(57)【要約】【課題】固相合成用樹脂【解決手段】　（ｉ）２−クロロトリチルクロリド基により官能基化され、（ｉｉ）Ｌｅｕにより０．６５ミリモル／ｇまでカップリングされ、そして（ｉｉｉ）Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）によりカップリングされる場合に、１．５当量のＨＯＢＴ、１．５当量のＤＩＥＡおよび１．５当量のＨＢＴＵの存在下Ｋａｉｓｅｒ試験で定量して１．５当量の量のＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−ＯＨのカップリングが３５分以内に完結することが可能である架橋ポリマービーズ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　（ｉ）２−クロロトリチルクロリド基により官能基化され；
　（ｉｉ）Ｌｅｕにより０．６５ミリモル／ｇまでカップリングされ；そして
　（ｉｉｉ）Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）によりカップリングされる場合に、
１．５当量のＨＯＢＴ、１．５当量のＤＩＥＡおよび１．５当量のＨＢＴＵの存在下Ｋａｉｓｅｒ試験で定量して１．５当量の量のＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−ＯＨのカップリングが３５分以内に完結することが可能である架橋ポリマービーズ。
【請求項２】
　該ビーズがスチレンポリマーである請求項１のビーズ。
【請求項３】
　（ａ）該ビーズを第１の溶媒あるいは溶媒混合物中で乾燥時の容積の２００％〜３１０％の容積まで膨潤させ；そして
　（ｂ）該ビーズを乾燥時の容積の２００％〜３１０％の容積まで膨潤させる能力のある第２の溶媒または溶媒混合物中で該ビーズを官能基化剤と接触させる
ことを含む方法により製造される官能基化された架橋ポリマービーズ。
【請求項４】
　該ビーズが架橋体から誘導されるモノマー残基を０．５モルパーセント〜１．５モルパーセント有するスチレンポリマーである請求項３の官能基化された架橋ポリマービーズ。
【請求項５】
　該ビーズが乾燥時の容積の２２０％〜３００％の容積まで膨潤され；そして該ビーズが乾燥時の容積の２２０％〜３００％の容積まで膨潤させる能力のある第２の溶媒または溶媒混合物中で官能基化剤と接触される請求項４の官能基化された架橋ポリマービーズ。
【請求項６】
　該官能基化されたビーズが０．２５から０．７ミリ当量／ｇのアミノ酸により装填される請求項５の官能基化された架橋ポリマービーズ。
【請求項７】
　該ビーズを乾燥時の容積の２００％〜４００％の容積まで膨潤させる能力のある溶媒または溶媒混合物中で、乾燥時の容積の１００％〜２００％の容積で該ビーズを官能基化剤と接触させることにより製造される官能基化された架橋ポリマービーズ。
【請求項８】
　該ポリマーが該官能基化剤と接触される場合、乾燥時の容積の１００％から１５０％の容積にある請求項７の官能基化された架橋ポリマービーズ。
【請求項９】
　該ビーズが架橋体から誘導されるモノマー残基を０．５モルパーセント〜１．５モルパーセント有するスチレンポリマーである請求項７の官能基化された架橋ポリマービーズ。
【請求項１０】
　該溶媒あるいは溶媒混合物がニトロベンゼンを含む請求項８又は９の官能基化された架橋ポリマービーズ。
【請求項１１】
　該官能基化されたビーズが０．２５から０．７ミリ当量／ｇのアミノ酸により装填される請求項１０の官能基化された架橋ポリマービーズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、固相合成における担体として有用な官能基化されたポリマー樹脂に関する。本発明は、また、このような樹脂を製造する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
　軽く架橋された樹脂は、アミノ酸からポリペプチドを製造するなどの固相有機合成法用の固体担体としての著しい有用性を見出した。このような樹脂は通常３パーセント未満で架橋されている。この樹脂上の官能基への接近しやすさは、収率、動力学、使用原料、および製品純度を左右するので、固相合成において極めて重要である。この樹脂架橋を低下させることによって、この樹脂の膨潤能力が増大し、官能基への接近しやすさが増大することができる。例えば、Ｓ．Ｒａｎａら、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｒｅｓｉｎ　Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇｏｎ　Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．，２００１，３，９−１５を見られたい。しかしながら、この方法では、加工困難な柔らかい樹脂が生成し、樹脂床で大きな容積が必要となる。
【０００３】
【非特許文献１】Ｓ．Ｒａｎａら著、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｒｅｓｉｎ　Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇｏｎ　Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、３，９−１５ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
　本発明が取り組む問題は、高度な膨潤をせずに接近することができる官能基を有する固相合成用架橋ポリマー担体を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
