(57)【要約】  【課題】人に栄養補給等の目的で投与される脂肪乳剤あるいはドラッグ・デリバリー・システムのためのリポソーム製剤中のエンドトキシン活性を失活させる工業的に有利な方法を提供する。  【解決手段】脂肪乳剤またはリポソーム製剤を１００〜１２５℃で加熱処理することを特徴とする脂肪乳剤またはリポソーム製剤中のエンドトキシンの失活方法。このときの加熱時間は、５〜６０分間で目的が達せられ、オートクレーブなどの汎用的な加熱装置が採用できる。脂肪乳剤またはリポソーム製剤は、これらと混和しても凝集を起こさない限りにおいて、他の成分例えばぶどう糖などの糖類が共存していてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪乳剤またはリポソーム製剤を１００〜１２５℃で加熱処理することを特徴とする脂肪乳剤またはリポソーム製剤中のエンドトキシンの失活方法。
【請求項２】
温度１００〜１２５℃で、５〜６０分間加熱する請求項１記載の脂肪乳剤またはリポソーム製剤中のエンドトキシンの失活方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪乳剤またはリポソーム製剤中のエンドトキシンの失活方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシン（細胞内毒素）はグラム陰性菌の外膜における構成成分の一つである。化学構造的には、アミノ糖と脂肪酸からなるリピドＡ、Ｒコア糖鎖、および菌の抗原性を担うＯ多糖で構成されるリポ多糖である。エンドトキシンは複雑多岐にわたる生理活性を示す物質であり、生体レベルにおいて、発熱活性、エンドトキシンショックの誘発、シュワルツマン反応、エピネフリン反応、骨髄反応、血液凝固、白血球の減少および増加、血小板減少、血糖低下、血清鉄減少、補体活性化、アジュバント作用、免疫賦活作用、免疫抑制作用、抗腫瘍作用、放射線障害保護、トレランスの誘導あるいは副腎皮質ホルモンの放出などの作用を有する（例えば、非特許文献１参照）。これらの中でも発熱活性は特徴的なものであり、極めて微量で強い発熱活性を示す。
【０００３】
このような複雑多岐な生理活性を有するエンドトキシンは、医薬品等の製造において混入してくることがあってはならず、品質管理上、その検出と除去には厳重な注意が払われている。エンドトキシンは両親媒性でミセルを形成するため、分子形態が均一でなく、低分子化しても活性を示し、化学的処理にも比較的安定である。従って、試料中のエンドトキシンの完全除去、あるいは失活には困難が伴う。例えば、ガラスやステンレス等の耐熱性器具や、塩化ナトリウムなどの無機物に混在するエンドトキシンを不活性化するには、２５０℃で３０分以上、あるいは１７０℃で１２０分以上の加熱が必要である、とされている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
このようにエンドトキシンは高温の乾熱滅菌により失活するが、輸液のような液剤では過酷な加熱方法を施すことは不可能であるといってよい。そこで、輸液の製造では、その原料、中間製品あるいは最終製品等において多段的にエンドトキシンの検出試験を行い、万が一検出されるような事態になればそのロットを廃棄する方向で細心の製造管理がなされている。
【０００５】
一方、リポソームはドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）の一つの手段として開発が進められているが、リポソ−ム中に薬物を含むリポソーム製剤を静脈投与する場合、製剤中のエンドトキシンの量が問題となるために、日本薬局方では製剤中のエンドトキシン量が規制されている。これに関連してリポソ−ム分散液中のエンドトキシン量を測定する方法として、合成基質法を利用することが提案されている（特許文献１参照）。
【非特許文献１】「第十四改正  日本薬局方解説書」広川書店刊行  ２００１年、ｐ．Ｂ−７６〜Ｂ−７９。
【非特許文献２】中野昌康・小玉正智／編「エンドトキシン―新しい治療・診断・検査―」講談社発行、１９９７年８月１日、ｐ．１３９〜１４５。
【特許文献１】特開平８−２９０号公報（請求項１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
