(57)【要約】【課題】ラクトパーオキシダーゼという酵素活性を自在に制御できる阻害剤を提供すること。ラクトパーオキシダーゼによる微生物抑制を阻止する方法を提供すること。【解決手段】希少糖よりなるラクトパーオキシダーゼ阻害剤。希少糖がＤ−アロースである上記のラクトパーオキシダーゼ阻害剤。上記の阻害剤を用いることを特徴とする、ラクトパーオキシダーゼによる微生物抑制が問題となっている系の微生物抑制を阻止する方法。【選択図】        図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
希少糖よりなるラクトパーオキシダーゼ阻害剤。
【請求項２】
希少糖がＤ−アロースである請求項１のラクトパーオキシダーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１または２の阻害剤を用いることを特徴とする、ラクトパーオキシダーゼによる微生物抑制が問題となっている系の微生物抑制を阻止する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業の属する技術分野】
本発明は、微生物生育に抑制的に働く酵素ラクトパーオキシダーゼの阻害剤に関するものであり、酵素阻害によって従来の微生物抑制を阻止する方法に関する。
本発明は、希少糖が酵素反応を阻害することを初めて純粋な酵素を用いて明らかにした発明であり、他の多くの酸化還元酵素へ希少糖が影響を与える可能性を予見させるものであり、希少糖の新しい用途開発の可能性を示唆する成果である。
【０００２】
【従来の技術】
近年日本で起こっている食中毒はそのほとんどが「細菌性食中毒」であり、事件数では９割以上、また患者数にいたっては、ほぼ１００％を占めている。食中毒菌には、Ｏ−１５７の病原性大腸菌をはじめ、サルモネラ菌や腸炎ビブリオ、ぶどう球菌、カンピロバクター、ウエルシュ菌、セレウス菌、ボツリヌス菌などがある。このうち、サルモネラ菌と腸炎ビブリオ、ぶどう球菌は、一般に事件数が多く“御三家”と呼ばれている（非特許文献１）。
我が国では１９８９年に突如としてＳＥによる食中毒事件が多発し、その発生件数（１４６事例）は例年の２倍に増加し、１９９２年には食中毒事件数の中で第１位を示すようになった（非特許文献２）。サルモネラ食中毒患者数の約８０％以上がＳＥによるものであり、また１９９５年以後本菌による死者も毎年発生している（非特許文献３）。
一方、牛乳中には殺菌効果を発揮するラクトパーオキシダーゼ（ＬＰＯ）が存在するが、現在の食中毒の原因菌として最も問題視されているサルモネラを用いてＬＰＯの作用メカニズムを解明すること、食品中の汚染菌数を明確に測定することなど、多くの解決すべき課題が残されている現状である。
【０００３】
【非特許文献１】
「ヘルスダイジェスト」３月１０日号，ｐ２，雪印乳業株式会社健康生活研
究所（１９９９）
【非特許文献２】
「モダンメディア」４１，ｐ２３０〜２４４（１９９５）
【非特許文献３】
厚生労働省生活局乳肉衛生課：食品衛生調査会  乳肉水産食品部会資
料，７月２３日（１９９７）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来ラクトパーオキシダーゼを阻害する物質は、重金属などの全ての酵素を失活させるなどによる阻害以外には報告が存在しない。すなわち、ラクトパーオキシダーゼを特異的に阻害する物質は全く報告されていなかった。
本発明は、ラクトパーオキシダーゼという酵素活性を自在に制御できる阻害剤を提供することを目的とする。また、本発明は、ラクトパーオキシダーゼによる微生物抑制を阻止する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、牛乳中には殺菌効果を発揮するラクトパーオキシダーゼが存在するが、その殺菌効果にたいする希少糖の影響を調べていて、Ｄ−アロースを添加すると細菌の汚染抵抗活性が弱くなる現象を発見し、その原因がラクトパーオキシダーゼをＤ−アロースが特異的に阻害していることをつきとめ、本発明を完成させたものである。すなわち、本発明者らはグラム陰性菌として現在の食中毒の原因菌として最も問題視されているサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）を用いてＬＰＯの作用メカニズムを解明すること、食品中にＬＰＯを加えたときにＬＰＯの抗菌活性や酵素作用が食品中の成分すなわちタンパク質、糖質によってどのような影響を受けるのかを調べることを通して、ＬＰＯを食品保存に用いるために必要な条件を検討し、Ｄ−アロースを添加すると細菌の汚染抵抗活性が弱くなる現象を発見したものである。本発明は、Ｄ−アロースという希少糖である単糖が酵素反応を阻害するという全くこれまで発見されていなかった現象に基づくものである。酵素阻害剤としての各種の利用が考えられるものである。
