(57)【要約】【課題】本発明の課題は、石灰化促進因子、特にＤＭＰ１由来のペプチドのうち有効なエピトープ配列を特定し、これを使い抗体を作成し、さらにその抗体を使った新規な測定・診断方法を提供することにある。【課題を解決するための手段】ＤＭＰ１由来の種々のペプチドを作成し、その免疫原性を検討し、得られたペプチドを使って抗体を作成し、さらにはこの抗体の有用性を種々検討した。その結果、本発明で特定されたペプチドを使って作製した抗体は、ヒトを含めた哺乳類のＤＭＰ１分子を極めて特異的に、かつ高感度に認識することを証明し、次に、ヒトの骨軟化症を引き起こす腫瘍や骨粗鬆症などの代謝性骨疾患の診断に有効であることを見出し、本発明を完成した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下から選らばれるポリペプチド；
１）配列番号１のペプチド。
２）配列番号１の少なくとも５つの配列を含む免疫原性を維持したペプチド。
３）配列番号１のペプチドの少なくとも１のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されているが、配列番号１のペプチドと実質的に同一の免疫原性を維持したペプチド。
【請求項２】
配列番号１のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項３】
請求項２の抗体を使った免疫学的測定方法。
【請求項４】
腫瘍誘導性骨軟化症（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ）又は骨粗鬆症などの骨代謝疾患の検査に使用する請求項３の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、骨の石灰化促進因子であるＤＭＰ１（Ｄｅｎｔｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）由来の免疫原を保持したポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、及びその抗体を利用した免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨、象牙質及びセメント質は、細胞外マトリックスにリン酸カルシウムが沈着し、石灰化したものである。該細胞外マトリックスは、主にコラーゲンであるが、非コラーゲン性マトリックスも含まれ、非コラーゲン性マトリックスの殆どは酸性リン酸化蛋白質である。該コラーゲン線維はハイドロキシアパタイト結晶の沈着する足場として機能し、酸性リン酸化蛋白質は細胞外マトリックスの石灰化に関与すると考えられてきた。組み換えＤＮＡ技術で同定された該酸性リン酸化蛋白質は、最初ＡＧ１と名づけられ（非特許文献１）、後にＤＭＰ１と変更された（非特許文献２）。ＤＭＰ１のｃＤＮＡクローンは、ラットの歯のｃＤＮＡライブラリーから同定され、歯の象牙質に特異的であると考えられていたが（非特許文献３）、後に他の石灰化組織にも発現することが示された。
最近、本発明者は、歯の形成能を欠失した動物種である鳥類のゲノム中にもＤＭＰ１  遺伝子が存在し、骨組織に特異的にＤＭＰ１遺伝子の発現がある事から、ＤＭＰ１は骨組織で重要な働きがある事を示唆した（非特許文献４）。さらに、本発明者は、ＤＭＰ１遺伝子が骨組織ではその動物種に関係なく石灰化した骨マトリックス中の骨細胞に特異的に発現し、その蛋白は骨細胞周囲の骨マトリックスに分布する事を見い出した（非特許文献５）。
一方、腫瘍誘導性骨軟化症は、ＭｃＣａｎｃｅ  ＲＡにより見出された疾患であり（非特許文献６）、骨痛、骨折、筋力低下、全身疲労などの重篤な症状を引き起こすにもかかわらず、これらを引き起こす腫瘍本体は非常に小さく、多彩な組織像を示すため、その同定が困難で、その特異的な検出方法は報告されていない。そのため、診断がおくれたり、筋神経疾患と誤診されたり、治療が後手に回ることとなっていた。
【０００３】
【先行技術】
【非特許文献１】Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ１９９３；２６８：１２６２４−１２６３０
【非特許文献２】Ｊ．  Ｈｉｓｔｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １９９４；４２：１５２７−１５３１
【非特許文献３】Ｊ．  Ｈｉｓｔｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  １９９４；４２：１５２７−１５３１
【非特許文献４】Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０００；  ４８：１６０−１６６
