(57)【要約】【課題】本発明の課題は、培地単位体積当たりの生産数の高い、胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエの胞子嚢の製造方法を提供する。【解決手段】バチルス・ポピリエに属する菌を吸着剤と０．１〜０．７質量％のプロリンとを含む液体培地で培養することにより、胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を培地単位体積当たり高い生産数で製造することができる。また、前記液体培地にさらにピルビン酸を添加することで、培地単位体積当たりさらに高い生産数で前記胞子嚢を製造することができる。【選択図】　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸着剤を含む液体培地でバチルス・ポピリエに属する菌を培養し、胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を製造する方法であって、該液体培地が０．１〜０．７質量％のプロリンを含むことを特徴とするバチルス・ポピリエの胞子嚢の製造方法。
【請求項２】
前記液体培地がピルビン酸を含む請求項１に記載のバチルス・ポピリエの胞子嚢の製造方法。
【請求項３】
バチルス・ポピリエに属する菌が、バチルス・ポピリエ・セマダラ、バチルス・ポピリエ・マメ、バチルス・ポピリエ・ヒメ、バチルス・ポピリエ・サクラである請求項１又は２に記載のバチルス・ポピリエの胞子嚢の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バチルス・ポピリエに属する菌を液体培地で培養し、コガネムシ科昆虫の防除剤として有用な胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエの胞子嚢を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コガネムシ科昆虫の幼虫は、芝や農園芸作物や樹木等の広範囲な植物の根を食餌し、多大な被害を与えることが知られている。これらコガネムシ科昆虫の幼虫は地中に棲息するため、地上から散布する化学農薬では防除効果が得にくく、また幼虫の棲息場所も特定しにくい。このため広範囲に多量の農薬を散布して地中に農薬を浸透させる必要があり、自然環境や人体に対する悪影響が懸念されるため、より有効な防除方法が切望されていた。
【０００３】
バチルス・ポピリエに属する菌はコガネムシ科昆虫の幼虫に寄生して乳化病を発病させ最終的にこれらを死に至らしめることが知られている。このため化学農薬が効きにくいコガネムシ科昆虫の防除に該菌の胞子嚢を利用しようとする試みが古くから行われてきた。
【０００４】
例えば、特開２００１−１４９０６６号公報には、バチルス・ポピリエに属する菌を培地に対し０．０５〜０．５質量％の活性炭を含有する固体培地で該菌を培養することにより、胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を菌数に対し４．８％の割合で製造する例が記載されている。しかしながら、固体培地を用いた培養法は生産性が低いという問題があった。
【０００５】
一方、液体培地を用いた培養例として、例えば、ハイネスらはペプトン０．５％、酵母エキス１．５％、リン酸水素二カリウム０．３％、グルコース０．１％及び活性炭１％を含む液体培地でバチルス・ポピリエ・ＮＲＲＬ　Ｂ−２３０９Ｓの培養を試みた例を報告している（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２２巻，３７７−３８１頁，１９７３年）。しかし、培養液１ｍｌ当たり最大で２．０６×１０７個の胞子嚢しか得られておらず、より高い生産性を達成するためには胞子嚢の濃度が低いといった問題があった。
【０００６】
また、ハイネスらは対数増殖後期の成熟したバチルス・ポピリエ・ＮＲＲＬ　Ｂ−２３０９Ｓの菌体をペプトン（トリプトン）０．５％、酵母エキス１．５％、リン酸水素二カリウム０．３％、グルコース０．１％、活性炭１％を含む液体培地成分で培養することで培養液１ｍｌ当たり３．１×１０７個の胞子嚢を得たと報告している（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９巻，１２５−１３０頁，１９７２年）。また、この培養方法は培養時間が長く、２週間程度かかっていた。
【０００７】
