(57)【要約】【課題】共役脂肪酸のポリグリセリンエステル、および該共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステルを、煩雑な操作を必要とすることなく、温和な条件下で容易にかつ効率的に製造し得る技術を提供する。【解決手段】共役脂肪酸（共役リノール酸など）を含有する（好ましくは全脂肪酸中５０重量％以上）ポリグリセリンエステルリパーゼを触媒として用い、共役脂肪酸とポリグリセリンをエステル化反応に付すことを特徴とする、上記ポリグリセリンエステルの製造方法。反応終了液を分子蒸留に付することにより、モノエステル、ジエステルまたはトリエステルを分離精製することを特徴とする、上記ポリグリセリンエステルの精製方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
共役脂肪酸のポリグリセリンエステル。
【請求項２】
共役脂肪酸を全脂肪酸中５０重量％以上含有する、請求項１に記載のポリグリセリンエステル。
【請求項３】
共役脂肪酸が共役リノール酸である、請求項１または２に記載のポリグリセリンエステル。
【請求項４】
アルコール部分がジグリセリン以上のポリグリセリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリグリセリンエステル。
【請求項５】
ポリグリセリンのモノ、ジまたはトリ−アシルエステルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリグリセリンエステル。
【請求項６】
リパーゼを触媒として用い、共役脂肪酸とポリグリセリンをエステル化反応に付すことを特徴とする、請求項１に記載されたポリグリセリンエステルの製造方法。
【請求項７】
ポリグリセリンを共役脂肪酸に対して過剰量用いることにより、エステル化率およびモノエステル含量を高めることを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
反応開始時より反応液を減圧脱水することにより、エステル化率およびモノエステル含量を高めることを特徴とする、請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項９】
共役脂肪酸の１モル量に対してポリグリセリンを１〜２０モル量使用し、温度を２０℃〜７０℃に設定し、反応開始時から減圧下で脱水し、エステル化率が９０％以上に達するまで温度を維持することを特徴とする、請求項６〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
反応終了液を、遊離脂肪酸除去後に分子蒸留に付することにより、モノエステル、ジエステルまたはトリエステルを分離精製することを特徴とする、請求項１に記載されたポリグリセリンエステルの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共役脂肪酸のポリグリセリンエステル（もしくは共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステル）およびその製造方法に関し、更に詳細には、本発明は食品の乳化剤あるいは飲料用添加物等の用途に有用な共役脂肪酸ポリグリセリンエステル、および、リパーゼの存在下で共役脂肪酸とポリグリセリンを基質として、エステル化反応を利用して共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステルを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
共役リノール酸等の共役脂肪酸は抗ガン作用、体脂肪低減作用、動脈硬化抑制作用、抗アレルギー作用等の多彩な生理活性を有し、遊離脂肪酸の形態で健康食品として利用されているが、ポリグリセリンエステルの形態では利用されていない。非共役脂肪酸による通常の脂肪酸ポリグリセリンエステルは、食品、医薬品、化粧品の分野において乳化剤として広く使用されており、なかでもポリグリセリンモノエステルは最もよく用いられている。一般的に、通常の非共役脂肪酸のポリグリセリンエステルは、ポリグリセリンと脂肪酸を高温下でエステル化させるか、油脂（トリグリセリド）や脂肪酸メチル（あるいはエチル）とポリグリセリンを高温下でエステル交換させることによって製造されている。
【０００３】
しかし、不安定な共役リノール酸を含む共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステルの製造に従来の化学的方法を適用することはできず、本発明者らの知る限り共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステルに関してはその製造法を含めて報告されていない。
【０００４】
