(57)【要約】【課題】臓器移植時の拒絶反応の抑制等に使用できる副作用の少ない免疫抑制剤を提供する。【解決手段】抗原性タンパク質を特異的に認識する、ヒストンＨ１に対する抗体を含有する免疫抑制剤を用いて、臓器移植に伴う拒絶反応等の状態を治療または予防するために哺乳動物の免疫を抑制する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンＨ１に対する抗体を含有する免疫抑制剤。
【請求項２】
前記ヒストンＨ１に対する抗体が抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載の免疫抑制剤。
【請求項３】
前記ヒストンＨ１がヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載の免疫抑制剤。
【請求項４】
移植免疫抑制に適用されることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の免疫抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫抑制剤に関する。さらに、詳しくは、本発明はヒストンＨ１に対する抗体を含有する、免疫抑制（特に、移植免疫抑制）に有用な薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臓器移植の外科的技術が著しく向上した現在、臓器移植手術の成否は術後の移植拒絶反応をいかにして制御できるかにかかってきている。拒絶反応は、移植片を生体が異物と認識し、それを排除するために一連の免疫反応が惹起されることにより生じる。これらの免疫反応を抑制するために、臨床上、従来から用いられている免疫抑制剤としては、ステロイド剤（例えば、プレドニゾロン）、代謝拮抗剤（例えば、アザチオプリン、ミゾリビン）、抗生物質（例えば、シクロスポリンＡ、タクロリムス）等が挙げられる。これら薬剤の登場により、腎、心、肝臓移植はすでに一般医療として定着し、肺、膵、小腸移植は、成績向上に伴い次第に普及しつつある（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、これら薬剤には、少なからぬ副作用があり、例えばステロイド剤は、他の免疫抑制剤と比較して、幅広い作用を有するが、免疫抑制作用は一般に弱く、長期連続投与により有効性の減少や抵抗性の発現が見られることがある。アザチオプリンは、核酸合成を阻害することにより、免疫抑制効果を発揮するが、その使用は細菌などの感染症発症の危険性を増大させ、また、骨髄抑制作用（白血球減少・血小板減少・貧血）と肝臓障害を引き起こすことがある。ミゾリビンは、アザチオプリンと比べ、骨髄抑制作用と肝臓障害が少ないという利点を持つ反面、免疫抑制効果がそれほど高くない。シクロスポリンＡ、タクロリムスは、きわめて強力な免疫抑制活性を持ち、臓器移植の成績向上に貢献した薬剤である。しかしながら、これらには、重篤な中枢神経毒性、腎毒性等があることが明らかとなり、その使用に際しては、細心の注意が必要とされる（非特許文献２）。
【０００４】
一方、臓器移植において、肝臓はきわめて特異な臓器として注目されている。それは、ある種の異系動物間の組み合わせにおいて、同所性肝移植が免疫抑制剤の投与なしに成功することが示されてきたためである（非特許文献３）。これとは別に、肝炎等の肝細胞障害時には免疫抑制状態になることから、障害肝や再生肝が免疫抑制物質を産生しているのではないかと考えられた（非特許文献４）。
【０００５】
このような考えのもと、現在までに数種類の免疫抑制タンパク質が報告されているが、以下にその例を示す。
【０００６】
（Ｌ―アルギナーゼ）
肝細胞内より分離されたＬ―アルギナーゼは、肝が障害を受けた際に血中に放出されると考えられた免疫抑制タンパク質である。大量に放出されたＬ―アルギナーゼは、Ｌ―アルギニンを消化してＬ―オルニチンと尿素を生成させ、体内でアルギニン欠乏状態を作り出し、リンパ球の活発な増殖を抑えるものと考えられる（非特許文献５および特許文献１）。しかし、一方で、アルギニンを加えることによりこの状態は改善されることから、個々の細胞でアルギニン供給量の異なる生体で、例えば、アルギニン供給能の高い肝臓で、長期にわたり拒絶反応を抑制することができるかに疑問点がある。また、大量にアルギニンを消化させることは、同時に大量の尿素を生成させるため、臨床上問題のある高窒素血症を生じさせ、投与が長期にわたれば、腎不全を引き起こす可能性が示唆されている（非特許文献６）。
【０００７】
（超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ））
この物質は、肝細胞より分泌され血清中に出てくるものと考えられている。ＶＬＤＬは末梢血単核球のＤＮＡ合成を阻害してその活性化を抑制する（非特許文献７）。しかし、薬剤としてＶＬＤＬ投与を長期に行うことは、血清ＶＬＤＬの上昇およびリポプロテインリパーゼにより転換された中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）値の上昇を慢性化させ、高脂血症、トリグリセライド血症、糖尿病、尿毒症、動脈硬化を引き起こす可能性がある（非特許文献８）。
【０００８】
（α―フェトプロテインおよび初期妊娠因子（ｅａｒｌｙ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｆａｃｔｏｒ））
