(57)【要約】【課題】鎮痛活性を有する新規化合物及び該化合物を固定化した固定化物、並びにこのような固定化物を用いて前記固定化物に結合し得る蛋白質をスクリーニングする方法を提供すること。【解決手段】本発明の化合物は、例えば、３−｛２−（３−カルボキシプロピオニル）アミノエトキシ｝−１７−（シクロプロピルメチル）−６，７−デヒドロ−４，５α−エポキシ−１４−ヒドロキシ−６，７−２’，３’−インドーロモルヒナンのような、一般式【化１】2004292386.tif 000021で示される化合物またはその薬理学的に許容される酸付加塩である。上記本発明の化合物が、樹脂粒子と結合してなる固定化物を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の固定化物を用いて、一般式（Ｉ）の化合物に結合し得る蛋白質をスクリーニングするプロセスを含む蛋白質のスクリーニング方法を提供した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2004292386.tif 000017
［式中、Ｒ１は、水素、ハロゲン、ニトロ、イソチオシアナト、トリフルオロメチル、トリフルオロメチルオキシ、シアノ、置換されてもよいアミノ基、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６のアルコキシ、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルを表し、
Ｒ２は、水素、ヒドロキシ、炭素数１〜５のアルカノイルオキシ、炭素数１〜６のアルコキシ、炭素数７〜１３のアリールカルボニルオキシまたは炭素数７〜１３のアラルキルオキシを表し、
ＸおよびＹはそれぞれ独立して、単結合、酸素、炭素数１〜３のアルキレンまたはＮＲ５であり（ここで、Ｒ５は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルである）、
Ｒ３とＲ４のいずれか一つが下記一般式（ＩＩ）
【化２】
2004292386.tif 000018
（式中、Ａは、単結合、炭素数１〜６のアルキレンまたは炭素数１〜６のアルケニレンを表し、Ｒ６は、水素または炭素数１〜６のアルキルを表し、Ｒ７は、置換されてもよいアミノ基、ヒドロキシル、チオール、ハロゲン、エポキシ、カルボキシルまたはカルバモイルを表し、ｎは、１〜６の整数である）で表される基であり、Ｒ３が前記一般式（ＩＩ）で定義される基である場合、Ｒ４は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルであり、Ｒ４が前記一般式（ＩＩ）で定義される基である場合、Ｒ３は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルである］で示される化合物またはその薬理学的に許容される酸付加塩。
【請求項２】
上記一般式（Ｉ）において、
［Ｘは、酸素またはＮＲ５を表し（Ｒ５は請求項１におけるＲ５の定義に同じ）、
Ｙは、単結合を表し、
Ｒ３とＲ４のいずれか一つが下記一般式（ＩＩＩ）
【化３】
2004292386.tif 000019
（式中、Ｂは、炭素数１〜６のアルキレンまたは炭素数１〜６のアルケニレンを表し、Ｒ８は、置換されてもよいアミノ基、ヒドロキシル、チオール、ハロゲン、エポキシ、カルボキシルまたはカルバモイルを表し、ｎは、１〜６の整数である）で表される基であり、Ｒ３が前記一般式（ＩＩＩ）で定義される基である場合、Ｒ４は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルであり、Ｒ４が前記一般式（ＩＩＩ）で定義される基である場合、Ｒ３は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルである］
で示される請求項１に記載の化合物またはその薬理学的に許容される酸付加塩。
【請求項３】
上記一般式（Ｉ）において、
［Ｘは、ＮＨを表し、
Ｒ３およびＲ４のいずれか一つが下記一般式（ＩＶ）
【化４】
2004292386.tif 000020
（式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して２〜４の整数である）で表される基であり、Ｒ３が前記一般式（ＩＶ）で定義される基である場合、Ｒ４は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキルまたは炭素数６〜１２のアリールを表し、Ｒ４が前記一般式（ＩＶ）で定義される基である場合、Ｒ３は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキルまたは炭素数６〜１２のアリールである］
で示される請求項２記載の化合物またはその薬理学的に許容される酸付加塩。
【請求項４】
上記置換されていてもよいアミノ基上の置換基は、炭素数１〜６のアルキル基、Ｂｏｃ基、Ｆｍｏｃ基、又はカルボニルアミノ基である請求項１又は２記載の化合物またはその薬理学的に許容される酸付加塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物が、樹脂粒子と結合してなる固定化物。
【請求項６】
前記樹脂がスチレン−グリシジルメタクリート重合体から成る請求項５記載の固定化物。
【請求項７】
請求項５に記載の固定化物を用いて、一般式（Ｉ）の化合物に結合し得る蛋白質をスクリーニングするプロセスを含む蛋白質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、新規化合物又はその塩、この化合物を固定化した固定化物、及びこの固定化物を用いる蛋白質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌を根治するための療法も薬剤も見出されていない現状において、癌の堪え難い痛みから患者を解放することは患者の生活の質（ＱＯＬ）を維持する上で大変重要なことである。そこで癌疼痛に対する鎮痛薬としてモルヒネに代表されるオピオイド系鎮痛薬が臨床現場では広く用いられている。しかし使用上の問題として、モルヒネには麻薬性（薬物依存性）、呼吸抑制、消化器系の副作用を有しており、薬効と副作用の両面で満足できる鎮痛薬は得られていないのが現状である。
【０００３】
一方、医薬品開発の一つの技術として、医薬品をキャッチする生体レセプターを同定し、分離精製することにより、このレセプターを利用して薬物のスクリーニングやドラッグデザインのための構造解析を行う方法が提案されているが（例えば特許文献１−４、非特許文献１−２参照）、癌疼痛をターゲット疾患として、このような医薬品開発の技術を利用した例は未だ見られない。したがって、癌疼痛をターゲット疾患として、上記のような医薬品開発の技術を利用することにより、薬理活性物質−生体レセプターの相互作用を解析し、コンビナトリアル化学に基づいて新規な薬理活性物質を創製し、より理想的な癌疼痛治療用薬剤さらには術後疼痛などの激しい疼痛に対する鎮痛薬を早期に開発する方法が求められている。
