(57)【要約】【課題】多様な微生物の増殖や活性に関する定量的測定を微生物を破壊せずかつ迅速簡便に行える方法、及びこの測定方法を用いて、種々の細菌に対する各抗菌剤の抗菌力を迅速簡便に評価できる薬剤感受性試験方法及びキットを提供すること。【解決手段】培養液中で微生物をコエンザイムＱとともにインキュベーションし、生成物を化学発光法で定量する微生物の増殖及び／又は活性の測定方法。培養液中で微生物を、抗菌剤の存在下、コエンザイムＱとともにインキュベーションし、生成物を化学発光法で定量して、定量された微生物の増殖力及び／又は活性から前記微生物の抗菌剤に対する感受性を評価する薬剤感受性試験方法。抗菌剤、コエンザイムＱ、及び発光試薬を含む微生物の抗菌剤に対する感受性を評価するためのキット。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液で微生物をコエンザイムＱとともにインキュベーションし、生成物を化学発光法で定量することを特長とする微生物の増殖及び／又は活性の測定方法。
【請求項２】
培養液中で微生物を、抗菌剤の存在下、コエンザイムＱとともにインキュベーションし、生成物を化学発光法で定量して、定量された微生物の増殖力及び／又は活性から前記微生物の抗菌剤に対する感受性を評価することを特徴とする感受性試験方法。
【請求項３】
前記生成物がスーパーオキシドアニオンである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記化学発光法において発光試薬を用いる請求項１￣３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記発光試薬がルミノールまたはルシゲニンである請求項１￣４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記コエンザイムＱがコエンザイムＱ１０よりも低分子のコエンザイムＱである請求項１￣５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記コエンザイムＱがコエンザイムＱ１である請求項１￣５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
微生物の抗菌剤に対する感受性を評価するためのキットであって、
１種または２種以上の抗菌剤、コエンザイムＱ、及び発光試薬を含むことを特徴とする感受性試験用キット。
【請求項９】
複数の窪みを有するプレートの各窪みに異なる種類または異なる量の抗菌剤が収納されている請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
複数の窪みを有するプレートが９６ウェルプレートである請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物の増殖や活性を迅速簡便に測定する方法及びこの方法を用いる感受性試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
微生物を高感度に検出する方法として、例えば、細胞内のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の濃度をＤ−ルシフェリンとルシフェラーゼを用いて生物化学発光で測定する方法がある。しかし、この方法は、微生物の生死の区別ができない条件があるという点が問題であった。例えば、瞬間加熱殺菌の場合、微生物内にＡＴＰが酵素で分解されないまま残存し、生きた微生物と同程度のＡＴＰが死んだ微生物体内に残存することで、結果が擬陽性となる恐れがある。また、微生物体内のＡＴＰを定量する前に、培養液に含まれているＡＴＰを完全に分解除去する操作が必要である。その結果、測定操作が煩雑になり、ＡＴＰの定量感度が低下する恐れもある。
【０００３】
別法として、微生物の培養液に酸化型キノンとしてナメジオンを添加して、還元キノンを生成させた後、この還元型キノンが培養液中の溶存酸素と反応し、スーパーオキシドアニオンを発生させる方法がある（特開２００１−１２０２９９号公報）。スーパーオキシドアニオンの発生量は、微生物や活性に比例するため、微量のスーパーオキシドアニオンを化学発光法で定量し、微生物の濃度や活性を測定することができる。
