをコードするＤＮＡのクローニング
前記（１）で示したペプチド断片のアミノ酸配列（内部アミノ酸配列）に基づいて、それぞれ以下の通りＰＣＲプライマー（センスプライマー及びアンチセンスプライマー）を作製した。
【００７０】
ペプチド１：
５’−ＧＡＹＣＡＲＹＴＩＧＣＩＡＴＹＧＴＩＣＡＲＡＴ−３’（センス；プライマー１）（配列番号４）
５’−ＡＴＹＴＧＩＡＣＲＡＴＩＧＣＩＡＲＹＴＧＲＴＣ−３’（アンチセンス；プライマー２）（配列番号５）
【００７１】
ペプチド２：
５’−ＹＴＩＡＴＩＣＣＩＡＣＩＡＴＩＧＴＩＧＡＹＧＣ−３’（センス；プライマー３）（配列番号６）
５’−ＡＴＩＧＴＩＧＧＩＡＴＩＡＲＩＧＣＩＧＧＹＴ−３’　（アンチセンス；プライマー４）（配列番号７）
【００７２】
ペプチド３：
５’−ＧＣＩＧＡＹＣＣＩＣＣＩＧＴＩＡＣＩＧＡＲＣＣ−３’（センス；プライマー５）（配列番号８）
５’−ＡＣＩＧＧＩＧＧＲＴＣＩＧＣＩＧＧＩＣＣＹＴＧ−３’（アンチセンス；プライマー６）（配列番号９）
【００７３】
なお、プライマー１〜６における”Ｒ”はＧ又はＡを、”Ｙ”はＴ又はＣを、”Ｉ”はイノシンを意味する。
次に、プライマー配列の基礎となったペプチド同士の全ての組み合わせ（６種類）でセンスプライマーとアンチセンスプライマーを組み合わせ、プライマーを各７５　ｐｍｏｌと、Ｅｘ−Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用い、前記（２）で調製した染色体ＤＮＡ　０．１μｇを鋳型としてｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は「９４℃，５分−（９４℃，２０秒−６０℃，３０秒−７２℃，２分）を３０サイクル−７２℃，１０分」とし、反応液の量は５０μｌとした。
【００７４】
ＰＣＲ後の溶液を電気泳動した結果、プライマー５及びプライマー４の組み合わせにおいて、メインバンドとして２．５ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られ、またプライマー５及びプライマー２の組み合わせで０．５ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。
これらのＰＣＲ産物をＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇベクター（ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ）にサブクローニングし、ＰＣＲ産物の両端の塩基配列をＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０（ＰＥバイオシステムズ社））で決定した。また当該ＰＣＲ産物の各種制限酵素処理断片をクローニングベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＳＫ（−））にサブクローニングすることによって、同様に内部の塩基配列を決定した。２．５ｋｂｐの産物の塩基配列を配列番号１０に示す。
【００７５】
解析した結果、０．５ｋｂｐの産物の塩基配列は２．５ｋｂｐの産物の塩基配列中に全て含まれていた。すなわち、２．５ｋｂｐのＰＣＲ産物は「ペプチド１」をコードする配列を含んでいた。また、「ペプチド１」をコードするようなリーディングフレームにおいて終止コドンは存在しなかった。これらの結果から、２．５ｋｂｐのＰＣＲ産物はケラタナーゼをコードするＤＮＡの一部であると推定された。
【００７６】
次に当該ＰＣＲ産物の上流及び下流に存在する未知の塩基配列を決定するために、Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを行った。まずＢｇｌＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）によって染色体ＤＮＡを処理した後、各種条件でセルフライゲーションを行った。決定済みのｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　ＰＣＲ産物の塩基配列に基づいて新たに以下のＰＣＲプライマー（センスプライマー及びアンチセンスプライマー）を作製し、当該染色体ＤＮＡ断片のセルフライゲートを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は「９４℃，５分−（９４℃，１５秒−６０℃，３０秒−７２℃，７分）を１０サイクル−（９４℃，１５秒−６０℃，３０秒−７２℃，７分＋２０秒）を２５サイクル」とした。
【００７７】
５’−ＧＡＴＣＴＡＧＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＣＧＧＧＧＧＣＧＣＧＡＴＧＡＡＴＣ−３’（センス；プライマー７）（配列番号１１）
５’−ＴＣＧＴＡＡＧＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴＴＧＣＴＧＴＡＧＴＴＡＧ−３’（アンチセンス；プライマー８）（配列番号１２）
【００７８】
ＰＣＲ後の電気泳動においてメインバンドとして得られた２．５ＫｂｐのＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯにサブクローニングしてＰＣＲ産物の両端の塩基配列を決定した。また当該ＰＣＲ産物の各種制限酵素処理断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＳＫ（−）にサブクローニングすることによって、同様に内部の塩基配列を決定した。決定された塩基配列に基づいて新たにＰＣＲプライマーを作製し、前記と同様のＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを繰り返して、塩基配列を決定した。決定された塩基配列を繋ぎ合わせることによって、バチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株のケラタナーゼの全ＤＮＡ配列（５，８１１ｂｐ）を決定した。決定された塩基配列を、これに対応するアミノ酸配列とともに配列番号１３に示す。また、このアミノ酸配列のみを配列番号１４に示す。
