(57)【要約】【課題】抗体・抗原・酵素・ホルモン等のタンパク物質、ＤＮＡ・ＲＮＡ等の核酸物質あるいは生理活性糖鎖化合物（以下、これらを生理活性物質という）を粒子表面に化学結合法で感作させる生理活性物質担体ポリマー粒子を得る。【解決手段】（１）カルボン酸基を有するラジカル重合性ビニルモノマー０．１〜２０重量％、（２）下記一般式（１）で表される化合物および強酸基を有するラジカル重合性ビニルモノマーもしくはいずれか一方０．０５〜２０重量％、一般式（１）ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１）ＣＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＲ２（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アルコキシフェニル基、フェニル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を示し、ｎは２〜２２の数を示す）ならびに（３）上記（１）および（２）に記載のモノマーと共重合可能なラジカル重合性ビニルモノマー４０〜９９．８重量％をラジカル乳化重合することにより得られる化学結合感作用生理活性物質担体ポリマー粒子。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）カルボン酸基を有するラジカル重合性ビニルモノマー０．１〜２０重量％、
（２）下記一般式（１）で表される化合物および強酸基を有するラジカル重合性ビニルモノマーもしくはいずれか一方０．０５〜２０重量％、
一般式（１）
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１）ＣＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＲ２
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アルコキシフェニル基、フェニル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を示し、ｎは２〜２２の数を示す）
ならびに
（３）上記（１）および（２）に記載のモノマーと共重合可能なラジカル重合性ビニルモノマー６０〜９９．８重量％
をラジカル乳化重合することにより得られる化学結合感作用生理活性物質担体ポリマー粒子。
【請求項２】
強酸基を有するラジカル重合性ビニルモノマーが、スチレンスルホン酸あるいはスチレンスルホン酸塩である請求項１の化学結合感作用生理活性物質担体ポリマー粒子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定組成のモノマーをラジカル乳化重合することにより得られる化学結合感作用生理活性物質担体ポリマー粒子、より詳しくは、抗体・抗原・酵素・ホルモン等のタンパク物質、ＤＮＡ・ＲＮＡ等の核酸物質あるいは生理活性糖鎖化合物（以下、これらを生理活性物質という）を粒子表面に化学結合法で感作させる生理活性物質担体ポリマー粒子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、医学・生物学用途での担体用ポリマー粒子としては物理吸着感作用に主にポリスチレン粒子、化学結合感作用に主にカルボキシル基変性ポリスチレン粒子が広く使用されていた。
このうち、ポリスチレン粒子はタンパク等による物理吸着能力が高く、目的とする生理活性物質を容易に吸着する（感作する）ことが可能との特徴があり、広い範囲の生理活性物質に対して使用されている。しかしながら、このポリスチレン系の粒子は試験検体中に存在する目的としない他の生理活性物質等の吸着（これを非特異吸着という）が大きく、感作粒子の性能を阻害して使用する上での大きな障害になっていた。これに対して、粒子表面に目的の生理活性物質を感作したあと、残りの粒子表面をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の害の少ないタンパクを先に吸着させるブロッキングの手法が用いられているが効果は完全ではなかった。ポリスチレン粒子にスチレンスルホン酸塩あるいは特定のオリゴエチレンオキシド側鎖またはオリゴプロピレンオキシド側鎖のアクリルエステルを共重合させたり、あるいは粒子の乳化重合後にアルカリ性水溶液中で加熱処理して粒子に結合した過硫酸塩系開始剤の断片を加水分解させることで生理活性物質担体粒子としての性能を向上させることが知られているが、充分でなかった。また、物理吸着法による感作では感作粒子の使用時あるいは経時保存中に、感作した生理活性物質の一部が脱着することがあるとの本質的な問題があった。
【０００３】
