(57)【要約】【課題】本発明は、高濃度のトリニトロトルエン（ＴＮＴ）を生物化学的に分解し得る新規な微生物と、これを用いた高濃度トリニトロトルエンの効率的な分解方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、トリニトロトルエンの分解能が２５０ｍｇ／Ｌ以上であるグラム陰性の細菌株に関する。より詳しくは、２５０ｍｇ／Ｌ以上のトリニトロトルエンを分解して無機化するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌株に関する。また、本発明は、上記細菌株を用いて、２５０ｍｇ／Ｌ以上のトリニトロトルエンを分解するトリニトロトルエンの分解方法、就中、トリニトロトルエンを分解して無機化するトリニトロトルエンの分解方法に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリニトロトルエン（ＴＮＴ）の分解能が２５０ｍｇ／Ｌ以上であるグラム陰性の細菌株。
【請求項２】
トリニトロトルエン（ＴＮＴ）の分解能が１０００ｍｇ／Ｌ以上である請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
トリニトロトルエン（ＴＮＴ）を分解して無機化する請求項１又は２に記載の菌株。
【請求項４】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌株である請求項１〜３の何れかに記載の菌株。
【請求項５】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２２３である請求項１に記載の菌株。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかに記載の菌株を用いることを特徴とする、トリニトロトルエン（ＴＮＴ）の分解方法。
【請求項７】
トリニトロトルエン（ＴＮＴ）を分解して無機化する請求項６に記載の分解方法。
【請求項８】
２５０ｍｇ／Ｌ以上のトリニトロトルエン（ＴＮＴ）を分解する請求項７に記載の分解方法。
【請求項９】
１０００ｍｇ／Ｌ以上のトリニトロトルエン（ＴＮＴ）を分解する請求項８に記載の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、世界中の火薬製造工場などにおけるトリニトロトルエン（ＴＮＴ）廃棄処理やＴＮＴ汚染土壌の環境浄化に大いに貢献し得る新規な細菌株と、これを用いた高濃度ＴＮＴの分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
第二次世界大戦をはじめとする活発な軍事活動によって、トリニトロトルエン（以下、ＴＮＴと略す。）などを使用した爆薬は２０世紀に大量に製造されてきた。その見積もりはＴＮＴだけでも１，０００，０００ｋｇ／年とされている。ＴＮＴは爆薬の中でも高い毒性を有する化学物質の一つであり、肝臓障害やメトヘモグロビン血症（赤血球が芳香族ニトロ化合物に取り囲まれ、酸素の輸送が不可能になる病気）などの原因物質となっている。ＴＮＴは芳香環に三つの電子吸引性の高いニトロ基が規則正しく配置しており、その影響により芳香環のπ電子が欠如した状態となる。このようなＴＮＴ特有の化学的な特性によって、生分解が比較的困難な化合物として環境中で挙動する。その理由から、ＴＮＴをはじめとするニトロ芳香族化合物は生物圏に残留しやすく、人間を始めとした哺乳類、魚、藻類や、微生物などの生物に対して毒性や突然変異性を与え続けている。また、ＴＮＴなどの火薬類は爆発の危険性から、離れた場所に大量に保存される傾向にあったために、一度汚染が進行すると、比較的高濃度の環境汚染が生じ、その結果、生物圏に対して不適合な環境へと変化させた。アメリカ合衆国、ドイツやカナダなどでは、第二次世界大戦などの軍事活動が原因となり、ＴＮＴなどの火薬による土壌・水汚染が深刻な問題となっている。いくつかの産業工場付近の土壌や堆積物において、土壌１ｋｇあたりＴＮＴ１０ｇ以上にも及ぶ汚染事例も存在する。
現在、ＴＮＴの処理は、主に焼却処分である。しかし、この処理法は高価であることや地球温暖化の原因ガスである窒素酸化物（ＮＯｘ）の放出などの問題、更にはその焼却灰は危険廃棄物として処理しなければならないという理由などから大いに懸念が持たれている。
一方、いくつかのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などの細菌がＴＮＴを生分解することが報告されているが（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３等参照）、それらの細菌が処理できるＴＮＴ濃度は１００ｍｇ／Ｌ以下と低く、到底実用化に耐えない。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ：１７５，２２７８−２２８３（１９９３）
【非特許文献２】
Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ：５４，６０５−６１８（２０００）
【非特許文献３】
Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ：９４，５７−６１（２００２）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した如き現状に鑑みなされたもので、高濃度のＴＮＴを生物化学的に分解し得る新規な微生物と、これを用いた高濃度ＴＮＴの効率的な分解方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＴＮＴの分解能が２５０ｍｇ／Ｌ以上であるグラム陰性の細菌株に関する。
【０００６】
また、本発明は、上記菌株を用いることを特徴とする、ＴＮＴの分解方法に関する。
【０００７】
