(57)【要約】【課題】容易で、迅速なタンパク質相互作用検出方法を提供することを課題とするものである。また、本発明は、サイズが大きく、多様性の高い、オリゴヌクレオチドライブラリーまたはオリゴペプチドライブラリーを提供することを課題とするものである。【解決手段】コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）である塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーを作製し、ライブラリーから供給されるランダムオリゴヌクレオチドをツーハイブリッドシステムに組み込み、標的タンパク質またはベイトタンパク質として発現させ、タンパク質相互作用の検出を行う。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）である塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）となるようにヌクレオチドを結合させて、ランダムな塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製する、ランダムオリゴヌクレオチド作製方法。
【請求項３】
コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）である塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドの両端に、前記ランダムオリゴヌクレオチドでは出現しない塩基配列パターンの制限酵素認識配列を含むライゲーション部を有する、ランダムオリゴヌクレオチドカセット。
【請求項４】
ランダムオリゴヌクレオチドの両端にあるライゲーション部がそれぞれ異種の制限酵素認識配列を含む、請求項３に記載のランダムオリゴヌクレオチドカセット。
【請求項５】
コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）である塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドが組み込まれた組換えＤＮＡ。
【請求項６】
コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）である塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドと、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドとが連結されたポリヌクレオチドが組み込まれた、組換えＤＮＡ。
【請求項７】
コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）である塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドと、転写活性化ドメインをコードするポリヌクレオチドとが連結されたポリヌクレオチドが組み込まれた、組換えＤＮＡ。
【請求項８】
請求項５から７のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡを有する形質転換細胞。
【請求項９】
請求項１に記載のランダムオリゴヌクレオチド、請求項３または４に記載のランダムオリゴヌクレオチドカセット、請求項５から７のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ、および、請求項８に記載の形質転換細胞からなる群より選ばれる１種または２種以上を含み、かつ、複数種のランダムオリゴヌクレオチドが含まれる、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリー。
【請求項１０】
請求項９に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに含まれる組換えＤＮＡ中のランダムオリゴヌクレオチドが発現して生成された複数のランダムオリゴペプチドが含まれる、ランダムオリゴペプチドライブラリー。
【請求項１１】
コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）となるようにヌクレオチドを結合させて、塩基配列がランダムなランダムオリゴヌクレオチドを作製する工程と、
前記ランダムオリゴヌクレオチドをベクターに組み込んで組換えベクターを作製する工程と、
前記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程と、
前記形質転換体が有するランダムオリゴヌクレオチドを発現させて、ランダムオリゴペプチドを生成せしめる工程と、
を有する、ランダムオリゴペプチドライブラリー作製方法。
【請求項１２】
タンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する組換えＤＮＡおよびタンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する組換えＤＮＡを細胞内に導入し、前記細胞内でタンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体およびタンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体を発現させ、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとが相互作用する場合に前記ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性化される前記細胞内のレポーター遺伝子の転写産物を検出して、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの相互作用を検出するツーハイブリッドシステムにおいて、
タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙのうち少なくとも一方のタンパク質を構成するポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが、請求項９に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに由来するランダムオリゴヌクレオチドである、タンパク質相互作用検出方法。
【請求項１３】
前記レポーター遺伝子の発現量を測定して、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの結合力を測定する、請求項１２に記載のタンパク質相互作用検出方法。
【請求項１４】
請求項１２のタンパク質相互作用検出方法におけるタンパク質Ｘまたはタンパク質Ｙのいずれか一方が受容体タンパク質またはその一部であり、他方が請求項９に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに由来するランダムオリゴペプチドである、リガンドのスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１２のタンパク質相互作用検出方法におけるタンパク質Ｘまたはタンパク質Ｙのいずれか一方がリガンドまたはその一部であり、他方が請求項９に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに由来するランダムオリゴペプチドである、受容体タンパク質の結合部位のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載のタンパク質相互作用検出方法により相互作用が検出された細胞を採取し、
タンパク質Ｘおよび／またはタンパク質Ｙをコードする塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドにより特定されるランダムオリゴペプチドのアミノ酸配列を解析し、解析されたアミノ酸配列をアミノ酸配列データベース内に予め蓄積された配列情報と比較し、
ランダムオリゴペプチドが有するアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する、相互作用タンパク質検索方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載のタンパク質相互作用検出方法により相互作用が検出された細胞を採取し、
タンパク質Ｘおよび／またはタンパク質Ｙをコードするランダムオリゴヌクレオチドが有する塩基配列を解析し、解析された塩基配列を塩基配列データベース内に予め蓄積された配列情報と比較し、
ランダムオリゴペプチドが有するアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する、相互作用タンパク質検索方法。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の相互作用タンパク質検索方法によりデータベースから検出されたタンパク質中で、当該タンパク質に含まれるランダムオリゴペプチドの位置を、当該タンパク質および当該ランダムオリゴペプチドのアミノ酸配列を対比することにより特定して、当該タンパク質の相互作用部位を特定する、タンパク質の相互作用部位特定方法。
【請求項１９】
請求項１２に記載のタンパク質相互作用検出方法により相互作用が検出された細胞を採取し、タンパク質Ｘおよび／またはタンパク質Ｙをコードする塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドにより特定されるランダムオリゴペプチドのアミノ酸配列を解析し、当該アミノ酸配列の一部の配列を改変するようにオリゴヌクレオチドを作製し、改変ペプチドについて再度ツーハイブリッドシステムによる相互作用検出を行い、相互作用の有無を検出して相互作用の必須配列部位を特定することを特徴とする、タンパク質相互作用検出方法。
【請求項２０】
タンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドと、
タンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドと、
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインにより転写活性が調節されるレポーター遺伝子とが導入されており、
前記タンパク質Ｘおよび前記タンパク質Ｙのうち少なくとも一方のタンパク質を構成するポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが、請求項９に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに由来するランダムオリゴヌクレオチドである、ツーハイブリッドシステム細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、大腸菌である、請求項２０に記載のツーハイブリッドシステム細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、酵母である、請求項２０に記載のツーハイブリッドシステム細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、哺乳類に由来する細胞である、請求項２０に記載のツーハイブリッドシステム細胞。
【請求項２４】
請求項９に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーと、
ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれた組換えベクターと、
転写活性化ドメインが組み込まれた組換えベクターと、
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性が調節されるレポーター遺伝子が導入された宿主細胞と、
を備える、タンパク質相互作用検出キット。
【請求項２５】
請求項３または４に記載のランダムオリゴヌクレオチドカセットを含むランダムオリゴヌクレオチドライブラリーと、
前記ランダムオリゴヌクレオチドカセットが有するライゲーション部の制限酵素認識配列に対応して連結可能な制限酵素認識配列、および、ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれた組換えベクターと、
前記ランダムオリゴヌクレオチドカセットが有するライゲーション部の制限酵素認識配列に対応して連結可能な制限酵素認識配列、および、転写活性化ドメインが組み込まれた組換えベクターと、
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性が調節されるレポーター遺伝子が導入された細胞と、
を備える、タンパク質相互作用検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質相互作用検出方法に関し、詳しくは、タンパク質同士の相互作用を効率よく見出すことができる方法に関する。また、本発明は、タンパク質相互作用検出方法において好適に用いられるランダムオリゴヌクレオチドライブラリーなどに関する。さらに、本発明は、タンパク質相互作用検出方法を応用したタンパク質検索方法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質は主要な生体構成分子であり、タンパク質とタンパク質との相互作用は、生体における代謝、シグナル伝達などの様々なプロセスにおいて不可欠なものである。また、近年のゲノム解析の進展等により、次々に新規なタンパク質が見出されている。このような状況で、タンパク質の相互作用を系統立て解析し、タンパク質の機能を解析することが、学術的のみならず、バイオテクノロジーに関わるすべての産業界において急務とされている。
