(57)【要約】【課題】海水から、原油を炭素源として加えたマリンブロスで生育でき、かつ原油乳化能を示す微生物を検索した。【解決手段】その結果、３種の菌株を得た。これらの菌株は、バイオサーファクタントを産生し、油乳化能を示す。即ち、Ｍｙｒｏｉｄｅｓ  ｏｄｏｒａｔｕｓ  ＳＭ−１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＭ−４（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０５９）、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＳＭ−９（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６０）から成る群から選択される微生物である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｙｒｏｉｄｅｓ  ｏｄｏｒａｔｕｓ  ＳＭ−１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＭ−４（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０５９）、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＳＭ−９（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６０）から成る群から選択される微生物。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物の培養液。
【請求項３】
請求項２に記載の培養液から抽出されたバイオサーファクタント。
【請求項４】
請求項２に記載の培養液、又は請求項３に記載のバイオサーファクタントを主要成分とする界面活性剤組成物。
【請求項５】
請求項２に記載の培養液、請求項３に記載のバイオサーファクタント、又は請求項４に記載の界面活性剤組成物を用いて油を乳化する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、海洋由来の新規微生物、この微生物の産生するバイオサーファクタント、及びこのバイオサーファクタントを用いて油、特に原油を乳化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
界面活性剤は、現代生活には欠かせない物質としていわゆる洗剤のほか様々な生産過程で使用されるとともに、様々な日用製品や食品中に含まれている。特に、天然の界面活性剤として知られたサポニンやいわゆる石鹸の使用は歴史的にも長いが、天然の界面活性剤はその界面活性能力や生産性から用途が限定されている。界面活性剤としては、コストや生産量などから一般に合成界面活性剤が用いられているが、生物毒性や環境残留性といった問題が指摘されている。
一方、微生物由来の様々な界面活性剤様物質が報告されており、これらはバイオサーファクタントと称されるが、ミセル形成臨界濃度（ＣＭＣ）が合成洗剤に比べて低く、生物毒性や環境残留性がないといった長所を有している。また、培養により大量生産することができるといった特徴も有している。
【０００３】
自然界には様々な微生物が存在し、それらの中にはまだ未知の機能を持つものが含まれており、バイオサーファクタント生産菌も次々と報告されている。ラムノリピド（例えば、非特許文献１参照。）やソフオロリピド（例えば、非特許文献２参照。）を含むいくつかのバイオサーファクタントは生産性を上げて既に実用化され、生合成経路なども解明されている。
これらの中で海洋細菌は生育環境が海水であるため、塩分濃度の高い環境で生育可能であり、生産されるバイオサーファクタントは、塩分その他の物質が含まれる海水や廃水のような、高塩分濃度においても有効に界面活性剤として働くことが期待される。更に、このような海洋細菌由来のバイオサーファクタントは基本的に生分解性を有するので、環境残留性はない。
これまで、海洋細菌由来バイオサーファクタントについてはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．  ＭＭＩ  の  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｉｐｉｄ（例えば、非特許文献３参照。）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  の  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｌｉｐｉｄ（例えば、非特許文献４参照。）や  Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ  の  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｌｉｐｉｄ  ｇｌｙｃｉｎｅａｍｉｄｅ（例えば、非特許文献５参照。）の報告があるが、これらの海洋細菌は本発明の海洋細菌とは分類学的に異なり、これらが産生するバイオサーファクタントも本発明のものとは異なる。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｍ．  Ｂｅｎｉｎｃａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２．  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｅｎｇ．  ５４：２８３−２８８
【非特許文献２】
