(57)【要約】      （修正有）【課題】アスペルギルス・オリゼー由来の高い転写活性と転写制御機能を持つプロモーターの提供。【解決手段】特定の配列のＤＮＡ、または特定の配列に示すＤＮＡ塩基配列の特定のｇがａであるＤＮＡをプロモーターとして利用し、所望する各種有用蛋白質遺伝子を高発現させる。【効果】本発明により新たに開発したプロモーターは非常に高い転写活性を有し、常に高発現するものと、容易な操作で非常に明瞭な転写量の制御が可能なものの２種類がある。これらを利用することにより、高い蛋白質生産能を持ち有用蛋白質生産の宿主として優れたアスペルギルス・オリゼーを用いて、従来よりもより効率的な有用蛋白質の高生産システムを構築することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の番号１に示されるＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の番号１に示されるＤＮＡ塩基配列の６７０番目のｇがａであるＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなるプロモーター。
（ａ）  請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡ。
（ｂ）  塩基配列（ａ）において１もしくは１以上の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のプロモーターを利用することを特徴とする有用蛋白質遺伝子の高発現用プラスミド。
【請求項５】
請求項４に記載のプラスミドを糸状菌に導入し、得られた形質転換体を培養することからなる有用蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）より取得された転写を活性化する塩基配列、つまりプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）として機能するＤＮＡ配列、およびその利用に関する。さらに詳細には、本発明はアスペルギルス・オリゼーよりクローニングしたプロモーターを利用し、アスペルギルス属糸状菌などを宿主として有用蛋白質およびペプチドを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子組換え技術の進歩により、大腸菌や酵母を利用した有用蛋白質の生産が可能となった。しかし大腸菌を宿主として真核生物由来の異種蛋白質遺伝子を発現させた場合、合成されたペプチド鎖の加水分解によるプロセッシングや糖鎖の付加などの翻訳後の修飾が正常に行われないといった問題がある。一方酵母の場合、翻訳後の修飾の問題は解決し得るが蛋白質の分泌量が非常に少ないという欠点が指摘されている。そのため蛋白質分泌能力の高い糸状菌が、真核生物由来の異種蛋白質を高生産させるための宿主として注目されている。アスペルギルス・オリゼーは様々な有用酵素を大量に生産分泌することができる有用微生物であり、清酒醸造や醤油、味噌などの生産に利用されている。また日本の伝統産業で古くから利用されてきた実績からも、その安全性は既に歴史的に証明されており、アメリカ食品薬品局（ＦＤＡ）においても安全な宿主として認定されている。このような点からアスペルギルス・オリゼーは、近年異種蛋白質の生産宿主として利用されている。
【０００３】遺伝子組換え技術を利用した有用蛋白質の生産を行う場合、その生産量は遺伝子のコピー数、転写以後の翻訳効率、翻訳後の修飾、プロテアーゼによる分解など多くの要因により影響を受ける。しかしながら転写活性の低いプロモーターからは効率の高い蛋白質生産は期待できない。つまり効率的な蛋白質生産のためには、第一に転写活性の高いプロモーターを利用することが必要な条件である。従来、アスペルギルス・オリゼーを宿主として異種蛋白質生産を行う場合、高発現プロモーターとしてアミラーゼ系遺伝子のプロモーター、例えばアスペルギルス・オリゼーのα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＢ）［  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６，  １４１９，  １９８７  ］やグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）［  Ｇｅｎｅ，  １０８，  １４５，  １９９１  ］が用いられてきた。しかしこれらのプロモーターはグルコースレプレッションを受けるため、培地中に混入するグルコースによって有用蛋白質の生産量が低下する。したがってアスペルギルス・オリゼーを宿主とした組換え蛋白質生産を行う場合、高い転写活性を示しグルコースレプレッションを受けないプロモーターを利用することが望ましい。これまでにアスペルギルス・オリゼーのα−グルコシダーゼ遺伝子（ａｇｄＡ）［Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５９，  １５１６，  １９９５  ］のプロモーターを人為的に改変することにより転写活性を向上させ、グルコースレプレッションを解除する方法［特許３３４３５６７］が報告されている。しかしながらこのプロモーターの転写活性は既存のα−アミラーゼ遺伝子やグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーターと同程度にとどまるものである。アスペルギルス・オリゼーを用いたさらに高効率の異種蛋白質生産システムの構築のためには、より高い転写活性を持ち、グルコースレプレッションを受けないプロモーターを開発することが望まれている。
