(57)【要約】【課題】ＲＮＡｉ表現型をもつマウスなどの哺乳動物の取得効率を向上させるために、ｄｓＲＮＡの導入方法を改良すること。【解決手段】標的遺伝子を組み込んだパピローマウイルスベクターを細胞に導入することを含む、該標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物を作製する方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子を組み込んだパピローマウイルスベクターを細胞に導入することを含む、該標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【請求項２】
標的遺伝子の逆向き反復配列を組み込んだパピローマウイルスベクターを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パピローマウイルスベクターがウシパピローマウイルスベクターである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
目的遺伝子を組み込んだパピローマウイルスベクターを受精卵に導入し、該受精卵を用いてトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作成する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１から４の何れかに記載の方法により作製される、標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物又はその子孫又はその一部。
【請求項６】
哺乳動物細胞で発現可能な標的遺伝子の逆向き反復配列をパピローマウイルスベクターに組み込んだ、組み換えベクター。
【請求項７】
パピローマウイルスベクターがウシパピローマウイルスベクターである、請求項６に記載の組み換えベクター。
【請求項８】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列を含む、請求項６又は７に記載の組み換えベクター。
【請求項９】
標的遺伝子が、外来性レポータータンパク質またはその変異タンパク質の遺伝子である、請求項６から８の何れかに記載の組み換えベクター。
【請求項１０】
外来性レポータータンパク質が、Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｉｅｎ（ＥＧＦＰ）である、請求項９に記載の組み換えベクター。
【請求項１１】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製のために使用する、請求項６から１０の何れかに記載の組み換えベクター。
【請求項１２】
請求項６から１１の何れかに記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項１３】
請求項６から１１の何れかに記載の組み換えベクターを導入した非ヒト哺乳動物の受精卵から発生した胚。
【請求項１４】
請求項１３に記載の胚を、対応する非ヒト哺乳動物の子宮または卵管へ移植して発生させた胎児。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、パピローマウイルスベクターを用いてＲＮＡｉ表現型を有する非ヒト哺乳動物を作製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、個体レベルにおけるＤＮＡの機能解明においては、遺伝子ノックアウト動物を作成し、その表現系を解析するという方法で行われてきた。しかしながら、このノックアウト法は多大な労力と時間がかかり、数多くの遺伝子機能解析には実用的ではない。従って、これまでのノックアウト法より有効でかつ、より簡便な、動物個体での遺伝子機能抑制方法が望まれている。
【０００３】
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、ある遺伝子（ターゲット遺伝子とよぶ）の一部をコードするｍＲＮＡの一部を二本鎖にしたＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を細胞へ導入すると、ターゲット遺伝子の発現が抑制される現象を言う。１９９８年、生体内へのｄｓＲＮＡの導入が導入遺伝子と同じ遺伝子の発現に対して抑制作用を持つことが，線虫において発見された（Ｎａｔｕｒｅ，　３９１（６６６９）　８０６−８１１，　　１９９８）。その後、真菌類、植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｃｕｍとＯｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ、プラナリア、トリパノソーマＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２７５（５１）　４０１７４−４０１７９，　２０００）、ハエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｃｅｌｌ，　９５（７）　１０１７−１０２６，　１９９８）及び脊椎動物であるゼブラフィッシュでも観察され、ＲＮＡｉは種を越えて普遍的に存在する現象であると考えられるようになった。
【０００４】
ＲＮＡｉの技術的応用については、線虫において、遺伝子ノックアウト技術として確立し、線虫全ゲノム配列決定計画により得られた全塩基配列情報を用いた、ゲノム機能解析の主要な手段として利用されている（Ｎａｔｕｒｅ，　４０８（６８１０）　３２５−３３０，２０００；Ｎａｔｕｒｅ，　４０８（６８１０）　３３１−３３６，２０００）。哺乳動物のゲノム機能解析においても、遺伝子ノックアウトより時間的、労力的に負担の少ない方法として、効率的な遺伝子発現抑制の方法として期待されている。
【０００５】
哺乳類では、マウスの初期胚（Ｎａｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，２（２）　７０−７５，　２０００）にｄｓＲＮＡをインジェクションする実験においてＲＮＡｉ効果が初めて報告されたが、その効果は初期胚に限られ、誕生した時にはＲＮＡｉ効果が消失していた。この理由としては、１細胞期受精卵に導入したｄｓＲＮＡが胚の分割増殖に依存して希釈され、ＲＮＡｉに必要な濃度を維持できなくなっていると考えられているが、その他、哺乳類には生物学的に線虫と異なるメカニズムが存在する可能性もある。
【０００６】
本発明者らはこれまでに、導入したｄｓＲＮＡの細胞内濃度を維持することを目的として、逆向き反復配列を含む遺伝子を哺乳類発現ベクターの下流に連結した遺伝子を構築し、ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの受精卵へ導入し、胚をマウス卵管へ移植することによりＥＧＦＰ　ｄｓＲＮＡ発現ベクター遺伝子導入マウスを作成した。このマウスにおいては、ターゲット遺伝子（ＥＧＦＰ）発現の抑制された表現型を示す個体が観察された（特願２００１−４６０８９）が、その取得効率は低く、ＲＮＡｉ効果を用いてマウス個体において遺伝子機能解析を行うためにはさらなる改良が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した従来法の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、ＲＮＡｉ表現型をもつマウスなどの哺乳動物の取得効率を向上させるために、ｄｓＲＮＡの導入方法を改良することを解決すべき課題とした。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、先ず逆向き反復配列を導入したＢＰＶベクターを受精卵に導入してトランスジェニックマウスを作成し、その作成したマウスからリンパ球を取得し、それを用いてＦＡＣＳによりＥＧＦＰ蛍光を解析した。その結果、出生個体数の約３０％という高効率においてＲＮＡｉ表現型が確認された。上記の通り、本発明者らは、初期胚における細胞分裂による導入ＤＮＡの希釈を避けるために、細胞周期に同調してプラスミドとして複製可能なＢＰＶベクターを用い、ｄｓＲＮＡを染色体外で発現させることにより初期胚でのＲＮＡｉ効果を高め、ＲＮＡｉ表現型をもつ非ヒト哺乳動物を効率よく取得できることを今回見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、標的遺伝子を組み込んだパピローマウイルスベクターを細胞に導入することを含む、該標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物を作製する方法が提供される。
