(57)【要約】【課題】ナットウキナーゼの新規な抽出方法を提供すること。【解決手段】納豆菌に含まれる線溶酵素（ナットウキナーゼ）の抽出方法として、１）菌体を水抽出する、２）菌体をアセトン、トルエン、ヘキサンなどの有機溶媒で前処理してから抽出する、３）ｐＨ１１．０のアルカリ処理する、あるいは４）４℃の低温下で１日以上の長時間放置することにより菌体の自己消化を起こすという４方法を適用する。このようにして得られたいずれの抽出分画に強いフィブリン溶解活性（平板法）、あるいはＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ及びＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡに対するアミド分解活性が認められた。【選択図】　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
納豆菌からナットウキナーゼを抽出する方法において、納豆菌を水処理してからナットウキナーゼを抽出することを特徴とするナットウキナーゼの抽出方法。
【請求項２】
納豆菌からナットウキナーゼを抽出する方法において、納豆菌を有機溶媒で前処理してからナットウキナーゼを抽出することを特徴とするナットウキナーゼの抽出方法。
【請求項３】
前記有機溶媒は、アセトン、トルエン、ヘキサン又はこれら２種類以上の混合溶媒であることを特徴とする請求項２に記載のナットウキナーゼの抽出方法。
【請求項４】
納豆菌からナットウキナーゼを抽出する方法において、納豆菌を約ｐＨ１１．０のアルカリ処理してからナットウキナーゼを抽出することを特徴とするナットウキナーゼの抽出方法。
【請求項５】
前記アルカリ処理は、２４時間以内であることを特徴とする請求項４に記載のナットウキナーゼの抽出方法。
【請求項６】
納豆菌からナットウキナーゼを抽出する方法において、納豆菌を自己消化させてからナットウキナーゼを抽出することを特徴とするナットウキナーゼの抽出方法。
【請求項７】
前記自己消化は、約４℃で１日以上放置することによって行われることを特徴とする請求項６に記載のナットウキナーゼの抽出方法。
【請求項８】
納豆菌からナットウキナーゼを抽出する方法において、納豆菌を水処理する工程と、納豆菌を有機溶媒で処理する工程と、納豆菌を約ｐＨ１１．０のアルカリ処理する工程と、納豆菌を自己消化させる工程の少なくとも２工程を行ってからナットウキナーゼを抽出することを特徴とするナットウキナーゼの抽出方法。
【請求項９】
前記請求項１〜８の何れかの方法で抽出されたナットウキナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ナットウキナーゼの抽出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
我々は１９８０年、世界で初めてそれまで静注薬であったウロキナーゼをヒトに経口投与しても血中線溶発現が可能であることを認めて以降（Ｈ．　Ｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．　：　Ｔｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ，　２０：７１１，　１９８０）、その線溶発現の機序を検討（Ｈ．　Ｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｅｎｚｙｍｅ，　３３：１２１，　１９８５；Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｎｔ．，　７５：１２１２，　１９８５；　Ｂｌｏｏｄ，　６６：６９，　１９８５）、あるいは経口化により適した線溶酵素の検索を行い、漢方薬である地竜（ミミズ）（Ｈ．　Ｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｃｏｍｐ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　１０６Ｂ：　７６３，　１９９３；　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ，　５７：　１７２６，　１９９３）、カツオの塩辛（Ｈ．　Ｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｃｏｍｐ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　１１２Ｂ：　５４３，　１９９５）、インドネシアの伝統食品であるテンペ（須見ら，生化学，６１：　８３４，　１９８９；　月刊フードケミカル，１２：　７２，１９９０；日農化誌，７１：　２３４，　１９９７）、あるいは我が国の伝統食品である納豆　中に新しい酵素を発見した（Ｈ．　Ｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，　３：　１１１０，　１９８７）。
【０００３】
