(57)【要約】【課題】ＴＮＦやＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生抑制作用を有する、経口摂取可能なペプチドを提供することを課題とする。また炎症反応を緩和する作用を併せもたせた経口・経腸栄養剤の製造に使用する該ペプチドを提供する。【解決手段】β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）およびウシラクトフェリン（Ｌｆ）のプロテアーゼ加水分解物の限外（ＵＦ）濾過の透過物が、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α産生あるいはＩＬ−６産生を抑制する作用を有することを見出した。さらにその透過物から該活性を有するペプチドを同定し、単離・精製することができた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カゼイン、カゼイネート、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ウシラクトフェリンおよびトータルミルクプロテイン（ＴＭＰ）からなる群より選ばれる乳タンパク質の酵素加水分解物の、５，０００〜１００，０００ダルトンのカットオフ値を有する限外濾過膜（ＵＦ）パーミエイトとして得られるＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６抑制作用を有する加水分解物。
【請求項２】
β−ラクトグロブリンのトリプシン加水分解物で、カットオフ値が１０，０００である請求項１記載の加水分解物。
【請求項３】
溶出パターンが図４に示す逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムで示される請求項２記載の加水分解物。
【請求項４】
ＡＬＰＭＨ、ＡＬＰＭＨＩＲおよびＦＫＩＤＡＬＮＥからなる群より選ばれる少なくとも１つ若しくは２つ以上のペプチドを含む請求項２記載の加水分解物。
【請求項５】
α−ラクトアルブミンのトリプシン加水分解物で、カットオフ値が１０，０００である請求項１記載の加水分解物。
【請求項６】
溶出パターンが図６に示す逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムで示される請求項５記載の加水分解物。
【請求項７】
ＷＬＡＨＫ、ＬＡＨＫＡＬおよびＬＤＱＷＬＣ（−ＣＥＶＦＲ）ＥＫからなる群より選ばれる少なくとも１つ若しくは２つ以上のペプチドを含む請求項５記載の加水分解物。
【請求項８】
ウシラクトフェリンのトリプシン加水分解物で、カットオフ値が１０，０００である請求項１記載の加水分解物。
【請求項９】
溶出パターンが図１１に示す逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムで示される請求項８記載の加水分解物。
【請求項１０】
ＷＱＷＲ、ＥＤＬＩＷＫ、ＥＴＡＥＥＶＫおよびＬＧＡＰＳＩＴＣ（−ＣＲ）ＶＲからなる群より選ばれる少なくとも１つ若しくは２つ以上のペプチドを含む請求項８記載の加水分解物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の加水分解物の有効量を含有する、生体侵襲時の栄養管理のための経口・経腸栄養剤。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の加水分解物の有効量を含有する、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の症状を緩和する作用を有する、経口・経腸栄養剤。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の加水分解物の有効量を含有する、炎症反応を緩和する作用を有する保健機能食品。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の加水分解物の有効量を含有する、炎症反応を緩和する作用を有するサプリメント。
【請求項１５】
請求項１１記載の経口・経腸栄養剤を製造するための請求項１〜８のいずれか１項記載の加水分解物の使用。
【請求項１６】
請求項１２記載の経口・経腸栄養剤を製造するための請求項１〜８のいずれか１項記載の加水分解物の使用。
【請求項１７】
請求項１３記載の保健機能食品を製造するための請求項１〜８のいずれか１項記載の加水分解物の使用。
【請求項１８】
請求項１４記載のサプリメントを製造するための請求項１〜８のいずれか１項記載の加水分解物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体侵襲時におけるＴＮＦやＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生に刺激を加えることなく抑制しかつ、免疫能を賦活化する作用を有する乳タンパク質の酵素加水分解物に関する。
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体侵襲時の経口免疫栄養療法に有用なペプチドに関する。すなわち、生体侵襲時の栄養療法において、ＴＮＦやＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生に刺激を加えることなく、それを抑制しつつ、免疫能を賦活化する作用を有するペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
全身性炎症反応症候群（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＳＩＲＳ）は、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）を定義するために提唱された概念で、侵襲（外傷、熱傷、急性炎症あるいは癌手術など）によって炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦなど）が過剰に誘導され、全身的な炎症反応が惹起された状態を指している。一方、炎症性サイトカインが誘導されると同時に、ＳＩＲＳに対するホメオスタシス反応として抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０）が誘導されることが知られている。この抗炎症性サイトカインが過剰に誘導された病態をｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＣＡＲＳ）とよんでいる。この２つの病態にかかわる背景因子としてのサイトカインについては、程度の差こそあれ相互に調節する関係にあり、潜在的につねに同時に存在する病態ともいえ、ＳＩＲＳ／ＣＡＲＳのバランスという考え方から侵襲時の生体反応の把握が試みられている。ＳＩＲＳ優位の状態では過度の炎症反応、ＣＡＲＳ優位の状態では感染の遷延・重症化から臓器障害へと進展していくと考えられている。
【０００３】
侵襲時の栄養管理はたんなる炎症反応の抑制だけではなく患者の免疫能を亢進させるような栄養管理法が推奨される。侵襲を受けた患者がその後の感染を伴うと、しばしば不幸な転帰をたどる症例が少なくなく、とくにＣＡＲＳ優位になっている病態では感染防止が最優先されるべき対応項目となる。そこで経腸栄養によるＳＩＲＳ、ＣＡＲＳの制御は重要である。サイトカインによる侵襲時の代謝異常や臓器障害を防止するには、局所のサイトカインは正常に産生させるが、全身へのこの波及を防止する方法が合理的と考えられる。
【０００４】
ラットを同一組成の輸液で経静脈栄養あるいは経腸栄養で管理後、腹腔滲出細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＰＳ刺激下に培養すると、経腸栄養群は経静脈栄養群に比べＴＮＦ−αの産生能が高く、それに関連して腹腔内Ｅ．  ｃｏｌｉ投与後の腹腔内細菌数は少なかった（（例えば、非特許文献１参照）。また、細菌投与後の血中ＴＮＦ−α濃度は経腸栄養群で経静脈栄養群に比べ優位に低かった。すなわち、経腸的な栄養投与は感染局所の生体防御に必要な腹腔滲出細胞の炎症性サイトカインＴＮＦ−α産生能を維持し局所の免疫能を保つ一方で、全身の過剰な炎症反応を抑制する。このような経腸栄養は、例えば、生体侵襲時（手術、外傷、熱傷、感染症、急性膵炎、肝不全、腹膜炎、または悪性腫瘍）のＳＩＲＳ、ＣＡＲＳの発生の制御にも有用と考えられる。
【０００５】
局所のサイトカインは正常に産生させるが、全身へのこの波及を防止する方法としては、経腸栄養、あるいはｎ−３系多価不飽和脂肪酸（Ｎ３ＰＵＦＡ）の投与が考えられる。Ｎ３ＰＵＦＡの侵襲下投与による侵襲反応に対する効果について、ラット熱傷モデルを用いて基礎的に、また高度侵襲手術のひとつである食道癌手術症例により臨床的に検討された。その結果、Ｎ３ＰＵＦＡを投与することで侵襲下の炎症反応の軽減化、細胞性免疫機能低下の防止作用が認められ、Ｎ３ＰＵＦＡ投与の有効性が示された（例えば、非特許文献２参照）。
さて、乳タンパクはその栄養的価値に加えて生物学的に活性のペプチドの源である。
乳タンパク質由来の生物活性ペプチドについては、吉川（例えば、非特許文献３参照）や大谷（例えば、非特許文献４参照）によって包括的にまとめられており、また免疫調節作用については大谷（例えば、非特許文献５，６参照）による報告がある。
【０００６】
Ｍ．  Ｚｉｍｅｃｋｉらは、ウシラクトフェリン（ＢＬＦＴ）含有カプセルを１０日間健常人に経口摂取させ、いくつかの免疫パラメータをモニターした。その結果、血清中のＴＮＦ−αのレベルはモニター期間中低下傾向を示したが、ＩＬ−６は変化がなかった（例えば、非特許文献７参照）。また、ウシカゼイン由来のペプチド、ＬＬＹ、ＰＧＰＩＰＮおよびＴＴＭＰＬＷがＬＰＳ刺激ネズミマクロファージによるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６産生を増強したとの報告がある（例えば、非特許文献８参照）。栗岩はラクトフェリン由来のＮ末端領域から２５アミノ酸残基からなるペプチドがエンドトキシン誘導性炎症を抑止することを開示している（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｌｉｎ，  ＭＴ  ｅｔ．ａｌ．「Ｒｏｕｔｅ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｌｏｃａｌ，  ｓｙｓｔｅｍｉｃ，  ａｎｄ  ｒｅｍｏｔｅ  ｏｒｇａｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．」Ａｎｎ．
Ｓｕｒｇ、Ｖｏｌ  ２２３、１９９６年、ｐ．８４−９３
【０００８】
【非特許文献２】
稲葉毅「経静脈栄養下における成長因子療法の可能性」医学のあゆみ、Ｖｏｌ  １９８、Ｎｏ．  １３、２００１年、ｐ．１０４１
【０００９】
【非特許文献３】
吉川正明など「ミルクの先端機能」弘学出版、吉川正明ら編、１９９８、ｐ．１８８
【００１０】
【非特許文献４】
大谷元など「ミルクの先端機能」弘学出版、吉川正明ら編、１９９８、ｐ．９７
【００１１】
【非特許文献５】
大谷元「牛乳カゼイン由来ペプチドの栄養生理機能」Ｍｉｌｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ  ４７、Ｎｏ．  ３、１９９８年、ｐ．１８３−１９３
【００１２】
【非特許文献６】
大谷元「牛乳カゼインの消化により生成するペプチドの免疫調節機能」Ｍｉｌｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ  ５０、Ｎｏ．  ３、２００１年、ｐ．１３９−１４４
【００１３】
【非特許文献７】
Ｚｉｍｅｃｋｉ，  Ｍ  ｅｔ．  ａｌ．「Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ｔａｋｅｎ  ｏｒａｌｌｙ  ｂｙ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ」Ａｒｃｈ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  Ｅｘｐ．、Ｖｏｌ  ４６、１９９８年、ｐ．２３１−２４０
【００１４】
【非特許文献８】
Ｚｉａｏ，  Ｃ．  ｅｔ．  ａｌ．「Ｂｏｖｉｎｅ  ｃａｓｅｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｎａｉｖｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｒｅｌｅａｓｅ」Ｊ．  Ｓｃｉ．  Ｆｏｏｄ．  Ａｇｒｉｃ．、Ｖｏｌ  ８１、２０００年、ｐ．３００−３０４
【００１５】
【特許文献１】
特開平８−１６５２４８
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＴＮＦやＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生に刺激を加えることなく、それを抑制しつつ、免疫能を賦活化する作用を有する、経口摂取可能なペプチドを提供することを課題とする。また本発明は、生体侵襲に伴うＳＩＲＳにおける炎症緩和および栄養治療に有用である。該ペプチドを提供する。さらにまた、本発明は、栄養補給や健康維持などに有用な保健機能食品（特定保健用食品および栄養機能食品）の製造に使用する該ペプチドを提供する。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
１９７９年、Ｂｒａｎｔｌらにより、牛乳カゼインからオピオイドペプチド（β−ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）が単離されて以来、数多くの生理活性ペプチドがカゼインおよびホエイタンパク質の酵素消化物から得られた。そこで、当初は、これらの生理活性ペプチドはすべて合目的性をもって存在することが期待された。しかし、同様な生理活性ペプチドが動物のみならず植物からも派生し、ある確率のもとに生理活性ペプチドが存在することが分かっている今日では、乳タンパク質から派生する生理活性ペプチドがすべて生物学的合目的性をもって存在するとは断定できない。いずれにせよ、他の起源のものに較べて、乳タンパク質から派生する生理活性ペプチドには生物学的合目的性が存在する確率ははるかに大きいことは事実である〔吉川正明：  ミルクの先端機能、吉川正明ら編、ｐ．  １８８、弘学出版（１９９８）〕。
一方、経腸栄養によって炎症局所や全身、あるいは遠隔臓器である肺のサイトカイン産生が修飾されること、またサイトカインの種類によってその修飾のされかたが異なることが明らかにされている（Ｆｏｎｇ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．，  ２１０：  ４４９−４５７，  １９８９；  Ｌｉｎ，  Ｍ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．，  ２２３：  ８４−９３，  １９９６  ）。
【００１８】
そこで、本発明者らは侵襲時の炎症性サイトカイン過剰産生を抑制し、経口・経腸栄養剤に配合可能な食品素材を得るために、ＴＮＦ−α産生抑制活性を指標に、乳タンパク質の加水分解物の活性ペプチドをスクリーニングした。
本発明者らは、ホエイタンパク質単離物（Ｗｈｅｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｅ：ＷＰＩ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）およびウシラクトフェリン（Ｌｆ）のプロテアーゼ加水分解物の限外（ＵＦ）濾過の透過物（パーミエイト）が、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α産生あるいはＩＬ−６産生を抑制する作用を有することを見出した。さらに、これらのパーミエイトを逆相ＨＰＬＣで分画して、分子量約２，０００ダルトン以下の画分に、ＴＮＦ−α産生あるいはＩＬ−６産生抑制活性を有するいくつかのピークが存在し、これらの活性ピークからペプチドを単離、精製しアミノ酸配列を決定した。そして、これらの配列を基に、対応するペプチドを合成し、ＴＮＦ−α産生抑制活性を調べた結果、同じような活性を有することを確認することができた。さらに、β−Ｌｇ分子上で隣接する、あるいは数個のアミノ酸がオーバーラップする領域から新たなペプチドを合成し、ＴＮＦ−α産生抑制活性を有するいくつかのペプチドを得ることができた。
