(57)【要約】【課題】            ステロイド生合成をできるだけ自然な態様で阻害し、従って病的状態の処置に大幅に適合化されているＳｔＡＲ遺伝子発現阻害剤。【解決手段】        ＳｔＡＲ遺伝子の発現阻害剤は、プロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストを含む。【選択図】          図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストを使用するＳｔＡＲ遺伝子の発現阻害剤。
【請求項２】
哺乳動物の処置、とりわけ治療的又は予防的処置に適用されること
を特徴とする請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
ステロイド合成の病的状態の処置に適用されること
を特徴とする請求項１に記載の阻害剤。
【請求項４】
前記プロゲステロンレセプタアゴニストは、Ｒ５０２０又はドロスピレノンであること
を特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の阻害剤。
【請求項５】
ＳｔＡＲ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、とりわけ少なくとも５０％低下すること
を特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の阻害剤。
【請求項６】
病気により活性化される刺激機構により副腎ステロイド合成が病的に増強されている状態の処置、又は先天的若しくは薬剤により引き起こされるグルココルチコイド・レセプタ耐性から生じる副腎皮質の活性が病的に増強されている状態の処置に適用されること
を特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の阻害剤。
【請求項７】
前記病的状態は、慢性ストレス、アルコール禁断症状、内因性うつ病、脳下垂体前葉のＡＣＴＨ−及び／又はゴナドトロピン分泌腫瘍ないしその転移、異所性ＡＣＴＨ産生症候群（気管支カルチノイド）、前立腺肥大症、癌、小結節性副腎疾患、先天性副腎肥大症（ＣＡＨ）、性的早熟、女性の男性化症、及びアンドロゲン過分泌が検出される多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択される状態であること
を特徴とする請求項６に記載の阻害剤。
【請求項８】
哺乳動物、とりわけ人間の処置に適用されること
を特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載の阻害剤。
【請求項９】
前記プロゲステロン又は前記プロゲステロンレセプタアゴニストは、例えば錠剤の形態によるような経口的に、又は例えば皮下注射、静脈注射若しくは腹腔内注射又はカテーテル処置によるような非経口的に投与されること
を特徴とする請求項１〜８の何れか一項に記載の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロゲステロン又はプロゲステロンレセプタ・アゴニストを用いたステロイド合成阻害剤に関し、とりわけプロゲステロン又はプロゲステロンレセプタ・アゴニストを用いた「ステロイド産生急性調節タンパク質（steroidogenic acute regulatory protein）」（以下“ＳｔＡＲ”という）遺伝子発現阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロゲステロンないし４−プレグネン−３，２０−ジオンは、最も重要な天然のゲスタゲン（黄体ホルモン）であり、主として、黄体及び胎盤で産生される。男性の場合、このホルモンは、副腎皮質及び精巣で産生される。
【０００３】
プロゲステロンは、ステロイドホルモンであり、エストロゲンと共に生殖器官に作用し、殆どすべての女性の生殖機能の調節に関与している。そのため、このホルモンは、月経周期の黄体期を規定し、生物に妊娠の準備をさせ、受胎及び着床のための重要な前提条件を整え、また、エストロゲンから独立して熱発生効果を有する。
【０００４】
ステロイドホルモンの産生は、人間の生存（生命維持）及び生殖機能に関する本質的要素である。ステロイドホルモンの生合成は、基礎条件（basalen Bedingungen）下又は急性若しくは慢性的制御により、（脳）下垂体腺（Hirnanhangsdruese）で産生される刺激ホルモンによって行うことができる（非特許文献１及び２参照）。刺激ホルモンと７回膜貫通ドメインＧタンパク質共役型受容体との結合により、アデニル酸シクラーゼの活性は高まり、ｃＡＭＰが産生される。ｃＡＭＰは、ステロイド産生遺伝子の発現を誘導することによりステロイド産生を促進する（非特許文献１及び２参照）。