　本発明は、（ｉ）２−クロロトリチルクロリド基により官能基化され、（ｉｉ）Ｌｅｕにより０．６５ミリモル／ｇまでカップリングされ、そして（ｉｉｉ）Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）によりカップリングされ、１．５当量のＨＯＢＴ、１．５当量のＤＩＥＡおよび１．５当量のＨＢＴＵの存在下、Ｋａｉｓｅｒ試験で定量して１．５当量の量のＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−ＯＨのカップリングが３５分以内に完結することが可能である架橋ポリマービーズを提供する。
【０００６】
　本発明は、（ａ）このビーズを第１の溶媒あるいは溶媒混合物中で乾燥時の容積の２００％〜３１０％の容積まで膨潤させ、そして（ｂ）このビーズを乾燥時の容積の２００％〜３１０％の容積まで膨潤させる能力のある第２の溶媒または溶媒混合物中で官能基化剤と接触させることを含む方法により製造される官能基化された架橋ポリマービーズを更に提供する。
【０００７】
　本発明は、乾燥時の容積の２００％〜４００％の容積まで膨潤させる能力のある溶媒または溶媒混合物中で、乾燥時の容積の１００％〜２００％の容積でこのビーズを官能基化剤と接触させることにより製造される官能基化された架橋ポリマービーズを更に提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
　特記しない限り、パーセントは重量パーセントである。本明細書で使用するように、用語「（メタ）アクリル」はアクリルまたはメタクリルを示す。用語「ビニルモノマー」は、付加重合に好適で、単一の重合性の炭素−炭素二重結合を含有するモノマーを示す。用語「スチレンポリマー」は、全モノマー重量基準で少なくとも５０重量パーセントのスチレンモノマーを少なくとも１つの架橋体と共に含有する、ビニルモノマーまたはビニルモノマーの混合物から重合されるコポリマーを示す。好ましくは、スチレンポリマーは、少なくとも７５％のスチレン、更に好ましくは少なくとも９０％のスチレンであるモノマーの混合物から、そして最も好ましくは本質的にスチレンと少なくとも１種のビニル芳香族架橋体からなるモノマーの混合物から製造される。本発明で出発材料として使用されるポリマービーズは、１個の共重合性の炭素−炭素二重結合を有する少なくとも１つのモノマーと少なくとも１つの架橋体からのモノマー残基を含有する。この架橋体から誘導されるモノマー残基は、すべてのモノマー残基の合計基準で０．５モルパーセント〜１．５モルパーセントである。好ましくは、架橋体の量は、０．７〜１．３モルパーセント、更に好ましくは０．７〜１．２モルパーセント、そして最も好ましくは０．８〜１．２モルパーセントである。
【０００９】
　本発明で出発材料として使用されるポリマービーズは、好ましくは２００ミクロン（μｍ）以下の、好ましくは１７０μｍ以下の、更に好ましくは１５０μｍ以下の、更に好ましくは１２５μｍ以下の、そして最も好ましくは１００μｍ以下の粒子直径を有する球状のコポリマービーズである。好ましくは、このビーズは、３μｍ以上の直径を有する空隙を有さず、更に好ましくは２μｍ以上の直径を有する空隙を有さず、そして最も好ましくは１μｍ以上の直径を有する空隙を有しない。通常、このビーズの表面を光学顕微鏡などの手法により検査すれば、空隙は容易に分かる。
【００１０】
　本発明で出発材料として使用されるポリマービーズは、好ましくは懸濁重合により製造される。通常のビーズ製造は、例えば、通常の懸濁助剤、例えば、分散剤、保護コロイドと緩衝剤を含有する連続的な水性相の液の製造を包含してもよい。好ましくは、相対的に小さいビーズを製造するのを助けるために、界面活性剤、好ましくはアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤がこの水溶液中に包含され、重合工程時に激しい攪拌が維持される。この水溶液は、少なくとも１つのビニルモノマー、少なくとも１つの架橋体および少なくとも１つのフリーラジカル開始剤を含有するモノマー混合物と合体される。好ましくは、この合計の開始剤レベルは、全モノマー装填量基準で０．２５モルパーセント〜２モル％、好ましくは０．４モルパーセント〜１．５モルパーセント、更に好ましくは０．４モルパーセント〜１モルパーセント、そして最も好ましくは０．５モルパーセント〜０．８モルパーセントである。次に、モノマーの混合物は高温で重合される。好ましくは、この重合は、未反応ビニルモノマー内容物を出発量の１％未満まで低下させるのに充分な時間継続される。次に、この生成ビーズは、脱水、非プロトン性有機溶媒による洗浄、および乾燥などの従来の手段により単離される。
【００１１】
　架橋体は、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、トリビニルベンゼン、トリビニルシクロヘキサン、ジビニルナフタレン、トリビニルナフタレン、ジエチレングリコールジビニルエーテル、エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、アリルメタクリレート、１，５−ヘキサジエン、１，７−オクタジエンまたは１，４−ビス（４−ビニルフェノキシ）ブタンなどの１分子当たり２個以上の共重合性炭素−炭素二重結合を有するモノマーであり、前述の架橋体の各々の種々の位置異性体のいずれも好適であることは理解される。好ましい架橋体は、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、トリビニルベンゼンまたは１，４−ビス（４−ビニルフェノキシ）ブタンである。最も好ましい架橋体はジビニルベンゼンである。
【００１２】
　本発明で出発材料として使用されるビーズの製造に使用可能な好適なモノ不飽和ビニル芳香族モノマーは、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル置換スチレンおよびビニルナフタレンを包含し、好ましくは１つ以上のモノ不飽和ビニル芳香族モノマーはスチレンと（Ｃ１−Ｃ４）アルキル置換スチレンからなる群から選ばれる。好適な（Ｃｌ−Ｃ４）アルキル置換スチレンのなかに包含されるのは、例えば、エチルビニルベンゼン、ビニルトルエン、ジエチルスチレン、エチルメチルスチレン、ジメチルスチレンおよびビニルベンジルクロリドの異性体であり、前述のビニル芳香族モノマーの各々の種々の位置異性体のいずれも好適であることは理解される。
