(57)【要約】【課題】ミトコンドリアのチトクロムｃ酸化酵素の水素イオン能動輸送活性を改変する。【解決手段】本発明者らが既に出願した、タンパク質をミトコンドリアへ輸送する方法（特願２００２−２０２２７９）を利用して、チトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのＮ末端から５１番目のアスパラギン酸残基を改変した。本発明は、改変されたサブユニットＩを有するチトクロムｃ酸化酵素であって、該改変されたサブユニットＩが、脊椎動物のチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのアミノ酸配列のＮ末端から５１番目又はそれに相当する位置のアスパラギン酸残基が改変されたものであることを特徴とするチトクロムｃ酸化酵素である。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたサブユニットＩを有するチトクロムｃ酸化酵素であって、該改変されたサブユニットＩが、脊椎動物のチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのアミノ酸配列のＮ末端から５１番目又はそれに相当する位置のアスパラギン酸残基が改変されたものであることを特徴とするチトクロムｃ酸化酵素。
【請求項２】
前記脊椎動物のチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列である請求項１に記載のチトクロムｃ酸化酵素。
【請求項３】
前記脊椎動物のチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有する請求項１又は２に記載のチトクロムｃ酸化酵素。
【請求項４】
前記アスパラギン酸残基が、側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸残基に改変された請求項１〜３のいずれか一項に記載のチトクロムｃ酸化酵素。
【請求項５】
前記側鎖にカルボキシル基を含まないアミノ酸残基がアスパラギン、アラニン、バリン、スレオニン、セリン及びグルタミンから成る群から選択される少なくとも１種のアミノ酸残基である請求項４に記載のチトクロムｃ酸化酵素。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のチトクロムｃ酸化酵素を有するミトコンドリア。
【請求項７】
請求項６に記載のミトコンドリアを含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、チトクロムｃ酸化酵素及びミトコンドリアの機能を改変する手段に関し、より詳細には、ミトコンドリアのサブユニットＩ（以下「Ｓ　Ｉ」ともいう。）のＮ末端から５１番目又はそれに相当する位置のアスパラギン酸残基を改変することにより、チトクロムｃ酸化酵素の酸素還元活性や水素イオン能動輸送活性を改変し、ミトコンドリアの機能を改変する手段に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内のミトコンドリアは、酸素を利用して、炭水化物、脂質、蛋白質などがもつ化学エネルギーをＡＴＰの化学エネルギーに変換し、細胞にＡＴＰを供給する役割をもつ。したがってミトコンドリアは細胞ひいては生物個体全体の存続に不可欠である。
上記エネルギー変換反応は、大きく３つの過程に分けられ、まず前者の化学エネルギーは、高い還元力をもつ生体内物質を生じ、ついでそれが酸素を還元する際に生じるエネルギーを使って、水素イオンをミトコンドリア内膜内のマトリックスから膜間空間に運び（水素イオンの能動輸送と呼ぶ）、結果として膜内外に水素イオン濃度勾配を生じさせる。最後に水素イオン濃度勾配のエネルギーを使ってＡＤＰとリン酸からＡＴＰが合成される。上記の酸素を還元する反応は、呼吸系酵素と呼ばれる３つの巨大膜タンパク質（膜に存在するタンパク質）によって触媒され、最初のタンパク質の働きによって高い還元力をもつ生体内物質から中程度の還元力をもつ生体内物質が生じ、次のタンパク質によって弱い還元力をもつ生体内物質、すなわちチトクロムｃが生じ、その還元力によって酸素が還元される。いずれの過程でも水素イオンが能動輸送される。３つの酵素のうち、最後の酸素を還元する反応を触媒するのがチトクロムｃ酸化酵素と呼ばれる酵素である。本酵素は、上述したようにミトコンドリア内膜を貫通したタンパク質で、酸素を還元して水に変換するとともに、そこで発生するエネルギーを使って水素イオンを膜の内から外へタンパク内部を通して輸送する。
【０００３】
