(57)【要約】【解決手段】イソフラボンを含有する大豆由来の原料素材やイソフラボン自体を、イソフラボンをリン酸化する能力を有する微生物、特にバチルス属あるいはアスペルギルス属の微生物と共に培養することにより、あるいは培養した該微生物菌体又は該微生物から抽出したリン酸化酵素で作用させることにより、イソフラボンをリン酸化してリン酸化イソフラボンを製造する。【効果】安全性が高く、水溶性が著しく高く、不快味が低下し、体内への吸収性が増大して健康機能が増大すると期待されるリン酸化イソフラボンを含有する健康食品素材あるいはリン酸化イソフラボン含有大豆食品を、提供できる。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソフラボンをリン酸化する能力を有する微生物、該微生物由来のリン酸化酵素、該酵素含有物から選ばれる少なくともひとつを、イソフラボン又はイソフラボン含有物に作用させてリン酸化を行って得られる、下記化１に示す構造式のリン酸化イソフラボンを含有すること、を特徴とする健康食品素材。
【化１】
2004024139.tif 000007
（但し、式中、Ｒ１〜Ｒ４は次のことを表わす。
Ｒ１：水酸基、リン酸基のいずれか
Ｒ２：水素、メトキシル基のいずれか
Ｒ３：水素、水酸基、リン酸基のいずれか
Ｒ４：水素、水酸基、リン酸基のいずれか
であり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ４のいずれか１つ以上がリン酸基である。）
【請求項２】
健康食品素材がイソフラボンの体内吸収率を高めたものであること、を特徴とする請求項１に記載の健康食品素材。
【請求項３】
イソフラボン含有物が大豆又は大豆処理物であること、を特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に記載の健康食品素材。
【請求項４】
微生物が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する糸状菌であること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の健康食品素材。
【請求項５】
微生物が、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）であること、を特徴とする請求項４に記載の健康食品素材。
【請求項６】
イソフラボンが配糖体の場合、これを加水分解してアグリコンとし、これをリン酸化すること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の健康食品素材。
【請求項７】
イソフラボンをリン酸化する能力を有する微生物、該微生物由来のリン酸化酵素、該酵素含有物から選ばれる少なくともひとつを、イソフラボン又はイソフラボン含有物に作用させてイソフラボンのリン酸化を行い、生成したリン酸化イソフラボン（その構造式を下記化２に示す）を有効成分としてなること、を特徴とするイソフラボンの体内吸収率を高めたイソフラボン製剤。
【化２】
2004024139.tif 000008
（但し、式中、Ｒ１〜Ｒ４は次のことを表わす。
Ｒ１：水酸基、リン酸基のいずれか
Ｒ２：水素、メトキシル基のいずれか
Ｒ３：水素、水酸基、リン酸基のいずれか
Ｒ４：水素、水酸基、リン酸基のいずれか
であり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ４のいずれか１つ以上がリン酸基である。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水溶性が顕著に増大し、苦味が軽減されて摂食しやすくなり、かつ体内への吸収性が増大するため、生体内での機能性が著しく増大すると期待されるイソフラボン（Ｉｓｏｆｌａｖｏｎ）を含有する健康食品素材に関するものであり、さらに詳しくは、本発明は、イソフラボンをリン酸化する能力を有する微生物及び／又は該微生物由来の酵素（酵素含有物も包含される）によりリン酸化されたイソフラボンを含有することを特徴とする健康食品素材に関するものであって、新規な生化学的方法によって製造されたリン酸化イソフラボンを含有する健康食品素材に関するものである。また本発明は、大豆等イソフラボン含有物中のイソフラボンもリン酸化できるので、リン酸化イソフラボン含有大豆加工食品といった、品質が改良された新しい健康食品を提供できるものである。
【０００２】
【従来の技術】
大豆は食品原料として広く利用されてきているが、エグ味や苦味などを呈する不快味成分を多く含んでいることが食味品質の面で古くからの課題となっており、そして大豆中の主要な不快味成分の一つはイソフラボンであると言われている（Ｎｅｗ　Ｆｏｏｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，　３６　（１０），　１７−２７，　１９９４）。
【０００３】
一方、イソフラボンはコレステロール低減や骨強化などの健康機能を有することが知られるようになり、大豆などから分離精製したイソフラボンの健康食品素材としての利用法が提案されており、さらには、糖代謝の改善、動脈硬化予防、糖質代謝の改善、抗腫瘍活性、骨粗しょう症予防、抗酸化効果、フィトエストロゲン効果、免疫賦活作用などでは濃度依存的に効果が上昇することが判明している。
【０００４】
現在までに大豆および大豆発酵食品中には、ダイジン、グリシチン、ゲニスチンあるいはこれらのアグリコンであるダイゼイン、グリシテイン、ゲニステインなど約１５種類のイソフラボンが確認されているが（食品と開発、３１（６），４４−４７，１９９６）、この大豆中イソフラボンの多くはダイジン、ゲニスチン、グリシチンなどの配糖体で存在している。
【０００５】
これら配糖体はダイゼイン、ゲニステイン、グリシテインなどのアグリコンに比べて体内への吸収性が劣ることから、生体内で効果が表れるために必要な局所における濃度が達成しにくいとされており、吸収性を向上させたイソフラボン素材は健康機能効果を増大させることが期待されている。