【００１３】
　場合によっては、このビニル芳香族のモノマーに加えて、脂肪族不飽和モノマー、例えば、アクリロニトリル、グリシジルメタクリレート、（メタ）アクリル酸およびアミドまたは（メタ）アクリル酸のＣ１−Ｃ６アルキルエステルなどの非芳香族ビニルモノマーも使用してもよい。使用する場合には、この非芳香族ビニルモノマーは、通常、このコポリマーの形成に使用される全モノマー重量基準でゼロ〜２０％の、好ましくはゼロ〜１０％の、そして更に好ましくはゼロ〜５％のこのコポリマーを重合単位として含む。
【００１４】
　好ましいビニルモノマーはビニル芳香族モノマーであり、更に好ましくはスチレン、ビニルベンジルクロリドの異性体、およびα−メチルスチレンである。最も好ましいビニルモノマーはスチレンである。
【００１５】
　本発明で有用な重合開始剤は、ペルオキシド、ヒドロペルオキシド、ペルオキシエステルおよび関連の開始剤、例えば、ベンゾイルペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンペルオキシド、テトラリンペルオキシド、アセチルペルオキシド、カプロイルペルオキシド、ｔ−ブチルペルオクトエート（ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエートとしても知られている）、ｔ−アミルペルオクトエート、ｔ−ブチルペルベンゾエート、ｔ−ブチルジペルフタレート、ジシクロヘキシルペルオキシジカーボネート、ジ（４−ｔ−ブチルシクロへキシル）ペルオキシジカーボネートおよびメチルエチルケトンペルオキシドなどのモノマー可溶性開始剤を包含する。アゾジイソブチロニトリル、アゾジイソブチロアミド、２，２’−アゾ−ビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾ−ビス（α−メチル−ブチロニトリル）およびジメチル−、ジエチル−あるいはジブチルアゾ−ビス（メチルバレレート）などのアゾ開始剤も有用である。好ましいペルオキシド開始剤は、ベンゾイルペルオキシドなどのジアシルペルオキシドとｔ−ブチルペルオクトエートおよびｔ−ブチルペルベンゾエートなどのペルオキシエステルである。
【００１６】
　本発明で有用な分散剤と懸濁剤は、ヒドロキシアルキルセルロース骨格、１〜２４個の炭素原子を含有する疎水性アルキル側鎖と、このヒドロキシアルキルセルロース骨格の各繰り返し単位を置換する平均１〜８個の、好ましくは１〜５個のエチレンオキシド基を有し、このアルキル側鎖がヒドロキシアルキルセルロース骨格中の１００個の繰り返し単位当たり０．１から１０個のアルキル基のレベルで存在する非イオン界面活性剤である。このヒドロキシアルキルセルロース中のアルキル基は、１〜２４個の炭素を含有し、線状、分枝状、あるいは環状であってもよい。更に好ましいのは、１００個のアンヒドログルコース単位当たり０．１〜１０個の（Ｃ１６）アルキル側鎖と各アンヒドログルコース単位を置換する約２．５〜４個のエチレンオキシド基を含有するヒドロキシエチルセルロースである。分散剤の通常の使用レベルは、水性相の重量基準で約０．０１〜約４％である。
【００１７】
　場合によっては、このビーズの製造は、酵素処理を包含して、重合の間に使用される分散剤と懸濁剤の残渣をこのポリマー表面から洗い流してもよい。この酵素処理は、通常、重合時、重合後、あるいはこのポリマーの単離後に、このポリマー相を酵素材料（１つ以上のセルロース分解酵素とタンパク質分解酵素から選ばれる）と接触させることを伴う。ポリマー樹脂の製造時の酵素の使用についての更に全般的および具体的な詳細を知るためには、日本特許出願Ｎｏ．６１−１４１７０４およびＮｏ．５７−９８５０４を参考にしてもよい。好適な酵素は、例えば、セルロースベースの分散剤系に対するβ−１，４−グルカン−４−グルカノ−ヒドラーゼ、β−１，４−グルカン−４−グルカンヒドロラーゼ、β−１，４−グルカン−４−グルコヒドラーゼおよびβ−１、４−グルカン−４−セロビオヒドラーゼなどのセルロース分解酵素と、ゼラチンベースの分散剤系に対するウロキナーゼ、エラスターゼおよびエンテロキナーゼなどのタンパク質分解酵素を包含する。通常、このポリマーに対して使用される酵素の量は、ポリマーの全重量基準で２〜３５％、好ましくは５〜２５％、そして更に好ましくは１０〜２０％である。
【００１８】
　本発明の方法においては、この架橋ポリマービーズの膨潤は、官能基化時にビーズが部分的に膨潤するように制御される。理論により束縛されることを意図するのではないが、部分的に膨潤したビーズを官能基化する効果は、結合官能基の位置をビーズの表面に相対的に近接した領域に制約することである。好ましくは、官能基化が起こる時に、このポリマービーズは、乾燥時の容積の少なくとも２００％、更に好ましくは少なくとも２１０％、更に好ましくは少なくとも２２０％、更に好ましくは少なくとも２３０％、そして最も好ましくは少なくとも２４０％まで膨潤させる。好ましくは、このビーズは、乾燥時の容積の少なくとも３１０％以下、更に好ましくは少なくとも３００％以下、更に好ましくは少なくとも２９０％以下、そして最も好ましくは少なくとも２８０％以下まで膨潤させる。官能基化時に所望の膨潤度を達成するいくつかの異なる手段がある。
【００１９】
