(57)【要約】【課題】疎水性に優れたＷＰＣ製品を低コストで生産する。【解決手段】１又は複数のモノマー供給系酵素遺伝子と合成されたモノマーから高分子化合物を合成する重合酵素遺伝子とをゲノム中に含み、上記１又は複数のモノマー供給系酵素遺伝子及び上記重合酵素遺伝子を含む高分子材料合成関連酵素群により合成された高分子材料を含有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数のモノマー供給系酵素遺伝子と、合成されたモノマーから高分子化合物を合成する重合酵素遺伝子とをゲノム中に含み、
上記１又は複数のモノマー供給系酵素遺伝子及び上記重合酵素遺伝子を含む高分子材料合成関連酵素群により合成された高分子材料を含有する高分子材料含有植物。
【請求項２】
上記モノマー供給系酵素遺伝子が生物由来のｐｈａ  Ｂであり、上記重合酵素遺伝子が生物由来のｐｈａ  Ｃであることを特徴とする請求項１記載の高分子材料含有植物。
【請求項３】
上記生物がＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａであることを特徴とする請求項２記載の高分子材料含有植物。
【請求項４】
上記複数のモノマー供給系酵素遺伝子が脂肪酸のβ−酸化経路を経てモノマーを供給する複数の遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の高分子材料含有植物。
【請求項５】
上記複数のモノマー供給系酵素遺伝子がＤｅ  ｎｏｖｏ脂肪酸合成経路を経てモノマーを供給する複数の遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の高分子材料含有植物。
【請求項６】
上記高分子材料がポリヒドロキシアルカン酸であることを特徴とする請求項１記載の高分子材料含有植物。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれか一項記載の高分子材料含有植物体から得られる建材、製品又は工業原料。
【請求項８】
１又は複数のモノマー供給系酵素遺伝子と、合成されたモノマーから高分子化合物を合成する重合酵素遺伝子とを、機能しうるかたちで染色体に導入して形質転換体を得る工程と、
上記工程で得た形質転換体を植物体に成長させる工程とを含む高分子材料含有植物の製造方法。
【請求項９】
上記モノマー供給系酵素遺伝子が生物由来のｐｈａ  Ｂであり、上記重合酵素遺伝子が生物由来のｐｈａ  Ｃであることを特徴とする請求項８記載の高分子材料含有植物の製造方法。
【請求項１０】
上記生物がＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａであることを特徴とする請求項９記載の高分子材料含有植物の製造方法。
【請求項１１】
上記高分子材料がポリヒドロキシアルカン酸であることを特徴とする請求項８記載の高分子材料含有植物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高分子材料を蓄積した高分子材料含有植物及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
木質と石油系プラスチックとの複合材料（以下、ＷＰＣ製品（ｗｏｏｄ  ａｎｄ  ｐ１ａｓｔｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）と呼ぶ。）は、プラスチックのモノマーを植物系バイオマスヘ充填し、加熱触媒処理によるポリマー化を行う事により生産されている製品群として知られている。ＷＰＣ製品は、天然繊維素をプラスチックポリマー化する事により、疎水性等の向上を目的とした工業製品である。プラスチックポリマー化された繊維素は、各種特性が変化することによって、糸、パルプ、紙及び建材などの様々な製品に使用することが可能となる。
【０００３】
例えば、建材・船舶用材などをＷＰＣ製品とすることで、吸湿・吸水による体積変化を抑制できるといった寸法安定性を向上させることができ、また、腐食低下並びに虫害低下などを付与できるといった耐朽性の向上を図ることができる。
【０００４】
ＷＰＣ製品の生産方法としては、プラスティックのモノマーを植物系バイオマスヘ浸透させ、加熱触媒処理によりポリマー化を行うといった生産方法が知られている（非特許文献１参照）。しかしながら、この方法では、モノマー充填（例えば、減圧法では１〜２０ｍｍＨｇで０．５〜２．０時間の条件であり、加圧法では１〜２０ｋｇｆ／ｃｍ２で２〜２０時間の条件）や重合（加熱条件が５０〜８０℃で１〜２０時間）の際に多くのエネルギーが必要となる。このため、この方法には、生産コストが高いといった問題がある。
【０００５】
また、重合に際して放射線照射法を使用する場合には、特に、製造工程での労働従事者の人体への影響の可能性が問題点として考えられる。
【０００６】
さらに、モノマー充填に際して、減圧法及び加圧法のいずれで行ったとしても、バイオマスの微細構造が原因で、樹種によってはモノマーを充填しにくい場合がある。言い換えると、この方法には、ＷＰＣ製造に適さない樹種があり、樹種による制限を受るといった問題がある。
【０００７】
さらにまた、プラスチックモノマーとしては、スチレン、不飽和ポリエステル・スチレン、スチレン・アクロニトリルなどを使用している。これらは人体に有毒なＶＯＣ（揮発性有機物質）や環境ホルモンとなる可能性があるため、特に完全に重合しないでバイオマス中に残存した場合、人体や環境への負荷が大きいなどの問題の発生する恐れがある。
【０００８】
【非特許文献１】
木質新素材ハンドブック、技報堂出版、木質新素材ハンドブック編集委員会、４６１〜７７４頁、１９９６年。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は上述したような実状に鑑み、疎水性に優れたＷＰＣ製品を低コスト、石油系エネルギー消費量の削減、環境負荷の低減させて生産すべく、疎水性に優れた高分子含有植物を提供することを目的とし、樹種の適用範囲が広く、低コスト、低環境負荷を達成することができる高分子含有植物の製造方法を提供することを目標とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
（１）  １又は複数のモノマー供給系酵素遺伝子と、合成されたモノマーから高分子化合物を合成する重合酵素遺伝子とをゲノム中に含み、
上記１又は複数のモノマー供給系酵素遺伝子及び上記重合酵素遺伝子を含む高分子材料合成関連酵素群により合成された高分子材料を含有する高分子材料含有植物。
（２）  上記モノマー供給系酵素遺伝子が生物由来のｐｈａ  Ｂであり、上記重合酵素遺伝子が生物由来のｐｈａ  Ｃであることを特徴とする（１）記載の高分子材料含有植物。
（３）  上記生物がＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａであることを特徴とする（２）記載の高分子材料含有植物。
（４）  上記複数のモノマー供給系酵素遺伝子が脂肪酸のβ−酸化経路を経てモノマーを供給する複数の遺伝子であることを特徴とする（１）記載の高分子材料含有植物。
（５）  上記複数のモノマー供給系酵素遺伝子がＤｅ  ｎｏｖｏ脂肪酸合成経路を経てモノマーを供給する複数の遺伝子であることを特徴とする（１）記載の高分子材料含有植物。
（６）  上記高分子材料がポリヒドロキシアルカン酸であることを特徴とする（１）記載の高分子材料含有植物。
（７）  （１）乃至（６）いずれか一項記載の高分子材料含有植物体から得られる建材、製品又は工業原料。
（８）  １又は複数のモノマー供給系酵素遺伝子と、合成されたモノマーから高分子化合物を合成する重合酵素遺伝子とを、機能しうるかたちで染色体に導入して形質転換体を得る工程と、
上記工程で得た形質転換体を植物体に成長させる工程とを含む高分子材料含有植物の製造方法。
（９）  上記モノマー供給系酵素遺伝子が生物由来のｐｈａ  Ｂであり、上記重合酵素遺伝子が生物由来のｐｈａ  Ｃであることを特徴とする（８）記載の高分子材料含有植物の製造方法。
（１０）  上記生物がＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａであることを特徴とする（８）記載の高分子材料含有植物の製造方法。
