(57)【要約】【課題】ハイブリダイゼーションその他の物質間の相互作用を定量性よく検出する。【解決手段】セル検出部２において、カンチレバー１３の端面１３ａは予め表面処理が施されており、検出用ヌクレオチド鎖Ｄを固定化可能とされている。反応領域１０には正電極１１及び負電極１２によって電界が生じており、ノズル３から滴下された標的ヌクレオチド鎖Ｔは、伸長したまま端面１３ａの方向に移動する。検出用ヌクレオチド鎖Ｄと標的ヌクレオチド鎖Ｔとがハイブリダイゼーションするとカンチレバー１３の質量が増加するため、固有振動数が低下する。そこで、カンチレバー１３に交流電圧を印加して固有振動数変化を測定することで、ハイブリダイゼーションの有無を検出すると共に、ハイブリダイゼーションした標的ヌクレオチド鎖Ｔの本数等を定量的に検出する。【選択図】　図２
2004125706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域と、上記カンチレバーを振動励起する駆動源と、上記カンチレバーの振動振幅を検出する振動検出手段とを少なくとも備える検出部において物質間の相互反応作用を検出する相互反応作用検出方法であって、
上記相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数の変化を測定することで、上記相互反応作用を検出する検出工程を有すること
を特徴とする相互反応作用検出方法。
【請求項２】
上記カンチレバーは、対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有しており、
上記駆動源は、上記対向電極間に交流電圧を印加することにより上記カンチレバーを振動励起すること
を特徴とする請求項１記載の相互反応作用検出方法。
【請求項３】
上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖であり、上記相互反応作用がハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載の相互反応作用検出方法。
【請求項４】
上記反応領域に電場を形成し、該反応領域内の検出用ヌクレオチドと標的ヌクレオチドとを伸長させた状態で相対的に移動させ、ハイブリダイゼーションを行わせる電場形成工程を有することを特徴とする請求項３記載の相互反応作用検出方法。
【請求項５】
検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域と、上記カンチレバーを振動励起する駆動源と、上記カンチレバーの振動振幅を検出する振動検出手段とを少なくとも有する検出部を備えたことを特徴とするバイオアッセイ装置。
【請求項６】
上記カンチレバーは、対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有しており、
上記駆動源は、上記対向電極間に交流電圧を印加することにより上記カンチレバーを振動励起すること
を特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ装置。
【請求項７】
上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖であり、上記相互反応作用がハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ装置。
【請求項８】
上記検出部は、上記反応領域に電場を形成し、該反応領域内の検出用ヌクレオチドと標的ヌクレオチドとを伸長させた状態で相対的に移動させ、ハイブリダイゼーションを行わせる電場形成手段をさらに有することを特徴とする請求項７記載のバイオアッセイ装置。
【請求項９】
検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域とを少なくとも備える検出部が設けられたことを特徴とするバイオアッセイ用基板。
【請求項１０】
上記検出部は、上記カンチレバーが一壁面から突出して設けられたセル検出部であって、当該セル検出部が基板上に複数配設されたことを特徴とする請求項９記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１１】
円盤状基板として形成され、
上記セル検出部は、上記円盤状基板上に上方視放射状を呈するように配設されたこと
を特徴とする請求項１０記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１２】
上記セル検出部単位又はグルーピングされた複数のセル検出部単位に、異なる検出用物質が固定化されたことを特徴とする請求項１０記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１３】
円盤状基板として形成され、
上記反応領域は、基板上に放射状に延設された条溝内に設けられ、上記条溝の片側から上記カンチレバーが突出して設けられたこと
を特徴とする請求項９記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１４】
上記条溝単位又はグルーピングされた複数の条溝単位に、異なる検出用物質が固定化されたことを特徴とする請求項１３記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１５】
上記反応領域に対して、室温と反応至適温度との間で、ゲル、ゾルの可逆相変化が起こり得る物質を充填したことを特徴とする請求項９記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１６】