　本発明の一つの実施形態においては、ビーズは予備膨潤させない（すなわち、乾燥時の容積の１００％）か、あるいは乾燥時の容積の２００％以下の容積まで予備膨潤させたビーズが、乾燥時の容積の２００％、更に好ましくは少なくとも２１０％、更に好ましくは少なくとも２２０％、更に好ましくは少なくとも２３０％、そして最も好ましくは少なくとも２４０％までこのビーズを膨潤させる能力のある溶媒または溶媒混合物中で官能基化剤と接触される。好ましくは、この溶媒または溶媒混合物は、このビーズを乾燥時の容積の４００％以下、更に好ましくは３７０％以下、更に好ましくは３４０％以下、そして最も好ましくは３２０％以下まで膨潤させる能力がある。好ましくは、このビーズは、１５０％以下、更に好ましくは１００％以下、更に好ましくは８０％以下、更に好ましくは６０％以下、そして最も好ましくは４０％以下まで予備膨潤される。一つの実施形態においては、このビーズは予備膨潤せずに乾燥状態で使用される。
【００２０】
　本発明のもう一つの実施形態においては、このビーズは、乾燥時の容積の少なくとも２００％、更に好ましくは少なくとも２１０％、更に好ましくは少なくとも２２０％、更に好ましくは少なくとも２３０％、そして最も好ましくは少なくとも２４０％までこのビーズを膨潤させる溶媒または溶媒混合物中で予備膨潤される。好ましくは、このビーズは、乾燥時の容積の少なくとも３１０％以下、更に好ましくは少なくとも３００％以下、更に好ましくは少なくとも２９０％以下、そして最も好ましくは少なくとも２８０％以下まで膨潤させる。予備膨潤後、このビーズは、上述の限度内でこのビーズを膨潤させる能力のある溶媒または溶媒混合物中で官能基化剤と接触される。最も好ましくは、予備膨潤と官能基化に使用される溶媒または溶媒混合物は同一である。
【００２１】
　官能基化剤は、このビーズを構成するポリマーに共有結合により官能基を結合させるものである。固相合成用担体としてこのビーズの有用性を最大とするためには、官能基の更なる精致な反応が必要である。しかしながら、この官能基の初期の結合は、官能基化されるビーズの領域を決め、このようにしてビーズが固相合成用基質と反応し、そして合成製品の回収を可能とする能力を左右する傾向がある。スチレンポリマーに対しては、この官能基化は、通常、この芳香族環上のフリーデル−クラフツ置換、好ましくはアシル化、ブロム化、またはハロメチル化である。初期の官能基の引き続く精致な反応が通常行われる。例えば、しばしば、アロイルハライドによるアシル化に続いて、この生成物のカルボニル基へのアリールリチウムの付加を行って、トリアリールカルビノール官能基を生成し、次にこれをハロゲン化して、トリチルハライド官能基を生成させる。本発明の一つの好ましい実施形態においては、２−クロロベンゾイルクロリドに続いてフェニルリチウム、次に塩化チオニルによれば、２−クロロトリチルクロリド官能基が生成される。ブロム化には、通常、アルキルリチウム試剤による処理とアリールリチウム生成物と種々の試剤との反応が後続し、異なる官能基を生成させる。ハロメチル基は、また、種々の試剤とも反応して、異なる官能基を生成してもよい。
【００２２】
　このビーズを部分的に膨潤させる能力のある溶媒は、例えば、Ｃ１−Ｃ６ニトロアルカンと相対的に非膨潤性の溶媒との混合物、たとえばアルカンとニトロベンゼンまたは塩素化炭化水素との混合物を包含する。フリーデル−クラフツ化学を用いる官能基化に対しては、Ｃ３−Ｃ６ニトロアルカンとアルカンなどの相対的に非膨潤性の溶媒との混合物、たとえばアルカンとニトロベンゼンの混合物が好ましい。
【００２３】
　本明細書中に記述されている表面官能基化されたビーズは、例えば、固相有機合成、固相ペプチド合成、および反応副生成物の掃去において有用である。通常、表面官能基化されたビーズと溶液中の試剤の間のカップリング反応は、従来の官能基化されたポリマービーズの場合よりも急速に起こる。例えば、本明細書中に記述されている表面官能基化されたビーズ上の２−クロロトリチルクロリド官能基を、ペプチド合成で使用される通常のカップリング試剤の存在下で一定濃度の保護されたアミノ酸試剤と反応させる場合、下記の実施例８と表４に示すように、この反応は、通常、従来の官能基化されたビーズに対して観察される時間と同一の時間または短い時間で完結する。下記の実施例６と表２中でこのビーズの重量増により、また実施例７と表３中の切断されたアミノ酸のＨＰＬＣ測定により示されるように、本発明の表面官能基化されたビーズと保護されたアミノ酸残基との反応のカップリング効率は従来のビーズの効率よりも大きい。
【００２４】
　ペプチド合成において既知の通常の保護基を有する場合、あるいは有しない場合での本発明の表面官能基化されたビーズ上へのアミノ酸の通常の装填量は、非装填ビーズの重量基準で０．２ミリ当量／ｇ〜１．０ミリ当量／ｇである。本発明の一つの実施形態においては、好ましくは、少なくとも０．２５ミリ当量／ｇ、更に好ましくは少なくとも０．３ミリ当量／ｇ、更に好ましくは少なくとも０．５ミリ当量／ｇ、そして最も好ましくは少なくとも０．６ミリ当量／ｇが装填される。好ましくは、この装填量は、０．９ミリ当量／ｇ以下、更に好ましくは０．８ミリ当量／ｇ以下、そして最も好ましくは０．７ミリ当量／ｇ以下である。本発明のもう一つの実施形態においては、好ましくは、少なくとも０．６ミリ当量／ｇ、更に好ましくは少なくとも０．７ミリ当量／ｇ、更に好ましくは少なくとも０．８ミリ当量／ｇ、そして最も好ましくは少なくとも０．９ミリ当量／ｇが装填される。好ましくは、この装填量は、１．２ミリ当量／ｇ以下、更に好ましくは１．１ミリ当量／ｇ以下、そして最も好ましくは１．０ミリ当量／ｇ以下である。
【実施例】
【００２５】
　比較例１：予備膨潤された架橋ポリスチレンビーズの内部および表面の官能基化
