(57)【要約】【課題】軟骨損傷治療のため、生体内および生体外での軟骨組織再生を可能にする三次元細胞結合体の製造を、産業化を前提に、より実用的にするためには、ＴＧＦ−βのような蛋白性因子に替わる非蛋白性の軟骨誘導因子、特に軟骨組織創製促進を可能する非蛋白性の軟骨誘導因子を見つけだすことが重要な課題である。【解決手段】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された間葉系幹細胞あるいは前駆細胞を、生体内、生体外においてＦＫ５０６を含有する三次元培養環境下で軟骨細胞に分化誘導させる方法および同方法による生体内および生体外での軟骨組織再生用を可能にする三次元細胞結合体の製造方法を開発することにより、上記課題解決が可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された間葉系幹細胞あるいは前駆細胞を、生体内、生体外において軟骨誘導作用を有する非蛋白性低分子化合物を含有する三次元培養環境下で軟骨細胞に分化誘導させる分化誘導方法。
【請求項２】
非蛋白性低分子化合物がＦＫ５０６様の軟骨誘導作用を有することを特徴とする請求項１記載の分化誘導方法。
【請求項３】
非蛋白性低分子化合物がＦＫ５０６である請求項１記載の分化誘導方法。
【請求項４】
前記三次元培養環境を附与するものが、孔径１０μｍ以上５００μｍ以下、孔長５０μｍ以上１ｃｍ以下の縦長形状の孔が並列的に配置され、並置された各孔間は孔径１０μｍ以下の小孔で連通した構造を有する組織再生用の三次元多孔性支持体である請求項１記載の分化誘導方法。
【請求項５】
三次元多孔性支持体が、厚み方向に縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置された概平板形状を有し、一方の面が開孔処理されているものである請求項４記載の分化誘導方法。
【請求項６】
三次元多孔性支持体が生体適合性材料からなるものである請求項４記載の分化誘導方法。
【請求項７】
生体適合性材料がポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸／グリコール酸共重合体、ポリεカプロラクトン、及び、乳酸／εカプロラクトン共重合体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含んでなる請求項６記載の三次元多孔性支持体。
【請求項８】
請求項４記載の方法で製造された三次元細胞結合体。
【請求項９】
三次元細胞結合体が２．５×１０−３ＭＰａ〜１．５×１０−１ＭＰａの圧縮弾性率を有する部分と、１．５×１０−１ＭＰａ〜２．０ＭＰａの圧縮弾性率を有する部分とからなる請求項８記載の三次元細胞結合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された間葉系幹細胞を生体内、生体外における三次元培養環境下で軟骨細胞に分化誘導するための分化誘導因子およびこれを用いた生体内および生体外での軟骨組織再生用三次元細胞結合体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
変形性関節症などの軟骨疾患は、老齢人口の増加とともに急速な増加傾向にあり、これに起因する社会的経済的コストは大きく、関節機能を回復できる有効な治療法が強く望まれている。
【０００３】
従来、損傷関節面が適切な細胞外基質を再構築するとみられる自己由来細胞を移植することにより損傷関節面が修復されるという仮説に基づき、培養軟骨細胞を膝に導入することに伴う一つの研究が非常に有望であるものとして現れ、これの実用化、製品化もなされた（非特許文献１、非特許文献２）。しかしながらこの治療方法はスポーツ障害など小規模の軟骨欠損を対象としたもので患者数の多い重篤度の高い変形性膝関節症など大規模な軟骨欠損への適用は無理とされている。また小規模への適用においてもその効果に疑問が投げかけられているのが現実である（非特許文献３）。さらに関節由来軟骨細胞を用いた自家移植治療においては、患者自身の細胞を関節より採取する必要があることより侵襲性の問題が指摘されている。また治療のためには採取細胞を大幅に増幅させる必要があるが、分化した軟骨細胞は増幅させることにより、その本来の軟骨細胞の機能を失う脱分化の問題もある。このような状況の中、軟骨欠損治療において優れた治療成績を望むべく、高い分化能を保持したまま大幅増殖が可能とされる間葉系幹細胞の利用が期待され、この実用化が強く望まれている。間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は脂肪、骨、軟骨、弾性、筋および線維などの結合組織を含む特殊な型の間葉あるいは結合組織に分化することのできる骨髄、血液、真皮、および骨膜に見出される形成多能芽細胞あるいは胚状細胞である。これらの細胞が入る特異的分化経路は機械的影響およびもしくは成長因子、サイトカインなどの内因性生物活性因子、およびもしくは宿主組織により確立された局所微環境条件からの各種の影響に依存する。これらの細胞は通常骨髄に非常に低い頻度で存在する。組織培養でこれらの細胞の集団を分離し、増幅させるプロセスは、フリーデンスタイン他により既に報告されている（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００４】
