(57)【要約】【課題】本発明は、より安全性が高く、しかもメイラード反応抑制効果がより高い物質を提供すること、並びに、メイラード阻害効果と共に、ＡＧＥ−タンパク質架橋物質切断活性をも有するメイラード反応抑制物質を提供すること、を目的とするものである。【解決手段】本発明は、柑橘類の揮発性油状物を有効成分とするメイラード反応抑制物質を提供するものである。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
柑橘類の揮発性油状物を有効成分とするメイラード反応抑制物質。
【請求項２】
柑橘類の揮発性油状物が、柑橘類を非極性有機溶媒抽出又は水蒸気蒸留することによって得られるものである、請求項１記載のメイラード反応抑制物質。
【請求項３】
揮発性油状物が、モノテルペン類、セスキテルペン類及びモノテルペンアルコール類の中から選ばれる１種以上を含有するものである、請求項１又は２記載のメイラード反応抑制物質。
【請求項４】
柑橘類がユズである、請求項１〜３のいずれかに記載のメイラード反応抑制物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品や生体内におけるメイラード反応を抑制する物質に関し、さらに詳しくは柑橘類の揮発性油状物であるモノテルペン類、セスキテルペン類、モノテルペンアルコール類などを有効成分とするメイラード反応抑制物質に関する。本発明のメイラード反応抑制物質は、食品の褐変抑制剤、糖尿病とその合併症の予防及び治療剤などとして有用である。
【０００２】
【従来の技術】
メイラード反応は、古くから食品などの褐変化反応として知られており、アミノ酸、タンパク質、ペプチド等のアミノ基と、還元糖のアルデヒド基が非酵素的に結合する反応であって、この反応は初期段階と後期段階とに分けられている（ファルマシア，　Ｖｏｌ．２８，　Ｎｏ．５，　ｐ．４６６−４７０，　１９９２）。
【０００３】
初期段階は、アミノ基とアルデヒド基とが反応しシッフ塩基を形成することから始まり、１，２−エナミノールを経てケトアミンなどのアマドリ化合物を形成する反応である。
また、後期段階は、前記のアマドリ化合物が脱水、転移、縮合など非可逆的反応を受け、非常に反応性に富みタンパク質の架橋形成を起こす３−デオキシグルコソンのようなジカルボニル化合物を経て、最終的に褐色や蛍光などの物理化学的特徴を持つペントシジンなどの後期反応産物（ＡＧＥ：ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に変化する反応である。
【０００４】
これら一連の反応により、食品の色、香、物性などの品質が劣化するため、メイラード反応を抑制することによって食品の品質劣化を防止することが期待できる。
【０００５】
一方、メイラード反応は生体内でも起こっており、特に糖尿病患者においては高血糖によるメイラード反応後期反応産物とタンパク質とが架橋した架橋形成物によって、白内障、腎臓、血管障害などの種々の糖尿病合併症が引き起こされることが知られている。また、老化によっても、同様の反応が進行し、皮膚の角質層機能を傷害し、皺や染みなどの老化症状の原因となっているとも言われている。
【０００６】
従って、メイラード反応の進行を阻害することによってメイラード反応産物を抑制する物質を開発することは重要であり、また、一度生成されたメイラード反応後期反応産物であるジカルボニル化合物やメラノイジンとタンパク質との架橋形成物を分解除去する物質を開発することも、糖尿病の合併症の予防や治療、老化の防止などにおいてさらに重要であると言われている。
【０００７】
メイラード反応を阻害する物質としては、アミノグアニジン誘導体（特開平２−７６５号公報）、アミジノヘテロ環誘導体（特開平６−１９２０８９号公報）やパラバン酸誘導体（特開平１０−１８２４６０号公報）などのメイラード反応阻害剤が開示されている。
また、メイラード反応後期反応産物であるジカルボニル化合物などの架橋形成物を分解除去する物質としては、Ｎ−ｐｈｅｎａｃｙｌｔｈｉｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ（ＰＴＢ）（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３８２，　ｐ．２７５−２７８，　１９９６）、４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｉｕｍ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ（ＡＬＴ−７１１）（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　Ｖｏｌ．９５，　ｐ．４６３０−４６３４，　１９９８）などが報告されている。