【０００６】
本発明は、希少糖、好ましくはＤ−アロースよりなるラクトパーオキシダーゼ阻害剤を要旨としている。
【０００７】
また、本発明は、希少糖、好ましくはＤ−アロースよりなるラクトパーオキシダーゼ阻害剤を用いることを特徴とする、ラクトパーオキシダーゼによる微生物抑制が問題となっている系の微生物抑制を阻止する方法を要旨としている。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ラクトパーオキシダーゼについて説明する。
ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰＯ）は、分子量７７，５００の一本鎖ポリペプチドであり、鉄を１分子含む糖タンパク質である。ＬＰＯは、牛乳中に多く含まれる酵素であり、未殺菌牛乳に約３０  ｍｇ／ｌ含まれている。また、ＬＰＯは耐熱性が比較的高いが、８０℃、２秒の加熱で失活する〔乳とその加工，  ｐ１０２，  １０３，  建帛社  （１９８７）〕。
ＬＰＯは、過酸化水素を分解して活性酸素を生成させる。この活性酸素が、ＳＣＮ−をヒポチオシアン酸（ＯＳＣＮ−）に酸化する。ＯＳＣＮ−は不安定な物質ではあるが、大腸菌などグラム陰性菌の細胞壁を破壊し、菌体のスルフヒドリル酵素（ＳＨ酵素）を失活させて抗菌作用を示す。このような一連の抗菌作用は、ラクトパーオキシダーゼシステムといわれている。ＬＰＯシステムが最適に働くには、約８ｐｐｍの過酸化水素および約１２ｐｐｍのチオシアン酸イオン（ＳＣＮ−）が必要とされている。
過酸化水素は通常乳中には含まれないが、発酵乳では、乳酸菌が産生する。
ＳＣＮ−は１〜１０ｐｐｍ程度乳中に存在する他、ヒトの唾液や、胃液には高濃度に含まれる〔日本食品工業学会誌  ４１，  ｐ５２６  （１９９４）、Ｊ．ＦｏｏｄＰｒｏｔ．，  ４７，  ７２４  （１９８４）〕。一方、乳酸菌などのグラム陽性菌は、ＯＳＣＮ−をＳＣＮ−に変換する機構を持つので、一時的に増殖が抑えられるが死滅はしない。また、動物細胞は、ＯＳＣＮ−の影響を受けない。
【０００９】
希少糖について説明する。
一般に物質は、その構造あるいは性質によって定義されるが希少糖はこの方法によらずに定義されている。希少糖は、その構造や性質によらず、自然界の存在量によって定義されるのである。すなわち、希少糖は自然界に少量しか存在しない単糖および糖アルコールと定義づけられている。自然界に多量に存在する単糖は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース等であるが、それ以外の多くの自然界に存在量が少ない単糖は全て希少糖である。また糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはＤ−ソルビトールおよびＤ−マンニトールが比較的多く存在するがそれ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖と定義されている。
炭素数が６の六炭糖については、単糖および糖アルコールの総数は３４存在するが、その存在量から希少糖は、Ｄ−プシコース、Ｄ−タガトース、Ｄ−ソルボース、Ｄ−アロース等２８種類が存在する。
【００１０】
希少糖のうち、現在大量生産ができているＤ−アロースとＤ−プシコースという２つの希少糖について説明する。
Ｄ−アロース（Ｄ−アロヘキソース）は、アルドース（アルドヘキソース）に分類されるアロースのＤ体であり、融点が１７８℃の六炭糖（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）である。このＤ−アロースの製法としては、Ｄ−アロン酸ラクトンをナトリウムアマルガムで還元する方法による製法や、また、シェイクワット・ホセイン・プイヤン等による「ジャーナル・オブ・ファンメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング」第８５巻、５３９ないし５４１頁（１９９３年）において記載されている、Ｌ−ラムノース・イソメラーゼを用いてＤ−プシコースから合成する製法がある。さらに近年では、特開２００２−１７３９２号公報に記載されている。Ｄ−プシコースを含有する溶液にＤ−キシロース・イソメラーゼを作用させて、Ｄ−プシコースからＤ−アロースを生成する製法が発明されている。
