(57)【要約】【課題】ＧＲＰ、青色変種Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰおよびＳ６５Ｔ−ＧＦＰを発現する細胞からの細胞性蛍光を遥かに超える細胞性蛍光を生じる、新規な蛍光性タンパクを提供すること。【解決手段】緑色蛍光性タンパク（ＧＦＰ）または何れかの機能的ＧＦＰ類縁体から誘導された蛍光性タンパクであって、蛍光強度を増大させるために、発色団から上流に向かって位置１にあるアミノ酸が突然変異されている蛍光性タンパク［但し、位置６４〜６９の配列ＧＳＹＧＬＬ，ＬＬＹＧＡＱ，ＧＣＹＧＭＮ，ＭＧＹＧＶＬ，ＶＡＹＧＭＬおよびＬＣＹＧＴＶを有するＧＦＰ変種は、本発明の蛍光性タンパク群には含まれない］。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑色蛍光性タンパク（ＧＦＰ）または何れかの機能的ＧＦＰ類縁体から誘導された蛍光性タンパクであって、蛍光強度を増大させるために、発色団から上流に向かって位置１にあるアミノ酸が突然変異されている蛍光性タンパク［但し、位置６４〜６９の配列ＧＳＹＧＬＬ，ＬＬＹＧＡＱ，ＧＣＹＧＭＮ，ＭＧＹＧＶＬ，ＶＡＹＧＭＬおよびＬＣＹＧＴＶを有するＧＦＰ変種は、本発明の蛍光性タンパク群には含まれない］。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光性タンパクであって、前記発色団がＧＦＰの予想一次アミノ酸配列の位置６５−６７にある蛍光性タンパク。
【請求項３】
請求項１または２に記載の蛍光性タンパクであって、該蛍光性タンパクを発現する細胞において、該細胞を３０℃以上の温度、好ましくは３２℃〜３９℃の温度、より好ましくは３５℃〜３８℃の温度、最も好ましくは約３７℃の温度でインキュベートしたときに増大した蛍光を生じる蛍光性タンパク。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の蛍光性タンパクであって、該タンパクはアエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｅａ）またはレニラ・レニホルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ　ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来である蛍光性タンパク。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の蛍光性タンパクであって、ＧＦＰまたはＹ６６Ｈ−ＧＦＰの位置６４にあるアミノ酸Ｆが、Ｌ，Ｉ，Ｖ，ＡおよびＧからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている蛍光性タンパク。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の蛍光性タンパクであって、前記発色団から上流に向かって位置１にあるアミノ酸ＦがＬで置換されており、発色団のアミノ酸がＳＹＧ，ＳＨＧ，ＴＨＧまたはＴＹＧである蛍光性タンパク。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の蛍光性タンパクであって、図３、図４または図５のアミノ酸配列を有する蛍光性タンパク。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の蛍光性タンパク（ＧＦＰ）を含む融合化合物であって、前記ＧＦＰがポリペプチドに連結されている融合化合物。
【請求項９】
請求項８に記載の融合化合物であって、前記ポリペプチドがキナーゼ、好ましくはプロテインキナーゼＡ若しくはプロテインキナーゼＣの触媒サブユニット、Ｅｒｋ１、または細胞骨格要素である融合化合物。
【請求項１０】
請求項１，２，３，４，５，６若しくは７の蛍光性タンパクまたは請求項８若しくは９の融合化合物をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１１】
図３，図４および図５に示す配列から選択される、請求項１０に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１２】
適切な１以上の制御領域と、請求項１０または１１のヌクレオチド配列とを具備し、該配列は前記制御領域の制御下にあるＤＮＡ構築物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＤＮＡ構築物であって、天然のＧＦＰプロモータ、或いは哺乳類の構造的もしくは調節的プロモータ、ウイルスのプロモータ、酵母のプロモータ、糸状菌のプロモータまたはバクテリアプロモータの制御下にあるＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
請求項１２または１３のＤＮＡ構築物で形質転換された宿主。
【請求項１５】
バクテリア、酵母、真菌、ブロトゾアおよび高度の真核生物から選択される、請求項１４に記載の宿主。
【請求項１６】
ポリペプチドを製造する方法であって、請求項１４または１５の宿主を培養することと、該ホストから、前記ヌクレオチド配列によって発現されたポリペプチドを回収することとを具備した方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記ヌクレオチド配列の発現が、天然のＧＦＰプロモータによって行われる方法。
【請求項１８】
プロテインキナーゼ活性または脱リン酸化活性を測定するためのインビトロ試験における、請求項１，２，３，４，５，６または７の蛍光性タンパクの使用であって、純粋な形の前記蛍光性タンパクが生物学的サンプル、好ましくは細胞抽出物に添加され、蛍光の何らかの変化が記録される使用。
【請求項１９】
生きた細胞内における遺伝子発現のためのレポータとしての、請求項１，２，３，４，５，６または７の蛍光性タンパクの使用。
【請求項２０】
生きた完全な細胞内における２以上の遺伝子を同時にモニターするための、請求項１，２，３，４，５，６または７の蛍光性タンパクの使用。
【請求項２１】
生きた細胞内における細胞小器官プロセスまたは細胞プロセスを同時に可視化するための細胞小器官または細胞の標識としての、請求項１，２，３，４，５，６または７の蛍光性タンパクの使用。
【請求項２２】
代謝活性、好ましくはキナーゼ活性および脱リン酸化活性を測定するためのインビボ試験における、請求項１４または１５の宿主の使用。
【請求項２３】
生きた細胞内における遺伝子発現のレポータとして使用するための、請求項１，２，３，４，５，６または７の何れか１項に記載の蛍光性タンパク。
【請求項２４】
生きた完全な細胞における２以上の遺伝子の同時モニターに使用するための、請求項１，２，３，４，５，６または７の何れか１項に記載の蛍光性タンパク。
【請求項２５】
生きた細胞内における細胞小器官プロセスまたは細胞プロセスを同時に可視化するために、細胞小器官標識または細胞標識として使用するための、請求項１，２，３，４，５，６または７項に記載の二以上の蛍光性タンパク。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、改善された蛍光特性を有する蛍光性タンパクＧＦＰの新規な変種に関する。
【０００２】
【発明の背景】
クラゲ　Ａ．ビクトリア（Ａ．　ｖｉｃｔｏｒｉａ）　由来の緑色蛍光性タンパク（ＧＦＰ）が異種細胞内で発現されたときに蛍光特性を保持するという発見によって、生物学の研究には新しいユニークで且つ強力な手段が与えられた（Ｃｈａｌｆｉｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９９４）−　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３：８０２；　Ｐｒａｓｈｅｒ　（１９９５）　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１：３２０；　ＷＯ　９５／０７４６３）。
【０００３】
更に、異なった励起および発光スペクトルがあれば２以上のプロセスを同時にモニターすることが可能になるから、ＧＦＰの青色蛍光変種（Ｈｅｉｍ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９４）．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　９１：１２５０１）により、蛍光組換えプローブを用いて細胞の事象または機能をモニターするといった応用の可能性が非常に高まっている。
【０００４】
しかし、ヘイム等（Ｈｅｉｍ　ｅｔ　ａｌ．）が記載した青色蛍光変種　Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰには、一定の限界がある。即ち、この青色蛍光は弱く（４４８ｎｍでの極大発光）、従って検出が困難であり、またＹ６６Ｈ−ＧＦＰを発現する細胞の長時間に渡る励起を必要とする。更に、励起波長はＵＶ範囲（３６０ｎｍ−３９０ｎｍ）なので、長時間の励起は細胞に対して損傷を与える。
【０００５】
細胞機能を研究する上で、組換え蛍光性タンパクを用いることの非常に重要な側面は、試験が本来的に非侵襲的なことである。これは、無傷の生きた細胞内における細胞事象の検出を可能にする。しかし、現在の蛍光性タンパクを用いる場合の制限は、可視化するために比較的高い強度の光源を必要とすることである。特に、青色変種のＹ６６Ｈ−ＧＦＰを用いる場合、殆どの細胞を損傷するような強度で励起する必要がある。細胞内の信号伝達システム（例えば原形質ゾル遊離カルシウム）における振動のような、幾つかの細胞事象は非常に光感受性であることに言及しておく価値があろう。低発光の更なる結果は、高レベルの発現しか検出できないことである。このような高レベルの発現を得ることは、細胞の転写および／または翻訳機構にストレスを与える可能性がある。
