(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規の細胞外マトリックスタンパク質、特に、網膜に発現する細胞外マトリックスタンパク質及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供する。【解決手段】本発明にかかるタンパク質及びその遺伝子は、マウス由来の新規な細胞外マトリックス因子であり、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び／又は、上記アミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質と、これをコードする遺伝子である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項２】
マウス由来である請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のうち、９９〜２１４１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号３に示される塩基配列のうち、３６３〜２６００番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号５に示される塩基配列のうち、３９２〜１８２５番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項６】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｄ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項７】
ヒト由来である請求項６記載の遺伝子。
【請求項８】
配列番号７に示される塩基配列のうち、１０６〜２０６４番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項６又は７記載の遺伝子。
【請求項９】
配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１０】
配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項１１】
細胞外マトリックス因子に結合する性質を有する請求項９又は１０記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記細胞外マトリックス因子が、ヒアルロン酸である請求項１１記載のタンパク質。
【請求項１３】
分泌タンパク質である請求項９〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
網膜に発現する請求項９〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１５】
配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１６】
配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１９】
請求項９〜１６のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、網膜に発現する新規細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞外マトリックスは、組織の細胞を取り巻く細胞支持組織であり、コラーゲン、エラスチン、フィブリリンなどの繊維性タンパク質、フィブロネクチン、ラミニンなどの糖タンパク質、プロテオグリカンなどの複合糖質及びヒアルロン酸などの糖質からなる。細胞外マトリックスは、細胞表面レセプターと結合することにより細胞の接着、移動、増殖、分化、形態形成、代謝などの細胞機能に働いていることが知られている。従って、生体の受精、発生、成熟、加齢、炎症、創傷治癒、免疫、腫瘍など多くの生体現象に深く関わっている。
【０００３】
図８（ａ）に示すように、網膜に存在する細胞外マトリックスとしては、インターフォトレセプターマトリックス（ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｍａｔｒｉｘ）が知られている。図８（ｂ）に示すように、このインターフォトレセプターマトリックスは、ヒアルロン酸を主要骨格とした細胞外マトリックスであり、網膜の色素上皮細胞とミューラー細胞とに囲まれた領域に存在している。この領域には、光受容細胞が整然と配列しており、これらの光受容細胞からなる光受容器は、光の明暗や色の識別など、眼の機能において重要な役割を果たしている。インターフォトレセプターマトリックスは、この光受容器を物理的に支持し、その精密な機能の維持に関与していると考えられる。
【０００４】
しかし、インターフォトレセプターマトリックスの主要骨格であるヒアルロン酸は物理的強度が低いことが知られている。このため、インターフォトレセプターマトリックスでは、ヒアルロン酸を束ねて物理的強度を高め、細胞と細胞とを連結させている。これらヒアルロン酸を束ねる機能をもつ構成分子として、ＳＰＡＣＲ（ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｅｓ　ａｎｄ　ｒｏｄｓ）、ＳＰＡＣＲＣＡＮ（ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｅｓ　ａｎｄ　ｒｏｄｓ　ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、ＣＤ４４（ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　４４）、ＲＨＡＭＭ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ）などのヒアルロン酸結合タンパク質が同定されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このように、インターフォトレセプターマトリックスは、眼の重要な器官である光受容器を物理的に支え、その機能の維持のために重要な役割を果たしている。また、インターフォトレセプターマトリックスの構造異常により眼圧の上昇が引き起こされ、緑内障等の疾患の原因となる可能性が論じられている。
【０００６】
従って、網膜、とりわけそのインターフォトレセプターマトリックスに発現する新規細胞外マトリックス因子の遺伝子、タンパク質や当該タンパク質に対する抗体は、光の明暗や色の識別など、眼の機能を研究する上で、さらに、網膜における細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病（緑内障もその一つと考えられる）を研究する上で、非常に有用である。
【０００７】
また、上記の遺伝子、タンパク質や抗体等は、その細胞外マトリックスの関与する病気の診断や、その治療効果の検査などにも有用である。そのため、より多くの新規な細胞外マトリックス因子を見出し、これを生産し利用する方法の開発が強く望まれている。
【０００８】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、新規の細胞外マトリックスタンパク質、特に、網膜に発現する細胞外マトリックスタンパク質及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、マウス由来のｃＤＮＡライブラリーの中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡを選別し、これを用いてタンパク質を発現させ、その機能を解析したところ、このタンパク質が分泌タンパク質であることが確認され、新規の細胞外マトリックスタンパク質であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であり、本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【００１１】
また、本発明に係る他のタンパク質は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であり、本発明に係る他の遺伝子は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ｃ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｄ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【００１２】
上記（ａ）のタンパク質は、本発明者らが今回新たにマウスから細胞外マトリックスタンパク質として単離・同定したものであり、このうち後述のｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２は、眼及びその他の組織に発現が認められた細胞外マトリックスタンパク質である。上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２は、Ｎ末端側に予想分泌シグナル配列を有し、分子内に複数のヒアルロン酸結合モチーフ（ＲＨＡＭＭ−ｌｉｋｅ　ＨＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ）を有する。また、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２の遺伝子の発現プラスミドを導入した２９３Ｔ細胞の培養細胞から抽出したマトリックス画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンから、これらタンパク質は細胞外に分泌される分泌タンパク質であることが確認されている。
【００１３】
また、上記（ｃ）のタンパク質は、本発明者らによってマウスｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子に相当するヒトの遺伝子として同定されたものであり、後述するように、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１と相同性を有している。
【００１４】
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記（ａ）又は（ｂ）或いは（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１、３又は５に示される遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
【００１５】
本発明に係る形質転換体は、上記（ａ）又は（ｂ）或いは（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（マウスやラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、マウスやラットは、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、ノックアウトマウス等は、細胞外マトリックス因子の機能解析、同因子が関係する病気の病態解析やその病気の診断法、診断薬、治療法、治療薬の開発などに有用である。
【００１６】
本発明に係る抗体は、上記（ａ）又は（ｂ）或いは（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質、又はその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００１７】
本発明に係る遺伝子は、後述するように、インターフォトレセプターマトリックス及び色素上皮細胞の基底膜に発現するとともに、緑内障原因遺伝子として同定されているｍｙｏｃｉｌｉｎと同様にオルファクトメディンドメイン（ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ　ｄｏｍａｉｎ）を有すること等から、新たな緑内障原因遺伝子である可能性が高い。それゆえ、本発明に係る遺伝子、タンパク質、抗体等は、緑内障の治療剤、診断剤等として用いることが可能である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
本発明は、新規な細胞外マトリックス因子であるタンパク質とこれをコードする遺伝子とを見出すとともに、これら遺伝子及びタンパク質の機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明の遺伝子、タンパク質の配列、構造について説明し、次いでこれら遺伝子、タンパク質の機能、利用方法等について説明することとする。
【００２０】
（１）本発明に係る遺伝子及びタンパク質の配列、構造
本発明者らは、マウス由来ｃＤＮＡライブラリーの中から分泌シグナル配列と予想される配列を含む３つのｃＤＮＡをスクリーニングし、これら３つの全長ｃＤＮＡ配列を決定し、さらにこれら３つのｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ決定した。
【００２１】
これら新規タンパク質の構造解析の結果、第１の新規ｃＤＮＡと第２の新規ｃＤＮＡとは、オルファクトメディンモチーフ（ｏｌｆａｃｔｏｍｅｄｉｎ　ｍｏｔｉｆ）をＣ末端側に有することがわかった。オルファクトメディンモチーフを有するその他のタンパク質として、網膜の組織の細胞外マトリックスに局在するｍｙｏｃｉｌｉｎ、ｏｐｔｉｍｅｄｉｎが挙げられる。従って、前記２つの新規タンパク質は、網膜の組織に存在する細胞外マトリックス因子と考えられた。そこで、以下の説明では、配列を決定した第１の新規ｃＤＮＡを「ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質」と称して説明する。また、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子のアイソフォームと考えられる第２の新規ｃＤＮＡを「ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質」と称して説明する。また、第３の新規ｃＤＮＡは、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子の選択的スプライシングアイソフォームと考えられるが、この第３の新規ｃＤＮＡを「３７２６１遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「３７２６１タンパク質」と称して説明する。
【００２２】
さらに、本発明者らは、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子と相同性を有する核酸配列をヒトゲノム配列と比較することから、ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１ファミリーのタンパク質をコードする遺伝子を同定し、さらにこのｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を決定した。そこで、以下の説明では、ヒト由来の新規ｃＤＮＡを「ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質」と称して説明する。
