(57)【要約】      （修正有）【課題】特に、オオムギにおいて非背地性遺伝子の座乗位置を特定することが可能な遺伝マーカーと、その利用法とを提供する。【解決手段】３０種類の特定塩基配列で示される塩基配列の群から選択される少なくとも一つの塩基配列またはその一部を有するオリゴヌクレオチドからなり、当該塩基配列中に、オオムギ染色体の塩基配列中に存在する塩基置換を含んでいる。この遺伝マーカーを用いれば、オオムギ染色体の遺伝子地図を作成することが可能となり、この遺伝子地図を用いれば、植物染色体から非背地性遺伝子の座乗位置を特定することが可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１ないし３０で示される塩基配列の群から選択される少なくとも一つの塩基配列またはその一部を有するオリゴヌクレオチドからなり、
当該塩基配列中に、オオムギ染色体の塩基配列中に存在する塩基置換を含んでいることを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項２】
上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１ないし３０で示される塩基配列において１個または数個の塩基配列が置換、欠失、挿入、および／または付加された塩基配列を有していることを特徴とする請求項１に記載の遺伝マーカー。
【請求項３】
請求項１または２に記載の遺伝マーカーを少なくとも含み、オオムギ染色体の遺伝子地図の作成に用いられることを特徴とする遺伝マーカー群。
【請求項４】
さらに、制限酵素断片長多型マーカーおよびマイクロサテライトマーカーの少なくとも一方を含むことを特徴とする請求項３に記載の遺伝マーカー群。
【請求項５】
さらに、オオムギの３Ｈ染色体に位置付けられる遺伝マーカーを含むことを特徴とする請求項３または４に記載の遺伝マーカー群。
【請求項６】
請求項３ないし５の何れか１項に記載の遺伝マーカー群を用いて作成されることを特徴とするオオムギ染色体の遺伝子地図。
【請求項７】
少なくとも、請求項１または２に記載の遺伝マーカーを用いて、植物染色体から非背地性遺伝子の座乗位置を特定する工程を含むことを特徴とする非背地性遺伝子の単離方法。
【請求項８】
上記遺伝マーカーをプライマーまたはプローブとして用いることを特徴とする請求項７に記載の非背地性遺伝子の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規遺伝マーカーおよびその利用法に関するものであり、特に、オオムギ等のイネ科植物における非背地性遺伝子の染色体上の座乗位置を特定するために好適に用いられる遺伝マーカーと、その利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、イネ科植物は重力に逆らい生育するが、イネ科植物の変異体には、重力に逆らって生育する形質を示さないものが存在する。このような変異体は、“地に這いつくばる”形質を有しており、この形質を、以下の説明では「非背地性」と称する。
【０００３】
非背地性変異体はイネ、トウモロコシ、オオムギ等で報告されている。この非背地性形質を示す遺伝子は、イネでは第１１染色体、トウモロコシでは第４染色体（非特許文献１参照）に位置しており、さらに、オオムギでは、非背地性に関与する遺伝子が３Ｈ染色体短腕（非特許文献２参照）に座乗すると報告されている。
【０００４】
ここで、上記非背地性遺伝子について、イネ・トウモロコシ・コムギ連においてゲノム間の相同性を見てみると、イネとトウモロコシではゲノム間に相同性が見られるが、コムギ連では相同性が見られないことが知られている（非特許文献３参照）。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｊｅｎｋｉｎｓ，  ＭＴ，  Ｆ．  Ｇｅｒｈａｒｂａｒ，  Ｉｏｗａ  Ａｇｒｉｃ  Ｅｘｐ．  Ｓｔｎ．  Ｒｅｓ．  Ｂｕｌｌ．  １３８（１９３１）：１２１−１５１
【０００６】
【非特許文献２】
Ｔａｋｅｏ  Ｋｏｎｉｓｈｉ，  Ｊｉｒｏ  Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｉｓａｍｕ  Ｍｏｒｉｙａ，  Ｒｙｕｈｅｉ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｂｅｒ．  Ｏｈａｒａ  Ｉｎｓｔ．  Ｌａｎｄｏｗ  ．Ｂｉｏｌ．，  Ｏｋａｙａｍａ  Ｕｎｉｖ．  １８  （１９８４）：  ２５１−２６４
【０００７】
【非特許文献３】
Ｋａｔｒｉｅｎ  Ｍ．  Ｄｅｖｏｓ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｄ．  Ｇａｌｅ，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３５（１９９７）：３−１５
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
オオムギにおいては、上記非背地性遺伝子の厳密な位置は特定されていない。また、上述したように、非背地性遺伝子に関しては、オオムギの属するコムギ連では、イネ・トウモロコシとはゲノム間の相同性が見られない。それゆえ、コムギ連において非背地性遺伝子を特定するには、独自の遺伝マーカーを用いることが好ましいと考えられる。しかしながら、これまで、オオムギでは非背地性遺伝子の位置を特定するためのマーカーについては知られていなかった。
【０００９】
一般に、新たな遺伝子型の創出を目的とする植物の育種においては、染色体の情報、特に、遺伝子地図が有用となる。遺伝子地図は、生物の遺伝情報の位置をまとめたものであって、その作成方法により、連鎖地図と物理地図との２種類に分けることができる。連鎖地図は、遺伝子や遺伝マーカー（遺伝的標的）間の組み換え価に基づいて、その配列順序と距離とを示したものである。一方、物理地図は、遺伝子やマーカーの配列順序とその距離とを染色体上の特定の領域に位置付けたもので、各遺伝子やマーカーの位置（間隔）は、染色体上の物理的な距離により表される。
【００１０】
オオムギにおいては、形態や生理学的遺伝マーカーによって連鎖地図が作成されているが、特に、ＳＮＰマーカーのような塩基配列の多型に基づくマーカーを用いて上記非背地性遺伝子の染色体上での位置を特定する遺伝子地図はこれまで作成されていない。上記非背地性という形質は、イネ科植物の成長における光や重力の影響について何らかの異常が生じていると考えられることから、オオムギにおいて非背地性遺伝子を特定すれば、光や重力の影響を考慮したオオムギの成長の制御に利用することが可能であり、ひいては、コムギ連の各種作物にも応用することが可能である。
【００１１】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、特に、オオムギにおいて非背地性遺伝子の座乗位置を特定することが可能な遺伝マーカーと、その利用法とを提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、オオムギゲノムの大部分をカバーするＲＦＬＰマーカーをＳＴＳ化することにより得られる遺伝マーカーを用いることにより、上記課題を達成することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１ないし３０で示される塩基配列の群から選択される少なくとも一つの塩基配列またはその一部を有するオリゴヌクレオチドからなり、当該塩基配列中に、オオムギ染色体の塩基配列中に存在する塩基置換を含んでいることを特徴としている。この上記遺伝マーカーにおいては、上記オリゴヌクレオチドが、配列番号１ないし３０で示される塩基配列において１個または数個の塩基配列が置換、欠失、挿入、および／または付加された塩基配列を有していてもよい。
【００１４】
また、本発明にかかる遺伝マーカー群は、上記遺伝マーカーを少なくとも含み、オオムギ染色体の遺伝子地図の作成に用いられることを特徴としている。この遺伝マーカー群は、さらに、制限酵素断片長多型マーカーおよびマイクロサテライトマーカーの少なくとも一方を含んでいてもよい。また、上記遺伝マーカー群は、さらに、オオムギの３Ｈ染色体に位置付けられる遺伝マーカーを含むことが好ましい。加えて、本発明には、これら遺伝マーカー群を用いて作成されるオオムギ染色体の遺伝子地図が含まれていてもよい。
【００１５】
さらに、本発明にかかる非背地性遺伝子の単離方法は、少なくとも、請求項１または２に記載の遺伝マーカーを用いて、植物染色体から非背地性遺伝子の座乗位置を特定する工程を含むことを特徴としている。この単離方法においては、上記遺伝マーカーをプライマーまたはプローブとして用いることができる。