（１１）  上記高分子材料がポリヒドロキシアルカン酸であることを特徴とする（８）記載の高分子材料含有植物の製造方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明に係る高分子材料含有植物の製造方法は、先ず、１又は複数のモノマー供給系酵素遺伝子と、合成されたモノマーから高分子化合物を合成する重合酵素遺伝子とを、機能しうるかたちで染色体に導入する。
【００１３】
ここでモノマー供給系酵素遺伝子とは、植物内におけるモノマー生合成に関与する全ての酵素の遺伝子を含む意味である。例えば、モノマー供給系酵素遺伝子としては、モノマー合成酵素遺伝子、及びモノマー合成酵素が利用する基質を合成する酵素遺伝子を挙げることができる。モノマー合成酵素遺伝子とは、植物内に存在する基質を利用し、高分子化合物を構成するモノマーを合成する機能を有する酵素をコードする遺伝子である。例えば、モノマー合成酵素遺伝子としては、特に限定されないが、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ遺伝子（以下、ｐｈｂＢ遺伝子と呼ぶ）を例示することができる。ｐｈｂＢ遺伝子は、植物内で合成されたアセトアセチル−ＣｏＡを基質として、３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡを合成するアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ（以下、ｐｈｂＢと呼ぶ）をコードする遺伝子である。
【００１４】
ｐｈｂＢ遺伝子は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のものを使用することが好ましい。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈｂＢ遺伝子は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａのゲノムライブラリー或いはｃＤＮＡライブラリーから定法に従って取得することもできるし、ｐｈｂＢ遺伝子の塩基配列に基づいて設計された一対のプライマーを用いてＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａゲノムを鋳型としたＰＣＲによっても取得することができる。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来ｐｈｂＢ遺伝子の塩基配列の一例を配列番号１に示し、ｐｈｂＢ遺伝子がコードするｐｈｂＢのアミノ酸配列の一例を配列番号２に示す。
【００１５】
なお、本発明において、ｐｈｂＢ遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からなるものに限定されず、ｐｈｂＢをコードするならば配列番号１と異なる塩基配列であっても良い。また、本発明において、ｐｈｂＢとしては、配列番号２のアミノ酸配列からなるものに限定されず、配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸を欠失、置換、付加或いは挿入したアミノ酸配列からなり、且つ、アセトアセチル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡを合成する活性を示すアミノ酸配列からなるものであっても良い。
【００１６】
また、本発明において、ｐｈｂＢ遺伝子としては、配列番号１に示す塩基配列において１又は複数の塩基が欠失、置換、付加或いは挿入された塩基配列であって且つアセトアセチル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡを合成する活性を示す酵素（ｐｈｂＢ）をコードする塩基配列からなるものであっても良い。また、本発明において、ｐｈｂＢ遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であってアセトアセチル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡを合成する活性を示す酵素（ｐｈｂＢ）をコードする塩基配列からなるものであっても良い。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が５００〜１０００ｍＭ、好ましくは７００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
【００１７】
一方、重合酵素遺伝子とは、ｐｈｂＢ等のモノマー合成酵素によって合成されたモノマーを基質として高分子化合物を合成する酵素をコードする遺伝子である。例えば、重合酵素遺伝子としては、特に限定されないが、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素（以下、ｐｈｂＣ）をコードする遺伝子（以下、ｐｈｂＣ遺伝子と呼ぶ）が挙げられる。なお、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は、３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡを基質としてポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を生成する触媒機能を有するほか、３−ヒドロキシペンタノイル−ＣｏＡ又は３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡを基質としてポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を生成する触媒機能を有する酵素である。
【００１８】
ｐｈｂＣ遺伝子は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のものを使用することが好ましい。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈｂＣ遺伝子は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａのゲノムライブラリー或いはｃＤＮＡライブラリーから定法に従って取得することもできるし、ｐｈｂＣ遺伝子の塩基配列に基づいて設計された一対のプライマーを用いてＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａゲノムを鋳型としたＰＣＲによっても取得することができる。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来ｐｈｂＣ遺伝子の塩基配列の一例を配列番号３に示し、ｐｈｂＣ遺伝子がコードするｐｈｂＣのアミノ酸配列の一例を配列番号４に示す。
【００１９】
なお、本発明において、ｐｈｂＣ遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列からなるものに限定されず、ｐｈｂＣをコードするならば配列番号３と異なる塩基配列であっても良い。また、本発明において、ｐｈｂＣとしては、配列番号４のアミノ酸配列からなるものに限定されず、配列番号４のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸を欠失、置換、付加或いは挿入したアミノ酸配列からなり、且つ、３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡを基質としてポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を生成する触媒機能を有するアミノ酸配列からなるものであっても良い。
【００２０】
