(57)【要約】【課題】複数の増幅反応を同時に行うための混合試薬溶液を、同一の操作を必要以上に繰り返すことなく簡便に調製する。【解決手段】チップ１０上の複数のチャンバ１２のそれぞれに、被固定化試薬溶液セットの成分を、共有結合又は非共有結合により固定化する。次いで、試薬溶液セットのうち残りの反応試薬溶液セットを、未固定状態でチャンバ１２に添加し、チャンバ１２にカバー板１４を載せて、個々のチャンバ１２を独立に密封する。それから、被固定化試薬溶液セット成分の固定方法に対応した遊離条件に付して、被固定化試薬溶液セットの成分を遊離させて反応試薬溶液セットと混合し、最後に、ポリメラーゼ連鎖反応を実行する。【選択図】　　　　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上の複数の微小孔中での反応のための反応溶液を調製する溶液調製方法において、
前記反応溶液から選択された被固定試薬を、遊離状態に変更可能な方法によって前記複数の微小孔の表面上に固定する工程と、
前記反応溶液のうちの残りの試薬を、各微小孔に添加する工程と、
各微小孔を密封する工程と、
前記固定方法に応じた方法によって各微小孔表面に固定された被固定試薬を遊離して前記残りの試薬と混合する工程
を含むことを特徴とする、反応溶液調製方法。
【請求項２】
前記残りの試薬が、各微小孔容量の合計に対し過剰量で且つ１回の操作で、前記基板に添加される請求項１記載の反応溶液調製方法。
【請求項３】
微小孔を密封した後に、さらに、過剰な前記残りの試薬を除去する工程を含む請求項１又は２に記載の反応溶液調製方法。
【請求項４】
前記固定方法が、蝋の層による物理的な隔離によるものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の反応溶液調製方法。
【請求項５】
前記固定方法が、共有結合又は非共有結合によるものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の反応溶液調製方法。
【請求項６】
前記反応がポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする請求項４又は５に記載の反応溶液調製方法。
【請求項７】
前記微小孔が、０．１ｐＬ以上１００μＬ以下の大きさであることを特徴とする請求項６に記載の反応溶液調製方法。
【請求項８】
前記微小孔を画定する基板表面に密着補助材を直接的に又は間接的に配置する工程を更に含み、前記密封工程における密着補助材微小孔の密封性が、該密着補助材によって向上することを特徴とする請求項１又は２に記載の反応溶液調製方法。
【請求項９】
複数の微小スケールの反応溶液の調製及び反応を行うための、試薬を含む反応容器であって、
基板上の複数の微小孔を反応容器とし、遊離状態に変更可能な方法によって前記複数微小孔の表面上に反応溶液の被固定溶液が固定されていることを特徴とする反応容器。
【請求項１０】
前記反応がポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする請求項９に記載の反応容器。
【請求項１１】
前記微小孔が、０．１ｐＬ以上１００μＬ以下の大きさであることを特徴とする請求項９に記載の反応容器。
【請求項１２】
前記基板上に密着補助材が配置されていることを特徴とする請求項９記載の反応容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、反応溶液調製方法及び反応容器に関し、特に、基板上の複数の微小孔中での反応のための反応溶液を調製する溶液調製方法及び、複数の微小スケールの反応溶液の調製及び反応を行うための、試薬を含む反応容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡマイクロアレイの技術開発により、生体中の微量な核酸試料から、多種類の同時検出・定量および／または多種類の核酸配列の変異解析、特に一塩基変異の同時解析が簡便に行うことができるようになった。
これらの解析を行うための前処理として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡの増幅がほとんどの場合に必須となる。試料がＲＮＡの場合でも、ＤＮＡに逆転写してからＰＣＲを行うことが多い。
【０００３】
核酸の定量やＤＮＡ変異解析用のＰＣＲの場合、多種類の検出対象ＤＮＡ断片を増幅するためには本来、使用するプライマーのペア毎に別々の反応容器で増幅を行う必要があり、ペアの種類が増えると非常に実験操作が煩雑になる。
また、複数のチャンバを有する基板上で同時に複数の核酸を増幅させることが行われているが、各チャンバの反応が混じり合わないように試薬溶液を投入しなければならず、同一操作の繰り返しが要求されている。
【０００４】
上記操作を簡略化するために、複数種のプライマーペアを混合した状態で複合ＰＣＲを行うことがある。また、複数の反応ウェルにおいて反応溶液が混合しないように、特許文献１ではカバーガラスとマイクロウェル集積体との間に膜を配置させている。特許文献２では、反応チューブ中においてＰＣＲ試薬の寿命を延ばすと共に溶液の混合を対流混合により行うために蝋を配置させたＰＣＲ反応チューブを開示している。
【０００５】
【特許文献１】
特許第３０４１４２３号公報
【特許文献２】
特許第３０７８９０７号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、複数種のプライマーペアを用いた混合ＰＣＲでは、増幅の競合により目的のＤＮＡ断片の収率が低下したり不安定になる。また目的以外のＤＮＡ断片の増幅を誘発する可能性が高くなる。このような事象は正確な定量及び変異解析には好ましくない。