【０００４】
この方法は、微生物を破壊することなしに迅速かつ簡便に微生物の濃度や活性を測定できるのが大きな特徴である。従来の微生物検査には１８時間￣２４時間という長時間が必要であり、検査結果の臨床への迅速な適用が妨げられていた。しかし、この化学発光法によれば、迅速かつ簡便な薬剤感受性試験が可能になる。
【０００５】
しかしながら、上記方法は、大腸菌、黄色ブドウ球菌、腸内球菌、緑膿菌などの迅速発育菌には極めて有効な測定方法であるが、結核菌のような遅発育菌には適用が困難であった。
【０００６】
そこで本発明の目的は、多様な微生物の増殖や活性に関する定量的測定を、微生物を破壊せず、メナジオンでは対応できない微生物の増殖や活性を迅速簡便に行える方法及びキットを提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
以上の実情に鑑み、本発明者は、結核菌のような遅発育菌には適用が困難である理由について検討した。その結果、酸化型キノンとして使用しているメナジオンが、結核菌の細胞膜の酵素や細胞内の酵素と充分反応できず、スーパーオキシドアニオンが生成しにくくなっていることが推測された。結核菌は乾燥重量の４０％近くが脂質であることから、メナジオンが脂質豊富な膜を通過できなかったのではないかと考えられ、多様な微生物の増殖や活性を調べるためには、メナジオンでは対応できなかった微生物に対して、より有効にスーパーオキシドアニオンの生成を促進するキノンが必要であると考えた。そこで、種々の物質について検討した結果、酸化型キノンとしてコエンザイムＱを用いることで、上記課題を解決できることを見いだして本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、培養液中で微生物をコエンザイムＱとともにインキュベーションし、生成物を化学発光法で定量することを特徴とする微生物の増殖及び／又は活性の測定方法に関する。
【０００９】
さらに本発明は、培養液中で微生物を抗菌剤の存在下、コエンザイムＱとともにインキュベーションし、生成物を化学発光法で定量して、定量された微生物の増殖力及び／又は活性から前記微生物の抗菌剤に対する感受性を評価することを特徴とする薬剤感受性試験方法に関する。
【００１０】
さらに本発明は、微生物の抗菌剤に対する感受性を評価するためのキットであって、１種または２種以上の抗菌剤、コエンザイムＱ、及び発光試薬を含むことを特徴とする感受性試験用キットに関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物の増殖及び／又は活性の測定方法および薬剤感受性試験方法では、培養液中で微生物をコエンザイムＱとともにインキュベーションすることにより生成する生成物を化学発光法で定量することを特徴とする。
【００１２】
本発明において酸化型キノンとして用いるコエンザイムＱは、ユビキノンあるいは補酵素Ｑとも呼ばれ、ＵＱとも略記され、２，３−ジメトキシ−５−メチル−６−ポリプレニル−１，４−ベンゾキノンである。側鎖であるポリプレニル基のイソプレンの縮合数により、例えば、縮合数であれば、ＵＱ１０と称される。
縮合数ｎが４以上のＵＱは、天然型であり、例えば、ＵＱ４、ＵＱ６、ＵＱ７、ＵＱ８、ＵＱ９及びＵＱ１０を挙げることができる。縮合数ｎが３以下のＵＱは、非天然型であり、ＵＱ０、ＵＱ１及びＵＱ２を挙げることができる。
【００１３】
本発明の微生物の増殖及び／又は活性の測定方法および薬剤感受性試験方法に使用するコエンザイムＱは、培養液に対する溶解度が大きいものの方が望ましく、この観点からは、２，３−ジメトキシ−５−メチル−６−ポリプレニル−１，４−ベンゾキノンのイソプレン縮合数ｎが小さい物質が好ましい。
また、コエンザイムＱは、培養液に対する溶解度以外に、対象となる微生物の種類に応じて、適宜選択することも好ましい。例えば、対象微生物が結核菌の場合、コエンザイムＱとしてＵＱ１及びＵＱ２を用いることが好ましく、対象微生物が大腸菌の場合、コエンザイムＱとしてＵＱ２を用いることが好ましい。
