(57)【要約】【課題】造血幹細胞を未分化の状態に維持したまま、自己増殖させるための細胞培養器材。【解決手段】哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞を培養器内に備えてなる細胞培養器材を提供する。特には、前記哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞が、培養する細胞と直接に接することができるように培養器内に設けられている細胞培養器材、あるいは前記哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞が、培養する細胞と、微孔性膜を介して接することができるように培養器内に設けられている細胞培養器材が好ましい。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞を培養器内に備えた細胞培養器材。
【請求項２】
前記哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞が、培養する細胞と接触状態で培養されるように培養器内に付着されている請求項１に記載の細胞培養器材。
【請求項３】
前記哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞が、培養する細胞と間接的接触状態で培養されるように培養器内に備えられている請求項１に記載の細胞培養器材。
【請求項４】
前記培養器内に微孔性膜をさらに備え、前記哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞が、該微孔性膜を介して培養する細胞と接触可能であるように備えられることにより、前記間接的接触状態が達成される請求項３に記載の細胞培養器材。
【請求項５】
微孔性膜と、哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞とを含み、
該微孔性膜により形成された袋状の空間内に、該微孔性膜にある微孔を介して膜外にある細胞と接触可能であるように該哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞を備えた細胞培養用膜体。
【請求項６】
前記ストローマ細胞が、ヒト由来のストローマ細胞または該ストローマ細胞を含むヒトの組織である請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養器材。
【請求項７】
前記ストローマ細胞が、マウス由来のストローマ細胞または該ストローマ細胞を含むマウスの組織である請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養器材。
【請求項８】
前記培養する細胞が、ヒトの臍帯血、骨髄、肝臓、脾臓又は末梢血に由来するＣＤ３４陽性細胞であり、培養により産生される細胞がＣＤ３４陽性細胞である請求項１〜４又は６、７のいずれかに記載の細胞培養器材。
【請求項９】
請求項１〜４又は６〜８のいずれかに記載の細胞培養器材と、栄養培地とサイトカインとを含む、ヒト由来のＣＤ３４陽性細胞を哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞と共に培養するための細胞培養キット。
【請求項１０】
ヒト由来のＣＤ３４陽性細胞を哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞と共に培養する工程を含む、造血幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、細胞培養器材に関する。さらに詳しくは、血液細胞、特に造血幹細胞または造血幹細胞から分化した血液細胞を培養するための細胞培養器材に関する。
【０００２】
【従来技術】
血液中には、生体機能を司る血球細胞として酸素運搬に関わる赤血球系、血小板を産生する巨核球系、感染防御に関わる顆粒球、単球／マクロファージなどの骨髄球系、免疫を担当するＴ細胞・Ｂ細胞などのリンパ球系の各細胞系列がある。これらの血液細胞は、共通の起源である造血幹細胞より分化・成熟して生じたものであるが、造血幹細胞には多能性を維持したまま自己増幅する性質と、上述の各細胞系列へと分化・成熟していく性質がある。
【０００３】
造血幹細胞は、主として骨髄中に多く存在することが知られており、骨髄移植は、急性白血病をはじめとする腫瘍性血液疾患や、重症免疫不全、アデノシンデアミナーゼ欠損症、再生不良性貧血等の疾患に対する治療法として、中心的位置を占めている。
【０００４】
近年、造血幹細胞が少量ながら末梢血にも存在することが明らかになった。そのため、造血幹細胞を含む末梢血に顆粒球コロニー刺激因子製剤（Ｇ−ＣＳＦ）を投与したものを用いた移植も普及しつつある（新しい造血幹細胞移植、南江堂、１９９８）。この方法は、骨髄移植が大量の骨髄細胞を必要とするためドナーの心身への負担が大きいのに対して、ドナーに対して心身への負担が軽減され、また白血球や血小板の回復が早いという利点がある。しかし、比較的高用量のＧ−ＣＳＦによる副作用もしばしば見られるため、骨髄採取よりは簡便であるが、決してドナーの安全性が高いとは言い切れない（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　Ｃｅｌｌ．　Ｍｏｌ．　Ｔｈｅｒ．，　３，　１０１−１０４，　１９９７）。
【０００５】
また近年、臍帯血が骨髄と同程度の造血幹細胞を含むことが明らかにされ、移植治療に有用であることが明らかにされた（Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．，　３２１，　１１７４−１１７８，　１９８９）。臍帯血は、骨髄や末梢血と比べて重症の急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生率が低く、その有用性が期待されている。しかしながら臍帯血の場合、採取量の少なさが問題とされ、１個体に由来する臍帯血の量では、体重４０ｋｇ程度までのレシピエントにのみ移植可能であることが問題である。（Ｂｌｏｏｄ，　８７，　３０８２，
１９９６）。
【０００６】
