(57)【要約】【課題】末梢血管疾患部位の血管を新生することができ、人体に対する安全性が高く、実施が容易である治療方法を提供すること。【解決手段】二酸化炭素濃度が７００ｐｐｍ以上であり、水温が３３〜４２℃である炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、該疾患部位の新生血管数を増加させることを特徴とする血管新生療法。前記炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、該疾患部位組織中の血管内皮細胞数を１．５倍以上に増加させることを特徴とする血管新生療法。前記炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、該疾患部位の末梢血液中の血管内皮前駆細胞数を１．１倍以上に増加させることを特徴とする血管新生療法。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二酸化炭素濃度が７００ｐｐｍ以上であり、水温が３３〜４２℃である炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、該疾患部位の新生血管数を増加させることを特徴とする血管新生療法。
【請求項２】
二酸化炭素濃度が７００ｐｐｍ以上であり、水温が３３〜４２℃である炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、該疾患部位の組織中の血管内皮細胞数を１．５倍以上に増加させることを特徴とする血管新生療法。
【請求項３】
二酸化炭素濃度が７００ｐｐｍ以上であり、水温が３３〜４２℃である炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、該疾患部位の末梢血液中の血管内皮前駆細胞数を１．１倍以上に増加させることを特徴とする血管新生療法。
【請求項４】
経皮的に吸収された二酸化炭素の血管拡張作用により組織血流量を増加させること、および／または前記疾患部位の組織中体液のｐＨを局所的に酸性側に移行させて血管成長因子を誘発させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の血管新生療法。
【請求項５】
前記炭酸温水への末梢血管疾患部位の浸漬は、１回の浸漬時間が１０分間以上であり、かつ２４時間に１回以上の頻度で断続的に実施されるものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の血管新生療法。
【請求項６】
前記疾患部位を前記炭酸温水へ浸漬する前に、前記炭酸温水に殺菌剤が溶解されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の血管新生療法。
【請求項７】
前記末梢血管疾患部位が潰瘍を伴うものであって、該潰瘍部位に二酸化炭素透過性フィルムが添付された状態で、前記疾患部位を前記炭酸水に浸漬することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の血管新生療法。
【請求項８】
前記末梢血管疾患部位が足部に存在し、該疾患が下肢の疼痛を伴うものであって、少なくとも膝関節から前記疾患部位までの範囲にわたる部位を前記炭酸温水へ浸漬することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の血管新生療法。
【請求項９】
細胞増殖因子の直接投与、細胞増殖因子発現遺伝子の導入、および骨髄単核球細胞の移植から選ばれるいずれか１種以上の血管新生療法を併用して実施することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の血管新生療法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高濃度炭酸温水浴による血管新生療法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
炭酸泉は、その強力な血管拡張作用により末梢血液循環不全に優れた効果を発揮すると考えられていることから、広く治療や湯治に使用されている。これまでは天然より湧出した炭酸泉が使用されていたが、優れた人工炭酸泉製造方法の開発により、現在では広く内科治療の一つとして人工炭酸泉治療が使用されるに至っている。このような二酸化炭素の血管拡張作用は、以下のような機構により起こると考えられている。