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−１９５０９９号公報
【特許文献２】特開２０００−３００２８３号公報
【特許文献３】特開２０００−３５１８１４号公報
【特許文献４】特開２００２−２８４７７２号公報
【非特許文献１】「メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、（米国）、１９９５年、第２５４巻、ｐ．５９５−６０４
【非特許文献２】「ネーチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、（米国）、２０００年、第１８巻、ｐ８７７−８８１
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような観点からなされたものであって、鎮痛活性を有する新規化合物ならびに、該化合物を固定化した固定化物を提供することにある。さらに、本発明の課題は、このような固定化物を用いて前記固定化物に結合し得る蛋白質をスクリーニングする方法を提供することにある。本発明によってスクリーニングされた蛋白質は、レセプターとして、薬物のスクリーニングやドラッグデザインのための構造解析に用いられる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の化合物が、鎮痛活性を有し、また、該化合物の固定化物が、レセプターとして、薬物のスクリーニングやドラッグデザインのための構造解析に有用なタンパク質のスクリーニングに有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、一般式（Ｉ）：
【化５】
2004292386.tif 000002
［式中、Ｒ１は、水素、ハロゲン、ニトロ、イソチオシアナト、トリフルオロメチル、トリフルオロメチルオキシ、シアノ、置換されてもよいアミノ基、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６のアルコキシ、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルを表し、
Ｒ２は、水素、ヒドロキシ、炭素数１〜５のアルカノイルオキシ、炭素数１〜６のアルコキシ、炭素数７〜１３のアリールカルボニルオキシまたは炭素数７〜１３のアラルキルオキシを表し、
ＸおよびＹはそれぞれ独立して、単結合、酸素、炭素数１〜３のアルキレンまたはＮＲ５であり（ここで、Ｒ５は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルである）、
Ｒ３とＲ４のいずれか一つが下記一般式（ＩＩ）
【化６】
2004292386.tif 000003
（式中、Ａは、単結合、炭素数１〜６のアルキレンまたは炭素数１〜６のアルケニレンを表し、Ｒ６は、水素または炭素数１〜６のアルキルを表し、Ｒ７は、置換されてもよいアミノ基、ヒドロキシル、チオール、ハロゲン、エポキシ、カルボキシルまたはカルバモイルを表し、ｎは、１〜６の整数である）で表される基であり、Ｒ３が前記一般式（ＩＩ）で定義される基である場合、Ｒ４は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルであり、Ｒ４が前記一般式（ＩＩ）で定義される基である場合、Ｒ３は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルである］で示される化合物またはその薬理学的に許容される酸付加塩を提供する。また、本発明は、上記本発明の化合物が、樹脂粒子と結合してなる固定化物を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の固定化物を用いて、一般式（Ｉ）の化合物に結合し得る蛋白質をスクリーニングするプロセスを含む蛋白質のスクリーニング方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の一般式（Ｉ）で示される新規化合物またはその薬理学的に許容される酸付加塩のなかで、好ましい実施形態は以下の通りである。
【０００９】
式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素、ハロゲン、ニトロ、イソチオシアナト、トリフルオロメチル、トリフルオロメチルオキシ、シアノ、置換されてもよいアミノ基、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６のアルコキシ、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルである。具体的には、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。置換されてもよいアミノ基としては、無置換アミノ基；炭素数１〜６のアルキル基で置換されたアミノ基、すなわち、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、ブチルアミノ；アミノ基の保護基（例えば、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ等）で置換されたアミノ基；カルボニルアミノ基で置換されたアミノ基（すなわち、カルバミド）等が好ましい例として挙げられる。炭素数１〜６のアルキルとしては、直鎖または分岐状のものが挙げられ、具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル等が好ましい例として挙げられる。炭素数１〜６のアルコキシとしては、直鎖または分岐状のものが挙げられ、具体的には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシルオキシ等が好ましい例として挙げられる。炭素数１〜６のアルケニルとしては、直鎖または分岐状のものが挙げられ、具体的には、ビニル、アリル、プロぺニル、イソプロぺニル等が好ましい例として挙げられる。炭素数６〜１２のアリールとしては、フェニル、ナフチル、トリル、キシリル、ビフェニル等が好ましい例として挙げられる。炭素数７〜１３のアラルキルとしては、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等が好ましい例として挙げられる。
【００１０】
