(57)【要約】【課題】本発明は、単子葉植物と双子葉植物の両植物において有効に機能する、新規な感染誘導性プロモーターを提供することを目的とする。【解決手段】カシュウイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　ｂｕｌｂｉｆｅｒａ　Ｌ．）のＰＲ４タンパク質遺伝子を調節するプロモーター領域の単離、および該プロモーターを用いたトランスジェニック植物の作製。【選択図】　図１
2004049143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ配列で特定される、カシュウイモ由来の感染誘導性プロモーター。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ感染誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項２】
単子葉植物と双子葉植物の両方で有効に機能しうることを特徴とする、請求項１記載のプロモーター。
【請求項３】
請求項１または２記載のプロモーターを含有するベクター。
【請求項４】
請求項１または２記載のプロモーターを宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項５】
宿主が植物である、請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項１記載のプロモーターを導入することにより、感染誘導性耐病性を付与されたトランスジェニック植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な感染誘導性プロモーターに関する。より詳細には、カシュウイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　ｂｕｌｂｉｆｅｒａ　Ｌ．）のＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４　（ＰＲ４タンパク質）遺伝子の調節領域に由来し、単子葉植物および双子葉植物の両植物で有効に機能する感染誘導性プロモーターおよびその利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、植物における遺伝子工学的手法の進歩により、外来遺伝子を植物体中で発現させる技術が確立した。こうした技術を利用して、抗菌性タンパク質遺伝子や耐病性付与遺伝子を導入した、種々の耐病性品種も開発されている。
【０００３】
いもち病はイネにおいて最も被害の大きい病害であり、その耐病性育種は水稲開発における重要な課題である。従来、形質転換系を用いたイネの耐病性育種では、プロモーターとして、ユビキチン１プロモーター、アクチン１プロモーター、およびＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターなどが用いられてきた。これらのプロモーターはイネの全組織において構成的発現性をもつため、非感染時にも定常的に耐病性関連遺伝子を発現させる。しかし、耐病性関連タンパク質が定常的に過剰発現することは植物の生育に好ましくないばかりか、収穫後の植物の利用においても問題を生じる場合がある。そのため、いもち病感染時にのみ耐病性関連遺伝子を発現させる、感染誘導性プロモーターが望まれるが、これまでイネ科において有効な感染誘導性プロモーターはほとんど単離されたことがなく、利用されていないのが現状である。
【０００４】
一方、灰色カビ病はタバコ植物をはじめとする双子葉植物にとって、深刻な病害である。従来、双子葉植物における形質転換系を用いた耐病性付与では、プロモーターとして、主にＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターが用いられてきた。しかし、このＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターは、前述のとおり構成的発現性を有するため、非感染時にも耐病性関連タンパク質の定常的な過剰発現をもたらすという問題があった。そして、双子葉植物においても、これまで有効な感染誘導性プロモーターはほとんど利用されていないのが現状である。
【０００５】
ところで、植物は病原菌等の外界からの刺激に対して種々の防衛機構を備えており、その防御過程では一群の抵抗性タンパク質（ｄｅｆｅｎｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が誘導される。この抵抗性タンパク質のうち、特に植物に病原菌が感染した際に誘導されるタンパク質群は、感染特異的タンパク質（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＰＲタンパク質）と呼ばれ、由来する植物種に関わらず、そのアミノ酸配列、血清学的・免疫学的特徴、酵素活性等に基づいて幾つかのファミリーに分類されている。
【０００６】
