(57)【要約】【課題】立体障害等を防止することにより、ハイブリダイゼーション効率の良い検出表面を提供する。【解決手段】検出用ヌクレオチド鎖Ｄの末端が固定化され、固定化された状態の前記検出用ヌクレオチド鎖Ｄと標的ヌクレオチド鎖Ｔとの間のハイブリダイゼーションを検出するための検出表面２において、ハイブリダイゼーションの際の立体障害を防止できるように、前記検出用ヌクレオチド鎖Ｔを、介挿分子Ｓを介して前記表面２に固定化する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出用ヌクレオチド鎖の末端が固定化されており、固定化された状態の前記検出用ヌクレオチド鎖と標的ヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーションを検出するためのセンサー表面であって、
前記ハイブリダイゼーションの際の立体障害を防止できるように、前記検出用ヌクレオチド鎖が介挿分子を介して前記表面に固定化されたことを特徴とする検出表面。
【請求項２】
前記介挿分子には、分子長の異なる複数種の分子が用いられたことを特徴とする請求項１記載の検出表面。
【請求項３】
分子長の異なる分子を交互に配列させたことを特徴とする請求項２記載の検出表面。
【請求項４】
前記介挿分子は電界の作用により伸長されていることを特徴とする請求項１記載の検出表面。
【請求項５】
請求項１記載の検出表面を備えることを特徴とするセンサーチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において特に有用である、物質間相互反応作用をセンシングするための検出表面に関する。より詳しくは、ハイブリダイゼーションの際の立体障害を、介挿分子を用いて効果的に防止できるように工夫された検出表面と、該検出表面を備えるＤＮＡチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明の主たる従来技術を以下説明する。現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００３】
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
ＤＮＡチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に固相化されたＤＮＡプローブに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡを逆転写ＰＣＲ反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅し、前記基板上においてハイブリダイゼーションを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うという手法である。
【０００５】
ここで、ＤＮＡチップは二つのタイプに分類できる。第１のタイプは、半導体露光技術を応用したフォトリソグラフィーの技術を用いて、所定の基板上に直接オリゴヌクレオチドを合成していくものであり、アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）によるものが代表的である（例えば、特表平４−５０５７６３号公報参照）。この種のチップは、集積度は高いが、基板上でのＤＮＡ合成には限界があって、数十塩基程度の長さである。第２のタイプは、「スタンフォード方式」とも称されるもので、先割れピンを用いて、予め用意されたＤＮＡを基板上に分注・固相化していくことによって作製されるものである（例えば、特許第３２７２３６５号公報参照）。この種のチップは、集積度は前者に比べて低いが、１ｋｂ程度のＤＮＡ断片を固相化できるという利点がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した従来のＤＮＡチップ技術では、検出表面に固定化配列された状態のＤＮＡプローブ等の検出用ヌクレオチド鎖がランダムコイル状に丸まっていたり、近接する検出用ヌクレオチド鎖同士が絡み合っていたり等していることが原因となって、ハイブリダイゼーション効率が悪かった。