式（Ｉ）において、Ｒ２は、水素、ヒドロキシ、炭素数１〜５のアルカノイルオキシ、炭素数１〜６のアルコキシ、炭素数７〜１３のアリールカルボニルオキシまたは炭素数７〜１３のアラルキルオキシである。具体的には、炭素数１〜５のアルカノイルオキシとしては、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ等が好ましい例として挙げられる。炭素数１〜６のアルコキシとしては上記と同様のものが好ましい例として挙げられる。炭素数７〜１３のアリールカルボニルオキシとしては、ベンゾイルオキシ、ナフチルカルボニルオキシ等が好ましい例として挙げられる。炭素数７〜１３のアラルキルオキシとしては、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ、ナフチルメチルオキシ等が好ましい例として挙げられる。
【００１１】
式（Ｉ）において、Ｘは単結合、酸素、炭素数１〜３のアルキレンまたはＮＲ５（ここで、Ｒ５は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルである）であり、中でも酸素またはＮＲ５が好ましく、特にＮＨ（Ｒ５が水素の場合）が好ましい。具体的には、炭素数１〜３のアルキレンとしては、メチレン、エチレン、プロピレン等が好ましい例として挙げられる。炭素数１〜６のアルキル、炭素数６〜１２のアリールおよび炭素数７〜１３のアラルキルとしては、上記と同様のものが好ましい例として挙げられる。
【００１２】
式（Ｉ）において、Ｙは単結合、酸素、炭素数１〜３のアルキレンまたはＮＲ５（ここで、Ｒ５は、上記と同様である）であり、特に単結合が好ましい。
【００１３】
式（Ｉ）において、Ｒ３とＲ４のいずれかが下記一般式（ＩＩ）
【化７】
2004292386.tif 000004
（式中、Ａは、単結合、炭素数１〜６のアルキレンまたは炭素数１〜６のアルケニレンであり、中でも炭素数１〜６のアルキレンまたは炭素数１〜６のアルケニレンが好ましく、特に炭素数２〜４のアルキレンが好ましい。Ｒ６は、水素または炭素数１〜６のアルキルであり、特に水素が好ましい。Ｒ７は、置換されてもよいアミノ基（好ましい例は上記と同じ）、ヒドロキシル、チオール、ハロゲン、エポキシ、カルボキシルまたはカルバモイルであり、特にカルボキシルが好ましい。ｎは、１〜６の整数であり、特に２〜４の時が好ましい。具体的には、炭素数１〜６のアルキレンおよび炭素数１〜６のアルキルとしては、上記と同様のものが好ましい例として挙げられる。炭素数１〜６のアルケニレンとしては、アリレン、イソプロペニレン等が好ましい例として挙げれられる。）で表される基が好ましい。
【００１４】
Ｒ３が前記一般式（ＩＩ）で定義される基である場合、Ｒ４は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルであり、中でもで水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数６〜１２のアリールが好ましい。具体的には、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールおよび炭素数７〜１３のアラルキルとしては、上記と同様のものが好ましい例として挙げられる。炭素数４〜７のシクロアルキルアルキルとしては、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル等が好ましい例として挙げられる。炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキルとしては、シクロブテニルメチル、シクロヘキセニルメチル等が好ましい例として挙げられる。
【００１５】
Ｒ４が前記一般式（ＩＩ）で定義される基である場合、Ｒ３は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルが好ましい例として挙げられ、中でもで水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数６〜１２のアリールが好ましい。
【００１６】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、好ましい一群の化合物として、上記一般式（Ｉ）において、Ｘは、酸素またはＮＲ５を表し（Ｒ５は請求項１におけるＲ５の定義に同じ）、
Ｙは、単結合を表し、
Ｒ３とＲ４のいずれか一つが下記一般式（ＩＩＩ）
【００１７】
【化８】
2004292386.tif 000005
【００１８】
（式中、Ｂは、炭素数１〜６のアルキレンまたは炭素数１〜６のアルケニレンを表し、Ｒ８は、置換されてもよいアミノ基、ヒドロキシル、チオール、ハロゲン、エポキシ、カルボキシルまたはカルバモイルを表し、ｎは、１〜６の整数である）で表される基であり、Ｒ３が前記一般式（ＩＩＩ）で定義される基である場合、Ｒ４は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルであり、Ｒ４が前記一般式（ＩＩＩ）で定義される基である場合、Ｒ３は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキル、炭素数１〜６のアルケニル、炭素数６〜１２のアリールまたは炭素数７〜１３のアラルキルである］
で示されるものを挙げることができる。
【００１９】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、さらに好ましい一群の化合物として、上記一般式（Ｉ）において、Ｘは、ＮＨを表し、
Ｒ３およびＲ４のいずれか一つが下記一般式（ＩＶ）
【００２０】
【化９】
2004292386.tif 000006
【００２１】
（式中、ｎおよびｍは、それぞれ独立して２〜４の整数である）で表される基で
あり、Ｒ３が前記一般式（ＩＶ）で定義される基である場合、Ｒ４は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキルまたは炭素数６〜１２のアリールを表し、Ｒ４が前記一般式（ＩＶ）で定義される基である場合、Ｒ３は、水素、炭素数１〜６のアルキル、炭素数４〜７のシクロアルキルアルキル、炭素数５〜７のシクロアルケニルアルキルまたは炭素数６〜１２のアリールである］
で示されるものを挙げることができる。
【００２２】
本発明の化合物としては、例えば下記表１及び表２に示すようなものが挙げられる。
【００２３】
表１
【化１０】
2004292386.tif 000007
【表１】
2004292386.tif 000008
【００２４】
表２
【化１１】
2004292386.tif 000009
【表２】
2004292386.tif 000010
【００２５】
