(57)【要約】【課題】アセトアルデヒドを反応基質とする前進性反応で、アマドリ転位反応以降の反応産物の存在は確認されておらず、製造法も不明である。該産物は、前進性反応産物の引き起こす各種疾病の病因解明、診断、治療に必要とされるものである。【解決手段】生体内に存在する有機化合物とアルデヒド基を有する全炭素数２以下の低分子アルデヒドを混合する反応系により得られ、且つ、アマドリ転位反応以降の反応産物であることを特徴とする低分子アルデヒド由来前進性反応産物、該前進性反応産物に対する抗体およびそれらの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来の有機化合物とアルデヒド基を有する全炭素数２以下の低分子アルデヒドを混合する反応系により得られ、且つ、アマドリ転位反応以降の反応産物であることを特徴とする低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項２】
前記反応系にＤＴＰＡ（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）をさらに混合することにより得られることを特徴とする請求項１に記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項３】
前記反応系の反応温度が１０℃〜９０℃の範囲であることを特徴とする請求項１または２に記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項４】
前記反応系のｐＨが２〜１２の範囲であることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項５】
前記反応系の反応時間が１時間以上であることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項６】
前記低分子アルデヒドの濃度が１ｎＭ〜１０Ｍの範囲であることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項７】
前記有機化合物が１つ以上の塩基性官能基を持つことを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項８】
前記塩基性官能基がアミノ酸由来であることを特徴とする請求項７に記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項９】
前記反応産物の物性が、以下のａ）〜ｅ）のいずれかの性質を１つ以上含むことを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
ａ）蛍光性
ｂ）着色（褐色）性
ｃ）架橋反応性
ｄ）生物反応性
ｅ）ＲＡＧＥ非結合性
【請求項１０】
前記反応産物が、Ｎ−エチルリジン構造体でないことを特徴とする請求項１〜９の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項１１】
神経細胞の細胞死を誘導できることを特徴とする請求項１〜１０の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項１２】
単球由来細胞の炎症反応を誘起しないことを特徴とする請求項１〜１１の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項１３】
低分子アルデヒドがアセトアルデヒドであることを特徴とする請求項１〜１２の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物を用いることを特徴とした低分子アルデヒド由来前進性反応産物を認識する抗体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の製造方法で製造された低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体。
【請求項１７】
以下の構造体と反応しないことを特徴とする請求項１５または１６に記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体。
ａ）Ｎ−カルボキシメチルリジン構造体
ｂ）Ｎ−カルボキシエチルリジン構造体
ｃ）Ｎ−エチルリジン構造体
【請求項１８】
体液由来試料中の低分子アルデヒド由来前進性反応産物の検出に用いられることを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体。
【請求項１９】
低分子アルデヒド由来前進性反応産物の生物反応を中和することができる請求項１５〜１８のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物に反応し、下記ａ）〜ｃ）の各構造体に反応しない抗体の製造方法であって、下記のａ）〜ｃ）の各構造体に反応する抗体を除去する工程を含むことを特徴とする低分子アルデヒド由来前進性反応産物を認識する抗体の製造方法。
ａ）Ｎ−カルボキシメチルリジン構造体
ｂ）Ｎ−カルボキシエチルリジン構造体
ｃ）Ｎ−エチルリジン構造体
【請求項２１】
請求項１５〜１８のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体を用いてアルコール性障害を判定する方法。
【請求項２２】
請求項１５〜１８のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体と結合する分子量１５０〜２５０ｋＤの物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内に存在する有機化合物とアルデヒド基を有する全炭素数２以下の低分子アルデヒドを混合する反応系により得られ、且つ、アマドリ転位反応以降の反応産物であることを特徴とする低分子アルデヒド由来前進性反応産物であり、該低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体の製造方法、並びに、該抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体内に存在する有機化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、糖及び多糖、ビタミン、及びこれら有機化合物の複合体の一部が、慢性的な環境の影響や経時的に劣化、蓄積することで、慢性的且つ難治性の疾患を引き起こす原因となることが指摘されている。特に、食品学に於ける複雑な前進性反応の総称として知られるメイラード反応は有名であり、このメイラード反応の最終産物（ＡＧＥ；ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）が糖尿病合併症と言った慢性且つ難治性の疾患に関わる可能性が指摘されるようになり、医学の分野でも注目されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
特に最近になって、これまで注目されていた反応基質をグルコースと考えるＡＧＥ（狭義のＡＧＥ）よりも、寧ろ、グルコースよりも炭素数が少ない反応基質から得られるＡＧＥ（広義のＡＧＥ、ｍａｉｌｌａｒｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）の方が、生成が遙かに短い時間で起こり（例えば、非特許文献２参照。）、従来の狭義のＡＧＥよりも強力な細胞反応性が引き出されることも判明してきた（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００４】
上記背景から、従来の知見からは因果関係が明瞭でなかった長期大量飲酒者やアルコール依存者に高頻度に見られるアルコール性脳障害や肝障害の発症原因として、これら患者の体内で代謝発生するアセトアルデヒドなどの低分子アルデヒドを反応基質とする広義のＡＧＥ（低分子アルデヒド由来前進性反応産物、ＡＡ−ＡＧＥ）が、慢性且つ難治性の疾患原因を形成する病因物質である可能性を検証する価値が出てきた。
【０００５】
動物実験に於いても、ラットをアルコール飲料で長期間飼育した後、アルコール飲料を中止した後も引き続いて進行性の神経細胞脱落が起こっていることが示されている（例えば、非特許文献４参照。）。アルコール性肝障害では病理組織学的に終末肝静脈周辺領域を中心にその病変が進展しており、この領域はアルコール代謝酵素の局在と一致していることが知られている（例えば、非特許文献５参照。）。つまり、エタノールの酸化により生成したアセトアルデヒド等の低分子アルデヒドは直ちにタンパク質中の遊離のアミノ基等の塩基性官能基と結合して広義のＡＧＥ、つまり、低分子アルデヒド由来前進性反応産物を形成して、アセトアルデヒド等の低分子アルデヒドが血液中から消失した後も長期的に神経や肝細胞毒性を発揮し続けることが考えられる。
【０００６】
ところが、アセトアルデヒドを反応基質としたメイラード反応産物の従来の検出方法については、メイラード反応の極初期段階の反応、つまり、第一段階のシッフ塩基形成反応体を更にＮａＣＮＢＨ３で途中還元して前進性反応を停止させてから検出するに過ぎない方法であり、煩雑且つ前進反応性のメイラード反応を経た広義のＡＧＥを検出する技術とは言えなかったのが現状である（例えば、特許文献１参照。）。技術的に更に詳しく述べるならば、この特許文献に記載されたアセトアルデヒドを反応基質とするメイラード反応産物は、発明の実施の形態の抗体の作成の項に記載されているように、メイラード反応を起こす際に還元剤であるＮａＣＮＢＨ３を共存させるためにアマドリ転位反応を起こさずに途中還元されて、構造上安定なＮ−エチルリジン（ＮＥＬ）と言う構造体になる（図１）。
【０００７】
【非特許文献１】
マキタ（Ｍａｋｉｔａ  Ｚ），他８名，  「糖尿病性神経障害患者における前進性糖化反応産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．）」，ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１９９１年，第３２５巻，ｐ８３６−８４２
【０００８】
【非特許文献２】
タケウチ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｍ），  他４名，「糖尿病患者血清中からの前進性糖化反応産物の非カルボキシメチルリジンとカルボキシメチルリジンの検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＡＧＥ）  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．）」，モレキュラー・メディスン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１９９９年，第５巻，ｐ３９３−４０５
【０００９】
【非特許文献３】
タケウチ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｍ），  他７名，「培養大脳皮質神経細胞に対する前進性糖化反応産物の神経毒性（Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．）」，ジャーナル・オブ・ニューロパソロジー・アンド・エクスペリメンタル・ニューロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ＆Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ），２０００年，第５９巻，ｐ１０９４−１１０５
【００１０】
【非特許文献４】
カデット−ライト（Ｃａｄｅｔ−Ｌｅｉｔｅ  Ａ．），  他２名，「慢性アルコール飼養ラットへのアルコール給餌停止は海馬下流細胞の進行性脱落を抑制しない。（Ａｌｃｏｈｏｌ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｉｍｐｅｄｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｌｃｏｈｏｌ−ｆｅｄ  ｒａｔｓ．）」，ニューロサイエンス・レターズ（ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ），１９８８年，第８６巻，ｐ４５−５０