【非特許文献５】Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；１６：２０１７−２０２６
【非特許文献６】Ｑ．Ｊ．  Ｍｅｄ  １９４７；１６：３３−４６
【０００４】
【発明の解決すべき課題】
本発明の課題は、骨軟化症を引き起こす腫瘍が高率に発現するＤＭＰ１に由来するペプチドのうち有効なエピトープ配列を特定し、これを使い抗体を作成し、さらにその抗体を使った新規な測定・診断方法を提供することにある。特に、腫瘍誘導性骨軟化症の判定マーカーとしてＤＭＰ１由来の特定ペプチドが極めて有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、ＤＭＰ１由来の種々のペプチドを作成し、その免疫原性を検討し、得られたペプチドを使って抗体を作成し、さらにはこの抗体の有用性を種々検討した。その結果、本発明で特定されたペプチドを使って作成した抗体は、骨軟化症を引き起こす腫瘍の判定に極めて有効であることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、以下よりなる。
１．以下から選らばれるポリペプチド；
１）配列番号１のペプチド。
２）配列番号１の少なくとも５つの配列を含む免疫原性を維持したペプチド。
３）配列番号１のペプチドの少なくとも１のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されているが、配列番号１のペプチドと実質的に同一の免疫原性を維持したペプチド。
２．配列番号１のポリペプチドを認識する抗体。
３．前項２の抗体を使った免疫学的測定方法。
４．腫瘍誘導性骨軟化症、又は骨粗鬆症などの骨代謝疾患の検査に使用する前項３の方法。
【０００７】
【発明の実施の態様】
ＤＭＰ１遺伝子は公知の遺伝子であり、ヒトを含む１０種の動物からＤＭＰ１の配列が報告されている。そのアミノ酸配列及び遺伝子配列は、豊澤等による「Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  １９９９；４８：１６０−１６６，  Ｇｅｎｅ  １９９９；２３４：３０７−３１４，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０００；５０：３１−３８など」に開示され、アミノ酸数４００〜５５０個の細胞外マトリックス蛋白質であって酸性蛋白質である。アミノ酸配列の比較から、全ての種のＤＭＰ１は１６−２１個のアミノ酸を含む疎水性リーダー配列で始まる。細胞接着性のペプチドＲＧＤモチーフはＤＭＰ１分子特異的ではないが、多くの他の酸性リン酸化蛋白質、例えばオステオポンチン、骨シアロ蛋白質、及び象牙質シアロリン酸化蛋白質に存在することが確認されている。Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列は厳格に哺乳動物のＤＭＰ１配列で保存され、その重要な生物学的機能をもつことが示唆されている。また、ＤＭＰ１配列のＣ末端部も哺乳動物間で厳格に保存されており、ＤＭＰ１のＣ末端部の重要性な生物学的機能が示唆されている。
【０００８】
本発明のＤＭＰ１由来のペプチドは、上記のごとく、重要な生物学的機能が示唆されたＤＭＰ１のＣ末端部の１５個のアミノ酸配列（配列表の配列番号１；  ＤＡＹＨＮＫＰＩＧＤＱＤＤＮＤ）（なお以下ペプチドＣ又はペプチド１と称することもある）として示される。ＤＭＰ１のＣ末端側のアミノ酸配列は、ＤＭＰ１の免疫原としてのエピト−プ配列として有用であり、げっ歯類からウシやヒトまでの哺乳類に共通の配列を示している。しかし、これまでにこの部位でのその有用性は認識されていなかった。本発明において有用なペプチドは、必ずしもこの配列に限定されない。当業者であれば、自体公知の手法により、適宜少なくとも３個、好ましくは５個のペプチドを合成して利用可能である。該ペプチドを構成するアミノ酸は、必ずしもＤＭＰ１のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一である必要はなく、該ペプチドと同様の免疫原としての機能を有するものであれば、該ペプチドのアミノ酸配列に、適宜、欠失、置換、付加、挿入などの変異を導入したペプチドであってもよい（以下、等価ペプチドと呼ぶこともある）。
【０００９】
本発明では、上記のようなペプチドを認識する抗体が調製される。該抗体は例えば配列番号１のペプチドに対する抗体である。抗体は、抗原性ポリペプチドによって、アジュバンドの存在下または不存在下で、  単独でまたは担体に連結して、細胞性応答および／または体液性応答による誘導によって調製される。
