(57)【要約】【課題】ＦＧＦ２３タンパク質変異体もしくはその部分断片、または、それらをコードするＤＮＡの新規な用途を提供することを課題とする。【解決手段】本発明者らは、ＦＧＦ２３タンパク質およびその変異体が慢性腎不全進展に影響を及ぼすか否かを検討した。具体的には、慢性腎不全モデルラットに、野生型ＦＧＦ２３タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターおよびＲ１７９Ｑ　ＦＧＦ２３タンパク質変異体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを投与した後に、生化学的パラメーターの検討および病理組織学的検討を行った。その結果、Ｒ１７９Ｑ　ＦＧＦ２３タンパク質変異体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを投与することで、腎不全の進展が抑制されることが判明した。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡを有効成分として含有する、腎不全の治療または予防のための薬剤。
【請求項２】
ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片を有効成分として含有する、腎不全の治療または予防のための薬剤。
【請求項３】
ＦＧＦ２３タンパク質変異体が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、１７９位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、または、１７９位のアルギニンがトリプトファンに置換した変異体である、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡを投与する工程を含む、腎不全の治療または予防のため方法。
【請求項５】
ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片を投与する工程を含む、腎不全の治療または予防のため方法。
【請求項６】
ＦＧＦ２３タンパク質変異体が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、１７９位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、または、１７９位のアルギニンがトリプトファンに置換した変異体である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
腎不全の治療または予防のための薬剤の製造におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡの使用。
【請求項８】
腎不全の治療または予防のための薬剤の製造におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片の使用。
【請求項９】
ＦＧＦ２３タンパク質変異体が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、１７９位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、または、１７９位のアルギニンがトリプトファンに置換した変異体である、請求項７または８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＦＧＦ２３タンパク質変異体もしくはその部分断片、または、それらをコードするＤＮＡの新規な用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＦＧＦ２３は、京都大学の伊藤らによってクローニングされた遺伝子であり、脳で発現されていることが確認されている　（Ｙａｍａｓｈｉｔａ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２７７：　４９４−４９８、国際公開０１／６６５９６号公報）。また、ＬＵＥＴＨＹらは、ＦＧＦ２３遺伝子をクローニングし、該遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの作出を行い、該マウスの表現型を解析している（国際公開０１／６１００７号公報）。
【０００３】
一方、先天的低リン血症であるクル病患者の遺伝的家系解析によりＦＧＦ２３の突然変異（Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９Ｑ、Ｒ１７９Ｗ）が原因であるという報告がなされた（Ｔｈｅ　ＡＤＨＲ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ　（２０００）　Ｎａｔ．　Ｇｅｎｅｔ．　２６：　３４５−３４８）。さらに、ＦＧＦ２３タンパク質の変異体が、血中のリン濃度を低下させる能力を有することが開示された（ＰＣＴ／ＪＰ０１／１１４８２）。しかしながら、これまでに、ＦＧＦ２３タンパク質変異体が腎不全に対して有効であることを示す報告例は皆無である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＦＧＦ２３タンパク質変異体もしくはその部分断片、または、それらをコードするＤＮＡの腎不全の治療または予防のための用途を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＦＧＦ２３タンパク質およびその変異体が慢性腎不全進展に影響を及ぼすか否かを検討した。具体的には、慢性腎不全モデルラットに、ＦＧＦ２３ベクター（野生型ＦＧＦ２３タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクター）およびＲ１７９Ｑ　ＦＧＦ２３変異体ベクター（Ｒ１７９Ｑ　ＦＧＦ２３タンパク質変異体をコードするＤＮＡを含む発現ベクター）を投与した後に、生化学的パラメーターの検討および病理組織学的検討を行った。検討の結果、Ｒ１７９Ｑ　ＦＧＦ２３変異体ベクターを投与した群（Ｒ１７９Ｑ群）では、ＭＯＣＫベクターを投与した群（ＭＯＣＫ群）に比して血清リン濃度が著明に低下しており、投与後２、６、１０週では統計学的に有意であった。これに対し、ＦＧＦ２３ベクターを投与した群（Ｗｉｌｄ群）では投与後１３週で血清リン濃度に低下傾向が認められるものの、ＭＯＣＫ群に比して有意な差は認められなかった。また、腎機能パラメータである血清クレアチニン濃度は、Ｒ１７９Ｑ群では、投与後１０週でＭＯＣＫ群に比して低値を示し、１３週では統計学的に有意な低下を認めた。これに対し、Ｗｉｌｄ群ではＭＯＣＫ群に比して有意な差は認められなかったものの、投与後１０、１３週でＭＯＣＫ群より低値を示した。さらに、病理組織学的検討では、Ｒ１７９Ｑ群で、糸球体におけるエオジン陽性物質の沈着および糸球体のボーマン嚢への癒着の程度がＭＯＣＫ群に比して有意に軽度であった。また、間質における線維化および炎症性細胞の浸潤の病変がＭＯＣＫ群に比べて有意に軽度であった。
