(57)【要約】【課題】この発明は、ヒスタミン遊離抑制剤の開発を目的とする。【解決手段】▲１▼Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅを含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。▲２▼メシマコブ菌糸体から得られるＮ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅを使用する請求項１に記載するヒスタミン遊離抑制剤。【選択図】    なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅを含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
【請求項２】
メシマコブ菌糸体から得られるＮ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅを使用する請求項１に記載するヒスタミン遊離抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅを含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、ヒスタミン遊離抑制作用を有する物質として、下記の物質が知られている。
▲１▼トリカフェオイルキナ酸等（特開２００２−８０３６０）
▲２▼トマト抽出物（特開２００２−８０３８７）
▲３▼アピゲニン等（特開２０００−８６５１０）
▲３▼ニッケイ、ヤマモモ等の樹皮抽出物（特開平１０−２８７５８２）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
発明者等は、メシマコブ（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ  ）菌糸体のヒスタミン遊離抑制作用に着目して鋭意研究したところ、メシマコブから抽出・分離されたＮ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅには、顕著なヒスタミン遊離抑制作用が存在することを知り本発明を完成した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本願発明は、下記の請求項（１）、及び請求項（２）により構成されている。（１）Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅを含有することを特徴とするヒスタミン遊離抑制剤。
（２）メシマコブ菌糸体から得られるＮ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅを使用する請求項１に記載するヒスタミン遊離抑制剤。
本願発明を以上のように構成する理由は、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅには、従来ヒスタミン遊離抑制作用が知られていなかったことによる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
【０００６】
（１）メシマコブからＮ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅの抽出（調製）方法
（Ａ）メシマコブ菌糸体
大型タンク（１０００Ｌ）を用いて、炭素源としてグルコースを４．０％、天然物由来窒素源イーストエキス及びポリぺプトンを各０．３％、ＫＨ２ＰＯ４及びＮａ２ＨＰＯ４  を各０．０５％を含み、初発培地ｐＨ５．５の培養液に、メシマコブの菌糸体を接種し、強制的に０．２２μｍフィルターを通した無菌空気を培地内へ通気し、温度２８℃で４５日間培養した。
この培養液を遠心分離して得られた菌糸体を凍結乾燥してメシマコブ菌糸体の乾燥粉末を得た。
【０００７】
なお、本願発明に用いたメシマコブは、１９９８年１０月に宮崎県西諸県郡須木村で子実体を採取し、株式会社アイビーアイ（ＩＢＩ）応用きのこ研究所で菌糸体化した上でＰＬ−０８株として保存していたものを使用した。この菌株は、子実体を農林水産省林野庁総合研究所  森林生物部森林微生物科  腐朽病害研究室の阿部恭久博士の鑑定により、▲１▼メシマコブ子実体に特有の黄褐色の剛毛体を持つこと、及び▲２▼担子胞子の形態、からメシマコブと同定されたものを用いた。
【０００８】
供試菌株の前培養は、５℃で低温保存してあった菌糸体を、内径９０ｍｍのペトリ皿内のＰｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ  社製）へ接種して、２５℃暗黒下で１５日間表面培養した。この培養菌糸体を内径５ｍｍのコルクボーラーで切り取り（乾燥菌糸体重量  ０．３５ｍｇに相当）、段落０００６、（Ａ）の菌株として用いた。
