(57)【要約】    【課  題】  本発明は、患者にとって有用なホルモン又はタンパク質等の生物学的活性因子を分泌する細胞を、ポリビニルアルコール中で安定かつ長期に保持できる細胞製剤並びに該細胞製剤の製造方法、及び該細胞製剤を患者に投与することによる内分泌・代謝疾患、血友病、骨疾患又は癌等の予防・治療方法を提供することを目的とする。    【解決手段】細胞保存剤が配合されたポリビニルアルコール中に、細胞を含有する細胞製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞保存剤が配合されたポリビニルアルコール中に、細胞を含有する細胞製剤。
【請求項２】
細胞表面が、更に細胞外マトリックスで覆われていることを特徴とする請求項１に記載の細胞製剤。
【請求項３】
更にグロースファクターを含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞製剤。
【請求項４】
細胞が、膵島細胞、膵内分泌細胞、肝細胞、前葉細胞、成長ホルモン分泌細胞、骨細胞、甲状腺ホルモン分泌細胞及び副甲状腺ホルモン分泌細胞から成る群から選択される１種又は２種以上の細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞製剤。
【請求項５】
細胞が、細胞保存剤で処理されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞製剤。
【請求項６】
細胞が、形質転換体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞製剤。
【請求項７】
シート状、板状、棒状、チューブ状又はビーズ状の形状を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の細胞製剤。
【請求項８】
細胞保存液が、Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ液、セルバンカー又はＵＷ液であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の細胞製剤。
【請求項９】
哺乳動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に移植することを特徴とする請求項１〜８に記載の細胞製剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞製剤を用いることを特徴とする内分泌・代謝疾患の予防及び治療方法。
【請求項１１】
内分泌・代謝疾患が、糖尿病又は下垂体性小人症であることを特徴とする請求項１０に記載の内分泌・代謝疾患の予防及び治療方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞製剤を用いることを特徴とする血友病の予防及び治療方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞製剤を用いることを特徴とする骨疾患の予防及び治療方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞製剤を用いることを特徴とする癌の予防及び治療方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞製剤を用いることを特徴とする肝不全又は先天性代謝異常の予防及び治療方法。
【請求項１６】
ポリビニルアルコールに細胞保存剤を配合後、細胞を該ポリビニルアルコールに混合し、得られた細胞含有ポリビニルアルコールをゲル化することを特徴とする細胞製剤の製造方法。
【請求項１７】
ヒト又は動物用の医薬である請求項１〜９のいずれかに記載の細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト又は動物用の医薬品組成物として有用な細胞製剤に関する。より詳しくは、生体にとって有用なホルモン又はタンパク質等の生物学的活性因子を産生・分泌する細胞或いは有害な物質を解毒する作用を有する細胞を、安定かつ長期に保持する製剤であって、患者に投与することによって、内分泌・代謝疾患、血友病、骨疾患又は癌等の予防・治療に効果を発揮する細胞製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ人工臓器とは、生細胞や生体組織等を含有し、患者に必要な代謝機能、具体的にはその代謝機能を司るホルモンやタンパク質等の生物学的活性因子を患者に供給することによって、患者の疾病を予防又は治療することを目的とする装置である。免疫抑制剤による副作用やドナーの需要と供給等の問題を有する生体臓器移植と比べ、バイオ人工臓器は、免疫隔離膜によって細胞を生体の防御機構から保護できるため、免疫抑制剤を必要とせず、同種移植のみならず異種移植も可能であるという点で優れている。
【０００３】
バイオ人工臓器は、その中に含有する細胞等の種類を変えることにより、あらゆる疾患の治療に対応できる。例えばバイオ人工膵島は、インスリン分泌細胞、例えば膵島細胞をその中に有し、膵島細胞から分泌されるインスリンホルモンを患者に供給して血糖値の是正を図るために用いられる。血液凝固因子生産型バイオ人工臓器は、その内部に血液凝固因子を生産する肝細胞を有しており、ＶＩＩＩ因子やＸＩ因子の不足により血液の凝固障害を有する血友病の治療に用いられている。また、成長ホルモン生産型バイオ人工臓器は、その内部に成長ホルモン（ｈＧＨ）分泌細胞を有しており、成長ホルモンの分泌不足が原因で起こる下垂体小人症等の治療に用いられている。また、副甲状腺ホルモンおよびエリスロポエチンをそれぞれ分泌する細胞をバイオ人工臓器に含有させることにより、上皮小体機能低下症及び貧血のような他の疾病も治療することができる。
【０００４】
バイオ人工臓器には様々な形状がある。その例として、細胞を高分子重合体で包み込んだマイクロカプセル型又はマクロカプセル型等が挙げられる。これらは、高分子重合体が有する強固な架橋構造によって、その中に含有される細胞を生体の防御機構から護り、更に高分子重合体が有する分子透過能を利用して、細胞から分泌されるホルモン等を生体に供給することを特徴としている。
【０００５】
マクロカプセル型人工臓器等に用いられる高分子重合体として、近年、ポリビニルアルコール（以降ＰＶＡと略す）が着目されている。ＰＶＡは、従来より食品業界や医療業界において用いられ、具体的には手術用縫合糸や食品と接触する容器等に応用されてきた。また、ＰＶＡを人工関節軟骨材料として用いる技術（例えば非特許文献１参照）がこれまでに開示されており、臨床面での安全性についても評価されている（例えば非特許文献２参照）。
【０００６】
ＰＶＡは、化学的又は物理的処理を施すことによりゲル化し、あらゆる形状に成形が可能である。化学的処理としては、ＰＶＡを含む水溶液にグルタルアルデヒド（架橋剤）及び塩酸（触媒）を添加する方法（例えば非特許文献３参照）、又はＰＶＡを含む水溶液をガラスプレート等に塗布し、これをＮａ2ＳＯ4／ＫＯＨ水溶液に浸漬する方法（例えば非特許文献４参照）等が、また物理的処理としては、ＰＶＡを含む水溶液を約−８０℃で急冷しゲル化する方法等が通常用いられる。しかしながら、ＰＶＡをマクロカプセル型人工臓器等の高分子重合体として用いる場合には、これらの化学的又は物理的処理の必要性が問題となる。
【０００７】