【０００６】
以上の結果から、ＦＧＦ２３タンパク質変異体もしくはその部分断片、または、それらをコードするＤＮＡの腎不全の治療または予防のための用途を提供することが可能となった。
【０００７】
即ち、本発明は、
〔１〕ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡを有効成分として含有する、腎不全の治療または予防のための薬剤、
〔２〕ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片を有効成分として含有する、腎不全の治療または予防のための薬剤、
〔３〕ＦＧＦ２３タンパク質変異体が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、１７９位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、または、１７９位のアルギニンがトリプトファンに置換した変異体である、〔１〕または〔２〕に記載の薬剤、
〔４〕ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡを投与する工程を含む、腎不全の治療または予防のため方法、
〔５〕ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片を投与する工程を含む、腎不全の治療または予防のため方法、
〔６〕ＦＧＦ２３タンパク質変異体が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、１７９位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、または、１７９位のアルギニンがトリプトファンに置換した変異体である、〔４〕または〔５〕に記載の方法、
〔７〕腎不全の治療または予防のための薬剤の製造におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡの使用、
〔８〕腎不全の治療または予防のための薬剤の製造におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片の使用、
〔９〕ＦＧＦ２３タンパク質変異体が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、１７９位のアルギニンがグルタミンに置換した変異体、または、１７９位のアルギニンがトリプトファンに置換した変異体である、〔７〕または〔８〕に記載の使用、
を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＦＧＦ２３タンパク質変異体もしくはその部分断片、または、それらをコードするＤＮＡの新規な用途を提供する。具体的には、ＦＧＦ２３タンパク質変異体もしくはその部分断片、または、それらをコードするＤＮＡの腎不全の治療または予防のための用途を提供する。
【０００９】
本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体には、配列番号：２に記載のヒトＦＧＦ２３タンパク質のアミノ酸配列において、１７６位のアルギニンがグルタミンへ置換された変異体（Ｒ１７６Ｑ　ＦＧＦ２３タンパク質変異体）、１７９位のアルギニンがグルタミンへ置換された変異体（Ｒ１７９Ｑ　ＦＧＦ２３タンパク質変異体）、および１７９位のアルギニンがトリプトファンへ置換された変異体（Ｒ１７９Ｗ　ＦＧＦ２３タンパク質変異体）が含まれる。これら変異体において、好ましい変異体はＲ１７９Ｑ　ＦＧＦ２３タンパク質変異体である。また、本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体の部分断片としては、例えば、少なくとも１から１９０位のアミノ酸配列を含む断片が挙げられる。
【００１０】
本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡは、ヒトＦＧＦ２３　ｃＤＮＡを改変して作製することができる。ヒトＦＧＦ２３　ｃＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、ＦＧＦ２３タンパク質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、ＦＧＦ２３　ｃＤＮＡの配列（配列番号：１）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、ＦＧＦ２３タンパク質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、ＦＧＦ２３　ｃＤＮＡの配列（配列番号：１）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＦＧＦ２３タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
【００１１】
例えば、次のようにすればよい。まず、ＦＧＦ２３タンパク質を発現する細胞、組織、臓器から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７９）　１８，　５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法　（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，　Ｎ．，　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　（１９８７）　１６２，　１５６−１５９）　等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）　等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）　を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