【０００９】
（Ｂ）メシマコブ菌糸体の熱水抽出物
前記メシマコブ菌糸体の乾燥粉末に１０倍量のイオン交換水を加え、１００℃で２時間、熱水抽出処理を行ない、不溶物を除去してメシマコブ菌糸体の熱水抽出物を得た。この熱水抽出物を約７０℃で減圧濃縮した。
なお、前記メシマコブの乾燥菌糸体粉末１３００ｇより、前記メシマコブ熱水抽出液濃縮物が約２８０ｇ得られた。
この熱水抽出物を図１に示す方法により分画した。
【００１０】
（Ｃ）メシマコブ菌糸体の熱水抽出物のメタノールによる分画
前記メシマコブ熱水抽出物に対し、３倍量のメタノールを加え、２時間静置した後遠心分離し、メタノール可溶画分と、メタノール不溶画分を得た。
なお、前記メシマコブ熱水抽出物濃縮液２８０ｇから、メタノール可溶画分が５１ｇ、及びメタノール不溶画分が２２６ｇ得られた。
【００１１】
（Ｄ）前記メタノール可溶画分のイオン吸着剤による分画
（イ）カラムに充填したイオン吸着剤（Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０（日本錬水社）、以下ＨＰ−２０ともいう）に、前記メタノール可溶画分を吸着させた後，水溶出画分とメタノール溶出画分に分画した。
なお、前記メタノール可溶画分５１ｇから、水溶出画分が４３ｇ及びメタノール溶出画分が４．０ｇが得られた。
【００１２】
（Ｅ）イオン吸着剤処理後のメタノール可溶画分の分画
ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０  （ファルマシア社製、以下ＬＨ−２０ともい）カラムを用い、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、前記（Ｃ）で得られたメタノール可溶画分４．０ｇを、下記のように分画・分取した。
目的成分の溶出は、蒸留水を用いて行ない、全体を８フラクション（Ｆｒ１〜Ｆｒ８）として分取した（前記メタノール可溶画分４．０ｇを０．５ｇずつ５回に分けて分画・分取した。）。
表１に、ＬＨ−２０による分画条件を示す。
【００１３】
【表１】
2004331619.tif 000002
【００１４】
得られた８フラクションのうち、Ｆｒ７（図１参照）について、ＯＤＳカラム（シリカゲル担体に、オクタデシルシリル基を化学結合した充填剤、島津製作所製）を用いたＨＰＬＣにより、成分Ｂを単離・分取した。分析条件を表２に、分取チャートを図２に示す。
【００１５】
【表２】
2004331619.tif 000003
【００１６】
ＨＰＬＣで単離・分取した成分Ｂ（メタノール溶液）を、質量スペクトル（ＧＣ−ＭＳ）にかけて、ピークＢに係る化合物（以下化合物Ｂという）の分子量及びこの化合物Ｂに結合している官能基を推定した。
その結果、化合物Ｂの分子量は、２９７と推定した。スペクトルのチャートを図３に示す。
【００１７】
化合物Ａ（ＤＭＳＯ及び数滴のクロロホルムで溶解させたもの）を、核磁気共鳴（１ＨＮ−ＭＲ・１３ＣＮ−ＭＲ）にかけた。
その結果を図４（  １ＨＮ−ＭＲ）及び図５（１３ＣＮ−ＭＲ）に示す。
図４から、化合物Ｂは、糖類及び芳香環領域の水素のシグナルが見られた。
又図５から、化合物Ｂの単素数は１１と推定され、糖類及び芳香環領域の炭素のシグナルが見られた。
【００１８】
化合物Ｂについて、赤外スペクトルを測定した。
その結果を図６に示す。
【００１９】
ＨＰＬＣで得られた化合物Ｂ（エタノールに溶解）について、紫外・可視スペクトル（ＵＶ）を測定した（λｍａｘ  ２５９ｎｍ）。その結果を図７に示す。
【００２０】
以上の結果から、化合物Ｂは、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅアデノシン（下式）と同定した。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
（２）メシマコブ菌糸体から得られたＮ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅについて、マスト細胞からのヒスタミン遊離抑制効果を調べることによって、Ｉ型アレルギー反応抑制効果を調べた。
（Ａ）被験動物及び細胞の調製方法
（ａ）被験動物には、Ｗｉｓｔｅｒ系ラット雄（６〜８週齢）を用いた。
（ｂ）細胞の調製方法
