(57)【要約】      （修正有）【課題】マトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害作用を有する、ヒドロキサム酸誘導体とヒアルロン酸の結合体の提供。【解決手段】下記一般式（１）2004292465.tif 000030（式中、Ｒ１は、水素原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基を表し；Ｒ２は、直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表し；Ｒ３は、直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表し；Ｒ４は、水素原子、又はアルキル基を表し；Ｒ５は、−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−を表し、ここで、Ｒ７は、直鎖もしくは分枝鎖状のアルキレン基を表し、Ｒ８は、メチレン基もしくはイミノ基、又は酸素原子を表し、Ｒ９は、１〜３個の酸素原子が挿入されていてもよいアルキレン基を表す；Ｒ６は、水素原子、又はアルキル基を表す；又、Ｒ１とＲ３は環を形成してもよい。）で表される基と、ヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体又はそれらの塩の水酸基とが、カーバメート結合している結合体。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
2004292465.tif 000021
（式中、
Ｒ１は、水素原子、水酸基、炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基、または炭素数２〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルケニル基を表し；
Ｒ２は、炭素数３〜１０のシクロアルキル基によってもしくは炭素数６〜１４のアリ−ル基によって置換されていてもよい炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表し；
Ｒ３は、炭素数３〜１０のシクロアルキル基によってもしくは炭素数６〜１４のアリ−ル基によって置換されていてもよい炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表し；
Ｒ４は、水素原子、または炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表し；
Ｒ５は、−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−を表し、ここで、
Ｒ７は、炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキレン基を表し、
Ｒ８は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基もしくはイミノ基、または酸素原子を表し、
Ｒ９は、１〜３個の酸素原子が挿入されていてもよい炭素数１〜１０の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキレン基を表す；
Ｒ６は、水素原子、または炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表す；
また、Ｒ１とＲ３は環を形成してもよい。）
で表される基と、ヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩の水酸基とが、カーバメート結合している結合体。
【請求項２】
一般式（１）で表される基と、ヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩の構成成分であるＮ−アセチルグルコサミンの水酸基とが、カーバメート結合している請求項１記載の結合体。
【請求項３】
一般式（１）において、Ｒ２がイソブチル基である請求項１または２に記載の結合体。
【請求項４】
一般式（１）において、Ｒ１が水素原子、水酸基、メチル基、またはメトキシ基であり、かつＲ３がｔ−ブチル基であるか、あるいはＲ１とＲ３が一般式（２）
【化２】
2004292465.tif 000022
で表される環を形成する請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項５】
一般式（１）で表される基が、下記の式（３）〜（７）
【化３】
2004292465.tif 000023
【化４】
2004292465.tif 000024
【化５】
2004292465.tif 000025
【化６】
2004292465.tif 000026
【化７】
2004292465.tif 000027
から選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項６】
一般式（１）で表される基の、ヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩中のＮ−アセチルグルコサミン数に対する結合率が、０．０１〜５０％である請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合体。
【請求項７】
式（８）
【化８】
2004292465.tif 000028
で表される化合物、カルボジイミド類、およびヒアルロン酸を反応させ、活性化ヒアルロン酸を得る工程と；
その活性化ヒアルロン酸と式（９）
【化９】
2004292465.tif 000029
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項１における定義と同じであり、Ｒ１４は保護基を表す。）で表されるアミン化合物とを反応させる工程と；
得られた反応物のＲ１４を脱保護する工程と；
を含む、請求項１記載の結合体を製造する方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合体を含む医薬。
【請求項９】
関節疾患治療薬である請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
関節疾患が変形性関節症、慢性関節リウマチ、または肩関節周囲炎である請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合体の、医薬を製造するための使用。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合体の、関節疾患治療薬を製造するための使用。
【請求項１３】
関節疾患を有する患者を治療するための方法であって、薬学的に有効量の請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合体を有効成分として含む医薬を該患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マトリックスメタロプロテア−ゼ（以下ＭＭＰとも称す）阻害活性を有し、変形性関節症、慢性関節リウマチ等の関節疾患の治療に有用な、ヒドロキサム酸誘導体とヒアルロン酸との結合体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
関節軟骨は約７０％の水分と、軟骨細胞および軟骨マトリックスとから構成されている。軟骨マトリックスを構成する主成分はコラーゲンとプロテオグリカンであり、網目構造を有するコラーゲンのネットワークに水分保持能に富むプロテオグリカンが含有されている。軟骨マトリックスは粘弾性に富み、軟骨にかかる刺激や負荷を軽減して、関節軟骨が正常な形態と機能を保持する上で重要な役割を果たしている。
【０００３】
変形性関節症（以下、ＯＡとも称す）と慢性関節リウマチ（以下、ＲＡとも称す）は、共に軟骨マトリックスの破壊を伴う代表的な疾患である。両疾患におけるマトリックスの破壊は、ＯＡでは加齢に伴うメカニカルストレス、ＲＡでは滑膜表層細胞の過剰増殖、パンヌス形成、炎症性細胞の浸潤などが引き金となり、いずれもプロテアーゼの誘導を介して惹起されるものと考えられている。軟骨マトリックスの分解が中性のｐＨを持つ細胞外で行われることから、この領域のｐＨを至適とするマトリックスメタロプロテアーゼが分解の中心的な担い手と言われている［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ，  ｖｏｌ．２，  １６−２５，  （２０００）］。
【０００４】