【０００４】有用蛋白質の効率的な生産のために、宿主菌の増殖と蛋白質の生産を二段階に分けて行うことが望ましい場合がある。つまり、培養初期においては蛋白質の生産を抑制して宿主菌の増殖を優先させ、十分な菌体密度に達した時点で蛋白質の生産を開始させるのである。そのためにはこのような高い転写活性を有し、かつ容易な操作によって転写活性を明瞭に制御できるプロモーターを用いることが必要である。しかし実用的な高転写活性を有し、容易な操作により明瞭に転写活性の制御が可能なアスペルギルス属糸状菌由来のプロモーターはいまだ報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は糸状菌において目的の蛋白質遺伝子を大量発現するため、アミラーゼ系遺伝子のプロモーターよりもさらに強力な転写活性を持ちグルコースレプレッションを受けない新規なプロモーター、および実用的な高い転写活性と容易な操作により明確に転写活性を制御可能なプロモーターを提供し、異種有用蛋白質の生産に利用することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究を行った結果、アスペルギルス・オリゼーのピリチアミン（ｐｙｒｉｔｈｉａｍｉｎｅ）耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）［  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６４，  １４１６，  ２０００  ］およびその野生型遺伝子であるチアゾール（ｔｈｉａｚｏｌｅ）合成遺伝子（ｔｈｉＡ）のプロモーターが非常に高い転写活性を持つことを見いだした。さらに、ｔｈｉＡ遺伝子のプロモーターは微量のチアミン（ｔｈｉａｍｉｎｅ）を培地に添加することでその転写活性を著しく減少させることが可能であった。本発明は、該遺伝子のプロモーターによる発現系を用いることにより、上記目的を達成することに成功したものである。以下本発明を詳細に説明する。
【０００７】プロモーターの転写活性を測定するため、例として図１に示すような転写活性解析用プラスミドｐＮＧ１を使用した。本プラスミドは、形質転換用の選択マーカーとしてアスペルギルス・オリゼーの硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ）［  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２１８，  ９９，  １９８９  ］と、レポーター遺伝子として大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ｕｉｄＡ）［  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｔａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８３，  ８４４７，  １９８６  ］  とその下流にアスペルギルス・オリゼーのａｍｙＢ遺伝子のターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ）を含む。本プラスミドのｕｉｄＡ遺伝子の上流（ＳｍａＩ−ＳａｌＩ  サイト）に解析するｐｔｒＡ、ｔｈｉＡ、ａｍｙＢおよびｇｌａＡ各遺伝子のプロモーターを挿入してプラスミドを構築した。
【０００８】配列表の１に、本発明に関わる上記ｐｔｒＡ遺伝子のプロモーター配列を示す。ｔｈｉＡ遺伝子のプロモーター配列は、配列表の１に示されるＤＮＡ配列の６７０番目のｇがａに置換したものである。
【０００９】各プロモーターを挿入した上記プラスミドを適当なｎｉａＤ変異（硝酸資化能欠損）を持つアスペルギルス・オリゼーを宿主として形質転換を行い、サザン解析により形質転換株からプラスミドが  ｎｉａＤ座位に１コピー導入された株を選抜した。これらの形質転換株について種々の培養条件下における菌体内のＧＵＳ活性を測定し、プロモーター転写活性の指標とした。
【００１０】上記プロモーター解析方法により、ｐｔｒＡおよびｔｈｉＡ遺伝子のプロモーターが液体培養において非常に高い転写活性を示すことが確認された。具体的にはアスペルギルス・オリゼーのａｍｙＢやｇｌａＡ遺伝子のプロモーターの２〜５倍以上の転写活性を示した。また、ｔｈｉＡ遺伝子のプロモーターは培地にチアミンを１０  μＭ添加することにより転写活性が著しく低下（非添加時の１％  以下）したのに対してｐｔｒＡ遺伝子のプロモーターはチアミンによる影響はほとんど受けず、構成的に高転写活性を示した。