また、本発明において、ｐｈｂＣ遺伝子としては、配列番号３に示す塩基配列において１又は複数の塩基が欠失、置換、付加或いは挿入された塩基配列であって且つ３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡを基質としてポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を生成する触媒機能を有する酵素（ｐｈｂＣ）をコードする塩基配列からなるものであっても良い。また、本発明において、ｐｈｂＣ遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって３−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡを基質としてポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を生成する触媒機能を有する酵素（ｐｈｂＣ）をコードする塩基配列からなるものであっても良い。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が５００〜１０００ｍＭ、好ましくは７００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
【００２１】
ところで、これらモノマー合成酵素遺伝子及び重合酵素遺伝子を機能しうるかたちで染色体に導入するには、これらモノマー合成酵素遺伝子及び重合酵素遺伝子を含む発現ベクターを構築する。発現ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡ（バイナリーベクター）としては、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．  ＆  Ｄｏｌｙ，Ｊ．（１９７９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ７：  １５１３）等により調製することができる。バイナリーベクターとしては、例えばｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１等が挙げられる。また、市販のプラスミドとして例えばｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１９  （宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  社製）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いてもよい。ファージ  ＤＮＡとしては、例えば、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９、Ｍ１３ｔｖ１８等が挙げられる。
【００２２】
ベクターにプロモーターを挿入するには、まず、精製されたモノマー合成酵素遺伝子及び重合酵素遺伝子を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して連結する方法などが採用される。プロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター等が挙げられる。ここで、発現の目的となるモノマー合成酵素遺伝子及び重合酵素遺伝子は、いずれもその遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、発現用ベクターには、上記プロモーター及び上記遺伝子のほか、ターミネーター、薬物耐性遺伝子等を組み込むことができる。この場合、ターミネーターとしてはノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターなどが挙げられ、エンハンサーとしてはタバコモザイクウイルスΩ配列などが挙げられ、薬物耐性遺伝子としてはカナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２３】
具体的には、例えば、図１に示すように、ｐｈｂＢ遺伝子及びｐｈｂＣ遺伝子をそれぞれカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ）の下流につなぎ、その下流にノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（ＮｏｓＴ）をそれぞれつなぐ（それぞれｐｈｂＢ遺伝子カセット及びｐｈｂＣ遺伝子カセットという）。また、ｐｈｂＣ遺伝子カセットの下流に、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ）及びノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（ＮｏｓＴ）をつないだカセットも作製する（ＮＰＴカセットという）。そして、ｐｈｂＢ遺伝子カセット、ｐｈｂＣ遺伝子カセット及びＮＰＴカセットの順で連結し、発現ベクターを得ることができる。
【００２４】
得られた発現ベクターを用いて、宿主となる植物を形質転換することによって、モノマー合成酵素遺伝子及び重合酵素遺伝子を機能しうるかたちで染色体に導入することができる。
【００２５】
ここで、宿主とは、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞のいずれであってもよい。形質転換に用いられる植物としては、いかなる植物であってもよいが、例えば、イネ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、マメ科、ヤシ科、アカネ科、マツ科、ヒノキ科、カバノキ科（カバ科）、ブナ科、ナンヨウスギ科、ギョリュウ科、ヤナギ科、ツツジ科、スギ科、ニレ科、モクレン科、クルミ科、クスノキ科、ウコギ科、モクセイ科、トチノキ科、センダン科、イヌガヤ科、トチュウ科、ゴム科、マンサク科、シナノキ科、カエデ科、ツゲ科に属する植物が挙げられる。
【００２６】
植物体、植物器官又は植物組織を宿主とする場合、形質転換は、採取した植物切片に、上述した発現用ベクターをアグロバクテリウム法で導入することにより行うことができる。また、プロトプラストにエレクトロポレーション法で導入することもでき、あるいはパーティクルボンバードメント法で植物器官又は植物組織に導入することにより行うこともできる。
【００２７】
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモンの投与などにより植物体に再生させることができる。植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、上述した発現用ベクターをエレクトロポレーション法又はアグロバクテリウムのバイナリーベクター法等で培養細胞に導入し、その後、前記と同様にして細胞培養、組織培養、器官培養を行うことで植物体を得ることができる。
【００２８】
このようにして得られた形質転換体を培養又は栽培すれば、高分子材料を含有する植物体を生産することができる。
【００２９】
形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばＭＳ基本培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，  Ｔ．  ＆  Ｓｋｏｏｇ，  Ｆ．  （１９６２）  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．  １５：  ４７３）、ＬＳ基本培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ，  Ｅ．  Ｍ．  ＆  Ｓｋｏｏｇ，  Ｆ．  （１９６５）  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．  １８：  １００）、プロトプラスト培養培地（ＬＳ培地を改変したもの）等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好ましい。
【００３０】
上記培地に、細胞、組織又は器官を０．５〜４０ｇ新鮮重／ｌ接種し、必要によりＮＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡ、カイネチン等を適宜添加して培養する。培養開始時の培地の  ｐＨ  は５．６〜５．８に調節し、培養は通常２５〜３０℃、好ましくは２５℃前後で、２０〜１２０ｒｐｍ攪拌で１〜８週間培養する。形質転換体が植物体である場合は、圃場やガラスハウスなどで栽培又は水耕培養することができる。
【００３１】
