(57)【要約】【課題】本発明は、テアニンの効率的な新規製造法を提供し、簡易かつ工業的に有利なテアニン生産を可能とすることを目的とする。【解決手段】本発明者らが自然界の土壌より新規に分離・選定したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡ（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９５８）は、属：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、種：ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓに属し、γ−グルタミル基転移反応を有するテアニン生産菌である。この生産菌由来のグルタミナーゼをグルタミンとエチルアミンの混合物中にｐＨ９〜１２の条件下で用いることにより、従来の方法に比べると非常に効率的にテアニンを製造することができる。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡを用いることを特徴とするテアニンの製造法。
【請求項２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡ由来のグルタミナーゼを用いることを特徴とする請求項１に記載のテアニンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、テアニンの新規な製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
テアニン（ｔｈｅａｎｉｎｅ）は緑茶の旨味の主要成分として知られており、茶をはじめとする食品の香味物質として重要な物質である。また一方、テアニンを含めてγ−グルタミル誘導体は、動・植物体における生理活性物質として作用することが指摘されている。例えば、Ｃｈｅｍ．Ｐａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，　１９（７），　１３０１−１３０７（１９７１）．　同１９（６），１２５７−１２６１（１９７１）．　同３４（７），　３０５３−３０５７（１９８６）．　薬学雑誌，９５（７），　８９２−８９５（１９７５）等の文献には、テアニンやグルタミンがカフェインによって誘発される痙攣に拮抗することが報告されている。このことから、これらの化合物が中枢神経系に作用することが考えられ、生理活性物質としての有用性が期待されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来より、テアニンの製造法としては、テアニンを含有する玉露の生産用茶園において得られる茶葉乾燥物より抽出する方法が一般的である。しかし、テアニンは、茶葉乾燥物あたりわずかに１．５％前後程度しか蓄積されないことに加え、一般の煎茶用茶園の茶葉は光合成が活発であるため、テアニンが速やかに分解されてしまうことから、充分な収量を確保することが困難である。従って、茶葉乾燥物からの抽出法では、工業的に実用的ではないことが指摘されている。
【０００４】
このようなことから、工業的生産方法の開発が期待されており、その一つとして、テアニンを化学的に有機合成する方法が報告されている（Ｃｈｅｍ．　Ｐａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．，１９（７），　１３０１−１３０８（１９７１））。しかし、このような有機合成反応では、収率が低く、合成物の分離精製等において煩雑な操作を必要とするという問題点が指摘されている。
また、グルタミナーゼのγ−グルタミル基転移反応を利用して、グルタミン、エチルアミンからテアニンを合成する酵素法も報告されている（特公平０７−５５１５４号）。しかし、グルタミナーゼの加水分解反応によってテアニンと同時に副合成されるグルタミン酸の存在が、テアニン精製を煩雑にするという問題点がある。本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、テアニンの効率的な製造法を提供し、簡易かつ工業的に有利なテアニン生産を可能とすることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記の課題を解決するために、自然界の土壌より新規テアニン生産菌の分離・選定を重ねた結果、特定の微生物が持つグルタミナーゼの性質が特公平０７−５５１５４にて報告されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１２６９４　のグルタミナーゼに比べ高いテアニン合成活性・低いグルタミン酸合成活性であることを見い出し、基本的には、本発明を完成するに到った。上記のテアニン生産菌は、本発明者らが初めて発見・同定した新規菌株であり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡ（受託番号　ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９５８）である。
以下、本発明の詳細について記述する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施形態について、詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
本発明におけるテアニンとは、γ−グルタミルエチルアミド、Ｌ−グルタミン酸−γ−エチルアミドなどである。テアニンは茶の旨味成分であって、呈味を用途とする食品添加物として使用されている。
【０００７】
本発明に用いるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡ（受託番号　ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９５８）とは、本発明者らによって新規に見出された菌株であり、属：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、種：ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓに属し、γ−グルタミル基転移反応を有するテアニン生産菌である。また、本発明に用いるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡの同定は、定法に基づいた菌学的性質・生化学的性質の解析、および１６ｓ　ｒＲＮＡに相当するＤＮＡの塩基配列を既知の微生物と比較することにより行ったものである。
【０００８】