また同一操作を繰り返すといった操作上の煩雑さは、ＰＣＲに限らず、特定反応のために試薬溶液を調製する場合も同様である。特に、複数の反応チャンバが連続しているプレートなどを使用して複数種の反応溶液を調製する際に、問題となる。
本発明は、複数の試薬溶液を混合して得られる反応溶液を複数調製する場合であっても、同一の操作を必要以上に繰り返すことなく簡便に調製することができる反応溶液調製方法及び反応容器を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の溶液調製方法は、基板上の複数の微小孔中での反応のための溶液調製方法において、前記反応溶液から選択された被固定試薬を、遊離状態に変更可能な方法によって前記複数微小孔の表面上に固定する工程と、前記反応溶液のうちの残りの試薬を、各微小孔に添加する工程と、各微小孔を密封する工程と、前記固定方法に応じた方法によって各微小孔表面に固定された被固定試薬を遊離して前記残りの試薬と混合する工程を含むことを特徴としている。
【０００８】
この方法によれば、被固定試薬を予め微小孔に固定してから残りの試薬を添加し、その後、被固定試薬を遊離状態にしてから前記残りの試薬と混合するので、被固定試薬が遊離状態となる時期を調整することができる。これにより、該残りの試薬溶液を添加する際に、被固定試薬溶液の成分が固定された状態を維持することができる。また、他の微小孔中の試薬と混じり合わないように個々の微小孔のそれぞれに投入するといった手間を排除することができる。この結果、残りの試薬を２つ以上の微小孔に対して同時に添加することができ、煩雑な作業を簡略化することができる。
【０００９】
また、前記残りの試薬が、各微小孔容量の合計に対し過剰量で且つ１回の操作で、前記基板に添加されることが好ましい。この場合には、より少ない操作回数で容易に反応溶液を調製することができる。
さらに、本発明の他の形態では、微小孔を密封した後に、さらに、過剰な前記残りの試薬を排出する工程を含むことを特徴としている。
本発明において、固定方法は、蝋の層による物理的な隔離によるものであってもよく、共有結合又は非共有結合によるものであってもよい。
また本発明の更に他の形態では、前記微小孔を画定する基板表面に密着補助材を直接的又は間接的に配置する工程を更に含み、前記密封工程における微小孔の密封性が、該密着補助材によって向上することを特徴としている。
ここで密着補助材を直接的又は間接的に配置するとは、基板表面に直接配置させるだけでなく、他の部材、例えば密封手段に配置させてから基板表面に配置させる場合を含むことを意味する。なお、密着補助材は、基板表面に配置されていればよく、微小孔が密封されれば基板表面の一部に配置されていても表面全面に配置されていてもよく、さらには基板及び／又は他の部材、例えば密封手段の全体として配置されていてもよい。
【００１０】
本発明の反応容器は、複数の微小スケールの反応溶液の調製及び反応を行うための、試薬を含む反応容器であって、基板上の複数の微小孔を反応容器とし、反応溶液の被固定溶液を遊離状態に変更可能な方法によって前記複数微小孔の表面上に固定されていることを特徴としている。
また本発明の他の反応容器は、基板上に密着補助材が配置されていることを特徴としている。
【００１１】
ここで、本発明では、前記反応がポリメラーゼ連鎖反応であることが好ましい。
また、前記微小孔が、０．１ｐＬ以上１００μＬ以下の大きさであることが好ましい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施形態を、添付図面を参照しながら説明する。なお、図中、同一符号は同一又は対応する部分を示すものとする。
【００１３】
図１は、本実施の形態で使用される核酸増幅用のチップ１０の一部が示されており、このチップ１０上には、チャンバ１２（本発明における反応器又は微小孔に相当）が複数設けられている。
【００１４】
チップ１０の材質はシリコン、ガラス、石英、またはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリプロピレン、ポリカーボネート及びポリイミド等のポリマー等、この分野で通常既知のもののいずれも用いることができる。ＰＣＲ反応が加熱処理を必要とすることを考慮すれば、耐熱性であることが好ましい。ポリメラーゼ増幅反応の阻害を防止するために、必要に応じて既知の表面処理を行う。例えばシリコンでは表面を熱酸化しておき、ＰＣＲ反応溶液中にＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を添加することで反応阻害を防止できる。チャンバ１２は、公知の半導体微細加工技術等を応用して直接作製するか、鋳型を作製後に射出成型等で作製できる。チャンバ１２の形状は、逆四角錐型、四角柱型、六角柱型、半球型等様々な形状から適宜選択することができる。チップ１０に設けられるチャンバ１２の数は、チップ１０のサイズに応じて選択することができる。チップ１０上のチャンバ１２の数及び配置の密度は、この分野で通常行われているものをそのまま採用することができ、特に制限されない。このチャンバ１２の壁面に、後述する被固定反応溶液の成分が固定される。
【００１５】
