(57)【要約】【課題】インターフェロンτの分泌動態を解明するために効果的な検出、定量が可能な測定系を開発すること。【解決手段】配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるｃＤＮＡにより誘起される、ウシインターフェロンτに対する特異的な抗体を用いることを特徴とするウシインターフェロンτの免疫学的測定法並びにウシインターフェロンτを含む検体と上記のウシインターフェロンτに対する特異的な抗体を、標識したウシインターフェロンτに加え、該抗体に対する標識したウシインターフェロンτと検体中のウシインターフェロンτとの競合反応を生起させ、検体中のウシインターフェロンτの量を測定することを特徴とするウシインターフェロンτの免疫学的測定法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるｃＤＮＡにより誘起される、ウシインターフェロンτに対して特異的な抗体を用いることを特徴とするウシインターフェロンτの免疫学的測定法。
【請求項２】
ウシインターフェロンτを含む検体と請求項１記載のウシインターフェロンτに対する特異的な抗体を、標識したウシインターフェロンτに加え、該抗体に対する標識したウシインターフェロンτと検体中のウシインターフェロンτとの競合反応を生起させ、検体中のウシインターフェロンτの量を測定することを特徴とするウシインターフェロンτの免疫学的測定法。
【請求項３】
標識したウシインターフェロンτが放射性同位元素で標識したものである請求項１記載のウシインターフェロンτの免疫学的測定法。
【請求項４】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるｃＤＮＡにより誘起される、ウシインターフェロンτに対して特異的な抗体を含むことを特徴とするウシインターフェロンτ測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウシインターフェロンτの測定法に関し、詳しくはウシの胚や栄養膜細胞が分泌するウシインターフェロンτあるいは組換えにより作出されたウシインターフェロンτを含む溶液中のウシインターフェロンτを測定する方法に関する。この方法は、ウシ胚が分泌するウシインターフェロンτあるいは組換えにより作出されたウシインターフェロンτの効果的な測定法である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ウシ胚が分泌するウシインターフェロンτあるいは組換えにより作出されたウシインターフェロンτの測定（あるいは検出）方法としては、インターフェロン（以下、ＩＦＮと略記することもある。）が有する性質である抗ウイルス活性を、ある種の細胞に特定のウイルスを感染させ、その阻止力価を検定する生物検定（非特許文献１）もしくはその存在の有無について抗体を用いて検出するイミュノブロット法（非特許文献２）等がある。
これらの方法を用いることにより、ＩＦＮ共通の力価としてウシインターフェロンτの力価を示すこと、あるいは抗体に反応するウシインターフェロンτの有無の評価が可能である。
しかし、いずれの検出法も、操作方法が煩雑である上、多検体処理が難しいなど、満足し得る技術ではなかった。しかも、抗ウイルス活性による生物検定では、ＩＦＮ類の活性の総和として表されるため、ウシインターフェロンτの活性をＩＦＮαやＩＦＮβ等の他の抗ウイルス作用を有する物質の活性と区別することができない。また、イミュノブロット法では検出感度が十分でない等の問題を抱えている。
そこで、これらの問題点を解消したウシインターフェロンτの測定法の開発が強く要望されている。
【０００３】
一方、ＩＦＮは、生体内でリンパ球や線維芽細胞等の様々な細胞が生産する生理活性タンパク質で、抗ウイルス作用や抗腫瘍作用等を有することが知られている。
ＩＦＮには、α、β、γの主要サブタイプがあり、それぞれＩＦＮα、ＩＦＮβおよびＩＦＮγと呼ばれている。
これらのうちＩＦＮαには、抗ウイルス作用が異なる近縁タンパクが存在し、これらはＩＦＮαファミリーと呼ばれている。また、ＩＦＮαとＩＦＮβは類似した性質を持っていることから、ＩＦＮαとアミノ酸配列の相同性が高いＩＦＮとして見出されたＩＦＮωおよびτとを合わせて、タイプ１ＩＦＮと呼ばれている。
【０００４】
ところで、タイプ１ＩＦＮに含まれるインターフェロンτ（以下、ＩＦＮτと略記することもある。）は、反芻動物において着床前の栄養膜（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）　細胞によって産生される妊娠認識に関与する因子として単離されたタンパク質であり、アミノ酸配列レベルではＩＦＮαと５０〜７０％の相同性がある（非特許文献３）。ウシのＩＦＮτはＩｍａｋａｗａ　らによって単離され（非特許文献４）、ウシおよびヒツジＩＦＮτ間のアミノ酸配列の相同性は８０．４％である。
