(57)【要約】【課題】中性からアルカリ性条件下、低温領域においても高い活性を保持するカテプシンＢを探索し生産すること。【解決手段】日本産ホコックアカエビを用いることで、その肝膵臓中に低温領域においても活性を保持する新規カテプシンＢを見出すことに成功した。更に、当該新規カテプシンＢの遺伝子配列を決定し、遺伝子組み換え法による生産を可能とした。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号２の位置番号７６番以降のアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつカテプシンＢ様システインプロテアーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）である請求項１記載の蛋白質。
（ａ）配列番号２の位置番号７６番以降のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＢ様システインプロテアーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項３】
請求項１−２記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の２５３塩基から１０１１塩基を含むＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＢ様酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）である請求項４記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の２５３塩基から１０１１塩基からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＢ様酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のプレプロ型カテプシンＢ様システインプロテアーゼ蛋白質。
（ａ）配列番号２からなる蛋白質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＢ様システインプロテアーゼ活性を有する蛋白質のプレプロ体。
【請求項７】
請求項６記載のプレプロ型カテプシンＢ様システインプロテアーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１記載のＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＢ様酵素活性を有する蛋白質のプレプロ体をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項２又は６記載のアミノ酸配列の全部又は１部と８０％以上同一であるポリペプチドの産生能を有するＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項３−５又は請求項７‐９のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載のベクターで形質転換されたカテプシンＢ様システインプロテアーゼを発現することができる宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１１記載の宿主細胞を用いてカテプシンＢ様蛋白質を発現させ、回収することを含むカテプシンＢ様システインプロテアーゼ蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のカテプシンＢ様システインプロテアーゼのシグナルペプチド。
（ａ）配列番号２の位置番号１から１５（Ｍｅｔ〜Ａｌａ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＢ様システインプロテアーゼのシグナルペプチドとして機能できるペプチド。
【請求項１４】
請求項１３記載のテプシンＢ様システインプロテアーゼのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の２８塩基から７２塩基からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＢ様酵素のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のカテプシンＢ様システインプロテアーゼのプロペプチド。
（ａ）配列番号２の位置番号１６から７５（Ｇｌｕ〜Ｇｌｕ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＢ様システインプロテアーゼのプロペプチドとして機能できるペプチド。
【請求項１７】
請求項１６記載のカテプシンＢ様システインプロテアーゼのプロペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の７３塩基から２５２塩基からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＢ様酵素のプロペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項３−５又は７−９いずれか１項記載のＤＮＡ又はその相補鎖の連続する１５塩基以上からなるカテプシンＢ様システインプロテアーゼ遺伝子検出用のプライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホッコクアカエビより新たに同定された新規プロテアーゼであるカテプシンＢ様システインプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合を加水分解する最も重要な酵素群の一つで、微生物、植物および動物に広く分布しており、多種多様な生物学的プロセスに関与する。また、プロテアーゼは、触媒基に基づいて、アスパラギン酸―、システイン―、セリン―、メタロ―プロテアーゼの大きく４つのファミリーに分類されている。これらの酵素の分子的作用機序は広く研究されている。