【００１１】
【非特許文献５】
リーバー（Ｌｉｅｂｅｒ  Ｃ．Ｓ．），「アルコールと肝臓１９８４増補（Ａｌｃｏｈｏｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ：１９８４  ｕｐｄａｔｅ．）」，ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），１９８４年，第４巻，第６号，ｐ１２４３−１２６０
【００１２】
【特許文献１】
特許第２７６２０５８号公報（第３−５頁）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
公知の方法では、アセトアルデヒドを反応基質としたアマドリ転位以降の反応産物を検出できていないため、該反応産物の存在は明らかにされていなかった。従って、アセトアルデヒドを反応基質とした広義のＡＧＥがどのような物性を有し、更には、生物学的にどれくらい意味があるのかについても、全く明らかではなかった。また、図１で示された例はアセトアルデヒドについてのものであるが、反応基質がアセトアルデヒドの代わりのアルデヒド基を有する低分子誘導体であっても同様の前進性反応が引き起こされると考えられるが、これまでに明らかにされていなかった。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために以下の構成を有する。
「（１）生体内由来の有機化合物とアルデヒド基を有する全炭素数２以下の低分子アルデヒドを混合する反応系により得られ、且つ、アマドリ転位反応以降の反応産物であることを特徴とする低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００１５】
（２）前記反応系にＤＴＰＡ（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）をさらに混合することにより得られることを特徴とする（１）に記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００１６】
（３）前記反応系の反応温度が１０℃〜９０℃の範囲であることを特徴とする（１）または（２）に記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００１７】
（４）前記反応系のｐＨが２〜１２の範囲であることを特徴とする（１）〜（３）の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００１８】
（５）前記反応系の反応時間が１時間以上であることを特徴とする（１）〜（４）の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００１９】
（６）前記低分子アルデヒドの濃度が１ｎＭ〜１０Ｍの範囲であることを特徴とする（１）〜（５）の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００２０】
（７）前記有機化合物が１つ以上の塩基性官能基を持つことを特徴とする（１）〜（６）の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００２１】
（８）前記塩基性官能基がアミノ酸由来であることを特徴とする（７）に記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００２２】
（９）前記反応産物の物性が、以下のａ）〜ｅ）のいずれかの性質を１つ以上含むことを特徴とする（１）〜（８）の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００２３】
ａ）蛍光性
ｂ）着色（褐色）性
ｃ）架橋反応性
ｄ）生物反応性
ｅ）ＲＡＧＥ非結合性
（１０）前記反応産物が、Ｎ−エチルリジン構造体でないことを特徴とする（１）〜（９）の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００２４】
（１１）神経細胞の細胞死を誘導できることを特徴とする（１）〜（１０）の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００２５】
（１２）単球由来細胞の炎症反応を誘起しないことを特徴とする（１）〜（１１の）何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００２６】
（１３）低分子アルデヒドがアセトアルデヒドであることを特徴とする（１）〜（１２）の何れかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物。
【００２７】
（１４）（１）〜（１３）のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物を用いることを特徴とした低分子アルデヒド由来前進性反応産物を認識する抗体の製造方法。
【００２８】
（１５）（１４）に記載の製造方法で製造された低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体。
【００２９】
（１６）（１）〜（１３）のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体。
【００３０】
（１７）以下の構造体と反応しないことを特徴とする（１５）または（１６）に記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体。
【００３１】
ａ）Ｎ−カルボキシメチルリジン構造体
ｂ）Ｎ−カルボキシエチルリジン構造体
ｃ）Ｎ−エチルリジン構造体
（１８）体液由来試料中の低分子アルデヒド由来前進性反応産物の検出に用いられることを特徴とする（１５）〜（１７）のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体。
【００３２】
（１９）低分子アルデヒド由来前進性反応産物の生物反応を中和することができる（１５）〜（１８）のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体。
【００３３】
（２０）低分子アルデヒド由来前進性反応産物に反応し、下記ａ）〜ｃ）の各構造体に反応しない抗体の製造方法であって、下記のａ）〜ｃ）の各構造体に反応する抗体を除去する工程を含むことを特徴とする（１４）に記載の抗体の製造方法。
【００３４】
ａ）Ｎ−カルボキシメチルリジン構造体
ｂ）Ｎ−カルボキシエチルリジン構造体
ｃ）Ｎ−エチルリジン構造体」
（２１）（１５）〜（１８）のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体を用いることでアルコール性障害を判定する方法。
【００３５】
（２２）（１５）〜（１８）のいずれかに記載の低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体と結合する分子量１５０〜２５０ｋＤの物質。
【００３６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３７】
本発明で言うところの前進性反応産物とは、被反応物と反応基質が非酵素的反応、つまり、化学反応して生成した反応産物が、続けて、他の反応基質と反応したり、更に、自己開裂、官能基脱離や自己酸化などの自己反応を複合的に起こして、連続的に反応産物の化学的構造が変化することができる反応産物を言う。連続的に起こる前進性反応に於いて、反応を触媒する物質（例えば、酵素や重金属化合物）が介在しても良く、また、酵素が介在しない反応、つまり、非酵素的反応と言った化学反応であっても良く、特に限定を受けない。
【００３８】
被反応物とは、生体内にある物質や外部から体内に取り込んで酵素的に代謝、又は、非酵素的に化学反応した物でも良い。更に、この被反応物は、体内に存在する有機化合物であればよく、例えば、タンパク質やペプチド、アミノ酸、核酸、脂質、糖及び多糖体、ビタミンやこれらの複合体（例えば、糖タンパク質や糖脂質、リン脂質）が挙げられるが、その中でも好ましくは塩基性官能基が含まれていれば良く、前進性反応し得る被反応物ならば特に限定を受けない。本発明でいう生体由来の有機化合物とは、前記の被反応物のことである。
【００３９】
更に、上記の被反応物と反応する低分子アルデヒドとは、体内で代謝されて生成する低分子アルデヒドや体外から体内に摂取される全炭素数２個のアルデヒド官能基を有する化合物であれば、特に限定を受けない。その中でも好ましくは、アセトアルデヒドである。
【００４０】
本発明で言うところの低分子アルデヒド由来前進性反応産物を得るための反応系の条件においては、更なる添加物、反応温度、ｐＨ、反応時間、低分子アルデヒド濃度を適宜変更することが出来るし、記載以外の反応条件についても変更することは可能である。
【００４１】
例えば、低分子アルデヒド由来前進性反応中の酸化反応を抑制する目的で、反応溶液中に極微量に含まれる銅イオン、鉄イオン等の重金属をキレートして重金属イオンが触媒する酸化反応を抑制するためにキレート剤を添加して前進性反応を進行させることが出来る。本反応系については、使用できるキレート剤を特に限定する必要はないが、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）やＤＴＰＡを使用することが可能である。好ましくは、ＤＴＰＡである。
【００４２】
また、本反応系での反応温度は特に記載の温度に限定される訳ではないが、１０℃〜９０℃の範囲であれば良く、好ましくは２０℃〜５０℃、更に好ましくは３０℃〜４０℃、最も好ましくは３７℃である。
【００４３】
更に、本反応系での反応溶液のｐＨも特に記載の温度に限定される訳ではないが、２〜１２の範囲であれば良く、好ましくは４〜１０、更に好ましくは６〜８、一層好ましくは６．８〜７．４である。
【００４４】
本反応系の反応時間についても記載の時間に限定されない。例えば、１時間以上から数年の範囲でも良い。但し、実験室で低分子アルデヒド由来前進性反応産物を標品として得るために容易に調製するには１時間以上が好ましく、より好ましくは１日間〜１０週間であり、更に好ましくは１週間〜８週間、最も好ましくは１週間前後である。
【００４５】
そして、本反応系で使用できる反応基質としての低分子アルデヒドの濃度は、特に限定を受けない。例えば、ヒトの場合に血液中のアルコールが瞬時にアセトアルデヒドに代謝されると仮定するならば、０．２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの範囲が好ましい。但し、実験室で簡便に低分子アルデヒド由来反応産物を調製するには、反応時間を短縮するために反応基質である低分子アルデヒド濃度を非生理的な濃度以上に設定しても問題ない。例えば、低分子アルデヒドを１ｎＭ〜１０Ｍの幅広い濃度で用いても構わない。より好ましくは０．０１Ｍ〜１Ｍの範囲であり、最も好ましくは０．１Ｍ前後である。
【００４６】
本発明で言うところの低分子アルデヒド由来前進性反応産物には、様々な構造が存在する可能性があるが、構造は未だ明らかではない。但し、既知の構造であるＮ−エチルリジンは、アマドリ転位以降の低分子アルデヒド由来前進性反応産物には含まれないことが分かっている。一方で、本発明者らは、低分子アルデヒド由来前進性反応産物の製造法と、それらが持つ物性について検討した結果、これまで調べられてきたグルコース由来の前進性反応産物のもつ種々の物性と異なる物性を有する低分子アルデヒド由来前進性反応物が存在し、従来、低分子アルデヒド由来前進性反応産物ではまだ見出されていないアマドリ転位以降の反応生成物が存在することを本発明者らは解明し、さらにそれらの製造方法を完成するに至った。アマドリ転位以降の低分子アルデヒド由来前進性反応産物の存在は、その蛍光性、着色性、架橋反応性、抗原性、生物反応性、ＲＡＧＥ非結合性と言った物性評価によって確認することができる。