一方、生理活性物質と化学結合できるカルボキシル基、アミノ基、グリシジル基等の活性官能基を粒子表面に有するポリマー粒子を用いる化学結合感作法では、生理活性物質が化学結合によって強固に粒子表面に結合されていて外れ難い、化学結合感作の際に目的とする生理活性物質のみを存在させて感作できる等の利点がある。このため、一般に化学結合感作法による感作粒子は性能の安定性に優れるが、粒子と化学結合できる生理活性物質には制限があり、適用できる対象が狭いとの制限があった。また、化学結合感作用粒子の表面はカルボキシル基、アミノ基、グリシジル基等の活性官能基が存在するために親水性が高く、疎水性の物理吸着用ポリスチレン粒子と比べて生理活性物質との親和性が低い。このため化学結合法では感作効率が悪く、感度等の性能が低い、性能に調節の幅が狭い、高価な感作抗体が多量に必要で製造コストが高いとの問題があった。
化学結合感作でのこれらの問題に対し、粒子表面のカルボキシル基の量を極微量にして物理吸着法と化学結合法の折衷をねらう提案、粒子表面に水酸基あるいは特定構造の側鎖のアクリルエステル構造を有する粒子の提案、粒子表面に多量のエポキシ基を有する粒子の提案、粒子表面に一級アミンを有する粒子の提案、重合の初期にカルボン酸モノマー濃度の高いモノマー混合物を先に重合させることで粒子表面のカルボン酸含量を高めたカルボキシル基変性粒子を用いる提案等があるが、完全ではなかった。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、診断薬用の化学結合担体粒子として、試薬化した粒子の保存安定性および感度と感度の直線性に優れる担体粒子を得ることを目的とする。
【０００５】
【本発明を解決するための手段】
本発明は、（１）カルボン酸基を有するラジカル重合性ビニルモノマー０．１〜２０重量％、
（２）下記一般式（１）で表される化合物および強酸基を有するラジカル重合性ビニルモノマーもしくはいずれか一方０．０５〜２０重量％、
一般式（１）
ＣＨ２＝Ｃ（Ｒ１）ＣＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＲ２
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は水素原子、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アルコキシフェニル基、フェニル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基を示し、ｎは２〜２２の数を示す）
ならびに
（３）上記（１）および（２）に記載のモノマーと共重合可能なラジカル重合性ビニルモノマー６０〜９９．８重量％
をラジカル乳化重合することにより得られる化学結合感作用生理活性物質担体ポリマー粒子を提供するものである。
【０００６】
本発明において、カルボン酸基を含有するラジカル重合性ビニルモノマーとは、アクリル酸、メタクリル酸、プロピオン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、無水マレイン酸、２−カルボキシエチルアクリレート、２−カルボキシエチルアクリレートオリゴマー等の重合可能な不飽和カルボン酸である。このうち、特にアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、フマル酸が好ましい。これらは複数を併用することもできる。
本発明で使用するカルボン酸基を含有するラジカル重合性ビニルモノマーの量は、全単量体に対し、０．１〜２０重量％、好ましくは０．５−１０重量％、さらに好ましくは１−６重量％である。０．１重量％未満では生理活性物質との化学結合のための反応基が不足して化学結合感作が困難である。２０重量％を超えるとモノマーの水溶性が高すぎて乳化重合での安定性が不良となり、重合凝集物が多量に発生する。
【０００７】
本発明で、強酸基を有するラジカル重合性ビニルモノマーとは、スルホン酸基あるいは硫酸エステル基を有するモノマーである。具体例としてはスチレンスルホン酸、２−スルホエチルメタクリレート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、１−アリロキシ−２−ヒドロキシプロパンスルホネート　およびこれらのナトリウム、カリウム、アンモニウム塩が挙げられる。これらは複数を併用することができる。このうち、特にスチレンスルホン酸およびその塩が粒子の非特異吸着を下げる効果が大きく好ましい。
本発明で使用する強酸基を有するラジカル重合性ビニルモノマーの量は、全単量体に対し、０．０５〜２０重量％、好ましくは０．１−１０重量％、さらに好ましくは０．５−６重量％である。０．０５重量％未満では実質的な効果が得られない。２０重量％を超えるとモノマーの水溶性が高すぎて乳化重合での安定性が不良となり、重合凝集物が多量に発生する。
