(57)【要約】【課題】液体クロマトグラフ質量分析計による感度の高い有機酸分析法を提供する。【解決手段】有機酸を含有する試料を、酸性水溶液を移動相とした液体クロマトグラフ用カラムに付して分離し、該カラムからの分離溶出液に、塩基もしくは有機溶媒、もしくは塩基と有機溶媒を添加混合した後、質量分析計にて検出を行うことを特徴とする有機酸分析方法。好ましくは、前記塩基はアンモニア水、アルキルアミンであり、前記有機溶媒はメタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、ＴＨＦである。【選択図】　　　　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸を含有する試料を、酸性水溶液を移動相とした液体クロマトグラフ用カラムに付して分離し、該カラムからの分離溶出液に、塩基もしくは有機溶媒、もしくは塩基と有機溶媒を添加混合した後、質量分析計にて検出を行うことを特徴とする有機酸分析方法。
【請求項２】
前記塩基が、アンモニア水、アルキルアミンである、請求項１に記載の有機酸分析方法。
【請求項３】
前記有機溶媒が、メタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、ＴＨＦである、請求項１に記載の有機酸分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、液体クロマトグラフ質量分析計による有機酸混合物の分析技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、有機酸の分離はイオン排除カラムを使用した高速液体クロマトグラフィにより行われている（例えば、特許文献１参照）。このイオン排除クロマトグラフィでは負に帯電した固定相と酸性水溶液からなる移動相を用い、分析対象の有機酸の分離が該有機酸陰イオンと上記固定相との静電気斥力の強さに基づいて行われる。この方法にて有機酸を分離した後、ポストカラムｐＨ調製電気伝導度検出法や紫外可視（ＵＶ）吸光光度法で検出を行う。ポストカラムｐＨ調整電気伝導度検出法では、カラムから溶出した移動相に緩衝液を添加してｐＨを中性付近に固定した後、有機酸が解離してイオンとなる成分の変化量を測定する。また、紫外可視（ＵＶ）吸光光度法では、有機酸のカルボキシル基に着目して２０５−２１０ｎｍでの吸光度に基づいて検出する。
【０００３】
【特許文献１】特開平８−２０１３６５号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の従来検出法は検出感度が低い。上記ポストカラムｐＨ調整電気伝導度法の検出感度は３×１０−１１〜５×１０−１１であり、分子量１９２であるクエン酸を例にとると、４０ｐＮ×１９２／３＝２５６０ｐｇの感度となり、ナノグラムオーダーしかない。紫外可視（ＵＶ）吸光光度法の場合、検出感度はポストカラムｐＨ調整電気伝導度法より低い。
【０００５】
さらに、上記の従来検出法は選択性が低いために、多成分の有機酸を一斉分析する場合にはピークとピークが重ならないようにするために、２本のカラムをつなげて分析しなくてはならない。特に、紫外可視（ＵＶ）吸光光度法では、２０５−２１０ｎｍでの吸光度を検出するために共存する吸光性の中性夾雑物質の受けやすく、選択性が悪く十分な分析ができない。
【０００６】
一方、液体クロマトグラフィの検出方法として質量分析計を使用することが考えられる。質量分析計によれば、特に選択性の向上ができる。しかしながら、液体クロマトグラフ質量分析計に一般的に用いられているイオン化部である、エレクトロンスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）あるいは大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ法）では、分離カラムからの溶出液が酸性水溶液であるためにイオン化が抑制され、検出感度は低くなる。
