(57)【要約】【課題】外来ＤＮＡを安定に保持または効率的に増殖させる宿主細胞、および該宿主細胞を利用した外来ＤＮＡを保持または増幅させる方法の提供を課題とする。【解決手段】非相同組換えを促進する因子の変異であるｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異又はｈｅｌＤ変異を少なくとも１つ、若しくはこれらの二重変異若しくは三重変異、又は上記変異とその他の非相同組換えを促進する因子の変異または相同組換えの促進する因子の変異等との組み合わせを宿主細胞に組み込んだ宿主細胞を作製し、それに外来ＤＮＡを組み込んで保持又は増殖させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来ＤＮＡを保持または増殖させるための宿主細胞であって、変異した非相同組換えの促進に関わる因子を少なくとも一つ有することを特徴とする宿主細胞。
【請求項２】
宿主細胞が大腸菌由来である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記変異した非相同組換えの促進に関わる因子がｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異またはｈｅｌＤ変異である、請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
外来ＤＮＡが導入された請求項１〜３のうちいずれか一項に記載の宿主細胞を増殖させることを含む、外来ＤＮＡを宿主細胞において保持または増殖させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞を用いて外来ＤＮＡを細胞内で保持または増殖させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日新たな性質を有する細胞等を取得するため、組換えＤＮＡ技術はあらゆる実験に用いられている。現在では様々な細菌や細胞が組換えＤＮＡ実験に用いられているが、その中でも大腸菌は宿主として幅広く用いられている細菌の一つであり、かつ該組換えＤＮＡ技術の基礎を確立した重要な細菌でもある。
【０００３】
組換えＤＮＡ実験では形質転換、形質導入等が主に行われているが、取り込んだ外来ＤＮＡ（ベクターＤＮＡ）をどのように安定させて保持し、更に効率よく再現性を向上させるかということが問題となっている。特に、外来ＤＮＡを大腸菌宿主内で保持または増殖させる際に、該ＤＮＡが組換えを起こすことにより構造が変化する。これにより、外来ＤＮＡを有するベクターが宿主内で安定に保持されず、更には増殖されないため、発現産物の収率が悪化するという問題がある。この問題は、特にコスミドなどの長大なＤＮＡを挿入する際に顕著に表れる。
【０００４】
このため、該外来ＤＮＡを増殖（クローニング）若しくは発現させるための宿主として、相同組換えを促進する遺伝子であるｒｅｃＡを変異させたｒｅｃＡ変異株が用いられる。このｒｅｃＡ変異株を用いると、相同組換えの促進に関わる遺伝子ｒｅｃＡが変異しているので、相同組換えの促進に作用せず、外来ＤＮＡを導入しても相同組換えを抑制することができる。このため、安定性が増し、発現産物の収率が良好となる。
【０００５】
ここで、相同組換えとは、数十ｂｐから数百ｂｐの長い相同性領域がある場合に誘導される組換えをいい、主にＤＮＡの損傷の修復に働き、日常的に起こりうる現象である。相同組換えが起こると、外来ＤＮＡと大腸菌内のＤＮＡとの組換えが起こり、外来ＤＮＡを安定に保持することができなくなる。但し、後述する非相同組換えと異なり、相同組換えが起こることによる外来ＤＮＡ及び宿主内のＤＮＡ構造の大きな変化はない。
また、ＲｅｃＡタンパク質だけでなく、例えばＲｅｃＯタンパク質、ＲｅｃＲタンパク質、ＲｅｃＦタンパク質、ＵｖｒＤタンパク質及びＨｅｌＤタンパク質も相同組換えに関わる因子として知られている（非特許文献１〜４参照）。
【０００６】
【非特許文献１】Tseng,Y.-C著「Mutat.res.」1994年、Vol.315、p.1-9
【非特許文献２】Takahashi NK.著「J Bacteriol.」1993年、Vol.175、p.5176-85
【非特許文献３】Keller KL.著「Mutat Res.」2001年、Vol.486、p.21-9
【非特許文献４】ANDREI  KUZMINOV著「Mic. Mol. Bio. Rev, 」Vol.63, Mp.4.1999, P751-813
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ｒｅｃＡ変異株を用いても、ｒｅｃＡ変異株は相同組換えを抑制するものであり、非相同組換えの抑制は難しいという問題がある。
ここで、非相同組換えとは、０ｂｐから十数ｂｐという相同領域をほとんど必要としない若しくは非常に短い相同領域で生じる組換えである。組換え頻度は、前述の相同組換えと比較すると低い。
