(57)【要約】【課題】ポリシストロンの転写単位の構造の予測を可能とすること、開始コドンの位置の同定精度を高めること、予備情報を不要とすること、ＧＣ含量が高い塩基配列に対応すること、又は種名が明らかでない原核生物より単離したＤＮＡ断片の塩基配列情報から、そのＤＮＡ断片が由来した原核生物の種名を推定することを可能にする方法を提供する。【解決手段】ＤＮＡ断片の配列情報をもとに同定したＣＤＳのコドン使用頻度を算出した後、複数の原核生物のコドン使用頻度の中から、このコドン使用頻度と最も類似しているコドン使用頻度を選択し、選択されたコドン使用頻度をもとに遺伝子構造を同定する。また、複数の原核生物のコドン使用頻度の中から選択したコドン使用頻度が由来した微生物を、該ＤＮＡ断片が由来した微生物であると推定する。【選択図】  図１４
2004310688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｇ）の工程：
（ａ）すでに２個以上の翻訳領域が確定している複数種の原核生物に関して、該翻訳領域のコドン使用頻度を算出する；
（ｂ）原核生物の塩基配列（塩基配列とはＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列をいう）情報から、翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のオープン・リーディング・フレーム（Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ；以下、ＯＲＦと略記する）を与える仮の翻訳開始コドンを設定する；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた個々のＯＲＦについて、翻訳領域としての真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定することにより、翻訳領域を仮同定する；
（ｄ）工程（ｃ）または（ｆ）で真と判定された、１つないしはそれ以上の数の翻訳領域のコドン使用頻度を算出する；
（ｅ）類似性の尺度を用いて、工程（ａ）で算出した複数種の原核生物の翻訳領域のコドン使用頻度の中から、工程（ｄ）で得られた該コドン使用頻度に最も近いコドン使用頻度を示す原核生物を選択する；
（ｆ）工程（ｅ）で選択した原核生物の翻訳領域の塩基配列の特徴をもとに該翻訳領域の真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定し、この翻訳開始コドンの同定処理がＣ回目の処理であるときに工程（ｇ）に移り、Ｃ回目未満のときには工程（ｃ）に移る〔ただし、Ｃは１以上の整数とする〕；
（ｇ）工程（ｂ）、（ｃ）および（ｆ）の結果から、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、並びに翻訳領域を確定し遺伝子構造を同定する；
工程を含む原核生物の遺伝子構造同定方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ）を、転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法もしくは相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法のいずれかの方法、または転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法および相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法を組み合わせた方法を用いて行なうものである、請求項１記載の原核生物の遺伝子構造同定方法。
【請求項３】
工程（ｃ）の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」が、下記（ｈ）〜（ｎ）：
（ｈ）原核生物の塩基配列情報から、翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを設定する。
（ｉ）工程（ｈ）で得られた任意の隣り合い、かつ同じ鎖にある２つのＯＲＦを下流からＯＲＦ−Ａ、ＯＲＦ−Ｂとしたとき、ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンが、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの上流にあるか、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内にあるとき、ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが一つの転写単位を形成する可能性があると判定する〔ここで、ＤＳは２０〜１００の整数〕；
（ｊ）工程（ｉ）においてＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが一つの転写単位を形成する可能性があると判定された場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドン第１文字目のＴ（チミジン）残基から下流に向かってＤＢ塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内の領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍」という）の中に翻訳開始コドンの候補があるときに、その候補をＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンと同定し〔ここで、ＤＢは１０〜２０の整数で、ＵＢは３〜１５の整数である〕、翻訳開始コドンの候補が複数ある場合、各候補とＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位を決めることによりＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを同定する；
（ｋ）工程（ｊ）でＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが同定できなかった場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの第１文字目のＴ残基から下流に向かってＲＤ塩基以内、および該Ｔ残基から上流に向かってＲＵ塩基以内の領域であり、かつ「該翻訳終止コドンの近傍」を除いた領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」という）にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるかどうか調べる〔ここで、ＲＤは３０〜１２０の整数で、ＲＵは２０〜１２０の整数である〕；
（ｌ）工程（ｋ）で該領域にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるとき、各候補の上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定する；
（ｍ）工程（ｉ）で一つの転写単位を形成する可能性があると判定されなかったＯＲＦ−Ａまたは工程（ｌ）で翻訳開始コドンを同定できなかったＯＲＦ−Ａについて、最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めて、５’末端から最多Ｎ個までの翻訳開始コドンの候補を検索した後、各候補についてその上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定する〔ここで、Ｎは５〜２０の整数である〕；
（ｎ）工程（ｊ）、（ｌ）または（ｍ）の同定結果から、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、翻訳領域並びに転写単位を確定し遺伝子構造を同定する；
の工程を含む遺伝子構造同定方法である請求項２記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項４】
工程（ｌ）が、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って数値化したものを「ｍＲＮＡとリボソームとの結合状態を表わすスコア（以下、リボソーム結合スコア、という）」とした場合に、該スコアが閾値Ｖ３〔ここで、Ｖ３は４〜１２の整数である〕を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定し、該翻訳開始コドンが複数ある場合は「ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分け「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の順の優先度に従い、該優先度が高い翻訳開始コドンを真の翻訳開始コドンと同定し、さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときはＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位を決めることにより、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを同定する工程であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項５】
工程（ｍ）が、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って数値化したものを「リボソーム結合スコア」とした場合に、該スコアが閾値Ｖ１〔ここで、Ｖ１は請求項４のＶ３よりも大きい７〜１４の整数である〕を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定し、該翻訳開始コドンが複数ある場合はより高いスコアを与えるリボソーム結合配列に対応する翻訳コドンを真の翻訳コドンと同定し、閾値Ｖ１を越える候補がないときは、該スコアがＶ１より小さい閾値Ｖ３を含む１個以上の閾値を設定し、該閾値を越えたときにＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを段階的に同定する工程であることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項６】
工程（ｃ）における「相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法」として、相同性解析プログラムＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを用いることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項７】
工程（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）で用いるＰ個〔ここで、Ｐは１以上の整数である〕の翻訳領域のコドン使用頻度として、該翻訳領域の塩基配列を各翻訳終止コドンを除いて連結した後、連結した塩基配列について下式（１）：
【数１】
2004310688.tif 000085
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、Ｐ個の翻訳領域の塩基配列を連結した塩基配列について、２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
から算出された値を用いることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項８】
上式（１）において、トリプトファンとメチオニンを除く１８種類アミノ酸の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数を用いてコドン使用頻度を算出することを特徴とすることを特徴とする、請求項７記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項９】
工程（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）で用いるＰ個〔ここで、Ｐは１以上の整数である〕の翻訳領域のコドン使用頻度として、該翻訳領域の塩基配列を各翻訳終止コドンを除いて連結した後、連結した塩基配列について下式（２）：
【数２】
2004310688.tif 000086
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、Ｐ個の翻訳領域の塩基配列を連結した塩基配列について、２０種類（アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）のアミノ酸の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
から算出された値を用いることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項１０】
工程（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）で用いるＰ個〔ここで、Ｐは１以上の整数である〕の翻訳領域のコドン使用頻度として、該翻訳領域の塩基配列を各翻訳終止コドンを除いて連結した後、連結した塩基配列について下式（３）：
【数３】
2004310688.tif 000087
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、Ｐ個の翻訳領域の塩基配列を連結した塩基配列について、２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
から算出された値を用いることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項１１】
工程（ｅ）で用いる類似性の尺度として、距離、内積および方向余弦からなる尺度より選ばれる尺度を用いることを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項１２】
類似性の尺度としてユークリッド距離を用いることを特徴とする請求項１１記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項１３】
工程（ｆ）において、下記（ｒ）と（ｓ）：
（ｒ）すでに同定された原核生物の複数（Ｔ）個の翻訳領域において、「あるコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンの出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ種類選別する。
（ｓ）「出現頻度が高い方のｋ種類のコドンが該翻訳領域とは別の未同定の翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度が低い方のｋ種類のコドンが翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較することにより該翻訳領域Ａの真偽を判定する〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｋは５以上２０以下の整数である〕。
の工程を含む方法により翻訳領域の真偽を判定することを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項１４】
「出現頻度が高いｋ種類のコドンが翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｋ種類のコドンが翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、さらに該逆数の値が一定値を下回るときに該翻訳領域Ａを「偽」と判定する方法を用いることを特徴とする、請求項１３記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項１５】
すでに同定された原核生物のＴ個の翻訳領域の塩基配列をもとにＴ個の翻訳領域とは別の未同定の翻訳領域Ａの「真偽」を下記（ｔ）〜（ｗ）：
（ｔ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べる、
（ｕ）ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数４】
2004310688.tif 000088
としたとき、下式（４）によりｙｉを、そして下式（５）によりｙｉ＋３２を求める、
【数５】
2004310688.tif 000089
または
【数６】
2004310688.tif 000090
（ｖ）ｙｉおよびｙｉ＋３２の値が大きい順番に、工程（ｔ）で並べた６４種類のコドンを並べ替えた後、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選び、翻訳領域ＡのＳｄＡの値を下式（６）により求める、
【数７】
2004310688.tif 000091
ただし、
【数８】
2004310688.tif 000092
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする。
および
（ｗ）工程（ｖ）で算出した翻訳領域ＡのＳｄＡの値が閾値Ｓ１以上であるときに該翻訳領域を真の翻訳領域とし、該ＳｄＡの値が閾値Ｓ１未満であるときに偽の翻訳領域とする、
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは３２以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｋは５〜２０の整数、Ｓ１は０．５〜２．０の値である。〕
の工程で判定することを特徴とする、請求項１４記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項１６】
工程（ｆ）において、「コーディング・ポテンシャルを用いて翻訳領域の真偽を判定する方法」を用いて翻訳領域の真偽を判定することを特徴とする、請求項１乃至１５のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項１７】
「コーディング・ポテンシャルを用いて翻訳領域の真偽を判定する方法」として、「マルコフモデルまたは隠れマルコフモデルに基づいたコーディング・ポテンシャルを用いて翻訳領域の真偽を判定する方法」を用いることを特徴とする、請求項１６記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項１８】
「コーディング・ポテンシャルを用いて翻訳領域を真偽を判定する方法」として、すでに同定された原核生物のＴ個の翻訳領域の塩基配列をもとに、Ｔ個の翻訳領域において「出現頻度の高いｍ種類のコドンが未同定の翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｍ種類のコドンが未同定の翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較することにより該翻訳領域Ａの真偽を判定する方法を用いることを特徴とする、請求項１乃至１７のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
【請求項１９】
「出現頻度の高いｍ種類のコドンが未同定の翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｍ種類のコドンが未同定の翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、該逆数の値が一定値を下回るときに該翻訳領域Ａを「偽」と判定する方法であることを特徴とする、請求項１８記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
【請求項２０】
下記（ｘ）〜（ｚ）：
（ｘ）ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数９】
2004310688.tif 000093
としたとき、下式（７）によりｙｉを求める、
【数１０】
2004310688.tif 000094
（ｙ）ｙｉが大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、翻訳領域ＡのＣｄＡの値を下式（８）により求める、
【数１１】
2004310688.tif 000095
ただし、
【数１２】
2004310688.tif 000096
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする、
および
（ｚ）工程（ｙ）で算出した翻訳領域ＡのＣｄＡの値が閾値ＣＶ以上であるときに該翻訳領域を真の翻訳領域とし、該ＣｄＡの値が閾値ＣＶ未満であるときに偽の翻訳領域とする、
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０の整数、ＣＶは０．８〜２．０の値とする。〕
の工程を含む請求項１９記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）または（ｆ）において、請求項１乃至２０のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて同定された転写単位Ｐ、翻訳領域Ａ、転写単位Ｑおよび翻訳領域Ｂにおいて、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａが転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂと重複する場合、さらに下記（ａａ）〜（ａｃ）：
（ａａ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａと同じ鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂが、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａの中に内包される場合に、転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂを「偽」と判定する、
（ａｂ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａと相補的な鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂが、転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａの中に内包される場合に、転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂを「偽」と判定する、
（ａｃ）転写単位Ｐまたは翻訳領域Ａが相補的な鎖上に存在する転写単位Ｑまたは翻訳領域Ｂと重複するときに、転写単位または翻訳領域の長さが短い方を「偽」と判定する、
の工程を含む判定を行うことを特徴とする遺伝子構造同定方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）または（ｆ）において、請求項１乃至２０のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて同定された原核生物の任意の翻訳領域Ａが相補鎖の翻訳領域Ｂと重複し、かつ翻訳領域Ｂが翻訳領域Ａによって内包される場合に、下記（ａｄ）と（ａｅ）：
（ａｄ）翻訳領域Ａの長さＬＡ（塩基対）と翻訳領域Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＡがＬＢのＴＰ％以下のときに、翻訳領域Ｂを「偽」と判定する、および（ａｅ）ＬＡがＬＢのＴＰ％を越えるとき、請求項１４乃至２０のいずれか一項記載の方法により翻訳領域Ａと翻訳領域Ｂの真偽を判定する〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕
の工程を含む方法により翻訳領域ＡおよびＢの真偽を判定することを特徴とする遺伝子構造同定方法。
【請求項２３】
原核生物の塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越えるときであって、工程（ｃ）または（ｆ）において、該塩基配列内の翻訳領域内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて算出された含量が一定値を下回るときに該翻訳領域を「偽」と判定することを特徴とする、請求項１乃至２２のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【請求項２４】
計算式として下式（９）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いることを特徴とする請求項２３記載の遺伝子構造同定方法。
【数１３】
2004310688.tif 000097
〔ここで、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒ  は１，２または３である）の塩基がｂ（ｂ  は１，２，３または４である）のとき、
【数１４】
2004310688.tif 000098
であり、このとき、ｂは、ｉ番目の翻訳領域の第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目の翻訳領域のコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす。〕
【請求項２５】
工程（ｂ）の原核生物の塩基配列情報が、種名が明らかでない原核生物のＤＮＡ断片の塩基配列情報であり、該塩基配列情報をもとに請求項１乃至２４のいずれか一項に記載の遺伝子構造同定方法を用いて翻訳領域を同定し、工程（ｅ）においてコドン使用頻度の類似性により選択した原核生物を該ＤＮＡ断片が由来した微生物であると推定する方法。
【請求項２６】
（ａ）すでに２個以上の翻訳領域が確定している複数の原核生物に関して、該翻訳領域の塩基配列データを入力装置により入力し、これらデータから算出したコドン使用頻度をメモリーに格納し、
（ｂ）入力装置により入力した原核生物の塩基配列情報から、該塩基配列中の翻訳終止コドンを検索し、得られたすべての翻訳終止コドンについて、最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを検索し、上記翻訳終止コドンと仮の翻訳開始コドンとの組み合わせを翻訳領域の候補とし、これらコドンの上記塩基配列上の位置をメモリーに格納し、
（ｃ）メモリーからＯＲＦ候補を呼び出し、翻訳領域としての真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定することにより、翻訳領域を仮同定し、同定結果をメモリーに格納し、
（ｄ）ステップ（ｃ）または（ｆ）で真と判定された、１つないしはそれ以上の数の翻訳領域の塩基配列をメモリーから呼び出し、該塩基配列から算出した該翻訳領域のコドン使用頻度をメモリーに書き込み、
（ｅ）ステップ（ａ）で得られた上記の複数の原核生物の翻訳領域のコドン使用頻度とステップ（ｄ）で得られた該コドン使用頻度をそれぞれメモリから呼び出し、類似性の尺度を用いて両方の使用頻度を比較することにより、後者のコドン使用頻度と最も類似しているコドン使用頻度を示す原核生物を選択した後、選択した原核生物の翻訳領域の位置と塩基配列の特徴を分析し、その分析結果と選択された原核生物の種名をメモリーに格納し、
（ｆ）ステップ（ｅ）の分析結果をメモリーから呼び出し、この分析結果をもとに該翻訳領域の真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定し、同定結果をメモリーに格納した後、ステップ（ｆ）の処理がＣ回目の処理であるときにステップ（ｇ）に移り、Ｃ回目未満〔ただし、Ｃは１以上の整数とする〕のときにはステップ（ｃ）に移り、
（ｇ）メモリーに格納したステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｆ）での翻訳開始コドン及び翻訳終止コドンの位置並びに翻訳領域の同定結果、ならびにステップ（ｅ）でメモリーに格納した原核生物の種名を出力装置により出力する処理をコンピューターに実行させるためのプログラム。
【請求項２７】
ステップ（ｃ）の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」が、下記（ｈ）〜（ｎ）のステップを含む遺伝子構造同定方法である請求項２６記載のプログラム。
（ｈ）入力装置により入力された原核生物の塩基配列データから、該塩基配列中の翻訳終止コドンを検索し、得られた全ての翻訳終止コドンについて、最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを検索し、上記翻訳終止コドンと仮の翻訳開始コドンの組み合わせをＯＲＦ候補とし、これらのコドンの上記塩基配列上の位置を、メモリに格納し、
（ｉ）メモリから、同じ鎖にある隣り合う２つのＯＲＦ候補を呼び出し、下流側ＯＲＦ（ＯＲＦ−Ａとする）の仮の翻訳開始コドンと、上流側ＯＲＦ（ＯＲＦ−Ｂとする）の翻訳終止コドンの位置と距離を調べ、
ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンが、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの上流にあるか、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内〔ここで、ＤＳは２０〜１００の整数〕にあるとき、この隣接する２つのＯＲＦが一つの転写単位を形成する可能性があると判定してステップ（ｊ）に移り、
ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンとＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの位置と距離が上記条件を満たさない場合は、この隣接する２つのＯＲＦの組（ＯＲＦ−Ａ，ＯＲＦ−Ｂ）は一つの転写単位を形成しないと判定してステップ（ｆ）に移り、
（ｊ）ステップ（ｉ）で、２つのＯＲＦが一つの転写単位を形成する可能性があると判定したものについて、上記塩基配列データを呼び出して、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドン第１文字目のＴ（チミジン）残基から下流に向かってＤＢ塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内の領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍」という）の中から、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補を検索し〔ここで、ＤＢは１０〜２０の整数で、ＵＢは３〜１５の整数である〕、
翻訳開始コドン候補が１つの場合、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
翻訳開始コドン候補が複数ある場合、各候補とＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位の最も高いものを選択し、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｋ）ステップ（ｊ）でＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが同定できなかった場合、上記塩基配列データを呼び出して、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの第１文字目のＴ残基から下流に向かってＲＤ塩基以内、および該Ｔ残基から上流に向かってＲＵ塩基以内の領域〔ここで、ＲＤは３０〜１２０の整数で、ＲＵは２０〜１２０の整数である〕であり、かつ「該翻訳終止コドンの近傍」を除いた領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」という）にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるかどうか検索し、
該領域にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるときはステップ（ｌ）に移り、該候補がないときはステップ（ｍ）に移り、
（ｌ）ステップ（ｋ）で検索したＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補について、上記塩基配列データを呼び出して、各候補の上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域の存在の有無を調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｍ）ステップ（ｉ）で一つの転写単位を形成しないと判定されたＯＲＦ−Ａまたは処理（ｌ）で翻訳開始コドンを同定できなかったＯＲＦ−Ａについて、上記塩基配列データを呼び出して、最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めて、５’末端から最多Ｎ個〔ここで、Ｎは５〜２０の整数である〕までの翻訳開始コドンの候補を検索した後、各候補についてその上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを検索し、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｎ）以上のステップを、メモリに格納された全てのＯＲＦについて処理済みとなるまで繰り返し、
メモリに格納されたステップ（ｊ）、（ｋ）または（ｍ）ステップでの転写単位及び翻訳領域の同定結果を出力装置により出力する。
【請求項２８】
上記ステップ（ｌ）が、
上記塩基配列データを呼び出し、
ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って「リボソーム結合スコア」を算出し、該リボソーム結合スコアに対する閾値Ｖ３〔ここで、Ｖ３は４〜１２の整数である〕を保持し、閾値Ｖ３を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
該ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが複数ある場合は「ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分け「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の順の優先度に従い、該優先度が高い候補を選択し、
さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときはＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として該優先度が高い候補を選択し、
選択した候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書き込むことを特徴とする、請求項２７記載のプログラム。
【請求項２９】
上記ステップ（ｍ）が、
上記塩基配列データを呼び出し、
ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って「リボソーム結合スコア」を算出し、該リボソーム結合スコアに対する閾値Ｖ１を保持し、閾値Ｖ１を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
該翻訳開始コドンが複数ある場合はより高いスコアを与えるリボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンを、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
閾値Ｖ１を越える候補がないときは、該スコアがＶ１より小さい閾値Ｖ３を含む１個以上の閾値を段階的に設定し、該閾値を越える上記ｍＲＮＡ配列を段階的に検索して、リボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
選択した候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、同定結果をメモリに書きこむものである請求項２７又は２８記載のプログラム〔ここで、Ｖ１は請求項３のＶ３よりも大きい７〜１４の整数である〕。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）の原核生物の塩基配列情報が、種名が明らかでない原核生物のＤＮＡ断片の塩基配列情報であり、該塩基配列情報をもとに請求項１乃至２５のいずれか一項に記載の遺伝子構造同定方法を用いて翻訳領域を同定し、かつステップ（ｅ）においてコドン使用頻度の類似性により選択した原核生物を該ＤＮＡ断片が由来した微生物であると推定する処理をコンピュータに行わせることを特徴とするプログラム。
【請求項３１】
ステップ（ｅ）でメモリーに格納した原核生物の種名を、ステップ（ｇ）でメモリーから呼び出し、該原核生物の種名を出力装置により出力する処理をコンピュータに実行させるための請求項３０記載のプログラム。
【請求項３２】
請求項２６乃至３１のいずれか一項記載のプログラムを記録した、コンピュータで読み取り可能な記録媒体。
【請求項３３】
（ｉ）  塩基配列データを入力するための入力手段、（ｉｉ）  入力されたデータを用いて、請求項２６乃至２９のいずれかに記載のプログラムを実行する手段、および（ｉｉｉ）  （ｉｉ）  により得られた結果を出力するための出力装置とを備えた、遺伝子構造同定システム。
【請求項３４】
（ｉ）  あるＤＮＡ断片の塩基配列データを入力するための入力手段、（ｉｉ）  入力されたデータを用いて、請求項３０又は３１に記載のプログラムを実行する手段、および（ｉｉｉ）  （ｉｉ）  により得られた結果を出力するための出力装置とを備えた、該ＤＮＡ断片が由来した微生物の種名を推定するシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、原核生物の塩基配列（塩基配列とは、ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列をいう）をもとにした遺伝子構造同定方法及びＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法、その実行プログラム、そのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、さらにその記録媒体を利用したコンピュータに基づく遺伝子構造同定システム及びＤＮＡ断片が由来した微生物の推定システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
様々な微生物や微生物が生産する酵素が広い産業分野で利用されており、これら微生物の改良や新しい遺伝子や酵素の発見は重要な課題である。１９８０年代後半の自動蛍光シークエンサーの開発を契機に生物の塩基配列情報の解読が加速され、ゲノム研究は大きく発展している。１９９５年に初めて細菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）の全ゲノム配列が決定された後、現在では約１００種類の微生物の全ゲノム配列が決定されている。さらに現在ゲノム配列が決定中の微生物は約３５０種類あり、まもなく４５０種類を越える微生物のゲノム配列が明らかになる。このように微生物バイオテクノロジー分野はポストゲノム時代に突入した。
【０００３】
このように、微生物の遺伝子の配列情報が蓄積すると、有用遺伝子の探索や有用微生物の同定についても、コンピュータを用いて配列情報を解析する方法の利用が重要となる。また、自然界から採取したサンプル中の未知微生物の種類、ある食品サンプル中に存在する微生物の種類、あるいは培養困難な微生物の種類を同定することは重要な研究開発課題である。この場合、数ｋｂ程度の小さなＤＮＡ断片の配列を決定した後、そのＤＮＡ断片上の遺伝子構造を迅速かつ精度高く同定するとともに、微生物の種名を推定する技術の開発が求められている。従来、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下、ＰＣＲ法と略記する）により増幅したリボソームＲＮＡ遺伝子やＤＮＡジャイラーゼ（ｇｙｒａｓｅ）遺伝子のＤＮＡ断片の配列を決定し、既知の配列情報と比較することにより、微生物の種名の推定を行ってきた。しかしながら、この方法では、リボソームＲＮＡ遺伝子やＤＮＡジャイラーゼ（ｇｙｒａｓｅ）遺伝子以外の遺伝子の由来を調べることは不可能であり、新しい微生物の種名の推定方法の開発が望まれている。
