(57)【要約】【課題】Ｎ−ミリストイルトランスフェーゼ（ＮＭＴ）活性を簡便かつ迅速に、しかも高感度で測定する方法、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性測定用キット、及びＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性阻害物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】下記の工程：（１）　　Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼを含む測定試料、Ｎ末端にＧｌｙを含みＣ末端を標識物質で標識したペプチド基質、及びミリストイルＣｏＡを混合して酵素反応を行い、Ｎ−ミリストイル化標識ペプチドを生成する工程；（２）　　前記反応で生成したＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、固相担体に固定化した該ペプチドのＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識する抗体で捕捉する工程：（３）　　前記反応で捕捉したＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、該標識物質を利用して検出する工程：を含む、測定試料中のＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性の測定方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程：
（１）　　Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼを含む測定試料、Ｎ末端にＧｌｙを含みＣ末端を標識物質で標識したペプチド基質、及びミリストイルＣｏＡを混合して酵素反応を行い、Ｎ−ミリストイル化標識ペプチドを生成する工程；
（２）　　前記反応で生成したＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、固相担体に固定化した該ペプチドのＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識する抗体で捕捉する工程：
（３）　　前記反応で捕捉したＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、該標識物質を利用して検出する工程：
を含む、測定試料中のＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性の測定方法。
【請求項２】
前記標識物質が酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、又はアビジンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識物質がビオチンであり、前記抗体で捕捉したＮ−ミリストイル化標識ペプチドをストレプトアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ複合体）及びパーオキシダーゼの発色基質を反応させて検出を行う請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチド基質がアミノ酸数５〜３０のオリゴペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチド基質が下記のペプチド：
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、及び
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、
から成る群より選ばれるペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
下記の試薬：
（１）　　ミリストイルＣｏＡ
（２）　　Ｎ末端にＧｌｙを含みＣ末端を標識物質で標識したペプチド基質
（３）　　ミリストイル化ペプチドのＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識する抗体
を含む、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性測定用キット。
【請求項８】
下記の工程：
（１）　　Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ、Ｎ末端にＧｌｙを含みＣ末端を標識物質で標識したペプチド基質、及びミリストイルＣｏＡを用いてＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性を阻害する候補物質の存在下で酵素反応を行い、Ｎ−ミリストイル化標識ペプチドを生成する工程；
（２）　　前記反応で生成したＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、固相担体に固定化した該ペプチドのＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識する抗体で捕捉する工程：
（３）　　前記反応で捕捉したＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、該標識物質を利用して検出する工程：
を含む、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記標識物質が酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、又はアビジンである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識物質がビオチンであり、前記抗体で捕捉したＮ−ミリストイル化標識ペプチドをストレプトアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ複合体）及びパーオキシダーゼの発色基質を反応させて検出を行う請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチド基質がアミノ酸数５〜３０のオリゴペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチド基質が下記のペプチド：
Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ、
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ、及び
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ、
