(57)【要約】【課題】抗腫瘍活性および細胞運動能阻害活性を有する新規な化合物、その製造方法、それを有効成分とする抗腫瘍剤および細胞運動能阻害剤並びにそれを生産する能力を有する新規な微生物の提供。【解決手段】下記一般式（Ｉ）で示される化合物。【化１】2004099456.tif 000004アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属し、上記化合物を生産する能力を有する微生物を培養して、培養物から上記化合物を採取する化合物の製造方法。上記化合物を有効成分とする抗腫瘍剤および細胞運動能阻害剤。上記化合物を生産する能力を有するアスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）　Ｆ７７２０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８１９８）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
2004099456.tif 000003
で示される化合物。
【請求項２】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属し、請求項１に記載の化合物を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から請求項１記載の化合物を採取することを特徴とする請求項１記載の化合物の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の化合物を生産する能力を有するアスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）　Ｆ７７２０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８１９８）またはその相同体。
【請求項４】
請求項１記載の化合物を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項５】
請求項１記載の化合物を有効成分とする細胞運動能阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が生産する新規物質に関し、より具体的には抗腫瘍活性および細胞運動能の阻害活性を有する新規生理活性物質に関する。
【０００２】
【発明の背景】
近年、がんの治療法は急速な進歩を遂げており、特に外科的な手術または放射線療法によって原発がんを除去できる成功率が大幅に向上している。ところが原発巣の除去に成功してもがんの転移により死に至る場合が少なくなく、がんの転移抑制ががん治療上の克服すべき重要な課題となっている。しかしながら、外科的手術や放射線療法では手法的に限界があり、がんの転移を有効に抑制することはできない。また抗がん剤を用いる化学療法は、がん細胞を、殺細胞性の活性物質または人の免疫系を介して死滅させる活性物質を有効成分とする薬剤が主体である。臨床に用いられているものもあるが、それらの多くは細胞毒性が強く、消化管障害や造血器障害などの副作用があり、まだ十分とは言えない。さらにがん細胞の転移抑制を作用の主体とする物質は数少なく、臨床で用いられているものはまだない。このような状況から、細胞毒性が少なく、がん転移を特異的に抑制する薬剤の開発が強く望まれている。
【０００３】
一方、がん転移は、まずがん細胞が原発巣から、細胞運動することにより離脱して始まる。この細胞運動は、種々の因子を細胞が受け取り、細胞内情報伝達機構が活性化されることにより促進されることが知られている。このため、細胞運動を阻害する物質は、がんの転移を阻害することが期待される。また、血管新生も血管内皮細胞の運動により開始されることが知られており、細胞運動を阻害する物質は、血管新生を阻害することも期待されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が生産する、細胞運動能の阻害活性および抗腫瘍活性を有する新規な生理活性物質、その製造方法、それを生産する微生物、それを有効成分とする抗腫瘍剤および細胞運動能阻害剤を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため、種々検討を行っていたところ、ある種の微生物の培養液中に細胞運動能を阻害する物質が生産されていることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
本発明により提供される新規な生理活性物質は、下記式（Ｉ）
【化２】
2004099456.tif 000002
で示される化合物である。
【０００７】
本発明者らは、この化合物をモベラスチンと命名した。以後、本化合物を前記名称を用いて説明する。
【０００８】
本発明に使用される微生物は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属し、本発明のモベラスチンを生産する能力を有するものであれば、どのようなものでも使用できる。そのような微生物の探索は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【０００９】
５％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したヒト食道がん細胞ＥＣ−１７細胞（６×１０４個）を４８ｗｅｌｌプラスチックプレートに播き、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養する。各ｗｅｌｌの細胞面の中央を一直線にマイクロピペットチップにて傷をつけ、同じ太さになるように細胞をはがす。その後、直ちに培養上清を除去し、リン酸緩衝液３００μｌで細胞をはがさないように注意しながら洗浄し、微生物培養液サンプルおよび１％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地５００μｌを静かに注入する。これを３７℃、５％ＣＯ２、一晩培養後、顕微鏡下で観察し、マイクロピペットチップで傷つけた線が埋まっている程度を観察することにより遊走能を評価する。
【００１０】
そのようにして見出された微生物として、例えば、本発明者らが土壌から分離したアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属するＦ７７２０株を挙げることができる。
【００１１】
以下、Ｆ７７２０株の菌学的性状を説明する。
