(57)【要約】【課題】ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞に対して、簡便、安全且つ効率良く、ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子を導入すること。【解決手段】ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞に、トランスフェクション試薬の共存下に、ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子の導入を行うことを特徴とする方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞にペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体を導入する方法であって、該方法をトランスフェクション試薬の共存下に行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞に金属微粒子を導入する方法であって、該方法をトランスフェクション試薬の共存下に行うことを特徴とする方法。
【請求項３】
トランスフェクション試薬が脂質を主成分とする試薬である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
トランスフェクション試薬がカチオンリポソームである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
原核細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
金属微粒子が、鉄、酸化チタン、白金及び金からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子とトランスフェクション試薬とを含むトランスフェクションキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞にペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子を導入する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
原核細胞にペプチド及びＤＮＡタンパク質複合体を導入し、タンパク質や遺伝子の発現を行うことは、今まであまり行われてこなかったが、今後発展が見込まれる技術である。
【０００３】
原核細胞にペプチド及びＤＮＡタンパク質複合体を導入する方法としては、主として物理法と化学法とが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
物理法は、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等を含み、例えば、エレクトロポレーション法の場合、大腸菌では対数増殖期の細胞を純水などの塩をほとんど含まない溶液にて洗浄し、氷上にてペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体と共存させた後、短い時間高電圧をかけることで細胞に一時的に小孔を生じさせペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体を導入し、賦活培地にて１時間程度３７℃で培養し、ペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体の発現を行うものである。
【０００５】
化学法は、例えば、大腸菌の場合には、塩化カルシウム溶液などで細胞を処理し、氷上でペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体と共存させた後、４２℃で短時間温め、再度氷上で２分程度冷却した後に、賦活培地にて１時間程度３７℃で培養し、ペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体の発現を行うものである。
【０００６】
また真核細胞、特に培養細胞の場合には、化学法として上記の方法のほかにリポフェクション法が知られている。リポフェクション法は、主に正に荷電しているリポソーム（カチオンリポソーム）とポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、該カチオンリポソームを負に荷電している細胞表面に吸着させ、細胞膜と融合させることによって、細胞内にペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体を導入させる方法である。
【０００７】
これらの方法は従来から用いられてきた手法であり、以下に示すように問題点も多い。
【０００８】
例えば、化学法は、細胞を処理する操作が煩雑であり、熟練した技術が必要である。また、ヒートショック処理なども必要であり細胞に負担がかかる。細胞へのペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体の導入効率もきわめて低い。
【０００９】
エレクトロポレーション法は、細菌類、菌類、酵母、植物細胞、動物細胞等ほとんどの細胞に対して高い導入効率を示すが、死滅する細胞が多く、導入した細胞に対して損傷又は分極を引き起こすために、導入効率に違いを生じることがある。また、特別な装置を必要とする。
【００１０】
リポフェクション法は、ペプチドグリカン層やセルロース層などの細胞壁を有する細胞の場合、リポフェクション試薬と融合する細胞膜が露出していないため、適用対象が細胞壁を有さない細胞に限定されると考えられてきたが、最近、本発明者は、細菌類においても可能であることを見出した（例えば、未公開特許出願１及び２参照）。
【００１１】
【未公開特許出願１】
特願２００２−１３２１９７
【００１２】
【未公開特許出願２】
特願２００２−３３７５２９
【００１３】
【非特許文献１】
サムブルック・ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．）及びディー．ダブリュー．ラッセル（Ｄ．Ｗ．　Ｒｕｓｓｅｌｌ）著，「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」，（米国），第３版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ），２００１年