【０００６】
また、食品素材での重要な一面として呈味性が挙げられる。上記アグリコンは配糖体と比べ不快味が強いことがわかっており、イソフラボンの有する健康機能性を向上させるだけでなく、不快味を低減させるイソフラボン素材がなお望ましい。
【０００７】
大豆のエグ味や苦味などの不快味を改善する為の方法として、大豆中のイソフラボンを分解、除去または低減化する方法（特開平５−３２８９２９号公報）があるが、このような方法では大豆の健康機能が損なわれてしまう欠点を有していた。そこで、健康機能が発揮される十分量のイソフラボンを含有していても不快味を感じないようにする品質改良方法が求められていた。
【０００８】
一方、イソフラボンは水溶性が極めて小さく、食品などへの添加量が制限されたり、体内の吸収効率が悪くなることなどから、健康機能面で十分な効果が発揮されていないという欠点もあった。
【０００９】
そこで、これらのイソフラボンの欠点が改善できれば、大豆加工食品の用途範囲が広がるとともに、健康食品素材であるイソフラボンの用途範囲も広げることができるものと期待される。
【００１０】
このような背景において、イソフラボンの不快味を低減させる方法として食品添加物を添加して不快味をマスキングする方法が提案されており、例えばサイクロデキストリンを添加する方法（特開平９−３０９９０２号公報、特開平１０−２９８１７５号公報）などが試みられてきた。
【００１１】
しかし、これらの方法では不快味をある程度は軽減できるが、効果としては未だ不十分であった。また、イソフラボンの水溶性を高める効果も不十分なものであった。さらに、これらの方法では、大豆や大豆素材などのイソフラボン以外の不純物が多量に混在するものについては、不快味の軽減などの効果が得られにくい欠点もあった。
【００１２】
一方、イソフラボンの化学構造を変換して各種の誘導体とすることにより、エグ味や苦味などの不快味を低減し、水溶性を高めることができることが示されている。例えば、コハク酸が付加されたイソフラボン誘導体（特開平７−７０１７０号公報）、アセチル基が付加されたイソフラボン誘導体（特開平８−２９１１９１号公報）やリン酸化されたイソフラボン誘導体（ＰＣＴ／ＵＳ９９／１３１６０）などがある。これらの誘導体の中では、リン酸化イソフラボンが最も水溶性が高く、不快味を低減する効果に優れていると期待されている。
【００１３】
しかし、上記のリン酸化イソフラボンの製造方法は化学合成法であるため、イソフラボンを含む天然素材のままでリン酸化しようとする場合やイソフラボン以外の混合物が混在している場合などでは利用しにくいこと、また化学合成法は、リン酸化イソフラボンを試薬や工業上の用途に使用する場合には格別の支障はないが、化学合成法は劇物や安全性の懸念される有機溶媒、化学合成助剤などを使用する必要があり、その結果、リン酸化イソフラボンを食品などに利用する上では安全性が懸念されること等の欠点があった。
【００１４】
すなわち、最も有効なイソフラボン誘導体の一つであると期待されるリン酸化イソフラボンの安全でかつ効率的な製造方法を開発し、それによって製造されたリン酸化イソフラボンを含有する安全で優れた健康食品素材を開発することが求められていたのである。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した当業界の要望に応える目的でなされたものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、本発明者らは、各方面から検討を行い、安全性の面にも配慮して、イソフラボンのリン酸化に関して化学合成法ではなく生物学的方法に着目し、微生物を用いる方法を開発することとした。
【００１７】
そこで、本発明者らは、イソフラボンを様々な発酵微生物と共に培養し、リン酸化イソフラボンを生成する能力を持つ微生物を広く検索した。その中でイソフラボンの水酸基をリン酸化する能力を有する微生物を初めて見出し、特にバチルス属又はアスペルギルス属の微生物が有効であることを見出して、そしてこれらの方法で製造されたリン酸化イソフラボンは、イソフラボンが有する健康機能は維持している一方、水溶性は顕著に向上し、苦味やエグ味といった不快味は著しく低減していることをはじめて見出した。そして特筆すべきことに、後記からも明らかなように、このようにして製造したリン酸イソフラボンは体内の吸収性が大幅に向上するという有用新知見を得た。
【００１８】
本発明は、これらの新知見に基づき、更に研究の結果、遂に完成されたものである。本発明で使用するリン酸化イソフラボンは、体内吸収率が大幅に向上しているため、イソフラボンが本来有している糖代謝の改善作用その他の生理作用を生体内で充分に発揮することができ、健康食品素材として特に有効であるという特徴を有するものである。
【００１９】
すなわち、本発明は、微生物、又は該微生物から抽出したリン酸化酵素を利用し、イソフラボンを安全かつ効率良く変換された、下記化３に示す構造式のリン酸化イソフラボンを含有する健康食品素材に関するものである。
【化３】
2004024139.tif 000002
【００２０】
（但し、式中、Ｒ１〜Ｒ４は次のことを表わす。
Ｒ１：水酸基、リン酸基のいずれか
Ｒ２：水素、メトキシル基のいずれか
Ｒ３：水素、水酸基、リン酸基のいずれか
Ｒ４：水素、水酸基、リン酸基のいずれか
であり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ４のいずれか１つ以上がリン酸基である。）
【００２１】