【０００５】
ステロイドは、副腎、卵巣、胎盤、精巣及び脳の特殊化したステロイド産生細胞によって合成される。ステロイドホルモンは種々の生理学的作用を有するが、あらゆるステロイドの生合成は、コレステロールからプレグネノロンへの変化によって開始される。この反応は、ミトコンドリア内膜のマトリクス側に局在するシトクロムＰ４５０側鎖切断酵素（“cytochrome P450 side-chain-cleavage enzyme”又はP450 sec）による触媒作用を受ける（非特許文献３参照）。Ｐ４５０酵素の活性化がステロイド合成における制限ステップをなすということを長年にわたり前提としていた。基質たるコレステロールの量が十分にないと、実際に、制限的にしかこの酵素の活性化をすることができない。しかしながら、後に、この酵素の活性化は実際に調節を行うステップではなく、むしろ基質たるコレステロールのミトコンドリア内膜及びＰ４５０ ｓｅｃへの輸送が制限ステップであるということが明らかとなった（非特許文献４〜７参照）。
【０００６】
これらの研究において観察された決定的な結果は、新たなタンパク質の合成が、ステロイド合成の調節のための絶対的な前提条件をなすということにあった（非特許文献８及び９参照）。この認識は、例えば副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）や黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような刺激ホルモンによって誘導されるステロイド合成もまた、タンパク質合成阻害物質によって阻害されたという観察結果に基づいていた。更なる研究によって、タンパク質合成の阻害は、ミトコンドリア外膜への細胞（内）コレステロールの輸送に影響を与えなかったということを示すことができた。しかしながら、（ミトコンドリア）外膜からミトコンドリア内膜へのこの基質の輸送は、完全に阻害された（非特許文献７及び１０参照）。
【０００７】
従って、ミトコンドリア外膜から膜間含水領域を介して（ミトコンドリア）内膜へコレステロールを輸送する調節タンパク質の存在が前提とされた。この輸送には、輸送体が必須である。というのは、コレステロールは疎水性なので、ホルモンの刺激によるステロイドの観察された合成量に必要な量のコレステロールをＰ４５０ ｓｅｃへ送達することは、輸送体がなければ、不可能だからである。その後、ＳｔＡＲタンパク質（「ステロイド産生急性調節タンパク質（steroidogenic acute regulatory protein）」）がこの輸送体であること、従ってステロイド合成を調節することに関し有力な可能性が現れた。
【０００８】
ＳｔＡＲは、元々は、オルヌ−ジョンソン（Orne-Johnson）等によって文献に記された（非特許文献４参照）。ＳｔＡＲは、ＡＣＴＨ処理されたラット及びマウスの副腎細胞、並びにラットの黄体のＬＨ処理細胞及びマウスのライディッヒ細胞において迅速に誘導可能な３０ｋＤａのリンタンパク質として同定された。後に、ホルモンによって刺激されたＭＡ−１０マウスライディッヒ腫瘍細胞中のものが、ストッコ（Stocco）等によって文献に記された（非特許文献１１〜１３参照）。
【０００９】
このタンパク質は、ミトコンドリアに局在し、かつ性腺刺激ホルモンの影響下で新たに合成される３０ｋＤａのタンパク質の種々の形態から構成される。３０ｋＤａのタンパク質の他に、このタンパク質の異なるＮ末端シグナル配列を有する３７ｋＤａの前駆体も発見された（非特許文献１４及び１５参照）。
【００１０】
この３７ｋＤａのミトコンドリアタンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングし、一過性の形質移入によりＭＡ−１０及びＣＯＳ−１細胞に導入した（exprimiert）。これらの細胞は、形質移入によりステロイド合成能が与えられた。この処置により、コレステロールからプレグネノロンへの転化は何倍も高められた（非特許文献１２、１１、１６及び１７参照）。
【００１１】
これらの結果により、３７ないし３０ｋＤａタンパク質とホルモン調節性のステロイド合成との間の直接的な因果関係の存在が裏付けられた。更に、ＳｔＡＲ遺伝子の突然変異が、先天性リポイド副腎肥大症（リポイドＣＡＨ）と称される場合によっては致死的な状態の原因であるという観察結果から、ステロイド合成におけるＳｔＡＲの本質的関与についての示唆も得られる（非特許文献１７）。
【００１２】
この疾病に罹患している患者は、十分な量のステロイドを生成することができない。このような患者は、副腎及びステロイド産生精巣細胞に過剰な量のコレステロールとコレステロールエステルを有する。これらの患者は、適切なステロイド代償（置換・補充）療法（Steroidersatztherapie）を行わなければ生存することができない。