【０００３】
プロテアーゼの応用範囲も多岐にわたっており、例えば、食品の改質剤用、洗剤用、化粧品原料用、ビールの清澄剤用、皮革なめし剤用、医薬用などに利用されている。
【０００４】
システインプロテアーゼのパパインスーパーファミリーに属するカテプシンＢ  （ＥＣ  ３．４．２２．１）  およびそのホモログは、現在までのところ、数種類の生物から同定され、配列が決定されている。以下にそれを列挙する。
Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ  （ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｍｏｓｑｕｉｔｏ），  Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｃａｎｉｎｕｍ  （ｄｏｇ  ｈｏｏｋｗｏｒｍ），  Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  （ｃｏｗ），  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ，  Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  （ｃｈｉｃｋｅｎ），  Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ，  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ｈｕｍａｎ）  ，  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ，  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ，  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  （ｈｏｕｓｅ  ｍｏｕｓｅ），  Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ （Ｎｏｒｗａｙ  ｒａｔ），  Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ，  Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  （ｂｒｅａｄ  ｗｈｅａｔ），  Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ
【０００５】
最もよく研究されているのは、哺乳類のカテプシンＢであるが、寄生虫のカテプシンＢホモログについても広く研究されている。寄生虫のカテプシンＢホモログは、哺乳類のカテプシンＢとは異なる性状をいくつかもつことが示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在までのところ、エビ類由来のカテプシンＢをコードするｃＤＮＡはクローニングされていない。また、低温適応種のカテプシンＢに関するデータもほとんどない。したがって、低温適応種であるホッコクアカエビからカテプシンＢをコードするｃＤＮＡをクローニングできれば、構造と機能の関係などの基礎的な知見を与えるばかりでなく、新規特異性や高い触媒効率など上記に示したカテプシンＢとは異なる性状をもつ酵素の開発に寄与すると考えられる。さらに、この発明はバイオテクノロジーにおいて極めて重要なものになる可能性があり、食品の改質剤用、洗剤用、化粧品原料用、医薬用などに応用する際に、非常に有用な酵素を提供できることとなる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明者等は、低温適応種由来のカテプシンＢを自然界に求め、鋭意スクリーニングを重ねた結果、偶然にも、日本産ホッコクアカエビの肝膵臓から、カテプシンＢをコードする遺伝子を見出すことに成功した。
【０００８】
ホッコクアカエビは、北太平洋、北大西洋に分布し、通常、−１．６〜５℃の低温環境下に生息する低温適応種である。低温適応種の酵素はそれらに対応する哺乳類の酵素より、実質的に高い触媒効率を示すことがいくつか報告されている。例えば、プロテアーゼの中でも特によく研究されているセリンプロテアーゼのトリプシンでは、ウシトリプシンと比較してサケトリプシンの触媒効率は４０倍高いことが報告されている。
【０００９】
本発明者等は、遺伝子工学的手法を駆使して種々研究した結果、低温適応種であるホッコクアカエビより、カテプシンＢをコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、遺伝子の塩基配列および演繹アミノ酸配列のすべてを明らかにし、本発明を完成させるに至った。この遺伝子にコードされるタンパク質をホッコクアカエビ・カテプシンＢと命名した。
【００１０】
ホッコクアカエビ・カテプシンＢをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組込み、該発現ベクターで適切な宿主細胞を形質転換することにより、ホッコクアカエビ・カテプシンＢを遺伝子組換え法により生産することができる。発現ベクターとしては、周知の種々のベクターを用いることができるが、例えば、宿主を大腸菌とする場合には、一連のｐＵＲベクター、ｐＡＴＨベクター、ｐＧＥＸベクター等が挙げられ、ＣＯＳやＣＨＯ等動物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＸＭ、ｐＤＣ２０１等のベクターを用いることができる。
【００１１】