【００１１】本発明のｐｔｒＡおよびｔｈｉＡ遺伝子のプロモーターはその下流に所望の有用蛋白質をコードする遺伝子、さらに下流に適当なターミネーターを連結してプラスミドを構築し、該プラスミドで宿主を形質転換し、それを培養することにより、有用蛋白質を著量生産することができる。得られたプロモーターへの有用蛋白質遺伝子およびターミネーターの連結、プラスミドへの挿入は、それ自体公知の方法［細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド，  ２，  秀潤社，  １９９８  ］で行うことができる。有用蛋白質遺伝子としては特に限定するものではないが、例としてアスペルギルス・オリゼーのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）  ［Ｇｅｎｅ，  １０８，  １４５，  １９９１］や酸性プロテアーゼ遺伝子（ｐｅｐＡ）［Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５７，  １０９５，  １９９３］などが挙げられる。ターミネーターについても特に限定するものではないが、例としてアスペルギルス・オリゼーのａｍｙＢまたはｇｌａＡ  遺伝子などのターミネーターが挙げられる。また、プラスミドとしては、ウリジンやアルギニン要求性などの栄養要求性を相補する遺伝子、硫黄、炭素および窒素源などの資化性に関わる遺伝子、並びにピリチアミン耐性遺伝子などの選択マーカーを含むものを使用できる。宿主としてはアスペルギルス・オリゼーをはじめ、その他のアスペルギルス属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒｅ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属などの微生物が使用できる。宿主への形質転換も公知の方法  ［Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５１，  ３２３，  １９８７］  で行うことができる。なお、該形質転換体の培養は、宿主や、所望の蛋白質に適した培地、培養条件を適宜選択する必要がある。また、得られた蛋白質の採取、精製も所望の蛋白質に適した公知の方法で行うことが望ましい。このような情報の収集や具体的な条件の設定は、同業他社であれば容易に実施できるものである。
【００１２】
【実施例】以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１３】（転写活性解析用プラスミドの構築）図１に示した転写活性解析用プラスミドｐＮＧ１の構築は以下のようにして行なった。ｎｉａＤ遺伝子を含むプラスミドｐＵＮ１［  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６１，  １３６７，  １９９７  ］のＳａｌＩ−ＳｐｈＩサイトに、プラスミドｐＧＡＰＧ１［  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２２，  ８５，  １９９２  ］を鋳型としてＰＣＲ法により増幅したｕｉｄＡ遺伝子とその下流にａｍｙＢ遺伝子のターミネーターを含むＤＮＡ断片を挿入した。このＤＮＡ断片を増幅するために、ＳａｌＩサイトを付加した上流プライマーとして、
Ｓａｌｕｓ：  ５’−ｇｇｔｃｇａｃａｔｇｔｔａｃｇｔｃｃｔｇｔａｇａａａｃｃｃｃ−３’
ＳｐｈＩサイトを付加した下流プライマーとして、
Ｓｐｈｕａ：  ５’−ｃｃｇｃａｔｇｃｃｔｔｔｃｃｔａｔａａｔａｇａｃｔａｇｃｇ−３’
をシグマジェノシスジャパン株式会社に委託合成して用いた。
【００１４】（プロモーター遺伝子断片の取得とｐＮＧ１への挿入）ｐＮＧ１のｕｉｄＡ遺伝子上流のＳｍａＩ−ＳａｌＩサイトに、ｐｔｒＡ、ｔｈｉＡ、ａｍｙＢおよびｇｌａＡ遺伝子それぞれのプロモーターを挿入したプラスミドを作製した。ｐｔｒＡ遺伝子のプロモーターは糸状菌形質転換用ベクターｐＰＴＲＩ  ＤＮＡ（タカラバイオ株式会社）を鋳型として、ｔｈｉＡ、ａｍｙＢおよびｇｌａＡ遺伝子の各プロモーターはアスペルギルス・オリゼーＲＩＢ１２８（独立行政法人酒類総合研究所）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅した。上記各遺伝子のプロモーターを増幅するプライマーにはそれぞれ適当な制限酵素サイトを付加した。具体的にはｐｔｒＡおよびｔｈｉＡ遺伝子ではＳｍａＩサイトを付加した上流プライマーとして、
Ｓｍａｐｔｒｓ：  ５’−ｇｇｃｃｃｇｇｇｇａｃａｇａｃｇｇｇｃａａｔｔｇａｔｔａｃｇ−３’
ＳａｌＩサイトを付加した下流プライマーとして、
Ｓａｌｐｔｒａ：  ５’−ｃｃｇｔｃｇａｃｇｔｔｔｃａａｇｔｔｇｃａａｔｇａｃ−３’
ａｍｙＢ遺伝子ではＳｍａＩサイトを付加した上流プライマーとして、
Ｓｍａａｍｙｓ：  ５’−ｇｇｃｃｃｇｇｇｃａｔｔｔｔａａａｔｔｔｔｔａｔａｔｇｇ−３’
ＳａｌＩサイトを付加した下流プライマーとして、
Ｓａｌａｍｙａ：  ５’−ｃｃｇｔｃｇａｃａａａｔｇｃｃｔｔｃｔｇｔｇｇｇｇ−３’
ｇｌａＡ遺伝子ではＳｃａＩサイトを付加した上流プライマーとして、
Ｓｃａｇｌａｓ：  ５’−ｇｇａｇｔａｃｔａｇｃｃｔａｃｇｃｔａａａｇｃａａａｇｔ−３’
ＳａｌＩサイトを付加した下流プライマーとして、
Ｓａｌｇｌａａ：  ５’−ｃｃｇｔｃｇａｃｔｇｃｔｔｃｇａｃｔｔｃｇｔｔｔｇ−３’