またＭＳＣｓの軟骨細胞への分化は既に数多く報告されている（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。生体内でのＭＳＣｓからの軟骨創製は、ウサギを用いて軟骨欠損治療実験を行ったＷａｋｉｔａｎｉらの報告がある（非特許文献１０）。また生体外での軟骨創製は、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅらのウサギ骨髄由来間葉系幹細胞を用いた軟骨創製に関する報告など（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）がある。
【０００５】
以上の技術状況の中、このＭＳＣｓからの軟骨創製を産業化を前提とした実際の治療へ応用する研究が行われている。そのひとつは、治療により有効な性能を有する軟骨様組織の創製である。上記に述べた多くの方法ではＭＳＣｓ細胞を三次元培養環境下におくために遠心操作等により細胞塊を形成させている。このような方法で形成させた細胞塊を培養することにより、軟骨様組織の形成は確認されているが、細胞塊全体にわたった軟骨形成ではないなどまだまだ不十分といわざるを得ない。また本手法ではかなり多くの細胞数を必要とし患者自身の細胞を用いるという自家移植治療においては侵襲性あるいは脱分化の点で問題点となる。細胞塊を形成させることなく軟骨創製を行う系として、Ｍａｒｔｉｎらによるポリグリコール酸支持体に幹細胞を播種したものを培養することによる軟骨創製の報告があるが（非特許文献１４）、この報告でも大量な細胞数が必要とされ、実際の治療応用には現実的でない。
【０００６】
そこで我々は以前の報告で、生分解ポリマーのＰＬＧＡ（乳酸とグリコール酸の共重合体）で作製したユニークな構造を有する多孔質支持体を用いＭＳＣｓ細胞を培養することにより、用いる細胞数をＭａｒｔｉｎらの方法の１０分の１以下で正常軟骨様に支持体全体にわたり同細胞を均一に分布させ、さらに組織、生化学的にもまた力学的にも正常軟骨に近い性能の軟骨様組織を形成させることに成功し、ＭＳＣｓ細胞を用いた軟骨欠損治療を一歩実用化に近づけた（特願２００２−２６３１２６）。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．３３１，Ｎｏ．１４、８８９−８９５、１９９４
【非特許文献２】
諸橋ら（培養自己軟骨移植法の米国における企業化事例）組織培養工学、ｖｏｌ．２３、５６８−５７１
【非特許文献３】
Ｂｒｅｉｎａｎら  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ  Ｖｏｌ．２０：５２５−５３８、１９９７
【非特許文献４】
Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ  Ｈａｍａｔｏｌ  Ｂｌｕｔｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｖｏｌ．２５、１９−２９、１９８０
【非特許文献５】
Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｖｏｌ．１０、Ｎｏ．２、２１７−２２７、１９８２
【非特許文献６】
Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．１０６，２１３９，１９８８、
【非特許文献７】
Ｂａｂら  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  Ｖｏｌ．８４、１３９−１５１、１９８６
【非特許文献８】
Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎら  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｖｏｌ．７、２４３−２７２、１９９０
【非特許文献９】