例えば、大腸菌を用いた系では、ｐＥＴ３９ｂ  （Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＲＳＥＴ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に本発明の遺伝子を挿入し、大腸菌に導入して、発現誘導することにより、発現することができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、目的の分子量を持つ蛋白質が発現されたことを確認した。また、酵母を用いた系では、本遺伝子を挿入した酵母発現ベクターｐＰＩＣＺαをエレクトロポレーション法により、宿主酵母Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＭ７１Ｈ株に導入し、高濃度（２ｍｇ／ｍｌ）のｚｅｏｃｉｎを含む培地で増殖できる形質転換体を選別した。ゼラチンザイモグラフィーで活性を確認したところ、目的の酵素に相当するサイズのバンドが検出された。また、カテプシンＢの特異的基質であるＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ  （Ｂａｃｈｅｍ）を用いて活性を確認できた。
【００１２】
本発明は、ホッコクアカエビ・カテプシンＢのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＢ様酵素活性を有する蛋白質を包含する。また、本発明は、このカテプシンＢ様酵素のプレプロ体をも包含する。また、このカテプシンＢとアミノ酸配列の全部又は１部と８０％以上同一であるポリペプチドをも包含する。さらに、本発明は、このカテプシンＢのシグナルペプチド及びプロペプチドをも包含する。このプロペプチドはカテプシンＢ様酵素の阻害剤としても有用である。
【００１３】
そして、本発明は、この酵素、そのシグナルペプチド及びプロペプチドをコードするＤＮＡも包含する。
例えば、本発明には上記ホッコクアカエビ・カテプシンＢ又はそのプレプロ体の相補鎖からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカテプシンＢ様酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを包含する。
【００１４】
なお、ストリンジェントな条件下とは、例えば、１２０℃で２０分間処理してＤＮＡを結合させたＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロンメンブレン（アマシャムファルマシア）をチャーチリン酸塩緩衝液（０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ７％ＳＤＳ）中、６５℃で５分間処理し、プレハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは同緩衝液中、後述の操作で得られたプローブを加え、６５℃で１７時間行う。ハイブリダイゼーション後のメンブレンは室温で２０分間、０．１％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣ  （ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ；  １ｘＳＳＣは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ，  ｐＨ７．０）で処理した後、０．１％ＳＤＳを含む１ｘＳＳＣ中６５℃で２０分間の洗浄を２回を行う。さらに０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣ、６５℃で２０分間処理し洗浄を完了する。Ｘ線フィルムへの感光は−８０℃で２４時間行う。
【００１５】
プローブの作成では、例えば、ＰＣＲにより増幅したｃＤＮＡ断片を、Ｔａｋａｒａ  ｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２  （Ｔａｋａｒａ）を用いて、［α３２Ｐ］−ｄＣＴＰによるプローブの標識を行う。その後、遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて未反応のアイソトープを除去する。
【００１６】
さらに，本発明には、ホッコクアカエビ・カテプシンＢおよびそのプレプロ体のアミノ酸配列に対し１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカテプシンＢ様酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、またはカテプシンＢ様酵素活性を有する蛋白質のプレプロ体をコードするＤＮＡも包含される。
【００１７】
また、本発明には、ホッコクアカエビ・カテプシンＢおよびそのプレプロ体をコードするＤＮＡに対して、１〜１００個、好ましくは１〜１０、さらに好ましくは１〜数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加したＤＮＡであって、ホッコクアカエビ・カテプシンＢの活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを包含するものである。
【００１８】
また、ホッコクアカエビ・カテプシンＢのアミノ酸配列の全部または１部と８０％以上同一であるポリペプチドの産生能を有するＤＮＡを包含する。さらに、このカテプシンＢまたはプレプロカテプシンＢをコードするＤＮＡ配列に対し、相同性が８０％、好適には、９０％、特に好適には、９５％以上となるカテプシンＢの活性を有する蛋白質またはプレプロカテプシンＢとして機能する蛋白質をコードするＤＮＡを包含する。
【００１９】
本発明は、この遺伝子を検出するためのプライマー、例えば、ホッコクアカエビ・カテプシンＢをコードする塩基配列中の連続する１５塩基以上の配列または当該配列に１または数個の欠失、置換、付加がなされた塩基配列を包含する。
【００２０】
【実施例】
実施例は例示であって、本発明を限定するものではない。
［実施例１］      ホッコクアカエビ・カテプシンＢのクローニング。
クローニングはＲＡＣＥ法により、行った。その概要を図１に示した。
【００２１】
＜ホッコクアカエビの解剖＞
石川県にある西海漁協より生きたホッコクアカエビを購入し、解剖して肝膵臓、筋肉、腸を採取した。採取した各組織は、直ちに液体窒素中で凍結し、使用するときまで−８０℃に凍結保存した。
