(57)【要約】【課題】細胞，オルガネラ，微生物などのような粒子を分離する際，粒子を標識することなく，迅速かつ大量に分離すること。【解決手段】流路中に２種類以上の液体を流した時，その各液体の界面近傍においては，各液体の混合を行わなくても，粒子の表面電荷や表面の親疎水性などの違いによって，粒子の分配が生じていることに着目し，両端の少なくとも一方に複数の分岐を持つ流路を利用し，前記複数の分岐を経由して流路中に異なる２種類以上の液体を連続的に導入し，その際，少なくとも１種類が粒子を含む液体である場合に，前記２種類以上の液体に対する該粒子の親和性の違いによって，該粒子をより親和性の高い液体の中に多く分配することで分離を行う。その際，流路の一部に，粒子のサイズに匹敵するあるいはそれ以下の部分を作成し，その直後に，流路幅が広がるような構造を作成することにより，粒子の界面への接触及び分配の効率を向上させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
両端のうち一方のみに複数の分岐を持つ流路を利用し，前記複数の分岐を経由して前記流路中に異なる２種類以上の液体を連続的に導入し，その際，少なくとも１種類が粒子を含む液体である場合に，前記２種類以上の液体に対する該粒子の親和性の違いによって，該粒子をより親和性の高い液体の中に多く分配することで分離を行う連続粒子分離機構及びその装置。
【請求項２】
両端にそれぞれ複数の分岐をもつ流路を有し，前記流路における一方の端部における前記複数の分岐を経由して，前記流路中に，少なくとも１種類が粒子を含む液体である異なる２種類以上の液体を連続的に導入し，前記２種類以上の液体に対する粒子の親和性の違いによって，粒子をより親和性の高い液体の中に多く分配することで分離を行う連続粒子分離機構及びその装置。
【請求項３】
請求項１，または請求項２のいずれか１項に記載の連続粒子分離機構及びその装置において，前記流路の幅，深さ，直径などのいずれかのスケールがセンチメートル以下のオーダーであり，前記流路内において液体は安定な層流を保ちながら流れる連続粒子分離機構及びその装置。
【請求項４】
請求項１，請求項２，または請求項３のいずれか１項に記載の連続粒子分離機構及びその装置において，前記流路内を連続的に流れる前記２種類以上の液体が，前記流路内において少なくとも部分的に，混合しない状態を保ちながら流れる連続粒子分離機構及びその装置。
【請求項５】
請求項１，請求項２，請求項３，または請求項４のいずれか１項に記載の連続粒子分離機構及びその装置において，前記流路内が，前記２種類以上の液体が混合しない状態を保ったまま流れる範囲において，少なくとも部分的に，前記２種類以上の液体のうち少なくとも１種類の液体の幅，深さ，直径などのいずれかのスケールが，分離対象とする粒子の代表径と同程度であるか，或いはそれ以下となる部分（部分Ａ）を有する連続粒子分離機構及びその装置。
【請求項６】
請求項５に記載の連続粒子分離機構及びその装置において，前記流路が，前記の部分Ａの直後に，前記２種類以上の液体の幅，深さ，直径などのスケールのいずれもが，分離対象とする粒子の代表径よりも大きくなる部分（部分Ｂ）を有する連続粒子分離機構及びその装置。
【請求項７】
請求項１，請求項２，請求項３，請求項４，請求項５，または請求項６のいずれか１項に記載の連続粒子分離機構及びその装置において，前記流路がマイクロチップに形成されたチャネルである連続粒子分離機構及びその装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，連続粒子分離機構及びその装置に関し，さらに詳細には，動植物細胞細胞，オルガネラ，微生物などの粒子を連続的に分離する際に用いて好適な連続粒子分離機構及びその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に，細胞，オルガネラ，微生物などの粒子を分離する技術は，基礎研究のみならず，血液からの造血幹細胞の分離といった医学的に有用な細胞の分離や，有用物質の生産性の高い植物培養細胞の選抜などの分野で重要な技術として認識されている。
【０００３】
従来の粒子を分離する技術としては，例えば，フローサイトメトリーを利用した分離法や，水性ポリマー多相系での分配を利用した分離法が知られている。
【０００４】
しかしながら，フローサイトメトリーを利用した分離法では，粒子混合物のうち標的とする粒子にラベルする必要があることが多いほか，特殊な装置が必要，大量処理が困難，分離のためには長時間を要する，といった問題点があった。
【０００５】
また，水性ポリマー多相系での分配を利用した分離法は，それぞれの相に対する親和性の違いにより分離を行うものであり，粒子の大量処理が可能となり，また温和な条件で分離を行うことができるといった利点がある。