さらに、米国特許第４８２４６７１号には１％可溶性デンプン、０．１％トレハロース、０．５％酵母エキス、０．３％リン酸水素二カリウム、０．１％炭酸カルシウムを含む液体培地で培養し、培養液１ｍｌ当たり１×１０９個の胞子嚢が得られた例が挙げられている。しかし、得られた胞子嚢にはパラスポラルボディが存在せず、このため土壌１ｋｇに２．０×１０１２個の割合で胞子嚢を散布しコガネムシ科昆虫の幼虫に経口摂取させた際の乳化病感染率は７週間で４７．５９％で、幼虫体内で形成されたパラスポラルボディを含む胞子嚢と比較してコガネムシ科昆虫の幼虫に対する殺虫効果は弱かった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、培地単位体積当たりの生産数の高い、胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエの胞子嚢の製造方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、バチルス・ポピリエに属する菌を吸着剤と０．１〜０．７質量％のプロリンとを含む液体培地で培養することにより、胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を培地単位体積当たり高い生産数で製造できることを見出し上記課題を解決した。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるバチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に属する菌の細菌学的性質は、バージェイズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）によれば、長さが１．３〜５．２μｍ、幅が０．５〜０．８μｍのグラム陰性桿菌で、生育温度が２０〜３５℃であり、図１に示す模式図の如く胞子嚢の中に胞子とパラスポラルボディとを有する。しかし、バチルス・ポピリエはパエニバチルス・ポピリエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に再分類されるべきとのパターソンらの学説（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４９巻，５３１−５４０頁，１９９９年）が提示されており、現段階ではその分類扱が明確になっていないため、本発明においてはバチルス・ポピリエに属する菌とはパエニバチルス・ポピリエに属する菌をも包含するものとする。
【００１１】
本発明に用いる液体培地はバチルス・ポピリエの生育を阻害する物質の除去を目的とした吸着剤を含む。該吸着剤としては活性炭、吸着樹脂、アロフォサイト又はモレキュラーシーブ等が挙げられる。生育阻害物質の主たるものは過酸化水素であると考えられ、吸着剤は過酸化水素分解能若しくは過酸化水素吸着能を有するものが好ましく、具体的には活性炭が好ましい。本発明に用いる活性炭の形状は、粉末状、粒状又はシート状等、いずれであってもよいが、単位質量当たりの分解又は吸着能が最も高い粉末状の活性炭を使用するのが好ましい。
【００１２】
吸着樹脂は、吸着能を有する多孔質重合体を意味し、例えば粒子状に成型された架橋性多孔質重合体で、粒子内部にまで達する細孔構造により水溶液中の生育阻害物質を効率よく吸着しうる合成樹脂である。具体的には、三菱化学社製の芳香族系合成樹脂吸着剤「ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰ２０」、「ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰ２１」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ８２５」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ８５０」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ７０」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ７００」、置換芳香族系合成樹脂吸着剤「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ２０７」、アクリル系合成樹脂吸着剤「ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰ２ＭＧ」などを挙げることができる。
【００１３】
本発明に用いる液体培地中の吸着剤の含有率は、液体培地の０．０５〜５質量％が好ましい。０．０５質量％以上であれば菌の生育阻害物質の吸着、除去効果を十分発揮し、５％以下であれば菌の増殖に必要な栄養源の吸着も少ないため、該範囲内で菌の高い増殖促進効果を示す。
【００１４】
本発明に使用するプロリンの液体培地中の含有率は菌の増殖を促進し、かつ胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の単位体積当たりの生産数を高くできることから液体培地の０．１〜０．７質量％であり、より好ましくは０．２〜０．６質量％である。該含有率が０．１質量％未満である場合、及び０．７質量％を超える場合、菌の増殖促進効果が低下するだけでなく培地単位体積当たりの胞子嚢の生産数も低下する。
