(57)【要約】【課題】イネの品種を簡便かつ確実に識別・特定できる方法を提供する。またイネ種子、玄米、精米、炊飯米の純度を検査する方法を提供する。【解決手段】ＧＡ、ＡＴＴ、ＣＴＴ、ＧＴ、（ＡＴ及びＧＴ）、（ＴＡＴ及びＣＴＴ）、（ＴＡＴ及びＡＴＴ）、ＧＡＡ、ＡＡＧ、ＡＴＡＣ、ＴＴＡ、ＴＡＴＧ、ＡＴＡＧ、ＴＴＡ、ＡＴＡ、ＴＣＴＡ、ＡＴＣＴ、ＴＡＣＡまたはＴＡＴＣの繰り返しをモチーフに含むマイクロサテライトマーカーを少なくとも一つ含む、イネの近縁品種内で多型性を示すマイクロサテライトマーカーの多型の型に基づくデータベースを作成し、これを用いて、イネ品種を識別する。同データベースに基づいて、イネ種子等から抽出されたＤＮＡの多型の型を検出し、イネ種子等の純度を測定する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースを準備する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、前記データベースに含まれるマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程を含み、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、ＧＡ、ＡＴＴ、ＣＴＴ、ＧＴ、（ＡＴ及びＧＴ）、（ＴＡＴ及びＣＴＴ）、（ＴＡＴ及びＡＴＴ）、ＧＡＡ、ＡＡＧ、ＡＴＡＣ、ＴＴＡ、ＴＡＴＧ、ＡＴＡＧ、ＴＴＡ、ＡＴＡ、ＴＣＴＡ、ＡＴＣＴ、ＴＡＣＡまたはＴＡＴＣの繰り返しをモチーフに含むものである、イネの品種を識別する方法。
【請求項２】
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースに基づいて、前記品種から選ばれる１以上の品種の識別に必要十分なマイクロサテライトマーカーを選択する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、選択されたマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を、前記データベースの選択されたマイクロサテライトマーカーに対応する部分と照合する工程を含み、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、ＧＡ、ＡＴＴ、ＣＴＴ、ＧＴ、（ＡＴ及びＧＴ）、（ＴＡＴ及びＣＴＴ）、（ＴＡＴ及びＡＴＴ）、ＧＡＡ、ＡＡＧ、ＡＴＡＣ、ＴＴＡ、ＴＡＴＧ、ＡＴＡＧ、ＴＴＡ、ＡＴＡ、ＴＣＴＡ、ＡＴＣＴ、ＴＡＣＡまたはＴＡＴＣの繰り返しをモチーフに含むものである、イネの品種を識別する方法。
【請求項３】
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースを準備する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、前記データベースに含まれる一部のマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程、照合により多型の型が全て一致した品種を検索する工程、検索された品種内で多型の型が異なるマイクロサテライトマーカーを検索する工程、前記ＤＮＡを、検索されたマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程を含み、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、ＧＡ、ＡＴＴ、ＣＴＴ、ＧＴ、（ＡＴ及びＧＴ）、（ＴＡＴ及びＣＴＴ）、（ＴＡＴ及びＡＴＴ）、ＧＡＡ、ＡＡＧ、ＡＴＡＣ、ＴＴＡ、ＴＡＴＧ、ＡＴＡＧ、ＴＴＡ、ＡＴＡ、ＴＣＴＡ、ＡＴＣＴ、ＴＡＣＡまたはＴＡＴＣの繰り返しをモチーフに含むものである、イネの品種を識別する方法。
【請求項４】
前記データベースが、第１表に示す品種と、第２表に示すマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けた第３表に示すデータベースである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
マイクロサテライトマーカーの多型の分析を、試料から抽出したＤＮＡを鋳型とし、第２表に示すプライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した産物の断片長の測定により行う請求項４に記載の方法。
【請求項６】
イネの組織から抽出したＤＮＡを、第４表のマーカー欄に示す少なくとも一つのマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を、第４表の該マーカーに対応する型欄に示す型と照合する工程を含む、イネの品種の識別方法。
【請求項７】
識別するイネのジャポニカ種の品種の候補の範囲の入力を受ける手段、
前記範囲から選ばれる識別するイネのジャポニカ種の品種の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された候補の範囲内で、入力された品種が識別されるのに必要十分なマイクロサテライトマーカーを検索する手段、
検索されたマイクロサテライトマーカーを出力する手段
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラム。
【請求項８】
識別するイネのジャポニカ種の品種の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された品種が識別されるのに必要十分なマイクロサテライトマーカーを検索する手段、
検索されたマイクロサテライトマーカーを出力する手段
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラム。
