(57)【要約】【課題】アンドロゲンレセプターに転写活性化能力の低下をもたらすアミノ酸置換を明らかにし、このようなアミノ酸置換の有無を調べるための方法を開発する。【解決手段】変異型アンドロゲンレセプターを発現し、かつ、アンドロゲン応答配列と転写開始に必要な塩基配列との下流にレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなるレポーター遺伝子がその染色体に導入されてなることを特徴とする人工動物細胞、当該細胞を用いた変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力の評価方法等。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）の変異型アンドロゲンレセプターを発現し、かつアンドロゲン応答配列と転写開始に必要な塩基配列との下流にレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなるレポーター遺伝子がその染色体に導入されてなることを特徴とする人工動物細胞。
（１）以下の（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸を含有する変異型アンドロゲンレセプター。
（ａ）アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置から選ばれる１以上の位置にあるアミノ酸が、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なる。
（ｂ）（ａ）記載の異なるアミノ酸が、当該アミノ酸を含有する変異型アンドロゲンレセプターに以下の性質を付与する；動物細胞の染色体に含有され、かつ、アンドロゲン応答配列と転写開始に必要な塩基配列との下流にレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなるレポーター遺伝子の転写をアンドロゲンの存在下に活性化する能力が、標準型アンドロゲンレセプターよりも低い。
【請求項２】
アンドロゲンが、ジヒドロテストステロンであることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項３】
標準型アンドロゲンレセプターが、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７、７５〜４４４および４７２〜９１８で示されるアミノ酸に相当する位置に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸と同じアミノ酸を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする請求項１または２記載の細胞。
【請求項４】
標準型アンドロゲンレセプターが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載される細胞。
【請求項５】
標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の
アミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置においてはスレオニンであり、
アミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはプロリンであり、
アミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはグルタミンであり、
アミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置においてはロイシンであり、
アミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはアルギニンであることを特徴とする請求項３または４記載の細胞。
【請求項６】
変異型アンドロゲンレセプターが、配列番号２〜６のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載される細胞。
【請求項７】
物質が有する変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力の評価方法であって、
（１）請求項１〜６のいずれかに記載される人工動物細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）前記工程（１）において被験物質と接触した細胞におけるレポーター遺伝子の発現量またはその量と相関関係を有する指標値を測定する工程、及び
（３）前記工程（２）において測定された発現量またはその量と相関関係を有する指標値に基づき、前記物質の変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力を評価する工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法により評価された変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力に基づき、変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力を有する物質の探索方法。
【請求項９】
請求項８記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター活性調節剤。
【請求項１０】
以下の（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸を含有する変異型アンドロゲンレセプター。
（ａ）アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置から選ばれる１以上の位置にあり、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なる。
（ｂ）（ａ）記載の異なるアミノ酸が、当該アミノ酸を含有する変異型アンドロゲンレセプターに以下の性質を付与する；動物細胞の染色体に含有、かつ、アンドロゲン応答配列と転写開始に必要な塩基配列との下流にレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなるレポーター遺伝子の転写をアンドロゲンの存在下に活性化する能力が、標準型アンドロゲンレセプターよりも低い。
【請求項１１】
標準型アンドロゲンレセプターが、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７、７５〜４４４および４７２〜９１８で示されるアミノ酸に相当する位置に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸と同じアミノ酸を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする請求項１０記載の変異型アンドロゲンレセプター。
【請求項１２】
標準型アンドロゲンレセプターが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする請求項１０または１１記載の変異型アンドロゲンレセプター。
【請求項１３】
標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の
アミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置においてはスレオニンであり、
アミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはプロリンであり、
アミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはグルタミンであり、
アミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置においてはロイシンであり、
アミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはアルギニンであることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれかに記載される変異型アンドロゲンレセプター。
【請求項１４】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター。
【請求項１５】
配列番号３で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター。
【請求項１６】
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター。
【請求項１７】
配列番号５で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター。
【請求項１８】
配列番号６で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター。
【請求項１９】
請求項１０〜１７のいずれかに記載される変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２０】
請求項１９記載のＤＮＡを含有することを特徴とするベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載のＤＮＡの上流にプロモーターが機能可能な形で結合されてなるＤＮＡを含有することを特徴とするベクター。
【請求項２２】
宿主細胞内で複製可能なベクターに、請求項１９記載のＤＮＡを組込む工程を有することを特徴とするベクターの製造方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる人工細胞。
【請求項２４】
請求項１９記載のＤＮＡまたは請求項２０もしくは２１記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を有することを特徴とする人工細胞の製造方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の人工細胞を培養して変異型アンドロゲンレセプターを産生させ当該変異型アンドロゲンレセプターを回収する工程を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプターの製造方法。
【請求項２６】
請求項１０〜１８のいずれかに記載される変異型アンドロゲンレセプターに結合する物質をスクリーニングする方法であって、
（１）前記変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列を有するポリペプチドと被験物質とを接触させる工程、及び
（２）前記ポリペプチドに結合する物質を選択する工程、を有することを特徴とする方法。
【請求項２７】
アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の遺伝子型を分析する方法であって、被験試料から調製される核酸において、前記アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、以下の（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる工程を有することを特徴とする方法。
（ａ）アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置から選ばれる１以上の位置にあるアミノ酸が、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なる。
（ｂ）（ａ）記載の異なるアミノ酸が、当該アミノ酸を含有する変異型アンドロゲンレセプターに以下の性質を付与する；動物細胞の染色体に含有されるアンドロゲン応答配列と転写開始に必要な塩基配列との下流にレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなるレポーター遺伝子の転写をアンドロゲンの存在下に活性化する能力が、標準型アンドロゲンレセプターよりも低い。
【請求項２８】
標準型アンドロゲンレセプターが、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７、７５〜４４４および４７２〜９１８で示されるアミノ酸に相当する位置に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸と同じアミノ酸を有するアンドロゲンレセプターである請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
標準型アンドロゲンレセプターが配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする請求項２７または２８記載の方法。
【請求項３０】
前記（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる工程が、
被験試料から調製される核酸を鋳型として、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定する工程
を有することを特徴とする請求項２７〜２９のいずれかに記載される方法。
【請求項３１】
（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる工程が、
（ｉ）被験試料から調製される核酸を鋳型として、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅する工程、および
（ｉｉ）増幅されたＤＮＡを電気泳動し、その移動度を測定して標準と比較する工程
を有することを特徴とする請求項２７〜２９のいずれかに記載される方法。
【請求項３２】
（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる工程が、被験試料から調製される核酸と、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプローブとのストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションの効率を測定して標準と比較する工程を有することを特徴とする請求項２７〜２９のいずれかに記載される方法。
【請求項３３】
（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる工程が、
（ｉ）被験試料から調製される核酸を鋳型として、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅する工程、および
（ｉｉ）増幅されたＤＮＡを、上記の（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列への置換によりその認識配列が出現するかもしくは消失する制限酵素により消化し、消化の有無を測定する工程を含む請求項２７〜２９のいずれかに記載される方法。
【請求項３４】
請求項２７〜３３のいずれかに記載される方法によって分析された遺伝子型に基づき、アンドロゲンレセプター活性調節剤による治療の効果を予測することを特徴とするアンドロゲンレセプター活性調節剤の有効性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異型アンドロゲンレセプターおよびその活性評価用細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
アンドロゲンのさまざまな生理的作用はアンドロゲンレセプターを介して引き起こされる。アンドロゲンレセプターは、前立腺、脳、精巣、筋肉等の組織中のアンドロゲンの標的細胞に存在する。アンドロゲンレセプターは、アンドロゲンと結合すると活性化されて染色体上のアンドロゲン応答配列に結合し、当該応答配列の下流に在する標的遺伝子の転写を活性化する。ところが、アンドロゲンレセプターを構成するアミノ酸のいずれかが置換され、アンドロゲンの存在下に標的遺伝子の転写を活性化する当該レセプターの能力が従来よりも低下すると、種々の異常の誘発につながる可能性が危惧される。そこで、アンドロゲンレセプターにかかる転写活性化能力の低下をもたらすアミノ酸置換を明らかにし、このようなアミノ酸置換の有無を調べるための方法を開発することが切望されている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、アンドロゲンレセプターに転写活性化能力の低下をもたらす特定のアミノ酸置換を見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、
１．以下の（１）の変異型アンドロゲンレセプターを発現し、かつアンドロゲン応答配列と転写開始に必要な塩基配列との下流にレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなるレポーター遺伝子がその染色体に導入されてなることを特徴とする人工動物細胞（以下、本発明評価用細胞と記すことがある。）：
（１）以下の（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸を含有する変異型アンドロゲンレセプター。
（ａ）アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置から選ばれる１以上の位置にあるアミノ酸が、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なる。
（ｂ）（ａ）記載の異なるアミノ酸が、当該アミノ酸を含有する変異型アンドロゲンレセプターに以下の性質を付与する；動物細胞の染色体に含有され、かつ、アンドロゲン応答配列と転写開始に必要な塩基配列との下流にレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなるレポーター遺伝子の転写をアンドロゲンの存在下に活性化する能力が、標準型アンドロゲンレセプターよりも低い。
２．アンドロゲンが、ジヒドロテストステロンであることを特徴とする前項１記載の細胞：
３．標準型アンドロゲンレセプターが、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７、７５〜４４４および４７２〜９１８で示されるアミノ酸に相当する位置に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸と同じアミノ酸を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする前項１または２記載の細胞。
４．標準型アンドロゲンレセプターが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする前項１〜３のいずれかに記載される細胞：
５．標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の
アミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置においてはスレオニンであり、
アミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはプロリンであり、
アミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはグルタミンであり、
アミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置においてはロイシンであり、
アミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはアルギニンであることを特徴とする前項３または４記載の細胞：
６．変異型アンドロゲンレセプターが、配列番号２〜６のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする前項１〜５のいずれかに記載される細胞：
７．物質が有する変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力の評価方法であって、
（１）前項１〜６のいずれかに記載される人工動物細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）前記工程（１）において被験物質と接触した細胞におけるレポーター遺伝子の発現量またはその量と相関関係を有する指標値を測定する工程、及び
（３）前記工程（２）において測定された発現量またはその量と相関関係を有する指標値に基づき、前記物質の変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力を評価する工程
を有することを特徴とする方法：
８．前項７記載の方法により評価された変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力に基づき、変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力を有する物質の探索方法：
９．前項８記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター活性調節剤：
１０．以下の（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸を含有する変異型アンドロゲンレセプター：
（ａ）アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置から選ばれる１以上の位置にあり、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なる。
（ｂ）（ａ）記載の異なるアミノ酸が、当該アミノ酸を含有する変異型アンドロゲンレセプターに以下の性質を付与する；動物細胞の染色体に含有、かつ、アンドロゲン応答配列と転写開始に必要な塩基配列との下流にレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなるレポーター遺伝子の転写をアンドロゲンの存在下に活性化する能力が、標準型アンドロゲンレセプターよりも低い。
１１．標準型アンドロゲンレセプターが、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７、７５〜４４４および４７２〜９１８で示されるアミノ酸に相当する位置に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸と同じアミノ酸を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする前項１０記載の変異型アンドロゲンレセプター：
１２．標準型アンドロゲンレセプターが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする前項１０または１１記載の変異型アンドロゲンレセプター：
１３．標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の
アミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置においてはスレオニンであり、
アミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはプロリンであり、
アミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはグルタミンであり、
アミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置においてはロイシンであり、
アミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはアルギニンであることを特徴とする前項１０〜１２のいずれかに記載される変異型アンドロゲンレセプター：
１４．配列番号２で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター：
１５．配列番号３で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター：
１６．配列番号４で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター：
１７．配列番号５で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター：
１８．配列番号６で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプター：
１９．前項１０〜１７のいずれかに記載される変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡ：
２０．前項１９記載のＤＮＡを含有することを特徴とするベクター：
２１．前項１９に記載のＤＮＡの上流にプロモーターが機能可能な形で結合されてなるＤＮＡを含有することを特徴とするベクター：
２２．宿主細胞内で複製可能なベクターに、前項１９記載のＤＮＡを組込む工程を有することを特徴とするベクターの製造方法：
２３．前項１８に記載のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる人工細胞：
２４．前項１９記載のＤＮＡまたは前項２０もしくは２１記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を有することを特徴とする人工細胞の製造方法：
２５．前項２３記載の人工細胞を培養して変異型アンドロゲンレセプターを産生させ当該変異型アンドロゲンレセプターを回収する工程を有することを特徴とする変異型アンドロゲンレセプターの製造方法：
２６．前項１０〜１８のいずれかに記載される変異型アンドロゲンレセプターに結合する物質をスクリーニングする方法であって、
（１）前記変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列を有するポリペプチドと被験物質とを接触させる工程、及び
（２）前記ポリペプチドに結合する物質を選択する工程、を有することを特徴とする方法：
２７．アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の遺伝子型を分析する方法であって、被験試料から調製される核酸において、前記アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、以下の（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる工程を有することを特徴とする方法：
（ａ）アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置から選ばれる１以上の位置にあるアミノ酸が、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なる。
（ｂ）（ａ）記載の異なるアミノ酸が、当該アミノ酸を含有する変異型アンドロゲンレセプターに以下の性質を付与する；動物細胞の染色体に含有されるアンドロゲン応答配列と転写開始に必要な塩基配列との下流にレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなるレポーター遺伝子の転写をアンドロゲンの存在下に活性化する能力が、標準型アンドロゲンレセプターよりも低い。
２８．標準型アンドロゲンレセプターが、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７、７５〜４４４および４７２〜９１８で示されるアミノ酸に相当する位置に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸と同じアミノ酸を有するアンドロゲンレセプターである前項２７記載の方法：
２９．標準型アンドロゲンレセプターが配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアンドロゲンレセプターであることを特徴とする前項２７または２８記載の方法：
３０．前記（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる工程が、
被験試料から調製される核酸を鋳型として、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定する工程
を有することを特徴とする前項２７〜２９のいずれかに記載される方法：
３０．（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる工程が、
（ｉ）被験試料から調製される核酸を鋳型として、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅する工程、および
（ｉｉ）増幅されたＤＮＡを電気泳動し、その移動度を測定して標準と比較する工程
を有することを特徴とする前項２７〜２９のいずれかに記載される方法：
３２．（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる工程が、被験試料から調製される核酸と、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプローブとのストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションの効率を測定して標準と比較する工程を有することを特徴とする前項２７〜２９のいずれかに記載される方法：
３３．（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる工程が、
（ｉ）被験試料から調製される核酸を鋳型として、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅する工程、および
（ｉｉ）増幅されたＤＮＡを、上記の（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列への置換によりその認識配列が出現するかもしくは消失する制限酵素により消化し、消化の有無を測定する工程を含む前項２７〜２９のいずれかに記載される方法及び
３４．前項２７〜３３のいずれかに記載される方法によって分析された遺伝子型に基づき、アンドロゲンレセプター活性調節剤による治療の効果を予測することを特徴とするアンドロゲンレセプター活性調節剤の有効性の評価方法：
を提供するものである。
【０００４】
【発明の実施の形態】
本発明評価用細胞は、以下の（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸（以下、置換されたアミノ酸と記すことがある。）を含有する変異型アンドロゲンレセプター（以下、本発明変異型アンドロゲンレセプターと記すことがある。）を発現する人工動物細胞である。
（ａ）アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置から選ばれる１以上の位置にるアミノ酸が、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なる。
（ｂ）（ａ）記載の異なるアミノ酸が、当該アミノ酸を有する変異型アンドロゲンレセプターに以下の性質を付与する；動物細胞の染色体に含有され、かつ、アンドロゲン応答配列と転写開始に必要な塩基配列との下流にレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなるレポーター遺伝子の転写をアンドロゲンの存在下に活性化する能力が、標準型アンドロゲンレセプターよりも低い。
また、本発明評価用細胞は、その染色体上に上記のレポーター遺伝子が導入されている。本発明評価用細胞は、例えば、上記のレポーター遺伝子を、動物由来のアンドロゲンレセプター非内在性の宿主細胞、具体的には、例えば、ヒト由来のＨｅＬａ細胞、サル由来のＣＶ−１細胞、マウス由来のＨｅｐａ１細胞、マウス由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞、ヒト由来のＨｅｐＧ２細胞、サル由来のＣＯＳ１細胞、チャイニーズハムスター由来のＣＨＯ−１細胞、ヒト由来のＤＵ１４５細胞、ヒト由来のＰＣ−３細胞［いずれも、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能］等に導入して当該レポーター遺伝子が染色体に組み込まれた細胞を選抜し、選抜された細胞にさらに本発明変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを導入すること等により調製することができる。
【０００５】
「アンドロゲン応答配列と転写開始に必要な塩基配列との下流にレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなるレポーター遺伝子」（以下、応答性レポーター遺伝子と記すことがある。）は、例えば、上流から順に、アンドロゲン応答配列を有するＤＮＡ、転写開始に必要な塩基配列を有するＤＮＡ、およびレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが並ぶように、これらのＤＮＡを接続することにより調製することができる。
「アンドロゲン応答配列」とは、アンドロゲンレセプターによって発現量が調節される標的遺伝子の転写調節領域に存在する特定の塩基配列である。例えば、アンドロゲンとアンドロゲンレセプターとの複合体が、当該配列を認識しここに結合すると、その下流に存在する標的遺伝子の転写が促進される。このようなアンドロゲン応答配列としては、具体的には例えば、マウスパピローマウイルス（ＭＭＴＶ）のＬＴＲ中の塩基配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１９，１５６３−１５６９）等をあげることができる。また、アンドロゲン応答配列のコンセンサス配列［５’−ＡＧＡＡＣＡｎｎｎＴＧＴＴＣＴ−３’；ｎはＡ、Ｇ、ＣまたはＴを表す。］を１回以上含む塩基配列をあげることもできる。尚、十分な転写制御能を得るには、前記のようなコンセンサス配列は通常２〜５程度タンデムに連結されていることが好ましい。かかる塩基配列を有するＤＮＡは、化学合成するか、またはポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）などにより増幅しクローニングすること等により調製することができる。
「転写開始に必要な塩基配列」としては、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始のリーダー配列を有する塩基配列をあげることができる。具体的には、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）の５’上流領域の塩基配列、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子の５’上流領域の−３３番目（転写開始点を＋１番目とする。以下、同様。）の塩基から＋１５番目の塩基までの塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００６０５）や、チキンオボアルブミン遺伝子の５’上流領域の−４０番目の塩基から＋１０番目の塩基までの塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００８９５）等があげられる。このような塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、その塩基配列に基づいて化学合成することにより調製することができる。また、前記のような領域をコードするＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドを、既知の塩基配列に基づいて設計して作製し、作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲを行うことなどにより調製することもできる。
「レポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列」としては、例えば、上記の「アンドロゲン応答配列」とは異なる遺伝子に本来由来する「レポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列」等をあげることができる。かかる塩基配列にコードされるレポータータンパク質としては、例えば、そのタンパク質の有する酵素活性や生理活性等に基づき発現量の測定が可能なタンパク質をあげることができる。具体的には、例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどがあげられる。宿主細胞における安定性が比較的高いレポータータンパク質が好ましい。このようなレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、既知の塩基配列に基づいて設計・作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲを行うことにより調製することができる。また、当該ＤＮＡを含む市販のプラスミドのＤＮＡを制限酵素消化して目的とするＤＮＡを単離すること等により得ることもできる。
【０００６】
上記の応答性レポーター遺伝子を含むＤＮＡをプラスミド等のベクターに組込んで上述のような宿主細胞に導入し、応答性レポーター遺伝子が染色体に組み込まれた細胞を選抜する。このとき、応答性レポーター遺伝子が導入された細胞の選抜を容易にするために、薬剤耐性遺伝子等の選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドを同時に宿主細胞に導入してもよい。このようにして使用することのできる選抜マーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ）遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などがあげられる。宿主細胞に導入するプラスミドのＤＮＡは、通常、上記応答性レポーター遺伝子や選抜マーカー遺伝子の塩基配列に認識部位の存在しない制限酵素であらかじめ消化することにより直鎖化して用いられる。細胞へのＤＮＡ導入法としては、一般的なリポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などをあげることができる。例えば、応答性レポーター遺伝子の組込まれたプラスミドと選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドとが導入された細胞を、細胞へ導入された選抜マーカー遺伝子に対応する条件の培地で培養し、非形質転換細胞が死滅して形質転換細胞に由来するコロニーが適当な大きさになるまで培養を続ける。この間、必要に応じて、培地交換を１回〜２回／週の割合で行う。このような操作を行なうことにより、導入された応答性レポーター遺伝子が染色体に組み込まれ、応答性レポーター遺伝子を細胞内に安定に保持する細胞を得ることができる。導入された応答性レポーター遺伝子が細胞の染色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入されたレポーター遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーやプローブとしたＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、応答性レポーター遺伝子の存在を検出すればよい。
【０００７】
上記のようにして得られる応答性レポーター遺伝子を染色体上に含有する細胞に、本発明変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを、例えば、その上流にプロモーターが機能可能な形で結合された状態となるよう後述のようにして導入することにより、本発明評価用細胞を得ることができる。尚、本発明変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを上記細胞内へ導入する際に、その導入効率をモニターするために、アンドロゲンにより転写活性が変化しないプロモーターの下流に、上記応答性レポーター遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するレポータータンパク質とは異なる種類のレポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が接続されてなる遺伝子（以下、コントロールレポーター遺伝子と記すことがある。）を同時に導入しておいてもよい。アンドロゲンにより転写活性が変化しないプロモーターとは、上記のようなアンドロゲン応答配列の制御を受けず構成的な転写能を有するプロモーターであって、例えば、ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター等があげられる。このようなプロモーターのＤＮＡは、例えば、これらのプロモーターを含む市販のプラスミドのＤＮＡを制限酵素消化して目的とするＤＮＡを単離すること等により得ることができる。応答性レポーター遺伝子の塩基配列とコントロールレポーター遺伝子の塩基配列とにそれぞれコードされるアミノ酸配列を有するレポータータンパク質の組み合わせとしては、具体的には、例えば、ホタルルシフェラーゼとシーパンジールシフェラーゼ、または、ホタルルシフェラーゼとβガラクトシダーゼの組み合わせ等があげられる。例えば、後述のように、本発明評価用細胞を用いて物質が有する本発明変異型アンドロゲンレセプターの活性調節能力を測定する際に、応答性レポーター遺伝子の発現量の測定と併行して、コントロールレポーター遺伝子の発現量も測定し、コントロールレポーター遺伝子の発現量を本発明変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの細胞への導入効率の指標として、応答性レポーター遺伝子の発現量を評価してもよい。
【０００８】
本発明変異型アンドロゲンレセプターにおいて、「置換されたアミノ酸」は、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置から選ばれる１以上の位置に存在する。
【０００９】
アンドロゲンレセプターの「アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメント」とは、種々のアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列を、各アミノ酸配列の間で同一、または類似性の高いアミノ酸配列を揃えるように並べて示した表である。比較対象のアミノ酸配列を最適に揃えて並べる（アラインする）ために、通常、ギャップ等の挿入が許容される。かかるアラインメントは、例えば、ＦＡＳＴＡ［Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，４，  ２４４４−２４４８（１９８８）］、ＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２１５，  ４０３−４１０（１９９０）］、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２２，  ４６７３−４６８０（１９９４ａ）］等のプログラムを用いて、種々のアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列について相同性解析を行うことにより作成することができる。上記のプログラムは、例えば、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ［国立遺伝学研究所  生命情報・ＤＤＢＪ研究センター  （Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  ；ＣＩＢ／ＤＤＢＪ）内で運営される国際ＤＮＡデータバンク］のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）等において、一般的に利用可能である。また、市販の配列解析ソフトウェア、具体的には例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．５（ソフトウェア開発株式会社製）」等を用い、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法［Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｗ．Ｒ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２７，  １４３５−１４４１，（１９８５）］により相同性解析を行うことによってアラインメントを作成することもできる。一例として、ヒト、ラット由来のアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列のアラインメントを表１に示す。表１において、アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をそれぞれアミノ酸の１文字表記で示し、アラインメント作成の際にアミノ酸配列に挿入されたギャップを「−」で示す。併記された３種のアミノ酸配列のうち、最上段に記載のアミノ酸配列は配列番号１で示されるヒトアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列を示し、２段目に記載のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ２０１３２に記載されたヒトアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列を示し、３段目に記載のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ２３２６４に記載されたラットアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列を示す。また、上記３種のアミノ酸配列の下の段に、その位置のアミノ酸の類似性の度合いを記号で示す；「＊」は、その位置のアミノ酸が上記３種のアミノ酸配列において一致することを示し、「．」は、その位置のアミノ酸が上記３種のアミノ酸配列のうち２種において一致することを示す。当該アラインメントは、Ｇｅｎｅｔｙｘ−ｗｉｎ  ＳＶ／Ｒ  ｖｅｒ４．０（ソフトウエア開発株式会社販売）を使用して作成された。
【００１０】
【表１】
2004254602.tif 000002
2004254602.tif 000003
2004254602.tif 000004
【００１１】
「アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列の特定のアミノ酸番号で示されるアミノ酸に相当する位置」とは、上記のようなアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列のアラインメントにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列の特定のアミノ酸番号で示されるアミノ酸に揃えて並べられる（アラインされる）アミノ酸の位置を意味する。
例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列と比較すると、上記のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ２０１３２に記載されたヒトアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５８〜７４で示されるグルタミン残基の繰り返し配列よりも４残基長いグルタミン繰り返し配列を有し、また、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４４５〜４７１で示されるグリシン残基の繰り返し配列よりも３残基短いグリシン繰り返し配列を有するが、かかる繰り返し配列の長さの違いを除けば、その他のアミノ酸配列は全て配列番号１で示されるアミノ酸配列と一致する。そこで、配列番号１で示されるアミノ酸配列と、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ２０１３２に記載されたヒトアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列とのアラインメントを作成すると、上記の繰り返し配列における残基数が少ない部分にギャップが挿入されて、前記２種のアミノ酸配列が並べられる。かかるアラインメントにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置とは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ２０１３２に記載されたヒトアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列において、それぞれ順に、アミノ末端から７２１、８３０、８８０、８９１、または９１０番目のアミノ酸の位置である。
【００１２】
標準型アンドロゲンレセプターとしては、例えば、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７、７５〜４４４および４７２〜９１８で示されるアミノ酸に相当する位置、すなわち、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５８〜７４で示されるグルタミン残基とアミノ酸番号４４５〜４７１で示されるグリシン残基とを除くその他のアミノ酸に相当する位置に、同一種の生物由来の当該レセプター間で最も数多く報告されているアミノ酸配列、同一種の生物由来の当該レセプター間で天然に最も高頻度に見出されるアミノ酸配列、もしくは当該レセプターの研究者間で標準とされているアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸と同じアミノ酸を有するアンドロゲンレセプターをあげることができる。具体的には、例えば、ヒト由来のアンドロゲンレセプターの標準型としては、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７、７５〜４４４および４７２〜９１８で示されるアミノ酸に相当する位置に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸と同じアミノ酸を有するアンドロゲンレセプターをあげることができる。より具体的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアンドロゲンレセプターや、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ２０１３２に記載されたアミノ酸配列を有するアンドロゲンレセプター等をあげることができる。
【００１３】
本発明変異型アンドロゲンレセプターが上記の位置に有する「置換されたアミノ酸」は、本発明変異型アンドロゲンレセプターに、「動物細胞の染色体に含有される応答性レポーター遺伝子の転写をアンドロゲンの存在下に活性化する能力が、標準型アンドロゲンレセプターよりも低い」という性質を付与する。
かかる「置換されたアミノ酸」を選択するには、例えば、まず、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する
ＤＮＡに、後述するように部位特異的変異導入法等によって変異を導入することにより、「標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸」をコードするコドンを含むアンドロゲンレセプター遺伝子を調製し、これを上記のような応答性レポーター遺伝子を染色体上に有する動物細胞に導入して発現させる。発現した「標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸」を有するアンドロゲンレセプターが、染色体に含有される応答性レポーター遺伝子の転写をアンドロゲンの存在下に活性化する能力を、後述のようにして応答性レポーター遺伝子の発現量またはその量と相関関係を有する指標値を測定する。得られた測定値を、標準型アンドロゲンレセプターの測定値と比較することにより、目的とする「置換されたアミノ酸」を選択することができる。アンドロゲンとしては、例えば、ジヒドロテストステロンがあげられる。上記の測定に際しては、例えば、応答性レポーター遺伝子を染色体上に有し「標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸」を有するアンドロゲンレセプターを発現する細胞の培地に、ジヒドロテストステロンを約１ｐＭ〜約１μＭ程度、好ましくは約１０ｐＭ〜約１００ｎＭ程度となるよう添加する。このようにして得られたアンドロゲン存在下での測定値が、アンドロゲン非存在下での測定値に比べて統計学上優位な差を示せば「活性化する能力」を有すると判断できる。
本発明変異型アンドロゲンレセプターが有する「置換されたアミノ酸」の具体例としては、例えば、標準型アンドロゲンレセプターが、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７、７５〜４４４および４７２〜９１８で示されるアミノ酸に相当する位置に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の当該位置のアミノ酸と同じアミノ酸を有するアンドロゲンレセプターである場合には、配列番号１で示されるアミノ酸配列の
アミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置においてはスレオニン、
アミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはプロリン、
アミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはグルタミン、
アミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置においてはロイシン、
アミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置においてはアルギニン
をあげることができる。
かかる「置換されたアミノ酸」を有する本発明変異型アンドロゲンレセプターの例としては、「置換されたアミノ酸」を含有し、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアンドロゲンレセプターを標準型アンドロゲンレセプターとする変異型アンドロゲンレセプター等をあげることができる。より具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０で示されるアラニンがスレオニンに置換されてなるアミノ酸配列）を有するアンドロゲンレセプター（以下、本発明変異型アンドロゲンレセプターＡ７２０Ｔと記すことがある。）、配列番号３で示されるアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８２９で示されるロイシンがプロリンに置換されてなるアミノ酸配列）を有するアンドロゲンレセプター（以下、本発明変異型アンドロゲンレセプターＬ８２９Ｐと記すことがある。）、配列番号４で示されるアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８７９で示されるロイシンがグルタミンに置換されてなるアミノ酸配列）を有するアンドロゲンレセプター（以下、本発明変異型アンドロゲンレセプターＬ８７９Ｑと記すことがある。）、配列番号５で示されるアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８９０で示されるフェニルアラニンがロイシンに置換されてなるアミノ酸配列）を有するアンドロゲンレセプター（以下、本発明変異型アンドロゲンレセプターＦ８９０Ｌと記すことがある。）、配列番号６で示されるアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９０９で示されるリジンがアルギニンに置換されてなるアミノ酸配列）を有するアンドロゲンレセプター（以下、本発明変異型アンドロゲンレセプターＫ９０９Ｒと記すことがある。）等をあげることができる。
【００１４】
本発明評価用細胞は、例えば、当該細胞が発現する本発明変異型アンドロゲンレセプターの転写調節活性を調節する能力を有する物質の検定に利用することができる。本発明変異型アンドロゲンレセプターの活性を調節する能力を有する物質としては、当該レセプターに対して、アゴニスト作用を示す物質や、アンタゴニスト作用を示す物質をあげることができる。
例えば、本発明評価用細胞と被験物質とを、数時間から数日間接触させた後、具体的には、被験物質が添加された培地中で前記本発明評価用細胞を数時間から数日間培養した後、本発明評価用細胞が有する応答性レポーター遺伝子の発現量又はその量と相関関係を有する指標値を測定する。本発明評価用細胞が産生する本発明変異型アンドロゲンレセプターが被験物質（アンドロゲン様活性物質）の結合により活性化された場合には、レポーター遺伝子の転写が促進され、当該レポーター遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するレポータータンパク質が前記本発明評価用細胞の細胞内等に蓄積されるかもしくは培地中に分泌される。このレポータータンパク質の量又はその量と相関関係を有する指標値を測定することにより、本発明評価用細胞あたりのレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を得る。具体的には、例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いた場合には、被験物質を接触させた本発明評価用細胞から調製された細胞粗抽出物にルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを加えると、当該細胞粗抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーター等の測定装置で測定することにより、ルシフェラーゼ量、ひいては、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を知ることができる。同様にして、本発明評価用細胞と被験物質とを接触させない条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定し、当該測定値と被験物質とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値とを比較することにより、被験物質が有する本発明変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力（この場合には、本発明変異型アンドロゲンレセプターに対するアゴニスト活性）を評価することができる。一方、例えば、上記の本発明評価用細胞に、当該細胞が発現する本発明変異型アンドロゲンレセプターに対してアゴニスト活性を有する物質を接触させた条件下、及び、前記アゴニスト活性物質と被験物質とを同時に接触させた条件下の各々において、上記と同様な方法でレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値を測定する。本発明評価用細胞に前記アゴニスト活性物質を接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値と比較して、前記アゴニスト活性物質と被験物質とを接触させた条件下におけるレポーター遺伝子の発現量又はその量に相関関係を有する指標値が低ければ、前記被験物質は本発明変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力（この場合には、本発明変異型アンドロゲンレセプターに対するアンタゴニスト活性）を有すると評価することができる。
このような評価方法により評価された本発明変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力に基づき、本発明変異型アンドロゲンレセプター活性を調節する能力を有する物質を選抜することが可能となる。さらに、当該物質又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する本発明変異型アンドロゲンレセプター活性調節剤を提供することも可能となる。例えば、本発明変異型アンドロゲンレセプターに対するアゴニスト活性を有する物質を有効成分として含有する薬剤は、本発明変異型アンドロゲンレセプターの「置換されたアミノ酸」に起因するアンドロゲン応答性の低下によって誘発される疾患等の病態の改善に有用である。
【００１５】
本発明変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（以下、本発明ＤＮＡと記すこともある。）は、天然から単離することもできるし、また、天然から単離されたＤＮＡに、例えば部位特異的変異導入法や突然変異処理等によって変異を導入することにより作出することもできる。
本発明ＤＮＡは、例えば、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡから以下のようにして調製することができる。
標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを取得するには、まず、Ｇｅｎｂａｎｋ等の遺伝子データベースや文献などに記載されている塩基配列に基づき、ヒト、サル、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳類等の動物由来の標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーを設計し合成する。具体的には、例えば  ヒト由来の標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡを取得するためには、配列番号４２で示される塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号４３で示される塩基配列からなるリバースプライマーを、アプライドバイオシステムズ社製モデル３９４等のＤＮＡ合成機を用いて合成する。
一方、例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳類動物等の組織から、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー  クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）等に記載の遺伝子工学的方法に準じて二本鎖ｃＤＮＡを調製する。具体的には、まず、ヒト、サル、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳類動物等の組織から全ＲＮＡを調製する。例えば肝臓等の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに当該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェノール法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の方法により全ＲＮＡを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン製）、ＴＲＩＳＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）がある。次いで、得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴプライマーをＲＮＡのポリＡ配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで該一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、かつ大腸菌ＲＮａｓｅＨを用いてＲＮＡ鎖にニックとギャップを入れることにより得られるＲＮＡ断片をプライマーとして大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二本鎖のｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡはフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。なお、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えばｃＤＮＡ合成システムプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）やＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ合成キット（アマシャムバイオサイエンス社製）等があげられる。
次に、前記のようにして合成されたｃＤＮＡ  １０ｎｇを鋳型にし、前記のプライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌ程度添加し、例えばＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）および該酵素に添付されたバッファーを用いてＰＣＲを行う。かかるＰＣＲとしては、例えば、ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００（アプライドバイオシステムズ社製）等の市販のＰＣＲ用サーマルサイクラーを用いて、９５℃１分間次いで６８℃３分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル程度行う。ここで、前記のようにして合成されたｃＤＮＡに替えて、クロンテック社製クイッククローンｃＤＮＡ等の市販の各種動物由来のｃＤＮＡを用いてもよい。得られた反応液全量を、低融点アガロース（アガロースＬ：ニッポンジーン社製）を用いたアガロースゲル電気泳動に供する。電気泳動したゲル上にて既知配列から予想される大きさの標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡからなるバンドの存在を確認した後、そのバンド部分のゲルからＤＮＡを回収する。回収されたＤＮＡの塩基配列を分析することにより、回収されたＤＮＡが目的とするＤＮＡであることを確認することができる。
このようにして取得された標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡは、必要に応じて、大腸菌等において複製可能なベクターにクローニングする。具体的には例えば、回収されたＤＮＡの約１μｇをＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇキット（宝酒造社製）等で処理してその末端を平滑化し、これに次にＴ４ポリヌクレオチドカイネースを反応させてその末端をリン酸化する。当該ＤＮＡをフェノール処理した後、エタノール沈殿法により精製し、精製されたＤＮＡを大腸菌等において複製可能なベクターに導入することにより、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを保有するベクターを得ることができる。
【００１６】
次いで、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡに、「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列をもたらす塩基置換を、部位特異的変異導入法等によって導入する。具体的には、例えば、上記のようにして作製された標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを保有するベクターのＤＮＡを調製する。調製されたＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、塩基置換を導入しようとする塩基配列を含むＤＮＡを単離する。得られたＤＮＡを、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等の１本鎖ＤＮＡ調製用に用いられるベクターにクローニングし、大腸菌ＣＪ２３６等に導入する。得られた大腸菌クローンを、例えば、約１ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ以上の濃度のＭ１３ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含む２ｘＹＴ培地１０  ｍｌへ懸濁する。得られた懸濁液を３７℃で約２時間振とう培養した後に、カナマイシン（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を終濃度５０  μｇ／ｍｌになるように加え、更に約２２時間培養する。培養液を遠心分離した後、８  ｍｌの遠心上清を１５  ｍｌ容チューブに移し、２  ｍｌの２．５Ｍ  ＮａＣｌ−４０  ％  ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ社製）を加え攪拌する。これを４℃で１時間静置した後、遠心分離（３，０００  ｒｐｍ、１０  分間、４  ℃）してファージを回収する。回収されたファージを４００  μｌの蒸留水に懸濁し、フェノール−クロロホルム処理をした後、エタノール沈殿を行なうことにより、塩基置換を導入しようとする塩基配列を含む１本鎖ＤＮＡを得る。
調製された１本鎖ＤＮＡを鋳型として塩基置換用のオリゴヌクレオチドを用いて変異を導入する。塩基置換用のオリゴヌクレオチドとしては、約２０塩基〜約４０塩基からなり、上記のようにして調製された１本鎖ＤＮＡに相補し、かつ目的の部位に「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する。例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列の
アミノ酸番号７２０で示されるアラニンをコードする塩基配列をスレオニンをコードする塩基配列に置換するためのオリゴヌクレオチドとしては、配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、