酵素反応を使用した非共役脂肪酸のポリグリセリンエステルの合成法については、特開平３−４３０９２号公報（特許文献１）や特公平５−５２１９１号公報（特許文献２）などの公報に記載がある。前者の公報はＣａｎｄｉｄａ属、Ｍｕｃｏｒ属由来リパーゼの存在下、脂肪酸とポリオール（ポリグリセリンを包含）との混合物に第２級および／または第３級アルコールを加えエステル化反応によりポリオール脂肪酸モノエステル（ポリグリセリンエステルを包含）を製造する方法を提案している。この方法を使用して共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステルを製造しようとした場合、反応後、残存する第２級および／または第３級アルコールや副生する低級アルコール脂肪酸エステルの除去が必要となる。また、後者の公報は、ポリアルコール（ポリグリセリンを包含）と脂肪酸またはそのエステルを、有機溶媒の存在下もしくは不存在下で微生物アルカリ性リパーゼを作用させ、ポリアルコール脂肪酸エステル（ポリグリセリンエステルを包含）を製造する方法を提案している。しかしながら、実施例には有機溶媒不存在下での例は記載されていない。有機溶媒を使用した場合も、脂肪酸の低級アルコールエステルとポリグリセリンとの間のポリグリセリン脂肪酸エステルおよびそれに伴う低級アルコールが副生されるためこれらの除去が必要となり、また、使用するリパーゼが微生物アルカリ性リパーゼに限定される。また、特公昭６３−１３６７７号公報（特許文献３）では、脂肪酸とポリグリセリンの混合物をリパーゼの存在下、９０％以上の水を含む反応系でインキュベートし、ポリグリセリン脂肪酸エステルを製造する方法を提案しているが、この方法を使用した場合でも、使用するリパーゼはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属、Ｃａｎｄｉｄａ属由来のリパーゼに限定され、エステル化率は低く６０％程度である。
さらに、特許公報第３２７６６９６号公報（特許文献４）では、油脂とポリグリセリンの混合物にリパーゼを作用させ、エステル交換反応によりポリグリセリンエステルを製造する方法を提案している。この方法を適用した場合には、反応液の混液中に共役脂肪酸のトリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドが混在するため、目的とする共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステル（例えばモノエステル）を得る場合には上記混合物から目的のエステルを精製しなければならない。
【０００５】
共役脂肪酸は前記のように多彩な生理活性を有し、遊離脂肪酸の形態で健康食品として利用されている。この共役脂肪酸について各種の食品、特にドリンク剤への添加物あるいは乳化剤としての利用用途を開くために、遊離脂肪酸に比べて強い乳化力を有し、ナノエマルションの作成に有効な脂肪酸ポリグリセリンエステルの形態としての供給が期待される。しかし、上述のように、共役脂肪酸は熱に対して不安定であるため、共役脂肪酸ポリグリセリンエステルの製造に、従来の化学法による非共役脂肪酸ポリグリセリンエステルの製造に使われている製造方法を応用することはできない。また、非共役脂肪酸ポリグリセリンエステルの製造に関してこれまでに提案されている酵素的方法は、有機溶剤存在下でのエステル化反応（特許文献１参照）、特定のリパーゼ（微生物アルカリ性リパーゼ）、および特定の微生物（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属、Ｃａｎｄｉｄａ  属）由来のリパーゼを触媒とし多量の水が存在する反応系でのエステル化反応（特許文献２および３参照）、および油脂（トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド）との混合物として共役脂肪酸ポリグリセリンエステルを得るエステル交換反応（特許文献４参照）の場合にのみ有効な方法である。
【０００６】
【特許文献１】
特開平３−４３０９２号公報（第（１）〜（１０）頁）
【特許文献２】
特公平５−５２１９１号公報（第（１）〜（２４）頁、第１図）
【特許文献３】
特公昭６３−１３６７７号公報（第（１）〜（３）頁）
【特許文献４】
特許公報第３２７６６９６号公報（第（１）〜（６）頁、図１）
【０００７】
本発明は、共役脂肪酸のポリグリセリンエステルを製造する技術、さらに具体的には、全てのリパーゼ（モノグリセリドリパーゼ、モノおよびジグリセリドリパーゼ、トリグリセリドリパーゼを包含する）を触媒として用いることが可能で、かつ、煩雑な操作を必要とすることなく、温和な条件下で容易にかつ効率的に共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステルを製造、分離し得る技術を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような技術的背景に鑑み、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、リパーゼを触媒としてエステル化を利用した反応系の構築に成功し、この知見を基に本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は下記のポリグリセリンエステル、その製造方法および精製方法を要旨とするものである。
