(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ペプチドの固相合成に使用される自由流動性及び／又は非凝集性樹脂を製造する方法を提供する。【解決方法】非膨潤性溶媒を用いて、機械的混合、タンブリング、向流充填、樹脂の流動化、樹脂床の拡大、溶媒を樹脂床の底部から樹脂中に充填することからなる方法から選択される、乾燥前に撹拌下で樹脂を収縮させることを含む自由流動性及び／又は非凝集性樹脂を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　乾燥前に、撹拌下で樹脂を収縮させることを含む自由流動性樹脂を製造する方法。
【請求項２】
　該樹脂が固相合成樹脂である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
　該収縮が非膨潤溶媒を容器に充填することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
　該容器がフィルターを含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
　撹拌が機械的混合、タンブリング、向流充填、樹脂への運動エネルギーの提供、樹脂を樹脂床から持ち上げること、樹脂の流動化、樹脂床の拡大、溶媒を樹脂床の底部から樹脂中に充填することからなる郡から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
　請求項１に記載の樹脂を使用してポリペプチドを製造する方法。
【請求項７】
　請求項６に記載の方法を使用して作られるポリペプチド。
【請求項８】
　請求項７に記載のポリペプチドを使用して作られる治療剤。
【請求項９】
　請求項１に記載の方法を使用して作られる樹脂製品。
【請求項１０】
　非充填樹脂床を非膨潤性溶媒と接触させ、該樹脂が膨潤性溶媒に分散されて、容積減少樹脂製品を得ることを含む、実質的にビーズ対ビーズ均一性のある樹脂製品の製造法。
【請求項１１】
　更に該容積減少樹脂製品を乾燥することを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
　該樹脂が非凝集性である請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　軽度に架橋された架橋樹脂は、ポリマー鎖を溶媒和する液体と接触したとき大いに膨潤する。例えば、１％ＤＶＢで架橋したポリスチレンビーズは、膨潤性溶媒と接触したときに、１．７ｍＬから６．５ｍＬ／ｇを超えて膨潤する。この膨潤は、ポリマービーズの内部をより利用しやすいものとしており、しばしば樹脂を洗浄し又は樹脂に結合した官能基に関する化学を遂行する場合に有益である。洗浄又は化学作用が完了したとき、樹脂を乾燥することがしばしば要求される。樹脂が膨潤状態から直接乾燥されるとき、生じた乾燥生成物は望ましい自由流動性物質よりむしろビーズの集塊又は集団を形成する。
【背景技術】
【０００２】
　商業的又は小規模で、軽度に架橋された樹脂、例として、（１）任意の膨潤性溶媒中に存在した後で、例えば洗浄後の１％架橋、スチレンＤＶＢ樹脂（即ち、メリフィールド（Ｍｅｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂、ＣＴＣ樹脂、非官能化ポリスチレン、ワング（Ｗａｎｇ）樹脂及び固相合成に有用な樹脂）を直接乾燥するとき、ビーズの集塊が生成し及びその生成物は非自由流動性となる。この結果として、次の工程はより困難となり、生成物の性能は劣化する。次の加工過程での凝集現象の結果として、集塊の内部のビーズが官能化不十分であるのに対し集塊の外側のビーズは、過剰官能化となる。例えば、ＣＴＣ樹脂が作られるとき、樹脂が反応性アシル化混合物に充填されるとき、望ましくない生成物の混合物が得られ、即ち、黒ずんだビーズが形成される。これらの黒ずんだビーズは、過剰官能化である。ペプチドを製造するとき、成長するペプチド鎖が立体的に圧迫されないようビーズからビーズに官能基の均一な分布が望まれる。
【０００３】
　幾つかの慣用の固相合成生成物は、顕微鏡分析により見られるように同時過剰官能化及び未熟官能化の問題を有する。不活性であるビーズ及び過剰官能化を示す退色したビーズが存在する。
【０００４】
　均一なビーズ対ビーズ（ｂｅａｄ　ｔｏ　ｂｅａｄ）性能特性を有するビーズの均一な分布を生み出す当分野における必要性が存在する。
【０００５】
　凝集現象についての他の問題は、従来の製品は供給管、漏斗及び他の製造部材を詰らせることである。これは、システム全体が閉鎖され及び洗浄され又はより大きな部材で設計される必要があることを意味する。製造部材を詰らせない自由流動性樹脂を生み出す必要が当分野において存在する。
【０００６】
　組合わせ化学において、均一性における如何なる不均衡も、信頼できない結果をもたらすので均一なビーズを有することは必要である。非常に少量のビーズが容器に入れられ、過剰官能化又は低官能化ビーズが存在するときには、組合わせ研究の結果は信頼が置けない。
【０００７】
　通常、樹脂は、エンドユーザーに対しバルク容器で出荷される。もし、樹脂が自由流動性でないならば、バルク樹脂の製造設備への移動は困難となる。ペプチド合成及び組合わせ合成に使用され得る自由流動性樹脂について当工業界において必要性が存在する。更なる実施例として、自由流動性生成物は、バルク容器から高処理量充填装置、例えば小さな開口部を通して物質をプレート上に拡散させる装置に使用のためバルク樹脂を充填するときに望ましい。
【０００８】
　慣用的に、樹脂は膨潤状態で乾燥する。この手順に従う場合の問題は、大きな乾燥機容量が膨潤した樹脂を乾燥するのに必要なことである。第二の問題は、一旦、膨潤樹脂が乾燥機に置かれたら、より長時間の乾燥及びより高エネルギー消費につながるずっと大量の溶媒を膨潤樹脂から除去しなけれなければならないことである。これらすべての困難にも拘らず、より低い品質、凝集した樹脂が生成される。当分野においてこれらの課題を解決する必要が、存在する。
【０００９】
　別の困難は、研究所使用のより小さな小売りパッケージングにバルク樹脂を移動する場合である。もし、樹脂が凝集する傾向にあるならば、望ましい正確さでの重量を移動し、提供することは困難となる。販売される樹脂は、製造するには高価であり、従って高い販売価格を有する。そうであるので、顧客に購入するまさしくその量を提供するよう樹脂量を正確に計量し、包装することは必要である。バルク容器から小さな、研究所規模の包装に容易に移動可能な樹脂を提供する必要性が当分野で存在する。
【００１０】
　ビーズを、集塊を防止する物質でコーティングすることにより自由流動性条件を作り出すことが当業界において、試みられてきた。この方法は、乾燥後ビーズに残留するグリセリンモノステアレート及びグリセリンジステアレートのような物質を採用する。ＤＥ２９３２３２１号が参照される。ＪＰ６２０１１７４０Ａ２号に開示されたような類似の方法は、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルのような非イオン性界面活性剤の使用を伴う。これらの特許は、膨潤又は洗浄を教示、又は正しく示唆せず、それらの効率性についてはビーズに残留する残留物に依存している。
【００１１】
　樹脂を膨潤性溶媒で洗浄することは当業者に知られている。カメロン等（Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００２，４，１９９〜２０３）は、最終洗浄溶媒としてメタノールの使用に関する。この開示においてこの樹脂は、メタノールにより溶媒和され、且つ膨潤される極性４級アミンである。同様な例が、その最終洗浄としてメタノールでの樹脂の単一例を提供する米国特許第６，１４７，１５９号（‘１５９特許）において見出され得る。しかしながら、米国特許‘１５９号における樹脂は、樹脂をメタノール中で膨潤させるであろうポリエチレングリコール鎖を有している。スニル等（Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ，２００１，３，９〜１５）は、膨潤性溶媒、ついでエタノールでの洗浄を開示するが、この手順はＤＶＢ／スチレン／塩化ビニルベンジルについて遂行され４２％から８０％未満の収率であった。スニル樹脂は、本発明の対象である樹脂と同一ではない。ワング（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７３，９５，１３２８〜１３３３）は、官能化された１％架橋樹脂の膨潤溶媒での洗浄を開示する。
