(57)【要約】【課題】  ２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物、その作製方法、及び該モデル非ヒト動物を用いた、２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法及び該糖尿病及び／又は下垂体性小人症の診断法等を提供すること。【解決手段】  ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損した、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物を作製する。該２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物を用いることにより、該２型糖尿病、及び／又は、該下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニングを行う。更に、該モデル非ヒト動物を用いることにより、該２型糖尿病、及び／又は、該下垂体性小人症の診断を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能を染色体上で欠損させたことを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病及び／又は成長ホルモン生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
【請求項２】
インスリン分泌異常が、膵臓β細胞におけるインスリン生合成異常に起因することを特徴とする請求項１記載の２型糖尿病、及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
【請求項３】
小胞体機能異常が、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害であることを特徴とする請求項１又は２記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
【請求項４】
下垂体性小人症の発症が、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
【請求項５】
ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能の欠損が、配列表の配列番号１に示されるＳＥＲＰ１遺伝子の機能の欠損であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
【請求項６】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
【請求項７】
マウス遺伝子ライブラリーから得られたストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、マーカー遺伝子で置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後、胚幹細胞に導入し、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子の遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物の作製方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官におけるインスリン生合成／分泌、及び／又は小胞体機能の異常、或いは、下垂体での成長ホルモンの生合成異常を測定・評価することを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
小胞体機能の異常の測定・評価が、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害の測定・評価であることを特徴とする請求項８記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与した場合と、野生型非ヒト動物の場合及び／又はインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物の場合とを、比較・評価することを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬。
【請求項１３】
検体からストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子を抽出し、その遺伝子異常の有無を調べることを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断法。
【請求項１４】
ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１に特異的に結合する抗体を用いて、検体におけるストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子の発現の異常を検出・測定することを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症下垂体性小人症の診断法。
【請求項１５】
ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなるインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断用プローブ。
【請求項１６】
請求項１５に記載の診断用プローブを含むことを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断用キット。
【請求項１７】
配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１７記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損した、インスリン生合成の異常によるインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物、及び該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物を用いた、該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法及び、該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞においては、その細胞内膜系の一つとして小胞体（endoplasmic reticulum:ＥＲ）と呼ばれる小器官がある。小胞体（ＥＲ）では、一重膜に囲まれた細管状或いは平板状の膜系がつながり、細胞質全体に広がる一つの網状構造が形成されている。小胞体（ＥＲ）には、リボソームを結合しタンパク質合成を行う粗面小胞体とリボソームを結合していない滑面小胞体とが存在する。小胞体の機能としては、粗面小胞体では、分泌タンパク質、細胞膜タンパク質、ゴルジ体タンパク質、リソソームタンパク質、小胞体タンパク質等の合成が行われている。
【０００３】
また、滑面小胞体では、主として、リン脂質やコレステロールなどの複合脂質の合成や、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨを水素供与体とし、シトクロムＰ４５０、シトクロムｂ5とそれぞれの還元酵素からなる二つの電子伝達系やグルコース−６−ホスファターゼ、エステラーゼ等の酵素の存在下に、種々の内因性、外因性物質の代謝への関与が行われている。更に、滑面小胞体では、Ｃａ2+結合タンパク質やＣａ2+−ＡＴＰアーゼ、イノシトール１，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）受容体の存在により、動因可能な細胞内Ｃａ2+貯留を構成し、細胞内シグナル伝達に重要な役割が演じられている。
【０００４】
これらの小胞体は、膵臓においては、粗面小胞体が著明に発達し、肝細胞では、粗面小胞体と滑面小胞体とが約１：１の比率で、また、Ｃａ2+貯留の機能の発達した筋細胞や神経細胞では、固有の滑面小胞体が存在する。
【０００５】