　オーバーヘッドスターラー、上流側に過圧防止装置を嵌めたＮ２入口、および熱電対を嵌めた１Ｌ丸底フラスコを微正圧の窒素によりパージした（添加の間開いた栓に対して掃気）。ニトロベンゼン（４００ｍＬ）を装填し、室温に保持した。ポリスチレン樹脂（４０ｇ、０．３７９モル）を窒素掃気しながら装填し、１／２時間攪拌する。クロロベンゾイルクロリド（２４．８９ｇ、０．１４２モル）をこのフラスコに装填し、そして１５分間攪拌した。窒素で充填したグローブバッグの内で、塩化アルミニウム（１８．９６ｇ、０．１４２モル）を密封した瓶に秤取し、次にこれをこの反応フラスコの中に窒素掃気しながら装填した。このフラスコの内容物を３０℃まで加熱し、４時間保持した。この反応混合物をブフナーフィルター漏斗の中に注ぎ込み、そしてこの反応フラスコを少量のニトロベンゼンで洗浄して、移液を完結した。このフィルターを樹脂レベルまで排液し、ニトロベンゼン（２８０ｍＬ、樹脂床容積１倍の）を添加し、そしてこのフィルターを再度排液する。テトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」）（樹脂床容積２倍の）を樹脂床の頂部まで添加し、排液した。ＴＨＦがニトロベンゼンを置換するに従って、色が除去された。樹脂床容積１倍の４：１ＴＨＦ：Ｈ２Ｏを添加し、この樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のＴＨＦを樹脂床の頂部まで添加した。フィルターを樹脂レベルまで排液させた。樹脂床容積１倍のＴＨＦを添加し、樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のＴＨＦを樹脂床の頂部まで添加した。フィルターを樹脂レベルまで排液した。樹脂床容積１倍のメタノールを樹脂床の頂部まで添加した。フィルターを樹脂レベルまで排液した。樹脂床容積１倍のメタノールを添加し、そして樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のメタノールを樹脂床の頂部まで添加した。フィルターを樹脂レベルまで排液した。最小の真空を印加して、過剰の溶媒を除去した。この樹脂を３５℃の真空オーブン中で一定の重量まで乾燥した。
【００２６】
　実施例１：非膨潤ビーズの官能基化による架橋ポリスチレンビーズの表面官能基化
　オーバーヘッドスターラー、上流側の過圧防止装置を嵌めたＮ２入口、および熱電対を嵌めた１Ｌ丸底フラスコを微正圧の窒素によりパージした（添加の間開けた栓に向かって掃気）。ニトロベンゼン（４００ｍＬ）を装填し、室温に保持した。窒素で充填したグローブバッグの内で、塩化アルミニウム（１８．９６ｇ、０．１４２モル）を密封した瓶に秤取し、次にこれをこの反応フラスコの中に窒素掃気しながら装填した。この塩化アルミニウムを溶解した後（約５分）、クロロベンゾイルクロリド（２４．８９ｇ、０．１４２モル）をこのフラスコに装填し、そして５分間攪拌した。ポリスチレン樹脂（４０ｇ、０．３７９モル）を窒素掃気しながら装填し、１／２時間攪拌する。このフラスコの内容物を３０℃まで加熱し、追加の３．５時間保持した。この反応混合物をブフナーフィルター漏斗の中に注ぎ込み、そしてこの反応フラスコを少量のニトロベンゼンで洗浄して、移液を完結した。このフィルターを樹脂レベルまで排液し、ニトロベンゼン（２８０ｍＬ、樹脂床容積１倍の）を添加し、そしてフィルターを再度排液した。テトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」）（樹脂床容積２倍の）を樹脂床の頂部まで添加し、これを排液した。ＴＨＦがニトロベンゼンを置換するに従って、色が除去された。樹脂床容積１倍の４：１ＴＨＦ：Ｈ２Ｏを添加し、樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のＴＨＦを樹脂床の頂部まで添加した。フィルターを樹脂レベルまで排液した。樹脂床容積１倍のＴＨＦを添加し、樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のＴＨＦを樹脂床の頂部まで添加した。フィルターを樹脂レベルまで排液させた。床容積１倍のメタノールを樹脂床の頂部まで添加した。フィルターを樹脂レベルまで排液した。樹脂床容積１倍のメタノールを添加し、そして樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のメタノールを樹脂床の頂部まで添加した。フィルターを樹脂レベルまで排液した。最小の真空を印加して、過剰の溶媒を除去した。この樹脂を３５℃の真空オーブン中で一定の重量まで乾燥した。
【００２７】
　実施例２：官能基化溶媒の選択による架橋ポリスチレンビーズの表面官能基化
　オーバーヘッドスターラー、上流側の過圧防止装置を嵌めたＮ２入口、および熱電対を嵌めた１Ｌ丸底フラスコを微正圧の窒素によりパージする（添加の間開けた栓に向かって掃気）。ニトロエタン（４００ｍＬ）を装填し、室温に保持する。ポリスチレン樹脂（４０ｇ、０．３７９モル）を窒素掃気しながら装填し、１／２時間攪拌する。クロロベンゾイルクロリド（２４．８９ｇ、０．１４２モル）をこのフラスコに装填し、１５分間攪拌する。窒素で充填したグローブバッグの内で、塩化アルミニウム（１８．９６ｇ、０．１４２モル）を密封した瓶に秤取し、次にこれをこの反応フラスコの中に窒素掃気しながら装填する。このフラスコの内容物を３０℃まで加熱し、追加の３．７５時間保持する。この反応混合物をブフナーフィルター漏斗の中に注ぎ込み、そしてこの反応フラスコを少量のニトロベンゼンで洗浄して、移液を完結する。このフィルターを樹脂レベルまで排液し、ニトロベンゼン（２８０ｍＬ、樹脂床容積１倍の）を添加し、そしてフィルターを再度排液する。テトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」）（樹脂床容積２倍の）を樹脂床の頂部まで添加し、排液する。ＴＨＦがニトロベンゼンを置換するに従って、色が除去される。樹脂床容積１倍の４：１ＴＨＦ：Ｈ２Ｏを添加し、樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のＴＨＦを樹脂床の頂部まで添加する。フィルターを樹脂レベルまで排液する。樹脂床容積１倍のＴＨＦを添加し、樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のＴＨＦを樹脂床の頂部まで添加する。フィルターを樹脂レベルまで排液させる。樹脂床容積１倍のメタノールを樹脂床の頂部まで添加する。フィルターを樹脂レベルまで排液する。樹脂床容積１倍のメタノールを添加し、そして樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のメタノールを樹脂床の頂部まで添加する。フィルターを樹脂レベルまで排液する。最小の真空を印加して、過剰の溶媒を除去する。この樹脂を３５℃の真空オーブン中で一定の重量まで乾燥する。
