(57)【要約】【課題】核酸が血液中の酵素によって分解されることを防止ないし抑制することが可能でかつ血管壁への透過性が良好な核酸複合体とその製造方法を提供する。【解決手段】核酸と低密度リポタンパクを緩衝溶液中で混合する混合工程を有する核酸複合体の製造方法及びこの方法により製造された核酸複合体。低密度リポタンパクとしては、ヒト由来のＣＭ、ＩＤＬ、ミッドバンド、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、スモールサイズＬＤＬが好適である。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸と低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体とを液体中で混合する混合工程を有する核酸複合体の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、前記混合工程において、核酸の浮遊液中に低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体を添加して混合することを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項３】
請求項１において、前記混合工程において、低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体浮遊液中に核酸の浮遊液を添加して混合することを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、核酸の終濃度が１０〜５０００μｇ／ｍＬであり、低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体の終濃度が５〜５００ｍｇ／ｄＬであることを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体を、核酸と混合するに先立ち、有機溶媒で処理することにより脂質を除去する脂質除去工程を有する核酸複合体の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか１項において、該混合工程で得られた複合体を更に有機溶媒で処理することにより脂質を除去する脂質除去工程を有する核酸複合体の製造方法。
【請求項７】
請求項５又は６において、該有機溶媒がアルコールであることを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、低密度リポタンパクが、ＣＭ、ＩＤＬ、ミッドバンド、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びスモールサイズＬＤＬからなる群から選択される１又は２以上であることを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、低密度リポタンパクの化学修飾体は、低密度リポタンパク中のアポタンパクがアセチル化及び／又はカチオン化されたものであることを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか１項において、低密度リポタンパクの脂質側がアセチル化及び／又はカチオン化されていることを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項において、液体が緩衝溶液であることを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項において、前記混合工程において、前記液にカチオン性化合物を含有させることを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項において、前記混合工程において、前記液に界面活性剤を含有させることを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１ないし１３のいずれか１項において、前記混合工程において、前記液に還元剤を含有させることを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１４において、還元剤がトコフェロール、アスコルビン酸、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、ポリフェノール、没食子酸及びカテキンからなる群から選択される１又は２以上であることを特徴とする核酸複合体の製造方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の製造方法により製造された核酸複合体。
【請求項１７】
請求項１６において、粒子径が１００ｎｍ〜４００ｎｍであることを特徴とする核酸複合体。
【請求項１８】
請求項１６又は１７の核酸複合体からなる病変血管の治療用医薬。
【請求項１９】
請求項１６又は１７の核酸複合体を血管内へ注入する病変血管の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的部位、特に病変血管に効率的に核酸を導入することができる核酸複合体とその製造方法に関する。また、本発明は、この核酸複合体を用いた病変血管の治療用医薬と治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
ＤＮＡを細胞中に運搬するための非ウイルス系ベクターとして、例えば、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（登録商標）として商品化された、カチオン性脂質であるジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４，  ７４１３−７４１７，  １９８７）がある。これに引き続いて更に多くのカチオン性脂質が合成され、幾つかは、実験室用のトランスフェクション試薬として市販されている。例えば、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（登録商標））、ＤＯＳＰＡ（リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標））、ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＡＰ（登録商標））である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な核酸複合体の製造方法、該方法による核酸複合体及び該複合体による病変血管の治療方法を提供することを目的とする。本発明は、特に、核酸が血液中の酵素によって分解するのを防止することができ、かつ血管壁への透過性が良好な核酸複合体とその製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の核酸複合体の製造方法は、核酸と低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体とを液体中で混合する混合工程を有するものである。