から成る群より選ばれるペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルス性タンパク質などのＮ−ミリストイル化を触媒するＮ−ミリストイルトランスフェラーゼの活性を簡便かつ迅速に高感度で測定する方法、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性測定用キット、及びＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性阻害物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９８２年，仔ウシ心筋由来ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットの全一次構造配列決定途上、Ｎ−末端グリシン残基のα−ＮＨ２基に炭素数１４の長鎖飽和脂肪酸であるミリスチン酸が酸アミド結合を介して共有結合していることがＳｈｏｊｉらにより初めて見い出された（Ｓ．Ａ．，　Ｃａｒｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，　６１２８−６１３１，　１９８２；Ｓ．，　Ｓｈｏｊｉ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２２，　３７０２−３７０９，　１９８３）。以降、このタンパク質修飾はＮ−ミリストイル化と呼ばれ、現在までに多数の細胞性、癌原性、ウイルス性タンパク質、及び菌類のタンパク質においてＮ−ミリストイル化が報告されており（庄司省三ら、薬学雑誌、１０９、７１−８５、１９８９）、Ｎ−ミリストイル化の生物学的意義が注目されている。細胞性Ｎ−ミリストイル化タンパク質としては、Ｓｒｃ　ｆａｍｉｌｙ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅであるｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ　（Ｊ．Ｅ．，　Ｂｕｓｓ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，　５３，　７−１２，　１９８５）、ｐ５６ｌｃｋ（Ｇ．Ａ．，　Ｍａｒｃｈｉｌｄｏｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８１，　７６７９−７６８２，　１９８４）及びその他のＹｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｈｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍ．Ｄ．，　Ｒｅｓｈ，　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，　１４５１，　１−１６，　１９９９）、Ｓｅｒｉｎｅ／Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅであるｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（Ｊ．Ｚｈａ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２９０，　１７６１−１７６５，　２０００）、Ｇｕａｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎのＧ　ｐｒｏｔｅｉｎαｓｕｂｕｎｉｔ（Ｍ．Ｄ．，Ｒｅｓｈ，　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，　１４５１，　１−１６，　１９９９）、ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ群（Ｈ．Ａ．，　Ｂｒｏｗｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ，　７５，　１１３７−１１４４，　１９９３）、細胞骨格タンパク質ｖｉｎｃｕｌｉｎ（Ｓ．，　Ｋｅｌｌｉｅ，　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲＳ，　２１３，　４２８−４３２，　１９８７）、膜及び細胞骨格結合タンパク質Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ　Ａｌａｎｉｎｅ−Ｒｉｃｈ　Ｃ　Ｋｉｎａｓｅ（Ａ．Ａ．，　Ａｄｅｒｅｍ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　３３２，　３６２−３５４，　１９８８）等がある。また、ウイルス性Ｎ−ミリストイル化タンパク質としては、ヒトレトロウイルスであるＨｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ−１（ＨＴＬＶ−１）のｐ１９ｇａｇタンパク質（Ｙ．，　Ｏｏｔｕｙａｍａ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒａｓ．，　７６，　１１３２−１１３５，　１９８５）、Ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ−１（ＨＩＶ−１）の前駆体タンパク質Ｐｒ５５ｇａｇ　（Ｆ．Ｍ．，　Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｖｉｒｏ��．，　６２，　７９５−８０１，　１９８８）、及び調節タンパク質であるｐ２７ｎｅｆ（Ｓ．，　Ｓｈｏｊｉ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，　１０３，　７４７−７４９，　１９８８）等が報告されており、これら以外でもほぼ全てのレトロウイルスの構造タンパク質ＧａｇがＮ−ミリストイル化を受けている（Ａ．Ｍ．，　Ｓｈｕｌｔｚ，　ｅｔ　ａｌ．，　　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，　４６，　３５５−３６１，　１９８３）。
【０００３】
タンパク質のＮ−ミリストイル化はＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ（Ｎ−Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＮＭＴ）により触媒され，タンパク質生合成においてまだ発生期のポリペプチド鎖がリボソームに結合している間に生じる翻訳時修飾である（Ｉ．，　Ｄｅｉｃｈａｉｔｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，　８，　４２９５−４３０１，　１９８８；Ｃ．，　Ｗｉｌｃｏｘ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３８，　１２７５−１２７８，　１９８７）。ＮＭＴはミリストイル−ＣｏＡからミリストイル基を基質タンパク質のＮ−末端へＮ−転移する過程を触媒する酵素である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＮＭＴ１ｐに関する酵素学的研究により、そのメカニズムは、ミリストイル−ＣｏＡがＮＭＴに結合することによりペプチド基質がＮＭＴに結合できるようになり、ミリスチン酸がペプチドＮ−末端のＧｌｙに転移後、ＣｏＡが酵素から放出されるとＮ−ミリストイル化ペプチドが生成されるという、いわゆるＢｉ−Ｂｉ反応過程を示すことが明らかとなった（Ｄ．Ａ．，　Ｒｕｄｎｉｃｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２６５，　１３３７０−１３３７８，　１９９０）。