【００２３】
なお、以下の説明では、特に断りのない限り、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子又はｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質とは、マウス由来の上記第１の新規ｃＤＮＡ又はそれにコードされるタンパク質を指し、ヒト由来のものは、必ず「ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子」又は「ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質」と称するものとする。
【００２４】
本発明に係る遺伝子は、前述のように、（ａ）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子か、（ｂ）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号１に示される塩基配列のうち、９９〜２１４１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子）、▲２▼配列番号３に示される塩基配列のうち、３６３〜２６００番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子）、▲３▼配列番号５に示される塩基配列のうち、３９２〜１８２５番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（３７２６１遺伝子）、▲４▼これらｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例示される。これら遺伝子はマウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来である。
【００２５】
また、本発明に係る他の遺伝子は、前述のように、（ｃ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子か、（ｄ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子であればよいが、本実施の形態では、▲５▼配列番号７に示される塩基配列のうち、１０６〜２０６４番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子）、▲６▼このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例示される。これら遺伝子はヒト由来である。
【００２６】
なお、本発明の「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）或いは（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２７】
一方、本発明に係るタンパク質は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号２に示されるアミノ酸配列を有しており、６８１のアミノ酸残基からなるｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、及び、▲２▼配列番号４に示されるアミノ酸配列を有しており、７４６のアミノ酸残基からなるｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、並びに、▲３▼配列番号６に示されるアミノ酸配列を有しており、４７８のアミノ酸残基からなる３７２６１タンパク質が例示される。
【００２８】
また、本発明に係る他のタンパク質は、上記（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、▲４▼配列番号８に示されるアミノ酸配列を有しており、６５２のアミノ酸残基からなるヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質が例示される。
【００２９】
本発明に係るタンパク質には、前記（ｂ）のタンパク質、即ち、配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質、或いは（ｄ）のタンパク質、即ち、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質が含まれるが、ここで、「１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）又は（ｄ）のタンパク質は、換言すれば、それぞれ上記（ａ）又は（ｃ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３０】
上記変異タンパク質には、野生型の活性（後述するヒアルロン酸との結合性等）に異常を持つ変異タンパク質（機能欠失型の変異タンパク質と称する）が含まれていても良い。このような機能欠失型の変異タンパク質は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析において有用である。また、本発明に係る遺伝子には、上記機能欠失型の変異タンパク質をコードする遺伝子が含まれても良い。このような遺伝子は、例えば、新たな形質転換体の作出に有用である。
【００３１】
本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）やＦｌａｇ等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。また、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎなどの各種修飾を受けていてもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。
【００３２】
次に、本発明に係る上記４種類の遺伝子及びタンパク質について個別に説明する。
【００３３】
＜ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子及びタンパク質＞
上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質は、Ｎ末端に分泌シグナル配列を持ち、膜貫通ドメインは存在しないことがその１次構造から推定されるため、細胞外分泌タンパク質であると予測される。
【００３４】
図１に示すように、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質は、そのＣ末端側に、オルファクトメディンモチーフ（４２５番目〜６８１番目までのアミノ酸残基）を有しており、Ｎ末端側に、機能未知な２つのシステインリッチリピート（４７番目〜６６番目までのアミノ酸残基、８６番目〜１０５番目までのアミノ酸残基）を、分子中央部に、４アミノ酸残基の３繰り返し構造（３０４番目〜３１５番目までのアミノ酸残基）を有している。
【００３５】
さらに、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質は、２つのヒアルロン酸結合モチーフ（ＲＨＡＭＭ−ｌｉｋｅ　ＨＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ：５５番目〜６３番目のアミノ酸残基、５０９番目〜５１７番目までのアミノ酸残基）を有していることからヒアルロン酸結合タンパク質と考えられる。また、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質は、２つのアスパラギン結合型糖鎖結合部位（１６４番目〜１６６番目のアミノ酸残基、３６１番目〜３６３番目までのアミノ酸残基）、及び、セリン、スレオニンに富んだ領域（３６７番目〜３９７番目までのアミノ酸残基）を有しており、糖鎖修飾（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を受けると推測される。
【００３６】
上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質のアミノ酸組成は表１に示すようになっている。
【００３７】
【表１】
2004065133.tif 000002
【００３８】
なお、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子と相同性のあるｃＤＮＡは報告されていない。
【００３９】
＜ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子及びタンパク質＞
上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質と同様に、Ｎ末端に分泌シグナル配列を持ち、膜貫通ドメインは存在しないことがその１次構造から推定されるため、細胞外分泌タンパク質であると予測される。
【００４０】
図２に示すように、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、そのＣ末端にオルファクトメディンモチーフ（４９１番目〜７４５番目までのアミノ酸残基）を有する点、及び、Ｎ末端に２つの機能未知のシステインリピート（７０番目〜８９番目までのアミノ酸残基、１１２番目〜１２８番目までのアミノ酸残基）を有する点で上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質と共通している。
【００４１】
これに対して、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、ヒアルロン酸結合モチーフ（ＲＨＡＭＭ−ｌｉｋｅ　ＨＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ）を４つ（７８番目〜８６番目までのアミノ酸残基、９１番目〜９９番目までのアミノ酸残基、２９７番目〜３０５番目のアミノ酸残基、５７５番目〜５８３番目のアミノ酸残基）、アスパラギン結合型糖鎖結合部位を３つ（１８７番目〜１８９番目までのアミノ酸残基、２１３番目〜２１５番目のアミノ酸残基、６９１番目〜６９３番目までのアミノ酸残基）有しており、この点で上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質と異なる。
【００４２】
上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質のアミノ酸組成は表２に示すようになっている。
【００４３】
【表２】
2004065133.tif 000003
【００４４】
上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質に見られるようなセリン、スレオニンが連続して存在する領域は含まれていない。しかしながら、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、表２から明らかなように、分子全体としてはセリン（６．３％）とスレオニン（７．９％）に富んだタンパク質である。
【００４５】
図３に示すように、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質とｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質とは、特にＮ末端側のシステインリピート、及びＣ末端側のオルファクトメディンモチーフ領域について高い相同性を示す。
【００４６】
さらに、図４に示すように、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質の一次構造は、ヒトの機能未知ｃＤＮＡであるＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１遺伝子の塩基配列から予測されるアミノ酸配列と、９９．５％という高い相同性を示す。また、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質と相同性の高いマウスオルソログも報告されている（ＧｅｎＢｎａｋ＃：ＡＡＨ２５６５４）。図５に示すように、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質とマウスオルソログ遺伝子ＡＡＨ２５６５４から予測されるアミノ酸配列とは、約９９．５％という高い相同性を示す。これら、ヒト遺伝子ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１及びマウスオルソログ遺伝子ＡＡＨ２５６５４については配列以外の報告はなく、機能は全くわかっていない。
【００４７】
＜３７２６１遺伝子及びタンパク質＞
上記３７２６１遺伝子は本発明に係る第３の新規ｃＤＮＡとして見出されたものであり、配列番号６に示すように、３７２６１タンパク質は、オルファクトメディンモチーフを完全に欠損していることから、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質の選択的スプライシングアイソフォームをコードしていると考えられる。
【００４８】
＜ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質＞
上記ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子は、図１３・図１４・図１５に示すように、その塩基配列が上記マウスｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子と高い相同性を有しており、同じく、ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質は、図１６に示すように、そのアミノ酸配列が上記マウスｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質と高い相同性を示している。なお、図１３〜図１５及び図１６の何れもアスタリスクで示しているアミノ酸残基は同一の残基である。また、図１６におけるコロンはヒトのアミノ酸残基の性質がマウスのアミノ酸残基のそれと非常によく似ていること示し、ピリオドはヒトのアミノ酸残基の性質がマウスのアミノ酸残基のそれとよく似ていることを示す。
【００４９】
（２）新規細胞外マトリックスタンパク質の機能
上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、及び３７２６１タンパク質は何れも、分泌シグナル配列を有しており、何れも細胞外分泌型のタンパク質（分泌タンパク質）であることが予測される。また、図１、図２、配列番号６に示すように、これらｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、及び３７２６１タンパク質は、何れも、複数のＲＨＡＭＭ−ｌｉｋｅ　ＨＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｔｉｆを有していることから、ヒアルロン酸結合活性を有していると予測される。