現在この水素イオンの能動輸送が、どのように、しかもどのような経路を経て起こるのか、世界的に活発な研究対象となっている。これまでウシチトクロムｃ酸化酵素のＸ線結晶構造解析に基づいて、マトリックス側から膜間空間近くまで伸びたＨ−チャネルと呼ばれるタンパク内の水素イオン輸送経路が提唱されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２７２，　１１３６　（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８０，　１７２３　（１９９８））。
この経路の膜間空間近く、すなわちこの経路の端に当る部分にアスパラギン酸が存在する。このアスパラギン酸残基の側鎖のカルボキシル基は、この酵素の金属が酸化型の時は、タンパク内に埋もれているが、還元型のときは、分子表面に位置を変えることがＸ線構造解析で見い出されており、この場合に水素イオンを放出する。したがって水素イオンが上記水素イオン輸送経路を通じて、タンパク外に輸送されることになる。そこで、上記水素イオン輸送経路が水素イオンの能動輸送経路であると提唱された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８０，　１７２３（１９９８））。
【０００４】
しかし、これに対し多くの反論がある。まずウシチトクロムｃ酸化酵素と同じ機能をもつ細菌のチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩの、上記アスパラギン酸に対応する位置には、アスパラギン酸残基が存在せず、重要な機能は細菌から高等動物まで保存される立場から否定されている。つぎに上記水素イオンの輸送経路に存在し、しかも細菌の酵素にも存在する各種アミノ酸残基を水素イオン輸送ができないアミノ酸に置換しても細菌の酵素の機能に変化がなかったので、Ｈ−チャネルは細菌の酵素では否定された（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　４０，７４９１　（２００１））。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ミトコンドリアのチトクロムｃ酸化酵素の水素イオン能動輸送活性を改変する手段を提供することを目的とする。
即ち、チトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのＮ末端から５１番目又はそれに相当する位置のアスパラギン酸残基を他のアミノ酸に置換して、このチトクロムｃ酸化酵素の水素イオン能動輸送活性を改変する手段を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らが既に出願した、タンパク質をミトコンドリアへ輸送する方法（特願２００２−２０２２７９）を利用して、チトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのＮ末端から５１番目のアスパラギン酸残基を、側鎖にカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を含まないアミノ酸に改変し、この改変したミトコンドリアのチトクロムｃ酸化活性と水素イオン能動輸送活性を調べたところ、この改変により水素イオン能動輸送活性が失われたことが見出され、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、改変されたサブユニットＩを有するチトクロムｃ酸化酵素であって、該改変されたサブユニットＩが、脊椎動物のチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのアミノ酸配列のＮ末端から５１番目又はそれに相当する位置のアスパラギン酸残基が改変されたものであることを特徴とするチトクロムｃ酸化酵素である。
この脊椎動物のチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であってもよいし、配列番号１のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
また、本発明は、上記のいずれかのチトクロムｃ酸化酵素を有するミトコンドリアであり、またこのミトコンドリアを含む細胞である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
チトクロムｃ酸化酵素は、ミトコンドリアにコードされる３つのサブユニット（Ｓ　Ｉ　−　ＩＩＩ）と核にコードされ細胞質からミトコンドリアに輸送される１０個のサブユニット（Ｓ　ＩＶ　−　ＸＩＩＩ）からなる。Ｓ　Ｉは本酵素の活性中心を担うもっとも重要なサブユニットである。