さらに、複数の種類のコエンザイムＱを併用することもできる。
【００１４】
本発明の方法では増殖及び／又は活性の測定することができる微生物には特に制限はなく、迅速発育菌や遅発育菌の測定が可能になったことを特徴とする。
迅速発育菌としては、例えば、大腸菌、黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、腸内球菌、緑膿菌、腸炎ビブリオ菌、コレラ菌、ペスト菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌などを挙げることができる。遅発育菌としては、例えば、百日咳菌、レジオネラ菌、抗酸菌の結核菌群、光発色菌群、暗発色菌群、非光発色菌群などを挙げることができる。
【００１５】
微生物の細胞膜には呼吸鎖つまり電子伝達系が存在し、電子伝達系には種々のキノンが特異的に存在している。また、これらのキノンを特異的に還元する酵素も存在する。
従って、コエンザイムＱを培養液に添加してやると、微生物によってコエンザイムＱは還元され、還元生成物は更に培養液中の溶存酸素と反応して、不安定なスーパーオキシドアニオンが発生すると推測される。即ち、本発明の方法において、前記生成物は、例えば、スーパーオキシドアニオンである。
【００１６】
本発明の方法では、迅速発育菌や遅発育菌の培養液に、コエンザイムＱを添加し、インキュベーションすると、好気的条件下では、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）が培養液中に発生する。そして、スーパーオキシドアニオンを化学発光法により定量することで、微生物の増殖や活性を測定することができる。
【００１７】
特開平１−１６０４９９号公報に記載された方法では、測定対象である生細胞が主に酵母や真核細胞の場合、キノンの酸化還元を介して過酸化水素が定量的に生成されるため、この過酸化水素量を定量することで、生細胞の増殖や活性を定量することができた。しかし、測定対象が細菌の場合、主たる生成物はスーパーオキシドアニオンであるため、これに特異的な発光試薬が必要になる。
【００１８】
本発明の微生物の増殖及び／又は活性の測定方法および薬剤感受性試験方法においては、培養液中のコエンザイムＱの濃度は数十から数百μＭ程度とすることができ、培養液に含まれる栄養成分やインキュベーシヨンの温度は、微生物の種類により適宜選択することができる。これにより微生物の濃度は数万￣数百万個／ｍｌ程度の範囲で測定が可能になる。インキュベーション時間は数十分から数時間まで設定ができ、微生物の濃度や活性に応じて、最適の反応条件を選択することが望ましい。
【００１９】
化学発光の測定は以下のように行うことができる。微生物を含む培養液にコエンザイムＱを添加してインキュベーションを開始し、適当な間隔で培養液から適量をサンプリングする。サンプリング液にルミノール等の発光試薬を添加し、発光強度を測定する。発光強度の測定は、発光試薬の種類に応じて、常法により行うことができる。
【００２０】
従来の病原菌の薬剤感受性試験は、細菌の増殖の変化を目視で判定しているため、試験結果が得られるまでに最低でも１０時間以上必要であった。しかし、本発明の測定方法では、数分から数時間程度の時間で、細菌の増殖や活性を測定することができる。
【００２１】
本発明の感受性試験方法は、上記コエンザイムＱを含む培養液中での微生物のインキュベーションを抗菌剤の存在下で実施する。使用される抗菌剤の種類には特に制限はない。微生物の種類に応じて適宜選択できる。
また、培養液中の抗菌剤の濃度を変化させて試験することや２種以上の抗菌剤を併用することで、種々の角度から薬剤感受性試験を行うこともできる。本発の方法は上記のように短時間で薬剤の微生物に対する影響が観察できるので、この時間内に薬剤感受性試験が完了する。
【００２２】
さらに本発明は、微生物の抗菌剤に対する感受性を評価するためのキットを包含する。このキットは、例えば、複数の窪みを有するプレートの各窪みに異なる種類または異なる量の抗菌剤を収納した、試験用プレートと、コエンザイムＱ及び発光試薬を含む。コエンザイムＱ及び発光試薬は上述のものと同様である。