【０００３】
生体内の物質代謝によって得られるエネルギーは、筋肉や臓器において消費されるが、その際の直接のエネルギーはＡＴＰ（アデノシン３リン酸）がＡＤＰ（アデノシン２リン酸）に変換される際に発生する熱エネルギーである。一方、糖（グリコーゲン）は、ピルビン酸、ＴＣＡ回路を経て酸化され、この時発生するエネルギーが変換されたＡＤＰをＡＴＰにふたたび回復する際のエネルギー源として使用されている。糖が酸化される際には酸素が消費されると同時に、代謝産物としてＨ２Ｏと炭酸ガスが放出され、血液によって肺から呼気として生体外に排出される。
生体内では、これらの必要とされるエネルギーを安定して供給するようにさまざまな調節機構が備えられているが、特に重要な調節機構が、代謝に必要な物質の輸送路である血流量の調節である。血液および組織中における炭酸ガス量は、このような血流量の調節機構にさまざまな形で影響を与えている。通常、炭酸ガス量の増大は代謝の亢進（エネルギーの大量消費）を意味し、これを補うためにいくつかの調節機構により血管の拡張、すなわち血流量の増加をもたらし、酸素の供給と炭酸ガスの排出を促進するのである。
【０００４】
炭酸ガスは経皮的な吸収が容易なガスであることから、炭酸水浴によって経皮的に炭酸ガスを吸収し、本来代謝の最終産物である炭酸ガスを組織中に作為的に増大させ、血管の拡張と血流量の増大を行わせることが可能である。この作用により、一時的に血管を拡張させ、あるいは機能不全となっている微小血管を再び開通させて血流量を増大または末梢組織への血液流入をさせ、症状の緩和を図る手法が広く炭酸泉療法として活用されているものである。
しかし、炭酸浴による血管拡張作用は数分で消失する。したがって、上記の治療法は、炭酸ガスによる一時的な血管拡張作用と血流増加を利用したものであり、一時的な温熱療法と併用した疼痛の緩和や、血流増加による創傷部位への補助的治療、あるいは末梢血管の拡張による血圧低下（血管抵抗の軽減）を利用した心臓疾患のリスク軽減とリハビリテーションにその応用が限定されている。
また、炭酸ガス以外にも、プロスタグランジンＥ１などの生体内における血管拡張物質の投与により同様の効果を得る治療手段もあり、投与量により血管拡張作用を持続することができるが、血行障害そのものを治癒することはできない。
【０００５】
一方、動脈硬化や糖尿病などによる重症の末梢循環疾患の中には、血管そのものが本来の機能を非可逆的に消失し、もはや血管拡張物質の投与が意味をなさない症例が多く、一時的な血流量増加ではなく失われた血管そのものを再生し得る治療法が望まれている。
生体内においては血管の損傷や血行不全が起こった際にそれを修復する機能が備えられている。それは、いくつかの組織成長因子によってプロモートされており、現在、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子）、ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）などのたんぱく質やそれらの遺伝子を、直接疾患部位に注入し血管の再生を促す治療法が研究されている。また、血管内皮前駆細胞と前記成長因子を分泌する骨髄単核球細胞を骨髄より採取し、精製して患部に移植する治療法も考案されている（例えば非特許文献１、２参照）。
【０００６】
しかし、これらの治療法で必要な成長因子や遺伝子を直接患部に投与するには、生体内で微量にしか存在しない成長因子を捕集・濃縮したりあるいはその発現遺伝子を合成してウィルスなどのベクターに導入して製剤化する必要がある。さらに、患部への投与については、高濃度の成長因子を注射等により一般的には数十箇所に分けて患部に注射する必要がある。また、それらの成長因子は生体内では血管の再生以外の作用も想定されるため、その副作用が皆無ではない。注射によって投与された高濃度の成長因子が血液中にのって全身に拡散した場合には全身に影響を及ぼす可能性もある。
【０００７】
【非特許文献１】