配列番号１に、ウシチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのアミノ酸配列を示す。また図１に、ウシやヒトを含む脊椎動物のチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのアミノ酸配列（１〜８０番目のみ）の比較を示す。ここに挙げた脊椎動物においては、アスパラギン酸（Ｄ）は全て５１番目に位置し、またこれらのウシに対する同一性は、それぞれ、９０％（ｈｕｍａｎ）、９１％（ｒａｔ）、９０％（ｍｏｎｋｅｙ）、８６％（ｆｉｓｈ）及び８８％（ｆｒｏｇ）である。
【０００９】
本発明においては、改変するサブユニットＩは脊椎動物、好ましくは哺乳類のものを用いる。従って、改変するサブユニットＩのアミノ酸配列はウシのサブユニットＩのアミノ酸配列（配列番号１）に対して、８５％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有する。
一方、このような改変するサブユニットＩにより改変されるチトクロムｃ酸化酵素、ミトコンドリア及び細胞は、如何なるチトクロムｃ酸化酵素、ミトコンドリア及び細胞であってもよく、上記改変されたサブユニットＩの由来する動物のものである必要はないが、脊椎動物、特に哺乳類のものであることが好ましい。
【００１０】
図２に、ウシチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩにおける酸化還元に関するＨ−チャネルの立体構造の変化を示す。この図に５１番目のアスパラギン酸（Ｄ５１）の酸化型（左）と還元型（右）における水素結合状態を示す。分子表面に近い、Ｈ−チャネルの端に当る部分に、本酵素のサブユニットＩのＮ末端から５１番目のアスパラギン酸残基が存在する。このアスパラギン酸残基は、側鎖にカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）をもち、本酵素の金属が酸化型（左）の時は、タンパク内に埋もれているが、還元型（右）のときは分子表面に位置を変え、水素イオンを放出して−ＣＯＯ−になる。このような立体構造の変化により、水素イオンがＨ−チャネルを通じて、タンパク外に輸送されると考えられる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２８０，　１７２３（１９９８））。
【００１１】
このアスパラギン酸は、図１に示す脊椎動物（ウシ、ヒト等）のチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩの場合には、Ｎ末端から５１番目に位置する。しかし、サブユニットＩのＮ末端から５１番目に位置しないアスパラギン酸であっても、この位置に相当する位置のアスパラギン酸であれば、即ち、ウシチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのＮ末端から５１番目のアスパラギン酸残基と、上記に説明した機能と同じ機能を果たすアスパラギン酸残基であれば、これを同様に改変することにより、本発明と同じ効果を奏することが出来る。
この位置（ウシチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのＮ末端から５１番目）に相当する位置は、市販の遺伝子解析ソフト（例えば、日立ソフトウェアーエンジニアリングの遺伝子解析ソフトＤＮＡＳＩＳのマキシマムマッチング（ｍａｘｉｍｕｍ　ｍａｔｃｈｉｎｇ））等によって決定することができる。
【００１２】
本発明においては、このような位置にあるアスパラギン酸を、アスパラギン酸以外のアミノ酸に置換する。このようなアミノ酸は、アスパラギン酸と異なる構造をもち、ペプチド結合が可能なアミノ酸やイミノ酸であるといえる。またこのアミノ酸には天然アミノ酸にかぎらず非天然型アミノ酸が含まれる。非天然型アミノ酸には天然型アミノ酸を化学修飾したもの、例えば、カルボキシル基をエステル化したものなどが含まれる。
また、アスパラギン酸と側鎖に同じカルボキシル基をもつグルタミン酸に置換した場合、アスパラギン酸と同等の機能を果たすと予想されるが、グルタミン酸では側鎖が長くなるため、カルボキシル基の立体的な位置が変化し、また酵素の構造変化が起こり、その結果、機能がなくなる、あるいは減じる可能性がある。また、中性や塩基性のアミノ酸では、程度の差はありえるが、アスパラギン酸と同様の機能を有することは不可能と考えられる。