【００５０】
ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１　ｍＲＮＡは、骨髄、脊髄、眼、精巣、心臓、子宮、肺及び胎仔で多く発現していることが明らかとなっている（後述の実施例と図６参照）。ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２　ｍＲＮＡの発現はｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１　ｍＲＮＡより幅広く、脳、骨髄、脊髄、顎下腺、胃、眼、心臓、精巣、子宮、リンパ節や胎仔などで多く発現していることが明らかとなった（後述の実施例と図６参照）。
【００５１】
さらに、マウス生体の眼組織を免疫染色にて調べたところ、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、特に、インターフォトレセプターマトリックス及び色素上皮細胞の基底膜に局在することが明らかとなった（後述の実施例及び図７参照）。
【００５２】
ところで、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質と同様に網膜の組織で発現する既知のオルファクトメディンドメイン含有タンパク質として、細胞外タンパク質ｍｙｏｃｉｌｉｎ及びｏｐｔｉｍｅｄｉｎが挙げられる。上記免疫染色の結果から明らかになったｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、ｍｙｏｃｉｌｉｎ及びｏｐｔｉｍｅｄｉｎとそれぞれお互いに重ならない部位に局在して発現する。即ち、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、インターフォトレセプターマトリックスに局在するのに対し、ｍｙｏｃｉｌｉｎは、インターフォトレセプターマトリックス、色素上皮細胞、基底膜の外側に存在する線維柱体（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ　ｍｅｓｈｗｏｒｋ：図８（ａ）参照）にて、一方ｏｐｔｉｍｅｄｉｎは、インターフォトレセプターマトリックスより内側に存在する内境界膜（ｉｎｎｅｒ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｍｅｍｂｒａｎｅ：図８（ａ）参照）にてそれぞれ発現することが知られている。従って、これらｍｙｏｃｉｌｉｎタンパク質、ｏｐｔｉｍｅｄｉｎタンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、それぞれの局在部位において、その部位特異的な重要な機能を担っていると推測される。
【００５３】
このように、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、及び３７２６１タンパク質は、何れも細胞外に分泌されること、ヒアルロン酸結合活性を有していると予測されること、多くの生体組織で発現することから、細胞外マトリックスにてヒアルロン酸と結合し、これらの組織を細胞外から物理的に支持するとともに、上記組織の発生や、上記組織を構成する細胞の活動等を、細胞の外側から調節する役割を果たしていると考えられる。
【００５４】
特に、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、網膜の組織にて発現することから、インターフォトレセプターマトリックスの骨格であるヒアルロン酸を束ね、その配向と強度とを規定していると考えられる。さらに、インターフォトレセプターマトリックスでのヒアルロン酸の構造は、光受容器の配向に関わっていると考えられていることから、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、色、明るさ、方向といった視覚にとって本質的な機能を支える役割を果たしていると考えられる。
【００５５】
さらに、上記ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質は、マウスｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質と高い相同性を有しているため、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質と同様の機能を有すると考えられる。
【００５６】
また、インターフォトレセプターマトリックスは、眼のレンズ部分を除く外周全域（近傍）に存在することから、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、眼の恒常性の維持に極めて重要な役割を果たしていると考えられる。例えば、インターフォトレセプターマトリックスの異常は眼の外周全域に亘る構造異常を引き起こし、眼圧を上昇させ、緑内障の発症原因になることが予測される。ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、これら生理的機能、及び疾患に深く関わっている可能性がある。
【００５７】
先天的緑内障は常染色体優性遺伝であり、いくつかの原因遺伝子座が同定されている。そのうち、染色体部位１ｑ２１−２４には上記ｍｙｏｃｉｌｉｎ遺伝子が存在しており、若年性隅角緑内障患者では、このｍｙｏｃｉｌｉｎ遺伝子に遺伝的変異が見いだされている。この遺伝的変異は、オルファクトメディンドメインに限局していることから、オルファクトメディンドメインはｍｙｏｃｉｌｉｎタンパク質の機能に極めて重要な部位であると考えられている。
【００５８】
最近、もう一つの先天的緑内障の原因遺伝子が染色体部位９ｑ３１−３４に存在することが判明したが、一部の隅角緑内障患者ではこの部位にコードされている転写因子ＬＭＸ１Ｂ遺伝子に変異があることが報告された。ＬＭＸ１Ｂ遺伝子の遺伝子異常の頻度はまだ明らかでないが、ｍｙｏｃｉｌｉｎ遺伝子の遺伝子異常の頻度は約５％でしかないことが報告されている。このため、未だ発見されていない先天的緑内障の原因遺伝子が存在しているのではないかと推定される。
【００５９】
マウスｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子の塩基配列を用いてヒトゲノム塩基配列を検索した結果、これらｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子のヒトオルソログ遺伝子は、緑内障遺伝子の存在部位として報告されている１ｑ２３．３及び９ｑ３４にそれぞれ存在していることが明らかとなった。また、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は、インターフォトレセプターマトリックスに存在しており、その機能等に深く関わっているものと推測される。さらに、これらの遺伝子が、緑内障原因遺伝子として同定されているｍｙｏｃｉｌｉｎ遺伝子と同様にオルファクトメディンドメインを有することから、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子は、新たな緑内障の原因遺伝子である可能性が高い。
【００６０】
なお、上記３７２１６遺伝子は、前述したように、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質の選択的スプライシングアイソフォームをコードしていると考えられるため、３７２１６遺伝子及び３７２１６タンパク質は、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質と同様の機能を有していることが予測される。
【００６１】
（３）本発明に係るタンパク質、及びその遺伝子の利用方法
上記のように、本発明に係るタンパク質は、本発明者によって初めて明らかにされた新規な細胞外マトリックスタンパク質であり、ヒアルロン酸結合タンパク質として機能すると予測される。従って、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は以下の有用性を有する。
【００６２】
網膜のインターフォトレセプターマトリックスの異常は、眼の外周全域に亘る構造異常を引き起こし、眼圧を上昇させ、緑内障をはじめとした、眼の疾患の発症原因となることが知られている。本発明に係るタンパク質は、上記インターフォトレセプターマトリックスの骨格であるヒアルロン酸と結合する活性を有していると予測されることから、ヒアルロン酸結合タンパク質としての観点からは、インターフォトレセプターマトリックスの構造を安定化させ、その機能の維持を図ることができると考えられる。このため、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、インターフォトレセプターマトリックスの異常を原因とする疾患の診断、治療へ応用することが可能である。
【００６３】
さらに、インターフォトレセプターマトリックスでのヒアルロン酸の構造は、光受容器の機能や配向に深く関わっていると考えられていることから、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、色、明るさ、方向といった視覚にとって本質的な機能に異常が生じることにより引き起こされる疾患等の診断、治療への応用、並びに、治療薬探索の標的タンパク質として利用が可能である。
【００６４】
また、本発明に係る遺伝子は、緑内障の原因遺伝子であると推定されることから、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、緑内障の診断、治療へ利用する可能性も見出すことができる。
【００６５】
また、細胞外マトリックスは、組織を構成する細胞外環境であることから、細胞の接着、移動、増殖、分化、形態形成、又は代謝等の細胞の各種活動に重大な影響を与えるため、生体の受精、発生、成熟、加齢、炎症、創傷治癒、免疫、腫瘍等多くの生体現象と関連することが知られている。また、同様な観点から様々な組織形成を規定する働きを有することも知られており、細胞外マトリックス因子は、細胞・組織の働きを細胞の外側から調節する重要な役割を果たしている。
【００６６】
それゆえ、本発明に係る遺伝子、タンパク質、及びその抗体等は、受精、胚発生、形態形成、さらには細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病を研究する上で大変有用な道具となり得る。また、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、細胞外マトリックスの関与する病気の診断薬や、その治療効果を検査するための検査薬として有効に用いることができる。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に応用可能である。
【００６７】
また、前述したように、細胞外マトリックスの多くは細胞の接着、伸展活性を持ち、組織での細胞の接着を支持することにより細胞の形態を規定する物理的作用のほかに、細胞表面レセプターを介して細胞に生存、増殖、分化等細胞の生命活動を支配する細胞内シグナルを伝達する。個々の細胞外マトリックス因子は異なる細胞内シグナルを伝達し、これによって細胞、及びその集合体である組織の形成、機能を緻密に制御している。本発明に係るタンパク質は、新たな細胞機能制御因子として、これら制御にかかわっていることが十分予測される。
【００６８】
従って、本発明の遺伝子、タンパク質等は、たとえば生体内において罹患時や術後の組織修復の促進もしくはその制御にも有用であると考えられる。
【００６９】
以下では、本発明に係る遺伝子、タンパク質等の具体的な利用方法について説明する。
【００７０】
本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、各種ホスト細胞中に導入して、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質又はその変異タンパク質を発現させることができる。導入された本発明に係る遺伝子又は変異遺伝子は、ホスト細胞中でベクターとして存在してもよいし、ホスト細胞のゲノムＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、ホスト細胞のゲノム中には天然に存在しないが人為的操作の結果、ホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定のホスト細胞のゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加してホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００７１】
上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。さらに、上記発現ベクターには、プロモーター配列だけでなくターミネーター配列を含めてもよい。
【００７２】
また、上記遺伝子又は変異遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーを含むプラスミド等を、本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターとともにホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質のＧＦＰ融合タンパク質を発現させてもよい。
【００７３】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物の培養細胞、あるいは昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００７４】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００７５】
前述したように、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子等は、研究用の各種試薬だけでなく、細胞外マトリックスの関与する病気の診断や治療、治療効果の検査等に用いられる各種薬剤に応用することが可能となる。
【００７６】
本発明に係る遺伝子やタンパク質等の薬剤化については、従来公知の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば研究用試薬の場合、本発明に係る遺伝子を形質転換キット化したり、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質を異種発現系で大量生産し精製したりすればよい。
【００７７】
