(57)【要約】【課題】成熟個体の肝臓における異所性骨及び／または骨髄形成方法を提供する。【解決手段】ポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素（Ｐａｒｐ−１）活性を欠損した非ヒト動物をＤＮＡ損傷剤で処理することにより、非ヒト動物の肝臓に異所性骨及び／または骨髄の形成を誘導する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素（Ｐａｒｐ−１）活性を欠損した非ヒト動物をＤＮＡ損傷剤で処理することにより、非ヒト動物の肝臓に異所性骨及び／または骨髄の形成を誘導する方法。
【請求項２】
Ｐａｒｐ−１遺伝子を欠損した非ヒト動物を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
正常な非ヒト動物をＰａｒｐ−１阻害剤で処理した非ヒト動物を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｐａｒｐ−１遺伝子対の双方が欠損したホモ欠損型動物を用いる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡ損傷剤がアゾキシメタンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって得られる、異所性骨及び／または骨髄が誘導された非ヒト動物。
【請求項７】
げっ歯類である、請求項６に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
マウスである、請求項７に記載の非ヒト動物。
【請求項９】
肝臓に異所性骨及び／または骨髄が形成されている、請求項６〜８のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素活性欠損マウス成熟個体におけるＤＮＡ損傷刺激後の肝臓における異所性骨及び／または骨髄形成に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨を形成する骨芽細胞は間葉系幹細胞から、骨吸収を司る破骨細胞は血液幹細胞から分化誘導される。手、足、脊柱等の長管骨は、軟骨細胞から分化した肥大軟骨と接して骨芽細胞と破骨細胞が存在し、石灰化軟骨を経て骨が形成されることが知られている。臨床的にはコラーゲンゲルに包埋した自己軟骨細胞あるいは自己骨髄間葉系細胞を培養した後、関節軟骨に自家移植し、軟骨を修復する技術が開発されている。また、骨髄の間葉系細胞を免疫不全を有するＳＣＩＤマウスに移植すると、骨および軟骨の形成を誘導できる。
【０００３】
成熟個体における骨及び／または骨髄の異所性形成の技術は再生医学の領域において重要な課題である。近年、成人の骨髄に含まれる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から骨芽細胞、軟骨細胞へ分化が起き、骨形成の誘導が可能となっている。ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）が骨髄間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導し、骨形成量を増大させることもわかってきた。しかし、間葉系幹細胞から骨への分化、及び血液幹細胞から骨髄への分化の誘導機構には不明な点が多く、基盤となる研究が必要な段階にある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は成熟個体における異所性骨及び／または骨髄形成方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、意外なことにポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素（Ｐａｒｐ−１）活性欠損マウスにおいてアゾキシメタンによるＤＮＡ損傷刺激を与えることで肝臓に骨及び／または骨髄が形成できることを見出した。本発明者等は従来、抗がん剤により切断されたＤＮＡの修復に関与するだけでなく、細胞周期停止やアポトーシス誘導などに関係していることが明らかになってきたポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素の活性を欠損したマウスの胚性幹細胞株を確立し（特開平１１−１２３０７４号）、これを用いて抗がん剤の評価や新規抗がん剤の開発を進めてきたが、こうした活性を欠損した動物において、ＤＮＡ損傷刺激によって異所性骨及び／または骨髄が形成されることは予想外のことであった。
そして本発明者等はこの知見に基づいて更に研究を進め、本発明を完成させるに到った。
【０００６】
すなわち本発明は以下の（１）〜（９）を提供する。
（１）　ポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素（Ｐａｒｐ−１）活性を欠損した非ヒト動物をＤＮＡ損傷剤で処理することにより、非ヒト動物の肝臓に異所性骨及び／または骨髄の形成を誘導する方法。
（２）　Ｐａｒｐ−１遺伝子を欠損した非ヒト動物を用いる、上記（１）に記載の方法。
（３）　正常な非ヒト動物をＰａｒｐ−１阻害剤で処理した非ヒト動物を用いる、上記（１）に記載の方法。
（４）　Ｐａｒｐ−１遺伝子対の双方が欠損したホモ欠損型動物を用いる、上記（２）に記載の方法。
（５）　ＤＮＡ損傷剤がアゾキシメタンである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）　上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法によって得られる、異所性骨が誘導された非ヒト動物。
（７）　げっ歯類である、上記（６）に記載の非ヒト動物。
（８）　マウスである、上記（７）に記載の非ヒト動物。
（９）　肝臓に異所性骨及び／または骨髄が形成されている、上記（６）〜（８）のいずれかに記載の非ヒト動物。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における「異所性」とは、天然の状態においては本来形成されない部位であることを意味し、本発明においては骨及び／または骨髄が肝臓内に形成されることをいう。
