(57)【要約】【課題】Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質及びＮ−末端がアシル化されていないペプチド又はタンパク質の双方を分解できるアミノペプチダーゼであって、従来より分子活性の高いアミノペプチダーゼを提供する。【解決手段】本発明者は、パイロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＪＣＭ９９７４株から、アミノペプチダーゼをコードする二つの遺伝子を単離し、それらの発現産物が、それぞれ８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有するとともに、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有する耐熱性アミノペプチダーゼであることを見出した。これらの酵素は、９８℃で１時間熱処理した場合に、それぞれ９５％及び９０％の活性が残存する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有する耐熱性アミノペプチダーゼ。
（ａ）    ８５℃、ｐＨ７．５の環境中で、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間  ）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有する。
（ｂ）    Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有する。
【請求項２】
以下の（ｃ）及び（ｄ）の性質を備える請求項１に記載の耐熱性アミノペプチダーゼ。
（ｃ）    ９８℃で１時間の熱処理により９０％以上のアミノペプチダーゼ活性が残存する。
（ｄ）    ｐＨ７．５の下で、アミノペプチダーゼ活性の至適温度が１００℃以上である。
【請求項３】
パイロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の酵素である請求項１又は２に記載の耐熱性アミノペプチダーゼ。
【請求項４】
以下の（１）又は（２）のポリペプチド。
（１）    配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）    配列番号２において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、８５  ℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチド。
【請求項５】
以下の（３）、（４）又は（５）のポリヌクレオチド。
（３）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（４）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（５）    請求項４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の（６）又は（７）のポリペプチド。
（６）    配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（７）    配列番号４において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、８５  ℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチド。
【請求項７】
以下の（８）、（９）又は（１０）のポリヌクレオチド。
（８）    配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（９）    配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１０）  請求項６に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５又は７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を培養し、その形質転換体から耐熱性アミノペプチダーゼを回収する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチド又はタンパク質のＮ−末端分析、ペプチド又はタンパク質の分解によるアミノ酸の製造などに用いられるアミノペプチダーゼ、それをコードするポリヌクレオチド等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ペプチド又はタンパク質のＮ−末端分析には、これらのアミノ酸をＮ−末端から順次遊離するアミノペプチダーゼを用いたエドマン分解法が利用されている。また、アミノペプチダーゼは、ペプチド又はタンパク質の分解によるアミノ酸の製造にも利用されている。
【０００３】
ここで、生体内のポリペプチド又はタンパク質は、プロテアーゼによる分解から自身を保護するためにＮ−末端のアミノ基がアシル化されているものが多い。従って、アシル化されたポリペプチド又はタンパク質の分析やこれらを原料とするアミノ酸の製造には、アシルペプチド加水分解酵素が使用される。
【０００４】
従来は哺乳動物由来の易熱性のアシルペプチド加水分解酵素が用いられている。しかし、耐熱性のアシルペプチド加水分解酵素を用いて、アシルペプチドの加水分解反応を高温で行うことができれば、その分高濃度の基質溶液を用いることができ反応効率がよく、また混入微生物又は夾雑酵素による影響を抑えることができる。
【０００５】
このような耐熱性のアシルペプチド加水分解酵素として、本発明者は、特許文献１において、パイロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ    ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）から単離されたアミノペプチダーゼであって、Ｎ−ブロックペプチド及びＮ−ブロックされていないペプチドのＮ末端から順次アミノ酸を遊離する反応及び遮断基自身を分解する反応の双方を触媒する耐熱性アミノペプチダーゼを開示している。この酵素は、９０℃で数時間処理しても活性が殆ど低下せず、至適温度はｐＨ７．５で約９５℃である。しかし、この酵素は、アミノペプチダーゼの分子活性が１０（１／秒間）と比較的低い。