【請求項９】
識別するイネのジャポニカ種の品種の候補の入力を受ける手段、
識別するイネのジャポニカ種のマイクロサテライトマーカーの多型の型の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された品種の候補を検索する手段、
検索された候補内で、入力されたマイクロサテライトマーカーの多型の型と一致する型を有する候補を検索する手段、
検索された候補が１つである場合には、検索された候補の品種名を出力し、検索された候補が１つでない場合には、検索された候補の品種名のリストとともに、情報が入力されたマイクロサテライトマーカーの多型以外であって、検索された候補に於いて多型の型が一致しないマイクロサテライトマーカーとその多型の型を出力する手段、
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラム。
【請求項１０】
前記データベースが、第１表に示す品種と、第２表に示すマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けた第３表に示すデータベースである請求項７〜９のいずれか一項に記載のプログラム。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イネの品種を識別する方法に関する。この方法は、種子の純度管理や流通しているコメの品種識別に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
日本で栽培されている粳米は温帯ジャポニカに分類される品種であり、現在２００種を越える品種が栽培されている。イネの科学的な品種識別法としては、アイソザイム法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ＲＡＰＤ法、マイクロサテライト法などが知られているが、サティバ種に属し、ジャポニカ亜種に分類される日本で栽培されている粳米を識別することは容易ではなく、品種を特定する有効な方法は知られていない。さらに、精米が対象となる場合には、発芽能力もなく、酵素活性が高い糖層もなく、イネの品種判別法として報告されている交配稔実性・草型による方法や酵素多型による方法を適用することはできず、精米によって粒形を変えることも可能なため粒形による類別による方法を適用することも困難である。
【０００３】
現在お米の流通段階で品種を識別する方法として用いられているものは、平成１２年４月に施行された改正ＪＡＳ法の「玄米及び精米品質表示基準」である。この基準においても、農作物検査官による肉眼の検査が実施されているのみであり、科学的な検証のもとに品種の鑑定が実施されている訳ではない。イネもしくはお米の科学的な品種識別を困難にしている理由は、日本において栽培されているジャポニカに分類される極めて多数の品種が、数種の在来品種をベースとした極近縁種間の交配によって育成されてきたものであり、これらの遺伝的背景が極めて類縁していることによる。
【０００４】
真核生物のマイクロサテライトとは、ゲノム中に散在する単純な塩基配列の繰り返し領域のことであり、繰り返し数に依存するこの領域の長さは極めて多型性に富むことが知られている。近年、イネゲノムの解析により多くのマイクロサテライトが同定されており、該マイクロサテライト両側に位置する特異的な塩基配列を含むマイクロサテライトマーカーが開発された。マイクロサテライトマーカーを遺伝子増幅法で検出することができる特異的な塩基配列が、プライマー配列として非特許文献１〜４に公開されている。最近の文献（例えば、非特許文献５参照）では、イネのマイクロサテライトマーカーの２７４０個が染色体上にマップされており、平均して１５７ｋｂｐに１つ存在することが報告されている。また同文献の図１において、モチーフ種別の存在割合はｐｏｌｙ（ＧＡ）が３６％、ｐｏｌｙ（ＡＴ）が１５％、ｐｏｌｙ（ＣＣＧ）が８％となっている。これらのマイクロサテライトマーカーを特異的に増幅するプライマー（オリゴヌクレオチド）を利用することにより、イネの野生種と栽培種であるサティバ種およびグラベリマ種が識別できるのみならず、サティバ種のインディカとジャポニカの亜種も識別できることが知られている。また、ＡＴまたはＴＡが５回以上繰り返された配列を有するマイクロサテライトマーカーを用いると、日本で栽培される５９品種の識別が可能なことが示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、日本で栽培されている極近縁なジャポニカ種の品種間において、この他のどのマイクロサテライトマーカーが多型性に富み、品種の識別・特定に有効なマイクロサテライトマーカーとなりえるか否かについては全く不明であった。さらに、品種の識別・特定に有効なマイクロサテライトマーカーを選択し、繰り返し数に依存する多型性に基づくデータベースを作成し品種識別に利用する試みはなされていなかった。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１０−５７０７３号公報
【非特許文献１】
Ｈ．Ａｋａｇｉ　ｅｔ．ａｌ、「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、（１９９６年）、　ｖｏｌ．９３、　ｐ１０７１−１０７７
【非特許文献２】
Ｘ．Ｃｈｅｎ　ｅｔ．ａｌ、「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、（１９９７年）、　ｖｏｌ．９５、　ｐ５５３−５６７
【非特許文献３】
Ｓ．Ｔｅｍｎｙｋｈ　ｅｔ．ａｌ、「Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、（２０００年）、　ｖｏｌ．１００、　ｐ６９７−７１２
【非特許文献４】