【００１２】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（生化学工業社）等を用いて行うこともできる。また、配列番号：１に記載した配列を基にして作製したプライマー等を用いて、５’−Ａｍｐｌｉ　ＦＩＮＤＥＲ　ＲＡＣＥ　Ｋｉｔ　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応　（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　；　ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，　Ｍ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　（１９８８）　８５，　８９９８−９００２　；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　（１９８９）　１７，　２９１９−２９３２）　に従い、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
【００１３】
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
【００１４】
本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡを作製するための、ヒトＦＧＦ２３　ｃＤＮＡの改変は、当業者によって一般的に行われるＤＮＡ変異導入（ＤＮＡ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）技術によって実施することができる。
【００１５】
また、本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡは、ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
【００１６】
また、本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた変異体もしくはその部分断片、または、それらをコードするＤＮＡが、腎不全に対する治療する能力（例えば、腎不全進展抑制能力）や予防する能力を有する限り、本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片に含まれる。例えば、ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の変異体のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加されるが、このような変異体も含まれる。
【００１７】
本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片は、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして調製することが可能である。組み換えポリペプチドの製造のための産生系としては、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ　の産生系がある。ｉｎ　ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。例えば、本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。また、本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的の変異体以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
【００１８】
上記発現ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールにより判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明の変異体またはその部分断片を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，　Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）　３４１，　５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　（１９９２）　６，　２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）　２４０，　１０４１−１０４３　）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ　ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
【００１９】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，　Ｓ．　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　（１９８７）　１６９，　４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００２０】
大腸菌以外にも、例えば、本発明の変異体またはその部分断片を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３　（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．１９９０，　１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ　ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
【００２１】
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９）　２７７，　１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　（１９９０）　１８，　５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
【００２２】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０　Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【００２３】
ＦＧＦ２３タンパク質変異体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
【００２４】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｅｄ　Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．　Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【００２５】