ＰＲ４は、このＰＲタンパク質ファミリーの１つで、抗カビ活性、エンドキチナーゼ活性を有し、オオムギ、タバコ、ジャガイモ、ゴムノキ等の植物において、よく研究されている。また、カシュウイモについては、炭疸病菌エリシター処理後の培養細胞から作成したｃＤＮＡにおいて、タバコ由来のＰＲ４タンパク質にアミノ酸レベルで７９％の相同性を示すクローンＤＢＰＲ４が既に報告されている（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．　［１９９９］　１８：６０１−６０６）。しかし、これまでカシュウイモ由来のＰＲ４プロモーターについて、その配列や機能に関する報告はなく、またＰＲ４やその調節遺伝子を耐病性育種に利用したという報告もない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、単子葉植物と双子葉植物の両植物において有効に機能する、新規な感染誘導性プロモーターを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、カシュウイモの病原菌感染時の全ＲＮＡから、ＰＲ４タンパク質遺伝子の発現調節を行うプロモーター領域を単離した。そして、当該プロモーター領域が単子葉植物と双子葉植物の双方において有効な感染誘導性プロモーターとして機能しうることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）を提供する。
（１）　以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ配列で特定される、カシュウイモ由来の感染誘導性プロモーター。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ感染誘導性プロモーター活性を有するＤＮＡ。
（２）　単子葉植物と双子葉植物の両方で有効に機能しうることを特徴とする、上記（１）記載のプロモーター。
（３）　上記（１）または（２）記載のプロモーターを含有するベクター。
（４）　上記（１）または（２）記載のプロモーターを宿主に導入して得られる形質転換体。
（５）　宿主が植物である、上記（４）記載の形質転換体。
（６）　上記（１）記載のプロモーターを導入することにより、感染誘導性耐病性を付与されたトランスジェニック植物。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．　カシュウイモ由来の感染誘導性プロモーター
本発明は、カシュウイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　ｂｕｌｂｉｆｅｒａ　Ｌ．）のＰＲ４遺伝子調節領域に由来する、新規な感染誘導性プロモーターを提供する。該プロモーターは、他の単子葉植物および双子葉植物においても、感染誘導性プロモーターとして有効に機能するという特徴を有する。
【００１１】
なお、本明細書中において、「感染誘導性」とは、病原菌の感染によって特異的に発現が誘導されることを意味する。たとえば、本発明のプロモーターは、イネに導入した場合はいもち病菌接種により誘導され、タバコに導入した場合は灰色カビ病菌接種により誘導され、病原菌感染特異的にその下流に連結された遺伝子の発現を誘導する。
【００１２】
１．１　プロモーター領域の単離
前述のとおり、カシュウイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　ｂｕｌｂｉｆｅｒａ　Ｌ．）については、ＰＲ４類似ｃＤＮＡクローン（以下、ＤＢＰＲ４という。）の塩基配列（配列番号８）が既に報告されている（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．　［１９９９］　１８：６０１−６０６）。そこで、このＤＢＰＲ４の塩基配列情報を用いることにより、公知の方法にしたがい、ＤＢＰＲ４遺伝子の発現を制御するプロモーター配列を単離することができる。
【００１３】
たとえば、ＤＢＰＲ４領域の塩基配列情報にＴＡＩＬ−ＰＣＲ　法を適用して、カシュウイモのゲノムライブラリーよりＤＢＰＲ４上流に隣接する領域を単離することができる。なお、ＴＡＩＬ（Ｔｈｅｒｍａｌ　ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ）−ＰＣＲ法とは、ゲノムＤＮＡを鋳型に特異的プライマーと任意プライマーを用いて、ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行い、特異的プライマーに隣接した未知領域を単離する方法である。ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法は、たとえば、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２５：６７４−６８１；Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２６３：５５４−５６０等の記載に基づいて実施することができる。
【００１４】
本発明で用いられる、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ特異的プライマーとしては、たとえば、配列番号２〜６で示される塩基配列を有するプライマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また任意プライマーとしては、たとえば、配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１５】
１．２　塩基配列の決定