しかしながら、非相同組換えが誘導されると、外来ＤＮＡが欠失、挿入等のＤＮＡ再編成を生じ、外来ＤＮＡ及び宿主内のＤＮＡ構造を大きく変化させる。
従って、相同組換えと比較してＤＮＡ構造に大きな影響を与える非相同組換えを抑制しなければ、宿主細胞内において外来ＤＮＡを保持または効率良く増殖させることが難しいという問題がある。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、外来ＤＮＡを安定に保持または効率的に増殖させる宿主細胞及びその利用を提供することを目的とする。更に詳しくは、本発明は該細胞を利用した、外来ＤＮＡを安定に保持または増殖させる方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。まず本発明者らは、非相同組換え頻度を評価するシステム（Ikeda H. et al., Adv. Biophys. 31: p197-208 (1995)）を利用して、非相同組換えに関与する因子の探索を行った。その結果、大腸菌のｒｅｃＯ変異株、ｒｅｃＲ変異株、ｒｅｃＦ変異株、ｕｖｒＤ変異株またはｈｅｌＤ変異株において、ＲｅｃＯタンパク質、ＲｅｃＲタンパク質、ＲｅｃＦタンパク質、ＵｖｒＤタンパク質及びＨｅｌＤタンパク質は非相同組換えを促進する因子であることが分かった。ここで、因子とは、タンパク質と遺伝子の両方を示している。
さらに本発明者らは、ｒｅｃＯ変異株、ｒｅｃＲ変異株、ｒｅｃＦ変異株、ｕｖｒＤ変異株及びｈｅｌＤ変異株は変異株であるにもかかわらず、培地中で良好に増殖することを見出した。
このことから、ｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異またはｈｅｌＤ変異を有する宿主細胞は、ベクターＤＮＡ等の外来ＤＮＡを細胞内で保持または増殖させ、必要に応じて遺伝子の発現産物を取得するための宿主細胞として、十分に実用に耐え得るものであることが判明した。
すなわち、ｒｅｃＯ変異株、ｒｅｃＲ変異株、ｒｅｃＦ変異株、ｕｖｒＤ変異株及びｈｅｌＤ変異株は、相同組換えおよび非相同組換えの両者を抑制することにより、宿主細胞内の外来ＤＮＡの組換え頻度を顕著に低下させ、外来ＤＮＡを細胞において保持あるいは効率的に増殖させる。
【０００９】
ここで、上記因子が非相同組換えに係わる機構について、図を用いて説明する。
図１はＲｅｃＯ、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＦ、ＵｖｒＤ並びにＨｅｌＤタンパク質が非相同組換えの発生に係わるメカニズムを説明する模式図である。
この図によれば、ＲｅｃＪタンパク質は、５’→３’１本鎖エキソヌクレアーゼ活性を持ち、非相同組換えを誘導するために必要な３’突出末端を形成する。またＵｖｒＤ及びＨｅｌＤタンパク質は、非相同組換えを誘導するために必要な３’突出末端の形成に関与する。よってこれらタンパク質は非相同組換えの促進に作用する。
また、ＲｅｃＯタンパク質は、１本鎖ＤＮＡ同士を結合させるアニーリング活性を有することから、短い相同領域で非相同組換えが誘導されると考えられる。さらに相同組換えにおいてＲｅｃＯ、ＲｅｃＲ及びＲｅｃＦタンパク質は複合的に作用することが知られているが、これと同様に、非相同組換えにおいてもＲｅｃＯ、ＲｅｃＲ及びＲｅｃＦタンパク質が複合的に作用し、これにより非相同組換えの促進に作用する。
【００１０】
上記の如く本発明者らは、外来ＤＮＡを保持または効率的に増殖させることが可能な宿主細胞を見出し、本発明を完成させた。
即ち本発明は、外来ＤＮＡを保持または効率的に増殖させるための宿主細胞、および該宿主細胞を利用した外来ＤＮＡを保持または増幅させる方法に関し、より具体的には、
〔１〕  外来ＤＮＡを保持または増殖させるための宿主細胞であって、変異した非相同組換えの促進に関わる因子を少なくとも一つ有することを特徴とする宿主細胞、
〔２〕  宿主細胞が大腸菌由来である、〔１〕に記載の宿主細胞、
〔３〕  前記変異した非相同組換えの促進に関わる因子がｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異またはｈｅｌＤ変異を有する、〔１〕または〔２〕に記載の宿主細胞、
〔４〕  外来ＤＮＡが導入された〔１〕〜〔３〕のうちいずれか一項に記載の宿主細胞を増殖させることを含む、外来ＤＮＡを宿主細胞において保持または増幅させる方法、を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、外来ＤＮＡを保持または増殖させるための宿主細胞が提供された。本発明の宿主細胞においては、外来ＤＮＡの組換え頻度が顕著に抑制されるため、所望の外来ＤＮＡを安定に保持あるいは効率的に増殖させることが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ｒｅｃＯ変異株、ｒｅｃＲ変異株、ｒｅｃＦ変異株、ｕｖｒＤ変異株またはｈｅｌＤ変異株は、非相同組換えを制御することで、宿主細胞内の外来ＤＮＡの組換え頻度を顕著に低下させることにより、外来ＤＮＡを安定に保持あるいは効率的に増殖させることが本発明者らにより初めて見出された。ここで、安定とは、非相同組換えや相同組換えによる外来ＤＮＡの構造変化を起こさず、また、該外来ＤＮＡを長期に保持している状態を示す。