本発明で用いるＤ−アロースは、前記製法、或いはその他の製法のいずれによって得られたものでもよい。基質を含む溶液を原料にして酵素反応でＤ−アロースを含む溶液として得られるＤ−アロース液は、必要により、例えば、除蛋白、脱色、脱塩などの方法で精製され９９％以上の高純度の標品も容易に得ることができる。
【００１１】
プシコースは、単糖類の中で、ケトン基を持つ六炭糖の一つである。このプシコースには光学異性体としてＤ体とＬ体とが有ることが知られている。ここで、Ｄ−プシコースは既知物質であるが自然界に希にしか存在しないので、国際希少糖学会の定義によれば「希少糖」と定義されている。本発明で使用するＤ−プシコースは、ケトースに分類されるプシコースのＤ体であり六炭糖（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）である。このようなＤ−プシコースは、自然界から抽出されたもの、化学的またはバイオ的な合成法により合成されたもの等を含めて、どのような手段により入手してもよい。比較的容易には、例えば、エピメラーゼを用いた手法（例えば、特開平６−１２５７７６号公報参照）により調製されたものでもよい。得られたＤ−プシコース液は、必要により、例えば、除蛋白、脱色、脱塩などの方法で精製され、濃縮してシラップ状のＤ−プシコース製品を採取することができ、更に、カラムクロマトグラフィーで分画、精製することにより９９％以上の高純度の標品も容易に得ることができる。このようなＤ−プシコースは単糖としてそのまま利用できるほか、必要に応じて各種の誘導体として用いることも期待される。
【００１２】
【作用】
本発明は、ラクトパーオキシダーゼという酵素活性を自在に制御できる阻害剤を得ることができたことである。このことにより、従来不可能であった酵素活性の制御が可能となった。
用途として考えられるものは、研究面におけるラクトパーオキシダーゼの役割を明確にするためにラクトパーオキシダーゼを特異的に阻害しておくことが非常に有効である。さらに実用的用途としては、ラクトパーオキシダーゼを阻害しておき、生菌数を測定することによって食品中の汚染菌数を明確に測定可能であることである。
すなわち、ラクトパーオキシダーゼが生菌数を測定する間に細菌数を変化させるため確実な菌数を測定できないが、Ｄ−アロースを添加して酵素活性を阻害し菌数減少をおさえることで正確に生菌数を測定できることが可能となる。
【００１３】
【実施例】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００１４】
参考例１
ラクトパーオキシダーゼの精製
▲１▼ホエー（乳清）の調製
山田牧場（香川県三木町）から入手した生乳（未殺菌乳）を９０００×ｇで３０分間遠心分離し、浮上したクリームと沈殿を除き、脱脂乳を得た。ｐＨ６となるように脱脂乳１Ｌに対し、乳酸を２ｍｌ、２％レンネット（Ｓｉｇｍａ  Ｒ−３３７６）１０ｍｌを加え、恒温槽で３０℃、４０分間静置しカード形成させ、カゼインとホエーを分離させた。ホエーの２０倍量の１０ｍＭ  リン酸バッファーを用いてホエーを一晩透析した。透析後のホエーを気泡が生じなくなるまで脱気し、濾紙Ｎｏ．１を２枚重ねてブフナーロートにより濾過を行い不純物を取り除いた。
▲２▼ＳＰ−セファロースによるＬＰＯの精製
１０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ６．８）で平衡化したＳＰ−セファロースカラムにホエーを負荷した。０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸バッファーを３００ｍｌ流した。その後、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸バッファー５００ｍｌを流し、溶出液を試験管に５ｍｌずつ分画した。以上の操作はすべて４℃で行った。
各フラクションの吸光度を２８０ｎｍで測定し、溶出パターンを求めた。また、発色液（ＡＢＴＳ基質溶液ＫＰＬ社：ＡＢＴＳ＋過酸化水素）を用いてＬＰＯ活性を求めた。プレートリーダー専用のプレートを用いて測定を行った。１つのウェルに発色液を１００μｌ加え、サンプルを１０μｌ加えて反応をスタートさせた。３０分間反応させて１％ＳＤＳを１００μｌ加えることで反応をストップさせた。すばやくプレートリーダーにより４１２ｎｍでの吸光度を測定した。その結果、活性の高かったフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、純度の確認を行った。
▲３▼ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
