(57)【要約】【課題】本発明は、プローブアレイを使用して、効率よく且つ高精度で核酸の分離回収を行う方法を提供することを目的とする。また、核酸の分離回収を行うためのプローブ固相化反応アレイを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、所望の核酸を分離回収するためのプローブ固相化反応アレイであって、該プローブ固相化反応アレイは、プローブが支持体に固相化されたプローブ固相化反応アレイであり、該支持体には、独立して形成された１または複数の反応部を備え、該支持体の各反応部は、２以上の開口部を有し、該反応部には、反応部毎に分離回収したい核酸とハイブリダイズ可能なプローブが固定化されており、該反応部は、電極を具備することを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。また、該プローブ固相化反応アレイを使用して核酸を分離回収する方法を提供する。【選択図】    図１
2004298018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の核酸を分離回収するためのプローブ固相化反応アレイであって、
該プローブ固相化反応アレイは、プローブが支持体に固相化されたプローブ固相化反応アレイであり、
前記支持体は、該支持体に独立して形成された１または複数の反応部を備え、
前記支持体の各反応部は、２以上の開口部を有し、
前記反応部には、反応部毎に分離回収したい核酸とハイブリダイズ可能なプローブが固定化されており、
前記反応部は、電極を具備すること、
を特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項２】
請求項１に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記反応部は、キャピラリ形状であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項３】
請求項２に記載のプローブ固相化反応アレイであって、
前記２以上の開口部は、１の注排出口と、複数の溶液分取口であり、
前記注排出口は、前記反応部におけるキャピラリの一端に位置し、
前記注排出口からは、該キャピラリの他端に向けて主流路が形成され、
前記主流路の末端からは、複数の分岐流路が形成され、
前記分岐流路の各末端には、前記溶液分取口が形成されていること、
を特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項４】
請求項２に記載のプローブ固相化反応アレイであって、
前記２以上の開口部は、１の注入口と、１の排出口と、複数の溶液分取口とであり、
前記注入口は、前記反応部におけるキャピラリの一端に位置し、
前記排出口は、前記反応部におけるキャピラリの他端に位置し、
前記注入口から前記排出口に向けて主流路が形成されており、
前記主流路には、複数の分岐流路が形成されており、かつ前記分岐流路は、前記主流路に固定化されたいずれのプローブよりも排出口側に形成されており、
前記分岐流路の各末端には、前記溶液分取口が形成されていること、
を特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項５】
請求項１に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記反応部は、ウェル形状であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記電極は、プローブ固定化位置に独立して設けられていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記反応部は、さらにヒータを具備することを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記アレイは、さらに伝熱層を具備することを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、該プローブが固定されたビーズにより間接的に支持体に固相化されているプローブ固相化反応アレイ。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記反応部には、反応部毎に１つのプローブが固定化されているプローブ固相化反応アレイ。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記反応部には、複数種類のプローブが固定化されているプローブ固相化反応アレイ。
【請求項１２】
プローブ固相化反応アレイにおいて核酸を分離回収するための方法であって、
１．  前記プローブ固相化反応アレイの反応部に被検試料を注入する工程と、
２．  前記被検試料に含まれる標的核酸を、プローブとハイブリダイゼーションさせる工程と、
３．  前記プローブにハイブリダイズしていない被検試料を除去する工程と、
４．  前記ハイブリダイズした核酸を検出する工程と、
５．  前記ハイブリダイズした核酸を解離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
前記工程１において、前記プローブ固相化反応アレイは、反応部毎に同一のプローブが固定化されたアレイであり、前記被検試料は、反応部毎に異なった被検試料であり、且つ該被検試料は、それぞれ異なった種類の標識物質で標識されており、各反応部に異なった被検試料を注入することと、
前記工程５において、前記工程４の検出の結果、被検試料間でハイブリダイゼーションに差が見出された核酸のみを解離して回収することと、
