(57)【要約】【課題】　生物的サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量する方法の提供。【解決手段】　生物的サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量する方法は、HIVプロテアーゼ、HIVプロテアーゼの分光学的基質、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われる生物学的サンプルを一緒にしてアッセイ混合物を形成することを含む。アッセイ混合物の分光学的性質を測定し、生物学的サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に関連付けることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　生物学的サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量する方法であって、
　HIVプロテアーゼ、HIVプロテアーゼの分光学的基質、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われる生物学的サンプルを一緒にしてアッセイ混合物を形成させ；
　アッセイ混合物の分光学的性質を測定し；そして
　アッセイ混合物の分光学的性質を、生物学的サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に関連付けることを含む、方法。
【請求項２】
　分光学的性質は、蛍光放射を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
　分光学的性質は、UV-可視吸収を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
　生物学的サンプルは、ヒト血清を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
　生物学的サンプルは、ヒト血漿を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
　HIVプロテアーゼは、HIV-1プロテアーゼを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
　HIVプロテアーゼインヒビターは、HIVプロテアーゼインヒビター化合物を含む、請求項１の方法。
【請求項８】
　インヒビター化合物は、アンプレナビル（amprenavir）、インジナビル（indinavir）、ロピナビル（lopinavir）、ネルフィナビル（nelfinavir）、リトナビル（ritonavir）、およびサキナビル（saquinavir）よりなる群から選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
　HIVプロテアーゼインヒビターは、抗HIVプロテアーゼ抗体である、請求項１の方法。
【請求項１０】
　分光学的基質は、配列番号５、配列番号19、配列番号20、および配列番号21よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項２の方法。
【請求項１１】
　　分光学的基質は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、および配列番号18よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項３の方法。
【請求項１２】
　分光学的基質は、第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基の間に切断可能な結合を含むポリペプチドを含み、
　第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基の少なくとも１つは、p-ニトロフェニルアラニン残基である、請求項２の方法。
【請求項１３】
　分光学的基質は、第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基の間に切断可能な結合を含むポリペプチドを含み、
　第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基の少なくとも１つは、p-ニトロフェニルアラニン残基である、請求項３の方法。
【請求項１４】
　生物中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度をモニタする方法であって、
　ある用量のHIVプロテアーゼインヒビターを生物に投与し；
　生物から液体サンプルを得て；
　サンプルをHIVプロテアーゼとHIVプロテアーゼの分光学的基質と一緒にし；
　サンプルの分光学的性質を測定し；そして
　サンプルの分光学的性質を、生物中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度と関連付けることを含む、方法。
【請求項１５】
　HIVプロテアーゼインヒビターは、アンプレナビル（amprenavir）、インジナビル（indinavir）、ロピナビル（lopinavir）、ネルフィナビル（nelfinavir）、リトナビル（ritonavir）、およびサキナビル（saquinavir）よりなる群から選択されるHIVプロテアーゼインヒビター化合物を含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
　生物学的サンプルは、ヒト血清またはヒト血漿を含む、請求項１４の方法。