本発明方法は、イソフラボンのリン酸化に非常にすぐれており、イソフラボン含有物中のイソフラボン、例えば大豆中に含まれているイソフラボンを大豆から取り出すことなく、大豆中に存在せしめたままイソフラボンをリン酸化して、リン酸化イソフラボン含有大豆を製造することもできるという特筆すべき利点を有しており、また、このように含有物中に含まれているイソフラボンではなく、単離したイソフラボン、つまりイソフラボン自体を直接処理してストレートにリン酸化してリン酸化イソフラボン化合物を直接製造することももちろん可能であって、どのような状態にあるイソフラボンもリン酸化して、リン酸化イソフラボン含有大豆食品素材やリン酸化イソフラボン自体を適宜製造することができる。
【００２２】
リン酸化するイソフラボンとしては、配糖体タイプのイソフラボン、配糖体部分を除去したアグリコンタイプのイソフラボンのいずれも使用可能であり、次のようなものが非限定的に例示される：ダイジン（ダイズイン、Ｄａｉｄｚｉｎ）、グリシチン（Ｇｌｙｃｉｔｉｎ）、ゲニスチン（Ｇｅｎｉｓｔｉｎ）、これらの６”−Ｏ−マロニル誘導体、６”−Ｏ−アセチル誘導体、ダイゼイン（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）、グリシテイン（Ｇｌｙｃｉｔｅｉｎ）、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）その他。したがって、本発明によれば、これらのイソフラボンをリン酸化して、先の構造式に示したリン酸化イソフラボンを各種製造することができ、このようにして製造された吸収性の高いリン酸化イソフラボンを含有する健康食品素材を提供することができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明で使用する微生物としては、イソフラボンのリン酸化能を有する微生物であればすべてのものが用いられ、中でもバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の微生物が好ましい。例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ）などを挙げることができる。
【００２４】
更に、例えばバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＳＦＫ０８１株（産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所微生物寄託センター（現、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ　ＢＰ−７４３９として寄託）やアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）ＩＳＦＫ０２９株（産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所微生物寄託センター（現、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ　ＢＰ−７４４０として寄託）などが好適な微生物として挙げられる。
【００２５】
これらの微生物の培養方法は、通常用いられる方法であれば、液体培養法、固体培養法などいずれの方法でも良い。すなわち培養する微生物に適した炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有した合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。
【００２６】
リン酸化イソフラボンを取得する場合には、イソフラボンを培地中に１００〜１００００ｐｐｍ程度添加して培養すれば良い。微生物の培養温度は１５〜３６℃程度、好ましくは３０℃前後で実施し、培養時間はイソフラボンが十分にリン酸化される時間であれば良く、通常１２〜２４０時間程度、好ましくは５０〜７０時間行えば良い。
【００２７】
本発明にしたがってイソフラボンをリン酸化するには、上記したようにイソフラボン含有培地で微生物を培養するほか、イソフラボンの存在下、微生物菌体、微生物菌体破砕物等とインキュベートすればよい。また、このような微生物で直接処理するほか、リン酸化酵素を用いて処理してもよい。
【００２８】
リン酸化酵素を得るには、該微生物の培養上清、又は微生物破砕液上清の硫安沈澱画分を回収し、緩衝液で脱塩し、必要あればクロマト処理等により更に精製すればよく、該微生物を起源とし、酵素製造の常法にしたがって、抽出、単離、精製すればよい。
【００２９】
また、リン酸化酵素としては、精製酵素のほか粗製酵素も使用可能であって、各種の該酵素含有物が適宜使用可能である。酵素含有物は、該酵素を含有しているものをすべて包含するものであって、次のものが非限定的に例示される：酵素精製に至る各工程における生成物（上清、硫安画分等）、菌体培養物、それから菌体を除去した培養物その他。また、酵素含有物は、その処理物、すなわち、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、希釈物等も広く含有するものである。
【００３０】
本発明は、イソフラボン含有物についても、上記と同様に処理することにより、イソフラボン含有物中のイソフラボンを酸化してリン酸化イソフラボン含有物を製造するだけでなく、イソフラボン含有物として大豆や大豆破砕物を用い、これに該微生物菌体又は胞子を直接接種して固体培養したり、あるいは液体培養したりして、リン酸化イソフラボン含有大豆加工食品を製造することができる。この場合のリン酸化処理の条件も上記と同様であって適宜処理すればよい。
【００３１】
本発明において、イソフラボン含有物としては、大豆又は大豆処理物等イソフラボンを含有するものがすべて包含され、大豆処理物としては、大豆を各種処理したものを指し、例えば、蒸煮大豆、大豆煮汁、大豆破砕物、大豆粉末、大豆加工製品（豆乳、納豆、味噌、醤油等）その他が挙げられる。なお、大豆加工製品の場合にあっては、その原料である大豆類をリン酸化処理し、得られたリン酸化イソフラボン含有大豆加工食品としたものを更にリン酸化することを妨げるものではなく、この場合にはリン酸化処理が再度あるいはそれ以上行われることになる。