アミノ酸番号８２９で示されるロイシンをコードする塩基配列をプロリンをコードする塩基配列に置換するためのオリゴヌクレオチドとしては、配列番号７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、
アミノ酸番号８７９で示されるロイシンをコードする塩基配列をグルタミンをコードする塩基配列に置換するためのオリゴヌクレオチドとしては、配列番号８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、
アミノ酸番号８９０で示されるフェニルアラニンをコードする塩基配列をロイシンをコードする塩基配列に置換するためのオリゴヌクレオチドとしては、配列番号９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、
アミノ酸番号９０９で示されるリジンをコードする塩基配列をアルギニンをコードする塩基配列に置換するためのオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
【００１７】
例えば、合成された塩基置換用オリゴヌクレオチド約１０ｐｍｏｌをポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）でリン酸化した後、上記の１本鎖ＤＮＡの約０．２ｐｍｏｌと混合し、アニーリングバッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４），  ２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ５０ｍＭ  ＮａＣｌ］１０μｌ中で、７０℃で１０分間、次いで３７℃で６０分間、さらに４℃で保温する。得られた混合液に、１．２  μｌの合成用バッファー（１７．５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４），３７．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ５００μＭ  ＤＴＴ、  ４００μＭ  ｄＡＴＰ、  ４００μＭ  ｄＣＴＰ、  ４００μＭ  ｄＧＴＰ、  ４００μＭ  ｄＴＴＰ、７５０μＭ  ＡＴＰ）と２ユニット（０．２５  μｌ）のＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂｓ社製）と２ユニット（０．２５  μｌ）のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）とを加えた後、４℃で５分間、次いで室温で５分間、さらに３７℃で２時間保温する。得られた反応液のうち２μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換する。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのＤＮＡを精製し、これらの塩基配列を分析して、目的の「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するプラスミドを選択する。
得られたプラスミドのＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、目的の「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列を有するＤＮＡを単離する。得られたＤＮＡを、標準型アンドロゲンレセプターをコードするＤＮＡの相当する部分と、通常の遺伝子工学的手法に準じて置き換えることにより、本発明変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが得られる。得られたＤＮＡの塩基配列を通常の方法で分析することにより、該ＤＮＡが目的とするＤＮＡであることを確認することができる。
【００１８】
このようにして取得される本発明ＤＮＡは、導入される宿主細胞において利用可能なベクター、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるベクターであって、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーをもつベクター（以下、基本ベクターと記すこともある。）に、通常の遺伝子工学的手法に準じて組み込むことができる。
基本ベクターとしては、具体的には微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合、例えばプラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造社製）や、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合は、プラスミドｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などをあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合はｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドｐＢＰＶ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ＥＢウイルスプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルスなどをあげることができ、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。
自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用プラスミドｐＡＣＴ２や、ウシパピローマウイルスプラスミドｐＢＰＶ、ＥＢウイルスプラスミドｐＣＥＰ４などに本発明ＤＮＡを組込むと、得られたベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。
バキュロウイルスやワクシニアウイルス等のウイルスに本発明ＤＮＡを組み込むには、使用しようとするウイルスのゲノムと相同な塩基配列を含有するトランスファーベクターを用いることができる。このようなトランスファーベクターの具体的例としては、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から市販されているｐＶＬ１３９２，ｐＶＬ１３９３（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｓｕｍｍｅｒｓ  Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３））、ｐＳＦＢ５（Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５８４−５５８８（１９９１））などのプラスミドをあげることができる。本発明ＤＮＡを前記のようなトランスファーベクターに挿入し、当該トランスファーベクターとウイルスゲノムとを同時に宿主細胞に導入すると、トランスファーベクターとウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こり、本発明ＤＮＡがゲノム上にくみこまれたウイルスを得ることができる。ウイルスゲノムとしては、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，Ｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓなどのゲノムを用いることができる。より具体的には、例えばバキュロウイルスに本発明ＤＮＡを組み込む場合、トランスファーベクターｐＶＬ１３９３、ｐＶＬ１３９２等のマルチクローニング部位に本発明ＤＮＡを挿入した後、該トランスファーベクターのＤＮＡとＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）とを昆虫細胞Ｓｆ２１（ＡＴＣＣから入手可能）株にリン酸カルシウム法等により導入し、当該細胞を培養する。前記、当該トランスファーベクターのＤＮＡとＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡを用いると、本発明ＤＮＡの挿入されたウイルスＤＮＡを含有するウイルス粒子のみが宿主細胞の培養液中へ放出される。かかる組換えウイルス粒子を培養液から回収しこれをフェノール等で除蛋白処理することにより、本発明ＤＮＡを含有するウイルスのＤＮＡを得ることができる。さらに、該ウイルスのＤＮＡを、昆虫細胞Ｓｆ２１株などのウイルス粒子形成能を有する宿主細胞にリン酸カルシウム法等により導入し、当該細胞を培養することにより、前記組換えウイルス粒子を増やすことができる。
一方、マウス白血病レトロウイルスなどの比較的小さなゲノムへは、トランスファーベクターを利用せずに、本発明ＤＮＡを直接組み込むこともできる。例えばウイルスベクタ−ＤＣ（Ｘ）（Ｅｌｉ  Ｇｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，５０４−５１２（１９８６））などは、該ベクター上のクローニング部位に本発明ＤＮＡを組み込むとよい。このようにして構築した組換えウイルスを例えばＡｍｐｌｉ−ＧＰＥ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，３７５５（１９９２））などのパッケージング細胞に導入すれば、本発明ＤＮＡの挿入されたウイルスＤＮＡを含有するウイルス粒子を得ることができる。
【００１９】
本発明ＤＮＡの上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のような基本ベクターに組み込むことにより、本発明ＤＮＡを宿主細胞で発現させることの可能なベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、本発明ＤＮＡが導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下に本発明ＤＮＡが発現されるように、該プロモーターと本発明ＤＮＡとを結合させることを意味する。使用されるプロモーターは、導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示すものであって、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（ｌａｃＰ）、トリプトファンオペロンのプロモーター（ｔｒｐＰ）、アルギニンオペロンのプロモーター（ａｒｇＰ）、ガラクトースオペロンのプロモーター（ｇａｌＰ）、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター（λ−ｐＬ、λ−ｐＲ）等をあげることができ、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期または後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター等をあげることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合にはＡＤＨ１プロモーターなどをあげることができる。
また、宿主細胞において機能するプロモーターをあらかじめ保有する基本ベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターと本発明ＤＮＡとが機能可能な形で結合するように、当該プロモーターの下流に本発明ＤＮＡを挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、当該クローニング部位に本発明ＤＮＡを挿入し動物細胞へ導入すれば、本発明ＤＮＡを発現させることができる。これらのプラスミドにはあらかじめＳＶ４０の自律複製起点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉ（−）のＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えばＣＯＳ細胞等に当該プラスミドを導入すると、細胞内でプラスミドのコピー数が非常に増大し、結果として当該プラスミドに組み込まれた本発明ＤＮＡを大量発現させることもできる。また前述の酵母用プラスミドｐＡＣＴ２はＡＤＨ１プロモーターを有しており、当該プラスミドまたはその誘導体のＡＤＨ１プロモーターの下流に本発明ＤＮＡを挿入すれば、本発明ＤＮＡを例えばＣＧ１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等の出芽酵母内で大量発現させることが可能なベクターが構築できる。
【００２０】
本発明ＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる人工細胞（以下、本発明ＤＮＡ導入細胞と記すこともある。）は、例えば、本発明ＤＮＡまたは本発明ＤＮＡが導入されたベクターを宿主細胞に導入することにより取得することができる。本発明ＤＮＡまたは本発明ＤＮＡの組込まれたベクターを宿主細胞へ導入する方法としては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、微生物である大腸菌を宿主細胞とする場合は、「モレキュラー・クローニング」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることができる。また、哺乳類動物細胞または昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、またはリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法により前記細胞に導入することができる。酵母菌を宿主細胞とする場合には、例えばリチウム法を基にしたＹｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いて導入することができる。
尚、ウイルスをベクターに用いる場合には、上述のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスＤＮＡを宿主細胞に導入できるほか、ウイルスＤＮＡを含有する組み換えウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによってもウイルスＤＮＡを宿主細胞に導入することができる。
【００２１】
本発明ＤＮＡ導入細胞を選抜するには、例えば、本発明ＤＮＡまたは本発明ＤＮＡが組込まれたベクターを宿主細胞へ導入する際に、同時に選抜マーカー遺伝子を宿主細胞へ導入し、得られた細胞を、導入された選抜マーカー遺伝子の性質に応じた条件で培養するとよい。例えば、選抜マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、本発明ＤＮＡまたは本発明ＤＮＡが組込まれたベクターと、選抜マーカー遺伝子とが導入された宿主細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤の組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせなどをあげることができる。また、選抜マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、該栄養素を含まない最少培地を用いて、本発明ＤＮＡまたは本発明ＤＮＡが組込まれたベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。
本発明ＤＮＡが宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明ＤＮＡ導入細胞を取得するには、例えば、本発明ＤＮＡが組込まれたベクターを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これを選抜マーカー遺伝子とともに、前述の方法で宿主細胞へ導入して該細胞を通常数週間培養し、導入された選抜マーカー遺伝子の形質発現を指標にして目的とする本発明ＤＮＡ導入細胞を選抜する。例えば、前述のような選抜薬剤に対する耐性付与遺伝子を選抜マーカー遺伝子として、本発明ＤＮＡの組込まれたベクターとともに前述の方法で宿主細胞に導入し、当該細胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上該細胞を継代培養して、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培養することにより、本発明ＤＮＡが宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明ＤＮＡ導入細胞を選抜することができる。当該細胞は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、一過性に本発明ＤＮＡを導入した株と比較して、実験毎のＤＮＡ導入の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された細胞を用いて試験を実施することが可能となる。
【００２２】
上述のようにして得られた本発明ＤＮＡ導入細胞を培養することにより、本発明変異型アンドロゲンレセプターを産生させることができる。
例えば、本発明ＤＮＡ導入細胞が微生物である場合、当該細胞は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養される。培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（試験管振とう式培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（ＪａｒＦｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等）などが可能である。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更できるが、例えば、約１５℃〜約４０℃の培養温度、約６〜約８の培地ｐＨで培養するのが一般的である。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間〜約５日間である。温度シフト型やＩＰＴＧ誘導型等の誘導型のプロモーターを有する発現ベクターを用いた場合には誘導時間は１日以内が望ましく、通常数時間である。
また、本発明ＤＮＡ導入細胞が哺乳類、昆虫類等の動物細胞である場合には、当該細胞は一般の培養細胞における通常の培養に使用される培地を用いて培養することができる。選抜薬剤を利用して当該細胞を作製した場合には、当該選抜薬剤の存在下に培養するのが望ましい。哺乳類動物細胞の場合には、例えば終濃度が１０％となるようＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地（ニッスイ社製等）を用いて３７℃、５％ＣＯ２存在下等の条件で数日ごとに新しい培養液に交換しながら培養すればよい。細胞がコンフルエントになるまで増殖したら、例えば０．２５ｗ／ｖ％程度のトリプシンＰＢＳ溶液を加えて個々の細胞に分散させ、数倍に希釈して新しいシャーレに播種し培養を続ける。昆虫類動物細胞の場合も同様に、例えば１０ｖ／ｖ％ＦＢＳおよび２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔｌａｔｅを含むＧｒａｃｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ等の昆虫細胞用培養液を用いて培養温度２５℃から３５℃で培養すればよい。この際、Ｓｆ２１細胞などのシャーレからはがれやすい細胞の場合は、トリプシン液を用いずピペッテイングにより分散させ継代培養を行なうことができる。また、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ等ウイルスベクターを含む細胞の場合には、培養時間は細胞質効果が現れて細胞が死滅する前、例えばウイルス感染後７２時間までとするのが好ましい。
本発明ＤＮＡ導入細胞により産生された本発明変異型アンドロゲンレセプターの回収は、適宜、通常の単離、精製の方法を組み合わせて行えば良く、例えば、培養終了後、本発明ＤＮＡ導入細胞を遠心分離等で集め、集められた該細胞を通常のバッファー、例えば２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦからなるバッファーに懸濁した後、ポリトロン、超音波処理、ダウンスホモジナイザー等で破砕し、破砕液を数万ｘｇで数十分間から１時間程度超遠心分離し、上清画分を回収することにより、本発明変異型アンドロゲンレセプターを含む画分を得ることができる。さらに、前記上清画分をイオン交換、疎水、ゲルろ過、アフィニティ等の各種クロマトグラフィーに供することにより、より精製された本発明変異型アンドロゲンレセプターを回収することもできる。この際、アンドロゲン応答配列を含む約１５ｂｐから約２００ｂｐ程度の長さのオリゴヌクレオチドをプローブとしたＤＮＡ結合アッセイなどにより、本発明変異型アンドロゲンレセプターを含む画分を見分けることもできる。
このようにして製造された本発明変異型アンドロゲンレセプターは、例えば、被験物質の本発明変異型アンドロゲンレセプターに対する結合能・結合量などを評価するためのレセプターバインディングアッセイ等に用いることができる。
【００２３】
本発明変異型アンドロゲンレセプターを用いたレセプターバインディングアッセイは、当該変異型アンドロゲンレセプターに対する化学物質の結合能の測定や結合量の定量のほか結合特異性、結合力の分析などが可能な試験方法である。例えば、上述のようにして本発明ＤＮＡ導入細胞から回収された本発明変異型アンドロゲンレセプターに、標識されたリガンド（以下、標識リガンドと記す。）が結合しているところへ、被験物質を共存させると、被験物質と標識リガンドとの競合から、両者のレセプターへの親和性に応じて、標識リガンドがレセプターから遊離し、レセプターに結合した標識リガンドの量が減少し、よってレセプターに結合した標識量が減少する。従って、遊離型の標識リガンドの標識量または結合型の標識リガンドの標識量をモニターすることにより、被験物質のレセプターへの結合能が間接的にわかる。
