(57)【要約】【課題】摂食調節剤の提供【解決手段】本発明のペプチドと本発明の蛋白質等の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法／スクリーニング用キット、該スクリーニングによって得られる摂食調節剤など。【効果】本発明のスクリーニングで得られる化合物またはその塩は、例えば、摂食調節剤などとして、摂食障害、肥満症などの予防・治療に使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害または促進する化合物またはその塩を含有してなる摂食調節剤。
【請求項２】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害の予防・治療剤。
【請求項３】
配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害の予防・治療剤。
【請求項４】
（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩と（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害または肥満症の予防・治療剤。
【請求項５】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満症の予防・治療剤。
【請求項６】
配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満症の予防・治療剤。
【請求項７】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含有してなる摂食障害の予防・治療剤。
【請求項８】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる摂食障害の予防・治療剤。
【請求項９】
配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含有してなる摂食障害の予防・治療剤。
【請求項１０】
配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる摂食障害の予防・治療剤。
【請求項１１】
（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、または（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有してなる摂食障害または肥満症の診断薬。
【請求項１２】
（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、および（または）（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする摂食調節剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
摂食調節剤が摂食障害または肥満症の予防・治療剤である請求項１２記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、および（または）（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を含有することを特徴とする摂食調節剤のスクリーニング用キット。
【請求項１５】
摂食調節剤が摂食障害または肥満症の予防・治療剤である請求項１４記載のスクリーニング用キット。
【請求項１６】
（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、および（または）（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする摂食調節剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、および（または）（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする摂食調節剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１２、請求項１６もしくは請求項１７記載のスクリーニング方法または請求項１４記載のスクリーニング用キットを用いて得られる摂食調節剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（１）（ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、および（ｉｉ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩とを用いる、摂食調節剤として有用な化合物またはその塩などのスクリーニング方法／キット、（２）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する摂食障害予防・治療剤、（３）上記蛋白質またはその塩の活性を促進する肥満症の予防・治療剤などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
回腸収縮活性を有するＺＡＱリガンド（ＺＡＱリガンドペプチドとも記載する）は、オーファン受容体であるＺＡＱおよびＩ５Ｅに結合し、ＺＡＱおよびＩ５Ｅを活性化する（特許文献１  ＷＯ  ０１／１６３０９号公報、特許文献２  ＷＯ  ０２／６４８３号公報、特許文献３  ＷＯ  ０２／６２９９６号公報など）ことが、また、回腸収縮活性を有するＢｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１も、オーファン受容体であるＺＡＱおよびＩ５Ｅに結合し、ＺＡＱおよびＩ５Ｅを活性化する（特許文献４  ＷＯ  ０２／６２９４４号公報など）ことが報告されている。ヒト型ＺＡＱリガンドおよびヒト型Ｂｖ８ペプチドについては、それらの活性化方法も報告されている（特許文献５  ＷＯ  ０２／５７４４３号公報）。
一方、各種の分泌蛋白質を集めたライブラリーからウシ副腎毛細血管内皮細胞に対する新たな増殖因子が見出され、この物質は、既知の血管内皮細胞増殖因子ＶＥＧＦとは異なり、内分泌性組織由来の内皮細胞に特異的な増殖因子であり、この性質からＥＧ−ＶＥＧＦ（ヒト型ＺＡＱリガンドとも記載する）と名づけられた（非特許文献１  Ｎａｔｕｒｅ、４１２巻、８７７−８８４頁、２００１年）。ＥＧ−ＶＥＧＦは生理的には内分泌組織を特徴づける透過性の高い内皮構造（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｅ）の形成に関与することが示唆されている。また、その遺伝子の転写制御領域には低酸素下での発現誘導に関わるｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ−１（ＨＩＦ−１）の認識部位が存在し、実際に副腎由来の癌細胞では、低酸素下でのＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子発現誘導が確認された。さらに、ヒト多嚢胞性卵巣症候群（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｏｖａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）ではＥＧ−ＶＥＧＦの強発現が認められたとの記載がなされている。
また、脳内のＢｖ８ペプチド（ＰＫ−２）は、ラット視交叉上核に局在し、その発現は日内変動し明期に増大し、脳室内投与したＰＫ−２はラットの行動量を減少させることが知られている（非特許文献２  Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻、４０５−４１０頁、２００２年）。
【特許文献１】
ＷＯ  ０１／１６３０９号公報
【特許文献２】
ＷＯ  ０２／６４８３号公報
【特許文献３】
ＷＯ  ０２／６２９９６号公報
【特許文献４】
ＷＯ  ０２／６２９４４号公報
【特許文献５】
ＷＯ  ０２／５７４４３号公報
【非特許文献１】
Ｎａｔｕｒｅ、４１２巻、８７７−８８４頁、２００１年
【非特許文献２】
Ｎａｔｕｒｅ、４１７巻、４０５−４１０頁、２００２年
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
安全で、優れた摂食障害の予防・治療剤および肥満症の予防・治療剤が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒト型Ｂｖ８ペプチドをラット脳室内投与したところ、摂食抑制作用を有すること、ラットの体温が減少することを見出し、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）  配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害または促進する化合物またはその塩を含有してなる摂食調節剤、
（１ａ）  配列番号：１、配列番号：３もしくは配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害または促進する化合物またはその塩を含有してなる摂食調節剤、
（２）  配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害の予防・治療剤、
（２ａ）  配列番号：１、配列番号：３もしくは配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害の予防・治療剤、
（３）  配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害の予防・治療剤、
（３ａ）  配列番号：３７もしくは配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害の予防・治療剤、
（４）  （ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩と（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害または肥満症の予防・治療剤、
（４ａ）  （ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：２５もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩と（ｂ）配列番号：３７もしくは配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害または肥満症の予防・治療剤、
（５）  配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満症の予防・治療剤、
（６）  配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満症の予防・治療剤、
（７）  配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含有してなる摂食障害の予防・治療剤、
（８）  配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる摂食障害の予防・治療剤、
（９）  配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含有してなる摂食障害の予防・治療剤、
（１０）  配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる摂食障害の予防・治療剤、
（１１）  （ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、または（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有してなる摂食障害または肥満症の診断薬、
（１２）  （ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、および（または）（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする摂食調節剤のスクリーニング方法、
（１２ａ）  （ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：２５もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、および（または）（ｂ）配列番号：３７もしくは配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を用いることを特徴とする摂食調節剤のスクリーニング方法、
（１３）  摂食調節剤が摂食障害または肥満症の予防・治療剤である上記（１２）記載のスクリーニング方法、
（１４）  （ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩、および（または）（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を含有することを特徴とする摂食調節剤のスクリーニング用キット、
（１５）  摂食調節剤が摂食障害または肥満症の予防・治療剤である上記（１４）記載のスクリーニング用キット、
（１６）  （ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、および（または）（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする摂食調節剤のスクリーニング方法、
（１７）  （ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、および（または）（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする摂食調節剤のスクリーニング方法、
（１８）  上記（１２）、（１６）もしくは（１７）記載のスクリーニング方法または上記（１４）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる摂食調節剤などを提供する。
さらに、
（１９）  配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の、配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性化作用を阻害する化合物またはその塩を含有してなる摂食障害の予防・治療剤
（２０）  配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩の、配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩の活性化作用を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満症の予防・治療剤、
（２１）  （ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５、配列番号：２９もしくは配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩と（ｂ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩との結合を促進する化合物またはその塩を含有してなる肥満症の予防・治療剤なども提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５もしくは配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩（以下、本発明のペプチドと略記することがある）は、配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩（以下、本発明の蛋白質と略記することがある）と結合する能力を有するペプチドまたはその塩であり、本発明の蛋白質と結合し、本発明の蛋白質を活性化する能力を有するペプチドまたはその塩である。本発明のペプチドの本発明の蛋白質と結合する能力および本発明の蛋白質を活性化する能力は、後述の方法により測定することができる。
【０００７】
本発明のペプチドは、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞（例、ＭＥＬ、Ｍ１、ＣＴＬＬ−２、ＨＴ−２、ＷＥＨＩ−３、ＨＬ−６０、ＪＯＳＫ−１、Ｋ５６２、ＭＬ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ−１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＴＡＬＬ−１、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、ＨＵＴ−７８、ＨＵＴ−１０２、Ｈ９、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＨＥＬ、ＪＫ−１、ＣＭＫ、ＫＯ−８１２、ＭＥＧ−０１など）、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など（特に、脳や脳の各部位）に由来するペプチドであってもよく、また合成ペプチドであってもよい。
本発明のペプチドがシグナル配列を有している場合は、該ペプチドを効率良く細胞外に分泌させることができる。
【０００８】
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と約６０％以上（好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の性質を有するペプチドなどが好ましい。
以下、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをヒト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドと記載することがある。
【０００９】
配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましく、具体的には配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するペプチド等が挙げられる。
以下、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドと記載することがある。
【００１０】
配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と９５％以上（好ましくは約９７％以上、さらに好ましくは約９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
以下、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをマウス型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドと記載することがある。
【００１１】
配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号：９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましく、具体的には配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド等が挙げられる。
以下、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをマウス型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドと記載することがある。
【００１２】
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と９５％以上（好ましくは約９７％以上、さらに好ましくは約９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとして具体的には、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するペプチド、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドなどが挙げられる。
以下、配列番号：１３、配列番号：１５または配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをラット型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドと記載することがある。
【００１３】
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとして具体的には配列番号：１９、配列番号：２１または配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド等も挙げられる。
以下、配列番号：１９、配列番号：２１または配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをラット型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドと記載することがある。
【００１４】
配列番号：２５または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：２５または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と約６０％以上（好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：２５または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号：２５または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２５または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
以下、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをヒト型Ｂｖ８成熟体ペプチド、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをラット型Ｂｖ８成熟体ペプチドまたはマウス型Ｂｖ８成熟体ペプチドと記載することがある。
【００１５】
配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましく、具体的には配列番号：２７または配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド等が挙げられる。
配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましく、具体的には配列番号：３２、配列番号：２９または配列番号：３４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド等が挙げられる。
以下、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをヒト型Ｂｖ８前駆体ペプチドと記載することがある。配列番号：３２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをラット型Ｂｖ８前駆体ペプチドと記載することがある。配列番号：３４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをマウス型Ｂｖ８前駆体ペプチドと記載することがある。
配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と約６０％以上（好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチドなどが好ましい。
以下、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをＭＩＴ１と記載することがある。
【００１６】
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
これらの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後述するスクリーニング方法などに従って測定することができる。
【００１７】
また、本発明のペプチドとしては、（ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜２０個程度）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜４０個程度、より好ましくは１〜３０個程度、なかでも好ましくは１〜２０個程度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：２５または配列番号：２９で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜４０個程度、より好ましくは１〜３０個程度、なかでも好ましくは１〜２０個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｉｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するペプチドなども用いられる。
本発明のペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来のペプチド、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来のペプチド、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するマウス由来のペプチド、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するラット由来のペプチド、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するラット由来のペプチド、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するラット由来のペプチド、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来のペプチド、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するラット由来またはマウス由来のペプチドなどがあげられる。
【００１８】
本発明のペプチドの部分ペプチドとしては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできるものであれば、いかなるものであってもよく、本発明のペプチドと実質的に同質の活性を有していればよい。該部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明のペプチドの構成アミノ酸配列のうち少なくとも１０個以上、好ましくは２０個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、（ｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が欠失し、（ｉｉ）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または（ｉｉｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは数個（１〜４個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
以下、本発明のペプチドとの本発明のペプチドの部分ペプチドとをまとめて本発明のペプチドと称することがある。
【００１９】
本発明の蛋白質は、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞（例えば、ＭＥＬ、Ｍ１、ＣＴＬＬ−２、ＨＴ−２、ＷＥＨＩ−３、ＨＬ−６０、ＪＯＳＫ−１、Ｋ５６２、ＭＬ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ−１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＴＡＬＬ−１、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、ＨＵＴ−７８、ＨＵＴ−１０２、Ｈ９、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＨＥＬ、ＪＫ−１、ＣＭＫ、ＫＯ−８１２、ＭＥＧ−０１など）、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など（特に、脳や脳の各部位）に由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。
本発明の蛋白質がシグナル配列を有している場合は該ペプチドまたは蛋白質を効率良く細胞外に分泌させることができる。
【００２０】
配列番号：３７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：３７で表されるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：３７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：３７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：３７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
本発明の配列番号：３７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：３７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：３７で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。具体的にはＷＯ  ０１／１６３０９号公報に記載の蛋白質などが挙げられる。
以下、配列番号：３７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をＺＡＱまたはヒトＺＡＱと記載することがある。
【００２１】
配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と約９７％以上、好ましくは約９８％以上、より好ましくは約９９％以上、最も好ましくは約９９．５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、例えば、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号：４４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列と約９５％以上、好ましくは約９６％以上、より好ましくは約９７％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：４４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、例えば、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号：４４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
【００２２】
配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、例えば、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましく、具体的にはＷＯ  ９８／４６６２０号公報に記載の蛋白質などが挙げられる。
以下、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をＩ５Ｅまたはヒト型Ｉ５Ｅなどと記載することがある。
【００２３】
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と約９５％以上、好ましくは約９６％以上、より好ましくは約９７％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、例えば、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましく、具体的には、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４９１巻，  ３６９−３７５頁，  ２０００年に記載の蛋白質などが挙げられる。
配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と約９５％以上、好ましくは約９６％以上、より好ましくは約９７％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、例えば、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましく、具体的にはＷＯ  ９８／４６６２０号公報に記載の蛋白質などが挙げられる。
【００２４】
配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
本発明の配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
以下、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をウシ型ＺＡＱと記載することがある。
【００２５】