【００２８】
　実施例３：混合官能基化溶媒の使用による架橋ポリスチレンビーズの表面官能基化
　オーバーヘッドスターラー、上流側の過圧防止装置を嵌めたＮ２入口、および熱電対を嵌めた１Ｌ丸底フラスコを微正圧の窒素によりパージする（添加の間開けた栓に向かって掃気）。ニトロベンゼン（６０ｍＬ）とヘプタン（４４０ｍＬ）を装填し、室温に保持する。ポリスチレン樹脂（４０ｇ、０．３７９モル）を窒素掃気しながら装填し、１／２時間攪拌する。クロロベンゾイルクロリド（２４．８９ｇ、０．１４２モル）をこのフラスコに装填し、１５分間攪拌する。窒素で充填したグローブバッグの内で、塩化アルミニウム（１８．９６ｇ、０．１４２モル）を密封した瓶に秤取し、次にこれをこの反応フラスコの中に窒素掃気しながら装填する。このフラスコの内容物を３０℃まで加熱し、４時間保持する。この反応混合物をブフナーフィルター漏斗の中に注ぎ込み、そしてこの反応フラスコを少量のニトロベンゼンで洗浄して、移液を完結する。このフィルターを樹脂レベルまで排液し、ニトロベンゼン（２８０ｍＬ、樹脂床容積１倍の）を添加し、そしてフィルターを再度排液する。テトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」）（樹脂床容積２倍の）を樹脂床の頂部まで添加し、排液する。ＴＨＦがニトロベンゼンを置換するに従って、色が除去される。樹脂床容積１倍の４：１ＴＨＦ：Ｈ２Ｏを添加し、樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のＴＨＦを樹脂床の頂部まで添加する。フィルターを樹脂レベルまで排液させる。樹脂床容積１倍のＴＨＦを添加し、樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のＴＨＦを樹脂床の頂部まで添加する。フィルターを樹脂レベルまで排液する。樹脂床容積１倍のメタノールを樹脂床の頂部まで添加する。フィルターを樹脂レベルまで排液する。樹脂床容積１倍のメタノールを添加し、そして樹脂を再懸濁させ、次にフィルターを樹脂レベルまで排液し、そして樹脂床容積１倍のメタノールを樹脂床の頂部まで添加する。フィルターを樹脂レベルまで排液する。最小の真空を印加して、過剰の溶媒を除去する。この樹脂を３５℃の真空オーブン中で一定の重量まで乾燥する。
【００２９】
　実施例４：架橋ビーズの最終官能基化の一般的な手順
　オーブン乾燥した４つ口丸底フラスコ（スターラー、窒素バブラー付きのコンデンサー、温度制御器、およびセプタムを備えた）中にＴＨＦと前の実施例のいずれかで得られた乾燥されたビーズ（１０：１、容積：重量）を入れた。この混合物を１５分間攪拌した。フェニルリチウム（１．２５当量）を１０分にわたって滴加した。この温度を氷／水浴により３０℃より低く保った。次に、この反応混合物を外周温度で１時間攪拌した。１０％のＨＣｌ水溶液の滴加により反応を止め、この反応温度を３０℃以下に保った。この混合物を１時間攪拌した。次に、この内容物を焼結ガラス漏斗に移し、樹脂床高さまで排液した。次に、この樹脂を樹脂床容積１倍の４：１ＴＨＦ／１０％ＨＣｌ（ｖ／ｖ）中に再懸濁し、樹脂床高さまでゆっくりと排液した。樹脂床容積１倍の４：１ＴＨＦ／水により樹脂を再懸濁させ、排液した。次に、この樹脂床を再懸濁させ、樹脂床容積１倍のＴＨＦにより３回排液させ、続いて樹脂床容積１倍のメタノールにより３回再懸濁／排液した。この樹脂床の最終すすぎを樹脂床容積１倍のメタノールにより行う。真空を印加して、過剰の溶媒を除去し、次にこのビーズを３５℃真空オーブン中で乾燥した。
【００３０】
　オーブン乾燥した４つ口丸底フラスコ（スターラー、温度制御器、窒素バブラー付きのコンデンサー、およびストッパーを備えた）中にメチレンクロリドと前の段階からの乾燥されたビーズ（１０：１）を入れた。塩化チオニル（５当量）、続いてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（塩化チオニル基準で５モル％）を滴加した。この混合物を加温して、４時間還流（３７℃）した。外周温度まで冷却した後、この内容物を窒素パージした焼結ガラス漏斗に移し、樹脂床高さまで排液した。次に、この樹脂床を再懸濁させ、樹脂床容積１倍のメチレンクロリドにより２回排液した。次に、樹脂床容積１倍の無水ヘキサンにより３回再懸濁／排液させることによりこれを更に洗浄した。この樹脂床を窒素によりパージして、過剰の溶媒を除去し、次にこのビーズを外周温度で真空オーブン中に入れた。この製造から得られるトリチルクロリドで官能基化されたビーズは、例えば、固相ペプチド合成において有用である。
【００３１】
　実施例５：種々の溶媒中での架橋ポリスチレンビーズの膨潤
　１％およびほぼ１．５％のジビニルベンゼンを架橋体として用いて製造し、１．６５ｍＬ／ｇの乾燥時の容積を有する架橋ポリスチレンビーズを溶媒中で膨潤させ、結果を下記で表１中にｍＬ／ｇで表わした。溶媒比は容積：容積である。
【００３２】
【表１】
2004143445.tif 000002
【００３３】
　実施例６：Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシンによる表面官能基化された架橋ビーズの装填