造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性の細胞集団として濃縮することができる。しかも不要な細胞、具体的には、骨髄球系細胞には分化しないリンパ球系細胞等を除去できる可能性があることから（Ｈｅｍａｔｏｌ．　Ｏｎｃｏｌ．　Ａｎｎ．，　２，　７８，　１９９４）、今日では、ＣＤ３４陽性細胞移植が行われるようになった（Ｂｌｏｏｄ，　７７，　１７１７，　１９９１；　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｏｎｃｏｌ．，　１２，　２８，　１９９４）。このため、前記のとおり造血幹細胞を多く含む臍帯血の採取量が少ないという問題を解決すべく、造血幹細胞を生体外で効率的に増幅する試みは近年盛んに行われている（Ｂｌｏｏｄ，　８７，　３０８２−３０８８，　１９９６）。ここで、造血幹細胞の増幅とは、造血幹細胞が分化により、多能性を有しない機能性細胞に分化し、増殖していくことと、造血幹細胞の自己増殖との両方を含む意味で用いられる。
【０００７】
これまでに報告されたＣＤ３４陽性細胞の増幅においては、増殖を促進する物質として、サイトカインが用いられてきた。サイトカインの候補としては幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン１（ＩＬ−１β）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、顆粒球・マクロファージコロニー形成因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー形成因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー形成因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質（ＰＩＸＹ３２１）などの種々のサイトカインを組み合わせた増幅法が研究されている。しかし、サイトカインの組み合わせによるＣＤ３４陽性細胞の増幅では、培養後の全血球細胞数は増加するものの、培養中に造血幹細胞の分化が誘導され、結果的には最終分化したＣＤ３４陰性の血球細胞が増加する一方で、ＣＤ３４陽性細胞自体はほとんど枯渇されてしまうと考えられている（Ｂｌｏｏｄ，８７，３０８２−３０８８，１９９６）。現時点では造血幹細胞を未分化の状態に維持したまま自己増殖を促進することが可能なサイトカインは単離されていない。
【０００８】
ＣＤ３４陽性細胞の他の増幅方法として、ヒト骨髄由来のストローマ細胞を株化し、この上で造血幹細胞・前駆細胞を維持・増殖させる方法が試みられている（Ｅｘｐ．　Ｈｅｍａｔｏｌ．，　２２，　４８２−４８７（１９９４））。また、特開平１０−２９５３６９号公報には、哺乳動物由来のストローマ細胞とＣＤ３４陽性細胞を、共培養することによりＣＤ３４陽性造血幹細胞を製造する方法が開示されている。しかし、この方法では、ＣＤ３４陽性細胞が分化していくために造血幹細胞自体はほとんど増幅しないか、むしろ最初の時点より減少してしまう。そのため、移植してもやがては血球細胞が枯渇するおそれがあり、移植のための技術としては不適当である。
【０００９】
さらに別の方法として、培養するＣＤ３４陽性細胞とストローマ細胞との接触がなくても、ストローマ細胞から産生される液性因子のみでＣＤ３４陽性細胞を培養することにより、ＣＤ３４陽性細胞を増幅することができるとの報告もある（国際特許出願公開第９３／２０１８４号公報）。しかし、この方法においても造血幹細胞は分化するのみで自己増殖しないために、上記方法と同様の理由で移植のための技術としては不適合である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べてきたように、造血再構築能を有する多能性造血幹細胞をはじめとするＣＤ３４陽性細胞の増幅においては、増幅を行う過程でおこる多能性を有しない機能性細胞への分化を抑制して、多能性を有するＣＤ３４陽性細胞自体の増殖を可能にすることが大きな課題となっている。また生体外で簡便に、安定して増幅でき、かつ安全性の高いＣＤ３４陽性細胞の培養法の開発が望まれている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、死滅したストローマ細胞との共存下において、ＣＤ３４陽性細胞である造血幹細胞を顕著に、かつ安全に自己増殖させることができ、必要に応じて栄養培地中にサイトカインを混合させると、ＣＤ３４陽性細胞である造血幹細胞をさらに増殖させること、また、造血幹細胞より若干分化段階の進んだ骨髄系前駆細胞群についても同様に増殖を誘導することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は、細胞培養器材であって、哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞を培養器内に備えたものである。
ここで、「死滅したストローマ細胞」とは、ストローマ細胞が凝固し、細胞内のタンパク質等が変性して、サイトカイン等を産生しなくなった状態をいう。生存しているストローマ細胞を死滅させるためには、適当な固定液でストローマ細胞を処理することができる。
【００１３】
本発明は、また、細胞培養器材であって、前記哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞が、培養する細胞と接触状態で培養されるように培養器内に付着されているものである。
「接触状態」とは、本発明に係る細胞培養器材を培養に使用する際に、培養器内に栄養培地等を加え、培養する細胞を添加したとき、死滅したストローマ細胞と培養する細胞とが、任意にいりまじって存在しており、十分に接することができる量及び状態で存在していることをいう。具体的には、死滅したストローマ細胞は、培養器内に、単層状に吸着固定されるように付着していることが好ましい。培養器として、ウェルを備えるプレートを用いる場合には、ウェルの壁面全体に死滅したストローマ細胞が単層状に付着している。また、「付着」とは、細胞が壁面から剥がれて培養液中に浮遊することのない状態をいう。
【００１４】
別の局面においては、本発明は、細胞培養器材であって、前記哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞が、培養する細胞と間接的接触状態で培養されるように培養器内に備えられているものである。
詳細には、前記培養器内に微孔性膜をさらに備え、前記哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞が、該微孔性膜を介して培養する細胞と接触可能であるように備えられることにより、前記間接的接触状態が達成される。このとき、死滅したストローマ細胞が培養器に単層状に付着され、その上に微孔性膜が設けられて、さらにその上から培養する細胞が間接的接触状態に置かれることが可能な状態でもよい。あるいは、死滅したストローマ細胞が培養器と接しない状態で、膜の中に備えられてもよい。