以上のようにして、培養された植物体内部には、上記モノマー合成酵素遺伝子及び上記重合酵素遺伝子によって高分子材料が合成されることとなる。特に、モノマー合成酵素遺伝子としてｐｈｂＢ遺伝子を導入するとともに重合酵素遺伝子としてｐｈｂＣ遺伝子を導入することによって、植物内で合成されたアセトアセチル−ＣｏＡを出発物質として、最終的にポリ−（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート（以下、ＰＨＢと呼ぶ）を蓄積した植物体を生産することができる。ここで、出発物質であるアセトアセチル−ＣｏＡは、植物が本来有するβケトチオラーゼ（以下、ｐｈｂＡ）によってアセチル−ＣｏＡから生合成される。
【００３２】
本発明に係る高分子材料含有植物の製造方法によれば、生物反応を利用して細胞体内にＰＨＢのような高分子材料を充填させるので、従来法で行う天然繊維へのプラスチックモノマーの浸透、熱触媒によるポリマー化工程（以下、従来法と呼ぶ）を経ることなく、生物的にＷＰＣが作出される。すなわち、本発明に係る高分子材料含有植物の製造方法は、従来法と比較してより簡易であり、且つ、光合成による太陽エネルギーを利用するために環境負荷が少なく、優れた生産効率を達成することができる。
【００３３】
また、本発明に係る高分子材料含有植物の製造方法によれば、従来法で行う繊維細胞に外来からプラスティックを浸透させた場合と比較して、高分子材料の蓄積量が少量であっても類似或いはそれ以上の効果が生じる。
【００３４】
さらに、本発明に係る高分子材料含有植物の製造方法によれば、植物細胞内で生合成された高分子材料を含有するため、従来法により得られたプラスティック含有植物と比較して、熱特性の変化等新たな物性変化を与えることもできる。
【００３５】
また、得られた高分子材料含有植物は、ＷＰＣ製品として広く利用することができる。高分子材料含有植物の利用範囲としては、特に限定されないが、建材、製品又は工業原料を挙げることができる。その他にも、洋風床材、床暖房用床材、家具（テーブル、学童机、脚物など）、運道具（ゴルフクラブヘッド、木刀、銃床、ビリヤードのキュー）、食器などの日用品、工芸品、楽器、アセチル化ＷＰＣ床材用の原料、紙、糸などの原料、ちょうちん用油紙の代替え品などにも用途が見込める。
【００３６】
特に、得られた高分子材料含有植物は、天然植物性ポリマーと比較して疎水性の高い高分子材料を蓄積させることができるため、例えば建材・船舶用材等に利用する場合の寸法安定性（吸湿・吸水による体積変化の抑制）ならびに耐朽性の向上（腐食低下、虫害低下などによる）を達成したものとなる。
【００３７】
また、得られた高分子材料含有植物は、植物全組織に高分子材料を含有するため、全体をＷＰＣ製品の材料として利用できる。このため、本発明に係る高分子材料含有植物の製造方法は、廃棄物が出ないゼロエミッション型の工業原料生産技術となる。
【００３８】
ところで、本発明において高分子材料としては、ＰＨＢに限定されず、例えばＰＨＢと同等の効力をもつバイオポリエステル、ポリヒドロキシアルカン酸、つまり、Ｐ（３ＨＢ−３ＨＶ）、Ｐ（３ＨＢ−４ＨＢ）、Ｐ（３ＨＯ−３ＨＢ）などを挙げることができる。
【００３９】
例えば、モノマー合成酵素遺伝子としてＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈｂ  Ｂを用い、重合酵素遺伝子としてＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈｂ  Ｃを用いることによって、高分子材料としてポリ（３−ヒドロキシブタン酸）を蓄積した高分子材料含有植物を製造することができる。また、モノマー合成酵素遺伝子としてＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉｅ由来のｐｈａ  Ｊを用い、重合酵素遺伝子としてＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉｅ由来のｐｈａ  Ｃを用いることによって、高分子材料としてポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）共重合体を蓄積した高分子材料含有植物を製造することができる。さらに、モノマー合成酵素遺伝子としてＣｏｍａｍｏｎｕｓ  ａｃｉｄｖｏｒａｎｓ由来のｐｈａ  Ｂを用い、重合酵素遺伝子としてＣｏｍａｍｏｎｕｓ  ａｃｉｄｖｏｒａｎｓ由来のｐｈａ  Ｃを用いることによって、高分子材料としてポリ（３−ヒドロキシブタン酸）蓄積した高分子材料含有植物を製造することができる。
【００４０】
また、モノマー合成酵素遺伝子としては、生物由来の遺伝子（ｐｈａ  Ｂ）であれば上述の例示列挙された遺伝子に限定されず、如何なる遺伝子をもちいてもよい。さらに、１つのモノマー合成酵素遺伝子を用いてもよいが、複数のモノマー合成酵素遺伝子を用いてもよい。
【００４１】
いずれの場合であっても、本発明に係る高分子材料含有植物の製造方法によれば、充填した繊維素（セルロース、ヘミセルロース、リグニンなど）を、植物等の繊維素生産生物を用いて生産することができる。本発明に係る高分子材料含有植物の製造方法においては、植物の持つ光合成機能から生産される化学エネルギーを利用してポリマー化を行い、バイオポリエステルを充填した植物細胞（ポリマー充填繊維素或いはハイブリッドファイバーとも呼ばれる）を生産することができる。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４３】
〔実施例１〕発現ベクターの構築
本例では、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のｐｈｂＢ遺伝子及びｐｈｂＣ遺伝子を機能しうるかたちで有する発現ベクターを構築した（図１参照）。なお、一般的なＤＮＡの実験方法は、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ−ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）』に従った。まず、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ起源のｐｈｂＡ遺伝子、ｐｈｂＢ遺伝子およびｐｈｂＣ遺伝子（ＰＨＢ合成遺伝子断片）をＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．  ２６４，  Ｎｏ．  ２６，  １５２９３−１５２９７  （１９８９）およびＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２６４，  Ｎｏ．  ２６，  １５２９８−１５３０３  （１９８９）に記載されている方法で調整した。一方、得られたＰＨＢ合成遺伝子断片をプラスミドに導入するため、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用意し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡製）およびＳｍａ  Ｉ（東洋紡製）を反応させた。エタノール沈澱してプラスミドを回収の後、アルカリホスファターゼ（ロッシュ製）用いて脱リン酸化反応をおこない、さらにフェノール抽出により精製した。次に、ＥｃｏＲＩとＳｍａＩ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋とＰＨＢ合成遺伝子断片を連結するために、ＰＨＢ合成遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡製）およびＳｍａ  Ｉ（東洋紡社製）処理し、フェノール抽出により精製した。その後、宝  バイオ社製のライゲーションキットｖｅｒ．  Ｉを用いて、ＰＨＢ合成遺伝子断片（約５．３ｋｂ）とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のライゲーション反応を行った。このようにして、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋にＰＨＢ合成遺伝子断片を導入したものをｐＲＥ−ｃａｂと名付けた。
【００４４】
