(57)【要約】【課題】本発明は、対象物質のＤＮＡとの親和性を、簡便に、高い精度で検査する汎用的な方法を提供することを課題とする。また、例えば、ＤＮＡ合成阻害剤、ダイオキシン類、ＰＣＢ類、環境ホルモン類の存在を簡便に確認する方法を提供することを課題とする。【解決手段】ＤＮＡと疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質と陽イオンを含有する水溶液に、ＤＮＡを２本差にして凝集反応を起こす条件として、検査対象物質を添加し、該水溶液の光散乱強度、または光透過率のいずれかの変化を測定することにより、検査対象物質がＤＮＡ親和性を有するか否かを検査することができる。このことを利用し、上記課題を解決できた。【選択図】　　　　　なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ鎖と疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質を用いることを特徴とする検査対象物質のＤＮＡ親和性の検査方法。
【請求項２】
ＤＮＡ鎖と疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質と陽イオンを含有する水溶液を用いることを特徴とする検査対象物質のＤＮＡ親和性の検査方法。
【請求項３】
水溶液に検査対象物質を添加し、該水溶液の光散乱強度および／または光透過率の変化を測定することを特徴とする請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
ＤＮＡコンジュゲート物質を形成しているＤＮＡ鎖と相補性のＤＮＡ鎖を用いることを特徴とする特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項５】
ＤＮＡコンジュゲート物質を形成しているＤＮＡ鎖がループを形成しうるＤＮＡ鎖であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項６】
ＤＮＡ鎖と疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質におけるＤＮＡ鎖の含有率が０．１ｍｏｌ％以上０．５ｍｏｌ％以下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の検査方法。
【請求項７】
陽イオンが、金属陽イオンおよび／または分子量３００以下のアンモニウムイオンのいずれかから選択されることを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載の検査方法。
【請求項８】
検査対象物質が、ＤＮＡ合成阻害剤であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の検査方法。
【請求項９】
検査対象性物質が、ダイオキシン類であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１０】
検査対象物質が、ＰＣＢ類であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１１】
検査対象物質が、環境ホルモン類であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の検査方法を用いることによる、物質のＤＮＡ親和性を確認する方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１の検査方法を用いることによる、ＤＮＡ親和性を有する物質の存在を確認する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質のＤＮＡ親和性の検査方法に関するものである。さらに詳しくは、ＤＮＡコンジュゲート物質の水溶液に検査対象物質を添加するＤＮＡ親和性の検査方法に関するものである。
これにより、ある物質のＤＮＡ親和性の有無を確認できると共に、複数の物質の混合物中にＤＮＡ親和性を有する物質の存在の有無を確認することも可能である。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡと親和性を有するＤＮＡ親和性物質は、ＧＲＯＯＶＥ−ＢＩＮＤＩＮＧＤＲＵＧやインターカレーターなど、ＤＮＡとの相互作用により薬効を発現する医薬品や遺伝子工学の研究に使用される重要な物質群として知られている。
【０００３】
従来、ある物質がＤＮＡと親和性を有するか否かをを正確に評価するには、物質とＤＮＡの複合体を合成した後ＮＭＲ測定やＸ線結晶解析を行う方法が取られており、測定自体も煩雑な上、評価したい物質やＤＮＡ側の配列に応じて個別に複合体を合成し直す必要があるなど、極めて時間を要する状況にあった（Ｉｈｔｓｈａｍｕｌ　Ｈ，　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｊ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，　１３，　１８８−１９７，　２０００）。ヒトゲノム全解読に伴い、ＤＮＡと特定の相互作用をする物質の重要性は益々増加してきたが、この相互作用を簡便に評価できる方法が無く、ＤＮＡ親和性物質の開発を大きく制限する要因となっていた。