【０００８】
しかし、これらはいずれも化学合成物であり、食品での安全性の点や、薬剤としての副作用の発生など、その効力について問題が指摘されている。
【０００９】
一方、天然成分としては、プロアントシアニジン（特開平６−３３６４３０号公報）、フラボノイド化合物（特開平９−２４１１６５号公報）、フラバノン類（特開平７−３２４０２５号公報）などが開示されており、これらは比較的安全性が高いと期待されるが、一方、これらの効力は決して満足できるものではなかった。
【００１０】
従って、より安全性が高いと考えられる食物由来の天然成分であって、かつ、メイラード反応抑制効果がより高い物質を開発することが望まれていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来の問題点を解消し、より安全性が高く、しかもメイラード反応抑制効果がより高い物質を提供することを目的とするものである。
【００１２】
さらに、本発明は、メイラード阻害効果と共に、ＡＧＥ−タンパク質架橋物質切断活性をも有するメイラード反応抑制物質を提供することを目的とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、安全性が高い天然成分について広く検索した結果、驚くべきことに、食経験が豊富な柑橘類から、非極性有機溶媒抽出又は水蒸気蒸留によって得られる揮発性油状物、特にモノテルペン類、セスキテルペン類、モノテルペンアルコール類などが強いメイラード反応阻害効果を保有していること、さらには、この柑橘類の揮発性油状物が一度形成されたタンパク質架橋形成物を切断する能力をも保有することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに到った。
【００１４】
なお、メイラード反応抑制作用を有する柑橘類の成分としては、特開平７−３２４０２５号公報に開示されたナリンギン、ナリンゲニンなどのフラバノン類や、特開平９−２４１１６５号公報に開示のフラボノイド化合物が知られているが、これらの物質は、柑橘果実、果皮などからメタノールなどの極性溶媒によって抽出されるものである。
【００１５】
これに対して、本発明の揮発性油状物も柑橘類から調製されるが、本発明の揮発性油状物は、水蒸気蒸留法やエチルエーテルなどの非極性有機溶媒によって抽出されるものであり、モノテルペン類、セスキテルペン類及びモノテルペンアルコール類から選ばれる１種以上を含有するものであって、上記フラバノン類やフラボノイド化合物とは全く異なる物質であり、また、一度形成されたＡＧＥ−タンパク質架橋形成物を切断する能力をも保有するなど、その効果が高いことを見出し、本発明を完成することができた。
【００１６】
すなわち、請求項１に係る本発明は、柑橘類の揮発性油状物を有効成分とするメイラード反応抑制物質を提供するものである。
【００１７】
請求項２に係る本発明は、柑橘類の揮発性油状物が、柑橘類を非極性有機溶媒抽出又は水蒸気蒸留することによって得られるものである、請求項１記載のメイラード反応抑制物質を提供するものである。
【００１８】
請求項３に係る本発明は、揮発性油状物が、モノテルペン類、セスキテルペン類及びモノテルペンアルコール類の中から選ばれる１種以上を含有するものである、請求項１又は２記載のメイラード反応抑制物質を提供するものである。
【００１９】
請求項４に係る本発明は、柑橘類がユズである、請求項１〜３のいずれかに記載のメイラード反応抑制物質を提供するものである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
請求項１に係る本発明は、柑橘類の揮発性油状物を有効成分とするメイラード反応抑制物質である。
請求項１に係る本発明のメイラード反応抑制物質は、柑橘類、例えば柑橘類の破砕物、搾汁液、搾汁残渣を使用し、これを請求項２に記載したように非極性有機溶媒抽出又は水蒸気蒸留することによって調製することができる。
【００２１】
ここで柑橘類としては、ユズ、ハッサク、ナツミカン、オレンジ、レモン、ミカンなどが挙げられ、これらの中でも、請求項４に記載したように、特にユズが最も好ましい。
【００２２】
このような柑橘類の破砕物、搾汁液、搾汁残渣を使用し、これを非極性有機溶媒抽出又は水蒸気蒸留することによって、目的とする柑橘類の揮発性油状物が得られる。
【００２３】
非極性有機溶媒抽出の場合に用いる抽出溶媒としては、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ｎ−ペンタンなどの非極性有機溶媒の１種、又は２種以上の混合物が挙げられる。