特に納豆から分離されたナットウキナーゼ（以下、ＮＫと称す。）は分子当りの線溶活性が最も高く、また食品由来で安全性も高いと考えられ経口投与で長時間血液中の線溶活性を高め血栓溶解に働くことから（Ｈ．　Ｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．：　Ａｃｔａ　Ｈａｅｍａｔｏｌ，　８４：　１３９，　１９９０；　須見，植物資源の生理活性物質ハンドブック４．納豆キナーゼ，ｐ．５７９，　谷村監修，サイエンスフォーラム，１９９８；　Ｈ．　Ｓｕｍｉ：　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈｙ　Ｎａｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ，　ｐ．９８，　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　２０００；　須見、日本微生物資源学会、第８回大会講演要旨集、ｐ．１５（東京農業大学）、２００１）、最近は「血の巡り」改善目的の健康食品としても実用化されつつある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ナットウキナーゼの新規な抽出方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、納豆菌に含まれる線溶酵素（ナットウキナーゼ）の抽出方法として、１）菌体を水抽出する、２）菌体をアセトン、トルエン、ヘキサンなどの有機溶媒で前処理してから抽出する、３）ｐＨ１１．０のアルカリ処理する、あるいは４）４℃の低温下で１日以上の長時間放置することにより菌体の自己消化を起こすという４方法が検討された。このようにして得られたいずれの抽出分画に強いフィブリン溶解活性（平板法）、あるいはＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ及びＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡに対するアミド分解活性が認められた。なお、上述した４つの工程を２つ以上組み合わせることも可能である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
１．試験材料及び測定方法
納豆菌は目黒研究所（大阪）、および日東薬品工業（京都）より提供された乾燥品、あるいは宮城野納豆製造所（東京）より購入した。これを５００ｍｌの三角フラスコ内で１５０ｍｌの２％グリセリンを含む２％ソイペプトン（和光純薬）で３７℃、１００ｒｐｍの条件下で２日間振盪培養し、得られた菌体（ｗｅｔ）を試料として用いた。その他、用いた試薬は全て特級品である。
【０００７】
ナットウキナーゼ（ＮＫと略す）は、既に報告しているフィブリン平板法及びＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ，　Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ　を用いた合成アミド分解法で測定した１）。後者の反応系は１．０ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４で基質濃度５×１０−４Ｍである。
【０００８】
納豆菌体中のビタミンＫ２（メナキノン−７）の分析は既に報告したＨＰＬＣ法１０）で行った。
【０００９】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動はＳｕｍｍａｒｉａらの方法１３）で操作し、ゲルタンパク帯の染色はクマージブリリアントブルーで行った。
【００１０】
実験的な肺血栓症はＡｂｉｋｏらの方法１４）で、ウィスター系雄性ラット（８‐９週令、体重２５０−３００ｇ）の大腿静脈に乳酸１．５ｇ／ｋｇを２時間持続点滴して起した。光学顕微鏡による肺血栓数計測は肺組織５葉のＨＥ（ヘマトキシリン−オレンジ）染色を行った後、５葉の横断切片を２００倍で観察し、各葉３フィールドにおける直径２５μｍ以上の血栓を総和して血栓数とした。
【００１１】
血液凝固系としてはクロットデジタムＴＥ−２０（エルマ光学）を用い、血漿０．２ｍｌと５０ｍＭＣａＣｌ２　０．１ｍｌをセル内に添加してカルシウム再加凝固時間を、またセル内に血漿０．１ｍｌとリオプラスチン（持田製薬５ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌをセル内に添加してプロトロンビン時間を測定した。
【００１２】
２．実験内容及び結果
納豆菌体中のナットウキナーゼ活性
以下に挙げる各種の方法で納豆菌を処理し、抽出分画に来るナットウキナーゼ活性を測定した。
【００１３】
（１）納豆菌の血栓溶解酵素
