(57)【要約】【課題】酵母内で、染色体を分断・脱落させるために簡易な方法を提供すること。【解決手段】テロメア配列（ａ）、酵母染色体のセントロメア配列、および標的配列（ａ）をこの順で有する線状化された染色体分断ベクター（１）を準備する工程；標的配列（ｂ）、マーカー遺伝子配列、およびテロメア配列（ｂ）をこの順で有する線状化された染色体分断ベクター（２）を準備する工程；ここで、該テロメア配列（ｂ）は該テロメア配列（ａ）とは逆向きに配置されている；および、該染色体分断ベクター（１）および（２）を酵母に導入する工程；を含む方法を提供する。この方法により、酵母中の染色体の改変が容易に行われる。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメア配列（ａ）、酵母染色体のセントロメア配列、および標的配列（ａ）をこの順で有する線状化された染色体分断ベクター（１）を準備する工程；
標的配列（ｂ）、マーカー遺伝子配列、およびテロメア配列（ｂ）をこの順で有する線状化された染色体分断ベクター（２）を準備する工程であって、該テロメア配列（ｂ）が該テロメア配列（ａ）とは逆向きに配置されている工程；および、
該染色体分断ベクター（１）および（２）を酵母に導入する工程；　を含む、
酵母中の染色体の改変方法。
【請求項２】
前記染色体の改変が、酵母染色体の分断（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）および／または脱落（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的配列（ａ）が、テロメア配列（ａ）の方向とは逆向きに配置されている、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母の染色体分断ベクターを用いる、酵母中に存在する染色体の改変方法に関する。さらに、詳しくは、本発明は、２つの線状化染色体分断ベクターを用いて、染色体を改変する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
組換えＤＮＡ技術の発展によって、遺伝子を自在に改変あるいは加工する技術が発展し、種々の生物において改変遺伝子を導入することが可能となっている。
【０００３】
ＤＮＡの改変技術には、部位特異的変異誘発、制限酵素による処理、あるいはＰＣＲを用いる方法なども含まれるが、対象となる遺伝子は、１０ｋｂ程度、大きくても４０ｋｂ程度の、ごく限られた大きさの遺伝子であり、染色体のような、巨大ＤＮＡを自在に改変する技術は、まだ、検討が始まったばかりである。
【０００４】
ところで、酵母は、古くから発酵工業に用いられている有用な微生物である。この酵母の染色体を、染色体の分断、脱落などの染色体改変技術により改変することにより、例えば、必要な染色体の数、長さ、量などに関する知見が得られ、ゲノムの構築原理の解明が期待される。この原理が構築されれば、これを利用して、例えば、エネルギーを消費する不要な遺伝子を削除した酵母を宿主として、効率的に物質生産を行うことなどが可能になると期待される。さらに、所望の染色体領域を他の酵母に移植できれば、酵母染色体機能の解析や有用酵母の育種が可能となる。
【０００５】
さらに、例えば、酵母人工染色体ベクター（ＹＡＣべクター）を用いて構築された、植物染色体の巨大ＤＮＡ（例えば、２００ｋｂ以上）を含むＤＮＡライブラリーが作成されている。この巨大ＤＮＡを、多様な目的に応じて自在に分離、加工することができれば、今までにない有用形質転換植物の創成をはじめとする植物バイオテクノロジーだけでなく、植物染色体構造の解明、ポジショナルクローニングの迅速化、植物遺伝子機能検定の簡便化、植物人工染色体の構築など、植物基礎生物学をも飛躍的に進展させることが期待される。
【０００６】
そこで、酵母の染色体あるいは植物染色体を対象にして、染色体を改変する試みがなされている。例えば、特開平１０−８４９４５号公報には、酵母のセントロメア遺伝子（ＣＥＮ４）、マーカー遺伝子（ＵＲＡ３）、および２つの逆向きに配置されたテロメア配列と、そのテロメア配列の間にｓｔｕｆｆｅｒ　ＤＮＡとしてＨＩＳ３遺伝子を有する酵母染色体分断ベクターｐＣＳＶ１を用いて、酵母染色体を分断する試みが記載されている。
【０００７】
ところで、この分断ベクターｐＣＳＶ１を用いる酵母染色体の分断は、図１３に示すように、分断部位に対応する標的遺伝子配列を分断ベクターｐＣＳＶ１に導入すること（Ｓｔｅｐ１）、ｓｔｕｆｆｅｒ　ＤＮＡを除去すること（Ｓｔｅｐ２）、除去後、再環状化すること（Ｓｔｅｐ３）、再環状化後、標的遺伝子配列を切断して、線状化して（Ｓｔｅｐ４）、酵母に導入することという複雑な、４工程の手順を踏む必要があり、あまり効率的ではない。
