(57)【要約】      （修正有）【課題】洗剤用アルカリプロテアーゼ或いは従来の真性ズブチリシンとはアミノ酸配列において相同性が低く、熱やｐＨに対する安定性にカルシウムイオンの影響を受けない、新規アルカリプロテアーゼを提供する。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；（ａ）バチルス属由来の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質；及び当該タンパク質をコードする遺伝子。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子：
（ａ）配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３記載のいずれかの遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗剤用をはじめとする各種産業用酵素として有用な新規アルカリプロテアーゼ及びこれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤へ配合されているアルカリプロテアーゼは、洗浄力の向上に不可欠な一成分として重要な役割を果たしてきている。アルカリプロテアーゼは、このように洗剤という大量消費剤に用いられることから、工業用酵素の中でも最も大量に生産されている酵素である。
【０００３】
現在用いられている洗剤用アルカリプロテアーゼとしては、例えばサビナーゼ（登録商標；ノボザイムズ社製）、カンナーゼ（登録商標；ノボザイムズ社製）、デュラザイム（登録商標；ノボザイムズ社製）、マキサカル（登録商標；ジェネンコア社製）、ブラップ（登録商標；ヘンケル社製）、ＫＡＰ（花王社製）等が挙げられ、これらは、いずれもバチルス属細菌由来で、ズブチリシンファミリーに属しており、相互のアミノ酸配列の相同性が非常に高い（特許文献１、非特許文献１等参照）。
【０００４】
しかしながら、これらのアルカリプロテアーゼは、アルカリ耐性、界面活性剤耐性、酸化剤耐性、低温活性、耐熱性、洗浄性、低い基質特異性、キレート剤耐性、金属イオン耐性等において一長一短のあるものであり、洗浄用酵素としてより優れた性質を有するプロテアーゼが求められている。
【０００５】
本発明は、上記のような洗剤用アルカリプロテアーゼ又は従来の真性ズブチリシンとはアミノ酸配列において相同性が低く、熱やｐＨに対する安定性にカルシウムイオンの影響を受けない、洗剤用をはじめとする各種産業用アルカリプロテアーゼ及びこれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
【特許文献１】
特開平６−２９２５７７号公報
【非特許文献１】
Ｓｉｅｚｅｎ，  Ｒ．Ｊ．  ＆  Ｌｅｕｎｉｓｓｅｎ  Ｊ．Ａ．Ｍ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ６，  ５０１−５２３（１９９７）
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、好アルカリ性バチルス属細菌のゲノムＤＮＡから公知のズブチリシンとアミノ酸配列において相同性の低いアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を取得し、種々検討したところ、熱やｐＨに対する安定性にカルシウムイオンの影響を受けない新規なアルカリプロテアーゼを生産することに成功した。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターを有する形質転換体を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質（以下、「アルカリプロテアーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１０】
ここで、配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてアルカリプロテアーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１１】
なお、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット［Ｍｕｔａｎ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ  キット（Ｔａｋａｒａ）］等を用いて変異を導入し調製することができる。
【００１２】
本発明の配列番号１のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼと他の公知であるアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列と比較した場合、ズブチリシンＢＰＮ’と６７．４％、ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇとは６９．６％の中程度の相同性を示すにすぎない。さらに洗剤用酵素として用いられているサビナ−ゼとは５８．８％、エスペラーゼとは５６．４％、ＫＡＰ（Ｍ−プロテアーゼ）とは５８．０％の相同性を示すにすぎない。さらに本発明の遺伝子を取得したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−ＬＤ１株由来のアルカリプロテアーゼＬＤ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  ＡＢ０８５７５２）とは６３．３％、アルカリプロテアーゼＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  ＡＢ０９０３３４）とは７５．０％の相同性を示した。また、好アルカリバチルスＬＧ１２株由来のＳｐｒＣとは７７．９％、ＳｐｒＤとは８６．２％の相同性を示した（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６１，  ４４９０−４４９３，  １９９５）が、完全に一致するものではなかった。これらの結果は、本発明のアルカリプロテアーゼが新規な酵素であることを示唆するものである。参考までに、プレプロ配列（例えば、配列番号２の第−１０１番目から第−１番目までのアミノ酸配列）における相同性は、上記アルカリプロテアーゼのプレプロ配列或いは他の公知であるアルカリプロテアーゼのプレプロ配列と比較した場合、１５〜５１％の相同性を示すにすぎず、相同性の高い配列は見当たらない。
【００１３】
すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、９０％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼを包含するものであり、配列番号１のアミノ酸配列における相同性が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上あるものが望ましい。
尚、ここで述べる相同性の検索は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発）のサーチホモロジ−プログラムやマキシマムマッチング法を用いて算出することができる。
【００１４】