【０００６】
本発明の核酸複合体は、かかる本発明方法により製造されたものである。
【０００７】
本発明で使用する低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体は、その表面に存在するアポタンパクの持つ正電荷によって正帯電している。この低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体を陰電荷を有する核酸と混合すると複合体が形成される。この低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体は、酵素によって核酸が分解することを防止ないし抑制する。また、この低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体は、血液中で動脈硬化症などの病変血管部位へ遊走するため、病変血管の血管壁へ到達し、容易に血管壁を透過し、核酸を放出させることができる。
【０００８】
なお、このような低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体から低密度リポタンパクの脂質を除去してアポタンパクを残し、アポタンパクと核酸との複合体としたものであっても、上記と同様の効果を得ることができる。
【０００９】
従って、本発明の核酸複合体の製造方法は、低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体を、核酸と混合するに先立ち、有機溶媒で処理することにより脂質を除去する脂質除去工程を有するもの、或いは、核酸と低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体とを液体中で混合して得られた複合体を更に有機溶媒で処理することにより脂質を除去する脂質除去工程を有するものであっても良い。
【００１０】
本発明の病変血管の治療用医薬は、このような本発明の核酸複合体よりなるものである。
【００１１】
また、本発明の病変血管の治療方法は、このような本発明の核酸複合体を血管内へ注入する方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸複合体の製造方法においては、核酸と低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体とを液中で混合する。この液としては緩衝溶液が好適である。この緩衝溶液については後に詳述する。
【００１３】
この混合を行う際には、核酸の浮遊液中に低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体を添加する方法と逆に低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体に核酸の浮遊液中を添加する方法があり、いずれの方法も使用可能であるが、低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体が核酸を包囲するように複合体を形成させると、外周に存在する低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体粒子によって内部の核酸が被覆されるようになり、血液中の酵素によって核酸が分解するのを効果的に防止又は抑制する効果が期待できる。
【００１４】
核酸の終濃度は１０〜５０００μｇ／ｍＬであることが好ましく、低密度リポタンパクの終濃度は５０〜５００ｍｇ／ｄＬであることが好ましい。
【００１５】
低密度リポタンパクとしては、ＣＭ（カイロミクロン）、ＩＤＬ（レムナント）、ミッドバンド、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びスモールサイズＬＤＬからなる群から選択される１又は２以上が使用可能であるが、好ましくはスモールデンスＬＤＬ分画を除去したＬＤＬである。
【００１６】
すなわち、通常の２６ｎｍ〜２７ｎｍの粒子径のＬＤＬ分画を選択し、粒子径２５．５ｎｍ以下のスモールデンスＬＤＬの分画を除去すれば、ＬＤＬとして病変血管へ遊走し、核酸を放出した後に血管壁を透過して沈着する量が少なくてすむ。
【００１７】
このような低密度リポタンパクとしては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ヤギなど哺乳類由来のものであればいずれでも使用可能であるが、ヒト由来のものが好ましい。
【００１８】
これらは、当業者に周知の方法で採集、精製が可能である。例えば、抗凝固剤フリーの試験管へ哺乳類の全血を採取し、溶血させないように緩やかに攪拌して凝固させることで血清を調製し、この血清を密度勾配遠心法にて分離することでＬＤＬ分画やＣＭ分画を得ることが可能なのである。
【００１９】
本発明では、低密度リポタンパクは天然のリポタンパクのみならず、それの化学修飾体も使用可能である。化学修飾体の好ましい例としては、低密度リポタンパクの脂質側をアセチル化したアセチル化体や低密度リポタンパクの脂質側をカチオン化したカチオン化体が挙げられる。
【００２０】
アセチル化体への化学修飾は、当業者に周知の方法、例えば酢酸等の脂肪酸を用いて行うことができ、具体的には、無水酢酸による処理などが挙げられる。アセチル化することにより核酸複合体の細胞透過性を向上させることができ、血管内皮細胞への導入能を向上させることができる。
【００２１】
