(57)【要約】【課題】魚類の細菌性冷水病を治療および予防する薬剤を提供する。【解決手段】薬剤に、フラボバクテリウム・サイクロフィラムに特異的に感染して溶菌させるバクテリオファージを含ませる。上記バクテリオファージは、例えばフラボバクテリウム・サイクロフィラムを指示細菌として集殖法、または２重寒天法にて得たものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボバクテリウム・サイクロフィラムに特異的に感染して溶菌させるバクテリオファージを含むことを特徴とする細菌性冷水病治療用の薬剤。
【請求項２】
上記バクテリオファージは、フラボバクテリウム・サイクロフィラムを指示細菌として、集殖法または２重寒天法により得られたものであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
上記バクテリオファージがミオウィルス科、シホウィルス科、またはポドウィルス科に分類されるものであることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
上記バクテリオファージが感染特性の異なる複数種類の株を含んでいることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５】
サケ科またはアユ科の魚類に投与されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項６】
魚類に経口投与されることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項７】
上記薬剤に魚類を浸漬することを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項８】
上記バクテリオファージが動物の循環器系を循環したものであることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、魚類の細菌性冷水病を治療する薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
１９８０年代後半から、アユ養殖場等において、フラボバクテリウム・サイクロフィラムを原因菌とする「細菌性冷水病」が発生し始め、近年では全国的に被害が広まっている。細菌性冷水病は、貧血、体表の白濁、鰓蓋下部の出血、体表の潰瘍等の穴あき症状を特徴とし、症状の悪化により死に至る。このような冷水病の発生は年々高まっており、養殖場に限らず天然の河川の遊魚への影響も確認されており、社会問題化している。
【０００３】
冷水病の予防策としては、化学的薬剤を投与したり（化学療法）、アユを加温処理する方法、またはこれらを組み合わせた方法が主に用いられている。
【０００４】
化学的薬剤としては、例えばスルフィゾール（ＳＩＺ）などの、アユのビブリオ病に効能を有する複数の医薬品がフラボバクテリウム・サイクロフィラムに感受性を示すことが分かり、使用されている。さらに、抗生物質等を投与する方法もある。
【０００５】
また、上記加熱処理は、保菌アユを２５℃前後に加熱処理するという方法である。これは、細菌性冷水病の原因菌であるフラボバクテリウム・サイクロフィラムが水温が低いほど活性化するという性質を利用し、水温を上げることによってフラボバクテリウム・サイクロフィラムの活動を抑え、冷水病の発症が抑えるという方法である。
【０００６】
さらに、冷水病を予防する方法として、卵や稚仔魚を消毒する技術の開発や、冷水病のワクチンの開発なども行われている。
【０００７】
一方、近年、細菌性の感染症をバクテリオファージを用いて治療する方法が研究されている。例えば、非特許文献１には、マウスの大腸菌感染をファージを用いて治療する方法が記載されている。バクテリオファージは、細菌内で増殖して短時間（約３０分）で細菌を殺す能力があり、しかも特定の細菌種あるいは特定の株にのみ感染するという特徴を有するので、感染症の治療に用いることができるのである。また、ファージは自然界における細菌の存在量を調整する役割を担っており、環境への有害性は皆無である。
【０００８】
魚類についても、同様の方法を用いて、冷水病に次いで被害の多い細菌感染症である出血性腹水病に関して、出血性腹水病の原因菌に特異的に感染し、溶菌するバクテリオファージを用いて感染症をコントロールできることが非特許文献２および３に記載されている。
【０００９】
【非特許文献１】
「ジャーナルオブジェネラルマイクロバイオロジー」（”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”），（イギリス），１９８２年，第１２８巻，ｐ．３０７−３１８
【００１０】
【非特許文献２】
