(57)【要約】【課題】新規な急性創傷治療剤、ケラノサイト増殖促進剤または再上皮形成剤を提供する。また急性創傷治癒過程を研究するのに有用な病態非ヒトモデル動物を提供する。【解決手段】本発明の急性創傷治療剤、ケラノサイト増殖促進剤または再上皮形成剤は、アディポネクチンを有効成分とすることを特徴とする。また、アディポネクチン遺伝子欠損非ヒト動物を、急性創傷治癒過程を研究するのに有用な急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物として提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アディポネクチンを有効成分として含有する急性創傷治療剤。
【請求項２】
下記（ａ）または（ｂ）に記載するポリペプチドを有効成分として含有する急性創傷治療剤。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走促進活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
前記アディポネクチンが遺伝子組換え体であることを特徴とする請求項１に記載の急性創傷治療剤。
【請求項４】
アディポネクチンを有効成分として含有するケラチノサイト増殖促進剤。
【請求項５】
下記（ａ）または（ｂ）に記載するポリペプチドを有効成分として含有するケラチノサイト増殖促進剤。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走促進活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
前記アディポネクチンが遺伝子組換え体であることを特徴とする請求項４に記載のケラチノサイト増殖促進剤。
【請求項７】
アディポネクチンを有効成分として含有する再上皮形成促進剤。
【請求項８】
下記（ａ）または（ｂ）に記載するポリペプチドを有効成分として含有する再上皮形成促進剤。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走促進活性を有するポリペプチド。
【請求項９】
前記アディポネクチンが遺伝子組換え体であることを特徴とする請求項７に記載の再上皮形成促進剤。
【請求項１０】
アディポネクチン遺伝子の全部若しくは一部が欠失してなるか、または任意の部位に他の遺伝子が挿入若しくは置換されてなることを特徴とする急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物。
【請求項１１】
アディポネクチンのマウスｃＤＮＡの３８〜２６８番目に相当するゲノム領域を欠失しているか、または該ゲノム領域が他の塩基配列で置換されてなる形質転換マウスである請求項１０に記載の急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物。
【請求項１２】
再上皮形成が、対応する正常非ヒト動物に比べて低下してなる請求項１０又は１１に記載の急性創傷遅延非ヒトモデル動物。
【請求項１３】
下記の工程を有する、創傷治療剤の有効成分のスクリーニング方法：
（１）請求項１０〜１２のいずれかに記載に急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物  に急性創傷を形成する工程、
（２）  上記急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に対して、被験物質を投与する工程、
（３）  以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかの試験を実施する工程、
（ａ）上記被験物質を投与した急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物の創傷部位における再上皮形成を測定し、被験物質を投与しない対照の急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物の創傷部位における再上皮形成と対比する、
（ｂ）上記被験物質を投与した急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物について創傷によって誘導される創傷部位におけるケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数叉はＢｒｄＵ取込みの増加量を測定し、被験物質を投与しない対照の急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物について創傷によって誘導される創傷部位におけるケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数叉はＢｒｄＵ取込みの増加量と対比する、
（４）（３）で実施した（ａ）または（ｂ）のいずれかの試験の結果に基づいて、被験物質を投与しない対照の急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に比してそれぞれ下記（ａ’）または（ｂ’）のいずれかの効果が得られた、急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に対して投与された被験物質を、急性創傷治療剤の有効成分の候補成分として選択する工程：
（ａ’）再上皮形成促進または増加、
（ｂ’）ケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数の増加またはＢｒｄＵ取込み量の増加。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アディポネクチンの新規用途に関する。より詳細には本発明はアディポネクチンの急性創傷治療剤、ケラチノサイト増殖促進剤または再上皮形成促進剤の有効成分としての新たな用途に関する。
【０００２】
また、本発明は上記アディポネクチン遺伝子を欠損した非ヒト動物の急性創傷治癒遅延モデル動物としての用途に関する。
【０００３】
【従来の技術】
難治性創傷は、肥満のヒトや糖尿病患者において、重大な問題である。米国においてはおよそ６５０万人のヒトが毎年糖尿病性の足趾潰瘍を患っている（例えば非特許文献１等を参照のこと）。創傷治療剤を開発するためにも創傷治癒の分子メカニズムを解き明かすことは重要な問題である。
【０００４】
創傷治癒過程の最初の段階は、創傷部のフィブリン塊を溶解することである。創傷端ではケラチノサイトは創傷を被覆するために遊走し、成長因子の刺激によって増殖する。創傷隣接部の線維芽細胞は肉芽組織を形成するために増殖し、基質蛋白質を産生する。主要な線維溶解性酵素はプラスミンであり、脂肪細胞はそれらの活性を制御するためにプラスミノーゲンアクチベーターのインヒビター、ＰＡＩ−１を産生する。ＰＡＩ−１は線溶系を抑制する。肥満では、脂肪細胞は循環系と同様に局所の皮下脂肪でＰＡＩ−１を過剰産生する。
【０００５】
脂肪組織は皮下に存在し、創傷治癒過程において重要な役割を演じているかもしれない。脂肪組織は、過剰なエネルギー貯蔵組織として元来見なされていたけれども、近年の研究によると、この組織がアディポサイトカイン叉はアディポカインとして概念として纏められた種々の生物活性物質を産生分泌していることが指摘されている（例えば非特許文献２〜８等を参照のこと）。
【０００６】
これらの生物活性物質は、サイトカインや成長因子などの免疫系における補充因子を含んでいる。幾つかのアディポサイトカインは、肥満や２型糖尿病において過剰産生されている。ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）は、インスリンレセプターシグナリングと相互作用する（例えば非特許文献５等を参照のこと）。ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ｈｅｐａｒｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：  ＨＢ−ＥＧＦ）は、血管平滑筋細胞の増殖を促進する（例えば非特許文献９等を参照のこと）。これらのアディポサイトカインは創傷治癒に影響を与えるかもしれないが、そのような過程についてはわずかしか知られていない現状にある。わずかに１つの事例として、レプチンがケラチノサイト成長を増加させ、再上皮形成を加速させることが報告されている（例えば非特許文献１０等を参照のこと）。しかしながら、レプチンは脳に対する飽食シグナルを主に伝送し、その主な機能は肥満においてはレプチン抵抗性のため弱められる（例えば非特許文献１１及び１２等を参照のこと）。
【０００７】
ところで、アディポネクチンは２４４アミノ酸残基からなる蛋白質で、可溶性防御コラーゲン・スーパーファミリーのメンバーである。アディポネクチンの発現は、脂肪組織に限定されている（例えば非特許文献１３〜１５等を参照のこと）。また当該蛋白質は、繊維状コラーゲン用ドメインと補体系Ｃ１ｑ様小球体ドメインからなっている（例えば非特許文献１４等を参照のこと）。しかしながらアディポネクチンの生理学的な機能は完全にはわかっていないのが現状である。今まで知られているアディポネクチンの作用としては、インビトロ及びインビボの両者において抗動脈硬化作用及び抗糖尿病作用を有すること（例えば、非特許文献１５〜１９等参照のこと）、並びに、単球系細胞又は単球系前駆細胞の増殖を抑制する作用やこの作用に基づく抗炎症作用を有することが報告されている（例えば、特許文献１等参照のこと）。
【０００８】
動脈硬化は、傷害した動脈壁の高反応性治癒過程として考えられている。循環している血漿中のアディポネクチン濃度は、肥満や２型糖尿病患者において低下している（例えば、非特許文献２０及び２１等参照のこと）。また、このアディポネクチン遺伝子が欠損した遺伝子欠損マウスは、インスリン抵抗性、耐糖能異常、動脈硬化を呈することが最近報告されている（例えば、非特許文献２２〜２４等参照のこと）  。
【０００９】
またアディポネクチンは、ヒト動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣｓ）において、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＨＢ−ＥＧＦ、ｂＦＧＦを含む種々の成長因子によって誘導される増殖と遊走を抑制することも報告されている（例えば、非特許文献１８及び１９等参照のこと）。マウスにおいては、カテーテル誘導性剥離後の動脈における平滑筋細胞の新生血管内膜の増殖は、アディポネクチン遺伝子を破壊することによって促進され、逆にアディポネクチン遺伝子を過剰発現させることによって抑制されることも報告されている（例えば、非特許文献１９等参照のこと）。
【００１０】
【非特許文献１】
Ｓｉｎｇｅｒ，  Ａ．Ｊ．，  Ｃｌａｒｋ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３４１，  ７３８−７４６  （１９９９）
【００１１】
【非特許文献２】
Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．，  Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．  Ｓ．，  Ｃｅｌｌ，８７，３７７−３８９  （１９９６）
【００１２】
【非特許文献３】
Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ｇ．Ｓ．，Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，  Ｂ．  Ｍ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ４３，１２７１−１２７８  （１９９４）
【００１３】
【非特許文献４】
Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｈａｌａａｓ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９５，  ７６３−７７０  （１９９８）
【００１４】
【非特許文献５】
Ｓａｌｔｉｅｌ，  Ａ．Ｒ．，  Ｋａｈｎ，  Ｃ．Ｒ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１４，７  ９９−８０６  （２００１）
【００１５】
【非特許文献６】
Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，  Ｇ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９５，  ２４０９−２４１５  （１９９５）
【００１６】
【非特許文献７】
Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  ２，  ８００−８０２  （１９９６）
【００１７】
【非特許文献８】
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂ．  Ｂ．  Ｒ．  Ｃ．，  ２９２，  ７８１−７８６  （２００２）
【００１８】
【非特許文献９】
Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５１，  ９３６−９３９  （２０００））。
【００１９】
【非特許文献１０】
Ｆｒａｎｋ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，１０６，  ５０１−５０９  （２０００）
【００２０】
【非特許文献１１】
Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７２，  ４２５−４３２  （１９９４）
【００２１】
【非特許文献１２】
Ｆｒｅｄｅｒｉｃｈ，  Ｒ．Ｃ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９６，  １６５８−１６６３  （１９９５）
【００２２】
【非特許文献１３】
Ｍａｅｄａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂ．  Ｂ．Ｒ  ．  Ｃ．，  ２２１，  ２８６−２８９（１９９６）
【００２３】
【非特許文献１４】
Ｓｃｈｅｒｅｒ，  Ｅ．  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７０，  ２６７４６−２６７４９  （１９９５）
【００２４】
【非特許文献１５】
Ｏｕｃｈｉ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １００，  ２４７３−２４７６  （１９９９）
【００２５】
【非特許文献１６】
Ｏｕｃｈｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １０２，  １２９６−１３０１  （２０００）
【００２６】
【非特許文献１７】
Ｏｕｃｈｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １０３，  １０５７−１０６３  （２００１）
【００２７】
【非特許文献１８】
Ａｒｉｔａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １０５，  ２８９３−２９９８  （２００２）
【００２８】
【非特許文献１９】
Ｍａｔｓｕｄａ，  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ３７４８７−３７４９１  （２００２））。
【００２９】
【非特許文献２０】
Ａｒｉｔａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２５７，７９−８３  （１９９９）
【００３０】
【非特許文献２１】
Ｈｏｔｔａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ２０，  １５９５−１５９９  （２０００）
【００３１】
【非特許文献２２】
Ｋｕｂｏｔａ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ２５８６３−２５８６６  （２００２）
【００３２】
【非特許文献２３】
Ｍａｅｄａ，Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｅｃｉｎｅ，  ８，  ７３１−７３７  （２００２）
【００３３】
【非特許文献２４】
Ｍａ，  Ｋｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ３４６５８−３４６６１  （２００２）
【００３４】
【非特許文献２５】
Ｂｅｒｇ，  Ａ．  Ｈ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ７（８）  ９４７−９５３  （２００１）
【００３５】
【非特許文献２６】
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，  Ｋ．，  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  ２８，  ５２１−５３４  （２００１）
【００３６】
【非特許文献２７】
Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．，  ３２，  ４７−５０（２０００）
【００３７】
【非特許文献２８】
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １１２，  ４８３−４８８  （１９９９）
【００３８】
【非特許文献２９】
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｓｃｉ．，  １８，  ３５−４２  （１９９８）
【００３９】
【非特許文献３０】
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｓｕｒｇ．，  ２８，  ３１４−３１９  （２００２）
【００４０】
【非特許文献３１】
Ｓａｎｏ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １８，  ４６５７−４６６８  （１９９９）
【００４１】
【非特許文献３２】
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｓｕｒｇ．，  ２８，  ３１４−３１９  （２００２）
【００４２】
【非特許文献３３】
Ｗａｉｋｅｌ，Ｒ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２８，  １６５−１６８  （２００１）
【００４３】
【非特許文献３４】
Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，７５−８１（１９９７）
【００４４】
【非特許文献３５】
Ｆｒａｎｋ，  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７１，    １０１８８−１０１９３  （１９９６）
【００４５】
【特許文献１】
特許第３０１８１８６号公報
【００４６】
【特許文献２】
ＰＣＴ国際公開ＷＯ９６／３９４２９
【００４７】
【特許文献３】
特開２０００−３２５０８７号公報
【００４８】
【特許文献４】
ＰＣＴ国際公開ＷＯ９９／２１５７７
【００４９】
【発明が解決しようとする課題】
アディポネクチンを初めとするアディポサイトカインの創傷治癒との関わりを研究し、創傷治癒の分子メカニズムを解明するうえで、アディポネクチン遺伝子を全く産生しないか若しくは少量しか産生しないような、所謂アディポネクチン遺伝子を欠損した動物（アディポネクチン遺伝子発現不全動物）のさらなる特性を研究することは極めて有用と思われる。
【００５０】
そこで、本発明の目的は、アディポネクチン遺伝子及びその発現産物（蛋白質、ポリペプチド）の創傷治癒に関する生理学的機能を解明し、創傷やそれに関連する病態を治療するための新しい方法や薬剤を提供することである。さらに本発明は、アディポネクチン遺伝子を欠損した非ヒト動物を新たな病態モデル動物として提供することを目的とする。
