(57)【要約】【課題】所望の分子を細胞または核に効率よく送達するための送達系を提供すること。【解決手段】ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜トランスロケーション配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜トランスロケーション配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質。
【請求項２】
寒冷ショックドメインが、ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、真核生物Ｙ−ボックスタンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質Ｂ（ＤＢＰＢ）、ＤＢＰＡ、ＥＦＥ−１、ｍＲＮＰ３、ｍＲＮＰ４、ＦＲＧ　Ｙ１およびヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質１（ＮＳＥＰ１）からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
寒冷ショックドメインが、ＣｓｐＡ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、ヒトＹＢ−１およびＤＮＡ結合タンパク質ＡおよびＢならびにＦＲＧ　Ｙ１からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項４】
寒冷ショックドメインの機能的に等価な誘導体が、ＤＮＡ縮合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインを寒冷ショックドメインに挿入することにより改変される請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ＤＮＡ縮合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインが、ＤＮＡ縮合ドメイン（ＳＰＫＲ）３−４および正に帯電した核局在化配列（ＮＬＳ＋）からなる群より選ばれる請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
膜トランスロケーション配列が、タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）または膜融合配列である請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ＰＴＤが、配列番号：１　〜８からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＰＴＤが、配列番号：１　、２、４、５、６および７からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項９】
膜融合配列が、配列番号：９〜２１からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
膜融合配列が、配列番号：９、１０、１１、１２および２０からなる群より選ばれる請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）タンパク質伝達ドメインまたはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる融合タンパク質。
【請求項１２】
ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜融合配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる融合タンパク質。
【請求項１３】
さらに核局在化配列を含有してなる請求項１２記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる請求項１４記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる請求項１１記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる請求項１６記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる請求項１２記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる請求項１８記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる請求項２０記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
遺伝子送達のための細胞への核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）の送達における使用のための請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための請求項１１記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための請求項１１記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための請求項１２記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための請求項１２記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための請求項１１記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための請求項１２記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための請求項１３記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞に分子を送達するための新規ベクターと呼ばれる融合タンパク質に関連する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物における細胞への遺伝子物質の伝達は、治療上および商業上の重要性が増加している。例えば、遺伝子治療手順は、後天性および遺伝性の遺伝子欠損、癌、ならびにウイルス感染を修正するために使用される。ヒトにおいて人工の遺伝子を発現する能力は、他の療法による治療の影響を受けにくい多くの疾患を含む、多くの主要なヒト疾患の予防および／または治癒を促進する。しかしながら、生物学的膜は、生体系における区分の中心の天然バリアである。それゆえに、ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドは、一般に限定された治療価値であるとみなされる。多数の研究が、かかるポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドの送達の問題を克服するために行なわれている。
【０００３】
初期の研究のほとんどは、これらの細胞を形質転換するレトロウイルスベクターの使用に焦点を当てた。しかしながら、レトロウイルスに伴う多数の問題点が報告されている。例えば、一定の細胞型を感染させることは困難である。レトロウイルスは、典型的にはレセプターを介して細胞に入り、かかるレセプターが細胞に存在しないかまたは多数で存在しない場合、感染は可能でないかまたは効率が悪い。
【０００４】
多数の研究者が、ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドを細胞に送達するためのリポソーム系を開発した。リポソームは膜で囲まれた小さな球体であり、その中に適切なＤＮＡが閉じ込められて形成されている。しかしながら、この系はまた、固有の問題点を有している。リポソームの大きさの制御は困難であり、このために個々の細胞に対する送達の均一性を制御するのは困難である。さらに、リポソームの中身の漏出を阻止するのは困難であり、他の技術と同様に、細胞型特異性を管理するのは困難である。