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞に対して、簡便、安全且つ効率良く、ペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子を導入する方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の如き従来技術の問題点を解決するために、鋭意研究を重ねてきた。その結果、ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する細胞に対して、トランスフェクション試薬を用いてペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体の導入を行うことにより、簡便、安全且つ効率良くペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体を導入できることを見出した。
【００１６】
即ち、本発明は、以下のペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子を導入する方法に関する。
【００１７】
１．ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞にペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体を導入する方法であって、該方法をトランスフェクション試薬の共存下に行うことを特徴とする方法。
【００１８】
２．ペプチドグリカンを主体とする細胞壁を有する原核細胞に金属微粒子を導入する方法であって、該方法をトランスフェクション試薬の共存下に行うことを特徴とする方法。
【００１９】
３．トランスフェクション試薬が脂質を主成分とする試薬である上記項１に記載の方法。
【００２０】
４．トランスフェクション試薬がカチオンリポソームである上記項１に記載の方法。
【００２１】
５．原核細胞が大腸菌であることを特徴とする上記項１に記載の方法。
【００２２】
６．金属微粒子が、鉄、酸化チタン、白金及び金からなる群から選ばれる少なくとも１種である上記項２に記載の方法。
【００２３】
７．ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子とトランスフェクション試薬とを含むトランスフェクションキット。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子を導入する方法は、ペプチドグリカンを細胞壁に有する原核細胞に、通常のトランスフェクション試薬を使用することに特徴がある。
【００２５】
本発明においてペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子が導入される原核細胞は、ペプチドグリカン又はペプチドグリカンに類似する物質を細胞壁に有する原核細胞であり、例えば、大腸菌、枯草菌等を含む細菌類、ラン藻類等が挙げられる。その中でも、利便性等の点から大腸菌、ラン藻類等が好ましい。
【００２６】
大腸菌の種類は限定されず、例えば、通常遺伝子組換えに使用されているＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＢＬ２１（ＤＥ３）等のＫ１２株由来のものを挙げることができる。また、ラン藻類の種類も限定されず、例えば、シネココッカス、シネコキスチス、スピルリナ等を挙げることができる。
【００２７】
本明細書において、ペプチドとは、例えば、アミノ酸数が２個以上結合している通常のペプチドだけでなく、タンパク質、酵素等を含む。ペプチドの種類、調製法等は特に限定されず、実験の目的等に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
本明細書において、ＤＮＡタンパク質複合体とは、ポリヌクレオチドと酵素等のタンパク質との複合体をいうものとする。タンパク質及びポリヌクレオチドの種類は特に限定されず、それらの組み合わせも実験の目的等に応じて適宜選択することができる。例えば、トランスポゾン・トランスポゼース複合体や、制限酵素認識部位と制限酵素の複合体などを例示することができる。
【００２９】
また、本明細書において、金属微粒子とは、原核細胞に入るものであれば特に限定されない。例えば、鉄、酸化チタン、白金及び金からなる群から選ばれる少なくとも１種が使用でき、その中でも好ましくは、鉄、酸化チタン等の金属微粒子である。金属微粒子の平均粒子径は、原核細胞に導入されれば限定されないが、例えば、約０．０１μｍ〜約１．０μｍ、好ましくは約０．０１μｍ〜約０．５μｍ、より好ましくは約０．０１μｍ〜約０．０５μｍが挙げられる。
【００３０】
得られたペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子を原核細胞に導入する際に、トランスフェクション試薬を用いることが必要である。トランスフェクション試薬としては、一般に動物の培養細胞に使用されるトランスフェクション試薬を用いることができ、好ましくは脂質を主成分とするトランスフェクション試薬、更に好ましくはカチオンリポソームを主成分とするトランスフェクション試薬がよい。
【００３１】
また、カチオンリポソームとは、例えば、不飽和度が低い炭素分子鎖を主体とする分子の片端にカチオンとなる原子団（カチオン荷電分子）を有する荷電した分子を意味する。
【００３２】
炭素分子鎖を主体とする分子の例として、炭素数１２〜２０、二重結合の数が０〜４の脂肪酸の他に、官能基を有するベンゼン環、窒素原子を含む複素環化合物が挙げられる。具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等や、（Ｓ）−２−メチル−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−４−カルボン酸（（Ｓ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−１，４，５，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、（Ｓ）−２−メチル−５−ヒドロキシ−１，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−４−カルボン酸（（Ｓ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−１，４，５，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）等が例示できる。これらを単独で使用することもできるし、２種以上使用することもできる。
【００３３】
カチオン荷電分子とは、カチオンに荷電する分子をいい、例えば、アミン塩、第４級アンモニウム塩、ピリジニウム塩等が挙げられる。これらも単独で使用しても良いし、２種以上用いても良い。
【００３４】
炭素分子鎖を主体とする分子とカチオン荷電分子とは、任意の組み合わせで用いることができ、これらを結合させる方法は適宜選択することができる。