【請求項１７】
　HIVプロテアーゼはHIV-1プロテアーゼを含む、請求項１４の方法。
【請求項１８】
　分光学的性質は、UV-可視吸収を含み、分光学的基質は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、および配列番号18よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１４の方法。
【請求項１９】
　分光学的性質は、蛍光放射を含み、分光学的基質は、配列番号５、配列番号19、配列番号20、および配列番号21よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１４の方法。
【請求項２０】
　分光学的基質は、第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基の間に切断可能な結合を含むポリペプチドを含み、
　第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基の少なくとも１つは、p-ニトロフェニルアラニン残基である、請求項１４の方法。
【請求項２１】
　HIVプロテアーゼを含む第１の容器；
　HIVプロテアーゼのための分光学的基質を含む第２の容器；および
　HIVプロテアーゼと分光学的基質を生物学的サンプルと一緒にし、サンプルの分光学的シグナルを測定し、分光学的シグナルをサンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度と関連付けるための指示書、
　とを含む検査キット。
【請求項２２】
　HIVプロテアーゼは、HIV-1プロテアーゼを含む、請求項２１の検査キット。
【請求項２３】
　請求項１４の検査キットであって、分光学的基質は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号21よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１４の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　後天性免疫不全症（AIDS）を有する患者の臨床的管理は、強力かつ特異的なHIVプロテアーゼインヒビターとして機能する化合物の導入により実質的に改善されている。ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）はAIDSの原因菌であり、酵素HIVプロテアーゼは、HIVのgagとgag-polポリペプチドを特異的に切断すると考えられている。変異により不活性化したHIVプロテアーゼを合成するウイルスは、一般に感染性ビリオンを形成しない。従ってHIVプロテアーゼは、AIDSに対する薬剤を設計することができる重要な標的である。HIVプロテアーゼインヒビター化合物ならびに抗HIVプロテアーゼ抗体は、HIVプロテアーゼの活性の低下または停止を引き起こすことができる。
【０００２】
　現在、AIDS患者の治療用に食品医薬品局（FDA）により６つのHIVプロテアーゼインヒビター化合物が認可されている（アンプレナビル（amprenavir）、インジナビル（indinavir）、ロピナビル（lopinavir）、ネルフィナビル（nelfinavir）、リトナビル（ritonavir）、およびサキナビル（saquinavir））。HIVプロテアーゼインヒビター化合物とHIV逆転写酵素を用いる併用療法は、HIV感染に現在推奨されている治療法の土台である。必ずしもすべてのAIDS患者が、併用療法に対して同じ最適応答を示すわけではない。個々の患者間の薬剤への応答には大きな変動があり、プロテアーゼインヒビター化合物への全身性暴露と抗ウイルス作用の関係が、臨床的情報の蓄積により裏付けられている。併用療法が患者に行われる時、薬物動態的薬物−薬物相互作用の可能性が、治療を改善したり弱めたりすることがある。充分な薬物レベルの維持に直接関係する患者のコンプライアンスもまた、治療の結果に影響を与える。
【背景技術】
【０００３】
　従って、患者でHIVプロテアーゼインヒビター化合物の濃度を測定して、薬物への暴露がAIDS患者の抗ウイルス活性を維持するのに充分であることを確実にすることが好ましい。さらに、被験体の生物学的サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビター化合物の定量的測定は、薬剤開発プロセスに非常に重要である。HIVの治療に関連する他の測定には、患者サンプル中の抗HIVプロテアーゼ抗体の測定がある。抗HIVプロテアーゼ抗体の存在は、HIVによる患者の感染を示し、従って抗体の検出は、感染の可能性を診断するのに使用することができる。
【０００４】
　典型的には、患者サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビター化合物は、不連続アッセイ法により定量されている。不連続法は、特定の時点での１つ以上の化合物の濃度の単一の測定値を与える。濃度の経時変化の測定は、明確な時間間隔で複数のサンプルの別々の測定が必要である。例えば、血漿サンプルは、クロマトグラフィー法を使用して、多数のHIVプロテアーゼインヒビター化合物について同時に分析することができる。例えば、Poirier, J.M.ら、Ther. Drug Monit. 22:465-473 (2000)；Marzonlini, C.ら、J. Chromatogr. 740:43-58 (2000)；および Remmel, R.P.ら、Clin. Chem. 46(1):73-81 (2000)を参照されたい。血漿サンプルは典型的には、固相抽出法を行ってから試験される。すなわち、血漿は直接測定はできず、修飾が必要であり、分析の複雑さと費用が増える。