を特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
さらに、回収した核酸の塩基配列の決定を行うことを含む方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、前記核酸の解離は、電気化学的に解離される方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の方法であって、前記核酸の解離は、電気化学的に解離および加熱による解離である方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法であって、前記工程５において、各プローブ固定領域毎に独立して電圧をかけて、各プローブ毎に解離した標的核酸を回収することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プローブ固相化反応アレイによる核酸の分離回収法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の核酸分離回収法として、ディファレンシャルディスプレイ法のようなゲル上で泳動後、目的のバンドを切り出す手法や、サブトラクション法などが行われている。また、特許文献１に記載の方法では、複数種の核酸が固定化された基材を用いてハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズされた核酸のそれぞれを分離して、一体のままの基材から直接回収する方法が開示されている。
【０００３】
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、支持体に複数種の核酸が固定化されているため、ハイブリダイゼーション後にハイブリダイズした核酸を回収する際に、注意深く核酸固定化位置の同定を行う必要があり、チップ先端等で一つ一つの核酸をはぎ取るのは煩雑な操作である。またＤＮＡマイクロアレイ基板を使用した場合、ハイブリダイゼーション後には核酸がどの位置に固定化されているか目視できないため、核酸固定化位置の同定が難しく、目的以外の核酸を回収してしまう危険性もある。
【０００４】
また、特許文献２には、マイクロアレイを利用したポリヌクレオチド分離方法が開示されているが、この方法ではハイブリダイズしたターゲットを加熱することにより解離させているが、局所的に溶液を加熱しても溶液中に熱が伝播して周囲のプローブにハイブリダイズしているターゲットについても解離してしまう可能性がある。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−２５３２３８号公報
【０００６】
【特許文献２】
特開２０００−２７９１６９号公報
【０００７】
【特許文献３】
特表平１１−５０９４２３号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような状況に鑑み、本発明は、プローブアレイを使用して、効率よく且つ高精度で核酸の分離回収を行うことを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究の結果、従来キャピラリアレイは、核酸を検出することにのみ使用されるものであったが、解析後の核酸を回収するという大胆な発想に基づいて本発明を完成するに至った。具体的には、キャピラリ形状などの反応部を有するプローブ固相化反応アレイを使用して、固定化したプローブに核酸をハイブリダイゼーションさせるとともに、該ハイブリダイゼーションした核酸を解離することが可能なプローブ固相化反応アレイを開発し目的を達成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の一つの態様において、所望の核酸を分離回収するためのプローブ固相化反応アレイであって、
該プローブ固相化反応アレイは、プローブが支持体に固相化されたプローブ固相化反応アレイであり、
前記支持体は、該支持体に独立して形成された１または複数の反応部を備え、
前記支持体の各反応部は、２以上の開口部を有し、
前記反応部には、反応部毎に分離回収したい核酸とハイブリダイズ可能なプローブが固定化されており、
前記反応部は、電極を具備すること、
を特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１１】
また、上記プローブ固相化反応アレイであって、反応部は、キャピラリ形状であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１２】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、
前記２以上の開口部は、１の注排出口と、複数の溶液分取口であり、
前記注排出口は、前記反応部におけるキャピラリの一端に位置し、
前記注排出口からは、該キャピラリの他端に向けて主流路が形成され、
前記主流路の末端からは、複数の分岐流路が形成され、
前記分岐流路の各末端には、前記溶液分取口が形成されていること、
を特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１３】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、
前記２以上の開口部は、１の注入口と、１の排出口と、複数の溶液分取口とであり、
前記注入口は、前記反応部におけるキャピラリの一端に位置し、
前記排出口は、前記反応部におけるキャピラリの他端に位置し、