Ｃａｐｌａｎら  Ｊ．  Ｏｒｔｈｏｐ．  Ｒｅｓ．  Ｖｏｌ．９、６４１−６５０、１９９１
【非特許文献１０】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ａｍ．、Ｖｏｌ．７６Ａ、５７９，１９９４
【非特許文献１１】
Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅら  Ｔｒａｎｓ．  Ｏｒｔｈｏｐ．  Ｒｅｓ．  Ｓｏｃ．  Ｖｏｌ．２１、６５、１９９６
【非特許文献１２】
Ｊｏｈｏｎｓｔｏｎｅら  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．２３８、２６５−２７２、１９９８
【非特許文献１３】
Ｍａｃｋａｙら  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．４、Ｎｏ．４、４１５−４２８、１９９８
【非特許文献１４】
Ｍａｒｔｉｎら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．１６、１８１−１８９、１９９８
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記の「従来の技術」の項で述べてきた作製方法では、すべて分化誘導因子としてトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β）など蛋白性因子を用いている。産業化を前提とした場合、一般的にいって蛋白性因子を用いることはいくつかの理由で好ましくない。すなわち蛋白性因子の場合、まず一般的に言って低分子因子より高コストである。さらに蛋白性因子は一般的に活性的に不安定であり、その活性維持のための煩雑な操作性は体外培養された軟骨組織など実際に治療に用いる製品生産を行う上でも大きな負担となる。また現段階では、特に強い軟骨誘導活性が認められているＴＧＦ−βは医薬品として認可されておらず、実際に軟骨誘導因子として利用するにはまだ時間を要する。また用いるサンプル量を少なくすることでコスト面の改善を図り、さらに効果の面で効率化するためには、誘導因子自体を予め支持体に固定しておき、これに細胞を入れ培養することで体外での軟骨創製を行うこと、または誘導因子を固定した支持体あるいは同支持体／細胞混合物を直接移植に供することがひとつの手法として考えられる。このような使い方をする上でも滅菌安定性など誘導因子の安定性が重要であり、非蛋白性のものが望まれる。
【０００９】
よってＴＧＦ−βのような蛋白性因子に替わる非蛋白性の軟骨誘導因子、特に軟骨組織創製促進を可能にする非蛋白性の軟骨誘導因子を見つけだすことがＭＳＣｓからの軟骨創製を産業レベルに導く上で重要な課題であると考えた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、軟骨損傷治療のための生体内および生体外での軟骨組織再生用三次元細胞結合体の製造を、産業化を前提に、より実用的にするための手段を提供するものである。即ち、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された間葉系幹細胞あるいは前駆細胞を、生体内、生体外において軟骨誘導作用を有する非蛋白性低分子化合物を含有する三次元培養環境下で軟骨細胞に分化誘導させる分化誘導方法である。
【００１１】
我々は非蛋白性の軟骨誘導因子を探索し、結果として本発明で示したＦＫ５０６が、ＭＳＣｓを用いた軟骨創製系において、効果的な同組織形成促進因子であることを見いだすに至った。
【００１２】
ＦＫ５０６（タクロリムス）は、１９８４年に発見されたマクロライド構造を有する化合物で、ＮＦＡＴ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）とＦＫＢＰｓ（ＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の結合を阻害することにより、カルシニューリンを介したＮＦＡＴの脱リン酸化を阻害し、結果、Ｔ細胞の活性化を選択的に阻害することによる強力な免疫抑制作用を発揮する。最近、ＮＦＡＴファミリーのひとつであるＮＦＡＴｐが軟骨創製のリプレッサーであるとの報告がなされた（Ｒａｎｇｅｒら  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．１９１，９−２１，２０００）。さらにＮｉｓｈｉｇａｋｉらにより、ＦＫ５０６には幹細胞ラインからの軟骨細胞誘導を促進する効果があることが報告されている（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００２
