(57)【要約】【課題】血液細胞を刺激材料として接触させ、血液細胞から産生される生理活性物質量を測定する細胞機能測定方法であって、産生される生理活性物質量を増大させることができ、高感度に測定することを可能とする方法を提供する。【解決手段】血液細胞を、中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料と、生物学的活性材料とに接触させ、上記凹凸を表面に有する材料及び生物学的活性材料の双方の刺激により、測定対象物質としての生理活性物質の産生量を増大させ、産生された測定対象物質である生理活性物質量を測定する、細胞機能測定方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液細胞を刺激材料と接触させ、該血液細胞から産生される生理活性物質量を測定する細胞機能測定方法であって、
血液細胞を、中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料と、生物学的活性材料とに接触させ、上記凹凸を表面に有する材料及び生物学的活性材料の双方の刺激により、測定対象物質である生理活性物質の産生を増大し、産生された生理活性物質量を測定することを特徴とする、細胞機能測定方法。
【請求項２】
前記凹凸を表面に有する材料及び前記生物学的活性材料が収納されており、かつ必要量の血液を採取し得るように減圧状態下で密栓された容器を用意する工程と、
前記容器の栓体を外すことなく血液を採取する工程と、
前記容器内の凹凸を表面に有する材料、生物学的活性材料及び血液を３７℃の温度で一定時間混和する工程と、
前記混和工程後に、遠心する工程と、
遠心により分離された血漿中の血液細胞から産生された生理活性物質量を測定する工程とを備える、請求項１に記載の細胞機能測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫反応や炎症反応などに関与する細胞機能を測定するための細胞機能測定方法に関し、より詳細には、顆粒球、単球、マクロファージまたはリンパ球などの血液細胞の細胞機能としての、サイトカインなどの生理活性物質産生能力を測定するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
顆粒球、単球、マクロファージまたはリンパ球などの白血球は、血液中や、各種臓器もしくは器官において、炎症反応や免疫反応などの種々の生体防御反応において様々な役割を担っている。これらの血液細胞は、感染症；肝炎や腎炎などの炎症性疾患；慢性関節リウマチや喘息などの免疫・アレルギー性疾患；あるいは癌などの様々な病態において重要な働きをしており、病態の変動とともにこられの細胞の機能が抑制されたり、増強されたりすることが知られている。
【０００３】
また、これらの疾患の治療に、抗炎症剤、免疫抑制剤、免疫増強剤、抗癌剤などの種々の薬剤が用いられている。薬剤が用いられている際にも、これらの細胞の機能が抑制されたり、あるいは増強されたりすることも知られている。そのため、各種疾患の病態、薬剤の効果もしくは副作用を把握し、治療指針や薬剤の投与量及びタイミングを決定するために、これらの細胞の機能を測定することが重要である。
【０００４】
従来、病院の検査室や検査センターでは、上記理由により、これらの細胞の機能を測定するために、顆粒球貪食機能試験、顆粒球殺菌能（活性酸素産生能）試験、リンパ球幼若化試験などが行われてきた。また、最近では、フローサイトメトリー装置と、各種免疫担当細胞表面抗原に対する蛍光標識モノクローナル抗体を用いた表面抗原試験などが行われてきている。
【０００５】
しかしながら、従来の試験方法では、細胞分離、細胞培養、顕微鏡測定などの特殊な技術が要求され、測定に長い時間がかからざるを得なかった。加えて、ＲＩ（ラジオアイソトーブ）施設やフローサイトメーターなどの高価な装置が必要であった。
【０００６】
近年、白血球の細胞機能を測定する方法として、血液や血液から分離された白血球からのサイトカインなどの生理活性物質の産生機能を調べる種々の方法が報告されている。
【０００７】
例えば、血液にリポ多糖（ＬＰＳ）やレクチンを反応させ、それによって産生誘導されたＴＮＦαやＩＬ−１βなどのサイトカイン量を測定する方法が知られている（特表平１−５０３３３１号公報、特開平２−１９６９６１号公報、特開平３−２８５６９２号公報など）。
【０００８】
また、特定の表面粗さを有する高分子材料や特定の化学構造を有する高分子材料と血液とを接触させ、ＴＮＦαの産生を誘導する方法が提案されている（例えば、特開平６−２０９９９２号公報、特開平７−６７９５５号公報など）。