標識リガンドとしては、例えば、トリチウム標識されたｍｉｂｏｌｅｒｏｎｅ等を用いることができる。標識リガンドの結合型／遊離型の分離はヒドロキシアパタイト法やグリセロール密度勾配超遠心法などで行うことができる。反応系は大きく３群にわけられる。一つの系は、本発明変異型アンドロゲンレセプターに標識リガンドが結合しているところへ溶媒のみが添加される群であり、被験物質の濃度がゼロの系に相当し、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドのアンドロゲンレセプターに対する総結合量を示す。もう一つの系は、本発明変異型アンドロゲンレセプターに標識リガンドが結合しているところへ、例えば、標識されていないＥ２が、レセプターを十分飽和し標識リガンドが結合できなくなるだけの濃度（例えば１０μＭ）となるよう添加された系であり、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、標識リガンドの本発明変異型アンドロゲンレセプターに対する非特異的な結合量と判断される。したがって、本発明変異型アンドロゲンレセプターへの標識リガンドの特異的結合量は、総結合量からこの非特異的結合量を引いた値となる。３番目の系は、本発明変異型アンドロゲンレセプターに標識リガンドが結合しているところへ、被験物質が、例えば最終濃度１０μＭ（この濃度は目的により任意に変更する。）となるよう添加された系である。被験物質が本発明変異型アンドロゲンレセプターへの結合能を有する場合は、この系から得られる結合型の標識リガンドの標識量は、上記のようにして求めた被験物質濃度がゼロの時の本発明変異型アンドロゲンレセプターへの標識リガンドの特異的結合量より小さくなる。このようにしてレセプターバインディングアッセイを行うことにより、本発明変異型アンドロゲンレセプターに対する被験物質の結合能を調べることができ、被験物質が複数の物質を含む場合にはその中に本発明変異型アンドロゲンレセプターに親和性を示す物質が存在するかどうかを調べることもできる。さらに、本発明変異型アンドロゲンレセプターに対する被験物質の結合能をより詳細に評価するには、例えば前記の３番目の系における被験物質の添加濃度を変えて同様にアッセイを行い結合型の標識リガンドの標識量を測定する。該測定値に基づき、各アッセイにおける結合型と遊離型のリガンド量を算出して、例えばスキャッチャード解析を行うことにより、被験物質と本発明変異型アンドロゲンレセプターとの結合親和性、結合特異性、結合容量等を評価することができる。
【００２４】
ヒト等の動物の組織や細胞が保有するアンドロゲンレセプター遺伝子が本発明変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であるか否かを調べるには、例えば、該組織や細胞から調製される核酸において、アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、本発明変異型アンドロゲンレセプターの「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べるとよい。
まず、ヒト等の動物からの組織や細胞等の被験試料を採取し、当該試料からゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等の核酸を調製する。例えば、毛髪、末梢血、口腔上皮細胞などのゲノムＤＮＡの抽出が可能な細胞組織の試料から、例えば村松正寶、”ラボマニュアル遺伝子工学”（丸善１９８８）やＴＡＫＡＲＡ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｎｅｗｓ  Ｎｏ２，宝酒造（１９９１．９）等に記載される通常の方法に準じてゲノムＤＮＡ調製する。具体的には、たとえば試料が毛髪の場合は、毛髪２〜３本を滅菌水、エタノールで洗浄後、２〜３  ｍｍの長さに切断し、これにＢＣＬ−Ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），  ５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．３２Ｍ  Ｓｕｃｒｏｓｅ，  １  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００］２００μｌを加え、さらにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを最終濃度１００μｌ／ｍｌ  、ＳＤＳを最終濃度０．５  ％（ｗ／ｖ）になるようにそれぞれ加え混合する。この混合物を７０℃で１時間保温した後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡを得ることができる。また、試料が末梢血の場合は、ＤＮＡ−Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等を用いて該試料を処理することによりゲノムＤＮＡを得ることができる。また、試料が手術や針等により得られた生検組織サンプルである場合は、該試料が新鮮なうちに例えばＴＲＩＺＯＬ試薬（ＧＩＢＣＯ社製）等を用いてＲＮＡを調製し、調製されたＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成すれば、合成されたｃＤＮＡをゲノムＤＮＡの替わりに検査に使用することができる。
【００２５】
このようにして被験試料から調製されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等の核酸に含まれるアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、本発明変異型アンドロゲンレセプターの「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる方法としては、例えば、試料から調製された核酸を鋳型として、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定する方法をあげることができる。
「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有するＤＮＡは、例えばＰＣＲにより増幅することができる。かかるＰＣＲに使用することのできるプライマーは、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸」よりもアミノ末端側もしくはカルボキシ末端側のアミノ酸配列をコードする塩基配列に基づいて設計することができる。ＧＣ含量が約３０％以上約７０％以下、好ましくは約３５％以上約７０％以下程度であり、かつ約１０塩基〜約５０塩基、好ましくは約１５塩基〜約４０塩基からなるオリゴヌクレオチドをあげることができる。
具体的には、例えば、ヒト由来のアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の遺伝子型を分析する場合に、
例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅するには、フォワードプライマーとして配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、リバースプライマーとして配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅するには、フォワードプライマーとして配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、リバースプライマーとして配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅するには、フォワードプライマーとして配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、リバースプライマーとして配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅するには、フォワードプライマーとして配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、リバースプライマーとして配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅するには、フォワードプライマーとして配列番号２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、リバースプライマーとして配列番号２１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
上記のようなオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行う場合には、一般にはフォワード用とリバース用の二種類のオリゴヌクレオチドを組み合わせて用いる。これらのオリゴヌクレオチドは、例えばβ−シアノエチルホスホアミダイト法やチオホスファイト法を用いる市販の自動ＤＮＡ合成装置によって調製することができる。
ＰＣＲは、例えば、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２３０巻、第１３５０ページから第１３５４ページ（１９８５）等に記載の方法に準じて行うことができる。例えば、プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類の塩基（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）及びゲノムＤＮＡをあらかじめ加えた約１．５  ｍＭから約３．０  ｍＭの塩化マグネシウム等を含有する増幅用緩衝液を調製する。調製された増幅用緩衝液を用いて、例えば以下の条件による３工程の増幅サイクルを繰返して行う。まず変性工程として、たとえば、約９０℃から約９５℃、好ましくは約９４℃から約９５℃で、１分間から約５分間、好ましくは約１分間から約２分間の保温が行われる。次にプライマーのアニーリング工程として、たとえば、約３０℃から７０℃、好ましくは４０℃から６０℃で、約３秒間から約３分間、好ましくは約５秒間から約２分間の保温が行われる。さらにＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程として、たとえば、約７０℃から約７５℃、好ましくは約７２℃から約７３℃で、約１５秒間から約５分間、好ましくは約３０秒間から約４分間の保温が行われる。この３工程からなる増幅サイクルを、約２０回から約５０回、好ましくは約２５回から約４０回行う。
このようなＰＣＲで増幅されたＤＮＡを、必要に応じて低融点アガロース電気泳動等に供して回収した後、回収されたＤＮＡについてダイレクトシークエンス［ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７，４９４（１９８９）］を行うことにより該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩基配列は、Ｍａｘａｍ  Ｇｉｌｂｅｒｔ法（例えば、Ｍａｘａｍ．Ａ．Ｍ  ＆  Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ７４，  ５６０，  １９７７等に記載される）やＳａｎｇｅｒ法（例えばＳａｎｇｅｒ，Ｆ．  ＆  Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４，  ４４１，  １９７５．，Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，  ＆  Ｎｉｃｋｌｅｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，  ７４，  ５４６３，  １９７７等に記載される）に準じて解析すればよい。ＡＢＩ社製モデル３７７等の自動ＤＮＡシークエンサーを用いる場合には、対応するＤＮＡシークエンスキット例えばＡＢＩ社製ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ等を用いることができる。決定された塩基配列が、本発明変異型アンドロゲンレセプターの「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列を含有しているか否かを確認する。
【００２６】
被験試料から調製されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等の核酸に含まれるアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、本発明変異型アンドロゲンレセプターの「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる方法としては、例えば、
（ｉ）試料から調製された核酸を鋳型として、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅し、
（ｉｉ）増幅されたＤＮＡを電気泳動し、その移動度を測定して標準と比較する方法をあげることもできる。
具体的には、例えば、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有するＤＮＡを、上記と同様にしてＰＣＲで増幅する。この際、プライマーとして使用する上記のようなオリゴヌクレオチドを、あらかじめ通常の方法に準じて３２Ｐ等の放射性同位元素で標識した後、これをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅する。また、標準型アンドロゲンレセプターの相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも同様にして増幅する。
増幅されたＤＮＡを、例えばＨｕｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ，  ２巻、３３８ページに記載されるＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法などに準じて電気泳動する。具体的には、増幅されたＤＮＡを加熱変性して１本鎖ＤＮＡとし、非変性ポリアクリルアミド電気泳動に供して１本鎖ＤＮＡを各々分離する。電気泳動に用いられる緩衝液としては、トリス−リン酸系（ｐＨ７．５−８．０）、トリス−酢酸系（ｐＨ７．５−８．０）、トリス−ホウ酸系（ｐＨ７．５−８．３）などが上げられ、好ましくはトリス−ホウ酸系を上げることができる。また必要に応じて、ＥＤＴＡ等を添加することもできる。電気泳動の条件としては、例えば、定電力３０Ｗ−４０Ｗ、泳動温度室温（約２０℃から約２５℃）または４℃にて、１時間から４時間泳動する条件をあげることができる。次いで、電気泳動後のゲルをろ紙上に移し、この上にＸ線フィルムを密着させ、適当な遮光カセットの中で、放射能標識された各々の１本鎖ＤＮＡから放射される放射線をフィルム上に感光させる。当該フィルムを現像し、得られたオートラジオグラム上で、試料由来の「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有するＤＮＡと、標準型アンドロゲンレセプターの相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの移動度とを比較する。これらの移動度が異なる場合には、試料由来の「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列に、標準型アンドロゲンレセプターの相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列とは異なる塩基配列が含まれると判定することができる。さらに、例えば、この移動度の異なるＤＮＡを含むゲルからそこに含まれるＤＮＡを抽出し、これを鋳型にしてＰＣＲを行うことによって該ＤＮＡを増幅し、低融点アガロースゲル電気泳動に供して回収したのちダイレクトシークエンスを行うことにより、当該ＤＮＡの塩基配列を決定することもできる。決定された塩基配列が、本発明変異型アンドロゲンレセプターの「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列を含有しているか否かを確認する。
【００２７】
被験試料から調製されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等の核酸に含まれるアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、本発明変異型アンドロゲンレセプターの「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる方法としては、例えば、被験試料から調製される核酸と、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプローブとのストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションの効率を測定し標準と比較する方法をあげることもできる。
例えば、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列のうちの、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有するプローブを調製する。かかるプローブとしては、ＧＣ含量が約３０％以上約７０％以下のオリゴヌクレオチドを用いることができる。ハイブリダイゼーションによる検出に適するようにオリゴヌクレオチドを構成する塩基数として約１５個以上約４０個以下が好ましい。具体的には、例えば、ヒト由来標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列のうちの、
「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有するプローブとしては、配列番号２２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、
「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有するプローブとしては、配列番号２３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、
「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有するプローブとしては、配列番号２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、
「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有するプローブとしては、配列番号２５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、
「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有するプローブとしては、配列番号２６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
上記のようなオリゴヌクレオチドは、一般的に、オリゴヌクレオチドを構成する塩基数が約１００個以下の場合には、例えばβ−シアノエチルホスホアミダイト法やチオホスファイト法を用いる市販の自動ＤＮＡ合成装置によって調製することができる。
上述のようにして被験試料から調製されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等の核酸と、前記のプローブとを混合してストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションを行う。被験試料中の核酸から、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する核酸を、例えば、配列番号１０〜１７のいずれかで示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等をプライマーとして用いたＰＣＲにより上述のようにして増幅した後、ハイブリダイゼーションに供してもよい。ハイブリダイゼーションは、通常のドットブロットハイブリダイゼーション法や、ミスマッチハイブリダイゼーション部位に結合する酵素であるＴａｑ  ＭｕｔＳという酵素を利用したミスマッチ検出方法［  Ｂｉｓｗａｓ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈｓｉｅｈ，Ｐ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１  ９  ｐｐ５０４０−５０４８（１９９６）やＮｉｐｐｏｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  １９９９  Ｎｏ．１２５，ニッポンジーン社  、富山  などに記載されている。］などに準じて行うことができる。
ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件としては、例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液（０．１％（ｗ／ｖ）  フィコール４００、０．１％（ｗ／ｖ）  ポリビニルピロリドン、０．１％ＢＳＡ）、０．５％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ存在下に行うか、または１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むＤＩＧ  ＥＡＳＹ  Ｈｙｂ溶液（ベーリンガーマンハイム社）中で行い、洗浄工程として、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）および０．５％ＳＤＳ存在下に、室温で１５分間の保温を２回行い、さらに０．１×ＳＳＣ（０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム）および０．５％ＳＤＳ存在下に、３０分間保温する条件等をあげることができる。、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における保温温度は、使用されるプローブの長さと組成によって異なるが、一般的には、プローブのＴｍ値と同じか、Ｔｍ値よりも若干低い温度に設定される。具体的には例えば、ハイブリダイゼーションにおいて、プローブと試料中の核酸との間に塩基間水素結合が形成される際の塩基対を想定し、ＡとＴの塩基対１つにつき２℃、ＧとＣの塩基対１つにつき４℃として、水素結合を形成するすべての塩基対の値を合計してこれをＴｍ値とする。このようにして算出されるＴｍ値と同じ温度か、およそ２℃〜３℃程度低い温度を選択する。
ドットブロットハイブリダイゼーション法の具体的な手順としては、例えば、まず、被験試料から調製されたゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ等の核酸、またはＰＣＲにより増幅された「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する核酸を、例えば、９０℃から１００℃で、３分間〜５分間保温した後、ナイロンフィルター［Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ（アマシャムファルマシア社製）など］にスポットし、スポットされたフィルターを濾紙上で乾燥した後、これに紫外線照射することにより核酸をフィルターに固定する。次いで、得られたＤＮＡ固定フィルターと上記のプローブとを、例えば、４０〜５０℃で、１０〜２０時間インキュベートすることによりハイブリダイズさせ、通常の方法に準じてプローブを含むハイブリッドを検出する。プローブとして３２Ｐ等の放射性同位元素で標識した放射性プローブを用いる場合には、ハイブリダイズ後のフィルターをＸ線フィルムに感光させることによりプローブを含むハイブリッドを検出することができる。ビオチン化ヌクレオチドで標識した非放射性プローブを用いる場合には、ストレプトアビジンを介してビオチン化アルカリ性フォスファターゼ等により当該プローブを含むハイブリッドを酵素標識し、酵素反応による基質の呈色あるいは発光を検出することによりプローブを含むハイブリッドを検出することができる。また、アルカリ性フォスファターゼあるいはペルオキシダーゼ等の酵素でスぺーサーを介して直接標識した非放射性プローブを用いることもできる。プローブを含むハイブリッドが検出されない場合には、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列に、使用したプローブの塩基配列と異なる塩基配列が含まれると判定することができる。