【００１９】
すなわち、本発明は、
（１）  カゼイン、カゼイネート、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ウシラクトフェリンおよびトータルミルクプロテイン（ＴＭＰ）からなる群より選ばれる乳タンパク質の酵素加水分解物の、５，０００〜１００，０００ダルトンのカットオフ値を有する限外濾過膜（ＵＦ）パーミエイトとして得られうるＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６抑制作用を有する加水分解物、
（２）  β−ラクトグロブリンのトリプシン加水分解物で、カットオフ値が１０，０００である（１）の加水分解物、
（３）  溶出パターンが図４に示す逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムで示される（２）の加水分解物、
（４）  ＡＬＰＭＨ、ＡＬＰＭＨＩＲおよびＦＫＩＤＡＬＮＥからなる群より選ばれる少なくとも１つ若しくは２つ以上のペプチドを含む（２）の加水分解物、
（５）  α−ラクトアルブミンのトリプシン加水分解物で、カットオフ値が１０，０００である（１）の加水分解物、
（６）  溶出パターンが図６に示す逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムで示される（５）の加水分解物、
（７）  ＷＬＡＨＫ、ＬＡＨＫＡＬおよびＬＤＱＷＬＣ（−ＣＥＶＦＲ）ＥＫからなる群より選ばれる少なくとも１つ若しくは２つ以上のペプチドを含む（５）の加水分解物、
（８）  ウシラクトフェリンのトリプシン加水分解物で、カットオフ値が１０，０００である（１）の加水分解物、
（９）  溶出パターンが図１１に示す逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムで示される（８）の加水分解物、
（１０）  ＷＱＷＲ、ＥＤＬＩＷＫ、ＥＴＡＥＥＶＫおよびＬＧＡＰＳＩＴＣ（−ＣＲ）ＶＲからなる群より選ばれる少なくとも１つ若しくは２つ以上のペプチドを含む（８）の加水分解物、
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１つの加水分解物の有効量を含有する、生体侵襲時の栄養管理のための経口・経腸栄養剤、
（１２）（１）〜（１０）のいずれか１つの加水分解物の有効量を含有する、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の症状を緩和する作用を有する、経口・経腸栄養剤、
（１３）（１）〜（１０）のいずれか１つの加水分解物の有効量を含有する、炎症反応を緩和する作用を有する保健機能食品、
（１４）  （１）〜（１０）のいずれか１つの加水分解物の有効量を含有する、炎症反応を緩和する作用を有するサプリメント、
（１５）  （１１）の経口・経腸栄養剤を製造するための（１）〜（８）のいずれか１項記載の加水分解物の使用、
（１６）（１２）の経口・経腸栄養剤を製造するための（１）〜（８）のいずれか１項記載の加水分解物の使用、
（１７）（１３）の保健機能食品を製造するための（１）〜（８）のいずれか１項記載の加水分解物の使用、
（１８）（１４）のサプリメントを製造するための（１）〜（８）のいずれか１項記載の加水分解物の使用、
からなる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
出発物質として、乳タンパク質は後述する理由により最適である。トウモロコシや大豆タンパク質も候補であるが、乳タンパク質ほど有利ではない。乳タンパク質はウシ由来のカゼインおよびホエイタンパク質である。とくにタンパク質含量が９０％以上のホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、カゼイネート、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンおよびラクトフェリンなどの分画物は、活性物質の純度の観点から有利である。他に、タンパク質含量が８０％以上のホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、カゼイン、トータルミルクプロテイン（ＴＭＰ）、あるいは還元乳なども有利な原料の候補としてあげられる。またこの他に乳タンパク質を含む一般的原料として、脱脂粉乳、ホエイ粉、脱塩ホエイ粉、脱乳糖ホエイ粉、クリーム、バターミルク、バターゼラム、ミネラル濃縮ホエイなどがあげられる。
【００２１】
ＷＰＩからβ−Ｌｇやα−Ｌａの分画する方法については多くの報告〔たとえば、桑田有：月刊フードケミカル，  ２月号，  ６８  （１９９１）；  米国特許  ５，４２０，２４９等  〕がある。また市販品を利用することもできる。
トータルミルクプロテイン（ＴＭＰ）は、脱脂粉乳から乳糖とミネラルを除いたもので、タンパク成分として、カゼインおよびホエイの両成分を含む。一般に製法には沈澱法と膜処理法がある。しかし、沈澱法で製造したもののみをＴＭＰ、または共沈殿物（ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）とよび、ＵＦ膜処理で製造したものをミルクプロテインコンセントレート（ＭＰＣ）として区別する場合もある。
加水分解物のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６産生抑制活性は、加水分解率（Ｄｅｇｒｅｅｏｆ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ：ＤＨ）に依存すると考えられる。以下に、タンパク質の加水分解に関するさまざまな公知技術（関連する文献、特許等）をあげる。当業者であれば、これらの公知技術単独であるいは組み合わせて用いることにより、乳タンパク質から本願発明のペプチドをスクリーニングすることができる。
【００２２】
食品グレードのタンパク質加水分解酵素（プロテアーゼ）は、エンド型およびエキソ型プロテアーゼを含む。基本となる酵素はエンド型の活性が高いプロテアーゼから選択される場合が多い。エンド型プロテアーゼは、例えば、ＡｌｃａｌａｓｅＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来）、エスペラーゼ（Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ由来）、ＮｅｕｔｒａｓｅＲ（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）、プロタメックス（バクテリア由来）、ＰＴＮ６．０Ｓ（ブタ膵臓トリプシン）など、エキソ型ペプチダーゼ／エンド型プロテアーゼ複合酵素としては、例えばフレーバーザイム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来）などがあげられる（以上ノボ社）。他に、エンド型プロテアーゼとして、例えば、キモトリプシン（ノボ社、ベーリンガー社）、プロテアーゼＮアマノ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来、天野製薬）、ビオプラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来、ナガセ産業）、パパインＷ−４０（天野製薬）、エクソ型プロテアーゼとして、豚あるいはウシ内臓由来のカルボキシペプチダーゼなどがあげられる。これらの酵素は限定的なものを意味しない。
抗原性を低下させたアレルギー対応の乳タンパク質の酵素分解には、特異性が比較的高い動物由来のトリプシンやキモトリプシン、植物由来のパパインやブロメラインに加えて、乳タンパク質を非特異的に低分子化できる微生物由来のズブチリシン系の酵素などが用いられている。植物起源のパパイン、バクテリアや菌類由来のプロテアーゼを用いた研究報告（Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ４８：  ６８−７１，  １９９４；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ７：  １２０−１２５，  １９９６；Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  ｐｐ．  ４４３−４７２，  １９９７）もある。加水分解は、これらの基本となる酵素を単独で、あるいは複数組み合わせて行われる。
ホエイタンパク質の加水分解についてのまとめた報告（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ７：  ３０７−３１９，  １９９８）を以下にあげる。
【００２３】
ホエイタンパク質を加水分解する酵素活性は大きく変動する。ペプシンはα−Ｌａおよび変性したα−Ｌａを分解するが、ｎａｔｉｖｅなβ−Ｌｇを分解しない（Ｎｅｔｈ．  Ｍｉｌｋ  ｄａｉｒｙ  Ｊ．，  ４７：  １５−２２，  １９９３）。トリプシンはα−Ｌａをゆっくり加水分解するがβ−Ｌｇはほとんど未分解のままである（Ｎｅｔｈ．  Ｍｉｌｋ  ｄａｉｒｙ  Ｊ．，  ４５：  ２２５−２４０，  １９９１）。キモトリプシンはα−Ｌａを速く分解するが、β−Ｌｇはゆっくり分解される。パパインはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびβ−Ｌｇを加水分解したが、α−Ｌａは抵抗性があった（Ｉｎｔ．  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：  １３−３１，  １９９６ａ）。しかしながら、Ｃａを結合していないα−Ｌａは酸性のｐＨでパパインにより完全に分解された（Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，  ７６：  ３１１−３２０，  １９９３）。乳タンパク質の酵素分解をコントロールして該タンパク質を修飾することにより、広範囲のｐＨおよびプロセッシング条件にわたって、該タンパク質の機能的特性を変更することができる（Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ’ｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｐｐ．  ３９３−４２３，  １９９７  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９７  ；Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ４８：  ６８−７１，  １９９４）。ペプチド結合の加水分解は、荷電基の数および疎水性の増加、低分子量化、および分子の立体配置の修飾をもたらす（Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，  ７６：  ３１１−３２０，  １９９３）。機能的特性の変化は大きく加水分解度に依存する。ホエイタンパク質の機能性に共通してみられる最も大きな変化は溶解性の増加と粘度の低下である。加水分解度が高い場合、しばしば、加水分解物は加熱しても沈澱せず、ｐＨ  ３．５〜４．０で溶解性が高い。加水分解物は、また、ｉｎｔａｃｔなタンパク質よりもはるかに粘度が低い。この差異はとくにタンパク濃度が高い場合に顕著である。その他の影響は、ゲル特性の変化、熱安定性を高める、乳化および起泡性の増強、乳化および泡の安定性の低下である（Ｉｎｔ．  Ｄａｉｒｙ  ｊｏｕｒｎａｌ，  ６：  １３−３１，  １９９６ａ；Ｄａｉｒｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４，ｐｐ．  ３４７−３７６，  １９８９；Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，  ７９：  ７８２−７９０，  １９９６）。
【００２４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の測定から推定される、アンギオテンシン変換酵素Ｉ（ＡＣＥ）阻害活性の可能性のある数多くのペプチドに関する報告がある（例えば、Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．，  ６７：  ５３−６４，  ２０００；Ｂｒ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．，  ８４：  Ｓ３３−Ｓ３７，  ２０００）。加水分解物から、さまざまなクロマトグラフィー技術を用いて、ＡＣＥ阻害ペプチドを精製および同定する研究報告がなされている（例えば、Ｍａｒｕｙａｍａ，  Ｓ．，  ＆  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｈ．：  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４６：  １３９３−１３９４，  １９８２；Ｍｉｙｏｓｈｉ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ａｇｒｉ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５：  １３１３−１３１８，  １９９１；Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ８：  １７２−１７８，  １９９９；Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５７：  ９２２−９２５，  １９９３）。これらの報告から、ＡＣＥ阻害活性は、さまざまな分離原理に基づくカラム操作で得られた数多くのフラクションに存在していると考えられ、これはＡＣＥ阻害物質の分子特性がかなり多様であることを示している。ＡＣＥ阻害が、さまざまなタンパク質、プロテアーゼおよび加水分解条件で産生される加水分解物中に見出されるという事実は、多様なアミノ酸配列をもったさまざまなペプチドもまた、ＡＣＥ阻害活性を有する可能性を示唆している。このようなペプチドの化学的多様性のために、加水分解物のクロマトグラフィーによる精製は、部分的な活性ペプチドの損失を常に伴うこととなろう。加水分解中、ＡＣＥ阻害活性は連続的に形成され一方で分解される。加水分解物の最大活性はこれら２つのプロセスの最適化の結果である。加水分解物の全体的なペプチド組成は、ＡＣＥ阻害活性を決定し、それは加水分解酵素の特異性およびプロセス条件に依存する。
【００２５】
そこで、必要とする加水分解を最小限にとどめ、ＡＣＥ阻害活性を最大化すべく、ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｅｔｈｏｄｌｏｇｙを用いたホエイタンパク質加水分解の最適化についての報告（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２：  ８１３−８２０，  ２００２）がなされている。
【００２６】
ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドをに関する文献を参照すると、最も短い鎖長のペプチドはＩＰＰおよびＶＰＰ〔吉川正明：  ミルクの先端機能、吉川正明ら編、ｐ．  １８８、弘学出版（１９９８）〕である。