次いで、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法によって得られたＤＢＰＲ４上流領域を含むゲノムＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　社製）、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等の適切なベクターにサブクローニングした後、塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、またはＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等、公知の手法により行うことができるが、自動塩基配列解析装置（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製　：ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　等）を用いる方法が簡便で好ましい。
【００１６】
こうして決定されたＤＢＰＲ４上流領域ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１に示す。該領域は、図１に示すように、ＴＡＴＡ　ｂｏｘ　を含み、翻訳開始のＡＴＧコドンから１１３１ｂｐ上流までの塩基配列を含む。
【００１７】
しかし、本発明にかかるプロモーターは、上記配列に限定されず、配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる他のポリヌクレオチドも、それが本発明の感染誘導性プロモーター活性を有する限り、本発明のプロモーターに含まれる。なお、ストリンジェントな条件下とは、たとえば、ナトリウム濃度が３０ｍＭかつ温度が６５℃、好ましくはナトリウム濃度が１０ｍＭかつ温度が６５℃の条件下を言う。
【００１８】
かくして、一旦本発明のプロモーター領域とその塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、またはゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、さらに本発明のプロモーターを得ることができる。
【００１９】
１．３　プロモーター活性の確認
次に、得られたＤＮＡ断片（配列番号１）の感染誘導性プロモーター活性について確認を行う。活性の確認は、たとえば、当該ＤＮＡ断片の下流に適当なレポーター遺伝子を連結して（図２）他の植物に導入し、病原菌感染下と非感染下でのレポーター活性を比較することにより確かめることができる。
【００２０】
用いられるレポーター遺伝子としては、たとえば、ＬＵＣ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、ＧＵＳ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＡＴ（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　ａｃｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）等を挙げることができる。また、植物へのＤＮＡ断片の導入法としては、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法等を挙げることができる。なかでも、操作の簡便性、再現性の高さからアグロバクテリウム法が好ましい。
【００２１】
周知のとおり、単子葉植物と双子葉植物は植物の進化上遠い位置にあるため、単子葉植物で有効な遺伝子が必ずしも双子葉植物で有効に機能するとは限らない。しかしながら、本発明の感染誘導性プロモーターは、単子葉植物と双子葉植物の両方において有効に機能するという、優れた特徴を有する。
【００２２】
２．　感染誘導性プロモーターを含むベクター
本発明はまた、本発明の感染誘導性プロモーターを含むベクターを提供する。前記ベクターは、さらに本発明の感染誘導性プロモーターの下流域に他の構造遺伝子を機能しうる態様で含んでいてもよい。そのような構造遺伝子としては、たとえば、抗菌性タンパク質をコードする遺伝子、感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）等の植物に耐病性を付与する遺伝子を挙げることができる。なお、「機能しうる態様」とは、発現させたい遺伝子に対し、本発明のプロモーターがプロモーター活性を発揮し得る態様で連結されていることを意味する。
【００２３】
本発明のベクターにおいて、前項で得られた本発明の感染誘導性プロモーターＤＮＡ（たとえば、配列番号１）はそのまま、または適当な制限酵素で消化し、あるいは、適当なリンカーに連結して使用することができる。用いられるベクターとしては、　ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９　等の　ｐＵＣ　系ベクター、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２　等のバイナリーベクターを挙げることができる。
【００２４】
特に、アグロバクテリウムのバイナリーベクターを用いる場合は、該バイナリーベクターの境界配列（ＬＢ，　ＲＢ）間に外来遺伝子（本発明のプロモーター等）を挿入し、この組換えベクターを大腸菌内で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス　ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ　等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等を用いて導入し、これを植物の形質転換体作出用ベクターとして用いる。
【００２５】
