(57)【要約】【課題】異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドが多数混在する試料中で、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの存在有無を迅速に確認できるポリヌクレオチドの検出方法を提供すること。【解決手段】試料液中の特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの検出方法であって、流路径が３〜２００μｍで、かつ、前記特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドと親和性を持つ流路壁を有する流路に、前記ポリヌクレオチドを移送し、前記流路に入る前の前記試料液中のポリヌクレオチドの濃度（Ｎｉ）と、前記流路から出る試料液中のポリヌクレオチドの濃度（Ｎｏ）とを測定し、前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）を比較することにより、前記試料液中の前記特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの有無を検出する。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液中の特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの検出方法であって、流路径が３〜２００μｍで、かつ、前記特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドと親和性を持つ流路壁を有する流路に、前記ポリヌクレオチドを移送し、前記流路に入る前の前記試料液中のポリヌクレオチド濃度（Ｎｉ）と、前記流路から出る試料液中のポリヌクレオチド濃度（Ｎｏ）とを測定し、前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）を比較することにより、前記試料液中の前記特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの有無を検出することを特徴とするポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項２】
前記検出対象のポリヌクレオチドと親和性を持つ流路壁を有する流路が、前記特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも一部が相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを流路壁に結合させた流路である請求項１に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項３】
前記特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも一部が相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項４】
前記検出対象のポリヌクレオチドが、遺伝子変異型ＤＮＡであり、該遺伝子変異型ＤＮＡのポリヌクレオチドに対する相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを結合させた流路を用いる請求項２に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項５】
前記検出対象のポリヌクレオチドに対する相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを流路壁に結合させた流路と、オリゴヌクレオチドを結合させていない同形同質の流路とにポリヌクレオチドを移送し、両流路における前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）を測定し、両流路における前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）との比（Ｎｏ／Ｎｉ）又は前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）との差（Ｎｉ−Ｎｏ）を比較する請求項２に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項６】
前記検出対象のポリヌクレオチドが、変異が起こりやすいホットスポットを複数有する遺伝子ＤＮＡであり、前記流路に該遺伝子ＤＮＡのホットスポットの変異型塩基配列を有するヌクレオチドを流路壁に結合させた複数の流路部分を並列に繋いだ流路にポリヌクレオチドを移送し、各流路における前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）を測定し、各流路における前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）との比（Ｎｏ／Ｎｉ）又は前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）との差（Ｎｉ−Ｎｏ）を比較することにより、前記遺伝子ＤＮＡ中のホットスポットでの変異の有無を検出する請求項２に記載のポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項７】
試料液中の特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの検出方法に用いる流体デバイスであって、前記特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドと少なくとも一部が相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを前記流体デバイスの流路壁に結合させた流路部分であって、流路径が３〜２００μｍの流路部分と、前記流路部分の上流部分と下流部分のそれぞれに前記流路部分に入る前の前記試料液中のポリヌクレオチド濃度と該流路から出る試料液のポリヌクレオチドの濃度測定部を備えることを特徴とするポリヌクレオチドの検出用流体デバイス。
【請求項８】
前記検出用流体デバイス内の流路が、複数の流路に分岐しており、分岐した各流路がそれぞれ異なる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが流路壁に結合した前記流路部分を有し、かつ、（ｉ）分岐前の流路部分と分岐した各流路の該オリゴヌクレオチドが結合した部分の下流側に、或いは（ｉｉ）分岐した前記各流路の該オリゴヌクレオチドが結合した部分の上流側と下流側に、試料液のポリヌクレオチドの濃度測定部を備えた請求項７に記載の流体デバイス。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドの濃度測定部が、蛍光測定用のセルと窓である請求項７に記載のポリヌクレオチドの検出用流体デバイス。
【請求項１０】
（Ａ）請求項７〜９のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドの検出用流体デバイスを一定位置に保持する機構、（Ｂ）検出用流体デバイスの流路中にポリヌクレオチドを移送する機構、及び（Ｃ）検出用流体デバイスのポリヌクレオチドの濃度測定部を用いてポリヌクレオチド濃度を測定する機構を有することを特徴とするポリヌクレオチドの検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はポリヌクレオチドの検出方法、それに用いる流体デバイス及びポリヌクレオチドの検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む試料液に特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドが含まれるか否かを迅速に判定することは産業上大きな意味がある。例えば、検出対象のポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、細胞などの生体試料からＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅法によって特定の塩基配列を有するＤＮＡの断片を増幅させ、被験者から採取した試料液中に前記増幅させた特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドが存在するか否かを調べることにより、被験者が癌、感染症、遺伝的多形性などを有するか否かの検査を迅速に容易に行うことができる。