本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子は、上記のとおり、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであるが、例えば配列番号２の第３０４番目から第１１３１番目までの塩基配列で示されるＤＮＡが挙げられ、好ましくは、（ａ）配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ又は（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００１５】
ここで「ストリンジエントな条件下」とは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  −  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１６】
本発明のアルカリプロテアーゼは、例えばバチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＬＤ１株の染色体ＤＮＡからクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。ここでＫＳＭ−ＬＤ１株の菌学的性質を以下に示す。
【００１７】
Ａ．形態学的性質
（ａ）細胞の形及び大きさ      ：桿菌（０．７×２〜３．０μｍ）
（ｂ）細胞の多形性            ：なし
（ｃ）運動性                  ：なし
（ｄ）胞子                    ：有（０．６〜０．７×１．０〜１．２μｍ）
（ｅ）グラム染色              ：不定
【００１８】
Ｂ．各種培地での生育状態
（ａ）肉汁寒天培地での生育状態    ：円形、低凸状、全縁なめらかなコロニーを形成する。コロニーの表面は無光沢。クリーム色
（ｂ）肉汁液体培養                ：混濁する
（ｃ）肉汁ゼラチン穿刺培養        ：生育良好で液化する
（ｄ）リトマスミルク              ：生育しない
（ｅ）卵黄培地                    ：生育しない
（ｆ）チロシン寒天培地            ：生育しない
【００１９】
Ｃ．生理的性質
（ａ）硝酸塩の還元                ：陰性
（ｂ）ＭＲテスト                  ：陰性
（ｃ）ＶＰテスト                  ：陽性
（ｄ）硫化水素の生成              ：陰性
（ｅ）インドールの産生            ：陰性
（ｆ）澱粉の加水分解              ：陽性
（ｇ）クエン酸の利用              ：利用しない
（ｈ）ウレアーゼ                  ：陰性
（ｉ）オキシダーゼ                ：陽性
（ｊ）β−ガラクトシダーゼ        ：陽性
（ｋ）アルギニンヒドラーゼ        ：陰性
（ｌ）リシンデカルボキシラーゼ    ：陰性
（ｍ）オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性
（ｎ）トリプトファンデアミナーゼ  ：陰性
（ｏ）ゼラチナーゼ                ：陽性
（ｐ）カタラーゼ                  ：陽性
（ｑ）生育の温度範囲              ：５〜４０℃で生育可能
（ｒ）生育のｐＨ範囲              ：ｐＨ７〜１０で生育良好
（ｓ）嫌気培養                    ：嫌気的条件で生育不能
（ｔ）糖類からの酸の生成（＋；生成する−；生成しない）
グリセロール                ：−
エリスリトール              ：−
Ｄ−アラビノース            ：−
Ｌ−アラビノース            ：−
リボース                    ：−
Ｄ−キシロース              ：−
Ｌ−キシロース              ：−
アドニトール                ：−
β−メチル−Ｄ−キシロース  ：−
ガラクトース                ：−
グルコース                  ：＋
フラクトース                ：＋
マンノース                  ：＋
ソルボース                  ：−
ラムノース                  ：−
ズノシトール                ：−
イノシトール                ：−
マンニトール                ：＋
ソルビトール                ：−
α−メチル−Ｄ−マンノース  ：−
α−メチル−Ｄ−グルコース  ：−
Ｎ−アセチルグリコサミン    ：−
アミグダリン                ：−
アルブチン                  ：−
エスクリン                  ：＋
サリシン                    ：＋
セロビオース                ：＋
マルトース                  ：＋
乳糖                        ：−
メリビオース                ：−
白糖                        ：＋
トレハロース                ：＋
イヌリン                    ：−
メレチトース                ：−
ラフィノース                ：−
澱粉                        ：＋
グリコーゲン                ：＋
キシリトール                ：−
ゲンチオビオース            ：−
Ｄ−ツラノース              ：−
Ｄ−リキソース              ：−
Ｄ−タガトース              ：−
Ｄ−フコース                ：−
Ｌ−フコース                ：−
Ｄ−アラビトール            ：−
Ｌ−アラビトール            ：−
グルコネート                ：−
２−ケトグルコン酸          ：−
５−ケトグルコン酸          ：＋
【００２０】
上記ＫＳＭ−ＬＤ１株は、その形態学及び生理学的性質について、「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ社、１９８４年）の記載に準じ検討したところ、バチルス属に属させることが妥当であるが、種については、既知のバチルス属の種の諸性質とは完全に一致しないため、新規な微生物として、本菌株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにバチルス  エスピー  ＫＳＭ−ＬＤ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−ＬＤ１；ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５７６）として寄託した。
【００２１】
本発明の遺伝子は、上述したアルカリプロテアーゼ産生菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−ＬＤ１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５７６）等から、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いることよりクローニングすることができる。