【００１２】
　また、本発明を使用して成される固相合成基体を使用して商業規模でペプチドを製造する方法について当分野で深刻な必要性が存在する。研究所規模においては役に立つ種々の技術が知られているが、これらの技術は工業的設備にうまく調整できないことが判明した。
【００１３】
【特許文献１】独国特許出願公開第２９３２３２１号明細書
【特許文献２】特開昭６２−０１１７４０Ａ２号公報
【特許文献３】米国特許第６，１４７，１５９号明細書
【非特許文献１】カメロン等（Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００２，４，１９９〜２０３）
【非特許文献２】スニル等（Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ，２００１，３，９〜１５）
【非特許文献３】ワング（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７３，９５，１３２８〜１３３３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
　乾燥前に撹拌下で樹脂を収縮する出願人等の発明は、当分野で遭遇する自由流動性の問題を解決する。樹脂は乾燥機空間に換算して膨潤容積が２５％だけしか要求せず、除去すべき溶媒がかなり少ししか存在しないので、更なる利点は多大に増加した乾燥機効率である。更に、本発明は、膨潤した樹脂について使用され、ビーズ上になんらの残留物を残さない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
　本発明は、乾燥前に撹拌下で樹脂を収縮させることを含む自由流動性樹脂を製造する方法である。収縮は、非膨潤性溶媒を容器に充填することを含む。撹拌は、次の一つ以上、機械的混合、タンブリング、向流充填を単独又は組み合わせて使用し、樹脂に運動エネルギーを提供すること、空気又は振動装置を使用して樹脂を樹脂床から持ち上げること、樹脂を流動化すること、樹脂床を拡大すること、及び／又は溶剤を樹脂床の底部から樹脂中に装填することを含む。一変形においては、容器はフィルターを含む。本発明の一変形においては、その樹脂はペプチドの固相合成に使用される。
【００１６】
　別の態様においては、本発明はここで記載される自由流動性樹脂を使用してペプチドを製造する方法及び本法を使用して製造されたポリペプチドを提供する。種々の治療剤が、その後、そのポリペプチドを使用して製造され得る。
【００１７】
　更に他の態様において、本発明は実質的ビーズ対ビーズ均一性のある樹脂製品を製造する方法を提供する。その方法は、パックされていない（ｎｏｎ−ｐａｃｋｅｄ　ｒｅｓｉｎ）樹脂床と非膨潤性溶媒とを接触させることを含む。樹脂は膨潤性溶媒に分散され、その方法は容積減少樹脂製品を入手できるようにする。更に、その方法は、上記工程で得られた容積減少樹脂製品を乾燥することを含む。更に、樹脂は、非凝集性である。
【００１８】
　別の態様において、本発明は膨潤溶媒に分散するよう樹脂を接触させ、次に非膨潤性溶媒を分散した樹脂に添加して容積の減少した樹脂を得て、得られた容積減少樹脂を乾燥する工程を含む自由流動性樹脂を製造する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
　本発明の実施には、膨潤樹脂に非膨潤溶媒を添加することが必要となる。非極性ポリスチレン樹脂についての本発明の実施に有用な非膨潤性溶媒としては、メタノール、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、アセトニトリル、エタノール、ペンタン、イソプロパノール及び水及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。非膨潤性溶媒は、メタノール、ヘキサン及びエタノールである。
【００２０】
　ＰＥＧ官能化ポリスチレン樹脂について本発明の実施に有用な非膨潤性溶媒としては、オクタン、ペンタン、シクロヘキサン、ヘキサン、ヘプタン、メチル‐ｔ‐ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ｔ‐ブタノール及びエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
　膨潤を受けやすい本発明の実施に有用な樹脂は、スチレン−ＤＶＢ共重合体、エステル結合で架橋されたスチレン及びエーテル結合で架橋されたスチレンを含むが、これらに限定されない非極性ポリスチレン樹脂である。ＰＥＧで官能化されたスチレンＤＶＢコポリマーは、また、本発明の実施に有用である。　
【００２２】
　非膨潤性溶媒の添加後の容積減少は、例として、好ましくは５０〜９０％、より好ましくは６０〜８０％及び最も好ましくは６５〜７０％の幾つかの異なる範囲である。
【００２３】
　本明細書において、用語「分散性」又は「分散液」又は「分散された」は、液体中で樹脂を流動化することを意味する。これは、機械的撹拌、又は混合物を含有する容器の底部から樹脂を持ち上げ、樹脂ビーズを自由に又は実質的に自由に混合させるに十分な力を有する液体又は空気流による手段により達成され得る。
【００２４】
　ある種の樹脂は、ある種の溶媒に置かれたとき膨潤する。例えば、非極性ポリスチレン樹脂を膨潤する溶媒としては、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルム、ジクロロエタン（ＥＤＣ）、ジオキサン、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ｎ‐メチルピロリジノン（ＮＭＰ）及びトルエン及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
　ＰＥＧ官能化スチレンＤＶＢ樹脂を膨潤させる膨潤性溶媒としては、ＴＨＦ及びＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、酢酸、トリフルオロ酢酸、ＴＨＦ／水混合物、ニトロメタン及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒は、ＴＨＦ／水、酢酸、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸を包含する。
【００２６】
　次に非限定的実施例は、本発明の実施を例示する。
【実施例】
【００２７】
実施例１
　次の実施例は、実質的に自由流動性生成物を生じさせる本発明におけるメタノールの使用を例示する。４４２リットルのＴＨＦ中のポリマー結合（１％ＤＶＢ／スチレン）２’クロロベンゾフェノン約５９ｋｇのスラリーは、ノイッチェ（ｎｅｕｔｃｈｅ）フィルターに含有させられた。樹脂床は沈降させられ、ＴＨＦは樹脂レベル上２インチまで排液された。樹脂溶媒混合物は、その後、その溶媒中に樹脂を完全に分散するため撹拌され、撹拌しながら２７５リットルのメタノールが添加され、混合は１５分間継続された。樹脂床は沈降させられ、次いで樹脂レベルの上端まで排液された。次に９２リットルのメタノールが添加され、混合物は１５分間、撹拌され、そして完全に排液された。窒素が、完全に排液するために床を通された。樹脂は、３５℃真空オーブンにおいて恒量となるまで乾燥された。水の自由流動特性と同様の流動特性を有する自由流動性生成物が得られた。
【００２８】
比較実施例２
　この実施例は、自由流動性生成物を自由に与えない比較法を例示する。２１０リットルのＴＨＦ中のポリマー結合（１％ＤＶＢ／スチレン）２’クロロベンゾフェノン約２８ｋｇのスラリーは、ノイッチェフィルターに含有させられた。その樹脂は沈降させられ、ＴＨＦは排液された。２１０リットルのメタノールが添加され、樹脂床を通して排液された。別の２１０リットルのメタノールが、流出液がフィルターから除去されるのと同じ速度で添加された。撹拌が開始され、樹脂は、部分的にのみ分解する大きな塊となった。フィルターは、完全に排液された。１０５リットルのメタノールが添加された。撹拌が開始され、再び大きな塊の樹脂が認められ、樹脂は１５分間撹拌され、完全に排液された。真空が、過剰の溶媒を除去するため適用された。樹脂は、３５℃真空オーブンにおいて恒量となるまで乾燥された。塊のない自由流動性樹脂は得られなかった。
