(57)【要約】【課題】培養骨を構成する細胞の状態を精度よく評価することを可能にする。【解決手段】患者から採取した骨髄細胞を所定の培地内で培養することにより間葉系幹細胞を取得する一次培養ステップＳ１と、培養された間葉系幹細胞を所定の骨形成培地内で培養することにより骨芽細胞へ分化させる二次培養ステップＳ２と、分化された骨芽細胞および産生された骨基質を回収する回収ステップＳ３と、回収された骨芽細胞および骨基質を骨補填材顆粒と混合する混合ステップＳ４とを備える培養骨の製造方法を提供する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から採取した骨髄細胞を所定の培地内で培養することにより間葉系幹細胞を取得する一次培養ステップと、培養された間葉系幹細胞を所定の骨形成培地内で培養することにより骨芽細胞へ分化させる二次培養ステップと、分化された骨芽細胞および産生された骨基質を回収する回収ステップと、回収された骨芽細胞および骨基質を骨補填材顆粒と混合する混合ステップとを備える培養骨の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、培養骨の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨組織に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成するいわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系幹細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。間葉系幹細胞が骨補填材の内部に浸透するように成長する。したがって、このような培養骨を骨欠損部に補填することにより、骨補填材の内部に配されている間葉系幹細胞からも骨形成作用が生じるので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、培養骨が一旦製造された状態では、該培養骨を分割して検査をしない限り、間葉系幹細胞が骨補填材の内部まで浸透しているか否か、骨補填材内部の間葉系幹細胞の状態がいかなる状態であるかを判断することは困難であるという問題がある。
【０００５】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、培養骨を構成する細胞の状態を精度よく評価することを可能にする培養骨の製造方法を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、患者から採取した骨髄細胞を所定の培地内で培養することにより間葉系幹細胞を取得する一次培養ステップと、培養された間葉系幹細胞を所定の骨形成培地内で培養することにより骨芽細胞へ分化させる二次培養ステップと、分化された骨芽細胞および産生された骨基質を回収する回収ステップと、回収された骨芽細胞および骨基質を骨補填材顆粒と混合する混合ステップとを備える培養骨の製造方法を提供する。
【０００７】
この発明によれば、一次培養ステップにおいて培養された間葉系幹細胞を、骨補填材顆粒と混合する前の二次培養ステップにおいて骨芽細胞へと分化させるので、回収ステップを経て回収された骨芽細胞および骨基質を骨補填材顆粒に混合する前に検査することにより、その後の混合ステップにおいて製造されることとなる培養骨内部に配される細胞の状態を精度よく評価することが可能となる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
この発明の一実施形態に係る培養骨の製造方法について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る製造方法は、図１に示されるように、患者から採取した骨髄細胞を所定の培地内で培養することにより間葉系幹細胞を取得する一次培養ステップＳ１と、培養された間葉系幹細胞を所定の骨形成培地内で培養することにより骨芽細胞へ分化させる二次培養ステップＳ２と、分化された骨芽細胞および産生された骨基質を回収する回収ステップＳ３と、回収された骨芽細胞および骨基質を骨補填材顆粒と混合する混合ステップＳ４とを備えている。
【０００９】
一次培養ステップＳ１を行う前工程Ｓ０として、患者から骨髄液を採取する抽出工程Ｓ０１と、採取した骨髄液から骨髄細胞を分離する分離工程Ｓ０２とが行われる。分離工程は、例えば、遠心分離機による。
分離された骨髄細胞は、所定の培養容器内に投入された培地と混合される。培地は、例えば、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）、抗生剤を、例えば、８４：１５：１の配合割合で混合したものである。抗生剤は、例えば、ペニシリン系抗生物質である。
【００１０】
一次培養ステップＳ１は、このようにして培養容器内に混合された骨髄細胞と培地とをインキュベータ内に配置して、例えば、３７±０．５℃、５％ＣＯ２濃度に保持することにより行われる。培養容器内においては、骨髄細胞中に含まれる間葉系幹細胞が培養容器の底面に付着しながら成長する一方、他の造血系の細胞等は培地内に浮遊する。そして、一次培養ステップＳ１の期間、例えば、８〜１０日間の内の所定の時期、例えば、１日置きに定期的に培地を交換することにより、培養容器の底面に付着している間葉系幹細胞のみを抽出することができる。
【００１１】
このようにして一次培養ステップＳ１が終了すると、培養容器には、底面に付着して成長した間葉系幹細胞が抽出されている。その後、例えば、トリプシンのような蛋白質分解酵素を培養容器内に供給することにより、間葉系幹細胞を培養容器底面から引き剥がす。引き剥がされた間葉系幹細胞は、例えば、遠心分離機にかけることによりトリプシン等の他の成分から分離されるので、これを、他の培養容器に移動して培地を供給し、二次培養ステップＳ２を開始する。
【００１２】