【０００８】
この分断ベクターｐＣＳＶ１は、相同組換えの頻度を上げる目的で、標的遺伝子配列中で切断して線状化され（Ｓｔｅｐ４）、酵母細胞内に導入される。細胞内に導入された線状化分断ベクターは、標的遺伝子配列付近で相同組換えを起こし、ついで、対向するテロメア配列が解離されると考えられる。従って、標的遺伝子配列付近で分断が可能である。しかし、このような方法は、依然として煩雑な工程を必要とし、改良の余地がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、酵母を宿主として、特に染色体などの、巨大ＤＮＡを簡単に分離し、加工し、脱落させ、あるいは単離する技術の開発が望まれている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記問題を解決するために行われたものであり、その目的は、染色体分断ベクターを容易に調製でき、しかも、染色体改変、特に分断（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）と脱落（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、並びに染色体の単離を容易に行うことが可能な方法を提供することにある。
【００１１】
本発明は、テロメア配列（ａ）、酵母染色体のセントロメア配列、および標的配列（ａ）をこの順で有する線状化された染色体分断ベクター（１）を準備する工程；標的配列（ｂ）、マーカー遺伝子配列、およびテロメア配列（ｂ）をこの順で有する線状化された染色体分断ベクター（２）を準備する工程であって、該テロメア配列（ｂ）が該テロメア配列（ａ）とは逆向きに配置されている工程；および、該染色体分断ベクター（１）および（２）を酵母に導入する工程；を含む、酵母中の染色体の改変方法を提供する。
【００１２】
好ましい実施態様においては、前記染色体の改変が、酵母染色体の分断（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）および／または脱落（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により引き起こされる。
【００１３】
好ましい実施態様においては、前記前記標的配列（ａ）が、テロメア配列（ａ）の方向とは逆向きに配置されている。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の方法には、図１で示される線状化された染色体分断べクター（１）および染色体分断ベクター（２）が用いられる。図１において、ＴＥＬはテロメア配列、ＣＥＮはセントロメア配列を意味する。染色体分断ベクター（１）は、テロメア配列（ａ）、酵母染色体のセントロメア配列（ＣＥＮ）、および標的配列（ａ）をこの順で有する。染色体分断ベクター（２）は、標的配列（ｂ）、マーカー遺伝子配列、およびテロメア配列（ｂ）をこの順で有する。酵母染色体の改変は、染色体の分断（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）、脱落（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）などが、単独であるいは組合されて、引き起こされる。酵母染色体の分断および／または脱落を行う上で、このテロメア配列（ａ）とテロメア配列（ｂ）とが、逆向きに配置されることが、必要である。なお、「この順で」というときは、上記配列が、染色体分断ベクター（１）および（２）において、これらが、ともに５’から３’の方向に配置されるか、ともに３’から５’の方向に配置されることを意味する。
【００１５】
この２つの染色体分断ベクター（１）および（２）を酵母に同時に導入することにより、酵母中の染色体を簡単に改変し、酵母染色体を分断あるいは脱落させることができる。これらの染色体分断ベクター（１）および（２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で環状ベクターを増幅させた後、適切な制限酵素を用いて、線状化（直鎖状に）するか、不要な断片を削除することにより得られる。従って、例えば、図１３に示すような、染色体分断ベクターを用いる従来の方法に必要とされる複雑な工程は不要となる。
【００１６】
