(57)【要約】【課題】アンドロゲン受容体に対する化学物質の結合強度を簡便に測定する方法を提供する。【解決手段】次式（１）【化１】2004155740.tif 000012〔式（１）中、ｎは４〜８の整数を示す〕で表される蛍光リガンド、及び前記蛍光リガンドとアンドロゲン受容体と試料化学物質とを溶液中で共存させ、アンドロゲン受容体に結合している蛍光リガンド量を測定することによりアンドロゲン受容体と試料化学物質との結合強度を評価する結合強度測定方法。アンドロゲン受容体、蛍光リガンド、試料化学物質を溶液に添加し、蛍光リガンドと化学物質のアンドロゲン受容体への結合が平衡に達した後、遊離の蛍光リガンドを溶液中から取り除き、溶液の蛍光強度を測定する。遊離した蛍光リガンドは、デキストラン被覆活性炭（ＤＣＣ）に吸着させ分離する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（１）
【化１】
2004155740.tif 000011
〔式（１）中、ｎは４〜８の整数を示す〕
で表される蛍光リガンド。
【請求項２】
ｎが６又は７である請求項１記載の蛍光リガンド。
【請求項３】
アンドロゲン受容体と、請求項１記載の蛍光リガンドと、試料化学物質とを溶液中で共存させ、アンドロゲン受容体に結合している蛍光リガンド量を測定することによりアンドロゲン受容体と試料化学物質との結合強度を評価する結合強度測定方法。
【請求項４】
アンドロゲン受容体と請求項１記載の蛍光リガンドとの結合体を含む溶液に試料化学物質を添加し、試料化学物質とアンドロゲン受容体とを結合させ、遊離した蛍光リガンドを取り除いた溶液の蛍光強度を測定してアンドロゲン受容体と試料化学物質との結合強度を評価する結合強度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学物質のアンドロゲン受容体への結合強度を簡便に試験することができる蛍光リガンド及び当該蛍光リガンドを用いた化学物質のアンドロゲン受容体への結合強度測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、環境中に存在する化学物質（内分泌攪乱物質）がヒトや環境生物の内分泌系に影響を及ぼし、生殖障害等を引き起こすことが問題となっている。ある種の化学物質はホルモン受容体（エストロゲン、アンドロゲン、甲状腺ホルモン受容体等）に結合してそれらのホルモンの支配下に置かれている遺伝子の転写活性化を誘導するホルモン様作用または阻害する抗ホルモン作用を有している。これらの作用は、化学物質が環境中生物等の内分泌系の攪乱を引き起こす主要な作用メカニズムであると考えられている。
【０００３】
化学物質のこのような作用を測定する方法として、ホルモン受容体への結合試験法やホルモン受容体への結合を介したレポーター遺伝子転写活性化試験方法がある（例えば、非特許文献１−３参照）。これらの方法は、内分泌攪乱物質のプレスクリーニング法として採用されている。ホルモン受容体への結合試験法では、放射リガンド（〔３Ｈ〕エストラジオール）を用いた方法が標準的であるが、放射性物質を取り扱うため、特別な施設が必要などの制約がある。
【０００４】
本発明者は、ヒトエストロゲン受容体への結合試験法に用いる蛍光リガンドを合成し、種々の化学物質のヒトエストロゲン受容体に対する結合性を簡便に測定できる方法を先に特許出願した（特許文献１）。しかしながら、化学物質の内分泌攪乱作用の発現は、女性ホルモン系以外に男性ホルモン系への影響も懸念されており、簡便な男性ホルモン受容体結合試験法の開発が急務となっている。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−１２２６０２号公報
【非特許文献１】
ナカイ，  エム．  エト  アル．  （１９９９）  バインディング  キャラクタリゼーション  オブ  ジアルキル  フタレート  フォー  ジ  エストロゲン  レセプター，  バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ，  ２５４，  ３１１−３１４．（Ｎａｋａｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｌｋｙｌ  Ｐｈｔｈａｌａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２５４，
３１１−３１４．）
【非特許文献２】