【０００３】
検出対象のポリヌクレオチドをポリヌクレオチドの塩基配列の決定を行わずに簡便に検査する基本的方法はドット・ハイブリダイゼーション法である。この原理を利用して多種の特定塩基配列ＤＮＡの存在を同時に効率良く検出するシステムとして、様々なＤＮＡチップ法やＤＮＡマイクロアレイ法が開発されている。
【０００４】
また、非常に類似した塩基配列を有する多数のＤＮＡの中から僅かに相違する塩基配列を有するＤＮＡの存在を検出する方法、例えば野性型塩基配列ＤＮＡの集団中に存在する比較的小さい配列欠失、挿入、逆位、置換ＤＮＡの存在を検出する方法も検討されている。なかでも最小の相違形は一塩基置換であるが、一塩基置換ＤＮＡの検出は遺伝子疾患、腫瘍などの検出に極めて利用価値が高い。
【０００５】
しかし、ポリヌクレオチドは化学的性質の類似した非常に限られた種類のヌクレオチドの連続により成るため、複数のポリヌクレオチドが混在する試料から特定塩基配列のポリヌクレオチドのみを塩基配列の相違を認識して分離しないまま直接検出することは大変困難であった。このため、従来の特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの検出法は全て、検出対象のポリヌクレオチドを他の塩基配列を有するポリヌクレオチドと分離して、検出する方法であり、厳密な分離条件の設定が必要で、かつ時間がかかる問題点があった。特に一塩基置換の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドの場合は、極めて厳密で、時間のかかる分離操作を行われなければならなかった。
【０００６】
特許文献１には、野性型対立遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドが結合した担体を用いた野性型対立遺伝子の分離を含む、多くの野性型対立遺伝子を含む試料中の突然変異対立遺伝子の検出方法が開示されている。該方法は野生型対立遺伝子に相補的な塩基配列を有する対立遺伝子を固定した充填カラムに野生型と変異型の混合対立遺伝子試料を流し、ハイブリダイゼーションによって野生型対立遺伝子を選択的にカラムに吸着させ、変異型対立遺伝子は吸着させずに流出させることで、変異型遺伝子を濃縮する方法である。
【０００７】
しかしながら、該方法は野生型対立遺伝子を該遺伝子に相補的な塩基配列を有する対立遺伝子とハイブリダイズさせて野生型対立遺伝子と変異型対立遺伝子を分離する方法であるため、これらの塩基配列の違いがごくわずかである場合、例えば一塩基の違いである場合には、選択性が低下するという欠点があり、選択性を増すためには、長時間のインキュベーションが必要であった。そのため、短時間では濃縮効率に劣るか、分析の信頼性に欠けるため、信頼性の良い分離には長時間を要する問題があった。
【０００８】
一方、非特許文献１には、昇温アフィニティークロマトグラフィーが記載されている。該方法では、単体に固定したオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、例えば野性型対立遺伝子と、該固定オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有しないポリヌクレオチド、変位型対立遺伝子の溶出ピークとを分離する方式である。そのために、オリゴヌクレオチドを結合させた担体に親和性の低い突然変異体遺伝子の溶出ピークが先に出現するが、少なくとも、担体に親和性の高い野性型対立遺伝子の溶出ピークの溶出が始まるまでは、クロマトグラフィーを続ける必要があり、従来使用されている長さが数十ｃｍのカラムでは突然変異対立遺伝子の検出に時間がかかる問題点があった。
【０００９】
さらに、昇温アフィニティークロマトグラフィーは、長さの短いカラムを用いることによって、微量の試料で高速分析を行うことは原理的には可能であるが、実際に実施しようとすると、断面積が小さくかつ微小な充填カラムの一部に試料ポリヌクレオチドをバンドとして導入することが極めて困難であり、例えば、カラム長が１ｃｍ以下の微小なカラムに、マイクロシリンジを用いて試料を注入しても、微小な分離カラム全体に試料溶液が行き渡りがちであり、カラムの一部にバンドとして再現性よく導入することは極めて困難であった。
【００１０】
ポストゲノム時代を迎え、膨大な遺伝子ポリヌクレオチドの配列情報が入手可能と成った今日では、簡便な検出装置を用いて、かつ迅速に様々な種類の特定塩基配列を有するポリヌクレオチドの検出を行うことができるポリヌクレオチドの検出方法が強く望まれている。
【００１１】
【特許文献１】
特表２００１−５１４５０４号公報
【非特許文献１】
近藤壽彦，阿部修三，「クロマトグラフィー」，１９９７年，第１８巻，第２号，ｐ．１２２〜１２５
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドが多数混在する試料中で、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの存在の有無を迅速に検出できるポリヌクレオチドの検出方法、該方法に用いるポリヌクレオチドの検出用流体デバイス及び簡便なポリヌクレオチドの検出装置を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、流路壁自体が検出対象のポリヌクレオチドと親和性を有する流路を使用することにより、流路内に検出対象のポリヌクレオチドと親和性を有する充填剤や化学物質を配する必要がないためポリヌクレオチドの移送が阻害されることがない。また流路径が３〜２００μｍの流路を使用することにより、使用する試料がごく微量でよく、ポリヌクレオチドを迅速に移送させることができ、さらに、流路に移送されたポリヌクレオチドが環流して流路壁と良好に接近するため、検出対象のポリヌクレオチドが流路壁の有する親和性の影響を受けやすくなり、検出対象のポリヌクレオチドの移送速度と、その他のポリヌクレオチドの移送速度との差が十分に生じる。該移送速度の差を、該流路に入る前の前記試料液中のポリヌクレオチド濃度（Ｎｉ）と、前記流路から出る試料液中のポリヌクレオチド濃度（Ｎｏ）とを測定し、両濃度を比較することにより、特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドの有無を簡便かつ迅速に検出することができる。
【００１４】
すなわち、本発明は試料液中の特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの検出方法であって、流路径が３〜２００μｍで、かつ、前記特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドと親和性を持つ流路壁を有する流路に、前記ポリヌクレオチドを移送し、前記流路に入る前の前記試料液中のポリヌクレオチドの濃度（Ｎｉ）と、前記流路から出る試料液中のポリヌクレオチドの濃度（Ｎｏ）とを測定し、前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）を比較することにより、前記試料液中の前記特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの有無を検出することを特徴とするポリヌクレオチドの検出方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、試料液中の特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの検出方法に用いる流体デバイスであって、前記特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドと少なくとも一部が相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを前記流体デバイスの流路壁に結合させた流路部分であって、流路径が３〜２００μｍの流路部分と、前記流路部分の上流部分と下流部分のそれぞれに前記流路部分に入る前の前記試料液中のポリヌクレオチド濃度と該流路から出る試料液のポリヌクレオチドの濃度測定部を備えることを特徴とするポリヌクレオチドの検出用流体デバイスを提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、（Ａ）上記のポリヌクレオチドの検出用流体デバイスを一定位置に保持する機構、（Ｂ）検出用流体デバイスの流路中に試料液を移送する機構、及び（Ｃ）検出用流体デバイスのポリヌクレオチドの濃度測定部を用いてポリヌクレオチド濃度を測定する機構を有することを特徴とするポリヌクレオチドの検出装置を提供する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明で言う特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドと親和性を持つ流路壁を有する流路とは、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドと親和性を有するものである。このような性質を有する流路は、最も一般的には、前記特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも一部が相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを流路壁に結合させた流路部分を有する流路である。この様なオリゴヌクレオチドの流路壁への結合は、ビオチン−アビジンなどの蛋白質間の結合を介しても良く、また、共有結合などによりオリゴヌクレオチドを流路壁を構成する成分に直接結合させても良い。