一方、置換するアミノ酸の側鎖のサイズ（あるいは嵩高さ）によっては、酵素の構造が大きく変化するため変異酵素が形成されなくなる可能性がある。したがって機能が改変された変異酵素を得るためには、置換するアミノ酸はアスパラギン酸とほぼ同等または小さなものが、酵素の立体構造変化を最小限度に抑えられるとの理由で好ましいといえる。
【００１３】
このような置換アミノ酸として、チトクロムｃ酸化酵素の水素イオン能動輸送活性を減少又は失わせるためには、側鎖にカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を含まないアミノ酸に改変することが好ましい。このようなカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を含まないアミノ酸として、水素イオンの解離会合が難しく、かつ側鎖の嵩高さが等しいアスパラギン（側鎖の構造：−ＣＯＮＨ２）、水素イオンの解離会合ができなくて、かつ側鎖の嵩高さが近いアラニン、バリン、スレオニン、セリン、グルタミンなどが挙げられるが、後述の実施例に示すように、アスパラギンが好ましい。
【００１４】
このような、チトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのＮ末端から５１番目のアスパラギン酸残基を他のアミノ酸に改変する方法に特に制限はないが、本発明者らが既に出願した、タンパク質をミトコンドリアへ輸送する方法（特願２００２−２０２２７９）を利用することが好ましい。
即ち、改変したＳＩをコードする遺伝子に輸送シグナルをコードする塩基配列を、改変したＳＩのＮ末端に相当する端に結合するように、連結して核ＤＮＡに導入し、細胞質でタンパク質のＮ末端に輸送シグナルを結合した融合タンパク質を発現させることができる。この輸送シグナルは、核ＤＮＡにコードされたミトコンドリアの膜タンパク質のサブユニットであって、そのサブユニットがミトコンドリアの膜に存在するときにそのＮ末端がミトコンドリアのマトリックス側に存在するサブユニットの輸送シグナルであることがよい。この場合に、ＳＩはミトコンドリアにコードされるため、ミトコンドリア遺伝子を核で同じタンパク質をもたらすよう適宜遺伝コードを改変する必要がある。このように改変したＳＩを細胞質で発現させ、細胞質からミトコンドリアに輸送させる。例えば、ウシ酵素のＳ　Ｉ遺伝子を適宜改変し、ヒトの培養細胞に組み込み、細胞質で発現させたＳＩをミトコンドリアに輸送し、そこでヒト由来の他のサブユニットと会合させ、ウシとヒトとの雑種チトクロムｃ酸化酵素を発現させる。
【００１５】
【発明の効果】
本発明は、ミトコンドリアのチトクロムｃ酸化酵素の水素イオン能動輸送活性を改変させる手段、特に、チトクロムｃ酸化酵素の酸素還元活性に影響を与えずに水素イオン能動輸送活性を改変する手段を見出したものである。
この改変は、本発明者らが既に出願した、チトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのような比較的大きなタンパク質を細胞質からミトコンドリアへ輸送する方法（特願２００２−２０２２７９）を利用することにより、初めて可能となったものである。
これにより、ミトコンドリアの呼吸を停止することなしに、ＡＴＰ産生反応の効率を低下させることが可能になった。したがってエネルギー産生効率の低下が細胞機能にどのような影響を与えるかを、エネルギー消費の高い神経細胞や筋肉細胞で、またエネルギー消費の少ない一般的な細胞で検討する基礎的研究に有効な手段を提供する。
また本発明により、細胞のエネルギー変換効率を低下させることが出来るため、いわばやせ薬に相当する効果が期待される。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
本実施例では、野生型ウシチトクロムｃ酸化酵素のＳ　ＩのＮ末端から５１番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させた遺伝子をヒトのＨｅＬａ細胞の染色体に組み込んだ。比較のため、野生型ウシチトクロムｃ酸化酵素のＳ　Ｉ遺伝子についても同様の操作を行った。
【００１７】
比較例１
ミトコンドリアに輸送させたＳ　Ｉを検知するためＳ　ＩのＣ末端にヒスチジンタグ（ヒスチジンが６つ連続したアミノ酸配列）を付け加えた。機能の検討には、Ｓ　Ｉ遺伝子が染色体に組み込まれた培養細胞を増殖させ、そこからミトコンドリアを調製して、ミトコンドリアのチトクロムｃ酸化活性と水素イオン能動輸送活性を測定した。
【００１８】
Ｓ　Ｉ遺伝子のクローニング