Ｍ．  Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌｓ，  Ｌ．  １９９５．  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ５３：１４３−１５０
【非特許文献３】
Ａ．  Ｐａｓｓｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３７：２８１−２８６
【非特許文献４】
Ａ．  Ｐａｓｓｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｚ．  Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．  ４６ｃ，  ２０４−２０９
【非特許文献５】
Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １３９３（１）：  ５７−６２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
海洋汚染の要因として原油汚染が問題になっているが、海洋由来の原油分解菌は汚染現場のバイオレメディエーションに適していると考えられる。そこで、本発明者は原油を炭素源として加えたマリンブロスで生育でき、かつ原油乳化能を示す微生物を海水から検索した。このような菌株は海洋由来であるため塩水環境でも生育できるので単独で原油処理に用いることができる。原油は乳化剤が存在しないといわゆるタールボールを形成するが、微生物が乳化力を示すと、均一に懸濁される。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
これらの観点から培養液中にバイオサーファクタントを生産する海洋細菌をスクリーニングし、本発明の菌株を得ることができた。これらの菌株は、バイオサーファクタントを産生し、油乳化能を示す。
即ち、本発明は、Ｍｙｒｏｉｄｅｓ  ｏｄｏｒａｔｕｓ  ＳＭ−１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６１）（以下、単に「ＳＭ−１」という。）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＭ−４（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０５９）（以下、単に「ＳＭ−４」という。）、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＳＭ−９（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９０６０）（以下、単に「ＳＭ−９」という。）から成る群から選択される微生物である。
また本発明は、この微生物の培養液、好ましくはその上澄液である。
ここで用いる培地に特に制限はなく、マリンブロス（例えば、Ｄｉｆｃｏ社製、Ｂａｃｔｏ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ  ２２１６）が好ましいが、各微生物についてそれぞれ下記の基礎塩培地を使用してもよい。
【０００７】
１）ＳＭ−１用培地には、下記溶液Ａ、Ｂ及びＣを混合して全量を１Ｌとし、ｐＨ７．５に調製したものを使用できる。
溶液Ａ：
ｇｌｕｃｏｓｅ                      ２０  ｇ／Ｌ
ＮＨ４ＮＯ３                        １．０  ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                          ３０  ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４．  ７Ｈ２Ｏ                  ０．５  ｇ／Ｌ
ＫＣｌ                          ０．３  ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４                        １．５  ｇ／Ｌ
Ｐｅｐｔｏｎｅ                      ０．５  ｇ／Ｌ
Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ                ０．１  ｇ／Ｌ
０．１  Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ        ９８０  ｍｌ
溶液Ｂ：
ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７．ｎＨ２Ｏ                  ２０  ｍｇ／５  ｍｌ
溶液Ｃ：
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ                    ２００  ｍｇ／５ｍｌ
【０００８】
２）ＳＭ−４及びＳＭ−９用培地には、溶液Ｄ  １Ｌに対し溶液Ｅ  １ｍｌを加え、ｐＨを７．５に調整したものを使用できる。
溶液Ｄ：
Ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ                ２０  ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４                        ２．２  ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                        １．４  ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                          ３０  ｇ／Ｌ