従来、酵母における染色体の分断においては、対向するテロメア配列を結合させたまま酵母に導入する必要があると考えられていた。しかし、本発明により、テロメア配列を結合したまま用いなくても、染色体分断ベクターとして利用できることが示された。本発明により、酵母染色体の改変、特に酵母染色体の分断と脱落が、染色体分断ベクターの作成を含め、簡単に行えるようになる。
【００１７】
（テロメア配列）
テロメア配列は、酵母染色体の末端の複製に必要な、繰り返し配列をいうが、いわゆるＡＲＳを含む領域ではない。テロメア配列としては、酵母で機能するものであれば起源を問わない。例えば、酵母のテロメア配列、テトラヒメナのリボゾームＲＮＡ遺伝子をコードする配列（以下、テトラヒメナのテロメア配列という）が用いられる。好ましくは、テトラヒメナのテロメア配列が用いられる。
【００１８】
テロメア配列は、例えば、テトラヒメナのテロメア配列を有するプラスミドｐＹＡＣ４（Ｂｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３６，　８０６−１２，　１９８７）を出発材料として調製される。図２に基づいて説明すると、まず、ｐＹＡＣ４をＢａｍＨＩで切断し、自己閉環させてｐＳＩＧ６を作成する。次に、ｐＳＩＧ６をＢａｍＨＩで開環してＫｌｅｎｏｗ酵素で処理し、ＫｐｎＩリンカーを加え、閉環処理してｐＳＩＧ７を作成する。このｐＳＩＧ７をＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ処理して、テロメア配列が得られる。
【００１９】
（酵母染色体のセントロメア配列）
酵母染色体のセントロメア配列は、酵母染色体の有糸分裂に必要な配列をいい、どの染色体のセントロメアであっても、特に制限なく用いられる。特に、ＣＥＮ４、ＣＥＮ６などが好ましく使用される。酵母染色体のセントロメア配列は、所望のセントロメア配列を有するプラスミド（例えば、ｐＤＷ２６（Ｗｉｎｄｉａｎｔ，Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｆｅｒｍｅｎｔ．　Ｂｉｏｅｎｇ．　８２，　１９９−２０４　（１９９６））を鋳型とする、ＰＣＲ法で調製される。調製に際し、適切な制限酵素切断部位を含むプライマーを用いれば、所望のセントロメア配列を含む染色体断片が、容易に調製される。
【００２０】
（マーカー遺伝子）
マーカー遺伝子としては、酵母に染色体分断ベクターが導入されたことが確認できるマーカーであれば、特に制限はない。一般的には、例えば、ＨＩＳ３、ＨＩＳ５、ＵＲＡ３、ＡＤＥ２、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＬＹＳ２などの栄養要求性マーカー遺伝子などが用いられる。また、真核細胞で発現する薬剤耐性マーカー遺伝子、例えばカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍ）を用いることもできる。マーカー遺伝子配列は、そのマーカー遺伝子を有するプラスミドを鋳型とする、ＰＣＲ法で調製される。調製に際し、適切な制限酵素切断部位を含むプライマーを用いれば、所望のマーカー遺伝子配列を含むＤＮＡ断片が、容易に調製される。
【００２１】
（標的配列）
標的配列は、酵母中に存在する、分断あるいは脱落の対象となる染色体（例えば、酵母染色体、植物染色体、動物染色体など）の分断個所を含む配列に対応する配列をいう。標的配列は、染色体の分断位置に相当する配列を、例えば、適切な制限酵素部位を含むように合成することにより得られる。例えば、適切な制限酵素切断部位を含むように設計されたプライマーを用い、酵母全ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、所望の標的配列を含むＤＮＡ断片が容易に調製される。
【００２２】
（染色体分断ベクター（１）の調製）
染色体分断ベクター（１）は、テロメア配列（ａ）、酵母染色体のセントロメア配列（ＣＥＮ）、および標的配列（ａ）をこの順で有する。この染色体分断ベクター（１）は、例えば、テロメア配列、セントロメア配列、および標的配列（ａ）がこの順になるように、それぞれの配列を適切なプラスミドに挿入し、増幅することにより得られる。一例を挙げると、図３に示されるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ切断部位にテロメア配列を導入し、ＥｃｏＲＩ部位にセントロメア配列を導入し、そして、ＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ切断部位に標的配列（ａ）を導入することにより、プラスミドｐＳＩＧＸが得られる。
【００２３】