また、α−Ｌａおよびβ−Ｌｇを、ペプシンまたはトリプシン単独で、あるいはペプシンとトリプシン、ペプシン、トリプシンおよびキモトリプシンとを組み合わせで得られた加水分解物（ｄｉｇｅｓｔｓ）、さらに、この加水分解物を２段階のＵＦ濾過（カットオフ値３０ｋＤａ→１  ｋＤａ）で処理した後のそれぞれの保持物（Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）および透過物（Ｐｅｒｍｅａｔｅ）のＡＣＥ阻害活性を測定している（Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．，  ６７：  ５３−６４，  ２０００  ）。それによると、α−Ｌａおよびβ−ＬｇのＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０）は、ともにトリプシン加水分解物（３  ｈ）の＜１  ｋＤａのフラクションが最も高い値（α−Ｌａ：ＩＣ５０＝１０９μｇ／ｍＬ、β−Ｌｇ＝２３７μｇ／ｍＬ）を示している。このときα−ＬａのＤＨは６．２  ％で、分子量分布は、＞５  ｋＤａ：５２  ％、２−５ｋＤａ：１５  ％、１−２ｋＤａ：２０  ％、＜１  ｋＤａ：１３  ％であり、β−ＬｇのＤＨは６．７  ％で、分子量の分布は、＞５  ｋＤａ：２３  ％、２−５ｋＤａ：２７  ％、１−２ｋＤａ：２８  ％、＜１  ｋＤａ：２４  ％である。
また、牛乳カゼイン由来のＡＣＥ阻害ペプチドとして、アミノ酸残基５〜１２からなるペプチドの報告がある（Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  ４９：  １４０５−１４０９，  １９８５  ）。
一方、後述する実施例では、本発明のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６産生抑制活性を有するペプチドは、鎖長（アミノ酸残基数）が５〜１４であり、分子量は５００〜１８００の範囲内にある。
これらのことを勘案すると、本発明のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６阻害活性を有するペプチドは、鎖長が３〜１６、分子量分布が４００〜２０００ｋＤａ（１アミノ酸の分子量を１３０とした）と見積られる。
乳タンパクから派生するペプチドのサイトカイン産生に対する影響に関しては、ウシカゼイン由来のペプチドが、ネズミ骨髄マクロファージからのＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６産生を増加させるという報告（Ｊ．  Ｓｃｉ．  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．，  ８１：  ３００−３０４，  ２０００）やｐｒｏｂｉｏｔｉｃ乳酸菌による発酵乳の上清中に、ＬＰＳ刺激によるＩＬ−６産生を誘導するペプチドが存在するという報告（Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ，  ５７（２）：  ６６−７０，  ２００２）がある。
【００２７】
ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６産生を抑制する作用を有するペプチドについても、上記ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドのように、さまざまな分離原理に基づくカラム操作で得られた数多くのフラクションに存在している可能性を否定することはできない。
そこで、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α及び／又はＩＬ−６産生の抑制効果を指標に乳タンパクの加水分解条件（変性温度、ｐＨ、温度、加水分解時間および酵素／基質の比）の最適化を上記文献（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２：  ８１３−８２０，  ２００２）を参考に試みることができる。したがって、この結果得られた加水分解の最適化条件は本発明に包含される。
本願発明の実施例によって、ホエイタンパク質由来のペプチドがＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６産生抑制活性を有することが初めて見出された。そこで、さらに加水分解対象を広げ、また加水分解条件をさまざまに変更することによって、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６産生抑制活性を指標に、該活性を有する新たなペプチドをスクリーニングする作業は、当業者にとって、なんら発明的努力を要しない、ルーチン的な作業となった。
【００２８】
すなわち、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６量の測定方法は公知〔例えば、実験医学別冊、バイオマニュアルＵＰ実験シリーズ、サイトカイン実験法、宮島  篤、山本  雅編、（株）羊土社、（１９９７）〕であること、当業者であれば、これら炎症性サイトカインの産生を抑制するペプチドをスクリーニングすべく、上記文献あるいは以下の関連文献を参照することによって、乳タンパク質のさまざまな加水分解条件を設定することが可能となった。
加水分解は、原理的には酸または塩基による加水分解も考えられるが、この方法は制御できないプロセスを含む。すなわち、タンパク質の分解が不規則に起こり、またアミノ酸のいくつかが分解される（例えばＬｅｕ、Ｖａｌおよび／またはＩｌｅが破壊されうる）。したがって、通常は酵素加水分解が選択される。
酵素によるタンパク質加水分解物の機能性は、上記したようにＤＨに依存する。ＤＨは、当業者公知の方法、例えば氷点降下から測定される浸透圧の上昇、ＯＰＡまたはＴＮＢＳ法による遊離アミノ酸の測定、あるいはｐＨスタット法による遊離アミノ酸の測定、等によりモニターできる。ＤＨは、原料、酵素の性質および反応条件（ｐＨ、温度および時間）によって制御することができる。
【００２９】
また、カゼインを各種酵素で加水分解したときの典型的なＤＨの経時変化についての文献（食品と開発，  ｖｏｌ．  ３１（２）：  ２０−２２）がある。すなわち、カゼインをＡｌｃａｌａｓｅＲとフレーバーザイムの併用、フレーバーザイム、プロタメックス、ＮｅｕｔｒａｓｅＲ、ＡｌｃａｌａｓｅＲ、あるいはエスペラーゼを用いて加水分解したとき、ＡｌｃａｌａｓｅＲとＮｅｕｔｒａｓｅＲはＤＨの経時変化が全く同様な形で推移し、加水分解１時間後までＤＥは急激に上昇（約１４  ％）し、それ以後は漸増している（４時間後にほぼ１８  ％）。プロタメックスのＤＥもほぼ同じ値で推移している。ＤＥが最も高い値で推移するのはフレーバーザイム単独あるいはＡｌｃａｌａｓｅＲとフレーバーザイムの併用であり、両者はほぼ同じ値で推移している。併用におけるＤＥは分解１時間後まで急激に上昇（約３４  ％）し、それ以後は漸増している（４時間後にほぼ５３  ％）。
【００３０】
以上の文献から、分解時間６時間でほぼ最大のＤＥ値が得られることが推定される。
特許３１６７７２３は、Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のプロテアーゼとＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のプロテアーゼを用いてホエイタンパク質を非ｐＨスタット法によりＤＥ１５〜３５  ％まで加水分解する方法を開示している。
特表平１０−５０７６４１は、Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来の中性およびアルカリ性プロテアーゼと、Ａ．  ｏｒｙｚａｅ由来のエンド／エクソプロテアーゼとの組み合わせによる乳タンパク質の加水分解方法を開示している。
一方、アレルギー患者の栄養管理、術前術後の患者の栄養管理に有用なオリゴペプチド混合物に関する特許３２２２６３８がある。オリゴペプチド混合物は、ホエイタンパク質を、バチルス属由来のプロテアーゼ〔ビオプラーゼ（ナガセ生化学工業）、アルカラーゼ（ノボ社）、プロテアーゼＮアマノ（天野製薬）など〕と放線菌由来のプロテアーゼ〔アクチナーゼ（科研ファルマ社）、プロナーゼ（シグマ社）〕〕の２種類で加水分解した後、酵素と不溶性の加水分解物を除いたもので、平均鎖長３〜５、最大分子量１５００以下、抗原性がβ−Ｌｇの１／１０，０００以下で苦味や旨味が極めて少ないことを特徴としている。
【００３１】
加水分解温度、ｐＨ、反応時間、および酵素添加量等は、酵素メーカーの使用説明書等を参考に決定することができるが、温度３０〜６５℃、ｐＨ  ５〜９、反応時間２０時間未満から上記文献を参照して選択されうる。
酵素失活は酵素の耐熱性に依存する。加水分解物は分画分子量５０００〜２０，０００ダルトンのＵＦ膜、好ましくは１００００〜１００，０００ダルトンのＵＦ膜で濾過する。この場合のカットオフ値は臨界的なものではない。カットオフ値の測定方法は膜メーカーによって異なり、標準化された方法はまだない。膜モジュールは、Ｐ  ＆  Ｆ（プレートアンドフレーム）型、ＴＵ（チューブラー）型、ＨＦ（ホローファイバー）型、ＳＷ（スパイラルワウンド）型、ＰＬ（プリーツ）型がある。ＵＦ濾過によって、パーミエイト中の２０００ダルトンを大きく超える分子量を有する加水分解物は、大部分除かれる。
パーミエイトは、公知方法で濃縮・噴霧乾燥あるいは凍結乾燥することができる。
【００３２】
α−Ｌａのトリプシン加水分解物、β−Ｌｇの加水分解物、あるいはＬｆの加水分解物のＵＦパーミエイトは、例えば、逆相ＨＰＬＣ（ＯＤＳ  Ｐｒｅｐ，  ２０×３００  ｍｍ、Ｔｏｓｏ，  Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で活性成分を分画することができる。０．１  ％  ＴＦＡを含むアセトニトリル（１  ％／分）の直線勾配で溶出（１０  ｍＬ／分）する。溶出は２１０  ｎｍでモニターする。各フラクションを集めてＴＮＦ−α抑制活性あるいはＩＬ−６抑制活性を測定する。活性画分は分子量＜２  ，０００ダルトンに存在する。
ＴＮＦ−α抑制活性については、α−Ｌａおよびβ−Ｌｇにおいてそれぞれ３つのピーク、Ｌｆにおいて４つのピークに該活性が認められる。これらのピークからペプチドを単離・精製し、分子量測定〔液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ−ＭＳＤ：ＨＰ１１００  ｓｅｒｉｅｓ〕、およびアミノ酸配列を決定する。
【００３３】
α−Ｌａ、β−ＬｇおよびウシＬｆの一次構造は公知（山内邦男，  横山健吉編，  ミルク総合事典，  （株）朝倉書店，  １９９７）である。
α−Ｌａからは、ＷＬＡＨＫ（アミノ酸残基１０４〜１０８位）、ＬＡＨＫＡＬ（アミノ酸残基１０５〜１１０位）、ならびにＣＥＶＦＲ（アミノ酸残基６〜１０位）とＬＤＱＷＬＣＥＫ（アミノ酸残基１１５〜１２２位）のＣ残基がＳ−Ｓ結合したペプチドＬＤＱＷＬＣ（−ＣＥＶＦＲ）ＥＫが得られ、β−Ｌｇからは、ＡＬＰＭＨ（アミノ酸残基１４２〜１４６位）、ＡＬＰＭＨＩＲ（アミノ酸残基１４２〜１４８位）およびＦＫＩＤＡＬＮＥ（アミノ酸残基８３〜８９位）が得られ、そしてＬｆからは、ＷＱＷＲ（アミノ酸残基４１〜４４位）、ＥＤＬＩＷＫ（アミノ酸残基２８３〜２８８位）、ＥＴＡＥＥＶＫ（アミノ酸残基３５２〜３５８位）およびＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲ（アミノ酸残基４８〜５７位）とＣＲのＣ残基がＳ−Ｓ結合したペプチドＬＧＡＰＳＩＴＣ（−ＣＲ）ＶＲが得られうる。
したがって、α−Ｌａ加水分解物のＵＦカットオフ値１０，０００のパーミエイトのＴＮＦ−α抑制活性活性成分はペプチドＷＬＡＨＫ、ＬＡＨＫＡＬおよびＬＤＱＷＬＣ（−ＣＥＶＦＲ）ＥＫである。この３つのペプチドの少なくとも１つを含むα−Ｌａ加水分解物は活性を有する。β−ＬｇのそれはＡＬＰＭＨ、ＡＬＰＭＨＩＲおよびＦＫＩＤＡＬＮＥであり、この３つのペプチドの少なくとも１つを含むβ−Ｌｇ加水分解物は活性を有する。そしてＬｆからは、ＷＱＷＲ、ＥＤＬＩＷＫ、ＥＴＡＥＥＶＫおよびＬＧＡＰＳＩＴＣ（−ＣＲ）ＶＲであり、この３つのペプチドの少なくとも１つを含むＬｆ加水分解物は活性を有する。
α−Ｌａ、β−ＬｇおよびウシＬｆのトリプシン加水分解条件をさまざまに変更することにより活性ペプチドおよびその構成は変わりうる。したがって、本発明は上記活性ペプチドに限定されるものではない。トリプシン以外の他の酵素についても同様なことがいえる。
トリプシンはＡｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）のカルボキシル側のペプチド結合を選択的に切断するエンドペプチダーゼとして作用する（生化学辞典第３版，  （株）東京同人，１９９８  ）。しかしながら、α−Ｌａ由来のＬＡＨＫＡＬ、ならびにβ−Ｌｇ由来のＡＬＰＭＨおよびＦＫＩＤＡＬＮＥのＣ末端側は非特異的に切断されている。
そこで、いくつかの新たなトリプシン認識ペプチドを化学合成し、ＴＮＦ−α抑制活性（以下、「活性」ともいう）を調べた。
ＦＫＩＤＡＬＮＥ（アミノ酸残基８２〜８９位）のＮ末端の近傍に位置するトリプシン認識部位のＫ（アミノ酸残基７７位）とＦＫＩＤＡＬＮＥの間のＩＰＡＶの４残基とＦＫＩＤＡＬＮＥのトリプシン認識部位のＮ末端のＦＫ２残基とを繋いだペプチドＩＰＡＶＦＫ（アミノ酸残基７８〜８３位）を合成した。このＩＰＡＶＦＫのＴＮＦ−α抑制活性を調べたところ活性が認められた（表１、ＥＤ５０＝７．１μＭ）。ＦＫＩＤＡＬＮＥのトリプシン認識部位のＫ以降のＩＤＡＬＮＥと、ＦＫＩＤＡＬＮＥのＣ末端に隣接するＮＫを繋いだＩＤＡＬＮＥＮＫ（アミノ酸残基８４〜９１位）も活性認められた（表１、ＥＤ５０＝３．２μＭ）。また、ＩＰＡＶＦＫとＩＤＡＬＮＥＮＫとを繋いだペプチドＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫ（アミノ酸残基７８〜９１位）も活性が認められた（表１、ＥＤ５０＝０．８μＭ）。
ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫのＣ末端のＮＫを除いたペプチドＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥ（アミノ酸残基７８〜８９位）はＣ末端がトリプシンにより非特異的に切断されたペプチドであるが活性が認められた（表１、ＥＤ５０＝１．８μＭ）。
以上、新たに合成した４つのペプチドＩＤＡＬＮＥＮＫ、ＩＰＡＶＦＫ、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫおよびＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥはトリプシンによる加水分解条件の条件設定により、得られうる。
ところで、ＩＰＡＶＦＫを除く３つの上記ペプチドはいずれもＩＤＡＬＮＥ（アミノ酸残基８４〜８９位）を共有している。また、４つのペプチドのＴＮＦ−α抑制活性を比較すると、３つのペプチドのＥＤ５０は０．８〜３．２μＭである。一方、ＩＰＡＶＦＫのＥＤ５０は７．１μＭと極めて弱いがＩＤＡＬＮＥあるいはＩＤＡＬＮＥＮＫと繋いものは活性が３．９〜８．９倍と強くなる。これらのことを勘案すると、共通配列ＩＤＡＬＮＥはＴＮＦ−α抑制活性発現に必須であることが示唆される。そこでＩＤＡＬＮＥのＴＮＦ−α抑制活性の測定、そして活性が認められた場合の、Ｎ末端あるいはＣ末端の逐次除去による活性発現に必須の最小アミノ酸配列（コア配列）を決定することができる。したがってこのようにして得られた活性を有するペプチドは本発明に包含される。
さらに、α−Ｌａ、β−ＬｇあるいはＬｆの一次構造上には上記ペプチド以外にトリプシン認識部位が存在する。そこで、トリプシンの加水分解条件をさまざまに変更することにより新たな活性ペプチドをスクリーニングすることができる。また、トリプシンで認識されるさまざま切断断片ペプチドを化学合成し、その活性を調べることができる。したがって、このようにして得られた活性を有するペプチドは本発明に包含される。
一方、α−Ｌａ由来のＬＤＱＷＬＣ（−ＣＥＶＦＲ）ＥＫのＳ−Ｓ結合を切断して得られたＬＤＱＷＬＣＥＫとＣＥＶＦＲのＴＮＦ−α産生抑制活性を調べると、前者には活性が認められたが後者には認められなかった。また、ウシＬｆ由来のＬＧＡＰＳＩＬＣ（−ＣＲ）ＶＲのＳ−Ｓ結合を切断して得られたＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲとＣＲのＴＮＦ−α産生抑制活性を調べると前者には活性が認められたが後者には認められなかった。