【０００６】
しかしながら，水性ポリマー多相系での分配を利用した分離法は，物性の近い２相の水溶液の分離に長時間を要する，重力の影響を多大に受けるため，粒子が沈降してしまう，といった欠点があった。
【０００７】
さらにまた，水性ポリマー多相系での分配を利用した分離法は，平衡状態にある多相系への分配を利用した方法であるため，例えばある細胞に対する抗体ように，粒子に対して特異的に親和性のある物質を用いた場合，その物質自体が分配を起こしてしまい，そのような粒子に対して特異的に親和性のある物質を用いた高効率な分離が困難であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は，従来の技術の有する上記したような種々の問題点に鑑みてなされたものであり，その目的とするところは，細胞，オルガネラ，微生物などのような粒子を分離する際，粒子を標識することなく，迅速かつ大量に分離することができるようにした連続粒子分離機構及びその装置を提供しようとするものである。
【０００９】
また，本発明の目的とするところは，２種類以上の液体に対する親和性の違いによって粒子を分離する際，重力の影響を受けないようにした連続粒子分離機構及びその装置を提供しようとするものである。
【００１０】
さらにまた，本発明の目的とするところは，非平衡状態にある２種類以上の液体への親和性の違いにより分配を行うことで，特異的かつ高選択性な連続粒子分離機構及びその装置を提供しようとするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために，本研究は，流路中に２種類以上の液体を流した時，その各液体の界面近傍においては，各液体の混合を行わなくても，粒子の表面電荷や表面の親疎水性などの違いによって，粒子の分配が生じていることに着目してなされたものである。
【００１２】
ここでまず，流路内に２種類以上の異なる液体を導入するためには，流路がその入口において，複数の分岐をもつ必要がある。
【００１３】
本発明のうち請求項１に記載の発明は，両端のうち一方のみに複数の分岐をもつ流路を有し，前記複数の分岐を経由して，前記流路中に，少なくとも１種類が粒子を含む液体である異なる２種類以上の液体を連続的に導入し，前記２種類以上の液体に対する粒子の親和性の違いによって，粒子をより親和性の高い液体の中に多く分配することで分離を行う，というものである。
【００１４】
したがって，本発明のうち請求項１に記載の発明によれば，流路はその両端のうち一方の端にのみ複数の分岐をもつため，その分岐から異なる種類の液体を導入することで，流路内においてそれぞれの液体への親和性の違いにより，粒子を分離し，その挙動を観察することができるようになる。
【００１５】
また，本発明のうち請求項２に記載の発明は，両端にそれぞれ複数の分岐をもつ流路を有し，前記流路における一方の端部における前記複数の分岐を経由して，前記流路中に，少なくとも１種類が粒子を含む液体である異なる２種類以上の液体を連続的に導入し，前記２種類以上の液体に対する粒子の親和性の違いによって，粒子をより親和性の高い液体の中に多く分配することで分離を行う，というものである。
【００１６】
したがって，本発明のうち請求項２に記載の発明によれば，流路はその両端に複数の分岐をもつため，その分岐から異なる種類の液体を導入することで，流路内においてそれぞれの液体への親和性の違いにより粒子を分離し，さらには分離した粒子を別々に回収することができるようになる。
【００１７】
また，本発明のうち請求項３に記載の発明は，請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の連続粒子分離機構及びその装置において，前記流路の幅，深さ，直径などのいずれかのスケールがセンチメートル以下のオーダーであり，前記流路内において液体は安定な層流を保ちながら流れる，というものである。
【００１８】
したがって，本発明のうち請求項３に記載の発明によれば，導入したそれぞれの液体は安定な層流を保って流れるため，安定な界面を形成することが可能となり，粒子の分離と回収を正確に行うことができるようになる。
【００１９】
また，本発明のうち請求項４に記載の発明は，請求項１，請求項２または請求項３のいずれか１項に記載の連続粒子分離機構及びその装置において，前記流路内を連続的に流れる前記２種類以上の液体が，前記流路内において少なくとも部分的に，混合しない状態を保ちながら流れる，というものである。
【００２０】
したがって，本発明のうち請求項４に記載の発明によれば，非平衡状態にある２種類以上の液体，つまり，本来ならば混合が起こってしまうような２種類以上の液体を用いた場合においても，それぞれの液体に対する粒子の親和性の違いによって，粒子を分離することができるようになる。