【００１５】
本発明に用いる液体培地は、上記含有率のプロリンと吸着剤とを含有させること以外には特に限定はなく、バチルス・ポピリエに属する菌を培養する公知の液体培地を使用することができる。そのような公知の液体培地に含まれる成分としては、例えば窒素源、炭素源及び無機塩が挙げられる。
窒素源としては、通常、微生物の培養に用いられるアンモニア、硝酸及びそれらの塩等の無機窒素源や、ペプトン、肉エキス、魚肉エキス、ラクトアルブミン水解物又は酵母エキス等の有機性窒素源が挙げられ、このうちペプトン、ラクトアルブミン水解物又は酵母エキスが特に好ましい。本発明に用いる窒素源の液体培地中の含有率は、菌の高い増殖促進効果を示すことから０．００１〜５質量％であることが好ましく、０．２〜４質量％がより好ましい。
【００１６】
上記窒素源中には各種のアミノ酸が含まれており、各種アミノ酸の中にはプロリンも含まれるが、含有量がごく微量であるので別途プロリンを添加し、全アミノ酸に対するプロリンの含有率を１０〜６５質量％とするのが好ましく、２５〜５０質量％とするのがより好ましい。
【００１７】
本発明において全アミノ酸とは、通常、液体培地成分として用いられるペプトンや酵母エキス等の窒素源に含まれていることが知られているアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、チロシン及びバリンからなる１６種類の遊離型アミノ酸をいう。全アミノ酸、すなわち、上述の１６種類の遊離型アミノ酸の合計量は、ペプトンや酵母エキス等に含まれる総ての遊離型アミノ酸量を概ね示すものとして用いられるものである。
【００１８】
本発明においては炭素源として、デンプン、トレハロース、シュークロース等の糖類や、廃糖蜜、デンプン分解物、チーズホエー等の農産廃棄物を使用することができる。これらの炭素源の含有率は、液体培地の０．００１〜５質量％が好ましい。ただし、グルコースはバチルス・ポピリエの菌体の増殖には適するものの、胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の形成を阻害する傾向があるので該液体培地に含まれるグルコース濃度は液体培地の０．０１質量％以下とするのが好ましい。
【００１９】
無機塩としては、通常の微生物の培養に用いられる塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸ナトリウム又はリン酸塩等の無機塩が挙げられ、このうちリン酸塩が好ましく、さらにリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はリン酸水素二ナトリウムが特に好ましい。該無機塩の含有率は、液体培地の１質量％以下が好ましい。
これらの他に、本発明の効果を損なわない範囲内でｐＨ調整剤等の公知の添加剤を使用しても良い。
【００２０】
以上述べた液体培地成分のうち、本発明の胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエの胞子嚢の製造方法に用いる好ましい液体培地例を表１に挙げる。
【００２１】
【表１】
2004024127.tif 000002
【００２２】
また、本発明のプロリンと吸着剤とを含有する液体培地にさらにピルビン酸を加えることで、バチルス・ポピリエの菌の増殖をさらに促進し、かつ胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の培地単位体積当たりの生産数をさらに高くすることができる。なお、本発明で言うピルビン酸にはピルビン酸の生理学的に許容される塩を含む。具体的にピルビン酸の生理学的に許容される塩としてはピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム等が挙げられる。
【００２３】
菌の高い増殖促進効果と培地単位体積当たりの前記胞子嚢の生産数をさらに高くするためには液体培地中のピルビン酸の含有率は液体培地の０．０１〜０．５質量％であり、０．０３〜０．３質量％とすることがより好ましい。
【００２４】
本発明に用いるバチルス・ポピリエに属する菌の増殖に適した培養温度は２５〜３２℃である。また、培養ｐＨは６．５〜８．５であり、より好ましくは７〜８である。ｐＨの調整には各種の緩衝液や塩酸又は硫酸など通常用いられる酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニアなど、通常用いられるアルカリを使用することができる。
【００２５】
液体培地による培養は、回分培養、連続培養、半回分培養又は流加培養など、いずれの方式で行っても良い。培養時間は培養方法、培養温度、培養ｐＨ又は接種菌体量によって異なるが、通常、回分培養の場合で５〜１０日である。
【００２６】