【０００５】
最近、タンパク質伝達（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）ドメイン（ＰＴＤ）と呼ばれるいくつかのタンパク質の小さな領域が、分子を細胞に輸送するために開発されている（Ｆｉｓｃｈｅｒ　ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．１２，　Ｎｏ．６，　２００１）。かかるＰＴＤは、レセプター−またはトランスポーター−独立で、不飽和であり、かつエネルギーを消費しない方法で、自由に細胞膜を移動しうる。ＰＴＤは、１時間未満で細胞膜のバリアを横切りうる。哺乳動物細胞に影響を及ぼすＴＡＴ融合タンパク質の創造、単離および利用に対して基本的に必要なものは、Ｂｅｃｋｅｒ−Ｈａｐａｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　２４，　２４７−２５６，２００１に記載されている。Ｓｔｅｖｅｎらにおける、αヘリックス含量を強化し、アルギニン残基の位置を最適化する合成のＰＴＤ系列を合成した。いくつかのＰＴＤペプチドは、ＴＡＴと比較して有意に増大したタンパク質伝達ポテンシャルを所有した（Ｓｔｅｖｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６１，　４７４−４７７，　２００１年　１月１５日）。さらに、ＵＳＰ６，０９０，６１９は、新規な非ウイルスベクターの調製について記載しており、それは、所望のＤＮＡに結合して、ヒトまたは動物細胞の疾患したミトコンドリアをトランスフェクトするのに有用な組み合わせを形成しうる。ＵＳＰ６，３３９，１３９は、リガンドオリゴペプチド／ポリカチオン性ポリペプチド／エンドソーム放出オリゴペプチド／外因性ＤＮＡからなる４−エレメント複合体遺伝子伝達系、またはリガンドオリゴペプチド／ポリカチオン性ポリペプチド／外因性ＤＮＡからなる３−エレメント複合体を含有してなる成長因子レセプターに結合する遺伝子伝達系を提供する。
【０００６】
当該分野で送達ベクター系は、下記の１つ以上の障害に直面した。第１に、免疫応答は、ウイルスベクターおよびカチオン性リポソームが生存動物に注射される場合、それらによって惹起される。第２に、血流のような細胞の細胞外流体は、遺伝子カーゴ（ｃａｒｇｏ　）を希釈するかまたは最終的に消化し、それは、送達される遺伝子の損失を生じる。第３に、細胞膜のリン脂質二重層は、ヌクレオチド分子の侵入に対する天然のバリアーを形成する。それゆえ、ＤＮＡ遺伝子のような大きな分子は、細胞膜を自由な（能動的なまたは受動的な）輸送方法で細胞膜を横切り、外来ＤＮＡ遺伝子カーゴを細胞に送達できない。第４に、ゲル様細胞質はプロテアーゼおよび／またはヌクレアーゼ環境中に豊富にあり、そこでＤＮＡ遺伝子カーゴはエンドソーム捕捉の機構により分解される。第５に、細胞の細胞質におけるベクターＤＮＡカーゴは、第２のバリアー−−核膜に遭遇する。ＤＮＡ遺伝子カーゴは核膜を通過し、遺伝子が作用しうる核においてＤＮＡ遺伝子カーゴを放出しなければならない。第６に、たとえＤＮＡ遺伝子カーゴが細胞核に侵入する能力を有していたとしても、その送達効率は低い。
【０００７】
上記障害に基づき、所望の分子を細胞または核に効率よく送達するための送達系を開発する必要がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、所望の分子を細胞または核に効率よく送達するための送達系を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜トランスロケーション配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質に関する。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、
（１）　ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜トランスロケーション配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質、
（２）　寒冷ショックドメインが、ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、真核生物Ｙ−ボックスタンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質Ｂ（ＤＢＰＢ）、ＤＢＰＡ、ＥＦＥ−１、ｍＲＮＰ３、ｍＲＮＰ４、ＦＲＧ　Ｙ１およびヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質１（ＮＳＥＰ１）からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（３）　寒冷ショックドメインが、ＣｓｐＡ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、ヒトＹＢ−１およびＤＮＡ結合タンパク質ＡおよびＢならびにＦＲＧ　Ｙ１からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（４）　寒冷ショックドメインの機能的に等価な誘導体が、ＤＮＡ縮合（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインを寒冷ショックドメインに挿入することにより改変される前記（１）記載の融合タンパク質、
（５）　ＤＮＡ縮合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインが、ＤＮＡ縮合ドメイン（ＳＰＫＲ）３−４および正に帯電した核局在化配列（ＮＬＳ＋）からなる群より選ばれる前記（４）記載の融合タンパク質、
（６）　膜トランスロケーション配列が、タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）または膜融合配列である前記（１）記載の融合タンパク質、
（７）　ＰＴＤが、配列番号：１　〜８からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（８）　ＰＴＤが、配列番号：１　、２、４、５、６および７からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（９）　膜融合配列が、配列番号：９〜２１からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（１０）　膜融合配列が、配列番号：９、１０、１１、１２および２０からなる群より選ばれる前記（１）記載の融合タンパク質、
（１１）　ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）タンパク質伝達ドメインまたはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる融合タンパク質、
（１２）　ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜融合配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる融合タンパク質、
（１３）　さらに核局在化配列を含有してなる前記（１２）記載の融合タンパク質、
（１４）　さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる前記（１）記載の融合タンパク質、
（１５）　タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる前記（１４）記載の融合タンパク質、