上記相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数の変化を測定することで上記相互反応作用が検出されることを特徴とする請求項９記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１７】
上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖であり、上記相互反応作用がハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項９記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１８】
上記検出部は、上記反応領域に電場を形成し、該反応領域内の検出用ヌクレオチドと標的ヌクレオチドとを伸長させた状態で相対的に移動させ、ハイブリダイゼーションを行わせる電場形成手段をさらに有することを特徴とする請求項１７記載のバイオアッセイ用基板。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において特に有用な相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置、並びにバイオアッセイ用基板に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップと総称する。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の突然変異、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範に活用され始めている。
【０００３】
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多数のＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖や、ｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
ＤＮＡチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に固相化されたＤＮＡプローブに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ）を逆転写ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅し、上記基板上においてハイブリダイゼーションを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うというものである。
【０００５】
ここで、ＤＮＡチップは、２つのタイプに分類できる。第１のタイプは、半導体露光技術を応用したフォトリソグラフィーの技術を用いて、所定の基板上に直接オリゴヌクレオチドを合成していくものであり、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社によるものが代表的である。この第１のタイプのＤＮＡチップについては、例えば下記の特許文献１に記載されている。
【０００６】
一方、第２のタイプは、「スタンフォード方式」とも称されるもので、先割れピンを用いて、予め用意されたＤＮＡを基板上に分注・固相化していくことによって作製されるものである。この第２のタイプのＤＮＡチップは、集積度は第１のタイプのＤＮＡチップに比べて低いものの、１ｋｂ程度のＤＮＡ断片を固相化できるという利点がある。この第２のタイプのＤＮＡチップについては、例えば下記の特許文献２に記載されている。
【０００７】
また、下記の特許文献３には、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ　Ｅｌｅｃｔｒｏ　Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ：マイクロマシン）を用いて作製されたカンチレバー（片持ち梁）を利用する、上述した従来のＤＮＡチップ技術とは異なる技術的思想に基づくカンチレバーセンサー技術が提案されている。
【０００８】
この特許文献３に記載されたカンチレバーセンサーによる解析手法の一例を簡潔に説明すると、上面にＤＮＡプローブが固相化されたカンチレバーにレーザー光を照射し、ハイブリダイゼーション反応の結果カンチレバーが撓むことにより所定位置の受光部における反射光の強度が変化するのを測定することで、ハイブリダイゼーション反応の有無を検出するというものである。
【０００９】
【特許文献１】
特表平４−５０５７６３号公報
【特許文献２】
特表平１０−５０３８４１号公報
【特許文献３】
国際公開第０１／３３２２６号パンフレット
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述した従来のＤＮＡチップ技術では、２次元である基板の狭小な検出部において、ＤＮＡプローブ等の検出用ヌクレオチド鎖やタンパク質等を固相化（固定化）し、ハイブリダイゼーション反応や抗原抗体反応等の物質間の相互反応を進行させるという技術であることから、空間的に反応生成物の自由度が制限され、また、反応の際に立体障害が発生する可能性があった。このため、従来のＤＮＡチップ技術等では、相互反応の効率が悪く、反応時間が長いという問題があった。
【００１１】
また、従来のＤＮＡチップ技術では、試料溶液は、基板上の所定のスポット部位（検出部）に滴下されるのみであって、試料溶液に含まれている標的物質とスポット部位に固定された状態の検出物質との相対的な位置決めを行うための工夫は、何ら講じられていなかった。
【００１２】
一方、上述したカンチレバーセンサー技術では、試料溶液に含まれている標的物質を予め蛍光標識する必要がないという利点がある一方で、カンチレバーを高集積化した場合に、カンチレバー表面にレーザー光を照射し、その反射光を受光する機械的な制御が困難になるという問題があった。
