(57)【要約】【課題】Ａ３・コラーゲン複合体の界面情報を提供する。また、界面情報に基づき阻害剤のスクリーニング方法、遺伝性止血性疾患および血栓症関連疾患の発症易否の予測（ＳＮＰｓ診断）法を提供する。【解決手段】構造解析して得られた結合部位の界面情報を基にして、阻害剤を設計、作製する方法。本発明は、ＮＭＲを用いた構造解析技術により決定したコラーゲン・Ａ３複合体の界面情報に基づき、複合体形成を阻害する薬物を設計、または、スクリーニングする方法に関する。本複合体形成を微量で阻害する薬物を見出せば、抗血栓症薬となり得る産業上の有用性がある。また、予防医学的見地、または、テーラー・メイド医療の観点から、本発明で特定した相互作用界面存在アミノ酸残基の変異に着目して、個々の遺伝性止血性疾患および血栓症発症の易否並びに原因の種別を診断する方法として用いることによる健康管理サービス事業の基盤を提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基を特定するための方法であって、
（１）　対象とする第１のタンパク質と、該タンパク質が相互作用する第２のタンパク質とを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施してこれらのタンパク質間の相互作用に関与するタンパク質の界面に存在する１つ以上のアミノ酸残基を特定するステップ；そして、
（２）　上記ステップ（１）で特定されたアミノ酸残基のうちの１つ以上の残基から一定の距離内に存在する１つ以上のアミノ酸残基をさらに特定するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項２】
上記ステップ（２）において、
ステップ（１）で特定されたアミノ酸残基のうちの２つ以上の残基から一定の距離内に存在するアミノ酸残基をさらに特定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記ステップ（２）において、特定の距離内に存在するアミノ酸残基を、データベース上の分子座標に基づいて特定することを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
上記ステップ（２）の特定の距離が、９Å以下であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記ステップ（２）の特定の距離が、８．４Å以下であることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
コラーゲンとフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン間の相互作用に関与するフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン中のアミノ酸残基を特定するための方法であって、フォンヴィルブランド因子とコラーゲンとを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して、フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン中の、コラーゲンと相互作用する界面に存在する１つ以上のアミノ酸残基を特定するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項７】
特定されたアミノ酸残基のうちの１つ以上の残基から一定の距離内に存在する１つ以上のアミノ酸残基をさらに特定するステップ；
をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
特定されたアミノ酸残基のうちの２つ以上の残基から一定の距離内に存在するアミノ酸残基をさらに特定する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
特定の距離内に存在するアミノ酸残基を、データベース上の分子座標に基づいて特定することを特徴とする、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
特定の距離が９Å以下であることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
特定の距離が８．４Å以下であることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
特定の距離が８．１７Å以下であることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質間の相互作用に影響を与える化合物をスクリーニングするための方法であって、
（１）　第１のタンパク質と該タンパク質と相互作用する第２のタンパク質とを用いて、候補化合物の存在下または非存在下で転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して、これらのタンパク質間の相互作用界面上にある第１のタンパク質のアミノ酸残基からのシグナルパターンを得るステップ；そして、
（２）　得られた候補化合物の存在下でのシグナルパターンを候補化合物の非存在下でのシグナルパターンと比較して、該候補化合物が該相互作用に影響を与えるか否かを判定するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項１４】
遺伝性止血性疾患または血栓症の治療または予防薬となり得る化合物をスクリーニングするための方法であって、
（１）　フォンヴィルブランド因子とコラーゲンとを用いて、候補化合物の存在下または非存在下で転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して該タンパク質間の相互作用界面上のアミノ酸残基に由来するシグナルパターンを得るステップ；そして、
（２）　得られた候補化合物の存在下でのシグナルパターンを候補化合物の非存在下でのシグナルパターンと比較して、該候補化合物がフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメインとコラーゲンとの相互作用に影響を与えるか否かを判定するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項１５】
上記ステップ（２）の判定が、化合物の存在下では、フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン内のＴ９７７，　Ｉ９７８，　Ｄ９７９，　Ｐ９８１，　Ｌ９９４，　Ｖ９９７，　Ｑ９９９，　Ｆ１０１３，　Ｒ１０１６，　Ｙ１０１７，　Ｈ１０２３からなる群より選択される少なくとも１残基に由来するシグナルが、化合物の非存在下の対応するシグナルと比較して差異があるか否かを検出することにより達成されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
フォンヴィルブランド因子とコラーゲンとの相互作用に影響を与える化合物をスクリーニングするための方法であって、Ｘ線解析手法、ＮＭＲまたは電子顕微鏡法を用いてフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン内のＴ９７７，　Ｉ９７８，　Ｄ９７９，　Ｐ９８１，　Ｌ９９４，　Ｖ９９７，　Ｑ９９９，　Ｆ１０１３，　Ｒ１０１６，　Ｙ１０１７，　Ｈ１０２３からなる群より選択される少なくとも１残基と相互作用する化合物を探索することを含む、上記方法。
【請求項１７】
タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基の突然変異の有無を検出する方法であって、
（１）　突然変異を有するかまたは有すると疑われる第１のタンパク質と該タンパク質と相互作用する第２のタンパク質とを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して、これらのタンパク質間の相互作用に関与するアミノ酸に由来するシグナルパターンを得るステップ；
（２）野生型の第１のタンパク質と第２のタンパク質とを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施してこれらのタンパク質間の相互作用に関与する第１のタンパク質のアミノ酸残基に由来するシグナルパターンを得るステップ；そして、
（３）　ステップ（１）で得られたシグナルパターンをステップ（２）で得られたシグナルパターンと比較して差異があるか否かを判定するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項１８】
タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基に変異をもたらす遺伝子変異を検出する方法であって、請求項１７記載の方法を含み、さらに、
（４）上記ステップ（３）においてシグナルに差異が検出されたアミノ酸残基を特定するステップ、そして、
（５）上記第１のタンパク質をコードする遺伝子中の該アミノ酸残基に対応するコドンの配列を特定するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１９】
コラーゲンとフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン間の相互作用に関与するフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン中のアミノ酸残基の突然変異の有無を検出する方法であって、
（１）突然変異を有するかまたは有すると疑われるフォンヴィルブランド因子とコラーゲンとを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して該タンパク質間の相互作用に関与するアミノ酸に由来するシグナルパターンを得るステップ；
（２）野生型フォンヴィルブランド因子とコラーゲンとを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して該タンパク質間の相互作用に関与するアミノ酸に由来するシグナルパターンを得るステップ；そして、
（３）　ステップ（１）で得られたシグナルパターンをステップ（２）で得られたシグナルパターンと比較して差異があるか否かを判定するステップ；
を含む、上記方法。
【請求項２０】
上記ステップ（３）において、フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメインとコラーゲンとの相互作用に関与する界面に存在するアミノ酸残基がＴ９７７，　Ｉ９７８，　Ｄ９７９，　Ｐ９８１，　Ｌ９９４，　Ｖ９９７，　Ｑ９９９，　Ｆ１０１３，　Ｒ１０１６，　Ｙ１０１７，　Ｈ１０２３からなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物中のフォンヴィルブランド因子遺伝子内の遺伝性止血性疾患または血栓症に関与する変異を検出する方法であって、請求項１９または２０記載の方法を含み、さらに、
（４）上記ステップ（３）においてシグナルに差異が検出されたアミノ酸残基を特定するステップ、そして、
（５）当該フォンヴィルブランド因子が由来する個体のフォンヴィルブランド因子遺伝子中の該アミノ酸残基に対応するコドンの配列を特定するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項２２】
哺乳動物中のフォンヴィルブランド因子遺伝子の遺伝性止血性疾患または血栓症に関与する変異を検出する方法であって、請求項６〜１２までのいずれか１項に記載の方法により特定されたアミノ酸残基に対応するコドン内に変異が存在するか否かを検出することを含む、上記方法。
【請求項２３】
特定されたアミノ酸残基が、フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン内のＴ９７７、Ｉ９７８、Ｄ９７９、Ｐ９８１、Ｌ９９４、Ｖ９９７、Ｑ９９９、Ｆ１０１３、Ｒ１０１６、Ｙ１０１７、Ｈ１０２３、Ｐ９４４、Ｖ９６７、Ｖ９６９、Ｌ９７０、Ｑ９７１、Ｙ９７２、Ｉ９７５、Ｔ９７６、Ｖ９８０、Ｗ９８２、Ｎ９８３、Ｖ９８４、Ｈ９９０、Ｌ９９１、Ｌ９９２、Ｓ９９３、Ｖ９９５、Ｄ９９６、Ｍ９９８、Ｒ１０００、Ｅ１００１、Ｄ１００９、Ａ１０１０、Ｌ１０１１、Ｇ１０１２、Ａ１０１４、Ｖ１０１５、Ｌ１０１８、Ｔ１０１９、Ｓ１０２０、Ｅ１０２１、Ｍ１０２２、Ｇ１０２４、Ａ１０２５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基であることを特徴とする、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＮＭＲを用いた構造解析技術により決定したタンパク質間相互作用、特にコラーゲンとフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメインとの相互作用に関与する界面情報に基づき、当該相互作用を促進または阻害する薬物をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