【００１３】
従って本発明は、外来ＤＮＡを保持または増殖させるための宿主細胞であって、非相同組換えの促進に関わる因子を少なくとも一つ有することを特徴とする宿主細胞を提供する。
本発明の宿主細胞は、変異した非相同組換えの促進に関わる因子を少なくとも一つ有する細胞であれば、特に制限されないが、好ましくは原核生物細菌であり、より好ましくは大腸菌（大腸菌由来細胞）であり、更により好ましくはｒｅｃＢＣ  ｓｂｃＡ変異バックグラウンド条件下の大腸菌である。
【００１４】
本発明において「非相同的組換えの促進に関わる因子」とは、例えば、ｒｅｃＯ、ｒｅｃＲ、ｒｅｃＦ、ｕｖｒＤ、またはｈｅｌＤの各遺伝子（または、該遺伝子によってコードされるタンパク質）を言う。従って、本発明における上記「変異した非相同組換えの促進に関わる因子」とは、具体的には、以下の（１）〜（５）の遺伝子変異を挙げることができる。
（１）ｒｅｃＯ変異
（２）ｒｅｃＲ変異
（３）ｒｅｃＦ変異
（４）ｕｖｒＤ変異
（５）ｈｅｌＤ変異
【００１５】
変異した非相同組換えの促進に関わる因子を有する本発明の宿主細胞としては、少なくとも一つこれに関わる遺伝子変異を有していれば構わないが、ｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異またはｈｅｌＤ変異の遺伝子変異が例えば少なくとも２つの組み合わせで同時に存在しても良い。具体的には、以下の（６）〜（１５）の２つの遺伝子変異の組み合わせを挙げることができる。
（６）ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＲ変異
（７）ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＦ変異
（８）ｒｅｃＯ変異  ｕｖｒＤ変異
（９）ｒｅｃＯ変異  ｈｅｌＤ変異
（１０）ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＦ変異
（１１）ｒｅｃＲ変異  ｕｖｒＤ変異
（１２）ｒｅｃＲ変異  ｈｅｌＤ変異
（１３）ｒｅｃＦ変異  ｕｖｒＤ変異
（１４）ｒｅｃＦ変異  ｈｅｌＤ変異
（１５）ｕｖｒＤ変異  ｈｅｌＤ変異
【００１６】
また、更にｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異またはｈｅｌＤ変異の遺伝子変異が３つ同時に存在しても良い。具体的には、以下の（１６）〜（２５）の３つの遺伝子変異の組み合わせを挙げることができる。
（１６）ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＦ変異
（１７）ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＲ変異  ｕｖｒＤ変異
（１８）ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＲ変異  ｈｅｌＤ変異
（１９）ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＦ変異  ｕｖｒＤ変異
（２０）ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＦ変異  ｈｅｌＤ変異
（２１）ｒｅｃＯ変異  ｕｖｒＤ変異  ｈｅｌＤ変異
（２２）ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＦ変異  ｕｖｒＤ変異
（２３）ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＦ変異  ｈｅｌＤ変異
（２４）ｒｅｃＲ変異  ｕｖｒＤ変異  ｈｅｌＤ変異
（２５）ｒｅｃＦ変異  ｕｖｒＤ変異  ｈｅｌＤ変異
【００１７】
ＲｅｃＯタンパク質、ＲｅｃＲタンパク質、ＲｅｃＦタンパク質、ＵｖｒＤタンパク質及びＨｅｌＤタンパク質は、ＲｅｃＥ経路による相同組換えに関与し、ｒｅｃＢＣ  ｓｂｃＡ変異バックグランド条件下では、ＲｅｃＥ経路が活性化される。そこでｒｅｃＢＣ  ｓｂｃＡ変異バックグラウンド条件下において、ｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異及びｈｅｌＤ変異を導入すると、相同組換え及び非相同組換えの抑制をより効果的に確認することができる。
また、その他の非相同組換えの促進に関与する遺伝子変異と、本発明に係るｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異またはｈｅｌＤ変異との組み合わせて用いることも可能である。
【００１８】
