(57)【要約】      （修正有）【課題】動物細胞に分化誘導因子を添加する分化誘導培養や立体的な分化誘導培養において、目的の細胞へ分化誘導する効率を上げること。【解決手段】動物細胞を平面培養したのちに立体的培養すること、あるいは、２種類以上の分化誘導因子を添加することを特徴とする動物細胞の分化誘導培養方法に関する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．動物細胞を平面培養したのちに立体的培養することを特徴とする分化誘導培養方法。
２．動物細胞が骨髄細胞である請求項１に記載の分化誘導培養方法。
３．骨髄細胞を軟骨細胞に分化誘導することを特徴とする請求項２に記載の分化誘導培養方法。
４．立体的培養がゲル包埋培養であることを特徴とする請求項３に記載の分化誘導培養方法。
５．２種類以上の分化誘導因子を添加することを特徴とする動物細胞の分化誘導培養方法。
６．トランスフォーミング増殖因子ベータとインシュリン様増殖因子を添加することを特徴とする骨髄細胞の軟骨細胞への分化誘導培養方法。
７．トランスフォーミング増殖因子ベータとインシュリン様増殖因子を含むことを特徴とする骨髄細胞から軟骨細胞への分化誘導培地組成物。
８．トランスフォーミング増殖因子ベータとインシュリン様増殖因子を添加することを特徴とする請求項３に記載の分化誘導培養方法。
９．トランスフォーミング増殖因子ベータとインシュリン様増殖因子を添加することを特徴とする請求項４に記載の分化誘導培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、動物細胞の分化誘導培養方法に係わる。
【０００２】
【従来の技術】
近年、初代動物細胞に含まれるヒト間葉系幹細胞、神経幹細胞など幹細胞を用いた組織再生に関する基礎的知見が多々発見されその臨床応用に期待が寄せられている。しかし、一般に動物やヒト体内から分離された細胞には、幹細胞以外の細胞が含まれていることが多い。たとえば、骨髄から採取した初代細胞の中には間葉系幹細胞以外の血液細胞が多量に含まれており、間葉系幹細胞の割合はわずかに０．０１〜０．００１％といわれている。（宿南ら、細胞、３３（３），８４−８７，２００１）また、肝臓からコラゲナーゼ灌流法で得られた初代細胞の中には、肝幹細胞といわれている小型肝細胞以外に、通常の肝実質細胞や肝非実質細胞が多量に含まれており、この中での肝幹細胞の割合は、わずかに１％程度以下と報告されている。（立野ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３１（１），６５−７４，２０００）これら少数の幹細胞あるいは前駆細胞を増殖させてその数を増やした後に目的の細胞へと分化誘導することが必要である。これらの幹細胞を目的とする細胞へと分化させるには、増殖因子やサイトカインなどの分化誘導因子の添加が行われる。しかし、これらの分化誘導因子は幹細胞を目的の細胞に分化誘導する以外に、他の細胞へ分化誘導したり、増殖を促進したりするなど、異なる複数種の活性を持つことが多い。また、分化誘導因子が細胞を癌化することもある。そのため分化誘導因子を添加して培養しても、目的の細胞だけを得ることは困難であり、その結果異なる種類の細胞やガン細胞を含むこととなる。したがって、分化の結果生じる目的の細胞の割合が極めて低くなったり、ガンを併発するなど臨床応用上好ましくない。実際、ある幹細胞が目的の細胞へ分化した、と学会などで発表される場合でも、培養されている細胞のごく一部分だけが目的の細胞へ分化していることを示しているものがほとんどである。したがって、現行の技術では、初代動物細胞に少数含まれる幹細胞に対して分化誘導因子を作用させて目的の細胞への分化が、培養中の細胞集団の一部分のみで確認されているだけであり、このままでは臨床応用上の問題があるといわざるを得ない。
【０００３】
また幹細胞を分化させて組織を構築する場合、立体的に培養することにより立体的な組織を獲得する必要がある。立体的に培養する方法としては、不織布や多孔性ビーズなどを用いる培養法や、コラーゲンやアガロースなどのゲルに細胞を包埋して培養する方法などがある。これらの立体的培養方法において、これら立体的な培養物の外側に添加する培養液に分化誘導因子を加えるが、これらの分化誘導因子が立体培養されている細胞に到達するには、分化誘導因子が立体培養の中を拡散して細胞に達する必要があり、拡散速度が遅いため実質的な分化誘導速度が遅くなるという問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、動物細胞に分化誘導因子を添加する分化誘導培養や立体的な分化誘導培養において、目的の細胞へ分化誘導する効率を上げることを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は少なくとも、動物細胞を平面培養したのちに立体的培養すること、あるいは、２種類以上の分化誘導因子を添加することを特徴とする動物細胞の分化誘導培養方法に関する。
【０００６】