タビラ，  ワイ．，  エト  アル．  （１９９９）  ストラクチュラル  リクワイアメンツ  オブ  パラ−アルキルフェノールズ  トゥ  バインド  トゥ  エストロゲン  レセプター，  ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー，  ２６２，  ２４０−２４５．（Ｔａｂｉｒａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐａｒａ−Ａｌｋｙｌｐｈｅｎｏｌｓ  ｔｏ  Ｂｉｎｄ  ｔｏ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２６２，  ２４０−２４５．）
【非特許文献３】
クイパー，  ジー．ジー．ジェイ．エム．，  エト  アル．  （１９９８）  インタラクション  オブ  エストロジェニック  ケミカルス  アンド  ファイトエストロゲンズ  ウィズ  エストロゲン  レセプター  β，  エンドクライノロジー，  １３９，  ４２５２−４２６３．（Ｋｕｉｐｅｒ，  Ｇ．Ｇ．Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｔｏｒ  β，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，  １３９，  ４２５２−４２６３．）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、化学物質のアンドロゲン受容体への結合性を簡便に評価することができる蛍光リガンド、及びアンドロゲン受容体と試料化学物質との結合強度を評価する結合強度測定方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する本発明は、以下に記載するものである。
【０００８】
〔１〕    次式（１）
【０００９】
【化２】
2004155740.tif 000002
〔式（１）中、ｎは４〜８の整数を示す〕
で表される蛍光リガンド。
【００１０】
〔２〕  ｎが６又は７である〔１〕記載の蛍光リガンド。
【００１１】
〔３〕  アンドロゲン受容体と、〔１〕記載の蛍光リガンドと、試料化学物質とを溶液中で共存させ、アンドロゲン受容体に結合している蛍光リガンド量を測定することによりアンドロゲン受容体と試料化学物質との結合強度を評価する結合強度測定方法。
【００１２】
〔４〕  アンドロゲン受容体と〔１〕記載の蛍光リガンドとの結合体を含む溶液に試料化学物質を添加し、試料化学物質とアンドロゲン受容体とを結合させ、遊離した蛍光リガンドを取り除いた溶液の蛍光強度を測定してアンドロゲン受容体と試料化学物質との結合強度を評価する結合強度測定方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
上記式（１）で表される化合物は、フルオレセイン架橋ジヒドロテストステロンであって、次の方法により製造できる。
【００１４】
【化３】
2004155740.tif 000003
【００１５】
式（１）、（３）、（４）中、ｎは４〜８の整数を示すが、４〜７が好ましく、６又は７がより好ましい。
【００１６】
化合物（１）は、ジヒドロテストステロンに由来する部分を有しているのでアンドロゲン受容体に対して特異的結合をする。従って、試料化学物質のアンドロゲン受容体への結合強度を測定するための蛍光リガンドとして好適に用いることができる。
【００１７】
上記化合物（１）を蛍光リガンドとして用い化学物質のアンドロゲン受容体への結合強度を測定する方法につき以下説明する。
【００１８】
アンドロゲン受容体と、蛍光リガンドと、試料化学物質とを溶液に添加し共存させる。蛍光リガンドと化学物質のアンドロゲン受容体への結合が平衡に達した後、遊離の蛍光リガンドを溶液中から取り除き、溶液の蛍光強度を測定する。溶液の蛍光強度は、アンドロゲン受容体に結合している蛍光リガンドの量に比例する。試料化学物質のアンドロゲン受容体への結合強度が強いほど遊離の蛍光リガンド量が多く、測定される溶液の蛍光強度は弱くなる。
【００１９】
アンドロゲン受容体に対する蛍光リガンド及び化学物質の結合は競争結合であるので、結合強度の測定は、アンドロゲン受容体と上記蛍光リガンドとの結合体を含む溶液に試料化学物質を添加し、試料化学物質とアンドロゲン受容体とを結合させ、遊離した蛍光リガンドを取り除いた溶液の蛍光強度を測定してもよい。
【００２０】