化合物（Ｉ）の塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム又はカリウム塩）  及びアルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム又はマグネシウム塩）のような金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩  （例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン又はＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンとの塩）、有機酸との塩（例えば、酢酸、マレイン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ギ酸、トルエンスルホン酸もしくはトリフルオロ酢酸との塩）、無機酸との塩  （例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸又は燐酸との塩）、アミノ酸との塩（例えば、アルギニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸との塩）  等が挙げられ、中でも塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩が好ましく用いられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２６】
化合物（Ｉ）は、不斉炭素原子及び二重結合による１個以上の立体異性体を含んでいてもよく、このような異性体及びそれらの混合物もこの発明の範囲に含まれる。
【００２７】
化合物（Ｉ）およびその塩は、例えば、以下の方法により製造することができる。
方法１
【００２８】
【化１２】
2004292386.tif 000011
［式中、Ｒ１〜Ｒ３は上記と同義である。］
【００２９】
原料のアミン化合物は、モルヒナン化合物として市販されているものを用いることができる。中でもノルオキシコドンが特に好ましい。なおこの反応式中で、ＤＭＡＰはジメチルアミノピリジン、ＤＩＣはジイソプロピルカルボジイミド、ＨＯＢｔはヒドロキシベンゾトリアゾールを表す。またＲｅｓｉｎ（樹脂）は、ポリスチレンとジビニルベンゼンの架橋樹脂が好ましく、一般にメルフィールドレジン、Ｗａｎｇレジン、トリチルレジン、Ｒｉｎｋレジンと呼ばれる樹脂が好ましく、特にＷａｎｇレジンが好ましい。
【００３０】
方法２
【化１３】
2004292386.tif 000012
［式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は上記と同義である。］
【００３１】
原料のアルコール化合物は、モルヒナン化合物として市販されているものを用いることができる。中でもナルトレキソン、ナロキソンが好ましく、特にナルトレキソンが好ましい。なおこの反応式中で、ＤＥＡＤはジエチルアゾジカルボジイミドを表す。またＲｅｓｉｎは、上記と同義である。得られた化合物（Ｉ）の置換基が保護されている場合には、通常の方法でこの保護基を脱離してもよい。
【００３２】
これらの反応の各工程は、公知の化合物又は公知の化合物から誘導された化合物を使用して、後述する実施例に記載の方法又はこれらに準じた方法によって行うことができる。
【００３３】
この発明の化合物（Ｉ）及びその塩は癌疼痛治療用薬剤および鎮痛薬として有用である。化合物（Ｉ）を癌疼痛の治療または予防剤として用いる場合には、治療または予防を受ける者の年齢及び症状等により異なるが、治療剤としては、例えば、全身投与の場合、通常、１日あたり約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．１〜５００ｍｇ、より好ましくは約０．５〜１００ｍｇの化合物（Ｉ）またはその塩が投与され、具体的には、１日あたり平均０．２〜０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ及び５００ｍｇが投与される。長期間投与の際には、１日あたり約０．３ｍｇ／身体〜１０００ｍｇ／身体の範囲で投与される。
【００３４】
化合物（Ｉ）は、樹脂粒子、好ましくは、スチレン−グリシジルメタクリレート重合体からなる微粒子（以下「ＳＧ粒子」と記す）と結合して、本発明の固定化物となる。ＳＧＮＥＧＤＥＮ（ＳＧ粒子にアンモニアを加えエチレングリコールジグリシジルエーテルと反応させ、さらにアンモニアと反応させた）粒子は、特開平１０−１９５０９９号公報、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ２５４：ｐ５９５−６０４，  １９９５、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ，  １０：ｐ４１−４９，  １９９７及びＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １８：  ｐ８７７−８８１，  ２０００等の文献にしたがって合成することができる。この方法の好ましい例を以下に述べる。
【００３５】
スチレン（Ｓｔ；和光純薬工業、２１．５ｍｍＨｇ、４６℃で減圧蒸留後使用）、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ；和光純薬工業、２ｍｍＨｇ、３３℃で減圧蒸留後使用）、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ；東京化成工業）、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパンジハイドロクロライド）（Ｖ−５０；和光純薬工業）、及び水を過熱重合反応を行う。重合はソープフリー乳化重合により行う。重合開始後にＧＭＡを添加し、得られた重合体の表面を完全にＧＭＡにより覆う。得られた重合体（ＳＧ粒子）を遠心分離により沈澱し、上清をデカンテーション後、水に再分散する。上記操作を繰り返しＳＧ粒子を洗浄し、最後に水で分散する。この洗浄したＳＧ粒子にアミノ基を導入するために、ＮＨ４ＯＨを加え、ＨＣｌでｐＨ  を調整する。スターラーで攪拌しながら過熱反応させ、ＧＭＡのエポキシ基を開環する。
【００３６】
次に、スペーサーとしてエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ；和光純薬工業）を導入する。ＳＧ粒子表面のアミノ基の数十から数百倍量  （ｍｏｌ）となるように過剰のＥＧＤＥを仕込み、ＥＧＤＥのエポキシ基とＳＧ粒子上のアミノ基との間で共有結合させる。ＥＧＤＥ１分子の両末端にあるエポキシ基が同時にＳＧ粒子に固定化されることを防ぐために過剰量のＥＧＤＥを加えた。反応後、得られた粒子を遠心操作により水で洗浄する。こうして得られた粒子をＳＧＥＧＤＥ粒子とする。ＳＧＥＧＤＥ粒子にアミノ基を導入するために、ＮＨ４ＯＨを加え、ＨＣｌでｐＨ  を調整する。スターラーで攪拌しながら過熱反応させ、ＳＧＥＧＤＥ粒子の表面エポキシ基を開環する。こうして得られたアミノ基型スペーサー固定化ＳＧＥＧＤＥＮ粒子を生理活性化合物を固定化するための粒子として使用する。