【００２９】
実施例３
　以下の実施例は、自由流動性ＣＴＣ樹脂を与えるヘキサンを使用する方法を記載する。３３０リットルのトルエン中のポリマー結合（１％ＤＶＢ／スチレン）２’クロロトリチルクロライド約５５ｋｇのスラリーは、ノイッチェフィルターに含有させられた。樹脂床は沈降させられ、トルエンは樹脂レベル上２インチまで排液された。樹脂溶媒混合物は、その後、その溶媒中に樹脂を完全に分散するため撹拌され、撹拌しながら２２７リットルのヘキサンが添加された。混合は１５分間継続された。樹脂床は沈降させられ、樹脂レベルの上端まで排液された。次に８７リットルのヘキサンが樹脂床上端に添加され、混合物は１５分間、撹拌され、そして樹脂上端まで排液された。この工程は、任意に繰り返されることができる。窒素が、完全に排液するため床を通過させられた。次いで樹脂は、３５℃真空オーブンにおいて恒量となるまで乾燥された。水の自由流動特性と同様の流動特性を有する自由流動性生成物が得られた。
【００３０】
実施例４
　この実施例は、自由流動性ロイシンロードＣＴＣ樹脂を与えるイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を使用する方法を記載する。この発明は、また、アミノ酸ロード固相表面基体及び樹脂用に有用である。５５ｍｌのＤＭＦ中のポリマー結合（１％ＤＶＢ／スチレン）ＦＭＯＣロイシンロード２’クロロトリチルクロリド約１０ｇのスラリーは、ブフナーフィルターに含有させられた。樹脂床は沈降させられ、ＤＭＦは丁度樹脂レベルの上まで排液された。樹脂溶媒混合物は、その後、その溶媒中に樹脂を完全に分散するため撹拌され、撹拌しながら５５ｍｌのＩＰＡが添加され、混合は１５分間継続された。樹脂床は沈降させられ、樹脂レベルの上端まで排液された。次に５５ｍｌのＩＰＡが樹脂床の上端に添加され、混合物は１５分間、撹拌され、そして樹脂上端まで排液された。この工程は、任意に１回以上繰り返されてもよい。窒素が、完全に排液するため樹脂中に通された。次いで樹脂は、３５℃真空オーブンにおいて恒量となるまで乾燥された。生成物は優れた非凝集性、自由流動特性を発揮し、それが生成物をバルクからより小さな容器に再包装用途に適したものにしている。
【００３１】
比較実施例５
　本実施例は、望ましい自由流動特性を生じさせない比較法を例示する。本法は、自由流動性ロイシンロードＣＴＣ樹脂を与えないイソプロピルアルコールを使用する。５５ｍｌのＤＭＦ中のポリマー結合（１％ＤＶＢ／スチレン）ＦＭＯＣロイシンロード２’クロロトリチルクロリド約１０ｇのスラリーは、ブフナーフィルターに含有させられた。樹脂床は沈降させられ、ＤＭＦは完全に排液された。撹拌せずに５５ｍｌのＩＰＡが添加され、混合が開始され１５分間継続された。樹脂床は沈降させられ、次に完全に排液された。次に５５ｍｌのＩＰＡが樹脂床上端に添加され、混合物は１５分間、撹拌され、そして完全に排液された。窒素が完全に排液するため床中に通された。その後、樹脂は、３５℃真空オーブンにおいて恒量となるまで乾燥された。塊状の非自由流動性生成物が得られた。
【００３２】
実施例６
　１％ＤＶＢ／スチレン樹脂／ＴＨＦスラリーをブフナー漏斗に入れ、床を沈降させ、ＴＨＦを樹脂レベルまで排液する。１床容積（ＢＶ）のＴＨＦを樹脂床の上端に添加する。栓流排液させる。１ＢＶのＴＨＦを加え、樹脂を再懸濁させる。工程＃２を繰り返す。１床容積（ＢＶ）のＴＨＦを加え、樹脂溶媒混合物を撹拌して溶媒中に樹脂を完全に分散し、その後１ＢＶのメタノールを撹拌しながら加え、排液を開始する。流出液がフィルターから除去されるのと同じ速度でもう一つのＢＶのメタノールを加える。添加の最後に床を沈降させる。１ＢＶのメタノールを樹脂床の上端に加える。栓流排液する。１ＢＶのメタノールを加え、樹脂を再懸濁して完全に排液する。過剰の溶媒を除去するため僅かに真空にする。樹脂は、３５℃真空オーブンにおいて恒量となるまで乾燥する。
【００３３】
実施例７
　ポリマー結合（１％ＤＶＢ／スチレンコポリマー）２’クロロトリチルクロリドを、空気との接触を最小限にするため窒素で掃引されたブフナー漏斗に入れる。ＤＣＭですすぐ。樹脂をレベルまで排液する。１ＢＶのＤＣＭを加え、レベルまで栓流排液する。１ＢＶのＤＣＭを加え、樹脂溶媒混合物を撹拌して溶媒中に樹脂を完全に分散し、その後１ＢＶの無水ヘキサンを撹拌しながら加え、排液を開始する。流出液がフィルターから除去されるのと同じ速度で別のＢＶの無水ヘキサンを加える。添加の最後に床を沈降させる。１ＢＶの無水ヘキサンを加え、樹脂を再懸濁する。レベルまで排液する。工程＃４を繰り返す。過剰の溶媒を除去するため窒素で僅かに圧力をかける。樹脂は、３５℃真空オーブンにおいて乾燥して、完了のときに窒素をバックフィル（ｂａｃｋ　ｆｉｌｌ）した。
【００３４】
　本発明に記載された樹脂と共に使用され、樹脂にロードされ得る「アミノ酸」の例は、ＮＨ２−ＣＨＲ−ＣＯＯＨで表される化合物である、ここでＲはＨ、脂肪族基、置換脂肪族基、芳香族基又は置換芳香族基である。「天然に産生するアミノ酸」は自然において見出される。例としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジン、オミチン、プロリン、ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン及びヒスチジンが挙げられる。Ｒは、アミノ酸の側鎖である。天然に産生するアミノ酸側鎖の例としては、メチル（アラニン）、イソプロピル（バリン）、ｓｅｃ‐ブチル（イソロイシン）、−ＣＨ２ＣＨ（−ＣＨ）２（ロイシン）、ベンジル（フェニルアラニン）、ｐ‐ヒドロキシベンジル（チロシン）、−ＣＨ２ＯＨ（セリン）、ＣＨＯＨＣＨ３（トレオニン）、ＣＨ２‐３‐インドリル（トリプトファン）、−ＣＨ２ＣＯＯＨ（アスパラギン酸）、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ（グルタミン酸）、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（アスパラギン）、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（グルタミン）、ＣＨ２ＳＨ（システイン）、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３（メチオニン）、−（ＣＨ２）４ＮＨ２（リジン）、−（ＣＨ２）３ＮＨ２（オミチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ））、‐［（ＣＨ）２］４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２（アルギニン）及び−ＣＨ２‐３‐イミダゾイル（ヒスチジン）が挙げられる。アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンの側鎖は、脂肪族、即ち、炭素と水素だけを含有し、それぞれは本明細書において「天然産生アミノ酸の脂肪族側鎖」と称される。
【００３５】
　本発明に使用され得る他の天然産生アミノ酸の側鎖としては、ヘテロ原子含有官能基、例えば、アルコール（セリン、チロシン、ヒドロキシプロリン及びトレオニン）、アミン（リジン、オミチン、ヒスチジン及びアルギニン）、チオール（システイン）又はカルボン酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）が挙げられる。ヘテロ原子含有官能基が保護基を含ませるため変性されるとき、側鎖はアミノ酸の「保護側鎖」と称される。
【００３６】
　好適な保護基の選択は、保護される官能基、保護基が暴露される条件及び分子中に存在し得る他の官能基に依存する。上記で検討した官能基についての好適な保護基は、グリーン及びワッツの「有機合成における保護基」、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９９１）に記載され、本出願において取り込れているものについての全教示が本明細書において記載されているものとして参照される。当業者は、通常の実験を超えないものを使用して、下記に記載されたもの以外の保護基を含む開示された合成に使用される好適な保護基、並びに保護基を適用し及び除去する条件を選択することができる。