ＫＮＯ３                          ３．０  ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４                        ０．６  ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２                          ０．０４  ｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４                        ０．０２  ｇ／Ｌ
【０００９】
溶液Ｅ：
ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ                    ２．３２  ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４．４Ｈ２Ｏ                    １．７８  ｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３                          ０．５３  ｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ                    １．０  ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ                  ０．３９  ｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ                    ０．４２  ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ                          １．０  ｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ２．６Ｈ２Ｏ                    ０．００４  ｇ／Ｌ
ＫＩ                            ０．６６  ｇ／Ｌ
【００１０】
更に本発明は、この培養液から抽出されたバイオサーファクタントである。この抽出方法としては、通常の界面活性剤の抽出法を用いればよいが、例えば、濃塩酸でｐＨ２に調整後、１／４量の酢酸エチルで抽出を例えば３回繰り返すことにより行うことができる。ここで培養液としてその上澄液を用いて抽出を行ってもよい。
また本発明は、上記培養液、又は上記バイオサーファクタントを主要成分とする界面活性剤組成物である。この界面活性剤組成物は、上記培養液、又は上記バイオサーファクタントの一種若しくは２種以上を主要成分として含んでもよく、またこれら以外の公知の界面活性剤を含んでもよい。この培養液としてその上澄液を用いてもよい。更に、この界面活性剤組成物は、必要に応じて、公知の添加剤、例えば、酸化防止剤、香料、精油、防腐剤、化粧用活性剤、加湿剤、ビタミン、スフィンゴ脂質、脂溶性ポリマー等を含んでもよい。
更に、本発明は、上記培養液、上記バイオサーファクタント、又は上記界面活性剤組成物を用いて油、特に原油を乳化する方法である。これらは乳化能を有するため、常法に従い使用すれば、油、特に原油を乳化できる。なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＭ−４、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＳＭ−９については、更に、タンパク質を溶解する方法に用いることができる。
【００１１】
なお、Ｍｙｒｏｉｄｅｓ  ｏｄｏｒａｔｕｓ  ＳＭ−１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＭ−４及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＳＭ−９は、２００２年１０月９日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６１、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０５９及びＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６０が付与された。
【００１２】
これら微生物の形態的性質、培養的性質及び生理学的性質を表１に示す。
【表１】
2004154090.tif 000002
【００１３】
2004154090.tif 000003
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は下記の方法により単離した。
（１）１次スクリーニング：
タイ南部海域海水を微生物源として使用し、３％食塩を添加した栄養培地にこの海水を塗り付け、出現したコロニーを分取し、約２００株の細菌を分離した。このコロニーを３％食塩を添加した血液寒天培地に塗布し、溶血反応を示したものを選択し、２３株を選択した。
（２）２次スクリーニング：
市販のマリンブロス（Ｄｉｆｃｏ  社製、Ｂａｃｔｏ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ  ２２１６）に２滴の人工風化原油（ｗｅａｔｈｅｒｅｄ  ｃｒｕｄｅ  ｏｉｌ，「ｗ．ｃ．ｏ．」と略す。：Ａｒａｂｉａｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｒｕｄｅ  ｏｉｌを２３０℃で２時間処理したもの。）を加えたもので、上記の選択菌株を培養し、強い乳化能を示した９菌株を選択した。