配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
本発明の配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
以下、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をウシ型Ｉ５Ｅと記載することがある。
【００２６】
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、本発明のペプチドに対する結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。
【００２７】
さらに、本発明の蛋白質としては、（ｉ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０または配列番号：５２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０または配列番号：５２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０または配列番号：５２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｉｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
【００２８】
本発明の蛋白質の具体例としては、例えば、配列番号：３７または配列番号：４０で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来（より好ましくはヒト脳由来）の蛋白質、配列番号：４２または配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有するラット由来の蛋白質、配列番号：４６または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するマウス由来の蛋白質、配列番号：５０または配列番号：５２で表されるアミノ酸配列を含有するウシ由来の蛋白質などがあげられる。
【００２９】
本発明の蛋白質の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した本発明の蛋白質の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、本発明の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のリガンド結合活性を有するものなどが用いられる。
具体例として、本発明の蛋白質の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、前記した本発明の蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、「実質的に同質のリガンド結合活性」とは、前記と同意義を示す。「実質的に同質のリガンド結合活性」の測定は自体公知の方法に準じて行なうことができる。
【００３０】
また、本発明の部分ペプチドは、配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０または配列番号：５２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは１〜５個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
【００３１】
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００３２】
本明細書におけるペプチドおよび蛋白質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：３７で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする本発明の蛋白質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のペプチドおよび本発明の蛋白質（本発明のペプチド・蛋白質）がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチド・蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のペプチド・蛋白質には、上記したペプチド・蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド・糖蛋白質などの複合ペプチド・複合蛋白質なども含まれる。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００３３】
本発明のペプチドもしくは蛋白質またはその塩は、前述したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のペプチド・蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：９、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：２９、配列番号：３７、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０または配列番号：５２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド・蛋白質合成法またはこれに準じて製造することもできる。さらに、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはその塩は、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １４９１巻，  ３６９−３７５頁，  ２０００年に記載の方法に準じて製造できる。配列番号：４０または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質またはその塩は、ＷＯ  ９８／４６６２０号公報に記載の方法に準じて製造できる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００３４】
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそれらのアミド体またはそれらの塩の合成には、通常市販のペプチド・蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチド・蛋白質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチド・蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のペプチド・蛋白質またはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ペプチド・蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００３５】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド・蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００３６】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００３７】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００３８】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
ペプチド・蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチド・蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したペプチド・蛋白質とを製造し、この両ペプチド・両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチド・保護蛋白質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチド・粗蛋白質を得ることができる。この粗ペプチド・粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチド・蛋白質のアミド体を得ることができる。
ペプチド・蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチド・蛋白質のアミド体と同様にして、所望のペプチド・蛋白質のエステル体を得ることができる。
【００３９】
本発明のペプチドおよび本発明の蛋白質は、自体公知のペプチドの合成法に従って製造することができる。また、本発明の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のペプチドもしくは本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドまたはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  および  Ｍ．Ａ．  Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド  シンセシス  （Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ  ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、  丸善（株）  （１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明  および榊原俊平、生化学実験講座  １、  蛋白質の化学ＩＶ、  ２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発  第１４巻  ペプチド合成  広川書店
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドまたは本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドまたは部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００４０】
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
【００４１】
具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性（例、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用など）を有するペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡとしては、配列番号：２または配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。
配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４２】
具体的には、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性（例、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用など）を有するペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡとしては、配列番号：４または配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。
配列番号：４で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４３】
具体的には、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１０で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性（例、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用など）を有するペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：１０で表される塩基配列を含有するＤＮＡとしては、配列番号：１０または配列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。
配列番号：１０で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１０で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４４】
具体的には、配列番号：１３、配列番号：１５または配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１４、配列番号：１６または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１４、配列番号：１６または配列番号：１８で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：１３、配列番号：１５または配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性（例、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用など）を有するペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：１４、配列番号：１６または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡとしては、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：１４、配列番号：１６または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。
配列番号：１４、配列番号：１６または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１４、配列番号：１６または配列番号：１８で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４５】
具体的には、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２６で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２６で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性（例、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用など）を有するペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２６で表される塩基配列を含有するＤＮＡとしては、配列番号：２６または配列番号：２８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。
配列番号：２６で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２６で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
具体的には、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３０または配列番号：３１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：３０または配列番号：３１で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性（例、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用など）を有するペプチドをコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：３０または配列番号：３１で表される塩基配列を含有するＤＮＡとしては、配列番号：３３、配列番号：３０、配列番号：３５または配列番号：３１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。
配列番号：３０または配列番号：３１で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３０または配列番号：３１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４６】
また、配列番号：３７で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３８または配列番号：３９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：３８または配列番号：３９で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：３７で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：３８または配列番号：３９で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３８または配列番号：３９で表される塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４３で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：４３で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４３で表される塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４５で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４５で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
【００４７】
配列番号：４５で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４５で表される塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４０で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４１で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：４１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：４１で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４１で表される塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４７で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：４７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：４７で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４７で表される塩基配列と約９５％以上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４９で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：４９で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：４９で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４９で表される塩基配列と約９５％以上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４８】
配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５１で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：５１で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：５２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５３で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：５３で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５３で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは約９７％以上、より好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００４９】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００５０】
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１０で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１４で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１６で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：１９で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２０で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２２で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２４で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：２７で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２８で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：２９で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３０または配列番号：３１で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：３２で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３３で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：３４で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３５で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられる。
【００５１】
また、配列番号：３７で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３８または配列番号：３９で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４３で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４５で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：４０で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４１で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４７で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４９で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：５０で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５１で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられ、配列番号：５２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５３で表される塩基配列を含有するＤＮＡがあげられる。
【００５２】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）とは、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、本発明のペプチドの遺伝子の複製又は発現を阻害することのできるアンチセンス・（オリゴ）ヌクレオチド（核酸）を、クローン化したあるいは決定されたペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした（オリゴ）ヌクレオチド（核酸）は、本発明のペプチドの遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成又は機能を阻害することができるか、あるいは本発明のペプチド関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のペプチドの遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のペプチド関連ＲＮＡの選択された配列に相補的な（オリゴ）ヌクレオチド、及び本発明のペプチド関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができる（オリゴ）ヌクレオチドは、生体内及び生体外で本発明のペプチドの遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。
用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列又は核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列又は核酸とペプチドとの間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチドのアミノ酸を通常指している。本発明のペプチドの遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、及び３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、本発明のペプチドの遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００５３】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的な（オリゴ）ヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができる（オリゴ）ヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・（オリゴ）ヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリナグや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド又は非修飾オリゴヌクレオチド、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」及び「核酸」とは、プリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン及びピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００５４】
本発明のアンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＰｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，  ８巻，  ２４７頁，  １９９２年、同８巻，  ３９５頁，  １９９２年、Ｓ．  Ｔ．  Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３  などに開示がある。本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピッド、コレステロールなど）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００５５】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎによって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４１、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１または配列番号：５３で表される塩基配列を含有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（ｉｉ）配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４１、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１または配列番号：５３で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有し、本発明の蛋白質と実質的に同質の活性（例、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４１、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１または配列番号：５３で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４１、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１または配列番号：５３で表される塩基配列と約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００５６】
本発明のペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチド（以下、本発明の蛋白質と略記する）を完全にコードするＤＮＡのクローニングも本発明のペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングと同様にして行うことができる。
【００５７】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇｕｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたペプチド・蛋白質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のペプチド・蛋白質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のペプチド・蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００５８】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００５９】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のペプチド・蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００６０】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）  〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。
【００６１】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，  Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３，  ２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００６２】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，  ４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新  細胞工学実験プロトコール．２６３２−６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、Ｇ蛋白質共役型蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００６３】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル  アクリル酸のような薬剤を加えることができる。  宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．    Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００６４】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のペプチド・蛋白質を生成せしめることができる。