【００３７】
　好適のアルコール保護基の例としては、ベンジル、アリル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ‐ブチルジメチルシリル及びアセテート等が挙げられる。好適なアミノ保護基の例としては、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ‐ブチル、ベンジル及びフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が挙げられる。Ｔｅｒｔ‐ブトキシカルボニルは、アミン保護基である。好適なカルボン酸保護基としては、ｔｅｒｔ‐ブチル、トリチル、メチル、メトキシメチル、トリメチルシリル、ベンジルオキシメチル及びｔｅｒｔ‐ブチルジメチルシリル等が挙げられる。Ｔｅｒｔ‐ブチルはカルボン酸保護基である。好適なチオール保護基の例としては、Ｓ‐ベンジル、Ｓ‐ｔｅｒｔ‐ブチル、Ｓ‐アセチル、Ｓ‐メトキシメチル及びＳ‐トリチル等が挙げられる。
【００３８】
　リジン、アスパラギン酸塩及びトレオニンは、本発明の一変形において保護されるアミノ酸側鎖の例である。脂肪族基としては、完全に飽和され又は１以上の不飽和単位を含有する直鎖、分岐Ｃ１〜Ｃ８又は環状Ｃ３〜Ｃ８炭化水素が挙げられる。一例においては、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基である。芳香族基には、フェニル、１‐ナフチル、２‐ナフチル、１‐アントラシル及び２‐アントラシルのような炭素環式芳香族基及びＮ‐イミダゾリル、２‐イミダゾール、２‐チエニル、３‐チエニル、２‐フラニル、３‐フラニル、２‐ピリジル、３‐ピリジル、４‐ピリジル、２‐ピリミジル、４‐ピリミジル、２‐ピラニル、３‐ピラニル、３‐ピラゾリル、４‐ピラゾリル、５‐ピラゾリル、２‐ピラジニル、２‐チアゾール、４‐チアゾール、５‐チアゾール、２‐オキサゾリル、４‐オキサゾリル及び５‐オキサゾリルのような複素環式芳香族基が含まれる。
【００３９】
　芳香族基としては、また、炭素環式芳香族環又は複素環式環が１以上の他のヘテロアリール環と縮合している縮合多環式芳香族環系が挙げられる。例としては、２‐ベンゾチエニル、３‐ベンゾチエニル、２‐ベンゾフラニル、３‐ベンゾフラニル、２‐インドリル、３‐インドリル、２‐キノリニル、３‐キノリニル、２‐ベンゾチアゾール、２‐ベンゾオキサゾール、２−ベンズイミダゾール、２‐キノリニル、３‐キノリニル、１‐イソキノリニル、３‐キノリニル、１‐イソインドリル、３‐イソインドリル及びアクリジンチルが挙げられる。
【００４０】
　アリール基及び脂肪族基についての好適な置換基は、開示された反応と適合するもの、即ち、顕著には反応の収量を減少させず、副反応の量を深刻には生じさせないものである。好適な置換基には、一般に脂肪族基、置換脂肪族基、アリール基、ハロゲン、ハロゲン化アルキル基（例えば、トリハロメチル）、ニトロ、ニトリル、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＮ（Ｒ）２、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、ここで、それぞれのＲは、独立して脂肪族基又はアリール基である。ある種の官能基は１以上の開示された反応と適合することができないけれども、これらの官能基は保護型で存在してもよい。保護基は、それから、元の官能基を再生させるために除去され得る。当業者は、通常の実験を超えない手順を使用して、開示された反応と適合し得る保護基を選択することができるであろう。
【００４１】
　ペプチド擬似物又はそれらの成分は、また、本明細書に記載された樹脂にロードされて、又は本明細書に記載された方法により生み出されて、本発明に使用され得る。ペプチド擬似物は、ペプチドの望ましい特性がその擬似物により保持されるようペプチドと十分な構造的な類似性を有する化合物である。例えば、ＨＩＶ感染を取り扱うためのプロテアーゼとして使用されるペプチド擬似物は、タング等のＷＯ９４／０５６３９号、バツクエッツ等のＷＯ９４／０４４９１号、バツクエッツ等のＷＯ９４／１０１３４号及びバツクエッツ等のＷＯ９４／０４４９３号に開示されている。薬剤として有用であるためには、ペプチド擬似物はペプチドの生物学的活性を保持すべきであるが、また、模倣されるペプチドと比較して１以上の改良された特性を有するものである。例えば、幾つかのペプチド擬似物は生体内での加水分解又は劣化に対し抵抗性である。ペプチド擬似物を調製するための一つの戦略は、ペプチド中の１以上のアミノ酸残基を交換されるべきアミノ酸残基と構造的に関連し、且つびペプチド結合を形成する基と置き換えることである。ペプチド中でアミノ酸残基と交換するのに使用され得る新規なアミノ酸誘導体の開発は、新規なペプチド擬似物薬剤の開発を進歩させるであろう。
【００４２】
　ペプチド擬似物の例は、２００２年、１２月１２日に出願された「アミノ酸誘導体及びそれを製造する方法」と題されたガブリエル、リチャード　Ｌ等による米国特許出願番号２００２０１８８１３５に記載されている。また、本発明の一変形において有用なのは、これらの化合物の生理学的に許容され得る塩である。アミン又は他の塩基性基を含有する化合物の塩は、例えば、塩化水素、臭化水素、酢酸及び過塩素酸等の好適な有機又は無機酸と反応させることにより得ることができる。４級アンモニウム基を有する化合物は、また、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩及び過塩素酸塩等の対アニオンを含有する。カルボン酸又は他の酸性官能基を含有する化合物の塩は、好適な塩基、例えば、水酸化物塩基と反応させることにより調製され得る。酸性官能基の塩は、ナトリウム及びカリウム等の対カチオンを含有する。
【００４３】
　本発明は、１以上のペプチド、ペプチド誘導体又はビルディングブロック又はその成分等のペプチド擬似物を有する治療用薬剤及び生物学的活性物質の創製又は製造にも有用な樹脂及び／又はアミノ酸ロード樹脂を生成する。エステル官能基で末端が終了している化合物又は化合物フラグメントは、また、本発明で創製され得る。本発明を使用して製造され又は生み出される治療用薬剤は、組成物の目的と共に広く変化し得る。薬剤は、単一薬剤又は組み合わせ薬剤として記載され得る。配達系は、高い水溶解度を有する治療用薬剤並びに制御された放出速度を有する配達系を生成する低い水溶解度を有するものと共に使用されるよう設計される。用語「治療用薬剤」及び「生物学的活性物質」としては、薬物；ビタミン剤；ミネラルサプリメント；治療、予防、診断用に使用される物質が挙げられる。
【００４４】
　ポリペプチドを作る本発明に有用な樹脂は、ＣＴＣ樹脂（又は他の種類のハロゲン化樹脂）である。これは樹脂の表面に向かってバイアスされた官能性を有することができる樹脂である。官能性の表面バイアスは、結合基を成長するペプチド鎖へのより良い接近を提供することができる樹脂表面近くに置く。表面バイアスは、制御された膨潤条件の下で樹脂にリンカーをロードさせることにより創製される。非完全膨潤状態で官能化試薬と樹脂とを接触させることにより、リンカーは、より立体的に接近し得るビーズ領域に配置される。この方法は、ボーリング等による２００２年、８月１６日に出願された、出願番号６０／４０４，０４４号、固相合成用樹脂（ＤＮ　Ａ０１４０７）と題された米国予備特許出願に詳細に記載されている。その樹脂は、１以上のＴ‐２０又はＴ‐１２４９フラグメントを創製するためにアミノ酸又はアミノ酸誘導体で任意にロードされる。
【００４５】
　実例として、（ｉ）２‐クロロトリチルクロリド基で官能化され；（ｉｉ）ロイシンと０．６５ｍモル／ｇ量に結合され；及び（ｉｉｉ）グルタミン酸（ｔ‐ブチル）と結合されるとき、３５分を超えない内にカイザー試験で決定されるように、１．５当量のＨＯＢＴ、１．５当量のＤＩＥＡ及び１．５当量のＨＢＴＵの存在下で１．５当量の量においてＦＭＯＣ‐Ｌｙｓ（ＢＯＣ）‐ＯＨのカップリングを完了させる：架橋ポリマービーズを本発明は使用する。
【００４６】