ミスマッチハイブリダイゼーション部位に結合する酵素であるＴａｑ  ＭｕｔＳという酵素を利用したミスマッチ検出方法を利用する場合には、熱（０〜７５℃）に対して安定で、高い温度でも活性を維持してＤＮＡのミスマッチ塩基対を認識して結合可能なＴａｑ  ＭｕｔＳの結合特性を利用して、未変性ポリアクリルアミドゲルを利用したゲルシフトアッセイまたはナイロンフィルターやニトロセルロースフィルターなどの固相上でのドットブロッテイング法等にてミスマッチ塩基対を検出することができる。ミスマッチが検出された場合には、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列に、使用したプローブの塩基配列と異なる塩基配列が含まれると判定することができる。
【００２８】
被験試料から調製されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等の核酸に含まれるアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、本発明変異型アンドロゲンレセプターの「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列を含有しているか否かを調べる方法としては、例えば、
（ｉ）被験試料から調製される核酸を鋳型として、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅し、
（ｉｉ）増幅されたＤＮＡを、上記の（ａ）および（ｂ）の性質を有するアミノ酸をコードする塩基配列への置換によりその認識配列が出現するかもしくは消失する制限酵素により消化し、消化の有無を測定する方法をあげることもできる。
例えば、まず、該試料から調製されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等の核酸を鋳型とし、後述のようにしてＰＣＲを行い、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅する。併行して、標準型アンドロゲンレセプターの相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを同様にして増幅しておいてもよい。増幅されたＤＮＡを、標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸をコードする塩基配列から「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列への塩基置換によりその認識配列が出現するかもしくは消失する制限酵素を用いて消化する。得られたＤＮＡ消化物を、例えば、アガロースやポリアクリルアミド等を用いたゲル電気泳動に供すれば、被験試料由来のＤＮＡの消化の有無を測定することができる。被験試料由来のＤＮＡの消化物のパターンを、標準型アンドロゲンレセプターの相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの消化物のパターンと比較してもよい。測定された消化の有無に基づき、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する核酸に、標準型アンドロゲンレセプターの相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列と異なる塩基配列が含まれるか否かを判定することができる。さらに、例えば、上記のように増幅されたＤＮＡを、必要に応じて低融点アガロース電気泳動等に供して回収した後、回収されたＤＮＡについてシークエンスを行うことにより該ＤＮＡの塩基配列を決定してもよい。このようにして、被験試料から調製される核酸において、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列が、本発明変異型アンドロゲンレセプターの「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列を含有しているか否かを確認することができる。
具体的には、例えば、ヒト由来のアンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の遺伝子型を分析する場合に、被験試料から調製された核酸を鋳型として、
例えば、フォワードプライマーとして配列番号２７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号２８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行うと、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する約１００ｂｐのＤＮＡが増幅される。増幅された約１００ｂｐの長さのＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩで処理すると、鋳型として用いた核酸が、標準型アンドロゲンレセプターをコードする塩基配列を有している場合は消化されない。ところが、鋳型として用いた核酸が、アミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアラニンをコードする塩基配列ＧＣＣがスレオニンをコードする塩基配列ＡＣＣへ置換されてなる塩基配列を有する場合は、上記の約１００ｂｐの増幅ＤＮＡに制限酵素ＢｇｌＩＩで認識される塩基配列（ＡＧＡＴＣＴ）が生ずる。そこで、上記の約１００ｂｐの増幅ＤＮＡは該制限酵素により消化されて、約４０ｂｐのＤＮＡと約６０ｂｐのＤＮＡとが生じる。
例えば、フォワードプライマーとして配列番号２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行うと、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する約１００ｂｐのＤＮＡが増幅される。増幅された約１００ｂｐの長さのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで処理すると、鋳型として用いた核酸が、標準型アンドロゲンレセプターをコードする塩基配列を有している場合は消化されない。ところが、鋳型として用いた核酸が、アミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるロイシンをコードする塩基配列ＣＴＴがプロリンをコードする塩基配列ＣＣＴへ置換されてなる塩基配列を有する場合は、上記の約１００ｂｐの増幅ＤＮＡに制限酵素ＢａｍＨＩで認識される塩基配列（ＧＧＡＴＣＣ）が生ずる。そこで、上記の約１００ｂｐの増幅ＤＮＡは該制限酵素により消化されて、約４０ｂｐのＤＮＡと約６０ｂｐのＤＮＡとが生じる。
例えば、フォワードプライマーとして配列番号３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行うと、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する約１００ｂｐのＤＮＡが増幅される。増幅された約１００ｂｐの長さのＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで処理すると、鋳型として用いた核酸が、標準型アンドロゲンレセプターをコードする塩基配列を有している場合は消化されない。ところが、鋳型として用いた核酸が、アミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるロイシンをコードする塩基配列ＣＴＧがグルタミンをコードする塩基配列ＣＡＧへ置換されてなる塩基配列を有する場合は、上記の約１００ｂｐの増幅ＤＮＡに制限酵素ＰｖｕＩＩで認識される塩基配列（ＧＴＴＡＡＣ）が生ずる。そこで、上記の約１００ｂｐの増幅ＤＮＡは該制限酵素により消化されて、約４０ｂｐのＤＮＡと約６０ｂｐのＤＮＡとが生じる。
例えば、フォワードプライマーとして配列番号３３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行うと、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する約１００ｂｐのＤＮＡが増幅される。増幅された約１００ｂｐの長さのＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理すると、鋳型として用いた核酸が、標準型アンドロゲンレセプターをコードする塩基配列を有している場合は消化されない。ところが、鋳型として用いた核酸が、アミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるフェニルアラニンをコードする塩基配列ＴＴＴがロイシンをコードする塩基配列ＣＴＴへ置換されてなる塩基配列を有する場合は、上記の約１００ｂｐの増幅ＤＮＡに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで認識される塩基配列（ＡＡＧＣＴＴ）が生ずる。そこで、上記の約１００ｂｐの増幅ＤＮＡは該制限酵素により消化されて、約４０ｂｐのＤＮＡと約６０ｂｐのＤＮＡとが生じる。
例えば、フォワードプライマーとして配列番号３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行うと、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する約１００ｂｐのＤＮＡが増幅される。増幅された約１００ｂｐの長さのＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩで処理すると、鋳型として用いた核酸が、標準型アンドロゲンレセプターをコードする塩基配列を有している場合には消化されない。ところが、鋳型として用いた核酸が、アミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるリジンをコードする塩基配列ＡＡＡがセリンをコードする塩基配列ＡＧＡへ置換されてなる塩基配列を有する場合は、上記の約１００ｂｐの増幅ＤＮＡに制限酵素ＢｇｌＩＩで認識される塩基配列（ＡＧＡＴＣＴ）が生ずる。そこで、上記の約１００ｂｐの増幅ＤＮＡは該制限酵素により消化されて、約４０ｂｐのＤＮＡと約６０ｂｐのＤＮＡとが生じる。
このようにして、本発明変異型アンドロゲンレセプターの置換されたアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを検出することができる。
【００２９】
上述のようにして行うことができるヒト等の動物個体に由来する被験試料中のアンドロゲンレセプター遺伝子型の判定は、該個体の有するアンドロゲンレセプターのアンドロゲンに対する応答性を予測するうえで有用である。例えば、上述のようにしてアンドロゲンレセプター遺伝子型を分析することにより、アンドロゲンレセプターに転写活性化能力の低下をもたらす「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列の存在が明らかになれば、例えば、アンドロゲン不適応症等のアンドロゲン応答性の低下を伴う疾患等の原因解明の一助となる。また、例えば、前立腺癌等の通常アンドロゲンに依存して増殖する組織中のアンドロゲンレセプター遺伝子について、上述のようにしてその遺伝子型を分析し、アンドロゲンレセプターに転写活性化能力の低下をもたらす「置換されたアミノ酸」をコードする塩基配列の有無を調べると、当該組織の抗アンドロゲン物質による増殖抑制効果の予測につながる。
【００３０】
【実施例】
以下に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
実施例１  応答性レポーター遺伝子と選抜マーカー遺伝子とを含むプラスミドの作製
プラスミドｐＭＳＧ（ファルマシア社製）を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＳｍａＩで消化し、ＭＭＴＶ−ＬＴＲ由来のアンドロゲン応答配列を含む１４６３ｂｐのＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡをＢｌｕｎｔｉｎｇキット（宝酒造社製）で処理した（以下、当該ＤＮＡをＡＲＥ  ＤＮＡと記す。）。
また、ホタルルシフェラーゼをコードする塩基配列を含むプラスミドｐＧＬ３（プロメガ社製）を制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化した後、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ）を加えて６５℃で１時間保温し、さらにこれをＢｌｕｎｔｉｎｇキット（宝酒造社製）で処理した。得られたＤＮＡを低融点アガロース（ＡｇａｒｏｓｅＬ；ニッポンジーン社製）を用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルからＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡ約１００ｎｇと、上記のＡＲＥ  ＤＮＡ１μｇとを混合し、Ｔ４リガーゼを反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのＤＮＡを精製し、これらを制限酵素Ｋｐｎ  ＩおよびＣｌａＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動で分析した。プラスミドｐＧＬ３のＢｇｌ  ＩＩ部位とＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位の間にＡＲＥ  ＤＮＡが正しい方向で１コピー導入された構造を有するプラスミドを選択し、これをプラスミドｐＧＬ３−ＭＭＴＶと名づけた。
次いで、プラスミドｐＵＣＳＶ−ＢＳＤ（フナコシ社から購入）をＢａｍＨＩで消化し、ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子発現カセットをコードするＤＮＡを調製した。当該ＤＮＡと、上記プラスミドｐＧＬ３−ＭＭＴＶをＢａｍＨＩで消化しＢＡＰ処理して得られたＤＮＡとを混合して、Ｔ４リガーゼを反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換した。得られたアンピシリン耐性の大腸菌クローンからプラスミドＤＮＡを調製し、それぞれを制限酵素Ｂａｍ  ＨＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動で分析した。ブラストサイジンＳデアミナーゼ遺伝子発現カセットがＢａｍ  ＨＩサイトに導入された構造を有するプラスミドを選択し、プラスミドｐＧＬ３−ＭＭＴＶ−ＢＳＤと名づけた。
【００３２】
実施例２  標準型アンドロゲンレセプター発現プラスミドの作製
ヒト由来の標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡを取得するために、配列番号８で示される塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号９で示される塩基配列からなるリバースプライマーを、ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社製モデル３９４）を用いて合成した。
ヒトＰｒｏｓｔａｔｅ  ｃＤＮＡ  １０ｎｇ（クロンテック社製クイッククローンｃＤＮＡ＃７１２３−１）を鋳型にし、上記のプライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌ添加し、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）および該酵素に添付されたバッファーを用いて、反応液量を５０μｌとしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲにおいて反応液の保温は、ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、９５℃１分間次いで６８℃３分間の保温を１サイクルとしてこれを３５サイクル行った。次いで、反応液全量を、低融点アガロース（アガロースＬ：ニッポンジーン）を用いたアガロースゲル電気泳動に供した。エチジウムブロマイド染色により、既知配列から予想される大きさのＤＮＡが増幅されていることを確認した後、該ＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡの一部とダイターミネーターシークエンスキットＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）とを用いてダイレクトシークエンス用のサンプルを調製し、これを、オートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製、モデル３７００）を用いた塩基配列解析に供した。回収されたＤＮＡは配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することが確認された。
上記のようにして回収されたＤＮＡ約１００ｎｇを鋳型にして、配列番号４４で示される塩基配列を有するフォワードプライマー、および、配列番号９で示される塩基配列を有するリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行い、コザックのコンセンサス配列の直後にヒト標準型アンドロゲンレセプターをコードする塩基配列が連結されてなる塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。当該ＰＣＲの反応液は、鋳型とするＤＮＡ  ０．１μｇ、ＬＡ−Ｔａｑ  ポリメラーゼ（宝酒造社製）、当該酵素に添付された反応バッファー、および上記プライマー各１０ｐｍｏｌずつを混合し、反応液量を５０μｌとして調製した。当該反応液の保温は、９５℃１分間次いで６８℃にて３分間の保温を１サイクルとしてこれを２０サイクル行った。増幅されたＤＮＡを低融点アガロースゲル電気泳動法により分離回収した。回収されたＤＮＡの約１μｇを、ＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇキット（宝酒造社製）で処理してその末端を平滑化し、次いでＴ４ポリヌクレオチドカイネースを反応させてその末端をリン酸化した。得られたＤＮＡをフェノール処理した後、エタノール沈殿により精製し、その全量を以下の発現プラスミド作製用のインサートＤＮＡとして用いた。
プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで消化した後、ＢＡＰを加えて６５℃で１時間保温した。保温液からフェノール処理、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＢｌｕｎｔｉｎｇキット（宝酒造社製）で処理して末端を平滑化し、低融点アガロース（ニッポンジーン社製；アガロースＬ）を用いたアガロースゲル電気泳動に供し、バンド部分のゲルからＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡ約１００  ｎｇと、上記のインサートＤＮＡ全量とを混合し、Ｔ４  リガーゼを添加して反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換した。アンピシリン耐性を示したコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、その塩基配列をＡＢＩモデル３７００型オートシークエンサーを用いてダイターミネーター法で決定した。得られた塩基配列を、前述のダイレクトシークエンスで得られた塩基配列と比較して、翻訳領域の塩基配列が完全に一致していることが確認されたプラスミドを選択し、ｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲコザックと名づけた。
【００３３】
実施例３  本発明変異型アンドロゲンレセプター発現プラスミドの作製
（１）変異導入用一本鎖ＤＮＡの調製
実施例２で作製されたプラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲコザックを制限酵素ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｒｕＩ（宝酒造社製）で３７℃にて１時間消化した。当該消化液を低融点アガロースゲル電気泳動（ＡｇａｒｏｓｅＬ；ニッポンジーン社製）に供し、約１．５ｋｂのバンド部分のゲルからＤＮＡを回収した。次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）とで３７℃にて１時間消化したのち、これにＢＡＰを加えて６５℃で１時間保温した。次いで、当該保温液を低融点アガロース（ＡｇａｒｏｓｅＬ；ニッポンジーン社製）を用いた電気泳動に供し、バンド部分のゲルからＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡ約１００ｎｇと、上記の約１．５ｋｂのＤＮＡ約１００ｎｇとを混合し、Ｔ４リガーゼを反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのＤＮＡを精製し、これらを制限酵素ＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩとで、またはＰｓｔＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動で分析した。ＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩとの消化により約１．５ｋｂのＤＮＡが生じ、ＰｓｔＩの消化により約４．５ｋｂのＤＮＡが生じたプラスミド［Ｍ１３ファージの自律複製起点（ｆ１  ｏｒｉ）からの複製により、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５６５〜９１８で示されるアミノ酸配列（ヒト標準型アンドロゲンレセプターのＤＮＡ結合領域からＡＦ２領域までのアミノ酸配列）をコードする塩基配列を有するセンス鎖を含む１本鎖ＤＮＡが得られる構造のプラスミド］を選択し、これをプラスミドＫＳ−ＡＲＴと名づけた。