２２；４３７（３）：１２３−１２８）。
【００１３】
しかしながら実際の治療を前提としたＦＫ５０６によるヒトＭＳＣｓからの軟骨細胞の誘導の可否についてはまだ明確ではない状況であった。この状況の中、我々は実際にヒトＭＳＣｓを用い、さらに軟骨組織形成に好ましい三次元培養環境を付与する我々のユニークな多孔質支持体を用いることにより、このＦＫ５０６の軟骨細胞および軟骨組織形成誘導促進効果を検討し、結果として、このＦＫ５０６が有効な軟骨組織形成促進作用を持つこと見出した。
【００１４】
【発明の実施の形態】
軟骨への分化誘導効果を有するものとして、デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、トランスフォーミング成長因子−βファミリーと呼ばれる因子、例えば骨形態形成タンパク質（望ましくはＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インヒビンＡあるいは軟骨形成刺激活性因子（ＣＳＡ）、Ｉ型コラーゲン（とりわけゲル形態にあるもの）などのコラーゲン性細胞外基質、およびレチノイン酸などのビタミンＡ類似体などがある。
【００１５】
しかしながら現実的にはＴＧＦ−βなど蛋白性因子は軟骨創製において必須のものであるとされている。例えば、ＴＧＦ−β１は軟骨形成の有力なプロモーターであるとして知られており、数多くの研究で軟骨の修復を実行するために使用されてきており、またＴＧＦ−β３は子宮平滑筋腫細胞に際立った効果を持つものとして発見され、オシリスのグループにより間葉系幹細胞の軟骨形成分化に対する作用が報告されている（Ｍａｃｋａｙら  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．４、Ｎｏ．４、４１５−４２８、１９９８）。
【００１６】
本発明の非蛋白性の軟骨分化因子探索では、上記の軟骨分化誘導活性を有する蛋白性因子を共存させることなく、単独でその効果を発揮し得るものを見出すことを目的としたものであり、以下に述べるＦＫ５０６はこれを満たすものとして本発明でその活性が確認された。なお本発明で言うＦＫ５０６様の軟骨誘導作用とは、ＦＫ５０６の作用経路に関連する物質に作用することによる軟骨細胞分化誘導を意味する。
【００１７】
本発明においては、軟骨誘導作用を有する非蛋白性低分子化合物として、ＦＫ５０６又はＦＫ５０６様の軟骨誘導作用を有する化合物が用いられる。ＦＫ５０６は、免疫抑制剤として市販されているもの（藤沢薬品製、プログラフ）を用いた。培養に添加する溶液は、同製品に付属する溶解液（無水エタノール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０を含む溶液）にて凍結乾燥品を溶解したものを用いた。ＦＫ５０６濃度は少くとも約１ｎｇ／ｍｌであり、望ましくは５−１５ｎｇ／ｍｌである。
【００１８】
間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は骨髄、血液（末梢血を含む）、骨膜および真皮、ならびに中胚葉起源を持つ他の組織などからウシまたはヒト血清環境あるいは合成無血清環境下の密度勾配分画などにより分離することができる。それら組織に含まれているＭＳＣｓは年齢と共に大幅に減少するが、とりわけ骨髄から分離することができ、分離された分画調製物は細胞の少くとも約９０％、また望ましくは少くとも約９５％がヒト間葉系幹細胞の細胞を含むであろうということが考えられる。
【００１９】
さらに分画調製された同細胞は、ウシまたはヒト血清環境あるいは合成無血清環境下で培養増幅され、軟骨組織の形成はこれらの細胞を三次元形態、望ましくは三次元培養環境を付与する多孔質支持体との混合物（三次元細胞結合体と呼ぶ）として合成無血清環境下で培養することにより行われた。この三次元細胞結合体は体外および体内での軟骨形成に適用することができる。なお本発明で使用されたヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）は、市販のもの（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）である。
【００２０】
本発明において三次元培養環境とは、間葉系幹細胞あるいは前駆細胞が三次元方向に増殖することができる培養環境を意味する。三次元培養環境を付与する多孔質支持体としては、これまでの我々の報告したものを用いた。以下、詳細を述べる。