【０００８】
本発明において使用しうる非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、サル等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、魚類等の脊椎動物が挙げられ、好ましくは哺乳動物である。本発明において、特に限定されるものではないが、飼育及び操作上の点、また実験に関する文献等の情報が豊富であること等からげっ歯類が好ましく、マウスが特に好ましい。
【０００９】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素（Ｐａｒｐ−１）遺伝子の配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ等から得ることができる。例えばマウスにおける配列は登録番号ＮＭ００７４１５としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。配列が既知でない種に関しては、例えばマウス等におけるポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素（Ｐａｒｐ−１）遺伝子配列との相同性を指標としてＢＬＡＳＴサーチ等を行い、配列相同性が高いものを候補遺伝子として選択することができる。また、マウス等における配列の一部をプライマーとして用いて目的の動物の組織に対してＰＣＲを行うことによって、相同遺伝子を取得することができる。
エクソン１を欠損させたポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素（Ｐａｒｐ−１）活性欠損マウスは、例えばＭａｓｕｔａｎｉらの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　９６：２３０１−２３０４．１９９９に記載の方法を用いて得ることができる。
【００１０】
Ｐａｒｐ−１活性欠損マウス胚性幹細胞株（ＥＳ細胞株）の作製方法は既に確立されており、例えばＷａｎｇ，　Ｚ．　Ｑ．，　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．　９，　５０９−５２０　（１９９５）；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９４，　７３０３−７３０７　（１９９７）；　Ｍａｓｕｔａｎｉ，　Ｍ．，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９３，　１４９−１５２　（１９９９）；　Ｍａｓｕｔａｎｉ，　Ｍ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ．　Ｓｅｒ．　Ｂ７４，　２３３−２３６　（１９９８）；　特開平１１−１２３０７４号に記載されている。具体的には、例えば以下のようにしてヘテロ型のＰａｒｐ−１活性欠損株を得ることができる。マウスのゲノムライブラリーからＰａｒｐ−１遺伝子のエクソン部分を含むＤＮＡ　を単離し、このＤＮＡ　断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法などによりマウスＥＳ細胞株に導入し、相同組換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためにはターゲッティングベクターにジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子などを結合させておくのが好ましい。これにより、非相同的な組換えを起こした細胞株を排除することができる。以上の操作により、Ｐａｒｐ−１遺伝子の遺伝子対の一方が不活化された細胞株を得ることができる。
【００１１】
得られたＥＳ細胞クローンは桑実胚または胚盤胞の段階までｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養した後、擬妊娠マウスの子宮に移し、産仔を得る。こうしてＰａｒｐ−１遺伝子の遺伝子対の一方が不活化されたキメラマウスを得ることができ、このキメラマウスを交配に用いてヘテロ欠損型マウスを得ることができ、ヘテロ欠損型マウス同士の交配によってホモ欠損型マウスを得ることができる。
【００１２】
あるいは、Ｐａｒｐ−１遺伝子の遺伝子対の一方が不活化された細胞株に再度ターゲッティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞株を選抜する。ターゲッティングベクターに挿入するマーカー遺伝子は、前出のマーカー遺伝子とは異なるものを使用する。このような操作によりＰａｒｐ−１遺伝子の遺伝子対の双方が不活化されたマウスＥＳ細胞株を得ることができ、これを上記のように偽妊娠マウスの子宮に移して産仔を得ることができる。
【００１３】
マウスに限らず、このような技術によって目的の遺伝子を欠損させたホモまたはヘテロ欠損型動物の作製は、当業者には公知の手段であり、例えばＭｃＣｒｅａｔｈ，　Ｋ．　Ｊ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　４０５，　１０６６−１０６８　（２０００）等に記載された手法によって行うことができる。
【００１４】
本発明において用いるポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素（Ｐａｒｐ−１）遺伝子を欠損した非ヒト動物は、高い効率で異所性骨及び／または骨髄の形成が誘導されるという理由で、ホモ欠損型動物でなければならない。
なお、Ｐａｒｐ−１遺伝子の遺伝子対の双方が不活化されたマウスＥＳ細胞株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１６３５６として寄託されている（寄託日：平成９年７月２８日）。
【００１５】