「微孔性膜」とは、死滅したストローマ細胞及び培養する細胞は通過することができない一方、水やアルコール等の溶液と、培養の際に使用する栄養培地に含まれる栄養成分、具体的には無機イオン類、糖類、サイトカイン類は通過できる大きさの孔を有する孔であることが好ましい。
【００１５】
また本発明は、細胞培養用膜体であって、微孔性膜と、哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞とを含み、該微孔性膜により形成される袋状の空間内に、該微孔を介して膜外にある細胞と接触可能であるように該哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞を備えたものも提供する。微孔性膜により形成される袋状の空間は、閉じていても、開いていてもよいが、死滅したストローマ細胞と培養する細胞との上記間接的接触状態を達成することができるものである。かかる細胞培養用膜体は、シャーレ、ウェルプレートなどの培養器を構成要素として含まない。別途準備する培養器に、この細胞培養用膜体を置いて、細胞の培養に用いるものである。
【００１６】
前記ストローマ細胞は、ヒト由来のストローマ細胞または該ストローマ細胞を含むヒトの組織、あるいは、マウス由来のストローマ細胞または該ストローマ細胞を含むマウスの組織であることが好ましい。
前記培養する細胞には、ヒトの臍帯血、骨髄、肝臓、脾臓又は末梢血に由来するＣＤ３４陽性細胞が含まれる。ＣＤ３４陽性細胞は、抗体を用いることにより単離することができ、造血幹細胞移植に用いられるものである。また、培養により産生されるのはＣＤ３４陽性細胞である。
【００１７】
さらに別の局面においては、本発明は、細胞培養キットであって、前述の細胞培養器材のいずれかと、栄養培地と、サイトカインとを含み、ヒト由来のＣＤ３４陽性細胞を哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞と共に培養するために使用されるものである。
サイトカインとしては、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６を用いることが好ましく、これに加え、可溶性サイトカイン受容体タンパク質である可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）を加えることがさらに好ましい。栄養培地は、通常、細胞を培養するのに必要な栄養培地を用いることができる。
【００１８】
さらに別の局面においては、本発明は、造血幹細胞の培養方法であって、ヒト由来のＣＤ３４陽性細胞を哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞と共に培養する工程を含む方法である。
ここでいう、「造血幹細胞」とは、造血幹細胞のみならず、造血幹細胞から分化した血液細胞をも含むものである。前述のいずれかの細胞培養器材又は細胞培養キットを用いて、ヒト由来のＣＤ３４陽性細胞を哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞と共に培養してもよい。
【００１９】
本発明の細胞培養器材及び細胞培養キットによれば、移植に有用な造血幹細胞を死滅したストローマ細胞とともに培養することで、造血幹細胞の分化を抑制して、自己増殖を促進することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。以下の説明は本発明を限定するものではない。
【００２１】
本発明に係る細胞培養器材を用いて培養を行う対象となるのは、造血幹細胞である。造血幹細胞自体は本発明に係る細胞培養器材の構成要素となるものではないが、細胞培養器材の構造と機能を説明するために、ここで、造血幹細胞について記載する。
【００２２】
「造血幹細胞」とは、赤血球、白血球、巨核球、血小板、Ｔ細胞、Ｂ細胞などの機能性細胞に分化する能力を有するとともに多能性を保持したまま自己増幅する細胞をいう。このような造血幹細胞は臍帯血、骨髄、肝臓中、脾臓、又は末梢血に存在する。
【００２３】
造血幹細胞は、分化して造血前駆細胞となり、さらに分化して前述の機能性細胞となる。造血幹細胞も造血前駆細胞もいずれも多能性を有するものであるが、機能性細胞は多能性を有しない。本来、造血幹細胞と造血前駆細胞は区別されるべきものであるが、概念上の定義であることもあり、しばしば区別せずに用いられる。本発明においても、造血幹細胞と造血前駆細胞の両方を併せて「造血幹細胞」という用語で標記している。用語の定義については、例えば「血液幹細胞の運命（羊土社）須田年生著」に詳しい記載がある。
【００２４】
造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性細胞集団に含まれていることが明らかとなっている。このためＣＤ３４抗原を利用して造血幹細胞を分離、濃縮することが行われており、体外増幅のための出発材料として利用されている（Ｂｌｏｏｄ，　８７，　３０８２−３０８８，　１９９６）。これらＣＤ３４陽性細胞は骨髄や臍帯血の血液細胞中に１〜２％存在している。
【００２５】
このような造血幹細胞は、あらゆる血液細胞へ分化する能力を維持したまま移植できるため、様々な病状の治療に有効であり、体外で増殖させることが求められているものである。
【００２６】
次に、本発明に係る培養器材について実施形態を挙げて説明する。
本発明の一実施の形態によれば、細胞培養器材は、前記哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞が、培養する細胞と接触状態で培養できるように培養器内に付着されているものである。
【００２７】
「培養器」とは、ＣＤ３４陽性細胞を増殖させるときに用いる容器をいう。このような培養器としては、固定処理を行う前のストローマ細胞が維持・生存でき、栄養培地を添加してＣＤ３４陽性細胞を培養することが可能な容器を用いることができる。
【００２８】