【００１３】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、標的物質に対する蛍光標識等を行うことなく、ハイブリダイゼーションその他の物質間の相互作用を定量性よく検出する相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置、並びにバイオアッセイ用基板を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するために、本発明に係る相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置は、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域と、上記カンチレバーを振動励起する駆動源と、上記カンチレバーの振動振幅を検出する振動検出手段とを少なくとも備える検出部において物質間の相互反応作用を検出するものであり、上記相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数の変化を測定することで、上記相互反応作用を検出する。
【００１５】
ここで、上記カンチレバーは、対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有しており、上記駆動源は、上記対向電極間に交流電圧を印加することにより上記カンチレバーを振動励起する。
【００１６】
また、上記検出用物質及び上記標的物質は、例えばヌクレオチド鎖であり、上記相互反応作用は、例えばハイブリダイゼーションである。
【００１７】
このような相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置では、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーに検出用物質を固定化し、上記検出用物質と標的物質との相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数変化を測定することで、上記相互反応作用を検出する。
【００１８】
例えば、上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖である場合、上記カンチレバーの端面に固定化された検出用ヌクレオチド鎖と標的ヌクレオチド鎖とがハイブリダイゼーションすると上記カンチレバーの質量が増加するため、カンチレバーの固有振動数が低下する。そこで、本発明に係る相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置では、この固有振動数変化を測定することで、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００１９】
また、上述した目的を達成するために、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域とを少なくとも備える検出部が設けられたものである。
【００２０】
ここで、上記検出部は、上記カンチレバーが一壁面から突出して設けられたセル検出部として構成することができ、このセル検出部は、基板上に複数配設される。本発明に係るバイオアッセイ用基板は、円盤状基板として形成することができ、この場合、セル検出部は、上方視放射状を呈するように配設される。
【００２１】
また、バイオアッセイ用基板を円盤状基板として形成する場合において、上記反応領域を基板上に放射状に延設された条溝内に設けるようにしてもよく、この場合、上記カンチレバーは、上記条溝の片側から突出して設けられる。
【００２２】
さらに、上記セル検出部若しくは条溝単位、又はグルーピングされた複数のセル検出部若しくは条溝単位に、異なる検出用物質を固定化することができる。
【００２３】
さらにまた、上記反応領域に対して、室温と反応至適温度との間で、ゲル、ゾルの可逆相変化が起こり得る物質を充填してもよい。
【００２４】
このようなバイオアッセイ用基板では、上記相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数の変化を測定することで上記相互反応作用が検出される。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。この実施の形態で説明するバイオアッセイ装置及びその相互反応作用検出方法は、対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有するカンチレバー（片持ち梁）の端面に予め検出用ヌクレオチド鎖（検出用物質）の末端部位を固定化し、この検出用ヌクレオチド鎖と標的ヌクレオチド鎖（標的物質）とのハイブリダイゼーション反応に由来する質量変化によりカンチレバーの固有振動数が変化することを利用して、ハイブリダイゼーション反応を定量的に検出するものである。
【００２６】
ここで、本明細書において「ヌクレオチド鎖」とは、プリン塩基又はピリミジン塩基と糖とがグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体を意味し、ＤＮＡプローブを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドとが重合したＤＮＡ（全長或いはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃＤＮＡプローブ）、ＲＮＡ等を広く含む。
【００２７】