プラスミドＫＳ−ＡＲＴＨを用いて、ＭｃＣｌａｒｙ  ＪＡ等の方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９８９（３）：２８２−２８９）に準じ、ヒト標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列に部位特異的変異を導入した。まず、プラスミドＫＳ−ＡＲＨを大腸菌ＣＪ２３６コンピテントセル（宝酒造社製）に、当該セルに添付の説明書にしたがって導入した。アンピシリン耐性の大腸菌クローンを選択し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天培地［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー  クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）］上で１６時間培養した後、１コロニーを、約１ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌ以上の濃度のＭ１３ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含む２ｘＹＴ培地１０ｍｌへ懸濁した。得られた懸濁液を３７℃で２時間振とう培養した後に、カナマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を終濃度５０  μｇ／ｍｌになるように加え、更に２２時間培養した。培養液を遠心分離して菌を沈殿させた後、８  ｍｌの遠心上清を１５  ｍｌ容チューブに移し、２  ｍｌの２．５Ｍ  ＮａＣｌ−４０  ％  ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ社製）を加え攪拌した。これを４℃で１時間静置した後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）してファージを回収した。回収されたファージを４００μｌの蒸留水に懸濁し、等量のフェノールを加えて５分間緩やかに振とうした後、遠心分離（１５，０００  ｒｐｍ、５分間、４℃）した。水層を回収し、これに再度フェノールを加えて激しく振とうした後、遠心分離した。水層を回収しこれに等量のクロロホルムを加え、激しく振とうした後、遠心分離して水層を回収した。回収された水層に８００μｌの１００％エタノールと５０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムとを加え、−８０℃にて２０  分間保温した後に遠心分離した。得られた沈殿を７０％エタノールでリンスし、乾燥させた後、滅菌水に溶解した。得られた溶解液の波長２６０  ｎｍにおける吸光度を測定した。１吸光度が４０  ｎｇ／μｌに相当し、３０００塩基を有する１本鎖ＤＮＡは２００  ｎｇが０．２  ｐｍｏｌに相当するとして、当該溶解液のモル濃度を計算すると、０．５４  ｐｍｏｌ／μｌであった。このようにして配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５６５で示されるアミノ酸配列（ヒト標準型アンドロゲンレセプターのアミノ末端からＡＦ１領域までのアミノ酸配列）をコードするセンス鎖を含む１本鎖ＤＮＡの溶液を得た。
【００３４】
（２）変異の導入
実施例３（１）で調製された１本鎖ＤＮＡを鋳型として塩基置換用の合成オリゴヌクレオチドを用いて変異を導入した。
配列番号７〜１１のいずれかで示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。合成されたオリゴヌクレオチド１０  ｐｍｏｌをポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）でリン酸化した。リン酸化の反応条件は、当該酵素に添付された専用バッファー中で２ｍＭのＡＴＰを添加し、３７℃で３０分間の保温とした。
上記リン酸化反応溶液のうち、配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド１ｐｍｏｌ相当分と、実施例３（１）で調製された１本鎖ＤＮＡの０．２ｐｍｏｌとを混合し、アニーリングバッファー（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４），  ２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１０μｌ中で、７０℃で１０分間、次いで３７℃で６０分間保温した後、４℃で保温した。該混合液に、１．２μｌの合成用バッファー［１７５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４），３７５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ５  ｍＭ  ＤＴＴ，  ４  ｍＭ  ｄＡＴＰ，４  ｍＭ  ｄＣＴＰ，  ４  ｍＭ  ｄＧＴＰ，４  ｍＭ  ｄＴＴＰ，７．５  ｍＭ  ＡＴＰ］と２ユニット（０．２５μｌ）のＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂｓ製）と２ユニット（０．２５μｌ）のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）とを加えた後、４℃で５分間、次いで室温で５分間、さらに３７  ℃で２  時間保温した。当該反応液のうち２  μｌを用いて大腸菌ＤＨ５  αコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのＤＮＡを精製し、これらの塩基配列を分析した。配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号７２０で示されるアラニンをコードする塩基配列ＧＣＣがスレオニンをコードする塩基配列ＡＣＣに置換される塩基置換が、プラスミドＫＳ−ＡＲＴへ導入されてなるプラスミドを選択した。選択されたプラスミドをＴＲ７２０と名づけた。
配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのリン酸化反応溶液の代わりに、配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのリン酸化反応溶液１ｐｍｏｌ相当分を用いた以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号８２９で示されるロイシンをコードする塩基配列ＣＴＴがプロリンをコードする塩基配列ＣＣＴに置換される塩基置換が、プラスミドＫＳ−ＡＲＴへ導入されてなるプラスミドを得た。得られたプラスミドをＴＲ８２９と名づけた。
配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのリン酸化反応溶液の代わりに、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのリン酸化反応溶液１ｐｍｏｌ相当分を用いた以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号８７９で示されるロイシンをコードする塩基配列ＣＴＧがグルタミンをコードする塩基配列ＣＡＧに置換される塩基置換が、プラスミドＫＳ−ＡＲＴへ導入されてなるプラスミドを得た。得られたプラスミドをＴＲ８７９と名づけた。
配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのリン酸化反応溶液の代わりに、配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのリン酸化反応溶液１ｐｍｏｌ相当分を用いた以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号８９０で示されるフェニルアラニンをコードする塩基配列ＴＴＴがロイシンをコードする塩基配列ＣＴＴに置換される塩基置換が、プラスミドＫＳ−ＡＲＴへ導入されてなるプラスミドを得た。得られたプラスミドをＴＲ８９０と名づけた。
配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのリン酸化反応溶液の代わりに、配列番号１１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのリン酸化反応溶液１ｐｍｏｌ相当分を用いた以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号９０９で示されるリジンをコードする塩基配列ＡＡＡがアルギニンをコードする塩基配列ＡＧＡに置換される塩基置換が、プラスミドＫＳ−ＡＲＴへ導入されてなるプラスミドを得た。得られたプラスミドをＴＲ９０９と名づけた。
【００３５】
プラスミドＴＲ７２０を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩ（宝酒造社製）とで３７℃で１時間消化した。得られた消化物を低融点アガロースゲル電気泳動（ＡｇａｒｏｓｅＬ；ニッポンジーン社製）に供し、約１．５ｋｂのバンド部分のゲルからＤＮＡを回収した。また、実施例２で作製されたプラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲコザックを制限酵素制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩ（宝酒造社製）とで３７℃で１時間消化したのち、これにＢＡＰを加えて６５℃で１時間保温した。次いで、当該保温液を低融点アガロース（ＡｇａｒｏｓｅＬ；ニッポンジーン社製）を用いた電気泳動に供し、約６  ｋｂのバンド部分のゲルからＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡ約１００ｎｇと上記の約１．５ｋｂのＤＮＡ１００ｎｇとを混合し、Ｔ４リガーゼを反応させた。当該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した。アンピシリン耐性を示した大腸菌のコロニー数個からそれぞれの保有するプラスミドのＤＮＡ溶液を調製した。これら溶液の一部を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩとで、または制限酵素ＳａｃＩで消化した後、消化物をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分析した。その結果から、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩとによる消化物から約６ｋｂと約１．５ｋｂのバンドが検出され、かつ制限酵素ＳａｃＩによる消化物から約０．７ｋｂ、約１．０ｋｂ、約１．４ｋｂの三種類のバンドが検出されるプラスミドを複数個選択した。選択されたプラスミドの塩基配列を、ＡＢＩモデル３７００型オートシークエンサーを用いてダイターミネーター法で決定した。その結果、配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号７２０で示されるアラニンをコードする塩基配列ＧＣＣが、スレオニンをコードする塩基配列ＡＣＣに置換された塩基配列を有することを確認した。このようにして得られた本発明変異型アンドロゲンレセプター発現プラスミドをｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲ７２０と名付けた。
プラスミドＴＲ７２０の代わりに、プラスミドＴＲ８２９を用いた以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号８２９で示されるロイシンをコードする塩基配列ＣＴＴがプロリンをコードするＣＣＴに置換される塩基置換が、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲコザックに導入されてなるプラスミドを得た。このようにして得られた本発明変異型アンドロゲンレセプターＬ８２９Ｐの発現プラスミドをｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲ８２９と名づけた。
プラスミドＴＲ７２０の代わりに、プラスミドＴＲ８７９を用いた以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号８７９で示されるロイシンをコードする塩基配列ＣＴＧがグルタミンをコードするＣＡＧに置換される塩基置換が、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲコザックに導入されてなるプラスミドを得た。このようにして得られた本発明変異型アンドロゲンレセプターＬ８２９Ｐの発現プラスミドをｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲ８７９と名づけた。
プラスミドＴＲ７２０の代わりに、プラスミドＴＲ８９０を用いた以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号８９０で示されるフェニルアラニンをコードする塩基配列ＴＴＴがロイシンをコードする塩基配列ＣＴＴに置換される塩基置換が、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲコザックに導入されてなるプラスミドを得た。このようにして得られた本発明変異型アンドロゲンレセプターＦ８９０Ｌの発現プラスミドをｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲ８９０と名づけた。
プラスミドＴＲ７２０の代わりに、プラスミドＴＲ９０９を用いた以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号９０９で示されるリジンをコードする塩基配列ＡＡＡがアルギニンをコードするＡＧＡに置換される塩基置換が、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲコザックに導入されてなるプラスミドを得た。このようにして得られた本発明変異型アンドロゲンレセプターＫ９０９Ｒの発現プラスミドをｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲ９０９と名づけた。
【００３６】
実施例４  応答性レポーター遺伝子が染色体に導入されてなる動物細胞の作製
ヒト由来のＨｅＬａ細胞に、実施例１で作製されたプラスミドｐＧＬ３−ＭＭＴＶ−ＢＳＤのＤＮＡを直鎖化して導入し、安定形質転換細胞を作製した。
まず、プラスミドｐＧＬ３−ＭＭＴＶ−ＢＳＤのＤＮＡをＳａｌ  Ｉで消化した。約１ｘ１０６細胞のＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）を用いて３７℃にて５％ＣＯ２存在下に、直径約１０ｃｍのシャーレ（ファルコン社製）を用いて１２時間培養した。当該細胞に、リポフェクトアミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いたリポフェクション法により、上記の直鎖化されたプラスミドｐＧＬ３−ＭＭＴＶ−ＢＳＤのＤＮＡを導入した。リポフェクション法の条件はリポフェクトアミンに添付されたマニュアルの記載に従って、処理時間は１７時間、直鎖化されたプラスミドＤＮＡの総量は７μｇ／シャーレ、リポフェクトアミン量は２１μｌ／シャーレとした。リポフェクション処理後、培地を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換して約４８時間培養した。次いで、当該細胞をトリプシン処理によりシャーレから剥がして回収し、９６穴プレートに約１ｘ１０５／ウェルになるように播種し、更に２４時間培養した。培地を終濃度１６μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳが添加された培地に交換した後、培地を３日から４日ごとに新しい培地（ブラストサイジンＳを含む）に交換しながら約１ヶ月間培養した。出現した直径１ｍｍから数ｍｍの細胞コロニーを、トリプシン処理によりウェルより剥がし、その半量をあらかじめ培地を分注しておいた新しい９６穴ビュープレート（ベルトールド社製）に播種した。残り半量は培地を加えてそのまま継代しながら培養を続け、これをマスタープレートとした。上記の９６穴ビュープレートに播種した細胞は２４時間培養した後に、ＤＭＳＯに溶解させたデキサメタゾン（和光純薬製）を培地中の濃度が１００ｎＭ（培地中のＤＭＳＯ濃度は０．１％）となるように培地に添加し、更に２４時間培養した。次いでこのプレートについて、ウェルから培地を除き、器壁に接着している細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、５倍に希釈したＰＧＣ５０（東洋インキ社製）をウェルあたり１５μｌずつ加えて室温に１時間放置した。当該プレートを、酵素基質自動インジェクター付きルミノメーターＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）にそれぞれセットし、５０μｌの基質液ＰＧＬ１００（東洋インキ社製）を自動分注して、ルシフェラーゼ活性を測定した。この中で高いルシフェラーゼ活性を示す細胞を２１個選択して保存した。さらに前記細胞をそれぞれ１０ｃｍプレート上で拡大培養した。この２１種の細胞に実施例２で作製された標準型アンドロゲンレセプター発現プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲコザックをリポフェクトアミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いたリポフェクション法で、添付されたマニュアルの記載に従って導入した。得られた細胞に、ＤＭＳＯに溶解させたジヒドロテストステロン（以下、ＤＨＴと記す。）を培地中の終濃度が１ｎＭとなるように加えて２４時間培養し、上述した方法に従いルシフェラーゼ活性を測定した。ＤＨＴを添加した系で最も高い活性誘導を示した細胞に対応する標準型アンドロゲンレセプター発現プラスミド導入前の細胞を、応答性レポーター遺伝子の導入された安定形質転換細胞として選択した。
【００３７】
実施例５  本発明評価用細胞の調製と当該細胞を用いた本発明変異型アンドロゲンレセプター活性の測定
実施例４で選択された安定形質転換細胞を、１０ｃｍプレートに約２ｘ１０６細胞播種し、チャコールデキストラン処理済みＦＢＳが１０％となるよう添加されたＥ−ＭＥＭ培地（以下、ＦＢＳ含有Ｅ−ＭＥＭ培地と記す。）で、５％ＣＯ２条件下３７℃にて１日間培養を行った。当該細胞に、リポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてそのプロトコールに従い、６．５μｇの本発明変異型アンドロゲンレセプター発現プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲ１０８と０．５μｇのｐＲＬ−ｔｋ（東洋インキ社製）とを導入することにより、本発明評価用細胞を得た。また、上記の本発明変異型アンドロゲンレセプター発現プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲ７２０に替えて、６．５μｇのヒト標準型アンドロゲンレセプター発現プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲコザックを導入した細胞も同様に調製した。これらの細胞を３７℃にて１６時間培養した後、培地を交換し、さらに３時間培養した。その後、細胞を集めてＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地に懸濁して均一化し、予めＤＭＳＯで溶解したＤＨＴを培地中濃度が１００ｐＭ、１ｎＭもしくは１０ｎＭとなるように添加した（ＤＭＳＯの培地中濃度は０．１％）９６穴プレートに播種した。細胞が播種された９６穴プレートは３７℃にて約４０時間培養した後、５倍に希釈した細胞溶解剤ＰＧＣ５０（ニッポンジーン社製）を５０μｌ／ｗｅｌｌずつ加えて、時々軽くゆすりながら室温にて３０分間放置して細胞を溶解させた。このように調製された細胞溶解液を１０μｌずつ９６穴白色サンプルプレート（ベルトールド社製）に採取し、ｐＧＬ３−ＭＭＴＶ−ＢＳＤにコードされたホタルルシフェラーゼと、ｐＲＬ−ｔｋにコードされたシーパンジールシフェラーゼの活性を、基質自動インジェクター付きのルミノメーターＬＢ９６ｐ（ベルトールド社製）でデュアルルシフェラーゼ  レポーターシステム測定キット（プロメガ社製）を用いて添付の説明書に従って測定した。シーパンジールシフェラーゼの活性値（コントロールレポーターレポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）を１として、ホタルルシフェラーゼの活性値（応答性レポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）を表した。本発明変異型アンドロゲンレセプターＡ７２０Ｔがホタルルシフェラーゼ遺伝子（応答性レポーター遺伝子）の転写をＤＨＴの存在下に活性化する能力は、標準型アンドロゲンレセプターの該能力よりも低かった。
プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−  ｈＡＲ７２０の代わりに、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲ８２９を用いた以外は、上記と同様にして、ホタルルシフェラーゼとシーパンジールシフェラーゼの活性を測定し、シーパンジールシフェラーゼの活性値（コントロールレポーターレポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）を１として、ホタルルシフェラーゼの活性値（応答性レポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）を表した。本発明変異型アンドロゲンレセプターＬ８２９Ｐがホタルルシフェラーゼ遺伝子（応答性レポーター遺伝子）の転写をＤＨＴの存在下に活性化する能力は、標準型アンドロゲンレセプターの該能力よりも低かった。
プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−  ｈＡＲ７２０の代わりに、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲ８７９を用いた以外は、上記と同様にして、ホタルルシフェラーゼとシーパンジールシフェラーゼの活性を測定し、シーパンジールシフェラーゼの活性値（コントロールレポーターレポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）を１として、ホタルルシフェラーゼの活性値（応答性レポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）を表した。本発明変異型アンドロゲンレセプターＬ８７９Ｐがホタルルシフェラーゼ遺伝子（応答性レポーター遺伝子）の転写をＤＨＴの存在下に活性化する能力は、標準型アンドロゲンレセプターの該能力よりも低かった。
プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−  ｈＡＲ７２０の代わりに、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲ８９０を用いた以外は、上記と同様にして、ホタルルシフェラーゼとシーパンジールシフェラーゼの活性を測定し、シーパンジールシフェラーゼの活性値（コントロールレポーターレポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）を１として、ホタルルシフェラーゼの活性値（応答性レポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）を表した。本発明変異型アンドロゲンレセプターＦ８９０Ｌがホタルルシフェラーゼ遺伝子（応答性レポーター遺伝子）の転写をＤＨＴの存在下に活性化する能力は、標準型アンドロゲンレセプターの該能力よりも低かった。
プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−  ｈＡＲ７２０の代わりに、プラスミドｐＲｃ／ＲＳＶ−ｈＡＲ９０９を用いた以外は、上記と同様にして、ホタルルシフェラーゼとシーパンジールシフェラーゼの活性を測定し、シーパンジールシフェラーゼの活性値（コントロールレポーターレポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）を１として、ホタルルシフェラーゼの活性値（応答性レポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）を表した。本発明変異型アンドロゲンレセプターＫ９０９Ｒがホタルルシフェラーゼ遺伝子（応答性レポーター遺伝子）の転写をＤＨＴの存在下に活性化する能力は、標準型アンドロゲンレセプターの該能力よりも低かった。