アンドロゲン受容体から遊離した蛍光リガンドを溶液から取り除く方法としては、例えばデキストラン被覆活性炭（ＤＣＣ）を用いる方法を挙げることができる。蛍光リガンドが結合したアンドロゲン受容体は、デキストラン被覆活性炭表面のデキストランが障害となって、活性炭に吸着しない。一方、遊離した蛍光リガンドはデキストランを通過して活性炭表面に吸着する。蛍光リガンドが吸着したデキストラン被覆活性炭を濾過、遠心分離等公知の方法を用いて分離することにより、遊離の蛍光リガンドを溶液から取り除くことができる。
【００２１】
溶液の蛍光強度を測定する際の条件としては、励起波長を４８０〜５１０ｎｍ、蛍光波長を５２０〜５５０ｎｍとすることが好ましい。
【００２２】
溶液中に添加する蛍光リガンド濃度は２〜５０ｎＭが好ましく、２〜２０ｎＭがより好ましい。アンドロゲン受容体濃度は０．５〜１．５ｎＭが好ましい。
【００２３】
試料化学物質のアンドロゲン受容体に対する結合強度を具体的に評価する方法としては、例えば化学物質の濃度を種々変化させた多数の溶液の蛍光強度を測定し、試料化学物質が無添加のときのアンドロゲン受容体に結合している蛍光リガンド量の５０％が化学物質に置き換わる化学物質濃度（５０％阻害濃度、又はＩＣ５０）を求める方法がある。ＩＣ５０値は、リガンドの種類や濃度等の試験条件に依存するが、同一条件下においては化学物質とアンドロゲン受容体との結合強さに比例するのでＩＣ５０値から化学物質のアンドロゲン受容体への結合強度の相対的な関係を評価できる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【００２５】
製造例１
蛍光リガンドの合成
（１）Ｂｏｃ−ω−アミノ酸−ジヒドロテストステロンの合成
ジヒドロテストステロン及びＢｏｃ−ω−アミノ酸のＤＭＦ溶液に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩及びジメチルアミノピリジンを加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧濃縮後、残渣の酢酸エチル溶液を酸及び塩基洗いして硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）共存下に乾燥した。Ｎａ２ＳＯ４をろ過により除いた後、減圧濃縮して油状物の目的物を得た。
【００２６】
（２）Ｈ−ω−アミノ酸−ジヒドロテストステロンの合成
Ｂｏｃ−ω−アミノ酸−ジヒドロテストステロンを４Ｍ塩化水素（ＨＣｌ）／ジオキサンに溶かし、室温で５時間反応させた。減圧濃縮後、微量の未反応原料をエーテルでのデカンテーションにより除き、目的物を得た。
【００２７】
（３）フルオレセイン−ω−アミノ酸−ジヒドロテストステロンの合成
Ｈ−ω−アミノ酸−ジヒドロテストステロン塩酸塩をＤＭＦに溶かし、トリエチルアミンで中和して遊離塩基とした後、さらに、トリエチルアミンを加えてｐＨ７．５とした。カルボキシフルオレセインスクシンイミドエステルを加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（φ＝２ｃｍ，ｌ＝１４０ｃｍ，ｖ＝０．５ｍｌ／ｍｉｎ，ｅｌｕｅｎｔ＝ＤＭＦ）によるゲルろ過で精製した。目的物を含むフラクションを濃縮後、さらに逆相ＨＰＬＣにより精製した。質量分析により目的物を確認した。
【００２８】
（４）ＮＢＤ−ω−アミノ酸−ジヒドロテストステロンの合成
Ｈ−ω−アミノ酸−ジヒドロテストステロン塩酸塩をＤＭＦに溶かし、トリエチルアミンで中和した。さらに、トリエチルアミンを加えてｐＨ７．５とした。ＮＢＤ（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）クロリドを加え、室温で一晩撹拌した。生成物はＤＭＦにはほとんど溶けず、反応進行に伴って反応溶液中に析出した。反応終了後、減圧濃縮して得た残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノールの系）により溶離させて精製した。
【００２９】
（５）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製
（３）及び（４）で得られた化合物は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製を行った。ＨＰＬＣは、日立６５５Ａ−１１液体クロマトグラフィー（日立製作所社製）を用い、カラムとしてＬ−ｃｏｌｕｍｎ  ＯＤＳ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅｄ  ｃｏｌｕｍｎ（４．６×２５０ｍｍ；（財）化学物質評価研究機構製）を使用して行った。溶媒として、０．０５％ＴＦＡ／水（Ａ）と０．０４％ＴＦＡ／アセトニトリル（Ｂ）を用い、化合物の分離状況に応じてＡ／Ｂグラディエントの溶離条件を変えて設定した。