チャンバ１２の容量は０．１ｐＬ以上１００μＬ以下の範囲であり、好ましくは１０ｐＬ以上１μＬ以下、更に好ましくは１００ｐＬ以上１μＬ以下である。０．１ｐＬ以上であれば、微小孔の大きさ制御、後述の被固定試薬溶液の分注位置決め、また増幅後におけるＤＮＡ断片の解析が容易となる。１００μＬ以下であれば、所要の試料ＤＮＡ量を適度な量に抑えると共に試薬溶液の混合状態を十分に保つことができ、ＰＣＲ処理における熱効率を著しく下げることがない。ただし、他の手段を用いて又は用いずに、これらの影響が大きくならない場合には、チャンバ１２の容量はこれらの範囲外でもよい。
【００１６】
チップ１０の上面には、密封手段としてのカバー板１４（図２参照）が載置される。このカバー板１４には、チップ１０の上面に密着するものであって、後段の分析方法に応じた材質のものが選択される。例えば増幅ＤＮＡを蛍光試薬を用いて検出したい場合には、ガラス等の励起光及び蛍光透過性の材質のものが使用される。
【００１７】
このカバー板１４は、チップ１０上のチャンバ１２を一度にすべて覆うサイズであることが好ましい。このようなサイズであれば、チップ１０に対してカバー板１４を１枚用意すれば足りるが、チップ１０上のチャンバ１２の一部のみを使用する場合には、使用するチャンバ１２の範囲に対応したサイズであってもよい。
【００１８】
次に図２を参照しながら本発明の反応溶液調製方法に従った核酸増幅方法を説明する。
本核酸増幅方法では、核酸増幅のための１セットの試薬溶液を用いて、固定工程と、添加工程と、密封工程と、遊離工程と、増幅工程とを含む一連の工程によって、ＤＮＡが増幅される。
【００１９】
ここで用いられる核酸増幅のための試薬溶液セットには、ＰＣＲ及びその後の分析に必要なすべての試薬溶液が含まれ、例えば、１組のプローブ、鋳型となる目的ＤＮＡ又はＲＮＡ、ポリメラーゼなどが該当する。試薬溶液セットは、被固定試薬溶液セットと反応試薬溶液セットとに選別される。ここで被固定試薬溶液セットとは、この試薬溶液セットの一部であり、各チャンバ１２に先に添加されると共に、その成分が、後述する固定の工程でチャンバ１２表面に固定化されるものを指す。なお、本発明では、「被固定試薬溶液セット」との用語には、２種以上の試薬溶液を含む場合のみならず、１種類のみの試薬溶液を被固定試薬溶液セットとする場合にも用いられる。反応試薬溶液セットとは、ＰＣＲとその後の分析に必要なすべての試薬溶液セットから被固定試薬溶液セットを除いた残りの試薬溶液を指す。
【００２０】
被固定試薬溶液セットには、チャンバ１２毎に異なる試薬を選択することができる。例えばチャンバ１２毎に異なるＤＮＡ断片を増幅したい場合は、被固定試薬溶液セットに異なる種類のプライマーを含める。またＤＮＡ増幅後の分析に必要な試薬溶液、例えば蛍光標識ＤＮＡプローブについても、チャンバ１２毎に異なるものを添加したい場合は被固定試薬溶液セットに含める。このようにチャンバ１２毎に異なる種類の被固定試薬溶液セットを使用することは、１つのチップで複数種の核酸を増幅することができるので、好ましい。なお、各チャンバ１２に共通して使用される試薬溶液も、被固定試薬溶液セットに含めてもよい。
【００２１】
固定工程では、試薬溶液セットから選択された被固定試薬溶液セットが各チャンバ１２に添加され、その成分がチャンバ１２の表面に固定される。
被固定試薬溶液セットの添加は水溶液の状態で行う（図２上段）。このとき、操作の簡略化及び正確さを期するために溶液定量吐出装置を使用するのが望ましい。マイクロメートル単位オーダーの溶液吐出の位置決めや溶液のピコリットル単位オーダーの定量的吐出には、公知の装置・方法を使用することができる。被固定試薬溶液セットが、複数種の試薬溶液で構成される場合、各チャンバ１２に別々に添加してもよいが、固定化の効率を一定にするために予め混合してから添加する方が望ましい。
【００２２】
添加された試薬溶液は、次にチャンバ１２内に固定される。ここでいう固定とは、チャンバ１２に添加後、チャンバ１２に反応試薬溶液を新たに添加しても、反応試薬溶液に被固定試薬溶液セットの成分が混入しない状態にすると共に、後述する特定の遊離条件にすることによって容易に固定状態が解除されるものをいう。特に、室温及び／又は暗所のような特定の状態に一時的又は持続的にすることによって、被固定試薬溶液セットの成分を遊離するものが好ましい。
【００２３】
このような固定方法としては、共有結合によるもの、非共有結合によるものが挙げられる。共有結合様式には、アミド結合、エステル結合、イミン結合（アルデヒド基とアミノ基のカップリングにより生成）、アミン結合（エポキシ基とアミノ基のカップリング等により生成）、尿素結合（イソシアナート基とアミノ基のカップリングにより生成）、チオ尿素結合（イソチオシアナート基とアミノ基のカップリングにより生成）、チオエーテル結合（マレイミド派生物とチオール基のカップリング等により生成）、ジスルフィド結合、フォスフォロアミダイト結合（リン酸基とアミノ基のカップリングにより生成）が含まれる。
【００２４】
共有結合による固定方法の場合、結合の種類や溶液の性質に応じた加熱により遊離させることができる。例えば特願平８−２４０９９６号公報によると、一般的なＰＣＲに用いられるＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を室温付近でｐＨ８〜９に調製されたものの場合、室温付近ではアミド結合に影響がない一方で、加熱するに従いｐＨの減少が生じると、加熱自身の効果と併せてアミド結合が不安定化し、９５℃１０分間程度の加熱によって、アミド結合によって固定されていた被固定試薬溶液セットの成分を有意に遊離させることができる。
またイミド結合の場合には、アミド結合に比較して加熱で切れやすいので、初期の熱変性を５分程度に短縮することができる。