【０００４】
ゲノム情報の解読の第１ステップは、決定された塩基配列情報から遺伝子構造を同定することである。遺伝子構造、特に翻訳領域（Ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＣＤＳ）（以下、遺伝子翻訳領域を単に翻訳領域という。）の位置を同定できれば、アミノ酸配列を予測できるので、遺伝子産物の機能予測を行うことが可能になる。またポリシストロンのような転写単位の構造を予測できれば、同一転写単位上にある遺伝子群の発現調節機構が予測できる。このように、塩基配列情報から遺伝子構造を予測する方法は、基本的かつ重要な技術であり、これまでにも様々な方法が開発されている。コンピュータを用いて塩基配列情報から遺伝子構造を予測した場合、「正しい」すなわち「真」の集団の総数をＮＴ、コンピュータによって予測した総数をＮＳ、およびコンピュータによって予測したものが「正しい」すなわち「真」のものと一致した数をＮＴＰとした場合に、ＮＴＰ／ＮＴを感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）といい、またＮＴＰ／ＮＳを特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）というが、感度と特異性の両方が１に近づくほど、プログラムの性能が優れていると判断される。
【０００５】
原核生物の翻訳領域の特徴をマルコフモデルなどの確率過程を利用して抽出し、この抽出した特徴を利用して翻訳領域を同定する手法、例えばＧｅｎＭａｒｋ〔非特許文献１〕、ＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍ〔非特許文献２、非特許文献３〕およびＧｌｉｍｍｅｒ〔非特許文献４、非特許文献５〕などのプログラムが開発されている。この中でＧｌｉｍｍｅｒが世界で最も広く使われているプログラムである。また相同性解析に基づいて翻訳領域を同定するプログラムＣＲＩＴＩＣＡ〔非特許文献６〕やリボソーム結合配列の存在とコドン使用頻度分析に基づいて翻訳領域を同定するＯＲＰＨＥＬＵＳ〔非特許文献７〕というプログラムも開発されている。またごく最近、翻訳開始コドンの同定精度を高めることにより翻訳領域を高精度に同定するプログラムＧｅｎＭａｒｋＳ〔非特許文献８〕も開発された。
【０００６】
これらの遺伝子構造同定方法は、いずれも多数の真の翻訳領域の配列特性を利用しているので、小さいＤＮＡ断片（例えば、１０，０００塩基対以下）について遺伝子構造を精度高く同定することは不可能であった。したがって、小さいＤＮＡ断片から遺伝子構造を同定するときは、蛋白質をコードする可能性がある翻訳の読取り枠（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ；以下、「ＯＲＦ」と略記する）を拾い出し、個々のＯＲＦについてアミノ酸配列に翻訳した後、実験データや既知の遺伝子のアミノ酸配列と比較することにより、真の遺伝子を予測する方法が用いられてきた。しかしながら、この方法は、煩雑な操作を要するとともに、機能未知遺伝子の構造を同定することは困難であった。
【０００７】
原核生物の塩基配列情報から遺伝子構造を同定する際のより一般的な問題点をより具体的に示すために、原核生物の遺伝子の構造について図１と図２を使って説明を加える（図１と図２を参照）。原核生物の遺伝子の基本構造は、図１に示すように、ｍＲＮＡの合成を開始するプロモーター、ｍＲＮＡとリボソームとの結合と翻訳開始に関与するリボソーム結合部位、開始コドン、翻訳終止コドン（以下、終止コドンと略記する）、およびｍＲＮＡの合成を終結するターミネーターから成る。なお、開始コドンとしては、ＡＵＧコドンが最適であり、次にＧＵＧコドンが使われる。ＵＵＧコドンもまれに使われる。ごくまれにＣＵＧコドンなども使われると報告されている。
【０００８】
以下、開始コドンや翻訳領域の同定はＤＮＡ配列をもとに行うことが多いので、本明細書では、特に断らない限り、開始コドン、終止コドンの配列およびリボソームとｍＲＮＡの結合に関わる配列はＲＮＡ配列でだけでなく、適宜ＤＮＡ配列としても表現することにする。リボソーム結合部位はシャイン・ダルガーノ配列（Ｓｈｉｎｅ  Ｄａｌｇａｒｎｏ配列；以下、ＳＤ配列と略記する）とも呼ばれ、一般に１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端と相補的な配列を有する。特に、頻度が高く出現するＳＤ配列はＡＧＧＡＧＧまたはＡＡＧＧＡＧＧ（以下、この配列を「コンセンサスＳＤ配列」と略記する）、またはこの「コンセンサスＳＤ配列」に類似した配列である。このような配列は遺伝子の様々な部位に出現するが、開始コドンの上流の領域にＳＤ配列が高頻度に出現することがわかっている。本明細書では、「開始コドンの上流の位置」を明示するために、コンセンサスＳＤ配列（ＡＧＧＡＧＧまたはＡＡＧＧＡＧＧ）の中のＡＧＧＡ（または位置的にＡＧＧＡと一致する配列）と開始コドンの間の距離（以下、ＳＤ−ＡＴＧ間の距離と略記する）を以下の説明の中に加えることにする。なお、このＳＤ−ＡＴＧ間の距離は遺伝子の翻訳開始効率に大きく影響を与えることが知られている〔Ｓｈｅｐａｒｄ，  Ｈ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  ＤＮＡ  Ｖｏｌ．２，  ｐ．１２５−１３１  （１９８２）、Ｉｔｏｈ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  ＤＮＡ  Ｖｏｌ．２，  ｐ．１５７−１６５  （１９８２）〕。
【０００９】
次に、図２に示すように、蛋白質をコードする可能性がある翻訳の読取り枠が多数出現するが、本明細書の中では、蛋白質をコードする可能性がある翻訳の読取り枠を「ＯＲＦ」と呼び、ＯＲＦの中で、蛋白質が実際に翻訳される翻訳領域を「ＣＤＳ（Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と呼ぶことにする。また個々の任意のＯＲＦ、ＣＤＳ、翻訳領域、転写単位に関しては、それぞれに数字または記号を付けて、ＯＲＦ−１、ＯＲＦ−Ａ、ＯＲＦ−Ｂ、ＣＤＳ−１、ＣＤＳ−Ａ、ＣＤＳ−Ｂ、翻訳領域Ａ、翻訳領域Ｂ、転写単位Ｐ、転写単位Ｑなどと標記することにする。本明細書の中では、ＯＲＦは多くの場合、最長の長さのＯＲＦを意味するものとする。本明細書においては、図２に示すように、上側のＤＮＡ鎖すなわち右方向に翻訳される遺伝子が並んでいるＤＮＡ鎖をプラス鎖と呼び、一方、下側のＤＮＡ鎖をマイナス鎖と呼ぶことにする。
【００１０】
多くの場合、図２に示すように、ＣＤＳ（真の蛋白質をコードしている領域）はＯＲＦと同一であるか、またはＯＲＦのうちの一部の領域である。また開始コドンの候補も多数存在し、真の開始コドンの同定は容易でない。また原核生物の遺伝子の場合、複数のＣＤＳが同一のｍＲＮＡ上に存在し、しかも個々のＣＤＳすなわちシストロンが接近し、連結している構造をとることがある。この転写単位の構造を「ポリシストロン性ｍＲＮＡ」というが、このポリシストロンの転写単位構造を情報科学的に予測することは困難であり、効率よく転写単位を予測し、その結果を出力できるＣＤＳ同定プログラムは開発されていない。また、ＣＤＳまたは転写単位が他のＣＤＳまたは転写単位と重複、あるいは他のＣＤＳまたは転写単位を含んでいる（本明細書では「内包する」または「内包関係にある」と表現する）場合は、各々のＣＤＳまたは転写単位の真偽を判定する必要もある。
【００１１】
以上のように、塩基配列情報が与えられた場合、「ＣＤＳの候補が多数存在する」、「開始コドンの候補が多数存在する」、および「２つ以上のＣＤＳの候補が重なり合う」というような理由により、正しいＣＤＳを同定することは困難であるという問題点があった。
また、これまで開発されたＣＤＳ同定プログラムの多くは、Ｇ残基とＣ残基の含量（以下、「ＧＣ含量」と略記する）が高い塩基配列からＣＤＳを予測する場合、ＣＤＳの同定精度が悪くなるという問題点があった。前述のＧｅｎＭａｒｋＳとＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍの２つのプログラムを組み合わせる方法でも、ＧＣ含量が高い（例えば６５％以上）微生物ゲノムから高精度にＣＤＳが同定できることが示されていない。
上述のように、従来の方法は、すでに同定された真の遺伝子に関する情報を利用して与えられた塩基配列情報から遺伝子構造を予測する、あるいは多数の正しい遺伝子を同定した後、それら遺伝子の配列を統計学的に分析することによって得られた配列特性をもとに遺伝子構造を予測している。そのために、小さいＤＮＡ断片に存在する遺伝子を高精度に予測することは極めて困難であるか、または不可能であった。
さらに、単離したＤＮＡ断片がどの微生物から由来したか明らかでない場合には、そのＤＮＡ断片が由来した微生物の種名を推定することは不可能であった。
【００１２】
【非特許文献１】
Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ  ＆  ＭｃＩｎｉｎｃｈ，  Ｊ．  ：  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  Ｃｈｅｍ．  第１７巻，  ｐ．１２３−１３３  （１９９３）
【非特許文献２】
Ｌｕｋａｓｈｉｎ，  Ａ．Ｖ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２６巻，  ｐ．１１０７  −  １１１５  （１９９８）
【非特許文献３】
Ｂｅｓｅｍｅｒ，  Ｊ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２７巻，  ｐ．３９１１  −  ３９２０  （１９９９）
【非特許文献４】
Ｓａｌｚｂｅｒｇ，  Ｓ．  ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２６巻，  ｐ．５４４−５４８  （１９９８）
【非特許文献５】
Ｄｅｌｃｈｅｒ，  Ａ．Ｌ．ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２７巻，  ｐ．４６３６−４６４１  （１９９９）
【非特許文献６】
Ｂａｄｇｅｒ，  Ｊ．  Ｈ．  ＆  Ｌｏｓｅｎ，  Ｇ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  第１６巻，  ｐ．５１２−５２４  （１９９９）
【非特許文献７】
Ｆｒｉｓｈｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２６巻，  ｐ．２９４１−２９４７  （１９９８）
【非特許文献８】
Ｂｅｓｅｍｅｒ，  Ｊ．，  Ｌｏｍｓａｄｚｅ，  Ａ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２９巻，  ｐ．２６０７−２６１８  （２００１）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ポリシストロンの転写単位の構造の予測を可能とすること、開始コドンの位置の同定精度を高めること、予備情報を不要とすること、およびＧＣ含量が高い塩基配列に対応することに主眼をおき、特に配列の長さは１０，０００塩基対以下の小さいＤＮＡ断片の塩基配列情報から遺伝子構造を高精度に同定する方法を開発することを課題としてなされた。さらに、本発明は、種名が明らかでない原核生物より単離したＤＮＡ断片の塩基配列情報から、そのＤＮＡ断片が由来した原核生物の種名を推定することを課題としてなされた。本発明の目的は、これらの課題を解決した原核生物の塩基配列をもとにした遺伝子構造同定方法及びＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法、その実行プログラム、そのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、さらにその記録媒体を利用したコンピュータに基づく遺伝子構造同定システム及びＤＮＡ断片が由来した微生物の推定システムを提供することである。
【００１４】
本発明でいう遺伝子構造同定方法とは、ＣＤＳ、翻訳開始コドンの位置、翻訳終止コドンの位置、および転写単位のうちの一つ以上を同定する方法をいう。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、あるＤＮＡ断片の配列情報をもとに同定したＣＤＳのコドン使用頻度を算出した後、複数の原核生物のコドン使用頻度の中から、このコドン使用頻度と最も類似しているコドン使用頻度を選択し、選択されたコドン使用頻度をもとに遺伝子構造を同定することにより本課題を解決できることを見い出した。また、複数の原核生物のコドン使用頻度の中から選択したコドン使用頻度が由来した微生物を、該ＤＮＡ断片が由来した微生物であると推定することにより、本課題を解決できることを見い出した。
ここで、ＣＤＳのコドン使用頻度は、「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」もしくは「相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法」のいずれかの方法、または「これら２つの方法を組み合わせた方法」を用いて行なうことが好ましい。
【００１６】
上述の遺伝子構造同定方法は、従来の方法では精度高くＣＤＳを同定できなかった、配列長が短いＤＮＡ断片からのＣＤＳを高精度で同定できることから、本方法を「小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法」と呼称する。また、該ＤＮＡ断片が由来した微生物を推定する方法を「ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法」と呼称する。
すなわち、本発明の「小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法」とは、下記（１）〜（６）で示される、あるＤＮＡ断片の配列情報をもとに同定したＣＤＳのコドン使用頻度を算出した後、複数の原核生物のコドン使用頻度の中から、このコドン使用頻度と最も類似しているコドン使用頻度を選択し、選択されたコドン使用頻度をもとに遺伝子構造を同定する方法」である。
【００１７】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（６）で示される、あるＤＮＡ断片の配列情報をもとに、同定したＣＤＳのコドン使用頻度を算出した後、複数の原核生物のコドン使用頻度の中から、このコドン使用頻度と最も類似しているコドン使用頻度を選択し、選択されたコドン使用頻度をもとに遺伝子構造を同定する方法である。
【００１８】
なお、「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」を用いてＣＤＳを同定する場合には、後述する「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」または「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」を用いることにより、ＣＤＳの同定精度を高めることができる。
【００１９】
本発明は下記の遺伝子構造同定方法を提供する。
（１）下記（ａ）〜（ｇ）の工程：
（ａ）すでに２個以上のＣＤＳが確定している複数種の原核生物に関して、該ＣＤＳのコドン使用頻度を算出する；
（ｂ）原核生物の塩基配列（塩基配列とはＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列をいう）情報から、翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを設定する；
（ｃ）工程（ｂ）で得られた個々のＯＲＦについてＣＤＳとしての真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定することにより、ＣＤＳを仮同定する；
（ｄ）工程（ｃ）または（ｆ）で真と判定された、１つないしはそれ以上の数のＣＤＳのコドン使用頻度を算出する；
（ｅ）類似性の尺度を用いて、工程（ａ）で算出した複数種の原核生物のＣＤＳのコドン使用頻度の中から、工程（ｄ）で得られた該コドン使用頻度に最も近いコドン使用頻度を示す原核生物を選択する；
（ｆ）工程（ｅ）で選択した原核生物のＣＤＳの塩基配列の特徴をもとに、該ＣＤＳの真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定し、この翻訳開始コドンの同定処理がＣ回目の処理であるときに工程（ｇ）に移り、Ｃ回目未満のときには工程（ｃ）に移る；
（ｇ）工程（ｂ）、（ｃ）および（ｆ）の結果から、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、並びにＣＤＳを確定し遺伝子構造を同定する；
工程を含む原核生物の遺伝子構造同定方法〔ただし、Ｃは１以上の整数とする〕。
【００２０】
前記工程（ｃ）は、転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法もしくは相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法のいずれかの方法、または転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法および相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法を組み合わせた方法を用いて、行なうことができる。
また、前記遺伝子構造同定方法（（１）項の遺伝子構造同定方法）は、下記の実施態様として実施することができる。
（２）  工程（ｃ）の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」が、下記（ｈ）〜（ｎ）の工程を含む遺伝子構造同定方法である（１）項の遺伝子構造同定方法。
（ｈ）原核生物の塩基配列情報から、翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを設定する。
（ｉ）工程（ｈ）で得られた任意の隣り合い、かつ同じ鎖にある２つのＯＲＦを下流からＯＲＦ−Ａ、ＯＲＦ−Ｂとしたとき、ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンが、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの上流にあるか、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内にあるとき、ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが一つの転写単位を形成する可能性があると判定する〔ここで、ＤＳは２０〜１００の整数〕。
（ｊ）工程（ｉ）においてＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが一つの転写単位を形成する可能性があると判定された場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドン第１文字目のＴ（チミジン）残基から下流に向かってＤＢ塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内の領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍」という）の中に翻訳開始コドンの候補があるときに、その候補をＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンと同定し〔ここで、ＤＢは１０〜２０の整数で、ＵＢは３〜１５の整数である〕、翻訳開始コドンの候補が複数ある場合、各候補とＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位を決めることによりＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを同定する。
（ｋ）工程（ｊ）でＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが同定できなかった場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの第１文字目のＴ残基から下流に向かってＲＤ塩基以内、および該Ｔ残基から上流に向かってＲＵ塩基以内の領域であり、かつ「該翻訳終止コドンの近傍」を除いた領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」という）にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるかどうか調べる〔ここで、ＲＤは３０〜１２０の整数で、ＲＵは２０〜１２０の整数である〕。
（ｌ）工程（ｋ）で該領域にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるとき、各候補の上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定する。
（ｍ）工程（ｉ）で一つの転写単位を形成する可能性があると判定されなかったＯＲＦ−Ａまたは工程（ｌ）で翻訳開始コドンを同定できなかったＯＲＦ−Ａについて、最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めて、５’末端から最多Ｎ個までの翻訳開始コドンの候補を検索した後、各候補についてその上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定する〔ここで、Ｎは５〜２０の整数である〕。
（ｎ）工程（ｊ）、（ｌ）または（ｍ）の同定結果から、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、ＣＤＳ並びに転写単位を確定し遺伝子構造を同定する。
【００２１】
（３）  工程（ｌ）が、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（ｉ）ＧとＣの対合は＋４を与える
（ｉｉ）ＡとＵの対合は＋２を与える
（ｉｉｉ）ＧとＵの対合は＋１を与える
（ｉｖ）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って数値化したものを「ｍＲＮＡとリボソームとの結合状態を表わすスコア（以下、リボソーム結合スコア、という）」とした場合に、該スコアが閾値Ｖ３を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定し、該翻訳開始コドンが複数ある場合は「ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分け「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の順の優先度に従い、該優先度が高い翻訳開始コドンを真の翻訳開始コドンと同定し、さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときはＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位を決めることにより、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを同定する工程であることを特徴とする、（１）項または（２）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｖ３は４〜１２の整数である〕。
【００２２】
（４）  工程（ｍ）が、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（ｉ）ＧとＣの対合は＋４を与える
（ｉｉ）ＡとＵの対合は＋２を与える
（ｉｉｉ）ＧとＵの対合は＋１を与える
（ｉｖ）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って数値化したものを「リボソーム結合スコア」とした場合に、該スコアが閾値Ｖ１を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定し、該翻訳開始コドンが複数ある場合はより高いスコアを与えるリボソーム結合配列に対応する翻訳コドンを真の翻訳コドンと同定し、閾値Ｖ１を越える候補がないときは、該スコアがＶ１より小さい閾値Ｖ３を含む１個以上の閾値を設定し、該閾値を越えたときにＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを段階的に同定する工程であることを特徴とする、（１）項〜（３）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｖ１は請求項４のＶ３よりも大きい７〜１４の整数、Ｎは５〜２０の整数である〕。
【００２３】
（５）  「リボソーム結合スコア」を算出する際に、翻訳開始コドンがＧＴＧのときには数値ＰＧを差し引き、翻訳開始コドンがＴＴＧのときには数値ＰＴを差し引いて該スコアを求めることを特徴とする（３）項または（４）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、ＰＧは１〜４の整数で、ＰＴは２〜６の整数である〕。
【００２４】
（６）  工程（ｃ）における「相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法」として、相同性解析プログラムＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを用いることを特徴とする、（１）項〜（５）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【００２５】
また本発明は、下記（７）〜（１２）で示される方法によりコドン使用頻度を算出し、このコドン使用頻度をもとに遺伝子構造を同定する方法である。
【００２６】
（７）  工程（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）で用いるＰ個の翻訳領域のコドン使用頻度として、該翻訳領域の塩基配列を各翻訳終止コドンを除いて連結した後、連結した塩基配列について下式（１）から算出された値を用いることを特徴とする、（１）項〜（６）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｐは１以上の整数である〕。
【数１５】
2004310688.tif 000003
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、Ｐ個の翻訳領域の塩基配列を連結した塩基配列について、２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
（８）  上式（１）において、トリプトファンとメチオニンを除く１８種類アミノ酸の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数を用いてコドン使用頻度を算出することを特徴とすることを特徴とする、（７）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｐは１以上の整数である〕。
（９）  工程（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）で用いるＰ個の翻訳領域のコドン使用頻度として、該翻訳領域の塩基配列を各翻訳終止コドンを除いて連結した後、連結した塩基配列について下式（２）から算出された値を用いることを特徴とする、（１）項〜（６）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｐは１以上の整数である〕。
【数１６】
2004310688.tif 000004
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、Ｐ個の翻訳領域の塩基配列を連結した塩基配列について、２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
（１０）  工程（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）で用いるＰ個の翻訳領域のコドン使用頻度として、該翻訳領域の塩基配列を各翻訳終止コドンを除いて連結した後、連結した塩基配列について下式（３）から算出された値を用いることを特徴とする、（１）項〜（６）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｐは１以上の整数である〕。
【数１７】
2004310688.tif 000005
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、Ｐ個の翻訳領域の塩基配列を連結した塩基配列について、２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
【００２７】
（１１）  工程（ｅ）で用いる類似性の尺度として、距離、内積および方向余弦からなる尺度より選ばれる尺度を用いることを特徴とする、（１）項〜（１０）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【００２８】
（１２）  類似性の尺度としてユークリッド距離を用いることを特徴とする（１１）項記載の遺伝子構造同定方法。
【００２９】
また本発明は、本発明は、下記（１３）〜（１５）で示される実施態様によりＣＤＳの真偽を判定し、原核生物のＣＤＳを同定する精度を高める遺伝子の構造を同定することもできる。以下、下記（１３）〜（１５）で示される方法は、遺伝子の影（シャドー）を判別する方法であることから、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」と呼称することにする。
【００３０】
（１３）  工程（ｆ）において、下記（ｒ）と（ｓ）の工程を含む方法によりＣＤＳの真偽を判定することを特徴とする、（１）項〜（１２）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法：
（ｒ）すでに同定された原核生物の複数（Ｔ）個のＣＤＳにおいて、「あるコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンの出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ種類選別する。
（ｓ）「出現頻度が高い方のｋ種類のコドンが該ＣＤＳとは別の未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低い方のｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較することにより該ＣＤＳ−Ａの真偽を判定する〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｋは５以上２０以下の整数である〕。
【００３１】
（１４）  「出現頻度が高いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、さらに該逆数の値が一定値を下回るときに該ＣＤＳ−Ａを「偽」と判定する方法を用いることを特徴とする、（１３）項記載の遺伝子構造同定方法。
【００３２】
（１５）  すでに同定された原核生物のＴ個のＣＤＳの塩基配列をもとにＴ個のＣＤＳとは別の未同定のＣＤＳ−Ａの「真偽」を下記（ｔ）〜（ｗ）の工程で判定することを特徴とする、（１４）項記載の遺伝子構造同定方法：
（ｔ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べる、
（ｕ）ｔ番目のＣＤＳにおけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数１８】
2004310688.tif 000006
としたとき、下式（４）によりｙｉを、そして下式（５）によりｙｉ＋３２を求める、
【数１９】
2004310688.tif 000007
または
【数２０】
2004310688.tif 000008
（ｖ）ｙｉおよびｙｉ＋３２の値が大きい順番に、工程（ｔ）で並べた６４種類のコドンを並べ替えた後、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選び、ＣＤＳ−ＡのＳｄＡの値を下式（６）により求める、
【数２１】
2004310688.tif 000009
ただし、
【数２２】
2004310688.tif 000010
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする、
および
（ｗ）工程（ｖ）で算出したＣＤＳ−ＡのＳｄＡの値が閾値Ｓ１以上であるときに該ＣＤＳを真のＣＤＳとし、該ＳｄＡの値が閾値Ｓ１未満であるときに偽のＣＤＳとする
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは３２以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｋは５〜２０の整数、Ｓ１は０．５〜２．０の値である。〕。
【００３３】
また本発明は、下記（１６）〜（２０）で示される「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」を用いてＣＤＳの真偽を判定することにより遺伝子構造を同定する方法である。
【００３４】
（１６）  工程（ｆ）において、「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」を用いてＣＤＳの真偽を判定することを特徴とする、（１）項〜（１５）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【００３５】
（１７）  「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」として、「マルコフモデルまたは隠れマルコフモデルに基づいたコーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」を用いることを特徴とする、（１６）項記載の遺伝子構造同定方法。
【００３６】
（１８）  「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」として、すでに同定された原核生物のＴ個のＣＤＳの塩基配列をもとに、Ｔ個のＣＤＳにおいて「出現頻度の高いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較することにより該ＣＤＳ−Ａの真偽を判定する方法を用いることを特徴とする、（１６）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
【００３７】
（１９）  「出現頻度の高いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、該逆数の値が一定値を下回るときに該ＣＤＳ−Ａを「偽」と判定する方法であることを特徴とする、（１８）項記載の遺伝子構造同定方法〔ここで、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
【００３８】
（２０）  下記（ｘ）〜（ｚ）の工程を含む（１９）項記載の遺伝子構造同定方法：
（ｘ）ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数２３】
2004310688.tif 000011
としたとき、下式（７）によりｙｉを求める、
【数２４】
2004310688.tif 000012
（ｙ）ｙｉが大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、翻訳領域ＡのＣｄＡの値を下式（８）により求める、
【数２５】
2004310688.tif 000013
ただし、
【数２６】
2004310688.tif 000014
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする、
および
（ｚ）工程（ｙ）で算出したＣＤＳ−ＡのＣｄＡの値が閾値ＣＶ以上であるときに該ＣＤＳを真のＣＤＳとし、該ＣｄＡの値が閾値ＣＶ未満であるときに偽のＣＤＳとする、
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０の整数、ＣＶは０．８〜２．０の値とする。〕。
【００３９】
また本発明は、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」と「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」を組み合わせて原核生物のＣＤＳを同定する遺伝子構造同定方法として実施することもでき、下記（２１）で示される。
【００４０】
（２１）  工程（ｆ）において、（１３）項〜（１５）項のいずれか一項記載のＣＤＳの真偽を判定する方法及び（１６）項〜（２０）項のいずれか一項記載の「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」を組み合わせて用いてＣＤＳの真偽を判定することを特徴とする遺伝子構造同定方法。
【００４１】
また本発明は、２つの転写単位またはＣＤＳが重複するときに、工程（ｃ）または（ｆ）において、下記（２２）〜（２４）で示される方法により転写単位またはＣＤＳの真偽を判定し、原核生物のＣＤＳを同定する精度を高める遺伝子の構造を同定する方法である。
【００４２】
（２２）  工程（ｃ）または（ｆ）において、（１）項〜（２１）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて同定された転写単位Ｐ、ＣＤＳ−Ａ、転写単位ＱおよびＣＤＳ−Ｂにおいて、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａが転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂと重複する場合、さらに下記（ａａ）〜（ａｃ）の工程を含む判定を行うことを特徴とする遺伝子構造同定方法：
（ａａ）転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａと同じ鎖上に存在する転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂが、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａの中に内包される場合に、転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂを「偽」と判定する、
（ａｂ）転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａと相補的な鎖上に存在する転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂが、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａの中に内包される場合に、転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂを「偽」と判定する、
（ａｃ）転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａが相補的な鎖上に存在する転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂと重複するときに、転写単位またはＣＤＳの長さが短い方を「偽」と判定する。
【００４３】
（２３）  工程（ｃ）または（ｆ）において、（１）項〜（２０）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて同定された原核生物の任意のＣＤＳ−Ａが相補鎖のＣＤＳ−Ｂと重複し、かつＣＤＳ−ＢがＣＤＳ−Ａによって内包される場合に、下記（ａｄ）と（ａｅ）の工程を含む方法によりＣＤＳ−ＡおよびＢの真偽を判定することを特徴とする遺伝子構造同定方法：