【０００６】
また、特許文献２は、パイロコッカスホリコシから単離されたアシルペプチド加水分解酵素であって、ｐＨ７．５の下での至適温度が９０〜９５℃であり、９５℃で３時間加熱しても活性を失わない耐熱性アシルペプチド加水分解酵素を開示している。しかし、この酵素は、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質からアシルアミノ酸を遊離する反応のみを触媒するものであり、基質特異性が低い。
【０００７】
【特許文献１】
特開２０００−２４５４８０号（段落００１１、００１２など）
【０００８】
【特許文献２】
特開平１０−２１０９７７号（段落０００８、０００９、００２３など）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質及びＮ−末端がアシル化されていないペプチド又はタンパク質の双方を分解できる耐熱性アミノペプチダーゼであって、従来より分子活性の高い耐熱性アミノペプチダーゼを提供することを主目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は、９０〜１００℃の環境下で生育する超好熱性始原菌に着目し、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＪＣＭ９９７４株（理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）番号９９７４）からアシルアミノペプチダーゼ遺伝子をクローニングし、そのアシルアミノペプチダーゼが、８５℃、ｐＨ７．５の環境中で、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有するとともに、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質、及び、Ｎ−末端がアシル化されていないペプチド又はタンパク質の双方を分解できる耐熱性アミノペプチダーゼであることを見出した。また、この酵素が、９８℃で１時間の熱処理によっても９０％以上のアミノペプチダーゼ活性が残存する極めて耐熱性の高い酵素であることを見出した。
【００１１】
本発明は前記知見に基づき完成されたものであり、以下の耐熱性アミノペプチダーゼ等を提供する。
【００１２】
項１．  以下の（ａ）及び（ｂ）の性質を有する耐熱性アミノペプチダーゼ。
（ａ）    ８５℃、ｐＨ７．５の環境中で、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性（１秒間に１分  子の酵素が作用する基質の分子数）が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチ  ダーゼ活性を有する。
（ｂ）    Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有する。
【００１３】
項２．  以下の（ｃ）及び（ｄ）の性質を備える項１に記載の耐熱性アミノペプチダーゼ。
（ｃ）    ９８℃で１時間の熱処理により９０％以上のアミノペプチダーゼ活性が残存する。
（ｄ）    ｐＨ７．５の下で、アミノペプチダーゼ活性の至適温度が１００℃以上である。
【００１４】
項３．  パイロコッカスホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の酵素である項１又は２に記載の耐熱性アミノペプチダーゼ。
【００１５】
項４．  以下の（１）又は（２）のポリペプチド。
（１）    配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）    配列番号２において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、８５  ℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチド。
【００１６】
項５．  以下の（３）、（４）又は（５）のポリヌクレオチド。
（３）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（４）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（５）    項４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１７】
項６．  以下の（６）又は（７）のポリペプチド。
（６）    配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（７）    配列番号４において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチド。
【００１８】
項７．  以下の（８）、（９）又は（１０）のポリヌクレオチド。
（８）    配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（９）    配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１０）  項６に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１９】
項８．  項５又は７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００２０】
項９．  項８に記載のベクターを保持する形質転換体。
【００２１】
項１０．  項９に記載の形質転換体を培養し、その形質転換体から耐熱性アミノペプチダーゼを回収する方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）耐熱性アミノペプチダーゼ
本発明の耐熱性アミノペプチダーゼは、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上であるアミノペプチダーゼ活性を有するとともに、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有する酵素である。
活性