【０００４】
一方、ポリハロゲン化ビフェニル（ＰＣＢ）やダイオキシン等、人体に極めて有害な物質の毒性の評価は，検体から化合物を濃縮分離した上、一般に高価なＧＣやＨＰＬＣで化合物を分離分析し，結果から毒性当量値を計算する必要がある。この方法は煩雑かつ検査費用が高価であり、また迅速な検査ができないため、特に毒物取扱現場などでの環境モニタリングとしては不十分なものであった。より安価な検査法として、バイオアッセイ法（Ｂｏｓｖｅｌｄ　Ａ．　Ｔ，　ｅｔ．　Ａｌ．，　ＦｒｅｓｅｎｉｕｓＪ．　Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．，　３４８（１／２），　１０６−１１０，　１９９４）等も検討されているが、迅速さの点で課題があった。
【０００５】
以上のように、迅速かつ鋭敏な毒性物質の検査方法が切望されている状況にあった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、この実情を解決すべくなされたものであり、対象物質のＤＮＡとの親和性すなわち相互作用の有無を、簡便に且つ高い精度で評価しうる汎用的な検査方法を提供することを課題の一つとする。
また、例えば、ＤＮＡ合成阻害剤、ダイオキシン類、ＰＣＢ類、環境ホルモン類の存在を簡便に確認する方法を提供することを課題の一つとする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、１本鎖ＤＮＡとビニルポリマーの複合体（つまりコンジュゲート）を合成し、新規物質として報告している（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，　１９９８，　１４３３−１４３４）。この物質は、水中でＤＮＡ鎖を親水部位、ビニルポリマー鎖を疎水部位として、ミセルを形成することが分かっている。
【０００８】
その後、発明者らの研究により、１本鎖ＤＮＡ鎖と疎水性物質が結合したさまざまなＤＮＡコンジュゲート物質が、水中でミセル構造体を形成しているとき、該１本鎖ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を水溶液中に添加すると、ミセル構造体表面でＤＮＡ鎖が二重らせんを形成し、ミセルの自律的な凝集が生じることが明らかになった。発明者らは、この時僅かでも相補鎖にミスマッチが有ると凝集反応が起こらない現象すなわち凝集反応が阻害される現象を利用して、一塩基多型（ＳＮＰｓ）などの遺伝子診断法として利用する方法を発明し特許出願している（特開２００１−２５２０９８）。
【０００９】
その後さらなる研究を進めた結果、相補鎖のミスマッチにより阻害される該凝集反応が、ミスマッチの無い２本鎖ＤＮＡ鎖に対して親和性を有する物質を添加することによっても阻害されること、特にＤＮＡ鎖に結合して構造変化を誘起するような物質により効果的に凝集反応が阻害されることを見いだし、この現象を利用して、物質のＤＮＡに対する親和性を検査するという本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、ＤＮＡと疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質と陽イオンを含有する水溶液に、検査したい物質と必要によりＤＮＡコンジュゲート物質のＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を添加し、該水溶液の光散乱強度、または光透過率のいずれかの変化を測定することにより、物質のＤＮＡ親和性を検査するものである。
【００１１】
すなわち、本発明は例えば下記の事項に関するものである。
［１］ＤＮＡ鎖と疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質を用いることを特徴とする検査対象物質のＤＮＡ親和性の検査方法。
［２］ＤＮＡ鎖と疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質と陽イオンを含有する水溶液を用いることを特徴とする検査対象物質のＤＮＡ親和性の検査方法。
【００１２】
［３］水溶液に検査対象物質を添加し、該水溶液の光散乱強度および／または光透過率の変化を測定することを特徴とする［１］または［２］に記載の検査方法。
［４］ＤＮＡコンジュゲート物質を形成しているＤＮＡ鎖と相補性のＤＮＡ鎖を用いることを特徴とする特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載の検査方法。