（ａｄ）ＣＤＳ−Ａの長さＬＡ（塩基対）とＣＤＳ−Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＡがＬＢのＴＰ％以下のときに、ＣＤＳ−Ｂを「偽」と判定する、および（ａｅ）ＬＡがＬＢのＴＰ％を越えるとき、（１４）項〜（２１）項いずれか一項記載の方法によりＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの真偽を判定する〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕。
【００４４】
（２４）  転写単位を構成する翻訳領域の翻訳終止コドンを除いた翻訳領域を連結して、一つの翻訳領域にした後に、（１３）項〜（２３）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を適用することを特徴とする遺伝子構造同定方法。
【００４５】
また本発明は下記（２５）項〜（２８）項で示される「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」によりＣＤＳの真偽を判定し、原核生物のＣＤＳを同定する精度を高める遺伝子の構造を同定する方法として実施することができる。以下、下記（２５）項〜（２８）項で示される方法は、「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」と呼称することにする。
【００４６】
（２５）  原核生物の塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越えるときであって、工程（ｃ）または（ｆ）において、該塩基配列内のＣＤＳ内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて算出された含量が一定値を下回るときに該ＣＤＳを「偽」と判定することを特徴とする、（１）項〜（２４）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【００４７】
（２６）  計算式として下式（９）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いることを特徴とする（２５）項記載の遺伝子構造同定方法：
【数２７】
2004310688.tif 000015
〔ここで、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒ  は１，２または３である）の塩基がｂ（ｂ  は１，２，３または４である）のとき、
【数２８】
2004310688.tif 000016
であり、このとき、ｂは、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目のＣＤＳのコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす。〕。
【００４８】
（２７）  工程（ｃ）または（ｆ）において、原核生物の塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越えるときであって、該塩基配列内のＣＤＳの５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて算出された含量が一定値を下回るときに該ＣＤＳの翻訳開始コドン「偽」と判定し、該偽翻訳開始コドンより下流に存在する翻訳開始コドンを再検索することを特徴とする、（１）項〜（２６）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法。
【００４９】
（２８）  計算式として下式（９）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いることを特徴とする、（２７）項記載の遺伝子構造同定方法：
【数２９】
2004310688.tif 000017
〔ここで、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒ  は１，２または３である）の塩基がｂ（ｂ  は１，２，３または４である）のとき、
【数３０】
2004310688.tif 000018
であり、このとき、ｂは、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目のＣＤＳのコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす。〕。
【００５０】
本発明の「ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法」とは、下記（２９）で示されるＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法である。
【００５１】
（２９）  工程（ｂ）の原核生物の塩基配列情報が、種名が明らかでない原核生物のＤＮＡ断片の塩基配列情報であり、該塩基配列情報をもとに（１）項〜（２８）項のいずれか一項に記載の遺伝子構造同定方法を用いてＣＤＳを同定し、工程（ｅ）においてコドン使用頻度の類似性により選択した原核生物を該ＤＮＡ断片が由来した微生物であると推定する方法。
さらに本発明は下記（３０）〜（６２）のプログラムを用いて実施することができる。
【００５２】
本発明の遺伝子構造同定方法（前記（１）の遺伝子構造同定方法）は、下記（３０）のプログラムを用いて実施することができる。
（３０）  （ａ）すでに２個以上のＣＤＳが確定している複数の原核生物に関して、該ＣＤＳの塩基配列データを入力装置により入力し、これらデータから算出したコドン使用頻度をメモリーに格納し、
（ｂ）入力装置により入力した原核生物の塩基配列情報から、該塩基配列中の翻訳終止コドンを検索し、得られたすべての翻訳終止コドンについて、最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを検索し、上記翻訳終止コドンと仮の翻訳開始コドンとの組み合わせをＣＤＳの候補とし、これらコドンの上記塩基配列上の位置をメモリーに格納し、
（ｃ）メモリーからＯＲＦ候補を呼び出し、「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」もしくは「相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法」のいずれかの方法、または「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法および相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法を組み合わせた方法」を用いて、ＣＤＳとしての真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定することにより、ＣＤＳを仮同定し、同定結果をメモリーに格納し、
（ｄ）ステップ（ｃ）または（ｆ）で真と判定された、１つないしはそれ以上の数のＣＤＳの塩基配列をメモリーから呼び出し、該塩基配列から算出した該ＣＤＳのコドン使用頻度をメモリーに書き込み、
（ｅ）ステップ（ａ）で得られた上記の複数の原核生物の翻訳領域のコドン使用頻度とステップ（ｄ）で得られた該コドン使用頻度をそれぞれメモリから呼び出し、類似性の尺度を用いて両方の使用頻度を比較することにより、後者のコドン使用頻度と最も類似しているコドン使用頻度を示す原核生物を選択した後、選択した原核生物の翻訳領域の位置と塩基配列の特徴を分析し、その分析結果と選択された原核生物の種名をメモリーに格納し、
（ｆ）ステップ（ｅ）の分析結果をメモリーから呼び出し、この分析結果をもとに該ＣＤＳの真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定し、同定結果をメモリーに格納した後、ステップ（ｆ）の処理がＣ回目の処理であるときにステップ（ｇ）に移り、Ｃ回目未満のときにはステップ（ｃ）に移り、
（ｇ）メモリーに格納したステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｆ）での翻訳開始コドン及び翻訳終止コドンの位置並びにＣＤＳの同定結果、ならびにステップ（ｅ）でメモリーに格納した原核生物の種名を出力装置により出力する処理をコンピューターに実行させるためのプログラム〔ただし、Ｃは１以上の整数とする〕。
【００５３】
前記（２）の遺伝子構造同定方法は、下記（３１）のプログラムを用いて実施することができる。
（３１）  ステップ（ｃ）の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」が、下記（ｈ）〜（ｎ）のステップを含む遺伝子構造同定方法である（３１）項記載のプログラム：
（ｈ）入力装置により入力された原核生物の塩基配列データから、該塩基配列中の翻訳終止コドンを検索し、得られた全ての翻訳終止コドンについて、最長のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を与える仮の翻訳開始コドンを検索し、上記翻訳終止コドンと仮の翻訳開始コドンの組み合わせをＯＲＦ候補とし、これらのコドンの上記塩基配列上の位置を、メモリに格納し、
（ｉ）メモリから、同じ鎖にある隣り合う２つのＯＲＦ候補を呼び出し、下流側ＯＲＦ（ＯＲＦ−Ａとする）の仮の翻訳開始コドンと、上流側ＯＲＦ（ＯＲＦ−Ｂとする）の翻訳終止コドンの位置と距離を調べ、
ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンが、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの上流にあるか、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内〔ここで、ＤＳは２０〜１００の整数〕にあるとき、この隣接する２つのＯＲＦが一つの転写単位を形成する可能性があると判定してステップ（ｊ）に移り、
ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンとＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの位置と距離が上記条件を満たさない場合は、この隣接する２つのＯＲＦの組（ＯＲＦ−Ａ，ＯＲＦ−Ｂ）は一つの転写単位を形成しないと判定してステップ（ｆ）に移り、（ｊ）ステップ（ｉ）で、２つのＯＲＦが一つの転写単位を形成する可能性があると判定したものについて、上記塩基配列データを呼び出して、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドン第１文字目のＴ（チミジン）残基から下流に向かってＤＢ塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内の領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍」という）の中から、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補を検索し〔ここで、ＤＢは１０〜２０の整数で、ＵＢは３〜１５の整数である〕、
翻訳開始コドン候補が１つの場合、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
翻訳開始コドン候補が複数ある場合、各候補とＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位の最も高いものを選択し、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｋ）ステップ（ｊ）でＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが同定できなかった場合、上記塩基配列データを呼び出して、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの第１文字目のＴ残基から下流に向かってＲＤ塩基以内、および該Ｔ残基から上流に向かってＲＵ塩基以内の領域〔ここで、ＲＤは３０〜１２０の整数で、ＲＵは２０〜１２０の整数である〕であり、かつ「該翻訳終止コドンの近傍」を除いた領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」という）にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるかどうか検索し、
該領域にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるときはステップ（ｌ）に移り、該候補がないときはステップ（ｍ）に移り、
（ｌ）ステップ（ｋ）で検索したＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補について、上記塩基配列データを呼び出して、各候補の上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域の存在の有無を調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｍ）ステップ（ｉ）で一つの転写単位を形成しないと判定されたＯＲＦ−Ａまたは処理（ｌ）で翻訳開始コドンを同定できなかったＯＲＦ−Ａについて、上記塩基配列データを呼び出して、最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めて、５’末端から最多Ｎ個〔ここで、Ｎは５〜２０の整数である〕までの翻訳開始コドンの候補を検索した後、各候補についてその上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを検索し、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと同定し、同定結果をメモリに書きこみ、
（ｎ）以上のステップを、メモリに格納された全てのＯＲＦについて処理済みとなるまで繰り返し、
メモリに格納されたステップ（ｊ）、（ｋ）または（ｍ）ステップでの転写単位及び翻訳領域の同定結果を出力装置により出力する。
【００５４】
前記（３）の遺伝子構造同定方法は、下記（３２）のプログラムを用いて実施することができる。
（３２）上記ステップ（ｌ）が、
上記塩基配列データを呼び出し、
ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（ｉ）ＧとＣの対合は＋４を与える
（ｉｉ）ＡとＵの対合は＋２を与える
（ｉｉｉ）ＧとＵの対合は＋１を与える
（ｉｖ）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って「リボソーム結合スコア」を算出し、該リボソーム結合スコアに対する閾値Ｖ３〔ここで、Ｖ３は４〜１２の整数である〕を保持し、閾値Ｖ３を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
該ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが複数ある場合は「ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分け「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の順の優先度に従い、該優先度が高い候補を選択し、
さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときはＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として該優先度が高い候補を選択し、
選択した候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書き込むことを特徴とする、（３１）項記載のプログラム。
【００５５】
前記（４）の遺伝子構造同定方法は、下記（３３）のプログラムを用いて実施することができる。
（３３）  上記ステップ（ｍ）が、
上記塩基配列データを呼び出し、
ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該候補の上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則；
（ｉ）ＧとＣの対合は＋４を与える
（ｉｉ）ＡとＵの対合は＋２を与える
（ｉｉｉ）ＧとＵの対合は＋１を与える
（ｉｖ）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って「リボソーム結合スコア」を算出し、該リボソーム結合スコアに対する閾値Ｖ１を保持し、閾値Ｖ１を越える上記ｍＲＮＡ配列をリボソーム結合配列と決定し、該リボソーム結合配列に対応する候翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
該翻訳開始コドンが複数ある場合はより高いスコアを与えるリボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンを、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
閾値Ｖ１を越える候補がないときは、該スコアがＶ１より小さい閾値Ｖ３を含む１個以上の閾値を段階的に設定し、該閾値を越える上記ｍＲＮＡ配列を段階的に検索して、リボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する翻訳開始コドンをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンとして選択し、
選択した候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと同定し、同定結果をメモリに書きこむものである（３２）項または（３３）項記載のプログラム〔ここで、Ｖ１は（４）項のＶ３よりも大きい７〜１４の整数である〕。
【００５６】
前記（５）の遺伝子構造同定方法は、下記（３４）のプログラムを用いて実施することができる。
（３４）  「リボソーム結合スコア」を算出する際に、翻訳開始コドンがＧＴＧのときには数値ＰＧを差し引き、翻訳開始コドンがＴＴＧのときには数値ＰＴを差し引いて該スコアを求めることを特徴とする（３２）項または（３３）項記載のプログラム〔ここで、ＰＧは１〜４の整数で、ＰＴは２〜６の整数である〕。
【００５７】
前記（６）の遺伝子構造同定方法は、下記（３５）のプログラムを用いて実施することができる。
（３５）  ステップ（ｃ）における「相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法」として、相同性解析プログラムＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを用いることを特徴とする、（３０）項〜（３４）項のいずれか記載のプログラム。
【００５８】
前記（７）の遺伝子構造同定方法は、下記（３６）のプログラムを用いて実施することができる。
（３６）  ステップ（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）において、コドン使用頻度として、Ｐ個の翻訳領域の塩基配列を各翻訳終止コドンを除いて連結した後、連結した塩基配列について下式（１）から算出された値を用いることを特徴とする、（３０）項〜（３５）項のいずれか一項記載のプログラム〔ここで、Ｐは１以上の整数である〕：
【数３１】
2004310688.tif 000019
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、Ｐ個の翻訳領域の塩基配列を連結した塩基配列について、２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕。
前記（８）の遺伝子構造同定方法は、下記（３７）のプログラムを用いて実施することができる。
（３７）  上式（１）において、トリプトファンとメチオニンを除く１８種類アミノ酸の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数を用いてコドン使用頻度を算出することを特徴とすることを特徴とする、（３６）項記載のプログラム〔ここで、Ｐは１以上の整数である〕。
前記（９）の遺伝子構造同定方法は、下記（３８）のプログラムを用いて実施することができる。
（３８）  ステップ（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）で用いるＰ個の翻訳領域のコドン使用頻度として、該翻訳領域の塩基配列を各翻訳終止コドンを除いて連結した後、連結した塩基配列について下式（２）から算出された値を用いることを特徴とする、（３０）項〜（３５）項のいずれか一項記載のプログラム〔ここで、Ｐは１以上の整数である〕。
【数３２】
2004310688.tif 000020
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、Ｐ個の翻訳領域の塩基配列を連結した塩基配列について、２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
前記（１０）の遺伝子構造同定方法は、下記（３９）のプログラムを用いて実施することができる。
（３９）  ステップ（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）で用いるＰ個の翻訳領域のコドン使用頻度として、該翻訳領域の塩基配列を各翻訳終止コドンを除いて連結した後、連結した塩基配列について下式（３）から算出された値を用いることを特徴とする、（３０）項〜（３５）項のいずれか一項記載のプログラム〔ここで、Ｐは１以上の整数である〕。
【数３３】
2004310688.tif 000021
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、Ｐ個の翻訳領域の塩基配列を連結した塩基配列について、２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
【００５９】
前記（１１）の遺伝子構造同定方法は、下記（４０）のプログラムを用いて実施することができる。
（４０）  ステップ（ｅ）で用いる類似性の尺度として、距離、内積および方向余弦からなる尺度より選ばれる尺度を用いることを特徴とする、（３０）項〜（３９）項のいずれか一項記載のプログラム。
【００６０】
前記（１２）の遺伝子構造同定方法は、下記（４１）のプログラムを用いて実施することができる。
（４１）  類似性の尺度としてユークリッド距離を用いることを特徴とする（４０）項記載のプログラム。
【００６１】
前記（１３）の遺伝子構造同定方法は、下記（４２）のプログラムを用いて実施することができる。
（４２）  ステップ（ｆ）において、原核生物のＣＤＳの塩基配列の特徴にもとにＣＤＳの真偽を判定する方法として、下記（ｒ）と（ｓ）のステップを含む方法を用いてＣＤＳの真偽を判定し、その判定結果を出力装置に表示する処理をコンピュータに行わせるためのプログラム：
（ｒ）入力手段により入力されたすでに同定された原核生物の複数（Ｔ）個のＣＤＳの中で、使用されているコドンの種類とその数を調べ、この中で「あるコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンの出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ種類選別して、メモリに格納し；（ｓ）入力手段により入力されたＣＤＳと推定される翻訳領域Ａのデータから、翻訳領域Ａでの上記選択されたコドンの出現頻度を計測し、
上記「出現頻度が高い方のｋ種類のコドンが該ＣＤＳとは別の未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低い方のｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較することにより該ＣＤＳ−Ａの真偽を判定する〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｋは５以上２０以下の整数である〕。
【００６２】
前記（１４）の遺伝子構造同定方法は、下記（４３）のプログラムを用いて実施することができる。
（４３）  ステップ（ｓ）が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用いて「出現頻度の高いｋ種類のコドンがＣＤＳと推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンが該ＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較し、さらに該逆数の値が一定値を下回るときに該ＣＤＳ−Ａを「偽」と判定する処理を行うものである、（４２）項記載のプログラム。
【００６３】
前記（１５）の遺伝子構造同定方法は、下記（４４）のプログラムを用いて実施することができる。
（４４）  （ｔ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べたコドンテーブルを作成し、メモリーに格納し、
（ｕ）すでに同定された原核生物のＴ個のＣＤＳの塩基配列を入力し、ｔ番目のＣＤＳにおけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数３４】
2004310688.tif 000022
としたとき、下式（４）によりｙｉを、そして下式（５）によりｙｉ＋３２を求める、
【数３５】
2004310688.tif 000023
または
【数３６】
2004310688.tif 000024
（ｖ）メモリーから、ステップ（ｔ）で得られたコドンテーブルを呼び出し、テーブル中の各コドンのｙｉおよびｙｉ＋３２の値が大きい順番に、テーブル中のコドン配列を並べ替えた後、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選び、ＣＤＳ−ＡのＳｄＡの値を下式（６）により求める、
【数３７】
2004310688.tif 000025
〔ここで、
【数３８】
2004310688.tif 000026
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする〕：
および
（ｗ）上記処理により求めた、ＣＤＳ−ＡのＳｄＡの値が閾値Ｓ１以上であるときに該ＣＤＳを真のＣＤＳとし、該ＳｄＡの値が閾値Ｓ１未満であるときに偽のＣＤＳとする、
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは３２以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｋは５〜２０の整数、Ｓ１は０．４〜１．８の値である。〕
をコンピューターに行わせるための、（４３）項記載のプログラム。
【００６４】
前記（１６）の遺伝子構造同定方法は、下記（４５）のプログラムを用いて実施することができる。
（４５）  ステップ（ｆ）において、「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」を用いてＣＤＳの真偽を判定する処理を行わせることを特徴とする、（３０）項〜（４４）項のいずれか一項記載のプログラム。
【００６５】
前記（１７）の遺伝子構造同定方法は、下記（４６）のプログラムを用いて実施することができる。
（４６）  「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」として、「マルコフモデル及び隠れマルコフモデルに基づいたコーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」を用いることを特徴とする、（４５）項記載のプログラム。
【００６６】
前記（１８）の遺伝子構造同定方法は、下記（４７）のプログラムを用いて実施することができる。
（４７）  「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」として、すでに同定された原核生物のＴ個のＣＤＳの塩基配列をもとに、Ｔ個のＣＤＳにおいて「出現頻度の高いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較することにより該ＣＤＳ−Ａの真偽を判定する方法を用いることを特徴とする、（４５）項記載のプログラム。〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
【００６７】
前記（１９）の遺伝子構造同定方法は、下記（４８）のプログラムを用いて実施することができる。
（４８）  「出現頻度の高いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、該逆数の値が一定値を下回るときに該ＣＤＳ−Ａを「偽」と判定する方法であることを特徴とする、（４５）項記載のプログラム〔ここで、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
【００６８】
前記（２０）の遺伝子構造同定方法は、下記（４９）のプログラムを用いて実施することができる。
（４９）  下記（ｚ）〜ａｂ）のステップを含む（４８）項のプログラム：
（ｚ）ｔ番目のＣＤＳにおけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数３９】
2004310688.tif 000027
としたとき、下式（７）によりｙｉを求め、メモリーに格納する；
【数４０】
2004310688.tif 000028
（ａａ）メモリーからｙｉを呼び出し、ｙｉが大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、ＣＤＳ−ＡのＣｄＡの値を下式（８）により求め、メモリーに格納する；
【数４１】
2004310688.tif 000029
ただし、
【数４２】
2004310688.tif 000030
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする。
および
（ａｂ）メモリーよりＣｄＡを呼び出し、ＣｄＡの値が閾値ＣＶ以上であるときに該ＣＤＳを真のＣＤＳとし、該ＣｄＡの値が閾値ＣＶ未満であるときに偽のＣＤＳと判定し、判定結果を出力装置により出力する
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０の整数、ＣＶは０．８〜２．０の値とする。〕。
【００６９】
前記（２１）の遺伝子構造同定方法は、下記（５０）のプログラムを用いて実施することができる。
（５０）  ステップ（ｆ）において原核生物のＣＤＳの塩基配列の特徴にもとにＣＤＳの真偽を判定する方法として、（４２）項〜（４４）項のいずれか一項記載のＣＤＳの真偽を判定する方法及び（４５）項〜（４９）項いずれか一項記載の「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法」を組み合わせて用いてＣＤＳの真偽を判定し、判定結果を出力装置により出力する処理をコンピュータに行わせるためのプログラム。
【００７０】
前記（２２）の遺伝子構造同定方法は、下記（５１）のプログラムを用いて実施することができる。
（５１）  ステップ（ｃ）または（ｆ）において、（３０）項〜（５０）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて同定された転写単位Ｐ、ＣＤＳ−Ａ、転写単位ＱおよびＣＤＳ−Ｂにおいて、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａが転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂと重複する場合、さらに下記（ｏ）〜（ｑ）のステップを含む判定を行い、判定結果を出力装置により出力する処理をコンピュータに行わせるためのプログラム：
（ｏ）転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａと同じ鎖上に存在する転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂが、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａの中に内包される場合に、転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂを「偽」と判定する；
（ｐ）転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａと相補的な鎖上に存在する転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂが、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａの中に内包される場合に、転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂを「偽」と判定する；
（ｑ）転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａが相補的な鎖上に存在する転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂと重複するときに、転写単位またはＣＤＳの長さが短い方を「偽」と判定する。
【００７１】
前記（２３）の遺伝子構造同定方法は、下記（５２）のプログラムを用いて実施することができる。
（５２）  ステップ（ｃ）または（ｆ）において、（３０）項〜（５０）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて同定された原核生物の任意のＣＤＳ−Ａが相補鎖のＣＤＳ−Ｂと重複し、かつＣＤＳ−ＢがＣＤＳ−Ａによって内包される場合に、下記（ｘ）と（ｙ）の工程を含む方法によりＣＤＳ−ＡおよびＣＤＳ−Ｂの真偽を判定し、判定結果を出力装置により出力する処理をコンピュータに行わせるためのプログラム：
（ｘ）ＣＤＳ−Ａの長さＬＡ（塩基対）とＣＤＳ−Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＡがＬＢのＴＰ％以下のときに、ＣＤＳ−Ｂを「偽」と判定する、および
（ｙ）ＬＡがＬＢのＴＰ％を越えるとき、（４２）項〜（５０）項いずれか一項記載の方法によりＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−の真偽を判定する〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕。
【００７２】
前記（２４）の遺伝子構造同定方法は、下記（５３）のプログラムを用いて実施することができる。
（５３）  転写単位を構成する翻訳領域の翻訳終止コドンを除いた翻訳領域を連結して、一つの翻訳領域にした後に、（１３）項〜（２３）項のいずれか一項記載の遺伝子構造同定方法を用いて翻訳領域の真偽を判定する処理を行わせることを特徴とするプログラム。
【００７３】
前記（２５）の遺伝子構造同定方法は、下記（５４）のプログラムを用いて実施することができる。
（５４）  原核生物の塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越えるときであって、ステップ（ｃ）または（ｆ）において、該塩基配列内のＣＤＳ内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて算出された含量が一定値を下回るときに該ＣＤＳを「偽」と判定する処理を行わせることを特徴とする、（３０）項〜（５３）項いずれか一項記載のプログラム。
【００７４】
前記（２６）の遺伝子構造同定方法は、下記（５５）のプログラムを用いて実施することができる。
（５５）  計算式として下式（９）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いることを特徴とする（５４）項記載のプログラム。
【数４３】
2004310688.tif 000031
〔ここで、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒ  は１，２または３である）の塩基がｂ（ｂ  は１，２，３または４である）のとき、
【数４４】
2004310688.tif 000032
であり、このとき、ｂは、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目のＣＤＳのコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす。〕
【００７５】
前記（２７）の遺伝子構造同定方法は、下記（５６）のプログラムを用いて実施することができる。
（５６）  ステップ（ｃ）または（ｆ）において、原核生物の塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越えるときであって、該ＣＤＳ内のＣＤＳの５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて算出された含量が一定値を下回るときに該ＣＤＳの翻訳開始コドン「偽」と判定し、該偽翻訳開始コドンより下流に存在する翻訳開始コドンを再検索する処理をコンピュータに行わせることを特徴とする、（３０）項〜（５５）項いずれか一項記載のプログラム。
【００７６】
前記（２８）の遺伝子構造同定方法は、下記（５７）のプログラムを用いて実施することができる。
（５７）  計算式として下式（９）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いることを特徴とする、（５６）項記載のプログラム。
【数４５】
2004310688.tif 000033
〔ここで、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒ  は１，２または３である）の塩基がｂ（ｂ  は１，２，３または４である）のとき、
【数４６】
2004310688.tif 000034
であり、このとき、ｂは、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目のＣＤＳのコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす。〕
【００７７】
前記（２９）の遺伝子構造同定方法は、下記（５８）のプログラムを用いて実施することができる。
（５８）  ステップ（ｂ）の原核生物の塩基配列情報が、種名が明らかでない原核生物のＤＮＡ断片の塩基配列情報であり、該塩基配列情報をもとに（１）項〜（２７）項のいずれか一項に記載の遺伝子構造同定方法を用いてＣＤＳを同定し、かつステップ（ｅ）においてコドン使用頻度の類似性により選択した原核生物を該ＤＮＡ断片が由来した微生物であると推定する処理をコンピュータに行わせることを特徴とするプログラム。
【００７８】
前記（３０）の遺伝子構造同定方法は、下記（５９）のプログラムを用いて実施することができる。
（５９）  ステップ（ｅ）でメモリーに格納した原核生物の種名を、ステップ（ｇ）でメモリーから呼び出し、該原核生物の種名を出力装置により出力する処理をコンピューターに実行させるための（５６）項記載のプログラム。
【００７９】
さらに、本発明は、下記（６０）〜（６２）の実施態様も含む。
（６０）  （３０）項〜（５９）項のいずれか一項記載のプログラムを記録した、コンピュータで読み取り可能な記録媒体。
【００８０】
（６１）  （ｉ）  塩基配列データを入力するための入力手段、（ｉｉ）  入力されたデータを用いて、（３０）項〜（５７）項のいずれかに記載のプログラムを実行する手段、および（ｉｉｉ）  （ｉｉ）  により得られた結果を出力するための出力装置とを備えた、遺伝子構造同定システム。
【００８１】
（６２）  （ｉ）  あるＤＮＡ断片の塩基配列データを入力するための入力手段、（ｉｉ）  入力されたデータを用いて、（５８）項または（５９）項に記載のプログラムを実行する手段、および（ｉｉｉ）  （ｉｉ）  により得られた結果を出力するための出力装置とを備えた、該ＤＮＡ断片が由来した微生物の種名を推定するシステム。
【００８２】
【発明の実施の形態】
本発明の「小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法」および「ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法」の実施は、コンピューターを用いた方法に限られるものではないが、大量の塩基配列データを高速で処理することが可能であるという点から、コンピューターを用いて実施することが好ましい。