本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片は、これらの精製方法を用いることで、実質的に精製された変異体またはその部分断片として提供することができる。ここで、「実質的に精製された」とは、外部環境から切り離されて、他の成分を少なくとも６０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％含まないことを意味する。
【００２６】
また、ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
【００２７】
本発明におけるＦＧＦ２３タンパク質変異体もしくはその部分断片、または、それらをコードするＤＮＡは、ヒトや他の動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの腎不全の治療または予防のために使用することができる。
【００２８】
上記ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡは、例えば、Ｎａｋｅｄ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ法（Ｎｉｗａ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　１０８：　１９３−２００，　１９９１）により生体内に導入することができる。この方法では、ｐＣＡＧＧＳベクターを用いる。該ベクターは、サイトメガロウイルスのエンハンサーに、ニワトリのβアクチンプロモーターを組み合わせることで、ベクターに挿入されたＤＮＡを哺乳類細胞で強く発現させることができるベクターである。また、上記ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡを、生体内で該ＤＮＡの発現を保証する、その他のベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入することができる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡをベクターへ挿入する操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ　ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ　ｖｉｖｏ法であってもよい。本発明においては、上記の方法により、腎不全に対する遺伝子治療を行うことが可能である。
【００２９】
本発明においては、ＦＧＦ２３タンパク質変異体もしくはその部分断片、または、それらをコードするＤＮＡ自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した薬剤として投与を行うことも可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００３０】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【００３１】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００３２】
患者への投与は、好ましくは非経口投与であり、例えば、注射剤型が挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
【００３３】
ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片をコードするＤＮＡを非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
【００３４】
また、ＦＧＦ２３タンパク質変異体またはその部分断片を非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）被験物質
ＦＧＦ２３ベクター（野生型ＦＧＦ２３タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクター）およびＲ１７９Ｑ　ＦＧＦ２３変異体ベクター（Ｒ１７９Ｑ　ＦＧＦ２３タンパク質変異体をコードするＤＮＡを含む発現ベクター）を検体として、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８．０）溶液の形状で用いた。なお、Ｒ１７９ＱとはＦＧＦ２３の１７９位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）に置換された変異体を意味する。
【００３６】
（２）対照物質（陰性対照物質）
ＭＯＣＫベクター（ｐＣＡＧＧＳ）を検体として、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８．０）溶液の形状で用いた。
【００３７】
（３）調製方法
投与剤型は溶液であり、ＴｒａｎｓＩＴＲ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ＰａｎＶｅｒａ社）のプロトコールを一部改変して行った。すなわちＭＯＣＫベクター、ＦＧＦ２３ベクターまたはＲ１７９Ｑ　ＦＧＦ２３変異体ベクターを１匹当たり１０μｇ使用した。１０μｇのＤＮＡに１０μｌＬのＴｒａｎｓＩＴ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎと適当量の滅菌水を加えて２００μｌＬとし５０ｍｌ混合した。５分間室温に放置後、１１．８ｍＬの１×Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて全量を１２．０ｍＬとして投与液とした。投与液は調製当日に使いきり保存しなかった。
【００３８】
（４）使用動物
入荷時６週齢のＳｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ系統の雄ラットを用いた。該ラットの供給元は日本エスエルシー株式会社である。個体の識別方法は、色素（ピクリン酸）塗布法を使用した。馴化期間は８日間とした。安楽死法は麻酔下放血とした。
【００３９】
（５）飼育環境
次の環境で飼育した。室温：２４±２℃、相対湿度：５５±１０％、点灯時間：５：００〜１９：００、換気回数：１０〜３０回／時、飼育ケージ：Ｒ−１ケージ（寸法６６０×３１０×２００ｍｍ）、飼育密度：４〜５匹／ケージ、飼料：固形ＣＥ−２（日本クレア株式会社）、給餌方法：不断給餌法、飲料水：水道水、給水方法：自動給水法。
【００４０】
（６）片腎摘出Ｔｈｙ１腎不全ラットの作製法
