(57)【要約】【課題】ＥＳ細胞から質的に安定したＥＢを簡便に、かつ効率よく形成することが可能な胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器及び培養方法を提供しようとするものである。【解決手段】容器の材質をポリプロピレンとして培養中にＥＳ細胞が容器に付着することを避けるとともに、容器の形状を細胞が一か所に集合させやすいように容器の径が下にいくほど小さくなるコニカル型（円錐形）としてその底部には丸みを持たせ、ＥＳ細胞を容器内で細胞集塊が形成された状態で培養可能とすることにより、効率よくＥＢを形成させることができるようにしたことを特徴とする胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器の材質をポリプロピレンとして培養中にＥＳ細胞が容器に付着することを避けるとともに、容器の形状を細胞が一か所に集合させやすいように容器の径が下にいくほど小さくなるコニカル型（円錐形）としてその底部には丸みを持たせ、ＥＳ細胞を容器内で細胞集塊が形成された状態で培養可能とすることにより、効率よくＥＢを形成させることができるようにしたことを特徴とする胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器。
【請求項２】
材質がポリプロピレン製で、かつ形状が細胞を一か所に集合させやすいように容器の径が下にいくほど小さくなるコニカル型（円錐形）であり、その底部には丸みを持たせた容器を用い、ＥＳ細胞が容器内に付着することを避けながら、ＥＳ細胞を容器内で細胞集塊が形成された状態で培養することにより、効率よくＥＢを形成させることができるようにしたことを特徴とする胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】この発明は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のために使用される培養容器及び培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】胚性幹細胞（以下ＥＳ細胞という）を培養して胚様体（以下ＥＢという）を形成する際には、従来、「ハンギングドロップ法」と呼ばれる培養法が用いられてきた。
通常ハンギングドロップ法は、図６に示すように、例えば９６ｗｅｌｌのポリスチレン製マルチウエルプレート（ディッシュ）２１を用い、以下のような手順で行われる。マルチウエルプレート２１の各ｗｅｌｌ２２には緩衝液２３を約１３０μｌとミネラルオイル２４とを約２００μｌを満たす。各ｗｅｌｌ２２に対応する位置の蓋２５側に、ＥＳ細胞（１０００個）を含む培地２６を約５０μ１を液滴となるようにたらす。この液滴が表面張力で蓋に張り付くことを利用して、マルチウエルプレート２１に上記蓋２５をかぶせて、静かに培養を行っている。
しかしながら以上の操作は煩雑な上に、９６個の各ｗｅｌｌ２２の条件が一定にならないという問題点がある。このため、得ようとするＥＢ２７の形成率が低く、また形成されるＥＢ２７の質も不安定である。
【０００３】
【特許文献】参考になるものは特になし。
【０００４】
【非特許文献】参考になるものは特になし。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、ＥＳ細胞からＥＢを形成させるための培養法であるハンギングドロップ法は、操作が煩雑な上にＥＢの形成率が低いという問題点がある。また、形成されたＥＢの質も不安定である。このため、その後のＥＢの分化の程度が不均一になりやすい。本発明は、ＥＳ細胞から質的に安定したＥＢを簡便に、かつ効率よく形成することが可能な胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器及び培養方法を提供しようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】すなわちこの発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器は、容器の材質をポリプロピレンとして培養中にＥＳ細胞が容器に付着することを避けるとともに、容器の形状を細胞が一か所に集合させやすいように容器の径が下にいくほど小さくなるコニカル型（円錐形）としてその底部には丸みを持たせ、ＥＳ細胞を容器内で細胞集塊が形成された状態で培養可能とすることにより、効率よくＥＢを形成させることができるようにしたことを特徴とするものである。
【０００７】また、この発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養方法は、材質がポリプロピレン製で、かつ形状が細胞を一か所に集合させやすいように容器の径が下にいくほど小さくなるコニカル型（円錐形）であり、その底部には丸みを持たせた容器を用い、ＥＳ細胞が容器内に付着することを避けながら、ＥＳ細胞を容器内で細胞集塊が形成された状態で培養することにより、効率よくＥＢを形成させることができるようにしたことをも特徴とするものである。
【０００８】ＥＳ細胞によるＥＢの形成は酸素供給条件により影響を受けやすいため、一般的に細胞培養で用いられる酸素分圧（２０％）下であっても、酸素供給が過剰となり、ＥＢが形成されないことがある。このことが上記ハンギングドロップ法におけるＥＢ形成率低下の一因になっていると思われる。