培養器の素材としてはガラス、合成樹脂、天然樹脂、金属、プラスチックなどが挙げられ、形状としては具体的には三角柱、立方体、直方体などの多角柱、三角錐、四角錐などの多角錘、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円柱（底面が円形、楕円形または半円形等を含む）、膜状などを挙げることができる。しかし、これらに限定されることなく、ＣＤ３４陽性細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる素材、形状のものを用いてもよい。具体的には、プラスチック製のウェルプレート、ガラス製のシャーレなどが挙げられる。ストローマ細胞が付着可能な素材からなる膜体の培養器であってもよい。あるいは、適切な容器と、死滅したストローマ細胞を付着させるための担体とからなる培養器であってもよい。
【００２９】
「ストローマ細胞」とは、骨髄、臍帯血、脾臓などに由来する基質細胞または間質細胞をいう。本発明においては、造血幹細胞を増殖する能力を有するストローマ細胞であれば、どのようなストローマ細胞も用いることができる。造血幹細胞を増殖する能力を有するストローマ細胞は、特にＣＤ３４陽性細胞の増殖を指示する性質を有するものである。
【００３０】
ストローマ細胞は、哺乳類由来のものを用いることができ、ヒト、マウス、ブタ、ヒヒから採取したものを用いることができる。特にヒト由来のストローマ細胞を用いることが好ましい。同種あるいは移植患者自己由来細胞を用いることはより安全性が高いためである。
【００３１】
「死滅したストローマ細胞」とは、組織、細胞のタンパク質を脱水や変性を起こさせて凝固した状態のストローマ細胞である。「死滅したストローマ細胞」は、代謝やタンパク質の生産などといった生命活動が停止した状態の細胞をいう。生きたストローマ細胞であれば、通常サイトカインの産生を行うが、死滅したストローマ細胞はサイトカインの産生も行うことがない。死滅したストローマ細胞の細胞表面上には、生存しているときに産生された細胞外マトリクスやプロテオグリカン等の天然高分子が残存している。
【００３２】
死滅したストローマ細胞は、ＣＤ３４陽性細胞の培養が可能な形態で、培養器内に設けられる。「細胞の培養が可能な形態」とは、具体的にはＣＤ３４陽性細胞と死滅したストローマ細胞が一つの栄養培地（培養液）中で任意の状態で存在している状態をいう。具体的には、ＣＤ３４陽性細胞と死滅したストローマ細胞が、接触状態、あるいは間接的接触状態にあることをいう。本実施の形態では、ＣＤ３４陽性細胞と死滅したストローマ細胞とが、特に、接触状態で培養されるように、死滅したストローマ細胞が培養器内に備えられている。
【００３３】
「接触状態」とは、ＣＤ３４陽性細胞と死滅したストローマ細胞とが任意に入り混じって存在して、双方が直接に接している状態であり、これらが整然と層状に並んでいる状態、一方の細胞間に他方の細胞が潜り込んだ状態のいずれの状態であってもよい。
【００３４】
ＣＤ３４陽性細胞は、培養を実施する際に加えられるものであって、本発明に係る細胞培養器材は、培養器内に死滅したストローマ細胞が備えられたものである。従って、上述の接触状態を達成するように培養器内に死滅したストローマ細胞が備えられる。具体的には、後から加えるＣＤ３４陽性細胞が接触しやすいように、層状に、培養器の表面に付着するように備えられる。あるいは、培養器が、容器と担体とからなる場合には、担体の表面上に死滅したストローマ細胞が層状に付着され、かかる担体を容器内に設置してもよい。培養器が膜状である場合には、膜上に層状に付着していてもよい。
【００３５】
ストローマ細胞を死滅させるためには、固定液を使用することができる。生きたストローマ細胞を後述の培養器に維持し、これに固定液を加えて、５分間〜１時間程度浸漬することにより、死滅した状態とすることができる。ストローマ細胞が死滅したことは、トリパンブルー、エリスロジンＢ、エオジンＹ等を用いた染色法によって判別することができる。
【００３６】
固定液の成分としては、メタノール、エタノール、アセトン、ピクリン酸、塩化第二水銀（昇汞）、クロム酸、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、カルボジイミド等のタンパク質分子架橋剤、重クロム酸カリウム、四酸化オスミウム、酢酸等が挙げられる。さらに前記固定液を複数組み合わせた固定液を使用することもできる。
【００３７】
固定液の組成としては、１０％ホルムアルデヒド水溶液、ＢＯＵＩＮ液（ホルムアルデヒド、ピクリン酸、氷酢酸混合液）、酢酸アルコール（酢酸、アルコール混合溶液）、Ｃａｒｎｏｙ液（アルコール、クロロホルム、氷酢酸混合液）、Ｓｕｃａ液（ホルムアルデヒド、昇汞、氷酢酸、食塩、三塩化酢酸混合水溶液）、Ｚｅｎｋｅｒ液（重クロム酸カリウム、硫酸ナトリウム、昇汞、氷酢酸混合水溶液）等が挙げられる。
【００３８】
ここで、本実施の形態に係る細胞培養器材の製造について説明する。例えば、ウェルプレートなどの培養器に、３ｘ１０４個の生きたストローマ細胞を準備し、一週間程度にわたってインキュベートして培養器に付着させる。その後、付着していないストローマ細胞を除去した後、固定液を用いた処理により付着したストローマ細胞を死滅させる。死滅させたストローマ細胞に対して、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の洗浄液を用いて固定液を洗浄し、本発明の細胞培養器材を得る。このようにして製造された細胞培養器材において、死滅させたストローマ細胞は、通常、培養器の壁面に単層を形成して付着しており、培養器の培養する細胞を添加する部分の内壁にコーティングされたような状態で存在する。
【００３９】
このようにして得られた細胞培養器材は、栄養培地、サイトカイン等を加え、培養する細胞を添加することで、培養に使用することができる。ストローマ細胞は死滅しているため、本発明の細胞培養器材は、常温で長期間、例えば半年〜１年間保存することができ、必要なときに使用することができる。
【００４０】
生きたストローマ細胞を用いて造血幹細胞の培養を行うとき、生きたストローマ細胞により産生されるサイトカインが造血幹細胞の分化を誘導する。そのため、造血幹細胞は自己増殖しても、分化が進行して、未分化の造血幹細胞自体はほとんど得ることができなかった。しかし、死滅したストローマ細胞はサイトカインの産生も行うことがないため、サイトカインによる造血幹細胞の分化が抑制される。その一方で、死滅したストローマ細胞の表面上に残存している細胞外マトリクスやプロテオグリカン等の天然高分子が、造血幹細胞を活性化または増殖支持することによって、結果的に造血幹細胞の自己増幅につながるためと推定される。このような死滅したストローマ細胞を培養器内に設けた本実施の形態による細胞培養器材によれば、造血幹細胞の分化を抑制して、自己増幅のみを促進するため、移植に適した造血幹細胞を大量に自己増殖することができる。