【００４７】
アマドリ転位以降の低分子アルデヒド由来前進性反応産物の存在を確認するには、以下に記載する一定の試料調製をすればよい。記載の範囲で反応させた低分子アルデヒド由来前進性反応産物を調製するには、先ず、ＰＤ−１０脱塩カラムを１回通液してＰＢＳに緩衝液置換して、更に再度、ＰＢＳを用いて４℃で３回（１回の透析時間は１２時間〜２４時間の範囲）の頻度で透析を行うことで、試料から過剰な反応基質の除去を行う。調製後の試料は、濾過滅菌後に４℃で無菌的に遮光保管し、１ヶ月以内に以下の物性評価に使用する。
【００４８】
蛍光性については、アマドリ転位を経由して更に前進性反応を繰り返すことで、ある特定範囲の励起光に対する蛍光特性が現れる。励起光と蛍光の波長は被反応物が前進性反応を受けることで強調されることが分かる場合であればどんな波長でも良いが、本発明において、「蛍光性を有する」とは、ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに溶解した上記調製試料を日立８５０型分光蛍光光度計での測定時に、３００ｎｍ以上３９５ｎｍ未満の範囲のいずれかの励起光（波長スリット幅：５ｎｍ）で４００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の範囲で観測される最大蛍光強度（波長スリット幅：５ｎｍ）が低分子アルデヒド由来の前進性反応を受ける前後での蛍光強度比率が５％以上増加することを言い、該最大蛍光強度の増加比率は、２０％以上がより好ましく、５０％以上であればよりいっそう好ましい。
【００４９】
低分子アルデヒド由来反応産物が示す特徴である着色性についても、前進性反応の段階で経時的に変化する物であり、詳しく述べるならば、反応初期に薄黄色に着色し、更に反応が進むことにより、茶色に着色し、最終的には、茶色から褐色になる。本発明で言うところの着色性を評価するには、分光光度計（日立分光光度計）で着色度を評価する場合には、上記調製試料の濃度をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに調製した時の吸光波長３３０ｎｍの吸光度が、低分子アルデヒド由来の前進性反応を受ける前後で５％以上増加することを言い、更に２０％以上ならば好ましく、５０％以上ならばより好ましい。
【００５０】
更に、低分子アルデヒド由来前進性反応産物が形成される段階で架橋反応も形成されることがある。架橋度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の移動度の変化から評価することができる。
【００５１】
本発明で言うところの架橋反応の確認は次の方法で確認できる。先ず、上記調製方法で調製された低分子アルデヒド由来反応前後の産物について、１試料当たり２μｇ採取する。次に、試料にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル調製液（２−メルカプトエタノール含）を加えて、１００℃、３分間加熱処理する。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動ゲル（１０ウェル、厚さ１ｍｍ、テフコ製）とＬａｅｍｍｌｉ溶液とを使って電気泳動を行う。泳動条件は室温で泳動電流２０ｍＡ／ゲルで泳動を行い、泳動装置はテフコ製を用いる。泳動する際に、分子量マーカーも同時に泳動することで、分子量マーカーと試料の泳動距離から分子量を導き出す。上記方法で分子量が算出できない場合、例えば、リポタンパク質のように分子量が大きすぎて泳動出来ないとか、低分子核酸のように分子量が小さすぎて十分に分画出来ない場合には、アガロースゲルを用いた電気泳動を採用する。試料の検出は、ＣＢＢコロイド染色（テフコ）で実施するが、上記方法で検出できないときは、被反応産物に対して低分子アルデヒド由来前進性反応による反応の影響をほとんど受けない特異的反応抗体を用いた免疫染色を用いてウエスタンブロット法で検出する。ウエスタンブロット法で検出時の試料は、１試量当たり０．２μｇ採取する。以上の方法で導き出された分子量の最大増加率が、低分子アルデヒド由来前進性反応の前後で１．５倍以上であることを言い、好ましくは２倍以上、より好ましくは５倍以上、更に好ましくは１０倍以上である。
【００５２】
更に、鋭意研究の結果、低分子アルデヒド由来前進性反応産物は抗原性も有することが分かった。シッフ塩基形成直後にＮａＣＮＢＨ３還元することで、Ｎ−エチルリジン構造を生成させると強い抗原性が得られるが、シッフ塩基形成後に強制的に還元することなく、アマドリ転位させて、引き続き煩雑な前進性反応を経由して出来上がった低分子アルデヒド由来反応産物も弱いながらも抗原性を有することを見出している。ここで言う抗原性の有無の確認方法とは、キャリア上に本発明で言う低分子アルデヒド由来前進性反応産物を形成させて、これを免疫原として宿主の皮下に適切なアジュバントとともに投与するといった免疫の後に得られた抗血清若しくは抗体が抗原固相化法というＥＬＩＳＡの手法で抗原抗体反応性を評価する。上記キャリアはアルブミンを使用する。特に好ましくは宿主のアルブミンであるが、宿主のアルブミンでは抗原提示性が弱く反応性の確認が出来ない場合には、キャリアのアルブミンをウサギ、ウシ、ヒト、マウス、イヌ、ヤギから選択することが出来、このキャリアの中から低分子アルデヒド由来反応産物に最も高い抗原提示性があるアルブミンを使用する。免疫する動物はウサギ（日本白色ウサギ）を使用する。但し、ウサギで十分な反応性が見出されない場合には、マウス、ラット、イヌ、ヤギから選ばれる最も免疫原反応が高い動物を使用する。免疫するアジュバントは、ＦＣＡ（和光純薬）を使用する。もし、ＦＣＡで十分な抗体力価が得られないならば、不活性化百日咳菌の死菌懸濁液（和光純薬）を用いたアラムアジュバントを初回免疫して以降の免疫にアラムアジュバントを用いた免疫方法、または、ＲＡＳアジュバント（フナコシ）を使用して最も力価の高い抗体が得られるアジュバントを選択する。免疫の回数は１回あたり１週間の間隔で５回であり、５回で不十分であれば１０回以下、最長でも１年以下である。その際に得られた最大力価の抗血清または抗血清から調製した抗体溶液を使用する。
【００５３】
また、本発明で言う低分子アルデヒド由来前進性反応産物の生物反応性とは、あらゆる生物や細胞と低分子アルデヒド由来前進性反応産物を反応させることで引き起こされる現象を特に限定されることなく意味するが、好ましく用いられる生物反応の例としては、肝細胞や神経細胞との反応に於いて、サイトカインや成長因子の放出、細胞増殖、細胞死の誘導が挙げられる。更に上記生物反応の評価条件を詳細に述べるならば、以下の手法で一義的に評価できる。つまり、１８日目のラット胎仔（Ｓｔｄ：Ｗｉｓｔｅｒ／ＳＴ）の大脳皮質神経細胞を用いた細胞毒性試験で神経細胞を細胞死できる生物反応を用いる。大脳皮質神経細胞の採取方法は、公知の手法（オグラら，エクスペリメンタル・ブレイン・リサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１９８８年，第７３巻，ｐ４４７−４５８）に従い採取する。細胞毒性試験を行う培養条件は、０．２５％ポリエチレンイミンでコーティングした２４穴培養プレートに細胞懸濁液（３．７×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ）を１ｍｌずつはん種し、更に４８時間培養後にグリア細胞の増殖を抑制するために最終濃度１０μＭのＡｒａＣで２４時間処理した後で、ＣＭＦ−ＰＢＳで２回洗浄後に無血清のＤＭＥＭ培地に交換して、更に２４時間培養後に細胞毒性試験を行う。本発明に係る低分子アルデヒド由来先進性反応産物は評価対象細胞の細胞死を５０％誘導できる低分子アルデヒド由来前進性反応産物の細胞培養液添加時の初期濃度（ＩＣ５０値）が、１ｍｇ／ｍｌ以下のものを指すが、より好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ以下であり、最も好ましくは０．３５ｍｇ／ｍｌ以下であれば良い。また、細胞死を評価する方法は、全細胞数のＭＴＴ活性を定量的に評価することで表す。具体的には、はじめに培地０．５ｍｌ中に５ｍｇ／ｍｌの濃度のＭＴＴ溶液を５０μｌ添加して、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間静置する。生成したＭＴＴ−フォルマザンを０．０４Ｎ塩酸を含んだイソプロパノール溶液０．５ｍｌにて抽出して、マイクロプレートリーダー（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｍｉｎｉ  ＮＪ−２３００，  ＩｎｔｅｒＭｅｄ社）を用いて５７０ｎｍでの吸光度を測定して評価する。
【００５４】
また、これら生物反応を引き起こす鍵は、ある種の受容体であり、特に限定を受けることはないが、スカベンジャー機能を持つ受容体である。従来知られている前進性反応産物（ＡＧＥ）と結合し、生物反応を媒介する受容体で最も有名な物はＲＡＧＥであるが、本発明で見出された低分子アルデヒド由来前進性反応産物はＲＡＧＥとは結合せずに、特定の細胞にのみ生物活性を誘導する特徴を持つ。例えば、上記のように低分子アルデヒド由来前進性反応産物は神経細胞等の細胞死を誘導できるが、その一方で、ＲＡＧＥを発現していることが知られている単球系細胞（例えば、ＴＨＰ−１細胞）と反応させても、従来の前進性反応産物と同様に単球系細胞のサイトカインの放出を促すことはできない特徴をもつ。つまり、低分子アルデヒド由来前進性反応産物はＲＡＧＥとは異なる受容体を介した生物反応を引き起こすことがわかる。
【００５５】
本発明で言うところのＲＡＧＥ非結合性を評価する方法とは、先ず、９６穴マイクロプレート（ＮＵＮＣ）にＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡとネガティブコントロールであるＢＳＡをそれぞれ固相化する。固相化条件は、リン酸緩衝生理食塩水で２０μｇ／ｍｌに希釈した調製液を１００μｌ添加して、４℃、１２時間である。固相化反応後、０．５％ＢＳＡリン酸緩衝生理食塩水で室温、２時間でブロッキング処理し、ブロッキング処理後に、リン酸緩衝生理食塩水に０．０５％ツイーン２０（登録商標）を添加した洗浄液（ＰＢＳＴ）で１回洗浄して、０．５μｇ／ｍｌに調製した精製ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン溶液を１００μｌ添加して、室温で２時間振とう反応し、反応後に、ＰＢＳＴで３回洗浄して、０．１μｇ／ｍｌに調製した抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体溶液（ＱＩＡＧＥＮ）を室温、１時間反応させる。更にＰＢＳＴで３回洗浄後、抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰ標識（Ｚｙｍｅｄ）を室温、３０分間反応させ、反応後、３回洗浄して、発色液を入れて、室温、３０分間発色させ、停止液を添加して発色反応を止めて、発色液の吸光度を測定することでＲＡＧＥ結合性を評価する。発色度が、ネガティブコントロールであるＢＳＡに対して、低分子アルデヒド由来前進性反応で５倍未満であれば結合性なしと判定する。
【００５６】
上記生物反応がヒトに於いて観測される場合は、ある特定の疾患という現象で見られる。特に、これまで知られている疾患は難治性疾患が多く、俗に言う、酸化ストレスが関与する疾患が多い。具体的には、記載事項のみに限定されるわけではないが、アルコール性脳神経障害や肝臓障害に代表されるアルコール性障害、腎障害、糖尿病合併症、脳神経障害、アミロイド性疾患、遺伝性代謝性疾患が挙げられる。また、必ずしも疾患ではないが、老化現象も挙げられる。更に、低分子アルデヒドを摂取することによって、体内に吸収される中毒症状も当てはまる。その中でも特に重要な疾患が、アルコール性障害である。
【００５７】