ＩＦＮτは、プロスタグランジンＦ２　α（この物質は妊娠していない反芻家畜において、卵巣の黄体の生理学的および内分泌学的な退行へ誘導する）の子宮からの分泌を阻害することが知られている（非特許文献５）。これは、抗黄体退行作用と呼ばれ、この作用を持つＩＦＮτは、妊娠認識の確立に寄与しているものと考えられている。
【０００５】
また、ＩＦＮτを子宮内に投与することで、反芻家畜の発情周期延長効果が確認されており（非特許文献６）、ＩＦＮτには受胎率向上を含めた利用が期待されている。その他の生理活性としては、抗ウイルス作用に加え、細胞増殖抑制作用があることが見出されている。
さて、畜産分野でのＩＦＮτは、ウシの受胎促進関連の生理活性物質として利用される可能性が高い。様々な発現系で作出される組換えウシＩＦＮτを、ウシＩＦＮτ特異的に検出並びに定量し、独自の量として示すことが産業利用の上で必要である。しかし、ウシＩＦＮτに特異的な測定系が未だ確立されておらず、これらの早期解明のために効果的な検出並びに定量が可能な測定系の開発が待たれている現状である。
【０００６】
【非特許文献１】
日本化学会編、新生化学実験講座、第１２巻、３７２−３７８　（１９８９）
【非特許文献２】
Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１６６：　３６８−３７９　（１９８７）
【非特許文献３】
Ｎａｔｕｒｅ，　３３０；　３３７，　１９８７
【非特許文献４】
Ｍｏｌ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，　３；　１２７−１３９，　１９８９
【非特許文献５】
Ｊ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　Ｆｅｒｔ．，　７６；　８４１，　１９８６
【非特許文献６】
Ｊ．　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ．，　７８（９）；　１９２１−１９３１，　１９９５
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ウシ胚よりウシＩＦＮτ（以下、ｂ　ＩＦＮτと略記することもある。）のクローンを得、組換え体および　ｂＩＦＮτに対する特異抗体を作出した。これらを用いることにより、ウシ胚が分泌する　ｂＩＦＮτあるいは組換えにより作出された　ｂＩＦＮτを、生物検定あるいはイミュノブロット法によらないで、　ｂＩＦＮτの検出および定量が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の本発明は、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるｃＤＮＡにより誘起される、ウシインターフェロンτに対して特異的な抗体を用いることを特徴とするウシインターフェロンτの免疫学的測定法である。
請求項２記載の本発明は、ウシインターフェロンτを含む検体と請求項１記載のウシインターフェロンτに対する特異的な抗体を、標識したウシインターフェロンτに加え、該抗体に対する標識したウシインターフェロンτと検体中のウシインターフェロンτとの競合反応を生起させ、検体中のウシインターフェロンτの量を測定することを特徴とするウシインターフェロンτの免疫学的測定法である。
請求項３記載の本発明は、標識したウシインターフェロンτが放射性同位元素で標識したものである請求項１記載のウシインターフェロンτの免疫学的測定法である。
請求項４記載の本発明は、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるｃＤＮＡにより誘起される、ウシインターフェロンτに対して特異的な抗体を含むことを特徴とするウシインターフェロンτ測定用キットである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の　ｂＩＦＮτの測定法は、　ｂＩＦＮτに対して特異的な抗体を用いた免疫学的測定法を用いることにより、　ｂＩＦＮτを検出・測定することを特徴とするものである。
本発明の方法を適用できる対象は、　ｂＩＦＮτを含有する溶液である。また、本発明におけるＩＦＮτとは、タイプ１に分類される分子種を意味している。
【００１０】