本複合体形成を微量で促進または阻害する薬物は抗止血性疾患または抗血栓症薬となり得るので、本発明は産業上の有用性がある。また、予防医学的見地またはテーラー・メイド医療の観点から、本発明で特定した相互作用界面存在アミノ酸残基の変異に着目して、個々人の止血性疾患または血栓症羅患の易否並びに止血性疾患または血栓症原因の種別を診断し治療方法を選択する方法として用いることによる健康管理サービス事業の基盤を提供する。これは、既に世間で行われている遺伝子を出発点としたアプローチとは違って、タンパク質分子間相互作用を調べることに基づく言わば逆ＳＮＰｓのアプローチを提案するものである。
【０００３】
【従来の技術】
近年の分子生物学的技法の進歩に伴い、さまざまな疾患の原因となる遺伝子変異（一塩基多型も含む）が明らかとなりつつある。これらの遺伝子変異の一部は、遺伝子発現の制御に影響を及ぼすものであるが、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を変異（置換、付加、欠失を含む）させるものも多い。かかるアミノ酸配列の変異により、疾患に関連するタンパク質がその機能に異常を来たすために、遺伝的疾患がもたらされる場合が多い。したがって、このようなタンパク質の機能　（相互作用特性、他分子への結合能、酵素活性、転写活性化／抑制能などタンパク質のあらゆる機能を含む）に関与するアミノ酸残基を特定することは、疾患の発症メカニズムおよび遺伝的疾患の要因を研究する意味においても非常に重要である。
【０００４】
また、高齢化社会における最重要課題の一つは、「生活習慣病」への取り組みである。「生活習慣病」（Ｌｉｆｅ−ｓｔｙｌｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）は、「食習慣、運動習慣、休養、喫煙、飲酒等の生活習慣が、その発症・進行に関与する疾患群」と規定され、具体的には、インスリン非依存性糖尿病（成人型糖尿病）、肥満、高脂血症（家族性を除く）、高尿酸血症、循環器疾患（先天性を除く）、大腸癌（家族性を除く）、慢性気管支炎、肺気腫、高血圧症、肺扁平上皮癌、アルコール性肝障害、歯周病などが含まれる。この中の循環器疾患では、血液循環に関するものが重要であり、その点、「最新医学」５５巻２号特集では、「急性心筋梗塞，脳血栓梗塞、深部静脈血栓症、播種性血管内凝固症候群など、血栓形成が成因や病態に密接に関与する疾患は多い。血栓症は血管壁、血小板、血液凝固、血流の相互作用の結果として起こるが、静脈、動脈、微小血管など部位により成因が異なる。近年、血液流動性維持機構の詳細の解明とともに血栓形成機序も明らかになりつつある。また血小板粘着・凝集の分子メカニズムの理解により、新しい抗血栓薬も臨床応用されるようになった」としている（病態生理の理解を目指して；齋藤英彦名古屋大学医学部第一内科教授）。
【０００５】
しかし、これら血栓形成機序の中で、特に分子メカニズムには未解明な部分も多く、とりわけ原子レベルで、即ちオングストローム（Å；または１００ピコメートル）単位の物差しで解析することで取得可能となる因子間の相互作用界面情報が不足しており、この点は、今後個々人の疾病リスクの解明によるオーダー・メイド医療を考える上では見落とすことが許されない。そして、先天性または家族性・遺伝的要素の全くない純粋に生活習慣のみから発症する疾患はあり得ないと考えられ得る。即ち、同じ遺伝子でも各個人毎に遺伝子の塩基配列は若干異なっているが、このような個人間における１塩基の違いをＳＮＰｓ（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：一塩基多型）と呼んでおり、ＳＮＰｓを原子レベルで解明することができれば、個人毎のオーダー・メイド医療への道が開けることとなるので、タンパク質相互作用界面情報は、極めて重要である。ＳＮＰｓは、ＤＮＡ塩基配列１０００個に１個くらいの割合で存在する塩基の違いである。１塩基の違いが遺伝子内に存在すれば、しばしば突然変異となり、遺伝子機能に多大な影響をもたらす。また、ヒト遺伝子のＤＮＡ配列のうち、遺伝子として意味を持つのは約５％と推定されているが、それ以外の読み取られない（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＤＮＡ配列にも多型が存在し、その複数の組合せが生活習慣病の誘因に関わることも解明されてきている。このＳＮＰｓは２００１年２月号のＮａｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅの論文にも詳細が紹介され、各ヒト染色体中の出現頻度も公表されている。現時点では、通常一塩基多型　（ＳＮＰｓ）　は、　主に薬物応答性との関連から解析するが、世界中で新しく有力な方法が続々と開発中である。
【０００６】
「最新医学」（前掲）では、「血小板凝集は、血小板活性化刺激により膜タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが活性化され、そこにフィブリノーゲンが結合することにより起きるが、そのためにはＧＰＩｂ、コラーゲン受容体などの膜タンパク質の関与が必要である。血管傷害部位では、まず　ＧＰＩｂ　とコラーゲンに付着したフォンヴィルブランド因子が結合（すなわち、相互作用）することが、コラーゲンとコラーゲン受容体の結合に必要とされている。コラーゲンとコラーゲン受容体の結合により血小板内活性化信号が発生し、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ　が活性化される（「血小板凝集の分子機構」尾崎由基男山梨医科大学臨床検査医学　教授）、としているがÅ単位の分子構造視点での解説はない。
【０００７】
そこで、発明者らは、まず、コラーゲンとフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメインを採り上げて、その界面情報を取得することを試みた。
【０００８】
細胞外マトリックスの主要な構成成分であり、人体を構成するタンパク質総量の約３分の１を占めるコラーゲンは、３本のポリペプチド鎖からなる特有のトリプルへリックス構造を有する。このような構造を形成するために、それぞれのポリペプチド鎖のアミノ酸配列においては、３つおきにグリシン残基が存在することが必須であり、残り二つの残基には高頻度でプロリン残基が見られる。３残基目のプロリンはしばしば水酸化され、さらにトリプルへリックス構造が安定化されている。人体を構成するコラーゲンは基本的には５種類であり、これまでに遺伝的に異なる１９種類のコラーゲンが報告されているが、生体内に存在するコラーゲンの多くはトリプルへリックス構造がさらに会合して線維（フィブリル）構造を形成することが知られる。このようなコラーゲンフィブリルは、機械的な組織の支持機能を有するのみならず、様々な細胞接着などのプロセスを細胞表面のコラーゲン受容体などと相互作用することにより媒介していることが明らかとなってきた。具体的には、発生・分化、炎症・腫瘍などの病態の進行、また治癒・再生など多岐にわたる生命活動に関与している。よって、コラーゲン受容体は様々な疾患に対する創薬のターゲットとなることから、コラーゲンとコラーゲン受容体との相互作用様式を詳細に解析することにより、これらの疾患に有効な薬剤の候補となる新規化合物のデザイン・最適化において重要な構造情報がもたらされると期待される。
【０００９】
いくつかのコラーゲン受容体は、フォンヴィルブランド因子（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ；ｖＷＦ）のＡドメインとアミノ酸相同性の高い領域を持っており、その領域はＶＷＡ（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　Ｆａｃｔｏｒ　Ａ−ｔｙｐｅ）ドメインスーパーファミリーに分類されている。コラーゲン結合能を有するＶＷＡドメインのうち、最もよく解析されているのはインテグリンのα２サブユニット中に存在するα２−Ｉドメインである。α２−Ｉドメインはコラーゲン模倣ペプチドとの複合体の立体構造がＸ線結晶解析により明らかにされている。この構造で、α２−Ｉドメインは中央のβストランドの両側を両親媒性のαへリックスが取り囲んでいる、いわゆる“ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ”フォールドをしており、コラーゲンのトリプルへリックスは分子の上面で結合していた。また結合部位においては、コラーゲンペプチドのグルタミン酸残基の側鎖がＭＩＤＡＳモチーフと呼ばれる構造中に存在するマグネシウム及び／又はマンガンの二価イオンに直接配位していた。このＭＩＤＡＳモチーフは他のＶＷＡドメインにおいてもリガンド結合部位となることが知られている。
【００１０】
フォンヴィルブランド因子は、血管損傷部位において露出した内皮構造と血小板膜上受容体を架橋することにより、血小板凝集反応を開始させる。ｖＷＦの主要なコラーゲン結合部位はＡ３ドメイン（アミノ酸番号９２０−１１１１）であり、ＶＷＡドメインに分類される。最近にわかに創薬ターゲットとしての有効性がクローズアップされている（Ｗｕ，　Ｄ　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｌｏｏｄ　（２００２）　ｖｏｌ．　９９，　３６２３−３６２７）。該Ａ３ドメイン単独の構造は既に明らかにされており、他のＶＷＡと類似した立体構造を形成していることが示された。しかしながら、Ａ３ドメインの構造ではＭＩＤＡＳモチーフが立体的に形成されておらず、その結果金属イオンも配位していなかった。また、Ａ３ドメインのコラーゲン結合活性はＭＩＤＡＳ領域への変異によっても損なわれることもなかった。最近、Ａ３ドメインとコラーゲン結合を阻害するモノクローナル抗体ＲＵ５との複合体の結晶構造が明らかにされた。ＲＵ５の結合部位からＡ３ドメインのコラーゲン結合部位は、分子の底面付近ではないかと推察されたが、ＲＵ５のエピトープ付近への変異導入実験からＡ３ドメインのコラーゲン認識様式を明らかにすることはできなかった。このように現時点では、Ａ３ドメインのコラーゲン結合部位に関する情報は極めて少ないのが現状である。
【００１１】
このようなコラーゲンとコラーゲン受容体タンパク質の間の相互作用様式を原子レベルで解析する場合において、従来のＸ線結晶構造解析やＮＭＲ法によりネイティブ状態のコラーゲンを解析対象とすることは不可能であった。その理由は、コラーゲンは生理的条件下において、不溶性のフィブリルを形成してしまうからである。そこで従来の構造解析においては前述したように、コラーゲンの構造を模倣した短い合成ペプチドや、コラーゲン結合を競合的に阻害するコラーゲン受容体に対するモノクローナル抗体を代わりのリガンドとして用いる以外に方法は無かった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的の一つは、疾患に関連するタンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基を特定するための方法を提供することである。また、本発明により、抗血栓性を有する化合物をスクリーニングする新規方法が提供される。さらに、疾患に関連するタンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基を特定し、遺伝子内のそのコード部位を特定することにより、該疾患の遺伝的要因となり得る変異を診断するための指標とすることを含む、新しい遺伝子診断手法を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らが以前に開発した転移交差飽和（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｃｒｏｓｓ　ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ；ＴＣＳ）法（特開２００２−３１６１０参照のこと）は、生体分子、特にタンパク質同士の相互作用界面を複合体全体の分子量によらず決定することが可能な手法である。即ち、該方法は、複合体を構成する複数の生体分子のうち、一の生体分子の非易動性水素を重水素に、その易動性水素の少なくとも７０％を重水素に、それぞれ置換した後、交差飽和現象により、これに隣接する他の生体分子に含まれる水素から１０Å以内に存在する当該一の生体分子中に含まれ、交差飽和（ＴＣＳ）を受ける易動性水素の位置を特定することにより生体分子複合体の界面残基を同定し得る。この結果、複合体の相互作用界面を従来法に比較してより厳密に決定することができる。よって、コラーゲンのような均一の分子構造を有していない巨大分子に対しても原子レベルの構造情報を得ることが期待できる。そこで、本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、この方法により得られる界面情報に基づいて疾患に関連するタンパク質相互作用に関与するアミノ酸残基の特定を検討し、本発明を完成させるに至った。さらに、Ａ３ドメインとフィブリル型コラーゲン複合体に対してこの手法を適用し、Ａ３ドメインにおけるコラーゲン分子と相互作用するアミノ酸残基の同定を試みた。尚、後述する新規ＴＣＳ法を用いることも可能である。
【００１４】
本発明は、以下の態様：
１．　タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基を特定するための方法であって、
（１）　　対象とする第１のタンパク質と、該タンパク質が相互作用する第２のタンパク質とを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施してこれらのタンパク質間の相互作用に関与するタンパク質の界面に存在する１つ以上のアミノ酸残基を特定するステップ；そして、