水中では原油は溶解せず塊のままであるので、原油が乳化したということは、培養液中でバイオサーファクタント（以下「ＢＳ」という。）が生産されていることを示す。乳化能を観察して、最も優れた乳化能を示した菌株をＳＭ−１と名付けた。
（３）３次スクリーニング：
さらに市販牛乳の乾燥粉末に対して溶解能を示すかどうかを調べて、溶解能を示した２株を選んだ。これらをＳＭ−４とＳＭ−９と名付けた。
【００１５】
次に、上記スクリーニングで得られた３種の菌株について、簡単な形態観察、培養及び生理学的所見とともに１６Ｓ  リボゾームＲＮＡ遺伝子を解析し、データベースからホモロジー検索により同定した。
遺伝子解析は菌体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、既報の方法（Ａ．  Ｈｉｒａｉｓｈｉ，  Ｙ．  Ｋ．  Ｓｈｉｎ，  Ｙ．  Ｕｅｄａ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓｕｇｉｙａｍａ，  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９，  １４５−１５４  （１９９４））に従って作成した下記のプライマーを用いて、１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターにサブクローニングしシーケンスした。この結果をＢＬＡＳＴと照合して判定した。
【００１６】
（１）ＰＣＲ増幅用プライマー
Ｅｕ８ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’，  Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ８  ｔｏ  ２７）（配列番号１）
Ｅｕ１４９２ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’，  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １５１０  ｔｏ  １４９２）（配列番号２）
（２）シーケンス用プライマー
Ｅｕ５１８ｒ（５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’，  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ５３６−５１８）（配列番号３）
Ｅｕ８０３ｒ（５’−ＣＡＴＣＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣ−３’，  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ８２１−８０３）（配列番号４）
Ｅｕ１０９２ｆ（５’−ＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡ−３’，  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １０９２−１１１０）（配列番号５）
Ｅｕ１０９３ｒ（５’−ＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴ−３’，  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １１１１−１０９３）（配列番号６）
Ｅｕ１３８９ｒ（５’−ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧ−３’，  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １４０６−１３８９）（配列番号７）
【００１７】
その結果、ＳＭ−１、ＳＭ−４及びＳＭ−９は、それぞれＭｙｒｏｉｄｅｓ  ｏｄｏｒａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  と判定された。
Ｍｙｒｏｉｄｅｓ  ｏｄｏｒａｔｕｓはｇｕｔ  ｂａｃｔｅｒｉａあるいは淡水魚から分離されているが、ＢＳ生産に関する報告はない。
【００１８】
次に、本発明の微生物が産生するＢＳの活性を調べた。この調査においては下記の方法により、乳化能、タンパク質溶解能、抗菌性を調べた。
本発明の微生物は、培養液中で原油が乳化されることから（上記２次スクリーニングを参照のこと）、乳化剤（バイオサーファクタント）を産出していることは明らかであるが、その乳化能を次のような方法で定量的に測定した。培養上清は３％ＮａＣｌを含んでいるので、活性測定は３％ＮａＣｌ存在下で行われたことになる。酢酸エチル抽出液の場合は３％ＮａＣｌを加えて活性を測定した。
乳化試験１（ヘキサデカン乳化能力）
４ｍｌの培養上清に同量のヘキサデカンを加えて、２分間ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒで十分撹拌した後、１０分間静置する。結果は、乳化部分の高さの元のヘキサデカン層液全体に占める割合（％）で表わす。この数値が高いほど、乳化能力は高い。
乳化試験２（人工風化原油の乳化力）
２．５ｍｌの培養上清に２滴のｗ．ｃ．ｏ．を加えて室温で２４時間振盪し、生成したミセルの有無と大きさを肉眼で観察した。ミセルが細かいほど乳化能は高い。観察結果は、乳化力が大きく生成するミセルがほぼ識別できないものを「微小」、乳化力が大きいが生成するミセルがほぼ識別できるものを「小」、乳化力が小さく生成するミセルがはっきり識別できるもの（大きさはｍｍ単位であると考えられる。）を「大」、全く乳化が見られなかったものを「なし」とした。