【０００９】一方、この発明における培養容器は、ポリプロピレンを材質とするコニカル型の形状をしている。すなわち、上記容器の材質をとしてポリプロピレンを用いることにより培養中にＥＳ細胞が容器に付着することを避けることができ、また容器の形状を細胞が一か所に集合させやすいように容器の径が下にいくほど小さくなるコニカル型（円錐形）とし、その底部には丸みを持たせてあるので、ＥＳ細胞を容器内で細胞集塊が形成された状態で培養可能であり、非常に効率よくＥＢを形成させることができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下この発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器及び培養方法の実施の形態を図面に基いて詳細に説明する。
図１はこの発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器の要部を説明するための説明図、図２はその全体の概要を示す斜視図、図３はその概略断面図である。
【００１１】図１ないし図３はこの発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器を示すものである。
＜培養容器の材質＞
ＥＳ細胞を培養してＥＢを形成させるには、培養中にＥＳ細胞が培養容器に付着することを避けなければならない。このため、培養容器の材質をポリプロピレンとしている。
＜培養容器の形状＞
培養容器の形状は、図１に示すようにスクリュー式の蓋１２を有する丸底（Ｒ＝２ｍ）１３の底部構造のコニカル型の円筒状チューブ（全容量は約１．５ｍｌ  以下コニカルチューブという）１１を各単位ｗｅｌｌとすることができる。また培養容器の全体図は、図２及び図３のように、例えば９６ｗｅｌｌのマルチウエルプレート１０である。
【００１２】そして、この９６ｗｅｌｌのマルチウエルプレート１０におけるコニカルチューブ１１からなる各ｗｅｌｌは、一度に多くの試料を扱う際の操作を簡便化するために、蓋の部分を上記スクリュー式ではなく、図３のように単に突起物１５を所定の間隔に配置した蓋１４によって各ｗｅｌｌの開口部１６を塞ぐ形式としてもよい。
【００１３】ただし、開口部１６を完全に塞ぐと全く通気が遮断されて酸素が細胞に供給されなくなるので、突起物１５の径は図３のように開口部１６よりも僅かに小さく設計されている。この突起物１５により、過剰な酸素供給を抑えることができる。他方、スクリュー式の蓋１２を有するコニカルチューブ１１では、通気口を確保するためにネジ一周分ほど蓋１２を緩めて培養する。この操作により、適量の酸素が細胞に供給される。
【００１４】より具体的に培養容器の形状について説明すると、ＥＳ細胞がＥＢとなるには、細胞集塊が形成されなければならない。すなわち、細胞が一所に集合して集塊を形成しやすいように、培養容器の形状をコニカル型の円筒状チューブ、すなわちコニカルチューブ１１とし（全容量は約１．５ｍｌ）、その開口部１６にはスクリュー式の蓋１２を取り付けている（図１参照）。１８は自立スタンドである。また開口部１６の直径は１０ｍｍ、底部はＲ＝２ｍｍの丸底１３で、深さは３０〜４０ｍｍであることが望ましい。コニカルな形状を有している部分は、培養容器の底部から１５〜２０ｍｍの範囲である。すなわち、培養容器の上半分は容器径が１０ｍｍの円筒となっている。これにより、細胞同士の接触度合いが高まり、細胞集塊が形成されやすくなる。
【００１５】また、培養容器が多数のサンプルを取扱う場合には、コニカルチューブ１１をラック１９に収納して用いる（図２参照）。このとき、個々のコニカルチューブ１１にスクリュー式の蓋１２が取り付けられていると取り扱いにくいので、シーリングマット１７の片面に所定の間隔に突起物１５を配置した蓋１４を用意し、一括して蓋１４の着脱が可能なようにしてある。上記シーリングマット１７の材質としてはシリコンゴム製が望ましく、その厚さは約０．５ｍｍであればよい。
【００１６】
＜酸素供給の制御＞
ＥＳ細胞は、一般的に細胞培養で用いられる通常の酸素分圧（２０％）を与えても酸素供給が過剰となり、ＥＢが形成されないことがある。したがって、培養容器がスクリュー式の蓋１２を有する場合は、蓋１２の緩め具合を調節することにより、細胞に適量の酸素を供給することができる。シリコンゴム製のシーリングマット１７の片面に所定の間隔に突起物１５を配置した蓋１４においては、シリコンゴムが酸素透過性を有しているので、これで完全に開口部１６をシールしても適度な酸素供給が期待できる。
【００１７】この発明における培養容器は、ポリプロピレンを材質とし、蓋１２もしくは１４を有する丸底（Ｒ＝２ｍｍ）のコニカルチューブ１１である。この培養容器を使用してＥＳ細胞を培養するに当たっては、コニカルチューブ１１内に濃度（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）で懸濁したＥＳ細胞を１ｍｌ入れる。ＥＳ細胞に適量の酸素が供給されるよう、スクリュ−式の蓋１２を完全に閉め切らずネジ１周分ほど緩め、炭酸ガスインキュベーター（温度３７℃）内で培養する。炭酸ガスインキュベーターの庫内のガス組成は、一般的に用いられている細胞の培養条件である、２０％酸素−５％炭酸ガスとする。そしてそのまま、５日間培養するとＥＢが形成される。