【００１０】
好ましくは、標的遺伝子の逆向き反復配列を組み込んだパピローマウイルスベクターを用いる。
好ましくは、パピローマウイルスベクターはウシパピローマウイルスベクターである。
好ましくは、目的遺伝子を組み込んだパピローマウイルスベクターを受精卵に導入し、該受精卵を用いてトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作成する。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により作製される、標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物又はその子孫又はその一部が提供される。
本発明の別の側面によれば、哺乳動物細胞で発現可能な標的遺伝子の逆向き反復配列をパピローマウイルスベクターに組み込んだ、組み換えベクターが提供される。
本発明の組み換えベクターでは、好ましくは、パピローマウイルスベクターはウシパピローマウイルスベクターである。
本発明の組み換えベクターは、好ましくは、哺乳動物細胞で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列を含む。
本発明の組み換えベクターでは、好ましくは、標的遺伝子が、外来性レポータータンパク質またはその変異タンパク質の遺伝子である。好ましくは、外来性レポータータンパク質は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｉｅｎ（ＥＧＦＰ）である。本発明の組み換えベクターは、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製のために使用することができる。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の組み換えベクターを導入した非ヒト哺乳動物の受精卵から発生した胚が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の胚を、対応する非ヒト哺乳動物の子宮または卵管へ移植して発生させた胎児が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、標的遺伝子を組み込んだパピローマウイルスベクターを細胞に導入することによって、該標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物を作製する方法に関するものである。
【００１４】
これまでの本発明者の研究から、トランスジェニックでないマウスにおいてターゲット遺伝子発現の抑制されたＲＮＡｉ表現型マウスが取得された。さらに、ＥＳ細胞の系におけるＲＮＡｉ効果（特願２００１−３４８７０５）、初期胚におけるＲＮＡｉ効果（Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，２（２）　７０−７５，　２０００）が確認されたことを踏まえ、初期胚におけるＲＮＡｉ効果が個体マウスにおけるＲＮＡｉ効果の持続に重要であると考えられた。そこで初期胚において十分なＲＮＡｉ活性をもたせることによりＲＮＡｉ表現型マウスを効率的に取得できると考え、非ヒト哺乳動物細胞において細胞質内での大量の遺伝子発現に有効であり、トランジェント発現が可能なＢＰＶ（　ＢｏｖｉｎｅＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）ベクターを用いることとした。
【００１５】
ＢＰＶ（　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）ベクター（ＢＣＭＧＳＮｅｏ）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２，　９６９−９７２，　１９９０）は、約１４．３ｋｂｐのサイズをもち、ＢＰＶ　ｔｙｐｅ１の遺伝子断片ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＢａｍＨＩ（６９％領域）、ヒトβグロビン遺伝子の一部、ネオマイシン耐性遺伝子、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ウサギβグロビン遺伝子のイントロン配列及びｃＤＮＡ導入部位、ウサギβグロビンｐｏｌｙ（Ａ）シグナルからなる。ＢＰＶ　ｔｙｐｅ１遺伝子はウシの皮膚に感染して乳頭腫をつくるＤＮＡウイルスであり、その遺伝子は７９４５ｂｐの二本鎖環状ＤＮＡウイルスである。このベクターに用いられる６９％領域はこの遺伝子の感染に関与するキャプシド蛋白質等の配列がなく、複製に関与する領域のみを含んでおり、ＢＰＶベクターが非ヒト哺乳動物細胞の細胞周期に同調して複製できる特徴を保持する（蛋白質核酸酵素Ｖｏｌ．４０，　Ｎｏ．１７，　２５３９−２５４４，　１９９５）。また、ヒトβグロビン遺伝子の一部を導入することによりＢＰＶベクターの複製能力を高めることが報告されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　ｖｏｌ．１８，　９７−１０４，　１９８８）。
【００１６】
本発明では、このＢＰＶベクターに、ＣＭＶエンハンサー、ＥＦ１αプロモーター、ＥＧＦＰの逆向き反復配列、ＳＶ４０由来のｐｏｌｙ（Ａ）シグナル配列を導入し、ＥＧＦＰの逆向き反復配列を非ヒト哺乳動物細胞内で発現させるプラスミドを作製した。このプラスミドをマウス初期胚に導入することで、逆向き反復配列を初期胚においてトランジェント発現させた。さらに作成したマウスからリンパ球を取得し、それを用いてＦＡＣＳによりＥＧＦＰ蛍光を解析した結果、出生個体数の約３０％がＲＮＡｉ表現型をもつことが判明した。
【００１７】
本発明で用いるパピローマウイルスベクターとしては、上記した　ＢＰＶ（　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）ベクター（ＢＣＭＧＳＮｅｏ）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２，　９６９−９７２，　１９９０）を使用することができるが、これ以外のパピローマウイルスに由来するベクターを使用することもできる。パピローマウイルスは、パポーバウイルス科に属する約８ｋｂの二本鎖環状ＤＮＡをゲノムにもつ小型のＤＮＡ腫瘍ウイルスである。ヒトパピローマウイルス、ウサギパピローマウイルス、ウシパピローマウイルスなど各種のパピローマウイルスが知られているが、これらの中でも、ウシパピローマウイルスのＩ型（ＢＰＶ　ｔｙｐｅ１）はクローニングベクターとして常用されている。
【００１８】
逆向き反復配列とは、標的遺伝子並びにその逆向きの配列が適当な配列を介して並列している配列を言う。具体的には、標的遺伝子が、以下に示すｎ個の塩基配列から成る２本鎖を有する場合、