現在までに、  ＭＭＰに属する酵素として２０種類が報告されており、それらと結合して活性を阻害する組織メタロプロテアーゼインヒビター（以下、ＴＩＭＰとも称す）と呼ばれる生体内タンパク質も４種類が見いだされている［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．２７４，  ２１４９１−２１４９４，  （１９９９）］。また、近年、分子内にメタロプロテアーゼ様のドメインとディスインテグリン様のドメインとを併せ持つ新たなＭＭＰ様タンパク質（以下、ＡＤＡＭまたはＡＤＡＭＴＳとも称す）が少なくとも３０種類以上見いだされている。ＡＤＡＭやＡＤＡＭＴＳの内のいくつかは、例えば、ＡＤＡＭ１７（ＴＮＦα変換酵素）やＡＤＡＭＴＳ−４，−５（アグリカナーゼ−Ｉ，−ＩＩ）などのように、ＭＭＰ様のプロテアーゼ活性を持つことも明らかにされつつある［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ，  ｖｏｌ．２，  １６−２５，  （２０００）］。
【０００５】
これら一連のＭＭＰファミリーに属する酵素群は、生理的条件下では発生、血管新生、性周期、骨リモデリング、組織修復などさまざまな機能を担っている。これらの機能が適切に発現されるよう、酵素の産生、活性化および基質との相互作用の各段階はＴＩＭＰ等の生体内インヒビターによって厳密にコントロールされている。換言すれば、病態でのマトリックスの破壊は、ＭＭＰの調節機構に何らかの破綻が生じ、ＭＭＰが過剰に産生、活性化されたことに起因すると考えられる。
【０００６】
それゆえ、ＭＭＰを阻害する薬物は、ＯＡやＲＡ等の関節疾患における軟骨マトリックスの破壊を抑制する薬物として極めて有望である。ＭＭＰを阻害する薬物はこれまでにも数多く報告されている（Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ  （１９９８）  ｖｏｌ．８，  ２５９−２８２、Ｊ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  （１９９８）  ｖｏｌ．１３，  ７９−１０１、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  （１９９６）  ｖｏｌ．１，  １６−２６，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  （１９９９）  ｖｏｌ．９９，  ２７３５−２７７６）が、阻害活性の強さとＭＭＰへの特異性の高さから、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（以下、ＭＭＰＩとも称す）としてはヒドロキサム酸誘導体が、現在、最も注目されている。既に経口投与でもＭＭＰ阻害作用を発揮するヒドロキサム酸誘導体が見いだされており、そのうちのいくつかは癌患者や関節疾患の患者を対象に、臨床試験が進められている。しかし、この種のＭＭＰＩは、程度の差こそあれ、すべてのＭＭＰに対する阻害作用を持ち、生理的な機能に関わるＭＭＰをも抑制してしまう可能性がある。事実、癌患者を対象に進行中である、ヒドロキサム酸誘導体の臨床試験では、一過性ながら骨筋肉痛などの副作用が約３０％の頻度で起こることが報告されている［Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ｖｏｌ．８７８，  ２２８−２３５，  （１９９９）］。最近では、特定のＭＭＰへの特異性を高めた改良品の開発も進められているが、未だ病態のみに関与するＭＭＰは特定されておらず、また、続々と未知のＭＭＰが発見されていることから、全身投与時にＭＭＰの何らかの生理作用を抑制してしまう可能性も払拭されていない。
【０００７】
こうした問題点を解消する試みとしては、まず、ＭＭＰＩの関節腔内への局所投与が考えられる。しかし、公知のヒドロキサム酸誘導体では、頻回の関節腔内注射が必要となり、ＯＡやＲＡ患者への長期の使用は極めて困難である。他の試みとしては、ＭＭＰＩを標的部位にのみ限局させる、いわゆるドラッグデリバリーシステムが考えられる。しかし、従来技術では投与されたＭＭＰＩを罹患関節内に限局または貯留させる方法は確立されていない。
【０００８】
このように、ＭＭＰＩは優れた薬理作用を有しながらも、ＯＡやＲＡのような慢性疾患の治療薬として臨床応用するためには、依然として解決すべき問題が存在する。
【０００９】
ところで、ヒアルロン酸（以下、ＨＡとも称す）は、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸との繰り返し単位より構成される生体内ポリカルボン酸であり、関節液を構成する主成分として関節液の粘弾性、荷重吸収作用および潤滑作用の保持に重要な働きを果たしている。また、軟骨マトリックスにおいては、軟骨プロテオグリカンと結合してアグリカンと呼ばれる重合体を形成し、水分保持能と粘弾性の維持に中心的な役割を担っている。
【００１０】
現在、関節疾患、特にＯＡや肩関節周囲炎においては、ＨＡおよびその架橋物（以下、臨床的に使用されているＨＡとその架橋物を総称してＨＡ製剤とも称す）の関節内注入療法が臨床的に広く行われている。ＨＡは細胞外マトリックスの構成成分であることから軟骨マトリックスにも高い親和性を有する。またそれ自身高い粘弾性を有していることから、関節内に注入された後、関節腔内に長時間局在する特徴を有している。
【００１１】
これまで関節腔内の貯留性を高めるため、ヒアルロン酸自体の物性を変化させるなどの試みが報告されている（特開平６−２５４３８１号公報、特開平１１−１３０６９７号公報、ＷＯ９９／１０３８５号公報など）。しかし、ＨＡ製剤にはＭＭＰを阻害する作用はないため、ＯＡやＲＡの病態において進行する関節破壊を十分に止める効果は期待できない。
【００１２】
これまでに、ＨＡと薬物の結合体が報告されている（特開平５−８５９４２号公報、ＷＯ９２／０６７１４号公報、特開昭６２−６４８０２号公報、特許第２７０１８６５号公報、ＷＯ９９／５９６０３号公報など）。これらは、ＨＡの上述のような局所貯留性に着目し、薬物を局所に長時間貯留させ、特定部位での薬物の作用時間が延長されることを期待したものである。
【００１３】
特に、ＷＯ９９／５９６０３号公報には、ヒドロキサム酸残基とＨＡとの結合体が開示されており、その結合体がＭＭＰ阻害作用を有し関節疾患治療剤として使用し得ることが開示されている。該公報に具体的に開示されている結合体の、ＭＭＰ阻害活性や安定性をさらに改善することは、非常に優れた結合体の創製につながる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＭＭＰ阻害作用を有する、ヒドロキサム酸誘導体とヒアルロン酸の結合体を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、上記結合体を含み、ＭＭＰ阻害作用を関節腔内または関節組織上に限局させうる関節疾患治療薬などとして有用な医薬を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、特定のヒドロキサム酸誘導体にヒアルロン酸誘導体を結合させた結合体が、これまで報告されてきた結合体よりも極めて優れたＭＭＰ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
即ち、本発明は、  下記一般式（１）
【００１８】
【化１０】
2004292465.tif 000002
【００１９】
（式中、
Ｒ１は、水素原子、水酸基、炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基、炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルコキシ基、または炭素数２〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルケニル基を表し；
Ｒ２は、炭素数３〜１０のシクロアルキル基によってもしくは炭素数６〜１４のアリ−ル基によって置換されていてもよい炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表し；
Ｒ３は、炭素数３〜１０のシクロアルキル基によってもしくは炭素数６〜１４のアリ−ル基によって置換されていてもよい炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表し；
Ｒ４は、水素原子、または炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表し；
Ｒ５は、−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−を表し、ここで、
Ｒ７は、炭素数１〜８の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキレン基を表し、
Ｒ８は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基もしくはイミノ基、または酸素原子を表し、