【０００７】
より具体的に説明する。有機高分子間の反応においては、相互の分子の構造やコンフォーメーションの関係によって、いわゆる「立体障害」が発生し、反応効率が低下することが知られている。ヌクレオチド鎖間のハイブリダイゼーションにおいても例外ではない。
【０００８】
ＤＮＡチップ等の狭小な検出表面に固定化されて集積されている状態の検出用ヌクレオチド鎖やこれと二重鎖を作った標的ヌクレオチド鎖（検出用ヌクレオチド鎖の塩基配列と相補性のある塩基配列部分を備えるヌクレオチド鎖）がランダムコイル状に丸まっていたり、近接する検出用ヌクレオチド鎖同士が絡み合っていたり、検出部（スポット部）での蛍光強度を上げるために検出用ヌクレオチド鎖の密度を上げすぎたり等している状態では、検出用ヌクレオチド鎖に対して標的ヌクレオチド鎖が近づく際に立体障害が発生し、ハイブリダイゼーションが円滑に進行しない。これは、ＤＮＡチップ全体の検出精度の低下を招き、また、反応に長時間を要する原因となっていた。
【０００９】
特に、ＤＮＡの検出表面に固定化されるプローブＤＮＡ（検出用ヌクレオチド鎖）は、一般に５０〜１００塩基であり、一方の標的ヌクレオチド鎖は、一般に１６００塩基であるので、ハイブリダイゼーションの際における立体障害の問題は深刻である。事実、スタンフォード式のＤＮＡチップでは、プローブＤＮＡをスポッティングした後の乾燥工程の際、プローブＤＮＡが検出表面（スポット領域）の中心に集まり易く、高密度になるので、検出表面の中心では立体障害が発生してハイブリダイゼーションが進行し難くなることが知られている。
【００１０】
そこで、本発明は、ＤＮＡチップの検出表面におけるハイブリダイゼーションの際の立体障害を所定の介挿分子を利用して防止することにより、ハイブリダイゼーション効率を高めることを主な目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記技術的課題を解決するために、本願では、以下の「検出表面」並びに該検出表面を備えるＤＮＡチップを含む「センサーチップ」を提供する。なお、センサーチップとは、物質間の相互反応作用を検出するための検出表面を備える基板を意味する。
【００１２】
まず、本発明に係る検出表面は、検出用ヌクレオチド鎖の末端が固定化されており、この固定化された状態の前記検出用ヌクレオチド鎖と標的ヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーションを検出するためのセンサー表面として利用される。そして、前記ハイブリダイゼーションの際の立体障害を防止できるように、前記検出用ヌクレオチド鎖を、介挿分子を介して前記表面に固定化するように工夫されている。介挿分子は、一種に限らず、分子長の異なる複数種の分子を用いることができ、好適には、分子長の異なる分子を交互に配列させてもよい。
【００１３】
この手段では、所定の介挿分子を介して、検出用ヌクレオチド鎖を検出表面の官能基又は該官能基に結合したリンカー分子に結合、配列させるように工夫したので、検出ヌクレオチド鎖を検出表面から離れた位置に存在させることができるようになる。
【００１４】
この結果、検出表面に固定化された状態の検出ヌクレオチド鎖が傾倒し、その検出表面に付着してしまう状態（ヌクレオチド鎖の陰電荷を帯びるリン酸基群がアミノ基等の陽電荷をもつ検出表面に静電結合する状態）や近接する検出用ヌクレオチド鎖同士が絡み合った状態など、ハイブリダイゼーションには好ましくないと考えられる状態を有効に回避することができる。
【００１５】
また、本発明では、複数種の介挿分子を用い、特に好適には分子長の異なる分子を交互に配列させて用いて、検出表面に固定化された状態の検出用ヌクレオチド鎖同士を隣接しないように工夫することによって、検出用ヌクレオチド鎖同士の絡み合いや立体障害を有効に防止することができる。
【００１６】
更に、検出表面に結合された介挿分子を電界の作用、より詳しくは誘電泳動（一様でない電界において粒子が電界の強い方へ駆動する原理）によって伸長させるようにすれば、各介挿分子が検出表面上に直立した構成の検出表面を作製できる。
【００１７】