［５］ＤＮＡコンジュゲート物質を形成しているＤＮＡ鎖がループを形成しうるＤＮＡ鎖であることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載の検査方法。
【００１３】
［６］ＤＮＡ鎖と疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質におけるＤＮＡ鎖の含有率が０．１ｍｏｌ％以上０．５ｍｏｌ％以下であることを特徴とする［１］〜［５］のいずれかに記載の検査方法。
［７］陽イオンが、金属陽イオンおよび／または分子量３００以下のアンモニウムイオンのいずれかから選択されることを特徴とする［２］〜［６］のいずれかに記載の検査方法。
【００１４】
［８］検査対象物質が、ＤＮＡ合成阻害剤であることを特徴とする［１］〜［７］のいずれかに記載の検査方法。
［９］検査対象性物質が、ダイオキシン類であることを特徴とする［１］〜［７］のいずれかに記載の検査方法。
［１０］検査対象物質が、ＰＣＢ類であることを特徴とする［１］〜［７］のいずれかに記載の検査方法。
［１１］検査対象物質が、環境ホルモン類であることを特徴とする［１］〜［７］のいずれかに記載の検査方法。
【００１５】
［１２］［１］〜［１１］の検査方法を用いることによる、物質のＤＮＡ親和性を確認する方法。
［１３］［１］〜［１１］の検査方法を用いることによる、ＤＮＡ親和性を有する物質の存在を確認する方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＤＮＡと疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質の水溶液に検査対象物質を添加し、溶液の光散乱強度、または光透過率等の変化から、検査対象物質のＤＮＡ鎖への作用の有無を判断することができるというものである。
【００１７】
すなわち、本発明では、ＤＮＡコンジュゲート物質は、水溶液中で安定なミセルを形成する。このミセル表面にはＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ鎖部分が存在し、おそらくＤＮＡ鎖に起因する電荷反発により安定な均一分散系を形成している。このミセル分散溶液で、表面ＤＮＡ鎖が完全な二本鎖を形成するようにする、即ち、表面ＤＮＡ鎖が分子内ループを形成しうるか、または、ＤＮＡ鎖と相補的なＤＮＡ鎖を添加すると、ＤＮＡに起因する性質が弱められ、ミセルはＤＮＡコンジュゲートの疎水性部分の性質に基づいた挙動を示すようになる。すなわち、相転移温度以上の温度で、適当な陽イオンを存在させるとき、ミセルは凝集反応を起こす。このＤＮＡに起因するミセルの分散性は表面ＤＮＡ鎖が完全な二本鎖を形成したときにのみ消失する。例えば、１塩基でも対合のミスマッチがあり一本鎖部分が残ると凝集しない（ミセルが形成されたままになる。）。
【００１８】
本発明は、この鋭敏な性質を利用するものである。即ち、ＤＮＡコンジュゲート溶液で、上記のごとく表面ＤＮＡ鎖が二本鎖ＤＮＡとなるようにし、更に検査対象物質を存在させたとき、その物質がＤＮＡ親和性を有していれば、二本鎖ＤＮＡの構造に影響を及ぼすことにより完全二本鎖状態では凝集する環境下での該凝集反応が阻害されることを利用するものである。この様に、検査対象物質の存在しない溶液と存在する溶液との光散乱強度、光透過率等の相違を比較することにより、検査対象物質のＤＮＡ親和性を検査することが可能である。
【００１９】
光散乱強度、光透過率の測定は、市販の分光光度計等で測定が可能であり、また、溶液の濁り状態を目視で観察することによっても定性的に、対象物質のＤＮＡ親和性を判定することができる。
【００２０】
検査方法は、ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ鎖部分によって大きく２種に分けられる。即ち、▲１▼ＤＮＡ鎖が単独で完全な分子内ループを形成し、二本鎖ＤＮＡとなる場合と、▲２▼ＤＮＡ鎖の相補鎖を添加して二本鎖ＤＮＡとする場合である。▲１▼の分子内ループ形成が単独では完全ではなく、完全二本鎖ＤＮＡとするためには更なる相補鎖ＤＮＡの添加を要する場合は▲２▼と同じ方法による。いずれの方法でも、まず、検査対象物を含まない基本系で凝集反応が起こる温度と陽イオン濃度条件を設定した後、同じ系に検査対象物を添加し、凝集反応の有無を観察する。
【００２１】
▲１▼ＤＮＡ鎖が単独で完全な分子内ループを形成し、二本鎖ＤＮＡとなる場合
試験管や分光光度計測定セルなどの透明な容器に、ＤＮＡコンジュゲート物質を含む水溶液を入れ、陽イオン溶液を添加し、相転移温度に達せしめる。この溶液に適当量の検査対象物質を添加し混合すると、検査対象物質のＤＮＡ鎖への親和性がある場合は非凝集、無い場合は凝集する。この凝集状態を分光光度計で測定するか、濁りとして肉眼で観察する。
【００２２】
▲２▼ＤＮＡ鎖の相補鎖を添加して二本鎖ＤＮＡとする場合
試験管や分光光度計測定セルなどの透明な容器に、ＤＮＡコンジュゲート物質と完全二本鎖ＤＮＡを形成しうる相補鎖ＤＮＡ（複数の断片であってもよい）を含む水溶液を入れ、陽イオン溶液を添加し、相転移温度に達せしめる。この溶液に適当量の検査対象物質を添加し混合すると、検査対象物質のＤＮＡ鎖への親和性がある場合は非凝集、無い場合は凝集する。この凝集状態を分光光度計で測定するか、濁りとして肉眼で観察する。