【００１８】
本発明の検出方法においては、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドを他の塩基配列を有するポリヌクレオチドから完全に分離する必要はない。検出対象の特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドが他のポリヌクレオチドと共存すると考えられる試料を、該特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドと親和性を持つ流路壁を有する流路、最も簡単な例で言えば該特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが結合されている流路に流入させ、一定方向へ流出させる。この場合、該相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは１本鎖オリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。
【００１９】
その場合、該流路と親和性を有する該特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの一部が流路に結合し、または流路との親和性のために流路中での移動速度が遅くなるため、流路と親和性を有さない他の塩基配列を有するポリヌクレオチドが流出する時間では全量が流出しない。この時、当該流路に流入させた試料中のポリヌクレオチド濃度の測定値（Ｎｉ）と流出したポリヌクレオチド濃度の測定値（Ｎｏ）を比較することにより、検出対象のポリヌクレオチドの有無が検出できる。なお、本発明において、ポリヌクレオチド濃度を例えば蛍光強度で測定する場合には、蛍光強度をもってポリヌクレオチド濃度（ＮｉやＮｏ）と称する場合がある。吸光度測定における吸光度、電流測定における電流などについても同様である。
【００２０】
前記濃度（Ｎｉ）は流路に導入された試料溶液のポリヌクレオチド濃度であり、前記濃度（Ｎｉ）の測定時点は任意である。例えば、流路を有するデバイスとは別の測定装置で前記濃度（Ｎｉ）を予め測定し、その試料を流路に導入することも出来るし、また例えば、ポリヌクレオチド濃度が一定の試料溶液を継続的に流路に導入するときには、前記濃度（Ｎｉ）は時間に依存しない一定値となるから、任意の時点の前記濃度（Ｎｉ）を採用しうる。さらに、例えば、一定量の試料溶液を流路に導入した後、まだポリヌクレオチドが流出しない時点で、試料溶液を移送用の液体に交換し、該移動用液体でもって試料溶液を押して移送するするときには、ポリヌクレオチドが流出する時点では流路に導入されているのは移送用液体であるため、前記濃度（Ｎｉ）は試料溶液導入時の前記濃度（Ｎｉ）とされる。
【００２１】
前記濃度（Ｎｏ）は、時間の経過と共に変化する値である。前記濃度（Ｎｏ）を測定する時点は、分析方法のバリエーションに応じて決定できる。例えば、ポリヌクレオチドを連続的に移送した場合には、流路壁と親和性の低いポリヌクレオチドが流出した後、流路壁と親和性の高いポリヌクレオチドが徐々に流出し、最終的には流路から出る試料液中のポリヌクレオチド濃度は、流路に入る前の前記試料液中のポリヌクレオチド濃度と同濃度となる。このような場合には、前記濃度（Ｎｏ）の測定は、ポリヌクレオチドが流出をはじめる時点から、前記濃度（Ｎｉ）と同濃度となる時点の間であればいずれの点で測定しても良いが、この間の前記濃度（Ｎｏ）を経時的に連続して測定することで、より精度良く特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドを検出することができる。
【００２２】
試料溶液の全量をポンプなどにより流路に注入し終えた時点で、まだ濃度（Ｎｏ）の測定が終了していない場合には、引き続いて前記試料溶液に使用されている溶媒などを流路に導入することによって、試料溶液や試料を流路内で移送することが出来る。このような場合には、濃度（Ｎｉ）は、前記導入された試料溶液の濃度を採用する。また、電気泳動などにより、溶液中のポリヌクレオチドのみを移送する場合も同様である。
【００２３】
流路に分析すべきポリヌクレオチドを移送する方法は任意であり、例えば、該ポリヌクレオチド溶液の送液、電気泳動による移送などであり得る。ポリヌクレオチド溶液の送液は、デバイス外のポンプ、例えばシリンジポンプ、ギヤポンプ、ダイヤフラムポンプ、チューブポンプによる送液、流路端に設けられた導入口の加圧による送液、流路端に設けられた流出口の減圧による送液、電気浸透流による送液、デバイス内に設けられたポンプ機構、例えばダイヤフラムポンプ機構による送液、流路に導入された磁性流体でポリヌクレオチド溶液を押すまたは引くことによる送液、などであり得る。電気泳動による移送は、流路の任意の２点間に電圧を印加することによって、溶液中のポリヌクレオチドを移送する方法である。これらの移送方法は、用途目的に応じて選定できるが、電気泳動による移送方法が、機構が簡単で好ましい。勿論、ここでいう「ポリヌクレオチドを移送する」とは、そのような操作を行うことであり、分析結果として溶液中にポリヌクレオチドが存在しないことが判明する場合もあり得る。
【００２４】
前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）の比較は、例えばその比（Ｎｏ／Ｎｉ）による判定であってよい。即ち、例えば試料溶液中にただ１種類のポリヌクレオチドが存在する場合には、試料溶液導入後、好適に選ばれた時間が経過した時点における前記比（Ｎｏ／Ｎｉ）が大きければ（即ち、１に近ければ）試料中のポリヌクレオチドは流路壁と親和性が小さいために吸着されずに流出したことを示しており、試料中に検出対象のポリヌクレオチドが存在しないと判定でき、少なければ（即ち、ゼロに近ければ）試料中のポリヌクレオチドは流路壁と親和性が高いために吸着されて流出しないことを示しており、検出対象のポリヌクレオチドが存在すると判定できる。前記「試料溶液導入後、好適に選ばれた時間が経過した時点」は、測定装置や条件によって変わりうるものであり、その要因としては、例えば、流路長、流路壁と検出対象のポリヌクレオチドの親和性の強さ、温度、流速等が挙げられる。前記好適な時間は、検量線を作成することによって決定できる。
【００２５】
もちろん、検出対象のポリヌクレオチドと親和性を有する壁面が、他のポリヌクレオチドに対してそれより弱い親和性を有し、被特異的吸着が生じることもあり得る。従って、非特異的吸着の影響を除去するために、例えば、あらかじめ相補的な塩基配列を有することがわかっているポリヌクレオチドや、相補的でないことがわかっているポリヌクレオチドを用いた対照実験を行うことが好ましい。
【００２６】
前記比（Ｎｏ／Ｎｉ）からの判断は、絶対的な数値からの判断であっても良いし、複数の流路や複数の実験の相対的な比較であっても良い。前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）の比較は、また、それらの差（Ｎｉ−Ｎｏ）や濃度（Ｎｉ）と濃度（Ｎｏ）との比や差を含む複雑な関数であり得るが、比（Ｎｏ／Ｎｉ）を用いることが好ましい。以下、説明の簡略化のために、濃度（Ｎｉ）と濃度（Ｎｏ）の比較を、比（Ｎｏ／Ｎｉ）で代表させて説明する。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドの検出方法は、検出対象の塩基配列を有するポリヌクレオチドと他の塩基配列を有するポリヌクレオチドでは流路中での移動速度が相違することが検出原理であるため、試料が流路を通過する速度の設定が重要である。このために、試料と同種の他のポリヌクレオチド混在物で検出対象のポリヌクレオチドを含まない試料の比（Ｎｏ／Ｎｉ）や、同種の他のポリヌクレオチド混在物に検出対象のポリヌクレオチドを一定濃度添加した試料の比（Ｎｏ／Ｎｉ）を同時に測定し、試料の比（Ｎｏ／Ｎｉ）と比較することが有用である。