「アプライドアンドエンバイロンメンタルマイクロバイオロジー」（”ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＮＤ  ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ”），（アメリカ合衆国），第６６巻，２０００年４月，ｐ．１４１６−１４２２
【００１１】
【非特許文献３】
「デジーズオブアクアティックオーガニズムズ」（”ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＯＦ  ＡＱＵＡＴＩＣ  ＯＲＧＡＮＩＳＭＳ”），（ドイツ），２００３年１月，第５３巻，ｐ．３３−３９
【００１２】
【非特許文献４】
「プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンスイズオブザユナイテッドステーツオブアメリカ」（”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ”），（アメリカ合衆国），１９９６年４月，第９３巻，ｐ．３１８８−３１９２
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、従来技術の細菌性冷水病の対策では、加熱処理や化学薬剤投与が行われているが、これは自然環境を大きく変化させることとなり、細菌性冷水病を抑えることができたとしても、環境変化に伴う他の問題が生じてしまう。
【００１４】
具体的には、保菌アユを加熱処理する方法では、水温の上昇に伴い出血性腹水病が誘発されるという問題を有している。すなわち、細菌性出血性腹水病の原因菌であるシュードモナス・プレコグロシシーダは高温を好み、２０℃以上で活性化するため、２５℃前後の加熱処理に伴って活性化して増殖し、出血性腹水病が発症しやすい環境になるのである。従って、冷水病対策として加熱処理を続けていると、潜在的にシュードモナス・プレコグロシシーダが増殖し、冷水病に代わって腹水病が発生しやすくなると考えられる。さらに、加熱処理を行うと、アユの生体防御機能が低下するため、細菌性冷水病の被害が大きくなるという問題も有している。
【００１５】
また、化学薬剤投与においては、化学薬剤が河川への散布されることで環境汚染につながり、他の生息生物やヒトへ有害な影響が与えられるといった問題が発生する。また、化学薬剤の投与は治療効果が不安定であり、安定して冷水病を抑えることができない。さらに、薬剤耐性を有するフラボバクテリウム・サイクロフィラムが出現することも考えられ、この場合、長期間の使用においては、良好な治療効果が得られなくなるという問題を有している。
【００１６】
以上のように、従来の加熱処理や化学薬剤の投与という方法では、他の細菌の増殖や環境汚染を引き起こしたり、良好に細菌性冷水病を抑えることができなかったりという問題を有している。
【００１７】
本発明は、上記従来の問題に鑑みなされたものであり、その目的は、良好な効果を示す細菌性冷水病の予防および治療のための薬剤を提供ことにあり、特に他の細菌の増殖を誘発せず、環境にも無害であるものを提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明の細菌性冷水病の治療または予防用の薬剤は、上記の課題を解決するために、フラボバクテリウム・サイクロフィラムに特異的に感染して溶菌させるバクテリオファージを含むことを特徴としている。
【００１９】
上記バクテリオファージとは、細菌に感染するウィルスであり、フラボバクテリウム・サイクロフィラムに特異的に感染するバクテリオファージは、例えば、フラボバクテリウム・サイクロフィラムを指示細菌として、集殖法または２重寒天法にて採取できる。
【００２０】
ここで、上記「指示細菌として採取する」とは、特定の細菌種あるいは細菌株（指示細菌）を含む環境で、この指示細菌を溶菌するバクテリオファージを培養することによってこのバクテリオファージを増殖させて、バクテリオファージを得る方法である。具体的には、集殖法では、材料すなわち目的のバクテリオファージを含む試料を指示細菌をいれた液体培地で培養することにより、材料中のバクテリオファージの数を増やす。また、２重寒天法では、材料と指示細菌とを軟寒天中で混合し、栄養寒天平板上に重層させることで、材料中のバクテリオファージにプラーク（溶菌斑）を形成させる。
【００２１】
また、上記バクテリオファージとしては、特にミオウィルス科、シホウィルス科、またはポドウィルス科に分類されるものが挙げられる。
【００２２】
このような薬剤を細菌性冷水病を発症した魚類に対して投与すれば、上記バクテリオファージが、細菌性冷水病の原因菌であるフラボバクテリウム・サイクロフィラムに特異的に感染して溶菌するので、安定した治療効果を発揮する。このように、本発明の薬剤はバクテリオファージを用いて、病原菌を溶菌しているので、細菌性冷水病を防ぐ生物農薬であるということもできる。