コーネル大学（ウェブサイト提供元）、“マイクロサテライトマーカー（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　Ｍａｒｋｅｒｓ）”、［ｏｎｌｉｎｅ］、（２００２年）、［平成１５年６月１１日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／ｍｉｃｒｏｓａｔ＞
【非特許文献５】
Ｓ．Ｒ．ＭｃＣｏｕｃｈら、「ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、（２００２年）、　ｖｏｌ．９、　ｐ１９９−２０７
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、従来、熟練と経験を要する検査で行われてきたイネまたは玄米等の品種識別に科学的で客観的な方法を導入することである。さらに、日本で広く流通している温帯型ジャポニカ間の交雑によって育種されているイネの極近縁品種を識別する方法を提供することである。また、本発明の課題は、イネの品種の識別を支援するプログラムを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
日本において広く流通しているジャポニカに分類される極めて多数の品種は、数種の品種から極近縁種間の交配によって育成されてきたものであり、これらの遺伝的類縁性は極めて高い。本発明者らは、遺伝的類縁性は極めて高く、遺伝的多型性の低い温帯型ジャポニカの品種識別を可能にする方法について鋭意検討を加えたところ、特定のマイクロサテライトマーカーを多数用いて、それらの単純な塩基配列の繰り返し数を計測することによって、品種識別が困難とされていた温帯型ジャポニカの品種識別が可能になることを見出した。
【０００９】
すなわち、既知のマイクロサテライトマーカーから温帯型ジャポニカの品種識別に有用な多型性に富むマイクロサテライトマーカーを選別し、これらのマーカーを組み合わせて用いることによって、日本で広く流通している温帯型ジャポニカ、日本型品種を科学的且つ客観的に識別できることを見出した。さらに、マイクロサテライトマーカーの多型性に基づくデータベースを作成することによって、選択すべきマイクロサテライトマーカーの選択が容易となり、困難であった温帯型ジャポニカの品種識別が簡便に行えることを見出した。これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）　イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースを準備する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、前記データベースに含まれるマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程を含み、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、ＧＡ、ＡＴＴ、ＣＴＴ、ＧＴ、（ＡＴ及びＧＴ）、（ＴＡＴ及びＣＴＴ）、（ＴＡＴ及びＡＴＴ）、ＧＡＡ、ＡＡＧ、ＡＴＡＣ、ＴＴＡ、ＴＡＴＧ、ＡＴＡＧ、ＴＴＡ、ＡＴＡ、ＴＣＴＡ、ＡＴＣＴ、ＴＡＣＡまたはＴＡＴＣの繰り返しをモチーフに含むものである、イネの品種を識別する方法。
【００１１】
（２）　イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースに基づいて、前記品種から選ばれる１以上の品種の識別に必要十分なマイクロサテライトマーカーを選択する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、選択されたマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を、前記データベースの選択されたマイクロサテライトマーカーに対応する部分と照合する工程を含み、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、ＧＡ、ＡＴＴ、ＣＴＴ、ＧＴ、（ＡＴ及びＧＴ）、（ＴＡＴ及びＣＴＴ）、（ＴＡＴ及びＡＴＴ）、ＧＡＡ、ＡＡＧ、ＡＴＡＣ、ＴＴＡ、ＴＡＴＧ、ＡＴＡＧ、ＴＴＡ、ＡＴＡ、ＴＣＴＡ、ＡＴＣＴ、ＴＡＣＡまたはＴＡＴＣの繰り返しをモチーフに含むものである、イネの品種を識別する方法。
【００１２】
（３）　イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースを準備する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、前記データベースに含まれる一部のマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程、照合により多型の型が全て一致した品種を検索する工程、検索された品種内で多型の型が異なるマイクロサテライトマーカーを検索する工程、前記ＤＮＡを、検索されたマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程を含み、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、ＧＡ、ＡＴＴ、ＣＴＴ、ＧＴ、（ＡＴ及びＧＴ）、（ＴＡＴ及びＣＴＴ）、（ＴＡＴ及びＡＴＴ）、ＧＡＡ、ＡＡＧ、ＡＴＡＣ、ＴＴＡ、ＴＡＴＧ、ＡＴＡＧ、ＴＴＡ、ＡＴＡ、ＴＣＴＡ、ＡＴＣＴ、ＴＡＣＡまたはＴＡＴＣの繰り返しをモチーフに含むものである、イネの品種を識別する方法。
【００１３】
（４）　前記データベースが、第１表に示す品種と、第２表に示すマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けた第３表に示すデータベースである（１）〜（３）のいずれかの方法。