本発明はこのような課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、液体クロマトグラフ質量分析計による感度の高い有機酸分析法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上述のような問題点を解消するために、本発明は、有機酸を含有する試料を、酸性水溶液を移動相とした液体クロマトグラム用カラムに付して分離し、該カラムからの分離溶出液に、塩基もしくは有機溶媒、もしくは塩基および有機溶媒を添加混合した後、質量分析計にて検出を行うことを特徴とする有機酸分析方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明は、前記塩基が、アンモニア水、アルキルアミンである、請求項１に記載の有機酸分析方法である。
【０００９】
本発明は、前記有機溶媒が、メタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、ＴＨＦである、請求項１に記載の有機酸分析方法である。
【００１０】
ここで、液体クロマトグラフの分離カラムには、イオン排除カラム、イオン交換クロマトグラフカラムを使用する。イオン排除カラムは、負に帯電した固定相と酸性移動相とによる公知の組み合わせによるものを使用することができるが、この発明において固定相はスルホン基を有するイオン交換体を充填したカラムが、一方、酸性移動相としては、ｐＨ２〜３の強酸性のもので等量伝導度の低い酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸、が好ましい。
【００１１】
分離カラムの移動相としては、例えば、イオン排除カラムを用いる場合、ギ酸水、過塩素酸水、りん酸水、酢酸水などの酸性移動相を使用する。ｐＨは２〜３の強酸性が好ましい。
【００１２】
質量分析計のイオン化部には、例えばエレクトロンスプレーイオン化法もしくは大気圧化学イオン化法を使用することができるが、これらに限定されない。
【００１３】
有機溶媒としては、例えばメタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、ＴＨＦを使用することができるが、これらに限定されない。濃度は１０〜９０％が好ましい。
【００１４】
塩基としては、例えば、アンモニア水、アルキルアミンが使用できるが、これらに限定されない。最終ｐＨ６〜１０であり、好ましくは、ｐＨ８〜１２である。
【００１５】
有機溶媒と塩基の混合溶媒を用いる場合の混合比は、有機溶媒：塩基＝１：９〜９：１が好ましい。
【００１６】
混合手段としては、Ｔ字管、反応コイル、ミキサーが使用できるが、これらに限定されない。
【００１７】
なお、本発明で分析できる有機酸は、クエン酸、ピルビン酸、りんご酸、コハク酸、乳酸、フマル酸、酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
有機酸分離に用いるイオン排除カラムは、有機酸の解離を抑えるために移動相には酸性水溶液を用いる。一方、有機酸の質量分析ではプロトン脱離分子（［Ｍ−Ｈ］−）を検出するため、脱プロトンが起こり易い塩基性溶媒が適している。そこで、イオン排除カラム溶出後の移動相に塩基性溶液を添加・混合することにより、試料のｐＨを上昇させ、イオン化を促進し有機酸の検出感度を上げることができる。また、質量分析において多量の移動相溶媒が存在するとイオン化が抑制されるため、有機溶媒を添加することが望ましい。しかし、分離カラムには有機溶媒は導入不可能であるために、カラムによる分離が終了した時点で有機溶媒を添加・混合することで移動相溶媒の揮発性を高め、イオン化を促進し検出感度を上げることができる。
【００１９】
さらに、質量分析計では、分子量が特定できるために、分子量が異なる物質については必ずしもピークを分離する必要がなく、１本のカラムで有機酸を分離するだけで有機酸の同定が可能である。また、従来検出法では、未知のピークに対して保持時間以外の情報は得られなかったが、質量分析法を用いることによって未知ピークの分子量が推定でき、有機酸の同定が可能となる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明の実施例を図面を参照して説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
図１にイオンクロマトグラフ質量分析計による有機酸分析システムの基本的な流路図を示す。図１中、１は移動相溜、２は移動相送液ポンプ、３はオートサンプラー、４は分離カラム、５は試薬（塩基または有機溶媒または有機溶媒混合塩基）溜、６は試薬送液ポンプ、７は混合部、８は質量分析計を各々示す。