ｂＩＦＮτの測定においては、上記　ｂＩＦＮτを放射性同位元素、例えば１２５Ｉにて標識する。該標識した　ｂＩＦＮτに対し、測定すべき　ｂＩＦＮτを含む検体とともに、一定量の配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるｃＤＮＡにより誘起される、　ｂＩＦＮτに対する特異的な抗体（以下、一次抗体と略することもある。）並びに一次抗体に対する二次抗体を反応させ、該一次抗体に対する標識　ｂＩＦＮτと検体中の　ｂＩＦＮτとの競合反応により、溶液中に標識　ｂＩＦＮτと一次抗体（抗　ｂＩＦＮτ抗体）および二次抗体からなる免疫複合体を形成させ、沈澱させた免疫複合体（ｂｏｕｎｄ；　Ｂ）　と液層の部分（ｆｒｅｅ；　Ｆ）とを分離した後、沈澱物中の該標識　ｂＩＦＮτのシグナルを測定することにより、測定すべき　ｂＩＦＮτの量を知る。一次抗体並びに二次抗体の添加量は、標識　ｂＩＦＮτや検体中の　ｂＩＦＮτの状態を考慮して、適宜選択することができる。
【００１１】
前記したように、本発明の方法を実施するにあたり、ウシ胚より　ｂＩＦＮτのｃＤＮＡクローンを得、組換え体および　ｂＩＦＮτに対する特異的な抗体を作出する。
ｂＩＦＮτのｃＤＮＡクローンは、ＩＦＮα遺伝子およびＩＦＮβ遺伝子は増幅せず、ＩＦＮτ遺伝子のみが増幅されるように設計した１対のプライマー（配列表の配列番号１および２）を用いて、体外受精由来ウシ透明帯脱出胚盤胞より得られた栄養膜細胞、ウシ子宮より回収した胎子の栄養膜細胞などから抽出したｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法に供し、シグナルペプチド領域を含む　ｂＩＦＮτ　ｃＤＮＡ（配列番号３）を増幅し、ｐＣＲＩＩにクローニングする。
【００１２】
続いて、これをトランスファーベクターｐＡｃＹＭ１にリクローニングし、バキュロウイルスのＤＮＡと共にＳＦ２１ＡＥ細胞、カイコ細胞（ＢｍＮ細胞：ＢｏＭｏ細胞）、鱗翅目ヤガ科の昆虫細胞〔Ｓｆ９細胞、ＩＰＬＢ　ＳＦ−２１ＡＥ細胞（ＳＦ２１ＡＥ細胞）（ハスモンヨトウガ；Ｓｐｏｄｅｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｄａ由来）　、ＢＴＩ　ＴＮ５Ｂ１−４細胞（ＴＮ５細胞）（イラクサキンウクバ；Ｔｒｉｃｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　由来）　等の細胞〕に同時トランスフェクションを行い、常法にしたがって組換えウイルスを得る。
次に、この組換えウイルスを昆虫細胞に感染させて培養し、培養上清に組換え型　ｂＩＦＮτを分泌、蓄積させた後、精製し、当該精製物の抗ウイルス活性を測定する。
ＩＦＮτの抗ウイルス活性は、ウシ腎由来細胞（ＭＤＢＫ細胞）とシンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ　ｖｉｒｕｓ）を用い、一般に知られている抗ウイルス活性測定法（日本化学会編、新生化学実験講座、第１２巻、３７２−３７８（１９８９）、東京化学同人発行）にしたがって測定することができる。
【００１３】
次に、　ｂＩＦＮτに対する特異的な抗体は、上記ヤガ細胞発現系由来　ｂＩＦＮτを、常法にしたがってアジュバントと等量混合して雌家兎の皮内に投与した後、追加免疫を繰り返し行う。得られた血清を免疫学的手法で検定して目的とする特異的な抗体を得る。この家兎血清が一次抗体である。
一方、二次抗体の抗家兎ヤギ血清は、家兎ＩｇＧ　を常法にしたがってアジュバントと等量混合してヤギリンパ節内に投与した後、追加免疫を３回反復し、血清を得ることができる。この血清が抗家兎ヤギ血清で、二次抗体である（生体の科学、３８（５）：３６１−３６２，１９８７、若林　克己、免疫法の実際）。
なお、　ｂＩＦＮτに対する特異抗体としては、上記の他にマウスモノクローナル抗体、マウスポリクローナル抗体およびこれらに対する抗マウスヤギ（あるいはヒツジ、家兎）血清なども使用可能である。
【００１４】
前記反応に用いる一次抗体並びに二次抗体の添加量は、標識　ｂＩＦＮτや測定対象溶液中の　ｂＩＦＮτの状態を考慮して、適宜選択することができる。通常は、一次抗体については５００〜２００００倍、好ましくは２０００〜８０００倍の範囲で、二次抗体については１０〜１００倍、好ましくは３０〜６０倍の範囲で用いる。
また、標識および既知濃度を得るために用いる　ｂＩＦＮτとしては限定されるものではなく、広く　ｂＩＦＮτを使用することができる。その中でも、ヤガ細胞およびカイコ虫体の発現系により作出された　ｂＩＦＮτが好ましいものである。標識は、前記１２５Ｉ以外に、例えば酵素、蛍光物質、ランタノイド元素、発光物質、スピン試薬などを用いる手法でも可能である。
【００１５】
本発明によれば、例えば胚を移植したウシより得た子宮灌流液あるいは組換えにより作出した　ｂＩＦＮτ溶液と標識した　ｂＩＦＮτ、既知濃度の　ｂＩＦＮτ、一次抗体並びに二次抗体とを反応させる測定系により、測定対象溶液中の　ｂＩＦＮτ濃度を知ることができる。