【００３２】
本発明によれば、イソフラボン含有物として例えば蒸煮大豆を用い、これにバチルス属菌又はアスペルギルス属菌の胞子を接種して培養し、納豆又は麹を製造することができるが、この場合、大豆に含まれているイソフラボンが大豆中においてリン酸化することから、本発明によれば、リン酸化イソフラボン含有納豆又は同麹という新規な大豆加工食品を製造することができる。また、更に、この麹を用いるほかは常法にしたがって処理、操作することによって、リン酸化イソフラボンを含有した味噌、醤油その他発酵調味料といった新規な大豆加工食品を製造することもできる。
【００３３】
この場合、例えば蒸煮大豆、又は大豆破砕物に必要に応じて粉砕した小麦などを添加し蒸煮したものなどに、１０〜１０６個／ｇ、好ましくは１０２〜１０３個／ｇ程度のバチルス属微生物の胞子、又はアスペルギルス属微生物の胞子を接種し、１２〜２４０時間培養すればリン酸化イソフラボンを含有した納豆や発酵調味料などの大豆発酵食品が得られる。
【００３４】
また本発明は、バイオリアクターを用いて実施することも可能であって、その場合、固定化微生物菌体や該微生物菌体から抽出した酵素をイソフラボンに作用させリン酸化イソフラボンを得るための方法は、通常の固定化微生物菌体を用いた方法や酵素反応で用いられる方法であればいずれの方法でも良い。
【００３５】
例えば、培養菌体を用いる場合は、遠心分離等で集菌した菌体をアルギン酸ゲル等に１０〜１０１２個／ｍｌ、好ましくは１０３〜１０９個／ｍｌの濃度で固定化させた後、カラム等に充填し、イソフラボンを含んだ溶液、または豆乳などを通液させて変換反応を行うことができる。
【００３６】
イソフラボンはリン酸化反応をさせる前に、β−グリコシダーゼで予め処理するなどしてイソフラボンの配糖体部分を除去したアグリコンを使用すると効率良く変換を行うことができる。この場合のβ−グリコシダーゼは、例えば１００ｐｐｍの中性付近のイソフラボン溶液に１０００単位程度の割合で添加し、２５〜３５℃で３０〜６０分間作用させれば良い。
【００３７】
本発明において、固定化微生物菌体に代えて微生物から得られる酵素を固定化したものも用いることもできる。微生物から酵素を得るには、例えば微生物菌体をダイノミル等で破砕後、遠心上清の４０〜８０％の硫安沈殿画分を回収し、適当な緩衝液で脱塩する方法が利用できるし、培養上清の濃縮液や凍結乾燥物を使用できる。
【００３８】
培養液または変換反応液からリン酸化イソフラボンを採取するためには、溶媒抽出及びクロマト分画などの通常の方法を用いることができ、例えば以下の方法を用いて採取することができる。
【００３９】
すなわち、培養液または変換反応液を遠心分離して固形分、および微生物菌体を除去する。上清に６０〜９０％のエタノールを加えて攪拌した後、生成したタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去する。遠心上清をロータリーエバポレーターで蒸留した後、乾固物を少量の蒸留水に溶解してｐＨ３〜５に調製後、８０〜９０％のエタノールを加え一晩放置する。さらに遠心分離して得られた上清をロータリーエバポレーターで蒸留して得られた乾固物を回収し、リン酸化イソフラボンを得る事ができる。
【００４０】
そして所望するのであれば、クロマトグラフィー等既知の分離手段によって、リン酸化イソフラボンを各構成成分に分離して、それぞれの成分を単離することもできる。また、食品等に添加使用する場合のように各成分を単離する必要のない場合には、混合物のままとしてもよい。
【００４１】
このようにして製造されたリン酸化イソフラボンは水溶性が顕著に向上し、苦味、エグ味等の不快味が著しく軽減し、かつ体内への吸収性が向上するので、リン酸化イソフラボン単独で、またはリン酸化イソフラボン含有物を食品素材とさして経口的に摂食することによって、効果的に各種の健康機能を増強することが期待できる。
【００４２】
本発明は、イソフラボン及び／又はイソフラボン含有物をリン酸化し、得られたリン酸化物を含有する健康食品素材を新たに提供するものである。また、本発明に係る健康食品素材は、これ自体で、あるいは、他の成分と併用して、あるいは、更に加工及び／又は処理して、健康食品とすることができる。
【００４３】
他の成分としては、食品、食品素材、製剤用補助剤、アミノ酸類、ビタミン類、ミネラル類、各種栄養成分等が挙げられ、その形態、性状も固体状、ペースト状、液状のいずれでもよい。加工、処理法としては、加熱、破砕、粉末化、発酵、調味、調理等が挙げられる。
【００４４】
また本発明は、イソフラボン及び／又はイソフラボン含有物をリン酸化し、得られたリン酸化物を有効成分とするイソフラボン製剤に関するものである。本製剤は、体内での吸収率が大幅に向上するという特徴を有するため、イソフラボンが本来有している各種生理作用、効果（糖や脂質代謝の改善、動脈硬化予防、抗腫瘍活性、骨粗しょう症予防、抗酸化効果、フィトエストロゲン効果、免疫賦活作用その他）が生体内で更に高まり、健康機能効果が更に増大するという著効を奏するものである。
【００４５】
したがって、本製剤は、医薬品のほか、栄養剤、健康食品製剤、保健用製剤、サプリメント等飲食品タイプとしても使用することができる。製剤化は、常法にしたがって行えばよい。例えば、医薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤と共に混合し、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤等として用いても良い。但し固体散剤や錠剤では吸収に時間を要することがある場合には、有効成分自体の経口投与が望ましい。この場合には、適切な添加剤、例えば塩化ナトリウムのような塩類、ｐＨ調節剤、キレート剤と共に前述した溶液として投与しても良い。また、上記と同様に、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類、栄養成分等を更に配合してもよい。