【０００９】
さらに、特定の表面粗さを有する高分子材料と血液とを接触させ、ＴＮＦαやＩＬ−１βの産生量を測定する生体反応検査方法も提案されている（特開平７−２９９７３２号公報、特開平７−１５１７５２号公報）。
【００１０】
さらに、ＴＮＦαやＩＬ−１βのヒト抹消血白血球からのサイトカインの産生誘導量を測定することにより、試験物質の免疫活性能力を測定する方法も知られている（特表平７−５００９０５号公報）。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の血液細胞の生理活性物質産生機能を測定する方法では、生理活性物質の産生量が十分でなく、すなわち、血液細胞の細胞機能を高感度に測定することが困難であった。
【００１２】
本発明の目的は、上述した従来技術の現状に鑑み、血液細胞などの細胞機能をより一層高感度に測定し得る細胞機能測定方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、血液細胞を刺激材料と接触させ、該血液細胞から産生される生理活性物質量を測定する細胞機能測定方法であって、血液細胞を、中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料と、生物学的活性材料とに接触させ、上記凹凸を表面に有する材料及び生物学的活性材料の双方の刺激により、測定対象物質である生理活性物質の産生を増大し、産生された生理活性物質量を測定することを特徴とする、細胞機能測定方法である。
【００１４】
本発明のある特定の局面では、前記凹凸を表面に有する材料及び前記生物学的活性材料が収納されており、かつ必要量の血液を採取し得るように減圧状態下で密栓された容器を用意する工程と、前記容器の栓体を外すことなく血液を採取する工程と、前記容器内の凹凸を表面に有する材料、生物学的活性材料及び血液を３７℃の温度で一定時間混和する工程と、前記混和工程後に、遠心する工程と、遠心により分離された血漿中の血液細胞から産生された生理活性物質量を測定する工程が備えられる。
【００１５】
以下、本発明の詳細を説明する。
本願発明者は、上述した従来技術を種々検討した結果、中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料や種々の生物学的活性材料をそれぞれ単独で用いて血液細胞を刺激する場合に比べ、双方の材料を同時に用いた共刺激により血液細胞からのサイトカインなどの生理活性物質の極めて高い産生が起こることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００１６】
本発明では、中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料と生物学的活性材料との組み合わせに応じて、一定の検体血液量に対し、両材料の最適な量比を設定することが望ましい。
【００１７】
本発明に係る細胞機能測定方法では、全血をそのまま利用して測定を行うことができる。その場合には、血液から単球や好中球などを分離する必要がない。従って、分離に伴う操作や処理時間が不要である。加えて、分離操作や処理時間等による細胞の活性低下や不要な活性化が引き起こされる問題もない。もっとも、本発明では、分離操作が施された測定試料を用いてもよい。
【００１８】
さらに、本発明では、測定に必要とされる血液量も非常に少なくてすみ、被採血者の負担も軽減される。また、全血またはその希釈液を用いた場合、血液中に含まれる様々な液性因子や細胞の関与が生体内と同様に働き、より的確に病態を反映した細胞機能の測定が可能である。
【００１９】
本発明において用いられる中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料において、材料の種類は特に制限されるものではない。すなわち、中心線平均粗さＲａ値が上記特定の範囲であれば、任意の材料を用いることができる。なお、中心線平均粗さＲａ値とは、ＪＩＳ　Ｂ０６０１−１９８２における中心線平均粗さである。
【００２０】
上記のような凹凸を表面に有する材料を用意するにあたっては、材料を研磨することにより表面粗さを付与する方法が一般的であるが、他の方法によって上記特定の表面粗さを有するように構成されてもよい。例えば、材料表面に微粒子を物理的あるいは化学的に固定する方法や、表面が多孔質の材料を用いる方法なども利用することができる。
【００２１】