また、上記疾患で観測される低分子アルデヒド由来前進性反応産物は、特に限定を受けるわけではないが、体液や体の組織中で見出される。体液は、血液や血清、血漿、尿、リンパ液、関節液、消化液、髄膜液が挙げられ、更には、人工透析などで生じた透析液中でも見出されることがある。更に、低分子アルデヒド由来前進性反応産物が見出される組織とは、脳や神経と言った神経系全般、血管や心臓と言った循環器系全般、肝臓、腎臓、消化器、そして、皮膚や骨等の支持組織であっても良く、これら記載の事項にのみ限定を受けるものではない。
【００５８】
本発明で言うところの抗体とは、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも良く、特に限定を受けるものではない。また、抗血清や腹水、抗体を産生するハイブリドーマの培養上清でもよく、低分子アルデヒド由来前進性反応産物に反応する抗体が含まれていれば良く、抗体が含まれる試料形態に特に限定を受けるものではない。
【００５９】
本発明で言うところの抗体製造方法とは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、トリ、ウシ等の適当な動物に、抗原である低分子アルデヒド由来前進性反応産物をアジュバントと共に投与することで低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体（抗血清）を得る工程を含む。更に、抗血清から低分子アルデヒド由来前進性反応産物と反応する抗体を効率よく分離するために抗原である低分子アルデヒド由来前進性反応産物を液体クロマトカラム用ビーズ等の担体に固定化したアフィニティーカラムに通液した後で、アフィニティーカラムに結合した抗体を分離回収するアフィニティー精製の工程が含まれても良い。更には、アフィニティー精製した抗体の中から更に必要な抗体の純度を上げるために、Ｎ−カルボキシメチルリジン構造体、Ｎ−カルボキシエチルリジン構造体、Ｎ−エチルリジンのアマドリ転位反応を経由せずに形成された低分子アルデヒド由来の反応産物と結合する抗体を除去する目的で、Ｎ−カルボキシメチルリジン構造体、Ｎ−カルボキシエチルリジン構造体、Ｎ−エチルリジン等の反応産物を固定化したアフィニティーカラムに通液する事で不要な抗体を除去する工程が含まれても良い。但し、抗体の製造方法は記載の方法に限定されるものではない。
【００６０】
本発明の体液由来試料中の低分子アルデヒド由来前進性反応産物の検出に用いられる抗体を製造するには、上記の抗体製造法を利用することが可能である。より好ましくは、体液由来試料との非特異的反応、つまり、抗原となる低分子アルデヒド由来前進性反応産物以外との反応を最小限に抑えるために、上記製造法で得られた抗体に対して、更に、評価対象となる動物種の健常な体液由来試料を液体クロマトカラム用ビーズ等の担体に固定化したアフィニティーカラムに通液して素通りした抗体を分離回収するアフィニティー精製の工程が含まれても良い。もし、評価対象となる動物種の健常な体液由来試料が入手困難であれば、評価対象となる動物種の免疫グロブリンを固定化するだけでも効果的である。
【００６１】
更に、本発明の生物反応を中和できる抗体を製造するには、上記記載の抗体製造法、または、体液由来試料中の低分子アルデヒド由来前進性反応産物の検出に用いられる抗体の製造方法を利用することが出来る。但し、より好ましくは、生物反応を中和できる抗体のみが回収できればよいので、低分子アルデヒド由来前進性反応産物を担体に固定化して、更に、この担体上に固定化された低分子アルデヒド由来前進性反応産物と生物反応を媒介するタンパク質、好ましくは受容体のリガンド結合能力が保存された受容体又は可溶性受容体で、具体例としてＲＡＧＥ等のスカベンジャー受容体が挙げられるが、そのような生物反応を媒介する生体内に存在するタンパク質を結合させて、更にグルタルアルデヒド等で化学的に架橋固定化させた担体を用いたアフィニティーカラムに通液して素通りした抗体のみを回収して生物反応を中和する抗体として用いると効果的である。
【００６２】
そして、本発明で言うところの抗体で中和できる生物反応の手段としては、中和対象に於いて、抗体をそのまま添加しても良く、さらに、カプセル中やヒドロゲルに包埋、結合させて用いてもよい。更に、上記記載のように液性性状として抗体を使用しても良いが、水不溶性担体と言った固体性状に固定化して使用しても良く、抗体を用いた中和手段について特に記載の内容にのみ限定を受けるものではない。
【００６３】
本発明の低分子アルデヒド由来前進性反応産物は、医薬設計のためのスクリーニング材料、診断材料、食品の劣化度評価等の用途に用いることが出来る。医薬設計のためのスクリーニング用途については、低分子アルデヒド由来前進性反応産物の抗原提示性評価や細胞や動物を用いた生物活性評価の品質が安定して扱える標品として利用可能である。特に、抗体やペプチドや合成化合物等で設計し得ることが可能なアンタゴニストのスクリーニング用途には、品質が安定して大量供給可能な標品が必要であり、大いに利活用できる。また、診断材料の開発に対する用途についても、品質が安定して扱える標品を提供する形で見出すことが出来る。また、低分子アルデヒドに対する抗体を作製する免疫原や抗原としても提供可能である。一番期待できる診断用途は、アルコール性慢性疾患、例えば、アルコール性神経疾患、肝障害、代謝障害等の診断であるが、アセトアルデヒドに代表される低分子アルデヒドは、アルコール摂取以外にも代謝等で体内に発生することが十分予想され、アルコール性慢性疾患以外にも、アルツハイマー病等の一般の慢性神経疾患や腎症、糖尿病、高脂血症、透析合併症、老化、血管障害、アミロイド症等の様々な酸化ストレスが発生しうる疾患対象にも、安定した標品を提供する形で利活用できる。更には、人体以外にも、植物をはじめ肉、魚等の生食品や加工食品の劣化試験の標品としても利用できる。更には、香料等の食品、化粧品、衣類、住居等への人工添加物の影響を評価する安定した標品としても提供可能である。
【００６４】
本発明の低分子アルデヒド由来前進性反応産物に対する抗体は、上記同様に、医薬設計のためのスクリーニング材料、診断材料、食品の劣化度評価等の用途に用いることが出来る。医薬設計のためのスクリーニング用途については、低分子アルデヒド由来前進性反応産物に対する抗原提示性評価の抗体標品や細胞や動物に対する生物活性評価の影響を抗体価上昇とした指標で評価する際にポジティブコントロールとしての抗体標品として利用可能である。特に、生物活性を中和する抗体は、アンタゴニストのスクリーニング用途、または、アンタゴニストそのものとして利活用可能であり、更には、品質が安定して大量供給可能な抗体標品として大いに利活用できる。また、診断材料の開発に対する用途についても、生物活性を中和することを必須条件とせずに抗体標品を提供する形で見出すことが出来る。また、低分子アルデヒド由来前進性反応産物の精製状況を微量検出する高感度測定用抗体としても提供可能である。一番期待できる診断用途は、アルコール性慢性疾患、例えば、アルコール性神経疾患、肝障害、代謝障害等の診断であるが、アセトアルデヒドに代表される低分子アルデヒドは、アルコール摂取以外にも代謝等で体内に発生することが十分予想されるため、抗体の製造方法を鋭意検討することで、アルコール性慢性疾患以外にも、アルツハイマー病等の一般の慢性神経疾患や腎症、糖尿病、高脂血症、透析合併症、老化、血管障害、アミロイド症等の様々な酸化ストレスが発生しうる疾患対象にも、抗体を用いた検出材料を提供する用途ととして利活用できる。更には、人体以外にも、植物をはじめ肉、魚等の生食品や加工食品の劣化試験の検出材料としても利用できる。更には、香料等の食品、化粧品、衣類、住居等への人工添加物の影響を評価する安定した検出標品としても提供可能である。
【００６５】
【実施例】
以下、実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）：各種ＡＧＥ（前進性反応産物）の作製
本発明にかかる低分子アルデヒド由来前進性反応産物として、アセトアルデヒド由来ＡＧＥ−ｒａｂｂｉｔ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＡＡ−ＡＧＥ−ＲＳＡ）とアセトアルデヒド由来ＡＧＥ−ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ）を以下のような方法で作製した。
【００６６】
生体内に存在する有機化合物として、２５ｍｇ／ｍｌのＲＳＡ（ｒａｂｂｉｔ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ウサギ血清アルブミン）を０．１Ｍのアセトアルデヒドと５ｍＭのＤＴＰＡ（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のアルデヒドを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）による透析により取り除き、本発明にかかる低分子アルデヒド由来前進性反応産物（実施例１、ＡＡ−ＡＧＥ−ＲＳＡ）を得た。タンパク質定量は、ＢＳＡを標準物質としてＤｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて行った。
【００６７】
２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを０．１Ｍのアセトアルデヒドと５ｍＭのＤＴＰＡ（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のアルデヒドを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）による透析により取り除き、本発明にかかる低分子アルデヒド由来前進性反応産物（実施例２、ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ）を得た。２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを０．５Ｍのグルコースと５ｍＭのＤＴＰＡと共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で８週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のグルコースを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、比較例１（ＡＧＥ−１）を得た。
【００６８】
２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを０．１Ｍのグリセルアルデヒドと５ｍＭのＤＴＰＡと共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のグリセルアルデヒドを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、比較例２（ＡＧＥ−２）を得た。
【００６９】
２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを０．１Ｍのグリコールアルデヒドと５ｍＭのＤＴＰＡと共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のグリコールアルデヒドを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、比較例３（ＡＧＥ−３）を得た。
【００７０】
２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを０．１Ｍのメチルグリオキサールと５ｍＭのＤＴＰＡと共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のメチルグリオキサールを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、比較例４（ＡＧＥ−４）を得た。
【００７１】
２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを０．１Ｍのグリオキサールと５ｍＭのＤＴＰＡと共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のグリオキサールを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、比較例５（ＡＧＥ−５）を得た。