【００１４】
（５）　マイクロサテライトマーカーの多型の分析を、試料から抽出したＤＮＡを鋳型とし、第２表に示すプライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した産物の断片長の測定により行う（４）の方法。
【００１５】
【表１】
2004065251.tif 000002
【００１６】
【表２】
2004065251.tif 000003
【００１７】
【表３】
2004065251.tif 000004
【００１８】
【表４】
2004065251.tif 000005
【００１９】
（６）　イネの組織から抽出したＤＮＡを、第４表のマーカー欄に示す少なくとも一つのマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を、第４表の該マーカーに対応する型欄に示す型と照合する工程を含む、イネの品種の識別方法。
【００２０】
【表５】
2004065251.tif 000006
【００２１】
（７）　識別するイネのジャポニカ種の品種の候補の範囲の入力を受ける手段、
前記範囲から選ばれる識別するイネのジャポニカ種の品種の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された候補の範囲内で、入力された品種が識別されるのに必要十分なマイクロサテライトマーカーを検索する手段、
検索されたマイクロサテライトマーカーを出力する手段
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラム。
【００２２】
（８）　識別するイネのジャポニカ種の品種の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された品種が識別されるのに必要十分なマイクロサテライトマーカーを検索する手段、
検索されたマイクロサテライトマーカーを出力する手段
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラム。
【００２３】
（９）　識別するイネのジャポニカ種の品種の候補の入力を受ける手段、
識別するイネのジャポニカ種のマイクロサテライトマーカーの多型の型の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された品種の候補を検索する手段、
検索された候補内で、入力されたマイクロサテライトマーカーの多型の型と一致する型を有する候補を検索する手段、
検索された候補が１つである場合には、検索された候補の品種名を出力し、検索された候補が１つでない場合には、検索された候補の品種名のリストとともに、情報が入力されたマイクロサテライトマーカーの多型以外であって、検索された候補に於いて多型の型が一致しないマイクロサテライトマーカーとその多型の型を出力する手段、
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラム。
【００２４】
（１０）　前記データベースが、第１表に示す品種と、第２表に示すマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けた第３表に示すデータベースである（７）〜（９）のいずれかのプログラム。
【００２５】
（１１）　（７）〜（１０）のいずれかのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明の、イネの品種を識別する方法は、イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースを準備する工程、イネの品種を識別すべき試料から抽出したＤＮＡを、データベースに含まれるマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程を含む。
【００２７】
本発明においては、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、ＧＡ、ＡＴＴ、ＣＴＴ、ＧＴ、（ＡＴ及びＧＴ）、（ＴＡＴ及びＣＴＴ）、（ＴＡＴ及びＡＴＴ）、ＧＡＡ、ＡＡＧ、ＡＴＡＣ、ＴＴＡ、ＴＡＴＧ、ＡＴＡＧ、ＴＴＡ、ＡＴＡ、ＴＣＴＡ、ＡＴＣＴ、ＴＡＣＡまたはＴＡＴＣの繰り返しをモチーフに含むものである。また、マイクロサテライトマーカーの少なくとも一つ以上が、ＧＡ、ＡＴＴ、ＣＴＴまたはＧＴの繰り返しをモチーフに含むものであってもよい。なお、前記の（ＡＴ及びＧＴ）はＡＴとＧＴがランダムに繰り返されることを示し、（ＴＡＴ及びＣＴＴ）、（ＴＡＴ及びＡＴＴ）についても同様である。マイクロサテライトマーカーのモチーフとは、マイクロサテライトマーカーを特徴付ける繰り返し配列を意味する。このような、特定の配列をモチーフに含むマイクロサテライトマーカーは、公知のものから選択可能である（例えば、従来の技術の欄で引用したＴｈｅｏｒ．　Ａｐｐｌ．　Ｇｅｎｅｔ．　（２０００）　１００：６９７−７１２等参照）。上記の特定のマイクロサテライトマーカーのモチーフにおける繰り返し配列の繰り返し数は、通常には５〜４０である。本発明において好ましいマイクロサテライトマーカーは、イネのジャポニカ種間でより多くの多型を有するマイクロサテライトマーカーであり、より好ましくは第２表に挙げられたＲＭ９、ＲＭ４８、ＲＭ１４４、ＲＭ２２３、ＲＭ２４７、ＲＭ２５３、ＲＭ２５７、ＲＭ２５９、ＲＭ２６４、ＲＭ３２０、ＲＭ３３５及びＲＭ３３６、並びにその他のマイクロサテライトマーカーである。
【００２８】
本発明のデータベースには、上記の特定のマイクロサテライトマーカーが１以上含まれていればよく、そのほかのマイクロサテライトマーカーも含まれていてもよい。
【００２９】