目黒研究所より提供された納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｎａｔｔｏ　ＢＮ−１，　ＢＮ−１と略す）の乾燥粉末（１×１０１１／ｇ）１．０ｇを１５ｍｌの生理的食塩水に懸濁した後、３，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を抽出液Ｎｏ．１、得られた沈殿をさらに１５ｍｌの生理的食塩水で洗浄後、５ｍｌの生理的食塩水に懸濁したものを懸濁液Ｎｏ．２として、各々のナットウキナーゼ活性をフィブリン平板法で測定した。表１に示すように抽出液Ｎｏ．１には活性があったが、菌体懸濁液であるＮｏ．２には痕跡程度の活性しか見られなかった。しかし、より感度のよいＮＫの合成基質として知られているＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ１）を用いた場合は強い分解活性が認められ、またその活性の一部はＳＢＴＩ（大豆トリプシンインヒビター）及びアプロチニンで阻害されることが分かった。
【００１４】
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【００１５】
＊：直径３５ｍｍのシャーレに０．４％フィブリノーゲン／０．１２Ｍ　ｂｏｒａｔｅ　ｓａｌｉｎｅ　ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．８で調整したフィブリン平板に１０μｌの試料をのせ、３７℃、１８時間目の溶解窓の面積である。
【００１６】
＊＊：いずれも反応系１ｍｌで５×１０−４Ｍ／０．１Ｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４を用いてインキュベイション後、１．０ｍｌの５０％酢酸で反応を停止させ、吸光度４０５ｎｍを測定し、標準のｐ−ニトロアニリンのモル数に換算。大豆トリプシンインヒビター１ｍｇ／ｍｌ、アプロチニン１０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌは０．１Ｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４に溶解し、０．５ｍｌ使用。
【００１７】
（２）有機溶媒処理
納豆菌（ＢＮ−１）の乾燥粉末の有機溶媒処理を行った。図１は、４×１０１１／ｇの目黒菌０．１ｇに５種類の溶媒を各々５．０ｍｌ加え撹拌、４℃、２．５時間静置後、遠心分離して得られた沈殿分画を５０℃で乾燥後、蒸留水１．０ｍｌを加え乳鉢ですりつぶし、遠心分離して得られた上清３０μｌをフィブリン平板にのせて、３７℃、８時間目の写真である。細胞を溶解させリザートを得るために用いた溶媒は、１．蒸留水、２．メタノール、３．ヘキサン、４．トルエン、および５．アセトンである。その結果、水やメタノールよりもアセトン、トルエンあるいはヘキサンで処理すると、菌体からのＮＫの水抽出率が著しく高まることが分かった（図１）。
【００１８】
なお、この抽出液中には同時にビタミンＫ２も含まれＨＰＬＣ法で測定した各々の値はコントロールである水処理物１．７μｇ／ｇに対してメタノール処理物１．１μｇ／ｇ、アセトン処理物３．９μｇ／ｇ、トルエン処理物２．１μｇ／ｇ及びヘキサン処理物３．１μｇ／ｇであった。
【００１９】
（３）アルカリ処理
納豆菌（日東薬品工業）の乾燥粉末に対して高濃度のロダンカリ、あるいは尿素を用いて抽出を行った。各種抽出液による納豆菌からのナットウキナーゼ抽出効率の比較結果を示す。菌体（目黒菌）の湿重量１．０ｇに対して蒸留水１．０ｍｌを加えたもの（コントロール）、それを１Ｍ　ＮａＯＨでｐＨ１１．０に併せたもの（ｐＨ１１．０処理）、２Ｍ　過塩素酸ナトリウム１．０ｍｌを加えたもの（ＮａＣｌＯ４処理）、６Ｍ　尿素ｍｌを加えたもの（尿素処理）、及び２Ｍ１．０　ＫＳＣＮ１．０ｍｌを加えたもの（ＫＳＣＮ処理）を各々３７℃、０．５〜４日間インキュベイションした。各々を蒸留水で透析後、活性は３０μｌを試料としてフィブリン平板上にのせ、３７℃、１８時間後に生じた溶解面積（ｍｍ２）で測定した。結果を図２に示す。
【００２０】
菌をｐＨ１１．０のアルカリで処理した結果、抽出効率ははるかに高いことが分かった（図２）。ただし、アルカリ処理の場合は長時間すると含まれるＮＫ活性は漸減することが分かった。例えば、アルカリ処理の時間は２４時間以内とする。
【００２１】
（４）自己消化処理
三角コルベン内での振盪培養で得られた納豆菌（宮城野）の湿重量１．０ｇに対して０．１％ＮａＮ３を含む蒸留水５．０ｍｌを加え、これを４℃で各時間放置し菌体の自己消化を試みた。図３は、人工血栓の溶解法で測定したこの納豆菌リザート中のナットウキナーゼ活性を示す。具体的には、宮城野菌の湿重量１．０ｇを０．１％ＮａＮ３を含む蒸留水５．０ｍｌで４℃、各時間自己消化させた後、遠心分離して得られた上清（リザート）３０μｌのナットウキナーゼ活性をフィブリン平板を用いて３７℃、１８時間インキュベイションした時の写真を図３に示す。１．０時間（コントロール）、２．１日間自己消化物、３．３日間自己消化物、４．５日間自己消化物、および５．７日間自己消化物を示す。
【００２２】