この結果、これらの介挿分子に連結された検出用ヌクレオチド鎖は、検出表面との間に所定距離（介挿分子の分子長に相当する距離）を保って固定化されるようになるため、検出用ヌクレオチド鎖が傾倒し、静電結合等により検出表面に付着してしまうのを有効に防止できる。
【００１８】
なお、上記電界（誘電泳動）の作用を利用すれば、介挿分子に結合された検出用ヌクレオチド鎖や反応領域に添加された標的ヌクレオチド鎖をも伸長させることができるので（監修・林　輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）、相補性のある塩基配列同士の会合（水素結合）の確率をより高めることができる。
【００１９】
上記した検出表面は、ＤＮＡチップ等のバイオセンサーチップにおける反応領域に設けることができ、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用できる。
【００２０】
ここで、本願における主な技術用語の定義付けを行う。
【００２１】
ここで、本願において「ヌクレオチド鎖」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体を意味し、ＤＮＡプローブを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃＤＮＡプローブ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２２】
「検出表面」は、ヌクレオチド鎖の末端を固定化できる好適な表面処理が施された表面部位を意味する。一例を挙げれば、例えば、ストレプトアビジンによって表面処理された検出表面の場合には、ビオチン化されたヌクレオチド鎖の固定化に適する。
【００２３】
「検出用ヌクレオチド鎖」は、前記検出表面に直接的に又は間接的に固定化されるヌクレオチド鎖であり、「標的ヌクレオチド鎖」は、前記検出用ヌクレオチド鎖と相補的な塩基配列を備えるヌクレオチド鎖であって、場合によっては、蛍光物質等により標識される。
【００２４】
「介挿分子」は、その一端部が検出表面の官能基又は該検出表面に結合するリンカー分子に結合し、他端部が検出用ヌクレオチド鎖の末端に結合可能に構成された分子、即ち、ＤＮＡプローブ等の検出用ヌクレオチド鎖と検出表面をつなぐ分子である。例えば、ポリＴ、ポリエチレングリコール等の長鎖エチレン分子、フッ化炭素（ＣＦ）２分子等を例示できる。
【００２５】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備えるヌクレオチド鎖間の相補鎖（二重鎖）形成反応を意味する。
【００２６】
「立体障害（ｓｔｅｒｉｃ　ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）」は、分子内の反応中心等の近傍に嵩高い置換基の存在や反応分子の姿勢や立体構造（高次構造）によって、反応相手の分子の接近が困難になることによって、所望の反応（本願では、ハイブリダイゼーション）が起こりにくくなる効果を意味する。
【００２７】
以上のように、本発明は、ＤＮＡチップ等のバイオセンサーチップに利用できる検出表面に係わる新規技術を提供するという技術的意義を有している。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に基づき、本発明の好適な実施形態について説明する。
【００２９】
まず、図１〜図４は、本発明に係る好適な検出表面の好適な実施形態を模式的に表す部分拡大図である。各図に示された符号１は、ＤＮＡチップ等のセンサーチップを構成する基板を示している。この基板１は、石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレンその他の合成樹脂によって形成される。
【００３０】
符号２は、ＤＮＡプローブ等の検出用ヌクレオチド鎖Ｄを固定化するのに適した表面処理が施されている検出表面を示している。この検出表面２は、ＤＮＡプローブ等の所望の検出用ヌクレオチド鎖Ｄを固定化するのに適した表面処理が適宜選択される。
【００３１】