溶媒の使用量は特に制限はないが、一般に柑橘類の破砕物、搾汁液、搾汁残渣１００質量部に対して、１〜１０００質量部程度である。
抽出条件は、室温程度で１０〜３００分間程度であるが、これに限定されるものではない。
柑橘類の破砕物、搾汁液、搾汁残渣に所定量の非極性有機溶媒を加え、還流して抽出し、得られた抽出液から溶媒を留去することにより、非極性有機溶媒抽出による柑橘類の揮発性油状物が得られる。
【００２４】
また、水蒸気蒸留による場合、公知の水蒸気蒸留装置を用いて柑橘類の破砕物、搾汁液、搾汁残渣を水蒸気蒸留し、得られた水蒸気蒸留液を遠心分離し、上層を回収することにより、水蒸気蒸留による柑橘類の揮発性油状物が得られる。
【００２５】
このようにして得られる柑橘類の揮発性油状物について、更に各種有機溶媒による分画や、シリカゲルによるクロマト分画などによって精製をした後に、溶媒を除去して用いることができる。また、必要に応じて化学合成物を利用することもできる。
【００２６】
このようにして得られる本発明の柑橘類の揮発性油状物は、請求項３に記載したように、モノテルペン類、セスキテルペン類及びモノテルペンアルコール類の中から選ばれる１種以上を含有するものである。
このようにして得られる本発明の柑橘類の揮発性油状物は、モノテルペン類、セスキテルペン類及びモノテルペンアルコール類が主要な有効成分となっているが、この他に、アルデヒド類やエステル類が含まれていてもよい。但し、少なくともモノテルペン類、セスキテルペン類及びモノテルペンアルコール類の中から選ばれる１種以上を含有していることが必要である。
【００２７】
ここでモノテルペン類としては、様々なものがあるが、特にオシメン、ｄ−リモネン、α−テルピネン、カレン、カンフェン、或いはこれらの２種以上の混合物が好ましい。
また、セスキテルペン類としては、様々なものがあるが、特にβ−ファルネセン、β−ビサボレン、或いはこれらの混合物が好ましい。
さらに、モノテルペンアルコール類としては、様々なものがあるが、特にテルピネン−４−オール、α−テルピネオール、トランス−カルベノール、ボルネオール、或いはこれらの２種以上の混合物が好ましい。
【００２８】
本発明のメイラード反応抑制物質は、上記した如き柑橘類の揮発性油状物を有効成分とするものである。
本発明のメイラード反応抑制物質を食品等の製品に添加して、褐変などの品質劣化の抑制を目的として使用する場合の食品への添加量は、食品成分によって異なるため、一義的に決定することは困難であり、特に限定されない。一つの目安としては、例えば、ドレッシングで効果を発揮させるためには、一般に０．０１〜５％の範囲、更に望ましくは０．０１〜０．１％の範囲となるように設計することが望ましい。
【００２９】
また、本発明のメイラード反応抑制物質を糖尿病の合併症の予防、治療を目的として使用する場合、投与量は、年齢、症状程度などによって異なるため特に限定されない。なお、摂取形態としては、錠剤でも液剤でも、製剤として許容され得る形態で投与することができる。さらに、非経口的に皮下注射、経鼻投与などの形態で投与することでも効果が得られ、摂取、投与方法に限定はない。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
実施例１（柑橘類の非極性有機溶媒による揮発性油状物の調製）
ユズ５００ｇを水道水で洗浄後、フードカッターで粉砕した。粉砕物をサラシで絞り搾汁液とした。この搾汁液３００ｍｌに対し２００ｍｌのエチルエーテルを添加し１Ｌ容量の分液ロートに入れ、室温で３０分間振盪した後、エチルエーテル層を回収した。残った水層に対して同様の操作を２回繰り返して、計６００ｍｌのエチルエーテル層を得た。
このエチルエーテル層を２０℃でエバポレーターにて減圧を低く抑えながらエチルエーテルを蒸発させて、低沸点で、かつ、低極性である、非極性有機溶媒による揮発性油状物約１０ｍｌを得た。
【００３２】
実施例２（柑橘類の水蒸気蒸留による揮発性油状物の調製）
ユズ１００ｇを水道水で洗浄後、フードカッターで粉砕した。粉砕物をサラシで絞った後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間）し、上清液７０ｍｌを得た。この上清液を水蒸気蒸留装置〔柴田科学社製セミ・ミクロ水蒸気蒸留装置（小林式）〕を用いて蒸留し、約２００ｍｌの水蒸気蒸留液を得た。
得られた水蒸気蒸留液を遠心分離（７０００ｒｐｍ、３０分間）し、その上層の油状物を回収して、最終的にユズの水蒸気蒸留による揮発性油状物約３ｍｌを得た。