次に、植物遺伝子導入用の発現ベクターへ導入するため、ｐｈｂＣ遺伝子断片をプラスミドｐＲＥ−ｃａｂを制限酵素ＢｓｔＢ  Ｉ（ＢｉｏＬａｂ社製）とＳｂｆ  Ｉ（ＢｉｏＬａｂ社製）で処理し、ｐｈｂＣ遺伝子断片（約１．９ｋｂ）を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）をもちいて精製した。このｐｈｂ  Ｃ遺伝子断片をさらに宝バイオ社製のブランテイングキットを用いて平滑末端化し、フェノール抽出により精製した。次いで発現ベクターｐＩＧ１２１  Ｈｍ（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，  Ｖｏｌ．  １２，  ７−１１  （１９９２）、名古屋大学  中村研三氏より入手）を制限酵素Ｘｂａ  Ｉ（東洋紡社製）とＳａｃ  Ｉ  （東洋紡社製）処理してＧＵＳ遺伝子断片とプラスミドベクター断片を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）をもちいてベクター断片を精製した。さらに宝バイオ社製のブランテイングキットでベクター断片を平滑末端化した。その後、宝  バイオ社製のライゲーションキットｖｅｒ．  Ｉを用いて、ｐｈｂＣ遺伝子断片とバイナリーベクター断片のライゲーション反応を行い、プラスミドベクター  ｐＩＧ１２１Ｈｍの３５Ｓプロモーター部分に対してセンス方向にｐｈｂＣ遺伝子断片が挿入したクローンを選抜した。このようにして、発現ベクターｐＩＧ１２１  ＨｍのＧＵＳ遺伝子部分をｐｈｂＣ遺伝子断片と置換したものをｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｃとした。
【００４５】
次に、ｐｈｂＢ遺伝子断片をｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｃに導入するため、まず、プラスミドｐＲＥ−ｃａｂをＸｃｍ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ社製）とＸｍｎ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ社製）で処理し、ｐｈｂＢ遺伝子断片（約０．９ｋｂ）を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離し、キアゲン社製ゲル抽出キットをもちいてｐｈｂＢ遺伝子断片を精製した。このｐｈｂ  Ｂ遺伝子断片をさらに宝バイオ社製のブランテイングキットを用いて平滑末端化し、フェノール抽出により精製した。プラスミドｐＢＩ  ２２１（クロンテック社製）をＸｂａ  ＩとＳａｃ  Ｉ  （東洋紡社製）で制限酵素処理してＧＵＳ遺伝子断片とプラスミドベクター断片を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）をもちいてｐＢＩ２２１ベクター断片を精製した。さらに宝バイオ社製のブランテイングキットでベクター断片を平滑末端化した。その後、宝  バイオ社製のライゲーションキットｖｅｒ．  Ｉを用いて、ｐｈｂＢ遺伝子断片とベクター断片のライゲーション反応を行い、プラスミドベクターｐＢＩ  ２２１の３５Ｓプロモーター部分に対してセンス方向にｐｈｂＢ遺伝子断片が挿入したクローンを選抜した。このようにして、ｐＢＩ  ２２１のＧＵＳ部分をｐｈｂＢ遺伝子断片と置換したものをｐＢＩ  ２２１−Ｂとした。
【００４６】
このｐＢＩ  ２２１−ＢをＨｉｎｄ  ＩＩＩとＥｃｏＲ  Ｉ（東洋紡社製）で制限酵素処理し、ｐｈｂ  Ｂ遺伝子発現カセット断片（３５Ｓプロモーター：ｐｈｂＢ遺伝子断片：Ｎｏｓターミネーター、約２ｋｂ）を０．７％アガロースゲル電気泳動により分離し、キアゲン社製ゲル抽出キットをもちいて精製した。このｐｈｂ  Ｂ遺伝子発現カセット断片をさらに宝バイオ社製のブランテイングキットを用いて平滑末端化し、フェノール抽出により精製した。次に、ｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｃをＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、宝バイオ社製のブランテイングキットを用いて平滑末端化し、フェノール抽出により精製した。その後、宝  バイオ社製のライゲーションキットｖｅｒ．  Ｉを用いて、ｐｈｂ  Ｂ遺伝子発現カセット断片とｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｃ断片のライゲーション反応を行い、ｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｃのＨｉｎｄ  ＩＩＩのサイトにｐｈｂ  Ｂ遺伝子発現カセット断片が挿入したものを選抜した。このようにして、プラスミドベクターｐＩＧ１２１  ＨｍのＧＵＳ遺伝子部分がｐｈｂＣ遺伝子断片と置換され、更にＨｉｎｄ  ＩＩＩのサイトにｐｈｂ  Ｂ遺伝子発現カセット断片が挿入した植物用の発現ベクターをｐＢＩ  １２１Ｈｍ−ｂ，  ｃとした。
【００４７】
〔実施例２〕形質転換
実施例１で調製した発現ベクターを用いてアグロバクテリウム法によりイネに形質導入した。本例では、Ｔ−ＤＮＡ領域を削除したアグロバクテリウム、ＬＢＡ４４０４（ＡＴＣＣ  ３７３４９より入手）またはＥＨＡ１０１（Ｐｒｏｄｉ−ｇｅｎｅ社のＨｏｏｄ  Ｅ．Ｅ．氏より入手した。）を使用した。
【００４８】
先ず、ＢｉｏＲａｄ社製エレクトロポレーション装置ジーンパルサーＩＩを用い、発現ベクターｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｂ，  ｃをアグロバクテリウムに導入した。具体的には、予め氷冷した電極板間０．２ｍｍのキュベットに４０μＬのコンピテントセルを入れ、そこへ１μＬの滅菌水に溶かした５０ｎｇの発現ベクターｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｂ，  ｃを添加した。抵抗２００Ω、電気容量２５μＦ、電圧２．５ｋＶで電気パルスを１回与えた後、１ｍｌの冷やしたＹＭ培地（インビトロジェン社製）を、ピペットを用いてキュベットへ添加し、２８℃で１時間振騰培養した後、５０μｇ／Ｌカナマイシン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンまたは、５０μｇ／Ｌハイグロマイシン、５０μｇ／Ｌカナマイシン、１００μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＹＭ固形培地で２〜３日２８℃で培養した。得られたコロニーを同様の抗生物質を含むＬＢ培地（インビトロジェン社製）で、２８℃で２〜３日間、液体培養した。増殖したクローンからプラスミドを抽出し、制限酵素処理によりプラスミドの有無およびプラスミドの変異の確認を行った。
【００４９】
正常に、発現ベクターｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｂ，  ｃの導入されたクローンを５０μｇ／Ｌカナマイシン、５０μｇ／Ｌハイグロマイシン、１００μｇ／Ｌのストレプトマイシンまたは５０μｇ／Ｌハイグロマイシン、５０μｇ／Ｌカナマイシン、１００μｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１２．５μｇ／Ｌリファンピシンを含むＡＢ固形培地（Ｄｒｉｃａ  Ｋ．Ａ．  ａｎｄ  Ｋａｄｏ  Ｃ．  Ｉ．  １９７４  ；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．  ７１：  ３６７７−３６８１，）上で２８℃で２〜３日間増殖した。増殖したコロニーを滅菌した薬匙でかき取り、１０ｍｇ／Ｌのアセトシリンゴンを添加したアグロバクテリウム懸濁培地（ＡＡ）（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４；  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６，  ２７１−２８２、横井修司、鳥山欽哉、１９９６、植物細胞工学シリーズ、モデル植物の実験プロトコール９３〜９８秀潤社）に懸濁し、ＯＤ  ６００が０．１６〜０．２になるように菌濃度を調節した。
【００５０】