５’−Ｘ１Ｘ２．．．．．．Ｘｎ−１Ｘｎ−３’
３’−Ｙ１Ｙ２．．．．．．Ｙｎ−１Ｙｎ−５’
その逆向き配列は以下の配列を有する。
５’−ＹｎＹｎ−１．．．．．．Ｙ２Ｙ１−３’
３’−ＸｎＸｎ−１．．．．．．Ｘ２Ｘ１−５’
（ここで、Ｘで表される塩基とＹで表される塩基において、添え字の数字が同じものは互いに相補的な塩基である）
【００１９】
逆向き反復配列は上記２種の配列が適当な配列を介して配列である。逆向き反復配列としては、標的遺伝子の配列が逆向き配列の上流にある場合と、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流にある場合の２つの場合が考えられる。本発明で用いる逆向き反復配列は上記の何れでもよいが、好ましくは、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流に存在する。
標的遺伝子の配列とその逆向き配列の間に存在する配列は、ＲＮＡに転写された際にヘアピンループを形成する領域である。この領域の長さは、ヘアピンループを形成できる限り特には限定されないが、一般的には、０ｂｐから７００ｂｐであり、好ましくは０〜３００ｂｐ程度、より好ましくは０〜１００ｂｐ程度である。この配列の中には制限酵素部位が存在していてもよい。
【００２０】
本発明で用いる標的遺伝子としては任意の遺伝子を使用できる。本発明の組み換えベクターを用いてトランスジェニック動物を作成し、ＲＮＡｉによる遺伝子ノックアウトを意図する場合には、標的遺伝子は発現を抑制することを意図する遺伝子（ノックアウトを意図する遺伝子）である。このような標的遺伝子としては、クローニングはされているが機能が未知の遺伝子も含まれる。
【００２１】
あるいは、標的遺伝子は、外来性レポータータンパク質またはその変異タンパク質の遺伝子であってもよい。このような外来性レポータータンパク質またはその変異タンパク質の遺伝子を標的遺伝子として使用した場合は、本発明の組み換えベクターを用いたトランスジェニック技術においてＲＮＡｉ効果を容易に検出及び評価することができる。
外来性レポータータンパク質としては、エンハンスド・グリーン・フルオレッセント・プロテイン（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｉｅｎ）、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（Ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｉｅｎ）、エクオリン、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼなどが挙げられる。
【００２２】
外来性レポータータンパク質の変異タンパク質としては、上記した野生型のレポータータンパク質のアミノ酸配列中に１〜複数個（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するタンパク質であって、好ましくは野生型のレポータータンパク質と同等以上の機能を維持している。
レポータータンパク質の変異タンパク質の遺伝子として具体的には、レポータータンパク質の遺伝子中の塩基配列の一部が欠損した遺伝子、レポーター遺伝子の塩基配列が他の塩基配列で置換された遺伝子、レポーター遺伝子の一部に他の塩基配列が挿入された遺伝子などが用いられる。欠損、置換または付加を受ける塩基の数は、特に限定されないが、通常、１ないし６０個程度、好ましくは１から３０個程度、より好ましくは１ないし１０個程度である。なお、これらの変異遺伝子は、レポーター遺伝子としての機能を維持していることが望ましい。
【００２３】
変異タンパク質の遺伝子は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。具体的には、天然型レポータータンパク質をコードするＤＮＡに対して変異原となる薬剤を接触作用させたり、紫外線を照射したり、あるいはＰＣＲ法などの遺伝子工学的手法を用いることにより変異タンパク質をコードする遺伝子を取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから特に有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，　２ｎＤ　ＥＤ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＮＹ．，１９８９、及びＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１〜３８，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７−１９９７）等に記載の方法に準じて実施することができる。
【００２４】
本発明のパピローマウイルスを用いた組み換えベクターでは、哺乳動物で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列が存在する。このような構成をとることにより、哺乳動物の細胞内において標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることが可能になる。即ち、本発明の組み換えベクターでは、標的遺伝子の逆向き反復配列は上記プロモーターの制御下に置かれるように配置されている。
【００２５】
本発明で用いるプロモーター配列は、哺乳動物で作動可能であれば特に限定されない。
このように非ヒト動物で発現可能なプロモーターとしては、例えば、ウィルス（例、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルスなど）由来遺伝子プロモーター、各種哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーターなどが用いられる。各哺乳動物由来のプロモーターとしては、例えば、アルブミン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパクキナーゼβサブユニット（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　Ｖｏｌ．２７１，　Ｎｏ．３，　ｐｐ１６３８−１６４４，　１９９６）、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），　Ｖｏｌ．２７０，　Ｎｏ．４３，　ｐｐ２５７３９−２５７４５，　１９９５および同　Ｖｏｌ．２７２，　Ｎｏ．４０，　ｐｐ２５１１２−２５１２０，１９９７）、メタロチオネイン、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドＰコンポーネント、レニンなどのプロモーターが用いられる。
【００２６】
上記以外にも、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ臨時増刊号、マニュアル疾患モデルマウス；山村研一、勝木元也、相沢慎一編、中山書店等の文献に記載されているプロモーターも使用することができる。
本発明で用いるのに好ましいプロモーターとしては、本明細書の実施例で使用したＥＦ１αプロモーターが挙げられるが、それ以外にも以下のものが挙げられる。
【００２７】
（１）βアクチンプロモーター