培養終了後に培養物から胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を回収する方法は、培養液から遠心分離や濾過等の一般的な分離方法で該胞子嚢を含む菌体を分離し回収すればよい。この際、必要に応じて水や緩衝液を使った洗浄操作を加えてもよい。
【００２７】
本発明の製造方法によれば、胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエの胞子嚢の数を、菌数に対し６〜５０％の割合で製造することができ、かつ該胞子嚢の数を培養液１ｍｌ当たり５×１０７〜１×１０９個の割合で製造することができる。
【００２８】
本発明の製造方法により得られた胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエの胞子嚢はコガネムシ科昆虫に殺虫活性又は幼虫の生育抑制等の防除効果を示し、コガネムシ科昆虫の防除剤として有用である。
【００２９】
バチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に属する菌株の中で、顕著にコガネムシ科昆虫の幼虫に生育阻害若しくは殺虫活性を示す菌種としては、バチルス・ポピリエ・セマダラ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ　Ｓｅｍａｄａｒａ、ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０６８）、バチルス・ポピリエ・マメ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ　ｖａｒ．　ｐｏｐｉｌｌｉａｅＭａｍｅ、ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０６９）、バチルス・ポピリエ・ヒメ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ　ｖａｒ．　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ　Ｈｉｍｅ、ＦＥＲＭ　Ｐ−１７６６０）、バチルス・ポピリエ・サクラ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｐｉｌｌｉａｅ　ｖａｒ．　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ　Ｓａｋｕｒａ、ＦＥＲＭ　Ｐ−１７６６２）、バチルス・ポピリエ・デュトキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ　Ｄｕｔｋｙ、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．１４７０６）、バチルス・ポピリエ・メロロンサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｐｉｌｌｉａｅ　ｓｕｂｓｐ．　ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａｅ）等が挙げられる。
【００３０】
一方、防除対象のコガネムシ科昆虫としては、ドウガネブイブイ（Ａｎｏｍａｌａ　ｃｕｐｒｅａ）、セマダラコガネ（Ｂｌｉｔｏｐｅｒｔｈａ　ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、ウスチャコガネ（Ｐｈｙｌｌｏｐｅｒｔｈａ　ｄｉｖｅｒｓａ）、チャイロコガネ（Ａｄｏｒｅｔｕｓ　ｔｅｎｕｉｍａｃｕｌａｔｕｓ）、ヒメコガネ（Ａｎｏｍａｌａ
ｒｕｆｏｃｕｐｒｅａ）等が挙げられる。
【００３１】
本発明の製造方法により製造した胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢は、それらを懸濁した液のままコガネムシ科昆虫の防除剤として用いても良く、または乾燥して粉末にして散布しても良い。また乾燥した粉末を水あるいは緩衝液との懸濁液とし、土壌に散布しても良い。しかし、通常は該胞子嚢を農薬に用いられる慣用の添加剤と共に通常の微生物農薬の製造方法で製剤化してコガネムシ科昆虫の防除剤として施用することが好ましい。また本発明の製造方法により得られる胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を他の微生物製剤に混合して使用することも可能である。前記防除剤中に含まれる胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の含有率は、コガネムシ科昆虫に防除効果を示す範囲であれば特に限定されるものではないが、例えば、施用に際して水和剤、乳剤では防除剤１リットル当たり胞子嚢が１×１０９〜１×１０１３個程度となるよう調製することが好ましく、粉剤、粒剤では防除剤１ｇ当たり１×１０８〜１×１０１２個程度となるよう調製することが好ましい。