【００６５】
上記培養物から本発明のペプチド・蛋白質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のペプチド・蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にペプチド・蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるペプチド・蛋白質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００６６】
かくして得られるペプチド・蛋白質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するペプチド・蛋白質を、精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ペプチド・ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のペプチドの活性は、標識した本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
また、生成する本発明の蛋白質の活性は、標識した本発明のペプチドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００６７】
また、本発明のペプチドは、遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させ、レドックスバッファー中でリフォールディングして活性型のペプチドとして製造してもよい（ＷＯ  ０２／５７４４３号公報）。
【００６８】
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のペプチド・蛋白質と略記することもある）に対する抗体は、本発明のペプチド・蛋白質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００６９】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のペプチド・蛋白質は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化した本発明のペプチド・蛋白質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００７０】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、本発明のペプチド・蛋白質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明のペプチド・蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
【００７１】
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００７２】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００７３】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発明のペプチド・蛋白質の抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のペプチド・蛋白質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアー蛋白質とハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
【００７４】
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００７５】
本発明のペプチド、配列番号：３６で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはその塩（以下、ＭＩＴ１類と略記する場合がある）もしくは本発明の蛋白質、それらをコードするポリヌクレオチドまたはそれらに対する抗体は、摂食調節剤を得るための簡便な探索法（スクリーニング）、さらには、肥満症〔例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ  ｂｏｄｙ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症  （ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ  ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ  ｏｂｅｓｉｔｙ）など〕、摂食障害（例、拒食症、過食症など）などの予防・治療剤を得るための簡便な探索法（スクリーニング）に有用である。特に、本発明の蛋白質のアンタゴニストは、優れた摂食障害のなどの予防・治療剤として、また本発明の蛋白質のアゴニストは、優れた肥満症の予防・治療剤として有用である。
【００７６】
さらに、本発明の蛋白質、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のアンチセンスＤＮＡおよび本発明のペプチドに対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、（ｉ）本発明の蛋白質が関与する各種疾病の予防・治療剤、（ｉｉ）本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング、（ｉｉｉ）本発明の蛋白質の定量、（ｉｖ）遺伝子診断薬、（ｖ）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬、（ｖｉ）本発明の抗体を含有する医薬および診断薬、（ｖｉｉ）本発明のＤＮＡを有する非ヒト動物の作製、（ｖｉｉｉ）構造的に類似したリガンド・受容体との比較にもとづいたドラッグデザインなどの実施のために有用である。特に、本発明の組換え蛋白質の発現系を用いた受容体結合アッセイ系を用いることによって、ヒトや哺乳動物に特異的な本発明の蛋白質に対するリガンドの結合性を変化させる化合物（例、ＺＡＱアゴニスト、ＺＡＱアンタゴニストなど）をスクリーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病の予防・治療剤などとして使用することができる。
これら用途について、以下に具体的に説明する。
【００７７】
（１）（ｉ）本発明のペプチドの活性を阻害または促進する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明の蛋白質の活性を阻害または促進する化合物またはその塩、（ｉｉｉ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻害または促進する化合物またはその塩、または（ｉｖ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を阻害または促進する化合物またはその塩を含有してなる摂食調節剤。
（ｉ−１）本発明のペプチドの活性を阻害する化合物としては、本発明のペプチドの活性を阻害する化合物であればよく、例えば、摂食抑制作用、体温降下作用、腸管収縮制御活性、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用などを阻害する化合物などが挙げられる。
（ｉ−２）本発明のペプチドの活性を促進する化合物としては、本発明のペプチドの活性を促進する化合物であればよく、例えば、摂食促進作用、体温上昇作用を有する化合物、腸管収縮制御活性、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用などを促進する化合物などが挙げられる。
（ｉｉ−１）本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物としては、本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物であればよく、例えば、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用などを阻害する化合物などが挙げられる。
（ｉｉ−２）本発明の蛋白質の活性を促進する化合物としては、本発明の蛋白質の活性を促進する化合物であればよく、例えば、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用などを促進する化合物などが挙げられる。
（ｉｉｉ−１）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻害する化合物としては、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻害する化合物であればよい。
（ｉｉｉ−２）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を促進する化合物としては、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を促進する化合物であればよい。
（ｉｖ−１）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を阻害する化合物としては、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を阻害する化合物であればよく、例えば、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類による、本発明の蛋白質の本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用などを阻害する化合物などが挙げられる。
（ｉｖ−２）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を促進する化合物としては、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を促進する化合物であればよく、例えば、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類による、本発明の蛋白質の本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用などを促進する化合物などが挙げられる。
上記（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物またはその塩は、例えば、後述の本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いることにより得られうる。
【００７８】
該塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩などがあげられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
上記化合物またはその塩は、例えば、低毒性で安全な摂食調節剤として用いられる。
中でも、（ｉ）本発明のペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物またはその塩、（ｉｉｉ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩、（ｉｖ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を阻害する化合物またはその塩は、例えば、摂食障害（例、拒食症、過食症など）、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの予防・治療剤として用いられる。好ましくは摂食障害の予防・治療剤として用いられる。
（ｉ）本発明のペプチドの活性を促進する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明の蛋白質の活性を促進する化合物またはその塩、（ｉｉｉ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻害または促進する化合物またはその塩、（ｉｖ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を促進する化合物またはその塩は、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食障害（例、拒食症、過食症など）、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの予防・治療剤として用いられる。好ましくは肥満症などの予防・治療剤として用いられる。
このような医薬として使用する場合、後述の本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いることにより得られる化合物を医薬として実施する場合と同様にして実施することができる。
【００７９】
（２）本発明のペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスヌクレオチドを含有してなる摂食障害の予防・治療剤
上記アンチセンスヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ等）は、生体内における本発明のペプチドまたはそのＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば摂食調節剤として、例えば、摂食障害（例、拒食症、過食症など）などの予防・治療剤などの医薬として安全に用いられる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
【００８０】
（３）本発明のペプチドに対する抗体または本発明の蛋白質に対する抗体を含有してなる摂食障害の予防・治療剤
上記抗体は、例えば、本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の発現過多に起因する疾患、例えば摂食調節剤として、例えば、摂食障害（例、拒食症、過食症など）などの予防・治療剤などの医薬として安全に用いられる。
このような医薬として使用する場合、後述の本発明の抗体を含有する医薬を実施する場合と同様にして実施することができる。
【００８１】
（４）本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有してなる摂食障害または肥満症などの診断薬
上記ポリヌクレオチドは、例えばプローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）における本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多等の遺伝子診断薬として有用である。
上記遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））、  ＤＮＡマイクロアレイ等により実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションやＤＮＡマイクロアレイにより発現低下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法やＤＮＡマイクロアレイによりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、摂食障害（例、拒食症、過食症など）、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）などに罹患している可能性が高いと診断することができる。
【００８２】
（５）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質とを用いるスクリーニング
本発明のペプチド（その部分ペプチドも含む）またはＭＩＴ１類および本発明の蛋白質（本発明の蛋白質の部分ペプチドも含む）を用いることを特徴とするスクリーニング方法、または本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類および本発明の蛋白質を用いることを特徴とするスクリーニング用キット（以下、本発明のスクリーニング方法、本発明のスクリーニング用キットと略記する場合もある）により、例えば、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物、好ましくは、
（ｉ）本発明のペプチドの活性を阻害または促進する化合物またはその塩、
（ｉｉ）本発明の蛋白質の活性を阻害または促進する化合物またはその塩、
（ｉｉｉ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻害または促進する化合物またはその塩、
（ｉｖ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を阻害または促進する化合物またはその塩などが得られる。
上記の本発明のペプチドの活性を阻害する化合物は、本発明のペプチドの活性を阻害し、例えば、摂食抑制作用、体温降下作用、腸管収縮制御活性、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用などを阻害する。
上記の本発明のペプチドの活性を促進する化合物は、本発明のペプチドの活性を促進し、例えば、摂食抑制作用、体温降下作用、腸管収縮制御活性、本発明の蛋白質に対する結合活性、本発明の蛋白質を介するシグナル情報伝達作用などを促進する。
上記の本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物は、本発明の蛋白質の活性を阻害し、例えば、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用などを阻害する。
上記の本発明の蛋白質の活性を促進する化合物は、本発明の蛋白質の活性を促進し、例えば、本発明のペプチドに対する結合活性、シグナル情報伝達作用などを促進する。
上記化合物またはその塩は、例えば、低毒性で安全な摂食調節剤として用いられる。
（ｉ）本発明のペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物またはその塩、（ｉｉｉ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩、（ｉｖ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を阻害する化合物またはその塩は、例えば、摂食障害（例、拒食症、過食症など）、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの予防・治療剤として用いられる。好ましくは摂食障害の予防・治療剤として用いられる。
（ｉ）本発明のペプチドの活性を促進する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明の蛋白質の活性を促進する化合物またはその塩、（ｉｉｉ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻害または促進する化合物またはその塩、（ｉｖ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を促進する化合物またはその塩は、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食障害（例、拒食症、過食症など）、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの予防・治療剤として用いられる。好ましくは肥満症などの予防・治療剤として用いられる。
【００８３】
本発明のスクリーニング方法または本発明のスクリーニング用キットについて、以下に詳述する。
本発明の蛋白質を用いるか、または組換え型本発明の蛋白質の発現系を構築し、該発現系を用いた本発明のペプチドとの結合アッセイ系（リガンド・受容体アッセイ系）を用いることによって、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物（例、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩などをスクリーニングすることができる。
このような化合物には、本発明の蛋白質を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物（アゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（アンタゴニスト）などが含まれる。「本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる」とは、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合を阻害する場合と促進する場合の両方を包含するものである。
本発明は、（ｉ）本発明の蛋白質に、本発明のペプチドを接触させた場合と（ｉｉ）上記した本発明の蛋白質に、本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本スクリーニングにおいては、ＭＩＴ１類は、本発明のペプチドと同様に使用すればよい。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）上記した本発明の蛋白質に本発明のペプチドを接触させた場合と（ｉｉ）上記した本発明の蛋白質に本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば該本発明の蛋白質に対する本発明のペプチドの結合量、細胞刺激活性などを測定して比較する。
【００８４】
本発明のスクリーニング方法としての具体例としては、例えば、
（ａ）本発明のペプチドを本発明の蛋白質に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質に接触させた場合における、本発明のペプチドの本発明の蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｂ）本発明のペプチドを、本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、本発明のペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（ｃ）本発明の蛋白質が、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質である上記（ｂ）記載のスクリーニング方法、
（ｄ）本発明のペプチドが、標識したペプチドである上記（ａ）〜（ｃ）のスクリーニング方法などの受容体結合アッセイ系、
（ｅ）本発明のペプチドを本発明の蛋白質に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質に接触させた場合における、本発明の蛋白質を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（ｆ）本発明のペプチドを本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、本発明の蛋白質を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（ｇ）本発明の蛋白質が、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の蛋白質である上記（ｆ）のスクリーニング方法などの細胞刺激アッセイ系などが挙げられる。
【００８５】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の蛋白質としては、上記の本発明の蛋白質を含有するものであれば何れのものであってもよい。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明の蛋白質などが適している。また、哺乳動物由来の内皮細胞も使用できる。
本発明の蛋白質を製造するには、前述の方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、本発明の蛋白質を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
本発明の蛋白質を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。
本発明の蛋白質を含有する細胞としては、本発明の蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明の蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該本発明の蛋白質を含有する細胞や膜画分中の本発明の蛋白質の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００８６】
上記の哺乳動物由来の内皮細胞としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ラット、マウスなどの内皮細胞（例、動脈血管内皮細胞、毛細血管内皮細胞など）が挙げられる。
例えば、哺乳動物由来の毛細血管内皮細胞の一つであるウシ毛細血管内皮細胞は、以下の方法で調製することができる。また、同様の方法で、哺乳動物の脳、卵巣などからも毛細血管内皮細胞を調製することができる。
先ず、ウシ副腎の表面についている脂質をはさみで除去後、副腎を２０％イソジンを含む生理食塩水に５分間浸し消毒する。その後、生理食塩水で副腎を洗浄してから半分に切断し副腎髄質を除去する。残った副腎皮質を内側からメスとはさみで採取し細かく切断する。続いて、副腎皮質半分を用いて以下の操作を実施する。すなわち、細片に０．５％コラゲナーゼ（和光純薬）と０．１％  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  （ＢＳＡ）を含むＭｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）２０  ｍｌを加え、３７℃で３０分間インキュベーションする。その後、ピペッティングして組織塊を崩した後、１〜６００  ｒｐｍで５分間遠心し、得られた沈殿に２５％  ＢＳＡを含むＭＥＭを２５  ｍｌ添加し再度２，７００ｒｐｍで２０分間遠心する。得られた沈殿に上述のコラゲナーゼを含むＭＥＭを加えて懸濁し３７℃で１５分間インキュベーションした後、コラゲナーゼ消化物をナイロンガーゼ（１００ミクロン）で濾過し濾液を回収する。この濾液を再度ナイロンガーゼ（５０ミクロン）で濾過し、ガーゼに捕集されたくずを１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  （ＦＢＳ）を含むＭＥＭを用いてゼラチンコートした６穴プレートに洗いこむ。４時間後、１０％  ＦＢＳ／ＭＥＭでプレートを穏やかに洗浄後、２  ｎｇ／ｍｌ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒと１０％  ＦＢＳを含むＭＥＭを添加し５％ＣＯ２下３７℃で培養する。以後、培地は３日毎に全量交換する。５〜６日後に目的とする細胞のコロニーを残して不要細胞を顕微鏡下でパスツールピペットを用いて除去する。９〜１０日後に目的コロニーにクローニングリングをかけ、トリプシン処理により細胞を回収し２４穴プレートに移して培養する。得られた細胞を適当なスケールになるまで培養し実験に使用する。
【００８７】
前記の受容体結合アッセイ系や細胞刺激アッセイ系などのスクリーニング方法を実施するためには、例えば、本発明の蛋白質画分と、本発明のペプチド（例、標識した本発明のペプチド）などが用いられる。本発明の蛋白質画分としては、天然型の本発明の蛋白質画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明の蛋白質画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識した本発明のペプチドとしては、例えば、放射性同位元素（例、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕など）、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど〕、酵素（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、ビオチン、ランタニド元素などで標識された本発明のペプチド、好ましくは放射性同位元素で標識された本発明のペプチドなどを用いることができる。また、ボルトン−ハンター試薬を用いて公知の方法で調製した本発明のペプチドの標識体を利用することもできる。
具体的には、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まず本発明の蛋白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより本発明の蛋白質標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明の蛋白質や本発明のペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１〜１０ｍｌの該本発明の蛋白質溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のペプチドを添加し、同時に１０−４〜１０−１μＭの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は０〜５０℃、望ましくは４〜３７℃で、２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００８８】
また、本発明の蛋白質と本発明のペプチドとの結合を測定する方法として、ＢＩＡｃｏｒｅ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いることもできる。この方法では、本発明のペプチドを装置に添付のプロトコールに従ったアミノカップリング法によってセンサーチップに固定し、本発明の蛋白質を含有する細胞または本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質変換体から精製した本発明の蛋白質または本発明の蛋白質を含む膜画分、あるいは精製した本発明の蛋白質または本発明の蛋白質を含む膜画分および試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を毎分２〜２０μｌの流量で通過させる。  センサーチップ上の本発明のペプチドと本発明の蛋白質とが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を共存する試験化合物が変化させることを観察することによって本発明の蛋白質と本発明のペプチドとの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。この方法は、本発明の蛋白質をセンサーチップに固定し、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を通過させる方法を用いても同様に測定することができる。試験化合物としては、上記と同様のものなどがあげられる。
【００８９】
前記の細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法を実施するためには、本発明の蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明の蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【００９０】
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明の蛋白質を発現した細胞が用いられる。本発明の蛋白質を発現した細胞としては、前述の組換え型本発明の蛋白質発現細胞株などが望ましい。形質転換体である本発明の蛋白質発現細胞は安定発現株でも一過性発現株でも構わない。また、動物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。
試験化合物としては、例えばペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【００９１】
上記細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法について、さらに具体的に以下〔１〕〜〔１２〕に記載する。
〔１〕受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激されると細胞内のＧ蛋白質が活性化されてＧＴＰが結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと変化するが、このとき反応液中にＧＴＰγＳを添加しておくと、ＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧ蛋白質に結合するが、加水分解されずにＧ蛋白質を含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いると細胞膜に残存した標識されたＧＴＰγＳを測定することにより、受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。
この反応を利用して、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