一般的にはＣＭＶエンハンサーとβアクチンプロモーターの組み合わせとして使用される。例えば、ｐＣＡＧＧＳ；ｃｈｉｃｋｅｎ　ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ　ｖｉｒｕｓ　ｅｎｈａｎｃｅｒ．　ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ　ｉｎｔｒｏｎ　ａｎｄ　ｂｏｖｉｎｅ　ｇｌｏｂｉｎ　ｐｏｌｙ−ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌなど。引用文献としては、Ｈ．　Ｎｉｗａ，　Ｋ．　Ｙａｍａｎａｍｉ，　Ｊ．　Ｍｉｙａｚａｋｉ，　Ｇｅｎｅ，　１０８，　（１９９１）１９３−１９９を参照。
【００２８】
（２）ＣＭＶプロモーター
一般的には、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーターの組み合わせとして使用される。引用文献としては、Ｊａｎｅｔ　Ａ．　Ｓａｗｉｃｋｉ　ｅｔ　ａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２４４，　３６７−３６９　（１９９８）を参照。
【００２９】
（３）メタロチオネインプロモーター
引用文献としては、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｍｉｃｅ　Ｃａｒｒｙｉｎｇ　Ｈｕｍａｎ　Ｆｅｔｕｓ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＣＹＰ３Ａ７　Ｙｏｎｇ　Ｌｉ，　ｅｔ　ａｌ，　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，　Ｖｏｌ．　３２９，　Ｎｏ．　２，　２３５−２４０，　１９９６を参照。
【００３０】
（４）Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅ　プロモーター
胎児肝臓での発現を意図したプロモーター。引用文献としては、Ｓｉｍｏｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６８，　８２２１−８２２９を参照。（５）導入したい遺伝子本来のプロモーター
この場合は、ゲノムそのものを導入することによりトランスジェニックマウスを作成する場合が挙げられる。引用文献としては、Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．，　１７５，　７１　（１９９２）を参照。
【００３１】
本発明の組み換えベクターは、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列を含んでいてもよい。使用できるエンハンサー配列としては上記したＣＭＶエンハンサーなどが挙げられる。
【００３２】
本発明の組み換えベクターは、インスレーター配列又はその一部を含んでいてもよい。インスレーター配列とは，トランスジェニック動物においては，「位置効果」からの遺伝子発現の抑制から守る遺伝子配列のことである。近隣のシスエレメントの影響に対するバリアとして期待されている。
インスレーター配列又はその一部の位置は特に限定されないが、導入遺伝子（即ち、標的遺伝子の逆向き反復配列）の５’側（上流）に存在することが、効果の面から好ましい。最も好ましくは、インスレーター配列又はその一部は、プロモーター配列の上流（又はエンハンサー配列が存在する場合にはその上流）に存在する。
【００３３】
本発明で使用できるインスレーター配列としては、本明細書の実施例で使用したニワトリベータグロビン由来インスレーター配列の他にも以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
（１）ショウジョウバエｓｃｓおよびｓｃｓ’配列
Ｒｅｂｅｃｃａ　Ｋｅｌｌｕｍ　ａｎｄ　Ｐａｕｌ　Ｓｃｈｅｄｌ，　Ｃｅｌｌ，　Ｖｏｌ．　６４，　９４１−９５０，　Ｍａｒｃｈ　８，　１９９１
（２）ショウジョウバエｇｙｐｓｙトランスポゾンのインスレーター配列
Ｈｏｌｄｒｉｇｅ，　Ｃ．，　ａｎｄ　Ｄ．　Ｄｏｒｓｅｔｔ，　１９９１　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１１：　１８９４−１９００
（３）ウニアリルサルファターゼインスレータ配列
Ｋｏｊｉ　Ａｋａｓａｋａ，　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４５　（　５　），　５５５−５６５，１９９９
（４）ヒトＴ細胞レセプターα／δ遺伝子座ＢＥＡＤエレメント
Ｚｈｏｎｇ，　Ｘ．　Ｐ．，　ａｎｄ　Ｍ．　Ｓ．　Ｋｒａｎｇｅｌ，　１９９７　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｕｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ
（５）ヒトアポリポ蛋白Ｂ−１００（ａｐｏＢ）マトリックスアタッチメント部位
Ｎａｍｃｉｕ　ｅｔ　ａｌ，　１９９８，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１８：　２３８２−２３９１
【００３５】
本発明の組み換えベクターは、標的遺伝子の逆向き反復配列の下流にポリＡ付加シグナル配列を含んでいてもよい。ポリＡ付加シグナル配列を挿入することにより、目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結することができる。
ポリＡ付加シグナル配列の具体例としては、ＳＶ４０ポリＡ付加シグナルなどが挙げられるが、これに限定されるわけではない。
本発明の組み換えベクターは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。
【００３６】
本発明はさらに、上記した本発明の組み換えベクターを有する形質転換体にも関する。
細菌を宿主とする場合のベクターの具体例としては、例えば、ｐＢＴｒＰ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもべ一リンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　４８，　６６９（１９８４）〕、ＰＬＳＡ１〔Ａｇｒｃ．　Ｂｌｏ１．　Ｃｈｅｍ．，　５３，　２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８２，　４３０６　（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｌｐｔＩＩ　ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０７）、ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５４０８）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，　３３，　１０３（１９８５）〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，　３３，　１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．，　１７２，　２３９２（１９９０）〕、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００３７】
酵母を宿主とするベクターの具体例として、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、Ｙｃｐ５Ｏ（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