【０００６】
アエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光性タンパクの励起スペクトルは二つのピーク、即ち、３９６ｎｍの主ピーク（これは細胞を損傷し得るＵＶ領域にある）と、４７５ｎｍの副ピーク（これは細胞に対する損傷性が極めて低い励起領域にある）とを示す。文献（Ｈｅｉｍ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５），　Ｎａｔｕｒｅ，　Ｖｏｌ．　３７３，　ｐ．　６６３−４）は、野生型ＧＲＰよりも長波長での励起および発光（夫々４９０ｎｍおよび５１０ｎｍ）を有し、且つ蛍光団形成が野生型ＧＦＰよりも約４倍速く進行するような、ＧＦＰのＳｅｒ６５Ｔｈｒ突然変異（Ｓ６５Ｔ）を開示している。
【０００７】
生きた細胞内でのＧＦＰまたはその蛍光変種の発現は、細胞事象の研究のための価値ある道具を提供するものであり、哺乳類細胞を含む多くの細胞が、最適および／または生理学的に適切な増殖を保障するために、略３７℃でインキュベートされることは周知である。異なった生物または組織を起源とする細胞株は、繊維芽細胞についての約３５℃から、マウスβ細胞についての約３８℃〜３９℃までの範囲に亘る異なった好適温度を有し得る。しかし、前記細胞を室温よりも高い温度でインキュベートすると、ＧＦＰを発現する細胞からの蛍光信号は弱いか、または存在しないことが実験で示されている（Ｗｅｂｂ，　Ｃ．Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｃｔ．　１９９５，　ｐ．　５９０６−５９１１．　Ｏｇａｗａ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．　９２，　ｐｐ．　１１８９９−１１９０３，　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１９９５およびＬｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１１８，　１３−１７　（１９９５）を参照されたい）。また、上記のヘイム等（１９９５）が記載した改善された蛍光変種であるＳ６５Ｔは、通常の培養条件下（３７℃）でインキュベートすると、非常に低い蛍光を示す（Ｋａｅｔｈｅｒ　ａｎｄ　Ｇｅｒｄｅｓ　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　３６９　（１９９５）　ｐｐ．　２６７−２７１を参照されたい）。細胞代謝を含む多くの実験は、生理学的に適切な温度、即ち、約３７℃の温度で細胞をインキュベートできる可能性に依存する。
【０００８】
【発明の概要】
本発明の目的は、元のタンパク、即ち、ＧＲＰ、青色変種Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰおよびＳ６５Ｔ−ＧＦＰを発現する細胞からの細胞性蛍光を遥かに超える細胞性蛍光を生じる、Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰおよびＦ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰのような新規な蛍光性タンパクを提供することである。これは、生きた細胞での細胞機能の研究において、蛍光性タンパクの有用性を著しく改善するものである。
【０００９】
本発明の更なる目的は、新規な蛍光性タンパクであって、これらを発現する細胞を３０℃以上、好ましくは３２℃〜３９℃、より好ましくは３５℃〜３８℃の温度、最も好ましくは約３７℃の温度でインキュベートしたときに、この細胞内において高い蛍光を示す蛍光性タンパクを提供することである。
【００１０】
野生型ＧＦＰの蛍光は発色団の存在によるものであり、該発色団は予想一次アミノ酸配列における位置６５〜６７のＳＹＧの環化および酸化、並びにおそらくは他のＧＦＰ類縁体の位置６５〜６７におけるＳＨＧ配列の環化および酸化によって発生することが知られている（Ｈｅｉｍ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９４））。我々は、驚くべきことに、ＳＹＧまたはＳＨＧ発色団のＳの前の位置１におけるＦアミノ酸残基の変異（好ましくは置換）、または予想一次アミノ酸配列における位置６４の場合のＴＨＧ発色団のＴの変異によって、励起波長および発光波長の移動を伴わずに、蛍光強度の実質的な増大を生じることを見出した。
【００１１】
Ｆ６４Ｌ、Ｆ６４Ｉ、Ｆ６４Ｖ、Ｆ６４Ａ、およびＦ６４Ｇの置換が好ましく、Ｆ６４Ｆ置換が最も好ましい。しかし、種々の蛍光性タンパクにおける改善された蛍光特性を与える限り、他の変異（例えば発色団の直前の欠失、挿入または翻訳後の修飾）もまた本発明に含まれるものである。広範な欠失は、ＧＦＰの蛍光特性の喪失を生じる可能性があることに留意すべきである。アミノ末端から１残基のみ、およびカルボキシ末端から１０または１５残基未満を、蛍光の喪失を伴わずに犠牲にすることができる（Ｃｕｂｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ．　ＴＩＢＳ　Ｖｏｌ．２０（１１），　ｐｐ．　４４８−４５６，　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９９５）。
【００１２】
従って、本発明の一つの側面は、本発明の蛍光性タンパクが細胞内で発現されたときに蛍光強度を増大させるように、発色団の上流側の位置１におけるアミノ酸が変異された、アエクオレア緑色蛍光性タンパク（ＧＦＰ）またはその何等かの機能的類縁体に関するものである。驚くべきことに、前記の変異はまた、従来技術のＧＦＰ変種に比較して、３０℃以上でインキュベートされた該突然変異ＧＦＰを発現する細胞からの蛍光信号強度の著しい増大をもたらす。
【００１３】
本発明のタンパクには幾つかの利点があるが、その中には下記の事項が含まれる。
【００１４】
低エネルギー光源での励起。Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰおよびＦ６４Ｌ−ＧＦＰの高い輝度に起因して、それらの発光は低エネルギー光源での励起後にも検出することができる。それによって、光誘導性損傷に対して感受性の、細胞内信号伝達系における振動のような細胞現象を研究することが可能である。新規な青色および緑色発光蛍光性タンパクから放出される光の強度は同じなので、同一の光源を用いてこれらを同時に可視化することが可能である。
【００１５】
Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰおよびＦ６４Ｌ−ＧＦは、野生型ＧＦＰおよび従来公知のその誘導体よりも遥かに迅速に検出可能レベルに達するので、今や、生きた細胞内での遺伝子発現のリアルタイムでのレポータが可能である。従って、それは生きた細胞における遺伝子発現のリアルタイムでの研究に更に適している。発色団のより短時間での成熟、より高い発光強度、より安定なタンパクまたはそれらの組合せに起因して、検出可能な蛍光をより速く得ることができる。
【００１６】
２以上の別々のプロモータの制御下における、新規な蛍光性タンパク類の同時発現。
【００１７】
生きた細胞に何等の損傷を伴うことなく、２以上の遺伝子の発現を同時にモニターすることができる。
【００１８】
内部標準として一つのレポータを用い、視認可能なマーカーとして他のレポータを用いた、これら新規タンパク類の同時発現。何故なら、プロモータを例えばＦ６４Ｌ−ＧＦＰ（またはＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ）に融合させ、蛍光を測定し、それを構造的に発現されたＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ（またはＦ６４Ｌ−ＧＦＰ）の蛍光に対して正規化することにより、遺伝子の調節された発現を定量的にモニターすることができるからである。構造的に発現されたＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ（またはＦ６４Ｌ−ＧＦＰ）は内部標準として働く。
【００１９】
生きた細胞および固定された細胞におけるタンパク質の標識としての使用。蛍光が強いため、この新規タンパク類は低濃度で存在するタンパクのための適切な標識である。基質を必要とせず、また細胞の可視化によって細胞が損傷されないから、ダイナミックな分析を行うことができる。
【００２０】
細胞小器官の標識としての使用。生きた細胞、例えば小胞体および細胞骨格内において、２以上の細胞小器官を標識し、同時に可視化することができる。
【００２１】
細胞融合または細胞小器官融合のマーカーとしての使用。２以上の細胞または細胞小器官を本発明の新規タンパク、例えばＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰおよびＦ６４Ｌ−ＧＦＰでそれぞれ標識することにより、異核共存体の形成のような融合をモニターすることができる。
【００２２】
本発明の新規タンパクに融合されたタンパクの移動を可視化できる。問題のタンパクを一つの蛍光性タンパク（例えばＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ）に融合させ、細胞小器官を他の蛍光性タンパク（例えばＦ６４Ｌ−ＧＦＰ）でラベルすることによって、細胞内タンパクの特定の細胞小器官への移動を可視化することができる。但し、ここで両者の蛍光性タンパクは異なった波長の光を放出する。ものとする。次いで、特定の細胞小器官内での蛍光性タンパクのスペクトル変化として、その移動を検出することができる。
