(57)【要約】【課題】被験試料中の標的物質と結合する捕捉物質を、検出精度に悪影響を及ぼすことなくセンサ素子上に担持することのできる検出素子を提供する。【解決手段】検出素子１の基体２の表面に、接着層３を介して結合される架橋層４の架橋分子は、シラン系もしくはチタン系カップリング剤に含まれる官能基が加水分解により変換されるなどしたカルボキシル基を含むので、このカルボキシル基に直接捕捉物質５を担持することができる。このため、巨大分子である標的物質と捕捉物質５との結合を検出素子１の表面上において均一化でき、高精度な検出が可能となる。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体の表面に接着層を付し、前記接着層に架橋分子で形成された架橋層を結合し、前記架橋層に捕捉物質を担持した検出素子において、前記架橋分子は、カルボキシル基を含んだシラン化合物もしくはチタン化合物より形成されることを特徴とする検出素子。
【請求項２】
基体の表面に接着層を付し、前記接着層に架橋分子で形成された架橋層を結合し、前記架橋層に捕捉物質を担持した検出素子において、前記架橋分子は、シラン系もしくはチタン系カップリング剤に含まれる官能基の加水分解反応によって得られたカルボキシル基を含むことを特徴とする検出素子。
【請求項３】
前記加水分解反応は、炭酸水素ナトリウム溶液への浸漬により行なわれることを特徴とする請求項２に記載の検出素子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体物質の親和性を利用した分析に関し、センサ素子上の捕捉物質が被検試料中の特定の標的物質と結合する免疫センサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、生体物質の親和性を利用した分析、特に免疫センサの領域では、被験試料中の標的物質と結合する捕捉物質（主に抗体）をセンサ素子上に担持する場合に、適当なポリマーやゲルに固定化する方法が採用されている（特開昭５３−１４９３９４、特表平４−５０１６０５、Ｗａｙｎｅ　Ｒ等（１９８６年）、Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌ１，ｃｈａｐｔｅｒ５，ｐａｇｅ９５−１２６など）。用いられたヒドロゲルとしては硝酸セルロース、デキストラン、ポリメタクリル酸などがあり、センサシステムとしては、ＦＥＴセンサ、レゾナントミラーセンサ、表面プラズモン共鳴センサなどが用いられている。この方法は、センサ素子の単位面積あたりの捕捉物質担持量を高めるために有効であるとされてきた。実際、センサ素子表面に二次元的に捕捉物質を担持した場合よりも、検出感度が上昇するという報告もある（Ｉｎｇｅｍａｒ　Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ（１９９４年）、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　＆　Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，ｖｏｌ９，ｐａｇｅ７２５−７３６、Ｂｏ　Ｌｉｅｄｂｅｒｇ（１９９５年）、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　＆　Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，ｖｏｌ１０，ｐａｇｅ１−９など）。
【０００３】
このような構造のセンサ素子は、微視的には素子表面がある一定濃度のポリマーやゲルに覆われており（水溶液と接触して膨潤した場合には数％程度のヒドロゲル濃度となる場合もありうる）、被験試料溶液と接触させた場合には、これらのヒドロゲルと三次元的に共存する溶液となっている点が、二次元的に捕捉物質を担持したセンサ素子とは異なっている。このような状況で、標的物質が捕捉物質と結合する場合には、これらのヒドロゲルと共溶解した被験試料溶液中に移動していくことになる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような場合、高分子物質の含まれる溶液中では物質移動速度が低下する。免疫分析の標的物質になることの多い蛋白質などは、それ自体も高分子であるため、センサ素子表面への接近にはセンサ素子表面のヒドロゲルの影響を受ける。特に被験試料が細胞やウィルスなどの巨大分子の場合、被験試料がセンサ素子表面への接近する際に受けるヒドロゲルの影響が無視できず、正確な検出ができなくなる場合があるという問題があった。