抗原性ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列より設計される。通常５個程度のアミノ酸からなる断片が抗原性領域を特徴付けていることから、配列番号１の配列を中心として、少なくとも５個のアミノ酸配列を抗原性ポリペプチドとする。小さすぎて免疫原性が十分でない場合には，このポリペプチドを，適当な担体に結合させればよい。
このような結合を得るための多くの方法が当該分野で公知であり、  それには、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手されるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）  およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）  を用いてジスルフィド結合を形成する方法が包含される〔例えばＩｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．（１９８２）６２：１８５〕。担体としては、  それ自身が宿主に対して有害な抗体の生産を誘導しないものであれば、いずれの担体も用いられ得る。適当な担体は、典型的には、タンパク、多糖体、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体および不活性ウイルス粒子がある。特に有用なタンパク質には、  血清アルブミン、  キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、  チログロブリン、卵アルブミン、  テタヌス毒素  および当業者に公知の他のタンパクがある。
【００１０】
（抗体の調製）
調製された免疫原性ポリペプチドは、ポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体を生産するのに用いられる。ポリクローナル抗体が所望であれば、免疫原性ポリペプチドを用いて、  選択された哺乳動物（例えば、  マウス、  ウサギ、ヤギ、ウマなど）を免疫する。免疫された動物から得られた血清を回収し、公知の方法によって処理する。ポリクローナル抗体を含有する血清が所望以外の抗原に対する抗体を含んでいる場合には、このポリクローナル抗体は免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクローナルな抗血清を生産し、  加工処理する方法は、  当該分野では公知である。  例えばＭａｙｅｒ  およびＷａｌｋｅｒ（１９８７）：ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ）。
モノクローナル抗体もまた、当業者により容易に生産され得る。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を調製する一般的な方法は公知である。永久増殖性の抗体産生細胞系は細胞融合によって調製することができる。さらに、腫瘍原性ＤＮＡ  を用いたＢリンパ球の直接形質転換、  あるいはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスを用いたトランスフェクションのような他の方法によってもまた調製することができる。例えば、  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６０：１１５３．Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，  Ｍ．ら（１９８０）；  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６２：１６７．Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）；Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊ．  ２９５：９４６．Ｋｅｎｎｅｔｔ  ら（１９８０）。また、ヒトの疾患の診断・治療に使用可能なように、これらのモノクローナル抗体をヒト化することをも含む。
【００１１】
形成されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、  いずれも特に配列番号１の配列の一部を認識可能な抗体であり、抗原抗体反応性においてすぐれている。本発明で得られる抗体は、実験例に示すようにＤＭＰ１の他の配列部位、公知の配列部位に比してより特異的で、かつ、高い免疫反応性を有するものである。さらに、げっ歯類からウシやヒトまでの哺乳類に共通のＤＭＰ１配列を認識する。その結果、本発明で得られる抗体は、ＤＭＰ１をマーカーとする各種診断において有用である。
