(57)【要約】【課題】ビタミンＡの安定的でかつ再現性のよい正確な定量分析法を提供すること。【解決手段】ビタミンＡ、その誘導体およびカロテノイドの高速液体クロマトグラフィー分析法であって、移動相に酸化防止剤（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、２−＆３−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ｔ−ブチルハイドロキノン（ＴＢＨＱ）、エトキシキンなど。）を添加し、分析カラム温度を約１０℃から約−２０℃に保持して分析することを特徴とする分析法、酸化防止剤は通常、１０〜１０００ｐｐｍ添加する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＡ、その誘導体およびカロテノイドの高速液体クロマトグラフィー分析法であって、移動相に酸化防止剤を添加し、分析カラム温度を約１０℃から約−２０℃に保持して分析することを特徴とする分析法。
【請求項２】
移動相中の酸化防止剤の濃度が１００〜５００ｐｐｍである請求項１に記載の分析法。
【請求項３】
酸化防止剤が、３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）である請求項１または２に記載の分析法。
【請求項４】
ビタミンＡ誘導体が、ビタミンＡアセテートである請求項１、２または３に記載の分析法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、飼料添加物、食品添加物の分野などで重要なビタミンＡ、その誘導体およびカロテノイドの高速液体クロマトグラフィーを用いる分析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビタミンＡ、その誘導体およびカロテノイドの高速液体クロマトグラフィー（以下，ＨＰＬＣと略す。）による異性体分析および定量分析の方法は、知られている（例えば、非特許文献１など）。しかしながら、ビタミンＡ、その誘導体およびカロテノイドはその特異な化学構造から酸素、光、熱に極めて不安定であり、それらの安定的でかつ再現性のよい正確な定量分析には熟練と工夫を要する。工夫のひとつとして、ＨＰＬＣでの分析中に酸化防止剤（ＢＨＴ，ＢＨＡ）を１５分毎に注入する方法が知られている（非特許文献２など。）。
【０００３】
【非特許文献１】
ビタミン学実験法［Ｉ］  日本ビタミン学会編、東京化学同人、Ｐ．５〜Ｐ．３３
【非特許文献２】
Ｊ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｖｏｌ．８３，  ４４７−４５３（１９７３）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、１５分毎に注入するのは極めて煩雑であり実用的ではない。
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、ＨＰＬＣの分析カラムを１０℃以下に冷却し、移動相に酸化防止剤を添加することで安定的かつ再現性のよい分析が可能であることを見出し、本発明に至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、ビタミンＡ、その誘導体およびカロテノイドの高速液体クロマトグラフィー分析法であって、移動相に酸化防止剤を添加し、分析カラム温度を約１０℃から約−２０℃に保持して分析することを特徴とする分析法を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明におけるビタミンＡとは、ビタミンＡアルコールを示し、全ての異性体を含む。例えばａｌｌ−ｔｒａｎｓ体、１３−ｃｉｓ体、１１−ｃｉｓ体、９−ｃｉｓ体、１１，１３−ｃｉｓ体、９，１３ｃｉｓ体、９，１１−ｃｉｓ体、ｒｅｔｒｏ体などが挙げられる。ビタミンＡ誘導体とは、ビタミンＡアセテート、ビタミンＡパルミテート、ビタミンＡステアレート、ビタミンＡラウレート、ビタミンＡミリステート、ビタミンＡリノレエート、ビタミンＡ酸、ビタミンＡアルデヒド、アンヒドロビタミンＡなどが挙げられ、これらのシス−トランスの異性体全てを示す。
カロテノイドとは、β−カロチン、α−カロチン、γ−カロチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、リコペン、β−クリプトキサンチン、フコキサンチン、カプサンチンなどが挙げられ、これらの位置、および立体異性体全てを示す。
【０００７】
本発明における最適なＨＰＬＣ分析カラムは分析対象となる化合物によって異なる。ビタミンＡおよびその誘導体の場合、特に限定されないが、高純度（９９．９９％以上）で粒度分布の狭い球状シリカゲルを用いた順相用カラムが好ましい。
【０００８】
本発明では、分析カラムを冷却することによって熱に不安定なビタミンＡおよびその誘導体およびカロテノイドを安定的に分析することができる。その冷却温度は約１０℃以下が好ましく、下限は通常、約−２０℃である。より好ましくは５℃以下である。冷却方法としては冷却機能付カラムオーブンがすでに市販されており、それらを用いればよい。例えばＧＬサイエンス社製ＬＣカラムオーブン  ＭＯＤＥＬ５５７などが挙げられる。
【０００９】
本発明では、移動相に酸化防止剤を添加することによって、酸化されやすいビタミンＡ、その誘導体およびカロテノイドを安定的に分析することができる。添加する酸化防止剤としては、例えば３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、２−＆３−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ｔ−ブチルハイドロキノン（ＴＢＨＱ）、エトキシキンなどが挙げられる。