Ｒ９は、１〜３個の酸素原子が挿入されていてもよい炭素数１〜１０の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキレン基を表す；
Ｒ６は、水素原子、または炭素数１〜４の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を表す；
また、Ｒ１とＲ３は環を形成してもよい。）
で表される基と、ヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体またはそれらの塩の水酸基とが、カーバメート（ｃａｒｂａｍａｔｅ）結合により結合している結合体を提供する。
【００２０】
また、本発明は、式（８）
【００２１】
【化１１】
2004292465.tif 000003
【００２２】
で表される化合物、カルボジイミド類、およびヒアルロン酸を反応させ、活性化ヒアルロン酸を得る工程と；その活性化ヒアルロン酸と式（９）
【００２３】
【化１２】
2004292465.tif 000004
【００２４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項１における定義と同じであり、Ｒ１４は保護基を表す。）で表されるアミン化合物とを反応させる工程と；得られた反応物のＲ１４を脱保護する工程と；を含む、上記の結合体を製造する方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、上記の結合体を含む医薬を提供する。
なお、ＷＯ９９／５９６０３号公報には、ヒドロキサム酸残基がスペ−サ−を介してＨＡと結合した結合体が開示されているが、本発明における結合体については具体的な開示はない。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明における「ヒドロキサム酸誘導体」には、ヒドロキサム酸骨格（Ｎ−ヒドロキシアミド）を有する物質が含まれ、具体的には、例えば、前述の一般式（１）で表される基を有する化合物などが含まれる。
【００２７】
本発明において、一般式（１）における置換基の非限定的具体例としては、特に示さない限り以下の内容を含む。
Ｒ１の、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基などが挙げられるが、中でもメチル基が好ましい。
【００２８】
Ｒ１の、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、イソペンチルオキシ基などが挙げられが、中でもメトキシ基が好ましい。
【００２９】
Ｒ１の、炭素数２〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基としては、ビニル基、アリル基、ｎ−ブテニル基、ｉ−ブテニル基、ｓｅｃ−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基等が挙げられる。
【００３０】
Ｒ１は上記のような定義を有するが、Ｒ１としては水素原子、水酸基、メチル基、およびメトキシ基が特に好ましい。
Ｒ２の、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基などが挙げられるが、中でもイソブチル基が好ましい。
【００３１】
Ｒ２の炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基の置換基としての炭素数３〜１０のシクロアルキル基としては、好ましくは炭素数５〜７のシクロアルキル基が挙げられ、具体的にはシクロペンチル基、シクロヘキシル基、またはシクロヘプチル基等があげられる。
【００３２】
Ｒ２の炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基の置換基としての炭素数６〜１４のアリ−ル基としては、水酸基、メトキシ基等の置換基を有していてもよい炭素数６〜１４のアリール基が挙げられ、具体的にはフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、またはナフチル基等が挙げられる。
【００３３】
Ｒ２は上記のような定義を有するが、Ｒ２としてはイソブチル基が好ましい。
Ｒ３の、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基などが挙げられるが、中でもｔ−ブチル基が好ましい。
【００３４】
Ｒ３の炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基の置換基としての炭素数３〜１０のシクロアルキル基としては、好ましくは炭素数５〜７のシクロアルキル基が挙げられ、具体的にはシクロペンチル基、シクロヘキシル基、またはシクロヘプチル基等があげられる。
【００３５】
Ｒ３の、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基の置換基としての炭素数６〜１４のアリ−ル基としては、水酸基、メトキシ基等の置換基を有していてもよい炭素数６〜１４のアリール基が挙げられ、具体的にはフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、またはナフチル基等が挙げられる。
【００３６】
Ｒ１が水素原子、水酸基、メチル基、またはメトキシ基である場合には、Ｒ３がｔ−ブチル基であることが好ましい。
Ｒ３は上記のような定義を有するが、Ｒ３としてはｔ−ブチル基が好ましい。
【００３７】
Ｒ４の、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基が挙げられ、中でもメチル基が好ましい。
【００３８】
Ｒ４としては、水素原子およびメチル基が好ましく、水素原子が特に好ましい。
Ｒ５の−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−においては、Ｒ７はＮＲ４のＮと結合し、Ｒ９はＮＲ６のＮと結合している。
【００３９】
Ｒ７の炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基としては、メチレン基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基、２−メチルペンタン−１，３−ジイル基、２−メチルブタン−１，４−ジイル基、３−メチルブタン−１，４−ジイル基、３−メチルペンタン−１，５−ジイル基、３−エチルペンタン−１，５−ジイル基、３−メチルヘキサン−１，６−ジイル基、４−メチルヘキサン−１，６−ジイル基、４−メチルヘプタン−１，７−ジイル基などが挙げられる。
【００４０】
Ｒ７としては、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基が好ましい。
Ｒ８の炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基もしくはイミノ基における置換基としての炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基が挙げられる。
【００４１】
Ｒ８としては、炭素数１〜３の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基、及び酸素原子が好ましく、メチレン基、及び酸素原子が特に好ましい。
【００４２】
Ｒ９の１〜３個の酸素原子が挿入されていてもよい炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキレン基の非限定的具体例としては、メチレン基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基、ノナン−１，９−ジイル基、オクタン−１，１０−ジイル基、２−メチルペンタン−１，３−ジイル基、２−メチルブタン−１，４−ジイル基、３−メチルブタン−１，４−ジイル基、３−メチルペンタン−１，５−ジイル基、３−エチルペンタン−１，５−ジイル基、３−メチルヘキサン−１，６−ジイル基、４−メチルヘキサン−１，６−ジイル基、４−メチルヘプタン−１，７−ジイル基、１−オキサ−プロパン−１，３−ジイル基、２−オキサブタン−１，４−ジイル基、３−オキサペンタン−１，５−ジイル基、２−オキサヘキサン−１，６−ジイル基、３−オキサヘキサン−１，６−ジイル基、１，４−ジオキサヘキサン−１，６−ジイル基、３−オキサヘプタン−１，７−ジイル基、２，５−ジオキサヘプタン−１，７−ジイル基、４−オキサオクタン−１，８−ジイル基、２，６−ジオキサオクタン−１，８−ジイル基、３，６−ジオキサノナン−１，９−ジイル基、３，６−ジオキサ−４−メチルノナン−１，９−ジイル基、３，６−ジオキサ−５−エチルノナン−１，９−ジイル基、１，４，７−トリオキサオクタン−１，１０−ジイル基などが挙げられる。Ｒ９は、好ましくはエタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、３，６−ジオキサノナン−１，９−ジイル基などが挙げられる。