以上の結果をまとめると、乳タンパク質のトリプシン特異的加水分解物あるいは非特異的加水分解物由来のＴＮＦ−α産生抑制活性を有するペプチドとして、α−ＬａからはＷＬＡＨＫ（配列番号１）、ＬＡＨＫＡＬ（配列番号２）およびＬＤＱＷＬＣＥＫ（配列番号３）が、β−ＬｇからはＡＬＰＭＨ（配列番号４）、ＡＬＰＭＨＩＲ（配列番号５）、ＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号６）、ＩＤＡＬＮＥＮＫ（配列番号７）、ＩＰＡＶＦＫ（配列番号８）、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫ（配列番号９）、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号１０）、そしてウシＬＦからはＷＱＷＲ（配列番号１１）、ＥＤＬＩＷＫ（配列番号１２）、ＥＴＡＥＥＶＫ（配列番号１３）、ＬＧＡＰＳＩＬＣＶＲ（配列番号１４）が得られうる。これらペプチドの分子量あるいは乳タンパク質由来の生物学的活性を有するペプチドの分子量分布から、乳タンパク質のＴＮＦ−α産生抑制活性画分は分子量＜２  ，０００ダルトンに存在することが示唆される。
ここで、α−Ｌａ由来のＷＬＡＨＫとＬＡＨＫＡＬはＬＡＨＫを共有している。そこでこれらのペプチド以外にＬＡＨＫ、ＷＬＡＨＫＡ、ＷＬＡＨＫＡＬおよびＬＡＨＫＡ  の４ペプチドの存在が考えられ、ＴＮＦ−α産生抑制活性の有無を確認することができる。したがって、活性が確認されたペプチドは本発明に包含される。
【００３４】
また、上記ペプチドのいずれも、Ｎ末端あるいはＣ末端のアミノ酸残基を逐次欠失させ、それらの欠失ペプチドの活性を確認することができる。したがって、活性が確認された場合は本発明に包含される。
さらに、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥ、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫのペプチドにおいて、弱いながらＩＰＡＶＦＫは活性を有しており、したがってこの２つのペプチドのＩＰＡＶＦＫ以降のアミノ酸残基を逐次欠失させたペプチドも活性を有する可能性が極めて高く、活性が確認されたそれぞれのペプチドは本発明に包含される。
さらに、活性が確認されたペプチドあるいはこれらのペプチドのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基（Ｄ−アミノ酸を含む）に置換したペプチド誘導体も本願発明に包含される。Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＤＰ−５８）がＬＰＳ刺激ＲＡＷ２６４．７細胞およびネズミの大腸炎のＴＮＦ−α翻訳を阻害するがｍＲＮＡの合成には影響しなかったとする報告（Ｉｎｆｌａｍｍ．  ｒｅｓ．，  ５１：  ４７９−４８２，  ２００２）はこれをサポートする。
また、α−Ｌａ、β−ＬｇあるいはウシＬｆの一次構造に基づき、全一次構造をカバーする、たがいに数残基（３〜５残基程度）オーバーラップペプチド（５〜１０残基程度）を化学合成し、ＴＮＦ−α産生抑制活性あるいはＩＬ−６活性を指標に目的のペプチドをスクリーニングすることも可能である。ペプチドの化学合成法は公知である。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｒ．Ｂ．によって開発された固相法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９６４，  ３，  ｐｐ．  １３８５；  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １９７９，  ２，  ｐｐ．  １−２８４，  ｂｙ  ｅｄ  Ｅ．  Ｇｒｏｓｓ  ＆  Ｊ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）である。他に、同様の固相法で、フロー法を適用し、場合によって側鎖を酸に不安定な基で保護したＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて合成することもできる（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，  Ｅ．  ＆  Ｓｈｅｐｐａｒｄ  Ｒ．  Ｃ．  “Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”，  ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８９  ）。したがって活性が確認されたペプチドは全て本発明に包含される。
【００３５】
しかしながら、食品としての利用を考えた場合、安全の面より、合成ペプチドよりも、食品タンパク質、とりわけ乳タンパク質を加水分解して得られるペプチドの方が望ましい。一方、経済的な面から、乳タンパク質加水分解物から、上記ペプチドを単離精製して用いることは、産業上実用的ではない。実施例で示すように、α−Ｌａおよびβ−Ｌｇの加水分解物の限外（ＵＦ）濾過のパーミエイトそのものがＴＮＦ−αあるいはＩＬ−６産生を抑制する作用を有している。したがって、炎症緩和作用もつ経口・経腸栄養剤の添加物として、乳タンパク質加水分解物のＵＦパーミエイトそのものあるいはその乾燥物で十分と考えられる。
本発明のＴＮＦ−αあるいはＩＬ−６産生を抑制する作用を有する乳タンパク加水分解物、該加水分解物から粗精製した該活性を有するペプチドあるいは精製ペプチドの１つもしくは２つ以上を含むものは、炭水化物、脂質、ビタミン類、ミネラル類等の適当な混合によって、ＳＩＲＳにおける炎症緩和のための非経口および末梢非経口投与によく適する。
【００３６】
すなわち、本発明の乳タンパク加水分解物、該加水分解物から粗精製したペプチドあるいは精製したペプチドは、侵襲による臓器不全予防のため、ＳＩＲＳ、ＣＡＲＳの制御に有用な経口・経腸栄養剤の製造のための使用に期待がもたれる。また、術前の栄養管理にも使用することができる。ペプチドの有効添加量の１００  ｋｃａｌ中３  ｇ（活性ペプチド換算）以上と推定されるが、有効量はヒトの実験により決定されるべきものである。具体的には、手術、外傷、熱傷、急性膵炎、感染症、腹膜炎、悪性腫瘍などのための経口・経腸栄養剤である。さらに新たに制定された保健機能食品の食品素材としてもその有用性が期待される。保健機能食品あるいはサプリメントに対する加水分解物のの配合量は、ペプチド換算で製品１００  ｍＬ当たり０．９〜３  ｇ好ましくは１．２〜２ｇと推定される。
【００３７】
【実施例】
本発明を実施例および試験例により具体的に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されて解釈されるものではない。
［実施例１］  ホエイタンパク質加水分解物の調製
ＷＰＩ（タンパク含量９０％、ダビスコ社）、β−Ｌｇ（β−Ｌｇ含量９０  ％、ダビスコ社）、あるいはα−Ｌａ（α−Ｌａ含量９０  ％、ダビスコ社）をリン酸緩衝液に１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。対照として、カゼインナトリウム（純度９５％以上、和光純薬）を同濃度でリン酸緩衝液に溶解した。タンパク１  ｇ当たりトリプシン（ブタ膵臓由来、活性：２５  ＵＳＰキモトリプシンＵｎｉｔｓ／ｍｇ以下、和光純薬）５０  ｍｇを添加し、３７℃で６時間反応させた。反応後、２０，０００×ｇ、１０分で遠心して不溶性成分を沈殿除去した後、分画分子量１０，０００のＵＦ膜処理（ミリポア社ウルトラフリー−ＭＣ）した。透過画分（パーミエイト）は０．２２μｍのＭＦ膜（ミリポア社マイレックス−ＧＶ）処理後、実験に供した。
【００３８】
［実施例２］  ＷＰＩ加水分解物の調製
ＷＰＩ（タンパク含量９０％、ダビスコ社）をリン酸緩衝液に１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、以下の４つの反応区分に分けた。
（１）トリプシン（実施例１と同じ、以下同様）を添加し、５０℃で５時間反応させた。
（２）プロテアーゼＡアマノＧを５０  ｍｇ添加し、５０℃で５時間反応させた。
（３）トリプシンを添加し、５０℃で５時間反応させた後、さらに、プロテアーゼＡアマノＧを５０  ｍｇ添加し、５０℃で５時間反応させた。
（４）プロテアーゼＡアマノＧを５０  ｍｇ添加し、５０℃で５時間反応させた後、さらに、トリプシンを５０  ｍｇ添加し、５０℃で５時間反応させた。
反応終了後、１５分間煮沸した。遠心処理（２０，０００×ｇ、１０分）後、分画分子量１０，０００のＵＦ膜処理（ミリポア社ウルトラフリー−ＭＣ）した。パーミエイトは０．２２μｍ  ＭＦ膜処理後、実験に供した。
【００３９】
［実施例３］  β−Ｌｇ由来およびα−Ｌａ由来のＴＮＦ−α産生抑活性を有するペプチドの同定
β−Ｌｇ（β−Ｌｇ含量９０％、ダビスコ社）、あるいはα−Ｌａ（α−Ｌａ含量９０％、シグマ社）のトリプシン加水分解物を、実施例１に準じて調製した。
これらのトリプシン加水分解物の活性成分を逆相ＨＰＬＣで分画した。分析カラムはＣ１８  ＳＧ１２０（資生堂）４．６  ｍｍφｘ  ２５０  ｍｍを、移動相はアセトニトリル／０．１％ＴＦＡの溶媒による直線濃度勾配を用いた。分取カラムは、Ｃ１８  ＳＧ１２０  （資生堂）１５  ｍｍφｘ  ２５０  ｍｍを用い、同様の溶媒で行った。β−Ｌｇ由来のペプチドの逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを図４に、α−Ｌａ由来のペプチドの逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを図６に示す。
［試験例１］  ＴＮＦ−α産生抑制作用
実施例１における、分解前のＷＰＩ、β−Ｌｇ、α−Ｌａおよびカゼイン、あるいはこれらの加水分解物について、ＴＮＦ−α産生抑制作用を調べた。
ＴＨＰ−１細胞（急性単球性白血病患者由来、理化学研究所）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：三菱化学）、ホルボールエステル（ＴＰＡ、和光純薬）  ２００  ｎＭを含むＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｓｉｇｍａ）中、５％ＣＯ２の条件下で３７℃、７２時間培養し、単球・マクロファージに分化誘導させた。
分化誘導後、分解前のＷＰＩ、β−Ｌｇ、α−Ｌａ、およびカゼインを０  ｍｇ／ｍＬ（対照）、０．１  ｍｇ／ｍＬ、１．０  ｍｇ／ｍＬ、あるいは加水分解物を０  ｍｇ／ｍＬ（対照）、０．０２  ｍｇ／ｍＬ、０．２  ｍｇ／ｍＬ含むＲＰＭＩ  １６４０培地に交換し、２時間培養した。次いでＬＰＳ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌ．  Ｌａｂ．  Ｉｎｃ．）を  １００  ｎｇ／ｍｌの終濃度で培地に添加し、４時間培養した。培養上清中のＴＮＦ−α量を、市販のＴＮＦ−α測定用ＥＬＩＳＡキット（アマシャムバイオサイエンス）で測定した。分解前のＷＰＩ、β−Ｌｇ、α−Ｌａ、およびカゼインのＴＮＦ−α産生抑制作用を図１に、これらの加水分解物のＴＮＦ−α産生抑制作用を図２、８および９に示す。
各ホエイタンパク、各ホエイタンパク質のトリプシン分解物はいずれもＴＮＦ−α産生抑制効果を示した。カゼインは分解前も分解後もＴＮＦ−α産生抑制効果を示さなかった。ホエイタンパク質のトリプシン分解物は熱安定性が高く、加熱処理してもＴＮＦ−α産生抑制作用を有するので、炎症反応緩和のため、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）患者用の経口・経腸栄養剤に添加することが可能である。
【００４０】
［試験例２］  プロテアーゼの組み合わせによる加水分解物のＴＮＦ−α産生抑制作用
実施例２で得られたＷＰＩの各プロテアーゼ加水分解物について、試験例１の方法に準じて、培養上清中のＴＮＦ−α産生量を測定した。結果を図３に示す。
トリプシンによるＷＰＩの加水分解物のＴＮＦ−α産生抑制作用は、ＡアマノＧによる加水分解物のそれよりも強かった。
一方、ＷＰＩをトリプシンで分解後さらにＡアマノＧで分解（トリプシン→ＡアマノＧ）した場合、あるいは逆に、ＷＰＩをＡアマノＧで分解後トリプシンで分解（ＡアマノＧ→ＧＰＴＮ６．０Ｓ）した場合、いずれもＴＮＦ−α産生抑制作用はほぼ同程度で、トリプシン単独のそれよりもやや強い傾向を示した。このことは、２つの酵素の組み合わせにより、よりＴＮＦ−α産生抑制活性の高い分解物が得られることを示唆している。
［試験例３］  ＴＮＦ−α産生抑制活性を有するペプチドの単離・精製
実施例１と同様の方法で調製したβ−Ｌｇ、α−Ｌａおよび同様に実施例１の方法で調製したウシＬｆ（Ｗａｋｏ社）のＵＦパーミエイトを逆相ＨＰＬＣで分画した（図４、６および１１）。各ピークを分取し、それらのＴＮＦ−α産生量（ＴＮＦ−α産生抑制活性）を試験例１の方法に準じて測定した。その結果、β−Ｌｇおよびα−Ｌａについてそれぞれ３つのピーク、そしてＬｆは４つのピークにＴＮＦ−α産生抑制活性が認められた。そこで各ピークを精製し、分子量測定〔液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ−ＭＳＤ：ＨＰ１１００  ｓｅｒｉｅｓ〕およびアミノ酸配列を決定した。β−ＬｇからはＡＬＰＭＨ、ＡＬＰＭＨＩＲおよびＦＫＩＤＡＬＮＥ、α−ＬａからはＬＡＨＫＡＬ、ＷＬＡＨＫ、ならびにＣＥＶＦＲとＬＤＱＷＬＣＥＫのＣ残基がＳ−Ｓ結合したペプチド、そしてＬｆからはＥＴＡＥＥＶＫ、ＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲとＣＲのＣ残基がＳ−Ｓ結合したペプチド、ＷＱＷＲおよびＥＤＬＩＷＫが得られた。β−Ｌｇについては、その一次構造に基づき、ＦＫＩＤＡＬＮＥのＮ末端に隣接するＩＰＡＶ４残基とＮ末端ＦＫの２残基を結合したＩＰＡＶＦＫ、ＦＫＩＤＡＬＮＥのＮ末端のＦＫを除き一方Ｃ末端にＮＫを付加したＩＤＡＬＮＥＮＫ、ＦＫＩＤＡＬＮＥのＮ末端に隣接するＩＰＡＶの４残基をＮ末端に付加したＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥ、さらにＦＫＩＤＡＬＮＥのＣ末端に隣接するＮＫを付加したＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫを化学合成した。また、α−Ｌａについて、ＣＥＶＦＲとＬＤＱＷＬＣＥＫのＳ−Ｓ結合を切断して得られたＣＥＶＦＲとＬＤＱＷＬＣＥＫのＴＮＦ−α産生抑制活性を調べた結果、ＣＥＶＦＲには活性が認められなかった。
また、ウシＬｆについて、ＬＧＡＰＳＩＬＣＶＲとＣＲのＳ−Ｓ結合を切断して得られたＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲとＣＲのＴＮＦ−α産生抑制活性を調べた結果、ＣＲには活性が認められなかった。以上の結果をまとめると、乳タンパク質由来のＴＮＦ−α産生抑制活性を有するペプチドとして、α−ＬａからはＷＬＡＨＫ（配列番号１）、ＬＡＨＫＡＬ（配列番号２）およびＬＤＱＷＬＣＥＫ（配列番号３）が、β−ＬｇからはＡＬＰＭＨ（配列番号４）、ＡＬＰＭＨＩＲ（配列番号５）、ＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号６）、ＩＤＡＬＮＥＮＫ（配列番号７）、ＩＰＡＶＦＫ（配列番号８）、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫ（配列番号９）、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号１０）、そしてＬＦからはＷＱＷＲ（配列番号１１）、ＥＤＬＩＷＫ（配列番号１２）、ＥＴＡＥＥＶＫ（配列番号１３）、ＬＧＡＰＳＩＬＣＶＲ（配列番号１４）が得られた。
