(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ヒトＩＬ−１８遺伝子における遺伝的多型をスクリーニングし、そしてそれらの多型と成人発症スチル病に対する罹病性との関連を確かめること。【解決手段】特定の核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６３１１位と−６３１０位との間の９塩基挿入、−５８９位、−５３１６位、−４７６２位、−４６７５位、−３２６８位、−６８９位、および−６４０位の多型性を検出することを含む、トのＩＬ−１８遺伝子における遺伝子多型を調べる方法であって、前記ヌクレオチドの位置は、核酸配列の６５７４番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記の方法。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６３１１位と−６３１０位との間の９塩基挿入、−５８９０位、−５３１６位、−４７６２位、−４６７５位、−３２６８位、−６８９位、および−６４０位の多型性を検出することを含む、ヒトのＩＬ−１８遺伝子における遺伝子多型を調べる方法であって、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記の方法。
【請求項２】
被験者からのサンプルの核酸を用いて、成人発症スチル病へのかかりやすさを検査する方法であって、前記被験者のＩＬ−１８遺伝子における、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３１６位、−４７６２位および−４６７５位のうちの少なくとも１つの位置の多型性を検出することを含み、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記方法。
【請求項３】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドにおける、−６３１１位または−６３１０位のヌクレオチドから−６４０位のヌクレオチドまでを含む連続した５６７２個または５６７１個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６３１１位と−６３１０位との間の９塩基挿入を検出することができるプライマー、−５８９０位の多型性を検出することができるプライマー、−５３１６位の多型性を検出することができるプライマー、−４７６２位の多型性を検出することができるプライマー、−４６７５位の多型性を検出することができるプライマー、−３２６８位の多型性を検出することができるプライマー、−６８９位の多型性を検出することができるプライマー、および−６４０位の多型性を検出することができるプライマーからなるプライマーの組み合わせであって、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記の組み合せ。
【請求項５】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５８９０位の多型性を検出することができるプローブ、−５３１６位の多型性を検出することができるプローブ、−４７６２位の多型性を検出することができるプローブ、−４６７５位の多型性を検出することができるプローブ、−３２６８位の多型性を検出することができるプローブ、−６８９位の多型性を検出することができるプローブ、および−６４０位の多型性を検出することができるプローブからなるプローブの組み合わせであって、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記の組み合せ。
【請求項６】
配列番号２〜６２のいずれかで表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
標識されている請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項４記載のプライマーの組み合わせおよび／または請求項５記載のプローブの組み合わせを含む、検査キット。
【請求項９】
請求項４記載のプライマーの組み合わせおよび／または請求項５記載のプローブの組み合わせを含む、診断キット。
【請求項１０】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３１６位の多型性を検出することができるプライマー、−４７６２位の多型性を検出することができるプライマーおよび−４６７５位の多型性を検出することができるプライマーのうちの少なくとも１つおよび／または配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３１６位の多型性を検出することができるプローブ、−４７６２位の多型性を検出することができるプローブ、−４６７５位の多型性を検出することができるプローブ、−４７６２位の多型性を検出することができる制限酵素および−４６７５位の多型性を検出することができる制限酵素のうちの少なくとも１つを含む、成人発症スチル病へのかかりやすさを検査するためのキットであって、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターロイキン−１８（以下、「ＩＬ−１８」と記す）プロモーター領域における遺伝子多型を調べる方法、ＩＬ−１８プロモーター領域における遺伝子多型を含むポリヌクレオチド、ＩＬ−１８プロモーター領域における遺伝子多型を調べるためのプライマーおよびプローブ、検査キット、並びに診断キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＬ−１８は最初インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）誘導因子として記述され（１）、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるＩＦＮ−γ合成の誘導（１，２）、Ｔｈ１型免疫応答の促進、活性化Ｔ細胞の増殖応答および活性化Ｔ細胞によるサイトカイン産生の増強（１−３）を含む多数の機能を有する。ＩＬ−１８は強力なＴｈ１インデューサーであるＩＬ−１２と生物学的機能を共有し、主としてマクロファージ系統の細胞によって分泌される（２）。最近の研究によって、ＩＬ−１８は最初に報告された生物学的機能に加えて他の生物学的機能をも有することが判明した。ＩＬ−１８の全身投与はＴｈ２サイトカイン、ＩｇＥおよびＩｇＧ１の産生を誘導し（４）、またＩＬ−１８トランスジェニックマウスは高レベルのＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ発現を示す（５）。これらの所見は、ＩＬ−１８がＴｈ１型およびＴｈ２型の両方の免疫応答を促進することを示している。
【０００３】
ＩＬ−１８は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患、等のいくつかの自己免疫疾患および炎症性疾患の発生において役割を果たしていることが報告されている（６−１０）。成人発症スチル病（ＡＯＳＤ）に関する最近の報告は注目に値するものであった（９，１０）。ＡＯＳＤは弛張熱、関節炎、サーモンピンク色の発疹および血清フェリチン濃度の上昇によって特徴づけられる炎症性疾患である。その発生機構はいまだに不明であるが、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ等のいくつかのサイトカインの高い血清濃度がその発生に何らかの役割を果たしていると示唆されている（１１）。しかし、これらのサイトカインはＲＡ等の他の全身性疾患においてもしばしば血清濃度が上昇するので、これらは必ずしもＡＯＳＤに特異的ではない。最近、Ｋａｗａｓｈｉｍａらは他の炎症性疾患（ＲＡ、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）および他の膠原病、等）の患者ならびに健常な被験者と比較して、ＡＯＳＤ患者においてはＩＬ−１８の血清濃度が有意に（１０００倍以上）上昇していると報告した（９）。その後、我々はＫａｗａｓｈｉｍａらの結果と類似した結果を報告した（１０）。ＡＯＳＤ患者におけるＩＬ−１８の血清濃度は、疾患の重篤度（１０）および疾患活性を反映する血清フェリチン濃度（９）の両方とよく相関している。これらの所見は、ＩＬ−１８の血清濃度の上昇はＡＯＳＤに特異的であるかもしれないこと、そしてこの疾患の発生において重大な役割を果たしているかもしれないことを示唆している。
【０００４】
ヒトＩＬ−１８遺伝子は染色体１１ｑ２２．２−ｑ２２．３上に存在し（１２）、６個のエキソンと５個のイントロンからなる。エキソン１は翻訳されない（１３）。２つのプロモーター領域が報告されており、そのうち１つはエキソン２の上流に存在する６．７　ｋｂ領域内に位置し（１４）、もう１つは５’フランキング領域内に位置している（１３）。エキソン２の上流に存在する６．７　ｋｂ領域のプロモーター活性は、ヒト上皮様細胞においてマンニトールによって誘導される高浸透圧ストレスに応答してアップレギュレーションされる（１４）。この６．７　ｋｂ領域はＰＵ．１（プリンに富む配列）、　　　　　　　ＮＦ−κＢ（核因子）、ＡＰ１（アダプタープライマー）およびＳｐ−１（特異性タンパク質）等の認識部位を含む。しかし、この広い６．７　ｋｂ領域内のプロモーター活性の正確な位置および重大な転写因子結合配列は、まだ突き止められていない。５’フランキング領域内に位置する他方のプロモーター活性は構成的に作用することが示された。転写因子５のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター（ＳＴＡＴ５）は、このプロモーター領域の上流に存在する３つの共通配列に結合してプロモーター活性を活性化する（１３）。ヒトＩＬ−１８遺伝子のプロモーターは両方ともＴＡＴＡ　ｂｏｘを欠き、かつＧ＋Ｃに乏しい。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトＩＬ−１８遺伝子における遺伝的多型をスクリーニングし、そしてそれらの多型とＡＯＳＤに対する罹病性との関連を確かめることを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトＩＬ−１８遺伝子内の何らかの遺伝的多型がＡＯＳＤにおけるＩＬ−１８タンパク質の高産生に寄与しているのではないかと推測した。それゆえ、我々はヒトＩＬ−１８遺伝子のプロモーター領域に焦点を合わせた。エキソン２の上流に位置する６．７　ｋｂ領域をスクリーニングすることによって、我々は１０個の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）および１個の９　ｂｐ挿入を見いだした。これらのうち、７個のＳＮＰおよび上記の９　ｂｐ挿入がＡＯＳＤへの罹病性に関して重要であるように思われた。なぜなら、ＡＯＳＤ患者におけるこれらの多型の頻度は健常な被験者およびＲＡ患者と比較して有意に高かったからである。これらの結果は、ヒトＩＬ−１８遺伝子のこれらの多型がＡＯＳＤの発生において何らかの役割を果たしていることを強く示唆する。本発明は、上記の知見に基づいて、完成された。