【００２３】
また、本発明に係るバクテリオファージは自然環境に生息するものであるので、環境汚染や人を含めた他生物への悪影響もない。さらに、化学薬剤の投与に対しては薬剤耐性細菌が出現するのに対し、バクテリオファージ耐性のフラボバクテリウム・サイクロフィラムが現れる可能性も低い。
【００２４】
また、本発明の薬剤は、上記バクテリオファージとして感染特性の異なる複数種類の株を含んでいることが望ましい。
【００２５】
本発明の薬剤に含まれるバクテリオファージはフラボバクテリウム・サイクロフィラムに特異的に感染し、溶菌させるものであるが、それぞれのバクテリオファージ株はすべてのフラボバクテリウム・サイクロフィラムに感染できるわけではなく、フラボバクテリウム・サイクロフィラムの株によって感染可能なものと感染できないものがある。上記「感染特性が異なる」とは、この感染できるフラボバクテリウム・サイクロフィラムの株が異なることを示している。従って、薬剤に複数の株種のバクテリオファージを含ませることで、感染、溶菌が可能なフラボバクテリウム・サイクロフィラムの株が増え、細菌性冷水病の治療の可能性が増える。
【００２６】
また、本発明の薬剤は、サケ科またはアユ科の魚類に投与されることを特徴としている。
【００２７】
本発明の薬剤を投与する対象としては、サケ科またはアユ科の魚類が挙げられる。サケ科またはアユ科の魚類は、細菌性冷水病の発症が多く確認され、被害が広がっている。これらの魚類に本発明の薬剤を投与することで、細菌性冷水病の被害を抑えることができる。
【００２８】
また、魚個体に経口投与されることで、本発明の薬剤は、口から体内に侵入し、腎臓等に蓄積されたフラボバクテリウム・サイクロフィラムを溶菌して、細菌性冷水病を発症した個体を治療したり、発症を抑えたりできる。
【００２９】
また、本発明の薬剤に魚類を浸漬することによって、薬剤を投与してもよい。これにより、体表やエラに付着した、フラボバクテリウム・サイクロフィラムを溶菌して、細菌性冷水病を発症した個体を治療したり、発症を抑えたりできる。
【００３０】
また、上記バクテリオファージは動物の循環器系を循環したものであることが望ましい。
【００３１】
バクテリオファージを生体に投与する場合、バクテリオファージが、体内にある種々の生体防御因子（補体など）の作用により比較的短時間で消滅してしまい、長時間生体に作用できない。そこで、バクテリオファージを動物の循環器系を循環させれば、これらの防御因子の作用を受けにくい、あるいは受けない株が選択され、長時間体内に存在し得るバクテリオファージ株を取得できる。これにより、バクテリオファージが投与対象個体の体内に長く留まり、治療効果が長く持続する薬剤とすることができる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
バクテリオファージ（以下ファージと称する）は、細菌内で増殖して短時間（約３０分）で細菌を殺す能力があり、しかも特定の細菌種あるいは特定の株にのみ感染するという特徴を有するものがある。また、ファージは自然界における細菌の存在量を調整する役割を担っており、環境への有害性は皆無であることが分かっている。そこで、発明者らは、難病とされている「細菌性冷水病」の原因菌であるフラボバクテリウム・サイクロフィラムを特異的に溶菌するファージを採取し、治療に利用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００３３】
以下、本発明の一実施の形態について、図１ないし図４を用いて説明する。
【００３４】
本発明の薬剤は、フラボバクテリウム・サイクロフィラム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ  以下  Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍと称する）に特異的に感染して溶菌させるバクテリオファージを含むものである。
【００３５】
Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍは、細菌性冷水病（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｌｄｗａｔｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ、以下冷水病と称する）の原因菌であり、河川や養殖場などで魚類の体表に付着し、あるいはエラや口から侵入して感染し、貧血、体表の白濁、鰓蓋下部の出血の他、体表の潰瘍等の穴明き症状を引き起こす。つまり、細菌性冷水病は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ  感染病である。