特殊な状態で、肝臓より免疫抑制タンパク質が分泌されることも知られている。肝癌の腫瘍マーカーとして知られるα―フェトプロテインも免疫抑制力があり、胎仔マウスから同定され、調べられた（非特許文献９）。初期妊娠性因子は、妊娠初期の妊婦尿中、血中から検出された免疫抑制力を有するタンパク質（非特許文献１０）であり、また、肝葉切除後に分泌されることも確かめられた。これらのタンパク質は、非特異的にリンパ球の増殖を抑制する物質で、肝障害が生じた際の旺盛な肝再生力に随伴する物質と思われる。しかし、肝移植が誘導する免疫寛容を説明するに至っていない。
【０００９】
（可溶性クラスＩ抗原）
臨床の肝移植において、多量のドナー型の可溶性クラスＩ抗原が移植直後からレシピエントの血液中に認められる。同物質が免疫寛容を誘導するものと考えられたが、インビボにおいて、同物質を投与しても免疫抑制が十分に誘導されなかった（非特許文献１１）。
【００１０】
（肝抑制因子（ｌｉｖｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＬＳＦ―１））
ラット肝移植後の血清を経時的に採取し、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで電気泳動を行うことにより得られた分子量約４０ｋＤの免疫抑制タンパク質であり、その効果は、極めて高いと推測されるが、タンパク質の同定が行われておらず（非特許文献１２）、薬剤として実用化するためには、今後さらなる検討が必要である。
【００１１】
（インドールアミン酸素添加酵素（ＩＤＯ））
ＩＤＯは、肝臓以外の臓器由来免疫抑制性タンパク質である。マウス異系父母間の受胎産物の生育に関して、ＩＤＯが胎盤の多核栄養芽層で発現していること、さらに受胎産物の拒絶反応を抑制することが示された（非特許文献１３）。また、ＩＤＯを移植免疫抑制剤として使用する試みも報告されている（特許文献２）
【００１２】
（抗ＭＨＣ抗体）
ラット肝移植後の血清中にドナー型ＭＨＣクラスＩ抗原およびクラスＩＩ抗原に対する抗体が認められた（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）。抗クラスＩ抗体は、上述の可溶性クラスＩ抗原と複合体を形成し、免疫抑制作用を有する可能性が考えられている。また、抗クラスＩＩ抗体は、組織片に存在するクラスＩＩ抗原（分子量３５ｋＤの鎖と分子量２８〜２９ｋＤの鎖からなる）をマスクすることにより免疫抑制作用を有すると考えられている。
【００１３】
以上のように、現在臨床上使用されている免疫抑制剤には、骨髄抑制作用、肝臓障害中枢神経毒性、腎毒性等の副作用が知られている。また肝移植後に認められた免疫抑制タンパク質も、臨床上応用可能な活性を持つものは未だ発見されていない。
【００１４】
本発明者らは、ラット異系間同所性肝移植モデルにおいて、肝移植後のラット血清に免疫抑制活性があることを認め、その本体が肝移植直後に発現する免疫グロブリン様物質であることを見出した（特許文献３）。さらに、この免疫グロブリン様物質がラット脾臓由来の３種類のタンパク質（分子量７３ｋＤ／等電点５．２、分子量３４ｋＤ／等電点４．９、分子量３１ｋＤ／等電点５．３）を特異的に認識するものであり、したがって前述の抗ＭＨＣ抗体とは異なるものであると考えた。
【００１５】
【特許文献１】
特開平３―１５７３９９号公報
【特許文献２】
国際公開第ＷＯ／５０９０１Ａ１号パンフレット
【特許文献３】
特開２００１−２３３９００号公報
【非特許文献１】
今日の移植，ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１，５３，１９９８
【非特許文献２】
今日の移植，ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１，３７，１９９８
【非特許文献３】
Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２２３，４２７，１９６９
【非特許文献４】
Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２５１，６５５，１９７４
【非特許文献５】
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１３１，２４２７，１９８３
【非特許文献６】
ｍｅｄｉｃｉｎａ，ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１１，６０，１９９４
【非特許文献７】
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ｖｏｌ．１１９  ２１２９  １９７７
【非特許文献８】
ｍｅｄｉｃｉｎａ  ｖｏｌ．３１  Ｎｏ．１１  １７９  １９９４
【非特許文献９】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１４１，２６９，１９７５
【非特許文献１０】
Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２７８，６４９，１９７９
【非特許文献１１】
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．５０，６７８，１９９０
【非特許文献１２】
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．３，１７４，１９９５
【非特許文献１３】
Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２８１，１１９１，１９９８
【非特許文献１４】