材料表面に微粒子を固定する方法としては、例えば０．１〜２０μｍの微粒子を表面にコーティングする方法が挙げられる。上記微粒子は、例えば、スチレン系やアクリル系などのビニル系モノマーの単独あるいは２成分以上の混合物を乳化重合や懸濁重合することにより調製することができる。望ましくは、上記微粒子としては、例えば、スチレン系やアクリル系などのビニル系モノマーと、ジビニルベンゼンのような２官能基以上の多官能性モノマーとの共重合体からなるものが用いられる。
【００２２】
多孔質材料を用いる場合には、その形状は特に限定されず、膜状、繊維状またはビーズ状のいずれであってもよい。また、表面のみが多孔性であってもよく、材料全体が多孔性であってもよい。
【００２３】
表面が多孔質の材料は、例えば、有機もしくは無機材料からなるビーズ、繊維またはフィルム状の材料に、コーティング液として合成高分子や天然高分子をそれらの良溶媒中に０．１〜５重量％程度溶解させた液をスプレーにより霧状に吹き付け、加熱乾燥することにより得られる。
【００２４】
また、材料全体が多孔性となっている材料の製法としては、一般的な多孔性膜、及び多孔性ビーズなどの製造方法を用いることができる。例えば、多孔膜の場合には、合成高分子を両溶媒に溶解させ、ガラス板上に流延させ、キャスティングフィルムを作製し、しかる後合成高分子の貧溶媒にてフィルムを洗浄し、良溶媒を抽出することにより多孔性膜を得ることができる。
【００２５】
多孔性材料の中では、多孔性微粒子が製造が容易であり、かつ取扱いが容易であるため好ましい。多孔性材料の場合、Ｒａ値の調整は細孔径や細孔量を調整することによって達成され、細孔径や細孔量は材料を溶解させる溶媒の種類や量を変えることにより容易に調節することができる。
【００２６】
表面に凹凸を有する上記材料としては、人体に対して無害なもの、例えば血液と材料が接触された際に有毒な金属や可塑剤などの添加物の流出がないものが好ましく用いられる。すなわち、ガラス及びアルミナなどの無機材料、並びに酢酸セルロース、ポリスチレン、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリトリフルオロエチレン、パーフルオロエチレン−プロピレン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、アクリル樹脂、エチルセルロースなどの合成もしくは天然の有機高分子材料などが挙げられる。
【００２７】
本発明で用いられる生物学的活性材料とは、血液細胞（赤血球、血小板及び顆粒球、単球、リンパ球等の白血球）と反応し、これらの細胞の活性化を促し、種々の生理活性物質の産生、遊離もしくは誘導を引き起こす材料をいい、従来、前記細胞の活性化物質として知られる種々の材料が挙げられる。例えば、ＢＣＧ死菌やコリネバクテリウム属などの種々の微生物、合成リピドＡ、ピランコポリマー、精製ツベルクリン、レクチン（フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、ポークウィードマイトゲン等）、ＯＫ４３２（ピシバニール）、ＰＳＫ（クレスチン）、レンチナン、ザイモザン、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）、カルシウムイオノフォア、ホルボルエステル、免疫グロブリン固定化担体、ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン（ＦＭＬＰ）などのホルミルペプチド、種々のサイトカインなどが挙げられる。その他の例としては　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ（ＰＰＤ）抗原、カンジダ抗原、ムンプスウィルス抗原や喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、消化管アレルギー、寄生虫アレルギーなどのアレルゲン検査に用いられる抗原（ハウスダストやダニ抗原やブタクサ花粉抽出物、スギ花粉抽出物、イネ抽出物などの種々の花粉抗原や真菌抗原やアスカリス抽出物などの寄生虫抗原や卵白アルブミン、小麦、大豆、エビ、カニ、肉類などの食物抗原やハチ毒など）が用いられる。後述の実施例から明らかなように、ＢＣＧ、ＯＫ４３２及びＬＰＳが特に好適な材料である。
【００２８】