【００３３】
実施例３（実施例１で調製した揮発性油状物のペントシジン生成阻害活性）
実施例１で調製したユズの非極性有機溶媒による揮発性油状物について、ＡＧＥの一つであるペントシジンの生成阻害活性を測定した。
測定方法は、以下の表１に示す組成の反応溶液を１．５ｍｌ容量のプラスチックチューブに調製し、６０℃、２４時間、ヒートブロック上でインキュベートした。
【００３４】
【表１】
2004035424.tif 000002
【００３５】
反応終了後、反応溶液１００μｌに４００μｌの蒸留水を加え、ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラムのピーク面積からペントシジン生成阻害活性を、阻害率（％）として算出した。なお、ＨＰＬＣの測定条件は、以下の通りであった。
【００３６】
〔ＨＰＬＣの測定条件〕
・ポンプ；ＨＰ１１００（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
・カラム；ＲＰ−１８，４．６×２５０ｍｍ（関東化学社製）
・溶媒；３％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ
・流速；１ｍｌ／ｍｉｎ．
・温度；４０℃
・検出器；ｅｘ．３３５ｎｍ，ｅｍ．３８０ｎｍ
・試料注入量；１０μｌ
・保持時間；１２ｍｉｎ．
【００３７】
なお、ペントシジンはＳｅｌｌらの方法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．２６４，　ｐ．２１５９７−２１６０２，　１９８９）に基づいて調製したものを用い、ＨＰＬＣ分析により得られたクロマトグラム上のピークがペントシジンであることを確認した後、使用した。
市販試薬アミノグアニジン・硫酸塩を蒸留水に溶解し、１ｍＭと１０ｍＭの濃度にそれぞれ調製して、ペントシジン生成阻害の対照試料溶液とした。また、実施例１で調製したユズの非極性有機溶媒による揮発性油状物を蒸留水で適宜希釈し、試料溶液とした。
ペントシジン生成阻害活性は、阻害率として算出したが、算出方法は以下の通りである。ペントシジン生成阻害活性を表２に示す。
【００３８】
阻害率（％）＝１００−［（各試料溶液のペントシジン量／蒸留水を試料溶液とした時のペントシジン量）×１００］
【００３９】
【表２】
（ペントシジン生成阻害活性）
2004035424.tif 000003
【００４０】
以上の結果、ユズの非極性有機溶媒による揮発性油状物には、ＡＧＥの一種であるペントシジンの生成を阻害する強い活性があることが確認できた。
【００４１】
実施例４（実施例２で調製した揮発性油状物のペントシジン生成阻害活性）
実施例２で調製したユズの水蒸気蒸留による揮発性油状物について、実施例３と同様にして、ＡＧＥの一つであるペントシジンの生成阻害活性を測定した。
すなわち、前記表１に示す組成の反応溶液を１．５ｍｌ容量のプラスチックチューブに調製し、６０℃、２４時間、ヒートブロック上でインキュベートした。反応終了後、反応溶液１００μｌに４００μｌの蒸留水を加えてＨＰＬＣ分析し、その結果得られたクロマトグラムのピーク面積から、実施例３と同様にして、ペントシジン生成阻害活性を阻害率（％）として算出した。なお、ＨＰＬＣの測定条件は、前記の通りであった。
また、ペントシジンは、実施例３で調製したものを用い、市販試薬アミノグアニジン・硫酸塩を蒸留水に溶解し、１ｍＭと１０ｍＭの濃度にそれぞれ調製して、ペントシジン生成阻害の対照試料溶液とした。一方、実施例２で調製したユズの水蒸気蒸留による揮発性油状物を蒸留水で適宜希釈したものを試料溶液とした。
ペントシジン生成阻害活性を表３に示す。
【００４２】
【表３】
（ペントシジン生成阻害活性）
2004035424.tif 000004
【００４３】
以上の結果、実施例１，２で調製したいずれの揮発性油状物においても、ほぼ濃度依存的にペントシジン生成阻害活性があることが確認できた。
【００４４】
実施例５（揮発性油状物のＡＧＥ−タンパク質架橋形成物モデル切断活性）
Ｓ．Ｖａｓａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３８２，　ｐ．２７５−２７８，　１９９６）に従って、ＡＧＥ−タンパク質架橋形成物モデルの切断活性を測定した。すなわち、リン酸緩衝液中でタンパク質架橋形成物モデルであるジカルボニル化合物　１−フェニル−１，２−プロパンジオンに試料を加えて反応させ、発生する安息香酸をＨＰＬＣで定量した。なお、反応液は以下の表４に示した組成とした。
【００４５】
【表４】
（反応液組成）
2004035424.tif 000005