臨床科学，ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．６，１９９０
【非特許文献１５】
生体防御，ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１，１９９０
【非特許文献１６】
細胞工学，ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．５，１９９３
【００１６】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上述のような副作用等の問題点の少ない免疫抑制剤を提供することであり、特に臓器移植において拒絶反応を特異的に抑制することができる抗原特異的な移植免疫抑制を提供することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、肝移植後のラット血清が免疫抑制活性を有することを見出した。さらに、その免疫抑制活性の中心が前記血清のＩｇＧ成分であり、この抗体は自己リンパ球上の特異抗原（７３，３４，３１ｋＤ）を認識することも見出した。前記抗原から３１ｋＤタンパク質を単離、シークエンスして、その部分配列構造から明らかとなったフラグメントについて、ＢＬＡＳＴ解析を行った。その結果、該配列と高いホモロジーを有するタンパク質としてヒストンＨ１タンパク質（ラット、ウシ、ヒト）を同定した。そこで、ヒストンＨ１タンパク質に対するポリクローナル抗体を入手し、その免疫抑制活性を調べたところ、免疫抑制効果を確認した。さらに、臓器移植拒絶のモデル系として、認められているラット異所性心移植試験の結果、その拒絶抑制効果を確認した。くわえて、抗ヒストンポリクローナル抗体が肝移植後のラット血清中で発現されていることも確認した。以上のような知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明はヒストンＨ１に対する抗体を含有する免疫抑制剤を提供する。
【００１９】
好ましくは、前記免疫抑制剤の有効成分である、ヒストンＨ１に対する抗体が抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体である。
【００２０】
また好ましくは、前記ヒストンがヒト由来である。
【００２１】
また、上記免疫抑制剤は、移植免疫抑制に適用されることが特に好ましい。
【００２２】
さらに、本発明は、薬学的に許容される担体と共に、ヒストンＨ１に対する抗体の治療的に有効な量を含有する免疫抑制のための薬学的組成物を提供する。
【００２３】
好ましくは、前記薬学的組成物において、ヒストンＨ１に対する抗体が抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体である。
【００２４】
また好ましくは、前記薬学的組成物において、ヒストンがヒト由来である。
【００２５】
さらに、本発明は、免疫抑制を必要とするヒトを含む哺乳動物に、ヒストンＨ１に対する抗体の治療的に有効な量を投与することからなる、該哺乳動物の治療方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、前記治療方法において、免疫抑制が移植免疫抑制である。
【００２７】
また好ましくは、前記治療方法において、ヒストンＨ１に対する抗体が抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体である。
【００２８】
また好ましくは、前記治療方法において、ヒストンがヒト由来である。
【００２９】
くわえて、本発明は、ヒトを含む哺乳動物レシピエントに、ヒストンＨ１に対する抗体の治療的に有効な量を投与することからなる、該哺乳動物レシピエントで移植拒絶を防ぐ方法をも提供する。
【００３０】
また、本発明は、ラット脾細胞から単離、精製された抗原性タンパク質であって、
該タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定された分子量３１ｋＤと、等電点電気泳動によって決定された等電点５．３を有し、さらにＲＲＫＡＳＧＰＰＶＳＥＬＩＴＫＡＶで表される部分アミノ酸配列を含むことを特徴とする前記単離、精製されたタンパク質を提供する。
【００３１】
また、本発明は、異系間同所性肝移植後のラット血清から単離、精製されたタンパク質であって、
該タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定された分子量３７ｋＤと、等電点電気泳動によって決定された等電点約５．０を有し、さらに移植後期のラット血清に発現することを特徴とする前記単離、精製されたタンパク質を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は、ヒトを含む哺乳動物レシピエントにおいて肝移植の拒絶反応の有無を診断する方法であって、
移植後の血清中に発現される自己抗原タンパク質に対する該血清の免疫反応性レベルを測定するステップを含み、ここで該免疫反応性レベルは前記拒絶反応の有無の指標である、
ことを特徴とする前記診断方法を提供する。
【００３３】
さらに、本発明は、前記免疫反応性レベルが抗ヒストンＨ１抗体価であることを特徴とする上記診断方法を提供する。
【００３４】
なお、本発明の免疫抑制剤は、臓器・組織移植（特に、肝移植）における拒絶反応の防止に有用であるのみならず、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等の炎症性疾患の治療薬としての可能性もある。