【００２２】
＜全ＲＮＡの抽出＞
ホッコクアカエビの肝膵臓、筋肉及び腸より、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。１００ｍｇの組織から、約１００μｇの全ＲＮＡが得られた。
【００２３】
＜プライマーの設計＞
種々の哺乳類から得たカテプシンＢのよく保存されている領域ＦＤＡＲＥＱＷとＳＣＧＳＣＷＡを参考にして、縮重プライマーＰ１及びＰ２を作成した（表１、図１）。
【００２４】
【表１】
2004154044.tif 000002
位置は配列番号１の位置番号を示す。３’−及び５’−ＡＵＡＰプライマーは３’−  及び  ５’−ＲＡＣＥ  ｋｉｔに含まれているプライマーで同じ配列である。ＮはＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔを表す。
【００２５】
＜１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの作成＞
肝膵臓より抽出した全ＲＮＡ１μｇから、３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを作成した。
【００２６】
＜３’ＲＡＣＥ＞
上記の１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ約１μｇを鋳型にして、２０  ｐｍｏｌのプライマー（Ｐ１及び３’−ＡＵＡＰ）、２０  ｎｍｏｌ  ｄＮＴＰ、１０μｌの１０  ｘ  Ｅｘ  ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、１Ｕの  Ｅｘ  ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を含む１００μｌの反応液でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）を用いて、９４℃で３分間処理後、９４℃で３０秒間の熱変性  、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸張反応のサイクルを３０回行い、最後の伸張工程は５分間延長し、終了させた。さらに、ｎｅｓｔｅｄプライマーＰ２を用いて、同様の反応条件でＰＣＲを行った。増幅産物は１％アガロースゲル電気泳動により分離後、エチジウムブロマイド染色により検出した（図．１Ａ）。次に、増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターに挿入して、サブクローニングし、３’末端側の塩基配列を決定した。
【００２７】
＜５’ＲＡＣＥ＞
３’ＲＡＣＥ法で決定した配列を基に、表１に示したアンチセンス鎖のプライマーＰ３、Ｐ４及びＰ５を作成し、５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、プロトコールに従って５’ＲＡＣＥ法を行った（図．１Ａ）。得られたＰＣＲ断片を、３’ＲＡＣＥ法と同様にサブクローニングし、５’末端側の塩基配列を決定した。
【００２８】
＜全長の単離と配列決定＞
全長のｃＤＮＡを増幅するために、５’ＲＡＣＥで得られた塩基配列の５’末端側よりプライマーＰ６を作成した。上述の１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡからプライマーＰ６と３’−ＡＵＡＰを用いて、ホッコクアカエビ・カテプシンＢをコードする全長のｃＤＮＡを単離し（図．１Ｂ）、塩基配列を決定した。決定した塩基配列と演繹アミノ酸配列を図２に示した。
【００２９】
全長はポリＡテールを含めて１，１５９塩基からなり、開始コドン（ＡＴＧ）から終始コドン（ＴＧＡ）までの９８７ｂｐの翻訳領域を含んでいた。ポリアデニレーションシグナルＡＡＴＡＡＡは３’非翻訳領域の１１１０−１１１５塩基目に存在した。
【００３０】
＜ホッコクアカエビ・カテプシンＢの一次構造＞
ホッコクアカエビ・カテプシンＢ遺伝子は、３２８アミノ酸残基をコードしており、推定された１５残基のシグナルペプチド、６０残基のプロペプチド及び２５３残基の成熟型酵素領域を含んでいた（図２）。演繹アミノ酸配列をＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈによる相同性検索に供した結果、哺乳類のカテプシンＢと高い相同性を示した。
【００３１】
図．３はＢＬＡＳＴＰで高い相同性を示した哺乳類のカテプシンＢ及び無脊椎動物のカテプシンＢ様システインプロテアーゼとともに、ホッコクアカエビ・カテプシンＢをアラインメントした図である。プレプロ領域は一次構造よりもむしろ二次構造において保存されているので、それらは一次構造の相同性が低いため、成熟型酵素領域（図．３Ｂ）から分離して（図．３Ａ）アラインメントした。
【００３２】
パパインスーパーファミリーに属するシステインプロテアーゼは配列に基づいて、プロ領域にＥＲＦＮＩＮモチーフを持つカテプシンＬ様酵素などのグループと、それを持たないカテプシンＢ様酵素の２つのサブグループに分けられている（Ｋａｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。ホッコクアカエビ・カテプシンＢには、ＥＲＦＮＩＮモチーフが存在しなかった。また、ほとんどのシステインプロテアーゼにおいて、保存されているＧＮＦＤモチーフ（Ｖｅｒｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）は、ホッコクアカエビ・カテプシンＢにも存在した（図．３Ａ）。
【００３３】
ホッコクアカエビ・成熟型カテプシンＢはヒトカテプシンＢと最も高い相同性（５３％）を示した。その他の生物のカテプシンＢまたはカテプシンＢ様酵素とのアミノ酸配列の相同性を表２に示す。
【００３４】
【表２】
2004154044.tif 000003
【００３５】