【００５１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、創傷を有する患者の皮膚組織におけるアディポネクチンの局在と発現解析をおこない、さらに創傷治癒過程におけるアディポネクチンの機能を検討したところ、驚くべきことに、急性創傷の治癒過程では、アディポネクチンは、正常平滑筋細胞における作用（Ａｒｉｔａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，  １０５，  ２８９３−２９９８  （２００２）；Ｍａｔｓｕｄａ，  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ３７４８７−３７４９１  （２００２））に反して、ケラチノサイトの増殖と遊走を促進することを見出した。また、アディポネクチン遺伝子欠損マウスと野生型マウスとで皮膚創傷を作製して皮膚創傷治癒の過程を比較したところ、アディポネクチン遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比較して、乏しい再上皮形成と増加した肉芽組織によって特徴づけられる創傷治癒の遅延が認められた。また培養ケラチノサイトにおいて、アディポネクチンは、ＥＲＫ１／２のリン酸化を高め、用量依存的にケラチノサイトの増殖と遊走を促進した。以上の知見はアディポネクチンが創傷治癒に関係することを示すものであり、アディポネクチンが急性創傷治療剤、ケラチノサイト増殖促進剤または再上皮形成促進剤の有効成分として有用であることが示唆された。
【００５２】
また、上記のことから、アディポネクチン遺伝子を欠損したマウスは、急性創傷治癒遅延モデル動物として、創傷治癒過程の研究並びに急性創傷治療剤、ケラチノサイト増殖促進剤または再上皮形成促進剤の有効成分のスクリーニング系に有効に使用できるものと考えられる。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。
【００５３】
すなわち、本発明はアディポネクチンの新規な用途、特にアディポネクチンを有効成分とする急性創傷治療剤、ケラチノサイト増殖促進剤または再上皮形成促進剤を提供するものである。本発明によれば、種々の創傷、潰瘍並びに皮膚障害の治療のためのアディポネクチンを有効成分とする治療剤を提供することができる。
【００５４】
また、本発明は、アディポネクチン遺伝子欠損非ヒト動物の新規な病態モデルとしての用途、特に急性創傷遅延モデル動物としての用途を提供し、さらに当該急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物を用いた急性創傷治療のための候補薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【００５５】
具体的には、本発明は下記の態様を包含するものである：
項１．アディポネクチンを有効成分として含有する急性創傷治療剤。
項２．下記（ａ）または（ｂ）に記載するポリペプチドを有効成分として含有する急性創傷治療剤。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走促進活性を有するポリペプチド。
項３．前記アディポネクチンが遺伝子組換え体であることを特徴とする項１に記載の急性創傷治療剤。
【００５６】
項４．アディポネクチンを有効成分として含有するケラチノサイト増殖促進剤。
項５．下記（ａ）または（ｂ）に記載するポリペプチドを有効成分として含有するケラチノサイト増殖促進剤。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走促進活性を有するポリペプチド。
項６．前記アディポネクチンが遺伝子組換え体であることを特徴とする項４に記載のケラチノサイト増殖促進剤。
【００５７】
項７．アディポネクチンを有効成分として含有する再上皮形成促進剤。
項８．下記（ａ）または（ｂ）に記載するポリペプチドを有効成分として含有する再上皮形成促進剤。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走促進活性を有するポリペプチド。
項９．前記アディポネクチンが遺伝子組換え体であることを特徴とする項７に記載の再上皮形成促進剤。
【００５８】
項１０．アディポネクチン遺伝子の全部若しくは一部が欠失してなるか、または任意の部位に他の遺伝子が挿入若しくは置換されてなることを特徴とする急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物。
項１１．アディポネクチンのマウスｃＤＮＡの３８〜２６８番目に相当するゲノム領域を欠失しているか、または該ゲノム領域が他の塩基配列で置換されてなる形質転換マウスである項１０に記載の急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物。
項１２．再上皮形成が対応する正常非ヒト動物に比べて低下してなる項１０又は１１に記載の急性創傷遅延非ヒトモデル動物。
【００５９】
なお、上記項１０〜１２は、下記の項１０’〜１２’と言い換えることもできる。
項１０’．アディポネクチン遺伝子の全部若しくは一部が欠失してなるか、または任意の部位に他の遺伝子が挿入若しくは置換されてなるアディポネクチン遺伝子欠損非ヒト動物の急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物としての使用。
項１１’．アディポネクチン遺伝子欠損非ヒト動物がマウスのアディポネクチンのｃＤＮＡの３８〜２６８番目に相当するゲノム領域を欠失しているか、または該ゲノム領域が他の塩基配列で置換されてなる形質転換マウスである項１０’に記載する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物としての使用。
項１２’．アディポネクチン遺伝子欠損非ヒト動物が、再上皮形成過程障害が対応する正常非ヒト動物に比べて低下してなるものである項１０’又は１１’に記載の急性創傷遅延非ヒトモデル動物としての使用。
【００６０】
項１３．下記の工程を有する、創傷治療剤の有効成分のスクリーニング方法：
（１）項１０〜１２のいずれかに記載に急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に急性創傷を形成する工程、
（２）記急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に対して、被験物質を投与する工程、
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかの試験を実施する工程、
（ａ）上記被験物質を投与した急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル
動物の創傷部位における再上皮形成を測定し、被験物質を投与しない対照の急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物の創傷部位におけ
る再上皮形成と対比する、
（ｂ）上記被験物質を投与した急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル
動物について創傷によって誘導される創傷部位におけるケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数叉はＢｒｄＵ取込みの増加量を測定し、被験物質を投与しない対照の急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物について創傷によって誘導される創傷部位におけるケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数叉はＢｒｄＵ取込みの増加量と対比する、
（４）（３）で実施した（ａ）または（ｂ）のいずれかの試験の結果に基づいて、被験物質を投与しない対照の急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に比してそれぞれ下記（ａ’）または（ｂ’）のいずれかの効果が得られた急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に対して投与された被験物質を、急性創傷治療剤の有効成分として選択する工程：
（ａ’）再上皮形成促進または増加、
（ｂ’）ケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数の増加またはＢｒｄＵ取込み量の増加。
【００６１】
【発明の実施の形態】
（１）本発明で使用する用語の定義
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １３８：  ９  （１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００６２】
また、ＤＮＡの合成、外因性遺伝子を含有するベクター（発現ベクター）の製造、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換する方法、該宿主細胞を用いて所望蛋白質を製造する方法などは、一般的遺伝子工学的手法に従うか若しくはそれらに準じて容易に行うことができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）など参照〕。
【００６３】
本発明において遺伝子とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡをいずれも包含する趣旨で用いられ、またその長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子には、特に言及しない限り、動物のゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及びｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
【００６４】
また、本発明において遺伝子とは、特に言及しない限り、リーダ配列、コード領域、エキソン及びイントロン等の機能領域の別を問うものではなく、いずれも包含するものである。またポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡ及びＤＮＡが例示される。ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡがいずれも含まれ、また特定のアミノ酸配列からなる（ポリ）ペプチドには、その同等効果物（同族体、誘導体、変異体）がいずれも含まれる。またＲＮＡには１本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡｉ（２本鎖ＲＮＡ）が含まれる。
【００６５】
なお、遺伝子及び（ポリ）ペプチドに関する変異体には、天然において突然変異や翻訳後の修飾等によって生じる変異体（例えばアレル変異体）、天然由来の遺伝子又は（ポリ）ペプチドの配列の任意部位を人為的に欠失、置換または、付加（若しくは挿入）させることによって作成される変異体が包含される。
【００６６】
（２）アディポネクチン遺伝子およびその発現産物
アディポネクチン遺伝子は、アディポサイトカインの概念のひとつとして知られている脂肪組織に特異的に高発現している遺伝子である。ａｐＭ１、Ａｃｒｐ３０、ＡｄｉｐｏＱ等として、その遺伝子配列も知られている。
Ａｃｒｐ３０  ｍＲＮＡ発現量はｏｂ／ｏｂマウスなどの肥満モデルマウスやヒト肥満患者で減少する。ヒトＡｃｒｐ３０遺伝子は糖尿病の責任遺伝子座である３ｑ２７に存在し、さらにこの遺伝子の一塩基多型とインスリン抵抗性、血中アディポネクチン濃度との間に有意な相関が認められている（非特許文献２５）。
【００６７】
また、その発現産物であるアディポネクチンは、分子量約３０ＫＤａの分泌蛋白質である（非特許文献１３）。この蛋白質は２４７アミノ酸残基からなり、Ｃ末端側に補体Ｃｑｉ様球状ドメインを有する。そのアミノ酸配列は、８型、１０型コラーゲンやプレセレベリン（ｐｒｅｃｅｒｅｂｅｌｉｎ）、冬眠動物に見られる冬眠調節蛋白（ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ  −  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｈｉｂ）などと類似しており、また立体構造はＴＮＦ−αに酷似している。
【００６８】
（３）  本発明医薬組成物の有効成分として用いられるポリペプチド（以下、単に「本発明ポリペプチド」ともいう）
本発明は急性創傷治療のために有効に用いられる医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、その有効成分として「アディポネクチン」と名付けられたポリペプチドを含むことを特徴とするものである。ヒトのアディポネクチンをコードする全長ＤＮＡの配列は４５１７ｂｐからなるが、そのうちＯＲＦをコードするＤＮＡ配列は７３２ｂｐからなり、配列番号：２に示すとおりである。そのＯＲＦによってコードされるポリペプチドは、配列番号：１に示すように２４４アミノ酸配列からなる。また、マウスのアディポネクチン（マウスＡｃｒｏｐ３０）をコードする全長ＤＮＡの配列は１２７６ｂｐからなるが、そのうちＯＲＦをコードするＤＮＡ配列は７４１ｂｐからなり、配列番号：４に示すとおりである。そのＯＲＦによってコードされるポリペプチドは、配列番号：３に示すように２４７アミノ酸配列からなる。また、ヒト及びマウスのアディポネクチンは脂肪組織に特異的にその遺伝子の発現が認められている。
【００６９】
尚、ヒト及びマウスのアディポネクチン遺伝子は、（非特許文献２）のヒトＡｃｒｏｐ３０及びマウスＡｃｒｏｐ３０として、ヒトアディポネクチン（ポリペプチド）は、ａｐＭ１として、（非特許文献１３）に開示されている。
【００７０】
アディポネクチンのアミノ酸配列は、例えば特許文献２及び４にその推定アミノ酸配列が記載されているように公知である。しかしながら、後者の文献には、当該アディポネクチンの作用として動脈硬化症予防・改善作用、平滑筋細胞増殖抑制作用、血管再建術後の再狭窄予防・治療作用、及び抗炎症作用が記載されているにすぎず、また、特許文献１にも単球系細胞増殖抑制作用や抗炎症作用が記載されているだけである。本発明は、アディポネクチンが急性期の創傷治癒過程において、ケラチノサイトの増殖と遊走を促進するという新たな作用を有することを見いだしたことに基づくものである。かかる知見は、アディポネクチンがヒト動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣｓ）において種々の成長因子によって誘導される細胞増殖と遊走を抑制するという従来の知見（例えば、非特許文献１８及び１９参照）と相反する、新たな知見である。
【００７１】
アディポネクチンに見出された急性期の創傷治癒過程におけるケラチノサイトの増殖及び遊走促進作用に基づいて、当該アディポネクチンは急性創傷治癒促進作用を有する。それ故、アディポネクチンを有効成分とする本発明の医薬組成物は、例えばケラチノサイトの増殖促進剤、または急性創傷治療剤などとして有効に用いることができる。急性創傷としては、例えば創傷ややけどなどによって生じる種々の創傷症状を挙げることができる。具体的には、切り傷、すり傷、外科的侵襲、皮膚移植、やけど、日焼け等；または種々の潰瘍、例えば皮膚潰瘍、消化管潰瘍、糖尿病足趾部の潰瘍、床ずれ、静脈うっ血のような潰瘍傷；さらに、破傷、乾癬、皮膚発疹のような皮膚傷害、並びに角膜損傷による傷などを例示することができる。
【００７２】
本発明の医薬組成物が有効成分とするポリペプチドは、好ましくは配列番号：１で表わされるヒトのアディポネクチンのアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００７３】
該本発明ポリペプチドは、例えば、ヒト細胞、特にヒト脂肪細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト（ケラチノサイト）、平滑筋細胞、血管内皮細胞、肝細胞、心筋細胞、上皮細胞臓脂肪組織、あるいは例えばヒト組織、特に脂肪組織、動脈血管、肝臓、門脈血管、心臓、肉芽組織、上皮を起源として単離されたヒト細胞乃至組織由来ポリペプチドであってもよく、またそのアミノ酸配列情報に従って合成して得られるポリペプチドであってもよい。
【００７４】
また、本発明ポリペプチドには、上記ヒト由来のアディポネクチンだけでなく、当該アディポネクチンと同質の活性を有する、酵母、線虫、植物組織、哺乳動物由来のポリペプチドも含まれる。ここで哺乳動物としては、ヒト以外の例えばウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、マウス、ウサギなどが例示できる。
【００７５】
本発明ポリペプチドは、上記配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するアディポネクチンに限定されず、これと一定の相同性を有するものであることができる（当該ポリペプチドを「アディポネクチン同効物」ともいう）。
【００７６】
該相同性を有するアディポネクチン同効物としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と例えば約８０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の割合で同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを例示することができる。但し、かかる一定の相同性を有するアミノ酸配列のポリペプチドは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質のケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走を促進する活性を有する必要がある。ここで、実質的に同質とは、上記の活性が性質的に（例えば生理化学的にまたは薬理学的に）同質であることを意味するものであって、活性の程度などの量的要素は異なっていてもよい。
【００７７】
また、アディポネクチン同効物としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列（改変アミノ酸配列）からなり、且つケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走を促進する活性を有するものを例示することができる。
【００７８】
ここで「配列番号：１で表わされるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換また付加されたアミノ酸配列」との記載において、「欠失、挿入、置換または付加」の程度およびそれらの位置は、改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質のケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走を促進する活性を有する同効物であれば特に制限されない。上記改変の程度は、通常１から数個程度であるのが好ましい。ここで実質的に同質とは上記した意味である。また改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（アディポネクチン同効物）は、上記のいずれか少なくとも１つの活性を有するものであればよいが、好ましくは更に配列番号：１のアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の抗原性および免疫原性活性を有していることが望ましい。
【００７９】
本発明ポリペプチドが有する急性創傷治癒促進活性とは、創傷、皮膚移植、外科的侵襲、やけどなどの組織傷害を負った際の急性期の創傷治癒過程におけるケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走を促進する作用を含むものとして例示されるか、または傷害細胞におけるＢｒｄＵ陽性細胞数の増加、又はケラチノサイトへＢｒｄＵ取り込み増加作用として例示される。或いは本発明ポリペプチドが有する急性創傷治癒促進活性とは、傷害組織の瘢痕形成における再上皮形成を促進する作用として例示することができる。従って、アディポネクチンを有効成分とする本発明の医薬組成物は、上記ケラチノサイトの増殖促進剤または急性創傷治療剤以外にも、再上皮形成促進剤としても有効に用いることができる。
【００８０】