本発明者らは、ＴＮＴと酢酸を加えたＭ８最少培地にＴＮＴ汚染地から採取した土壌を添加し、ＴＮＴを生分解する微生物をスクリーニングした。そして、生育したコロニーを分離し、試験したところ、全てのクローンはグラム陰性の桿菌、ブドウ糖非発酵性であることが判明した。更に、これらの菌株についてアピ２０ＮＥシステム（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）に基づいた炭素源の資化性や生化学的な試験を行った結果、全てのクローンがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに属する細菌であることがわかった。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌がＴＮＴを分解することは既に知られている。しかし、ＴＮＴは細胞毒性があるために、これまで知られているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌では１００ｍｇ／Ｌ以下のＴＮＴしか分解出来ないことは既に報告されている通りである（例えば、前記非特許文献２等参照。）。
今回、本発明者らがスクリーニングした菌株の中に、特に高濃度（２５０ｍｇ／Ｌ以上）のＴＮＴを生分解する菌株を発見し、本発明に到達した。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の菌株について生化学的／生理学的性質及び１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子相同性解析によって同定を行ったところ、下記の表１に示すような性質を示し、また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｖｏｒａｎｓの近縁に位置する菌株であることが判った（表２参照。）。
【０００９】
【表１】
2004254505.tif 000002
【００１０】
【表２】
2004254505.tif 000003
【００１１】
本菌株は特に高濃度のＴＮＴを分解できるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の新菌種と判断されるので、本発明者らは本菌株をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５と命名した。
本菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５の凍結乾燥標品は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００３年２月２１日付で受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２２３として受託された。
このＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５は特徴的にＴＮＴ分解能が高く、他の分離した菌株や文献値の、２．５倍は疎か約１０倍の、１０００ｍｇ／ＬのＴＮＴ濃度に対する分解能が見られた（図１及び表３参照。）。
なお、図１中、−○−はＴＮＴ濃度１００ｍｇ／Ｌ、−●−はＴＮＴ濃度２５０ｍｇ／Ｌ、−△−はＴＮＴ濃度５００ｍｇ／Ｌ、−▲−はＴＮＴ濃度１０００ｍｇ／Ｌの場合をそれぞれ示す。
【００１２】
【表３】
2004254505.tif 000004
【００１３】
また、ＴＮＴの全有機炭素をＴＯＣ測定によって経時的に追跡した結果、この菌株によってＴＮＴがほぼ完全に無機化されることが明らかとなった（図２参照。）。
なお、図２中、−○−は酢酸のみの場合、−●−はＴＮＴ＋酢酸の場合をそれぞれ示す。
本菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５を用いたＴＮＴの分解方法を利用した環境浄化法は、ｉｎ−ｓｉｔｕで比較的安価に処理することができ、また高効率に無機化することが出来るので、有害物質（副産物）を生成することなく効率的な浄化が実現できる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００１５】
実施例１  スクリーニングおよび細菌の同定
ＴＮＴ（１００ｍｇ／Ｌ）と酢酸（１０ｍＭ）を窒素源及び炭素源とした１００ｍｌのＭ８最少培地に北九州市山田緑地（１９３４年から旧日本軍によってＴＮＴ火薬の填薬所として、また、戦後も米軍により約２０年間弾薬庫として利用されており、ＴＮＴなどの爆薬による土壌・水汚染等の環境汚染が生じていると考えられる地域）の土壌を湿重量２０ｇ添加し、３０℃で１週間振とう培養した。その後、連続希釈した液を同様のＭ８最少寒天培地に塗布して培養し、この条件下で生育したコロニーを分離した。単離した全てのコロニーについて、グラム染色、ヒューレイフソン培地を用いてＯＦ試験、及びアピ２０ＮＥシステム（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）試験を行った結果、全てＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌であることが判明した。
スクリーニングによって獲得した菌株の中でＴＮＴ分解能の高いもの（実施例２の方法で測定した）を選び、その菌株について、形態的および生化学的性質を調べた。
本菌株は約１．５×０．５μｍのグラム陰性桿菌で運動性を有し、前記表１のような生化学的／生理学的性質を持つ細菌である。
【００１６】
また、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子相同性解析を行った。