【００２５】
また非共有結合様式には、抗原抗体結合、アビジン−ビオチン結合、ＰＤＢＡ（Ｐｈｅｎｙｌｄｉｂｏｒｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ）−ＳＨＡ（Ｓａｌｉｃｙｌｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ　Ａｃｉｄ）結合、またポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等のポリ陽イオンと核酸等のポリ陰イオンによる静電結合や疎水結合が含まれる。非共有結合による固定方法の場合、結合の種類に応じた加熱、例えば抗原抗体結合の場合には９５℃数分間の加熱によって速やかに結合が解離し、固定されていた試薬を遊離させることができる。
共有結合または非共有結合による被固定試薬の固定量の制御は、チャンバ１２、被固定試薬、及びそれらの修飾方法によって経験的に定まる、最大固定化量（固定化の飽和量）を基準にすることが望ましい。必要な固定量が最大固定化量を下回る場合は、被固定試薬と競合して固定化される試薬を混合することによって固定化量を調節することができる。必要な固定量が最大固定化量を上回る場合は、被固定試薬の結合サイトを多く持つスペーサー（ポリマーやデンドリマー等）をチャンバ１２表面に導入することで最大固定化量を増加させることができる。
【００２６】
更に、これらの他に、被固定試薬溶液セット溶液の上に蝋等を上層することにより、物理的に隔離する方法を使用できる。このような物理的隔離による固定方法では、被固定試薬溶液を速やかに遊離することができ、また化学的結合では固定化しにくい被固定試薬溶液セットの成分、例えばマグネシウムなどに対しても容易に適用できる。蝋によって固定化した場合には、選択された蝋の種類に応じた溶融温度、例えば９５℃１分間の加熱によって容易に固定状態を解除することができる。また、被固定試薬溶液セットの成分を定量的に遊離させることができるので、被固定試薬溶液セット成分の濃度及び量の厳密な制御も容易に行うことができる。このような蝋としては、アンプリワックス（ＡｍｐｌｉＷａｘ、アプライドバイオシステムズ）の他、特願平３−５０４５７１に挙げられるような、パラプラスト（シャーウッドメディカル）、ウルトラフレックス（ペトロライトコーポレーション）といった市販製品を挙げることができる。
【００２７】
なおこのような固定法において反応試薬の添加量を制御するためには、チャンバ１２の大きさの制御に加えて、被固定試薬溶液セット及び蝋等の容量を制御する必要がある。特に被固定試薬溶液セットの蒸発による液量のばらつきを抑制するため、十分な湿度管理を行って蒸発を防止するか、逆に溶媒を完全に蒸発させ、その上から蝋等でコーティングすることが望ましい。
【００２８】
更に別の固定方法としては、各チャンバ１２上に複数種類の核酸を直接合成する方法も挙げることができる。このような方法には、Ｆｏｄｏｒ，　Ｓ．Ｐ．Ａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２５１，　７６７−７７３　（１９９１）　等の技術を利用することができる。この場合には、光化学的に除去できる保護基で修飾したアミノ基を持つリンカーを、アルデヒド基を介してイミン結合で微小孔表面に結合させておき、反応部位のみを照射できるようなマスク（フォトリソグラフィックマスク）をかけて光照射する。次いで、同保護基をもつヌクレオチド単量体との最初のカップリング反応を行う。このサイクルを繰り返すことで所望の核酸を各微小孔表面に合成することができる。微小孔に残りのＰＣＲ反応溶液を添加後、９５℃１０分間の加熱により、微小孔表面のイミン結合が切れ、合成核酸を遊離させることができる。
【００２９】
上記の固定方法による被固定試薬溶液セットの固定はいずれも、公知の試薬溶液や方法を用いて容易に実施できる。また、上記の共有又は非共有結合を行う場合は、必要に応じてチャンバ１２表面の処理や固定試薬溶液の添加を、被固定試薬溶液添加の前後に行う必要がある。なお、固定後、未固定の被固定試薬溶液セットを蒸留水等でリンスすることが好ましい。
【００３０】
次の添加工程では、反応試薬溶液セットが、未固定状態で各チャンバ１２に添加される（図２中段）。
反応試薬溶液セットの添加量は、チャンバ１２の容量合計量よりも過剰な容量とすることが好ましい。これにより、反応試薬溶液セットをすべてのチャンバ１２へ確実に添加することができると共に添加のための操作回数を減らすことができる。またチャンバ１２に反応試薬溶液を完全に満たすので、チャンバ作製時にチャンバ１２の大きさを個別に設定（チャンバ１２の大きさは同一でも異なってもよい）して制御しておけば、反応試薬溶液の添加量を、それぞれのチャンバ１２について制御できる。また液量を制御することで、後段で遊離させる被固定試薬の最終濃度もより正確に制御できる。これらのことにより、反応の再現性及び定量性を高めることができる。ここで各チャンバ１２の容量合計量よりも過剰の容量とは、ほぼ等量から相当量過剰な量までを含み、チップ１０に添加した場合に、すべてのチャンバ１２が試薬溶液セットで満たされ且つ少量の反応試薬溶液セットがチップ１０から溢れる程度であることが好ましい。
【００３１】
またこの場合、複数のチャンバ１２を有するチップ１０に対して、１回の操作ですべてのチャンバ１２へ反応試薬溶液セットが行き渡るように添加することが好ましい。過剰量の反応試薬溶液セットによって複数のチャンバ１２の液が連続したとしても、各チャンバ１２には被固体試薬溶液セットが固定化されているので、隣接する他のチャンバ１２にこの成分が移動することがない。