【００４１】
本発明の別の実施形態によれば、哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞が、培養する対象となるＣＤ３４陽性細胞と間接的接触状態で培養できるように培養器内に付着されている細胞培養器材が提供される。
【００４２】
死滅したストローマ細胞と培養器に関しては、先の実施の形態において記載したものと同様であるため、説明を省略する。本実施の形態は、死滅したストローマ細胞を培養器に備える形態が先の実施の形態と大きく異なる。
本実施の形態によれば、培養の際、死滅したストローマ細胞と培養する細胞とが、間接的接触状態となるように培養器内に、死滅したストローマ細胞が備えられる。「間接的接触状態」とは、ＣＤ３４陽性細胞と死滅したストローマ細胞とが、それぞれ微孔性の支持膜の片側と別の側に、微孔性の支持膜を隔てて層状に存在する状態をいう。
【００４３】
このとき、支持膜の孔の大きさは死滅したストローマ細胞とＣＤ３４陽性細胞の両方ともが通過できない大きさの孔であることが好ましい。具体的には、水、ナトリウムイオンや塩素イオンなどの電解質などが通過でき、脂肪酸、糖、タンパク質、ホルモンなどの高分子が通過できないセロハンのような膜であってもよいし、水、ナトリウムイオンや塩素イオンなどの電解質、脂肪酸、糖、タンパク質、ホルモンなどの高分子が通過できる膜であってもよい。好ましくは水、ナトリウムイオンや塩素イオンなどの電解質、脂肪酸、糖、サイトカイン等のタンパク質、ホルモンなどは通過でき、両方の細胞または一方の細胞の一部が突起状に突き出すことができる程度の大きさの孔を有する微孔性膜を用いることが好ましい。
【００４４】
微孔性膜の素材は、ＣＤ３４陽性細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる素材であってもよい。素材としては具体的にはポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどが挙げられる。
【００４５】
このような微孔性膜を用いて、間接的接触状態とするためには、袋状あるいは球形などの閉鎖系（密閉系）の微孔性膜を用いることができる。このとき、培養器内に閉鎖系の微孔性膜を設け、この微孔性膜の内部に死滅したストローマ細胞を納めることができる。
また、予め微孔性膜上で生きたストローマ細胞を培養し、細胞層を形成させた後に死滅処理をし、このような死滅したストローマ細胞層が付着した膜を、内部に死滅したストローマ細胞が位置するようにして袋状、あるいは球形に加工して細胞培養用膜体を作製することができる。この細胞培養用膜体は、ウェルプレート等の培養器に設置して用いることができる。
【００４６】
または、上記と同様の方法で死滅したストローマ細胞層が付着した状態の微孔性膜を、付着した死滅したストローマ細胞層が外側になるように袋状、あるいは球状に加工し、その内側であって、微孔性膜を介して死滅したストローマ細胞層と反対の側にＣＤ３４陽性細胞を入れて培養することができる形態としてもよい。
このように、間接的接触状態とするために用いる膜は、その膜上で生きたストローマ細胞に細胞層を形成させるために使用することができる。
【００４７】
あるいは、ストローマ細胞は、先の実施の形態と同様に培養器の内壁に付着させた状態で、培養器内に開閉可能な閉鎖系を構成できるように膜をさらに設けて、培養する際にＣＤ３４陽性細胞を膜の中に入れることができるようにしてもよい。
【００４８】
このような形態においては、膜は必要に応じて支持具を用いて設置してもよい。例えば、培養器内部を二分するように、支持具を用いて膜を張り、二分された一方の側にＣＤ３４陽性細胞が、膜を介して他方の側に位置する膜表面に死滅したストローマ細胞層が設けられるような形態とすることができる。
このときの支持具としてはＣＤ３４陽性細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる素材・形状のものを用いてもよい。支持台の素材としては具体的にはガラス、合成樹脂、天然樹脂または金属などが挙げられる。
【００４９】
ここに挙げた以外にも、膜を介して、ＣＤ３４陽性細胞と死滅したストローマ細胞とが接触できる形態であれば、本発明の培養器材とすることができる。膜は形状が一定しないで変化する任意の形状であってもよいし、形状の一定しているものであってもよい。具体的には平面状、半球形、水槽のような一部が開放されている形状、球形、チューブ状または形状が一定しないで変化する任意の形状でもよい。また膜の硬さは如何なるものであってもよい。
【００５０】
かかる間接的接触状態によりＣＤ３４陽性細胞の増殖を可能にする本実施の形態によれば、増幅後のＣＤ３４陽性細胞の単離が容易であるといった利点がある。
【００５１】
本発明のさらに別の実施形態によれば、前述のいずれかの細胞培養器材と、栄養培地と、サイトカインとを含む、ヒト由来のＣＤ３４陽性細胞を哺乳動物由来の死滅したストローマ細胞と共に培養するための細胞培養キットを提供する。このようなキットは、造血幹細胞を培養するために必要な培養器材及び試薬を備えたものであり、前述のいずれかの細胞培養器材を用いて簡便に細胞の培養を行うのに有利である。
【００５２】
ここで、「栄養培地」とは、培養する細胞、すなわち前述に定義されたＣＤ３４陽性細胞を、自己増殖を含め、増殖、分化、成熟または保存させるために用いられるものである。このような栄養培地は、基本成分としてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または必要に応じてサイトカイン等その他の成分もしくは血清のような生体成分を含有することもできる。
【００５３】
このような栄養培地としては、細胞培養に用いられるようなものであれば如何なる栄養培地を用いてもよく、栄養培地の種類としては、天然培地、半合成培地、合成培地、固形培地、半固形培地、液体培地などが挙げられる。具体的には、α−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などを挙げることができる。
【００５４】
「サイトカイン」とは、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子をいい、一般的に、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖・分化の調節作用などを示す物質である。本発明に係る栄養培地に添加されたサイトカインは、造血幹細胞を増殖させる働きをするものであり、使用するサイトカインは可能な限り造血幹細胞を未分化の状態に維持できるものが好ましい。