タテイシ−ユヤマ、マツバラ、ムロハラ、イケダ、シンタニ、マサキ、キシモト、ヨシモト、アカシ、シマダ、イワサカ、イマイズミ（Ｔａｔｅｉｓｈｉ−Ｙｕｙａｍａ  Ｅ，  Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｈ，  Ｍｕｒｏｈａｒａ  Ｔ，  Ｉｋｅｄａ  Ｕ，  Ｓｈｉｎｔａｎｉ  Ｓ，  Ｍａｓａｋｉ  Ｈ，  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ，  Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｋ，  Ａｋａｓｈｉ  Ｈ，  Ｓｈｉｍａｄａ  Ｋ，  Ｉｗａｓａｋａ  Ｔ，  Ｉｍａｉｚｕｍｉ  Ｔ．）、  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｏｒｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｂｙ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｄ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）２００２年、第３６０巻、４２７−４３５頁。
【非特許文献２】
イバ、マツバラ、ノザワ、フジヤマ、アマノ、モリ、コジマ、イワサカ（Ｉｂａ  Ｏ，  Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｈ，  Ｎｏｚａｗａ  Ｙ，  Ｆｕｊｉｙａｍａ  Ｓ，  Ａｍａｎｏ  Ｋ，  Ｍｏｒｉ  Ｙ，  Ｋｏｊｉｍａ  Ｈ，  Ｉｗａｓａｋａ  Ｔ）、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｉｎｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｌｉｍｂｓ．、サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、２００２年、第１０６巻、２０１９−２０２５頁。
【０００８】
本発明は、かかる従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、末梢血管疾患部位の血流量を増加させるのみではなく、低下または消失した血管の機能を新生しうる治療方法であり、人体に対する安全性が高く、実施が容易である治療方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、高濃度の二酸化炭素を含有する炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、上記課題を解決することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第一の発明は、二酸化炭素濃度が７００ｐｐｍ以上であり、水温が３３〜４２℃である炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、新生血管数を増加させることを特徴とする血管新生療法である。
本発明の第二の発明は、二酸化炭素濃度が７００ｐｐｍ以上であり、水温が３３〜４２℃である炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、疾患部位組織中の血管内皮細胞数を１．５倍以上に増加させることを特徴とする血管新生療法である。
また、本発明の第三の発明は、二酸化炭素濃度が７００ｐｐｍ以上であり、水温が３３〜４２℃である炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、末梢血液中の血管内皮前駆細胞数を１．１倍以上に増加させることを特徴とする血管新生療法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の方法に用いられる炭酸温水中の二酸化炭素濃度は、７００ｐｐｍ以上である。
炭酸温水浴による炭酸ガスの経皮吸収量は、炭酸温水中に溶解する炭酸ガスの濃度に比例して増加する。単に創傷部位への適応や温熱療法の補助療法である場合には、炭酸ガスは皮膚表面近傍に作用させれば良いため、炭酸ガスの有効最低濃度は、健常人の場合で４００ｐｐｍ程度である。
しかしながら、本発明の血管新生療法においては、炭酸ガスをより組織の深部に到達させることが必要となるため、より高濃度であることが必要となり、７００ｐｐｍ以上の濃度とされる。二酸化炭素濃度が７００ｐｐｍより低いと、血管拡張作用はあるが、血管新生作用が得られない。さらに、二酸化炭素の濃度は、１０００〜１４００ｐｐｍであることが好ましい。二酸化炭素濃度が上記範囲内であると、十分な血管新生の効果が得られ、かつ皮膚や組織への過度の刺激を与えないため好ましい。