図１３に本発明の「小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法」および「ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法」を好ましく実施するためのハードウェア構成図を示したものであり、基本的に、入力装置１、記憶装置２、中央演算処理装置（ＣＰＵ）３、出力装置４からなり、バス線５に接続されている。
ＣＰＵ３は、プログラムを実行して、配列の検索、各種指標の計算、比較、記憶又は出力すべきデータの指示などを行なうものである。
入力装置１は、解析すべき塩基配列データを入力したり、各種の処理を実行するための指示コマンドなどを入力するための装置である。
記憶装置２とは、入力情報及び計算結果を記憶するメモリ、およびそれにアクセスしうるメモリアクセス手段をいい、主に、外部記憶手段６、データ記憶手段７、プログラムファイル８などからなる。
外部記憶手段６は、解析すべき塩基配列のデータが格納されたフレキシブルディスク、光磁気ディスク、ハードディスクおよびメモリーなどの記録媒体である。
データ記憶手段７（以下、単にメモリともいう）には、本発明の「小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法」および「ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法」を実施するための各種処理で得られるデータを記憶するためのものである。そして、本発明の「小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法」および「ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法」により、同定され、あるいは真偽が判定された、ＯＲＦ、ＣＤＳ、転写単位、コドン使用頻度、微生物の種名のデータも記憶される。
プログラムファイル８には、本発明の方法を実行するためのプログラム、後述するランク関数表などが記憶されている。
出力装置４は、本発明の「小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法」および「ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法」により、同定され、あるいは真偽が判定された、ＯＲＦ、ＣＤＳ、転写単位、微生物の種名の同定または判定結果を出力するものであり、ディスプレイ、プリンタ、記録媒体などが用いられる。すなわち、翻訳開始ドンおよび終止コドンの位置、並びに個々の転写単位に含まれるＣＤＳに関する情報は、ディスプレイへの表示、プリンタへの出力による印刷、または記録媒体への記録により、出力することができる。
さらに、本発明の実施のためのハードウェアにおいては、通信ネットワーク９に接続されて、該ネットワークを介して外部の塩基配列データベースを電送し、外部記憶手段に格納することができるようになっていることが好ましい。
【００８３】
［小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法およびＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法］
本発明の「小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法」及び「ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法」は、原核生物由来のＤＮＡ断片の塩基配列情報から仮同定したＣＤＳのコドン使用頻度と他の原核生物のＣＤＳのコドン使用頻度と比較することにより、最も近いコドン使用頻度を示す原核生物を選択した後、選択した原核生物のＣＤＳの塩基配列の特徴をもとに仮同定したＣＤＳの真偽を判定することにより、原核生物の遺伝子構造と該原核生物の種名を高精度に同定する方法である。この遺伝子構造同定方法及び原核生物の推定方法において、原核生物由来のＤＮＡ断片の塩基配列情報からＣＤＳを仮同定するには、遺伝子を同定する方法であれば、いずれの同定方法を用いることができるが、以下に述べる「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」または「相同性解析を利用した遺伝子構造同定法」を用いることが好ましい。
なお、本発明の遺伝子構造同定方法は、１０，０００塩基対以下の小ＤＮＡ断片に限定されるものではなく、１０，０００塩基対を超えるＤＮＡ断片にも適用することができる。
【００８４】
本発明において、「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」とは、開始コドンの位置とポリシストロンの転写単位の構造を高精度に予測する方法を用いる高精度な原核生物の遺伝子構造同定方法であり、これによりポリシストロンの転写単位の構造も同定できる。この遺伝子構造同定方法においては、開始コドンの位置の同定、ＣＤＳの同定およびポリシストロンの転写単位の構造の同定は互いに密接に関連している。すなわち、ある翻訳領域ＣＤＳ−Ａの開始コドンの位置の同定に関しては、ＣＤＳ−Ａが他の翻訳領域ＣＤＳ−Ｂとポリシストロンの転写単位を形成するかどうか調べて、該転写単位を形成する可能性のあるときには、ＣＤＳ−Ｂの終止コドンと開始コドンの候補との位置関係を調べて、開始コドンの真偽を判定している。さらに、ｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のリボソーム結合配列との対合状態を数値化することにより、開始コドンの位置を同定するとともに、ＣＤＳの真偽を判定している。
【００８５】
本発明において「相同性解析を利用した遺伝子構造同定法」とは、相同性解析を用いて遺伝子構造同定法であれば、いずれの方法も用いることができるが、相同性解析プログラムＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを用いることが好ましい。相同性解析プログラムＢＬＡＳＴは、米国の生命情報の管理機関であるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＦＴＰサイト（ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／ｂｌａｓｔｚ．ｅｘｅ）からダウンロードすることにより得ることができる。相同性解析プログラムＦＡＳＴＡは、バージニア大学のＦＴＰサイト（ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ）からダウンロードすることにより得ることができる。
【００８６】
図１３に示した構成の装置を用いて、本発明の実施態様における遺伝子構造同定法および生物の推定方法を実施する場合の全体処理フロー図を図１４に示す。
【００８７】
図１４において、Ｓ１では、多数（２個以上）のＣＤＳがすでに同定されているＭ種類（Ｍは２以上の整数で、１０以上が好ましい）の原核生物のゲノム上のＣＤＳの塩基情報が入力装置により入力される。
本発明の方法において、塩基配列データは、キーボードから直接入力する、インターネットなどを介して電送されるデータを読み込む、あるいはフレキシブルディスク、光磁気ディスク、ハードディスクおよびメモリーなどの記録媒体（外部記憶ファイル）上に記録されたデータを読み込むことにより、コンピュータに入力することができる。
Ｓ２において、ＣＰＵは、Ｓ１で入力した個々の生物の塩基配列をもとに、個々の生物のコドン使用頻度を算出し、メモリーに格納する。
これとは別に、Ｓ３では、入力装置によりある原核生物から由来したＤＮＡ断片の塩基配列データを入力される。
Ｓ４において、ＣＰＵは、Ｓ３で入力した塩基配列データから、終止コドンを検索し、該終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを検索し、終止コドンと仮の開始コドンの組をＯＲＦ候補とする。
Ｓ５では、ＯＲＦの仮同定を行なう。このとき好ましくは、「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」もしくは「相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法」のいずれかの方法、または「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法および相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法を組み合わせた方法」を用いる。ＯＲＦ候補のＣＤＳとしての真偽を判定することにより、ＣＤＳを仮同定し、該ＣＤＳの配列データをメモリに格納する。
Ｓ６では、ＣＰＵは、メモリーから、該配列データを呼び出し、コドン使用頻度（ここで、このコドン使用頻度Ａと名付ける）を算出し、メモリーに格納する。
Ｓ７では、ＣＰＵは、メモリーからコドン使用頻度ＡとＳ１で得られたＭ種類の原核生物のコドン使用頻度を呼び出す。コドン使用頻度Ａと個々のＭ種類のコドン使用頻度を比較することにより、Ｍ種類のコドン使用頻度の中からコドン使用頻度Ａに最も類似しているコドン使用頻度を選び出し、該コドン使用頻度が由来した原核生物の名前と該コドン使用頻度をメモリーに格納する。
Ｓ８では、Ｓ６でメモリーに格納したコドン使用頻度を呼び出し、このコドン使用頻度をもとに、好ましくは「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」もしくは「相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法」のいずれかの方法、または「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法および相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法を組み合わせた方法」を用いて、転写単位、ＣＤＳ、翻訳開始コドンを同定し、メモリーに格納する。
Ｓ９では、メモリに格納した、同定ずみの転写単位、ＣＤＳ、翻訳開始コドン、原核生物の名前のデータを出力装置により出力する。
【００８８】
出力の際には、開始コドンの位置は、プラス鎖上の開始コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置、およびマイナス鎖上の開始コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置または最後の位置で表わすことができる。終止コドンの位置は、プラス鎖上の終止コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置または最後の位置、およびマイナス鎖上の終止コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置で表わすことができる。
【００８９】
上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」は開始コドンの位置とポリシストロンの転写単位の構造を高精度に予測する方法を用いる高精度な原核生物の遺伝子構造同定方法であり、これによりポリシストロンの転写単位の構造も同定できる。この遺伝子構造同定方法においては、開始コドンの位置の同定、ＣＤＳの同定およびポリシストロンの転写単位の構造の同定は互いに密接に関連している。すなわち、ある翻訳領域ＣＤＳ−Ａの開始コドンの位置の同定に関しては、ＣＤＳ−Ａが他の翻訳領域ＣＤＳ−Ｂとポリシストロンの転写単位を形成するかどうか調べて、該転写単位を形成する可能性のあるときには、ＣＤＳ−Ｂの終止コドンと開始コドンの候補との位置関係を調べて、開始コドンの真偽を判定している。さらに、ｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のリボソーム結合配列との対合状態を数値化することにより、開始コドンの位置を同定するとともに、ＣＤＳの真偽を判定している。
【００９０】
本発明で取り扱うことができる塩基配列の情報は、原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列の情報である。塩基配列としては、１本鎖と２本鎖いずれも扱うことができるが、２本鎖の場合には、どちらか一方の鎖の塩基配列の情報を取り扱う。２本鎖のプラス鎖の塩基配列情報を最初に扱った後、マイナス鎖の塩基配列情報を扱ってもよい。ＲＮＡの塩基配列を扱う場合には、Ｕ残基をＴ残基に置換して用いることが好ましい。１００  塩基対程度の塩基配列だけでなく、１００万塩基対以上のゲノムＤＮＡの塩基配列に関しても、ＣＤＳを予測することができる。
【００９１】
原核生物の塩基配列としては、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿０００８５４）、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣＢ１５のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００２６９６）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３４５０）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ  Ｃｌｉｐ１１２６２のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３２１２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００２５１６）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿０００９１１）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＢ４Ｔのゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００３８６９）などが挙げられる。塩基配列は、相同性検索プログラムや  ｔＲＮＡ予測プログラムなどを用いて前もってＲＮＡ遺伝子領域を予測し、予測された領域の塩基をｘなどで置換して、ＣＤＳの同定から除外することができる。
【００９２】
図１４に示す遺伝子同定方法について、さらに、図３のフローチャートを用いて詳述する。
図３の工程（ａ）は、（ａ）すでに２個以上の翻訳領域が確定している複数の原核生物に関して、該翻訳領域の塩基配列データを入力装置により入力し、これらデータから算出したコドン使用頻度をメモリーに格納する工程であり、図１４のＳ１とＳ２に対応するものである。ここで、多数の翻訳領域とは、２個以上の翻訳領域、好ましくは１０〜１００００個程度の翻訳領域をさし、複数の原核生物とは、２種以上、好ましくは１０種以上の原核生物をさす。
工程（ａ）では、複数種の原核生物について、すでに確定しているＣＤＳを２個以上選び、それらの塩基配列からコドン使用頻度を算出する。この場合、個々の翻訳領域についてコドン使用頻度を算出し、それらコドン使用頻度の平均値を求めてもよい。好ましくは、複数個の翻訳領域の塩基配列を各翻訳終止コドンを除いて連結した後、連結した塩基配列をもとにコドン使用頻度を算出することができる。コドン使用頻度としては、アミノ酸をコードする複数種の３文字の塩基配列の頻度を分母として、それら３文字の塩基配列の中から任意の塩基配列の頻度を分子として算出される値であるならば、いかなる値も用いることができるが、以下に示す式（１）、（２）または（３）を用いて求められるコドン使用頻度を用いることが好ましい。または、これらの値の逆数など、これらの式を変形した式から求められる値を用いることもできる。
【数４７】
2004310688.tif 000035
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、２０種類のアミノ酸の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
【数４８】
2004310688.tif 000036
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、２０種類のアミノ酸の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
【数４９】
2004310688.tif 000037
〔ここで、ｆｑ（ｓ） は、２０種類のアミノ酸の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
【００９３】
上記の３つの式（１）、（２）、（３）においては、２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、アラニン、グリシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリン）に対するコドンについて同義コドンの出現度数をもとにコドン使用頻度を求めたが、２０種類のアミノ酸に限定される必要はなく、５種類から２０種類のアミノ酸であれば、いずれも用いることができる。より好ましくは、２０種類のアミノ酸から、トリプトファンとメチオニンを除く１８種類のアミノ酸を用いて、上式（１）からコドン使用頻度を求めることができる。
【００９４】
上式（１）、（２）、（３）に関して、２０種類のアミノ酸に対するＭ（ｓ）  の数は、通常、アスパラギン酸の場合は２、グルタミン酸の場合は２、ヒスチジンの場合は２、リジンの場合は２、アルギニンの場合は６、アスパラギンの場合は２、グルタミンの場合は２、システインの場合は２、セリンの場合は６、スレオニンの場合は４、アラニンの場合は４、グリシンの場合は４、プロリンの場合は４、メチオニンの場合は１、チロシンの場合は２、トリプトファンの場合は１、フェニルアラニンの場合は２、イソロイシンの場合は３、ロイシンの場合は６およびバリンの場合は４である。
【００９５】
図３の工程（ｂ）は、（ｂ）入力装置により入力した原核生物の塩基配列情報から、該塩基配列中の翻訳終止コドンを検索し、得られたすべての翻訳終止コドンについて、最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを検索し、上記翻訳終止コドンと仮の翻訳開始コドンとの組み合わせを翻訳領域の候補とし、これらコドンの上記塩基配列上の位置をメモリーに格納する工程であり、図１４のＳ３とＳ４に対応するものである。
工程（ｂ）では、原核生物の塩基配列情報から、翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを設定する。
最長のＯＲＦとは、５’末端から数えてｉ番目の終止コドンと（ｉ＋１）番目の終止コドンに着目したとき、ｉ番目の終止コドンから３’方向に向かって最初に出現するＡＴＧコドン、ＧＴＧコドン、またはＴＴＧコドン（これを仮の開始コドンとする）から（ｉ＋１）番目の終止コドンに至るまでの領域である〔ここで、ｉは１以上の整数〕。終止コドンとしては、ＴＡＡコドン、ＴＡＧコドン、ＴＧＡコドンを用いることができる。
ついで、終止コドンと仮の翻訳開始コドンの組（仮のＯＲＦ）を、終止コドンの位置に基づき５’末端から３’末端の方向にしたがって配列し、終止コドン、仮の開始コドンの上記塩基配上の位置とともに、メモリに格納する。
なお、本発明において、開始コドンとしては特にことわりのない限りＡＴＧ、ＧＴＧ、およびＴＴＧを用いる。
【００９６】
図３の工程（ｃ）は、（ｃ）メモリーからＯＲＦ候補を呼び出し、翻訳領域としての真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定することにより、翻訳領域を仮同定し、同定結果をメモリーに格納する工程であり、図１４のＳ５に対応するものである。
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で得られた個々のＯＲＦについて、好ましくは、転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法、または相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法のいずれかの方法、ないしは転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法および相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法を組み合わせた方法を用いて、ＣＤＳとしての真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定することにより、ＣＤＳを仮同定する。
【００９７】
本発明でいう「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」とは、開始コドンの位置とポリシストロンの転写単位の構造を高精度に予測する方法を用いる高精度な原核生物の遺伝子構造同定方法であり、下記（ｈ）〜（ｎ）の工程を含む遺伝子構造同定方法である。
（ｈ）原核生物の塩基配列情報から、翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを設定する。
（ｉ）工程（ｈ）で得られた任意の隣り合い、かつ同じ鎖にある２つのＯＲＦを下流からＯＲＦ−Ａ、ＯＲＦ−Ｂとしたとき、ＯＲＦ−Ａの仮の翻訳開始コドンが、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの上流にあるか、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内にあるとき、ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが一つの転写単位を形成する可能性があると判定する〔ここで、ＤＳは２０〜１００の整数〕。
（ｊ）工程（ｉ）においてＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが一つの転写単位を形成する可能性があると判定された場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドン第１文字目のＴ（チミジン）残基から下流に向かってＤＢ塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内の領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍」という）の中に翻訳開始コドンの候補があるときに、その候補をＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンと同定し〔ここで、ＤＢは１０〜２０の整数で、ＵＢは３〜１５の整数である〕、翻訳開始コドンの候補が複数ある場合、各候補とＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位を決めることによりＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを同定する。
（ｋ）工程（ｊ）でＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンが同定できなかった場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンの第１文字目のＴ残基から下流に向かってＲＤ塩基以内、および該Ｔ残基から上流に向かってＲＵ塩基以内の領域であり、かつ「該翻訳終止コドンの近傍」を除いた領域（以下、「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」という）にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるかどうか調べる〔ここで、ＲＤは３０〜１２０の整数で、ＲＵは２０〜１２０の整数である〕。
（ｌ）工程（ｋ）で該領域にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補があるとき、各候補の上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定する。
（ｍ）工程（ｉ）で一つの転写単位を形成する可能性があると判定されなかったＯＲＦ−Ａまたは工程（ｌ）で翻訳開始コドンを同定できなかったＯＲＦ−Ａについて、最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めて、５’末端から最多Ｎ個までの翻訳開始コドンの候補を検索した後、各候補についてその上流１〜３０塩基にリボソーム結合領域があるか否かを調べ、リボソーム結合領域がある場合、そのリボソーム結合配列を決定し、該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンと同定する〔ここで、Ｎは５〜２０の整数である〕。
（ｎ）工程（ｊ）、（ｌ）または（ｍ）の同定結果から、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、ＣＤＳ並びに転写単位を確定し遺伝子構造を同定する。
【００９８】
図３の工程（ｄ）は、工程（ｃ）または（ｆ）で真と判定された、１つないしはそれ以上の数の翻訳領域の塩基配列をメモリーから呼び出し、該塩基配列から算出した該翻訳領域のコドン使用頻度をメモリーに書き込む工程であり、図１４のＳ６に対応するものである。
工程（ｄ）では、工程（ｃ）または（ｆ）で真と判定された、１つないしはそれ以上の数のＣＤＳのコドン使用頻度を算出する。
【００９９】
図３の工程（ｅ）は、工程（ａ）で得られた上記の複数の原核生物の翻訳領域のコドン使用頻度と工程（ｄ）で得られた該コドン使用頻度をそれぞれメモリから呼び出し、類似性の尺度を用いて両方の使用頻度を比較することにより、後者のコドン使用頻度と最も類似しているコドン使用頻度を示す原核生物を選択した後、選択した原核生物の翻訳領域の位置と塩基配列の特徴を分析し、その分析結果と選択された原核生物の種名をメモリーに格納する工程であり、図１４のＳ７に対応するものである。
工程（ｅ）では、類似性の尺度を用いて、工程（ａ）で算出した複数種の原核生物のＣＤＳのコドン使用頻度の中から、工程（ｄ）で得られた該コドン使用頻度に最も近いコドン使用頻度を示す原核生物を選択する。
【０１００】
類似性の尺度としては、距離、内積および方向余弦からなる尺度より選ばれる尺度であるならば、いずれの尺度を用いることができるが、距離、特にユークリッド距離を用いることが好ましい。
ここでいう距離とは、ｆを未知ベクトル、ｇを標準ベクトルとし、これらのベクトルの空間上の２点の座標を定義したときに、座標空間上の２点の距離のことである。距離としては、ユークリッド距離、重み付きユークリッド距離、マハラノビス距離などが挙げられる。これらの距離については、一般的な統計学や他多変量解析の教科書に説明されている。
内積とは、ｆを未知ベクトル、ｇを標準ベクトル、ｆ’をｆの転置ベクトルとしたときに、ｆ’ｇ（またはｆ’・ｇ）で定義される。
方向余弦とは、あるベクトルについて、その方向ベクトルとＮ次元空間における各軸とのなす角度をθとしたときに、各軸へ投影した成分であるｃｏｓθを方向余弦という。たとえば、３次元空間の未知ベクトルｆがあったときに、その方向ベクトルが各軸となる角度を各軸となす角度をα、β、γとすると、その方向ベクトルを各軸へ投影した成分は  （ｃｏｓα、ｃｏｓβ、ｃｏｓγ）となり、これらは方向余弦となる。
【０１０１】
中でも、工程（ｃ）で同定したＣＤＳのコドン使用頻度ｘ’’’ｑ（ｓ）  が、工程（ａ）で算出した複数種の原核生物のＣＤＳのコドン使用頻度ｘｑ（ｓ）の中から、最も類似しているものを選び出すときに、次に示す計算方法に示すユークリッド距離Ｄを用いることがより好ましい。
【数５０】
2004310688.tif 000038
【０１０２】
図３の工程（ｆ）は、工程（ｅ）の分析結果をメモリーから呼び出し、この分析結果をもとに該翻訳領域の真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定し、同定結果をメモリーに格納する工程であり、図１４のＳ８に対応するものである。
工程（ｆ）では、工程（ｅ）で選択した原核生物のＣＤＳの塩基配列の特徴をもとに該ＣＤＳの真偽を判定するとともに翻訳開始コドンを同定し、この翻訳開始コドンの同定処理がＣ回目の処理であるときに工程（ｇ）に移り、Ｃ回目未満のときには工程（ｃ）に移る。
原核生物のＣＤＳの塩基配列の特徴をもとに該ＣＤＳの真偽を判定する方法とは、該塩基配列をもとに算出される特定の塩基配列の頻度を用いて該ＣＤＳの真偽を判定する方法を用いることができる。塩基配列の頻度として上述のコドン使用頻度や上述のシャドー判別関数の値を用いることができる。シャドー判別関数の値を用いる方法としては、下記（ｒ）と（ｓ）の工程を含む方法であることが望ましい。
（ｒ）すでに同定された原核生物の複数（Ｔ）個のＣＤＳにおいて、「あるコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンの出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ種類選別する。
（ｓ）「出現頻度が高い方のｋ種類のコドンが該ＣＤＳとは別の未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低い方のｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較することにより該ＣＤＳ−Ａの真偽を判定する〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｋは５以上２０以下の整数である〕。
「出現頻度が高いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、さらに該逆数の値が一定値を下回るときに該ＣＤＳ−Ａを「偽」と判定する方法を用いてもよい。
【０１０３】
さらに、すでに同定された原核生物のＴ個のＣＤＳの塩基配列をもとにＴ個のＣＤＳとは別の未同定のＣＤＳ−Ａの「真偽」を下記（ｔ）〜（ｗ）の工程で判定する方法であってもよい。
（ｔ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べる、
（ｕ）ｔ番目のＣＤＳにおけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数５１】
2004310688.tif 000039
としたとき、下式（４）によりｙｉを、そして下式（５）によりｙｉ＋３２を求める、
【数５２】
2004310688.tif 000040
または
【数５３】
2004310688.tif 000041
（ｖ）ｙｉおよびｙｉ＋３２の値が大きい順番に、工程（ｔ）で並べた６４種類のコドンを並べ替えた後、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選び、翻訳領域ＡのＳｄＡの値を下式（６）により求める、
【数５４】
2004310688.tif 000042
ただし、
【数５５】
2004310688.tif 000043
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする。
および
（ｗ）工程（ｖ）で算出した翻訳領域ＡのＳｄＡの値が閾値Ｓ１以上であるときに該翻訳領域を真の翻訳領域とし、該ＳｄＡの値が閾値Ｓ１未満であるときに偽の翻訳領域とする、
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは３２以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｋは５〜２０の整数、Ｓ１は０．５〜２．０の値である。〕
【０１０４】
原核生物のＣＤＳの塩基配列の特徴をもとに該ＣＤＳの真偽を判定する方法として、ＣＤＳの可能性を示す値である、「コーディング・ポテンシャルまたはコドン使用頻度分析法」を用いてＣＤＳの真偽を判定する方法を用いることができる。
コーディング・ポテンシャルとしては、マルコフモデルまたは隠れマルコフモデルに基づいたコーディング・ポテンシャルを用いてもよい。
マルコフモデルまたは隠れマルコフモデルに基づいたコーディング・ポテンシャルとしては、例えば、ＧｅｎＭａｒｋ〔Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ  ＆  ＭｃＩｎｉｎｃｈ，  Ｊ．  ：  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  １７，  １２３−１３３  （１９９３）〕、ＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍ〔Ｌｕｋａｓｈｉｎ，  Ａ．Ｖ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  １１０７  −  １１１５  （１９９８）、  Ｂｅｓｅｍｅｒ，  Ｊ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２７，  ３９１１  −  ３９２０  （１９９９）〕およびＧｌｉｍｍｅｒ〔Ｓａｌｚｂｅｒｇ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  ｐ．５４４  −  ５４８  （１９９８）、Ｄｅｌｃｈｅｒ，  Ａ．Ｌ．ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２７，  ｐ．４６３６  −  ４６４１  （１９９９）〕を用いることができる。
また、コーディング・ポテンシャルとしては、コドン使用頻度分析に基づいて翻訳領域を同定するＯＲＰＨＥＬＵＳ〔Ｆｒｉｓｈｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  ｐ．２９４１  −  ２９４７  （１９９８）〕を用いてもよい。
また、コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法として、すでに同定された原核生物のＴ個のＣＤＳの塩基配列をもとに、Ｔ個のＣＤＳにおいて「出現頻度の高いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較することにより該ＣＤＳ−Ａの真偽を判定する方法を用いてもよい〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
好ましくは、出現頻度の高いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｍ種類のコドンが未同定のＣＤＳ−Ａに出現する個数」とを比較する方法が、計算式として「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、該逆数の値が一定値を下回るときに該ＣＤＳ−Ａを「偽」と判定する方法を用いてもよい〔ここで、ｍは５以上２０以下の整数である〕。
【０１０５】
より好ましくは、下記（ｘ）〜（ｚ）の工程を用いて該ＣＤＳ−Ａを「偽」と判定する方法を用いてもよい
（ｘ）ｔ番目のＣＤＳにおけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数５６】
2004310688.tif 000044
としたとき、下式（７）によりｙｉを求める、
【数５７】
2004310688.tif 000045
（ｙ）ｙｉが大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、ＣＤＳ−ＡのＣｄＡの値を下式（８）により求める、
【数５８】
2004310688.tif 000046
ただし、
【数５９】
2004310688.tif 000047
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする。
および
（ｚ）工程（ｙ）で算出したＣＤＳ−ＡのＣｄＡの値が閾値ＣＶ以上であるときに該ＣＤＳを真のＣＤＳとし、該ＣｄＡの値が閾値ＣＶ未満であるときに偽のＣＤＳとする、
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０の整数、ＣＶは０．８〜２．０の値とする。〕
【０１０６】
さらに、ＣＤＳの真偽を判定する方法として、コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法単独でなく、上述のシャドー判別関数の値を用いる方法を組み合わせて用いてＣＤＳの真偽を判定する方法を用いてもよい。
【０１０７】
また本発明は、２つの転写単位またはＣＤＳが重複するときに、工程（ｃ）または（ｆ）において、下記（ａａ）〜（ａｃ）の工程を含む判定を行うことにより転写単位またはＣＤＳの真偽を判定してもよい。
（ａａ）転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａと同じ鎖上に存在する転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂが、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａの中に内包される場合に、転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂを「偽」と判定する。
（ａｂ）転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａと相補的な鎖上に存在する転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂが、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａの中に内包される場合に、転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂを「偽」と判定する。
（ａｃ）転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａが相補的な鎖上に存在する転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂと重複するときに、転写単位またはＣＤＳの長さが短い方を「偽」と判定する。
【０１０８】
また、原核生物の任意のＣＤＳ−Ａが相補鎖のＣＤＳ−Ｂと重複し、かつＣＤＳ−ＢがＣＤＳ−Ａによって内包される場合に、下記（ａｄ）と（ａｅ）の工程を含む方法によりＣＤＳ−ＡおよびＣＤＳ−Ｂの真偽を判定してもよい。
（ａｄ）ＣＤＳ−Ａの長さＬＡ（塩基対）とＣＤＳ−Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＡがＬＢのＴＰ％以下のときに、ＣＤＳ−Ｂを「偽」と判定する、および（ａｅ）ＬＡがＬＢのＴＰ％を越えるとき、。シャドー判別関数の値を用いる方法またはコーディング・ポテンシャルを用いる方法によりＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの真偽を判定する〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕。
【０１０９】
また、工程（ｃ）または（ｆ）において、原核生物の任意のＣＤＳ−Ａが相補鎖の長さＬＢ（塩基対）ＣＤＳ−Ｂと重複し、かつＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂが重複している領域の長さＬＡＢ（塩基対）がＬＢのＴＰ％以上であり、かつＣＤＳ−Ａのアミノ酸配列が既知遺伝子と相同性を示す場合に、ＣＤＳ−Ｂを偽と判定してもよい〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数である〕。
また、工程（ｃ）または（ｆ）において、転写単位を構成するＣＤＳの翻訳終止コドンを除いたＣＤＳを連結して、一つのＣＤＳにした後に、上述の方法によりＣＤＳの真偽を判定してもよい。
【０１１０】
また本発明は、原核生物の塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越えるとき、工程（ｃ）または（ｆ）において、該塩基配列内のＣＤＳ内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて算出された含量が一定値を下回るときに該ＣＤＳを「偽」と判定してもよい。
【０１１１】