次に、イネ種子（品種：日本晴、滋賀県農協より種籾を入手可能）をカルス誘導培地Ｎ６Ｃ１（横井修司、鳥山欽哉、１９９６、植物細胞工学シリーズ、モデル植物の実験プロトコール９３〜９８、秀潤社）に置床して、２８℃、１６時間日長で３〜４週間培養した。そして、得られた大きさ約１ｍｍ程度のカルス塊を種子よりはずして、同じカルス誘導培地Ｎ６Ｃ１培地に植え変え、２５℃、暗黒下で３日間、前培養した。前培養の後、培地を滅菌した茶漉しに入れ、前述したアグロバクテリウムの懸濁液に１〜３分浸漬した。浸漬後、滅菌ろ紙でカルス表面のアグロバクテリウム懸濁液を拭き取り、滅菌ろ紙を引いた共存培養培地Ｎ６ＣＯ（横井修司、鳥山欽哉、１９９６、植物細胞工学シリーズ、モデル植物の実験プロトコール９３〜９８、秀潤社）にカルスを置床した。これを２５℃、暗黒下で３日間培養した。培養後、２５０μｇ／Ｌセフォタキシム（和光純薬）を含むカルス誘導液体培地Ｎ６Ｃ１にカルスを浸漬し、３分間洗浄した。このカルスを選抜培地Ｎ６ＳＥ（横井修司、鳥山欽哉、１９９６、植物細胞工学シリーズ、モデル植物の実験プロトコール９３〜９８、秀潤社）に置床し、２８℃、１６時間日長で２週間培養し、新しい選抜培地Ｎ６ＳＥに植え換え、さらに２週間培養した。全てのカルスを再分化培地ＭＳＲＥ（横井修司、鳥山欽哉、１９９６、植物細胞工学シリーズ、モデル植物の実験プロトコール、９３〜９８、秀潤社）に植え、２８℃、１６時間日長で培養し、さらに３〜４週間培養した。
【００５１】
次に、再分化植物体をカルス塊からはずし、検定培地ＭＳＨＦ（横井修司、鳥山欽哉、１９９６、植物細胞工学シリーズ、モデル植物の実験プロトコール、９３〜９８、秀潤社）に置床した。そして、発根してくる個体を選抜し、選抜した個体についてシャーレの蓋を開けて、滅菌水をシャーレの培地上に注ぎ、１週間馴化を行った。この時、培地が乾かないように２日に１回滅菌水を供給した。馴化後、選抜された植物体（形質転換イネ）をイネ育成用土壌（三菱化学）：赤玉（１：１）隔離温室に出して育成した。
【００５２】
次に、形質転換イネからのゲノムＤＮＡの抽出は、若葉を１〜３ｃｍの長さに切り、滅菌したエッペンドルフチューブに入れ、１００μＬのＴＥ  緩衝液（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ）を更に添加し、エッペンドルフチューブ用のホモジェナイザーで１〜３分磨砕した。磨砕後は氷上に保管し、４℃、１５０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を新しい滅菌チューブに移した。この上清をゲノムＤＮＡ画分とした。
【００５３】
次に、ｐｈｂＢ遺伝子の存在を確認するためにＰＣＲを行った。このＰＣＲにおいては、配列番号５に示す１０  ｐｍｏｌｅｓのセンスプライマー、配列番号６に示す１０  ｐｍｏｌｅｓのアンチセンスプライマーを用い、酵素として１．２５  ＵのＫＯＤ−Ｄａｓｈを（東洋紡製）用い、０．２  ｍＭのｄＮＴＰ及び反応用緩衝液（終濃度：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７．５  ｍＭ  ＤＴＴ、２．５  μｇ／５０μＬ  ＢＳＡ）を用いた。また、鋳型となるゲノムＤＮＡは、２０μＬのＰＣＲ反応液全量に対して１０μＬを使用した。反応装置は、ＡＢＩ社製のＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲシステム９６００またはＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲシステム９７００を使用した。ＰＣＲの条件は、９８℃で２分維持した後、９８℃で３０秒、続いて５０℃で２秒、続いて７４℃で３０秒を１サイクルとして３０サイクル行い、最後に７４℃で５分反応させた後、４℃で保存するものとした。
【００５４】
このＰＣＲの結果を図２に示す。図２において矢印はｐｈｂＢ遺伝子の内部配列３９８ｂｐのバンドの位置を示している。また、図２において、Ｖレーンは発現ベクターｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｂ，  ｃを鋳型とした場合であり、ＮＴレーンは非組み換えイネのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合である。図２から、７８個体のハイグロマイシン耐性イネのうち、３０個体にｐｈｂＢ遺伝子を示すバンドを確認する事ができた。
【００５５】
一方、同様にｐｈｂＣ遺伝子の存在を確認するためにＰＣＲを行った。このＰＣＲにおいては、配列番号７に示す１０  ｐｍｏｌｅｓのセンスプライマー、配列番号８に示す１０  ｐｍｏｌｅｓのアンチセンスプライマーを用いた以外は、上述した「ｐｈｂＢ遺伝子の存在を確認するためのＰＣＲ」と同様に行った。このＰＣＲの結果を図３に示す。図３において矢印はｐｈｂＣ遺伝子の内部配列６３３ｂｐのバンドの位置を示している。また、図３において、Ｖレーンは発現ベクターｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｂ，  ｃを鋳型とした場合であり、ＮＴレーンは非組み換えイネのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合である。図３から、７８個体のハイグロマイシン耐性イネのうち、３４個体にｐｈｂＣ遺伝子を示すバンドを確認する事ができた。
【００５６】
次に、形質転換イネにおいて、ｐｈｂＢ遺伝子の転写を確認するためのＲＴ−ＰＣＲを行った。まず、形質転換イネからのトータルＲＮＡの抽出は、Ｒｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉキット（キアゲン社製）を用いて行った。次に、Ｄｎａｓｅ処理した後のトータルＲＮＡ１０μｇを用いて、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の合成キットにより１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを作成した。この１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子の発現の確認を行った。
【００５７】
ｐｈｂＢ遺伝子の転写を確認するためのＲＴ−ＰＣＲにおいては、配列番号５に示す１０  ｐｍｏｌｅｓのセンスプライマー、配列番号６に示す１０  ｐｍｏｌｅｓのアンチセンスプライマーを用い、酵素として１．２５  ＵのＫＯＤ−Ｄａｓｈを（東洋紡製）を用い、０．２ｍＭのｄＮＴＰ及び反応用緩衝液（終濃度：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７．５  ｍＭ  ＤＴＴ、２．５  μｇ／５０μＬ  ＢＳＡ）を用いた。また、鋳型となる１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡは、２０μＬのＰＣＲ反応液全量に対して０．２〜１０μＬを使用した。反応装置及び反応条件は上述したＰＣＲと同様とした。
【００５８】
ｐｈｂＢ遺伝子の転写を確認するためのＲＴ−ＰＣＲの結果の一部を図４に示す。図４において矢印はｐｈｂＢ遺伝子の内部配列３９８ｂｐのバンドの位置を示している。また、図４において、Ｖレーンは発現ベクターｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｂ，  ｃを鋳型とした場合であり、ＮＴレーンは非組み換えイネの１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型とした場合である。図４ｋら、１１個体のハイグロマイシン耐性イネのうち、１個体にｐｈｂＢ遺伝子の転写を示すバンドを確認する事ができた。全体では、４０個体のハイグロマイシン耐性イネのうち、３個体にｐｈｂＢ遺伝子の転写を示すバンドを確認する事ができた。
【００５９】
また、同様に、形質転換イネにおいて、ｐｈｂＣ遺伝子の転写を確認するためのＲＴ−ＰＣＲを行った。このＲＴ−ＰＣＲにおいては、配列番号７に示す１０  ｐｍｏｌｅｓのセンスプライマー、配列番号８に示す１０  ｐｍｏｌｅｓのアンチセンスプライマーを用いた以外は、上述した「ｐｈｂＢ遺伝子の転写を確認するためのＲＴ−ＰＣＲ」と同様に行った。このＲＴ−ＰＣＲの結果の一部を図５に示す。図５において矢印はｐｈｂＣ遺伝子の内部配列６３３ｂｐのバンドの位置を示している。また、図５において、Ｖレーンは発現ベクターｐＢＩ１２１Ｈｍ−ｂ，  ｃを鋳型とした場合であり、ＮＴレーンは非組み換えイネの１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型とした場合である。図５から、１０個体のハイグロマイシン耐性イネのうち、３個体にｐｈｂＣ遺伝子の転写を示すバンドを確認する事ができた。全体では、３０個体のハイグロマイシン耐性イネのうち、７個体にｐｈｂＣ遺伝子の転写を示すバンドを確認する事ができた。