【００７２】
２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを０．２Ｍの３−デオキシグルコゾンと５ｍＭのＤＴＰＡと共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で２週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応の３−デオキシグルコゾンを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、比較例６（ＡＧＥ−６）を得た。比較例１〜６のタンパク質定量は、実施例１〜２のタンパク質定量と同様の手法でＰＤ−１０カラムと透析後に、行った。
【００７３】
ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡの蛍光スペクトルを測定した（日立８５０型分光蛍光光度計）。濃度は０．５ｍｇ／ｍｌに調製した。蛍光はＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡにのみ特異的に見られ（図２）、未修飾のＢＳＡには見られなかった。ＡＡ−ＡＧＥの蛍光スペクトルのピークは励起波長が３６０ｎｍ、蛍光波長が４４０ｎｍに観察された。これは各種ＡＧＥ（ＡＧＥ−１〜−６）のピーク（励起光波長範囲：３６０ｎｍ〜３８０ｎｍ、蛍光波長範囲：４３０ｎｍ〜４５０ｎｍ）と近い値であった。
（２）：Ｎ−エチルリジン−ＢＳＡ（ＮＥＬ−ＢＳＡ）、Ｎ−カルボキシメチルリジン−ＢＳＡ（ＣＭＬ−ＢＳＡ）、Ｎ−カルボキシエチルリジン−ＢＳＡ（ＣＥＬ−ＢＳＡ）の作成
ＮＥＬ−ＢＳＡは、５０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを４５ｍＭのアセトアルデヒドと１５０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３とともに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して３７℃で２４時間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のアルデヒドを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、比較例７（ＮＥＬ−ＢＳＡ）を得た。
【００７４】
ＣＭＬ−ＢＳＡは、５０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを４５ｍＭのグリオキサール酸と１５０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３とともに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して３７℃で２４時間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のグリオキサール酸を、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、比較例８（ＣＭＬ−ＢＳＡ）を得た。
【００７５】
ＣＥＬ−ＢＳＡは、５０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを４５ｍＭのピルビン酸と１５０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３とともに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して３７℃で２４時間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のピルビン酸を、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、比較例９（ＣＥＬ−ＢＳＡ）を得た。
【００７６】
ＮＥＬ−ＢＳＡ、ＣＭＬ−ＢＳＡ、ＣＥＬ−ＢＳＡの蛍光特性について測定した（日立８５０型分光蛍光光度計）。濃度は０．５ｍｇ／ｍｌに調製した。ＮＥＬ−ＢＳＡ、ＣＭＬ−ＢＳＡ、ＣＥＬ−ＢＳＡには実施例１〜２及び比較例１〜６で見られた蛍光スペクトルは見られなかった（図２）。アマドリ転位以降に発生する特徴的な蛍光特性が観察されなかったことが示された。
（３）低分子アルデヒド由来前進性反応産物に対する抗血清の作成
アセトアルデヒドでＡＧＥ化した４ｍｇの実施例１のＡＡ−ＡＧＥ−ＲＳＡ（ｒａｂｂｉｔ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）をフロイント完全アジュバント（和光純薬）と１：１の割合で乳化し、日本白色ウサギ（雌、２．５ｋｇ）の背部数カ所に皮下注射した。初回免疫後、１週間おきに５回の追加免疫を抗体価が上昇するまで行った。追加免疫後、経時的にウサギの耳静脈より少量採血し、抗体価の確認を行った。抗体価の上昇の見られた時点からさらに２週間後、最終追加免疫を行い、その１０日後に抗血清の精製を行うために全採血を行い、抗血清１を得た。
（４）ＡＡ−ＡＧＥ特異抗体及びＮＥＬ特異抗体の調製
得られた抗血清１の中にはＡＡ−ＡＧＥ特異抗体の他、シッフ塩基あるいはアマドリ化合物から生成するＮＥＬ構造体に対する抗体も含まれているため、２種類のアフィニティークロマトグラフィーを用いてそれぞれの抗体の分離を行った。
【００７７】
まず、ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡおよびＮＥＬ−ＢＳＡアフィニティーカラムを調製した。７．５ｇのＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  を１ｍＭ塩酸で膨潤後、２Ｌの１ｍＭ塩酸で洗浄した。リガンドとして１００ｍｇのＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）またはＮＥＬ−ＢＳＡ（比較例７）をＣｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．３）と混合し、２５ｍｌのＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂゲルと室温で１時間振とうしてカンプリングさせた。カップリング後、余分なリガンドはＣｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。ゲルの活性残基は、０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）とゲルを室温で２時間振とうしてブロッキングした。ブロッキング終了後、Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとＷａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０）とで交互に３回洗浄し、更にＰＢＳで３回洗浄することでアフィニティー樹脂を調製した。
【００７８】
２０ｍｌの抗血清１をこのＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（２．５ｃｍ×５ｃｍ）に４℃で一晩吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、吸着画分を１Ｍ  チオシアン酸カリウムを含んだ２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。溶出時は各フラクションを２８０ｎｍの吸光度でモニターし、ピーク部分を集めてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０で濃縮後、ＰＤ−１０ゲル濾過カラムを用いて緩衝液の置換を行った。
【００７９】
得られた溶出画分をさらにＮＥＬ−ＢＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（１．５×５．５ｃｍ）に４℃で一晩吸着させた。カラムを３０ｍｌのＰＢＳで洗い非吸着画分を、次に２０ｍｌの１Ｍ  チオシアン酸カリウムを含んだ２０ｍＭ  リン酸緩衝液で吸着画分を得た。どちらも各フラクション（１ｍｌ）を２８０ｎｍの吸光度でモニターし（図３）、ピーク部分を集めてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０で濃縮後、ＰＤ−１０カラムにて緩衝液の置換を行った。ここで得られた非吸着画分が、ＮＥＬ以外のアセトアルデヒド由来ＡＧＥ構造を認識するＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３）である。一方、ＮＥＬ−ＢＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムに対する吸着画分がＮＥＬ構造を特異的に認識するＮＥＬ抗体（比較例１０）である。ＡＡ−ＡＧＥ抗体及びＮＥＬ抗体は、それぞれ安定化剤として１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加後、−８０℃にて保存した。
（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法によるＡＡ−ＡＧＥの物性評価
ＡＡ−ＡＧＥ−ＲＳＡ（実施例１）並びにＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）を７．５％ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲルを用いて、電気泳動を行い、タンパク質染色またはＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。
【００８０】
ＡＡ−ＡＧＥ−ＲＳＡ並びにＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡのサンプル溶液は最終的に１レーンにつきタンパク質染色を行う場合には２μｇ、Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行う場合には、０．２μｇのタンパク質濃度になるように調製した。必要量を２５μｌに希釈したＡＧＥ溶液とサンプル調製液２５μｌを混合し、１００℃で３分間の加熱処理をした。分子量マーカーはＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｌｏｗ  ｒａｎｇｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用した。電流はゲル板１枚につき２０ｍＡで行い、マーカーがゲルの下端から５ｍｍの位置まで泳動した。タンパク質染色はクマシー染色液にゲルを浸し３０分間室温で振とう後、脱色液に浸し、室温で振とうした。脱色液は液に色が着かなくなるまで頻繁に交換した。
【００８１】
Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇは泳動の終了したゲルとＰｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜および各Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ用ｂｕｆｆｅｒに浸したろ紙を重ね、２．５ｍＡ／ｃｍ２の電圧で３０分かけて転写した。転写の終了したＰＶＤＦ膜は４％スキムミルク入りのＰＢＳにより室温で１時間ブロッキングした。洗浄後、ＰＶＤＦ膜と４％スキムミルク入りのＰＢＳで希釈したＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３、希釈倍率１：２０００）を３０℃で２時間反応させた。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）入りのＰＢＳでの洗浄を５分間ずつ３回行った。次に４％スキムミルク入りのＰＢＳで希釈したＡｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＰ）標識したヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体（希釈倍率１：２０００）を２次抗体として加え３０℃で１時間反応させた。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）入りのＰＢＳでの洗浄を５分間ずつ５回行い、ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ  Ｋｉｔ  （和光純薬）を用いて検出した。