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースとしては、品種毎のレコードに、各サテライトマーカーの多型の型を格納したデータベースが挙げられる。
【００３０】
本発明において用いられるデータベースは、好ましくは、前記データベースが、第１表に示す品種と、第２表に示すマイクロサテライトマーカーとを関連付けた第３表に示すデータベースである。
【００３１】
本発明においては、識別すべき品種によってあるいは識別すべき品種の数によっては、識別に必要十分のマイクロサテライトマーカーの数が少なくてもよいこともある。このような場合、多数の品種に関して準備されたデータベースの一部を用いて品種の識別を行ってもよい。従って、本発明は、イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースに基づいて、前記品種から選ばれる１以上の品種の識別に必要十分なマイクロサテライトマーカーを選択する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、選択されたマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を、前記データベースの選択されたマイクロサテライトマーカーに対応する部分と照合する工程を含む、イネの品種を識別する方法も提供する。
【００３２】
例えば、データーベースとして第３表のデーターベースが準備された場合、このデーターベースによれば、第１表に示した品種内においてコシヒカリを識別するためには、第２表に示したマイクロサテライトマーカーの、例えばＲＭ９，　ＲＭ２２３，　ＲＭ２４７，　ＲＭ２５３，　ＲＭ２５７，　ＲＭ４８の組合せ、ＲＭ２５３，　ＲＭ１５３，　ＭＲＧ６５４５，　ＭＲＧ６２８８，　ＭＲＧ４６５３，　ＭＲＧ４９３１の組合せ、またはＲＭ２５３，　ＲＭ１５３，　ＭＲＧ６５０８，　ＭＲＧ５９２９の組合せを用いれば良いことが判るので、これらのマイクロサテライトマーカーについて多型の分析を行えばよい。また同様にアキタコマチを識別するには、例えばＲＭ２５３，　ＲＭ１５３，　ＲＭ３３３，　ＭＲＧ６５４５の組合せ、またはＲＭ２５３，　ＲＭ１５３，　ＲＭ２６４，　ＭＲＧ６５４５の組合せを用いれば良いことが判るので、これらのマイクロサテライトマーカーについて多型の分析を行えばよい。上記マイクロサテライトマーカーの組合せは、はえぬきを識別する場合においても同様である。また同様にひとめぼれを識別するには、例えばＲＭ２５３，　ＲＭ１５３，　ＲＭ３２０，　ＭＲＧ６５４５の組合せ、ＲＭ２５３，　ＲＭ４８，　ＲＭ２６４，　ＭＲＧ６５４５の組合せ、ＲＭ２５３，　ＲＭ１５３，　ＲＭ７２，　ＭＲＧ５９２９の組合せ、またはＲＭ２５３，　ＲＭ１５３，　ＭＲＧ４８５１，　ＭＲＧ５９２９の組合せを用いれば良いことが判るので、これらのマイクロサテライトマーカーについて多型の分析を行えばよい。また同様にきらら３９７を識別するには、例えばＲＭ２５３，　ＭＲＧ４６５３，　ＭＲＧ６５４５の組合せ、ＲＭ２５３，　ＭＲＧ５９２９，　ＭＲＧ６５４５の組合せ、またはＲＭ２５３，　ＭＲＧ６２３７，　ＭＲＧ６５４５の組合せを用いれば良いことが判るので、これらのマイクロサテライトマーカーについて多型の分析を行えばよい。
【００３３】
また、本発明においては、識別に必要十分なマイクロサテライトマーカーが判明していない場合には、一部のマイクロサテライトマーカーについて多型の分析を行い、その結果をデータベースと照合して、さらに分析すべきマイクロサテライトマーカーを選択するようにしてもよい。従って、本発明は、イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースを準備する工程、品種を識別すべきイネの組織から抽出したＤＮＡを、前記データベースに含まれる一部のマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程、照合により多型の型が全て一致した品種を検索する工程、検索された品種内で多型の型が異なるマイクロサテライトマーカーを検索する工程、前記ＤＮＡを、検索されたマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を前記データベースと照合する工程を含む、イネの品種を識別する方法も提供する。
【００３４】
第２表に示すマイクロサテライトマーカーには、その多型の型が、第１表に示す品種の内の一つの品種に固有であるものが存在する。第４表に、一つの品種に固有の型を有するマイクロサテライトマーカーとその型を示す。このようなマイクロサテライトマーカーの型が存在する品種を識別する場合には、第１表に示す品種の内の２種以上が候補であるとき、そのマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析し、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型が、品種に固有のものであれば、そのマイクロサテライトマーカーのみの多型の分析で、品種を識別することができる。例えば、ＲＭ７２の多型を分析する場合には、その型がＣであれば、山田錦であると識別でき、ＭＲＧ３３６の多型を分析する場合には、その型がＣであれば山田錦、Ｅであればコガネマサリであると識別できる。
【００３５】
従って、本発明は、イネの組織から抽出したＤＮＡを、第４表のマーカー欄に示す少なくとも一つのマイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する工程、及び、分析されたマイクロサテライトマーカーの多型の型を、第４表の該マーカーに対応する型欄に示す型と照合する工程を含む、イネの品種の識別方法も提供する。
【００３６】