動物細胞を宿主とするベクターの具体例として、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９；　Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　３，　１３３，（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，　３２９，　８４０，（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｌｏｃｈｅｍ．，　１０１，　１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００３８】
形質転換体を作成する際に使用する宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。例えば、細菌（例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等）、酵母（クルイベロミセス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等）、動物細胞（ナマルバ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等）、植物細胞、昆虫細胞（Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ５細胞等）等を用いることができる。
【００３９】
組み換えベクターの宿主への導入方法は、宿主の種類等に応じて任意の方法を適宜選択できる。細菌宿主への導入方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト法等を挙げることができ、酵母への導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法又は酢酸リチウム法など挙げることができ、動物細胞への導入方法としては、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を挙げることができる。
【００４０】
本発明はさらに、上記した本発明の組み換えベクターを導入した非ヒト哺乳動物の受精卵から発生した胚、並びにこの胚を、対応する非ヒト哺乳動物の子宮または卵管へ移植して発生させた胎児にも関する。これらの動物は、標的遺伝子の逆向き反復配列を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物である。
【００４１】
該非ヒト哺乳動物の一部としては、非ヒト哺乳動物の細胞内小器官、細胞、組織および臓器のほか、頭部、指、手、足、腹部、尾などが挙げられる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびサルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。非ヒト哺乳動物としてはマウス、ラット、モルモットなどの齧歯目の哺乳動物が好ましく、マウス又はラットが特に好ましい。マウスとしては、例えば、純系としてはＣ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統などが挙げられ、交雑系としてはＢ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統などが挙げられる。ラットの具体例としては、例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなどが挙げられる。
【００４２】
好ましい実施態様の一つにおいては、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の部位で発現するように組み込んだＤＮＡを有していてもよい。
本明細書で言う「特定の部位で発現するように」とは、細胞内特定部位、細胞内小器官、細胞、組織または臓器などの特定部位で標的遺伝子の逆向き反復配列を発現し得ることをいう。
【００４３】
細胞内特定部位としては神経細胞等における軸索などが挙げられる。細胞内小器官としては、例えば、核、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、リボソーム、細胞膜などが挙げられる。細胞とは、例えば、哺乳動物の肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞またはガン細胞などの細胞が挙げられる。組織としては、上記細胞が存在するあらゆる組織、脳（扁桃核、大脳基底球、海馬、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳、松果体など）、脊髄、下垂体、胃、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、大腸、小腸、十二指腸、直腸、血管、胸腺、顎下腺、末梢血、前立腺、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などが挙げられ、また血球系細胞でもよく、上記細胞の培養細胞でもよい。臓器としては心臓、腎臓、膵臓、肝臓、脾臓が挙げられる。
【００４４】
好ましい実施態様の一つにおいては、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の時期に発現するように組み込んだＤＮＡを有していてもよい。
本明細書で言う「特定の時期」とは、胚発生、出産、発生などから、死亡までのある特定の時期を指す。したがって、特定の時期としては、外来遺伝子を導入した時期を含めた胚発生の各ステージ、生後から時間単位、日単位、週単位、月単位、年単位の時期が経過したいずれの時期であってもよい。
【００４５】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物において、標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の時期に発現させるためには、特定の時期にタンパク質を発現し得るプロモーター領域、特定の時期にタンパク質を発現し得るシグナル配列などを組み込んだ発現ベクターを用いて、標的遺伝子の逆向き反復配列を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を製造する。
【００４６】
標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の時期に発現させるためには、タンパク質発現誘導系を構築したり、特定の時期にタンパク質発現誘導剤を非ヒト哺乳動物に投与することによっても可能である。該タンパク質発現誘導系としては、例えば、テトラサイクリンやエクジソン（ｅｃｄｙｓｏｎｅ）を利用した誘導発現システムを利用することができ、その際投与されるものは、それぞれテトラサイクリンあるいはその類縁体、エクジソンあるいはその類縁体である。また、リコンビナーゼを利用したｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムなどが用いられる。
さらに、標的遺伝子の逆向き反復配列を特定の時期に発現させるためには、前記したテトラサイクリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンなどの抗生物質に対する耐性遺伝子などを発現ベクターに組み込むことによっても可能である。本発明の発現ベクターにおける該耐性遺伝子の配置は特に限定されないが、通常、レポーター遺伝子またはその変異遺伝子の下流、プロモーター領域やシグナル配列の上流に配置するのが好ましい。