【００２８】
このようにして測定した対照の比（Ｎｏ／Ｎｉ）値と、添加した検出対象のポリヌクレオチドの対照濃度との関係を標準曲線として用いることで、或る一定の濃度範囲内であれば、試料中の検出対象のポリヌクレオチドを比（Ｎｏ／Ｎｉ）から定量することも可能である。
【００２９】
アフィニティークロマトグラフィーは、カラム充填物である担体に検体中の特定の成分と親和性を持たせ、該担体と親和性のある成分の移動速度が遅れる原理を利用する点では、本発明と類似している。しかし、検出対象のポリヌクレオチドに親和性を有する担体をカラムに充填したアフィニティークロマトグラフィーでは、検出対象のポリヌクレオチドは担体との親和性のために他のポリヌクレオチドよりも遅く溶出し、該検出対象のポリヌクレオチドのピーク流出まで検出対象のポリヌクレオチドの存在を判定できないため、従来より使用されているカラム長が２０〜３０ｃｍあるようなアフィニティクロマトグラフィーでは、分析に時間を要する。
【００３０】
また、分析時間の短縮のため、細くかつ長さの短い充填カラムを用いることによって、微量の試料で高速分析を行うことは原理的には可能であるが、実際に実施しようとすると、微小な分離カラムの一部に試料ポリヌクレオチドをバンドとして導入することが極めて困難であり、例えば、カラム長が１ｃｍ以下の微小なカラムに、マイクロシリンジを用いて試料を注入しても、微小な分離カラム全体に試料溶液が行き渡りがちであり、カラムの一部にバンドとして再現性よく導入することは極めて困難であるため、単にカラム長を短くするだけでは、検出精度が著しく低下してしまう。
【００３１】
また、アフィニティークロマトグラフィーでは、温度が低すぎると分析時間が長くなり、極端な場合には数時間かけてもピークが現れなくなり、分析不能となる場合もある。逆に温度が高すぎると、担体との相互作用の差が小さくなり、分離不十分となる場合も生じる。そのため、正確な温度調節を行う必要である上、測定対象毎に温度を設定する必要があった。あるいは、上記の困難を避けるために、昇温クロマトグラフィー方式を採用する必要があり、機構が複雑になる上、分析の迅速化に限界があった。それに対し、本発明の方法では、前記クロマトグラフィーでは使用できない低温でも分離可能であり、測定温度の許容幅がアフィニティークロマトグラフィーに比べて非常に広い。このことは、予想されざる驚くべきことである。
【００３２】
これに対して、本発明のポリヌクレオチドの検出方法では、流路壁自体が検出対象のポリヌクレオチドと親和性を有する流路を使用することにより、流路内に検出対象のポリヌクレオチドと親和性を有する充填剤や化学物質を配する必要がないためポリヌクレオチドの移送が阻害されることがなく、また流路径が３〜２００μｍの流路を使用することにより、使用する試料がごく微量でよく、ポリヌクレオチドを迅速に移送させることができ、さらに、流路に移送されたポリヌクレオチドが環流して流路壁と良好に接近するため、検出対象のポリヌクレオチドが流路壁の有する親和性の影響を受けやすくなり、検出対象のポリヌクレオチドの移送速度と、その他のポリヌクレオチドの移送速度との差が十分に生じることから、良好な検出精度を有しつつ測定時間を大幅に短縮できる。
【００３３】
また、検出対象のポリヌクレオチドの移送速度と、その他のポリヌクレオチドの移送速度の差を、該流路に入る前の前記試料液中のポリヌクレオチド濃度（Ｎｉ）と、前記流路から出る試料液中のポリヌクレオチド濃度（Ｎｏ）とを測定し、両濃度を比較するだけで、特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドの有無を検出できることから、各成分の濃度やその合計濃度が不明であっても、検出対象のポリヌクレオチドの流出濃度がピークに達する以前に判定可能であり、検出対象のポリヌクレオチドの有無を簡便かつ迅速に検出できる。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドの検出方法は、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドと親和性を持つ流路壁を有する流路と、前記流路に用いた特定のポリヌクレオチドとは異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドと親和性を持つ流路壁を有する流路とを直列または並列に繋いで用いることにより、更に有効に利用することができる。
【００３５】
（直列流路）
例えば、ｐ５３遺伝子のように１つの遺伝子中に変異が起こりやすいホットスポットが複数存在するような遺伝子では、その複数のホットスポットのどれか１つにでも変異があれば癌化細胞である可能性が高い。
【００３６】
この場合、１つの流路に１つのホットスポットの変異塩基配列を有するヌクレオチドを結合させたものをホットスポットの数だけ作製し、これらを直列に繋ぎ、この直列流路に試料標識ＤＮＡ（細胞から抽出、増幅したｐ５３遺伝子）を通過させた時、ｐ５３ＤＮＡのホットスポットのいずれにも変異の無い試料ＤＮＡの比（Ｎｏ／Ｎｉ）と、ｐ５３のホットスポットのいずれか１カ所以上に変異を有する試料ＤＮＡの比（Ｎｏ／Ｎｉ）とは異なるものとなる。癌化細胞であることが疑われる被験細胞から抽出増幅したｐ５３遺伝子を用い、１本の連結流路通過での（Ｎｏ／Ｎｉ）測定により、このｐ５３遺伝子中のホットスポットでの変異の有無を検出でき、これにより被験細胞の癌化についての情報を容易に得ることができる。
【００３７】
さらにこのような方法を用いれば、遺伝子のどれか１つ以上の変異の存在有無を簡便に検出することが可能で、迅速な遺伝子変異の検出に大きく寄与する。例えば、ｐ５３遺伝子の変異ホットスポットとＫ−ｒａｓ遺伝子の変異ホットスポットを組み合わせて、そのいずれかに変異が存在することを検出することで、大腸癌の検出に利用することが可能である。
【００３８】
（並列流路）
検出対象の特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを流路壁に結合させた流路と、オリゴヌクレオチドを結合させない同型同質の流路とを並列に並べ、試料液を同時に両流路に配し、流路中にポリヌクレオチドを移送した時の両流路の（Ｎｏ／Ｎｉ）を比較することにより、試料液中での検出対象のポリヌクレオチドが存在するか否かをより明確に検出することが可能である。
【００３９】
また、同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを流路壁に結合させた複数の同じ流路を並列に並べ、その１つに試料液を、その他に対照ＤＮＡ（検出対照のＤＮＡと同一方法で抽出増幅した性質の分かっているＤＮＡ）を流し、それらの（Ｎｏ／Ｎｉ）を比較することで、試料ＤＮＡと対照ＤＮＡの相違をより明確にし、更に条件設定を適切に行えば、定量的な結果を得ることも可能である。
【００４０】
（直列並列の併用方法）
例えば、複数の遺伝子の塩基配列に対する相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを流路壁に結合させた流路を直列にし、オリゴヌクレオチドを結合させない同型同質の流路を同数直列させたものを並列にし、両方の流路に同時に試料液中のポリヌクレオチドを移送して並列流路のそれぞれの比（Ｎｏ／Ｎｉ）を比較すれば、これら複数の遺伝子中のいずれか１つに変異がある試料を、より正確に検出することが出来る。
【００４１】
（流路）
迅速に検出を行うためには、試料液中の成分と流路壁に結合したオリゴヌクレオチドとの接触が大きいことが望ましく、そのためには、出来るだけ流路径が小さい毛細管状流路であることが好ましい。一般に拡散による混合時間は流路径の２乗に比例するため、流路径の小さな流路では、通過するポリヌクレオチドが流路壁に結合されたオリゴヌクレオチドと接触する確率が高くなるからである。
【００４２】
ここで、上記の観点から、オリゴヌクレオチドが結合した流路壁を有する流路部分の流路径は、流路の断面形状の異方性が高い場合、例えば、流路の断面形状が楕円や細長いスリット状の場合には、短径を表すものとし、その短径が３〜２００μｍであることが好ましく、より好ましくは１０〜１００μｍ程度である。
該流路部分の断面の長径は任意であり、例えば１０ｍｍであり得るが、好ましくは３μｍ〜３ｍｍ、さらに好ましくは３μｍ〜１ｍｍ、最も好ましくは５μｍ〜３００μｍである。この範囲を超えると、必要とする試料の量が増え、この範囲未満であると製造の困難性が増す上、検出感度が低下する。これらの毛細管状の流路を有する、いわゆるマイクロ流体デバイスは、本発明者らが既に報告している後述の製造方法により好適に製造することができる。