【００３５】
カチオンリポソームを主成分とする具体的なトランスフェクション試薬としては、例えば、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）、ＤＯＳＦＥＲ（１，３−Ｄｉ−Ｏｌｅｏｘｙｌｏｘｙ−２−（６−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）、Ｔｒａｎｓｏｍｅ（登録商標）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６、Ｃｈａｒｉｏｔ　Ｋｉｔ（登録商標、Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｅｆ社製）等を例示することができる。
【００３６】
ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子を原核細胞に導入する際には、ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子とトランスフェクション試薬をあらかじめ室温で混合し、複合体を形成させればよい。
【００３７】
ペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体とトランスフェクション試薬とを混ぜ合わせる割合は、ペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体の種類、用いるトランスフェクション試薬の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体１μｇあたり脂質成分として１〜１０００μｇ程度が例示できる。
【００３８】
また、金属微粒子とトランスフェクション試薬とを混ぜ合わせる割合は、金属微粒子の種類、用いるトランスフェクション試薬の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、金属微粒子１μｇあたり脂質成分として０．０１〜１００μｇ程度が例示できる。
【００３９】
ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子とトランスフェクション試薬とを混ぜる方法は、ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子とトランスフェクション試薬とが複合体を形成する限り限定されないが、例えばマイクロチューブのようなケースにトランスフェクション試薬を含む溶液を予め入れておき、必要量のペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子を含む溶液を添加し、必要に応じて軽く混和し、１分以上、好ましくは３〜１５分間程度、例えば氷上で静置すればよい。
【００４０】
その後、得られたペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子とトランスフェクション試薬との複合体を細胞と接触させればよい。その方法も限定されず、例えば、細胞の希釈液にペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子−トランスフェクション試薬複合体液を添加し、必要に応じて軽く混和し、静置すればよい。
【００４１】
ペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子−トランスフェクション試薬複合体と細胞希釈液との混合割合も、使用する細胞の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、細胞１×１０９個あたり、ペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体１〜１００ｎｇ程度、好ましくは１〜１０ｎｇ程度になるようにすることができる。また、細胞１×１０９個あたり金属微粒子１〜１００ｎｇ程度、好ましくは１〜１０ｎｇ程度になるようにすることができる。
【００４２】
その後、選択培地で細胞を培養した後、ペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体が原核細胞に導入されたことを、公知の方法により確認することができる。例えば、抗生物質耐性などによる確認、導入タンパク酵素のアッセイによる酵素活性の検出等が挙げられる。
【００４３】
また、金属微粒子が原核細胞に導入されたことは、例えば、ＳＥＭ等を用いる公知の方法により直接観測することにより確認できる。
【００４４】
原核細胞の中に導入できるペプチド又はＤＮＡタンパク質複合体は、ペプチドライブラリーのスクリーニング、ペプチド性阻害物質の導入、タンパク質半減期の研究、細胞内の抗体などによる標識に利用可能であり、また、トランスポゾン・トランスポゼース複合体等によるゲノムへの遺伝子導入形質転換体の作成にも、この技術は利用可能である。
【００４５】
また、金属微粒子を原核細胞に導入することにより、ドラッグデリバリーが可能となる。例えば、鉄の微粒子を導入することにより、薬理活性化合物（タンパク質等）を発現した原核細胞を直接生体内の作用部位まで磁力で運搬し、そこで溶菌させることにより薬理活性を発揮させることができる。
【００４６】
更に、本来生体が持たない機能を金属微粒子によって触媒機能として付与し、高次の生体機能と触媒活性との融合が考えられる。例えば、光触媒と使用されている酸化チタンにより有毒な酸化窒素等を酸化し、原核細胞の栄養素として利用することもできる。
【００４７】
上記のペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子と、トランスフェクション試薬とを含む混合液（複合体）は冷蔵又は冷凍保存することができ、必要なときに使用することができる。また、トランスフェクションキットして用いることもできる。
【００４８】
【実施例】
以下に、実施例を示し、本発明の特徴とするところをより一層明瞭にする。
【００４９】
実施例１　＜β−ガラクトシダーゼの導入＞
０．２５μｇ／μｌのβ−ガラクトシダーゼ溶液を４μｌずつ３本のマイクロチューブに分注し、１本目はそのまま、２本目はカチオンリポソーム　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）４μｌを、３本目にはＣｈａｒｉｏｔ　ＫｉｔのＣｈａｒｉｏｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｅｆ社　２ｍｇ／ｍｌ）８μｌを室温にて混合し、１５分放置した。
【００５０】