具体的な非相同組換えに関与する因子の変異であるｒｅｃＪ変異と本発明における「非相同組換えの促進に関わる変異の因子」との組み合わせを以下の（２６）〜（３５）に示す。
（２６）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＯ変異
（２７）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＲ変異
（２８）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＦ変異
（２９）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＲ変異
（３０）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＦ変異
（３１）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＦ変異  ｒｅｃＲ変異
（３２）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＦ変異  ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＲ変異
（３３）ｒｅｃＪ変異  ｕｖｒＤ変異
（３４）ｒｅｃＪ変異  ｈｅｌＤ変異
（３５）ｒｅｃＪ変異  ｕｖｒＤ変異  ｈｅｌＤ変異
【００１９】
また、本発明者らの研究により、ＲｅｃＥ経路においてもＲｅｃＪタンパク質が非相同組換えの促進に働くことが示されている。ＲｅｃＪタンパク質は組換えの基質となる３’突出末端を形成していることが知られており、ＲｅｃＯタンパク質、ＲｅｃＲタンパク質、ＲｅｃＦタンパク質、ＵｖｒＤタンパク質並びにＨｅｌＤタンパク質とは異なる部分で非相同組換えの促進に働いていると考えられる。そのため、ｒｅｃＪ変異を導入することで、さらなる効果が期待できると考えられ、望ましい。
また非相同組換えには関与しないが、相同組換え全般に関与するｒｅｃＡ変異をさらに導入した菌株を作れば、よりＤＮＡの安定化を促進する菌株を得ることができると考えられる。
【００２０】
「相同組換えの促進に関わる因子の変異であるｒｅｃＡ変異」を導入した例として、具体的には以下の（３６）〜（４５）の遺伝子変異、またはこれら変異の組み合わせからなる遺伝子変異を挙げることができる。
（３６）ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＡ変異
（３７）ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＡ変異
（３８）ｒｅｃＦ変異  ｒｅｃＡ変異
（３９）ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＡ変異
（４０）ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＦ変異  ｒｅｃＡ変異
（４１）ｒｅｃＦ変異  ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＡ変異
（４２）ｒｅｃＦ変異  ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＡ変異
（４３）ｕｖｒＤ変異  ｒｅｃＡ変異
（４４）ｈｅｌＤ変異  ｒｅｃＡ変異
（４５）ｕｖｒＤ変異  ｈｅｌＤ変異  ｒｅｃＡ変異
【００２１】
更に、「非相同組換えに関与する因子の変異であるｒｅｃＪ変異」及び「相同組換えの促進に関わる因子の変異であるｒｅｃＡ変異」を導入した例として、具体的には以下の（４６）〜（５５）の遺伝子変異、またはこれら変異の組み合わせからなる遺伝子変異を挙げることができる。
（４６）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＡ変異
（４７）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＡ変異
（４８）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＦ変異  ｒｅｃＡ変異
（４９）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＡ変異
（５０）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＦ変異  ｒｅｃＡ変異
（５１）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＦ変異  ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＡ変異
（５２）ｒｅｃＪ変異  ｒｅｃＦ変異  ｒｅｃＯ変異  ｒｅｃＲ変異  ｒｅｃＡ変異
（５３）ｒｅｃＪ変異  ｕｖｒＤ変異  ｒｅｃＡ変異
（５４）ｒｅｃＪ変異  ｈｅｌＤ変異  ｒｅｃＡ変異