【００１９】
タンパク溶解能力試験
市販牛乳を電気炉内で１７０、１８０、１９０℃で水分を蒸発させたものをふるいにかけ、ある程度粒を均一にしたものを供試サンプルとした（それぞれサンプル１及び２、３とする）。含有成分比率は脂肪、乳糖、カゼインがそれぞれ３．６５％、４．４７％、３．３２％である。また、灰分が１．０１％含まれる。これらの粉末はいずれも水に溶けない。
このようにして調製した市販牛乳乾燥粉末を２．５％（ｗ／ｖ）になるように培養上清４ｍｌに加え、６０℃で保温し、経時的に溶解するかどうかを肉眼で観察した。
【００２０】
抗菌試験
市販栄養寒天培地に下記の試験菌を混釈して平板培地を作成し、直径８ｍｍの穴をあけて、培養上清２０〜７０μｌを入れて、３０℃で１〜２日培養した。生育抑制を示すクリアーゾーンの有無を判断した。
試験菌：  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＩＦＯ  １３２７５、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＩＦＯ  １３２７６、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ  ＢＫ１、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ＩＦＯ  ３３１８、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  １１Ｗ２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＦＯ  ３３１４、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ  ＩＦＯ  １２６４８
【００２１】
まず、ＳＭ−１について、下記の方法でＢＳを単離した。
上記の市販マリンブロスで１〜３日培養させた後、菌体を遠心分離で除去した培養上清を６ＮＨＣｌでｐＨ２に調整し、酢酸エチルで抽出した。抽出液を濃縮後、シリカゲルカラムに吸着させヘキサン、クロロホルム、クロロホルム＋メタノール（１〜９％）で順に溶出させた。各溶出画分を濃縮し、溶媒を蒸発させた後、水に溶かしてＢＳ活性を調べた。活性はクロロホルム＋メタノール４％画分にのみ見い出された。これを調製用シリカゲル薄層クロマトグラフィー（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０Ｆ２５４  ２０ｃｍ×２０ｃｍ、厚さ２ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）にかけた。溶媒はクロロホルム／メタノール／２８％アンモニア（６５／３５／５）を使用した。アニスアルデヒド発色で３つのバンド（ｐ１〜ｐ３）に分離したので、それぞれを掻き取り、溶媒抽出した（クロロホルム／メタノールー１：１）。活性はＰ２画分に認められたので、これをさらにＨＰＬＣにかけ、ＯＤＳカラム（ＯＤＳ１２０Ｔ、東ソー株式会社製）を用いてアセトニトリル／水（１：１）で溶出させ、主ピークを分取した。主ピークは０．５ｍｌ／分の溶出速度で７．２１分に溶出されたが、９分あたりに若干ショルダーが認められたので、溶出ピークを８分の前後で２分割して、ピークの前半を回収した。この回収物について、さらにＨＰＬＣ上にかけてシングルピークであることを確認した。
【００２２】
次に、この回収物（即ち、ＳＭ−１が産生したＢＳ）の活性を調べた。
（ａ）定性反応
アニスアルデヒド反応  陽性（糖発色）
ニンヒドリン反応      陰性（アミノ酸発色）
ローダミン反応        陽性（脂質）
この結果から、このＢＳは糖脂質と考えられる。
（ｂ）熱安定性
酢酸エチル抽出画分を、表２に示す３０〜１２１℃の各温度で２０分保ち、室温に冷却した後、乳化試験１及び２を実施した。その結果を表２に示す。
【表２】
2004154090.tif 000004
この結果から、本ＢＳは熱安定性が高いといえる。
本菌の病原性については通常使用では認められない。同種の菌について日和見感染の可能性が示唆されているものの、本菌は表１に示すように、４０℃で生育せず、かつ表２から生産するＢＳは熱安定性が高いので、必要に応じて熱処理することも可能である。
【００２３】
（ｃ）ｐＨの影響
酢酸エチル抽出画分を、表３に示すようにｐＨ２〜１２に調製して、４℃で１２時間放置した後、ｐＨを７．４に再調整して乳化試験１及び２を実施した。その結果を表３に示す。
【表３】
2004154090.tif 000005
ｐＨ２〜１２ではほとんど変化がなかったので、酸及びアルカリの両方に強いと思われる。
【００２４】
（ｄ）食塩濃度の影響
酢酸エチル抽出画分に食塩を加えて、乳化試験１及び２を実施した。その結果を表４に示す。
【表４】
2004154090.tif 000006
乳化能は９％ＮａＣｌの時に最大値を示したように、高塩分濃度でむしろ増加した。
【００２５】
（ｅ）培養条件（市販マリンブロス）
培養経過とＢＳ生産性を調べるために、乳化試験１及び２を実施した。その結果を表５に示す。
【表５】
2004154090.tif 000007
２４時間後の培養上清は５倍希釈でも１００％の乳化率を示し、微小ミセルを形成した。
その他の特性については、溶血性：＋、抗菌性：特になし、タンパク質溶解能：特になし、であった。
【００２６】