【０００９】
共役脂肪酸のポリグリセリンエステル、好ましくは共役脂肪酸（例えば共役リノール酸など）を全脂肪酸中５０重量％以上含有する上記ポリグリセリンエステル。
リパーゼを触媒として用い、共役脂肪酸とポリグリセリンをエステル化反応に付することを特徴とする、上記共役脂肪酸ポリグリセリンエステルの製造方法。
上記製造方法の一つの態様において、ポリグリセリンを共役脂肪酸に対して過剰量使用するか、反応開始時より反応液を減圧脱水することによりエステル化率およびモノエステル含量を高めることを特徴とする、上記ポリグリセリンエステルの製造方法。
反応終了液を、遊離脂肪酸除去後に分子蒸留に付することにより、モノエステル、ジエステルまたはトリエステルを分離精製することを特徴とする、上記ポリグリセリンエステルの精製方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明によるポリグリセリンエステルは、共役脂肪酸のポリグリセリンエステルもしくは共役脂肪酸を含有するポリグリセリンエステルであることは上記したところであり、好ましくは共役脂肪酸を５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上（ポリグリセリンに結合した全脂肪酸中）含有するポリグリセリンエステルである。また、本発明のポリグリセリンエステルは遊離脂肪酸をほとんど含まない（５％以下）共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステルである。本発明の共役脂肪酸ポリグリセリンエステルは、脂肪酸の結合数によりモノ、ジまたはトリ−アシルエステルの形態があり得る。
本発明において、共役脂肪酸としては共役リノール酸、共役トリエン酸（特に共役リノレン酸）、共役ＥＰＡ、共役ＤＨＡ等が好ましい例として挙げられるが、共役リノール酸が代表例である。
なお、本明細書において％表示は特に断りのない限り、あるいは％表示のみで明確な場合（エステル化率など）を除き重量％を意味する。
【００１１】
上記のような共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステルは、前記のようにリパーゼを触媒として用い、共役脂肪酸とポリグリセリンの混合物を、エステル化反応に付すことにより製造することができる。
【００１２】
本発明の方法で用いる共役脂肪酸は、上記のような共役脂肪酸を含むものであればいずれの起源のものでも使用できるが、好ましくは共役脂肪酸を５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上（全脂肪酸中）含む遊離脂肪酸である。このような遊離脂肪酸の実用的な好ましい例としては、リノール酸を含む油（サフラワー油、ヒマワリ油等）をプロピレングリコールなどの溶媒の存在下でアルカリ共役化（例えば特開平１０−１３０１９９号公報）して製造したｃ９，ｔｌｌ−およびｔ１０，ｃ１２−共役リノール酸異性体をそれぞれ３０％以上含む遊離脂肪酸の混合物（例えばＣＬＡ−８０：リノール油脂社製）等があげられるが、微生物等（例えば乳酸菌）によって生産される共役リノール酸含有油脂から得られた脂肪酸の混合物であってもよい（例えば、乳酸菌を用いた米国特許第６，０６０，３０４号公報参照）。共役脂肪酸の含有率は、上記アルカリ共役化の共役化率を上げたり（反応温度の増加等）、脂肪酸含有量の高い原料（例えば市販の９８％リノール酸）を使用すること等により増加する。
また、油脂を原料とした場合において共役脂肪酸含量を更に高めるため、上記のような共役脂肪酸含有遊離脂肪酸について、分子蒸留後に尿素付加を行い飽和脂肪酸を除去する尿素付加法（例えばＪ．Ａｍ．Ｏｉｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ７９，  ３０３−３０８  （２００２）参照）、低温下で飽和脂肪酸を結晶化して除去する低温結晶法（例えばＬｉｐｉｄｓ，３４，９７９−９８７（１９９９））、酵素（リパーゼ）を用いた異性体選択的な反応を利用した方法（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６，  １２６５−１２６８（１９９９））等の手段またはそれらの組合せにより所望に精製して共役脂肪酸（共役リノール酸等）含有率あるいはいずれかの共役脂肪酸異性体含有率を高めた遊離脂肪酸を得ることができる。例えば、尿素付加法を採用すると飽和脂肪酸とモノエン酸を除去することができ、共役リノール酸の含量を６７％から８０％程度まで高めることができる。また酵素（リパーゼ）法と尿素付加法を組合せるとｃ９，ｔ１１−共役リノール酸およびｔ１０，ｃ１２−共役リノール酸の含量を８０％あるいはそれ以上に高めることもできる。この共役脂肪酸の含有率は上記の方法における精製の程度を適宜調節することにより共役脂肪酸異性体の含有率を所望の割合に調節することができる。後記の実験例１〜３には、高純度の脂肪酸を原料とした共役リノール酸異性体の分離法が示されており、分離した異性体を原料とすることもできる。
