(57)【要約】【課題】アグマチンの簡易で、再現性良い測定方法の提供【解決手段】被測定試料をプトレッシンオキシターゼを固定した担体のみを充填したカラム１のみを経由した後に設けられた過酸化水素及び／または酸素電極３により測定する経路とプトレッシンオキシターゼのみを固定したカラムのみを経由した後にアグマチナーゼ（ａｇｍａｔｉｎａｓｅ）（アグマチンウレオヒドラーゼ、ＥＣ  ３．５３．１１）を固定した担体とプトレッシンオキシターゼを固定した担体との組み合わせた充填剤を充填したカラム２を経緯由後の過酸化水素及び／または酸素電極４により測定する経路とに供給し、それぞれ経路の測定値の相対値をアグマチン量に相関させてアグマチン量を算出することを特徴とするアグマチン量の検出方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定試料をプトレッシンオキシターゼを固定した担体のみを充填したカラムのみを経由した後に設けられた過酸化水素及び／または酸素電極により測定する経路とプトレッシンオキシターゼのみを固定したカラムのみを経由した後にアグマチナーゼ（ａｇｍａｔｉｎａｓｅ）（アグマチンウレオヒドラーゼ、ＥＣ３．５３．１１）を固定した担体とプトレッシンオキシターゼを固定した担体との組み合わせた充填剤を充填したカラムを経緯由後の過酸化水素及び／または酸素電極により測定する経路とに供給し、それぞれ経路の測定値の相対値をアグマチン量に相関させてアグマチン量を算出することを特徴とするアグマチン量の検出方法。
【請求項２】
カラム内のアグマチナーゼの活性を高める二価Ｍｎ（ＩＩ）Ａ（ＡはＭｎのカウンターイオン）を前記カラム内に存在させることを特徴とする請求項１に記載のアグマチン量の検出方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアグマチン量の検出方法を海産無脊椎動物肉の鮮度を評価する方法に適用することを特徴とするアグマチン量の検出方法。
【請求項４】
被測定試料中にＴｒｉｓを存在させｐＨを７より大きく９までに調整することを特徴とする請求項１、２または３に記載のアグマチン量の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プトレッシンオキシターゼのみを固定したカラムとアグマチナーゼ（ａｇｍａｔｉｎａｓｅ）（アグマチンウレオヒドラーゼ、ＥＣ  ３．５３．１１）とプトレッシンオキシターゼとの組み合わせを固定したカラムとをそれぞれ酸素電極に接続し前記各カラム内で消費酸素量または生成過酸化水素量の相対値をアグマチン量に対応させて算出する構成としたアグマチン量の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素を用いる食品の分析法は，今日広く一般に受け入れられる様になって来た。酵素法の特徴としては、（１）酵素の基質特異性による被分析成分の選択性が良い、（２）高い測定感度、（３）（１）と関連するが分離，前処理が不要乃至比較的簡易であり、熟練を必要とせず高い精度の分析が可能である、（４）検量線の作製が、例えば２点補完で済みまたはＮＡＤなどの化学量比から検量線なしでも定量が可能である、（５）特殊な機器を必要としないなどがある。
最近では食品分析用にキット化された酵素製品も市販され、食品添加物の分析においても、例えばグルタミン酸ナトリウム，糖類，有機酸類などの項目で酵素法が準公定法に取り入れられるなど、今後は酵素法の利用が増々盛んになると思われる。
魚介類の鮮度指標Ｋ値の測定にも，核酸関連物質の各濃度を酵素法により定量することが研究されている。Ｋ値の測定には酸素電極を利用した実用的鮮度測定器や酵素電極を用いた多機能型酵素センサーシステムが開発され注目を集めた。因みに、Ｋ値＝〔ＨｘＲ（イノシン）＋Ｈｘ（ヒポキサンチン）〕／〔ＡＴＰ＋ＡＤＴ＋ＡＭＰ＋ＩＭＰ＋ＨｘＲ＋Ｈｘ〕×１００であり、ＡＴＰの尿酸（ＵＡ）への分解程度を測定して、魚介類の鮮度指標とするものである。
【０００３】
アグマチンはアルギニンの脱炭酸により合成される物質であり、食物においてはイカやタコ等の海産無脊椎移動物の筋肉中やニシンの精子等に見出されている。また最近アグマチンがイミダゾリン受容体に対する神経伝達物質であることが知られ、脳や血漿中のアグマチンの濃度の測定もされるようになっている。前記のように、アグマチンはイカなどの食品に存在し、それらの鮮度のマーカーとして利用できることが知られている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｈ．Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．５２，９３６−９３８（１９８７）