また本発明は、原核生物の塩基配列におけるＧＣ含量が５０％を越えるとき、工程（ｃ）または（ｆ）において、該塩基配列内のＣＤＳ内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて算出された含量が一定値を下回るときに該ＣＤＳの翻訳開始コドン「偽」と判定し、該偽翻訳開始コドンより下流に存在する翻訳開始コドンを再検索してもよい。
【０１１２】
また、ＣＤＳ内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式として、下式（９）、算出された含量として下記ＧＣｉの値、および一定値として０．６〜０．７５から選ばれる一の値を用いてもよい。
【数６０】
2004310688.tif 000048
〔ここで、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒ  は１，２または３である）の塩基がｂ（ｂ  は１，２，３または４である）のとき、
【数６１】
2004310688.tif 000049
であり、このとき、ｂは、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なお、ｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目のＣＤＳのコドンの総数（翻訳終止コドンを除く）を表わす。〕
【０１１３】
図３の工程（ｇ）は図１４のＳ９に対応するものである。
本発明の工程（ｇ）においては、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｆ）の結果から、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、並びにＣＤＳに関する遺伝子構造を確定することができる。
【０１１４】
また本発明は、工程（ｂ）の原核生物の塩基配列情報が、種名が明らかでない原核生物（仮に原核生物Ｘと名付ける）のＤＮＡ断片の塩基配列情報である場合に、該塩基配列情報をもとに上述のいずれかの遺伝子構造同定方法を用いてＣＤＳを同定し、工程（ｅ）においてコドン使用頻度の類似性によりある特定の原核生物（仮に原核生物Ｐと名付ける）を選択することができるが、原核生物Ｐのコドン使用頻度が原核生物Ｘのコドン使用頻度と類似していることより、原核生物Ｘの該ＤＮＡ断片は原核生物Ｐと類縁の微生物から由来したと推定することができる。
【０１１５】
［転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法］
以下に、本発明の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」について詳述する。
図１３に示した構成の装置を用いて、本発明の実施態様における「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」を実施する場合の全体処理フロー図を図１５に示す。
図１５において、Ｓ１１では、入力装置により解析すべき原核生物の塩基情報が入力される。
本発明の方法において、塩基配列データは、キーボードから直接入力する、インターネットなどを介して電送されるデータを読み込む、あるいはフレキシブルディスク、光磁気ディスク、ハードディスクおよびメモリーなどの記録媒体（外部記憶ファイル）上に記録されたデータを読み込むことにより、コンピュータに入力することができる。
Ｓ１２において、ＣＰＵは、Ｓ１１で入力した塩基配列データから、終止コドンを検索し、該終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを検索し、終止コドンと仮の開始コドンの組をＯＲＦ候補としてメモリに格納する。
Ｓ１３では、ＣＰＵは、メモリから、同じ鎖にある隣り合う２つのＯＲＦを呼び出し、下流側の翻訳開始コドンと、上流側の翻訳終止コドンの位置関係を調べ、一つの転写単位を形成する可能性を判定する。
Ｓ１４では、Ｓ１３で一つの転写単位の可能性のあるものについては、その下流側の翻訳開始コドンの周囲の領域から、再度翻訳コドン候補を検索し、上流側の翻訳終止コドンとの位置関係に基づいて、あらかじめ定めた優先順位に基づいて下流側の翻訳開始コドンを同定し、同定した転写単位とＣＤＳをメモリに格納する。それ以外のものについては、上記仮の翻訳開始コドンの周囲から、再度翻訳コドン候補を検索し、その中からその上流の適当な位置にリボソーム結合領域を有するものを選択して、翻訳開始コドンを同定し、同定したＣＤＳをメモリに格納する。
Ｓ１７では、メモリに格納した、同定ずみの転写単位・ＣＤＳのデータを出力装置により出力する。
出力の際には、開始コドンの位置は、プラス鎖上の開始コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置、およびマイナス鎖上の開始コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置または最後の位置で表わすことができる。終止コドンの位置は、プラス鎖上の終止コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置または最後の位置、およびマイナス鎖上の終止コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置で表わすことができる。
【０１１６】
図１５に示す遺伝子構造同定方法について、さらに、図４のフローチャートを用いて詳述する。
図４の工程（ｈ）は図１５のＳ１２に対応するものである。
工程（ｈ）では、この入力装置により入力された原核生物の塩基配列情報から、翻訳終止コドンを検索し、該終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを設定する。
最長のＯＲＦとは、５’末端から数えてｉ番目の終止コドンと（ｉ＋１）番目の終止コドンに着目したとき、ｉ番目の終止コドンから３’方向に向かって最初に出現するＡＴＧコドン、ＧＴＧコドン、またはＴＴＧコドン（これを仮の開始コドンとする）から（ｉ＋１）番目の終止コドンに至るまでの領域である〔ここで、ｉは１以上の整数〕。終止コドンとしては、ＴＡＡコドン、ＴＡＧコドン、ＴＧＡコドンを用いることができる。
ついで、終止コドンと仮の翻訳開始コドンの組（仮のＯＲＦ）を、終止コドンの位置に基づき５’末端から３’末端の方向にしたがって配列し、終止コドン、仮の開始コドンの上記塩基配上の位置とともに、メモリに格納する。
なお、本発明において、開始コドンとしては特にことわりのない限りＡＴＧ、ＧＴＧ、およびＴＴＧを用いる。
【０１１７】
工程（ｉ）は、図１５のＳ１３に対応する処理であり、ＣＰＵがポリシストロンの転写単位の予測を行う。複数のＣＤＳすなわちシストロンがポリシストロンを形成するとき、同一のリボソーム結合部位を利用してこれらのシストロン（ＣＤＳ）の翻訳が行われる場合が多い。すなわち、隣り合っているＣＤＳ同士は翻訳の共役が起こる場合がある。あるＣＤＳ−Ａとその上流にあるＣＤＳ−Ｂの間で翻訳の共役が起こりうる条件としては、少なくともＣＤＳ−Ａを含む最長のＯＲＦの仮の開始コドンがＣＤＳ−Ｂの終止コドンの上流にある、または該終止コドンの下流の近い位置に存在することが必要である。より好ましくは、ＣＤＳ−Ａの開始コドンが、ＣＤＳ−Ｂの終止コドンの上流にあるか、または該終止コドンの下流ＤＳ塩基（ＤＳは２０〜１００の整数である）以内にあるときに、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂとの間で翻訳の共役が起こる、すなわちポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定できる。従って、本工程におけるＯＲＦ−Ａ、ＯＲＦ−Ｂについては、ＯＲＦ−Ａの仮の開始コドンが、ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの上流にあるか（Ｓ４０２）、または該終止コドンの下流ＤＳ塩基以内にあるとき（Ｓ４０３）、ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂがポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定してメモリに格納し、これに該当しない場合は、この隣接する２つのＯＲＦの組（ＯＲＦ−Ａ，ＯＲＦ−Ｂ）は一つの転写単位を形成しないと判定する。
【０１１８】
つづいて、ＯＲＦ−Ａの開始コドンを同定する工程［図１５のＳ１４、工程（ｊ）〜（ｍ）］について説明する。
一般に、原核生物の遺伝子の発現において、リボソームがＯＲＦ−Ｂの翻訳を終えたとき、ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍にＯＲＦ−Ａの開始コドンが存在するときに、該開始コドンの上流にリボソーム結合配列がなくても、ＯＲＦ−Ａの翻訳が起こりうる。従って、このＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍に開始コドンが存在するときは、該開始コドンをＣＤＳ−Ａの開始コドンと同定できる。本発明の工程（ｊ）においては、メモリに格納した隣り合う２つのＯＲＦ候補を呼び出し、ＯＲＦ−Ａの翻訳が起こりうるＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍」として、ＯＲＦ−Ｂの終止コドン第１文字目のＴ残基から下流に向かってＤＢ塩基以内（ここで、ＤＢは１０〜２０の整数とする）および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内（ここで、ＵＢは３〜１５の整数とする）の領域で開始コドンを検索することが好ましい。さらに好ましくは、図５に示す場合のように、ＤＢが１４で、ＵＢが１１である領域で検索する（Ｓ４０４）。
【０１１９】
なお、このＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍」において検索する開始コドンはＡＴＧおよびＧＴＧに限定することが好ましい。これは好適なリボソーム結合配列が存在しないときに、ＴＴＧコドンから翻訳が開始されにくいという予測による。
ここで得られた翻訳開始コドン候補が１つの場合、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこむ（Ｓ４１２）。
一方、Ｓ４０４の検索において、翻訳開始コドン候補が複数ある場合、各候補とＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標として優先順位の最も高いものを選択する。
【０１２０】
工程（ｊ）で開始コドンが同定できなかった場合、さらに工程（ｋ）として、ＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍の周囲の領域」にＯＲＦ−Ａの翻訳が起こりうる開始コドンの候補があるかどうか調べる（Ｓ４０５）。本発明において、ＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍の周囲の領域」とは、該終止コドンの第１文字目のＴ（チミジン）残基から下流に向かってＲＤ塩基以内、および該Ｔ残基から上流に向かってＲＵ塩基以内の領域であり、かつ該「終止コドンの近傍」を除いた領域であることが望ましい〔ここで、ＲＤは３０〜１２０の整数で、ＲＵは２０〜１２０の整数とする〕。
ここで単一の翻訳開始コドンを同定できた場合は、該候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこむ。
なお、上記（ｊ）及び（ｋ）の工程でＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補が複数得られた場合は、ＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分けた後、３つの領域すなわち「該近傍」、「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の優先度に従い、該優先度が高い翻訳開始コドンを真の翻訳開始コドンと同定することができる。さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときはＯＲＦ−Ｂの翻訳終止コドンとの距離を指標としてあらかじめ定めた優先順位に従い、該優先順位が最も高い開始コドンをＯＲＦ−Ａの真の開始コドンと同定することができる。
【０１２１】
図５は、ＯＲＦ−Ｂの終止コドン付近に存在する翻訳開始コドンの優先順位付けを「ランク関数」として表示した例を示している。図５においては、ＯＲＦ−Ｂの終止コドン第１文字目のＴ残基から下流に向かって１４塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かって１１塩基以内の領域を「ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍」に設定した例を示している。優先順位の決め方は、一般的には上記３つの領域について優先順位を設け、さらにＯＲＦ−Ｂの終止コドンに近いほど優先順位が高いというルールを採用することができる。
本発明において「距離を指標として優先順位を決める」とは、このルールを採用することであるが、好ましくは、図５に示すように、ＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補のＯＲＦ−Ｂの終止コドンとの位置関係を表わす値（本明細書では、「ランク関数」と名付けた）を用いることにより、開始コドンの優先順位を決めることができる。「ランク関数」の値は図５に示したが、小さい数ほど優先順位が高いことを意味する。「ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍」、「該近傍の下流域」および「該近傍の上流域」のそれぞれの領域において、ＯＲＦ−Ａの開始コドンがＯＲＦ−Ｂの終止コドンに近いほど、ランク関数は小さい値をとる。
【０１２２】
具体的には、図５において、最も優先順位の高い「ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍」は、ＯＲＦ−Ｂの終止コドン第１文字目のＴ残基から下流に向かって１４塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かって１１塩基以内の領域であり、この領域のランク関数は、図５に示したように１〜８の値をとる。
前述のようにＯＲＦ−Ｂの「終止コドンの近傍の周囲の領域」にＯＲＦ−Ａの開始コドンが存在する場合に翻訳が起こりうる。ただし、ＯＲＦ−Ａの開始コドンがＯＲＦ−Ｂの終止コドンから離れているので、通常は効率のよい翻訳開始が起こるために、ＯＲＦ−Ａの開始コドンの上流にはリボソーム結合配列が存在することが望ましい。すなわち、ＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補が翻訳開始コドンと同定されるためには、該候補の上流の配列にリボソームとｍＲＮＡが結合することが可能であるリボソーム結合配列が存在することが望ましい。
リボソーム結合配列を調べる方法としては、リボソームとｍＲＮＡとの結合状態を表わすスコアを、該候補から上流に向かって１〜３０塩基離れた領域にあるｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列との対合状態を数値化（Ｓ４０６）することにより求めた後、そのスコアがある閾値を越えたときには、該開始コドンの候補をＯＲＦ−Ａの開始コドンと同定する（Ｓ４０７）方法などが挙げられる。
【０１２３】
１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列については、多くの細菌および古細菌が、３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’または３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’という配列を有している。従って、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列がわかっていない原核細胞の翻訳領域の開始コドンを同定する場合には、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列として３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’または３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’を用いることが望ましい。もしくは、その配列の周囲の配列（通常１〜３塩基）を含めた６〜１３塩基の配列をｍＲＮＡ結合配列として用いることもできる。さらに１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列がわかっている原核細胞のＣＤＳの開始コドンを同定する場合には、該ｒＲＮＡの３’末端配列を用いることもできる。
【０１２４】
効率のよい翻訳開始が起こるには、このｍＲＮＡ結合配列との結合に関与するＳＤ配列と呼ばれる配列が開始コドンの上流の翻訳開始に適切な位置に存在する必要がある。そこで、開始コドンから上流に向かって１〜３０塩基離れた領域に、１６Ｓ  ＲＮＡのｍＲＮＡ結合配列と対合しうる配列があるかどうかを調べる。
具体的には、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’と該開始コドンの上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列との対合状態、または１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’と該開始コドンの上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列との対合状態を数値化してリボソームとｍＲＮＡとの結合状態を表わすスコアを算出する方法により調べる。リボソームとｍＲＮＡとの結合状態を表わすスコアの算出法としては、ＣＤＳの開始コドンから上流に向かって１〜３０塩基離れた領域にあるｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列の間の塩基の対合を数値化する方法ならいかなる方法も用いることができる。該方法としては、例えば核酸の対合物の解離温度の規則を利用する方法、核酸の対合物の結合状態を表わす自由エネルギーの値〔Ｓｃｈｕｒｒ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２１，  ４０１９  −  ４０２３  （１９９３）〕を用いる方法、またはウエイトマトリックス法を利用したリボソーム結合部位の検索法〔Ｆｒｉｓｈｍａｎ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  ２９４１  −  ２９４７  （１９９８）〕などをあげることができる。上記方法を用いてリボソームとｍＲＮＡとの結合状態を表わすスコアを求めたとき、各々の方法で設定される一定の閾値を越えたスコアを示す配列がリボソーム結合配列であると同定することができる。
【０１２５】
以下、リボソームとｍＲＮＡとの結合状態を表わすスコアを、核酸の対合物の解離温度の規則を利用して算出する方法について説明する。
ＤＮＡとオリゴヌクレオチドとの対合物の解離温度を算出する場合、ＧとＣの対合を４℃、ＡとＴとの対合を２℃、ＧとＴとの対合を１℃として計算することがよく行われるが、核酸の対合物の解離温度の規則を利用する方法においても同じ算出法を適用することができる。たとえば、ＧとＣの対合を＋４、ＡとＵとの対合を＋２、ＧとＵとの対合を＋１とし、１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列と開始コドンの上流の塩基配列の間の対合をもとにスコア（以下、該スコアを「リボソーム結合スコア」と略記する）を求める。さらに、対合が観察された塩基のとなりの塩基で対合が起こらない場合、ペナルティーを与えることも望ましい。ペナルティースコアとしては、たとえば−１が挙げられる。従って核酸の対合物の解離温度の規則を利用するスコアの算出法として
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
の４つの規則に従って数値化する方法を用いる。通常、「リボソーム結合スコア」は、ＳＤ配列と開始コドンの間の距離が５〜１２塩基対である８通りの距離について算出し、最大値を求めた後、ＣＤＳの真偽の判定に用いることが望ましい。
【０１２６】
ｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡ結合配列との対合状態がよいほど、翻訳開始効率が高いことが知られているので、リボソーム結合スコアの値が大きいほど、翻訳開始の効率が高いと予想できる。したがって、開始コドンの位置はリボソーム結合スコアの値の大きさで同定することが可能である。開始コドンの同定法として、各開始コドンに対してリボソーム結合スコアの値を求めて、ある閾値Ｖ１を越えるときに開始コドンとして選別する方法を用いることができる。ＳＤ配列がＡＧＧＡあるいはＡＧＧのときに効率のよい翻訳開始が起こることが知られており、これらの配列のリボソーム結合スコアはそれぞれ１１および９である。このような知見から、リボソーム結合スコアの計算に核酸の対合物の解離温度の規則を利用する場合、閾値Ｖ１は７〜１４の整数に設定する。多くのＣＤＳの開始コドンは、最長のＯＲＦの５’末端領域に存在することが知られている。したがって、リボソーム結合スコアの算出は、最長のＯＲＦの５’末端から検索してＮ個（Ｎは５〜１０の整数）の開始コドンの候補に対して行えばよい。しかも５’末端に近い開始コドンの候補ほど真の開始コドンである確率が高いので、リボソーム結合スコアと閾値Ｖ１との比較は、５’末端に近い開始コドンの候補から順番に行い、最初に該スコアが閾値Ｖ１を越えた開始コドンの候補を開始コドンとして同定することができる。しかしながら、ＳＤ配列がＡＡＧまたはＧＧでも翻訳開始が起こるとされているので、閾値Ｖ１を用いたときに開始コドンが同定できない場合、Ｖ１より小さい値を持つ複数の閾値を用いて再度開始コドンを段階的に同定することが望ましい。
【０１２７】
ただし、前述の工程（ｋ）において、ＯＲＦ−Ｂの「翻訳終止コドンの近傍」の周囲の領域にＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンの候補がある場合、ＯＲＦ−Ｂの翻訳を終えたリボソームはＯＲＦ−Ａの翻訳開始を行いやすいので、開始コドンの選別に用いる上述の閾値はＶ１より小さい値Ｖ３でよい。Ｖ３の値としては、４〜１２の整数が好ましい。
一般に、開始コドンとしては、ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧの順番で翻訳開始の効率が高いと考えられる。したがって、開始コドンの塩基の違いを反映させて、リボソーム結合スコアを補正することが好ましい。この補正の手段としては、たとえば、リボソーム結合スコアを算出する際に、開始コドンがＧＴＧのときには数値ＰＧを差し引き、翻訳開始コドンがＴＴＧのときには数値ＰＴを差し引くことができる。リボソーム結合配列を求める計算に核酸の対合物の解離温度の規則を利用した方法を用いた場合はＰＧとしては１〜４の整数を、ＰＴとしては２〜６の整数を用いることができるが、より好ましくは、ＰＧとしては２、ＰＴとしては４を用いることができる。
【０１２８】
図６に、リボソーム結合スコアの算出の方法の一例をフローチャートとして示した。
まず、すでに検索された開始コドン候補（ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ）のうちの一つを選択し（Ｓ６０１）、まずＳＤ−開始コドンの距離ｄを１２と設定する（Ｓ６０２）。これは、対合状態を調べる開始コドン候補の上流の、上流１７塩基目から１０塩基目までの領域の８塩基について、スコアを計算する設定であることを意味する。
Ｓ６０３では、Ｓ６０２の設定に従い、まずｄ＝１２でスコアを計算する。すなわち、対合状態を調べる開始コドンの上流の、上流１７塩基目から１０塩基目までの領域の８塩基について、所定の方式でスコアを計算し、さらにＳ６０４で、開始コドンがＧＵＧまたはＵＵＧであるとき、Ｓ６０５でペナルティスコアを与える。
ついで、Ｓ６０３からＳ６０５の処理を、ｄの設定を１ずつ減らして繰り返し、開始コドン候補の上流１６塩基目から９塩基目までの領域（ｄ＝１１）についてのスコア、開始コドン候補の上流１５塩基目から８塩基目までの領域（ｄ＝１０）についてのスコア、開始コドン候補の上流１４塩基目から７塩基目までの領域（ｄ＝９）についてのスコア、開始コドン候補の上流１３塩基目から６塩基目までの領域（ｄ＝８）についてのスコア、開始コドン候補の上流１２塩基目から５塩基目までの領域（ｄ＝７）についてのスコア、開始コドン候補の上流１１塩基目から４塩基目までの領域（ｄ＝６）についてのスコア、開始コドン候補の上流１０塩基目から３塩基目までの領域（ｄ＝５）についてのスコアを求め、この中の最大値を上記開始コドン候補のリボソーム結合スコアとする。
ついで、すべての開始コドン候補について、Ｓ６０１〜Ｓ６０６の処理を繰り返し、すべての開始コドン候補のリボソーム結合スコアを求める。
【０１２９】
リボソーム結合スコアの算出の具体例を挙げると、図７に示すように、大腸菌のトリプトファンオペロンの先頭のｔｒｐＬ遺伝子のリボソーム結合スコアは１２と算出される。
こうして求めたリボソーム結合スコアは、上述の如く、ある閾値Ｖ１を越えるものを開始コドンとして選別するために用いることができる。
こうして選別されたコドンを翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真の翻訳領域と同定し、かつ該ＯＲＦ−ＡはＯＲＦ−Ｂと１つの転写単位を形成すると同定し、同定結果をメモリに書きこむ。
【０１３０】
工程（ｉ）でポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定されなかったＯＲＦ−Ａまたは工程（ｌ）で開始コドンを同定できなかったＯＲＦ−Ａについては、工程（ｍ）で最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めた最長のＯＲＦの５’端側の領域にある開始コドンの候補から開始コドンとしての真偽を調べる。その理由は、正しい開始コドンの上流に、次の開始コドンと終止コドンが出現する確率を予測した場合、終止コドンが出現せずに、複数のＡＴＧ、ＧＴＧまたはＴＴＧコドンが出現する確率は低くなるからである。したがって、通常５’末端側からＮ個〔Ｎは５〜２０の整数〕までの開始コドンの候補のリボソーム結合スコアを上述した方法などにより求め（Ｓ４０８）該スコアを閾値Ｖ１（閾値Ｖ１は、閾値Ｖ３よりも大きい値である）と比較し、最初に該スコアが閾値Ｖ１を越えた開始コドンの候補を開始コドンとして同定する（Ｓ４０９）ことができる。しかしながら、ＳＤ配列がＡＡＧまたはＧＧでも翻訳開始が起こるとされているので、閾値Ｖ１を用いたときに開始コドンが同定できない場合、Ｖ１より小さい値を持つ複数の閾値を用いて再度開始コドンを段階的に同定する（Ｓ４１０）ことが望ましい。より好ましくは、閾値Ｖ１に加えて、Ｖ１より小さい閾値Ｖ２およびＶ２より小さい閾値Ｖ３を用いることができる。この場合、Ｖ２の値としては５〜１３の整数を、そしてＶ３の値としては４〜１２の整数を用いることが好ましい。
【０１３１】
こうして、選択した該リボソーム結合配列に対応する候補を翻訳開始コドンとするＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと同定し、同定結果をメモリに書きこむ（Ｓ４１１）。
ここで、Ｖ１より小さい値を持つ複数の閾値でリボソーム結合部位の存在を調べ、翻訳開始コドンが同定できないときは、ＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳを含むものとしないことが好ましい（Ｓ３１３）。
工程（ｎ）では工程（ｊ）、（ｌ）または（ｍ）の同定結果から、開始コドンおよび終止コドンの位置、ＣＤＳ並びに転写単位を確定し遺伝子構造を同定する（Ｓ４１１）。
開始コドンおよび終止コドンの位置、並びに個々の転写単位に含まれるＣＤＳに関する情報は、コンピュータを用いて本方法を実施したときは、ディスプレイへの表示、プリンタへの出力による印刷、または記録媒体への記録により、出力することができる。開始コドンの位置は、プラス鎖上の開始コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置、およびマイナス鎖上の開始コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置または最後の位置で表わすことができる。終止コドンの位置は、プラス鎖上の終止コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置または最後の位置、およびマイナス鎖上の終止コドンの場合にはコドン３塩基の最初の位置で表わすことができる。
【０１３２】
転写単位の構造に関しては、同定した転写単位がモノシストロンであるか、ポリシストロンであるか、表示する必要がある。また、ポリシストロンの場合には、先頭のＣＤＳ、最後尾のＣＤＳ、および先頭のＣＤＳと最後尾のＣＤＳに挟まれた内部に存在するＣＤＳを区別して情報を出力することが望ましい。転写単位の構造の情報に関する出力法の好適な例としては、モノシストロンのＣＤＳに対して「１」というラベルを与え、また先頭のＣＤＳ、最後尾のＣＤＳ、および先頭のＣＤＳと最後尾のＣＤＳに挟まれた内部に存在するＣＤＳに対しては、それぞれ「２」、「４」、「３」というラベルを与えることができる。
【０１３３】
上に示した「転写単位構造を予測する翻訳領域同定法」以外に、この変法を用いて遺伝子の構造を同定することもできる。その変法は、下記（ｈ１）〜（ｎ３）の工程を含む原核生物の遺伝子構造同定方法である。
（ｈ１）原核生物の塩基配列情報から、翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを設定する。
（ｈ２）工程（ｈ１）で得られたＯＲＦから、該ＯＲＦの長さ（翻訳終止コドンの第１文字目の位置と翻訳開始コドンの第１文字目の位置の差）がＬＯ塩基以上のものを選んだ後、選んだＫ個のＯＲＦに対してその翻訳終止コドンの位置で５’末端側から順番に、第１番目ＯＲＦ、第２番目ＯＲＦ、・・・第Ｋ番目ＯＲＦと名付ける〔ここでＬＯは３０から９００までの整数、およびＫは２以上の整数〕。
（ｉ１）工程（ｉ２）で得られた第Ｉ番目ＯＲＦの仮の翻訳開始コドンが、第１番目ＯＲＦから第（Ｉ−１）番目ＯＲＦまでのＯＲＦの中で工程（ｎ３）において「真の翻訳領域」と判定された翻訳領域を含む第Ｊ番目ＯＲＦの翻訳終止コドンの上流にあるか、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内にあるとき、第Ｉ番目ＯＲＦと第Ｊ番目ＯＲＦがポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定する〔ここで、Ｉは１からＫまでの整数、ＪはＩより小さい正の整数、ＤＳは２０〜１００の整数〕。
（ｊ１）工程（ｉ１）において第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定された第Ｊ番目ＯＲＦの中で、Ｊの値が最も小さいＯＲＦを選んだ後、第Ｊ番目ＯＲＦの「翻訳終止コドンの近傍」すなわち「該終止コドン第１文字目のＴ残基から下流に向かってＤＢ塩基以内および該Ｔ残基から上流に向かってＵＢ塩基以内の領域」の中に翻訳開始コドンの候補があるときに、その候補を第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンと同定する〔ここで、ＤＢは１０〜２０の整数で、ＵＢは３〜１５の整数である〕。ここで、翻訳開始コドンの候補が複数ある場合、各候補と第Ｊ番目ＯＲＦの翻訳終止コドンとの距離を指標として短い方から優先順位を決めることにより第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンを同定する。
（ｋ１）工程（ｊ１）で第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンが同定できなかった場合、第Ｊ番目ＯＲＦの「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」内の翻訳の再開始が可能な位置に第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンの候補があるかどうか調べる。
（ｌ１）工程（ｋ１）で該領域内に第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンの候補があるときに、該候補の上流４〜１７塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＵＣＣＵＣＣ−５’）または該翻訳開始コドンの上流４〜１６塩基のｍＲＮＡ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列内のｍＲＮＡとの結合に関わる配列（３’−ＵＣＣＵＣＣ−５’）との対合状態を下記の４つの規則、
（１）ＧとＣの対合は＋４を与える
（２）ＡとＵの対合は＋２を与える
（３）ＧとＵの対合は＋１を与える
（４）対合が認められた塩基対の隣の塩基対に対合が認められない場合、−１を与える
に従って数値化したものを「ｍＲＮＡとリボソームとの結合状態を表わすスコア（リボソーム結合スコア）」とした場合に、該スコアが閾値Ｖ３を越えるときは該候補を第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンと同定する。ここで、翻訳開始コドンの候補が複数ある場合、第Ｊ番目ＯＲＦの「翻訳終止コドンの近傍の周囲の領域」を「該近傍の下流域」と「該近傍の上流域」の２つに分け「該近傍の下流域」、「該近傍の上流域」の順で翻訳開始の優先度を決め、さらにそれぞれの領域内で翻訳開始コドンが複数あるときは第Ｊ番目ＯＲＦの翻訳終止コドンとの距離を指標として短い方から優先順位を決めることにより、候補を段階的に選定し、閾値Ｖ３を超えるものを第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンと同定する。
（ｌ２）工程（ｋ１）または工程（ｌ１）で第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンを同定できなかった場合、工程（ｊ１）に戻り、工程（ｉ１）において第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定された第Ｊ番目ＯＲＦの中で、Ｊの値が次に小さいＯＲＦを選んだ後、工程（ｊ１）から（ｌ１）までの工程により第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンを同定する操作を、第Ｉ番目ＯＲＦの長さがＬＯアミノ酸未満になるまで繰り返す〔ここでＬＯは工程（ｈ２）で示したＬＯと同じ値〕。
（ｍ１）工程（ｉ１）でポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定されなかった第Ｉ番目ＯＲＦ、または工程（ｊ１）から（ｌ２）までの工程で翻訳開始コドンを同定できなかった第Ｉ番目ＯＲＦについて、最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンを含めて、５’末端から最多Ｎ個までの翻訳開始コドンの候補を検索した後、各候補について工程（ｌ１）と同じようにして「リボソーム結合スコア」を求め、該スコアが閾値Ｖ１を超えるものをＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンと同定する。さらに閾値Ｖ１を越える候補がないときは、該スコアがＶ１より小さい閾値Ｖ３を含む１個以上の閾値を設定し、この設定した閾値を越えたときにＯＲＦ−Ａの翻訳開始コドンを段階的に同定する〔ここで、Ｖ１は工程（ｌ２）のＶ３よりも大きい７から１４までの整数、Ｎは５〜２０の整数である〕。
（ｎ１）工程（ｊ１）から（ｍ１）までの工程で翻訳開始コドンを同定できなかった第Ｉ番目ＯＲＦは「偽のＯＲＦ」と判定する。
（ｎ２）工程（ｊ１）、（ｋ１）、（ｌ１）または（ｍ１）で翻訳領域の翻訳開始コドンが同定された第Ｉ番目ＯＲＦは「真のＯＲＦ」を含むと判定し、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、翻訳領域および転写単位を確定して遺伝子構造を同定する。
（ｎ３）第１番目ＯＲＦから第Ｋ番目ＯＲＦまでのＫ個のすべてのＯＲＦについて工程（ｎ１）および工程（ｎ２）の方法により翻訳領域の「真」「偽」を判定し、「真」と判定されたすべての翻訳領域の翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、翻訳領域並びに転写単位を確定して遺伝子構造を同定する〔ここでＫは２以上の整数〕。
【０１３４】
以下に、上述の「転写単位構造を予測する翻訳領域同定法」の変法を、コンピュータで行う方法について、図８および図９のフローチャートを参照しながら詳述する。
まず工程（ｈ１）において、入力装置により入力された原核生物の塩基配列情報から、ＣＰＵは翻訳終止コドンを設定し、該翻訳終止コドンに基づき最長のＯＲＦを与える仮の翻訳開始コドンを設定する（Ｓ８０１）。翻訳終止コドン、翻訳開始コドン、最長ＯＲＦの定義は、上記と同義である。
【０１３５】
工程（ｈ２）において、工程（ｈ１）で得られた複数のＯＲＦのうち、短いＯＲＦは真の翻訳領域でない可能性が高いので、ＣＰＵは各ＯＲＦの長さを計算し、一定の長さ以上のＯＲＦを選別する。選別に用いるＯＲＦの長さとしては３０〜９００塩基を用いることができるが、３０〜６００塩基が好ましい。このようにして選別したＯＲＦについては、以下の工程での操作を簡便にするために、各ＯＲＦの終止コドンの位置をもとに５’末端側から順番に、第１番目ＯＲＦ、第２番目ＯＲＦ、・・・第Ｋ番目ＯＲＦと名付けることが好ましい〔ここでＫは２以上の整数〕。これらのデータをメモリに格納する（Ｓ８０２）。
工程（ｉ１）においては、ＣＰＵは工程（ｈ２）で得られた第Ｉ番目ＯＲＦの仮の翻訳開始コドンが、第１番目ＯＲＦから第（Ｉ−１）番目ＯＲＦまでのＯＲＦの中で第Ｊ番目ＯＲＦの翻訳終止コドンの上流にあるか（Ｓ８０４）、または該翻訳終止コドンの下流ＤＳ塩基以内にあるとき（Ｓ８０５）、第Ｉ番目ＯＲＦと第Ｊ番目ＯＲＦがポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定する（Ｓ８０６）〔ここで、Ｉは１からＫまでの整数、ＪはＩより小さい正の整数、ＤＳは２０〜１００の整数〕。第Ｊ番目ＯＲＦが工程（ｎ３）により「偽のＯＲＦ」と判定されたＯＲＦである場合もあるので、その場合は、ＣＰＵは第Ｊ番目ＯＲＦは第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンを形成しないと判断する（Ｓ８０３）。第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンを形成する可能性がある第Ｉ番目ＯＲＦの上流のＯＲＦは複数個得られた場合には、その複数個のＯＲＦを選び出し、番号が小さい順に並び替えて整理して、メモリに格納することが望ましい。
【０１３６】
工程（ｊ１）は前述の工程（ｊ）と同じである（Ｓ８０８）。
工程（ｋ１）は前述の工程（ｋ）と同じである（Ｓ８０９）
工程（ｌ１）は前述の工程（ｌ）と同じである（Ｓ９０１，Ｓ９０２）。さらに、本工程においては、同定された開始コドンの位置から算出される翻訳領域の長さが非常に短い場合は「偽の翻訳領域」と判定し、棄却することが好ましい。その判定に用いる長さは前述の工程（ｈ２）で用いた長さを用いることが好ましい。工程（ｌ２）においては、工程（ｋ１）または工程（ｌ１）で第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンを同定できなかった場合、工程（ｊ１）に戻り、ＣＰＵは第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンの転写単位を形成する可能性がある他のＯＲＦを検索する。すなわち工程（ｊ１）において第Ｉ番目ＯＲＦとポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定された第Ｊ番目ＯＲＦの中で、Ｊの値が次に小さいＯＲＦを選んだ後（Ｓ９０３，Ｓ９０４）、ＣＰＵは工程（ｊ１）から（ｌ１）までの工程により第Ｉ番目ＯＲＦの翻訳開始コドンを同定する操作を行う。工程（ｊ１）から（ｌ１）までの繰り返しは、第Ｉ番目ＯＲＦの長さが短くなった時点で中止することが望ましい。その長さは前述の工程（ｈ２）で用いた長さを用いることが好ましい。