本発明において血液細胞から産生される生理活性物質としては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６等のインターロイキン、ＩＮＦα、ＩＮＦβ、ＩＮＦγ等のインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子、ＲＡＮＴＥＳ等の種々のサイトカインやＰＧＥ２、ＰＧＩ２等のプロスタグランジン、ＬＴＢ４、ＬＴＣ４等のロイコトリエン、一酸化窒素、活性酸素、ヒスタミン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）などの種々のケミカルメディエーターが挙げられる。また、可溶性ＩＣＡＭ１などの接着因子、可溶性ＩＬ−２レセプターなどの可溶性サイトカインレセプターが挙げられる。後述の実施例から明らかなように、特に、ＴＮＦ−α、ＩＮＦγ及びＩＬ−１０が好ましい。
【００２９】
本発明の細胞機能測定方法のある特定の局面では、検体の採取から生理活性物質の産生反応までを一貫して閉鎖系において操作することを可能とするために、以下の方法が用いられる。
【００３０】
すなわち、使用前の状態において、生物学的活性材料と、中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料の最適な量が予め容器内に収納される。この容器としては、最終的な産生された生理活性物質量を測定し得る測定容器が用いられる。また、反応に必要とされる血液量を採取し得るように、上記容器内は予め減圧密封される。
【００３１】
この場合、予め容器中には、必要に応じて血液が凝固しないように血液抗凝固剤を添加することが望ましい。血液抗凝固剤としては、ヘパリン化合物、クエン酸化合物、シュウ酸化合物などが挙げられ、中でもヘパリンナトリウムなどが細胞の生物学的反応を阻害しないため好ましい。ヘパリンナトリウムの容器中の収容量としては、容器に血液が収容された時に、血液中の濃度が低くなると血液凝固のおそれがあり、高くなり過ぎると細胞に不測の活性化や不活性化を引き起こすおそれがあるため、４〜５０ｕ／ｍｌとすることが望ましい。
【００３２】
上述した容器の材質としては、特に限定されないが、プラスチックまたはガラスが好適に用いられる。上記プラスチックとしては、熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂のいずれをも用いることができる。熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メチルメタクリレート共重合体、エチレン−プロピレン共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。熱硬化性樹脂としては、例えば、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリレート樹脂等が挙げられる。
【００３３】
また、容器において採血から血液の反応までを一貫して行うことを可能とするために、かつ必要量の血液を採取し得るように、予め減圧密封するには、通常栓体が用いられる。栓体の材質としては、例えば、ブチルゴム、塩素化ブチルゴム、熱可塑性エラストマーなどが挙げられる。容器の減圧の程度は、容器中に常圧の血液が必要量だけ吸入され得る程度の圧力であればよい。この圧力は、採取しようとする血液量によって決められる。
【００３４】
採取する血液量は、容器の容積によって異なるが、通常、４〜５ｍｌの容積の容器を用いる場合であれば、０．５〜２ｍｌ程度でよい。
上述した容器の製造方法は特に限定されないが、例えば、内部を減圧にすることができるチューブ状の容器に、上述した生物学的活性材料と、上記特定の表面粗さの凹凸を表面に有する材料の最適量、及び必要に応じて血液抗凝固剤を加え、容器を所定の減圧状態にした後、閉栓することにより得られる。
【００３５】
容器としては、例えば、一端が開口し、他端が閉塞されている有底の管体が好ましく用いられる。容器の開口部は、栓体により閉塞可能なものが望ましい。有底管体としては、例えば、反応後に、生理活性物質を測定するための遠心分離操作に好適な試験管状のものがより好ましく、外径が５〜８０ｍｍ及び高さが２０〜１５０ｍｍ程度の試験管状のものが好適に用いられる。
【００３６】
上記生物学的活性材料は、容器内において、液状、粒子状または固体状のいずれの状態で存在していてもよい。
本発明において、産生された生理活性物質を測定する方法としては、公知の種々の測定方法が挙げられる。例えば、測定しようとする生理活性物質に対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体及びペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素及びそれぞれの酵素の発色基質などを用いた酵素免疫測定方法などが挙げられる。