輸液は、血液以外の液体で静脈内に投与される液剤であって、例えばアミノ酸液、糖液、電解質液あるいは脂肪乳剤などが挙げられ、これらは複合的に投与されることも多い。現在のところ、いずれの輸液の製造においてもエンドトキシンが混入していることが判明すれば直ちに関係ロットを廃棄しなければならないので、予め混入自体を避ける方向で原料管理や工程管理を行っており、多大な労力と時間を要している。従って、輸液の製造において、エンドトキシンを簡単に失活できる方法が開発できればその実用価値は極めて大きいものがある。輸液に加えて、小容量のワンショット注射剤でも同様である。また、リポソーム製剤についても、そのＤＤＳの機能に支障を起こさないように、エンドトキシンを失活させる方法が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者らは、輸液のエンドトキシンの失活方法を鋭意検討した結果、輸液の中でも脂肪乳剤に限って、比較的に低温下の加熱処理によって混入中のエンドトキシンを失活できるという意外な知見を得、これに基づいてさらに脂質から調製されるリポソーム製剤についても検討した結果同様の知見を得、本発明を完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は、脂肪乳剤またはリポソーム製剤を１００〜１２５℃で加熱処理することを特徴とする脂肪乳剤またはリポソーム製剤中のエンドトキシンの失活方法、である。
【０００８】
従来、脂肪乳剤またはリポソーム製剤の製造は、脂質等の原料や製造設備においてエンドトキシンが検出されないことを確認し、いわゆるエンドトキシンフリーの状態で行われており、この状態で最終製品を得ている。従って、これら製剤を加熱処理することがあっても、それはエンドトキシンの存在しない状態であり、微生物を殺菌することが目的である。
【０００９】
これに対して本発明の方法によると、エンドトキシンの存在する脂肪乳剤またはリポソーム製剤であっても、１００〜１２５℃で加熱処理したのち無菌的に保存すればよく、製造上の原料管理あるいは工程管理が極めて簡便になり、安全度も高くなる。
本発明において、エンドトキシンを失活するための加熱温度は１００〜１２５℃であり、この温度に達しない状態で長時間の加熱を続けても安全性を保障できるほどに失活させることが困難である。逆に１２５℃を超えて加熱することは、脂肪乳剤あるいはリポソーム製剤の品質を損なうことになり避ける必要がある。上記の温度範囲の中でも、とりわけ１０５〜１２１℃で加熱処理することが好ましい。本発明における加熱処理は、上記の温度範囲においてエンドトキシンが失活するまで行うが、上限の処理時間は脂肪乳剤やリポソーム製剤が加熱による品質変化を受けない範囲で特に限定されない。具体的な加熱時間は、上記の加熱温度の低温側であるか高温側であるかを考慮して適宜設定されるが、通常は５〜６０分間の範囲であり、好ましくは２０〜４０分間の範囲である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、脂肪乳剤またはリポソーム製剤を対象に１００〜１２５℃の加熱処理を施すことによって混在するエンドトキシンを失活させることができる。この効果は、アミノ酸輸液あるいは糖輸液中のエンドトキシンに対してはみられない特異的なものである。従来、エンドトキシンは、２５０℃で３０分以上あるいは１７０℃で１２０分以上などの高温加熱によってはじめて失活するという一般的背景があり、液剤中のエンドトキシンを加熱により失活させることは実用上、困難であると考えられていたのである。ところが、本発明によると、オートクレーブなど実用的の加熱手段を採用して１００〜１２５℃という比較的、低温加熱においてエンドトキシンを失活させることができるので、従来のように製造工程の最初からエンドトキシンフリーの状態で製造を進める場合に比べて、工程管理が極めて簡便であるという特徴を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、脂肪乳剤は栄養補給などのために脂質を乳化状態で含む輸液もしくは小容量のワンショット注射剤などを、またリポソーム製剤はＤＤＳのためのリポソーム（脂質二重層膜閉鎖小胞）を分散した液剤を主な対象とする。