すなわち紡錘状などの縦長形状の孔が並列に並んだ構造を有する。孔の孔径は１０μｍ以上５００μｍ以下であり、細胞を導入可能でかつ漏れにくい構造の確保の点から、好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下である。上記孔の孔長は５０μｍ以上１ｃｍ以下であるが、支持体内の培地拡散性保持の点から、好ましくは５０μｍ以上５ｍｍ以下である。
【００２１】
本発明で使用される支持体は、並置された各孔間は孔径１０μｍ以下の小孔で連通した構造となっている。「孔径１０μｍ以下の小孔で連通した構造」とは、上記縦長形状の孔が、５０％以上、好ましくは７０％以上が孔径１０μｍ以下である小孔で互いに連結された構造を意味する。この小孔は、培地等の溶液は通すが、細胞は通さないものである。
【００２２】
本支持体においては、有孔率は７０％以上であることが好ましいが、細胞密度確保の点から７０〜９５％のものがより好ましい。ここで有孔率とは、支持体における縦長形状の孔と小孔との合計の割合をいい、単位体積あたりの支持体材料の重量から算出したものである。また孔径及び孔長は、電顕観察で評価、算出した。
本発明でいうところの組織再生用とは、生体を構成する種々組織の再生用を意味する。
【００２３】
本発明の多孔性支持体の構造としては、不織布、フォーム、スポンジ、織物構造などが考えられ、作製可能であるが、機械的強度を考慮してフォームまたはスポンジ構造のものが望ましい。
【００２４】
この支持体では両方の面に１０μｍ程度の孔径を有する孔が空いている形状のもので、培地通性は十分確保した上で細胞が通過しにくい構造を有している。これは支持体の中に導入された細胞が漏れ出ることを防ぐとともに、外部、特に軟骨下骨からの炎症性細胞の浸潤を防ぐために有効な構造である。また各孔間の横方向の連通性については、培地の移動は可能であるが、細胞の移動はできない孔径１０μｍ以下のサイズの小孔で連通しており、細胞の生育性に良好な環境を与え、播種された細胞が横面から漏出することを防ぐ構造を有している。
【００２５】
本発明で使用される支持体のより好ましい態様として、厚み方向に縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置された概平板形状を有し、一方の面が開孔処理されている三次元多孔性支持体を挙げることができる。ここで、「厚み方向」とは縦長孔の縦長方向を意味し、「縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置」とは縦長孔を同じ方向に並置することを意味する。また、「概平板形状」とは完全な平板形状はもちろんのこと、平板形状に近い形状であるものを全て含むものである。
【００２６】
「開孔処理」とは孔径を拡大させることを意味し、例えば以下のような塩溶出法による開孔処理、剥離法による開孔処理などが挙げられる。
塩溶出法とは、支持体を作製する時に、片面の表層部についてのみリーチング法と呼ばれる塩溶出処理操作を組み合わせた方法である。これにより、片面を孔拡大することができ、さらにロート状の形状をとることにより孔への細胞導入を効率的に行うことができる。
【００２７】
剥離法とは、凍結乾燥法で作製した支持体が、例えば紡錘状の縦長形状の孔の厚み方向の中央付近に広面と並行に空隙あるいは結晶境界を形成することを活用し、支持体を中心部あたりで縦に割く形で、つまり平板方向に剥離して作製する方法である。これにより、一方の面（剥離面）に５０から１５０μｍ平均の細胞が容易に通過できる孔径を確保できる。
【００２８】
本発明で使用される多孔性支持体の材質は特に限定されないが、生理学的条件下で体内に吸収される物質、つまり生体適合性材料が好ましく、これは天然のものでも合成物質でもよい。
【００２９】
多孔性支持体を構成する生体適合性材料としては、天然物から得られるものと合成により得られるものが挙げられるが、加工性、滅菌性、感染性の点から、加水分解により分解し得る合成ポリマーが好ましく、特にαおよびβ−ヒドロキシカルボン酸の加水分解性ポリマーが好ましい。このような生体適合性材料の例としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸／グリコール酸共重合体、ポリεカプロラクトン、乳酸／εカプロラクトン共重合体などが挙げられる。
【００３０】
本発明で使用される乳酸とグリコール酸とのコポリマー（ＰＬＧＡ）としては、グリコール酸と乳酸との重量比が、９９：１ないし１：９９であるコポリマー、特に７５：２５ないし２５：７５の比のコポリマーが好ましい。また他の共重合体についても、乳酸以外のコモノマーと乳酸との重量比は、上述したグリコール酸と乳酸との重量比と同じ範囲にあることが好ましい。
【００３１】