前記注入口から前記排出口に向けて主流路が形成されており、
前記主流路には、複数の分岐流路が形成されており、かつ前記分岐流路は、前記主流路に固定化されたいずれのプローブよりも排出口側に形成されており、
前記分岐流路の各末端には、前記溶液分取口が形成されていること、
を特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１４】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記反応部は、ウェル形状であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１５】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記電極は、プローブ固定化位置に独立して設けられていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１６】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記反応部は、さらにヒータを具備することを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１７】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記アレイは、さらに伝熱層を具備することを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１８】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、該プローブが固定されたビーズにより間接的に支持体に固相化されているプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１９】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記反応部には、反応部毎に１つのプローブが固定化されているプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００２０】
さらに、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記反応部には、複数種類のプローブが固定化されているプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００２１】
本発明の第二の態様において、プローブ固相化反応アレイにおいて核酸を分離回収するための方法であって、
１．  前記プローブ固相化反応アレイの反応部に被検試料を注入する工程と、
２．  前記被検試料に含まれる標的核酸を、プローブとハイブリダイゼーションさせる工程と、
３．  前記プローブにハイブリダイズしていない被検試料を除去する工程と、
４．  前記ハイブリダイズした核酸を検出する工程と、
５．  前記ハイブリダイズした核酸を解離して回収する工程と、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００２２】
また、上記方法であって、
前記工程１において、前記プローブ固相化反応アレイは、反応部毎に同一のプローブが固定化されたアレイであり、前記被検試料は、反応部毎に異なった被検試料であり、且つ該被検試料は、それぞれ異なった種類の標識物質で標識されており、各反応部に異なった被検試料を注入することと、
前記工程５において、前記工程４の検出の結果、被検試料間でハイブリダイゼーションに差が見出された核酸のみを解離して回収することと、
を特徴とする方法を提供する。
【００２３】
さらに、上記方法であって、
さらに、回収した核酸の塩基配列の決定を行うことを含む方法を提供する。
【００２４】
さらに、上記方法であって、前記核酸の解離は、電気化学的に解離される方法を提供する。
【００２５】
さらに、上記方法であって、前記核酸の解離は、加熱による方法を提供する。
【００２６】
さらに、上記方法であって、前記工程５において、各プローブ固定領域毎に独立して電圧をかけて、各プローブ毎に解離した標的核酸を回収することを特徴とする方法を提供する。
【００２７】
【発明の実施の形態】
ここで、本明細書において使用される「核酸」の語は天然に存在する種々のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ−オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体などを指す。
【００２８】
本明細書において使用される「標的核酸」の語は、プローブにより検出されるべき核酸をいう。一般的に、核酸プローブは、標的核酸に相補的な塩基配列を有するように設計される。被検試料に含まれる被検核酸が標的配列が有する塩基配列を有している場合には、核酸プローブと標的配列の間にハイブリダイゼーションが生じる。したがって、このハイブリダイゼーションを検出することにより被検試料に含まれる核酸を解析することが可能である。ハイブリダイゼーションの検出はそれ自身公知の手段により行ってよい。標的核酸の標的になる塩基配列を「標的配列」と称す。
【００２９】
本明細書において使用される「被検試料」の語は、生物個体から採取した細胞、組織、臓器、血液、血清、リンパ液、組織、毛髪および耳垢などの生物試料を所望に応じて調製した試料や、人工的に合成または製造した物質を含む試験に供したい試料をいう。また、「被検試料」は必要に応じて、生物試料をホモジネートおよび抽出などの必要な任意の前処理を行って得た試料であってもよい。このような前処理は、対象となる生物試料に応じて当業者によって選択され得るであろう。