本発明において、分子活性とは、１秒間に１分子の酵素が作用する基質の分子数をいう。本発明のアミノペプチダーゼは、８５℃、ｐＨ７．５の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有する酵素である。同様の環境中でＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２２０（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有する酵素であることが好ましい。
【００２３】
本発明においてアミノペプチダーゼ活性は実施例に記載の方法により測定した値である。すなわち、Ｎ−末端がアシル化されていないＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａを基質として用いて測定した値である。
基質特異性
本発明のアミノペプチダーゼは、Ｎ−末端がアシル化されていないペプチド又はタンパク質のＮ−末端からアミノ酸を順次加水分解により遊離する活性を有する。但し、プロリン及びプロリンの１残基手前に存在するアミノ酸は遊離しない。また、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質についても同様に、Ｎ−末端からアミノ酸を順次加水分解により遊離する活性を有する。但し同様に、プロリン及びプロリンの１残基手前に存在するアミノ酸は遊離しない。いずれの場合もペプチド又はタンパク質のアミノ酸数は問わない。
【００２４】
また本発明のアミノペプチダーゼは、Ｎ−末端のアシル基がアセチル基であるペプチド又はタンパク質、すなわちＮ−アセチル化ペプチド又はタンパク質を分解することができる。
【００２５】
さらに、Ｒが炭素数１〜２０の脂肪族炭化水素又は芳香族炭化水素であるようなＲＣＯ−基がＮ−末端アミノ基に導入されたＮ−アシルペプチド又はタンパク質であれば分解できるものであることが好ましい。また、アシル基自体を分解できる酵素であることがより好ましい。
【００２６】
また本発明のアミノペプチダーゼは、その他に、Ｄ型のアミノ酸等がＮ−末端に導入されたペプチド又はタンパク質を分解できるものであることがより好ましい。この場合も保護基自体を分解できる酵素であることがより好ましい。
耐熱性
本発明のアミノペプチダーゼは非常に耐熱性に優れる酵素であり、９８℃で１時間熱処理した場合に９０％以上のアミノペプチダーゼ活性が残存する酵素である。特に、９８℃で１時間熱処理した場合に９５％以上のアミノペプチダーゼ活性が残存する酵素であることが好ましい。
【００２７】
また本発明のアミノペプチダーゼは、９８℃で２時間熱処理した場合に７５％以上、特に８５％以上のアミノペプチダーゼ活性が残存する酵素であることが好ましい。
【００２８】
また本発明のアミノペプチダーゼは、酵素反応を行う緩衝液の種類によっても異なるが、酵素反応の初速度を測定した場合の至適温度がｐＨ７．５の環境中で１００℃以上、特に１０５℃以上の酵素であることが好ましい。
常温での安定性
本発明のアミノペプチダーゼは常温下での安定性にも勿論優れており、常温２５℃で３０日間以上放置しても実質的に活性が低下しないことが好ましい。実質的に活性が低下しないとは、通常９０％以上の活性が残存することをいう。
有機溶媒耐性
本発明のアミノペプチダーゼは、有機溶媒に耐性である。例えば、エタノール、ブタノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチル等の有機溶媒を２０容量％以上含む緩衝液中で活性を示す酵素であることが好ましい。本発明のアミノペプチダーゼが酵素活性を示し得る、緩衝液中の有機溶媒の容量比率の上限は、酵素蛋白が沈殿しない範囲である。
生産細菌
本発明のアミノペプチダーゼの由来は特に限定されないが、好熱性細菌、例えばパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アエロパイラム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、スフォロバス（Ｓｕｆｏｌｏｂｕｓ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、マスティゴクラダス（Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属又はサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属等の細菌により生産されたものが挙げられる。特に、超好熱性古細菌パイロコッカスホリコシにより生産されたものが好ましい。
アミノ酸配列
また、本発明のアミノペプチダーゼとしては、例えば以下の（１）又は（２）のアミノ酸配列を有するポリペプチド（第１のポリペプチド）が挙げられる。
（１）    配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）    配列番号２において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチド。
【００２９】
また、本発明のアミノペプチダーゼとしては、例えば以下の（６）又は（７）のアミノ酸配列を有するポリペプチド（第２のポリペプチド）も挙げられる。
（６）    配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（７）    配列番号４において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチド。
【００３０】
（２）のポリペプチドは、  配列番号２のアミノ酸配列において、１￣１２０個程度、特に１￣５０個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましいが、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するアミノペプチダーゼ間で保存されていない領域であれば、配列番号２のアミノ酸配列を、全アミノ酸数の３０％以下の範囲で改変したものであってよい。
【００３１】
同様に（７）のポリペプチドは、  配列番号４のアミノ酸配列において、１￣１２０個程度、特に１￣５０個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましいが、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するアミノペプチダーゼ間で保存されていない領域であれば、配列番号４のアミノ酸配列を、全アミノ酸数の３０％以下の範囲で改変したものであってよい。
【００３２】