【００１６】
上記構成によれば、学術上でも産業上でも有用な非背地性遺伝子を有効に単離・同定することができるだけでなく、オオムギの遺伝子地図を作成するためにも有効となる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１８】
本発明にかかる遺伝マーカーは、塩基配列中に、オオムギ染色体の塩基配列中に存在する塩基置換を含んでいるオリゴヌクレオチドである。また、本発明にかかる遺伝マーカーの利用方法としては、マッピング用の遺伝マーカー群や特定の遺伝子を単離する用途等を挙げることができる。
【００１９】
（１）本発明にかかる遺伝マーカー、およびその構造
本発明にかかる遺伝マーカーは、その塩基配列中にオオムギ染色体の塩基配列中に存在する塩基置換が含まれているオリゴヌクレオチドであればよいが、具体的には、配列番号１ないし３０で示される塩基配列の群から選択される少なくとも一つの塩基配列またはその一部を有するオリゴヌクレオチドである。すなわち、図１ないし３０に示すように、これらオリゴヌクレオチド（遺伝マーカー）には、塩基配列に多型が含まれている。
【００２０】
なお、図１ないし図３０において枠で囲まれた塩基配列は制限酵素により認識される配列であり、下線を引いた塩基配列はプライマーの配列であり、図中矢印は、プライマーを設計した方向である。これら各事項については、後述する（３）本発明にかかる遺伝マーカーの作製方法にて説明する。また、図１ないし図３０における塩基配列の多型部位では、上段が「はるな二条」種の塩基配列を示し、下段に「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」種の塩基多型のみを示している。
【００２１】
まず、図１および配列番号１に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ２０２１（３７５ｂａｓｅ  ｐａｉｒ（ｂｐと略す））には、１１６番目の塩基に一塩基多型（ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、スニップとも称する）が存在する。配列番号１ではｙで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではシトシン（Ｃ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではチミン（Ｔ）である。
【００２２】
次に、図２および配列番号２に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ８９６（６２８ｂｐ）には、５９番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２ではｒで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではアデニン（Ａ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではグアニン（Ｇ）である。
【００２３】
次に、図３および配列番号３に示す遺伝マーカー：ＡＢＧ５００（１８９ｂｐ）には、１４９番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号３ではｋで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではチミン（Ｔ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではグアニン（Ｇ）である。
【００２４】
次に、図４および配列番号４に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ９５４（３２３ｂｐ）には、２５３番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２ではｗで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではアデニン（Ａ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではチミン（Ｔ）である。
【００２５】
次に、図５および配列番号５に示す遺伝マーカー：ＡＢＧ３８７（３０４ｂｐ）には、１２８番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号５ではｒで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではグアニン（Ｇ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではアデニン（Ａ）である。
【００２６】
次に、図６および配列番号６に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ８３５（５２８ｂｐ）には、２１６番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号６ではｒで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではアデニン（Ａ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではグアニン（Ｇ）である。
【００２７】
次に、図７および配列番号７に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ２２３６（６４０ｂｐ）には、５１１番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号７ではｓで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではグアニン（Ｇ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではシトシン（Ｃ）である。
【００２８】
次に、図８および配列番号８に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ８７８（２６４ｂｐ）には、２１５番目および２１６番目の２つ塩基に連続したＳＮＰが存在する。配列番号８ではｗで示される２１５番目のＳＮＰは、「はるな二条」ではチミン（Ｔ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではアデニン（Ａ）である。また、配列番号８ではｋで示される２１６番目のＳＮＰは、「はるな二条」ではチミン（Ｔ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではグアニン（Ｇ）である。
【００２９】
次に、図９および配列番号９に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ８６５（２９８ｂｐ）には、２１９番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号９ではｍで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではシトシン（Ｃ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではアデニン（Ａ）である。
【００３０】
次に、図１０および配列番号１０に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ５０３（４１３ｂｐ）には、２８７番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号１０ではｓで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではグアニン（Ｇ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではシトシン（Ｃ）である。
【００３１】
次に、図１１および配列番号１１に示す遺伝マーカー：ＡＢＣ１５３（２９２ｂｐ）には、８７番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号１１ではｙで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではチミン（Ｔ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではシトシン（Ｃ）である。
【００３２】