【００３０】
試験例１
合成した蛍光リガンドを化学物質のアンドロゲン受容体への化学物質の結合試験に使用するためには、その蛍光リガンドが天然リガンドと同様にアンドロゲン受容体に特異的結合をしなければならない。そこで、製造例１で合成した蛍光リガンドのアンドロゲン受容体への特異的結合を調べるために、次の試験を行った。特異的結合による蛍光強度は、全結合による蛍光強度からジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）大過剰存在下での蛍光強度を非特異的結合によるものとして差し引いて求めた。
【００３１】
用いた試薬及び試験条件は以下の通りである。
アンドロゲン受容体（ＡＲ）：ＭＢＰ融合ヒトアンドロゲン受容体−ＬＢＤ（東洋紡社製）
蛍光リガンド：Ｆ−（ｎ＝３，４，５，６，７，１０）−ＤＨＴ＃１、Ｆ−（ｎ＝２，３，４，５，６，７，１０）−ＤＨＴ＃２
【００３２】
【化４】
2004155740.tif 000004
【００３３】
バッファー：１０ｍＭバインディングバッファー  ｐＨ７．４
（組成）１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４
１ｍＭ  ＥＤＴＡ（同仁化学社製）
１ｍＭ  ＥＧＴＡ（同仁化学社製）
１ｍＭ  ＮａＶＯ３（和光純薬社製）
１０％グリセロール（和光純薬社製）
５ｍｇ／ｍＬ  γ−グロブリン（ＳＩＧＭＡ社製）
０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ（和光純薬社製）
ＤＣＣ懸濁液：０．０４％デキストラン、０．４％活性炭のバインディングバッファー懸濁液
試験濃度：ＭＢＰ融合ヒトアンドロゲン受容体−ＬＢＤ：３．４５ｎＭ
蛍光リガンド：１〜１００ｎＭ
ＤＨＴ：１μＭ
測定装置：蛍光偏光マルチプレートリーダー（ポラリオン：テカン社製）
測定波長：励起波長  ４８５ｎｍ、蛍光波長  ５３５ｎｍ
【００３４】
９６ウェルマイクロプレートに以下の組成の反応混合溶液を調製した。
2004155740.tif 000005
【００３５】
上記の組成の反応混合溶液を遮光した後室温で５分振とうし、１時間放置した。１５０μＬのＤＣＣ懸濁液を添加して氷上で１０分間放置した。溶液を濾過してＤＣＣを除去した後、溶液の蛍光強度の測定を行った。
【００３６】
蛍光リガンドの濃度を５０ｎＭとしたときのＦ−ＤＨＴ＃１、＃２の全結合に対する特異的結合の蛍光強度比を図１に示す。なお、図１において、横軸は上記化学式に示すＦ−ＤＨＴ＃１、＃２のメチレン数ｎとした。Ｆ−（ｎ＝４，５，６，７）−ＤＨＴ＃１、＃２については、全結合における特異的結合の割合が高く、特にＦ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃１、＃２及びＦ−（ｎ＝７）−ＤＨＴ＃２については特異的結合の割合は全結合の約９０％であった。一方、Ｆ−（ｎ＝２，３）−ＤＨＴ＃２については特異的結合が確認できなかった。Ｆ−（ｎ＝３，１０）−ＤＨＴ＃１、Ｆ−（ｎ＝１０）−ＤＨＴ＃２は特異的結合が確認できたものの、全結合における非特異的結合の割合が高いものであった。
【００３７】
特に特異的結合の割合が高かったＦ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃１、＃２及びＦ−（ｎ＝７）−ＤＨＴ＃２について蛍光リガンドの濃度を変化させて蛍光強度を測定した結果を図２〜４に示す。
【００３８】
比較試験例１
比較のため蛍光リガンドとしてＮＢＤ−（ｎ＝６）−ＤＨＴを用いて試験例１と同様にアンドロゲン受容体に対する特異的結合を調べた。
【００３９】
【化５】
2004155740.tif 000006
【００４０】
ＮＢＤ−（ｎ＝６）−ＤＨＴはいずれの濃度においても非特異的結合の割合が極めて高いものであった。
【００４１】
実施例１
試験例１において特に良好な結果が得られた蛍光リガンドを用いて下記の化学物質について競争結合試験を行った。
【００４２】
用いた試薬及び試験条件は以下の通りである。
アンドロゲン受容体（ＡＲ）：ＭＢＰ融合ヒトアンドロゲン受容体−ＬＢＤ（東洋紡社製）
蛍光リガンド：Ｆ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃１，＃２、Ｆ−（ｎ＝７）−ＤＨＴ＃２