【００７９】
（４）ケラタナーゼタンパク質のドメイン解析
配列番号１４に示すアミノ酸配列について、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ　Ｈｏｍｅ　Ｐａｇｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）の”ｔｂｌａｓｔｎ”及び”ＣＤ（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｄｏｍａｉｎ）−Ｓｅａｒｃｈ”を用いてタンパク質ホモロジー検索を行った。解析結果の模式図を図１に示す。その結果、ケラタナーゼタンパク質は、アミノ酸番号３０７〜４５７（対応する塩基：配列番号１３の塩基番号９１９〜１３７１）にセルロース結合ドメインＶＩを有していた（図１中の▲２▼）。また、Ｃ末端領域にＳ−ｌａｙｅｒホモロジードメインが存在していた（図１中の▲３▼）。また遺伝子解析ソフト（製品名：ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ、ゼネティックス社製　）を用いたシグナルペプチド予測によって、配列番号１４におけるアミノ酸番号１−３４（対応する塩基：配列番号１３におけるヌクレオチド番号１−１０２）（図１中の▲１▼）がシグナルペプチドであることが予想された。
【００８０】
実施例２　ケラタナーゼタンパク質の発現と酵素活性測定
（１）大腸菌における組換えケラタナーゼタンパク質の発現
実施例１で明らかとなったケラタナーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて、シグナルペプチドと予想される配列を除いたＤＮＡを増幅する以下のＰＣＲプライマーを作製した。なお、プライマー９にはＢａｍＨＩ切断サイトが、プライマー１０にはＥｃｏＲＩ切断サイトがそれぞれ付加されている。
【００８１】
５’−ＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＡＴＴＣＧＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＡＣ−３’（センス；プライマー９）（配列番号１５）
５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴＧＴＴＡＡＡ−３’（アンチセンス；プライマー１０）（配列番号１６）
【００８２】
その結果メインバンドとして得られた目的のＤＮＡを含む５．７ＫｂｐのＤＮＡフラグメントをクローニングベクターにサブクローニングした後、ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）およびＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切り出し、同制限酵素で処理した大腸菌タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフォーメーションした。
【００８３】
実施例１の（２）で調製したＫｓＴ２０２株染色体ＤＮＡ　０．５μｇを鋳型に、プライマー９及びプライマー１０を各２５ｐｍｏｌ、およびｐｆｕ　ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、９４℃，３ｍｉｎ−（９４℃，１５ｓｅｃ−６０℃，３０ｓｅｃ−７２℃，７ｍｉｎ）×２５サイクル−７２℃，１０ｍｉｎのＰＣＲを行った（全　５０μｌ）。
【００８４】
ＰＣＲの結果メインバンドとして得られた目的のＤＮＡを含む５．７ＫｂｐのＤＮＡフラグメントをクローニングベクター（製品名ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＫＳ（＋））にサブクローニングした後、ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）及びＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切り出し、同制限酵素で処理した大腸菌タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入して、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフォーメーションした。
【００８５】
目的酵素タンパク質の発現は、上記で得られた形質転換株を５０　μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地で３７℃にて培養液の濁度がＯＤ６００＝０．６となるまで撹拌培養した後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、さらに３７℃で３時間撹拌培養することで行った。培養後、遠心分離（９，０００ｒｐｍ，　２０ｍｉｎ）により集めた菌体を、緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，　３００ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））に懸濁後、氷冷下で超音波処理（１０ｓｅｃ×５，　ｉｎｔｅｒｖａｌ　１０ｓｅｃ）することによって完全に菌体を破砕した。この破砕物を遠心分離（９，０００ｒｐｍ，　２０ｍｉｎ）することによって得られた上清を可溶性タンパク質画分とした。