ＤＮＡを抽出するための組織としては、イネの根、葉、種子など植物体のあらゆる部分を利用でき、また玄米、精米、炊飯米も用いることができる。ＤＮＡの抽出方法としてはそれ自体公知のどの様な方法も用いることができ、粗精製のＤＮＡを用いることもできる。
【００３７】
抽出されたＤＮＡを、マイクロサテライトマーカーの多型に関して分析する方法としては、公知の方法が採用できる。通常には、抽出されたＤＮＡを鋳型としてマイクロサテライトマーカーをＰＣＲ法によって増幅する。ＰＣＲの方法は公知の方法が採用できる。ＰＣＲに用いるプライマー対はマイクロサテライトマーカーに応じて適宜選択される。第２表に挙げたマイクロサテライトマーカーの場合には、第２表に示したプライマー対が好ましいものとして挙げられる。さらに、増幅されたＤＮＡ断片の分子サイズを電気泳動等によって測定し、その分子サイズによってイネ品種を識別・特定する。このとき、分子サイズを測定する電気泳動方法として、アガロースゲル、変性および非変性のポリアクリルアミドゲルを用いる方法が行える。また、蛍光色素を利用する方法も用いることができる。
【００３８】
本発明の方法は、データベースの作成に用いたイネ品種、好ましくは第１表に示されたイネ品種であれば、イネまたは玄米等コメの流通段階における品種識別ばかりでなく、ハイブリッドライスに用いられた親品種の識別やイネの種子の純度検定にも同様な方法で利用することができる。分子サイズと本数から雑種種子と雑種以外の種子を容易に識別できる。この分析結果を基に、雑種種子の集団に対する雑種以外の種子の混入率を検査することができる。
【００３９】
また、本発明は、本発明の方法の実施を支援するためのプログラムも提供する。
本発明の第１のプログラムは、識別するイネのジャポニカ種の品種の候補の範囲の入力を受ける手段、
前記範囲から選ばれる識別するイネのジャポニカ種の品種の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された候補の範囲内で、入力された品種が識別されるのに必要十分なマイクロサテライトマーカーを検索する手段、
検索されたマイクロサテライトマーカーを出力する手段
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラムである。
【００４０】
上記プログラムのフローチャートを図４に示す。
入力を受ける手段は、キーボード、タッチパネル等の入力装置からの信号を受信する手段により構成できる。ディスプレイ、液晶などの表示装置に品種や多型の候補を表示し、その候補から選択させるように構成することが好ましい。
【００４１】
データベースは、イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とが関連付けられている限り、その構成は制限されず、例えば、品種毎のレコードを有し、各レコードにその品種の各多型の型の情報が格納されているデータベースが挙げられる。データベースにおける検索は公知の方法により行うことができる。検索手段としては、例えば、マイクロソフト社の表計算ソフト「Ｅｘｃｅｌ」によりデータベースが用意された場合、そのオートフィルター機能を用いることができる。
【００４２】
出力手段としては、ディスプレイ、液晶表示装置などの表示装置に信号を送信する手段により構成できる。
【００４３】
第３表のデータベースを用いた場合を例に挙げて、さらに具体的に説明する。このデータベースでは、６２品種と、３３種のマイクロサテライトマーカーの多型の型とが関連付けられている。マイクロサテライトマーカーの多型は断片長であるが、第１表に示した６２品種の中で認められる断片長の相違（多型の型）について、それぞれの断片長を記号化（例えば、６種の断片長が有る場合はそれぞれＡ〜Ｆの記号を付与）した。また、０はマイクロサテライトマーカーの増幅が確認されなかったことを示している。
【００４４】
候補として第３表に記載の全ての６２品種を入力する。次に、識別すべき品種としてコシヒカリを入力する。６２品種からコシヒカリを識別するのに必要十分なマイクロサテライトマーカーの組み合わせの一つとして、ＲＭ９、ＲＭ２３３、ＲＭ２４７、ＲＭ２５３、ＲＭ２５７及びＲＭ４８が検索される。この結果、３３種のマイクロサテライトマーカーの多型を分析しなくとも６種の分析のみでコシヒカリを識別でき、イネの品種の識別が効率化される。
【００４５】
また、２種の品種の混合物について品種を識別する場合について説明する。コシヒカリ及びアキタコマチを候補の範囲と入力する。次に識別すべき品種としてコシヒカリを入力する。２品種からコシヒカリを識別するのに必要十分なマイクロサテライトマーカーとしてＲＭ２５７が検索される。この結果、１種のマイクロサテライトマーカーの分析のみでコシヒカリを識別でき、イネの品種の識別が効率化される。
【００４６】
本発明の第１のプログラムにおいては、データベースを、識別する品種の候補の範囲内で準備し、候補の範囲の入力を受ける手段を省略することもできる。すなわち、識別するイネのジャポニカ種の品種の入力を受ける手段、イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された品種が識別されるのに必要十分なマイクロサテライトマーカーを検索する手段、検索されたマイクロサテライトマーカーを出力する手段として機能させるための、イネの品種識別支援プログラムとしてもよい。
【００４７】
本発明の第２のプログラムは、識別するイネのジャポニカ種の品種の候補の入力を受ける手段、
識別するイネのジャポニカ種のマイクロサテライトマーカーの多型の型の入力を受ける手段、
イネのジャポニカ種の複数の品種と、その品種内で多型性を有するマイクロサテライトマーカーの多型の型とを関連付けたデータベースにおいて、入力された品種の候補を検索する手段、
検索された候補内で、入力されたマイクロサテライトマーカーの多型の型と一致する型を有する候補を検索する手段、