微生物の進化系統の研究に最も有効な分子マーカーとして利用されている１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子をＰＣＲによって増幅させ（６３ｆ  ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ：５’−ａｇｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇｔｃ−３’、１３８７ｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ｇｇｇｃｇｇｔｇｔｇｔａｃａａｇｇｃ−３’、反応条件：９５℃を５分間；９５℃を１分間、５０℃を１分間、７２℃を１．５分間、このサイクルを３０回；７２℃で５分間）、ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてその産物を連結させた。その後、Ｍ１３  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒあるいはｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒによってシークエンス反応させ、得られた塩基配列をもとにＲｉｂｏｓｏｍｅ  ＤａｔａＰｒｏｊｅｃｔ  ＩＩ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）  にてシークエンスマッチを行った。
１０００塩基程度の１６Ｓ  ｒＤＮＡ情報から相同性解析を行ったところ、前記表２のような結果となり、本ＴＮＴを高効率に生分解する細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓと相同性の高い細菌株であることが判明した。
また、実施例２に示すように本菌株は従来のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌株の１０倍高濃度（１０００ｍｇ／Ｌ）のＴＮＴに対して分解能を有すること、並びに１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の相同性が９７％以下であることから、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌株の新菌種と判断されるので、この細菌をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５と命名した。
【００１７】
実施例２  ＴＮＴ分解能の測定
（１）ＴＮＴの測定方法
ＴＮＴは、１．５ｍｌのＴＮＴ溶液に２４０μｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加し（ｐＨ１２以上）、最大吸収波長４４７ｎｍの吸光度を測定することにより分析した。
（２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５の培養方法
本菌株はＴＮＴ（１００ｍｇ／Ｌ）を含んだＬＢ培地（バクトトリプトン：１０ｇ／Ｌ、バクト酵母エキス粉末：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ）を用いて、３０℃で２４時間、好気的に培養した。
（３）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５のＴＮＴ分解能の測定
１００ｍｇ／ＬのＴＮＴ溶液に培養した菌株を添加し、経時的にＴＮＴの分解率を検討した。その結果、ＴＮＴ未汚染土壌から分離したいくつかの菌株と比較して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５は高効率にＴＮＴを変換する細菌であることが判った。
次に、各種濃度のＴＮＴ（１００、２５０、５００、１０００ｍｇ／Ｌ）に対する分解性について検討した。結果を図１に示す。
図１から明らかなように、本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５は、高濃度ＴＮＴを高効率に分解する活性を有する。
また、各種菌株のＴＮＴ分解能を比較した結果を表３に示す。
表３から明らかなように、本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５は、他の現在までに報告されている菌株と比較して、より高効率にＴＮＴを生分解することが出来る。
更に、１００ｍｇ／ＬのＴＮＴと１ｍＭの酢酸を添加した反応溶液にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５を添加し、一定時間毎にサンプリングして、その菌体を除去したサンプルについて、全有機炭素（ＴＯＣ）測定を行った。結果を図２に示す。
図２から明らかなように、本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５により、ＴＮＴはほぼ完全に近い状態まで無機化されていることが判る。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５は、他の現在までに報告されている菌株と比較して、高効率に高濃度ＴＮＴを生分解する活性を有し（従来のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌株の１０倍高濃度（１０００ｍｇ／Ｌ）のＴＮＴに対して分解能を有する。）、且つこれらをほぼ完全に無機化する。
本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５を利用するバイオレメディエーション技術は、従来技術である焼却処分と比較して、安価に処理できるという点が優れている。即ち、焼却処理では、汚染土壌の開削、運搬や焼却エネルギーなどの莫大な費用がかかる。これに対し、バイオレメディエーション技術ではｉｎ−ｓｉｔｕ  処理が可能であり、また細菌の培養も比較的安価に且つ容易に実施できる。
【００１９】
【配列表】