【０００３】
タンパク質同士の相互作用を検出するにあたっては、まず最初の段階としてオリゴペプチドなどタンパク質の一部を用いて相互作用を検出するという手法が開発されている。例えば、次のような方法がある。
【０００４】
第１に、コンビナトリアルケミストリーを利用して様々なアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを化学合成してライブラリーを作製し、そのライブラリーに含まれるオリゴペプチドを所望のタンパク質に作用させ、オリゴペプチド−標的タンパク質の複合体を形成したものを選別する方法である。
【０００５】
第２に、オリゴペプチドを生物の膜表面に提示させたライブラリーを作製し、ライブラリーの中から所望のタンパク質と結合するものを選別する方法である。例えば、Ｍ１３ファージの外殻タンパク質とオリゴヌクレオチドとを融合させた形態でＭ１３ファージ表面に提示させて、外殻タンパク質と結合するものを選別する方法がある。また、大腸菌の鞭毛タンパク質とオリゴヌクレオチドを融合させたかたちで大腸菌表面に提示させるものもある。さらに、出芽酵母やヒューマン培養細胞系において、レセプタータンパク質にオリゴヌクレオチドを融合させた形態で細胞表面に提示させるシステムもある。
【０００６】
第３にピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）などの抗生物質を利用する方法がある。ＤＮＡから転写・翻訳を行う際に、ピューロマイシンを添加しておくことにより、ポリペプチドとそのポリペプチドをコードするＲＮＡとの複合体が生成される現象を利用した方法である。この現象を利用し、オリゴペプチド−ＲＮＡ複合体のライブラリーを作製し、このライブラリーの中から標的タンパク質と結合するオリゴペプチド−ＲＮＡ複合体を選抜する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、第１の場合のようにコンビナトリアルケミストリーを利用した方法は、現時点では化学合成しにくいアミノ酸配列パターンがあるという大きな問題がある。すなわち、化学合成されるポリペプチドの配列パターンは、あらゆるアミノ酸配列パターンを網羅できるわけではなく、また、確かめたいと考えてもそのパターンのアミノ酸配列を有するポリペプチドが得られない場合がある。また、合成を行う実験者に高い熟練度が要求されることや、費用などの点で、新たにタンパク質の相互作用を見出すために要求される大きなライブラリーを得ることが実際のところ困難である。
【０００８】
合成されにくいアミノ酸配列があるという問題点に関しては、分子生物学的手法を用いた上記の第２、第３の手法は有利である。細胞内で、あるいは生体物質を用いて試験管内で、オリゴペプチドを合成する場合、基本的にはコンビナトリアルケミストリーの場合のようなアミノ酸配列パターンの制限はない。
【０００９】
しかし、第１の方法も含めこれらの手法はいずれも、タンパク質相互作用のスクリーニングをｉｎ　ｖｉｔｒｏで行う実験系である。したがって、相互作用するペプチドをスクリーニングするためには、相互作用を調べようとする対象となるタンパク質を生理活性が保たれた状態で精製することが必須となる。さらに、生理活性が保たれた状態で試験対象タンパク質を固層に固定化し、大量なオリゴペプチドからなるライブラリーと反応させて、結合しなかったオリゴペプチドは除去し、強固に結合するオリゴペプチドを選別してこなければならない。当然ながらこれらの処理工程の間、タンパク質の活性が保たれるようにしなければならない。タンパク質の単離、精製、生理活性の維持は、煩雑で繊細な処理がつきまとう。
【００１０】
さらに、第３の手法については、オリゴペプチド−ＲＮＡ複合体を安定して生成させることがまだ難しく、ピューロマイシンの添加条件などに関し、さらに改良を加えるべき余地が大きいと考えられる。
【００１１】
ところで、オリゴペプチドを用いる場合を含め、タンパク質の相互作用を検出する手法として、ツーハイブリッドシステムが開発されている。ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（１９８９）により、酵母を用いたツーハイブリッドシステムが構築され、タンパク質相互作用の同定手法に大きな進展をもたらした。
【００１２】
酵母ツーハイブリッド系の一例を挙げ、ツーハイブリッドシステムの原理を説明する。酵母ツーハイブリッド系は、２つの分離可能な機能性ドメインを保有する多種多様な真核生物転写因子の特徴を利用する。２つのドメインのうちの一方は、シスエレメントを特異的に認識して結合するＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」と略称する場合がある）であり、他方は、転写を活性化する転写活性化ドメイン（「ＡＤ」と略称される場合がある）である。このツーハイブリッド系では、ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ｂｄまたはｌｅｘＡ）と関心のあるタンパク質「Ａ」とを含むいわゆるｂａｉｔタンパク質が酵母内で融合タンパク質として発現される。同じ酵母細胞はまた、同時に、ＤＮＡ活性化ドメイン（ＧＡＬ４ａｄまたはＶＰ１６）およびタンパク質「Ｂ」を含むいわゆるｆｉｓｈタンパク質も発現する。ｂａｉｔタンパク質とｆｉｓｈタンパク質とが相互作用すると、これらの融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが近接するようになり、その結果生じるタンパク質複合体がレポーター遺伝子（例えばＨＩＳ３またはｌａｃＺ）の発現を誘発する。この発現は、ヒスチジン不含の選択培地上での該酵母細胞の培養により、またはｌａｃＺ遺伝子の活性化により容易にモニターできる。例えば未知のｆｉｓｈタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、対応するプラスミドを単離し、続いて塩基配列分析を行うことにより容易に同定可能である。なお、ツーハイブリッドシステムにおいては、試験対象となる一方のタンパク質であって、探索の標的となるタンパク質のことを標的タンパク質、ｐｒｅｙ（プレイ：獲物）タンパク質またはｆｉｓｈ（フィッシュ）タンパク質などといい、標的タンパク質の相方となるタンパク質のことをｂａｉｔ（ベイト：餌）タンパク質ということがある。
【００１３】
さらに、ツーハイブリッド系の改変系がいくつか開発されている。生物学上の系に見られる様々な相互作用を同定、検出およびアッセイするためには、異なるツーハイブリッド系を使用しなければならないと考えられており、実際、その他のツーハイブリッド技術が発達し、タンパク質−タンパク質相互作用を別の生物体および／または異なる細胞コンパートメントの中で調査することが可能になった。
【００１４】
ツーハイブリッドシステムは、相互作用を確認しようとする供試タンパク質を用意するところからタンパク質相互作用のスクリーニング段階に至るまでを、分子生物学手法により生体内で迅速に行うことが可能であり、関心のあるタンパク質の生理活性を保持しつつ単離・精製して供試するという手間を省くことができる。さらに、ツーハイブリッドシステムは、相互作用パートナーをコードする対応する核酸配列を簡易に単離可能であるという点でも優れている。すなわち、タンパク質相互作用を検出するに当たってはツーハイブリッドシステムを利用することが、迅速性、容易さ、コストなどの点で有利であると考えられる。
【００１５】
本発明者らは、ツーハイブリッドシステムを利用し、新たなタンパク質相互作用をより一層効率よく検出するためには、相互作用を確かめようとするタンパク質（あるいはポリペプチド）の組み合わせパターンを多く用意する必要があり、そのためには如何にサイズが大きく、多様性の高い供試サンプルのライブラリーを作製するかが重要となるという着想に至った。
【００１６】
以上のような観点から、本発明は、容易で、迅速なタンパク質相互作用検出方法を提供することを課題とするものである。また、本発明は、サイズが大きく、多様性の高い、オリゴヌクレオチドライブラリーまたはオリゴペプチドライブラリーを提供することを課題とするものである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を進めたところ、ある所定の規則性に基づいた配列を有するランダムオリゴヌクレオチドを作製してランダムオリゴヌクレオチド等のライブラリーを得ることにより、配列のランダム性が高く、かつサイズの大きなオリゴヌクレオチドライブラリー等を得ることに成功し、このライブラリーに含まれるオリゴヌクレオチドをツーハイブリッドシステムの供試タンパク質として供給することにより、極めて効率よくタンパク質の相互作用を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は次の通りである。
〔１〕　コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）である塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチド。
〔２〕　コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）となるようにヌクレオチドを結合させて、ランダムな塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製する、ランダムオリゴヌクレオチド作製方法。
〔３〕　コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）である塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドの両端に、前記ランダムオリゴヌクレオチドでは出現しない塩基配列パターンの制限酵素認識配列を含むライゲーション部を有する、ランダムオリゴヌクレオチドカセット。
〔４〕　ランダムオリゴヌクレオチドの両端にあるライゲーション部がそれぞれ異種の制限酵素認識配列を含む、請求項３に記載のランダムオリゴヌクレオチドカセット。
〔５〕　コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）である塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドが組み込まれた組換えＤＮＡ。
〔６〕　コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）である塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドと、ＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドとが連結されたポリヌクレオチドが組み込まれた、組換えＤＮＡ。
〔７〕　コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）である塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドと、転写活性化ドメインをコードするポリヌクレオチドとが連結されたポリヌクレオチドが組み込まれた、組換えＤＮＡ。
〔８〕　上記〔５〕から〔７〕のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡを有する形質転換細胞。
〔９〕　上記〔１〕に記載のランダムオリゴヌクレオチド、上記〔３〕または〔４〕に記載のランダムオリゴヌクレオチドカセット、上記〔５〕から〔７〕のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ、および、上記〔８〕に記載の形質転換細胞からなる群より選ばれる１種または２種以上を含み、かつ、複数種のランダムオリゴヌクレオチドが含まれる、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリー。
〔１０〕　上記〔９〕に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに含まれる組換えＤＮＡ中のランダムオリゴヌクレオチドが発現して生成された複数のランダムオリゴペプチドが含まれる、ランダムオリゴペプチドライブラリー。
〔１１〕　コドンの第１番目および第２番目の各塩基がＧ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）またはＡのうちのいずれかであり、かつ、コドンの第３番目の塩基が、ＧまたはＣ、あるいは、ＧまたはＴ（Ｕ）となるようにヌクレオチドを結合させて、塩基配列がランダムなランダムオリゴヌクレオチドを作製する工程と、
前記ランダムオリゴヌクレオチドをベクターに組み込んで組換えベクターを作製する工程と、
前記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程と、