【００８２】
図４にＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３）を用いたＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法による解析結果を示す。未修飾のＢＳＡの場合には、分子量６７ｋＤａにバンドが現れた。それに比べＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡの移動度は小さくなり、また、ブロードなバンドが観察された。つまり、低分子アルデヒド由来前進性反応による架橋反応でＢＳＡが高分子量化した。低分子アルデヒド由来前進性反応の特徴の一つには架橋反応が含まれることが示された。また、抗ＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３）はＮＥＬ−ＢＳＡ（比較例７）とは全く反応しなかった。
（７）ＡＡ−ＡＧＥ抗体の特異性の検討
アフィニティーカラムにより調製したＡＡ−ＡＧＥ抗体の特異性を競合ＥＬＩＳＡ法を用いて検討した。競合剤として各種ＡＧＥ−ＢＳＡ（ＡＧＥ−１〜−６、比較例１〜６）の他、既知構造であるＮＥＬ−ＢＳＡ（比較例７）、ＣＭＬ−ＢＳＡ（比較例８）並びにＣＥＬ−ＢＳＡ（比較例９）を用いた。
【００８３】
ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）をＣｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに１μｇ／ｍｌになるように溶解し、９６ウェルのＨｉｇｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｅ．Ｉ．Ａ／Ｒ．Ｉ．Ａ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅｓの各ウェルに１００μｌずつ加え４℃で一晩吸着させ固相化した。Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを１５０μｌ加え室温で１時間インキュベートしてブロッキングを行った。洗浄後、非競合法の場合には固相化したＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）とＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３、５０μｌ；希釈倍率１：１０００）との反応にサンプル（５０μｌ）を競合させた。どちらの場合も３０℃、振とう条件下で２時間インキュベートした。洗浄後、次にＤｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで希釈した１００μｌのＡｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＰ）標識したヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（希釈倍率１：２０００）を２次抗体として加え、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌのＡＰ基質キット溶液を加え３７℃で１時間インキュベート後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ５５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で４０５ｎｍの吸光度を測定した。得られたＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３）は、未修飾ＢＳＡ、ＡＧＥ−１〜−６（比較例１〜６）並びに既知の３構造体（比較例７〜９）は全く認識せず、免疫原であるＡＡ−ＡＧＥ構造を特異的に認識した（図５）。
（８）低分子アルデヒド由来前進性反応産物の生物反応評価
ラット胎仔大脳皮質神経細胞に対する細胞死誘導への影響を評価した。ラット胎仔大脳皮質神経細胞の初代培養は以下のような方法を用いて行った。妊娠１８日のラット（Ｓｔｄ：Ｗｉｓｔｅｒ／ＳＴ）をエーテル麻酔後、断頭し、子宮を摘出した。子宮から胎仔を取り出し、頭皮及び頭蓋を開き全脳を摘出した。全脳を実体顕微鏡下でメスを用いて中脳を切り離し、大脳を３枚におろした。大脳半球を伏せて軟膜を取り除き、大脳皮質後端の海馬溝を目安に海馬を取り除き大脳皮質を得た。この操作を全胎仔分行った。細かく刻んだ大脳皮質をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で軽く３回洗浄した後、０．２５％トリプシン溶液と０．２％Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）を用いて３７℃で２０分間振とう条件（１５０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ）下でインキュベートした。準胎仔ウシ血清（Ｓｅｍｉ  ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＳＦＣＳ）を添加し消化を停止後、ピペッティングにより細胞をほぐし、レンズペーパーフィルターで細胞懸濁液を濾過した。１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、ＤＭＥＭで再懸濁を３回行い、１０％ＳＦＣＳを含んだＤＭＥＭにより３．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に希釈して、０．２５％  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅでコーティングした２４穴のプレートに１．０ｍｌずつはん種した。４８時間、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養後、グリア細胞の増殖を抑制するために最終濃度１０ｕＭのＣｙｔｏｓｉｎｅ−β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（Ａｒａ  Ｃ）での処理を２４時間、３７℃、５％ＣＯ２条件下で行った。処理後、Ｃａ２＋  ａｎｄ  Ｍｇ２＋  ｆｒｅｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＣＭＦ−ＰＢＳ）で２回洗浄し、無血清のＤＭＥＭに交換した。更に２４時間培養後、各種ＡＧＥ処理を次のように行った。
【００８４】
ＡｒａＣ処理後、無血清のＤＭＥＭに交換して更に２４時間培養後、ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）により大脳皮質神経細胞を処理した。タンパク質濃度０．２５〜２ｍｇ／ｍｌのＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡを培地中に添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養して３〜４日間細胞の状態（細胞死誘導状況）を顕微鏡観察した（図６）。
【００８５】
別途、神経細胞障害の検討は３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）  ａｓｓａｙ法を用いて以下のようにも行った。はじめに培地０．５ｍｌ中に５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ溶液５０μｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて２時間静置した。生成したＭＴＴ−ｆｏｒｍａｚａｎを０．０４Ｎ塩酸を含んだＩｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ溶液０．５ｍｌにて抽出し、マイクロプレートリーダー（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｍｉｎｉ  ＮＪ−２３００、ＩｎｔｅｒＭｅｄ社）を用いて５７０ｎｍでの吸光度を測定した。まず、１ｍｇ／ｍｌのＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）を培地に添加し７２時間培養後、神経細胞に対する低分子アルデヒド由来前進性反応産物の生物反応の評価を行った。結果、ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡによってＭＴＴ還元活性が有意に低下した（図７）。低分子アルデヒド由来前進性反応産物の神経細胞毒性に関するＩＣ５０値は０．３５ｍｇ／ｍｌであった。
【００８６】
次に、ＡＧＥによる毒性の濃度依存性を検討した。０．２５〜２ｍｇ／ｍｌのＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）を培地に添加し、９６時間培養後、神経細胞に対するＡＧＥの毒性の評価を行った。ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡは、濃度に依存して毒性が強く現れた（図６及び図７）。形態学的にもＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡの濃度に依存して、突起の長さや数が減少し、縮小した細胞の増加が認められた（図６）。
（９）未修飾タンパク質の生物反応評価
実施例７と同様の手法で、未修飾タンパク質（ＢＳＡ）によるラット胎仔大脳皮質神経細胞に対する細胞死誘導への影響を評価した。結果、未修飾タンパク質による細胞誘導死は確認できなかった（図６及び図７）。ＮＥＬ−ＢＳＡ（比較例７）についても同様に細胞死誘導は確認できなかった（図７）。
（１０）ＡＡ−ＡＧＥ抗体による生物反応中和評価
更に、ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）を用いて、ＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３、０．５ｍｇ／ｍｌ）による低分子アルデヒド由来前進性反応産物の神経細胞への保護作用を検討した。０．５ｍｇ／ｍｌのＡＡ−ＡＧＥとＡＡ−ＡＧＥ抗体を室温で１時間プレインキュベートした後、培地に添加し、７２時間培養後、神経細胞に対するＡＡ−ＡＧＥの毒性評価を行った。対照として、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを用いた。ＡＡ−ＡＧＥによる細胞毒性はＡＡ−ＡＧＥ抗体により濃度依存的に抑制された（図８及び図９）。
（１１）ＮＥＬ抗体による生物反応中和評価
ＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３）の代わりにＮＥＬ抗体（比較例１０、０．５ｍｇ／ｍｌ、１５ｕｌ）を用いたことによる保護作用を検討した。結果、ＮＥＬ抗体では全く毒性が抑制されなかった（図８及び図９）。
（１２）ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインのクローニング
ヒト肺ｃＤＮＡライブラリー（宝酒造（株））を鋳型にＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、細胞外領域上流及び下流の２つの断片を増幅した。ＰＣＲプライマーはヒトＲＡＧＥのデータベース配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ９１２１１）を基に４種類設計し、各々２種類ずつを上流及び下流増幅プライマーとして用いた。