同様に、本発明に係るタンパク質に対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質及び、３７２６１タンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができる。
【００７８】
また、本発明に係る遺伝子は、緑内障原因遺伝子と推定されることから、緑内障治療用又は緑内障診断用の薬剤として利用できる可能性がある。このように緑内障治療剤又は緑内障診断剤として利用する場合、その具体的な組成は、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質又はその遺伝子が含まれていれば特に限定されるものではない。具体的には、使用対象の動物個体の種類に応じて、緑内障の治療及び緑内障の診断のために、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質又はその遺伝子の機能が発揮できるような緩衝液等が含まれていればよい。
【００７９】
また、本発明に係る遺伝子の一部配列をプローブやプライマーとして用いることができる。上記一部配列とは、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子及び３７２６１遺伝子に含まれる特徴的・特異的な配列であればよい。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００８０】
（４）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
本発明に係る上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子及び３７２６１遺伝子、並びにヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、３７２６１タンパク質、又はヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質をコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒトやマウスなどのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、３７２６１タンパク質、又はヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００８１】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００８２】
また、上記プローブの配列を、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、３７２６１タンパク質、又はヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質の機能上重要と考えられる領域（例えば、分泌シグナル配列、Ｎ型糖結合領域、システインリピート、又はオルファクトメディンモチーフ等）の中から選択し、ヒト・マウスやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、３７２６１タンパク質、又はヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００８３】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、３７２６１タンパク質、又はヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト・マウスなどのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００８４】
本発明に係るタンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、３７２６１タンパク質、又はヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、あるいはその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、３７２６１タンパク質、又はヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質等の本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
【００８５】
上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質、３７２６１タンパク質、又はヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　Ｇｅｎｅ　１５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００８６】
【実施例】
以下の実施例では、本発明に係るｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子、及び３７２６１遺伝子をマウスから取得した具体的な方法、並びにヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子をヒトから取得した具体的な方法、及び本発明に係るｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質の物性を調べた結果について、順番に説明する。
【００８７】
〔実施例１：ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
なお、本実施例で説明するｃＤＮＡライブラリーの作製は、本発明に係るｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子、及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子に共通である。
【００８８】
（１）ｍＲＮＡの調製
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）各器官又は組織０．５ｇ〜１ｇを１０ｍｌの懸濁液でホモジェナイズし、２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）１ｍｌと、同量のフェノール／クロロホルム（体積比５：１）混合液を加え抽出した。抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えて、ＲＮＡを水相から分離沈澱させた。この試料を氷の上で１時間インキュベーションした後、４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で冷却遠心機にかけ、沈澱物を回収した。得られた沈殿物を７０％エタノールで洗い、水８ｍｌに溶解後、２ｍｌの５Ｍ　ＮａＣｌ、１％ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）、４Ｍ尿素、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓを含むｐＨ７．０の水溶液１６ｍｌを加えてＲＮＡを沈澱させ、ポリサッカライドを除いた（ＣＴＡＢ沈澱）。
【００８９】
続いて、室温で４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心機にかけ、ＲＮＡを４ｍｌの７Ｍグアニジン−Ｃ１に溶解した。そして２倍量のエタノールを加えた後、氷上で１時間インキュベーションし、４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心機にかけ、生じた沈澱物を７０％エタノールで洗いＲＮＡを回収した、これを再度水に溶解し、ＲＮＡの純度をＯＤ比２６０／２８０（＞１．８）と２３０／２６０（＜０．４５）を読むことによって計測した。
【００９０】
（２）第１鎖ｃＤＮＡの調製
調製した上記ｍＲＮＡ１５μｇを用いて、逆転写酵素３，０００ｕｎｉｔにより、最終容量１６５μｌの反応液中で、５−メチル−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを各々０．５４ｍＭ、０．６Ｍトレハロース、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ　ＫＣｌ、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ、５２ｎｇ／μｌ　ＢＳＡ、ＲＮａｓｅインヒビター５ｕｎｉｔの条件下で逆転写反応を行った。
【００９１】
なお、プライマーとしては、次に示す制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含むオリゴヌクレオチド１ｓｔ　ＢＳ（配列中、ＶはＡ，Ｇ又はＣを示し、ＮはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴを示す）を１２．６μｌ用いた。
【００９２】
５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号９）
上記逆転写反応を始める際、反応液の１／４を採取し、それに１．５μｌの［α−３２Ｐ］−ｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０μＣｉ／μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を加えることにより、第１鎖ｃＤＮＡの合成効率を測定した。ＲＩ標識した反応液の０．５μｌをＤＥ−８１ペーパー上にスポットし、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗った前後のＲＩ活性を測定し、計算した。その後、ＲＩ標識した反応液と非標識の反応液を混合し、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ８μｌ、１０％ＳＤＳ２μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ２０μｇを加え、４５℃で１５分間加熱した。フェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱後、沈澱をＲＮａｓｅフリーに処理してある水（以下ＲＮａｓｅフリー水とする）４７μｌに溶解した。
【００９３】
（３）５’キャップ構造及び３’末端へのビオチン付加
ＲＮＡジオールのビオチン化ＲＮＡのジオール部位（Ｃａｐ構造のある５’末端と、ポリＡ鎖のある３’末端のリボースの双方に存在）にビオチンを結合させるために、２段階の反応を行った。この２段階の反応は、それぞれ、ジオール基の酸化とそれに続くビオチンヒドラジトと酸化ＲＮＡ体のカップリング反応である。まず、逆転写反応で得られたＲＮＡ−第１鎖ｃＤＮＡ複合体１５μｇを、６．６ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）と、酸化剤として過ヨウ素酸ナトリウムを用いて５０μｌの反応液中で処理した。この酸化反応は遮光条件の下、氷上で４５分間行った。
【００９４】
続いて、５Ｍ塩化ナトリウム１１μｌ、１０％ＳＤＳ０．５μｌ、そして同量のイソプロパノールを加え、６０分間氷上に放置した後、４℃で１５分間１５，０００ｒｐｍ遠心し沈澱を取得した。沈澱物は７０％エタノールで洗い、ＲＮａｓｅフリー水５０μｌに再溶解させた。その試料に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）５μｌ、１０％ＳＤＳ５μｌ、１０ｍＭビオチンヒドラジド（Ｓｉｇｍａ社製）１５０μｌを加え、室温（２２〜２６℃）で終夜反応させた。最後に、５μｌの５Ｍ　ＮａＣｌ、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）７５μｌ、及び２．５倍量のエタノールを加え、１時間の氷上冷却後、４℃において１５分間遠心し、ビオチン化した。反応後、反応液を１５分間遠心し、再度ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を沈澱させた。沈澱物は７０％エタノールで１回、更に８０％エタノールで１回洗い、ＲＮａｓｅフリー水７０μｌに溶解した。
【００９５】
（４）ＲＮａｓｅＩによる完全長ｃＤＮＡの選択
上記のようにして得られたビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体について、１本鎖ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅＩで処理することにより、逆転写反応時に完全なｃＤＮＡの伸長が得られなかったｍＲＮＡ、及びｍＲＮＡの３’末端に標識されたビオチン残基を取り除いた。具体的には、上記ビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の試料７０μｌに、１０×ＲＮａｓｅＩバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｍ　ＮａＯＡｃ）１０μｌ、ＲＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ　ＯｎｅＴＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２００ｕｎｉｔを加えて、３７℃で１５分間処理することで１本鎖ＲＮＡを消化した。
【００９６】
（５）完全長ｃＤＮＡの採取
ストレプトアビジンをコートしたマグネティックビーズにｃＤＮＡが非特異的に吸着するのを防止するため、１００μｇの酵母ｔＲＮＡ（ＤＮａｓｅＩ処理したもの）を５ｍｇ（５００μｌ）のマグネティックビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｐｏｒｏｕｓ　ｇｌａｓｓ（ＭＰＧ）ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｃｏａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＣＰＧ，ＮＪ））に加え、１時間氷上に放置した後、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｍ　ＮａＣｌの溶液にて洗った。
【００９７】
上記ビーズを５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｍ　ＮａＣｌの溶液５００μｌ中に懸濁し、上記（４）で取得したＲＮａｓｅＩ処理されたｃＤＮＡを加えた。室温にて３０分間撹拌することで、マグネティックビーズと完全長ｃＤＮＡを結合させた。
【００９８】