本発明の方法においては、　ｂＩＦＮτのみに反応する特異的抗体を用いるために、他のタイプ１ＩＦＮを含まず、　ｂＩＦＮτの検出並びに定量を行うことができる。
【００１６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例等により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
製造例１（　ｂＩＦＮτ遺伝子組換えバキュロウイルスの調製）
（１）　ｂＩＦＮτ　ｃＤＮＡのクローニング
体外受精・体外培養し、発育したウシ透明帯脱出胚盤胞より得られた栄養膜細胞から抽出したｍＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって　ｂＩＦＮτのｃＤＮＡをクローニングした。
【００１７】
ＩＦＮτ遺伝子の塩基配列は、ＩＦＮαの塩基配列と非常にホモロジーが高いため、Ｆｌｉｎｔ　ら（Ｊ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　Ｆｅｒｔ．　Ｓｕｐｐｌ．，　４３（１９９１），　１３−２５）　およびＲｏｂｅｒｔら（Ｊ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　Ｆｅｒｔ．　Ｓｕｐｐｌ．，　４３（１９９１），　３−１２）によって報告されている　ｂＩＦＮτ　　ｃＤＮＡの塩基配列および　ｂＩＦＮαＩＩまたはωの塩基配列を比較し、翻訳領域の外側でＩＦＮτの遺伝子は増幅するが、ＩＦＮαＩＩまたはωは増幅しない後記の２種類のプライマー（配列表の配列番号１および２）を設計した。
【００１８】
前記の２種類のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法で増幅してきたフラグメントをｐＣＲＩＩベクター（インビトロゲン社製）に組み込んだ。翻訳領域の内にあり、ＩＦＮτの遺伝子は増幅するが、ＩＦＮαは増幅しないプライマーを設計してＰＣＲを行い、クローンを選択した。得られたクローンの塩基配列を決定し、既に報告されている　ｂＩＦＮτ　　ｃＤＮＡの塩基配列（データベース名：ジーンバンク、アクセッション番号：ＡＦ２３８６１２）と比較することにより、２ヵ所に違いがあるものの、９９．６％の一致を確認した（配列番号３）。
【００１９】
得られた　ｂＩＦＮτ　　ｃＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ　［ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２　（タカラ社製）使用　］を用い、クローニングベクターｐＣＲＩＩベクター（インビトロゲン社製）のクローニング部位に連結した。さらに、これをコンピテントセルＪＭ１０９　［ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ　ｈｉｇｈ（タカラ社製）］　へ形質転換し、常法にしたがってクローニングした。
【００２０】
（２）　ｂＩＦＮτ組換えＡｃバキュロウイルス（　ｂＩＦＮτ・ＡｃＮＰＶ）の作成ｂＩＦＮτ　　ｃＤＮＡがクローニングされたプラスミド（ｐＣＲ／　ｂＩＦＮτ）を鋳型にして、２種類のプライマー（配列表の配列番号４および５）を利用して、ＰＣＲ法により　ｂＩＦＮτ　　ｃＤＮＡの増幅と共にｃＤＮＡの５’末端並びに３’末端に制限酵素の認識配列を導入した。ＰＣＲ法には、ＥＸ　Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ社製）を使用した。
【００２１】
得られた　ｂＩＦＮτ　　ｃＤＮＡ／Ｂａｍ　ＨＩ　Ｂａｍ　ＨＩ　を制限酵素　Ｂａｍ　ＨＩ　で処理した後、ｐＡｃＹＭ１にクローニングし、トランスファーベクターを構築した。続いて、バキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｉｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ：ＡｃＮＰＶ）　のＤＮＡと共に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　細胞系であるＳＦ２１ＡＥ細胞に同時に導入することによって相同組換えを行い、　ｂＩＦＮτ遺伝子組換えＡｃバキュロウイルス（ＣＰｄ／　ｂＩＦＮτ・ＡｃＮＰＶ）を得た。
【００２２】
（３）　ｂＩＦＮτ組換えＢｍバキュロウイルス（　ｂＩＦＮτ・ＢｍＮＰＶ）の作成