サンプルは遠心濃縮により、タンパク質濃度をそれぞれ０．１％と一定した。上層ゲル濃度４．５％、下層ゲル濃度１２．５％のポリアクリルアミドゲルをもちいて、１２ｍＡで２時間電気泳動を行った。泳動後、クマシーブリリアントブルーにより３０分間染色後、脱色した。
▲４▼ダイアフローによる濃縮
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果よりＬＰＯ純度の高かったフラクションを集め、限外ろ過  （ＵＫ−１０，  ６２ｍｍ，  Ａｄｖａｎｔｅｃ）を用いて濃縮を行った。圧力を１．５ｋｇｆ／ｃｍ２と一定にして、氷中にて濃縮を行った。濃縮後のサンプル中のタンパク質濃度をローリー法で求めた後にクリーンベンチ内で孔径０．２２μｍのディスクフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ）で無菌ろ過し、滅菌チューブに小分けし、ディープフリーザー（−８０℃）で使用するまで保存した。
【００１５】
参考例２
精製ＬＰＯの抗菌活性
抗菌活性は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  （ＩＦＯ  ３３１３，ＳＥ）を用いて行った。表１の斜面培地にＳＥを３代継代培養した後、滅菌した生理食塩水を４ｍｌ加え、懸濁した。懸濁液の吸光度を生理食塩水で１／３６に希釈し、その吸光度を６００ｎｍで測定した。吸光度から次式（Ｙ＝１．２×１０−９ｘ＋０．０６１）により菌数を概算し、加える菌数を１０６とした。  菌液１０６ＣＦＵ、ＫＳＣＮ  １０ｐｐｍ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）（和光純薬工業株式会社）  ０．７Ｕ／ｍｌ、Ｇｌｃ  ０．５％、ＬＰＯのユニット数を０．２７Ｕ、０．５４Ｕ、１．０８Ｕ、２．１６Ｕ、４．３２Ｕとなるように加え、ＰＢＳで全液量を１ｍｌにした。コントロールにはＰＢＳ  （ｐＨ７．０）のみを加えた。各サンプルを３０℃で２時間インキュベートした後、１０４ＣＦＵ／ｍ  ｌ（ＣＦＵ：コロニー形成数すなわち生菌数）になるように滅菌水で希釈して表２のＤＨＬ寒天培地に１００μｌずつ塗沫し、３７℃で２４時間培養しコロニーを形成させた。肉眼で確認できるコロニー数を数え、各サンプルのＣＦＵを求め、各サンプルのＣＦＵから抗菌活性を求めた。尚、同じ実験を三回行い再現性の有無を確認した。同様の方法を用いて、ＬＰＯを４．３２Ｕと一定にし、糖及びタンパク質をＬＰＯに加えて、抗菌活性にどれぐらい影響するかを調べた。
抗菌活性は、以下の式を用いて求めた。
抗菌活性＝Ｌｏｇ（コントロールのＣＦＵ／各サンプルのＣＦＵ）
【００１６】
【表１】
斜面培地
ポリペプトン              １．０ｇ
酵母エキス                ０．５ｇ
グルコース                ０．３ｇ
ＮａＣｌ                      １．０ｇ
硫酸マグネシウム          ０．１ｇ
寒天                      １．５ｇ
イオン交換水１００ｍｌに溶解した。
【００１７】
【表２】
寒天平板培地
ＤＨＬ寒天培地（日本製薬Ｎｏ．Ｓ１０２）    ６４ｇ
イオン交換水１Ｌに溶解した。
【００１８】
結果及び考察
生乳からのＬＰＯ精製
図１にＳＰ−セファロースにおける分画を示した。２８０ｎｍの吸光度はタンパク質の溶出パターンを、４０５ｎｍの吸光度はＬＰＯの活性をそれぞれ示している。タンパク質の溶出パターンの２つ目のピークとＬＰＯの活性のピークが重なっていることから、この２つ目のピークがＬＰＯのピークであると考えた。２８０ｎｍにおける２つのピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたところ、図２に示したように１つ目のピークであるフラクションＮｏ．７〜１３には、ＬＰＯ以外のタンパク質のバンドが多数みられたが、２つ目のピークであるフラクションＮｏ．１５〜２３には、ＬＰＯ以外のタンパク質のバンドも若干みられたものの、ＬＰＯの太いバンドがみられたため精製したＬＰＯの純度が高いことが確認できた。この結果からフラクションＮｏ．１６〜５０までをダイアフローを用いて濃縮することとした。濃縮後にローリー法を行った結果、タンパク質濃度は１．８９
ｍｇ／ｍｌ、酵素活性は  ２０４  Ｕ／ｍｌであった。
【００１９】
参考例３
ＬＰＯ活性の測定
▲１▼ＬＰＯの酵素活性