【０００７】
本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）　配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６３１１位と−６３１０位との間の９塩基挿入、−５８９０位、−５３１６位、−４７６２位、−４６７５位、−３２６８位、−６８９位、および−６４０位の多型性を検出することを含む、ヒトのＩＬ−１８遺伝子における遺伝子多型を調べる方法であって、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記の方法。
（２）　被験者からのサンプルの核酸を用いて、成人発症スチル病へのかかりやすさを検査する方法であって、前記被験者のＩＬ−１８遺伝子における、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３１６位、−４７６２位および−４６７５位のうちの少なくとも１つの位置の多型性を検出することを含み、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記方法。
（３）　配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドにおける、−６３１１位または−６３１０位のヌクレオチドから−６４０位のヌクレオチドまでを含む連続した５６７２個または５６７１個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記のポリヌクレオチド。
（４）　配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６３１１位と−６３１０位との間の９塩基挿入を検出することができるプライマー、−５８９０位の多型性を検出することができるプライマー、−５３１６位の多型性を検出することができるプライマー、−４７６２位の多型性を検出することができるプライマー、−４６７５位の多型性を検出することができるプライマー、−３２６８位の多型性を検出することができるプライマー、−６８９位の多型性を検出することができるプライマー、および−６４０位の多型性を検出することができるプライマーからなるプライマーの組み合わせであって、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記の組み合せ。
（５）　配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５８９０位の多型性を検出することができるプローブ、−５３１６位の多型性を検出することができるプローブ、−４７６２位の多型性を検出することができるプローブ、−４６７５位の多型性を検出することができるプローブ、−３２６８位の多型性を検出することができるプローブ、−６８９位の多型性を検出することができるプローブ、および−６４０位の多型性を検出することができるプローブからなるプローブの組み合わせであって、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記の組み合せ。
（６）　配列番号２〜６２のいずれかで表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチド。
（７）　標識されている（６）記載のオリゴヌクレオチド。
（８）　（４）記載のプライマーの組み合わせおよび／または（５）記載のプローブの組み合わせを含む、検査キット。
（９）　（４）記載のプライマーの組み合わせおよび／または（５）記載のプローブの組み合わせを含む、診断キット。
（１０）　配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３１６位の多型性を検出することができるプライマー、−４７６２位の多型性を検出することができるプライマーおよび−４６７５位の多型性を検出することができるプライマーのうちの少なくとも１つおよび／または配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３１６位の多型性を検出することができるプローブ、−４７６２位の多型性を検出することができるプローブ、−４６７５位の多型性を検出することができるプローブ、−４７６２位の多型性を検出することができる制限酵素および−４６７５位の多型性を検出することができる制限酵素のうちの少なくとも１つを含む、成人発症スチル病へのかかりやすさを検査するためのキットであって、前記ヌクレオチドの位置は、配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置を＋１として、ここから番号付けをしたものである、前記のキット。
【０００８】
配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置は、エクソン２の１番目のヌクレオチドである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６３１１位と−６３１０位との間の９塩基挿入、−５８９０位、−５３１６位、−４７６２位、−４６７５位、−３２６８位、−６８９位、および−６４０位の多型性を検出することを含む、ヒトのＩＬ−１８遺伝子における遺伝子多型を調べる方法を提供する。配列番号１で表される核酸配列は、ヒトＩＬ−１８遺伝子のエキソン２の上流に位置する６．７　ｋｂ領域のゲノム配列であり、その番号付けは、エキソン２の第１番目のヌクレオチドの位置（配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置）を＋１として、ここから番号をつけた。本明細書中のヒトＩＬ−１８遺伝子の全ての位置は、特にことわりのない限り、エキソン２の第１番目のヌクレオチドの位置（配列番号１で表される核酸配列の６５７５番目の位置）を＋１として、ここから番号をつけたものとする。
【００１０】
好ましい多型性を以下に記載する。
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【００１１】
本発明者らは、９ｂｐ挿入が有り、ＳＮＰ１がＴ，ＳＮＰ２がＧ，ＳＮＰ４がＣ，ＳＮＰ５がＧ，ＳＮＰ６がＣ，ＳＮＰ９がＴ，ＳＮＰ１０がＡである多型をハプロタイプＳ０１と命名した。ハプロタイプＳ０１は、健康対象者に比べ成人発症スチル病患者に高い頻度で存在することが見出された。さらに、Ｓ０１／Ｓ０１というディプロタイプ形（すなわち、２つのハプロタイプの組合せ）を担持する個体の頻度は、成人発症スチル病患者において健康対象者およびＲＡ患者に比べ更に高かった。従って、本発明の方法においては、ハプロタイプＳ０１の存在を検出すること、さらに、Ｓ０１／Ｓ０１というディプロタイプ形の存在を検出することが好ましい。
【００１２】
遺伝子多型は、被験者からのサンプルの核酸（例えば、被験者の血液、痰、皮膚、気管支肺胞洗浄液、その他の体液、組織試料などから抽出した核酸）を用いて、直接シークエンス法、制限酵素消化、遺伝子多型配列に特異的な蛍光標識プローブを用い、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００ＨＴ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて検出する対立遺伝子識別法などの方法により調べることができる。
【００１３】
上記の多型性を検出することにより成人発症スチル病の発病の遺伝的なリスクを予測することができる。この予測には、被験者のＩＬ−１８遺伝子における、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３１６位、−４７６２位および−４６７５位のうちの少なくとも１つの位置の多型性を検出すればよい。−５３１６位、−４７６２位および−４６７５位は完全な連鎖不平衡にあり、更にこれらの多型はＳ０１に特有であるため、ある個体が上記３箇所のうち、少なくとも１箇所の多型を有していれば、Ｓ０１を有していると考えられるからである（図２参照）。
【００１４】
また、本発明は、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドにおいて、−６３１１位または−６３１０位のヌクレオチドから−６４０位のヌクレオチドまでを含む連続した５６７２個または５６７１個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。本発明者らが見出した遺伝子多型はイントロン中の配列なので、ゲノムＤＮＡを利用することによって検索することができる。今後今回見出した遺伝子多型のうちある部位の、或いは複数の部位の遺伝子多型の組み合わせにより、ＩＬ−１８蛋白質合成亢進が引き起こされることが明らかになれば、それを標的にした遺伝子治療に応用できる可能性がある。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドは、公知の方法で合成することができる。例えば、市販のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
【００１６】