好ましくはＢＨＴが挙げられる。
該酸化防止剤の移動相中の濃度は通常、１０〜１０００ｐｐｍ程度、好ましくは１００〜５００ｐｐｍ程度、さらに好ましくは２００〜５００ｐｐｍ程度である。また、該酸化防止剤はＨＰＬＣの測定試料を溶解する溶媒中にも添加するのが好ましい。
【００１０】
【発明の効果】
かくして本発明の方法によれば、医薬、飼料添加物、食品添加物として重要なビタミンＡ、その誘導体およびカロテノイドを高速液体クロマトグラフィーを用いて、安定的にかつ再現性よく分析することができる。
【００１１】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
（実施例１）  分析カラム温度の影響
［分析方法］：ビタミンＡアセテート（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体）試料約５０ｍｇを５０ｍｌ容メスフラスコに精密に量り、溶解溶媒１）を加えて完全に均一になった後に定容した。この溶液５ｍｌをホールピペットを用い２０ｍｌ容メスフラスコに正確に加えた。さらに内標準溶液２）を１０ｍｌのホールピペットを用い正確に加えた後、溶解溶媒（１）にて定容し、よく混合した。これをＨＰＬＣ試料溶液とした。
１）溶解溶媒：  １００ｍｌ容メスフラスコに３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）約５００ｍｇを正確に量り、イソプロピルアルコールを加えて、完全に均一になった後に定容した。これを溶解溶媒とした。
２）内標準溶液：  １００ｍｌ容のメスフラスコにフルオランテン（内標準物質）約１００〜５００ｍｇを正確に量り、溶解溶媒（１）を加え、完全に均一になった後に定容した。これを内標準溶液とした。
［ＨＰＬＣ測定条件］
装置名：島津ＬＣ−１０ＡＴ型
カラム：ナカライテスク社製  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５ＳＬ−ＩＩ  （４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ，  ５μｍ）
カラム温度：−１０℃、０℃、５℃、７℃、１０℃、２０℃、２５℃
移動相３）：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／ＢＨＴ＝９９．５／０．５／０．０２５
移動相流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ．
ＵＶ検出波長：３３０ｎｍ
試料注入量：１μｌ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）
定量法：内標準法（ＩＳ：フルオランテン）
３）移動相：  ｎ−ヘキサン１９９０ｍｌに３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）５００ｍｇ、酢酸エチル１０ｍｌをホールピペットを用いて加え、よく混合し、溶液を均一にした。これを移動相とした。
上記分析方法でビタミンＡアセテート（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ体）試料を各カラム温度で５回分析し、各温度におけるビタミンＡアセテートの面積値と内標準物質の面積値との比の平均値を算出し、グラフにプロットした（内標準物質の濃度は３．９ｍｇ／ｍｌ）（結果を図１に示す。）。図１のグラフから明らかなように１０℃以下では面積比にあまり変化は見られないが、２０℃以上では面積比は大きく低下し、ビタミンＡアセテートが分解していることがわかる。
【００１２】
（実施例２）  酸化防止剤（ＢＨＴ）の影響
移動相および溶解溶媒中の酸化防止剤（ＢＨＴ）濃度を下表の如く変え、カラム温度を５℃とする以外は、実施例１と同様の分析条件により１０回連続分析し、面積比（ビタミンＡアセテート／ＩＳ）の相対標準偏差（ＣＶ値）を算出した。（内標準物質の濃度は１．０ｍｇ／ｍｌ）
【表１】
2004233312.tif 000002
上記表より、（１）移動相にも溶解溶媒にもＢＨＴを加えない場合、ＣＶ値は４．０となりばらつきが大きく再現性が悪いことが分かる。（２）移動相にＢＨＴを２５０ｐｐｍ加えた場合、ＣＶ値は２．７となりばらつきが抑制され再現性がみられる。（３）移動相に２５０ｐｐｍ、溶解溶媒に５０００ｐｐｍのＢＨＴを加えた場合、ＣＶ値は０．４となり極めて再現性が高いことがわかる。
【００１３】
（実施例３）  酸化防止剤（ＢＨＴ）の影響
移動相中の酸化防止剤（ＢＨＴ）濃度を５０ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、１０００ｐｐｍに変え、カラム温度を５℃とする以外は、実施例１に準じた分析条件により７回分析し、面積比（ビタミンＡアセテート／ＩＳ）の平均値を算出し、グラフにプロットした（内標準物質の濃度は１．０ｍｇ／ｍｌ）（結果を図２に示す。）。
図２のグラフより移動相中の酸化防止剤（ＢＨＴ）の添加量は５０ｐｐｍよりも２５０ｐｐｍの方がビタミンＡアセテートの分解が抑制されていることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】実施例３の結果を示すグラフである。
【図１】
2004233312.tif 000003
【図２】
2004233312.tif 000004