前記形質転換体が有するランダムオリゴヌクレオチドを発現させて、ランダムオリゴペプチドを生成せしめる工程と、
を有する、ランダムオリゴペプチドライブラリー作製方法。
〔１２〕　タンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する組換えＤＮＡおよびタンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する組換えＤＮＡを細胞内に導入し、前記細胞内でタンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体およびタンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体を発現させ、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとが相互作用する場合に前記ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性化される前記細胞内のレポーター遺伝子の転写産物を検出して、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの相互作用を検出するツーハイブリッドシステムにおいて、
タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙのうち少なくとも一方のタンパク質を構成するポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが、上記〔９〕に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに由来するランダムオリゴヌクレオチドである、タンパク質相互作用検出方法。
〔１３〕　前記レポーター遺伝子の発現量を測定して、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの結合力を測定する、上記〔１２〕に記載のタンパク質相互作用検出方法。
〔１４〕　上記〔１２〕のタンパク質相互作用検出方法におけるタンパク質Ｘまたはタンパク質Ｙのいずれか一方が受容体タンパク質またはその一部であり、他方が上記〔９〕に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに由来するランダムオリゴペプチドである、リガンドのスクリーニング方法。
〔１５〕　上記１〔１２〕のタンパク質相互作用検出方法におけるタンパク質Ｘまたはタンパク質Ｙのいずれか一方がリガンドまたはその一部であり、他方が上記〔９〕に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに由来するランダムオリゴペプチドである、受容体タンパク質の結合部位のスクリーニング方法。
〔１６〕　〔１２〕に記載のタンパク質相互作用検出方法により相互作用が検出された細胞を採取し、
タンパク質Ｘおよび／またはタンパク質Ｙをコードする塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドにより特定されるランダムオリゴペプチドのアミノ酸配列を解析し、解析されたアミノ酸配列をアミノ酸配列データベース内に予め蓄積された配列情報と比較し、
ランダムオリゴペプチドが有するアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する、相互作用タンパク質検索方法。
〔１７〕　上記〔１２〕に記載のタンパク質相互作用検出方法により相互作用が検出された細胞を採取し、
タンパク質Ｘおよび／またはタンパク質Ｙをコードするランダムオリゴヌクレオチドが有する塩基配列を解析し、解析された塩基配列を塩基配列データベース内に予め蓄積された配列情報と比較し、
ランダムオリゴペプチドが有するアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する、相互作用タンパク質検索方法。
〔１８〕　上記〔１６〕または〔１７〕に記載の相互作用タンパク質検索方法によりデータベースから検出されたタンパク質中で、当該タンパク質に含まれるランダムオリゴペプチドの位置を、当該タンパク質および当該ランダムオリゴペプチドのアミノ酸配列を対比することにより特定して、当該タンパク質の相互作用部位を特定する、タンパク質の相互作用部位特定方法。
〔１９〕　上記〔１２〕に記載のタンパク質相互作用検出方法により相互作用が検出された細胞を採取し、タンパク質Ｘおよび／またはタンパク質Ｙをコードする塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドにより特定されるランダムオリゴペプチドのアミノ酸配列を解析し、当該アミノ酸配列の一部の配列を改変するようにオリゴヌクレオチドを作製し、改変ペプチドについて再度ツーハイブリッドシステムによる相互作用検出を行い、相互作用の有無を検出して相互作用の必須配列部位を特定することを特徴とする、タンパク質相互作用検出方法。
〔２０〕　タンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドと、
タンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドと、
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインにより転写活性が調節されるレポーター遺伝子とが導入されており、
前記タンパク質Ｘおよび前記タンパク質Ｙのうち少なくとも一方のタンパク質を構成するポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが、上記〔９〕に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに由来するランダムオリゴヌクレオチドである、ツーハイブリッドシステム細胞。
〔２１〕　前記細胞が、大腸菌である、上記〔２０〕に記載のツーハイブリッドシステム細胞。
〔２２〕　前記細胞が、酵母である、上記〔２０〕に記載のツーハイブリッドシステム細胞。
〔２３〕　前記細胞が、哺乳類に由来する細胞である、上記〔２０〕に記載のツーハイブリッドシステム細胞。
〔２４〕　上記〔９〕に記載のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーと、
ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれた組換えベクターと、
転写活性化ドメインが組み込まれた組換えベクターと、
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性が調節されるレポーター遺伝子が導入された宿主細胞と、
を備える、タンパク質相互作用検出キット。
〔２５〕　上記〔３〕または〔４〕に記載のランダムオリゴヌクレオチドカセットを含むランダムオリゴヌクレオチドライブラリーと、
前記ランダムオリゴヌクレオチドカセットが有するライゲーション部の制限酵素認識配列に対応して連結可能な制限酵素認識配列、および、ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれた組換えベクターと、
前記ランダムオリゴヌクレオチドカセットが有するライゲーション部の制限酵素認識配列に対応して連結可能な制限酵素認識配列、および、転写活性化ドメインが組み込まれた組換えベクターと、
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性が調節されるレポーター遺伝子が導入された細胞と、
を備える、タンパク質相互作用検出キット。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を、１．ランダムオリゴヌクレオチド、２．ランダムオリゴヌクレオチドカセットおよび組換えＤＮＡ等、３．ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーおよびランダムオリゴペプチドライブラリー、４．タンパク質相互作用の検出方法およびその応用、５．タンパク質相互作用検出キットの順に説明する。なお、本発明における遺伝子工学的な処理、例えば、プラスミド、ＤＮＡ断片、種々の酵素、形質転換体の作製、形質転換体の選抜などを扱う諸操作については、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ，　Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８９、ＣＯＬＤ　ＳＰＲＩＮＧ　ＨＡＲＢＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＰＲＥＳＳ等の既知の実験マニュアルを採用することができる。
【００２０】
１．ランダムオリゴヌクレオチド
本発明のランダムオリゴヌクレオチドは、その一本鎖の配列が、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に示されるオリゴヌクレオチドである（図１、２）。本明細書では、「オリゴヌクレオチド」における「オリゴ」とは、生体内などに存在する大型のタンパク質（ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドのような大きな分子量のポリヌクレオチドに比べ、化学的に合成できる程度の小さい分子量であることを意味する。したがって本明細書において「オリゴ」の語句は、数値的に明確に限定されるものではないが、概算的には、アミノ酸数として１〜５０個のポリペプチドまたは塩基数として３〜１５０ｂのヌクレオチド程度の大きさを意味する。どのようなサイズのオリゴペプチドを作製するかは、上記のような範囲を目安に、適宜目的に応じて定めることができる。なお、「ポリヌクレオチド」とは、２以上のヌクレオチドを有する分子であり、オリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドの一形態に含まれる。また、「ポリペプチド」とは、２以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合した分子であり「ポリペプチド」とは、２以上のペプチド結合を有する分子である。「オリゴヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドの一形態に含まれる。
【００２１】
また、「オリゴヌクレオチド」という場合、修飾されていないＲＮＡ、ＤＮＡの他、修飾されたＲＮＡ、ＤＮＡを含む。「修飾された」とは、１又は２以上の塩基がいわゆる修飾塩基であることいい、例えば、メチル体、含硫誘導体、脱アミノ誘導体、アデノシン誘導体などの塩基誘導体が含まれる。また、「オリゴヌクレオチド」は、アンチセンス鎖（ｍＲＮＡに対して相補的な関係にある鎖）、コード鎖のいずれでもよい。また、「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、さらにＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれか一方からなる三本鎖領域、または、ＲＮＡとＤＮＡの双方を含む三本鎖領域を有していてもよい。
【００２２】
一般式（Ｉ）または（ＩＩ）において、「Ｎ」は、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グリシン）またはＴ（Ｕ）から選ばれる塩基である。「Ｔ（Ｕ）」は、ＤＮＡであればＴ（チミン）が該当し、ＲＮＡであればＵ（ウラシル）が該当する。また、「Ｋ」は、ＧまたはＴ（Ｕ）のいずれか一方である。「Ｓ」はＧまたはＣのいずれか一方である。
【００２３】
一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に示されるように、本発明のランダムオリゴヌクレオチドは、コドンの１番目、２番目の塩基としてＮで表される塩基が配列されており、コドンの３番目の塩基として、Ｋが配置される場合と、Ｓが配置される場合の２形態がある。「ｘ」は、１または２以上の整数を示す。すなわち、本発明のランダムオリゴヌクレオチドは、図１および図２に示される模式配列のように、（ＮＮＫ）または（ＮＮＳ）の繰り返し配列を有するヌクレオチド分子である。図１中、模式配列に示される配列上部の▲１▼〜▲３▼の数値はコドンの第１〜３番目を示す。
【００２４】
一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に示されるような規則性を有する配列により、コドンによりコードされる２０種のアミノ酸はすべて網羅される。また、コドンには縮重があるが、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）に示されるような規則性に基づいて配列することにより、重複するコードの数を減らすことができる。すなわち、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で示されるような規則性なしにランダムに合成する場合よりも、個々のアミノ酸の出現頻度を均等化することができる。そのため、オリゴヌクレオチドがコードするアミノ酸配列パターンが多様化しやすく、確率的にランダム性の高いオリゴヌクレオチドを得やすい。重複するコードを減らせる例としては、アルギニン（Ａｒｇ）には６種の対応コドンがあるが、本発明の場合、３種の対応コドンしか現れない。したがって、オリゴヌクレオチドを合成する場合に、アルギニンの現れる確率を縮重の少ないアミノ酸の現れる確率に近づけることができる。さらに、このような配列を有するランダムオリゴヌクレオチドが複数集合して形成されるライブラリーも、対応するアミノ酸配列のパターンについてランダム性の高い複数種の分子を含む集合とすることができる。