【００４６】
上記組成の反応液を１．５ｍｌ容のプラスチックチューブに調製し、３７℃、４時間振盪機でインキュベートした。
なお、比較試料として１００ｍＭのＰＴＢ溶液を用いたが、ＰＴＢは文献（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３８２，　ｐ．２７５−２７８，　１９９６）に記載の通りに調製した。また、実施例１で調製した揮発性油状物を蒸留水で適宜希釈し試料溶液とした。
反応終了後、２Ｎ−ＨＣｌを２００μｌ加えて攪拌し反応を停止させた。その後、本溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過しＨＰＬＣ測定溶液とした。なお、ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
【００４７】
〔ＨＰＬＣ測定条件〕
・ポンプ；ＨＰ１１００（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
・カラム；ＲＰ−１８，４．６×２５０ｍｍ（関東化学社製）
・溶媒；４０％ＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ
・流速；１ｍｌ／ｍｉｎ．
・温度；４０℃
・検出器；２５４ｎｍ
・試料注入量；２０μｌ
【００４８】
以上の方法で実験した結果を表５に示す。なお、切断率は全ての１−フェニル−１，２−プロパンジオンが切断された場合には１０ｍＭの安息香酸が遊離すると仮定できるので、以下の式に従って算出した。
切断率（％）＝（各試料溶液から発生する安息香酸量／１０ｍＭ安息香酸量）×１００
【００４９】
【表５】
（ＡＧＥ−タンパク質架橋形成物モデル切断活性）
2004035424.tif 000006
【００５０】
以上の結果、揮発性油状物中には、一旦生成したＡＧＥ−タンパク質架橋形成物の架橋を切断、分解する活性が、比較試料であるＰＴＢと同等以上に強い物質が含有されていることが推定できた。
【００５１】
実施例６（精油成分によるペントシジン生成阻害活性及びＡＧＥ−タンパク質架橋形成物切断活性）
ユズの揮発性油状物に含有されている精油成分の内、主な物質について、実施例３と同様の方法でペントシジン生成阻害活性を、また、実施例５と同様の方法でＡＧＥ−タンパク質架橋形成物モデル切断活性をそれぞれ測定した。対照としては、アミノグアニジン及びＰＴＢを用いた。結果を表６に示した。
【００５２】
【表６】
（精油成分によるＡＧＥ生成阻害活性及び切断活性）
2004035424.tif 000007
【００５３】
以上の結果、柑橘類の揮発性油状物に含有されている精油成分の内、モノテルペン類、セスキテルペン類、モノテルペンアルコール類のいずれにおいても、ペントシジン生成を阻害する強い活性が認められ、また、同時にＡＧＥとタンパク質の架橋を切断する強い活性も保有することが推定できる結果が得られた。
【００５４】
実施例７（揮発性油状物のＡＧＥ−タンパク質架橋切断活性の効果確認）
Ｓ．Ｖａｓａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．３８２，　ｐ．２７５−２７８，　１９９６）により、実施例１で調製したユズの揮発性油状物のＡＧＥ−タンパク質架橋切断活性を確認した。
すなわち、コラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　ｔｙｐｅ　Ｉ−Ｃ，３ｍｇ／ｍｌ：新田ゼラチン社製）を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）（以下、ＰＢＳ）を用いて１０μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、シールで蓋をして、３７℃、４時間インキュベートして、コラーゲンを吸着させた。
その後、Ｓ．Ｖａｓａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，　３８２，　２７５−２７８，　１９９６）で調製したＡＧＥ−牛血清アルブミン（ＢＳＡ）架橋形成物（ＡＧＥ−ＢＳＡ）を１０μｇ／ｍｌ濃度でＰＢＳに溶解して調製した溶液を、１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、シールで蓋をし、さらに３７℃で４時間インキュベートして、コラーゲンにＡＧＥ−ＢＳＡを結合させた。