本発明で使用される支持体は、厚さを適宜設定し、患部を補填するために必要なサイズにすることができる。本発明の支持体の厚さは、好ましくは５０μｍから１ｃｍである。なおヒトの膝あるいは股関節の治療に用いる場合には、１ないし３ｍｍの厚さのものが実際上好ましい。
【００３２】
また上記支持体の形状および面積については特に限定はなく、患部を補填するために十分なサイズのものを作製することができる。例えば、ヒトの膝あるいは股関節の治療に用いる場合には、好ましくは１０ないし２０ｍｍの直径の円筒形のものである。
【００３３】
次に本発明で使用される三次元多孔性支持体の製造法について説明する。本発明で使用される三次元多孔性支持体の製造法は、下記の工程からなることを特徴とする：
ａ）支持体材料を有機溶媒に溶解し、
ｂ）調製した溶液を型枠に流し込んだあと５℃／分以上の冷却速度で凍結し、
ｃ）凍結した溶液を真空乾燥して、有機溶媒を除去する。
凍結乾燥処理に先立ってこれら支持体材料を溶液状にするにあたり、溶媒としては通常種々の有機溶媒を用いることができるが、好ましくはクロロホルム、ジオキサン、ポリエチレングリコールである。
【００３４】
また溶解させた支持体材料の溶液を流し込む型枠について、その材質は特に限定されるものではないが、凍結乾燥処理に耐える材質である金属、ガラス製が好ましい。
【００３５】
また上記型枠の形状は特に限定されず、例えば軟骨損傷治療の場合には、軟骨の構造に類似する概平板形状を用いるなど、再生を目指す各組織の形状の構築を基本とするものであれば、各疾患の治療上有効な形状については、すべて使用することができる。
【００３６】
凍結による固化は、少なくとも５℃／分の温度低下、つまり５℃／分以上の冷却速度となるように急速に凍結することが必要となる。例えば、超低温フリーザーや液体窒素を用いることにより、この温度低下（冷却速度）が可能となる。
この後、凍結した溶液を真空乾燥して、有機溶媒を除去することにより、三次元多孔性支持体を得ることができる。
【００３７】
本発明で使用される支持体の好ましい態様である、厚み方向に縦長な形状の孔が面方向に並列的に配置された概平板形状を有する三次元多孔性支持体は、剥離法を用いた下記の工程から製造することができる：
ａ）支持体材料を有機溶媒に溶解し、
ｂ）調製した溶液を、概平板形状になるような型枠に流し込んだ後、５℃／分以上の冷却速度で凍結し、
ｃ）凍結した溶液を真空乾燥して、有機溶媒を除去し、
ｄ）乾燥後の支持体を厚み方向の中心部で平板方向に剥離する。
本明細書において、「厚み方向の中心部で平板方向に剥離する」とは、支持体の厚み方向の中央付近で、平板の上下方向に剥離することを意味する。
【００３８】
上記概平板形状を有する三次元多孔性支持体は、塩溶出法を用いた下記の工程から製造することもできる：
ａ）支持体材料を有機溶媒に溶解し、
ｂ）概平板形状になるような型枠に粒状塩を分散させ、
ｃ）調製した溶液を上記型枠に流し込んだ後、５℃／分以上の冷却速度で凍結し、
ｄ）凍結した溶液を真空乾燥して、有機溶媒を除去し、
ｅ）粒状塩を水洗により除去する。
【００３９】
ここで、粒状塩とは粒子径５００μｍ以下の結晶性物質を意味し、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２のような無機塩、各種アンモニウム塩、クエン酸三ナトリウムのような有機化合物の塩などが挙げられる。粒子径の点からクエン酸三ナトリウムが特に好ましい。
【００４０】
塩溶出法を用いた本発明の方法で三次元多孔性支持体を作製した場合、厚みの１〜２０％で塩溶出処理部による孔が形成され、残りの８０％〜９９％で上記縦長形状の孔が形成された構造となる。
【００４１】
本発明の軟骨組織再生用三次元細胞結合体は、間葉系幹細胞あるいは組織由来の前駆細胞を本明細書記載の支持体に播種して、これを人工環境内および／または生体内で培養することで作製された軟骨組織およびその類似体をいう。ここで、前駆細胞とは未分化の細胞を意味する。
【００４２】
本発明で用いる間葉系幹細胞又は組織由来の前駆細胞としては、骨髄、血液（末梢血、臍帯血）、真皮、骨膜および中胚葉起源を持つその他組織のものが好ましく用いられる。
【００４３】
本発明の軟骨組織再生用三次元細胞結合体としては、塩溶出法を用いる本明細書記載の方法で作製した三次元多孔性支持体に、間葉系幹細胞あるいは組織由来の前駆細胞を人工環境内および／または生体内において培養することにより得られ、厚みの１〜２０％相当の塩溶出処理部、すなわち開孔処理された構造部分が生体軟骨の１／１０未満の圧縮弾性率、残りの８０％〜９９％の部分が生体軟骨の１／１０以上の圧縮弾性率を有する三次元細胞結合体も挙げられる。このような本発明の三次元細胞結合体は生体軟骨の１０％以上の圧縮弾性率を有することが好ましい。