ホモロジー検索の結果、配列番号３、６、７、８、９、１０、１３および１４は新規物質であることが判明した。配列番号１、２、４および５は、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する報告（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６７：  ６５−７１，  ２０００；  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  ８４：  Ｓｕｐｐｌ．  １：  Ｓ３３−３７，  ２０００  ）があるが、ＴＮＦ−α産生抑制活性については報告がない。また、ＷＱＷＲは抗疱疹作用、ＥＤＬＩＷＫは抗ガン、抗アポトーシス、抗潰瘍剤、創傷治療剤、強心剤、抗ｈｅｐａｒｉｎ、抗ｉｃｈｅｍｉａ、抗酸化剤としての用途がある。
これらのペプチドのアミノ酸配列に基づいて、それぞれの対応するペプチドを合成し、合成ペプチドのＴＮＦ−α産生抑制作用を試験例１の方法に準じて調べた。その結果、これらのペプチドは全て１〜１０μｇ／ｍＬで濃度依存的にＴＮＦ−α産生抑活性を示した（図５、７、１０および１１）。これらのペプチドのＥＤ５０（５０  ％  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）を表１にまとめて示した。
【００４１】
【表１】
2004155751.tif 000002
【００４２】
［試験例４］  ＩＬ−６産生抑制作用
６週齢のＩＣＲマウス（雄）を購入し、１週間ＡＩＮ−９３Ｍ飼料および飲水を自由摂取させ馴化させた。１群７匹として、体重の平均値が等しくなるように、カゼイン分解物投与群（５ｍｇ／マウス）、β−Ｌｇトリプシン分解物投与群（５ｍｇ／マウス）、α−Ｌａトリプシン分解物投与群（５ｍｇ／マウス）、ＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号６）投与群（１ｍｇ／マウス）、ＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号６）投与群（５ｍｇ／マウス）、ＬＤＱＷＬＣＥＫ（配列番号３）投与群（１ｍｇ／マウス）、ＬＤＱＷＬＣＥＫ（配列番号３）投与群（５ｍｇ／マウス）の７群に分けた。試料は３日間連続（１３：００）してゾンデを用いて経口投与した。最終投与から２４時間後、ＬＰＳを５０μｇ／マウスで腹腔内投与した。９０分後に眼窩より採血し遠心操作により血清を得た。血清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより測定した（図１３）。Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＳＬＤによる統計学的処理により、カゼイン投与群に対する有意差を検定した。
β−Ｌｇトリプシン分解物投与群、ＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号６）投与群およびＬＤＱＷＬＣＥＫ（配列番号３）投与群のＩＬ−６濃度は、カゼインに対して濃度依存的に有意に低下（＊＊ｐ＜０．０５）し、後者２群の低下は濃度依存的であった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明により、ＴＮＦやＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生に刺激を加えることなく、それを抑制しつつ、免疫能を賦活化する作用を有する、経口摂取可能なペプチドを提供することができた。また、生体侵襲時の代謝異常や臓器障害を防止しかつ免疫能を亢進させる経口・経腸栄養剤の製造に使用する該ペプチドを提供することができた。さらにまた、栄養補給や健康維持などに有用な保健機能食品（特定保健用食品および栄養機能食品）の製造に使用する該ペプチドを提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＨＰ−１細胞の単球・マクロファージへの分化誘導後における、未分解のＷＰＩ、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンあるいはカゼインの、ＬＰＳ誘導ＴＮＦ−α産生抑制効果を示す。
【図２】ＷＰＩ、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンおよびカゼインのトリプシン加水分解物の、同上ＴＮＦ−α産生抑制効果を示す。
【図３】ＷＰＩのトリプシン（ブタ膵臓由来、Ｗａｋｏ社）加水分解物、ＷＰＩのＡアマノＧ加水分解物、ＷＰＩのトリプシンとＡアマノＧの組み合わせによる加水分解物、およびＡアマノＧとトリプシンの加水分解物の、同上ＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図４】β−ラクトグロブリンのトリプシン加水分解物のＵＦパーミエイトの逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図５】β−ラクトグロブリン由来のペプチドＡＬＰＭＨ、ＡＬＰＭＨＩＲおよびＦＫＩＤＡＬＮＥの同上ＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図６】α−ラクトアルブミンのトリプシン加水分解物のＵＦパーミエイトの逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図７】α−ラクトアルブミン由来のペプチドＷＬＡＨＫ、ＬＡＨＫＡＬ、ＣＥＶＦＲおよびＬＤＱＷＬＣＥＫの同上ＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図８】β−ラクトグロブリンのトリプシン加水分解物の各濃度における同上ＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図９】α−ラクトアルブミンのトリプシン加水分解物の各濃度におけるＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図１０】β−ラクトグロブリン由来のペプチドＩＤＡＬＮＥＮＫ、ＩＰＡＶＦＫ、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥおよびＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫの、同上ＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図１１】ウシラクトフェリンのトリプシン加水分解物の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【図１２】ウシラクトフェリン由来のペプチドＷＱＷＲ、ＥＤＬＩＷＫ、ＥＴＡＥＥＶＫおよびＬＧＡＰＳＩＬＣＶＲの各濃度におけるＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図１３】カゼイントリプシン加水分解物、β−Ｌｇトリプシン分解物、α−Ｌａトリプシン加水分解物、β−Ｌｇ由来のペプチドＦＫＩＤＡＬＮＥ、あるいはα−Ｌａ由来のＬＤＱＷＬＣＥＫマウスにおける経口摂取後の血清中のＬＰＳ誘導ＩＬ−６の産生抑制作用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2004155751.tif 000012
【図１１】
2004155751.tif 000013
【図１２】
2004155751.tif 000014
【図１３】
2004155751.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成15年1月30日(2003.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体侵襲時におけるＴＮＦやＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生に刺激を加えることなく抑制しかつ、免疫能を賦活化する作用を有する乳タンパク質の酵素加水分解物に関する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体侵襲時の経口免疫栄養療法に有用なペプチドに関する。すなわち、生体侵襲時の栄養療法において、ＴＮＦやＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生に刺激を加えることなく、それを抑制しつつ、免疫能を賦活化する作用を有するペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
全身性炎症反応症候群（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＳＩＲＳ）は、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）を定義するために提唱された概念で、侵襲（外傷、熱傷、急性炎症あるいは癌手術など）によって炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦなど）が過剰に誘導され、全身的な炎症反応が惹起された状態を指している。一方、炎症性サイトカインが誘導されると同時に、ＳＩＲＳに対するホメオスタシス反応として抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０）が誘導されることが知られている。この抗炎症性サイトカインが過剰に誘導された病態をｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＣＡＲＳ）とよんでいる。この２つの病態にかかわる背景因子としてのサイトカインについては、程度の差こそあれ相互に調節する関係にあり、潜在的につねに同時に存在する病態ともいえ、ＳＩＲＳ／ＣＡＲＳのバランスという考え方から侵襲時の生体反応の把握が試みられている。ＳＩＲＳ優位の状態では過度の炎症反応、ＣＡＲＳ優位の状態では感染の遷延・重症化から臓器障害へと進展していくと考えられている。
【０００３】
侵襲時の栄養管理はたんなる炎症反応の抑制だけではなく患者の免疫能を亢進させるような栄養管理法が推奨される。侵襲を受けた患者がその後の感染を伴うと、しばしば不幸な転帰をたどる症例が少なくなく、とくにＣＡＲＳ優位になっている病態では感染防止が最優先されるべき対応項目となる。そこで経腸栄養によるＳＩＲＳ、ＣＡＲＳの制御は重要である。サイトカインによる侵襲時の代謝異常や臓器障害を防止するには、局所のサイトカインは正常に産生させるが、全身へのこの波及を防止する方法が合理的と考えられる。
【０００４】
ラットを同一組成の輸液で経静脈栄養あるいは経腸栄養で管理後、腹腔滲出細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＰＳ刺激下に培養すると、経腸栄養群は経静脈栄養群に比べＴＮＦ−αの産生能が高く、それに関連して腹腔内Ｅ．  ｃｏｌｉ投与後の腹腔内細菌数は少なかった（（例えば、非特許文献１参照）。また、細菌投与後の血中ＴＮＦ−α濃度は経腸栄養群で経静脈栄養群に比べ優位に低かった。すなわち、経腸的な栄養投与は感染局所の生体防御に必要な腹腔滲出細胞の炎症性サイトカインＴＮＦ−α産生能を維持し局所の免疫能を保つ一方で、全身の過剰な炎症反応を抑制する。このような経腸栄養は、例えば、生体侵襲時（手術、外傷、熱傷、感染症、急性膵炎、肝不全、腹膜炎、または悪性腫瘍）のＳＩＲＳ、ＣＡＲＳの発生の制御にも有用と考えられる。
【０００５】
局所のサイトカインは正常に産生させるが、全身へのこの波及を防止する方法としては、経腸栄養、あるいはｎ−３系多価不飽和脂肪酸（Ｎ３ＰＵＦＡ）の投与が考えられる。Ｎ３ＰＵＦＡの侵襲下投与による侵襲反応に対する効果について、ラット熱傷モデルを用いて基礎的に、また高度侵襲手術のひとつである食道癌手術症例により臨床的に検討された。その結果、Ｎ３ＰＵＦＡを投与することで侵襲下の炎症反応の軽減化、細胞性免疫機能低下の防止作用が認められ、Ｎ３ＰＵＦＡ投与の有効性が示された（例えば、非特許文献２参照）。
さて、乳タンパクはその栄養的価値に加えて生物学的に活性のペプチドの源である。
乳タンパク質由来の生物活性ペプチドについては、吉川（例えば、非特許文献３参照）や大谷（例えば、非特許文献４参照）によって包括的にまとめられており、また免疫調節作用については大谷（例えば、非特許文献５，６参照）による報告がある。
【０００６】
Ｍ．  Ｚｉｍｅｃｋｉらは、ウシラクトフェリン（ＢＬＦＴ）含有カプセルを１０日間健常人に経口摂取させ、いくつかの免疫パラメータをモニターした。その結果、血清中のＴＮＦ−αのレベルはモニター期間中低下傾向を示したが、ＩＬ−６は変化がなかった（例えば、非特許文献７参照）。また、ウシカゼイン由来のペプチド、ＬＬＹ、ＰＧＰＩＰＮおよびＴＴＭＰＬＷがＬＰＳ刺激ネズミマクロファージによるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６産生を増強したとの報告がある（例えば、非特許文献８参照）。栗岩はラクトフェリン由来のＮ末端領域から２５アミノ酸残基からなるペプチドがエンドトキシン誘導性炎症を抑止することを開示している（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｌｉｎ，  ＭＴ  ｅｔ．ａｌ．「Ｒｏｕｔｅ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｌｏｃａｌ，  ｓｙｓｔｅｍｉｃ，  ａｎｄ  ｒｅｍｏｔｅ  ｏｒｇａｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．」Ａｎｎ．
Ｓｕｒｇ、Ｖｏｌ  ２２３、１９９６年、ｐ．８４−９３
【０００８】
【非特許文献２】
稲葉毅「経静脈栄養下における成長因子療法の可能性」医学のあゆみ、Ｖｏｌ  １９８、Ｎｏ．  １３、２００１年、ｐ．１０４１
【０００９】
【非特許文献３】
吉川正明など「ミルクの先端機能」弘学出版、吉川正明ら編、１９９８、ｐ．１８８
【００１０】
【非特許文献４】
大谷元など「ミルクの先端機能」弘学出版、吉川正明ら編、１９９８、ｐ．９７
【００１１】
【非特許文献５】
大谷元「牛乳カゼイン由来ペプチドの栄養生理機能」Ｍｉｌｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ  ４７、Ｎｏ．  ３、１９９８年、ｐ．１８３−１９３
【００１２】
【非特許文献６】
大谷元「牛乳カゼインの消化により生成するペプチドの免疫調節機能」Ｍｉｌｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ  ５０、Ｎｏ．  ３、２００１年、ｐ．１３９−１４４
【００１３】
【非特許文献７】
Ｚｉｍｅｃｋｉ，  Ｍ  ｅｔ．  ａｌ．「Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ｔａｋｅｎ  ｏｒａｌｌｙ  ｂｙ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ」Ａｒｃｈ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  Ｅｘｐ．、Ｖｏｌ  ４６、１９９８年、ｐ．２３１−２４０
【００１４】
【非特許文献８】
Ｚｉａｏ，  Ｃ．  ｅｔ．  ａｌ．「Ｂｏｖｉｎｅ  ｃａｓｅｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｎａｉｖｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｒｅｌｅａｓｅ」Ｊ．  Ｓｃｉ．  Ｆｏｏｄ．  Ａｇｒｉｃ．、Ｖｏｌ  ８１、２０００年、ｐ．３００−３０４
【００１５】
【特許文献１】
特開平８−１６５２４８
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＴＮＦやＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生に刺激を加えることなく、それを抑制しつつ、免疫能を賦活化する作用を有する、経口摂取可能なペプチドを提供することを課題とする。また本発明は、生体侵襲に伴うＳＩＲＳにおける炎症緩和および栄養治療に有用である。該ペプチドを提供する。さらにまた、本発明は、栄養補給や健康維持などに有用な保健機能食品（特定保健用食品および栄養機能食品）の製造に使用する該ペプチドを提供する。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