【００３２】
次の密封工程では、試料ＤＮＡを含んだ反応溶液サブセットが各チャンバ１２に一様に行き渡った後に、カバー板がチャンバ１２上に密着するよう載置され（図２下段）、各チャンバ１２が独立に密封される。カバー板１４が基板上に密着する際に、反応試薬溶液セットの余剰分がカバー板１４とチップ１０との密着部分の外へ追い出される場合には、追い出された過剰な反応試薬溶液セットを、必要に応じて除去することが好ましい。
また、各チャンバ１２内に気泡を入れないように注意することが好ましい。気泡が入ると各チャンバ１２への反応試薬溶液セットの添加量が変化し、また後段で遊離する被固定試薬の濃度が変わることにより、再現性や定量性が失われ得る。さらに気泡は、蛍光等の光学的な分析を行う場合に励起光や発光を散乱させ、分析に悪影響を及ぼす恐れがある。
カバー板１４によるチャンバ１２の密封は、カバー板１４の自重や圧着、或いは加熱によるチップ１０の上面との密着によって達成されることが好ましい。
【００３３】
これにより、各チャンバ１２内の試薬溶液セット（被固定化試薬溶液セット及び反応試薬溶液セット）はいずれも、カバー板１４によって、隣接する他のチャンバ１２から完全に独立となり、他のチャンバ１２内の試料セットに混入することがなく、チャンバ１２内で試薬溶液を混合することができる。
【００３４】
カバー板１４によるチャンバ１２の密封が完了すると、遊離工程では、各チャンバ１２に固定化した被固定試薬溶液セットに対して、遊離処理が行われる。
この遊離方法は、固定方法に対応した方法が選択され、特に、後段のＰＣＲ処理に大きな悪影響を与えないものであることが好ましい。このような遊離方法には、加熱及び／又は光照射等が挙げられるが、ＰＣＲ増幅への影響を考慮して行うことが更に好ましい。例えば加熱では主に増幅酵素の失活を抑制するため１００℃以下であることが好ましく、また６０℃以上では２０分以内とすることが特に好ましい。一方、光照射により遊離させる場合には、ＤＮＡや酵素が吸収を持つ２８０ｎｍより長い波長の光照射を選択することが好ましい。
【００３５】
被固定反応試薬セットの成分は、遊離されることによってチャンバ１２内で、反応溶液セットの成分と混合する。なお、チップ１０のサイズが、固定状態を解除して遊離状態にするだけではチャンバ１２内での各試薬成分が充分に混合・均一化しないサイズである場合には、遊離工程中又はその後で、例えば振動手段による混合工程を設けてもよい。
【００３６】
遊離工程によって、チャンバ１２での個別のＰＣＲ反応溶液の調製が完了すると、増幅工程においてＰＣＲ処理が開始され、チャンバ１２内で核酸が増幅する。ＰＣＲは、公知の熱サイクルによってＤＮＡ断片の複製を繰り返し行い、特定のＤＮＡ断片を増幅するものであるが、一連の処理には既知の如何なる工程も含まれる。
【００３７】
また、本増幅工程では、多種類のＤＮＡ断片の同時増幅に加え、公知技術により多種類のＤＮＡの同時定量及び／又は多種類のＤＮＡ配列の同時変異解析も含むことができる。例えば、蛍光プローブを利用した増幅量の多点同時計測は、特許３０４１４２３を参考に行うことができる。
【００３８】
従って、本実施の形態によれば、被固定反応試薬セットの成分が、予めチャンバ１２の表面に固定され、反応試薬溶液セットを添加し、チャンバ１２を密封した後で遊離状態となるので、被固定試薬溶液セットの成分が反応試薬溶液セットの添加時に他のチャンバ１２に混入することがなく、複数のチャンバ１２に対して反応試薬溶液セットを１回の操作で同時に添加することができる。このため、連続して複数の試薬溶液セットを添加してＰＣＲ処理を行う場合でも、実験操作を簡略化することができる。
【００３９】
また、多種類のＰＣＲ反応溶液を簡便に調製することが可能となり、ＰＣＲを用いた操作の効率が向上し、遺伝子工学に関わる研究及び遺伝子診断等において大きく貢献することができる。
【００４０】
次に図３を参照して、本発明の他の実施形態を説明する。
図３には、本発明の他の実施形態に係るチップ２０が示されている。このチップ２０には複数のチャンバ１２が配置されていると共に、チャンバ１２を画定するチップ２０の上面には密着補助材２６が配置されている。この密着補助材２６は、チップ２０の上面とカバー板１４との間の夾雑物シール性を高めて密着性を向上させる密着補助物質で構成されている。
ここで用いられる密着補助材２６としては、チップ２０の上面に水分等が存在していても、圧着等の操作によりチップ２０の上面とカバー板１４との間の密着性を向上させてチャンバ１２の密封性を高めることができる物質のものであれば如何なるものでも使用することができる。このような密着補助物質としては、レイキュアー４２００シリーズＰＦ（十條ケミカル）のようなＵＶまたは電子ビーム硬化性樹脂、ＰＤＭＳや接着性液状シリコーンゴムＴＳＥ３０３３（ＧＥ東芝シリコーン）のような熱硬化性樹脂、シリコーンシール材ＴＳＥ３９２（ＧＥ東芝シリコーン）のような湿度硬化性樹脂などが挙げられる。
【００４１】
密着補助材２６の配置方法は、用いられる材料の性質に応じて適宜決定され、スプレーコーティングなどによってチップ２０の上面に密着補助物質を塗布してもよく、リソグラフィなどによって配置しても良い。
例えば、ＵＶ硬化性シリコーン樹脂の場合には、チップ２０の上面全面に塗布した後にフォトマスクを配置して選択的にＵＶを照射することによって、位置選択的に塗布することができる。また、チップ２０の上面のみに密着補助材２６を配置するように設計されたスクリーンを用いたスクリーン印刷であれば、広範な種類の密着補助物質を塗布することもできる。