次に、図１２および配列番号１２に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ２１５８−ＨＡ（５０４ｂｐ）には、２１２番目および２１３番目の２つ塩基に連続したＳＮＰが存在する。配列番号１２ではｍで示される２１２番目のＳＮＰは、「はるな二条」ではアデニン（Ａ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではシトシン（Ｃ）である。また、配列番号１２ではｙで示される２１３番目のＳＮＰは、「はるな二条」ではチミン（Ｔ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではシトシン（Ｃ）である。
【００３３】
次に、図１３および配列番号１３に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ５８４（３６５ｂｐ）には、３３６番目〜３３８番目の３つ塩基に連続したＳＮＰが存在する。配列番号１３ではｗで示される３３６番目のＳＮＰは、「はるな二条」ではチミン（Ｔ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではアデニン（Ａ）である。また、配列番号１３ではｓで示される３３７番目のＳＮＰは、「はるな二条」ではシトシン（Ｃ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではグアニン（Ｇ）である。さらに、配列番号１３ではｋで示される３３８番目のＳＮＰは、「はるな二条」ではグアニン（Ｇ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではチミン（Ｔ）である。
【００３４】
次に、図１４および配列番号１４に示す遺伝マーカー：ＡＢＧ４６０（３８０ｂｐ）には、２０７番目〜２０９番目の３つ塩基に連続したＳＮＰが存在する。配列番号１４ではｙで示される２０７番目のＳＮＰは、「はるな二条」ではチミン（Ｔ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではシトシン（Ｃ）である。また、配列番号１４ではｒで示される２０８番目のＳＮＰは、「はるな二条」ではグアニン（Ｇ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではアデニン（Ａ）である。さらに、配列番号１４ではｙで示される２０９番目のＳＮＰは、「はるな二条」ではシトシン（Ｃ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではチミン（Ｔ）である。
【００３５】
次に、図１５および配列番号１５に示す遺伝マーカー：ＢＣＤ０２６３（４６１ｂｐ）には、２０３番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号１５ではｙで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではシトシン（Ｃ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではチミン（Ｔ）である。
【００３６】
次に、図１６および配列番号１６に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ２１３８（３８０ｂｐ）には、２８９番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号１６ではｒで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではグアニン（Ｇ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではアデニン（Ａ）である。
【００３７】
次に、図１７および配列番号１７に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ９４８（２８３ｂｐ）には、１８７番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号１７ではｙで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではチミン（Ｔ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではシトシン（Ｃ）である。
【００３８】
次に、図１８および配列番号１８に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ５８（１９８ｂｐ）には、１５２番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号１８ではｙで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではシトシン（Ｃ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではチミン（Ｔ）である。
【００３９】
次に、図１９および配列番号１９に示す遺伝マーカー：ＡＢＧ１（３１９ｂｐ）には、２０７番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号１９ではｓで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではシトシン（Ｃ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではグアニン（Ｇ）である。
【００４０】
次に、図２０および配列番号２０に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ９１４（２６９ｂｐ）には、７３番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２０ではｓで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではシトシン（Ｃ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではグアニン（Ｇ）である。
【００４１】
次に、図２１および配列番号２１に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ８７７（４０７ｂｐ）には、２０２番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２１ではｓで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではシトシン（Ｃ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではグアニン（Ｇ）である。
【００４２】
次に、図２２および配列番号２２に示す遺伝マーカー：ＡＢＧ３９１（４８５ｂｐ）には、４５３番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２２ではｙで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではチミン（Ｔ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではシトシン（Ｃ）である。
【００４３】
次に、図２３および配列番号２３に示す遺伝マーカー：ｃＭＷＧ６５２（４１７ｂｐ）には、２４７番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２３ではｋで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではグアニン（Ｇ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではチミン（Ｔ）である。
【００４４】
次に、図２４および配列番号２４に示す遺伝マーカー：ＡＢＣ１７５（２７０ｂｐ）には、１２０番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２４ではｒで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではアデニン（Ａ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではグアニン（Ｇ）である。
【００４５】