ホッコクアカエビ・成熟型カテプシンＢは、一般的にシステインプロテアーゼの特徴を示すアミノ酸残基のすべて、及びカテプシンＢに特徴的なアミノ酸残基を含んでいた。すなわち、ホッコクアカエビ・成熟型カテプシンＢは、触媒基であるＣｙｓ２９、Ｈｉｓ１９９及びＡｓｎ２１９（番号はヒトの成熟型カテプシンＢの位置番号を示す。以下同様）、オキシアニオンホールを形成するＧｌｎ２３及びＧｌｙ２７、基質の主鎖と相互作用する部位の近傍であるＧｌｙ７３、Ｇｌｙ７４及びＴｒｐ２２１、Ｎ末端付近に存在するＰｒｏ２を含んでいた（図．３Ｂ）。カテプシンＢは、パパインスーパーファミリーに属する他のシステインプロテアーゼに比べ、エキソペプチダーゼ活性を示すという点で特徴的である。この特徴を示すために重要な役割を担うｏｃｃｌｕｄｉｎｇループ（１０５塩基目から１２６塩基目）（Ｍｕｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）は、ホッコクアカエビ・カテプシンＢにも存在していた。さらに、このループに存在し、Ｓ２’サブサイト（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒの表記法）を構成する２つの連続するヒスチジン残基（Ｈｉｓ１１０及びＨｉｓ１１１）は、保存されていた（図．３Ｂ）。また、ヒト・カテプシンＢにおいて６つのジスルフィド結合を形成する１２のシステイン残基は、ホッコクアカエビ・カテプシンＢにおいても保存されていた（図．３Ｂ）。
【００３６】
＜ホッコクアカエビ・カテプシンＢの系統関係＞
ホッコクアカエビ・カテプシンＢ、パパイン及びパパインスーパーファミリーに属する典型的なカテプシンについて、プレプロ領域を除いた成熟型酵素の系統樹を作成した。系統樹は近隣結合法により、ＰＨＹＬＩＰ  ｐａｃｋａｇｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５ｃ  （Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，  １９９３）  を用いて構築した。系統樹においても、ホッコクアカエビ・カテプシンＢは、カテプシンＢの系統群に分類された（図．４）。
【００３７】
＜ホッコクアカエビ・カテプシンＢの構造特性＞
ホッコクアカエビ・成熟型カテプシンＢの分子量の計算値は２８，１０８であり、これまでに知られているカテプシンＢ及びそのホモログの分子量の範囲と良く一致した。ホッコクアカエビ・成熟型カテプシンＢは、カテプシンＢの中で最も高い負の電荷を持っていた。等電点の理論値は、他のホモログに比べて顕著に低く、ｐＩ４．１９であった。また、Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  （１９８２）の方法で計算したｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙは、‐０．４８７と推定された。電荷、等電点及びｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ値の結果から、ホッコクアカエビ・カテプシンＢは、低温適応した水圏生物の典型的な構造特性を示した。
【００３８】
＜ノーザンブロット解析＞
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  （１９８９）らの方法に従って、以下の操作を行った。上述の各組織の全ＲＮＡ  （１０μｇ）を電気泳動後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜に転写した後、６５℃で１晩ハイブリダイゼーションを行った。３’末端領域のＤＮＡ断片３６９塩基（６９６−１０６４塩基目）をＰＣＲにより増幅し、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．０  （Ｔａｋａｒａ）を用いて、〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰにより標識した。ノーザンブロット解析を行った結果、肝膵臓において圧倒的に強いシグナルが検出された（図５）。
【００３９】
＜発現系の構築＞
大腸菌を用いた系では、ｐＥＴ３９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に本発明の遺伝子を挿入し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して、発現誘導することにより、発現することができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、目的の分子量を持つ融合蛋白質が発現されたことを確認した。
【００４０】
酵母を用いた系では、本遺伝子を挿入した酵母発現ベクターｐＰＩＣＺ  α  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をエレクトロポレーション法により、宿主酵母  Ｐ．  Ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＭ７１Ｈ  株に導入し、高濃度（２ｍｇ／ｍｌ）のｚｅｏｃｉｎを含む培地で増殖できる形質転換体を選別した。単一コロニーの形質転換株（ＫＭ７１Ｈ株）を１２５ｍｌのＧＹ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ−ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｅｄｉｕｍ，ｐＨ＜３．０）に接種し、３０℃で７２時間振盪培養した。次に、この培養液を遠心により集菌して、１５ｍｌのＭＭ（ｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｔｈａｎｏｌ  ｍｅｄｉｕｍ，ｐＨ＜３．０）に再懸濁した。メタノール添加を約２４時間ごとに繰り返し、２６℃で１２０時間振盪培養した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析で、目的の蛋白質に相当するサイズのバンドが検出された。次に、ゼラチンザイモグラフィーで活性を確認したところ、目的の酵素に相当するサイズのバンドが検出された。また、カテプシンＢの特異的基質であるＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｂａｃｈｅｍ）を用いて活性を確認できた。