【００３５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳しく説明する。
【００３６】
本発明に係るタンパク質類は、例えば、Ｋａｍａｄａらの手法（Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｖｏｌ．９３，６４，１９８３）を用いて、異種ラット間（例えば、ＤＡ系ラットからＰＶＧ系ラット）で同所肝移植手術を行うことによりそれらの発現を誘導させることができる。具体的には、ＤＡ系ラツトの肝臓をＰＶＧ系ラットへ移植する。肝臓移植後の血液を採取し、遠心分離後上清を回収して、タンパク質類を含む血清を得ることができる。
【００３７】
この血清から前記タンパク質類を精製する方法としては、例えば、Ｏｄａら手法（Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ  Ｖｏｌ．２０４，  Ｎｏ．  ３  １１３１，１９９４）に準じる。具体的には、血清をＤＥＡＥセファロースカラムにかけ、吸着したタンパク質画分を溶出する。さらに、ＣＮ−Ｂｒ活性化セファロースカラムで溶出して、精製を行う。得られた試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動すると、タンパク質バンドが回収される。
【００３８】
本発明に係る肝移植後のラット血清（以下、ラット肝移植後血清、または単に肝移植後血清という）は、免疫抑制活性を有するが、これはラット脾臓リンパ球を用いる混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで確認できる（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，１９９４）。この結果から、移植後のレシピエントＰＶＧラットの血清中には、免疫抑制因子が存在することが明らかとなった。さらに、前記血清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム等を用いて、ＩｇＧ画分を精製し、或いは除去してＩｇＧ除去画分を調製できる。これらの各画分と血清とをＭＬＲアッセイで分析すると、免疫抑制活性の本体はＩｇＧ画分であることが明らかとなった。
【００３９】
さらに、このＩｇＧ画分は、ラット脾細胞由来の１つ以上の抗原性タンパク質を特異的に認識する。これらの抗原タンパク質は、分子量３１ｋＤ／等電点５．３、３４ｋＤ／等電点４．９、および７３ｋＤ／等電点５．２を示すタンパク質である（前掲特許文献３）。
【００４０】
前記抗原性タンパク質のうちから、単離・精製された分子量３１ｋＤのタンパク質を常法に従い、そのＮ−末端配列部分を解析し、さらに得られた配列を、ＢＬＡＳＴ解析を介してホモロジー検索を行ったところ、既知タンパク質であるヒトヒストンＨ１の推定エピトープ部分と高いホモロジーを有することが分かった。この部分配列は、配列表の配列番号１に記載されているように、ＲＲＫＡＳＧＰＰＶＳＥＬＩＴＫＡＶである。
【００４１】
本発明に係る抗ヒストンＨ１抗体とは、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を含有し、それぞれは常法に従いヒストンＨ１或いはその抗原性断片に対する抗体として作製される。なお、本明細書で使用する「抗体」という用語は、前記のヒストンＨ１抗原に対する抗体、および該抗体の断片または誘導体、さらにはその修飾体（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２断片、キメラ抗体、またはヒト化抗体等）を意味する。前記誘導体および修飾体は、抗体からその免疫抑制活性の強化、抗原性の低減、副作用の軽減、または血中安定性の改善等の目的で作製されるものである。そのような修飾体の一例として、ポリエチレングリコールやデキストランで抗体を修飾したものは、血中半減期が延びることが知られている。
【００４２】
ポリクローナル抗体の作製は、まず免疫原であるヒストンＨ１をアジュバントに混合し、哺乳動物を免疫感作し、その動物から抗血清を得ることによってなされる。免疫感作の方法は、通常の抗血清を得るための方法であれば、特に限定されるものではないが、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄのコンプリートアジュバンドが最適である。
【００４３】
前記哺乳動物としては、ウサギ、ラット、ヤギ等が利用できるが、抗血清の量的確保の問題、飼育条件等を考慮するとウサギが適している。例えば、ウサギに免疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内等のいずれを介しても可能である。接種間隔、接種量についても特に制限されるものではないが、例えば２週間間隔で、２〜１０回接種することが好ましい。摂取量は１回当たり、ヒストンＨ１量として１０μｇ以上、好ましくは１００μｇ〜１０ｍｇ用いることが望ましい。最終免疫後、３〜１０日目、好ましくは７日目に全採血を行い、抗血清を得る。得られた抗血清を精製する方法としては、通常の抗体を精製する様々な方法が利用可能であるが、特にアフィニティークロマトグラフィーが最適である。精製抗体は、常法に従って免疫抑制活性を測定する（例えば、上記ＭＬＲアッセイ）のに必要な濃度に濃縮調整する。
【００４４】