【００６０】
次に、形質転換イネにおけるｐｈｂＢ遺伝子の翻訳を確認するため、タンパク質の粗抽出を行った。具体的には、０．１ｇの若葉を採取し、液体窒素下で粉砕し、３００μＬの抽出緩衝液Ａ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１０％のＳｏｒｂｉｔｏｌ、５ｍＭのＤＴＴ、ロッシュ製Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル１錠／１０ｍｌ）または電気泳動用抽出緩衝液Ｂ（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．５）、１０％のＳｏｒｂｉｔｏｌ、１％のメルカプトエタノール、０．０２％のＳＤＳ、ロッシュ製Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル１錠／１０ｍｌ）、０．１ｇポリクラールＡＴ、０．１ｇ石英砂を添加し、氷上で磨砕した。磨砕液をエッペンドルフチューブに回収し、４℃、１５０００ｒｐｍ、２０分の条件で遠心した。上清を粗蛋白抽出画分として、ブラッドフォード法（バイオラッド社製）によりＢＳＡ  をスタンダードとして定量した。
【００６１】
ｐｈｂＢ遺伝子について翻訳の確認は、ｐｈｂＢ遺伝子の翻訳産物であるアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性を測定（Ｎａｋａｓｈｉｔａ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  １９９９；  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６３：  ８７０−８７４．）することで行った。反応は、得られた粗蛋白抽出画分に、１２μＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＮＡＤＰＨ、０．１ｍＭのａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡを加えることで行った。測定条件は、５００μＬの液量で波長３４０ｎｍの吸光度を光路長１ｃｍで測定した。吸光度測定にはＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−６４０を用いた。
【００６２】
より詳細には、上述した形質転換イネからの粗蛋白抽出画分を、１回の反応あたり２００μｇ用いた。まず、基質となる０．１ｍＭ  ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡを添加しない状態で、粗蛋白抽出画分を添加して３４０ｎｍの吸光度低下速度Δ３４０ａ／ｍｉｎを５分間測定し、次に０．１ｍＭ  ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡを添加して３４０ｎｍの吸光度低下速度Δ３４０ｂ／ｍｉｎを５分間測定した。このΔ３４０ｂ／ｍｉｎからΔ３４０ａ／ｍｉｎを引いた値Δ３４０ｂ−ａ／ｍｉｎをもとめ、下記式を用いて活性を算出した。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝Δ３４０ｂ−ａ／ｍｉｎ÷（６．２２×１０３）×１０３×（反応液量÷酵素液量）
【００６３】
ｐｈｂＢ遺伝子の翻訳を確認するためのアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性の測定結果を図６に示す。図６に示すように非形質転換イネではアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性は全く認められなかった。調査した２０個体のハイグロマイシン耐性イネのうち３個体にアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性の高いものが認められ、ｐｈｂＢ遺伝子の翻訳を確認する事が出来た。これは、上述のＲＴ−ＰＣＲの結果と一致した。
【００６４】
また、ｐｈｂＣ遺伝子の翻訳を確認するため、ｐｈｂＣ蛋白質のＣ末端の配列（Ｎ−ＧＮＡＲＹＲＡＩＥＰＡＰＧＲＹＶＫＡＫＡ−Ｃ）の合成ペプチドに対する抗血清を用いて、ウエスタンブロット解析を行った。この抗血清は理化学研究所の高分子化学研究室の土肥氏より使用許可を受けた（Ｎａｋａｓｈｉｔａ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  １９９９；  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６３：  ８７０−８７４．）。上述の粗蛋白質の画分２０μｇをＬｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ社製）と混合し、１００℃で１０分間加熱処理した後、１０〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミドミニゲル（７×９ｃｍ、Ｒｅａｄｙ  Ｇｅｌ  Ｊ、ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、電気泳動を定電圧１００Ｖ、７５分の条件で行った。その後、電気泳動ゲル上の蛋白質をセミドライのブロッテング装置（Ｔｒａｎｓ  Ｂｌｏｔ  ＳＤ、ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、ＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｐ、アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。１次抗体として上述の抗血清とＥＣＬＰｌｕｓ検出キット（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、キットのプロトコールに従って、ｐｈｂＣ蛋白質の検出を行った。ＰｈｂＣ遺伝子の翻訳を確認するためのウエスタンブロッテイングによるｐｈｂＣ蛋白質の検出結果を図７に示す。図７において矢印はｐｈｂＣ蛋白質の位置（分子量約６４．３ｋＤ）を示している。また、図７において「Ｒ．  ｅｕｔｒｏｐｈａ」レーンはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａから抽出したタンパク質２０μｇを用いた結果を示している。図７から、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａから抽出したタンパク質では、ｐｈｂＣ蛋白質のバンドが強く検出され、ＮＴの非形質転換イネの場合では全くバンドが検出されなかった。また、図７から、上述したＲＴ−ＰＣＲ検出によりｐｈｂＣが確認された７個体の形質転換イネのうち、５個体にｐｈｂＣ蛋白質の存在を示すバンドを確認する事ができた。
【００６５】
また、形質転換イネにおけるポリ（３−ヒドロキシブタン酸）の確認はガスクロマトグラフィーを用いて行った。形質転換イネからのサンプルは以下のように調製した。すなわち、先ず、１０ｇの生葉を１００ｍｌの５０％エタノールで５５℃にて３０分間４回洗浄し、さらに１００ｍｌのメタノールで５５℃にて３０分間４回洗浄した。洗浄した葉をすり潰し、１００ｍｌのクロロホルムで６０℃にて１２時間抽出操作を行った。次に、抽出物を濃縮し、−２０℃で冷やしたメタノールを加え、−２０℃にて一晩放置した。これを４℃にて、１００００ｒｐｍ、２０分間の遠心操作を行い、沈澱物を回収した。この沈殿物をメタノールで洗浄し、クロロホルムに溶かし、ｎ−ヘキサンで再度沈澱させた。この沈殿物を１ｍｌのクロロホルムに溶かし、これを０．５ｍｌとり、１．７ｍｌのエタノールと０．２ｍｌの塩酸を加えて、１００℃で４時間処理した（Ｎａｋａｓｈｉｔａ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  １９９９；  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６３：  ８７０−８７４．）。