例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で表面処理される。基板１が合成樹脂製であれば、その表面をプラズマ処理及びＤＵＶ（ＤｅｅｐＵＶ、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理する。また、表面に銅、銀、アルミニウム又は金をスパッタして成膜して、その表層にアミノ基、チオール基、カルボキシル基等の官能基（活性基）を有する物質やシステアミン、ストレプトアビジン等をコートすることもできる。
【００３２】
検出表面２の表面処理の具体例を示すと、前記検出表面２は、例えば、ガラス基板１表面の水酸基に、Ｓｉ原子の反対側末端にアルデヒド基を持つアルデヒドプロピルシランを反応させておき、更にストレプトアビジン蛋白（リンカー分子）を反応させ、このストレプトアビジン蛋白表面のアミノ基と前記アルデヒド基とを結合させた構成を採用できる。
【００３３】
この構成の表面に対して、５’末端がビオチン修飾された検出用ヌクレオチド鎖Ｄを反応させると、アビジン−ビオチン結合によって、前記検出用ヌクレオチド鎖Ｄを検出表面２に確実に固定化できる。なお、図１中の符号Ｔは、検出表面２の周囲に形成された反応領域Ｒに添加された試料溶液中の標的ヌクレオチド鎖を表している。
【００３４】
ここで、前記ストレプトアビジン蛋白の直径は、約１０ｎｍであることから、該蛋白分子を検出表面２に対してほぼ飽和するまで反応させると、蛋白分子同士は、該蛋白分子直径の１．５〜２倍程度の距離１５〜２０ｎｍ程度に配列することになり、蛋白分子の濃度等の条件を調整することによって、検出表面２上のストレプトアビジン蛋白の密度（蛋白分子間の距離）を、例えば２０〜５０ｎｍにまで調整することができる。
【００３５】
従って、リンカー分子として機能するストレプトアビジン蛋白の密度を調整することにより、（該蛋白に結合する）検出用ヌクレオチド鎖Ｄの検出表面２上の密度を調整することができる。
【００３６】
また、ストレプトアビジン蛋白をリンカー分子として利用して検出表面２を被覆することによって、検出表面２に固定化された状態の検出用ヌクレオチド鎖Ｄが、検出表面２に静電結合等をして付着してしまうことを有効に防止できる。即ち、検出表面２に固定化された状態の検出用ヌクレオチド鎖Ｄの姿勢を自由状態に維持できるので、ハイブリダイゼーション効率を高めることが可能となる。
【００３７】
なお、上記リンカー分子は、ストレプトアビジン蛋白に限定されることはなく、直径１０〜４０ｎｍ程度の種々のタンパク質を利用できる。
【００３８】
ここで、本発明では、上記説明した検出表面２と検出用ヌクレオチド鎖Ｄとの間に、符号Ｓで示す介挿分子を挿入することによって、検出表面２からより離れた位置に検出用ヌクレオチド鎖Ｄを固定化することを特徴としている（第１実施形態、図１参照）。
【００３９】
例えば、ガラス基板１の水酸基に、Ｓｉ原子の反対側末端にアルデヒド基を持つアルデヒドプロピルシランを反応させておき、一方では、検出用ヌクレオチド鎖Ｄの５’末端位置に、例えば分子長２０〜５０ｎｍのポリエチレングリコールからなる介挿分子Ｓを導入して、固定化用の検出用ヌクレオチド鎖Ｘを得る。
【００４０】
そして、（介挿分子Ｓが導入された）検出用ヌクレオチド鎖Ｘと前記アルデヒドプロピルシラン処理した検出表面２とを反応させると、検出用ヌクレオチド鎖Ｘは、導入された介挿分子Ｓを介して検出表面２に固定化されることになる。
【００４１】
また、本発明では、前記検出用ヌクレオチド鎖Ｘと介挿分子Ｓを持たない検出用ヌクレオチド鎖Ｄ（５’末端がアミノ基修飾されている）を等モル混合して、アルデヒドプロピルシラン処理した検出表面２と反応させることによって、検出表面２上に、検出用ヌクレオチド鎖ＸとＤとを確率的に交互に配列させることができる（第２実施形態、図２参照）。
【００４２】
更に、本発明では、分子長の異なる介挿分子ＳａとＳｂを用意し、介挿分子Ｓａ導入された検出用ヌクレオチド鎖Ｙと介挿分子Ｓｂが導入された検出用ヌクレオチド鎖Ｙとを等モル混合し、アルデヒドプロピルシラン処理した検出表面２と反応させることによって、検出表面２上に、検出用ヌクレオチド鎖ＹとＺとを確率的に交互に配列させることができる（第３実施形態、図３参照）。
【００４３】