【００５５】
本発明において用いることができる具体的なサイトカインとしては、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ−１６）、インタ−フェロンα（ＩＦＮ−α）、インタ−フェロンβ（ＩＦＮ−β）、インタ−フェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、好酸球コロニー刺激因子、血小板コロニー刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３−リガンド（ＦＬ）、白血病阻害（阻止）因子（ＬＩＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ由来炎症性タンパク１α（ＭＩＰ−１α）などが挙げられ、好ましくはＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６などが挙げられる。
【００５６】
特に、造血幹細胞の培養において、分化を最大限に抑制して、自己増殖を促進するためには、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６を添加して用いることが好ましい。そのときの添加量は、ＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯについては、１〜２０　ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、ＩＬ−６については、５０〜２００　ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００５７】
本発明のキットには、その他の成分をさらに含むことができる。このような成分としては、特に制限は無いが、例えば、可溶性サイトカイン受容体タンパク質が挙げられる。可溶性サイトカイン受容体タンパク質は、培養する造血幹細胞に対し、未分化維持を増強するといった作用をする。
【００５８】
このような可溶性サイトカイン受容体タンパク質としては、具体的には、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）を用いることが好ましい。そのとき、栄養培地への添加量が、１００〜１０００　ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。このような可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）は、前述のサイトカインであるＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯ、ＩＬ−６とともに用いることが好ましい。ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒが複合体を形成し、これらがＳＣＦ、ＦＬ、ＴＰＯによる造血幹細胞の未分化維持作用を増強するからである。
【００５９】
本発明のキットは、造血幹細胞の自己増殖に非常に有効である死滅したストローマ細胞を備えてなる培養器材に、通常の細胞の培養に必要な成分をキットとして組み込むことで、簡便に細胞の培養を実施することを可能とする。
【００６０】
次に本発明に係る細胞培養器材を用いて、造血幹細胞、特にはＣＤ３４陽性細胞を培養し、自己増殖させる方法について説明する。
まず、増殖の対象となるＣＤ３４陽性細胞の調製につき説明する。ヒト臍帯血から、密度勾配遠心法に従って、一定の比重、詳しくは、１．０７７ｇ／ｍｌ以下の比重を有する単核球を採取する。これから、市販の分離装置を用いてＣＤ３４陽性細胞を分離し、さらにフィトエリスリン標識抗ＣＤ３４抗体を用いてＣＤ３４細胞を得ることができる。このようなＣＤ３４陽性細胞の単離方法は、当業者には既知の技術であり、その他にも適当な方法を用いて行うことができる。
【００６１】
死滅ヒトストローマ細胞層が設けられた本発明に係る細胞培養器材に、サイトカイン、可溶性サイトカイン受容体タンパク質、及び、必須培地成分を加え、ＣＤ３４陽性細胞を加えて共培養する。あるいは、本発明の培養器材を用いなくとも、本明細書で開示した方法により死滅したヒトストローマ細胞を得て、必要な成分と共にＣＤ３４陽性細胞を加えて共培養することもできる。
【００６２】
培養するにあたり、温度、浸透圧、光などの物理的環境条件、酸素、炭酸ガス、ｐＨ、酸化還元電位などの化学的環境条件としては死滅処理前のストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４陽性細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる環境条件であってもよい。好ましい条件を以下に示す。
【００６３】
温度については具体的には、３０℃〜４０℃であり、好ましくは３７℃である。浸透圧については具体的には生理条件における浸透圧であり、好ましくは生理食塩水と等しい浸透圧である。
【００６４】
光は暗室ほどの暗い条件であってもよいし、晴天時の外の明るさほどに明るくてもよい。
【００６５】
酸素濃度としては具体的には培養系が気相中の酸素濃度が１０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度〜気相中の酸素濃度が３０％の気相と接触している状態での酸素濃度であってもよく、好ましくは気相中の酸素濃度が２０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度の気相と接触している状態での酸素濃度である。
【００６６】
培養系において一般的にｐＨをコントロ−ルするためのｐＨとして具体的にはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０であり、好ましくは生理条件と同等のｐＨである。ｐＨをコントロ−ルする為には二酸化炭素を用いてもよいし、他のいかなる緩衝液を用いてもよい。炭酸ガスの濃度としては具体的には培養系が５％の気相と接触している状態での溶存炭酸ガス濃度である。
【００６７】