【００２３】
分泌マーカーとしての使用。当該新規タンパクをシグナルペプチドまたは分泌されるべきペプチドに融合させることによって、分泌は、生きた細胞内においてオンラインで追跡され得る。そのための前提条件は、検出可能な数の新規蛍光性タンパク分子の成熟が、分泌よりも迅速に起きることである。従来技術の蛍光性タンパクＧＦＰまたはＹ６６Ｈ−ＧＦＰの場合は、そうではないように思える。
【００２４】
トランスジェニック動物における遺伝子レポータまたはタンパク質の標識としての使用。本発明の新規タンパクの強い蛍光に起因して、信号／ノイズ比が顕著に改善されるから、該タンパクはタンパクおよび遺伝子発現のための標識として適している。
【００２５】
細胞または細胞小器官の完全性マーカー。二つの当該新規タンパク（一方は細胞小器官に向けられ、他方は細胞質ゾル内で発現される）を同時発現させることによって、細胞質ゾルタンパクの相対的な漏出を計算し、それを細胞の完全性の尺度として用いることが可能である。
【００２６】
細胞形態学的変化のためのマーカーとしての使用。当該新規タンパク類の細胞内での発現によって、細胞毒剤またはアポトーシスによって生じる細胞形態学的変化（例えば水泡、気泡）の容易な検出を可能にする。このような形態学的変化は、蛍光プローブを使用せずに、完全な細胞中で可視化することは困難である。
【００２７】
トランスフェクションマーカー、並びにＦＡＣＳ分類と組み合わせて用いるマーカーとしての使用。当該新規タンパクの輝度が増大することに起因して、細胞検出および分類の質を顕著に改善することができる。
【００２８】
当該新規タンパク類の比率リアルタイムでのキナーゼプローブ（ｒａｔｉｏ　ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｐｒｏｂｅ）としての使用。これは、例えばリン酸化に際してより多くの光を放出するＦ６４Ｌ−ＧＦＰ（またはＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ）と、リン酸化に際してより少ない光を放出するＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰとの同時発現による。二つの強度の比率によって、一つのプローブだけの場合よりも、キナーゼ活性がより正確に解明されるであろう。
【００２９】
生理学的濃度の近傍で作用するリアルタイムプローブとしての使用。当該新規なタンパク類は約３７℃において野生型ＧＦＰおよび従来の誘導体よりも顕著に輝度が高いから、可視化のために必要な濃度を下げることができる。従って、当該新規タンパク類（例えばＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰまたはＦ６４Ｌ−ＧＦＰ）の中に組み入れられる酵素の標的部位は、生きた細胞内における低い濃度で細胞中に存在させることができる。このことは、（１）研究すべき細胞内プロセスのプローブによる妨害は、可能な限り少なくしなければならない；および（２）翻訳および転写の機構のストレスは最小限にしなければならないという二つの理由で重要である。
【００３０】
当該新規タンパク類は、エネルギー移動に基づくリアルタイムプローブとして使用することができる。例えば、Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰからＦ６４Ｌ−ＧＦＰへのエネルギーに基づくプローブ系である。
【００３１】
当該新規タンパク類は、真菌のような生物の生きたバイオマス／死んだバイオマスをモニターするためのレポータとして使用することができる。Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰまたはＦ６４Ｌ−ＧＦＰの真菌中での発現によって、生存しているバイオマスはライトアップされるであろう。
【００３２】
当該新規タンパク類を転写融合および翻訳融合におけるマーカーに用いて、トランスポゾンベクター突然変異を起こすことができる。
【００３３】
当該新規タンパク類をコードする微生物中で使用すべきトランスポゾン。このトランスポゾンは、翻訳融合および転写融合のために構築され得る。プロモータについてスクリーニングするために使用される。
【００３４】
Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰまたはＦ６４Ｌ−ＧＦＰのような本発明の新規タンパク類をコードするトランスポゾンベクターは、プラスミド類および染色体類の標識するために使用することができる。
【００３５】
当該新規タンパク類の使用は、２以上のパラメータを生きた細胞内で追跡できるから、複合プラスミドの転移の研究を可能にする。このプラスミドはＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰまたはＦ６４Ｌ−ＧＦＰによって標識し、ドナー／レシピエントの染色体はＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰまたはＦ６４Ｌ−ＧＦＰによって標識すればよい。
【００３６】
当該新規タンパクをバクテリオファージのゲノムに導入することによる、バクテリア検出用のレポータとしての使用。
【００３７】
当該新規タンパク、例えばＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰまたはＦ６４Ｌ−ＧＦＰをファージのゲノムに組み込むことによって、診断用のツールを設計することができる。Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰまたはＦ６４Ｌ−ＧＦＰは、このゲノムを生きた宿主の中にトランスフェクトした際にのみ発現されるであろう。宿主特異性はバクテリオファージによって定義される。
【００３８】
ここに記載した何れかの特徴または特徴の組合せは、本発明に本質的なものとみなされる。
【００３９】
【発明の詳細な記述】
本発明の好ましい態様において、新規な蛍光性タンパクは、ＧＦＰまたは青色変種Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰのＦ６４Ｌ変異体であり、該変異体は増大した蛍光強度を示す。アエクオレア・ビクトリア由来の緑色ＧＦＰをコードする遺伝子の好ましい配列は、図２に開示されている。図２は、野生型ＧＦＰのヌクレオチド配列（Ｈｉｎｄ３−ＥｃｏＲ１フラグメント）およびアミノ酸配列を示しており、ここで開始コドンＡＴＧは該ヌクレオチド配列の位置８に対応しており、停止コドンＴＡＡは位置７２２に対応している。図２に示すＤＮＡ配列をもった微生物Ｅ．ｃｏｌｉ　ＮＮ０４９０８７は、特許手続きのために、ブダペスト条約に従って、ドイツ連邦共和国ブラウンシュバイッヒ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）Ｄ−３８１２４マッシェローダーベルグ１ｂのドイツ微生物および細胞培養収集館ＧｍｂＨに寄託番号ＤＳＭ　１０２６０の下に寄託された。この遺伝子の他のアイソタイプの配列は、文献（Ｐｒａｓｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　１１１，　１９９２，　ｐｐ．　２２９−２３３）に開示されている（ジーンバンク受付番号Ｍ６２６５３）。加えて、当該新規蛍光性タンパクは、他の蛍光性タンパク、例えばウミシイタケ（Ｒａｎｉｌｌａ　ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の蛍光性タンパクから誘導してもよい。
【００４０】
ここで、アミノ酸について用いられる略号は、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２４３　（１９６８），　３５５８に述べられている。
【００４１】
新規な蛍光性タンパクをコードする本発明のＤＮＡ構築物は、確立された標準的方法、例えばビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカルザーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）によって記載されたホスホアミダイト法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２　（１９８１），　１８５９−１８６９）、またはマッテス等（Ｍａｔｔｈｅｓ　ｅｔ　ａｌ．）によって記載された方法（ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　３（１９８４），　８０１−８０５）により、合成によって製造すればよい。ホスホアミダイト法に従えば、オリゴヌクレオチドが例えばＤＮＡ合成器で合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされて、適切なベクターにクローン化される。
【００４２】
ＤＮＡ構築物はまた、例えば米国特許第４，６８３，２０２号または文献（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９　（１９８８），　４８７−４９１）に記載されたように、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により製造してもよい。ＰＣＲ法のより詳細な総説は、「ＰＣＲプロトコール」（ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，　１９９０，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，
Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，　ＵＳＡ）に見られる。