ＬＰＯの酵素活性を過酸化水素と、発色剤としてＡＢＴＳを用いて測定した。０．１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）をもちいてＬＰＯを２〜３μｇ／ｍｌに希釈しておき、１ｍＭ  ＡＢＴＳ〔下記注）参照〕、０．５５ｍＭ  過酸化水素を４５０μｌずつ１ｍｌ容セルに入れた後に、希釈したＬＰＯを１００μｌ加えた。最終ＬＰＯ濃度０．２〜０．３μｇ／ｍｌ  とした。ＬＰＯを加えてから５秒間隔で４回、４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。
▲２▼ＬＰＯに種々の糖及びタンパク質を加えたときの酵素活性
ＬＰＯ溶液に種々の濃度の糖及びタンパク質を加え、混合液の濃度をそれぞれＬＰＯ  ２〜３μｇ  ／ｍｌ、糖及びタンパク質濃度を０．１２５％〜２％となるように０．１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）を用いて調製した。１ｍＭ  ＡＢＴＳ〔下記注）参照〕、０．５５ｍＭ過酸化水素を４５０μｌずつ１ｍｌ容セルに入れた後に、調製したサンプルを１００μｌ加えた。したがって、最終ＬＰＯ濃度は０．２〜０．３μｇ／ｍｌ、糖及びタンパク質濃度は０．０１２５％〜０．２％となった。サンプルを加えてから５秒間隔で４回、４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。実験に用いた糖はケトヘキソースとしてＤ−プシコース（Ｄ−Ｐｓｉ）、Ｄ−フルクトース（Ｄ−Ｆｒｕ）、Ｄ−タガトース（Ｄ−Ｔａｇ）、Ｌ−ソルボース（Ｌ−Ｓｏｒ）、アルドヘキソースとしてＤ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−アロース（Ｄ−Ａｌｏ）、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｄ−ガラクトース（Ｄ−Ｇａｌ）を用いて行った。タンパク質はオボアルブミン（ＯＶＡ）を用いて行った。
相対活性は糖及びタンパク質を加えた時の吸光度増加の傾き（ＬＰＯ活性）をＬＰＯのみの時の吸光度増加の傾き（ＬＰＯ活性）で割って１００を乗じた値で示した。
注）１ｍＭ  ＡＢＴＳ：２，２−ａｚｉｎｏｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）  ０．０５１ｇを０．１Ｍ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ４．４）  １００ｍｌに溶解したもの
【００２０】
結果及び考察
精製ＬＰＯの抗菌活性
精製ＬＰＯのユニット数を０．２７Ｕから４．３２Ｕまで段階的に変化させて抗菌活性を調べたところ、図３に示したようにＬＰＯのユニット数が上昇するにつれ抗菌活性も上昇していった。また、ＬＰＯのユニット数が４．３２ユニットを超えても抗菌活性の大きな変化がみられなかった。そのため抗菌活性の測定に用いるＬＰＯの量は、４．３２Ｕ／ｍｌで十分であることが分かった。
【００２１】
実施例１〜２，比較例１〜５
比較例１
食品中の成分によるＬＰＯの抗菌作用の阻害
ＬＰＯに牛乳を加えたときの抗菌活性
菌数１０６ＣＦＵ、ＬＰＯ  ４．２３Ｕ／ｍｌ、ＫＳＣＮ  １０ｐｐｍ、ＧＯ  ０．７Ｕ／ｍｌ、Ｇｌｃ  ０．５％、牛乳  ３．２％、６．２５％、１２．５％、２５％、５０％となるように加え、ＰＢＳで全液量を１ｍｌとした。コントロールにはＰＢＳ（ｐＨ７．０）のみを加えたもの、牛乳を５０％加えたもので行った。
結果を図４に示した。ＬＰＯに牛乳を加えることにより、抗菌活性が大きく低下した。また、加える牛乳の量が増えるにしたがい抗菌活性の低下は大きなものとなった。
牛乳中にはＬＰＯやラクトフェリン（Ｌｆ）のような抗菌作用のあるタンパク質が含まれているものの、ＬＰＯは耐熱性が比較的高いが、８０℃２秒の加熱で失活する。ＬＰＯに添加した牛乳は１３０℃で２秒間殺菌されているためＬＰＯは失活していると考えられる。またＬｆの殺菌効果は、ＬｆをｐＨ２において１２０℃、１５分間加熱した場合でも発揮されるものの、ウシ常乳中に含まれる量は低い（約０．２〜０．４ｍｇ／ｍｌ）ためＬｆの抗菌作用もみられない。そのため殺菌牛乳を添加することによる抗菌性の増加はないと考えられる。
牛乳中には、３．０％のタンパク質、３．８％の脂質、４．４％の糖質などが含まれている。そのため、これらの成分の存在により菌の増殖に有利な環境が形成され抗菌活性が低下したのだと考えられる。
【００２２】
比較例２
ＬＰＯにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたときの抗菌活性
