(57)【要約】【課題】活性酸素に対する高い抗酸化能を有し、メラニン生成抑制効果に優れ、皮膚美白効果が高い化粧料の提供を目的とする。【解決手段】ケフィア（ｋｅｆｉａ）粒を、緑茶エキスを含有する培地にて所定時間培養し、得られた培養液から菌体を除去することにより得られる化粧料とした。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケフィア（ｋｅｆｉａ）粒を、緑茶エキスを含有する培地にて所定時間培養し、得られた培養液から菌体を除去することにより得られることを特徴とする化粧料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた抗酸化能を有し、高いメラニン生成抑制効果による皮膚美白効果に優れた化粧料（化粧水）に関し、特にケフィア（ｋｅｆｉａ）粒の培養により得られる新規な化粧料に係る。
【０００２】
【従来の技術】
従来、皮膚美白効果を有する化粧料（化粧水）としては、コウジ酸及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン及びその配糖体等、動植物からの抽出物を成分とするものであったが、人体への悪影響や肌荒れ等の心配もあった。
また、充分に美白効果が得られるものではなかった。
【０００３】
一方、日焼け等による肌の色黒化、シミ、ソバカス等は、黒褐色無定形の色素であるメラニンの生成によるものと考えられている。
このメラニンは、表皮基底層に存在するメラノサイトと呼ばれる色素細胞内のメラノソームにおいて、チロシナーゼによってチロシンから各種メラニン中間代謝産物を経て、酸化重合して生成されると考えられている。
そして、紫外線等により生成された活性酸素がこの反応系を活性化させるためにメラニンが過剰に生成され、皮膚への色素沈着を促進していると考えられている。
【０００４】
また、活性酸素は、皮膚の過酸化脂質を増大させることにより、肌の柔軟性及び弾力性を低下させ、肌のいわゆる、しっとり感が失われる原因の１つとも考えられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安全性が高く、活性酸素に対する高い抗酸化能を有し、メラニン生成抑制効果に優れ、皮膚美白効果が高い化粧料の提供を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
コーカサス地方が発祥の地と考えられている伝統的な乳酸菌と酵母の複合醗酵乳ケフィア（ｋｅｆｉａ）は、そのスタータであるケフィア粒を牛乳にて培養して製造される。
【０００７】
本発明者らは、ケフィア粒を牛乳ではなく、緑茶のエキスにて培養すると、その培養液が優れた皮膚美白効果を有することを見い出したものである。
従って、本発明の技術的要旨は、ケフィア（ｋｅｆｉａ）粒を、緑茶エキスを含有する培地にて所定時間培養し、得られた培養液から菌体を除去することで得られる培養液を化粧料（化粧水）として使用する点にある。
【０００８】
ここで、緑茶エキスとは、茶葉をミキサーで粉末にして水に溶かしたものや、温水に茶葉を入れて抽出した液等、何らかの方法で緑茶の成分を水に溶かしたものをいう。
また、緑茶の種類は特に限定されるものでな無く、各種茶の若葉を焙炉の上で揉みやわらげ、緑色を保有させたものをいう。
【０００９】
【発明の実施の形態】
緑茶の茶葉をミキサーで粉末にしたものを約０．５〜２ｇ程度を、水５０〜２００ｍＬに溶かして緑茶エキスとした。
これに水５００〜１５００ｍＬ程度加え、はちみつを２５〜１００ｍＬ添加したものを培地として使用した。
ここで、はちみつを添加したのは、糖分の供給を目的とする趣旨である。
従って、はちみつに限定されるものでは無いが、はちみつを用いるとケフィア粒を培養した後の培養液をそのまま、化粧料として使用出来るという利点がある。
【００１０】
上記培地にケフィア粒を５〜２０ｇ添加し、５〜２０℃にて２４〜４８時間培養後に遠心分離機にて菌体を除去した。
これを滅菌フィルターを用いて滅菌処理をするか、あるいは加熱処理にして滅菌処理をして化粧料を得る。
【００１１】
上記の方法にて得られた化粧料の抗酸化能及びメラニン生成抑制試験評価を実施した。
【００１２】
抗酸化能試験は次のように実施した。
上述したように、緑茶エキスと、はちみつの培地にてケフィア粒を活性化、４８時間培養した培養液を遠心分離機（１０００ｒｐｍ，５分）にかけて、その上清を０．４５μｍフィルターで滅菌したものを試験体として用いた。
この試験体を容積濃度が１／６４，１／３２，１／１６，１／８になるように調整したものと、ブランク試験体として培養液を入れないものを準備した。
この試験体（サンプル）２５μＬに対して、４０×１０４   ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞５０μＬを植菌し、活性酸素発生源としてメチル  ビオロゲン（Ｍｅｔｈｙｌ  ｖｉｏｌｏｇｅｎ）２５μＬを加えた。
これをＣＯ２  インキュベーターにて３７℃，４８時間保温放置した。
