(57)【要約】【課題】本発明の課題は、新たな肺高血圧症の予防・治療剤を提供することである。【解決手段】肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）は抗線維化作用、抗アポトーシス作用、血管新生作用などの臓器保護作用を発揮しうる。かかる作用を発揮しうるＨＧＦを有効成分として含有する肺高血圧症予防・治療剤による。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子を有効成分として含有してなる肺高血圧症予防・治療剤。
【請求項２】
肺高血圧症が原発性肺高血圧症である請求項１に記載の肺高血圧症予防・治療剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の肺高血圧症予防・治療剤を使用することによる肺高血圧症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な肺高血圧予防・治療剤などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
肺高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ：ＰＨ）は、肺血管抵抗および肺動脈圧が上昇した状態であり、これは換気−潅流関係を妨害する。ＰＨは典型的には、肺循環内の上昇した血圧（収縮期３０ｍｍＨｇ以上および拡張期１２ｍｍＨｇ以上）を特徴としている。肺高血圧には二つのサブセット：原発性（特発性または「解明されていない」）および二次性がある。二次性形態が遙かに広く行きわたっている二次性肺高血圧の最も一般的な原因は心疾患および肺疾患である。肺高血圧の根本的原因とは無関係に、肺の抵抗性（前毛細）血管は、肺高血圧の進行に寄与する解剖学的変化を受ける。後天性心疾患に二次的な肺動脈高血圧は左心室の障害で始まり、この障害が肺胞高血圧に続いて肺動脈高血圧を引き起こす。
【０００３】
原発性肺高血圧症（ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）は予後不良の疾患であり、現在、心肺移植が唯一の効果的な治療方法である。しかし、心肺移植療法はドナーが少なく現実的な治療方法としてはかなり問題がある。
【０００４】
原発性肺高血圧症では、その初期に肺小動脈の炎症（単球／マクロファージを主体として炎症反応）が生じ、ついで中膜肥厚による肺血管抵抗の増加、右心室肥大などが起る事が知られている。ＭＣＰ−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１：マクロファージ走化性因子）はＣ−Ｃケモカインファミリーに属し、動脈硬化症（アテローム性動脈硬化症など）の病変部に多く発現していることが知られている（Ｔａｋｅｙａ，  Ｍ．  ｅｔ．ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２４：５３４−５３９  （１９９３）；Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，  Ｓ．  ｅｔ．ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：５２５２−５２５７  （１９９１））。上記ＭＣＰ−１の作用を抑制する作用を有するＭＣＰ−１の拮抗阻害型ムテイン等を原発性肺高血圧症の予防・治療剤が開示されている（特許文献１）。
しかしながら、さらに新たな原発性肺高血圧症の予防・治療薬の開発が望まれている。
【０００５】
肝実質細胞増殖因子（以下「ＨＧＦ」という。）は、成熟肝細胞に対する強力な増殖促進因子として発見され、その遺伝子クローニングがなされた（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  Ｖｏｌ．１６３，  ｐ９６７  （１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．３４２，  ｐ４４０  （１９８９））。
その後の研究により、ＨＧＦは生体内で腎、肺、胃、十二指腸、皮膚などの創傷治癒にも関係していることが明らかとなり、またＨＧＦの受容体に関しては、ｃ−Ｍｅｔ原腫瘍遺伝子がＨＧＦ受容体をコードしていることが明らかにされている（非特許文献１、２）。
現在ではＨＧＦは、当該受容体を介することにより、多くの組織修復、器官再生に働く因子であると考えられている（非特許文献３、４）。
ＨＧＦを有効成分として含有する、ｂａｘの低下及び／又はｂｃｌ−２の増加誘導剤、あるいはアポトーシスの進行抑制剤が開示されている（特許文献２）。さらに、ＨＧＦを有効成分する心筋梗塞又は狭心症の治療剤も開示されている（特許文献３）。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−４７２０３号公報
【特許文献２】
特開平１１−２４６４３４号公報
【特許文献３】
特開平１１−２４６４３３号公報
【非特許文献１】
Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．２５１，ｐ８０２−８０４（１９９１）
【非特許文献２】
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  Ｖｏｌ．６，ｐ５０１−５０４  （１９９１）
【非特許文献３】
実験医学  Ｖｏｌ．１０，ｐ１４４−１５３  （１９９２）
【非特許文献４】
動脈硬化  Ｖｏｌ．２３，ｐ６８３−６８８  （１９９６）
【０００７】
【解決すべき課題】
本発明の課題は、新たな肺高血圧症の予防・治療剤を提供することである。具体的には、ＨＧＦを有効成分として含有する肺高血圧症の予防・治療剤を提供することである。
【０００８】
【課題を解決する手段】
本発明者らはＨＧＦは抗線維化作用、抗アポトーシス作用、血管新生作用などの臓器保護作用を発揮しうることに着目し、鋭意研究を重ねた結果、ＨＧＦの投与が肺高血圧に有効であることを見出した。
【０００９】
つまり、本発明は、
１．肝細胞増殖因子を有効成分として含有してなる肺高血圧症予防・治療剤、
２．肺高血圧症が原発性肺高血圧症である前項１に記載の肺高血圧症予防・治療剤、
