(57)【要約】【課題】物質のホルモン作用に関し、信頼性、感度に優れ、簡単で廉価かつ迅速に判断可能な方法を提供する。【解決手段】物質のホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用の検査方法で、ａ）２つのベクターで形質転換した細胞を物質に暴露し、一方のベクターが核内受容体タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含み、他方のベクターがコモジュレーターＨＳＲＮＡＡＭまたはその断片をコードするＤＮＡを含み、ｂ）コモジュレーターまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定したり、物質が受容体またはその断片とコモジュレーターまたはその断片との相互作用に与える影響を、タンパク質・タンパク質の相互作用またはタンパク質・タンパク質・ＤＮＡの相互作用により測定する。アンドロゲン受容体とＨＳＲＮＡＡＭとの間のコモジュレーション機構における障害を規定する。【選択図】　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質のホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用を検査するための方法であって、
ａ）２つのベクターで形質転換した細胞を物質に暴露し、しかも一方のベクターが核内受容体タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含み、他方のベクターがコモジュレーターＨＳＲＮＡＡＭまたはその断片をコードするＤＮＡを含んでおり、
ｂ）ＨＳＲＮＡＡＭまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定し、および／または物質が受容体またはその断片とＨＳＲＮＡＡＭまたその断片との相互作用に与える影響を、タンパク質・タンパク質の相互作用またはタンパク質・タンパク質・ＤＮＡの相互作用によって測定するようにした、物質のホルモン作用を検査するための方法。
【請求項２】
ＨＳＲＮＡＡＭの断片が、ＨＳＲＮＡＡＭのアミノ酸２７１〜４３３を有している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核内受容体を、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体Ａ、プロゲステロン受容体Ｂ、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、ビタミンＤ受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体およびオーファン受容体の中から選択するようにした、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
細胞が確立された細胞株および／または真核細胞であることを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
真核細胞を、前立腺細胞、神経細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、血球、骨芽細胞、砕骨細胞、肝細胞、上皮細胞または筋肉細胞の中から選択するようにした、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが真核性発現ベクターである、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
アンドロゲン受容体とＨＳＲＮＡＡＭとの間のコモジュレーション機構の障害を規定するための方法であって、ＨＳＲＮＡＡＭまたはその断片および／またはアンドロゲン受容体またはその断片の濃度を測定するようにした方法。
【請求項８】
濃度測定が、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡテスト、免疫染色、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロットまたはノーザンブロットによって行われることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質のホルモン作用を検査するための方法、およびアンドロゲン受容体とコアクチベーター、アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＨＳＲＮＡＡＭ）との間のコモジュレーション機構の障害を規定するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ある物質がなんらかの製薬に使用するのに適しているか否かを判定する際、当該物質が場合によってはホルモン作用、特にアンドロゲン活性または抗アンドロゲン活性を有していないか調べる方法が一般的に用いられている。薬理作用のある物質を投与するに当たって、多くの場合に当該物質のホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用に関する知見が重要となる。なぜならば、これらの作用は患者に好ましくない副作用を引き起こす恐れがあるからである。物質のホルモン作用を調べるためには、特に物質がホルモン受容体を当該物質に結合せしめて、それらの転写活動を活性化する能力を測定する方法が用いられる。