上記のような方法により得られる共役脂肪酸含有遊離脂肪酸中の共役脂肪酸は、一般に１０〜９８％程度であり、残りの成分は飽和脂肪酸および未共役脂肪酸である。このようにして得られる共役脂肪酸を使用すれば、本発明の共役脂肪酸ポリグリセリンエステル、好ましくは最終的に共役脂肪酸含量の高い、あるいは目的とする共役脂肪酸異性体含量の高いポリグリセリンエステルを得ることができる。
【００１３】
触媒として使用するリパーゼは、グリセリド類を基質として認識する酵素であれば粗製、部分精製、精製のいずれのものでもよく、モノグリセリドリパーゼ、モノおよびジグリセリドリパーゼ（以下モノ／ジグリセリドリパーゼともいう）、トリグリセリドリパーゼも包含する。本発明においては、上記のいずれの型のリパーゼを触媒として用いても効率よくエステル化反応が進行する。リパーゼの種類は限定されないが、特に、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属等の微生物が生産する酵素や、豚膵臓由来の酵素が食品用ポリグリセリンエステルを製造するという観点から好ましい。これらの酵素は油脂の分解、合成等において一般的に使用されており、市販品として容易に入手可能である。本発明において、モノエステルを優先的に製造したいときにはモノグリセリドリパーゼ（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属由来）やモノおよびジグリセリドリパーゼ（例えばＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属由来）が有効であり、モノエステルとジエステルを優先的に製造したいときにはモノおよびジグリセリドリパーゼ（例えばＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属由来）や１，３−位特異的リパーゼ（例えばＲｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来など）が有効であり、またモノエステル、ジエステルに加えてトリエステルも製造したいときには位置特異性を持たないリパーゼ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属など）が有効である。これらの酵素を使用して最終的に得られる各エステルの割合は、モノおよびジグリセリドリパーゼ（以後、モノ／ジグリセリドリパーゼともいう）あるいはモノグリセリドリパーゼを用いた場合トリエステルは合成されずモノエステル含量をジエステル含量の約２倍まで高めることができる。１，３−位特異的リパーゼを用いた場合、モノエステルとジエステルがほぼ等量合成され、トリエステルもわずか（１〜５％程度）合成される。また、位置特異性において非特異的なリパーゼを用いるとモノ、ジ、トリエステルの混合物を合成することができる。種々のリパーゼ酵素によるエステル化反応の具体例は後記実施例に記載されている。
酵素は遊離型のまま、あるいはイオン交換樹脂、多孔性樹脂、セラミックス、炭酸カルシウム等の担体に固定して使用してもよい。遊離型酵素を使用するときは、一旦酵素を水に溶かし、酵素水溶液を所定の酵素量になるように反応混液（共役脂肪酸とポリグリセリン）中に添加するのが好ましく、このとき酵素剤はできるだけ少ない量の水で溶かしたほうがよい。また、固定化酵素を使用するときには反応液に水を加える必要はない。
【００１４】
使用する酵素としてのリパーゼの量は、反応時間や反応温度などの反応条件により決定されるため特に規定されないが、一般的には反応混液１ｇ当たり１単位（Ｕ）〜１００００Ｕ、好ましくは５Ｕ〜２０００Ｕ、より好ましくは２０〜１０００Ｕ添加すればよく、適宜設定することができる。ここでリパーゼ（トリグリセリドリパーゼ）１Ｕとは、オリーブ油の加水分解反応において１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量であり、モノグリセリドリパーゼ、モノ／ジグリセリドリパーゼ１Ｕとは、モノオレインの加水分解反応において１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量である。
【００１５】