【００３０】
本明細書において使用される「個体」の語は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む任意の哺乳動物、並びに植物および昆虫など哺乳動物以外の生物を示す。
【００３１】
以下、本発明のプローブ固相化反応アレイについて、反応部がキャピラリ形状のアレイを例にしてその一実施形態を説明する（図１）。
【００３２】
図１（Ａ）は、本発明のプローブ固相化反応アレイを上面から見た平面図である。プローブ固相化反応アレイ１は、シリコン基板８と透明なガラス製の基板９を用いて製造されたプローブ固相化反応アレイの例である。
【００３３】
プローブ固相化反応アレイ１の基板の内部には複数のキャピラリ２を含む３つのキャピラリが、同一平面上に並列して平行に形成されている。それぞれのキャピラリは互いに独立して形成されるので、他のキャピラリに含まれる流体と互いに混じり合うことはない。また、それぞれのキャピラリの両端には、開口部が形成されている。具体的には、キャピラリ２には、それぞれ試料注入口５と、試料排出口６が形成されている。キャピラリ２の内部には、ハイブリダイゼーションにより捕獲して回収したい核酸に応じて、適切なプローブ群３が固定されている。
【００３４】
このプローブ固相化反応アレイのように、複数の反応部を有するプローブ固相化反応アレイを使用することにより、独立したキャピラリ毎に異なる被検試料について反応を行うことが可能となり、同一基板上で複数の反応を行うことができる。
【００３５】
それぞれのキャピラリには、検出すべき標的核酸に特異的に結合する核酸をプローブとして固定化する。使用するプローブは、当業者であれば解析項目に応じて容易に選択することが可能であろう。また、このようなプローブは、当業者であれば容易に作成することができるであろう。たとえば、ＰＣＲ産物または合成オリゴヌクレオチドなどを使用することができる。
【００３６】
上述したとおり、一枚のプローブ固相化反応アレイに固定化されるプローブは、一種類に限定されず、解析項目に応じて、また、回収したい核酸に応じて、複数のプローブが固定化されていてもよい。この場合、一度に複数の核酸をハイブリダイズさせ、かつハイブリダイズした核酸を回収することが可能となり、効率化を図ることができる。たとえば、一枚のアレイにおいて、一個体に由来する種々の核酸配列についてハイブリダイゼーションおよび回収を行うことが可能となり、検体間で被検試料の取り扱いについてミスを減少することが可能となる。
【００３７】
たとえば図１において、キャピラリ２において一個体に由来する被検試料についてハイブリダイゼーションを行い、もう一つのキャピラリにおいて、他の個体に由来する被検試料についてハイブリダイゼーションを行い、残りのキャピラリを対照用としていずれの解析も行わないとすることもできる。
【００３８】
図１（Ｂ）は、本態様であるプローブ固相化反応アレイ１をキャピラリ２に沿って切断した断面図である。
【００３９】
上記のプローブ固相化反応アレイ１は、たとえば、次のように製造することが可能である。同じ大きさのシリコン基板とガラス基板を用意し、基板８と基板９とする。基板８にエッチングにより溝を形成する。また、基板８には、非電導部位４のパターンに応じて穴が空けられ、非伝導体を充填しておく。
【００４０】
一方、標的核酸に応じて所望のプローブを予め準備しておく。これらのプローブは、各反応部毎に各反応部の溝の底部に対してスポッティングすることによって固定すればよい。また、基板９には、基板８の溝の両端に対応する部分に対して貫通穴が空けられる。次に、基板８と基板９を接合する。それぞれの開口部に所望の長さのガラス管を接着することにより連結部５ａおよび６ｂを形成するとともに、キャピラリを形成する。キャピラリ形状の空間のサイズは、用途に合わせて種々の大きさに設定することができるが、実用的には幅が１０μｍ〜数ｍｍ、深さ１μｍ〜５００μｍ、長さ数ｍｍ〜１００ｍｍ、キャピラリ間隔１０μｍ〜数ｍｍ程度で充分である。ただし、反応の効率性を考えると、測定対象となるｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転換したｃＤＮＡなどの核酸の拡散速度は毎秒数μｍと遅いので、キャピラリ形状の空間の断面形状は、幅を広くしても深さは浅くするような扁平構造をとることにより、反応時間の短縮、試料の微量化、観察視野の増加等が期待できる。
【００４１】
上記の例では、基板８に溝を形成したが、基板９でもよいし基板８と基板９の両方に形成されていてもよい。また、支持体の材料として、蓋として用いる基板にはガラス製基板を使用し、溝を形成する基板にはシリコン基板を使用したが、これに限定されるものではなく、蓋として用いる基板にシリコン基板を使用してもよい。また、使用される２枚の基板を同じ材質としてもよい。だたし、プローブを固定化する基板は、たとえばシリコン基材などの伝導性の基材でなければならない。また、観察の方向に透過性部材が配置されるように、使用する部材を決定してもよい。あるいは、プラスチック樹脂やゴムなどで形成された支持体を使用してもよい。また、これらの材質、ガラス、シリコン、プラスチック樹脂およびゴムなどの材質で形成された支持体を組み合わせて使用してもよい。ただし、この場合もプローブ固定化部分は、伝導性の基材でなければならない。さらに、図では基板８に非伝導体を組み込んだが、逆に、非伝導性の材質からなる基板８のプローブ固相化部分に伝導性の材質を組み込んでもよい。また、非伝導体は基板８に組み込まれていなくてもよい。