具体的には、例えばアミノ酸の置換の場合には、タンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され；セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族側鎖を有するアミノ酸に分類され；リジン、アルギニン、ヒスチジンは塩基性アミノ酸に分類され；アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。
【００３３】
また、アミノ酸の置換により側鎖が小さくなる場合は、ポリペプチドの３次元構造が変化し難く、それにより活性が変化し難いため、配列番号２又は４のアミノ酸配列についてこのような置換を行うことにより  （２）又は（７）のポリペプチドを得ることができる。
【００３４】
本発明のアミノペプチダーゼは、例えば、この酵素を生産する細菌を培養し、菌体破砕液から回収又はさらに精製することにより得られる。また、配列番号２又は４のアミノ酸配列を基に化学的に合成することによっても得ることができる。また、後述する本発明方法によっても得ることができる。
（２）ポリヌクレオチド
本発明の第１のポリヌクレオチドは以下の（３）、（４）又は（５）のポリヌクレオチドである。（３）の配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、（１）の配列番号２のポリペプチドをコードするものである。
（３）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（４）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（５）    上記（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３５】
また、本発明の第２のポリヌクレオチドは以下の（８）、（９）又は（１０）のポリヌクレオチドである。（８）の配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、  （６）の配列番号４のポリペプチドをコードするものである。
（８）    配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（９）    配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性が２００（１／秒間）以上のアミノペプチダーゼ活性を有し、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（１０）  上記（６）又は（７）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３６】
（３）のポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列において１〜１２０個程度、特に１〜５０個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。しかし、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するアミノペプチダーゼ間で保存されていない領域であればであれば、配列番号２のアミノ酸配列を全アミノ酸数の４０％以下の範囲で改変したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってよい。
【００３７】
同様に（８）のＤＮＡは、配列番号４のアミノ酸配列において１〜１２０個程度、特に１〜５０個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。しかし、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質を分解する活性も有するアミノペプチダーゼ間で保存されていない領域であればであれば、配列番号４のアミノ酸配列を全アミノ酸数の４０％以下の範囲で改変したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってよい。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドには、特に言及しない限り、その塩基配列を有するポリヌクレオチドの他、それに相補的なポリヌクレオチドが含まれる。また、本発明のポリヌクレオチドにはＤＮＡ及びＲＮＡの双方が含まれる。また、本発明の目的を達成できる範囲であれば修飾されたＤＮＡ（例えばホスホロチオエートＤＮＡ、Ｈ−ホスホネートＤＮＡなど）及び修飾されたＲＮＡも含まれる。さらに、１本鎖ポリヌクレオチド、２本鎖ポリヌクレオチドの双方が含まれ、２本鎖ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドも含まれる。
【００３９】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常のハイブリダイゼーション溶液中であれば６８℃で行う条件が挙げられ、５０％フォルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中であれば４２℃で行う条件が挙げられる。詳しくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版第２巻に記載のサザンハイブリダイゼーションに用いられる条件が挙げられる。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばパイロコッカス属、アエロパイラム属、スフォロバス属、サーモプラズマ属、サーモプロテウス属、マスティゴクラダス属、バチルス属、シネココッカス属、サーマス属等の好熱性細菌の染色体ＤＮＡのライブラリーから、配列番号１又は３に基づき設計したプローブを用いてハイブリダイゼーションにより単離することができる。また、配列番号１又は３の塩基配列を基に設計したプライマーを用いて、例えば上記好熱性細菌の染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲ法により増幅することもできる。また、化学合成によっても取得できる。
【００４１】