【００４３】
本発明のＤＮＡ構築物は組換えベクターの中に挿入され得るが、このベクターは、組換えＤＮＡ法の適用に便利な如何なるベクターであってもよい。ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞に依存する。こうして、ベクターは自立的に複製するベクター、即ち、その複製が染色体の複製に依存しない染色体の外に存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。或いは、該ベクターは、宿主細胞に導入されたときに宿主細胞のゲノムに組み込まれて、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００４４】
好ましくは、上記ベクターは発現ベクターであり、該ベクターにおいては、本発明の蛍光性タンパクをコードするＤＮＡ配列が、該ＤＮＡの転写に必要な追加要素に対して機能的に連結されている。一般に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスＤＮＡから誘導され、または両方の要素を含んでいてもよい。「機能的に連結された」の用語は、これらの部分が意図した目的で正しく機能するように配置されること、例えば、転写がプロモータで開始して、本発明の蛍光性タンパクをコードするＤＮＡ配列の全体に亘って進行するように配置されることを意味する。
【００４５】
プロモータは、選択した宿主細胞における転写活性を示すＤＮＡ配列であってもよく、また該宿主細胞に対して同種または異種のタンパクをコードする遺伝子（天然のアエクオレアＧＦＰ遺伝子を含む）から誘導されてもよい。
【００４６】
哺乳類細胞において本発明の蛍光性タンパクをコードするＤＮＡ配列の転写を指令する適切なプロモータの例は、ＳＶ４０プロモータ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１　（１９８１），　８５４−８６４）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ（Ｐａｌｍｉｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２２　（１９８３），　８０９−８１４）またはアデノウイルス２主後期プロモータである。
【００４７】
昆虫細胞で使用するための適切なプロモータの例は、ポリヘドリンプロモータ（米国特許第４，７４５，０５１号；Ｖａｓｕｖｅｄａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３１１，　（１９９２）　７−１１）、Ｐ１０プロモータ（Ｊ．　Ｍ．　Ｖｌａｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６９，　１９８８，　ｐｐ．７６５−７７６）、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（ＥＰ　３９７　４８５）、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ（米国特許第５，１５５，０３７号；米国特許第５，１６２，２２２号）、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ（米国特許第５，１５５，０３７号；米国特許第５，１６２，２２２号）である。
【００４８】
酵母宿主細胞で使用するための適切なプロモータの例には、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２５５　（１９８９），　１２０７３−１２０８０；Ａｌｂｅｒ　ａｎｄ　Ｋａｗａｓａｋｉ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎ．　１　（１９８２），　４１９−４３４）またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ（Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；　Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ，　ｅｄｓ．，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８２）またはＴＰＩ１プロモータ（米国特許第４，５９９，３１１号）若しくはＡＤＨ２−４ｃ（Ｒｕｓｓｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　３０４　（１９８３），　６５２−６５４）プロモータが含まれる。
【００４９】
糸状菌宿主細胞で使用するための適切なプロモータの例は、例えば、ＡＤＨ３プロモータ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊ．　４　（１９８５），　２０９３−２０９９）またはｔｐｉＡプロモータである。他の有用なプロモータの例は、Ａ．オリザエＴＡＫＡアミラーゼ（Ａ．　ｏｒｙｚａｅ　ＴＡＫＡ　ａｍｙｌａｓｅ）、リゾムコル・ミエヘイ・アスパラギン酸プロティナーゼ（Ｈｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ　ａｓｐａｒｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）、Ａ．ニガー中性αアミラーゼ（Ａ．　ｎｉｇｅｒ　ｎｅｕｔｒａｌ　α−ａｍｙｌａｓｅ）、Ａ．ニガー酸安定型αアミラーゼ（Ａ．　ｎｉｇｅｒ　ａｃｉｄ　ｓｔａｂｌｅ　α−ａｍｙｌａｓｅ）、Ａ．ニガー・グルコアミラーゼ若しくはＡ．アワモリ・グルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、リゾムコル・ミエヘイ・リパーゼ、Ａ．オリザエ・アルカリプロテアーゼ、Ａ．オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼ、またはＡ．ニデュランス・アセタミダーゼをコードする遺伝子から誘導されたものである。好ましいのは、ＴＡＫＡアミラーゼプロモータおよびｇｌｕＡプロモータである。
【００５０】
バクテリア宿主細胞での使用に適したプロモータには、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ　ａｍｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　ＢＡＮ　ａｍｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ　ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ　ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータが含まれる。
【００５１】
また、本発明の新規蛍光性タンパクをコードするＤＮＡ配列は、必要であれば、例えばヒト成長ホルモンターミネータ（Ｐａｌｍｉｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　ｏｐ．　ｃｉｔ．）、または真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネータ（Ａｌｂｅｒ　ａｎｄ　Ｋａｗａｓａｋｉ，　ｏｐ．　ｃｉｔ．）若しくはＡＤＨ３ターミネータ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ．，　ｏｐ．　ｃｉｔ．）のような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。当該ベクターは更に、ポリアデニレーション信号（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅｌｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルスＶＡ　ＲＮＡをコードするもの）のような要素を具備してもよい。
【００５２】
当該組換えベクターは更に、該ベクターが問題の宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよい。このような配列の一例（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）は、ＳＶ４０複製起点である。
【００５３】
宿主細胞が酵母細胞であるとき、当該ベクターの複製を可能にする適切な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１−３および複製起点である。
【００５４】
当該ベクターはまた、選別マーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ　ＴＰＩ　ｇｅｎｅ）（Ｐ．Ｒ．　Ｒｕｓｓｅｌｌ，　Ｇｅｎｅ　４０，　１９８５，　ｐｐ．　１２５−１３０に記載されたもの）のように、その補体が宿主細胞に欠けている遺伝子産物、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤に対する耐性を与える遺伝子産物を具備していてもよい。糸状菌については、選別マーカーにはａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、ｓＣが含まれる。
【００５５】
本発明の蛍光性タンパクをコードするＤＮＡ配列、プロモータ、および任意にターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれライゲートし、これらを複製のための必要な情報を含んだ適切なベクターに挿入するために用いられる方法は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　ｏｐ．　ｃｉｔ．）。