次に、図２５および配列番号２５に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ９５１（４０８ｂｐ）には、２０９番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２５ではｍで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではアデニン（Ａ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではシトシン（Ｃ）である。
【００４６】
次に、図２６および配列番号２６に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ７９８（３３２ｂｐ）には、２１４番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２６ではｙで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではチミン（Ｔ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではシトシン（Ｃ）である。
【００４７】
次に、図２７および配列番号２７に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ８３６（２６１ｂｐ）には、１５３番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２７ではｋで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではグアニン（Ｇ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではチミン（Ｔ）である。
【００４８】
次に、図２８および配列番号２８に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ５１１（５６７ｂｐ）には、３８０番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２８ではｓで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではシトシン（Ｃ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではグアニン（Ｇ）である。
【００４９】
次に、図２９および配列番号２９に示す遺伝マーカー：ＭＷＧ８８９（３７７ｂｐ）には、２６２番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号２９ではｗで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではアデニン（Ａ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではチミン（Ｔ）である。
【００５０】
最後に、図３０および配列番号３０に示す遺伝マーカー：ＡＢＧ４６１（２８３ｂｐ）には、４８番目の塩基にＳＮＰが存在する。配列番号３０ではｙで示されるこのＳＮＰは、「はるな二条」ではチミン（Ｔ）であり、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」ではシトシン（Ｃ）である。
【００５１】
このように、本発明にかかる遺伝マーカーは、その塩基配列中にＳＮＰを含むオリゴヌクレオチドである。オオムギにおけるＳＮＰは、進化の過程や長年の栽培過程で突然変異によって生じたと考えられ、ビールの醸造特性や味噌等の食品の生産性、植物の病気の抵抗性等、重要な形質を決定する役割を有している。換言すれば、ＳＮＰは栽培種の個体差に大きな影響を及ぼす突然変異に関わる可能性のある多型であるため、後述する非背地性遺伝子のような任意の遺伝子について、その座乗位置を特定する等の用途に有効に利用できるだけでなく、複数の栽培種（本発明では、「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」）を鑑別するための用途等にも好適に利用することが可能となる。なお、以下の説明では、必要に応じて、本発明にかかる遺伝マーカーをＳＮＰマーカーと称する場合がある。
【００５２】
本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１ないし３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドそのものであってもよいが、その一部の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。ここでいう「一部の塩基配列」とは、上記ＳＮＰを含んでおり、遺伝マーカーとして使用可能な長さの塩基配列を示すものであり、その長さは特に限定されるものではない。
【００５３】
また、本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１ないし３０で示される塩基配列において１個または数個の塩基配列が置換、欠失、挿入、および／または付加された塩基配列を有しているオリゴヌクレオチドであってもよい。ここでいう「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、公知の人為的な手法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加される変異を意味する。また、上記変異は、人為的に導入された変異ではなくてもよい。例えば、天然に存在する植物のゲノムから同様の変異を有するオリゴヌクレオチドを単離して、本発明にかかる遺伝マーカーとして用いてもよい。
【００５４】
（２）本発明にかかる遺伝マーカーの利用法（有用性）
本発明にかかる遺伝マーカーの用途としては、遺伝子のクローニングや細胞融合、交配等の実験において目的とする遺伝子の所在を追跡するためのマーカーとして広く用いることができる。特に、本発明にかかる遺伝マーカーは、塩基配列中にＳＮＰを含んでいるので、検出が容易であるという利点がある。
【００５５】
また、本発明にかかる遺伝マーカーを用いる対象となる生物は特に限定されるものではないが、これら遺伝マーカーがオオムギ由来のものであるので、特に好ましい対象としては、オオムギおよびオオムギの属するコムギ連、イネ科植物を挙げることができる。もちろん、用途によってはイネ科植物以外の植物や場合によっては動物も対象とすることができる。
【００５６】
本発明にかかる遺伝マーカーは、それぞれ単独で上述した各種用途に用いることもできるが、特に、オオムギ染色体の遺伝子地図の作成に用いるために、複数を組み合わせて遺伝マーカー群として用いることが好ましい。本発明にかかる遺伝マーカー群をマッピングして得られた遺伝子地図は、染色体から目的とする遺伝子を特定する用途に好適に用いることができるが、本発明では、特に、非背地性遺伝子の座乗位置を特定する用途に好適に用いることができる。
【００５７】
前述したように、イネ科植物を含む多くの植物は重力に逆らい生育する。換言すれば、多くの植物は、通常、根を土壌の中に下ろす一方、茎を鉛直方向に伸ばすように生育する。茎が鉛直方向に伸びる理由は光や空気を求めるためであり、特に、茎の伸長は光に大きな影響を受けることが知られている。例えば、横の一方向からだけ光が入射する環境下で植物を生育させれば、この植物は光のある方向に茎を伸ばすように成長する。
【００５８】
また、植物の成長には重力が大きな影響を及ぼすことも知られている。例えば、植物の種子を播いて暗所で発芽させると、根は下に茎は上に伸びるが、この発芽直後の植物を抜き取って逆方向に植え替えると、短時間に根や茎は元通りの方向に生育することが知られている。また、回転する環境下で植物の種子を発芽させたときに、植物は遠心力に反応して、根を回転中心から見て外側に、茎を回転中心側に向けて伸ばすことも知られている。
【００５９】
発芽後の成長により茎が伸長して土壌から外に出る、すなわち「芽が出る」と、茎（および葉）の成長に最も大きな影響を及ぼすのは光であると考えられるが、発芽前の成長にも重力が大きな影響を及ぼすことからも明らかなように、植物の成長、特に茎の伸長は、光に加えて重力にも影響を受ける。ここで、植物の成長に対する光や重力の影響については、植物ホルモンであるオーキシンの作用によって説明することが可能である。しかしながら、植物の成長と光・重力の影響との関係については明らかではないことも多い。
【００６０】