以上のような手順で培養した臍帯血由来の造血幹細胞について、自己増殖の割合を評価する必要があるが、造血幹細胞は、自己増幅能についてはいまだ実証されておらず、これを測定する系も確立されていない。従って、本発明の培養器材を用いて造血幹細胞を培養するときには、造血幹細胞の指標としては半固形培地でのコロニー形成法が用いられる。造血幹細胞から一段階分化して分化の方向が決定した細胞を造血前駆細胞と呼んでおり、造血前駆細胞は自己増幅能が無くインビトロで分化、増殖してコロニーを形成する。従って、前駆細胞は、通常、コロニー形成単位であるＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）として標記される。本発明においても顆粒球・単球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）の数を造血幹細胞数の指標としている。
【００６８】
このような造血幹細胞の培養方法を用いることで生体外において簡便に、安定して造血幹細胞を増幅することが可能となる。
【００６９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。本実施例における培養の際の造血幹細胞と死滅したヒトストローマ細胞の接触は、特に断わりのない限り接触状態を意味するものとする。また、本実施例において、ヒト由来の死滅したストローマ細胞を、「死滅ヒトストローマ」と、マウス由来の死滅したストローマ細胞を、「死滅マウスストローマ」という。
【００７０】
［実施例１．死滅ヒトストローマ細胞による造血幹細胞の増幅活性］
［（１）材料の調製］
本実施例で用いたサイトカインは、精製法によって得られたか又は遺伝子組換え法によって得られた市販のものであった。具体的には幹細胞因子（ＳＣＦ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、トロンボポエチン（ＴＰＯ、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ、Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社製）、インターロイキン６（ＩＬ−６）等である。また可溶性サイトカイン受容体として可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ、Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社製）を用いた。
【００７１】
［（２）ヒト臍帯血からのＣＤ３４陽性細胞の採取及び調製］
ヒト臍帯血は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いた密度勾配遠心法に従って、比重が１．０７７ｇ／ｍｌ以下の単核球を採取した。次に、ＣＤ３４陽性細胞とＣＤ３４陰性細胞をＣＤ３４プロジェニーター・アイソレーション・キット（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＢｅｎｄ／１０）社製）とＭＡＣＳマグネチック・セル　ソーティング・システム（Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ　ＧｍｂＨ社製）を用いて分離し、ＣＤ３４陽性細胞率をフローサイトメーターで測定した。方法は、細胞の一部にフィトエリスリン標識抗ＣＤ３４抗体（べクトン・ディキンソン社製）を添加して、氷上で３０分染色し、細胞を洗浄後、ＦＡＣＳキャリバー（べクトン・ディキンソン社製）で測定した。ＣＤ３４細胞の純度は８５〜９５％程度であった。
【００７２】
［（３）死滅ヒトストローマ細胞の調製］
健常人ボランティア骨髄細胞液１ｍｌから比重分離法で分離した単核球を２４ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに１０−６Ｍ　ハイドロコルチゾンを添加したミエロカルトＨ５１００（１２．５％ＨＳ及び１２．５％胎児牛血清（ＦＣＳ）、１０−４Ｍ　２−メルカプトエタノールを添加したα−ＭＥＭ：ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．製）で培養した。１週間後、非付着細胞を除去し、付着ヒトストローマ細胞単層を得た。次に２％グルタルアルデヒド水溶液１ｍｌを各ウェルに加え、３７℃、５分間処理した後にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１ｍｌで５回洗浄し、死滅ヒトストローマ細胞層を得た。
【００７３】
［（４）臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞と死滅ヒトストローマ細胞の共培養］
臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞（１．５ｘ１０３細胞／ｍｌ）を２４ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各々のウェル中に２０％胎児牛血清（ＦＣＳ）、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したα−ＭＥＭ培地１ｍｌを加え、サイトカインとして、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ（各１０ｎｇ／ｍｌ）あるいはＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ（各１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｓＩＬ−６Ｒ（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、死滅ヒトストローマ細胞上で接触培養した。
【００７４】
培養して２１日後、細胞を回収して全細胞数を測定し、その中から２００個を１　ｍｌのコロニーアッセイ用培地（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ　ＧＦ　Ｈ４４３４Ｖ　（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．　社製）に懸濁させ、２週間培養を継続し、２週間後に確認されたＣＦＵ−ＧＭ数を造血幹細胞として計測し、全細胞数から増幅倍率を求めた。なお、比較のためにサイトカインとしてＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ（各１０ｎｇ／ｍｌ）存在下、通常ヒトストローマ細胞上での接触培養と、ヒトストローマ細胞を使用しないＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ（各１０ｎｇ／ｍｌ）存在下による培養についても同様に実験を行った。