具体的には、ＰＶＡを化学的処理によりゲル化して袋状のＰＶＡゲル膜を作製し、その袋内に細胞を入れてバイオ人工臓器を作製するという方法がある。しかしながらこの方法では、袋のシーリング処理やＰＶＡゲル膜に残存した架橋剤等により細胞がダメージを受けたり、袋内の細胞が凝集することにより細胞が壊死する等、生存細胞数の減少又は生物活性の低下によるホルモン分泌量の低下が否めない。
【０００８】
物理的処理は薬剤を使用することがなく、またＰＶＡゲル中に細胞を分散させて包含することができるため、凝集等による細胞の壊死の危惧がない点で好ましいが、−８０℃で急冷する際に細胞が破壊される恐れがある。
【０００９】
バイオ人工臓器内に含有された細胞は、患者に必要な代謝機能を発揮する生物学的活性因子を安定に供給できる状態にあることが望ましい。従ってＰＶＡは、その特性からマクロカプセル型バイオ人工臓器等に適した高分子重合体ではあるものの、その応用技術は未確立であった。よって本発明の如く、ＰＶＡが有する特性を利用し、かつＰＶＡゲル内で細胞を安定に保持できるバイオ人工臓器はこれまでに全く知られていない。
【特許文献１】小林ら（Kobayashi M., et al.）、ポリビニルアルコールハイドロゲル製人工関節軟骨の予備研究（Preliminary study of polyvinyl alcohol-hydrogel (PVA-H) artificial meniscus）、バイオマテリアルズ（Biomaterials）、2003年、第24巻、p639-647
【非特許文献１】小林ら（Kobayashi M., et al.）、ポリビニルアルコールハイドロゲル製人工関節軟骨の予備研究（Preliminary study of polyvinyl alcohol-hydrogel (PVA-H) artificial meniscus）、バイオマテリアルズ（Biomaterials）、2003年、第24巻、p639-647
【非特許文献２】ＣＣデメルリスら（C.C.Demerlis et.al）、ポリビニルアルコールの口腔内毒性に関する調査（Review of the oral toxicity of PVA）、フードアンドケミカルトキシコロジー（Food and Chemical Toxicology）、2003年、第41巻、p319-326
【非特許文献３】クリスティーナＢら（Krystyna Burczak et. al）、マイクロカプセル型ＰＶＡハイドロゲル人工膵の生体内長期安定性と生物学的互換性（Long-term in vivo performance and biocompatibility of PVA hydrogelmacrocapsules for hybrid-type artificial pancreas）、バイオマテリアルズ（Biomaterials）、1996年、第17巻、p2351-2356
【非特許文献４】タイ−ホーン  ヤンら（Tai-Horn Young et. al）生体内ＰＶＡ人工膵の評価とモデリング（Assessment and modeling of PVA bioartificial pancreas in vivo）、バイオマテリアルズ（Biomaterials）、2002年、第23巻、p3495-3501
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ヒト又は動物用の医薬品組成物として有用な細胞製剤を提供することを目的とする。より詳しくは、患者にとって有用なホルモン又はタンパク質等の生物学的活性因子を分泌する細胞を、バイオ人工臓器に用いられる高分子重合体として適切な材料であるＰＶＡ中で安定かつ長期に保持できる細胞製剤及び該細胞製剤の製造方法を提供することを目的とする。更には、該細胞製剤を患者に投与するにより、内分泌・代謝疾患、血友病、骨疾患又は癌等の予防・治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、予めＰＶＡを細胞保存剤、例えばEuro−Collins液、セルバンカー又はＵＷ液等で処理した後に細胞と混合してゲル化させることによって、ＰＶＡゲル中の細胞の死滅率やダメージを低減することができ、ＰＶＡ中で細胞が安定に保持されることを見出した。より具体的には、粉体のＰＶＡを液状細胞保存剤で溶解してＰＶＡ−細胞保存剤混合液を作製後、その混合液中に細胞を分散させて急冷し、ＰＶＡをゲル化させることにより、ＰＶＡ中の細胞の生存率及び生物学的活性因子分泌機能の低下が抑制されること、更には、安定に長期間患者にホルモン又はタンパク質等を供給することができる細胞製剤が得られることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて更に検討を重ね、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は
（１）  細胞保存剤が配合されたポリビニルアルコール中に、細胞を含有する細胞製剤、
（２）  細胞表面が、更に細胞外マトリックスで覆われていることを特徴とする前記（１）に記載の細胞製剤、
（３）  更にグロースファクターを含有することを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の細胞製剤、
（４）  細胞が、膵島細胞、膵内分泌細胞、肝細胞、前葉細胞、成長ホルモン分泌細胞、骨細胞、甲状腺ホルモン分泌細胞及び副甲状腺ホルモン分泌細胞から成る群から選択される１種又は２種以上の細胞であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞製剤、
（５）  細胞が、細胞保存剤で処理されていることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞製剤、
（６）  細胞が、形質転換体であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞製剤、
（７）  シート状、板状、棒状、チューブ状又はビーズ状の形状を有することを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞製剤、
【００１３】
（８）  細胞保存液が、Euro−Collins液、セルバンカー又はＵＷ液であることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞製剤、
（９）  哺乳動物の皮下、筋肉内又は腹腔内に移植することを特徴とする前記（１）〜（８）に記載の細胞製剤、
（１０）  前記（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞製剤を用いることを特徴とする内分泌・代謝疾患の予防及び治療方法、
（１１）  内分泌・代謝疾患が、糖尿病又は下垂体性小人症であることを特徴とする前記（１０）に記載の内分泌・代謝疾患の予防及び治療方法、
（１２）  前記（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞製剤を用いることを特徴とする血友病の予防及び治療方法、
（１３）  前記（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞製剤を用いることを特徴とする骨疾患の予防及び治療方法、
（１４）  前記（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞製剤を用いることを特徴とする癌の予防及び治療方法、