反応系に加えるポリグリセリンの種類は、ジグリセリン以上であればいずれの重合度のポリグリセリンも使用することができるが、好ましくはジ〜デカグリセリン、より好ましくはジ〜ペンタグリセリンである。
ポリグリセリンの量は反応上重要な因子の一つであり、特にエステル化率とポリグリセリンエステル画分のモノエステル含量に影響を与える。ポリグリセリン量は、通常共役脂肪酸１モル量に対して１〜２０モル量、好ましくは２〜１０モル量を用いる。ポリグリセリンを過剰量使用することにより、エステル化率あるいは得られるポリグリセリンエステル中のモノエステル含量を高めることができる。ポリグリセリンの過剰量とは、共役脂肪酸１モル量に対して１モル量を超える量、好ましくは２モル以上の量、より好ましくは２〜１０モル量程度である。
【００１６】
本発明において、エステル化の反応温度は通常１０〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃程度である。また、反応時間はエステル化率等により変化するが、例えば好ましいエステル化率（９０％以上）を達成するためには通常０．５〜１２０時間、好ましくは２〜７２時間程度である。また、エステル化率は通常５０〜９９％程度であり、好ましくは７０〜９９％、より好ましくは９０〜９９％程度である。
【００１７】
反応系に存在する酵素溶液由来の水とエステル化反応によって生成してくる水は、エステル化反応に大きな影響を及ぼす。この場合の反応において、反応開始時点より真空ポンプ等を用いて減圧脱水（通常、減圧後の絶対圧力０．５〜５ｍｍＨｇ程度の真空下）を行うことにより９０％以上のエステル化率に達するまでの時間を短縮（１０〜２４時間程度まで）することができると共に、より高いエステル化率（例えば約９５％）を得ることもできる。
本発明において、ポリグリセリン量および減圧脱水を考慮した好ましい態様は、共役脂肪酸の１モル量に対してポリグリセリンを１〜２０モル量、好ましくは２〜１０モル量使用し、温度を１０℃〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃程度に設定し、反応開始時から減圧下で脱水し、エステル化率が９０％以上に達するまで温度を維持する方法である。
【００１８】
エステル化反応後、通常反応液を遠心分離し（通常５０００〜１００００×ｇ）、油層を回収して共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステル生成物を得る。
上記のようなエステル化反応により得られる共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステル生成物は、使用されたリパーゼ等により前述のようにモノエステルを主体とするもの（例えば全エステル中、モノエステル：ジエステル：トリエステル＝５５〜７０：２５〜４５：０〜５）、モノ／ジエステルを主体とするもの（例えば全エステル中、モノエステル：ジエステル：トリエステル＝２０〜４０：４０〜６０：５〜１５）、モノ、ジ、トリエステルを含むもの（例えば全エステル中、モノエステル：ジエステル：トリエステル＝２０〜３５：３０〜６０：２０〜３５）が得られる。上記エステル生成物中のエステル体は通常５０〜９９％、好ましくは７０〜９９％、より好ましくは９０〜９９％、残りは遊離脂肪酸である。
反応後、所望により反応液（上記共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステル生成物）からエステル体を精製するには、合目的的な任意の方法を採用することができるが、例えばアルカリ中和による通常の脱酸、ｎ−へキサン、アセトン、低級アルコール（エタノール、メタノール等）中でのアルカリ脱酸、膜分離、蒸留、イオン交換クロマトグラフィー等の方法あるいはその組み合わせにより、遊離脂肪酸を除去してエステル体を純度よく精製（通常９０〜１００％）することができる。更にモノ、ジ、トリ−アシルエステル体を相互に分離、精製するには、分子蒸留法を組み合わせた方法が特に効果的であり、具体的には、例えば反応液を１８０〜２２０℃、０．００１〜０．５ｍｍＨｇの条件で分子蒸留に付し、未反応の遊離脂肪酸を留分として除去した後、２００〜２５０℃、０．００１〜０．１ｍｍＨｇの条件でモノエステルを蒸留、留出させ、さらに２５０〜２８０℃、０．００１〜０．０２ｍｍＨｇの条件でジエステルを蒸留、留出させることにより精製したモノエステル（通常全エステル中６０〜１００％、好ましくは８０〜１００％）、ジエステル（通常全エステル中６０〜１００％、好ましくは８０〜１００％）、トリエステル（通常全エステル中４０〜８０％、好ましくは６０〜８０％）をそれぞれ高純度で得ることができる。さらに具体的な方法については後記実施例に記載されている。
【００１９】