【００３２】
防除剤の施用方法としては、剤型や対象作物等によって適宜選択され、例えば、地上液剤散布、地上固形散布、空中液剤散布、空中固形散布、施設内施用、土壌混和施用又は土壌潅注施用等の方法を挙げることができる。また、他の薬剤、すなわち殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、除草剤、殺菌剤、植物生長調節剤、肥料又は土壌改良資材（泥炭、腐植酸資材又はポリビニルアルコール系資材等）等と混合して施用、あるいは混合せずに交互施用または同時施用することもできる。
【００３３】
前記防除剤の施用量は、コガネムシ科昆虫の種類、適用植物の種類及び剤型等によって異なるため一概には規定できないが、例えば、地上散布する場合、本発明の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の施用量が１アール当たり１０１０〜１０１５個、好ましくは１アール当たり１０１１〜１０１４個程度となるようにすればよい。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例及び試験例により本発明を更に具体的に説明する。
【００３５】
（参考例１）
各実施例の液体培地に添加したペプトン、酵母エキス及びラクトアルブミン水解物中に含まれる遊離型アミノ酸の含有量はオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）を用いた下記のポストカラム法により測定した。
【００３６】
（１）試料の調製
標準試料としてアミノ酸混合標準液Ｈ型（和光純薬社製、各アミノ酸２．５ｍｍｏｌ／ｌを含む）を０．０２ｍｏｌ／ｌ塩酸で５倍希釈し、ポアサイズ０．２μｍのフィルターで濾過し、標準試料溶液とした。
【００３７】
測定試料は、ペプトンとして「ポリペプトンＳ」（日本製薬社製）、「トリプトン」（ディフコ社製）を、酵母エキスとしてオクソイド社製、ディフコ社製のものを、及びラクトアルブミン水解物として和光純薬社製のものを用い、１．０質量％溶液を各々調製し、これらを１０質量％トリクロロ酢酸水溶液で２倍希釈し、よく撹拌した後、遠心分離により不溶性沈殿を除去した。その後、上清をポアサイズ０．２μｍのフィルターで濾過して各測定試料溶液を調製した。
【００３８】
（２）分析
標準試料溶液、および各測定試料溶液につき、１０μｌを高速液体クロマトグラフィーに注入し、アミノ酸分析を行った。なお、アミノ酸分析は日立製作所製のアミノ酸自動分析装置「ＬａＣｈｒｏｍ」を使用して行った。なお、該アミノ酸分析に用いたＯＰＡ標識用反応液及び溶離液の組成を表２及び３に記載した。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
【表３】
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【００４１】
試薬は全て和光純薬社製を使用し、クエン酸ナトリウム２Ｈ２Ｏ、クエン酸Ｈ２Ｏ、カプリル酸はアミノ酸分析用、その他は特級品を使用した。標準試料溶液及び各測定試料溶液より得られたピークエリアから換算して、各測定試料中に含まれるＬ−プロリン及び全アミノ酸の濃度を算出し表４に示した。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
（実施例１、比較例１）　液体培地の調製
ビーカーに蒸留水７００ｇを入れ、添加するアミノ酸としてＬ−プロリン（和光純薬社製特級）又はＬ−アラニン（和光純薬社製特級）を、さらにそれらにペプトン（日本製薬社製「ポリペプトンＳ」）、酵母エキス（オクソイド社製）及びトレハロース二水和物（和光純薬社製特級）を表５に示した量、混合した。さらに攪拌しながら５ｍｏｌ／ｌの水酸化カリウム水溶液を添加してｐＨを７．６に調整し、更に蒸留水を加えて最終的に８５０ｇとした。この液体培地を、ｐＨ電極を備えた発酵槽（丸菱バイオエンジ社製）に移し、１２１℃、６０分間、オートクレーブにて殺菌した。
【００４４】
次に、フラスコに活性炭素粉末（和光純薬社製特級）を表５に示した量添加し、さらに蒸留水を加えて１００ｇとし活性炭分散液を調製した。また、フラスコに消泡剤（日本油脂社製「ディスホームＣＡ−１２３」）を表５に示す量添加し、さらに蒸留水を添加して５０ｇとし、消泡剤液を調製した。活性炭分散液及び消泡剤液を殺菌し、その後上記発酵槽に無菌的に加え、実施例として液体培地（Ａ）を、比較例として液体培地（Ｂ−１）〜（Ｂ−３）を調製した。
【００４５】
【表５】
2004024127.tif 000006
【００４６】
（比較例２）