菌数１０６ＣＦＵ、ＬＰＯ  ４．２３Ｕ／ｍｌ、ＫＳＣＮ  １０ｐｐｍ、ＧＯ  ０．７Ｕ／ｍｌ、Ｇｌｃ  ０．５％、ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）  ０．０２５％、０．０５％、０．１％、０．２％となるように加え、ＰＢＳで全液量を１ｍｌとした。コントロールにはＰＢＳ（ｐＨ７．０）のみを加えたものとＢＳＡを０．４％加えたものを用いた。  各サンプルの結果を図５に示した。ＬＰＯにＢＳＡを加えなかったＮｏｒｍａｌと比べＬＰＯにＢＳＡを加えた場合、抗菌活性に大きな変化がみられなかった。このことからＢＳＡはＬＰＯの働きに対し大きな影響を持たないため牛乳中でＬＰＯの抗菌活性を阻害していないと考えられる。
【００２３】
比較例３
ＬＰＯにβラクトグロブリン（β−Ｌｇ）を加えたときの抗菌活性
菌数１０６ＣＦＵ、ＬＰＯ  ４．２３Ｕ／ｍｌ、ＫＳＣＮ  １０ｐｐｍ、ＧＯ  ０．７Ｕ／ｍｌ、Ｇｌｃ  ０．５％、β−Ｌｇ（ＳＩＧＭＡ社）  ０．０２５％、０．０５％、０．１％、０．２％となるように加え、ＰＢＳで全液量を１ｍｌとした。コントロールにはＰＢＳ（ｐＨ７．０）のみを加えたもの、β−Ｌｇを０．４％加えたもので行った。
結果を図６に示した。ＬＰＯにβ−Ｌｇを加えなかったＮｏｒｍａｌに比べ、β−Ｌｇを加えたものは一様に抗菌活性が低くなった。また、β−Ｌｇの濃度が高くなるにつれ抗菌活性の低下が徐々に大きくなった。この結果を図４と比較してみると、ＬＰＯに牛乳を加えたときのほうが抗菌活性は大きく低下している。したがって、β−ＬｇはＬＰＯの抗菌活性を阻害するものの牛乳中で決定的に阻害しているわけではないと考えられる。
【００２４】
比較例４
ＬＰＯにＯＶＡを加えたときの抗菌活性
菌数１０６ＣＦＵ、ＬＰＯ  ４．２３Ｕ／ｍｌ、ＫＳＣＮ  １０ｐｐｍ、ＧＯ  ０．７Ｕ／ｍｌ、Ｇｌｃ  ０．５％、ＯＶＡ  ０．２％となるように加え、ＰＢＳで全液量を１ｍｌとした。コントロールにはＰＢＳ（ｐＨ７．０）のみを加えたもので行った。
ＬＰＯにＯＶＡを加えると大きな抗菌活性の低下がみられた。ＯＶＡは卵中の主要タンパク質であり卵白中に５４％含まれている。本発明者らの研究室は、ＬＰＯに卵白、卵黄を別々に加えたときの抗菌活性を調べた。そしてこのときもＬＰＯに卵白を加えることによりＬＰＯの抗菌活性に大きな低下がみられた。本比較例の実験では０．２％のＯＶＡを加えて行った、これは実際の卵中に含まれるＯＶＡの量よりは遙かに少ない量ではあるが、抗菌活性が大きく低下していることが確認できた（図７）。
【００２５】
比較例５
ＬＰＯに乳糖（Ｌａｃ）を加えたときの抗菌活性
菌数１０６ＣＦＵ、ＬＰＯ  ４．２３Ｕ／ｍｌ、ＫＳＣＮ  １０ｐｐｍ、ＧＯ  ０．７Ｕ／ｍｌ、Ｇｌｃ  ０．５％、Ｌａｃ  ０．２５％、０．５％、１％、２％となるように加え、ＰＢＳで全液量を１ｍｌとした。コントロールにはＰＢＳ（ｐＨ７．０）のみを加えたもの、Ｌａｃを０．８％加えたもので行った。
結果を図８に示した。ＬＰＯにＬａｃを加えることにより、抗菌活性はＮｏｒｍａｌと比べ一様に低下した。また、乳糖の濃度が高くなるにつれ抗菌活性の低下はより大きなものとなった。しかし、この抗菌活性の低下は図４に示した牛乳を加えたときにみられる抗菌活性の低下と比べると小さなものである。したがって、乳糖は牛乳中でＬＰＯの抗菌活性を決定的に阻害している成分ではないと考えられる。
【００２６】
実施例１
ＬＰＯにケトヘキソースを加えたときの抗菌活性
菌数１０６ＣＦＵ、ＬＰＯ  ４．２３Ｕ／ｍｌ、ＫＳＣＮ  １０ｐｐｍ、ＧＯ  ０．７Ｕ／ｍｌ、Ｇｌｃ  ０．５％、ケトヘキソース  ２％となるように加え、ＰＢＳで全液量を１ｍｌとした。コントロールにはＰＢＳ（ｐＨ７．０）のみを加えたもので行った。結果を図９に示した。Ｄ−Ｆｒｕ０．２％の結果は、ケトヘキソースを加えなかったＮｏｒｍａｌと大して変わらなかったがＤ−Ｐｓｉ０．２％、Ｄ−Ｔａｇ０．２％、Ｄ−Ｓｏｒ０．２％はＮｏｒｍａｌよりも低い結果となった。Ｄ−ＦｒｕとＤ−Ｐｓｉは互いにエピマーで近い構造をしているにもかかわらず抗菌活性の値が異なるのはＤ−Ｐｓｉがもっている抗酸化作用によるものであると考えられる。Ｄ−Ｐｓｉのもつ抗酸化作用によりＬＰＯが過酸化水素を酸化する働きや活性酸素がＯＳＣＮ−を酸化する働きが阻害されるためＳＥに作用するＯＳＣＮ−が作られにくくなり抗菌活性が下がってしまったのだと考えられる。
【００２７】
実施例２
Ｄ−Ａｌｏを加えたときの抗菌活性
菌数１０６ＣＦＵ、ＬＰＯ  ４．２３Ｕ／ｍｌ、ＫＳＣＮ  １０ｐｐｍ、ＧＯ  ０．７Ｕ／ｍｌ、Ｇｌｃ  ０．５％、Ｄ−Ａｌｏ  ０．５％、２％となるように加え、ＰＢＳで全液量を１ｍｌとした。コントロールにはＰＢＳ（ｐＨ７．０）のみを加えたもので行った。
結果を図１０に示した。ＬＰＯに２％Ｄ−Ａｌｏを加えたときの抗菌活性は０．３とＤ−Ａｌｏを加えなかったＮｏｒｍａｌと比べ大きく低下していた。これは、ＬＰＯにＤ−ＰｓｉやＤ−Ｔａｇを加えたときにみられる抗菌活性の低下よりも大きかった。