新鮮なウシ心臓の筋肉からミトコンドリアを調製し、常法によってミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を得た。ウシ心筋のｍｔＤＮＡは、すでに遺伝子配列が決定されているので（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１５６，　６８３−７１７　（１９８２））、その配列を利用して、配列番号３及び４に示す合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によってＳ　Ｉ遺伝子（配列番号２）のみを増幅させて当該遺伝子をクローン化し、プラスミドｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトに挿入した（図３（Ａ））。このプラスミドをｐＳＩｍと名付けた。なお、配列番号３の合成ＤＮＡの４〜９番目の塩基は制限酵素Ｓａｃ　Ｉ、配列番号４の合成ＤＮＡの４〜９番目の塩基はＰｓｔ　Ｉのそれぞれ切断部位である。増幅されたサブユニットＩ遺伝子は両端に上記の制限酵素切断部位をもつため、切断し得られたＳａｃ　Ｉ−Ｐｓｔ　Ｉ　ＤＮＡ断片を上記のプラスミッドに挿入した。
【００１９】
塩基の改変
なお、ミトコンドリア遺伝子でＴＧＡとＡＴＡは、それぞれトリプトファンとメチオニンをコードするが、核にそのまま組み込まれると、それらは翻訳停止とイソロイシンに対応するので、Ｓ　Ｉ遺伝子上の上記配列をそれぞれ細胞質でトリプトファンとメチオニンに翻訳されるようにＴＧＧとＡＴＧに改変した。改変は通常の部位特異的変異方法を用いた。改変した遺伝子を担うプラスミッドをｐＳＩと名付けた。
また５１番目のアスパラギン酸をアスパラギンになるようにｐＳＩの塩基を改変した。塩基の配列とその改変はＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで確認した。
【００２０】
塩基配列ヒスチジンタグの付加と発現ベクターの調製
上記プラスミッドｐＳＩをＰＣＲの鋳型として、配列番号５の合成ＤＮＡとＴａｋａｒａ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社のｐＵＣ用の逆プライマー（配列番号６）を使用して、ヒスチジンタグをＣ末端にもつＳ　Ｉ遺伝子を増幅させた（図３（Ｂ）上）。配列番号５で示す上記プライマーの３〜８番目の塩基は、制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位、１２〜２９番目の塩基は、ヒスチジンタグをコードする配列と相補的な部分をそれぞれ示す。得られたＳ　Ｉ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＳａｃ　Ｉ−Ｂｇｌ　ＩＩで切断後（図３（Ｂ）中）、ｐＵＣ１８のＳａｃ　ＩとＢａｍ　ＨＩ部位に挿入し（切断された後の突出部位がＢｇｌ　ＩＩのそれと相補的なので結合が可能）、プラスミッドｐＳＩ−ｈｔを得た（図３（Ｂ）下）。
【００２１】
輸送シグナルの付加
輸送シグナルとなるアミノ酸配列（配列番号７）を以下の方法でＳ　Ｉ遺伝子に結合させた。
２つのオリゴヌクレオチド（配列番号８及び９、配列番号８の３〜８番目はＳａｃ　Ｉ、配列番号９の２〜７番目はＳｐｌ　Ｉ切断部位を示し、配列番号８の３５〜５５番目と配列番号９の２０〜４０番目は相補的配列を示す。）を合成し、これらの相補的配列で２つのＤＮＡを結合させＰＣＲ法で完全な２本鎖ＤＮＡを調製した。
続いて、Ｓａｃ　Ｉで切断し、他端は平滑末端のままｐＵＣ１９のＳａｃ　ＩとＳｍａ　Ｉ部位（Ｓｍａ　Ｉ切断で平滑末端を生じる）に挿入した（図３（Ｃ）上）。ここからＥｃｏ　ＲＩ−Ｓｐｌ　Ｉ　ＤＮＡ断片を切り出した（図３（Ｃ）上の矢印）。
一方ｐＳＩ−ｈｔのＳ　Ｉ遺伝子をＳｐｌ　Ｉ部位をもつ配列番号１０のプライマーとＴａｋａｒａ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社のｐＵＣ用ユニバーサルプライマー（配列番号１１）で増幅し（図３（Ｃ）中）、得られたＤＮＡ断片をＳｐｌ　ＩとＰｓｔ　Ｉで切断して（図３（Ｃ）中の矢印）、上記のＥｃｏ　Ｉ−ＳｐＩ　Ｉ　ＤＮＡ断片と併せてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳに挿入し、プラスミッドｐＢ／ＳＩＷを得た（図３（Ｃ）下）。
【００２２】
発現ベクターの調製
プラスミッドｐＢ／ＳＩＷからＨｉｎｄ　ＩＩＩとＮｏｔ　ＩでＳ　Ｉ遺伝子を切り出し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプラスミッドｐＲｃ／ＣＭＶに挿入し、発現ベクターｐＳＩｗｔ（野生型）を得た。
【００２３】
実施例１
常法に従って、配列番号２の塩基配列の１５１〜１５３番目のｇａｃをａａｔに改変し、この塩基配列を配列番号２の塩基配列の代わりに用いて比較例１と同様の操作を行った。この５１番目のアスパラギン酸をアスパラギンに変異させた変異ＳＩ遺伝子を有する発現ベクターを、ｐＳＩ５１ｎと名付けた。