尚、ポリペプチドの相同性は、該ポリペプチドのアミノ酸配列またはそれをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を、配列分析ソフトウェア、例えばＦＡＳＴＡプログラムを使用して解析（Ｃｌｕｓｔａｌ，Ｖ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５，  ３０７−３１８  （１９９４））することによって求めることができる。相同性検索において最も好ましく簡便な方法は、コンピューターにより読取り可能な媒体（例えば、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、外部ディスクドライブおよびＤＶＤ）中にアミノ酸配列またはそれをコードする塩基配列を記憶させ、ついでその記憶された配列を使用して、よく知られた検索手段で配列データベースを検索することである。公的なデータベースの具体例には以下のものが含まれる。
ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）；
Ｇｅｎｅｂａｎｋ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．  ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｗｅｂ／Ｇｅｎｅｂａｎｋ／Ｉｎｄｅｘ．ｈｔｌｍ）；  およびｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＥＭＢＬ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｂｉ  ｄｏｃｓ／ｅｍｂｌ  ｄｂ．ｈｔｍｌ）。
【００８１】
多数の種々の検索アルゴリズムが当業者に利用可能であり、その一例として、ＢＬＡＳＴプログラムと称されるプログラム１式が挙げられる。５つのＢＬＡＳＴ手段があり、そのうちの３つはヌクレオチド配列の照会用に設計されたものであり（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸおよびＴＢＬＡＳＴＸ）、２つはタンパク質配列の照会用に設計されたものである（ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ）（Ｃｏｕｌｓｏｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １２：７６−８０  （１９９４）；  Ｂｉｒｒｅｎら，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  １：５４３−５５９  （１９９７）  ）。追加的なプログラム、例えば、配列アライメントプログラム、より遠縁の配列の同定のためのプログラムなどが、同定された配列の分析のために当技術分野において利用可能であり、当業者によく知られている。
【００８２】
下記に相互に置換可能なアミノ酸を列記する。当該情報は、活性を保存した状態で配列番号：１のアミノ酸配列を改変してなる本発明のポリペプチドの調製に有効に利用することができる。
＜元のアミノ酸残基保存的な置換アミノ酸残基＞
Ａｌａ；  Ｓｅｒ
Ａｒｇ；  Ｌｙｓ
Ａｓｎ；  ＧｌｎまたはＨｉｓ
Ａｓｐ；  Ｇｌｕ
Ｃｙｓ；  Ｓｅｒ
Ｇｌｎ；  Ａｓｎ
Ｇｌｕ；  Ａｓｐ
Ｇｌｙ；  Ｐｒｏ
Ｈｉｓ；  Ａｓｎ  またはＧｌｎ
Ｉｌｅ；  Ｌｅｕ  またはＶａｌ
Ｌｅｕ；  Ｉｌｅ  またはＶａｌ
Ｌｙｓ；  Ａｒｇ，  Ａｓｎ，  または  Ｇｌｕ
Ｍｅｔ；  Ｌｅｕ  またはＩｌｅ
Ｐｈｅ；  Ｍｅｔ，  Ｌｅｕ  またはＴｙｒ
Ｓｅｒ；  Ｔｈｒ
Ｔｈｒ；  Ｓｅｒ
Ｔｒｐ；  Ｔｙｒ
Ｔｙｒ；  Ｔｒｐ  またはＰｈｅ
Ｖａｌ；  Ｉｌｅ  またはＬｅｕ。
【００８３】
また、アミノ酸を置換することによって、一般に例えば、
ａ）置換した領域におけるポリペプチドの構造背景、
ｂ）標的部位のポリペプチドの電荷または疎水性、
ｃ）アミノ酸側鎖の大きさ（容積）。
が変化することが知られている。蛋白質の特性に最も大きな変化を生み出すとされている置換には、以下のものがあげられる：
ａ）  親水性残基、例えばＳｅｒまたはＴｈｒを疎水性残基例えば、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＶａｌまたはＡｌａに置換する、
ｂ）  ＣｙｓまたはＰｒｏを、他の任意の残基に置換する、
ｃ）  電気的陽性側鎖を有している残基、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓを電気的陰性残基、例えば、ＶａｌまたはＡｓｐで置換する、
ｄ）非常に大きな側鎖を有している残基、例えばＰｈｅを、Ｇｌｙのような側鎖を有し  ないものと置換する。
【００８４】
本発明ポリペプチドは、アディポネクチンまたはその同効物をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドからなるＤＮＡ分子を保有させた形質転換体から調製することができる。ここで形質転換体は、アディポネクチンまたはその同効物をコードする塩基配列を有し、上記所定のケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走を促進する活性を有するポリペプチドを発現可能なＤＮＡ分子を適当な起源ベクターに導入して得られる組換え発現ベクターにて、適当な宿主を形質転換することにより得られる。該形質転換体が保有するＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）の一具体例としては配列番号：２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００８５】
また、他のポリヌクレオチドの例として、上記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ且つケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走を促進する活性を有するポリペプチド（アディポネクチン同効物）を発現可能なポリヌクレオチドを挙げることができる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、０．１％ＳＤＳを含む０．１％  ＳＳＣ中、６０℃の条件を挙げることかできる。更に他のポリヌクレオチドの例として、上記配列番号：２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドと全長において８０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９８％以上相同性のあるＤＮＡ配列を有し、且つケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走を促進する活性を有するポリペプチド（アディポネクチン同効物）を発現可能なポリヌクレオチドを挙げることができる（上記するこれらのポリヌクレオチドを、総称して「アディポネクチン遺伝子同効物」ともいう）。尚、ここでポリヌクレオチドの相同性は、前述するようにその塩基配列を、公知の配列分析ソフトウェア、例えばＦＡＳＴＡプログラムを使用して解析（Ｃｌｕｓｔａｌ，Ｖ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５，  ３０７−３１８  （１９９４））することによって求めることができる。
【００８６】
これらのポリヌクレオチドにおける上記各活性を有するポリペプチドの発現は、これらのＤＮＡ分子を有する組換え体発現ベクターにて形質転換された形質転換体が、ケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走を促進する活性を有するポリペプチドを発現できるか否かで判断することができる。
【００８７】
具体的には、ケラチノサイトの増殖及び遊走促進活性は、自体公知の方法、例えばヤマグチらの方法に従うことができる（例えば、非特許文献２６に記載される方法を参照のこと）。例えば後記実施例に記載されているように培養されたケラチノサイトに、被験ポリペプチドを添加して、ケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数、ケラチノサイトへのＢｒｄＵ取り込み、或いはケラチノサイトの遊走能を測定し、その増加の有無を評価する方法を挙げることができる。
【００８８】
より詳しくは、ケラチノサイトの増殖アッセイは下記のようにして実施することができる：
ヒトケラチノサイトをＩ型コラーゲンコートされた９６穴プレート上に５ｘ１０３細胞／ウェルの密度で播き、ＫＧＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）と共に一晩インキュベートし、さらに２４時間、ＫＧＭ（−）の条件下でインキュベートする。そして０、３、１０、及び３０μｇ／ｍｌの濃度の被験ポリペプチドで２４時間処理した後、ケラチノサイトを４０μＭの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で４時間パルス標識する。次いで、細胞増殖キット（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を製品使用説明書に従って使用し、ケラチノサイトに取り込まれたＢｒｄＵの取り込み量やＢｒｄＵ陽性の数を、４１０ｎｍでの吸収度をモデル４５０マイクロプレート・リーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて測定し、ケラチノサイトの増殖を評価する。
【００８９】
また、ケラチノサイトのインビトロ遊走アッセイは、下記のようにして実施することができる（インビトロ・スクラッチ・アッセイ法）：
ヒトケラチノサイトをコンフルエントとなるまでＩ型コラーゲンコートされた１２穴プレートにてＫＧＭを用いて培養し、次いで２４時間飢餓処理を行い、さらに細胞増殖を抑制するために１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで２時間処理する。次いでイエロー・ピペット・チップで単層を引き剥がすことによって細胞フリー部位を導入した後、被験ポリペプチド（０−３０μｇ／ｍｌ）存在下、４８時間での細胞フリー部位への細胞遊走を評価する。次いでインビトロ創傷端の辺境を超えて遊走しているケラチノサイトの数を、４つの非重複部位の写真を位相差顕微鏡  （ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＤＩＡＰＨＯＴ３００）を使って撮影して、計測する。
【００９０】
（４）  本発明ポリペプチドをコードする遺伝子
以下、本発明ポリペプチドをコードする遺伝子（以下、「本発明遺伝子」という）につき詳述する。
【００９１】
本発明遺伝子は、具体的には配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチドからなる遺伝子として示される。かかる遺伝子の具体的態様としては、配列番号：２に示される塩基配列を有する遺伝子が例示できる。この塩基配列は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示すものである。本発明遺伝子は、かかる特定の塩基配列に限らず、配列番号：１で示される各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ｎｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ９，  ４３  （１９８１）〕。
【００９２】
本発明遺伝子は、特にこれらに限定されることなく、例えば、上記配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの同効物（アディポネクチン同効物）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する遺伝子、または配列番号：２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの同効物（アディポネクチン遺伝子同効物）であることができる（これらを以下「本発明遺伝子の改変体」という）。なお、上記「アディポネクチン遺伝子同効物」とは、配列番号：２で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドの塩基配列と配列相同性を有し、構造的特徴並びに発現パターンにおける共通性および生物学的機能の類似性より、ひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味する。これにはアディポネクチン遺伝子のアレル体（対立遺伝子）も含まれる。
【００９３】
本発明遺伝子の改変体には、具体的には配列番号：１に示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列（改変されたアミノ酸配列）をコードする塩基配列を含む遺伝子が包含される。ここで、「アミノ酸の欠失、挿入、置換または付加」の程度およびそれらの位置は、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（アディポネクチン）と実質的に同質の機能を有する同効物であれば特に制限されない。ここで「実質的に同質の機能」とは、アディポネクチンが有する急性期の創傷治癒過程におけるケラチノサイトの増殖及び／叉は遊走を促進する作用と性質的に（例えば生理化学的にまたは薬理学的に）同質であることを意味するものであって、作用の程度などといった量的要素は異なっていてもよい。
【００９４】
また、本発明遺伝子の改変体には、配列番号：２に示される塩基配列と全長において少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９９％の同一性を有し、かつアディポネクチンと実質的に同質の機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオチドが含まれる。
【００９５】
塩基配列の改変（変異）などは、天然において、例えば突然変異などにより生じることもあり、また天然由来の遺伝子（例えば本発明のヒトアディポネクチン遺伝子）に基づいて人為的に改変することもできる。本発明遺伝子には、このような改変、変異の原因および手段などを問わず、上記特性を有する全ての遺伝子を包含する。
【００９６】
上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Ｍｅｔｈｏｄｓ    ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５４，  ３５０，  ３６７−３８２  （１９８７）；同  １００，  ４６８  （１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，    １２，  ９４４１  （１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，  ｐ１０５  （１９８６  ）〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成  手段〔Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８９，  ４８０１  （１９６７）；同  ９１，  ３３５０  （１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １５０，  １７８  （  １９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ２２，  １８５９  （１９８１）；同  ２４，  ２４５  （１９８３）〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
【００９７】
（５）  本発明ポリペプチドをコードする遺伝子の製造
本発明遺伝子は、本明細書に開示された本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編（１９８６）など参照〕。
【００９８】
具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ７８，  ６６１３  （１９８１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２２，  ７７８  （１９８３）など〕。
【００９９】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、本発明遺伝子を発現する各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞などを例示することができる。これら起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離、精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどは、いずれも常法に従って実施することができる。ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれら市販のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）などより市販の各種ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー、特にヒトの脂肪組織のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。本発明遺伝子をｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。
【０１００】
具体的方法としては、例えばｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せなどを例示できる。
【０１０１】
用いられるプローブとしては、本発明遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的であるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片であってもよい。本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【０１０２】
プローブとして用いられるヌクレオチドは、配列番号：２に対応する部分ヌクレオチドであって、少なくとも１５個の連続した塩基配列、好ましくは１００個の連続した塩基配列、より好ましくは１５０個の連続した塩基配列、最も好ましくは２００個の連続した塩基配列を有するものである。こうした塩基配列を有する陽性クローンそれ自体もプローブとして用いることができる。
【０１０３】
本発明遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０，  １３５０  （１９８５）〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ；実験医学、１２（６），  ３５  （１９９４）〕、特に５’−ＲＡＣＥ法〔Ｍ．Ａ．  Ｆｒｏｈｍａｎ，  ｅｔａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ８，  ８９９８  （１９８８）〕などを採用するのが好適である。
【０１０４】
ＰＣＲ法の実施に用いられるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、常法に従い、例えばゲル電気泳動法などによることができる。
【０１０５】
上記で得られる本発明遺伝子或いは各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａ  ｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ７４，  ５４６３  （１９７７）〕、マキサム−ギルバート法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ６５，  ４９９  （１９８０）〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、そのＤＮＡ配列を決定することができる。