【００１３】
従来技術では、実質的にリポイドＣＡＨの表現型に対応する表現型を有するＳｔＡＲノックアウトマウスが作られている（非特許文献１８参照）。生化学的及び遺伝学的研究によって、ＳｔＡＲは副腎及び生殖腺の組織におけるステロイドホルモンの生合成に関して重要な役割を有するということが矛盾なく裏付けられた。精巣ライディッヒ細胞は、ＬＨによる慢性的刺激に依存して、その構造及びステロイド産生機能を維持している（非特許文献１９参照）。加齢と共に、ライディッヒ細胞のステロイド産生能は衰えていく（非特許文献２０参照）。加齢の過程には、脂質、タンパク質及び／又はＤＮＡを損傷する活性酸素ラジカルの生成が含まれる（非特許文献２１参照）。活性酸素種（ＲＯＳ）による損傷作用により、場合によっては、機能的な老化が起こる。このＲＯＳによってステロイド生合成経路の重要な構成部分が損傷されることを確認することができた（非特許文献２２及び２３参照）。更に、加齢が起こっているライディッヒ細胞では、プロゲステロンの産生が増加し、テストステロンの産生が減少することが観察された。
【００１４】
【非特許文献１】Menon et al., 1974, Fertil Steril 25:732-750
【非特許文献２】Waterman et al., 1996, Vit horm 52:129-1548
【非特許文献３】Farkash et al., 1986, Endicrinology 118;1353-1365
【非特許文献４】Brownie et al., Biochem Biophys Res Commun 46; 1972, 483-490
【非特許文献５】Simpson et al., J 1979, Biol Chem 253; 3135-3139
【非特許文献６】Crivello et al., J Biol Chem 255; 1980, 8144-8151
【非特許文献７】Privalle et al., 1983, Proc Natl Aad Sci USA 80:702-706
【非特許文献８】Ferguson JJ, 1962, Biochim Biophys Acta 57:616-617
【非特許文献９】Ferguson JJ, 1963, J Biol Chem 238:2754-2759
【非特許文献１０】Ohno et al., 1983, Endocrinology 30:355-228
【非特許文献１１】Clark et al., J Biol Chem 269; 1994, 28314-28322
【非特許文献１２】Stocco et al., 1996, Endocr Rev 17:221-244
【非特許文献１３】Stocco et al., 1997, Steroids 62:29-36
【非特許文献１４】Epstein und Orme-Johnson 1991, J. Biol. Chem., 266:19739-19745
【非特許文献１５】Stocco et al., 1991, J Biol Chem 266:19731-19738
【非特許文献１６】Sugawara et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:4778-4782
【非特許文献１７】Lin et al., 1995 Science 267:1828-1831
【非特許文献１８】Caron et al., Proc Natl Acad Sci USA 94; 1997, 11540-11545
【非特許文献１９】Saez JM 1994, 1994, Endocr Rev 15:574-626
【非特許文献２０】Luo et al., 1996, J. Andrology 17:509-515
【非特許文献２１】Stadtman, 1992, Science 257:1220-1224
【非特許文献２２】Quinn et al., 1984, J Biol Chem 259:4130-4135
【非特許文献２３】Quinn et al., 1985, J Biol Chem 260:2092-2099
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
副腎ステロイド合成が、病的に活性化された刺激機構によって異常に増強される疾患が数多くある。ステロイド合成の自然かつ安全な制御は、この種の疾病状態の治療及びさらにはその他の医療目的のために望ましいであろう。
【００１６】