（２）　　上記ステップ（１）で特定されたアミノ酸残基のうちの１つ以上の残基から一定の距離内に存在する１つ以上のアミノ酸残基をさらに特定するステップ；
を含む、上記方法、
２．　上記ステップ（２）において、
ステップ（１）で特定されたアミノ酸残基のうちの２つ以上の残基から一定の距離内に存在するアミノ酸残基をさらに特定する、上記１記載の方法、
３．　上記ステップ（２）において、特定の距離内に存在するアミノ酸残基を、データベース上の分子座標に基づいて特定することを特徴とする、上記１または２記載の方法、
４．　上記ステップ（２）の特定の距離が、９Å以下であることを特徴とする、上記１〜３のいずれか１つに記載の方法、
５．　上記ステップ（２）の特定の距離が、８．４Å以下であることを特徴とする、上記４記載の方法、
６．　コラーゲンとフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン間の相互作用に関与するフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン中のアミノ酸残基を特定するための方法であって、フォンヴィルブランド因子とコラーゲンとを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して、フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン中の、コラーゲンと相互作用する界面に存在する１つ以上のアミノ酸残基を特定するステップ；を含む、上記方法、
７．　特定されたアミノ酸残基のうちの１つ以上の残基から一定の距離内に存在する１つ以上のアミノ酸残基をさらに特定するステップ；
をさらに含む、上記６記載の方法、
８．　特定されたアミノ酸残基のうちの２つ以上の残基から一定の距離内に存在するアミノ酸残基をさらに特定する、上記７記載の方法、
９．　特定の距離内に存在するアミノ酸残基を、データベース上の分子座標に基づいて特定することを特徴とする、上記７または８記載の方法、
１０．　特定の距離が９Å以下であることを特徴とする、上記７〜９のいずれか１つに記載の方法、
１１．　特定の距離が８．４Å以下であることを特徴とする、上記１０記載の方法、
１２．　特定の距離が８．１７Å以下であることを特徴とする、上記１１記載の方法、
１３．　タンパク質間の相互作用に影響を与える化合物をスクリーニングするための方法であって、
（１）　　第１のタンパク質と該タンパク質と相互作用する第２のタンパク質とを用いて、候補化合物の存在下または非存在下で転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して、これらのタンパク質間の相互作用界面上にある第１のタンパク質のアミノ酸残基からのシグナルパターンを得るステップ；そして、
（２）　　得られた候補化合物の存在下でのシグナルパターンを候補化合物の非存在下でのシグナルパターンと比較して、該候補化合物が該相互作用に影響を与えるか否かを判定するステップ；
を含む、上記方法、
１４．　遺伝性止血性疾患または血栓症の治療または予防薬となり得る化合物をスクリーニングするための方法であって、
（１）　　フォンヴィルブランド因子とコラーゲンとを用いて、候補化合物の存在下または非存在下で転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して該タンパク質間の相互作用界面上のアミノ酸残基に由来するシグナルパターンを得るステップ；そして、
（２）　　得られた候補化合物の存在下でのシグナルパターンを候補化合物の非存在下でのシグナルパターンと比較して、該候補化合物がフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメインとコラーゲンとの相互作用に影響を与えるか否かを判定するステップ；
を含む、上記方法、
１５．　フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン内のＴ９７７，　Ｉ９７８，　Ｄ９７９，　Ｐ９８１，　Ｌ９９４，　Ｖ９９７，　Ｑ９９９，　Ｆ１０１３，　Ｒ１０１６，　Ｙ１０１７，　Ｈ１０２３からなる群より選択される少なくとも１残基に由来するシグナルが、化合物の非存在下の対応するシグナルと比較して差異があるか否かを検出することにより達成されることを特徴とする、上記１４記載の方法、
１６．　フォンヴィルブランド因子とコラーゲンとの相互作用に影響を与える化合物をスクリーニングするための方法であって、Ｘ線解析手法、ＮＭＲまたは電子顕微鏡法を用いてフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン内のＴ９７７，　Ｉ９７８，　Ｄ９７９，　Ｐ９８１，　Ｌ９９４，　Ｖ９９７，　Ｑ９９９，　Ｆ１０１３，　Ｒ１０１６，　Ｙ１０１７，　Ｈ１０２３からなる群より選択される少なくとも１残基と相互作用する化合物を探索することを含む、上記方法、
１７．　タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基の突然変異の有無を検出する方法であって、
（１）　突然変異を有するかまたは有すると疑われる第１のタンパク質と該タンパク質と相互作用する第２のタンパク質とを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して、これらのタンパク質間の相互作用に関与するアミノ酸に由来するシグナルパターンを得るステップ；
（２）　野生型の第１のタンパク質と第２のタンパク質とを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施してこれらのタンパク質間の相互作用に関与する第１のタンパク質のアミノ酸残基に由来するシグナルパターンを得るステップ；そして、
（３）　　ステップ（１）で得られたシグナルパターンをステップ（２）で得られたシグナルパターンと比較して差異があるか否かを判定するステップ；
を含む、上記方法、
１８．　タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基に変異をもたらす遺伝子変異を検出する方法であって、上記１７記載の方法を含み、さらに、
（４）　上記ステップ（３）においてシグナルに差異が検出されたアミノ酸残基を特定するステップ、そして、
（５）　上記第１のタンパク質をコードする遺伝子中の該アミノ酸残基に対応するコドンの配列を特定するステップ、
を含む、上記方法、
１９．　コラーゲンとフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン間の相互作用に関与するフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン中のアミノ酸残基の突然変異の有無を検出する方法であって、
（１）突然変異を有するかまたは有すると疑われるフォンヴィルブランド因子とコラーゲンとを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して該タンパク質間の相互作用に関与するアミノ酸に由来するシグナルパターンを得るステップ；
（２）野生型フォンヴィルブランド因子とコラーゲンとを用いて、転移交差飽和（ＴＣＳ）法を実施して該タンパク質間の相互作用に関与するアミノ酸に由来するシグナルパターンを得るステップ；そして、
（３）　　ステップ（１）で得られたシグナルパターンをステップ（２）で得られたシグナルパターンと比較して差異があるか否かを判定するステップ；
を含む、上記方法、
２０．　上記ステップ（３）において、フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメインとコラーゲンとの相互作用に関与する界面に存在するアミノ酸残基がＴ９７７，　Ｉ９７８，　Ｄ９７９，　Ｐ９８１，　Ｌ９９４，　Ｖ９９７，　Ｑ９９９，　Ｆ１０１３，　Ｒ１０１６，　Ｙ１０１７，　Ｈ１０２３からなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする、上記１９記載の方法、
２１．　哺乳動物中のフォンヴィルブランド因子遺伝子内の遺伝性止血性疾患または血栓症に関与する変異を検出する方法であって、上記１９または２０記載の方法を含み、さらに、
（４）　上記ステップ（３）においてシグナルに差異が検出されたアミノ酸残基を特定するステップ、そして、
（５）　当該フォンヴィルブランド因子が由来する個体のフォンヴィルブランド因子遺伝子中の該アミノ酸残基に対応するコドンの配列を特定するステップ、を含む、上記方法、
２２．　哺乳動物中のフォンヴィルブランド因子遺伝子の遺伝性止血性疾患または血栓症に関与する変異を検出する方法であって、上記６〜１２までのいずれか１つに記載の方法により特定されたアミノ酸残基に対応するコドン内に変異が存在するか否かを検出することを含む、上記方法、ならびに、
２３．　特定されたアミノ酸残基が、フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン内のＴ９７７、Ｉ９７８、Ｄ９７９、Ｐ９８１、Ｌ９９４、Ｖ９９７、Ｑ９９９、Ｆ１０１３、Ｒ１０１６、Ｙ１０１７、Ｈ１０２３、Ｐ９４４、Ｖ９６７、Ｖ９６９、Ｌ９７０、Ｑ９７１、Ｙ９７２、Ｉ９７５、Ｔ９７６、Ｖ９８０、Ｗ９８２、Ｎ９８３、Ｖ９８４、Ｈ９９０、Ｌ９９１、Ｌ９９２、Ｓ９９３、Ｖ９９５、Ｄ９９６、Ｍ９９８、Ｒ１０００、Ｅ１００１、Ｄ１００９、Ａ１０１０、Ｌ１０１１、Ｇ１０１２、Ａ１０１４、Ｖ１０１５、Ｌ１０１８、Ｔ１０１９、Ｓ１０２０、Ｅ１０２１、Ｍ１０２２、Ｇ１０２４、Ａ１０２５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基であることを特徴とする、上記２２記載の方法、
に関する。
【００１５】
すなわち、本発明は、阻害剤を設計、作製する方法、及び、遺伝子変異（一塩基多型；ＳＮＰｓを含む）に対する診断指標を提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
ＴＣＳ法は、重水素化と交差飽和現象を利用することによって、高分子量タンパク質複合体における相互作用界面を同定する方法をいう。
【００１７】
ＴＣＳ法の具体的な手順については、特開２００２−３１６１０を参照されたい。相互作用する２つのタンパク質をそれぞれ公知の遺伝子組換え法および／またはタンパク質精製法に従って準備する。そして、一方のタンパク質を均一に２Ｈ，１５Ｎで標識し、標識タンパク質を非標識タンパク質に対して過剰量（例えば、モル比で５〜１０倍程度）添加してＮＭＲサンプルとし、該サンプルの脂肪族領域を選択的にラジオ波照射することにより、２Ｈ，１５Ｎ標識したタンパク質は脂肪族プロトンを有していないためにラジオ波の影響を直接受けることはなく、非標識タンパク質のプロトンのみがラジオ波により選択的かつ均一に飽和される。この飽和がスピン拡散現象により、さらに該タンパク質分子と相互作用して結合したタンパク質分子（上記２Ｈ，１５Ｎ標識をしたタンパク質）の相互作用界面近傍のプロトンにも伝播され、界面上のプロトンに飽和が転移される。そして、この転移された飽和の影響は、ＮＭＲシグナル強度として観測することができる。すなわち、選択的飽和を行ったときと行わないときで化学シフト相関（ＨＳＱＣ）スペクトル上に出現するＮＭＲシグナル（以下ＨＳＱＣシグナルと呼ぶ）の強度比を見積もることにより、結合界面に存在する、すなわち上記相互作用に関与する残基を特定することができる。
【００１８】