（１５）  前記（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞製剤を用いることを特徴とする肝不全又は先天性代謝異常の予防及び治療方法、
（１６）  ポリビニルアルコールに細胞保存剤を配合後、細胞を該ポリビニルアルコールに混合し、得られた細胞含有ポリビニルアルコールをゲル化することを特徴とする細胞製剤の製造方法、
（１７）  ヒト又は動物用の医薬である前記（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞製剤、
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、患者にとって有用なホルモン又はタンパク質等の生物学的活性因子を分泌する細胞を、バイオ人工臓器に用いられる高分子重合体として適切な材料であるＰＶＡ中で安定かつ長期に保持できる細胞製剤を提供することができる。更には、本発明を患者に投与するにより、内分泌・代謝疾患、血友病、骨疾患又は癌等の予防及び治療を行うことができる。本発明は、細胞を安定な状態で長期間有することができるため、その移植の頻度を低減することができ、しかも様々な形状に形成できるため、注射等による皮下や筋肉内への移植も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、細胞保存剤を配合したＰＶＡを含有し、そのＰＶＡ中に患者にとって有用なホルモンやタンパク質等の生物学的活性因子を産生・分泌する細胞を有していることを特徴とする。
本発明で用いられるＰＶＡは、本発明の目的を阻害しない限りどのようなものでもよいが、例えば目薬の角質保護・保湿剤、腸管癒着防止膜等の医用材料や、食品包装フィルム等の食品接触材料として用いられうる程度の純度を有するものであることが好ましい。また市販物であっても、酢酸ビニルからポリ酢酸ビニルを作り、これを加水分解することにより得られる製造物の凍結乾燥品であってもよい。またＰＶＡを製造する場合、その製造方法並びに凍結乾燥方法は、それ自体公知の技術に従ってよい。ＰＶＡの平均重合分子量は、約５，０００〜１６，６００程度で、ケン化度は約８５％以上のものが好ましい。
これらのＰＶＡは、細かい粒子状の凍結乾燥品で、生理食塩水やリン酸バッファー等の溶液に容易に懸濁できる形状であることが望ましい。
【００１６】
細胞保存剤が配合されたＰＶＡとは、ＰＶＡ中に細胞保存剤を含有するＰＶＡを意味する。本発明で用いられる細胞保存剤は、特に限定されないが、通常動物細胞等の保存に用いられる液剤であって、例えばEuro-Collins液又はセルバンカー（SERUBANNKA code 630-01601：Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka, Japan）やＵＷ液（ビアスパンViaSpan：Bristol-Myers Squibb Company, USA）等の市販の保存液であってよい。これらは市販のものであっても、実験室内で調製された組成物であってもよい。実験室で調製する場合は、蒸留水等に各組成成分を添加・混合し、フィルターろ過等することにより除菌して調製することが好ましい。例えば、Euro-Collins液の組成は、表１の通りである。
【００１７】
【表１】
2004331643.tif 000002
また、ＵＷ液（ビアスパン）の組成は、表２の通りである。
【表２】
2004331643.tif 000003
【００１８】
ＰＶＡ中に細胞保存剤を含有するＰＶＡは、例えばＰＶＡと細胞保存剤とを混合して作製することができる。また得られる細胞保存剤が配合されたＰＶＡは、無菌的であることが望ましい。ＰＶＡと細胞保存剤とを混合する方法は特に限定されないが、例えば、市販の粒子状ＰＶＡを蒸留水等に懸濁し、該ＰＶＡ懸濁液を加熱滅菌（オートクレーブ等）することにより溶解・殺菌処理し、得られた無菌ＰＶＡ水溶液に無菌的に細胞保存剤を添加・混合する方法等が挙げられる。加熱滅菌処理や、無菌操作は、それ自体公知の手段に従ってよい。
ここで、上記の混合手段及びそれ以外の何らかの手段を用いて作製された細胞保存剤を含有するＰＶＡを、細胞保存剤で処理されたＰＶＡと称することとすると、この細胞保存剤で処理されたＰＶＡも本発明の範囲内であることは言うまでもない。
【００１９】
またＰＶＡ懸濁水溶液と細胞保存剤とを混合して得られる混合液（以降、ＰＶＡ−細胞保存剤溶液と称する）中のＰＶＡの含有量は、ＰＶＡ−細胞保存剤溶液に対して、通常約２〜５重量％、より好ましくは約２．５〜３．５重量％、特に好ましくは約２．５〜３重量％である。これは、該濃度域においてＰＶＡが最もゲル化し易く、かつ本発明の細胞製剤の細胞を包含するのに好ましい強度のＰＶＡゲルが得られるからである。またＰＶＡ−細胞保存剤溶液中の細胞保存剤の濃度は、通常の細胞保存に用いる細胞保存剤の濃度を１倍とすると、通常約０．８〜１倍、より好ましくは約０．９〜１倍、特に好ましくは約０．９５〜１倍である。これは、該濃度域の範囲を外れると、細胞が安定に生存できない場合があるからである。従って、本発明においては、通常の細胞保存に用いる濃度の約２〜１０倍である濃縮細胞保存液を調整又は購入し、これと上記ＰＶＡ懸濁水溶液とを適宜（例えば、１０倍濃縮細胞保存液：ＰＶＡ懸濁水溶液＝１：９）混合して、約１倍濃度の細胞保存剤を含有するＰＶＡ−細胞保存剤溶液を作製するのが好ましい。
【００２０】
本発明の細胞製剤には、更に、細胞の保護を目的としてジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等が、雑菌の混入を阻止する目的で抗生物質等が、また細胞の活性維持のためにニコチンアミド等のビタミン類等が含まれていてもよい。更に本発明は、通常製剤に添加されることが薬事法上許容されている他の添加成分、例えば徐放性付与剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等が補填されていてもよい。これら他の添加成分の、細胞製剤への添加方法は特に限定されないが、上記ＰＶＡ−細胞保存剤溶液を作製する際に、該溶液中に無菌的に混合されるのが好ましい。これらの含有量は、本発明に含まれる細胞の増殖・生存及び／又は生物学的活性因子の分泌等を阻害しない範囲であって、本発明の目的を損なわない範囲であることが好ましい。
細胞保存剤で処理されたＰＶＡは、上述した様に無菌的に製造されることから、本発明の細胞製剤は雑菌等による汚染の確率が低く、室温（約１５〜３５℃）で長期間保存が可能である。
【００２１】
本発明に用いられる細胞として、膵島細胞、膵内分泌細胞、肝細胞、前葉細胞、成長ホルモン分泌細胞、骨細胞、甲状腺ホルモン分泌細胞又は副甲状腺ホルモン分泌細胞等を挙げることができる。これらの細胞は、ヒト、ブタ、ラット又はマウス等の哺乳動物由来であって、患者にとって有用なホルモン又はタンパク質等の生物学的活性因子を産生・分泌する細胞であることが好ましい。細胞の種類の選択は、投与される患者の疾患の種類よって決定されるのが好ましい。例えば、糖尿病患者等にはインスリンを産生する膵島細胞又は膵内分泌細胞等を、血友病患者等には血管凝固因子等を産生する肝細胞等を、下垂体性小人症等の患者には成長ホルモンを産生する前葉細胞や成長ホルモン分泌細胞等を、また骨折等の骨疾患患者には骨形成タンパク質（Bone Morphogenetic Protein：ＢＭＰ）を産生する骨細胞等を用いるのがよい。癌患者等には、遺伝子組換えにより腫瘍成長抑制物質を大量に産生しうる形質転換細胞等を用いることもできる。また肝不全、腎不全又は先天性代謝異常等により体内に有毒な代謝産物が蓄積する疾患の患者に対しては、有毒な代謝産物を選択的に代謝・解毒する作用を有する細胞を用いることもできる。患者が複数の疾患を有する等、複数の生物学的活性因子を必要とする場合には、上記細胞を２種以上組み合わせてもよい。本発明はこれらの細胞を含有することにより、上記患者等に有用な生物学的活性因子を供給することができる。従って、本発明の細胞製剤を用いることにより、生物学的活性因子を供給することや有害な代謝産物を解毒することにより治療が可能な様々な疾患の発症を予防したり、治療することができる。