（１６）　さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる前記（１１）記載の融合タンパク質、
（１７）　タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる前記（１６）記載の融合タンパク質、
（１８）　さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる前記（１２）記載の融合タンパク質、
（１９）　タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる前記（１８）記載の融合タンパク質、
（２０）　さらにタンパク質精製タグ化配列を含有してなる前記（１３）記載の融合タンパク質、
（２１）　タンパク質精製タグ化配列が、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる前記（２０）記載の融合タンパク質、
（２２）　遺伝子送達のための細胞への核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）の送達における使用のための前記（１）記載の融合タンパク質、
（２３）　遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための前記（１）記載の融合タンパク質、
（２４）　遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための前記（１１）記載の融合タンパク質、
（２５）　遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための前記（１１）記載の融合タンパク質、
（２６）　遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための前記（１２）記載の融合タンパク質、
（２７）　遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための前記（１２）記載の融合タンパク質、
（２８）　遺伝子送達のための細胞への核酸の送達における使用のための前記（１３）記載の融合タンパク質、
（２９）　遺伝子送達のためのインビボの細胞への核酸の送達における使用のための前記（１３）記載の融合タンパク質、
（３０）　トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための前記（１）記載の融合タンパク質、
（３１）　トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための前記（１１）記載の融合タンパク質、
（３２）　トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための前記（１２）記載の融合タンパク質、
（３３）　トランスジェニック動物の生産のための胚および生存動物への核酸の送達における使用のための前記（１３）記載の融合タンパク質、
である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
現代のバイオテクノロジーは、単にＤＮＡ遺伝子送達基盤に基づいて構築されている；例えば、嚢包性線維症、インスリン不足性糖尿病および血友病ＡおよびＢ等を含む体細胞遺伝子治療、およびトランスジェニック動物。これらの研究分野および商業上重要な論点の全ては、ヒトの健康管理改良の目標を達成するように、より効率がよく、実用的でかつ安全な遺伝子送達ベクターの確保を必要とする。
【００１２】
本発明は、ベクターとして使用される新規な融合タンパク質を提供する。本発明のベクターは、非ウイルスベクターであり、所望の核酸に結合でき、それを動物、細胞株および胚などのいずれの有機体へも効率的に送達できる。それは最少量のコストで大量に作製され得、トランスジェニック動物および遺伝子治療などの種々の分野で広く適用されうる。
【００１３】
本発明の組換え融合タンパク質
本明細書で使用される「融合タンパク質」は、標的ポリペプチドをコードする第１アミノ酸配列と、標的タンパク質のいずれのドメインとも異なりかつ実質上ホモログでないドメイン（例えば、ポリペプチド部分）を規定する第２またはそれ以上のアミノ酸配列との融合に関する。
【００１４】
本発明は、ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜トランスロケーション配列またはその機能的に等価なペプチドおよび／またはその誘導体を含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質を提供する。
【００１５】
寒冷ショックドメイン
本発明のいずれの適切な寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体も、本発明の融合タンパク質に使用されうる。寒冷ショックドメイン（ＣＳＤ）を選択する理由は、その利点により充分説明される：（１）ＣＳＤは、一般的に保存された核酸結合ドメインであり、それは原核生物および真核生物界に優勢に存在し、その結果免疫応答の危険性を最小化するかまたはかかる危険性を零に下げさえすることに寄与する。それゆえに、ＣＳＤは、遺伝子送達タンパク質ベクターの構築のための最も適切な候補である。ＣＳＤは、遺伝子送達ベクターを受ける宿主の大きな免疫応答を生じないので、（２）ＣＳＤの内因性核酸結合作用は、細胞の外側と内側において異なるＮａ＋／Ｋ＋イオン分布に適応しうる。それは、ＣＳＤが送達プロセスの間に遺伝子カーゴを失なうことなく、高い効率の遺伝子送達を達成することが非常に起こりうることを意味し、（３）アルファウイルス、フラビウイルスの外被糖タンパク質が、宿主細胞の膜の挿入にβバレル型構造を採用し、したがって、ＣＳＤとの融合誘導（ｆｕｓｏｑｕｅｎｉｃ）ペプチドイン−フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合が、エンドソーム捕捉または直接の細胞膜融合から免れうることを最近Ｌｅｓｃａｒらは提案している（Ｌｅｓｃａｒ，Ｊ，　、Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ａ，、Ｗｅｉｎ，Ｍ．Ｗ．　、Ｎａｖａｚａ，Ｊ．　、Ｆｕｌｌｅｒ，Ｓ．Ｄ．　、Ｗｅｎｇｌｅｒ，Ｇ．、Ｗｅｎｇｌｅｒ，Ｇ．およびＲｅｙ，Ｆ．Ａ．（２００１）。セムリキ森林熱ウイルスの融合糖タンパク質殻：エンドソームのｐＨで融合誘導（ｆｕｓｏｇｕｅｎｉｃ）活性のためにプライムされる（ｐｒｉｍｅｄ）二十面体集合。Ｃｅｌｌ　１０５、１３７−１４８　およびＫｕｈｎ，Ｒ．Ｊ．　ら、Ｃｅｌｌ　１０８、７１７−７２５　；２００２）。
【００１６】
ＣＳＤは、既に構造的によく特徴づけられており、それは逆平行、５鎖βバレル構造と呼ばれ、ＯＢ−フォールドとして示される。それゆえ、ＣＳＤに類似する構造を有するＯＢ−フォールドファミリーは、本発明の融合タンパク質において使用されうる。多くの研究結果は、ＣＳＤが、一本鎖核酸に結合しうることを示している。例えば、寒冷ショックドメインの外側の表面上のＲＮＰ−１およびＲＮＰ−２　ＲＮＡ結合モチーフならびにフェニルアラニン、リジン残基は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ結合を担っている（Ｂｙｃｒｏｆｔ　ら、Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．８８、２３５−２４２　、１９９７年１月２４日）。Ｉｚｕｍｉ　らは、Ｙ−ボックス結合タンパク質−１が一本鎖核酸に結合することを示した（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１、Ｖｏｌ．２９、Ｎｏ．５、１２００−１２０７　）。好ましくは、寒冷ショックドメインは、ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＣ、ＣｓｐＤ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、真核生物Ｙ−ボックスタンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質Ｂ（ＤＢＰＢ）、ＤＢＰＡ、ＥＦ−１、ｍＲＮＰ３、ｍＲＮＰ４、ＦＲＧ　Ｙ１およびヌクレアーゼ感受性エレメント結合タンパク質１（ＮＳＥＰ　１）からなる群より選ばれる。より好ましくは、寒冷ショックドメインは、ＣｓｐＡ、ｒｐｌ　Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメイン、ヒトＹＢ−１およびＤＮＡ結合タンパク質Ｂからなる群より選ばれる。