【００３８】
上記と同様にして、ＤＨＴのＤＭＳＯ溶液に替えて被験物質のＤＭＳＯ溶液またはＤＭＳＯを添加した培地で本発明評価用細胞を培養した後、それぞれの細胞を溶解させて細胞溶解液を調製する。得られた細胞溶解液について、ホタルルシフェラーゼの活性値（応答性レポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）とシーパンジールシフェラーゼの活性値（コントロールレポーター遺伝子の発現量と相関関係を有する指標値）とを測定し、シーパンジールシフェラーゼの活性値を１としてホタルルシフェラーゼの活性値を表す。本発明評価用細胞と被験物質とを接触させない条件下におけるホタルルシフェラーゼの活性値と、本発明評価用細胞と被験物質とを接触させた条件下におけるホタルルシフェラーゼの活性値とを比較することにより、被験物質が有する本発明変異型アンドロゲンレセプターに対するアゴニスト活性（本発明変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力）を評価する。
また、上記の本発明評価用細胞に、本発明変異型アンドロゲンレセプターに対してアゴニスト活性を有する物質を接触させた条件下、及び、前記アゴニスト活性物質と被験物質とを同時に接触させた条件下の各々において、上記と同様な方法でホタルルシフェラーゼの活性値を測定する。本発明評価用細胞に前記アゴニスト活性物質を接触させた条件下におけるホタルルシフェラーゼの活性値と比較して、前記アゴニスト活性物質と被験物質とを接触させた条件下におけるホタルルシフェラーゼの活性値が低ければ、前記被験物質は本発明変異型アンドロゲンレセプターに対するアンタゴニスト活性（本発明変異型アンドロゲンレセプター活性調節能力）を有すると評価する。
【００３９】
実施例６（増幅用オリゴヌクレオチドの作製）
アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントにおいて配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０、８２９、８７９、８９０、または９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を増幅することができ、ＧＣ含量が３０  ％以上７０  ％以下であって、かつ２０塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドを設計する。設計された塩基配列に基づきオリゴヌクレオチドを作製する。
【００４０】
実施例７（ヒト組織を材料にした遺伝子型分析）
ヒト前立腺癌組織凍結サンプル０．１グラム分を［４Ｍ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）  １  ％  β−メルカプトエタノール］５ｍｌに加えポリトロンホモジナイザーで粉砕する。これを５．７Ｍ  ＣｓＣｌ水溶液２５に重層し９０，０００ｘ  ｇで２４時間密度勾配超遠心にてペレットとしてＲＮＡを分離する。このペレットを７０  ％エタノールでリンスする後、室温で風乾する。これを滅菌水１０  μｌに溶解し、濃度測定する。このＲＮＡ１〜５ｎｇを鋳型にして、オリゴｄＴプライマー（アマシャムファルマシア社製）１μｇを逆転写合成合成の際のプライマーとして用い、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）により添付バッファー中でｃＤＮＡを合成する。この際の条件は３７℃で１時間の反応時間とする。このようにして得たｃＤＮＡ溶液の５０分の１を鋳型にして、配列番号１２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行なう。ＰＣＲは、耐熱性ポリメラーゼにＰｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社製ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用し、各々２５μＭの４種類の塩基（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）および酵素に添付された専用バッファー中で、熱変性９４  ℃にて１分間、アニーリング５５  ℃にて３０秒間、伸長反応７２  ℃にて１分間の条件で３５サイクル実施する。このようにして増幅されたＤＮＡを、１  ％の低融点アガロース（アガロースＬ、ニッポンジーン社製）で電気泳動して回収する。この全量を鋳型にして、配列番号３７で示される配列からなるオリゴヌクレオチド５  ｐＭをシークエンスプライマーとして用いダイターミネーターシークエンスキットＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）によりダイレクトシークエンス用のサンプルを調製する。これを、オートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製、モデル３７００）を用いた塩基配列解析に供し塩基配列を決定する。このようにして、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸をコードする塩基配列を調べる。
ＰＣＲのプライマーとして配列番号１４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを用い、シークエンスプライマーとして配列番号３８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる以外は、上記と同様にして、塩基配列を決定する。このようにして、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸をコードする塩基配列を調べる。ＰＣＲのプライマーとして配列番号１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを用い、シークエンスプライマーとして配列番号３９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる以外は、上記と同様にして、塩基配列を決定する。このようにして、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸をコードする塩基配列を調べる。ＰＣＲのプライマーとして配列番号１８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを用い、シークエンスプライマーとして配列番号４０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる以外は、上記と同様にして、塩基配列を決定する。このようにして、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸をコードする塩基配列を調べる。
ＰＣＲのプライマーとして配列番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを用い、シークエンスプライマーとして配列番号４１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いる以外は、上記と同様にして、塩基配列を決定する。このようにして、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸をコードする塩基配列を調べる。
【００４１】
実施例８（被験試料中に含まれるゲノムＤＮＡの抽出）
被験試料中に含まれるゲノムＤＮＡは、ＴＡＫＡＲＡ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｎｅｗｓ  Ｎｏ２．宝酒造（１９９１．９）に記載される方法によって調製する。具体的には、毛髪２〜３本を滅菌水で洗浄した後、さらに１００  ％エタノールで洗浄する。室温で風乾後、２〜３  ｍｍの長さに切断し、これをプラスチック製チューブに移す。これにＢＣＬ  ｂｕｆｆｅｒ［１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），  ５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．３２  Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ，  １  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００］２００μｌを加え、さらに最終濃度１００μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液  及び最終濃度０．５  ％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ溶液をそれぞれ混合する。この混合物を７０  ℃にて１時間保温した後、等量のフェノール／クロロホルムを加え、激しく振とう後遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５分間、４  ℃）する。水層を回収し、もう一度フェノール抽出を行なう。回収された水層に等量のクロロホルムを加え、激しく振とう後遠心分離により水層を回収する。これに５００  μｌの１００％エタノールを加え、−８０  ℃にて２０分間保温した後、遠心分離する。得られたペレットを乾燥した後、滅菌水に溶解させる。
この他、ゲノムＤＮＡの採取可能な細胞組織として末梢血を用いる。１０  ｍｌの血液を採取し、ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて添付マニュアルに従いゲノムＤＮＡを抽出する。
【００４２】
実施例９（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法による遺伝子型の分析）
配列番号１２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ  ＭＥＧＡＬＡＢＥＬキット（宝酒造社製）を用いて３２Ｐ標識する。次に上述のようにして得られるヒトゲノムＤＮＡ１μｇを鋳型にして、上記の標識されたオリゴヌクレオチド１００  ｐｍｏｌずつをプライマーとして用いたＰＣＲによって、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅する。ＰＣＲは、耐熱性ポリメラーゼにＰｅｒｋｉｎ  ｅｌｍｅｒ社製ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用し、それぞれ２５μＭの４種類の塩基（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）および酵素に添付された専用バッファー中で、熱変性９４℃にて１分間、アニーリング５５℃にて３０秒間、伸長反応７２℃にて１分間の保温を３５サイクル実施する。反応終了後、増幅されたＤＮＡの１／２０量を８０  ％ホルムアミド中で８０℃、５分間の条件で加熱変性した後、その１／２０量を５  ％未変性中性ポリアクリルアミドゲルを用いて、１８０  ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で電気泳動分析する。電気泳動の条件は、室温空冷にて定電力４０Ｗ、泳動時間は６０分間である。泳動終了後、ゲルをＸ線フィルムでオートラジオグラムをとることによって３２Ｐ標識されたＤＮＡを検出する。配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むヒト由来標準型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを同様に処理して隣り合わせて泳動しておき、標識されたＤＮＡの泳動位置を比較すると、本発明変異型アンドロゲンレセプターのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡは、標準型アンドロゲンレセプターの相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとは異なる移動度を示す。
３２Ｐ標識されたプライマーとして配列番号１４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを用いる以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの移動度を調べる。
３２Ｐ標識されたプライマーとして配列番号１６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを用いる以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの移動度を調べる。
３２Ｐ標識されたプライマーとして配列番号１８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを用いる以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの移動度を調べる。
３２Ｐ標識されたプライマーとして配列番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを用いる以外は、上記と同様にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの移動度を調べる。
【００４３】
実施例１０（塩基配列解析による遺伝子型の分析）
実施例９でオートラジオグラフィーにより検出される３２Ｐ標識されたＤＮＡのバンドに対応する位置のゲルの一部を１  ｍｍ×１ｍｍ角に切り取り、滅菌水１００  μｌ中で９０  ℃にて１０分間保温し、その１／２０量を鋳型にして、ＰＣＲを行う。なお、当該ＰＣＲでは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにＡＢＩ社製ＡｍｐｌｉＴａｑ  を２．５  Ｕ使用し、該酵素に添付のバッファー中で、熱変性９４  ℃にて１分間、アニーリング５５  ℃にて３０秒間、伸長反応７２℃にて１分間の保温を３５サイクル実施する。
反応終了後、増幅されたＤＮＡを低融点アガロース電気泳動で分離した後回収し、これを鋳型にして、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅａｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）と自動ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製モデル３７００）を使用して塩基配列を決定する。
【００４４】
実施例１１（ＰＣＲと制限酵素を組み合わせた遺伝子型の分析）
ヒト由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２８で示される塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲを行い、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを増幅する。なお、上記のＰＣＲは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにＡＢＩ社製ＡｍｐｌｉＴａｑを２．５Ｕ使用し、添付バッファー中で、熱変性９４  ℃にて１分間、アニーリング５５  ℃にて３０秒間、伸長反応７２  ℃にて１分間の保温を３０サイクル実施する。増幅された約１００ｂｐのＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩで消化することにより、約４０ｂｐと約６０ｂｐのＤＮＡが生じた場合には、被験試料から調製された核酸において、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号７２０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアラニンをコードする塩基配列ＧＣＣが、スレオニンをコードする塩基配列ＡＣＣへ置換されていると判定することができる。
配列番号２９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３０で示される塩基配列からなるプライマーとを用いて、上記と同様にしてＰＣＲを行い、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する約１００ｂｐのＤＮＡを増幅する。増幅された約１００ｂｐのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化することにより、約４０ｂｐと約６０ｂｐのＤＮＡが生じた場合には、被験試料から調製された核酸において、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８２９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるロイシンをコードする塩基配列ＣＴＴが、プロリンをコードする塩基配列ＣＣＴへ置換されていると判定することができる。
配列番号３１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３２で示される塩基配列からなるプライマーとを用いて、上記と同様にしてＰＣＲを行い、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する約１００ｂｐのＤＮＡを増幅する。増幅された約１００ｂｐのＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化することにより、約４０ｂｐと約６０ｂｐのＤＮＡが生じた場合には、被験試料から調製された核酸において、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８７９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるロイシンをコードする塩基配列ＣＴＧが、グルタミンをコードする塩基配列ＣＡＧへ置換されていると判定することができる。
配列番号３３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３４で示される塩基配列からなるプライマーとを用いて、上記と同様にしてＰＣＲを行い、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する約１００ｂｐのＤＮＡを増幅する。増幅された約１００ｂｐのＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより、約４０ｂｐと約６０ｂｐのＤＮＡが生じた場合には、被験試料から調製された核酸において、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号８９０で示されるアミノ酸に相当する位置にあるフェニルアラニンをコードする塩基配列ＴＴＴが、ロイシンをコードする塩基配列ＣＴＴへ置換されていると判定することができる。
配列番号３５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号３６で示される塩基配列からなるプライマーとを用いて、上記と同様にしてＰＣＲを行い、「配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるアミノ酸を含むアミノ酸配列」をコードする塩基配列を有する約１００ｂｐのＤＮＡを増幅する。増幅された約１００ｂｐのＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩで消化することにより、約４０ｂｐと約６０ｂｐのＤＮＡが生じた場合には、被験試料から調製された核酸において、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号９０９で示されるアミノ酸に相当する位置にあるリジンをコードする塩基配列ＡＡＡが、アルギニンをコードする塩基配列ＡＧＡへ置換されていると判定することができる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、特定の位置に置換されたアミノ酸を有しアンドロゲンの存在下に標的遺伝子の転写を活性化する能力が標準型アンドロゲンレセプターよりも低下した変異型アンドロゲンレセプター、当該変異型アンドロゲンレセプターをコードするＤＮＡ、当該変異型アンドロゲンレセプターの活性を調節する能力の評価方法、上記の置換されたアミノ酸をコードする塩基配列の有無を調べることによるアンドロゲンレセプター遺伝子型の分析方法等が提供可能となる。
【００４６】
〔配列表フリーテキスト〕
配列番号７
オリゴヌクレオチド変異導入のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
オリゴヌクレオチド変異導入のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
オリゴヌクレオチド変異導入のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
オリゴヌクレオチド変異導入のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
オリゴヌクレオチド変異導入のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
サザンハイブリダイゼーションのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号２３
サザンハイブリダイゼーションのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号２４
サザンハイブリダイゼーションのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号２５
サザンハイブリダイゼーションのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号２６
サザンハイブリダイゼーションのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号２７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７
塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８
塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９
塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４０
塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４１
塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００４７】
【配列表】
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