本発明における「動物細胞」の由来する動物の種類としては鳥類、爬虫類、両生類、魚類、哺乳類などを挙げることができる。哺乳類動物としては、たとえばヒト、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ネズミなどを例としてあげることができる。また、動物から採取してから一般的に５０回程度までの限られた回数のみ分裂、増殖できる初代細胞および動物から採取された後一般に５０回以上の多数回分裂、増殖できる細胞株の両方とも用いることができる。初代細胞の例として、ラット初代肝細胞、マウス初代骨髄細胞、ブタ初代肝細胞、ヒト初代臍帯血細胞、ヒト骨髄間葉系幹細胞、ヒト軟骨細胞などを挙げることができる。細胞株の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ細胞、ヒト子宮癌細胞株ＨｅＬａ、アフリカミドリザル腎細胞株Ｖｅｒｏ細胞、ヒト肝ガン細胞株Ｈｕｈ７細胞などを挙げることができる。また、以上にあげた細胞に対して、プラスミドの導入、ウイルス感染などの手段により遺伝子操作を施して得られた細胞も本発明で用いることができる。チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ細胞）とは、チャイニーズハムスターの卵巣組織から分離された全ての細胞株およびそれらに遺伝子操作を施して得られた細胞株であり、たとえばＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ１−１５５００株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６０６）、ＣＨＯ  ＤＧ４４株などを例としてあげることができる。
【０００７】
本発明における「平面培養」の例としては、プラスチックディッシュ、ガラスシャーレの培養器底面に細胞を接着させて培養する培養、マイクロキャリアー担体などマクロ的に見ると立体的ではあるが局部的に見ると平面とみなせる面に細胞を接着させて培養する場合などを挙げることができる。
【０００８】
本発明における「立体的培養」の例としては、不織布、織物やセラミックス、多孔性ビーズなどの多孔性担体に接着させて培養する場合や、ゲルなどに包埋して培養する場合を挙げることができる。本発明に用いる不織布や織物に含まれる繊維素材としては、セルロースなどの天然繊維、ポリエステル、ポリプロピレンなどの合成化合物およびこれらの混合物、ポリＬ乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）などの生体吸収性をもった生体吸収性ポリマーなどがある。繊維の太さ、繊維間の距離、布の厚さなどは、培養したい細胞の密度などに応じて適宜選択すればよい。これらの繊維素材を、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチンなどの天然の細胞外マトリクスやエチレンビニルアルコール共重合体などの非天然化合物によりコーティングし、親水化しても良い。また、ジエチルアミン、ジエチルアミノエチルなどにより修飾したり、プラズマ放電処理などを施し、表面に荷電基を導入しても良い。  本発明におけるゲルの例としては、コラーゲン、アガロースなどの天然ポリマーをゲル化させたものや、これらに生理活性ペプチドを付加するなどの修飾をくわえたポリマーなど、および非天然のゲルなどを挙げることができる。
【０００９】
本発明における「分化誘導培養」の例としては、骨髄間葉系幹細胞からの軟骨細胞への分化誘導、骨髄間葉系幹細胞からの骨芽細胞への分化誘導、骨髄造血幹細胞からのリンパ球細胞への分化誘導、骨髄造血幹細胞からの樹状細胞への分化誘導、胚性幹細胞からの心筋細胞への分化誘導、肝幹細胞からの肝実質細胞への分化誘導、神経幹細胞からの神経細胞への分化誘導、などを挙げることができる。
【００１０】
本発明における「骨髄細胞」の例としては、骨髄間葉系幹細胞、骨髄造血幹細胞、骨髄ストローマ細胞、などを挙げることができる。
【００１１】
本発明における「軟骨細胞」の例としては、関節軟骨細胞、硝子軟骨細胞などを挙げることができる。
【００１２】
本発明における「ゲル包埋培養」の例としては、細胞を含ませたコラーゲン、アガロースなどをゲル化し、ゲルに細胞を含んだ状態で培養する方法などを挙げることができる。
【００１３】
本発明における「分化誘導因子」の例としては、増殖因子、サイトカインなどを挙げることができる。増殖因子としては、例えば塩基性線維芽細胞成長因子、表皮成長因子、血小板由来成長因子、トランスフェリン、血清アルブミン及びインシュリン、並びにコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞外マトリックス成分が使用できる。塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、脳下垂体、脳、網膜、黄体、副腎、腎、胎盤、前立腺、胸腺などの臓器より抽出されるもの、組み換えＤＮＡ技術などの遺伝子工学的手法で製造されるもの、さらにこれらの修飾体であって繊維芽細胞増殖因子として作用し得るものを含む。ｂＦＧＦの修飾体としては、例えば上記の抽出により得られたまたは遺伝子工学的手法で得られたｂＦＧＦのアミノ酸配列においてアミノ酸が付加されたもの、アミノ酸の一部が他のアミノ酸で置換されたもの、またはアミノ酸の一部が欠損したものなどが挙げられる。サイトカインの例として、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＭＧＦ（ＳＣＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ３融合タンパクなどを挙げることができる。
【００１４】
本発明における「トランスフォーミング増殖因子ベータ」の例としては、ヒト由来、ウマ由来、ニワトリ由来などを挙げることができるが、これらをもとにした組換えタンパク質や潜在型でもよい。
【００１５】
本発明における「インシュリン様増殖因子」の例としては、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ソマトメジン、インシュリン、プロインスリンなどを挙げることができる。
【００１６】