【００２５】
さらに、本発明者らは、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される配列は、特定の制限酵素の認識配列が現れないことを見出した。本発明のランダムオリゴヌクレオチドを遺伝子工学的に何らかの加工、処理等を施す場合、本発明のランダムオリゴヌクレオチド配列中には制限酵素認識配列がないような酵素を用いることにより、処理中に所定のランダムオリゴヌクレオチドを切断し、ランダムオリゴヌクレオチドを損失してしまうことを抑制することができる。一般式（Ｉ）の配列では認識部位がないような制限酵素の例を表１に、一般式（ＩＩ）の配列では認識部位がないような制限酵素の例を表２にそれぞれ示す。
【００２６】
【表１】
2004024078.tif 000002
【００２７】
【表２】
2004024078.tif 000003
【００２８】
一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で示されるように複数のオリゴヌクレオチドを作製すると、ＴＡＧという停止コドンが生じ得るが、ＴＡＧという配列が不規則に生じることにより、オリゴペプチドの長さの点でもランダム性の高いオリゴヌクレオチドのライブラリーを作製することができる。
【００２９】
一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で示されるランダムオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成装置などを用いて、化学合成により作製することができる。「ＮＮＫ」または「ＮＮＳ」のように規則的な配列を有する分子を作製するには、４種のヌクレオチド分子を含む試薬貯蔵タンクと、２種のヌクレオチド分子を含む試薬貯蔵タンクとを用意し、コンピュータ制御により「Ｎ」の位置にヌクレオチド分子を結合させる際には４種のヌクレオチド誘導体を含む試薬貯蔵タンクから試薬を供給し、「Ｋ」または「Ｓ」の位置にヌクレオチド分子を結合させる際には２種のヌクレオチド誘導体が含まれる試薬貯蔵タンクから試薬を供給し、五炭糖の３’と５’との間をリン酸ジエステル結合することを繰り返し、ＤＮＡ鎖を合成伸長していけばよい。また、ＲＮＡを作製する場合には、ＤＮＡを鋳型とすれば、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の規則性を有するＲＮＡを作製することができる。ランダムオリゴヌクレオチドの長さは、目的等に応じて適宜調節可能である。
【００３０】
２．ランダムオリゴヌクレオチドカセットおよび組換えＤＮＡ等
本発明のランダムオリゴヌクレオチドカセットは、上記本発明のランダムオリゴヌクレオチドの両端に、ライゲーション部を備えたものである。本明細書において「ライゲーション部」とは、ランダムオリゴヌクレオチドを他のポリヌクレオチドとライゲーションするための配列を有するポリヌクレオチドであり、リンカー、アダプター、ホモポリマーなどのいずれでもよい。本発明においては、ライゲーション部の配列には、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）には現れない塩基配列で構成される制限酵素認識配列が含まれるようにする。このようなライゲーション部を両端に備えることにより、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドを切断してしまうことなく、制限酵素等を用いて容易にベクターなどに組み込むことができる。なお、制限酵素認識配列は、切断されていない状態に相当する配列を備えていても、また切断された状態に相当する配列を備えていても、本発明のカセットである。
【００３１】
具体例を挙げれば、ライゲーション部は、一般式（Ｉ）の配列を有するランダムオリゴヌクレオチドに対しては表１に例示された制限酵素認識配列を内在するようにして作製することができ、一般式（ＩＩ）のランダムオリゴヌクレオチドに対しては表２に例示された制限酵素認識配列を内在するようにして作製することができる。なお、表１および２中、黒三角で示す部分は切断箇所を示す。
【００３２】
また、ランダムオリゴヌクレオチドカセットを作製する場合には、ランダムオリゴヌクレオチドを合成する際に、ランダム配列部分と共に最初から制限酵素認識配列が付加して作製することが好ましい。プラスミドなどのベクターに組み込むことを予定する場合には、一本鎖のランダムオリゴヌクレオチドを合成し、これを鋳型として相補的な鎖を合成して二本鎖とする。このようにして、両端には所定のライゲーション部が備えられるので、ライゲーション部に含まれる制限酵素認識配列を認識する制限酵素を用いて所定の末端を形成し、ベクターなどに組み込むことができる。
【００３３】
ランダムオリゴヌクレオチドの両端に備えられるライゲーション部の種類を異なるものとすることにより、組換えＤＮＡを作製する際に、ランダムオリゴヌクレオチドの配列の向きを特定することができる。より具体的には、制限酵素認識配列の配列または切断仕様が異なるライゲーション部をそれぞれオリゴヌクレオチドの一端に設け、切断した際の末端の形状、付着末端の場合には突出部の配列が異なるように形成する。
【００３４】
ランダムオリゴヌクレオチドカセットの作製から組換えＤＮＡの作製までについて、より具体的な例を図３に示す。図３中、「Ｎ」に相補的な塩基を「ｎ」と、「Ｋ」に相補的な塩基を「ｋ」として示す。まず、ランダムオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置で作製する。この際、［（ＮＮＫ）ｘ］で示されるランダム配列部分の両端には、ライゲーション部としてリンカーとなる配列が既に設計されて付加されている。また３’末端側は、プライマーを兼ねるようにポリＡが付加された配列となっている。
【００３５】
合成された一本鎖を二本鎖にするためのプライマーも別途合成する。このプライマーは、ランダムオリゴヌクレオチドの３’側のポリＡ部に相補的にポリＴを有するＤＮＡ断片である。
【００３６】
合成されたランダムオリゴヌクレオチドとプライマーとをアニーリングして二本鎖を形成させ、ＤＮＡポリメラーゼ　Ｉ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー部から相補的な配列を伸長させて、二本鎖のランダムオリゴヌクレオチドカセットが得られる。図３上、左側のライゲーション部には、Ｂｇｌ　ＩＩの制限酵素認識配列が含まれており、イタリックで表示している。また、図３上、右側のライゲーション部には、Ｄｒａ　Ｉの制限酵素認識配列が含まれており、同様にイタリックで表示している。
【００３７】
得られたランダムオリゴヌクレオチドカセットを、プラスミドベクターｐＴＲＧ２のクローニングサイトに組み込む。ｐＴＲＧ２は、Ｂａｍ　ＨＩおよびＳｍａ　Ｉの認識部位を備えるように加工しておく。ｐＴＲＧ２をＢａｍ　ＨＩおよびＳｍａ　Ｉで処理し、他方、ランダムオリゴヌクレオチドカセットは、Ｂｇｌ　ＩＩおよび　Ｄｒａ　Ｉで処理し、所定の向きに、組み込むことができる。Ｂｇｌ　ＩＩ　および　Ｄｒａ　Ｉは［（ＮＮＫ）ｘ］で示されるＤＮＡを切断しないので、組換えＤＮＡを作製するためにランダムオリゴヌクレオチドを損失することがない。
【００３８】
本明細書において組換えＤＮＡとは、２種以上のＤＮＡ同士が連結されたハイブリッド分子のことである。本発明の組換えＤＮＡの好ましい形態としては発現ベクターが挙げられる。発現ベクターは様々な形態のものが既に知られており、また市販されているものもある。本発明では組換えＤＮＡの形態は、用途などに応じて適宜選択してよく、市販の発現ベクターなど公知の発現ベクターを用いることができる。下記に限定されるものではないが発現ベクターに関連する具体例を示す。
【００３９】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３、市販品としてｐＢＴ　Ｖｅｃｔｏｒ，　ｐＴＲＧ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）など）、酵母由来プラスミド（例、ＹＥｐ２４，ＹＣｐ５０など）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス、枯草菌に好適に用いられるプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４など）などの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
【００４０】
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主細胞がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主細胞が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが挙げられる。また、動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
【００４１】
発現ベクターは、組換え操作についての扱いやすさの観点からマルチクローニングサイトを有することが好ましい。また、以上の他に、発現ベクターには、所望により選択マーカー、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）、ターミネーターなどを組み込むことができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（カルベジニシリン耐性遺伝子ともいわれる。以下、ＡｍｐＲと略称する場合がある）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（以下、ＣａｍＲと略称する場合がある）、テトラサイクリン耐性遺伝子（以下、ＴｅｔＲと略称する場合がある）、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、ＮｅｏＲと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。また、必要に応じて、宿主細胞に合ったシグナル配列を、本発明のランダムオリゴヌクレオチドまたはカセットのＮ端末側に付加する。宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主細胞がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主細胞が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主細胞が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、Ｒａｓファルネシル化・シグナル配列などをそれぞれ利用できる。
【００４２】
上記のようにランダムオリゴヌクレオチドを有する発現ベクターを作製し、これを宿主細胞に導入し、ランダムオリゴヌクレオチドでコードされたランダムオリゴヌクレオチドを発現する形質転換体を作製することができる。
【００４３】
宿主細胞としては、例えば、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌細胞；酵母、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌細胞；ドロソフィラＳ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｓ２）およびスポドプテラＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　Ｓｆ９）などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ボウズ（Ｂｏｗｓ）黒色腫細胞および血球系細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。
【００４４】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら、ＢＡＳＩＣ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）のような、多くの標準的な実験マニュアルに記載される方法により行うことができる。より具体的には、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、バイオリスティック導入（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ法）または感染等がある。
【００４５】