【００４３】
Ｒ５の好ましい具体例としては、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）７−、−（ＣＨ２）８−、−（ＣＨ２）９−、−（ＣＨ２）１０−、−（ＣＨ２）１１−、−（ＣＨ２）１２−、−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−Ｏ−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−等が挙げられる。特に好適には、Ｒ５は、−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−である。
【００４４】
Ｒ６の炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基が挙げられ、中でもメチル基が好ましい。
【００４５】
Ｒ６としては、メチル基および水素原子が好ましく、水素原子が特に好ましい。
Ｒ１とＲ３が一緒になって環を形成する場合には、−Ｉ−Ｊ−Ｋ−Ｌ−（Ｉは酸素原子を含んでもよい炭素数１〜８のアルキレン基、ＪはＯ、Ｓ、ＮＨ、ＣＯＮＨまたはＮＨＣＯ、Ｋは存在しないかあるいは置換基を有してもよい芳香環、Ｌは炭素数１〜８のアルキレン基である）を形成することが好ましい。このとき、ＩはＲ１側から結合し、ＬはＲ３側から結合する。また、Ｋが芳香環を表す場合には、ＪとＬはそれぞれ芳香環の任意の位置に結合することができる。
【００４６】
ＩおよびＬの非限定的具体例としては、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレンが挙げられ、好ましくは、Ｉとしては、例えば、トリメチレンが挙げられ、Ｌとしては、例えば、メチレンが挙げられる。Ｋは存在しないか、あるいは置換基を有してもよい芳香環を示すが、ここで芳香環としては、フェニル、トリル、キシリル、ナフチル、ビフェニル、アントリル、フェナントリル、ピリジル、インドリル、キノリル、イミダゾリル等が挙げられ、好ましくはフェニルが挙げられる。
【００４７】
−Ｉ−Ｊ−Ｋ−Ｌ−は、例えば、Ｒ１側からの残基がハロゲン化アルキル基、好ましくはプロピルブロマイド基、Ｒ３側からの残基が水酸基を有するアルコール誘導体またはフェノール誘導体、好ましくはパラヒドロキシベンジル基である化合物を縮合することにより得られる。
【００４８】
−Ｉ−Ｊ−Ｋ−Ｌ−の非限定的具体例としては、一般式（２）：
【００４９】
【化１３】
2004292465.tif 000005
【００５０】
で示される基などが挙げられる。
一般式（１）で示される基は、Ｒ２がイソブチル基であることが好ましい。
一般式（１）で示される基は、Ｒ１が水酸基またはメトキシ基、かつ、Ｒ３がｔ−ブチル基であることが好ましい。
【００５１】
一般式（１）で示される基は、Ｒ１とＲ３が一般式（２）で表される環であることが好ましい。
一般式（１）で示される基は、式（３）〜（７）の基であることが好ましい（。
【００５２】
一般式（１）の光学異性体およびそれらの任意の割合の混合物等はいずれも本発明に包含される。
本発明において、「ヒアルロン酸（ＨＡ）」とは、重量平均分子量５０，０００〜１０，０００，０００を有する、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとから成る二糖の重合体、並びにこれらの混合物を挙げられる。ＨＡは、粘弾性の強さの点から、重量平均分子量７００，０００〜１０，０００，０００を有するものが好ましく、重量平均分子量１，０００，０００〜１０，０００，０００であることが特に好ましい。
【００５３】
本発明において「ヒアルロン酸誘導体」とは、ヒアルロン酸から誘導されるヒアルロン酸骨格を有する全ての物質を意味する。ヒアルロン酸誘導体の非限定的具体例としては；
（１）  糖成分であるグルクロン酸及び／またはＮ−アセチルグルコサミンが還元末端を有しているヒアルロン酸誘導体；
（２）  ＨＡ中の１以上のカルボキシル基がエステル化されているヒアルロン酸誘導体（例えば、ベンジルエステル化ＨＡ（Ｈｙａｆｆ、登録商標、Ｆｉｄｉａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ））；
（３）  重量平均分子量５０，０００〜１０，０００，０００を有するグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとからなる二糖の重合体を、ホルムアルデヒドで架橋してさらに高分子化した誘導体（例えば、シンビスク（Ｓｙｎｖｉｓｃ、登録商標、バイオマトリックス））；並びに
（４）  その他、ＨＡ中の１以上の水酸基がアセチル化されているアセチル化ＨＡや、あるいは上記したＨＡまたはＨＡ誘導体に１以上の薬効成分、例えば制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等が挙げられる）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド系抗炎症剤等が挙げられる）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、ポリペプチド系抗生物質、サルファ剤等が挙げられる）などを、スペーサーを介してまたは介さずに結合させることによって得られる誘導体等
が含まれる。
【００５４】
ＨＡまたはＨＡ誘導体の塩の非限定的具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩などを挙げることができる。
【００５５】
ＨＡの由来には特に制限されないが、例えば、連鎖球菌等のバクテリア、ヒト、ブタ、ニワトリ等に由来するＨＡを使用できる。
ＨＡ、ＨＡ誘導体及びそれらの塩の非限定的具体例としては、例えば、スベニール（登録商標、日本ルセル）、アルツ（登録商標、科研製薬）、オペガン（登録商標、参天製薬）、ヒアルガン（登録商標、フィーディア）、オルトビスク（登録商標、アニカセラピューティックス）、ヒアロン（登録商標、ファルマシア＆アップジョン）等を挙げることでき、また、和光純薬工業（株）等の各種試薬メーカーのカタログに記載のＨＡ、ＨＡ誘導体及びこれらの塩を挙げることもできる。
【００５６】
本発明の結合体においては、一般式（１）で表される基と、ＨＡもしくはＨＡ誘導体またはそれらの塩のＮ−アセチルグルコサミン（以下「ＧｌｃＮＡｃ」とも記す）の水酸基とが、カーバメート結合していることが好ましい。
【００５７】
また、一般式（１）で表される基の、ＨＡもしくはＨＡ誘導体またはそれらの塩中のＧｌｃＮＡｃ数に対する結合率が、０．０１〜５０％であることが好ましく、０．１〜１０％であることが特に好ましい。ここで「結合率」とは、本発明の結合体を構成するＨＡもしくはＨＡ誘導体またはそれらの塩に含まれる全ＧｌｃＮＡｃ数に対する、そのＨＡに結合した一般式（１）で表される基の総数の割合をいう。こうした結合率は、例えば、後述の実施例２に記載の方法により算出できる。
【００５８】
本発明の結合体を医薬として適用する場合、薬学的に許容できる賦形剤または安定剤などと一緒に製剤化してから使用してもよい。
本発明の結合体を含む医薬の投与形態は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよく、また、全身投与でも局所投与でもよい。一般的には、本発明の医薬は非経口的に局所投与するのが好ましく、例えば、注射剤として、関節内、静脈内、筋肉内または皮下に投与することができ、あるいはスプレー剤、局所用クリーム、ローション、または軟膏として経皮的に投与することができる。
【００５９】
本発明の結合体を含む医薬は、変形性関節症、慢性関節リウマチまたは肩関節周囲炎等の関節疾患治療薬としても使用できる。こうした医薬の製造に、好ましく関節疾患治療薬の製造に使用される。
【００６０】
薬学的に有効量の本発明の結合体を有効成分として含む医薬を、関節疾患等を有する患者を治療するために投与することも好ましい。そうした場合、本発明の医薬の投与量は、患者の症状、年齢、性別などに応じて適宜選択できるが、注射剤として用いる場合は一般的には、有効成分である結合体の量として０．０１ｍｇ／体重ｋｇ／日〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日、好ましくは０．１ｍｇ／体重ｋｇ／日〜１０ｍｇ／体重ｋｇ／日である。前記１日当たりの投与量の医薬を、１日に数回に分けて投与してもよく、１日１回投与してもよい。あるいは、２日〜２８日に１回投与してもよい。
【００６１】