小胞体（ＥＲ）では、膜タンパク質及び分泌タンパク質がそれぞれ正しく折りたたまれ（folding）、オリゴマーの形成がなされている。細胞がいったんグルコース欠乏、タンパク質の糖鎖形成の抑制、Ｃａ2+恒常性の阻害（小胞体ストレス）又は低酸素などのストレスにさらされると、折り畳まれていないタンパク質が小胞体に蓄積し、真核細胞は転写の誘導、翻訳の抑制、及び分解にかかわる機構で応答する（Cell. 101, 451-454, 2000）。このように真核細胞が、ストレスにさらされると細胞の応答反応として、ストレスタンパク質の誘導がなされるが、ストレスタンパク質は、タンパク質の折りたたみ（高次構造形成）や解離会合を制御（シャペロン機能）し、膜透過、局在化、分解などに重要な役割を果たす。小胞体ストレス関連タンパク質の最も重要な役割として、虚血、糖尿病、癌及び神経変性疾病等といった、様々な病理学的症状が知られており、これまでにも多くの報告がなされている（Nature Med. 7, 317-323, 2001、Mol Cell. 7, 1153-1163, 2001、J. Clin. Invest. 109, 525-532, 2002、Cancer Res. 61, 4206-4213, 2001、Nat. Cell. Biol. 1, 479-485, 1999）。
【０００６】
膵臓β細胞は、小胞体からはじまる高度に発達した分泌腺組織を持っており、グルコースの刺激に応答して莫大な量のインスリンを産生・分泌する。β細胞のグルコースに対する応答は主に２段階で制御されている。１）秒／分単位で行われる貯蔵顆粒からのインスリン分泌（Eur. J. Biochem. 259, 3-17, 1999）。２）分／時間単位で行われる翻訳レベルのプレプロインスリンの生合成（Nature 283, 100-102, 1980、Biochem. J. 235, 459-467, 1986）。グルコース恒常性と膵臓β細胞生存における小胞体機能の重要な役割について、これまでに数多くの報告がなされている。高グルコース条件下では、ＭＩＮ６細胞において、トランスロコン構成分子７種類を含む早期分泌経路構成成分の発現が上昇する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5773-5778, 2000）。小胞体局在リン酸化酵素、ＰＥＲＫ、又は真核生物翻訳開始因子２（ｅＩＦ２ａ）αサブユニットのホモ接合性変異により、グルコース恒常性は重度の障害をうけ、膵臓β細胞の細胞死を伴うことが報告されている（Mol Cell. 7, 1153-1163, 2001、EMBO J. 18, 4804-4815, 1999）。対照的に、ＣＨＯＰ遺伝子を分裂させることにより小胞体ストレス関連糖尿病を遅らせることが報告されている（J. Clin. Invest. 109, 525-532, 2002）。
【０００７】
ＳＥＲＰ１（ストレス関連小胞体タンパク質１：Stress-associated ER protein 1）は、低酸素・虚血又は小胞体ストレスによって誘導される分子であると考えられており（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）、最初、Ｓｅｃ６１複合体と一緒に精製されたＲＡＭＰ４（リボゾーム関連膜タンパク質４：Ribosome-associate membrane protein 4）と同一であることが判明している（Cell 75, 615-630, 1993）。
【０００８】
また、ＲＡＭＰ４は移動休止機構（translocational pausing mechanism）によって、ＭＨＣクラスII関連インバリアント（不変）鎖に対し糖鎖形成を調節し（EMBO J. 18, 4804-4815, 1999）、ＳＥＲＰ１の過剰発現はＳｅｃ６１複合体と関連して小胞体ストレス条件下において、新規合成膜タンパク質を安定化することも報告されている（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）。
【０００９】
ストレス関連小胞体タンパク質１（ＳＥＲＰ１）の遺伝子は、本発明者らによって取得され、そのストレス関連小胞体タンパク質１は、６６アミノ酸からなる小タンパク質であることが開示されている（特開２０００−２４５４７４号公報）。
【特許文献１】特開２０００−２４５４７４号公報。
【非特許文献１】Cell. 101, 451-454, 2000。
【非特許文献２】Nature Med. 7, 317-323, 2001。
【非特許文献３】Mol Cell. 7, 1153-1163, 2001。
【非特許文献４】J. Clin. Invest. 109, 525-532, 2002。
【非特許文献５】Cancer Res. 61, 4206-4213, 2001。
【非特許文献６】Nat. Cell. Biol. 1, 479-485, 1999。
【非特許文献７】Eur. J. Biochem. 259, 3-17, 1999。
【非特許文献８】Nature 283, 100-102, 1980。
【非特許文献９】Biochem. J. 235, 459-467, 1986。
【非特許文献１０】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5773-5778, 2000。
【非特許文献１１】EMBO J. 18, 4804-4815, 1999。
【非特許文献１２】J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999。
【非特許文献１３】Cell 75, 615-630, 1993。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物、その作製方法、及び該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物を用いた、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法及び、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
中枢神経系を構成する細胞のうち、神経細胞はストレスに対して極めて脆弱であるのに対して、グリア細胞、特にアストロサイトはストレス抵抗性を示す。本発明者は、アストロサイトのストレス抵抗性には様々なストレス関連遺伝子の誘導が必要であることを発見し、低酸素・再酸素に暴露した培養アストロサイトを用いて、いくつかの新規ストレス関連遺伝子をクローニングし、その一つとして、ＳＥＲＰ１の遺伝子をクローニングした（配列表の配列番号１）。
【００１２】
ＳＥＲＰ１（ストレス関連小胞体タンパク質１）は、６６アミノ酸からなる小タンパク質（配列表の配列番号２）で、細胞内で小胞体に存在し、Ｃ末端に膜貫通領域を持つ、いわゆるＣ末端アンカータンパク質（C-terminal anchored protein）と呼ばれる膜タンパク質であり、小胞体膜上で、Ｓｅｃ６１複合体（Sec61 complex）と結合している。Ｓｅｃ６１複合体は、分泌系タンパク質が小胞体へ入る際のチャネルのような働きをしているもので、通常は細胞質から小胞体へ分泌系タンパク質を移動させ、小胞体にストレスがかかった状態では、小胞体から細胞質へフォールデイングのうまくできなかったタンパク質を移動させる働きを持っていると考えられている。
【００１３】
本発明者は、このＳＥＲＰ１の機能解析を行う中で、ＳＥＲＰ１の過剰発現はＳｅｃ６１複合体と関連して小胞体ストレス下において、新規合成膜タンパク質を安定化すること、すなわち、小胞体ストレス下において、小胞体に貯まる膜タンパク質の安定化を行うことを確認していたので、これらのことより、ＳＥＲＰ１は分泌系タンパク質或いは膜タンパク質に直接作用していることを想定した。そして、本発明者は、ＳＥＲＰ１が膵臓ランゲルハンス島とＭＩＮ６細胞において、Ｓｅｃ６１複合体と同程度に極めて強く発現していることを見い出し、ＳＥＲＰ１遺伝子機能欠損マウスを用いて確認した結果、ＳＥＲＰ１はグルコース刺激後のインスリン生合成に不可欠ではないものの、インスリン生合成を促進し、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に役立つことを明らかにした。
【００１４】