本発明は、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６３１１位と−６３１０位との間の９塩基挿入を検出することができるプライマー、−５８９０位の多型性を検出することができるプライマー、−５３１６位の多型性を検出することができるプライマー、−４７６２位の多型性を検出することができるプライマー、−４６７５位の多型性を検出することができるプライマー、−３２６８位の多型性を検出することができるプライマー、−６８９位の多型性を検出することができるプライマー、および−６４０位の多型性を検出することができるプライマーからなるプライマーの組み合わせを提供する。
【００１７】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６３１１位と−６３１０位との間の９塩基挿入を検出することができるプライマーは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６５７４〜−６５５５位のいずれかの位置を起点とし、−５３７９〜−５３６１位ののいずれかの位置を終点とする配列を増幅できるものであるとよく、プライマーの例としては、以下の配列を有するものの組合せを例示することができる。
−６５７４Ｆ（フォワード）　５’−ＡＣＴ　ＴＧＣ　ＣＴＴ　ＡＡＡ　ＡＧＣ　ＴＴＴ　ＧＣ−３’（配列番号２）及び−５３６１Ｒ（リバース）５’−ＧＴＣ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　Ａ−３’（配列番号３）。
【００１８】
−６５７４Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６５７４〜−６５５５位の配列と同じ配列を有する。
【００１９】
−５３６１Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３７９〜−５３６１位の配列と相補的な配列を有する。
【００２０】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５８９０位の多型性（ＳＮＰ１）を検出することができるプライマーは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６５７４〜−６５５５位のいずれかの位置を起点とし、−５３７９〜−５３６１位ののいずれかの位置を終点とする配列を増幅できるものであるとよく、プライマーの例としては、以下の配列を有するものの組合せを例示することができる。
−６５７４Ｆ（フォワード）　５’−ＡＣＴ　ＴＧＣ　ＣＴＴ　ＡＡＡ　ＡＧＣ　ＴＴＴ　ＧＣ−３’（配列番号２）及び−５３６１Ｒ（リバース）５’−ＧＴＣ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　Ａ−３’（配列番号３）。
【００２１】
−６５７４Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６５７４〜−６５５５位の配列と同じ配列を有する。
【００２２】
−５３６１Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３７９〜−５３６１位の配列と相補的な配列を有する。
【００２３】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３１６位の多型性（ＳＮＰ２）を検出することができるプライマーは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５４８６〜−５４６９位のいずれかの位置を起点とし、−４４７３〜−４４９１位のいずれかの位置を終点とする配列を増幅できるものであるとよく、プライマーの例としては、以下の配列を有するものの組合せを例示することができる。
−５４８６Ｆ（フォワード）５’−ＧＧＣ　ＡＣＡ　ＧＡＣ　ＴＣＡ　ＣＴＴ　ＣＴＧ−３’（配列番号４）及び−４４７３Ｒ（リバース）５’−ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＣＧＣ　ＴＣＴ　Ｇ−３’（配列番号５）。
【００２４】
−５４８６Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５４８６〜−５４６９位の配列と同じ配列を有する。
【００２５】
−４４７３Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４４７３〜−４４９１位の配列と相補的な配列を有する。
【００２６】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４７６２位の多型性（ＳＮＰ４）を検出することができるプライマーは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５４８６〜−５４６９位のいずれかの位置を起点とし、−４４７３〜−４４９１位のいずれかの位置を終点とする配列を増幅できるものであるとよく、プライマーの例としては、以下の配列を有するものの組合せを例示することができる。
−５８４６Ｆ（フォワード）５’−ＧＧＣ　ＡＣＡ　ＧＡＣ　ＴＣＡ　ＣＴＴ　ＣＴＧ−３’（配列番号４）及び−４４７３Ｒ（リバース）５’−ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＣＧＣ　ＴＣＴ　Ｇ−３’（配列番号５）。
【００２７】
−５４８６Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５４８６〜−５４６９位の配列と同じ配列を有する。
【００２８】
−４４７３Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４４７３〜−４４９１位の配列と相補的な配列を有する。
【００２９】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４６７５位の多型性（ＳＮＰ５）を検出することができるプライマーは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５４８６〜−５４６９位のいずれかの位置を起点とし、−４４７３〜−４４９１位のいずれかの位置を終点とする配列を増幅できるものであるとよく、プライマーの例としては、以下の配列を有するものの組合せを例示することができる。
−５４８６Ｆ（フォワード）５’−ＧＧＣ　ＡＣＡ　ＧＡＣ　ＴＣＡ　ＣＴＴ　ＣＴＧ−３’（配列番号４）及び−４４７３Ｒ（リバース）５’−ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＣＧＣ　ＴＣＴ　Ｇ−３’（配列番号５）。
【００３０】
−５４８６Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５４８６〜−５４６９位の配列と同じ配列を有する。
【００３１】
−４４７３Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４４７３〜−４４９１位の配列と相補的な配列を有する。
【００３２】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−３２６８位の多型性（ＳＮＰ６）を検出することができるプライマーは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−３６７４〜−３６５３位のいずれかの位置を起点とし、−２６３１−２６５０位のいずれかの位置を終点とする配列を増幅できるものであるとよく、プライマーの例としては、以下の配列を有するものの組合せを例示することができる。
−３６７４Ｆ（フォワード）５’−ＡＴＣ　ＣＡＧ　ＧＣＣ　ＴＧＧ　ＴＧＧ　ＡＣＧ　ＧＧＣ　Ｔ−３’（配列番号８）及び−２６３１Ｒ（リバース）５’−ＧＴＧ　ＡＧＣ　ＣＡＴ　ＧＴＧ　ＴＧＴ　ＴＡＴ　ＧＣ−３’（配列番号９）
【００３３】
−３６７４Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−３６７４〜−３６５３位の配列と同じ配列を有する。
【００３４】
−２６３１Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−２６３１−２６５０位の配列と相補的な配列を有する。
【００３５】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６８９位の多型性（ＳＮＰ９）を検出することができるプライマーは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−１０５８〜−１０３６位のいずれかの位置を起点とし、＋４５〜＋６６位のいずれかの位置を終点とする配列を増幅できるものであるとよく、プライマーの例としては、以下の配列を有するものの組合せを例示することができる。
−１０５８Ｆ（フォワード）５’−ＧＴＴ　ＣＣＣ　ＴＧＡ　ＣＴＣ　ＴＡＧ　ＧＡＡ　ＣＣＣ　ＣＴ−３’（配列番号１４）及び＋６６Ｒ（リバース）５’−ＡＧＧ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＴＧＣ　ＡＣＴ　ＧＧＧ　ＡＧＡ　Ｃ−３’（配列番号１５）。
【００３６】
−１０５８Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−１０５８〜−１０３６位の配列と同じ配列を有する。
【００３７】
＋６６Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの＋４５〜＋６６位の配列と相補的な配列を有する。
【００３８】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６４０位の多型性（ＳＮＰ１０）を検出することができるプライマーは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−１０５８〜−１０３６位のいずれかの位置を起点とし、＋４５〜＋６６位のいずれかの位置を終点とする配列を増幅できるものであるとよく、プライマーの例としては、以下の配列を有するものの組合せを例示することができる。
−１０５８Ｆ（フォワード）５’−ＧＴＴ　ＣＣＣ　ＴＧＡ　ＣＴＣ　ＴＡＧ　ＧＡＡ　ＣＣＣ　ＣＴ−３’（配列番号１４）及び＋６６Ｒ（リバース）５’−ＡＧＧ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＴＧＣ　ＡＣＴ　ＧＧＧ　ＡＧＡ　Ｃ−３’（配列番号１５）。
【００３９】