先ず、本実施の形態におけるバイオアッセイ装置に用いられるバイオアッセイ用基板（以下、基板と略称する。）１の外観斜視図を図１に示す。図１に示す基板１は、ＣＤ（Ｃｏｍｐａｃｔ　Ｄｉｓｋ）、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　Ｄｉｓｋ）、ＭＤ（Ｍｉｎｉ　Ｄｉｓｋ）（登録商標）等の光情報記録媒体に用いられる円盤状基板（ディスク）に採用される基材から形成されている。
【００２８】
この基材は、石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレンその他の円盤状に成型可能な合成樹脂、好ましくは射出成型可能な合成樹脂によって円盤状に形成されている。なお、安価な合成樹脂基板を用いることで、従来のガラス基板に比して低ランニングコストを実現できる。基板１の中心には、基板１を回転する場合に使用されるスピンドル固定用の孔（図示せず）を形成することもできる。
【００２９】
基板１の一方の表面には、基板１の中心の周辺領域から上方視放射状に延びるように、周辺の基板領域とは区画された小室状の反応領域を備えるセル検出部２が多数配設されている。
【００３０】
このセル検出部２は、基板１上の適切な位置に配設することが可能であるが、このように上方視放射状に配設することで、基板１上のスペースを有効に利用することができ、情報の集積密度を高めることができる。
【００３１】
また、セル検出部２は、互いにコンタミネーションしないように区画されているため、セル検出部単位又はグルーピングされたセル検出部単位で、異なる検出用ヌクレオチド鎖を固定化し、検出用ヌクレオチド鎖毎に別個独立の条件を設定して、ハイブリダイゼーション反応を進行させることができる。
【００３２】
例えば、疾病発症のマーカー遺伝子を基板１上にグルーピングして固定化することができ、これにより１つの基板１を用いて同時に複数の疾病の発現状況を確認することができる。
【００３３】
また、Ｔｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）又はＧＣ含有率の違いに基づいて、固定化する検出用ヌクレオチド鎖をグルーピングしておくことも可能である。これにより、アクティブなハイブリダイゼーション反応が得られるバッファー組成、濃度等の反応条件、洗浄条件、滴下するサンプル溶液濃度等を、検出用ヌクレオチド鎖の性質に応じてきめ細かく選択することが可能となり、解析作業において疑陽性又は疑陰性が示される危険性を減少させることができる。
【００３４】
このセル検出部２の１つを拡大した外観斜視図を図２に示す。図２に示すように、セル検出部２は、検出用ヌクレオチド鎖Ｄと標的ヌクレオチド鎖Ｔとの間のハイブリダイゼーション反応の場となる反応領域１０と、その反応領域１０の両端に電場（電界）を形成する正電極１１及び負電極１２と、セル検出部２の負電極１２側から突出して設けられたカンチレバー１３とを備えている。
【００３５】
反応領域１０は、上方に開口する略正方形のセル、例えば、深さが１μｍ、長さ及び幅が共に１００μｍのセルとして形成されているが、図示された形状、サイズに限定されない。
【００３６】
上述したカンチレバー１３の反応領域１０側の端面１３ａは、検出用ヌクレオチド鎖Ｄの末端部位がカップリング反応等の化学結合によって固定化されるように、表面処理が施されている。すなわち、この端面１３ａは、ＤＮＡプローブ等の検出用ヌクレオチドＤの予め加工された末端部位を固定化するのに好適な表面処理が施されていればよい。例えば、ストレプトアビジンによってカンチレバー１３の端面１３ａが表面処理されている場合には、ビオチン化されたヌクレオチド鎖末端の固定化に適している。なお、ここでは端面１３ａに表面処理が施されているが、これに限定されるものではなく、カンチレバー１３の少なくとも一部に表面処理が施されていればよい。
【００３７】
ここで、ヌクレオチド鎖内では、ヌクレオチド鎖の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素イオン（陽電荷）とによってイオン雲が形成されていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトルが、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果としてヌクレオチド鎖が伸長する。さらに、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合、ヌクレオチド鎖は、電気力線が集中する部位に向かって移動する（Ｓｅｉｉｃｈｉ　Ｓｕｚｕｋｉ，　Ｔａｋｅｓｈｉ　Ｙａｍａｎａｓｈｉ，　Ｓｈｉｎ−ｉｃｈｉ　Ｔａｚａｗａ，　Ｏｓａｍｕ　Ｋｕｒｏｓａｗａ　ａｎｄ　Ｍａｓａｏ　Ｗａｓｈｉｚｕ：　”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｏｆ　ＤＮＡ　ｉｎ　ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ　ＡＣ　ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｉｅｌｄ　ｕｓｉｎｇ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ”，　ＩＥＥＥ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，　Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１，　ｐ．７５−８３　（１９９８）参照）。
【００３８】