それゆえ、本発明の課題は、ステロイド生合成をできるだけ自然な態様で阻害し、従って病的状態の処置に大幅に適合化されている作用物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記の課題を解決するために、本発明の一視点によれば、プロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストを使用するＳｔＡＲ遺伝子発現阻害剤が提供される（形態１・基本構成）。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の独立請求項１により、所定の課題として掲げた効果が上述の通り達成される。即ち、本発明のＳｔＡＲ遺伝子発現阻害剤は、ステロイド生合成をできるだけ自然な態様で阻害し、従って病的状態の処置に大幅に適合化されている（基本構成）。
更に、各従属請求項により、付加的な効果が後述の通りそれぞれ達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明の好ましい実施の形態を示すが、これらは従属請求項の対象でもある。
（２）  上記の阻害剤は、哺乳動物の処置、とりわけ治療的又は予防的処置に適用されることが好ましい（形態２）。
（３）  上記の阻害剤は、ステロイド合成の病的状態の処置に適用されることが好ましい（形態３）。
（４）  上記の阻害剤は、前記プロゲステロンレセプタアゴニストは、Ｒ５０２０又はドロスピレノン（Drospirenon）であることが好ましい（形態４）。
（５）  上記の阻害剤は、ＳｔＡＲ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、とりわけ少なくとも５０％低下することが好ましい（形態５）。
（６）  上記の阻害剤は、病気により活性化される刺激機構により副腎ステロイド合成が病的に増強されている状態の処置、又は先天的又は薬剤により引き起こされるグルココルチコイド・レセプタ耐性から生じる副腎皮質の活性が病的に増強されている状態の処置に適用されることが好ましい（形態６）。
（７）  上記の阻害剤において、前記病的状態（病的に増強されている状態）は、慢性ストレス、アルコール禁断症状、内因性うつ病、脳下垂体前葉のＡＣＴＨ−及び／又はゴナドトロピン分泌腫瘍ないしその転移、異所性ＡＣＴＨ産生症候群（気管支カルチノイド）、前立腺肥大症、癌、小結節性副腎疾患、先天性副腎肥大症（ＣＡＨ）、性的早熟、女性の男性化症、及びアンドロゲン過分泌が検出される多嚢胞性卵巣症候群からなる群から選択される状態であることが好ましい（形態７）。
（８）  上記の阻害剤は、哺乳動物、とりわけ人間の処置に適用されることが好ましい（形態８）。
（９）  上記の阻害剤は、前記プロゲステロン又は前記プロゲステロンレセプタアゴニストは、例えば錠剤の形態によるような経口的に、又は例えば皮下注射、静脈注射若しくは腹腔内注射又はカテーテル処置によるような非経口的に投与されることが好ましい（形態９）。
【００２０】
本発明によりまず確認されたことは、ステロイドホルモン、即ちプロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストは、ＳｔＡＲ遺伝子の発現阻害に大いに適合しているということである。従って、プロゲステロン及びプロゲステロンレセプタアゴニストは、ＳｔＡＲ発現の自然で、安全でしかも効きめの大きい阻害物質であり、その発現の阻害の結果、副腎上の要素の阻害から独立した現象であるステロイド合成阻害が行われる。
【００２１】
化合物４−プレグネン−３，２０−ジオン（ＩＵＰＡＣ）を表すために、本書においては、慣用的な命名法に従い、用語プロゲステロン（ＩＮＮ）を用いる。
【００２２】
更に、用語「プロゲステロンレセプタアゴニスト」は、本発明の枠内において、プロゲステロンレセプタと測定可能な程度に特異的に結合し、該レセプタとの結合後、定義されたゲスタゲン応答遺伝子の転写に重要な変化を引き起こす化合物を意味するものとする。プロゲステロンレセプタアゴニストの例としては、例えばＲ５０２０やドロスピレノン（Drospirenon）のようなゲスタゲンがある。
【００２３】
処置された被検体からの試料において、同じ被検体の処置前の対応する試料又は処置が行われない（別の）被検体の対応する試料と比較して、ＳｔＡＲ遺伝子の発現の少なくとも２０％の低下が検出できる場合、ＳｔＡＲ遺伝子発現の阻害が起こっているというものとする。試料としては、組織試料を使用することができる。
【００２４】
本発明の阻害剤により、ＳｔＡＲ遺伝子の発現は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、とりわけ少なくとも５０％低下する。ＳｔＡＲ遺伝子の発現の完全な阻止、即ちＳｔＡＲ遺伝子の転写物の量を検出限界未満にまで減少するような阻害剤も、本発明の技術的思想の範囲に含まれることはいうまでもない。
【００２５】