【００２３】
この時用いる温度調節装置は通常のウォーターバスやインキュベーターの他、温度調節可能な分光光度計セルフォルダーなどを用いれば良く、特に制限は無いが２０〜６０℃の温度調節が可能なことが望ましい。凝集反応の有無は肉眼で濁りを観察するか、分光光度計で波長６００〜７００ｎｍの光透過率を測定すればよい。
【００２４】
検査対象物を添加するタイミングはいつでも良く、ＤＮＡコンジュゲート溶液に陽イオン溶液を添加する前後、相転移温度に達せしめる前後、また▲２▼の場合は相補鎖ＤＮＡを添加する前後のいつであっても良い。
【００２５】
本発明で用いられるＤＮＡコンジュゲート物質は、１本鎖ＤＮＡと疎水性物質が結合し複合体を形成していればよく、その構造はとくに限定されない。つまり、ＤＮＡ部位と疎水性部位を有し、水中で安定なミセル構造を形成することができるものであればよい。１本鎖ＤＮＡは、結合を観察したい物質に適したＤＮＡ配列の１本鎖であれば、長さ、末端などの配列はとくに限定されない。
【００２６】
本発明で使用されるＤＮＡコンジュゲート物質のＤＮＡ鎖の配列には特に制限が無く、目的に応じて鎖長及び配列を変化させることができるが、例えばアクチノマイシンＤのごときＤＮＡの５’―ＣＧ―３’配列に対してインターカレートすることが知られているような物質の評価には５’―ＣＧ―３’配列を含む配列を用いることができる。また例えば、結合ターゲットとするゲノム／遺伝子の配列が決まっている場合には、該配列を持つＤＮＡ鎖を用いることで目的配列に結合する物質を探索・評価・検出することができる。
【００２７】
ＤＮＡ鎖は一本鎖であるが、分子内ループを形成する配列や、適当な相補鎖を有するＤＮＡとアニールさせて用いる。この時、相補鎖は１本でもよく、複数のＤＮＡ鎖で構成されていても良い。例えばＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ鎖と、長いＤＮＡ鎖を完全にアニールさせることが困難である場合は、不完全なアニール状態のために凝集反応が起こりにくく、正確なＤＮＡ親和性物質の影響を観察し難い場合がある。このような場合は、ＤＮＡコンジュゲート上のＤＮＡ鎖に相補的な配列をその配列の一部とする長い相補ＤＮＡ鎖Ａと、ＤＮＡコンジュゲート上のＤＮＡ鎖と相補的な配列以外の部分に対する相補ＤＮＡ鎖Ｂを用意し、ＤＮＡ鎖ＡとＤＮＡ鎖Ｂを先にアニールさせた後、この一部２本鎖となったＤＮＡ鎖をＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ鎖とアニールさせることによって完全アニール状態を再現性良く作成することができる。この時、ＤＮＡ親和性物質はＤＮＡコンジュゲートとのアニールの前に、一部２本鎖となったＤＮＡ鎖と反応させておくこともできる。特に対象のＤＮＡ親和性物質の取扱い要件（溶解させる溶媒や温度条件など）がＤＮＡコンジュゲートの凝集に影響を及ぼすような場合、個別にＤＮＡ鎖との結合反応を行うことが適当である。
【００２８】
また、ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ鎖以外の部分を構成する疎水性物質の構造は、水中で凝集しうる構造であればどのようなものであってもよく、限定されない。例えば、ビニルポリマーなどの疎水性高分子鎖、ラテックス微粒子、金コロイド、無機微粒子などが例として示される。
【００２９】
また、本発明のＤＮＡ親和性物質検査方法で使用されるＤＮＡコンジュゲート物質においては、安定なミセル構造を形成できれば、１本鎖ＤＮＡの含有率は限定されない。あまり低い含有率では、相補的ＤＮＡ鎖の添加による光分散強度の変化が確認されにくいばかりでなく、ミセルが形成されないことも考えられるので好ましくない。また、ＤＮＡコンジュゲート物質中の１本鎖ＤＮＡ含有率が高すぎる場合には、ＤＮＡコンジュゲートがミセルとなりにくく、ミセルが形成されても不安定となる場合が多い。したがって、ＤＮＡコンジュゲート物質中の１本鎖ＤＮＡ含有率は、０．１ｍｏｌ％以上０．５ｍｏｌ％以下程度が好ましい。但し、１本鎖ＤＮＡの含有率は、１本鎖ＤＮＡの鎖長や疎水性物質の構造に応じて変更することが望ましい。
【００３０】
本発明のＤＮＡ親和性物質検査方法では、１本鎖ＤＮＡコンジュゲート物質の水溶液中には、陽イオンを共存させることで凝集反応を促進する。一般に、イオン性界面活性剤のミセル形成や高分子ミセルでは、溶液中の対イオン濃度の増大に伴って、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の低下と会合数の増大が起こることが知られている。つまり、対イオンが増大すると、少量の界面活性剤でもミセルを形成できるようになったり、ミセルの粒子径が増大したりする。陽イオンとしてはＤＮＡ鎖の荷電を相殺しうるものであれば制限は無いが、金属イオンや低分子のアンモニウムイオンが好ましい。アンモニウムイオンとしては、窒素原子への置換基は特に制限はないが、分子量は３００以下であることが好ましい。金属イオンもどの様なものでも使用可能であるが、通常、アルカリ土類金属イオンやアルカリ金属イオンが好適に使用され、特にマグネシウムイオンやナトリウムイオンが最も好適に使用される。