【００５６】
本発明のＤＮＡ構築物または組換えベクター宿を導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できる如何なる細胞であってもよく、バクテリア、酵母、真菌および高等真核細胞が含まれる。
【００５７】
培養に際して本発明のＤＮＡ構築物を発現できるバクテリア宿主細胞の例は、グラム陽性菌、例えばバチルス株（例えばＢ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．　ｌｅｎｔｕｓ、ｂ．　ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．　ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．　ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．　ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．　ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍまたはＢ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）またはストレプトマイセス株（Ｓ．　ｌｉｖｉｄａｎｓ　またはＳ．　ｍｕｒｉｎｕｓ）、或いは大腸菌のようなグラム陰性菌である。これらバクテリアの形質転換は、プロトプラスト形質転換によって、またはそれ自体公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行なえばよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　ｓｕｐｒａ）。
【００５８】
適切な哺乳類細胞の例は、ＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞株、一次細胞、およびＣＯＳ細胞株（例えばＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５０）、ＢＨＫ細胞株（例えばＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６３２、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１０）、ＣＨＬ細胞株（例えばＡＴＣＣ　ＣＣＬ３９）またはＣＨＯ細胞株（例えばＡＴＣＣ　ＣＣＬ　６１）である。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は、文献［例えばＫａｕｆｍａｎ　ａｎｄ　Ｓｈａｒｐ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１５９　（１９８２），６０１−６２１；　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　１　（１９８２），　３２７−３４１；　Ｌｏｙｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　１４　（１９７８），　７２５；　Ｃｏｒｓａｒｏ　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏｎ，　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７　（１９８１），　６０３；　Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２　（１９７３），　４５６；およびＮｅｕｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１　（１９８２），　８４１−８４５］に記載されている。
【００５９】
適切な酵母細胞の例には、サッカロマイセスｓｐｐ．またはシゾサッカロマイセスｓｐｐ．、特に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ）の株が含まれる。酵母細胞を異種ＤＮＡで形質転換して、該形質転換細胞から異種ポリペプチドを製造する方法は、例えば、米国特許第４，５９９，３１１号、同第４，９３１，３７３号、同第４，８７０，００８号、同第５，０３７，７４３号、および同第４，８５４，０７５号に記載されており、これら全ての特許はここでの引用によって本願明細書に組み込まれる。形質転換細胞は、選別マーカーによって決定されるフェノタイプ、共通の薬剤耐性、または特定の栄養素（例えばロイシン）なしで増殖する能力によって選別される。酵母で使用するための好ましいベクターは、米国特許第４，９３１，３７３号に開示されたＰＯＴ１ベクターである。本発明の蛍光性タンパクをコードするＤＮＡ配列の前には、例えば上記のようにシグナル配列および任意にリーダー配列が存在している。適切な酵母細胞の更なる例は、クルイベロマイセスの株（例えばＫ．　ｌａｃｔｉｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の株（例えばＨ．　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）の株（例えばＰ．　ｐａｓｔｏｒｉｓ）である［Ｇｌｅｅｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１３２，　１９８６，　ｐｐ．　３４５９−３４６５；米国特許第４，８８２，２７９号を参照されたい］。
【００６０】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルスｓｐｐ．、ニューロスポラｓｐｐ．、フザリウムｓｐｐ．、またはトリコデルマｓｐｐ．の細胞であり、特にＡ．オリザエ、Ａ．ニデュラスまたはＡ．ニガーである。タンパクの発現のためのアスペルギルスｓｐｐ．の使用は、例えばＥＰ　２７２　２７７、ＥＰ　２３０　２２３、ＥＰ　１８４　４３８に記載されている。
【００６１】
宿主細胞として糸状菌が用いられるとき、それは、該ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより、適宜本発明のＤＮＡ構築物で形質転換される。ＤＮＡ配列は細胞内で安定に保持される傾向にあるので、この組み込みは一般には有利とみなされる。該ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、従来の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行なえばよい。昆虫細胞の形質転換およびその中での異種ポリペプチドの産生は、米国特許第４，７４５，０５１号、同第４，８７９，２３６号、同第５，１５５，０３７号、５，１６２，２２２号、ＥＰ　３９７，４８５号に記載されているようにして行えばよく、これら特許は全て、ここでの引用により本明細書に組み込まれる。宿主として用いられる昆虫細胞株は、適切にはレピドプテラ細胞株（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）、例えばスポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞またはトリコプルシア・ニー（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）細胞（米国特許第５，０７７，２１４号）である。培養条件は、適切には、例えばＷＯ８９／０１０２９またはＷＯ８９／０１０２８または上記参照文献の何れかに記載されているものである。
【００６２】
次いで、上記の形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、当該ＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下に適切な栄養培地中で培養された後、本発明のスクリーニング方法に用いればよい。或いは、細胞を破壊した後に、細胞抽出物および／または上清の蛍光を分析すればよい。
【００６３】
細胞を培養するのに用いる培地は、適切な追加成分を含有する最小培地または複合培地のような、上記宿主細胞の増殖に適した如何なる慣用培地であってもよい。適切な培地は商業的供給業者から入手可能であり、或いは公表されたレシピ（例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ）に従って調製することが可能である。
【００６４】
本発明の方法においては、本発明のＤＮＡ構築物で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を分光光度計または蛍光顕微鏡で適切に測定し、光励起および光放出の走査として、液体培養中の細胞のスペクトル特性を決定することができる。
【００６５】
以下、添付の図面を参照し、実施例に従って本発明を更に詳細に説明する。
【００６６】
【実施例】
実施例１
ＧＦＰをコードしているｃＤＮＡのクローニング