こうして得られたＰａｒｐ−１活性欠損マウスをＤＮＡ損傷剤で処理する。マウスの場合には、雌７−８週令のＰａｒｐ−１活性欠損マウスを用いることが好ましい。ＤＮＡ損傷剤としては、例えばマイトマイシンＣ、シスプラチン、ブレオマイシン、カンプトテシン、５−フルオロウラシル等が利用できる可能性があるが、肝障害を広範に起こす等の理由からアゾキシメタンを使用することが好ましい。ＤＮＡ損傷剤の処理方法は、動物の種類によるが、動物のＤＮＡに損傷を与え得るものであれば当分野において通常行われる方法のいずれでも良く、特に限定するものではないが、アゾキシメタンをマウスに投与する場合には、１０ｍｇ／ｋｇ体重を週１回、計６回連続腹腔内投与を行うことが好ましい。処理中及び処理後は、マウスをＳＰＦレベルの飼育室で飼育する。投与開始後３０週間飼育し解剖後、肝臓等の各臓器のパラフィン包理標本を作成し、薄切片をヘマトキシリン・エオジン染色することにより、肝臓の各葉に骨及び／または骨髄形成の有無を確認することができる。
【００１６】
また、正常な非ヒト動物をポリ（ＡＤＰ−リボース）合成酵素（Ｐａｒｐ−１）阻害剤で処理した非ヒト動物をＤＮＡ損傷剤で処理することによっても同様の効果が期待される。Ｐａｒｐ−１阻害剤としては、例えばベンズアミド、３−アミノベンズアミド、１，５−ジヒドロイソキノリン、　３−メトキシベンズアミド、等が挙げられる（Ｕｃｈｉｇａｔａ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２５７，　６０８４−６０８８，　１９８２、　Ｅｌｉａｓｓｏｎ，　Ｍ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．，　３，　１０８９−１０９５，　１９９７）。ＤＮＡ損傷剤としては、前述のものが利用できる。Ｐａｒｐ−１活性欠損マウスはストレプトゾトシンによる糖尿病誘発に対して抵抗性を示す（Ｍａｓｕｔａｎｉ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９６，２３０１−２３０４，　１９９９）が、同様な効果は正常なラットに（Ｐａｒｐ−１）阻害剤である３−アミノベンズアミドを投与することによっても観察される（Ｍａｓｉｅｌｌｏ，　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，　２８，　６８３−６８６，　１９８５）。このような事実から、本発明の異所性骨及び／または骨髄の形成誘導方法においては、Ｐａｒｐ−１活性が欠損している動物であればよく、Ｐａｒｐ−１遺伝子欠損非ヒト動物を用いる代わりに正常非ヒト動物をＰａｒｐ−１阻害剤で処理した非ヒト動物が利用可能であることが推察される。
【００１７】
本発明の方法によって得られる非ヒト動物は、例えば成熟個体における異所性骨及び／または骨髄形成のモデルとして次のように利用できる。
１）Ｐａｒｐ−１活性欠損による骨及び／または骨髄の異所性形成の機構の解明とヒトヘの臨床応用
ＤＮＡ損傷剤投与を行ったＰａｒｐ−１活性欠損動物の肝臓における骨及び／または骨髄の異所性形成に伴って変動する遺伝子の発現を、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法あるいはＲＴ−ＰＣＲ法により調べることで、成熟個体における骨及び／または骨髄の異所性形成を制御する遺伝子群とその変動を明らかにできる。更に、この発明に基づき、ヒト肝臓組織を単離し、Ｐａｒｐ−１阻害剤の存在下でアゾキシメタン等のＤＮＡ損傷剤で処理した後に、ヌードマウスに移植する。本発明の非ヒト動物において骨及び／または骨髄形成時に誘導される遺伝子群の変動を、この系において調べることにより、骨及び／または骨髄の異所性形成を誘導できる系の確立を推進することができる。
【００１８】
【実施例】
Ａ．方法
エクソン１を欠損させた雌７−８週令のＰａｒｐ−１活性欠損マウスと野生型マウス各２０−２５匹にアゾキシメタン１０ｍｇ／ｋｇ体重を週１回、計６回腹腔内連続投与を行った。アゾキシメタンは注射用生理食塩水に１ｍｇ／ｍｌの濃度で希釈して用いた。投与開始３０週後に解剖し、１０％中性ホルマリン溶液で肝臓を固定後、パラフィン包理標本を作成した。標本を薄切後、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、一切片上の肝臓各葉における骨及び／または骨髄の出現を各個体において観察した。
【００１９】
Ｂ．結果
アゾキシメタン１０ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内へ投与したＰａｒｐ−１欠損マウスでは、２２匹中１３匹（５９％）に骨形成を認めた。骨形成が認められた切片あたりの骨の出現数は平均１．９個であった。また、骨髄の形成を伴った骨の出現頻度は２２匹中９匹（４１％）であった。骨髄形成が認められた個体あたりの骨髄の出現頻度は平均２．１個であった。骨あるいは骨髄のいずれかを伴う個体は２２匹中１３匹（５９％）であり、平均３．２個の骨あるいは骨髄のいずれかが観察された（表１）。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
一方、アゾキシメタン投与を行った野生型マウスでは１９匹中３匹（１６％）にのみ骨の形成を認めた。骨髄の形成を伴った骨の出現頻度は１９匹中１匹（５％）であった。またアゾキシメタン非投与群のＰａｒｐ−１欠損マウス及び野生型マウスでは骨及ぴ骨髄を伴った骨の形成を認めなかった。
【００２２】
図１にＰａｒｐ−１活性欠損マウス肝臓内に形成された典型的な骨及び骨髄の写真を示す。
【００２３】
【発明の効果】
本発明は、Ｐａｒｐ−１活性欠損とＤＮＡ損傷刺激を組み合わせることにより成熟個体の肝臓における異所性骨及び／または骨髄の新規形成方法を提供する。肝臓に異所性骨及び／または骨髄を意図的かつ高率に形成させる技術はこれまで報告されておらず、本発明の方法は、成熟個体における異所性骨及び／または骨髄の形成メカニズムの研究、臨床応用技術の開発に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アゾキシメタン投与後のＰａｒｐ−１欠損マウス肝臓における骨及び骨髄の形成像を示す。ヘマトキシリン・エオジン染色
【図１】
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