【実施例】以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００１７】
【実施例１】
インフォームドコンセントをへて３人の健常人ボランティアの堆骨から１３ｍｌづつ採取した骨髄液中の有核細胞数を定法に従いチュルク液を用いて計数し、下記の培地を用いてそれぞれ細胞濃度が６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように細胞培養用ディッシュ（コーニング社製、底面積５５ｃｍ２、培養液量１０ｍｌ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内で静置培養した。培地としては、ＤＭＥＭ（ギブコ社製、型番３１６００−３４）に１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製、ロット番号２６１４０−０７９）を添加したものを用いた。培養開始後１日後と２日後に培地交換し、浮遊細胞を除去したところ、何れの培養でもディッシュ底面にわずかに接着細胞が認められた。その後、接着細胞がコンフルエント近くまで増殖したのを顕微鏡で確認した１９日後に、すべてのディッシュの接着細胞をトリプシン処理により剥離し、トリパンブルー液を用いて接着していた生細胞の密度を計数した。これを骨髄間葉系幹細胞として以下の培養に用いた。
【００１８】
この細胞を以下の２通りの方法で軟骨細胞へ分化誘導し、三次元の軟骨組織を作成した。培養には、ＤＭＥＭハイグルコース培地にＴＧＦ−β３（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した分化誘導培地を用いた。
【００１９】
まづ、最初から三次元培養（３Ｄ）を行った。氷浴中の１５ｍｌ容遠心管の中でＤＭＥＭ培地（１０倍濃度、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）０．９ｍｌ、Ｈｅｐｅｓ（１００倍濃度）０．０９ｍｌ、ＮａＨＣＯ３（１００倍濃度）０．０９ｍｌ、抗生物質０．０９ｍｌ、蒸留水０．６３ｍｌ、ウシ胎仔血清１ｍｌをこの順によく混合しながら加え、このうちの３６０μＬに上記の骨髄間葉系幹細胞（１０×１０５ｃｅｌｌｓ）を加えよくピペッティングした。さらに、コラーゲン（高研、０．５％）を９２０μｌ加え十分混合した。そして、底部にＰＬＧＡメッシュの円盤（Ｊ＆Ｊ社製、厚み０．２５ｍｍ、直径６．３ｍｍ、かさ体積８μＬ）を５枚敷いた９６穴ウェルプレート（ＳＵＭＩＬＯＮ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＳ−８０９６）に、本混合液を４０μＬ注入した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内に移し、３０分間コラーゲンをゲル化させた。ゲルの上に上記の分化誘導培地を重層し、１週間後に培地交換し、２週間まで培養した。
【００２０】
これとは別に、二次元培養した後に三次元培養する培養（２Ｄ／３Ｄ）も行った。すなわち、上記の骨髄間葉系幹細胞を１００φディッシュに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度に播種し１週間培養した（２Ｄ培養）。この後、ディッシュ底面に接着した細胞をトリプシン処理により剥離、回収し、該細胞を用いて上記の３Ｄ培養を１週間行った。
【００２１】
これらの３Ｄ培養した細胞およぴ２Ｄ／３Ｄ培養した細胞を回収し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により、軟骨特有のタンパク質であるアグリカンのｍＲＮＡ発現量を調べた。この際、初代ヒト軟骨細胞の発現量を１００％とした。
【００２２】
その結果、３Ｄ培養により分化誘導した場合が１０．５％であったのに対し、２Ｄ／３Ｄ培養により分化誘導した場合は３２．５％と、明らかに軟骨細胞への分化割合が高かった。
【００２３】
【実施例２】
実施例１と同様に調製した骨髄間葉系幹細胞を２週間の３Ｄ培養により分化誘導した。その際に、分化誘導培地として、ＤＭＥＭハイグルコース培地にＴＧＦ−β３（１０ｎｇ／ｍｌ）またはインシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＧＦ−β３とＩＧＦの両方を添加した培地を用いた。これらの３Ｄ培養した細胞をそれぞれ回収し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により、軟骨特有のタンパク質であるアグリカンのｍＲＮＡ発現量を調べた。この際、初代ヒト軟骨細胞の発現量を１００％とした。
【００２４】
その結果、ＴＧＦ−β３単独添加の場合が１１．５％、ＩＧＦ単独添加の場合が７．５％であったのに対して、これらの両方を混合添加したものは３５．４％と明らかに高い発現が得られた。
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【発明の効果】以上示したように、本発明によれば動物細胞を効率よく分化誘導することができる。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月2日(2003.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】分化誘導培養方法が軟骨細胞への分化割合に及ぼす影響
【図２】分化誘導因子の混合添加が軟骨細胞への分化割合に及ぼす影響
【符号の説明】
３Ｄ：三次元培養、  ２Ｄ／３Ｄ：二次元培養した後に三次元培養する培養、  ＴＧＦ−β３：トランスフォーミング増殖因子ベータ３、  ＩＧＦ：インシュリン様増殖因子