【０００５】
本発明は、上記課題を解決するためになされたもので、本発明の目的は、被験試料中の標的物質と結合する捕捉物質を、検出精度に悪影響を及ぼすことなくセンサ素子上に担持することのできる検出素子を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段及びその作用・効果】
上記目的を達成するために請求項１は、基体の表面に接着層を付し、前記接着層に架橋分子で形成された架橋層を結合し、前記架橋層に捕捉物質を担持した検出素子において、前記架橋分子は、カルボキシル基を含んだシラン化合物もしくはチタン化合物より形成されることとした。よって、架橋層のカルボキシル基に直接捕捉物質を担持することができるので、巨大分子である標的物質と捕捉物質との結合が検出素子表面上において均一化でき、高精度な検出が可能となる。
【０００７】
請求項２は、基体の表面に接着層を付し、前記接着層に架橋分子で形成された架橋層を結合し、前記架橋層に捕捉物質を担持した検出素子において、前記架橋分子は、シラン系もしくはチタン系カップリング剤に含まれる官能基の加水分解反応によって得られたカルボキシル基を含むこととした。よって、架橋層のカルボキシル基に直接捕捉物質を担持することができるので、巨大分子である標的物質と捕捉物質との結合が検出素子表面上において均一化でき、高精度な検出が可能となる。また、この構成においては、カルボキシル基を持たないカップリング剤を用いても、検出素子表面に確実にカルボキシル基を導入することができる。
【０００８】
請求項３は、請求項２に記載の検出素子において、前記加水分解反応は、炭酸水素ナトリウム溶液への浸漬により行なわれることとした。この場合、高精度の検出素子が得られる。また、無機酸化物、無機炭化物、無機窒化物から構成される接着層が腐食することもない。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を、図面により詳細に説明する。
【００１０】
図１は、本発明の一実施形態にかかる検出素子１の基本構造を示す図である。図１に示すように検出素子１は、基体２と、基体２の表面に接着層３を介して結合された架橋層４と、適当な方法により架橋層４に担持した捕捉物質５から形成される。基体２、接着層３、架橋層４は、種々のトランスデューサーを備えてなる検出装置に応じて適宜選択される。例えば、表面プラズモン共鳴を利用したセンサにおいては、ガラス薄板に金薄膜を蒸着した基体２の上に、接着層３として二酸化シリコン、二酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化亜鉛が利用できる。また架橋層４としては、例えば、３―（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物を接着層３に結合した後、コハク酸部分を加水分解してカルボキシル基を露出したものが利用できる。
【００１１】
本発明による検出素子は、次のように利用される。捕捉物質を担持した検出素子表面に標的物質を含んだ試料を接触させる。試料中に標的物質が存在すると、検出素子表面に担持した捕捉物質に捕捉される。この捕捉の程度は、両者の親和性と、試料中の標的物質の濃度に比例する。よって、検出素子表面に捕捉される標的物質の量は、試料中の標的物質の濃度に依存する。標的物質が検出素子表面に捕捉されると、その結合量に依存して、検出素子の屈折率、質量、キャパシタンス、およびインピーダンスが変化する。よって、標的物質について所定の濃度と、屈折率、質量、キャパシタンス、およびインピーダンスの変化との関係を示す検量線をあらかじめ作成しておくことにより、それに基づいて検出素子表面に結合する試料中の標的物質の濃度を知ることができる。
【００１２】
ここで、標的物質と親和性を有する捕捉物質の具体例としては、蛋白質、ペプチド、抗生物質、色素、核酸、農薬、微生物、ホルモン、もしくはウイルス、またはそれらの構成成分の抗原；これらの抗原を認識するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組み換え抗体、一本鎖抗体、もしくはこれら抗体種の改変修飾体；または活性部位を破壊し結合部位の機能のみを有する酵素、レクチン、核酸、もしくは生体内のシグナル伝達に関わるレセプターリガンドなどの生体関連物質が挙げられる。このような生体関連物質を利用することにより、本発明による検出素子は、例えば、表面抗原を認識することでサルモネラ菌や病原性大腸菌などに代表される病原性微生物の検出が可能なバイオセンサとして利用できる。