したがって、ＳＥＲＰ１はＳｅｃ６１複合体と共に、膵臓においてインスリン生産制御及びストレス応答に関し極めて重要な役割を果たしている。そして、本発明者は、ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスが、インスリン生合成の異常によるインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病を発症することを見い出した。
【００１５】
更に、ＳＥＲＰ１遺伝子機能欠損マウスを用いて確認した結果、ＳＥＲＰ（−／−）マウスは、生後４週間以内に起こる成長障害があることを認め、その後の検討により、下垂体での成長ホルモンの生合成が顕著に低下していることが判明した。そして、このＳＥＲＰ１遺伝子機能欠損マウスが、下垂体性小人症を発症することを見い出した。
【００１６】
本発明は、ＳＥＲＰ１の機能解析における上記知見に基づいて完成するに至ったものであり、本発明は、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損した、インスリン生合成の異常によるインスリン分泌異常（以下、「インスリン分泌異常」という。）及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物、その作製方法、及び該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物を用いた、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法及び、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断法等からなる。
【００１７】
すなわち詳細には、本発明は、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能を染色体上で欠損させたことを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病及び／又は成長ホルモン生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項１）や、インスリン分泌異常が、膵臓β細胞におけるインスリン生合成異常に起因することを特徴とする請求項１記載の２型糖尿病、及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項２）や、小胞体機能異常が、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害であることを特徴とする請求項１又は２記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項３）や、下垂体性小人症の発症が、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項４）や、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能の欠損が、配列表の配列番号１に示されるＳＥＲＰ１遺伝子の機能の欠損であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項５）や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物（請求項６）や、マウス遺伝子ライブラリーから得られたストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、マーカー遺伝子で置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後、胚幹細胞に導入し、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子の遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物の作製方法（請求項７）からなる。
【００１８】
また本発明は、請求項１〜６のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官におけるインスリン生合成／分泌、及び／又は小胞体機能の異常、或いは、下垂体での成長ホルモンの生合成異常を測定・評価することを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項８）や、小胞体機能の異常の測定・評価が、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害の測定・評価であることを特徴とする請求項８記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項９）や、請求項１〜６のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与した場合と、野生型非ヒト動物の場合及び／又はインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物の場合とを、比較・評価することを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項１０）や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか記載のインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項１１）からなる。
【００１９】
さらに本発明は、請求項８〜１１のいずれか記載のスクリーニング方法により得られるインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬（請求項１２）や、検体からストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子を抽出し、その遺伝子異常の有無を調べることを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断法（請求項１３）や、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１に特異的に結合する抗体を用いて、検体におけるストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子の発現の異常を検出・測定することを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症下垂体性小人症の診断法（請求項１４）や、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなるインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断用プローブ（請求項１５）や、請求項１５に記載の診断用プローブを含むことを特徴とするインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断用キット（請求項１６）や、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項１７）や、請求項１７記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１をコードすることを特徴とするＤＮＡ（請求項１８）からなる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明において、小胞体に存在し、分泌系タンパク質或いは膜タンパク質に直接作用しているＳＥＲＰ１が、インスリンの合成自身に必須ではないが、グルコース負荷後の急速なインスリン合成に必要であることを明らかにした。２型糖尿病は、末梢でのインスリン抵抗性、及び、ランゲルハンス島β細胞からのインスリン分泌障害を特徴とする多因子疾患である。本発明において、ＳＥＲＰ１遺伝子欠損（ノックアウト）モデル非ヒト動物（マウス）を作製することにより、２型糖尿病におけるインスリン合成異常及び小胞体機能の異常を確認し、解明した。
【００２１】
更に、本発明においては、ＳＥＲＰ１遺伝子機能欠損マウスを用いて確認した結果、ＳＥＲＰ（−／−）マウスは、生後４週間以内に起こる成長障害があることを認め、その後の検討により、下垂体での成長ホルモンの生合成が顕著に低下していることが判明した。そして、このＳＥＲＰ１遺伝子機能欠損マウスが、下垂体性小人症を発症することを見い出した。
【００２２】