【０００３】
しかし、物質のホルモン作用に関する知見は、可能な医薬物質のみならず、非医薬物質に関しても興味が持たれる。なぜならば、環境中に存在している多くの物質について、一部の住民の間でアンドロゲン活性もしくは抗アンドロゲン活性またはエストロゲン活性もしくは抗エストロゲン活性を有する可能性が推定されているからである。その結果として好ましくない有害な作用が引き起こされる恐れがある。
【０００４】
それゆえ、物質のホルモン作用に関して、信頼性があり、感度が高く、簡単で廉価かつ迅速に判断を下すことのできる方法が非常に強く求められている。従来公知の方法では、この必要性を満たすことができない。
【非特許文献１】
Ｂｅａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００，　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．　Ｕｐｄａｔｅ，　６，　２２５−２３６
【非特許文献２】
Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ　＆　Ｅｖａｎｓ，　１９９５；Ｃｅｌｌ，　８３，　８４１−８５０
【非特許文献３】
Ｒｏｂｙｒ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００，　Ｍｏｌ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，　１４，　３２９−３４７
【非特許文献４】
Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｊ．　Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ａｎｄ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　６９，　３０７−３１３
【非特許文献５】
ＭｃＫｅｎｎａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｅｎｄｏｃｒ．　Ｒｅｖ．，　２０，　３２１−３４７
【非特許文献６】
Ｄｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，　Ｍｏｌ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，　１２，　３０２−３１３
【非特許文献７】
Ｃｈａｏ　Ｑｕｉ　ｅｔ　ａｌ．，　ＪＢＣ　Ｐａｐｅｒｓ　ｉｎ　Ｐｒｅｓｓ　、２００２年５　月３０日、草稿Ｍ２０１０５３２００
【非特許文献８】
Ｓｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８，　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　４８．　３３０−３４９
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、物質のホルモン作用に関して、信頼性があり、感度が高く、簡単で廉価かつ迅速に判断を下すことのできる方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題は本発明により驚くべきことに、物質のホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用を検査するための方法であって、ａ）２つのベクターで形質転換した細胞を物質に暴露し、しかも一方のベクターが核内受容体タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含み、他方のベクターがコモジュレーターＨＳＲＮＡＡＭまたはその断片をコードするＤＮＡを含んでおり、ｂ）コモジュレーターまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定し、および／または物質が受容体またはその断片とＨＳＲＮＡＡＭまたその断片との相互作用に与える影響を、タンパク質・タンパク質の相互作用またはタンパク質・タンパク質・ＤＮＡの相互作用によって測定するようにした、物質のホルモン作用を検査するための方法によって解決される。
【０００７】
本発明の方法によって驚くべきことに、たとえば環境関連または薬理学関連で興味の対象となり得る物質が、ホルモン作用、特にアンドロゲン作用または抗アンドロゲン作用を及ぼすか否かについて、高い信頼性と感度をもって、簡単で廉価かつ迅速にテストできることが分かった。
【０００８】
本発明による方法ではベクターで形質転換された細胞を用いるが、ベクターは核内受容体タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含んでいる。