そこで、正電極１１及び負電極１２により、各カンチレバー１３の端面１３ａに電気力線が集中するような高周波高電圧の電界を印加すると、高周波高電圧の印加によって伸長処理されたヌクレオチド鎖が端面１３ａに向かって移動し、その末端部位が端面１３ａと接触することによって、検出用ヌクレオチドＤの末端部位をカンチレバー１３の端面１３ａに確実に固定化することができる。特に、カンチレバー１３として、後述するようにＰＺＴ（ジルコン酸チタン酸鉛）やＳＢＴ（タンタル酸ストロンチウムビスマス）等の圧電性を有する強誘電体を用いる場合には、その強誘電体により電気力線がカンチレバー１３の端面１３ａに集中するため好適である。
【００３９】
図２中にその先端部位を示すノズル３は、試料溶液Ｓ（Ｓ’）を滴下するものであり、後述するように基板１から提供される位置情報と回転同期情報とに基づいて、検出用ヌクレオチド鎖Ｄを含有する試料溶液Ｓと標的ヌクレオチド鎖Ｔを含有する試料溶液Ｓ’とを、反応領域１０に正確に追従して滴下する構成とされている。
【００４０】
滴下手段としては、インクジェットプリンティング法を好適に採用することができる。これは、所定の反応領域１０に正確に追従して微小滴を滴下することができるためである。
【００４１】
「インクジェットプリンティング法」は、インクジェットプリンターで用いられるノズルを応用する方法であり、電気を用いてインクジェットプリンターのようにプリンターヘッドから基板１に試料溶液Ｓ（Ｓ’）を噴射するものである。この方法には、圧電式インクジェット法、バブルジェット（登録商標）法、超音波ジェット法がある。
【００４２】
圧電式インクジェット法は、圧電体にパルスを印加することによって生じる変位の圧力により液滴を飛ばす方式である。また、バブルジェット（登録商標）法は、熱方式であって、ノズル中のヒーターを熱して発生させた気泡の圧力によって液滴を飛ばす方式である。ノズル内にヒーターとなるシリコン基板を埋め込み、約３００℃／ｓで制御して一様な気泡を作成し、液滴を押し出す。しかしながら、試料溶液Ｓ（Ｓ’）が高温に曝されることになるため、生体物質試料を用いる場合には注意を要する。超音波ジェット法は、超音波ビームを試料溶液Ｓ（Ｓ’）の自由面に当て、局所的に高い圧力を与えることによってその箇所から小滴を放出させる方式である。ノズルを必要とせず、高速で直径約１μｍの小滴を形成できる。
【００４３】
本実施の形態においては、「インクジェットプリント法」として、「圧電式インクジェット法」を好適に採用できる。印加するパルスの形状を変えることによって、液滴（微小滴）のサイズを制御することができるため、解析精度向上に好適である。すなわち、液滴表面の曲率半径が小さいときには液滴を小さくし、液滴の曲率半径が大きいときには液滴を大きくすることができる。また、パルスを急激に負の方向に変化させることにより液滴表面を内側に引っ張り、曲率半径を小さくすることも可能である。
【００４４】
ここで、反応領域１０に滴下されてきた検出用ヌクレオチドＤの多くは、塩基が重層した状態でカンチレバー１３の端面１３ａに固定化されるため、後から滴下された標的ヌクレオチド鎖Ｔとのハイブリダイゼーション反応の際には、立体障害の問題が発生してしまう。
【００４５】
そこで本実施の形態では、セル検出部２に配設された正電極１１と負電極１２との間に電位差を生じさせることで反応領域１０に貯留保持されている液層（塩溶液）に電場（電界）を形成し、電界の向きに沿って検出用ヌクレオチドＤを直鎖状に伸長させる。なお、上記高周波高電圧は、１×１０６　Ｖ／ｍ、約１ＭＨｚ付近が好適と考えられる（Ｍａｓａｏ　Ｗａｓｈｉｚｕ　ａｎｄ　Ｏｓａｍｕ　Ｋｕｒｏｓａｗａ：　”Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，ＩＥＥＥ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，　Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２６，　ｐ．１１６５−１１７２　（１９９０）　参照）。
【００４６】
なお、基板１上にセル検出部２が列設された場合においては、セル検出部２毎に正電極１１及び負電極１２を設けるようにしてもよく、また、正電極１１及び負電極１２をそれぞれ共通電極化するようにしてもよい。
【００４７】
上述のように高周波高電圧を印加することにより、検出用ヌクレオチド鎖Ｄ及び標的ヌクレオチド鎖Ｔが直鎖状に伸長するため、立体障害が少なくなり、ハイブリダイゼーション反応が効率よく進行することになる。この結果、ハイブリダイゼーションの反応時間が短縮化されるとともに、疑陽性又は疑陰性を示す確率も減少する。
【００４８】
ここで、セル検出部２の反応領域１０側に突設されたカンチレバー１３を拡大して図３に示す。この図３は、カンチレバー１３の端面１３ａにその末端部位が固定化された検出用ヌクレオチド鎖Ｄと該検出用ヌクレオチド鎖Ｄの塩基配列と相補性のある塩基配列を有する標的ヌクレオチド鎖Ｔとがハイブリダイゼーションし、２本鎖を形成している状態を模式的に表したものである。なお、図３では、簡単のため、端面１３ａに１本の検出用ヌクレオチド鎖Ｄが固定化されている状態を示しているが、実際にはカンチレバー１３の幅に応じて相当数の検出用ヌクレオチド鎖Ｄが固定化される。
【００４９】
反応領域１０に対しては、室温と反応至適温度との間で、ゲル、ゾルの可逆相変化が起こり得るアガロースゲル等の相変化物質（図示せず）を充填することも可能である。この場合には、相変化物質を高温下でゾル化し、この状態で電圧を印加して１本鎖ＤＮＡ等のヌクレオチド鎖を配列した後に、温度を低下させてゲル化し、さらに続いてハイブリダイゼーション時には、反応至適温度でゾル化する手順を行うことができるという利点がある。また、ハイブリダイゼーション時において相変化物質をゲル状態に保持しておけば、ＤＮＡ等のヌクレオチド鎖を伸長させた状態でハイブリダイゼーションさせることができるため好適である。
【００５０】