（５５）ｒｅｃＪ変異  ｕｖｒＤ変異  ｈｅｌＤ変異  ｒｅｃＡ変異
【００２２】
なお、「ｒｅｃＯ」、「ｒｅｃＲ」、「ｒｅｃＦ」、「ｕｖｒＤ」、「ｈｅｌＤ」の遺伝子表記は、通常、大腸菌におけるものであるが、大腸菌以外の生物種にもこれらの遺伝子のホモログが存在することが知られており、本発明の「ｒｅｃＯ」、「ｒｅｃＲ」、「ｒｅｃＦ」、「ｕｖｒＤ」または「ｈｅｌＤ」は、大腸菌の遺伝子に限定されず、他の生物種のホモログでもよい。
【００２３】
本発明の宿主細胞は、ｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異またはｈｅｌＤ変異を有するものであれば、その他の変異の有無について特に制限されないが、具体的には、Ｒ５９４株（Viology,27,p329(1965)）、Ｃ６００株（genetics,39,p.440(1954)）、ＮＭ５３８株（J.Mol.Biol.,170,p.827(1983)）にｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異またはｈｅｌＤ変異を導入したもの等を例示することができる。
【００２４】
本発明の細胞は、通常、任意の細胞へｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異またはｈｅｌＤ変異を導入することにより、作製することができる。
細胞へのｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異並びにｈｅｌＤ変異の導入は、例えば、Ｐ１トランスダクション法（別冊  蛋白質核酸酵素  細菌・ファージ遺伝実験法，p.71-72，共立出版株式会社(1972)）等の公知の方法により、当業者においては容易に実施することができる。
【００２５】
また、本発明のｒｅｃＯ変異、ｒｅｃＲ変異、ｒｅｃＦ変異、ｕｖｒＤ変異またはｈｅｌＤ変異は、該遺伝子によってコードされるタンパク質が発現しない（もしくは発現が低下している）、または活性を有さない（活性が低下している）ような変異であれば、特にその変異（アリル）の種類あるいは変異部位は制限されない。
【００２６】
本発明の外来ＤＮＡとしては、細胞において安定に保持あるいは効率的に増殖させたい所望のＤＮＡを用いることができ、また、本発明の外来ＤＮＡの長さには特に制限はない。
本発明の宿主細胞は、組換え頻度が顕著に低下していることから、従来の宿主細胞において保持または増殖させるのが困難であった長大な外来ＤＮＡであっても、安定に保持または効率的に増殖させることが可能である。
ただし外来ＤＮＡ配列上に反復配列を持つとＤＮＡの損傷が起こる可能性がある（Mol.  Gen. Genet(1988)214:1-5）ことから、該外来ＤＮＡは反復配列を含まないＤＮＡであることが好ましい。
【００２７】
また本発明の外来ＤＮＡは、通常、ベクターＤＮＡを指す。ベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクター、ファージベクターいずれでもよく、例えばプラスミドベクターとしてはｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ系プラスミド、ファージベクターとしては、ＥＢＭＬ系ファージ、λｇｔ系ファージなどが挙げられる。
なお、本発明の宿主−ベクター系は、Ｐ１ベクター、コスミドなどの長大な外来ＤＮＡを有するベクターの増殖に特に有効である。ベクターは、クローニングベクターでも発現ベクターでもよい。発現ベクターの場合、プロモーターの下流に構造遺伝子を接続すれば、宿主内で該構造遺伝子を発現させ、発現産物を取得することができる。
【００２８】
また本発明は、外来ＤＮＡが導入された本発明の宿主細胞を増殖させることを含む、外来ＤＮＡを宿主細胞において保持または増殖させる方法を提供する。
本方法の好ましい態様においては、まず、細胞において保持または増殖させたい所望の外来ＤＮＡを、本発明の細胞へ導入する。外来ＤＮＡの細胞への導入は、当業者においては公知の形質転換法によって行うことができる。外来ＤＮＡによって形質転換された細胞は、常法に従い培養することができる。
培地としては、細胞が増殖すれば、いずれのものでもよい。より具体的には、本発明の細胞として大腸菌を使用する場合、例えばＬ培地、ＬＢ培地、Ｍ９培地、ＳＯＢ培地等を好適に用いることができる。通常、培養は振盪条件下、温度２５℃〜４０℃、ｐＨ５〜９で行うのが望ましいが、この条件に特に制限されない。
【００２９】
培養した形質転換宿主からのベクターの回収は、常法に従って行うことができる。例えば、外来ＤＮＡがプラスミドベクターの場合は、アルカリ法、ボイリング法等によって行うことができ（Molecular Cloning  第2版，J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),1.21-1.52）、ファージベクターの場合は、例えばファージライセートからファージを回収することによって行うことができる（Molecular Cloning  第2版，J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),2.60-2.80）。