モノクローナル抗体の作製は、Ｋｏｅｈｉｅｒ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎらの手法（Ｋｏｅｈｉｅｒ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５，１９７５）に準じて行うことができる。すなわち、免疫動物の脾臓細胞と同種動物由来のミエローマ細胞との融合によってつくられる融合細胞（ハイブリドーマ）から製造することができる。細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、細胞融合の効率が高く、増殖性がよいマウスミエローマ細胞が好ましくは、利用される。免疫感作の方法は、上述のポリクローナル抗体作製の場合と異ならないが、使用する動物としては、マウスが好ましい。最終免疫後、脾細胞を取り出す。次いで、免疫したマウスの脾臓細胞由来リンパ球を適当なミエローマ細胞と融合させる。融合にはセンダイウイルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の融合剤を使用する。融合細胞を適当な培地（ＨＡＴ培地等）で、選択的に増殖する。増殖した細胞を目的とする抗体の産生能に関して、スクリーニングし、望ましい細胞株（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローン）を得る。得られたモノクローナル抗体は、常法によって精製する。精製抗体は、これも常法に従って免疫抑制活性アッセイに必要な濃度に濃縮調整する。
【００４５】
本発明に係る抗ヒストンＨ１抗体は、免疫抑制活性を有し、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚等の組織もしくは臓器の移植、骨髄移植による移植片対ホスト（レシピエント）反応（拒絶反応）の治療および予防のために、さらには自己免疫疾患等の治療および予防のために、処置計画において有用である。特定的には、本発明に係る抗ヒストンＨ１抗体は、免疫抑制剤の有効成分として、通常の薬剤と同様に薬学的に許容される担体等とともに、薬学的組成物の形態で被験者（ヒトを含む哺乳動物）に投与される。例えば、注射用生理食塩水、注射用蒸留水等に溶解し、点滴、静注、皮下注等で投与する。必要ならば、適当な緩衝剤、保存剤または安定化剤（ヒト血清アルブミン、ブドウ糖等）を含有させてもよい。本発明の免疫抑制剤を移植免疫抑制に使用する場合、移植臓器への潅流または局所投与、バルーンカテーテルを利用した投与が好ましい。肝移植の拒絶反応を抑制するために使用する場合、特に門脈内投与が好ましい。その投与量は、被験者の状態、年齢等により異なるが、通常、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇを１回または数回に分けて投与することが好ましい。通常、本発明に係る抗ヒストンＨ１抗体は、免疫抑制を必要とする疾患の進行度また状態に応じて、所望の治療的効果を発揮するのに十分な量で薬学的組成物に含まれる。また、投与期間は、１回のみとすることもできるが、数日から数ヶ月の間に反復投与してもよい。
【００４６】
以上、本発明の免疫抑制剤について、抗ヒストンＨ１抗体を詳細に説明してきたが、該抗体に限らず、本発明に係るタンパク質（特に、抗原性タンパク質）に反応性を示す拮抗剤であれば、同様に免疫抑制活性をもつことが期待される。従って本発明は、低分子量化合物を含むこのような拮抗剤をも包含する。
【００４７】
本発明の免疫抑制剤は、特に移植免疫抑制剤として有用であるが、その他にリウマチ、アトピー、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患にも有効であり得る。
【００４８】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１）  ラット免疫抑制物質の誘導
Ｋａｍａｄａらの手法（前掲）を用いて、ラットの同所性肝移植手術を行った。手術には、２００〜３００ｇの雄のＰＶＧ系、ＤＡ系ラット（Ｈａｒｌａｎ社）を用いて、ＤＡラットの肝臓をＰＶＧラットに移植した。肝移植手術後、経時的に血液を採取（７、１４、１８、２１、６３日目）した。その血液を１００ｘｇで遠心分離して、上清を回収して、肝移植後血清を得た。
【００５０】
（実施例２）  ラット肝移植後血清のＭＬＲアッセイ
無処理のＰＶＧ系ラット由来の脾臓リンパ球（応答反応）およびマイトマイシンＣ（和光純薬工業株式会社製）処理を行ったＤＡ系ラット由来の脾臓リンパ球（刺激細胞）を用いた。応答細胞と刺激細胞をそれぞれ１ｘ１０６細胞／ｍｌ、８ｘ１０６細胞／ｍｌに増殖培地（ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製）、ウシ胎仔血清（ライフテックオリエンタル株式会社製））で調製した。各細胞懸濁液１００μｌを９６穴丸底プレート（Ｎｕｎｃ  Ｂｒａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）に播種した後、ＰＶＧコントロール血清および実施例１で得た肝移植後血清を４μｌ（終濃度約２％）添加して５日間培養した。また、陽性対照として、タクロリムス（ＦＫ５０６：藤沢薬品工業株式会社製）を添加して、培養した。ＢｒｄＵラベリング＆ディテクションキットＩＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて、培養５日目の細胞内ＤＮＡに取り込まれたブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）量を指標として細胞増殖度を測定した。ここで、細胞増殖能が高い程（Ｔ細胞が活性化されている）、取り込み量も多くなる。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、肝移植後の採取血清には、免疫抑制活性が認められ、しかも移植中期から後期の血清の免疫抑制活性は、強力な免疫抑制剤であるタクロリムスと同等であった。したがって、肝移植後のレシピエントＰＶＧ血清中には、免疫抑制因子が存在することが明らかとなった。