大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ）を、前記の３本のマイクロチューブそれぞれに加え、氷上にて５分おいた後、３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養した。
【００５１】
この細胞液をそれぞれマイクロチューブに移し、５０００ｒｐｍにて１分遠心し上清をのぞき、ＰＢＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（１．５ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４）にて、２回遠心、洗浄した。
【００５２】
この菌体を、ＬＢ培地にて懸濁し、１時間３７℃にてインキュベートしたのち、再度遠心し上清をのぞき、０．０５％のＸｇａｌを含むＬＢ培地に懸濁してさらに１時間インキュベートした。
【００５３】
菌体懸濁液を顕微鏡下で観察したところ、トランスフェクション試薬であるＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔでは３０％程度、Ｃｈａｒｉｏｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔでは２０％程度、β−ガラクトシダーゼ活性を示す青色に染まった菌体が観察された。しかし、トランスフェクション試薬を含まなかったものには、青色に染まった菌体が観察されなかった。
【００５４】
実施例２　＜　ＤＮＡタンパク質複合体の導入　＞
（１）Ｔｎ５トランスポゼースをＣＲＵＺらの手法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１７５、　Ｎｏ．２１、　ｐ．６９３２−６９３８、１９９３）により精製した。
【００５５】
（２）カナマイシン耐性のＴｎ５トランスポゾンＥＺ：：ＴＮＴＭ＜ＫＡＮ２＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）１５μｇ／ｍｌ溶液　０．４μｌ（０．００７５ｐｍｏｌ）とＴｎ５トランスポゼース０．４μｌ（０．１ｐｍｏｌ相当）を静かにタッピングにて混合し、３７℃にて１０分間インキュベートした。
【００５６】
（３）インキュベートした混合物を０．４μｌずつ３本のマイクロチューブに分注し、１本目はそのまま、２本目はカチオンリポソーム　ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）０．４μｌを、３本目にはＣｈａｒｉｏｔ　ＫｉｔのＣｈａｒｉｏｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｅｆ社　２ｍｇ／ｍｌ）２．０ｍｌを室温にて混合し、１５分放置した。
【００５７】
（４）大腸菌エレクトロコンピテントセルＤＨ５α（ＴＡＫＡＲＡ）を、前記の３本のマイクロチューブそれぞれに加え、氷上にて５分おいた後、３７℃に温めておいたＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間振盪培養し、カナマイシンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００５８】
トランスポゾン１μｇあたり、ＤＯＴＡＰ　Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔを混ぜた方では４．０×１０３株、Ｃｈａｒｉｏｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔを混ぜた方では２．０×１０３株のカナマイシン耐性の形質転換株が得ら、それぞれのトランスフェクション試薬を混ぜなかったものでは形質転換体が得られなかった。
【００５９】
（５）この際に得られた形質転換株にはプラスミドは存在せず、これらの形質転換体がトランスポゼースによってゲノムに遺伝子が導入されたものであることがわかった。
【００６０】
実施例３　＜金属微粒子の導入＞
磁性粒体：Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ　Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を遠心回収し、０．６ｍｇを１０μｇ／μｌにＭｉｌｉ−Ｑ水に懸濁した。アンピシリン耐性を示すｐＵＣ１９　ｐｌａｓｍｉｄを含む大腸菌ＤＨ５αセルをＬＢ培地にて培養し、ＯＤ６００＝０．６で遠心回収し、Ｍｉｌｉ−Ｑ水にて３回洗浄した後、ＯＤ６００＝１０．０程度となるようにＭｉｌｉ−Ｑ水にて懸濁した。
【００６１】
５本のマイクロチューブに上記の大腸菌を５０μｌずつ分注し氷の上に置いた。その５本のマイクロチューブをａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅと名付け、それぞれのマイクロチューブに以下の組成のものを添加した。
ａ：大腸菌のみ
ｂ：大腸菌＋磁性粒体５μｌ
ｃ：大腸菌＋ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ社１μｇ／１μｌ）５μｌ
ｄ：大腸菌＋磁性粒体５μｌ＋　ＤＯＴＡＰ　５μｌ（別々に加える）
ｅ：大腸菌＋（磁性粒体５μｌ＋ＤＯＴＡＰ　５μｌを３７℃で５分インキュベートしたもの）。
【００６２】
それぞれ、氷上にて５分間静置した後、４２℃で９０秒間ヒートショックを行い、３７℃のＳＯＣ培養液１ｍｌにて懸濁した。ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓｔａｎｄｓを用いて１分放置することで、磁性粒体を含む画分を回収し、上清を取り除いた。
【００６３】
同様の操作を３回繰り返し、磁性粒体を含む画分を回収した。回収した菌体をＳＯＣ培養液０．１ｍｌにて懸濁し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含むＬＢプレートに植菌し、３７℃一晩培養した後、生じたコロニーの数を計測した。
【００６４】
コロニーを生じたのは、ｂが１株、ｅが８７株であり、磁性粒体により菌体が回収されたことが示された。ｅの菌体を拡大して観察したところ、磁性粒体と思われる黒い粒が菌体内に見られたが、他の条件の菌体には細胞内には黒い粒は観察されなかった。
【００６５】
【発明の効果】
本発明のペプチド、ＤＮＡタンパク質複合体又は金属微粒子を原核細胞に導入する方法によれば、ペプチドグリカンを主成分とする細胞壁を有する原核細胞にヌクレオチドを導入する際に、トランスフェクション試薬を共存させることによって、簡便、安全且つ効率良く導入することができる。
【００６６】
また、本発明の方法は、操作が簡便で熟練した技術を要さず、特殊な機械等も使用しないので、誰でも行うことができる。例えば、小学校、中学校、高校、大学、専門学校等における実験、実習等にも使用することができる。