本発明の結合体の製造方法は、特に限定されないが、例えば、以下に示す方法等により、あるいは後述の合成実施例に示す方法により、またはそれを応用して製造することができる。
【００６２】
即ち、ＨＡもしくはＨＡ誘導体又はそれらの塩の水溶液にカルボジイミド類と式（８）で示される化合物とを加え、塩酸やリン酸などの酸や緩衝液を用いて反応液のｐＨを４〜６に維持しながら、０〜３５℃で１〜９６時間反応させる。反応液から透析などにより余分な低分子物質を除去し、活性化されたＨＡもしくはＨＡ誘導体又はそれらの塩を得る。続いて、こうして得られた活性化されたＨＡもしくはＨＡ誘導体又はそれらの塩の水溶液に、式（９）で示されるアミン化合物を加え、水酸化ナトリウムやトリエチルアミンなどの塩基を用いて反応液のｐＨを９〜１２に維持しながら、０〜３５℃で１〜９６時間反応させる。もし、ここで用いる式（９）で示されるアミン化合物の、水に対する溶解性が低い場合には、１〜５０％の有機溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジオキサン、エタノ−ル、ピリジンなど）を含む水溶液を反応溶媒としてもよい。
【００６３】
反応後、反応液にエタノ−ル、アセトン等の有機溶媒を加え沈殿を生じさせ、沈殿物をアルコ−ル沈殿、ゲルろ過、透析、イオン交換クロマトグラフィ−等の手段で精製することにより、目的とする結合体を得ることができる。なお、必要に応じて、この精製過程の前や途中にＲ１４を脱保護する操作（ｐＨ２〜６の酸性下に暴露、または、接触還元）を加えてもよい。
【００６４】
なお、カルボジイミド類としては、例えば、下記化合物
【００６５】
【化１４】
2004292465.tif 000006
【００６６】
などが挙げられ、好ましくは
【００６７】
【化１５】
2004292465.tif 000007
【００６８】
である。
式（９）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６における置換基の非限定的具体例は、特に示さない限りは、上述した一般式（１）における置換基の非限定的具体例と同様である。
【００６９】
Ｒ１４（保護基）としては、
【００７０】
【化１６】
2004292465.tif 000008
【００７１】
などが挙げられ、好ましくは、
【００７２】
【化１７】
2004292465.tif 000009
【００７３】
である。
以下、実施例および試験例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例および試験例になんら限定されるものではない。
【００７４】
【実施例】
（実施例１）  ヒドロキサム酸誘導体の合成例
Ｎ’−（１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ−１−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの合成
【００７５】
【化１８】
2004292465.tif 000010
【００７６】
（ａ） Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの合成
【００７７】
【化１９】
2004292465.tif 000011
【００７８】
１−アミノ−１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカン（７．９ｇ）、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン（５．１ｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル水和物（３．４ｇ）、ジクロロメタン（８０ｍｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）の混合物に、−２５℃にて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（４．３ｇ）およびトリエチルアミン（３．２ｍｌ）を加え、−２５℃にて３０分間、５℃にて１時間、さらに室温にて７時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣にジクロロメタンを加え、５％クエン酸水溶液、飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノ−ル＝１００：３）を用いて精製し表題化合物（８．２ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．８８（９Ｈ，ｓ）、１．６０（９Ｈ，ｓ）、１．５０−１．６５（４Ｈ，ｍ）、２．９２−３．５０（１６Ｈ，ｍ）、３．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、５．００（２Ｈ，ｓ）、６．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、７．１５−７．２５（１Ｈ，ｍ）、７．２５−７．４０（５Ｈ，ｍ）、７．  ８０−７．９０（１Ｈ，ｍ）。
【００７９】
（ｂ）Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）− Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造
【００８０】
【化２０】
2004292465.tif 000012
【００８１】
Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド（４．２ｇ）、トリフルオロ酢酸（１２ｍｌ）およびジクロロメタン（３ｍｌ）の混合物を室温にて１時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノ−ル：アンモニア水＝１００：１０：１）を用いて精製し表題化合物（２．６ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１．０１（９Ｈ，ｓ）、１．６５−１．８０（４Ｈ，ｍ）、１．８０−２．８０（２Ｈ，ｂｒ）、３．１０−３．６５（１７Ｈ，ｍ）、５．０８（２Ｈ，ｓ）、５．６５−５．８０（１Ｈ，ｍ）、７．２５−７．４０（５Ｈ，ｍ）、７．  ５０−７．６５（１Ｈ，ｍ）。
【００８２】
（ｃ）Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（２Ｒ−（２，２−ジメチル−４−オキソ−１，３−ジオキソラン−５Ｓ−イル）−４−メチルペンタノイル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造
【００８３】
【化２１】
2004292465.tif 000013
【００８４】
２Ｒ−（２，２−ジメチル−４−オキソ−１，３−ジオキソラン−５Ｓ−イル）−４−メチルペンタン酸（１．８０ｇ）、Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド（３．４８ｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル水和物（１．２０ｇ）、ジクロロメタン（２８．８ｍｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７．２ｍｌ）の混合物に、−１０℃にてＥＤＣ（１．５０ｇ）およびトリエチルアミン（１．０９ｍｌ）を加え、−１０℃にて３０分間、０℃にて１時間、さらに室温にて１６時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノ−ル＝９７：３）を用いて精製し、表題化合物（４．９０ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．８１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、０．８４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、０．９０（９Ｈ，ｓ），１．４０−１．６４（７Ｈ，ｍ）、１．４６（３Ｈ，ｓ）、１．５６（３Ｈ，ｓ）、２．９４−３．１０（５Ｈ，ｍ）、３．２５−３．５１（１２Ｈ，ｍ）、４．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、４．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、５．００（２Ｈ，ｓ）、７．１９−７．２４（１Ｈ，ｍ）、７．２７−７．４０（５Ｈ，ｍ）、７．８１−７．８７（１Ｈ，ｍ）、７．９９−８．０６（１Ｈ，ｍ）。
【００８５】
（ｄ）Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造
【００８６】
【化２２】