【００１２】
（イムノアッセイおよび診断用キット）
本発明の配列番号１のペプチドを認識する抗体は、  イムノアッセイにおいて、  生物学的試料におけるＤＭＰ１の存在を検出するために有用である。このイムノアッセイの設計は多くの変更を行うことが可能であり、これらアッセイの多様性については当該技術分野では既知である。このイムノアッセイでは、例えば、ＤＭＰ１のエピトープに対する１種のモノクローナル抗体、異なるＤＭＰ１に対する複数のモノクローナル抗体、同一のＤＭＰ１のエピトープに対するポリクローナル抗体、  あるいは異なるＤＭＰ１に対するポリクローナル抗体が使用され得る。プロトコールは、例えば、競合分析法、直接反応タイプ分析法、あるいはサンドイッチタイプ分析法を基本とすることができる。このプロトコールでは、また、固体支持体を用いるか、あるいは免疫沈澱法でも可能である。ほとんどのアッセイは標識化抗体あるいはマーカーポリペプチドの使用を含む。この標識物には、例えば、螢光分子、化学発光分子、放射性分子、あるいは色素分子がある。このプローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知である。その例としては、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンを利用するアッセイ、および酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ（例えば  ＥＬＩＳＡ  アッセイ）がある。
【００１３】
免疫診断用標識された試薬を有するキットは、適切な材料を適当な容器中に包装することによって得られる。この適切な材料には、標準ＤＭＰ１、あるいは配列番号１のペプチドを認識する抗体が含まれる。このキットは、アッセイを実施するのに必要な残りの試薬および材料と、さらにアッセイの指示書の適当なセットとを含む。
【００１４】
ＥＬＩＳＡ  法は、抗原もしくは抗体のいずれかの濃度を測定するのに利用され得る。この方法は、酵素と、抗原もしくは抗体との結合に依存し、定量の標識として、結合した酵素の活性を用いる。ＤＭＰ１を測定するには、本発明の抗体を固相（例えば、マイクロプレートまたはプラスチック製カップ）に固定し、被検血清の希釈物とともにインキュベートし、固相を洗浄し、酵素で標識した抗体とともにインキュベートし、再び洗浄する。標識化するために好適な酵素は、当該技術分野で公知であり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼがある。固相に結合した酵素活性は、特異的な基質を添加し、そして生成物の生成または基質の利用率を比色法で測定し抗原濃度に換算される。
【００１５】
免疫染色法は、本発明の抗体を適当な標識物質で修飾し、生体内又は生体外で組織及び／又は細胞と接触させ、抗原抗体反応をえて、標識物質を目印にしてＤＭＰ１の組織及び／又は細胞の存在を確認する方法である。
【００１６】
以上のような測定法によって、本発明では、本発明で提供する抗体を利用する測定系が、骨軟化症を引き起こす腫瘍を特異的に検出すること、又は骨粗鬆症などの骨代謝疾患の診断が可能であることを見出した。実験例は、ヒトから得た組織の免疫染色図を示すが、本測定系の有用性を示唆するものである。
【００１７】
実施例
以下、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
（実施例１）
（配列表の配列番号１、２、３のペプチドを認識する抗体の作成）
配列番号１：ＤＡＹＨＮＫＰＩＧＤＱＤＤＮＤ  （４９４−５０８）  （ｐｅｐｔｉｄｅ  １）
配列番号２：ＴＲＹＱＮＮＥＳＥＤＳＥＥ  （２０−３２）  （ｐｅｐｔｉｄｅ  ２）
配列番号３：ＳＧＤＤＴＦＧＤＤＤＳＧＰＧＰＫＤＲＱＥＧＧ  （１０９−１３０）  （ｐｅｐｔｉｄｅ  ３）
配列番号１、２、３のペプチドを固相法により常法どおり合成し、このオリゴペプチドを抗原として、アジュバントとともにニュージーランドホワイト種のウサギに免疫して抗血清を得た。得られた抗血清は、プロティンＡと配列番号１、２、３のＤＭＰ１ペプチドを各結合させたアフィニティーカラムによって精製した。なお、上記４９４−５０８、２０−３２、１０９−１３０はＤＭＰ１ペプチドのアミノ酸番号を意味する。なお、配列番号１のペプチドをペプチドＣ又はペプチド１と称することもある。
【００１８】
（試験例）
【００１９】
Ａ．材料と方法
【００２０】
１．抗体の生産