この方法は、本発明の蛋白質を含む膜画分を用いて行う。本測定法において本発明の蛋白質膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を示す物質はアゴニストである。
具体的には、標識したＧＴＰγＳの存在下、本発明のペプチドを本発明の蛋白質細胞膜画分に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質細胞膜画分に接触させた場合における、本発明の蛋白質細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のペプチドによる本発明の蛋白質細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の蛋白質細胞膜画分に接触させ、本発明の蛋白質細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定することにより、アゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００９２】
スクリーニング法の一例についてより具体的に以下に述べる。
公知の方法に準じて調製した本発明の蛋白質を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１μＭ  ＧＤＰ、０．１％  ＢＳＡ；ｐＨ７．４）で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。これをＦａｌｃｏｎ２０５３に０．２ｍｌずつ分注し、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を加え、さらに終濃度２００ｐＭとなるように［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを加える。２５℃で１時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ＢＳＡ，０．０５％  ＣＨＡＰＳ；ｐＨ７．４）１．５ｍｌを加えて、ガラス繊維ろ紙ＧＦ／Ｆでろ過する。６５℃、３０分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの放射活性を測定する。本発明のペプチドのみを加えた実験区の放射活性を１００％、本発明のペプチドを加えなかった実験区の放射活性を０％とし、本発明のペプチドによるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する試験化合物の影響を算出する。ＧＴＰγＳ結合促進活性が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００９３】
〔２〕本発明の蛋白質発現細胞は、本発明のペプチドの刺激により、細胞内ｃＡＭＰの産生が抑制される。この反応を利用して、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、本発明のペプチドを本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生抑制活性を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質としては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなどが用いられる。
本発明の蛋白質発現細胞内のｃＡＭＰ産生量は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗ｃＡＭＰ抗体と〔１２５Ｉ〕標識ｃＡＭＰ（ともに市販品）を使用することによるＲＩＡ系、または抗ｃＡＭＰ抗体と標識ｃＡＭＰとを組み合わせたＥＩＡ系で測定することができる。また、抗ｃＡＭＰ抗体を、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａまたは抗ｃＡＭＰ抗体産生に用いた動物のＩｇＧなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと〔１２５Ｉ〕標識ｃＡＭＰとを使用するＳＰＡ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）法による定量も可能である（アマシャムファルマシアバイオテク社製のキットを使用する）。
本方法において、本発明のペプチドによる本発明の蛋白質発現細胞のｃＡＭＰ産生抑制活性を阻害する活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させて、ｃＡＭＰ産生抑制活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
【００９４】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞（例、ＣＨＯ細胞などの動物細胞）（例、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞；ＷＯ  ０１／１６３０９号公報の実施例３記載）を２４穴プレートに５ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ  ３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％  ＢＳＡおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後、０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、１μＭの本発明のペプチドまたは１μＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した２μＭフォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。１００μｌの２０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、その後氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出する。抽出液中のｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰ  ＥＩＡキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定する。フォルスコリンの刺激によって産生されたｃＡＭＰ量を１００％とし、１μＭの本発明のペプチドの添加によって抑制されたｃＡＭＰ量を０％として、本発明のペプチドによるｃＡＭＰ産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算出する。本発明のペプチドの活性を阻害して、ｃＡＭＰ産生活性が例えば５０％以上になる試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
また、本発明のペプチドの刺激により、細胞内ｃＡＭＰ量が増加する性質を示す本発明の蛋白質発現細胞を使用する場合、本発明のペプチドを本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生促進活性を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、本発明のペプチドによる本発明の蛋白質発現細胞のｃＡＭＰ産生促進活性を阻害する活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させてｃＡＭＰ産生促進活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
ｃＡＭＰ産生促進活性は、上記のスクリーニング法においてフォルスコリンを添加せずに本発明の蛋白質発現細胞（例、ＣＨＯ細胞などの動物細胞）に本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加して産生されたｃＡＭＰを上記の方法で定量して測定する。
【００９５】
〔３〕ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを用いて、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
ＣＲＥ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを得る。ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の蛋白質発現細胞において、ｃＡＭＰの上昇を伴う刺激は、ＣＲＥを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のｃＡＭＰ量の変動を検出することができる。
具体的には、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、本発明のペプチドを、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質としては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなどが用いられる。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン  ベイシックベクター、ピッカジーン  エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。ＣＲＥを含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、本発明のペプチドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性抑制を回復させる試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させて、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量の本発明のペプチドと同様な抑制を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００９６】
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
ＣＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の蛋白質発現細胞を、２４穴プレートに５ｘ１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．２ｍＭ  ３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％  ＢＳＡおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、１μＭの本発明のペプチドまたは１μＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した２μＭフォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを、細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。本発明のペプチド単独を添加した場合と、１μＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。
本発明のペプチドは、フォルスコリン刺激に基づくルシフェラーゼによる発光量の増加を抑制する。該抑制を回復させる化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００９７】
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ  ５３０を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴ  ＣＡＴ  ｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＫｉＴを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Ａｕｒｏｒａ  Ｇａｌ−ＸＥを用いて測定する。
【００９８】
〔４〕本発明の蛋白質発現細胞は、本発明のペプチドの刺激により、アラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。この反応を利用して、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
あらかじめ、標識したアラキドン酸を、本発明の蛋白質発現細胞に取り込ませておくことによって、アラキドン酸代謝物放出活性を、細胞外に放出された標識されたアラキドン酸代謝物を測定することによって測定することができる。
具体的には、本発明のペプチドを、標識したアラキドン酸を含有する本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、標識したアラキドン酸を含有する本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、アラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のペプチドによるアラキドン酸代謝物放出活性を阻害する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
また、試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、本発明の蛋白質発現細胞のアラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。
【００９９】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに５ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養後、［３Ｈ］アラキドン酸を０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌとなるよう添加し、１６時間後、細胞を０．０５％  ＢＳＡおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）（以下、反応用バッファーと略記する）で洗浄する。終濃度１０μＭの本発明のペプチドまたは終濃度１０μＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を含む反応用バッファー  ５００μｌを、各ｗｅｌｌに添加する。３７℃で６０分間インキュベートした後、反応液  ４００μｌをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定する。
反応用バッファー  ５００μｌのみを添加した場合（本発明のペプチド非添加・試験化合物非添加）の遊離［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を０％、１０μＭの本発明のペプチドを含む反応用バッファーを添加した場合（試験化合物非添加）の遊離［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を１００％として、試験化合物を添加した場合の遊離［３Ｈ］アラキドン酸代謝物の量を算出する。
アラキドン酸代謝物放出活性が、例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【０１００】
〔５〕本発明の蛋白質発現細胞は、本発明のペプチドの刺激により、細胞内のＣａ濃度が上昇する。この反応を利用して、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のペプチドを、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、本発明のペプチドによる細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、２日後、培養液を、４ｍＭ  Ｆｕｒａ−２  ＡＭ（同仁化学研究所）を縣濁したＨＢＳＳに置換し、室温で２時間３０分おく。ＨＢＳＳで洗浄した後、キュベットにカバーグラスをセットし、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し、励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍでの、５０５ｎｍの蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
また、ＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社製）を使って行ってもよい。本発明の蛋白質発現細胞縣濁液にＦｌｕｏ−３  ＡＭ（同仁化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄後、９６穴プレートに細胞を播く。ＦＬＩＰＲ装置にセットし、Ｆｕｒａ−２の場合と同様に、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
さらに、本発明の蛋白質発現細胞に、細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）を共発現させておき、細胞内Ｃａイオン濃度の上昇によって、該遺伝子蛋白質（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）がＣａ結合型となり発光することを利用して、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることもできる。
細胞内Ｃａイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発現させた本発明の蛋白質発現細胞を、９６穴プレートに播き、上記と同様に、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
本発明のペプチドによる蛍光強度の上昇を、抑制する試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【０１０１】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
対照としてＥＴＡ（エンドセリンＡ受容体）発現ＣＨＯ細胞２４番クローン（以後ＥＴＡ２４細胞と略称する。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ２７９巻、６７５−６８５頁、１９９６年参照）を用い、アッセイ用サンプルについて、ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞；ＷＯ  ０１／１６３０９号公報の実施例３記載）およびＥＴＡ２４細胞における細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性の測定をＦＬＩＰＲ（モレキュラーデバイス社製）を用いて行う。ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞、ＥＴＡ２４細胞共に１０％透析処理済ウシ胎児血清（以後ｄ  ＦＢＳとする）を加えたＤＭＥＭで継代培養しているものを用いる。ＺＡＱＣ−Ｂ１細胞、ＥＴＡ２４細胞をそれぞれ１５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように培地（１０％  ｄ  ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）に懸濁し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Ｂｌａｃｋ  ｐｌａｔｅ  ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ、Ｃｏｓｔｅｒ社）に分注器を用いて各ウェルに２００μｌずつ植え込み（３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ウェル）、５％  ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃で一晩培養した後用いる（以後、細胞プレートとする）。Ｈ／ＨＢＳＳ（ニッスイハンクス２（日水製薬株式会社）  ９．８  ｇ、炭酸水素ナトリウム  ０．３５ｇ、ＨＥＰＥＳ  ４．７７  ｇ  、水酸化ナトリウム溶液で  ｐＨ７．４に合わせた後、フィルター滅菌処理）２０  ｍｌ、２５０  ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ    ２００  μｌ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）  ２００  μｌを混合する。また、Ｆｌｕｏ  ３−ＡＭ（同仁化学研究所）  ２バイアル（５０  μｇ）をジメチルスルフォキサイド  ４０  μｌ、２０％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）  ４０  μｌに溶解し、これを上記Ｈ／ＨＢＳＳ−Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ−ＦＢＳ  に加え、混和後、８連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル  １００  μｌずつ分注し、５％  ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃で１時間インキュベートする（色素ローディング）。アッセイ用サンプル（各フラクション）に、２．５  ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、０．１％  ＣＨＡＰＳを含むＨ／ＨＢＳＳ  １５０  μｌを加えて希釈し、ＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Ｖ−Ｂｏｔｔｏｍプレート、Ｃｏｓｔｅｒ社）へ移す（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素ローディング終了後、Ｈ／ＨＢＳＳに２．５  ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて細胞プレートを４回洗浄し、洗浄後１００  μｌの洗浄バッファーを残す。この細胞プレートとサンプルプレートをＦＬＩＰＲにセットしアッセイを行う（ＦＬＩＰＲにより、サンプルプレートから５０  μｌのサンプルが細胞プレートへと移される）。
【０１０２】
〔６〕受容体を発現する細胞に、受容体アゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度は上昇する。本発明のペプチドの、本発明の蛋白質発現細胞における細胞内イノシトール三リン酸産生活性を利用することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、標識したイノシトールの存在下、本発明のペプチドを、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、イノシトール三リン酸産生活性を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、イノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、イノシトール三リン酸産生上昇を測定することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【０１０３】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに播き、１日間培養する。その後、ｍｙｏ−［２−３Ｈ］ｉｎｏｓｉｔｏｌ（２．５μＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加した培地で１日間培養し、細胞を放射活性を有するイノシトールを無添加の培地でよく洗浄する。本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加後、１０％過塩素酸を加え、反応を止める。１．５Ｍ  水酸化カリウムおよび６０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液で中和し、０．５ｍｌのＡＧ１ｘ８樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を詰めたカラムに通し、５ｍＭ  四ホウ酸ナトリウム（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７）および６０ｍＭ  ギ酸アンモニウムで洗浄した後、１Ｍ  ギ酸アンモニウムおよび０．１Ｍ  ギ酸で溶出した放射活性を、液体シンチレーションカウンターで測定する。本発明のペプチドを添加しない場合の放射活性を０％、本発明のペプチドを添加した場合の放射活性を１００％とし、試験化合物の、本発明のペプチドと本発明の蛋白質の結合に対する影響を算出する。
イノシトール三リン酸産生活性が、例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【０１０４】
〔７〕ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを用いて、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
ＴＲＥ（ＴＰＡ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むＤＮＡを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを得る。ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の蛋白質発現細胞において、細胞内カルシウム濃度の上昇を伴う刺激は、ＴＲＥを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。
具体的には、本発明のペプチドを、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン  ベイシックベクター、ピッカジーン  エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。ＴＲＥを含むＤＮＡを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、本発明のペプチドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみをＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、本発明のペプチドと同様な発光量の増加を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【０１０５】
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
ＴＲＥ−レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の蛋白質発現細胞を、２４穴プレートに５ｘ１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養する。細胞を０．０５％  ＢＳＡおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した後、１０ｎＭの本発明のペプチドまたは１０ｎＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を添加し、３７℃で６０分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。本発明のペプチドを添加した場合と、１０ｎＭの本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。
本発明のペプチドによる細胞内カルシウムの上昇によって、ルシフェラーゼによる発光量が増加する。この増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【０１０６】
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ  ５３０を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製ＦＡＳＴ  ＣＡＴ  ｃｈｒｏｌａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＫｉＴを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Ａｕｒｏｒａ  Ｇａｌ−ＸＥを用いて測定する。
【０１０７】
〔８〕本発明の蛋白質発現細胞は、本発明のペプチドの刺激により、ＭＡＰキナーゼが活性化され、増殖する。この反応を利用して、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のペプチドを、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、細胞増殖を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本発明の蛋白質発現細胞の増殖は、例えば、ＭＡＰキナーゼ活性、チミジン取り込み活性、細胞数などを測定すればよい。
具体例としては、ＭＡＰキナーゼ活性については、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を、本発明の蛋白質発現細胞に添加した後、細胞溶解液から抗ＭＡＰキナーゼ抗体を用いた免疫沈降によりＭＡＰキナーゼ分画を得た後、公知の方法、例えば和光純薬製ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔおよびγ−［３２Ｐ］−ＡＴＰを使用してＭＡＰキナーゼ活性を測定し、比較する。
チミジン取り込み活性については、本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに播種し、培養し、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した後、放射活性により標識したチミジン（例、［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］−チミジンなど）を加え、その後、細胞を溶解し、細胞内に取り込まれたチミジンの放射活性を、液体シンチレーションカウンターで計数することにより、チミジン取り込み活性を測定し、比較する。
細胞数の測定については、本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに播種し、培養し、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を添加した後、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を添加する。細胞内に取り込まれてＭＴＴが変化したＭＴＴホルマザンを、塩酸にて酸性としたイソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、５７０ｎｍの吸収によって測定し、比較する。
本方法において、本発明の蛋白質発現細胞の増殖を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、本発明のペプチドと同様な細胞増殖活性を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【０１０８】
チミジン取り込み活性を利用するスクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに５０００個／ウェル播き、１日間培養する。次に血清を含まない培地で２日間培養し、細胞を飢餓状態にする。本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を、細胞に添加して２４時間培養した後、［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］−チミジンをウェル当たり０．０１５ＭＢｑ添加し、６時間培養する。細胞をＰＢＳで洗った後、メタノールを添加して１０分間放置する。次に５％トリクロロ酢酸を添加して１５分間放置後、固定された細胞を蒸留水で４回洗う。０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。
本発明のペプチドを添加した場合の放射活性の増加を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【０１０９】
〔９〕本発明の蛋白質発現細胞は、本発明のペプチドの刺激により、カリウムチャネルが活性化し、細胞内にあるＫイオンが、細胞外に流出する。この反応を利用して、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
Ｋイオンと同族元素であるＲｂイオン（ルビジウムイオン）は、Ｋイオンと区別無く、カリウムチャネルを通って細胞外に流出する。よって、本発明の蛋白質発現細胞に、放射活性同位体であるＲｂ（［８６Ｒｂ］）を取り込ませておいた後、本発明のペプチドの刺激によって流出する８６Ｒｂの流れ（流出活性）を測定することにより、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定する。