【００８６】
（２）ケラタン硫酸分解活性（ケラタナーゼ活性）の測定
酵素の活性測定はＰａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１８１，　ｐ１４９　（１９４９））に従って行った。１０ｍｇ／ｍｌのサメ軟骨由来のケラタンポリ硫酸水溶液１０μｌに対し、実施例２の（１）で調製した可溶性タンパク質画分１０μｌ、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１８０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた。次に炭酸−シアン化物溶液を２００μｌ加えて反応を停止し、フェリシアニド溶液２００μｌを加えた後、１０分間沸騰水中で加熱した。続いて流水中で反応液を冷却し、第二鉄溶液１ｍｌを加えて混合し、１５分後の６９０ｎｍの吸光度を測定した。また酵素量　１単位（１Ｕ）は、上記条件下で１分間に１μｍｏｌのガラクトースに相当する還元末端を生成する酵素量として定義した。ケラタン硫酸分解活性の測定結果を図２に示す。
【００８７】
その結果、実施例２（１）で調製したＤＮＡを導入した大腸菌から発現させたタンパク質の可溶性画分中に、ウシ血清アルブミン相当でタンパク質１ｍｇあたり８３ｍＵのケラタナーゼ活性が認められた（図２の右側）。このことから、実施例１で得られたＤＮＡがケラタナーゼをコードすることが示された。また当該ＤＮＡを挿入していない発現ベクターのみをトランスフォーメーションした大腸菌では、ケラタン硫酸分解活性は認められなかった（図２の左側）。
【００８８】
実施例３　組換えタンパク質によるケラタン硫酸の分解
（１）大腸菌発現タンパク質によるサメ軟骨由来のケラタンポリ硫酸の分解
実施例２で得られた組換えタンパク質のケラタナーゼ活性の有無と、その作用を調べるために、以下の実験を行った。
【００８９】
実施例２の（１）で調製した大腸菌可溶性タンパク質画分（２ｍＵ／ｍｌ相当）、又はバチルス・サーキュランスＫｓＴ２０２株由来の精製ケラタン硫酸分解酵素（２ｍＵ／ｍｌ相当）と、終濃度２ｍｇ／ｍｌのサメ軟骨由来のケラタンポリ硫酸を、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、３７℃で２４時間反応させた（全　０．１ｍｌ）。
【００９０】
（２）反応物のゲルろ過高速液体クロマトグラフィー
実施例３の（１）で調製した酵素反応後の溶液を、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、遠心上清液１０μｌをゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）に付した。ＧＰＣ−ＨＰＬＣのカラムとしてＴＳＫ−ＧＵＡＲＤＣＯＬＵＭＮ　ＰＷＸＬ（６．０　ｘ　４０ｍｍ）、ＴＳＫ−ＧＥＬ　Ｇ４０００ＰＷＸＬ（７．８　ｘ３００ｍｍ）、Ｇ３０００ＰＷＸＬ（７．８　ｘ　３００ｍｍ）及びＧ２５００ＰＷＸＬ（７．８　ｘ　３００ｍｍ）（いずれも東ソー株式会社製）をこの順番に連結させたものを用い、２００ｍＭ　ＮａＣｌで溶出した。またカラム温度は３５℃、流速は０．６ｍｌ／分とした。なお、これと同一の条件で標準物質（ケラタナーゼＩＩによるサメ軟骨由来のケラタンポリ硫酸の分解物であるケラタン硫酸オリゴ糖）を付したところ、硫酸化ケラタン四糖および硫酸化ケラタン二糖の保持時間はそれぞれ４０．６分及び４３．０分であった。
【００９１】
ＧＰＣ−ＨＰＬＣの結果を図３に示す。酵素の代わりに蒸留水を添加した場合（図３中の（Ａ））には、サメ軟骨由来のケラタンポリ硫酸の低分子化は見られなかった。一方、国際公開ＷＯ９６／１６１６６に記載の方法で精製したバチルス・サーキュランス　ＫｓＴ２０２株由来のケラタン硫酸分解酵素を添加した場合（図３中の（Ｂ））、又は実施例２の（１）で調製した可溶性タンパク質画分を添加した場合（図３中の（Ｃ））には、分解産物である低分子化合物が見られた。保持時間からみて、図中のピークＩ及びＩＩはそれぞれ硫酸化ケラタン四糖および硫酸化ケラタン二糖であると考えられた。また図３中の（Ｂ）と（Ｃ）のクロマトグラムがほぼ一致していることから、大腸菌に導入したＤＮＡが、バチルス・サーキュランス　ＫｓＴ２０２株のケラタナーゼをコードするＤＮＡであることが確認された。
【００９２】
【発明の効果】
本発明ＤＮＡは、耐熱性ケラタナーゼをコードするＤＮＡであり、本発明ベクターや本発明プローブの作製などに利用できることから極めて有用である。本発明ベクターは、本発明形質転換体の製造に利用することができることから極めて有用である。本発明形質転換体は、本発明製造方法に利用できることから極めて有用である。本発明製造方法は、耐熱性ケラタナーゼを効率よく大量に生産できることから極めて有用である。本発明プローブは、耐熱性ケラタナーゼをコードするＤＮＡやＲＮＡの検出・定量用試薬等として利用しうることから、極めて有用である。
【００９３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】クローニングされたケラタナーゼの、タンパク質ホモロジー解析結果の模式図を示す。
【図２】本発明ＤＮＡ（本発明ベクター）を用いて発現させたポリペプチドのケラタン硫酸分解活性を示す。
【図３】ケラタン硫酸を本発明ＤＮＡ（本発明ベクター）を用いて発現させたポリペプチドと反応させた場合の分解産物のパターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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