【００２２】
本発明遺伝子を用いてアルカリプロテアーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリプロテアーゼ遺伝子（例えば配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡ）を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリプロテアーゼを採取すればよい。
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００２３】
かくして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００２４】
本発明のアルカリプロテアーゼの特徴としては、次のような性質が好ましい。即ち、分子量約３０，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、最適反応ｐＨを１０．５付近（グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液）、最適温度を６０℃付近に有し、熱やｐＨに対する安定化にカルシウムイオンを必要しないことが望ましく、段落〔００３０〕〜〔００３４〕に示す性質を有していることがより好ましい。
【００２５】
【実施例】
実施例１  遺伝子のクローニング及び塩基配列の決定
枯草菌が産生するセリンプロテアーゼファミリー１において高度に保存されている領域である６４番目のＨｉｓ周辺及び２２１番目のＳｅｒ周辺のアミノ酸配列ＨＧＴＨＶＡＧ及びＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧに対して、これらの領域間を増幅させる目的でプライマー１（配列番号３：５’−ＣＡＹＧＧＮＡＣＮＣＡＹＧＴＮＧＣＮＧＧ−３’）、プライマー２（配列番号４：５’−ＣＣＮＧＣＮＡＣＲＴＧＮＧＧＮＧＮＮＧＣＣＡＴＮＧＡＮＧＴＮＣＣ−３’）、プライマー３（配列番号５：５’−ＣＣＮＧＣＮＡＣＲＴＧＮＧＧＮＧＮＮＧＣＣＡＴＲＣＴＮＧＴＮＣＣ−３’）を合成した。なお、アミノ酸番号はＢＰＮ’を基準に示した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−ＬＤ１株から斎藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ７２，  ６１９−６２９，  １９６３）に準じ、ゲノムＤＮＡを調製し、プライマー１と２、プライマー１と３を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件はゲノムＤＮＡ１０〜１００ｎｇを鋳型に２０ｎｍｏｌのプライマーを用い、ポリメラーゼにＰｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて５０μＬの反応系とし、Ｂｉｏｍｅｔｒａ：Ｔ−Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ワットマン）にて９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、４０〜６０℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ断片をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  キット（ロッシュ）にて精製し、ＳｍａＩにて消化したｐＵＣ１８に連結し、大腸菌ＨＢ１０１株に導入した。形質転換体よりＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  キット（ロッシュ）を用いてプラスミドを調製し、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化後１．２％アガロースゲル電気泳動により挿入断片の有無と大きさを確認した。挿入断片の大きさが約２００ｂｐ〜１５００ｂｐのものに対してＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ    Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（パーキンエルマー）及びＤＮＡシークエンサー（３７７型：アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を決定した。なお、プライマーは、ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ−Ｍ（Ｔａｋａｒａ）又はＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ１３−４７（Ｔａｋａｒａ）を用いた。塩基配列を比較し異なるものを選抜し、上流及び下流方向の塩基配列決定に適したプライマー（同一種、同一方向につき２種ずつ：外側、内側）を合成した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−ＬＤ１株のゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｌｏｎｉｎｇ  キット（Ｔａｋａｒａ）中のＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩカセットに上記ＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩ分解断片をそれぞれ連結させ、各々の外側プライマーと付属のプライマーＣ１にてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件はカセットに連結されたＤＮＡ断片０．１〜１．０ｎｇを鋳型にプライマー１０〜２０ｐｍｏｌを用い、５０μＬ反応系にて９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。その後増幅ＤＮＡ断片を各々の内側プライマーと付属のプライマーＣ２でＰＣＲを行ない増幅させた。この際のＰＣＲ条件は先に得られた増幅ＤＮＡ断片を１００００倍希釈したもの１μＬを鋳型に１０〜２０ｐｍｏｌのプライマーを用いて５０μＬ反応系、９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし３０サイクルにて行なった。増幅した断片の塩基配列を先と同様にＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ    Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（パーキンエルマー）及びＤＮＡシークエンサー（３７７型：アプライドバイオシステムズ）を用いて決定した。新たに得られた塩基配列情報をもとに上流域、下流域の塩基配列を決定するためのプライマーを合成し、同様の手法によりプロテアーゼをコードすると思われる領域及びその上流、下流領域の全塩基配列を決定した。
【００２６】
実施例２  枯草菌形質転換体によるアルカリプロテアーゼの生産