ところで、非背地性変異体では、“地に這いつくばる”形質を示すため、変異の無い植物に比べて、成長時に光や重力による影響を受け難いのではないかと推測される。それゆえ、この非背地性を示す遺伝子（非背地性遺伝子）の機能を明らかにすることは、植物の成長の制御に応用することが可能であり、これを利用した産業（各種バイオ産業や種苗産業）への応用も見出すことができる。例えば、植物で地表を覆うカバークロップとして利用する場合、“地に這いつくばる”形質を有する植物は、より速く地表を覆って雑草の発生を抑え土壌を保護したり、建物の表面を効率よく覆って夏季の温度上昇を抑えたりすることができる。
【００６１】
このように非背地性遺伝子は、学術上でも産業上でも有用なものであり、本発明にかかる遺伝マーカーまたは遺伝マーカー群を利用すれば、少なくともオオムギから非背地性遺伝子を有効に単離することが可能となる。
【００６２】
本発明にかかる遺伝マーカー群は、前述したオリゴヌクレオチドからなる遺伝マーカーを含んでいればよいが、さらに他の遺伝マーカーを含んでいてもよい。他の遺伝マーカーとしては、染色体上で遺伝的な標識として用いることができるものであれば特に限定されないが、具体的には、例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカーやマイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ  Ｒｅｐｅａｔ）マーカー）を挙げることができる。
【００６３】
後述する（３）や実施例で説明するように、本発明では、オオムギのゲノムの大部分をカバーするＲＦＬＰマーカーを用いてＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｇｅｄ  Ｓｉｔｅ、配列認識部位）化することに遺伝マーカーを作製している。それゆえ、本発明にかかる遺伝マーカーは、ゲノム上で唯一存在するような特異的な塩基配列を含んでいるため、ＲＦＬＰマーカーやＳＳＲマーカーよりも有用性が高い。しかしながら、本発明にかかるＳＮＰマーカーと、ＲＦＬＰマーカーやＳＳＲマーカーとを組み合わせて遺伝マーカー群として用いれば、より詳細な遺伝子地図を作成することができるので、その有用性はさらに一層向上する。
【００６４】
例えば、本発明では、図３１に示すように、本発明にかかるＳＮＰマーカーと、ＳＳＲマーカー・ＲＦＬＰマーカーとを組み合わせてオオムギの遺伝子地図を作成することができる。この遺伝子地図では、１Ｈないし７Ｈの染色体について、次のように遺伝マーカーが位置付けられている。
【００６５】
まず、１Ｈ染色体については、７個の遺伝マーカーが位置付けられる。各遺伝マーカーの期待分離比との適合度のχ２  値は平均９．９５９で、最大４９．９７８、最小０．１３３となっている。また、染色体の全長は２７４．５ｃＭで、マーカー間の平均距離は３９．２ｃＭとなっている。
【００６６】
次に、２Ｈ染色体については、６個のＤＮＡマーカーが位置付けられる。各遺伝マーカーの期待分離比との適合度のχ２  値は平均２．５５２で、最大８．３６３、最小０．０３２となっている。また、染色体の全長は２４１．５ｃＭで、マーカー間の平均距離は４０．３ｃＭとなっている。
【００６７】
次に、３Ｈ染色体については、１１個の遺伝マーカーが位置付けられる。各遺伝マーカーの期待分離比との適合度のχ２  値は平均１．７８５で、最大３．８８２、最小０．２５７となっている。また、染色体の全長は１９１．４ｃＭで、マーカー間の平均距離は１７．４ｃＭとなっている。
【００６８】
次に、４Ｈ染色体については、７個のＤＮＡマーカーが位置付けられる。各遺伝マーカーの期待分離比との適合度のχ２  値は平均３．８３で、最大９．５８１、最小０．４１３となっている。染色体の全長は１２８．１ｃＭで、マーカー間の平均距離は１８．３ｃＭとなっている。
【００６９】
次に、５Ｈ染色体については、６個の遺伝マーカーが位置付けられる。各遺伝マーカーの期待分離比との適合度のχ２  値は平均１２．３９で、最大６９．２５１、最小０．０５８となっている。また、染色体の全長は９８．１ｃＭで、マーカー間の平均距離は１６．４ｃＭとなっている。
【００７０】
次に、６Ｈ染色体については、５個の遺伝マーカーが位置付けられる。各遺伝マーカーの期待分離比との適合度のχ２  値は平均２．４６８で、最大４．８４、最小０．５５２となっている。また、染色体の全長は１２０．４ｃＭで、マーカー間の平均距離は２４．１ｃＭとなっている。
【００７１】
最後に、７Ｈ染色体については、６個の遺伝マーカーが位置付けられる。各遺伝マーカーの期待分離比との適合度のχ２  値は平均２．２５２で、最大１．１０７、最小０．０３３となっている。また、染色体の全長は１４９．６ｃＭで、マーカー間の平均距離は２５．１ｃＭとなっている。
【００７２】
また、図３１に示す遺伝子地図における地図距離と、マーカー数とを次の表１に示す。
【００７３】
【表１】
2004298098.tif 000002
【００７４】
本発明にかかる遺伝マーカー群においては、非背地性遺伝子を特定する用途では、特に、オオムギの３Ｈ染色体に位置付けられる遺伝マーカーを含むことが好ましい。前述したようにオオムギにおける非背地性遺伝子は、３Ｈ染色体短腕に座乗すると報告されている。それゆえ、非背地性遺伝子を特定するために遺伝子地図を作成するには、３Ｈ染色体に位置付けられる遺伝マーカーを含む必要がある。
【００７５】
具体的には、図３２に示すように、３Ｈ染色体の遺伝子地図（全長２３１．５ｃＭ、マーカー数１１個、マーカー間の平均距離１９．２９ｃＭ）では、上述した遺伝マーカーと表現型との連鎖分析の結果、非背地性遺伝子であるｌｚｄ（ｔ）遺伝子が３Ｈ染色体の短腕に位置付けられた。この遺伝子地図に位置付けられる遺伝マーカーのうち、本発明にかかるＳＮＰマーカーは、ＭＷＧ２１５８（図１２では、ＭＷＧ２１５８Ｌ−ＨＡ）、ＭＷＧ５８４、ＡＢＧ４６０、ＢＣＤ０２６３、ＭＷＧ２１３８であり、中でも、ＭＷＧ２１５８はｌｚｄ（ｔ）遺伝子に最も近い遺伝マーカーである。
【００７６】
これまで公表されている遺伝子地図には、「Ｌｉｎａ」×Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ集団による遺伝子地図（Ｒａｍｓａｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５６（２０００）：１９９７−２００５）や形態マーカーによる遺伝子地図（非特許文献２）等が挙げられる。このうち、前者の遺伝子地図における３Ｈ染色体の全長は１８１ｃＭであり、後者の遺伝子地図における３Ｈ染色体の全長は１１１．５ｃＭである。これらに比較して、本発明の遺伝子地図では、３Ｈ染色体の全長は２３１．５ｃＭと長くなっている。これは、従来の遺伝子地図には、ｌｚｄ（ｔ）遺伝子の近傍に連鎖する遺伝マーカーがなかったためと考えられるため、この点からも本発明の有用性が明らかである。
【００７７】
オオムギｌｚｄ（ｔ）遺伝子と類似する形質を示す遺伝子は、イネでは第１１染色体に座乗し、トウモロコシでは第４染色体に座乗することが知られている。そこでこれらの植物についてゲノム間の類似性を見てみると、イネとトウモロコシとの間ではゲノムに相同性が見られるが、コムギ連ではゲノムに相同性が見られない。それゆえ、オオムギｌｚｄ（ｔ）遺伝子は、イネおよびトウモロコシとは異なる遺伝子または進化の過程でｌｚｄ（ｔ）領域が転座したものと考えられる。
【００７８】
上記のように、本発明にかかる遺伝マーカーや遺伝マーカー群を用いれば、非背地性遺伝子を特定するための遺伝子地図を作成することができるので、本発明には、上記遺伝マーカーや遺伝マーカー群を用いて、植物染色体から非背地性遺伝子の座乗位置を特定する工程を含む非背地性遺伝子の単離方法（クローニング方法）が含まれる。
【００７９】
非背地性遺伝子のクローニング方法としては、具体的には、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。例えば、本発明にかかる上記遺伝マーカーをプライマーまたはプローブとして用いることにより、非背地性遺伝子を単離すればよい。
【００８０】
（３）本発明にかかる遺伝マーカーの作製方法
本発明にかかる遺伝マーカーの作製方法は、後述する実施例で詳細に説明するように、「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」の葉から抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ＲＦＬＰを用いてＳＴＳ化することにより作製している。
【００８１】
具体的には、まず（ａ）ＰＣＲで増幅されるＤＮＡ断片を、アガロースゲルで分離し、サイズの違いにより多型の有無を検出する。次に、（ｂ）ＤＮＡ断片のサイズの違いから多型を検出できないものについては、塩基配列を決定し、制限酵素により認識される塩基配列（説明の便宜上、制限酵素サイトと称する）に多型が存在するものを見出する。そして（ｃ）制限酵素サイトに多型が存在しないものについては、新たなプライマーを設計し、多型の有無を検出する。