【非特許文献２】
Ｈｉｒｏｋａｚｕ  Ｏｋｕｍａ，Ｅｓｔｕｏ  Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １７（２００２）３６７−３７２
【非特許文献３】
Ｈｉｒｏｋａｚｕ  Ｏｋｕｍａ，Ｈｉｔｏｓｈｉ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓｅｉｉｃｈｉ  Ｙａｚａｗａ，Ｓｈｕｉｃｈｉ  Ｓｅｋｉｍｕｋａｉ，Ｅｓｔｕｏ  Ｗａｔａｎａｂｅ，Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．２６０，Ｎｏ．１（１９９２），９３−９８
【非特許文献４】
Ｃ．ＳＡＴＩＳＨＣＨＡＮＤＲＡＮ  ａｎｄ  ＳＴＥＰＨＥＮ  Ｍ．ＢＯＹＬＥ，Ｊ．ｏｆ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｍａｒ．１９８６，ｐ８４３−８４８，
【特許文献１】
特開２００１−２４９１０８、特許請求の範囲、図２、〔００１１〕
【０００５】
前記海産無脊椎動物のエキス成分に含まれるアルギニンが時間の経過と共に脱炭酸されてアグマチンを生成することに着目して、例えばスルメイカの貯蔵条件におけるアグマチンの量をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）で測定し、アグマチンがスルメイカの鮮度の判定指標となることを発表している（非特許文献１）。
Ｈｉｒｏｋａｚｕ  Ｏｋｕｍａらは、魚介類の鮮度指標Ｋ値を、２系列の酵素リアクターをそれぞれ酸素電極などに結合し、ぞれぞれの系列での、例えば酸素消費量を酸素電極で測定し、それぞれの測定における相対値から高速に、かつ再現性良く、前記ＨＰＬＣで得られる結果と相関する値が得られることを発表している（非特許文献２、３）。
しかしながら、アグマチンを酵素反応カラムを用いて測定する技術は知られていないし、まして酵素反応カラムと酸素電極とを組み合わせて測定する技術は知られていない。
ただ、アグマチンはアグマチナーゼにより加水分解されプトレッシンと尿素を生成すること、プトレッシンの測定方法として、プトレッシンの分解酵素プトレッシン  オキシダーゼによる反応系の成分、例えば酸素消費などを酸素電極により測定して行う方法は公知である（特許文献１、酵素ハンドブック、１９８７年１１月１日朝倉書店発行、１１９頁、１．４．３，１０  Ｐｕｔｒｅｓｃｉｅｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ，）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アグマチンを簡易、迅速に計測する方法を提供することである。そこで前記Ｈｉｒｏｋａｚｕ  Ｏｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，の手法をアグマチンの計測に適用できないかを検討するために、アグマチンの加水分解酵素であるアグマチナーゼを前記非特許文献４に記載の方法を工夫して生産性良く合成し、この酵素をＬＣカラム充填材（ビーズ）表面に固定し、更にアグマチンの加水分解生成物であるプトレッシンの分解酵素プトレッシン  オキシダーゼを固定したカラム充填材を作製し、これらを用いたカラムと酸素電極などとを組み合わせて、所望のアグマチンの測定が可能となる手法を検量線の作製と合わせて鋭意検討し、アグマチナーゼ（ａｇｍａｔｉｎａｓｅ）（アグマチンウレオヒドラーゼ、ＥＣ  ３．５３．１１）とプトレッシンオキシターゼとの組み合わせを固定したカラムとプトレッシンオキシターゼのみを固定したカラムとそれぞれのカラムに組み合わせた酸素電極により酸素濃度を電流値として測定し、それらの差とアグマチ濃度との相関の検量線を、アグマチン濃度が既知の少なくとも２つの試料から作製し、該検量線を用いて被測定試料の酸素消費量の相対値からアグマチン濃度を測定できることを確認し、前記課題を解決することが出来た。