形質転換体の培養は、宿主の種類等に応じて調節して行えばよい。宿主の種類は多数に上るが、いくつかの具体例を挙げると次の通りである。例えば、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地は液体培地でも寒天培地でもよく、その中には形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を配合する。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機塩としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の好適な培地として具体的には、酵母エキス、トリプトン、塩（ＮａＣｌ）を含むＬＢ培地などが例示される。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドのような誘導剤を添加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。
【００４６】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地、０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地などが挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００４７】
また、宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，　Ｎａｔｕｒｅ、１９５、７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００４８】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９巻、５１９（１９６７））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７３巻、１（１９５０））などが用いられる。ｐＨは約６〜８であることが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。また必要に応じて、ＣＯ２濃度の調節を行う。
【００４９】
以上のようにして、形質転換体に、ランダムオリゴヌクレオチドに対応したランダムオリゴポリペプチドを生成させることができる。
【００５０】
３．ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーおよびランダムオリゴペプチドライブラリー
本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーは、複数種のランダムオリゴヌクレオチドが含まれる集合体である。ライブラリーの形態には特に制限はなく、ランダムオリゴヌクレオチド、ランダムオリゴヌクレオチドカセット、ランダムオリゴヌクレオチドを有する組換えＤＮＡ、この組換えＤＮＡにより形質転換された形質転換体のいずれの形態であってもよく、これらの１種によりランダムオリゴヌクレオチドの集合が構成されていても２種以上が混合されて集合が構成されていてもよい。
【００５１】
上記のように、本発明のランダムオリゴヌクレオチドは、所定の規則性を持って作製されており、その集合体は様々な塩基配列パターンのオリゴヌクレオチドを含み、集合体としてのランダム性は高い。また、作製するランダムオリゴヌクレオチドの長さにもよるが、上記のように本発明のランダムオリゴヌクレオチドは合成装置により自動的に合成可能である。すなわち、オリゴヌクレオチドの種類の多さ、オリゴヌクレオチドの量などについてライブラリーサイズの大きなものを容易に作製することができる。
【００５２】
本発明のオリゴペプチドライブラリーは、形質転換体で構成されるランダムオリゴヌクレオチドライブラリーを用い、当該ライブラリーに含まれている各形質転換体内で、オリゴヌクレオチドを発現させることにより得ることができる。上記ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーのランダム性が高く、またアミノ酸の出現頻度を均等化されているため、本発明のランダムオリゴペプチドライブラリーのランダム性も高いものとすることができる。また、適切な形質転換体を作製することにより、オリゴペプチドの発現量を多くすることが可能である。すなわち、オリゴペプチドの種類の多さ、オリゴペプチドの量などについてライブラリーサイズの大きなものを容易に作製することができる。
【００５３】
本発明のランダムオリゴペプチドライブラリーは、複数種のランダムオリゴペプチドを含んでいれば、特に形態には制限はない。上記のように、形質転換体を作製し、ランダムオリゴヌクレオチドを発現させた培養物の形態でもよいし、培養物からランダムオリゴペプチドを必要に応じて精製してもよい。
【００５４】
培養物からランダムオリゴペプチドを分離・精製するには、例えば、次のような方法により行なうことができる。オリゴペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、既知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標）などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にオリゴペプチドが分泌される場合には、培養終了後、既知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、既知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。
【００５５】
これらの既知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００５６】
また、ランダムオリゴペプチドライブラリー中に含まれるオリゴペプチドは、既知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができる。また、形質転換体が産生するオリゴペプチドを、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、オリゴペプチドを部分的に除去してもよい。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどを用い得る。オリゴペプチドまたはその塩の存在あるいは活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチドライブラリー、オリゴペプチドライブラリーは、Ｍ１３ファージの外殻タンパク質を利用したライブラリー作製、大腸菌の鞭毛タンパク質を利用したライブラリー作製、出芽酵母やヒューマン培養細胞系においてレセプタータンパク質を利用したライブラリー作製、ピューロマイシンを利用した系に於けるライブラリー作製など様々な生物化学的なライブラリーの構築に利用することができる。また、下記に、本発明のライブラリーの特に好適な用途となる、ツーハイブリッドシステムを利用したタンパク質相互作用検出方法について説明する。
【００５８】
４．タンパク質相互作用の検出方法およびその応用
以下、上記の本発明のランダムオリゴヌクレオチドライブラリーまたはランダムオリゴペプチドライブラリー（第「４．」章において「ランダムライブラリー」と略称する）を活用したタンパク質相互作用検出方法等について説明する。
【００５９】
本発明のタンパク質相互作用検出方法は、ツーハイブリッドシステムにおいて、相互作用を調査しようとする少なくとも一方のタンパク質として、上記本発明のランダムライブラリーに含まれるランダムオリゴペプチドを供試するものである。すなわち、上記本発明のランダムライブラリーの中から、タンパク質相互作用を生じ得るオリゴペプチドを検索する。本発明のランダムライブラリーは、ランダム性が高く、大きなライブラリーとすることができるため、極めて多種多様な配列パターンのポリペプチドについて相互作用の有無を検出可能であり、新規な相互作用関係を見出す可能性が高い方法である。
【００６０】
「タンパク質相互作用」というが、本明細書においては、「タンパク質−タンパク質相互作用」、「ポリペプチド−タンパク質相互作用」、「ポリペプチド−ポリペプチド相互作用」のいずれの形態も含まれる。また、「ポリペプチド」の語句にはオリゴヌクレオチドが含まれることは上記の通りである。なお、「タンパク質相互作用検出方法」のことを「相互作用検出方法」と略称する場合がある。
【００６１】
本発明の相互作用検出方法では、タンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する組換えＤＮＡおよびタンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する組換えＤＮＡを細胞内に導入し、前記細胞内でタンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体およびタンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体を発現させ、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとが相互作用する場合に前記ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性化される前記細胞内のレポーター遺伝子の転写産物を検出して、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの相互作用を検出するツーハイブリッドシステムを用いる。
【００６２】
図４に示す一例に沿って、ツーハイブリッドシステムについてより具体的に説明する。ツーハイブリッドシステムは、転写調節因子内に２つのドメインがあり、その機能発現のためには２つのドメインが結合している必要があるが、その結合は、ドメイン間に他のタンパク質などを挟んでいても機能し得るという性質を利用したものである。ツーハイブリッドシステムは、標的となるタンパク質を単離・精製する手間を要せず、生体内の生理条件下でタンパク質相互作用を確認できるという特性を有する。
【００６３】
図４に示す例では、相互作用を確認しようする２種のタンパク質ペアのうちの一方をタンパク質Ｘ、他方をタンパク質Ｙという。本明細書において、タンパク質Ｘとは、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」と略称する場合がある）と複合体を形成するように設計されているほうのタンパク質またはポリペプチドをいう。タンパク質Ｙとは、転写活性化ドメイン（「ＡＤ」と略称する場合がある）と複合体を形成するように設計されているほうのタンパク質またはポリペプチドをいう。ツーハイブリッドシステムでは、一方のタンパク質をｂａｉｔタンパク質といい、所定のｂａｉｔタンパク質に結合し得るタンパク質を探索する場合、新たに見出そうとしているほうのタンパク質を標的（Ｔａｒｇｅｔ）タンパク質という場合がある。本発明においては、上記タンパク質ＸおよびＹのどちらが、ｂａｉｔタンパク質または標的タンパク質であってもよい。
【００６４】
ツーハイブリッドシステムでは、これらタンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙが発現するような発現系を構築する。図４に示す例では、発現系を構成する組換えベクターであるｐＸベクターおよびｐＹベクターにはプラスミドベクターを用いている。ｐＸベクターにはタンパク質ＸをコードするＤＮＡ（ｐＸベクター中「ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｘ」と表示）が組み込まれ、他方、ｐＹベクター中にはタンパク質ＹをコードするＤＮＡ（ｐＹベクター中「ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｙ」と表示）が組み込まれている。ｐＸベクターには、さらにＤＢＤをコードするＤＮＡが組み込まれており、発現時に、タンパク質Ｘ−ＤＢＤ複合体が生成されるように設計される。他方、ｐＹベクターには、さらにＡＤをコードするＤＮＡが組み込まれており、発現時にタンパク質Ｙ−ＡＤ複合体を形成するように設計される。これらのベクターは、上記「２．」章で説明した、本発明の組換えＤＮＡと同様の構成、すなわち、プラスミド等の組換え体の種類、プロモーター、選択マーカーなど、発現ベクターとして用いられる種々の構成を採用することができる。
【００６５】
これらの発現ベクターをレポーター遺伝子を保有する所定の宿主細胞に導入する。宿主細胞にはレポーター遺伝子が導入されている。レポーター遺伝子は、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとが相互作用を生じた場合に、それを検出するために組み込まれている遺伝子である。レポーター遺伝子はＡＤが基本転写装置を活性化することにより発現する。レポーター遺伝子は宿主細胞内で、プラスミドのように独立的に存在していても、染色体ＤＮＡに組み込まれていてもよい。レポーター遺伝子を保有する宿主細胞も、上記「２．」の章で例示した宿主細胞を採用することができ、好ましくは、酵母細胞、大腸菌細胞、哺乳動物細胞などを用いることができる。
【００６６】