尚、ここでアミド水素の観測によるのではなく、別のプロトンを観測することによっても界面残基の同定が可能である。最近発明者らは、複合体を構成する複数の生体分子のうち、一の生体分子のメチル基水素を除く水素を重水素に置換した後、交差飽和現象により、これに隣接する他の生体分子に含まれる水素から１０Å以内に存在する当該一の生体分子中に含まれ、交差飽和を受けるメチル基水素の位置を特定することを特徴とする生体分子複合体の界面残基を同定する方法、および、交差飽和現象がメチル基水素以外の水素に対して選択的にパルスを与える方法によるものであるようなメチル位置特定による界面残基同定法（メチル基位置特定による界面残基同定法）を開発した（「蛋白質複合体解析法」特願２００２−２１７９３８）ので、それを用いても良い。この「メチル基位置特定による界面残基同定法」によれば、アミノ酸側鎖のメチル基において交差飽和現象（Ｃｒｏｓｓ　ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｐｈｅｎｏｍｅｎａ）を利用しタンパク質や核酸などの生体分子が複数結合して構成した複合体の界面残基を同定することにより相互作用界面を従来法に比較してより高感度かつ高効率に決定することができる。従来より、ＮＭＲ法を用いたタンパク質−タンパク質及びタンパク質−核酸複合体の相互作用界面残基の特定には、上述したように、複合体形成に伴う主鎖アミド水素の交差飽和法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００、Ｎａｔｕｒｅ　Ｓｔｒｕｃｔ．　Ｂｉｏｌ．　７，　２２０−２２３参照。）や転移交差飽和法（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００２、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　３１８，　２４５−２４９参照。）を利用することによって行われてきた。即ち、例えば、プロテインＡは黄色ブドウ球菌の細胞壁構成タンパク質で、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に結合することが分かっている（Ｌａｎｇｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８２、Ａｄｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　３２，　１５７−２５２６参照。）。プロテインＡの細胞外領域はＡ〜Ｅの五つのドメインから構成されている。ＦＢのＩｇＧとの結合に重要な残基は、すでにＮＭＲを用いた転移交差飽和法実験をもとに求められている（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００２、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　３１８，　２４５−２４９参照。）。しかし、この方法は、スピン拡散を抑え相互作用界面の検出精度を高める目的で高い重水率の溶媒を用いる必要があること、また、検出するアミド水素自体は相互作用界面そのものに存在することが少なく、原子間距離に依存する交差飽和の効率は高いものではないことから、検出感度は高いとはいえない方法であった。以上のような状況下に、従来のＮＭＲ法では生体分子複合体、例えばタンパク質複合体の相互作用界面を感度良くかつ効率良く捉えるには不十分であり、別の相互作用界面を捉えることのできる方法が望まれていた。このような課題を解決するために、生体分子複合体における相互作用界面をより高感度かつ高効率に同定することができる方法を開発すべく、まず従来法について詳細に検討を行った。これまで、転移交差飽和法により、例えば高分子量タンパク質複合体（分子量１５０，０００以上）の相互作用界面は、複合体形成に伴うアミド水素の交差飽和を指標に行われてきた（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００２、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　３１８，　２４５−２４９参照。）。しかし、この方法は、感度が高くないため、測定に多大な時間を要する上に、交差飽和の効率も良いとはいえず、厳密な分析には限界があること分かった。そこで、検出方法について鋭意検討した結果、アミノ酸側鎖のメチル基の交差飽和現象に着目することによって高分子量タンパク質複合体における相互作用界面をより高感度かつ高効率に決定できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、複合体を構成する複数の生体分子のうち、一の生体分子のメチル基水素以外の水素を重水素に置換した後、交差飽和現象により、これに隣接する生体分子に含まれる水素から１０　Å以内に存在する当該一の生体分子中に含まれ、交差飽和を受けるメチル基水素の位置を特定することに特徴を有する生体分子複合体の界面残基を決定する方法に存する。生体分子のメチル基水素以外の水素を重水素化するには、当該生体分子を発現する微生物を重水素化した成分を含有する培地で培養した後、発現誘導を行う直前に重水素化されていない特定の前駆体物質を添加すれば良い。また、生体分子を重水素化アミノ酸或いは重水素化核酸から合成する方法も適用することもできる。この発明においては、被同定界面残基を含む生体分子のメチル基水素以外の水素が重水素化されているため、当該生体分子に隣接する生体分子の水素から１０　Å以内に存する当該生体分子のメチル基水素が交差飽和を受ける。メチル基のＮＭＲシグナルは等価な三つの水素分の強度を持ち、その運動性の高さによりシグナル自体が先鋭化している。また、相互作用界面に存在するアミノ酸側鎖のメチル基はその距離的条件からアミド水素よりも交差飽和の効率も高い。さらには、メチル基以外の水素は重水素化されていることに加え、メチルプロトンの速いＴ１緩和によりスピン拡散の影響が抑制されている。従って、当該生体分子の界面残基或いは相互作用界面を高感度かつ高効率に決定することができる。
【００１９】
この「メチル基位置特定による界面残基同定法」の原理は、次の通りである。相互作用界面を同定する対象である第１のタンパク質であるタンパク質Ｉのアミ
ノ酸側鎖のメチル基水素以外の水素を２Ｈで標識し、それと複合体を形成する第２のタンパク質であるタンパク質ＩＩは非標識にする。このとき、タンパク質複合体は水素密度が極めて低いタンパク質Ｉと高いタンパク質ＩＩから構成されることになる。水素密度の高い高分子量タンパク質の場合、分子のある一部分を飽和しても、その影響は瞬時に他の部位にも伝播し、他の水素原子も同様に飽和されることになる。この現象はスピン拡散として良く知られている（Ｋａｌｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９７６；Ａｋａｓａｋａ，　１９８１）。ここで４〜１０　ｐｐｍの水素領域への広域ラジオ波照射をタンパク質Ｉ−ＩＩ複合体に対して適用すると、タンパク質ＩＩの残余アミド水素、芳香族
水素、α水素、及び一部のメチレン水素領域がラジオ波照射の影響を受けるが、スピン拡散減少によりタンパク質ＩＩ分子の水素全体が飽和されることになる。この時、タンパク質Ｉの相互作用界面付近に存在するメチル基水素は、その界面を介してタンパク質ＩＩの飽和した水素との交差緩和の機構により、飽和の移動が観測されるのである。タンパク質Ｉにおいては、メチル基水素以外は重水素化されている上にメチル基水素のＴ１緩和時間が比較的速いため、スピン拡散の影響は抑制されており、交差飽和現象は相互作用界面に留まることになる。磁化の飽和はＮＭＲシグナルの強度減少として観測されるため、複合体の１Ｈ−１３Ｃ　ＨＳＱＣスペクトル上に観測されるメチル基水素のシグナル強度減少を指標として、タンパク質Ｉ
の相互作用界面に存在するメチル基を含むアミノ酸残基を特定することができる。
【００２０】
「メチル基位置特定による界面残基同定法」におけるＮＭＲ測定他実験の詳細は、次の通りである。即ち、本研究において使用するＮＭＲパルススキームは、６．０　ｐｐｍ±３　ｐｐｍのＷＵＲＳＴ照射であり、ＩｇＧの残余アミド水素、芳香族水素、α水素、および一部のメチレン水素領域を０．２５秒間照射している。また、交差飽和現象の観測は、１Ｈ−１３Ｃ　コンスタントタイム（ｃｔ）ＨＳＱＣスペクトル（Ｖｕｉｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｂａｘ，　１９９２参照。）において解析した。対象は、ＦＢ−ＩｇＧ複合体であり、ロイシン、およびイソロイシンを１３Ｃで均一標識し、そのメチル基水素以外の水素を２Ｈで標識したＦＢと、非標識のＩｇＧ（マウスサブクラスγ１）と上記のＮＭＲ測定法を用いて解析を行った。その結果、Ｌｅｕ１８の２つのメチル基、およびＩｌｅ３２のδメチル基に顕著な交差飽和現象が観察された。これらの残基は、全て相互作用界面に存在するものである（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００２）。また、アミド水素を利用した従来法においては、２４時間程度の測定時間を要するのに対して、本法の測定時間は約３時間であった。さらに、界面に存在するメチル基の場合、転移交差飽和実験でありながら、０．２５秒間の照射時間で、強度比が０．６程度までの交差飽和現象が観測された。これは従来のアミド水素を利用した方法に比べて著しく効率が高い。
【００２１】
以上の説明から明らかなように、「メチル基位置特定による界面残基同定法」の発明においては、複合体を構成する複数の生体分子のうち、一の生体分子におけるメチル基水素以外の水素を重水素に置換し、交差飽和現象を起こさせることにより、複合体相互作用界面残基をより高感度かつ高効率に決定できるので、この方法は、主鎖のアミド水素を指標にした従来の方法よりも明らかに優れているといえる。それは、この方法が複合体中、アミド水素より相互作用界面に近接する側鎖メチル基を観測していることから、交差飽和の効率も高い上にスピン拡散の影響も抑制されており、またメチル基水素のシグナルも等価な三つ分の水素の強度を持つ上に先鋭化しているからである。さらに、アミノ酸前駆体がメチル基のみ１３Ｃ標識されたものを利用した場合、コンスタントタイム実験の必要がなくなるので、より高感度な測定が、３０分程度の短時間で行うことが可能となるとともに、より高分子量の複合体に対しても適用可能になることが期待される（Ｈａｊｄｕｋ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１２２，　７８９８−７９０４）。また、本手法は、他の複合体、例えばタンパク質−核酸複合体やタンパク質−脂質複合体に対しても適用可能な方法であると考えられる。まとめると、交差飽和現象をアミノ酸側鎖におけるメチル基水素に対して利用したもので、従来法に比較して高感度かつ高効率に相互作用界面を決定することができる。
【００２２】
したがって、この新規ＴＣＳ法または上記特許公開のＴＣＳ法に基づき、疾患に関連するタンパク質間相互作用をもたらすタンパク質をサンプルとして用いることにより、その相互作用に関与する残基を特定することができ、該相互作用を制御する（促進および抑制のいずれをも含む）薬剤の創薬研究のターゲットとなる残基が特定され得る。また、このような疾患関連タンパク質間相互作用に直接的に関与するアミノ酸残基が特定されると、当該アミノ酸の変異（置換または欠失）をもたらす遺伝子内の突然変異を同定することが容易に可能となり、遺伝的疾患に関与する変異（ＳＮＰｓ等）の特定、遺伝子治療への応用等に利用することができる。
【００２３】
また、上記で相互作用界面に存在するアミノ酸残基が特定されることより、立体構造的に当該アミノ酸残基の周辺に存在するアミノ酸残基もまた、データベースまたは当該タンパク質分子のＸ線解析データ等から特定することができる。これらの界面近傍に位置するアミノ酸残基は、界面の立体構造の維持に密接に関与している可能性が高い。このような場合においては、界面に存在するアミノ酸のみならず、界面近傍に位置するアミノ酸残基が変異することによっても、当該タンパク質間相互作用は改変され得る。したがって、タンパク質の相互作用に関与するアミノ酸残基には、相互作用界面に存在するアミノ酸残基および界面近傍に位置するアミノ酸残基も含まれる。相互作用界面に存在するアミノ酸残基から立体構造上の一定の距離内に存在するアミノ酸残基を特定することもまた、当該タンパク質間相互作用の機序の解明に役立つ。さらに、疾患関連タンパク質内のこのようなアミノ酸残基もまた、上記のように薬剤の開発に有用である。
【００２４】
したがって、上記一定の距離とは、互いのアミノ酸残基が相互作用可能な距離であることが好ましく、直鎖上の２つのアミノ酸残基のα位の炭素原子は約３．８Åの距離にあるので、その２倍以内であることおよびさまざまな原因による原子位置の０．５〜１．４Å程度の変動等を考慮すると、このような距離は９．０Å以下、好ましくは８．４Å以下、さらに好ましくは８．１７Å以下であり得る。
【００２５】
上記の方法により、コラーゲンとフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン間の相互作用に関与するフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン中のアミノ酸残基を特定することができる。
【００２６】
後述の実施例に示すように、上記方法により、フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメインのコラーゲンとの相互作用界面に存在する１１アミノ酸残基（Ｔ９７７，　Ｉ９７８，　Ｄ９７９，　Ｐ９８１，　Ｌ９９４，　Ｖ９９７，　Ｑ９９９，　Ｆ１０１３，　Ｒ１０１６，　Ｙ１０１７，　Ｈ１０２３）が特定された。この場合、コントロールとして、ラジオ波の照射を行わない場合のＨＳＱＣシグナルの強度を用いた。さらに、これらの１１アミノ酸残基を変異させた変異体を用いた実験でこれらの残基がコラーゲンとの相互作用に重要であることが実証された。さらに、この１１アミノ酸残基のいずれかから一定の距離内にあるアミノ酸残基を、フォンヴィルブランド因子の立体座標（データベースから入手可能）から特定することができ、８．１７Å以内の距離にある３５個のアミノ酸残基（Ｓ９２８、Ｐ９４４、Ｖ９６７、Ｖ９６９、Ｌ９７０、Ｑ９７１、Ｙ９７２、Ｉ９７５、Ｔ９７６、Ｖ９８０、Ｗ９８２、Ｎ９８３、Ｖ９８４、Ｈ９９０、Ｌ９９１、Ｌ９９２、Ｓ９９３、Ｖ９９５、Ｄ９９６、Ｍ９９８、Ｒ１０００、Ｅ１００１、Ｄ１００９、Ａ１０１０、Ｌ１０１１、Ｇ１０１２、Ａ１０１４、Ｖ１０１５、Ｌ１０１８、Ｔ１０１９、Ｓ１０２０、Ｅ１０２１、Ｍ１０２２、Ｇ１０２４およびＡ１０２５）が特定され得る。この中には、その変異が血栓症と関連があることが報告されているアミノ酸残基Ｓ９６８が含まれていることからも、本発明の有用性が示唆される。したがって、遺伝子内の、これら合計４６個のアミノ酸残基をコードする部位に標的を絞って変異を検出すると、遺伝性止血性疾患または血栓症に関与する遺伝子変異を見出すことが可能である。
【００２７】