【００５１】
（実施例３）  ラット肝移植後血清の分析
ラット肝移植後血清をウエスタンブロット法で分析した。ＤＡ、ＰＶＧコントロール血清およびラット肝移植後血清（実施例１）各１μｌを１．５ｍｌチューブに入れ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（１２５ｍＭＴｒｉｓ塩酸  ｐＨ６．８、１０％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノール：和光純薬工業株式会社製））を３μｌ加え、５分間煮沸してサンプルとした。このサンプル溶液１μｌを１０％ポリアクリルアミドゲルにアプライして、電気泳動を行った。
【００５２】
電気泳動後、セミドライブブロッテイング装置（ＡＴＴＯ科学機器社製）を用いて、イモビロン−Ｐトランスファーメンブレン０．４５μｍポリビニリデンフロライドメンブレン（ＰＶＤＦ膜、ミリポア社製）にブロッティング（ブロッティングバッファー：２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、２０％メタノール、和光純薬工業株式会社製）を行った。ブロッティング後のＰＶＤＦ膜をブロッキング溶液（３％スキムミルク、０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、１０ｍＭリン酸緩衝液、和光純薬工業株式会社製）に浸し、室温で１時間振盪した。１／５００００（ｖ／ｖ）量のラットＩｇＧのＨ、Ｌ鎖に対する抗体Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−ＲａｔＩｇ’ｓ（抗ラットＩｇＧ）、ＨＲＰ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）を含むＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭリン酸緩衝液）にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で１時間振盪した。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで１５分間１回、５分間３回洗浄した後、ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｅｔ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）により検出し、Ｘ線フィルム（富士写真フィルム株式会社製）に露光後現像した。その結果を図２に示す。図中、上の段のスポット列は、Ｈ鎖（５０ｋＤ）に対応し、下段のスポット列は、Ｌ鎖（２７ｋＤ）に対応する。
【００５３】
図２に示した結果から、ＰＶＧコントロールと比較して、肝移植後の血清中、免疫染色されるＩｇＧ成分が経時的に増加していることが分かる。
【００５４】
（実施例４）  ラット肝移植後血清中のＩｇＧ画分の分離
ＦＰＬＣシステム（アマシャムファルマシアバイオテック社製）、Ｈｉｔｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）を用いて、ラット肝移植後血清（１４、６３日目）を分画した。１０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）でＨｉｔｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムを平衡化した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で１０倍希釈したラット肝移植後血清１ｍｌをアプライした。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄した後、１０ｍｌの０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ２．５、和光純薬工業株式会社製）で吸着画分（ＩｇＧ）を溶出させた。１ＭＴｒｉｓ塩酸、ｐＨ９．０を添加して、溶液のｐＨを中性とした。溶出画分を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）を使用して濃縮し、バッファーをリン酸緩衝液に置換し、元の血清の容積（１００μｌ）にした。
【００５５】
（実施例５）  ラット肝移植後血清中のＩｇＧ画分の免疫抑制活性
実施例４で得られたＩｇＧ画分の免疫抑制活性を実施例２と同様にして、ＭＬＲアッセイで測定した。すなわち、ＰＶＧコントロール血清、肝移植後１４日目の血清（ネイティヴ）、該血清のＩｇＧ画分、そして、肝移植後６３日目の血清、該血清のＩｇＧ画分のそれぞれを濃度調節して免疫抑制活性を測定した。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、いずれの場合もＩｇＧ画分は、ネイティヴな血清と同程度の免疫抑制活性を示した。これらのデータからラット肝移植後血清中の免疫活性物質は、ＩｇＧ画分であることが分かる。
【００５６】
（実施例６）  ラット肝移植後血清が認識する抗原