試験物質：ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ：和光純薬社製）、メチルテストステロン（Ｍｅ−Ｔ：和光純薬社製）、Ｄ−ノルゲストレル（Ｄ−Ｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ：アルドリッチ社製）、ノルエチンドロン（Ｎｏｒｅｔｈｉｎｄｒｏｎｅ：シグマ社製）、ノルエチノドレル（Ｎｏｒｅｔｈｙｎｏｄｒｅｌ：シグマ社製）、エストラジオール（Ｅ２：和光純薬社製）、コルチコステロン（Ｃｏｒｔ：シグマ社製）、フタル酸ジエチルヘキシル（ＤＥＨＰ：和光純薬社製）、アジピン酸ジエチルヘキシル（ＤＯＡ：和光純薬社製）、リニュロン（Ｌｉｎｕｒｏｎ：Ｄｒ  Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ  ＧｍｂＨ製）、１−（２−クロロフェニル）−１−（４−クロロフェニル）−２，２−ジクロロエチレン（ｏ，ｐ’−ＤＤＥ：和光純薬社製）
【００４３】
バッファー：１０ｍＭバインディングバッファー  ｐＨ７．４
（組成）１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４
１ｍＭ  ＥＤＴＡ（同仁化学社製）
１ｍＭ  ＥＧＴＡ（同仁化学社製）
１ｍＭ  ＮａＶＯ３（和光純薬社製）
１０％グリセロール（和光純薬社製）
５ｍｇ／ｍＬ  γ−グロブリン（ＳＩＧＭＡ社製）
０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ（和光純薬社製）
ＤＣＣ懸濁液：０．０４％デキストラン、０．４％活性炭のバインディングバッファー懸濁液
2004155740.tif 000007
測定装置：蛍光偏光マルチプレートリーダー（ポラリオン：テカン社製）
測定波長：励起波長  ４８５ｎｍ、蛍光波長  ５３５ｎｍ
【００４４】
９６ウェルマイクロプレートに以下の組成の反応混合溶液を調製した。
2004155740.tif 000008
上記の組成の反応混合溶液を遮光した後室温で５分振とうし、１時間放置した。１５０μＬのＤＣＣ懸濁液を添加して氷上で１０分間放置した。溶液を濾過してＤＣＣを除去した後、上澄溶液（２００）μＬの蛍光強度の測定を行った。
【００４５】
蛍光リガンドとしてＦ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃１を用いた場合の各化学物質の競争結合試験の結果を図５〜７に示す。なお、これらの図において、Ｂは測定した溶液の蛍光強度を、Ｂ０は化学物質無添加の溶液の蛍光強度を示す。
【００４６】
試験例２
比較のため放射リガンドを用いて実施例１で用いた各化学物質の競争結合試験を行った。
アンドロゲン受容体（ＡＲ）：ＭＢＰ融合ヒトアンドロゲン受容体−ＬＢＤ（東洋紡社製）  ３．４５ｎＭ
放射リガンド（ＲＩ）：５α−ジヒドロ［１，２，４，５，６，７−３Ｈ］テストステロン（１１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製：ＴＲＫ４４３）
【００４７】
バッファー：１０ｍＭバインディングバッファー  ｐＨ７．４
（組成）１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４
１ｍＭ  ＥＤＴＡ（同仁化学社製）
１ｍＭ  ＥＧＴＡ（同仁化学社製）
１ｍＭ  ＮａＶＯ３（和光純薬社製）
１０％グリセロール（和光純薬社製）
１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（和光純薬社製）
０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ（和光純薬社製）
ＤＣＣ懸濁液：０．０４％デキストラン、０．４％活性炭のＰＢＳ懸濁液
【００４８】
９６ウェルマイクロプレートに以下の組成の反応混合溶液を調製した。
2004155740.tif 000009
上記の組成の反応混合溶液を室温で１時間放置した。１００μＬのＤＣＣ懸濁液を添加して氷上で１０分間放置した。溶液を濾過してＤＣＣを除去した後、上清（１００μＬ）に含まれる標準リガンドの放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００４９】