【０１０６】
本発明遺伝子の一部または全部の塩基配列を利用して、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。この検出は常法に従って実施できる。該方法としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；  Ｅ．Ｓ．  Ｋａｗａｓａｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ．  Ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ＳａｎＤｉｅｇｏ，  ２１−２７  （１９９１）〕によるＲＮＡ増幅、ノーザンブロッティング解析〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  （１９８９）〕、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ〔Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２１，  ３１５９−３  １６６  （１９９３）〕、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳＢＡ法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５０，  ９１−９２  （１９９１）〕およびその他の各種方法を挙げることができる。好適にはＲＴ−ＰＣＲによる検出法を挙げることができる。
【０１０７】
尚、ＰＣＲ法を採用する検出に用いられるプライマーとしては、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り特に制限はない。このプライマーは、本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。通常、該プライマーとしては、１０−３５ヌクレオチド、好ましくは１５−３０ヌクレオチド程度の長さを有する本発明遺伝子の部分配列を用いることができる。
【０１０８】
（６）  本発明ポリペプチドの遺伝子工学的製造
本発明ポリペプチドは、前述する本発明遺伝子を利用して、通常の遺伝子工学的手法に従って、該遺伝子の発現物としてまたはこれを含む蛋白質として、容易に、大量に且つ安定して製造することができる。
【０１０９】
本発明は、本発明遺伝子によってコードされるポリペプチド、該ポリペプチドの製造のための、例えば本発明遺伝子を含有するベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養して本発明ポリペプチドを製造する方法などをも提供する。
【０１１０】
本発明ポリペプチド（発現物）は、本発明により提供される本発明遺伝子の配列情報に基づいて、通常の遺伝子組換え技術〔例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２４，  １４３１  （１９８４）  ；  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．，  １３０，  ６９２  （１９８５）；Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ８０，  ５９９０  （１９８３）など参照〕に従って調製することができる。
【０１１１】
該方法は、より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から本発明ポリペプチドを回収することにより行われる。
【０１１２】
宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。例えば原核生物の宿主としては、大腸菌、枯草菌などの一般的に用いられるもののいずれでもよく、好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２株を例示できる。真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母などの細胞が含まれる。前者としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Ｃｅｌｌ，  ２３：  １７５  （１９８１）〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ７７：  ４２１６  （１９８０）〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【０１１３】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、  ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡＬ−Ｐ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤ／  Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを例示できる。
【０１１４】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および  転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ〔Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １：  ８５４  （１９８１）〕などが例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦＰ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Ｃｌｏｎｔｒｅｃｈ社）、ｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、  ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの動物細胞用ベクター、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）  などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。
【０１１５】
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ８０  ：  １  （１９８３）〕などが例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰＩＣＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＰＩＣＺ・Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが包含される。
【０１１６】
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばｐＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを例示できる。
【０１１７】
尚、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ  社）などを例示できる。
【０１１８】
また、成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列などが例示できる。これらの配列には、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列（ヘキサヒスチジン・タグ、ヒスチジン・タグ）、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン（ＨＡ）・タグが含まれる。
【０１１９】
所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【０１２０】
また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
【０１２１】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【０１２２】
かくして得られる組換え蛋白質（本発明ポリペプチド）は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年  ６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２５（２５），  ８２７  ４  （１９８６）；  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６３，  ３１３  （１９８７）など参照〕により分離、精製できる。
【０１２３】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過  ）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明ポリペプチドに対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示することができる。
【０１２４】
尚、本発明ポリペプチドをコードする遺伝子の設計に際しては、配列番号：２に示されるヒトアディポネクチン遺伝子の塩基配列を良好に利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。
また、アディポネクチン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基乃至アミノ酸配列を置換、挿入、欠失、付加などにより改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した各種方法を採用することができる。
【０１２５】
（７）  本発明ポリペプチドの化学合成
本発明ポリペプチドは、配列番号：１に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。
【０１２６】
ペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明ポリペプチドの合成は、そのいずれによってもよい。
【０１２７】
ペプチド合成に採用される縮合法も常法に従うことができる。例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法などに従うことができる。
【０１２８】
これら各方法に利用される溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることの知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
【０１２９】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルなどとして保護することができる。
【０１３０】
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基などで保護してもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。
【０１３１】
保護基を有するアミノ酸、ペプチドおよび最終的に得られる本発明ポリペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施することができる。
【０１３２】
かくして得られる本発明ポリペプチドは、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製することができる。
【０１３３】
（８）  本発明ポリペプチドを含む医薬組成物の調製
本発明医薬組成物は、有効成分とする本発明ポリペプチドに特有の前述した作用、例えば種々の創傷、皮膚移植、種々の潰瘍傷、やけどなどの急性創傷のある部位におけるケラチノサイトの増殖及び遊走を促進する作用、急性創傷治癒促進作用または再上皮形成促進作用を利用して、各種医療分野において有効に用いることができる。
【０１３４】
本発明医薬組成物が有効成分とする本発明ポリペプチドが奏するケラチノサイトの増殖及び遊走を促進する活性を確認する方法としては、例えば後記実施例に記載されているように培養されたケラチノサイトに、被験ポリペプチドを添加して、ケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数、ケラチノサイトへのＢｒｄＵ取り込み、或いはケラチノサイトの遊走能を測定し、その増加の有無を評価する方法を挙げることができる。
【０１３５】
より詳しくは、ケラチノサイトの増殖アッセイは下記のようにして実施することができる：
ヒトケラチノサイトをＩ型コラーゲンコートされた９６穴プレート上に５ｘ１０３細胞／ウェルの密度で播き、ＫＧＭ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ）と共に一晩インキュベート、さらに２４時間ＫＧＭ（−）でインキュベートする。そして０、３、１０、及び３０μｇ／ｍｌの濃度の被験ポリペプチドで２４時間処理した後、ケラチノサイトを４０μＭ５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で４時間パルス標識する。次いで、細胞増殖キット（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて細胞増殖し、ケラチノサイトへのＢｒｄＵ取り込み量やＢｒｄＵ陽性細胞の数を４１０ｎｍでの吸収度（モデル４５０マイクロプレート・リーダー：Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）から測定して、ケラチノサイトの増殖（ＢｒｄＵ取込み）を評価する。
【０１３６】
また、ケラチノサイトのインビトロ遊走アッセイは、下記のようにして実施することができる（インビトロ・スクラッチ・アッセイ）：
ヒトケラチノサイトをコンフルエントとなるまでＩ型コラーゲンコートされた１２穴プレートにてＫＧＭで培養し、次いで２４時間飢餓処理を行い、さらに細胞増殖を抑制するために１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで２時間処理する。次いでイエロー・ピペット・チップで単層を引き剥がすことによって細胞フリー部位を導入した後、被験ポリペプチド（０−３０μｇ／ｍｌ）存在下４８時間での細胞フリー部位への細胞遊走を評価する。次いでインビトロ創傷端の辺境を超えて遊走しているケラチノサイトの数を計測するために４つの非重複部位の写真を位相差顕微鏡  （ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＤＩＡＰＨＯＴ３００）を使って撮影する。
【０１３７】
本発明医薬組成物において有効成分とするポリペプチドには、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含される。更に上記塩には、本発明ポリペプチドと適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ナプシレートなどが例示される。
【０１３８】
本発明医薬組成物は、更に本発明ポリペプチドおよびそれらの塩を活性成分として、その薬学的有効量を、適当な医薬担体ないし希釈剤と共に含有させて医薬製剤形態に調製される。
【０１３９】
該医薬製剤の調製に利用される医薬担体としては、製剤形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。特に好ましい医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用される各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。
【０１４０】
上記において安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
【０１４１】
Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はなく、例えばグリシン、システィン、グルタミン酸などのいずれでもよい。
【０１４２】
糖類としても、特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類；マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール；ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類；デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などを使用できる。
【０１４３】
界面活性剤としても、特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。その具体例としては、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。
【０１４４】
セルロース誘導体としても、特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。
【０１４５】
上記糖類の添加量は、有効成分１μｇ当たり約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１−１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分１μｇ当たり約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０００１−０．０１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分１μｇ当たり約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１−０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。Ｌ−アミノ酸の添加量は、有効成分１μｇ当たり約０．００１−１０ｍｇ程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当たり約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．００１−０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。
【０１４６】
本発明医薬組成物中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、製剤１００重量％中に約０．００００１−７０重量％、好ましくは０．０００１−５重量％程度が含まれる量とするのが適当である。
【０１４７】
本発明医薬組成物中には、また各種の添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε（イプシロン）−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウ  ム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類    金属塩）などを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
【０１４８】
本発明医薬組成物は、溶液製剤として調製できる他に、これを凍結乾燥し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製される凍結乾燥剤形態とすることも可能である。
【０１４９】
本発明医薬組成物の投与単位形態は、治療目的に応じて適宜選択できる。その代表例には、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態および溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【０１５０】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。