【００８２】
（ｂ）の過程について、制限酵素サイトに多型が存在する場合では、図１ないし図３０に示すように、制限酵素サイトを枠で囲み、当該枠の下に制限酵素の名称を記載している。また、（ｃ）の過程で用いたプライマーは、図１ないし図３０において下線で示す塩基配列となっており、当該プライマーは、ＳＮＰが３’末端に配置されるように設計している。また、設計した方向については、図中（Ｌ）・（Ｒ）および矢印で表している。
【００８３】
もちろん、本発明にかかる遺伝マーカーの作製方法は、これに限定されるものではなく、公知の他の方法を用いて作製してもよい。すなわち、本発明では、前述した遺伝マーカー（ＳＮＰマーカー）やこれを含む遺伝マーカー群を作製できるような方法であれば、どのような方法を採用してもよい。
【００８４】
【実施例】
以下の実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８５】
〔実施例１：ＳＮＰマーカーの作製〕
（１）オオムギの栽培
実験にはオオムギ品種として「はるな二条」、「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」を供試した。それぞれ健全な種子３粒を、ろ紙を１枚敷いた直径９０ｍｍのシャーレに置床し、ベンレート１，０００倍液を３ｍｌ加えて、２５℃で２４時間催芽させた種子を１／５０００ａワグナールポットに深さ１ｃｍ程度の深さに播種し育苗した。潅水は適宜行った。
【００８６】
（２）ＤＮＡの抽出
ＤＮＡ抽出用の葉のサンプリングは、下方の葉を選び５ｇ程度行った。葉は液体窒素で凍らせ、乳鉢で十分粉砕した。葉の粉を２×ＣＴＡＢ（抽出液）５ｍｌで抽出し、６５℃で３０分間振とうした。ここにクロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１を５ｍｌ加え、溶液が混ざるように反応させた。３，５００回転で１５分間遠心し上清を取った。ＲＮＡ分解酵素（１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ）５μｌを加えて３７℃で３０分間振とう後、氷上で５分間放置した。
【００８７】
抽出した液の０．６倍量の２−プロパノールを入れ、ＤＮＡを沈殿させガラス棒で巻き取った。エッペンドルチューブに入れ７０％エタノール５００μｌ加えた。１３，０００回転で５分間遠心した。エタノールを捨て、１００％アルコールを加えて再び１３，０００回転で５分間遠心した。エタノールを捨て遠心乾燥機で乾燥させた。ＴＥバッファーを入れてＤＮＡを溶かし１０ｎｇ／μｌに調製した。
【００８８】
（３）ＰＣＲ条件の設定
ＳＴＳプライマー１１８対と（１）で抽出した「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」のＤＮＡを供試した。ＳＴＳプライマーとしては、「Ｓｔｅｐｔｏｅ」×「Ｍｏｒｅｘ」、「Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ」×「ＴＲ３０６」、「Ｉｇｒｉ」×「Ｆｒａｎｋａ」のＤＨ系統でマッピングされたＲＦＬＰマーカー、「Ｓｔｅｐｔｏｅ」×「Ｍｏｒｅｘ」  ４００マーカー、「Ｈａｒｉｎｇｔｏｎ」×「ＴＲ３０６」  ２５０マーカー、「Ｉｇｒｉ」×「Ｆｒａｎｋａ」  ４００マーカーについて、シークエンス情報が既知でＳＴＳ化された内のサイズが２００ｂｐ以上でアニーリング温度が高いプライマー１１８対をランダムに選んだ。
【００８９】
プライマー特異性の高いアニーリング温度を決めると同時にＤＮＡ断片サイズの違いによる、「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」の多型を確認した。
【００９０】
ＰＣＲの反応液は１０×ＰＣＲ（Ｍｇ２＋ｂｕｆｆｅｒ濃度２０ｍＭ）、ｄＮＴＰｍｉｘ（各２．５ｍＭ）、Ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、ＴａＫａＲａＥｘ  Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、宝酒造製、５Ｕ／μｌ）、鋳型ＤＮＡを混ぜて全量１０μｌに調製した。ＰＣＲは、次の表２に示すプログラムにしたがって実施した。
【００９１】
【表２】
2004298098.tif 000003
【００９２】
電気泳動条件は１％アガロースゲルと１×ＴＡＥを使って、それぞれのＤＮＡ断片を分画した。１３５Ｖで２０分間泳動した。エチジウムブロマイドを用いて蛍光染色した核酸をトランスイルミネーター上で確認をした。ゲルの泳動像は電気泳動ゲル撮影装置を使って保存した。
【００９３】
（４）ＤＮＡマーカー（遺伝マーカー）の開発
設定した条件で「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」のＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、アガロースゲルで分画し、電気泳動ゲル撮影装置を使って保存し、保存した写真を基に多型の判断をした。保存した写真を基にＤＮＡ断片のサイズに差がない場合、ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
【００９４】
（５）塩基配列の決定方法
（５−１）ＤＮＡ断片の精製
精製にはキアゲン社製のＰＣＲスピンカラムを用いた。ＰＣＲで増幅させたＤＮＡ断片の入ったチューブに５倍量のＰＢｂｕｆｆｅｒを加えて、これをスピンカラムに載せかえて５０μｌ  ＥＢを加えた。１３，０００回転で１分間遠心した。
【００９５】
（５−２）シークエンスゲルの作製
５０ｍｌビーカーにＵｒｅａ２５ｇを量りとり、ビーカーに蒸留水で完全に溶かし５ｍｌのｌｏｎｇ  ｒａｎｇｅｒと５ｍｌの１０×ＴＡＥ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、５０ｍｌにメスアップした。それを濾過滅菌して１０％ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）２５０μｌを加えて回転混合し、ＴＥＭＥＤ  ２５μｌを加えて回転混合して、ガラス板に流しこんだ。これによりポリアクリルアミドゲル１０％、５０ｍｌのシークエンスゲルを作製した。
【００９６】
（５−３）サンプルＤＮＡの準備（シークエンスサンプルＤＮＡの蛍光標識）
蛍光標識にはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（商品名、アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００９７】
滅菌水５．５μｌ、ＢｉｇＤｙｅ  ２μｌ、反応試薬希釈バッファー（５×Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、アプライドバイオシステムズ社製）１μｌ、プライマー１μｌ、精製したＤＮＡ０．５μｌを全量で１０μｌにしてＰＣＲを行い、精製したＤＮＡ断片に蛍光色素を付加した。蛍光色素を付加したＤＮＡ断片の入った反応液に１０μｌの滅菌水を加え、３Ｍ酢酸ナトリウム２μｌと９５％エタノール５０μｌを加え、室温で１５分間放置した。新たな１．５ｍｌのエッペンドルチューブに移した。室温、１３，０００回転で２０分間遠心した。上清を取った。７０％エタノール２５０ｌを入れて軽く撹拌した。室温、１３，０００回転で５分間遠心した。上清を吸い取った。サンプルＤＮＡに５μｌのシークエンス用ＬＢを入れ混合し、１００℃で２分間置きＤＮＡの１本鎖にした後、氷上に３分間放置した。
【００９８】
（５−４）塩基配列の解析
上記サンプルをシークエンスゲルの上にのせた。シークエンス装置（３７３Ａ、アプライドバイオシステムズ社製）で２，８００Ｖ、１８時間、４０Ｗの条件で電気泳動した。塩基配列の解析はコンピューターソフトＳｅｑ  Ｅｄ（商品名）を用いて行った。「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」における多型配列および制限酵素認識配列の検索はコンピューターソフトＧｅｎｅｔｙｃ  ｍａｃ（商品名）で行った。
【００９９】
（５−５）多型の確認
制限酵素でＤＮＡ断片を処理し、電気泳動（１．５％アガロースゲル、１×ＴＡＥ、１３５Ｖ，３５分）で分画し、エチジウムブロマイドを用いて蛍光染色した。その後、電気泳動ゲル撮影装置を使って保存し、保存した写真を基に多型の判断が可能なものをＤＮＡマーカーとした。