【００４１】
ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ
Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｊ．，  １９９３．  ＰＨＹＬＩＰ  （Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５ｃ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｓｅａｔｔｌｅ．Ｋａｒｒｅｒ，  Ｋ．Ｍ．，  Ｐｅｉｆｆｅｒ，  Ｓ．Ｌ．，  ＤｉＴｏｍａｓ，  Ｍ．Ｅ．，  １９９３．  Ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｅ    ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９０，  ３０６３−３０６７．
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Ｍｕｓｉｌ，  Ｄ．，  Ｚｕｃｉｃ，  Ｄ．，  Ｔｕｒｋ，  Ｄ．，  Ｅｎｇｈ，  Ｒ．Ａ．，  Ｍａｙｒ，  Ｉ．，  Ｈｕｂｅｒ，  Ｒ．，  Ｐｏｐｏｖｉｃ，  Ｔ．，  Ｔｕｒｋ，  Ｖ．，  Ｔｏｗａｔａｒｉ，  Ｔ．，  Ｋａｔｕｎｕｍａ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１．  Ｔｈｅ  ｒｅｆｉｎｅｄ  ２．１５  Ａ  Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ：  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０，  ２３２１−２３３０．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  １９８９．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ    Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，  Ｉ．，  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ａ．，  １９６７．  Ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ．  Ｉ．  Ｐａｐａｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２７，  １５７−１６２．
Ｖｅｒｎｅｔ，  Ｔ．，  Ｂｅｒｔｉ，  Ｐ．Ｊ．，  ｄｅ  Ｍｏｎｔｉｇｎｙ，  Ｃ．，  Ｍｕｓｉｌ，  Ｒ．，  Ｔｅｓｓｉｅｒ，  Ｄ．Ｃ．，  Ｍｅｎａｒｄ，  Ｒ．，  Ｍａｇｎｙ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｓｔｏｒｅｒ，  Ａ．Ｃ．，  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｄ．Ｙ．，  １９９５．  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅｐａｐａｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ．  Ｔｈｅ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｏｔｉｆ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏ  ｒｅｇｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ    ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  １０８３８−１０８４６．
【００４２】
［実施例２］    ホッコクアカエビ肝膵臓粗抽出液のカテプシンＢ酵素活性。
＜粗抽出液の調製＞
粗抽出液は、‐８０℃で凍結保存した肝膵臓から調製した。凍結した組織を部分解凍し、２倍量の１５０ｍＭ    ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ６．５）とともに、ポリトロンホモジナイザーを用いて５分間ホモジナイズした。１／３倍量のテトラクロロメタンをゆっくりと加えて攪拌後、混合液を遠心分離することにより、脱脂を行った。脱脂された上清を粗抽出液として用いた。
【００４３】
＜カテプシンＢ活性の測定＞
カテプシンＢの特異的基質であるＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて粗抽出液の活性を測定した。２  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２  ｍＭ  ＤＴＴ，  ０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１００  ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ  ５．５）中、基質の終濃度１００μＭで反応を行った。遊離するＡＭＣの蛍光強度を励起波長３７０  ｎｍ、蛍光波長４６０  ｎｍで測定した。測定は５回繰り返し行った。標準曲線を作成して遊離するＡＭＣを定量し、２５℃で、１分間に１μｍｏｌのＡＭＣを遊離させる酵素量を１Ｕとした。その結果、粗抽出液は、４３８．１±９．１  ｍＵと高いカテプシンＢ活性を示した。この活性は、システインプロテアーゼの特異的阻害剤であるＥ−６４により阻害された。また、セリンプロテアーゼの特異的阻害剤であるＰＭＳＦはほとんど影響しなかった。以上のことから、ホッコクアカエビ肝膵臓には蛋白質レベルでもカテプシンＢが存在することが示唆された。