【０１５１】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
【０１５２】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
【０１５３】
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整される。
【０１５４】
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【０１５５】
非経口投与用の液体投与投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびオリーブ油などの植物油などを使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤などを添加することもできる。滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理および加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
【０１５６】
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチンおよび半合成グリセライドなどを使用できる。
【０１５７】
ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフィン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイトおよびオリーブ油などの植物油などを使用できる。
【０１５８】
経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
【０１５９】
尚、本発明医薬組成物中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【０１６０】
上記医薬組成物の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【０１６１】
上記医薬組成物中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約０．０１μｇ−１０ｍｇ  程度、好ましくは約０．１  μｇ−１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１−数回に分けて投与することができる。
【０１６２】
また、経皮吸収剤として、創傷部位、潰瘍傷、やけどなどの部位に、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、パップ剤等の方法により局所適用することにより、例えば、本発明ポリペプチド、特にアディポネクチン濃度を約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で投与することができる。
【０１６３】
なお、本発明ポリペプチドを有効成分とする医薬組成物に加えて、インスリン、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ｂ−ＦＧＦを有効成分として含有する製剤と併用することができる。当該併用は適時に、或いは同時に、それぞれ、一日約０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌとなる量を投与することができる。
【０１６４】
さらに、やけどのときに用いる培養皮膚移植等に際しては、細胞の培養液中に、本発明ポリペプチド、特にアディポネクチン濃度を例えば約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．１〜１００μｇ／ｍｌの濃度で投与することができる。さらに上記と同様に本発明ポリペプチドを有効成分とする本発明の医薬組成物に加えて、インスリン、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ｂ−ＦＧＦを有効成分として含有する製剤と併用することができる。上記併用は適時に、或いは同時に、それぞれ一日約０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、０．０１〜１００μｇ／ｍｌとなる量を投与することができる。
【０１６５】
以下に製剤例を示す。
【０１６６】
注射製剤１：アディポネクチン０．５ｍｇ、塩化ナトリウム８０ｍｇ、マニトール２０ｍｇ、リン酸ナトリウム３４．５ｍｇ、  ＰＥＧ４５ｍｇを注射用蒸留水１０ｍｌに溶解し、無菌濾過後、１．０ｍｌずつ無菌バイアルに分注し、凍結乾燥して注射製剤を調製した。
【０１６７】
軟膏製剤２：アディポネクチン３％、白色ワセリン９５．５％、流動パラフィン３％、ジブチルヒドロキシトルエン０．２％を混合し、撹拌して均一な組成物を調製した。
【０１６８】
本発明医薬組成物は、有効成分とする本発明ポリペプチド（例えばアディポネクチン）がケラチノサイトの増殖及び遊走を促進する活性作用、傷害組織の瘢痕形成における再上皮形成促進活性作用、或いは急性創傷治癒促進活性作用を有していることに基づいて、急性創傷治療剤として有効に用いることができる。  本発明医薬組成物の適用される疾患としては、上記したように創傷ややけどなどによって生じる種々の創傷症状、例えば、切り傷、すり傷、外科的侵襲、皮膚移植、やけど、日焼け、種々の潰瘍、例えば皮膚潰瘍、消化管潰瘍、糖尿病足趾部の潰瘍、床ずれ、静脈うっ血のような潰瘍傷、破傷、乾癬、皮膚発疹のような皮膚傷害、角膜損傷による傷など有する患者などを挙げることができる。
【０１６９】
（９）急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物（アディポネクチン遺伝子欠損非ヒト動物の新規用途）
本発明が対象とする急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物とは、ヒト以外の動物（非ヒト動物）のアディポネクチンゲノム遺伝子（またはアディポネクチンｍＲＮＡの転写、翻訳並びに発現に関連する遺伝子）に人為的に変異（欠失、置換、付加、挿入）を加えることにより、該遺伝子の発現能が抑制乃至は喪失するか、若しくは該遺伝子がコードするアディポネクチンの活性が実質的に抑制乃至は喪失することによって、正常の非ヒト動物に比して実質的に血清中のアディポネクチン濃度が低下してなるアディポネクチン遺伝子欠損非ヒト動物乃至はアディポネクチン遺伝子発現不全非ヒト動物（以下、ノックアウト動物ともいう）である。なお、本明細書においてアディポネクチン遺伝子欠損非ヒト動物とアディポネクチン遺伝子発現不全非ヒト動物とは同意義で使用される。
【０１７０】
ここで、非ヒト動物としては、動物モデルを作出するうえで、個体発生期間及び生涯サイクルが短くかつ繁殖が比較的容易なマウスやラット等のゲッ歯動物が好ましいが、特にこれに限定されるものではなく、ヒト以外のウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ等の他の哺乳動物もこれに含まれる。
【０１７１】
上記でいうアディポネクチンゲノム遺伝子またはその発現に関連する遺伝子に人為的に変    異を加える方法としては、遺伝子工学的手法により該遺伝子の塩基配列の全部を欠失するか、コドンの読み取り枠をずらしたりプロモーターあるいはエキソンの機能を破壊するように、上記ゲノム遺伝子の塩基配列の一部を欠失したり、または任意の部位に他の遺伝子を挿入するかまたは他の遺伝子で置換することによって行なうことができる。上記人為的変異方法は、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５４，  ３５０，  ３６７−３８２  （１９８７）；同  １００，  ４６８  （１９８３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２，  ９４４１  （１９８４）  ；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，  ｐ１０５  （１９８６）〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８９，  ４８０１  （１９６７）；同  ９１，  ３３５０  （１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １５０，  １７８  （１９６８）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ２２，  １８５９  （１９８１）；同  ２４，  ２４５  （１９８３）〕及びそれらの組合せることによって実施できる。
【０１７２】
本発明の野生型に比較して、急性創傷治癒の遅延を呈するノックアウト動物の作製方法は、まずマエダ（Ｍａｅｄａ）らに開示された方法（非特許文献２３）に従い製造することができる。具体的には、例えば下記のようにして作出することができる：まず目的とする非ヒト動物のアディポネクチンゲノム遺伝子を単離し、そのエキソン部分に他の遺伝子を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入することによって、完全なメッセンジャーＲＮＡが合成できないように構築した配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲティングベクターと略する）を作成する。これをエレクトロポレーション法等の方法で上記目的の非ヒト動物細胞（胚幹細胞）の染色体に導入して組み換え胚幹細胞を作成する。次いで、得られた組換え胚幹細胞について、アディポネクチン遺伝子が破壊されたアディポネクチンノックアウト胚幹細胞を選別して、動物胚へ注入し、仮親の子宮に移植して生殖系列のキメラ動物を取得し、このキメラ動物を正常な動物と交配させてヘテロ欠損型動物（＋／−）を作出する。さらにヘテロ欠損型同士を交配させることにより、ホモ欠損型動物（−／−）、すなわち遺伝子座の双方ともアディポネクチンを実質的にコードしない本発明の所望のアディポネクチン遺伝子欠損非ヒト動物（ノックアウト動物）を得ることができる。
【０１７３】
上記操作において、目的とする非ヒト動物のアディポネクチンゲノム遺伝子の単離は、例えば公知のヒトアディポネクチンｃＤＮＡ配列（特許文献３参照）（配列番号２：ヒトアディポネクチンのＯＲＦ領域）をプローブとして非ヒト動物のゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、蛋白質コード領域を含む陽性クローンを単離し、これをベクターに挿入後、制限酵素で消化し、特定のエキソンを含む染色体ＤＮＡをサブクローニングすることによって取得できる。例えばマウスゲノムＤＮＡライブラリーの作成は、ラボマニュアル遺伝子工学（丸善株式会社発行，  村松正實編，１９９０）１００−１１２  頁記載の方法に従って行うことができ、またマウスアディポネクチンｃＤＮＡの作成は、例えば、ラボマニュアル遺伝子工学（丸善株式会社発行，  村松正實編，１９９０  ）８３−９９  頁記載の方法に従って行うことができる。
【０１７４】
また、非ヒト動物のアディポネクチンがヒトアディポネクチンの相同物であるかどうかの一    確認法としては、ラディエーション・ハイブリッド・マッピング（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ）によって、非ヒトアディポネクチンｃＤＮＡクローンの染色体マッピングを行ない（Ｃｏｘ，  Ｄ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５０，  ２４５−２５０  （１９９０））、非ヒトアディポネクチン遺伝子の染色体座位と、ヒト相同遺伝子が存在する染色体座位が相同領域であるかどうかで判断するとよい。
【０１７５】
かくして、上記ライブラリーよりアディポネクチンゲノムＤＮＡクローンを得、これを用いてターゲティングベクターの作製のために目的とする遺伝子領域の構造を破壊する。
【０１７６】
ターゲッティングベクターの作成において、アディポネクチンゲノム遺伝子のエキソン部分に他の遺伝子を挿入する場合、アディポネクチン遺伝子の変異を検出するための選択マーカー（ポジティブ選択マーカー）としても機能する遺伝子を挿入することが好ましく、このような遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、ｎｅｏという）、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子あるいは  ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挙げることができる。好ましくはネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）である。この場合、組み換えが生じたことがネオマイシン（あるいはそのアナローグであるＧ４１８）耐性の獲得により判定可能となる。さらにランダム組み換え体を除くため、ポジティブ−ネガティブ選別が可能となるように相同部位の外側にジフテリア毒素Ａ断片遺伝子（以下「ＤＴ−Ａ」という）のような、細胞に対して致死性を有する遺伝子をネガティブ選択マーカーとして導入することが望ましい。こうして得られるターゲティングベクターはランダム組み換えにより致死性遺伝子が導入され、このような細胞は致死となる。したがって、このようにポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを用いてポジティブ−ネガティブ選別を行うことにより、相同組み換え体を効率的に取得することが可能となる。なお、これらの遺伝子の挿入は、試験管内で常用のＤＮＡ組換え技法により行うことができる。
【０１７７】
本発明の実施にあたっては、アディポネクチン遺伝子の第２エキソン領域の特定部位（アディポネクチン遺伝子の３８−２６８番目塩基）が欠失しており、その欠失領域に選択マーカー遺伝子が挿入されていることが好ましい。具体的には、ポジティブ選択マーカーとしてＭＣ１−ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡ（ＭＣ１プロモーター（Ｐｏｌｙｏｍａ  ｖｉｒｕｓ由来変異エンハンサー配列およびチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター配列からなるプロモーター）の下流にネオマイシン耐性遺伝子とＳＶ４０由来ポリＡ付加シグナルを連結したもの：Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．  ＆  Ｃａｐｅｃｃｈｉ．Ｍ．Ｒ．：  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．：  Ｃｅｌｌ，  ５１，  ５０３  （１９８７））、及びネガティブ選択マーカーとして、ＭＣ１−ＤＴ−Ａ（ＭＣ１プロモーターの下流にジフテリア毒素Ａ断片が連結されたもの：Ｙａｇｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：  Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２１４，  ７７，  （１９９３））が好適に使用される。
【０１７８】
後述する実施例においては、相同領域として第１エクソン上流のＳａｌＩ−ＭｕｎＩ断片（７．３ｋｂ）および下流のＳｃａＩ−ＢｇｌＩＩ断片（１．１ｋｂ）を、またポジティブ選択マーカーとしてｐＫＯ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｅｏ  （Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）、ネガティブ選択マーカーとしてｐＫＯ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＤＴＡ  （Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）をそれぞれ使用し、相同置換を行っている。
【０１７９】
尚、本発明のアディポネクチン遺伝子欠損非ヒト動物作成のためのターゲットとなるマウスアディポネクチンゲノム遺伝子は少なくとも３つのエキソンからなる遺伝子である。後述する実施例においては第１のエキソン部分を含む領域をネオマイシン耐性遺伝子に相同置換させているが、これに限定されることなく、他のエキソン部分のいずれか、或いは複数のエキソン部分を組み合わせて、ネオマイシン耐性遺伝子等の遺伝子に相同置換させるか、欠失させてもよい。
【０１８０】
上記方法によって得られたターゲッティングベクターを導入する胚幹細胞としては、例えば既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のエバンスとカウフマンの方法（Ｎａｔｕｒｅ，  ２９２，１５４  （１９８１））に準じて新しく樹立したものでもよい。
【０１８１】
例えば、マウスの胚幹細胞の場合、一般的には１２９系の胚幹細胞が使用される。しかし、これに限定されることなく、純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかな胚幹細胞を取得するために例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立した胚幹細胞等も良好に使用し得る。かかる胚幹細胞は、採卵数が多くかつ卵が丈夫であるというＢＤＦ１マウスの利点に加えてＣ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これから病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスする事でその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに変えることが可能である点で有利に用い得る。
【０１８２】
また、胚幹細胞を樹立する場合、一般には受精後３〜５日目の胚盤胞を使用するが、それ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することも可能である。また、雌雄いずれの胚幹細胞を用いてもよいが、通常雄の胚幹細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。
【０１８３】
胚幹細胞にターゲティングベクターを導入するには、胚幹細胞を生殖細胞への分化能を保つように未分化の状態で培養維持する必要がある。そのためには、培地に適当な栄養細胞をフィーダー細胞として加え、また、ヒトＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）を添加し、さらに牛胎仔血清、ヌクレオシド、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノールなどを添加して培養することを要する。栄養細胞（フィーダー細胞）としては、ＳＴＯ細胞（ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−１５０３）、あるいはマウス胎仔線維芽細胞を好ましく例示できる。
【０１８４】
栄養細胞（フィーダー細胞）の添加濃度は、２．５ｘ１０５細胞／ｍｌ（１０ｍｌ／１００ｍｍ培養皿、  ２ｍｌ／３５ｍｍ培養皿、４ｍｌ／６０ｍｍ培養皿、０．５ｍｌ／ｗｅｌｌ：２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ等の使用）が好ましい。ヒトＬＩＦの添加濃度は、１０３ユニット／ｍｌが好ましいがそれ以上でもよい。牛胎仔血清の添加濃度は２０％、ヌクレオシドの添加濃度は１０〜３０ｎＭが好ましい。非必須アミノ酸としては、例えば、ギブコ社製の非必須アミノ酸溶液が好ましく、その濃度は各０．１ｍＭが好ましい。２−メルカプトエタノールの濃度は０．１ｍＭが好ましい。
【０１８５】
エレクトロポレーション法で胚幹細胞にターゲティングベクターを導入するには、胚幹細胞を一定の濃度になるように緩衝液に浮遊させ、適当な制限酵素で処理して線状化したターゲティングベクターを添加し、ＥＣＭ６００（ＢＴＸ社製）、或いはジーンパルサー（  バイオ・ラド社製）等の適当なエレクトロポレーション装置を用い、例えば２７０Ｖ／１．８ｍｍ、または２５０Ｖ／４ｍｍ、及び５００μＦでエレクトロポレーションを行うことが好ましい。緩衝液としては、ｐＨを７．０に調整されたＰＢＳ等を用いることが好ましい。制限酵素はターゲティングベクターの制限酵素部位を考慮して選択することができる。