【００４２】
また、上記の例では支持体として板状の基板を使用しているが、これに限定されるものではない。
【００４３】
ガラスやシリコンウエハ様の基板では、たとえば、フォトリソ−エッチングなどの技術により溝、非伝導体用の穴および貫通穴を形成することが可能である。また、プラスチック樹脂やゴムなどの場合には機械加工やモールド加工などにより溝、非伝導体用の穴および貫通穴を形成することが可能である。
【００４４】
プローブの固定手段は、それ自身公知の何れかの手段を使用してよい。たとえば、核酸プローブの固定化であれば、スポッティング法および光固相化法などを使用してよい。上記の例では、基板８の溝の底部にプローブを固定したが、基板９にそれを固定してもよく、また、各反応部の側面にそれを固定してもよい。基板には、プローブを固相化するために適切な表面処理、たとえば、ポリＬリジン処理、アミノシラン処理および酸化膜処理等の表面処理を行うことが可能である。
【００４５】
さらに、固定化するプローブは、あらかじめビーズに固定化されたプローブを使用してもよい。この場合、該プローブが固定化されたビーズを基板に固定化することとなる。使用するビーズは、たとえば、平均直径０．０５〜２００μｍのビーズを使用してもよく、好ましくは、０．１〜３０μｍのビーズである。また、使用するビーズの材質は、伝導性の材質である必要がある。
【００４６】
このようなビーズに所望の核酸プローブを固相するための手段は、基体の材料により、それ自身公知の何れかの手段を使用することができる。たとえば、公知の手段を、立体状基体または粒状基体の曲面、特に球面に適用し得るように改良することが可能である。たとえば、曲面体に加工を施した基体上に核酸プローブを配するためには、光固相方式および点着方式の２つの手法を適宜組み合わせて用いることによって曲面の部分領域に対して定量的に核酸プローブを固相することが可能となる。
【００４７】
上記ビーズを基板に固定化するには、たとえばそれ自体公知のいずれの手段を使用してもよい。特に、ビーズが磁性粒子であることが好ましく、あらかじめキャピラリ内の所望の位置に磁石を固定化しておくことにより、磁力でビーズを固定することも可能である。
【００４８】
またビーズ表面は、プローブを結合させた後、不活性化処理を行うことにより非特異的な結合を防止しておくことができる。この不活性化処理はサケ精子ＤＮＡ部分分解物、ランダムオリゴヌクレオチド、牛血清アルブミンなどで処理する方法や、未反応の官能基をエタノールアミンなどの公知の方法で処理することにより達成される。
【００４９】
また、図１では、１つのキャピラリに３つのスポットが存在する例を示した。しかしながら、１キャピラリに固相化されるスポット数はこれに限定されるものではない。被検試料に含まれる標的核酸の数に応じて、スポットの数は１または複数の任意の数でスポットしてもよい。したがって、キャピラリ毎に異なるスポット数としてもよい。また、プローブ固相化反応アレイに含まれる全てのキャピラリが複数種類のプローブを含んでいる必要はなく、また、何も固相化していない対照用のキャピラリを具備していてもよい。
【００５０】
次いで、２枚の基板の接合は、それ自身公知の手段により、プローブの固定前または固定後に行われればよい。たとえば、核酸プローブを固定前に接合した場合には、光固相化法（たとえば特表平６−５０４９９７参照）を適用して核酸プローブを固定化するのが好ましい。たとえば、シリコン−石英ガラスの場合には、接着剤をスクリーン印刷機により印刷して接着すればよい。たとえば、シリコン−パイレックスガラスの場合には、半導体プロセスで使用される陽極接合法により、高温および高電圧の下で接合を行えばよい。
【００５１】
また、本発明のプローブ固相化反応アレイは、電極を具備している。電極は、固定化したプローブにマイナスの電荷をかけるためのものである。したがって、上述のようにプローブが固定化される部分は伝導性であり、かつ該部分は、電極から電荷をかけることが可能なように構成されている必要がある。たとえば、図１（Ｂ）に示したように、伝導性基板のプローブ固相化部位の裏側に電極７が固定されていることが好ましい。電極は、アレイ底面を覆うものであってもよいが、プローブ固相化部位毎に独立した電極であることが好ましい。かかる構造によれば、プローブ毎に電極を制御することができる。しかし、この場合は、目的のプローブ固定化位置以外の部分に電気が伝わらないように基材に非伝導体を組み込んでおく必要がある（図１など）。このような構造により、回収したい領域にのみマイナスの電荷をかけることが可能となり、プローブ毎にハイブリダイズした核酸を分離することができる。
【００５２】
また、本発明のプローブ固相化反応アレイは、温度を制御できることが好ましい。温度の制御は、いずれの方法で行われてもよいが、たとえば図１のようにヒータ１０を具備することによって制御することができる。その他、アレイに伝熱部を具備することにより、外部から温度制御されてもよい。図１においては、１つのヒータ１０を使用して、アレイ全体の温度を制御する場合を示している。しかし、各反応部毎に独立したヒータを具備し、反応部毎に温度制御がなされてもよい。
【００５３】
また、本実施の形態では、電極およびヒータが本発明に従う反応アレイと別体である１例を示したが、電極、ヒータおよびセンサ並びに必要な配線等が反応アレイ内に組み込まれていてもよい。
【００５４】
上記キャピラリ形状のプローブ固相化反応アレイの他に、ＰＣＲ反応が可能なように容器形状の反応部を有し、試料注入口および試料排出口が作製された微量液体の反応装置（特許文献１に開示されている）にプローブを固定化したものも、本発明のプローブ固相化反応アレイとして使用することもできる。たとえば、該装置に電極を具備した構造であってもよい。