この操作によって、上清に抽出されるＮＫ　活性は著しく高まることが分かった（図３）。なお、抽出液中のタンパク（Ａ２８０）はコントロール（０日）が１．２４であったのに対して、１日、３日、５日、及び７日目は各々３．６４、６．６５、９．８５、及び１１．７４であった。この菌体の消化はＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンの変化（図４）からも確認できた。図４は、納豆菌リザートのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す。図３と同じ納豆菌（宮城野菌）の自己消化物を試料として電気泳動後、タンパク帯をクマージブリリアントブルーで染色したものである。写真中、１及び７は分子量マーカータンパクである。２はコントロール（未処理）、３は１日間自己消化した物、４は３日間自己消化した物、５は５日間自己消化した物、６は７日間自己消化した物を示す。
【００２３】
経時的な抽出液中のＮＫ　活性を合成基質であるＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡおよびＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡでも調べてみたが、やはり共に著しく高まっていることが分かった（表２）。
【００２４】
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【００２５】
活性指標１：人工血栓（フィブリン）溶解能（ｍｍ２／２４時間）
反応条件：０．１％　ＮａＮ３抽出液３０μｌによる標準フィブリン平板の溶解面積（ｍｍ２）を示す。
活性指標２：Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ　分解能　（ΔＯＤ４０５／４時間）
反応条件：同抽出液０．１ｍｌを用いて反応系１．０ｍｌ、ｐＨ７．４、基質濃度５×１０−４Ｍにおける吸光度４０５ｎｍの変化を示す。
活性指標３：Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ　分解能　（ΔＯＤ４０５／４時間）
反応条件：同抽出液０．０１ｍｌを用いて反応系１．０ｍｌ、ｐＨ７．４、基質濃度５×１０−４Ｍにおける吸光度４０５ｎｍの変化を示す。
【００２６】
考察
納豆菌が生産するＮＫ　は菌体外酵素とされるが、今回、菌体中にはそれがかなり高濃度存在すること、またそれが細胞を前もってアセトン、トルエン、ヘキサンなどの有機溶媒処理をする、ｐＨ１１．０のアルカリ処理をする、あるいは菌体を自己消化させることによって容易に抽出されることを人工血栓溶解法（図１−３）、合成アミド基質の分解法（表２）、あるいはＮＫ阻害剤への反応性（表１）を調べて明らかにした。なお、これまで納豆菌の自己融解に関しては、須崎１６）が生じる抗菌活性で検討したものはあったが、線溶酵素で調べたのは初めてである。
【００２７】
以上、本発明の実施例（実施形態、実施態様）について説明したが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではなく、特許請求の範囲に示された技術的思想の範疇において変更可能なものである。
【００２８】
引用文献
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２１）　Ｓｕｍｉ，　Ｈ．，　Ｏｈｓｕｇｉ，　Ｔ．，　Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，　Ｙ．，　Ｓａｉｔｏ，　Ｊ．：　Ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｐｌａｓｍａ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ｋ　（ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ−７）　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｎａｔｔｏ　ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ，Ａｎｎ　Ｎｕｔｒ　　Ｍｅｔａｂ，　４５（ｓｕｐｐｌ　１）：　１１３，　２００１．
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ナットウキナーゼ抽出のための有機溶媒による納豆菌の前処理状態を示す写真である。
【図２】図２は、各種抽出液による納豆菌からのナットウキナーゼ抽出効率の比較結果を示すグラフである。
【図３】図３は、人工血栓の溶解法で測定した納豆菌リザート中のナットウキナーゼ活性を示す写真である。
【図４】図４は、納豆菌リザートのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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