検索された候補が１つである場合には、検索された候補の品種名を出力し、検索された候補が１つでない場合には、検索された候補の品種名のリストとともに、情報が入力されたマイクロサテライトマーカーの多型以外であって、検索された候補に於いて多型の型が一致しないマイクロサテライトマーカーとその多型の型を出力する手段、
として機能させるための、イネの品種識別支援プログラムである。
【００４８】
上記プログラムのフローチャートを図５に示す。
入力手段及び出力手段は、入力情報及び出力情報が異なる他は上記第１のプログラムと同様に構成できる。データベースにおける検索は公知の方法により行うことができる。検索手段としては前記と同様に、例えば、マイクロソフト社の表計算ソフト「Ｅｘｃｅｌ」によりデータベースが用意された場合、そのオートフィルター機能を用いることができる。
【００４９】
このプログラムによれば、識別すべき品種が不明な場合に、分析すべきマイクロサテライトマーカーを効率的に絞り込むことができる。
【００５０】
本発明のプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されていてもよい。コンピュータ読み出し可能な媒体としては、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体が挙げられる。
【００５１】
【実施例】
以下に本発明を実施例に基づき詳細に説明する。
【００５２】
【実施例１】
第１表に示す６２品種の日本で流通している温帯ジャポニカの種子または玄米を農業生物資源研究所及び下記の農業試験場等より入手した。これらをそれぞれの品種を代表する基準品種として用いた。
【００５３】
北海道立植物遺伝資源センター
青森県農業試験場
岩手県農業研究センター
山形県立農業試験場
新潟県農業総合研究所
群馬県農業試験場
千葉県農業総合研究センター
石川県農業総合研究センター
愛知県農業総合試験場
岡山県農業総合センター
熊本県農業研究センター
福岡県農業総合試験場
【００５４】
第１表に示す品種の種子または玄米（試料）を１粒ずつ２ｍｌ容のチューブに入れ、さらに滅菌超純水を３００μｌ加え、９８℃で１５分間加温した。その後、これにジルコニアビーズを加え、ミキサーミルＭＭ３００（レッチェ製）を用いて粉砕した。５０μｌの５％キレックス１００（Ｃｈｅｌｅｘ　１００、Ｂｉｏｒａｄ社）水溶液に粉砕物５μｌを加え、激しく振とう混和した後、６０℃で３０分及び９５℃で５分の処理を行い、遠心分離により上清画分を得、ＤＮＡ粗精製物とした。これをＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡとして用いた。上記操作を各品種試料に対して、５粒ずつ実施した。
【００５５】
第２表に示すマイクロサテライトマーカーに対応するプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、ＧｅｎｅＡｍｐ９６００システム（Ｒｏｃｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用し、３０μｌの反応液量で行った。反応液３０μｌ中には１μｌ鋳型ＤＮＡ，０．７５　ｕｎｉｔｓ　　ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（ロッシュ社）、６　ｎｍｏｌｅ　ｄＮＴＰ、　６　ｐｍｏｌｅ　各プライマー、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ　８．３）、５０　ｍＭ　ＫＣｌ及び２．０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２が含まれる。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分の後、９５℃で３０秒及び６０℃で１分を１サイクルとし、３５サイクル反応させた。反応終了後、変性液（４０％　ホルムアミド、５．６　Ｍ尿素）とＰＣＲ反応終了液を４：１（容量比）で混合し、９５℃で１０分間処理後、その５μｌを変性ゲル（６％変性ポリアクリルアミドゲル，　５０％　尿素，　アクリルアミド（モノマー：ビス＝１９：１））にて電気泳動に付した。電気泳動終了後、Ｇｅｌｓｔａｒ（宝酒造）で染色し、それぞれの品種の増幅断片長を測定した。第１表に示した品種内で認められる断片長の相違（多型の型）について、それぞれの断片長を記号化（例えば、６種の断片長がある場合はそれぞれＡ〜Ｆの記号を付与）してデータベース（第３表）を作成した。ここで、０はマイクロサテライトマーカーの増幅が確認されなかったことを示している。
【００５６】
【実施例２】
蛍光標識したプライマーを用いた品種識別方法について以下に示す。
各マイクロサテライトマーカーに対するＰＣＲ増幅断片長の異なる品種から抽出したＤＮＡを鋳型にプライマーの５’末端をＴｅｘａｓ　Ｒｅｄで標識したフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーと未標識のリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーとを用いたＰＣＲを行い、得られた増幅産物の濃度を測定後、各増幅産物を同濃度となるように混合し、各マイクロサテライトマーカーのＰＣＲ増幅断片長の分子量マーカーを作製した。
【００５７】