５０種類以上のタンパク質が属している核内受容体（ＮＲｓ）のスーパーファミリーは、それぞれの標的遺伝子の転写を、特異的なリガンド、たとえばホルモンに対する反応として制御する類似した転写因子のグループである。このファミリーは、特定の特徴、たとえば二量化状態、リガンドの種類またはＤＮＡ応答配列の構造によって幾つかのサブファミリーに区分できる（非特許文献１）。ＮＲｓの特徴は、機能ドメイン（Ａ〜Ｆで表示）の構造が、自律的な構成的活性化機能（ＡＦ−１）を有する著しく可変的で保存性の低いＮ末端可変領域と、特異的なＤＮＡ応答配列の認識を受け持ち、２つの亜鉛フィンガーモチーフからなる保存性の高い結合ドメイン（ＤＢＤ）と、可変なヒンジドメインと、そして二量化およびリガンドに依存したトランス活性化機能（ＡＦ−２）を有する、保存された多機能Ｃ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と一致していることである。この後に最も遠位のＣ末端領域が続くが、その機能は知られておらず、ＰＲ（プロゲステロン受容体）、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）およびＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）などの受容体には欠如している（非特許文献２，３）。若干のＮＲｓ（たとえばアンドロゲン受容体（ＡＲ））　について、Ｎ末端領域はＣ　末端領域と相互作用できることが証明された（非特許文献４）。ステロイドホルモン受容体、たとえばエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）は、プレグネノロンから導かれるステロイドリガンド、たとえばプロゲスチン、エストロゲン、グルココルチコイドおよびミネラルコルチコイドおよびアンドロゲンを結合する。リガンド結合は受容体を活性化し、対応する標的遺伝子の発現を制御する。
【０００９】
上述したように、本発明の方法の段階ａ）で使用する細胞は、さらにコモジュレーターＨＳＲＮＡＡＭまたはその断片をコードするＤＮＡを含んだベクターを有している。
【００１０】
いわゆるコモジュレーターは、遺伝子転写の活性化（コアクチベーター）もしくは抑制（コリプレッサー）の際に、転写開始複合体とＮＲｓとの間の橋渡し分子として働く種類のタンパク質である（非特許文献５）。コアクチベーターは、受容体機能を強化し、かつアゴニストの存在下でＮＲｓの活性化ドメインと直接相互作用できなければならない。それはまた基本転写装置とも相互作用しなければならず、最終的にそれ自身基本転写活性を強化してはならない。ほとんどのコモジュレーターは１つ以上のＬＸＸＬＬモチーフ（ＮＲボックス）を用いてＮＲｓのＡＦ−２ドメインと相互作用するが、他のＮＲ領域と相互作用するコモジュレーターも幾つか記載されている（非特許文献６）。Ｃｈａｏ　Ｑｕｉらは、タンパク質ＰＲＭＴ２（ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　２）をＥＲαに対するコアクチベーターとして記述している（非特許文献７）。
【００１１】
本発明による方法において、アルギニンメチルトランスファーゼ（ＨＳＲＮＡＡＭ）と呼ぶコモジュレーターまたは特にアミノ酸２７１〜４３３を有するＨＳＲＮＡＡＭの断片を使用する。ｃＤＮＡ配列は登録されており（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ９９２０９）、４３３アミノ酸を有している（非特許文献８）。ＨＳＲＮＡＡＭのアミノ酸１〜４３３もしくは２７１〜４３３をコードするプラスミドを含んでいるＤＨ５α大腸菌は、２００２年６月５日、ドイツ微生物・培地コレクションにＤＳＭ１５０４１もしくはＤＳＭ１５０４２で登録された。
【００１２】
本発明による方法はこれらのタンパク質を使用すると、特に高い信頼性と感度で、簡単かつ廉価にして迅速に実施できる。さらにＨＳＲＮＡＡＭ断片、特にアミノ酸２７１〜４３３を有するＨＳＲＮＡＡＭの断片は、取り扱いが簡単であり、クローン化可能であり、しかもなおＨＳＲＮＡＡＭの機能的性質を持つという長所を有する。
【００１３】
ＨＳＲＮＡＡＭとは、ヒト・アンドロゲン受容体およびその他の核内受容体に対するコアクチベーターであり、アンドロゲンと受容体との相互作用を強化する。ＨＳＲＮＡＡＭの配列はすでにＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ９９２０９に登録されている。しかしここでは核内受容体、特にＡＲとの相互作用は記載されてない。本発明は、核内受容体、特にＡＲとＨＳＲＮＡＡＭとの間に相互作用が存在し、さらにＡＲに媒介されたトランス活性化を強化することが確認できたという驚くべき認識に基づいている。ＨＳＲＮＡＡＭは、ステロイドを核内受容体に結合した後、転写作用を強化または抑制し、さらには以前ホルモン作用が認められなかった分子への核内受容体の結合および活性化を促進することによって、コメディエーターとして機能するタンパク質である。
【００１４】