【００４３】
本発明の検出用流体デバイスには、特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドと少なくとも一部が相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチドを前記デバイスの流路壁に結合させた流路部分を設けたポリヌクレオチドの検出用流体デバイスを含む。本発明の検出用流体デバイスは、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドと親和性を持つ流路壁を有する流路部分が毛細管状の流路であるポリヌクレオチドの検出用流体デバイスである。
【００４４】
毛細管状の流路を有するポリヌクレオチドの検出用流体デバイスの素材は任意であり、公知の、例えば硝子、石英などの結晶、シリコンなどの半導体、ステンレススチール等の金属、重合体などを素材として製造できる。これらの中でも、重合体は、流路表面へのオリゴヌクレオチドの高密度な結合や成形が容易であるために好ましく、また、前記重合体の中でも、特に生産性が高く、且つオリゴヌクレオチドを結合させることが可能な官能基を高密度に導入できる点から、エネルギー線硬化性樹脂組成物の硬化物が、さらに好ましい。
【００４５】
流路表面には細かな凹凸または多孔質層が形成されていることが好ましい。細かな凹凸間の細孔径や多孔質層の細孔径は、５０ｎｍ〜１０μｍが好ましく、１００ｎｍ〜１μｍがさらに好ましい。この範囲とすることで、流路表面の表面積を増加させてオリゴヌクレオチドの固定量を増すことができ、また、試料液中のポリヌクレオチドが細孔内部に入り込めないために該ポリヌクレオチドと相互作用できるオリゴヌクレオチドの量が減少することもない。前記流路表面の多孔質層の厚みは５０ｎｍ〜１０μｍが好ましく、１００ｎｍ〜１５μｍがさらに好ましい。このとき、厚みの加減は孔径程度とすることが好ましい。この範囲にすることにより、流路表面のオリゴヌクレオチドの固定量を十分高くすることができ、かつ、分析速度の低下や分解能の無視し得ない低下を招くこともない。
【００４６】
流路壁面にオリゴヌクレオチドを結合させる方法は任意であり、慣用の方法が利用できるが、流路に結合させるオリゴヌクレオチド量がより多いことが望ましい。望ましい方法としては、流路壁面を、オリゴヌクレオチドと結合可能な官能基を多数有するポリマーから構成し、該官能基にオリゴヌクレオチドを結合させる方法が挙げられる。
【００４７】
前記オリゴヌクレオチドと直接または他の化合物を介して結合可能な官能基としては、例えば、水酸基、アミド基、アミノ基、４級アンモニウム基、カルボキシ基、リン酸エステル基、亜燐酸エステル基、フォスフォニウム基、アミノ酸残基などが挙げられる。
【００４８】
長い流路を用いれば、流路に結合したオリゴヌクレオチドと試料ポリヌクレオチドの接触は大きくなり、より明確に、比（Ｎｏ／Ｎｉ）又は差（Ｎｉ−Ｎｏ）の相違が生じるが、この場合には、接触増大に比例して流路を通過するのに要する時間が増加するため、迅速な検出に結びつかない。本発明の目的の１つは、検出対象のポリヌクレオチドの迅速な検出法の提供であり、この場合の迅速とは、１回の検出操作時間が３０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、３分以内であることがさらに好ましい。このため、流路の長さは、明確に、比（Ｎｏ／Ｎｉ）の相違が生じる長さ以上であれば、可能な限り、短いことが望ましい。
【００４９】
流路に試料液を流す方法は任意であり、例えば、一定速度であって良いし、間欠的であっても良い。一定速度で流す場合には、流出開始時からポリヌクレオチド濃度の測定までの時間を、感度とＳ／Ｎ比（信号／ノイズ比）が最も良好な時点を選択すれば良い。間欠的に流す場合には、例えば、流路のオリゴヌクレオチド結合部分に試料溶液が充填されるまで比較的高速で該溶液を流入させ、一定時間その状態で保持し、その後、比較的高速で流出させる。流出させた溶液は、ポリヌクレオチド濃度の測定の為に再び停止させることもできる。
【００５０】
流路に流入する前の試料液中のポリヌクレオチド量と該流路から流出する試料液中のポリヌクレオチド量の測定は、慣用のポリヌクレオチドの測定方法を用いて測定することができる。例えば、放射性同位体や蛍光試薬で標識したポリヌクレオチド試料を用いて、放射線強度や蛍光強度により測定できる。また、紫外可視吸収、電導度、電位等の測定なども用いることができるが、蛍光強度による測定は、高感度であり、また、緩衝液の影響を受けないので好ましい。蛍光強度の測定は、ポリヌクレオチドに標識した蛍光物質の蛍光、例えば、ＰＣＲ法でＤＮＡを増幅する際に導入した蛍光物質の蛍光、ＤＮＡ二重螺旋へインターカレーションさせた蛍光物質による蛍光で測定できる。
【００５１】
本発明の検出用流体デバイスは、オリゴヌクレオチドが結合した流路壁を有する流路部分の上流部分及び下流部分に、それぞれ該流路部分に入る前の試料液中のポリヌクレオチド濃度と該流路から出る試料液中のポリヌクレオチドの濃度測定部を有する。該測定部は、前述の測定方法に応じて、例えば、放射線計測用のセルと窓、蛍光測定用のセルと窓、紫外可視吸収測定用のセルと窓、電導度測定用の電極、電位測定用の電極、酵素固定電極などでありうる。上流部分と下流部分の該測定部は、同じ種類の機構や構造であることが好ましい。
【００５２】
本発明の検出用流体デバイスにおいて、流路が複数に分岐している場合には、上流側の測定部は共通の流路に１つ設けても良いし、分岐後のそれぞれの流路に設けても良い。下流側の測定部は各流路毎に設けられる。また、前記セルは、測定部分の流路そのものであっても良いし、測定部分の寸法がそれ以外の流路部分の寸法と異なるものであってもよい。前記セルは、デバイス表面から見た奥行き（深さ）が厚くなっているものであることが、検出感度を増す点で好ましい。
【００５３】
測定方法として蛍光測定を採用する場合、マイクロ流体デバイスの前記窓は、励起光と蛍光を透過する必要があり、かつ、窓の素材や窓を通して観察される部分の素材は、測定に使用する励起光によって観測波長に蛍光を発しない材料である必要がある。励起用の窓と蛍光測定用の窓は同じ窓であっても良いし、流体デバイスの裏表に形成された別のものであってもよい。
【００５４】
蛍光測定装置は、任意のものが特に制限なく使用でき、例えば、ＤＮＡマイクロ電気泳動の検出装置と同様のフォトマルチプライヤーやＣＣＤによる微小領域の蛍光強度測定装置を使用することができる。励起用光源は、通常の蛍光測定に用いられるレーザー、水銀灯、メタルハライドランプ、ハロゲンランプなどが使用できるが、蛍光物質の濃度が低い場合や測定部分の流路径が小さい場合には、検出感度が高くなることからレーザーが好ましい。
【００５５】
（流路の作製方法）
本発明の流路径が３〜２００μｍの流路を有する検出用流体デバイスは、例えば、本発明者らが特開２０００−２８８３８１号報に開示した下記の微小ケミカルデバイスの製造法により製造することができる。すなわち、
（イ）部材（Ａ）に架橋重合性の活性エネルギー線硬化性化合物を含有する樹脂組成物を厚さ３〜２００μｍとなるように塗布し、
（ロ）該塗膜の幅３〜３０００μｍ程度の溝と成るべき部分以外の部分に活性エネルギー線を照射して、樹脂組成物が流動性を喪失し、かつ未反応の重合性基が残存する程度まで半硬化させ、
【００５６】
（ハ）未照射部分の未硬化の樹脂組成物を除去することによって部材（Ａ）の表面に深さ３〜２００μｍ、幅３〜３０００μｍ程度の溝を形成し、
（ニ）部材（Ａ）の溝形成面に部材（Ｂ）を接触させ、その状態で部材（Ａ）及び／又は部材（Ｂ）の外部から活性エネルギー線を照射して、樹脂組成物を完全に硬化させて接着させる、部材（Ａ）と（Ｂ）の間に流路径（流路深さ）が３〜２００μｍの流路が形成された微小ケミカルデバイスの製造方法。
【００５７】
本発明の検出用流体デバイスの流路の流路壁に、検出対象のポリヌクレオチドと少なくとも一部が相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを結合させることが可能な官能基を導入する方法としては、流路の構成成分として使用する前記活性エネルギー線硬化性化合物を含有する樹脂組成物に官能基を有するモノマーやオリゴマーを添加することにより実施することができる。
【００５８】