本発明のベクターは、上記以外に適当なターミネーター配列を含んでいても良い。該ターミネーター配列としては、たとえばカリフラワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター配列等が挙げられる。また、必要に応じてプロモーター配列と構造遺伝子の間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列を含んでいてもよい。
【００２６】
さらに、目的の形質転換体を効率的に選抜するために、本発明のベクターは適当な選抜マーカー遺伝子を含んでいても良い。該選抜マーカーとしては、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子およびビアラフォスに対する抵抗性を植物に付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等を挙げることができる。
【００２７】
３．　感染誘導性プロモーターを含む形質転換体
本発明はまた、本発明の感染誘導性プロモーターを適当な宿主に導入して得られる形質転換体を提供する。
【００２８】
３．１　宿主
本発明の形質転換体において、宿主は特に限定されないが、植物であることが好ましい。なお、本明細書中において、宿主植物は、本発明のプロモーターの導入が可能なものであれば、特に限定されず、イネ等の単子葉植物であっても、タバコ等の双子葉植物であってもよい。また、遺伝子導入に用いられる外植片は、宿主植物の全体、器官（たとえば葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、組織（たとえば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）または培養細胞のいずれであってもよい。
【００２９】
３．２　宿主の形質転換
宿主植物の外植片として、宿主植物の全体、器官、組織、培養細胞を用いて遺伝子導入する場合、採取した植物外植片に、本発明のベクターをアグロバクテリウムのバイナリーベクター法、パーティクルガン法、またはポリエチレングリコール法等を用いて導入することができる。あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法で導入することもできる。かくして、本発明のプロモーターが導入された形質転換体（植物）が作出される。
【００３０】
なお、パーティクルガン法等による直接遺伝子導入法では、選抜マーカー遺伝子を含むベクターと本発明のプロモーターを含有するベクターとを混合して同時に植物の細胞に撃ち込む、いわゆる　ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　法により行うこともできる。
【００３１】
３．３　形質転換体の再生
本発明の感染誘導性プロモーターが導入された植物細胞は、選抜マーカーによるスクリーニング、またはプロモーター支配下で発現する産物の発現解析により、選抜することが可能である。形質転換の結果得られるシュート、毛状根などは細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用いて、適当な濃度の植物ホルモンの投与などによって、さらに植物体に再生させることができる。得られた植物体は、土壌またはバーミキュライトを詰めたポットで栽培し、株分けすることによって増殖させることが可能である。このように増殖させた植物やその種子も本発明の形質転換体の範囲に含まれる。
【００３２】
４．　感染誘導性耐病性を付与されたトランスジェニック植物
上記のとおり、本発明のプロモーターを宿主植物に導入することにより、植物病原糸状菌および植物病原細菌に対して抵抗性を有するトランスジェニック植物を作製することができる。しかも、本発明のプロモーターは感染誘導性プロモーターであるため、形質転換された植物は、病原菌感染時のみ特異的にその下流に連結された耐病性関連遺伝子の発現を誘導する。したがって、従来の構成的発現性を有するプロモーターによる、耐病性関連遺伝子の定常的発現による問題、例えばＰＲタンパク質の過剰発現によるアレルギー等の問題、を解消することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によってさらに説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、核酸を扱う基本的な方法は、Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓらの「　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　」（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２）　にしたがって行った。
【００３４】
実施例１：ＤＢＰＲ４プロモーター配列導入用アグロバクテリウムの作製
１．　ＤＢＰＲ４プロモーター配列の単離
ＤＢＰＲ４遺伝子のｃＤＮＡ配列　（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．　［１９９９］　１８：６０１−６０６）をもとにＴＡＩＬ−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２５：６７４−６８１；Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２６３：５５４−５６０）によって５’−上流配列を単離した。
【００３５】
まず、ＤＢＰＲ４遺伝子ｃＤＮＡ配列のアミノ末端付近の配列をもとに、５’−上流方向に向けて以下の５種類のプライマーを設計した。