本発明のＳＥＲＰ１遺伝子欠損（ノックアウト）モデル非ヒト動物（マウス）は、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニングを可能にする。また、該インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の、２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物とは、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損することにより、膵臓β細胞等におけるインスリン分泌異常や、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害のような小胞体機能異常に起因する２型糖尿病を発症する非ヒト動物、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症する非ヒト動物をいう。本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット、モルモット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができ、本発明の２型糖尿病及び／又は下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニングに用いるモデル非ヒト動物としては、マウスが特に有利に利用することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明のＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト動物の作製は、公知の遺伝子欠損モデル非ヒト動物の作製方法を用いて作製することができる。以下に、ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト動物の作製方法を、ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスを例にとって説明する。
【００２５】
本発明のモデル非ヒト動物の作製に際しての、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１のアミノ酸配列（配列番号２）及びその遺伝子の塩基配列（配列番号１）の情報は、本発明において新規にクローニングしたマウスＳＥＲＰ１遺伝子の遺伝子配列（配列表の配列番号１）及びそのＳＥＲＰ１タンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号２）、更に、本発明者が既にクローニングしたラット及びヒトのＳＥＲＰ１遺伝子の遺伝子配列及びそのＳＥＲＰ１タンパク質のアミノ酸配列（特開２０００−２４５４７４号公報）から得ることができる。
【００２６】
本発明は、本発明において新規にクローニングした上記配列表の配列番号１に示されるマウスＳＥＲＰ１遺伝子の塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡ、更には、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１をコードするＤＮＡを含むものである。
【００２７】
なお、ここで該ＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。
【００２８】
ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちホモ接合体変異マウス（−／−）は、例えば、マウス膵臓から構築したマウス遺伝子ライブラリー或いはＭＩＮ６細胞からＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＳＥＲＰ１遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＳＥＲＰ１遺伝子の一部又は全部を、例えばｌａｃ−Ｚ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、必要に応じて、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲッティングベクターを作製し、この作製されたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｘ−ｇａｌによる染色あるいはＧ４１８やガンシクロビル（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００２９】
上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体変異マウス（＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体変異マウスをインタークロスさせることによって、ホモ接合体変異マウス（−／−）を得ることができる。そして、かかるホモ接合体変異マウスにＳＥＲＰ１遺伝子が欠損しているかどうかを確認する方法としては、例えば、このマウスのＳＥＲＰ１遺伝子の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００３０】
本発明における、インスリン生合成の異常によるインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニングは、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官におけるインスリン分泌の状態及び／又は小胞体機能の異常、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常を測定・評価することにより行う。
【００３１】
上記インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニングをする際、野生型非ヒト動物及び／又はＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いて、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物の場合と比較・評価することことが好ましく、野生型非ヒト動物としては、上記ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物を好適に例示することができ、ＳＥＲＰ１遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物は、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6132-6137, 2000）記載の方法等によって作製することができる。ＳＥＲＰ１欠損型と、それらの同腹の野生型は、個体レベルで正確な比較実験・評価（解析）等を行うことができる点で同時に用いることが好ましい。
【００３２】
インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニングにおける被検物質を投与したモデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官におけるインスリン分泌の状態及び小胞体機能の異常の測定・評価には、グルコース負荷試験による血糖値・インスリン分泌量の測定や、ランゲルハンス島β細胞におけるインスリンの分泌や生合成の測定、或いはランゲルハンス島における細胞死、更には、下垂体での成長ホルモンの生合成の検出・測定等、適宜の測定・評価方法を用いることができる。
【００３３】
更に、本発明においては、検体からストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子を抽出し、その遺伝子異常の有無を調べることにより、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断を行うことができる。
【００３４】
また、本発明のストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部をインスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断用プローブとすることができ、また、このＳＥＲＰ１遺伝子の欠損に起因する疾病の診断用プローブをセットして、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断用キットとして製品化することもできる。