【００１７】
本発明のＣＳＤは、上記説明した種に限定されることなく、いずれの他の供給源から得られたホモログ配列をも含むことが理解されるだろう。上記開示により、当業者は、核酸に結合しうるいずれのＣＳＤホモログもまた本発明の融合タンパク質に使用しうることを理解しうる。
【００１８】
本発明のＣＳＤの機能的に等価な誘導体およびそのホモログはまた、本発明の融合タンパク質において使用されうる。ＣＳＤまたはそのホモログは、二本鎖核酸の結合を改変しうる。ＣＳＤの「機能的に等価な誘導体」およびそのホモログは、参照分子と同様に機能して所望の結果を達成する組換え的に作製された分子または化学的に合成されたポリペプチドを含む。したがって、ＣＳＤの機能的に等価な誘導体およびそのホモログは、内部でまたはそのアミノ末端もしくはカルボキシ末端で生じる単一または複数のアミノ酸付加、置換および／または欠失を含む誘導体、ならびにＤＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ縮合ドメインの挿入などの任意の改変を含む誘導体を包含する。ＣＳＤは、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに結合できるように修飾しうることも証明されている。例えば、Ｗａｎｇらは、真核生物の対応物のＹＢ−１タンパク質由来の正に帯電したアミノ酸と交換したドメインにより改変されたＣｓｐＡの寒冷ショックドメインが、二本鎖ＤＮＡ結合活性の獲得を生じうることを見出した（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　３８（３）：　５２６−５３４．　２０００　）。
【００１９】
本発明のＣＳＤは、二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡ結合活性を有する誘導体を得るために改変され得、それはＣＳＤにＤＮＡ縮合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインのいずれかを挿入することによりなし遂げられうる。ＤＮＡ縮合ドメインは、より多くのＤＮＡおよび／または縮合ＤＮＡ分子と結合して、ＤＮＡアーゼ消化に耐性であるヌクレオソーム様構造を形成しえ、それにより、より少ない融合タンパク質が使用される。本発明により、二本鎖ＤＮＡに結合するように寒冷ショックドメイン／リボソームタンパク質Ｓ１　ＲＮＡ結合ドメインを改変しうるいずれの適切なＤＮＡ縮合または結合ドメインも、本発明で使用しうる。例えば、適切なＤＮＡ縮合配列またはＤＮＡ結合配列は、ＳＶ４０のラージＴ抗原、Ｍｙｃ、ＹＢ１タンパク質および他の推定のＮＬＳなどの正に帯電したアミノ酸のアルギニン、リジンが豊富な、ヒストン、高速移動群（ＨＭＧ）タンパク質または核局在化配列（ＮＬＳ）に由来するＤＮＡ縮合ドメイン（ＳＰＫＲ）３−４である。
【００２０】
膜トランスロケーション配列
本発明の融合タンパク質の膜トランスロケーション配列は、タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）および膜融合配列ならびにその機能的に等価なペプチドまたは誘導体などのタンパク質伝達と呼ばれるプロセスで生物学的膜を効率よく横切る能力を持つものである。タンパク質伝達は、慣用のレポーター−、トランスポーター−、またはエンドソーム−媒介様式を介して生じないことが知られている。膜トランスロケーション配列は、迅速にかつ効率よく分子を細胞に形質導入する。膜トランスロケーション配列の例を、下の表に示す。
【００２１】
2004035409.tif 000002
【００２２】
本発明の１つの好ましい態様は、ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体ならびにｉｉ）膜トランスロケーションドメインを含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質を提供することである。ＰＴＤが細胞膜および核膜を横切って核酸を送達しうることは、当該分野で公知である。ＣＳＤおよびＰＴＤをあわせることにより、本発明の融合タンパク質は、所望の核酸を細胞質および細胞核に十分に送達しうる。いくらかのＰＴＤならびにそれらの特性、特徴および効力を研究により見出した（Ｆｉｓｃｈｅｒ　ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．，２００１，Ｖｏｌ．１２，　Ｎｏ．６，　８２５−８４１；Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、Ｔｉｐｓ−Ｍａｒｃｈ　２０００，　Ｖｏｌ．２１；Ｂｅｃｋｅｒ−Ｈｅｐａｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　２４，　２４７−２５６，２００１；　およびＨｏら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６１，　４７４−４７７，２００１年１月１５日）。例えば、Ｔａｔは、ウイルス株に依存する８６〜１０２アミノ酸の長さの転写活性化因子であり、ＨＩＶの複製に関与する。最小のＴａｔ伝達ドメインは、塩基性残基（ｂａｓｉｃ　ｒｅｓｉｄｕｅ　）４９〜５７である。単純ヘルペスウイルス１由来の３８−ｋＤａの構造タンパク質であるＶＰ２２は、優れた細胞内輸送特性を有する。最小のＶＰ２２伝達ドメインは、塩基性残基２６７〜３００である。Ａｎｔｐは、キイロショウジョウバエのホメオティック転写因子であり、ヘリックス２と３の間のβターンを有する３つのαヘリックスから構成される。Ａｎｔｐの３番目のαヘリックス（残基４３〜５８）は、伝達に必要である。
【００２３】
好ましくは、ＰＴＤは配列番号：１〜８からなる群より選ばれる。より好ましくは、ＰＴＤは配列番号：１、２、４、５、６および７からなる群より選ばれる。
【００２４】
本発明の別の態様は、ｉ）寒冷ショックドメインおよびそのホモログまたは機能的に等価な誘導体を含有してなる、細胞または核への所望の分子の送達のための融合タンパク質を提供することである。膜融合配列が細胞膜に分子を移動しうることもまた、当該分野で公知である。ＣＳＤおよび膜融合配列をあわせることにより、本発明の融合タンパク質は、所望の核酸を細胞質に送達しうる。所望の核酸を細胞核に送達するために、融合タンパク質はさらに核局在化配列を含有する。例えば、１つの典型的な膜融合配列は、ＰｒｅＳ２−ＴＬＭである。ＰｒｅＳ２は、そのトランスロケーションモチーフがＰｒｅＳ２−ＴＬＭと呼ばれる透過性ペプチドである。ＰｒｅＳ２−ＴＬＭは、ＰｒｅＳ２タンパク質の残基４１〜５２の両親媒性αヘリックスに対応する。このペプチドは、植物細胞を含む種々の細胞を貫通しうると思われる。好ましくは、膜融合配列は、配列番号：９〜２１からなる群より選ばれる。より好ましくは、膜融合配列は、９、１０、１１、１２および１３からなる群より選ばれる。
【００２５】
タンパク質精製タグ化配列