【００２１】
また，本発明のうち請求項５に記載の発明は，請求項１，請求項２，請求項３または請求項４のいずれか１項に記載の連続粒子分離機構及びその装置において，前記流路内が，前記２種類以上の液体が混合しない状態を保ったまま流れる範囲において，少なくとも部分的に，前記２種類以上の液体のうち少なくとも１種類の液体の幅，深さ，直径などのいずれかのスケールが，分離対象とする粒子の代表径と同程度であるか，或いはそれ以下となる部分（部分Ａ）を有する，というものである。
【００２２】
したがって，本発明のうち請求項５に記載の発明によれば，上記の部分Ａにおいて，粒子を強制的に界面に接触することが可能となるため，分離時間の短縮や分離効率を向上が可能となる。
【００２３】
また，本発明のうち請求項６に記載の発明は，請求項５に記載の連続粒子分離機構及びその装置において，前記流路が，前記の部分Ａの直後に，前記２種類以上の液体の幅，深さ，直径などのスケールのいずれもが，分離対象とする粒子の代表径よりも大きくなる部分（部分Ｂ）を有する，というものである。
【００２４】
したがって，本発明のうち請求項６に記載の発明によれば，上記部分Ａにおいて界面に強制的に接触させた粒子を，より幅などの広い上記部分Ｂに導入することで，粒子を界面から離す確率を高くすることができるため，分離時間の短縮や分離効率の向上が可能となる。
【００２５】
また，本発明のうち請求項７に記載の発明は，請求項１，請求項２，請求項３，請求項４，請求項５または請求項６のいずれか１項に記載の連続粒子分離機構及びその装置において，前記流路がマイクロチップ上に形成されたチャネルである，というものである。
【００２６】
したがって，本発明のうち請求項７に記載の発明によれば，流路の形状を正確にコントロールすることができ，また，流路の並列化も容易になるため，分離性能の向上や，処理量の向上が期待できる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下，添付の書類に基づいて，本発明による連続粒子分離機構及びその装置の実施の形態を詳細に説明するものとする。
【００２８】
図１（ａ）（ｂ）には，本発明による液体制御機構の実施形態を備えたマイクロチップ１０が示されており，図１（ａ）は図１（ｂ）におけるＡ矢視図であり，図１（ｂ）は図１（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図である。また，図１（ｃ）は，図１（ａ）における部分Ｃの拡大図である。
【００２９】
このマイクロチップ１０は，直径約１００μｍ程度の粒子混合物を，２種類の液体への親和性によって分離するためのマイクロチップであり高分子（ポリマー）材料，例えば，ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）により形成された，表面が疎水的な２枚の平板状の基板１１と基板１２により形成された平板状の構造を有している。
【００３０】
そして，基板１１の下面１１ａには，深さがＤ１である流路が形成されており，その値は例えば，１８０μｍ程度であるが，この値は１μｍから１ｃｍまでの任意の値に設定することが可能である。
【００３１】
ポート１３，ポート１４はそれぞれ異なる種類の溶液の入口であり，ポート１５，ポート１６はそれぞれの溶液の出口である。
【００３２】
また，流路１７は流路であり，両端にそれぞれ２つづつの分岐（分岐１８，１９と分岐２０，２１）を有し，さらに流路１７は３つの異なる形状を持つ部分２２，２３，２４から構成されている。
【００３３】
なお，流路１７の全体の長さは，例えば７０ｍｍであり，部分２２，２３，２４の長さは，例えばそれぞれ２０ｍｍ，１０ｍｍ，４０ｍｍであるが，この値は１０μｍ以上の任意の値に設定することが可能である。
【００３４】
また，部分２２，２３，２４の幅は，例えばそれぞれ４００μｍ，１５０μｍ，８００μｍであり，分岐１８〜２１の幅は，例えば２００μｍであるが，この値はそれぞれ１μｍ以上の任意の値に設定することが可能である。
【００３５】
以上の構成において，上記したマイクロチップ１０を用いて動植物細胞，オルガネラ，バクテリアなどの粒子を分離する連続粒子分離機構及びその装置について説明する。
【００３６】
分離に必要な液体としては，ポリエチレングリコール−デキストランに代表される水性ポリマー多相系のように，安定した相分離状態を保つ２種類以上の水溶液を用いても良く，また，水性ポリマー多相系の１つの相にのみ，特定の粒子との親和性を高める物質（抗体など）を加えた水溶液を用いても良く，さらには，全く安定的に相分離しない２種類の溶液，つまりは完全に混合してしまう２種類以上の水溶液を用いても良い。