【００１３】
この態様にあって、接着層に用いられる無機酸化物、無機炭化物、無機窒化物から構成される化合物の具体例としては、シリコン、チタン、タンタル、アルミニウム、亜鉛などの単体、その酸化物、炭化物、窒化物等が挙げられる。接着層の厚みは、種々のトランスデューサーを備えてなる検出装置に応じて適宜選択するものとするが、例えば、表面プラズモン共鳴を利用したセンサにおいては、好ましくは１〜１０ｎｍ、より好ましくは３〜１０ｎｍである。
【００１４】
また、架橋層を形成する架橋分子としては、カルボキシル基を含んだシラン化合物もしくはチタン化合物、あるいは、コハク酸基を含むシラン系もしくはチタン系カップリング剤を接着層に結合した後、コハク酸基を加水分解してカルボキシル基に変換したものが利用できる。この場合、架橋層のカルボキシル基に直接捕捉物質を担持することができるので、巨大分子である標的物質と捕捉物質との結合が検出素子表面上において均一化でき、高精度な検出が可能となる。また、加水分解を用いる場合は、カルボキシル基を持たないカップリング剤を用いても、検出素子表面に確実にカルボキシル基を導入することができる。
【００１５】
本発明による検出素子の使用態様において、被検試料が検出素子と接触すると検出素子表面には標的物質が捕捉物質に捕捉されて残るが、この捕捉された標的物質は、適当な条件で解離させることができる。例えば、抗原抗体反応を利用している場合、抗原抗体複合体が解離するｐＨに緩衝能を有する緩衝液もしくは酸で洗浄することで、抗原と抗体を互いに引き離すことができる。このような方法によって標的物質がその表面から除かれた検出素子は、再度測定に利用することができる。
【００１６】
本発明による検出素子は、好ましくは次のように製造される。まず基体を用意する。表面プラズモン共鳴を利用したセンサにおいては、ガラス薄板を洗浄後、２ｎｍのクロム薄膜と５０ｎｍの金薄膜を蒸着して基体とする。さらに、接着層として５ｎｍの二酸化シリコンを蒸着する。蒸着は、スパッタリング装置や真空蒸着装置を使用して行なう。接着層への架橋分子の結合は、架橋分子を溶解した水、有機溶媒、もしくは水と有機溶媒の混合液中に、接着層を結合した基体を浸漬することにより実施できる。架橋分子への標的物質に対する捕捉物質の担持は、架橋分子に含まれるカルボキシル基を活性化して、捕捉物質に含まれる官能基と共有結合を介して化学的に結合させることにより行なう。例えば、捕捉物質に含まれるアミノ基を架橋分子に結合させる場合、架橋分子のカルボキシル基をジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキスクシンイミドで処理した後、捕捉物質を含む酢酸緩衝液に浸漬させることにより達成される。
【００１７】
【実施例】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１８】
（実施例１）検出素子の作製
支持体としてのガラス基板（１０ｍｍ×８ｍｍ）を用意し、希硝酸、中性洗剤、および超純水の順で洗浄した。この支持体上に、マグネトロンスパッタリング法によって２ｎｍ厚のクロム接着層を付し、その後で５０ｎｍ厚の金薄膜を蒸着し基体とする。さらに、接着層として５ｎｍ厚の二酸化シリコンを蒸着した。その基板をアセトン、超純水、アセトンの順で洗浄し、その後、ＵＶクリーナーを使用してオゾン洗浄を行なった。洗浄後、基板をさらに１ｍｏｌ／ｌの炭酸ナトリウム溶液と１ｍｏｌ／ｌの硝酸で、各々３０℃で３０分処理した。次に、その基板を０．５（ｖ／ｖ）％の３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物溶液（溶媒：イソプロピルアルコール）に７５℃で５分間浸漬して、表面に架橋層を形成した。その後、イソプロピルアルコールで洗浄した。そして、架橋層を形成した基板を１ｍｏｌ／ｌの炭酸水素ナトリウム水溶液中に３０℃で２０時間浸漬して、コハク酸無水物を加水分解して架橋層中にカルボキシル基を発現させた。その後、大量の水で洗浄した。
【００１９】
（実施例２）アルブミン測定用検出素子の作製