本発明の融合タンパク質は、タンパク質精製タグ化配列をさらに含みうる。本発明の精製タグ化配列は、融合タンパク質の任意エレメントに過ぎず、タンパク質の精製のためだけのものである。本発明の融合タンパク質は、化学的精製技術により精製されうる。例えば、Ｔａｔ−ＰＴＤ含有タンパク質は、ヘパリンカラムにより精製されうる（Ｈａｋａｎｓｓｏｎ　ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｃｉｅｎｃｅ　（２００１）、１０：２１３８−２１３９。さらに、ＤＮＡカラムはまた、本発明の融合タンパク質の精製に使用されうる。
【００２６】
本発明のタンパク質精製タグ化配列は、遺伝子送達タンパク質ベクターとのＮ−またはＣ−末端融合でありうる。好ましくは、タンパク質精製タグ化配列は、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６タグからなる群より選ばれる。より好ましくは、タンパク質精製タグ化配列は、Ｈｉｓ６タグである。
【００２７】
本発明の融合タンパク質の調製
本発明の融合タンパク質は、該タンパク質の発現を可能にする条件下で、組換えベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養し、それにより産生されたタンパク質を単離することにより産生されうる。
【００２８】
本発明の融合タンパク質の発現に適したＤＮＡ構築物、すなわち組換えＤＮＡ分子が、本発明において使用され得る。本発明のタンパク質の発現のために、ＤＮＡ構築物は、本発明の融合タンパク質を発現する発現ベクターにクローン化される。発現ベクターは、もちろん、前記タンパク質の発現に選択された宿主細胞の性質に従って選択される。適切なかかる発現ベクターは市販されている。適切な発現ベクターが、Ｎｏｖａｇｅｎ．Ｃｏから提供されるｐＥＴ系の細菌プラスミドなどの原核生物発現ベクターである場合、発現は、好ましくは原核生物宿主、より好ましくは微生物宿主、特に大腸菌において行われる。
【００２９】
本発明の融合タンパク質の応用
本発明は、送達ベクターとして融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、インビトロおよび特にインビボでトランスフェクションの高い効率を有し、細胞、胚および生存動物に遺伝子を送達しうる。前記融合タンパク質により行われる遺伝子送達は、種特異的、さらに個体特異的な方法で行われうる。それゆえ、本発明の融合タンパク質は、遺伝子治療およびトランスジェニック動物の生産の分野において有効なツールである。
【００３０】
以下の実施例は、説明のために提供されるものであり、限定のためではない。
【００３１】
【実施例】
実施例１
本発明の融合タンパク質のクローニングおよび構築
大腸菌株ＤＨ５αの単一コロニーをピックアップし、次いで１００μｌの滅菌水に加えた。得られた溶液を５分間沸騰させた。短い遠心分離の後、１０μｌのアリコートを取り出し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＣｓｐＡ遺伝子増幅のＤＮＡテンプレートとして使用した。プライマー１およびプライマー２を、大腸菌由来のＣｓｐＡ遺伝子を増幅するために使用した。プライマー１および２の配列を以下に列挙する：
プライマー１；
５’−ｇｃｔａｇｃＡＴＧＴＣＣＧＧＴＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＧＴＡＴＣＧＴＡＡＡ−３’
プライマー２；
５’−ｃｔｃｇａｇＡＴＴＡＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＡＣＧＴＴＡ−３’（小文字はＮｈｅＩ切断部位を示す。下線の小文字はＸｈｏＩ切断部位を示す）
【００３２】
２５サイクルのＰＣＲ（アニーリング温度を５５℃、１分に設定した）の後、ＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲル電気泳動により解析し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ産物精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，　Ｃｏ．　）により精製した。精製したＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏ．　）にクローン化し、組換えプラスミドのスクリーニングを、製造業者の技術マニュアルにより行い、プラスミドｐＧＥＭ（Ｔ）／ＣｓｐＡを得、次いでＤＮＡ配列決定により確認した。それゆえ、本発明の寒冷ショックドメインにＤＮＡ縮合または結合ドメインを挿入することによりさらに改変されたかかる寒冷ショックタンパク質Ａ（ＣｓｐＡ；寒冷ショックドメイン）は、二本鎖核酸に結合させるために使用される。
【００３３】
融合タンパク質Ｉ：融合タンパク質の最もシンプルな形態は、ＴＡＴおよびＣＳＤに由来するＮＬＳ＋／ＰＴＤの組み合わせにより構成され、ｒＴＡＴと呼ばれる（図１参照）。ＤＮＡ結合／ＮＬＳ＋／ＰＴＤ、Ｔａｔペプチド配列のリバース形態（ｒＴａｔ）は、以下の合成オリゴヌクレオチドによりコードされていた：
オリゴ（１）：
５’−ｔａＴＧＧＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＡＡＣＧＴＣＧＴＡＡＡＡＡＧＣＧＣＣＧＴＴ−３’
オリゴ（２）：
５’−ｃｔａｇＡＡＣＣＧＣＧＣＴＴＴＴＴＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＣＣＡ−３’
【００３４】
融合タンパク質ＩＩ：融合タンパク質の第２形態は、ＴＡＴに由来するＮＬＳ＋／ＰＴＤと（ＳＰＫＲ）４およびＣＳＤのＤＮＡ縮合配列との組合せから構成され、（ＳＰＫＲ）４−ｉＴＡＴ−ＣｓｐＡと呼ばれる（図２参照）。ＤＮＡ縮合配列（ＳＰＲＫ）４は、以下の合成オリゴヌクレオチドによりコードされていた：
オリゴ（３）：
５’−ｔａＴＧＧＧＣＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＧＣＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＧＣＴＣＴ
ＣＣＴＡＡＡＣＧＣＴＣＴ　ＣＣＴＡＡＡＣＧＴＧＧＴＴ−３’
オリゴ（４）：
５’−ｃｔａｇＡＡＣＣＡＣＧＴＴＴＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＴＴＡＧＧＡＧＡＧＣＧ
ＴＴＴＡＧＧＡＧＡＧ　ＣＧＴＴＴＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＡ−３’
【００３５】
１００ｐｍｏｌのそれぞれオリゴ（１）およびオリゴ（２）またはオリゴ（３）およびオリゴ（４）を別々に混合し、９５℃で５分間加熱した。アニールした二本鎖オリゴヌクレオチドを、緩徐に４℃に冷却し、２０℃で一晩保存した。アニールした二本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端標識を、製造業者の薦めによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏ．から購入）およびＡＴＰを用いて行った。３７℃で１時間のインキュベーションの後、反応を熱不活化により停止し、次いでフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（ｖ／ｖ／ｖ＝２５：２４：１；Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ　Ｃｏ．　）により抽出した。アニールした二本鎖オリゴヌクレオチドを、グリコーゲン（Ｒｏｃｈｅ　Ｃｏ．　）および冷無水エタノール（Ｍｅｒｃｋ　Ｃｏ．　）により沈殿させた。
【００３６】