【００４２】
このチップ２０を使用する場合には、チャンバ１２への反応試薬溶液セットの滴下を行った後、カバー板１４をチップ２０の上面に載置する。
このとき、チップ２０の上面には、密着補助材２６が配置されているので、カバー板１４をその上に載置して圧着・加熱などを行うと、カバー板１４とチップ２０の上面とが密着補助材２６を介してより強固に密着する。これにより、チャンバ１２をより確実に密封状態にして、次の遊離工程及び混合工程において、隣接するチャンバ１２の溶液が混入することを一層確実に防止することができる。これにより、チップ２０でのＰＣＲ反応をより一層精度良く確実に行うことができる。
【００４３】
また、密着補助材２６は、チップ２０の上面に直接配置されていてもよく、チップ２０に対して用いられるカバー板１４のチップ２０との対向面に配置されてからチップ２０の上面に間接的に配置されてもよい。チップ２０の上面とカバー板１４との双方に配置された場合には両者の密着がより強固となり、チャンバ１２の密封性をより一層高くすることができる。カバー板１４に配置可能な密着補助材２６としては、チップ２０の上面に配置可能な密着補助材２６と同様のものを使用できるが、後段のステップでカバー板を通して蛍光等を測定する場合は、測定に必要な光波長域に吸収を持たない又は吸収の小さい材質を使用する必要がある。特に、チップ２０に密着補助材２６として自己接着性樹脂を配置した場合には、同種の自己接着性樹脂をカバー板１４に配置することが好ましい。
なおカバー板１４に密着補助材２６の配置は、全面に一様に配置すればよいので、スピンコートやスプレー塗り、刷毛塗り等、一般的な塗布方法を用いることができる。
これにより、チャンバ１２内でのＰＣＲ反応をより一層精度良く確実に行うことができる。
【００４４】
なお、チップ２０及びカバー板１４に密着補助材２６を配置する代わりに、チップ２０及び／又はカバー板１４全体を密着補助物質で構成してもよい。これにより密着補助材２６を配置させる工程を省略することができる。このとき、チップ２０について予め鋳型を作製しておくことによって、生産性よくチップ２０を作製することができる。
【００４５】
本発明の実施の形態では、ＤＮＡ試料からＤＮＡ断片を増幅する場合について説明したが、ＤＮＡ試料からＲＮＡへの転写や、ＲＮＡ試料から相補ＤＮＡへの逆転写の場合でも、転写反応または逆転写反応の工程をＤＮＡ増幅反応の工程に類似した様態で組み込むことにより、定量及び／又は核酸配列の変異解析を行うことができる。
【００４６】
本発明の実施の形態では、被固定試薬溶液セットの成分の固定処理と反応試薬溶液セットの添加処理とを一連の作業で行っているが、これに限定されない。
例えば、専用のチップ製造施設にて被固定試薬溶液セットを固定した固定化チップを生産し、このような固定化チップを入手した後であってＰＣＲ処理を行う際に反応試薬溶液セットの添加を行うこともできる。この場合には、固定化チップを大量に生産することができると共に、ＰＣＲ実験実施者は反応試薬溶液セットの添加から行えばよいので、一層、実験操作を簡略化することができる。さらにこの場合には、ＰＣＲ試験の実施者は溶液定量吐出装置のような高価な装置を自ら導入することなく、簡便かつハイスループットな実験を行うことができる。
【００４７】
また、上記のような被固定試薬溶液セットを予め固定化した固定化チップとして生産する場合には、このような成分固定化チップと、処理に必要な反応試薬溶液セットとを含む反応キットとして提供することもできる。このようなキットにすることによって、より一層作業性よく、ＰＣＲ処理を行うことができる。
【００４８】
本発明の実施の形態では、複数のチャンバ１２を有するチップ１０を用いて行うＰＣＲ処理について説明したが、これに限定されない。
例えば、チューブ型の反応器を連結させて使用する場合でも、複数の試薬溶液セットを連続的に添加することによって特定の処理を行う反応系であれば、本発明を同様に適用することができる。
【００４９】
また、本発明の反応溶液調製方法及び反応容器は、微小スケールかつ複数の反応容器内での同時反応を対象とするものであれば、ＰＣＲ反応に制限されるものではなく、複数種の反応溶液を一度に調製する用途として、例えば、ＬＣＲ（ＬｉｇａｓｅＣｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｉｎｖａｄｅｒ　Ａｓｓａｙ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ　Ｖ．，　Ｂｒｏｗ　Ｍ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，　ｖｏｌ．　５１０９，　ｐ７７８）等の生化学反応や各種化学反応の溶液調製についても本発明を同様に適用することができる。
なお、固相合成のように反応に直接関与する試薬（反応物及び触媒）の一部の遊離を行わずに表面に結合させたまま反応させることも可能であるが、全ての試薬が液相中に存在する方が一般に反応効率が高いので、ペプチド合成や核酸合成などの固相逐次反応や、酵素固定等による試薬（触媒）の繰り返し使用を目的とする場合除いて、被固定試薬を全て遊離してから反応を行うことが望ましい。
【００５０】
【実施例】
［実施例１］
共有結合による固定方法