・上流増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置ｏｒ  塩基番号（ＲＡＧＥの開始コドンＡＴＧのＡを１とした））
Ｓ（１〜２９）及びＡＳ（７３０〜７４９）
・下流増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置）
Ｓ（４６２〜４８１）及びＡＳ（１００７〜１０３２）
（上流には制限酵素ＥｃｏＲＩ、下流にはＢｇｌＩＩの切断部位を付加した。）また、プライマーの安定性と遺伝子発現効率を上げるためにいくつかの塩基は適宜置換した。さらに、ＲＡＧＥを可溶型とするため、細胞外ドメインの下流末端に終止コドン（ＴＧＡ）を付加した。
【００８７】
２種類の反応産物をアガロースゲル電気泳動した。さらに得られた各ＰＣＲ増幅断片を電気泳動のゲルから回収した後、ｐＵＣ１８ベクターにクローニングし、ＰＣＲ産物の塩基配列確認を行った。
（１３）バキュロウイルストランスファーベクターへのＲＡＧＥ遺伝子挿入
バキュロウイルスベクターへのクローニングを以下のように行った。ベクターはｐＶＬ１３９３（ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた。まず、ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断し、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化した後精製した。実施例１で得たＲＡＧＥ細胞外領域上流及び下流の２つの断片は以下に示す制限酵素で切断後、目的断片を精製した（目的断片の塩基数）。
・上流：ＥｃｏＲＩ／ＦｓｐＩ（６６６ｂｐ）
・下流：ＦｓｐＩ／ＢｇｌＩＩ（３８４ｂｐ）
精製した２断片をｐＶＬ１３９３ベクターのポリヘドリンプロモーターの下流に挿入した。得られたクローンについて電気泳動による挿入断片のサイズ確認と塩基配列決定により、目的ＤＮＡを持つクローンが構築できたことを確認した。
【００８８】
上記ＲＡＧＥプラスミドＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、細胞外領域下流末端にＨｉｓ−Ｔａｇを付加した断片を増幅した。ＰＣＲプライマーは、（１２）ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインのクローニングで用いた下流増幅用プライマーの終止コドンの前にＨｉｓをコードするコドン（ＣＡＴ）の６回繰り返し配列を挿入したものを作製した。
・増幅プライマー：（プライマーのＲＡＧＥ中の位置ｏｒ  塩基番号（ＲＡＧＥの開始コドンＡＴＧのＡを１とした））
Ｓ（４６２〜４８１）及びＡＳ（１００７〜１０３２  ＋  （ＣＡＴ）６  ＋  （ＴＧＡ）２  ＋  ＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅ  ）
プライマーの安定性と遺伝子発現効率を上げるためにいくつかの塩基は適宜置換した。確認の結果、ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインのＣ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇを融合した遺伝子配列を得た。
（１４）ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインの精製
バキュロウイルスを感染させる昆虫細胞はＳｆ−９を用いた。バキュロウイルス感染６０時間後の培養上清を回収して、４℃でリン酸緩衝生理食塩水中で十分透析した後で、濾過を行い、ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインを含む培養液を得た。
【００８９】
上記で得られたヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインを含む培養液から目的タンパク質を精製した。精製には、ＨｉｓＴｒａｐ（ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた。精製後のヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン溶液は、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に０．１５ＭＮａＣｌを添加した緩衝液で十分透析処理して精製ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン（実施例４）を得た。
（１５）ＲＡＧＥ結合性評価
先ず、９６穴マイクロプレート（ＮＵＮＣ）に各種ＡＧＥ（ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）、ＡＧＥ３（比較例３））とネガティブコントロールであるＢＳＡ（比較例１１）をそれぞれ固相化した。固相化条件は、リン酸緩衝生理食塩水で２０μｇ／ｍｌに希釈した調製液を１００μｌ添加して、４℃、１２時間とした。固相化反応後、０．５％ＢＳＡリン酸緩衝生理食塩水で室温、２時間でブロッキング処理した。ブロッキング処理後に、リン酸緩衝生理食塩水に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を添加した洗浄液（ＰＢＳＴ）で１回洗浄して、０．５μｇ／ｍｌに調製した精製ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメイン溶液を１００μｌ添加して、室温で２時間振とう反応した。反応後に、ＰＢＳＴで３回洗浄して、０．１μｇ／ｍｌに調製した抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体溶液（ＱＩＡＧＥＮ）を室温、１時間反応させた。更にＰＢＳＴで３回洗浄後、抗マウスＩｇＧ抗体ＨＲＰ標識（Ｚｙｍｅｄ）を室温、３０分間反応させた。反応後、３回洗浄して、発色液を入れて、室温、３０分間発色させ、停止液を添加して発色反応を止めて、発色液の吸光度を測定することでＲＡＧＥ結合性を評価した（図１０）。ヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインは、ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）に対して結合性を示さなかった。
（１６）単球由来細胞を用いた生物反応評価
ヒト単球由来細胞株（ＴＨＰ−１）に対する炎症反応誘導への影響を評価した。培養液はＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＣＳ、２−ＭＥ、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加した培地を用いた。培養器は９６穴培養プレート（ＣＯＳＴＡＲ）を使用した。各ウェルに細胞密度が３×１０５個／ｍｌで２００μｌになるように撒いた。各種ＡＧＥ（ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）、ＡＧＥ３（比較例３））とネガティブコントロールであるＢＳＡ（比較例１１）は濃度が２００μｇ／ｍｌになるように培地中に添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。培養後の培養上清を回収して、培養液中に放出されたＭＣＰ−１の濃度を測定することで炎症反応誘導性を評価した（図１１）。ＭＣＰ−１の測定は抗ＭＣＰ−１抗体を使ったサンドイッチＥＬＩＳＡで評価した。評価した結果、ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡは、ヒト単球由来細胞株の炎症反応を誘導しなかった。つまり、細胞種特異的な生物反応を示し、それはヒトＲＡＧＥ細胞外ドメインとの結合性と相関する結果となった。更には、神経細胞に対する細胞死誘導は、ＲＡＧＥとは異なる受容体を経由して引き起こされる生物反応であることが明らかとなった。
（１７）ヒト血液中のＡＡ−ＡＧＥ量測定
アルコール依存症者（１０名）と健常者（１０名）の血液中のＡＡ−ＡＧＥ量を測定した。アルコール依存症者は入院後数週間断酒した状態で採血して血清を得た。健常者も同じく５日間断酒したボランティアから採血して血清を得た。ＡＡ−ＡＧＥ量は抗ＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３）を用いた拮抗型ＥＬＩＳＡ法で評価した。詳しくは、ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）をＣｏａｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに１μｇ／ｍｌになるように溶解し、９６ウェルのＨｉｇｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｅ．Ｉ．Ａ／Ｒ．Ｉ．Ａ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｐｌａｔｅｓの各ウェルに１００μｌずつ加え４℃で一晩吸着させ固相化した。Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを１５０μｌ加え室温で１時間インキュベートしてブロッキングを行った。洗浄後、非競合法の場合には固相化したＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ（実施例２）とＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３、５０μｌ；希釈倍率１：１０００）との反応にヒト血清（５０μｌ）を競合させた。どちらの場合も３０℃、振とう条件下で２時間インキュベートした。洗浄後、次にＤｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで希釈した１００μｌのＡｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＰ）標識したヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（希釈倍率１：２０００）を２次抗体として加え、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌのＡＰ基質キット溶液を加え３７℃で１時間インキュベート後、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ５５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で４０５ｎｍの吸光度を測定した（図１２）。測定した結果をＴ検定した結果、アルコール依存症者で有意に高値のＡＡ−ＡＧＥ量が検出された（ｐ＜０．０５）。つまり、ヒト血液中のＡＡ−ＡＧＥ量を測定することで、アルコール依存症状態を判別することができた。
（１８）肝組織中のＡＡ−ＡＧＥ検出
Ｗｉｓｔｅｒ系ラットをエタノール（アルコール群）あるいは等カロリーの炭水化物（コントロール群）含有の液体試料でｐａｉｒ−ｆｅｅｄｉｎｇを８週間行った。ラットを飼育４〜８週目に於いて肝組織を病理組織学的に観察するとともに、ＡＡ−ＡＧＥ抗体を用いて免疫組織化学的に染色した。肝組織はパラフィン処理した後で、脱パラフィン処理およびキシレンを除去してＰＢＳ洗浄を３回行った。抗原性を回復させる目的で２０％硫酸亜鉛水溶液中で電子レンジを用いて１０分間煮沸処理した。さらに、３％過酸化水素水で室温、１０分間処理して、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、１０％正常ヤギ血清で１０分間処理して、溶液をキムワイプ（登録商標）で軽く吸い取った。次に、抗ＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３）を４℃、１２時間静置反応して、ＰＢＳ洗浄を３回行った。ＳＬＡＢ２キット／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）を使って処理を行い、ＤＡＢ発色試薬を用いてＡＡ−ＡＧＥの存在する部分を染色した（図１３）。染色結果から、アルコール群でのみ中心静脈周辺の肝組織が染色され、ＡＡ−ＡＧＥが発生、蓄積されていることがわかった。つまり、アルコール性肝障害とＡＡ−ＡＧＥの相関性が指摘された。