【００２８】
実施例３〜７，比較例６〜７
糖及びタンパク質によるＬＰＯの酵素活性の阻害
比較例６
乳糖を加えたときのＬＰＯ酵素活性
最終ＬＰＯ濃度０．２〜０．３μｇ／ｍｌ、乳糖０．２％、０．５％とした時、ＬＰＯ酵素活性にはほとんど変化は見られなかった。
【００２９】
実施例３
ケトヘキソースを加えたときのＬＰＯ酵素活性
ＬＰＯに２％ケトヘキソースを加えたときの酵素活性を過酸化水素と、発色剤としてＡＢＴＳを用いて測定した。サンプル１ｍｌのＬＰＯと糖混合液の濃度をそれぞれＬＰＯ  ２〜３μｇ／ｍｌ、ケトヘキソース２％となるように０．１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）を用いて調整した。１ｍＭ  ＡＢＴＳ、０．５５ｍＭ  過酸化水素を４５０μｌずつ１ｍｌ容セルに入れた後に、調整しておいたサンプルを１００μｌ加えた。最終ＬＰＯ濃度０．２〜０．３μｇ／ｍｌ、ケトヘキソース０．２％とした。ケトヘキソースとしてＤ−プシコース（Ｄ−Ｐｓｉ）、Ｄ−フルクトース（Ｄ−Ｆｒｕ）、Ｄ−タガトース（Ｄ−Ｔａｇ）、Ｌ−ソルボース（Ｌ−Ｓｏｒ）を用いて行った。
【００３０】
結果を図１１に示した。Ｄ−Ｆｒｕ、Ｌ−Ｓｏｒは相対活性が１００％に近い値となったため、ＬＰＯの酵素活性を阻害していないのだと考えられる。Ｄ−Ｐｓｉ、Ｄ−ＴａｇはＬＰＯの酵素活性を大きく阻害し、相対活性が２０％近くまで下がった。特にＤ−Ｐｓｉには抗酸化作用があることが知られている。Ｄ−ＦｒｕとＤ−Ｐｓｉ、Ｄ−ＦｒｕとＤ−Ｔａｇはたがいにエピマーで近い構造をしていて、３番目のキラル炭素の持つＯＨ基の向きのみが異なる。
そしてこの違いがＬＰＯの酵素活性に与える影響に大きく影響すると考えられる。
【００３１】
実施例４
ケトヘキソース濃度によるＬＰＯ酵素活性への影響
ＬＰＯに濃度を段階的に変化させたケトヘキソースを加えたときの酵素活性を調べた。ケトヘキソース  ０．１２５％、０．２５％、０．５％、１％、２％（最終ケトヘキソース  濃度０．０１２５％、０．０２５％、０．０５％、０．１％、０．２％）となるようにＬＰＯに加え、酵素活性を測定した。結果を図１２に示した。Ｄ−Ｆｒｕ、Ｌ−ＳｏｒをＬＰＯに加えたときは、常に相対活性が１００％に近い値を示し酵素活性の阻害はみられなかった。Ｄ−Ｐｓｉ、Ｄ−Ｔａｇを加えたときは、濃度が０．２％のときには、相対活性がＤ−Ｐｓｉでは２５％、Ｄ−Ｔａｇでは２７％とＬＰＯの酵素活性を強く阻害していたが糖の濃度を０．１％にして酵素活性を測定してみると両者とも８０％近くまで相対活性が回復した。また０．０５％以降では、ＬＰＯの相対活性は、Ｄ−ＦｒｕやＬ−Ｓｏｒとほぼ同じ値を示した。このことからＤ−Ｐｓｉ、Ｄ−ＴａｇはＬＰＯの酵素活性を阻害するものの低濃度では、ほとんど影響がないことがわかる。
【００３２】
実施例５
アルドヘキソースを加えたときのＬＰＯ酵素活性
ＬＰＯにケトヘキソースと同様に２％アルドヘキソースを加えたときの酵素活性を求めた。
結果を図１３に示した。ＬＰＯにＤ−Ｇｌｃを加えたときの相対活性は、ＬＰＯにアルドヘキソースを添加しなかったＮｏよりも高くなっていた。ただしＧｌｕはＧＯの基質でもあるのでこの結果が抗菌活性を行ったときに直接反映されるとは必ずしもいえない。
ＬＰＯに加えたアルドヘキソースは全体的にＬＰＯの酵素活性に対する影響は比較的小さかったが、Ｄ−Ａｌｏだけが例外でＬＰＯの酵素活性を非常に強く阻害していた。そのためＬＰＯにＤ−Ａｌｏを加えたときの影響をさらに詳しく調べることとした。
【００３３】
実施例６
Ｄ−ＡｌｏによるＬＰＯ酵素活性阻害の反応時間による影響
結果を図１４に示した。ＬＰＯに０．２％Ｄ−Ａｌｏを加えたサンプルの酵素活性は、加えなかったものよりも大きく低下し、回復しなかった。このことからＤ−Ａｌｏによる阻害は強く、長い時間持続するものと考えられる。
【００３４】
実施例７
Ｄ−ＡｌｏによるＬＰＯ酵素活性阻害の濃度による影響
ＬＰＯにＤ−Ａｌｏの濃度を変えて加えたときの酵素活性への影響を調べた結果を図１５に示した。ＬＰＯにＤ−Ａｌｏを加えたときの阻害は、強く相対活性が５０％に回復するのにはＤ−Ａｌｏの濃度を０．０２％にまで下げなければならないほどであった。特にＤ−Ａｌｏ０．２％のときの相対活性は０．０５６％と非常に低いものだった。
【００３５】
比較例７
オボアルブミンを加えたときのＬＰＯ酵素活性
結果を図１６に示した。ＯＶＡをＬＰＯに加えても、ＯＶＡ濃度が０．２％のときにＬＰＯの相対活
性が６０％を示したことからＬＰＯの働きが大して阻害されなかったことがわかる。
【００３６】