2004254505.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５の高濃度ＴＮＴに対する分解能を測定した結果を示す。
【図２】図２は、本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５によるＴＮＴの無機化について調べた結果を示す。
【図１】
2004254505.tif 000006
【図２】
2004254505.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成15年5月12日(2003.5.12)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】トリニトロトルエン（ＴＮＴ）の分解能が２５０ｍｇ／Ｌ以上であるグラム陰性の細菌株。
【請求項２】トリニトロトルエン（ＴＮＴ）の分解能が１０００ｍｇ／Ｌ以上である請求項１に記載の菌株。
【請求項３】トリニトロトルエン（ＴＮＴ）を分解して無機化する請求項１又は２に記載の菌株。
【請求項４】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌株である請求項１〜３の何れかに記載の菌株。
【請求項５】受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２２３である請求項１に記載の菌株。
【請求項６】請求項１〜５の何れかに記載の菌株を用いることを特徴とする、トリニトロトルエン（ＴＮＴ）の分解方法。
【請求項７】トリニトロトルエン（ＴＮＴ）を分解して無機化する請求項６に記載の分解方法。
【請求項８】２５０ｍｇ／Ｌ以上のトリニトロトルエン（ＴＮＴ）を分解する請求項７に記載の分解方法。
【請求項９】１０００ｍｇ／Ｌ以上のトリニトロトルエン（ＴＮＴ）を分解する請求項８に記載の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、世界中の火薬製造工場などにおけるトリニトロトルエン（ＴＮＴ）廃棄処理やＴＮＴ汚染土壌の環境浄化に大いに貢献し得る新規な細菌株と、これを用いた高濃度ＴＮＴの分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
第二次世界大戦をはじめとする活発な軍事活動によって、トリニトロトルエン（以下、ＴＮＴと略す。）などを使用した爆薬は２０世紀に大量に製造されてきた。その見積もりはＴＮＴだけでも１，０００，０００ｋｇ／年とされている。ＴＮＴは爆薬の中でも高い毒性を有する化学物質の一つであり、肝臓障害やメトヘモグロビン血症（赤血球が芳香族ニトロ化合物に取り囲まれ、酸素の輸送が不可能になる病気）などの原因物質となっている。ＴＮＴは芳香環に三つの電子吸引性の高いニトロ基が規則正しく配置しており、その影響により芳香環のπ電子が欠如した状態となる。このようなＴＮＴ特有の化学的な特性によって、生分解が比較的困難な化合物として環境中で挙動する。その理由から、ＴＮＴをはじめとするニトロ芳香族化合物は生物圏に残留しやすく、人間を始めとした哺乳類、魚、藻類や、微生物などの生物に対して毒性や突然変異性を与え続けている。また、ＴＮＴなどの火薬類は爆発の危険性から、離れた場所に大量に保存される傾向にあったために、一度汚染が進行すると、比較的高濃度の環境汚染が生じ、その結果、生物圏に対して不適合な環境へと変化させた。アメリカ合衆国、ドイツやカナダなどでは、第二次世界大戦などの軍事活動が原因となり、ＴＮＴなどの火薬による土壌・水汚染が深刻な問題となっている。いくつかの産業工場付近の土壌や堆積物において、土壌１ｋｇあたりＴＮＴ１０ｇ以上にも及ぶ汚染事例も存在する。
現在、ＴＮＴの処理は、主に焼却処分である。しかし、この処理法は高価であることや地球温暖化の原因ガスである二酸化炭素や窒素酸化物（ＮＯｘ）の放出などの問題、更にはその焼却灰は危険廃棄物として処理しなければならないという理由などから大いに懸念が持たれている。
一方、いくつかのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などの細菌がＴＮＴを生分解することが報告されているが（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３等参照）、それらの細菌が処理できるＴＮＴ濃度は１００ｍｇ／Ｌ以下と低く、到底実用化に耐えない。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ：１７５，２２７８−２２８３（１９９３）
【非特許文献２】
Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ：５４，６０５−６１８（２０００）
【非特許文献３】
Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ：９４，５７−６１（２００２）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した如き現状に鑑みなされたもので、高濃度のＴＮＴを生物化学的に分解し得る新規な微生物と、これを用いた高濃度ＴＮＴの効率的な分解方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＴＮＴの分解能が２５０ｍｇ／Ｌ以上であるグラム陰性の細菌株に関する。
【０００６】
また、本発明は、上記菌株を用いることを特徴とする、ＴＮＴの分解方法に関する。
【０００７】