−１０５８Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−１０５８〜−１０３６位の配列と同じ配列を有する。
【００４０】
＋６６Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの＋４５〜＋６６位の配列と相補的な配列を有する。
【００４１】
本発明のプライマーの長さは、好ましくは１５〜２５ｂｐである。
【００４２】
本発明のプライマーを用いて、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６３１１位と−６３１０位との間の塩基挿入、−５８９０位、−５３１６位、−４７６２位、−４６７５位、−３２６８位、−６８９位、および−６４０位の多型性を検出することができる。その方法を簡単に説明すると、以下の通りである。
【００４３】
ＰＣＲを９２度１分、５８度３０秒、７２度１分の４０サイクルで行う。２％アガロースゲルにて泳動し、バンドをゲルから切り出して、フナコシのウルトラクリーンゲルスピンカラムを用いて精製し、シークエンスを行う。シークエンスは、後述の配列決定用プライマーを用いて、アプライド・バイオシステムズ社のＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　にて解析することができる。
【００４４】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６３１１位と−６３１０位との間の９塩基挿入（９ｂｐ挿入）を検出することができる配列決定用プライマーは、例えば、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６５５４〜−６５３５位の配列に相補的な配列とハイブリダイズできるもの、−６１４９〜−６１６７位の配列とハイブリダイズできるものであるとよく、その例としては、以下の配列を有するものを例示することができる。
−６５５４Ｆ（フォワード）５’−ＡＴＡ　ＧＧＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＴＡＧ　ＡＴ−３’（配列番号１６）
−６１４９Ｒ（リバース）　５’−ＣＴＴ　ＧＧＧ　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＡＡＴ　ＴＴＣ　Ｃ−３’（配列番号１８）
【００４５】
−６５５４Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６５５４〜−６５３５位の配列と同じ配列を有する。
【００４６】
−６１４９Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６１４９〜−６１６７位の配列と相補的な配列を有する。
【００４７】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５８９０位の多型性（ＳＮＰ１）を検出することができる配列決定用プライマーは、例えば、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６１６７〜−６１４９位の配列に相補的な配列とハイブリダイスできるものであるとよく、その例としては、以下の配列を有するものを例示することができる。
−６１６７Ｆ（フォワード）５’−ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＴＴＡ　ＣＡＧ　ＧＣＣ　ＣＡＡ　Ｇ−３’（配列番号１７）
【００４８】
−６１６７Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６１６７〜−６１４９位の配列と同じ配列を有する。
【００４９】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３１６位の多型性（ＳＮＰ２）を検出することができる配列決定用プライマーは、例えば、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５４２３〜−５４０５位の配列に相補的な配列とハイブリダイスできるもの、−４８９５〜−４９１３位の配列とハイブリダイズできるものであるとよく、そのの例としては、以下の配列を有するものを例示することができる。
−５４２３Ｆ（フォワード）５’−ＴＧＧ　ＡＧＧ　ＣＣＴ　ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＡＧＴ　Ｇ−３’（配列番号２０）
−４８９５Ｒ（リバース）５’−ＧＧＣ　ＣＡＴ　ＡＴＣ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　Ｃ−３’（配列番号２１）
【００５０】
−５４２３Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５４２３〜−５４０５位の配列と同じ配列を有する。
【００５１】
−４８９５Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４８９５〜−４９１３位の配列と相補的な配列を有する。
【００５２】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４７６２位の多型性（ＳＮＰ４）を検出することができる配列決定用プライマーは、例えば、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４９８３〜−４９６７位の配列に相補的な配列とハイブリダイスできるもの、−４５１３〜−４５３３位の配列とハイブリダイズできるものであるとよく、その例としては、以下の配列を有するものを例示することができる。
−４９８３Ｆ（フォワード）５’−ＧＧＧ　ＴＡＡ　ＴＣＴ　ＴＴＣ　ＡＡＡ　ＡＣ−３’（配列番号２２）
−４５１３Ｒ（リバース）５’−ＧＧＣ　ＡＣＡ　ＡＴＣ　ＴＣＧ　ＧＣＴ　ＣＡＣ　ＴＧＣ　−３’（配列番号２３）
【００５３】
−４９８３Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４９８３〜−４９６７位の配列と同じ配列を有する。
【００５４】
−４５１３Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４５１３〜−４５３３位の配列と相補的な配列を有する。
【００５５】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４６７５位の多型性（ＳＮＰ５）を検出することができる配列決定用プライマーは、例えば、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４９８３〜−４９６７位の配列に相補的な配列とハイブリダイスできるもの、−４５１３〜−４５３３位の配列とハイブリダイズできるものであるとよく、その例としては、以下の配列を有するものを例示することができる。
−４９８３Ｆ（フォワード）５’−ＧＧＧ　ＴＡＡ　ＴＣＴ　ＴＴＣ　ＡＡＡ　ＡＣ−３’（配列番号２２）
−４５１３Ｒ（リバース）５’−ＧＧＣ　ＡＣＡ　ＡＴＣ　ＴＣＧ　ＧＣＴ　ＣＡＣ　ＴＧＣ　−３’（配列番号２３）
【００５６】
−４９８３Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４９８３〜−４９６７位の配列と同じ配列を有する。
【００５７】
−４５１３Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４５１３〜−４５３３位の配列と相補的な配列を有する。
【００５８】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−３２６８位の多型性（ＳＮＰ６）を検出することができる配列決定用プライマーは、例えば、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−３６２４〜−３６０７位の配列に相補的な配列とハイブリダイズできるもの、−３１０６〜−３１２７位の配列とハイブリダイズできるものであるとよく、その例としては、以下の配列を有するものを例示することができる。
−３６２４Ｆ（フォワード）５’−ＡＣＴ　ＧＣＣ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＣＣＡ−３’（配列番号２７）
−３１０６Ｒ（リバース）５’−ＣＣＧ　ＧＧＡ　ＡＡＡ　ＡＧＣ　ＴＧＣ　ＣＴＴ　ＴＣＣ　Ｇ−３’（配列番号２８）
【００５９】
−３６２４Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−３６２４〜−３６０７位の配列と同じ配列を有する。
【００６０】
−３１０６Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−３１０６〜−３１２７位の配列と相補的な配列を有する。
【００６１】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６８９位の多型性（ＳＮＰ９）を検出することができる配列決定用プライマーは、例えば、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−９９０〜−９７３位の配列に相補的な配列とハイブリダイズできるもの、−４７３〜−４９０位の配列とハイブリダイズできるものであるとよく、その例としては、以下の配列を有するものを例示することができる。
−９９０Ｆ（フォワード）５’−ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＴＴＧ　ＣＴＡ　ＡＴＴ　ＣＣＣ−３’（配列番号３８）
−４７３Ｒ（リバース）５’−ＣＣＴ　ＣＡＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＣＣＣ−３’（配列番号３９）
【００６２】
−９９０Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−９９０〜−９７３位の配列と同じ配列を有する。
【００６３】
−４７３Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４７３〜−４９０位の配列と相補的な配列を有する。
【００６４】