2004292465.tif 000014
【００８７】
塩化ヒドロキシルアンモニウム（０．４３ｇ）および１Ｎナトリウムメトキシド−メタノ−ル溶液（６ｍｌ）の混合物を室温にて２時間攪拌した。反応混合物から不溶物をろ別し、得られたろ液をＮ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（２Ｒ−（２，２−ジメチル−４−オキソ−１，３−ジオキソラン−５Ｓ−イル）−４−メチルペンタノイル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド（０．９５ｇ）およびメタノ−ル（１０ｍｌ）の混合物に加え、室温にて３時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカルムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノ−ル＝１０：１）を用いて精製し、表題化合物（０．８４ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、０．８０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、０．９０（９Ｈ，ｓ），１．３０−１．５２（３Ｈ，ｍ）、１．５４−１．６８（４Ｈ，ｍ）、２．６５−２．７３（１Ｈ，ｍ）、３．００−３．１２（４Ｈ，ｍ）、３．２４−３．５２（１２Ｈ，ｍ）、３．７０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、５．００（２Ｈ，ｓ）、５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．１８−７．２４（１Ｈ，ｍ）、７．２６−７．３９（５Ｈ，ｍ）、７．４３−７．４９（１Ｈ，ｍ）、７．８８−７．９４（１Ｈ，ｍ）、８．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ）、１０．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ）。
【００８８】
（ｅ）Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ−１−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造
【００８９】
【化２３】
2004292465.tif 000015
【００９０】
Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−ヒドロキシアミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド（０．８４ｇ）、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム塩（２０ｍｇ）およびジクロロメタン（４０ｍｌ）の混合物に、室温にて２−メトキシプロペン（０．２４ｍｌ）を滴下し、さらに室温にて５０分間攪拌した。反応混合物を飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカルムクロマトグラフィ（溶出溶媒  ジクロロメタン：メタノ−ル＝２０：１）を用いて精製し表題化合物（０．８６ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．７９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．９０（９Ｈ，ｓ），０．９０−１．０６（１Ｈ，ｍ）、１．２９（３Ｈ，ｓ），１．３０（３Ｈ，ｓ），１．３０−１．６８（６Ｈ，ｍ）、２．６２−２．７６（１Ｈ，ｍ）、３．００−３．１５（４Ｈ，ｍ）、３．２２（３Ｈ，ｓ），３．２６−３．５２（１２Ｈ，ｍ）、３．８１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）、５．００（２Ｈ，ｓ）、５．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．１９−７．２６（１Ｈ，ｍ）、７．２７−７．４２（５Ｈ，ｍ）、７．４５−７．５０（１Ｈ，ｍ）、７．８９−７．９９（１Ｈ，ｍ）、１０．４１（１Ｈ，ｓ）。
【００９１】
（ｆ）Ｎ’−（１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ−１−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造
【００９２】
【化２４】
2004292465.tif 000016
【００９３】
Ｎ’−（１３−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ−１−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド（０．８６ｇ）、１０％パラジウム−炭素（０．３０ｇ）およびメタノ−ル（５０ｍｌ）の混合物を、水素雰囲気下室温にて４時間攪拌した。反応混合物より触媒をろ別後、減圧下濃縮し表題化合物（０．６６ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．７７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．８０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．９０（９Ｈ，ｓ），０．９０−１．０２（１Ｈ，ｍ）、１．２９（３Ｈ，ｓ），１．３０（３Ｈ，ｓ），１．３０−１．６５（６Ｈ，ｍ）、２．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、２．６３−２．７４（１Ｈ，ｍ）、３．０３−３．１４（２Ｈ，ｍ）、３．２２（３Ｈ，ｓ），３．２２−３．５３（１２Ｈ，ｍ）、３．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、４．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、７．４７−７．５１（１Ｈ，ｍ）、７．９２−７．９９（１Ｈ，ｍ）。
【００９４】
（実施例２）  本発明の結合体の合成例
【００９５】
【化２５】
2004292465.tif 000017
【００９６】
ヒアルロン酸ナトリウム塩（６００ｍｇ、重量平均分子量：約２２０万）を蒸留水（６０ｍｌ）に溶解し、得られた溶液にピリジン  （１．２  ｍｌ）、１Ｎ  塩酸  （１２  ｍｌ）および蒸留水（４６．８  ｍｌ）を添加したのち、さらにＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド（ＨＯＮＢ）（１．０６８  ｇ）、ＥＤＣ  （１．１５２  ｇ）を添加し、攪拌しながら４℃で１晩放置した。反応を停止させるため、２％酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ６．０）（６０  ｍｌ）を添加した後、４℃で３０分間攪拌した。この溶液を透析膜（分子量カットオフ１２，０００〜１４，０００、三光純薬製）を用いて、イオン交換水を外液として、４℃で６時間透析を行った。透析後の溶液に、実施例１で得られたヒドロキサム酸誘導体であるＮ’−（１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ−１−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの２５  ｍＭ水溶液（２０  ｍｌ）を添加した後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ９．２に調整し、４℃で２２時間攪拌した。次いで、さらに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ１０．９に調整し、４℃で１日間攪拌した。この溶液に塩化ナトリウム（８．４ｇ）を添加した後、エタノ−ル（５００  ｍｌ）を滴下してエタノ−ル析出を行い、析出物を遠心分離により上清と分離した。析出物を超純水（３６０  ｍｌ）に溶解した後、塩化ナトリウム（１４  ｇ）を添加し、クリ−ンベンチ内でポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ−（ミリポア製）でろ過し、エタノ−ル９００  ｍｌを滴下してエタノ−ル析出を行った。析出物を遠心分離により分離後、再び０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液（１８０  ｍｌ）に溶解し、エタノ−ル４５０  ｍｌを滴下してエタノ−ル析出を行った。析出物を遠心分離により分離し、生理食塩水（大塚）３０ｍｌに溶解し、表題化合物（結合体）の水溶液を得た。