さらに、このような特定のタンパク質間相互作用に関与するアミノ酸が特定されることにより、該タンパク質間相互作用に影響を与える遺伝子変異の探索が非常に容易になる。実際にタンパク質間相互作用に関与しているアミノ酸残基は、アミノ酸置換変異タンパク質等を用いた実験などにより特定されていたが、候補となるアミノ酸残基を特定する必要があり、本発明によると実際に相互作用に関与する界面に存在するアミノ酸残基を限定でき、候補アミノ酸残基の数を絞ることができ、例えばそのそれぞれについて、既に公知のアラニンスキャニング法等を実施することにより、実際にタンパク質間相互作用に関与しているアミノ酸残基を特定できる。
【００２８】
そして、疾患に関連する相互作用に関与するアミノ酸残基が特定されると、該アミノ酸残基をコードする位置の変異（ＳＮＰを含む）を有するか否かを調べることにより、その疾患に対する遺伝的要因の有無を判定することができる。したがって、本発明は、疾患に対する遺伝的要因を探るためにも有用であり、治療的・予防的利用が考えられる。
【００２９】
より具体的な例としては、実施例において、フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン内のコラーゲンと相互作用する界面上に位置する１１アミノ酸残基のうち変異導入試験を行ったほとんどのアミノ酸残基においてその変異は、血栓症等のフォンヴィルブランド因子とコラーゲンとの相互作用の結合特性（結合定数等）を変化させることが、実証されている。したがって、上記Ａ３ドメイン中のこれらのアミノ酸残基、およびこれらのアミノ酸の立体配置を支持していると考えられるこれらのアミノ酸の近傍に位置するアミノ酸残基をコードする位置の遺伝子変異は、血栓症の遺伝的要因である可能性がきわめて高い。ゆえに、これらの遺伝子変異を特定することは、血栓症の予防的・治療的手段として有効な診断手法となり得る。
【００３０】
同様に、他の疾患に関連するタンパク質間相互作用についても、疾患関連遺伝的変異を特定するのに本発明の手法を用いることができることは、当業者に理解できよう。
【００３１】
また、本発明の方法により、対象とするタンパク質間相互作用の結合特性を変化（阻害または増進）させ得る化合物のスクリーニングを実施することができる。かかる化合物は、対象とするタンパク質間相互作用が関連する疾患に対する治療薬または予防薬の候補となり得る。
【００３２】
このような化合物のスクリーニングは、上記相互作用を検出するための反応条件に候補化合物を適切な濃度で添加して、相互作用に対する影響を調べることを含む。
【００３３】
該スクリーニングに用いる際の候補化合物の適切な濃度は、当業者が設定可能であるが、通常は約１０ｍＭ以下好ましくは１ｍＭ以下が適切である。化合物を加えない場合と、化合物を加えた場合との相互作用界面情報を比較して、相互作用界面のシグナル（飽和度）に差異が認められるか否かを判定し、差異が認められる場合、該化合物が相互作用に影響を与えると判断することができる。
【００３４】
さらに、予め相互作用界面に存在するアミノ酸残基を特定しておくと、そのアミノ酸残基についての化合物の存在下または非存在下でのシグナル（飽和度）の変化を検出することによって、界面に存在する特定のアミノ酸残基に対する化合物の影響を調べることができ、所望であればこのような化合物をスクリーニングすることができる。
【００３５】
例えば、後述の実施例において、コラーゲンと相互作用する界面に存在することが分かった１１個のフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン内のアミノ酸残基の少なくとも１個についてのシグナルを、化合物の存在下および非存在下で比較して、飽和度、すなわちラジオ波照射を行ったときと行わないときのＨＳＱＣシグナルの強度比の差異の有無を判定すればよい。ここで差異が検出された化合物は、遺伝性止血性疾患または血栓症の予防または治療薬として有望である。
【００３６】
薬物スクリーニングは、ＮＭＲ分光学やＸ線結晶解析によるのではなく、電子顕微鏡等による一分子直接観測によっても可能である。即ち、例えば、生理学研究所の研究会「Ｘ線，　電子線，　光によるナノイメージング」（日時：１９９８年７月９日（木）１３時　−　１０日　（金）１５時、場所：岡崎国立共同研究機構・生理学研究所（１階会議室））世話人：木原　裕（関西医科大学物理学教室）、永山　国昭（生理学研究所）両博士）で明らかにしているように、「近年Ｘ線顕微鏡の発達が著しい。現在　３０　ｎｍ　の分解能でウエットな細胞をそのまま観測できる水準に到達した。既に一分子の可視化を可能にしている光学顕微鏡などと相まって，　細胞のナノイメージングに大きな進歩を遂げようとしている。」状況にあり、一分子イメージングによってターゲットに結合する薬物を選別することが可能になる。また、科学技術振興調整費によって（平成４年度〜６年度（第Ｉ期）・平成７年度〜平成９年度（第ＩＩ期））６年間にわたって（第ＩＩ期平成７〜９年度）実施された「生体ナノ機構の解明のための基盤技術の開発に関する研究」「生体ナノ機構の解明のための基盤技術の開発」の成果報告書（平成１０年１２月科学技術庁研究開発局）によれば、「本総合研究から広がった生体ナノ機構の研究法ナノバイオロジーの研究手法がライフサイエンスの様々な研究分野で使用されるようになってきた。一分子観察／操作や一分子生化学、生体系のナノメートル解析というようなタイトルの講演会や学会のシンポジウムが頻繁に開かれるようになり、本総合研究の班員が、各所で講師として活躍している。本総合研究がきっかけとなって開発された装置が市販されるようになったケースも何件もある。これらを通じて、生体ナノ機構の研究の輪がどんどん広がっていくように思われる。現在のライフサイエンスを特徴づける最も重要なキーワードは「分子間相互作用」である。本総合研究で開発された１分子レベル／ナノメートルの空間精度／ピコニュートンレベルでの生体分子の操作技術は、分子間相互作用を、物理化学の言葉ではなく、力学の言葉で非常に直接的に語ることを可能にしつつある。さらに、本研究を含めた新しい研究法の発展によって明らかになってきたように、分子間相互作用を確率過程論的に記述することが出来るようになりつつある。これによって、我々は、生体分子装置の形成機構と作動機構のエッセンスに迫ることが可能になってきた。これが、最も本質的な意味での波及効果だと考えられる。」とされており、今回明らかにしたような相互作用界面情報に基づき、分子間相互作用の観測がより円滑に進めることができることが期待される。また、ウエット実験によらずにコンピュータ上での仮想的ドライスクリーニングを行う上でも、今回明らかにしたような情報は有用な筈である。
【００３７】
【実施例】
以下、コラーゲンとフォンヴィルブランド因子を用いた実施例により、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００３８】
実施例１　Ａ３ドメイン大腸菌大量発現系の構築
ｖＷＦ（Ｈｕｍａｎ）のｃＤＮＡ断片から、両端に制限酵素（ＲｃｏＲＶ・ＢａｍＨＩ）部位が付加されたプライマーを用いてＡ３ドメイン（９２０−１１１１）に対応する領域をＰＣＲにより増幅し、制限酵素処理を行った後、発現用のベクターｐＥＴ−４２ｂに組み込んだ。この発現系では、目的タンパク質のＮ末端側にＧＳＴ（グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ）タグとＦａｃｔｏｒ　Ｘａ切断部位が付加される。得られたベクターのＤＮＡシークエンスを確認後、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。大量培養は培養液のＯＤ６００が０．６のときＩＰＴＧを加え、その後２５℃で一晩培養した。培養後は菌体を超音波破砕し、遠心分離後の上清画分をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂアガロースカラムによる精製を行った。ＧＳＴタグをＦａｃｔｏｒ　Ｘａで酵素消化し、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂアガロースカラム・ＭｏｎｏＱ陰イオン交換カラムにより精製を行った。
【００３９】
実施例２　ＳＰＲ法によるコラーゲン結合活性の検討
固定化されたタイプＩＩＩコラーゲンに対するリコンビナントＡ３ドメインの結合定数がＳＰＲ法により調べられた。結合・解離過程ともに速度論的なデータを得ることができないほど速かったため、平衡法による解析を行った結果、１５ｕＭのＫｄ値をｐＨ７．０において得た。この値は以前ＥＬＩＳＡにより見積もられた値とほぼ同等であった。次に、結合定数のｐＨ依存性を調べたところ、Ａ３ドメインとコラーゲンの相互作用は低ｐＨでは弱くなり、５．５以下ではほとんど完全に失われることが見出された。
【００４０】
実施例３　Ａ３ドメイン主鎖シグナルの帰属
Ａ３ドメイン主鎖シグナル帰属を行うため、均一１３Ｃ，１５Ｎ標識サンプルを用いて、ＨＮＣＡ・ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ・ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨの三重共鳴実験を行った。また均一２Ｈ，１３Ｃ，１５Ｎ標識サンプルを用いて、ＨＮＣＡＣＢ実験を行った。また、アミノ酸選択的に主鎖１５Ｎ標識したサンプルも幾つか調製した。以上のＮＭＲ測定を行った結果、Ａ３ドメインの主鎖シグナルをほぼ完全に帰属することに成功した。
【００４１】
実施例４　転移交差飽和実験
ＴＣＳ実験用に、均一２Ｈ，１５Ｎ標識されたＡ３ドメインとフィブリルを形成した非標識のコラーゲンの混合サンプルを準備した。Ａ３ドメインのコラーゲン結合部位同定のために行ったＴＣＳ実験の概略は以下のとおりである。まず、脂肪族領域のプロトン選択的にラジオ波を照射することにより、コラーゲン分子のプロトンのみを選択的に飽和した。この飽和はスピン拡散現象によりコラーゲン分子全体に広がることに加えて、コラーゲン分子に結合したＡ３ドメインの特に界面近傍にも伝播される。図１のＳＰＲのセンサーグラムにも示すように、Ａ３ドメインとコラーゲンはＮＭＲタイムスケールにおいて速い結合と解離を繰り返していることから、遊離の状態におけるＡ３ドメインのシグナルを観測することにより、結合状態において転移された飽和の影響を観測することができる。なお、図１において、ＳＰＲのセンサーグラムの形がこのような「箱型」であることは、解離速度が大きく、速い交換系にあることを示す。即ち、このような箱型の場合、ＳＰＲの解離相の速度論的解析が困難であることから、解離速度定数は十分１ｓ−１以上であると予測され、Ａ３ドメインのコラーゲン結合の滞在時間は１秒以下であり、ＮＭＲの飽和時間（１秒程度）に比して十分短いと考えられ、結合状態で受けた交差飽和の影響を、遊離の状態で効率よく観測できる。つまり、選択的飽和を行ったときと行わないときでＨＳＱＣスペクトルを測定し、その結果得られる２つのスペクトル（図２）間で相互に対応するシグナルの強度比を見積もることにより、Ａ３ドメインのコラーゲン結合部位に近接する残基を同定することが可能となる。
【００４２】
本実験においては、十分な遊離状態のＡ３ドメインのシグナルを観測するため、Ａ３ドメインとコラーゲンのモル比を１：０．１、ｐＨ６．０（結合定数６．５　ｘ　１０４に対応）に調整した。フィブリル型コラーゲン存在・非存在下のＨＳＱＣスペクトルのシグナルパターンはほとんど同一であったことから、遊離の状態のＡ３ドメインのみが観測されていることが確認された。溶媒のプロトン密度は１０％に下げることにより、Ａ３ドメイン内の交換可能なアミドプロトンを介したスピン拡散の抑制を行った。
【００４３】
実施例５　Ａ３ドメインにおけるコラーゲン結合部位
図３に示すような原理に基づき、フィブリル型コラーゲン存在下におけるＡ３ドメインの１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣスペクトルを、ラジオ波照射を行ったときと行わないときのそれぞれについて測定し、ピーク強度の減少率を各残基ごとに計算し、図４のような結果を得た。０．４以上の極めて強いシグナル減衰率が観測されたシグナルはＩ９７８、Ｖ９８０、Ｖａｌ１０１５、Ｒ１０１６、Ｙ１０１７であり、０．３から０．４の顕著なシグナル減衰が観測されたのはＴ９７７、Ｄ９７９、Ｌ９９４、Ｑ９９９、Ｆ１０１３、Ｈ１０２３をはじめとする残基であった。図５のように、これらの残基をＡ３ドメインの立体構造上にマッピングするとこれらの残基はＡ３ドメインのひとつの領域に集中して分布していることが明らかとなった。よってこの結果から、コラーゲンはＡ３ドメインの分子の前面をヘリックス３−ストランドＣ−へリックス４を横断するように結合していることが示された。興味深いことに、Ａ３ドメイン表面構造において、顕著なシグナル減衰が見られた残基が集中する領域には、コラーゲンのトリプルへリックス構造を収容することが可能な溝が形成されていることが観察された。
【００４４】
実施例６　変異体実験（血栓止血評価）
ＴＣＳの結果を評価し、Ａ３ドメインによるコラーゲン認識様式をさらに追求するため、Ａ３ドメインの推定されるコラーゲン結合部位の表面残基に対するアミノ酸変異導入を行った。ＴＣＳ実験の結果と一致して、コラーゲン結合溝を形成する残基（Ｔ９７７、Ｉ９７８、Ｄ９７９、Ｐ９８１、Ｖ９９７、Ｆ１０１３、Ｒ１０１６、Ｙ１０１７、Ｈ１０２３）への変異導入はいずれも５０％以上の結合定数の減少が確認された。特にＤ９７９ＡとＨ１０２３Ａの各変異体ついては、５％以下まで結合定数が劇的に減少した。他の変異体とは異なり、Ｌ９９４Ａはおよそ５倍の活性上昇が観測された。一方、ＭＩＤＡＳ配列に対応するＳ９３８のＡｒｇへの置換はコラーゲン結合には変化を及ぼさなかった。ドメイン底部への変異Ｒ９６３Ａも野生型と同等の結合定数を保っていた。以上の結果はＴＣＳ実験の結果を完全に支持する。