この導入に際して、標的配列（ａ）は、酵母染色体の切断位置を考慮して、テロメア配列（ａ）の方向と同じ向きに、あるいは、テロメア配列（ａ）の方向とは逆向きに導入される。酵母染色体のセントロメアの左側で分断を起こしたい場合、標的配列（ａ）は、テロメア配列（ａ）の方向とは逆向きに導入されることが好ましい。標的配列（ａ）を逆向きに導入する方法の一例を、図４で説明する。図４ａに示すように、標的配列（ａ）の５’側のプライマーとして、ＳａｃＩＩ切断部位を有するプライマー（破線）と、３’側のプライマーとしてＫｐｎＩ−ＳａｃＩ切断部位を有するプライマー（破線）を用いて、標的配列（ａ）とアニールする。次に、図４ｂに示すように、ＰＣＲを行い、３’側にＳａｃＩＩおよび５’側にＫｐｎＩ−ＳａｃＩの制限酵素切断位置を有するＰＣＲ増幅物が得られる。ついで、図４ｂで得られたＰＣＲ増幅物をＳａｃＩ−ＳａｃＩＩで処理すると、図４ｃに示すような断片が得られる。得られた断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋のＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ部位に導入することにより、図４ｄに示すように、標的配列（ａ）がテロメア配列（ａ）の方向とは逆向きに導入される。
【００２４】
上記得られたプラスミドｐＳＩＧＸ（図３）を大腸菌に導入し、増幅させて回収し、ＫｐｎＩで切断し、テロメア配列を有する断片を回収することにより、線状化された染色体分断ベクター（１）を調製することができる。
【００２５】
（染色体分断ベクター（２）の調製）
染色体分断ベクター（２）は、テロメア配列（ｂ）、マーカー遺伝子配列、および標的配列（ｂ）をこの順で有する。この染色体分断ベクター（２）の調製を図５の模式図に示す。すなわち、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ切断部位にテロメア配列を導入し、ＮｏｔＩ部位にマーカー遺伝子配列（ＴＲＰ１）を導入し、そして、ＳａｃＩ−ＳａｃＩＩ切断部位に標的配列（ｂ）を導入することにより、プラスミドｐＳＩＧＹが得られる。
【００２６】
上記得られたプラスミドｐＳＩＧＹ（図５）を大腸菌に導入し、増幅させて回収し、ＫｐｎＩで切断し、テロメア配列を有する断片を回収することにより、線状化された染色体分断ベクター（２）を調製することができる。
【００２７】
なお、本発明に用いる染色体分断ベクター（１）および（２）の調製に際して、中間のプラスミド（ベクター）を大腸菌に導入して調製する観点から、染色体分断ベクター（１）および（２）の基礎となるベクターには、さらに、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃ）、ストレプトマイシン耐性遺伝子などの大腸菌あるいはその他の原核細胞で機能する薬剤耐性遺伝子を有していることが好ましい。
【００２８】
（染色体の分断・脱落）
以下、染色体分断ベクター（１）および（２）を用いて、染色体を分断あるいは脱落させる場合について説明する。染色体を分断する場合、染色体の脱落を伴わない場合と、染色体の脱落を伴う場合とがある。染色体の分断を、図６（Ａ）に例示する。例えば、図６（Ａ）において、標的配列（ａ）が分断位置を挟んで分断位置の左側の染色体配列を有し、標的配列（ｂ）が分断位置の右側の染色体配列を有するように、標的配列（ａ）および（ｂ）を構成する。このような標的配列（ａ）および（ｂ）をそれぞれ有する線状化された染色体分断ベクター（１）および（２）を同時に酵母に導入することにより、図６（Ａ）に示されるような染色体の分断が生じると考えられる。
【００２９】
染色体の脱落を伴う分断の場合、染色体分断ベクター（１）および（２）が、標的配列（ａ）および（ｂ）として、脱落させる染色体部分の両端部分の配列を有していることが必要である。このような標的配列（ａ）および（ｂ）を有する染色体分断ベクター（１）および（２）を用いると、図６（Ｃ）、図７（Ｄ）および図７（Ｆ）に示されるような様式で、染色体の分断と脱落が生じると推定される。また、染色体分断ベクター（１）あるいは（２）が、例えば、図６の（Ｂ）あるいは図７の（Ｅ）に示されるように、単独で、分断・脱落に関与することも考えられる。図６および図７は、分断・脱落様式の一例を示し、これらの（Ａ）〜（Ｆ）の様式が、単独で、あるいはこれらが複合して、さらには、その他の様式で、染色体の分断・脱落が起こると考えられる。
【００３０】