【０１３７】
工程（ｍ１）においては、工程（ｉ１）でポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定されなかった第Ｉ番目ＯＲＦ、または工程（ｊ１）から（ｌ２）までの工程で翻訳開始コドンを同定できなかった第Ｉ番目ＯＲＦについて、ＣＰＵが「リボソーム結合スコア」を求めることにより、翻訳開始コドンを検索するが、その方法は前述の工程（ｍ）と同じである（Ｓ９０５〜Ｓ９０８）。
工程（ｎ１）においては、ＣＰＵが工程（ｊ１）から（ｍ１）までの工程で翻訳開始コドンを同定できなかった第Ｉ番目ＯＲＦは「偽のＯＲＦ」と判定する（Ｓ９０９）。
工程（ｎ２）においては、工程（ｊ１）、（ｋ１）、（ｌ１）または（ｍ１）で翻訳領域の翻訳開始コドンが同定された第Ｉ番目ＯＲＦは「真」の翻訳領域を含むと判定するが（Ｓ９１０）、翻訳開始コドンの位置の確定により翻訳終止コドンの位置と翻訳領域が確定するとともに、工程（ｉ１）〜工程（ｌ２）において第Ｉ番目ＯＲＦがその上流のＯＲＦとポリシストロンを形成する可能性が示されているときは、第Ｉ番目ＯＲＦはポリシストロン形成に参加する遺伝子であると確定できる。工程（ｎ３）においては、ＣＰＵが、第１番目ＯＲＦから第Ｋ番目ＯＲＦまでのＫ個のすべてのＯＲＦについて工程（ｎ１）および工程（ｎ２）の方法により翻訳領域の「真」「偽」を判定し、「真の翻訳領域」と判定されたすべての翻訳領域の翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンの位置、翻訳領域並びに転写単位を確定することにより、遺伝子構造を同定することができる〔ここでＫは２以上の整数〕。最後に、得られた同定結果を、出力装置により出力する（Ｓ９１１）。
【０１３８】
上述の遺伝子構造同定方法を用いて、原核細胞のＤＮＡのプラス鎖マイナス鎖からＣＤＳの候補を選別するとともに転写単位の構造を予測した後、次の方法により互いに重複するＣＤＳまた転写単位の真偽を判定することによりＣＤＳの同定精度を高めることができる。すなわち、選別した複数のＣＤＳと転写単位の位置関係を調べた後、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａと同じ鎖上に存在する別の転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂが、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａの中に内包される場合に、「偽の転写単位」または「偽のＣＤＳ」と判定することができる。また、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａと相補的な鎖上に存在する別の転写単位ＱまたはＣＤＳ−Ｂが、転写単位ＰまたはＣＤＳ−Ａの中に内包される場合に、「偽の転写単位」または「偽のＣＤＳ」と判定することができる。転写単位ＰまたはＣＤＳ―Ａが相補的な鎖上に存在する別の転写単位ＱまたはＣＤＳ―Ｂと重複するときに、転写単位またはＣＤＳの長さが短い方を「偽の転写単位」または「偽のＣＤＳ」と判定することができる。
【０１３９】
さらに、プラス鎖のＣＤＳまたは転写単位とマイナス鎖のＣＤＳまたは転写単位が重複してはいるが、互いに内包関係にない場合には、双方の長さを比較し、短い方を「偽のＣＤＳ」または「偽の転写単位」とすることによってもＣＤＳまたは転写単位の同定精度を向上させることができる。
同じ鎖上のとなり合う２個の翻訳領域が、上流の翻訳領域の３’末端側の一部と下流の翻訳領域の５’末端側の一部が重なり合うことがあることが知られているので、翻訳領域同士の重複を調べ、このような重複が観察されたときには、双方の翻訳領域を真の翻訳領域としてよい。なお、通常その重なりの長さは長さが小さい方の翻訳領域の１０％以下であることが好ましい。またプラス鎖の翻訳領域とマイナス鎖の翻訳領域が、それぞれの３’末端側の一部同士が重なり合う場合があることも知られているので、翻訳領域同士の重複を調べ、このような重複が観察されたときには、双方の翻訳領域を「真の翻訳領域」と判定してよい。なお、通常その重なりの長さは長さが小さい方の翻訳領域の１０％以下であることが好ましい。
【０１４０】
図１０に、互いに重複するＣＤＳまた転写単位の真偽を判定するための上記方法の一例をフローチャートとして示した。
図１０において、Ｓ１００１では、入力装置により、塩基配列、構造データが入力される。サイズの大きいＤＮＡ（１０００塩基対以上のＤＮＡの塩基配列）から多数のＣＤＳを同定するときは、個々のＯＲＦに対して上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」などを繰り返して使用することによりＣＤＳを選別する。
Ｓ１００２では、プラス鎖とマイナス鎖の各々について、転写ユニットとを、５’末端から３’末端の順に番号付けして整列し、メモリに格納する。
Ｓ１００３〜Ｓ１００８では、メモリからまず、プラス鎖とマイナス鎖の各１の転写ユニットを呼び出し、転写単位Ｐと相補的な鎖上に存在する別の転写単位Ｑが、転写単位Ｐの中に内包される場合に、「偽の転写単位」と判定し、この操作をすべての組み合わせについて処理済みとなるまで繰り返す。
ついで、Ｓ１００９では、プラス鎖とマイナス鎖の各々から、同定した転写単位とを、５’末端から３’末端の順に番号付けして整列し、メモリに格納する。Ｓ１０１０〜Ｓ１０１６では、メモリからまず、プラス鎖とマイナス鎖の各１のＣＤＳを呼び出し、ＣＤＳ―Ａが相補的な鎖上に存在する別のＣＤＳ―Ｂと重複するときに、転写単位またはＣＤＳの長さが短い方を「偽の転写単位」または「偽のＣＤＳ」と判定し、この操作をすべての組み合わせについて処理済みとなるまで繰り返す。
最後に、Ｓ１００９で得られた転写単位の同定結果と、Ｓ１０１６で得られたＣＤＳの同定結果を、出力装置により出力する。
【０１４１】
図１０に示すように、まずプラス鎖から各ＯＲＦについて開始コドンの同定を行うとともに、ＣＤＳとしての真偽を判定し、「真のＣＤＳ」であると判定されたＣＤＳが出現した場合、上述の方法により該ＣＤＳが同じ鎖上にある別のＣＤＳを内包するかどうか調べることにより、ＣＤＳの同定精度を高めることができる。なお、上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」を用いた場合、ＣＤＳだけでなく、転写単位の構造も同定できる。同様にして、マイナス鎖からもＣＤＳと転写単位の構造を同定した後、上述の方法により各転写単位が相補鎖上にある別の転写単位を内包するかどうか調べることにより、他の転写単位によって内包された転写単位を「偽の転写単位」と判定することにより転写単位の同定精度を高めることができる。
【０１４２】
近年多数の微生物の全ゲノム配列が決定され、その数も年々増加している。このように、原核生物の塩基配列からのＣＤＳの同定については、全ゲノム配列からＣＤＳを同定する必要性が高まってきている。したがって、サイズの大きいＤＮＡ（１，０００塩基対以上のＤＮＡ）の塩基配列から多数のＣＤＳを同定するときは、個々のＯＲＦに対して上述の遺伝子構造同定方法を繰り返して使用することによりＣＤＳを選別する、あるいはＣＤＳとしての真偽を判定することが好ましい。遺伝子構造同定方法を繰り返して用いる方法としては、同じ鎖上から選別されたＯＲＦを終止コドンの位置で並べ替えた後、５’末端側のＯＲＦから順番に開始コドンの存在を調べ、またＣＤＳとしての真偽を判定する方法が挙げられる。その一例を図１１に示した。
【０１４３】
図１１において、Ｓ１１０１では、入力装置により解析すべき塩基配列を入力する。
Ｓ１１０２、Ｓ１１０３においては、上記Ｓ８０１、Ｓ８０２と同様の処理をＣＰＵが行なう。
Ｓ１１０４、Ｓ１１０５においては、ＣＰＵが上記Ｓ８０３〜Ｓ８０９及びＳ９０１〜Ｓ９１１と同様の処理を行ない、同定結果をメモリに格納するとともに、真のＣＤＳと判定されたＣＤＳについては、その同定精度をあげるため、以下の判定処理にうつる。
Ｓ１１０６〜１１１１では、ＣＰＵは、上流のＣＤＳとの重複の有無と長さ、内包を調べ、重複度が高い場合、短い方のＣＤＳを偽と判定し、上流のＣＤＳを内包する場合は、その上流のＣＤＳを偽と判定する。
この処理を、Ｓ１１０２におけるすべてのＯＲＦについて処理済みとなるまで繰り返し、判定結果をメモリに格納し、最後に得られた判定結果を、出力装置により出力する（Ｓ１１１３）。
【０１４４】
図１１に示す方法によれば、まずプラス鎖から各ＯＲＦについて開始コドンの同定を行うとともに、ＣＤＳとしての真偽を判定し、真のＣＤＳであると判定されたＣＤＳが出現した場合、上述の方法により該ＣＤＳが同じ鎖上にある別のＣＤＳを内包するかどうか調べることにより、ＣＤＳの同定精度を高めることができる。同様にして、マイナス鎖からもＣＤＳを同定した後、上述の方法により各ＣＤＳまたは転写単位が相補鎖上にある別のＣＤＳまたは転写単位を内包するかどうか調べることにより、他のＣＤＳまたは転写単位によって内包されたＣＤＳまたは転写単位は「偽のＣＤＳ」または「偽の転写単位」と判定することによりＣＤＳの同定精度を高めることができる。
【０１４５】
［シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法］
以下に、本発明の「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」について詳述する。
通常、原核細胞のＣＤＳの相補鎖に重複する「偽のＣＤＳ」が存在することが多く、この「偽のＣＤＳ」の存在がＣＤＳの同定精度の向上を困難にさせている。この相補鎖に出現する「偽のＣＤＳ」のことを「遺伝子の影（ｇｅｎｅ  ｓｈａｄｏｗ）」と呼ぶことが多い。これまで開発されたＣＤＳの同定方法では、個々の原核生物の「真」のＣＤＳに特徴的な塩基配列の組成やコドンの使用頻度に着目し、この「遺伝子の影」を判別しているので、正しいＣＤＳを別の方法によって知る必要がある。
【０１４６】
ところが、以下に述べるように、本発明では、上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」などの方法を用いて同定したＯＲＦの情報をもとに、「遺伝子の影」を判別するための計算式を用いてＣＤＳの真偽を調べることにより、事前に正しいＣＤＳの情報がなくてもＣＤＳの同定精度を向上させることができることを見い出した。すなわち、まず上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」などを用いて同定した複数個のＣＤＳの情報に基づいて、「真のＣＤＳ」と判定されたＣＤＳ内のコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンが該ＣＤＳに出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ通り選別した後、「出現頻度の高いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」の比較を可能にする計算式（以下、「シャドー判別関数（ｓｈａｄｏｗ−ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」と呼ぶ）を用いてＣＤＳ−Ａの真偽を判定することにより、ＣＤＳの同定精度を向上させることができる〔ここで、ｋは５以上２０以下の整数〕。
【０１４７】
本発明のシャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法は、上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」により同定されたＣＤＳに限定されず、周知のいかなる方法で同定されたＣＤＳについても適用することができる。例えば、ＧｅｎＭａｒｋ〔Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ  ＆  ＭｃＩｎｉｎｃｈ，  Ｊ．  ：  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  １７，  １２３−１３３  （１９９３）〕、ＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍ〔Ｌｕｋａｓｈｉｎ，  Ａ．Ｖ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  １１０７  −  １１１５  （１９９８）、  Ｂｅｓｅｍｅｒ，  Ｊ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２７，  ３９１１  −  ３９２０  （１９９９）〕、Ｇｌｉｍｍｅｒ〔Ｓａｌｚｂｅｒｇ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  ｐ．５４４  −  ５４８  （１９９８）、Ｄｅｌｃｈｅｒ，  Ａ．Ｌ．ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２７，  ｐ．４６３６  −  ４６４１  （１９９９）〕、ＣＲＩＴＩＣＡ〔Ｂａｄｇｅｒ，  Ｊ．  Ｈ．  ＆  Ｌｏｓｅｎ，  Ｇ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  Ｖｏｌ．  １６，  ｐ．５１２  −  ５２４  （１９９９）〕、ＯＲＰＨＥＬＵＳ〔Ｆｒｉｓｈｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  ｐ．２９４１  −  ２９４７  （１９９８）〕、またはＧｅｎＭａｒｋＳ〔Ｂｅｓｅｍｅｒ，  Ｊ．，  Ｌｏｍｓａｄｚｅ，  Ａ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２９，  ２６０７  −  ２６１８  （２００１）〕などの、従来より知られた翻訳領域を同定する方法によって同定されたＣＤＳについて、本発明の「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」を適用して、その同定精度を高めることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１４８】
「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」は、
（ｒ）入力手段により入力されたすでに同定された原核生物の複数（Ｔ）個の翻訳領域の中で、使用されているコドンの種類とその数を調べ、この中で、「あるコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンの出現頻度が低い」というコドンの組み合わせをｋ種類選別して、メモリに格納し；
（ｓ）入力手段により入力された翻訳領域と推定される翻訳領域Ａのデータから、該翻訳領域Ａでの上記選択されたコドンの出現頻度を計測し、
上記「出現頻度の高いｋ種類のコドンが翻訳領域と推定される翻訳領域Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンが該翻訳領域Ａに出現する個数」とを比較することにより、該翻訳領域Ａの真偽を判定し〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｋは５以上２０以下の整数である〕；
上記判定結果を出力装置が表示する処理をコンピューターに行なわせることにより、実施することができる。
【０１４９】
上で述べた「出現頻度の高いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｋ種類のコドンがＣＤＳ−Ａに出現する個数」の比較を可能にする計算式である「シャドー判別関数」としては、前者のコドンの出現個数と後者のコドンの出現個数との比を含む計算式ならいかなるものも用いることができる。「シャドー判別関数」の式の好適な例としては、前者のコドンの出現個数を「Ｈ」および後者のコドンの出現個数を「Ｌ」とした場合、Ｈ／Ｌ、Ｌ／Ｈ、（Ｈ／Ｌ＋１）、（Ｌ／Ｈ＋１）、１／（Ｈ／Ｌ＋１）、１／（Ｌ／Ｈ＋１）、２Ｈ／（Ｈ＋Ｌ）などが挙げられる。これらの計算式の中で、「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」を用い、さらに該逆数の値が一定値を下回るときに該ＣＤＳ−Ａを「偽のＣＤＳ」と判定することにより、ＣＤＳの同定精度を向上させることができる〔ここで、ｋは５以上２０以下の整数〕。
【０１５０】
以下に、本方法の具体的な「シャドー判別関数」の式の一例について説明する。
まず、６４種類のコドンを
ＴＴＡ、ＣＴＡ、ＴＣＡ、ＴＴＴ、ＴＴＣ、ＴＴＧ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＡＣ、ＡＧＣ、ＧＴＣ、ＧＣＣ、
ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＡＡＡ、ＧＡＡ、ＣＡＡ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＣＧＡ、ＡＴＡ、ＧＴＡ、ＡＣＡ、ＧＣＡ、ＣＣＡ、ＡＡＧ、ＧＡＧ、ＣＡＧ、ＡＧＧ、ＧＧＧ、ＣＧＧ、ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＡＣＧ、ＧＣＧ、ＡＡＴ、ＧＡＴ、ＡＧＴ、ＧＧＴ、ＧＴＴ、ＧＣＴ、ＧＡＣ、ＧＧＣ
の順で並べたとき、ｉ番目（ｉは３２以下）のコドンの３塩基は（ｉ＋３２）番目のコドンの３塩基の相補的配列を有する。ｉ番目のコドンの３塩基が真のＣＤＳに出現する頻度が高く、（ｉ＋３２）番目のコドンに相当する３塩基が真のＣＤＳに出現する頻度が低いと、ｉ番目のコドンの３塩基が反対鎖の塩基配列に出現する頻度が低く、（ｉ＋３２）番目のコドンに相当する３塩基が反対鎖の塩基配列に出現する頻度が高くなる。このことから、真のＣＤＳに出現するコドンを分析したとき、ｉ番目のコドンの３塩基の出現頻度と（ｉ＋３２）番目のコドンの３塩基の出現頻度の差を求め、その差の値が大きければ大きいほど、ｉ番目のコドンは真のＣＤＳに出現しやすく、また（ｉ＋３２）番目のコドンは真のＣＤＳの反対鎖の塩基配列に出現しやすくなる。
【０１５１】
すなわち、真のＣＤＳとしてＴ個のＣＤＳを選別し、選別したｔ番目のＣＤＳにおけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数６２】
2004310688.tif 000050
としたとき、上記の差ｙｉおよびｙｉ＋３２は次の式で表せる。
【数６３】
2004310688.tif 000051
または
【数６４】
2004310688.tif 000052
【０１５２】
次に、ｙｉとｙｉ＋３２（ｉは３２以下の正の整数）の値を計算し、その値が大きい順番に、上述の６４種類のコドンを並べ替える。ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選んだとき、ｎ番目のＣＤＳのシャドー判別関数（以下、Ｓｄと略記する）の値は次の式で表せる。
【数６５】
2004310688.tif 000053
（ｋは５  〜２０の整数）
ここで、
【数６６】
2004310688.tif 000054
が０のときは、Ｓｄｎの値は１とする。
【０１５３】
次のようにして、このシャドー判別関数Ｓｄの値をもとに、あるＯＲＦのＳｄの値を予め定めた閾値（例えば１．０）を越えるときに、「真」のＣＤＳと判定できる。また、２つのＣＤＳが重複する、または内包関係にあるときには、各ＣＤＳのＳｄ値を算出し、それらの値を比較することにより、ＣＤＳの真偽を判定できる。ＣＤＳでなく、転写単位の真偽を判定するときには、転写単位を構成するＣＤＳの全コドンをもとに、Ｓｄ値を算出した後、そのＳｄ値により転写単位の真偽を判定することができる。
【０１５４】
上記方法は、図１６に示すように、
（ｔ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べたコドンテーブルを作成し、メモリに格納し（Ｓ１６０１）；
（ｕ）すでに同定された原核生物のＴ個の翻訳領域の塩基配列を入力し、ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数６７】
2004310688.tif 000055
としたとき、下式（４）によりｙｉを、そして下式（５）によりｙｉ＋３２を求める（Ｓ１６０２）；
【数６８】
2004310688.tif 000056
または
【数６９】
2004310688.tif 000057
（ｖ）メモリから、ステップ（ｍ）で得られたコドンテーブルを呼び出し、テーブル中の各コドンのｙｉおよびｙｉ＋３２を対応付け、ｙｉおよびｙｉ＋３２の値が大きい順番に、テーブル中のコドンの配列を並べ替えた（Ｓ１６０３）後、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位ｋ個のコドンを選び、翻訳領域ＡのＳｄＡの値を下式（６）により求める（Ｓ１６０４）
【数７０】
2004310688.tif 000058
［ここで、
【数７１】
2004310688.tif 000059
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする］；
（ｗ）上記処理により求めた、翻訳領域ＡのＳｄＡの値が閾値Ｓ１以上であるときに該翻訳領域を真の翻訳領域とし、該ＳｄＡの値が閾値Ｓ１未満であるときに偽の翻訳領域と判定し（Ｓ１６０５）〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは３２以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｋは５〜２０の整数、Ｓ１は０．８〜１．８の値である。〕；
上記判定結果を出力装置により出力する処理をコンピューターに行なわせることにより実施することができる。
【０１５５】
２つのＣＤＳまたは転写単位の真偽の判定におけるシャドー判別関数Ｓｄの利用例としては、上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」より、長いＣＤＳ（ＣＤＳがコードするポリペプチドの長さがＬアミノ酸以上で、Ｌは１００以上の正の整数）を同定した後に、これらＣＤＳの配列情報から上述のシャドー判別関数Ｓｄの値を求め、該Ｓｄ値を閾値としてＣＤＳの真偽を判定することによりＣＤＳの同定精度を高めることができる。この方法において、ＣＤＳの同定法としては、上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」以外の方法を用いてもよい。
【０１５６】
プラス鎖のＣＤＳまたは転写単位とマイナス鎖のＣＤＳまたは転写単位が重複する、または内包関係にあるときに、双方の長さに大きな違いがある場合には、ＣＤＳまたは転写単位の長さが短い方を「偽のＣＤＳ」または「偽の転写単位」と判定してよい。しかし、長さの違いが大きくない場合には、上述の方法、特にそれぞれのＣＤＳまたは転写単位のシャドー判別関数の値を求めて比較することにより、ＣＤＳまたは転写単位の真偽を判定することができる。より好ましくは、ＣＤＳ−Ａのまたは転写単位Ａの長さＬＡ（塩基対）とＣＤＳ−Ｂまたは転写単位Ｂ長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、ＣＤＳ―Ｂまたは転写単位Ｂを「偽のＣＤＳ」または「偽の転写単位」と判定することができる〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数〕。さらに、ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、「シャドー判別関数」を用いる上記方法によりＣＤＳ−Ａまたは転写単位ＡとＣＤＳ−Ｂまたは転写単位Ｂの真偽を判定することができる〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数〕。
【０１５７】
このＣＤＳ−Ａまたは転写単位ＡとＣＤＳ−Ｂまたは転写単位Ｂの真偽を判定する方法は、上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」により同定されたＣＤＳに限定されず、周知のいかなる方法で同定されたＣＤＳまたは転写単位についても適用することができる。例えば、ＧｅｎＭａｒｋ〔Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ  ＆  ＭｃＩｎｉｎｃｈ，  Ｊ．  ：  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  １７，  １２３−１３３  （１９９３）〕、ＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍ〔Ｌｕｋａｓｈｉｎ，  Ａ．Ｖ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  １１０７  −  １１１５  （１９９８）、  Ｂｅｓｅｍｅｒ，  Ｊ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２７，  ３９１１  −  ３９２０  （１９９９）〕、Ｇｌｉｍｍｅｒ〔Ｓａｌｚｂｅｒｇ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  ｐ．５４４  −  ５４８  （１９９８）、Ｄｅｌｃｈｅｒ，  Ａ．Ｌ．ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２７，  ｐ．４６３６  −  ４６４１  （１９９９）〕、ＣＲＩＴＩＣＡ〔Ｂａｄｇｅｒ，  Ｊ．  Ｈ．  ＆  Ｌｏｓｅｎ，  Ｇ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  Ｖｏｌ．  １６，  ｐ．５１２  −  ５２４  （１９９９）〕、ＯＲＰＨＥＬＵＳ〔Ｆｒｉｓｈｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  ｐ．２９４１  −  ２９４７  （１９９８）〕、またはＧｅｎＭａｒｋＳ〔Ｂｅｓｅｍｅｒ，  Ｊ．，  Ｌｏｍｓａｄｚｅ，  Ａ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２９，  ２６０７  −  ２６１８  （２００１）〕などの、従来より知られた方法によって同定されたＣＤＳまたは転写単位について、上記のＣＤＳ−Ａまたは転写単位ＡとＣＤＳ−Ｂまたは転写単位Ｂの真偽を判定する方法を適用して、その真偽を判定することができるが、これらに限定されるものではない。
【０１５８】
図１１で示した方法において、互いに重複するＣＤＳまた転写単位の真偽を判定する処理は、上記「シャドー判別関数」を用いて判定することができる。
上述のように、近年多数の微生物の全ゲノム配列からＣＤＳを迅速にかつ高精度に同定する必要性が高まってきている。以下に、原核生物の全ゲノム配列からＣＤＳを同定する際に、上記のシャドー判別関数Ｓｄの値を利用して、ＣＤＳの同定精度を高める方法の例について詳述する。
サイズの大きいＤＮＡ（１０００塩基対以上のＤＮＡの塩基配列）から多数のＣＤＳを同定するときは、個々のＯＲＦに対して上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」などを繰り返して使用することによりＣＤＳを選別する。
【０１５９】
図１０に示すように、まずプラス鎖から各ＯＲＦについて開始コドンの同定を行うとともに、ＣＤＳとしての真偽を判定し、「真のＣＤＳ」であると判定されたＣＤＳが出現した場合、上述の方法により該ＣＤＳが同じ鎖上にある別のＣＤＳを内包するかどうか調べることにより、ＣＤＳの同定精度を高めることができる。なお、上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」を用いた場合、ＣＤＳだけでなく、転写単位の構造も同定できる。同様にして、マイナス鎖からもＣＤＳと転写単位の構造を同定した後、上述の方法により各転写単位が相補鎖上にある別の転写単位を内包するかどうか調べることにより、他の転写単位によって内包された転写単位を「偽の転写単位」と判定することにより転写単位およびＣＤＳの同定精度を高めることができる。このようにして同定したＣＤＳの情報をもとに、「真のＣＤＳ」と判定されたＣＤＳ内のコドンの出現頻度が高く、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンが該ＣＤＳに出現頻度が低い」という２種類のコドンの組み合わせをｋ通り（ｋは５〜２０の整数）選別する。このようにして選別した「出現頻度の高いｋ種類のコドン」と「出現頻度の低いｋ種類のコドン」をもとに、上述の方法により、各ＣＤＳのシャドー判別関数Ｓｄの値を求めることができる。
【０１６０】
次に、再び、上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」を用いてプラス鎖およびマイナス鎖からＣＤＳと転写単位の構造を同定する。
図１２に示すように、プラス鎖から選別したＵＰ１個の転写単位とマイナス鎖から選別したＵＭ１個の転写単位について、上述のシャドー判別関数Ｓｄの値を利用することにより、転写単位の真偽を判定し、転写単位およびＣＤＳの同定精度を高めることができる。
上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」とは別の方法によりＣＤＳを同定した場合には、となり合う２つのＣＤＳの距離、すなわち上流のＣＤＳの終止コドンと下流のＣＤＳの開始コドンの距離がＤＣ塩基対（ＤＣは３０〜１２０の整数）であるときにポリシストロンを形成すると判定することにより転写単位を形成することができる。
このようにして形成した転写単位について、上述のシャドー判別関数Ｓｄの値を利用することにより、転写単位の真偽を判定し、転写単位およびＣＤＳの同定精度を高めることができる。
【０１６１】
図１２において、Ｓ１２０１では、入力装置により解析すべき塩基配列データを入力する。
Ｓ１２０２では、プラス鎖とマイナス鎖の転写単位を選別し、終止コドンの位置を基準に５’末端から３’順に整列し、メモリに格納する。転写単位の選別・整列は、上記いかなる方法でもよい。
ついで、ＣＰＵは、Ｓ１２０２で格納されたプラス鎖とマイナス鎖の転写単位を５’末端側から順に１つずつ呼び出し、互いに内包しているかを調べ（Ｓ１２０３，Ｓ１２０６）、内包する場合は、２つの転写単位の長さを比較し（Ｓ１２０４，１２０７）、一方が他方のＰ１％以下であれば、各々のシャドー判別関数を計算、比較し（Ｓ１２０５、Ｓ１２０８）、シャドー判別関数の小さい方を偽とする。
この操作をＳ１２０２でメモリに格納された転写単位について行ない、その結果、偽としなかったプラス鎖とマイナス鎖の転写単位を選別し、終止コドンの位置を基準に５’末端から３’順に整列し、メモリに格納する（Ｓ１２０９）。
ついで、ＣＰＵは、Ｓ１２０９でメモリに格納されたプラス鎖とマイナス鎖の転写単位を５’末端側から順に１つずつ呼び出し、各５’’末端側と３’’末端側が重複しているかを調べ（Ｓ１２１０，Ｓ１２１３）、重複する場合は、２つの転写単位の長さを比較し（Ｓ１２１１，１２１４）、一方が他方のＰ１％以下であれば、各々のシャドー判別関数を計算、比較し（Ｓ１２１２、Ｓ１２１５）、シャドー判別関数の小さい方を偽とする。
この操作をＳ１２０９でメモリに格納された転写単位について行ない、その結果、偽としなかったプラス鎖とマイナス鎖の転写単位を選別し、この結果を出力装置により出力する（Ｓ１２１６）。
【０１６２】
［コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法］
以下に、本発明の「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」について詳述する。
ＧＣ含量が高い原核生物の塩基配列からＣＤＳを同定する場合、長いＯＲＦが多数存在するために、ＣＤＳを高精度に同定することは困難である。本発明では、ＧＣ含量が５０％を越える原核生物のＣＤＳの特徴として、該ＣＤＳ内のコドンの第１文字目および第３文字目の塩基のＧＣ含量が高いことを見い出し、この特徴をＣＤＳの同定精度を向上させるために利用した「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」を考案した。すなわち、該ＣＤＳ内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて該含量を算出した後、該含量が一定値を下回るときに該ＣＤＳを「偽のＣＤＳ」と判定することにより、原核生物のＣＤＳを同定する精度を高める方法である。塩基配列のＧＣ含量の値が５０％以上のとき本方法が適用できるが、６０％以上であることが望ましい。本方法の計算式としては、該ＣＤＳ内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式ならどのような計算式でも用いることができ、該計算式の好適な例としては、「該ＣＤＳ内の全コドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の総数を全コドンの塩基数で割った式」、「該総数を全コドンのＧ残基とＣ残基の総数で割った式」、または「該総数を全コドンの第２文字目のＧ残基とＣ残基の総数で割った式」を用いることができる。より好ましくは、該計算式の値が塩基配列のＧＣ含量に影響を受けにくい計算式を用いる。「該ＣＤＳ内の全コドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の総数を全コドンのＧ残基とＣ残基の塩基の総数で割った式」としては、下式（９）により算出されるｉ番目のＣＤＳに対するＧＣｉ（以下、「ＧＣ関数」またはＧＣと略記する）の値を用いることができる。
【数７２】
2004310688.tif 000060
〔ここで、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒ  ＝  １，  ２，  ３）の塩基がｂ（ｂ  ＝  １，  ２，  ３，  ４）のとき、
【数７３】
2004310688.tif 000061
であり、このとき、ｂは、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なおｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目のＣＤＳのコドンの総数（終止コドンを除く）を表わす。
ＧＣ含量が５０％のＣＤＳの「ＧＣ関数」の値を求めた場合、平均２／３（０．６６６６６）になる。すなわち「ＧＣ関数」の値は、２／３を中心に分散した値になる。ここで、ＧＣ含量が６０％越えるＣＤＳの「ＧＣ関数」の値は、ほとんどのＣＤＳについて２／３を越えることがわかった。したがって、上記の「ＧＣ関数」を用いてＣＤＳの真偽を判別する場合、一定値としては、０．６〜０．７５の範囲に入る数値を用いることが好ましい。
【０１６３】
本発明の「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」は、上述の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」により同定されたＣＤＳに限定されず、周知のいかなる方法で同定されたＣＤＳについても適用することができる。例えば、ＧｅｎＭａｒｋ〔Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ  ＆  ＭｃＩｎｉｎｃｈ，  Ｊ．  ：  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  １７，  １２３−１３３  （１９９３）〕、ＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍ〔Ｌｕｋａｓｈｉｎ，  Ａ．Ｖ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  １１０７  −  １１１５  （１９９８）、  Ｂｅｓｅｍｅｒ，  Ｊ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２７，  ３９１１  −  ３９２０  （１９９９）〕、Ｇｌｉｍｍｅｒ〔Ｓａｌｚｂｅｒｇ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  ｐ．５４４  −  ５４８  （１９９８）、Ｄｅｌｃｈｅｒ，  Ａ．Ｌ．ら：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２７，  ｐ．４６３６  −  ４６４１  （１９９９）〕、ＣＲＩＴＩＣＡ〔Ｂａｄｇｅｒ，  Ｊ．  Ｈ．  ＆  Ｌｏｓｅｎ，  Ｇ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  Ｖｏｌ．  １６，  ｐ．５１２  −  ５２４  （１９９９）〕、ＯＲＰＨＥＬＵＳ〔Ｆｒｉｓｈｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２６，  ｐ．２９４１  −  ２９４７  （１９９８）〕、またはＧｅｎＭａｒｋＳ〔Ｂｅｓｅｍｅｒ，  Ｊ．，  Ｌｏｍｓａｄｚｅ，  Ａ．  ＆  Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，  Ｍ．  ：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．  ２９，  ２６０７  −  ２６１８  （２００１）〕などの、従来より知られた翻訳領域を同定する方法によって同定されたＣＤＳについて、本発明の「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」を適用して、その同定精度を高めることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１６４】
上記「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」は、図１７に示すように、入力装置により入力された、ＧＣ含量が５０％を超える原核生物のすでに選択された翻訳領域のデータ（Ｓ１７０１）から、上記翻訳領域内のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を所定の計算式を用いて算出し（Ｓ１７０２）、この算出された含量が一定値を下回るときに該翻訳領域を「偽の翻訳領域」と判定し（Ｓ１７０３）、判定結果を出力装置により出力する処理を、コンピューターに行なわせることにより実施することができる。ＣＤＳを同定するときに、偽の開始コドンを選択することにより、ＣＤＳの同定精度が下がる場合がある。真のＣＤＳの開始コドンの上流のコドンを開始コドンとして選別した場合、真のＣＤＳの５’末端に偽のＣＤＳが連結した形になっている。そこで、該ＣＤＳの５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式を用いて該含量を算出した後、該含量が一定値を下回るときには、５’末端側の領域が真のＣＤＳの一部でない可能性が高い。このような場合は、この開始コドンから下流に向かって翻訳開始コドンを再検索することにより、開始コドンの同定精度を高めることができる。この開始コドンを再検索する方法としてはいかなる方法をも用いることができる。例えば、開始コドンの上流にリボソーム結合配列が存在することを指標として開始コドンを同定する方法、あるいは本発明の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」の中で用いられる開始コドンを同定する方法が挙げられる。該ＣＤＳの５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を与える計算式としては、上述の計算式を用いることができる。また５’末端側の領域としては３０〜３００塩基対の長さの領域が好ましい。
【０１６５】
上記方法は、入力装置により入力された、ＧＣ含量が５０％を超える原核生物のすでに選択された翻訳領域のデータから、上記翻訳領域の５’末端側の領域のコドンの第１文字目および第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量を、所定の計算式を用いて算出し、算出された含量が一定値を下回るとき、該翻訳領域の翻訳開始コドン「偽の翻訳開始コドン」と判定し、判定結果を出力装置により出力すると共に、入力装置により入力された、上記翻訳領域の塩基配列データを呼び出し、該偽翻訳開始コドンより下流に存在する翻訳開始コドンを再検索する処理をコンピューターに行なわせることにより実施することができる。