【００２１】
以上の構成において、移動相送液ポンプ２によって移動相溜１から移動相がオートサンプラー４に送られて試料と混合され、分離カラム５に送られる。カラムから溶出した試料は、ポストカラム法によって塩基または有機溶媒または有機溶媒混合塩基が混合部８において添加・混合された後、質量分析計９に導入されて検出される。
【００２２】
次の条件にて本発明の有用性を調べた。
移動相として０．１％ギ酸水を流速０．２ｍＬ／ｍｉｎを使用し、４００ｎＭのクエン酸標準溶液を４０μｌ分離カラムに注入した。分離カラムから溶出した試料（ｐＨ＝２．６）に、Ｔ字管を用いて０．５％アンモニア水を添加混合し、試料のｐＨを８．９に上昇させた。その後、質量分析計に導入した。イオン化法はエレクトロンスプレーイオン化法とし、ネガティブイオンの測定を行った。
【００２３】
なお、分析条件の詳細は以下の通りである。
＜分析条件＞
（株）島津製作所製液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣＭＳ−２０１０Ａにおいて、
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ　ＳＰＲ−Ｈ（株）島津製作所製（４．６ｍｍｌ．Ｄ．　×２５０ｍｍ，８μｍ）
移動相：０．１％ぎ酸水
移動相流量：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４５℃
試料注入量：５０μＬ
ポストカラム
塩基：０．５％アンモニウム水
移動相流量：０．１５ｍＬ／ｍｉｎ
最終ｐＨ：ｐＨ８．９
質量分析計
イオン化モード：ＥＳＩ（−）
霧化ガス流量：４．５Ｌ／ｍｉｎ
印加電圧：−３．５ｋＶ
ＣＤＬ温度：２５０℃
乾燥ガス流量：０．０５Ｍｐａ
分析モード：ＳＩＭ測定
分析範囲：ｍ／ｚ（−）１９０．８５
取込時間：１．０ｓｅｃ／Ｃｈ
【００２４】
＜結果＞
クエン酸の分子量は１９２であり、ＥＳＩ法ではプロトンが脱離したネガティブイオンｍ／ｚ１９１（＝［Ｍ−Ｈ］−）がメインピークとして観測される。図２に、上述分析による、ｍ／ｚ１９１をターゲットイオンとして、クエン酸標準液（４００ｎＭ）のＳＩＭ測定をしたマスクロマトグラムを示す。横軸はｍ／ｚ比、縦軸は相対強度である。この時のクエン酸ピークはＳ／Ｎ＝１５１（σ＝３）である。よって、定量限界をＳ／Ｎ＝１０と考えると、４００ｎＭ／１５１．０１×１０＝２６．４９ｎＭが定量限界となる。２６．４９ｎＭを５０μｌ注入して測定したので、２６．４６×１０−９μｇ／μＬ×５０μＬ×１９２＝２．５４×１０−４μｇ＝２５４μｇのクエン酸を定量できることになる。これは、従来の検出法であるポストカラムｐＨ調整電気伝導度検出法の感度より約１０倍上昇した。
【００２５】
なお、本発明に使用できる移動相の種類は、上記ギ酸水に限定されず、酸性であればＴＦＡ、過塩素酸水、りん酸水、酢酸水も使用することができる。
【００２６】
また、塩基は、上記アンモニア水に限定されず、アルカリ性であればアルキルアミンも利用することができる。
【００２７】
また、有機溶媒を添加することにより、移動相溶媒が揮発しやすくなることで、イオン化を促進させることができる。この場合の有機溶媒には、例えばメタノール、アセトニトリル、イソプロパノール、ＴＨＦを使用することができる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、質量分析計で有機酸を選択的に感度良く分析可能となった。このことは、有機酸以外の未知物質が混合した試料の場合に未知物質と有機酸同定が容易になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の有機酸分析方法の流路図
【図２】本発明によりクエン酸標準液をＳＩＭ測定した結果
【符号の説明】
１…移動相溜
２…移動相送液ポンプ
３…オートサンプラー
４…分離カラム
５…試薬溜
６…試薬送液ポンプ
７…混合部
８…質量分析計
【図１】
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【図２】
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