フラスコに蒸留水８０ｇを入れ、さらにペプトン（ディフコ社製「トリプトン」）、酵母エキス（オクソイド社製）、リン酸水素二カリウム（和光純薬社製特級）、グルコース（和光純薬社製特級）及び活性炭素粉末（和光純薬社製特級）を表６に示した量、混合し、更に蒸留水を加えて最終的に１００ｇとした後、１２１℃、２０分間、オートクレーブにて殺菌した。これを液体培地（Ｂ−４）と称する。
【００４７】
【表６】
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【００４８】
（実施例２、比較例３）　液体培地を用いた培養例
予め特開２００１−１４９０６６号公報に記載の公知の固体培養による方法でバチルス・ポピリエ・セマダラ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０６８）、バチルス・ポピリエ・サクラ（ＦＥＲＭ　Ｐ−１７６６２）又はバチルス・ポピリエ・マメ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０６９）の胞子嚢を培養した。さらに、各々無菌的に回収し顕微鏡による直接検鏡計測で蒸留水１ｍｌ中に胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の数が１×１０９個となるよう調整し、胞子嚢液を作製した。
【００４９】
各菌株の胞子嚢液を１ｍｌずつプラスチックチューブに分注し、ヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。液体培地（Ａ）及び（Ｂ−１）〜（Ｂ−３）には胞子嚢液を各１ｍｌ接種し、撹拌１５０ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、３０℃、ｐＨ７．６制御の条件で７日間培養した。一方、液体培地（Ｂ−４）は胞子嚢液を１ｍｌ接種し、３０℃の培養装置内にて１００ｒｐｍの回転数で撹拌し、７日間培養した。
【００５０】
培養終了後、培養液中の単位容積当たりの胞子とパラスポラルボディを含む胞子嚢の数及び菌数を顕微鏡（株式会社ニコン製「ＥＣＬＩＰＳＥ　Ｅ６００」　倍率３８００倍）による直接検鏡で計測し、菌数に対する胞子嚢数の比率（以下、胞子嚢化率という）を算出した。表７〜９に培養液１ｍｌ当たりの胞子嚢数と胞子嚢化率を示す。
【００５１】
【表７】
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【００５２】
【表８】
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【００５３】
【表９】
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【００５４】
表７〜９の結果から吸着剤とプロリンとを添加した液体培地においてのみ胞子嚢が得られ、該胞子嚢中には１つの胞子と１つのパラスポラルボディが含まれていることを顕微鏡による観察で確認した。
【００５５】
（実施例３、比較例４）　液体培地の調製例
ビーカーに蒸留水７００ｇを入れ、Ｌ−プロリン（和光純薬社製特級）、ペプトン（日本製薬社製「ポリペプトンＳ」）、酵母エキス（オクソイド社製）、ラクトアルブミン水解物（和光純薬社製）、トレハロース二水和物（和光純薬社製特級）を表１０に示した量、混合した。攪拌しながら５ｍｏｌ／ｌの水酸化カリウム水溶液を添加してｐＨを７．６に調整し、更に蒸留水を加えて８５０ｇとした。この液体培地を、ｐＨ電極を備えた発酵槽（丸菱バイオエンジ社製）に移し、１２１℃、６０分間、オートクレーブにて殺菌した。
【００５６】
次に、フラスコに活性炭素粉末（和光純薬社製特級）を表１０に示した量添加し、蒸留水を加えて１００ｇとして活性炭分散液を調製した。また、フラスコに消泡剤（日本油脂社製「ディスホームＣＡ−１２３」）を表１０に示した量添加し、さらに蒸留水を加えて５０ｇとし消泡剤液を調製した。該活性炭分散液及び消泡剤液を殺菌し、その後各発酵槽に無菌的に加え、さらに蒸留水を加え最終的に１０００ｇとし、実施例として液体培地（Ｃ−２）〜（Ｃ−４）、比較例として液体培地（Ｃ−１）及び（Ｃ−５）を調製した。
【００５７】
【表１０】
2004024127.tif 000011
【００５８】
（実施例４、比較例５）　液体培地を用いた培養例
予め特開２００１−１４９０６６号公報に記載の公知の固体培養による方法でバチルス・ポピリエ・セマダラ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０６８）の胞子嚢を培養した。さらに、無菌的に回収し顕微鏡による直接検鏡計測で蒸留水１ｍｌ中に胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の数が１×１０９個となるよう調整し、胞子嚢液を作製した。
【００５９】