【００３７】
ＳＧ粒子は、重合状態、形態等、特に限定されるものではないが、通常の液体クロマトグラフィーの固定相に使用し得るものであることが好ましい。例えば、スチレンとグリシジルメタクリレートとを重合させ、重合体の表面にグリシジル基を有するものが挙げられる。ＳＧ粒子の大きさは、例えば、０．０５から０．５μｍ程度が好ましい。
【００３８】
本願一般式（Ｉ）の化合物とＳＧ粒子を結合させる際は、結合前の化合物（Ｉ）とＳＧ粒子の両端が同一又は異なってアミノ基、カルボキシ基、エポキシ基等の官能基を有していることが好ましい。通常、化合物（Ｉ）とＳＧ粒子の両方またはいずれかが、活性エステルまたはハロゲン体（例えば、ヨード体等）等に変換された後、アミド結合、アミノ結合、エーテル結合、炭素−炭素結合によって結合する。
【００３９】
本発明の蛋白質のスクリーニング方法は、上記の固定化物を用いて、化合物（Ｉ）に結合し得る蛋白質をスクリーニングすることにより行われる。
【００４０】
具体的には、蛋白質を含有する細胞抽出液に上記固定化物を混合し、必要に応じて攪拌した後、固定化物を分離し、この固定化物から蛋白質を溶出して、解離させることにより行われる。このようにして、化合物（Ｉ）に作用する部位を含む特定の蛋白質（例えば、レセプター）をスクリーニングすることができる。
【００４１】
固定化物と蛋白質との特異的な結合は、水素結合等の化学結合、化学的又は物理的な吸着等のいずれであってもよい。
【００４２】
得られた蛋白質は、任意に、クロマトグラフィー等の公知の方法により精製し、蛋白質をコードする遺伝子をクローニングし、そのアミノ酸配列、遺伝子の塩基配列を決定することができ、ひいてはこの蛋白質やその部分配列を有するペプチドを遺伝子組換え微生物で多量に製造することにより、薬物のスクリーニングやドラッグデザインのための構造解析などに利用することができる。すなわち、上記のようにして得られたレセプターとしての蛋白質に親和性を有する化合物を探索することにより、癌疼痛に対してより強い鎮痛活性を有する化合物を見出すことができる。
【００４３】
【実施例】
以下に、本発明の化合物、固定化物の実施例を具体的に説明する。
実施例１：１７−｛４−（３−カルボキシプロピオニル）アミノブチル｝−６，７−デヒドロ−４，５α−エポキシ−１４−ヒドロキシ−３−メトキシ−６，７−２’，３’−インドーロモルヒナンの合成
【００４４】
【化１４】
2004292386.tif 000013
【００４５】
Ｗａｎｇレジン（１．２２  ｍｍｏｌ／ｇ，  １．０  ｇ，  １．２  ｍｍｏｌ）に無水コハク酸  （３．０  ｇ，  ３０  ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（６２  ｍｇ，  ０．５  ｍｍｏｌ）、塩化メチレン（１０  ｍｌ）を加え６０℃で５時間加熱を行った。混合物を濾過し、樹脂をＤＭＦ（５  ｍｌ、５回）、メタノール（５  ｍｌ、５回）、ＴＨＦ（５  ｍｌ、５回）、塩化メチレン（５  ｍｌ、５回）で洗浄し、真空乾燥を行い、樹脂１（１．１７  ｇ）を得た。
ＩＲ  ：  １７１７  ｃｍ−１
【００４６】
樹脂１（１．０  ｇ，  ２５０  ｍｇずつメッシュ状反応容器（マクロカン）４個に詰めた。合計１．０  ｍｍｏｌ）に無水１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２１７  ｍｇ，  １．６  ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（３２  ｍｌ）、ジイソプロピルカルボジイミド（２５０  μｌ，  １．６  ｍｍｏｌ）を加えて１５分間振蕩した。３−アミノプロピオンアルデヒドジエチルアセタール（５１７  μｌ，  ３．２  ｍｍｏｌ）を加えて１６時間振蕩した後、混合物を濾過し、樹脂をＤＭＦ（１０  ｍｌ、５回）、メタノール（１０  ｍｌ、５回）、ＴＨＦ（１０  ｍｌ、５回）、塩化メチレン（１０  ｍｌ、５回）で洗浄し、真空乾燥を行い、樹脂２を得た。
【００４７】
ＴＨＦ（３０  ｍｌ）と１Ｎ塩酸水溶液（６  ｍｌ）の混合溶媒の中に樹脂２を加え、２５分間振蕩を行った。混合物を濾過し、樹脂をＤＭＦ（１０  ｍｌ、５回）、メタノール（１０  ｍｌ、５回）、ＴＨＦ（１０  ｍｌ、５回）、塩化メチレン（１０  ｍｌ、５回）で洗浄し、真空乾燥を行った。続いてノルオキシコドン（１．８  ｇ，  ６  ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ−酢酸の混合溶媒（１００：１，  ２０  ｍｌ）、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（３７７  ｍｇ，  ６  ｍｍｏｌ）を加えて室温で１６時間振蕩を行った。混合物を濾過し、樹脂をＤＭＦ（１０  ｍｌ、５回）、メタノール（１０  ｍｌ、５回）、ＴＨＦ（１０  ｍｌ、５回）、塩化メチレン（１０  ｍｌ、５回）で洗浄し、真空乾燥を行い、樹脂３（メッシュ状反応容器４個）を得た。
【００４８】
樹脂３（メッシュ状反応容器１個、２６０  μｍｏｌ）に塩化メチレン−酢酸混合溶媒（１：１，  ２０  ｍｌ）、フェニルヒドラジン（２９０  μｌ，  ３．０  ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１時間振蕩を行った。混合物を濾過し、樹脂をＤＭＦ（１０  ｍｌ、５回）、メタノール（１０  ｍｌ、５回）、ＴＨＦ（１０  ｍｌ、５回）、塩化メチレン（１０  ｍｌ、５回）で洗浄し、真空乾燥を行った。得られた樹脂に５％  トリフルオロ酢酸の塩化メチレン溶液（２  ｍｌ）を加えて２．５時間振蘯した。濾過し、樹脂を塩化メチレン（２  ｍｌ、２回）で洗浄し、濾液とあわせて真空乾燥し、標題化合物（４１  ｍｇ）  を得た。
ＬＣ−ＭＳデータ：
カラム：ＨＹＰＥＲＳＩＬ  ＯＤＳ  ５μｍ，  ４＊１２５  ｍｍ  （ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）
展開溶媒：０．１％ギ酸水溶液：０．１％ギ酸アセトニトリル＝９５：５（０  ｍｉｎ）→０：１００（８  ｍｉｎ）
リテンションタイム：  ３．９  ｍｉｎ
ＥＳＩ−ＭＳ；５３２  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００４９】
実施例２：３−｛２−（３−カルボキシプロピオニル）アミノエトキシ｝−１７−（シクロプロピルメチル）−６，７−デヒドロ−４，５α−エポキシ−１４−ヒドロキシ−６，７−２’，３’−インドーロモルヒナンの合成