【０００４】
以上のように、ミリストイル化されたタンパク質は種々の細胞内タンパク質、ウイルス構成タンパク質及び発ガン遺伝子産物等で見出されている。特に、前記したようにウイルス構成タンパク質にミリストイル基が多く発見されていることにより、ウイルスの機能にとってタンパク質のミリストイル化が必須であると推定されている。従って、ミリストイル化を触媒するＮＭＴ活性を阻害することが抗ウイルス剤の開発のための一つの戦略であると提唱されており（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，　Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，　２８２，　１２０１−１２０５，　２００１；Ｆｕｒｕｉｓｈｉ，　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，　２３７，　５０４−５１１，　１９９７）、ウイルス性タンパク質がミリストイル化されることを阻止することのできる物質は抗ウイルス剤として有力な候補となる。また、ヒトＮＭＴは胆嚢癌（Ｒａｊａｌａ，　Ｒ．Ｖ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ，　８８，　１９９２−１９９９，　２０００）や直腸腺癌（Ｒａｊｕ，　Ｒ．Ｖ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，　２３５，　１４５−１５４，　１９９７）においてその発現が増加するゆえ抗腫瘍剤の標的となることもまた示唆される。
さらに、抗ＨＩＶ−１剤を開発することにおいて、ウイルス性タンパク質をターゲットとすると変異が起こってウイルスが耐性を獲得する問題がある。これに対して宿主側、つまり細胞性因子であるＮＭＴをターゲットとすれば変異が起きにくく耐性のウイルスの出現がないので有利でもある。
従って、抗ウイルス剤や抗腫瘍剤の開発を進める上で、ＮＭＴの酵素学的な研究、及び多数の化合物を効率よくスクリーニングし評価することが可能なＮＭＴ活性測定法の開発が望まれる。
【０００５】
ＮＭＴ活性のためのｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイとしては、これまで放射標識したミリストイル化ペプチド産物を同定するために逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｔｏｗｌｅｒ，　Ｄ．Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８４，　２７０８−２７１２，　１９８７）やＰ８１ホスホセルロースペーパーマトリックス（Ｋｉｎｇ，　Ｍ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９９，　１４９−１５３，　１９９１）を用いるアッセイ、酵素によって遊離される最初の産物であるＣｏＡの測定に基づくアッセイ（Ｆａｒａｚｉ，　Ｔ．Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３９，　１５８０７−１５８１６，　２０００；Ｒｕｄｎｉｃｋ，　Ｄ．Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２６５，　１３３７０−１３３７８，　１９９０）、及び基質としてダンシルペプチドを用いる連続蛍光比色法によるアッセイ（Ｐｅｎｎｉｓｅ，　Ｃ．Ｒ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　３００，　２７５−２７７，　２００２）などが報告されている。
しかしながら、上記の方法は、放射性同位体を使用するための特別な設備が必要であったり、あるいは多段階の工程を経るために操作が煩雑であるなどの問題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｎ−ミリストイルトランスフェーゼ（ＮＭＴ）活性を簡便かつ迅速に、しかも高感度で測定する方法、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性測定用キット、及びＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性阻害物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｎ末端にＧｌｙを含む特定構造のオリゴペプチドを基質とし、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）及びミリストイルＣｏＡを酵素として用いる酵素反応を行い、反応産物であるＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、該ペプチドのＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識するモノクローナル抗体を固定化した固相担体を用いるＥＬＩＳＡ系によって測定すれば、ＮＭＴ活性を簡便かつ迅速に、しかも高感度で測定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、下記の工程：
（１）　　Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼを含む測定試料、Ｎ末端にＧｌｙを含みＣ末端を標識物質で標識したペプチド基質、及びミリストイルＣｏＡを混合して酵素反応を行い、Ｎ−ミリストイル化標識ペプチドを生成する工程；
（２）　　前記反応で生成したＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、固相担体に固定化した該ペプチドのＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識する抗体で捕捉する工程：
（３）　　前記反応で捕捉したＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、該標識物質を利用して検出する工程：
を含む、測定試料中のＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性の測定方法が提供される。
【０００９】
また、本発明によれば、下記の試薬：
（１）　　ミリストイルＣｏＡ
（２）　　Ｎ末端にＧｌｙを含みＣ末端を標識物質で標識したペプチド基質
（３）　　ミリストイル化ペプチドのＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識する抗体
を含む、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性測定用キットが提供される。
【００１０】
さらに、本発明によれば、下記の工程：