具体的には、８６Ｒｂの存在下、本発明のペプチドを、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、８６Ｒｂの流出活性を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のペプチド刺激による８６Ｒｂの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、本発明のペプチドと同様な８６Ｒｂの流出活性の上昇を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【０１１０】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞を２４穴プレートに播き、２日間培養する。その後、１ｍＣｉ／ｍｌの８６ＲｂＣｌを含む培地中で２時間保温する。細胞を培地でよく洗浄し、外液中の８６ＲｂＣｌを完全に除く。本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を細胞に添加し、３０分後外液を回収し、γカウンターで放射活性を測定し、比較する。
本発明のペプチド刺激による８６Ｒｂの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【０１１１】
〔１０〕本発明の蛋白質発現細胞が本発明のペプチドに反応し、細胞外のｐＨが変化する。この反応を利用して、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のペプチドを、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、本発明の蛋白質発現細胞に接触させた場合における、細胞外のｐＨ変化を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞外ｐＨ変化は、例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ装置（モレキュラーデバイス社）を使用して測定する。
本方法において、本発明のペプチドによる細胞外ｐＨ変化を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の蛋白質発現細胞に接触させ、本発明のペプチドと同様な細胞外ｐＨ変化を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【０１１２】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の蛋白質発現細胞をＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ装置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチャンバーにセットして細胞外ｐＨが安定するまで約２時間、０．１％  ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地（モレキュラーデバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させる。灌流によって生じた培地のｐＨ変化を測定し、比較する。
本発明のペプチドによる細胞外ｐＨ変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【０１１３】
〔１１〕酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｈａｐｌｏｉｄα−ｍａｔｉｎｇ  Ｔｙｐｅ  （ＭＡＴα）  の性フェロモン受容体ＳＴｅ２は、Ｇ蛋白質Ｇｐａ１と共役しており、性フェロモンα−ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒに応答してＭＡＰキナーゼを活性化し、これに引き続き、Ｆａｒ１（ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ）および転写活性化因子Ｓｔｅ１２が活性化される。Ｓｔｅ１２は、種々の蛋白質（例えば、接合に関与するＦＵＳ１）の発現を誘導する。一方、制御因子Ｓｓｔ２は上記の過程に抑制的に機能する。この系において、受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体アゴニストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、その結果生じる増殖などを指標として用いる、受容体アゴニストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれている（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １５巻，  ４８７−４９４頁，  １９９７年）。上記の受容体遺伝子導入酵母の系を利用して、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
【０１１４】
具体例を以下に示す。
ＭＡＴα酵母のＳｔｅ２およびＧｐａ１をコードする遺伝子を除去し、代わりに、本発明の蛋白質遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａｉ２融合蛋白質をコードする遺伝子を導入する。Ｆａｒをコードする遺伝子を除去してｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔが生じないようにし、また、Ｓｓｔをコードする遺伝子を除去して本発明のペプチドに対する応答の感度を向上させておく。さらに、ＦＵＳ１にヒスチジン生合成遺伝子ＨＩＳ３を結合したＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子を導入する。この遺伝子組換え操作は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １５巻，  ６１８８−６１９５頁，  １９９５年に記載の方法において、ソマトスタチン受容体タイプ２（ＳＳＴＲ２）遺伝子を、本発明の蛋白質に置き換えて実施することができる。
このように構築された形質変換酵母は、本発明のペプチドに高感度で反応し、その結果、ＭＡＰキナーゼの活性化が起き、ヒスチジン生合成酵素が合成されるようになり、ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。
従って、上記の本発明の蛋白質発現酵母（Ｓｔｅ２遺伝子およびＧｐａ１遺伝子が除去され、本発明の蛋白質遺伝子およびＧｐａ１−Ｇａｉ２融合蛋白質コード遺伝子が導入され、Ｆａｒ遺伝子およびＳｓｔ遺伝子が除去され、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３遺伝子が導入されたＭＡＴα酵母）を、ヒスチジン欠乏培地で培養し、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を接触させ、該酵母の生育を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、該酵母の生育を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを上記の本発明の蛋白質発現酵母に接触させ、本発明のペプチドと同様な酵母の生育を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【０１１５】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
上記の本発明の蛋白質発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、その後、ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、２ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるように加える。ついで、９ｘ９ｃｍの角形シャーレに播く。寒天が固化した後、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、３０℃で３日間培養する。試験化合物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育を、本発明のペプチドのみをしみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較する。また、あらかじめ、ヒスチジンを除去した寒天培地に本発明のペプチドを添加しておき、滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培養し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察してもよい。
酵母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【０１１６】
〔１２〕本発明の蛋白質遺伝子ＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、本発明のペプチドによって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇して、ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｕｒｒｅｎｔが生じる。これは、膜電位の変化としてとらえることができる（Ｋイオン濃度勾配に変化がある場合も同様）。本発明のペプチドによって生じる本発明の蛋白質導入アフリカツメガエル卵母細胞における上記反応を利用して、本発明のペプチドの本発明の蛋白質発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のペプチドを、本発明の蛋白質遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、本発明のペプチドおよび試験化合物を、本発明の蛋白質遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合における、細胞膜電位の変化を測定し、比較することにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の蛋白質遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させ、本発明のペプチドと同様な細胞膜電位変化を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【０１１７】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカツメガエルから取り出した、卵母細胞塊を、ＭＢＳ液（８８ｍＭ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＫＣｌ，  ０．４１ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．３３ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２，  ０．８２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，  ２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；  ｐＨ７．４）に溶かしたコラゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で卵塊がほぐれるまで１９℃、１〜６時間、１５０ｒｐｍで処理する。外液をＭＢＳ液に置換することで３度洗浄し、マイクロマニピュレーターで本発明の蛋白質遺伝子ｐｏｌｙ  Ａ付加ｃＲＮＡ（５０ｎｇ／５０ｎｌ）を卵母細胞にマイクロインジェクションする。
本発明の蛋白質遺伝子ｍＲＮＡは、組織や細胞から調製してもよく、プラスミドからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写してもよい。本発明の蛋白質遺伝子ｍＲＮＡをＭＢＳ液中で２０℃で３日培養し、これをＲｉｎｇｅｒ液を流しているｖｏｌｔａｇｅ  ｃｌａｍｐ装置のくぼみに置き、電位固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、（−）極は細胞外に置く。電位が安定したら、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドおよび試験化合物を含むＲｉｎｇｅｒ液を流して電位変化を記録する。試験化合物の影響は、本発明の蛋白質遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を、本発明のペプチドのみ含むＲｉｎｇｅｒ液を流した場合と比較することによって測定することができる。
細胞膜電位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
上記の系において、電位の変化量を増大させると、測定しやすくなるため、各種のＧ蛋白質遺伝子のｐｏｌｙ  Ａ付加ＲＮＡを導入してもよい。また、カルシウム存在下で発光を生じるような蛋白質（例、ａｅｑｕｏｒｉｎなど）の遺伝子のｐｏｌｙ  Ａ付加ＲＮＡを共インジェクションすることにより、膜電位変化ではなく発光量を測定することもできる。
【０１１８】
さらに、哺乳動物由来の内皮細胞を使用したスクリーニング方法について、以下に述べる。
哺乳動物由来の血管内皮細胞、好ましくは大動脈血管内皮細胞、より好ましくは毛細血管内皮細胞、さらに好ましくは内分泌組織（例、副腎、卵巣、精巣など）由来の毛細血管内皮細胞を用いて以下の方法などにより、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
１）試験化合物の存在下および非存在下、培養用プレートに培養した内皮細胞または内皮細胞由来の膜画分に、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の放射性ヨード標識体を接触させ、放射性ヨード標識体の内皮細胞または膜画分への結合を測定し、比較することにより、放射性ヨード標識体の内皮細胞または膜画分への結合を阻害する化合物をスクリーニングする。
２）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類で内皮細胞刺激し、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇反応を測定し、比較することにより、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類に依存した細胞内カルシウムイオン濃度上昇を抑制する化合物をスクリーニングする。
３）試験化合物の存在下および非存在下、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類で内皮細胞を刺激し、ＭＡＰキナーゼ量、チミジン取り込み反応量または細胞増殖速度を測定し、比較することにより、本発明のペプチドあるいはＭＩＴ１類に依存したＭＡＰキナーゼ量、チミジン取り込み反応量または細胞増殖速度上昇を抑制する化合物ををスクリーニングする。
上記化合物をスクリーニングするには、直接上記３）の方法を実施してもよく、上記１）、２）、３）の順に従い、または上記２）、３）の順に従い実施してもよい。上記１）、２）、３）の順、または上記２）、３）の順で実施すると、効率的にスクリーニングを行うことができる。
【０１１９】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明の蛋白質、本発明の蛋白質を含有する細胞、または本発明の蛋白質を含有する細胞の膜画分、および本発明のペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものがあげられる。
１．スクリーニング用試薬
（ｉ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（ｉｉ）本発明の蛋白質の標品
本発明の蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞、または哺乳動物（例、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ラット、マウスなど）由来の内皮細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（ｉｉｉ）標識リガンド
〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識した本発明のペプチド。
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
（ｉｖ）リガンド標準液
本発明のペプチドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
２．測定法
（ｉ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の蛋白質を発現させた細胞または哺乳動物（例、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ラット、マウスなど）由来の内皮細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｉｉ）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識した本発明のペプチドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに１０−３Ｍの本発明のペプチドを５μｌ加えておく。
（ｉｉｉ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識した本発明のペプチドを０．２Ｎ  ＮａＯＨ−１％  ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｉｖ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ  ：Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ    ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ  ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０    ：最大結合量
【０１２０】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合を変化させる（結合を阻害または促進する）化合物であり、具体的には本発明の蛋白質を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆる本発明の蛋白質のアゴニスト）、または該刺激活性を有しない化合物（いわゆる本発明の蛋白質のアンタゴニスト）などである。該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記の化合物が、本発明の蛋白質のアゴニストであるか、アンタゴニストであるかの具体的な評価方法は、例えば以下の（Ａ）または（Ｂ）に従えばよい。
（Ａ）前記のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の蛋白質を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の蛋白質のアゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩は本発明の蛋白質のアンタゴニストである。
（Ｂ）（ａ）試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させ、上記本発明の蛋白質を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の蛋白質のアゴニストである。
（ｂ）  本発明の蛋白質を活性化する化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、本発明の蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を本発明の蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の蛋白質を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明の蛋白質を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の蛋白質のアンタゴニストである。
本発明の蛋白質アンタゴニストは、  本発明の蛋白質に対する本発明のペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、該受容体活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明の蛋白質アンタゴニストとして、例えば、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物、好ましくは、
（ｉ）本発明のペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩、
（ｉｉ）本発明の蛋白質の活性を阻害する化合物またはその塩、
（ｉｉｉ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩、
（ｉｖ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を阻害する化合物またはその塩などが挙げられる。
本発明の蛋白質アゴニストは、本発明の蛋白質に対する本発明のペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のペプチドと同様に安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明の蛋白質アゴニストとして、例えば、本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物、好ましくは、
（ｉ）本発明のペプチドの活性を促進する化合物またはその塩、
（ｉｉ）本発明の蛋白質の活性を促進する化合物またはその塩、
（ｉｉｉ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類と本発明の蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩、
（ｉｖ）本発明のペプチドまたはＭＩＴ１類の、本発明の蛋白質の活性化作用を促進する化合物またはその塩などが挙げられる。
【０１２１】
本発明のペプチドは摂食抑制作用、体温降下作用などを有するため、本発明の蛋白質のアゴニストは、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの予防・治療剤、好ましくは肥満症の予防・治療剤などの医薬として用いることができる。また、本発明の蛋白質のアンタゴニストは、例えば摂食障害（例、拒食症、過食症など）、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの予防・治療剤、好ましくは摂食障害の予防・治療剤などの医薬として用いることができる。
上記の化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩などがあげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
【０１２２】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
【０１２３】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜３００ｍｇ、より好ましくは約３．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人の摂食障害患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与する。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１２４】
（６）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いる摂食調節剤のスクリーニング方法
具体的には、例えば、（ａ）本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｂ）本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行い、摂食調節剤をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ａ）と（ｂ）の場合における、本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の遺伝子の発現量（具体的には、蛋白質量または該蛋白質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本スクリーニング方法を実施するには、本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどが用いられる。
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の蛋白量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記蛋白質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質の遺伝子発現量は、自体公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＡＢＩ社製、ＴａｑＭａｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
例えば、上記（ｂ）の場合における蛋白質の遺伝子発現量を、上記（ａ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、例えば摂食調節剤として、例えば摂食障害（例、拒食症、過食症など）などの予防・治療剤として選択することができる。
例えば、上記（ｂ）の場合における蛋白質の遺伝子発現量を、上記（ａ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、例えば摂食調節剤、例えば肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）などの予防・治療剤として選択することができる。
【０１２５】
（７）本発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質に対する抗体を用いる摂食調節剤のスクリーニング方法
具体的には、例えば、（ａ）本発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｂ）本発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を、本発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質に対する抗体を用いて行い、摂食調節剤をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ａ）と（ｂ）の場合における、本発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質の発現量（具体的には、蛋白質量）を上記抗体を用いて測定して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
本スクリーニング方法を実施するには、本発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどが用いられる。
本発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質を発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
例えば、上記（ｂ）の場合における蛋白質の発現量を、上記（ａ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、例えば摂食調節剤として、例えば摂食障害（例、拒食症、過食症など）などの予防・治療剤として選択することができる。
例えば、上記（ｂ）の場合における蛋白質の発現量を、上記（ａ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、例えば摂食調節剤として、例えば肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）などの予防・治療剤として選択することができる。
【０１２６】
（８）内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその塩を含有してなる摂食調節剤
内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその塩としては、内皮細胞増殖阻害作用を有する化合物またはその塩であれば、いずれのものでもよい。
該化合物またはその塩は、摂食調節剤などとして用いられ、例えば、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、摂食障害（例、拒食症、過食症など）などの予防・治療剤などの医薬として安全に用いられる。
このような医薬として使用する場合、前述の本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いることにより得られる化合物を医薬として実施する場合と同様にして実施することができる。
【０１２７】
（９）本発明の蛋白質または本発明のペプチドの定量
本発明の抗体は、本発明の蛋白質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明の蛋白質または本発明のペプチド（以下、（９）項では本発明の蛋白質と略記する）の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量等に使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明の蛋白質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明の蛋白質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質の定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明の蛋白質の定量法を提供する。
【０１２８】
また、本発明の蛋白質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明の蛋白質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２  、Ｆａｂ’またはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質の定量法は、  特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、本発明のペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素等が用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕等が用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が用いられる。蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等が用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等が用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【０１２９】
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常ペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース等の不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【０１３０】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリー等に用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体等を用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリー等が好適に用いられる。