なお、上記相変化物質がゲル化した状態のときには、標的ヌクレオチド鎖Ｔを含む試料溶液Ｓ’をセル検出部２に滴下した際に、ハイブリダイゼーションの進行が妨げられる虞があるため、通常の電気泳動の場合と同様に、滴下ポイントに垂直方向の溝を予め形成しておき、この溝の中に試料溶液Ｓ’を滴下するようにしてもよい。
【００５１】
ところで、上述したカンチレバー１３は、対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有しており、交流電圧を印加することで、その周波数に応じて振動させることができる。この際、カンチレバー１３の全体を圧電振動子として形成することもでき、また、カンチレバー１３上に圧電素子を形成することもできる。
【００５２】
このカンチレバー１３は、例えば特開２００１−３４７４９９号公報に記載された技術を応用して作製することができる。この作製手法の原理を図４を用いて簡潔に説明する。
【００５３】
先ず、図４（Ａ）に示すように、セル検出部２となるシリコン基板２０の底部の一部に、最終的に空隙部分を形成するための犠牲層となるポリシリコン層２１を形成し、底部全体が一様な高さとなるようにする。そして、底部表面にフォトレジストを塗布し、フォトリソグラフィー法などにより、カンチレバー１３を作製する部分以外をマスクするレジストパターンを形成する。その後、例えばＳｉＨ４−Ｎ２Ｏ系を用いたＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｖａｐｏｒ　Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：化学的気相成長）法により、同図（Ｂ）に示すようにＳｉＯ２（二酸化シリコン）からなる絶縁層２２を形成する。なお、ＳｉＯ２に限らず、例えばＳｉＨ４−ＮＨ３系を用いたＣＶＤ法により、ＳｉＮｘ（窒化シリコン）からなる絶縁層２２を形成するようにしても構わない。
【００５４】
そして、同図（Ｃ）に示すように、Ｐｔ（白金）又はＩｎ（インジウム）等からなる下部電極層２３、ＰＺＴ（Ｐｂ（Ｔｉ，Ｚｒ）Ｏ３：ジルコン酸チタン酸鉛）又はＳＢＴ（ＳｒＢｉ２Ｔａ２Ｏ９：タンタル酸ストロンチウムビスマス）等からなる圧電材料層２４、Ｐｔ又はＩｎ等からなる上部電極層２５を順次積層してパターニングする。
【００５５】
最後に、同図（Ｄ）に示すように、真空チャンバ内でＸｅＦ２（二フッ化キセノン）又はＢｒＦ３（三フッ化臭素）を昇華させて導入し、選択的エッチングによりポリシリコン層２１を完全に除去する。
【００５６】
本実施の形態では、このようにして作製されたカンチレバー１３の固有振動数変化を検出することにより、ハイブリダイゼーション反応の有無を検出する。
【００５７】
具体的には、図５に示すように、下部電極層２３と上部電極層２５とを接続した交流回路を形成し、カンチレバー１３の駆動源となる交流電源３０により周波数を変化させながらカンチレバー１３を振動励起する。そして、共振振幅に関連した電流を抵抗３１で電圧変換し、この電圧を振動検出手段としての電圧計３２で計測する。電圧計３２で計測される電圧波形は、例えば図６の実線のようになる。なお、カンチレバー１３の共振振幅は、交流電源３０の周波数がカンチレバー１３の固有振動数と一致したときに最大となるため、電圧のピーク時における交流電源３０の周波数ｆ１は、カンチレバー１３の固有振動数を示している。
【００５８】
ここで、カンチレバー１３の端面１３ａに固定化された検出用ヌクレオチド鎖Ｄと該検出用ヌクレオチド鎖Ｄの塩基配列と相補性のある塩基配列を有する標的ヌクレオチド鎖Ｔとがハイブリダイゼーションして２本鎖を形成した場合、標的ヌクレオチド鎖Ｔに由来するカンチレバー１３の質量増加によりカンチレバー１３の固有振動数が低下する。これにより、電圧波形は図６の破線の位置に下方シフトし、ピーク時における交流電源３０の周波数はｆ２となる。
【００５９】
したがって、この電圧のピーク時における周波数（固有振動数）の変化を検出することにより、ハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。
【００６０】
さらに、この固有振動数の変化量（ｆ１−ｆ２）は、カンチレバー１３の質量変化量と正に相関するため、検出用ヌクレオチド鎖Ｄの固定化前の固有振動数、検出用ヌクレオチド鎖Ｄの固定化後の固有振動数、及びハイブリダイゼーション反応完了後の固有振動数を測定することで、カンチレバー１３に固定化された検出用ヌクレオチド鎖Ｄの本数、或いは検出用ヌクレオチド鎖Ｄとハイブリダイゼーションした標的ヌクレオチド鎖Ｔの本数を定量的に検出することが可能である。
【００６１】
なお、質量変化の大きい方が固有振動数変化の検出感度が上がるため、標的ヌクレオチド鎖Ｔの末端をアンカー分子で修飾し、質量を増加させておくことが好ましい。
【００６２】
また、上述したように反応領域１０にアガロースゲル等の相変化物質を充填している場合には、正確に振動数を検出できない虞があるため、ハイブリダイゼーション反応完了後、振動数の測定前に、この相変化物質をゾル化し、基板１を回転させることで生じる遠心力の作用により、相変化物質を除去してもよい。
【００６３】
以上の例では、カンチレバー１３の全体を圧電振動子としたが、これに限定されるものではなく、図７に示すように、カンチレバー１３の上部に駆動電極となる圧電素子４０ａと検出電極となる圧電素子４０ｂとを設けるようにしても構わない。この場合における圧電素子４０ａ及び４０ｂを含む位置でのカンチレバー１３の垂直断面図を図８に示す。
【００６４】
図８に示すように、カンチレバー１３は、シリコン基板４１上にＳｉＯ２又はＳｉＮｘからなる絶縁層４２が形成されたものである。また、圧電素子４０ａ及び４０ｂは、Ｐｔ又はＩｎからなる下部電極層４３ａ，４３ｂ、ＰＺＴ又はＳＢＴからなる圧電材料層４４ａ，４４ｂ、Ｐｔ又はＩｎからなる上部電極層４５ａ，４５ｂとが順次積層されたものである。