【００５０】
【化１５】
2004292386.tif 000014
【００５１】
ナルトレキソン（２．０  ｇ，  ５．９  ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０  ｍｌ）にトリフェニルホスフィン（３．１  ｇ，  １１．７  ｍｍｏｌ）とＮ−Ｆｍｏｃ−エタノールアミン（３．７  ｇ，  １２．９  ｍｍｏｌ）を加えた後、ジエチルアゾジカルボン酸エステル（４０％トルエン溶液、６．４  ｍｌ，  １４．１  ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、１５分間攪拌した。反応溶液にクロロホルム（１００  ｍｌ）と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００  ｍｌ）を加えて分液を行った。有機層を飽和食塩水（４０  ｍｌ）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮、真空乾燥を行い、カラムクロマト（シリカゲル２００  ｇ、クロロホルム）により、精製を行い、化合物１（１１  ｇ）を得た。
【００５２】
化合物１（１．６  ｇ，  ０．８  ｍｍｏｌ）にエタノール（５  ｍｌ）、フェニルヒドラジン（３００  μｌ，  ３．１  ｍｍｏｌ）、メタンスルホン酸（３００  μｌ）を加えて、７０℃で１時間攪拌を行った。反応溶液にクロロホルム（２０  ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２０  ｍｌ）を加えて分液を行った。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮を行い、カラムクロマト（シリカゲル２５  ｇ，  クロロホルム）により精製を行い、化合物２（７５０  ｍｇ）を得た。
【００５３】
ピペラジノメチルポリスチレン（０．６９  ｍｍｏｌ／ｇ，  １．４  ｇ）に化合物２（２８０  ｍｇ）のＤＭＦ溶液（４  ｍｌ）を加えて１８時間振蕩を行った。混合物を濾過し、樹脂をＤＭＦ（４  ｍｌ）、ＴＨＦ（４  ｍｌ、２回）で洗浄し、濾液および洗浄溶液を合わせて濃縮し、オイル（２１０  ｍｇ）を得た。このオイルに酢酸エチル（１０  ｍｌ）と水（５  ｍｌ）を加えて分液を行った。有機層に１Ｎ塩酸水溶液（１０  ｍｌ）を加えて分液を行った。水層を酢酸エチル（５  ｍｌ）、クロロホルム（５  ｍｌ、４回）、酢酸エチル（５  ｍｌ）で洗浄を行い、濃縮し、塩化メチレン（１０  ｍｌ、５回）で洗浄し、真空乾燥を行い、化合物３（３３  ｍｇ）を得た。
【００５４】
化合物３（９．１ｍｇ，  ２０μｍｏｌ）をＤＭＦ（４５０μｌ）に溶解し、８９ｍＭとなるようにジオキサンに溶解した無水コハク酸（４５０μｌ）とトリエチルアミン（１００μｌ）を添加した（無水コハク酸とトリエチルアミンの終濃度はそれぞれ４０ｍＭと１０％）。チューブを激しく攪拌しながら、室温、３０分間反応させた。その後、溶媒を減圧下で除去し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍ６００  ｐｕｍｐ  ｓｙｓｔｅｍに装着したＳｙｍｍｅｔｒｙ  ８．０ｘ３００  ｍｍ  ＯＤＳ  ｃｏｌｕｍｎで、１０ｍＭ  酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．４）とアセトニトリルの混合溶媒を移動相として精製した。目的物は質量分析法により同定した。ＥＳＩ−ＭＳ；５５８  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００５５】
実施例３：１７−｛４−（３−カルボキシプロピオニル）アミノブチル｝−６，７−デヒドロ−４，５α−エポキシ−１４−ヒドロキシ−３−メトキシ−６，７−２’，３’−インドーロモルヒナン固定化ＳＧＮＥＧＤＥＮ粒子の作製
【００５６】
【化１６】
2004292386.tif 000015
【００５７】
１）ＳＧＮＥＧＤＥＮ粒子への固定化
スチレン（Ｓｔ；和光純薬工業、２１．５ｍｍＨｇ、４６℃で減圧蒸留後使用）、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ；和光純薬工業、２ｍｍＨｇ、３３℃で減圧蒸留後使用）、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ；東京化成工業）、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパンジハイドロクロライド）（Ｖ−５０；和光純薬工業）、及び水を以下の処方で、Ｓｔ／ＧＭＡ／ＤＶＢ／Ｖ−５０／Ｈ２０＝１．２／１．８＋０．３／０．０４／０．０６／１１０（ｇ）窒素置換後に７０℃、２４時間重合反応を行った。重合はソープフリー乳化重合により行った。重合開始２時間後にＧＭＡ  ０．３ｇを添加し、得られた重合体の表面を完全にＧＭＡにより覆った。得られた重合体（ＳＧ粒子）を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）により沈澱し、上清をデカンテーション後、水２００ｍｌに再分散した。上記操作を３回繰り返しＳＧ粒子を洗浄し、最後に水で分散した。この洗浄したＳＧ粒子（０．２５ｇ）にアミノ基を導入するために、ＮＨ４ＯＨ（５５．３ｍｍｏｌ；ＧＭＡ  ｕｎｉｔの５０倍量に相当）を加え、１ＮのＨＣｌでｐＨ  １１に調整した。スターラーで攪拌しながら７０℃、２４時間反応させ、ＧＭＡのエポキシ基を開環した。
【００５８】
次に、スペーサーとしてエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ；和光純薬工業）を導入した。約６２．５ｍｇのＳＧ粒子表面のアミノ基の１００倍量  （ｍｏｌ）となるように過剰のＥＧＤＥを仕込み、３０℃、２４時間、ｐＨ  １１（１ＮのＮａＯＨで調整）で攪拌することにより、ＥＧＤＥのエポキシ基とＳＧ粒子上のアミノ基との間で共有結合させた。ＥＧＤＥ１分子の両末端にあるエポキシ基が同時にＳＧ粒子に固定化されることを防ぐために過剰量のＥＧＤＥを加えた。この条件下で、粒子１ｇ当たり、約１ｍｍｏｌのＥＧＤＥが固定化された。反応後、得られた粒子を遠心操作により水で３回洗浄した。こうして得られた粒子をＳＧＥＧＤＥ粒子とした。
【００５９】
ＳＧＥＧＤＥ粒子（１ｇ）にアミノ基を導入するために、ＮＨ４ＯＨ（５０ｍｍｏｌ；ＥＧＤＥの５０倍量に相当）を加え、１ＮのＨＣｌでｐＨ  １１に調整した。スターラーで攪拌しながら７０℃、２４時間反応させ、ＳＧＥＧＤＥ粒子の表面エポキシ基を開環した。こうして得られたアミノ基型スペーサー固定化型粒子をＳＧＥＧＤＥＮ粒子とし、生理活性化合物を固定化するための粒子として使用した。