【００３１】
本発明のＤＮＡ親和性物質検査方法において用いられる１本鎖ＤＮＡコンジュゲート物質では、１本鎖ＤＮＡコンジュゲート物質の濃度が小さくてもミセルが形成されるようになる、ミセルの粒子径が大きくなり、光散乱の測定が容易になる等という理由からも陽イオンの共存が好ましいことは考えられる。しかし、発明者らの研究によれば、本発明のＤＮＡ親和性物質検査方法では、陽イオンが共存しない場合に相補的ＤＮＡ鎖が添加されても、溶液の透明度に変化（つまり白濁）が見られないため、陽イオンの添加は必須である。
【００３２】
陽イオンの濃度は、陽イオンの種類とＤＮＡ鎖により、最適な濃度を選択する必要があるが、通常１ｍＭ〜１０Ｍであり、より好ましくは１０ｍＭ〜５Ｍである。例えば、マグネシウムイオンの場合では、ＭｇＣｌ２を用いた場合には、その濃度は、２０〜１００ｍＭとすることが好ましく、より好ましくは、３０〜５０ｍＭである。また、ナトリウムイオンの場合では、ＮａＣｌ等を用いた場合には、その濃度は０．１〜２Ｍ、より好ましくは、０．５〜１．５Ｍである。これらの陽イオンがＤＮＡコンジュゲート物質の水溶液中に共存することにより、相補的ＤＮＡ鎖を添加した際、ミセル表面のＤＮＡ鎖と二重らせんが形成され、ミセルどうしの凝集が円滑に生じる。検査対象物質がイオン性である場合には、その対イオンと種類の影響を考慮し、陽イオンの種類と濃度を決定する必要がある。
【００３３】
また、一般に、同じ物質濃度の溶液におけるミセル形成は、温度に左右されることが知られている。つまり、相転移温度より低い温度と、それ以上では、ミセルの挙動が異なる。本発明のＤＮＡ親和性物質検査方法で使用されるＤＮＡコンジュゲート物質でも同様のことが考慮されるが、この温度は、水溶液中の１本鎖ＤＮＡの濃度、対イオンの濃度等と関連するため、各系の相転移温度に応じて選択される。
【００３４】
例えば、前述のＤＮＡ含有率（０．１〜０．５ｍｏｌ％）の範囲において、Ｍｇ２＋イオンを３０ｍＭ添加した、ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）の系では、水溶液の温度を相転移温度以上の３０℃以上とすることが好ましい。より好ましくは、３０〜４０℃である。親和性評価対象の物質自身がイオン性であったり界面活性作用を有する場合は、この温度にも影響を及ぼすことも考えられるため、影響を考慮し温度を決定する必要がある。
【００３５】
さらに、本発明のＤＮＡ親和性物質検査方法では、１本鎖ＤＮＡと相補鎖の二重らせん形成や光散乱強度の測定を妨げない範囲で、水溶液中に、１本鎖ＤＮＡコンジュゲートと陽イオン、ＤＮＡ親和性物質以外の物質を添加してもよい。例えば、緩衝液などが挙げられる。
【００３６】
したがって、本発明のＤＮＡ親和性物質は、１本鎖ＤＮＡコンジュゲート物質が水溶液中でミセルを形成し、相補ＤＮＡ鎖の存在によって、ミセル粒子上のＤＮＡが単体で二重らせんを形成する過程において自律的に凝集する現象を利用して、ＤＮＡ親和性物質が二重らせんの構造に与える僅かな影響を、凝集反応という視覚的な現象に翻訳し、１種類の微粒子でオン・オフ的に結果を出力できる、簡便で汎用性の高い評価方法といえる。さらに類縁構造ＤＮＡ親和性物質とそれぞれの凝集反応への影響の大きさの関係を詳細に解析すれば、ＤＮＡ親和性物質の構造と、結合／親和性の強さなどを推測するのに充分な情報を得ることも出来る。
【００３７】
本発明のＤＮＡ親和性物質の検査方法によれば、ある物質がＤＮＡと親和性を有するか否かを判定することが可能である。また、混合物等の中にＤＮＡ親和性を有する物質が含まれるか否かを判定することも可能である。
【００３８】
【実施例】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００３９】
＜参考例１＞　ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）コンジュゲートの合成（化学式１）
本発明に用いることのできるＤＮＡコンジュゲートの作成方法の例は、既に特開２００１−２５２０９８に詳細に示されている。即ち、１．５ｍｌの試験管内に、ＮＩＰＡＡｍを１４０ｍＭ、５’末端をビニル化したＤＮＡ（癌遺伝子として知られるラスタンパク質のコドン（ｃ−Ｋ−ｒａｓ　ｃｏｄｏｎ）：ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）を６００μＭとした溶液を調製した。
この溶液の窒素置換を行なった後、開始剤として過硫酸アンモニウム（１．３ｍＭ）と、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン８６ｍＭを加え、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４、１ｍｌ）を緩衝液とし、室温にて１時間重合した。