また、（４）又は（９）の変異したポリヌクレオチドは、化学合成法、遺伝子工学的手法、突然変異誘発法などの公知の方法で作成することができる。遺伝子工学的手法としては、（３）又は（８）のＤＮＡリガーゼ遺伝子に対して、エキソヌクレアーゼを用いたヌクレオチド欠失導入、リンカー導入、位置指定突然変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法による塩基配列の改変などを行う方法が挙げられる。
（３）ベクター
本発明のベクターは、上記説明した本発明の第１のポリヌクレオチド（ここではＤＮＡ）又は第２のポリヌクレオチド（ここではＤＮＡ）を含有する組換えベクターである。本発明のＤＮＡが組み込まれるベクターは公知のものを広く利用でき、細菌用ベクターの他、酵母用ベクター、動物細胞用ベクター等も利用できる。酵素の生産効率の点から、通常は細菌用ベクターを用いればよい。公知のベクターとしては、大腸菌ベクターのｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２３３−２等、バチルス属細菌ベクターのｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＴＨＴ１５、ｐＢＤ１６等、酵母用ベクターＹｉｐ５、Ｙｒｐ１７、Ｙｅｐ２４等、動物細胞用ベクターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｍ１３ｍｐ１８等を例示できる。
（４）形質転換体
また、本発明の形質転換体は、上記説明した本発明の組換えベクターを保持する形質転換体である。宿主としては、ベクターに応じて細菌、酵母、動物細胞等を利用できる。宿主としては、バチルスズブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ）、酵母、カビ等が、大量に目的タンパク質を生産できる点で好ましい。形質転換は、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等の公知の方法で行うことができる。これらの公知の方法の中から、宿主の種類に応じて選択すればよい。
（５）アミノペプチダーゼの製造方法
本発明のアミノペプチダーゼの製造方法は、本発明の形質転換体を培養し、この形質転換体からアミノペプチダーゼを回収する方法である。
【００４２】
培養条件は、特に限定されず、宿主の生育が可能な培地、温度等の条件下で培養すればよい。培養時間は、その他の培養条件により異なるが、通常１２〜２４時間程度とすればよい。温度シフト型やＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）誘導型等の誘導型の発現ベクターを用いる場合は、誘導時間は２〜１２時間程度とすればよい。
【００４３】
目的とするアミノペプチダーゼが宿主細胞内又はペリプラズム内に生産される場合は、超音波処理や界面活性剤処理などの公知の細胞破壊方法により細胞を破壊してアミノペプチダーゼを回収すればよい。宿主がアミノペプチダーゼを分泌する場合は、培地中に分泌されたアミノペプチダーゼを回収すればよい。
【００４４】
回収されたアミノペプチダーゼをさらに精製する場合は、遠心分離、塩析、溶媒沈殿法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、逆相高速液体クロマトグラフィー法等の公知のタンパク質精製方法を組み合わせて精製することができる。
【００４５】
本発明の耐熱性アミノペプチダーゼを精製する場合、精製ステップの一つとして、熱処理を行うことが好ましい。熱処理は、宿主の生育限界温度より通常１０℃以上、特に１５℃以上高い温度で、かつ、当該熱処理により本発明のアミノペプチダーゼの活性が６０〜８０％程度残存する温度である６０〜１００℃程度の温度で、１０〜６０分間程度行うことが効率的である。これにより、目的とするアミノペプチダーゼを殆ど失活させることなく、宿主が生産する夾雑タンパク質を変性により失活させることができる。この加熱処理後に、被精製酵素溶液を、特に限定されないが、例えば１５０００ｒｐｍ程度で２０分間程度遠心することにより変性した夾雑タンパク質を沈殿させることができる。この加熱処理工程は、精製のいずれの段階で行ってもよい。これにより耐熱性アミノペプチダーゼの精製度を飛躍的に向上させることができる。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＪＣＭ９９７４株のアミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング）
ｉ）細菌の培養
１３．５ｇの食塩、４ｇのＮａ２ＳＯ４、  ０．７  ｇのＫＣｌ、  ０．２ｇ  のＮａＨＣＯ３  、０．１ｇのＫＢｒ、３０  ｍｇ  のＨ３ＢＯ３、１０ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｇ  のＣａＣｌ２  、２５ｍｇのＳｒＣｌ２、１．０ｍｌのレザスリン溶液（０．２ｇ／Ｌ）、１．０ｇの酵母エキス、５ｇのバクトペプトンを１Ｌの水に溶かした液体培地を調製し、この溶液のｐＨを６．８に調整した後、加圧殺菌した。次いで、乾熱滅菌した元素硫黄を０．２重量％となるように加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気性とした。培地が嫌気性となっったことは、培地にＮａ２Ｓ溶液を加えて、Ｎａ２Ｓによるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。
【００４７】
嫌気性となった培地に、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＪＣＭ９９７４株を植菌し、９５℃で２〜４日間培養し、培養液を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより集菌した。
ｉｉ）染色体ＤＮＡの調製
菌体を１０ｍＭ  トリス（ｐＨ  ７．５）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ  溶液で２回洗浄後インサートアガロース（ＩｎＣｅｒｔ  Ａｇａｒｏｓｅ、ＦＭＣ社製）ブロック中に封入した。このブロックを１％Ｎ−ラウロイルザルコシン−１ｍｇ／ｍｌ  プロテアーゼＫ溶液中で処理することにより、染色体ＤＮＡがアガロースブロック中に分離調製された。インサートアガロースブロックを用いた染色体ＤＮＡの分離条件は、アガロースブロックの添付マニュアルに従った。
ｉｉｉ）アミノペプチダーゼ遺伝子の増幅
＜第１のアミノペプチダーゼ遺伝子＞