　実施例４に従って製造される２−クロロトリチルクロリド樹脂をＦｍｏｃ−Ｌ−ロイシンにより装填し、メタノールにより処理して、残存反応性クロリドを除去し、乾燥した。この重量増を使用して、装填量を定量化した。この樹脂は、１．３ミリモル／ｇの容量を有すると想定された。このメトキシ末端キャッピングの相対的に小さい分子量効果を無視した。この樹脂を１％のＴＦＡ／ＤＣＭにより切断し、そしてこの溶液をＨＰＬＣにより分析して、アミノ酸の切断収率（回収）を求めた。
【００３４】
　この樹脂の各試料（１．００００＋／−０．０５ｇ）をサイドポートと着脱型ディスク付きの６０ｍＬのガラス合成器容器に秤取した。この合成器中の樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）により予備膨潤させた。このＤＣＭを排液し、そして各合成器にＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨとジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の１０ｍｌのＤＣＭ中の溶液を添加した。ゆっくりとした窒素攪拌を開始した。本発明の５つの樹脂に対しては、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ量は試料当たりそれぞれグラムで（３．１８１，０．５９７，０．３５８，０．２９９，０．２３９）であり、ＤＩＥＡの量はｍＬで（１．５６８，０．２９４，０．１７７，０．１４７，０．１１８）であった。各混合物を外周温度で２時間反応させ、次に溶液を排液し、そしてメタノール（９ｍＬ）中のＤＩＥＡ（１ｍＬ）により少なくとも３０分間処理することによりいかなる残存トリチルクロリド末端基もキャップした。樹脂の各試料を５×１０ｍＬに区分けしたＤＣＭにより洗浄した。風袋を計った３０ｍＬの焼結ガラス漏斗に移し、もう一つの２×１０ｍＬに区分けしたＤＣＭにより洗浄した。次に、各装填された樹脂を４×１０ｍＬに区分けしたイソプロパノール（ＩＰＡ）により脱膨潤させ、そして真空によりフィルターケーキに空気を通して部分乾燥し、次にフィルターと樹脂を真空オーブン中３０℃で一夜乾燥することにより、乾燥した。次に、このフィルターと樹脂を再秤量し、重量差を計算した。Ｌｅｕの重量＝最終重量−（フィルター風袋＋１．０００ｇ樹脂）。装填効率＝（樹脂上のＬｅｕの重量／装填されたＬｅｕの重量）＊１００。本発明（ＲＨ１−ＲＨ５）の５つの樹脂と比較例（ＣＭ１−ＣＭ３）に示した手順に従って加工された３つの比較樹脂についての重量増と装填効率を表２に示す。同一樹脂に対する切断収率を表３に示す。アミノ酸（ＡＡ）の量はミリモルにより、重量増は（増加）ミリモルにより、そして装填効率（効率）は％による。
【００３５】
【表２】
2004143445.tif 000003
【００３６】
ＣＭ２は２−クロロトリチルクロリド樹脂（１００−２００メッシュ）、１％ＤＶＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．０１−６４−０１１４の名称でＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手可能な樹脂である。
ＣＭ３はＣｌ−Ｔｒｔ−Ｃｌ樹脂（７５−１５０ミクロン）、１％ＤＶＢ、ＰａｒｔＮｏ．３４７３−２７９９の名称でＰｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｓから入手可能な樹脂である。
【００３７】
　実施例７：表面官能基化されたビーズからのＦｍｏｃ−Ｌ−ロイシンの切断
　この樹脂の各試料（１．００００＋／−０．０５ｇ）を焼結ガラスフィルターに秤取した。この漏斗をＤＣＭ（１０ｍＬ）により振とうすることによりこの樹脂を予備膨潤させ、ＤＣＭを排液し、そして樹脂を３×１０ｍＬのＤＣＭにより洗浄した。９×１０ｍｌの１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（ｖ：ｖ）により振とうし、１００ｍＬの定容フラスコの中に排液し、そしてＤＣＭにより標線まで充填することにより、この樹脂に結合したＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨを切断した。このフラスコの内容物を振とうして、ＨＰＬＣにより分析する試料溶液を準備した。
【００３８】
　二元溶媒勾配の生成能力があり、そして試料注入器、可変波長検出器および電子データ取得システム（ソフトウエアＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）付きのＨＰ１０９０）を備えた液体クロマトグラフ系にこの試料溶液を注入した。
カラム：ＹＭＣ　ＯＤＳ−ＡＱ、Ｓ−３、１２０Ａ、５０ｍｍ×４ｍｍ内径カラム、カタログ＃ＡＱ１２Ｓ０３０５０４ＷＴ
条件：
流速：１．５ｍｌ／分
プログラム：４０％Ｂ、保持１０．０分
２．５分にわたって４０％Ｂから９０％Ｂ、保持１分
２分にわたって９０％Ｂ、次の注入まで１０分保持
注入容積：１０μＬ
検出：フォトダイオードアレイ検出器２６５ｎｍバンド幅１６ｎｍ、リファレンス：３５０ｎｍ、ｂｗ１００ｎｍ、または可変波長ＵＶ検出器（２６５ｎｍ）
標準作製：ほぼ５．０ｍｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨリファレンス標準を２５ｍＬの定容フラスコに秤取した。この標準を約１０ｍＬのアセトニトリル（しばしば、超音波照射を必要とする）に溶解した。水（１２ｍＬ）を添加し、内容物を混合し、そしてフラスコを外周温度とせしめた。フラスコを水により標線まで充填し、内容物を混合した。
試料作製：この試料溶液（５．００ｍＬ）を２５ｍＬの定容フラスコに秤り込み、穏やかな窒素流により外周温度で乾燥させた。この残渣を約１０ｍＬのアセトニトリル（しばしば、超音波照射を必要とする）に溶解した。水（１２ｍＬ）を添加し、内容物をよく混合し、そしてこのフラスコを外周温度とせしめた。フラスコを水により標線まで充填し、振とうした。ブランク（水：アセトニトリル３：２）を注入し、この勾配プログラムを開始した。同時に、試料と標準を注入した。この樹脂上のＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕの装填量を次のように計算した：