次に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＭ−４  及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＳＭ−９  について、精製を行わず、培養液そのものの活性、又は培養液をｐＨ２に調製した後の酢酸エチルによる抽出液の活性を調べた。その結果を以下に示す。
これら両菌は、溶血能を有し、原油に生育して原油乳化能を示す以外に、高いタンパク質溶解能を示すＢＳを生産する。また、これらの特性は３％食塩の存在下でも発揮される。
（ａ）熱安定性：培養上清は３０℃以上、６０℃以下では４０分の保温でも活性を示したが、７０℃以上では活性が認められなかった。
（ｂ）タンパク溶解能（市販牛乳の乾燥粉末に対する溶解能）：ＳＭ−４とＳＭ−９の培養上清にサンプル１〜３を２．５％の割合に加えて、６０℃で保温した。４０分後にサンプル１はほぼ完全にＳＭ−９で溶解した。ＳＭ−４は若干浮遊物が残存した。サンプル２及び３では若干の浮遊物が生じたが、市販のアルカリ洗剤（０．７％）に匹敵する溶解力が認められた。ＳＭ−４の培養上清はＳＭ−９に比べると少し劣るがサンプル１〜３に対する溶解力はいずれも有した。従って、ＳＭ−４及びＳＭ−９の培養上清はともにタンパク質溶解能を有している。
【００２７】
（ｃ）溶解温度：サンプル１及び２をＳＭ−９の培養上清に加えて２５、３０、４０、５０、６０℃に保温して溶解力をみたところ、３０℃以上で溶解力が認められ、５０℃ではサンプル１及び２ともに同程度溶解した。ＢＳそのものも熱に対してかなり安定であると思われる。
（ｄ）溶解濃度：サンプル１及び２について２．０〜１０．０％濃度で調べたところ６０℃で培養上清に２．０％までは完全に溶解したが、それ以上では完全に溶解できなかった。
（ｅ）抗菌性
試験菌中、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＦＯ３３１４に対して、両菌ともに抗菌性を示し、ＳＭ−４の方が強い抗菌性を示した。ＢＳ活性はむしろ、ＳＭ−９の方が強い。また、両菌はお互いに生育阻害を示さなかったので、混合培養も可能である。
【００２８】
【発明の効果】
本発明は、油分解性、特に原油分解性の新規微生物を提供する。これらの微生物は、バイオサーファクタントを産生し、これらは原油乳化能を示し、特に高塩分濃度において有効に界面活性剤として機能する。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＭ−４、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＳＭ−９については、更に、タンパク質を溶解する方法に用いることができる。更に、本発明の微生物は、自然界で生分解性を示すため、生物毒性や環境残留性がなく、環境上の問題を引き起こさない。
こららの培養液から得られたバイオサーファクタントは、粗精製物又は精製物として、原油汚染海域の環境修復や、廃油を含む廃液処理に用いることが可能であり、また合成界面活性剤の代替として、または合成界面活性剤と共に用いて、洗剤、乳化剤、化粧品、研究用試薬、衛生用品又は抗菌剤その他様々な用途に使用することができる。
【００２９】
【配列表】
2004154090.tif 000008
2004154090.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成14年11月29日(2002.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（１）ＰＣＲ増幅用プライマー
Ｅｕ８ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’，  Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ８  ｔｏ  ２７）（配列番号１）
Ｅｕ１４９２ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’，  Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １５１０  ｔｏ  １４９２）（配列番号２）
（２）シーケンス用プライマー
Ｅｕ５１８ｒ（５’−ＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’，  Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ５３６−５１８）（配列番号３）
Ｅｕ８０３ｒ（５’−ＣＡＴＣＧＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣ−３’，  Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ８２１−８０３）（配列番号４）
Ｅｕ１０９２ｆ（５’−ＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡ−３’，  Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １０９２−１１１０）（配列番号５）
Ｅｕ１０９３ｒ（５’−ＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴ−３’，  Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １１１１−１０９３）（配列番号６）
Ｅｕ１３８９ｒ（５’−ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＧ−３’，  Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  １４０６−１３８９）（配列番号７）