【０００８】
本発明において、前記一般式（１）で表されるモノマーは、ポリエチレングリコール構造の長さにより粒子表面の親水性と疎水性のバランスがよく、粒子表面の立体障害的保護バリアの強弱を調整できる。
前記一般式（１）において、　Ｃ１〜Ｃ６アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基などが、アルコキシフェニル基としては、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基、プロポキシフェニル基などが挙げられ、ｎは２〜２２で、好ましくは３〜１４である。
本発明において一般式（１）で表される化合物の使用量は、全単量体に対し、０．０５〜２０重量％、好ましくは０．１−１０重量％、さらに好ましくは０．２−６重量％である。０．０５重量％未満では実質的な効果が得られない。２０重量％を超えるとモノマーの水溶性が高すぎて乳化重合での安定性が不良となり、重合凝集物が多量に発生する。
なお、本発明において、強酸基を有するラジカル重合性ビニルモノマーおよび一般式（１）で表される化合物を併用する場合には、両者の合計が全単量体の０．０５〜２０重量％となるように使用する。
【０００９】
本発明で、これらと共重合可能なラジカル重合性ビニルモノマーの具体例としては、スチレン、ビニルトルエン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルナフタレン等の芳香族ビニル化合物、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレート等のアクリレートまたはメタクリレート化合物、酢酸ビニル、ギ酸ビニル、酢酸アリル等のビニルエステル化合物、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、シアン化ビニリデン等の重合性二重結合含有シアン化合物、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ビニルメチルエチルケトンビニルメチルエーテル等の前記以外の重合性二重結合化合物を挙げることができる。これらのうち、生理活性物質との親和性の点で、特にスチレンが好ましい。これらは複数併用することができる。
この共重合可能なラジカル重合性ビニルモノマーの使用割合は６０〜９９．８重量％である。
【００１０】
本発明の乳化重合は定法での乳化重合が適用できる。重合開始剤は水溶性のラジカル開始剤で、具体例としては過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過酸化水素／硫酸第一鉄、クメンヒドロキシペルオキシド／アスコルビン酸、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル等が挙げられる。これらのうち、過硫酸塩が好ましい。
本発明で使用する乳化剤は定法のものが使用できる。具体例としては、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、ドデシル硫酸塩等の陰イオン界面活性剤が好ましい。また、用途においては、ノニオン乳化剤を使用すること、あるいはアニオン乳化剤とともにノニオン乳化剤を併用することも可能である。また、一分子中にアニオン基とノニオン基を有するアニオン／ノニオン乳化剤を使用することも可能である。
本発明では、乳化剤を使用しないで乳化重合を行うこともでき、乳化剤を使用しない、いわゆるソープフリー重合も本発明の乳化重合に含める。
ソープフリー重合では粒子径のコントロールに制限があるが、この方法で重合した粒子は表面への乳化剤の吸着がないため、生理活性物質の吸着が良好であるとの利点がある。
本発明の生理活性物質担体ポリマー粒子の粒子径は、０．０３〜２μｍの範囲であり、好ましくは０．０５〜１μｍ、さらに好ましくは０．０７〜０．８μｍである。
【００１１】
本発明の生理活性物質担体用ポリマー粒子は、乳化重合の後、　ｐＨ調整、必要があればスチームストリップ等で残留モノマーの除去を行い、　透析・限外ろ過・遠心分離等で粒子表面を洗浄した上で医学生物学用途での担体粒子として使用できる。
本発明の生理活性物質担体用ポリマー粒子は、粒子表面にカルボン酸基を有しており、化学結合法による生理活性物質を結合することができる。従来のカルボン酸変性粒子と比べて生理活性物質の非特異吸着が少なく、高性能の免疫診断薬、バイオ担体粒子、核酸捕捉粒子等に利用することができる。
【００１２】