【００２４】
活性測定
以下、上記実施例１と比較例１で得た２種のプラスミッド（ＳＩｗｔ、ｐＳＩ５１ｎ）について活性測定を行った。
培養細胞への組み込み
上記２種のプラスミッド（ＳＩｗｔ、ｐＳＩ５１ｎ）をそれぞれＨｅＬａ細胞にＱｉａｇｅｎのＥｆｆｅｃｔｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔを用いて感染させ、１０％のｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ培地で培養し、つづいて抗生物質であるｇｅｎｅｔｉｃｉｎ存在下で増殖するコロニーを選択した。
【００２５】
ミトコンドリアの調製と活性測定
これら２種の培養細胞を、それぞれｇｅｎｅｔｉｃｉｎを含む上記培地で培養し、シャーレ内で細胞が１００％コンフルエントになると培養を止め、細胞を集めた。得られた細胞を０．２Ｍ　ショ糖と０．５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）緩衝液中でポッター型硝子攪拌装置（フッ素樹脂ペッスル）を用いて細胞を破壊し、常法によりミトコンドリアを得た。さらに常法通りにミトコンドリアを低張液で処理して０．２Ｍ　ショ糖と０．０２％牛血清アルブミンを含む１ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）に懸濁してミトコンドリアの外膜が破壊されたミトプラストを調製した。野生型のＳ　Ｉを発現させた細胞から得たミトプラストを「ＷＴ」、変異Ｓ　Ｉのミトプラストを「Ｄ５１Ｎ」で表す。
【００２６】
ウエスタンブロット法によるサブユニットＩの検出
上記のように調製したミトプラストを０．１％ＳＤＳに溶かし常法によってＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜に転写したのちヒスチジンタグ抗体と反応させた。その結果を図４に示す。図４（２）はＷＴのもの、図４（３）はＤ５１Ｎのものを示す。両者とも、精製ウシチトクロムｃ酸化酵素のＳ　Ｉと同じ移動度のところにタンパク質の存在を認めた。
一方、Ｓ　Ｉ遺伝子をもたないプラスミッドｐＲｃ／ＣＭＶを組み込ませたＨｅＬａ細胞（ｍｏｃｋ細胞）から調製したミトプラストには、上記のタンパク質は認められなかった（図４（１））。
【００２７】
チトクロムｃ酸化活性の測定
還元型ウマチトクロムｃを調製して上記ミトプラストと２５℃で反応させた。還元型チトクロムｃは５５０ｎｍに鋭い吸収示すが、酸化され酸化型になると、その吸収は消失する（図５）。そこで還元型チトクロムｃの酸化活性を５５０ｎｍの波長で追跡した。
反応液（６６０μｌ）は以下の通り。１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）の緩衝液で、５０ｍＭ　ＫＣｌ，０．２Ｍ　ショ糖，４０ｎｍｏｌ／ｍｇ　Ｎエチルマレイミド、０．２ｎｍｏｌ／ｍｇ　アンチマイシンＡ、４５ｐｍｏｌ／ｍｇ　バリノマイシン、２．０μＭ　ロテノン、１１．３ｎｍｏｌ／ｍｌ　オリゴマイシン、と１．０μＭミクソチアゾールを含む。ミトプラストは約５０μｇを加えた。
【００２８】
反応は８．４ｎｍｏｌの還元型チトクロムｃを添加して始めた。チトクロムｃによりチトクロムｃ酸化酵素に電子が送り込まれると、チトクロムｃは酸化型となり、５５０ｎｍの吸収が減少する。その様子を図６に示す。
野生型Ｓ　Ｉ（ＷＴ）を発現している細胞から調製したミトプラストはシアンによって阻害される速やかなチトクロムｃ酸化活性を示し（図６左）、活性はｍｏｃｋ細胞から得たミトプラストとほぼ同じであった。
一方、変異Ｓ　Ｉ（Ｄ５１Ｎ：５１番目のアミノ酸をアスパラギンに変異させたサブユニットＩ）を発現しているミトプラストも速やかなチトクロムｃ酸化活性を示した（図６右）。比活性で比較すると、むしろ野生型のＳ　Ｉを含むミトプラストより３０％程高かったが、ほぼ同じと考えられる。
【００２９】
水素イオン能動輸送活性の測定
また上記と同様の２種のミトプラストについて水素イオンの能動輸送活性を測定した。水素イオンの能動輸送活性は、上と同じ反応液の条件だが、緩衝液の濃度は０．５ｍＭに下げた。反応液中の水素イオン濃度の変化はベックマン社のｐＨメーターモデルφ６６０と同社の複合電極（ＢＥＣＫＭＡＮ、５１１０８２）を使った。測定は還元型チトクロムｃの添加によって起こる反応液の水素イオン濃度変化を追跡した。その結果を図７に示す。下方ほど水素イオン濃度は高い。
【００３０】