ｂＩＦＮτ　　ｃＤＮＡがクローニングされたプラスミド（ｐＣＲ／　ｂＩＦＮτ）を鋳型にして、２種類のプライマー（配列表の配列番号６および７）を利用して、ＰＣＲ法により　ｂＩＦＮτ　　ｃＤＮＡの増幅と共にｃＤＮＡの５’末端に制限酵素　Ｂａｍ　ＨＩ　を、３’末端に制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩの認識配列を導入した。ＰＣＲ法には、ＥＸ　Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ社製）を使用した。
【００２３】
得られた　ｂＩＦＮτ　　ｃＤＮＡ／Ｂａｍ　ＨＩ　Ｅｃｏ　ＲＩ　を制限酵素　Ｂａｍ　ＨＩ　および　Ｅｃｏ　ＲＩ　で処理した後、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）バキュロウイルス（ＢｍＮＰＶ：カイコ核多角体病ウイルス）用のトランスファーベクターｐＢＭ０５０　（Ｍａｅｄａ，　Ｓ．“Ｉｎ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，　ｐ．１−３１）　のマルチクローニングサイトの制限酵素切断部位　ＢｇＩＩＩおよび　Ｅｃｏ　ＲＩ　に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ　［ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２　（タカラ社製）使用　］を用いて連結した。
【００２４】
このベクターでコンピテントセルＪＭ１０９　［ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ　ｈｉｇｈ（タカラ社製）］　を形質転換し、常法によりクローニングして　ｂＩＦＮτ遺伝子組換えトランスファープラスミドｐＢＭ０５０／　ｂＩＦＮτを得た。
【００２５】
最後に、トランスファープラスミドｐＢＭ０５０／　ｂＩＦＮτとバキュロウイルスＢｍＮＰＶＣＰｄ株（システィンプロテアーゼ欠損株）ＤＮＡをカイコＢｍＮ細胞に同時に導入することによって相同組換えを行い、　ｂＩＦＮτ遺伝子組換えＢｍバキュロウイルス（ＣＰｄ／　ｂＩＦＮτ・ＢｍＮＰＶ）を得た。
【００２６】
製造例２　（　ｂＩＦＮτ・ＡｃＮＰＶとヤガ細胞発現系由来　ｂＩＦＮτ（Ａｃｂ　ＩＦＮτ）　の調製）
（１）ヤガ細胞培養上清の取得
ｂＩＦＮτ遺伝子組換えＡｃバキュロウイルス（ＣＰｄ／　ｂＩＦＮτ・ＡｃＮＰＶ）をＴｒｉｃｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　（ヤガ科昆虫）由来の細胞系であるＢＴＩ　ＴＮ５Ｂ１−４（以下、ＴＮ５と略記することもある。）細胞に感染させ、無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ４０１（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）中で２８℃で４日間培養し、培養上清に組換え型　ＡｃｂＩＦＮτを分泌、蓄積させた。
【００２７】
（２）ヤガ細胞培養上清より得られたＡｃｂ　ＩＦＮτの精製
続いて、超遠心（１２０００×ｇ、１５分間）および限外ろ過膜（商品名：セントリコン）により組換えウイルスを除去した後、得られた組換え型ウシＡｃｂ　ＩＦＮτを含む画分を５０〜７０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、これを弱陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。カラムとしてＤＥＡＥ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ６Ｂ　（ファルマシア社製）を用い、溶出液として１Ｍ　ＫＣｌ−５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）０〜１００％の濃度勾配で溶出した。流速は、０．５ｍｌ／ｍｉｎとした。
【００２８】
溶出した画分のうち、１００ｍＭ　ＫＣｌのときに溶出された画分をさらに強陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。カラムとしてＰＯＲＯＳ　ＨＳ／Ｈ（ファルマシア社製）を用い、溶出液として１Ｍ　ＮａＣｌ−１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）０〜５０％の濃度勾配で溶出した。流速は、５．０ｍｌ／ｍｉｎとした。