【０００５】
　他のクラスの不連続アッセイは、ラジオイムノアッセイである。例えば、ヨウ素125で標識したHIVプロテアーゼインヒビター化合物の誘導体は、患者血漿中の任意のインヒビター化合物と、化合物の抗体との結合について競合すると報告されている。次に、沈降した抗体複合体は、HIVプロテアーゼインヒビター化合物の濃度を決定するために、放射活性のレベルについて分析される。例えば、Wiltshire, H.R.ら、Analyt. Biochem. 281:105-114 (2000)。
【０００６】
　不連続アッセイの別の例において、血漿中の抗HIVプロテアーゼ抗体の存在は、血漿サンプルに加えられるHIVプロテアーゼの活性を測定することにより、定性的に測定することができると報告されている。例えば、HIVプロテアーゼは、HIVプロテアーゼの基質とともに、サンプルに加えることができる。基質の切断は、切断産物に特異的に結合する抗体を使用するイムノアッセイにより測定することができる。切断産物が存在しないことは、抗HIVプロテアーゼ抗体が存在することを示す。例えば、US Patent No. 5,171,662を参照されたい。
【０００７】
　HIVプロテアーゼのインヒビター化合物および／または抗体を測定するための上記の不連続法は、成功ばかりではない。すなわち、生物学的サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビター化合物および／または抗HIVプロテアーゼ抗体を定量するための改良された方法に対するニーズがある。そのような方法は、現在利用可能な分析装置を使用して連続アッセイで容易に行うことができる。
【非特許文献１】Poirier, J.M.ら、Ther. Drug Monit. 22:465-473 (2000)
【非特許文献２】Marzonlini, C.ら、J. Chromatogr. 740:43-58 (2000)
【非特許文献３】Remmel, R.P.ら、Clin. Chem. 46(1):73-81 (2000)
【非特許文献４】Wiltshire, H.R.ら、Analyt. Biochem. 281:105-114 (2000)
【特許文献１】US Patent No. 5,171,662
【発明の開示】
【０００８】
要約
　本発明の１つの態様において、生物学的サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量する方法であって、HIVプロテアーゼ、HIVプロテアーゼの分光学的基質、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われる生物学的サンプルを一緒にしてアッセイ混合物を形成させ；アッセイ混合物の分光学的性質を測定し；そしてアッセイ混合物の分光学的性質を、生物学的サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に関連付けることを含む、方法がある。
【０００９】
　本発明の別の態様において、生物中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度を追跡する方法であって、HIVプロテアーゼインヒビターのある用量を生物に投与し；生物から液体サンプルを得て；サンプルとHIVプロテアーゼおよびHIVプロテアーゼのための分光学的基質とを一緒にし；サンプルの分光学的性質を測定し；そしてサンプルの分光学的性質を、生物中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に関連付けることを含む、方法がある。
【００１０】
　本発明のさらに別の方法において、検査キットであって、HIVプロテアーゼを含む第１の容器；HIVプロテアーゼのための分光学的基質を含む第２の容器；およびHIVプロテアーゼと分光学的基質を生物学的サンプルと一緒にし、サンプルの分光学的シグナルを測定し、分光学的シグナルをサンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度と関連付けるための指示書、とを含むキットがある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
詳細な説明
　本発明は、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビター化合物および／または抗HIVプロテアーゼ抗体の濃度を測定するための、酵素アッセイ系に関する。この系は、HIVプロテアーゼ（HIV-PR）と、基質がHIV-PRにより切断される時、検出可能な分光学的シグナルを与える分光学的基質とを含む。HIV-PRおよび分光学的基質を、HIVプロテアーゼインヒビター化合物および／または抗HIVプロテアーゼ抗体を含有するサンプルと接触させると、分光学的シグナルが変化し、この変化は、サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビター化合物および／または抗HIVプロテアーゼ抗体の濃度と相関させることができる。
【００１２】