タンパク質ＨＳＲＮＡＡＭとは、アンドロゲン受容体およびその他の核内受容体、たとえばエストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、プロゲステロン受容体Ａ、プロゲステロン受容体Ｂ、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、ビタミンＤ受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体およびオーファン受容体に対するコアクチベーターである。本発明による方法では、これらの受容体を使用することが好ましい。なぜならば、それによって、上述した本発明による方法の利点を特に好都合に達成できるからである。
【００１５】
本発明による方法では、上記のタンパク質の断片をコードするベクターも使用できる。上記のタンパク質に関連した「断片」という表現は、全長がタンパク質よりも短い１つ以上のアミノ酸を有しながら、なおも核内受容体またはコモジュレーターの機能的性質を有するタンパク質を意味している。
【００１６】
上述したように、本発明による方法において、段階ａ）では特殊なタンパク質をコードする２つのベクターで形質転換した細胞を使用する。したがってこれらの細胞は、２種類のタンパク質を発現することができる。
【００１７】
細胞が、確立された細胞株および／または真核細胞、特に前立腺細胞、神経細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、血球、骨芽細胞、砕骨細胞、肝細胞、上皮細胞または筋肉細胞であることが好ましい。本発明による方法は、確立された細胞株により特に廉価かつ迅速に実施できる。本発明による方法で真核細胞、特に上述した真核細胞を使用すると、好都合にも非常に信憑性の高い結果が得られる。
【００１８】
本発明による方法の好ましい実施形態では、真核発現ベクター、たとえばｐＣＭＸ、ｐＣＭＶまたはｐＳＧ５を使用する。これらのベクターを使用すると、特に上記の確立された細胞株および／または真核細胞と組み合わせると、本発明による方法は特に有利かつ迅速に実施でき、非常に信憑性の高い結果が得られる。
【００１９】
当業者にとって、上記のタンパク質をコードするＤＮＡをベクターに挿入し、次いでこのベクターを細胞内に入れ、こうして得られた細胞を適当な培養条件下で培養し、それによってこれらのタンパク質を発現できるようにする方法およびそれに必要な材料は公知である。
【００２０】
本発明による段階ｂ）に従い、コモジュレーターまたはその断片の存在下で核内受容体またはその断片が誘発する転写活性を測定できる。これはたとえばレポーター遺伝子の検出によって行うことができる。
【００２１】
レポーター遺伝子とは、他の遺伝子または調節配列と結合して、この配列の活性を証明できるようにした遺伝子または遺伝子断片である。レポーター遺伝子は遺伝子産物を産生するが、それらはたとえば測光法を用いた色反応によって極めて簡単に検出できる。よく用いられるレポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼに対する遺伝子、アルカリ性ホスファターゼに対する遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼに対する遺伝子、カテコール・ジオキシゲナーゼに対する遺伝子、緑色蛍光タンパク質に対する遺伝子、および細胞を発光させることができる種々のルシフェラーゼ遺伝子である。
【００２２】
このようなレポーター遺伝子も同様にベクター、特に真核発現ベクターによって細胞内に導入できる。レポーター遺伝子をコードするＤＮＡを含んだベクターの例は、物質のアンドロゲン作用の測定に用いられるベクターＭＭＴＶルシフェラーゼである。
【００２３】
この場合、ホルモン作用、特にアンドロゲン作用／抗アンドロゲン作用を有する物質は、レポーター遺伝子の活性が増大しているか、または減少しているかによって認識できる。
【００２４】
検査物質が受容体またはその断片とコモジュレーターまたはその断片との相互作用に与える影響の測定は、タンパク質・タンパク質の相互作用を、たとえばツーハイブリッド系、免疫沈降、ＧＳＴプルダウンアッセイ、ＦＲＥＴ分析およびＡＢＣＤアッセイで規定することによって、およびまたタンパク質・ＤＮＡの相互作用を、たとえばゲル遅延アッセイで規定することによって行うことができる。
【００２５】