【００３５】
さらに、本発明においては、ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１に特異的に結合する抗体を用いて、検体におけるストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１遺伝子による該タンパク質の発現の異常を検出・測定することにより、インスリン分泌異常及び／又は小胞体機能異常に起因する２型糖尿病、及び／又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の診断を行うことができる。ストレス関連小胞体タンパク質ＳＥＲＰ１に特異的に結合する抗体としては、モノクロナール抗体及びポリクロナール抗体のいずれも利用することができる。
【００３６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
［材料と実験方法］
（マウスＳＥＲＰ１遺伝子のクローニング）
マウスＳＥＲＰ１ ｃＤＮＡの部分配列を、ラットＳＥＲＰ１との相同性によりＥＳＴクローンより得た。その配列を基に、センスプライマーとしてｍｓ１プライマー（5'-CTGTCCGGTGGTTGGATCCT-3'：配列番号３）、アンチセンスプライマーとしてｍｓ４プライマー（5'-ACTTTGCCGCGCTGAGTTAT-3'：配列番号４）を合成し、マウス１２９Ｓｖ／ＪゲノムＤＮＡライブラリーをＰＣＲにてスクリーニングした。得られたクローンをサザンブロット法により確認した。さらに、得られたクローンの配列をシークエンスすることにより決定した。同定されたマウスＳＥＲＰ１ ゲノムＤＮＡの配列を、配列番号１に示した。
（細胞培養）
マウスインスリノーマ由来の細胞系であるＭＩＮ６細胞（大阪大学の宮崎博士より供与；Endocrinology. 127, 126-132, 1990）を１５％のＦＣＳ及び２５ｍＭのグルコースを含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞が７０％コンフルエント状態に達した時に、培地を高グルコース濃度培地（２５ｍＭグルコース）又は低グルコース濃度培地（５．５ｍＭグルコース）と交換した。ＳＥＲＰ１及び他の分子の発現解析は培養開始から２４時間後に行った。
（ノザンブロット法及びin situハイブリダイゼーション）
ＭＩＮ６細胞及びマウス膵臓から全ＲＮＡを単離し、全ＲＮＡ１０μｇを１％アガロースを含むホルムアルデヒドゲルで分子量別に分けた後、Immobilon Nメンブレン（Millipore社製；MA, USA）に固定した。ＳＥＲＰ１のプローブとして、マウスＳＥＲＰ１ゲノムＤＮＡの５´側配列（配列表の配列番号１に記載のマウスＳＥＲＰ１ゲノムＤＮＡの４２８番目から７８８番目の塩基配列：配列番号５）及び、３´側配列（配列表の配列番号１に記載のマウスＳＥＲＰ１ゲノムＤＮＡの７９３５番目から８４０３番目の塩基配列：配列番号６）を用いた。ＳＥＲＰ１、Ｓｅｃ６１（α及びβサブユニット）、及びＧＲＰ７８のＤＮＡ断片によるハイブリダイゼーションは山口らの方法（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）に従って行った。
【００３８】
ヒトの内分泌組織におけるＳＥＲＰ１またはＳｅｃ６１複合体の発現は、Human Endocrine System MTN? Blot（CLONTECH社製；Palo Alto, CA）を用いて解析した。ジゴキジゲニン標識ＳＥＲＰ１ｃＲＮＡプローブを用いたin situハイブリダイゼーションは前述と同様の方法で行った（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999、J Cell Biol. 157, 1151-60, 2002）。膵臓標本を、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、厚さ８μｍの切片に切り分けた。アルカリホスファターゼ標識ジゴキジゲニン抗体を用いてｃＲＮＡプローブとハイブリダイゼーションをし、ＮＢＴ及びＸ−リン酸塩溶液で発色反応を行うことによりＳＥＲＰ１遺伝子の細胞内局在を調べた。
（免疫沈降、ウエスタンブロット法及び免疫染色）
タンパク質レベルにおけるＳＥＲＰ１の発現と小胞体内分子シャペロンＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４の発現を比較するため、ＭＩＮ６細胞及び単離した膵臓ランゲルハンス島を１％ TritonX-100、１０ｍＭ Tris（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、及び１μｇ／ｍｌペプスタチンを含む溶液で溶解した。免疫沈降又はウエスタンブロット法は抗ＳＥＲＰ１抗体（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）、抗ＫＤＥＬ抗体（ＧＲＰ７８及びＧＲＰ９４を認識する。StressGen Biotechnologies社製；Victoria, BC, Canada）、及び抗インスリン抗体（Biogenesis社製; Poole England, UK）を用いて行った。一次抗体認識部位はアルカリホスファターゼ標識二次抗体によって検出した。なお、免疫染色は、抗インスリン抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体（マウスより単離したランゲルハンス島にＡｄｅｘ１ ＣＡ ＳＥＲＰ１を用いてＳＥＲＰ１を強制発現させる際に、ＳＥＲＰ１ ｃＤＮＡをＦＬＡＧでタグしておいて異所性に発現しているＳＥＲＰ１のみＦＬＡＧで確認できるようにした。）を用い、厚さ５μｍの膵臓切片及び／又は単離した膵臓ランゲルハンス島を用いて行った。また、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。なお、山口らの方法（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）に従い、Quality Oneソフトウェア（pdi社製；Huntington Station, NY）を用いて、ウエスタン及びノーザンブロット法の結果を標準化するためにレーザー濃度測定を行った。
（ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスの作製）
マウス１２９Ｓｖ／Ｊライブラリー（Incyte genomics社製；St. Louis, Mo, USA）由来のマウスＳＥＲＰ１遺伝子のエキソン１をネオマイシン耐性遺伝子（pGK-neo）で置換し、さらに５．２ｋｂｐ上流にｈｓｖ−ｔＫ遺伝子を挿入した配列を、pPNT（Dr. Tybulewiczより供与；MRC National Institute for Medical Research, London, UK）に挿入することにより、ターゲッティングベクターを構築した（図３Ａ）。さらに、ヘテロ接合体胚幹細胞クローンを未分化胚芽細胞に注入することにより、ＳＥＲＰ１突然変異遺伝子の生殖系列伝達系を構築した。
【００３９】
マウスをＣ５７ＢＬ／６系統に８世代遡って交配し、ＰＣＲ及びサザンブロット法により遺伝子型を特定した。なお、ＰＣＲに用いたプライマーはＣＶｎｅｏ１（5'-CTACCCGGTAGAATTGACCT-3'（配列番号７）；pGK-neoカセットでアニールする）、センスプライマーとしてｍｓ６プライマー（配列表の配列番号１に記載のマウスＳＥＲＰ１ゲノムＤＮＡの６３２８番目から６３４７番目の塩基配列、5'-AGACCTCGGTAAGGGAAAGT-3（配列番号８）；ＳＥＲＰ１遺伝子の欠損領域でアニールする）、及びアンチセンスプライマーとしてｍｓ５プライマー（配列表の配列番号１に記載のマウスＳＥＲＰ１ゲノムＤＮＡの６６１５番目から６６３４番目の塩基配列、5'-GGCCAATAACCAGGGTCCTA-3'（配列番号９）；ＳＥＲＰ１遺伝子短腕３’側でアニールする）であり、ＳＥＲＰ１+/+マウス（野性型マウス）、ＳＥＲＰ１+/-マウス、及びＳＥＲＰ１-/-マウス（ＳＥＲＰ１ノックアウトマウス）の比較には、ＳＥＲＰ１+/-マウスの交配によって産まれた同性の同腹仔を用いた。