完全長ｃＤＮＡを捕獲したビーズを５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｍ　ＮａＣｌの溶液で４回、０．４％ＳＤＳ、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡで１回、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０％グリセロールで１回、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡ水溶液で１回、ＲＮａｓｅＨバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１回洗浄した後、ＲＮａｓｅＨ用バッファー１００μｌに懸濁し、ＲＮａｓｅＨ３ｕｎｉｔを加え、３７℃で３０分間加温した。その後、１０％ＳＤＳ１μｌ、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ２μｌを加えて、１０分間、６５℃に曝し、その上清を回収した。
【００９９】
回収した上清（１本鎖完全長ｃＤＮＡを含む）はフェノール／クロロホルムで抽出し、スピードバッグにて液量を１００μｌ以下に減じてからＧ２５／Ｇ１００　Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーに付した。ＲＩ活性を持った分画はシリコン処理したマイクロチューブに収集するとともに、グリコーゲン２μｇを加え、エタノール沈澱にて得られた沈澱物を３０μｌの超純水に溶解した。
【０１００】
（６）１本鎖ｃＤＮＡへのオリゴｄＧ付加
回収した１本鎖ｃＤＮＡ３０μｌを、最終容量５０μｌの反応液中で、２００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．９）、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＣｏＣｌ２、１ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１００μＭ　ｄＧＴＰの条件のもと、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）３２ｕｎｉｔを用いて３７℃で３０分間のオリゴｄＧ付加反応に付した。反応終了時にＥＤＴＡを５０ｍＭとなるように加え、一連のフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱を経て、３１μｌの超純水に溶解した。
【０１０１】
（７）第２鎖ｃＤＮＡ合成
第１鎖ｃＤＮＡを鋳型にした第２鎖ｃＤＮＡの合成は以下のように行った。最終容量６０μｌの反応系で、第２鎖低バッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、１００ｍＭ　ＫＣｌ、１００ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／μｌ　ＢＳＡ）３μｌ、第２鎖高バッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、６００ｍＭ　ＫＣｌ、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）３μｌ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ各々０．２５ｍＭ、β−ＮＡＤＨ　６μｌ、オリゴｄＧ付加された第１鎖ｃＤＮＡ３１μｌ、第２鎖プライマー−アダプター６００ｎｇを加え、Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ；宝酒造社製）１５ｕｎｉｔ、耐熱性ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）１５０ｕｎｉｔ、耐熱性ＲＮａｓｅＨ（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒｅ社製）３ｕｎｉｔによって第２鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１０２】
なお、第２鎖プライマー−アダプターとしては、次に示す２ｎｄ−Ｘ　プライマーを用いた。
【０１０３】
５’−　ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ　−３’（配列番号１０）
０．５Ｍ　ＥＤＴＡを１μｌ加えることで反応を停止させ、さらにタンパク質成分を分解するために、１０％ＳＤＳ１μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ１０μｇの存在下に４５℃で１５分間加熱し、最終的にフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した２本鎖完全長ｃＤＮＡを得た。
【０１０４】
（８）ライブラリーの調製
ＭｏｂｉＴｅｃ社製のλＰＳベクターをｃＤＮＡ用に改変してλＰＳ（ＲＩＫＥＮ）ベクター：λ−ＦＬＣ−１ベクターを作製し、これにｃＤＮＡを挿入してｃＤＮＡライブラリーを調製した（特開２０００−３２５０８０号公報参照）。
【０１０５】
次に、本発明に係る前記各遺伝子及びタンパク質のそれぞれについて、その単離方法及び物性等を調べた結果を説明する。
【０１０６】
＜ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質＞
〔実施例２：ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子の選別〕
上記作製方法により得られたマウスａｄｕｌｔ　ｕｒｉｎａｒｙ　ｂｌａｄｄｅｒ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子を選択した。
【０１０７】
具体的には、ｃＤＮＡライブラリーの各クラスタからひとつの代表クローンを選択した。代表クローンはＱ−ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ　ＬＩＭＩＴＥＤ製）で選択し、３８４穴プレートにアレイ化した。このとき、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は３０℃で１８〜２４時間、５０μｌのＬＢ培地で培養した。このとき、ＬＢ培地には、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した。
【０１０８】
培養した各クローンを、さらに１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１．３ｍｌのＨＴ液中で培養し、遠心分離により大腸菌を回収した後、ＱＩＡｐｒｅｐ　９６　Ｔｕｒｐｏ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収、精製した。取得されたプラスミド中に挿入されているｃＤＮＡの鎖長を調べるために、上記で取得したプラスミドＤＮＡの１／３０を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、１％のアガロースゲル電気泳動を行った。
【０１０９】
得られたプラスミド中に挿入された完全長ｃＤＮＡの全長の塩基配列解析には、３種類のシークエンサを用いた。また、プラスミドは挿入配列の長さが２．５ｋｂより短いものと長いものの２つのカテゴリに分けた。このうち２．５ｋｂより短い挿入配列を有するクローンについては両端から塩基配列を解析した。
【０１１０】
このとき、次に示すセンス鎖のプライマー（配列番号１１）と、アンチセンス鎖のプライマー（配列番号１２）を用いて、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で反応させ、Ｌｉｃｏｒ　ＤＮＡ４２００（ｌｏｎｇ　ｒｅａｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて解析した。
【０１１１】
５’−ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ−３’（センス鎖・配列番号１１）
５’−ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’（アンチセンス鎖・配列番号１２）
上記塩基配列解析により解析ができなかったギャップは、プライマウォーキング法により決定した。その際、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７７及び／又はＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．製）、ＢｉｇＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｋｉｔ、及びＣｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　ｒｅａｄｅｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．製）を用いた。
【０１１２】
また、挿入されているｃＤＮＡが２．５ｋｂより長いクローンの配列決定は、ショットガン法によって実施した。このとき、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＲＩＳＡ　３８４、及びＤＹＥｎａｍｉｃ　ＥＴ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いた。ショットガンライブラリを作製するために、４８の独立した代表クローンからＰＣＲで増殖した４８のＤＮＡフラグメントを用いた。増幅されたＤＮＡ断片の末端をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した。
【０１１３】
上記ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８ベクターへ挿入して組み換えベクターを作製し、この組み換えベクターを用いて、大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。この大腸菌から、上記代表クローンのアレイ化と同様にしてプラスミドを調製した。
【０１１４】
各代表クローンについては、両末端からの塩基配列解析によって塩基配列を決定し、該塩基配列をコンピューター上で連結した後、Ｄｏｕｂｌｅ　Ｓｔｒｏｋｅ　Ｓｈｅａｒｉｎｇ　Ｄｅｖｉｃｅ（Ｆｉｏｒｅ　Ｉｎｃ．製）によるｓｈｅａｒｉｎｇを行った。ショットガン法による塩基配列決定は、１２〜１５クローンの重複をもって行った。この塩基配列決定により配列が決定できなかったギャップは、上記と同様にプライマウォーキングによって決定した。
【０１１５】
〔実施例３：ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質発現用のプラスミドの作製〕
上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質を発現させるために、次のようにして作製したプラスミドをベクターとして用いた。
【０１１６】
（１）ｐＣＩｋａｎａの作製
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をＮｄｅＩサイト及びＮｏｔＩサイトにて切断し、ネオマイシン／カナマイシンを含む断片を精製した。また、ｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＮｄｅＩサイト及びＮｏｔＩサイトにて切断し、イントロンを含む断片を精製した。このイントロンを含む断片を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のネオマイシン／カナマイシンを含む断片のＮｄｅＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａを得た。
【０１１７】
（２）ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃの作製
ｈｒＧＦＰ　ｃＤＮＡを増幅するために、ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−２ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を鋳型とし、配列番号１３（フォワードプライマー）及び配列番号１４（リバースプライマー）に示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１１８】
配列番号１３にて表すプライマーは、ｈｒＧＦＰ　ｃＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧから１コドン分３’側にあるＧＴＧ配列を含み、さらに、図９に示す、ｃＤＮＡをクローニングするためのマルチクローニングサイトを５’側に配置したものである。また、配列番号１４にて表すプライマーは、ｈｒＧＦＰ　ｃＤＮＡの、翻訳停止コドンから１コドン分５’側にあるＧＴＧ配列を含んだ１９の塩基、１０アミノ酸のｍｙｃ　ｔａｇを２つタンデムにコードする配列、及び、上記プラスミドｐＣＩｋａｎａに組み込むためのＰｓｐＯＭＩサイトをタンデムに配したものである。
【０１１９】
５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣ−３’　（配列番号１３）
５’−ＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＣＧＣＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’　（配列番号１４）
上記のプライマーを用いたＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ　ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュ社製）を用い、そのプロトコールに従って行った。このＰＣＲにより増幅断片をｐＣＲ　２．１−ＴＯＰＯ（ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に挿入し、大腸菌（Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ　ＴＯＰ１０　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ，ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）の形質転換を行った。形質転換した大腸菌から、増幅断片が挿入されたｐＣＲ　２．１−ＴＯＰＯを抽出し、ＥｃｏＲＩサイト及びＰｓｐＯＭＩサイトにて切断して、ｈｒＧＦＰと２つのＭｙｃタグとがつながったｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を精製した。この精製ＤＮＡ断片を、上記（１）にて得たプラスミドｐＣＩｋａｎａのＥｃｏＲＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃを得た。