得られた結合体の分子量を、ヒアルロン酸を標準物質とするゲルろ過法により求めたところ、約１６４万であった。結合体水溶液の濃度は１％（ｗ／ｖ）であった。また、得られた結合体を塩酸加水分解して、結合体中のｔ−Ｌｅｕ量をアミノ酸分析装置を用いて測定することにより、Ｎ’−（１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカニル）−Ｎ−（３Ｓ−ヒドロキシ−４−（Ｎ−（１−メトキシ−１−メチルエトキシ）アミノ）−２Ｒ−イソブチルサクシニル）−Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの、ヒアルロン酸ナトリウム塩中のＮ−アセチルグルコサミンに対する結合率を算出したところ、３．８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ０．７８（ｄ）、０．８０（ｄ）、０．９２（ｓ），１．０４−１．１２（ｍ）、１．２７−１．３９（ｍ）、１．３９−１．６０（ｍ）、１．４６−１．５４（ｍ），１．６４（ｂｒ．ｓ）、１．６７−１．７６（ｍ）、１．９４（ｂｒ．ｓ）、２．７８−２．８７（ｍ）、２．９４（ｂｒ．ｓ）３．０３−３．１４（ｍ）、３．１９（ｍ）、３．２９（ｂｒ．ｓ）、３．３５（ｂｒ．ｓ）、３．４５（ｂｒ．ｓ）、３．４８（ｍ）、３．５９（ｓ）、３．６１（��）、３．７８（ｂｒ．ｓ）、４．０４（ｄ）、４．１０（ｓ）、４．４０（ｂｒ．ｓ）、４．４９（ｂｒ．ｓ）、４．５８（ｂｒ．ｓ）、６．１７（ｂｒ．ｓ）、６．２１（ｂｒ．ｓ）、６．４２（ｂｒ．ｓ）。
【００９７】
上記のＮＭＲデ−タから、保護基が除去されていること、および結合体の構成成分が確認された。即ち、
（１）保護基である１−メトキシ−１−メチルエチル基由来の１．３０付近および３．２２付近のシングレットシグナルは消失しているので、保護基は除去されている。
（２）３．２９、３．４５、３．７８ｐｐｍなどのヒアルロン酸由来のシグナルと、０．７８、０．８０、０．９２、４．０４、４．１０ｐｐｍなどのヒドロキサム酸誘導体由来のシグナルに加えて、６．１７、６．２１、６．４２ｐｐｍのシグナルが観測された。これら６．１７、６．２１、６．４２ｐｐｍのシグナルは、ＨＯＮＢのオレフィン位由来のシグナルである。
（３）ＨＯＮＢのオレフィン位のシグナルは、元々等価で２プロトン分のシングレットシグナル（６．０２ｐｐｍ）として観測されるが、ここでは２本のシングレットシグナル（６．１７ｐｐｍと６．４２ｐｐｍのペア、および６．２１ｐｐｍと６．４２ｐｐｍのペア）に割れている。この様に等価なプロトンが非等価に変化したことからＨＯＮＢが開環した形で存在することが示唆された。
【００９８】
（実施例３）  オリゴＨＡ（不飽和二糖）とヒドロキサム酸誘導体との結合体の取得及び解析
実施例２で得られた結合体（ＨＡとヒドロキサム酸誘導体との結合体、以下「結合体Ａ」とも記す）を、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ由来のヒアルロニダ−ゼ（生化学工業社製、商品名「ヒアルロニダ−ゼＳＤ」）を用いて、下記の条件で、オリゴＨＡ（非結合体）と、オリゴＨＡ（不飽和二糖）とヒドロキサム酸誘導体との結合体とに消化した。「ヒアルロニダ−ゼＳＤ」は、ＨＡのβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル（１→４）グルクロン酸結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ−４，５−グルクロン酸残基をもつ不飽和二糖を生成する酵素である。
［酵素消化条件］
４０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中。
結合体Ａの濃度：ＨＡとして０．４％（ｗ／ｖ）。
ヒアルロニダ−ゼＳＤ濃度：０．５  Ｕ／ｍｌ（１ＵはｐＨ６．２、３７℃で１分間にＨＡから１μモルの不飽和二糖を遊離する酵素量である）。
３７℃，２０時間。
【００９９】
反応停止は、反応液を熱処理（１００℃、５分間）することにより行った。得られた熱処理液をフィルタ−濾過（ポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ−、ミリポア製）して、濾液を回収した。得られた濾液を、以下の条件で逆相クロマトグラフィ−分画し、逆相カラムを素通りするオリゴＨＡ（非結合体）を除去し、アセトニトリルグラジエントにより溶出されるオリゴＨＡ（不飽和二糖）とヒドロキサム酸誘導体との結合体の画分を集めた。
［逆相クロマトグラフィ−条件］
使用装置：ＳＭＡＲＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア社製）。
逆相カラム：μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＰＣ３．２／３（ファルマシア社製）。
流速：２００μｌ／分。
溶離液組成：０分−５分    水＋０．１％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）。
【０１００】
５分−３０分  ０〜５０％アセトニトリル  リニア  グラジエント（０．１％  ＴＦＡ。）
サンプル：上記濾液  １００μｌ／クロマトグラフィ−。
検出：２０５ｎｍ。
分取回数：２回。
【０１０１】
上記逆相クロマトグラフィ−において、１５分付近で溶出した２０５ｎｍのピ−ク部分をオリゴＨＡ（不飽和二糖）とヒドロキサム酸誘導体との結合体の画分として分取し、２回分を合わせて凍結乾燥した。
【０１０２】
この凍結乾燥体を５０％メタノ−ルに溶解したものをサンプルとして、ＬＣ／ＭＳ分析を行った。ＬＣ／ＭＳ分析は、エレクトロスプレ−イオン化法（ＥＳＩ）とソニックスプレ−イオン化法（ＳＳＩ）によって、以下の条件で行った。
［ＬＣ／ＭＳ条件］
装置：日立社製  Ｍ−１２００Ｈ。
サンプル導入：フロ−インジェクション法。
【０１０３】
移動相：５０％メタノ−ル。
流速：５０μｌ／分。
イオン化法：ＥＳＩ（正イオンモ−ド）。
【０１０４】
ドリフト  ３０Ｖ，霧化器温度  ２５０℃、細孔温度  １２０℃。
ＳＳＩ（正イオンモ−ド）。
窒素ガス流量  ３Ｌ／分。
【０１０５】
ＥＳＩ法にて検出された質量は、ｍ／ｚ＝１０８３であった。ＳＳＩ法にて検出された質量は  ｍ／ｚ＝１１０５であった。この結果と上述のＮＭＲの測定結果から、酵素消化により生じたオリゴＨＡ（不飽和二糖）とヒドロキサム酸誘導体との結合体におけるＨＯＮＢの開環成分は、不飽和二糖のいずれかの水酸基部分と結合していることが確認された。ＥＳＩ法では１個のナトリウムイオンが付加して正イオン化された質量であり、ＳＳＩ法では１個のプロトンが脱離して２個のナトリウムイオンが付加して正イオン化された質量である。
【０１０６】
（実施例４）  Ｎ−アセチルグルコサミンとヒドロキサム酸誘導体との結合体の取得及び解析
実施例２で得られた結合体Ａを、ヒツジ睾丸由来のヒアルロニダ−ゼ（シグマ社製、Ｔｙｐｅ  Ｖ、ＨＡのβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル（１→４）グルクロン酸結合を加水分解して四糖及び六糖を生成する酵素）を用いて、以下の条件で、オリゴＨＡ（非結合体）と、オリゴＨＡとヒドロキサム酸誘導体との結合体とに消化した。
［酵素消化条件］
４０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中。
結合体Ａの濃度：ＨＡとして０．４％（ｗ／ｖ）。
ヒアルロニダ−ゼ濃度：１０，０００  Ｕ／ｍｌ（シグマ社表示活性）。
３７℃、３１時間。
【０１０７】
反応停止は、反応液を熱処理（１００℃，５分間）することにより行った。得られた熱処理液をフィルタ−濾過（ポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ−、ミリポア製）して、濾液を回収した。
【０１０８】
この濾液２５０μｌを、ＳＥＰ−ＰＡＫ  Ｃ１８カ−トリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）にかけ、５ｍｌの水を通液することにより、素通りするオリゴＨＡ（非結合体）を除去した。続いて２０％アセトニトリル溶液５ｍｌを通液し、溶出されるオリゴＨＡとヒドロキサム酸誘導体との結合体の画分を得た。
【０１０９】
得られた２０％アセトニトリル溶出画分を凍結乾燥し、以下の更なる酵素分解に供した。
この凍結乾燥物全量を、ウシ肝臓由来のβ−グルクロニダ−ゼ（シグマ社製、ｔｙｐｅ  Ｂ−１０、β−グルクロニドを加水分解してＤ−グルクロン酸を遊離させる反応を触媒する酵素で、オリゴＨＡの非還元末端のＤ−グルクロン酸を遊離させる）を用いて、以下の条件で消化した。
［酵素消化条件］