Ｔａｔペプチド配列のリバース形態（ｒＴａ）またはＤＮＡ縮合配列（ＳＰＫＲ）４をコードする合成オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ．Ｃｏｍ．　）により、各々、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ処理ｐＧＥＭ（Ｔ）／ＣｓｐＡにクローン化し、大腸菌株ＤＨ５αに形質転換し、各々、ｐＧＥＭ（Ｔ）／ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡおよびｐＧＥＭ（Ｔ）／（ＳＰＫＲ）４−ＣｓｐＡ　ＤＮＡプラスミドを得た。膜トランスロケーション活性を有する、改変（ＳＰＫＲ）４−ＣｓｐＡをさらに構築するために、我々は、ＣｓｐＡの部分コード配列に相補的であるプライマー３および４を用い、ＴＡＴ由来のＰＴＤコード配列をプライマー４に組み入れてＤＮＡプラスミドｐＧＥＭ（Ｔ）／（ＳＰＫＲ）４−ＣｓｐＡをＰＣＲテンプレートとして用いた。２５サイクルのＰＣＲの後、ＰＴＤ配列を、Ｔａｑ酵素（Ｔａｋａｒａ．Ｃｏ．から購入）を用いてプライマー３および４によりｐＧＥＭ（Ｔ）／（ＳＰＫＲ）４−ＣｓｐＡに導入した。ＰＴＤプライマー３および４の配列を以下に列挙する：
プライマー３：
５’−ＮＮＮＮＮＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＧＴＡＣＧＡＡＣＡＣＡＴＣ−３’
プライマー４：
５’−ＮＮＮＮＮＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＧＣＣＧＴ
ＣＡＡＣＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＧＴＣＡＧＡＡＡ．　（下線の文字はＢａｍＨＩ切断部位を示す）
【００３７】
アニーリング温度は５４℃で１分に設定する。２５サイクルのＰＣＲの後、得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製キットにより精製し、ＤｐｎＩおよびＢａｍＨＩ消化に供した。制限酵素消化の後、ＤＮＡを１％アガロースゲル（１×ＴＡＥ）において分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ．Ｃｏ　）によりＤＮＡを精製した。精製ＤＮＡを自己連結させ、次いで大腸菌株ＤＨ５αに形質転換し、ｐＧＥＭ（Ｔ）／（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡプラスミドを得た。
【００３８】
発現ベクターの構築
ｐＧＥＭ（Ｔ）／ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡプラスミドによりコードされる融合タンパク質配列を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ消化に供し、次いで１％アガロースゲルにおいて分離し、ＤＮＡインサートとして使用したｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡ融合タンパク質のコード配列をそれぞれ含むＤＮＡ断片を切り出した。発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ　Ｃｏ．　）を同じ制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで処理し、次いでＤＮＡインサートｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡ融合タンパク質コード配列にそれぞれ連結し、次いで大腸菌株のＤＨ５αを形質転換し、ｐＥＴ２８ａ／ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたはｐＥＴ２８ａ／（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡを得、次いでｐＥＴ発現ベクターをＤＮＡ配列決定に供する。配列決定により、本発明の融合タンパク質の発現のための、それぞれ、ｐＥＴ２８ａ／ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたはｐＥＴ２８ａ／（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡプラスミドが大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラス細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍから購入）に形質転換されたことが確認された。
【００３９】
本発明の融合タンパク質の発現および精製
ｐＥＴ２８ａ／ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたはｐＥＴ２８ａ／（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡプラスミドを保有する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラス細胞をＬＢ（Ｋａｎ＋、Ｃｍ＋）プレート上で増殖させた。単一コロニーをピックアップし、２ｍｌのＬＢブロス（Ｋａｎ＋、Ｃｍ＋）に播種し、次いで３７℃で４時間インキュベートした。さらなるインキュベーションのために光学密度ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで、細菌培養物の１ｍＬアリコートを４００ｍＬのテリフィック（ｔｅｒｒｉｆｉｃ）ブロス（Ｋａｎ＋、Ｃｍ＋）に播種した。最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、次いで３７℃で５〜７時間さらにインキュベートした。ＩＰＴＧ誘導性大腸菌細胞を、遠心分離により収集した。得られたペレットを、さらなるタンパク質精製のために冷凍庫中−７０℃で保存した。
【００４０】
本発明の融合タンパク質の精製
本発明のタンパク質の精製を、ｐＥＴシステムの製造業者の指示マニュアルに従って行った。ＩＰＴＧ誘導性発現大腸菌宿主ペレットを、８Ｍ尿素を含有する１×Ｈｉｓ結合バッファー（５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾールおよび２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．９）に再懸濁し、次いで超音波処理により細胞を破壊した。超遠心の後、超音波処理した上清画分をニッケルイオンアフィニティカラムに供し、次いでカラムを、８Ｍ尿素を含有する１０容積の１×結合緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのイミダゾールおよび２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．９）および８Ｍ尿素を含有する１×洗浄緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．９）で洗浄した。Ｈｉｓ６タグ融合タンパク質を、８Ｍ尿素を含有する１×溶出緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのイミダゾール、２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ７．９）によりカラムから溶出させた。Ｈｉｓ６タグタンパク質を、４Ｍ尿素溶液、次いで滅菌Ｈ２　Ｏに対して透析した。透析したタンパク質を凍結乾燥し、タンパク質粉体を１×ＰＢＳ溶液に溶解させ、タンパク質濃度をＢＣＡ（ＰＩＥＲＣＥ．Ｃｏ　）の方法により決定した。精製融合タンパク質を５％〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて解析し、クーマシーブルーでゲルを染色した（図３参照）。得られたタンパク質溶液は、核酸結合アッセイ（ゲル遅延またはＥｔＢｒ排除アッセイ）の用意ができており、その遺伝子送達活性について試験した。