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＪＣＭ９９７４株の染色体ＤＮＡ中の、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ条件は、ＰＣＲキットの添付マニュアルに従った。５’末端側に対応するプライマーとしては、配列番号１の塩基配列の５’末端より上流域に対応するプライマーであって制限酵素ＮｄｅＩサイトを付与したＤＮＡプライマーを合成した（ＧＡＡＡＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＡＴＡＴＧ；配列番号５）。また、３’末端側に対応するプライマーとしては、配列番号１の塩基配列の３’末端より下流域に対応するプライマーであって制限酵素ＢａｍＨＩサイトを構築する目的でＤＮＡプライマーを合成した（ＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＴＡＧＣ；配列番号６）。ＰＣＲ反応後、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより３７℃で３時間完全分解した。次いで、第１のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を精製カラムキットを用いて精製した。
＜第２のアミノペプチダーゼ遺伝子＞
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＪＣＭ９９７４株の染色体ＤＮＡ中の、配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ条件は、ＰＣＲキットの添付マニュアルに従った。５’末端側に対応するプライマーとしては、配列番号３の塩基配列の５’末端より上流域に対応するプライマーであって制限酵素ＮｃｏＩサイトを付与したＤＮＡプライマーを合成した（ＣＴＴＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＧＧＧＴＧＡＡＡＧ；配列番号７）。また、３’末端側に対応するプライマーとしては、配列番号３の塩基配列の３’末端より下流域に対応するプライマーであって制限酵素ＢａｍＨＩサイトを構築する目的でＤＮＡプライマーを合成した（ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＡＧＴＧＡＡＧＴＣＣ；配列番号８）。ＰＣＲ反応後、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより３７℃で３時間完全分解した。次いで、第２のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を精製カラムキットを用いて精製した。
ｉｉｉ）アミノペプチダーゼ遺伝子を含有するベクターの構築
＜第１のアミノペプチダーゼ遺伝子＞
ベクターのｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断し、精製した。次いで、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＥＴ−１１ａと  ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断された第１のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼを用いて１６℃で、３時間反応させることにより連結した。連結したＤＮＡを用いて、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）  ＸＬ２−ＢｌｕｅＭＲＦ’株（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌの  アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上でのコロニー形成を指標に選択した。形質転換体から第１のアミノペプチダーゼ遺伝子含有プラスミドをアルカリ法で抽出した。
＜第２のアミノペプチダーゼ遺伝子＞
ベクターのｐＥＴ−２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、精製した。次いで、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＥＴ−２１ｄと  ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断された第２のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片とをＴ４リガーゼを用いて１６℃で、３時間反応させることにより連結した。連結したＤＮＡを用いて、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）  ＸＬ２−ＢｌｕｅＭＲＦ’株（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌの  アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上でのコロニー形成を指標に選択した。形質転換体から第２のアミノペプチダーゼ遺伝子含有プラスミドをアルカリ法で抽出した。
実施例２（組み換えアミノペプチダーゼの発現）
ｉ）アミノペプチダーゼ遺伝子を含有する形質転換体の作製
１．５ｍｌ容チューブ内に、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（  Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセル０．０４ｍｌ（２×１０６ｃｆｕ）と、上記調製した第１のアミノペプチダーゼ遺伝子含有プラスミドＤＮＡ溶液又は第２のアミノペプチダーゼ遺伝子含有プラスミドＤＮＡ溶液０．００３ｍｌ（プラスミドＤＮＡ    １００  ｎｇ）を加え氷中に３０分間放置した後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与えた。次いで、チューブ内にＳＯＣｍｅｄｉｕｍ  を０．２５ｍｌ加え、３７℃で１時間振とう培養した。次いで、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、３７℃で一晩培養することにより形質転換体を得た。