【００２２】
本発明に用いられる上記の細胞は、実験室用に確立された細胞又は生体の組織から分離した細胞等のいずれであってもよいが、分化した非分裂細胞であることが好ましい。何故なら未分化な分裂細胞よりも、分化した非分裂細胞の方が、より目的とするホルモンやタンパク質等を産生・分泌しうるからである。
生体組織からの細胞の分離方法は特に限定されず、公知の技術に従ってよい。例えば、適切な手段で摘出した組織を、Ｄｉｓｐａｓｅ又はＥＤＴＡ等で処理し、ついでトリプシン処理して単一の細胞まで分離する方法等が挙げられる。
【００２３】
例えば本発明に用いられる細胞が膵島細胞である場合、この細胞の生体組織からの分離は、公知のコラゲナーゼ処理による分離方法、例えば J. Adam Van Der Vliet et al., Transplantation, 45(2), p493-495（1988）等に従ってよい。
本発明に用いられる細胞が膵内分泌細胞である場合、例えば特開２００１−２３１５４８号公報に記載の方法等に従ってよい。
上記のように生体組織から分離された細胞は、病原性ウイルス等の病原体が除去されていることが望ましい。
【００２４】
実験室用に既に確立された細胞又は生体組織から得られた単一細胞は、適切な培地でコンフルエントになるまで培養され、継代培養を２〜３回繰り返してから、本発明の細胞として用いられるのが好ましい。例えば本発明に用いる細胞が、膵島細胞又は膵内分泌細胞（以降膵内分泌細胞等と略す）である場合は、これらの細胞を、例えば１０％ウシ胎仔血清（以降、ＦＢＳと略す）及びニコチンアミドを補填したＣＭＲＬ−１０６６培地（Sigma, St. Louis, MO, USA）で継代培養するのが好ましい。継代培養された細胞は、トリプシン処理及びコラゲナーゼ処理等の公知の手段に従って、再度単一細胞として分離され、本発明の細胞として用いることができる。
【００２５】
また本発明に用いられる細胞は、投与される患者に必要なホルモン又はタンパク質等の生物学的活性因子ペプチドをコードする遺伝子が導入された形質転換細胞であってもよい。該形質転換細胞を用いることにより、目的とする生物学的活性因子ペプチドを効率的かつ大量に産生することができる。生物学的活性因子ペプチドをコードする遺伝子としては、既にその塩基配列が公開されており、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection：ＡＴＣＣ）等の寄託機関や一般の市販源から容易に入手が可能な遺伝子、又は既知の塩基配列からオリゴヌクレオチドプローブを作製し、該プローブを用いて、例えばＰＣＲ増幅法、ＤＮＡ合成法の公知の手段を用いて合成される遺伝子等が挙げられる。例えば、腫瘍成長抑制タンパク質をコードする遺伝子を有する形質転換細胞を用いることにより、本発明の細胞製剤を癌の予防及び治療剤として使用することができる。
【００２６】
上記の生物学的活性因子ペプチドをコードする遺伝子が導入される宿主細胞は特に限定されず、通常遺伝子組換え技術分野において用いられる公知の宿主細胞を使用してよい。例えば宿主細胞としては、上記の膵島細胞、膵内分泌細胞、肝細胞、前葉細胞、成長ホルモン分泌細胞、骨細胞等の他に、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウス細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスＣ１２７細胞、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒト細胞ＨｅＬａ、ヒトＦＬ細胞等が挙げられる。
【００２７】
本発明で用いられる細胞への上記の遺伝子の導入方法は、特に限定されず公知の手段に従ってよい。例えば、プラスミドやウイルス等の組換え発現ベクター又はリポソーム、マイクロカプセル等の人工ベクターに含有させて細胞に導入する等の公知の方法が挙げられる。組換え発現ベクターを用いる場合には、コンピテント細胞法[J. Mol. Biol., 53, p154 (1970)]、ＤＥＡＥデキストラン法[Science, 215, p166 (1982)]、インビトロパッケージング法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72, p581 (1975)]、ウイルスベクター法[Cell, 37, p1053 (1984)]、マイクロインジェクション法[Exp. Cell. Res., 153, p347 (1984)]、エレクトロポレーション法［Cytotechnology, 3, p133 (1990)］、リン酸カルシウム法[Science, 221, p551(1983)]、リポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, p7413 (1987)］、プロトプラスト法[特開昭６３−２４８３９４２号公報、Gene, 17, p107, (1982)、Molecular ＆ General Genetics, 168,p 111 (1979)]に記載の方法等を挙げることができる。
【００２８】
また、その遺伝子を宿主細胞に導入するためのベクター等も特に限定されず導入された細胞内で所望の遺伝子を発現させ、生物学的活性因子ペプチドを有効に産生する事ができる発現ベクターであればよい。例えば、λファージ等のバクテリオファージ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等の動物ウイルス等の他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が挙げられる。
【００２９】
本発明に用いられる細胞は、以下の手法によりＰＶＡ中に包含されるのが好ましい。
上記で作製したＰＶＡ−細胞保存剤溶液中に、細胞を添加・混合する。添加・混合される細胞は、予め細胞保存剤で処理されていることが好ましい。具体的には、細胞を細胞保存剤中に予め懸濁し、遠心により細胞を回収した後、ＰＶＡ−細胞保存剤溶液と混合するのが好ましい。本発明の細胞製剤中に含有される細胞の数は、該細胞製剤を投与される患者の疾患の種類及び疾患の程度等によって異なるため一概には言えず、医師の判断によって決定されるのが好ましいが、例えばＰＶＡ−細胞保存剤溶液中、好ましくは約１×１０７〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌである。細胞数をこの範囲に設定することにより、細胞がＰＶＡゲル内で均等に分散され、細胞凝集等による細胞への酸素及び栄養分の供給が阻害されることなく、細胞が長期間安定に生存することができる。