（血中グルコース濃度及びインスリン濃度の測定）
血中グルコース濃度は、携帯用グルコース測定装置Dexter-Z（Bayer Medical社製）を用いて測定した。腹腔内（ＩＰ）グルコース負荷試験及びインスリン負荷試験（ＩＴＴ）は、マウス体重１ｇあたり２ｍｇのグルコース又は体重１ｇあたり１Ｕのインスリン（１Ｕ／ｋｇ）を腹腔内投与し、特定時刻に尾静脈から血液を採取する方法で行った。血漿、培養培地、及び細胞抽出液中のインスリン濃度及び成長ホルモン濃度はＥＬＩＳＡキット（インスリン濃度：Shibayagi社製、成長ホルモン用キット：Cayman Chemical社製）を用いて測定した。
（組換えアデノウイルスの作製とアデノウイルスによる遺伝子発現）
マウスＳＥＲＰ１のコーディング領域全体とＦＬＡＧエピトープ（J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999）を含むｃＤＮＡ断片を、pAdx1CAコスミドベクターに挿入し、さらに、アデノウイルス発現キット（TaKaRa社製）を用いた相同組換えにより、組換え型アデノウィルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１を作製した。得られたウイルスの力価は、培地１ｍｌあたり約１０９プラーク形成単位（plaque-forming units：ｐｆｕ）であった。対照として、ウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＧＦＰ（大阪市立大学のKiyama博士より供与）を用いた。単離した膵臓ランゲルハンス島を、１１ｍＭのグルコースを含むＲＰＭＩ １６４０培地中にＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１又はＡｄｅｘ１ＣＡ ＧＦＰを添加することにより１６時間刺激した後、ＲＰＭＩ １６４０培地中で２４時間培養した。ＳＥＲＰ１の発現は、膵臓ランゲルハンス島を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色を行った後、蛍光顕微鏡で観察することにより解析した。
（パルスラベリング法による、膵臓ランゲルハンス島におけるインスリン生合成及び分泌量の測定）
ＳＥＲＰ１+/+、ＳＥＲＰ１+/-及びＳＥＲＰ１-/-マウスから、コラゲナーゼ処理により膵臓ランゲルハンス島を単離した。膵臓ランゲルハンス島細胞をグルコースを含まないＲＰＭＩ １６４０培地（Sigma社製）で１時間培養した後、培地中に異なる濃度のグルコース（０〜２２ｍＭ）を添加することにより細胞を刺激し、膵臓ランゲルハンス島細胞中のインスリン分泌及びインスリン含有量を特定時刻に測定した。インスリンの生合成及び分泌量の測定には、２２ｍＭグルコース及び２００μＣｉの35Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃｙｓ（Amersham Pharmacia Biotech Inc.社製；Piscataway, NJ, USA）を含む１００μｌのＲＰＭＩ １６４０培地中で３０分間培養することにより放射性標識した膵臓ランゲルハンス島細胞を用いた。これらの細胞を抗インスリン抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降したタンパク質を１５％トリシン緩衝ポリアクリルアミドゲル上で分離した後、オートラジオグラフィーにより目的のバンドを検出した。
（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ assay）
ＳＥＲＰ１+/+、ＳＥＲＰ１+/-及びＳＥＲＰ１-/-マウスより単離したランゲルハンス島をそれぞれ、1)小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシン（tunicamycin  １μｇ／ｍｌ: Sigma社製）入りのＲＰＭＩ１６４０培地、2)ツニカマイシン及びタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（cycloheximide  １μｇ／ｍｌ： Sigma社製）入りのＲＰＭＩ１６４０培地、3)ＲＰＭＩ１６４０培地のみの条件、の計６群に分けて４８時間培養した。その後の細胞の状態を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ assay（Molecular probe社；Eugene, OR, USA）にて評価した。
［実験結果］
（ヒトの内分泌組織におけるＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１遺伝子の発現分布）
ＳＥＲＰ１の機能を研究するためのモデル器官を探すため、ヒトの内分泌組織（膵臓、副腎髄質、甲状腺、副腎皮質、精巣、胸腺、小腸、胃の計８組織）における、ＳＥＲＰ１遺伝子及びＳｅｃ６１複合体遺伝子（α，βサブユニット）の組織分布をノザンブロット法により解析した（図１）。その結果、ＳＥＲＰ１遺伝子は膵臓で多く発現し、副腎髄質、甲状腺及び副腎皮質でも検出された。Ｓｅｃ６１αサブユニットは全体的に広く分布していたが、特に膵臓で高発現し、βサブユニットは膵臓の他、副腎皮質でも検出された。いずれの遺伝子も膵臓において高発現することが明らかになった。
（ＭＩＮ６細胞及び膵臓ランゲルハンス島におけるＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体の発現分布）
Ｓｅｃ６１複合体等のトランスロコンメンバーが、高グルコース濃度条件下のＭＩＮ６細胞において発現が上昇することから（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5773-5778, 2000）、膵臓内におけるＳＥＰＲ１の発現をさらに詳しく解析するために、マウスインスリノーマ由来の細胞系であるＭＩＮ６を用いて検討した。その結果、ＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体は、ｍＲＮＡ及びタンパク質共に、インスリン産生が盛んになる高濃度のグルコース条件下で発現が上昇することが明らかになった（図２Ａ、Ｂ）。また、膵臓切片を用いてin situハイブリダイゼーションを行ったところ、ＳＥＲＰ１はランゲルハンス島のβ細胞において強い発現が認められ、絶食条件下で発現が低下することが明らかになった（図２Ｃ）。
（ＳＥＲＰ１遺伝子ノックアウトマウスの作製）
インスリンの生合成、及び分泌におけるＳＥＲＰ１の役割を明らかにするために、相同組換え法を用いてＳＥＲＰ１遺伝子ノックアウトマウスを作製した（図３Ａ）。ＳＥＲＰ１+/+マウス（野性型）、ＳＥＲＰ１+/-マウス、及びＳＥＲＰ１-/-マウス（ＳＥＲＰ１ノックアウトマウス）の比較をサザンブロット法により行った（図３Ｂ）。さらにＳＥＲＰ１ ｍＲＮＡ及びＳｅｃ６１α ｍＲＮＡの発現をノザンブロット法で解析したところ、ＳＥＲＰ１-/-マウスでは、ＳＥＲＰ１遺伝子が発現しないことが確認された（図３Ｃ）。
【００４０】
また、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスは、生後約３週間以内に原因不明の理由で約半数が死亡し、生存したＳＥＲＰ１-/-マウスの体重も、ＳＥＲＰ１+/-及びＳＥＲＰ１+/-マウスの５割程度であることが確認された（図４Ｂ、Ｃ）。８週齢以降は、体重の増加と３群間における体重差の縮小が認められ、雌雄ともに生殖可能であることが明らかになった（図４Ｂ）。
【００４１】
ＳＥＲＰ１-/-マウスはメンデルの法則にしたがって生まれ、ＳＥＲＰ１+/+マウス及びＳＥＲＰ１+/-マウスと比較して、体重がわずかに減少したことを除いては、表現型による差は認められなかった（ＳＥＲＰ１-/-マウスに対して０．９±０．１ｇ、他の遺伝子型に対し１．０±０．１ｇ）。しかしながら、１週齢においては、ＳＥＲＰ１-/-マウスの死亡率の上昇（図４Ａ）、及び成長遅延（図４Ｂ及びＣ）が認められ、４週齢になるまで、このような減少が認められた。しかし、予想に反して、後述の２種の表現型では、背景となる系統に依存した。１２９Ｓｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統と交配させたＳＥＲＰ１-/-マウスの約７０％は、成体に成長したが（ｎ＝１４）、Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝１２）と交配させたＳＥＲＰ１-/-マウスでは、その２５％しか４週齢にまで生存しなかった（図４Ａ）。