本発明者らは、ＴＮＴと酢酸を加えたＭ８最少培地にＴＮＴ汚染地から採取した土壌を添加し、ＴＮＴを生分解する微生物をスクリーニングした。そして、生育したコロニーを分離し、試験したところ、全てのクローンはグラム陰性の桿菌、ブドウ糖非発酵性であることが判明した。更に、これらの菌株についてアピ２０ＮＥシステム（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）に基づいた炭素源の資化性や生化学的な試験を行った結果、全てのクローンがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに属する細菌であることがわかった。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌がＴＮＴを分解することは既に知られている。しかし、ＴＮＴは細胞毒性があるために、これまで知られているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌では１００ｍｇ／Ｌ以下のＴＮＴしか分解出来ないことは既に報告されている通りである（例えば、前記非特許文献２等参照。）。
今回、本発明者らがスクリーニングした菌株の中に、特に高濃度（２５０ｍｇ／Ｌ以上）のＴＮＴを生分解する菌株を発見し、本発明に到達した。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の菌株について生化学的／生理学的性質及び１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子相同性解析によって同定を行ったところ、下記の表１に示すような性質を示し、また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｖｏｒａｎｓの近縁に位置する菌株であることが判った（表２参照。）。
【０００９】
【表１】
2004254505.tif 000008
【００１０】
【表２】
2004254505.tif 000009
【００１１】
本菌株は特に高濃度のＴＮＴを分解できるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の新菌種と判断されるので、本発明者らは本菌株をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５と命名した。
本菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５の凍結乾燥標品は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００３年２月２１日付で受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２２３として受託された。
このＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５は特徴的にＴＮＴ分解能が高く、他の分離した菌株や文献値の、２．５倍は疎か約１０倍の、１０００ｍｇ／ＬのＴＮＴ濃度に対する分解能が見られた（図１及び表３参照。）。
なお、図１中、−○−はＴＮＴ濃度１００ｍｇ／Ｌ、−●−はＴＮＴ濃度２５０ｍｇ／Ｌ、−△−はＴＮＴ濃度５００ｍｇ／Ｌ、−▲−はＴＮＴ濃度１０００ｍｇ／Ｌの場合をそれぞれ示す。
【００１２】
【表３】
2004254505.tif 000010
【００１３】
また、ＴＮＴの全有機炭素をＴＯＣ測定によって経時的に追跡した結果、この菌株によってＴＮＴがほぼ完全に無機化されることが明らかとなった（図２参照。）。
なお、図２中、−○−は酢酸のみの場合、−●−はＴＮＴ＋酢酸の場合をそれぞれ示す。
本菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５を用いたＴＮＴの分解方法を利用した環境浄化法は、ｉｎ−ｓｉｔｕで比較的安価に処理することができ、また高効率に無機化することが出来るので、有害物質（副産物）を生成することなく効率的な浄化が実現できる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００１５】
実施例１  スクリーニングおよび細菌の同定
ＴＮＴ（１００ｍｇ／Ｌ）と酢酸（１０ｍＭ）を窒素源及び炭素源とした１００ｍｌのＭ８最少培地に北九州市山田緑地（１９３４年から旧日本軍によってＴＮＴ火薬の填薬所として、また、戦後も米軍により約２０年間弾薬庫として利用されており、ＴＮＴなどの爆薬による土壌・水汚染等の環境汚染が生じていると考えられる地域）の土壌を湿重量２０ｇ添加し、３０℃で１週間振とう培養した。その後、連続希釈した液を同様のＭ８最少寒天培地に塗布して培養し、この条件下で生育したコロニーを分離した。単離した全てのコロニーについて、グラム染色、ヒューレイフソン培地を用いてＯＦ試験、及びアピ２０ＮＥシステム（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）試験を行った結果、全てＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌であることが判明した。
スクリーニングによって獲得した菌株の中でＴＮＴ分解能の高いもの（実施例２の方法で測定した）を選び、その菌株について、形態的および生化学的性質を調べた。
本菌株は約１．５×０．５μｍのグラム陰性桿菌で運動性を有し、前記表１のような生化学的／生理学的性質を持つ細菌である。
【００１６】
また、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子相同性解析を行った。