　HIVプロテアーゼインヒビター（「HIV-PI」と呼ぶこともある）という用語は、HIVプロテアーゼインヒビター化合物と抗HIVプロテアーゼ抗体の両方を含む。HIVプロテアーゼインヒビター化合物の例には、HIVプロテアーゼの活性を低下または排除させることができる、ペプチド、有機化合物、有機金属化合物、および金属錯体がある。HIVプロテアーゼインヒビター化合物の具体例には、AIDS患者の治療のためにFDAにより現在認可されている化合物（すなわち、アンプレナビル（amprenavir）、インジナビル（indinavir）、ロピナビル（lopinavir）、ネルフィナビル（nelfinavir）、リトナビル（ritonavir）、およびサキナビル（saquinavir））がある。抗HIVプロテアーゼ抗体は、他の物質を除き、HIVプロテアーゼ酵素に対する特異的結合親和性を有する抗体である。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗体断片を含む。
【００１３】
　ペプチドは、アミド（ペプチド）結合により２つ以上のアミノ酸が結合して形成される任意の化合物であり、通常は、各アミノ酸残基のα−アミノ基（NH2末端を除く）が、線状の鎖の次の残基のα−カルボキシル基に結合するα−アミノ酸のポリマーである。ペプチド、ポリペプチド、およびポリ（アミノ酸）という用語は、本発明において同義で使用され、サイズは限定せずにこのクラスの化合物を意味する。このクラスの最大のメンバーは、タンパク質と呼ばれる。
【００１４】
　「生物学的サンプル」という用語は、生体から得られる体液を意味する。生物学的サンプルは、好ましくは水性混合物、例えば尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、便、喀痰、脳脊髄液、涙、粘液などがあるが、好ましくは血漿または血清、およびさらに好ましくはヒト血漿またはヒト血清である。
【００１５】
　HIV-PIを含有することが疑われる試料は、本発明の方法により分析することができる。必要であればサンプルを前処理し、アッセイを妨害しない便利な媒体中で調製することができる。水性媒体が好適である。
【００１６】
　分光学的基質は、HIV-PRと接触された時、検出可能な分光学的シグナルを与える物質である。分光学的シグナルは、例えば、特定の波長での放射線の吸収の増加または減少である。分光学的シグナルは、例えば特定の波長での蛍光または燐光の放射の増加または低下である。別の例において分光学的シグナルは、吸収または発光スペクトルの極大が観察される波長での、分光学的シグナルのシフトである。他の検出可能な分光学的シグナルは、光学密度と発光の測定がある。
【００１７】
　分光学的基質は、例えば、HIV-PRの天然の基質に類似したポリペプチド鎖である。HIV-PRは、gagおよびgag-polポリペプチド内の少なくとも９つの異なる部位の切断に関与すると考えられる。ある基質のHIV-PR切断は、以下の式で示される：
　P6-P5-P4-P3-P2-P1*P1'-P2'-P3'-P4'-P5'
ここで、アミノ酸は、切断可能な結合からペプチドのアミノ（N）末端に向かってP1、P2など、および切断可能な結合からカルボキシル(C)末端に向かってP1'、P2'などと番号を付ける。基質の切断中に破壊される切断可能な結合の位置は、”*”記号で示す。P4-P3'部位にまたがる少なくとも７つのアミノ酸残基が、酵素の表面上のサブ部位の伸長シリーズとの有効な相互作用を提供すると報告されている。
【００１８】
　分光学的基質は好ましくは、７〜11アミノ酸残基を含有し、さらにHIV-PRにより切断される切断可能な結合を含有する。好適な基質は、天然に存在するペプチド
　H-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Ala-Glu-Ala-Met-Ser-NH2 （配列番号１）
の-Leu*Ala-切断部位に基づく配列を有し、これは、HIVポリペプチド中のカプシドタンパク質（CA）とヌクレイオカプシドタンパク質（NC）の結合部の１つである。
【００１９】
　分光学的基質は、基質がHIV-PRにより切断される時変化する分光学的シグナルを与える、１つ以上の部分を含有してもよい。分光学的シグナルを与える分光学的基質内の部分は、種々の部分がある。例えば発色性基は、紫外線および／または可視（UV-可視）吸収の変化を引き起こすのに使用することができ、これは、UV-可視分光学的方法により検出することができる。別の例において、基質内の１つ以上の蛍光性基は、HIV-PRによる基質の切断により蛍光挙動の変化を引き起こし、次に、この変化は蛍光分光学的方法により検出することができる。さらに別の例において、重水素、炭素13、リン31、または他の安定なアイソトープを含有するアイソトープ標識した基を使用して、基質の放射線磁気的性質の変化を引き起こすことができ、これは、核磁気共鳴（NMR）法により検出することができる。さらに別の例において、ジオキセタンまたはルシフェリンのような発光性基を使用して、基質の発光の変化を引き起こすことができ、これは、ルミノメーターにより検出することができる。
【００２０】
　発色性基の例には、p-ニトロフェニル基（これは、p-ニトロフェニルアラニン（Nph）残基を含めることにより、ペプチド鎖内に取り込むことができる）がある。P1またはP1'にNph基を有するペプチドは、HIV-PR（Nph）の特に有用な分光学的基質である。P1またはP1'位でNphで分光学的基質を加水分解すると、特定の波長でUV-可視吸収の変化を引き起こし、これは切断速度に比例する。基質のアミノ酸配列のさらなる修飾は、HIV-PRに対する感受性、溶解度、および環境安定性を変化させ得ることがある。分光学的性質の変化のpH依存性はまた、酸化されにくいノルロイシン（Nle）残基による、PI'位のNph残基の置換、および容易に酸化されるメチオニン（Met）残基の置換を含む、配列修飾により改変することができる。
【００２１】