【００４４】
省略記号：  ＡＭＣ，  ７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ；  ＤＴＴ，  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；  Ｅ−６４，  Ｌ−ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−ｌｅｕｃｙｌ−ａｇｍａｔｉｎｅ；  ＭＣＡ，  ４−ｍｅｔｈｙｌ−７−ｃｏｕｍａｒｙｌａｍｉｄｅ；  ＰＭＳＦ，  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，  Ｚ，  ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ．
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、ホッコクアカエビ由来新規カテプシンＢが提供される。本酵素はホッコクアカエビ肝膵臓より、または本酵素をコードする遺伝子を導入し、形質転換した宿主細胞を培養することにより得ることができ、食品分野、化粧品分野、医薬分野など幅広い分野において有用に利用することができる。
【００４６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ホッコクアカエビ・カテプシンＢをコードするｃＤＮＡのクローニングの概要を示した図である。（Ａ）３’−及び５’−ＲＡＣＥに用いたプライマーの位置の模式図とそれぞれのＰＣＲ産物の電気泳動図を示した。（Ｂ）シングルＰＣＲによる全長ｃＤＮＡの単離を模式的に示した図とＰＣＲ産物の電気泳動図である。Ｍ，  ＤＮＡサイズマーカー；  ３’，  ３’ＲＡＣＥ産物；  ５’，    ５’ＲＡＣＥ産物；  Ｆ，  全長ｃＤＮＡ。
【図２】ホッコクアカエビ・カテプシンＢのヌクレオチド配列と演繹アミノ酸配列を示した図である。塩基配列の太字は、開始コドン（ＡＴＧ）および終始コドン（ＴＧＡ）を示し、下線は推定されるポリアデニレーションシグナル（ＡＡＴＡＡＡ）およびポリＡテールを示す。アミノ酸配列の白い長方形とグレーの長方形で囲った領域は、それぞれシグナルペプチドとプロペプチドを示し、白抜きは、活性部位のシステイン、ヒスチジンおよびアスパラギン残基を示す。
【図３】ホッコクアカエビ・カテプシンＢをその他の生物のカテプシンＢまたはカテプシンＢ様システインプロテアーゼとともにアラインメントした図である。省略記号は、Ｐｂ，  ホッコクアカエビ；  ＣｔＢ，  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ；  Ｈｓ，  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ；  Ｂｔ，  Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ；  Ｓｐ，  Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ；  Ｄｍ，  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；  Ｂｍ，  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ；  Ｓｍ，  Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉを示す。ホッコクアカエビ・カテプシンＢと同一のアミノ酸残基及び類似のアミノ酸残基をそれぞれ黒とグレーで示した。（Ａ）プレプロ領域のアラインメントを示した図である。（Ｂ）成熟型酵素のアラインメントを示した図である。
なお、配列上の数字は、ヒトカテプシンＢにおける位置番号を示している。
また、Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ１’、Ｓ２’はバインディングポケットを構成するアミノ酸残基を表す。アスタリスク＊の付いた番号は、触媒基のシステイン、ヒスチジン、アスパラギンを表す。
黒丸印は、ヒトカテプシンＢにおいてジスルフィド結合を形成するシステイン残基を、四角で囲った部分はｏｃｃｌｕｄｉｎｇ  ｌｏｏｐを示す。
【図４】図．３に示したすべてのカテプシンＢ（太字で示す）と様々なシステインプロテアーゼの成熟型酵素の配列に基づき、近隣結合法により無根系統樹を作成した図である。省略記号は、Ｃｔ，  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ；  Ｒｎ，  Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；  Ｌｍａ，  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ；  Ｌｍｅ，  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ；  ＰＡＭ，  ｐｅｒｃｅｎｔ  ａｃｃｅｐｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎを示す。各分岐点の数値はブートストラップ検定の値を示す。
【図５】ホッコクアカエビの各組織におけるカテプシンＢをコードするｍＲＮＡのノーザンブロット解析の結果を示した図である。全ＲＮＡ１０μｇを、０．９％アガロースゲルで電気泳動後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋  ｍｅｍｂｒａｎｅにブロッティングした。レーン１、筋肉；レーン２、肝膵臓；レーン３、腸。ＲＮＡサイズマーカーを左側に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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