【００３０】
また本発明に用いられる細胞が、その生物学的活性因子を最適に供給できる状態で安定に保持されるために、本発明の細胞製剤は、更にヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン酸等のムコ多糖、エラスチン、コラーゲン及びフィブリン等から選ばれる１種以上を含む細胞外マトリックス、及び／又は肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）又は成長ホルモン（ＧＨ）等のグロースファクター等を含有していてもよい。これらのグロースファクターは、１種又は２種以上含有されていてもよい。細胞外マトリックス及び／又はグロースファクター等を本発明に含有させる方法としては、例えば、上記ＰＶＡ−細胞保存剤溶液と細胞とを混合する前に、細胞外マトリックス及びグロースファクターを含有する細胞培養培地等に細胞を浸漬し、細胞表面に細胞外マトリックス等の膜を形成させるか、或いはＰＶＡ−細胞保存剤溶液に予め細胞外マトリックス及び／又はグロースファクターを含有させる方法等が挙げられる。本発明の細胞製剤における上記細胞外マトリックス及び／又はグロースファクター等の含有量は特に限定されないが、本発明に用いられる細胞の保持、生物学的活性因子の分泌機能を阻害しない範囲であって、細胞の生存期間及び生物学的活性因子の分泌期間を延長する効果を付加しうる範囲であることが望ましい。
【００３１】
ＰＶＡ−細胞保存剤溶液と細胞とを混合後、得られた細胞混合液（以降、細胞含有ＰＶＡ−細胞保存剤溶液と称す）を冷却し、ＰＶＡをゲル化することにより本発明の細胞製剤を作製することができる。冷却は、例えば約−２０〜−８０℃の超低温庫等で約半日〜３日間静置したり、約−８０℃の超低温庫に約１８〜３０時間保存することにより行うのがよい。
本発明は、ＰＶＡに予め細胞保存剤が配合されているため、上記温度で急冷しても、細胞の死滅やダメージを抑制することができる。しかもＰＶＡゲル中に細胞を分散して含有することができ、細胞の凝集等を防止することができる。
ＰＶＡがゲル化することにより、本発明は様々な形状、例えばシート状、板状、盤状、棒状、チューブ状又はビーズ状等に形成され得る。例えば、上記細胞含有ＰＶＡ−細胞保存剤溶液をガラスプレート上に塗抹し、このガラスプレートごと冷却することにより、薄膜シート状の細胞製剤を作製することができる。ガラスプレート単位面積当りの細胞含有ＰＶＡ−細胞保存剤溶液塗抹量を適宜変化させることにより、所望の厚みを有する細胞製剤を作製することができるが、通常は、約１００〜３００μｌ／ｍｍ2である。
【００３２】
本発明の細胞製剤は、その補強又は／及び操作性の簡便化のために、補強材と組み合わせて用いてもよい。例えば、細胞製剤を薄膜シート状にする場合には、その補強及び操作性の簡便化のために、上記細胞含有ＰＶＡ−細胞保存剤溶液を樹脂製メッシュシート等に固定してゲル化するのがよい。具体的には、図１において、例えばＰＥＴ(ポリエチレンテフタレート)樹脂製メッシュシート（４）をガラスプレート（５）上に設置し、このメッシュシート（４）上に細胞含有ＰＶＡ−細胞保存剤溶液を塗布する。別のメッシュシート（６）を上から被せ、更にその上から別のガラスプレート（７）を被せ、細胞含有ＰＶＡ−細胞保存剤溶液とメッシュシート（４）及び（６）を、ガラスプレート（５）及び（７）とで挟む。そのまま約−２０〜−８０℃で冷却することによりシート状ゲルに成形することができる。また上記メッシュシートは、予めＰＶＡ−細胞保存剤溶液に浸漬しておくことが好ましい。
【００３３】
上記の補強材、例えばメッシュシートは、生体にとって安全な素材、つまり生体内において非分解性であって生体適合性に優れた素材、例えばＰＥＴ等であることが好ましい。これは、生体内において本発明の細胞製剤中のメッシュシートが分解すると、該細胞製剤が生体組織に癒着し、本発明の効果を長期に奏することが困難となるばかりでなく、生体にとっても有害となりうる場合があるからである。もちろん、生体内で分解しても生体に有害でない補強材も、本発明に使用されうることは言うまでもない。
【００３４】
冷凍状態の細胞製剤は、冷凍状態にある細胞を活性化した後に生体に投与されるのが好ましい。冷凍細胞製剤中の細胞の活性化は、細胞を解凍し、適切な培地で再培養することにより行うことができる。具体的には、約３７℃の細胞培養培地、例えばＣＭＲＬ−１９６６等に冷凍状態の細胞製剤をすばやく浸漬して解凍した後、更に新たな細胞培養培地で、例えば約２４時間培養することによって行う。該細胞製剤にＤＭＳＯが含まれる場合には、解凍された細胞製剤を新たな細胞保存液、例えばＵＷ液等を用いて洗浄した後、更にＵＷ液中で、例えば約４℃、約２４時間浸漬することによって、ゲル中のＤＭＳＯを除去するのが好ましい。言うまでもないが、上記のように解凍され、ＤＭＳＯが除去された細胞製剤も本発明の細胞製剤である。
【００３５】
上記の方法により得られる細胞製剤の生体への投与形態は、投与される患者の疾患の種類、疾患部位、疾患の程度によって異なるため一概に言えず、医師の判断によって決定されるが、好ましい投与形態を以下に述べる。
本発明の細胞製剤を投与する対象は、ヒトをはじめ、イヌ、ネコ、サル、ウサギ及びマウス等のヒト以外の哺乳動物である。
本発明は、上述した通り、生体内の投与部位に適した形状に成形されて投与することができる。また本発明は、疾患を有する組織に直接接触する状態で投与部位に移植されてもよいが、比較的軽微な侵襲で投与できる皮下又は筋肉内に移植することもできる。例えば、チューブ状の該細胞製剤を細断し、移植針等を用いて皮下に移植したり、注射器等に該細胞製剤を充填し、筋肉内や皮下に注入することもできる。しかも該部位からの細胞製剤の回収も容易である。皮下や筋肉内等に該細胞製剤を移植する際、移植部位の血管分布密度が疎であり、細胞が増殖・生存するための酸素及び栄養分の供給が困難と考えられる場合には、公知の適切な血管新生誘導剤等を複合させて移植することもできる。血管新生誘導剤は、細胞製剤中に予め含有させておいてもよいし、細胞製剤とは別の形態で投与されてもよい。
【００３６】
本発明の細胞製剤から患者に供給されるホルモンやタンパク質等の生物学的活性因子の量は、用いられる細胞の生物学的活性因子の分泌能及び移植期間中の細胞生存率の推移等を考慮して、医師の判断により適宜設定することができる。例えば、患者の疾患が糖尿病である場合、用いられる細胞、例えば膵内分泌細胞等のインスリン分泌能をin vitroにて予め測定しておき、そのインスリン分泌能、細胞数、投与期間及び細胞の生存率の推移等から、本発明の細胞製剤のインスリン供給量を決定することができる。本発明の細胞製剤は、含有する細胞を安定に長期間保持できることから、時間経過に伴う生物学的活性因子の分泌能の低下率が低い。従って本発明を用いれば、患者に必要とされる生物学的活性因子を長期間安定して患者に供給することができ、細胞製剤の移植の頻度も少なくすることができる。
【００３７】
本発明の細胞製剤に用いられる細胞の生物学的活性因子の分泌能は、それぞれの生物学的活性因子の測定に適した公知の定量方法に従ってよい。例えば、細胞が膵内分泌細胞等である場合のインスリンの定量方法については、以下の実施例で詳細に説明する。
【００３８】
以下に、実施例等を示して本発明を具体的に説明するが、言うまでもなく、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、「％」は、いずれも「質量％」を表す。