続いて、強陽イオン交換クロマトグラフィーによって得たピークを、ゲルろ過クロマトグラフィーに供し、ヤガ細胞発現系由来の組換えＡｃｂ　ＩＦＮτの精製物を得た。なお、カラムとしてＨｉ　Ｌｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（ファルマシア社製）、溶出液としてＰＢＳを用い、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎとした。
【００２９】
精製したヤガ細胞発現系由来の組換えＡｃｂ　ＩＦＮτの抗ウイルス活性は、前記したウシ腎由来細胞（ＭＤＢＫ細胞）とシンドビス　ウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ　ｖｉｒｕｓ）を用い、一般に知られている抗ウイルス活性測定法で測定した。
Ａｃｂ　ＩＦＮτ感染ＴＮ５細胞の培養上清をトリシン−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色したところ、分子量約２３ｋＤａに相当するバンドが得られた。このバンドについて、ウエスタンブロット法を行ったところ、ｂＩＦＮτであることが確認され、１×１０７　ｕｎｉｔｓ／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が認められた。
【００３０】
製造例３　（ｂＩＦＮτ・ＢｍＮＰＶとカイコ虫体発現系由来ｂＩＦＮτ（ＢｍｂＩＦＮτの調製）
（１）カイコ体液の取得
カイコを宿主とし、組換え体ウイルスであるｂＩＦＮτ・ＢｍＮＰＶを用い、下記の方法でｂＩＦＮτを発現させた。すなわち、５齢１日のカイコに製造例２で得られたｂＩＦＮτ・ＢｍＮＰＶを接種し、人工飼料を用いて飼育した。
カイコ体液は、感染後４日目に、病虫の足をシリンジで刺して回収した。回収した体液に、最終濃度５ｍＭとなる量のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加し、８０℃で保存した。この体液（粗Ｂｍｂ　ＩＦＮτ体液）の抗ウイルス活性は、１．０６×１０８ｕｎｉｔｓ／ｍｌで、比活性は３．０６×１０６ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。
【００３１】
カイコ２０頭分の粗Ｂｍｂ　ＩＦＮτ体液約１５ｍｌを、５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて１０倍に希釈した。この希釈液１５０ｍｌに濃塩酸（和光純薬社製）を、液のｐＨが２．０付近になるまで添加した。その状態で３０分〜１時間程度攪拌（４℃以下）した後、５規定の水酸化ナトリウムを用いｐＨを８．０付近まで上昇させた。この溶液を１２０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離して上清を得た。
【００３２】
（２）カイコ体液より得られたＢｍｂ　ＩＦＮτの精製
上記（１）で得た上清１５０ｍｌを、陰イオン交換カラム　［ＱセファロースＦＦ（ファルマシア社製）］　に添加した。５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、３００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（５０ｍｌ）で溶出させて一次精製液を得た。
【００３３】
この溶出液を、銅イオンを結合させた金属キレートカラム　［キレーティング・セファロースＦＦ（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）］　に添加した。次いで、このカラムを５００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄後、５００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶出し、精製Ｂｍｂ　ＩＦＮτ溶液４５ｍｌを得た。得られた精製Ｂｍｂ　ＩＦＮτ溶液は、１．３７×１０７ｕｎｉｔｓ／ｍｌの抗ウイルス活性で、比活性は６．０１×１０８ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。
【００３４】
製造例４　（　ｂＩＦＮτに対する特異的な抗体の作成）
ヤガ細胞発現系由来Ａｃ　ｂＩＦＮτを、常法に従ってアジュバントと等量混合し、雌家兎の皮内に投与した。最初の免疫から４週間後に追加免疫を行い、以後２週間間隔で３回の追加免疫を行った。得られた血清を免疫学的手法で検定し、　ｂＩＦＮτに対しての反応が上昇したことを確認し、全採血して　ｂＩＦＮτに対する特異的な抗体（一次抗体）を得た。
家兎ＩｇＧを、常法に従ってアジュバントと等量混合し、ヤギの後肢リンパ節に投与した。最初の免疫から４週間後に追加免疫を行い、以後２週間間隔で３回の追加免疫を行った。得られた血清を免疫学的手法で検定し、家兎ＩｇＧに対しての反応が上昇したことを確認し、全採血して抗家兎ヤギ血清（二次抗体）を得た。