（１）　　Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ、Ｎ末端にＧｌｙを含みＣ末端を標識物質で標識したペプチド基質、及びミリストイルＣｏＡを用いてＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性を阻害する候補物質の存在下で酵素反応を行い、Ｎ−ミリストイル化標識ペプチドを生成する工程；
（２）　　前記反応で生成したＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、固相担体に固定化した該ペプチドのＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識する抗体で捕捉する工程：
（３）　　前記反応で捕捉したＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、該標識物質を利用して検出する工程：
を含む、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性阻害物質のスクリーニング方法が提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
［１］Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性の測定方法
以下、本発明のＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性の測定方法の好ましい態様を図１に基づいて説明する。
【００１２】
（１）Ｎ−ミリストイル化標識ペプチドの生成
まず、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼを含有する測定試料にＮ末端にＧｌｙを含みＣ末端を標識物質で標識したペプチド基質とミリストイルＣｏＡを添加して一定時間酵素反応を行う。
この酵素反応によってミリストイル残基が上記ペプチド基質のＮ末端に導入され、Ｎ−ミリストイル化標識ペプチドが生成される。
【００１３】
本発明において使用する、「Ｎ末端にＧｌｙを含みＣ末端を標識物質で標識したペプチド基質」のペプチドは、好ましくはアミノ酸数５〜３０のオリゴペプチド、より好ましくはアミノ酸数５〜２００のオリゴペプチド、特に好ましくは８から１５のオリゴペプチドである。具体的にはＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号１）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号２）、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、（配列番号３）、及びＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号４）等が好適に用いられる。
【００１４】
また、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼのペプチド基質におけるコンセンサスなアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−であり、開始Ｍｅｔは翻訳時にメチオニンアミノペプチダーゼによって除去され、Ｎ−末端にＧｌｙ残基が露出される。Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼを介したＮ−ミルストイル化にはＮ−末端にＧｌｙ残基が絶対的に要求され、他のアミノ酸ではＮ−ミルストイル化は起こらない。一般に、６位のＳｅｒ又はＴｈｒが好ましく、７位や８位には塩基性アミノ酸が好ましい（表１参照）。
【００１５】
【表１】
2004049133.tif 000002
【００１６】
従って、このようなＮ−ミリストイルトランスフェラーゼの基質特異性に関する情報を利用すれば、より選択的にＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性を測定するのに用いるためのペプチド基質をデザインできる。
【００１７】
また、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ阻害物質をスクリーニングする場合は、例えば現在までに報告のある下記表２、表３に示す細胞性Ｎ−ミリストイル化タンパク質、ウイルス性Ｎ−ミリストイル化タンパク質のＮ末端配列がペプチド基質として好適に使用されうる。例えば、ＨＩＶ−１ｐｒ５５ｇａｇ，ＨＩＶ−１ｐ２７ｎｅｆのＮ末端配列をペプチド基質として用いた場合は抗ＨＩＶ剤の候補物質を、またｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ　のＮ末端配列をペプチド基質として用いた場合は抗腫瘍剤の候補物質をスクリーニングすることができる。
【００１８】
【表２】
2004049133.tif 000003
【００１９】
【表３】
2004049133.tif 000004
【００２０】
ペプチド基質のＣ末端を標識する標識物質としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、又はアビジン等が挙げられる。具体的には、酵素としてはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等が、蛍光物質としては、フルオレスセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等が、化学発光物質としては、ルミノール、アクリジニウムエステル、アクリジニウムアシルスルホンアミド等が挙げられる。標識物質と抗体との結合法は、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を用いることができる。
【００２１】
本発明において使用する「Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ」としては、腫瘍細胞、ウイルス、真菌類などの天然由来のＮ−ミリストイルトランスフェラーゼであってもよく、大腸菌等で発現させた組換えＮ−ミリストイルトランスフェラーゼであってもよい。
【００２２】
（２）Ｎ−ミリストイル化標識ペプチドの固相担体への捕捉
次に、前記（１）の反応で生成したＮ−ミリストイル化標識ペプチドを試料とし、これを該ペプチドのＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識する抗体を固定化した固相担体に添加し、一定時間インキュベートする。
上記抗体はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも用いることができる。また、これらの抗体のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、又はＦａｂ等の活性断片等を用いてもよい。抗体のクラス、サブクラスは任意である。これらの抗体の調製は公知の方法にて行うことができる。例えば、ポリクローナル抗体はキーホールリンペットヘモシアニン（以下、ＫＬＨという）を結合させたＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−ＫＬＨをアジュバントとともに動物に注射等により投与して免疫し、抗体価が上昇した後にその血液を採取し、抗血清を分離するか、抗血清より抗Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ抗体を回収することにより製造される。