このように、本発明の染色体分断ベクター（１）および（２）は、いずれも簡便に調製でき、これらを同時に酵母に導入することにより、簡単に酵母中の染色体の分断・脱落を起こすことができる。従来の方法が、いったん、逆向きテロメア配列の間にｓｔｕｆｆｅｒ　ＤＮＡを有するプラスミドに標的配列を導入し、ｓｔｕｆｆｅｒ　ＤＮＡを除去し、これを環化した後に、標的配列内で切断しなければならないという煩雑な工程を必要とすること、並びに、１つの染色体分断ベクターを使用するだけでは、染色体の脱落を起こすのが困難であったことを考慮すると、染色体の分断・脱落を容易に行うことができる点で、本発明の方法は優れている。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を、実施例を挙げて説明するが、本発明がこの実施例に限定されないことはいうまでもない。
【００３２】
（参考例：染色体分断ベクターの構築）
（テロメア配列の調製）
テロメア配列は、テトラヒメナのテロメア配列を有するプラスミドｐＹＡＣ４（Ｂｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３６，　８０６−１２，　１９８７）を出発材料として、以下のように調製した。図２に示すように、まず、ｐＹＡＣ４をＢａｍＨＩで切断し、自己閉環させてｐＳＩＧ６を作成し、次に、ｐＳＩＧ６をＢａｍＨＩで開環してＫｌｅｎｏｗ酵素で処理し、ＫｐｎＩリンカー（宝酒造製）を加え、閉環処理してｐＳＩＧ７を作成した。このｐＳＩＧ７をＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ処理して、テロメア配列のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。
【００３３】
（酵母染色体のセントロメア配列の調製）
酵母染色体のセントロメア配列（ＣＥＮ）を、ｐＤＷ２６を鋳型とし、ＥｃｏＲＩ切断部位を含む２種類のプライマー：５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＡＴＡ−３’（配列番号１）および５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＡＧＡＧＧＴＧＡＴＡＣＴＴＡＴＴ−３’（配列番号２）を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅物をＥｃｏＲＩで切断することによって、調製した。
【００３４】
（マーカー遺伝子配列の調製）
プラスミドＹＲｐ７を鋳型として、ＮｏｔＩ切断部位を含む２種類のプライマー：５’−ＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＣＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧ−３’（配列番号３）および５’−ＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＡＣＡＡＴＡＣＴ−３’（配列番号４）を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅物をＮｏｔＩで切断することによって、ＴＲＰ１遺伝子断片を調製した。
【００３５】
プラスミドＹＥｐ２４を鋳型として、ＮｏｔＩ切断部位を含む２種類のプライマー：５’−ＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号５）および５’−ＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅物をＮｏｔＩで切断することにより、ＵＲＡ３遺伝子断片を調製した。
【００３６】
（標的配列の調製）
標的配列（ａ）として、酵母第６染色体のデルタ配列（１４３５３４〜１４３６８０位）を用いた。この標的配列（ａ）を、ｐＣＳＶ５を鋳型として、５’側のプライマーとして、ＳａｃＩＩ切断部位を含む配列：５’−ＣＴＣＣＣＧＣＧＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＡＴ−３’（配列番号７）および３’側のプライマーとして、ＳａｃＩ−ＫｐｎＩ切断部位を含む配列：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＣＴ−３’（配列番号８）を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅物をＳａｃＩ−ＳａｃＩＩで切断することにより、調製した。以下、この配列をδ（Ｌｅｆｔ）ということがある。なお、ｐＣＳＶ５は、ｐＣＳＶ１（構造および作成方法は、特開平１０−８４９４５号公報に記載されている）のＵＲＡ３遺伝子をＡＤＥ２遺伝子で置換して得られるプラスミドである。