【００４６】
摂取時期にも格別の制限はなく、任意の時期に摂取すればよく、例えばドリンク剤（清涼飲料、粉末飲料、等の飲食品タイプのほか、医療品としての飲料等を含む）として摂取すると好適である。
【００４７】
【実施例】
以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４８】
【実施例１】
（イソフラボンをリン酸化する微生物の検索）
微生物に適応した各種栄養培地５ｍｌにダイゼイン（和光純薬社製）０．５ｍｇを添加して２０ｍｌ容試験管に入れ、各種微生物を接種後１〜２週間培養した。培養液に８０％エタノールを３倍量添加し撹拌後、遠心分離して得られた上清を乾固し、さらに蒸留水に溶解した。
【００４９】
この溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過した後、高速液体クロマトグラフィーで成分分析を行った。高速液体クロマトグラフィーは、室温にてカラムＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０（資生堂社製；φ４．６×２５０ｍｍ）を使用した。流量１ｍｌ／分にて、１５％アセトニトリル／０．１％酢酸水溶液から３２％アセトニトリル／０．１％酢酸水溶液への直線濃度勾配により溶出させ、溶出液の吸光度（２５４ｎｍ）を測定した。
【００５０】
ダイゼインのリン酸化物の生成の有無は、７−リン酸化ダイゼインの溶出位置と対比させることにより同定した。このようにしてダイゼインのリン酸化能を有する微生物を検索した結果の一部を表１に示した。なお、リン酸化能については３段階（＋＋：リン酸化し変換効率高い、＋：リン酸化する、−：リン酸化しない）で評価した。
【００５１】
2004024139.tif 000003
【００５２】
以上の結果、種々の微生物の内、特にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の微生物にのみ、共通してイソフラボンの一種であるダイゼインのリン酸化能があることが初めて確認された。
【００５３】
【実施例２】
（リン酸化能を有する微生物の同定）
上記の結果からバチルス属及びアスペルギルス属の微生物がダイゼインのリン酸化能を有していることが確認されたが、その中でもさらに優れたリン酸化能を有するものを探索したところ、バチルス属で１株（ＩＳＦＫ０８１株）及びアスペルギルス属で１株（ＩＳＦＫ０２９株）の２株を取得することができた。
【００５４】
ＩＳＦＫ０８１株については、バージェイズマニュアル・オブ・システマテックバクテリオロジーＶｏｌ．２（１９８６年）に従って同定作業を進めた結果、表２に示した結果を得ることができた。その結果、本菌株はバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する微生物であると同定でき、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＳＦＫ０８１株と命名した。なお本菌株は、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所微生物寄託センター（現、同研究所　特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ　ＢＰ−７４３９として寄託されている。
【００５５】
（表２）
───────────────────────────────────
形態：　　　　　　　　　　　　　　　楕円形、１μｍ以下×２〜３μｍ
胞子形成：　　　　　　　　　　　　　＋
胞子の形：　　　　　　　　　　　　　楕円形
胞子の位置：　　　　　　　　　　　　亜端立
胞子のう：　　　　　　　　　　　　　非膨出
運動性：　　　　　　　　　　　　　　＋
酸素に対する態度：　　　　　　　　　好気性
５０℃での生育：　　　　　　　　　　＋
５５℃での生育：　　　　　　　　　　＋
５０℃処理による宿菌：　　　　　　　−
グラム染色：　　　　　　　　　　　　陽性
異染顆粒の有無：　　　　　　　　　　−
カタラーゼ：　　　　　　　　　　　　＋
硝酸塩還元：　　　　　　　　　　　　＋
ＶＰテスト：　　　　　　　　　　　　＋
クエン酸利用合成培地：　　　　　　　＋
クエン酸利用クリセテンセン培地：　　＋
澱粉分解性：　　　　　　　　　　　　＋
合成培地でのレシチナーゼ生産：　　　−
ＫＧ培地でのレシチナーゼ生産：　　　−
ＮＧＫＧ培地での生育：　　　　　　　−
最小培地での生育：　　　　　　　　　＋
ＧＳＰ５ファージによる溶菌：　　　　＋
グルコースからのガス生産：　　　　　＋
糖から酸の生産：
グルコース；　　　＋
蔗糖；　　　　　　＋
マンニット　　　　＋
イノシット；　　　＋
ガラクトース；　　＋
マンノース；　　　＋
キシロース；　　　＋
アラビノース；　　＋
乳糖；　　　　　　＋
───────────────────────────────────
【００５６】
また、ＩＳＦＫ０２９株についても、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｆｏｏｄ−Ｂｏｒｎ　Ｆｕｎｇｉ（１９８１年）に従い同定した結果、表３に示す結果が得られ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）に属する微生物であると同定でき、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）ＩＳＦＫ０２９株と命名した。なお、本菌株は、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所微生物寄託センター（現、同研究所　特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ　ＢＰ−７４４０として寄託されている。