即ち、Ａ．ビクトリアから単離された全ＲＮＡが、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２，　ｅｄｓ　（１９８９）（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ），　７．１９−７．２２）により、メーカー提示によるＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ，　ＵＳＡ）を使用してｃＤＮＡに変換された。次に、該ｃＤＮＡは、先般公表されたＧＦＰ配列（Ｐｒａｓｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　１１１　（１９９２），　２２９−２３３；　ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号　Ｍ６２６５３）を基に設計されたＰＣＲプライマーと、ＵｌＴｍａＴＭポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、　ＣＡ　ＵＳＡ）とを一緒に使用してＰＣＲ増幅された。該プライマーの配列は：ＧＦＰ２：　ＴＧＧＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴおよびＧＦＰ−１：　ＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＴ。５’であった。（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ部位）および３’（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位）プライマーに挿入された制限エンドヌクレース部位によって、若干修飾変更されたｐＵＣ１９ベクター中へのＰＣＲ増幅されたＧＦＰｃＤＮＡのクローニングが促進された。この構築の詳細は以下の通りである。ＬａｃＺシャインダルガノＡＧＧＡ、すぐ後に５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位プラス余剰Ｔ、及びＧＦＰ　ＡＴＧコドンが続いて、ＬａｃＺプロモータＧＦＰ融合点で下記のようなＤＮＡ配列：ＰＬａｃＺ　−　ＡＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＡＴＧ−ＧＦＰが提供された。ＧＦＰ　ｃＤＮＡの３’末端では、公表されたＧＦＰ配列（ＧｅｎＢａｎｋ認識番号　Ｍ６２６５３）中のヌクレオチド７７０に対応したベース対が、ＰＣＲ生成されたＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩリンカー領域を通じてｐＵＣ１９マルチクローニング部位（ＭＣＳ）のＥｃｏＲＩ部位と融合された。
【００６７】
該ＤＮＡ配列及びＧＦＰの予想一次アミノ酸配列が、下記図２ａに示される。図２ａに示されるものと同じアミノ酸配列をコードしている別のＤＮＡ配列が、図２ｂに示される。ハイム（Ｈｅｉｍ）ら（１９９４）によって記載された青蛍光変異物を生成するために、緑蛍光を青蛍光に変換することに関わるＹ６６Ｈ置換を持つＰＣＲプライマーを、５’ＰＣＲプライマーとして使用し、ＧＦＰ特異的３’プライマーが組み合わされた。テンプレートは、上記記載のＧＦＰクローンである。５’プライマーの配列は、５’　−　ＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＧＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＡＣＣＣ　−　３’。その５’末端は、ＧＦＰ配列中の位置１６４に対応する。Ｙ６６Ｈ置換に加えて、５’プライマーは位置２２３においてＡからＴへの置換を導入する。この変異によって、アミノ酸を変えることなくＸｂａｌ部位が創設される。該５’プライマーはまた、自然に存在するＮｃｏ１認識配列（ＧＦＰ配列中、位置１７３）を含む。３’プライマーの配列は：５’　−　ＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＴ−３’。５’末端からの位置３は、ＧＦＰ配列の３’末端に対応するＥｃｏＲＩ認識部位の第一塩基である。その結果得られるＰＣＲ産物は、Ｎｃｏ１及びＥｃｏＲＩで消化され、Ｎｃｏ１―ＥｃｏＲＩベクター断片中にクローンされて全Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰ遺伝子を再構築する。
【００６８】
Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰを含む発現ベクターを担持する大腸菌細胞を一晩、１ｍｌ中に１０マイクログラムのＮメチル・Ｎ・二トロ・ニトロソグアニジン存在下で生育させた。プラスミドＤＮＡを単離し、Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰを含む７６４塩基対Ｈｉｎｄ　３−ＥｃｏＲＩ挿入物が単離され、Ｈｉｎｄ３−ＥｃｏＲＩ消化ベクター断片中にクローンされて、大腸菌中で該挿入物を発現させる。大腸菌の形質転換体は、３６５　ｎｍ紫外光で励起され青蛍光について検査され、野生型ＢＦＰよりも蛍光が強く現れるコロニーを確認した。
【００６９】
ある一つの特定コロニー由来の１０ｎｇＤＮＡをテンプレートとして使用し、１．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ），　０．１ｍＭ　ＭｎＣｌ２，　ｄＧＴＰ，　ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰを各０．２ｍＭ、０．０５ｍＭのｄＡＴＰ，　１．７ｍＭのＭｇＣｌ２、及びメーカー提示の緩衝液を含むＰＣＲ１０反応が行われた。使用された該プライマーは、該Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰ挿入物の側面に位置する。５’プライマーの配列は、５’　−　ＡＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＧＣＴＴＴＡＴＧＡＧ　−　３’。これには、Ｈｉｎｄ　３認識部位が含まれている。３’プライマーの配列は、５’　−　ＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＡＧＴＧ　−　３’。これにはＥｃｏＲＩ認識配列が含まれている。
【００７０】
ＰＣＲ産物は、Ｈｉｎｄ３及びＥｃｏＲＩで消化され、Ｈｉｎｄ３−ＥｃｏＲＩ消化ベクター断片中にクローンされ、大腸菌形質転換体中における挿入物の発現を可能にする。大腸菌形質転換体は、３６５ｎｍ紫外光で励起されて、青蛍光について検査された。Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰよりも強い蛍光を現わすコロニーが確認された。強蛍光を発する（ＢＸ１２―１Ａと呼称される）コロニー一つからプラスミッドＤＮＡが単離され、Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰ挿入物は、配列決定に供された。変異物Ｆ６４Ｌが確認された。この変異物は、Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰのＳＨＧトリペプチド発色団配列に先行するフェニールアラニン残基をロイシンで置換している。ＢＸ１２―１ＡのＹ６６Ｈ−ＧＦＰ配列中には、他のアミノ酸の変更はない。該ＤＮＡ配列及びＦ６４Ｌ―Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰの予測一次アミノ酸配列は、下記図３に示される。
【００７１】
実施例２
Ｆ６４Ｌ―ＧＦＰは、下記のように構築された。Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰを含む大腸菌発現ベクターは制限酵素Ｎｃｏ１及びＸｂａＩで消化された。Ｎｃｏ１の認識配列は、下記に掲載されたＦ６４Ｌ―Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰ配列中の位置１７３に位置し、ＸｂａＩの認識配列は位置２２１に位置している。該Ｎｃｏ１―ＸｂａＩベクター大断片は単離され、下記配列の合成Ｎｃｏ１―ＸｂａＩＤＮＡリンカーと連結された。一方のＤＮＡ鎖は配列：５’　−　ＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＧＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴ　−　３’　を持ち、他方のＤＮＡ一本鎖は、配列：５’　−　ＣＴＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＧＴＴＧＧＣ　−　３’を持つ。
【００７２】
アニーリング後、該二本の鎖は、ＳＹＧに先行するＦ６４Ｌ置換を持つＧＦＰ発色団ＳＹＧの配列を含むＮｃｏ１―ＸｂａＩ断片を形成する。該ＤＮＡ配列及びＦ６４Ｌ―ＧＦＰの予測一次アミノ酸配列が下記図４に示される。
【００７３】
Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰ変異は、ハイムら（Ｎａｔｕｒｅ　ｖｏｌ．　３７３，　ｐｐ　６６３−６６４，　１９９５）によって記載されている。Ｆ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰは、下記のように構築された：Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰを含む大腸菌発現ベクターを、制限酵素Ｎｃｏ１及びＸｂａＩで消化した。Ｎｃｏ１の認識配列は、下記に掲載されたＦ６４Ｌ―Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰ配列中の位置１７３に位置し、ＸｂａＩの認識配列は位置２２１に位置している。該Ｎｃｏ１―ＸｂａＩベクター大断片は単離され、下記配列の合成Ｎｃｏ１―ＸｂａＩＤＮＡリンカーと連結された。一方のＤＮＡ鎖は配列：５’−　ＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＧＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＣＴＣＴＣＡＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴ　−　３’　を持ち、他方のＤＮＡ鎖は配列：５’　−　ＣＴＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＡＡＧＴＣＡＧＡＧＴＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＧＴＴＧＧＣ　−　３’を持つ。