胞子嚢液を１ｍｌずつプラスチックチューブに分注し、ヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。これを各液体培地に１ｍｌ接種し、撹拌１５０ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、３０℃、ｐＨ７．６制御の条件で７日間培養した。
培養終了後、培養液中の単位容積当たりの胞子嚢数及び菌数を顕微鏡による直接検鏡で計測し胞子嚢化率を算出した。表１１に培養液１ｍｌ当たりの菌数と胞子嚢数と胞子嚢化率を示す。また、図２に液体培地に対するプロリンの含有率と菌数及び胞子嚢数の関係を示す。
【００６０】
【表１１】
2004024127.tif 000012
【００６１】
実施例４で得られた胞子嚢には１つの胞子と１つのパラスポラルボディが含まれていた。また、表１１の結果をもとに、液体培地中のプロリン濃度に対する胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の生産数の関係を図２に示した。図２からプロリンの至適濃度範囲が０．１〜０．７質量％の範囲であることがわかった。
【００６２】
（実施例５、比較例６）　液体培地の調製例
ビーカーに蒸留水７００ｇを入れ、Ｌ−プロリン（和光純薬社製特級）、ピルビン酸ナトリウム（和光純薬社製特級）、ペプトン（日本製薬社製「ポリペプトンＳ」）、酵母エキス（オクソイド社製）、ラクトアルブミン水解物（和光純薬社製）、トレハロース二水和物（和光純薬社製特級）を表１２に示す量、混合した。続いて、撹拌しながら４ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨを７．６に調整し、更に蒸留水を加えて最終的に８５０ｇとした。調製した液体培地をｐＨ電極を備えた発酵槽（丸菱バイオエンジ社製）に入れて１２１℃、５０分間、オートクレーブにて殺菌した。
【００６３】
次に、フラスコに活性炭素粉末（和光純薬社製特級）を表１２に示す量添加し、さらに蒸留水を加えて１００ｇとし活性炭分散液を調製した。また、フラスコに消泡剤（日本油脂社製「ディスホームＣＡ−１２３」）を表１２に示す量添加し、さらに蒸留水を加えて５０ｇとし消泡剤液を調製した。該活性炭分散液及び消泡剤液を殺菌し、その後発酵槽に無菌的に加え、実施例として液体培地（Ｄ−１）及び（Ｄ−２）を、比較例として液体培地（Ｄ−３）を調製した。
【００６４】
【表１２】
2004024127.tif 000013
【００６５】
（実施例６、比較例７）　液体培地を用いた培養例
実施例４と同様にしてバチルス・ポピリエ・セマダラを種菌として用い、液体培地（Ｄ−１）〜（Ｄ−３）に各１ｍｌずつ無菌的に植菌して培養を開始した。培養条件は温度２９℃、通気量０．５ｖｖｍ、回転数１５０ｒｐｍとし、培養中は４ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム溶液及び４ｍｏｌ／ｌの硫酸水溶液にてｐＨ７．６に制御した。
【００６６】
培養を５日間行い、培養液中の単位容積当たりの胞子嚢数及び菌数を顕微鏡による直接検鏡で計測し胞子嚢化率を算出した。表１３に液体培地（Ｄ−１）〜（Ｄ−３）の菌数、胞子嚢数、胞子嚢化率を示した。
【００６７】
【表１３】
2004024127.tif 000014
【００６８】
実施例６で得られた胞子嚢には１つの胞子と１つのパラスポラルボディが含まれていた。また、表１３の結果から明らかなようにピルビン酸ナトリウムを添加しかつｐＨを制御することで胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の培地単位体積当たりの生産数をさらに高くすることができた。
【００６９】
（生物試験例１）
本発明の製造方法により得られた胞子嚢によるコガネムシ科昆虫の幼虫の生育抑制効果試験を行った。
実施例２の液体培地（Ａ）を用いた培地で取得したバチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢を蒸留水に２×１０８個／ｍｌとなるよう懸濁させ懸濁液（Ｉ）を調製した。さらに、該胞子嚢を含む懸濁液をフレンチプレス処理し、胞子嚢から胞子とパラスポラルボディとを分離し各々取り出した。分離した胞子を蒸留水に２×１０８個／ｍｌとなるよう懸濁させ懸濁液（ＩＩ）を調製した。また、分離したパラスポラルボディを蒸留水に２×１０８個／ｍｌとなるよう懸濁させ懸濁液（ＩＩＩ）を調製した。
【００７０】
腐葉土を約２０ｇずつ入れた直径６ｃｍのプラスチックカップを８０個準備した。
ｉ）プラスチックカップ２０個に対し、胞子嚢数が２×１０８個／カップとなるように胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を含む懸濁液（Ｉ）を散布した。
ｉｉ）プラスチックカップ２０個に対し、胞子数が２×１０８個／カップとなるように胞子のみを含む懸濁液（ＩＩ）を散布した。