【００２３】
また、モノクローナル抗体（以下、該Ｎ−ミリストイル化標識ペプチドのＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識するモノクローナル抗体を抗Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙモノクローナル抗体という）の調製は、特開平１１−０８０１９９号に記載の方法に従い、以下のようにして行えばよい。
まず、Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ抗原の調製を行なう。この抗原の調製には、水溶性活性エステル化試薬（ＤＳＰ：４−ヒドロキシフェニルジメチルスルホニウムメチルサルフェート）を用いることができる。免疫抗原としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を結合させたＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−ＫＬＨを調製し、スクリーニング抗原としては、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）を結合させたＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−ＢＳＡを調製する。免疫抗原としてＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−ＫＬＨをマウスに対して免疫し、マウスをしゃ血致死させ、脾細胞を取得し、常法に従ってＰＥＧを用いてマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）と細胞融合し、ＨＡＴ培地によりハイブリドーマの選別を行う。得られるハイブリドーマを、Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−ＢＳＡ抗原により２度スクリーニングを行い、限界希釈法によりミリストイル化ペプチド中のＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。得られたハイブリドーマを常法により培養し、培養終了後、培地を濾過して培養上清を得る。この培養上清を限外濾過等によって濃縮し、硫安によりタンパク質を沈澱させて沈澱物を回収し、この沈澱を透析することにより脱塩して抗Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙモノクローナル抗体を得る。また、別の製造方法として、上記ハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、増殖させて、腹水を採取し、この腹水を上記と同じ方法によって濃縮、沈澱、透析等を行うことによって抗Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００２４】
上記抗体を固定化させる固相担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、スチレン−ブタジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマー、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物のほか、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、固相担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等のいずれの形状でもよい。これらの中でも多数の検体を処理する際にはマイクロタイタープレートが好ましい。また、これら固相担体への抗体の固定化方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００２５】
（３）Ｎ−ミリストイル化標識ペプチドの検出
次に、固相担体に捕捉されたＮ−ミリストイル化標識ペプチドを、該標識を利用して検出する。標識物質として蛍光物質を用いた場合は、単独で検出可能なシグナルをもたらすことができるが、標識物質として酵素、ビオチン及びアビジンは、単独では検出可能なシグナルをもたらすことができないため、さらに１種以上の他の物質と反応することにより検出可能なシグナルを生じさせる。例えば、酵素の場合には少なくとも基質が必要であり、酵素活性を測定する方法（比色法、蛍光法、生物発光法あるいは化学発光法等）に依存して種々の基質が用いられる。例えば酵素としてパーオキシダーゼを用い、その活性を比色法で測定する場合は、発色基質としてオルトフェニレンジアミン又はテトラメチルベンジジンを用いる。
また、標識物質がビオチンの場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。必要に応じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が用いられる。
本発明においては特に、ビオチンを標識物質として用い、アビジンービオチニル化パーオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ；ａｖｉｄｉｎｅ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）を反応させる態様が好ましい。
【００２６】
これとは別にＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ標準試料を用いて上記と同じ方法によって検出のためのシグナル強度（例えば発色、蛍光、発光）を測定し、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ濃度に対してプロットして検量線を作成する。この検量線に基づき、上記の未知の測定試料を用いて測定したシグナル強度から測定試料中のＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性を求めることができる。
【００２７】
［２］Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性測定用キット
本発明のキットは、測定試料中のＮ−ミリストイルトランスフェラーゼと反応してＮ−ミリストイル化標識ペプチドを生成するためのミリストイルＣｏＡ、Ｎ末端にＧｌｙを含みＣ末端を標識したペプチド基質、ならびに生成したＮ−ミリストイル化標識ペプチドのＮ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ部分を認識する抗体を必須の試薬として含む。
本発明のキットには、該キットを効率的かつ簡便に利用できるようにするために、上記の試薬に種々の補助剤を含めてもよい。補助剤としては、例えば固相担体を洗浄するための洗浄剤、試薬が固体である場合にそれを溶解させるための溶解剤、標識物質として酵素を使用した場合に活性を測定するための基質、その反応停止剤などの免疫学的測定試薬のキットとして通常使用されるものが挙げられる。