【００４４】
塩溶出法を用いる本明細書記載の支持体は、良好な細胞播種性の附与のみならず、良好な組織形成を可能にする。ゆえに塩溶出法を用いる本発明の方法で三次元細胞結合体を作製すれば、上記圧縮弾性率で示されるように、厚みの１〜２０％にあたる開孔処理された構造部分（塩溶出処理部）が、残りの８０〜９９％の構造部分（非塩溶出処理部）に比べ、明らかに柔らかい性質の組織として作製できる。
【００４５】
本発明における力学強度測定条件では、その圧縮弾性率は塩溶出された部分が２．５×１０−３ＭＰａ〜１．５×１０−１ＭＰａの圧縮弾性率であり、その他の部分の１．５×１０−１ＭＰａ〜２．０ＭＰａに比べ、明らかに柔らかい構造であるといえる。このような性質は、本三次元細胞結合体を実際に患部に埋め込んだ際、反対側の軟骨組織を痛めることを回避する点で極めて有効な構造であるといえる。なお圧縮弾性率とは、圧縮時に受ける応力の歪みに対する変化率である。
【００４６】
次に、本発明の軟骨再生用三次元細胞結合体の製造法について説明する。上記製造法は、本発明で使用される三次元多孔性支持体に、間葉系幹細胞あるいは前駆細胞を播種し、生体外および／または生体内で合成培地を用い三次元培養環境下で培養することを特徴とする。
【００４７】
ここで使用される「合成培地」という用語は、この発明の組成物がとりわけこの発明の方法に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏで軟骨形成を受けることができ、また最小必須培地、アスコルビン酸塩あるいはその類似体、鉄源等微量金属およびインスリンもしくはインスリン状成長因子を含むような維持、成長あるいは培養培地を意味する。なお、その他蛋白性因子としてヒトでの実績のあるウシアルブミンを用いることが好ましい。本実験では最小必須培地としてＤＭＥＭ、鉄源等微量、インスリン、ウシアルブミンを別添加として用いた。
【００４８】
上記製造法において、間葉系幹細胞あるいは前駆細胞の播種は公知の方法で行うことができるが、支持体１ｃｍ３あたり１０６〜１０８個の密度となるように間葉系幹細胞又は前駆細胞を播種することが好ましい。
【００４９】
上記方法において、「生体外で培養」とは、試験管、培養器など人工環境内で培養することを意味する。静置または旋回でのバッチ培養、あるいは循環式の連続培養を行うことができ、望ましくは旋回バッチ培養あるいは循環式の連続培養である。また本発明で使用された三次元細胞結合体の製造法において、人工環境内の培養は、培養液を支持体に対し毎秒０．１ｃｍから毎秒５０ｃｍの速度で移動させる条件で行われることが、三次元細胞結合体への新鮮な培地の供給の観点、また三次元細胞結合体からの老廃物の除去の観点より好ましい。
【００５０】
上記方法において、「生体内で培養」とは、例えば、支持体あるいは支持体と細胞の混合物を生体組織内に設置して細胞を培養するような、生体組織内での培養を意味する。
【００５１】
本発明で使用される支持体に間葉系幹細胞又は前駆細胞を播種し培養するにあたり、ＦＫ５０６以外の非蛋白性因子を共存させることができる。例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチンなどムコ多糖、さらにアスコルビン酸、トコフェロール、コーエンザイムＱ１０など各種ビタミン類である。これらは細胞全般の生育性の維持、向上に寄与するものである。
【００５２】
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
（実施例１）ＰＬＧＡ支持体を用いた培養軟骨の作製
Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製ヒト間葉系幹細胞７．５×１０５個を１０％ウシ胎児血清を添加したＧＩＢＣＯ社製ＤＭＥＭ培地（５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸２−リン酸、１００μｇ／ｍｌ  ピルビン酸ナトリウム、１００ｎＭ  デキサメタソン、４０μｇ／ｍｌプロリン、ＩＴＳ−ｐｌｕｓ（ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））を用いて培養し、一週間後、約１０倍の細胞数に増幅した細胞を以下培養軟骨の作製に供した。なおここでいう培養軟骨は本明細書記載の軟骨再生用三次元細胞結合体を示す。
【００５４】