ｉｉｉ）プラスチックカップ２０個に対し、パラスポラルボディ数が２×１０８個／カップとなるようにパラスポラルボディのみを含む懸濁液（ＩＩＩ）を散布した。ｉｖ）残りの２０個には何も散布せず、対照試験とした。
それぞれのカップにドウガネブイブイ２令幼虫を１頭ずつ入れ、２５℃の培養装置内で３０日間飼育し、経時的に幼虫の死亡率と生存幼虫の平均体重の増加量を測定した。累積死亡率について表１４に示し、生育抑制効果について図３に結果を示す。
【００７１】
表１４から明らかなように胞子のみの場合やパラスポラルボディのみの場合と比較し、胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢がコガネムシ科昆虫の幼虫に対し優れた殺虫効果及び幼虫の生育抑制効果を有することが確認された。
【００７２】
【表１４】
2004024127.tif 000015
【００７３】
（生物試験例２）
本発明の製造方法（液体培養）により得られた胞子嚢によるコガネムシ科昆虫の殺虫試験を行った。
直径６ｃｍのプラスチックカップ６０個に腐葉土を約２０ｇずつ入れ各２０個に対し各々下記ｉ）又はｉｉ）の胞子嚢を含む胞子嚢液を該胞子嚢数が１×１０９個／カップとなるように散布した。ただし、散布した胞子嚢液は、
ｉ）実施例２の液体培地（Ａ）を用いた培養で取得した、胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢、
ｉｉ）実施例２の液体培地（Ａ）を用いた培養で取得した、胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエ・マメの胞子嚢、
を用いたものであった。残りの２０個には胞子嚢液を散布せず、対照試験とした。それぞれのカップにドウガネブイブイ２令幼虫を１頭ずつ入れ、２５℃の培養装置内で４０日間飼育し、経時的に死亡個体数を調べ、累積死亡率（％）を求めた。
【００７４】
表１５に本発明の液体培養で得られた胞子嚢のドウガネブイブイに対する殺虫活性を示す。４０日目では８０〜１００％の死亡率が観察された。すなわち胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢がコガネムシ科昆虫の幼虫に対し優れた殺虫効果及び幼虫の生育抑制効果を有することが確認された。
【００７５】
【表１５】
2004024127.tif 000016
【００７６】
（生物試験例３）
本発明の製造方法（液体培養）により得られた胞子嚢によるコガネムシ科昆虫の殺虫試験を行った。実施例６に示した液体培地（Ｄ−２）の培養により得た、胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢を蒸留水に１×１０９個／ｍｌとなるよう懸濁し胞子嚢液を調製した。
【００７７】
直径６ｃｍのプラスチックカップ４０個に腐葉土２０ｇずつを入れた。そのうちの２０個に対して、胞子嚢数が１×１０９個／カップとなるよう胞子嚢液を散布した。残りの２０個には胞子嚢液を散布せず、対照試験とした。それぞれのカップにドウガネブイブイ２令幼虫を１頭ずつ入れ、２５℃の培養装置内で４０日間飼育し、経時的に死亡個体数を調べ、累積死亡率（％）を調べた。
【００７８】
表１６にドウガネブイブイに対する昆虫体外形成胞子嚢の殺虫活性の結果を示す。得られた胞子嚢は殺虫活性を示し４０日目までに全ての幼虫が死亡した。すなわち、胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢がコガネムシ科昆虫の幼虫に対し優れた殺虫効果及び幼虫の生育抑制効果を有することが確認された。
【００７９】
【表１６】
2004024127.tif 000017
【００８０】
【発明の効果】
本発明は、バチルス・ポピリエに属する菌を吸着剤と０．１〜０．７質量％のプロリンとを含む液体培地で培養することにより、５〜１０日程度の液体培養で、培養液１ｍｌ当たり、胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を５×１０７個以上の割合で製造することができ、菌数に対する胞子嚢数の比率は６〜５０％である。また、前記液体培地にピルビン酸を添加することで、培地単位体積当たりの該胞子嚢の生産数をさらに高くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエの胞子嚢の模式図である。
【図２】実施例４における液体培地中のプロリン濃度に対する胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の生産数の関係を示したグラフである。
【図３】生物試験例１におけるドウガネブイブイの生育阻害効果を示したグラフである。
【符号の説明】
１　胞子嚢
２　パラスポラルボディ
３　胞子
【図１】
2004024127.tif 000018
【図２】
2004024127.tif 000019
【図３】
2004024127.tif 000020