【００６０】
合成したＳＧＮＥＧＤＥＮ粒子表面上のアミノ基含量は電気伝導度の変化を滴定することにより求めた。その方法は、Ｋａｗａｇｕｃｈｉらの報文（Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｏｌｙ．  Ｓｃｉ．，  ２６，  ２０１５−２０２２，  １９８１）に拠った。その概略は以下のとおりである。微粒子を含む溶液のｐＨを、水酸化ナトリウムを加えることにより過剰にアルカリ性に調整し、微粒子のアミノ基を非イオン型にしておく。そこに塩酸を加えると、水酸基の中和のためにイオンが消費されるため電気伝導度は低下する。溶液の水酸基が完全に中和され、アミノ基が中和され始める点で、電気伝導度変化が上昇に転じるため、第一の変曲点が現れる。さらに、塩酸を加え、完全にアミノ基が中和されると、加える塩酸が溶液中に過剰になるためにさらに伝導度が上昇し、電気伝導度変化に第二の変曲点が現れる。その、２つの変曲点間に滴下した塩酸に対して当量にあたる量がアミノ基量として計算される。
【００６１】
ＳＧＮＥＧＤＥＮ粒子（１．２％（ｗ／ｖ）水懸濁液、アミノ基含量  ０．４４  ｍｍｏｌ／ｇ）２０８μｌ（２．５ｍｇ）をエッペンドルフチューブに取り、蒸留水４２μｌを添加し１％（ｗ／ｖ）懸濁液にした。この懸濁液を微量高速遠心機（ＴＯＭＹ精工製  ＭＸ−１６０）で１５０００ｒｐｍ、５分遠心分離することにより微粒子を集め、再び５００μｌの水に懸濁する操作（以下、この操作を洗浄操作と呼ぶ）を２回行った。さらに遠心分離により微粒子を集め、５００μｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄する操作を５回繰り返して行い、溶媒を完全にＤＭＦに置換した。再び遠心分離により微粒子を集め、４５０μｌのＤＭＦに懸濁し、１００−５００  ｎｍｏｌ（２−１０ｍＭ）の実施例１記載の化合物，１７−｛４−（３−カルボキシプロピオニル）アミノブチル｝−６，７−デヒドロ−４，５α−エポキシ−１４−ヒドロキシ−３−メトキシ−６，７−２’，３’−インドーロモルヒナンを加え、縮合剤ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシミド），およびＷＳＣＤ（ウォーターソリブルカルボジイミド）  をそれぞれ１５００ｎｍｏｌ（３０ｍＭ）含むＤＭＦ溶液を５０μｌ加えて、激しく撹拌しながら室温で５時間反応させた。ＤＭＦで５回洗浄した。
【００６２】
２）アミノ基のマスキング
反応後の微粒子は５００μｌのＤＭＦで２回洗浄し、４５０μｌのＤＭＦに懸濁した。トリエチルアミン５０μｌ、無水酢酸２０μｌを添加し、激しく攪拌しながら、室温で２時間反応し、未反応のアミノ基をマスキングした。
【００６３】
マスキング反応後の微粒子は５００μｌのＤＭＦで２回洗浄し、さらに２５０μｌのＤＭＦに２回分散させた。
【００６４】
３）水酸基の再生
洗浄後の微粒子を２５０の０．１Ｎ  ＮａＯＨを加えて３０分間反応させた。
反応後の微粒子を５００μｌの水で５回洗浄後、５００μｌ水に懸濁し、４℃で保存した。
【００６５】
４）固定化の確認
オピオイド固定化ＳＧＮＥＧＤＥＮ微粒子０．５ｍｇを、Ｗａｔｅｒｓ製気相反応バイアルに試験管を入れ、試験管の外側に定沸点塩酸を３００μｌ加えた。真空ポンプを用いて、気相反応バイアル内を減圧し、バルブを閉じた。恒温アルミブロックで１１０℃、２４時間加熱し、加水分解反応を行った。反応後の加水分解物は、４００μｌの５０％アセトニトリル水溶液で抽出し、０．１μｍのフィルターを通して固形成分を除去した後、減圧乾固させた。ＬＣ−ＭＳで解析したところ、１７−｛４−（３−カルボキシプロピオニル）アミノブチル｝−６，７−デヒドロ−４，５α−エポキシ−１４−ヒドロキシ−３−メトキシ−６，７−２’，３’−インドーロモルヒナンの分解産物が同定されたことにより、１７−｛４−（３−カルボキシプロピオニル）アミノブチル｝−６，７−デヒドロ−４，５α−エポキシ−１４−ヒドロキシ−３−メトキシ−６，７−２’，３’−インドーロモルヒナンが微粒子に固定化されていることが確認された。以下に、ＨＰＬＣ分析条件および同定された分解産物を記す。
【００６６】
分析条件
カラム：ＰＥバイオシステムズ製ペプチド精製カラム（Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ４０１９６６）  ＯＤＳ，  ５μｍ，  １２０Ａ  ０．５ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ
移動相：Ａ液  ０．１％ギ酸  ／  水
Ｂ液  ０．１％ギ酸  ／  アセトニトリル
５％  Ｂ液  （０分）→９０％  Ｂ液  （４０分）
流速  ：５  μｌ／分
温度  ：４０℃
検出  ：ＰＥバイオシステムズ製Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳＩ飛行時間型質量分析装置
同定分解産物：５３２．３  （Ｍ＋Ｈ）＋
【００６７】
実施例４：３−｛２−（３−カルボキシプロピオニル）アミノエトキシ｝−１７−（シクロプロピルメチル）−６，７−デヒドロ−４，５α−エポキシ−１４−ヒドロキシ−６，７−２’，３’−インドーロモルヒナン固定化ＳＧＮＥＧＤＥＮ粒子の作製
【００６８】
【化１７】
2004292386.tif 000016
【００６９】
実施例３に準じて、（１７−｛４−（３−カルボキシプロピオニル）アミノブチル｝−６，７−デヒドロ−４，５α−エポキシ−１４−ヒドロキシ−３−メトキシ−６，７−２’，３’−インドーロモルヒナンに換えて、実施例２記載の化合物，３−｛２−（３−カルボキシプロピオニル）アミノエトキシ｝−１７−（シクロプロピルメチル）−６，７−デヒドロ−４，５α−エポキシ−１４−ヒドロキシ−６，７−２’，３’−インドーロモルヒナンを用いて、１）ＳＧＮＥＧＤＥＮ粒子ヘの固定化、２）アミノ基のマスキング、３）水酸基の再生、４）固定化確認を行った。以下に、ＨＰＬＣ分析条件および同定された分解産物を記す。
【００７０】
分析条件
カラム：ＰＥバイオシステムズ製ペプチド精製カラム（Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  ４０１９６６）  ＯＤＳ，  ５μｍ，  １２０Ａ  ０．５ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ
移動相：Ａ液  ０．１％ギ酸  ／  水
Ｂ液  ０．１％ギ酸  ／  アセトニトリル
５％  Ｂ液  （０分）→９０％  Ｂ液  （４０分）
流速  ：５  μｌ／分
温度  ：４０℃
検出  ：ＰＥバイオシステムズ製Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳＩ飛行時間型質量分析装置