２５キログレイ（ＫＧｒｙ）でγ線滅菌した明細書記載の塩溶出法で作製したＰＬＧＡ支持体を前記培地中に置き、減圧下で脱気して支持体表面に培地をなじませた後、培養した間葉系幹細胞を支持体１ｃｍ３当り３×１０７個の密度となるように播種した。間葉系幹細胞を播種した支持体を培養シャーレに置き、１０％ウシ胎児血清を添加したＧＩＢＣＯ社製ＤＭＥＭ培地を支持体が隠れる程度に加え、１晩静置培養した。この後、２０ｍｌのＧＩＢＣＯ社製ＤＭＥＭ培地がはいった直径１０ｃｍの培養シャーレに支持体を移し、１０００ｎｇ／ｍｌとなるようにＦＫ５０６を添加した後に、水平円運動を行える振盪機を用いて３０ｒｐｍの回転数で旋回培養を行った。旋回培養開始後１４日目に支持体を取り出し、作製された培養軟骨を組織学的及び生化学的に評価した。このＰＬＧＡ支持体を用いて作製された培養軟骨の組織像は、図１に示されたようにアルシアンブルーおよびサフラニンＯ染色陽性を呈した。さらに、これらの組織中に存在する軟骨細胞は繊維芽細胞様の形態ではなく、永久軟骨細胞と非常に似かよった形態を有していた。この培養軟骨の一部を４Ｍグアニジン塩酸溶液で可溶化し、ＤＭＭＢ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ）法と呼ばれる色素法により軟骨に特徴的なマトリクスであるアグレカンの検出を試みたところ、アグレカンの存在が認められた（表１）。また同じ培養軟骨の一部サンプルを用い、同じく軟骨特徴的マトリクスであるコラーゲンの産生（蛍光色素法（Ｓｉｒｃｏｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社製））による全コラーゲン量、ＥＬＩＳＡ法にてコラーゲンタイプ１およびタイプ２の産生）を調べたところ、全コラーゲン産生とともにタイプ別のコラーゲンの有意な産生が確認された（表１）。
【００５５】
【表１】
2004254655.tif 000002
【００５６】
表１中、ＤＮＡ測定は抽出効率の違いによるバラツキを相殺するための内部標準として測定したものである。したがってアグレカン量は単位ＤＮＡ量あたりの数字で示されている。Ａ／Ｄはアグレカン／ＤＮＡを指す。またコラーゲンについては、タイプ２／タイプ１の比という形で示した。
【００５７】
また明細書記載の剥離法で作製したＰＬＧＡ支持体を用いた実験も同様に実施し、塩溶出法によるものと同等の結果であることが確認された。
【００５８】
（実施例２）培養軟骨の力学強度測定
実施例１で作製された培養軟骨を、ＰＢＳ溶液中２５℃にて３０分間平衡化後、ヘッドスピード０．１ｍｍ／秒で圧縮を加えた時に受ける応力を以下の方法で測定した。
【００５９】
すなわち、応力値２．５×１０−４ＭＰａを呈する歪みをε０（サンプル表面）、応力値１．５×１０−２ＭＰａを呈する歪みをε１５とし、その間を開孔処理された部分と認識した。また、圧縮弾性率は開孔処理された部分を除く部分（内部構造）で求めることとし、歪みがε１５から０．１０増加する間の圧縮応力の変化率にて算出した。その結果、圧縮弾性率において、支持体のみのものに比べ有意に強度が増していることが示唆された（図２）。
【００６０】
なお、圧縮には、ＡＳＴＭ：Ｄ１６２１−９４に準拠した「テクスチャーアナライザーＴＡ−ＸＴ２ｉ（Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）」付属の制御解析ソフトＴｅｘｔｕｒｅ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｅｘｃｅｅｄを用い、そのマニュアルに従い圧縮解析を行った。図２中、「支持体」とは実施例１でＰＬＧＡ支持体のみを培養軟骨創製と同条件で培養したもの、「培養軟骨」とは本発明の軟骨再生用三次元細胞結合体である。
【００６１】
また剥離法で作製したＰＬＧＡ支持体を用いた実験も同様に実施し、塩溶出法によるものと同等の結果であることが確認された。
【００６２】
【発明の効果】
本発明は、軟骨損傷治療のための生体内および生体外での軟骨組織再生用三次元細胞結合体の製造を、産業化を前提に、より実用的にするための手段を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｈＭＳＣｓをＰＬＧＡ多孔質支持体に播種、培養後、得られた培養軟骨について組織解析を行った結果を示す図である。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はそれぞれ以下の染色結果を示す。ａ；ＨＥ（ヘマトキシリンエオシン）、ｂ；ＡＢ（アルシアンブルー）、ｃ；ＳＯ（サフラニンＯ）。
【図２】１４日間培養サンプルの力学強度測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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