脂肪乳剤の具体例としては、精製大豆油、精製卵黄レシチンおよび注射用グリセリンを含む乳化液が挙げられ、性状（脂肪濃度、ｐＨ、浸透圧比など）の設定や乳化を含む調製方法は、市販の脂肪乳剤（例、大塚製薬の「イントラリピッド１０％」）の場合に準じて行えばよい。リポソーム製剤についても、その膜形成等は従来法で調製すればよく、また包含させる薬物はそのＤＤＳ治療の目的に沿って選択したものであってよい。薬物を包含するリポソーム製剤は通常は静脈投与されることから、生体液と等圧程度に調整した水分散液剤が主たる投与形態である。
【００１２】
また、本発明は脂肪乳剤またはリポソーム製剤を対象とするものであるが、これら製剤と混和しても凝集を起こさないことを条件に他の成分（例えば、ぶどう糖などの糖類）が共存していてもよい。
本発明において、加熱処理を実施する時期は、エンドトキシンを失活させる目的であれば脂肪乳剤またはリポソーム製剤の調製工程において適宜選択できるが、通常は最終調製を終えた製剤に対して実施するのが効率的である。加熱処理には、加熱温度が１００〜１２５℃という温度領域であることから、加圧釜（レトルト、オートクレーブ）を利用する。すなわち、最終製品を輸液用容器あるいはバイヤル瓶などに充填・密封した後に加熱処理を施すか、あるいは別容器で加熱処理後に無菌的に最終容器に充填する。容器には、通常、注射剤に用いられるプラスチック製、ガラス製のものを用いることができ、加熱処理後は徐冷してもよく、また、冷水等を用いて急冷してもよい。
【００１３】
エンドトキシン活性は、例えば後述のパイロセップ法により測定することができる。この方法によりエンドトキシ活性が０．０１２ＥＵ／ｍＬ以下である脂肪乳剤またはリポソーム製剤は、実質上活性が０であると判断され、生体に投与しても発熱などのエンドトキシンに伴う毒性は認められない。
【実施例】
【００１４】
以下に実施例および比較例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
製剤１００ｍＬ当たり、精製大豆油１０ｇ、精製卵黄レシチン１．２ｇおよび注射用グリセロール２．２ｇがそれぞれ含まれるように、注射用蒸留水に分散して脂肪乳剤（Ａ）を調製し、次いでオートクレーブを用いて、１０６℃で４０分間加熱処理を行った。上記の加熱処理済の脂肪乳剤２ｍＬをエンドトキシンフリーの分注器を用いて乾熱滅菌試験管にとり、エンドトキシンフリーの緩衝液を用いてｐＨを５付近に調整した。この液をパイロセップゲル（和光純薬工業製）と接触させることにより、ゲルにエンドトキシンを吸着させるための操作を行い、ゲルを洗浄液（酸性のエンドトキシンを含まない水）にて洗浄した後、ライセート試薬の溶液０．３ｍＬに懸濁させ、その懸濁液の光透過率（青色発光ダイオード光源）の経時変化を測定し、初期透過率の９５％となるまでの時間をゲル時間とした。一方、コントロールスタンダードエンドトキシン（和光純薬工業製）の水溶液を３活性レベル（１０ＥＵ／ｍＬ，１ＥＵ／ｍＬおよび０．１ＥＵ／ｍＬ）についても同様の操作を行い、ゲル化時間の２回対数およびエンドトキシン活性の１回対数を用いて検量線を作成し、各検体のゲル化時間の２回対数からエンドトキシン活性を求めた。（パイロセップ法によるエンドトキシンの測定：和光純薬工業株式会社製の「エンドトキシン検出用Limulus PS Single Test wako」の使用説明書  参照）
この結果、上記の１０６℃で４０分間加熱処理した脂肪乳剤（Ａ）中にエンドトキシン活性は検出されなかった。なお、上記の「ＥＵ」はエンドトキシン単位を表し、エンドトキシンによるＬＡＬ（Limulus Amebocyte Lysate）のゲル化活性を表す単位である。
【００１５】
次に、前記の脂肪乳剤（Ａ）の調製において、モデル的にエンドトキシンを３ＥＵ／ｍＬを添加し、合成樹脂製の輸液用容器あるいはガラスバイアルに充填し、オートクレーブに入れて１０６℃で４０分間の加熱処理を行った。この脂肪乳剤のエンドトキシン活性をパイロセップ法により測定したところ、エンドトキシン活性が検出されなかった。
実施例２