　配列番号１のペプチドに基づきかつ発色性基を含む分光学的基質は、Nashed, N.T.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1079 (1989)；Richards, A.D.ら、J. Biol. Chem. 265 (14), 7733 (1990)；およびTomaszek, Jr., T.A. ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 168, 274 (1990)（これらのすべては、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。発色性基を含有するいくつかの好適な分光学的基質（発色基質と呼ぶ）の配列は、以下の通りである：
　Ac-Lys-Ala-Ser-Gln-Asn*Nph-Pro-Val-Val-NH2　　　　　　　　（配列番号2）
　H-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-Glu-Ala-Nle-Ser-NH2　　　　 （配列番号3）
　H-Lys-Ala-Arg-Val-Nle*Nph-Glu-Ala-Nle-NH2　　　　　　　　 （配列番号4）
　H-Lys-Ala-Arg-Val-Tyr*Nph-Glu-Ala-Nle-NH2　　　　　　　　 （配列番号5）
　H-Ala-Arg-Val-Nle*Nph-Glu-Ala-Nle-NH2　　　　　　　　　　 （配列番号6）
　H-Arg-Val-Nle*Nph-Glu-Ala-Nle-NH2　　　　　　　　　　　　 （配列番号7）
　Ac-Arg-Lys-Ile-Leu*Nph-Leu-Asp-Gly-NH2　　　　　　　　　　（配列番号8）
　H-Lys-Ala-Val-Leu*Nph-Glu-Ala-Met-NH2　　　　　　　　　　 （配列番号9）
　H-Lys-Ala-Val-Leu*Nph-Glu-Ala-Nle-Gly-NH2　　　　　　　　 （配列番号10）
　H-Lys-Ala-Val-Tyr*Nph-Glu-Ala-Nle-NH2　　　　　　　　　　 （配列番号11）
　H-Lys-Ala-Val-Met*Nph-Glu-Ala-Nle-NH2　　　　　　　　　　 （配列番号12）
　H-Lys-Ala-Val-Nle*Nph-Glu-Ala-Nle-NH2　　　　　　　　　　 （配列番号13）
　H-Lys-Ala-Val-Nle*Nph-Glu-Ala-Nle-Gly-NH2　　　　　　　　 （配列番号14）
　H-Lys-Ala-Val-Phe*Nph-Glu-Ala-Nle-Gly-NH2　　　　　　　　 （配列番号15）
　H-Lys-Ala-Val-Ile*Nph-Glu-Ala-Nle-NH2　　　　　　　　　　 （配列番号16）
　H-Lys-Ala-Val-Val*Nph-Glu-Ala-Nle-NH2　　　　　　　　　　 （配列番号17）
　Ac-Thr-Ile-Nle*Nph-Gln-Arg-NH2　　　　　　　　　　　　　　（配列番号18）
　溶液中のこれらの物質の切断は、300ナノメートル（nm）の波長での溶液の吸光度を測定することにより、追跡することができる。
【００２２】
　蛍光システムのHIV-PR基質（蛍光物質と呼ぶ）は、切断可能な結合の一端に蛍光ドナーを含有し、切断可能な結合の他端に蛍光アクセプターを含有してもよい。蛍光ドナーは、ある波長の放射線により励起されると、異なる波長の蛍光を介する光を放出する部分である。蛍光アクセプターは、ドナーからの蛍光を吸収して蛍光放射を防ぐことができる部分である。すなわち、ドナーとアクセプターが同じ基質上に局在化している時、正味の蛍光はほとんどまたは全く検出されない。基質がいったん切断されると、各成分の蛍光挙動は、蛍光ドナーからの蛍光放射の検出を含む標準的蛍光分光測定により検出することができる。
【００２３】
　蛍光ドナーの例には、フルオレセイン；フルオレセインの誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアネートおよび置換フルオレセイン；2-アミノ安息香酸塩；ローダミン；トリプトファン；およびナフタレン誘導体、例えば5-(2'-アミノエチルアミノ）ナフタレンスルネートを含む。フルオレセインアクセプターの例には、ベンジルアゾ誘導体基、例えば4-(4'-ジメチルアミノベンゼンアゾ）ベンゾイルを含む。
【００２４】
　蛍光性基を含有するHIV-PRの分光学的基質は、例えば、Toth, M.V.ら、Int. J. Pept. Res. Protein 36, 544 (1990)；Rich, D.H.ら、J. Med. Chem. 35, 3803 (1992)；Geoghegan, K.F.ら、FEBS Lett. 262, 119 (1990)；および Krafft, G.A.ら、Methods in Enzymology 241 (6), 70 (1994)（これらはすべて、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えば、基質
　Ac-Thr-Ile-Nle*Nph-Gln-Arg-NH2　　　　　　　　　　　　　　（配列番号18）
は、アセチル（Ac）末端基を2-アミノ安息香酸残基（Abz）で置換することにより蛍光基質に変換して、蛍光基質
　Abz-Thr-Ile-Nle*Nph-Gln-Arg-NH2　　　　　　　　　　　　　 （配列番号19）
を与えることができる。この基質がいったん切断されると、337nmの放射線により切断産物が励起されて、390-449nmに極大を有する蛍光放射を生じる。
【００２５】
　蛍光基質の他の例には、
　X-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Y　　　　　　　　　　　 （配列番号20）