【００４７】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、哺乳動物細胞で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列を含む組み換えベクター（以下、導入遺伝子とも称する）を対象動物に導入することによって作製できる。具体的には、該導入遺伝子を対象となる非ヒト哺乳動物の受精卵、胚性幹細胞、体細胞、精子、又は未受精卵へ導入することによって、該遺伝子が胚芽細胞を含むすべての細胞の染色体上に組み込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。受精卵、胚性幹細胞、体細胞、精子、未受精卵における導入遺伝子の導入は、対象の非ヒト哺乳動物の胚芽細胞および体細胞を含む全ての細胞の染色体上に存在するように確保されなくてはならない。
【００４８】
該遺伝子が胚芽細胞を含むすべての細胞の染色体上に組み込まれたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫は、同様に該遺伝子を有する。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代することができる。
【００４９】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法について以下により具体的に説明する。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む生殖細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚形成初期の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階で、かつ一般に８細胞期以前）に導入遺伝子を導入することによって作出することができる。
【００５０】
導入遺伝子の構成及び構築法は本明細書中上記した通りである。
導入遺伝子を対象の非ヒト哺乳動物またはその先祖の受精卵に導入する際に用いられる受精卵は、同種の雄非ヒト哺乳動物と雌非ヒト哺乳動物とを交配させることによって得られる。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）を例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましい。好ましいホルモンの投与量及び投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類により適宜決定できる。
【００５１】
導入遺伝子の導入法としては、公知の方法（例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法など）を用いることができる。また、上記した導入法により体細胞に目的とする導入遺伝子を導入し、この細胞（又はその核）を上述の生殖細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作出することもできる。
導入遺伝子の構成及び構築法は本明細書中上記した通りである。受精卵細胞段階における導入遺伝子の導入は、対象動物の生殖細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。
【００５２】
受精卵に導入遺伝子が導入された後、雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植・着床することにより、導入遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物が得られる。黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）あるいはその類縁体を投与後、雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物に、導入遺伝子が導入された受精卵を人工的に移植・着床させる方法が好ましい。ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は非ヒト哺乳動物の種類等により適宜選択できる。導入遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれているか否かは、産仔の尾部よりＤＮＡを抽出し、サザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲ法等によって検定することによって確認できる。
【００５３】
導入遺伝子の導入後の作出動物の生殖細胞において、導入遺伝子が存在することは、作出動物の後代が、その生殖細胞および体細胞の全てに導入遺伝子を保持することを意味する。導入遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその生殖細胞および体細胞のすべてに導入遺伝子を有する。
導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該導入遺伝子を有するように繁殖継代することができる。このようにして得られた子孫も本発明の動物に含まれる。
【００５４】
なお、トランスジェニック動物の作成の詳細については、例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ（Ｂｒｉｇｉｄ　Ｈｏｇａｎ　ｅｔ　ａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ａｔ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，　ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社　（１９９５）、発生工学実験マニュアル，　トランスジェニック・マウスの作り方，　講談社　（１９８７）等を参照することができる。
【００５５】
本発明による標的遺伝子の逆向き反復配列を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物においては、ＲＮＡｉ効果により、標的遺伝子の発現は抑制されていることが期待される。即ち、エンハンサー配列及びプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列を含む組み換えベクターを非ヒト哺乳動物の細胞に導入することを含む、標的遺伝子の発現を抑制する方法も本発明の範囲内である。上記したような標的遺伝子の機能がノックアウトしているモデル動物は、新規遺伝子の機能解析などに有用である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００５６】
【実施例】
実施例１：導入遺伝子５’　ＩＮＳ　２４０　ＣＥ　ＥＧＦＰ　ＩＲの構築
インスレーター検討における初期の研究において、クローニングサイトの５’側、３’側両方に同じ配列の２４０残基のインスレーターを持つベクターから作製した。その後、モデル実験の結果から、導入遺伝子の５’側のみにインスレーター配列を挿入したときが最も有効であると示唆する結果を得た。従って、５’側、３’側両方に同じ配列の２４０残基のインスレーターを持ち、ＣＭＶエンハンサー、ＥＦ１αプロモーター下流にＥＧＦＰの逆向き反復配列を持つｐＵＣ１９　５’３’ＩＮＳ２４０　ＣＥ　ＥＧＦＰ　ＩＲから導入遺伝子の３’末端に挿入されていた３’インスレーター配列を除くことにより、導入遺伝子である５’ＩＮＳ　２４０　ＣＥ　ＥＧＦＰ　ＩＲを下記の通り構築した。
【００５７】