【０１３１】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の蛋白質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書等を参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」  Ｖｏｌ．  ７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書  Ｖｏｌ．  ７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、  同書  Ｖｏｌ．  ７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、  同書  Ｖｏｌ．  ８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、  同書  Ｖｏｌ．  ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、  同書  Ｖｏｌ．  １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）等を参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明の蛋白質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明の蛋白質の脳脊髄液濃度または血中濃度を定量することによって、本発明の蛋白質の濃度の増多が検出された場合、肥満症や摂食障害などに罹患している、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織等の被検体中に存在する本発明の蛋白質を検出するために使用することができる。また、本発明の蛋白質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明の蛋白質の検出、被検細胞内における本発明の蛋白質の挙動の分析等のために使用することができる。
【０１３２】
（１０）遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）における本発明の蛋白質または本発明のペプチド（以下、（１０）項では本発明の蛋白質と略記する）をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多等の遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁，１９８９年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁，１９８９年）、ＤＮＡマイクロアレイ等により実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションやＤＮＡマイクロアレイにより本発明の蛋白質発現増大が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法やＤＮＡマイクロアレイによりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、摂食障害、肥満症などに罹患している可能性が高いと診断することができる。
【０１３３】
（１１）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内における本発明の蛋白質もしくは本発明のペプチド（以下、（１１）項では本発明の蛋白質と略記する）または本発明のＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、本発明の蛋白質の発現過多に起因する疾患、例えば摂食障害（例、拒食症、過食症など）などの予防・治療剤として使用することができる。
上記アンチセンスＤＮＡを上記の予防・治療剤として、前記した本発明のＤＮＡを含有する各種疾病の予防・治療剤と同様に使用することができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【０１３４】
さらに、本発明は、
（ｉ）本発明の蛋白質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ、
（ｉｉ）前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、
（ｉｉｉ）本発明の蛋白質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、
（ｉｖ）前記リボザイムを含有してなる医薬も提供する。
上記アンチセンスヌクレオチドと同様に、二重鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ；ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ法）、リボザイムなども、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができ、生体内における本発明の蛋白質またはＤＮＡの機能、およびそれに依存した本発明のペプチドの機能を抑制することができるので、例えば、摂食障害（例、拒食症、過食症など）などの予防・治療剤などとして使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１巻，  ４９４頁，  ２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ７巻，  ２２１頁，  ２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明の蛋白質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明の蛋白質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
【０１３５】
（１２）本発明の抗体を含有する医薬および診断薬
本発明の蛋白質または本発明のペプチド（以下、（１２）項では本発明の蛋白質と略記する）の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば、本発明の蛋白質の発現過多に起因する疾患、例えば、摂食障害（例、拒食症、過食症など）などの予防・治療剤などの医薬として、あるいは摂食障害や肥満症などの診断薬として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、摂食障害治療の目的で本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が用いられる。
【０１３６】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤等が例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ程度、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ程度、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ程度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【０１３７】
（１３）本発明のＤＮＡを有する非ヒト動物の作製
本発明のＤＮＡを用いて、本発明の蛋白質または本発明のペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。非ヒト動物としては、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）など（以下、動物と略記する）が挙げられるが、特に、マウス、ウサギなどが好適である。
本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、ウサギ由来の本発明のＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い動物由来の本発明のＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、例えば、ウサギ受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明の蛋白質または本発明のペプチドを高産生するＤＮＡ転移動物を作出できる。このプロモーターとしては、例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネイン等のユビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、好ましくは脳で特異的に発現するＮＧＦ遺伝子プロモーターやエノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
【０１３８】
受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの転移は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の蛋白質等が存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明の蛋白質または本発明のペプチドを有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の蛋白質または本発明のペプチドを有する。
本発明のＤＮＡ転移動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明のＤＮＡが転移された動物は、本発明の蛋白質または本発明のペプチドが高発現させられているので、本発明の蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニスト、本発明のペプチドの活性を阻害する化合物のスクリーニング用の動物などとして有用である。
本発明のＤＮＡ転移動物を、組織培養のための細胞源として使用することもできる。例えば、本発明のＤＮＡ転移マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、あるいは遺伝子により発現された本発明の蛋白質または本発明のペプチドが存在する組織を分析することにより、本発明の蛋白質について分析することができる。本発明の蛋白質または本発明のペプチドを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、例えば、脳や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。また、その細胞を用いることにより、例えば、各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこから、本発明の蛋白質または本発明のペプチドを単離精製することも可能である。
【０１３９】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
Ｙ            ：チミンまたはシトシン
Ｎ            ：チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン
Ｒ            ：アデニンまたはグアニン
Ｍ            ：シトシンまたはアデニン
Ｗ            ：チミンまたはアデニン
Ｓ            ：シトシンまたはグアニン
Ｂ                          ：グアニン、チミンまたはシトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＧｌｙまたはＧ  ：グリシン
ＡｌａまたはＡ  ：アラニン
ＶａｌまたはＶ  ：バリン
ＬｅｕまたはＬ  ：ロイシン
ＩｌｅまたはＩ    ：イソロイシン
ＳｅｒまたはＳ    ：セリン
ＴｈｒまたはＴ    ：スレオニン
ＣｙｓまたはＣ    ：システイン
ＭｅｔまたはＭ      ：メチオニン
ＧｌｕまたはＥ    ：グルタミン酸
ＡｓｐまたはＤ    ：アスパラギン酸
ＬｙｓまたはＫ    ：リジン
ＡｒｇまたはＲ    ：アルギニン
ＨｉｓまたはＨ    ：ヒスチジン
ＰｈｅまたはＦ    ：フェニルアラニン
ＴｙｒまたはＹ    ：チロシン
ＴｒｐまたはＷ    ：トリプトファン
ＰｒｏまたはＰ    ：プロリン
ＡｓｎまたはＮ    ：アスパラギン
ＧｌｎまたはＱ    ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｘａａ          ：未同定アミノ酸残基
【０１４０】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬等を下記の記号で表記する。
Ｍｅ              ：メチル基
Ｅｔ                ：エチル基
Ｂｕ              ：ブチル基
Ｐｈ              ：フェニル基
Ａｃ              ：アセチル基
ＴＣ              ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｂｏｍ            ：ベンジルオキシメチル
Ｂｚｌ            ：ベンジル
Ｚ                ：ベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ          ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ          ：２−クロルベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ２Ｂｚｌ        ：２−６−ジクロロベンジル
Ｂｏｃ            ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＨＯＢｔ            ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ        ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＰＡＭ            ：フェニルアセトアミドメチル
Ｔｏｓ            ：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｆｍｏｃ          ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＤＮＰ            ：ジニトロフェニル
Ｂｕｍ            ：ターシャリーブトキシメチル
Ｔｒｔ              ：トリチル
Ｂｏｍ            ：ベンジルオキシメチル
Ｚ                ：ベンジルオキシカルボニル
ＭｅＢｚｌ        ：４−メチルベンジル
ＤＣＣ            ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＨＯＮＢ          ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＮＭＰ            ：Ｎ−メチルピロリドン
ＨＯＮＢ          ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボキシイミド
ＮＭＰ            ：Ｎ−メチルピロリドン
ＴＦＡ            ：トリフルオロ酢酸
ＣＨＡＰＳ        ：３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート
ＰＭＳＦ          ：フェニルメチルスルホニルフルオリド
ＧＤＰ            ：グアノシン−５’−二リン酸
Ｆｕｒａ−２ＡＭ  ：１−［６−アミノ−２−（５−カルボキシ−２−オキサゾリル）−５−ベンゾフラニロキシ］−２−（２−アミノ−５メチルフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
Ｆｌｕｏ−３ＡＭ  ：１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
ＨＥＰＥＳ        ：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸
ＥＤＴＡ          ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ            ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＳＡ            ：ウシ血清アルブミン
ＨＢＳＳ          ：ハンクス平衡塩液
ＥＩＡ            ：エンザイムイムノアッセイ
【０１４１】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるヒト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
ヒト型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：３で表されるヒト型ＺＡＱリガンド成熟ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
ヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
配列番号：５で表されるヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
ヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
配列番号：７で表されるヒト型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
マウス型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
マウス型ＺＡＱリガンド成熟体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
マウス型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
マウス型ＺＡＱリガンド前駆体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプチド（ノーマルタイプ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプチド（ノーマルタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプチド（Ｙタイプ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプチド（Ｙタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプチド（Ｑタイプ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
ラット型ＺＡＱリガンド成熟体ぺプチド（Ｑタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプチド（ノーマルタイプ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２０〕
ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプチド（ノーマルタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプチド（Ｙタイプ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプチド（Ｙタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプチド（Ｑタイプ）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
ラット型ＺＡＱリガンド前駆体ぺプチド（Ｑタイプ）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
ヒト型Ｂｖ８成熟体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２６〕
ヒト型Ｂｖ８成熟体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
ヒト型Ｂｖ８前駆体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２８〕
ヒト型Ｂｖ８前駆体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
ラット型Ｂｖ８成熟体ペプチドおよびマウス型Ｂｖ８成熟体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３０〕
ラット型Ｂｖ８成熟体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
マウス型Ｂｖ８成熟体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
ラット型Ｂｖ８前駆体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３３〕
ラット型Ｂｖ８前駆体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
マウス型Ｂｖ８前駆体ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３５〕
マウス型Ｂｖ８前駆体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
ヘビ毒ＭＩＴ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３７〕
ヒト型ＺＡＱのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３８〕
ヒト型ＺＡＱをコードするＤＮＡの塩基配列を示す（ＺＡＱＣ）。
〔配列番号：３９〕
ヒト型ＺＡＱをコードするＤＮＡの塩基配列を示す（ＺＡＱＴ）。
〔配列番号：４０〕
ヒト型Ｉ５Ｅのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４１〕
ヒト型Ｉ５ＥをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
ラット由来ｒＺＡＱ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４３〕
ラット由来ｒＺＡＱ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
ラット由来ｒＺＡＱ２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４５〕
ラット由来ｒＺＡＱ２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
マウス由来ＧＰＲ７３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４７〕
マウス由来ＧＰＲ７３をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
マウス由来ｍＩ５Ｅのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４９〕
マウス由来ｍＩ５Ｅをコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：５０〕
ウシ型ＺＡＱのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５１〕
ウシ型ＺＡＱをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５２〕
ウシ型Ｉ５Ｅのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５３〕
ウシ型Ｉ５ＥをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５４〕
後述の参考例１で用いられたプライマーＺＡＱ−Ｂ１Ｆの塩基配列を示す。
〔配列番号：５５〕
後述の参考例１で用いられたプライマーＺＡＱ−Ｂ１Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：５６〕
後述の参考例１で得られたウシ型ＺＡＱの部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号：５７〕
後述の参考例１で得られたウシ型Ｉ５Ｅの部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号：５８〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱ５−２の塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱ５−３の塩基配列を示す。
〔配列番号：６０〕
後述の参考例１で得られたウシ型ＺＡＱの５’部分配列（ｔｙｐｅ１）の塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕
後述の参考例１で得られたウシ型ＺＡＱの５’部分配列（ｔｙｐｅ２）の塩基配列を示す。
〔配列番号：６２〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱａ−Ｆ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６３〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱａ−Ｆ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：６４〕
後述の参考例１で得られたウシ型ＺＡＱの３’部分配列（ｔｙｐｅ２）の塩基配列を示す。
〔配列番号：６５〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱａ−ＥＦ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６６〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱａ−ＩＦ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６７〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱａ−ＩＲ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６８〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱａ−ＥＲ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６９〕
後述の参考例１で得られたウシ型ＺＡＱ全長をコードする２０３８ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
〔配列番号：７０〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＩ５Ｅ５−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：７１〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＩ５Ｅ５−３の塩基配列を示す。
〔配列番号：７２〕
後述の参考例１で得られたウシ型Ｉ５Ｅの５’部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号：７３〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＩ５Ｅ３−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：７４〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＩ５Ｅ３−３の塩基配列を示す。
〔配列番号：７５〕
後述の参考例１で得られたウシ型Ｉ５Ｅの３’部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号：７６〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱｂ−Ｆの塩基配列を示す。
〔配列番号：７７〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱｂ−Ｆ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：７８〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱｂ−Ｒの塩基配列を示す。
〔配列番号：７９〕
後述の参考例１で用いられたプライマーｂＺＡＱｂ−Ｒ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：８０〕
後述の参考例１で得られたウシ型Ｉ５Ｅ全長をコードする１６２３ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
〔配列番号：８１〕
後述の参考例２で用いられたプライマーｂＺＡＱａ−ＩＦ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：８２〕
後述の参考例２で用いられたプライマーｂＺＡＱａ−ｔｅｍｐＩＲの塩基配列を示す。
〔配列番号：８３〕
後述の参考例２で用いられたプライマーｂＺＡＱａ−ｔａｑＦの塩基配列を示す。
〔配列番号：８４〕
後述の参考例２で用いられたプライマーｂＺＡＱａ−ｔａｑＲの塩基配列を示す。
〔配列番号：８５〕
後述の参考例２で用いられたプローブｂＺＡＱａ−ｐｒｏｂｅの塩基配列を示す。配列中、ＦＡＭは６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、ＴＡＭＲＡは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅをそれぞれ示す。
〔配列番号：８６〕
後述の参考例２で用いられたプライマーｂＺＡＱｂ−Ｆ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：８７〕
後述の参考例２で用いられたプライマーｂＺＡＱｂ−ｔｅｍｐＩＲの塩基配列を示す。
〔配列番号：８８〕
後述の参考例２で用いられたプライマーｂＺＡＱｂ−ｔａｑＦの塩基配列を示す。
〔配列番号：８９〕
後述の参考例２で用いられたプライマーｂＺＡＱｂ−ｔａｑＲの塩基配列を示す。
〔配列番号：９０〕
後述の参考例２で用いられたプローブｂＺＡＱｂ−ｐｒｏｂｅの塩基配列を示す。配列中、ＦＡＭは、６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、ＴＡＭＲＡは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅをそれぞれ示す。
【０１４２】
後述の参考例１で得られた形質転換体大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＢＺＡＱは、平成１４（２００２）年１月９日から、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４５として、２００１年１２月１８日から、日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ  １６７４０として寄託されている。
後述の参考例１で得られた形質転換体大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＢＩ５Ｅは、平成１４（２００２）年１月９日から、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８４４として、２００１年１２月１８日から、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ  １６７３９として寄託されている。
【０１４３】
【実施例】
以下に実施例および参考例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
【０１４４】
実施例１
ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与による摂餌量に及ぼす影響
ヒト型Ｂｖ８ペプチドの脳室内投与による摂餌量に及ぼす影響を検討した。以下のヒト型Ｂｖ８ペプチドは、ＷＯ  ０２／５７４４３号公報の実施例１に準じて作成した。
成熟Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット（８週齢）をペントバルビタール５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与にて麻酔し、ラット脳定位固定装置に固定した。切歯用バーはインターオーラルラインから３．３ｍｍ低くした。頭蓋骨を露出し、側脳室にガイドカニューレＡＧ１２（内径０．４ｍｍ、外径０．５ｍｍ、エイコム）を埋め込むために歯科用ドリルを用いて骨に穴をあけた。また、穴の周囲３箇所にアンカービスを埋め込んだ。ステンレス製ガイドカニューレ（ＡＧ−１２）を、その先端が脳室の上部に位置するように挿入した。定位座標は、Ｐａｘｉｎｏｓ＆ＷａｔｓｏｎのアトラスＥｄ．４（１９９８）に従い、ブレグマからＡＰ：−０．８、Ｌ：−１．５、Ｈ：４．５ｍｍとした。ガイドカニューレは瞬間接着剤と歯科用セメントおよびアンカービスで頭蓋骨に固定した。ガイドカニューレにはステンレス製ダミーカニューレＡＤ−１２（外径０．３５ｍｍ、エイコム）を挿入し、キャップナット（エイコム）で固定した。術後、ラットは個別のケージで飼育した。ガイドカニューレを埋め込んでから約１週間飼育して術後の回復（術後に減少した体重が、適切に増加していることを指標とする）を待ち、リン酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ７．２）またはヒト型Ｂｖ８ペプチド投与を実施した。