ＤＭＰ１残基の「ＤＡＹＨＮＫＰＩＧＤＱＤＤＮＤ」をコードするペプチド１配列（配列番号１）は、ヒト、ウシ、ラットそしてマウスのＤＭＰ１のＣ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌｓ）のアミノ酸配列と共通する（図１）。各ペプチド１、２、３は、ＡＢＩ４３３Ａペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により、ＮＨ２末端にシステインを付加して調製した。合成ペプチドの純度は高速液体クロマトグラフィーとアミノ酸分析により確認した。システイン化した各ペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）と共有結合させ、透析した。結合又は非結合ペプチドの混合物を、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏ．，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  Ｇａ，  ＵＳＡ）と混合し、ニュージーランドホワイトラビットに皮下注射し、その後、２回の追加免疫を行った。各抗血清の抗体価の評価は、各ＤＭＰ１ペプチドをコートしたマイクロプレートを用い、ＥＬＩＳＡ法で測定した。次に、各ＤＭＰ１ペプチドに対する抗ＤＭＰ１抗血清を、各ペプチドを結合させたＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ，  ＵＳＡ）よりアフィニティー精製した。
【００２１】
２．免疫ブロット
上記アフィニティー精製を行った各ＤＭＰ１ペプチドに対する抗ＤＭＰ１抗体を、組換えラットＤＭＰ１（非特許文献５）を用いたウエスタン・ブロットに使用した。組換えラットＤＭＰ１をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動上で展開し、セミドライ・トランスファーシステム（Ｎｉｈｏｎ  Ｅｉｄｏ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を使用してポリビニリデンジフルオロイド（ＰＶＤＦ）トランスファーメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ．，  ＵＳＡ）に移した。メンブレンを、５％のウシ血清アルブミンと０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝生理食塩水で、１時間ブロックし、希釈度１：１００００で抗ＤＭＰ１抗体と共に一晩インキュベートした。１：１０００に希釈したビオチニン化ブタ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，  Ｇｌｏｐｓｔｒｕｐ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）を反応後、１：５００に希釈したアルカリ性ホスファターゼ結合ストレプトアビジン  （Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と共にインキュベートし、その後ＮＴＢ（ｎｉｔｏｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｒｏｒｉｄｅ）／ＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｒｏｔｋｒｅｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で３０分間発色した。
【００２２】
３．検査症例
本実験では、腫瘍誘導性骨軟化症を引き起こす腫瘍の３症例を検討した。症例１は、５４歳の女性で、骨の疼痛と筋肉の衰弱を訴えて当病院に入院した。患者は左臀部に小さな皮内腫瘍があり、低リン血症性骨軟化症（ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ  ｏｓｔｅｏｍｌａｃｉａ）の典型的な特徴を示した。他の２症例の臨床経過も、低リン血症性骨軟化症の典型的な特徴を示した（Ｐａｔｈｏｌ  Ｉｎｔ．  １９９６；  ４６：２３８−２４１）（Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｍｅｔａｂ  ２００１；  １９：６１−６４）。これら３症例の血清リン酸値レベルは、手術による腫瘍の除去後、正常に回復した。また、病理組織検査の結果、３症例の腫瘍は、血管周皮腫様（ｈｅｍａｎｇｉｏｐｅｒｉｃｙｔｏｍａ−ｌｉｋｅ）の組織像を呈していた。これらの３症例とともに、組織学的に類似する腫瘍として、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、滑膜肉腫（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、悪性神経鞘腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｓｈｗａｎｎｏｍａ）などについても検討を行った（表１）。