１９７９年、Ｂｒａｎｔｌらにより、牛乳カゼインからオピオイドペプチド（β−ｃａｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）が単離されて以来、数多くの生理活性ペプチドがカゼインおよびホエイタンパク質の酵素消化物から得られた。そこで、当初は、これらの生理活性ペプチドはすべて合目的性をもって存在することが期待された。しかし、同様な生理活性ペプチドが動物のみならず植物からも派生し、ある確率のもとに生理活性ペプチドが存在することが分かっている今日では、乳タンパク質から派生する生理活性ペプチドがすべて生物学的合目的性をもって存在するとは断定できない。いずれにせよ、他の起源のものに較べて、乳タンパク質から派生する生理活性ペプチドには生物学的合目的性が存在する確率ははるかに大きいことは事実である〔吉川正明：  ミルクの先端機能、吉川正明ら編、ｐ．  １８８、弘学出版（１９９８）〕。
一方、経腸栄養によって炎症局所や全身、あるいは遠隔臓器である肺のサイトカイン産生が修飾されること、またサイトカインの種類によってその修飾のされかたが異なることが明らかにされている（Ｆｏｎｇ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．，  ２１０：  ４４９−４５７，  １９８９；  Ｌｉｎ，  Ｍ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．，  ２２３：  ８４−９３，  １９９６）。
【００１８】
そこで、本発明者らは侵襲時の炎症性サイトカイン過剰産生を抑制し、経口・経腸栄養剤に配合可能な食品素材を得るために、ＴＮＦ−α産生抑制活性を指標に、乳タンパク質の加水分解物の活性ペプチドをスクリーニングした。
本発明者らは、ホエイタンパク質単離物（Ｗｈｅｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｅ：ＷＰＩ）、β−ラクトグロブリン（β−Ｌｇ）、α−ラクトアルブミン（α−Ｌａ）およびウシラクトフェリン（Ｌｆ）のプロテアーゼ加水分解物の限外（ＵＦ）濾過の透過物（パーミエイト）が、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α産生あるいはＩＬ−６産生を抑制する作用を有することを見出した。さらに、これらのパーミエイトを逆相ＨＰＬＣで分画して、分子量約２，０００ダルトン以下の画分に、ＴＮＦ−α産生あるいはＩＬ−６産生抑制活性を有するいくつかのピークが存在し、これらの活性ピークからペプチドを単離、精製しアミノ酸配列を決定した。そして、これらの配列を基に、対応するペプチドを合成し、ＴＮＦ−α産生抑制活性を調べた結果、同じような活性を有することを確認することができた。さらに、β−Ｌｇ分子上で隣接する、あるいは数個のアミノ酸がオーバーラップする領域から新たなペプチドを合成し、ＴＮＦ−α産生抑制活性を有するいくつかのペプチドを得ることができた。
【００１９】
すなわち、本発明は、
（１）  カゼイン、カゼイネート、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ウシラクトフェリンおよびトータルミルクプロテイン（ＴＭＰ）からなる群より選ばれる乳タンパク質の酵素加水分解物の、５，０００〜１００，０００ダルトンのカットオフ値を有する限外濾過膜（ＵＦ）パーミエイトとして得られうるＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６抑制作用を有する加水分解物、
（２）  β−ラクトグロブリンのトリプシン加水分解物で、カットオフ値が１０，０００である（１）の加水分解物、
（３）  溶出パターンが図４に示す逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムで示される（２）の加水分解物、
（４）  ＡＬＰＭＨ、ＡＬＰＭＨＩＲおよびＦＫＩＤＡＬＮＥからなる群より選ばれる少なくとも１つ若しくは２つ以上のペプチドを含む（２）の加水分解物、
（５）  α−ラクトアルブミンのトリプシン加水分解物で、カットオフ値が１０，０００である（１）の加水分解物、
（６）  溶出パターンが図６に示す逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムで示される（５）の加水分解物、
（７）  ＷＬＡＨＫ、ＬＡＨＫＡＬおよびＬＤＱＷＬＣ（−ＣＥＶＦＲ）ＥＫからなる群より選ばれる少なくとも１つ若しくは２つ以上のペプチドを含む（５）の加水分解物、
（８）  ウシラクトフェリンのトリプシン加水分解物で、カットオフ値が１０，０００である（１）の加水分解物、
（９）  溶出パターンが図１１に示す逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムで示される（８）の加水分解物、
（１０）  ＷＱＷＲ、ＥＤＬＩＷＫ、ＥＴＡＥＥＶＫおよびＬＧＡＰＳＩＴＣ（−ＣＲ）ＶＲからなる群より選ばれる少なくとも１つ若しくは２つ以上のペプチドを含む（８）の加水分解物、
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１つの加水分解物の有効量を含有する、生体侵襲時の栄養管理のための経口・経腸栄養剤、
（１２）（１）〜（１０）のいずれか１つの加水分解物の有効量を含有する、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の症状を緩和する作用を有する、経口・経腸栄養剤、
（１３）（１）〜（１０）のいずれか１つの加水分解物の有効量を含有する、炎症反応を緩和する作用を有する保健機能食品、
（１４）  （１）〜（１０）のいずれか１つの加水分解物の有効量を含有する、炎症反応を緩和する作用を有するサプリメント、
（１５）  （１１）の経口・経腸栄養剤を製造するための（１）〜（８）のいずれか１項記載の加水分解物の使用、
（１６）（１２）の経口・経腸栄養剤を製造するための（１）〜（８）のいずれか１項記載の加水分解物の使用、
（１７）（１３）の保健機能食品を製造するための（１）〜（８）のいずれか１項記載の加水分解物の使用、
（１８）（１４）のサプリメントを製造するための（１）〜（８）のいずれか１項記載の加水分解物の使用、
からなる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
出発物質として、乳タンパク質は後述する理由により最適である。トウモロコシや大豆タンパク質も候補であるが、乳タンパク質ほど有利ではない。乳タンパク質はウシ由来のカゼインおよびホエイタンパク質である。とくにタンパク質含量が９０％以上のホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、カゼイネート、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンおよびラクトフェリンなどの分画物は、活性物質の純度の観点から有利である。他に、タンパク質含量が８０％以上のホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、カゼイン、トータルミルクプロテイン（ＴＭＰ）、あるいは還元乳なども有利な原料の候補としてあげられる。またこの他に乳タンパク質を含む一般的原料として、脱脂粉乳、ホエイ粉、脱塩ホエイ粉、脱乳糖ホエイ粉、クリーム、バターミルク、バターゼラム、ミネラル濃縮ホエイなどがあげられる。
【００２１】
ＷＰＩからβ−Ｌｇやα−Ｌａの分画する方法については多くの報告〔たとえば、桑田有：月刊フードケミカル，  ２月号，  ６８  （１９９１）；  米国特許  ５，４２０，２４９等  〕がある。また市販品を利用することもできる。
トータルミルクプロテイン（ＴＭＰ）は、脱脂粉乳から乳糖とミネラルを除いたもので、タンパク成分として、カゼインおよびホエイの両成分を含む。一般に製法には沈澱法と膜処理法がある。しかし、沈澱法で製造したもののみをＴＭＰ、または共沈殿物（ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）とよび、ＵＦ膜処理で製造したものをミルクプロテインコンセントレート（ＭＰＣ）として区別する場合もある。
加水分解物のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６産生抑制活性は、加水分解率（Ｄｅｇｒｅｅｏｆ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ：ＤＨ）に依存すると考えられる。以下に、タンパク質の加水分解に関するさまざまな公知技術（関連する文献、特許等）をあげる。当業者であれば、これらの公知技術単独であるいは組み合わせて用いることにより、乳タンパク質から本願発明のペプチドをスクリーニングすることができる。
【００２２】
食品グレードのタンパク質加水分解酵素（プロテアーゼ）は、エンド型およびエキソ型プロテアーゼを含む。基本となる酵素はエンド型の活性が高いプロテアーゼから選択される場合が多い。エンド型プロテアーゼは、例えば、ＡｌｃａｌａｓｅＲ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来）、エスペラーゼ（Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ由来）、ＮｅｕｔｒａｓｅＲ（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）、プロタメックス（バクテリア由来）、ＰＴＮ６．０Ｓ（ブタ膵臓トリプシン）など、エキソ型ペプチダーゼ／エンド型プロテアーゼ複合酵素としては、例えばフレーバーザイム（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来）などがあげられる（以上ノボ社）。他に、エンド型プロテアーゼとして、例えば、キモトリプシン（ノボ社、ベーリンガー社）、プロテアーゼＮアマノ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来、天野製薬）、ビオプラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来、ナガセ産業）、パパインＷ−４０（天野製薬）、エクソ型プロテアーゼとして、豚あるいはウシ内臓由来のカルボキシペプチダーゼなどがあげられる。これらの酵素は限定的なものを意味しない。
抗原性を低下させたアレルギー対応の乳タンパク質の酵素分解には、特異性が比較的高い動物由来のトリプシンやキモトリプシン、植物由来のパパインやブロメラインに加えて、乳タンパク質を非特異的に低分子化できる微生物由来のズブチリシン系の酵素などが用いられている。植物起源のパパイン、バクテリアや菌類由来のプロテアーゼを用いた研究報告（Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ４８：  ６８−７１，  １９９４；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ７：  １２０−１２５，  １９９６；Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  ｐｐ．  ４４３−４７２，  １９９７）もある。加水分解は、これらの基本となる酵素を単独で、あるいは複数組み合わせて行われる。
ホエイタンパク質の加水分解についてのまとめた報告（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ７：  ３０７−３１９，  １９９８）を以下にあげる。
【００２３】
ホエイタンパク質を加水分解する酵素活性は大きく変動する。ペプシンはα−Ｌａおよび変性したα−Ｌａを分解するが、ｎａｔｉｖｅなβ−Ｌｇを分解しない（Ｎｅｔｈ．  Ｍｉｌｋ  ｄａｉｒｙ  Ｊ．，  ４７：  １５−２２，  １９９３）。トリプシンはα−Ｌａをゆっくり加水分解するがβ−Ｌｇはほとんど未分解のままである（Ｎｅｔｈ．  Ｍｉｌｋ  ｄａｉｒｙ  Ｊ．，  ４５：  ２２５−２４０，  １９９１）。キモトリプシンはα−Ｌａを速く分解するが、β−Ｌｇはゆっくり分解される。パパインはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびβ−Ｌｇを加水分解したが、α−Ｌａは抵抗性があった（Ｉｎｔ．  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：  １３−３１，  １９９６ａ）。しかしながら、Ｃａを結合していないα−Ｌａは酸性のｐＨでパパインにより完全に分解された（Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，  ７６：  ３１１−３２０，  １９９３）。乳タンパク質の酵素分解をコントロールして該タンパク質を修飾することにより、広範囲のｐＨおよびプロセッシング条件にわたって、該タンパク質の機能的特性を変更することができる（Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ’ｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｐｐ．  ３９３−４２３，  １９９７  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９７  ；Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  ４８：  ６８−７１，  １９９４）。ペプチド結合の加水分解は、荷電基の数および疎水性の増加、低分子量化、および分子の立体配置の修飾をもたらす（Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，  ７６：  ３１１−３２０，  １９９３）。機能的特性の変化は大きく加水分解度に依存する。ホエイタンパク質の機能性に共通してみられる最も大きな変化は溶解性の増加と粘度の低下である。加水分解度が高い場合、しばしば、加水分解物は加熱しても沈澱せず、ｐＨ  ３．５〜４．０で溶解性が高い。加水分解物は、また、ｉｎｔａｃｔなタンパク質よりもはるかに粘度が低い。この差異はとくにタンパク濃度が高い場合に顕著である。その他の影響は、ゲル特性の変化、熱安定性を高める、乳化および起泡性の増強、乳化および泡の安定性の低下である（Ｉｎｔ．  Ｄａｉｒｙ  ｊｏｕｒｎａｌ，  ６：  １３−３１，  １９９６ａ；Ｄａｉｒｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４，ｐｐ．  ３４７−３７６，  １９８９；Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，  ７９：  ７８２−７９０，  １９９６）。