【００３７】
標的配列（ｂ）として、酵母第６染色体のデルタ配列（１４３７００〜１４３８４１位）を用いた。この標的配列（ｂ）を、ｐＣＳＶ５を鋳型として、５’側のプライマーとして、ＳａｃＩ−ＫｐｎＩ切断部位を含む配列：５’−ＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴ−３’（配列番号９）および３’側のプライマーとして、ＳａｃＩＩ切断部位を含む配列：５’−ＣＴＣＣＣＧＣＧＧＴＧＴＡＧＡＧＡＡＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＴＡ−３’（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅物をＳａｃＩ−ＳａｃＩＩで切断することにより、調製した。以下、この配列をδ（Ｒｉｇｈｔ）ということがある。
【００３８】
（染色体分断ベクター（１）の作成）
染色体分断ベクター（１）の作成を、図８に模式的に示す。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋をＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ処理し、ここにテロメア配列のＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入し、ｐＳＩＧ１２を構築した。このｐＳＩＧ１２をＳａｃＩ−ＳａｃＩＩで処理し、この部位にδ（Ｌｅｆｔ）配列を挿入し、ｐＳＩＧ１３を得た。このｐＳＩＧ１３のＥｃｏＲＩ部位にセントロメア配列を挿入して、ｐＳＩＧ１４を得た。このｐＳＩＧ１４に挿入されたδ（Ｌｅｆｔ）配列は、逆向きに（すなわち、１４３６８０→１４３５３４の向きに）挿入されている。
【００３９】
（染色体分断ベクター（２）の作成）
染色体分断ベクター（２）の作成を、図９に模式的に示す。染色体分断ベクター（１）の作成時に得られたｐＳＩＧ１２をＳａｃＩ−ＳａｃＩＩで処理し、この部位にδ（Ｒｉｇｈｔ）配列を挿入し、ｐＳＩＧ１５を得た。次に、このｐＳＩＧ１５のＮｏｔＩ部位にＴＲＰ１配列を挿入して、ｐＳＩＧ１６を得た。
【００４０】
上記ｐＳＩＧ１５のＮｏｔＩ部位に、ＴＲＰ１遺伝子の代りにＵＲＡ３遺伝子断片を挿入して、ｐＳＩＧ２０を得た。
【００４１】
（実施例１）
染色体分断ベクター（１）としてｐＳＩＧ１４を、染色体分断ベクター（２）としてｐＳＩＧ１６を用いて、酵母染色体の分断を以下のように行った。ｐＳＩＧ１４およびｐＳＩＧ１６をそれぞれＫｐｎＩで切断し、アガロースゲル電気泳動にて、それぞれ、約１．８ｋｂのテロメア配列を有する断片を回収した。これらを３５μｇずつ混合し、これを用いて酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｗ３０３−１Ａ株：ｕｒａ３−１　ｌｅｕ２−３，１１２　ｔｒｐ１　ｈｉｓ３−１１，１５　ａｄｅ２−１）を形質転換し、得られた形質転換酵母をランダムに８株サンプリングし、常法により処理して、染色体ＤＮＡを調製し、パルスフィールドゲル電気泳動を行った。
【００４２】
パルスフィールドゲル電気泳動は、Ｃｈｕらの方法（Ｃｈｕ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４：１５８２−１５８５　（１９８６）　）に基づいて行った。すなわち、アガロースプラグに包埋された染色体ＤＮＡを調製し、１％アガロースを含む０．５×ＴＢＥバッファーで作成したゲルに埋めこんだ。このサンプルに対し、ＣＨＥＦ　ＤＲＩＩＩシステムを用いて、水温１４℃、電圧２００Ｖで、２４時間、６０秒のスイッチングを行い、その後６時間、９０秒のスイッチングを行った。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、ＤＮＡの電気泳動パターンを観察した。また、この電気泳動したゲルに、セントロメア配列（ＣＥＮ４）およびＴＲＰ１配列をそれぞれプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った。
【００４３】
パルスフィールドゲル電気泳動の結果を図１０に示す。図１０Ａはエチジウムブロマイドによる染色、図１０ＢはＣＥＮ４配列をプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーション（以下、単に、ハイブリダイゼーションということがある）、および図１０ＣはＴＲＰ１をプローブとして用いるハイブリダイゼーションを示す写真である。図１０において、レーンＭはマーカー、そして、レーンＨは宿主の酵母Ｗ３０３−１Ａ株である（図１１、図１２においても同じである）。レーン１〜８は、選択した８株の形質転換株である。