　パーセンテージは、特に断りのない限り重量パーセンテージである。本明細書において使用される用語「（メタ）アクリル」はアクリル又はメタクリルを意味する。用語「ビニルモノマー」は、付加重合に好適な、且つ単一重合性炭素‐炭素二重結合を含有するモノマーを意味する。用語「スチレンポリマー」は、少なくとも一つの架橋剤と共に、ビニルモノマー、又は全モノマー重量を基準にして少なくとも５０重量％のスチレンモノマーを含有するビニルモノマー混合物から重合されたコポリマーを意味する。好ましくは、スチレンポリマーは、少なくとも７５％のスチレン、より好ましくは少なくとも９０％のスチレンであるモノマー混合物から、及び最も好ましくは本質的にスチレン及び少なくとも一つのビニル芳香族架橋剤からなるモノマー混合物から製造される。本発明において出発物質として使用される重合体ビーズは、一つの共重合可能な炭素‐炭素二重結合を有する少なくとも一つのモノマー、および少なくとも一つの架橋剤からのモノマー残基を含有する。架橋剤から誘導されるモノマー残基は、全モノマー残基の合計を基準にして０．５モルパーセントから３．０モルパーセントである。好ましくは、架橋剤の量は、０．７から１．３モルパーセント、より好ましくは０．７から１．２モルパーセント及び最も好ましくは０．８から１．２モルパーセントである。
【００４７】
　架橋剤は、分子当たり２以上の共重合可能炭素‐炭素二重結合を有するモノマーであり、例えば：ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、トリビニルベンゼン、トリビニルシクロヘキサン、ジビニルナフタレン、トリビニルナフタレン、ジエチレングリコールジビニルエーテル、エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、アリルメタクリレート、１，５‐ヘキサジエン、１，７‐オクタジエン又は１，４‐ビス（４‐ビニルフェノキシ）ブタン等である：上述された架橋剤のそれぞれの、任意の種々の位置異性体が好適であると理解される。好ましい架橋剤は、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、トリビニルベンゼン又は１，４‐ビス（４‐ビニルフェノキシ）ブタンである。最も好ましい架橋剤は、ジビニルベンゼンである。
【００４８】
　本発明において出発物質として使用されるビーズの調製に使用され得る好適なモノ不飽和ビニル芳香族モノマーとしては、例えば、スチレン、α‐メチルスチレン、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル置換スチレン及びビニルナフタレンが挙げられる：好ましい１以上のモノ不飽和ビニル芳香族モノマーは、スチレン及び（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル置換スチレンからなる群から選択される。好適な（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル置換スチレンの中で含まれるのは、例えば、エチルビニルベンゼン、ビニルトルエン、ジエチルスチレン、エチルメチルスチレン、ジメチルスチレン、及びビニルベンジルクロリドの異性体である；上述された架橋剤のそれぞれの、任意の種々の位置異性体が好適であると理解される。
【００４９】
　任意に、例えば、アクリロニトリル、グリシジルメタクリレート、（メタ）アクリル酸及びアミド又は（メタ）アクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステルのような非芳香族ビニルモノマーも、また、ビニル芳香族モノマーへの付加に使用され得る。使用される場合は、非芳香族ビニルモノマーは、典型的には重合単位として、コポリマーを形成するのに使用される総モノマー重量を基準にして０から２０％、好ましくは０から１０％及びより好ましくは０から５％コポリマーを含む。
【００５０】
　好ましいビニルモノマーは、ビニル芳香族モノマー；より好ましくはスチレン、ビニルベンジルクロリドの異性体及びα‐メチルスチレンである。最も好ましいビニルモノマーはスチレンである。
【００５１】
　任意に、ビーズの調製は、重合過程で使用される分散剤及び懸濁剤の残基のポリマー表面を浄化するために酵素処理を含む。酵素処理は、典型的には重合過程で重合体相と酵素物質（１以上のセルロース分解酵素及び蛋白質分解酵素から選択される）とを接触させ、引き続き重合し又はポリマーの後分離を行うことを伴う。日本特許出願第６１‐１４１７０４号及び第５７‐９８５０４号が、ポリマー樹脂の調製過程での酵素の使用についての更に一般的及び具体的な詳細について参考とされ得る。好適な酵素としては、例えば、セルロースベース分散剤系については、β‐１，４‐グルカン‐４‐グルカノ‐ヒドラーゼ、β‐１，４‐グルカン‐４‐グルカンヒドラーゼ、β‐１，４‐グルカン‐４‐グルコヒドラーゼ、及びβ‐１，４‐グルカン‐４‐セロビオヒドラーゼのようなセルロース‐分解酵素；ゼラチンベース分散剤系については、ウロキナーゼ、エラスターゼ及びエンテロキナーゼのような蛋白質分解酵素が挙げられる。典型的には、ポリマーに関して使用される酵素量は、ポリマーの総重量を基準にして２から３５％、好ましくは５から２５％及びより好ましくは１０から２０％である。
【００５２】
　官能化試薬は、ビーズを含むポリマーに官能基を共有結合させるものである。更に官能基の合成には、固相合成についての支持体のようなビーズの利用を最大化することが必要となり得る。しかしながら、官能基の初期結合は、官能化されるビーズの領域を決定し、したがって固相合成についての基体と反応し、合成品の回収を許容するビーズの能力を制御する傾向がある。スチレンポリマーについては、官能化は典型的には芳香族環上でのフリーデル‐クラフツ置換であり、好ましくはアシル化、臭素化又はハロメチル化である。引き続き初期官能基の合成が、典型的には成される。例えば、アロイルハライドによるアシル化はしばしば、引き続きアリールリチウムの生成物のカルボニル基への添加が行われトリアリールカルビノール官能基を生成し、それからハロゲン化されてトリチルハライド官能基を生成する。本発明の好ましい一態様においては、２‐クロロトベンゾイルクロライド、続いてフェニルリチウム及びそれから塩化チオニルにより、２‐クロロトリチルクロリド官能基を生成する。臭素化は、典型的には、続いてアルキルリチウム試薬での処理及びアリルリチウム生成物と多様な試薬との反応により異なる官能基を生成する。ハロメチル基は、また、多様な試薬と反応でき異なる官能基を生成する。
【００５３】
　更に他の変形において、本発明は、任意にアミノ酸又はアミノ酸誘導体をロードした低ボイド空間樹脂を使用して１以上のＴ‐２０又はＴ‐１２４９フラグメントを創製させる、Ｔ‐２０又はＴ‐１２４９組成物又はＴ‐２０又はＴ‐１２４９組成物のフラグメントを製造するための改良法を提供する。
【００５４】
　本明細書における新規な方法を使用して自由流動性とされ得る前駆体樹脂は、（ａ）（ｉ）少なくとも一つのビニルモノマー及び少なくとも一つの架橋剤を含むモノマー混合物；及び（ｉｉ）０．２５モルパーセントから１．５モルパーセントの少なくとも一つのフリーラジカル開始剤からなるビーズコポリマーを調製し；（ｂ）モノマー混合物を重合させ；及び（ｃ）ビーズを非プロトン性有機溶媒で洗浄することにより製造され得る。勿論、他の方法も、また、本発明で使用される樹脂を得るために使用され得ることが認識される。
【００５５】
　本明細書において使用される用語「（メタ）アクリル」はアクリル又はメタクリルを意味する。用語「ビニルモノマー」は、付加重合に好適な、且つ単一重合性炭素‐炭素二重結合を含有するモノマーを意味する。用語「スチレンポリマー」は、少なくとも一つの架橋剤と共に、ビニルモノマー又は全モノマー重量を基準にして少なくとも５０重量％のスチレンモノマーを含有するビニルモノマー混合物から重合されたコポリマーを意味する。好ましくは、スチレンポリマーは、少なくとも７５％のスチレン、より好ましくは少なくとも９０％のスチレンであるモノマー混合物から、及び最も好ましくは本質的にスチレン及び少なくとも一つのビニル芳香族架橋剤からなるモノマー混合物から製造される。本発明の軽度に架橋された重合体ビーズは、一つの共重合可能炭素‐炭素二重結合を有する少なくとも一つのモノマー及び少なくとも一つの架橋剤からのモノマー残基を含有する。架橋剤から誘導されるモノマー残基は、全モノマーの合計を基準にして０．５モルパーセントから２モルパーセントである。