本発明の実施例において、反応液中に含まれている成分の分析は、反応液を遠心分離（９０００×ｇ，１０分）し、得られた油層中の成分を分析した。油層中の遊離脂肪酸量は原料として用いたＣＬＡ−８０の酸価（１９９．７ｍｇ  ＫＯＨ／ｇ）に対する油層の酸価の割合から算出した。ポリグリセリンエステルの含量は、Ｕｌｔｒａｓｔｙｒａｇｅｌ  ５００Å（７．８×３００ｍｍ；ｗａｔｅｒｓ）とＴＳＫｇｅｌ  Ｇ１０００ＨＨＲ（７．８×３００ｍｍ；東ソー）を連結し、テトラヒロドフランを移動相とする高速液体クロマトグラフィーにより分析した。
特に記載しない限り、エステル化率は反応系中に含まれている全脂肪酸量のモル含量に対するポリグリセリンエステル中に含まれている脂肪酸のモル含量の割合（パーセント）で表示した。エステル中の脂肪酸組成は構成脂肪酸をメチルエステル化し、ＤＢ−２３キャピラリーカラム（０．２５ｍｍ×３０ｍ）を装着したガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００２０】
上記のような本発明方法、特に分子蒸留を用いた精製法により得られた共役脂肪酸ポリグリセリンエステルは、一般に遊離脂肪酸が５％以下、すなわち目的のポリグリセリンエステル含量が９５％以上のものである。また、ポリグリセリンエステル中の共役脂肪酸は、結合全脂肪酸中好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上であり、エステル化反応における共役脂肪酸含有遊離脂肪酸として共役脂肪酸含量の高いものを使用すれば、共役脂肪酸含量が９５％以上の共役脂肪酸高含有ポリグリセリンエステルを得ることも可能である。
【００２１】
【実施例】
［実施例１］各種の酵素によるＣＬＡとジグリセリンのエステル化
共役リノール酸を含む遊離脂肪酸の混合物は、リノール油脂（株）の製品ＣＬＡ−８０（９ｃ，１１ｔ−ＣＬＡ，３３．１％；１０ｔ，１１ｃ−ＣＬＡ，  ３３．９％；９ｃ，１１ｃ−ＣＬＡ，０．９％；１０ｃ，１２ｃ−ＣＬＡ，１．４％；その他のＣＬＡ，１．８％、その他の成分（パルミチン酸５．３％、ステアリン酸２．３％、オレイン酸１６．７％）を用いた。ＣＬＡ−８０と遊離脂肪酸量に対して０．５〜１０モル量のジグリセリンの混液９．８ｇに１００００Ｕ／ｍｌになるように溶かした各種リパーゼ［Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉリパーゼ（リパーゼＧ），天野エンザイム；Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ（リパーゼＯＦ），名糖産業；Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．リパーゼ（リパーゼＱＬＭ），名糖産業；Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒリパーゼ（タリパーゼ），田辺製薬］の水溶液を０．２ｍ１加え、３０℃で４８時間攪拌しながらインキュベートした。なお、Ｃ．ｒｕｇｏｓａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．、Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒのリパーゼ１単位（Ｕ）とは、オリーブ油を基質とした加水分解反応において１分間に１μｍｏｌｅの脂肪酸を遊離させる酵素量である。また、Ｐ．  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉリパーゼ１Ｕとは、モノオレインの加水分解反応において１分間に１μｍｏｌｅの脂肪酸を遊離させる酵素量である。
反応後、反応液を遠心分離（９０００×ｇ、１０分）して回収した油層中の成分とエステル化率を表１に示す。どのリパーゼを触媒として用いても、５０％あるいはそれ以上の脂肪酸（ＣＬＡ）が効率よくジグリセリンとエステル化することが分かった。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．、Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ、Ｐ．  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉのリパーゼを触媒としたとき、ジグリセリン量の増加と共にエステル化率が上昇したのに対し、Ｃ．  ｒｕｇｏｓａのリパーゼを触媒としたときにはジグリセリン量の増加と共にエステル化率は減少した。これより、Ｃ．  ｒｕｇｏｓａリパーゼは過剰量のジグリセリンによって阻害されることが示唆された。
酵素は反応産物であるエステル体の種類に大きな影響を与える。モノおよびジエステルを効率よく製造したいときには、モノグリセリドとジグリセリドを基質として認識し、トリグリセリドを認識しないＰ．  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉのリパーゼが有効である。また、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．やＲ．ｄｅｌｅｍａｒのリパーゼを用いてエステル化率を高めるとトリエステルを合成することもできる。