レポーター遺伝子は、少なくともレポーター遺伝子が転写されたことを示すｍＲＮＡ、タンパク質などの転写産物を、直接または間接的に検出できるものであれば特に制限はない。すなわち、視覚的検査、放射活性、化学発光、蛍光、光度、分光、赤外線、比色、共鳴検出などの周知の方法により、定性的または定量的にレポーター遺伝子の発現を検出できるものであればよい。レポーター遺伝子としては、発現ベクターに選択マーカーとして用いられる各種の耐性遺伝子や酵素遺伝子等を用いることができる。
【００６７】
ｐＸベクターとｐＹベクターとが宿主細胞内で発現すると、タンパク質Ｘ−ＤＢＤ複合体とタンパク質Ｙ−ＡＤ複合体とが生成する。ＤＢＤはＤＢＤ結合部位に結合する。すると、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとが相互作用する場合、「ＤＢＤ−タンパク質Ｘ−タンパク質Ｙ−ＡＤ複合体」が形成される。ＡＤが基本転写装置を活性化して、レポーター遺伝子が発現する。レポーター遺伝子の発現の有無により、相互作用の有無を確認することができる。
【００６８】
本発明の相互作用検出方法では、上記のようなｐＸベクター、ｐＹベクター、レポーター遺伝子を有する宿主細胞として、周知または市販されている発現ベクター、宿主細胞等を用いることができる。また、近年、酵母、大腸菌などを用いたツーハイブリッドシステムのキットが市販されており、これらを用いることもできる。また、公知のＤＢＤ、ＡＤを用いてｐＸベクター、ｐＹベクターを作製することもできる。
【００６９】
本発明の相互作用検出方法では、タンパク質ＸおよびＹのうち少なくともいずれか一方に該当するものとして、上記本発明のランダムライブラリーに由来するランダムオリゴペプチドを用いる。すなわち、タンパク質ＸおよびＹの組み合わせとしては、次の２種の相互作用検出形態が挙げられる。
【００７０】
（ｉ）ランダムオリゴペプチド−任意のタンパク質
（ｉｉ）ランダムオリゴペプチド−ランダムオリゴペプチド
タンパク質ＸまたはＹのうち一方のみをランダムオリゴペプチドとする場合、タンパク質ＸとＹのどちらにランダムオリゴペプチドを割り当てるかは任意である。
【００７１】
ツーハイブリッドシステムにおいては、タンパク質の相互作用を調べるため、そのタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込む。すなわち、タンパク質ＸまたはＹのうちの少なくとも一方のタンパク質を構成するポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを作製する。このようなポリヌクレオチドとして、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに含まれるランダムオリゴヌクレオチドを用い、発現ベクターに載せて所定の細胞内で発現させて、対応するランダムオリゴペプチドの相互作用を検出する。本発明のランダムライブラリーには、複数種のオリゴヌクレオチドが含まれているため、相互作用を検出する組み合わせパターンとしては、
（ａ）「１つのランダムオリゴヌクレオチドに対応するランダムオリゴペプチド」−「１つの任意タンパク質」
（ｂ）「複数種のランダムオリゴヌクレオチドに対応する複数種のランダムオリゴペプチド」−「１つの任意タンパク質」
（ｃ）「１つのランダムオリゴヌクレオチドに対応する複数種のランダムオリゴペプチド」−「複数種の任意タンパク質」
（ｄ）「複数種のランダムオリゴヌクレオチドに対応する複数種のランダムオリゴペプチド」−「複数種のランダムオリゴヌクレオチドに対応する複数種のランダムオリゴペプチド」
という組み合わせが挙げられる。
【００７２】
本発明のランダムライブラリーは、ランダム性が高く、サイズの大きいものを容易に作製できる。また、ツーハイブリッドシステムは、タンパク質の相互作用について、タンパク質を直接単離・精製する手間を要せず、遺伝子組換え操作の通常のプラクティスレベルで実施可能である。したがって、本発明のランダムライブラリーを用いたツーハイブリッドシステムにより、極めて多様な数多くの分子ペアについての情報を容易に得ることができる。さらに、レポーター遺伝子を保有する宿主として大腸菌を用いると、極めて短時間に結果を出すことができる。大腸菌を宿主とした場合、増殖時間が１日と短期間であり、全体として約７〜１０日程度で１サイクルの実験を完了させることが可能である。また、大腸菌を宿主とした場合、１サイクルに要する時間が短いことや、大腸菌の取り扱いが容易なことから、上記（ａ）〜（ｄ）で挙げた組み合わせパターンの実験を同時に２、３種類、また日程をずらすことによりさらに２、３種随時行っていくことが可能である。すなわち、本発明のタンパク質相互作用検出方法は、短期間に極めて多くのタンパク質ペアについてその相互作用の有無を確認が可能であり、新規なタンパク質ペアを見いだすことができる可能性が高い方法である。
【００７３】
ツーハイブリッドシステムでは、ＤＢＤとＡＤとの間に２種のタンパク質を介在させてＡＤが基本転写装置を活性化する。しかし、ＡＤがうまく基本転写装置を活性化させる位置に配置されないと、タンパク質の相互作用が生じていてもレポーター遺伝子が発現しないという偽陰性を生じることがあり得る。このような場合には、ＤＢＤ結合ドメインと基本転写装置との距離を調節することにより解決できる場合がある。または、タンパク質Ｘ−ＤＢＤ複合体におけるタンパク質ＸとＤＢＤの連結部位、あるいはタンパク質Ｙ−ＡＤ複合体におけるタンパク質ＹとＡＤの連結部位の長さを調節することによっても、偽陰性の発生を抑制できる場合がある。この連結部位の調製は、タンパク質Ｘ−ＤＢＤ複合体を例にすると、組換えＤＮＡに組み込む際に、一つの転写単位領域内でＤＢＤとタンパク質Ｘとの距離を調節することにより行うことができる。
【００７４】
また、本発明の具体的な実施形態例として、一方のタンパク質として、既知の受容体タンパク質を用い、この受容体タンパク質に結合するタンパク質を探索するという形態が挙げられる。すなわち、既知の受容体タンパク質をｂａｉｔタンパク質として用い、本発明のランダムライブラリー由来のオリゴペプチドを標的タンパク質とし、ランダムライブラリーの中から当該受容体タンパク質に結合するリガンドを探索する。受容体タンパク質の結合部位が既知の場合、その部分だけを用いることもできる。なお、本明細書において「受容体タンパク質」は、各種の生体物質、薬品を特異的に認識し、その作用を伝達し発現するタンパク質であり、細胞内受容体、細胞膜上受容体、ホルモン受容体などを広く含む。
【００７５】
また、既にリガンドとして知られているタンパク質分子がある場合、これが結合し得る新たな受容体を探索する形態も挙げられる。すなわち、リガンドまたはその一部をｂａｉｔタンパク質として用い、本発明のランダムライブラリー由来のオリゴペプチドの中から、リガンドに結合するものを探索する。この場合、リガンドに結合するオリゴペプチドは、その大きさからして受容体タンパク質の一部である結合部位を構成している可能性が高い。
【００７６】
受容体タンパク質の機能が既に明らかな場合、この受容体タンパク質に結合するリガンドは、アゴニスト候補またはアンタゴニスト候補となる。本発明の相互作用検出方法により見いだしたアゴニスト候補およびアンタゴニスト候補から、アゴニスト、アンタゴニストをスクリーニングするには、標識リガンド結合の阻害を測定する方法、細胞性応答を定量的にアッセイする方法など、既知の方法に従って行うことができる。
【００７７】
本発明の相互作用検出方法により見いだされた新たな相互作用分子ペアの同定は、例えば、発現ベクター内の所定の塩基配列部分をＰＣＲで増幅し、単離・精製して塩基配列を同定する、発現したポリペプチドを単離・精製して分析するなど、形質転換体を用いた遺伝子工学的実験において行われる、塩基配列やアミノ酸配列の解析、分析手法に従って行うことができる。
【００７８】
また、本発明のタンパク質相互作用の他の実施形態としては、レポーター遺伝子の発現量を測定して、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの結合力を測定することもできる。すなわち、発現量を定量的に測定し、その量をタンパク質ＸとＹとの結合力の指標とする。この場合、レポーター遺伝子はその発現が定量的に測定しやすいものを選ぶことが好ましい。例えば、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリフォスファターゼなどが挙げられる。定量法は周知の方法を用いればよい。
【００７９】
さらに、本発明は、上記のタンパク質相互作用検出方法により検出されたタンパク質ペアに基づき同定したり、さらに他の相互作用の組み合わせをコンピューター検索により見いだす方法を提供する。すなわち、上記のタンパク質相互作用検出方法により相互作用が検出された細胞を採取し、タンパク質Ｘおよび／またはタンパク質Ｙをコードする塩基配列を有するランダムオリゴヌクレオチドにより特定されるランダムオリゴペプチドのアミノ酸配列を解析し、解析されたアミノ酸配列をアミノ酸配列データベース内に予め蓄積された配列情報と比較して、ランダムオリゴペプチドが有するアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する。あるいは、上記タンパク質相互作用検出方法により相互作用が検出された細胞を採取し、タンパク質Ｘおよび／またはタンパク質Ｙをコードするランダムオリゴヌクレオチドが有する塩基配列を解析し、解析された塩基配列を塩基配列データベース内に予め蓄積された配列情報と比較し、ランダムオリゴペプチドが有するアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する。
【００８０】
本発明の相互作用検出方法では、タンパク質ペアの一方にランダムオリゴペプチドが用いられるため、分子の大きさに鑑みると、オリゴペプチドが生体内において天然に存在するリガンドまたは受容体などの機能性タンパク質の一部分を構成する分子である場合が考えられる。このような場合、ランダムオリゴペプチドまたはランダムオリゴヌクレオチドの配列を既知の配列データベースで検索することにより、そのペプチドまたはヌクレオチドを含む全体像、あるいはそのファミリーを見いだすことが可能である。データベースは、少なくともアミノ酸配列または塩基配列について対比解析できるものであればよい。このようなデータベースには、通常、ホモロジー解析など検索のためのソフトウエアが備わっている。公開されているデータベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＪＢ、ＳＷＩＳＳ−ＰＯＲＴ、ＴｒＥＭＢＬ、ＰＩＲなど多数存在する（実験医学　増刊　ｐ１６−２０，　　Ｖｏｌ．１９−Ｎｏ．１１，　２００１など参照）。
【００８１】
さらに、上記のようにデータベースに基づく解析により、タンパク質の相互作用部位を特定することもできる。すなわち、上記のようにして相互作用タンパク質検索方法により、データベースから検出されたタンパク質中で、当該タンパク質に含まれるランダムオリゴペプチドの位置を、当該タンパク質および当該ランダムオリゴペプチドのアミノ酸配列を対比することにより特定して、当該タンパク質の相互作用部位を特定する。
【００８２】
また、相互作用することが見出されたランダムオリゴペプチドの配列の一部を改変し、同じｂａｉｔタンパク質に対して改変したランダムオリゴペプチドが相互作用をするか否かについて、再度ツーハイブリッドシステムによる検出を行うことにより、相互作用に必須となる配列部位をより詳細に特定することもできる。ランダムオリゴペプチドの配列の一部を改変するには、ランダムオリゴペプチドの配列をコードする塩基配列の一部を変更してオリゴヌクレオチドを作製すればよい。改変したオリゴヌクレオチドを作製する際も、一般式（ＮＮＫ）または（ＮＮＳ）に従って作製することが望ましい。塩基配列を改変したオリゴヌクレオチドをツーハイブリッドシステムにおける標的タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドとしてＴａｒｇｅｔベクターに組み込み、改変前のオリゴペプチドが相互作用するタンパク質をｂａｉｔとしてツーハイブリッドシステムによる相互作用検出を行う。改変したオリゴヌクレオチドを多種作製し、一度に多種の改変配列について、ツーハイブリッドシステムによる検出を行うこともできる。相互作用することが確認されれば、改変前の配列部位は相互作用に必須ではない蓋然性が高いといえる。他方、相互作用しないことが確認されれば、改変前の配列部位は相互作用に必須の部位である蓋然性が高いといえる。
【００８３】
次に、図５から図７に沿い、本発明のツーハイブリッドシステムのさらに別の具体的な形態例について説明する。図５に示すように、ｐＢＴベクターには、ＤＢＤであるλｃＩタンパク質遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣａｍＲ）が組み込まれている。ｐＢＴベクターのマルチクローニングサイトにｂａｉｔとなるタンパク質をコードするＤＮＡを組み込む。他方、ｐＴＲＧベクターには、ＡＤであるＲＮＡＰα、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｅｔＲ）が組み込まれている。このｐＴＲＧベクターのマルチクローニングサイトに、本発明のオリゴヌクレオチドライブラリーから選ばれたポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込む。オリゴペプチドライブラリーから複数種のポリペプチドを供給し、複数種のｐＴＲＧベクターを作製する。これらのｐＢＴベクターおよびｐＴＲＧベクターをレポーター遺伝子を保有している大腸菌株に導入して形質転換体を作製する。本例では、レポーター遺伝子としてカルベニシリン耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）を用いる。