また、発現ベクターを保持する形質転換された大腸菌による構造遺伝子の発現と発現産物の回収は、当業者においては常法に従って行うことができる（Molecular Cloning  第2版，J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)第17章「Expression of Cloned Genes in Escherichia coli」）。
【００３０】
本発明の宿主細胞、あるいは本発明の方法を用いることにより、粘菌プラスミド等の従来の方法ではクローニングされにくい外来ＤＮＡが格納された宿主細胞の構築が可能となった。また、コスミドライブラリー等の長大な外来ＤＮＡが格納された宿主細胞の構築も可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
[実施例１]    変異株の作製
ｉ）ｒｅｃＯ変異株の作製
ｒｅｃＯ変異株の作製方法について示す。
まず、ｒｅｃＯ遺伝子の全長をプラスミドｐＳＪＳ８３８を鋳型としてＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＲＩとｓｔｙＩで消化したｐＵＣ１９プラスミドに組込んだ。ＤＮＡの配列を確認する為にシークエンスを行い、ｒｅｃＯ遺伝子である事を確認した後、ＥｃｏＲＩとＥｃｏＴ１４Ｉで消化した（これを１とする）。
次に、ｐＢＲ３２２プラスミドをＥｃｏＲＩとＥｃｏＴ１４Ｉで消化することで、テトラサイクリン耐性遺伝子を切り出し、それを１に組込むことでｒｅｃＯ遺伝子の中にテトラサイクリン耐性遺伝子を導入できるので、これによりｒｅｃＯ遺伝子の機能が欠失したプラスミドを作製した。
さらにこのｒｅｃＯ遺伝子の機能が欠失した領域を再度ｐＢＲ３２２プラスミドに導入し、この作製したプラスミドをｐｏｌＡ変異株（ｔｓ）に導入し、４２℃で一晩培養した。ｐｏｌＡ変異株は温度感受性の菌株で４２℃で機能が失活するが、ＰｏｌＡはｐＢＲ３２２プラスミドの保持に必要で、ｐｏｌＡ変異にする事でｐＢＲ３２２プラスミドの保持ができなくなるため、保持できなくなる前に相同組換えによってテトラサイクリン耐性遺伝子を導入したｒｅｃＯ欠失遺伝子を導入し、変異株を作製した。その際、培地にテトラサイクリンを添加し、形成したコロニーがアンピシリンに感受性である菌株を選別する。更にｒｅｃＯ変異株である事を確認する為に、フェノタイプとＰＣＲによる欠失を確認し、変異株を作製した。これにより、ｒｅｃＯ一重変異株を得た。また、同様の手法でｒｅｃＲ変異株、ｒｅｃＦ変異株、ｕｖｒＤ変異株、ｈｅｌＤ変異株を作製した。
【００３２】
ｉｉ）二重変異株及び三重変異株の作製
二重変異株及び三重変異株を作製する方法としては、上記で作製した一重変異株にＰ１トランスダクション法を用い変異を導入することによって作製した。
Ｐ１ファージは、大腸菌遺伝子の普遍形質導入を行うファージとして知られており、そのために大腸菌の遺伝分析を行う有用な手段の一つとしてよく使われている。また、Ｐ１ファージ粒子は１００ｋｂという大きなＤＮＡ断片を運ぶことが知られている。
ここで、Ｐ１トランスダクション法とは、目的とする遺伝子領域をファージにパッケージングさせ、目的とする菌株に感染させてＤＮＡを菌体内に注入し、相同組換えを介して目的とする遺伝子領域を移すことである。
但しこの方法で、二重変異株を作ろうとすると、変異株を作製する際に使用する耐性遺伝子として同じものを用いると抗生物質による選択ができない。
そのため、本発明に係る二重変異株を作製する場合には、それぞれ異なる耐性遺伝子を組み込んだ。また、三重変異株も同様に全て異なる耐性遺伝子を組み込んだ。
ただ例えばｒｅｃＯｒｅｃＦ変異株では、ｒｅｃＯ変異株はテトラサイクリン耐性遺伝子が挿入されているため、ｒｅｃＦ変異株でカナマイシン耐性遺伝子が挿入されている遺伝子領域を保持したＰ１ファージを作製した。
次にＰ１ファージをｒｅｃＯ変異株に感染させ、テトラサイクリン及びカナマイシン耐性菌を分取した。その後実際にｒｅｃＦ変異株が作製されたかを確認する為に、フェノタイプとＰＣＲを用いた欠失の確認を行い、ｒｅｃＯ及びｒｅｃＦの二重変異株を作製した。なお、他の二重変異株及び三重変異株の作製についても同様の手法により作製した。
【００３３】
ｉｉｉ）λ  Ｓｐｉ−  Ａｓｓａｙの説明
ここで、以下の実施例で用いる検出系について、λ  Ｓｐｉ−  Ａｓｓａｙの説明を行う。
溶原化したλファージが誘発される際、通常はプロファージ両端に位置するａｔｔ部位同士の部位特異的組換えによってファージＤＮＡの切り出しが起こる。しかし低頻度で、ａｔｔ部位以外の部位での非相同組換えによるλファージＤＮＡの切り出しも起こる。その結果、プロファージ座近傍の大腸菌のｇａｌ遺伝子又はｂｉｏ遺伝子をゲノム内に取り込んだ、形質導入ファージλｇａｌ又はλｂｉｏが形成される。