官能基を有するモノマーやオリゴマーとしては、例えば、エポキシ基やアルデヒド基を有する（メタ）アクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレートなどの水酸基を有する（メタ）アクリレート、アクリルアミド（Ｎ−アルキル置換体を含む）などのアミド基含有モノマー、アミノ基含有ビニルモノマー、アンモニウム基含有（メタ）アクリレート、カルボキシ基アンモニウム基含有（メタ）アクリレート、リン酸エステル基含有（メタ）アクリレート、亜燐酸エステル基含有（メタ）アクリレート、フォスフォニウム基含有（メタ）アクリレート、などが挙げられる。
【００５９】
さらに高密度に前記官能基を導入した流路壁を形成する方法について、（ａ）流路の側壁（以下、説明の簡略化のために、板状の検出用流体デバイスを水平に置いた状態で表現する。）に形成する方法と、（ｂ）流路の底と天井面に形成する方法に分けて説明する。
【００６０】
（ａ）流路の側壁に前記官能基を高密度に形成する方法
流路の側壁に高密度に官能基を有し、かつ、流路径が３〜２００μｍの流路は、例えば、本発明者らの出願による　特開２００２−５８８７号公報に記載の下記の方法により製造することができる。すなわち、
【００６１】
（１）架橋重合性の活性エネルギー線硬化性化合物を含む光硬化性樹脂組成物を基材に塗工して未硬化塗膜を形成させ、
（２）樹脂欠損部となすべき部分以外に活性エネルギー線を照射して照射部分の光硬化性樹脂組成物を硬化させて、硬化塗膜を作成させ、
（３）未硬化の光硬化性樹脂組成物を除去して、塗工物表面に硬化塗膜の欠損部としての凹部を形成させ、
（４）凹部側面に前記官能基を有するモノマー及び／又はオリゴマーを接触させ、次いで、接触下に凹部側面に活性エネルギー線を照射して、凹部側面の表面に前記官能基を有するモノマー及び／又はオリゴマーを化学的に結合させることにより、流路の側壁に前記官能基を高密度に有する検出用流体デバイスの製造方法。
【００６２】
（ｂ）流路の底と天井面に前記官能基を高密度に形成する方法
流路の底と天井面に高密度に官能基を有し、かつ、流路径が３〜２００μｍの流路は、例えば、本発明者らの特開平１０−５３６５８号公報に開示された下記の方法により製造することができる。すなわち、
【００６３】
光重合性樹脂組成物を賦形した未硬化賦形物と、前記官能基を有するモノマー及び／又はオリゴマーとを接触させた状態で活性エネルギー線を照射して未硬化賦形物を硬化させると共に、未硬化賦形物と前記官能基を有するモノマー及び／又はオリゴマーとの界面において、前記官能基を有するモノマー及び／又はオリゴマーの一部とを共重合させる表面親水性成型物の製造方法。
【００６４】
このような方法によって、流路内壁の任意の面や全ての面に高密度に官能基を導入することができる。
【００６５】
（オリゴヌクレオチドの結合方法）
前記官能基とオリゴヌクレオチドとを結合させる方法は、例えば、特開２００１−２７２４０２号公報に開示されており、具体的には、以下の（ａ）、（ｂ）の方法などが挙げられる。
【００６６】
（ａ）流路表面に導入された−ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２基、−ＮＨＣＯＮＨＣＯＣＨ＝ＣＨ２基、−ＣＯＸ基（Ｘはハロゲンを示す）、アルデヒド基、イソシアナアト基、エポキシ基、トリアジニル基などの官能基と、オリゴヌクレオチドに導入されたアミノ基とを反応させる方法。
【００６７】
（ｂ）流路表面とオリゴヌクレオチドの両者にアミノ基を導入し、複数の−ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２基、−ＮＨＣＯＮＨＣＯＣＨ＝ＣＨ２基、−ＣＯＸ基（Ｘはハロゲンを示す）、アルデヒド基、イソシアナト基、エポキシ基、トリアジニル基を有するポリマーを介して両者を結合させる方法。
【００６８】
（ポリヌクレオチド量の測定方法）
ポリヌクレオチド量の測定は、従来の慣用な方法を用いることができる。例えば、市販のヌクレオチド標識キットを用いてポリヌクレオチドを蛍光標識したものを用い、蛍光測定により測定する方法が挙げられる。また、例えば、ターミナルトランスフェラーゼによりポリヌクレオチドの３’末端にフルオレセイン−１１−ｄＵＴＰ（ｄＵＴＰは２’−デオキシウリジン−５’−トリフォスフェートのナトリウム塩を指す。）を結合させて、ポリヌクレオチドをフルオレセイン標識し、この標識ポリヌクレオチドを用い、ＵＶ照射により発する蛍光を測定してポリヌクレオチド量を定量する方法が挙げられる。
【００６９】
この他に、本発明で利用出来るポリヌクレオチド量の測定方法としては、例えば、［３２Ｐ］、［３Ｈ］、［３５Ｓ］などの放射性同位元素で標識されたヌクレオチドを用いる標識法、ポリヌクレオチドの紫外部吸収を直接測定する方法、様々な蛍光物質を直接標識する方法、ビオチンなどを介して標識する方法、酵素を利用して標識する方法、などが挙げられる。これらの測定のためには、標識キット、試薬として市販されているものを使用すれば良い。
【００７０】
（特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの検出方法）
特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの検出方法としては、例えば、癌化細胞由来の特定の塩基配列を有する複数の検出対象のポリヌクレオチドと親和性を持つ流路壁を有する流路部分を直列に繋いで前記ポリヌクレオチドを移送し、それと同時に該流路と同じに作成した流路に正常細胞由来の特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む試料を比較対象として移送して、両流路における前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）を測定し、両流路における前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）との比（Ｎｏ／Ｎｉ）を比較することにより、癌化細胞由来のポリヌクレオチドが試料液中に含まれるか否かを迅速に検出することができる。
【００７１】
また、検出に際しては、同じに作成した一対の流路を用いて、互いに特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドの流出時間を予め測定しておき、癌化細胞由来の特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドの溶出と正常細胞由来の特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドの溶出の差が大きくなる時間帯を確認しておき、該時間帯での両流路における前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）を測定し、両流路における前記濃度（Ｎｉ）と前記濃度（Ｎｏ）との比（Ｎｏ／Ｎｉ）を比較することも有効である。
【００７２】
（ポリヌクレオチドの検出用流体デバイス）
本発明のポリヌクレオチドの検出用流体デバイスは、本発明のポリヌクレオチドの検出方法に用いられる流体デバイスであって、試料液中の検出対象のポリヌクレオチドと少なくとも一部が相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを流路壁に結合させた流路部分と、該流路部分の上流部分及び下流部分に、それぞれ該流路部分に入る前の前記試料液と該流路から出る試料液のポリヌクレオチドの濃度測定部を有する流体デバイスである。
【００７３】
ポリヌクレオチドの検出用流体デバイスの素材、構造、流路の形状や寸法、オリゴヌクレオチドの結合方法、試料液中のポリヌクレオチドの濃度測定部に関しては、本発明のオリゴヌクレオチドの検出方法で述べた内容と同様である。ポリヌクレオチドの濃度測定部は蛍光測定用のセルと窓であることが好ましい。
【００７４】
ポリヌクレオチドの移送方法が電気泳動及び／又は電気浸透流方式である場合には、駆動用の電極挿入部を有する。該電極挿入部は、上記のオリゴヌクレオチド固定部位と上記の２つの濃度測定部の上流側と下流側であって、これらの構造部分を挟む物であることが好ましく、上記検出用流路の各端部に形成された導入口と流出口であることがさらに好ましい。
【００７５】
（ポリヌクレオチドの検出装置）
本発明のポリヌクレオチドの検出装置は、本発明のポリヌクレオチドの検出方法に用いる検出装置であって、（Ａ）ポリヌクレオチドの検出用流体デバイスを一定位置に保持する機構、（Ｂ）該検出用流体デバイスの流路中にポリヌクレオチドを移送する機構、及び（Ｃ）該検出用流体デバイスのポリヌクレオチドの濃度測定部を用いて、ポリヌクレオチド濃度を測定する機構とを備えたポリヌクレオチドの検出装置である。
【００７６】
（Ａ）ポリヌクレオチドの検出用流体デバイスを一定位置に保持する機構は、流体デバイスを所定位置に固定できるものであれば任意であるが、１動作で所定位置に固定できるものが好ましく、例えば位置決め機構とバネ式の押さえ機構であることが好ましい。位置決め機構は、例えば位置決めピン、案内枠、微調節可能なステージなどであり得る。