【００５６】
　重合体ビーズは、８００ミクロン（μｍ）より大きくない、好ましくは１７０μｍより大きくない、より好ましくは１５０μｍより大きくない、より好ましくは１２５μｍより大きくない及び最も好ましくは１００μｍより大きくない粒径を有する球状コポリマービーズである。
【００５７】
　本発明に使用される重合体ビーズは、好ましくはサスペンション重合又はシードエクスパンジョン法により製造される。典型的なビーズ調製の例としては、懸濁助剤、例えば、分散剤、保護コロイド及びバッファーを含有する連続水性相溶液の調製を挙げることができる。好ましくは、本発明の比較的小さなビーズの製造を助力するために、界面活性剤、好ましくはアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤が水溶液に含まれ、激しい撹拌が重合プロセスの過程で維持される。水溶液は、少なくとも一つのビニルモノマー、少なくとも一つの架橋剤及び少なくとも一つのフリーラジカル開始剤を含むモノマー混合物と混合される。好ましくは、総開始剤濃度は、総モノマー充填を基準にして０．２５モルパーセントから１．５モルパーセント、好ましくは０．４モルパーセントから１モルパーセント、より好ましくは０．４モルパーセントから０．８モルパーセント及び最も好ましくは０．５モルパーセントから０．７モルパーセントである。混合物は、反応容器中の雰囲気（ヘッドスペース）における酸素濃度が５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは２％未満及び最も好ましくは１％未満となるまで不活性ガスを導入することにより大部分の酸素を一掃する。好ましくは、不活性ガスは、水溶液及びモノマー混合物中に並びにヘッドスペースに導入される。モノマー混合物は、その後、高められた温度において重合される。好ましくは、重合は、未反応ビニルモノマー含量を出発量の１％未満まで減少させるに十分な時間、継続される。生じたビーズは、それから、脱水、非プロトン性有機溶媒による洗浄及び乾燥等の慣用の手段で分離される。
【００５８】
　架橋剤は、分子当たり２以上の共重合可能炭素‐炭素二重結合を有するモノマーであり、例えば：ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、トリビニルベンゼン、トリビニルシクロヘキサン、ジビニルナフタレン、トリビニルナフタレン、ジエチレングリコールジビニルエーテル、エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、アリルメタクリレート、１，５‐ヘキサジエン、１，７‐オクタジエン又は１，４‐ビス（４‐ビニルフェノキシ）ブタン等である：上述された架橋剤のそれぞれの、任意の種々の位置異性体が好適であると理解される。好ましい架橋剤は、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、トリビニルベンゼン又は１，４‐ビス（４‐ビニルフェノキシ）ブタンである。最も好ましい架橋剤は、ジビニルベンゼンである。
【００５９】
　本発明において出発物質として使用されるビーズの調製に使用され得る好適なモノ不飽和ビニル芳香族モノマーとしては、例えば、スチレン、α‐メチルスチレン、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル置換スチレン及びビニルナフタレンが挙げられる：好ましい１以上のモノ不飽和ビニル芳香族モノマーは、スチレン及び（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル置換スチレンからなる群から選択される。好適な（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル置換スチレンの中で挙げられるのは、例えば、エチルビニルベンゼン、ビニルトルエン、ジエチルスチレン、エチルメチルスチレン、ジメチルスチレン及びビニルベンジルクロリドの異性体である；上述された架橋剤のそれぞれの、任意の種々の位置異性体が好適であると理解される。
【００６０】
　任意に、例えば、ビニル芳香族モノマーに加えて、アクリロニトリル、グリシジルメタクリレート、（メタ）アクリル酸及びアミド又は（メタ）アクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステルも、また、使用され得る。使用される場合は、非芳香族ビニルモノマーは、典型的には重合単位として、コポリマーを形成するのに使用される総モノマー重量を基準にして０から２０％、好ましくは０から１０％及びより好ましくは０から５％コポリマーを含む。
【００６１】
　好ましいビニルモノマーは、ビニル芳香族モノマーであり；より好ましくはスチレン、ビニルベンジルクロリドの異性体及びα‐メチルスチレンである。最も好ましいビニルモノマーはスチレンである。
【００６２】
　本発明に使用されるビーズを調製するのに有用な重合開始剤としては、ペルオキシド、ヒドロペルオキシド、ペルオキシエステル等のモノマー可溶性開始剤及び関連開始剤が挙げられ；例えばベンゾイルペルオキシド、ｔｅｒｔ‐ブチルヒドロペルオキシド、クメンペルオキシド、テトラリンペルオキシド、アセチルペルオキシド、カプロイルペルオキシド、ｔｅｒｔ‐ブチルペルオクトエート（ｔｅｒｔ‐ブチルジペルオキシ‐２‐エチルヘキサノエートとしても知られる）、ｔｅｒｔ‐アミルペルオクトエート、ｔｅｒｔ‐ブチルペルベンゾエート、ｔｅｒｔ‐ブチルジペルフタレート、ジシクロヘキシルペルオキシジカーボネート、ジ（４‐ｔｅｒｔ‐ブチルシクロヘキシル）ペルオキシジカーボネート及びメチルエチルケトンペルオキシドである。また、有用なのはアゾジイソブチロニトリル、アゾジイソブチロアミド、２，２‐アゾ‐ビス（２，４‐ジメチルバレロニトリル）、アゾ‐（ビス‐メチル‐ブチロニトリル）及びジメチル‐、ジエチル‐、又はジブチルアゾ‐ビス（メチルバレレート）等のアゾ開始剤である。好ましいペルオキシド開始剤は、ベンゾイルペルオキシド等のジアシルペルオキシド、及びｔｅｒｔ‐ブチルペルオクトエート及びｔｅｒｔ‐ブチルペルベンゾエート等のペルオキシエステルである。
【００６３】
　任意に、ビーズの調製は、重合過程で使用される分散剤及び懸濁剤の残基のポリマー表面を浄化するための酵素処理を含む。酵素処理は、典型的には重合過程で重合体相と酵素物質（１以上のセルロース分解酵素及び蛋白質分解酵素から選択される）とを接触させ、引き続き重合し又はポリマーの後分離を行うことを伴う。日本特許出願第６１‐１４１７０４号及び第５７‐９８５０４号が、ポリマー樹脂の調製過程での酵素の使用についての更に一般的な及び具体的な詳細について参考とされ得る。好適な酵素としては、例えば、セルロースベース分散剤系については、β‐１，４‐グルカン‐４‐グルカノ‐ヒドラーゼ、β‐１，４‐グルカン‐４‐グルカンヒドラーゼ、β‐１，４‐グルカン‐４‐グルコヒドラーゼ、及びβ‐１，４‐グルカン‐４‐セロビオヒドラーゼのようなセルロース‐分解酵素；ゼラチンベース分散剤系については、ウロキナーゼ、エラスターゼ及びエンテロキナーゼのような蛋白質分解酵素が挙げられる。典型的には、ポリマーに関して使用される酵素量は、ポリマーの総重量を基準にして２から３５％、好ましくは５から２５％及びより好ましくは１０から２０％である。
【００６４】
　下記の実施例は、ペプチド構造の例を示す。この実施例の結果は表４に示される。ペプチド構造の種々の組み合わせは本明細書において記載される技術を使用して構築されるものと認識される。
【００６５】
　本明細書に記載される方法はペプチド、特にＴ‐２０及びＴ‐２０様ペプチドの低コスト且つ効率的な合成に使用され得るものと認識される。斯かる方法は、特異的なペプチドフラグメントの基を合成し及び組み合わせて目的のペプチドを生じさせる固液相合成手順を利用する。他の変形において、目的のペプチドの合成（例えば、Ｔ‐２０）における中間体として作用する個々のペプチドフラグメントが、また、創製される。更に別の態様において、本発明は共に利用され得る斯かるペプチド中間体フラグメントの群を提供して全長Ｔ‐２０及びＴ−２０様ペプチドを生成する。