また、カチオン化体への化学修飾も同様に当業者に周知の方法で行うことができ、例えば、アポタンパク鎖上のアミノ酸残基を足場としたり、カチオン性物質のリポタンパク質の脂質部分への物理吸着させたり溶解させたりする方法がある。具体的にはカチオン性化合物やカチオン性界面活性剤などを用いて低密度リポタンパクにプラスの電荷をチャージして用いて低密度リポタンパクを溶解させる方法が挙げられる。カチオン化体へ化学修飾することにより、核酸との複合化をさらに促進することが可能である。また，脂質部分へ溶解するカチオン性化合物には４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）骨格を有する有機化合物（例えば，ロイコマラカイトグリーン）に紫外線を照射したようなものもあるり，ＤＯＧＳ（トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（登録商標））、ＤＯＳＰＡ（リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標））、ＤＯＴＡＰ（ＤＯＴＡＰ（登録商標））などそれ単体でも核酸複合体を形成するものを脂質部分へ溶解することも可能である．
【００２２】
本発明の核酸複合体の製造方法では、混合する際の液にカチオン性化合物を含有させることが可能である。核酸複合体が低密度リポタンパク以外のカチオン化合物を含有することにより、核酸放出後に血管へ沈着する低密度リポタンパク量を減少させることができる。ただし、カチオン性化合物の含有量が多すぎると、病変血管への遊走性が低下してしまう。従って、このカチオン性化合物の含有量は、その種類、核酸の種類、粒子径などを考慮して選定することが好ましい。カチオン性脂質としてはポリビニルピリジンの４級化誘導体、ポリビニルピロリジノンの４級化誘導体などが例示される他、ＤＭＲＩＥ−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ，Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）骨格を有する有機化合物（例えば，ロイコマラカイトグリーン）に紫外線を照射したものなども利用可能である。また、これらカチオン性化合物を混合する際には、まず、カチオン性化合物と核酸を混合して複合を形成させた後にリポタンパク及び／又はアポタンパクを混合することで、このカチオン性化合物と核酸の複合体を被覆するようにカチオン性化合物を含有させることが可能であり、動脈硬化症などの病変血管部位へ遊走する機能、すなわち遺伝子導入細胞の選択性を高い状態で維持したまま複合体中のリポタンパク量を低減させることも可能である。
【００２３】
また、この混合する際の液に還元剤を含有させてもよい。このように還元剤を含有させることにより、低密度リポタンパクの酸化を抑制することができる。還元剤としては、（±）‐α‐トコフェロール、アスコルビン酸、システイン、Ｎ‐アセチルシステイン、没食子酸、カテキンなどのポリフェノールが好適である。
【００２４】
また、この混合する際の液に界面活性剤を含有させてもよい。このように界面活性剤を含有させることにより、複合体の形成が容易となる場合がある。このような界面活性剤としてはＴｗｅｅｎ２０，Ｔｗｅｎｎ４０，ＢＲＩＪ３５，ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３０が好適である。
【００２５】
上記のカチオン性物質、還元剤、界面活性剤は、低密度リポタンパクの添加の前、同時、後のいずれの時に液を添加されてもよい。
【００２６】
この液としては緩衝溶液が好ましい。緩衝溶液のｐＨとしては、核酸及び低密度リポタンパクの電荷状態を複合体が形成しやすい状態とし、得られた複合体を病変血管の治療に使用することを考慮すれば５．２〜８．５の範囲が好ましく、このような緩衝溶液としては乳酸バッファー、リン酸バッファー、重炭酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、グッドバッファー、ＨＥＰＥＳなどが例示されるが、Ｔｒｉｓバッファーが好ましい。
【００２７】
核酸の好ましい例としては、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が病変血管の治療に利用できる。
【００２８】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００２９】
本発明において、核酸を導入する細胞としては、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００３０】
なお、前述の如く、核酸との複合化に用いる低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体から低密度リポタンパクの脂質を除去してアポタンパクを残し、アポタンパクと核酸との複合体としたものであってもよく、脂質を除去して得られるアポタンパクと核酸との複合体であれば、粒子径が小さくなり、核酸との複合体中の核酸量を増加させるという効果が得られる。また、病変血管の治療にあたって、生体へ投与した際に、血管へ脂質が沈着する可能性を減らす効果も期待できる。
【００３１】
この場合には、上述のようにして、核酸と低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体とを液体中で混合して得られた複合体を、更に有機溶媒で処理することにより脂質を除去すれば良い。或いは、低密度リポタンパク及び／又はその化学修飾体を、核酸と混合するに先立ち、有機溶媒で処理することにより脂質を除去し、その後核酸と混合して複合化すれば良い。
【００３２】
ここで使用する有機溶媒としては、メタノール，エタノール，イソプロパノール等のアルコール、アセトン，酢酸エチル，酢酸イソアミル，エーテル，ピリジン等の１種又は２種以上を挙げることができる。
【００３３】
このようにして得られる本発明の核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Ｇａｕｃｈｅｒ病等）等が挙げられる。
【００３４】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００３５】
＜実施例１＞