【００３７】
次に、本発明の細胞機能測定方法の一実施態様を説明する。
上記のようにして、内部に上記特定の表面粗さの凹凸を表面に有する材料と、生物学的活性材料と、必要に応じて血液抗凝固剤が収納された容器、すなわち採血反応容器を用意する。血管と、上記採血反応容器とを例えばマルチプル注射針（両端が搾針でき、かつ連通ができる採血針）を用いて連通させ、圧力差により容器中に血液を採取する。次に、容器を適当に振とうしつつ、血液細胞と生物学的活性材料及び中心線平均粗さが上記特定の範囲にある凹凸を表面に有する材料とを同時に反応させ、血液細胞から生理活性物質を産生させる。反応後、静置もしくは遠心分離により、血球と血漿とに分離し、血液細胞から産生されたサイトカインなどの生理活性物質の血漿中濃度を定量可能な試薬により定量する。
【００３８】
血液と上記表面に凹凸を有する材料及び生物学的活性材料との反応温度は、生理活性物質の産生が効率的に行われ、過度の溶血を引き起こさない温度であればよく、１５〜４２℃が好ましく、より好ましくは３０〜４０℃である。反応時間は、生理活性物質の産生が効率的に行われ、過度の溶血を引き起こさない反応時間であればよく、１〜７２時間が好ましく、より好ましくは２〜２４時間である。
【００３９】
血液細胞から産生された生理活性物質の血漿中濃度を定量する工程の一実施態様をより詳細に説明する。
まず、血液と上記生物学的活性材料及び上記特定の表面粗さの凹凸を表面に有する材料とを反応させ、生理活性物質が産生された血液を１６００Ｇで遠心し、血球成分と血漿成分とに分離する。分離された血漿を、上記生理活性物質に対するモノクローナル抗体が固定化されたマイクロプレートのウェルに、ピペッティングにより添加し、３７℃で２時間反応させる。
【００４０】
次に、反応後の血漿液を吸引除去などの手段で廃棄し、さらに、未反応成分を除くため、Ｔｗｅｅｎ２０などのノニオン系界面活性剤を含有する中性ｐＨの洗浄用緩衝液で上記ウェルを洗浄する。次に、西洋わさびペルオキシダーゼ（添加された上記生理活性物質に対するポリクローナル抗体）をピペッティングにより添加し、３７℃で１時間反応させる。
【００４１】
次に、未反応に西洋わさびペルオキシダーゼ固定化抗体を除くために、ウェルを上記洗浄用緩衝液で洗浄した後、過酸化水素及びテトラメチルベンジンを含む基質溶液を添加し、５〜１０分間反応させる。
【００４２】
次に、１Ｍ硫酸水溶液を添加し、反応を停止させ、酵素反応による基質の発色を４５０ｍｍの吸光度から測定する。この測定値と、既知濃度の生理活性物質を用いて作成された検量線から、生理活性物質の産生量を定量する。
【００４３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的な実施例及び比較例を挙げることにより、本発明をより詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
なお、以下の実施例及び比較例における表面粗さの測定は下記のようにして行った。
表面粗さ測定装置（小坂研究所製、商品名：サーフコーダＳＥ−３０Ｄ）により、あるいは走査型レーザー顕微鏡（レーザーテック社製、品番：１ＭＬ２１Ｗ）により観察された表面画像を画像解析システム（三谷商事社製、商品名：ＳＵＰＥＲ　ＡＳＰＥＣＴ）により処理し、測定した。
【００４５】
（実施例１）
ポリエチレンテレフタレート製の有底のチューブ（１２．６ｍｍ径×長さ７５ｍｍ）に、１０Ｕのヘパリンナトリウム（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ社製、商品名：ノボ・ヘパリン注１０００）を添加した。次に、中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料として、三菱化学社製、商品名：ダイアイオンＨＰ−５０（中心線平均粗さＲａ値＝１μｍ）を精製水とメタノールで洗浄した後、生理食塩水に懸濁し、上記チューブに嵩体積量５０μｌとなるように添加した。
【００４６】
さらに、生物学的活性材料として、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｌ、Ｓｉｇｍａ社製）を１０μｇ／ｍｌの濃度となるように生理食塩水（大塚製薬社製、注射用生理食塩水）に溶解し、その０．１ｍｌを添加した。次に、管径に適合したブチルゴム製栓体を上記チューブの開口部に、開口部を密栓しないように軽く載せた後、減圧され得るシステム内に配置し、１ｍｌの血液を採取し得るように、試験管内を５７０ｍｍＨｇに減圧したところで密栓し、採血反応容器を得た。