オートミールアガー（ＯＡ）、モルトアガー（ＭＡ）、およびポテトデキストロースアガー（ＰＤＡ）プレート上のコロニーの肉眼的観察および菌糸体の光学顕微鏡観察の結果は以下のとおりである。なお、色調に関する記述は”Ｍｅｔｈｕｅｎ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｏｌｏｕｒ”　（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ　ａｎｄ　Ｗａｎｓｃｈｅｒ，　１９７８）に従った。
【００１２】
三培地とも２５℃での生育は普通からやや遅く、ＰＤＡプレートでは培養１週間で直径１．３〜２．８ｃｍ、その他のプレートでは直径３．３〜３．７ｃｍの生育をした。これら三培地においてコロニー周縁は滑らかで平坦な盛り上がりを示した。菌糸は寒天内にごく浅い潜り込みを見せた。気中菌糸は羊毛状ないしはフェルト状であった。菌糸体は複数寄り集まって束状となり放射状の広がりを示す様子が目視で観察された。コロニー表面色調は当初よりｗｈｉｔｅ（Ａ１）を示し、その後次第にｙｅｌｌｏｗｉｓｈ　ｗｈｉｔｅ（３Ａ２）を呈した。コロニー裏面の色調は表面色調とほぼ同様であった、全てのプレートから若干透明な滲出液の産生が認められたが、全てのプレートにおいて可溶性色素の産生は認められなかった。
【００１３】
光学顕微鏡による観察では、菌糸体に規則的な隔壁が認められた。基底菌糸は直線的な広がりを見せた。分枝は比較的多く観察された。気中菌糸は当初より直線的な生育を示したが、長期間培養後の検体からは若干湾曲した菌糸も確認された。菌糸幅は２．０〜５．５μｍである。菌糸表面は粗面で、瘤状の隆起が無数に観察された。培養１２週間経過後の比較的幅の広い菌糸内からは油滴状の構造物が観察された。
【００１４】
以上の結果より、本発明者らは本菌株をアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属すると同定し、アスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）　Ｆ７７２０と命名し、平成１３年２月５日付で産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ　Ｐ−１８１９８の番号で寄託した。
【００１５】
また本発明に使用される具体的な菌株には、Ｆ７７２０株の相同体も包含される。相同体とは、当該菌株からゲノムＤＮＡを抽出したものを通常の方法で分析して決定された小サブユニットリボソームＲＮＡ（１８Ｓ　ｒＲＮＡ）をコードするＤＮＡの全塩基配列を比較したときに、その配列がＦ７７２０株のものと９９％以上の相同性を示し、かつ、モベラスチン生産能を有する菌株である。
【００１６】
本発明のモベラスチンは上記菌株を栄養培地に接種し、好気的に培養することにより製造される。上記菌株の培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが、通常は液体培養による振とう培養、通気撹拌培養などの好気的条件下で行うのが好適である。
【００１７】
培養に用いることのできる培地としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも用いることができる。培地組成としては、例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース、水あめ、糖みつ、デキストリン、澱粉、グリセロール、動物油、植物油などを単独または組み合わせて使用することができ、また窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、尿素、硫酸アンモニウムなどを単独または組み合わせて使用することができる。
【００１８】
また必要に応じて、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸塩、金属塩などの無機塩を加えることができる。その他、本菌株の生育あるいはモベラスチンの生産を促進する有機物、例えば、ビタミン類、アミノ酸類を加えることができる。さらに必要に応じて、消泡剤、例えば、アデカノール（商品名：旭電化工業社製）、シリコンなどを添加することができる。
【００１９】
培養条件は、上記菌株が良好に生育してモベラスチンを生産し得る範囲内で適宜選択すればよい。例えば、培地のｐＨは、４〜８程度、通常中性付近とすることが好ましい。培養温度は、微生物が良好に生育する温度、通常１５〜３０℃、好ましくは２５〜２８℃に保つのがよい。培養時間は、２〜１０日間程度でよく、好ましくは３〜５日間である。もちろん上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれに応じて上記範囲から最適条件を選択、調整できる。その際、培養液中のモベラスチンの蓄積量が最大になったときに培養を停止して得た培養液を以下の精製工程に使用すればよい。
【００２０】
このようにして得た培養液中に蓄積されたモベラスチンは、培養後、濾過、遠心分離等の一般的固液分離手段によって菌体を分離し、濾液または上澄液から回収可能である。また分離した菌体からも回収可能である。
【００２１】
モベラスチンの分離、精製は、公知の種々の方法を選択、組み合わせて行うことができる。例えば、酢酸エチル、メタノール、ｎ−ブタノール等を用いた溶媒抽出や、アンバーライトＸＡＤ（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）等のポリスチレン系吸着樹脂、シリカゲル、アルミナ、活性炭などの担体を用いるカラムクロマトグラフィーによる方法を用いることができる。
【００２２】
これらの担体から目的物質を溶出させる方法は、担体の種類、性質によって異なるが、一例として、ポリスチレン系吸着樹脂の場合には、溶出溶媒として、含水アルコール、含水アセトン等を用いることができる。さらにセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０（ファルマシア社製）、バイオ・ゲルＰ−２（バイオ・ラッド社製）等によるゲル濾過、シリカゲル、アルミナ等による薄層クロマトグラフィー、順相あるいは逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）等を用いることができ、これらの方法を単独または適宜組み合せて、場合によっては反復使用することにより、分離、精製することができる。また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた溶媒抽出法や菌体破砕による溶出法により菌体から抽出し上記と同様に単離精製することができる。