本発明の生理活性物質担体用ポリマー粒子表面に化学結合法で直接にタンパク、核酸、糖鎖物質等の生理活性物質を結合させて使用することができるが、粒子表面に二官能のスペーサ化合物の一端を結合させ、他方に生理活性物質を結合させることで生理活性物質が粒子表面から若干の距離を離すことができる。例えばエチレングリコールジグリシジルエーテルおよびその誘導体をスペーサ化合物として使用することができる。生理活性物質が粒子表面から離れることで、生理活性物質の活性が大いに向上し、均一溶液中での値に近づき、時にはそれを越えることも期待できる。
本発明の担体粒子への抗体、抗原、タンパク、核酸、糖鎖物質等の生理活性物質の感作は化学結合法で行うが、その感作法としては、従来の通常の化学結合法のプロセス（プロトコール）が適用できる。
【００１３】
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する。
なお、本実施例において％および部は重量基準である。
実施例１
１Ｌの撹拌装置付き四ツ口フラスコに、水７００部、ドデシルベンゼンスルホン酸ソーダ０．５部、炭酸ナトリウム０．０５部、スチレン９５部、アクリル酸２部、スチレンスルホン酸ナトリウム１部を入れ、窒素置換して８０℃に昇温した。８０℃になったところで５％過硫酸アンモニウム水溶液１０部を添加して重合を開始した。そのまま８０℃で６時間の重合を行なった後、冷却し、５００メッシュの金網でろ過した。固形分を測定して重合転化率を計算したところ、９９．７％であり、凝固物量は０．０１％以下で重合安定性は良好であった。動的光散乱法で粒子径を測定したところ、１２５ｎｍであった。
この粒子は、１％水酸化ナトリウムでｐＨを８に調整した後、１０，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離で粒子を沈降させて上澄みを捨て、固形分をイオン交換水に再分散することを３回繰り返して粒子の精製を行った。
【００１４】
実施例２−９、比較例１−６
使用するモノマーの種類および量を表１または表２に記載とおりとした以外は実施例１と同様にして、実施例２−９、比較例１−６の粒子を合成した。
【００１５】
【表１】
2004061301.tif 000002
【００１６】
【表２】
2004061301.tif 000003
【００１７】
【表３】
2004061301.tif 000004
【００１８】
【表４】
2004061301.tif 000005
【００１９】
ラテックスの試薬化
精製した粒子をＭＥＳ液（ｐＨ６．１）に懸濁してなる１重量％の懸濁液１０ｍｌに１０ｍｇ／ｍｌの　１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１ｍｌと、１ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにｈＣＧ抗体をＭＥＳ液（ｐＨ６．１）に添加してなるｈＧＣ抗体液１０ｍｌを添加し、室温にて３時間攪拌した。次に４℃で　１６，０００ｒｐｍ×３０分の遠心分離を行ない上澄みを除去しＭＥＳ液に再分散することを３回行って粒子を洗浄し、１％血清アルブミンを含有したブロッキングバッファーに懸濁して、０．１重量％のｈＧＣ感作粒子の懸濁液を作製した。
【００２０】
感作粒子の評価
抗ｈＧＣ抗血清との反応性を、各感作粒子について比較した。抗ｈＧＣ抗血清は、１００，２００，４００，８００，１６００，３２００，６４００，１２８００，２５６００，５１２００の倍率で希釈し、１０段階の希釈系列を作製した。それぞれに感作粒子を添加し、粒子の凝集を認めた最大の希釈倍率を求めて評価した。　結果を表１に示す。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の担体粒子を用いることで、これまでより高感度・低バックグランド・広測定領域のラテックス診断薬粒子、特定のＤＮＡ・ＲＮＡを捕捉、精製、濃縮する特異核酸捕捉粒子、特定のタンパク分離粒子、ＤＮＡ転写制御因子タンパクの捕集粒子等を調整することができる。さらにこれら粒子をカラムに詰めると、特定の生理活性物質を検知、捕集するアフィニティクロマトができる。またこれら粒子をプレートに並べて使用することも可能である。
本発明の生理活性物質担体用ポリマー粒子の表面に医薬候補物質を結合させ、これをカラムに詰める、またはろ紙や薄層ゲルに担持させる、さらにはプレートに点着させたところに、細胞分解物あるいはタンパクを流して粒子に親和性のある成分を分別・分離することができる。これにより、医薬候補物質と相互作用する生体部位を探知することができる。あるいは逆に、本発明の生理活性物質担体用ポリマー粒子の表面に特定のタンパク、核酸、糖鎖等の生理活性物質を結合させ、これを詰めたカラム、ろ紙、薄層ゲルまたはプレートに医薬候補物質を流して粒子に親和性のある成分を分別・分離することで医薬物質をスクリーニングすることができる。