ＰＡ：５’−ＴＴＧＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＣ−３’（配列番号２）
ＰＢ：５’−ＣＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＴＣ−３’（配列番号３）
Ｐ１：５’−ＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＧＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＡ−３’（配列番号４）
Ｐ２：５’−ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＣＣＡＴ−３’（配列番号５）
Ｐ３：５’−ＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＡＧＣＡＡ−３’（配列番号６）
【００３６】
またＴＡＩＬ−ＰＣＲに用いる任意配列プライマーとしては、以下のＡＰ７８プライマーを用いた。
ＡＰ７８：５’−ＧＧＡＣＣＣＡＡＣＣ−３’（配列番号７）
第一回目のＰＣＲはＰＡとＡＰ７８のプライマーペアでおこない、そのＰＣＲ産物を鋳型として第二回目のＰＣＲをＰＢとＡＰ７８のプライマーペアでおこない、さらにそのＰＣＲ産物を鋳型として第三回目のＰＣＲをＰ１とＡＰ７８、Ｐ２とＡＰ７８、Ｐ３とＡＰ７８の３種類のプライマーペアでおこなった。
【００３７】
第三回目のＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動したところ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３のプライマー位置に対応する約７８０塩基対のＰＣＲ産物が得られたので、これをゲルから回収してプラスミドにクローン化して塩基配列を決定した。
【００３８】
この塩基配列の一部はＤＢＰＲ４遺伝子の配列と完全に一致した。したがって、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ法によって回収された約７８０塩基対の断片はＤＢＰＲ４遺伝子の５’領域を含むことが確認された。同様の方法で、この断片のさらに上流約４００塩基対を単離した。
【００３９】
その結果、得られた全長１１３１塩基対の断片には、ＴＡＴＡ−ｂｏｘ相同配列、９箇所のＷ−ｂｏｘ　（ＥＭＢＯ　Ｊ．　１５：５６９０−５７００）、２箇所のＭｙｂ−Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ−Ｅｌｅｍｅｎｔ　（ＭＲＥ：　Ｇ（Ｇ／Ｔ）Ｔ（Ａ／Ｔ）Ｇ−（Ｇ／Ｔ）Ｔ−３’相同配列（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９３：１４９７２−１４９７７）が存在することが確認された。なお、これらの配列の存在は上記文献に示唆されているが、その配列は特定されていない。
【００４０】
２．　植物細胞での発現ベクターの構築
前項で得られたＤＢＰＲ４のプロモーター配列を、ＧＵＳ遺伝子を含むｐＲＴ１０１−ｇｕｓプラスミド（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　２１７：６６−７８）のＣａＭＶ３５Ｓプロモータと置換し、キメラ遺伝子ｐＲＧ１０１を構築した。次いで、このｐＲＧ１０１を制限酵素ＳａｃＩで線状化した後、同様にＳａｃＩで線状化したバイナリーベクターｐＢＥＣＫＳ２０００（Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　２６１：２２６−２３５）とライゲートしてｐＲＴ１００１を作成した。ＧＵＳ遺伝子を含むバイナリーベクター：ｐＲＴ１００１の構造を図２に示す。
【００４１】
３．　アグロバクテリウムへのバイナリーベクターの導入
４０μｌずつ分注して−８０℃でストックしておいたアグロバクテリウム　ＥＨＡ１０５（Ｔｒａｎｓ．　Ｒｅｓ．　２：２０８−２１８）を氷中で溶解し、前項で作製したＧＵＳ遺伝子を含むバイナリーベクター（ｐＲＴ１００１）ＤＮＡの溶液（０．１ｎｇ／μｌ）を２μｌ加え、静かにピペッテイングして氷中に５分間放置した。その後氷中で、ＢｉｏＲａｄ社のＧｎｅＰｕｌｓｅｒ用キュベットに移し、２５μＦ、２００オーム、２．５ｋＶの設定において４．３秒間パルスを与えた。次に、速やかにＳＯＣ液体培地を１ｍｌ加え、薬剤耐性遺伝子の発現のために２８℃で１時間培養した。培養後のアグロバクテリウムを、カナマイシン５０ｐｐｍ、スペクチノマイシン５０ｐｐｍ、を含むＡＢ寒天固形培地に塗布し、２５℃３日間培養し、ｐＲＴ１００１プラスミドが導入されたアグロバクテリウムのみを増殖させた。
【００４２】
得られたアグロバクテリウムを、ＡＢ寒天固形培地に塗布し、２５℃、３日間培養した。増殖したアグロバクテリウムを薬匙でかきとり、アセトシリンゴン入りＡＡ培地（ＡＡ無機塩、アミノ酸、Ｂ５ビタミン、ショ糖　（２０ｇ／Ｌ）、２，４−Ｄ　（２ｍｇ／Ｌ）、カイネチン　（０．２ｍｇ／Ｌ）、アセトシリンゴン　（１０ｍｇ／Ｌ）；Ｍｕｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９７８）に懸濁させて、波長６００ｎｍにおける吸光度が０．１５〜０．２０となるように調整した。
【００４３】
実施例２：イネへのＤＢＰＲ４プロモーター配列の導入
１．　イネ培養細胞への発現ベクターの導入