次のようにして核酸複合体を製造した。ヒト血清を密度勾配遠心法にて分離することでＬＤＬ分画を得た。この分画中の総コレステロール、中性脂肪及びＨＤＬ濃度を臨床検査キット（トリグリセライド・テストワコー、ＨＤＬ−コレステロールテストワコー、コレステロールＣ−テストワコー、いずれも和光純薬製）を使用して求め、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄの計算式にて分画中のＬＤＬ濃度を計算した。これを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ＝７．４）＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液にて希釈し、ＬＤＬ濃度を１００ｍｇ／ｄＬに調整した。
【００３６】
このＬＤＬ溶液とｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ遺伝子の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．４）＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（濃度１０００μｇ／ｍＬ）を同容量混合し、緩やかに撹拌した後に２６０ｎｍの吸光度を測定すると、吸収が経時的に減少し、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ遺伝子が複合体を形成したことが示唆された。また、動的光散乱法により粒径分布を測定した結果、５０〜３５０ｎｍの範囲の粒子が観測され、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ遺伝子の複合体化が示唆された。
【００３７】
＜実施例２＞
実施例１で得られたＬＤＬ分画にエタノールを加えて沈殿させ、遠心分離による回収とエタノール混合を繰り返して低密度リポタンパクの脂質を除去してアポタンパクＢを得た。このアポタンパクＢと核酸を用い、低密度リポタンパクの代りにこのアポタンパクＢを用いたこと以外は、実施例１と同様の要領で複合体を得た。
【００３８】
＜実施例３＞
（ＬＤＬのカチオン化修飾）
８本の５０ｍＬのファルコンチューブにＥＤＴＡ水溶液（０．５Ｍ、３５０ｍＬ）と血液（５０ｍＬ）を入れ転倒混和後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５℃、１０分）により血漿（２２８ｍＬ）を得た。得られた血漿にＫＢｒ（４．２２ｇ）を加え溶解させた後、超遠心分離（４００００ｒｐｍ、１６℃、２４時間）によりＶＬＤＬ、ＩＤＬ分画を取り除いた。血漿残渣（１８０ｍＬ）にＫＢｒ（１１．５９ｇ）を加え溶解させた後、再び超遠心分離（４００００ｒｐｍ、１６℃、２４時間）によりＬＤＬ分画（１５ｍＬ）を得た。精製は０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液中で２晩透析することにより行った（蛋白濃度：３．７ｍｇ／ｍＬ）。
【００３９】
このようにして調整、精製したＬＤＬを表面修飾することで、カチオン性基を導入した。方法は以下の通りである。ＬＤＬを含む０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液（１６０ｕＬ、蛋白濃度：３．７ｍｇ／ｍＬ）にｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを含む水溶液（１Ｍ、２０ｕＬ）と水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ、１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を加え、室温でゆっくり攪拌した。１時間後０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液中で１晩透析を行い精製した。
【００４０】
修飾前後での平均粒径の変化を動的光散乱（ＤＬＳ）測定により、また表面電位を電気泳動光散乱（ＥＬＳ）測定により調べた。ＬＤＬの蛋白濃度はいずれも０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液で５７２ｕｇ／１０ｍＬに調整した。未修飾のＬＤＬでは平均粒径が２２．３±４．０ｎｍであったが、カチオン基の導入後には３５．２±３．７ｎｍとなり、粒径が少し増大した（図１参照）。また、表面電位は、未修飾では−２．２７ｍＶであったが、カチオン基の導入後には７．００ｍＶとなり正に荷電した。
【００４１】
（カチオン化修飾ＬＤＬとＤＮＡとの複合化）
上述のようにして合成したカチオン化修飾ＬＤＬとＤＮＡとの複合体を形成させた。修飾ＬＤＬを含む０．１５Ｍ  ＮａＣｌ−０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液（１．８ｍＬ、蛋白濃度：５７．２ｕｇ／ｍＬ）にＤＮＡ（０．２ｍＬ、濃度：５ｕＬ／ｍＬ、ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｃｔｏｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＴｒｉｓ緩衝液を加え、静置した。添加４時間後に動的光散乱測定により粒径を測定すると、約１１０ｎｍと得られ、ＤＮＡの添加によって粒径は約３倍に増大した（図２参照）。未修飾のＬＤＬ水溶液にＤＮＡ溶液を加えても粒径に全く変化が無かったことより、カチオン化ＬＤＬにおいてＤＮＡとのポリイオンコンプレックスが形成されたといえる。
【００４２】
【発明の効果】
本発明によると、核酸が血液中の酵素によって分解されることを防止ないし抑制することが可能であると共に、血管壁への透過性が良好な核酸複合体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３におけるエチレンジアミン修飾におけるＬＤＬの平均粒径の変化を示すグラフである。
【図２】実施例３におけるカチオン化ＬＤＬとＤＮＡとのポリイオンコンプレックス形成による粒径の変化を示すグラフである。
【図１】
2004155763.tif 000003
【図２】
2004155763.tif 000004