ラットの頭蓋骨に装着したキャップナットとダミーカニューレを取り外し、その代わりにテフロンチューブ（内径０．１ｍｍ、外径０．３５ｍｍ、長さ５０ｃｍ、エイコム）につないだステンレス製マイクロインジェクションカニューレＡＭＩ−９（内径０．１７ｍｍ、外径０．３５ｍｍ、エイコム）を挿入した。マイクロインジェクションカニューレの長さは、その先端１ｍｍがガイドカニューレから露出するように調節しておいた。テフロンチューブの一方をマイクロシリンジポンプにつなぎ、リン酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ７．２）またはヒト型Ｂｖ８ペプチド（２  ｎｍｏｌ）を溶解させたリン酸緩衝生理的食塩水を５  μｌ／ｍｉｎの流速で合計１０μｌを脳室に投与した。注入終了後２分間待ってからマイクロインジェクションカニューレを取り外し、再びダミーカニューレをキャップナットで固定した。
ラットの飼育は明暗周期１２時間（明期：８時から２０時）で飼育し、摂食実験は１８時から１９時の間に開始した。
マイクロインジェクションカニューレを取り外し、自由に標準飼料を摂食させた。投与終了から１時間、２時間、４時間、６時間および１５時間に摂食した餌を計量し、それぞれ１時間、２時間、４時間、６時間および１５時間摂餌量とした。
ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群（ｎ＝６）では、リン酸緩衝生理的食塩水投与群（ｎ＝６）に比較して、投与後１時間から６時間経過時点まで徐々に摂餌量の減少が認められた。投与後１５時間経過時点では、１４．３±０．７  ｇ（ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群）、１９．４±１．６  ｇ（リン酸緩衝生理的食塩水投与群）、ｐ＜０．０５（ｔ検定）であり、統計学的に有意な摂餌量の減少が認められた。
以下に経過時間ごとの各群の摂餌量を列挙する（平均値±ＳＥＭ）。
１時間後：１．８±０．４  ｇ（ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群）、２．１±０．３  ｇ（リン酸緩衝生理的食塩水投与群）。
２時間後：３．０±０．４  ｇ（ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群）、３．１±０．８  ｇ（リン酸緩衝生理的食塩水投与群）。
４時間後：５．０±０．４  ｇ（ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群）、５．６±０．４  ｇ（リン酸緩衝生理的食塩水投与群）。
６時間後：７．１±０．６  ｇ（ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群）、８．７±０．７  ｇ（リン酸緩衝生理的食塩水投与群）。
【０１４５】
実施例２
ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与による体温に及ぼす影響
以下のヒト型Ｂｖ８ペプチドは、ＷＯ  ０２／５７４４３号公報の実施例１に準じて作成した。
実施例１に記載と同様の操作で、ラットにヒト型Ｂｖ８ペプチド脳室内投与を行い、ヒト型Ｂｖ８ペプチドの脳室内投与による体温に及ぼす影響を検討した。
ラットの飼育は明暗周期１２時間（明期：８時から２０時）で飼育し、体温計測は、ラットに無麻酔下で直腸温計測プローブ（ＲＥＴ−２ラット用直腸プローブ、Ｍｏｄｅｌ  ＢＡＴ−１２デジタル温度計、Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ社）を直腸に挿入してヒト型Ｂｖ８ペプチド投与前体温を計測した。その後、１８時から１９時の間にラットに無麻酔、無拘束下でマイクロインジェクションカニューレを取り付け、リン酸緩衝生理的食塩水またはヒト型Ｂｖ８ペプチドの投与を実施した。
ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与を実施し、投与終了後から１時間、２時間、４時間、６時間および１５時間に前述の通り体温を計測した。ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群（ｎ＝６）では、リン酸緩衝生理的食塩水投与群（ｎ＝６）に比較して、投与後１時間から２時間経過時点まで統計学的に有意な体温の低下が認められた。
以下に経過時間ごとの各群の体温を列挙する（平均値±ＳＥＭ）。
投与前体温：３６．２±０．１℃（ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群）、３６．４±０．２℃（リン酸緩衝生理的食塩水投与群）。
１時間後：３４．２±０．２℃（ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群）、３６．６±０．２℃（リン酸緩衝生理的食塩水投与群）、ｐ＜０．０１（ｔ検定）。
２時間後：３４．９±０．２℃（ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群）、３６．８±０．２℃（リン酸緩衝生理的食塩水投与群）、ｐ＜０．０１（ｔ検定）。
４時間後：３６．３±０．３℃（ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群）、３６．９±０．２℃（リン酸緩衝生理的食塩水投与群）。
６時間後：３７．０±０．３℃（ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群）、３７．３±０．２℃（リン酸緩衝生理的食塩水投与群）。
１５時間後：３６．３±０．２℃（ヒト型Ｂｖ８ペプチド投与群）、３６．２±０．２℃（リン酸緩衝生理的食塩水投与群）。
【０１４６】
参考例１
ウシ型ＺＡＱおよびウシ型Ｉ５Ｅ  ｃＤＮＡのクローニング
ウシ副腎毛細血管内皮細胞（ＢＡＣＥ）  およびウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥ）より、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社）  を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってＢＡＣＥ  由来ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（ＢＡＣＥ  ｔＲＮＡ）およびＢＡＥ由来ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（ＢＡＥ  ｔＲＮＡ）を取得した。これを鋳型として、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）  を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってＢＡＣＥ  由来ｃＤＮＡ（ＢＡＣＥ  ｃＤＮＡ）およびＢＡＥ  由来ｃＤＮＡ（ＢＡＥ  ｃＤＮＡ）を取得した。続いてＢＡＣＥ  ｃＤＮＡを鋳型としてヒトＺＡＱ、マウスＺＡＱ、ラットＺＡＱ、ヒトＩ５Ｅ、マウスＩ５ＥおよびＧＰＲ７３の情報よりｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマー  ＺＡＱ−Ｂ１Ｆ（配列番号：５４）、ＺＡＱ−Ｂ１Ｒ（配列番号：５５）を作成し、以下に記したＰＣＲ反応を実施した。
ＰＣＲ反応液はＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を０．５  μｌ、添付の１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ  （１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ５００  ｍＭ  ＫＣｌ）を５μｌ、２５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を４μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．０  ｍＭ  ｅａｃｈ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を５μｌ、１２．５μＭ  プライマーＺＡＱ−Ｂ１ＦおよびＺＡＱ−Ｂ１Ｒを  ２．５μｌ、鋳型ｃＤＮＡを１μｌ、および蒸留水を２９．５  μｌを混合して作製した。反応条件は、９５℃・１０分の初期変性後、９５℃・２０秒−６６℃・３０秒のサイクル反応を３５回、および６６℃・１０分の最終伸長反応とした。
得られたＤＮＡ断片をＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。クローニングされたＤＮＡ配列をＡＢＩ３１００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解読し、ウシ型ＺＡＱの部分配列（配列番号：５６）およびウシ型Ｉ５Ｅの部分配列（配列番号：５７）の塩基配列を得た。
ウシ副腎毛細血管内皮細胞（ＢＡＣＥ）より、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）  を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってＢＡＣＥ  由来ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（ＢＡＣＥ  ｔＲＮＡ）を取得した。これを鋳型として、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）  を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってＢＡＣＥ  由来ｍＲＮＡ（ＢＡＣＥ  ｍＲＮＡ）を取得した。ＢＡＣＥ  ｍＲＮＡを鋳型として、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）  を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってＢＡＣＥ  由来Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ａｄａｐｔｏｒ−ｌｉｇａｔｅｄ  ｄｓ  ｃＤＮＡ（ＢＡＣＥ  ＡＬ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）を作成した。
配列番号：５６の情報より、プライマー  ｂＺＡＱ５−２（配列番号：５８）とｂＺＡＱ５−３（配列番号：５９）を作成し、ＢＡＣＥ  ＡＬ  ｄｓ  ｃＤＮＡを鋳型として以下に記した５’ＲＡＣＥ実験を実施した。
５’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応液は５０Ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を０．５μｌ、添付の５ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ    （２００  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ，  ７５  ｍＭ  ＫＯＡｃ，  １７．５  ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２，  ２５％  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，  １８．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，  ０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０，  ０．０２５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）を５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ，  宝酒造）を２μｌ、１０μＭプライマーｂＺＡＱ５−２を  ０．５μｌ、１０μＭプライマーＡＰ１（プライマーＡＰ１はＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔに添付のもの）を０．５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ（ＢＡＣＥ  ＡＬ  ｄｓ  ｃＤＮＡの５０倍希釈液）を２．５μｌ、および蒸留水を１４μｌを混合して作製した。反応条件は９４℃・３０秒の初期変性後、９４℃・５秒−７２℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−７０℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−６８℃・４分のサイクル反応を２５回行った。
続いて、該ＰＣＲ反応の反応液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを実施した。反応液は５０Ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を０．５μｌ、添付の５ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  （２００  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ，  ７５  ｍＭ  ＫＯＡｃ，  １７．５  ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２，  ２５％  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，１８．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，  ０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０，  ０．０２５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）を５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ，  宝酒造）を２．０μｌ、１０μＭプライマーｂＺＡＱ５−３を  ０．５μｌ、１０μＭプライマーＡＰ２（プライマーＡＰ２はＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔに添付のもの）を０．５  μｌ、鋳型ＤＮＡ（該ＰＣＲ反応液５０倍希釈液）を２．５μｌ、および蒸留水を１４μｌを混合して作製した。反応条件は９４℃・３０秒の初期変性後、９４℃・５秒−７２℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−７０℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−６８℃・４分のサイクル反応を２５回行った。
得られたＤＮＡ断片をＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。クローニングされたＤＮＡ配列をＡＢＩ３１００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解読し、２種類のウシ型ＺＡＱの５’部分配列  （ｔｙｐｅ１：配列番号：６０；ｔｙｐｅ２：配列番号：６１）の配列を得た。
配列番号：６０の情報より、プライマーｂＺＡＱａ−Ｆ１（配列番号：６２）とプライマーｂＺＡＱａ−Ｆ２  （配列番号：６３）を作成し、以下に記した３’ＲＡＣＥ実験を実施した。
３’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応液は、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を１μｌ、添付の１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ，  宝酒造）を４μｌ、１０μＭプライマーｂＺＡＱａ−Ｆ１および１０μＭプライマーＡＰ１（プライマーＡＰ１はＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔに添付のもの）を各２．５μｌ  、鋳型ｃＤＮＡ（ＢＡＣＥ  ＡＬ  ｄｓ  ｃＤＮＡの５０倍希釈液）を１μｌ、および蒸留水を３４μｌを混合して作製した。反応条件は９４℃・３０秒の初期変性後、９４℃・５秒−７２℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−７０℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−６８℃・４分のサイクル反応を２５回行った。
続いて、該ＰＣＲ反応の反応液を蒸留水で５０倍に希釈したものをを鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液は、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を１μｌ、添付の１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ，  宝酒造）を４μｌ、１０μＭプライマーｂＺＡＱａ−Ｆ２および１０μＭプライマーＡＰ１（プライマーＡＰ２はＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔに添付のもの）を各２．５μｌ  、鋳型ＤＮＡを１μｌ、および蒸留水を３４μｌを混合して作製した。反応条件は９４℃・３０秒の初期変性後、９４℃・５秒−７２℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−７０℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−６８℃・４分のサイクル反応を２５回行った。
得られたＤＮＡ断片をＺａｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。クローニングされたＤＮＡ配列をＡＢＩ３１００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解読し、ウシ型ＺＡＱの３’端の塩基配列（配列番号：６４）を得た。
５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥの情報より、プライマーｂＺＡＱａ−ＥＦ１（配列番号：６５）、プライマーｂＺＡＱａ−ＩＦ１（配列番号：６６）、プライマーｂＺＡＱａ−ＩＲ１（配列番号：６７）およびプライマーｂＺＡＱａ−ＥＲ１  （配列番号：６８）を作成し、ＢＡＣＥ  ＡＬ  ｄｓ  ｃＤＮＡの５０倍希釈液を鋳型として、以下に記したＰＣＲ反応を実施した。
ＰＣＲ反応液はＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を１  μｌ、添付の１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅを４μｌ、１０μＭプライマーｂＺＡＱａ−ＥＦ１およびｂＺＡＱａ−ＥＲ１を各２．５μｌ  、鋳型ＤＮＡを１μｌ、および蒸留水を３４μｌを混合して作製した。反応条件は９５℃・１分の初期変性後、９５℃・３０秒−６０℃・３０秒−７２℃・３分のサイクル反応を３５回、および７２℃・１０分の最終伸長反応とした。
続いて、該ＰＣＲ反応の反応液を蒸留水で５０倍に希釈したものを鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液はＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を１μｌ、添付の１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅを４μｌ、１０μＭプライマーｂＺＡＱａ−ＩＦ１およびｂＺＡＱａ−ＩＲ１を各２．５μｌ  、鋳型ＤＮＡを１μｌ、および蒸留水を３４  μｌを混合して作製した。反応条件は９５℃・１分の初期変性後、９５℃・３０秒−６０℃・３０秒−７２℃・３分のサイクル反応を３５回、および７２℃・１０分の最終伸長反応とした。
得られたＤＮＡ断片をＺａｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。クローニングされたＤＮＡ配列をＡＢＩ３１００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解読し、ウシ型ＺＡＱ全長をコードする２０３８  ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号：６９）を有するｐＢＺＡＱを得ることができた。該プラスミドによりトランスフォームさせた大腸菌ＤＨ５αを、大腸菌ＤＨ５α／ｐＢＺＡＱと命名した。
配列番号：６９で表される塩基配列を有するｃＤＮＡ断片には、３９３個のアミノ酸配列（配列番号：５０）がコードされており（配列番号：５１）、該アミノ酸配列を有する蛋白質をウシ型ＺＡＱと命名した。
配列番号：５７の情報より、プライマーｂＩ５Ｅ５−１（配列番号：７０）およびプライマーｂＩ５Ｅ５−３（配列番号：７１）を作成し、ＢＡＣＥ  ＡＬ  ｄｓ  ｃＤＮＡを鋳型として以下に記した５’ＲＡＣＥ実験を実施した。
５’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応液は５０Ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を０．５μｌ、添付の５ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  （２００  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ，  ７５  ｍＭ  ＫＯＡｃ，  １７．５  ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２，  ２５％  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，  １８．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，  ０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０，  ０．０２５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）を５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ，  宝酒造）を２μｌ、１０μＭプライマーｂＩ５Ｅ５−１を  ０．５μｌ、１０μＭプライマーＡＰ１（プライマーＡＰ１はＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔに添付のもの）を０．５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ（ＢＡＣＥ  ＡＬ  ｄｓ  ｃＤＮＡの５０倍希釈液）を２．５μｌ、および蒸留水を１４μｌを混合して作製した。反応条件は９４℃・３０秒の初期変性後、９４℃・５秒−７２℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−７０℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−６８℃・４分のサイクル反応を２５回行った。
続いて、該ＰＣＲ反応の反応液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを実施した。反応液は５０Ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を０．５μｌ、添付の５ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  （２００  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ，  ７５  ｍＭ  ＫＯＡｃ，  １７．５  ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２，  ２５％  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，  １８．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，  ０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０，  ０．０２５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）を５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ，  宝酒造）を２．０μｌ、１０μＭプライマーｂＩ５Ｅ５−３を  ０．５μｌ、１０μＭプライマーＡＰ２（プライマーＡＰ２はＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔに添付のもの）を０．５μｌ、鋳型ＤＮＡ（該ＰＣＲ反応液５０倍希釈液）を２．５μｌ、および蒸留水を１４μｌを混合して作製した。反応条件は９４℃・３０秒の初期変性後、９４℃・５秒−７２℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−７０℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−６８℃・４分のサイクル反応を２５回行った。
得られたＤＮＡ断片をＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。クローニングされたＤＮＡ配列をＡＢＩ３１００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解読し、ウシＩ５Ｅの５’部分配列（配列番号：７２）を得た。
配列番号：５７の情報より、プライマーｂＩ５Ｅ３−１（配列番号：７３）およびプライマーｂＩ５Ｅ３−３（配列番号：７４）を作成し、以下に記した３’ＲＡＣＥ実験を実施した。
３’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応液は５０Ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を０．５μｌ、添付の５ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  （２００  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ，  ７５  ｍＭ  ＫＯＡｃ，  １７．５  ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２，  ２５％  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，  １８．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，  ０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０，  ０．０２５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）を５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ，  宝酒造）を２μｌ、１０μＭプライマーｂＩ５Ｅ３−１を  ０．５μｌ、１０μＭプライマーＡＰ１（プライマーＡＰ１はＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔに添付のもの）を０．５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ（ＢＡＣＥ  ＡＬ  ｄｓ  ｃＤＮＡの５０倍希釈液）を２．５μｌ、および蒸留水を１４μｌを混合して作製した。反応条件は９４℃・３０秒の初期変性後、９４℃・５秒−７２℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−７０℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−６８℃・４分のサイクル反応を２５回行った。
続いて、該ＰＣＲ反応の反応液を鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを実施した。反応液は５０Ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ  （ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を０．５μｌ、添付の５ｘ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  （２００  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ，  ７５  ｍＭ  ＫＯＡｃ，  １７．５  ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２，  ２５％  Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，  １８．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，  ０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０，  ０．０２５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）を５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ，  宝酒造）を２．０μｌ、１０μＭプライマーｂＩ５Ｅ３−３を  ０．５μｌ、１０μＭプライマーＡＰ２（プライマーＡＰ２はＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔに添付のもの）を０．５μｌ、鋳型ＤＮＡ（該ＰＣＲ反応液５０倍希釈液）を２．５μｌ、および蒸留水を１４μｌを混合して作製した。反応条件は９４℃・３０秒の初期変性後、９４℃・５秒−７２℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−７０℃・４分のサイクル反応を５回、９４℃・５秒−６８℃・４分のサイクル反応を２５回行った。
得られたＤＮＡ断片をＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。クローニングされたＤＮＡ配列をＡＢＩ３１００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解読し、ウシＩ５Ｅの３’部分配列  （配列番号：７５）を得た。
５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥの情報より、プライマーｂＺＡＱｂ−Ｆ（配列番号：７６）、プライマーｂＺＡＱｂ−Ｆ２（配列番号：７７）、プライマーｂＺＡＱｂ−Ｒ（配列番号：７８）およびプライマーｂＺＡＱｂ−Ｒ２（配列番号：７９）を作成し、ＢＡＣＥ  ＡＬ  ｄｓ  ｃＤＮＡの５０倍希釈液を鋳型として、以下に記したＰＣＲ反応を実施した。
ＰＣＲ反応液はＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を１μｌ、添付の１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅを４μｌ、１０μＭプライマーｂＺＡＱｂ−ＦおよびｂＺＡＱｂ−Ｒを各２．５μｌ  、鋳型ＤＮＡを１μｌ、および蒸留水を３４μｌを混合して作製した。反応条件は９５℃・１分の初期変性後、９５℃・３０秒−５８℃・３０秒−７２℃・３分のサイクル反応を４０回、および７２℃・１０分の最終伸長反応とした。
続いて、該ＰＣＲ反応の反応液を蒸留水で５０倍に希釈したものを鋳型としてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液はＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を１  μｌ、添付の１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅを４μｌ、１０μＭプライマーｂＺＡＱｂ−Ｆ２およびｂＺＡＱｂ−Ｒ２を各２．５μｌ  、鋳型ＤＮＡを１μｌ、および蒸留水を３４μｌを混合して作製した。反応条件は９５℃・１分の初期変性後、９５℃・３０秒−５８℃・３０秒−７２℃・３分のサイクル反応を４０回、および７２℃・１０分の最終伸長反応とした。
得られたＤＮＡ断片をＺａｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。クローニングされたＤＮＡ配列をＡＢＩ３１００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解読し、ウシ型Ｉ５Ｅ全長をコードする１６２３  ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号：８０）を有するｐＢＩ５Ｅを得ることができた。該プラスミドによりトランスフォームさせた大腸菌ＴＯＰ１０を、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＢＩ５Ｅと命名した。
配列番号：８０で表される塩基配列を有するｃＤＮＡ断片には、３８４個のアミノ酸配列（配列番号：５２）がコードされており（配列番号：５３）、該アミノ酸配列を有する蛋白質をウシ型Ｉ５Ｅと命名した。
【０１４７】
参考例２
ウシ副腎毛細血管内皮細胞（ＢＡＣＥ）およびウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥ）に発現しているウシ型ＺＡＱおよびウシ型Ｉ５Ｅの同定