【００２３】
複数の窪みを有するプレートは、例えば、９６ウェルプレートであることができ、９６ウェルプレートの各ウェルに異なる種類または異なる量の抗菌剤を入れておく。場合により、１つのウェルに２種以上の抗菌剤を入れることもできる。そして、この９６ウェルプレートの各ウェルに抗菌剤に対する感受性を評価する対象となる微生物の培養液を添加し、さらにコエンザイムＱを添加する。コエンザイムＱは、微生物の培養液に予め添加しておいても構わない。適当な時間培養した後に、発光試薬を添加し、発光強度を測定する。
各ウェルに収納される抗菌剤の種類や量は、検査対象の微生物に応じて適宜選択できる。
【００２４】
【発明の効果】
上記のように本発明の方法及びキットを使用すれば、従来の薬剤感受性試験の所要時間に比べて、極めて短い時間で試験が完了する。特に、結核菌の薬剤感受性試験では目視による寒天培養法では１月以上要し、最近開発された溶存酸素感受性蛍光剤を使った試験管による培養法でも２週間以上要する。そのため、結核の予防すら危ぶまれる。本発明の方法では、一週間以内に結核菌の薬剤感受性試験が完了でき、患者に対して迅速な化学療法が行える。また、結核以外の緊急の化学療法を必要とする治療にも有用である。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１　　（結核菌によるルミノール化学発光に対するビタミンＫとコエンザイムＱの効果）
ミドルブルック７Ｈ９培養液で培養した結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＲＩＤＭ　１３１４００６）を、同培養液で希釈し、菌濃度を約３×１０６ＣＦＵ／ｍｌ相当に合わせた。尚、ＣＦＵはＣｏｌｏｎｙ　Ｆｏｒｍｉｎｇ　　Ｕｎｉｔの意味である。これに、各種のビタミンＫまたはコエンザイムＱを４００μＭの濃度になるように添加し、３７℃で１０分間なら１時間イキュベーションした。この後、ルミノール発光試薬を添加し、２秒間発光強度を測定した。
【００２６】
表１に示すように、ビタミンＫ３（メナジオン）　、コエンザイムＱ０、Ｑ１及びＱ２を添加した培養液で、１０分間インキュベーションで強い発光が観察された。特に、コエンザイムＱ１及びＱ２は、ビタミンＫ３よりも強い発光強度を示し、かつ、ブランク（結核菌不含の培養液）の発光強度に比べて、１０倍から２０倍の強い発光強度が得られた。一方、ビタミンＫ３は、発光強度が強かったにもかかわらず、ブランクに対して僅かに強かったにすぎなかった。この傾向は、１時間インキュベーションでもほぼ同じであった。このことから、結核菌による化学発光に対して、コエンザイムＱ１とＱ２が優れた発光強度をもたらすことがわかる。
【００２７】
【表１】
2004049085.tif 000003
初発菌濃度　　　　　　　ＯＤ＝０．０７　　６００ｎｍ
キノン濃度　　　　　　　４００μＭ
インキュベーション　　　３７℃　　１０分間
（　）は６０分間の値
【００２８】
実施例２
（大腸菌によるルミノール化学発光に対するビタミンＫとコエンザイムＱの効果）
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ＡＴＣＣ２５９２２）をミューラーヒントン培地で培養し、培地の菌濃度が約１０６ＣＦＵ／ｍｌ相当になるように調製し、これに実施例１と同じ条件でキノンを添加し、化学発光強度を測定した。
表２に示すように、ビタミンＫ３、コエンザイムＱ１及びＱ２を用いた系で、強い化学発光強度が観察された。１０分間よりも１時間インキュベーションした方が、より強い発光強度が得られ、ブランクに対する発光強度の比率も上昇した。このことは、実施例１の遅発育菌である結核菌よりも、迅速発育菌である大腸菌の方が、インキュベーション時間を長くすることで増殖が進行し、より強い発光強度がえられることを示している。また、表１と表２からコエンザイムＱ１が結核菌と大腸菌の両者に対して、有効なキノンであることがわかる。
【００２９】
【表２】
2004049085.tif 000004
初発菌濃度　　　　　　　ＯＤ＝０．２６７　　６００ｎｍ
キノン濃度　　　　　　　４００μＭ