シリコンウェハーを基板とし、異方エッチングにより作製された容積１００ｐＬのチャンバ１２を有するチップ１０を使用して、既知であるプライマーセット１：５’−ＡＣＣＴＧＣＧＴＴＧＣＧＴＡＡＡＴＡ−３’、５’−ＧＧＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧＴＴＧＡＴＧ−３’及びプライマーセット２：５’−ＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＡＧＴ−３’、５’−ＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＡＡＧＡＧ−３’を用いて、それぞれＥｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのｇａｄＡＢ及びｕｉｄＡ領域のＰＣＲによる増幅を、別個のチャンバで独立に行う。
【００５１】
チャンバ１２の表面のシリコンを、酸素雰囲気下９００℃の加熱によって酸化し、γ−ＡＰＴＥＳ（γ−アミノプロピルトリエトキシシラン）によりアミノ基を導入する。さらにグルタルアルデヒドによりイミン結合を介してアルデヒド基を導入後、アミノ基修飾のプライマー溶液を被固定試薬溶液サブセットとしてチャンバ１２毎に滴下する。プライマーセット１及び２を別個のチャンバ１２へ滴下する。チャンバ１２表面のアルデヒド基とプライマーのアミノ基との間が縮合してイミン結合が形成され、各チャンバ１２に滴下したプライマーが固定される。
リンス後、反応溶液サブセット、すなわち試料ＤＮＡ、緩衝液、マグネシウム、ＢＳＡ、増幅酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、及び蛍光色素ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　社製）の混合溶液をピペッティングでチップ１０上に１回の操作によって一様に添加する。
【００５２】
カバーガラスを載せ圧着して密封した後、９５℃、１０分間加熱する。これにより、イミン結合によってチャンバ１２に固定されていた固定化プライマーが、チャンバ１２から遊離して他の試薬成分と混合し、ＰＣＲ反応溶液の調製が完了する。このとき、隣接する他のチャンバ１２の試薬溶液が混入したチャンバ１２は認められない。
その後、通常、この用途に使用される既知のポリメラーゼを使用してＰＣＲ処理を既知の条件にしたがって実施し、次いでＰＣＲ反応中に蛍光強度をモニタリングすることにより公知の方法で試料ＤＮＡの定量を行う。
【００５３】
この一連の操作によって、チャンバ１２内の試薬溶液が他のチャンバ１２に混入することなく、かつ操作性よく、各チャンバ１２内において適切にＰＣＲ処理を行うことができる。
共有結合で固定する方法は、結合様式によっては遊離に時間がかかり、被固定試薬がＰＣＲ反応中に徐々に溶液に放出されることになる（徐放性）。ＰＣＲ反応の初期は溶液中にテンプレートＤＮＡが少ないので、通常の反応条件では適切なプライミング対象を持たないプライマーが大量に存在し、これがプライマーダイマー等の副産物の発生を誘発する。プライマーを共有結合で固定する場合、徐放性により反応初期のプライマー濃度を抑えることができ、副産物生成を抑制できる。
【００５４】
［実施例２］
非共有結合による固定方法
チャンバ１２へのアミノ基導入までは実施例１と同様に行う。その後、抗ビオチン抗体をチャンバ１２に一様に添加し、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）−ＥＤＣ（塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）により抗体のカルボキシル基を活性化し、チャンバ１２表面のアミノ基との脱水縮合により抗体をチャンバ１２に固定化し、チャンバ１２の表面処理を終了する。チャンバ１２内をリンス後、作製されたビオチン化プライマーを、被固定試薬溶液セットとしてチャンバ１２毎に滴下し、抗ビオチン化抗体と結合させる。これにより、ビオチン化プライマーがチャンバ１２に固定される。
その後、加熱処理を９５℃、１分間とした以外は実施例１と同様に行って、固定化プライマーを遊離させ、ＰＣＲ処理を行う。
【００５５】
実施例２では、実施例１と同様に、チャンバ１２内の試薬溶液が他のチャンバ１２に混入することなく、かつ操作性よく、各チャンバ１２内において適切にＰＣＲ処理を行うことができる。
またこの方法では、抗体を用いているので、熱による抗原抗体結合の遊離が比較的速く、反応の迅速化や増幅酵素の失活抑制を図りつつ、適切にＰＣＲ処理を操作性よく行うことができる。
【００５６】
［実施例３］
物理的隔離による固定方法
チャンバ１２の容量を１０μＬとした以外は、実施例１と同様に加工したチャンバ１２を使用する。
プライマー及び塩化マグネシウムを被固定試薬溶液セットとしてチャンバ１２毎に滴下した後、加熱で溶融させた蝋をチャンバ１２毎に滴下、徐冷して、被固定試薬溶液セットに上層した状態で蝋を凝固させる。その後、加熱処理を９５℃、１分間とした以外は実施例１と同様に行って、固定化プライマーを遊離させ、ＰＣＲ処理を行う。
【００５７】
実施例３では、実施例１と同様に、チャンバ１２内の試薬溶液が他のチャンバ１２に混入することなく、各チャンバ１２内において適切にＰＣＲ処理を操作性よく行うことができる。実施例１及び２では、被固定試薬及びチャンバ１２の化学修飾（活性基導入、カップリング等）が必要であったが、実施例３では不要である。
【００５８】
［実施例４］
実施例１と同様にシリコンウェハーを基板として異方エッチングを施して、容積１００ｐＬのチャンバ１２を得る。次いで、ＵＶ硬化性シリコーン樹脂をチップ１０の上面にスピンコートにより塗布してから、上面のみにＵＶが照射されるようにフォトマスクをチップ１０上に配置して、ＵＶを照射する。その後、未硬化部分を除去して、チャンバ１２周囲にＵＶ硬化性樹脂が選択的に配置されたチップ１２を得る。