これにより、本発明に係る化粧料であるこの培養液に抗酸化能があればその分、細胞の生存率が高いことになる。
生存細胞率の割合を測定するのに、ＭＴＳ（テトラゾリウム塩）溶液とＰＭＳ（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）溶液とを２０：１の割合で混合したものをそれぞれのサンプルに２０μＬ加えて生存細胞による蛍光反応をおこさせた。
ＣＯ２  インキュベーターにて３７℃，２時間放置後に１０％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を２５μＬ加えて反応を停止させた。
その後に、所定量サンプリングして各サンプルの４９０ｎｍ吸光度を測定した。
その結果を図１（グラフ１）に示す。
培養時間及び培養液の濃度に比例して抗酸化能（細胞の生存率）の増大が認められる。
特に、培養開始後２４時間以内で抗酸化能の大幅な増大が確認された。
なお、培養液を添加しないものより１／６４濃度の培養液添加のものの方が抗酸化能が低下しているのは培養液のｐＨ３．４〜３．２で無添加のもののｐＨ４．８より低くなったためと推定される。
【００１３】
メラニン生成抑制評価は、マウスのＢ１６メラノーマ株（Ｂ１６  ｍｏｕｓｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ）を用いたメラニン生成抑制試験にて実施した。
Ｂ１６メラノーマ細胞２０万個／ｗｅｌｌになるように１０％血清含有培地に入れ、ＣＯ２  インキュベーターにて３７℃，２４時間培養した。
次に、１％血清含有培地をメンテナンス培地として換えて試験体（サンプル）をこの培地９に対して１の割合で添加して、ＣＯ２  インキュベーターにて３７℃，４日間培養した。
試験に用いたサンプルは、ケフィア粒培養２４時間、４８時間のものと、比較のために１００μｇ／ｍＬコウジ酸添加したものである。
次に、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（０．２ｍＬ  Ｔｒｙｐｓｉｎ＋０．８ｍＬ  ＥＤＴＡ）で細胞をはがし、１％ＦＣＳ−ＰＢＳ［Ｆｅｔａｌ  Ｃｏｗ  Ｓｅｒｕｍ（子牛胎児血清）をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）に溶解したもの］を所定量加えて細胞数をカウントした。
次に、１０％ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）−ＩＮ  ＮａＯＨを加えて、メラニンを溶出し、その上清の４７０ｎｍ吸光度を測定した。
サンプルを添加しないものと、サンプルを添加したものの吸光度差からメラニン生成抑制率（％）を求めた結果を図２（グラフ２）に示す。
従来のコウジ酸より、本発明に係るケフィア粒を培養して得られた培養液（化粧料）の方が優れたメラニン生成抑制効果を示した。
【００１４】
次に、本発明に係る化粧料を得ることが出来たケフィア粒の菌株の同定を試みた。
ケフィア粒を緑茶エキス培地にて４８時間活性化培養したものから１ｍＬを無菌的にサンプリングして希釈平板法にて分離した結果、図３（表１）に示すように６種類に分離された。
なお、培養条件は、
栄養寒天培地  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）：３０℃、好気条件、寒天培地  ＹＭ  Ａｇａｒ（Ｙｅａｓｔ  Ｍａｌｔ  ｐｅｐｔｏｎｅ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）：２５℃、好気条件、
寒天培地  ＭＲＳ  Ａｇａｒ（ＤｅＭａｎ，Ｒｏｇｏｓａ，Ｓｈａｒｐｅ  ｂｒｏｔｈ）（Ｏｘｏｉｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）：３７℃、嫌気条件とした。
【００１５】
分離された菌株の性状観察及び塩基配列解析を実施した。
【００１６】
２ｂは桿菌で、グラム染色陰性、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陰性、生育時のグルコース要求性、グルコースからの酸産生、コロニー観察レベルで色素非産生の性状を示した。
これらの性状は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）に帰属する菌種の性状に類似する。
また、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析では、その系統樹を図４に示し、アセトバクター  アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）に対して、９７．５１％の相同性を示した。
２ｂは、菌の性状及び系統樹からアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）に属するものと推定される。
【００１７】