【表１】
2004331607.tif 000002
（ｎｄ：検出されず）
【００２２】
［実施例２］Ｐ．  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉリパーゼによるＣＬＡとトリグリセリンエステル化
ＣＬＡ−８０とトリグリセリン（Ｆｌｕｋａ社製）をモル比で１：１あるいは１：３になるように混合した。このＣＬＡ／トリグリセリン混液９．８ｇに１００００Ｕ／ｍｌのＰ．  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉリパーゼ０．２ｍｌを加え、３０℃で４８時間攪拌しながらインキュベートした。反応後、反応液を遠心分離して回収した油層中の成分とエステル化率を表２に示す。実施例１と同様、トリグリセリン量を多くするとエステル化率の上昇が認められ、脂肪酸量に対して３モル量のトリグリセリンを用いると、４８時間後のエステル化率は７４％まで上昇した。また、モノおよびジグリセリドリパーゼである本酵素を用いると、トリグリセリンを基質として用いてもモノエステルとジエステルしか合成されなかった。
【表２】
2004331607.tif 000003
【００２３】
［実施例３］Ｐ．  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉリパーゼによるべンタおよびオクタグリセリンのエステル化
モノおよびジグリセリドリパーゼであるＰ．  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉリパーゼを触媒として用い、ポリグリセリン［Ｋ−ＣＯＬ−ＩＶ５００（平均重合度５．５）およびＫ−ＣＯＬ−ＩＶ７５０（平均重合度８）；鹿島ケミカル］とＣＬＡのエステル化反応を行った。ＣＬＡ−８０と脂肪酸量に対して１または３モル量のポリグリセリンからなる混液４．９ｇに１００００Ｕ／ｍｌのＰ．  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉリパーゼを０．１ｍｌ加え、３０℃で攪拌しながら反応を行った。反応後、反応液を遠心分離して回収した油層のエステル化率を表３に示す。エステル化率は、反応前後の反応液の酸価を測定し、反応によって消費された脂肪酸量から算出した。基質として用いたポリグリセリンの重合度が大きくなる程、エステル化の効率は低下したが、ポリグリセリン量を増やすことによりエステル化率は上昇した。これより、重合度の高いポリグリセリンとＣＬＡのエステルも酵素を触媒としたエステル化反応によって合成できることが分かった。
【表３】
2004331607.tif 000004
【００２４】
［実施例４］ポリグリセリンエステルの合成におよぼす脱水の影響
ＣＬＡ−８０／ジグリセリン（１：２，ｍｏｌ／ｍｏｌ）混液２９４ｇと１００００Ｕ／ｍｌのＰ．  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉリパーゼ６ｍｌを１Ｌ容量の三ツロフラスコに入れ、３０℃，５ｍｍＨｇ（６６７Ｐａ）の減圧下、２００ｒｐｍで攪拌しながらエステル化反応を行った。反応経過に伴うエステル化率と反応液中の脂肪酸、モノエステル、ジエステルの含量を表４に示す。反応時間の経過と共にエステル化率は上昇し、反応は２４時間でほぼ平衡に達した（４８時間後のエステル化率，９４．２％）。また、４８時間後の反応液中のポリグリセンエステル組成は、モノエステルが６０％でジェステルが３６％であった（モノエステル／ジエステルの比は１．６９）。同じ反応液組成で脱水せずに反応を行ったとき、４８時間後のエステル化率は７０．２％であり、モノエステル／ジエステルの比は０．７６であった（実施例１、表１）。これらの結果は、エステル化率を高めるためには減圧下での脱水反応が有効であることを示している。また、脱水条件下で反応を行うとモノエステルからジエステルヘの変換反応が抑えられることも分かった。従って、モノエステルを優先的に合成したいときには脱水条件下でのエステル化反応が有効である。
【表４】
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【００２５】
［実施例５］酵素反応液からジグリセリンのモノおよびジエステルの分子蒸留による精製