【００６５】
ハイブリダイゼーション反応の有無を検出する際には、駆動源となる交流電源５０により周波数を変化させながらカンチレバー１３を振動励起する。そして、共振振幅に基づく電位差を振動検出手段としての電圧計５１で計測する。上述と同様に、ハイブリダイゼーション反応によりカンチレバー１３の質量が増加すると、カンチレバー１３の固有振動数が低下し、電圧のピーク時における交流電源５０の周波数は低くなる。
【００６６】
以上のようにしてハイブリダイゼーション反応に由来する固有振動数変化が確認された場合、例えば所定の細胞等から抽出された試料溶液Ｓ’中に、特定の疾患に関連するマーカー遺伝子を含む検出用ヌクレオチド鎖Ｄと相補性を有する標的ヌクレオチド鎖Ｔが存在するという事実が認識でき、その結果、上記細胞には上記疾患が発生していることが予測されることになる。
【００６７】
次に、本実施の形態におけるバイオアッセイ装置に用いられる基板の他の例について、図９を参照しながら説明する。ここで、図９（Ａ）は、本例における基板の上方視平面図を示し、図９（Ｂ）は、図９（Ａ）中のＸ部の拡大平面図を示す。
【００６８】
図９に示す基板６０は、条溝検出部６１を備える。この条溝検出部６１は、反応領域７０が基板６０上に放射状に延設された条溝を備え、該条溝を形成する長手方向の片側からは、同図（Ｂ）に示すように、上記セル検出部２におけるカンチレバー１３と同様の構成を備えるカンチレバー７３が所定間隔で突設されている。また、カンチレバー７３が設けられた各部位には、反応領域７０を挟むように正負電極７１，７２が対設されている。なお、条溝検出部６１は、上記セル検出部２が条溝内に配列された構成ともいえる。
【００６９】
各正電極７１は共通電極化することができ、同様に各負電極７２についても共通電極化できる。すなわち、正の共通電極と負の共通電極とを、反応領域７０を挟むように対向させて、基板６０上に放射状をなすように並設することができる。この構成により、針状のプローブを正負の共通電極に上方から押し当てて、通電させることができる。
【００７０】
上述の反応領域７０は、各条溝内に配列形成したピット（図示せず）に形成してもよく、このピットの反応領域に微小滴を滴下することによって、ほぼ同一のスポットサイズを実現することができる。
【００７１】
また、この条溝検出部６１では、毛細管現象を利用した送液や、円盤状の基板６０を所定の方法で回転させることによって生じる遠心力を活かした送液手段も利用することができる。
【００７２】
具体的には、基板６０の中心部に液溜部６２を設け、この液溜部６２に試料溶液Ｓ（Ｓ’）や、反応後にアクティブに結合しなかった余分な標的ヌクレオチド鎖Ｔを除去するための洗浄液等を注入し、基板６０を回転させることによって、基板中心領域から条溝内（すなわち反応領域７０）に円滑かつ確実に送液することができる。
【００７３】
なお、この条溝検出部６１においても、条溝検出部単位又はグルーピングされた条溝検出部単位に、異なる検出用ヌクレオチド鎖Ｄを固定化することができる。
【００７４】
以下、基板１，６０の位置情報及び回転同期情報について簡潔に説明する。基板１，６０の回転方向には、予めディスクマスタリングプロセスにより形成された多数のアドレスピットが形成されている。基板１，６０を光ディスクとして考えた場合、滴下検出位置である反応領域１０，７０は、ユーザーデータ領域と考えられる。他の領域には、サンプルサーボ方式等により同期ピットを配列し、かつトラッキングサーボとしても利用し、さらに、直後にアドレス部（ディスク上の地理的な番地）を挿入することによって位置情報を与える。
【００７５】
アドレス部は、先頭パターンであるセクターマークから始まり、実際に回転しているディスクの回転位相を与えるＶＦＯ、アドレスデータの開始位置を与えるアドレスマーク、トラック及びセクタのナンバーが入ったＩＤ（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）などが組み合わされてなる。
【００７６】
上述した構成の基板１，６０を用いてバイオアッセイを行うには、少なくとも以下の手段及び機構を備える装置を使用する。すなわち、上記基板１，６０を回転可能に保持する基板回転手段と、この基板回転手段によって基板１，６０を回転させながら、反応領域１０，７０に対して試料溶液Ｓ（Ｓ’）を一定の順序、タイミングで滴下する滴下手段と、該滴下手段（のノズル）と基板との間の距離を一定に保持するためのフォーカスサーボ機構と、基板１，６０から提供される位置情報及び回転同期情報に基づいて、試料溶液Ｓ（Ｓ’）の滴下を基板１，６０の反応領域１０，７０に追従させるトラッキングサーボ機構とを少なくとも備えている装置（図示せず）である。
【００７７】
以上説明した基板１，６０及びこれらを用いるバイオアッセイ装置を採用すれば、上述した本発明に係る相互反応作用検出方法を好適に実施することができる。
【００７８】
すなわち、カンチレバー１３，７３の端面に固定化された検出用ヌクレオチド鎖Ｄと標的ヌクレオチド鎖Ｔとがハイブリダイゼーションするとカンチレバー１３，７３の質量が増加するため、カンチレバー１３，７３の固有振動数が低下する。そこで、この固有振動数変化を測定することで、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００７９】
また、正電極１１，７１及び負電極１２，７２によって反応領域１０，７０に電場を形成することにより、反応領域１０，７０内の検出用ヌクレオチドＤと標的ヌクレオチドＴとを伸長させた状態で相対的に移動させ、ハイブリダイゼーションを行わせることができるため、ハイブリダイゼーションの効率が向上する。
【００８０】
なお、本発明は上述した実施の形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【００８１】