二次培養ステップＳ２は、間葉系幹細胞を培養する培地として骨形成培地を使用する。骨形成培地は、一次培養ステップＳ１において使用される培地４とは異なり、例えば、ＭＥＭ、ＦＢＳの他にデキサメサゾンやβグリセロフォスフェートのような分化誘導因子やビタミンＣのような栄養剤が混合される。
ここで、本実施形態に係る製造方法では、二次培養ステップＳ２の骨形成培地内には骨補填材を投入することなく、一次培養ステップＳ１で培養した間葉系幹細胞のみを投入して培養する。
【００１３】
このようにすると、間葉系幹細胞は、分化誘導因子の作用によって、骨芽細胞へと分化し、骨基質が産生される。これら、骨芽細胞および骨基質も培養容器の底面に付着して成長する。
【００１４】
回収ステップＳ３は、一次培養ステップＳ１と同様にして、例えば、トリプシンのような蛋白質分解酵素を培養容器内に供給することにより、骨芽細胞および骨基質を培養容器底面から引き剥がす。そして、引き剥がされた細胞および基質を、例えば、遠心分離機にかけることによりトリプシン等の他の成分から分離回収する。このようにして回収ステップＳ３において回収された骨芽細胞および骨基質は、この時点では骨補填材と混合されていないので、その成長の度合いを容易に検査することができる。
【００１５】
混合ステップＳ４は、このようにして回収された骨芽細胞および骨基質を骨補填材と混合することにより行われる。骨補填材は、例えば、βリン酸三カルシウム多孔体顆粒である。この混合ステップＳ４により、骨芽細胞および骨基質と骨補填材とが均質に混合されることになる。
【００１６】
このように、本実施形態に係る培養骨の製造方法によれば、二次培養ステップＳ２において、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる際に、骨補填材と混合することなく単独で行うので、分化した骨芽細胞の評価を適正に行うことができる。すなわち、従来、骨補填材の内部に浸透するように成長してしまった骨芽細胞の評価が困難であったのに対し、本実施形態に係る製造方法によれば、骨芽細胞の成長の度合いを精度よく検査することができる。
【００１７】
そして、このようにして充分に成長した状態の骨芽細胞を骨補填材と混合するので、骨芽細胞と骨補填材とを均質に混合し、内部まで充分に成長した細胞を有する培養骨を製造することができる。
【００１８】
なお、上記実施形態においては、トリプシンのような蛋白質分解酵素を用いて、培養容器の底面から間葉系幹細胞、骨芽細胞および骨基質を引き剥がすこととしたが、これに代えて、温度応答性培養容器を使用することにしてもよい。
温度応答性培養容器は、その底面に温度応答性高分子ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を共有結合で固定したものである。このような温度応答性培養容器は、その底面が、３２℃を境界温度として、それ以上では、市販の細胞用培養容器と同程度の弱い疎水性を呈するが、温度を境界温度以下に冷却することにより高い親水性を呈する。
【００１９】
したがって、培養温度の３７℃では、間葉系幹細胞、骨芽細胞は、疎水性を呈する培養容器の底面に付着して成長するが、培養終了後に、培養容器の温度を３２℃以下に冷却することにより、底面を親水性に切り替えて、細胞を容易に剥離させることができる。このようにすることで、蛋白質分解酵素を使用しなくて済むので、細胞を傷つけることなく非侵襲的に回収することができる。
【００２０】
また、抗生剤として、ペニシリン系抗生物質を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、これに代えて、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【００２１】
また、上記実施形態においては、ＭＥＭとＦＢＳと抗生剤との配合割合が、例えば、８４：１５：１となることとしたが、これに代えて、ＭＥＭ：ＦＢＳ：抗生剤＝８０〜９０：５〜１０：０．１〜５となるようにしてもよい。
また、培地構成成分Ａ，Ｂ，ＣをＭＥＭとＦＢＳと抗生剤の３成分からなるものとして説明したが、これに代えて他の培地構成成分、あるいは、追加の培地構成成分を採用することにしてもよい。特に、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を培地構成成分として混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合することにしてもよい。
【００２２】
また、骨補填材として、βリン酸三カルシウムの顆粒を例示して説明したが、これに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。
【００２３】
【発明の効果】
以上、説明したように、この発明に係る培養骨の製造方法によれば、二次培養ステップにおいて、骨補填材と混合することなく、骨形成培地内において細胞を分化させるので、骨補填材との混合前に、細胞の状態を正確に評価することができるという効果を奏する。
また、分化した細胞を顆粒状の骨補填材と混合するので、骨補填材中に、充分に成長した分化した細胞が均等に分布した培養骨を製造することができる。したがって、術後に骨欠損部内において早期に骨形成作用を生じさせ、骨欠損部の迅速な修復を行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施形態に係る培養骨の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の製造方法の製造手順を示す図である。
【符号の説明】
Ｓ１　一次培養ステップ
Ｓ２　二次培養ステップ
Ｓ３　回収ステップ
Ｓ４　混合ステップ
【図１】
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【図２】
2004049142.tif 000004