実施例４の条件下で４８時間のエステル化を２回行い、５６１ｇの反応液を得た（エステル化率９４．２％）。この反応液からジグリセリンのモノおよびジエステルを精製する工程および各工程における物質収支を表５に示す。まず、反応液を遠心分離（９０００×ｇ，  ２０分）して上清を回収した（収量，３６５ｇ）。上清画分を９０℃，  ３ｍｍＨｇ  （４００Ｐａ）で脱水後、セライトを１％加えて濾過した。得られた濾液を分子蒸留機（神鋼パンテック（株）、Ｗｉｐｒｅｎｅ  ｔｙｐｅ  ２−０３）に負荷し、モノエステルとジエステルの精製を試みた。まず、遊離脂肪酸を除去するために２００℃，０．２ｍｍＨｇ（２．７Ｐａ）で蒸留し、５８ｇの留分１と２４４ｇの残渣１を得た。得られた残渣１の酸価は０．７ｍｇ  ＫＯＨ／ｇであった。次いでモノエステルとジエステルを分画するために、２５０℃，０．０２ｍｍＨｇ（２．７Ｐａ）で蒸留し、１２９ｇの留分２と１０５ｇの残渣２を得た）。留分２はモノエステル画分でその純度は９８．１％であり、残渣２中のジエステルの含量は９３．８％であった。これより、遊離脂肪酸の除去およびモノエステルとジェステルの分画に分子蒸留が有効であると結論した。
分画・精製したモノエステル（留分２）とジエステル（残渣２）の構成脂肪酸を分析し、主な脂肪酸の組成を表６に示す。合成したモノエステルおよびジエステルの構成脂肪酸の組成は、原料として用いたＣＬＡ−８０の脂肪酸組成とほとんど同じであった。これより、Ｐ．  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉリパーゼはＣＬＡの種々の異性体を同じように認識する酵素であることが分かった。
【表５】
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【表６】
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表中の数字は重量％を示す。
【００２６】
［実験例１］高純度共役リノール酸の調製（ＣＬＡ異性体の分離）
リノール酸（純度９８％，東京化成工業（株）製）を原料とし、プロピレングリコールを使用し、常法に従いアルカリ共役化反応を行った（特許第３０１７１０８号公報参照）。得られたＣＬＡは９ｃｉｓ，１１ｔｒａｎｓ−ＣＬＡを４５．１重量％、１０ｔｒａｎｓ，１２ｃｉｓ−ＣＬＡを４６．８重量％包含するＣＬＡ異性体混合物である。まず第１段階の精製として、９ｃｉｓ，１１ｔｒａｎｓ−ＣＬＡと１０ｔｒａｎｓ，１２ｃｉｓ−ＣＬＡの分離を行った。２Ｌの反応容器に、９ｃｉｓ，１１ｔｒａｎｓ−ＣＬＡを４５．１重量％、１０ｔｒａｎｓ，１２ｃｉｓ−ＣＬＡを４６．８重量％包含するＣＬＡ異性体混合物１，０００ｇと、ラウリルアルコール６６４ｇとの混合物（１：１ｍｏｌ／ｍｏｌ）にＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼを２０Ｕ／ｇ混合液の濃度で加え、３０℃、１６時間の条件で選択的エステル交換を行った。この混合物を、常法に従い分子蒸留を行うことで、５１６ｇの遊離脂肪酸画分（１０ｔｒａｎｓ，１２ｃｉｓ−ＣＬＡを７８．１重量％包含する）と、７５１ｇのラウリルエステル画分（９ｃｉｓ，１１ｔｒａｎｓ−ＣＬＡを８５．１重量％包含する）を得た。
【００２７】
［実験例２］高純度共役リノール酸の調製（１０ｔｒａｎｓ，１２ｃｉｓ−ＣＬＡ  の精製）
実験例１で得た遊離脂肪酸画分５１０ｇと、ラウリルアルコールとの混合物２３５ｇ（１：１ｍｏｌ／ｍｏｌ）にＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼを３０Ｕ／ｇ混合液の濃度で加え、３０℃、１６時間の条件で選択的エステル交換を行い、常法に従い、分子蒸留を行うことで、遊離脂肪酸とラウリルエステル画分を得た（留出分の脂肪酸組成に１０ｔｒａｎｓ，１２ｃｉｓ−ＣＬＡを８６．３重量％包含する）。得られた分子蒸留留出画分を常法に従い、エタノール溶液中で尿素付加を行い、徐冷ろ過を行うことで、９５．７重量％の１０ｔｒａｎｓ，１２ｃｉｓ−ＣＬＡを得た。
【００２８】
［実験例３］高純度共役リノール酸の調製（９ｃｉｓ，１１ｔｒａｎｓ−ＣＬＡ  の精製）
実験例１で得たラウリルエステル画分を、常法に従いＮａＯＨのアルカリ存在下で加水分解を行った。得られた遊離脂肪酸画分とラウリルアルコールとの混合物（１：１ｍｏｌ／ｍｏｌ）７６０ｇに、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ由来のリパーゼを１０Ｕ／ｇ混合液の濃度で加え、３０℃、１６時間の条件で選択的エステル交換を行い、７１７ｇの油層を得た。反応物は常法に従い分子蒸留を行うことで、ラウリルエステル画分を回収し、常法に従いアルカリ存在下で加水分解を行い、９ｃｉｓ，１１ｔｒａｎｓ−ＣＬＡ９２．２重量％を１５９ｇ得た。
【００２９】
【発明の効果】
上述してきたように、本発明によれば、食品の乳化剤あるいは飲料用添加物等の用途に有用な共役脂肪酸ポリグリセリンエステルを提供することができる。
本発明は、全てのリパーゼ（モノグリセリドリパーゼ、モノおよびジグリセリドリパーゼ、トリグリセリドリパーゼを包含する）を触媒として用いることが可能で、かつ、煩雑な操作を必要とすることなく、温和な条件下で容易にかつ効率的に共役脂肪酸含有ポリグリセリンエステルを製造することができる。