【００５７】
（表３）
───────────────────────────────────
１）生育状況
ａ）ポテト・デキストロース寒天培地
生育：良好
分生子柄：気生菌糸と共に形成
分生子頭の形成：良好でオリーブ黄色、古くなると深黄緑色
集落裏面：白色
生育温度：３７℃でも生育
ｂ）麦芽エキス寒天培地
生育：良好
分生子の形成：良好
分生子頭の形成：良好
集落裏面：白色
生育温度：３７℃でも生育
２）形態
分生子：直径５〜８μｍの球形〜亜球形、表面滑面、分生子柄から乾いた連鎖状を形成
分生子頭：放射状、単列と複列が混在
分生子柄：長さ４〜５ｍｍ、無色
頂のう：直径４７〜５４μｍ、亜球形
３）最適生育条件
ｐＨ６〜７
温度：２５〜３７℃
───────────────────────────────────
【００５８】
【実施例３】
（リン酸化ダイゼインの調製）
バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＳＫ０８１株をブイヨン液体培地５ｍｌを入れた２０ｍｌ容試験管に植菌し、３７℃にて１２時間前培養した。
【００５９】
この前培養液５ｍｌを、１０００ｐｐｍのダイゼイン（和光純薬社製）を含む１００ｍｌブイヨン液体培地入りの３００ｍｌ容マイヤーに植菌し３０℃、３６時間培養した。培養液を遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分間）して得られた上清に、２００ｍｌの９９．５％エタノールを添加して発生した沈殿を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間）により除去した。上清の一部を分取し、実施例１と同様の高速液体クロマトグラフィーにより分析した。分析結果を図１に示す。
【００６０】
この高速クロマトグラフィーでの分析結果から、原料であるダイゼイン以外に、数種類のリン酸化ダイゼインのピークが確認された。これらのピークの内、最も量的に多かったピーク１の部分を分取し、さらにマススペクトル（Ｆａｂ　ｍａｓ）分析と各種ＮＭＲ分析を行って表４に示すデータを得た。
【００６１】
（表４）
（マススペクトル分析及びＮＭＲ分析のデータ）
───────────────────────────────────
Ｆａｂ　ｍａｓ（ｍ／ｚ）（３３３．０１８５−Ｈ）
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，δ）（ｐｐｍ）、
６．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−３’）、
７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−６）、
７．３４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−２’，６’）、
７．３７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−５）、
７．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−５）、
８．２９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−２）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，δ）（ｐｐｍ）：
１０７．１（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，Ｃ−８）、
１１５．１（Ｃ−３’，５’）、１１８．３（Ｃ−４ａ）、
１１８．６（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｃ−６）、
１２２．５（Ｃ−１’）、１２３．７（Ｃ−３）、
１２６．３（Ｃ−５）、１３０．１（Ｃ−２’，６’）、
１５３．３（Ｃ−２）、１５６．８（Ｃ−４’）、
１５７．４（Ｃ−８ａ）、
１５９．１（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，Ｃ−７）、
１７５．０（Ｃ−４）
３１Ｐ−ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，δ）（ｐｐｍ）
１１．０５（ｓ）
───────────────────────────────────
【００６２】
以上の結果から、上記の化合物はＲ１がリン酸基となった７−リン酸化ダイゼインすなわち３−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−７−（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｏｘｙ）−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅであると同定された。
【００６３】
【実施例４】
（リン酸化ゲニステインの調製）
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）ＩＳＦＫ０２９株を大豆胚軸を２０％含むフスマにて２５℃で１４日間培養した。培養終了後、培養物１００ｇ当たり２００ｍｌの蒸留水を加え、４℃にて３０分間撹拌した。
【００６４】
これを遠心分離し、上清を凍結乾燥して酵素粉末を得た。この粉末１ｇとβ−グルコシダーゼ（シグマ杜製）１００ｕｎｉｔｓを１００ｍｌの豆乳に添加して撹拌しながら４０℃にて１時間保温したところ、リン酸化ダイゼインおよびリン酸化ゲニステインが確認された。
【００６５】