実施例１にて決定したアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子をプライマー４（配列番号６：５’−ＧＴＣＡＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＣＣＣ−３、下線部は新たに付加したＢａｍＨＩサイトを示す）、プライマー５（配列番号７：５’−ＡＡＣＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＧＡＡＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣ−３、下線部は新たに付加したＸｂａＩサイトを示す）各２０ｐｍｏｌを用い、０．１〜１．０ｎｇのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−ＬＤ１株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ増幅断片をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  キット（ロッシュ）にて精製し、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩにて分解した後、同様に処理したベクターｐＨＡ６４に結合し、組換えプラスミドを調製した。これを用いてプロトプラスト法によりＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＳＷ１２１４株を形質転換した。得られた形質転換株を３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％魚肉エキス、０．１％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、３％マルトース（別滅菌）から成る培地にて３０℃、７２時間好気的に振盪培養を行なったところ、培養上清にプロテアーゼの生産を確認することができた。なお、培養液当たりの生産量は２５−３０Ｕ／ｍＬであった。
【００２７】
実施例３  プロテアーゼの調製法
実施例２で得られた培養液２００ｍＬを１ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したスーパーＱトヨパールカラム（東ソー：２．５×８ｃｍ）に添着し、同緩衝液で洗浄した後、０から０．５Ｍの塩化カリウムを用いた濃度勾配溶出法により吸着したプロテアーゼ活性画分を溶出した。この画分を限外濾過にて加水濃縮し（アミコン：ＹＭ３メンブレン）、予め１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．６）で平衡化しておいたＤＥＡＥ―トヨパールカラム（東ソー：１．５×１４ｃｍ）に添着し、０から０．１Ｍの塩化カリウムを用いた濃度勾配法、さらに０．１から０．２５Ｍの塩化カリウムを用いた濃度勾配法により吸着したプロテアーゼ活性画分を溶出した。活性画分を限外濾過にて加水濃縮（ＹＭ３メンブレン）した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化しておいたヒドロキシアパタイトカラム（バイオラッド：１．５×７ｃｍ）へ添着した。非吸着のプロテアーゼ活性画分を集め、濃縮した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った結果、分子量約３０，０００の均一なタンパク質であることを確認した。また、本精製酵素の比活性は１２１Ｕ／ｍｇであった。尚、タンパク質量は牛血清アルブミンを標準とし、ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド）を用いて測定した。
【００２８】
実施例４  ＫＳＭ−ＬＤ１株由来アルカリプロテアーゼの酵素学的性質
実施例３で得られた精製アルカリプロテアーゼの活性測定法はＮ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（ＡＡＰＦと略す）を用いた合成基質法により行った。
【００２９】
［合成基質法］
０．２５ｍＬの０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）、０．０５ｍＬの２０ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＬの脱イオン水及び０．０２５ｍＬの５０ｍＭＡＡＰＦからなる反応液を３０℃で３分間恒温した後、０．０２５ｍＬの酵素液を加え反応を開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２ｍＬの５％（ｗ／ｖ）クエン酸を加え反応を停止した。４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐ−二トロアニリンを定量した。酵素１ｕｎｉｔは上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離する量とした。
【００３０】
（１）最適反応ｐＨ
各種緩衝液中（ｐＨ７〜１２）で３０℃、１０分間反応させ、酵素活性を測定した。本発明のプロテアーゼは、５０ｍＭグリシン／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）において最も高い活性を示した。
【００３１】
（２）最適温度
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）中、３０〜８０℃までの各温度で活性測定を行った。その結果、本発明プロテアーゼの最適温度は６０℃であった。
【００３２】
（３）耐熱性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に酵素を加え、３０〜７０℃の各温度で１５分間熱処理を行った後、氷水中で急冷した。残存活性を測定した結果、本発明のプロテアーゼは、５ｍＭ塩化カルシウムの有無に拘らず５０℃まで安定であった。
【００３３】
（４）基質特異性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）にヘモグロビン、ケラチン、ゼラチン（０．２５％）を溶解／懸濁させ、酵素反応を行った。カゼインに対する分解活性を１００％とした場合、それぞれ３６％、５％、４６０％の相対活性を示した。
【００３４】
（５）等電点
ＰＡＧプレートを用いた等電点電気泳動法（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ：  ファルマシア）により、標準タンパク質（Ｂｒｏａｄ  ｐＩ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ：  ファルマシア）と本発明プロテアーゼの移動度から等電点を求めたところ、ｐＨ４．５付近であった。
【００３５】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼは、従来のズブチリシンとはアミノ酸配列において相同性が低く、熱に対する安定性にカルシウムイオンの影響を受けないことから、酵素の製造、精製、造粒化にカルシウムを添加する必要が無く、また反応に金属塩の添加を避けるような系にも応用が可能であり、衣料用洗浄剤をはじめ各種産業用の酵素として有用である。
【００３６】
【配列表】
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