【００４１】
実施例２
本発明の融合タンパク質のＤＮＡ結合能力
手短に説明すると、０．５μｇレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ．　から購入した）を、１×ＰＢＳ緩衝液の存在下で種々の量の融合タンパク質ベクターｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡとともにインキュベートした。室温で３０分間のインキュベーションの後、ＤＮＡ−タンパク質複合体を１％アガロースゲル（１×ＴＢＥ）において分離し、ＥｔＢｒで染色し、写真を撮った。大きなＤＮＡ−タンパク質複合体が形成されると、レポータープラスミドＤＮＡは、融合タンパク質結合によりゲルのトップウェルに遅滞し、それゆえ、ゲル内に泳動できず、ＥｔＢｒでウェルを染色できなかった（図４参照）。
【００４２】
実施例３
融合タンパク質ベクターおよびｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドによるＨｅｌａ細胞培養物のインビトロでのトランスフェクション
血清被覆カバーガラス上にプレーティングしたサブコンフルエント、単層のＨｅｌａ細胞のオーバーナイト増殖物（約１０６　細胞）を、２回の無血清ＤＭＥＭ培地および５回の１×ＰＢＳ緩衝液で穏やかに洗浄し、次いで５μｇのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１のみでまたは融合タンパク質（ｒＴａｔまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡ）−レポーターＤＮＡプラスミド複合体（５μｇ）のいずれかでそれぞれ細胞を処理した。３７℃で１時間のＨｅＬａ細胞のインキュベーションに、０．４５ｍｌの新鮮な血清＋ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃で６時間インキュベートし、および１ｍｌの新鮮な血清＋ＤＭＥＭ培地を加え、さらにインキュベートした。ＥＧＦＰタンパク質発現でトランスフェクしたＨｅｌａ細胞の観察を、インキュベーションの２４時間後に蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ．Ｃｏ．　）により直接行った。図５に示されるように、融合タンパク質ｐＥＧＦＰ−Ｎ１複合体でトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞は、細胞において有意なグリーン蛍光シグナルを示す。結果は、本発明の融合タンパク質が細胞にＤＮＡを効率的に送達しうることを示す。
【００４３】
実施例４
本発明の融合タンパク質およびｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドによりインビトロでトランスフェクトされた帯除去マウス胚
トランスフェクションに用いたマウス胚を、本質的にはＧｏｒｄｏｎら（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｗ．　およびＲｕｄｄｌｅ，Ｆ．Ｈ．　（１９８３）．　、マウス胚への遺伝子移入、前核注射によるトランスジェニックマウスの産生、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，　Ｐａｒｔ　Ｃ．，　１０１，　４１１−４３３　）およびＨｏｇａｎ，　Ｂ．　、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，　Ｆ．およびＬａｃｙ，　Ｅ．　（１９８６）　マウス胚の操作：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）に記載のように調製した。手短には、ＩＣＲ非近交系株をＮＴＵ研究動物センター（Ｔａｉｐｅｉ）から購入し、次いでＳｉｇｍａ　から購入した２．５ＩＵの妊馬血清ゴナドトロピン（Ｇ４５２７　）の注射、続いて４８時間後の５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ．Ｃｏ．，Ｃ８５５４　）の注射により過排卵させ、ＩＣＲ雄とともに個々に一晩ケージに入れた。マウス胚の１つの細胞を、ｈＣＧ注射後２４時間に卵管フラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）から収集した。マウス胚を、Ｍ２培地（Ｓｉｇｍａ．Ｃｏ．　）中の０．５％プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ．Ｃｏ、Ｐ５１４７）のアリコートとともに３７℃で５分間処理し、透明帯を取り出し、Ｍ２培地および１×ＰＢＳ緩衝液で穏やかに数回洗浄し、次いで０．７５μｇの対照プラスミドｐＣＤＮＡ３．１またはｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドを使用した以外はＨｅｌａ細胞のトランスフェクションと同じ条件下で、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍから購入した対照プラスミドｐｃＤＮＡ３．１または融合タンパク質ベクター（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡおよびレポーターｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドのいずれかでトランスフェクトした。３７℃で１５分のインキュベーションの後、１ｍｌのＭ１６培養培地（Ｓｉｇｍａ．Ｃｏ．　，Ｍ７２９２）を添加し、次いで胚を鉱油（Ｓｉｇｍａ．Ｃｏｍ．，Ｍ８４１０）とともにマウントした。インキュベーションの２４時間おきに、胚を、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　Ｃｏ．　）によりＥＧＦＰタンパク質発現について調査した。図６に示すように、融合タンパク質（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミド（左）は、蛍光顕微鏡写真において有意なグリーン蛍光シグナルを示し、これは融合タンパク質がＤＮＡ　ｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドを胚に首尾良く送達しうることを示す。
【００４４】
実施例５
本発明の融合タンパク質を用いたレポーターＤＮＡプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１のマウスへの送達
２０μｇのＤＮＡプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１を、１×ＰＢＳ緩衝液中の本発明の融合タンパク質ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡとともに混合し、ＲＴ℃で１５分間インキュベートし、それぞれマウスに腹腔内に注射した。４８時間後、マウスを屠殺し、その肝臓を凍結組織切片に供し、次いで共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ．Ｃｏ．　）によりＥＧＦＰタンパク質発現を観察した。図７は、本発明の融合タンパク質ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡまたは（ＳＰＫＲ）４−ｉＴａｔ−ＣｓｐＡがインビボで肝細胞にＤＮＡプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１を首尾良く送達し得たことを示す。
【００４５】
実施例６
本発明の融合タンパク質のＲＮＡ結合能力