【００７４】
アニーリング後、該二本の鎖は、ＧＦＰ発色団中Ｆ６４Ｌ及びＳ６５Ｔの変異を含むＮｃｏ１―ＸｂａＩ断片を形成する。該ＤＮＡ配列及びＦ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰの予測一次アミノ酸配列が下記図５に示される。
【００７５】
大腸菌発現ベクターは、ＩＰＴＧ（イソプロピル・チオ・ガラクトシド）誘導プロモータを含む。使用された大腸菌菌株は、Ｋ８０３（Ｓａｍｂｒｏｋｋ　ｅｔ　ａｌ．　上記）のｄｅｌ（ｌａｃＺ）ＭＩ５誘導体である。
【００７６】
ｐＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）中に存在するＧＦＰの対立遺伝子は、ＩＰＴＧに誘導される大腸菌発現ベクター中に下記方法によって導入された：１ｎｇ　ｐＧＦＰ　−Ｎ１プラスミドＤＮＡをテンプレートとして使用し、５’ＰＣＲプライマーが配列：　５’　−　ＴＧＧＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴ　−　３’を持ち、３’ＰＣＲプライマーが配列：　５’　−　ＧＡＡＴＣＧＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＧ　−　３’を持つ標準ＰＣＲ反応を行った。
【００７７】
該プライマーは、ベクターｐＧＦＰ−Ｎ１中のＧＦＰ―Ｎ１挿入物の側面に位置する。該５’プライマーは、Ｈｉｎｄ３クローニング部位によって先行されるＡＴＧｋ開始コドンを含む。該３’プライマーは、Ｂｇ１２クローニング部位が後に続くＴＡＡ停止コドンを含む。
【００７８】
該ＰＣＲ産物はＨｉｎｄ３及びＢｇｌ２で消化され、Ｈｉｎｄ３―ＢａｍＨ１で消化ベクター断片中、ＩＰＴＧによって誘導可能なプロモータの後方にクローンされて、ＩＰＴＧ存在下おいて大腸菌における挿入物の発現を可能にする。
【００７９】
ｐＺｅｏＳＶ―ＬａｃＺプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）中に存在するＬａｃＺ遺伝子は、ＩＰＴＧで誘導可能な大腸菌発現ベクター中に下記方法によって導入される：１ｎｇのｐＺｅｏＳＶ―ＬａｃＺプラスミドＤＮＡをテンプレートとして使用し、５’ＰＣＲプライマーが配列：　５’　−　ＴＧＧＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴ−　３’を持ち、３’ＰＣＲプライマーが配列：　５’　−　ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣ−　３’を持つ標準ＰＣＲ反応を行った。プライマーは、ベクターｐＺｅｏＳＶ−ＬａｃＺ中のＬａｃＺ挿入物の側面に位置する。５’プライマーは、Ｈｉｎｄ３クローニング部位によって先行されるＡＴＧ開始コドンを含む。３’プライマーは、ＥｃｏＲＩクローニング部位が後に続くＴＡＡ停止コドンを含む。
【００８０】
ＰＣＲ産物は、Ｈｉｎｄ３及びＥｃｏＲＩで消化され、Ｈｉｎｄ３―ＥｃｏＲＩで消化ベクター断片中、ＩＰＴＧ誘導可能プロモータの後方にクローンされて、ＩＰＴＧ存在下において大腸菌における挿入物の発現を可能にした。
【００８１】
ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｎ１、Ｆ６４Ｌ―ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰ、Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰ又はベータ・ガラクトシダーゼ（バックグラウンドコントロールとして）発現する大腸菌細胞中で生成される蛍光を、様々な条件下で測定し比較するため、下記実験が行われた：
ＩＰＴＧによって誘導されると、様々な遺伝子産物中の一つを発現させる発現プラスミドを含む大腸菌細胞を、ミリリットル中１００マイクログラムのアンピシリンを含むがＩＰＴＧは含まないＬＢ培地中で生育させた。１ｍｌの細胞懸濁物中に、０．５ｍｌの５０％グリセロールを加え細胞を凍結し、−８０℃で凍結を維持した。
【００８２】
−８０℃のグリセロール・ストックの細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌ　ＬＢ培地に播種し、３７℃で６時間曝気生育した。この播種物の２マイクロリットルを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと１ｍＭのＩＰＴＧを含む２ｍｌのＬＢ培地を含む２本のチューブに各々移した。二本のチューブセットは、二つの異なる温度：室温（２２℃）及び３７℃で曝気インキュベートされた。
【００８３】
１６時間後、０．２　ｍｌのサンプルをＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｎ１、Ｆ６４Ｌ―ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰ、Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰ又はベータ・ガラクトシダーゼを発現する細胞より採取した。細胞をペレット化し、上澄み液を除去し、細胞を２ｍｌの水中に再懸濁し、キュベットに移した。
【００８４】
蛍光発光スペクトルは、ＬＳ−５０ルミノメータ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で、励起しながら発光スリットを１０　ｎｍに設定して測定された。励起波長は、ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｎ１、Ｆ６４Ｌ―ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰについては３９８　ｎｍ及び　４７０　ｎｍに設定された。３９８　ｎｍは、ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｎ１、Ｆ６４Ｌ―ＧＦＰの至適励起波長に近く、４７０　ｎｍは、Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰの至適励起波長に近い。Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ及びＦ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰについては、励起波長が３８０　ｎｍに設定された。３８０　ｎｍは、これらの誘導体の至適励起波長に近い。ベータ・ガラクトシダーゼ発現細胞を、バックグラウンド・コントロールとして含めた。ＬＳ−５０ルミノメータでの測定後、４５０ｎｍにおける光学密度を、スペクトロフォトメータ（Ｌａｍｂｄａ　ＵＶ／ＶＩＳ，　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で各サンプルについて測定した。これは、該分析中全細胞の尺度とされた。ルミノメータは、サンプルの光学密度に対して標準化された。
【００８５】
実験結果は、下記図６ａ−６ｆに示され、次のように要約され得る。
【００８６】
１６時間後、２２℃で３９８ｎｍの励起波長で、ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ―ＧＦＰについては大きなシグナルが、ＧＦＰ−Ｎ１及びＦ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰについては検出可能なシグナルが見られた。図６ａ参照。
【００８７】
１６時間後、３７℃で３９８ｎｍの励起波長で、Ｆ６４Ｌ―ＧＦＰについては大きなシグナルが、Ｆ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰについては検出可能なシグナルが見られ、ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｎ１についてはシグナルは検出不可であった。図６ｂ参照。
【００８８】
１６時間後、２２℃で４７０ｎｍの励起波長で、Ｆ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰについては大きなシグナルが、ＧＦＰ及びＦ６４Ｌ−ＧＦＰについては検出可能なシグナルが見られ、ＧＦＰ−Ｎ１についてはシグナルは検出不可であった。図６ｃ参照。
【００８９】
１６時間後、３７℃で４７０ｎｍの励起波長で、Ｆ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰ及びＦ６４Ｌ−ＧＦＰについては大きなシグナルが、ＧＦＰ及びＧＦＰ−Ｎ１についてはシグナルは、検出不可であった。図６ｄ参照。
【００９０】
１６時間後、２２　℃で３８０　ｎｍの励起波長で、Ｙ６６Ｈ　−ＧＦＰ及び６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰについては、バックグラウンドを凌ぐ検出可能な信号は見られなかった。図６ｅ参照。
【００９１】