３ｂは桿菌で、グラム染色陰性、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陰性、生育時のグルコース要求性、グルコースからの酸産生、コロニー観察レベルで色素非産生の性状を示した。
これらの性状は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）に帰属する菌種の性状に類似する。
また、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析では、その系統樹を図５に示し、
グルコノバクター  オキシダンス  オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ｏｘｙｄａｎｓ）に９９．２６％の相同性を示した。
以上のことから３ｂは、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）に属すると推定される。
【００１８】
６ｂは、グラム染色陽性、非運動性、カタラーゼ反応陰性、オキシダーゼ反応陰性、ブドウ糖の醗酵性陽性を示し、ＭＲＳ培地で良好に生育する無芽胞の桿菌であることが示された。
これらの性状は、乳酸菌の一般性状に一致する。
また、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析では、その系統樹を図６に示すように、ラクトバチルス  マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｌｉ）に９５．２０％の相同性を示した。
以上より６ｂは、ラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）に属すると推定される。
【００１９】
次に、酵母として分離された１ｙ、４ｙ、５ｙの同定を２８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列解析により試みた。
その系統図を図７、図８、図９にそれぞれ示す。
その結果、１ｙは  ピピアメンブラニ  ファシエンス（Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎｉ  ｆａｃｉｅｎｓ）あるいは、ピピア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）あるいは、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）と推定された。
４ｙは、サッカロマイセス  セレヴィジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）あるいは、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）あるいは、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）と推定された。
５ｙは、ピピア  アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）と推定された。
【００２０】
【発明の効果】
本発明においては、ケフィア粒を緑茶エキスを用いて培養するだけでメラニン生成抑制効果により、優れた皮膚美白効果を有する化粧料が得られる。
また、本発明に係る化粧料を使用することにより、優れた抗酸化能によるメラニン生成抑制効果のみならず、皮膚の過酸化脂質の増大を防止し、肌のみずみずしさを維持し、老化を抑えることが期待される。
なお、数人の女性に実際にモニタリング試験を依頼し、片手にのみ本発明に係る化粧水を塗っていただき、数日間後に他の手と比較すると明らかに美白効果が確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】（グラフ１）抗酸化能試験結果を示す。
【図２】（グラフ２）メラニン生成抑制試験結果を示す。
【図３】（表１）ケフィア粒を緑茶エキスにて培養した際の菌種の分離結果を示す。
【図４】菌種２ｂの１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。
【図５】菌種３ｂの１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。
【図６】菌種６ｂの１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。
【図７】菌種１ｙの２８Ｓ  ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。
【図８】菌種４ｙの２８Ｓ  ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。
【図９】菌種５ｙの２８Ｓ  ｒＤＮＡ解析による系統樹を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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