上記した第２実施形態や第３実施形態のような「交互配列」を備える構成では、近傍に存在する検出用ヌクレオチド鎖Ｄ同士が隣接しなくなるので、検出用ヌクレオチド鎖Ｄが互いに絡み合ったりすることがなくなる。また、ハイブリダイゼーションした標的ヌクレオチド鎖Ｔの余剰塩基配列部分がブラウン運動の作用によって形作る糸球状の分子塊によってもたらされる立体障害の問題を有効に防止できるため、検出表面２上では効率の良いハイブリダイゼーションを達成することができる。
【００４４】
また、第２実施形態や第３実施形態のような交互配列を採用した場合には、検出用ヌクレオチド鎖Ｄ間の配置距離を確保しなくても、立体障害等の問題を解決できるので、所望のハイブリダイゼーション効率化効果を得ることができることから、検出用ヌクレオチド鎖Ｄの単位面積当たりの配列密度が高い検出表面２を提供することができるので、好ましい。
【００４５】
ここで、本発明においては、検出表面２に結合させたポリＴ等の介挿分子Ｓ（Ｓａ，Ｓｂ）が存在する反応領域Ｒに、不均一電界（不平等性を持つ電界）を形成することによって、前記電界に沿って伸長する介挿分子Ｓ’を作製すると同時に、該介挿分子Ｓ’に結合している検出用ヌクレオチド鎖Ｄも誘電泳動の作用によって伸長させることができる（第４実施形態、図４参照）。なお、図４中の符号Ｄ’は、伸長した検出用ヌクレオチド鎖を示している。
【００４６】
この第４実施形態では、介挿分子Ｓ’の伸長効果に基づいて、検出用ヌクレオチド鎖Ｄ（Ｄ’）を検出表面２からより離れた位置に存在させることによって（図４中の符号ＳとＳ’を比較参照）、検出用ヌクレオチド鎖Ｄ（Ｄ’）が検出表面２に静電結合等して付着することを有効に防止できる。
【００４７】
また、検出用ヌクレオチド鎖Ｄ（Ｄ’）に加えて反応領域Ｒ中の標的ヌクレオチド鎖Ｔを伸長させることによって、両鎖ＤとＴの相補性のある塩基配列同士の会合（水素結合）を効率よく進行させることが可能となる。なお、図４中の符号Ｔ’は、伸長した標的ヌクレオチド鎖を示している。
【００４８】
なお、上記実施形態で使用する介挿分子Ｓの分子長は、検出用ヌクレオチド鎖Ｄや標的ヌクレオチド鎖Ｄの長さ（塩基数）、検出用ヌクレオチド鎖Ｄ同士の距離等に応じて適宜決定できる。
【００４９】
例えば、５０〜１００塩基のプローブＤＮＡを伸長した検出用ヌクレオチド鎖Ｄに対して１，６００塩基程度の標的ヌクレオチド鎖Ｔをハイブリダイゼーションさせる場合を想定すると、標的ヌクレオチド鎖Ｔの余剰塩基配列部分（相補鎖を作らない配列部分）がブラウン運動によってランダムコイル状の分子塊になったときの直径は、１０〜４０ｎｍと計算できる。
【００５０】
この場合、標的ヌクレオチド鎖Ｔの前記分子塊部分による立体障害を有効に防ぐためには、介挿分子Ｓ（又は伸長した状態の介挿分子Ｓ’）の分子長は１０〜４０ｎｍ確保するのが好適であり、また検出表面２上に配列される介挿分子Ｓ（又はＳ’）間の距離についても、１０〜４０ｎｍ程度が望ましい。
【００５１】
【発明の効果】
（１）本発明に係る検出表面及び該検出表面を備えるＤＮＡチップ等のセンサーチップは、検出表面上において進行するハイブリダイゼーションの弊害となる立体障害を、介挿分子を利用して防止することが可能となるので、ハイブリダイゼーション効率を高め、反応時間を短縮することできる。
【００５２】
（２）本発明に係る検出表面を備えるＤＮＡチップは、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用でき、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形態の構成を表す検出表面部位拡大図
【図２】本発明の第２実施形態の構成を表す検出表面部位拡大図
【図３】本発明の第３実施形態の構成を表す検出表面部位拡大図
【図４】本発明の第４実施形態の構成を表す検出表面部位拡大図
【符号の説明】
１　基板
２　検出表面
Ｄ　検出用ヌクレオチド鎖
Ｒ　反応領域
Ｓ　介挿分子
Ｔ　標的ヌクレオチド鎖
【図１】
2004061205.tif 000003
【図２】
2004061205.tif 000004
【図３】
2004061205.tif 000005
【図４】
2004061205.tif 000006