【００４５】
実施例７　Ｓ９６８と同様な意味を有するアミノ酸残基の抽出
上述したように、止血障害の患者においてＳ９６８がＴｈｒに置換されていること、またこの変異ｖＷＦはコラーゲンへの結合活性が野生型と比較して減弱していることが報告されており、図６に示すように、Ｓ９６８は本研究において同定したコラーゲン結合表面のすぐ背後に位置している。即ち、二つの残基は、互いに下記のような共通に近い５つの残基があり、Ｓ９６８とＶａｌ５８（Ｖ９８０）とは水素結合を形成するなどして互いに緊密な関係にある。
【００４６】
以下の距離表示では、残基番号（−９２２）、アミノ酸名、原子名、残基番号（−９２２）、アミノ酸名、原子名、相互の距離（Å）の順に記載されている。
Ｉ５６（Ｉ９７８）
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　４７　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　６．３０
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　４８　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　４．４２
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　３．７９
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　５８　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　５．７０
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　５．９６
Ｓ４６（Ｓ９６８）
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　４７　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　３．８３
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　４８　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　６．６５
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　７．７６
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　５８　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　５．０５
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　５．０８
【００４７】
そこで、界面に位置するアミノ酸残基のＣα原子の中で、Ｓ９６８のそれとの距離が最も短いのはどれで、何Åか（以下では、ＸÅとする）を明らかにすることとした。界面に存在する残基は、論文におけるｃｒｏｓｓ．ｓａｔ．の値が０．３以上で分子表面にあるものは次の１１残基である。
Ｔ９７７，　Ｉ９７８，　Ｄ９７９，　Ｐ９８１，　Ｌ９９４，　Ｖ９９７，　Ｑ９９９，　Ｆ１０１３，　Ｒ１０１６，　Ｙ１０１７，　Ｈ１０２３
用いたＰＤＢ座標は、１ＡＯ３で、但し、ここでは，Ｓ９６８＝Ｓ４６となる（要確認）。使用ソフトはＭＯＬＭＯＬである。まず、Ｓ４６のＣα（ＣＡ）原子から８Å以内に存在するＣα原子をリストアップすると、以下の通りである。
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　６　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　７．８６
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　７　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　６．３５
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　８　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　　４．７９
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　９　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　６．３３
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　４４　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　　６．９２
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　４５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　３．７７
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　４７　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　３．８３
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　４８　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　６．６５
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　　７．６７
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　７．７６
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　５８　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　５．０５
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　５．０８
４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　６０　ＴＲＰ　　ＣＡ　　　　５．７３
【００４８】
界面残基のうち，最も近いものは，Ｉ５６（Ｉ９７８）であり，その距離は７．６７Åであることが分かる。相互作用における変動や実験誤差として０．５Åを加えた範囲で、類例を探すこととした。即ち、上記１１残基について、界面に位置するアミノ酸残基のＣα原子との距離が８．１７Å以内である様なアミノ酸残基名（残基番号、アミノ酸名）を網羅する。
【００４９】
尚、下記リストの残基番号については，ＰＤＢのものである。論文（ＪＢＣ，２７２，２５６１２〜２５１６７（１９９７）等）のものにそろえる場合は、９２２を加えて読み替える。
Ｔ５５（Ｔ９７７）
５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　４７　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　８．８１
５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　４８　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　５．５５
５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　４９　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　　５．７２
５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　５０　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　６．６４
５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　５１　ＧＬＹ　　ＣＡ　　　　８．６８
５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　５３　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　　６．３１
５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　５４　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　　３．８０
５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　　３．７９
５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　６．２１
５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　７９　ＧＬＵ　　ＣＡ　　　　８．１２
Ｉ５６（Ｉ９７８）
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　７．６７
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　４７　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　６．３０
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　４８　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　４．４２
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　４９　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　　６．８７
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　５４　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　　６．８７
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　　３．７９
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　３．７９
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　５８　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　５．７０
５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　５．９６
Ｄ５７（Ｄ９７９）
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　７．７６
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　４７　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　５．７５
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　４８　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　５．５５
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　４９　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　　７．５６
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　５５　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　　６．２１
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　　３．７９
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　５８　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　３．８２
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　６．３３
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　７．１４
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　７３　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　７．２４