遺伝子発現の阻害は、組織又は試料中のＳｔＡＲ ｍＲＮＡの定量又はＳｔＡＲタンパク量の測定によって検出することができる。例えばノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸チップ等のｍＲＮＡ定量法及び例えばウェスタンブロット、タンパク質チップ等のタンパク質質定量法の多くは、当業者に既知の事項であり、従って、本発明の枠内において、ＳｔＡＲ遺伝子発現の阻害を検出するために使用することができる。
【００２６】
本発明は、哺乳動物を処置するため、とりわけ人間を治療的又は予防的に処置するためＳｔＡＲ遺伝子発現を阻害するためのプロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストの使用、並びに当該処置のためプロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストを使用するＳｔＡＲ遺伝子発現の阻害剤を含む。
【００２７】
本発明のとりわけ好ましい一実施形態によれば、プロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストによるＳｔＡＲ遺伝子の発現阻害剤は、ステロイド合成の病的状態の処置のために利用される。本発明の枠内において、ステロイド合成の病的状態とは、同年齢の健康な個体のステロイド合成量に対し、基礎ステロイド合成量が、比較的長時間に亘って、好ましくは２４時間に亘って、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％増加する状態をいうものとする。例えば個体の年齢・性別等の所定のパラメータを考慮した上での各種ステロイドに対し、健康な個体で通常予期されるステロイドの量は、当業者には十分既知の事項である。ステロイド量の標準（基準）値ないし標準（基準）範囲は、とりわけにアロリオ及びシュルテの教科書「応用内分泌学」（Allolio und Schulte, “Praktische Endokrinologie”, Urban & Fischer Verlag, 1996, XV. Anhang, 730-736）に記載されている。
【００２８】
プロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストの本発明による使用ないし当該ホルモン等を使用する剤は、副腎ステロイド合成が病的に活性化された刺激機構によって病的ないし異常に増強された病的状態を処置するため、又は、先天的に又は薬剤を原因として引き起こされるグルココルチコイドレセプタ耐性に基づき副腎の活性が病的に高められた状態（例えばカミラリス及びクロウソスの「診断内分泌学」の「副腎疾患」（Kamilaris und Chrousos “Adrenal diseases”, In: Diagnostic Endocrinology, B.C. Decker Inc., 1990, pp. 79-109）参照）を処置するために利用される。ここで、病的状態とは、例えば、慢性ストレス、アルコール禁断症状（Alkoholentzug）、内因性うつ病、（脳）下垂体前葉のＡＣＴＨ−及び／又はゴナドトロピン分泌腫瘍ないしその転移、異所性ＡＣＴＨ産生症候群（気管支カルチノイド）、前立腺肥大症、癌、小結節性副腎疾患、先天性副腎肥大症（ＣＡＨ）、性的早熟、女性の男性化症、及びアンドロゲン過分泌が検出される多嚢胞性卵巣症候群でありうる。
【００２９】
本発明の枠内において、プロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニスト（を含む阻害剤）は、従来技術において既知の任意の方法により、被検体へ投与することができる。投与量は、個々の具体的事例の処置目的及び作用物質に応じて決まるが、当業者であれば、標準的な方法に従って決定することができる。そのため、プロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストの投与量は、例えば、個々の適応症に応じ２〜５ｍｇ／日の範囲とすることができる。
【００３０】
本発明の阻害剤は、各種の投与形態を使用することができるが、その中でも、例えば錠剤によるような経口投与、並びに例えば皮下注射、静脈注射、腹腔内注射、及びカテーテル投与等の非経口的投与が好ましい。更に、膏薬による投与（塗布）又は鼻及びその他の粘膜を介する形態の投与を行うことも可能である。
【００３１】
本発明は、プロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストを含みＳｔＡＲ遺伝子の発現阻害に使用されるべき薬剤の製造方法をも含む。このような薬剤の製造に必要な物質はすべて商業的に入手可能である（例えば、Schering AG（ドイツ）のドロスピレノン（Drospirenon）、NEN Liefe Science（Boston MA）のプロメゲストン（Promegestone）として得られるR5020）。
【００３２】
プロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストの配量及び投与方法は、当業者であれば、予想される医学的適応を考慮して、従来技術において既知の方法により求めることができる。
【００３３】
本発明の更なる一実施形態によれば、疾病の治療的又は予防的処置のための薬剤の製造にプロゲステロン又はプロゲステロンレセプタアゴニストが使用される。ここでいう疾病は、患者のステロイドの量を増加するようなものである。
【実施例】
【００３４】
材料及び方法
化学物質及び試薬は、以下の製造業者から入手した：
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、ベーリンガ・マンハイム（Boehringer Mannheim）（マンハイム、ドイツ）から入手した。ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、エストラジオール及びプロゲステロンのようなステロイドは、シグマ（Signma）（タウフキルヒェン（Taufkirchen）、ドイツ）から入手した。NEN Life SciencesのＲ５０２０及びドロスピレノンは、イエナファルム（Jenapharm）（イエナ、ドイツ）から入手した。（ウシ血清の）アルブミンフラクションＶは、メルク（Merck）（ダルムシュタット、ドイツ）から入手した。その他の試薬はすべて販売業者から入手した。純度は最高のものを用いた。
【００３５】
ライディッヒ細胞の単離・精製
ウィスターラット（Charles River, ズルツフェルト（Sulzfeld）, ドイツ）の幼体（生後３ヶ月）及び成体（生後２３〜２４ヶ月）の精巣を、炭酸ガス麻酔及び頚部転位（zervikaler Dislokation）によりこれらラット殺した後直ちに取り出した。
【００３６】
ラットの幼体及び成体の精巣からライディッヒ細胞を単離・精製するために、健康なウィスターラットの被膜剥離した精巣塊を、例えばMukhopadhyay等の文献（Mukhopadhyay et al., Biochem J., 1986a, 239:463-467及びMukhopadhyay et al., FEBS Lett., 1986b, 202:111-116）に記載されているように、室温で３０分間コラゲナーゼ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）によって処理した。このようにして得られた均質な細胞懸濁液をナイロンフィルタによって濾過し、未精製の（完全には精製されていない）ライディッヒ細胞調製物を得た。パーコール勾配によって更に精製した後、ノイバウエル計数装置（Neubauer-Kammer）を用いて高度に精製されたライディッヒ細胞の最終細胞数を求めた。
【００３７】
ｃＡＭＰを測定する実験を行うために、インキュベーション小管当たり100,000個の細胞を含むアリコートを調製した。これら細胞は、３時間プレインキュベートし、次いでＬＨの代用物としてのｈＣＧを種々の濃度で添加したものと添加しないものとを３０分間インキュベートした。種々異なるステロイドの効果を調べるために、ライディッヒ細胞を上述のとおり３時間（複数の）ステロイドと接触させた。次に、これら細胞を３０分間ｈＣＧ（３ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。無水エタノールを添加し（アルコールの終濃度は凡そ８０％）、そしてボルテックスで混合した後インキュベーションを終了した。エタノール抽出物を乾燥するまで蒸発・濃縮し、その残滓を、０．１％アジ化ナトリウムを含むＭＥＭ１ｍｌに溶解した。生成したｃＡＭＰの量は、Budnik及びMukhopadhyayの文献（Budnik und Mukhopadhyay, FEBS Letters 419, 1997, 4-8）に記載されているような特殊なＥＬＩＳＡによって求めた。しかしながら、この定量は、例えば、CM 59221（IBL、ハンブルク、ドイツ）又はDE 0355ないしDE 0450（R&D Systems GmbH、ヴィースバーデン、ドイツ）が使用される商業的に入手可能なキットによるＥＬＩＳＡによっても行うことができる。
【００３８】
テストステロンを測定する実験を行うために、上述したものと同様の培養条件を使用した。しかしながら、アリコートは、インキュベーション小管当たり50,000個の細胞数のものを使用した。細胞は、種々のステロイドを含むものと、ステロイドを含まないものとを、３時間プレインキュベートし、次に、ｈＣＧを添加したものと添加しないものとを３０分間インキュベートした。そして、無水エタノール添加し（アルコール終濃度は凡そ８０％）、次いでボルテックスで混合してインキュベーションを終了した。エタノール抽出物を乾燥するまで蒸発・濃縮し、その残滓を、０．１％アジ化ナトリウムを含むＭＥＭ１ｍｌに溶解した。テストステロンの含有量は、商業的に入手可能な特別なキット（IBL、ハンブルク）によって求めた。測定値から、100,000細胞当たりのテストステロン量を算出した。