【００３６】
この冷水病を治療するために、Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍに特異的に感染して溶菌するファージを利用するのであるが、このようなファージは、Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍを指示細菌として、自然環境から、例えば集殖法や２重寒天法を用いて採取できる。なお、集殖法および２重寒天法については、海洋学講座１１「海洋微生物」多賀信夫編、東京大学出版会（１９７４）に詳細に記載されている。
【００３７】
なお、ファージを採取するためのＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍは、例えば冷水病を発症した魚個体の患部や、冷水病の魚個体が生息している水から、塗沫法により取得でき、サイトフィーガ培地で１８℃にて培養することができる。
【００３８】
以上のようにして得たＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍを特異的に溶菌するファージは、生育環境とほぼ同等な条件の培養液にて保存することが可能であり、５℃程度の低温で保存した場合は、６ヶ月以上の保存が可能である。なお、Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍは貧栄養培地で発育するので、保存のためのコストは低い。
【００３９】
上記バクテリオファージは、細菌性冷水病の原因菌であるＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍに特異的に感染して溶菌させるので、魚類に対して投与することで、後述の実施例に示すように、冷水病を回復させる治療効果を安定して発揮する。さらに、本発明の薬剤に、出血性腹水病などの他の感染症を治療するバクテリオファージを混合することにより、細菌性冷水病の治療を行うと共に、出血性腹水病の病原菌などの別の細菌の繁殖を防ぎ、菌交代現象を防ぐこともできる。
【００４０】
また、上記のバクテリオファージはもともと自然環境に生息し、細菌の存在量を調整する役割を担っているものであるから、環境汚染や、人を含めた他生物への悪影響も皆無であると言える。
【００４１】
さらに、細菌を化学薬剤により死滅させる場合と異なり、ファージを細菌に感染させたとしても、ファージ耐性細菌の出現の可能性は低いと言われている（非特許文献１参照）。非特許文献３に示されるバクテリオファージを用いた細菌感染病（腹水病）の治療においても、観察期間の間、バクテリオファージ耐性菌の出現は観察されていない。従って、本発明のバクテリオファージに対する耐性を有するＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍが現れる可能性は低く、長期間の使用においても安定した冷水病の効果が得られると考えられる。
【００４２】
また、細菌に感染するウィルスであるバクテリオファージは、保持する遺伝子がＲＮＡであるかＤＮＡであるか、あるいは１本鎖であるか２本鎖により分類されており、さらに、粒子の形態的特徴から科に分類される。Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍを特異的に溶菌するファージとしては、２本鎖ＤＮＡを有し、図１のように、頭部、尾部を有しているもの、すなわち、ミオウィルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウィルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウィルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）に分類されるものが挙げられる。なお、図１（ａ）および（ｂ）のミオウィルス科は収縮可能な尾部を持ち、図１（ｃ）のシホウィルス科は収縮不可能な長い尾部を持ち、図１（ｄ）のポドウィルス科は収縮不可能な短い尾部を持つことなどにより特徴付けられている。
【００４３】
上記バクテリオファージはさらに細かく株に分類される。薬剤に含むファージは、一種類でも構わないが、多種類の株を含んでいることが好ましい。これは、種々の株のファージを含むことにより、種々の感染特性のファージを含むこととなり、多くの株種のＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍへ感染し、溶菌できるためである。多くの種類の株に作用する薬剤であれば、あらゆる細菌性冷水病に対して治療効果を発揮できる。