試料フラスコ中のＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ＝試料の面積／標準の面積×標準の重量×標準の純度／２５．０ｍＬ×２５．０ｍＬ／５．０ｍＬ、
樹脂充填量（ミリモル／ｇ乾燥樹脂）＝試料フラスコ中のＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨの量／充填された樹脂の重量ｇ×３５３．４［３５３．４はＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨの分子量である］。ＲＨ１からＲＨ５とＣＭ１材料について、この樹脂を装填するのに初期に使用されるアミノ酸の各量に対してのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨのミリモル（「ＡＡ」）での切断量の結果を表３に示す。切断量が樹脂への結合量に等しいと仮定して、装填効率も示す。
【００３９】
【表３】
2004143445.tif 000004
【００４０】
　実施例８：ペプチド形成動力学効率の比較
　この実施例は、Ｔ−２０として知られているペプチドであり、米国特許第６，０１５，８８１号に表１、アミノ酸１７−２６を含有するペプチドＮｏ．１１として記述されているものの９つのペプチドフラグメントの製造を記述する。この反応の動力学は、カップリング時に樹脂を定期的にサンプリングし、Ｋａｉｓｅｒ試験を行ってすべての未反応の一級アミンの存在も定量することにより追跡される。一方はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、そして他方はＰｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｓの２つの競合する樹脂と実施例４に従った樹脂を比較する。
【００４１】
　実施例４に従って製造される２−クロロトリチルクロリド樹脂をＦｍｏｃ−Ｌ−ロイシンにより装填し、メタノールにより処理して、残存反応性クロリドを除去し、乾燥した。この樹脂の試料（１．０ｇ）をサイドポートと着脱型ディスク付きの６０ｍＬのガラス合成器容器に秤取した。ＤＣＭ（１０ｍＬ）をこの容器に装填し、窒素により３０分間振とうし、次に排液した。次に、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中のピペリジンの２５％溶液１０ｍＬを装填し、１０分間振とうし、排液し、もう一度繰り返すことにより、このロイシンで誘導体化された樹脂を脱保護する。７×１０ｍＬ容積のＮＭＰにより洗浄することにより、この脱保護残渣を除去した。１．５当量のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨをこのシーケンス中に最初に添加した。装填と式量については表を見られたい）、１．５当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（０．１４９ｇ）および１．５当量のＤＩＥＡ（０．１２６ｇ）を７．５ｍＬのＮＭＰの中に室温で溶解することにより、シーケンスにおける次のアミノ酸の活性化エステルを作製した。次に、この溶液を急冷し、１．５当量のＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（０．３７０ｇ）を添加し、３０分間攪拌した。次に、ＤＣＭ（２．５ｍＬ）をこの溶液に装填し、３０分間放置した。次に、この排液した樹脂にこの活性化されたアミノ酸溶液を装填し、窒素と共に振とうした。試料を入手し、１５分毎に分析（Ｋａｉｓｅｒ試験）し、そして結果を示した。反応の完結時、樹脂を排液し、ＮＭＰ（３×１０ｍＬ）により洗浄した。次に、このシーケンス（Ｇｌｕ（ｔＢｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ａｓｎ（ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ｔＢｕ）、ｌｅｕ、ｌｅｕ、）中のアミノ酸の残りに対して、この方法をピペリジンによる脱保護から繰り返す。
【００４２】
　この３つの樹脂に対する結果を下記表４に示したが、時間はネガティブＫａｉｓｅｒ試験までの時間として表わされたものである。
【００４３】
【表４】
2004143445.tif 000005
【００４４】
　本発明のビーズ上の成長鎖に添加される各アミノ酸との反応を完結させるのに必要な時間は、従来のビーズに対して同一あるいはそれ未満である。
【００４５】
【表５】
2004143445.tif 000006
【００４６】
【表６】
2004143445.tif 000007
【００４７】
【表７】
2004143445.tif 000008
【００４８】
　（付録３）Ｋａｉｓｅｒ試験法
このＫａｉｓｅｒ試験は、一級アミンに対する試験であり、ペプチドカップリング度を定量するのに使用される。装填された樹脂の試料（３−２０ｍｇ）を培養管の中に入れ、乾燥するまで蒸発させる。次に、この樹脂をエタノールにより３回洗浄する。５滴の試剤１（ピリジン中のＫＣＮ）を３滴の試剤２（ニンヒドリン溶液）と３滴の試剤３（エタノール中のフェノール）と一緒に添加する。この溶液を０．５ｍＬまで希釈し、次に７５℃まで１０分間加熱する。１０分後この管を冷水浴中で急冷する。次に、このビーズを白色背景の前で観察する。この溶液が黄色であり、このビーズが透明であるならば、ネガティブな試験が示される。青色または紫色は遊離アミンの存在と未完結のカップリングを示す。
【外国語明細書】
2004143445000001.pdf
2004143445000002.pdf
2004143445000003.pdf