【００４７】
健常人のボランティアから、マルチプル注射針を用いて、上記採血反応容器内に血液を１ｍｌずつ採取した。次に、予め３７℃に保温されていた恒温器の中の転倒混和用ロッカープラットフォームに血液を採取した採血反応容器を取り付け、２４時間転倒混和した。、混和後、反応容器を１６００Ｇ×１０分及び４℃の条件で遠心分離し、血漿を採取した。採取した血漿注のＴＮＦ−αの濃度をＲ＆Ｄ社製、ＥＩＳＳＡキットを用いて測定した。
【００４８】
（実施例２）
中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料として、オルガノ社製、商品名：アンバーライトＸＡＤ−７（中心線平均粗さＲａ値：１．２５μｍ）を使用した以外は、実施例１と同様に操作した。
【００４９】
（実施例３）
中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料として、積水化学工業社製、酢酸セルロース（ＣＡ）研磨ビーズ（中心線平均粗さＲａ値：１．３６μｍ）を使用した以外は、実施例１と同様に操作した。
【００５０】
（比較例１）
採血反応容器にヘパリンナトリウム以外の材料を添加せず、実施例１と同様に操作した。
【００５１】
（比較例２）
採血反応容器にダイアイオンＨＰ−５０を添加せず、実施例１と同様に操作した。
【００５２】
（比較例３〜５）
採血反応容器にＰＨＡ−Ｌを添加せず、実施例２〜３と同様に操作した。
【００５３】
（比較例６）
採血反応容器に中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍではない表面に有する材料として、積水化学工業社製、酢酸セルロース（ＣＡ）未研磨ビーズ（中心線平均粗さＲａ値：０．１μｍ）を使用した以外は、実施例１と同様に操作した。
【００５４】
（実施例４〜６）
生物学的活性材料として、ＰＨＡ−Ｌに代えてＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を用い、その１μｇの量を採血反応容器に添加した以外は、実施例１〜３と同様に操作した。
【００５５】
（比較例７）
生物学的活性材料として、ＰＨＡ−Ｌに代えてＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を用い、その１μｇの量を採血反応容器に添加した以外は、比較例２と同様に操作した。
【００５６】
（比較例８）
生物学的活性材料として、ＰＨＡ−Ｌに代えてＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を用い、その１μｇの量を採血反応容器に添加した以外は、比較例６と同様に操作した。
【００５７】
（実施例７）
ポリエチレンテレフタレート製の有底のチューブ（１２．６ｍｍ径×長さ７５ｍｍ）に１０Ｕのヘパリンナトリウム（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ社製、商品名：ノボ・ヘパリン注１０００）を添加し、次に、生物学的活性材料として、ＢＣＧ（日本ＢＣＧ工業社製）を１０ｍｇ／ｍｌとなるように生理食塩水（大塚製薬社製、注射用生理食塩水）に懸濁し、その０．１ｍｌを添加した。中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料として、実施例１で用いたダイアイオンＨＰ−５０を精製水とメタノールで洗浄後生理食塩水に懸濁し、上記チューブに嵩体積量５０μｌを添加した。次に、管径に応じたブチルゴム製の栓体をチューブの開口部に開口部を密栓しないように軽く載せた後、減圧し得るシステム内に配置し、１ｍｌの血液を吸引し得るように、チューブ内を５７０ｍｍＨｇに減圧したところで、栓体によりチューブの開口部を密栓し、採血反応容器を得た。
【００５８】
次に、健常人ボランティアから、マルチプル注射針を用いて、上記採血反応容器内に、血液を１ｍｌ採取した。しかる後、予め３７℃に保温された恒温器の中の転倒混和用ロッカープラットフォームに血液を採取した各採血反応容器を取り付け、２４時間転倒混和した。混和後、反応容器を１６００Ｇ×１０分の条件で４℃で遠心分離し、上澄みの血漿を採取した。採取された血漿注のＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ及びＩＬ−１０の濃度を、Ｒ＆Ｄ社製、ＥＩＬＳＡキットを用いて測定した。
【００５９】
（実施例８）