前記酸素電極により酸素消費量の測定に変えて、酵素による反応における生成した成分、例えば過酸化水素量を測定しても良い。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、被測定試料をプトレッシンオキシターゼを固定した被測定試料をプトレッシンオキシターゼを固定した担体のみを充填したカラムのみを経由した後に設けられた過酸化水素及び／または酸素電極により測定する経路とプトレッシンオキシターゼのみを固定したカラムのみを経由した後にアグマチナーゼ（ａｇｍａｔｉｎａｓｅ）（アグマチンウレオヒドラーゼ、ＥＣ  ３．５３．１１）を固定した担体とプトレッシンオキシターゼを固定した担体との組み合わせた充填剤を充填したカラムを経緯由後の過酸化水素及び／または酸素電極により測定する経路とに供給し、それぞれ経路の測定値の相対値をアグマチン量に相関させてアグマチン量を算出することを特徴とするアグマチン量の検出方法である。好ましくは、カラム内のアグマチナーゼの活性を高める二価Ｍｎ（ＩＩ）Ａ（ＡはＭｎのカウンターイオン、例えばＳＯ４２−である。）を前記カラム内に存在させることを特徴とする前記アグマチン量の検出方法である。また好ましくは、前記各アグマチン量の検出方法を海産無脊椎動物肉の鮮度を評価する方法に適用することを特徴とするアグマチン量の検出方法である。より好ましくは、被測定試料中にＴｒｉｓを存在させｐＨを７より大きく９までに調整することを特徴とする前記各アグマチン量の検出方法である。
【０００８】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ａ．本発明の特徴を図１に記載の測定原理を参照しながら説明する。
１，プトレッシンオキシターゼによるプトレッシン酸化分解反応は、
プトレッシン＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ―→４−アミノブチルアルデヒド＋ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２
であり、この反応はカラム１及び２で進行する。
２，アグマチナーゼによるアグマチンの加水分解反応は、
アグマチン＋Ｈ２Ｏ―→  プトレッシン＋尿素
である。この反応はカラム２で進行する。
カラム１では被測定試料中に存在する可能性のあるプトレッシンを分解する前記１，の反応が進行する。また、カラム２では、２，の分解反応、１の分解反応が進行する。従って、カラム２での酸素消費量とカラム１での酸素消費量の違いは、実質的にアグマチンの存在量と相関する。プトレッシンオキシターゼ自身の酸素消費があったとしても、その量も補正される。
前記１，の反応の原理からすると、前記反応の検出が可能な被測定成分は、酸素消費量の他に、反応後の各生成物があるが、酸素消費量、Ｈ２Ｏ２量の測定が簡易である。
【０００９】
従って、例えば、それぞれのカラムと結合する酸素電極３及び４により酸素消費量を、エレクトロメータ５で電流値として求め、その相対値を求めればアグマチンの存在量と相関する。この測定結果はレコーダ６に記録される。
カラムに存在させるアグマチナーゼの量は４Ｕ（酵素の添加量の単位）、である。測定後の試料はペリスタポンプ（Ｐｅｒｉｓｔａ  ｐｕｍｐ）９で廃液槽に排出させる。
Ｂ．測定感度は、カラムの条件、酸素電極の条件により変動するから、予めアグマチンの濃度既知試料を測定し、検量線を作製しておけば、正確にアグマチン濃度を知ることができる。検量線の直線性は良いので、２点濃度の補完で充分である。
Ｃ．被測定試料は緩衝剤であるＴｒｉｓ〔（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕〔ｔｒｉｓ（ｈｙｄｏｘｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅｅ〕に加えた緩衝液８の流路に設けられた注入口７注入される。緩衝液にはアグマチナーゼを活性化する２価のマンガン化合物、例えばＭｎＳＯ４等を添加するが好ましい。前記活性剤を添加した場合、アグマチナーゼの使用量は４Ｕで充分であった。
Ｄ．カラム充填材及びカラムの調製；
酵素を担持させる不溶性の担体としては、通常使用されている担体材料が使用される。キトサン、デキストランなどの天然の高分子材料、ポリアクリルアミド、アセチルセルロース、ポリイミドなどの合成樹脂材料、シリケート結晶子多孔体、セラミック、多孔質ガラスなどからビーズ状に整形したものなどを例示できる。酵素の前記担体への固定方法としては、担体結合法、架橋法、包括法等がある。酵素の固定化量は、測定条件、例えば、緩衝液の流速、被測定試料液に含まれる特定物質の量に応じて、適宜選択される。また、アグマチナーゼを担持した充填を充填したカラムの作製方法としては、各酵素を固定化した担体を層状に充填する方法、混合して充填する方法、及び複数の酵素を単一の担体に固定化し充填する方法などがある。