ｉｉ）アミノペプチダーゼの精製
第１のアミノペプチダーゼ遺伝子を保持する形質転換体及び第２のアミノペプチダーゼ遺伝子を保持する形質転換体を、それぞれクロラムフェニコール及びアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、６００ｎｍにおける吸光度が０．６に達するまで、３７℃で培養した後、プラスミドの発現量を高めるためにＩＰＴＧを加えさらに４時間培養した。培養液を７，０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離することにより集菌した。
【００４８】
集菌した菌体５ｇに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）４０ｍｌを加え、菌体を６０Ｗの出力で３分間超音波破砕した。破砕した菌液を  １８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を採取した。
【００４９】
夾雑蛋白を沈殿させて除去する目的で、この上清を８５℃で３０分間加熱した後、１８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を採取した。上清を、５０  ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ    緩衝液（ｐＨ  ７．５    ）中で透析し、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂のＨｉｔｒａｐＱ（ファルマシア社製）カラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。
【００５０】
さらに、活性画分を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０  ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ７．５）中で透析し、同緩衝液で平衡化したゲル濾過材のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  （ファルマシア社製）カラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。活性画分には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一バンドを与える均一標品が含まれていた。
【００５１】
また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、第１のアミノペプチダーゼ遺伝子発現産物である第１のアミノペプチダーゼの分子量は約４２ｋＤａであり、第２のアミノペプチダーゼ遺伝子の発現産物である第２のアミノペプチダーゼの分子量は約４１ｋＤａであった。
実施例３（超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ ＪＣＭ９９７４株のアミノペプチダーゼ遺伝子の同定）
実施例１で得られた超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＪＣＭ９９７４株の染色体ＤＮＡ中の第１及び第２のアミノペプチダーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号１及び３に示す。第１のアミノペプチダーゼ遺伝子は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構においてＩＤ番号ＰＨ１５２７として登録されているものであり、第２のアミノペプチダーゼ遺伝子は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構においてＩＤ番号ＰＨ１８２１として登録されているものである。
【００５２】
また、実施例２で得られたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＪＣＭ９９７４株の第１及び第２のアミノペプチダーゼのアミノ酸配列を配列番号２及び４に示す。
実施例４（耐熱性アミノペプチダーゼの諸性質）
前記の方法で得られたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＪＣＭ９９７４株由来のアミノペプチダーゼの諸特性を評価した。アミノペプチダーゼ活性は以下に示すニンヒドリン反応により測定した。
＜ニンヒドリン反応＞
０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＣｏＣｌ２を含む５０ｍＭ  （Ｎ−エチルモルフォリン（  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ；ＮＥＭ）緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて２ｍＭ    Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ溶液を調製した。この基質溶液０．５ｍｌに精製した第１のアミノペプチダーゼについては、溶液中濃度が０．０５μｇ／ｍｌになるように添加し、精製した第２のアミノペプチダーゼについては、溶液中濃度が０．１μｇ／ｍｌになるように添加した。酵素反応溶液を８５℃下で１０分間加熱した後、氷中に放置した。酵素反応溶液１２０μｌに１重量％のニンヒドリン水溶液を８８０μｌ添加したニンヒドリン反応溶液を８５℃下で５分間放置した後、５０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５３】
さらに、以下の１〜３の手順に従い、アミノペプチダーゼ分子活性を算出した。
＜２ｍＭ  Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａを基質とした分子活性を算出する方法＞
１．    Ａｌａを用いてニンヒドリン反応の検量線を上記方法で作成する。
２．      ２ｍＭ  Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａを基質とした場合に測定された値を検量線を用いて、遊離されたＡｌａ量（生成物の濃度（ｍＭ））に換算する。ここで、Ａｌａ−Ａｌａ  及び  Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａの値はＡｌａに比べて格段に小さいので無視する。