１６時間後、３７℃で３８０ｎｍの励起波長で、Ｙ６６Ｈ　−ＧＦＰについてはバックグラウンドを凌ぐ検出可能な信号は見られなかった。Ｆ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰについては大きなシグナルが見られた。図６ｆ参照。
【００９２】
蛍光信号の差が発現レベルの差によるものであるかどうかを決定するために、上記に記載のように分析された大腸菌細胞からの全蛋白を，ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＢＩＯ−ＲＡＤ研究所からの１２％Ｔｒｉｓグリセリン・ゲル）　によって分画し、その後（ラビットからの）ポリクローナルＧＦＰ抗体でウエスタン・ブロット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌからのＥＣＬウエスタンブロット）分析を行った。その結果、ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｎ１、Ｆ６４Ｌ―ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰ、Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ及びＦ６４Ｌ―Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰの発現レベルは２２℃でも３７℃でも同等であった。従って、蛍光シグナルレベルの差は発現レベルの差によるものではない。
【００９３】
実施例３
哺乳動物細胞で発現されたときのＧＦＰ及びその誘導体におけるＦ６４Ｌ置換の影響Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ，　Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰ，　及びＦ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰは、その発現がＣＭＶプロモータのコントロール下でなされるようにｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｃａ，　ＵＳＡ）中にクローンされた。野生型ＧＦＰは、ＣＭＶプロモータが発現をコントロールしているｐＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｃａ，　ＵＳＡ）から発現された。トランスフェクションに使用されるプラスミドＤＮＡは、Ｊｅｔｓｔａｒ　Ｐｌａｓｍｉｄキット（Ｇｅｎｏｍｅｄ　Ｉｎｃ．　ＮＣ，　ＵＳＡ）を使用して精製され、蒸留水中に溶解された。
【００９４】
トランスフェクションに使用された沈殿物は、下記の成分を混合して作成された：４４μｌの水中２μｇのＤＮＡを５０μｌの２ｘＨＢＳ緩衝液（２８０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，　１２ｍＭデキストローゼ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ）及び６．２μｌの２ＭＣａＣｌ２と混合した。トランスフェクション混合物は、細胞に添加する前、室温で２５分間インキュベートされた。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１５７３）は、約１．５ｍｌ培地（グルタマックス（ｇｕｌｔａｍａｘ−１）、４５００　ｍｇ／Ｌのグルコース、及び１０％ウシ胎児血清配合のＤｕｌｂｅｃｃｏ　ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　，　ＭＤ，　ＵＳＡ）の入った２ｃｍＸ２ｃｍのカバーグラス・チェンバー（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で育生された。該ＤＮＡは、細胞中に２５―５０％集密に添加された。細胞は、３７℃二酸化炭素のインキュベータで生育された。黙視判定の前に培地が除去され、１．５　ｍｌのＣａ２＋―ＨＥＰＥＳ緩衝液（５ｍＭ　ＫＣｌ、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、５．５　ｍＭグルコース、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭ　ＣａＣｌ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ）がチェンバーに添加された。
【００９５】
トランスフェクタントは、Ａｘｉｏｖｅｒｔ　１３５（カールツワイス（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ），　Ｇｅｒｍａｎｙ）蛍光顕微鏡を使用して、視覚化された。顕微鏡には、ＨＢＯ１００水銀励起源、４０ＸＦｌｕａｒ、ＮＡ＝１．３対物レンズ（カールツワイス，　Ｇｅｒｍａｎｙ）が取り付けられている。ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ―ＧＦＰ及びＦ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰを視覚化するために下記フィルターが使用された：励起フィルター４８０／４０　ｎｍ，　干渉フィルター５０５　ｎｍ、発光フィルター５１０ＬＰ　ｎｍ　（全て、Ｃｈｒｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒｐ．，　Ｖｔ．　ＵＳＡ）。Ｆ６４Ｌ−Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰを視覚化するために下記フィルタが使用された：励起フィルター３８０／１５　ｎｍ　，干渉フィルター４００　ｎｍ、発光フィルター４５０／６５　ｎｍ　（全て，Ｏｍｅｇａ　Ｏｐｔｉｃａｌ，　Ｖｔ．　ＵＳＡ）。数個のチェンバー中の細胞を平行してトランスフェクトするので、サンプル時点毎に新チェンバーの採取が可能であった。インキュベーションが８．５時間を超えた場合、培地を交換するしてＣａ２＋沈殿物が除去された。
【００９６】
表１に示すように、Ｆ６４Ｌ変異体は、蛍光信号を著しく増加させる（野生型ＧＦＰ対Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰ及びＦ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰ）。蛍光細胞は、トランスフェクション後、１―２時間という早い時期に観察され、３７℃で発色団に有効な成熟が見られた。更にＦ６４Ｌ変異体は、励起スペクトルがずれる他のＳ６５Ｔ変異体のようなＧＦＰ誘導体及び、Ｆ６４Ｌ置換なしでは哺乳動物細胞中で検出することはできない青変異体を増加させている。（コメント：Ｆ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰ及びＦ６４Ｌ―ＧＦＰの結果を比較すると、励起スペクトルが異なる事、及び使用されたフィルターセットが、Ｆ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰに対して至適化されていることを考慮しなくてはならない。Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰ及びＷＴ　ＧＦＰは、同じスペクトル特性を分け合っている。）
【表１】
2004024258.tif 000002
Ｃａ２＋沈殿によってトランスフェクトされた蛍光ＨＥＫ２９３細胞の様子
１）蛍光細胞の予測平均強度を示す
２）蛍光細胞が多数ある事を示す
３）１００％の集密に達した細胞
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲ増幅されたＧＦＰｃＤＮＡを、ｐＵＣ１９ベクター中にクローニングした構築物を示す図である。
【図２ａ】ＧＦＰのＤＮＡ配列および予想一次アミノ酸配列を示す図である。
【図２ｂ】図２ａと同じアミノ酸配列をコードしている別のＤＮＡ配列を示す図である。
【図３】Ｆ６４Ｌ―Ｙ６６Ｈ―ＧＦＰのＤＮＡ配列および予想一次アミノ酸配列を示す図である。
【図４】Ｆ６４Ｌ―ＧＦＰのＤＮＡ配列および予想一次アミノ酸配列を示す図である。
【図５】Ｆ６４Ｌ―Ｓ６５Ｔ―ＧＦＰのＤＮＡ配列および予想一次アミノ酸配列を示す図である。
【図６ａ】ＧＦＰ遺伝子およびＧＦＰ変異体を大腸菌の中で発現させ、所定条件において所定波長の励起光で励起したときの蛍光スペクトルを比較して示すグラフである。
【図６ｂ】ＧＦＰ遺伝子およびＧＦＰ変異体を大腸菌の中で発現させ、所定条件において所定波長の励起光で励起したときの蛍光スペクトルを比較して示すグラフである。
【図６ｃ】ＧＦＰ遺伝子およびＧＦＰ変異体を大腸菌の中で発現させ、所定条件において所定波長の励起光で励起したときの蛍光スペクトルを比較して示すグラフである。
【図６ｄ】ＧＦＰ遺伝子およびＧＦＰ変異体を大腸菌の中で発現させ、所定条件において所定波長の励起光で励起したときの蛍光スペクトルを比較して示すグラフである。
【図６ｅ】ＧＦＰ遺伝子およびＧＦＰ変異体を大腸菌の中で発現させ、所定条件において所定波長の励起光で励起したときの蛍光スペクトルを比較して示すグラフである。
【図６ｆ】ＧＦＰ遺伝子およびＧＦＰ変異体を大腸菌の中で発現させ、所定条件において所定波長の励起光で励起したときの蛍光スペクトルを比較して示すグラフである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
2004024258.tif 000009
【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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