【００７５】
ＣＦＵ−ＧＭ増幅率の測定を行った結果を図１に示した。図中では２１日間の培養を行う前のＣＦＵ−ＧＭ総数を１として表した。図中では各群３ウェルの培養結果によって得られたＣＦＵ−ＧＭ増幅倍率の平均値±標準誤差で示した。ＣＦＵ−ＧＭ増幅倍率は死滅処理ヒトストローマ存在下（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ存在下）で１２８５±３５８倍、死滅処理ヒトストローマ存在下（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ、ＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒ存在下）では２０６０±３５９倍、通常ヒトストローマ存在下では４２６±１３．２倍、サイトカインのみでは８４．５±１１．３倍であった。
【００７６】
本実施例においては対照群であるサイトカインのみに比較して１５倍、通常ヒトストローマ存在下と比較して９倍のＣＦＵ−ＧＭ増幅効果が確認された。さらにはＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ、ＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒ存在下においては対照群であるサイトカインのみに比較して２４倍ものＣＦＵ−ＧＭ増幅効果が確認された。
【００７７】
［実施例２．死滅マウスストローマ細胞による造血幹細胞増幅活性］
［（１）材料の調製］
実施例１の（１）と同様のサイトカインを用いた。
【００７８】
［（２）ヒト臍帯血からのＣＤ３４陽性細胞の採取及び調製］
実施例１（２）と同様の方法でＣＤ３４陽性細胞を調製した。
【００７９】
［（３）死滅マウスストローマ細胞の調製］
マウス骨髄細胞液１ｍｌから比重分離法で分離した単核球を、２４ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに１０−６Ｍ　ハイドロコルチゾンを添加したミエロカルトＨ５１００（１２．５％ＨＳ及び１２．５％胎児牛血清（ＦＣＳ）、１０−４Ｍ　２−メルカプトエタノールを添加したα−ＭＥＭ：ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．社製）で培養した。１週間後、非付着細胞を除去し、付着マウスストローマ細胞単層を得た。次に２％グルタルアルデヒド水溶液１ｍｌを各ウェルに加え、３７℃、５分間処理した後にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１ｍｌで５回洗浄し、死滅マウスストローマ細胞層を得た。
【００８０】
［（４）臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞と死滅マウスストローマ細胞の共培養］
臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞（１．５ｘ１０３細胞／ｍｌ）を２４ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各々のウェル中に２０％胎児牛血清（ＦＣＳ）、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したα−ＭＥＭ培地１ｍｌを加え、さらにサイトカインとしてＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬ（各１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下に死滅マウスストローマ細胞上あるいは通常マウスストローマ細胞上で接触培養した。
【００８１】
培養して２１日後、細胞を回収して全細胞数を測定し、その中から２００個を１　ｍｌのコロニーアッセイ用培地（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ　ＧＦ　Ｈ４４３４Ｖ　（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．　社製）に懸濁させ、２週間培養を継続し、２週間後に確認されたＣＦＵ−ＧＭ数を計測し、全細胞数から増幅倍率を求めた。なお、比較のためにマウスストローマ細胞を使用しないサイトカインのみよる比較についても同様に実験を行なった。
【００８２】
ＣＦＵ−ＧＭ増幅率の測定を行った結果を図２に示した。図中では２１日間の培養を行う前のＣＦＵ−ＧＭ総数を１として表した。図中では各群３ウェルの培養結果によって得られたＣＦＵ−ＧＭ増幅倍率の平均値±標準誤差で示した。ＣＦＵ−ＧＭ増幅倍率は死滅マウスストローマ存在下で１３００±３６０倍、通常マウスストローマ存在下では６２４±２７．１倍、サイトカインのみでは１８０±２７．１倍であった。
【００８３】
【発明の効果】
本発明の細胞培養器材あるいは本発明に係る培養方法を用いれば、造血幹細胞の分化を抑制して、自己複製による増殖が可能となり、多能性を有する造血幹細胞を安定的に、かつ安全に製造することが可能である。
また、本発明の細胞培養器材は、予め死滅したストローマ細胞が付着した状態となっているため、培養するＣＤ３４陽性細胞と、必要な栄養培地等を加えるだけで、簡単にＣＤ３４陽性細胞の培養が可能となる。本発明に係る細胞培養キットを用いれば、さらに簡単にＣＤ３４陽性細胞の培養が可能となる。
造血幹細胞を大量に産生することで、任意の成人患者にも移植できる上に、数回にわたる継続投与も可能となり、骨髄移植を必要とする疾患の治療に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】死滅ヒトストローマ細胞による造血幹細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）の増幅倍率を示すグラフである。
【図２】死滅マウスストローマ細胞による造血幹細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）の増幅倍率を示すグラフである。
【図１】
2004024089.tif 000002
【図２】
2004024089.tif 000003