インキュベーション　　　３７℃　　１０分間
（　）は６０分間の値
【００３０】
実施例３
（結核菌のルミノール化学発光に対するコエンザイムＱ１とＱ２の最適濃度の検討とスーパーオキシドジスムターゼの効果）
結核菌の培養液の菌濃度を約９×１０６ＣＦＵ／ｍｌ相当に合わせ、これにコエンザイムＱの濃度が０￣４００μＭになるように添加した。６０分間のインキュベーション後にルミノール発光試薬を添加し、２秒間化学発光強度を測定した。また、コエンザイムＱ添加時に１５Ｕ／ｍｌのスーパーオキシドジスムターゼを添加し、その効果も調べた。
【００３１】
図１に示す化学発光強度（ＬＣＩ，　Ｌｕｍｉｎｏｌ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）はブランクの値を差し引いたものである。この図から、結核菌のルミノール化学発光に対するコエンザイムＱ１及びＱ２の最適濃度は２００μＭであることがわかる。また、スーパーオキシドジスムターゼによって完全に発光が消滅したことから、スーパーオキシドアニオンが、本発明の測定方法の主たる測定対象生成物はスーパーオキシドアニオンであることがわかる。
【００３２】
実施例４
（結核菌の定量に対するビタミンＫ３とコエンザイムＱ１とＱ２の効果）
結核菌をミドルブルック７Ｈ９で培養後、同培地で希釈し、２００μＭの濃度になるようにビタミンＫ３、コエンザイムＱ１及びＱ２をそれぞれ添加した。１０分から１時間インキュベーションした後、ルミノール発光試薬を添加して、２秒間発光強度を測定した。
【００３３】
図２と３に示す発光強度は、ブランクの発光強度を差し引いた値である。ビタミンＫ３の場合、菌濃度が約１０５ＣＦＵ／ｍｌ相当になるまで菌液を希釈すると、ブランクに対して有意な差が得られなかった。しかし、図２に示すように、コエンザイムＱ１及びＱ２の場合は、約１０４ＣＦＵ／ｍｌ相当まで発光強度の有意な差が観察できた。このことは、ビタミンＫ３よりもコエンザイムＱ１及びＱ２の方が１０倍感度が良く、結核菌の低濃度の生菌を測定するのに適していることがわかる。従って、抗菌剤による生菌の減少を測定することにも適していると期待できる。
【００３４】
実施例５　　（結核菌のストレプトマイシン感受性試験）
結核菌の菌濃度を約２×１０６ＣＦＵ／ｍｌ相当に合わせ、ストレブトマイシンを１０、２０、４０、１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で培養した。１、３、４、７日後に菌液を取り、２００μＭのビタミンＫ３、コエンザイムＱ１を添加し、１０分間インキュベーションした。各液にルミノール発光試薬を添加し、２秒間発光強度を測定した。
【００３５】
図４にコエンザイムＱ１を用いた場合の結果を、図５にビタミンＫ３を用いたの結果を示す。
図４に示すコエンザイムＱ１を用いた場合は、ストレブトマイシンの用量が多くなるにつれ、また、培養日数が経過することで、ＣＦＵが減少することが分かる。それに対して、図５に示すビタミンＫ３を用いた場合は、低濃度の菌濃度に対する検出感度が低下するため、ＣＦＵが過小評価される傾向があった。
従って、生菌数が低い菌液でも充分な発光強度をもたらすコエンザイムＱ１を用いた方が、安定した薬剤感受性試験の結果を得ることができることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】結核菌のルミノール化学発光に対するコエンザイムＱ１とＱ２の最適濃度を検討するための化学発光強度の測定結果。
【図２】結核菌の定量に対するビタミンＫ３とコエンザイムＱ１とＱ２の効果を検討するための化学発光強度の測定結果。
【図３】結核菌の定量に対するビタミンＫ３とコエンザイムＱ１とＱ２の効果を検討するための化学発光強度の測定結果。
【図４】コエンザイムＱ１を用いた結核菌のストレプトマイシン感受性試験結果。
【図５】ビタミンＫ３を用いた結核菌のストレプトマイシン感受性試験結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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