【００２３】
４．組織サンプルと免疫組織化学的分析
使用した組織は、大阪大学大学院医学系研究科臨床調査合同委員会のガイドラインに従って得たものである。これらのサンプルは、１０％中性ホルマリンで固定し、通法によりパラフィン包埋した。陽性コントロールとして、ヒトとラットの正常の骨組織を使用した。５μｍの厚さに切断した組織切片は、ペルオキシダーゼ法で免疫染色〔Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  （ＡＢＣ）  ｍｅｔｈｏｄ〕し、その一部はヘマトキシリン・エオジン染色を行った。骨組織のサンプルは、中性ホルマリンで固定後、１０％ＥＤＴＡ溶液中で、４℃で７日間攪拌し、脱灰した。処理後、骨組織サンプルを洗浄し、パラフィン包埋した。５μｍの厚さに切断した組織切片は、抗ＤＭＰ１抗体及び他の各種市販抗体（ビメンチン、ＣＤ３４、Ｆ−ＸＩＩＩ等に対する抗体。表２及び３）を用いて、ペルオキシダーゼ法で免疫染色（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  （ＡＢＣ）  ｍｅｔｈｏｄ）を行い、その一部はヘマトキシリン・エオジン染色を行った。各一次抗体に対する抗原賦活法、希釈、及び販売元は表２に示した。免疫染色後、核染色をメチルグリーンにて行った。また、ネガティブコントロールには、正常ウサギ又はマウスＩｇＧ血清（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を一次抗体として用い、陰性反応を確認した。
【００２４】
Ｂ．結果
【００２５】
１．各抗ＤＭＰ１ペプチド抗体の特徴
ＥＬＩＳＡ法で、ＤＭＰ１ペプチド１、３に対する抗血清には抗体価の上昇を認めたが、ペプチド２に対する抗体価の上昇は認められなかった。そこで、ＤＭＰ１ペプチド１及び３に対する抗血清を、各々のＤＭＰ１ペプチドを結合させたカラムでアフィニティー精製した。次に、アフィニティー精製した各々の抗ＤＭＰ１抗体を、ウエスタン・ブロットにて、組換えラットＤＭＰ１と反応させた。その結果、ＤＭＰ１の分子量に一致する１００ｋＤａのシングルバンドが検出できることを確認した（図２Ａのレーン３と４）。また、該抗体の代わりに正常血清を用いるとその反応は見られなかった（図２Ａのレーン５と６）。さらに、該抗体を各々のＤＭＰ１ペプチドで吸収すると、１００ｋＤａのシングルバンドが消失することを確認した。
次に、各々の抗ＤＭＰ１抗体を用いて、ラットとヒトの骨組織サンプルを免疫組織染色することにより、骨細胞周囲の骨マトリックスに陽性反応が認められ（図２Ｂ，２Ｃ）、これらの結果は、すでに報告したラット骨組織におけるＤＭＰ１分布と一致していた（Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；１６：２０１７−２０２６）。なお、抗ＤＭＰ１（ペプチド１）抗体は、極めて特異的に骨細胞周囲の骨マトリックスのみに陽性反応を示すのに対し、抗ＤＭＰ１（ペプチド３）抗体は、筋肉組織にも弱い陽性反応を示した。ゆえに、抗ＤＭＰ１（ペプチド１）抗体は、ラットと同様にヒトのＤＭＰ１分子を極めて特異的に認識することが証明された。
【００２６】
２．臨床病理学的特徴
３症例の骨軟化症を引き起こす腫瘍は、すべてｍｉｘｅｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｕｍｏｒｓに分類され、悪性血管周皮腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｅｍａｎｇｉｏｐｅｒｉｃｙｔｏｍａｓ）に類似の組織像を示した（Ｃａｎｃｅｒ  １９８７；  ５９：１４４２−１４５４）（図３Ａ１〜図３Ｃ１、図４Ａ１〜図４Ｅ１）。
【００２７】
３．骨軟化症を引き起こす腫瘍及び他の腫瘍の免疫組織化学的プロファイル
骨軟化症を引き起こす腫瘍及び他の腫瘍の免疫組織化学的プロファイルを表３に示した。骨軟化症を引き起こす腫瘍の免疫組織化学的プロファイルは、悪性血管周皮腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｅｍａｎｇｉｏｐｅｒｉｃｙｔｏｍａｓ）のものと類似しており、ビメンチン、ＣＤ３４、Ｆ−ＸＩＩＩａに対する抗体について陽性反応を示した（表３；図３Ａ３〜図３Ｄ３  ）。しかし、ＤＭＰ１発現については、骨軟化症を引き起こす腫瘍では強いＤＭＰ１発現がＤＭＰ１（ペプチド１）抗体によって観察されたのに対し（図３Ａ２〜図３Ｃ２）、悪性血管周皮腫ではその発現は認められなかった（図３Ｄ２）。さらに、検討した他のいずれの腫瘍（表３）にもＤＭＰ１発現はＤＭＰ１（ペプチド１）抗体によって認められなかった。ゆえに、ＤＭＰ１は骨軟化症を引き起こす腫瘍を同定するのに極めて有効なマーカーであり、ＤＭＰ１（ペプチド１）抗体が有効な試薬になりうることが証明された。