【００８４】
得られた複数種の形質転換体をテトラサイクリン、クロラムフェニコールおよびカルベニシリンを含有する培地に塗抹して培養する。基本的には、生存してコロニーを形成していれば、テトラサイクリンなど上記３種に対して耐性を有することを示すが、精度を上げるために、３種の耐性を有することが予め確認されている菌株をポジティブクローンとして培養し、ポジティブクローンにより形成されるコロニーの大きさを比較することが好ましい。このようにしてポジティブクローンとほぼ同等の大きさを形成したコロニーがテトラサイクリン等の上記３種の耐性を有すると考えられる形質転換体により形成されたものと判別することができる。テトラサイクリン等の上記３種の耐性を有するということは、ｂａｉｔタンパク質およびオリゴペプチドが相互作用をしたことを示す。生存株によるコロニーが形成されたこのプレートをマスタープレートとする。
【００８５】
コロニーごとに別々に、形質転換体からオリゴペプチドが組み込まれているｐＴＲＧベクターをＤＮＡとして精製するために、さらにテトラサイクリンを含む培地で培養を繰り返し、形質転換体からｐＢＴベクターを脱落させてテトラサイクリン耐性のみを有する菌株を作製する。生存した菌株からｐＴＲＧベクターを精製し、別の汎用大腸菌株に再度導入してテトラサイクリン耐性形質転換体を作製する。このテトラサイクリン耐性形質転換体をテトラサイクリン含有培地で培養すると共に、クロラムフェニコール含有培地でも別個に培養を行う。テトラサイクリン耐性を有し、かつ、クロラムフェニコール感受性を有する菌株が、ｐＢＴベクターを含まずｐＴＲＧベクターを含む形質転換体である。このようにして、ｂａｉｔタンパク質と相互作用したオリゴペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターのみを含む形質転換体を単離することができる。
【００８６】
このようにして得られた形質転換体から、オリゴペプチドが組み込まれているｐＴＲＧベクターを精製する。これをｐＢＴベクターと共に、再度レポーター遺伝子を保有している大腸菌に導入し、テトラサイクリン、クロラムフェニコールおよびカルベニシリンを含有する培地で形質転換体を培養し、ポジティブクローンとほぼ同等の大きさのコロニーが形成されたものが、相互作用するオリゴペプチドを発現する菌株である。相互作用するオリゴペプチドをコードするｐＴＲＧベクターは先に精製してあるので、オリゴペプチドをコードする領域の塩基配列を定法により決定し、そのペプチドのアミノ酸配列を解読することができる。
【００８７】
上記のようにｂａｉｔタンパク質と相互作用する可能性の高いオリゴペプチドをコードするｐＴＲＧベクターを精製して再度ツーハイブリッドシステムによる検定を行うことにより、ｂａｉｔタンパク質と相互作用する可能性の高いオリゴペプチドを精度良く検出することができる。
【００８８】
また、本発明の相互作用検出方法により相互作用を見いだした後、相互作用するオリゴペプチドに基づいてプローブを作製することもできる。相互作用分子ペアの少なくとも一方はランダムライブラリーに由来するオリゴペプチドである。このオリゴペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを回収し、ＰＣＲなどの手法を用いてオリゴペプチド部分を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片をプローブとすることができる。得られたプローブはさらにｃＤＮＡライブラリーからタンパク質をコードするＤＮＡを新たに探索などに用いることができる。発現ベクターの回収は、レポーター遺伝子を発現するクローンを選抜し、形質転換体から発現ベクターを回収する定法により分離・回収することができる。
【００８９】
近年の生化学的研究、遺伝子工学的研究、あるいは創薬研究などでは、タンパク質の相互作用を見いだすことが１つの重要な課題となっている。本発明のタンパク質相互作用検出方法等によれば、大量の組み合わせについて簡潔な操作で、短期間に試験可能であるため、相互作用ペアの組み合わせに関し大量の情報を短期間で得ることができる。このような相互作用の情報は、未知の機能性タンパク質の発見、あるいは機能不明なタンパク質の機能解析などの基礎情報とすることができる。さらに、このような情報は、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンス、あるいは抗体などに基づく遺伝子工学を利用した様々な医薬品の開発にも極めて有用な情報源となるものである。
【００９０】
５．タンパク質相互作用検出キット
本発明のタンパク質相互作用検出キットは、上記の第「４．」章にて説明したツーハイブリッドシステムを利用したタンパク質相互作用検出方法を実施するためのキットである。すなわち、本発明のタンパク質相互作用検出キットは、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーと、ＤＢＤが組み込まれた組換えベクターと、ＡＤが組み込まれた組換えベクターと、前記ＤＢＤおよびＡＤにより転写活性が調節されるレポーター遺伝子が導入された細胞と、を備える。
【００９１】
ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーは、上記「３．」章で説明したランダムオリゴヌクレオチドライブラリーが用いられる。相互作用を見いだせるか否かは、ライブラリーサイズに依存することが考えられるが、ランダムライブラリーは追加製造可能であり、ライブラリーサイズを増幅し、新規な相互作用を検出が見いだされるまで実験を繰り返せばよい。また、ＤＢＤが組み込まれた組換えベクター、ＡＤが組み込まれた組換えベクター、前記ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性が調節されるレポーター遺伝子が導入された細胞については、上記「２．」章で説明した組換えＤＮＡ、宿主細胞を用いることができる。
【００９２】
本発明のキットの好ましい一形態としては、上記「１．」章に記載のランダムオリゴヌクレオチドカセットを用いる形態が挙げられる。また、好ましい形態として、一方の発現ベクターには、ランダムオリゴヌクレオチドカセットが有するライゲーション部の制限酵素認識配列に対応して連結可能な制限酵素認識配列、および、ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれており、他方の発現ベクターには、ランダムオリゴヌクレオチドカセットが有するライゲーション部の制限酵素認識配列に対応して連結可能な制限酵素認識配列、および、転写活性化ドメインが組み込まれているようにする。このように発現ベクターを調製しておくことにより、実験者の作業負担を大幅に軽減することができる。また、発現ベクターには必要に応じて、上記「２．」の章で説明したプロモーター、選択マーカー、エンハンサー、ＳＶ４０Ｏｒｉ、ターミネーターなどが組み込まれる。
【００９３】
上記のキットを用い、タンパク質の相互作用検出を行うために、次のようなツーハイブリッドシステム細胞が構築されることになる。すなわち、本発明のツーハイブリッドシステム細胞は、タンパク質Ｘ−ＤＢＤ複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドと、タンパク質Ｙ−ＡＤ複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドと、前記ＤＢＤおよび前記ＡＤにより転写活性が調節されるレポーター遺伝子とが導入されている。前記タンパク質Ｘおよび前記タンパク質Ｙのうち少なくとも一方のタンパク質については、それを構成するポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとして、上記「１．」で説明したランダムオリゴヌクレオチドライブラリーに由来するランダムオリゴヌクレオチドを用いる。ツーハイブリッドシステム細胞の構築方法は、上記「４．」章に従って行うことができる。
【００９４】
実験キットとしては、実験操作の容易性から、組換えＤＮＡとしてプラスミドベクターが好ましく、また宿主細胞としては、大腸菌、酵母などが好ましい。また、実験の結果が早期に分かるという点に関しては、大腸菌が特に好ましい。ヒトなどの哺乳類における相互作用を検証する上では、その生理的な条件が近くなるように哺乳類由来の細胞を宿主として用いることが好適である。また、本発明のキットには、上記のタンパク質相互作用検出方法を実施するための容器、試薬、制限酵素、宿主細胞培養のための培地等を備えるようにしてもよい。
【００９５】
【実施例】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
（１）ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーの作製
一般式「ＮＮＫ」の繰り返しが１２回あり、その両端に制限酵素認識配列をもつ、以下のような式で示されるオリゴヌクレオチドを合成した。
【００９６】
５’　ＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＧＧ　（ＮＮＫ）ｘ　ＴＡＧＴＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　３’
ただし、ｘ＝１２、　Ｎ＝　Ｇ，　Ａ，　Ｔ，　Ｃ、　Ｋ＝　Ｇ，　Ｔ
なお試薬として、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＡの塩基を有するヌクレオチド誘導体を含む混合試薬１と、ＧまたはＴの塩基を有するヌクレオチド誘導体を含む混合試薬２とを調整し、「Ｎ」の部分を合成する際には混合試薬１を、「Ｋ」の部分を合成する際には混合試薬２を供給している。
【００９７】
また、この一本鎖ＤＮＡを二本鎖にするため、以下の配列をもつプライマーを別途合成した。
【００９８】
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＡＣＴＡ−３’（配列番号１１）
これらの合成ＤＮＡをＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，　ｐＨ７．５　／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中にて混合し、７０℃にて１０分間加熱後、室温まで徐冷することによりアニーリングさせた。その後、Ｋｌｅｎｏｗ　フラグメント（タカラバイオ社）により伸張反応させ２本鎖ＤＮＡを作製した。得られた２本鎖ＤＮＡ　を制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩとＤｒａ　Ｉで処理し、オリゴヌクレオチドカセットを作製した。これを制限酵素ＢａｍＨ　ＩとＳｍａ　Ｉで処理したｐＴＲＧ２にＴ４　ＤＮＡライゲース（タカラバイオ社）を用いて連結し、大腸菌に形質転換を行い、オリゴヌクレオチドカセットのライブラリーを得た。得られた個々の形質転換体から、プラスミドＤＮＡを抽出後、オリゴヌクレオチド部分の塩基配列を解析した。これに基づき、ペプチド配列に翻訳した結果を表３に示す。
【００９９】
【表３】
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【０１００】
表３に示されるとおり、本発明のランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーは、さまざまなオリゴペプチドの配列が出現しており、配列のランダム性が高いライブラリーが得られることが確認された。
【０１０１】
＜実施例２＞
（１）概要
本発明に従い作製したオリゴヌクレオチドカセットを用いたツーハイブリッド実験により、タンパク質とオリゴペプチドの相互作用が検出可能であるかどうかを検討した。まず概要について説明する。
【０１０２】
アポトーシス抑制因子であるＢｃｌ−ｘＬは、アポトーシス促進因子Ｂａｋと結合することが知られている。特にＢａｋに関してはＢｃｌ−ｘＬと結合する最小領域として１６アミノ酸（ＧＱＶＧＲＱＬＡＩＩＧＤＤＩＮＲ）からなる配列が同定されており、ＮＭＲによる構造解析も行われている（Ｓａｔｔｌｅｒら、１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ２７５：９８３−９８６）。さらにＢｃｌ−ｘＬタンパク質精製標品と、変異を導入した合成オリゴペプチドを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏの結合測定法（蛍光偏光測定法）により、結合に必須なアミノ酸が同定されている（７番目のロイシン）。また逆に結合に寄与していないアミノ酸もわかっている（１３番目のアスパラギン酸）。
【０１０３】
この知見を元に、ｂａｉｔベクター「ｐＢＴ」にＢｃｌ−ｘＬ、ｔａｒｇｅｔベクター「ｐＴＲＧ」にＢａｋ由来の１６アミノ酸および変異型１６アミノ酸を組み込んだプラスミドを作製し、大腸菌ツーハイブリッドの実験を行った。