【００４４】
また、本発明の薬剤を投与する対象としては、具体的には、アユ科のアユ、サケ科のギンザケ、ニジマス等が挙げられる。特にアユは、アユ養殖場などにおける冷水病被害が大きいので、その対策が望まれている。また、本実施の形態の薬剤は後述するように、人工的に冷水病を発症させたアユに投与することで、その症状が回復した。
【００４５】
しかし、本発明の薬剤の適用対象はこれに限らず、Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍに感受性を有する全ての淡水魚に適用可能であり、野生魚、養殖魚、種苗、魚の大きさ、魚の成長段階等を問わず、どのような魚類にも適用可能である。
【００４６】
本発明の薬剤は、魚個体に経口投与されることによって、薬剤を投与してもよい。経口投与は、例えば、魚の口内にファージを注入してもよいが、餌に本発明の薬剤を混入して、あるいはスプレーなどで染み込ませて個体に自由に摂取させれば、多数の個体に対して薬剤を投与することができ好ましい。この後ファージは、口から体内に侵入し、腎臓等消化系器官に存在するＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍを溶菌して、細菌性冷水病を発症した個体を治療したり、発症を抑えたりできる。
【００４７】
また、本発明の薬剤を水槽などに入れ、そこに魚類を浸漬することによって、体表やエラに付着したＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍを溶菌して、細菌性冷水病を発症した個体を治療したり、発症を抑えたりできる。その他にも、魚個体それぞれに注射する方法なども考えられる。
【００４８】
本発明の薬剤は、どのような濃度で  Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍを特異的に感染して溶菌するファージを含んでいてもよいが、使用時のファージの濃度は１０６ＰＦＵ／ｍｌ（ｇ）以上１０９ＰＦＵ／ｍｌ（ｇ）以下で薬剤に含ませ、魚を浸漬する、あるいは餌などに染み込ませることが望ましい。なお、ＰＦＵとは、プラーク形成単位であり、プラーク形成の元となるファージの濃度を示している。
【００４９】
また、上記バクテリオファージは動物の循環器系を循環したものであることが望ましい。上記動物にはアユやニジマスを用いることができ、例えばファージをこの動物の腹腔内に注入した後血液からファージを採取（動物透過）し、再び培養することで、動物の循環器系を循環したバクテリオファージを得る事ができる。この動物透過は複数回繰り返すことが好ましい。
【００５０】
バクテリオファージを生体に投与する場合、バクテリオファージが体内にある生体防御因子（補体など）の作用により比較的短時間で消滅してしまい、長時間生体に作用できない。しかし、例えば非特許文献４に示されるもののように動物の循環器系を循環させれば、生体防御因子（補体など）の作用を受けない突然変異株が選択され、長時間体内に存在し得るバクテリオファージ株を取得できる。これにより、バクテリオファージが投与対象個体の体内に長く留まり、治療および予防効果が長く持続する薬剤とすることができる。
【００５１】
【実施例】
〔実施例１〕特異的にＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍを溶菌するファージの取得方法
まず、ファージを得るためのＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍの取得方法について説明する。
【００５２】
徳島、広島、岡山、島根、山口、山梨および栃木県下で採取した、細菌性冷水病を発症したアユ、ウグイ、錦ゴイ、アマゴから、Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ４４株を分離した。この４４株それぞれについて、分離された魚種、その魚の採取された場所、採取年を表１に示している。
【００５３】
【表１】
2004269445.tif 000002
【００５４】
上記のようにして得られたＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍを指示細菌として、自然環境から、Ｐａｔｅｒｓｏｎらの論文（Ｊ．Ｆｉｓｈ．  Ｒｅｓ．  Ｃａｎ．  １９６９，２６：６２９−６３２）に記載の２重寒天法を用いてＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍに特異的に感染して溶菌するファージを採取した。
【００５５】