３．前項１又は２に記載の肺高血圧症予防・治療剤を使用することによる肺高血圧症の治療方法、からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の予防・治療剤に含有されるＨＧＦは公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを使用することができる。
ＨＧＦの製造法としては、例えば、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ＨＧＦを得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換ＨＧＦを得ることができる（例えば  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｖｏｌ．１７５，  ｐ６６０  （１９９１）など参照）。
上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられる各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞又は動物細胞などを用いることができる。
【００１１】
組み換えベクターを導入した導入体は、それぞれに適した培地により培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および耐性スクリーニングに用いられる薬剤などが含有される。具体的には、形質転換体の宿主が大腸菌の場合には、例えばＬＢ培地（ナカライテスク社製）等、酵母の場合には、ＹＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  １，  １１７，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９７９））等、宿主が昆虫細胞および動物細胞の場合は、２０％以下のウシ胎仔血清を含有するＨａｍ−１２培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）等を挙げることができる。また、培養温度、ＣＯ２濃度、培養時間は、宿主及び組み換えベクター等によって適宜選択することができる。さらに、必要に応じて通気、攪拌が行われる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも導入宿主が生育し、挿入されたＨＧＦポリヌクレオチドがコードする蛋白質が生成されればいかなるものであってもよい。
【００１２】
このようにして培養された導入体の回収方法は、例えば宿主が細胞である場合には、培養物を遠心分離等により細胞を分離した後、細胞体あるいは培養上清として回収する方法等が用いられる。回収された細胞体からの組み換え蛋白質の抽出方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が挙げられる。
【００１３】
ＨＧＦは、公知の無細胞蛋白質合成系等によっても調製することができる。無細胞蛋白質合成系に用いられる細胞抽出液として具体的には、大腸菌等の微生物、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等、既知のものが用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は、Ｐｒａｔｔ，  Ｊ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，  Ｈａｍｅｓ，  １７９−２０９，  Ｂ．  Ｄ．  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｔ．  Ａｌ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。
【００１４】
このようにして得られたＨＧＦは、天然型ＨＧＦと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。
【００１５】
本発明の予防・治療剤は、前記ＨＧＦを単独で、あるいは適当な製剤用添加物と共に製剤形態の医薬組成物として調製し、投与することができる。このような医薬組成物の投与形態としては、一般的に非経口的投与に使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、注射用アンプル剤や注射用凍結乾燥粉末剤等を用いることができる。各種製剤形態への調製は、当業者が利用可能な周知の製剤添加物、例えば、希釈剤や添加剤などを用いて慣用の手法に従って行うことができる。
【００１６】
例えば、注射用凍結乾燥粉末剤は、精製された前記ＨＧＦの有効量を注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の希釈液に溶解し、必要に応じてカルボキシメチルセファロース、アルギン酸ナトリウム等の賦形剤、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、アミノ酸、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノール等の保存剤、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカイン等の無痛化剤、塩酸、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウム等のｐＨ調節剤等を加え、常法により製造することができる。また、注射用アンプル剤は、前記ＨＧＦの有効量を注射用蒸留水、生理食塩水、リンゲル液などの希釈剤に溶解し、必要に応じてサリチル酸ナトリウム、マニトール等の溶解補助剤、クエン酸ナトリウム、グリセリン等の緩衝剤、ブドウ糖、添加糖等の等張化剤、前述の安定化剤、保存剤、無痛化剤、ｐＨ調節剤等の添加剤を加えた後、通常の加熱滅菌、無菌ろ過等により無菌化して調製することができる。なお、有効成分の種類によっては加熱滅菌工程で失活する場合があるので、滅菌方法は適宜選択すべきである。
【００１７】
本発明の医薬には、本発明のＨＧＦと同様な薬理作用あるいは他の薬理作用を有する他の薬剤の有効成分を配合してもよい。また、本発明の医薬の有効成分であるＨＧＦの肝細胞増殖作用を増強することが知られているヘパリン、デキストラン硫酸等の硫酸化他糖類もしくはその誘導体（特開平５−３０１８２４号公報）等の有効成分を配合しても良い。