【００１１】
上記のような二酸化炭素濃度を達成するための手段は特に限定されないが、例えば、化学反応により炭酸ガス気泡を温水中に発生、溶解させる方法、炭酸ガスを封入した圧力タンク中に温水を導入して炭酸ガスを溶解する方法（例えばＴｒａｕｔｗｅｉｎ社製、型式ＡＭ２１００を用いて炭酸温水を製造）、ガス透過性中空糸膜に温水および炭酸ガスを導入して炭酸ガスを溶解する方法（例えば三菱レイヨン・エンジニアリング社製、型式ＭＲＥ−ＳＰＡ−ＭＤを用いて炭酸温水を製造）等が挙げられる。これらのうち、１０００ｐｐｍ以上の炭酸ガス濃度の炭酸温水を簡便かつ正確な濃度で製造できる点から、ガス透過性中空糸膜に温水および炭酸ガスを導入して炭酸ガスを溶解する方法による炭酸温水製造装置を使用するのが好ましい。
また、大気圧下での炭酸ガスの温水中への飽和溶解濃度は３３℃〜４２℃で１１５０ｐｐｍ〜９５０ｐｐｍであるが炭酸ガスの生理作用は個体差や疾患にもよるが約１４００ｐｐｍまでは濃度依存的に増強される。大気圧下では過飽和に溶解した二酸化炭素は飽和濃度にまで容易に低下するため、常に過飽和の濃度を維持する目的で、実施中に継続的に温水中に炭酸ガスを補充することがより好ましい。
【００１２】
本発明の方法に用いられる炭酸温水の水温は、３３〜４２℃であり、より好ましくは、体温に近い３５℃〜３９℃である。水温が３３℃より低いと、血管新生作用を十分に得ることができず、また、患者が炭酸水を冷たく感じるため必要な時間患部を浸漬することが困難になる。また、水温が４２℃より高いと、過度に代謝が亢進されて組織の再生に悪影響を与えたり、患者が炭酸水を熱く感じるため必要な時間患部を浸漬することが困難になる。
【００１３】
本明細書において、末梢血管疾患部位とは、末梢血管疾患により組織に血液が十分に供給されていない部位、および／または虚血により末梢血管の機能が低下若しくは消失している部位をいう。
本発明の血管新生療法を好適に用いることができる末梢血管疾患としては、動脈硬化や血栓等による虚血性疾患や、糖尿病による末梢循環障害による疾患、バージャー病、レイノー病、膠原病等による末梢血管の循環障害等が挙げられる。
末梢血管疾患部位は、特に限定されないが、一般的に上肢、下肢等に疾患部位を有する場合が多い。これらのうち、膝下部、足部に疾患を有する場合が最も多く、有効な治療法も無いので、特に本発明の血管新生療法を好適に用いることができる。
【００１４】
本発明の第一の発明は、前記炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、該疾患部位の新生血管数を増加させることを特徴とする血管新生療法である。
上述のように、動脈硬化や糖尿病などによる重症の末梢循環疾患の中には、血管そのものが本来の機能を非可逆的に消失し、もはや血管拡張物質の投与が意味をなさない症例が多く、一時的な血流量増加ではなく失われた血管そのものを再生し得る治療法が望まれている。本発明の方法は、簡易な方法により、血流増加作用のみではなく、新生血管数を増加させることができるため、非常に優れたものである。
疾患部位の新生血管数の増加は、以下のようにして測定することができる。
本発明による新生血管数の増加は経皮的に吸収された炭酸ガスの作用によるものであり、特に皮膚近傍に強く発現するものであるから、皮膚近傍の微小血管の血流量を測定するレーザードップラー血流量計による組織血流量測定で確認することが可能である。また、生体への侵襲はあるが、造影剤を注入することによるＸ線血管造影や、組織を採取して、血管から血液中に分泌される酵素であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）をマーカーとして染色し、同定することにより、血流のある血管数を測定し、筋繊維数に対する血流のある血管数の比率を求めることによっても、疾患部位の組織中の生存血管数の増加を確認することができる。
【００１５】
本発明の第二の発明は、前記炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、該疾患部位組織中の血管内皮細胞数を１．５倍以上に増加させることを特徴とする血管新生療法である。血管内皮細胞数は多いほど血管の新生が多いことを示すので、２．０倍以上であることがさらに好ましい。