【００３５】
実施例１
（１）　ｂＩＦＮτの１２５Ｉ標識
ヤガ細胞発現系由来　ｂＩＦＮτを、常法に従って０．２Ｍ　リン酸緩衝液（以下、ＰＢと略記することもある。）を用いて２．５μｇ／２５μｌとなるように調整した。標識反応に用いる溶液は、他にクロラミンＴ（２ｍｇ／０．２Ｍ　ＰＢ）、ｓｏｄｉｕｍ　ｍｅｔａｂｉｓｕｌｆａｔｅ（以下、ＳＭＢＣと略記することもある。）（２．５ｍｇ／０．０５Ｍ　リン酸緩衝液（以下、ＰＢと略記することもある。）、１％ウシ血清アルブミンを含む０．０１Ｍ　リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略記することもある。）、移動溶液（ＫＩ　１００ｍｇ，シュークロース　０．８ｇ，１０％トライトン　Ｘ−１００　０．１ｍｌを水にて１０ｍｌに調整）であり、分画カラムはＢｉｏ−Ｇｅｌ　Ｐ−６０（バイオラド社製）　を用いて作成した。
【００３６】
次に、１．５ｍｌの反応チューブに　１２５Ｉ　２５０μＣｉ（パーキンエルマー社、ＮＥＺ−０３３）５μｌと、上記のように調整したＡｃ　ｂＩＦＮτ　　２５μｌとクロラミンＴ　１０μｌを入れて反応させた後、ＳＭＢＣ　　２５μｌを添加して反応を停止させた。
その後、反応チューブに移動溶液１００μｌを添加し、分画カラムへ移し、０．０５Ｍ　ＰＢを５００μｌ毎に試験管に分画採取した。得られた溶出画分について、キュリーメーターにて比放射活性を測定し、最初のピーク画分にあたる溶出画分を標識　ｂＩＦＮτとし、これを測定に用いた。
１２５Ｉと　ｂＩＦＮτ並びにクロラミンＴの反応時間については、実際に様々な反応時間について実施し、結合画分と遊離画分との比を測定した。その結果を図１に示す。図中、縦軸のＢ／Ｆ（％）は１２５Ｉで標識された　ｂＩＦＮτ（Ｂ）と　ｂＩＦＮτに結合しなかった遊離１２５Ｉ（Ｆ）の比を示す。Ｂ／Ｆ比が４０％程度の反応時間で最良のアッセイができるため、この実験結果より標識反応時間は４５秒とした。
【００３７】
（２）一次抗体の希釈倍率の検討
実際の測定反応に用いる試薬については、標識　ｂＩＦＮτ、既知濃度の　ｂＩＦＮτ並びに測定溶液の希釈には０．１％　　トライトン　　Ｘ−１００（バイオラド社製）、１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）　添加ＰＢＳを用いた。また、一次抗体の希釈には、１％正常家兎血清添加エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物（以下、ＥＤＴＡと略記することもある。）−ＰＢＳを、二次抗体として抗家兎ヤギ血清を用い、当該二次抗体の希釈には、３．５％ポリエチレングリコール添加ＥＤＴＡ−ＰＢＳを用いた。
【００３８】
一次抗体の希釈倍率について検討した。標識　ｂＩＦＮτは１００００ｃｐｍ／１００μｌとなるように調整し、二次抗体は４０倍希釈し、さらに一次抗体を様々な濃度に調整した。
反応は直径１２．５ｍｍ、長さ７５０ｍｍのガラス製試験管に標識　ｂＩＦＮτを５０００ｃｐｍ／５０μｌ、一次抗体を５０μｌ、０．１％　　トライトン　　Ｘ−１００添加１％ウシ血清アルブミン添加ＰＢＳを１５０μｌを混合し４℃にて一晩反応後、二次抗体１２５μｌを添加、混合し、さらに４℃にて一晩反応させた。その後、３０００回転、３０分間、４℃にて遠心し、上清を吸引除去後、沈殿物の放射活性を測定した。図２の横軸に　ｂＩＦＮτに対する特異的な抗体（一次抗体）の希釈倍率を、縦軸に標識　ｂＩＦＮτと特異的　ｂＩＦＮτ抗体との結合率の変化を示す。この結果より、一次抗体は２０００倍から８０００倍希釈の範囲で適用できることが明らかとなった。
【００３９】
（３）　ｂＩＦＮτの反応曲線並びに他のタイプ１ＩＦＮとの交差性の確認
次に、　ｂＩＦＮτの反応曲線について検討するため、蚕虫体由来　ｂＩＦＮτを１０００ｎｇ／ｍｌに調整し、以後倍希釈により７．８ｎｇ／ｍｌまでの８段階の既知濃度　ｂＩＦＮτを準備した。
標識　ｂＩＦＮτは１００００ｃｐｍ／１００μｌとなるように調整し、二次抗体は４０倍希釈し、さらに一次抗体は２０００倍希釈に調整した。反応は、直径１２．５ｍｍ、長さ７５０ｍｍのガラス製試験管に標識　ｂＩＦＮτ　　５０００ｃｐｍ／５０μｌ、一次抗体５０μｌ、０．１％　　トライトン　　Ｘ−１００添加１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ　１００μｌ、さらに既知濃度　ｂＩＦＮτを５０μｌ混合し、４℃にて一晩反応後、二次抗体１２５μｌを添加、混合し、さらに４℃にて一晩反応させた。