実施例１において、脂肪乳剤（Ａ）の調製において、モデル的にエンドトキシンを３ＥＵ／ｍＬを添加し、合成樹脂製の輸液用容器あるいはガラスバイアルに充填し、オートクレーブに入れて１２１℃で２０分間の加熱処理を行った。この脂肪乳剤のエンドトキシン活性をパイロセップ法により測定したところ、エンドトキシン活性が検出されなかった。
【００１６】
実施例３
精製卵黄レシチン（旭化成工業製）を注射用蒸留水（大塚製薬製）に分散させ、１５分間超音波処理を行ってリポソームを調製した。この調製時に、モデル的に１９０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンを添加したリポソーム製剤をガラスバイアルに充填し、オートクレーブに入れて１０６℃で４０分間加熱処理を行った。このリポソーム製剤中のエンドトキシン活性をパイロセップ法により測定したが、検出されなかった。
【００１７】
実施例４
実施例１において、脂肪乳剤（Ａ）の代わりに、市販の脂肪乳剤「イントラリポス」（大塚製薬製）を用いて、モデル的にエンドトキシンを５ＥＵ／ｍＬを添加し、合成樹脂製の輸液用容器あるいはガラスバイアルに充填し、オートクレーブに入れて１０６℃で４０分間の加熱処理を行った。この脂肪乳剤について、加熱処理前のエンドトキシン活性をパイロセップ法により測定したところ４ＥＵ／ｍＬであったが、加熱処理後はエンドトキシン活性が検出されなかった。
【００１８】
実施例５
実施例３において、リポソーム製剤として市販の小容量リポソーム製剤「リプル」（三菱ウェルファーマ社製）を用いて、モデル的に５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンを添加したリポソーム製剤をガラスバイアルに充填し、オートクレーブに入れて１０６℃で４０分間加熱処理を行った。このリポソーム製剤について、加熱処理前のエンドトキシン活性をパイロセップ法により測定したところ４ＥＵ／ｍＬであったが、加熱処理後はエンドトキシン活性が検出されなかった。
【００１９】
比較例１
実施例１における脂肪乳剤（Ａ）の調製において、モデル的にエンドトキシンを３ＥＵ／ｍＬを添加し、合成樹脂製の輸液用容器あるいはガラスバイアルに充填し、恒温水槽に入れて９０℃で６０分間の加熱処理を行った。この脂肪乳剤のエンドトキシン活性をパイロセップ法により測定したところ、２．５ＥＵ／ｍＬの活性が検出された。
【００２０】
比較例２
実施例１における脂肪乳剤（Ａ）の調製において、モデル的にエンドトキシンを３ＥＵ／ｍＬを添加し、合成樹脂製の輸液用容器あるいはガラスバイアルに充填し、オートクレーブに入れて１２９℃で６０分間の加熱処理を行った。この脂肪乳剤のエンドトキシン活性をパイロセップ法により測定したところ活性が検出されなかったが、着色および凝集が起こり輸液用脂肪乳剤として不適当であった。
【００２１】
比較例３
アミノ酸輸液を調製するために、輸液１５０ｍＬ当たり、表１に示すアミノ酸および第二燐酸カリウムを含むように、注射用蒸留水（大塚製薬製）に溶解した。この調製時に、モデル的に９ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンを添加し、合成樹脂製の輸液用容器あるいはガラスバイアルに充填し、オートクレーブに入れて１０６℃で４０分間加熱処理を行った。この溶液中のエンドトキシン活性をパイロセップ法により測定したところ、７ＥＵ／ｍＬの活性が検出された。
【００２２】
【表１】
2004155771.tif 000002
【００２３】
比較例４
糖輸液を調製するために、輸液３５０ｍＬ当たり、表２に示すグルコースをはじめとする成分を含むように、注射用蒸留水（大塚製薬製）に溶解した。この調製時に、モデル的に５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンを添加し、オートクレーブを用いて１０６℃で４０分間加熱処理を行った。この溶液中のエンドトキシン活性をパイロセップ法により測定したところ、２ＥＵ／ｍＬの活性が検出された。
【００２４】
【表２】
2004155771.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明によると、極めて簡易な方法により、エンドトキシン活性の認められない脂肪乳剤またはリポソーム製剤が提供される。