【００３９】
ＲＮＡの抽出及びノーザンハイブリダイゼーション
ＲＮＡは、１２ウェルプレート（750,000細胞／ウェル）で培養され、高度に精製された１．５×１０６個のライディッヒ細胞から単離した。このＲＮＡは、スモールスケールの無フェノールＲＮＡ単離キット（Ambion）を用いた、Chomczynski及びSacchiの修正された１ステップ法（Chomczynski und Sacchi, Anal. Biochem. 162, 1987, 156-159）によって抽出した。単離したＲＮＡは、増幅後、ホルムアルデヒド／モルフォリノプロパンスルホン酸（Formaldehyd/Morpholinopropansulfonsaeure）法（Sambrook et al., vol.1, 7・37, 7・39-7・52. Nolan, C.(ED), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, New York）を用いた１．２％のアガロースゲルでのゲル電気泳動により分離を行った。ゲルからナイロン膜（Nytran, Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland）へのＲＮＡの転写（ブロッティング）は、製造業者（Ambion, AMS Biotechnology, Wiesbaden, Deutschland）の指示をChomzynskiの修正（Chomczynski, P., Anal. Biochem. 201; 1992, 134-139）を施したものに従い、毛管移動により、４時間下方に向けた転写によって行った。
【００４０】
ＳｔＡＲに特異的なハイブリダイゼーションゾンデないしプローブ（Hybridisierungssonde）を、公表されているｃＤＮＡ配列（上記非特許文献１１参照）の位置３３９〜３６０ｎｔ及び位置５８１〜６００ｎｔにそれぞれ位置している５’プライマーと３’プライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、及びクローニングベクターｐＣＲＴＭＩＩ（Invitrogen, Groningen, Niederlande）でサブクローニングした。ライディッヒ細胞中のＳｔＡＲをコードしている転写物を検出するために、Ｔ７プロモータの転写制御下にあるＳｔＡＲタンパク質遺伝子の２６２塩基対のインサートを含む単離プラスミドＤＮＡから増幅されたｃＤＮＡフラグメント（１μｇ）からin vitroでアンチセンスＲＮＡを転写した。その際、ＳｔＡＲタンパク質のＭ１３前進プライマー（Forward Primer）と特異的５’プライマーを使用した。転写反応は、（アマルシャムファーマシア・バイオテック、フライブルク、ドイツから入手可能な）［α−３２Ｐ］ＵＴＰ（凡そ８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を用い、Ａｍｂｉｏｎのプロトコールに応じた条件下で行った。１×１０６ｃｐｍ／ｍｌによりハイブリダイゼーションを６８℃で１８時間行い、次いで、６８℃の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳと、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによるラフな洗浄と厳密な洗浄を行った。ブロットは、オートラジオグラフィフィルム又はStorm 860-Apperatur（モレキュラーダイナミクス、アマルシャムバイオサイエンス、フライブルク、ドイツ）を用いた蛍光イメージング分析（Phospho-Imaging-Detektion）にかけた。
【００４１】
実験例
ライディッヒ細胞を３種類の異なるステロイドと３時間接触させた（図１）。次に、当該ライディッヒ細胞をＬＨの代用物としてのｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン；３ｎｇ／ｍｌ）で３０分間刺激した。
【００４２】
生成したｃＡＭＰの量は、特殊なＥＬＩＳＡを用いて求めた。
【００４３】
得られたデータから、プロゲステロンの存在により、ライディッヒ細胞では、ゴナドトロピン刺激によるｃＡＭＰ反応が明確に阻害されるということが分かる。この実験で使用された他のステロイドは何れもｈＣＧ刺激によるｃＡＭＰの蓄積に対し同様の作用は示さなかった。
【００４４】