【００４０】
その後、３０００回転、３０分間、４℃にて遠心し、上清を吸引除去後、沈殿物の放射活性を測定した。同時にタイプ１ＩＦＮとの交差性を確認するため、ノバルティス社より提供を受けたウシ組換えＩＦＮα（１ｎｇ／ｍｌから１０００００ｎｇ／ｍｌ）、ヒト組換えＩＦＮβ（１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、ＰＥＰＲＯ　ＴＥＣＨ　ＥＣ　ＬＴＤ　製）についても同様に反応させた。その結果を図３に示す。図中、横軸の濃度（ｎｇ／ｍｌ）は　ｂＩＦＮτ，ウシ組換えＩＦＮαあるいはヒト組換えＩＦＮβの濃度を、縦軸は一次抗体との結合率（％）を示す。図中の●は既知濃度　ｂＩＦＮτの結合率を、□はウシ組換えＩＦＮαの結合率を、△はヒト組換えＩＦＮβの結合率を、それぞれ示す。
図３の結果から、既知濃度　ｂＩＦＮτでは競合反応により、７．８ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの濃度において良好な反応曲線が得られることがわかった（実験反復回数＝８回）。
また、ウシ組換えＩＦＮαおよびヒト組換えＩＦＮβは、いずれも本測定に用いた一次抗体と反応しないため、濃度が変化しても検出限界付近の測定値が得られるのみであり、本測定に用いた　ｂＩＦＮτに対する特異的な抗体との交差性は認められなかった（実験反復回数＝３）。
【００４１】
（４）回収率の検討
次に、この測定系における回収率を検討するため、カイコ虫体発現系由来　Ｂｍ　ｂＩＦＮτ　１５．６２５〜１０００ｎｇを、ウシ継代栄養膜細胞培養上清に添加し、前記（３）の方法と同様に反応後、その放射活性を測定した。その結果を表１に示す。
得られた結果からも明らかなように、既知濃度　ｂＩＦＮτの回収率は良好であることがわかった（実験反復回数＝４回）。
【００４２】
【表１】
表１　既知濃度　ｂＩＦＮτ添加による回収率
2004125660.tif 000002
【００４３】
（５）　ｂＩＦＮτ含有溶液の測定
次に、本測定系において　ｂＩＦＮτが含まれている溶液を実際に測定した。その内容は、体外培養系により作出した８日齢のウシ胚（０日齢＝体外受精、以下、Ｄ８ウシ胚と略すこともある。）を発情周期を同期化した発情後７日の受胚牛に複数移植し、さらに発情後１７日に非外科的に子宮灌流を行って胚を回収した子宮灌流液、並びにウシ４４回あるいは４８回継代栄養膜細胞（以下、４４ＴＢまたは４８ＴＢと略すこともある。）の培養上清、標準曲線の最高用量のタンパク質濃度に調整した組換え体陰性対照液として各５０μｌ用いて前記（３）の方法と同様に反応後、その放射活性を測定した。その結果を図４に示す。図中、縦軸は　ｂＩＦＮτ量（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
図４から明らかなように、　ｂＩＦＮτの存在が予想されるものでは数十ナノグラムの値、陰性対照では検出限界程度の結果が得られ、ｂ　ＩＦＮτの測定が可能であった（実験反復回数＝４回）。なお、子宮灌流液中に確認された胚の数を優良胚／退行胚として示すと、子宮灌流液（１）では０／０、（２）では２／３、（３）では９／３であった。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、ウシ胚の培養液、妊娠子宮灌流液あるいは組換えにより作出した　ｂＩＦＮτ溶液において、従来行われていた生物検定あるいはイミュノブロット法では、実施できなかったＩＦＮτの検出、定量を行うことが可能である。そのため、本発明を用いて、受胎促進に必要な　ｂＩＦＮτを測定したり、あるいはこれまで不明であったウシ胚発育過程における　ｂＩＦＮτの分泌動態を明らかにすることにより、様々な受胎率向上技術や体外培養環境の改善などにつながることが期待される。
【００４５】
【配列表】
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2004125660.tif 000004
2004125660.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１（１）の　ｂＩＦＮτ標識反応時間の検討結果を示す。
【図２】実施例１（２）の標識　ｂＩＦＮτと特異的　ｂＩＦＮτ抗体との結合率を示す。
【図３】実施例１（３）の　ｂＩＦＮτの反応曲線並びに他のタイプ１ＩＦＮとの交差性を示す。
【図４】実施例１（５）の　ｂＩＦＮτ含有溶液の　ｂＩＦＮτ量の測定結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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