【００２３】
以上のようにして得られる本発明の生理活性物質モベラスチンは以下に示す物理化学的性質を有する。
（１）外観：白色粉末
（２）分子式：Ｃ２３Ｈ３２Ｏ５
（３）ＦＡＢマススペクトル：３８９．２７（Ｍ＋Ｈ）＋，３８７．２９（Ｍ＋Ｈ）−
（４）比旋光度：［α］Ｄ２５　＋１．３３°（ｃ　０．３７５，ＣＨ３ＯＨ）
（５）融点：５８．８〜６３．５℃（分解）
【００２４】
（６）プロトン核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：図１に示すとおりである。
【００２５】
（７）炭素１３核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：図２に示すとおりである。また各シグナルの化学シフトは下記のとおりである。
δ（ｐｐｍ，ＴＭＳを基準にして）：　７．６，　１５．１，　１５．４，　１８．１，　２５．０，　２８．６，　３１．０，　３５．６，　３６．２，　４１．６，　４３．５，　５０．４，　７７．０，　１０８．８，　１０９．０，　１１０．３，　１１２．０，　１４２．７，　１５１．０，　１６４．１，　１６４．２，　１９２．９，　２１３．６
【００２６】
（８）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：シリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）にて０．７（トルエン：アセトン＝２：１）
【００２７】
本発明の生理活性物質モベラスチンは、抗腫瘍活性および細胞運動能の阻害活性を有しており、がん転移、血管新生などを抑制する抗腫瘍剤としての使用が期待される。また、がんの転移、血管内皮細胞の血管新生における細胞運動の機構解明のために有用なツールとなる細胞運動阻害剤としての使用も期待される。
【００２８】
本発明の生理活性物質モベラスチンの抗腫瘍活性は、例えば、以下に述べる方法により測定することができる。４８穴プレート上でヒト食道がん培養細胞ＥＣ１７を２×１０４個／ｍｌとなるように５％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）で培養し、適当な濃度に希釈した試験試料を加え、３７℃で３日間培養する。培養後の細胞数をコールターカウンターにて測定し、細胞の増殖抑制活性を求める。こうして求めた本発明のモベラスチンの抗腫瘍活性（ＩＣ５０）は２０．０μｇ／ｍｌであった。
【００２９】
また細胞運動能の阻害活性は以下に述べる方法により測定できる。５％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したヒト食道がん細胞ＥＣ−１７細胞（６×１０４個）を４８ｗｅｌｌプラスチックプレートに播き、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養する。各ｗｅｌｌの細胞面の中央を一直線にマイクロピペットチップにて傷をつけ、同じ太さになるように細胞をはがす。その後、直ちに培養上清を除去し、リン酸緩衝液３００μｌで細胞をはがさないように注意しながら洗浄後し、サンプルおよび１％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地５００μｌを静かに注入する。これを３７℃、５％ＣＯ２、一晩培養後、顕微鏡下で観察し、マイクロピペットチップで傷つけた線が埋まっている程度を、サンプル添加濃度を変えて比較観察することにより遊走能（細胞運動能）の阻害活性を評価する。この方法で評価したとき、本発明のモベラスチンは、ＥＣ１７の運動能を濃度依存的に阻害し、１０μｇ／ｍｌの濃度では直線状の傷の部分への細胞遊走を完全に阻害した。
【００３０】
以上述べたとおり、本発明の生理活性物質モベラスチンは抗腫瘍剤および細胞運動能阻害剤として有用である。
【００３１】
以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明する。
【００３２】
【実施例】
実施例１　モベラスチンの製造
寒天斜面培地に培養したアスペルギルス・エスピー　Ｆ７７２０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８１９８）の一白金耳を、ポテト澱粉２％、グルコース１％、大豆粉（エスサンミート：味の素社製）２％、リン酸一カリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％を含む液体培地６０ｍｌを入れた５００ｍｌ三角フラスコに植菌してロータリーシェーカー上で３日間、２５℃で培養して種母培養とした。グリセリン２％、ペプトン（極東製薬社製）１％、酵母エキス０．５％、乾燥酵母（エビオス：アサヒビール薬品社製）０．５％を含む液体培地６０ｍｌを入れた５００ｍｌ三角フラスコ２０本に種母を各々１ｍｌ植菌してロータリーシェーカー上で４日間、２５℃で培養した。
【００３３】
このようにして得られた培養液１０００ｍｌをろ過し、ろ液を等量の酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出液を減圧下、濃縮して得られた残留物１５２３ｍｇをシリカゲルカラム（メルク社製キーゼルゲル（４ｃｍφ×１５ｃｍ））に吸着させ、クロロホルム：メタノール（１００：１）で溶出された活性画分を濃縮乾固して、３７．６ｍｇの粗精製物を得た。これをさらに、セファデックスＬＨ−２０カラム（４ｃｍφ×４０ｃｍ）を用い、メタノールで展開して、活性画分２８．７ｍｇを得た。この活性画分を調製用シリカゲル薄層プレートを用いて、トルエン−アセトン（２：１）で展開し、得られた活性画分を高速液体クロマトグラフィーにて精製し、最終的に精製されたモベラスチン１．８ｍｇを得た。
【００３４】
【図面の簡単な説明】
【図１】生理活性物質モベラスチンの重クロロホルム中でのプロトン核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）である。
【図２】生理活性物質モベラスチンの重クロロホルム中での炭素１３核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）である。
【図１】
2004099456.tif 000005
【図２】
2004099456.tif 000006