【００４０】
各サンプルについて、３Ｌの超純水に対する２４時間の透析（ＳｐｅｃｔｒＰｏｒｅ６；ＭＷＣＯ１０００）を行なって、未反応のＮＩＰＡＡｍを除去し、さらにゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００）により、未反応のビニル化ＤＮＡを除去した（逆相ＨＰＬＣ分析により確認）。凍結乾燥後、純水に溶解させ、複合体の組成を、ＤＮＡ由来の吸光度と複合体の乾燥重量から算出した。
【００４１】
得られたＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲートのＤＮＡ含有率は、０．３５ｍｏｌ％、収率は８１％であった。
【００４２】
また、水中において、このＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲートは、安定なミセル構造をとることが確認された。
【００４３】
【化１】
2004085502.tif 000002
【００４４】
＜実施例１＞　ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）コンジュゲートを用いたＤＮＡ親和性物質の評価（１）アントラサイクリン系インターカレーター
上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた。この透明水溶液に、上記癌細胞（ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）と、ＤＮＡ鎖とモル等量のダウノマイシンを添加したところ、水溶液の透明度に変化は見られなかった。
光透過率の測定からも、透過率が変化しないことが確認された。
【００４５】
＜比較例１＞
上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた。この透明水溶液に、上記癌細胞（ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）を添加したところ、直ちに白濁が始まり、添加開始から１０分後には、透過率が１０２％以下となった。
【００４６】
本実験の実施例と比較例の光透過率測定の結果を図１に示す。
以上より、本発明の方法を用いることにより、ＤＮＡに結合するがＤＮＡらせん構造の巻き戻しは起こらない結合性物質のＤＮＡ鎖への影響を明瞭に識別できることが確認された。
【００４７】
＜実施例２＞　ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）コンジュゲートを用いたＤＮＡ親和性物質の評価（２）アクチノマイシン
上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた。この透明水溶液に、上記癌細胞の一塩基変異体（ＧＣＧ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＣＧＣ）と、ＤＮＡ鎖とモル等量のアクチノマイシンＤを添加したところ、水溶液の透明度に変化は見られなかった。
光透過率の測定からも、透過率が変化しないことが確認された。
【００４８】
＜比較例２−１＞
上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた。この透明水溶液に、上記癌細胞（ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）と、ＤＮＡ鎖とモル等量のアクチノマイシンＤを添加したところ、直ちに白濁が始まり、添加開始から１０分後には、透過率が１０％以下となった。
【００４９】
＜比較例２―２＞
上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた。この透明水溶液に、上記癌細胞の一塩基変異体（ＧＣＧ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＣＧＣ）を添加したところ、直ちに白濁が始まり、添加開始から１０分後には、透過率が１０％以下となった。
【００５０】
本実験の実施例と比較例の光透過率測定の結果を図２に示す。
以上より、本発明の方法を用いることにより、ＤＮＡの特定配列を認識して結合しＤＮＡらせん構造の巻き戻しを起こす結合性物質のＤＮＡ鎖への影響を明瞭に識別できることが確認された。
【００５１】
＜実施例３＞　ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）コンジュゲートを用いたＤＮＡ親和性物質の評価（３）結合様式不明な合成インターカレーター