ここで、血管内皮細胞と特異的に結合しているフォンブルブラント因子（ｖＷＦ）をマーカーとして免疫染色し、疾患部位の組織の筋繊維数に対する血管内皮細胞数の比率を測定することによって、血管を構成する血管内皮細胞数の増加を確認することができる。
【００１６】
本発明の第三の発明は、前記炭酸温水に、末梢血管疾患部位を浸漬することにより、該疾患部位の末梢血液中の血管内皮前駆細胞数を１．１倍以上に増加させることを特徴とする血管新生療法である。血管内皮前駆細胞数は、多いほど血管の新生能（血管内皮細胞への分化と血管形成）が強いことを示すので、１．２倍以上に増加させることがさらに好ましい。
ここで、末梢血液とは、心臓から遠位置にある血管を流れる血液を意味する。また、血管内皮前駆細胞とは、幹細胞の中でも血管内皮細胞に分化するものであり血管新生に不可欠な細胞である。
疾患部位の血管内皮前駆細胞は、末梢血液中の単核球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ／ＰＢＭｎＣ）から分化するものであり、単核球細胞とｌｅｃｔｉｎとの結合能と、単核球細胞へのＤｉｌ−Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ−Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ）の取り込みとを指標としてマッピングするフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）において、マップの一部領域に現れることが確認されている。従って、その領域にある単核球細胞の存在比率を測定することにより、血管内皮前駆細胞数の増加を確認することができる。
【００１７】
本発明の血管新生療法は、さらに好ましくは、経皮的に吸収された二酸化炭素の血管拡張作用により組織血流量を増加させること、および／または疾患部位の組織中体液のｐＨを局所的に酸性側に移行させて血管成長因子を誘発させることを特徴とする。
高濃度の二酸化炭素を含有する炭酸温水に疾患部位を浸漬すると、経皮的に炭酸ガスが吸収され、組織中の二酸化炭素濃度が増大する。従って、上述のように、生体内の調節機構により、血管拡張が起こり、組織血流量を増大させることができる。
また、吸収された炭酸ガスは、徐々に皮下組織内部に到達して、さらに、残存している血管内皮細胞に到達する。この炭酸ガスの直接刺激により、内皮細胞より血管成長因子が放出される。さらに、吸収された炭酸ガスは、組織中体液の中で炭酸イオンにイオン解離して組織を酸性側に移行させることによって、血管成長因子の放出を促進する。
【００１８】
本発明の方法においては、前記炭酸温水への末梢血管疾患部位の浸漬は、１回の浸漬時間が１０分間以上であり、かつ２４時間に１回以上の頻度で断続的に実施されることが好ましい。
本発明の血管新生療法は、細胞に対する炭酸ガスの刺激による療法であるため、長期にわたり断続的に実施することが好ましい。炭酸ガスの作用をより深部に到達させるためには、少なくとも１回の実施につき浸漬時間が１０分間以上であることが好ましい。さらに、１回の浸漬時間が１０〜３０分間の範囲内であると、十分な効果が得られ、かつ患者に対する負担が大きくなり過ぎないため好ましい。
浸漬の頻度は、少なくとも２４時間に１回以上実施することが好ましい。さらに、浸漬頻度が２４時間に１〜２回であると、十分な効果が得られ、かつ患者に対する負担が大きくなり過ぎないため好ましい。
【００１９】
上記末梢血管疾患部位が、潰瘍を伴うものである場合には、疾患部位を炭酸温水へ浸漬する前に、炭酸温水に殺菌剤を溶解させることが好ましい。
末梢血管疾患患者は、患部に潰瘍を発生していることが多い。従って、炭酸温水浴を実施する際に、水浴中の細菌による感染の懸念があるため、殺菌剤を溶解させた炭酸温水に患部を浸漬させることが好ましい。殺菌剤としては、炭酸水をアルカリ性にさせないものであり、なおかつ皮膚への刺激の少ないのもであれば良い。例えば、グルコン酸クロロヘキシジン、ポビドンヨード、ジクロロシアヌル酸塩、次亜塩素酸塩等が挙げられる。
【００２０】
また、上記末梢血管疾患部位が、潰瘍を伴うものである場合には、潰瘍部位に二酸化炭素透過性フィルムを添付した状態で、疾患部位を炭酸温水へ浸漬することが好ましい。