【０１０４】
その結果、本発明に従って作製したＢａｋ由来の１６アミノ酸をコードするｔａｒｇｅｔクローンを用いたツーハイブリッドの実験ではＢｃｌ−ｘＬとの結合が検出された。また７番目のロイシンをアラニンに置換した変異型１６アミノ酸をコードするｔａｒｇｅｔ　クローンでは結合が検出されなかった。さらに１３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した変異型１６アミノ酸をコードするｔａｒｇｅｔクローンでは結合が検出された。これらの結果は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験結果と一致している。
【０１０５】
以上のことより、ツーハイブリッドの実験によりタンパク質とオリゴペプチドの特異的な相互作用が検出可能であることが示された。これは、本発明に基づき作製したオリゴペプチドライブラリーを用いることにより、ｂａｉｔタンパク質と特異的に結合するオリゴペプチドを抽出してくることが可能であることを示している。
【０１０６】
【表４】
2004024078.tif 000005
【０１０７】
（２）材料及び方法
（２−１）Ｂｃｌ−ｘＬのクローニング
ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）を鋳型にＰＣＲを行い、ヒトＢｃｌ−ｘＬ　ｃＤＮＡを得た。ＰＣＲに用いたプライマーを配列表の配列番号１および配列番号２に示す。
【０１０８】
ＢｘＬ−Ｎ１には大腸菌ツーハイブリッド法に用いるｂａｉｔベクターであるｐＢＴに組み込むため制限酵素ＮｏｔＩを、ＢｘＬ−Ｃ２にはＸｈｏＩサイトを付加している。またＢｘＬ−Ｃ２は、Ｂｃｌ−ｘＬとＢａｋ由来の１６アミノ酸の構造解析が、Ｂｃ１−ｘＬの膜貫通領域（２１０番目から２３３番目）の欠損体を用いて行われている事を考慮して、２０９番目のアルギニンをコードするＣＧＣの後に、終止コドンであるＴＡＧを組み込んである。
【０１０９】
得られたｃＤＮＡ断片は、ＴＡクローニングベクターであるｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込み塩基配列を確認後、制限酵素ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩで処理を行い、ｐＢＴベクターに導入した。これによりλｃＩタンパク質とＢｃｌ−ｘＬ（配列番号６）の膜貫通領域欠損体の融合タンパク質を発現するプラスミド、ｐＢＴ−Ｂｃｌ−ｘＬ△ＴＭを得た。ヒトＢｃｌ−ｘＬのｃＤＮＡ配列を配列表の配列番号３に、そのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【０１１０】
（２−２）オリゴヌクレオチドカセットクローニング用ｔａｒｇｅｔベクターｐＴＲＧ２の作製
本実験ではオリゴヌクレオチドカセットを作製する際に制限酵素の組み合わせとしてＢｇｌＩＩ、ＤｒａＩを用いた。しかし大腸菌ツーハイブリッド法に使用されるｔａｒｇｅｔベクター、ｐＴＲＧのクローニングサイトには平滑末端を生成する制限酵素が存在しない（ＤｒａＩは平滑末端を生じる）。そこでｐＴＲＧのクローニングサイトに平滑末端でＤＮＡを切断する制限酵素ＳｍａＩサイトを導入した。
【０１１１】
まず、ｐＴＲＧを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントにより５’突出末端を平滑化した。その後、ＳｍａＩリンカー（タカラバイオ社：ｐＳｍａＩ　ｌｉｎｋｅｒ）をライゲーションし、さらに制限酵素ＳｍａＩによる処理を行った。これをＴ４　ＤＮＡライゲースにより自己環状化することにより、新たにＳｍａＩサイトを持つｐＴＲＧ２を作製した。
【０１１２】
（２−３）オリゴヌクレオチドカセット作製とｐＴＲＧ２への導入
Ｂａｋ由来の１６アミノ酸、ＧＱＶＧＲＱＬＡＩＩＧＤＤＩＮＲ（以下、野生型（配列番号６））と変異型１６アミノ酸、ＧＱＶＧＲＱＡＡＩＩＧＤＤＩＮＲ（以下、変異型ＬＡ（配列番号８））、ＧＱＶＧＲＱＬＡＩＩＧＤＡＩＮＲ（以下、変異型ＤＡ（配列番号１０））をコードする様に、本発明で述べた規則（本実験ではＮＮＫ）に従い、以下の配列のオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１１３】
野生型；
５’−ＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＣＡＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＣＧＴＴＡＧＴＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　−３’（配列番号５）
変異型ＬＡ；
５’−ＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＣＧＴＴＡＧＴＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　−３’（配列番号７）
変異型ＤＡ；
５’−ＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＣＡＧＧＴＴＧＧＴＣＧＴＣＡＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＣＧＴＴＡＧＴＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　−３’（配列番号９）
【０１１４】
これら合成ＤＮＡを各々２１ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＡＣＴＡ−３’）（配列番号１１）と混合し、７０℃で１０分間加熱後、室温まで徐冷することによりアニーリングさせた。その後、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントにより伸張反応をさせ２本鎖ＤＮＡを作製した。得られた２本鎖ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩとＤｒａＩで処理し、オリゴヌクレオチドカセットを作製した。これを制限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａＩで処理したｐＴＲＧ２にＴ４　ＤＮＡライゲースを用いて連結し、大腸菌に形質転換を行った。得られたクローンに関しては、プラスミドＤＮＡを抽出後、塩基配列を決定し、野生型あるいは変異型のＢａｋ由来の１６アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドカセットが、ｐＴＲＧ２に予想通り組み込まれていることを確認した。
【０１１５】
これによりＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅαタンパク質とＢａｋ由来の１６アミノ酸、及び変異型１６アミノ酸との融合タンパク質を発現するプラスミド、ｐＴＲＧ−Ｂａｋ１６ＷＴ、ｐＴＲＧ−Ｂａｋ１６ＬＡ、ｐＴＲＧ−Ｂａｋ１６ＤＡを得た。
【０１１６】
（２−４）ツーハイブリッドを用いた相互作用検定
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社ＢａｃｔｅｒｉｏＭａｔｃｈ（登録商標）Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔ添付の説明書に従い、Ｂｃｌ−ｘＬと野生型（ＷＴ）あるいは変異型のＢａｋ由来の１６アミノ酸との相互作用検定を行った。判定はレポーター遺伝子の発現表現型であるカルベニシリン耐性が検出されるかどうかで行った。
【０１１７】
相互作用検定を行ったのは、
▲１▼　ｐＢＴ−Ｂｃｌ−ｘＬ△ＴＭとｐＴＲＧ−Ｂａｋ１６ＷＴ、
▲２▼　ｐＢＴ−Ｂｃｌ−ｘＬ△ＴＭとｐＴＲＧ−Ｂａｋ１６ＬＡ、
▲３▼　ｐＢＴ−Ｂｃｌ−ｘＬ△ＴＭとｐＴＲＧ−Ｂａｋ１６ＤＡの３種類と、
▲４▼　Ｎｅｇａｔｕｖｅ　ＣｏｎｔｒｏｌとしてのｐＢＴ−Ｂｃｌ−ｘＬ△ＴＭとｐＴＲＧ、
の計４種類の組み合わせである。精製したＤＮＡを各々１０ｎｇずつ大腸菌ツーハイブリッド検出用菌株、ＢａｃｔｅｒｉｏＭａｔｃｈ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｓｔｒａｉｎのコンピテント細胞に形質転換後、菌培養液をＴＣＫ寒天培地（ＬＢ培地にテトラサイクリンを１５μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコールを３４μｇ／ｍｌ、カナマイシン５０μｇ／ｍｌとなるよう加えたもの）とＣＴＣＫ寒天培地（ＬＢ培地にカルペニシリンを２５０μｇ／ｍｌ、テトラサイクリンを１５μｇ／ｍｌ、ロラムフェニコールを３４μｇ／ｍｌ、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌとなるよう加えたもの）に５０μｌずつ塗抹した。これらを３０℃で〜２４時間培養後、ＴＣＫ寒天培地とＣＴＣＫ寒天培地、各々に生育してくる大腸菌のコロニーを比較し、相互作用の判定を行った。
【０１１８】
（３）結果
上記▲１▼〜▲４▼についての培養の結果を、図８〜１１に示す。３０℃で２４時間培養後のＴＣＫ寒天培地とＣＴＣＫ寒天培地上でのコロニーを比較した結果、Ｂｃｌ−ｘＬ△ＴＭとＢａｋ野生型配列、Ｂｃｌ−ｘＬ△ＴＭとＢａｋ変異型ＤＡ配列が相互作用することが示された。またＢａｋ変異型ＬＡ配列とは相互作用しないことが示された。すなわち、本発明により、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーをもちいて相互作用の検定ができることが確認される共に、相互作用をするオリゴペプチドにおいて、相互作用に必須となる配列部位、または必須とはならない部位の特定も可能であることが確認された。
【０１１９】
また、上記の結果を得るために要した日数は、オリゴヌクレオチドの合成にかかる日数を除いて５日であった。以上のように、一般式「ＮＮＫ」で示されるオリゴヌクレオチドを用いて相互作用の検出を短期間にかつ簡便に行うことができた。
【０１２０】
【発明の効果】
本発明により以下のような効果が得られる。
（１）本発明により、オリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチドの種類、量などの点でサイズの大きなライブラリーが提供される。
【０１２１】
（２）本発明によれば、ランダムオリゴヌクレオチドを組み換える際にランダムオリゴヌクレオチド部分が切断されてしまうことがないようにすることができるため、作製されたランダムオリゴヌクレオチドの組換えＤＮＡの損失が少ない。
【０１２２】
（３）本発明により、前記オリゴヌクレオチドライブラリーを利用した、タンパク質相互作用検出方法が提供される。配列のランダム性が高く、サイズの大きなオリゴヌクレオチドライブラリーから多様なオリゴヌクレオチドが供給され多様なオリゴペプチドについて相互作用の検出試験を行うことができるため、新規なタンパク質相互作用を見出す可能性が高い。また短期間に多数の組み合わせについて相互作用の検出試験が可能である。
【０１２３】
（４）また、本発明により、受容体の結合部位またはリガンドのスクリーニング、タンパク質相互作用部位の特定などを効率よく行うことができる。
【０１２４】
（５）また、本発明により、タンパク質の相互作用にあたり必須となる配列部位または必須とはならない配列部位の検出も簡便に行うことができる。
【０１２５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のランダムオリゴヌクレオチドの一形態である一般式（Ｉ）およびその模式配列を示した図である。
【図２】本発明のランダムオリゴヌクレオチドの一形態である一般式（ＩＩ）およびその模式配列を示した図である。
【図３】本発明のランダムオリゴヌクレオチドの末端にライゲーション部を導入し、ランダムオリゴヌクレオチド複合体を作製するプロセスの一例を示す図である。
【図４】ツーハイブリッドシステムの原理を模式的に示す図である。
【図５】ランダムオリゴヌクレオチドを、そのまま、あるいは改変することにより組み込むことができる２種のベクターを示す図である。
【図６】タンパク質相互作用の検出方法のプロセスを模式的に示した図である。
【図７】タンパク質相互作用の検出方法のプロセスを模式的に示した図であり、図６の続きである。
【図８】ｐＴＧＲベクターとして、ｐＴＲＧ−Ｂａｋ１６ＷＴを導入したツーハイブリッド検出用大腸菌株をＴＣＫ寒天培地およびＣＴＣＫ寒天培地で培養した結果を示す図である。
【図９】ｐＴＧＲベクターとして、ｐＴＲＧ−Ｂａｋ１６ＬＡを導入したツーハイブリッド検出用大腸菌株をＴＣＫ寒天培地およびＣＴＣＫ寒天培地で培養した結果を示す図である。
【図１０】ｐＴＧＲベクターとして、ｐＴＲＧ−Ｂａｋ１６ＤＡを導入したツーハイブリッド検出用大腸菌株をＴＣＫ寒天培地およびＣＴＣＫ寒天培地で培養した結果を示す図である。
【図１１】ネガティブコントロールとして、ｐＴＲＧを導入したツーハイブリッド検出用大腸菌株をＴＣＫ寒天培地およびＣＴＣＫ寒天培地で培養した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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