【０１２０】
（３）ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃの作製
ＥＧＦＰ　ｃＤＮＡを増幅するために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１を鋳型として、配列番号１５（フォワードプライマー）及び配列番号１６（リバースプライマー）に示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１２１】
配列番号１５に示すプライマーは、ＥＧＦＰ　ｃＤＮＡの、翻訳開始コドンＡＴＧから１コドン分３’側にあるＧＴＧ配列を含み、上記（２）にて得たプラスミドｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組込むためのＢｓｔＢＩサイトを５’側に配置したものである。また、配列番号１６に示すプライマーは、ＥＧＦＰ　ｃＤＮＡの、翻訳停止コドンから１コドン分５’側にあるＣＴＧ配列を含み、さらに、１０アミノ酸のｍｙｃ　ｔａｇをコードする配列、及び、上記（２）にて得たｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組み込むためのＢｓｔＢＩサイトをタンデムに配したものである。
【０１２２】
５’−　ＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ　−３’　　（配列番号１５）
５’−ＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＣＧＣＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’　（配列番号１６）
上記プライマーを用いたＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ　ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュ社製）を用い、そのプロトコールに従って行った。このＰＣＲによって得られた増幅断片をｐＣＲ　２．１−ＴＯＰＯ（ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に挿入し、大腸菌（Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ　ＴＯＰ１０　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ，ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）の形質転換を行った。形質転換した大腸菌から、ＥＧＦＰ　ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を精製した。この断片を、上記ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃの２つのＢｓｔＢＩサイト間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃを作製した。
【０１２３】
上記プラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃは、図１０に示すように、５１２２塩基対からなるプラスミドで、ｐＵＣｏｒｉ、ＳＶ４０　ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｋａｎｒ／Ｎｅｏｒ、ＨＳＴＫｐｏｌｙＡ、ＣＭＶ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｉｎｔｒｏｎ、Ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅ、ＥＧＦＰ、３ｘＭｙｃ　ｔａｇ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡを有している。上記ｐＵＣｏｒｉは、プラスミドを複製させるために必要な配列である。上記Ｋａｎｒ／Ｎｅｏｒは、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子である。上記ＳＶ４０　ｐｒｏｍｏｔｅｒは、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子を発現させるためのプロモーター配列である。
【０１２４】
また、図９に示すマルチクローニングサイトは、制限酵素サイトを複数有した配列であり、発現させたい遺伝子やｃＤＮＡ等を挿入するためのものである。マルチクローニングサイトに配された制限酵素サイトは、５’側から順に、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＢＩである。
【０１２５】
上記ＣＭＶ　ｐｒｏｍｏｔｅｒは、マルチクローニングサイトに挿入された遺伝子やｃＤＮＡを発現させるためのプロモーター配列である。上記ＥＧＦＰは、蛍光標識タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子である。３ｘＭｙｃ　ｔａｇは、標識タンパク質であるＭｙｃタグをコードする塩基配列が３つ連続して設けられているものであり、この３ｘＭｙｃ　ｔａｇの下流領域にＳＴＯＰコドン（Ｓｔｏｐ　ｃｏｄｏｎ）が設けられている。従って、マルチクローニングサイトに挿入された遺伝子にコードされているタンパク質が発現されると、このタンパク質のＣ末端下流域にＥＧＦＰと３ｘＭｙｃタグとが融合されることになる。
【０１２６】
〔実施例４：ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質の発現〕
上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子のｃＤＮＡを、配列番号１７（フォワードプライマー）及び配列番号１８（リバースプライマー）に示すプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。上記配列番号１７及び配列番号１８に示すプライマーは、上記ｐＣＩｋａｎａ−ＥＧＦＰ３ｘＭｙｃに、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡを組み込んでベクターとして用いるための制限酵素部位を有している。
【０１２７】
すなわち、配列番号１７に示すプライマーは、細胞外マトリックス遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）にて、翻訳開始コドンＡＴＧを含む９４番目〜１１４番目の塩基配列と、上記ｐＣＩｋａｎａ−ＥＧＦＰ３ｘＭｙｃに組み込むためのＥｃｏＲＩサイトとを有している。また、配列番号１８に示すプライマーは、配列番号１で表されるｃＤＮＡの２１１９番目〜２１４１番目の塩基配列、及び、上記ｐＣＩｋａｎａ−ＥＧＦＰ３ｘＭｙｃに組み込むためのＮｏｔＩサイトを有している。
【０１２８】
５’−　ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧ　−３’　　（配列番号１７）
５’−　ＣＴＴＡＣＡＣＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＧＴＧＧＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡ　−３’　（配列番号１８）
上記プライマーを用いたＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩサイト及びＮｏｔＩサイトにて制限酵素処理を行い、上記ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイト間、すなわちＥＦＧＰ−ｍｙｃタグとの融合タンパク質として発現するように挿入し、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質発現プラスミドを作製した。次いで、この発現プラスミドを、大腸菌（Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ　ＴＯＰ１０　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ，ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に導入して形質転換を行い、大腸菌を増殖させることにより、上記ベクターを精製した。
【０１２９】
続いて、遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ社製）を用いて、ヒト２９３Ｔ細胞に、精製した上記発現プラスミドを導入して培養を行った。培養したヒト２９３Ｔ細胞の細胞破砕物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜２０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル）にて電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに転写した。
【０１３０】
この発現プラスミドを導入した２９３Ｔ細胞の培養上清（ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｕｐ．）、細胞の破砕物（ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅ）及び細胞をはがした後に細胞培養皿に付着したタンパク質から抽出したマトリックス画分（ｍａｔｒｉｘ）を、それぞれ還元した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写後、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社）によりウェスタンブロットを行い、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１−ＥＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質を検出した。その結果、図１２に示すように、マトリックス画分で予想サイズとほぼ同じ約１１０ｋＤａの産物とそれより大きい約３００ｋＤａの産物が検出された。このことより、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質は細胞外分泌タンパク質であることが確認された。一方、細胞破砕物では予想サイズとほぼ同じ約１１０ｋＤａの産物とそれより大きい約３００ｋＤａの産物と３００ｋＤａ以上のブロードなバンドが検出された。
【０１３１】
〔実施例５：ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１　ｍＲＮＡのマウス組織での発現〕
上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１　ｍＲＮＡの、マウス胚における発生及びマウス組織での発現パターンをＲＴ−ＰＣＲによって調べた。
【０１３２】
具体的には、まず、マウス全ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）から、当該メーカーのプロトコールに従って、オリゴｄＴプライマー及びｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（ＲＮａｓｅＨ−）　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。マウスＲＮＡとしては、１；脳（Ｂｒａｉｎ）、２；骨髄（Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ）、３；７日目胎仔（Ｅ７）、４；１１日目胎仔（Ｅ１１）、５；１５日目胎仔（Ｅ１５）、６；１７日目胎仔（Ｅ１７）、７；眼（Ｅｙｅ）、８；心臓（Ｈｅａｒｔ）、９；腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、１０；肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、１１；肺（Ｌｕｎｇ）、１２；リンパ節（Ｌｙｍｐｈ　Ｎｏｄｅ）、１３；前立腺（Ｐｒｏｓｔａｔｅ）、１４；唾液腺（Ｓａｌｉｖａｒｙ　ｇｌａｎｄ）、１５；平滑筋（Ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ）、１６；脊髄（Ｓｐｉｎａｌ　Ｃｏｄｅ）、１７；脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、１８；胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）、１９；精巣（Ｔｅｓｔｉｓ）、　２０；胸腺（Ｔｈｙｍｕｓ）、２１；子宮（Ｕｔｅｒｕｓ）に由来するもの、の計２１種類を用意した。
【０１３３】
上記にて合成したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１に示す１５０１番〜１８６１番の塩基配列を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅しｃＤＮＡの定量を行った。ＲＴ−ＰＣＲは、配列番号１９（５’末端側）及び配列番号２０（３’末端側）に示すプライマーを用いて行った。
【０１３４】
５’−　ＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴＣＧＡＡＡＣＣＴＧＧ　−３’　（配列番号１９）
５’−　ＣＡＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣ　−３’　（配列番号２０）
Ｒｏｃｈｅ社（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）製Ｅｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍに、上記ｃＤＮＡと上記プライマーと終濃度０．２ｍＭｄＮＴＰを混合して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて３分反応させた後、９５℃にて２０秒、６５℃にて３０秒、７０℃にて１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後、７２℃にて１０分反応させた。次いで、１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動により分離した。
【０１３５】
その結果を図６に示す。図６に示すように、骨髄、脊髄、胃、目、子宮や胎仔等でＰＣＲ増幅産物のバンドを確認した。このことからｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１のｍＲＮＡは、骨髄、脊髄、胃、目、子宮や胎仔等で多く発現していることが分かった。