上記の「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」は、他のＣＤＳ同定法と組み合わせて用いることができる。好ましくは、本発明の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」および「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」を用いて、原核生物のＣＤＳを同定する精度を高めることができる。
原核細胞のＣＤＳを同定するときに、２つの公知の遺伝子構造同定方法を組み合わせてもＣＤＳ同定精度が向上しないこともあるが、本発明の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」または「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」のいずれかの方法は、多くの場合真のＣＤＳの塩基配列の出現頻度およびコドン使用頻度ならびにマルコフモデルおよび隠れマルコフモデルなどの確率過程のモデルを用いて算出した「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」を組み合わせることにより、さらにＣＤＳ同定精度を向上させることができる。
【０１６６】
前記の「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」の一例としては、すでに同定された原核生物のＴ個のＣＤＳの塩基配列をもとに、Ｔ個のＣＤＳにおいて「出現頻度の高いｍ種類のコドンがＣＤＳ―Ａに出現する個数」と「出現頻度の低いｍ種類のコドンがＣＤＳ―Ａに出現する個数」の比較を可能にする計算式を用いて該ＣＤＳ―Ａの真偽を判定する方法を挙げることができるが、コーディング・ポテンシャルを表わす計算式なら、いかなる計算式を用いることもできる〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｍは５以上２０以下の整数〕。
【０１６７】
前記の計算式の例として、「出現頻度が高いｍ種類のコドンがＣＤＳ―Ａに出現する個数」と「出現頻度が低いｍ種類のコドンがＣＤＳ―Ａに出現する個数」の比較を可能にする計算式として、「前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」が挙げられるが、この逆数の一例である「Ｃｄ値」は下記で表される。
【数７４】
2004310688.tif 000062
ここで、
【数７５】
2004310688.tif 000063
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする。
上記の「コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳを真偽を判定する方法」の一例は、
（ｔ）ｉ番目のコドンの３塩基の配列が（ｉ＋３２）番目のコドンの塩基配列と相補的な配列を持つように、６４種類のコドンを並べたコドンテーブルを作成し、メモリに格納する；
（ｚ）ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数７６】
2004310688.tif 000064
としたとき、下式（７）によりｙｉを求める；
【数７７】
2004310688.tif 000065
（ａａ）メモリのコドンテーブルを呼び出し、ｙｉが大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、翻訳領域ＡのＣｄＡの値を下式（７）により求める
【数７８】
2004310688.tif 000066
［ここで、
【数７９】
2004310688.tif 000067
が０のときは、ＣｄＡの値は１とする］；
（ａｂ）ステップ（ａａ）で算出した翻訳領域ＡのＣｄＡの値が閾値ＣＶ以上であるときに該翻訳領域を真の翻訳領域とし、該ＣｄＡの値が閾値ＣＶ未満であるときに偽の翻訳領域とし、判定結果を出力装置により出力する〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｊは６４以下の正の整数、ｔはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０の整数、ＣＶは０．８〜１．８の値とする〕
処理をコンピューターに行なわせることにより実施することができる。
【０１６８】
原核生物のＣＤＳ―Ａが相補鎖のＣＤＳ―Ｂと重複し、かつＣＤＳ―ＢがＣＤＳ―Ａによって内包される場合に、上述の方法を用いて同じ原核生物の別のＣＤＳを同定するときに、下記（ｘ）と（ｙ）の工程を含む方法を用いてＣＤＳの「真偽」を判定してもよい。
（ｘ）ＣＤＳ―Ａの長さＬＡ（塩基対）とＣＤＳ―Ｂの長さＬＢ（塩基対）を比較し、ＬＢがＬＡのＴＰ％以下のときに、ＣＤＳ―Ｂを「偽のＣＤＳ」と判定する、および
（ｙ）ＬＢがＬＡのＴＰ％を越えるとき、「出現頻度が高いｍ種類のコドンがＣＤＳ―Ａに出現する個数と出現頻度が低いｍ種類のコドンがＣＤＳ―Ａに出現する個数の比較を可能にする計算式として前者の個数に対する後者の個数の割合に１を加算したものの逆数」または「上述のＣｄ値」を用いる上述の方法によりＣＤＳ―ＡとＣＤＳ―Ｂの真偽を判定する〔ここで、ＴＰは３０〜９５の正の整数〕。
前記の方法を用いて転写単位の真偽を判定する場合に、各転写単位を構成するＣＤＳの終止コドンを除いたＣＤＳを連結して、一つのＣＤＳにした後に、前記の方法を適用することもできる。
【０１６９】
本発明で開示した「小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法」、「ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法」、「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」または「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」は、コンピュータを用いることにより高速に実行することができる。このためには、本発明の方法の各手順をコンピュータに指示するプログラムを作成する必要がある。本プログラムは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｐｅｒｌ、Ｆｏｒｔｒａｎ、ＢＡＳＩＣ、ＪＡＶＡ（登録商標）などのプログラミング言語を用いて作成することができる。本プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）、ＬＩＮＵＸ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＭａｃＯＳなどのオペレーティング・システム上で実行させることができる。
上記プログラムを実行させるために使用するコンピュータとしては、コンピュータとしての機能を有するものであればいずれも使用することができるが、計算速度の速いものが好ましい。具体例としては、セイコーエプソン株式会社製のパーソナルコンピュータ  エンデバー（Ｅｎｄｅａｖｏｒ）  ＭＴ−６０００、日本電気株式会社のパーソナルコンピュータ  ラビー（ＬａＶｉｅ）Ｍ  ＬＭ３００／１等を挙げることができる。本発明で開示した各方法または各工程は同一のコンピュータを用いて行う必要はない。すなわち、本発明で述べたある工程または方法で得られた結果を別のコンピュータに出力し、該コンピュータで次工程または別の方法の処理を行ってもよい。
【０１７０】
本発明で開示した「小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法」、「ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法」、「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」、「シャドー判別関数を用いた遺伝子構造同定方法」または「コドン内の塩基のＧＣ含量に着目した遺伝子構造同定方法」の手順をコンピュータに実行させるプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体を利用することにより、各方法を自動化することができる。該記録媒体は本発明の記録媒体である。
「コンピューターで読み取り可能な記録媒体」とは、コンピューターによって直接読みとられ、アクセスされうる任意の記録媒体をいう。このような記録媒体としては、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気記憶媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、ＤＶＤ＋Ｒ、ＤＶＤ＋ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、等の光学記憶媒体、ＲＡＭやＲＯＭ等の電気記憶媒体、およびこれらのカテゴリーのハイブリッド（例えばＭＯ等の磁気／光学記憶媒体）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１７１】
上記本発明のコンピューターで読みとり可能な記録媒体を利用した、コンピューターに基づく遺伝子構造同定システムは本発明のシステムである。
また上記本発明のコンピューターで読みとり可能な記録媒体を利用した、コンピューターに基づくＤＮＡ断片が由来した微生物の推定システムは本発明のシステムである。
「コンピューターに基づく遺伝子構造同定システム」および「コンピューターに基づくＤＮＡ断片が由来した微生物の推定システム」とは、本発明のコンピューターで読みとり可能な本発明の記録媒体に記録された情報を分析するために使用される、ハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段より構成されたものをいう。
【０１７２】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。
下記の実施例に示した手順をコンピュータに指示するためのプログラムを、プログラム言語Ｐｅｒｌバージョン５を用いて作成し、本プログラムをＰｅｒｌインタープリター・バージョン５．６．１を介してオペレーティングシステムＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＸＰ上で実行した。コンピュータとしてはセイコーエプソン株式会社製のパーソナルコンピュータ  エンデバー（Ｅｎｄｅａｖｏｒ）  ＭＴ−６０００、日本電気株式会社のパーソナルコンピュータ  ラビー（ＬａＶｉｅ）Ｍ  ＬＭ３００／１を用いた。
【０１７３】
実施例１  配列ＮＣ＿００２５１６の一部の配列からのＣＤＳの同定および微生物の種名の推定（１）：転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法を利用した遺伝子構造の同定と生物の種名の推定
図７および図８のフローチャートに示した手順に従って、米国の生命情報の管理機関であるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下、ＮＣＢＩと略記する）のＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列ファイルＮＣ＿００２５１６の配列から一部の配列を取り出し、その配列からＣＤＳ（真のＯＲＦということもある）を同定するとともに、その断片が由来した微生物の種名を推定した。その詳細を下記に述べる。
【０１７４】
（１）原核生物９１種類の翻訳領域の塩基配列データ
微生物の種名は、次の示す９１種類の原核生物の中から、下記に述べる方法により推定した。これら９１種類の微生物はＧｅｎＢａｎｋに全ゲノムの塩基配列データとアノテーション情報が登録されている微生物である。これらの微生物の全ゲノムの塩基配列データとアノテーション情報は、下記に掲げる微生物の名前の右横に付加した括弧内に示した登録番号のファイルとして、ＧｅｎＢａｎｋからインターネット経由で取得し、ハードディスク上に保存した。
【０１７５】
（微生物１）Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１（ＮＣ＿０００８５４）
（微生物２）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｃ５８（ＮＣ＿００３０６２）
（微生物３）Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５（ＮＣ＿０００９１８）
（微生物４）Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ  ＤＳＭ４３０４（ＮＣ＿０００９１７）
（微生物５）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｃ−１２５（ＮＣ＿００２５７０）
（微生物６）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（ＮＣ＿０００９６４）
（微生物７）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＮＣＣ２７０５（ＡＥ０１４２９５）
（微生物８）Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  Ｂ３１（ＮＣ＿００１３１８）
（微生物９）Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ  １６Ｍ（ＮＣ＿００３３１７）
（微生物１０）Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ  １３３０（ＡＥ０１４２９１）
（微生物１１）Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ  ｓｔｒ．  Ｓｇ（ＡＥ０１３２１８）
（微生物１２）Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ｓｐ．  ＡＰＳ（ＮＣ＿００２５２８）
（微生物１３）Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ１１１６８（ＮＣ＿００２１６３）
（微生物１４）Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣＢ１５（ＮＣ＿００２６９６）
（微生物１５）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ（ＮＣ＿００２６２０）
（微生物１６）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＲ３９（ＮＣ＿００２１７９）
（微生物１７）Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＣＷＬ０２９（ＮＣ＿０００９２２）
（微生物１８）Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｊ１３８（ＮＣ＿００２４９１）
（微生物１９）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  Ｄ／ＵＷ−３／ＣＸ  （ｓｅｏｖａｒ  Ｄ）（ＮＣ＿０００１１７）
（微生物２０）Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ  ＴＬＳ（ＡＥ００６４７０）
（微生物２１）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４（ＮＣ＿００３０３０）
（微生物２２）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  １３（ＮＣ＿００３３６６）
（微生物２３）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（ＮＣ＿００３４５０）
（微生物２４）Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  Ｒ１（ＮＣ＿００１２６３）
（微生物２５）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２（ＮＣ＿０００９１３）
（微生物２６）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７（ＮＣ＿００２６９５）
（微生物２７）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  ＥＤＬ９３３（ＮＣ＿００２６５５）
（微生物２８）Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５５８６（ＮＣ＿００３４５４）
（微生物２９）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ（ＮＣ＿０００９０７）
（微生物３０）Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＮＲＣ−１（ＮＣ＿００２６０７）
（微生物３１）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ２６６９５（ＮＣ＿０００９１５）
（微生物３２）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ，  ｓｔｒａｉｎ  Ｊ９９（ＮＣ＿０００９２１）
（微生物３３）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ（ＮＣ＿００２６６２）
（微生物３４）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ  Ｃｌｉｐ１１２６２（ＮＣ＿００３２１２）
（微生物３５）Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＥＧＤ（ＮＣ＿００３２１０）
（微生物３６）Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ  ＭＡＦＦ３０３０９９（ＮＣ＿００２６７８）
（微生物３７）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  ｓｔｒ．  Ｃ２Ａ（ＮＣ＿００３５５２）
（微生物３８）Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＤＳＭ２６６１（ＮＣ＿０００９０９）
（微生物３９）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｇｏｅ１（ＮＣ＿００３９０１）
（微生物４０）Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ｄｅｌｔａ  Ｈ（ＮＣ＿０００９１６）
（微生物４１）Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ  ＡＶ１９（ＮＣ＿００３５５１）
（微生物４２）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ  Ｇ３７（ＮＣ＿０００９０８）
（微生物４３）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ  ｓｔｒａｉｎ  ＴＮ（ＮＣ＿００２６７７）
（微生物４４）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｍ１２９（ＮＣ＿０００９１２）
（微生物４５）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｕｌｍｏｎｉｓ  ｓｔａｉｎ  ＵＡＢ  ＣＴＩＰ（ＮＣ＿００２７７１）
（微生物４６）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＣＤＣ１５５１（ＮＣ＿００２７５５）
（微生物４７）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ（ＮＣ＿０００９６２）
（微生物４８）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＣ５８（ＮＣ＿００３１１２）
（微生物４９）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒａｉｎ  Ｚ２４９１（ＮＣ＿００３１１６）
（微生物５０）Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０（ＮＣ＿００３２７２）
（微生物５１）Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ  ＨＴＥ８３１（ＢＡ００００２８）
（微生物５２）Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  ＰＭ７０（ＮＣ＿００２６６３）
（微生物５３）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１（ＮＣ＿００２５１６）
（微生物５４）Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ  ＩＭ２（ＮＣ＿００３３６４）
（微生物５５）Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ３（ＮＣ＿０００９６１）
（微生物５６）Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ  ＧＥ５（ＮＣ＿０００８６８）
（微生物５７）Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＧＭＩ１０００（ＮＣ＿００３２９６）
（微生物５８）Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｃｏｎｏｒｉｉ  Ｍａｌｉｓｈ  ７（ＮＣ＿００３１０３）
（微生物５９）Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｍａｄｒｉｄ  Ｅ（ＮＣ＿０００９６３）
（微生物６０）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ（ＮＣ＿００３１９８）
（微生物６１）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２（ＮＣ＿００３１９７）
（微生物６２）Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ＭＲ−１（ＡＥ０１４２９９）
（微生物６３）Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ｓｔｒ．３０１（ＡＥ００５６７４）
（微生物６４）Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  １０２１（ＮＣ＿００３０４７）
（微生物６５）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｍｕ５０（ＮＣ＿００２７５８）
（微生物６６）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ａｕｒｅｕｓ  ＭＷ２（ＮＣ＿００３９２３）
（微生物６７）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ａｕｒｅｕｓ  Ｎ３１５（ＮＣ＿００２７４５）
（微生物６８）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ２６０３（ＡＥ００９９４８）
（微生物６９）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）（ＮＣ＿００３８８８）
（微生物７０）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９（ＡＥ０１４１３３）
（微生物７１）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６（ＮＣ＿００３０９８）
（微生物７２）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＴＩＧＲ４（ＮＣ＿００３０２８）
（微生物７３）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍ１（ＮＣ＿００２７３７）
（微生物７４）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ３１５（ＮＣ＿００４０７０）
（微生物７５）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＧＡＳ８２３２（ＮＣ＿００３４８５）
（微生物７６）Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  Ｐ２（ＮＣ＿００２７５４）
（微生物７７）Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ  ７（ＮＣ＿００３１０６）
（微生物７８）Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３（ＮＣ＿０００９１１）
（微生物７９）Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＤＳＭ１７２８（ＮＣ＿００２５７８）
（微生物８０）Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ  ＢＰ−１（ＢＡ００００３９）
（微生物８１）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ  ＭＳＢ８（ＮＣ＿０００８５３）
（微生物８２）Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＢ４Ｔ（ＮＣ＿００３８６９）
（微生物８３）Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ  ＧＳＳ１（ＮＣ＿００２６８９）
（微生物８４）Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（ＮＣ＿０００９１９）
（微生物８５）Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ  ｓｅｒｏｖａｒ  ３（ＮＣ＿００２１６２）
（微生物８６）Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（ＮＣ＿００２５０５）
（微生物８７）Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ  ｐｖ．  ｃｉｔｒｉ  ｓｔｒ．  ３０６（ＮＣ＿００３９１９）
（微生物８８）Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｓｔｒ．  ＡＴＣＣ  ３３９１３（ＮＣ＿００３９０２）
（微生物８９）Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  ９ａ５ｃ（ＮＣ＿００２４８８）
（微生物９０）Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＣＯ９２（ＮＣ＿００３１４３）
（微生物９１）Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＫＩＭ（ＡＥ００９９５２）
【０１７６】
（２）９１種類の微生物のコドン使用頻度の算出
上記の９１種類の微生物について、ハードディスクに保存した各微生物の塩基配列データとアノテーション情報のファイルから、翻訳領域がコードするペプチド配列の長さは１００アミノ酸以上の翻訳領域を選択した。各微生物ごとに選択した翻訳領域の塩基配列から、２０種類のアミノ酸からトリプトファンとメチオニンを除く１８種類のアミノ酸に対するコドン、すなわち５種類のコドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＧＧ、ＡＴＧ）を除く５９種類のコドンの出現度数を算出した。これらの出現度数をもとに、下式（１）に従って、コドン使用頻度を算出した。
【数８０】
2004310688.tif 000068
〔ここで、ｆｐｑ（ｓ） は、１８種類のアミノ酸の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
【０１７７】
（３）配列番号ＮＣ＿００２５１６の一部の配列の取得
上述のようにしてハードディスクに保存した配列番号ＮＣ＿００２５１６のファイルの塩基配列から、塩基位置１から３２００までの配列を得た。この配列をプラス鎖の配列と名付ける。この配列の相補鎖の配列も計算により得た。以下、この配列をマイナス鎖の配列とと名付ける。
続いて、下記（４）から（１１）までの手順に従い、プラス鎖の配列とマイナス鎖の配列から、翻訳領域を同定した。
【０１７８】
（４）最長のＯＲＦを与える仮の開始コドンの同定
（３）で得たプラス鎖の配列に存在する終止コドンＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡを検索した。検索された各終止コドンについて最も長いＯＲＦを与える仮の開始コドン（ＡＴＧ、ＧＴＧ、およびＴＴＧのいずれか）を同定した後、長さが２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦを選別した。該選別により２個のＯＲＦが検出された。終止コドンの位置に基づき、各ＯＲＦは終止コドンの位置で、５’末端側から順番に、ＯＲＦ−Ｄ１、ＯＲＦ−Ｄ２の番号を付けた。ＯＲＦ−Ｄ１の仮の開始コドンの位置は４５０、終止コドンの位置は、２０３０であった。ＯＲＦ−Ｄ２の仮の開始コドンの位置は２０５６、終止コドンの位置は３１６２であった。
同様にして、マイナス鎖に関して終止コドンの検索および仮の開始コドンを同定した結果、３個のＯＲＦが選別された。長さが２００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするを選別し、終止コドンの位置に基づき、マイナス鎖の３’末端側から順番に、ＯＲＦ−Ｃ１、ＯＲＦ−Ｃ２の番号を付けた。ＯＲＦ−Ｃ１の仮の開始コドンの位置は１９６１、終止コドンの位置は７１１であった。ＯＲＦ−Ｃ２の仮の開始コドンの位置３１０８は、終止コドンの位置は１９６３であった。
【０１７９】
（５）リボソーム結合スコアの算出と開始コドンの検索の方法
ＯＲＦ−Ｄ１は上流にＯＲＦが存在しなかったため、以下の方法によって算出したリボソーム結合スコアをもとに開始コドンの同定を行った。
配列番号ＮＣ＿００２５１６の塩基配列が由来した微生物は不明であるとして翻訳領域の同定を行うので、ｍＲＮＡとリボソームとの結合に関与しうる１６Ｓ  ＲＮＡの３’末端の配列を３’―ＮＵＵＣＣＵＣＣＡＣＵＡ―５’として、以下の計算を実施した。すなわち、
図５に示した手順に従って、この配列のうち、３’―ＵＵＣＣＵＣＣＡ―５’と開始コドンの上流８塩基の配列との対合状態を調べ、
ＧとＣの対合：＋４、
ＡとＵの対合：＋２、
ＧとＵの対合：＋１、
対合が観察された塩基の次の塩基で対合が見られない場合：−１、
開始コドンがＧＴＧの場合：−２、
開始コドンがＴＴＧの場合：−４、
とし、これらの数値を足し合わせたものをリボソーム結合スコア（Ｓ）とした。ただし、３’−ＵＵＣＣＵＣＣＡ−５’の最後の塩基Ａが関与する対合に関してはスコアを与えなかった。
対合状態を調べる開始コドンの上流の８塩基は、上流１７塩基目から１０塩基目までの領域から、上流１０基目から３塩基目までの領域の８通りの配列を用いた。この８通りの配列（以下，上流に存在するはいれつから順にＵ−１〜Ｕ−８と名付ける）についてリボソーム結合スコアを求めて、最大値を与えるものを選んだ。
もし同じ最大値を与える配列が２つ以上存在した場合には、Ｕ−４、Ｕ−５、Ｕ−６を優先し、次にＵ−７、Ｕ−８を優先した。
【０１８０】
このリボソーム結合スコアの算出方法を用いて、各ＯＲＦの５’末端の開始コドンの候補から順番に最大１０個の開始コドンの候補（ＡＴＧ、ＧＴＧまたはＴＴＧ）についてリボソーム結合スコア（Ｓ）を算出した。
【０１８１】
各ＯＲＦの５’末端から順番に、１番目から５番目までの５個の開始コドンの候補についてリボソーム結合スコア（Ｓ）を閾値Ｖ１（Ｖ１  ＝  ９．０とする）と比較し、この閾値を越えた場合（Ｓ＞Ｖ１）、その開始コドン候補を真の開始コドン候補として選別した。Ｖ１を越えるリボソーム結合スコアがない場合には、閾値Ｖ２（Ｖ２  ＝  ７．０）を越える（Ｓ＞Ｖ２）開始コドンの候補が存在するときには、その開始コドンの候補を真の開始コドン候補として選別した。
【０１８２】
いずれの閾値を越える開始コドンの候補がない場合には、５’末端から数えて６番目から１０番目の５個の開始コドン候補のリボソーム結合スコアを求めた後、第一番目の開始コドンから順番に各開始コドンのリボソーム結合スコアを調べて、その値が閾値Ｖ３（Ｖ３＝  ６．０）以上であった場合には、その値を与えた開始コドンの候補を開始コドンとして選別した。
【０１８３】
すべての開始コドンの候補のリボソーム結合スコアが閾値Ｖ３を下回る場合には（Ｓ＜Ｖ３）、選別すべき開始コドンの候補が存在しなかった場合には、そのＯＲＦを「偽のＣＤＳ」とした。
その結果、ＯＲＦ−Ｄ１の真の開始コドン候補は４８３番目の塩基であった。
【０１８４】
同様にして、ＯＲＦ−Ｃ２の真の開始コドン候補は３１０８番目の塩基であった。
【０１８５】
（６）ポリシストロンの転写単位を形成する可能性があるＯＲＦの検索
上記（５）で選別されたＯＲＦ−Ｄ１の真の開始コドン候補に基づくＯＲＦを利用し、下流に存在するＯＲＦがポリシストロンを形成する可能性があるか調べた。
【０１８６】
上記（５）で選別されたＯＲＦ−Ｄ１の真のＯＲＦ候補と判定されたＯＲＦについて、その終止コドンのその終止コドンの下流６０塩基以内にＯＲＦ−Ｄ２の仮の開始コドンが存在していたため、ＯＲＦ−Ｄ２はＯＲＦ−Ｄ１とポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定した。
【０１８７】
同様に、ＯＲＦ−Ｃ２もＯＲＦ−Ｃ１とポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定された。
【０１８８】
（７）ポリシストロンの転写単位を形成する可能性があるＯＲＦの開始コドンの同定
上記（４）により、ＯＲＦ−Ｄ１とＯＲＦ−Ｄ２はポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定されたので、以下に述べる「図４に示した開始コドンの優先順位の規則」（これを「ランク関数」と呼び、値は１以上の整数を持つ）に従って、真の開始コドンを同定した。
ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの「近傍」は、図４の中のランク関数が１から８までの値を取る領域とした。この領域にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補（ＡＴＧまたはＧＴＧ）が存在するときには、上記の方法で求めたリボソーム結合スコアがいかなる値でも「開始コドン」として同定した。なお、この「近傍」の領域のみ、開始コドンの候補として、ＡＴＧかＧＴＧに限定した。
ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補が存在しないときには、ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍の下流域にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補（ＡＴＧ、ＧＴＧまたはＴＴＧ）が存在するかどうかを調べた。ポリシストロンを形成する条件としてＯＲＦ−Ｂの終止コドンとＯＲＦ−Ａの開始コドンの間の距離を６０塩基以内としたので、ランク関数の値が９〜２３までの値を取る領域にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補が存在するときには、ランク関数値が小さい順に、上の（３）で述べた方法を用いて各開始コドンの候補のリボソーム結合スコアを算出し、該スコアが閾値Ｖ３（６．０）以上であった場合に、その候補を開始コドンとして選別した。
【０１８９】
ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍にも、さらにその近傍の下流域にも、ＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補が存在しないときには、ＯＲＦ−Ｂの終止コドンの近傍の上流域にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補（ＡＴＧ、ＧＴＧまたはＴＴＧ）が存在するかどうかを調べた。その近傍の下流域は、ランク関数の値が２４〜ＲＤＮまでの値を取る領域にＯＲＦ−Ａの開始コドンの候補が存在するときには、ランク関数値が小さい順に、上の（３）で述べた方法を用いて各開始コドンの候補のリボソーム結合スコアを算出し、該スコアが閾値Ｖ３（６．０）以上であった場合に、その開始コドンの候補を開始コドンとして選別した。なお、ＯＲＦ−Ａのアミノ酸数の１０％以下の値に一番近い整数値を求めて、これに２３を足したをＲＤＮの値としたが、その値が５３を越える場合には、ＲＤＮの値を５３とした。
その結果、ＯＲＦ−Ｄ２の真の開始コドン候補の位置は２０５６番目の塩基、ＯＲＦ−Ｃ１の真の開始コドン候補の位置は１８８１番目の塩基であった。
【０１９０】
（８）上記の工程で同定できなかったＯＲＦの開始コドンの同定
上記の工程で、ポリシストロンの転写単位を形成する可能性がないと判定されたＯＲＦ―Ａが存在した場合には、以下のようにして、真の開始コドンを同定した。
【０１９１】
上述の（５）の方法を用いて、真の開始コドン候補を同定するとともに、ＯＲＦ−Ａが真のＯＲＦであるかどうかを判定した。同定した真の開始コドン候補の位置とＯＲＦ−Ａの上流にあるすべてのＯＲＦの終止コドンの位置を比較して、ＯＲＦ−Ａが上流のＯＲＦと重複するかどうか調べた。ＯＲＦ−ＡがあるＯＲＦ−Ｂと重複することがわかった場合には、その重複領域の長さが９０塩基対以上であるか、ＯＲＦ−Ｂの長さの１０％以上であるかどうかを調べた。
重複領域の長さが９０塩基対以上、またはＯＲＦ−Ｂの長さの１０％以上である場合には、そのＯＲＦ−Ａを「偽のＯＲＦ」と判定した。また、重複領域の長さが９０塩基対以下あるいはＯＲＦ−Ｂの長さの１０％以下である場合には、ＯＲＦ−Ａを「真のＯＲＦの候補」として選別した。
【０１９２】
（９）同じ鎖で内包されるＯＲＦの消去
上述の工程で、ＯＲＦ−Ａが「真のＯＲＦの候補」として選別された場合には、そのＯＲＦ−Ａの上流にあるすべての「真のＯＲＦの候補」について、そのＯＲＦ−Ａの開始コドンと終止コドンの間に内包されるかどうか調べ、内包されるＯＲＦはすべて「偽のＯＲＦ」と判定した。この判定方法により、ＯＲＦ−Ｄ１、ＯＲＦ−Ｄ２の２個のＯＲＦはすべて「真のＯＲＦの候補」と判定された。
【０１９３】
（１０）マイナス鎖上のＯＲＦの候補の選別
上述のプラス鎖上の「真のＯＲＦの候補」の選別と全く同じ手順で、マイナス鎖上の「真のＯＲＦの候補」を同定した。その結果、、ＯＲＦ−Ｃ１、ＯＲＦ−Ｃ２の２個のＯＲＦはすべて「真のＯＲＦの候補」と判定された。
該結果より、ＯＲＦ−Ｃ１はＯＲＦ−Ｃ２とポリシストロンの転写単位を形成する可能性があると判定された。
【０１９４】
（１１）プラス鎖とマイナス鎖の転写単位の比較
個々の真のＯＲＦ（ＣＤＳ）について、該ＣＤＳの開始コドンとその上流のＣＤＳの終止コドンの距離が９０塩基対以内のときは、双方のＣＤＳは同一転写単位上に存在すると判定した。
【０１９５】
このようにして転写単位の構造を、プラス鎖およびマイナス鎖について調べた結果、プラス鎖の転写単位の数は１個で、マイナス鎖の転写単位の数は１個であることがわかった。
【０１９６】
個々の転写単位の先頭のＣＤＳの開始コドンの位置と最後尾のＣＤＳの終止コドンの位置を求めて、プラス鎖の転写単位とマイナス鎖の転写単位の間で重複領域があるかどうか調べた。
【０１９７】
マイナス鎖で同定された１個の転写単位はプラス鎖で同定された１個の転写単位と重複領域が存在したため、以下の方法で転写単位の真偽の判定を行った。なお転写単位の長さは、「先頭のＣＤＳの開始コドンの位置」と「最後尾のＣＤＳの終止コドンの位置」の差とした。
【０１９８】