実施例１の蛍光リガンドと試験例２の放射リガンドを用いて得られた各化学物質のアンドロゲン受容体に対する結合曲線から試験物質の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。さらに試験物質のＩＣ５０値をＤＨＴのＩＣ５０値で除した値を算出し、ＲＢＡとした。ＲＢＡは、ＤＨＴのＭＢＰ融合ヒトアンドロゲン受容体−ＬＢＤへの結合を１００としたときの試験物質のＭＢＰ融合ヒトアンドロゲン受容体−ＬＢＤへの相対結合親和性を表す。各蛍光リガンド、放射リガンドを用いて得られた化学物質のｌｏｇ（ＩＣ５０）値、ＲＢＡ値を表１に示す。３種の蛍光リガンドと、放射リガンドを用いて求めた各化学物質のｌｏｇ（ＩＣ５０）値、ＲＢＡ値は、ほぼ一致していた。
【００５０】
【表１】
2004155740.tif 000010
【００５１】
次に、各蛍光リガンド用いて得た各化学物質のＲＢＡ値と放射リガンド（ＲＩ）を用いた方法から得たＲＢＡ値との相関関係を図８〜１０に示す。Ｆ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃１を用いたときの相関関数はＲ２＝０．９７であった。同様に、Ｆ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃２を用いた場合にはＲ２＝０．９６、Ｆ−（ｎ＝７）−ＤＨＴ＃２を用いた場合にはＲ２＝０．９３であった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明によれば、化学物質のアンドロゲン受容体に対する結合強度を簡便に測定することができる。従って、本発明は男性ホルモン系に影響を及ぼす内分泌攪乱物質のプレスクリーニング法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１における各蛍光リガンドのアンドロゲン受容体への全結合に対する特異的結合の蛍光強度比をプロットしたグラフである。
【図２】試験例１におけるＦ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃１の濃度と蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図３】試験例１におけるＦ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃２の濃度と蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図４】試験例１におけるＦ−（ｎ＝７）−ＤＨＴ＃２の濃度と蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図５】蛍光リガンドとしてＦ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃１を用いたときの化学物質のアンドロゲン受容体に対する結合強度の濃度依存性を示すグラフである。
【図６】蛍光リガンドとしてＦ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃１を用いたときの化学物質のアンドロゲン受容体に対する結合強度の濃度依存性を示すグラフである。
【図７】蛍光リガンドとしてＦ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃１を用いたときの化学物質のアンドロゲン受容体に対する結合強度の濃度依存性を示すグラフである。
【図８】Ｆ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃１を用いて測定したＲＢＡ値と放射リガンドを用いて測定したＲＢＡ値との相関関係を示すグラフである。
【図９】Ｆ−（ｎ＝６）−ＤＨＴ＃２を用いて測定したＲＢＡ値と放射リガンドを用いて測定したＲＢＡ値との相関関係を示すグラフである。
【図１０】Ｆ−（ｎ＝７）−ＤＨＴ＃２を用いて測定したＲＢＡ値と放射リガンドを用いて測定したＲＢＡ値との相関関係を示すグラフである。
【図１】
2004155740.tif 000013
【図２】
2004155740.tif 000014
【図３】
2004155740.tif 000015
【図４】
2004155740.tif 000016
【図５】
2004155740.tif 000017
【図６】
2004155740.tif 000018
【図７】
2004155740.tif 000019
【図８】
2004155740.tif 000020
【図９】
2004155740.tif 000021
【図１０】
2004155740.tif 000022