を用いた。
【００１５】ＰＣＲの反応条件は、（９４℃，  １分）→（５５℃，  １分）→（７２℃，  １分）で３０サイクル行った。ＰＣＲ増幅後の反応液はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （株式会社キアゲン）を用いて精製後、各プライマーに付加した制限サイトを切断する制限酵素で処理し、再度ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製した。これらの遺伝子断片を、ＳｍａＩ  およびＳａｌＩで処理したｐＮＧ１へＬｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．  ２（タカラバイオ株式会社）を用いて挿入し、各プロモーターの解析用プラスミドを構築した。
【００１６】（アスペルギルス・オリゼーへの形質転換）各プロモーターの解析用プラスミドをアスペルギルス・オリゼーに形質転換した。アスペルギルス・オリゼーのｎｉａＤ変異株であるｎｉａＤ３００（  独立行政法人酒類総合研究所  ）をデキストリン−ペプトン培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％  ＫＨ２ＰＯ４、０．１％  ＮａＮＯ３、０．０５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ  ６．５）で３０℃、１４５  ｒｐｍ、２０時間回転振とう培養後、得られた菌体を滅菌水で洗浄した。この菌体をプロトプラスト化緩衝液（１０  ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ  ６．０、０．８  Ｍ  ＮａＣｌ、０．５  ｍｇ／ｍｌ  Ｙａｔａｌａｓｅ  （タカラバイオ株式会社））に懸濁し、３０℃、２時間、緩やかに振とうすることによりプロトプラスト化した。得られたプロトプラストを乾熱滅菌した  ３Ｇ−３のグラスフィルターでろ過して残存する菌体を除去した後、０．８  Ｍ  ＮａＣｌ  溶液で２回洗浄した。次にこのプロトプラストをＴＦ液▲１▼（０．８  Ｍ  ＮａＣｌ、１０  ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０  ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ  ８．０）に２×１０８  個／ｍｌとなるように懸濁後、０．２容量のＴＦ液▲２▼（４０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ４０００、５０  ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０  ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液  ｐＨ  ８．０）を加えコンピテントセルを調製した。
【００１７】上記コンピテントセル０．２  ｍｌに導入する各プラスミドを５０  μｇ加え、氷上で３０分間静置後、ＴＦ液▲２▼  １  ｍｌ  を加えてさらに１５分間室温で静置した。これにＴＦ液▲１▼  ８．５  ｍｌ  を添加後、１８００  ｒｐｍ、５  分間遠心してプロトプラストを回収し、再度ＴＦ液▲１▼  ０．２  ｍｌ  に懸濁した。このプロトプラスト懸濁液を再生用下層最少平板培地（０．６％  ＮａＮＯ３、０．１５２％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５２％  ＫＣｌ、０．０５２％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８  Ｍ  ＮａＣｌ、２％  ａｇａｒ、ｐＨ  ６．５）上にのせ、さらに、あらかじめ４５℃に保温しておいた再生用上層最少培地（下層培地のａｇａｒ濃度を０．５％にしたもの）５  ｍｌを重層してプロトプラストを包埋した。３０℃、１０日間培養後、生育してきた形質転換体を釣菌した。
【００１８】（ｎｉａＤ相同組換えによるプラスミド１コピー導入株の選抜）サザン解析によって、形質転換体の中からｎｉａＤ座位にプラスミドが１コピー導入された菌株を選抜した。各形質転換体より抽出したゲノムＤＮＡをＳａｌＩで完全消化し、０．８％アガロース電気泳動により分離してナイロンメンブレン・ハイボンドＮ＋  （アマシャムバイオサイエンス株式会社）にブロットした。プローブとしてＰＣＲ法により増幅したｎｉａＤ遺伝子の塩基配列の一部を用いた。プローブを増幅するため鋳型としてはｐＵＮ１を用い、プライマーは上流側として、
Ｐｒｎｉｓ：  ５’−ｇｇｃａａｃｃａｔｃａｃｃｇａｇｇｔｇｃｇｇ−３’
下流側として、
Ｐｒｎｉａ：  ５’−ｇｇｔａａｇａｃｇｃｇｇｔｔｇｔｃａｔｔｇ−３’
を用いた。
【００１９】プローブのラベリングおよびシグナルの検出はＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を用いた。宿主であるアスペルギルス・オリゼー  ｎｉａＤ３００においては８．２−ｋｂのシグナルが現れるが、プラスミドがｎｉａＤ座位に１コピー導入した形質転換体はこのシグナルが消失し、代わりに８．５−ｋｂおよび  １１．１−ｋｂ  の２本のシグナルが現れる。これに基づいて目的の形質転換体を選抜した。