【００６６】
また、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａにおけるポリ（３−ヒドロキシブタン酸）の確認をガスクロマトグラフィーを用いて同様に行うために、以下のようにしてサンプルを調製した。すなわち、乾燥菌体３０ｍｇを耐圧スクリュー管に移し、酸性メタノール（メタノール８５％、硫酸１５％）２ｍｌとクロロホルム２ｍｌを加えて密封し、１００℃で１４０分間処理した。
【００６７】
その後、形質転換イネ由来のサンプルおよびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のサンプルを室温になるまで放冷し、蒸留水を１ｍｌ加えて約１分間激しく撹拌した。その後、静置して２層に分離させ、下層（クロロホルム層）を取り出し、等量の０．１％カプリル酸メチルのクロロホルム溶液と混合して測定サンプルとした。
【００６８】
ガスクロマトグラフの装置には、パーキンエルマー社製のオートシステムＸＬガスクロマトグラフィーを用い、カラムにはＧＬサイエンス社製のＮｅｕｔｒａ  Ｂｏｎｄ−１（３０ｍ×０．２５ｍ、Ｉ．Ｄ．  ０．４μｍ）を用いた。キャリアーガスにはヘリウムを用い、検出は水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）により行った。温度と時間設定は、インジェクター温度２８０℃、デイテクター温度２８０℃、カラム初期温度１００℃、カラム初期温度保持時間０分、カラム昇温速度６℃／分、カラム最終温度２８０℃、最終温度保持時間５分とした。ガス流量は、ＡＩＲが５００ｍｌ／分、水素が５０ｍｌ／分、ヘリウムが６０ｍｌ／分とした。また、サンプル注入量は１μＬとした。
【００６９】
標品である３−ヒドロキシブタン酸の保持時間は約５分で、これを図８において矢印で示す。また、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のサンプルにおけるポリ（３−ヒドロキシブタン酸）の確認結果を図９に示し、形質転換イネ由来のサンプルにおける同確認結果を図１０に示し、非形質転換イネ由来のサンプルにおける同確認結果を図１１に示す。
【００７０】
図８〜１１に示すように、３−ヒドロキシブタン酸のピークはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のサンプルと形質転換イネ由来のサンプルにおいて検出されたが、非形質転換イネ由来のサンプルでは検出されなかった。この結果から、上述したように作出した形質転換イネにおいては、ポリ（３−ヒドロキシブタン酸）が合成されており、ピーク面積から乾燥重量あたり０．０１％の合成量である事が示された。
【００７１】
〔実施例３〕高分子材料含有植物の製造
実施例２で得られた形質転換イネを隔離温室内で、水稲育苗土（ジフィーポット）に移植し、水を張った状態で栽培した。開花後、着粒した籾を採取し、次世代（Ｔ１世代）を育成した。実施例２と同様な方法で、４〜５葉期の葉を採取し、ゲノムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、蛋白質発現、ＰＨＢ定量を行い、０．０１％以下程度の蓄積の確認された個体の地上部（茎葉部）を収穫した。この地上部を６０℃で１昼夜、通風乾燥した。この乾燥個体を磨砕して粉体とし、圧縮装置で固形化して試験円板（サイズ：直径１ｃｍ、厚み１ｍｍ）を作製した。また、野生型イネの植物体を用いて同様にして試験円板を作製した。
【００７２】
そして、作製した試験円板を用いて、それぞれ熱特性を評価した。なお、試験円板は、乾燥重量０．１ｇのイネを用いて作製した。熱特性の評価は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）装置（パーキンエルマー社製、装置名Ｐｙｒｉｓ１ＤＳＣ）を用い、昇温速度１０℃／分、測定温度範囲２０〜２００℃、窒素雰囲気下で、温度上昇に伴う転移熱差（ｍＷ）を測定した。
【００７３】
本例で得られたイネで作製した試験板を用いたときの結果を図１２に示し、野生型のイネで作製した試験板を用いたときの結果を図１３に示す。図１２及び図１３の結果を比較すると、本例で得られたイネで作製した試験板を用いた場合には、野生型のイネで作製した試験板では見られない位置にＴｍ値（１５５℃）が認められた。この結果から、実施例２でのガスクロマトグラフィーからの結果と同様、本例で得られたイネ内部にＰＨＢが蓄積されていることが示され、しかも、ＰＨＢ本来のＴｍ値である１７７℃（Ｍｏｄｉｓｏｎ  Ｌ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｈｕｉｓｍａｎ  Ｇ．  Ｗ．  （１９９９）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｖｏｌ．  ６３，  ｐ２１−５３）よりも低いことから、ＷＰＣと同様にバイオマスとＰＨＢの複合化が起こっていることが明らかとなった。
【００７４】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、１又は複数のモノマー供給系酵素遺伝子と合成されたモノマーから高分子化合物を合成する重合酵素遺伝子とをゲノム中に含ませることで、従来にない全く新規な高分子含有植物を提供することができる。また、本発明によれば、１又は複数のモノマー供給系酵素遺伝子と合成されたモノマーから高分子化合物を合成する重合酵素遺伝子とをゲノム中に機能しうるかたちで導入することで、諸物性に優れた従来にない植物を作製することのできる高分子材料含有植物の製造方法を提供することができる。
【００７５】
【配列表】
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【００７６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５〜８は合成ＤＮＡ（プライマー）である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る高分子材料含有植物の製造方法に用いる発現ベクターの構築過程を示す模式図である。
【図２】ｐｈｂＢ遺伝子の存在を確認するために行ったＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図３】ｐｈｂＣ遺伝子の存在を確認するために行ったＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図４】ｐｈｂＢ遺伝子の転写を確認するために行ったＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図５】ｐｈｂＣ遺伝子の転写を確認するために行ったＲＴ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
【図６】形質転換イネにおけるｐｈｂ遺伝子の翻訳産物を確認するために行ったアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ活性の測定結果を示す特性図である。
【図７】形質転換イネにおけるｐｈＣ遺伝子の翻訳産物を確認するために行ったウエスタンブロットの結果を示す電気泳動写真である。
【図８】メチルエステル化した３−ヒドロキシブタン酸（標品）のガスクロマトグラムである。
【図９】Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のサンプルを用いたガスクロマトグラムである。
【図１０】形質転換イネ由来のサンプルを用いたガスクロマトグラムである。
【図１１】非形質転換イネ由来のサンプルを用いたガスクロマトグラムである。
【図１２】実施例２で得られたイネで作製した試験板における熱特性を示す特性図である。
【図１３】野生型のイネで作製した試験板における熱特性を示す特性図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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