【００４２】
ＳＥＲＰ１-/-マウスの体重は、生後４週間で、１２９Ｓｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統においては、５０〜７０％にまで減少し、Ｃ５７ＢＬ／６系統においても、４０〜６０％にまで減少した。ＳＥＲＰ１-/-マウスの体重は、同週齢（４週齢まで）のＳＥＲＰ１+/+マウスの約５０％であったため、死亡する傾向にあった。死亡したＳＥＲＰ１-/-マウスの解剖により、胃及び腸内に十分量のミルクを認めた。短命であったＳＥＲＰ１-/-マウスの血中グルコース濃度及び肝臓グリコーゲン濃度の解析により、１〜４週齢においては、他の遺伝子型と比較して、特に大きな違いは認められなかった。これらの結果により、ＳＥＲＰ１-/-マウスの高い死亡率は、哺乳量の減少又は腸での吸収障害によるものではないことが示唆された。ＳＥＲＰ１-/-マウスは、いったん４週齢まで生きると、成長及び体重とも一定して増加した。１２週齢まで、ＳＥＲＰ１-/-マウスの体重は、両系統において、ＳＥＲＰ１+/+マウスの８０％弱にまで回復した。
（グルコース及びインスリン負荷試験）
ＳＥＲＰ１の発現がインスリンの生合成及び分泌へ与える影響を、in vivoにおけるグルコース負荷試験により検討した。１０週齢及び２５週齢のマウスに、体重１ｇあたり２ｍｇのグルコースを腹腔内投与した後、血糖値を測定した結果、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスにおいて耐糖能異常が認められた。特に、雄においては、雌と比較してより強い耐糖能異常が見られたが、加齢による影響は認められなかった（図５）。
【００４３】
次に、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスの耐糖能異常が、末梢でのインスリン抵抗性に起因するものなのかどうかを、インスリン負荷試験により検討した。マウス１ｋｇあたり１ユニットのインスリンを腹腔内投与し、血糖値を測定した結果、ＳＥＲＰ１+/+、ＳＥＲＰ１+/-、及びＳＥＲＰ１-/-マウスの３群間に有意な差は認められなかった（図６）。従って、膵臓におけるインスリン生合成、或いは分泌異常により、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスの耐糖能異常が引き起こされることが示唆された。
（グルコース負荷によるインスリン分泌への影響）
ＳＥＲＰ１+/+マウス（野性型マウス）、ＳＥＲＰ１+/-マウス、及びＳＥＲＰ１-/-マウス（ＳＥＲＰ１ノックアウトマウス）よりランゲルハンス島を単離し、グルコース負荷によるインスリン分泌への影響を解析した。（結果を図７に示す。）その結果、グルコース負荷より１５分後のインスリンの分泌量においては、３群間で有意な差は認められなかったが、負荷後３０分及び６０分後では、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスにおけるインスリン分泌量が有意に減少し、さらに１２０分後には、再び３群間で有意な差が認められなくなった（図７Ａ）。従って、ＳＥＲＰ１は、グルコース負荷後のインスリンの生合成速度に影響を与えることが示唆された。また、インスリン分泌量は、負荷グルコース濃度依存的に増加することが明らかになった（図７Ｂ）。
（ＳＥＲＰ１の強制発現によるインスリン分泌への影響）
野性型マウス及びＳＥＲＰ１ノックアウトマウス由来のランゲルハンス島にアデノウイルスを用いてＳＥＲＰ１ ｃＤＮＡを導入することにより、インスリン分泌量への影響を検討した。はじめに、ランゲルハンス島への遺伝子導入効率を確認するため、作製した組換え型アデノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１を、対照として組換え型アデノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＧＦＰをランゲルハンス島に導入した。ＧＦＰ及びＳＥＲＰ１の発現は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫染色を行った後、蛍光顕微鏡で観察した（図８Ａ）。その結果、組換え型アデノウィルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１は７０％以上の効率で遺伝子が導入されることが確認された。
【００４４】
また、組換え型アデノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１を導入した野性型マウスは、ランゲルハンス島からのインスリン分泌に変化が認められなかったが、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスでは、対照群であるアデノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＧＦＰ導入群と比較して有意にインスリンの分泌が上昇することが認められた（図８Ｂ）。従って、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスでは、ＳＥＲＰ１の存在により、ランゲルハンス島からのインスリン分泌が顕著に改善することが示唆された。
（グルコース刺激後のプロインスリン及びインスリン生合成量の変化）
パルスラベリング法により、ランゲルハンス島でのインスリン生合成及び培養液中への分泌量の経時変化を解析した。その結果、野性型マウスではいずれも、グルコース負荷後３０〜６０分でプロインスリンの合成量が最大となり、その後減少していくのに対し、ノックアウトマウスでは、９０〜１２０分後に合成量が最大となることが認められた（図９Ａ、Ｂ）。従って、ＳＥＲＰ１は、インスリンの合成そのものに直接関与するのではなく、グルコース負荷後の急速なインスリン生合成に必須であることが示唆された。
（ＳＥＲＰ１の発現と膵臓ランゲルハンス島のストレス応答との関係）
ＳＥＲＰ１が、小胞体ストレスによりその発現が上昇することから、ＳＥＲＰ１の発現とランゲルハンス島のストレス抵抗性との関係を、（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ assay）を用いて検討した。ランゲルハンス島を、小胞体ストレスを誘導するツニカマイシン（tunicamycin）で処理したところ、４８時間後、野性型マウスでは、あまり多くの細胞死は認められなかったが、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスでは、細胞死に至る細胞の数が有意に増加した。この細胞死は、小胞体ストレスによる細胞死を防ぐ薬剤であるシクロヘキシミド（cycloheximide）を培地中に添加することにより抑制された。その結果、小胞体ストレスによって引き起こされた細胞死であることが示唆された（図１０）。
（下垂体及びホルモン生合成におけるＳＥＲＰ１遺伝子の影響）
出生後のＳＥＲＰ１-/-マウスにおいて一時的に成長発育不全が認められることから、ＳＥＲＰ１は、新生児の成長と相関しているホルモンの生合成において重要な役割を果たしていることが示唆された。マウス脳（大脳皮質及び視床下部）及び脳下垂体からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットより、ＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体（Ｓｅｃ６１β）両者とも下垂体において高発現していることが明らかになった（図１１Ａ）。免疫組織学的解析によりＳＥＲＰ１の発現は、成長ホルモンの分布と同様、前葉において観察された（図１１Ｂ）。Ｃ５６ＢＬ／６系統及び１２９ｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統の各遺伝子型の成熟マウス（１２〜１６週齢、図１１Ｃ  Ｉ、II）及び新生児マウス（６日）を用いて解析したところ、コントロールである野生型と比較して、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいて下垂体前葉の大きさが減少していることが明らかになった。下垂体中葉及び後葉においては、このような変化は認められなかった。