酵素の量はカラムのスケールにより変化し、以下の実施例における酵素量は、実施例でのカラムスケールの場合における数値である。
【００１０】
【実施例】
以下に、実施例により本発明を具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されない。
実施例１
各カラムの作製；
Ａ，プトレッシンオキシターゼ  カラムの作製。
０．５Ｍ、ｐＨ８のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１ｍＬ中にプトレッシンオキシターゼ４０Ｕの酵素を溶解し、これにグルタールアルデヒド１滴およびキトサンビーズを液面からでない程度に加える。これを５℃で１日放置した。余分のグルタールアルデヒドを除去するために前記緩衝液で洗浄する。グルタールアルデヒドを介してキトサンビーズに固定化したプトレッシンオキシターゼ担持ビーズが得れれた。得られたビーズは前記緩衝液と同組成の液中に５℃で保存する。
前記ビーズを１．５ｍｍ×５．５ｍｍのカラムに充填してプトレッシンオキシターゼ（４０Ｕのプトレッシンオキシターゼが存在）  カラムを得た。
Ｂ，アグマチナーゼ＋プトレッシンオキシターゼ  カラムの作製。
アグマチナーゼ担持ビーズを、前記Ａ，のプトレッシンオキシターゼビーズと同様に調製した。アグマチナーゼ担持ビーズと前記Ａ，で調製したプトレッシンオキシターゼビーズを１：１に層状になるようφ１．５ｍｍ×５．５ｍｍカラムに充填してアグマチナーゼ＋プトレッシンオキシターゼ  カラムを得た。
但し、プトレッシンオキシターゼの配合単位は４０Ｕとし、アグマチナーゼの配合単位は４Ｕとした。これは２価のＭｎ塩、ＭｎＳＯ４を添加することでアグマチナーゼの活性が１０倍に増加することの発見に基づくものである。
【００１１】
検量線の作製；
ｐＨ９．０、温度３０℃、２価のＭｎ（ＭｎＳＯ４）の含有０．０５ＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液を流速０．２ｍＬ／分で前記カラム中を移送させる。測定酸素電極の出力が安定したら、アグマチン濃度、２０μＭ（２．６ｍｇ／Ｌ）及び８０μＭ（１０．４ｍｇ／Ｌ）の標準サンプルを５０μＬ注入し、それぞれのセンサー出力（電流値）７０ｎＡおよび２８０ｎＡと前記アグマチン濃度との関係をプロットする（図２）。
前記２つの標準点を結んで得られる直線が、測定装置のパラメータ、被測定アグマチンの濃度など測定時の条件を反映した検量線、ｙ＝３．５ｘである。
ｙ＝（２８０−７０）／（８０−２０）ｘ＝３．５ｘ
【００１２】
被測定試料中のアグマチン濃度の測定。
スルメイカの胴肉をホモジナイズし、肉１０ｇに対し冷却した５％過塩素酸を、含有タンパク量に応じて５０〜２００ｍＬを加え、除タンパク処理をした。生じた沈澱を１００００回転／分で１０分間遠心処理することにより除去した。上清５０μＬを被測定試料とした。測定用酸素電極４及び３の出力を前記検量線の勾配３．５で除すると、前記被測定試料５０μＬ中のアグマチン濃度が得られる。これを１０００倍すると１００ｇ中に含まれるアグマチンの量（ｍｇ）が得られる。
表１に示したサンプルＡ、Ｂ及びＣの各保存温度及び経過後の被測定試料中のアグマチン量との関係を表に示す。図２の検量線上にサンプルＡ、Ｂ及びＣのアグマチン濃度とセンサー出力との相関をプロットした。
【００１３】
【表１】
2004233092.tif 000003
【００１４】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明のアグマチンの測定方法によれば、簡易に、かつ再現性良く得られると言う優れた効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアグマチンの測定装置
【図２】本発明測定法による被測定試料中のアグマチン量算出の検量線、測定試料中のアグマチン量と電流値とのプロット
【符号の説明】
１  プトレッシンオキシダーゼ  カラム
２  アグマチナーゼ＋プトレッシンオキシダーゼ  カラム
３、４  酸素または過酸化水素電極試料注入口  ５  算出部
６  算出信号記録部  ７  被検出物注入口  ８  緩衝液
９  ペリスタポンプ  １０  廃液溜
【図１】
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【図２】
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