【００４４】
エチジウムブロマイド染色（図１０Ａ）では、明確に消失した酵母本来の染色体バンドは見出せなかったが、レーン４の形質転換体には、新たなバンドが見られた。レーン３および６の形質転換体では、いずれも、ＣＥＮ４プローブおよびＴＲＰ１プローブとハイブリダイズする新たなバンドが見られた（図１０ＢおよびＣ）。レーン４および７の形質転換体では、ＣＥＮ４プローブとのみハイブリダイズする新たなバンドが見られた。レーン４のＣＥＮ４プローブとハイブリダイズするバンドは、図１０Ａのバンドと一致した。レーン８の形質転換体では、ＴＲＰ１プローブとのみハイブリダズする新たなバンドが見られた。これらのことから、線状化された染色体分断ベクター（１）（ｐＳＩＧ１４）と線状化された染色体分断ベクター（２）（ｐＳＩＧ１６）とを用いて、染色体の分断が可能であることがわかった。レーン３および６の形質転換体は、ハイブリダイゼーションにおける新たなバンドの位置が異なっているので、異なるデルタ配列部位で染色体の分断が起こったと考えられる。
【００４５】
（実施例２）
ｐＳＩＧ２０（ＵＲＡ３マーカー）を、実施例１と同様に処理して、テロメア配列を含む線状化した断片（約２．１ｋｂ）を得た。実施例１で得られたｐＳＩＧ１４の線状化ＤＮＡ断片と、このｐＳＩＧ２０の線状化断片とを、それぞれ３５μｇ混合し、これを用いてＷ３０３−１Ａ株を形質転換した。任意に１３株を選択し、染色体を常法により抽出し、パルスフィールドゲル電気泳動を行った。結果を図１１に示す。図１１Ａは、エチジウムブロマイド染色、図１１ＢはＣＥＮ４をプローブとするハイブリダイゼーション、そして図１１ＣはＵＲＡ３をプローブとするハイブリダイゼーションを示す写真である。
【００４６】
図１１Ａにおいては、レーン６、７、８および１３の形質転換体において、酵母染色体バンドの一部が消失し、新しいバンドが見られた。レーン１、３、および１１の形質転換体においては、酵母染色体の消失は不明であるが、新しいバンドが見られた。また、レーン１、３、４、６、７、８、１１、および１３の形質転換体においては、ＣＥＮ４プローブおよびＵＲＡ３プローブとハイブリダズする新しいバンドが見られた（図１１ＢおよびＣ）。また、レーン９および１２の形質転換体においては、ＵＲＡ３をプローブとした場合のみ、バンドが見られた。ＣＥＮ４をプローブとした場合のみ、新たなバンドが見られる形質転換体は、存在しなかった。
【００４７】
消失したバンドの位置から推測すると、レーン６および７の形質転換体では第３番染色体が、レーン８の形質転換体では第１番染色体が、レーン１３の形質転換体では第４番染色体が、それぞれ、分断されたと考えられる。また、レーン６と７、およびレーン３と１１の形質転換体においては、それぞれ、同じ位置で分断されたと考えられる。これらを考慮すると、レーン１、３（１１）、６（７）、８、１１および１３の６種の形質転換体は、互いに異なる位置で染色体の分断が生じていると考えられる。これらの結果から、２種類の線状化された染色体分断ベクターを用いる（二断片型の）染色体分断が可能であることが確認された。なお、デルタ配列は酵母染色体に多数存在することから、標的配列としてデルタ配列を用いると、種々の染色体に、ランダムに分断を引き起こすことができることが示唆される。また、標的配列として、特定の配列を用いると、特異的に染色体の分断を引き起こし得ることも、示唆される。
【００４８】
（実施例３）
実施例１および実施例２で調製した、ｐＳＩＧ１４、ｐＳＩＧ１６およびｐＳＩＧ２０からの線状化ＤＮＡ断片を、それぞれ４μｇ混合し、これらを用いてＷ３０３−１Ａ株を形質転換した。任意に１９株を選択し、染色体を常法により抽出し、パルスフィールドゲル電気泳動を行った。結果を図１２に示す。図１２Ａはエチジウムブロマイド染色、図１２ＢはＣＥＮ４をプローブとするハイブリダイゼーション、図１２ＣはＴＲＰ１をプローブとするハイブリダイゼーション、そして図１２ＤはＵＲＡ３をプローブとするハイブリダイゼーションを、それぞれ示す写真である。
【００４９】