【実施例１】
【００３９】
（製造例１）膵島細胞を含有するシート状細胞製剤の製造
（１）膵島細胞の調製
８〜１０週令、体重３００〜３５０ｇのＷｉｓｔｅｒラット（Shimazu animal Co. Ltd. Kyoto, Japan）から、以下の方法により膵島細胞を分離した。
まず摘出したラット膵臓の膵管内に、I型コラゲナーゼ（Sigma, St. Louis, MO, USA, 350U/mg）及びXI型コラゲナーゼ（Sigma, St. Louis, MO, USA, 2,200U/mg）をそれぞれ８００Ｕ／ｍｌ及び１５００Ｕ／ｍｌの濃度で含有するハンクス液１０ｍｌを注入し、３７℃、１５〜２０分間の酵素処理を施した。冷却ハンクス液を添加し、酵素反応を停止した。ピペットを用いて膵臓組織を分散し、遠心により組織ペレットを回収した後、ハンクス液で組織ペレットを２回洗浄した。尚、遠心は１，０００ｒｐｍ、１分間とした。組織懸濁液を８００μｍサイズのメッシュシートを用いてろ過した。ろ過液を５０ｍｌコニカルチューブに回収し、遠心（１５００ｒｐｍ、３分間）して組織ペレットを得た。該ペレットを２７％デキストラン（Sigma, St. Louis, MO, USA, MW 70.000）を含むハンクス液に懸濁し、不連続密度勾配遠心処理した。この時、最下層を２７％デキストラン（密度1.094g/ml）、上層を２３％デキストラン（密度1.081g/ml）及び１１％（密度1.041g/ml）デキストランの２層とした。不連続密度勾配遠心は、４００ｒｐｍで４分間、更に１，７００ｒｐｍで１０分間行った。遠心後、最上２層の界面より膵島細胞含有画分をパスツールピぺットを用いて採取した。得られた膵島細胞をＣＭＲＬ−１０６６培地を用いて２回洗浄した（１，０００ｒｐｍ、３分間）。
【００４０】
（２）ＰＶＡ−Euro−collins溶液の作製
ＰＶＡ３ｇ（グンセー社製：PVA-180H, Lot37435）を７５ｍｌの蒸留水に懸濁後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）による加熱溶解滅菌処理を２回施した。得られた無菌ＰＶＡ水溶液に、１０倍濃度Euro−collins溶液（以降、ＥＣ溶液と略す）１０ｍｌ、ＤＭＳＯ５ｍｌ、ＦＢＳ１０ｍｌ及び０．１２２ｇニコチンアミドを無菌的に混合・攪拌し、無菌３％ＰＶＡ−ＥＣ溶液１００ｍｌを得た。上記１０倍濃度ＥＣ溶液は、蒸留水１００ｍｌに、表１に示す成分を添加・混合した後、０．２２μｍのろ過除菌を行い作製した。作製後は室温で保存した。
【００４１】
（３）細胞の混合
（１）で得られた膵島細胞を、更に１０％ＦＢＳ及び１．２２ｇ／Lニコチンアミドを含むＣＭＲＬ−１０６６培地を用いて、炭酸ガスインキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）で２４時間培養した。１，０００個の膵島細胞を含む培養液を１．５ｍｌ容遠心チューブ内に入れ、８００ｒｐｍで１分間遠心した。得られた細胞ペレットにセルバンカー（SERUBANNKA code 630-01601：Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka, Japan）０．１ｍｌを添加し、細胞を懸濁した後５分間放置した。再度遠心して細胞を回収した。回収した細胞を、（２）で作製した無菌３％ＰＶＡ−ＥＣ溶液１００μｌ中に懸濁し、膵島細胞含有ＰＶＡ−ＥＣ溶液を得た。
【００４２】
（４）シートの形成
１０ｍｍ×１０ｍｍ角のＰＥＴ製メッシュシート（グンセー社製：ＴＮＯ６０ＳＳ）２枚を予め無菌３％ＰＶＡ水溶液に５分間浸漬し、この内の一枚（４）をガラスプレート（５）上に設置した。上記（３）で得られた膵島細胞含有ＰＶＡ−ＥＣ溶液を上記メッシュシート（４）上に均一に塗布し、もう一枚のメッシュシート（６）を上から被せ、メッシュシート（４）−膵島細胞含有ＰＶＡ−ＥＣ溶液−メッシュシート（６）の３層構成シートとした。更に上から別のガラスプレート（７）を被せ、圧力を加えて約１ｍｍ厚の３層構成シートとなるよう調整し、これを２枚のガラスプレートで挟んだ状態のままで−８０℃、２４時間保存してＰＶＡをゲル化した（図１）。
【００４３】
（５）シート状膵島細胞製剤の解凍及び細胞の活性化
上記（４）で得られた凍結シート状膵島細胞製剤を、３７℃のＣＭＲＬ−１０６６培地中で速やかに解凍した。解凍されたシート状膵島細胞製剤を、５ｍｌのＵＷ液（ビアスパンViaSpan：Bristol-Myers Squibb Company, USA）中に５分間浸漬した。この操作を３回繰り返し、該シート内に含有されるＤＭＳＯを除去した。該シートを更に５ｍｌのＵＷ液中で、４℃、２４時間浸漬した。浸漬後の該製剤をＣＭＲＬ−１０６６培地で２回洗浄後、更にＣＭＲＬ−１０６６培地中で２４時間（３７℃、５％ＣＯ2）培養し、細胞が活性化されたシート状膵島細胞製剤（製造例１）を得た。得られた製造例１を、以降の試験例に用いた。尚、上記（２）で１０倍濃度ＥＣ溶液１０ｍｌ、ＤＭＳＯ５ｍｌ、ＦＢＳ１０ｍｌ及び０．１２２ｇニコチンアミドを添加しない無菌３％ＰＶＡ水溶液を作製し、これを用いて製造したシート状膵島細胞製剤を比較例１とした。
【００４４】
(試験例１)  製剤中の細胞の安定性確認
上記製造例１、比較例１又は遊離の膵島細胞（２００個）を、ＣＭＲＬ−１０６６培地中で培養した（５％ＣＯ２、３７℃）。培養１日後の製造例１又は比較例１内の生細胞数及び遊離の膵島細胞数をそれぞれ顕微鏡下にてカウントし、生細胞の回収率（％）を求めた。回収率は培養前の細胞数を１００として表した。
図２に結果を示す。製造例１の生細胞の回収率は約８２％と、比較例１の回収率（約３５％）に比べて非常に高く、その値は遊離細胞の場合よりも高値であった。
【００４５】
（試験例２）  製剤中のインスリン含有量の確認
上記製造例１、比較例１又は遊離の膵島細胞（２００個）をＣＭＲＬ−１０６６培地中で培養し（５％ＣＯ２、３７℃）、培養１日後のそれぞれのインスリン含有量を調べた。培養１日後の製造例１、比較例１又は遊離の膵島細胞を塩酸−ＥｔＯＨに回収し、スパーテル等を用いてそれぞれすり潰し、次いでボルテックスで製剤中のゲル及び細胞を塩酸−ＥｔＯＨ中に攪拌・懸濁した（−２０℃、２４時間）。それぞれの細胞懸濁液中のインスリン濃度を測定した。インスリンは、市販インスリン測定ＥＬＩＳＡキット（レビスインスリンキット（シバヤギ））を用いて測定した。
結果を図３に示す。製造例１中のインスリン含有量（約２０５ｎｇ／ｍｌ）は、比較例１（約２０ｎｇ／ｍｌ）に比べて著しく高値を示し、その値は遊離細胞とほぼ同程度であった。
【００４６】
(試験例３)  
製剤のインスリン分泌能及び細胞の状態確認
上記製造例１、比較例１又は遊離の膵島細胞（２００個）をＣＭＲＬ−１０６６培地中で培養し（５％ＣＯ２、３７℃）、培養１日後、７日後、１４日後に、それぞれを回収した。回収後、それぞれについてグルコース反応試験を行った。グルコース反応試験は以下の通りである。まず、上記の回収した製造例１、比較例１又は遊離の膵島細胞を３．３ｍＭのグルコース及び０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＣＭＲＬ−１０６６培地中で1時間培養（５％ＣＯ２、３７℃）後、グルコースを含まないＣＭＲＬ−１０６６培地で洗浄した。再度この操作を繰り返し、更に３．３ｍＭのグルコースを含むＣＭＲＬ−１０６６培地中で1時間培養した後、それぞれの上清中のインスリン濃度を測定した。次いで１６．７ｍＭのグルコースを含むＣＭＲＬ−１０６６培地で1時間培養し、それぞれ上清中のインスリン濃度を測定した。