【００２８】
４．骨軟化症を引き起こす腫瘍におけるＤＭＰ１の分布
次に、腫瘍におけるＤＭＰ１の詳細な分布をＤＭＰ１（ペプチド１）抗体を使って検討した。ＤＭＰ１は、腫瘍細胞周囲の細胞外基質にその分布が認められた（図４Ａ〜４Ｃ）。粘液腫様の間質や多数の毛細血管を含む領域の間質には、多量の顆粒状ＤＭＰ１沈着物が認められた（図４Ａと４Ｂ）。また、異栄養性石灰化部にもＤＭＰ１の分布が認められた（図４Ｃ）。小嚢胞状の変性所見を示す領域では、ＤＭＰ１は腫瘍細胞の核近傍の細胞質内に分布しているのが認められた（図４Ｄと、図４Ｄの差込図）。
【００２９】
【発明の効果】
本発明のＤＭＰ１（ペプチド１）抗体は、ＤＭＰ１由来の抗体として従来にない高い免疫反応性を保持し、さらにＤＭＰ１に対する反応性において極めて高い特異性を保持している。そして、この抗体は、骨軟化症を誘導する腫瘍の診断に極めて有用な手段になりうることを見い出した。
本発明者が証明したのは、通常の病理組織切片をＤＭＰ１（ペプチド１）抗体を使って免疫組織化学的染色法で検討すると、骨軟化症を引き起こす腫瘍はＤＭＰ１陽性反応を示すのに対し、その他の腫瘍はＤＭＰ１には反応を示さないということである。一方、従来から病理診断に有用とされていたＣＤ３４やＦ−ＸＩＩＩａのマーカーは、悪性血管周皮腫や悪性線維性組織球腫の両者にも陽性反応を示すことから、ＣＤ３４やＦ−ＸＩＩＩａは、骨軟化症を引き起こす腫瘍を同定することができない。ゆえに、ＤＭＰ１は他の腫瘍から骨軟化症を引き起こす腫瘍を診断するのに唯一の診断マーカーとなること、及びＤＭＰ１（ペプチド１）抗体が唯一の診断試薬となることが判明した。
腫瘍誘導性骨軟化症の臨床症状は重篤にもかかわらず、腫瘍本体は非常に小さく、体のどこにでも発生する腫瘍であり、しかも多彩な病理組織像を示すため、その同定が臨床的にも病理学的にも非常に困難である。腫瘍細胞で生産されたＤＭＰ１は、腫瘍細胞内にも分布するが、主に腫瘍細胞周囲の細胞外基質に蓄積される。そこで、ＤＭＰ１（ペプチド１）抗体をヒト化し標識化することにより、腫瘍の細胞外基質に蓄積したＤＭＰ１を明確に認識でき、患者の本腫瘍の位置を同定できる。また、外科切除の際、本腫瘍とその周囲の結合組織の境界が明らかではなく、病理診断によるセーフティー・マージンの判定はほとんど不可能である。そこで、外科切除後の本腫瘍の残存が問題になるが、病理組織切片におけるＤＭＰ１（ペプチド１）抗体によるＤＭＰ１の免疫組織化学的検討により、本腫瘍のセーフティー・マージンを判定することが可能である。
また、ヒトなどの哺乳動物の正常の骨組織では、ＤＭＰ１は骨細胞周囲の骨基質にのみ分布するが、骨軟化症などの骨代謝疾患ではＤＭＰ１の分布が異常になることが分かっている。ゆえに、骨粗鬆症などの骨代謝疾患の骨組織サンプルをＤＭＰ１（ペプチド１）抗体を使いＤＭＰ１の免疫組織化学的染色法で検討することにより、その疾患の診断や病状の把握に有効であると考えられる。
さらに、ＤＭＰ１はウエスタン・ブロットにより正常のヒト血清中にもその存在を確認することができる（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２；  ２７７：１３７００−１３７０８）。同様に、腫瘍誘導性骨軟化症の患者血清中のＤＭＰ１レベルをＤＭＰ１（ペプチド１）抗体で測定することにより、ＤＭＰ１は腫瘍誘導性骨軟化症を診断する血清マーカーにもなりうる。同様に、骨軟化症などの骨代謝疾患ではＤＭＰ１の分布が異常になることから、ＤＭＰ１は骨粗鬆症などの骨代謝疾患を診断する血清マーカーになり、ＤＭＰ１（ペプチド１）抗体は診断試薬にもなりうる。
以上述べたように、本発明は、腫瘍誘導性骨軟化症や骨粗鬆症などの骨代謝疾患の新規の診断ツールを開発するのに有用であると考えられる。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
【表２】
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【００３２】
【表３】