ＰＶＧラットから摘出した脾臓から脾細胞を採取した。脾細胞と１％ＳＤＳ溶液を１：５（ｖ／ｖ）の割合で混合して十分に攪拌した。全液量の１／３０量の１０ｍｇ／ｍｌフェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ：和光純薬工業株式会社製）を添加して、氷中に３０分間静置することにより、ラット脾細胞抽出物を得た。その抽出物２．５μｌに等量の非還元サンプルバッファー（１２５ｍＭＴｒｉｓ塩酸ｐＨ６．８、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）を加え、５分間煮沸した。１２．５％ポリアクリルアミドゲルに５μｌのサンプル溶液をアプライし、電気泳動を行った。電気泳動後、実施例３の方法と同様にＰＶＤＦ膜にブロッティングした。ブロッキング後、１／５０００（ｖ／ｖ）量の肝移植後血清（１４日目）を加えたブロッキング溶液中でインキュベートした。ＰＶＦＤ膜をＰＢＳＴで１５分間１回、５分間３回洗浄した後、１／５００００（ｖ／ｖ）量のラットＩｇＧ抗体を添加したＰＢＳ中で１時間振盪した。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで１５分間１回、５分間３回洗浄した後、ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｅｔにより検出し、Ｘ線フィルムに露光後現像した。その結果を図４（ｂ）に示す。
【００５７】
また、電気泳動後のゲルを染色液（０．２５％クマシーブリリアントブル−Ｒ−２５０（ＣＢＢ）／エタノール：酢酸：水＝９：２：９、和光純薬工業株式会社製）に浸し、１時間振盪しながら染色した。染色後、脱色液（エタノール：酢酸：水＝２５：８：６５）に浸し、１時間振盪しながら脱色した。その後保存液（メタノール：酢酸：水＝１０：１５：１７５、和光純薬工業株式会社製）に浸して、バッククランドを脱色した。タンパク質分子量マーカーとして、ＬＭＷマーカキット（アマシャムファルマシアバイオテック社製）を用いた。その結果を図４（ａ）に示す。
【００５８】
図４（ａ）および図４（ｂ）に示した結果から、肝移植後血清を用いて免疫染色すると、主に脾細胞由来の３種類のタンパク質（それぞれ分子量７３ｋＤ、３４ｋＤ、３１ｋＤ）が特異的に認識されることが明らかとなった。
【００５９】
（実施例７）  免疫欠損させたラット肝移植後血清の免疫抑制活性
ＰＶＧラットから摘出した脾臓から脾細胞を採取した。その脾細胞を超音波処理した後、遠心分離して不溶性ペレットを得た。ラット肝移植後血清（１８日目）をＲＰＭＩ培地中の前記不溶性ペレットに添加して、３７℃で３時間インキュベートした。インュベート後、遠心分離して、その上清をＭＬＲアッセイ用の培養系に添加して、実施例２と同様に、免疫抑制活性のアッセイを行った。コントロールとして、無処理の肝移植後血清（１８日目）、ＰＶＧ血清（無処理と処理）、ＤＡ血清等を用いた。その結果を図５に示す。
【００６０】
脾細胞由来の抗原タンパク質によって同タンパク質に特異的なＩｇＧ成分を取り除いた肝移植後血清は、ネイティヴな血清と比較して免疫抑制活性が低下していた。
【００６１】
（実施例８）  ラット脾細胞から抗原性タンパク質の分離およびシークエンス実施例６に記載した電気泳動の結果、分離された３１ｋＤタンパク質をＣＮ−Ｂｒ−活性化セファロース４Ｂゲル（アマシャムファルマシアバイオテック社製）アフィニティーカラムで精製した。このようにして得られた分子量３１ｋＤタンパク質のＣＮＢｒ分解断片をプロテインシークエンサー（４７６Ａプロテインシークエンサー、ＡＢＩ社）で解析した。決定された部分配列をＢＬＡＳＴ検索にかけ、既知のタンパク質とのホモロジーを調べたところ、ヒトヒストンＨ１等の配列の部分一致をみた。ヒトヒストンＨ１の部分配列と前記シークエンスされた配列とのアラインメントを図６に示す。なお、ホモロジーが見出された部分（図中、四角で囲まれている）は、ヒト、ウシおよびラットにおいて、保存されている。また、３１ｋＤタンパク質を等電点測定用バッファーに混合して、サンプル溶液を調製した。常法に従い、膨潤させたＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にサンプル溶液をアプライして、等電点電気泳動を行った。泳動後のゲルを染色すると、このタンパク質は、等電点５．３を有していた。
【００６２】
さらに、電気泳動後、実施例６に記載の方法に従い、クマシー染色した。その結果を図７（ａ）に示す。図中、レーンＡは、脾細胞抽出物を表し、レーンＢは、ウシヒストンＨ１を表す。
【００６３】
また、電気泳動の結果、分離さらに精製された３１ｋＤタンパク質および３４ｋＤタンパク質を実施例３と同様に、ウエスタンブロット法により免疫染色した。染色に使用した抗体は、抗ＩｇＧ抗体（コントロール）（後述）と抗ヒストンＨ１抗体（後述）であった。免疫染色の結果を図７（ｂ）に示す。この結果から、分子量約３１ｋＤおよび３４ｋＤのタンパク質は、抗ヒストンＨ１抗体によって認識されることが明らかとなった。図中、レーンＣは、精製した３４ｋＤタンパク質を表し、レーンＤは、精製した３１ｋＤタンパク質を表す。
【００６４】
（実施例９）  ラット肝移植後血清から新規タンパク質類の分離と精製