【００１８】
【実施例】
マウスＥＳ細胞を培養してその胚様体（ＥＢ）を形成させる方法について述べる。
１．培地の調製
Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ  ７６ｍｌに対して、非働化牛胎児血清２０ｍｌ，ＭＥＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １ｍｌ，ＭＥＭ  ｎｏｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １ｍｌ，β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ  ０．８μｌ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−  Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ  ０．５ｍｌを加え、総量１００ｍｌのＥＢ形成用培地を作製する。
２．ＥＳ細胞懸濁液
ＳＴＯ（繊維芽）細胞をフィーダーとしてシャーレ面に敷き、このフィーダー上にて定法に従い培養したマウスＥＳ細胞を酵素処理（０．１％  Ｔｒｙｐｓｉｎ）で剥がし、所定個数を回収した後、遠心分離によって酵素溶液を除去する。ここに、ＥＳ細胞の濃度（密度）が２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＥＢ形成用培地を加え、良く懸濁する。
そしてこの懸濁液をＥＢ形成用の培養容器に播種して培養するのである。
３．ＥＢ形成培養の条件
スクリュー式の蓋１２を有する丸底（Ｒ＝２ｍｍ）１３のコニカルチューブ１１に、上述のＥＳ細胞の懸濁液１ｍｌを播種し、２０％酸素−５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃で５日間静置培養する。通気口を確保するためにスクリュー式の蓋１２をネジ一周分ほど緩めておく。
５日後、図４（ａ），（ｂ）に示したようなＥＢが形成される。形成されたＥＢを、分化を促す条件に移して培養すると、速やかに図５に示す心筋などに分化するのが認められた。
【００１９】
【比較例】ＥＢ形成のための一般的な培養法であるハンギングドロップ法と本発明の培養法を表１に基いて比較する。
【表１】
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【００２０】
【発明の効果】
ＥＢ形成のための一般的な培養法であるハンギングドロップ法とこの発明の培養法を比較すると、ハンギングドロップ法ではポリスチレンの９６  ｗｅｌｌマルチウエルプレートが用いられることによって、ＥＳ細胞が容器に付着するのを防ぐため、各ｗｅｌｌに緩衝液１３０μｌとミネラルオイル２００μｌをあらかじめ入れておき、ここに細胞懸濁液を播種する必要があった。
しかしながら、この方法は、図６に示したように極めて煩雑で、操作に熟練を要する。なおハンギングドロップ法でのＥＢ形成率は約８０％であり、ＥＢ形成に要する培養日数は７日間である。
【００２１】他方、この発明の培養法では、容器がポリプロピレン製であるために細胞接着が弱く、オイルを用いなくても細胞が容器に付着することがないので細胞懸濁液を直接培養容器に播種することができる。またこの発明の培養法のＥＢ形成率は９９％、必要培養日数は５日間である。すなわち、短期間でＥＢを高効率で形成することが可能となった。
【００２２】その他、この発明の培養法に特徴的なことは、ＥＢ形成可能な細胞数の範囲が広いことである。すなわち、この発明の培養法では容器（ｗｅｌｌ）当たり、２×１０４〜２×１０５個の細胞を培養してＥＢを形成させることができるのに対し、ハンギングドロップ法では各ｗｅｌｌ当たりの培養可能な細胞数は１０３個である。すなわち、この発明の培養法ではより多くの細胞が集塊することによりＥＢが形成されるので、より大きなサイズのＥＢが形成できる。このことは、その後ＥＢを分化させて、特定の組織を形成させる際に極めて有利に作用する。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の胚様体（ＥＢ）形成のための培養容器の要部を説明するための説明図である。
【図２】その全体の概要を示す斜視図である。
【図３】その概略断面図である。
【図４】（ａ），（ｂ）は形成されたＥＢを示す。
【図５】形成されたＥＢを、分化を促す条件に移して培養して得た心筋を示す。
【図６】ＥＳ細胞を培養してＥＢを形成する際に用いられてきた、従来の「ハンギングドロップ法による培養法の説明図である。
【符号の説明】
１０  マルチウエルプレート
１１  コニカルチューブ
１２  スクリュー式の蓋
１３  丸底
１４  蓋
１５  突起物
１６  開口部
１７  シーリングマット
１８  自立スタンド
１９  ラック
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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