【００２８】
［３］Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性阻害物質のスクリーニング方法
本発明のＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性阻害物質のスクリーニング方法は、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性を阻害する候補物質の存在下にＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ、Ｎ末端にＧｌｙを含みＣ末端を標識物質で標識したペプチド基質、及びミリストイルＣｏＡを用いる酵素反応を行い、前記［１］と同様にしてＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性の測定を行う。より具体的には、例えば、候補物質の存在下又は非存在下の両方の場合について上記酵素反応を行い、候補物質の非存在下で酵素反応行った場合に、検出のためのシグナル強度が低くなる被験物質を、Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性を阻害する物質の候補物質として選択する。
【００２９】
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
上記した本発明によるスクリーニング法により得られるＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性阻害物質も本発明の範囲内である。このようなＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性阻害物質は、抗ＨＩＶ剤を初めとする抗ウイルス剤、抗癌剤、抗真菌剤、免疫抑制剤などの各種薬剤の候補物質として有用である。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕　ＮＭＴ−ＥＬＩＳＡ系によるＮＭＴ活性の測定
（１）実験方法
▲１▼　材料
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＮＭＴ　（酵母（ｙ）ＮＭＴ）発現プラスミド（ｐＢＢ１３１）（Ｄｕｒｏｎｉｏ，　Ｒ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ　８７，　１５０６−１５１０，　１９９０）はＪ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ博士（ワシントン大学医学部）より得た。
抗Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙモノクローナル抗体（Ｆｕｒｕｉｓｈｉ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，　２２２，　３４４−３５１，　１９９６）を含む無血清培地は日水製薬株式会社より得た。
セリナール亜硫酸付加物は池田博士（Ｔｒｉｉ　＆　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．）より得た。
▲２▼　組み換えｙＮＭＴの調製
ｙＮＭＴ発現プラスミドであるＰＢＢ１３１（Ｄｕｒｏｎｉｏ，Ｒ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８７，　１５０６−１５１０，　１９９０）によって大腸菌ＪＭ１０１形質転換させた。形質転換させた大腸菌ＪＭ１０１をイソプロピル１−チオ−β−ガラクトシドで処理し、ｙＮＭＴを誘導し、ホモジナイズして酵素溶液として用いた（Ｔａｋａｍｕｎｅ，　Ｎ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．，　５０６，　８１−８４，　２００１）。
【００３１】
▲３▼　Ｃ末端ビオチン標識ペプチド基質の合成
ペプチド基質は１，２−ジアミノエタントリチル樹脂及びペプチドのＮ−末端アミノ酸残基としてＮ−α−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグリシンを用いるＦｍｏｃケミストリーに従い、自動ペプチド合成機を用いて合成した。
ペプチドのＣ末端アミノ酸を樹脂から除去した後、５−（Ｎ−スクシンイミジロキシカルボニル）ペンチルＤ−ビオチンアミドを用いて１，２−ジアミノエタンを介しビオチン標識した。ビオチン標識ペプチドの側鎖の全ての保護基をトルフルオロ酢酸と反応させることによって除去した。合成ペプチドはマトリックス支援イオン化―飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ−ｏｆ　ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ）（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｆｒａｎｚｅｎ　Ａｎａｌｙｔｉｋ　ＧｍｂＨ，　Ｂｒｅｍｅｎ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）によって同定した。
【００３２】
▲４▼　酵素反応
５０ｍＭ　ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０）　１５０μｌ　に所定濃度のＣ末端ビオチン標識ペプチド基質（ＮＨ２−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｂｉｏｔｉｎ）５０μｌ、０．５ｍＭミリスチルＣｏＡ１００μｌ、及び上記酵素溶液５０μｌを加えた。混合物を水浴で３７℃にて所定時間（０，１０，２０，３０分間）インキュベートすることにより酵素反応を行い、０．３　Ｎ　Ｈ２ＳＯ４　５０μｌを加えることで酵素反応を停止した。反応混合物を１５，０００　ｒｐｍ，５分間遠心し、その上清をＥＬＩＳＡ試料とした。
【００３３】
▲５▼　ＮＭＴ−ＥＬＩＳＡ
図１はＮＭＴ−ＥＬＩＳＡの模式図を示す。本ＮＭＴ−ＥＬＩＳＡ系において酵素反応から生じた反応混合物中のＮ−ミリストイル化ビオチン標識ペプチドを検出することができるかどうかを調べた。
Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭ　ｐｌａｔｅ　ＭａｘｉｓｏｒｐＴＭ　Ｓｕｒｆａｃｅの各ウェルを、抗Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙモノクローナル抗体を含む無血清培養上清と４℃にて一晩インキュベートすることによって抗Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙモノクローナル抗体を固定化した。次に、溶液を捨て、プレートの各ウェルを洗浄バッファー（０．１％ポリエチレンソルビタンモノオレート）で３回洗浄した。洗浄後、上記で調製したＥＬＩＳＡ試料１００μｌを、抗体を固定化したウェルに加え、２時間３７℃にてインキュベートした。プレートの各ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄し、Ｔｒｉｓ−緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．５）及び０．５Ｍ　ＮａＣｌ）ですすぎ、次いで１００μｌのストレプト−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）溶液（和光純薬工業（株）製）を加えた。３７℃にて３０分間インキュベートした後、プレートの各ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄し水にて２回すすいだ。Ｎ−ミリストル化ビオチン標識ペプチドに結合したパーオキシダーゼの測定は基質溶液（０．３８ｍｇ／ｍｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン２塩酸塩・２水和物（ＴＭＢＺ・ＨＣｌ）とインキュベーションした後に行った。反応は１００μｌの０．３ＮＨ２ＳＯ４の添加によって終結させた。主波長４５０　ｎｍ，参照波長６３０　ｎｍの吸光度（λ４５０−λ６３０）をＶｍａｘ　ｋｉｎｅｔｉｃ　Ｓｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ，　ＵＳＡ）にて測定した。
【００３４】
（２）実験結果
図２Ａは、Ｎ−ミリストイル化Ｃ末端ビオチン標識ペプチド（ＮＨ２−Ｍｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｂｉｏｔｉｎ）又はＣ末端ビオチン標識ペプチド（ＮＨ２−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｂｉｏｔｉｎ）をそれぞれ合成し、上記ＮＭＴ−ＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。
図２Ａに示すように、ミリストイル化されていないペプチドに比べてＮ−ミリストイル化ペプチドは、吸光度（λ４５０−λ６３０）が顕著に増加した。この結果は、Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭ　ｐｌａｔｅ　ＭａｘｉｓｏｒｐＴＭ上に固定化した抗Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙモノクローナル抗体はＮ−ミリストイル化ペプチドを特異的に認識し捕捉することができることを示す。
図２Ｂは、ビオチン標識ペプチド基質の濃度と吸光度との関係を示す。図２Ｂに示すように、３０分間のインキュベーション後の試料の吸光度の増加はビオチン標識ペプチド基質の濃度に依存していた。一方、０分間のインキュベーション後の試料の吸光度は基質濃度に関わらず一定であった。
図２Ｃは、インキュベーション時間と吸光度との関係（反応混合物中におけるＮ−ミリストイル化ビオチン標識ペプチドの経時変化）を示す。図２Ｃに示すように、吸光度はインキュベーション時間に比例していることがわかった。
図２Ｄは、酵素溶液のタンパク濃度と吸光度との関係を示す。図２Ｄに示すように、吸光度は酵素溶液のタンパク濃度に比例することもまた観察された。
図２Ｅは合成Ｎ−ミリストイル化ペプチドの濃度と相関係数０．９９３を有する吸光度との間の直接的な関係を示す。これは、本ＮＭＴ−ＥＬＩＳＡ系がＮＭＴの活性の定量的な分析に用いられることを示すものである。本ＮＭＴ−ＥＬＩＳＡ系を用いて、ビオチン標識Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇのミカエリス係数（Ｋｍ）をラインウィーバーブルクプロットから」算出した。Ｋｍの値は７６．６μＭであり、それは先の報告（Ｄｕｒｏｎｉｏ，Ｒ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８７，　１５０６−１５１０，　１９９０）の６５．８μＭよりわずかに高かった。
【００３５】
（実施例２）　（各種ビオチン標識ペプチドの合成と分析・確認およびＮＭＴ−ＥＬＩＳＡ）
（１）実験方法
▲１▼　Ｃ末端ビオチン標識ペプチド基質の合成
Ｎ−末端にＢｏｃ−Ｇｌｙを用いる以外はＦｍｏｃ法に従い、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　４３１Ａを用いて合成後、Ｃｌｅａｖｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて樹脂から保護基が結合した状態でペプチドを切り出し、Ｂｏｃ−ＧＮ（Ｔｒｔ）ＡＡＡＡＲ（Ｐｂｆ）Ｒ（Ｐｂｆ）−ＤＡＥ、Ｂｏｃ−ＧＳ（ｔＢｕ）Ｓ（ｔＢｕ）Ｋ（Ｂｏｃ）Ｓ（ｔＢｕ）Ｋ（Ｂｏｃ）ＰＫ（Ｂｏｃ）−ＤＡＥ、Ｂｏｃ−ＧＡＲ（Ｐｂｆ）ＡＳ（ｔＢｕ）ＶＬＳ（ｔＢｕ）−ＤＡＥ、Ｂｏｃ−ＧＧＫ（Ｂｏｃ）Ｗ（Ｂｏｃ）Ｓ（ｔＢｕ）Ｋ（Ｂｏｃ）Ｓ（ｔＢｕ）Ｓ（ｔＢｕ）−ＤＡＥを得た。
【００３６】
それぞれのペプチド０．１　ｍｍｏｌを１　ｍｌ　ＤＭＳＯに溶解し、０．１３　ｍｍｏｌの　Ｂｉｏｔｉｎ−（ＡＣ５）２−ＣＯＯＨ、ＢＯＰ、ＨＯＢｔを０．５　ｍｌのＤＭＳＯに溶解してペプチドの方へ加え、よく混合した後、ＴＥＡでｐＨ　８に調整し、室温で６時間反応させた。反応後，冷水を加えてペプチドを２７，７００×ｇ，４　℃で３０分間遠心した。得られた沈殿を８０　％　ＣＨ３ＣＮに溶解し、凍結乾燥した。この凍結乾燥品をＴＦＡ、ｍ−Ｃｒｅｓｏｌ、Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌ、ＥＤＴ、ＴＭＢＳを用いて脱保護し、冷エーテルを加え３，０００　ｒｐｍ，４℃で１０分間遠心し、沈殿を再度ＴＦＡに溶解し、冷エーテルで洗浄した後、８０％　ＣＨ３ＣＮに溶解し、凍結乾燥を行い、各種ビオチン標識ペプチドを得た。
【００３７】
▲２▼　ＨＰＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳ
得られた凍結乾燥品を１０　％　ＣＨ３ＣＮに溶解し、ＨＰＬＣにより１０〜１００　％　ＣＨ３ＣＮ　ｃｏｎｔｇ．　０．１　％ＴＦＡ，１５分の濃度勾配により分離分析し、目的とするビオチン標識ペプチドのピークをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳにより確認後（図３）、精製したビオチン標識ペプチドを凍結乾燥し、４　℃で保存した。
【００３８】
▲３▼　酵素反応
各種ビオチン標識ペプチド基質を５０　ｍＭ　ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ　８．０）に溶解し、０．８　ｍＭ基質溶液とした。また、Ｍｙｒ−ＣｏＡも同様に５０　ｍＭ　ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ　８．０）に溶解し、０．５　ｍＭ　Ｍｙｒ−ＣｏＡ溶液とした。基質溶液１００　μｌに５０　ｍＭ　ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ　８．０）　１５０μｌ、０．５　ｍＭ　Ｍｙｒ−ＣｏＡ溶液１００μｌ、ｙｅａｓｔ　ＮＭＴ及びｈｕｍａｎ　ＮＭＴ−１粗酵素溶液５０μｌを加えて混合した後、３７℃で０，１０，２０，３０分間インキュベートすることにより酵素反応を行った。０．３　Ｎ　Ｈ２ＳＯ４　５０μｌ加えることで酵素反応を停止し、１５，０００　ｒｐｍ，５分間遠心し、その上清をＥＬＩＳＡ試料とした。