配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６４０位の多型性（ＳＮＰ１０）を検出することができる配列決定用プライマーは、例えば、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−９９０〜−９７３位の配列に相補的な配列とハイブリダイズできるもの、−４７３〜−４９０位の配列とハイブリダイズできるものであるとよく、その例としては、以下の配列を有するものを例示することができる。
−９９０Ｆ（フォワード）５’−ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＴＴＧ　ＣＴＡ　ＡＴＴ　ＣＣＣ−３’（配列番号３８）
−４７３Ｒ（リバース）５’−ＣＣＴ　ＣＡＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＣＣＣ−３’（配列番号３９）
【００６５】
−９９０Ｆは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−９９０〜−９７３位の配列と同じ配列を有する。
【００６６】
−４７３Ｒは、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−４７３〜−４９０位の配列と相補的な配列を有する。
【００６７】
上記の配列決定用プライマーを用いて、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−６３１１位と−６３１０位との間の９塩基挿入、−５８９０位、−５３１６位、−４７６２位、−４６７５位、−３２６８位、−６８９位、および−６４０位の多型性を検出することができる。その方法の一例を簡単に説明すると、以下の通りである。
【００６８】
ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ７７００にてシークエンスする。解析結果シートの波形から、遺伝子多型の場所の塩基が何であるかを各検体につき確認する。１箇所の多型につき通常フォワード、リバース２種の配列決定用プライマーを用いて解析されているので、２方向から確認する。
【００６９】
本発明は、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５８９０位の多型性（ＳＮＰ１）を検出することができるプローブ、−５３１６位の多型性（ＳＮＰ２）を検出することができるプローブ、−４７６２位の多型性（ＳＮＰ４）を検出することができるプローブ、−４６７５位の多型性（ＳＮＰ５）を検出することができるプローブ、−３２６８位の多型性（ＳＮＰ６）を検出することができるプローブ、−６８９位の多型性（ＳＮＰ９）を検出することができるプローブ、および−６４０位の多型性（ＳＮＰ１０）を検出することができるプローブからなるプローブの組み合わせを提供する。
【００７０】
このようなプローブは、例えば、対立遺伝子識別化学で多型を検出するために用いることができる。
【００７１】
対立遺伝子識別化学で多型を検出するためのプローブを設計するには、多型部位をほぼ中央に可能な限り短く設計するが、１３塩基以下になってはいけない。多型部位を含むその前後４〜１０個のヌクレオチド配列に相補的な配列とすればよい。一つの多型がある場合、つまり１カ所につきアリル１とアリル２がある場合、アリル１に完全に一致したプローブと、アリル２に完全に一致したプローブを５’末端をそれぞれＦＡＭまたはＶＩＣで標識して作成するとよい。具体的には、以下のようなプローブを例示することができる。
2004049136.tif 000004
【００７２】
本発明のプローブはアレル特異的プローブであるとよい。プローブの長さは、好ましくは１５〜２０ｂｐである。
【００７３】
本発明のプローブを用いて、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５８９０位、−５３１６位、−４７６２位、−４６７５位、−３２６８位、−６８９位、および−６４０位の多型性を検出することができる。その方法の一例を簡単に説明すると、以下の通りである。
【００７４】
多型部位をほぼ中心に、ＰＣＲ産物がおよそ１００ｂｐになるようにフォワード、及びリバースのプライマーを設定し、ＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応混合物１０μｌ中には各９　ｐＭのフォワードおよびリバースプライマー、各２　ｐＭの野生型（ｗｔ）、および変異型（ｍｔ）に一致したアレル特異的プローブ、１０　ｎｇのゲノムＤＮＡ（鋳型として）、およびＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡ　ポリメラーゼを含むＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれている。ＰＣＲ条件は９５℃１０分、（以下４０サイクル）９２℃１５秒、６０℃１分である。混合液中で各プローブは鋳型ＤＮＡの相補配列に特異的にアニーリングしているが、ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡ　ポリメラーゼによるＤＮＡ伸長により開裂をうける。その結果、プローブからリポーター色素が分離される。従って、ＰＣＲ増幅の間に生成された蛍光シグナルをＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ７９００にて比較することにより、サンプル中に存在する配列を決定することが可能である。蛍光シグナルがＶＩＣのみである場合、そのサンプルはｗｔ対立遺伝子に関してホモ接合であり、ＦＡＭ蛍光のみの場合は、そのサンプルはｖｔ対立遺伝子に関してホモ接合である。両方の蛍光シグナルが増大した場合、そのサンプルはヘテロ接合である。
【００７５】
本発明のプライマーおよびプローブは、公知の方法で合成することができる。例えば、市販のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
必要により、検出を容易にするため、プライマーやプローブを標識することができる。例えば、アイソトープ（３２Ｐ、３５Ｓなど）、蛍光色素（ビオチン／アビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン−ローダミン、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　（ＦＩＴＣ）、ＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗ　ＣＨ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１２３、Ａｃｒｉｄｉｎｅ　ｏｒａｎｇｅ、Ｐｙｒｏｎｉｎ　Ｙ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ、ＢＯＢＯ−１、ＰＯＰＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−１、Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ　（ＣＦＤＡ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ　（ＦＤＡ）、Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ−ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ　（ＣＦＤＡ−ＡＭ）、５−ｃｙａｎｏ−２，３０ｄｉｔｏｌｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　（ＣＴＣ）、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＴＲＩＴＣ）、Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１０１　ａｃｉｄ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　（Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｎａｐｈｔｏｉｃ　ａｃｉｄ−２’−ｐｈｅｎｙｌａｎｉｌｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　（ＨＮＰＰ）、ＶＩＣ、ＦＡＭ、ＭＧＢ（ｍｉｎｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ　ｂｉｎｄｅｒ）など）、ジゴキシゲニン等の抗原物質などで標識するとよい。
【００７６】
本発明のプライマーおよびプローブは、ヒトのＩＬ−１８遺伝子における遺伝子多型を調べるために使用することができる。
【００７７】
本発明は、配列番号２〜６２のいずれかで表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００７８】
配列番号２〜４６、５１または５２のいずれかで表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ用プライマーとして使用できる。
【００７９】
配列番号４７〜５０、５３〜６２のいずれかで表される核酸配列からなるオリゴヌクレオチドは、シークエンス用プローブとして使用できる。
【００８０】
これらのオリゴヌクレオチドをプライマーやプローブとして使用する場合には、上記のように標識してもよい。
【００８１】
本発明は、上記のプライマーの組み合わせおよび／またはプローブの組み合わせを含む、検査キットを提供する。
【００８２】
本発明の検査キットは、ヒトのＩＬ−１８遺伝子における遺伝子多型を調べるために使用することができる。
【００８３】
また、本発明は、上記のプライマーの組み合わせおよび／またはプローブの組み合わせを含む、診断キットを提供する。
【００８４】
本発明の診断キットは、成人発症スチル病の診断に用いることができる。
【００８５】