【００５５】
本発明に従うプローブ固相化反応アレイに具備される反応部は、その領域において、化学反応または生化学反応等の使用者が意図する反応および処理を行う領域をいう。したがって、上記形状の他、たとえば、反応部の形状は、底面が角型、円または楕円であるようなウェル形状であってもよい。また、反応部の底面と天井面の面積は、等しくても異なっていてもよい。ここで使用される「ウェル形状」とは、たとえば、キャピラリ形状のように反応部の底面および天井面が特定の方向へのみに広がりを示すような形態ではなく、底面や天井面を構成する二次元の何れの方向に対してもある程度同じような広がりを示すような形状で、かつ複数のプローブ固定部位がグループとして一括処理できる程度に分割された凹部もしくは多孔質部を有するものを指す（たとえば、特表平９−５０４８６４を参照）。
【００５６】
また、本発明のプローブ固相化反応アレイは、物理的に互いに隔離された反応部が形成されたデバイス構造の種々の構造が考えられる。図１に示した例では、プローブ固相化反応アレイ１に含まれる反応部を３つとし、反応部のそれぞれに試料注入口および／または試料排出口として使用できる１以上の開口部を形成したが、この数に限定されるものではなく、１以上の反応部を具備すればよい。すなわち、該反応部は、互いに独立していればよく、たとえば、凹部または凸部により仕切られた領域に開口部を有する蓋または底部を配置し、有効容積のある反応部を形成すればよい。
【００５７】
また、反応部の形状は、図１に示したような直線構造だけでなく、種々の構造を有していてもよい。たとえば図２に示すように、キャピラリ形状の反応部は、
１の注排出口と、複数の溶液分取口が形成され、
該注排出口は、キャピラリの一端に位置し、
該注排出口からは、該キャピラリの他端に向けて主流路が形成され、
該主流路の末端からは、複数の分岐流路が形成され、
該分岐流路の各末端には、溶液分取口が形成された形状であってもよい。図２のアレイでは、各分岐流路の分流圧、流量を一定にするために、同一の断面形状および長さを有していることが好ましい。ただし、図２では、流路形状が直線であるが、曲線であってもよい。図２では、直線状に放射して伸びる分岐流路であるため、小型である。また、各分取口は同一円周上に円弧状に配置されている。図中の波線から波線までの領域が反応領域である。電極は、この領域の底面に、プローブ固相化部位毎に独立して具備されることが好ましい。
【００５８】
図２のような形状のキャピラリアレイを使用した場合、注排口１５の一箇所から注入と排出が行われ、分取口１８は分取のみに用いられる。したがって、注排出と分離で流路を分担しているため、処理能力が大きくなり迅速な回収が可能となる。
【００５９】
また、たとえば図３に示すように、キャピラリ形状の反応部は、
１の注入口と、１の排出口と、複数の溶液分取口が形成され、
該注入口は、キャピラリの一端に位置し、
該排出口は、キャピラリの他端に位置し、
注入口から排出口に向けて主流路が形成されており、
該主流路には、複数の分岐流路が形成されており、かつ該分岐流路は、主流路に固定化されたいずれのプローブよりも排出口側に形成されており、
該分岐流路の各末端には、溶液分取口が形成された形状であってもよい。図３のアレイにおいても、図２のアレイと同様に、断面と長さが同一であることが好ましい。また、図３と同様に電極が具備されていることが好ましい。また、図３のアレイは、中央の排水用主流路とは別に、分取用の分岐流路が主流路の異なる位置に配置されている。これにより、分取のタイミングを分岐流路毎に単独で行うことも、複数同時におこなうこともできる。また、同時に２以上の分取口からも回収できる。
【００６０】
図４のような形状のキャピラリアレイを使用した場合、分岐流路が枝上に交互に分岐しているので、互いに誤って別の分岐流路に混入してコンタミネーションが生じるおそれを有効に防止することができる。
【００６１】
また、本発明の態様に従うと、基板内部に内腔よりなる反応部を形成した閉鎖系の反応アレイばかりではなく、互いに独立し、かつ任意の方向に並列して複数の反応部を支持体に備えたものであれば、単に凹部または凸部により仕切られた容器に対しても、または平面からなる特に仕切のない領域であっても、充分に離間しているかあるいは多数の垂直孔によって液の拡散が妨げられていることで、互いに独立していれば本発明の態様に使用することが可能である。このような装置およびその使用も本発明の範囲に含まれる。
【００６２】
また、本発明のプローブ固相化反応アレイは、特に自動化装置で使用可能な形態であることが好ましい。たとえば、特許２００２−０３４１９７に示されるような自動化装置を使用することができる。このような形態であれば、被検溶液等の注入から洗浄、回収までを自動で行うことができる。
【００６３】
本発明のプローブ固相化反応アレイを使用することにより、煩雑な操作を伴わずに該核酸の分離回収を行うことができるであろう。
【００６４】
以下、図４を参照して本発明のプローブ固相化反応アレイを使用して核酸の分離回収を行う方法を説明する。一例として、既知の配列のプローブを使用して、該プローブにハイブリダイズする核酸を分離回収する場合について説明する。
【００６５】
図４は、本発明のプローブ固相化反応アレイにおいて所望の核酸を分離回収するための方法の概略図である。図４には、図１のキャピラリ２を使用して核酸を分離回収した場合を示す。
【００６６】
まず、標的核酸を含む被検試料溶液を、注入口５から注入する。
【００６７】