【０１８６】
ターゲティングベクターを導入した後、胚幹細胞を上記の培地で２４〜４８時間培養し、その後、Ｇ４１８（ジェネティシン：Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ：Ｓｉｇｍａ社製）を含む培地と交換する。１日ごとに新しいＧ４１８添加培地と交換し、約１週間培養を続ける。
【０１８７】
次いで、ターゲティングベクターが導入された所謂アディポネクチンノックアウト胚幹細胞は、上記培地で薬剤（Ｇ４１８）耐性胚幹細胞を増殖させ、得られたＧ４１８抵抗性のクローンから相同組み換え体を単離することによって行うことができる。
【０１８８】
相同組み換え体の検出は、アディポネクチン遺伝子上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲティングベクター作製に使用したアディポネクチン遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法による解析により、行うことができる。具体的には、上記のＧ４１８添加培地で増殖したＧ４１８抵抗性のクローンの一部からＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡを抽出後、制限酵素処理を行い、アガロース電気泳動を行った後、アディポネクチン遺伝子ＤＮＡをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行う。こうして、ターゲティングベクターの断片を検出できれば、その胚幹細胞は標的アディポネクチン遺伝子の一方の対立遺伝子がターゲティングベクターと相同組み換えを起こしたクローン（ヘテロ欠損型胚幹細胞）であることが証明されたことになる。
【０１８９】
次いで、生殖系のキメラ動物およびアディポネクチン遺伝子の破壊された改変遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物の作出は、以下のようにして行うことができる。
まず、目的の非ヒト動物の胚に上記で得られたヘテロ欠損型胚幹細胞を注入し、仮親の子宮に移植する。ここで、動物の胚としてはキメラの形成に好適であるという理由から胚盤胞が用いられる。胚幹細胞は通常約１０〜１５個注入される。こうして、胚幹細胞が注入された胚は直ちに仮親の子宮に移植される。
【０１９０】
上記の方法によって妊娠した仮親から生まれた子のうちキメラ動物を選ぶ。胚幹細胞の寄与率の高いキメラ動物は生殖系列のキメラ動物である可能性が高いが、キメラ動物を正常動物と交配して、得られた子マウスの毛色を指標とすることによって生殖系列のキメラ動物であることの確認が可能である。
【０１９１】
斯くして生殖系列のキメラ動物と正常動物との交配によりヘテロ欠損型動物が得られ、ヘテロ欠損型同士の交配によりアディポネクチン対立遺伝子の両方が破壊されたホモ欠損型動物を得ることができる。
【０１９２】
このようにして得られたホモ欠損型動物であるトランスジェニック非ヒト動物は、アディポネクチン遺伝子を欠損したアディポネクチン遺伝子発現不全非ヒト動物（例えば、アディポネクチン欠損マウス）であるが、急性創傷治癒遅延の病態モデル動物としての新たな用途に利用できる。これは、後述する実施例で示すように、当該非ヒト動物（実施例ではマウス使用）の背部上に急性創傷を作製すると、野生型非ヒト動物に比較して、凹凸を伴う創傷瘢痕の重篤な萎縮と再上皮形成過程の障害や創傷端でのケラチノサイト数の増殖障害が認められること、さらに急性創傷治癒過程の有意な遅延が認められること、並びにヒトの急性創傷皮膚下部におけるアディポネクチンの含有量が未傷害皮膚より有意に高いことなどの知見から裏付けられる。
【０１９３】
なお、上記において、急性創傷治癒遅延の病態モデル動物として用いられるアディポネクチン遺伝子発現不全非ヒト動物の作成方法として、不活性化されたアディポネクチン遺伝子断片を有するターゲティングベクターを非ヒト動物胚幹細胞あるいは非ヒト動物卵細胞に導入して胚幹細胞あるいは卵細胞の染色体上のアディポネクチン遺伝子と相同組換えすることによりアディポネクチン遺伝子を破壊させて調製する方法を記載したが、別の方法を採用して同様の効果を有することもできる。
【０１９４】
このように、本発明はアディポネクチン遺伝子発現不全非ヒト動物について急性創傷治癒過程の遅延が認められる新たな病態モデル動物としての用途を提供するものである。当該急性創傷治癒遅延の病態モデル動物は、急性創傷を形成した場合に、野生型非ヒト動物と比較して、その創傷の治癒過程に見られる凹凸を伴う創傷瘢痕の重篤な萎縮と再上皮形成過程の障害や創傷端でのケラチノサイト数の増殖障害が認められる。
【０１９５】
急性創傷の形成は、例えば、急性創傷治癒遅延の病態モデル動物の背部上の十分な厚さの皮膚（Ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｓｋｉｎ）  （直径１０ｍｍ）をフェントバルビタールナトリウム麻酔下で切除することによって行うことができる。或いは皮膚切除代えて、背部上にすり傷、皮膚移植、やけど、日焼け、硫酸などの塩酸腐食性薬剤による潰瘍形成方法などを用いることもできる。
【０１９６】
尚、本発明の急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物について、急性創傷の形成後の急性創傷治癒過程を評価する方法としては、通常この分野において用いられている種々の肉眼的所見、光学的顕微鏡所見、免疫組織化学的所見、ケラチノサイトの増殖や遊走の細胞測定などを用いる方法を例示することができる。具体的には、野生型非ヒト動物或いは非傷害組織と比較して、肉芽組織の容量の変化や萎縮の程度を光学顕微鏡下に、再上皮形成の進展度を免疫組織化学的に、或いは定量化により、ケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数の増加の程度を光学顕微鏡下と免疫組織化学的に、ケラチノサイトの遊走能の程度をインビトロ・スクラッチ・アッセイによって比較することにより、評価することができる。
【０１９７】
かくして、本発明の急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物によれば、創傷ややけどなどによって生じる種々の創傷症状、例えば、切り傷、すり傷、外科的侵襲、皮膚移植、やけど、日焼け、種々の潰瘍、例えば皮膚潰瘍、消化管潰瘍、糖尿病足趾部の潰瘍、床ずれ、静脈うっ血のような潰瘍傷、破傷、乾癬、皮膚発疹のような皮膚傷害、角膜損傷による傷などの傷害の急性期からの傷害治癒過程のメカニズムを解明し、その創傷の早期治療や予防方法の確立並びに医薬品の開発に資することができる。
【０１９８】
（１０）    急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物を用いる創傷治療剤のスクリーニング方法
また、本発明の上記急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物によれば、創傷治療剤の有効成分をスクリーニングする方法を提供することができる。
【０１９９】
該創傷治療剤の有効成分のスクリーニング方法は、例えば本発明の急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に急性創傷を形成し、次いで当該モデル動物に創傷治療剤の有効成分としての候補被験物質を投与して治癒過程進展度を計測することによって評価することができる。例えば、創傷治療剤の有効成分のスクリーニング方法は、以下の（１）から（４）の工程を実施することによって行うことができる：
（１）急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に急性創傷を形成する工程、
（２）上記急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に対して、被験物質を投与する工程、
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかの試験を実施する工程、
（ａ）被験物質を投与した急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物の創傷部位における再上皮形成を測定し、被験物質を投与しない対照の急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物の創傷部位における再上皮形成と対比する、
（ｂ）被験物質を投与した急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に創傷によって誘導される創傷部位におけるケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数叉はＢｒｄＵ取込み量の増加量を測定し、被験物質を投与しない対照の急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に創傷によって誘導される創傷部位におけるケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数叉はＢｒｄＵ取込み量の増加量と対比する、
（４）（３）で実施した（ａ）または（ｂ）のいずれかの試験の結果に基づいて、被験物質を投与しない対照の急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に比して、それぞれ下記（ａ’）または（ｂ’）のいずれかの効果が得られた急性創傷を有する急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に対して投与された被験物質を、急性創傷治療剤の有効成分として選択する工程：
（ａ’）再上皮形成促進または増加、
（ｂ’）ケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数の増加またはＢｒｄＵ取込み量の増加。
【０２００】
ここで急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物としては、前述する本発明の急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物（アディポネクチン遺伝子欠損非ヒト動物）を用いることができる。より好ましくはアディポネクチンホモ欠損型マウスである。
【０２０１】
被験物質となりえるものとしては、特に制限されないが、核酸、ペプチド、蛋白質、有機化合物、無機化合物などである。本発明のスクリーニングは具体的にはこれらの被験物質となりえる物質を含む試料（被験試料）を、急性創傷を形成させた急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に投与させて行うことができる。かかる被験試料としては、核酸含有ベヒクル（ベクターや細胞など）、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子または高分子化合物、合成ペプチド、または天然植物抽出物が制限されることなく例示される。好ましくは、核酸、ペプチドまたは蛋白質を含む核酸含有ベヒクル、細胞抽出物、合成ペプチドまたは遺伝子ライブラリーの発現産物等を挙げることができ、より具体的にはアディポネクチン及びその誘導体を例示することができる。なお、急性創傷の形成方法は、前述の通りである。
【０２０２】
実施例に示すように、本発明の急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物は、アディポネクチンのゲノム遺伝子の特定領域を欠失していることに基づいて、正常なアディポネクチンゲノム遺伝子を有する野生型非ヒト動物（正常非ヒト動物）に比して、創傷を形成させた場合、（ａ）当該創傷部位における再上皮形成過程が遅延しており、かつ（ｂ）ケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数の有意に減少しているか、またはＢｒｄＵ取込み量が有意に低下しているという特有の特性を備えている。これらの知見から、急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に対して、創傷を形成させた場合に、上記（ａ）〜（ｂ）のいずれか少なくとも１つ、好ましくは２つを改善（促進、増加させて正常非ヒト動物のものと同等にする）させる作用を有する物質は、急性創傷治癒過程の遅延（特に急性創傷、やけど、潰瘍）を改善するための有効物質として有用であると考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に創傷を負わせた場合に、該非ヒト動物に対して上記特性（ａ’）〜（ｂ’）の効果をもたらす物質を探索することによって、上記傷害治療薬の有効成分となる候補化合物を提供するものである。
【０２０３】
候補化合物の選別は、具体的には下記のようにして行うことができる。すなわち、急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に急性創傷を形成させ、次いで該非ヒト動物に被験物質を投与して、投与前と投与一定期間後の特性（ａ）創傷部位における再上皮形成過程の遅延、（ｂ）創傷によって誘導される創傷部位におけるケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数の減少、叉はＢｒｄＵ取込み量の低下を測定し、投与前と投与後とで各特性を比較して、被験物質の投与によって急性創傷を負った急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物が、下記のいずれか１つの効果を示していることを指標として被験物質の中から候補化合物を選別する：
（ａ）  創傷部位における再上皮形成過程の促進または亢進
（ｂ）  創傷によって誘導される創傷部位におけるケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数の増加、叉はＢｒｄＵ取込み量の上昇／増加。
【０２０４】
好ましい候補化合物は、上記（ａ）〜（ｂ）の効果をできるだけ多く示すものであって、好ましくは全ての効果を示すものである。
【０２０５】
なお、上記方法によって選別された候補化合物は、更に他の創傷治療非ヒトモデル動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに急性創傷を負っている患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することにより、より実用的な予防・改善薬を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【０２０６】
【発明の効果】
本発明によれば、アディポネクチンの新規用途を提供することができる。特に本発明によれば、アディポネクチンの急性期の創傷治癒過程におけるケラチノサイトの増殖及び遊走を促進する作用や傷害細胞におけるＢｒｄｕ陽性細胞数の増加、又はケラチノサイトへＢｒｄＵ取り込み増加作用に基づく急性創傷治癒促進作用、或いは傷害組織の瘢痕形成における再上皮形成促進作用に基づいて、アディポネクチンを有効成分とするケラチノサイトの増殖促進剤、急性創傷治療剤、または再上皮形成促進剤を提供することができる。
【０２０７】
本発明のアディポネクチンを有効成分とするケラチノサイトの増殖促進剤、急性創傷治療剤または再上皮形成促進剤によれば、殊に創傷ややけどなどによって生じる種々の創傷症状、例えば、切り傷、すり傷、外科的侵襲、皮膚移植、やけど、日焼け、種々の潰瘍、例えば皮膚潰瘍、消化管潰瘍、糖尿病足趾部の潰瘍、床ずれ、静脈うっ血のような潰瘍傷、破傷、乾癬、皮膚発疹のような皮膚傷害、角膜損傷による傷などを有する患者などに対する治療を有効に行うことができる。
【０２０８】
本発明の急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物、特にホモ欠損型マウスはアディポネクチンを欠損することによって、対応する野生型非ヒト動物に比して、急性創傷を形成させた場合に、急性創傷治癒過程の病態の特徴である
（ａ）創傷部位における再上皮形成過程が遅延し、且つ
（ｂ）創傷によって誘導される創傷部位におけるケラチノサイトのＢｒｄＵ陽性細胞数の減少、叉はＢｒｄＵ取込み量が低下しており、
急性創傷治癒遅延のモデル動物として有効に利用できる。
【０２０９】
また、本発明によれば、当該急性創傷治癒遅延非ヒトモデル動物に、急性創傷を形成させ、次いで被験物質を投与することによって急性創傷治癒に対して改善作用又は亢進作用を有する候補化合物を選択する方法、つまり急性創傷治療剤の有効成分の候補化合物をスクリーニングする方法を提供することができる。
【０２１０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
参考例
Ｇｅｎｂａｎｋデータベースより入手したマウスＡｃｒｏｐ３０（アディポネクチン遺伝子のマウスホモログ）の塩基配列に基いて，オリゴヌクレオチド（配列番号６：ＡｃｒｐＰｒｌ：  ＡＴＧＣＴＡＣＴＧＴＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＣＣＴ，配列番号７：Ｐ２：ＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＴＣＣＡＡＣＡ）を合成してマウスゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その産物をプローブとして１２９／ＳｖＪマウス・ファージライブラリー（ストラタジーン社製：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングした。その結果，マウス・アディポネクチン遺伝子の蛋白質翻訳開始エクソンを含む約１６ｋｂのゲノムＤＮＡ断片を回収し、これをｐＢｕｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＢＳＫ：ストラタジーン社製）にサブクローンした。ついで、ショットガン法［Ｋａｗａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，  蛋白質・核酸・酵素，Ｖｏｌ．２４，  Ｎｏ．５８，  ４１  （１９９６）］により、該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その結果、マウス・アディポネクチンの遺伝子は、３つのエクソンからなり、配列番号３に示す２４７アミノ酸配列をコードするＯＲＦ領域（配列番号５：全長ｃＤＮＡの塩基配列の３９−７８２位）を有していることがわかった。尚、５’および３’非翻訳領域と蛋白質翻訳領域を含むｃＤＮＡの塩基配列（１２７６塩基）を配列番号３に示す。該マウス・アディポネクチンのｃＤＮＡクローンとヒト・アディポネクチンのｃＤＮＡクローンの相同性は核酸レベルで８３％であり、推定されるアミノ酸配列レベルでは８３％であった。
【０２１１】
マウス・アディポネクチンのｃＤＮＡの塩基配列のうち、遺伝子破壊用ベクターの相同領域として第２エクソン上流のＳｎａＢＩ−ＡａｔＩＩ断片（上流フラグメント：７ｋｂ）および下流のＶｓｐＩ−ＥｃｏＲＩ断片（下流フラグメント：１．４ｋｂ）を用いた。また、ポジティブ選択マーカーとしてｐＫＯ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｅｏ  （Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）及びネガティブ選択マーカーとしてｐＫＯ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＤＴＡ  （Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）をそれぞれ使用し、これらをそれぞれ上記の上流フラグメントと下流フラグメントの間、及び下流フラグメントの下流に組み入れて遺伝子破壊用ベクター（ターゲティングベクター）を構築した（図１参照）。
【０２１２】
参考例２：アディポネクチン遺伝子欠損マウスの作製