同定分解産物：５４０．２（Ｍ＋Ｈ）＋  （加水分解処理中に生じた脱水分解物であることを確認した）
【００７１】
実施例５：膜結合型オピオイドレセプターの分離
１）オピオイドレセプターを含む細胞膜画分の抽出
δ型オピオイドレセプターの遺伝子を組み込んだＣｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ由来株化細胞（ＣＨＯ細胞）は、Ｋａｔｓｕｍａｔａ  Ｓ，  Ｍｉｎａｍｉ  Ｍ，  Ｎａｋａｇａｗａ  Ｔ，  Ｉｗａｍｕｒａ  Ｔ，  Ｓａｔｏｈ  Ｍ．，  ”Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｏｒｐｈｉｎｅ  ｉｎ  ｃｌｏｎｅｄ  ｍｕ−，  ｄｅｌｔａ−  ａｎｄ  ｋａｐｐａ−ｏｐｉｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９９５  ２９１（３）：３６７−７３記載の方法に従って調製した。その手順を以下に述べる。まず、ラットよりクローニングしたδ型オピオイドレセプター相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、遺伝子発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＵＳＡより入手）に挿入したものを作製した。その遺伝子ベクターを、遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＵＳＡより入手）を用いて、ＣＨＯ細胞に導入した。ＣＨＯ細胞は、ＣＨＯ細胞はＦ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）  （１０％非動化牛胎児血清，  Ｇ４１８  ５００  μｇ／ｍｌを含む）培地中、炭酸ガス濃度５％，３７℃で培養し、抗生物質Ｇ４１８に対して耐性を持つ細胞の単一クローンを分離した。分離したＧ４１８耐性ＣＨＯ細胞中のδ型オピオイドレセプターｍＲＮＡ量を、ノザンブロット法により確認した。
【００７２】
次に、δ型オピオイドレセプターを発現するＣＨＯ細胞の細胞膜画分を調製した。δ型オピオイドレセプター発現ＣＨＯ細胞は、Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）  （１０％非動化牛胎児血清，  ペニシリン６０  ユニット／ｍｌ，  ストレプトマイシン６０  μｇ／ｍｌ，  Ｇ４１８  １００  μｇ／ｍｌを含む）中で培養した。１２０枚の１５０ｍｍ培養用ディッシュにコンフルエント状態になるまで増殖させた後、物理的に培養ディッシュ底面より剥がした細胞をＰＢＳ（−）中に回収した。以下、氷上または４℃で操作を行なった。緩衝液Ａ（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．４），  １  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．５  ｍＭ  ＤＴＴ，  １ｍＭ  ＰＭＳＦ，  １  μＭ  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，  １  ｍｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）に、回収した細胞を分散させ、１０分間置いた。低張液中で膨張した細胞をグラスホモジナイザーで破砕し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに調整して低速遠心（１２００  ｘ  ｇ，  １０分間）を行なった。上清を分離し、超遠心（１０００００  ｘ  ｇ，  ６０分間）操作により得られた沈でん画分を粗膜蛋白質抽出試料とした。
【００７３】
オピオイドレセプターは７回膜貫通型タンパク質であることから、Ｏｆｒｉ  Ｄ，  Ｒｉｔｔｅｒ  ＡＭ，  Ｌｉｕ  ＹＦ，  Ｇｉｏａｎｎｉｎｉ  ＴＬ，  Ｈｉｌｌｅｒ  ＪＭ，  Ｓｉｍｏｎ  ＥＪ．，  ”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｐｉｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ．”  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １９９２  ５８（２）：６２８−３５に記載された方法に従って、界面活性剤により抽出した。その手順を以下に述べる。粗膜蛋白質抽出試料に緩衝液Ｂ（０．３  ％  ＣＨＡＰＳ，  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．４），  ２５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １ｍＭ  ＰＭＳＦ，  １  μＭ  Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，  １  ｍｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）を加え、２３ゲージの針に通して懸濁後２０分置いた。超遠心（１０００００  ｘ  ｇ，  ６０分間）して残査を除去した。
【００７４】
２）オピオイドレセプターの分離
上記のタンパク質抽出液に含まれる可溶化δ型オピオイドレセプターの結合スクリーニングを、実施例４で作製したオピオイド固定化ＳＧＮＥＧＤＥＮ粒子で行なった。オピオイドレセプターを含む粗膜蛋白質抽出試料と固定化ＳＧＮＥＧＤＥＮ粒子を混合し、一定時間ゆるく攪拌した後、微粒子を分離した。粒子に吸着した蛋白質を抽出後ＳＤＳ電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜にブロッティングし、市販の抗体および抗体発色試薬を用いてδ型オピオイドレセプターを検出した。その結果、固定化ＳＧＮＥＧＤＥＮ粒子に吸着した蛋白質にδ型オピオイドレセプターが含まれることが示された。そのことから、オピオイド固定化ＳＧＮＥＧＤＥＮ粒子がオピオイド結合活性型のレセプターを分離できることが判明した。
【００７５】
【発明の効果】
本発明により、一般式（Ｉ）で示される新規な化合物が提供された。本発明の化合物は、鎮痛活性を有し、癌疼痛の治療剤として用いられる。また、本発明の化合物とスチレン−グリシジルメタクリレート重合体からなる微粒子と結合させて固定化物とし、この固定化物を用いて本発明の化合物と結合し得る蛋白質をスクリーニングすることができる。この蛋白質は、レセプターとして薬効のスクリーニングやドラッグデザインのための構造解析に用いられる。