【００２０】（各形質転換体のＧＵＳ活性測定）選抜された上記形質転換体菌体内のＧＵＳ蛋白活性を公知の方法［  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８３，  ８４４７，  １９８６］  に準じて測定した。すなわち、最少培地（０．６％  ＮａＮＯ３、０．１５２％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５２％  ＫＣｌ、０．０５２％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ  ６．５）１００  ｍｌに３％グルコース、３％  デキストリンまたは３％デキストリンと１０  μＭ  チアミンを添加した３種類の液体培地へ各形質転換体の分生子を５×１０７  個／１００  ｍｌとなるよう接種、３０℃、４８  時間、１８０  ｒｐｍ、回転振とう培養した。菌体を３Ｇ−１のグラスフィルターで回収、滅菌水で３回洗浄、濾紙にはさんで十分脱水の後、液体窒素で凍結して乳鉢で破砕した破砕菌体０．５  ｇを抽出緩衝液（５０  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１０  ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ・Ｎａ２、０．１％  Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌ  ｓａｒｃｏｓｉｎｅ、ｐＨ  ７．０）５  ｍｌに懸濁した。これを室温で１  分間ボルテックスミキサーにより攪拌後、１５０００  ｒｐｍ、１０  分間遠心し、上清を粗酵素液とした。
【００２１】上記粗酵素液０．０５  ｍｌをＧＵＳ反応液（５０  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１０  ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１  ｍＭ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄ、ｐＨ  ７．０）０．４５  ｍｌに加え、３７  ℃、３０  分間反応させ、反応停止液（２．５  Ｍ  ２−ａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ）０．２  ｍｌを混和した後、４１５  ｎｍの吸光度を測定し、遊離したｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量を求めた。粗酵素液の蛋白質濃度はウシ血清アルブミンを標準とし、日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社のプロテインアッセイを用いて定量した。ＧＵＳ活性は基質であるｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄｅから１  分間に１  ｎ  ｍｏｌのｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを遊離する活性を１  Ｕとして表した。得られた結果を表１に示した。
【００２２】
【表１】
2004254670.tif 000002
【００２３】グルコースレプレッションが起こらない３％デキストリンの培地でも、ｐｔｒＡとｔｈｉＡ遺伝子のプロモーターはアミラーゼ系遺伝子（ａｍｙＢとｇｌａＡ）のプロモーターの２〜５倍の非常に高い転写活性を示した。一方、炭素源を３％グルコースにした場合は、ａｍｙＢやｇｌａＡ遺伝子のプロモーターは転写活性が２０〜２５％に低下したが、ｐｔｒＡとｔｈｉＡ遺伝子のプロモーターは炭素源がデキストリンの場合と同様の高い転写活性を示し、グルコースレプレッションを全く受けなかった。
【００２４】３％デキストリンの培地に１０  μＭチアミンを添加した場合、ｐｔｒＡ遺伝子のプロモーターはチアミン無添加の場合とほぼ同様の高い転写活性を示したが、ｔｈｉＡ遺伝子のプロモーターは無添加の場合の０．７％にまで転写活性が低下した。これは前述のａｍｙＢやｇｌａＡ遺伝子のプロモーターのグルコースレプレッションの場合（２０〜２５％）と比較して、２０  倍以上も明瞭な転写制御であった。
【００２５】
【発明の効果】本発明では、有用蛋白質の生産に適した糸状菌アスペルギルス・オリゼー由来の構成的に高い転写活性を示すプロモーターと、さらに転写活性も高く容易な操作で転写活性を制御可能な２  種類のプロモーターを新たに開発した。これらのプロモーターを利用することにより、アスペルギルス・オリゼーの遺伝子はもとより他種の有用蛋白質をコードする遺伝子の高転写システムを構築し、より効率的な蛋白質生産が可能となった。
【００２６】
【配列表】
2004254670.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＮＧ１の制限酵素地図。
【図１】
2004254670.tif 000004