使用する被検試料溶液は、ハイブリダイゼーション反応が可能な程度に精製された核酸を含む必要がある。たとえば、所望の組織または細胞からｔＲＮＡを抽出し、直接またはｍＲＮＡとして精製を行った後、以下に記載したような標識を行う。また、市販のキット等を使用して、ハイブリダイゼーション解析を行いたい個体から核酸を精製することができる。
【００６８】
上述したとおり、後の検出が可能となるように、標的核酸を含む被検試料に追跡可能な光学的または物理的標識が行われていることが望ましい。したがって、被検試料として上記のような追跡可能な標識分子、たとえば、蛍光色素、発光色素等で標識された核酸を使用することが考えられる。標的核酸を含む被検試料の標識は、たとえば、被検試料注の核酸をランダムプライマー等によるＰＣＲで増幅する際に、核酸の合成の際に蛍光標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＵＴＰ）を取り込みながら標識を行う方法、またはあらかじめ蛍光標識されたプライマーにより増幅を行って、標識物を導入する方法を使用することができる。その他にも、増幅後に色素を結合させる方法などを使用することができるが、これらに限定されない。使用可能な標識としては、Ｃｙ３、ＦＩＴＣおよびビオチン等であるが、これに限定されるものではない。また、ハイブリダイゼーションの検出方法として、ハイブリダイゼーション後の偏光性の変化を検出する方法を使用可能する場合等には、非標識のまま標的核酸を使用することもできる。
【００６９】
標的核酸として１種類の標的核酸だけでなく、２種類以上の標的核酸を混合させて行うことも可能である。この場合は、数種類の標識で標的核酸を標識してもよい。また、各反応部毎に標識の種類を変更して反応を行ってもよい。
【００７０】
次いで、被検試料に含まれる標的核酸をプローブにハイブリダイズさせる。
【００７１】
たとえば、図１のプローブ固相化反応アレイ１において、それぞれの反応部に固定化されたプローブに適した反応条件でハイブリダイゼーションが行われる。ハイブリダイゼーション条件は、たとえば、それぞれのキャピラリ毎に温度管理をしてもよい。また、ハイブリダイゼーション時に使用する反応液を調節すればよい。全ての反応部を一定の温度に維持してイオン濃度および塩濃度によって至適反応条件を得てもよい。
【００７２】
たとえば、核酸ハイブリダイゼーションを行う場合に、各反応部における至適濃度が異なっているときであっても、被検試料の溶液として使用する緩衝液等の塩濃度を反応部毎に調節することによって達成することが可能である。また、実際のハイブリダイゼーション反応において用いられる溶液の成分にＤＮＡの変性剤などが含まれる場合には、適宜、さらに塩濃度等を調整する必要がある。
【００７３】
一般に、ハイブリダイゼーション反応は、４５℃から６５℃前後の恒温状態で、１時間から一晩の間、標的核酸と核酸プローブとの反応が行われるが、検出するべき核酸等の条件に応じて反応条件を変更することが可能である。使用する適切な反応条件は、当業者であれば容易に選択可能であろう。
【００７４】
次いで、ハイブリダイズしていない被検試料溶液を除去する。たとえば、プレートウォッシャー等を用いて洗浄操作を行う。このような洗浄操作を施すことにより、未結合の標的核酸を除去される（図４上段）。この後、必要であれば、適切な塩濃度の洗浄液等で洗浄操作を行う。
【００７５】
ここで、ビーズを介してプローブを固定化した場合において、ビーズが磁性粒子であり、該ビーズが磁石によって固定化されているときは、ビーズを懸濁して洗浄することができる。たとえば、磁石をアレイから隔離してビーズを懸濁し、洗浄後は、磁石によって再度ビーズを固定化すればよい。
【００７６】
次いで、プローブとハイブリダイズした核酸を検出する。たとえば、各反応部ごとに、アレイ上に残った標識物質の有無または量を、標識物質の位置または標識物質の種類毎に分類しながら適宜の計測手段およびデータ処理手段によって決定することができる。特に、ハイブリダイゼーションは、支持体に含まれたままで観察され得ることが好ましい。たとえば、上述のように被検試料を視覚的に認識可能な標識（蛍光色素など）で標識しておくことにより、プローブと結合した標的物質の蛍光をそのまま視覚的に認識できるであろう。蛍光測定に限らず、電気化学的発光、発色反応、変更測定などによって検出してもよい。たとえば、非標識のまま標的核酸を使用した場合には、ハイブリダイゼーションの検出方法として、ハイブリダイゼーション後の偏光性の変化を検出する方法を使用することができる。
【００７７】
次いで、ハイブリダイズした核酸をプローブから解離させて、該核酸を回収する。プローブからの核酸の解離は、プローブをマイナスに荷電することによって行うことができる。
【００７８】
また、プローブを荷電することに加えて加熱することによっても解離させることができる。加熱してプローブのＴｍ近くの温度にしておくことにより、非特異的なハイブリダイゼーションを防止するとともに、荷電による核酸の解離が容易となる。たとえば、図１および図４に示したプローブ固相化反応アレイのように、電極が各プローブ固定領域毎に独立して具備されている場合は、各プローブ毎に荷電して標的核酸を解離させ、核酸を別々に回収することが可能である。たとえば、図４に示すように、排出口に最も近いプローブから順番にマイナスに荷電しながら洗浄液等を流し、解離した核酸を含む洗浄液等を排出口から回収してもよい。図４のように、排出口に最も近いプローブから順番に回収することにより、ハイブリダイズした核酸の上を他の核酸が通過することがなく、コンタミネーションを有効に防ぐことができる。
【００７９】