【０１３６】
〔実施例６：ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１抗体の作製〕
（１）抗原作製
ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質の１０６番目〜３６２番目のアミノ酸残基をＧＳＴとの融合タンパクとして発現させ、免疫原とした。この領域（１０６番目〜３６２番目のアミノ酸残基）をコードするｃＤＮＡの塩基配列をＰＣＲ反応で増幅し、ＧＳＴ融合タンパク発現ベクターに組み込んで融合タンパクの大腸菌大量合成系に供した。
【０１３７】
尚、ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、以下に示す通りで、配列番号２１のプライマーが抗原２の５’側であり、配列番号２２のプライマーが抗原２の３’側である。
【０１３８】
５’−　ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ　−３’（配列番号２１）
５’−　ＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＡＧＴＴＧＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＡＡ　−３’（配列番号２２）
実施例１で作製したマウスｃＤＮＡライブラリーから選択したｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子のｃＤＮＡが入ったプラスミドを鋳型として、上記抗原プライマーを用いて次の条件でＰＣＲ反応を行い、目的のバンドを得た。
【０１３９】
ＰＣＲ反応は９５℃３分の後、９５℃２０秒、５０℃３０秒、７２℃１分を１サイクルとして３０サイクル行い、１．５％アガロース上電気泳動によって目的サイズのバンドを確認した。ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製した後に、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで末端配列を切断した。０．５μｌの切断したＰＣＲ増幅産物と同じくＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩでマルチクローニングサイトを切断したｐＧＥＸ−４Ｔ−１　０．５（ｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を混ぜてＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）でライゲーション反応を行い、引き続きＪＭ１０９　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌ（宝酒造社製）にトランスフォーメーションを行い、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で３７℃一晩培養し複数のコロニーを得た。
【０１４０】
アガロース電気泳動によって目的サイズのバンドが出たクローンから２クローン選び、ＡＢＩ社製ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＫｉｔによってｃＤＮＡの全塩基配列を確認した。
【０１４１】
なお、上記シーケンス反応に用いたプライマー配列は、以下に示す通りで、配列番号２３のプライマーがｐＧＥＸ　５’プライマーであり、配列番号２４のプライマーがｐＧＥＸ　３’プライマーである。
【０１４２】
５’−　ＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ　−３’　　（配列番号２３）
５’−　ＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧ　−３’　　（配列番号２４）
（２）抗原の精製
上記ＧＳＴ融合抗原タンパクを発現する大腸菌を大量培養し、その大腸菌破砕物からＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃｏｌｕｍｎで目的タンパクを精製した。すなわち、一晩ＬＢ培地で増殖させた抗原発現大腸菌１ｍｌを７００ｍｌのＬＢ培地に移し、３７℃で４時間振とう培養し、終濃度０．５ｍＭ　Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２０℃で１０時間振とう培養した。大腸菌は遠心により回収し、−２０℃で保存した。融解した大腸菌を２０ｍｌのＬｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ，　１００μｇ／ｍｌ　Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、１ｍＭＤＴＴ）に懸濁し、超音波破砕によって得られた抽出液を遠心によって回収した。
【０１４３】
得られた抽出液はあらかじめＰＢＳ（−）で洗ったＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃｏｌｕｍｎに２回通し、目的タンパクをカラムに結合させた。カラムをさらにＰＢＳ（−）で洗った後、結合タンパクを２０ｍＭ　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅを０．５ｍｌずつ添加して回収していき、目的タンパクを含むｆｒａｃｔｉｏｎをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、クマシー染色で確認した。十分量の目的タンパクを含むｆｒａｃｔｉｏｎをまとめて、大量のＰＢＳ（−）溶液中で透析し抗原溶液とした。濃度はＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）で測定した。
【０１４４】
（３）抗原の免疫
得られた抗原タンパクをＪａｐａｎｅｓｅ　Ｗｈｉｔｅ　Ｒａｂｂｉｔに免役した。免疫は（株）医学生物学研究所に依頼し、最終的に８５ｍｌの全採血後抗血清を入手した。
【０１４５】
（４）抗体の精製
免疫に用いた抗原はＧＳＴ融合タンパクであるため、ＧＳＴタンパクに反応する抗体を除く目的で、まずＧＳＴカラムを作製した。１ｍｌのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに２ｍｇの精製ＧＳＴタンパクを結合させ、４０ｍＭのＤｉｍｅｔｈｙｌ　Ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ社）で室温１時間反応させ結合タンパクを架橋した後、未反応ＧＳＴを除いてＧＳＴカラムとした。次に抗原カラムを作製した。０．１ｍｌのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに０．１ｍｇの精製抗原タンパクを結合させ、４０ｍＭのＤｉｍｅｔｈｙｌ　Ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ社）で室温１時間反応させ結合タンパクを架橋した後、未反応の抗原タンパク質を除いて抗原カラムとした。まずＧＳＴカラムに抗血清１ｍｌを通してＧＳＴに対して反応する抗体を除いた後に、抗原カラムを使い抗体を精製した。そして、ＰＤ−１０（アマシャム社製）ゲル濾過カラムを用いて溶液をＰＢＳに置換した。これを抗ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１抗体とした。抗体濃度は２８０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定して算出した。
【０１４６】
＜ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質＞
〔実施例７：ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子の選別〕
前記実施例１の作製方法により得られたマウス０日新生仔頭部（０　ｄａｙ　ｎｅｏｎａｔｅ　ｈｅａｄ）由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、前記実施例２と同様にして決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子を選択した。
【０１４７】
その結果、配列番号３に示すように、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子のｃＤＮＡは７４６個のアミノ酸をコードしていると考えられた。
【０１４８】
〔実施例８：３７２６１遺伝子の選別〕
前記実施例１の作製方法により得られたマウス０日新生仔頭部由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、前記実施例２と同様にして決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、３７２６１遺伝子を選択した。
【０１４９】
その結果、配列番号３に示すように、上記３７２６１遺伝子のｃＤＮＡは４７８個のアミノ酸をコードしていると考えられた。
【０１５０】
〔実施例９：ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質の発現〕
ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子（ｃＤＮＡ）を、以下に示す配列番号２５（フォワードプライマー）及び配列番号２６のプライマー（リバースプライマー）を用いてＰＣＲにより増幅した。フォワードプライマーは、翻訳開始コドンＡＴＧを含む、配列番号３に示すｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子の３６１〜３８１番目の塩基配列と発現ベクターへ組み込むためのＥｃｏＲＩサイトをその５’側に配したプライマーであり、リバースプライマーは、配列番号３に示すｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子の２５７７〜２６００番目の塩基配列を含み、発現ベクターへ組み込むためのＮｏｔＩサイトをその３’側に配したプライマーである。
【０１５１】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＣＣＡＴＴＧ−３’　（配列番号２５）
５’−ＣＣＴＡＣＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡ−３’　（配列番号２６）
上記プライマーを用いたＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡを、前記実施例４と同様にして、上記ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃ（実施例３で作製）に挿入して、発現プラスミドを作製した。次いで、この発現プラスミドを、前記実施例４と同様にして精製し、ヒト２９３Ｔ細胞に導入して培養を行った。培養したヒト２９３Ｔ細胞の培養上清及び細胞破砕物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに転写した。
【０１５２】
発現プラスミドを導入した２９３Ｔ細胞の培養上清（ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｕｐ．）、細胞の破砕物（ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅ）及び細胞をはがした後に細胞培養皿に付着したタンパク質から抽出したマトリックス画分（ｍａｔｒｉｘ）をそれぞれ還元した後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写後、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社）によりウェスタンブロットを行い、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２−ＥＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質を検出した。その結果、図１２に示すように、マトリックス画分で予想サイズとほぼ同じ約１２０ｋＤａの産物とそれより大きい約３００ｋＤａの産物が検出された。このことよりｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は細胞外分泌タンパク質であることが見出された。一方、細胞破砕物では予想サイズとほぼ同じ約１２０ｋＤａの産物とそれより大きい約３００ｋＤａの産物と３００ｋＤａ以上のブロードなバンドが検出された。
【０１５３】
〔実施例１０：ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２　ｍＲＮＡのマウス組織での発現〕
前記実施例５と同様にして、上記ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２　ｍＲＮＡの、マウス胚における発生及びマウス組織での発現パターンをＲＴ−ＰＣＲによって調べた。なお、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーとしては、以下に示す配列番号２７及び配列番号２８のプライマーを用いた。配列番号２７、２８のプライマーは、配列番号３に示すｃＤＮＡの２１０２番目の塩基から２５１５番目の塩基までのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅するプライマーである。
【０１５４】
５’−ＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＴＡＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧ−３’　　（配列番号２７）
５’−ＧＴＧＧＴＧＴＡＣＧＡＡＴＡＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣ−３’　　（配列番号２８）
また、ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて３分反応させた後、９５℃にて２０秒、６５℃にて３０秒、７２℃にて６０秒を１サイクルとして３０サイクル行った。
【０１５５】
得られたｃＤＮＡサンプルを１．５％アガロースゲルにて電気泳動した。その結果、脳、骨髄、脊髄、顎下腺、胃、目、心臓、子宮、リンパ節や胎仔でバンドが認められた。このことから、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２のｍＲＮＡは、脳、骨髄、脊髄、顎下腺、胃、目、心臓、子宮、リンパ節や胎仔等で多く発現していることが分かった。
【０１５６】