【００７７】
（Ｂ）該検出用流体デバイスの流路中にポリヌクレオチドを移送する機構は、流体デバイスが内部にポンプ機構を有する場合には、その駆動装置、例えば、ダイヤフラムポンプ機構のダイヤフラムを周期的に圧迫するための電磁式、機械式、圧空式などのアクチュエータ、或いはダイヤフラムに固定された強磁性体を駆動するための周期的な磁力線発生装置であり得る。流体デバイス自体に内部ポンプを有せず、外部から配管などを通じて試料液や溶液を流路中に移送する場合には、そのための送液ポンプ、圧力気体や液体を供給するための減圧弁やタンク、圧力気体や液体を流体デバイスに導入するための接続配管などであり得る。電気泳動及び／又は電気浸透流で試料ポリヌクレオチドを思想する場合には、電圧発生装置と電極であり得る。試料液を移送する機構は、定量ポンプであることが、本発明の効果を発揮させる上で好ましい。
【００７８】
（Ｃ）該検出用流体デバイスのポリヌクレオチドの濃度測定部を用いて、ポリヌクレオチド濃度を測定する機構は、本発明のポリヌクレオチドの検出方法で例示した測定方法に用いる測定機構であり、前記濃度（Ｎｉ）と濃度（Ｎｏ）を実質的に同時に測定できる機構である。例えば、放射線カウンター、蛍光強度測定装置、紫外可視吸収測定装置、電流計、電位差計、等であり得るが、蛍光測測定装置であることが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドの検出装置は測定されたポリヌクレオチド濃度の測定値（Ｎｉ）と（Ｎｏ）の比や差を算出する解析機構を有することも迅速な検出のために好ましい。さらに、本装置は、本発明に成る流体デバイスを構成要素とするものであることが好ましい。
【００７９】
【実施例】
以下本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、「部」及び「％」は、特に断りがない限り、各々「質量％」、「質量部」を表す。
（実施例１）
【００８０】
〔組成物（Ｘ１）〕
検出用流体デバイスの製造例で使用する紫外線硬化性の組成物（Ｘ１）の調製方法を示す。
重合性化合物として、平均分子量約２０００の大日本インキ化学工業株式会社製３官能ウレタンアクリレートオリゴマー「ユニディックＶ−４２６３」６０部、第一工業製薬株式会社製ヘキサンジオールジアクリレート「ニューフロンティアＨＤＤＡ」４０部、光重合開始剤としてチバスペシャルテッィケミカルズ社製１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」５部、及び重合遅延剤として関東化学株式会社製２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン０．５部を混合して、組成物（Ｘ１）を調製した。
【００８１】
〔組成物（Ｘ２）〕
検出用流体デバイスの製造例で使用する紫外線硬化性の組成物（Ｘ２）の調製方法を示す。
重合性化合物として、上記「ユニディックＶ−４２６３」８０部、上記「ニューフロンティアＨＤＤＡ」２０部、光重合開始剤として上記「イルガキュアー１８４」」５部、を混合して、組成物（Ｘ２）を調製した。
【００８２】
〔製膜液（Ｙ）〕
検出用流体デバイスの製造例で使用する紫外線硬化性の組成物（Ｙ）の調製方法を示す。
重合性の化合物として、上記「ユニディックＶ−４２６３」７２部、日本化薬株式会社製ジシクロペンタニルジアクリレート「Ｒ−６８４」１８部、上記メタクリル酸グリシジル１０部、貧溶剤（Ｒ）として和光純薬工業株式会社製デカン酸メチル１８０部、揮発性の良溶剤としてアセトン１０部、紫外線重合開始剤として上記「イルガキュアー１８４」１３部、を均一に混合して製膜液（Ｙ）を調製した。
【００８３】
〔紫外線の照射〕
製造例に於ける紫外線照射は、２００Ｗメタルハライドランプを光源とするウシオ電機株式会社製のマルチライト２００型露光装置用光源ユニットを用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が１００ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を、特に指定が無い限り室温、窒素雰囲気中で照射した。
【００８４】
〔検出用流体デバイス〕
図１、図２は、本発明の分離方法に好適に用いられる検出用流体デバイスの一例を示したもので、図１は平面模式図、図２は側面模式図である。
図１、図２に示すように、本実施例の検出用流体デバイスは、板状の支持体１上に、多孔質層２、第一樹脂層３、及び第二樹脂層４が順に積層され、これらが一体化されて概略構成されており、全体の外形は長さ９５ｍｍ、幅２５ｍｍ、厚さ約１．１８ｍｍの板状となっている。なお、外形は例えば使用する光学的測定装置や温調ブロックに合わせて設計すれば良く、任意である。
【００８５】
支持体１としては、アクリル板、ポリスチレン板、ポリカーボネート板、硝子板等を用いることができるが、検出用流体デバイスにおいては透明なアクリル板が使用されている。
多孔質層２は、支持体１上に固着されて形成されており、上述の製膜液（Ｙ）の塗膜を硬化させ、貧溶剤を除去したものである。その厚さは任意であるが検出用流体デバイスにおいては約５μｍである。この多孔質層は、流路中間部５ｃの底面部分２ａを除いた部分が、第一樹脂層３の組成物（Ｘ１）で充填されて硬化させたものであり、上記２ａ部分以外はは透明になっている。
第一樹脂層３は、上述の組成物（Ｘ１）を硬化させた層である。この第一樹脂層３には、該層の表面から裏面に貫通する直線状の欠損部５が形成され、該欠損部５は、第一樹脂層３が多孔質層２と第二樹脂層４で表裏から挟持接着されることによって、毛細管状の検出用流路５となっている。この検出用流路５は、いずれの部分も幅が１５０μｍ、高さが３５μｍである。
この検出用流路５の内壁の底面には、両端部１０ｍｍを残した中心部５０ｍｍの範囲に、厚み５μｍ、平均孔径約０．５μｍの多孔質層２ｃが露出しており、該多孔質層の細孔の表面には、長さ２０塩基の１本鎖ＤＮＡが結合されている。
【００８６】
第二樹脂層４は、組成物（Ｘ２）を硬化させたものであり、その厚さは約９０μｍである。
第二樹脂層４には、層の表面から裏面に貫通する孔である流入口６および流出口７が形成されている。流入口６は、第一樹脂層３の検出用流路５の上流端に連通している。流出口７は、第一樹脂層３の検出用流路５の下流端に連通している。
また、検出用流路５の上流端から１０ｍｍの範囲５ａ、および下流端から１０ｍｍの範囲５ｂは、ともに、支持体１側から第二樹脂層４側まで透明であり、蛍光測定用の窓（蛍光検出部）となっている。検出用流路５の中間部５０ｍｍの範囲５ｃは、多孔質層２ｃが流路５の内面に露出していて、白色を呈している。
【００８７】
以下、この検出用流体デバイスの製造方法について説明する。
〔工程１：多孔質層の形成〕
厚さ１ｍｍのアクリル板製支持体１の上に、スピンコーターを用いて、製膜液（Ｙ）を塗工し、紫外線を６０秒照射して硬化させ、相分離した貧溶剤（Ｒ）をｎ−ヘキサンで洗浄除去して多孔質層２を形成する。
【００８８】
〔工程２：欠損部（検出用流路）の形成〕
上記多孔質層２の上に、スピンコーターを用いて組成物（Ｘ１）を塗工して未硬化塗膜を形成し、該未硬化塗膜の検出部（長さ２０塩基の１本鎖オリゴＤＮＡ固定部）２ｃと成すべき部分以外の部分にフォトマスクを通して紫外線を１０秒間照射して未硬化塗膜を半硬化させて、非照射部分の未硬化の組成物（Ｘ１）をエタノールで除去して、２ｃ部分の多孔質層を再び表面に露出させた、この処理によって、多孔質層２の２ａ部分以外の部分は透明になった。
次いで、上記塗膜の上に、再度スピンコーターを用いて組成物（Ｘ１）を塗工して未硬化塗膜を形成し、該未硬化塗膜の検出用流路５と成すべき部分以外の部分にフォトマスクを通して紫外線を１０秒間照射して未硬化塗膜を半硬化させて、第一樹脂層３と成した。次いで、非照射部分の未硬化の組成物（Ｘ１）をエタノールで洗浄除去して、検出用流路５となるべき第一樹脂層３の欠損部５を形成した。上記のエタノール洗浄により、多孔質層２ｃ部分に充填されていた組成物（Ｘ１）も除去され、欠損部５の底面に多孔質層２ｃが露出した。
【００８９】
〔工程３：カバー層の固着〕
二村化学株式会社製二軸延伸ポリプロピレンフィルム「ＯＰＰフィルム」上に組成物（Ｘ２）を、バーコーターを用いて塗工し、全面に紫外線を３秒間照射して半硬化させて、カバー層となる第二樹脂層４と成し、上記工程２で作製した部材の第一樹脂層３の上に貼り合わせ、紫外線を４０秒照射して、第一樹脂層３、第二樹脂層４共に完全に硬化させたのち、ＯＰＰフィルムを剥がして、第一樹脂層３の欠損部が検出用流路５となされた検出用流体デバイス前駆体を製造した。