ラットをエーテルで麻酔させ、脱血死させた後、ラットの腹腔内に  Ｔｙｒｏｄｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １５ｍｌを注入し、腹腔内液を回収した。更にラットの腹腔内にＴｙｒｏｄｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０ｍｌを注入し、更に腹腔内液を回収して先に採取した腹腔内液と混合した。この腹腔内液を、８００ｒｐｍ・４℃・１０分間遠心分離を行い、上澄を除去してフィルターをかけた。
更に、Ｔｙｒｏｄｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  を加えた細胞懸濁液を、８００ｒｐｍ・４℃・１０分間遠心分離を行い、上清を除去して、細胞を均一にした。この細胞懸濁液を血球計算盤で測定し、８×１０６  ｃｅｌｌｓ  ／ｍｌに調製して用いた。
【００２３】
（Ｂ）生物検定の実験方法およびヒスタミンの分析方法
（ａ）生物検定の実験方法
１．２ｍｌのマイクロチューブに分注した、細胞懸濁液３７０μｌを３７℃のウォーターバスでプレインキュベートした。
１０分後、各濃度に設定したサンプル２０μｌを添加した。
更に、１０分後、アレルギー誘発剤であるｃｏｍｐｏｕｎｄ４８  ／  ８０  （マスト細胞刺激用試薬：和光純薬）１０μｌ（０．５μｇ／ｍｌ）  を添加した。
１５分後、氷上で反応を停止した。
更に、マスト細胞を除去するため、１３．０００ｒｐｍ  ・４℃・１５分間遠心分離し、上清を回収した。
この上清を、ＨＰＬＣ分析のジアゾ化するサンプルとした。
【００２４】
（ｂ）ヒスタミンジアゾ化誘導体の調製
等量の２０ｍＭ  ｐ  −ニトロアニリン塩酸溶液と２００ｍＭ  亜硝酸ナトリウム水溶液をよく混合した  （ジアゾ試薬）  。
ジアゾ試薬１０μｌに、前記（ヒスタミン）ジアゾ化用サンプル２０μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合した。
更に、１０％  炭酸ナトリウムエタノール溶液３０μｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合した。
この溶液の２０μｌをＨＰＬＣ分析に用いた。
【００２５】
（ｃ）ヒスタミンの分析は、ジアゾ化法により行った（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｉｎ  Ｆｉｓｈ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｆｔｅｒ  Ｄｉａｚｉ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ：  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９（７），  １２０８−１２１０（１９９５）  ）。
生物検定におけるヒスタミンのＨＰＬＣ分析条件〈ジアゾ法）は、表３のとおりである。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
（Ｃ）ヒスタミン遊離抑制効果の測定
メシマコブ菌糸体から得られたＮ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅの一定濃度におけるマスト細胞からのヒスタミン遊離の抑制効果の結果を表４に示す。
比較資料として、市販のヒスタミン抑制剤（商品名：インタール，主要成分：クロモグリク酸ナトリウム，メーカー藤沢薬品工業）を用いた。
試験結果は、両者共３回試験した結果の平均値である。
【００２８】
【表４】
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【００２９】
抑制値は下記の計算式によった。
計算式：
（１−サンプルのピーク積分値／コントロールのピーク積分値）×１００
【００３０】
【発明の効果】
本願発明によれば、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅを用いて、ヒスタミン遊離抑制剤を得ることができるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】メシマコブ菌糸体の熱水抽出物の分画工程を示す図である。
【図２】Ｆｒ７の分取チャートを示す図である。
【図３】化合物Ｂの質量スペクトル（ＧＣ−ＭＳ）を示す図である。
【図４】化合物Ｂの  １ＨＮ−ＭＲのスペクトルを示す図である。
【図５】化合物Ｂの１３ＣＮ−ＭＲのスペクトルを示す図である。
【図６】化合物Ｂの赤外スペクトルを示す図である。
【図７】化合物Ｂの紫外・可視スペクトル（ＵＶ）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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