次に、得られたＰＦｐＷファージの形態および核酸型を調べた。これらの株は全て核酸として２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を有し、ＤＮＡの形態的特徴を基にした分類における、ミオウィルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウィルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウィルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）のいずれかに属していた（図１参照）。
【００５６】
また、得られたファージは、その感染性から、ＰＦｐＷ１、ＰＦｐＷ２、ＰＦｐＷ３、ＰＦｐＷ４、ＰＦｐＷ６の５株に分類された。それぞれの株の属する科と、頭部サイズ、尾部サイズを表２に示す。
【００５７】
【表２】
2004269445.tif 000003
【００５８】
次に、このようにして得られた５株のファージの感染性を、上述した４４株のＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍについて調べた。
【００５９】
上述した２重寒天法により、ＰＦｐＷ１、ＰＦｐＷ２、ＰＦｐＷ３、ＰＦｐＷ４、ＰＦｐＷ６の５株のファージが、それぞれのＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍに感染するか否かを調べた。その結果が表１に示されている。
【００６０】
これによれば、どのＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍもＰＦｐＷ１、ＰＦｐＷ２、ＰＦｐＷ３、ＰＦｐＷ４、ＰＦｐＷ６のうちの少なくとも一つに感受性を示した。
【００６１】
また、Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍＮ２−３株に対して、ファージの試験管内増殖抑制効果を調べたところ、いずれのファージも約１０３ＰＦＵ／ｍｌ以上で増殖抑制効果を示した。
【００６２】
〔実施例２〕人工的にアユに冷水病を発症させる方法
上記の４４種類のＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍのうちのＮ２−３株を使用し、以下の方法でアユに細菌性冷水病を発症させた。なお、全ての実験において、水温は１８℃に保たれている。
【００６３】
Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍＮ２−３株を、１．７×１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度で含む液に、平均１０ｇのアユを６０分間浸漬し（浸漬法）感染させた。この浸漬法によるアユの死亡は、１４日間の観察の間認められなかった。
【００６４】
また、平均１０ｇのアユを網の中で１分間に１００回揉んだ後、上記Ｎ２−３株を２．５×１０５ＣＦＵ／ｍｌの濃度で含む液に、アユを６０分間浸漬し（網もみ・浸漬法）感染させた。この網もみ・浸漬法によるアユの１４日目における累積死亡率は６６．７％であった。
【００６５】
さらに、アユの筋肉内に９．５×１０５ＣＦＵ／ｆｉｓｈとなるように、上記Ｎ２−３株を注射し（筋肉内注射法）感染させた。この筋肉内注射法によるアユの１４日目における累積死亡率は１００％であった。
【００６６】
〔実施例３〕網もみ・浸漬法によって冷水病を発症したアユのファージ治療
実施例２の網もみ・浸漬法と同様の方法で、上記Ｎ２−３株を１．６×１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度で含む液に浸漬させて、感染させた平均４５ｇのアユについて、感染後、ファージとしてのＰＦｐＷ３を３．４×１０６ＰＦＵ／ｍｌ含む液に３０分間浸漬して（浸漬法）ファージ治療を行った。感染アユをファージ液に浸漬した区（実験区）と、ファージ液を含まない液に浸漬した区（対照区）とについて、２週間（１４日間）に渡って飼育し、累積死亡率を算出した。
【００６７】
その結果を図２に示す。これによれば、対照区の累積死亡率が２日で５０％を越え、２週間後には９０％となるのに対し、実験区の累積死亡率は２週間後でも４０％であり、対照区に比べて有意に低かった。
【００６８】
また、感染後７日間に渡って魚の腎臓における上記Ｎ２−３株とＰＦｐＷ３の消長を調べたところ、ファージ浸漬後３日目まで腎臓から高濃度（最高で１０５ＣＦＵ／ｇ）のファージが検出された。
【００６９】
これは、浸漬にて本実施例のファージがアユ体内に高濃度で侵入し、その後３日間持続して腎臓等体内に留まることができたことを示し、このファージによりＮ２−３株が溶菌したと考えられる。