ｃＡＭＰ産生に関するライディッヒ細胞へのプロゲステロンの作用に対する投与量−作用曲線が求められた（図２）。図２に示したデータから、ライディッヒ細胞におけるｈＣＧ誘導性ｃＡＭＰ産生に対するプロゲステロンの投与量依存性阻害効果を観察できることが分かる。
【００４５】
プロゲステロンは、０．１μＭ（１０−７Ｍ）の濃度では作用を殆ど示さなかったが、２．５μＭまでのより大きい濃度では、プロゲステロンは、阻害作用を明確に示した。プロゲステロンのこの作用は、例えばＲ５０２０（図２及び図３）やドロスピレノン（図３）のような他のゲスタゲンによっても引き起こされる。その投与量−作用曲線は、プロゲステロンの投与量−作用曲線に比肩する（図２）。Ｒ５０２０及びドロスピレノンは、（ライディッヒ）細胞におけるゴナドトロピン刺激に対する反応として産生されるｃＡＭＰの量を著しく減少した。
【００４６】
Ｒ５０２０もドロスピレノンも、構造上、テストステロンとは明確に異なる。従って、これら２つの化合物が、同様に、ライディッヒ細胞におけるｈＣＧ誘導性テストステロン合成を阻害するか否かについて確認すべきであろう。図３に、図２の場合と同様の条件下で行った実験のデータを示した。この場合、細胞を、種々異なる濃度のＲ５０２０及びドロスピレノンによって３時間処理し、次いで、ｈＣＧ（５ｎｇ／ｍｌ）で３時間刺激し、溶媒中に蓄積したテストステロンを定量した。その結果から、これら２つの化合物もまたテストステロン産生を阻害することできるということが明確に分かる。
【００４７】
上述の何れのゲスタゲンも、ゴナドトロピンに刺激されたライディッヒ細胞におけるｃＡＭＰ（産生）に対してもステロイド合成に対しても明らかに阻害作用を示すので、ＳｔＡＲタンパク発現量に対するプロゲステロンの阻害作用を分析した。ＳｔＡＲタンパク質の発現に対するプロゲステロンの作用を調べるために、ライディッヒ細胞をプロゲステロンが存在するものと存在しないものとを３時間プレインキュベートした。次に、これらの細胞をｈＣＧ（５ｎｇ／ｍｌ）と共に更に３時間インキュベートした。インキュベーション終了後、全ＲＮＡを抽出し、ＳｔＡＲタンパク質の発現をノーザンブロットを用いて分析した。何れも独立した細胞プローブによって実行した２つの代表試験の結果を図４に示した。レーン１は、未処理の細胞であり、レーン２は、ｈＣＧのみで処理した細胞である。図４から明らかなことは、ＳｔＡＲタンパク質の２つの転写物、即ち一方は３.８ｋｂ長、他方は１.７ｋｂ長の転写物が検出されたということである。これら転写物の発現は、予想通り、ｈＣＧによる刺激によって増強されている。
【００４８】
プロゲステロンによって前処理しても、ゴナドトロピンで処理していない細胞（レーン３）におけるＳｔＡＲタンパク質の発現作用には大きな影響を与えることができなかった。これらの細胞は、この実験では、ネガティブコントロールとして利用した。これによって、プロゲステロンは、ＳｔＡＲタンパク質の発現の増加に寄与しないということを示すことができた。ステロイド合成の過剰刺激という条件下でのみ、阻害作用を検出することができる。即ち、細胞は、（コルチコトロピン又はゴナドトロピンのような）副腎上の要素（supra-adrenalen Faktoren）によって刺激されることによって初めてＳｔＡＲ発現が過剰に行われるのである。
【００４９】
尤も、レーン１に対するレーン３のバンドの（信号の）強さの減少も観察された。しかしながらレーン４が示しているように、プロゲステロンによる前処理により、ｈＣＧ刺激によるＳｔＡＲタンパク質の発現量が明確に減少した（レーン４とレーン２を比較せよ）。
【００５０】
それゆえ、本書に示した実験は、プロゲステロンによる処理によって、一次ライディッヒ細胞におけるｈＣＧ刺激性ＳｔＡＲタンパク質発現が阻害されることを明確に証明している。従って、本発明により、プロゲステロンがライディッヒ細胞においてＳｔＡＲタンパク質をコードする転写物の発現を阻害することを初めて分子レベルで示すことができたのである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ラットから単離されたライディッヒ細胞におけるｃＡＭＰ産生に対するＤＨＴ、エストラジオール及びプロゲステロンの作用。
【図２】ラットから単離されたライディッヒ細胞におけるｈＣＧ誘導性ｃＡＭＰ産生に対するＲ５０２０及びプロゲステロンの作用。
【図３】ラットから単離されたライディッヒ細胞におけるｈＣＧ誘導性テストステロン産生及びｃＡＭＰ産生に対するＲ５０２０及びドロスピレノンの作用。ゲスタゲンはすべて３時間のプレインキュベートに用いた。
【図４】in vitroでのライディッヒ細胞におけるＳｔＡＲタンパク質発現に対するプロゲステロンの作用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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