λファージはＰ２ファージ溶原菌を宿主として増殖できない。この性質は「Ｓｐｉ−」（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｐ２  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）といわれる。しかし例外的にλ  ｒｅｄ−γ−はＰ２ファージ溶原菌を宿主として増殖できる（λ  Ｓｐｉ−）。
本発明者らは、λファージが溶原化した野生株を様々な条件で誘導して得たλＳｐｉ−のゲノム構造をＰＣＲ法によって調べたところ、８４株中８２株がｂｉｏ遺伝子をゲノム内に取り込んでいることを見出した。
そこで、本実施例では、λｂｉｏの形成頻度を調べる代わりに、λ  Ｓｐｉ−の形成頻度を調べ、非相同組換え頻度の指標とした。
このλ  Ｓｐｉ−の検出による非相同組換え頻度の測定方法は、ノイズが極めて少ない、信頼性の高い方法である。
【００３４】
[実施例２]    自然条件下及びＵＶ照射による非相同組換えの誘発
上記した非相同組換え頻度の測定方法により測定するために必要な、全ファージ数を以下の手順で測定する。
溶原菌をλＹＰ培地（１リットル中バクトトリプトン（BactoTM Tryptone, BECTON DICKINSON社））１０ｇ、ＮａＣｌ（Wako） ２．５ｇ、イースト・エキストラクト（Bacto Yeast extract, BECTON DICKINSON社）１ｇ、寒天（Iwaki Chemicals社）１２ｇを滅菌し、１Ｍ  ＭｇＳＯ４（Wako）１．５ｍｌとＭ９Ａ液１０ｍｌを加える）中で一晩培養した。
培養液１／１００容をλＹＰ培地中３０℃で菌数が約１．５×１０８／ｍｌになるまで成育させ、この培養液２ｍｌをプレート（直径８．５ｃｍ）中に分注して、攪拌しながら紫外線を０．５５ｍＷ／ｃｍ２の強度で１０秒照射した。培養液を回収し、４２℃で１５分間振盪し、その後３７℃で２時間振盪培養し溶菌させた。
溶菌液に数滴のＣＨＣｌ３を加え、さらに１０分間振盪した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を得た。
このファージ液をＭ９培地で希釈し、指示菌（Ｙｍｅｌ）一晩培養液０．１ｍｌ、λトップ培地（１リットル中バクトトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、寒天５ｇ）にまき、一晩培養し、プラークを形成させ、全ファージ数を測定した。その結果を表１〜表３に示す。
【００３５】
【表１】
2004254691.tif 000002
【００３６】
【表２】
2004254691.tif 000003
【００３７】
【表３】
2004254691.tif 000004
【００３８】
[実施例３]    λ  Ｓｐｉ−ファージ数の測定
実施例２に示した非相同組換え頻度の測定方法により測定するために、必要なλ  Ｓｐｉ−ファージ数を以下の手順で測定した。
１プレート当り２．５×１０７個のファージを、指示菌（WL95（P2）：metB supE supF hsdRK tonA trpR（P2））一晩培養液０．１ｍｌ、λＴトップ培地２．５ｍｌとともにλトリプティケースプレート（１Ｌ中ＢＢＬトリプティケースペプトン（BBL Trypticase Peptone,BECTON DICKINSON社）１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、寒天１２ｇ）にまき、一晩培養し、プラークを形成させ、λ  Ｓｐｉ−ファージ数を測定した。
その結果を表４〜表６に示す。
【００３９】
【表４】
2004254691.tif 000005
【００４０】
【表５】
2004254691.tif 000006
【００４１】
【表６】
2004254691.tif 000007
【００４２】
[実施例４]    λ  Ｓｐｉ−ファージ形成頻度の測定
以下、λ  Ｓｐｉ−ファージ形成頻度の測定方法を以下に説明する。
培養液０．１ｍｌ中の全ファージ数（実施例２で測定した値）に対する、培養液０．１ｍｌ中のλ  Ｓｐｉ−ファージ数（実施例３で測定した値）を計測し、λ  Ｓｐｉ−ファージの形成頻度（非相同組換えの頻度）とした。具体的には、以下の計算式を用いて組換え頻度を計算した。
その結果を表７〜表９に示す。
（組換え頻度）=（Ｓｐｉ−ファージ）×(試験した時に用いたプレートの枚数)÷(２．５×１０１０（／ｍｌ）)
【００４３】
【表７】
2004254691.tif 000008
【００４４】
【表８】
2004254691.tif 000009
【００４５】
【表９】
2004254691.tif 000010
【００４６】
なお、表８に示したｕｖｒＤ変異株は紫外線感受性が高いため、紫外線照射の強度を表７及び表９の１０分の１の強度としている。
【００４７】