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　７５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　８．８５
５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　７６　ＭＥＴ　　ＣＡ　　　　６．７７
Ｐ５９（９８１）
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　４５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　７．９６
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　４６　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　５．０８
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　４７　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　６．８３
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　４８　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　８．０７
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　５６　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　　５．９６
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　６．３３
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　５８　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　３．８５
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　６０　ＴＲＰ　　ＣＡ　　　　３．８０
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　６１　ＡＳＮ　　ＣＡ　　　　６．３６
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　６２　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　６．８５
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　　８．１３
５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　１０２　ＧＬＹ　　ＣＡ　　　　８．０６
Ｌ７２（Ｌ９９４）
７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　７．１４
７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　５８　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　６．４５
７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　６８　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　　６．６１
７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　６９　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　５．２５
７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　７０　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　５．４４
７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　７１　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　３．８２
７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　７３　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　３．８０
７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　７４　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　５．４１
７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　７５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　５．４０
７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　７６　ＭＥＴ　　ＣＡ　　　　６．７９
Ｖ７５（Ｖ９９７）
７５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　５７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　８．８５
７５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　７０　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　８．７０
７５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　７１　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　６．３５
７５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　７２　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　５．４０
７５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　７３　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　５．３５
７５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　７４　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　３．７６
７５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　７６　ＭＥＴ　　ＣＡ　　　　３．８５
７５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　７７　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　　６．５４
Ｑ７７（Ｑ９９９）
７７　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　１３　ＧＬＹ　　ＣＡ　　　　８．３３
７７　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　２２　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　７．９３
７７　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　２３　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　８．５７
７７　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　７３　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　８．８５
７７　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　７４　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　８．４９
７７　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　７５　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　６．５４
７７　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　７６　ＭＥＴ　　ＣＡ　　　　３．８１
７７　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　７８　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　３．７７
７７　ＧＬＮ　　ＣＡ　　　７９　ＧＬＵ　　ＣＡ　　　　６．３５
Ｆ９１（Ｆ１０１３）
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　５４　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　　７．２８
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　８６　ＧＬＹ　　ＣＡ　　　　８．７４
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　８７　ＡＳＰ　　ＣＡ　　　　６．２２
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　８８　ＡＬＡ　　ＣＡ　　　　５．０４
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　８９　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　５．３３
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　９０　ＧＬＹ　　ＣＡ　　　　３．７９
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　９２　ＡＬＡ　　ＣＡ　　　　３．８１
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　９３　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　５．５７
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　５．４２
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　６．２５
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　９６　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　８．５８
９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　１２６　ＡＬＡ　　ＣＡ　　　　８．４５
Ｒ９４（Ｒ１０１６）
９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　８９　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　８．６８
９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　９０　ＧＬＹ　　ＣＡ　　　　６．５５
９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　５．４２
９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　９２　ＡＬＡ　　ＣＡ　　　　５．５０
９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　９３　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　３．７９
９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　３．８３
９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　９６　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　５．２６