【００７０】
〔実施例４〕筋肉注射によって冷水病を発症したアユのファージ治療
実施例２のアユの筋肉内注射法で、上記Ｎ２−３株を６．２×１０５ＣＦＵ／ｆｉｓｈの割合で注射して感染させた平均４５ｇのアユについて、ファージとしてのＰＦｐＷ３を３．４×１０６ＰＦＵ／ｍｌ含む液に３０分間浸漬して（浸漬法）ファージ治療を行った。感染アユをファージ液に浸漬した区（実験区）と、浸漬しなかった区（対照区）について、２週間（１４日間）に渡って観察を行い、その累積死亡率を算出した。
【００７１】
その結果を図３に示す。これによれば、対照区の累積死亡率が２週間後には４５％となるのに対し、実験区の累積死亡率は２週間後でも１３％であり、対照区に比べて有意に低かった。
【００７２】
また、感染後７日間に渡って魚の腎臓における上記Ｎ２−３株とＰＦｐＷ３の消長を調べたところ、ファージ浸漬後３日目までに腎臓から高濃度のファージが検出された。
【００７３】
これは、浸漬にて本実施例のファージがアユ体内に高濃度で侵入し、その後３日間持続して腎臓内に留まることができたことを示し、これによりＮ２−３株が溶菌したものと思われる。
【００７４】
〔実施例５〕病魚投与によって冷水病を発症したアユのファージ治療
実施例２のアユの筋肉内注射法で冷水病を発症して死亡したアユを、本試験の試験用アユ（平均１０ｇ）を収容した水槽に投入し、死亡アユから排出されるＦ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ  Ｎ２−３株により試験用アユを感染させた（病魚投与感染法）。この感染アユに、ファージとしてＰＦｐＷ３を含んだ餌（１．９×１０８ＰＦＵ／ｆｉｓｈ）を自由摂取させて（経口法）、ファージ治療を行った。感染アユにＰＦｐＷ３を含んだ餌を与えた区（実験区）と、ＰＦｐＷ３を含まない餌を与えた区（対照区）について、２週間（１４日間）に渡って観察を行い、その累積死亡率を算出した。
【００７５】
その結果を図４に示す。これによれば、対照区の累積死亡率が２週間後には５６％となるのに対し、実験区の累積死亡率は２週間後でも２８％であり、対照区に比べて有意に低かった。
【００７６】
以上のように、Ｆ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍＮ２−３株を種々の感染方法により感染させたアユは、ＰＦｐＷ３を含む液に浸漬されることによって、またはＰＦｐＷ３を経口投与することによって治療され、２週間後の累積死亡率が治療しない場合の半分以下となった。従って、種々の環境下で冷水病を発症したアユに対して、本発明のファージが治療効果を有することが分かった。
【００７７】
【発明の効果】
本発明の細菌性冷水病治療用の薬剤は、以上のように、フラボバクテリウム・サイクロフィラムに特異的に感染して溶菌させるバクテリオファージを含むものである。
【００７８】
それゆえ、細菌性冷水病の原因菌であるフラボバクテリウム・サイクロフィラムに感染した、あるいは感染する可能性のある魚類に対して投与することで、薬剤に含まれるバクテリオファージが、体内に侵入したフラボバクテリウム・サイクロフィラムに特異的に感染して溶菌するので、冷水病を回復させる治療効果を発揮すると言う効果を奏する。
【００７９】
また、本発明に係るバクテリオファージは自然環境に生息するものであるので、環境汚染や、人を含めた他生物への影響等の心配がない。さらに、化学薬剤の投与に対しては薬剤耐性細菌が出現するのに対し、バクテリオファージ耐性のフラボバクテリウム・サイクロフィラムが現れる可能性は低い。
【００８０】
従って、細菌性冷水病により深刻な被害がでているアユ養殖場などにおいて、環境への負担がなく、治療効果の高い細菌性冷水病治療用の薬剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】バクテリオファージの代表的形態を示す模式図である。
【図２】フラボバクテリウム・サイクロフィラムを含む液内で網もみ・浸漬することにより冷水病を発症したアユを、本発明の実施例に係る薬剤に浸漬したあと、２週間の累積死亡率の推移を示す図面である。
【図３】フラボバクテリウム・サイクロフィラムを筋肉内注射して冷水病を発症したアユを、本発明の実施例に係る薬剤に浸漬したあと、２週間の累積死亡率の推移を示す図面である。
【図４】冷水病により死亡したアユを投与した水槽にて飼育することにより冷水病を発症したアユに、本発明の実施例に係る薬剤を経口投与したあと、２週間の累積死亡率の推移を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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