２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）中。
β−グルクロニダ−ゼ：２０，０００  Ｕ／ｍｌ（シグマ社表示活性）。
反応液量：４００μｌ。
３７℃、２１時間。
【０１１０】
反応停止は、反応液を熱処理（１００℃，５分間）することにより行った。得られた熱処理液をフィルタ−濾過（ポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ−、ミリポア製）して、濾液を回収した。
【０１１１】
さらに、この濾液に含まれているオリゴＨＡとヒドロキサム酸誘導体との結合体を、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチナ−ゼ（生化学工業社製、商品名「コンドロイチナ−ゼＡＣＩＩアルスロ」、コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸のβ−１，４−ヘキソサミニド結合を脱離分解し不飽和二糖を生成する酵素）を用いて、以下の条件でオリゴＨＡ（非結合体）と、Ｎ−アセチルグルコサミンとヒドロキサム酸誘導体との結合体とに消化した。
［酵素消化条件］
４０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中。
コンドロイチナ−ゼＡＣＩＩアルスロ：５  Ｕ／ｍｌ（生化学工業社表示活性）。
上記濾液：３５０μｌ。
反応液量：４００μｌ。
３７℃、２０時間。
【０１１２】
反応停止は、反応液を熱処理（１００℃、５分間）することにより行った。得られた熱処理液をフィルタ−濾過（ポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ−、ミリポア製）し、濾液を回収した。
【０１１３】
得られた濾液を、以下の条件で逆相クロマトグラフィ−分画し、逆相カラムを素通りするオリゴＨＡ等（非結合体）を除去し、アセトニトリルグラジエントにより溶出されるＮ−アセチルグルコサミンとヒドロキサム酸誘導体との結合体の画分を集めた。
［逆相クロマトグラフィ−条件］
使用装置：ＳＭＡＲＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシア社製）。
逆相カラム：μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＰＣ３．２／３（ファルマシア社製）。
流速：２００μｌ／分。
溶離液組成：０分−５分    水＋０．１％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）。
【０１１４】
５分−３０分  ０〜５０％アセトニトリルリニアグラジエント（０．１％  ＴＦＡ）。
サンプル：上記濾液  １００μｌ／クロマトグラフィ−。
検出：２０５ｎｍ。
分取回数：３回。
【０１１５】
上記逆相クロマトグラフィ−において、１６分付近に溶出した２０５ｎｍのピ−ク部分をＮ−アセチルグルコサミンとヒドロキサム酸誘導体との結合体の画分として分取し、３回分合わせて凍結乾燥した。
【０１１６】
この凍結乾燥体を５０％メタノ−ルに溶解したものをサンプルとして、ＬＣ／ＭＳ分析を行った。ＬＣ／ＭＳ分析は、エレクトロスプレ−イオン化法（ＥＳＩ）とソニックスプレ−イオン化法（ＳＳＩ）によって、以下の条件で行った。
［ＬＣ／ＭＳ条件］
装置：日立社製  Ｍ−１２００Ｈ。
サンプル導入：フロ−インジェクション法。
【０１１７】
移動相：５０％メタノ−ル。
流速：５０μｌ／分。
イオン化法：
ＥＳＩ（正イオンモ−ド）：ドリフト  ３０Ｖ、霧化器温度  ２５０℃、細孔温度  １２０℃。
【０１１８】
ＳＳＩ（正イオンモ−ド）：窒素ガス流量  ３Ｌ／分。
ＥＳＩ法およびＳＳＩ法ともに、検出された質量は、ｍ／ｚ＝９２５であった。この結果から、酵素消化により生じたＮ−アセチルグルコサミンとヒドロキサム酸誘導体との結合体におけるＨＯＮＢの開環成分は、Ｎ−アセチルグルコサミンの水酸基部分と結合していることがわかった。ＥＳＩ法、ＳＳＩ法ともに、１個のナトリウムイオンが付加して正イオン化された質量である。
【０１１９】
（試験例１）  ＭＭＰ阻害活性
上述の実施例２に記載の方法により合成された結合体Ａのゲラチナ−ゼＡとストロメリシン−１とに対する阻害活性を測定した。比較のため、ＷＯ９９／５９６０３実施例８記載の「結合体７」についても同様の測定を行った。ゲラチナ−ゼＡに対する阻害活性は、ロッシュ・ダイアグノスティック社製のゲラチナ−ゼ活性測定キットを用い、添付のプロトコ−ルに従って、同社製のゲラチナ−ゼＡ（１．２  Ｕ）を活性化後、３７℃、１時間の酵素反応に対して測定した。また、ストロメリシン−１に対する酵素阻害活性は、ヤガイ社製のストロメリシン活性測定キットを用い、添付のプロトコ−ルに従って、同社製の活性型ストロメリシン−１（０．２  Ｕ）による３７℃、３．５時間の酵素反応に対して測定した。
【０１２０】
酵素阻害活性は、結合体Ａおよび結合体７非添加時の各酵素活性を５０％抑制するのに要する各結合体の濃度（ＩＣ５０、μｇ／ｍＬ、各結合体をヒアルロン酸として換算した濃度で表す）として表した。結果を表１に示した。結合体Ａは、結合体７と比べて５〜４０倍のＭＭＰ阻害活性を有していた。
【０１２１】
【表１】
2004292465.tif 000018
【０１２２】
（試験例２）  ウサギ関節軟骨コラ−ゲン破壊阻害活性
上述の実施例２に記載の方法により合成された結合体Ａについて、Ｓａｉｔｏらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，  ４９−５４（１９９７）］を改変した方法を用いて試験した。比較のため、ＷＯ９９／５９６０３の実施例８記載の「結合体７」についても同様の試験を行った。
【０１２３】
５−７週齢の雄性ウサギ由来の膝関節軟骨片（約１０  ｍｇ）を、５００μＬのＤｕｌｂｅｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ’  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を添加した培養プレ−ト上（Ｆａｌｃｏｎ社製、４８穴平底培養プレート、＃３０７８）で、３７℃のＣＯ２インキュベ−タ−中、２４時間培養した。培養液を０．２％のラクトアルブミンを含む５００μＬのＤＭＥＭに交換後、結合体Ａまたは結合体７を添加し、インタ−ロイキン１（Ｒ＆Ｄ社製、ヒトインターロイキン−１α、＃２００−ＬＡ）（１  ｎｇ／ｍＬ）とヒトプラスミノ−ゲン（Ｓｉｇｍａ社製、＃Ｐ７３９７）（１００  μｇ／ｍＬ）の存在下、３７℃のＣＯ２インキュベ−タ−中で、更に１０日間培養した（ｎ＝４〜６）。培養終了後、培養上清と関節片残渣を回収した。関節片残渣は、最終濃度４．５  ｍｇ／ｍＬのパパイン（Ｓｉｇｍａ社製、＃Ｐ３３７５）で６０℃、一夜消化した。培養上清とパパイン処理により得られた関節片残渣の消化液とを試料とし、それぞれに最終濃度６Ｎになるように濃塩酸を添加し、１１０℃のオ−トクレ−ブで２時間加水分解を行った。それぞれの試料にＮ２ガスを噴霧して乾固させた後、５  ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含む０．１  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に溶解し、各試料中のハイドロキシプロリン量を比色法（５６０  ｎｍ）にて測定した（Ｂｉｏｒａｄ社製、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）。
【０１２４】
関節片から培養上清中に遊離したハイドロキシプロリン量と関節片残渣中のハイドロキシプロリン量から、下記の式に従って、ハイドロキシプロリンの遊離率を算出した。
【０１２５】
【数１】
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【０１２６】
ウサギ関節軟骨コラ−ゲン破壊阻害活性は、結合体Ａあるいは結合体７非添加時のＩＬ−１とプラスミノ−ゲンによるハイドロキシプロリン遊離率を５０％抑制するのに要する各結合体の濃度（ＩＣ５０、μｇ／ｍＬ、各結合体をヒアルロン酸として換算した濃度で表す）として表した。結果を表２に示した。結合体７に比べ、結合体Ａは、約５倍の強さの関節軟骨コラ−ゲン破壊阻害活性を有していた。
【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
【発明の効果】
本発明の結合体は、優れたＭＭＰ阻害作用を有するとともに、作用の限局、長期化が可能である。本発明の結合体は、関節疾患治療薬とＨＡの両方の薬物としての有用性が改善された薬剤、例えば、関節破壊抑制作用が強化された薬剤として、優れた変形性関節症、慢性関節リウマチ又は肩関節周囲炎の治療薬となることが期待される。