ｐＢＺＡＱを鋳型としてウシ型ＺＡＱの情報より、プライマーｂＺＡＱａ−ＩＦ１（配列番号：８１）およびプライマーｂＺＡＱａ−ｔｅｍｐＩＲ（配列番号：８２）を作成し、以下に記した方法でＺＡＱ用標準ＤＮＡ断片を作製した。
ＰＣＲ反応液はＰｆｕＴｕｒｂｏ  ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を４μｌ、添付の１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒを２０μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ，  宝酒造）を１６μｌ、１０μＭプライマーｂＺＡＱａ−ＩＦ１およびｂＺＡＱａ−ｔｅｍｐＩＲを各１０μｌ  、鋳型ｃＤＮＡ（ｐＢＺＡＱ）を４μｌ、および蒸留水を１３６μｌを混合して作製した。反応条件は９５℃・１分の初期変性後、９５℃・３０秒−６０℃・３０秒−７２℃・１分のサイクル反応を４０回行った。得られたＤＮＡ断片をウシ型ＺＡＱ用標準ＤＮＡ断片とした。
ウシ型ＺＡＱの情報よりＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いて、ウシ型ＺＡＱ用ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅ  ＴａｑＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ、プライマーｂＺＡＱａ−ｔａｑＦ（配列番号：８３）およびプライマーｂＺＡＱａ−ｔａｑＲ（配列番号：８４）、ウシ型ＺＡＱ用ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ、ｂＺＡＱａ−ｐｒｏｂｅ（５’−ＦＡＭ−ＣＣＴＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴ−ＴＡＭＲＡ−３’；配列番号：８５）を作製した。
ウシ型ＺＡＱ遺伝子に対するＴａｑＭａｎ  ＰｒｏｂｅとＴａｑＭａｎ  Ｐｒｉｍｅｒとの組合せで、ＢＡＣＥ  由来ｃＤＮＡ（ＢＡＣＥ  ｃＤＮＡ）およびＢＡＥ  由来ｃＤＮＡ（ＢＡＥ  ｃＤＮＡ）を鋳型としてＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ解析によるウシ型ＺＡＱ遺伝子転写産物の定量を行った。反応液は２ｘＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  １２．５μｌ、５μＭプライマーｂＺＡＱａ−ｔａｑＦおよびｂＺＡＱａ−ｔａｑＲを各１．５μｌ  、５μＭプローブｂＺＡＱａ−ｐｒｏｂｅを各１μｌ  、希釈濃度の異なるウシ型ＺＡＱ用標準ＤＮＡ断片あるいは鋳型ｃＤＮＡを４μｌ  （２００ｎｇ  ｔＲＮＡ由来）、および蒸留水を４．５μｌを混合して作製した。
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応は、５０℃・２分９５℃・１０分の初期反応、９５℃・１５秒−６０℃・１分のサイクル反応を５０回という条件で、ＳＤＳ７７００（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＡＢＩ）を用いて行った。  反応終了後、ソフトウェア上で各希釈濃度の標準ＤＮＡ断片に対する蛍光強度より標準曲線をプロットし、鋳型ｃＤＮＡサンプル中のウシ型ＺＡＱ遺伝子転写産物を定量した。
ｐＢＩ５Ｅを鋳型としてウシ型Ｉ５Ｅの情報よりプライマーｂＺＡＱｂ−Ｆ２（配列番号：８６）およびプライマーｂＺＡＱｂ−ｔｅｍｐＩＲ（配列番号：８７）を作成し、以下に記した方法でＺＡＱ用標準ＤＮＡ断片を作製した。
ＰＣＲ反応液はＰｆｕＴｕｒｂｏ  ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を４μｌ、添付の１０ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒを２０μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ，  宝酒造）を１６μｌ、１０μＭプライマーｂＺＡＱｂ−Ｆ２およびｂＺＡＱｂ−ｔｅｍｐＩＲを各１０μｌ  、鋳型ｃＤＮＡ（ｐＢＩ５Ｅ）を４μｌ、および蒸留水を１３６μｌを混合して作製した。反応条件は９５℃・１分の初期変性後、９５℃・３０秒−６０℃・３０秒−７２℃・１分のサイクル反応を４０回行った。得られたＤＮＡ断片をウシ型Ｉ５Ｅ用標準ＤＮＡ断片とした。
ウシ型Ｉ５Ｅの情報よりＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いて、ウシ型Ｉ５Ｅ用ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅ  ＴａｑＭａｎ  ｐｒｉｍｅｒ、プライマーｂＺＡＱｂ−ｔａｑＦ（配列番号：８８）およびプライマーｂＺＡＱｂ−ｔａｑＲ（配列番号：８９）、ウシ型Ｉ５Ｅ用ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ、プローブｂＺＡＱｂ−ｐｒｏｂｅ（５’−ＦＡＭ−ＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＡ−ＴＡＭＲＡ−３’；配列番号：９０）を作製した。
ウシ型Ｉ５Ｅ遺伝子に対するＴａｑＭａｎ  ＰｒｏｂｅとＴａｑＭａｎ  Ｐｒｉｍｅｒとの組合せで、ＢＡＣＥ  由来ｃＤＮＡ（ＢＡＣＥ  ｃＤＮＡ）およびＢＡＥ  由来ｃＤＮＡ（ＢＡＥ  ｃＤＮＡ）を鋳型としてＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ解析によるウシ型Ｉ５Ｅ遺伝子転写産物の定量を行った。反応液は２ｘＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  １２．５μｌ、５μＭプライマーｂＺＡＱｂ−ｔａｑＦおよびｂＺＡＱｂ−ｔａｑＲを各１．５μｌ  、５μＭプローブｂＺＡＱｂ−ｐｒｏｂｅを各１μｌ  、希釈濃度の異なるウシ型Ｉ５Ｅ用標準ＤＮＡ断片あるいは鋳型ｃＤＮＡを４μｌ  （２００ｎｇ  ｔＲＮＡ由来）、および蒸留水を４．５μｌを混合して作製した。
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応は、５０℃・２分９５℃・１０分の初期反応、９５℃・１５秒−６０℃・１分のサイクル反応を５０回という条件で、ＳＤＳ７７００（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＡＢＩ）を用いて行った。  反応終了後、ソフトウェア上で各希釈濃度の標準ＤＮＡ断片に対する蛍光強度より標準曲線をプロットし、鋳型ｃＤＮＡサンプル中のウシ型Ｉ５Ｅ遺伝子転写産物を定量した。
結果を〔図１〕に示す。これより、ウシ副腎毛細血管内皮細胞にはウシ型ＺＡＱおよびウシ型Ｉ５Ｅが発現されていることがわかる。また、ウシ大動脈血管内皮細胞にはウシ型Ｉ５Ｅが発現されていることがわかる。
【０１４８】
参考例３
本参考例で用いられたヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１は、ＷＯ  ０２／５７４４３号公報の実施例１、ＷＯ  ０２／５７４４３号公報の実施例２およびＷＯ  ０２／６４８３号公報の実施例８に記載の方法に準じて調製した。
（１）ウシ副腎毛細血管内皮細胞（ＢＡＣＥ）を用いたＦＬＩＰＲによる細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性の測定
ＢＡＣＥはＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ等が報告している方法を用いて単離した（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２７，  １２１−１３６，  １９８６）。増殖用培地（１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００  μｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤＭＥＭ）に分散したＢＡＣＥを３×１０４ｃｅｌｌｓ／２００  μｌ／ｗｅｌｌになるようにＦＬＩＰＲ用９６穴プレート（Ｂｌａｃｋ  ｐｌａｔｅ  ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ、Ｃｏｓｔｅｒ社）に播種し、５％  ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃で一晩培養後実験に用いた（以後細胞プレートとする）。ＦＬＩＰＲアッセイバッファー（ニッスイハンクス２（日水製薬株式会社）  ９．８  ｇ、炭酸水素ナトリウム  ０．３５  ｇ、ＨＥＰＥＳ  ４．７７  ｇ  、６  Ｍ水酸化ナトリウム溶液で  ｐＨ  ７．４に合わせた後、１リットルにフィルアップ後フィルター滅菌）１０  ｍｌ、２５０  ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ  １００  μｌ、ＦＢＳ  １００  μｌを混合した。また、Ｆｌｕｏ  ３−ＡＭ（同人化学研究所）  １バイアル（２５  μｇ）にｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを２０  μｌと２０％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）  ２０  μｌを添加し溶解後、これを上記Ｈａｎｋｓ’／ＨＢＳＳ−Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ−ＦＢＳ  に加え、培養上清を除いた細胞プレートに各ウェル１００  μｌずつ分注し、５％  ＣＯ２インキュベーター中にて３７℃で１時間インキュベートした。
一方、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１を、２．５  ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、０．２％  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  （ＢＳＡ），  ０．１％  ＣＨＡＰＳを含むＨａｎｋｓ’／ＨＢＳＳで希釈し、９６穴プレートに分注した（サンプルプレート）。細胞プレートの色素ローディング終了後、細胞プレートを２．５  ｍＭ  Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを含むＦＬＩＰＲアッセイバッファ−（洗浄用バッファー）でプレートウォッシャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて４回洗浄後、１００  μｌの洗浄バッファーを残した。この細胞プレートとサンプルプレートをＦＬＩＰＲにセットしアッセイを行った（ＦＬＩＰＲにより、サンプルプレートから５０  μｌのサンプルが細胞プレートへと移される）。
結果を〔図２〕に示す。
これより、ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＡＣＥ）はヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１に応答して細胞内カルシウムイオンの上昇を起こすことが明らかである。
従って、試験化合物の存在下または非存在下、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１などの本発明のペプチドを用いてウシ毛細血管内皮細胞を刺激することにより、試験化合物にＺＡＱまたはＩ５Ｅのシグナル情報伝達を阻害する活性があるのか否かを知ることができ、摂食調節剤、好ましくは摂食障害の予防・治療剤を得ることができる。
【０１４９】
（２）リン酸化ｐ４２  ＭＡＰキナーゼおよびリン酸化ｐ４４  ＭＡＰキナーゼのウエスタンブロッティンブによる検出
増殖用培地に分散したＢＡＣＥを２×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２穴プレートに播種し一晩５％  ＣＯ２、３７℃で培養後実験に用いた。１０  ｎＭ、１００  ｎＭ、１，０００  ｎＭのリガンド溶液を１０  μｌ添加し３７℃で５分間インキュベーションした。
このリガンド溶液として、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１を、０．２％  ＢＳＡと０．１％  ＣＨＡＰＳを含むＨ／ＨＢＳＳに溶解したものを用いた。
その後、培養上清を除去しＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、２  ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５０  ｍＭ  ＮａＦ、４  ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１％  ＮＰ  ４０、１  ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  （ＰＭＳＦ）、２０  μｇ／ｍｌ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０  μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、ｐＨ  ７．４）を１００  μｌ添加した。氷上で３０分間放置後、上清を１５，０００  ｒｐｍで１０分間遠心し得られた上清にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（３００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｓｙｌｓｕｌｆａｔｅ、０．０２５％  ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ、５０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｐＨ  ６．８）を２０  μｌ添加し３分間煮沸した。このうち１８  μｌを１２．５％のゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。電気泳動後、ゲルをトランスファー用バッファー（２５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２  ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ、１０％  ＭｅＯＨ）中で１５分間しんとうした後、ゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜（ＭｉｎｉＰｒｏＢｌｏｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にトランスファーした。トランスファーした膜（ブロット）をブロッキングバッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１％  ＢＳＡ、ｐＨ  ７．４）を用いて一晩４℃でブロッキングした。この後、ブロットに一次抗体溶液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社のＰｈｏｓｐｈｏ  ｐ４２／４４  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙを前述のブロッキングバッファ−で５，０００倍希釈したもの）を３０  ｍｌ添加し室温で２時間インキュベートした。この後、ブロットを洗浄用バッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ７．４）で洗浄後（２０分間×３）、ブロットに二次抗体溶液（ＫＰＬ社のＡｎｔｉ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  （Ｇｏａｔ）を前述のブロッキングバッファーで１，０００倍希釈したもの）３０  ｍｌ添加し室温で１時間反応させた。この後、ブロットを洗浄用バッファーで洗浄し（２０分間×３）、さらにバッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）で洗浄後（２分間×２）、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてリン酸化ｐ４２／４４  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅを検出した。
結果を〔図３〕に示す。
図３より、リガンドを添加しないコントロールに比べ、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１を添加した場合にはリン酸化されたＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ−Ｐ）のバンドの染色強度が増強していることを読み取ることができる。また、ヘビ毒ＭＩＴ１は０．１ｎＭという低濃度からこの増強効果を現すことができ、ヒト型Ｂｖ８ペプチドは１ｎＭ  から、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチドは１０ｎＭからこの効果を現した。
ＢＡＣＥは、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１などのペプチドの添加によりＭＡＰキナーゼの活性化が起こることが明らかである。
従って、試験化合物の存在下または非存在下、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１などの本発明のペプチドを用いてウシ毛細血管内皮細胞を刺激することにより、試験化合物にＺＡＱまたはＩ５Ｅのシグナル情報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知ることができ、摂食調節剤、好ましくは摂食障害の予防・治療剤を得ることができる。
【０１５０】
（３）リン酸化ｐ３８  ＭＡＰキナーゼのウエスタンブロッティングによる検出
増殖用培地に分散したＢＡＣＥを２×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２穴プレートに播種し一晩５％  ＣＯ２、３７℃で培養後実験に用いた。１０  ｎＭ、１００  ｎＭ、１，０００  ｎＭのリガンド溶液を１０  μｌ添加し３７℃で５分間インキュベーションした。
このリガンド溶液は、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１を、０．２％  ＢＳＡと０．１％  ＣＨＡＰＳを含むＨ／ＨＢＳＳ  に溶解したものを用いた。
その後、培養上清を除去しＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、２  ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５０  ｍＭ  ＮａＦ、４  ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１％  ＮＰ  ４０、１  ｍＭ  ＰＭＳＦ、２０  μｇ／ｍｌ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０  μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、ｐＨ  ７．４）を１００  μｌ添加した。氷上で３０分間放置後、上清を１５，０００  ｒｐｍで１０分間遠心し得られた上清にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー２０μｌ添加し３分間煮沸した。このうち１８  μｌを１２．５％のゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。電気泳動後、ゲルをトランスファー用バッファー（２５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２  ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ、１０％  ＭｅＯＨ）中で１５分間しんとうした後、ゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜（ＭｉｎｉＰｒｏＢｌｏｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にトランスファーした。トランスファーした膜（ブロット）をブロッキングバッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１％  ＢＳＡ、ｐＨ  ７．４）を用いて室温で１時間ブロッキングした。この後、ブロットに一次抗体溶液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社のＰｈｏｓｐｈｏ  ｐ３８  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  （Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）  Ａｎｔｉｂｏｄｙを前述のブロッキング溶液で１，０００倍希釈したもの）を３０  ｍｌ添加し４℃で一晩インキュベートした。この後、ブロットを洗浄用バッファーで洗浄後（２０分間×３）、ブロットに二次抗体溶液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社のＡｎｔｉ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，    ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙを前述のブロッキングバッファーで１，０００倍希釈したもの）３０  ｍｌ添加し室温で１時間反応させた。この後、ブロットを洗浄用バッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ７．４）で洗浄し（２０分間×３）、さらにバッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．４）で洗浄後（２分間×２）、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてリン酸化ｐ３８  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅを検出した。
結果を〔図４〕に示す。
図４より、リガンドを添加しないコントロールに比べてヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１などのペプチドを添加した場合にはリン酸化されたＰ３８  ＭＡＰキナーゼ（ｐ３８  ＭＡＰＫ−Ｐ）のバンドの染色強度が増強していることを読み取ることができる。また、ヘビ毒ＭＩＴ１は０．１ｎＭという低濃度からこの増強効果を現すことができ、ヒト型Ｂｖ８ペプチドは１ｎＭから、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチドは１０ｎＭからこの効果を現した。
ＢＡＣＥは、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１などのペプチドの添加によりｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性化が起こることが明らかである。
従って、試験化合物の存在下または非存在下、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１などの本発明のペプチドを用いてウシ毛細血管内皮細胞を刺激することにより、試験化合物にＺＡＱまたはＩ５Ｅのシグナル情報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知ることができ、摂食調節剤、好ましくは摂食障害の予防・治療剤を得ることができる。
【０１５１】
（４）［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイ
増殖用培地に分散したＢＡＣＥを１．５×１０４  ｃｅｌｌｓ／２００  μｌ／ｗｅｌｌになるように４８ウェルプレートに播種し一晩培養後、培養上清を除去しアッセイバッファー（０．５％  ＢＳＡ、０．１％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）４９５  μｌとリガンド溶液５  μｌを添加し、さらに１５−１８時間培養した。
このリガンド溶液としては、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１を、０．２％  ＢＳＡと０．１％  ＣＨＡＰＳを含むＨ／ＨＢＳＳ  に溶解したものを用いた。
その後、各ウェルに［３Ｈ］Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ溶液（ＮＥＮ社、ＮＥＴ−０２７を血清不含ＤＭＥＭで１００倍希釈したもの）を５０  μｌ添加しさらに６時間培養した。この後、培養上清を除去し各ウェルに洗浄バッファー５００  μｌを添加し洗浄後、メタノール５００  μｌを添加し氷上で１５分間放置した。その後、各ウェルの上清を除去し５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）５００  μｌを添加し氷上で１５分間放置後、ＴＣＡを除去し水５００  μｌを添加し洗浄した。最後に０．３  Ｍ  ＮａＯＨを２００μｌ添加し溶解後、液体シンチレーターを３  ｍｌ添加し放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
結果を〔図５〕に示す。
図５より、リガンドを添加しないコントロールに比べてヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドまたはヘビ毒ＭＩＴ１を添加した場合にはウシ副腎毛細血管内皮細胞の［３Ｈ］チミジン取り込み量が増加していることがわかる。
従って、試験化合物の存在下または非存在下、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチド、ヒト型Ｂｖ８ペプチドおよびヘビ毒ＭＩＴ１などの本発明のペプチドを用いてウシ毛細血管内皮細胞を刺激することにより、試験化合物にＺＡＱまたはＩ５Ｅのシグナル情報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知ることができ、摂食調節剤、好ましくは摂食障害の予防・治療剤を得ることができる。
【０１５２】
（５）細胞増殖アッセイ
増殖用培地に分散したＢＡＣＥを５×１０３  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように２４穴プレートに播種し一晩培養した後、
ヒト型ＺＡＱリガンドペプチドまたはヒト型Ｂｖ８ペプチドを、０．２％  ＢＳＡと０．１％  ＣＨＡＰＳを含むＨ／ＨＢＳＳ  に溶解したものを１０  μｌ添加し、さらに４〜５日間培養した。その後、培養上清を除去しＰＢＳ１ｍｌをウェルに添加し細胞を洗浄後、トリプシン溶液２００  μｌを添加し細胞をピペッティングで回収し、細胞数を血球計算版で測定した。
結果を〔図６〕に示す。
図６より、上記ペプチドを添加しないコントロールに比べてヒト型ＺＡＱリガンドペプチドまたはヒト型Ｂｖ８ペプチドを添加した場合にはウシ副腎毛細血管内皮細胞の細胞数が増加していることがわかる。
従って、試験化合物の存在下または非存在下、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチドおよびヒト型Ｂｖ８ペプチドなどの本発明のペプチドを用いてウシ毛細血管内皮細胞を刺激することにより、試験化合物にＺＡＱまたはＩ５Ｅのシグナル情報伝達を阻害する活性を有しているのか否かを知ることができ、摂食調節剤、好ましくは摂食障害の予防・治療剤を得ることができる。
【０１５３】
【発明の効果】
本発明のペプチド、ＭＩＴ１類または本発明の蛋白質、それらに対する抗体、および本発明のペプチドまたは本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、摂食調節剤、好ましくは摂食障害または肥満症の予防・治療剤を得るための簡便な探索法（スクリーニング）に有用である。
本発明の蛋白質のアンタゴニストは、優れた摂食障害（例、拒食症、過食症など）、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの予防・治療剤として有用である。
本発明の蛋白質のアゴニストは、優れた肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）〕、季節鬱病、生殖機能障害、内分泌疾患、老人性痴呆、アルツハイマー病、老化に伴う各種障害、脳循環障害（例、脳卒中など）、頭部外傷、脊髄損傷、てんかん、不安、鬱病、躁鬱病、精神分裂病、アルコール依存症、パーキンソン病、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内症、癌、エイズ、糖尿病などの予防・治療剤として有用である。
また、本発明のスクリーニング方法は、哺乳動物由来の内皮細胞を用いて行うことにより、より生理的な条件下での摂食調節剤のスクリーニングが可能となる。
さらに、本発明の蛋白質、本発明のＤＮＡ、本発明のアンチセンスＤＮＡおよび本発明の抗体は、（ｉ）本発明の蛋白質が関与する各種疾病の予防・治療剤、（ｉｉ）本発明のペプチドと本発明の蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング、（ｉｉｉ）本発明の蛋白質の定量、（ｉｖ）遺伝子診断薬、（ｖ）アンチセンスＤＮＡを含有する医薬、（ｖｉ）本発明の抗体を含有する医薬および診断薬、（ｖｉｉ）本発明のＤＮＡを有する非ヒト動物の作製、（ｖｉｉｉ）構造的に類似したリガンド・受容体との比較にもとづいたドラッグデザインなどの実施のために有用である。特に、本発明の組換え蛋白質の発現系を用いた受容体結合アッセイ系を用いることによって、ヒトや哺乳動物に特異的な本発明の蛋白質に対するリガンドの結合性を変化させる化合物（例、アゴニスト、アンタゴニストなど）をスクリーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病、例えば摂食障害、肥満症などの予防・治療剤などとして安全に使用することができる。
【０１５４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】参考例２で行われたウシ副腎毛細血管内皮細胞（ＢＡＣＥ）およびウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥ）におけるウシ型ＺＡＱおよびウシ型Ｉ５Ｅ  ｍＲＮＡのＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法による定量結果を示す。図中、□はｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １  ｎｇあたりのウシ型ＺＡＱ  ｍＲＮＡのコピー数を、また、■は同様にウシ型Ｉ５Ｅ  ｍＲＮＡのコピー数を示す。
【図２】参考例３で行われたＢＡＣＥを用いたＦＬＩＰＲによる細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性の測定の結果を示す。図中、−●−は、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチドを、−▲−はヒト型Ｂｖ８ペプチドを、−■−はＭＩＴ１を示す。
【図３】参考例３で行われたＢＡＣＥにおけるｐ４２  ＭＡＰキナーゼおよびｐ４４  ＭＡＰキナーゼの活性化に及ぼすＺＡＱ関連ペプチドの用量反応性の結果を示す。図中、Ｃはリガンド（溶液）を投与しないコントロールを、ＭはＭＩＴ１を、Ｌ１はヒト型ＺＡＱリガンドペプチドを、Ｌ２はヒト型Ｂｖ８ペプチドをそれぞれ図中に示した濃度で添加したことを示す。また、ｐ４４  ＭＡＰＫ−Ｐはリン酸化されたｐ４４  ＭＡＰキナーゼのバンドを、またｐ４２  ＭＡＰＫ−Ｐはリン酸化されたｐ４２  ＭＡＰキナーゼのバンドを示す。
【図４】参考例３で行われたＢＡＣＥにおけるｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性化に及ぼすＺＡＱ関連ペプチドの用量反応性の結果を示す。図中、Ｃはリガンド（溶液）を投与しないコントロールを、ＭはＭＩＴ１を、Ｌ１はヒト型ＺＡＱリガンドペプチドを、Ｌ２はヒト型Ｂｖ８ペプチドをそれぞれ図中に示した濃度で添加したことを示す。また、ｐ３８  ＭＡＰＫ−Ｐはリン酸化されたｐ３８  ＭＡＰキナーゼのバンドを示す。
【図５】ＢＡＣＥにおける［３Ｈ］チミジン取り込みに及ぼすペプチドの用量反応性の結果を示す。図中、−●−は、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチドを、−▲−はヒト型Ｂｖ８ペプチドを、−■−はＭＩＴ１を示す。
【図６】ＢＡＣＥの増殖に及ぼすヒト型ＺＡＱリガンドペプチドおよびヒト型Ｂｖ８ペプチドの影響を示す。縦軸は、１ウェルあたりのＢＡＣＥの細胞数を示す。横軸のＺＡＱＬ−１は、ヒト型ＺＡＱリガンドペプチドを、ＺＡＱＬ−２は、ヒト型Ｂｖ８ペプチドを示す。＊は  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ  検定から得られたｐ値が０．０５より小さいことを、＊＊は同様に、ｐ値が０．００１より小さいことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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