（ここで、Ｘは、4-(4-ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸残基であり、Ｙは、5-[(2-アミノエチル）アミノ]ナフタレン-1-スルホン酸残基である）と
　Z-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Trp　　　　　　　　　　　　 （配列番号21）
（ここで、Ｚは、5-ジメチルアミノナフタレン-1-スルホニル残基である）がある。配列番号20のアミノ酸配列を有する基質の切断産物を340nmでの照射により励起すると、490nmに極大を有する蛍光放射を生成する。配列番号21のアミノ酸配列を有する基質の切断産物を290nmでの照射により励起すると、360nmに極大を有する蛍光放射を生成する。配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドはまた、有用な蛍光基質であると報告されており、277nmの照射により切断産物が励起され、306nmに極大を有する蛍光放射を生成する（PCT特許出願公報 WO 99/67417）。
【００２６】
　好ましくは、HIV-PRと上記の分光学的基質との相互作用は、ミハエリス−メンテン動力学に従う。これらの基質のミハエリス定数（Km）、速度定数（kcat）、および最大反応速度（Vmax）のような動力学的値は、例えばROCHE DIAGNOSTICS COBAS FARA（ROCHE DIAGNOSTICS、インディアポリス、インディアナ州）のような標準的自動分析機で分光光度計により測定することができる。好ましくは、動力学的値は、30〜180ナノモル（nM）（5〜30国際単位（IU））の濃度の活性HIV-PRを、0〜400マイクロモル（μM）の濃度の分光学的基質と混合して測定される。酵素は、HIV-1プロテアーゼまたはHIV-2プロテアーゼでもよい。好ましくは酵素はHIV-1プロテアーゼである。例えば、上記の発色基質について、切断速度は、好ましくはpH範囲２〜５で温度範囲25〜30℃での300〜310nmの吸光度の低下と相関している。蛍光基質について切断速度は、好ましくは適切な波長の照射による励起による、蛍光放射の低下と相関している。
【００２７】
　特定のHIV-PIの濃度は、HIV-PR活性の阻害に反比例する。従って、サンプル中のHIV-PRと分光学的基質の相互作用をモニタすることにより、サンプル中のHIV-PIの濃度を測定することができる。標準的HIV-PR阻害検査は、標準的自動アナライザーの分光光度計により行われる。好ましくは、60〜120nMの活性HIV-PRが、基質のKm値の100〜200％濃度の分光学的基質および０〜1000nMの濃度の目的のHIV-PIと混合される。生じる分光学的基質の切断速度の低下は、分光学的性質の変化を測定することにより決定することができる。ある範囲の濃度の速度低下測定値の結果は、未知量のインヒビターを含有するサンプル中の目的のHIV-PI濃度を測定するための較正物質として使用することができる。
【００２８】
　較正物質とは、測定すべきアナライトの既知量を含有する任意の標準的または基準物質を意味する。アナライトを含有することが疑われるサンプルと較正物質を、同様の条件下で測定する。次に、未知試料について得られた結果を、標準物質について得られた結果と比較することにより、アナライト濃度が計算される。
【００２９】
　目的の１つ以上のHIV-PIについて、分光学的アナライザーがいったん較正されたら、未知濃度の１つ以上のHIV-PIを有するサンプルを分析することができ、得られる分光学的シグナルは、サンプル中のHIV-PI濃度と相関付けられる。分光学的アナライザーの例には、UV-可視分光光度計、蛍光高度計、ルミノメーター、およびNMR装置がある。好ましくは、サンプル中のHIV-PIの測定濃度は、較正物質で使用される濃度の最小値と最大値の間の値である。
【００３０】
　本発明の方法は、生物学的サンプル中のHIV-PIを定量するのに使用することができる。生物学的サンプルには、生体から得られる液体サンプル、例えば、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、便、喀痰、脳脊髄液、涙、粘液などがある。このような液体は、典型的には、水と目的のHIV-PI以外に種々の成分（種々のペプチド、脂質、塩、および他の化合物および／または抗体）を含む。これらの外因性成分は、HIV-PRと、分光学的基質とHIV-PIのいずれかまたはその両方との相互作用を妨害し得る。例えば、基質および／またはHIV-PIは、１つ以上の外因性成分と吸着または反応することがある。HIV-PRはまた、液体中の他のペプチドを非特異的に切断することがある。体液のアッセイにおける妨害の可能性があるのに、HIV-PIが、本発明の酵素アッセイにより生物学的サンプル中で定量できることは、驚くべきことでかつ予想外である。
【００３１】
　従って本発明の方法は、治療用量を投与された患者のHIVプロテアーゼインヒビター化合物のレベルをモニタするのに使用される。HIVプロテアーゼインヒビター化合物のレベルの評価および陽性または陰性症状との相関は、AIDS患者の治療を修飾するのに使用することができる。HIVプロテアーゼインヒビター化合物の測定はまた、そのような化合物のまたはこのような化合物の組合せの有効性を評価するのに使用される。本発明の方法はまた、患者の抗HIVプロテアーゼ抗体のレベルを追跡するのに使用される。抗体の存在の測定は、HIVによる感染を診断するのに有用であり、抗体のレベルの測定は、ウイルスまたは抗ウイルス治療に対する患者の応答を評価するのに有用である。