還元型チトクロムｃの添加後、野生型のＳ　Ｉを発現しているミトプラスト（ＷＴ）では、顕著な反応液の酸性化が起こった（図７（Ａ）、ａで示す領域）。しかし時間経過とともに反応液はアルカリ化した。これは還元型チトクロムｃが酸化されると、同時に酸素は水に還元され水素イオンがミトプラスト内で消費された結果である。ミトプラストの膜は水素イオンを通し難いが完全ではないので非酵素的に水素イオンが膜を通過する。これはｂａｃｋｆｌｏｗとしてよく知られた現象である。反応開始後の酸性化（図７（Ａ）、ａで示す領域）は、本酵素による水素イオンの能動輸送の結果であり、膜が水素イオン通しにくいために過渡的に観察される。
しかし、反応開始前に脱共役剤（ｐ−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｏｘｙ　ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｃｙａｎｉｄｅ　ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）を１０μｇ加えて、水素イオンが膜の中を自由に出入りできるようにすると、最初の酸性化は消失した（図７（Ｂ））。
【００３１】
変異酵素（Ｄ５１Ｎ）の場合は、還元型チトクロムｃの添加によって起こる酸性化が起こらなかった（図７（Ｃ））。これは水素イオンの能動輸送が顕著に減少した、あるいは消失したことを示す。
この結果は、変異によって培養細胞のチトクロムｃ酸化活性はほとんど影響を受けなかったものの、もう一方の機能である水素イオン能動輸送活性が顕著に低下したことを示す。これは、ＳＩの５１番目のアスパラギン酸をアスパラギンに改変したことにより、ミトコンドリアの機能改変が実現したことを示す。
【００３２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ウシを含む各種脊椎動物のチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩのアミノ酸配列の１〜８０番目の比較を示す図である。下線は相違部分を示す。
【図２】ウシミトコンドリアのサブユニットＩの５１番目のアスパラギン酸（Ｄ５１）の酸化型（左）と還元型（右）における水素結合状態を示す図である。灰色の曲線は、膜間空間に存在する水分子が接近できる範囲（分子表面と呼ぶ）を示す。黒の四角、これに連結したＹ型構造物及び短い棒状物は、それぞれヘムの一部、プロピオネート基及びホルミル基を表す。水チャネルは灰色で表し、黒丸は水分子を表す。数字はサブユニットＩのアミノ酸配列のＮ末端からの番号を示し、その前のアルファベットは１文字表記のアミノ酸の種類を表す。ヘム近くの灰色の棒は、水チャネルの一部を示し、このチャネルがタンパク内を伸びてマトリックス側に通じている。
【図３】Ｃ端にヒスチジンタグ及びＮ端に輸送シグナルを結合させたウシチトクロムｃ酸化酵素のサブユニットＩの発現ベクターを作製する過程を示す図である。
【図４】精製ウシチトクロムｃ酸化酵素のＳ　Ｉと同じ移動度におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。（１）は、Ｓ　Ｉ遺伝子をもたないプラスミッドｐＲｃ／ＣＭＶを組み込ませたＨｅＬａ細胞（ｍｏｃｋ細胞）から調製したミトプラストのもの、（２）はプラスミッド（ＳＩｗｔ）を感染させたＨｅｌａ細胞から得たミトプラスト（ＷＴ）のもの、（３）はプラスミッド（ｐＳＩ５１ｎ）を感染させたＨｅｌａ細胞から得たミトプラスト（Ｄ５１Ｎ）のものを示す。
【図５】ウマチトクロムｃの吸収スペクトルを示す図である。還元型チトクロムｃは５５０ｎｍに鋭い吸収示すが、酸化型ではそれが消失する。
【図６】チトクロムｃ酸化活性を示す図である。縦軸は５５０ｎｍの吸光度を示し、減少（下方）は酸化が起こっていることを示す。横軸は時間を示す。傾きが急なほど活性が強いことを示す。白抜き矢印は還元型チトクロムｃの添加を示す。左（ＷＴ）は、野生型Ｓ　Ｉを発現している細胞から調製したミトプラスト、右（Ｄ５１Ｎ）は、変異Ｓ　Ｉ（５１番目のアミノ酸をアスパラギンに変異させたサブユニットＩ）を発現しているミトプラストのものを示す。
【図７】水素イオンの能動輸送活性を示す図である。縦軸は、水素イオン濃度を示し、下方ほど水素イオン濃度は高い。横軸は時間を示す。白抜き矢印は還元型チトクロムｃの添加を示す。（Ａ）はＷＴのもの、（Ｂ）はＷＴに脱共役剤を加えたもの、（Ｃ）はＤ５１Ｎのものを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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