３．分子活性（１／秒間）
＝生成物の濃度（ｍＭ）／〔酵素の濃度（ｍＭ）×反応時間（秒間）〕
の式により分子活性を算出する。
ｉ）至適温度
ニンヒドリン反応により、６０〜１１０℃の温度下で、第１及び第２の各アミノペプチダーゼの活性を測定した。反応液温度を１００℃以上にする場合は、加圧することにより当該温度に設定した。酵素活性の相対値を図１（Ａ）及び（Ｂ）に示す。（Ａ）は第１のアミノペプチダーゼの結果を示し、（Ｂ）は第２のアミノペプチダーゼの結果を示す。
【００５４】
図１（Ａ）から分かるように、ｐＨ  ７．５のＮＥＭバッファー中での第１のアミノペプチダーゼの至適温度は１０５℃であった。また、第１のアミノペプチダーゼの１０５℃下での分子活性は、７００（１／秒間）以上であった。
【００５５】
図２（Ｂ）から分かるように、ｐＨ７．５のＮＥＭバッファー中での第２のアミノペプチダーゼの至適温度は１００〜１０５℃であった。また、第２のアミノペプチダーゼの１００℃下での分子活性は、３５０（１／秒間）以上であった。
ｉｉ）耐熱性
第１のアミノペプチダーゼについては、反応液  （０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＣｏＣｌ２を含む５０ｍＭ  （Ｎ−エチルモルフォリン（  Ｎ−ｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ；ＮＥＭ）緩衝液（ｐＨ７．５））中に第１のアミノペプチダーゼを５μｇ／ｍｌになるように添加した酵素溶液を調製した。この酵素溶液を９８℃でインキュベートして経時的に残存活性を測定した。第２のアミノペプチダーゼについても、５μｇ／ｍｌの酵素溶液を用いて同様の操作を行った。
【００５６】
結果を図２に示す。図２の（Ａ）は第１のアミノペプチダーゼの結果を示し、（Ｂ）は第２のアミノペプチダーゼの結果を示す。図（Ａ）から分かるように第１のアミノペプチダーゼは、９８℃で熱処理した場合に１時間後に９５％の活性が残存し、２時間後にも８５％の活性が残存した。図（Ｂ）から分かるように第２のアミノペプチダーゼは、９８℃で熱処理した場合に１時間後に９０  ％の活性が残存し、２時間後にも７５％の活性が残存した。
ｉｉｉ）アシルペプチドの分解活性
精製した第１及び第２の各アミノペプチダーゼの、ａｃｅｔｙｌ−Ａｌａ−  Ａｌａ−  Ａｌａ−ＯＨに対する分解活性を測定した。詳述すれば、上記説明したニンヒドリン法によるアミノペプチダーゼ活性測定方法において、基質としてＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに代えてａｃｅｔｙｌ−Ａｌａ−  Ａｌａ−  Ａｌａ−ＯＨを用いた他は、上記と同様の条件で、８５℃下で、アミノペプチダーゼ活性を測定した。
【００５７】
この結果、第１のアミノペプチダーゼの分子活性は０．２（１／秒間）であり、この値はＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性を１とした場合に７．４×１０−４  であった。また第２のアミノペプチダーゼの分子活性は０．０２（１／秒間）であり、この値はＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａに対する分子活性を１とした場合に８．７×１０−５であった。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によれば、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質及びＮ−末端がアシル化されていないペプチド又はタンパク質の双方を分解できるアミノペプチダーゼであって、従来より分子活性の高いアミノペプチダーゼが提供された。
【００５９】
さらにいえば、本発明のアミノペプチダーゼは、Ｎ−末端がアシル化されたペプチド又はタンパク質及びＮ−末端がアシル化されていないペプチド又はタンパク質の双方を分解できる基質特異性の広いものであることから、生体内に多く見出されるアシルペプチドをＮ−末端から順次加水分解できる。これにより、アシルペプチドのＮ−末端分析やアシルペプチドの加水分解によるアミノ酸の製造を行うことができる。
【００６０】
また本発明のアミノペプチダーゼは、極めて高い耐熱性を有することから、アシルペプチドのＮ−末端分析やアミノ酸の製造を従来より格段に高温下で行うことができる。これにより、高濃度の基質溶液に対して効率よく反応を行うことができる。ペプチドは構成アミノ酸の種類によっても異なるが、一般に長くなるほど水への溶解度が低下する。本発明のアミノペプチダーゼを用いれば、水難溶性のペプチドであっても高温下で調製した高濃度のペプチド溶液に対して効率よく加水分解反応を行える。また、高温下で加水分解できることから、夾雑酵素や混入した微生物等による影響を抑えることができる。
【００６１】
また本発明のアミノペプチダーゼは分子構造が安定であることから有機溶媒に対しても安定である。従って、水に溶解し難いが有機溶媒には溶解し易いペプチド又はタンパク質についても、有機溶媒を用いて高濃度のペプチド又はタンパク質溶液を調製することができ、その分加水分解反応を効率よく行うことができるとともに、対象ペプチドの範囲が広がる。
【００６２】
また本発明のアミノペプチダーゼは、常温下でも安定であることから、長期保存に耐えることができる。
【００６３】
また本発明のアミノペプチダーゼは、従来の耐熱性アミノペプチダーゼには見られない極めて高い分子活性を有することから、極めて効率よくアシルペプチド加水分解反応を行える。
【００６４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）は、パイロコッカスホリコシＪＣＭ９９７４株由来の第１のアミノペプチダーゼの至適温度を示すグラフであり、（Ｂ）は、同株由来の第２のアミノペプチダーゼの至適温度を示すグラフである。
【図２】（Ａ）は、パイロコッカスホリコシＪＣＭ９９７４株由来の第１のアミノペプチダーゼを熱処理した場合の残存活性を示すグラフであり、（Ｂ）は、同株由来の第２のアミノペプチダーゼを熱処理した場合の残存活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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