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【００３３】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト、ウシ、ラット、及びマウスのＤＭＰ１のアミノ酸配列アラインメントを示す。囲みのある配列（ペプチドＣ）は、ヒト、ウシ、ラット、及びマウスのＤＭＰ１配列のＣ末端で、抗ＤＭＰ１抗体作製に使用される。アスタリスク（＊）はアラインメントギャップを示す。アミノ酸残基はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ一文字コードで示される。
【図２】抗ＤＭＰ１（ペプチド１）抗体の特徴を示す。
（Ａ）：レーン１、２は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で生産された組換えラットＤＭＰ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  （７％）を示す。レーン３−６は、抗ＤＭＰ１（ペプチド１）抗体による組換えラットＤＭＰ１のウエスタン・ブロット解析を示す。レーン１は組換えＤＭＰ１−ＧＳＴ融合タンパク質を示す。レーン２はＰｒｅＳｃｉｓｓｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅで消化した後の組換えＤＭＰ１を示す。組換えＤＭＰ１−ＧＳＴ融合タンパク質（レーン３）、そして組換えＤＭＰ１タンパク質（レーン４）は、アフィニティー精製した抗ＤＭＰ１（ペプチド１）抗体により検出されるが、いずれの組換えタンパク質も免疫前血清（レーン５、６）では検出されない。
（Ｂ）（Ｃ）：ラットとヒトの正常の骨組織におけるＤＭＰ１の免疫組織化学的検出（下図）を示す。生後１５日目のラット（下左図）、および胎生２３週目のヒト胎児（下右図）の骨幹端部海面骨組織において、抗ＤＭＰ１（ペプチド１）抗体は、骨細胞と骨細管を含む周囲の骨基質に陽性反応を示す。メチレングリーン対比染色である。
【図３】骨軟化症を引き起こす腫瘍及びその他の腫瘍の免疫組織化学的プロファイルを示す。各横列は、Ｈ＆Ｅ染色した切片  （Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１）（最上段列）、ＤＭＰ１（Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２）（中段列）そしてＣＤ３４（Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、Ｄ３）の免疫組織化学的発現を示す。各縦列は、腫瘍の連続切片でのＤＭＰ１とＣＤ３４発現の免疫組織化学的パターンを示す。各々の縦列の「Ａ１〜Ａ３とＢ１〜Ｂ３とＣ１〜Ｃ３」は、骨軟化症を引き起こす腫瘍の各々の症例１〜３の写真に代わる図面を示す。縦列の「Ｄ１〜Ｄ３」は悪性血管周皮腫の写真に代わる図面を示す。「Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１」はＨ＆Ｅ染色、「Ａ２〜Ａ３、Ｂ２〜Ｂ３、Ｃ２〜Ｃ３、Ｄ２〜Ｄ３」はメチルグリーン対比染色である。骨軟化症を引き起こす腫瘍（Ａ、Ｂ、Ｃ）  では、ＤＭＰ１の免疫反応は腫瘍細胞や血管細胞周囲の間質に観察される。ＣＤ３４免疫反応も腫瘍細胞に観察される。悪性血管周皮腫  （Ｄ）  では、ＣＤ３４  免疫反応が腫瘍細胞に観察されるが、ＤＭＰ１免疫反応は全く観察されない。
【図４】骨軟化症を引き起こす腫瘍におけるＤＭＰ１の免疫組織化学的分布を示す。左欄の「Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１」は、Ｈ＆Ｅ  染色された切片であり、右欄の「Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２」はその連続切片でＤＭＰ１の免疫組織化学的発現部位を示す。「Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１」はＨ＆Ｅ染色、「Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２」はメチルグリーン対比染色を示す。
骨軟化症を引き起こす腫瘍におけるＤＭＰ１の分布パターンは多彩である。Ａでは、粘液腫様間質領域には、ＤＭＰ１の顆粒状沈着物が多量に蓄積している。Ｂでは豊富な毛細血管を有する領域では、ＤＭＰ１の顆粒状沈着物が毛管血管周囲の間質に蓄積している。  Ｃでは、異栄養性石灰化部にＤＭＰ１の免疫反応が観察される。  Ｄでは、小嚢胞の変性所見の見られる領域ではＤＭＰ１は腫瘍細胞内の核近傍に分布する。その拡大図を  Ｄ２の差込図に示す。
【００３４】
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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