そして、さらに各ｗｅｌｌには、ＰＢＳに溶解させた測定試料を分注し、シールで蓋をして、３７℃で４時間インキュベートした後、ＰＢＳで３回ｗｅｌｌを洗浄し、０．１％カゼインコーティングバッファー（１５ｍＭ　Ｎａ２ＣＯ３，３０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３）を２００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注して、３７℃で４時間インキュベートした。
【００５５】
なお、測定試料としては、ＰＴＢを２ｍＭと２０ｍＭ添加したものを対照とし、ユズの揮発性油状物を５％、１０％及び２０％添加したものを用いた。
次に、ＰＢＳで３回洗浄後、ｗｅｌｌに最終的に残存したＢＳＡ量を分析した。すなわち、ラビット抗ＢＳＡ１次抗体〔Ａｎｔｉ−ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ，　ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　ｆｒａｃｔｉｏｎ（ａｎｔｉ−ＢＳＡ）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製〕を５０μｌ／ｗｅｌｌで分注し、室温で１時間インキュベートし、引き続きＰＢＳで３回洗浄後、ビオチン抗ラビットＩｇＧ２次抗体（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ−ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：Ｚｙｍｅｄ社製）を５０μｌ／ｗｅｌｌで分注し、室温で２０分間インキュベートした。
【００５６】
その後、ＰＢＳで３回洗浄後、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ溶液（Ａｌｋａｌｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ：Ｊａｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で２０分間インキュベートした。
さらに、ｐＮＰＰ発色溶液（１０ｍＭ　４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ，　５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２／１Ｍ　ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）を２００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１０分間反応後に、１Ｎ　ＮａＯＨを５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注して反応を停止し、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５７】
以上の方法で測定された各測定試料の吸光度（Ａｂ４０５ｎｍ：試料）と、測定試料の代わりにＰＢＳを添加して得られた吸光度（Ａｂ４０５ｎｍ：ＰＢＳ）をもとにして、ＢＳＡ放出率（％）を以下の式で算出した。
ＢＳＡ放出率（％）＝［（Ａｂ４０５ｎｍ：ＰＢＳ−Ａｂ４０５ｎｍ：試料）／Ａｂ４０５ｎｍ：ＰＢＳ］×１００
【００５８】
このＢＳＡ放出率を図１に示した。
その結果、揮発性油状物は、実際のＡＧＥ−タンパク質の架橋を分解、切断し、ＢＳＡを放出する活性が強いことが確認できた。
【００５９】
【発明の効果】
本発明によれば、より安全性が高いと考えられる食物由来の天然成分であって、かつ、メイラード反応抑制効果がより高い物質が提供される。
さらに、本発明によれば、メイラード阻害効果と共に、ＡＧＥ−タンパク質架橋物質切断活性をも有するメイラード反応抑制物質が提供される。
【００６０】
本発明の柑橘類の揮発性油状物、特にモノテルペン類、セスキテルペン類及びモノテルペンアルコール類の中から選ばれる１種以上を含有する柑橘類の揮発性油状物は、食品のメイラード反応による品質劣化の抑制、及び糖尿病合併症の発病などメイラード反応に起因する疾病の予防、治療を可能にするものである。
従って、本発明は、色調、香味品質のより優れた食品の提供や、白内障、腎臓、血管障害などの種々の糖尿病合併症の予防、治療、さらには老化による皺や染みなどの老化症状の抑制等に、安全に利用することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例５におけるＢＳＡ放出率の結果、つまり揮発性油状物のＡＧＥ−タンパク質架橋切断活性を示すグラフである。
【図１】
2004035424.tif 000008