【００３７】
また，上記のようにして用意した２種類の水溶液の一方または両方に，分離したい粒子混合物をあらかじめ混合しておくものとする。
【００３８】
そして，用意した２種類の液体を，シリンジポンプなどを用いて２つの入口ポート１３，１４から連続的に供給する。この時，流路１７内では，２種類の液体が層流を保ちつつ流れるため，２種類の溶液が相分離状態を保つ系においては，それらの液体は最後まで混合することなく流れる。
【００３９】
また，２種類の液体が相分離せず，拡散による混合が生じる系においても，ある程度の流速以上であれば，部分２３において，分離に必要な界面を容易に形成することができる。なお，この流速は，液体の粘度，拡散係数，流路の幅などの影響を受けると考えられる。
【００４０】
流路１７内に導入された粒子混合物は，流れに乗って下流方向に移動するが，まず，部分２３において強制的に界面に接触することになる。これは，粒子の大きさ（この場合は直径１００μｍ程度）に対し，部分２３におけるそれぞれの液体の幅（両方が同じ場合には，どちらも７５μｍ程度）が充分小さいためである。
【００４１】
界面に接触した粒子は，引き続いて幅の広い部分２４に導入されるが，部分２３と部分２４の接続部において，液体は図１（ｃ）における矢印のように流れているため，ここで粒子は界面２５から引き離され，より親和性の高い液体側へと移動し，これによって混合物の分離が可能となる。
【００４２】
また，部分２４は深さが充分に浅く，幅が充分に広いため，一度分離された粒子は流れと垂直な方向に移動することはなく，そのまま出口で分取される。
【００４３】
なお，より精度の高い分離，分取を行うために，入口と出口の数を増やし，導入する液体の種類と分取する液体の数を増やしても良い。
【００４４】
また，マイクロチップ１０は直径１００μｍ程度の粒子を分離するためのマイクロチップであるが，分離する目的の粒子の径が違う場合には，部分２３の幅を変えれば良く，例えばその幅は，目的の粒子の径に対して，１〜２倍程度にすればよい。
【００４５】
さらには，その処理量は流路の数に比例するため，大量処理を目的とする場合には同型の流路を並列化することが必要であるが，並列化は非常に容易に行うことができる。
【００４６】
実際に，このマイクロチップ１０を用い，溶液としては水性ポリマー多相系（ポリエチレングリコール及びデキストラン）を用いて，イチゴ培養細胞の集塊（径９６μｍ以下）を，その表面特性に従って分離することに成功した。
【００４７】
【発明の効果】
本発明は，以上説明したように構成されているので，細胞，オルガネラ，微生物などのような粒子を分離する際，粒子を標識することなく，迅速かつ大量に分離することができるという優れた効果を発揮する。
【００４８】
また，本発明は，以上説明したように構成されているので，２種類以上の液体に対する親和性の違いによって粒子を分離する際，重力の影響を受けないという優れた効果を発揮する。
【００４９】
さらにまた，本発明は，以上説明したように構成されているので，非平衡状態にある２種類以上の液体への親和性の違いにより分配を行うことで，特異的かつ高選択性な分離が可能になるという優れた効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による液体制御機構の実施形態を備えたマイクロチップ１０を示し，図１（ａ）は図１（ｂ）におけるＡ矢視図であり，図１（ｂ）は図１（ａ）におけるＢ−Ｂ線による断面図であり，図１（ｃ）は図１（ａ）における部分Ｃの拡大図である。
【符号の説明】
１０                  マイクロチップ
１１                  基板
１１ａ                基板１１下面
１２                  基板
１３                  入口側ポート
１４                  入口側ポート
１５                  出口側ポート
１６                  出口側ポート
１７                  流路
１８                  入口側分岐
１９                  入口側分岐
２０                  出口側分岐
２１                  出口側分岐
２２                  流路１７の部分
２３                  流路１７の部分
２４                  流路１７の部分
２５                  界面
【図１】
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