まとめ（実施例１〜７，比較例１〜７）
糖とタンパク質によるＬＰＯ抗菌活性と酵素活性への影響。
ＬＰＯに糖及びタンパク質を加えたときにオボアルブミンとＤ−アロースに顕著な抗菌活性の低下が見られた。ＬＰＯの抗菌活性はＬＰＯが過酸化水素を分解して活性酸素を生成し、この活性酸素がチオシアン酸をヒポチオシアン酸（ＯＳＣＮ−）に変え、ヒポチオシアン酸が菌の細胞壁を攻撃することにより発現する。オボアルブミンとＤ−アロースがどの過程で働いているかを検討してみることにする。
ＬＰＯにＤ−Ａｌｏを加えると図１３〜図１５に示したとおり、ＬＰＯの酵素活性を強く阻害するこのことからＬＰＯにＤ−Ａｌｏを加えたときにみられる抗菌活性の低下はＬＰＯの酵素活性の低下と関係があると考えられる。Ｄ−Ａｌｏには、強い抗酸化作用があるのでＬＰＯの働きにより生じた活性酸素が消去されてしまい、それ以降の反応が起こらずＳＥを攻撃するＯＳＣＮ−が作られないためＳＥが生き残り、抗菌活性が低くなってしまったのだと考えられる。
Ｄ−ＡｌｏにしろＤ−ＰｓｉにしろＬＰＯの活性を大きく阻害する糖にはキラル炭素が持つＯＨ基の向きがそろっているという特徴があることが今回の結果からあげられる。
特に、Ｄ−Ａｌｏでは４つのＯＨ基が同じ方向を向いていてその数は今回の実験で用いた糖の中では最も多い、そしてもっとも強くＬＰＯの酵素活性及び抗菌活性を阻害している。
また、ＬＰＯにＯＶＡを加えても酵素活性の阻害が比較的弱いのにもかかわらず、ＯＶＡが存在するときに抗菌活性が大きく阻害されるという結果（図７，図１６）となった。これはＯＶＡの存在によってＬＰＯ自体の働きが阻害されたり生じた活性酸素が消去されるのではなく、ＬＰＯの働きにより作られるＯＳＣＮ−がＯＶＡ表面のアミノ酸側鎖により消去されてしまい、結果としてＳＥが生き残りやすくなるため抗菌活性が低下したのだと考えられる。
【００３７】
【発明の効果】
食品中の汚染微生物の生菌数を正確に測定するシステムを構築することで、病原性微生物による食中毒を予防できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＰ−セファロースカラムによるＬＰＯ溶出パターン。
０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ６．８）を用いてＬＰＯを溶出させた。吸光度２８０ｎｍはタンパク質量、４０５ｎｍは酵素活性を示す。
【図２】ＳＰ−セファロースで得られた各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｎｏ．７〜Ｎｏ．２３：フラクションナンバー
【図３】ＬＰＯのユニット数を変化させたときの抗菌活性
菌数１０６ＣＦＵ、ＫＳＣＮ  １０ｐｐｍ、ＧＯ  ０．７Ｕ／ｍｌ、Ｇｌｃ  ０．５％、ｐＨ７．０と固定し、ＬＰＯのユニット数を０．２７Ｕから２倍ずつ４．３２Ｕまで変化させて、３０℃で２時間インキュベートした。
【図４】ＬＰＯに牛乳を加えたときの抗菌活性
Ｃ（ｍｉｌｋ）：  ５０％希釈牛乳、Ｎｏｒｍａｌ：ＬＰＯのみ、Ｍ３．２￣Ｍ５０：ＬＰＯ＋希釈牛乳
【図５】ＬＰＯにＢＳＡを加えたときの抗菌活性．
Ｃ（ＢＳＡ）：ＰＢＳ＋ＢＳＡ０．４％、Ｎｏｒｍａｌ：ＬＰＯのみ、Ｂ０．０２５％〜Ｂ０．４％：ＬＰＯ＋ＢＳＡ
【図６】ＬＰＯにβ−Ｌｇを加えたときの抗菌活性
Ｃ（β−Ｌｇ）：ＰＢＳ＋β−Ｌｇ０．４％、Ｎｏｒｍａｌ：ＬＰＯのみ、Ｇ０．０２５％￣Ｇ０．４％：ＬＰＯ＋β−Ｌｇ
【図７】ＬＰＯにＯＶＡを加えたときの抗菌活性
Ｎｏｒｍａｌ：ＬＰＯのみ、ＯＶＡ：ＬＰＯ＋ＯＶＡ
【図８】ＬＰＯに乳糖（Ｌａｃ）を加えたときの抗菌活性
Ｃ（Ｌａｃ）：ＰＢＳ＋Ｌａｃ０．８％、Ｎｏｒｍａｌ：ＬＰＯのみ、Ｌ０．２５％〜Ｌ２％：ＬＰＯ＋Ｌａｃ
【図９】ＬＰＯにケトヘキソースを加えたときの抗菌活性  Ｎｏｒｍａｌ：ＬＰＯのみ、Ｄ−Ｆｒｕ￣Ｄ−Ｓｏｒ：ＬＰＯ＋ケトヘキソース２％
【図１０】ＬＰＯにＤ−Ａｌｏを加えたときの抗菌活性
Ｎｏｒｍａｌ：ＬＰＯのみ、Ｄ−Ａｌｏ０．５％￣２％：ＬＰＯ＋Ｄ−Ａｌｏ
【図１１】ＬＰＯにケトヘキソースを加えたときの酵素活性
【図１２】ＬＰＯにケトヘキソースを加えたときの相対活性の変化
【図１３】ＬＰＯにアルドヘキソースを加えたときの相対活性
【図１４】ＬＰＯに０．２％Ｄ−Ａｌｏを加えたときの阻害の時間経過
【図１５】ＬＰＯ酵素活性に及ぼすＤ−Ａｌｏ濃度の影響
【図１６】ＬＰＯにＯＶＡを加えたときの酵素活性
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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