（１９）脳組織中のＡＡ−ＡＧＥ検出
Ａｕｓｔｒｏ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｎｋ（Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ大学）から入手したヒト脳組織中のＡＡ−ＡＧＥ検出を行った。ヒト脳組織は健常者（２検体）及びアルコール依存症患者（２検体）の双方に於けるＡＡ−ＡＧＥ検出を行った。アルコール患者の病理判定は、ＤＳＭ−３（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）診断基準に従い、更に、他の精神医学上の疾患及びアルコール以外の薬剤依存症がない患者のみに限定した。評価対象組織は、眼窩前頭皮質を選択した。先ず、５０μｇの脳組織ホモジネートを２−メルカプトエタノール不含の１％ＳＤＳ溶液で処理して、５−２０％ＴグラジエントゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをＣＢＢ染色したもの、また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＡＡ−ＡＧＥ抗体（実施例３）を用いて、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法を行った結果を図１４に示した。サンプルは、左から分子量マーカー、そして、レーン１及び２は健常者であり、レーン３及び４はアルコール依存症患者である。つまり、アルコール患者の脳組織にはＡＡ−ＡＧＥ（実施例３）と反応する分子量１５０ｋＤ〜２５０ｋＤ範囲の物質が存在することがわかった。
【００９０】
【発明の効果】
本発明により、初めて、生物反応を引き起こすことができるアマドリ転位反応以降の低分子アルデヒド由来前進性反応産物を安定して提供することが可能となった。また、該低分子アルデヒド由来前進性反応産物を免疫原とすることで、生物反応を引き起こすアマドリ転位反応以降の低分子アルデヒド由来前進性反応産物に対する特異的抗体も安定して提供可能となった。更には、該抗体の製造方法を鋭意検討することで、低分子アルデヒド由来前進性反応産物の特異的検出ばかりでなく、該前進性反応産物が媒介する生物反応の中和も初めて可能となった。
【００９１】
本発明で得られた低分子アルデヒド由来前進性反応産物は、医薬設計のためのスクリーニング材料、診断材料、食品の劣化度評価等の用途に用いることが出来る。医薬設計のためのスクリーニング用途については、低分子アルデヒド由来前進性反応産物の抗原提示性評価や細胞や動物を用いた生物活性評価の品質が安定して扱える標品として利用可能である。特に、抗体やペプチドや合成化合物等で設計し得ることが可能なアンタゴニストのスクリーニング用途には、品質が安定して大量供給可能な標品が必要であり、大いに利活用できる。また、診断材料の開発に対する用途についても、品質が安定して扱える標品を提供する形で見出すことが出来る。また、低分子アルデヒドに対する抗体を作製する免疫原や抗原としても提供可能である。一番期待できる診断用途は、アルコール性慢性疾患、例えば、アルコール性神経疾患、肝障害、代謝障害等の診断であるが、アセトアルデヒドに代表される低分子アルデヒドは、アルコール摂取以外にも代謝等で体内に発生することが十分予想され、アルコール性慢性疾患以外にも、アルツハイマー等の一般の慢性神経疾患や腎症、糖尿病、高脂血症、透析合併症、老化、血管障害、アミロイド症等の様々な酸化ストレスが発生しうる疾患対象にも、安定した標品を提供する形で利活用できる。更には、人体以外にも、植物をはじめ肉、魚等の生食品や加工食品の劣化試験の標品としても利用できる。更には、香料等の食品、化粧品、衣類、住居等への人工添加物の影響を評価する安定した標品としても提供可能である。
【００９２】
本発明で得られた低分子アルデヒド由来前進性反応産物に対する抗体は、上記同様に、医薬設計のためのスクリーニング材料、診断材料、食品の劣化度評価等の用途に用いることが出来る。医薬設計のためのスクリーニング用途については、低分子アルデヒド由来前進性反応産物に対する抗原提示性評価の抗体標品や細胞や動物に対する生物活性評価の影響を抗体価上昇とした指標で評価する際にポジティブコントロールとしての抗体標品として利用可能である。特に、生物活性を中和する抗体は、アンタゴニストのスクリーニング用途、または、アンタゴニストそのものとして利活用可能であり、更には、品質が安定して大量供給可能な抗体標品として大いに利活用できる。また、診断材料の開発に対する用途についても、生物活性を中和することを必須条件とせずに抗体標品を提供する形で見出すことが出来る。また、低分子アルデヒド由来前進性反応産物の精製状況を微量検出する高感度測定用抗体としても提供可能である。一番期待できる診断用途は、アルコール性慢性疾患、例えば、アルコール性神経疾患、肝障害、代謝障害等の診断であるが、アセトアルデヒドに代表される低分子アルデヒドは、アルコール摂取以外にも代謝等で体内に発生することが十分予想されるため、抗体の製造方法を鋭意検討することで、アルコール性慢性疾患以外にも、アルツハイマー等の一般の慢性神経疾患や腎症、糖尿病、高脂血症、透析合併症、老化、血管障害、アミロイド症等の様々な酸化ストレスが発生しうる疾患対象にも、抗体を用いた検出材料を提供する用途ととして利活用できる。更には、人体以外にも、植物をはじめ肉、魚等の生食品や加工食品の劣化試験の検出材料としても利用できる。更には、香料等の食品、化粧品、衣類、住居等への人工添加物の影響を評価する安定した検出標品としても提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の低分子アルデヒド由来前進性反応産物の一実施例の反応概要図である。
【図２】実施例２の低分子アルデヒド由来前進性反応産物（ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ）と比較例７（ＮＥＬ−ＢＳＡ）、比較例８（ＣＭＬ−ＢＳＡ）、比較例９（ＣＥＬ−ＢＳＡ）の蛍光特性のグラフを示す図面である。
【図３】ＡＡ−ＡＧＥ−ＲＳＡで免疫したウサギから得た血清のＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ吸着画分をＮＥＬ−ＡＧＥ−ＢＳＡ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂに吸着させ、溶出させた各画分の２８０ｎｍの吸光度のグラフを示す図面である。
【図４】（１）未修飾のＢＳＡ、（２）ＮＥＬ−ＢＳＡ、（３）ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡを電気泳動しＣＢＢ染色したゲル（Ｉ）およびウエスタンブロットしたメンブレン（ＩＩ）の写真を示す図面である。
【図５】固相化したＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡに対する抗ＡＡ−ＡＧＥ抗体の反応との各種ＡＧＥ−ＢＳＡの競合をＥＬＩＳＡ法で測定した結果のグラフを示す図面である。
【図６】本発明の低分子アルデヒド由来前進性反応産物のラット胎仔大脳皮質神経細胞に対する生物反応を顕微鏡で撮影した写真を示す図面である。
【図７】本発明で得られた低分子アルデヒド由来前進性反応産物の生物反応性をＭＴＴ法で測定した結果のグラフを示す図面である。
【図８】本発明で得られた低分子アルデヒド由来前進性反応産物に対する抗体の低分子アルデヒド由来前進性反応産物に由来する生物反応の中和作用をＭＴＴ法で測定した結果のグラフを示す図面である。
【図９】本発明で得られた低分子アルデヒド由来前進性反応産物に対する抗体の低分子アルデヒド由来前進性反応産物に由来する生物反応の中和作用を顕微鏡で撮影した写真を示す図面である。
【図１０】本発明で得られた低分子アルデヒド由来前進性反応産物がＲＡＧＥ非結合性である結果のグラフを示す図面である。
【図１１】本発明で得られた低分子アルデヒド由来前進性反応産物がヒト単球由来細胞株の炎症反応を誘起しない結果のグラフを示す図面である。
【図１２】アルコール依存症者と健常者の血液中のＡＡ−ＡＧＥ量を測定した結果を示す図面である。
【図１３】アルコール多加摂取のラット肝臓の中心静脈周辺にＡＡ−ＡＧＥが存在する写真（ＸＶ）〜（ＸＸ）を示す図面である。
【図１４】（１）健常者１、（２）健常者２、（３）アルコール依存症患者１、（４）アルコール依存症患者２の脳組織ホモジネート物を電気泳動しＣＢＢ染色したゲル（ＸＸＩ）およびウエスタンブロットしたメンブレン（ＸＸＩＩ）の写真を示す図面である。
【符号の説明】
（１）未修飾ＢＳＡ
（２）ＮＥＬ−ＢＳＡ
（３）ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ
（Ｉ）電気泳動しＣＢＢ染色したゲル
（ＩＩ）ウエスタンブロットしたメンブレン
（ＩＩＩ）：０．２５ｍｇ／ｍｌ−ＢＳＡ添加時の培養細胞
（ＩＶ）：０．５ｍｇ／ｍｌ−ＢＳＡ添加の培養細胞
（Ｖ）：１ｍｇ／ｍｌ−ＢＳＡ添加の培養細胞
（ＶＩ）：２ｍｇ／ｍｌ−ＢＳＡ添加の培養細胞
（ＶＩＩ）：０．２５ｍｇ／ｍｌ−ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ添加の培養細胞
（ＶＩＩＩ）：０．５ｍｇ／ｍｌ−ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ添加の培養細胞
（ＩＸ）：１ｍｇ／ｍｌ−ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ添加の培養細胞
（Ｘ）：２ｍｇ／ｍｌ−ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ添加の培養細胞
（ＸＩ）：ＢＳＡ添加の培養細胞
（ＸＩＩ）：ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ添加の培養細胞
（ＸＩＩＩ）：ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ＋ＮＥＬ抗体共添加の培養細胞
（ＸＩＶ）：ＡＡ−ＡＧＥ−ＢＳＡ＋ＡＡ−ＡＧＥ抗体共添加の培養細胞
（ＸＶ）：コントロール群（４週飼育、２００倍）
（ＸＶＩ）：アルコール群（４週飼育、２００倍）
（ＸＶＩＩ）：アルコール群（６週飼育、２００倍）
（ＸＶＩＩＩ）：アルコール群（８週飼育、２００倍）
（ＸＩＸ）：アルコール群（８週飼育、４００倍）
（ＸＸ）：アルコール群（８週飼育、４００倍）
（ＸＸＩ）電気泳動しＣＢＢ染色したゲル
（ＸＸＩＩ）ウエスタンブロットしたメンブレン
【図１】
2004155753.tif 000002
【図２】
2004155753.tif 000003
【図３】
2004155753.tif 000004
【図４】
2004155753.tif 000005
【図５】
2004155753.tif 000006
【図６】
2004155753.tif 000007
【図７】
2004155753.tif 000008
【図８】
2004155753.tif 000009
【図９】
2004155753.tif 000010
【図１０】
2004155753.tif 000011
【図１１】
2004155753.tif 000012
【図１２】
2004155753.tif 000013
【図１３】
2004155753.tif 000014
【図１４】
2004155753.tif 000015