本発明は、配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３１６位の多型性を検出することができるプライマー、−４７６２位の多型性を検出することができるプライマーおよび−４６７５位の多型性を検出することができるプライマーのうちの少なくとも１つおよび／または配列番号１で表される核酸配列からなるポリヌクレオチドの−５３１６位の多型性を検出することができるプローブ、−４７６２位の多型性を検出することができるプローブ、−４６７５位の多型性を検出することができるプローブ、−４７６２位の多型性を検出することができる制限酵素および−４６７５位の多型性を検出することができる制限酵素のうちの少なくとも１つを含む、成人発症スチル病へのかかりやすさを検査するためのキットを提供する。プライマーおよびプローブは上記の通りである。−４７６２位の多型性を検出することができる制限酵素としては、ＭｂｏＩＩを挙げることができる。−４６７５位の多型性を検出することができる制限酵素としては、ＴａｑＩを挙げることができる。制限酵素による多型性の検出方法の一例は後述の実施例に記載されている。
【００８６】
本発明の検査キットおよび診断キットは、さらに、適当な緩衝剤、ヌクレオチド、およびポリメラーゼ（例えば、熱安定性ポリメラーゼ（例えば、ｔａｑポリメラーゼなど）などを含むことができる。また、本発明の検査キットおよび診断キットは、説明書を含み、包装されていてもよい。説明書には、キットの使用方法、結果の解析方法などが記載されているとよい。
【００８７】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。患者および方法
【００８８】
患者および対照被験者。本研究は東京女子医大の学内ゲノム倫理委員会によって承認された。我々は、東京女子医大の膠原病リウマチ痛風センターがフォローしていた１４名のＡＯＳＤ患者をインフォームドコンセントのもとに検査した。このうち患者１０名（７１％）は女性で、また全ての患者はＣｕｓｈら（１５）のＡＯＳＤ基準およびＹａｍａｇｕｃｈｉら（１６）のＡＯＳＤ基準の両方を満たしていた。我々はまた９２名の健康な個人（女性６７％）をも検査した。また、炎症性疾患の対照として、外来患者の中からランダムに選択された１４４名のＲＡ患者（女性８１％）を検査した。全てのＲＡ患者は、ＡｍｅｒｉｃａｎＣｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　ＲｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙのＲＡに関する１９８７分類基準を満たしていた。全ての被験者は日本人で、ＡＯＳＤおよびＲＡ患者ならびに健康な被験者の間に性比における有意な差は存在しなかった。
【００８９】
ＤＮＡ単離および遺伝子型のタイピング。ゲノムＤＮＡは市販のキット（ＤｎａＱｕｉｃｋ、大日本インキ、日本）を用いて末梢血から単離した。ヒトＩＬ−１８遺伝子のエキソン２の上流に位置する６．７　ｋｂ領域のゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋ　ＤＮＡデータベース（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／；　受託番号：　ＡＢ０１５９６１）から得た。塩基配列を直接決定するため、ゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、エキソン２の上流に位置する６．７　ｋｂ領域に相当する断片を増幅した。直接シークエンス法に用いたプライマーを表１に示す。塩基配列はＰＣＲ産物を用いてＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　ＣＡ）によって分析した。直接シークエンス法による予備検査の結果、我々は１０個のＳＮＰおよび１個の９　ｂｐ挿入を見いだした（図１）。個々の被験者の遺伝子型を決定するため、我々は以下に記述するように直接シークエンス法、制限酵素消化、またはＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００ＨＴ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた対立遺伝子識別化学のいずれか、または必要に応じてそれぞれの組み合わせにより解析した。エキソン２の上流に位置する６．７　ｋｂ領域のゲノム配列は、エキソン２の第１番目のヌクレオチドの位置を＋１として、ここから番号をつけた。
【００９０】
【表１】
2004049136.tif 000005
【００９１】
表１のプライマーの配列と配列番号の対応付け
ＰＣＲ用プライマー
2004049136.tif 000006
2004049136.tif 000007
2004049136.tif 000008
【００９２】
制限酵素による遺伝子型のタイピング。ヌクレオチド−４７６２の多型（ＳＮＰ４）はＴからＣへの置換を構成し、他方ヌクレオチド−４６７５の多型（ＳＮＰ５）はＣからＧへの置換であった。制限酵素を用いて制限断片長多型によって各多型の遺伝子型を決定した。以下のプライマーを作製して、ＳＮＰ４およびＳＮＰ５の両方を含む−４９１６から−４４７３までの断片を増幅した：
フォワード５’−ＧＴＴＧＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＴＡＴＧＧＣＣＴ−３’（配列番号４２）
リバース　５’−ＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧ−３’（配列番号５）
４４４　ｂｐの各ＰＣＲ産物の１０μｌのアリコートを、ＳＮＰ４については１μｌのＭｂｏＩＩ　（東洋紡、東京、日本）で、ＳＮＰ５については１μｌのＴａｑＩ（東洋紡）で消化した。ＳＮＰ４はＭｂｏＩＩ制限部位を生成し、ＭｂｏＩＩによる消化は２９０　ｂｐおよび１５４　ｂｐの断片をもたらした。他方、ＳＮＰ４をもたないＰＣＲ産物は切断されなかった。ＳＮＰ５はＴａｑＩ制限部位を破壊し、これはＰＣＲ産物が２０３　ｂｐおよび　２４１　ｂｐの断片に切断されるのを妨げた。消化したＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで可視化した。
【００９３】
対立遺伝子識別化学。対立遺伝子識別化学を実施するため、フォワードおよびリバースプライマー、ならびに野生型（ｗｔ）または変異型（ｖｔ）配列とハイブリダイズする蛍光標識化プローブのセットを作製した。ヌクレオチド−５３１６の多型はＡからＧへの置換（ＳＮＰ２）を構成し、他方ヌクレオチド−３２６８の多型はＴからＣへの置換（ＳＮＰ６）であった。ＳＮＰ２およびＳＮＰ６用のプライマーは以下の通りであった：
2004049136.tif 000009
ＳＮＰ２およびＳＮＰ６用のプローブは以下の通りであった：
2004049136.tif 000010
（ＭＧＢ：ｍｉｎｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ　ｂｉｎｄｅｒ、ＦＡＭとＶＩＣはフルオレッセン系の蛍光色素（いずれもアプライド・バイオシステムズ社製））
ＰＣＲ反応混合物の１０μｌのアリコートは各９　ｐＭのフォワードおよびリバースプライマー、各２　ｐＭのプローブ、１０　ｎｇのゲノムＤＮＡ（鋳型として）、およびＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡ　ポリメラーゼを含むＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含んでいた。ＰＣＲの間に、各プローブはフォワードプライマー部位とリバースプライマー部位の間にある相補配列に特異的にアニーリングした。ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ　ＤＮＡ　ポリメラーゼは標的とハイブリダイズするプローブを開裂し、この開裂はプローブからリポーター色素を分離した。ＰＣＲ増幅の間に生成された蛍光シグナルを比較することによって、サンプル中に存在する配列を決定することが可能であった。蛍光シグナルがＶＩＣのみである場合、そのサンプルはｗｔ対立遺伝子に関してホモ接合であった。同様に、ＦＡＭ蛍光のみの場合は、そのサンプルはｖｔ対立遺伝子に関してホモ接合であった。両方の蛍光シグナルが増大した場合、そのサンプルはヘテロ接合であった。
【００９４】
９　ｂｐ挿入の検出：ヌクレオチド−６３１１と−６３１０の間の９　ｂｐ挿入を検出するために、ヌクレオチド−６３４７から−６２０１までを増幅するためのＰＣＲプライマーを作製した：
フォワード　５’−ＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＣＴＡＴＣ−３’　（配列番号５１）
リバース　５’−ＧＣＴＴＴＣＴＡＧＣＡＴＧＴＴＴＧＣＣＴＴ−３’　（配列番号５２）
この９　ｂｐ挿入を有するゲノムＤＮＡは１５６　ｂｐの断片を、またこれをもたないゲノムＤＮＡは１４７　ｂｐの断片を生じた。被験者がヘテロ接合である場合は、両方のサイズのＰＣＲ産物が生じるであろう。ＰＣＲ産物を１．５％　Ｎｕｓｉｅｖｅ　ＧＴＧアガロースゲル（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，　Ｒｏｃｋｌａｎｄ，　ＭＥ）によって分離し、臭化エチジウムにより可視化した。
【００９５】