参考例１により作製したマウス・アディポネクチン遺伝子の遺伝子破壊用ベクター（ターゲティングベクター）を導入するマウス胚幹細胞、フィーダー細胞及び培地として、ザ・マウス・キット  （Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｋｉｔ：  Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を使用した。マウス胚幹細胞の培養は製品の使用説明書に従い、次いでＮｏｔＩ消化により、線状化した遺伝子破壊用ベクター５０μｇをエレクトロポレーションによって３．０×１０７個の胚幹細胞に導入した。遺伝子導入には機材としてＥＣＭ６００（ＢＴＸ  Ｉｎｃ．社製）を用い、条件は２７０Ｖ／１．８ｍｍ  および５００μＦとした。導入後４８時間にジェネテイシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（２５０μＭ，シグマ社製：Ｓｉｇｍａ）を添加して、以後、当該薬剤への耐性を指標とした薬剤選択を７日間行い、２８９６個のジェネテイシン耐性コロニーの中から１２０クローンを回収した。回収されたこれらの胚幹細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、５’プローブ（５１３ｂｐマウスゲノムＤＮＡを鋳型として以下の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより作製した：ａｐＭＰ１  ：ＣＧＡＴＧＣＴＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＧＡＧＣ  （配列番号８），ａｐＭＰ２：ＣＣＴＴＴＣＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＡ（配列番号９））、および相同領域の下流に位置する３’プローブ（ｌ９１ｂｐ，ＰＣＲにより作製、ａｐＭ３Ｐｒ１：ＧＣＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＡＴＴＧＧＧＡＡＣＡ（配列番号１０）、ａｐＭ３Ｐｒ２：ＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＡＧＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧ  （配列番号１１））、並びにｎｅｏプローブを用いてサザンブロット解析を行った結果、８株が相同組換え体として同定された。これらのうち６株（クローン番号６３３，  ６４４，  ６４９，  ６６６，  ６６７および６６８）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス胚盤胞へ注入し、キメラマウスを作製した。
【０２１３】
次いで作製したキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス（日本クレア株式会社より入手）と交配させた。その結果、クローン番号６４９に由来するキメラマウスからへテロ欠損型マウス（＋／−）が得られた。さらにヘテロ欠損型マウス（＋／−）同士を交配させてホモ欠損型マウス（−／−）を作製した。
【０２１４】
なお、得られた野生型マウス（＋／＋）の雌から取り出した卵子をヘテロ欠損型マウス（＋／−）の雄から取り出した精子で受精させて調製した野生型マウス（＋／＋）及びヘテロ欠損型マウス（＋／−）の受精卵を、平成１４年８月２日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所    特許生物寄託センターに、微生物の表示：（寄託者が付した識別のための表示）ａｐＭ１欠損マウス由来受精卵、（受託番号）ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９６０として寄託した。
【０２１５】
参考例３：遺伝子型の判定
アディポネクチン遺伝子野生型マウス（＋／＋）及びアディポネクチン遺伝子へテロ欠損型マウス（＋／−）について、遺伝子型を判定した。
【０２１６】
遺伝子型の判定には、遺伝子破壊用ベクターの構築に使用した相同領域の上流に位置する５’プローブ（ａｐＭＰｌ：ＣＧＡＴＧＣＴＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＧＡＧＣ（配列番号８），ａｐＭＰ２：ＣＣＴＴＴＣＧＧＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＡ（配列番号９））、および相同領域の下流に位置する３’プローブ（ａｐＭ３Ｐｒ１：ＧＣ    ＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＡＴＴＧＧＧＡＡＣＡ（配列番号１０）、ａｐＭ３Ｐｒ２：ＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＡＧＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧ  （配列番号１１））を用いた  （図１参照）。アディポネクチン遺伝子野生型マウス（＋／＋）及びアディポネクチン遺伝子へテロ欠損型マウス（＋／−）のゲノムＤＮＡを制限酵素ＳｐｅＩで消化し、上記５’プローブまたは３’プローブのそれぞれを使用して、常法（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａ１．１９９０）に従ってサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行った。
【０２１７】
５’プローブによるサザンブロット解析において、野生型及び欠損型にはいずれも１７ｋｂのバンドが検出されたが、欠損型には特有に１０ｋｂのバンドが検出された。一方、３’プローブによるサザンブロット解析では、野生型及び欠損型にはいずれも１７ｋｂのバンドが検出されたが、欠損型には特有に７ｋｂのバンドが検出された。このことから、アディポネクチン遺伝子へテロ欠損型マウス（＋／−）は、第２エクソン部位が欠損し、ネオマイシン耐性遺伝子に置換されていることが確認された。
【０２１８】
実施例１  急性創傷に関するアディポネクチン及びアディポネクチン欠損マウスの各試験方法
１．１．創傷組織におけるアディポネクチンの発現
全ての外科施術及び創面切除はヘルシンキ宣言に従いインフォームドコンセントの後に実施した。ヒトの創傷組織におけるアディポネクチンの発現を調べるために、本発明者らは、非傷害皮膚、急性創傷、又は慢性難治性創傷下部の脂肪組織を得た。急性創傷は保存的療法または外科的療法を施したもので、１又は２週間以内に治癒した。慢性難治性創傷組織は、静脈潰瘍（１例）、圧迫潰瘍（１例）及び糖尿病性の足の潰瘍（３例）から得られた。非傷害皮膚、急性創傷、および慢性創傷試料を採取された人の年齢、性別、肥満度指数（ＢＭＩ）には有意異はなかった（非傷害皮膚；年齢５１．４±  ２０．２歳［ｍｅａｎ  ±  ＳＤ］，  ＢＭＩ  ２０．６６  ±  ２．５８ｇ／ｍ２  ；急性創傷；年齢５３．１±１８．７歳［ｍｅａｎ  ±  ＳＤ］，  ＢＭＩ  ２２．２４  ±  ２．４２ｇ／ｍ２  ；慢性創傷；年齢５７．４±  １０．７歳［ｍｅａｎ  ±  ＳＤ］，  ＢＭＩ  ２３．４８  ±  ２．１４ｇ／ｍ２）。試料は重量測定して同量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を加え、氷上で組織をホモジネートした後、脂質層と沈渣を取り除くために１２，０００ｇで３０秒間遠心分離した。こうして得た透明黄色の液体をアリタら（非特許文献２０）の方法に従ってＥＬＩＳＡに供した。
【０２１９】
尚、アディポネクチンの発現は、外科的治療１週間後の通常の熱症性急性創傷の脂肪組織を用いて検討した。
【０２２０】
１．２．細胞培養
ヒトのケラチノサイトは、ホッタ（非特許文献２１）らと同様に培養した。即ち、皮膚の手術中に得られた正常皮膚を細かく切り刻み、真皮と表皮を分離するために４℃で一晩ＤＭＥＭ培地に２５０単位／ｍｌのジスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ：  Ｇｏｄｏ  Ｓｈｕｓｅｉ社製）と共にインキュベートした。表皮シートを３７℃で１０分間トリプシン（０．２５％ＰＢＳ）と共にインキュベートして、ピンセットで軟らかく梳いた。表皮細胞は、２ｘ１０−７Ｍインスリン、０．５μｇ／ｍｌハイドロコルチゾン、２ｘ１０−４Ｍエタノラミン、２ｘ１０−４Ｍリン酸エタノラミン、２５μｇ／ｍｌウシ視床下部抽出物及び抗生物質を添加したケラチノサイト成長培地（ＫＧＭ：ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ＭＣＤＢ  １５３，キョクトウ社製）に懸濁させた。カルシウム（Ｃａ２＋）の濃度は０．１ｍＭに調整した。実験には継代数２〜４の細胞を用いた。
【０２２１】
１．３．免疫組織化学染色
脂肪組織を含むヒト非傷害皮膚、急性創傷、及び慢性難創傷試料は外科施術または創傷切除術により採取した後にパラフィン包埋した。アディポネクチンの免疫組織化学染色は、オカモトら（非特許文献２７）と同様に抗アディポネクチンモノクローナル抗体（ＡＮＯＣ９１０８）を用いて実施した。ケラチノサイトへのアディポネクチンの結合を調べるために、本発明者らはアディポネクチンで処理されたヒト培養ケラチノサイトに対するアディポネクチン抗体の結合を検討した。ケラチノサイトは３０μｇ／ｍｌのアディポネクチンを含むＫＧＭ（−）（ウシ視床下部抽出物不含ＫＧＭ）で１時間培養した。次いで培養培地を除去して細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、４℃で３０分間２％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定し、モノクローナルアディポネクチン抗体（ＡＮＯＣ９１０８）を用いて免疫染色を行なった。
【０２２２】
１．４．ＲＴ−ＰＣＲ
アディポネクチンｍＲＮＡの検出のために、製品使用説明書に従いＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ，Ｉｎｃ社）を用いてヒト脂肪細胞及びヒトケラチノサイトからｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、ヤマグチら（非特許文献２８）の方法と同様にして実施された。ＰＣＲのために用いられたオリゴヌクレオチドプライマーを以下に示す：
アディポネクチンＦ（配列番号１２）：５’−ＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡ−３’、
アディポネクチンＲ（配列番号１３）：５’−ＡＧＴＴＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧ−３’（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｚｅ  ７５０ｂｐ）、
ヒトＧＡＰＤＨ（コントロールとして）Ｆ（配列番号１４）：５’−ＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧ−３’、
Ｒ（配列番号１５）：５’−ＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴ−３’（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓｉｚｅ  ５６７ｂｐ）。
【０２２３】
ＰＣＲ増幅サイクルは、アディポネクチンに対して３５サイクル（各サイクル：９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分）、及びＧＡＰＤＨに対して３５サイクル（各サイクル：９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分）実施した。
【０２２４】
１．５．組換え蛋白の調製
組換えヒト全長アディポネクチンは大腸菌によって産生させて、アリタら（非特許文献２０）の方法に順じて精製した。
【０２２５】
１．６． 組換えアディポネクチンの製造（アディポネクチンの大腸菌での発現）
アディポネクチン遺伝子の塩基配列及び該遺伝子配列でコードされるアミノ酸配列は、ジーンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）にアクセッション番号Ｄ４５３７１として登録されている。そのコーディング領域（ＣＤＳ）は、配列番号２７−７６１番目に示されている。その推定アミノ酸配列は配列番号１に示すとおりである。該配列において、１−１４番目はシグナルペプチドであり、１５−２４４番目が成熟型アディポネクチンである。
【０２２６】
アディポネクチン遺伝子の塩基配列のうち、６９−７６１番の６９３塩基対を増幅し、その５’末端にＮｄｅＩサイトを、３’末端にＢａｍＨＩサイトを増設するように設計し、自動ＤＮＡ合成機により製造し、ＰＣＲ産物を取得した。上記で得られたＰＣＲ産物をｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバゲン社製）にサブクローニングし、その塩基配列（ｐＴ７−アディポネクチン）に変異がないことを確認した。次いで、発現ベクターｐＥＴ３ｃ（ノバゲン社製）をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、約４６００塩基対の断片得た。また、上記で得たｐＴ７−アディポネクチンをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化し、約７００塩基対の断片を得た。これらの断片をライゲーションし、得られた発現ベクターをｐＥＴ３ｃ−アディポネクチンとした。
【０２２７】
次に、宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓを、上記で得たｐＥＴ３ｃ−アディポネクチンでトランスフォームし、２  ｘ  Ｔ．Ｙ．Ａｍｐ．（トリプトン１６ｇ、酵母抽出物１０ｇ、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌ及びＮａＣｌ１５ｇ）で前培養し、翌日、その培養液を１００倍量の２  ｘ  Ｔ．Ｙ．Ａｍｐ．で希釈して更に培養した。２〜３時間培養して培養液のＯＤ５５０が０．３〜０．５の最終濃度０．４ｍＭの菌体が対数増殖期に入ったところでＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加し、組換えアディポネクチンの生産を誘導した。ＩＰＴＧによる誘導前後の大腸菌及びＩＰＴＧ誘導後のインクルージョンボディー（大腸菌の不溶性画分）をサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによりアディポネクチンの発現を確認した。
【０２２８】
そしてＩＰＴＧ添加後約３〜５時間で培養液を遠心分離（５０００ｒｐｍ，  ２０，  ４℃）し、得られた大腸菌の沈殿を凍結保存した。次いで大腸菌からのインクルージョンボディーの調製を以下のように行なった。即ち、大腸菌の沈殿を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾチームで３７℃、１時間処理した後、最終濃度０．２％のトリトンＸ−１００  （ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，片山化学社製）を添加した。その溶液を超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＯＮＩＦＩＥＲ，  ｏｕｔｐｕｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ５，  ３０秒）し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，  ３０分，  ４℃）して沈殿を回収した。その沈殿を０．２％のトリトンＸ−１００を添加した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２５ｍｌに懸濁し、超音波処理（同上条件）を行った。
【０２２９】
得られた溶液を遠心分離し、沈殿を再度同様の操作で洗浄し、得られた沈殿をインクルージョンボディーとした。次いでインクルージョンボディーのリフォールディング  インクルージョンボディーを少量の７Ｍ塩酸グアニジン，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１％  ２ＭＥに可溶化した。その溶液を２００倍量の２Ｍ  尿素、２０＜５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に滴下して希釈し、４℃で３晩放置した。リフォールディング溶液の濃縮は、リフォールディングした溶液を遠心分離（９０００ｒｐｍ，  ３０分間，  ４℃）し、得られた上清をアミコンＹＭ−１０メンブランを用いた限外濾過で約１００倍に濃縮した。その濃縮液を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。次いで得られたサンプルをＤＥＡＥ−５ＰＷ  （東ソー社製）による陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離、精製した。開始バッファーは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で、溶出は１Ｍ  ＮａＣｌのグラジェント（０→１Ｍ  ＮａＣｌ／６０ｍｌ）で行い、２８０ｎｍの吸収でモニターした。フラクションは１ｍｌずつ行い、各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥして分析した。
【０２３０】
組換えアディポネクチンは、大腸菌にインクルージョンボディーとして発現していたので、精製に際してはインクルージョンボディーの可溶化及びリフォールディングを行った。その結果、組換えアディポネクチンは可溶化され、陰イオン交換カラムで分離された。そのピークのフラクション（フラクションＮｏ．３０−３７）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、約３０ｋＤａのバンドが観察された。
【０２３１】
１．７．増殖アッセイ
ヒトケラチノサイトはＩ型コラーゲンコートされた９６穴プレート上に５ｘ１０３細胞／ウェルの密度で播かれ、ＫＧＭと共に一晩インキュベート、さらに２４時間ＫＧＭ（−）でインキュベートされた（非特許文献２８及び２９）。さらに０、３、１０、及び３０μｇ／ｍｌのアディポネクチンで２４時間処理後、ケラチノサイトは４０μＭ５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）でパルス標識された。ケラチノサイトの増殖を評価するために、細胞増殖キット（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を製品使用説明書に従い使用し、４１０ｎｍでの吸収度をモデル４５０マイクロプレート・リーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて測定した。
【０２３２】
１．８．インビトロ遊走アッセイ
ヒトケラチノサイトはコンフルエントとなるまでＩ型コラーゲンコートされた１２穴プレートにてＫＧＭで培養し、次いで２４時間飢餓処理を行い、さらに細胞増殖を抑制するために１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで２時間処理した（非特許文献３０及び３１）。イエロー・ピペット・チップで単層を引き剥がすことによって細胞フリー部位を導入した後、本発明者等は、アディポネクチン（０−３０μｇ／ｍｌ）存在下４８時間での細胞フリー部位への細胞遊走を評価した。
インビトロ創傷端の辺境を超えて遊走しているケラチノサイトの数を計測するために４つの非重複部位の写真を位相差顕微鏡  （ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ：  ＤＩＡＰＨＯＴ３００）を使って撮影した。
【０２３３】
１．９．ウエスタンブロッティング