【００６６】
　別の態様において、本明細書において記載される方法により創製されるペプチド又はペプチドのフラグメントは精製され及び／又は対象のペプチドの合成における中間体として作用する個々のペプチドフラグメントが、また、精製される。
【００６７】
　本発明は、また、融解関連事態を阻止し及び重要なことには強い抗ウィルス活性を発揮させる能力を発揮するペプチド及びペプチドフラグメントを創製するために使用され得る。これらのペプチド及びペプチドフラグメントは、本明細書において明白に記載されているものとして挿入され、参照される米国特許第５，４６４，９３３号；５，６５６，４８０号及びＰＣＴ公告第９６／１９４９５号に記載されている。本発明は、大規模な量でのこれらの治療剤を創製する方法を提供する。
【００６８】
　Ｔ‐２０及びＴ‐２０フラグメントは、特異的なペプチドフラグメントの群を合成し及び組み合わせて目的のペプチドを生じさせる固液相合成手順を使用して作られる。一般に、本発明の方法は、本発明により創製される固体支持体上でＴ‐２０及びＴ‐２０様ペプチドの特異的側鎖保護ペプチドフラグメント中間体を合成し、溶液中の保護フラグメントをカップリングして保護Ｔ‐２０又はＴ‐２０様ペプチドを形成し、引き続き側鎖を保護解除して最終Ｔ‐２０又はＴ‐２０様ペプチドを生じさせることを含む。本発明の方法の好ましい態様は、米国特許第６，０１５，８８１号（“８８１特許”）に表現されたようなアミノ酸配列を有するＴ‐２０ペプチドの合成を伴う。
【００６９】
　本発明は、更に目的のペプチド（たとえばＴ−２０）の合成において中間体として作用する個々のペプチドフラグメントに関する。本発明のペプチドフラグメントは、 ‘８８１特許に記載されたようなこれらのアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
　本発明は、また、ＣＴＣ樹脂を使用した慣用の技術を使用して１以上のペプチドフラグメントを創製することができ、２００３年２月１２日に出願した、ボーリング等による「アミノ酸ロードトリチルアルコール樹脂、及び生物学的に活性な物質及びそれにより製造される治療剤」と題された我々の特許出願に記載されたようなアルコールベース樹脂を使用する本明細書において記載された技術を使用して１以上のペプチドフラグメントを創製することができることが認識される。生じたペプチドは、その後、Ｔ‐２０ペプチド又はＴ‐２０様ペプチドを得るため混合され得る。
【００７１】
　本法、フラグメント及びフラグメント群及び本発明のフラグメント及びフラグメント群を選択するために利用される技術はＴ‐２０に加えてＴ‐２０様フラグメントを合成するのに使用され得る。本明細書において、用語「Ｔ‐２０様」は、ここに挿入されているそれぞれが、その全体が参照される米国特許第５，４６４，９３３号；５，６５６，４８０号及びＰＣＴ公告第９６／１９４９５号に掲げられた任意のＨＩＶ又は非ＨＩＶペプチドを意味する。
【００７２】
　上記したＴ‐２０及びＴ−２０様ペプチドに加えて、本発明の方法、フラグメント及びフラグメント群は変性されたアミノ及び／又はカルボキシル末端を有するペプチドを合成するのに使用され得る。
【００７３】
　好ましい態様において、本発明の方法は、Ｘがアセチル基及びＺがアミド基である式を有するペプチドを合成するのに使用される。好ましい方法においては、Ｔ−２０及びＴ‐２０様ペプチド及び中間体は、高ｐＨ範囲（>７より大）で安定なジルコニウムベース充填物、ポリスチレン、ポリアクリル又は他のポリマーベース充填物を包含するが、これらに限定されない、任意の非シリカベースカラム充填物（ロード能力の最大化のため）を使用して精製され得る。例えば、ｐＨバルブを含む広いｐＨ範囲を示す非シリカ充填カラム充填物の中で、それらより大きなものはトーソハウス（米国、ペンシルバニア州、モンゴメリー）から販売される。斯かる材料でパックされたカラムは、低、中、高圧クロマトグラフィーにおいて運転され得る。
【００７４】
　本発明は、また、上記‘８８１特許の表１で掲げられたような特異アミノ酸配列を有するＴ‐２０及びＴ‐２０様ペプチドのペプチドフラグメント中間体及び上記‘８８１特許の表２で掲げられたような特異アミノ酸配列を有するＴ‐２０及びＴ‐２０様ペプチドのペプチドフラグメント中間体群の大規模効率的な製造を提供する。斯かるペプチド中間体は、特に‘８８１特許の表２に掲げられたような群においてＴ‐２０及びＴ‐２０様ペプチドを製造するために利用される。
【００７５】
　任意の１以上のペプチドフラグメントのアミノ酸残基の側鎖は、ｔ‐ブチル（ｔ‐Ｂｕ）、トリチル（ｔｒｔ）及びｔ‐ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）のような標準保護基で保護され得る。ｔ‐Ｂｕ基は、アミノ酸残基、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）及びＡｓｐ（Ｄ）についての好ましい側鎖保護基であり；ｔｒｔ基はアミノ酸残基、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｎ（Ｑ）及びＡｓｎ（Ｎ）についての好ましい側鎖保護基であり；及びＢｏｃ基はＬｙｓ（Ｋ）及びＴｒｐ（Ｗ）についての好ましい側鎖保護基である。
【００７６】
　フラグメントの合成の過程で、ヒスチジン残基の側鎖は、好ましくはトリチル（ｔｒｔ）保護基で保護される。もし、保護されないなら、樹脂からペプチドフラグメントを開裂させるのに使用される酸は、ヒスチジン残基と不利益に反応して、ペプチドフラグメントの劣化を生じさせ得る。
【００７７】
　本発明のペプチドフラグメントのグルタミン残基はトリチル（ｔｒｔ）基で保護される。しかしながら、ある種のフラグメントのカルボキシ末端におけるグルタミン残基を保護しないことが可能である。本発明のそれぞれのペプチドフラグメントの全アスパラギン残基は、保護され得る。加えて、トリプトファン残基はＢｏｃ基で保護される。
【００７８】
　一部の個々のペプチドフラグメントは、本明細書において記載された固相合成技術を使用して作られ、一方で本発明の他のペプチドは固相及び溶液相合成技術の組み合わせを使用して任意に製造される。本発明のペプチドは、ペプチドのアミノ酸残基を結合させる１以上の結合が非ペプチド結合であるよう代替的に合成されてもよい。これらの代替的な非ペプチド結合は、当業者に良く知られた反応を利用することにより形成されることができ、少しではあるが名前を挙げればイミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジド及びアゾ結合が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
　本発明の更なる態様において、上記された配列を含むＴ‐２０及びＴ‐２０様ペプチドは、それらのアミノ及び／又はカルボキシ末端において存在する追加の化学基で合成され得る、その結果、例えば、ペプチドの安定性、反応性及び／又は溶解度が向上される。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、アセチル又はｔ‐ブチロキシカルボニル基のような疎水性基は、そのペプチドのアミノ末端に添加され得る。同様にアセチル基又は９‐フルオレニルメトキシ‐カルボキシ基は、ペプチドのアミノ末端に配置され得る。追加的に、疎水性基、ｔ‐ブチロキシカルボニル又はアミド基は、ペプチドのカルボキシ末端に添加され得る。同様に、パラ‐ニトロベンジルエステル基は、ペプチドのカルボキシ末端に配置され得る。
【００８０】
　好ましくは、本発明の１以上のペプチドフラグメントは、標準ＦＭＯＣプロトコルを使用して本明細書に記載された固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成される。カルピノ等の１９７０年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９２巻（１９）：５７４８〜５７４９；カルピノ等の１９７２年、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３７巻（２２）：３４０４〜３４０９頁が参照される。
【００８１】