上述のように、細菌による感染の危険性を低減させるために、炭酸温水に殺菌剤を溶解させることも好ましいが、殺菌剤の中には細胞の増殖を阻害する作用を持つものもあるため、治療効果を減少させる場合もある。
本発明においては、炭酸温水浴により炭酸ガスを経皮膚的に吸収させることが重要であるため、細菌の通過を阻止するが二酸化炭素透過性を有するフィルムを患部に添付することにより、細菌感染を防止しつつ炭酸ガスの効果を減少させることなく実施することが可能となる。このような二酸化炭素透過性フィルムとしては、例えば、フィルムドレッシング材（３Ｍ社製：商品名テガダーム、スミスアンドネフュー社製：商品名オプサイト  等）やガス透過性の高いシリコーン薄膜等が挙げられる。
炭酸温水に殺菌剤を溶解させることと、疾患部位に二酸化炭素透過性フィルムを添付することとは、それぞれ単独に行ってもよいが、２種を組み合わせて行ってもよい。
【００２１】
末梢血管疾患部位が足部に存在し、該疾患が下肢の疼痛を伴うものである場合には、少なくとも膝関節から前記疾患部位までの範囲にわたる部位を前記炭酸温水に浸漬することが好ましい。
炭酸温水浴は、通常自覚症状のある足部の疾患部位においてのみ実施されるが、本発明の血管新生療法を適用するに好ましい動脈血管が多く存在するのは筋肉組織であるため、膝関節から足部の間に存在する筋肉の部位が炭酸温水に浸漬されるようにして実施することが好ましい。
【００２２】
本発明の血管新生療法は、細胞増殖因子の直接投与、細胞増殖因子発現遺伝子の導入、および骨髄単核球細胞の移植から選ばれるいずれか１種以上の血管新生療法（以下、「他の血管新生療法」ということがある。）を併用して実施することが好ましい。
上述したように、現在、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞成長因子）、ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）などの細胞増殖因子やそれらの発現遺伝子を、直接疾患部位に注入し血管の再生を促す治療法が研究されている。また、血管内皮前駆細胞と前記成長因子とを分泌する骨髄単核球細胞を骨髄より採取し、精製して患部に移植する治療法も考案されている。
これらのような細胞増殖因子の直接投与、細胞増殖因子発現遺伝子の導入、骨髄単核球細胞の移植等による血管新生療法は、再生した血管を維持するためには、断続的に該療法を実施することが望ましいが、投与する作用物質を得ることが困難であると共に、投与に際して患者に与える負荷が大きいいため、反復して実施することができない。
【００２３】
しかしながら、これら他の血管新生療法と本発明による方法とを同時期に、または他の血管新生療法を実施した後に、本発明による方法を続けて実施することにより、断続的に他の血管新生療法を実施することなく、長期にわたって血管の機能を保持することが可能となる。特に、骨髄単核球細胞の移植による血管新生療法は一時的な効果は高く、特別な製剤を必要としないため実施しやすく好ましいが、患者本人の骨髄から作用物質を得るため患者への負荷も大きいため、骨髄単核球細胞の移植実施終了後から、本発明の療法を継続して実施することが好ましい。
【００２４】
本発明の血管新生作用は、血管を流れる血液中の炭酸ガス濃度の上昇で引き起こされると考えられる。通常、血液中の炭酸ガス濃度を意図的に上昇させようとすると、全身の血液中の炭酸ガス濃度を同時に上昇させうることになり危険を伴う。しかしながら、本発明の炭酸温水浴は、疾患部位に対して局所的であり、さらに血管組織の外側から作用させる。従って、作用させる炭酸ガスの絶対量は少なくてすみ、また、過剰の炭酸ガスはすみやかに呼気より排出されるため、全身の血液中の炭酸ガス濃度を過剰に上昇させることはなくきわめて安全である。また、炭酸ガスは本来生体内に広く存在している物質であることから、特段の副作用もないと思われる。
このように、本発明の高濃度炭酸温水浴による血管新生療法は、人体に対して安全性が高いものであり、また、特段の大掛りな装置、設備を必要とせずに簡便に行うことができるものである。
【００２５】
【実施例】
以下本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
［虚血モデルマウスの作成、炭酸温水への浸漬］