ヒトケラチノサイトはコンフルエントとなるまでＩ型コラーゲンコートされた１２穴プレートにてＫＧＭで培養し、次いでＫＢＭ（表皮角化細胞用基礎培地）で飢餓処理を２日間行なった。ケラチノサイトは、３０μｇ／ｍｌのアディポネクチンで０、１０、２０、４０、或いは６０分間それぞれ処理し、１００μｌのＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）サンプル緩衝液（６２．５ｍＭトリス，  ｐＨ７．０，  ０．２％ＳＤＳ，  １０％グリセロール，  ５０ｍＭ  ＤＴＴ，  ０．１％ブロモフェノールブルー）で可溶化した。サンプル蛋白質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜に転写した。尚、ＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓ  ｐ４４／４２  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ  （Ｔｈｒ２０２／Ｔｒｙ２０４）抗体キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｏｓ，  Ｉｎｃ．社製）がＥＲＫ１／２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ）を検出するために使用された。
【０２３４】
実施例２    創傷組織におけるアディポネクチンの局在と発現解析
未傷害皮膚、急性創傷皮膚、および慢性難治性創傷下の局所脂肪におけるアディポネクチン免疫組織化学、独立した７回の試験を行ない代表的な写真を撮影した。
【０２３５】
また、傷害１週間後に得られた急性創傷におけるアディポネクチンの免疫組織染色を行い、独立した５回の試験のうちの創傷端の代表的な写真を取得した。その結果、急性創傷皮膚下部の脂肪組織は、未傷害皮膚下部のそれに比較して、抗アディポネクチンモノクローナル抗体によってより強く染色された。
【０２３６】
免疫組織化学解析により、アディポネクチンは脂肪組織と同じく、舌上皮下部及び新生血管周囲に検出された。急性傷害組織におけるアディポネクチンの組織含量を評価するために、本発明者等は組織をホモジネートした後、可溶化し、ＥＬＩＳＡによって組織上清におけるアディポネクチンの含有量を特定した。
【０２３７】
その結果を図２に示す。  図中、縦軸は未傷害皮膚、急性創傷部、慢性難治性創傷の各組織におけるアディポネクチン発現の定量を示す（μｇ／ｍｇ組織）。データは平均±ＳＤ値を示し、＊はｐ＝０．０２７，＊＊はｐ＜０．０００５を示す。
【０２３８】
急性創傷部におけるアディポネクチンの含有量は、未傷害皮膚より高かった（それぞれ５．２２±２．３４μｇ／ｍｇ組織、  １．８８±０．２１μｇ／ｍｇ組織，  ｐ＜Ｐ０．００１）（図２参照）。また、静脈潰瘍、圧迫潰瘍及び糖尿病による足部潰瘍から得られた慢性難治性創傷におけるアディポネクチンの発現及び組織含有量について検討した。
【０２３９】
その結果、慢性難治性創傷下におけるアディポネクチンの発現は、通常の急性創傷より低かったが（３．０１±０．３０μｇ／ｍｇ組織）、非傷害皮膚より高い傾向があった（図２）。これらの結果により、アディポネクチンは急性創傷周辺の脂肪組織において過剰発現されており、新しく形成された血管を通じてパラクライン様、又はエンドクライン様に創傷組織の上皮舌下部に蓄積していることが示された。
【０２４０】
実施例３    創傷治癒アッセイ
以下の実験は、アディポネクチン欠損マウス（ＫＯマウス：ｎ＝１５  ６〜１２週令雄マウス）及び野生型（ＷＴ）マウス（ｎ＝１５）：６〜１２週令雄マウス）を用いて、実験動物のストレスを最小にする研究用ガイドラインに厳格に沿って実施した（非特許文献２３）。
【０２４１】
生検パンチを使ってマウス背部上の十分な厚さの皮膚（Ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｓｋｉｎ）  （直径１０ｍｍ）をフェントバルビタールナトリウム麻酔下で切除した（非特許文献２３）。創傷部位の写真を各日おきに撮り、創傷サイズをＳｃｉｏｎＩｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ社製）を使用する積算計によって測定した。
【０２４２】
また、手術６日後、マウスは２５０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社製）を含む０．９％食塩水を腹腔内に投与され、１時間後に屠殺された（非特許文献３３）。創傷部は非傷害皮膚を含めて切り出され、そして４％パラホルムアルデヒドに４℃で一晩固定された。各サンプルの半分はパラフィン包埋され、そしてヘマトキシリン及びエオジンで染色された。
【０２４３】
別の半分は、製品説明書の方法に従って、ＢｒｄＵ染色キット（ＢｒｄＵ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ：  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社製）を用いてＢｒｄＵ抗体で染色した。傷害端末部位でのＢｒｄＵ陽性細胞数を測定するため、重複しない１０箇所で写真を撮影した。表皮の創傷端において全細胞に対するＢｒｄＵ陽性細胞の比率が特定された。全てのサンプルは光学顕微鏡下において試験され、再上皮形成された表皮と新しく形成された肉芽瘢痕組織の範囲を組織病理学的に測定した。これらの範囲は、創傷表面に対して垂直方向の組織切片を用いて、ＳｃｉｏｎＩｍａｇｅによりトレースし、定量化した。
【０２４４】
その結果を図３に示す。図中縦軸は、傷害エリア（ｍｍ２）を示し、横軸は受傷後の日数をＫＯは、アディポネクチン欠損マウスを、ＷＴは、野生型マウスを示す。尚、平均±ＳＤ値を示した。＊は、野生型に対してｐ＜０．０５を意味する。また、実験における各群間の差異は、非対象ｔ−テストを用いて有意差検定を行なった（Ｐ＜０．０５）。
【０２４５】
その結果、アディポネクチン欠損（ＫＯ）マウスでは、野生型（ＷＴ）マウスと比較して創傷治癒過程の遅延が認められた（図３）。  アディポネクチン欠損マウスの創傷端は、野生型マウスと比較して、異常に突出していた（手術６日後の病理組織図から）。
【０２４６】
病理組織学的には滑らかな創傷萎縮とよく伸びた再上皮形成が野生型マウスにおいて観察された。対照的に、アディポネクチン欠損マウスでは、凹凸形成を伴う創傷瘢痕の重篤な萎縮と再上皮形成過程障害が認められた。
【０２４７】
また、アディポネクチン欠損マウス及び野生型マウスの間の創傷組織における再上皮形成及び肉芽形成における差異を図４に示す。図中、上段は、再上皮形成を下段は肉芽形成における野生型（ＷＴ）を１．０とするアディポネクチン欠損マウス（ＫＯ）の相対的な値を示しており、平均±ＳＥＭ値で示される。＊は野生型に対してｐ＜０．０５  、＊＊は野生型に対してｐ＜０．０１。
【０２４８】
再上皮形成過程の定量化により、アディポネクチン欠損マウスでは野性型と比較してこの過程が顕著に抑制されていることが明らかになった。更にアディポネクチン欠損マウスにおける肉芽組織の容量は、僅かではあるが有意に上昇した（ｐ＜０．０５）（図４参照）。新生血管数については２群間で有意差は観察されなかった。
【０２４９】
また、創傷端での再上皮形成過程の定量化のために、本発明者等は、インビボＢｒｄＵ標識アッセイにより増殖活性を評価した。
その結果を図５に示す。創傷端におけるＢｒｄＵ陽性細胞数は、１０の非重複分野の写真においてカウントされた（各ｎ＝５）。  データは、平均±ＳＥＭ値を意味する。＊は、野生型に対してｐ＜０．０５を意味する。  アディポネクチン欠損マウスのＢｒｄＵ陽性ケラチノサイト数は、野生型タイプのそれの約三分の一であった（Ｐ＜０．０００１）。
【０２５０】
これらのデータにより、アディポネクチン欠損マウスにおける創傷治癒の遅延は、少なくとも部分的には、ケラチノサイトの増殖障害に負うことが示唆された。
【０２５１】
実施例４  ケラチノサイトへのアディポネクチンの効果
再上皮形成はケラチノサイトの遊走および増殖の結果として生じる、正常な創傷治癒における重要な過程である（非特許文献２６及び３４）  。それ故に、本発明者等はインビトロで培養されたヒトケラチノサイトの増殖に対するアディポネクチンの影響を試験した。またヒトにおける創傷端周囲のケラチノサイトはアディポネクチン染色陽性であったので、ケラチノサイト自体がアディポネクチンを発現するかどうかをヒト脂肪細胞及びヒトケラチノサイトにおけるアディポネクチンｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲによって解析し、併せてケラチノサイトへのアディポネクチンの結合についても解析した。ヒトケラチノサイトを３０μｇ／ｍｌのアディポネクチンで１時間培養した。この細胞をアディポネクチンモノクローナル抗体（ＡＮＯＣ９１０８）を用いて免疫染色した。
【０２５２】
解析の結果、培養ヒトケラチノサイトにおいてアディポネクチンｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲでは検出することができなかった。一方、培養ケラチノサイトの培地へのアディポネクチンの添加により、細胞表面上にアディポネクチンが結合することから、ケラチノサイト上にレセプターが存在することが示唆された。
【０２５３】
さらにケラチノサイトの増殖に及ぼすアディポネクチンの効果を検討するために増殖アッセイを実施した。即ち、Ｉ型コラーゲンでコートした９６穴プレート上に播いたヒトケラチノサイトを生理的濃度のアディポネクチンで２４時間処理し、次いで細胞は４０μＭＢｒｄＵで４時間パルス標識された。ケラチノサイトの増殖はＢｒｄＵ取込みによって評価した。各群は１０穴からなる群で１０回測定を繰り返した結果である。未処理細胞の値を１．０として設定した。データは、平均±ＳＥＭ値で示した。その結果を図６のＡに示す。図中、＊は、ｐ＜０．０１未処理細胞と比較した差異を示す。その結果、アディポネクチンはケラチノサイトへのＢｒｄＵの取込みを容量依存的に促進した。
【０２５４】
さらに、ヒトケラチノサイトの増殖に対するアディポネクチン及び増殖因子の影響を上記に記載されたと同じ方法で分析した。３０μｇ／ｍｌのアディポネクチン及び１０ｎｇ／ｍｌの各増殖因子で細胞を２４時間培養した。コントロール細胞の値を１．０とした。データは、平均±ＳＥＭ値で示す。その結果を図６のＢに示す。図中、Ｃは未処理コントロールサンプルを表わし、ＢｒｄＵの取り込み上昇は、それを１．０と設定した相対値として示される。Ａｄはアディポネクチンを示す。
【０２５５】
その結果、生理的濃度のアディポネクチンの添加では、ケラチノサイトに対する潜在的なマイトジェンであるところのＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＴＧＦ−α及びＨＧＦの添加によって得られるＢｒｄＵ取り込みと同程度の効果が認められた  （図６のＢ）。
【０２５６】
更に本発明者等は、培養されたケラチノサイトの遊走についてもインビトロ・スクラッチ・アッセイによって測定した。
【０２５７】
即ち、Ｉ型コラーゲンコートされた１２穴プレート上に播いたコンフルエントなヒトケラチノサイトを２４時間飢餓処理した。そして、細胞成長を抑制するために更に２時間１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで処理した。イエローピペットティプで単層を引き剥がすことによって、細胞フリー部位を導入した後、４８時間でのアディポネクチン（０−３０μｇ／ｍｌ）の存在における細胞フリー部位への細胞遊走を評価した。その結果を図７のＡに示す。縦軸は、面積（ｍｍ２）当たりの遊走した細胞数を示し、定量的データは平均±ＳＤ値で示される。＊は、ｐ＜０．０１を未処理細胞と比較した差異を示す。各群は１０穴からなり、７回実験を繰り返した結果である。
【０２５８】
アディポネクチンの生理的濃度の補充は、用量依存的にケラチノサイトの遊走を顕著に促進した。
【０２５９】
成長因子やサイトカインによって誘導されるケラチノサイトの増殖と遊走は、ＭＡＰＫ  （ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉａｎａｓｅ）あるいはＳＴＡＴ  （ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を介して調節されることが知られている。  本発明者等は、ＥＲＫ  （ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ）１及びＥＲＫ２のリン酸化に対するアディポネクチンの影響をさらに検討した。
【０２６０】
即ち、コンフルエントなヒトケラチノサイトは、コラーゲンコートされた１２穴プレートにＫＧＭを用いて播き、続いてＫＢＭ中で２日間飢餓処理した。該細胞は、３０μｇ／ｍｌのアディポネクチンで０、１０、２０、４０、或いは６０分間それぞれ処理し、１００μｌのＳＤＳサンプル緩衝液で可溶化した。サンプル蛋白は、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（上のパネル）及び抗ＥＲＫ２抗体（下パネル）を用いたウエスタンブロッティングに供した。その結果を図７のＢに示す。アディポネクチンは、生理的な濃度（３０μｇ／ｍｌ）でケラチノサイトにおけるＥＲＫ１／２のリン酸化を誘導したが、ＳＴＡＴ３のリン酸化に対しては同量のアディポネクチンは有意な影響を与えなかった。
【０２６１】
本発明者らの上記試験結果により、アディポネクチンがケラチノサイトの増殖と遊走を促進することが示された。
【０２６２】
ヒト動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣｓ）において、アディポネクチンは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＨＢ−ＥＧＦ、ｂＦＧＦを含む種々の成長因子によって誘導される増殖と遊走を抑制した（非特許文献１８）。マウスにおいて、カテーテル誘導性剥離後の動脈における平滑筋細胞の新生血管内膜の増殖は、アディポネクチン遺伝的破壊によって促進され、その過剰発現によって抑制された（非特許文献１９）。アディポネクチンは、ヒト動脈平滑筋細胞においてレセプターの自己リン酸化に影響することなく、共通のポストレセプターシグナルであるＥＲＫのリン酸化を抑制した。対照的に本発明者等はここにアディポネクチンがケラチノサイトにおけるＥＲＫ１／２のリン酸化を刺激することを示した。ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）経路に関するアディポネクチンのメカニズムは、ほとんど理解されていない。アディポネクチンと対照的に、ＴＧＦ−βは、上皮細胞の増殖を抑制するが、間葉系細胞の増殖を亢進させる（非特許文献３５）。
【０２６３】
アディポネクチンは、上皮細胞と間葉系細胞のような異なった細胞タイプにおいてＭＡＰＫ経路と相互作用するために異なったシグナル経路を使用するかもしれない。或いは、ケラチノサイトやヒト動脈平滑筋細胞は、アディポネクチンに対してタイプ特異的レセプターである細胞を有するかもしれない。
【０２６４】
本発明者等は、このように皮膚の創傷治癒におけるアディポネクチンの役割について調べ新しいアディポネクチンの医薬用途を見出した。ヒトにおいて、アディポネクチンは急性創傷の舌上皮下の脂肪組織で過剰発現された。またアディポネクチン欠失マウスでは、野生型マウスと比較して、乏しい再上皮形成と増加した肉芽組織によって特徴づけられる創傷治癒過程の遅延が認められた。培養ケラチノサイトにおいて、アディポネクチンは、ＥＲＫ１／２のリン酸化を高め、用量依存的にケラチノサイトの増殖と遊走を促進した。これらの結果から、アディポネクチンが正常の創傷治癒過程に関係していることが示唆された。
【０２６５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】マウスアディポネクチン野生型（Ｉｎｔａｃｔ  ａｌｌｅｌｅ）（図Ａ）と欠損型（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅ）（図Ｂ）の遺伝子の構造図を示す。
【図２】実施例２において、急性傷害組織におけるアディポネクチンの組織含量をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図である。  図中、縦軸は未傷害皮膚（ｉｎｔａｃｔ  ｓｋｉｎ  ）、急性創傷部（ａｃｕｔｅ  ｗｏｕｎｄ）、慢性難治性創傷（ｉｎｔｒａｃｔａｂｌｅ  ｗｏｕｎｄ）の各組織におけるアディポネクチン発現量を示す（μｇ／ｍｇ組織）。データは平均±ＳＤ値を示し、＊はｐ＝０．０２７，＊＊はｐ＜０．０００５を示す。
【図３】実施例３において、アディポネクチン欠損（ＫＯ）マウスと野生型（ＷＴ）マウスにおける皮膚創傷治癒の経過を組織病理学的に測定した結果を示す図である。図中、縦軸は傷害エリア（ｗｏｕｎｄ  ａｒｅａ：ｍｍ２）を示し、横軸は受傷後の日数（ｄａｙｓ）を、ＫＯはアディポネクチン欠損マウス（―●―）を、ＷＴは野生型マウス（−−○−−）を示す。尚、平均±ＳＤ値を示した。＊は、野生型に対してｐ＜０．０５を意味する。また、実験における各群間の差異は、非対象ｔ−テストを用いて有意差検定を行なった（Ｐ＜０．０５）。
【図４】実施例３において、アディポネクチン欠損（ＫＯ）マウス及び野生型（ＷＴ）マウスの間の創傷組織における再上皮形成及び肉芽形成における差異を評価した結果を示す図である。図中、上段（図Ａ）は再上皮形成（Ｒｅｅｐｉｔｈｅｌｉｚａｔｉｏｎ）、下段（図Ｂ）は肉芽形成（Ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）について、それぞれ野生型（ＷＴ）マウスの場合を１．０とした場合におけるアディポネクチン欠損（ＫＯ）マウスの相対的な値（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔ）を示す。平均±ＳＥＭ値で示される。ＫＯはアディポネクチン欠損マウスを、ＷＴは野生型マウスを示す（以下の図において同じ）。＊は野生型マウスに対してｐ＜０．０５  、＊＊は野生型マウスに対してｐ＜０．０１であることを示す。
【図５】実施例３において創傷端での再上皮形成過程を定量化するために、インビボＢｒｄＵ標識アッセイにより増殖活性を評価した結果を示す図である。縦軸は、野生型マウス（ＷＴ）及びアディポネクチン欠損マウス（ＫＯ）について、創傷端におけるＢｒｄＵ陽性細胞（％）（ＢｒｄＵ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ：％）を示す。データは、平均±ＳＥＭ値を意味する。＊は、野生型に対してｐ＜０．０５を意味する。
【図６】図Ａは、実施例４において、アディポネクチンのケラチノサイト増殖に及ぼす効果をＢｒｄＵ取込み（ＢｒｄＵ  ｕｐｔａｋｅ）によって評価した結果を示す図である。アディポネクチン未処理細胞の値を１．０として、それに対する相対比（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔ）で示す。図中、＊は、ｐ＜０．０１未処理細胞と比較した差異を示す。図Ｂは、ヒトケラチノサイトの増殖に対するアディポネクチン及び各種の増殖因子の影響ををＢｒｄＵ取込み（ＢｒｄＵ  ｕｐｔａｋｅ）によって評価した結果を示す図である。未処理細胞（コントロール細胞）（Ｃで示す）の値を１．０とし、それに対する相対比で示す。Ａｄはアディポネクチンを示す。
【図７】図Ａは、実施例４において、ケラチノサイトの遊走に対するアディポネクチンの影響をインビトロ・スクラッチ・アッセイによって測定した結果を示す図である。縦軸は、面積（ｍｍ２）当たりの遊走した細胞数（ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｍｉｇｒａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２）を示し、定量的データは平均±ＳＤ値で示される。＊は、ｐ＜０．０１を未処理細胞と比較した差異を示す。図Ｂは、実施例４において、ケラチノサイトにおける抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（ｐＥＲＫ１、ｐＥＲＫ２）及び抗ＥＲＫ２抗体（ＥＲＫ２）との反応をウエスタンブロット解析でみた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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