【００１８】
本発明の肺高血圧症予防・治療剤は、医薬上許容される担体等を用いて、錠剤、顆粒、カプセル剤、散剤等の固型状、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、レモナーデ剤等の液状の態様で、経口投与、非経口投与、吸入投与あるいは外用に適した剤型に製剤化し、医薬製剤として用いることもできる。必要ならば、上記製剤に補助剤、安定化剤、湿潤剤、その他の常用添加剤、例えば乳糖、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、白土、庶糖、トウモロコシ澱粉、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、カカオ油、エチレングリコール等を配合してもよい。
【００１９】
上記製剤の用量は、投与ルート、病気の種類、患者の症状、体重あるいは年齢等によって異なり、また適用しようとする薬物の種類などによっても変動するが、一般には、１日当たり  １  ｍｇ〜２００  ｍｇ程度またはそれ以上の量を患者１人当たりに投与することができる。有効成分として含有されるＨＧＦの平均１回量を、５  ｍｇ〜  １００  ｍｇ程度として、肺高血圧症の予防・治療に用いればよい。
【００２０】
さらに本発明のＨＧＦは、肺高血圧症を予防及び／又は治療するための遺伝子治療薬として使用することができる。例えば、本発明のＨＧＦをリポフェクション試薬に封入し、これを生体に投与することにより、血中のＨＧＦを肺高血圧症の予防及び／又は治療に必要な濃度に維持することができる。本発明のＨＧＦの投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性などによるが、予防及び／又は治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
【００２１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２２】
（実施例１）ラット肺高血圧モデルにおけるＨＧＦ投与の効果
（肺高血圧モデルの作製）
生後６週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（１８０〜２００ｇ）を用いた。
該ラットをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与にて麻酔した後、腹部正中切開にて腹腔内に達し、腸管を保護した後、後腹膜を鈍的に剥離し左腎静脈の末梢側で腹部大動脈−下大動脈シャントを作製した。シャントは、露出した大動脈の頭側と尾側で血流を遮断した後、動脈側より静脈側に向けて１８Ｇの注射針を貫通させることにより作製した。１週間後モノクロタリン（ｍｏｎｏｃｒｏｔａｌｉｎｅ：以下「ＭＣＴ」という。）を６０ｍｇ／ｋｇ皮下投与することにより肺高血圧モデルを作製した。
【００２３】
ＭＣＴは、Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ  ｓｐｅｓｔａｂｉｌｉｓという植物の種子から抽出された毒性のあるｐｙｒｒｏｌｉｚｉｄｉｎｅ  ａｌｋａｌｏｉｄであり、肝のチトクロームＰ−４５０によって代謝された後のｍｏｎｏｃｒｏｔａｌｉｎｅ  ｐｙｒｒｏｌｅが肺血管に対する炎症を惹起する。１回皮下投与により、肺動脈炎に引き続き肺高血圧症、右室肥大が引き起こされる。ＭＣＴ投与のみで、肺高血圧モデルを作製することができるが、予めシャントを作製して血行力学的変化を付加することにより、さらに適切な病態モデルを作製可能である。すなわち、病理学的に血管内膜病変（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｌｅｓｉｏｎ）や叢状病変（ｐｌｅｘｉｆｏｒｍ  ｌｅｓｉｏｎ）も認められるようになり、より原発性肺高血圧症（ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）モデルに近づく。実際、新生動脈内病変の形成にはＭＣＴによる傷害に加えて血行力学的な変化が重要であることが報告されている。
【００２４】
（ＨＧＦの投与）
ＭＣＴ投与１週間後より、組換ヒトＨＧＦ（三菱ウェルファーマ（株）製）を１２５μｇ／ｋｇを連続２週間、尾静脈より投与した群をＨ群（ｎ＝４）、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を投与した群をＨ群（ｎ＝４）とする。
【００２５】
（効果の確認）
ＨＧＦ投与開始から３週間後にラットを犠牲死させ、心臓と肺を摘出し、右室自由壁及び左室＋中隔に分け重量を測定し、右室心筋重量対左質＋中隔重量比（右室／左室＋中隔：ＲＶ／ＬＶ＋ＩＶＳ）、右室壁厚（ＲＶ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を求めた。さらに、左肺組織のパラフィン包埋切片にてＨ．Ｅ．染色及び弾性線維染色（ＥＶＧ染色）を行い組織学的検討を行った。
ＭＣＴ投与群は、非投与群と比較して体重は増加せず、逆に体重減少を認めた。また、正常ラットの収縮期肺動脈圧は平均で２５．７５ｍｍＨｇであるのに対し、Ｃ群の収縮期肺動脈圧は平均で６４ｍｍＨｇであった。
【００２６】
（結果）
右室重量対左室＋中隔重量比と右室壁厚においてＨ群ではＣ群と比較し、有意に減少した。
１）右室心筋重量対左質＋中隔重量比（ＲＶ／ＬＶ＋ＩＶＳ）
Ｈ：  ０．５８９±０．０４０，  Ｃ：  ０．６６１±０．０３３；  ｐ＜０．０５，
２）右室壁厚（ＰＲ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）
Ｈ：  ０．１３３±０．０１１，  Ｃ：  ０．１４８±０．００２ｍｍ；  ｐ＜０．０５
【００２７】
ラット肺高血圧モデルにおいて、ＨＧＦは右室重量対左室＋中隔重量比、右室壁の肥厚及び肺動脈中膜の肥厚を改善させ、肺高血圧症の予防及び治療における有用性が示唆された。
【００２８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の肝細胞増殖因子を有効成分として含有してなる肺高血圧症予防・治療剤の投与は、肺高血圧症の予防及び治療に有用である。