【００３２】
　本発明の方法の使用は、HIV-PIの濃度を測定するための検査キットを提供することにより容易になる。例えば検査キットは、パッケージされた組合せで、活性HIV-PR、およびHIV-PRの分光学的基質を含有する。好ましくは、HIV-PR酵素と分光学的基質は、別々にパッケージされて、キット中の基質濃度が、酵素による切断によって低下しないようにされる。キットの成分は、液体または凍結乾燥型でもよい。好ましくは成分は、試薬の比率が、方法およびアッセイの実質的最適化を与えるような量で提供される。キットはまた、既知量のHIV-PIを含む１つ以上の較正物質を含有してもよい。キットはまた、本発明の方法を実施するための指示書を含有してもよい。例えば、キットは、HIV-PRと分光学的基質を生物学的サンプルと一緒にし、一緒にしたサンプルからの分光学的シグナルを測定するための指示書を含有してもよい。指示書はまた、サンプル中のHIV-PIの濃度の便利な計算を可能にするための適切な式を提供する。
【００３３】
　検査キットは、特定の目的のために最適化してもよい。例えば、HIV-PRの量と分光学的基質の種類と量は、HIV感染の診断のための抗HIVプロテアーゼ抗体に対する最適感度を提供するように変化させてもよい。別の例において、HIV-PRの量と分光学的基質の種類と量は、ある特定のHIVプロテアーゼインヒビター化合物に対する最適感度を与えるように変化させてもよい。さらに別の例において、HIV-PRの量と分光学的基質の種類と量は、化合物の個々の濃度が測定できるように、HIVプロテアーゼインヒビター化合物の組合せに対する最適感度を提供するように変化させてもよい。
【００３４】
実施例
　以下の例は、例示のためであって、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００３５】
　合成発色基質 H-His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-Glu-Ala-Nle-Ser-NH2（配列番号3）と酵素HIV-1プロテアーゼ（0.65mg/ml、16国際単位/mg（IU/mg））は、BACHEM AMERICAS（King of Prussia, PA）から購入した。
【実施例１】
【００３６】
発色基質の加水分解のモニタ
　５mgの発色基質を５mlのアッセイバッファーに溶解して、HIV-PRアッセイバッファー（50ミリモル（mM）酢酸ナトリウム、pH 4.9、200mM NaCl、５mM ジチオスレイトール（DTT）、10％(v/v)グリセロール）中の１mg/mlの発色基質を含有するストック溶液を、調製した。Roche COBAS FARAのサンプルカップに、101マイクロモル（μM）濃度の基質溶液を、基質ストックからHIV-PRアッセイバッファーに調製した。次に、受け取ったHIV-1 PRのストック混合物を、この混合物に20倍希釈した。HIV-1 PRによる基質の加水分解を、ROCHE DIAGNOSTICS COBAS FARA装置で、300nmで25℃でモニタした。加水分解の経時変化を図１に示す。
【実施例２】
【００３７】
動力学的パラメータの測定
　実施例１に記載のように、５mgの発色基質を1.67mlのアッセイバッファーに溶解して、３mg/ml濃度の発色基質を含有するストック溶液を調製した。０〜2282μMの濃度範囲にわたって、HIV-PRアッセイバッファーで一連の基質溶液を調製した。次に、HIV-1 PRのストック溶液を、HIV-PRアッセイバッファーで20倍希釈した。HIV-1 PRによる基質の加水分解を、実施例１に記載のようにROCHE DIAGNOSTICS COBAS FARA装置で、300nmで25℃でモニタした。ROCHE COBAS FARAのアッセイパラメータを表１に示す。代表的な動力学的プロットを図２に示す。基質は、見かけのKm、Vmzxおよびkcat値がそれぞれ67.03±7.55μM、156.81マイクロモル／ミリグラム分（μmol/mg・分）、および58.02s-1で、HIV-1 PRにより加水分解された。
【表１】
2004049239.tif 000002
【実施例３】
【００３８】
サキナビルによるHIV-PR阻害試験
　実施例１に記載のように、１mg/mlの基質のストック溶液を調製し、次にHIV-PRアッセイバッファーに加えて、最終基質濃度67μMを得た。１mgのサキナビルを１mlのメタノールに溶解して、１mg/ml（13.04μM）のサキナビルのストック溶液を調製した。サキナビルストックをさらに、正常血清（ROCHE ZERO CALIBRATOR）中に希釈して、0.01mg/ml濃度の血清ストックを作製した。一連のサキナビル溶液を、０〜522nMの濃度範囲にわたって、アッセイバッファーで血清ストックから調製した。HIV-1 PRのストック溶液を、アッセイバッファーで20倍希釈した。HIV-1 PRによる発色基質の加水分解を、ROCHE DIAGNOSTICS COBAS FARAで、300nmで25℃で追跡した。ROCHE COBAS FARAのアッセイパラメータを表１に示す。代表的な標準的阻害グラフを図３に示す。
【実施例４】
【００３９】
リトナビルよるHIV-PR阻害試験
　サキナビルの代わりにリトナビルを使用する以外は、実施例３に記載のように阻害試験を行った。１mgのリトナビルを１mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解して、１mg/ml（13.87μM）のリトナビルのストック溶液を調製した。一連のリトナビル溶液を、０〜462nMの濃度範囲にわたって、HIV-PRアッセイバッファーで血清ストックから調製した。ROCHE COBAS FARAのアッセイパラメータを表１に示す。代表的な標準的阻害グラフを図４に示す。