調整した懸濁液に、前記で得た胚様体カルスを、軽く振盪しながら１．５〜２分間浸漬することによって、胚様体カルスにアグロバクテリウムを感染させた。浸漬後の胚様体カルスは、滅菌したペーパータオル等で余分な水分を除去し、Ｎ６ＣＯ寒天固形培地（ＫＮＯ３　（２８３０ｍｇ／Ｌ），　　（ＮＨ４）２ＳＯ４　（４６３ｍｇ／Ｌ），　　ＫＨ２ＰＯ４　（４００ｍｇ／Ｌ），　　ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ　（１６６ｍｇ／Ｌ），　　ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１８５ｍｇ／Ｌ），　　ＭｎＳＯ４／４Ｈ２Ｏ（４．４ｍｇ／Ｌ），　　Ｈ３ＢＯ３（１．６ｍｇ／Ｌ），　　ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１．５ｍｇ／Ｌ），ＫＩ　（０．８ｍｇ／Ｌ），　　ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（２７．８ｍｇ／Ｌ），　　Ｎａ２ＥＤＴＡ　（３７．３ｍｇ／Ｌ），　　グリシン（２．０ｍｇ／Ｌ），　　ニコチン酸　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　ピリドキシン塩酸塩　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　チアミン　塩酸塩　（１．０ｍｇ／Ｌ），　　ミオイノシトール　（１００ｍｇ／Ｌ），　　ショ糖　（２０ｇ／Ｌ），　　２，４−Ｄ　（２ｍｇ／Ｌ），　　アセトシリンゴン　（１０ｍｇ／Ｌ），　　０．２％ゲルライト）に置床させ、２５〜２８℃の暗所で３日間培養した。これにより、胚様体カルスのゲノム中に、ＧＵＳ遺伝子および選抜マーカー遺伝子（ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）を組み込むことができた。
【００４４】
２．　胚様体カルスからの植物体の再生
上記で培養した胚様体カルスから、残存するアグロバクテリウムを除去するため、クラフォラン（５００ｍｇ／Ｌ）入り滅菌水で洗浄した。洗浄したカルスは滅菌したペーパータオル等で余分な水分を除去し、ハイグロマイシン等の選抜用マーカー薬剤を含んだＮ６ＳＥ寒天固形培地（ＫＮＯ３　（２８３０ｍｇ／Ｌ），　　（ＮＨ４）２ＳＯ４　（４６３ｍｇ／Ｌ），　　ＫＨ２ＰＯ４　（４００ｍｇ／Ｌ），　　ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ　（１６６ｍｇ／Ｌ），　　ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１８５ｍｇ／Ｌ），　　ＭｎＳＯ４／４Ｈ２Ｏ　（４．４ｍｇ／Ｌ），　　Ｈ３ＢＯ３　（１．６ｍｇ／Ｌ），　　ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１．５ｍｇ／Ｌ），ＫＩ　（０．８ｍｇ／Ｌ），　　ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（２７．８ｍｇ／Ｌ），　　Ｎａ２ＥＤＴＡ　（３７．３ｍｇ／Ｌ），　　グリシン（２．０ｍｇ／Ｌ），　　ニコチン酸　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　ピリドキシン塩酸塩　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　チアミン　塩酸塩　（１．０ｍｇ／Ｌ），ミオイノシトール　（１００ｍｇ／Ｌ），　　ショ糖　（２０ｇ／Ｌ），　　２，４−Ｄ　（２ｍｇ／Ｌ），　　アセトシリンゴン　（１０ｍｇ／Ｌ），　　０．２％ゲルライト，　　クラフォラン　（５００ｍｇ／Ｌ），　　ハイグロマイシン　（５０ｍｇ／Ｌ））に置床させた。置床後３週間、２５℃、暗所で培養し、増殖する薬剤耐性カルスを得ることができた。なお、この間、アグロバクテリウムが増殖してくるようであれば、クラフォラン　（５００ｍｇ／Ｌ）入り滅菌水で再度洗浄して、Ｎ６ＳＥ寒天固形培地での培養を継続する。
【００４５】
上記で得た耐性カルスを、ＭＳＲＥ寒天固形培地（ＭＳ無機塩，ＭＳビタミン，ＫＮＯ３　（２８３０ｍｇ／Ｌ），　　（ＮＨ４）２ＳＯ４　（４６３ｍｇ／Ｌ），　　ＫＨ２ＰＯ４　（４００ｍｇ／Ｌ），　　ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ　（１６６ｍｇ／Ｌ），ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１８５ｍｇ／Ｌ），　　ＭｎＳＯ４／４Ｈ２Ｏ　（４．４ｍｇ／Ｌ），　　Ｈ３ＢＯ３　（１．６ｍｇ／Ｌ），　　ＺｎＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（１．５ｍｇ／Ｌ），ＫＩ　（０．８ｍｇ／Ｌ），　　ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ　（２７．８ｍｇ／Ｌ），　　Ｎａ２ＥＤＴＡ　（３７．３ｍｇ／Ｌ），　　グリシン（２．０ｍｇ／Ｌ），　　ニコチン酸　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　ピリドキシン塩酸塩　（０．５ｍｇ／Ｌ），　　チアミン　塩酸塩　（１．０ｍｇ／Ｌ），　　ミオイノシトール　（１００ｍｇ／Ｌ），　　ショ糖　（２０ｇ／Ｌ），　　ソルビトール　（３０ｇ／Ｌ），　カザミノ酸　（２ｇ／Ｌ），　　ＮＡＡ　（１ｍｇ／Ｌ），　　２，４−Ｄ　（２ｍｇ／Ｌ），　　アセトシリンゴン　（１０ｍｇ／Ｌ），　　０．２％ゲルライト，　　クラフォラン　（５００ｍｇ／Ｌ），　　ハイグロマイシン　（５０ｍｇ／Ｌ））に置床させ、２５℃、明所で培養し、再分化を誘導した。再分化したシュートは、ＭＳＨＦ寒天固形培地（ＭＳ無機塩、ＭＳビタミン、ショ糖（３０ｇ／Ｌ）、ハイグロマイシン　（５０ｍｇ／Ｌ）、寒天　（８ｇ／Ｌ））に移して発根を促し、組換え植物体を育成した。