ｐＵＣ１９　５’，　３’　ＩＮＳ２４０　（ニワトリベータグロビン由来インスレーター配列の遺伝子を１０本のフラグメントに分けて化学合成後、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅで結合させた２４０塩基対のフラグメントをｐＵＣ１９ベクターのマルチクローニングサイトへ挿入したベクター）のＸｈｏＩ　、Ａｆｌ　ＩＩ部位へｐＣＥ−ＥＧＦＰ−１（文献名：Ｔａｋａｄａ，　Ｔ．，　他、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ｕｓｉｎｇ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓ　ａ　ｍａｒｋｅｒ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　１５：　４５８−４６１，　１９９７）のＸｈｏＩ　−　Ａｆｌ　ＩＩ　間断片を２段階で挿入して、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株をトランスフォームして、プラスミドｐＵＣ１９　５’，　３’　ＩＮＳ２４０　ＣＥ　ＥＧＦＰを得た。
【００５８】
ｐＵＣ１９　５’，　３’　ＩＮＳ２４０　ＣＥ　ＥＧＦＰのＫｐｎＩ　、ＳａｌＩ切断部位へＬｉｔｍｕｓ２８　ＥＧＦＰのＫｐｎ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片を挿入後、ライゲーションし、大腸菌ＳＵＲＥ２株（ストラタジーン社）をトランスホームして、逆向き反復配列を持つプラスミド、ｐＵＣ１９　５’，　３’ＩＮＳ２４０ＣＥ　ＥＧＦＰ　ＩＲを得た。
【００５９】
ｐＵＣ１９　５’，　３’ＩＮＳ２４０　ＣＥ　ＥＧＦＰ　ＩＲから３’インスレーター配列を含む断片を切断は以下の通り行なった。
ｐＵＣ１９　５’，３’ＩＮＳ２４０　ＣＥ　ＥＧＦＰ　ＩＲをＫｐｎＩとＳｗａＩにより処理した。電気泳動の約５．４ｋｂｐのＤＮＡ断片により，ｐＵＣ１９　５’，３’ＩＮＳ２４０　ＣＥ　ＥＧＦＰ　ＩＲ／ＫｐｎＩ，　ＳｗａＩ　ベクターを確認した。さらに、セルフライゲーションを防ぐためＢＡＰにより脱リン酸化処理した後、フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、ＢＡＰを除去した。
ｐＥＧＦＰ−１　（クロンテック）のＡｆｌＩＩ　制限酵素部位に、ＳｗａＩ制限酵素部位を持つＬｉｎｋｅｒを挿入したプラスミドｐＥＧＦＰ−１　ＳｗＬをＫｐｎＩとＳｗａＩで処理し、アガロースゲルで電気泳動し、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、ＫｐｎＩ−ＳｗａＩ断片とした（図２）。
【００６０】
ｐＵＣ１９　５’，３’ＩＮＳ２４０　ＣＥ　ＥＧＦＰ　ＩＲ／ＫｐｎＩ，　ＳｗａＩ　ベクターとＫｐｎＩ−ＳｗａＩ断片とをＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いてライゲーションし、大腸菌ＳＵＲＥ２株をトランスフォームして、ＥｃｏＴ２２ＩとＳｗａＩ，ＮｏｔＩで処理したＤＮＡの断片長によるスクリーニングによりポジティブクローンを得た。ＤＮＡの配列を確認後、ｐＵＣ１９　５’ＩＮＳ２４０　ＣＥ　ＥＧＦＰ　ＩＲと命名した。
【００６１】
また、ＥＧＦＰ　ｄｓＲＮＡ発現遺伝子（逆向き反復配列遺伝子）を持つプラスミドｐＵ１９５’　ＩＮＳ２４０　ＣＥ　ＨＩＲ　は以下に示す手法で構築した。
制限酵素ＳｆｉＩ部位を含むＥＧＦＰ半分長のＤＮＡ断片又はＣｐｏＩ部位を含むＥＧＦＰ半分長の　ＤＮＡ断片を得るため、ｐＣＥ−ＥＧＦＰ−１を鋳型に用い、制限酵素ＳｆｉＩ部位を含むプライマー　（配列番号１及び２）又は　ＣｐｏＩ部位を含むプライマー（配列番号３及び４）でＰＣＲを行った。
2004049083.tif 000002
【００６２】
ＰＣＲ条件は９４℃で５分、（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒）　ｘ　３０、７２℃で１０分とした。得られた　ＥＧＦＰ半分長のＤＮＡ断片をＣｐｏＩ　又はＳｆｉＩ処理し、アガロースゲルで電気泳動後ＤＮＡ断片を回収した。また、ｐＳＣ３ベクター（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４７９，７９−８２，　２０００）をＣｐｏＩ処理し、アガロースゲルで電気泳動後ＤＮＡ断片を回収した。ＥＧＦＰ半分長の　ＤＮＡ断片−ＣｐｏＩをｐＳＣ３ベクター−ＣｐｏＩ　にライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して、プラスミドｐＳＣ３−ＥＧＦＰ　−ＨＬＣｐｏＩを得た。次にｐＳＣ３−ＥＧＦＰ−ＨＬＣｐｏＩ　をＳｆｉＩ処理し、アガロースゲルで電気泳動後ＤＮＡ断片を回収した。次にＥＧＦＰ半分長のＤＮＡ断片−ＳｆｉＩ　をｐＳＣ３−ＥＧＦＰ−ＨＬＣｐｏＩ−ＳｆｉＩにライゲーションし、大腸菌ＳＵＲＥ２株（ストラタジーン社）を形質転換して、逆向き反復配列をもつプラスミドｐＳＣ３−ＥＧＦＰ−ＨＬＣｐｏＩ−ＳｆｉＩを得た。
【００６３】
さらに、プラスミドｐＳＣ３−ＥＧＦＰ−ＨＬＣｐｏＩ−ＳｆｉＩをＮｏｔＩ処理し、アガロースゲルで電気泳動後、約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。また、ｐＵＣ１９　５’ＩＮＳ２４０　ＣＥｐＡベクターをＮｏｔＩ処理した後、セルフライゲーションを防ぐためＢＡＰにより脱リン酸化処理し、フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行い、ＢＡＰを除去した。
【００６４】
ｐＳＣ３−ＥＧＦＰ−ＨＬＣｐｏＩ−ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩをｐＵＣ１９　５’ＩＮＳ２４０　ＣＥｐＡベクター−ＮｏｔＩにライゲーションし、大腸菌ＳＵＲＥ２株（ストラタジーン社）を形質転換して、逆向き反復配列をもつプラスミドｐＵＣ１９　５’　ＩＮＳ２４０　ＣＥ　ＨＩＲを得た。
【００６５】
実施例２：ＥＧＦＰ　ＩＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）　ＤＮＡ配列を含むＢＰＶ発現ベクターの構築
ＢＰＶ（Ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）ベクター（ＢＣＭＧＳＮｅｏ）（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２，　９６９−９７２，　１９９０）を、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで処理後、ＢＰＶ６９％領域を含む断片を切り出した。次にｐＵＣ１９　５’ＩＮＳ２４０　ＣＥ　ＥＧＦＰ　ＩＲ（実施例１で構築したもの）、ｐＵＣ１９　５’ＩＮＳ２４０　ＣＥ／ＨＩＲ（実施例１で構築したもの）をＳｐｅＩとＳｗａＩ　で処理後、ＥＧＦＰ　ＩＲを含むＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ　ｅｎｈａｎｃｅｒからＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ４０）由来のｐｏｌｙＡ　ｔａｉｌまでの　断片を切り出し、ライゲーション反応することにより、ＢＰＶ−　ＥＧＦＰ　ＩＲ、ＢＰＶ−　ＨＩＲベクターをそれぞれ作製した（図１）。
【００６６】
実施例３：ＥＧＦＰ　ＩＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）　ＤＮＡ配列を含むＢＰＶ発現ベクターの調製
ＢＰＶ−ＥＧＦＰ　ＩＲ、ＢＰＶ−　ＨＩＲプラスミドを、アルカリ溶解法により大量調製した。このプラスミドを超遠心分離によりさらに精製後、ＰＢＳ（−）で１．５ｎｇ／ｍｌになるように希釈した。この溶液を０．２２μｍ径のフィルターでろ過し、導入プラスミドとした。
【００６７】
実施例４：受精卵の作出