レーン１〜３は、ハイブリダイゼーション時のノイズが大きい（図１２ＣおよびＤ）ため、考慮しなかった。図１２Ａのエチジウムブロマイド染色では、レーン５、１２、１３、１７、１８、および１９の形質転換体において、酵母染色体のバンドの消失が認められるとともに、新しいバンドが見出された。また、ＣＥＮ４、およびＵＲＡ３を用いるハイブリダイゼーションで、新たなバンドが見られた（図１２ＢおよびＤ）。レーン７の形質転換体においては、ＣＥＮ４、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３とハイブリダイズする新たなバンドが見られた。しかし、ＣＥＮ４およびＴＲＰ１を用いるハイブリダイゼーションでは、両方に新たなバンドが見られる形質転換体は見られなかった。また、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３を用いるハイブリダイゼーションにおいても、両方に新たなバンドが見られる形質転換株はなかった。さらに、ＣＥＮ４あるいはＴＲＰ１を用いるハイブリダイゼーションにおいてのみ、新たなバンドが見られるような形質転換株はなかった。ＵＲＡ３を用いるハイブリダイゼーションでのみ新たなバンドが見られたのは、レーン９、１４、１５および１６の形質転換株であった。
【００５０】
消失したバンドの位置を考慮すると、レーン５、１２および１９の形質転換体では第１１番染色体が同じ位置で分断されたと考えられる。レーン１３の形質転換体では第１０番染色体が、レーン１７の形質転換体では第３番染色体が、そしてレーン１８の形質転換体では第６番染色体が分断されたと考えられる。従って、レーン５（１２、１９）、７、１３、１７、および１８の５種の形質転換体は、互いに異なる位置で染色体の分断が生じたと考えられる。
【００５１】
なお、レーン７の形質転換体では、すべてのサザンハイブリダイゼーションで新たなバンドが見出されたが、宿主由来のＣＥＮ４を用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、新たなバンドは１つしか確認されなかった。このことは、ＣＥＮ４を含む染色体の片方が脱落した可能性、および不均等な染色体分断が起きている可能性を示唆している。
【００５２】
この結果から、２種類の線状化された染色体分断ベクターを同時に用いて、酵母内で、種々のパターンで、酵母染色体ＤＮＡの分断あるいは分離、脱落を引き起こせることが示唆され、所望の位置で染色体を分断できることもまた、示された。
【００５３】
【発明の効果】
以上のように、本発明の方法を用いると、酵母遺伝子（染色体）の分断が行われる。また、本発明の方法は、酵母以外の染色体についても適用され、例えば、酵母内にクローニングされた植物遺伝子、動物遺伝子の分断、分離に利用される。有用形質転換微生物あるいは植物の創生、染色体の構造解析の加速、植物人工染色体の構築の加速、ポジショナルクローニングの迅速化、微生物、動植物遺伝子の機能試験の精密化あるいは簡便化などの、酵母あるいは動植物に関する研究が加速するばかりでなく、さらに、ヒトの染色体の研究および医療への応用などに有用である。
【００５４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】染色体分断ベクター（１）および（２）の模式図である。
【図２】本発明に用いるテロメア配列の取得方法を示す模式図である。
【図３】染色体分断ベクター（１）の構築の模式図である。
【図４】染色体分断ベクター（１）への標的配列（ａ）の導入を示す模式図である。
【図５】染色体分断ベクター（２）の構築の模式図である。
【図６】本発明の線状化された染色体分断ベクター（１）および（２）による染色体の分断・脱落様式を示す模式図である。
【図７】本発明の線状化された染色体分断ベクター（１）および（２）による染色体の分断・脱落様式を示す模式図である。
【図８】染色体分断ベクター（１）（ｐＳＩＧ１４）の構築の模式図である。
【図９】染色体分断ベクター（２）（ｐＳＩＧ１６）の構築の模式図である。
【図１０】染色体分断ベクター（１）（ｐＳＩＧ１４）と染色体分断ベクター（２）（ｐＳＩＧ１６）とで形質転換された酵母形質転換体から得られた染色体のパルスフィールドゲル電気泳動写真である。
【図１１】染色体分断ベクター（１）（ｐＳＩＧ１４）と染色体分断ベクター（２）（ｐＳＩＧ２０）とで形質転換された酵母形質転換体から得られた染色体のパルスフィールドゲル電気泳動写真である。
【図１２】染色体分断ベクター（１）（ｐＳＩＧ１４）、染色体分断ベクター（２）（ｐＳＩＧ１６）、および染色体分断ベクター（２）（ｐＳＩＧ２０）で形質転換された酵母形質転換体から得られた染色体のパルスフィールドゲル電気泳動写真である。
【図１３】従来の染色体分断方法を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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