　本明細書に記載された方法及び基体は、米国特許第６，４６９，１３６号（“１３６特許”）に記載されたポリペプチドを構築するのに使用され得る。特に、本明細書においてＴ‐１２４９及びＴ‐１２４９様ペプチドと称されるペプチドは本明細書において記載された新規な方法単独で、又は本明細書において記載された慣用の方法と組み合わされた方法を使用して構築され得る。これらの方法は、特異ペプチドフラグメントの群を合成し、組み合わせるために固液相合成手順を利用して目的のペプチドを生成させる。
【００８２】
　ペプチド、特にＴ‐１２４９及びＴ‐１２４９様ペプチドの合成についての新規な方法は、本明細書において記載される。これらの方法は、特異ペプチドフラグメントの群を合成し、組み合わせるために固液相合成手順を利用して目的のペプチドを生成させる。一般に、本法は創製される固体支持体上でＴ‐１２４９またはＴ−１２４９様の特異的側鎖保護ペプチドフラグメント中間体を合成し、溶液中の保護フラグメントをカップリングして保護Ｔ‐１２４９又はＴ‐１２４９様ペプチドを形成し、引き続き側鎖を保護解除して最終Ｔ‐１２４９又はＴ‐１２４９様ペプチドを生じさせることを含む。本発明の方法の好ましい態様は、‘１３６特許において表現されたようなアミノ酸配列を有するＴ‐１２４９ペプチドの合成を伴う。
【００８３】
　本発明は、更に目的のペプチド（例えば、Ｔ‐１２４９）の合成において中間体として作用する個々のペプチドフラグメントを構築するための低コスト、高効率法を提供する。本発明のペプチドフラグメントとしては、‘１３６特許の表１に表現されたアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において記載されたように固相及び液相合成反応の組み合わせは、当分野で記載されたものより高処理量及び高収量で大規模製造される高純度Ｔ‐１２４９及びＴ‐１２４９様ペプチドを与える。Ｔ‐１２４９及びＴ‐１２４９様ペプチドは、１以上のキログラムの規模で合成され得る。
【００８４】
　本発明は、Ｔ‐１２４９として知られるペプチドを合成するのに使用される。Ｔ‐１２４９は、その配列がＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２及びＳＩＶｇｐ４１ウイルスポリペプチド配列から誘導される３９アミノ酸残基ポリペプチドである。本法、フラグメント及びフラグメントの群、及び本発明のフラグメント及びフラグメントの群を選択するのに利用される技術はＴ‐１２４９に加えてＴ‐１２４９様フラグメントを合成するのに使用され得ることが理解されるであろう。本明細書において用語「Ｔ‐１２４９様」は、１９９９年、５月２０日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／１１２１９号、１９９９年、１１月２５日に公告された国際公告番号ＷＯ９９／５９６１５号に掲げられた任意のＨＩＶ又は非ＨＩＶペプチドを意味する。
【００８５】
上記されたＴ‐１２４９及びＴ‐１２４９様ペプチドに加えて、本法、本発明のフラグメント及びフラグメントの群は、変性アミノ及び／又はカルボキシ末端基を有するペプチド及び高及び低ｐＨ範囲で安定な他のポリマービーズ充填物を合成するのに使用される。
【００８６】
‘１３６特許の表１に掲げられた特異アミノ酸配列を有するＴ‐１２４９及びＴ‐１２４９様ペプチドの１以上のペプチドフラグメント中間体及び‘１３６特許の表２に掲げられた１以上のペプチドフラグメント中間体の群は、また、本明細書において記載された新規の方法単独で、又は他の先行技術方法と組み合わせで使用して構築される。
【００８７】
ペプチド合成
　本発明の他のペプチドが固相及び溶液相合成技術の組み合わせを使用して任意に製造されるのに対し、個々のペプチドフラグメントは、好ましくは固相重合技術を使用して製造される。この合成は、Ｔ‐１２４９及びＴ‐１２４９様ペプチドの製造において、最高点に達する。
【００８８】
　本発明のペプチドは、ペプチドのアミノ酸残基と結合する１以上の結合基が非ペプチド結合となるように代替的に合成され得る。これらの代替的非ペプチド結合は、当業者に知られた反応を利用して形成されることができ、少しではあるが名前を挙げればイミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジド及びアゾ結合を包含するが、これらに制限されない。更に、Ｔ‐１２４９及びＴ‐１２４９様ペプチドは、それらの立体形態が変更されるよう合成されてもよい。例えば、１以上のペプチドのアミノ酸残基のＤ型異性体が、通常のＬ型異性体よりむしろ使用されてもよい。
【００８９】
　より更に、本発明のペプチドのアミノ酸残基の少なくとも一つは、公知の天然産でないアミノ酸残基の一つにより置換され得る。このような変更は、本発明のペプチドの安定性、反応性及び／又は溶解度を増加させるのに役立つ。任意のＴ‐１２４９又はＴ‐１２４９様ペプチドは、そのアミノ及び／又はカルボキシ末端の共有結合されるマクロモレキュラーキャリヤー基を追加的に有するよう合成され得る。斯かるマクロモレキュラーキャリヤー基としては、例えば、脂質‐脂肪酸複合体、ポリエチレングリコール、炭水化物又は追加のペプチドが挙げられる。
【００９０】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）方法；一般手順
　自由流動性ＦｍｏｃＬｅｕ‐樹脂（１当量）が、ＳＰＰＳチャンバーに充填される。樹脂は、１５〜３０分間、窒素パージにより５％ピペリジンＤＣＭ（７．５容積）中で調節される。溶媒が排出され、樹脂はＦｍｏｃ保護基を除去するために３０分間、ＮＭＰ中の２０％ピペリジン（５容積）で２回処理される。２回目の２０％ピペリジン／ＮＭＰ処理の後で、樹脂はＮＭＰ（５容積）で５−７回洗浄されコラニル試験（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｈｏｒａｎｉｌ　ｔｅｓｔ）が陰性となる。
【００９１】
　一方で、後に続くアミノ酸（１．５当量）、ＨＯＢＴ（１．５当量）及びＤＩＥＡ（１．５当量）は、３：１ＮＭＰ／ＤＣＭ（１０容積）中で混合され、室温で完全に溶解させられて、０℃に冷却される。ＨＢＴＵが添加され、溶液は固体を溶解するために１０〜１５分撹拌され、その後樹脂に添加される。懸濁液は、１〜３時間窒素雰囲気下で撹拌される。カップリングの終了が定性ニンヒドリン試験でモニターされる。もし反応が３時間後に不完全であるならば、（ニンヒドリン試験が陽性を保持する）、反応器は排液され、活性アミノ酸（０．５当量）の新鮮な溶液で再カップリングが遂行されなければならない。通常は、再カップリングの３０分から１時間後、ニンヒドリン試験が陰性の結果が得られる。このサイクルは、フラグメント中の残存アミノ酸について繰り返される。フラグメントが蓄積するにつれ、洗浄に使用される溶媒容積は、５容積から増加する必要があるかもしれない。最終カップリングに続いて、樹脂は５〜８容積のＮＭＰで３回洗浄され、ついで１０容積のＤＣＭで２回洗浄され、４０℃において真空オーブン中で恒量となるまで乾燥される。
【００９２】
再利用実施例
　本発明で記載された樹脂は、標準条件を使用してペプチドを除去し、次いで水酸化ナトリウムでクロロトリチルアルコール樹脂に変換されて再利用される。クロロトリチルアルコール樹脂は、次に塩化チオニル及びトルエン中の触媒量のジメチルホルムアミドでの処理によりＣＴＣに変換される。均一に官能化された樹脂の増加した耐久性は、現行の当分野において見出される樹脂と比較して再利用された樹脂に関し非常に改善された完全ビーズ総数及び加工性をもたらす。
【００９３】
　更に、ペプチドの大規模製造が本発明の非凝集性及び／又は自由流動性樹脂生成物を使用して容易にされると認識される。自由流動性樹脂は、供給管及び漏斗を含む製造系部材を通してそれを自由に通過させ、バルク容器からエンドユーザー容器（即ち、０．５グラムから数グラム又はキログラム範囲の量を含有する実験室規模容器）に樹脂の容易な再包装を可能にし、ロードされたアミノ酸（ａａ）部位と他の反応物との有意な相互作用によりポリペプチド及びそれらのフラグメントを製造させ、慣用の樹脂よりもより大きなビーズ対ビーズ均一性を提供する特性を有する。
【外国語明細書】
2004143425000001.pdf
2004143425000002.pdf
2004143425000003.pdf