【００４７】
結果を図４に示す。図４中（ａ）は培養１日後、（ｂ）は培養７日後、（ｃ）は培養１４日後のインスリン分泌量（濃度）をそれぞれ示す。比較例１では、グルコース濃度の上昇に依存したインスリン分泌量の上昇は見られなかった。これに対し、製造例１は培養１日後、7日後、１４日後ともに、グルコース濃度の上昇に依存してインスリン分泌量（濃度）が上昇した。しかも遊離細胞では、既に７日後にグルコース濃度に依存したインスリン分泌量の上昇が見られなくなったのに対し、製造例１では１４日後においてもその上昇が認められた。
また、製造例１又は比較例１中に含有される細胞を顕微鏡観察した結果、比較例１中の細胞は１日目から既に細胞破壊が生じていた。これに対し製造例１中の細胞は顕著な細胞破壊が認められず、１４日後も比較的安定に生存していた（図５）。図５中、（ａ）は培養１日後、（ｂ）は培養７日後、（ｃ）は培養１４日後の細胞観察像をそれぞれ示す。
【００４８】
以上の結果より、製造例１中において膵島細胞は安定に生存し、長期間安定にその活性を維持し、グルコース濃度の上昇に反応してインスリンを分泌することが分かった。従って、ＰＶＡに予めＥＣ溶液を配合することにより、ＰＶＡゲル化の際の急冷による細胞の死滅及び細胞へのダメージが抑制され、その結果、ＰＶＡ中に含有される膵島細胞の生存率が高く、かつインスリン産生能及びグルコース濃度の上昇に対する反応性を維持できる細胞製剤が製造できることが証明された。
【実施例２】
【００４９】
（製造例２）膵島細胞を含有するシート状細胞製剤の製造
（１）膵島細胞の調製
Ｗｉｓｔｅｒラットをジエチルエーテルの吸収およびネンブタール１ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与にて全身麻酔した。開腹したのち、総胆管を同定し、これをベイター（Ｖａｔｅｒ）乳頭部付近で無鉤鉗子によりクランプした。胆嚢管合流部に小切開を置き、カニュレーションチューブを総胆管に挿入、結紮固定し、１２００〜１５００ｕ／ｍｌ相当のＸＩ型コラゲナーゼ（Sigma, St. Louis, MO, USA）を注入し、膵臓を膨化させた。膵を損傷しないように全摘し、フラスコに入れ、３７℃の恒温槽の中につけ、１８分前後で温消化した。消化後、数回フラスコを震盪して膵を破砕し、０．１％ウシ血清アルブミンを加えたハンクス液で３回洗浄した。ハンクス液中に細胞を浮遊させたのち、８５０μｍ径のメッシュフィルターに通し、ろ過した内容物を回収した。
【００５０】
膵島分離は、デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ  ７０）の比重勾配により行った。すなわち、上清を破棄した膵細胞成分を比重１．０９４のデキストラン＋ハンクス液に均一になるまで攪拌したのち、比重１．０９４のデキストラン液を静かに流入した。細胞層の上に比重１．０８１および１．０４１のデキストラン液を順次静かに入れ、４層にした。４００ｒｐｍで４分、さらに１７００ｒｐｍで１３分遠心した。１層目と２層目の間に分離された膵島をハンドピックにて回収し、洗浄したのち、ハンドピックにて純化した。４回洗浄後、３７℃、５％ＣＯ２９５％空気の環境下のインキュベーター中に一晩培養した。培地は、ＣＭＲＬ１０６６＋１０％不活化ウシ胎仔血清＋antibiotic-antimycotic solution（Gibco, BRL）＋ニコチンアミドを用いた。
【００５１】
（２）シート状膵島細胞製剤の調製
上記で得られた膵島細胞の培養液を用い、実施例１における製造例１の（２）、（３）、（４）および（５）と同様にして細胞が活性化されたシート状膵島細胞製剤（製造例２）を得た。
【００５２】
（試験例４）製剤のインスリン分泌能
上記得た膵島細胞製剤（製造例２、作製後１日目のもの）又は遊離の膵島細胞に、試験例３と同様に、低濃度グルコース（３．３ｍＭ）と高濃度グルコース（１６．７ｍＭ）による刺激を１時間ずつ加え、分泌するインスリン量をＥＬＩＳＡで測定した。
結果を図６に示す。この図６から分かるように、本発明にかかる膵島細胞製剤はグルコース刺激に応じてインスリンを分泌し、同時期の遊離の膵島細胞と比べて遜色がなかった。
【００５３】
（試験例５）移植試験
（１）糖尿病モデルマウスの作製
８〜１０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解したストレプトゾトシン２００ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。投与後１週間で血糖を３回測定し、２回以上血糖３５０ｍｇ／ｄｌ以上になったマウスを糖尿病成立したものと判断し、実験に使用した。なお、ストレプトゾトシン投与を行わないマウスを、正常マウス群とした。
【００５４】
（２）移植
膵島細胞製剤の移植は、次のようにして行った。すなわち、糖尿病モデルマウス（糖尿病作成後１週以上のもの）をエーテル麻酔下で正中切開にて開腹し、上記製造例２で得た膵島細胞製剤（製造例２）を腹腔内に留置した後、腹壁を２層に閉鎖した。このマウスを移植マウス群とした。なお、膵島細胞の入っていない製剤（比較例１と同様に調製）を移植したマウスを、糖尿病マウス群とした。
【００５５】
（３）生存期間の検討
移植した時を０日とし、以後の生存期間を観察した。
結果を図７に示す。この図７から明らかなように、糖尿病マウス群では、過半数が移植後４週以内に死亡し、経過観察期間の８週まで生存したマウスは存在しなかった。一方、膵島細胞製剤を移植した移植マウス群では、高血糖状態が続き死亡した２匹以外はすべて８週以上生存した（８週までの生存率は、０％対８１．８％、ｐ＜０．００１）。
【００５６】
（４）血糖・体重測定
血糖、体重共に、移植前、移植後１日目、３日目、５日目、７日目に測定し、それ以降は毎週１回測定した。各群の血糖変化を図８に示す。移植群では、移植後の血糖は、多数が速やかに３００ｍｇ／ｄｌ未満に低下（１３／１６）し、正常化したものも過半数に見られたが次第に上昇した（３００ｍｇ／ｄｌ未満に保たれた日数は３日〜７週）。しかし、血糖上昇の程度は軽度で、糖尿病マウス群に比べ血糖は有意に改善し（ｐ＜０．０００１）、また、移植後８週までの生命予後も明らかに改善した。８週まで観察した９匹のうち６匹に膵島細胞製剤の摘出術を施行したが、そのうちの５匹に血糖の再上昇がみとめられた。
【００５７】
各群の平均体重の変化を図９に示す。移植マウス群では、移植後、体重は術後の節食不良が原因と考えられるが減少し、移植後３週までの反復測定分散分析では、糖尿病マウス群との有意差は認められなかった。しかし、移植後３週には増加に転じ、経過中体重が最も低下した１週目に比べ、３週以降は有意な上昇を認めた（ｐ＜０．０５）。さらに、３週および４週では同時期の糖尿病マウス群の平均体重を有意に上回った。
【００５８】
（５）腎機能測定
ＢＵＮ（血中尿素窒素）、クレアチニンは、移植前、移植後は毎週１回測定した。移植後８週で膵島細胞製剤を摘出し、その後１週まで測定を行った。
ＢＵＮの変化を図１０に示す。膵島細胞製剤移植前に測定した血糖正常マウスＢＵＮの平均±ＳＥは２５．５３ｍｇ／ｄｌ±１．８０４（２０−３８．９）であった。ストレプトゾトシンを投与し１週間目の糖尿病マウス群のうち、４１．３％にＢＵＮの上昇が見られた（２４／５８、糖尿病マウス群：１３／３５  対  移植マウス群：１１／２３、ＢＵＮ＞３５ｍｇ／ｄｌ）。実験に使用した糖尿病マウス群１４匹のうち、１３匹が経過中ＢＵＮ高値を示した。