本発明におけるグルタミナーゼとは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡ由来の酵素である。この反応の酵素源としては、生菌体または各種処理標品、例えば菌体磨砕物、超音波処理菌体、溶剤処理菌体、低温乾燥菌体、硫安塩析物、精製酵素標品などをそのまま、あるいは固定化したものが使用できる。本発明において効率的な酵素反応を行うためには、ｐＨは９〜１２の範囲が好ましく、１０〜１１がより好ましい。また、反応温度は１０℃〜５５℃が好ましく、２５℃〜３５℃がより好ましい。
【０００９】
このようにして得られる反応液からのテアニンの単離精製は、公知の方法が用いられる。例えば、溶媒分配および各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣを組み合わせることにより容易に行うことができる。
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらのみに限定されるものではない。
【００１０】
【実施例】
実施例１　テアニン資化性菌の分離
滋賀県・京都府の土壌を採取、土壌懸濁液を調製した後に、テアニンを炭素源とする選択培地（テアニン０．５％、酵母エキス０．０３％、　ＫＨ２ＰＯ４　０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４　０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０３％、ｐＨ７）による継代培養を３回行うことにより、テアニン資化性菌を１００株分離した。
【００１１】
実施例２　無細胞抽出液の調製
実施例１の選択培地にて、１００株のテアニン資化性菌をそれぞれ１リットルで３０℃、２０時間培養した。その後、集菌・洗浄を行い、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５０ミリリットルに懸濁し、５℃〜２０℃で超音波破砕し、無細胞抽出液を得た。
【００１２】
実施例３　酵素反応
実施例２の無細胞抽出液を用いて、グルタミン０．３Ｍ、エチルアミン０．６Ｍを含有する１００ｍＭホウ酸緩衝液（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７−ＮａＯＨ、ｐＨ１１）中で３０℃、２４時間酵素反応を行い、テアニンを合成した。
【００１３】
実施例４　テアニン合成活性・グルタミン酸合成活性の測定
実施例３にてテアニン合成を行った酵素反応液を適宜希釈し、逆相高速液体クロマトグラフィーを行うことによりテアニン・グルタミン酸の合成量をそれぞれ定量した。分析条件は、次の通りであった。分析カラムとして、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＯＤＳ　ＨＧ−５（野村化学（株））を用い、検出器は、Ｗａｔｅｒｓ２４８７デュアルλＵＶ／ＶＩＳ検出器（Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用した。また、内部標準物質として、ニコチンアミド（ナカライテスク（株））を用いた。移動相は、純水：メタノール：トリフルオロ酢酸＝９８０：２０：１の割合で混合したものを用いた。
【００１４】
比較例１
１００株のテアニン資化性菌との比較株として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓの無細胞抽出液を用いて、テアニン合成活性およびグルタミン酸合成活性の測定を行った。
【００１５】
試験例１　テアニン合成活性を指標としたテアニン資化性菌群からの高テアニン生産菌の選別
実施例１にて分離したテアニン資化性菌１００株の無細胞抽出液を各菌株毎にそれぞれ実施例２の方法で調製し、実施例３の方法で酵素反応を行い、実施例４の方法でテアニン合成量を調べた。その結果、従来報告されているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓのテアニン合成活性に比べて、４倍以上高い活性を持つ新規テアニン生産菌の１菌株を得ることに成功した。
【００１６】
【表１】
2004065105.tif 000002
【００１７】
実施例５　新規テアニン生産菌の同定
試験例１で得られた新規テアニン生産菌の菌学的・生化学的性質を定法に従い、次の項目、すなわちグラム染色、細胞形態、カタラーゼテスト、硝酸塩還元能、ピラジナミダーゼ、ピロリドニルアリルアミダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ、β‐グルクロニダーゼ、α‐グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル‐β‐グルコサミニダーゼ、ウレアーゼ、ゼラチン液化能、エスクリン利用能、グルコース利用能、リボース利用能、キシロース利用能、マンニトール利用能、マルトース利用能、乳糖利用能、白糖利用能、グリコーゲン利用能について試験を行った。これらの試験成績に基づいて、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　ｍａｎｕａｌ（８版）を参照した結果、菌の属はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓであることを結論づけた。
また、１６ｓ　ｒＲＮＡに相当するＤＮＡ塩基配列を決定し、既知微生物の同配列との比較を行った。この結果、本菌株を属：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、　種：ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓと同定し、新種の菌であることよりＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡと命名した。
【００１８】
実施例６　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡの培養条件の最適化
実施例１における菌選択培地（炭素源：テアニン）以外の炭素源を用いた培地によるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡの培養を検討した。炭素源として、グルタミン、グルタミン酸、グルコース、グリセロールなどを検討した結果、グリセロールを用いた時に最も良好な結果を得た。次に培地中のグリセロール濃度を検討した結果、３％グリセロールで最も良好なテアニン合成活性を持つ無細胞抽出液を得ることができた。同時に、酵母エキス濃度を検討したところ、０．３％で最も良好なテアニン合成活性を持つ無細胞抽出液を得ることができた。
【００１９】
【表２】
2004065105.tif 000003
【００２０】
実施例７　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡ由来の無細胞抽出液を用いた酵素反応条件の最適化