【００４６】
実施例３：タバコ植物体へのＤＢＰＲ４プロモーターの導入
１．　タバコ細胞への発現ベクターの導入
タバコ（ＳＲ１系統）の葉を濾紙を敷いたシャーレ上に置き、葉脈に傷をつけ、主脈と葉の外縁部を除去して３−５ｍｍのリーフデイスクを得た後、滅菌水に浸漬したものにアグロバクテリウムを感染させた。実施例１で作製したアグロバクテリウム溶液１０ｍＬをプラスチックシャーレに移し、リーフデイスクを４分間浸漬させた。その後、リーフデイスクを濾紙上に置き、余分な水分を除去した。タバコ用共存培地ＭＳ２（ＭＳ＋ＢＡＰ　２ｍｇ／Ｌ　＋ＮＡＡ　０．１ｍｇ）上に濾紙を敷き、その上に感染後のリーフデイスクを置床させ、２日間共存培養を行った。その後アグロバクテリウムを除菌するために、リーフデイスクをタバコ用除菌培地ＭＳ３（ＭＳ＋ＢＡＰ　２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋５００ｍｇ／Ｌ　Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）に移植し、７日間培養した。
【００４７】
２．　リーフディスクからの植物体の再生
さらにリーフデイスクをタバコ用再分化培地ＭＳ４（ＭＳ＋ＢＡＰ２ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン＋２００ｍｇ／Ｌ　カナマイシン）に移植し、シュート原基が形成されるまで３週間培養した。形成されたシュート原基を含むカルス部位をリーフデイスクから切除し、同ＭＳ４でシュートが成長するまで培養した。さらにシュートの基部で切り出し、発根培地ＭＳ５（ＭＳ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）に差し込んで培養し、十分発根した植物体を順化して成長させた。
【００４８】
実施例４：形質転換植物におけるＤＢＰＲ４プロモータの効果
１．　イネ切葉試験
再分化したＧＵＳ遺伝子形質転換水稲を土壌に移植し、閉鎖系温室内で育成した。移植後３０日前後の３から５葉期の植物体を試験に用いた。植物体から７ｍｍ　ｘ７ｍｍ大の葉片を切りとり、以下の（１）〜（４）のいずれかの処理を行った。（１）そのまま液体窒素による凍結処理（無処理）、（２）マイクロタイタープレート内の蒸留水に浮かべて、３時間、６時間、１０時間、２４時間後に回収後凍結処理、（３）マイクロタイタープレート内の０．５％酵母エキス入り蒸留水に浮かべて、３時間、６時間、１０時間、２４時間後に回収後凍結処理、（４）マイクロタイタープレート内のいもち病菌細胞壁粗画分入り蒸留水に浮かべて、３時間、６時間、１０時間、２４時間後に回収後凍結処理。その後、各サンプルからタンパク質を抽出し、ＧＵＳ活性試験に供した。
【００４９】
２．　タバコ切葉試験
再分化したＧＵＳ遺伝子形質転換水稲を土壌に移植し、閉鎖系温室内で育成した。移植後３０日前後の植物体を試験に用いた。植物体から８ｍｍ径の葉片をコルクボーラーで切りとり、以下の（１）〜（３）のいずれかの処理を行った。（１）そのまま液体窒素による凍結処理（無処理）、（２）マイクロタイタープレート内の蒸留水に浮かべて、３時間、６時間、１０時間、２４時間後に回収後凍結処理、（３）マイクロタイタープレート内の０．５％酵母エキス入り蒸留水に浮かべて、３時間、６時間、１０時間、２４時間後に回収後凍結処理。その後各サンプルからタンパク質を抽出し、ＧＵＳ活性試験に供した。
【００５０】
３．　イネのいもち病菌接種試験
再分化したＧＵＳ遺伝子形質転換水稲を土壌に移植し、閉鎖系温室内で育成した。移植後３０日前後の３から５葉期の植物体を接種試験に用いた。ササニシキに対して親和性のいもち病菌系統である００７．０を接種試験に用いた。いもち病菌は１ｍＬあたり５ｘ１０５個の胞子濃度の０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む胞子懸濁液を植物体に散布し、その後湿度１００％で２５℃の加湿条件にて放置し、病斑進展後１週間の試料を採集しＧＵＳ活性試験に供した。
【００５１】
４．　タバコの灰色カビ病菌接種試験
再分化したＧＵＳ遺伝子形質転換タバコを土壌に移植し、閉鎖系温室内で育成した。移植後３０日前後の植物体を接種試験に用いた。灰色カビ病菌は１ｍＬあたり５ｘ１０５個の胞子濃度を含むＰＳ培地（２００ｇ／Ｌジャガイモ塊茎、２０ｇ／Ｌショ糖の煮沸上清）を植物体から切除したタバコ葉上に静置し、２日間その後湿度１００％で２５℃の加湿条件にて放置した後、ＧＵＳ活性試験に供した。
【００５２】
５．　ＧＵＳ活性試験
上記各試験サンプルについて、以下の方法でＧＵＳ活性の定量解析を行った。また、３および４の各試験サンプルについては、ＧＵＳ活性の組織化学的解析をおこなった。
（１）ＧＵＳ活性の定量解析
ＧＵＳ活性の定量解析は、Ｇｕｓ−ｌｉｇｈｔ　ＧＵＳ検出キット（Ｔｒｏｐｉｘ社）とルミノメータ（ＡＴＴＯ社）を利用して計測した。また、タンパク質量はＢｒａｄｆｏｒｄ（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　７２：２４８−２５４）にしたがって行った。