ハプロタイプおよびディプロタイプ形のタイピング。我々は、７個のＳＮＰおよび１個の９　ｂｐ挿入を含む８個の新規な多型を示した。我々は遺伝子型データをＬＤＳＵＰＰＯＲＴプログラム（Ｋｉｔａｍｕｒａ　Ｙ，　Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ　Ｍ，　Ｋａｎｅｋｏ　Ｈ．　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｐｌｏｔｙｐｅ　ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ　（ｄｉｐｌｏｔｙｐｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）　ｆｏｒ　ｅａｃｈ　ｓｕｂｊｅｃｔ　ｆｒｏｍ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｄａｔａ　ｕｓｉｎｇ　ＥＭ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．　　Ａｎｎ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ　（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ））に適用し、集団中のハプロタイプ頻度を推定し、そして各被験者についてディプロタイプ分布の事後確率を計算した。このプログラムは、集団がハーディ−ワインベルグ平衡（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ’ｓ　　ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）にあると仮定して、期待値最大化アルゴリズムに基づく最大尤度推定法を用いてハプロタイプをタイピングするために設計されたものである。この方法は、そこからサンプルを得た集団におけるハプロタイプの頻度を推定する。推定されたハプロタイプ頻度に基づいて、各被験者におけるディプロタイプ形（すなわち、２つのハプロタイプの組み合わせ）の事後分布を計算することができる。ＬＤＳＵＰＰＯＲＴによって推定されたハプロタイプ頻度は、ＥＭに基づく以前のプログラムＥＨ（１７）によって模擬および観察されたデータの両方を用いて得られたハプロタイプ頻度と同一であった。
【００９６】
統計学的分析。ハプロタイプまたはディプロタイプ形の頻度を比較するため、フィッシャーの直接法を用いた。差異はｐ＜０．０５である場合に有意とみなされた。特定のディプロタイプ形の担持者における罹病性についてオッズ比（ＯＲ）を決定した。ＯＲに対する９５％　信頼区間（９５％　ＣＩ）もまた計算した。
【００９７】
結果
ヒトＩＬ−１８遺伝子のイントロン１における多型。我々は、ＤＤＢＪヌクレオチド配列データベースに受託番号ＡＢ０１５９６１のもとに寄託されていた、ヒトＩＬ−１８遺伝子のエキソン２の上流に位置する６．７　ｋｂ領域の全域を調査した。ＰＢＭＣから得た４０人の日本人のゲノムＤＮＡをスクリーニングすることによって、我々はヒトＩＬ−１８遺伝子のエキソン２の上流に位置する６．７　ｋｂ領域に日本人に普遍的な（共通）ヌクレオチド配列を決定した。それらの配列は、ヒト胎盤に由来するサンプルを用いて決定された寄託配列との間にいくつかの差異を有していた。新たに決定された配列は、ヌクレオチド−３４１１の位置にさらなるＰＵ．１結合部位を含んでいた。
ヒトＩＬ−１８遺伝子のエキソン２の上流に位置する６．７　ｋｂ領域中に、我々は最初１０個のＳＮＰおよび１個の９　ｂｐ挿入を含む１１個の多型を見いだした。すなわち、ヌクレオチド−５８９０のＣからＴへの置換（ＳＮＰ１）、ヌクレオチド−５３１６のＡからＧへの置換（ＳＮＰ２）、ヌクレオチド−５２０７のＴからＣへの置換（ＳＮＰ３）、ヌクレオチド−４７６２のＴからＣへの置換（ＳＮＰ４）、ヌクレオチド−４６７５のＣからＧへの置換（ＳＮＰ５）、ヌクレオチド−３２６８のＴからＣへの置換（ＳＮＰ６）、ヌクレオチド−２８３５のＣからＴへの置換（ＳＮＰ７）、ヌクレオチド−２５６５のＴからＣへの置換（ＳＮＰ８）、ヌクレオチド−６８９のＧからＴへの置換（ＳＮＰ９）、ヌクレオチド−６４０のＣからＡへの置換（ＳＮＰ１０）、およびヌクレオチド−６３１１と−６３１０の間に９　ｂｐ　（ＡＡＣＡＧＧＡＣＡ）の挿入であった。これらの多型のうち、ＳＮＰ１、２、４、５、６、９および１０ならびに９　ｂｐ挿入は、健康な対照被験者よりもＡＯＳＤ患者により頻繁に存在していた。ＡＯＳＤ患者におけるＳＮＰ１、６、９および１０ならびに９　ｂｐ挿入のホモ接合性の頻度は６４．２％であり、他方、健康な対照被験者におけるその頻度は３０．４％であった（ｐ＝０．０１３、フィッシャーの直接法による）。ＳＮＰ２、４および５については、ＡＯＳＤ患者における頻度は５７．１％であり、健康な対照被験者における頻度は１４．１％にすぎなかった（ｐ＝０．０００９４、フィッシャーの直接法による）。これらの多型の位置および主要な転写因子認識配列の概略を図１に示す。これらの多型は公知の転写因子認識配列を変化させることも、新たな認識配列をもたらすこともない。
【００９８】
ハプロタイプおよびディプロタイプ形のタイピング。我々は、上記の８個の多型を含むヒトＩＬ−１８遺伝子のハプロタイプをＬＤＳＵＰＰＯＲＴプログラムを用いてタイピングした。我々は３つのハプロタイプＳ０１、Ｓ０２およびＳ０３を同定した。これらはそれぞれ、上記の部位（ＳＮＰ１、２、４、５、６、９および１０）におけるヌクレオチド変化の独特な組み合わせを含んでおり、また９　ｂｐ挿入は持つものと持たないものがあった。各ハプロタイプにおける上記７つのＳＮＰ部位のヌクレオチドおよび９　ｂｐ挿入の有無は以下の通りであった（図２）：
ハプロタイプＳ０１：Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｇ、Ｃ、Ｔおよび　Ａ、　９　ｂｐ挿入有り
ハプロタイプＳ０２：Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｔ、Ｇおよび　Ｃ、　９　ｂｐ挿入無し
ハプロタイプＳ０３：Ｔ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｃ、Ｔおよび　Ａ、　９　ｂｐ挿入有り
ＬＤＳＵＰＰＯＲＴプログラムによって、上記の９　ｂｐ挿入、ＳＮＰ１、ＳＮＰ６、ＳＮＰ９およびＳＮＰ１０は完全な連鎖不平衡の状態にあることが判明した。他方、ＳＮＰ２、ＳＮＰ４およびＳＮＰ５もまた完全な連鎖不平衡の状態にあった。ＡＯＳＤ患者、ＲＡ患者および健康な対照被験者におけるこれら３つのハプロタイプの対立遺伝子頻度を表２にまとめて示す。ハプロタイプＳ０１を担持する頻度はＡＯＳＤ患者において健康な対照被験者よりも有意に高かった（ｐ＝０．０２３、フィッシャーの直接法、ＯＲ＝２．７、９５％　ＣＩ＝１．１７−２．２５）。ＲＡ患者もまた、統計学的に有意な程度ではなかったが、ハプロタイプＳ０１が高い頻度を示す傾向があった（ｐ＝０．０７９、フィッシャーの直接法、ＯＲ＝１．４、９５％　ＣＩ＝０．９７−１．５０）。ディプロタイプ形、すなわち２つのハプロタイプの組み合わせもまたＬＤＳＵＰＰＯＲＴプログラムを用いて各被験者について決定した。Ｓ０１／Ｓ０１というディプロタイプ形の頻度は、ＡＯＳＤ患者において健康な対照被験者（Ｐ＝０．０００９４、フィッシャーの直接法、ＯＲ＝８．１、９５％　ＣＩ＝２．４−２７．２）またはＲＡ患者（Ｐ＝０．０２２６、フィッシャーの直接法、ＯＲ＝４．２、９５％　ＣＩ＝１．３−１２．８）におけるよりも有意に高かった（表３）。ＲＡ患者は、統計学的に有意な程度ではなかったが、Ｓ０１／Ｓ０１というディプロタイプ形が高い頻度を示す傾向があった（ｐ＝０．０６８、フィッシャーの直接法、ＯＲ＝１．９５、９５％　ＣＩ＝０．９７−３．９２）。健常な対照被験者の集団およびＲＡ患者の集団はハーディ−ワインベルグ平衡にあることが判明した。他方、ＡＯＳＤ患者の集団はハーディ−ワインベルグ平衡状態になかった。
【００９９】
【表２】
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【０１００】
【表３】
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【０１０１】
考察
本研究は、ＡＯＳＤ患者に頻繁に存在する、ヒトＩＬ−１８遺伝子のエキソン２の上流に位置する６．７　ｋｂ領域における新規な遺伝的多型を報告する最初の研究である。これらの多型の独特の組み合わせからなる３つのハプロタイプ、すなわちＳ０１、Ｓ０２およびＳ０３もまた決定された。ハプロタイプＳ０１の頻度およびディプロタイプ形Ｓ０１／Ｓ０１の頻度は、ＡＯＳＤ患者において健康な対照被験者およびＲＡ患者におけるよりも有意に高かった。統計学的観点から見ると、Ｓ０１がホモ接合性であることは単にＳ０１ハプロタイプを担持しているよりもＡＯＳＤへの罹病性に関してより重大である。なぜなら前者のｐ値は後者のｐ値よりも小さいからである。ハプロタイプＳ０１を構成する８つの多型のうち、ＳＮＰ２、４および５はＡＯＳＤへの罹病性に関与する重大な多型である。なぜなら、これらの３つのＳＮＰは図２に示すようにハプロタイプＳ０１に特異的だからである。
【０１０２】
本研究の所見は、これらの遺伝的多型はいかにしてＡＯＳＤの発生に寄与するのかという疑問を提起する。第１に、上記のＳＮＰがヒトＩＬ−１８遺伝子のプロモーター領域により高い転写活性を誘導する可能性が考えられる。これらの多型は、プロモーター活性が存在すると報告されているヒトＩＬ−１８遺伝子のイントロン１内に存在している。上記のヌクレオチド置換は新しい転写認識配列を創出しないが、それらは転写因子の認識部位への結合力を変化させ、その結果、不適切なＩＬ−１８　ｍＲＮＡの発現およびタンパク質産生をもたらしうるであろう。それがＡＯＳＤの発生に寄与するのであろう。この現象はヒトＴＮＦ−α遺伝子において観察されている。−３０８にＳＮＰ（ＴＮＦ２）を有するＴＮＦＡプロモーターは、一般的な対立遺伝子（ＴＮＦ１）を有するプロモーターよりもはるかに強力な転写活性を有する（１８）。ＴＮＦ２は、高いＴＮＦ−α産生に関連している、広範なＭＨＣハプロタイプである　ＨＬＡ−Ａ１−Ｂ８−ＤＲ３−ＤＱ２の構成要素である（１８）。これらの遺伝的多型がＩＬ−１８の高産生に直接関与していることを確認するためには、本研究の多型（特にＳＮＰ２、４および５）を含むトランスフェクタントを用いたリポーター遺伝子アッセイを実施しなければならない。第２の可能性は、ハプロタイプＳ０１と連鎖不平衡にある、まだ明らかにされていない遺伝的多型がヒトＩＬ−１８遺伝子の他の領域（コード領域を含む）に存在し、そしてそれらがＩＬ−１８の高発現に寄与するというものである。我々は少数のサンプルを用いて、構成的プロモーター活性（１３）を含む５’ＵＴＲおよびコード領域であるエキソン３から８をすでに調べた。予備検査の結果、我々はハプロタイプＳ０１を有する被験者に新規な遺伝的多型を何ら見いださなかった（データはここに記載していない）。
【０１０３】