【０１００】
設定したＰＣＲ条件でＰＣＲを行いアガロースゲルで分画し、ＤＮＡ断片サイズに差がないＤＮＡ断片に関しては塩基配列決定した。「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」で塩基配列に多型はあるが制限酵素認識配列がみられないものに関しては、多型配列が新たなプライマーの３’末端になり、「はるな二条」のＤＮＡで特異的に増幅し、さらに既存のプライマー対よりもＴｍ値が高くなるように設計した。「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」のＤＮＡを用い、新たに設計したプライマーを加えた計３種類のプライマーによるＰＣＲ条件をあらたに設定した。電気泳動（１．５％アガロースゲル、１×ＴＢＥ、１５０Ｖ６０分）で分画し、エチジウムブロマイドを用いて蛍光染色した後、電気泳動ゲル撮影装置を使って保存し、保存した写真を基に多型の判断をした。
【０１０１】
（６）結果
「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」の葉から抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、（ａ）アガロースゲルで分画し、電気泳動ゲル撮影装置を使って写真を保存し、保存した写真を基に多型の判断をした。次に、（ｂ）保存した写真を基にＤＮＡ断片のサイズに差がない場合、ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し塩基配列の多型を探した。多型部分に制限酵素認識配列があり多型が確認されるか否かを調べた。（ｃ）保存した写真を基にＤＮＡ断片のサイズに差がない場合、ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し塩基配列の多型を探した。多型部分に制限酵素認識配列がない場合新たなプライマーを設計し多型の確認できるか否かを調べた。その結果を表３〜表６に示す。
【０１０２】
なお、表５では、上段はＰＣＲのみでＤＮＡ断片の違いによる多型の確認できた個数を示し、下段はＰＣＲを行ったがＤＮＡ断片の違いによる多型の確認が不可能でありシークンスを行うことで塩基配列を決定した個数、塩基置換による多型の個数塩基置換と制限酵素認識配列が重なった個数、塩基置換部分に新たなプライマーを設計した個数をそれぞれ順に示している。
【０１０３】
また、表６では、ｃＤＮＡ由来のマーカーの個数は、表４でマーカー名がｃＭＷＧ、ＡＢＣ、ＢＣＤと表示されている個数で、ゲノムＤＮＡ由来のマーカーの個数は、同じく表４でマーカー名がＡＢＧ、ＷＧと表示されている個数を調べたものである。
【０１０４】
【表３】
2004298098.tif 000004
【０１０５】
【表４】
2004298098.tif 000005
【０１０６】
【表５】
2004298098.tif 000006
【０１０７】
【表６】
2004298098.tif 000007
【０１０８】
表３に示すように、ＤＮＡ増幅断片の確認よりアニーリング最適温度が６０℃または５５℃のものが多くみられた。また、表４に示すように、ＤＮＡ断片のサイズが最大で１，８００ｂｐ、最小で１６０ｂｐのものがみられた。表５に示すように、検出方法は制限酵素によるものが多くみられた。表６は表５の集計結果を示し、ＰＣＲでシングルバンドであるが多型の無いものは８４プライマー対みられた。８４プライマー対のうちシークエンスが可能だったのは７３プライマー対みられた。シークエンスが可能でそのうち多型がみられたのは４８プライマー対で実際に、上記（ａ）・（ｂ）のステップで多型のみられたものは、３２／４８（６６．７％）見られた。その内訳は、（ｂ）が２２／３１（７１％）であり、（ｃ）が１０／１７（５８．８％）であった。
【０１０９】
本実施例で使用したＳＴＳプライマー１１８対は、ＲＦＬＰの情報が既知で各プライマーが塩基配列のどの領域で作成されたかが分かる。それゆえ、ＳＮＰはそれらのプライマーによって増幅されたＤＮＡ断片より検出されているので、ＳＮＰがどの領域由来のものかを調べることができる。ＳＮＰマーカー由来毎におけるＳＮＰの頻度を表６である。ｃＤＮＡ由来のマーカーが４／３２（１２．５％）、ゲノムＤＮＡ由来のマーカーが２８／３２（８７．５％）見られた。
【０１１０】
さらに、塩基置換の割合を表７に示す。なお、表７では、／の左側が「はるな二条」の塩基で、／の右側が「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」の塩基を示している。また、（  ）は対応する塩基を示している。
【０１１１】
【表７】
2004298098.tif 000008
【０１１２】
多型の確認が可能なマーカーでの「はるな二条」の塩基を基準に「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」の塩基置換をみた割合で、トランジションでは、Ａ／Ｇ（Ｔ／Ｃ）１１／１８（６１．１％）、Ｃ／Ｔ（Ｇ／Ａ）７／１８（３８．９％）見られた。トランスバージョンでは、Ｃ／Ｇ（Ｇ／Ｃ）８／２０（４０％）、Ａ／Ｃ（Ｔ／Ｇ）４／２０（２０％）、Ｇ／Ｔ（Ｃ／Ａ）４／２０（２０％）、Ａ／Ｔ（Ｔ／Ａ）４／２０（２０％）見られた。合計３２プライマー対で３８個の塩基置換がみられた。
【０１１３】
上記（ａ）のステップに相当するプライマーは６対見られた。また、（ｂ）のステップに相当するプライマーは２２対見られた。（ｃ）のステップに相当するプライマーは１０対見られた。これにより、計３８プライマー対のマーカーを作製した。このうち、本発明にかかる遺伝マーカー（ＳＮＰマーカー）については、その塩基配列を配列番号１〜３０および図１〜３０に示す。
【０１１４】
〔実施例２：ＤＮＡマーカーのマッピング〕
（１）オオムギの栽培
「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」、「はるな二条」×「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」のＦ１、そのＦ２集団を供試した。
【０１１５】
「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」は３粒ずつ健全な種子を、Ｆ１は２粒の健全な種子を、Ｆ２集団９３粒の健全な種子を、ろ紙を１枚敷いた直径９０ｍｍのシャーレに置床し、ベンレート１，０００倍液を３ｍｌ加えて、２５℃で２４時間催芽させた種子を１／５０００ａワグナールポットに深さ１ｃｍ程度に播種した。潅水は適宜行った。
【０１１６】
（２）ＤＮＡの抽出
１ヶ月生育させたオオムギからそれぞれ１個体ずつエッペンドルチューブに０．０５ｇ程度の葉をサンプリングした。予備実験の結果に基づいてサンプリングした各個体の葉をホモジナイザー用いてＤＮＡを抽出することとした。
【０１１７】
サンプリングしたチューブに直接２×ＣＴＡＢ液を１００μｌ加えてホモジナイザーで押しつぶし葉の汁を出した。次に２×ＣＴＡＢ液を２００μｌ加えて混合して全量３００μｌにした。６５℃で３０分間放置した。１３，０００回転で１５分間遠心した。上清を取った。ＲＮＡ分解酵素（１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ）２μｌ加えて３７℃で３０分間放置した。抽出した液に等量の２−プロパノールを加えて混合した。１３，０００回転で１０分間遠心し２−プロパノールを捨てた。７０％エタノールを５００μｌ入れ混合した。１３，０００回転で５分間遠心しエタノールを捨てた。１００％エタノールを５００μｌ入れ混合した。１３，０００回転で５分間遠心しエタノールを捨て遠心乾燥機で乾燥させた。１００μｌのＴＥを入れてＤＮＡを溶かした。
【０１１８】
（３）ＤＮＡマーカーのマッピング
前記実施例１で作製した３６プライマー対のマーカーと染色体のアンカー役としてマイクロサテライトマーカー１２対（予備実験で「はるな二条」と「Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ」の多型が確認されているもの）、計４８対のマーカーを用いて、両親とＦ１とＦ２集団、計９６個体の各マーカーの遺伝子型を判別した。ＤＮＡマーカーの期待分離比の適合度見るためにχ２検定を行った。遺伝子型を判別できたＤＮＡマーカー４８対の連鎖分析をコンピューターソフトＭａｐｍａｋｅｒ（Ｌａｎｄｅｒ，  Ｅ．  Ｓ．，  Ｐ．  Ｇｒｅｅｎ，  Ｊ．  Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ，  Ａ．  Ｂａｒｌｏｗ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｄａｌｙ，  Ｓ．  Ｅ．  Ｌｉｎｃｏｌｎ  ａｎｄ  Ｌ．  Ｎｅｗｂｕｒｇ  （１９８７）  ＭＡＰＭＡＫＥＲ：Ａｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｍａｐｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １：１７４−１８１）で行い、連鎖地図を作成した。その結果を図３１に示す。なお、その詳細な内容については、前記実施の形態にて説明したので省略する。