例えば、上述の実施の形態では、バイオアッセイ用基板を円盤状に形成したが、この形態に限定されるものではなく、矩形状その他の平板状の形態を適宜選択決定することができる。
【００８２】
また、上述の実施の形態では、検出用ヌクレオチド鎖Ｄと標的ヌクレオチド鎖Ｔとのハイブリダイゼーション反応の有無を検出する場合を代表例として説明したが、本発明は、このようにハイブリダイゼーション反応の有無を検出する例に限定されるものではない。
【００８３】
すなわち、上述した反応領域１０，７０においては、ハイブリダイゼーション反応に加え、検出用ヌクレオチド鎖Ｄから所望の２本鎖ヌクレオチドを形成し、該２本鎖ヌクレオチドとペプチド（又はタンパク質）との相互反応、酵素応答反応その他の分子間相互作用を行わせることができる。具体的に、上記２本鎖ヌクレオチドを用いる場合には、転写因子であるホルモンレセプター等のレセプター分子と応答配列ＤＮＡ分子との結合などを分析することができる。
【００８４】
このように、本発明において「バイオアッセイ」とは、ハイブリダイゼーションその他の物質間の相互反応に基づく生化学的分析を広く意味するものである。
【００８５】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように本発明に係る相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置は、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域と、上記カンチレバーを振動励起する駆動源と、上記カンチレバーの振動振幅を検出する振動検出手段とを少なくとも備える検出部において物質間の相互反応作用を検出するものであり、上記相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数の変化を測定することで、上記相互反応作用を検出する。
【００８６】
このような相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置によれば、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーに検出用物質を固定化し、上記検出用物質と標的物質との相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数変化を測定することで、上記相互反応作用を検出することができる。特に、カンチレバーの固有振動数の変化量が標的物質と相互反応した検出用物質の質量に相関するため、相互反応作用を定量性よく検出することができる。また、固有振動数の変化により相互反応作用を検出するため、検出用物質に対して予め蛍光標識等を行う必要もない。
【００８７】
また、本発明に係るバイオアッセイ用基板は、検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーと、当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域とを少なくとも備える検出部が設けられたものである。
【００８８】
このようなバイオアッセイ用基板によれば、上述した本発明に係る相互反応作用検出方法を好適に実施することができる。
【００８９】
この相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置、並びにバイオアッセイ用基板は、ＤＮＡチップに基づくバイオアッセイ方法に特に好適であり、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用でき、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施の形態におけるバイオアッセイ装置に用いられるバイオアッセイ用基板の外観を示す斜視図である。
【図２】同バイオアッセイ用基板に多数配設されたセル検出部の１つを拡大して示す斜視図である。
【図３】同セル検出部の反応領域側に突設されたカンチレバーを拡大して示す斜視図である。
【図４】同図（Ａ）乃至（Ｄ）は、同カンチレバーの作製工程の一例を説明する図である。
【図５】同カンチレバーの固有振動数変化を検出する方法を示す図である。
【図６】交流電源の周波数を変化させた際に計測される電圧波形を示す図である。
【図７】同カンチレバーの他の構成を示す斜視図である。
【図８】圧電素子を含む位置におけるカンチレバーの垂直断面を示す図である。
【図９】同バイオアッセイ装置に用いられる基板の他の例を説明する図であり、同図（Ａ）は、基板の上方視平面図を示し、同図（Ｂ）は、同図（Ａ）中のＸ部の拡大平面図を示す。
【符号の説明】
１　バイオアッセイ用基板、２　セル検出部、３　ノズル、１０　反応領域、１１　正電極、１２　負電極、１３　カンチレバー、１３ａ　端面、２０　シリコン基板、２１　ポリシリコン層、２２　絶縁層、２３　下部電極層、２４　圧電材料層、２５　上部電極層、３０　交流電源、３１　抵抗、３２　電圧計、４０ａ，４０ｂ　圧電素子、４１　シリコン基板、４２　絶縁層、４３　下部電極層、４４　圧電材料層、４５　上部電極層、５０　交流電源、５１　電圧計、６０　基板、６１　条溝検出部、６２　液溜部、７０　反応領域、７１　正電極、７２　負電極、７３　カンチレバー
【図１】
2004125706.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004125706.tif 000009
【図８】
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【図９】
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