微生物の進化系統の研究に最も有効な分子マーカーとして利用されている１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子をＰＣＲによって増幅させ（６３ｆ  ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ：５’−ａｇｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇｔｃ−３’、１３８７ｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ｇｇｇｃｇｇｔｇｔｇｔａｃａａｇｇｃ−３’、反応条件：９５℃を５分間；９５℃を１分間、５０℃を１分間、７２℃を１．５分間、このサイクルを３０回；７２℃で５分間）、ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてその産物を連結させた。その後、Ｍ１３  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒあるいはｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒによってシークエンス反応させ、得られた塩基配列をもとにＲｉｂｏｓｏｍｅ  ＤａｔａＰｒｏｊｅｃｔ  ＩＩ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）  にてシークエンスマッチを行った。
１０００塩基程度の１６Ｓ  ｒＤＮＡ情報から相同性解析を行ったところ、前記表２のような結果となり、本ＴＮＴを高効率に生分解する細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｖｏｒａｎｓと相同性の高い細菌株であることが判明した。
また、実施例２に示すように本菌株は従来のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌株の１０倍高濃度（１０００ｍｇ／Ｌ）のＴＮＴに対して分解能を有すること、並びに１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の相同性が９８％以下であることから、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌株の新菌種と判断されるので、この細菌をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５と命名した。
【００１７】
実施例２  ＴＮＴ分解能の測定
（１）ＴＮＴの測定方法
ＴＮＴは、１．５ｍｌのＴＮＴ溶液に２４０μｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加し（ｐＨ１２以上）、最大吸収波長４４７ｎｍの吸光度を測定することにより分析した。
（２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５の培養方法
本菌株はＴＮＴ（１００ｍｇ／Ｌ）を含んだＬＢ培地（バクトトリプトン：１０ｇ／Ｌ、バクト酵母エキス粉末：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ）を用いて、３０℃で２４時間、好気的に培養した。
（３）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５のＴＮＴ分解能の測定
１００ｍｇ／ＬのＴＮＴ溶液に培養した菌株を添加し、経時的にＴＮＴの分解率を検討した。その結果、ＴＮＴ未汚染土壌から分離したいくつかの菌株と比較して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５は高効率にＴＮＴを変換する細菌であることが判った。
次に、各種濃度のＴＮＴ（１００、２５０、５００、１０００ｍｇ／Ｌ）に対する分解性について検討した。結果を図１に示す。
図１から明らかなように、本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５は、高濃度ＴＮＴを高効率に分解する活性を有する。
また、各種菌株のＴＮＴ分解能を比較した結果を表３に示す。
表３から明らかなように、本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５は、他の現在までに報告されている菌株と比較して、より高効率にＴＮＴを生分解することが出来る。
更に、１００ｍｇ／ＬのＴＮＴと１ｍＭの酢酸を添加した反応溶液にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５を添加し、一定時間毎にサンプリングして、その菌体を除去したサンプルについて、全有機炭素（ＴＯＣ）測定を行った。結果を図２に示す。
図２から明らかなように、本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５により、ＴＮＴはほぼ完全に近い状態まで無機化されていることが判る。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５は、他の現在までに報告されている菌株と比較して、高効率に高濃度ＴＮＴを生分解する活性を有し（従来のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌株の１０倍高濃度（１０００ｍｇ／Ｌ）のＴＮＴに対して分解能を有する。）、且つこれらをほぼ完全に無機化する。
本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５を利用するバイオレメディエーション技術は、従来技術である焼却処分と比較して、安価に処理できるという点が優れている。即ち、焼却処理では、汚染土壌の開削、運搬や焼却エネルギーなどの莫大な費用がかかる。これに対し、バイオレメディエーション技術ではｉｎ−ｓｉｔｕ  処理が可能であり、また細菌の培養も比較的安価に且つ容易に実施できる。
【００１９】
【配列表】
2004254505.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５の高濃度ＴＮＴに対する分解能を測定した結果を示す。
【図２】図２は、本発明の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＭ１５によるＴＮＴの無機化について調べた結果を示す。