【０１１９】
〔実施例３：非背地性遺伝子ｌｚｄ（ｔ）のマッピング〕
前記実施例２で用いたマッピング集団を供試した。Ｆ２集団各個体を表現型がはるな型かＳｅｒｐｅｎｔｉｎａ型かを親植物に基づいて判別した。表現型の観察数について期待分離比がはるな型：Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ型＝３：１としてχ２検定を行った。観察数に基づいて、前記実施例２で用いたＤＮＡマーカーと共に連鎖分析をコンピューターソフトＭａｐｍａｋｅｒで行い、ＤＮＡマーカーと関与遺伝子の連鎖地図の作成を試みた。
【０１２０】
Ｆ２集団各個体についての表現型、すなわちはるな型とＳｅｒｐｅｎｔｉｎａ型との分離調査の結果を表８に示す。なお、非背地性遺伝子をｌｚｄ（ｔ）遺伝子と称する。
【０１２１】
【表８】
2004298098.tif 000009
【０１２２】
表８から明らかなように、はるな型：Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ型＝６４：１８であり、χ２検定の結果０．４０７となった。このことからＳｅｒｐｅｎｔｉｎａ型は劣性遺伝子によるものであることが明らかとなった。
【０１２３】
また、実施例２で用いたＤＮＡマーカーと表現型との連鎖分析の結果、上記ｌｚｄ（ｔ）遺伝子は３Ｈ染色体の短腕に位置付けられた。その結果を図３２に示す。なお、図３２に示す３Ｈ染色体の遺伝子地図の詳細については、前記実施の形態にて説明したので省略する。
【０１２４】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１ないし３０で示される塩基配列の群から選択される少なくとも一つの塩基配列またはその一部を有するオリゴヌクレオチドからなり、当該塩基配列中に、オオムギ染色体の塩基配列中に存在する塩基置換を含んでいる。この遺伝マーカーを用いれば、オオムギ染色体の遺伝子地図を作成することが可能となり、この遺伝子地図を用いれば、植物染色体から非背地性遺伝子の座乗位置を特定することが可能となる。
【０１２５】
その結果、本発明では、学術上でも産業上でも有用な非背地性遺伝子を有効に単離・同定することができるだけでなく、オオムギの遺伝子地図を作成するためにも有用なものとなっている。それゆえ、本発明にかかる遺伝マーカーおよびその利用方法は、研究用の試薬や試料等を生産する産業だけでなく、植物を利用した各種バイオ産業や種苗産業にも応用の可能性が見出される。
【０１２６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ２０２１の塩基配列を示す図である。
【図２】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ８９６の塩基配列を示す図である。
【図３】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＡＢＧ５００の塩基配列を示す図である。
【図４】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ９５４の塩基配列を示す図である。
【図５】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＡＢＧ３８７の塩基配列を示す図である。
【図６】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ８３５の塩基配列を示す図である。
【図７】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ２２３６の塩基配列を示す図である。
【図８】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ８７８の塩基配列を示す図である。
【図９】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ８６５の塩基配列を示す図である。
【図１０】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ５０３の塩基配列を示す図である。
【図１１】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＡＢＣ１５３の塩基配列を示す図である。
【図１２】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ２１５８の塩基配列を示す図である。
【図１３】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ５８４の塩基配列を示す図である。
【図１４】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＡＢＧ４６０の塩基配列を示す図である。
【図１５】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＢＣＤ０２６３の塩基配列を示す図である。
【図１６】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ２１３８の塩基配列を示す図である。
【図１７】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ９４８の塩基配列を示す図である。
【図１８】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ５８の塩基配列を示す図である。
【図１９】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＡＢＧ１の塩基配列を示す図である。
【図２０】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ９１４の塩基配列を示す図である。
【図２１】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ８７７の塩基配列を示す図である。
【図２２】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＡＢＧ３９１の塩基配列を示す図である。
【図２３】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ６５２の塩基配列を示す図である。
【図２４】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＡＢＣ１７５の塩基配列を示す図である。
【図２５】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ９５１の塩基配列を示す図である。
【図２６】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ７９８の塩基配列を示す図である。
【図２７】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ８３６の塩基配列を示す図である。
【図２８】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ５１１の塩基配列を示す図である。
【図２９】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＭＷＧ８８９の塩基配列を示す図である。
【図３０】本発明にかかる遺伝マーカーの一つであるＡＢＧ４６１の塩基配列を示す図である。
【図３１】本発明にかかる遺伝マーカー群を用いて作成されたオオムギの遺伝子地図を示す図である。
【図３２】本発明にかかる遺伝マーカー群を用いて作成されたオオムギ３Ｈ染色体の遺伝子地図を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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