【実施例５】
【００４０】
対照被験体中のHIV-PIレベルの測定
　合成発色性ペプチド基質とHIV-1プロテアーゼを含有するストック溶液を、実施例１のように調製する。プロテアーゼインヒビター（インジナビル硫酸、ネルフィナビルメシレート、リトナビル、およびサキナビル）を含有するストック溶液は、Remmelらに記載のようにメタノール中で調製する。インジナビルについて最終濃度範囲が0.05〜19.4μg/ml、ネルフィナビルについて0.02〜8.6μg/ml、リトナビルについて0.05〜20.0μg/ml、およびサキナビルについて0.02〜8.8μg/mlになるように、ストック溶液から希釈して、異なる較正物質溶液を調製する（Remmelら）。別にメタノール中で、品質管理用のストック溶液を調製した。ヒト健常志願者から血清または血漿サンプルを得て、次にHIVプロテアーゼ、発色基質、およびHIVプロテアーゼインヒビターのストック溶液の一部を補足した。プロテアーゼインヒビターの濃度は、ROCHE COBAS FARAで300nmで25℃で吸光度を測定することにより、血清または血漿サンプル中のHIVプロテアーゼによる発色基質の加水分解をモニタして確立する。HIVプロテアーゼインヒビターの濃度は、測定された吸光度の低下と反比例するため、血清または血漿中のプロテアーゼインヒビターの濃度が計算される。
【実施例６】
【００４１】
AIDS患者中のHIV-PIレベルの測定
　合成発色性ペプチド基質を含有するストック溶液を、実施例１のように調製する。プロテアーゼインヒビター（PI）の経口投与で治療後８時間のAIDS患者から、血清または血漿サンプルを得る。次に、AIDS患者からの血清または血漿サンプルに、発色基質とHIV-1プロテアーゼを補足し、ROCHE COBAS FARAで300nmで25℃で吸光度を測定することにより、血清または血漿サンプル中のHIVプロテアーゼによる発色基質の加水分解を追跡して、HIV PIの濃度を確定する。HIVプロテアーゼインヒビターの濃度は、測定される吸光度の低下と反比例するため、血清または血漿中のプロテアーゼインヒビターの濃度が計算される。対照として、発色性ペプチド基質が無い場合についても、このアッセイを行う。
【実施例７】
【００４２】
生物学的サンプル中の抗HIVプロテアーゼ抗体レベルの測定
　合成発色性ペプチド基質を含有するストック溶液を、実施例１のように調製する。AIDS診断から１年以内のAIDS患者から、血清または血漿サンプルを得て、次に、発色基質とHIV-1プロテアーゼを補足する。ROCHE COBAS FARAで300nmで25℃で吸光度を測定することにより、血清または血漿サンプル中のHIVプロテアーゼによる発色基質の加水分解を追跡して、HIVプロテアーゼに対する抗体の濃度を測定する。抗HIVプロテアーゼ抗体の濃度は、測定される吸光度の低下と反比例するため、血清または血漿中の抗HIVプロテアーゼ抗体の濃度が計算される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、HIVプロテアーゼによる発色基質の切断についての、時間の関数としての吸光度の低下のグラフである。
【図２】図２は、発色基質の関数としての、HIVプロテアーゼによる基質の切断速度のグラフである。
【図３】図３は、サキナビル濃度の関数としての、HIVプロテアーゼの活性の低下のグラフである。
【図４】リトナビル濃度の関数としての、HIVプロテアーゼの活性の低下のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2004049239.tif 000006
【配列表】
2004049239000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月17日(2003.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　生物学的サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターを定量する方法であって、
　HIVプロテアーゼ、HIVプロテアーゼの分光学的基質、およびHIVプロテアーゼインヒビターを含有することが疑われる生物学的サンプルを一緒にしてアッセイ混合物を形成させ；
　アッセイ混合物の分光学的性質を測定し；そして
　アッセイ混合物の分光学的性質を、生物学的サンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度に関連付けることを含む、方法。
【請求項２】
　生物中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度をモニタする方法であって、
　ある用量のHIVプロテアーゼインヒビターを生物に投与し；
　生物から液体サンプルを得て；
　サンプルをHIVプロテアーゼとHIVプロテアーゼの分光学的基質と一緒にし；
　サンプルの分光学的性質を測定し；そして
　サンプルの分光学的性質を、生物中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度と関連付けることを含む、方法。
【請求項３】
　HIVプロテアーゼを含む第１の容器；
　HIVプロテアーゼのための分光学的基質を含む第２の容器；および
　HIVプロテアーゼと分光学的基質を生物学的サンプルと一緒にし、サンプルの分光学的シグナルを測定し、分光学的シグナルをサンプル中のHIVプロテアーゼインヒビターの濃度と関連付けるための指示書、
　とを含む検査キット。