上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた。この透明水溶液に、上記癌細胞（ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）と、ＤＮＡ鎖とモル等量のカチオン性合成インターカレーター・キナクリンを添加したところ、水溶液の透明度に変化は見られなかった。
光透過率の測定からも、透過率が変化しないことが確認された。
【００５２】
＜比較例３＞
上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた。この透明水溶液に、上記癌細胞（ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）を添加したところ、直ちに白濁が始まり、添加開始から１０分後には、透過率が１０％以下となった。
【００５３】
本実験の実施例と比較例の光透過率測定の結果を図３に示す。
以上より、本発明の方法を用いることにより、ＤＮＡへ結合するが結合様式が不明な各種の結合性物質のＤＮＡ鎖への影響を明瞭に識別できることが確認された。
【００５４】
＜実施例４＞　ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）コンジュゲートを用いたＤＮＡ親和性物質の評価（４）ｇｒｏｏｖｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｒｕｇ
上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた。この透明水溶液に、上記癌細胞（ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）と、ＤＮＡ鎖とモル等量のネトロプシン２ＨＣｌを添加したところ、水溶液の透明度に変化は見られなかった。
光透過率の測定からも、透過率が変化しないことが確認された。
【００５５】
＜比較例４＞
上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた。この透明水溶液に、上記癌細胞（ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）を添加したところ、直ちに白濁が始まり、添加開始から１０分後には、透過率が１０％以下となった。
【００５６】
本実験の実施例と比較例の光透過率測定の結果を図４に示す。
以上より、本発明の方法を用いることにより、ＤＮＡ鎖間にインターカレートしないが強い親和性を有する親和性物質のＤＮＡ鎖への影響を明瞭に識別できることが確認された。
【００５７】
＜実施例５＞　ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）コンジュゲートを用いたＤＮＡ親和性物質の評価（５）ダイオキシン
上記癌細胞（ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）の上流（５’側）に（ＧＴＴ　ＧＴＧ　ＧＴＡ　ＧＴＴ　ＧＧＡ）の配列を持つ長鎖ＤＮＡ（全配列；ＧＴＴ　ＧＴＧ　ＧＴＡ　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＧＣＴＧＧＴ　ＧＧＣ）と、この長鎖ＤＮＡに対する部分相補鎖（ＴＣＣ　ＡＡＣ　ＴＡＣ　ＣＡＣ　ＡＡＣ）をモル等量混合し、４０℃で１０分間置いてアニールさせる。この混合液へモル等量の２，３，７‐トリクロロ‐８‐メチルジベンゾ‐ｐ‐ダイオキシンを添加し、さらに１０分間置き物質とＤＮＡ鎖を反応させた。この混合液へ、上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液と、終濃度３０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えたところ、水溶液の透明度に変化は見られなかった。
光透過率の測定からも、透過率が変化しないことが確認された。
【００５８】
＜比較例５＞
上記癌細胞（ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）に対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）の上流（５’側）に（ＧＴＴ　ＧＴＧ　ＧＴＡ　ＧＴＴ　ＧＧＡ）の配列を持つ長鎖ＤＮＡ（全配列；ＧＴＴ　ＧＴＧ　ＧＴＡ　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＧＣＴＧＧＴ　ＧＧＣ）と、この長鎖ＤＮＡに対する部分相補鎖（ＴＣＣ　ＡＡＣ　ＴＡＣ　ＣＡＣ　ＡＡＣ）をモル等量混合し、４０℃で１０分間置いてアニールさせる。この混合液へ上記のＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液と、終濃度３０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えたところ、直ちに白濁が始まり、添加開始から１０分後には、透過率が１０％以下となった。
【００５９】
本実験の実施例と比較例の光透過率測定の結果を図５に示す。