〔実施例１１：抗ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１抗体を用いた、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質のウェスタンブロッティング〕
実施例４、９でｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質を発現させたヒト２９３Ｔ細胞の細胞破砕物を非還元条件下、９５℃５分処理で変性させ、５〜２０％アクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ社製）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い分離後、メンブレンに転写し、精製抗ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１抗体でウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。抗ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１抗体は０．０１μｇ／ｍｌの濃度で反応させ、２次抗体及び検出はＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＥＣＬシステムを使用した。
【０１５７】
ウェスタンブロッティングの結果、図１１に示すように、精製抗体はｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質を認識し、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１の予想サイズである約１１０ｋＤａのタンパク質と、これよりも約４０ｋＤａ大きい、約１５０ｋＤａ付近のバンドを検出した。また、予想サイズよりもかなり大きいバンドが検出された。その原因として、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質が修飾を受けていると思われる。
【０１５８】
また、精製抗体はｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質も認識し、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質の予想サイズである約１２０ｋＤａのタンパク質と、これよりも大きいサイズにブロードなバンドを検出した。その原因として、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質は多量体を形成する可能性、及び／又は修飾を受けている可能性が考えられる。
【０１５９】
また、抗ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１抗体はｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎを特異的に認識し、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質を同時に認識する抗体であることがわかった。
【０１６０】
〔実施例１２：抗ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１抗体を用いた網膜における免疫染色〕
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の目をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ　Ｏ．Ｃ．Ｔ．　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（さくら社製）に包埋した後に、−８０℃で凍結した。この組織をクライオスタットで０．７（ｍ厚に切って、ＡＰＳコートしたスライドガラスに貼り付けた。ＰＢＳ（−）で洗った後に、１．５％正常ヤギ血清でブロッキングし、ＰＢＳ（−）で３回洗った。その後、前記組織を貼り付けたスライドガラスを１．５％正常ヤギ血清の入った０．１（ｇ／ｍｌの抗ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１抗体と１２時間４℃で反応させた。また、コントロールとして、前記組織を貼り付けたスライドガラスを０．１（ｇ／ｍｌウサギＩｇＧと同様に反応させた。次に、ＰＢＳ（−）で３回洗い、ダコ　ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋ポリマー試薬／パーオキシダーゼ標識　ウサギ一次抗体用（ダコ社製）の２次抗体を用いて一次抗体を認識させた。この反応を室温２時間行った後に、ＰＢＳ（−）で３回洗い、３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）で発色させた。ヘマトキシリンで核を染色した後に脱水、透徹、封入した。
【０１６１】
その結果を、図７に示す。Ａ、Ａ’は顕微鏡にて、１０倍の倍率で観察したものであり、Ｂ、Ｂ’は４０倍の倍率で観察したものである。また、図７のＡ’、Ｂ’は、前記組織を貼り付けたスライドガラスとコントロールＩｇＧとを反応させた結果を示しており、図７のＡ、Ｂは、前記組織を貼り付けたスライドガラスと抗ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１抗体とを反応させた結果を示している。
【０１６２】
図７に示すように、インターフォトレセプターマトリックスが抗ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１抗体によって特異的に染色された。特にインターフォトレセプターマトリックスとミューラー細胞との境界である外境界膜（ｏｕｔｅｒ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）、及び色素上皮細胞の基底膜に強い染色が認められた。これらの結果から本新規細胞外マトリックス因子はインターフォトレセプターマトリックス及び色素上皮細胞の基底膜に局在することがわかった。
【０１６３】
〔実施例１３：ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子のクローニング〕
マウスｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１の塩基配列とセレラゲノミックスのヒトゲノム配列を比較してエクソンを予想し、エクソンが予想できないところは、プライマーを作製しＨｕｍａｎ　Ｒｅｔｉｎａ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）をテンプレートとしてＰＣＲ法により増幅し、ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子の配列を決定した（配列番号７）。
【０１６４】
このとき、７３番目から２３４番目の塩基配列を増幅するプライマーとして、配列番号２９及び配列番号３０のプライマー用い、９７１番目から１３１１番目の塩基配列を増幅するプライマーとして、配列番号３１及び配列番号３２のプライマーを用いた。ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて３分反応させた後、９５℃にて２０秒、６５℃にて３０秒、７２℃にて１分を１サイクルとして３５サイクル行った。得られたＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動し、目的サイズのバンドを確認した。
【０１６５】
ＣＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＣＧＴＧ　（配列番号２９）
ＣＴＣＣＧＡＧＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＴＣ　（配列番号３０）
ＧＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧ　（配列番号３１）
ＣＡＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＴＣＡ　（配列番号３２）
上記ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）と混ぜライゲーション反応を行い、得られたベクターを用いて、引き続きＪＭ１０９　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌ（宝酒造社製）をホストとしてトランスフォーメーションを行い、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で３７℃一晩培養し複数のコロニーを得た。
【０１６６】
アガロースゲル電気泳動によって目的サイズのバンドが出たクローンから、７３番目から２３４番目のＰＣＲ増幅産物については２クローン、９７１番から１３１１番目のＰＣＲ増幅産物については５クローン選び、ＡＢＩ社製ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔによって塩基配列を確認し、さらに当該塩基配列からヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質のアミノ酸配列を決定した（配列番号８）。
【０１６７】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係るタンパク質、遺伝子等は、細胞外マトリックス（特にインターフォトレセプターマトリックス）の機能解析等の研究に利用できるばかりでなく、細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常に起因する疾患、疾病の診断薬、治療薬、治療効果を検査するための検査薬の開発等に有効利用できるものである。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子等は、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に利用できるものである。
【０１６８】
さらに、本発明に係るタンパク質、遺伝子等は、▲１▼インターフォトレセプターマトリックスの異常を原因とする疾患の診断、治療への応用、▲２▼色、明るさ、方向といった視覚にとって本質的な機能に異常が生じることにより引き起こされる疾患等の診断、治療への応用、▲３▼緑内障の診断、治療への応用、が期待できるものである。
【０１６９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質のアミノ酸配列を示す配列図である。
【図２】本発明に係るｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図３】本発明に係るｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質とｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質とのアミノ酸配列を比較した図である。
【図４】本発明に係るｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質と既知ヒト遺伝子ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ１５１から予測されるタンパク質とのアミノ酸配列を比較した図である。
【図５】本発明に係るｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質と既知マウス遺伝子ＡＨＨ２５６５４から予測されるタンパク質とのアミノ酸配列を比較した図である。
【図６】マウスの各組織におけるｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析したアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図７】抗ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１抗体を用いた、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１、ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２遺伝子発現マウスの網膜における免疫染色の結果を示す図である。
【図８】（ａ）は、網膜の構造を示す模式図であり、（ｂ）は、インターフォトレセプターマトリックスの構造を示す模式図である。
【図９】実施例にて用いたプラスミドｐＣＩｋａｎａ−ＥＧＦＰ−３ｘＭｙｃのマルチクローニングサイトを示す塩基配列である。
【図１０】実施例にて用いたプラスミドｐＣＩｋａｎａ−ＥＧＦＰ−３ｘＭｙｃの構造を示す模式図である。
【図１１】ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質の２９３Ｔ細胞での発現を特異抗体により検出した結果のウェスタンブロッティングを示す図である。
【図１２】ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質、及びｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−２タンパク質の２９３Ｔ細胞での発現を抗ＧＦＰモノクローナル抗体により検出した結果のウェスタンブロッティングを示す図である。
【図１３】ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子とマウスｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子との塩基配列を比較した図である。
【図１４】ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子とマウスｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子との塩基配列を比較した図であり、図１３の続きを示す。
【図１５】ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子とマウスｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１遺伝子との塩基配列を比較した図であり、図１４の続きを示す。
【図１６】ヒトｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質とマウスｐｈｏｔｏｍｅｄｉｎ−１タンパク質とのアミノ酸配列を比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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