さらに、ＨＳＲＮＡＡＭはアンドロゲン由来疾患の指示薬として非常に効果的に使用できることが分かった。該当するアンドロゲン由来疾患は、たとえば前立腺癌、勃起不全、不妊症、脱毛症、アクネまたは性機能低下、およびアンドロゲン抵抗症候群、たとえば睾丸性女性化症が、ＡＲとＨＳＲＮＡＡＭとの間のコモジュレーション機構の欠陥に基づいている。そのような障害を持った患者の場合、ＡＲとＨＳＲＮＡＡＭの相対的濃度を測定することが可能である。この場合、測定は体液、体細胞または体組織で体外的に行うと好都合である。これはそれぞれの患者に、両分子の相対量を測定するための定量法を適用することによって可能であり、ＡＲおよびＨＳＲＮＡＡＭに対する抗体、またはそれらのｍＲＮＡに対して核酸プローブを患者に使用できる。この比較量を測定するための幾つかの方法が当業者に公知である。またこれに適した材料および装置、たとえばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡテスト、免疫染色、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロットまたはノーザンブロット、ＤＮＡチップまたはタンパク質チップも当業者に知られている。さらに、ＨＳＲＮＡＡＭ−ｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲアッセイ用のプローブを構成することも可能であり、これにより特定の患者において正常なＤＮＡ配列の突然変異を検出したり、ノーザンブロットアッセイ用の転写もしくはｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ用のＤＮＡを生成できる。
【００２６】
この場合、ＡＲ対ＨＳＲＮＡＡＭの測定比は、健康体におけるよりも高いか、または低いことがある。健康体における正常値は、たとえば多数の健康な被験者でＡＲ対ＨＳＲＮＡＡＭの比の平均を求めることによって簡単に規定できる。被験患者で求めたＡＲ対ＨＳＲＮＡＡＭの比と正常値とを比較することによって、求めた比の値が正常値よりも高いか低いかを確認できる。
【００２７】
組織内におけるＨＳＲＮＡＡＭおよび／またはＡＲの濃度は多様であり得る。たとえばＨＳＲＮＡＡＭの濃度は心房、骨髄、胸腺および子宮では非常に高いが、肝臓、肺および前立腺では非常に低いので、評価する際は組織によって異なる濃度を考慮しなければならない。すなわち検査値と正常値は、同じ組織のものでなければならない。
【００２８】
ＡＲとＨＳＲＮＡＡＭとの間のコモジュレーション機構における欠陥を規定するための別の可能性は、ＨＳＲＮＡＡＭの濃度だけを測定することである。この場合、ＡＲ濃度は少なくともほぼ一定であることが前提となっている。もし正常なＨＳＲＮＡＡＭ濃度よりも低い濃度が測定されたら、それはＡＲ対ＨＳＲＮＡＡＭの比が変化したことを意味しており、それはまたコモジュレーション機構に障害があることを示唆している。
【００２９】
ＨＳＲＮＡＡＭに特異的なプローブを使って、ＨＳＲＮＡＡＭ発現における変化、ひいてはＡＲとの比を規定することが可能である。そのような変化は、種々の病像で原因に関与しているか、または随伴症状として生じることがある。
【００３０】
ＡＲ／ＨＳＲＮＡＡＭ比のこのような測定は、ＨＳＲＮＡＡＭの検出と特性把握に基づく次のような知見を基礎としている。すなわち、たとえばアンドロゲン抵抗症候群はＡＲ優勢とＨＳＲＮＡＡＭ優勢の平衡状態の障害に起因することがある。ＨＳＲＮＡＡＭが過度に高いと、ＡＲ系の過敏症を招き、通常はアンドロゲン作用を有していない分子に反応することがある。反対に、ＨＳＲＮＡＡＭが欠如しているか、あるいはあらゆるレベルの機能不全の場合にアンドロゲン抵抗を招く。患者から過度のＨＳＲＮＡＡＭが検出されたら、臨床条件下でそれぞれの患者のＨＳＲＮＡＡＭ力価濃度を下げるために、ダウンレギュレーションのための薬剤、たとえばアンチセンス薬やこれに類似の薬剤を使用すべきであろう。同じことは、ＡＲとＨＳＲＮＡＡＭとの相互作用を抑制することのできる分子によって達成できる。ある患者のＨＳＲＮＡＡＭが不足している場合、それ自体公知の種々の機構を介してＨＳＲＮＡＡＭ−ｃＤＮＡ、ＨＳＲＮＡＡＭタンパク質またはＨＳＲＮＡＡＭ−ＤＮＡを患者に供給することによって、活性ＨＳＲＮＡＡＭの力価濃度を高めることができる。低分子薬剤により、または特異的なＨＳＲＮＡＡＭプロモーター・タンパク質を用いて自家合成を刺激することによってＨＳＲＮＡＡＭの濃度または活性を高めることも可能である。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
以下の例を用いた説明は本発明を限定するものではない。
例１：
胎児の脳から採取したｃＤＮＡライブラリー（クローンテク社マッチメーカー）と、アミノ酸３２５〜９１９をコードするヒトＡＲ断片をプローブとして使用し（図１）、アンドロゲン１０−８Ｍ　　ＤＨＴの存在下で通常のツーハイブリッド酵母系を用いてスクリーニングを行った。メーカー（クローンテク社）の指示に従い、スクリーニングしたクローンの数は２×１０７であった。独立クローンの数はメーカーの申告によれば、３．５×１０８であった。このうち３００個のポジティブクローンを選別し、βガラクトシダーゼアッセイでテストした結果、４０個がｌａｃＺポジティブクローンであることが確認された。これらのクローンのインサートをＰＣＲによって増幅した。制限断片分析と配列決定により、少なくとも３９種類のクローンを同定した。そのうち１つは１１１０ｂｐ（７３９ｂｐ−２２９２ｂｐ）を含むクローンであった。これはＨＳＲＮＡＡＭのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　Ｆｒａｍｅ）をコードする（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：Ｘ９９２０９）。