<実施例１〜４の考察>    自然状態ならびに紫外線照射条件下におけるＲｅｃＥタンパク質が発現する野生株または変異株におけるλ  Ｓｐｉ−ファージの形成頻度の比較
実施例４では、実施例２及び実施例３で測定した値を用いて、λ  Ｓｐｉ−ファージの形成頻度を測定した。その平均を以下の表１０〜１２に示す。
これらの結果から、野生株、ｒｅｃＯ変異株、ｒｅｃＲ変異株、ｒｅｃＦ変異株、ｕｖｒＤ変異株及びｈｅｌＤ変異株のλ  Ｓｐｉ−ファージの平均形成頻度を求め、野生株を１とした時のλ  Ｓｐｉ−ファージの形成頻度の比率を表１０〜表１２に示す。
表１０は、ｒｅｃＦ変異株、ｒｅｃＯ変異株、ｒｅｃＲ変異株の組換え頻度に関する結果をまとめたものである。（ａ）については自然条件下における野生株との比較であり、（ｂ）については紫外線照射時における野生株との比較である。
また、表１１は、ｕｖｒＤ変異株の組換え頻度に関する結果をまとめたものであり、（ａ）については自然条件下における野生株との比較であり、（ｂ）については紫外線照射時における野生株との比較である。
表１２はｈｅｌＤ変異株の組換え頻度に関する結果をまとめたものであり、（ａ）については自然条件下における野生株との比較であり、（ｂ）については紫外線照射時における野生株との比較である。
【００４８】
【表１０】
2004254691.tif 000011
【００４９】
【表１１】
2004254691.tif 000012
【００５０】
【表１２】
2004254691.tif 000013
【００５１】
表１０〜表１２に示すように、野生株に比べて、ｒｅｃＯ変異株は、自然条件下においては約７倍、また紫外線照射下では約１０倍頻度が低下し、ｒｅｃＲ変異株、ｒｅｃＦ変異株、ｕｖｒＤ変異株またはｈｅｌＤ変異株においても同様に良好な結果を得た。
このことから、野生株に比べて、ｒｅｃＯ変異株、ｒｅｃＲ変異株、ｒｅｃＦ変異株、ｕｖｒＤ変異株並びにｈｅｌＤ変異株においては、非相同組換えの頻度が低下することが判明した。
これにより、外来ＤＮＡの一つであるファージが自然条件下及び紫外線照射時において安定にＤＮＡを保持されていることが示された。
【００５２】
[実施例５]    野生株または変異株における大腸菌の増殖速度の測定
野生株及び各種変異株の大腸菌の増殖速度を下記の手順で測定するλＹＰ培地中でＲ５９４株（Biology,27,p.329(1965)）の野生株、Ｒ５９４株のｒｅｃＯ変異株、Ｒ５９４株のｒｅｃＲ変異株、Ｒ５９４株のｒｅｃＦ変異株、ＡＢ１１５７株のｕｖｒＤ変異株、ＡＢ１１５７株のｈｅｌＤ変異株を、３７℃で培養した。
遺伝子の変異を導入すると、大腸菌の増殖速度に影響を与える場合がある。そこで、対数増殖期において菌数が２倍になるときに必要な時間（doubling time）を測定した結果を表１３に示す。
【００５３】
【表１３】
2004254691.tif 000014
【００５４】
表１３に示すように、遺伝子の変異を導入したｒｅｃＯ変異株、ｒｅｃＲ変異株、ｒｅｃＦ変異株、ｕｖｒＤ変異株またはｈｅｌＤ変異株と、野生株との増殖速度に顕著な差異は見られなかった。
他の変異株として、例えば、ＤＮＡの複製や修復に作用することで知られるH-NS、HU及びIHFが変異した変異株などでは増殖速度が低下する（Kayoko Yasuzawa 著「Gene」 Vol.122, 1992, p9〜15）が、本発明で使用した変異株は野生株の増殖速度と同程度の増殖速度であるため、他の変異株と比較して増殖が良好に行われることが示された。
【００５５】
[実施例６]    野生株または変異株における外来ＤＮＡの保持の測定
野生株または変異株が外来ＤＮＡを保持した比率を下記の手順で測定した。
ビタミンＢ１含有のλ軟寒天培地に外来ＤＮＡの一つｐＢＲ３２２を保持した野生株、ｒｅｃＯ変異株並びｒｅｃＲ変異株、ｒｅｃＡ変異株であるＤＨ５αを植菌し、一年間室温にて保管した。
一年後、各寒天培地に１ｍｌλ培地を加え、懸濁した後、λ軟寒天培地とアンピシリン含有λ軟寒天培地にそれぞれ塗布し、３７℃で培養した。形成したコロニー数の測定を行い、プラスミドを保持している菌株と保持していない菌株との比率を示した結果を表１４に示す。
【００５６】
【表１４】
2004254691.tif 000015
【００５７】
表１４に示す通り、ｒｅｃＯ変異株、ｒｅｃＲ変異株は、野生株やＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ）より、約２倍プラスミド保持比率が高かった。以上の結果より、ｒｅｃＯ変異株、ｒｅｃＲ変異株では、野生株やＤＨ５αに比べて外来ＤＮＡを安定に保持すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明のＲｅｃＯ、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＦ、ＵｖｒＤ並びにＨｅｌＤタンパク質が非相同組換えの発生に係わるメカニズムを説明する模式図である。
【図１】
2004254691.tif 000016