（２）ＧＵＳ活性の組織化学的解析
ＧＵＳ活性の組織化学的検出についてはＪｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法（ＥＭＢＯ．　Ｊ．　６：　３９０１，　１９８７）に基づいておこなった。すなわち、クロロフィルをメタノールにより除去した組織切片を　５０ｍＭ　ＮａＰＯ４　（ｐＨ７．０），　０．２　ｍＭ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−グルクロニド　（Ｘ−Ｇｌｕｃ），　０．１　ｍＭ−フェロシアン化カリウム、０．１　ｍＭ−フェリシアン化カリウムとの混合物中で処理して観察した。
【００５３】
６．　試験結果
（１）イネ切葉試験
イネ切葉試験の結果、ＤＢＰＲ４プロモータに連結したＧＵＳ遺伝子の活性は、水処理（傷処理）によって経時的に増加した。また０．５％酵母エキス、いもち病菌細胞壁粗画分によって処理後２４時間後には傷処理の２倍（酵母エキス）および６倍（いもち病菌細胞壁粗画分）以上の活性化が観察された（図３）
（２）タバコ切葉試験
タバコ切葉試験の結果、ＤＢＰＲ４プロモータに連結したＧＵＳ遺伝子の活性は、水処理（傷処理）によって経時的に増加した。また０．５％酵母エキスによって処理後２４時間後には傷処理の１．２倍程度の活性化が観察された（図４）
ＤＢＰＲ４プロモータの活性化程度をイネとタバコで比較した場合、傷処理による活性化では、イネではタバコの１０倍程度高い活性化が見られた。
（３）イネのいもち病菌接種試験
形質転換イネへのいもち病菌接種試験をおこなった結果、無処理のイネ葉においてはＧＵＳ活性は低かったが、いもち病菌胞子噴霧接種葉においては、いもち病斑部位周辺においてＧＵＳ活性が顕著に上昇していることが確認された（図５）。
（４）タバコの灰色カビ病菌接種試験
無処理のタバコ葉においてはＧＵＳ活性は低かったが、灰色カビ病菌胞子接種葉においては、接種部位周辺においてＧＵＳ活性が顕著に上昇していることが確認された（図６）。
【００５４】
７．　結論
本研究の結果、ＤＢＰＲ４遺伝子プロモーターは通常の葉での発現レベルは低く、傷処理により若干の活性化がおこり、イネにおいては酵母エキスといもち病菌細胞壁粗画分によって、タバコにおいては酵母エキスによって一層の活性化がみられること、さらにイネにおいてはいもち病菌感染により、タバコにおいては灰色カビ病菌により活性化されることが確認された。以上より、本研究で得られたプロモーター配列は、単子葉植物および双子葉植物の両植物において、病原菌への感染特異的に遺伝子発現を制御しうることが確認された。
【００５５】
【発明の効果】
本発明のカシュウイモ由来プロモーターは、単子葉植物および双子葉植物において病原菌感染特異的に、その下流に連結した遺伝子の発現をさせることができる。したがって、本発明のプロモーターを利用すれば、安全かつ優れた耐病性トランスジェニック植物を作出することが可能になる。
【００５６】
【配列表】
2004049143.tif 000003
2004049143.tif 000004
2004049143.tif 000005
2004049143.tif 000006
2004049143.tif 000007
【００５７】
【配列表フリーテキスト】配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（プライマー）
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＤＢＰＲ４を調節するプロモーター領域の塩基配列を示す。図中、ＰＲ４タンパク質構造領域はイタリック体で示されている。
【図２】図２は、本発明のプロモーターをＧＵＳ遺伝子に連結させたバイナリーベクターｐＲＴ１００１の構造を示す。
【図３】図３は、イネ切葉試験の結果を示すグラフである。図３Ａは、左から、無処理イネ切葉、形質転換イネ切葉を水、酵母エキス、いもち病菌エリシターに２４時間浮かべた後のＧＵＳ活性を示す。図３Ｂは、ＧＵＳ活性の経時変化を調べた結果を示す。
【図４】図４は、タバコ切葉試験の結果を示すグラフである。図４Ａは、左から、無処理タバコ切葉、形質転換タバコ切葉を水、酵母エキスに２４時間浮かべた後のＧＵＳ活性を示す。図４Ｂは、ＧＵＳ活性の経時変化を調べた結果を示す。
【図５】図５は、いもち病菌胞子接種試験の結果を示す。図５ＡはＧＵＳ活性の組織化学的検出結果を、図５ＢはＧＵＳ活性の定量解析結果を示す（Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃ）：バッファーのみを噴霧した個体、ＭＧ／ＮＬ：いもち病菌接種後病斑が進展していない部分、　ＭＧ／Ｌｅｓｉｏｎ：いもち病菌接種後病斑が進展した部分）。
【図６】図６は、灰色カビ病菌胞子接種試験の結果を示す。図６ＡはＧＵＳ活性の組織化学的検出結果を、図６ＢはＧＵＳ活性の定量解析結果を示す（Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃ）：ＰＳ培養液のみ、ＢＣ：ＰＳ培養液に懸濁した胞子、ＮＴｐＲＴ１００１−１とＮＴｐＲＴ１００１−２は独立に得られた２系統の形質転換体の番号）。
【図１】
2004049143.tif 000008
【図２】
2004049143.tif 000009
【図３】
2004049143.tif 000010
【図４】
2004049143.tif 000011
【図５】
2004049143.tif 000012
【図６】
2004049143.tif 000013