【００３９】
▲４▼　ＮＭＴ−ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭ　ｐｌａｔｅ　ＭａｘｉｓｏｒｐＴＭを精製水で２回洗浄し、抗Ｎ−Ｍｙｒ−Ｇｌｙモノクローナル抗体の無血清培養上清１００μｌを各ウェルに加え、プレートをプラスチックフィルムで覆い、４　℃で一晩インキュベートすることによって抗体を固定化した。固定化後、抗体を除去し、洗浄バッファーで一回、水で一回洗浄を行い、ＥＬＩＳＡ試料及び標準品としてＭｙｒ−ＧＮＡＡＡＡＲＲ−ＤＡＥ−（ＡＣ５）２−Ｂｉｏｔｉｎを１００　μｌずつウェルに加え，フィルムを被せ、３７℃で２時間インキュベートした。試料溶液を除去し、プレートを先に述べた洗浄操作を３回繰り返すことで洗浄を行った。次にＴＢＳｂｕｆｆｅｒでＡＢＣ　溶液．を１００倍希釈したもの１００μｌを各ウェルに加え、フィルムで被い室温で３０分間インキュベートした。ＡＢＣ　溶液を除去し，３回の洗浄操作を行い、発色液１００μｌを各ウェルに加え発色を開始し、反応停止液１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止させた。オートリーダーにより主波長４５０　ｎｍ，参照波長６３０　ｎｍの吸光度（λ４５０−λ６３０）を測定した。
【００４０】
（２）実験結果
合成したＧＮＡＡＡＡＲＲ−ＤＡＥ−（ＡＣ５）２−Ｂｉｏｔｉｎ（ペプチド１）、ＧＳＳＫＳＫＰＫ−ＤＡＥ−（ＡＣ５）２−Ｂｉｏｔｉｎ（ペプチド２）、ＧＡＲＡＳＶＬＳ−ＤＡＥ−（ＡＣ５）２−Ｂｉｏｔｉｎ　（ペプチド３）、ＧＧＫＷＳＫＳＳ−ＤＡＥ−（ＡＣ５）２−Ｂｉｏｔｉｎ（ペプチド４）を基質として酵素反応を行い、得られた各Ｎ−ミリストイル化ビオチン標識ペプチドのＨＰＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析結果をそれぞれ図４〜図７に示す。
また、標準基質であるＭｙｒ−ＧＮＡＡＡＡＲＲ−ＤＡＥ−（ＡＣ５）２−ＢｉｏｔｉｎのＥＬＩＳＡによる分析結果を図８に示す。
【００４１】
（実施例３）　ＮＭＴ−ＥＬＩＳＡ系によるＮＭＴ活性阻害物質のスクリーニング
ＮＭＴ基質に関する共通配列はＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−であり、最初のＭｅｔはメチオニンアミノペプチダーゼによって翻訳中に除去されている。２位のＧｌｙは絶対的に要求され、６位のＳｅｒ又ＴｈｒはＮＭＴ活性にとって好ましい（Ｄｕｒｏｎｉｏ，Ｒ．Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　８７，　１５０６−１５１０，　１９９０）。ｙＮＭＴとミリストイルＣｏＡ及びペプチド基質アナログとの三元複合体の構造分析ではｙＮＭＴの６位のＳｅｒ／Ｔｈｒに結合部位の存在を示した。それゆえ、いくつかのセリナール誘導体（Ｔａｋａｍｕｎｅ，Ｎ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ＩＵＢＭＢ　ｌｉｆｅ，　４８，　３１１−３１５，　１９９９）　を設計・合成し、そのｙＮＭＴ阻害活性を前記ＮＭＴ−ＥＬＩＳＡ系を用いて実施例１と同様にして調べた。表４に示すように、誘導体のうちの一つ、セリナール亜硫酸付加物が強くｙＮＭＴ活性を阻害した（ＩＣ５０＝４．９μＭ）。このことによって本発明のＮＭＴ−ＥＬＩＳＡ系が抗菌剤としてＮＭＴ阻害物質を探索するのに役立つことが証明された。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、ウイルス性タンパク質などのＮ−ミリストイル化を触媒するＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ活性を簡便かつ迅速に、しかも高感度で測定することができるアッセイ系が提供される。本アッセイ系は、ハイスループット、非放射性という利点を備えているので多くの試料を一度に短時間で測定できる。また、本アッセイ系を用いることによってＮＭＴ活性阻害物質を探索することができ、ヒト癌、腫瘍、真菌感染症の治療薬の開発に応用できるほか、細胞内のＮＭＴの機構解明にも有用である。
【００４４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＮＭＴ−ＥＬＩＳＡの模式図を示す。
【図２】本発明のＮＭＴ−ＥＬＩＳＡによるＮ−ミリストイル化ビオチン標識ペプチドの特異的検出を示す。
図２Ａは、Ｎ−ミリストイル化ビオチン標識ペプチドとビオチン標識ペプチドをＮＭＴ−ＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。
図２Ｂは、ビオチン標識ペプチド基質の濃度と吸光度との関係を示す。
図２Ｃは、インキュベーション時間と吸光度との関係（反応混合物中におけるＮ−ミリストイル化ビオチン標識ペプチドの経時変化）を示す。
図２Ｄは、酵素溶液のタンパク濃度と吸光度との関係を示す。
図２Ｅは、Ｎ−ミリストイル化ビオチン標識ペプチドの濃度と吸光度との間の直線関係を示す。
【図３】各種ビオチン標識ペプチドのピークをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析により確認した結果を示す。
【図４】ＧＮＡＡＡＡＲＲ−ＤＡＥ−（ＡＣ５）２−Ｂｉｏｔｉｎ（ペプチド１）を基質として酵素反応を行うことによって得られたＮ−ミリストイル化ビオチン標識ペプチドのＨＰＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析結果を示す。
【図５】ＧＳＳＫＳＫＰＫ−ＤＡＥ−（ＡＣ５）２−Ｂｉｏｔｉｎ（ペプチド２）を基質として酵素反応を行うことによって得られたＮ−ミリストイル化ビオチン標識ペプチドのＨＰＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析結果を示す。
【図６】ＧＡＲＡＳＶＬＳ−ＤＡＥ−（ＡＣ５）２−Ｂｉｏｔｉｎ　（ペプチド３）を基質として酵素反応を行うことによって得られたＮ−ミリストイル化ビオチン標識ペプチドのＨＰＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析結果を示す。
【図７】ＧＧＫＷＳＫＳＳ−ＤＡＥ−（ＡＣ５）２−Ｂｉｏｔｉｎ（ペプチド４）を基質として酵素反応を行うことによって得られたＮ−ミリストイル化ビオチン標識ペプチドのＨＰＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ　ＭＳによる分析結果を示す。
【図８】標準基質であるＭｙｒ−ＧＮＡＡＡＡＲＲ−ＤＡＥ−（ＡＣ５）２−ＢｉｏｔｉｎのＥＬＩＳＡによる分析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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