実施例１で用いたものと同じコシヒカリを用いて１粒ずつ、計６粒から実施例１と同様な方法でＤＮＡを抽出した。データベース（第３表）によれば、第１表に示した品種内においてコシヒカリを識別するためには、第２表に示したマイクロサテライトマーカーのＲＭ９、ＲＭ２２３、ＲＭ２４７、ＲＭ２５３、ＲＭ２５７及びＲＭ４８を用いれば良いことが判る。また、ＲＭ１５３、ＲＭ２５３、ＭＲＧ５９２９及びＭＲＧ６５０８を用いることによってもコシヒカリを識別することができる。これらコシヒカリを識別するに足るプライマーを用いて、実施例１と同様にＰＣＲを行い、反応終了後、変性液（４０％　ホルムアミド、５．６　Ｍ尿素）とＰＣＲ反応終了液を４：１（容量比）で混合し、９５℃で１０　分間処理後、その５μｌを変性ゲル（６％変性ポリアクリルアミドゲル，　５０％　尿素，アクリルアミド（モノマー：ビス＝１９：１）、４０ｃｍ長）にて電気泳動に付した。上記分子量マーカーについても同様な処理を行い、同時に泳動した。電気泳動終了後、ＦＭＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング製）にて反応産物の断片長を解析した。解析結果を図１に示す。断片長測定の結果判定は、データベースに示した結果と同じであり、蛍光プライマーを用いても十分な解析ができることが判明した。
【００５８】
【実施例３】
実施例１で用いたものと同じコシヒカリ及びアキタコマチから実施例１と同様な方法で抽出して得られたＤＮＡの濃度をＰＩＣＯ　Ｇｒｅｅｎ試薬を用いて測定し、濃度比が４：１（２０％）、９：１（１０％）、１９：１（５％）となるように混合した。コシヒカリとあきたこまちを識別できるマイクロサテライトマーカーはデータベース（第３表）よりＲＭ２５７であることから、これを増幅するプライマーの５’末端をＴｅｘａｓ　Ｒｅｄで標識したｆｏｒｗａｒｄプライマーと未標識のｒｅｖｅｒｓｅプライマーとを用いたＰＣＲを行い、実施例２と同様に解析した。図２に示す解析結果から明らかなようにコシヒカリとアキタコマチを識別できるマイクロサテライトマーカーＲＭ２５７を用いることにより、コシヒカリへのアキタコマチの混合率が２０％、１０％及び５％の全ての場合でアキタコマチ由来蛍光シグナルを検出できた。さらに、コシヒカリ由来蛍光シグナルとアキタコマチ由来蛍光シグナルはＦＭＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング製）付属のソフトウェアを用いて、定量した結果を下記の表に示した。これにより、品種が混合している場合にも本法が有用であることが解った。
【００５９】
【表６】
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【００６０】
【実施例４】
流通米を用いて本法による品種識別を試みた。
きらら３９７が５０％、ほしのゆめが５０％と表示されている流通米（きらら３９７　５０％、ほしのゆめ５０％　　伊藤米穀（株））を５０ｇ計り取り、ミルを用いて、パウダー状になるまで粉砕した。この粉砕物から、０．５ｇを１５　ｍｌ容のチューブに計り取り、２５８０μｌの抽出溶液（１０　ｍＭ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ　８．０、オートクレーブで滅菌）、３０μｌの１０％　ＳＤＳ、３００μｌの５　Ｍ塩酸グアニジン、１２０μｌの２０　ｍｇ／ｍｌ　プロテイナーゼＫを加え、撹拌しながら５６℃で３時間加温した。次に３，０００ｒｐｍで１５分間遠心を行い、上清を２　ｍｌ容のマイクロチューブに移した後、再度１５，０００ｒｐｍで５分間遠心を行った。この上清０．５　ｍｌをＷｉｚａｒｄ　ＤＮＡ　Ｃｌｅａｎ　Ｕｐ　ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて精製し、粉砕物由来鋳型ＤＮＡとした。さらに１粒ずつ、計１０粒についても実施例１と同様な方法でＤＮＡを抽出した。
【００６１】
データベース（第３表）より、きらら３９７とほしのゆめを識別するに足るマイクロサテライトマーカー（ＲＭ３３６）及びそれに対応するプライマーを選択した。プライマーの５’末端をＴｅｘａｓ　Ｒｅｄで標識したｆｏｒｗａｒｄプライマーと未標識のｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いたＰＣＲを実施例２と同様に実施した。反応終了後、変性液（４０％ホルムアミド、５．６　Ｍ尿素）とＰＣＲ反応終了液を４：１（容量比）で混合し、９５℃で１０　分間処理後、その５μｌを変性ゲル（６％変性ポリアクリルアミドゲル，　５０％　尿素，　アクリルアミド（モノマー：ビス＝１９：１）にて電気泳動に付した。電気泳動終了後、ＦＭＢＩＯ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて蛍光シグナルを検出し、定量した。きらら３９７由来増幅産物とほしのゆめ由来増幅産物の蛍光シグナルの比は５４：４６であった。さらに、同時に解析した１粒ずつの解析結果は、図３に示すように、解析した１０粒のうち、きらら３９７と判定されたものは５粒、ほしのゆめと判定されたものは５粒であった。これにより、混合米であっても本法が有用であることが判明した。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、ＤＮＡレベルで近縁品種の識別が可能となり、科学的なイネ種子の純度管理や流通しているコメの品種識別が可能になる。また、イネの新品種の育成にも寄与できる。
【００６３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】コシヒカリ基準米のマイクロサテライトマーカーの分析結果を示す。
【図２】マイクロサテライトマーカーの分析結果を示す。
【図３】マイクロサテライトマーカーの分析結果を示す。
【図４】第１の態様の、イネの品種の識別支援プログラムのフローチャートを示す。
【図５】第２の態様の、イネの品種の識別支援プログラムのフローチャートを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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