中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料として、オルガノ社製、商品名：アンバーライトＸＡＤ−７（中心線平均粗さＲａ値：１．２５μｍ）を使用した以外は、実施例１と同様に操作した。
【００６０】
（実施例９）
中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料として、積水化学工業社製、酢酸セルロース（ＣＡ）研磨ビーズ（中心線平均粗さＲａ値：１．３６μｍ）を使用した以外は、実施例１と同様に操作した。
【００６１】
（比較例９）
採血反応容器にヘパリンナトリウム以外の材料を添加せず、実施例７と同様に操作した。
【００６２】
（比較例１０）
採血反応容器にダイアイオンＨＰ−５０を添加せず、実施例７と同様に操作した。
【００６３】
（比較例１１〜１３）
採血反応容器にＢＣＧを添加せず、実施例７〜９と同様に操作した。
【００６４】
（比較例１４）
採血反応容器に中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍではない表面に有する材料として、積水化学工業社製、酢酸セルロース（ＣＡ）未研磨ビーズ（中心線平均粗さＲａ値：０．１μｍ）を使用した以外は、実施例７と同様に操作した。
【００６５】
（実施例１０〜１２）
生物学的活性材料として、ＢＣＧに代えてピシバニール（中外製薬社製、ＯＫ４３２）を用い、その０．０１ＫＥの量を採血反応容器に添加した以外は、実施例７〜９と同様に操作した。
【００６６】
（比較例１５）
生物学的活性材料として、ＢＣＧに代えてピシバニール（中外製薬社製、ＯＫ４３２）を用い、その０．０１ＫＥの量を採血反応容器に添加した以外は、比較例９と同様に操作した。
【００６７】
（比較例１６）
生物学的活性材料として、ＢＣＧに代えてピシバニール（中外製薬社製、ＯＫ４３２）を用い、その０．０１ＫＥの量を採血反応容器に添加した以外は、比較例１４と同様に作成した。
【００６８】
結果を下記の表１及び表２に示す。
【００６９】
【表１】
2004061225.tif 000002
【００７０】
【表２】
2004061225.tif 000003
【００７１】
表１及び表２から明らかなように、実施例１〜１２では、ＰＨＡ−Ｌ、ＣｏｎＡ、ＢＣＧ及びＯＫ４３２のような生物学的活性材料と、中心線平均粗さＲａ値が０．２〜１０μｍである凹凸を表面に有する材料との共刺激が利用されているので、それぞれを単独で用いた比較例２〜５，７，１１〜１３及び比較例１５に比べて、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ及びＩＬ−１０の産生量のオーダーが異なるくらい増大することがわかる。
【００７２】
また、上記生物学的活性材料と、中心線平均粗さＲａ値が上記特定の範囲でない表面性状を有する材料と併用した場合には、比較例６，８，１４，１６の結果から明らかなように、産生の増大は認められなかった。
【００７３】
Ｒａ値が０．２〜１０μｍの表面粗さを有する材料単独を用いた場合には、ＴＮＦ−αの産生は引き起こされるものの、産生量が低く、またＩＮＦγやＩＬ−１０ではこれらのサイトカインの産生が認められなかった（比較例３〜５，比較例１１〜１３）。
【００７４】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係る細胞機能測定方法を用いれば、中心線平均粗さＲａ値が上記特定の範囲にある凹凸を表面に有する材料及び生物学的活性材料の共刺激により、生理活性物質の産生量が著しく増大される。従って、白血球などの血液細胞の生理活性物質産生機能を従来法に比べて高感度で測定することが可能となる。
【００７５】
また、本発明においては、上記凹凸を表面に有する材料及び生物学的活性材料が収納され、かつ必要量の血液を採取し得るように減圧状態下で密栓された容器を用いた場合には、被験者から血液を採血した後、産生された生理活性物質量の測定までを閉鎖系において容易に行うことができる。すなわち、採血後、ピペッティングなどの用手法により血液を様々な容器に移し替たり、細胞分離や細胞培養などの操作を必要としない。従って、試験者が、肝炎やＡＩＤＳなどの種々の感染症に感染するおそれも殆どない。また、血液使用中に種々の雑菌や埃などが混入するおそれもなく、これらの汚染物や種々の操作による細胞の不要な活性化や活性低下も引き起こされ難い。さらに、細胞分離、細胞培養あるいは顕微鏡測定などの特殊な技術を必要とせずに、細胞機能の測定を短時間で行うことができる。