片腎摘出Ｔｈｙ１腎不全ラットは、ＣＨＥＮＧらの方法（ＣＨＥＮＧ　ＱＬ，　ＯＲＩＫＡＳＡ　Ｍ，　ＭＯＲＩＯＫＡ　Ｔ，　ＫＡＷＡＣＨＩ　Ｈ，　ＣＨＥＮ　ＸＭ，　ＯＩＴＥ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ　ｒｅｎａｌ　ｌｅｓｉｏｎｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　１−２２−３　ｔｏ　ｕｎｉｌａｔｅｒａｌｌｙ　ｎｅｐｈｒｅｃｔｏｍｉｚｅｄ　ｒａｔｓ．　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１９９５；１０２：１８１−１８５．）に準じて作製した。すなわち７週齢ラットにエーテル麻酔下で右腎摘出術を施し、４〜５時間後に濃度１ｍｇ／ｍＬに調製した抗Ｔｈｙ１抗体溶液（Ａｎｔｉ−Ｒａｔ　ＣＤ９０（Ｔｈｙ１．１）　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｓｃｉｔｅｓ，　ＣＬ００５Ａ；　Ｃｅｄａｒｌａｎｅ　Ｌａｂ．　Ｌｔｄ．；　Ｏｎｔａｒｉｏ，　ＣＡＮＡＤＡ）を１匹あたり２００μＬの割合で尾静脈より投与した。また正常対照群として偽手術を施したラットに、溶媒（ＰＢＳ（−））を１匹あたり２００μＬの割合で尾静脈より投与した。７匹（無作為抽出）を正常対照群とし、６２匹を片腎摘出Ｔｈｙ１腎不全ラットの作製に用いた。
【００４１】
（７）片腎摘出Ｔｈｙ１腎不全ラットの群分け
術後１週および２週の血清クレアチニン濃度で群分けした。これら濃度の平均値が群間で均等になるように、ブロック無作為化によりラットを４群に割り付けた。すなわち術後１、２週後に、エーテル麻酔下で頸静脈より８００μＬ採血し、セパラピットチューブミニを用いて血清を分離し、血清クレアチニン濃度を測定した。群構成を表１に示した。
【００４２】
【表１】
2004035506.tif 000002
【００４３】
（８）投与
群分け後から投与を開始した。投与は２週に一回、尾静脈投与とし、各投与剤を１２ｍＬ／ｈｅａｄで行った。なお、病態対照群は何も投与をしなかった。
【００４４】
（９）血清パラメータの測定
病態進展を確認するため、投与前、投与開始後２週、６週、１０週および１３週で採血し血清パラメータの測定に供した。採血はエーテル麻酔下で頸静脈より８００μＬ採血し、セパラピットチューブミニを用いて血清を分離した。血清はクレアチニンをオートセラＣＲＥ（第一化学薬品株式会社）を用いて、日立７１７０−Ｅ形自動分析装置（株式会社日立製作所）で測定した。
【００４５】
（１０）病理組織学的検討
術後１３週において、麻酔下放血により屠殺したラットから、左腎を摘出し乳頭部を含む横断面にて厚さ５〜６ｍｍに切り出し、２０％ホルマリン溶液中で数日間固定した。パラフィン包埋後、ミクロトームで薄切しパラフィン切片を作製した。切片を常法にもとづきヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した。糸球体、尿細管および間質病変を、５段階（−、±、＋、＋＋、＋＋＋）に分けて評価した。
【００４６】
（１１）統計学的解析方法
統計解析ソフト（ＳＡＳ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ）　Ｖｅｒ．　６．１２）を用いて、有意水準を両側５％とした。血清リンおよび血清クレアチニンに関しては、正常対照群とＭＯＣＫベクターを投与した群（ＭＯＣＫ群）間あるいはＭＯＣＫ群と病態対照群、ＦＧＦ２３ベクターを投与した群（Ｗｉｌｄ群）あるいはＲ１７９Ｑ　ＦＧＦ２３変異体ベクターを投与した群（Ｒ１７９Ｑ群）間のそれぞれに関して、対応のないｔ検定を行った。病理組織評価については、ＭＯＣＫ群と病態対照群、Ｗｉｌｄ群あるいはＲ１７９Ｑ群間のそれぞれに関してＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を行った。
【００４７】
［実施例１］　片腎摘出Ｔｈｙ１腎不全ラットにおけるＦＧＦ２３タンパク質およびその変異体の腎不全進展抑制作用の検討
Ｎａｋｅｄ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ法を用いて、慢性腎不全モデルにおいてＦＧＦ２３タンパク質およびその変異体が慢性腎不全進展に影響を及ぼすか否かを検討した。その結果、Ｒ１７９Ｑ群では、ＭＯＣＫ群に比して血清リン濃度が著明に低下しており、投与後２、６、１０週では統計学的に有意であった。これに対し、Ｗｉｌｄ群では投与後１３週で血清リン濃度に低下傾向が認められるものの、ＭＯＣＫ群に比して有意な差は認められなかった（図１）。なお、血清リンおよびクレアチニン濃度に関して、病態対照群とＭＯＣＫ群間で統計学的有意な差が認められなかったことから、１２ｍＬの投与液を２週に一度投与しても腎不全の病態進展に影響を与えないことは確認している。
【００４８】
また、腎機能パラメータである血清クレアチニン濃度は、Ｒ１７９Ｑ群では、投与後１０週でＭＯＣＫ群に比して低値を示し、１３週では統計学的に有意な低下を認めた。これに対し、Ｗｉｌｄ群ではＭＯＣＫ群に比して有意な差は認められなかったものの、投与後１０、１３週でＭＯＣＫ群より低値を示した（図２）。
【００４９】
さらに、病理組織学的検討では、Ｒ１７９Ｑ群で、糸球体におけるエオジン陽性物質の沈着および糸球体のボーマン嚢への癒着の程度がＭＯＣＫ群に比して有意に軽度であった。また、間質における線維化および炎症性細胞の浸潤の病変がＭＯＣＫ群に比べて有意に軽度であった（表２：表中の＊は、ＭＯＣＫ群との有意差（ｐ＜０．０５）を示す）。以上の結果から、Ｒ１７９Ｑ群では生化学的パラメータおよび病理組織学的検討より、腎不全進展抑制効果が確認された。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
【発明の効果】
本発明者らによって、ＦＧＦ２３タンパク質変異体が腎不全進展抑制効果を有することが初めて見出された。このことにより、ＦＧＦ２３タンパク質変異体もしくはその部分断片、または、それらをコードするＤＮＡの腎不全の治療または予防のための用途を提供することが可能となった。
【００５２】
【配列表】
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2004035506.tif 000007
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【図面の簡単な説明】
【図１】ベクター投与後の血清リン濃度の時間変化を表す図である。図中＃及び＊はＭＯＣＫ群との有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図２】ベクター投与後の血清クレアチニン濃度の時間変化を表す図である。図中＃及び＊はＭＯＣＫ群との有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図１】
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【図２】
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