９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　９７　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　　５．１０
９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　９８　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　５．７２
９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　１２９　ＡＬＡ　　ＣＡ　　　　８．７５
９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　１３０　ＡＬＡ　　ＣＡ　　　　８．９７
Ｙ９５（Ｙ１０１７）
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　　８　ＩＬＥ　　ＣＡ　　　　８．９２
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　９０　ＧＬＹ　　ＣＡ　　　　８．８１
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　９１　ＰＨＥ　　ＣＡ　　　　６．２５
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　９２　ＡＬＡ　　ＣＡ　　　　５．１６
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　９３　ＶＡＬ　　ＣＡ　　　　５．５９
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　９４　ＡＲＧ＋　ＣＡ　　　　３．８３
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　９６　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　３．７８
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　９７　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　　５．５８
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　９８　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　５．１９
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　９９　ＧＬＵ　　ＣＡ　　　　８．６５
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　１００　ＭＥＴ　　ＣＡ　　　　８．９９
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　　６．９２
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　１０２　ＧＬＹ　　ＣＡ　　　　８．６４
９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　１０３　ＡＬＡ　　ＣＡ　　　　７．４２
Ｈ１０１（Ｈ１０２３）
１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　　５９　ＰＲＯ　　ＣＡ　　　　８．１３
１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　　６０　ＴＲＰ　　ＣＡ　　　　６．８０
１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　　６１　ＡＳＮ　　ＣＡ　　　　８．００
１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　　９５　ＴＹＲ　　ＣＡ　　　　６．９２
１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　　９６　ＬＥＵ　　ＣＡ　　　　８．３７
１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　　９７　ＴＨＲ　　ＣＡ　　　　８．７３
１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　　９８　ＳＥＲ　　ＣＡ　　　　５．７７
１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　　９９　ＧＬＵ　　ＣＡ　　　　５．８０
１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　１００　ＭＥＴ　　ＣＡ　　　　３．８２
１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　１０２　ＧＬＹ　　ＣＡ　　　　３．７５
１０１　ＨＩＳ＋　ＣＡ　　　１０３　ＡＬＡ　　ＣＡ　　　　５．９４
【００５０】
以上から、Ｓ９６８とＩ９７８との距離７．６７Åに変動を考慮に入れて０．５Å加えた８．１７Åの範囲で探索した結果、まず、Ｔ９７７との距離関係からは、Ｌ９７０、Ｑ９７１、Ｙ９７２、Ｉ９７５、Ｔ９７６、Ｅ１００１が見出される。次に、Ｉ９７８とでは、Ｓ９６８は公知であるが、Ｖ９６９、Ｖ９８０が追加される。Ｄ９７９とでは、Ｖ９９５、Ｍ９９８が、Ｐ９８１とでは、Ｖ９６７、Ｗ９８２、Ｎ９８３、Ｖ９８４、Ｇ１０２４が、Ｌ９９４とでは、　Ｈ９９０、Ｌ９９１、Ｌ９９２、Ｓ９９３、Ｄ９９６が新たに追加される。Ｖ９９７とでは、付け加えるものはない。Ｑ９９９とでは、Ｐ９４４、Ｒ１０００が、Ｆ１０１３とでは、Ｄ１００９、Ａ１０１０、Ｌ１０１１、Ｇ１０１２、Ａ１０１４、Ｖ１０１５が、Ｒ１０１６とでは、Ｌ１０１８、Ｔ１０１９、Ｓ１０２０が、Ｙ１０１７とでは、Ａ１０２５が、Ｈ１０２３とでは、Ｅ１０２１、Ｍ１０２２が重複しないものとして、それぞれ追加される。結局、下記の３４残基が見出された。
Ｐ９４４、Ｖ９６７、Ｖ９６９、Ｌ９７０、Ｑ９７１、Ｙ９７２、Ｉ９７５、Ｔ９７６、Ｖ９８０、Ｗ９８２、Ｎ９８３、Ｖ９８４、Ｈ９９０、Ｌ９９１、Ｌ９９２、Ｓ９９３、Ｖ９９５、Ｄ９９６、Ｍ９９８、Ｒ１０００、Ｅ１００１、Ｄ１００９、Ａ１０１０、Ｌ１０１１、Ｇ１０１２、Ａ１０１４、Ｖ１０１５、Ｌ１０１８、Ｔ１０１９、Ｓ１０２０、Ｅ１０２１、Ｍ１０２２、Ｇ１０２４、Ａ１０２５
【００５１】
これらのアミノ酸については、常法に従って、アラニン・スキャンニングを行い、その重要性を確認する意義がある。
【００５２】
結論および考察
上記ＴＣＳ実験の結果、Ａ３ドメインのインタクトコラーゲンに対する結合部位を明確に決定することに成功した。また、変異体実験の結果から、Ｄ９７９とＨ１０２３がコラーゲン認識において極めて重要な役割を果たしていることも明らかとなった。Ｄ９７９ＡのＨＳＱＣスペクトルのシグナルパターンが野生型のパターンと大きく異なることから、Ｄ９７９への変異は分子全体にわたって劇的な構造変化が誘起されることが示された。またＳＰＲの実験で結合定数に塩濃度依存性が観測されないことも考慮に入れると、Ｄ９７９はコラーゲン結合溝を含めたＡ３ドメインの全体構造を維持するために不可欠であると考えられる。
【００５３】
変異体の解析において、Ｈ１０２３Ａは野生型と比較しておよそ２桁の親和性減少を示した。ＳＰＲの結果でｐＨ５．５以下においてＡ３ドメインのコラーゲン結合活性が失われたこと、またＮＭＲ化学シフト摂動実験により決定されたＨｉｓ１０２３側鎖のｐＫａがおよそ５．８であることは、デプロトネート型Ｈｉｓ１０２３側鎖とコラーゲン分子の間に形成される水素結合が結合の主要な駆動力であることを示唆する。先に述べたＡ３ドメインとＲＵ５の結晶構造においてもインタクトｖＷＦのＨ１０２３Ａ変異体が作製され、Ａ３欠失変異体と同程度まで結合が損なわれることが報告されているが、本実験の結果より明確に解釈できる。下でも述べるように、Ｌ９９４は野生型と比較して５倍のコラーゲンに対する親和性を示したが、これは結合状態における立体障害がアラニンのような小さい残基に置換したことで解消されたためではないかと考えられる。
【００５４】
最近、止血障害の患者においてＳ９６８がＴｈｒに置換されていること、またこの変異ｖＷＦはコラーゲンへの結合活性が野生型と比較して減弱していることが報告された。Ｓ９６８は本研究において同定したコラーゲン結合表面のすぐ背後に位置している。よってこの変異導入によりコラーゲン結合溝の構造が乱されたことが病因であることが予測される。
【００５５】
Ａ３ドメインのコラーゲン結合溝の特徴として、疎水性の残基を多く含むことと、α２−Ｉドメインなどと比較して溝の深さが浅いことが挙げられる。相補的に、Ａ３ドメインが認識するコラーゲン領域は疎水的でかさ高い残基が少ない領域であることが予測される。このようなコラーゲン認識部位の特徴は、同じく血液凝固にかかわる他の２つの血小板膜上受容体と明確に異なっている。すなわち、インテグリンのα２−ＩドメインがコラーゲンのＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇという配列を認識し、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＰ）　ＶＩがＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐというコラーゲン配列の領域を認識する。このようなコラーゲン結合タンパク質のコラーゲン認識様式の多様性は、コラーゲン結合部位を競合的にふさぐことを回避することになり、これらの受容体が協奏的に血小板粘着を実行するうえで、有利になると思われる。
【００５６】
今回の結果に基づいて、我々はコラーゲンのトリプルへリックスがＡ３ドメインの前面に結合していると結論した。α２−Ｉドメイン（おそらくは他のＩドメインも）がコラーゲン分子を、ＭＩＤＡＳモチーフを含むドメインの’ｔｏｐ’　ｆａｃｅ（上面）で認識するのに対して、Ａ３ドメインがコラーゲンを分子の’ｆｒｏｎｔ’　ｆａｃｅ（前面）で認識するのは極めて興味深い。これまでにも、同じフォールドをもつタンパク質が異なるリガンドと結合するということは、数多く報告されているが、このケースは、同じフォールドで同じ分子をリガンドとするタンパク質が異なった認識部位を持っているという、初めての例である。ＶＷＡドメインの系統樹による解析から、インテグリンのＩドメインとｖＷＦ−Ａ３ドメインは進化の過程においてコラーゲン結合能を獲得する前に分かれたものと考えられている。このことが、Ａ３ドメインとＩドメインの間でコラーゲン結合部位と表面残基の性質に違いがある理由なのかもしれない。
【００５７】
本研究では、Ａ３ドメインにおけるフィブリル型コラーゲンとの相互作用部位を、ＴＣＳ法を利用して決定することに成功した。ＴＣＳ法は複合体の分子量によらず結合残基を同定可能な手法として提示されたが、本実験によりそれを実証することができた。本手法はコラーゲン結合タンパク質のコラーゲン結合部位を同定する場合のみならず、巨大タンパク質または不溶性の生体物質（細胞外マトリックス、細胞組織、細胞）と相互作用しているタンパク質の相互作用界面を決定する場合においても、非常に強力なテクニックとなることは間違いない。
【００５８】
ＮＭＲ構造解析によるタンパク質複合体の界面情報の取得は、本発明者の内の一人が発明し出願公開されている方法（特開２００２−３１６１０）または本明細書中に開示する新規ＴＣＳ法で行う。
尚、本研究で得た相互作用界面情報に基づけば、計算機での薬物スクリーニングも実施可能となる。
【００５９】
【発明の効果】
以上に示すように、本発明によると、疾患に関連するタンパク質間相互作用界面に存在し、該相互作用に直接的に関与するアミノ酸残基を特定することにより、疾患に対する治療または予防薬となり得る化合物の、設計、探索、評価が容易かつ精密に実施できる。さらに、疾患の遺伝的要因となり得る遺伝子変異の探索指標がもたらされる。さらに、上記実施例により、コラーゲンとフォンヴィルブランド因子との相互作用に関与するフォンヴィルブランド因子Ａ３ドメイン中のアミノ酸残基が特定され、血栓症または止血性疾患の治療または予防薬となり得る化合物のスクリーニングの標的が提供された。
【００６０】
【配列表】
2004085206.tif 000002
2004085206.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメインとコラーゲンとの系のＳＰＲデータである。
【図２】図２は、ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。濃い四角は、照射時（右）と非照射時（左）のシグナル強度減衰率が０．４を超えているピークを示す。
【図３】図３は、ＴＣＳ実験の原理を示す模式図である。
【図４】図４は、ＴＣＳ実験の結果を示す棒グラフである。
【図５】図５は、ＴＣＳ実験の結果を立体構造へのマッピングしたイメージ図である。
【図６】図６は、フォンヴィルブランド因子Ａ３ドメインのＳ９６８残基の位置を立体構造の模式図中に示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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