なお、ここで確認されたリン酸化ゲニステインは、表５に示したマススペクトル分析及び各種ＮＭＲ分析の結果から、Ｒ１がリン酸基となった７−リン酸化ゲニステインすなわち５−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−７−（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｏｘｙ）−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅであることが確認された。
【００６６】
（表５）
（マススペクトル分析及びＮＭＲ分析のデータ）
───────────────────────────────────
Ｆａｂ　ｍａｓ（ｍ／ｚ）（３４９．０１３２−Ｈ）
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，δ）（ｐｐｍ）
６．５７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−８）、
６．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−３’，−５’）、
６．８５（１Ｈ，ｓ，Ｈ−６）、
７．３３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−２’，−６’）、
８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−２）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，δ）（ｐｐｍ）
９８．０（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｃ−８）、
１０３．０（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｃ−６）、
１０５．７（Ｃ−４ａ）、１１５．２（Ｃ−３’，−５’）、
１２１．３（Ｃ−１’），１２２．４（Ｃ−３）、
１３０．２（Ｃ−２’，−６’）、
１５４．４（Ｃ−２）、１５６．９（Ｃ−８）、
１５７．６（Ｃ−４’）、１６１．１（Ｃ−５）、
１６１．３（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，Ｃ−７）、
１８０．６（Ｃ−４）
３１Ｐ−ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，δ）（ｐｐｍ）：
１１．２７（ｓ）
───────────────────────────────────
【００６７】
【実施例５】
（水溶性の比較）
実施例３に記載したと同様の操作で得られたリン酸化ダイゼイン、およびダイジン（和光純薬社製）、ダイゼイン（和光純薬社製）５００ｍｇに１０００μｌの蒸留水を加え、２５℃にて１夜撹拌した。その後各溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、濾液を希釈して高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより溶解濃度を求めた。なお、溶解濃度は予め作成しておいたピーク面積と濃度との検量線を基に算出した。結果を表６に示す。
【００６８】
（表６）
─────────────────────────────────
試　料　　　　　　　濃度（ｍｇ／ｌ）　　　　　ダイゼイン対比
─────────────────────────────────
ダイジン　　　　　　　　１９．８６　　　　　　　　２２．３
ダイゼイン　　　　　　　　０．８９　　　　　　　　　１
リン酸化ダイゼイン　　１０６．２９×１０３　　　　１．１２×１０５
─────────────────────────────────
【００６９】
以上の結果、ダイゼインやダイジンと比較して、リン酸化ダイゼインはそれぞれ数万倍から数１０万倍と著しく水溶性が高まることが示された。
【００７０】
【実施例６】
（抗酸化性の比較）
実施例３に記載したと同様の操作を行い、リン酸化ダイゼインを得た。イソフラボンは抗酸化能を持っており、その抗酸化能が生理機能にも反映していると考えられるためリン酸化ダイゼインの抗酸化力価を測定した。ジエチルチオバルビタール酸法（Ｊ．　Ｆｏｏｄ．　Ｓｃｉ．，　６２（３），　５２６−５２８，　１９９７）によりリノール酸の自動酸化に対する抗酸化効果を測定する方法で実施した。即ち１ｍｇ／ｍｌのリノール酸溶液中にダイゼイン、リン酸化ダイゼインを各５０μＭ及び５００μＭ濃度になるように添加し、８０℃で１時間自動酸化反応をさせた後、酸化反応物量を蛍光測定して求めた。その結果を表７に示した。
【００７１】
2004024139.tif 000004
【００７２】
表７の結果から、リン酸化ダイゼインを添加した場合は、ダイゼインを添加した場合とほぼ同等レベルの酸化物量しか生成せず、抗酸化力価はリン酸化によって低下しないことが確認された。
【００７３】
【実施例７】
（不快味の改善効果）
実施例３に記載したと同様の操作を行いリン酸化ダイゼインを、また実施例４記載したと同様の方法でリン酸化ゲニステインを得た。得られたこれらのリン酸化イソフラボン誘導体の苦味、エグ味をパネラー１０名にて官能評価した。
【００７４】
すなわち、ダイゼイン、ゲニステイン、リン酸化ダイゼイン、リン酸化ゲニステイン各々について４０ｍｇを１００ｍｌの炭酸カルシウム溶液（ｐＨ１０）に溶解して調製し、該水溶液を口に含んで苦味、エグ味を５段階（５：非常に強く感じられる、４：強く感じられる、３：感じられる、２：わずかに感じられる、１：全く感じられない）で官能評価した。評価結果は５段階評価の平均値で示し、表８にまとめた。
【００７５】
（表８）
───────────────────────
イソフラボンの種類　　　　官能評価（平均点）
───────────────────────
ダイゼイン　　　　　　　　　４．５
ゲニステイン　　　　　　　　４．２
リン酸化ダイゼイン　　　　　１．４
リン酸化ゲニステイン　　　　１．３