実施例１で作製した基板の架橋層中のカルボキシル基を、０．２ｍｏｌ／ｌのジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）および０．０５ｍｏｌ／ｌのＮ−ヒドロキスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合溶液で６分間活性化した後、１００ｍｇ／ｌの抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）抗体を含む０．０１ｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）の溶液に１０分間浸漬して、基板上に抗ＨＳＡ抗体を担持した。抗ＨＳＡ抗体を担持後、１ｍｏｌ／ｌのエタノールアミン水溶液（ｐＨ８．５）に８分間基板を浸漬して、基板上の活性化されたカルボキシル基を不活性化した。その後、０．１ｍｏｌ／ｌの塩酸に３分間基板を浸漬して、表面に共有結合を介さずに吸着している抗ＨＳＡ抗体を解離させた。こうして得られた基板を検出素子とした。以上の操作における共振角の変化を、図２に示す。図中、活性化溶液に浸漬する前と塩酸に浸漬した後の共振角変化量が、抗ＨＳＡ抗体の検出素子への固定化量に相当する。
【００２０】
（実施例３）ＨＳＡの検出
実施例２で作製した抗ＨＳＡ抗体を固定化した検出素子を、表面プラズモン共鳴を利用した装置に装着し、ＨＳＡの測定を行なった。ここでいう表面プラズモン共鳴を利用した装置とは、被験試料液中の標的物質の定量が可能なセンサ装置であって、基体に結合した材料種からなる担持層、もしくは架橋層に接触する物質の屈折率を観察する検出装置を備えてなる分析装置である。
【００２１】
まず、燐酸緩衝液（０．０６６ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．０、０．１ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム含有）を検出素子表面に通液し、そのときの共振角を測定しベースラインとした。次に、ＨＳＡ溶液を検出素子表面に一定時間接触させ、素子表面上の抗ＨＳＡ抗体とＨＳＡを結合させた。その後、始めに通液した燐酸緩衝液を用いて余剰のＨＳＡを洗い流して共振角を測定した。この共振角とベースラインでの共振角の差が、検出素子表面の抗体に結合したＨＳＡ量に起因するレスポンスとなる。抗体に結合したＨＳＡは、適当な解離液（ｐＨ３．０以下の希塩酸またはグリシン緩衝液）によって解離させ、検出表面の再使用を可能にした。以上の操作における共振角の変化を、図３に示す。図中、ＨＳＡ溶液に浸漬する前後の緩衝液浸漬時の共振角変化量が、ＨＳＡ溶液に対するレスポンスに相当する。
【００２２】
また、ＨＳＡ濃度が既知のいくつかの試料を用いてＨＳＡ濃度と共振角とを測定した。このときのＨＳＡ濃度とレスポンスの関係を、図４に示す。これを検量線として用いれば、濃度未知のＨＳＡの濃度測定を行なうことができる。
【００２３】
（比較例１）検出素子の作製
実施例１と同様の操作で、架橋層を形成した基板をイソプロピルアルコールで洗浄した。その後、１ｍｏｌ／ｌの炭酸ナトリウム水溶液中に３０℃で２０時間浸漬して、コハク酸無水物を加水分解して架橋層中にカルボキシル基を発現させた。その後、大量の水で洗浄した。
【００２４】
（比較例２）検出素子の作製
実施例１と同様の操作で、架橋層を形成した基板をイソプロピルアルコールで洗浄した。その後、１ｍｏｌ／ｌの塩酸に３０℃で２０時間浸漬して、コハク酸無水物を加水分解して架橋層中にカルボキシル基を発現させた。その後、大量の水で洗浄した。
【００２５】
（比較例３）アルブミン測定用検出素子の作製およびＨＳＡの検出
比較例１および比較例２で作製した検出素子を用いて、実施例２と同様の操作を行なってアルブミン測定用検出素子を作製するとともに抗体固定化量を測定した。続いて、実施例３と同様にアルブミンの検出を行い、１００ｍｇ／ｌのＨＳＡ溶液のレスポンスを測定した。比較例１、比較例２および実施例１で作製した検出素子をベースにそれぞれ作製したアルブミン測定用検出素子における抗体固定化量とレスポンスの値を、表１に示す。表１から、炭酸水素ナトリウム溶液で処理するのが最適であることがわかった。
【００２６】
【表１】
2004061328.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態にかかる検出素子１の基本構造を示す図
【図２】実施例２における共振角の変化を示す図
【図３】実施例３における共振角の変化を示す図
【図４】ＨＳＡ濃度とレスポンスの関係を示す図
【符号の説明】
１…検出素子
２…基体
３…接着層
４…架橋層
５…捕捉物質
【図１】
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【図２】
2004061328.tif 000005
【図３】
2004061328.tif 000006
【図４】
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