ディプロタイプ形Ｓ０１／Ｓ０１を持つことはｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＩＬ−１８の高産生と関連しているかどうかも考えなければならない。我々は１３名のＡＯＳＤ患者のうち血清ＩＬ−１８データが入手できた１０名を対象として、３種類のディプロタイプ形（すなわち２つのＳ０１ハプロタイプを持つもの、１つのＳ０１を持つもの、またはＳ０１を持たないもの）の間でＩＬ−１８の血清濃度を比較したが、それらの間に有意差は検出されなかった。これは、検査した試験集団が小さすぎたためであるかもしれない。上記の遺伝子型が高いＩＬ−１８産生を示す表現型と関連しているかどうかを確かめるため、我々は異なる遺伝子型を有する被験者から得た単球のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＩＬ−１８産生を、最大のＩＬ−１８産生が誘導されるように最適化した条件下で比較するつもりである。ＩＬ−１８の産生は転写、翻訳および翻訳後修飾　　を含む多数のレベルでカスパーゼ１によって調節されるため（１９，２０）、タンパク質レベルにおけるＩＬ−１８産生と上記のディプロタイプ形を相関させるのは難しいかもしれない。
【０１０４】
全身性炎症性疾患の対照として、ＲＡ患者におけるヒトＩＬ−１８遺伝子の遺伝子型もまた決定された。ハプロタイプおよびディプロタイプ形の頻度は、ＲＡ患者と健康な対照被験者との間で差異がなかった。我々は「共有されたエピトープ」と呼ばれるＤＲ抗原を担持するＲＡ患者におけるＳ０１／Ｓ０１ディプロタイプ形の頻度に何ら重大な増大を見いださなかった（データはここに記載していない）。ＲＡ患者から得た滑液中に高濃度のＩＬ−１８が見いだされている（７，２１，２２）。数人の研究者がＲＡ患者においては血清ＩＬ−１８濃度が高いと報告しているが（２１）、ＩＬ−１８濃度は血清中よりも滑液中の方が高いことは一般に認められている（７）。ＩＬ−１８は慢性関節リウマチにおいては疾患に冒された滑膜内でのみ病理学的な作用を果たすのであろう。他方、ＩＬ−１８の全身性の、かつ豊富な産生はＡＯＳＤに特異的なのであろう。これらの現象は、ＡＯＳＤにおいてのみ特定のディプロタイプ形が頻繁に観察されることを示す本研究のデータと一致している。
【０１０５】
要約すると、我々はＡＯＳＤにおけるヒトＩＬ−１８遺伝子のディプロタイプ形の偏り（ｓｋｅｗｉｎｇ）を同定した。このことはＡＯＳＤにおいて異常に高い血清ＩＬ−１８濃度を説明するかもしれない。
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
【発明の効果】
本発明により、ヒトＩＬ−１８遺伝子多型が見出された。この遺伝子多型を調べることにより、成人発症スチル病へのかかりやすさを予測することが可能となる。
【０１０８】
【配列表】
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【０１０９】
【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、ヒトＩＬ−１８遺伝子のエキソン２の上流に位置する６．７　ｋｂ領域のゲノム配列を示す。
【０１１０】
【配列番号２】
配列番号２は、プライマー−６５７４Ｆの核酸配列を示す。
【０１１１】
【配列番号３】
配列番号３は、プライマー−５３６１Ｒの核酸配列を示す。
【０１１２】
【配列番号４】
配列番号４は、プライマー−５８４６Ｆの核酸配列を示す。
【０１１３】
【配列番号５】
配列番号５は、プライマー−４４７３Ｒの核酸配列を示す。
【０１１４】
【配列番号６】
配列番号６は、プライマー−４５３５Ｆの核酸配列を示す。
【０１１５】
【配列番号７】
配列番号７は、プライマー−３５６２Ｒの核酸配列を示す。
【０１１６】
【配列番号８】
配列番号８は、プライマー−３６７５Ｆの核酸配列を示す。
【０１１７】
【配列番号９】
配列番号９は、プライマー−２６３１Ｒの核酸配列を示す。
【０１１８】
【配列番号１０】
配列番号１０は、プライマー−２７８６Ｆの核酸配列を示す。
【０１１９】
【配列番号１１】
配列番号１１は、プライマー−１８９４Ｒの核酸配列を示す。
【０１２０】
【配列番号１２】
配列番号１２は、プライマー−１９８５Ｆの核酸配列を示す。
【０１２１】
【配列番号１３】
配列番号１３は、プライマー−１００４Ｒの核酸配列を示す。
【０１２２】
【配列番号１４】
配列番号１４は、プライマー−１０５８Ｆの核酸配列を示す。
【０１２３】
【配列番号１５】
配列番号１５は、プライマー＋６６Ｒの核酸配列を示す。
【０１２４】
【配列番号１６】
配列番号１６は、プライマー−６５５４Ｆの核酸配列を示す。
【０１２５】
【配列番号１７】
配列番号１７は、プライマー−６１６７Ｆの核酸配列を示す。
【０１２６】
【配列番号１８】
配列番号１８は、プライマー−６１４９Ｒの核酸配列を示す。
【０１２７】
【配列番号１９】
配列番号１９は、プライマー−５７４９Ｆの核酸配列を示す。
【０１２８】
【配列番号２０】
配列番号２０は、プライマー−５４２３Ｆの核酸配列を示す。
【０１２９】
【配列番号２１】
配列番号２１は、プライマー−４８９５Ｒの核酸配列を示す。
【０１３０】
【配列番号２２】
配列番号２２は、プライマー−４９８３Ｆの核酸配列を示す。
【０１３１】
【配列番号２３】
配列番号２３は、プライマー−４５１３Ｒの核酸配列を示す。
【０１３２】
【配列番号２４】
配列番号２４は、プライマー−４３１３Ｆの核酸配列を示す。
【０１３３】
【配列番号２５】
配列番号２５は、プライマー−４１５６Ｆの核酸配列を示す。
【０１３４】
【配列番号２６】
配列番号２６は、プライマー−４１３７Ｒの核酸配列を示す。
【０１３５】
【配列番号２７】
配列番号２７は、プライマー−３６２５Ｆの核酸配列を示す。
【０１３６】
【配列番号２８】
配列番号２８は、プライマー−３１０６Ｒの核酸配列を示す。
【０１３７】
【配列番号２９】
配列番号２９は、プライマー−３２０３Ｆの核酸配列を示す。
【０１３８】
【配列番号３０】
配列番号３０は、プライマー−２６９８Ｒの核酸配列を示す。
【０１３９】
【配列番号３１】
配列番号３１は、プライマー−２７６６Ｆの核酸配列を示す。
【０１４０】
【配列番号３２】
配列番号３２は、プライマー−２３６７Ｆの核酸配列を示す。
【０１４１】
【配列番号３３】
配列番号３３は、プライマー−２２２４Ｒの核酸配列を示す。
【０１４２】
【配列番号３４】
配列番号３４は、プライマー−１９４３Ｆの核酸配列を示す。
【０１４３】
【配列番号３５】
配列番号３５は、プライマー−１７８４Ｒの核酸配列を示す。
【０１４４】
【配列番号３６】
配列番号３６は、プライマー−１６３０Ｆの核酸配列を示す。
【０１４５】
【配列番号３７】
配列番号３７は、プライマー−１３３８Ｆの核酸配列を示す。
【０１４６】
【配列番号３８】
配列番号３８は、プライマー−９９０Ｆの核酸配列を示す。
【０１４７】
【配列番号３９】
配列番号３９は、プライマー−４３７Ｒの核酸配列を示す。
【０１４８】
【配列番号４０】
配列番号４０は、プライマー−５３８Ｆの核酸配列を示す。
【０１４９】
【配列番号４１】
配列番号４１は、プライマー＋４０Ｒの核酸配列を示す。
【０１５０】
【配列番号４２】
配列番号４２は、配列番号１のヌクレオチド−４９１６から−４４７３までの断片を増幅するためのフォワードプライマーの核酸配列を示す。
【０１５１】
【配列番号４３】
配列番号４３は、ＳＮＰ２フォワードプライマーの核酸配列を示す。
【０１５２】
【配列番号４４】
配列番号４４は、ＳＮＰ２リバースプライマーの核酸配列を示す。
【０１５３】
【配列番号４５】
配列番号４５は、ＳＮＰ６フォワードプライマーの核酸配列を示す。
【０１５４】
【配列番号４６】
配列番号４６は、ＳＮＰ６リバースプライマーの核酸配列を示す。
【０１５５】
【配列番号４７】
配列番号４７は、ＳＮＰ２　ｗｔプローブの核酸配列を示す。
【０１５６】
【配列番号４８】
配列番号４８は、ＳＮＰ２　ｖｔプローブの核酸配列を示す。
【０１５７】
【配列番号４９】
配列番号４９は、ＳＮＰ６　ｗｔプローブの核酸配列を示す。
【０１５８】
【配列番号５０】
配列番号５０は、ＳＮＰ６　ｖｔプローブの核酸配列を示す。
【０１５９】
【配列番号５１】
配列番号５１は、配列番号１のヌクレオチド−６３４７から−６２０１までの断片を増幅するためのフォワードプライマーの核酸配列を示す。
【０１６０】
【配列番号５２】
配列番号５２は、配列番号１のヌクレオチド−６３４７から−６２０１までの断片を増幅するためのリバースプライマーの核酸配列を示す。
【０１６１】
【配列番号５３】
配列番号５３は、ＳＮＰ１　ｗｔプローブの核酸配列を示す。
【０１６２】
【配列番号５４】
配列番号５４は、ＳＮＰ１　ｍｔプローブの核酸配列を示す。
【０１６３】
【配列番号５５】
配列番号５５は、ＳＮＰ４　ｗｔプローブの核酸配列を示す。
【０１６４】
【配列番号５６】
配列番号５６は、ＳＮＰ４　ｍｔプローブの核酸配列を示す。
【０１６５】
【配列番号５７】
配列番号５７は、ＳＮＰ５　ｗｔプローブの核酸配列を示す。
【０１６６】
【配列番号５８】
配列番号５８は、ＳＮＰ５　ｍｔプローブの核酸配列を示す。
【０１６７】
【配列番号５９】
配列番号５９は、ＳＮＰ９　ｗｔプローブの核酸配列を示す。
【０１６８】
【配列番号６０】
配列番号６０は、ＳＮＰ９　ｍｔプローブの核酸配列を示す。
【０１６９】
【配列番号６１】
配列番号６１は、ＳＮＰ１０　ｗｔプローブの核酸配列を示す。
【０１７０】
【配列番号６２】
配列番号６２は、ＳＮＰ１０　ｍｔプローブの核酸配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＩＬ−１８遺伝子のエキソン２の上流に位置する６．７　ｋｂ領域および主要な転写因子認識配列を示す概略図である。矢印は７つのＳＮＰおよび１つの９　ｂｐ挿入を含む８つの異なる多型部位を示す。野生型対立遺伝子（Ｓ０２）においては、上記７つのＳＮＰ部位におけるヌクレオチドおよび９塩基挿入（９　ｂｐ挿入）の有無は以下の通りであった：Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｔ、ＧおよびＣ、９　ｂｐ挿入無し。
【図２】８つの新規な多型の独特な組み合せは３つの異なるハプロタイプ、すなわちＳ０１、Ｓ０２およびＳ０３を構成した。上記の９　ｂｐ挿入、ＳＮＰ１、６、９および１０、ならびにＳＮＰ２、４および５は連鎖不平衡の状態にあった。
灰色の四角、突然変異対立遺伝子；白抜きの四角、野生型対立遺伝子；＋、９　ｂｐ（ＡＡＣＡＧＧＡＣＡ）が挿入されている；−、９　ｂｐが挿入されていない。
【図１】
2004049136.tif 000048
【図２】
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