【００５９】
それから実施例１と同様にしてアミノ基を導入し、２５％グルタルアルデヒド水溶液中に４０℃、１２時間浸漬してアルデヒド基を導入し、アセトンでリンスする。次に、プライマー溶液を被固定試薬サブセットとしてチャンバ１２毎に滴下する。これにより実施例１と同様にチャンバ１２表面のアルデヒド基とプライマーのアミノ基との間をイミン結合によって固定する。
【００６０】
すべての試薬セットのチャンバ１２への添加が完了すると、カバー板１４をチップ２０上に載せる。このとき、チップ２０の上面には密着補助材２６としてのＵＶ硬化性シリコーン樹脂が塗布されているので、カバー板１４を載せて圧力をかけることによって、カバー板１４とチップ２０とがより強固に密着する。その後、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応処理を行う。
【００６１】
本実施例によれば、チップ２０の上面に密着補助材２６として接着性樹脂ＰＤＭＳが配置されているので、チャンバ１２の密封性がよく、隣接するチャンバ１２の反応溶液が他のチャンバ１２に移動して混じることがない。このため精度良く反応を行うことができる。
またアミド結合に比較して加熱で切れやすいイミン結合によってプライマーをチャンバ１２の表面に固定しているので、初期の熱変性に必要な時間を短縮することができる。
【００６２】
［実施例５］
ネガティブ型レジスト　ＳＵ−８　５０（Ｍｉｃｒｏ　Ｃｈｅｍ社製）をシリコン基板に塗布して、フォトリソグラフィーによりチップ２０の鋳型を作製する。この鋳型に、ＰＤＭＳ（ダウコーニング社製）を流し込み、８０℃で１時間、硬化させることにより、５００μｍ×５００μｍ角、深さ１００μｍ、０．０２５μＬのチャンバ１２を複数有する樹脂製のチップ２０を作製する。
またスライドガラスにＰＤＭＳ（ダウコーニング社製）を滴下してヘラで全面に延ばしてやや厚塗りし（１ｍｍ厚程度）、複写機用ＯＨＰシート（住友スリーエム）、押さえ用のスライドガラスを順に被せ、クランプを使用して挟み込んだ状態で８０℃、１時間加熱して硬化させる。クランプ、押さえ用のスライドガラスを取り除き、ＯＨＰシートをから剥がすことにより、ＰＤＭＳが片面に一様に配置されたカバー板１４を作製する。
【００６３】
このチップ２０に対して、反応性イオンエッチング装置（ＳＡＭＣＯ社製：ＲＩＥ−１０ＮＲ）を用いて酸素プラズマ処理（２００Ｗ、Ｏ２、８．８Ｐａ、４分間）し、続けて２％３−アミノプロピルトリメトキシシラン（Ａｖｏｄａｄｏ　Ｃｈｅｍ．社）のアセトン溶液に３０分間浸漬して、チャンバ１２表面にアミノ基を導入する。
【００６４】
被修飾のプライマー溶液を被固定試薬サブセットとしてチャンバ１２毎に滴下する。チャンバ１２内に滴下されたプライマーとチャンバ１２表面のアミノ基との間で静電結合が生じ、チャンバ１２の表面にプライマーが固定される。
リンス後、反応溶液サブセット（ＤＮＡ、最終濃度１．０〜５．０ｍＭのマグネシウム、及びＰＣＲ酵素ミックス（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　ＦａｓｔＳｔａｒｔ　ＤＮＡ　Ｍａｓｔｅｒ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ）の混合溶液）を、ピペッティングでチップ２０上に一様に添加する。
【００６５】
反応溶液サブセットをチップ２０上に添加した後、ＰＤＭＳコーティング済の面をチップ２０側に向けてカバー板１４をチップ２０上に載置し、ホフマン式ピンチコックで圧着・密封する。このとき、チップ２０全体が自己接着性のあるＰＤＭＳ樹脂で構成されているため、カバー板１４のＰＤＭＳと強固に密着する。その後、９５℃、１０分間の加熱を行って固定化プライマーを遊離させＰＣＲ反応溶液の調製を完了し、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応処理を行う。
【００６６】
本実施例によれば、チップ２０とカバー板１４の接触面とが自己接着性の樹脂で構成されているので、チャンバ１２の密封性を一層高くすることができ、他のチャンバ１２の反応液の混入をより一層確実に防止することができる。
またチップ２０自体を自己接着性の樹脂で構成しているので、チップ２０表面に接着性樹脂を塗布する工程を省略することができる。
更に、鋳型を利用してチップ２０を作製することができるので、一度鋳型を作製しておけば有用なチップ２０を生産性良く作製することができる。
【００６７】
【発明の効果】
本発明によれば、本発明は、複数の試薬溶液を混合して得られる反応溶液を複数調製する場合であっても、同一の操作を必要以上に繰り返すことなく簡便に調製することができる反応溶液調製方法及び反応容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態にかかるチップの部分斜視図である。
【図２】本発明の実施の形態にかかる核酸増幅方法を説明する図である。
【図３】本発明の他の実施の形態にかかるチップの部分斜視図である。
【符号の説明】
１０　　チップ（基板）
１２　　チャンバ（反応器、微小孔）
１４　　カバー板
２０　　チップ（基板）
２６　　密着補助材
【図１】
2004049230.tif 000003
【図２】
2004049230.tif 000004
【図３】
2004049230.tif 000005