【００４５】
下垂体前葉の体積の減少は、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいて下垂体前葉の細胞数が減少していることに起因した。免疫染色によって解析した結果、個々の細胞の大きさは、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいてもほぼ同程度であり、下垂体ホルモン陽性細胞の割合も、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいて顕著に減少することはなかった（図１１Ｄ）。
【００４６】
成長ホルモン（ＧＨ）生合成／分泌におけるＳＥＲＰ１遺伝子の欠損による影響を解析するために、インスリン負荷試験（ＩＴＴ）を行い、Ｃ５６ＢＬ／６系統及び１２９ｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統の各遺伝子型の成熟マウス（１２〜１６週齢）における血中ＧＨレベルを測定した。ＳＥＲＰ１+/+マウスにおいて、低血糖に対する応答に対して血中ＧＨが増加し、インスリン投与後６０分後に最高値に達した（１８±２．１ｎｇ／ｍＬ）。一方、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいて６０分後の時点で上昇しなかった（６±０．５ｎｇ／ｍＬ）。９０分後、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいてはＧＨレベルが上昇したが、野生型においてＧＨレベルが徐々に減少し始めた。１２０分後、各群ともＧＨレベルは同程度となった（１３〜１５ｎｇ／ｍＬ）。
【００４７】
下垂体前葉の研究において、ＧＨを有する細胞内においても、高レベルのＳＥＲＰ１の発現が観察された（図１１Ａ及びＢ）。実際、コントロールの野生型と比較して、ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいては下垂体前葉が顕著に減少し、細胞の大きさは同程度にもかかわらず、細胞数の減少に至った。これらのデータによりＳＥＲＰ１は、インスリンに対する膵臓ランゲルハンス島における実験と同様の機構で、下垂体ホルモンの生合成を促進すると推測される。この推測と一致して、免疫染色により判断したＧＨ又は他の下垂体ホルモンの基礎的生合成量は、各遺伝子型の間で変化なかったにもかかわらず（図１１Ｄ）、成熟ＳＥＲＰ１-/-マウスにおいては、インスリンで刺激された後のＧＨの産生が著しく遅延した（図１１Ｅ）。それゆえに、ＳＥＲＰ１はＧＨの生合成速度を増加させ、また、下垂体前葉におけるホルモン産生細胞の成長及び増殖に影響を与えることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の実施例における試験において、ヒトの内分泌組織におけるＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体ｍＲＮＡの発現分布を示す図である。
【図２】本発明の実施例における試験において、Ａは、ＭＩＮ６細胞におけるＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体ｍＲＮＡの発現量に対するグルコースの影響を示す図である。また、Ｂは、ＭＩＮ６細胞におけるＳＥＲＰ１及びＳｅｃ６１複合体タンパク質の発現量に対するグルコースの影響を示す図である。更に、Ｃは、膵臓におけるＳＥＲＰ１ｍＲＮＡの発現（ランゲルハンス島に強く発現）と、ＳＥＲＰ１発現に対する絶食の影響を、in situハイブリダイゼーションにより解析した結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例において、Ａは、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスの作製に用いたターゲッティングベクターの構造を示す図である。また、Ｂは、作製したＳＥＲＰ１ノックアウトマウスをサザンブロット法で確認した結果を示す図である。さらに、Ｃは、作製したＳＥＲＰ１ノックアウトマウスのＳＥＲＰ１ ｍＲＮＡの発現をノザンブロット法で確認した結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例における試験において、出生後のＳＥＲＰ１-/-マウスが成長遅延を呈すことを示す図である。Ａ：ＳＥＲＰ１+/+マウス、ＳＥＲＰ１+/-マウス、ＳＥＲＰ１-/-新生児マウスの生存率の変化を示す図である。各群の出生時におけるマウスの頭数を１００とした。Ｃ５６ＢＬ／６系統のＳＥＲＰ１-/-マウスは、１２９ｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統のＳＥＲＰ１-/-マウスと比較して生存率が低かった。Ｂ：特定の遺伝子型のＳＥＲＰ１マウスにおいて、出生後の体重が遺伝的要因によって決定されるを示す図である。Ｃ：１２９ｖ／ＪｘＣ５７ＢＬ／６系統の同腹仔における、ＳＥＲＰ１+/+マウスとＳＥＲＰ１-/-マウスの大きさを比較した図である。
【図５】本発明の実施例における試験において、インスリンの生合成及び分泌に対するＳＥＲＰ１の発現の影響を、グルコース負荷試験により調べた結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例における試験において、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスの耐糖能異常をインスリン負荷テストを用いて解析した結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例における試験において、Ａは、ランゲルハンス島β細胞におけるグルコース負荷後のインスリン分泌量の経時変化を示す図である。また、Ｂは、ランゲルハンス島β細胞において、インスリンの分泌量がグルコース濃度依存的に上昇することを示す図である。
【図８】本発明の実施例において、Ａは、ＳＥＲＰ１ノックアウトマウスのランゲルハンス島細胞に、組換え型アデノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡ ＳＥＲＰ１が導入されたことを示す図である。また、Ｂは、ＳＥＲＰ１ ｃＤＮＡを導入したランゲルハンス島におけるインスリンの分泌量の経時変化を示す図である。
【図９】本発明の実施例における試験において、Ａは、グルコース刺激後のランゲルハンス島における、細胞中のプロインスリン生合成量及び培養液中へのインスリン分泌量の経時変化を、パルスラベリング法により解析した結果を示す図である。また、Ｂは、Ａの結果をグラフ化した図である。
【図１０】本発明の実施例における試験において、ＳＥＲＰ１の発現と、ランゲルハンス島のストレス抵抗性との関係を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ assayにより解析した結果を示す図である。なお、図中のＴｍはツニカマイシン（tunicamycin）を、Ｃｘはシクロへキシミド（cycloheximide）をそれぞれ示す。
【図１１】Ａ及びＢ：下垂体における、ＳＥＲＰ１、Ｓｅｃ６１β、成長ホルモン（ＧＨ）、β−アクチン抗原の発現について、それぞれの抗体を用いて、ウエスタンブロットを行った結果、及び、抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す図である。Ｃ：ＳＥＲＰ１-/-マウス下垂体前葉の形成不全について、Ｉ：各遺伝子型のマウス（１２〜１６週齢、前額断）から摘出した下垂体をＨ＆Ｅ染色したものである。II：Iで得られた写真において、前葉（ａ）、及び後葉（ｐ）＋中葉（ｉ）部位の面積を測定した結果を示す図である。Ｄ：各遺伝子型における下垂体前葉ホルモン陽性細胞の数を、総細胞数に対する割合（％）で示した図である。Ｅ：各遺伝子型のＳＥＲＰ１マウス（８〜１２週齢）における、インスリンによる刺激後の所定時間におけるＧＨ生合成／分泌の関係について示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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