プラス鎖の転写単位Ｐがマイナス鎖の転写単位Ｑを内包する場合、マイナス鎖の転写単位Ｑを「偽の転写単位」とした。次に、プラス鎖の転写単位Ｐがマイナス鎖の転写単位Ｑに内包される場合、転写単位Ｐを「偽の転写単位」とした。
【０１９９】
また、転写単位Ｐと転写単位Ｑが重複しているが、転写単位Ｐが転写単位Ｑを内包していないし、また転写単位Ｑが転写単位Ｐを内包していない場合には、転写単位ＰとＱの長さを比較して、長さが短い方を「偽の転写単位」とした。
最終的に、転写単位Ｐと転写単位Ｑの真偽を判定できなかった場合には、いずれの転写単位も真とした。
【０２００】
このような転写単位の真偽の判定方法を用いた結果、マイナス鎖のモノシストロンの転写単位は、「偽の転写単位」と判定された（表１参照）。
【０２０１】
（１２）同定されたＣＤＳに関する情報のメモリーへの記憶
上記の工程により同定されたＣＤＳに関する情報をメモリーに記憶した。記憶された情報を表１に示した。
【０２０２】
【表１】
2004310688.tif 000069
なお、表中、転写単位に関する構造情報としては、モノシストロンのＣＤＳに対して「１」というラベルを与え、また先頭のＣＤＳ、最後尾のＣＤＳ、および先頭のＣＤＳと最後尾のＣＤＳに挟まれた内部に存在するＣＤＳに対しては、それぞれ「２」、「４」、「３」というラベルを与えている。
【０２０３】
（１３）同定されたＣＤＳのコドン使用頻度の算出
同定されたＣＤＳの塩基配列から５種類のコドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＧＧ、ＡＴＧ）を除く５９種類のコドンの出現度数を算出した。これらの出現度数をもとに、下式（１０）に従って、コドン使用頻度を算出した。
【数８１】
2004310688.tif 000070
〔ここで、ｆｐｑ（ｓ） は１８種類のアミノ酸の中でｓ番目のアミノ酸に関するｑ番目の同義コドンの出現度数である。Ｍ（ｓ）  は、ｓ番目のアミノ酸の同義コドンの種類である。〕
【０２０４】
（１４）コドン使用頻度の類似度の計算
上記（１３）で算出したコドン使用頻度ｘ’’’ｑ（ｓ）  が、上記９１種類のコドン使用頻度ｘｑ（ｓ）のうち、最も類似しているものを、次に示す計算方法でユークリッド距離Ｄを算出することにより選択した。
【数８２】
2004310688.tif 000071
その結果、上記（１３）で算出したコドン使用頻度ｘ’’’ｑ（ｓ）  は、（微生物５３）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１のコドン使用頻度に最も近く、ユークリッド距離Ｄの値は２．４５であった。
【０２０５】
（１５）３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦの検索
上記（３）記載の３２００塩基対の配列より、上記（４）〜（１１）記載の方法に準じて、３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦの終止コドンおよび仮の開始コドンを同定した。ただし、ＯＲＦの長さが１８０塩基対未満であり、かつ開始コドンがＴＴＧであるＯＲＦはＣＤＳとして選別しなかった。
プラス鎖からは８個のＯＲＦを、およびマイナス鎖からは１３個のＯＲＦを同定した。各ＯＲＦは終止コドンの位置で、プラス鎖の５’末端側から順番にＯＲＦ−Ｄ１０１〜ＯＲＦ−Ｄ１０８、マイナス鎖の３’末端側から順番にＯＲＦ−Ｃ１０１〜ＯＲＦ−Ｃ１１３までの番号を付けた。これれ２１個のＯＲＦについて、次の４つの条件を同時に満たすＯＲＦを真のＣＤＳとして判定した。
（ｉ）上述の（５）の方法に従って翻訳開始コドンを検索することにより、翻訳開始コドンが同定でき、アミノ酸数が３４以上である。
（ｉｉ）（ｉ）で同定された翻訳開始コドンを持つＯＲＦのシャドー判別関数の値を下記（１６）に述べる方法により求めることにより、その値が設定した閾値を越えている。
（ｉｉｉ）（ｉ）で同定された翻訳開始コドンを持つＯＲＦのコード関数の値を下記（１７）に述べる方法により求めることにより、その値が設定した閾値を越えている。
（ｉｖ）（ｉ）で同定された翻訳開始コドンを持つＯＲＦが同じ鎖上の他のＯＲＦが重複するときに、下記（１８）に述べる方法により真のＣＤＳと判定される。
【０２０６】
（１６）シャドー判別関数によるＣＤＳの真偽の判定
上記（１５）で翻訳開始コドンが同定された各ＯＲＦについて、シャドー判別関数を用いてＣＤＳの真偽を判定する方法により、ＣＤＳとしての真偽の判定を次のようにして行った。
上記（１４）で、同定されたＣＤＳのコドン使用頻度が、（微生物５３）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１のコドン使用頻度に最も近いことがわかったので、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１のアノテーション情報のファイルであるＮＣ＿００２５１６から、アミノ酸数１００以上の翻訳領域を選び出し、それら翻訳領域の塩基配列データをもとに、該コドンの３塩基の配列の相補的配列を有するコドンが該ＣＤＳに出現頻度が低い」というコドンの組み合わせを１２通り選んだ後、シャドー判別関数の値を求めた。
【０２０７】
すなわち、６４種類のコドンを
ＴＴＡ、ＣＴＡ、ＴＣＡ、ＴＴＴ、ＴＴＣ、ＴＴＧ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＡＣ、ＡＧＣ、ＧＴＣ、ＧＣＣ、
ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＡＡＡ、ＧＡＡ、ＣＡＡ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＣＧＡ、ＡＴＡ、ＧＴＡ、ＡＣＡ、ＧＣＡ、ＣＣＡ、ＡＡＧ、ＧＡＧ、ＣＡＧ、ＡＧＧ、ＧＧＧ、ＣＧＧ、ＡＴＧ、ＧＴＧ、ＡＣＧ、ＧＣＧ、ＡＡＴ、ＧＡＴ、ＡＧＴ、ＧＧＴ、ＧＴＴ、ＧＣＴ、ＧＡＣ、ＧＧＣ
の順に並べ、１番目のコドンはＴＴＡ、２番目のコドンはＣＴＡのように各コドンに番号をふった。下式に従ってｙｉおよびｙｉ＋３２の値（ｉは３２以下の正の整数）を計算し、その値が大きい順番に、上述の６４種類のコドンを並べ替え、各コドンに順番に番号をふった。
【０２０８】
【数８３】
2004310688.tif 000072
または
【数８４】
2004310688.tif 000073
〔ここで、ｔ番目のＣＤＳにおけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数８５】
2004310688.tif 000074
とする。〕
【０２０９】
続いて、ｙｉまたはｙｉ＋３２の値が大きい上位１２個のコドンとｙｉまたはｙｉ＋３２の値が小さい下位１２個のコドンを選び、真のＯＲＦ候補であるＯＲＦ−Ａにおけるシャドー判別関数ＳｄＡの値を下式によって求めた。
【数８６】
2004310688.tif 000075
ただし、
【数８７】
2004310688.tif 000076
が０のときは、ＳｄＡの値は１とする。
【０２１０】
このようにして求めたＳｄＡをもとに、次の条件を満たすときに、ＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと判断した。すなわち、１００アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡが０．９以上」、６０アミノ酸以上かつ９９アミノ酸以下のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡが１．０以上」、３４アミノ酸以上かつ５９アミノ酸以下のポリペプチドをコードするＯＲＦの場合、「ＳｄＡが１．１以上」のときに該ＯＲＦを真のＯＲＦ（ＣＤＳ）と判定した。
【０２１１】
（１７）「コード関数」の値の算出方法によるＣＤＳの真偽の判定
上記（１５）で翻訳開始コドンが同定された各ＯＲＦについて、コーディング・ポテンシャルを用いてＣＤＳの真偽を判定する方法により、ＣＤＳとしての真偽の判定を次のようにして行った。コーディング・ポテンシャルの指標として、以下に示す、真のＣＤＳに出現しやすいコドンの出現度数と出現しにくいコドンの出現度数をもとにした計算式（以下、「コード関数」またはＣｄと略記する）により得られた値を用いた。
【０２１２】
すでに同定されたＴ個の翻訳領域のうち、ｔ番目の翻訳領域におけるｉ番目のコドンの出現度数を
【数８８】
2004310688.tif 000077
としたとき、下式（７）によりｙｉを求めた。
【数８９】
2004310688.tif 000078
【０２１３】
次に、ｙＩの大きい順番に、６４種類のコドンを並べ替えた後、「ｙｉの値が大きい上位ｍ個のコドン」および「翻訳終止コドンを除くｙｉの値が大きい下位ｍ個のコドン」を選び、特定のＯＲＦ（ＯＲＦ−Ａとする）のＣｄＡの値は下式（８）により求めた。
【数９０】
2004310688.tif 000079
ただし、
【数９１】
2004310688.tif 000080
が０のときは、Ｃｄｎの値は１とする。
〔ここで、Ｔは２以上の整数、ｉは６４以下の正の整数、ｔとｊはＴ以下の正の整数、ｍは５〜２０までの整数とする。〕
本実施例では、ｍを１２とした。
【０２１４】
このようにして求めたＣｄＡをもとに、次の条件を満たすときに、ＯＲＦ−Ａを真のＣＤＳと判断した。
すなわち、１００アミノ酸以上ＯＲＦの場合、「ＣｄＡが１．０以上」のとき、６０アミノ酸以上、かつ９９アミノ酸以下のＯＲＦの場合、「ＣｄＡが１．１以上」とき、３４アミノ酸以上かつ、５９アミノ酸以下のＯＲＦの場合、「ＣｄＡが１．４以上」のときに該ＯＲＦを真のＣＤＳと判定した。
【０２１５】
「シャドー判別関数」の値が得られている場合には、ＯＲＦ−Ａの「シャドー判別関数」の値ＳｄＡと「コード関数」の値ＣｄＡの積の値（ＳｄＡ×ＣｄＡ）をもとに、ＣＤＳの真偽を判別した。
【０２１６】
すなわち、１００アミノ酸以上のＯＲＦの場合、「ＳｄＡ×ＣｄＡが１．１以上」のときに該ＯＲＦを真のＣＤＳを含むものと判定した。６０アミノ酸以上、かつ９９アミノ酸以下のＯＲＦの場合、「ＳｄＡ×ＣｄＡが１．４以上」ときに該ＯＲＦを真のＣＤＳを含むものと判定した。３４アミノ酸以上かつ、５９アミノ酸以下のＯＲＦの場合、「ＳｄＡ×ＣｄＡが１．６以上」のときに該ＯＲＦを真のＣＤＳを含むものと判定した。
以上のようにして算出したシャドー判別関数の値とコード関数の値を用いることにより、ＯＲＦ−Ｄ１０５とＯＲＦ−Ｄ１０８が真のＣＤＳと判定された。
【０２１７】
（１８）同じ鎖上の２つのＯＲＦが重複するときのＣＤＳの選別
上記工程により選別された同じ鎖上の２つのＯＲＦが重複するときには、次のようにしてＣＤＳを選別した。
真のＯＲＦ候補であるＯＲＦ−Ａの５’末端側が、該ＯＲＦの上流に存在するＯＲＦ−Ｂの３’末端側と重複することがわかった場合には以下の方法でこれらＯＲＦの真偽を判定した。
【０２１８】
ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂが重複している領域の長さが９０塩基対以下、ＯＲＦ−Ａの長さＬＡの１０％以下、かつＯＲＦ−Ｂの長さＬＢの１０％以下であるとき、双方のＯＲＦを真のＣＤＳとして選別した。
【０２１９】
重複している領域の長さが上記条件を満たさないときは、以下の方法でこれらＯＲＦの真偽を判定した。
ＬＡがＬＢより大きく、かつ下式（１２）を満たすときには、ＯＲＦ−ＡをＣＤＳとして選別した。
ＬＡ  ＜  ＬＢ×（ＬＡ＋１２０００）／２００００        （１２）
【０２２０】
ＬＡがＬＢより小さく、かつ下式（１３）を満たすときには、ＯＲＦ−ＢをＣＤＳとして選別した。
ＬＡ  ＜  ＬＢ×（ＬＢ＋１２０００）／２００００        （１３）
【０２２１】
ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂの長さの関係が式（１２）と式（１３）を満たさないときには、ＯＲＦ−ＡとＯＲＦ−Ｂのシャドー判別関数の値の大きさによってＣＤＳの真偽を判定した。
【０２２２】
上述の工程で、あるＯＲＦが「真のＯＲＦの候補」として選別された場合には、そのＯＲＦの上流にあるすべての「真のＯＲＦの候補」について、そのＯＲＦの開始コドンと終止コドンの間に内包されるかどうか調べて、内包されるＯＲＦはすべて「偽のＯＲＦ」と判定した。
以上の（１６）〜（１８）に述べた方法でＣＤＳの真偽を判定した結果、プラス鎖に存在する２個のＯＲＦであるＯＲＦ−Ｄ１０５とＯＲＦ−Ｄ１０８が真のＣＤＳとして選別された。
【０２２３】
（１９）プラス鎖とマイナス鎖の転写単位の比較
上記において、真のＯＲＦとして選別されたＣＤＳの開始コドンとその上流のＣＤＳの終止コドンの距離が９０塩基対以内のときは、双方のＣＤＳは同一転写単位に存在すると判定し、転写単位の構造を調べた。
【０２２４】
続いて、個々の転写単位の先頭のＣＤＳの開始コドンの位置と最後尾のＣＤＳの終止コドンの位置を求めて、プラス鎖の転写単位とマイナス鎖の転写単位の間で重複領域があるかどうか調べた。プラス鎖の転写単位Ｐがマイナス鎖の転写単位Ｑを内包する場合、またはプラス鎖の転写単位Ｐがマイナス鎖の転写単位Ｑに内包される場合は、次のようにして、転写単位の真偽を判定した。なお転写単位の長さは、「先頭のＣＤＳの開始コドンの位置」と「最後尾のＣＤＳの終止コドンの位置」の差とし、転写単位Ｐと転写単位Ｑの長さをそれぞれＬＰ、ＬＱとした。
【０２２５】
ＬＰがＬＱより大きく、かつ下式（１４）を満たすときには、転写単位Ｐを真の転写単位とし、転写単位Ｑを偽の転写単位とした。
ＬＱ  ＜  ＬＰ  ×（ＬＰ＋１４０００）／２００００        （１４）
【０２２６】
ＬＰがＬＱより小さく、かつ下式（１５）を満たすときには、転写単位Ｐを偽の転写単位とし、転写単位Ｑを真の転写単位とした。
ＬＰ  ＜  ＬＱ  ×（ＬＱ＋１４０００）／２００００        （１５）
【０２２７】
転写単位Ｐと転写単位Ｑの長さの関係が式（１４）と式（１５）を満たさないときには、転写単位Ｐと転写単位Ｑを構成しているすべてのＣＤＳを連結した後、この連結した翻訳領域に関して、上記（１６）に述べた方法に従ってシャドー判別関数の値を算出し、その値が大きい方を真の転写単位と判定した。
【０２２８】
（２０）プラス鎖とマイナス鎖のＣＤＳの比較およびプラス鎖とマイナス鎖のＣＤＳが５’末端側で重複しているときの処理
上記で選別された転写単位を構成するＣＤＳについて、（１９）に記載した方法により、内包関係にある２つのＣＤＳの真偽を判定した。
判定後、真のＣＤＳとして選別されたＣＤＳについて、プラス鎖のＣＤＳ（ＣＤＳ−Ａとする）とマイナス鎖のＣＤＳ（ＣＤＳ−Ｂとする）が５’末端側で重複しているかどうか調べた。
【０２２９】
重複が認められた２つのＣＤＳ（ＣＤＳ−ＡおよびＣＤＳ−Ｂ）の真偽を以下の手順に従って判定した。
【０２３０】
ＣＤＳ−Ａの開始コドンの次のコドンから下流に向かって、上記（６）で述べた方法を用いて、新しい開始コドンの同定を試みた。同様にして、ＣＤＳ−Ｂの開始コドンの次のコドンから下流に向かって、上記（６）で述べた方法を用いて、新しい開始コドンの同定を試みた。新しい開始コドンが同定された場合、前の開始コドンも含めて、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂが重複しない開始コドンの組み合わせが存在するか調べた。元の開始コドンおよび新しく同定された開始コドンの位置を比較して、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの重複が回避できるときには、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの両方を真のＣＤＳと判定した。ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの重複が回避できないときには、以下の方法で、ＣＤＳの真偽を判定した。
【０２３１】
ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの長さをそれぞれＬＡ、ＬＢとし、ＬＡがＬＢより大きく、かつ下式（１６）を満たすときには、ＣＤＳ−Ｂを「偽のＣＤＳ」とした。
ＬＢ  ＜ＬＡ×（ＬＡ＋１２０００）／２００００        （１６）
【０２３２】
ＬＡがＬＢより小さく、かつ下式（１７）を満たすときには、ＣＤＳ−Ａを「偽のＣＤＳ」とした。
ＬＡ  ＜ＬＢ×（ＬＢ＋１２０００）／２００００        （１７）
【０２３３】
上述のいずれの方法でもＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの真偽が判定できない場合には、上述と同じ方法によりそれぞれのＣＤＳのシャドー判別関数の値を比較することにより、ＣＤＳの真偽を判定した。
【０２３４】
（２１）プラス鎖とマイナス鎖のＣＤＳが３’末端側で重複しているときの処理プラス鎖のＣＤＳ−Ａとマイナス鎖のＣＤＳ−Ｂがそれぞれ３’末端側で重複しているが、ＣＤＳ−ＡがＣＤＳ−Ｂを内包していないし、またＣＤＳ−ＢがＣＤＳ−Ａを内包していない場合には、上述の（１９）の工程で述べた方法と同様の方法を用いて、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂの真偽を判定した。
まず、ＣＤＳ−ＡとＣＤＳ−Ｂが重複している領域の長さがそれぞれのＣＤＳの２０％未満である場合には、双方のＣＤＳを真のＣＤＳとして判定した。その重複領域の長さが片方のＣＤＳの２０％以上であるが、もう一方のＣＤＳの長さの２０％未満である場合には、前者のＣＤＳを偽のＣＤＳと判定した。これらの条件でのＣＤＳの真偽が判定できないときは、上述の式（１６）と式（１７）を用いる方法によりＣＤＳの真偽を判定した。
【０２３５】
（２２）同定されたＣＤＳに関する情報のメモリーへの記憶
上記の工程により同定されたＣＤＳに関する情報をメモリーに記憶した。記憶された情報を表２に示した。
【０２３６】
【表２】
2004310688.tif 000081
【０２３７】
（２３）ＣＤＳの同定とＤＮＡ断片が由来した微生物の種名の推定処理の繰り返し
ＣＤＳの同定とＤＮＡ断片が由来した微生物の種名の推定に関する予測制度を向上させることを目的として、上述の（１３）から（２２）に至るまでの処理を２回繰り返した。
【０２３８】
（２４）遺伝子構造の情報と由来した微生物の種名の出力
上述の（１）から（２３）までの処理を加えることにより、プラス鎖からは２個のＯＲＦを、およびマイナス鎖からは０個のＯＲＦを真のＣＤＳとして同定した。また、これらのＣＤＳは、（微生物５３）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１から由来したと推定された。最終的に同定された２個のＣＤＳに関する結果をハードディスク上にテキストファイルとして出力した。その結果を表３に示した。
【０２３９】
【表３】
2004310688.tif 000082
【０２４０】
これらの同定結果を、ＤＮＡ断片のアノテーション情報のファイルであるＮＣ＿００２５１６に記載されている情報と比較した。その結果、ＣＤＳの数、開始コドンの位置、終止コドンの位置に関して両者のデータは完全に一致した。さらに、ＮＣ＿００２５１６の塩基配列はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１の配列であることから、微生物の種名も両者で一致した。
【０２４１】
実施例２  配列ＮＣ＿００２５１６の一部の配列からのＣＤＳの同定および微生物の種名の推定（１）：相同性解析を利用した遺伝子構造同定方法を利用した遺伝子構造の同定と生物の種名の推定
実施例１の（１）から（３）に至るまでの処理を加えた後、実施例１の（４）に述べた方法と同様の方法を用いて、長さが３４アミノ酸以上のポリペプチドをコードするＯＲＦを選別した。その結果、プラス鎖からは８個のＯＲＦを、およびマイナス鎖からは１３個のＯＲＦを同定した。各ＯＲＦは終止コドンの位置で、プラス鎖の５’末端側から順番にＯＲＦ−Ｄ１０１〜ＯＲＦ−Ｄ１０８、マイナス鎖の３’末端側から順番にＯＲＦ−Ｃ１０１〜ＯＲＦ−Ｃ１１３までの番号を付けた。
これら２１個のＯＲＦのアミノ酸配列をもとに、相同性解析プログラムであるＢＬＡＳＴ（プログラム名：ｂｌａｓｔａｌｌ）を利用して、蛋白質配列データベースであるＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース（リリース３６）に対して相同性検索行った。まずＢＬＡＳＴプログラム一式はＮＣＢＩのＦＴＰサイト（ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／ｂｌａｓｔｚ．ｅｘｅ）からダウンロードした。また、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース（リリース３６）は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴのＦＴＰサイト（ｆｔｐ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ／ｓｗ＿ｏｌｄ＿ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｓｐｒｏｔ３６．ｔａｒ．ｇｚ）からダウンロードした。
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース（リリース３６）から配列データを切り出し、ｍｕｌｔｉ−ＦＡＳＴＡフォーマットのテキストファイルとしてハードディスク上に保存した。この配列ファイルをＢＬＡＳＴプログラム一式に含まれているｆｏｒｍａｔｄｂプログラムでフォーマットした後、ｂｌａｓｔａｌｌプログラムの中のＢＬＡＳＴ２．２．５を用いて２１個のＯＲＦのアミノ酸配列を問い合わせ配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として相同性検索行った。その結果、ＯＲＦ−Ｄ１０５（終止コドンの位置は２０２７）がＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースのアクセッション番号Ｐ１３４５４（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｎａＡ）と高い相同性を有することがわかった。なお、Ｐ１３４５４の配列はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来である。また、ＯＲＦ−Ｄ１０８（終止コドンの位置は３１５９）がＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースのアクセッション番号Ｐ１３４５４（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ，  ｂｅｔａ  ｃｈａｉｎ）と高い相同性を有することがわかった。なお、Ｐ１３４５５の配列はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来である。これらの相同性検索の結果をもとに、配列を整列することにより開始コドンを同定した結果、ＯＲＦ−Ｄ１０５の開始コドンは４８３番目の塩基であり、ＯＲＦ−Ｄ１０８の開始コドンは２０５６番目の塩基であった。
続いて、これら２つのＣＤＳをもとに、上記（１３）（１４）の方法により、配列ＮＣ＿００２５１６が由来した微生物の種名を推定したところ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１であると推定された。
【０２４２】
実施例３  配列ＮＣ＿００３４５０の一部の配列からのＣＤＳの同定および微生物の種名の推定：転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法を利用した遺伝子構造の同定と生物の種名の推定
ハードディスクに保存した配列番号ＮＣ＿００３４５０のファイルの塩基配列から、塩基位置３３０９３５１から３３０９４００までの５０塩基対の配列と塩基位置１から３５００までの３５００塩基対の配列を切り出し、前者の３’末端に後者を連結することにより、３５５０塩基対の配列を得た。この配列から、実施例１で述べた方法に従って、ＣＤＳの同定と微生物の種名の推定を行った。その結果、４７０アミノ酸の蛋白質をコードするＣＤＳ（開始コドン位置は２１３番目の塩基であり、終止コドンの位置は１６２５番目の塩基であった）と３８９アミノ酸の蛋白質をコードするＣＤＳ（開始コドン位置は２３５７番目の塩基であり終止コドンの位置は３５２６番目の塩基）が同定された。またこれらＣＤＳのコドン使用頻度の類似度の比較から、微生物の種名はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２であると推定された。
【０２４３】
これらの結果を、ＤＮＡ断片のアノテーション情報のファイルであるＮＣ＿００３４５０に記載されている情報と比較した。その結果、ＣＤＳの数、開始コドンの位置、終止コドンの位置に関して両者のデータは完全に一致した。さらに、ＮＣ＿００３４５０の塩基配列はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２の配列であることから、微生物の種名も両者で一致した。ＮＣ＿００３４５０に記載されている情報から、各ＣＤＳがコードしている遺伝子産物はそれぞれｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  （ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）  とＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ  （ｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔ）であった。
【０２４４】
実施例４  １個のＣＤＳの同定と微生物の種名の推定（１）
実施例１から実施例３に述べたＣＤＳの同定は、いずれもＣＤＳの同定数は２個であった。本発明で開示した方法がより小さいＤＮＡ断片からＣＤＳを同定できるかどうか、次のようにして調べた。
実施例３で作成した３５５０塩基対の配列を、１６５０塩基対（１番目から１６５０番目）の配列（ＮＣ＿００３４５０−Ａと命名）と１９００塩基対（１６５１番目から３５５０番目）の配列（ＮＣ＿００３４５０−Ｂと命名）の２つに分けて、それぞれからＣＤＳの同定と微生物の種名の推定を試みた。
まず、実施例１で述べた方法に従って、配列ＮＣ＿００３４５０−Ａについて解析を行った結果、４７０アミノ酸の蛋白質をコードするＣＤＳ（開始コドン位置は２１３番目の塩基であり、終止コドンの位置は１６２５番目の塩基であった）が同定された。またこのＣＤＳのコドン使用頻度の類似度の比較から、微生物の種名はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２であると推定された。
【０２４５】
一方、配列ＮＣ＿００３４５０−Ｂについて解析を行った結果、４８９アミノ酸の蛋白質をコードするＣＤＳ（開始コドン位置は７０７番目の塩基であり、終止コドンの位置は１８７６番目の塩基）が同定された。またこのＣＤＳのコドン使用頻度の類似度の比較から、微生物の種名はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２であると推定された。
これらの結果を、ＤＮＡ断片のアノテーション情報のファイルであるＮＣ＿００３４５０に記載されている情報と比較した。その結果、ＣＤＳの数、開始コドンの位置、終止コドンの位置に関して両者のデータは完全に一致した。さらに、ＮＣ＿００３４５０の塩基配列はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２の配列であることから、微生物の種名も両者で一致した。
【０２４６】
実施例５．ＧＣ含量が高い配列からのＣＤＳの同定および微生物の種名の推定
ＧＣ含量が高い配列として配列ＮＣ＿００２６９６を選んだ。ハードディスクに保存した配列番号ＮＣ＿００２６９６のファイルの塩基配列から、塩基位置５５８２から７１４１までの１５６０塩基対の配列を切り出した。この配列のＧＣ含量は６６．９％であった。この配列から、実施例１で述べた方法に加えて、次に述べるコドン内の塩基のＧＣ含量に着目したＣＤＳ同定精度向上法を用いてＣＤＳの真偽を判定することにより、ＣＤＳの同定と微生物の種名の推定を行った。
コドン内の塩基のＧＣ含量に着目したＣＤＳ同定精度向上法とは、次に述べる方法である。
ＣＤＳ内のコドンの第１文字目と第３文字目のＧ残基とＣ残基の含量をコドン内の塩基のＧＣ含量とし、下式（９）のＧＣｉの値（以下、「ＧＣ関数」の値と略記する）として算出した。
【数９２】
2004310688.tif 000083
〔ここで、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目（ｒ  ＝  １，  ２，  ３）の塩基がｂ（ｂ  ＝  １，  ２，  ３，  ４）のとき、
【数９３】
2004310688.tif 000084
であり、このとき、ｂは、ｉ番目のＣＤＳの第ｎ番目のコドンの第ｒ文字目の塩基がＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのときに、それぞれｂ＝１、２、３、４とする。なおｉとｎは正の整数であり、Ｎｉは、ｉ番目のＣＤＳのコドンの総数（終止コドンを除く）を表す。〕
上記の「ＧＣ関数」の値を、「開始コドンの再検索」と「ＣＤＳの真偽の判定」に用いた。
【０２４７】
「開始コドンの再検索」に関しては、実施例１（６）の記載に準拠した方法によりポリシストロンの転写単位を形成する可能性がないと判定されたときに「ＧＣ関数」の値を利用した。
具体的には、選別された１５０アミノ酸以上ポリペプチドをコードする真のＯＲＦ候補の５’末端側６０アミノ酸の領域の「ＧＣ関数」の値を求め、この値が２／３以下のときには、同定された開始コドンの次のコドンから３’側に向かって開始コドンを再検索した。「開始コドンの再検索」は最大２回繰り返した。
「ＣＤＳの真偽の判定」については、選別したＣＤＳの「ＧＣ関数」の値を求め、この値が２／３以下のときには、「偽のＣＤＳ」と判定した。
その結果、４９０アミノ酸の蛋白質をコードするＣＤＳ（開始コドン位置は５５番目の塩基であり、終止コドンの位置は１５２７番目の塩基であった）が同定された。またこれらＣＤＳのコドン使用頻度の類似度の比較から、微生物の種名はＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣＢ１５であると推定された。
これらの結果を、ＤＮＡ断片のアノテーション情報のファイルであるＮＣ＿００２６９６に記載されている情報と比較した。その結果、ＣＤＳの数、開始コドンの位置、終止コドンの位置に関して両者のデータは完全に一致した。さらに、ＮＣ＿００２６９６の塩基配列はＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  ＣＢ１５の配列であることから、微生物の種名も両者で一致した。
【０２４８】
実施例６．培養困難な微生物である好熱菌からのＣＤＳの同定および微生物の種名の推定
培養困難な微生物である好熱菌の配列として配列ＮＣ＿００３８６９を選んだ。ハードディスクに保存した配列番号ＮＣ＿００３８６９のファイルの塩基配列から、塩基位置１８７４から３０７３までの１２００塩基対の配列を切り出した。この配列から、実施例１で述べた方法に従って、ＣＤＳの同定と微生物の種名の推定を行った。その結果、３７０アミノ酸の蛋白質をコードするＣＤＳ（開始コドン位置は６１番目の塩基であり、終止コドンの位置は１１７３番目の塩基であった）が同定された。またこれらＣＤＳのコドン使用頻度の類似度の比較から、微生物の種名はＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＢ４Ｔであると推定された。
これらの結果を、ＤＮＡ断片のアノテーション情報のファイルであるＮＣ＿００３８６９に記載されている情報と比較した。その結果、ＣＤＳの数、開始コドンの位置、終止コドンの位置に関して両者のデータは完全に一致した。さらに、ＮＣ＿００３８６９の塩基配列はＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＢ４Ｔの配列であることから、微生物の種名も両者で一致した。
【０２４９】
実施例７．古細菌からのＣＤＳの同定および微生物の種名の推定
古細菌の配列としてＮＣ＿０００８５４を選んだ。ハードディスクに保存した配列番号ＮＣ＿０００８５４のファイルの塩基配列から、塩基位置１８７４から３０７３までの１２００塩基対の配列を切り出した。この配列から、実施例１で述べた方法に従って、ＣＤＳの同定と微生物の種名の推定を行った。その結果、３７０アミノ酸の蛋白質をコードするＣＤＳ（開始コドン位置は６１番目の塩基であり、終止コドンの位置は１１７３番目の塩基であった）が同定された。またこれらＣＤＳのコドン使用頻度の類似度の比較から、微生物の種名はＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１であると推定された。
これらの結果を、ＤＮＡ断片のアノテーション情報のファイルであるＮＣ＿０００８５４に記載されている情報と比較した。その結果、ＣＤＳの数、開始コドンの位置、終止コドンの位置に関して両者のデータは完全に一致した。さらに、ＮＣ＿０００８５４の塩基配列はＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１の配列であることから、微生物の種名も両者で一致した。
【０２５０】
実施例８．１個のＣＤＳの同定と微生物の種名の推定（２）
実施例１から７までに述べたＣＤＳの同定について、ＣＤＳがコードする遺伝子産物はＣｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｎａＡ  またはＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ，  ｂｅｔａ  ｃｈａｉｎであった。本実施例は、これらの蛋白質以外の遺伝子産物をコードするＣＤＳの同定例について以下に述べる。
ハードディスクに保存した配列番号ＮＣ＿０００９１１のファイルの塩基配列から、塩基位置７４２から１５２１までの７８０塩基対の配列を切り出した。この配列から、実施例１で述べた方法に従って、ＣＤＳの同定と微生物の種名の推定を行った。その結果、２３０アミノ酸の蛋白質をコードするＣＤＳ（開始コドン位置は７０番目の塩基であり、終止コドンの位置は７５３番目の塩基であった）が同定された。またこれらＣＤＳのコドン使用頻度の類似度の比較から、微生物の種名はＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３であると推定された。
これらの結果を、かずさＤＮＡ研究所のホームページ内のデータベースＣｙａｎｏＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｙａｎｏ／）に記載されている情報と比較した。その結果、ＣＤＳの数、開始コドンの位置、終止コドンの位置に関して両者のデータは完全に一致した。さらに、ＮＣ＿０００９１１の塩基配列はＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３の配列であることから、微生物の種名も両者で一致した。なお、データベースＣｙａｎｏＢａｓｅのアノテーション情報から、上記ＣＤＳはｐｒｏｂａｂｌｅ  ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  であることがわかった。
【０２５１】
【発明の効果】
本発明の、小さなＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法および該ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法によれば、ポリシストロンの転写単位の構造の予測を可能とすること、開始コドンの位置の同定精度を高めること、予備情報を不要とすること、ＧＣ含量が高い塩基配列に対応すること、又は種名が明らかでない原核生物より単離したＤＮＡ断片の塩基配列情報から、そのＤＮＡ断片が由来した原核生物の種名を推定することが可能となる。
本発明の方法は、本発明のプログラム、そのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、さらにその記録媒体を利用したコンピュータに基づく遺伝子構造同定システム及びＤＮＡ断片が由来した微生物の推定システムを用いて、実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、原核生物の遺伝子の構造を示した図である。本明細書では、図中のリボソーム結合配列の中で高頻度で出現する配列ＡＧＧＡと開始コドンの間の距離をＳＤ配列と開始コドンの間の距離と定義した。
【図２】図２は、原核生物の転写単位の構造を示した図である。図中に示すように、真のＣＤＳの反対鎖に「遺伝子の影」という偽のＣＤＳが多数出現することがＣＤＳの同定精度を下げる原因となっている。ＯＲＦは「白抜きのボックス」または「白抜きと灰色のボックスを合わせた領域」で示し、ＣＤＳは灰色のボックスで示す。また、ＳＤ配列は黒の小ボックスで、開始コドンの候補（通常ＡＴＧ、ＧＴＧ，ＴＴＧ）は黒の三角で、および終止コドンは黒丸（●）で示す。
ＣＤＳ、ＳＤ、開始コドン、終止コドン、オペロンが同定できれば、プロモーターとターミネーターの存在場所は推測できる。
本明細書でのＯＲＦの定義：途中に終止コドンが出てこない読み取り枠。開始コドンから終止コドンを持ち、内部に終止コドンが出てこないＣＤＳの候補
本明細書でのＣＤＳの定義：蛋白質が翻訳される可能性が高いＣＤＳ
ＣＤＳの位置が合ってても、開始コドンの位置が正確に同定できていない場合があることを指摘する。
【図３】図３は、本発明の「小ＤＮＡ断片からの遺伝子構造同定方法」と「ＤＮＡ断片が由来した微生物の推定方法」の手順のフローチャートを示した図である。
【図４】図４は、本発明の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」のアルゴリズムのフローチャートを示した図である。
【図５】図５は、本発明の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」において、２つの翻訳領域がオペロンを形成するときの開始コドンの位置の優先順位を決めるためのランク関数の値を示した図である。図中のＲＵＰの値は、（ＲＵＰ−２）の３倍の値が予め設定したポリシストロンを形成するための終止コドンと開始コドンの距離を越えず、かつ１０より大きい整数である。ＲＤＮは、予め設定された値（例えば３０）を越えない（ＲＵＰ＋２）以上の整数である。
【図６】図６は、翻訳領域Ａ（ＣＤＳ−Ａ）の「リボソーム結合スコア」の算出の手順をフローチャートとして示した図である。
【図７】図７は、大腸菌ｔｒｐＬ遺伝子のＳＤ配列と１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端配列の間の対合状態を示した図である。
【図８】図８は、本発明の「転写単位構造を予測するＣＤＳ同定法」の変法のアルゴリズムのフローチャートを示した図であり、図９に続く。
【図９】図９は、図８の続きで、本発明の「転写単位構造を予測するＣＤＳ同定法」の変法のアルゴリズムのフローチャートを示した図である。
【図１０】図１０は、本発明の「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」を用いてプラス鎖とマイナス鎖の塩基配列から複数個のＣＤＳおよび転写単位を同定した後、重複する転写単位の真偽を判定するための手順をフローチャートとして示した図である。
【図１１】図１１は、「転写単位構造を予測する遺伝子構造同定方法」を繰り返して用いることにより複数のＣＤＳを同定する方法の一例をフローチャートとして示した図である。図中のＸ１（％）通常５〜２０の値をとる。
【図１２】図１２は、シャドー判別関数を用いて翻訳領域Ａ（ＣＤＳ−Ａ）の真偽を判定することにより、ＣＤＳの同定精度を向上させるための手順をフローチャートとして示した図である。図中のＰ１（％）は通常５〜２０の値をとる。
【図１３】図１３は、本発明の方法を好ましく実施するためのハードウェア構成図である。
【図１４】図１４は、本発明の遺伝子構造同定法の一実施態様の全体処理フロー図である。
【図１５】図１５は、本発明の遺伝子構造同定法の一実施態様の全体処理フロー図である。
【図１６】図１６は、本発明の遺伝子構造同定法の一実施態様の全体処理フロー図である。
【図１７】図１７は、本発明の遺伝子構造同定法の一実施態様の全体処理フロー図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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