実施例１における酵素反応条件で、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡ由来の無細胞抽出液を用いた時のグルタミン、エチルアミンの種々の濃度を検討した。この結果、０．３Ｍグルタミンと０．９Ｍエチルアミンを用いて４８時間反応した時に、最大のテアニン合成量を得ることができた。
【００２１】
【表３】
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【００２２】
実施例８　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡを用いたテアニン製造
グリセリン３．０％、酵母エキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４　０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４　０．０５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．０３％を含む培養液２０リットルを用いて、３０リットル容のジャーファメンター（３０℃、回転数２０００ｒｐｍ）中、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡを２０時間培養した。培養後、遠心分離による集菌・洗浄を行い菌体１８０ｇを得た。
【００２３】
調製した菌体１０ｇを用いて、０．３Ｍグルタミン、０．９Ｍエチルアミン、ｐＨ１０、３０℃の条件で酵素反応を行ったところ、２４時間後に１リットルあたり４０ｇのテアニンを得た。テアニンの反応液からの単離精製は、反応液より菌体を除去した後に、Ｄｏｗｅｘ　５０×８、Ｄｏｗｅｘ　１×２カラムクロマトグラフィーにかけ、これをエタノール処理することにより行った。
【００２４】
この単離物質をアミノ酸アナライザー、ペーパークロマトグラフィーにかけると、標準物質と同じ挙動を示し、塩酸あるいはグルタミナーゼで加水分解処理を行うと、１：１の割合で、グルタミン酸とエチルアミンを生じた。このように、単離物質がグルタミナーゼによって加水分解されたことから、エチルアミンがグルタミン酸のγ位に結合していたことが示される。また、加水分解で生じたグルタミン酸がＬ型であることも、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ）により確認された。図１には、テアニン標品のＩＲスペクトルを示した。単離物質は、図１のＩＲスペクトルと同一のスペクトルが得られた。これらの結果から、単離物質がテアニンであることが確認された。
【００２５】
実施例９　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｓｉｓ　ＧＥＡ由来グルタミナーゼ固定化酵素を用いたテアニン製造
（１）無細胞抽出液の採取
実施例８で得られた菌体１６０ｇを洗浄後、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２リットルに懸濁し、５℃〜２０℃で超音波破砕し、無細胞抽出液を得た。
【００２６】
（２）硫酸アンモニウム分画の採取
上記（１）で得られた無細胞抽出液２リットルに７％アンモニア水でｐＨを７に調整しながら硫酸アンモニウムを添加した。３５％飽和溶液を得た段階で、遠心分離により沈殿を取り除き、再び硫酸アンモニウムを添加した。９０％飽和溶液を得た段階で一晩放置し、遠心分離により沈殿を回収し、これを０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶かし、同緩衝液に対して透析を行い、透析酵素液を得た。
【００２７】
（３）ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィーを用いた精製
上記（２）で得られた透析酵素液を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液で緩衝化した。次にＤＥＡＥ−セルロースカラム（１５×６０ｃｍ）に吸着させ、グルタミナーゼを０．１Ｍの食塩を含む緩衝液で溶出した。この結果、グルタミナーゼ粗精製品８００ｍｇを得た。
【００２８】
（４）固定化グルタミナーゼの調製
予め、水で膨潤させた市販の固定化担体であるキトパール３５１０（富士紡績（株））を十分に水洗した後０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で平衡化した。この湿潤担体２ｇを上記（３）にて調製したグルタミナーゼ粗精製品３５ｍｇを含む５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）に懸濁し、４℃で一晩撹拌した。更に、グルタルアルデヒドを終濃度２．５％（Ｖ／Ｖ）で添加し、４℃で３時間放置することにより架橋した。以上の操作により得られた固定化酵素を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で十分に洗浄し、４℃で保存した。
【００２９】
（５）固定化グルタミナーゼによる酵素反応
上記（４）で作製した固定化グルタミナーゼに、基質溶液（４％グルタミン、２５％エチルアミン　ｐＨ１０．０）を３０℃、ＳＶ＝０．２の流速で通筒した場合、６５％の収率でテアニンを得ることができた。テアニンの反応液からの単離精製は、反応液をＤｏｗｅｘ　５０×８、Ｄｏｗｅｘ　１×２カラムクロマトグラフィーにかけ、これをエタノール処理することにより行った。
【００３０】
この単離物質をアミノ酸アナライザー、ペーパークロマトグラフィーにかけると、標準物質と同じ挙動を示した。また、塩酸あるいはグルタミナーゼで加水分解処理を行うと、１：１の割合でグルタミン酸とエチルアミンを生じた。このように、単離物質がグルタミナーゼによって加水分解されたことから、エチルアミンがグルタミン酸のγ位に結合していたことが示された。また、加水分解で生じたグルタミン酸がＬ型であることも、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ）により確認された。テアニンのＩＲスペクトル分析を行ったところ、標品、単離物質ともに、実施例８と同様のスペクトルが得られた。これらのことから、単離物質がテアニンであることが確認できた。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によって、テアニンの効率的な新規製造法を提供し、簡易かつ工業的有利な生産を可能とすることができる。
【００３２】
【図面の簡単な説明】
【図１】テアニンのＩＲスペクトルを示した図である。
【図１】
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