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）オスの、左大腿動脈および大腿静脈を結紮し、下肢虚血モデルマウスを作成した。
炭酸水群としては、虚血モデルマウスを用い、血管結紮後４日目より、二酸化炭素濃度が１１００ｐｐｍである炭酸温水（３７℃）に、１０分間、マウスの両足を浸漬した。浸漬は、１日に１回、モデル作成後２８日目まで行った。対照群としては、炭酸を含まない蒸留水（３７℃）を用いたほかは炭酸水群と同様にして、虚血モデルマウスの両足を温水へ浸漬した。
上記炭酸水群および対照群について、以下の効果の確認を行った。
【００２７】
［１］  炭酸温水浴によるマウス虚血下肢の血流改善効果
本実施例では、虚血モデルマウスの下肢血流を測定した。レーザードップラーパーフュージョンイメージアナライザー（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて、モデル作成直後、ならびに３，７，１４，２１，２８日後の、炭酸水群および対照群の下肢血流を測定した。
この結果を図１に示した。定量化は、虚血を行っていない健康側下肢の血流を測定し、これに対する虚血側下肢の血流量比を示すことによって行った。
図１に示したように、７日後から炭酸水群にて虚血側下肢の有意な血流回復が観察された。２８日後には対照群と比較して約１．９倍もの有意な血流量増加が見られた。
【００２８】
［２］  炭酸温水浴によるマウス虚血下肢骨格筋での新生血管数の増加
本実施例では、モデル作成後２８日目におけるマウスの心臓から造影剤（リピオドール）を注入し、下肢血管を造影した。血管造影像の観察により、炭酸水群では対照群に比較して、顕著な側副血管の増加が認められた。また、マウス下肢骨格筋組織をＡＬＰ染色し、筋繊維に対する新生血管数を測定した。この結果を図２に示す。
血管数は、炭酸水群において対照群よりも約５．５倍増加しており、炭酸水群では有意に新生血管数が増加していることがわかった。
【００２９】
［３］  炭酸温水浴によるマウス虚血下肢骨格筋での血管内皮細胞数の増加
本実施例では、モデル作成後２８日目におけるマウス下肢骨格筋組織を血管内皮に特異的なｖＷＦ因子抗体を用いて免疫染色し、筋繊維に対する血管内皮胞数を測定した。結果を図３に示す。
血管内皮胞数は、炭酸水群において対照群よりも約３．１倍に増加しており、炭酸水群では有意に血管新生が促進されていることがわかった。
【００３０】
［４］  炭酸温水浴によるマウス末梢血中の血管内皮前駆細胞数の増加
本実施例では、モデル作成後２８日目におけるマウス末梢血の単核球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ／ＰＢＭｎＣ）をｌｅｃｔｉｎとの結合能およびＤｉｌ−Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ−Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ）の取り込みを指標としたフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）を行い、単核球細胞における血管内皮前駆細胞数を測定した。結果を図４に示す。
血管内皮前駆細胞数は、炭酸水群は対照群に対して約１．４倍に増加しており、炭酸水群では有意に血管新生が促進されていることがわかった。
【００３１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の血管新生療法は、末梢血管疾患部位の血流量を増加させるのみではなく、失われた血管の機能を新生させることができる。さらに、本発明の方法は、人体に対する安全性が高く、かつ容易に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】炭酸温水浴によるマウス虚血下肢の血流改善効果を示すグラフである。
【図２】炭酸温水浴によるマウス虚血下肢骨格筋での新生血管数の増加を示すグラフである。
【図３】炭酸温水浴によるマウス虚血下肢骨格筋での血管内皮細胞数の増加を示すグラフである。
【図４】炭酸温水浴によるマウス末梢血液中の血管内皮前駆細胞数の増加を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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