ヒト５ｓ　ｒＤＮＡのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ（Ｔ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ．Ｃｏ．　Ｅｌｏｎｇ　Ｌｉｎ　博士から寄贈）にクローン化した。ｐＧＥＭ（Ｔ）／ｈ５Ｓ　ｒＤＮＡプラスミドをＳｐｅＩで消化し、次いで１％アガロースゲル（１×ＴＡＥ）において分離した。線状ｐＧＥＭ（Ｔ）／ｈ５Ｓ　ｒＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル精製キット（ＱＩＡＧＥＮ．Ｃｏ．）により精製した。ヒト５ＳｒＲＮＡをＲｉｂｏＭＡＸ／Ｔ７大規模ＲＮＡ産生システム（Ｐｒｏｍｅｇａ．Ｃｏ．　）を用いることにより合成し、ＵＴＰ〔α−３２Ｐ〕（８００ｃｉ／ｍｍｏｌ，１０ｍＣｉ／ｍｌ；ＮＥＮ．Ｃｏ．　）を用いてヒト５Ｓ　ｒＲＮＡの均一な標識を、製造業者の指示マニュアルによって行った。インビトロ合成したヒト５Ｓ　ｒＲＮＡを１２％ＵＲＥＡ−ＰＡＧＥにおいて分離し、次いでＵＶ陰影法によりゲルから精製した。ヒト５Ｓ　ｒＲＮＡの酢酸アンモニウムおよびエタノール沈殿後、５分間の沸騰水浴において加熱することにより変性し、次いで室温に緩徐に冷却し、−２０℃で一晩保存した。１２５ｎｇのヒト５Ｓ　ｒＲＮＡを種々の量の本発明のタンパク質ｒＴＡＴタンパク質とともに混合し、ＲＴ℃で３０分間インキュベートし、次いでＲＮａｓｅＴ１（１０Ｕ；Ａｍｂｉｏｎ．Ｃｏ．）ありまたはなしで処理し３７℃にて１０分間さらにインキュベートした。結合複合体を８％未変性ＰＡＧＥ（０．５ＸＴＢＥ）で分離し、次いで１０％のさらなる酢酸でゲルを固定化し、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーに供した。図８に示すように、ＲＮａｓｅ−耐性結合複合体を記号「＊」　で示す。
【００４６】
【発明の効果】
本発明は、遺伝子治療およびトランスジェニック動物の産生の分野で有効なツールとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の融合タンパク質、ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡをコードする遺伝子の構築物が単純化されたフローチャートにより表されることを示す。ＣｓｐＡ遺伝子は、プライマー１および２を用いてＰＣＲにより大腸菌から増幅し、ＴＡＴ−ＰＴＤペプチド配列のリバース形態をコードするアニールした合成オリゴ１および２の挿入による二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ結合活性を得、ＣｓｐＡ遺伝子に導入し、次いで得られた本発明の改変遺伝子（ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡ）をｐＥＴ２８ａ発現ベクターにサブクローン化した。
【図２】図２は、本発明の融合タンパク質、（ＳＰＫＲ）４−ｉＴＡＴ−ＣｓｐＡをコードする遺伝子の構築が、単純化されたフローチャートにより表されることを示す。ＣｓｐＡ遺伝子は、プライマー１および２を用いてＰＣＲにより大腸菌から増幅し、ＤＮＡ縮合配列（ＳＰＫＲ）４およびＰＴＤ配列をコードするアニールした合成オリゴ３および４の挿入により二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ結合活性を得、プライマー３および４を用いたＰＣＲ増幅により改変ＣｓｐＡ遺伝子にさらに導入し、次いで得られた本発明の改変遺伝子をｐＥＴ２８ａ発現ベクターにサブクローン化した。
【図３】図３は、融合タンパク質の誘導および精製が製造業者の指示に従って行なわれ、精製タンパク質が５％〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で解析され、クーマシーブルーを用いてゲルが染色されたことを示す；レーン１はｐＥＴ２８ａ／融合タンパク質の全細胞溶解物である；レーン２はｐＥＴ２８ａ／融合タンパク質の超音波処理した上清１である；レーン３はｐＲＴ２８ａ／融合タンパク質の超音波処理した上清２である；レーン４はｐＥＴ２８ａ／融合タンパク質の超音波処理したペレットである；レーン５はニッケル−ビーズアフィニティカラムクロマトグラフィ後のフロースルー画分である；レーン６は１×結合緩衝溶中に２０ｍＭイミダゾールを含有する洗浄画分である；レーン７は、溶出緩衝液中に６０ｍＭイミダゾールを含有する溶出物１画分である；およびレーン８は、溶出緩衝液中に６０ｍＭイミダゾールを含有する溶出物２画分である；レーン９はＡｍｅｒｓｈａｎ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｏｍｐａｎｙから購入したタンパク質分子量マーカーである；レーン１０は精製ｉＴａｔタンパク質（０．２５μｇ）である；ならびにレーン１１は精製ｒＴａｔタンパク質（１．０μｇ）である。
【図４】図４は、ゲル遅滞アッセイを示す。０．５μｇのレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ．　から購入）を、１×ＰＢＳ緩衝液の存在下で、種々の量のタンパク質ベクター、「ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡ」または「ｉＴＡＴ−ＣｓｐＡ」とともにインキュベートした。室温で３０分間のインキュベーションの後、ＤＮＡ−タンパク質複合体を、１％アガロースゲル（１×ＴＢＥ）において分離し、ＥｔＢｒでゲルを染色した。
【図５】図５は、（１）ＤＮＡプラスミドなし（左パネル）、（２）ｒＴＡＴ−ＣｓｐＡ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１複合体（中央）、および（３）（ＳＰＲＫ）４−ｉＴＡＴ−ＣｓｐＡ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１でトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞からのグリーン蛍光タンパク質発現を示す。細胞とＤＮＡ−タンパク質複合体との１時間のインキュベーションの後、０．４５ｍＬの血清＋ＤＭＥＭブロスを添加し、３７℃で６時間インキュベートし、次いで１ｍＬの血清＋ＤＭＥＭブロスを添加し、細胞をさらに３７℃で２４時間インキュベートし、蛍光顕微鏡によりＥＧＦＰ遺伝子発現を調査した。
【図６】図６は、マウス胚にトランスフェクトした本発明の融合タンパク質ベクターｉＴＡＴ−ＣｓｐＡ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１複合体に由来するグリーン蛍光タンパク質発現を示す。帯除去マウス胚を、０．７５μｇのＤＮＡプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（左パネル）またはｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポーターＤＮＡプラスミド（右パネル）、それぞれとともに本発明のタンパク質ベクター、ｉＴＡＴ−ＣｓｐＡでトランスフェクトした。インキュベーションの間隔の時間の後、マウス胚を、蛍光顕微鏡によりグリーン蛍光タンパク質発現を調査した。
【図７】図７は、ｉ．ｐ．注射により本発明のタンパク質ベクターの複合体ｒＴＡＴ−またはｉＴＡＴ−ＣｓｐＡ−ｐＥＧＦＰ−Ｎ１　ＤＮＡ複合体で処理したマウスに由来する、肝臓の凍結組織切片を示す。４８時間後、マウスを屠殺し、次いで共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ．ｃｏｍ．）により肝臓におけるグリーン蛍光タンパク質発現を観察した。
【図８】図８は、本発明のタンパク質、ｒＴＡＴおよびヒト５Ｓ　ｒＲＮＡを用いて行った電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【外国語明細書】
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