受精卵の作出は、豊田らの手法に従い（マウス卵子の体外受精に関する研究、家畜繁殖誌１６：１４７−１５１、１９７１）体外受精で行った。すなわち、メスマウスに４８時間間隔でＰＭＧＳ及びｈＣＧ（５単位）を腹腔内注射し、その後１６〜１８時間に卵子を採取し、ＥＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｍａｓａｒｕ　Ｏｋａｂｅ，　ｅｔ　ａｌ，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４０７（　１９９７　）　３１３−３１９）精子（卵子採取の約１．５時間前に精子採取）を媒精した（約１００−１５０精子／μｌ）。媒精約６時間後に卵子の第２極体の放出と雌雄両前核の有無を確認し、受精卵のみ選抜した。得られた前核期受精卵は中尾らの手法（１９９７）に従って、簡易ガラス化法を用い凍結保存した。凍結された受精卵は実験前に融解し、顕微注入操作に供した。
【００６８】
実施例５：ＤＮＡ顕微注入
受精卵前核へのＤＮＡ顕微注入は、勝木らの手法（発生工学実験マニュアル　トランスジェニックマウスの作り方、１９８７）に従って行った。受精卵は修正ウィッテン培地（ｍＷＭ培地）の液滴に移し、核内注入では、位相差顕微鏡（Ｉｎｖｅｒｔ　Ｓｃｏｐｅ　Ｄ：Ｚｅｉｓｓ社）下で雄性前核を確認した後、精製したＤＮＡ溶液（１．５ｎｇ／ｕｌ）を約２ｐｌ注入した。細胞質内注入では、細胞質内にＤＮＡ溶液を約２ｐｌ注入した。生残胚はｍＷＭ胚に移し、５％ＣＯ２、９５％Ａｉｒ、３７℃の条件下で培養後、偽妊娠の雌ＩＣＲ系統マウスの卵管に移植し、着床させた。
【００６９】
実施例６：遺伝子型のタイピンク
出産後４週を経過したマウスの尾を約１センチメートル切断し、プロナーゼＫ及びプロテイナーゼＥを含む可溶化バッファーを加え、５５℃で一晩可溶化した。可溶化溶液から、ＤＮＡ抽出装置（クラボウ社製）を用いＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡを用いて、ＥＧＦＰ　の遺伝子配列を含むＤＮＡプローブ（自体公知のラジオアイソトープ標識法によりラベルした）によるサザンハイブリダイゼーション法により分析した。標識には市販のラベリングキット（ストラタジーン社製）を用いた。ＤＮＡ約１０μｇを制限酵素ＤｒａＩ及びＢａｍＨＩで完全に切断し、１％アガロースを通じて電気泳動を行い、かつサザンハイブリダイゼーション法（１９７５、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、第９８巻、５０３ページ）により記載された方法でナイロンフィルターへ移した。このフィルターをプローブとパーフェクトハイブリダイゼーション溶液（東洋紡社製）中で２時間ハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて６５℃にて５分間２回、さらに３０分間２回洗浄した。このサザンハイブリダイゼーションの結果、ＢＰＶ−　ＨＩＲに関しては、検定した１５６匹中８匹の個体でＨＩＲ遺伝子が確認された。また、ＢＰＶ−　ＥＧＦＰ　　ＩＲに関しては、検定した７１匹中２匹の個体でＥＧＦＰ　ＩＲ遺伝子が確認された。
【００７０】
実施例７：マウス個体における蛍光観察
前述の偽妊娠の雌ＩＣＲ系統マウスにおいて、１８日後に帝王切開を行い、仔マウスを取得した。暗箱（ＵＶＰ社Ｃ−１０型）中、得られた仔マウスに３６５ｎｍ紫外線ランプ（ＵＶＰ社ＵＶＬ−５６型）を照射し、ＥＧＦＰ蛍光観察を行ったところ、ＥＧＦＰ　ｄｓＲＮＡ発現遺伝子を顕微注入した受精卵から得た仔マウスの中に、体表面の目視において、ＥＧＦＰ蛍光が減少した仔マウスが認められた（図２、長波長紫外線により生じるＢｌｕｅｈａｚｅを除去するため、紫外線用安全メガネをフィルターとして使用し、撮影にデジカメを使用した）。
【００７１】
実施例８：マウス個体における表現型解析
４週齢以降のマウスについて、ヘパリン付着採血管を用いて眼窩静脈叢から部分採血し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ社製）を用いて末梢血単核球細胞を分離し、ＦＡＣＳ（ＢＤ社）により蛍光を解析した。解析方法としては、５０００個のリンパ球画分におけるＥＧＦＰ蛍光の平均値（ＧｅｏＭｅａｎ）をコントロールマウスのＧｅｏＭｅａｎ平均値と比較することにより減光の割合を算出した。この結果、ＢＰＶ−　ＨＩＲに関しては、出生個体数１５６匹中２７匹（うち±６匹）（表現型マウス取得率１２．８（１６．６）％）の個体マウスについてＥＧＦＰ蛍光が減少したリンパ球細胞群の存在を確認した。また、ＢＰＶ−　ＥＧＦＰ　ＩＲに関しては、出生個体数７１匹中１９匹（うち±６匹）（表現型マウス取得率１８．３（２６．８）％）の個体マウスについてＥＧＦＰ蛍光が減少したリンパ球細胞群の存在を確認した（図３及び４）。
【００７２】
１２週齢以降のマウスを採材し、脳、肝臓、心臓、腎臓、脾臓、大腿筋等の主要臓器を取得した。それら臓器についてデジタルビデオカメラ（ＬＥＩＣＡ　ＤＣ２００，　Ｌｅｉｃａ製）を接続した蛍光実体顕微鏡（ＬＥＩＣＡ　　ＭＺ　ＦＬＩＩＩ，　Ｌｅｉｃａ製）を用いてＥＧＦＰの蛍光を観察したところ、肝臓、腎臓、脾臓で特にＥＧＦＰの蛍光が減少していることを確認した（図５及び６）。
【００７３】
次に取得した臓器を用いＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）により全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ１０ｕｇ相当（大腿筋、心臓はＥＧＦＰのＲＮＡ発現が高いため、全ＲＮＡ３ｕｇ相当）をホルマリンを入れた１％変性アガロースゲルを用いて電気泳動した。さらにナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−ＸＬ，　アマシャムファルマシア製）にＲＮＡを固定し、このフィルターをプローブとパーフェクトハイブリダイゼーション溶液（東洋紡社製）中で２時間ハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて６５℃にて５分間２回、さらに３０分間２回洗浄した。ノーザンハイブリダイゼーションの結果、肝臓・腎臓・脾臓で特にＥＧＦＰの発現が減少していることが判明した。（図７）
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、従来のＲＮＡｉ表現型非ヒト哺乳動物の作成方法よりも効率的に取得できる。さらに、ＲＮＡｉ効果を用いた疾病等の関連遺伝子の解析、医薬品のターゲット遺伝子の解析等において、これまでのマウスよりもより確実に遺伝子の抑制が可能となり、産業上大いに貢献すると考えられる。
【００７５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＥＧＦＰ　ＩＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）　ＤＮＡ配列を含むＢＰＶ発現ベクターの構築の概要を示す。
【図２】図２は、マウス個体における蛍光観察を示す。
【図３】図３は、マウス個体（ＢＰＶ−　ＨＩＲ）におけるＦＡＣＳｃａｎ解析結果を示す。
【図４】図４は、マウス個体（ＢＰＶ−　ＥＧＦＰ　ＩＲ）におけるＦＡＣＳｃａｎ解析結果を示す。
【図５】図５は、ＥＧＦＰ減光マウスにおける各臓器の蛍光観察結果を示す。
【図６】図６は、ＥＧＦＰ減光マウスにおける各臓器の蛍光観察結果を示す。
【図７】図７は、ＥＧＦＰ減光マウスにおける各臓器のＥＧＦＰ　ＲＮＡ発現解析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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