次に、本発明のプローブ固相化反応アレイを使用して、被検試料間で遺伝子発現頻度に差が見出された遺伝子を同定する方法について説明する。本方法は、あらかじめ多数のプローブＤＮＡの塩基配列を同定することなく、遺伝子発現頻度に差のあった遺伝子のみの同定を可能とする方法である。
【００８０】
まず、被検試料を作製する。たとえば、二種類の被検試料について遺伝子発現頻度を解析する場合、所望の組織または細胞から、およびコントロールとなる正常組織または細胞からｔＲＮＡを抽出し、直接またはｍＲＮＡに精製を行った後、上述したように被検試料を標識する。また、市販のキット等を使用して、核酸を精製することもできる。このとき異なる標識物質で標識を行っておく。
【００８１】
次いで、同一のプローブが固定化された別々の反応部に、それぞれの被検試料を注入する。
【００８２】
次いで、上述したようにプローブとハイブリダイゼーションさせて、ハイブリダイゼーションしていない被検試料を除去する。
【００８３】
その後、標識に基づいて両被検試料のハイブリダイズ量を測定する。両被検試料が異なる蛍光物質で標識されているのであれば、それぞれの蛍光物質に対応した２種類の蛍光波長において蛍光を測定する。
【００８４】
両被検試料間で発現量に差のあるプローブを選択するにあたり、使用した２種類の被検試料の濃度などを補正する必要がある。この補正は、たとえば、アクチン遺伝子などの恒常的に発現していると考えられるハウスキーピング遺伝子を使用して行うことができる。２種類の被検試料ＤＮＡの濃度、標識効率、色素の差異などから生じる違いを補正しておく。補正を行った後、ハイブリダイゼーション量に差のあったもののみを選択する。
【００８５】
次いで、上述したように、ハイブリダイゼーション反応により捉えられた被検試料ＤＮＡをプローブアレイから解離して回収する。得られた核酸は、エタノール沈殿法などを用いることにより回収することができる。また被検試料ＤＮＡにｐｏｌｙＡ配列がある場合は、たとえば相補的なｐｏｌｙＴ配列またはオリゴｄＴ配列を固相化したカラムやビーズ担体などを用いて回収することも可能である。
【００８６】
次いで、一分子技術を利用した方法により、またはクローニングを行った後で、塩基配列の決定を行う。
【００８７】
得られたターゲットＤＮＡは、様々な遺伝子断片が含まれると予想される。このため、複数回の塩基配列決定が必要になる。近年開発された一分子検出技術を使用いて、クローンニング操作を伴わずに迅速に配列決定を行うことも可能である。詳細は、特許第２５７５２７０「核酸の塩基配列決定法、単一分子検出方法、その装置及び試料の作成方法」を参照することができる。
【００８８】
また、塩基配列同定の方法として、回収された被検試料ＤＮＡを従来のクローニング技術を用いてクローン化後、従来の塩基配列決定技術を用いて配列を同定してもよい。複数のＤＮＡ断片について塩基配列決定を行い、逆転写ＰＣＲ法などの手法を用いて、発現頻度に違いがあることをさらに確認することが好ましい。
【００８９】
この手法の利点として、配列未知のプローブＤＮＡを用いることが出来るため、これまでに同定されていない遺伝子を同定することも可能である。また、回収後、クローン化したＤＮＡをその後の解析に用いることもできる。たとえば、回収されたＤＮＡがある遺伝子の一部分だった場合でも、ｃＤＮＡライブラリーを用いたコロニーハイブリダイゼーションを行うことにより、全長の配列を得ることも可能である。全長遺伝子が同定された場合には、大腸菌または酵母などの宿主細胞に遺伝子を発現させて、発現解析または機能解析などへ発展させることが可能である。
【００９０】
【発明の効果】
本発明のプローブ固相化反応アレイにより、多数のプローブに対してターゲット核酸を高速で回収でき、しかも検体および試料は微量で済む。これまでのＤＮＡマイクロアレイでは困難であった高精度な核酸分離回収を行うことが可能となる。  一方、本発明の方法は、比較を行いたい複数の被検試料間で発現量の差を検出し、目的のプローブのみを分離回収してその塩基配列を決定することができる。したがって、従来のハイブリダイゼーション方法とは異なり、アレイに固定するプローブとして、配列が未知のプローブを使用することができるため、未知遺伝子解析を非常に効率よく行うことが可能となる。
【００９１】
すなわち、従来の核酸プローブアレイでは、プローブとして使用する核酸配列が同定されている必要があったが、本発明では、たとえばショットガンシークエンスで得られたｃＤＮＡ断片をクローン化した後、塩基配列決定することなしに直接プローブアレイに固定化を行い解析をおこなうことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に係るプローブ固相化反応アレイを示す図。
【図２】本発明の一実施形態に係るプローブ固相化反応アレイを示す図。
【図３】本発明の一実施形態に係るプローブ固相化反応アレイを示す図。
【図４】本発明のプローブ固相化反応アレイを使用して核酸の分離回収を行う方法の概略図。
【符号の説明】
１          プローブ固相化反応アレイ
２，１２，２２  キャピラリ（反応部）
３，１３，２３  プローブ群
４，１４，２４  非伝導体
５，１５，２５  試料注入口
６，１５，２９  試料排出口
７          電極
８，９      基板
１０        ヒータ
５ａ、６ｂ    連結部
１６，２６    主流路
１７，２７    分岐流路
１８，２８    分取口
３０        標的核酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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