タンパク質類の分離精製は、Ｏｄａらの方法に（前掲）準じて行った。ラット肝移植後血清（６３日目）５ｍｌを、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化を行ったＤＥＡＥセファロースカラムにアプライし、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で溶出した。ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂゲル（アマシャムファルマシアバイオテック社製）アフィニティーカラムに前記溶出液をアプライし、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を用いて、タンパク質画分を溶出した。タンパク質画分を分離して、分子量３７ｋＤタンパク質を得た。このタンパク質を等電点測定用バッファーに混合して、サンプル溶液を調製した。常法に従い膨潤させたＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にサンプル溶液をアプライして、等電点電気泳動を行った。泳動後のゲルを染色すると、このタンパク質は、等電点４．８６、４．８６、５．０４および５．０４をそれぞれ有する４種類の蛋白の混合物であることが分かった。
【００６５】
（実施例１０）  抗ヒストンＨ１抗体のインビトロ免疫抑制活性
前述のＭＬＲアッセイを用いて、抗ヒストンＨ１抗体のインビトロ免疫抑制活性を試験した。抗ヒストンＨ１抗体としては、市販の抗ヒストンＨ１ウサギポリクローナル抗体（サンタクルツ・バイオテクノロジー社製、カタログ番号ｓｃ−１０８０６）を使用した。この抗体は、全長ヒトヒストンＨ１に対するポリクローナル抗体である。コントロール抗体としては、ウサギＩｇＧ（サンタクルツ・バイオテクノロジー社製、カタログ番号ｓｃ−２０２７）を使用した。両抗体は、アッセイに先立って、ウルトラフリーＭＣ５０００ＮＭＷＬフィルター・ユニット（ミリポア社製）で脱塩処理後、バッファーをＰＢＳに置換した。このように前処理した各抗体を実施例２に記載したように、ＭＬＲアッセイ用の培養培地にＩｇＧ量０〜１．６μｇで添加し、培養した。細胞増殖度を同様に測定した結果を図８に示す。図８から明らかなように、抗ヒストンＨ１抗体は、免疫抑制活性を有している。
【００６６】
（実施例１１）  抗ヒストンＨ１抗体のインビボ免疫抑制活性
臓器移植拒絶のモデル系である異所性心移植手術（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）を用いて、抗ヒストンＨ１抗体の免疫抑制活性を試験した。試験には、実施例１０と同じく、市販の抗ヒストンＨ１ウサギポリクローナル抗体（サンタクルツ・バイオテクノロジー社製、カタログ番号ｓｃ−１０８０６）を使用した。Ｋａｍａｄａらの方法（上掲）に従い、ＤＡ系ラット（ドナー）の心臓をＰＶＧ系ラット（レシピエント）に移植し、術後１時間以内に、生理食塩水（大塚製薬）で３００μｇ／ｍｌに調製した１ｍｌの抗ヒストンＨ１抗体溶液を皮下投与した。対象群として、無処理の群を設けた。
【００６７】
無処理群では、平均生着日数が＜９．０日であったのに対して、抗ヒストンＨ１抗体の投与群では、平均生着日数が１４．３日となった。投与群において、移植された心臓は、生着日数が増加した。また、投与群のラットを開腹して、各臓器を観察したが、無処理の群と同様に、特に異常は認められなかった。このように、抗ヒストンＨ１抗体の免疫抑制活性がインビボでも観察されたことから、抗体の移植における拒絶抑制効果が明らかとなった。
【００６８】
（実施例１２）  ラット肝移植後血清の抗ヒストン抗体価の測定
ラット肝移植後血清（７〜６６日目）の抗ヒストン抗体価を標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて、測定した。その結果を図９に示す。移植後、１４〜２１日目の間に抗体価が上昇していることが分かる。
【００６９】
【発明の効果】
本発明の免疫抑制剤は、優れた免疫抑制作用を示すので、移植免疫抑制剤として、特に臓器・組織移植の際、拒絶反応の抑制に有用である。
【００７０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】肝移植後血清の免疫抑制活性をＭＬＲアッセイによって測定した結果を示す棒グラフである。
【図２】肝移植後血清をウエスタンブロット法により分析した結果を示す図である。
【図３】肝移植後血清中のＩｇＧ画分およびネイティヴ血清の免疫抑制活性をＭＬＲアッセイによって測定した結果を示す図である。（ａ）は、肝移植後１４日目の血清からの結果、（ｂ）は、肝移植後６３日目の血清からの結果を示す。
【図４】肝移植後血清のＩｇＧが認識する抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法により分析した結果を示す図である。（ａ）はクマシー染色の結果を、（ｂ）は免疫染色の結果を示す。
【図５】肝移植後血清を免疫欠損させて、その免疫抑制活性をＭＬＲアッセイによって測定した結果を示す棒グラフである。
【図６】ラット脾細胞由来の抗原性タンパク質の部分配列とラット、ウシ、ヒト各ヒストンＨ１の部分配列との配列アラインメント図である。
【図７】ラット脾細胞由来の抗原性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法により分析した結果を示す図である。（ａ）はクマシー染色の結果を、（ｂ）は免疫染色の結果を示す。
【図８】抗ヒストンＨ１抗体の免疫抑制活性をＭＬＲアッセイによって測定した結果を示す図である。
【図９】肝移植後血清について抗ヒストンＨ１抗体価を測定した結果を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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