以上より、本発明の方法を用いることにより、ＤＮＡ鎖に一定の親和性を有するダイオキシン類などの多環化合物のＤＮＡ鎖への影響を明瞭に識別できることが確認された。また特に長鎖ＤＮＡを用いることが有効な場合に於いて、上記のような部分配列を複数アニールして二重鎖にする方法で、上記実施例１〜４と同様の識別が可能であることが示された。
【００６０】
＜実施例６＞　ＤＮＡ−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡｍ）コンジュゲートを用いたＤＮＡ親和性物質の評価（６）環境ホルモン
上記癌細胞（ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）と、これに対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）からなる分子内ループを形成するＤＮＡ鎖（全配列；ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）を持つＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、ＤＮＡ鎖とモル等量のビスフェノールＡを添加した後、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を添加したところ、水溶液の透明度に変化は見られなかった。
光透過率の測定からも、透過率が変化しないことが確認された。
【００６１】
＜比較例６＞
上記癌細胞（ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ）と、これに対する相補鎖（ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）からなる分子内ループを形成するＤＮＡ鎖（全配列；ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＧＣ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ）を持つＤＮＡ−ＮＩＰＰＡＡｍコンジュゲート水溶液に、３０ｍＭのＭｇＣｌ２を添加したところ、直ちに白濁が始まり、添加開始から１０分後には、透過率が１０％以下となった。
【００６２】
本実験の実施例と比較例の光透過率測定の結果を図６に示す。
以上より、本発明の方法を用いることにより、環境ホルモンに属する多環化合物をもＤＮＡ鎖への弱い相互作用を用いて明瞭に識別できることが確認された。また特に、混合試薬類の数を減らすことが有効なフィールド検査などの場合に於いて、上記のような分子内ループを形成するＤＮＡ鎖を用いる方法で、より簡便に上記実施例１〜５と同様の識別が可能であることが示された。
【００６３】
【発明の効果】
本発明によって、簡便に、精度高く、ＤＮＡ親和性物質の識別を行うことが可能な検査方法が提供される。この検査方法は、ミセル粒子上のＤＮＡが単体で二重らせんを形成し、自律的に凝集するため、１種類の微粒子でオン・オフ的に結果を出力できる、簡便で汎用性の高い検査方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡ親和性物質の評価（１）アントラサイクリン系インターカレーター
【図２】ＤＮＡ親和性物質の評価（２）アクチノマイシン
【図３】ＤＮＡ親和性物質の評価（３）その他合成インターカレーター
【図４】ＤＮＡ親和性物質の評価（４）ｇｒｏｏｖｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｒｕｇ
【図５】ＤＮＡ親和性物質の評価（５）ダイオキシン類
【図６】ＤＮＡ親和性物質の評価（６）環境ホルモン類
【図１】
2004085502.tif 000003
【図２】
2004085502.tif 000004
【図３】
2004085502.tif 000005
【図４】
2004085502.tif 000006
【図５】
2004085502.tif 000007
【図６】
2004085502.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月25日(2003.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
本実験の実施例と比較例の光透過率測定の結果を図６に示す。
以上より、本発明の方法を用いることにより、環境ホルモンに属する多環化合物をもＤＮＡ鎖への弱い相互作用を用いて明瞭に識別できることが確認された。また特に、混合試薬類の数を減らすことが有効なフィールド検査などの場合に於いて、上記のような分子内ループを形成するＤＮＡ鎖を用いる方法で、より簡便に上記実施例１〜５と同様の識別が可能であることが示された。
【配列表】
2004085502.tif 000009
2004085502.tif 000010
2004085502.tif 000011
2004085502.tif 000012