【００９０】
〔流入口、流出口の形成〕
検出用流体デバイス前駆体の検出用流路５の両端部の位置に於いて、ドリルを用いて第二樹脂層４に直径０．５ｍｍの孔６、７を穿ち、検出用流路５に連結した流入口６と流出口７を形成して、検出用流体デバイスを製造した。
【００９１】
〔ＤＮＡの固定〕
流入部６から検出用流路５内に、５％ポリアリルアミン（日東紡株式会社）水溶液を注入し、５０℃で２時間静置した後、検出用流路５に流水を１５分間通して洗浄し余剰のポリアリルアミンを洗浄除去し、アミノ基を底面の多孔質層（２ａ部分）に導入する。
次いで、検出用流路５に５％グルタルアルデヒド水溶液を注入し、５０℃で２時間静置した後、流水を通して１０分間洗浄して余剰のグルタルアルデヒドを除去し、乾燥窒素を通して多孔質層と検出用流路内壁を乾燥させて、ホルミル基導入多孔質層を得る。
次いで、検出用流路５内にエスペックオリゴサービス株式会社製の５’末端にアミノ基を修飾した長さ２０塩基のＤＮＡの緩衝液溶液（ＤＮＡ濃度５０μＭ）を注入し、６０℃で１５時間静置した後、緩衝液を通して洗浄し、更に検出用流路５内に０．２％のテトラヒドロホウ酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）水溶液を注入し、室温３分間静置して、２ｍｌの蒸留水を通して洗浄して、検出用流路５内の固相（多孔質２ａ部）にプローブとなるＤＮＡを共有結合で固定する。
【００９２】
〔接続部材Ｆの作製〕
図３に、本発明にかかる検出用出刃薄に外部ポンプ等を接続するために好適に用いられる接続部材Ｆの斜視図を示す。接続部材Ｆは、図３に示すように、５ｍｍ×５ｍｍ×厚さ２ｍｍのポリスチレン板１１の平面の中心部に、直径１．６ｍｍの貫通孔１２を穿ち、該貫通孔１２にポリエチレン製のチューブ１３を接着して、接続部材Ｆを作製する。本接続部材Ｆは、オーリング１４を挟んで検出用デバイスの流入口６や流出口７にクランプ（図示せず）で密着させることによって、シリンジポンプ（図示せず）などに接続することができる。
【００９３】
〔ポリヌクレオチドの検出試験〕
（プローブＤＮＡと相補的なＤＮＡの検出）
６０℃に調節された温調ブロック（図示せず）を検出用流路５の中間部分５ｃ全体に接触させ、上流側蛍光検出部５ａにおける蛍光強度、および下流側蛍光検出部５ｂにおける蛍光強度を光電増倍管付き落射型蛍光顕微鏡（図示せず）で蛍光強度を観察しながら、シリンジポンプ（図示せず）を用いてプローブＤＮＡと相補的なＤＮＡ（長さ２０塩基の蛍光標識ＤＮＡ）の、ＤＮＡ濃度０．３μＭの緩衝液溶液を導入口６から検出用流路５に流量４μｌ／分の一定速度で導入した。この際の上流側蛍光検出部５ａにおける蛍光強度を（Ｎｉ）、下流側蛍光検出部５ｂにおける蛍光強度を（Ｎｏ）として、これらの経時変化を観測したところ、まず上流側流路５ａの蛍光強度が立ち上がり、一定値（Ｎｉ）を保った。一方、下流側流路５ｂにおける蛍光強度（Ｎｏ）は、試料溶液を導入した時点から３０秒後に少し増加し、（Ｎｏ／Ｎｉ）の値は約０．０７に収束し、さらに試料溶液を導入した時点から４分３０秒後に立ち上がり、（Ｎｏ／Ｎｉ）の値は約１に収束した。３０秒の時点における（Ｎｏ）の立ち上がりは、流路内壁と相互作用せずに漏れ出たものに起因し、４分３０秒の時点の立ち上がりは、流路内壁と相互作用したものと推定された。
【００９４】
（プローブＤＮＡと一塩基のミスマッチを有するＤＮＡの検出）
プローブＤＮＡとして一塩基のミスマッチを有するＤＮＡ（第１０塩基が置換された長さ２０塩基の蛍光標識ＤＮＡ）を用いたこと以外は、上記相補的なＤＮＡを用いた試験と同様の試験を行ったところ、（Ｎｏ）が大きく立ち上がる時間が試料溶液を導入した時点から１分１０秒後であること以外は上記相補的なＤＮＡの場合と同じ結果を得た。
【００９５】
（判定試験）
下記の３試料を作成した。
（試料１）上記相補的なＤＮＡの緩衝溶液を試料１とした。
（試料２）上記一塩基のミスマッチを有するＤＮＡの緩衝溶液を試料２とした。
（試料３）上記相補的なＤＮＡの緩衝溶液と、上記一塩基のミスマッチを有するＤＮＡの緩衝溶液との、１：１混合液を試料３とした。
【００９６】
試料として上記試料１、試料２、試料３をそれぞれ用いたこと、及び、測定者（判定者）には、各試料の内容を伏せたブラインドテストを行ったこと以外は、上記ポリヌクレオチドの検出と同様の試験を行った。
その結果、試料１は、試料溶液を導入した時点から１分１０秒後の時点における蛍光強度の立ち上がりが無く、この時点で相補的なＤＮＡ単独であると判定された。試料２は、試料溶液を導入した時点から１分１０秒後の時点において蛍光強度が立ち上がり、（Ｎｏ／Ｎｉ）の値が１に収束したため、この時点で一塩基のミスマッチを有するＤＮＡ単独であると判定された。試料３は、試料溶液を導入した時点から１分３０秒後の時点において蛍光強度が立ち上がり、（Ｎｏ／Ｎｉ）の値が０．５に収束したため、この時点で、相補的なＤＮＡと一塩基のミスマッチを有するＤＮＡの１：１混合物であると判定された。
これより、検体溶液中のＤＮＡが相補的なＤＮＡであるか、ミスマッチを有するＤＮＡであるかを（Ｎｉ）と（Ｎｏ）を比較することにより検出できた。
【００９７】
（実施例２）
〔検出用流体デバイスの作製〕
実施例１で作製した検出用デバイスと全く同じものを作製し、これを用いた。
【００９８】
〔接続部材Ｆの作製〕
ポリエチレンチューブを接着しなかったこと以外は、実施例１と同様にして接続部材Ｆ’また、ポリエチレン製のチューブを接続しないこと以外は上記と同様の接続部材Ｆ’を作製した。
【００９９】
〔ポリヌクレオチドの分離〕
検出用デバイスの流入口６及び流出口７に接続部材Ｆ’を装着したこと、シリンジポンプを接続する変わりに、両接続部材Ｆ’の穴に電気泳動用の針金状の白金電極（図示せず）を挿入したこと、緩衝液を流入口６から注入して流路５に満たしておき、どの後、流入口６側の接続部材Ｆ’の穴に試料溶液を注入したこと、及び、両電極間に５００ボルトの直流電圧を印可したことこと、以外は実施例１と同様にして、ポリヌクレオチドの分離試験を行った。その結果、上流側蛍光検出部５ａにおける蛍光強度が立ち上がってから、下流側蛍光検出部５ｂにおける蛍光強度が立ち上がる間での時間が、完全マッチＤＮＡが約２分３０秒、ミスマッチＤＮＡが約４０秒であったこと以外は、実施例１と同様の結果を得た。
【０１００】
【発明の効果】
本発明のポリヌクレオチドの検出方法は、多様な塩基配列を有する多くのポリヌクレオチドが混在する試料中で、特定の塩基配列を有する検出対象のポリヌクレオチドの有無検出を極めて簡便に行うことが出来る。特に、塩基配列の微少な違い、例えば一塩基の違いを高速、かつ簡便に判定できる。
【０１０１】
本発明のポリヌクレオチドの検出方法は、従来のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに比べて、担体に吸着したヌクレオチドと親和性の高いポリヌクレオチドの溶出まで待つ必要がないため、より短時間で、より少量の試料で、かつより簡便な機器で検出対象ポリヌクレオチドの試料中の有無検出を行うことができる。また、マイクロ流体デバイスに組み込めるような微小な分離デバイスを容易に形成可能であり、これを使用するに当たって、ごく微量の試料溶液を高い再現性で注入する必要がなく、高速分析を単純なデバイスで容易に実施できる。
【０１０２】
さらに、毛細管状の流路を有するマイクロ流体デバイスであるポリヌクレオチドの検出用流体デバイスを多数備えた検出装置を用いることにより、複数の検出対照のポリヌクレオチドを同時に、短時間で検出することが可能である。
【０１０３】
本発明のポリヌクレオチドの検出方法を用いることにより、血液、血球、糞便、尿沈査などに含まれる細胞から抽出増幅したポリヌクレオチド混合物試料を用いて迅速な遺伝子診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の製実施例で用いられる検出用流体デバイスの平面模式図である。
【図２】本発明の製実施例で用いられる検出用流体デバイスの側面模式図である。
【図３】本発明の実施例で用いられる接続部材Ｆの斜視図である。
【符号の説明】
Ｆ・・接続部材、
１・・支持体
２・・多孔質層
３・・第一樹脂層
４・・第二樹脂層
５・・検出用流路（欠損部）
５ａ・・・流路の上流側の透明部分（上流側蛍光検出部）
５ｂ・・・流路の下流側の透明部分（下流側蛍光検出部）
５ｃ・・・流路昼間部の多孔質層形成部分
６・・流入口
７・・流出口
１１・・ポリスチレン板
１２・・貫通孔
１３・・チューブ
１４・・オーリング
【図１】
2004049223.tif 000002
【図２】
2004049223.tif 000003
【図３】
2004049223.tif 000004