【００５９】
一方、移植マウス群１６匹の検討では、術前にＢＵＮが上昇した９匹は全て移植後１週で正常化が見られた。平均値では移植後１週で低下したＢＵＮ値は正常値とほとんど変わらず経過し、糖尿病マウス群との有意差が認められた（ｐ＝０．００２）。
さらに、移植後８週で膵島細胞製剤を摘出した６匹のうち、４匹に摘出後１週のＢＵＮ値を計測したが、いずれも摘出前に比べ上昇していた。
【００６０】
クレアチニンの変化を図１１に示す。クレアチニンの正常値は０．３５１ｍｇ／ｄｌ±０．０３２（０．１６−０．５）であった。ストレプトゾトシン投与後１週で半数近くの糖尿病群マウスが０．５ｍｇ／ｄｌの高値を示し、投与後４週で全てのマウスにクレアチニン値に異常を認めた。また、クレアチニン上昇後、いずれのマウスも数週で死亡し、ストレプトゾトシン投与後１０週まで生存できたマウスは存在しなかった。移植マウス群ではクレアチニンの移植後の上昇が６匹に認められたが、いずれも軽度で経過観察期間中生存可能であった。クレアチニン平均値は移植マウス群では、移植後５週のみ０．５ｍｇ／ｄｌを上回ったが、他のいずれの期間でも０．４ｍｇ／ｄｌ台に落ち着いており、糖尿病マウス群に比べ有意に低下していた（ｐ＝０．０４７８）。また、膵島細胞製剤摘出後はＢＵＮ同様、全てのマウスに再上昇が認められた。
【００６１】
（６）尿検査
２４時間尿を採取し、尿量、２４時間尿糖排泄量、２４時間尿アルブミン排泄量、尿ケトン体を測定した。移植マウス群、糖尿病マウス群、正常血糖マウス群ともに代謝ケージ内で２４時間、自由飲水、食事環境下で飼育し、２４時間尿を回収した。尿糖はＦｕｊｉ  ＤＲＩ−ＣＨＥＭシステムで測定し、尿量を乗じたものを尿糖排泄量とした。また、２４時間尿アルブミン排泄量は、尿アルブミン濃度をＥＬＩＳＡ（Ａｌｂｕｗｅｌｌ  Ｍ（Ｅｘｏｃｉｌｌ））で測定し、２４時間尿量を乗ずることで算出した。尿ケトン体はウロテープ（栄研）を使用し、色調を数値化することで評価した。
【００６２】
２４時間尿量の変化を図１２に示す。移植マウス群は糖尿病マウス群と比べ有意差はないが、若干の低値を示した。
【００６３】
尿糖排泄量の変化を図１３に示す。糖尿排泄量に関しても、移植マウス群は糖尿病マウス群に比べて低値で、移植後３週まで有意差が認められた（ｐ＜０．０４５２）。
【００６４】
また、尿ケトン体量の変化を図１４に示す。尿ケトン体量は糖尿病マウス群、移植マウス群共に移植前で上昇した。移植マウス群では、移植後１週で正常化し、その後も糖尿病マウス群と比べ有意に低下した（ｐ＝０．０２９４）。
【００６５】
さらに、尿アルブミン量の変化を図１５に示す。尿アルブミン量は、移植マウス群で糖尿病マウス群よりも低値を示したが、有意差は認められなかった。
【００６６】
（７）１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（１，５−ＡＧ）測定
糖尿病の程度を検討するため、１，５−ＡＧ測定を行った。１，５−ＡＧはグルコースと極めて類似した構造を持つポリオールで、主として食物中より摂取、吸収され、体内に広く豊富に蓄積される。そして腎にて再吸収を受ける。グルコースと競合作用があり、糖尿病時には尿糖のＡＧ再吸収は阻害を受け、尿中ＡＧ排泄の増大と、血中ＡＧの減少につながる。したがって、１，５−ＡＧは、グルコースの動態に対し極めて鋭敏に反応するため、リアルタイムの糖尿病の状態を反映するマーカーとなりうる。移植マウス群、糖尿病マウス群、正常血糖マウス群ともに移植前と、移植後毎週１回尾静脈より血液２５μｌを採取し、動物用１，５−ＡＧキット（日本化薬）で測定した。
【００６７】
結果を図１６に示す。この図から明らかなように、正常血糖マウス群に比べ、糖尿病マウス群では１，５−ＡＧ濃度は明らかに低値であり、糖尿病の状態をよく反映した。移植マウス群の１，５−ＡＧ平均値は術前と比べ、１週で上昇した。また、期間中糖尿病マウス群と比較して有意な上昇が認められた（ｐ＝０．０２０３）。
【００６８】
（８）考察
上記移植実験から明らかなように、本発明の膵島細胞製剤は、それを移植することにより、糖尿病状態を改善し、糖尿病による死亡および糖尿病性の腎障害の予防に有効であることが分かる。また、本発明の膵島細胞製剤の移植は、糖尿病の治癒のみでなく、合併症予防の点からも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】シート状膵島細胞製剤の製造方法を示す模式図である。
【図２】製造例１、比較例１又は遊離膵島細胞の培養1日後の生細胞の回収率を調べた結果を示す図である。
【図３】製造例１、比較例１又は遊離膵島細胞中の培養1日後のインスリン含有量を調べた結果を示す図である。
【図４】製造例１、比較例１又は遊離膵島細胞のインスリン分泌能を経時的に調べた結果を示す図である。
【図５】製造例１又は比較例１に含有される膵島細胞を経時的に観察した顕微鏡写真を示す図である。
【図６】製造例２又は遊離膵島細胞のインスリン分泌能を調べた結果を示す図である。
【図７】移植マウス群および糖尿病マウス群の生存期間を示す図である。
【図８】移植マウス群、糖尿病マウス群および正常血糖マウス群の血糖の変化を示す図である。
【図９】移植マウス群、糖尿病マウス群および正常血糖マウス群の体重の変化を示す図である。
【図１０】移植マウス群、糖尿病マウス群および正常血糖マウス群のＢＵＮ（血中尿素窒素）の変化を示す図である。
【図１１】移植マウス群、糖尿病マウス群および正常血糖マウス群のクレアチニンの変化を示す図である。
【図１２】移植マウス群、糖尿病マウス群および正常血糖マウス群の２４時間尿量の変化を示す図である。
【図１３】移植マウス群、糖尿病マウス群および正常血糖マウス群の２４時間尿糖排泄量の変化を示す図である。
【図１４】移植マウス群、糖尿病マウス群および正常血糖マウス群の尿ケトン体量の変化を示す図である。
【図１５】移植マウス群、糖尿病マウス群および正常血糖マウス群の２４時間尿アルブミン排泄量の変化を示す図である。
【図１６】移植マウス群、糖尿病マウス群および正常血糖マウス群の１，５−ＡＧ量の変化を示す図である。
【符号の説明】
【００７０】
１      膵島細胞
２      ＰＶＡ＋ＥＣ溶液
３      ＰＶＡ＋ＥＣゲル
４、６  メッシュシート
５、７  ガラスプレート
８      シート状膵島細胞含有製剤
【図２】
2004331643.tif 000004
【図３】
2004331643.tif 000005
【図４】
2004331643.tif 000006
【図６】
2004331643.tif 000007
【図７】
2004331643.tif 000008
【図８】
2004331643.tif 000009
【図９】
2004331643.tif 000010
【図１０】
2004331643.tif 000011
【図１１】
2004331643.tif 000012
【図１２】
2004331643.tif 000013
【図１３】
2004331643.tif 000014
【図１４】
2004331643.tif 000015
【図１５】
2004331643.tif 000016
【図１６】
2004331643.tif 000017
【図１】
2004331643.tif 000018
【図５】
2004331643.tif 000019