【００３２】
ＨＳＲＮＡＡＭ−ｃＤＮＡ配列の４９９ｂｐからなる断片（９８６ｂｐ−１４８５ｂｐ）は、ヒト・ブロットに対するプローブとして用いられた。アルギニンメチルタランスフェラーゼの組織分布をＮｏｒｔｈａｎ　Ｌｉｇｈｔｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍＲＮＡ　Ｂｌｏｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で規定した（図２）。ＨＳＲＮＡＡＭプローブを使用して、転写が発見された（図２）。
【００３３】
図２は、ノーザンブロット分析によりそれ自体公知の仕方で調べたＨＳＲＮＡＡＭの組織分布を示している。種々のヒト組織から単離されたポリＡ＋ＲＮＡをβ−アクチンで標準化して、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルで分離し、ナイロン膜にブロットし、標準化したＨＳＲＮＡＡＭ−ｃＤＮＡ断片（９８６−１４８５ｂｐ）でハイブリダイズした。種々のヒト組織で転写が発見された（図２）。
【００３４】
ＰＣＲと酵母ベクターに由来する特異的プライマーによって増幅された９８６−１４８５ｂｐ（ＡＳ２７１−４３３）のＨＳＲＮＡＡＭ−ｃＤＮＡを、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩにより通常のやり方でベクターｐＣＭＶ−ＮＦκＢにクローン化し、またヒトの汎用ｃＤＮＡ（クローンテク社）に由来する特異的プライマーによって増幅された１７７ｂｐ−１４８５ｂｐ（ＡＳ１−４３３）のＨＳＲＮＡＡＭ−ｃＤＮＡ断片を、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩにより通常のやり方でベクターｐＣＭＶ−ＮＦκＢにクローン化して、ＡＲを発現するＰＣ３−ＡＲｗｔ細胞においてＭＭＴＶルシフェラーゼをやはり通常の仕方でトランスフェクションした。
【００３５】
図３に見られるように、ＰＣ３−ＡＲｗｔ細胞におけるＨＳＲＮＡＡＭ−ｃＤＮＡ（ＡＳ１−４３３）の一過性トランスフェクションは、ＡＲシグナル活動の強いコモジュレーションを招き、それによってアルギニンメチルトランスフェラーゼは核内受容体に対するコアクチベーターとして作用する。さらに、ＰＣ３−ＡＲｗｔ細胞においてＮＦκＢのトランス活性化ドメインとインフレームで融合したＨＳＲＮＡＡＭ−ｃＤＮＡ断片（ＡＳ２７１−４３３）の一過性トランスフェクションは、ＡＲシグナル活動の強い共役活性化を招いた（図４）。このことはアルギニンメチルトランスフェラーゼと核内受容体またはその他のコモジュレーターとの間の相互作用を示すものである。そのために、それぞれ凹部当たり２×１０５の細胞が入る細胞培養シャーレに、１．０μｇＭＭＴＶルシフェラーゼプラスミドと、０．５μｇのｐＣＭＸ−ＨＳＲＮＡＡＭ構成物（ＡＳ１−４３３）もしくはネガティブ対照群として０．３７μｇのｐＣＭＶ−ＮＦκＢでトランスフェクションした（図３）。図４では、１．０μｇＭＭＴＶルシフェラーゼプラスミドと、０．３９μｇのｐＣＭＶ−ＮＦκＢ−ＨＳＲＮＡＡＭ構成物（ＡＳ２７１−４３３）もしくはネガティブ対照群として０．３５μｇのｐＣＭＶ−ＮＦκＢまたはポジティブ対照群として０．５μｇｐＣＭＶ−ＮＦκＢ−ＳＲＣ１ａでトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は、上記濃度のジヒドロキシテストステロン（ＤＨＴ）で２４時間処理し、さらに２４時間後に収穫した後、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）の活性を測定した。さらに標準化のために全細胞タンパク質量を規定した。トランスフェクションバッチおよび物質濃度当たり、２回の実験と、それぞれ３回の測定を行った。誤差をＳＤで示した。活性は相対的単位で示した。
【００３６】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明は物質のホルモン作用に関して、信頼性があり、感度が高く、簡単で廉価かつ迅速に判断を下すことのできるという優れた効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【図１】アンドロゲンの存在下でＨＳＲＮＡＡＭと相互作用ができる、アミノ酸３２５〜９１９に達するアンドロゲン受容体ドメイン（ＡＲ２）の表示を有するアンドロゲン受容体の概念図。
【図２】ＨＳＲＮＡＡＭの人間の組織における分布を示す説明図。
【図３】ＰＣ３−ＡＲｗｔ細胞におけるコモジュレーターとしてのＨＳＲＮＡＡＭ（ＡＳ１−４３３）とアンドロゲン受容体との作用を示す線図。
【図４】ＰＣ３−ＡＲｗｔ細胞におけるＨＳＲＮＡＡＭ断片（ＡＳ２７１−４３３）またはＳＲＣ−１ａとアンドロゲン受容体との作用を示す線図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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