───────────────────────
【００７６】
以上の結果、リン酸化イソフラボン誘導体は著しく苦味、エグ味が軽減することが確認された。
【００７７】
【実施例８】
（リン酸化イソフラボンの吸収に関する実験）
９週齢のウィスター系雄性ラットに１週間フラボノイドの含まれていない餌を食べさせた後、ダイゼイン、リン酸化ダイゼイン、ダイジン及びゲニステイン、リン酸化ゲニステイン、ゲニスチンの各イソフラボンを、１匹あたり５μｍｏｌずつ、胃ゾンデにて経口投与する。
【００７８】
投与溶液は被投与物を１０ｍＭの濃度となるように２５ｍＭＮａ２ＣＯ３溶液（ｐＨ１０．６）に溶解したものである。投与前と投与後１０分、３０分、６０分、１２０分後に、それぞれ尾部静脈より採血した。
【００７９】
各イソフラボンの血中濃度は、血清をスルファターゼ処理した後、ＨＰＬＣにて測定し、アグリコン換算で算出した。スルファターゼ処理の方法は、血清６０μｌに５００Ｕ／ｍｌ濃度になるようにスルファターゼ（シグマ社製タイプＨ５）を加え、３７℃にて１時間インキュベート後、１０８０μｌのエタノールを加えて反応を停止した。その後、３０秒間振とうし、さらに３０秒間超音波処理した後、５分間１２０００ｒｐｍにて遠心分離した。
【００８０】
その後、上清を回収し、遠心エバポレー夕ーにて濃縮乾固した後、１２０μｌの９０％メタノールにて溶解し、その内の５０μｌをＨＰＬＣ分析に用いた。
【００８１】
ＨＰＬＣでの測定法は、室温にてカラムＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８　ＵＧ１２０（資生堂社製；φ４．６×２５０ｍｍ）を使用した。流量１ｍｌ／分にて、１５％アセトニトリル／０．１％酢酸水溶液から３２％アセトニトリル／０．１％酢酸水溶液への直線濃度勾配により溶出させ、溶出液の吸光度（２５４ｎｍ）を測定した。
【００８２】
その測定結果の内、ダイゼイン、リン酸化ダイゼイン、ダイジンを投与した場合の結果を図２に、またゲニステイン、リン酸化ゲニステイン、デニスチンを投与した場合の結果を図３に示し、また各結果の吸収量比（投与後２時間までの積算吸収量で比較し、ダイゼインまたはゲニステインをそれぞれの実験での１００とした）を表９及び表１０にまとめた。
【００８３】
2004024139.tif 000005
【００８４】
2004024139.tif 000006
【００８５】
以上の結果、ダイゼイン、リン酸化ダイゼイン及びダイジンを投与した場合は、図２の結果から、投与１０分後での血中濃度はリン酸化ダイゼインを与えた場合の方がダイゼインを与えた場合の１．６倍、またダイジンを与えた場合の１０．１倍であった。また投与３０分後では、リン酸化ダイゼインを与えた場合はダイゼインを与えた場合の１．７倍、またダイジンを与えた場合の５．１倍であった。さらに投与６０分後では、リン酸化ダイゼインを与えた場合はダイゼインを与えた場合の１．５倍、またダイジンを与えた場合の４．６倍の濃度であり、いずれの時間においても、リン酸化ダイゼインを与えた場合の方が血中濃度が高かった。
【００８６】
また、ゲニステイン、リン酸化ゲニステイン及びゲニスチンを投与した場合は、図３の結果から、投与１０分後での血中濃度はリン酸化ゲニステインを与えた場合はゲニステインを与えた場合の２．５倍、またゲニスチンを与えた場合の２４．２倍であった。また投与３０分後では、リン酸化ゲニステインを与えた場合はゲニステインを与えた場合の１．９倍、またゲニステインを与えた場合の１０．５倍であった。さらに投与６０分後では、リン酸化ゲニステインを与えた場合はゲニステインを与えた場合の１．３倍、またゲニスチンを与えた場合の４．４倍の濃度であり、いずれの時間においても、リン酸化ゲニステインを与えた場合の方が血中濃度が高かった。
【００８７】
また、投与後２時間までの積算吸収量を比較した表９及び表１０の結果でも、リン酸化物（リン酸ダイゼイン、リン酸化ゲニステイン）を与えた方が、アグリコン（ダイゼイン、ゲニステイン）を与えた場合に比べて１．５〜１．６倍、配糖体（ダイジン、ゲニスチン）を与えた場合に比べて４．６〜５．２倍、吸収量が高かった。
【００８８】
以上の結果から、イソフラボンの吸収は、リン酸化物として与えた方が促進されることが判明した。イソフラボンの機能として、骨粗しょう症予防、高脂血症予防、高血圧予防、抗癌作用、放射線障害抑制などが報告されているが、リン酸化物を摂取することで吸収量を上げることにより、これらの効果をより高めることが期待できる。
【００８９】
【発明の効果】
本発明によれは、微生物、特にバチルス属またはアスペルギルス属の微生物を用い、安全かつ効率的に、イソフラボンのリン酸基を付与することができ、その結果、イソフラボンに特有の不快味を殆ど解消することができると同時に水溶性を著しく高めることができる。さらに、大豆抽出物やイソフラボンの食品、飲料、栄養補助食品などとしての利用を広げることができる。
【００９０】
また、オカラなどの大豆の残渣の中からイソフラボンを抽出分離する際にも、劇物や安全性が懸念される有機溶媒を使用することなく、水溶液に遊離させてリン酸化イソフラボンを獲得することができる。
【００９１】
リン酸化イソフラボンには吸収性の向上などの改善や新たな健康機能が期待されるため、健康食品素材として、また大豆加工食品や大豆発酵食品への新しい利用の可能性を開くことが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】高速液体クロマトグラフィーのチャートを示す。
【図２】ダイゼイン、リン酸化ダイゼイン、ダイジンの血中濃度を示す。
【図３】ゲニステイン、リン酸化ゲニステイン、ゲニスチンの血中濃度を示す。
【図１】
2004024139.tif 000009
【図２】
2004024139.tif 000010
【図３】
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