【００２４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の測定から推定される、アンギオテンシン変換酵素Ｉ（ＡＣＥ）阻害活性の可能性のある数多くのペプチドに関する報告がある（例えば、Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．，  ６７：  ５３−６４，  ２０００；Ｂｒ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．，  ８４：  Ｓ３３−Ｓ３７，  ２０００）。加水分解物から、さまざまなクロマトグラフィー技術を用いて、ＡＣＥ阻害ペプチドを精製および同定する研究報告がなされている（例えば、Ｍａｒｕｙａｍａ，  Ｓ．，  ＆  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｈ．：  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４６：  １３９３−１３９４，  １９８２；Ｍｉｙｏｓｈｉ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ａｇｒｉ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５：  １３１３−１３１８，  １９９１；Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ８：  １７２−１７８，  １９９９；Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５７：  ９２２−９２５，  １９９３）。これらの報告から、ＡＣＥ阻害活性は、さまざまな分離原理に基づくカラム操作で得られた数多くのフラクションに存在していると考えられ、これはＡＣＥ阻害物質の分子特性がかなり多様であることを示している。ＡＣＥ阻害が、さまざまなタンパク質、プロテアーゼおよび加水分解条件で産生される加水分解物中に見出されるという事実は、多様なアミノ酸配列をもったさまざまなペプチドもまた、ＡＣＥ阻害活性を有する可能性を示唆している。このようなペプチドの化学的多様性のために、加水分解物のクロマトグラフィーによる精製は、部分的な活性ペプチドの損失を常に伴うこととなろう。加水分解中、ＡＣＥ阻害活性は連続的に形成され一方で分解される。加水分解物の最大活性はこれら２つのプロセスの最適化の結果である。加水分解物の全体的なペプチド組成は、ＡＣＥ阻害活性を決定し、それは加水分解酵素の特異性およびプロセス条件に依存する。
【００２５】
そこで、必要とする加水分解を最小限にとどめ、ＡＣＥ阻害活性を最大化すべく、ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｅｔｈｏｄｌｏｇｙを用いたホエイタンパク質加水分解の最適化についての報告（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２：  ８１３−８２０，  ２００２）がなされている。
【００２６】
ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドをに関する文献を参照すると、最も短い鎖長のペプチドはＩＰＰおよびＶＰＰ〔吉川正明：  ミルクの先端機能、吉川正明ら編、ｐ．  １８８、弘学出版（１９９８）〕である。
また、α−Ｌａおよびβ−Ｌｇを、ペプシンまたはトリプシン単独で、あるいはペプシンとトリプシン、ペプシン、トリプシンおよびキモトリプシンとを組み合わせで得られた加水分解物（ｄｉｇｅｓｔｓ）、さらに、この加水分解物を２段階のＵＦ濾過（カットオフ値３０ｋＤａ→１  ｋＤａ）で処理した後のそれぞれの保持物（Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）および透過物（Ｐｅｒｍｅａｔｅ）のＡＣＥ阻害活性を測定している（Ｊ．  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．，  ６７：  ５３−６４，  ２０００  ）。それによると、α−Ｌａおよびβ−ＬｇのＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０）は、ともにトリプシン加水分解物（３  ｈ）の＜１  ｋＤａのフラクションが最も高い値（α−Ｌａ：ＩＣ５０＝１０９μｇ／ｍＬ、β−Ｌｇ＝２３７μｇ／ｍＬ）を示している。このときα−ＬａのＤＨは６．２  ％で、分子量分布は、＞５  ｋＤａ：５２  ％、２−５ｋＤａ：１５  ％、１−２ｋＤａ：２０  ％、＜１  ｋＤａ：１３  ％であり、β−ＬｇのＤＨは６．７  ％で、分子量の分布は、＞５  ｋＤａ：２３  ％、２−５ｋＤａ：２７  ％、１−２ｋＤａ：２８  ％、＜１  ｋＤａ：２４  ％である。
また、牛乳カゼイン由来のＡＣＥ阻害ペプチドとして、アミノ酸残基５〜１２からなるペプチドの報告がある（Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  ４９：  １４０５−１４０９，  １９８５）。
一方、後述する実施例では、本発明のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６産生抑制活性を有するペプチドは、鎖長（アミノ酸残基数）が５〜１４であり、分子量は５００〜１８００の範囲内にある。
これらのことを勘案すると、本発明のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６阻害活性を有するペプチドは、鎖長が３〜１６、分子量分布が４００〜２０００ｋＤａ（１アミノ酸の分子量を１３０とした）と見積られる。
乳タンパクから派生するペプチドのサイトカイン産生に対する影響に関しては、ウシカゼイン由来のペプチドが、ネズミ骨髄マクロファージからのＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６産生を増加させるという報告（Ｊ．  Ｓｃｉ．  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．，  ８１：  ３００−３０４，  ２０００）やｐｒｏｂｉｏｔｉｃ乳酸菌による発酵乳の上清中に、ＬＰＳ刺激によるＩＬ−６産生を誘導するペプチドが存在するという報告（Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ，  ５７（２）：  ６６−７０，  ２００２）がある。
【００２７】
ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６産生を抑制する作用を有するペプチドについても、上記ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドのように、さまざまな分離原理に基づくカラム操作で得られた数多くのフラクションに存在している可能性を否定することはできない。
そこで、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α及び／又はＩＬ−６産生の抑制効果を指標に乳タンパクの加水分解条件（変性温度、ｐＨ、温度、加水分解時間および酵素／基質の比）の最適化を上記文献（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２：  ８１３−８２０，  ２００２）を参考に試みることができる。したがって、この結果得られた加水分解の最適化条件は本発明に包含される。
本願発明の実施例によって、ホエイタンパク質由来のペプチドがＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６産生抑制活性を有することが初めて見出された。そこで、さらに加水分解対象を広げ、また加水分解条件をさまざまに変更することによって、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６産生抑制活性を指標に、該活性を有する新たなペプチドをスクリーニングする作業は、当業者にとって、なんら発明的努力を要しない、ルーチン的な作業となった。
【００２８】
すなわち、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６量の測定方法は公知〔例えば、実験医学別冊、バイオマニュアルＵＰ実験シリーズ、サイトカイン実験法、宮島  篤、山本  雅編、（株）羊土社、（１９９７）〕であること、当業者であれば、これら炎症性サイトカインの産生を抑制するペプチドをスクリーニングすべく、上記文献あるいは以下の関連文献を参照することによって、乳タンパク質のさまざまな加水分解条件を設定することが可能となった。
加水分解は、原理的には酸または塩基による加水分解も考えられるが、この方法は制御できないプロセスを含む。すなわち、タンパク質の分解が不規則に起こり、またアミノ酸のいくつかが分解される（例えばＬｅｕ、Ｖａｌおよび／またはＩｌｅが破壊されうる）。したがって、通常は酵素加水分解が選択される。
酵素によるタンパク質加水分解物の機能性は、上記したようにＤＨに依存する。ＤＨは、当業者公知の方法、例えば氷点降下から測定される浸透圧の上昇、ＯＰＡまたはＴＮＢＳ法による遊離アミノ酸の測定、あるいはｐＨスタット法による遊離アミノ酸の測定、等によりモニターできる。ＤＨは、原料、酵素の性質および反応条件（ｐＨ、温度および時間）によって制御することができる。
【００２９】
また、カゼインを各種酵素で加水分解したときの典型的なＤＨの経時変化についての文献（食品と開発，  ｖｏｌ．  ３１（２）：  ２０−２２）がある。すなわち、カゼインをＡｌｃａｌａｓｅＲとフレーバーザイムの併用、フレーバーザイム、プロタメックス、ＮｅｕｔｒａｓｅＲ、ＡｌｃａｌａｓｅＲ、あるいはエスペラーゼを用いて加水分解したとき、ＡｌｃａｌａｓｅＲとＮｅｕｔｒａｓｅＲはＤＨの経時変化が全く同様な形で推移し、加水分解１時間後までＤＥは急激に上昇（約１４  ％）し、それ以後は漸増している（４時間後にほぼ１８  ％）。プロタメックスのＤＥもほぼ同じ値で推移している。ＤＥが最も高い値で推移するのはフレーバーザイム単独あるいはＡｌｃａｌａｓｅＲとフレーバーザイムの併用であり、両者はほぼ同じ値で推移している。併用におけるＤＥは分解１時間後まで急激に上昇（約３４  ％）し、それ以後は漸増している（４時間後にほぼ５３  ％）。
【００３０】
以上の文献から、分解時間６時間でほぼ最大のＤＥ値が得られることが推定される。
特許３１６７７２３は、Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のプロテアーゼとＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のプロテアーゼを用いてホエイタンパク質を非ｐＨスタット法によりＤＥ１５〜３５  ％まで加水分解する方法を開示している。
特表平１０−５０７６４１は、Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来の中性およびアルカリ性プロテアーゼと、Ａ．  ｏｒｙｚａｅ由来のエンド／エクソプロテアーゼとの組み合わせによる乳タンパク質の加水分解方法を開示している。
一方、アレルギー患者の栄養管理、術前術後の患者の栄養管理に有用なオリゴペプチド混合物に関する特許３２２２６３８がある。オリゴペプチド混合物は、ホエイタンパク質を、バチルス属由来のプロテアーゼ〔ビオプラーゼ（ナガセ生化学工業）、アルカラーゼ（ノボ社）、プロテアーゼＮアマノ（天野製薬）など〕と放線菌由来のプロテアーゼ〔アクチナーゼ（科研ファルマ社）、プロナーゼ（シグマ社）〕〕の２種類で加水分解した後、酵素と不溶性の加水分解物を除いたもので、平均鎖長３〜５、最大分子量１５００以下、抗原性がβ−Ｌｇの１／１０，０００以下で苦味や旨味が極めて少ないことを特徴としている。
【００３１】
加水分解温度、ｐＨ、反応時間、および酵素添加量等は、酵素メーカーの使用説明書等を参考に決定することができるが、温度３０〜６５℃、ｐＨ  ５〜９、反応時間２０時間未満から上記文献を参照して選択されうる。
酵素失活は酵素の耐熱性に依存する。加水分解物は分画分子量５０００〜２０，０００ダルトンのＵＦ膜、好ましくは１００００〜１００，０００ダルトンのＵＦ膜で濾過する。この場合のカットオフ値は臨界的なものではない。カットオフ値の測定方法は膜メーカーによって異なり、標準化された方法はまだない。膜モジュールは、Ｐ  ＆  Ｆ（プレートアンドフレーム）型、ＴＵ（チューブラー）型、ＨＦ（ホローファイバー）型、ＳＷ（スパイラルワウンド）型、ＰＬ（プリーツ）型がある。ＵＦ濾過によって、パーミエイト中の２０００ダルトンを大きく超える分子量を有する加水分解物は、大部分除かれる。
パーミエイトは、公知方法で濃縮・噴霧乾燥あるいは凍結乾燥することができる。
【００３２】
α−Ｌａのトリプシン加水分解物、β−Ｌｇの加水分解物、あるいはＬｆの加水分解物のＵＦパーミエイトは、例えば、逆相ＨＰＬＣ（ＯＤＳ  Ｐｒｅｐ，  ２０×３００  ｍｍ、Ｔｏｓｏ，  Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で活性成分を分画することができる。０．１  ％  ＴＦＡを含むアセトニトリル（１  ％／分）の直線勾配で溶出（１０  ｍＬ／分）する。溶出は２１０  ｎｍでモニターする。各フラクションを集めてＴＮＦ−α抑制活性あるいはＩＬ−６抑制活性を測定する。活性画分は分子量＜２  ，０００ダルトンに存在する。
ＴＮＦ−α抑制活性については、α−Ｌａおよびβ−Ｌｇにおいてそれぞれ３つのピーク、Ｌｆにおいて４つのピークに該活性が認められる。これらのピークからペプチドを単離・精製し、分子量測定〔液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ−ＭＳＤ：ＨＰ１１００  ｓｅｒｉｅｓ〕、およびアミノ酸配列を決定する。
【００３３】
α−Ｌａ、β−ＬｇおよびウシＬｆの一次構造は公知（山内邦男，  横山健吉編，  ミルク総合事典，  （株）朝倉書店，  １９９７）である。
α−Ｌａからは、ＷＬＡＨＫ（アミノ酸残基１０４〜１０８位）、ＬＡＨＫＡＬ（アミノ酸残基１０５〜１１０位）、ならびにＣＥＶＦＲ（アミノ酸残基６〜１０位）とＬＤＱＷＬＣＥＫ（アミノ酸残基１１５〜１２２位）のＣ残基がＳ−Ｓ結合したペプチドＬＤＱＷＬＣ（−ＣＥＶＦＲ）ＥＫが得られ、β−Ｌｇからは、ＡＬＰＭＨ（アミノ酸残基１４２〜１４６位）、ＡＬＰＭＨＩＲ（アミノ酸残基１４２〜１４８位）およびＦＫＩＤＡＬＮＥ（アミノ酸残基８３〜８９位）が得られ、そしてＬｆからは、ＷＱＷＲ（アミノ酸残基４１〜４４位）、ＥＤＬＩＷＫ（アミノ酸残基２８３〜２８８位）、ＥＴＡＥＥＶＫ（アミノ酸残基３５２〜３５８位）およびＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲ（アミノ酸残基４８〜５７位）とＣＲのＣ残基がＳ−Ｓ結合したペプチドＬＧＡＰＳＩＴＣ（−ＣＲ）ＶＲが得られうる。
したがって、α−Ｌａ加水分解物のＵＦカットオフ値１０，０００のパーミエイトのＴＮＦ−α抑制活性活性成分はペプチドＷＬＡＨＫ、ＬＡＨＫＡＬおよびＬＤＱＷＬＣ（−ＣＥＶＦＲ）ＥＫである。この３つのペプチドの少なくとも１つを含むα−Ｌａ加水分解物は活性を有する。β−ＬｇのそれはＡＬＰＭＨ、ＡＬＰＭＨＩＲおよびＦＫＩＤＡＬＮＥであり、この３つのペプチドの少なくとも１つを含むβ−Ｌｇ加水分解物は活性を有する。そしてＬｆからは、ＷＱＷＲ、ＥＤＬＩＷＫ、ＥＴＡＥＥＶＫおよびＬＧＡＰＳＩＴＣ（−ＣＲ）ＶＲであり、この３つのペプチドの少なくとも１つを含むＬｆ加水分解物は活性を有する。
α−Ｌａ、β−ＬｇおよびウシＬｆのトリプシン加水分解条件をさまざまに変更することにより活性ペプチドおよびその構成は変わりうる。したがって、本発明は上記活性ペプチドに限定されるものではない。トリプシン以外の他の酵素についても同様なことがいえる。
トリプシンはＡｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）のカルボキシル側のペプチド結合を選択的に切断するエンドペプチダーゼとして作用する（生化学辞典第３版，  （株）東京同人，１９９８  ）。しかしながら、α−Ｌａ由来のＬＡＨＫＡＬ、ならびにβ−Ｌｇ由来のＡＬＰＭＨおよびＦＫＩＤＡＬＮＥのＣ末端側は非特異的に切断されている。
そこで、いくつかの新たなトリプシン認識ペプチドを化学合成し、ＴＮＦ−α抑制活性（以下、「活性」ともいう）を調べた。
ＦＫＩＤＡＬＮＥ（アミノ酸残基８２〜８９位）のＮ末端の近傍に位置するトリプシン認識部位のＫ（アミノ酸残基７７位）とＦＫＩＤＡＬＮＥの間のＩＰＡＶの４残基とＦＫＩＤＡＬＮＥのトリプシン認識部位のＮ末端のＦＫ２残基とを繋いだペプチドＩＰＡＶＦＫ（アミノ酸残基７８〜８３位）を合成した。このＩＰＡＶＦＫのＴＮＦ−α抑制活性を調べたところ活性が認められた（表１、ＥＤ５０＝７．１μＭ）。ＦＫＩＤＡＬＮＥのトリプシン認識部位のＫ以降のＩＤＡＬＮＥと、ＦＫＩＤＡＬＮＥのＣ末端に隣接するＮＫを繋いだＩＤＡＬＮＥＮＫ（アミノ酸残基８４〜９１位）も活性認められた（表１、ＥＤ５０＝３．２μＭ）。また、ＩＰＡＶＦＫとＩＤＡＬＮＥＮＫとを繋いだペプチドＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫ（アミノ酸残基７８〜９１位）も活性が認められた（表１、ＥＤ５０＝０．８μＭ）。
ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫのＣ末端のＮＫを除いたペプチドＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥ（アミノ酸残基７８〜８９位）はＣ末端がトリプシンにより非特異的に切断されたペプチドであるが活性が認められた（表１、ＥＤ５０＝１．８μＭ）。
以上、新たに合成した４つのペプチドＩＤＡＬＮＥＮＫ、ＩＰＡＶＦＫ、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫおよびＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥはトリプシンによる加水分解条件の条件設定により、得られうる。
ところで、ＩＰＡＶＦＫを除く３つの上記ペプチドはいずれもＩＤＡＬＮＥ（アミノ酸残基８４〜８９位）を共有している。また、４つのペプチドのＴＮＦ−α抑制活性を比較すると、３つのペプチドのＥＤ５０は０．８〜３．２μＭである。一方、ＩＰＡＶＦＫのＥＤ５０は７．１μＭと極めて弱いがＩＤＡＬＮＥあるいはＩＤＡＬＮＥＮＫと繋いものは活性が３．９〜８．９倍と強くなる。これらのことを勘案すると、共通配列ＩＤＡＬＮＥはＴＮＦ−α抑制活性発現に必須であることが示唆される。そこでＩＤＡＬＮＥのＴＮＦ−α抑制活性の測定、そして活性が認められた場合の、Ｎ末端あるいはＣ末端の逐次除去による活性発現に必須の最小アミノ酸配列（コア配列）を決定することができる。したがってこのようにして得られた活性を有するペプチドは本発明に包含される。
さらに、α−Ｌａ、β−ＬｇあるいはＬｆの一次構造上には上記ペプチド以外にトリプシン認識部位が存在する。そこで、トリプシンの加水分解条件をさまざまに変更することにより新たな活性ペプチドをスクリーニングすることができる。また、トリプシンで認識されるさまざま切断断片ペプチドを化学合成し、その活性を調べることができる。したがって、このようにして得られた活性を有するペプチドは本発明に包含される。
一方、α−Ｌａ由来のＬＤＱＷＬＣ（−ＣＥＶＦＲ）ＥＫのＳ−Ｓ結合を切断して得られたＬＤＱＷＬＣＥＫとＣＥＶＦＲのＴＮＦ−α産生抑制活性を調べると、前者には活性が認められたが後者には認められなかった。また、ウシＬｆ由来のＬＧＡＰＳＩＬＣ（−ＣＲ）ＶＲのＳ−Ｓ結合を切断して得られたＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲとＣＲのＴＮＦ−α産生抑制活性を調べると前者には活性が認められたが後者には認められなかった。
以上の結果をまとめると、乳タンパク質のトリプシン特異的加水分解物あるいは非特異的加水分解物由来のＴＮＦ−α産生抑制活性を有するペプチドとして、α−ＬａからはＷＬＡＨＫ（配列番号１）、ＬＡＨＫＡＬ（配列番号２）およびＬＤＱＷＬＣＥＫ（配列番号３）が、β−ＬｇからはＡＬＰＭＨ（配列番号４）、ＡＬＰＭＨＩＲ（配列番号５）、ＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号６）、ＩＤＡＬＮＥＮＫ（配列番号７）、ＩＰＡＶＦＫ（配列番号８）、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫ（配列番号９）、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号１０）、そしてウシＬＦからはＷＱＷＲ（配列番号１１）、ＥＤＬＩＷＫ（配列番号１２）、ＥＴＡＥＥＶＫ（配列番号１３）、ＬＧＡＰＳＩＬＣＶＲ（配列番号１４）が得られうる。これらペプチドの分子量あるいは乳タンパク質由来の生物学的活性を有するペプチドの分子量分布から、乳タンパク質のＴＮＦ−α産生抑制活性画分は分子量＜２  ，０００ダルトンに存在することが示唆される。
ここで、α−Ｌａ由来のＷＬＡＨＫとＬＡＨＫＡＬはＬＡＨＫを共有している。そこでこれらのペプチド以外にＬＡＨＫ、ＷＬＡＨＫＡ、ＷＬＡＨＫＡＬおよびＬＡＨＫＡ  の４ペプチドの存在が考えられ、ＴＮＦ−α産生抑制活性の有無を確認することができる。したがって、活性が確認されたペプチドは本発明に包含される。
【００３４】
また、上記ペプチドのいずれも、Ｎ末端あるいはＣ末端のアミノ酸残基を逐次欠失させ、それらの欠失ペプチドの活性を確認することができる。したがって、活性が確認された場合は本発明に包含される。
さらに、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥ、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫのペプチドにおいて、弱いながらＩＰＡＶＦＫは活性を有しており、したがってこの２つのペプチドのＩＰＡＶＦＫ以降のアミノ酸残基を逐次欠失させたペプチドも活性を有する可能性が極めて高く、活性が確認されたそれぞれのペプチドは本発明に包含される。
さらに、活性が確認されたペプチドあるいはこれらのペプチドのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基（Ｄ−アミノ酸を含む）に置換したペプチド誘導体も本願発明に包含される。Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＤＰ−５８）がＬＰＳ刺激ＲＡＷ２６４．７細胞およびネズミの大腸炎のＴＮＦ−α翻訳を阻害するがｍＲＮＡの合成には影響しなかったとする報告（Ｉｎｆｌａｍｍ．  ｒｅｓ．，  ５１：  ４７９−４８２，  ２００２）はこれをサポートする。
また、α−Ｌａ、β−ＬｇあるいはウシＬｆの一次構造に基づき、全一次構造をカバーする、たがいに数残基（３〜５残基程度）オーバーラップペプチド（５〜１０残基程度）を化学合成し、ＴＮＦ−α産生抑制活性あるいはＩＬ−６活性を指標に目的のペプチドをスクリーニングすることも可能である。ペプチドの化学合成法は公知である。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｒ．Ｂ．によって開発された固相法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９６４，  ３，  ｐｐ．  １３８５；  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １９７９，  ２，  ｐｐ．  １−２８４，  ｂｙ  ｅｄ  Ｅ．  Ｇｒｏｓｓ  ＆  Ｊ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）である。他に、同様の固相法で、フロー法を適用し、場合によって側鎖を酸に不安定な基で保護したＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて合成することもできる（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，  Ｅ．  ＆  Ｓｈｅｐｐａｒｄ  Ｒ．  Ｃ．  “Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”，  ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８９）。したがって活性が確認されたペプチドは全て本発明に包含される。
【００３５】
しかしながら、食品としての利用を考えた場合、安全の面より、合成ペプチドよりも、食品タンパク質、とりわけ乳タンパク質を加水分解して得られるペプチドの方が望ましい。一方、経済的な面から、乳タンパク質加水分解物から、上記ペプチドを単離精製して用いることは、産業上実用的ではない。実施例で示すように、α−Ｌａおよびβ−Ｌｇの加水分解物の限外（ＵＦ）濾過のパーミエイトそのものがＴＮＦ−αあるいはＩＬ−６産生を抑制する作用を有している。したがって、炎症緩和作用もつ経口・経腸栄養剤の添加物として、乳タンパク質加水分解物のＵＦパーミエイトそのものあるいはその乾燥物で十分と考えられる。
本発明のＴＮＦ−αあるいはＩＬ−６産生を抑制する作用を有する乳タンパク加水分解物、該加水分解物から粗精製した該活性を有するペプチドあるいは精製ペプチドの１つもしくは２つ以上を含むものは、炭水化物、脂質、ビタミン類、ミネラル類等の適当な混合によって、ＳＩＲＳにおける炎症緩和のための非経口および末梢非経口投与によく適する。
【００３６】
すなわち、本発明の乳タンパク加水分解物、該加水分解物から粗精製したペプチドあるいは精製したペプチドは、侵襲による臓器不全予防のため、ＳＩＲＳ、ＣＡＲＳの制御に有用な経口・経腸栄養剤の製造のための使用に期待がもたれる。また、術前の栄養管理にも使用することができる。ペプチドの有効添加量の１００  ｋｃａｌ中３  ｇ（活性ペプチド換算）以上と推定されるが、有効量はヒトの実験により決定されるべきものである。具体的には、手術、外傷、熱傷、急性膵炎、感染症、腹膜炎、悪性腫瘍などのための経口・経腸栄養剤である。さらに新たに制定された保健機能食品の食品素材としてもその有用性が期待される。保健機能食品あるいはサプリメントに対する加水分解物のの配合量は、ペプチド換算で製品１００  ｍＬ当たり０．９〜３  ｇ好ましくは１．２〜２ｇと推定される。
【００３７】
【実施例】
本発明を実施例および試験例により具体的に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されて解釈されるものではない。
［実施例１］  ホエイタンパク質加水分解物の調製
ＷＰＩ（タンパク含量９０％、ダビスコ社）、β−Ｌｇ（β−Ｌｇ含量９０  ％、ダビスコ社）、あるいはα−Ｌａ（α−Ｌａ含量９０  ％、ダビスコ社）をリン酸緩衝液に１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。対照として、カゼインナトリウム（純度９５％以上、和光純薬）を同濃度でリン酸緩衝液に溶解した。タンパク１  ｇ当たりトリプシン（ブタ膵臓由来、活性：２５  ＵＳＰキモトリプシンＵｎｉｔｓ／ｍｇ以下、和光純薬）５０  ｍｇを添加し、３７℃で６時間反応させた。反応後、２０，０００×ｇ、１０分で遠心して不溶性成分を沈殿除去した後、分画分子量１０，０００のＵＦ膜処理（ミリポア社ウルトラフリー−ＭＣ）した。透過画分（パーミエイト）は０．２２μｍのＭＦ膜（ミリポア社マイレックス−ＧＶ）処理後、実験に供した。
【００３８】
［実施例２］  ＷＰＩ加水分解物の調製
ＷＰＩ（タンパク含量９０％、ダビスコ社）をリン酸緩衝液に１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、以下の４つの反応区分に分けた。
（１）トリプシン（実施例１と同じ、以下同様）を添加し、５０℃で５時間反応させた。
（２）プロテアーゼＡアマノＧを５０  ｍｇ添加し、５０℃で５時間反応させた。
（３）トリプシンを添加し、５０℃で５時間反応させた後、さらに、プロテアーゼＡアマノＧを５０  ｍｇ添加し、５０℃で５時間反応させた。
（４）プロテアーゼＡアマノＧを５０  ｍｇ添加し、５０℃で５時間反応させた後、さらに、トリプシンを５０  ｍｇ添加し、５０℃で５時間反応させた。
反応終了後、１５分間煮沸した。遠心処理（２０，０００×ｇ、１０分）後、分画分子量１０，０００のＵＦ膜処理（ミリポア社ウルトラフリー−ＭＣ）した。パーミエイトは０．２２μｍ  ＭＦ膜処理後、実験に供した。
【００３９】
［実施例３］  β−Ｌｇ由来およびα−Ｌａ由来のＴＮＦ−α産生抑活性を有するペプチドの同定  β−Ｌｇ（β−Ｌｇ含量９０％、ダビスコ社）、あるいはα−Ｌａ（α−Ｌａ含量９０％、シグマ社）のトリプシン加水分解物を、実施例１に準じて調製した。
これらのトリプシン加水分解物の活性成分を逆相ＨＰＬＣで分画した。分析カラムはＣ１８  ＳＧ１２０（資生堂）４．６  ｍｍφｘ  ２５０  ｍｍを、移動相はアセトニトリル／０．１％ＴＦＡの溶媒による直線濃度勾配を用いた。分取カラムは、Ｃ１８  ＳＧ１２０  （資生堂）１５  ｍｍφｘ  ２５０  ｍｍを用い、同様の溶媒で行った。β−Ｌｇ由来のペプチドの逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを図４に、α−Ｌａ由来のペプチドの逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを図６に示す。
［試験例１］  ＴＮＦ−α産生抑制作用
実施例１における、分解前のＷＰＩ、β−Ｌｇ、α−Ｌａおよびカゼイン、あるいはこれらの加水分解物について、ＴＮＦ−α産生抑制作用を調べた。
ＴＨＰ−１細胞（急性単球性白血病患者由来、理化学研究所）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：三菱化学）、ホルボールエステル（ＴＰＡ、和光純薬）  ２００  ｎＭを含むＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｓｉｇｍａ）中、５％ＣＯ２の条件下で３７℃、７２時間培養し、単球・マクロファージに分化誘導させた。
分化誘導後、分解前のＷＰＩ、β−Ｌｇ、α−Ｌａ、およびカゼインを０  ｍｇ／ｍＬ（対照）、０．１  ｍｇ／ｍＬ、１．０  ｍｇ／ｍＬ、あるいは加水分解物を０  ｍｇ／ｍＬ（対照）、０．０２  ｍｇ／ｍＬ、０．２  ｍｇ／ｍＬ含むＲＰＭＩ  １６４０培地に交換し、２時間培養した。次いでＬＰＳ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌ．  Ｌａｂ．  Ｉｎｃ．）を  １００  ｎｇ／ｍｌの終濃度で培地に添加し、４時間培養した。培養上清中のＴＮＦ−α量を、市販のＴＮＦ−α測定用ＥＬＩＳＡキット（アマシャムバイオサイエンス）で測定した。分解前のＷＰＩ、β−Ｌｇ、α−Ｌａ、およびカゼインのＴＮＦ−α産生抑制作用を図１に、これらの加水分解物のＴＮＦ−α産生抑制作用を図２、８および９に示す。
各ホエイタンパク、各ホエイタンパク質のトリプシン分解物はいずれもＴＮＦ−α産生抑制効果を示した。カゼインは分解前も分解後もＴＮＦ−α産生抑制効果を示さなかった。ホエイタンパク質のトリプシン分解物は熱安定性が高く、加熱処理してもＴＮＦ−α産生抑制作用を有するので、炎症反応緩和のため、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）患者用の経口・経腸栄養剤に添加することが可能である。
【００４０】
［試験例２］  プロテアーゼの組み合わせによる加水分解物のＴＮＦ−α産生抑制作用
実施例２で得られたＷＰＩの各プロテアーゼ加水分解物について、試験例１の方法に準じて、培養上清中のＴＮＦ−α産生量を測定した。結果を図３に示す。
トリプシンによるＷＰＩの加水分解物のＴＮＦ−α産生抑制作用は、ＡアマノＧによる加水分解物のそれよりも強かった。
一方、ＷＰＩをトリプシンで分解後さらにＡアマノＧで分解（トリプシン→ＡアマノＧ）した場合、あるいは逆に、ＷＰＩをＡアマノＧで分解後トリプシンで分解（ＡアマノＧ→ＧＰＴＮ６．０Ｓ）した場合、いずれもＴＮＦ−α産生抑制作用はほぼ同程度で、トリプシン単独のそれよりもやや強い傾向を示した。このことは、２つの酵素の組み合わせにより、よりＴＮＦ−α産生抑制活性の高い分解物が得られることを示唆している。
［試験例３］  ＴＮＦ−α産生抑制活性を有するペプチドの単離・精製
実施例１と同様の方法で調製したβ−Ｌｇ、α−Ｌａおよび同様に実施例１の方法で調製したウシＬｆ（Ｗａｋｏ社）のＵＦパーミエイトを逆相ＨＰＬＣで分画した（図４、６および１１）。各ピークを分取し、それらのＴＮＦ−α産生量（ＴＮＦ−α産生抑制活性）を試験例１の方法に準じて測定した。その結果、β−Ｌｇおよびα−Ｌａについてそれぞれ３つのピーク、そしてＬｆは４つのピークにＴＮＦ−α産生抑制活性が認められた。そこで各ピークを精製し、分子量測定〔液体クロマトグラフ／質量分析計（ＬＣ−ＭＳＤ：ＨＰ１１００  ｓｅｒｉｅｓ〕およびアミノ酸配列を決定した。β−ＬｇからはＡＬＰＭＨ、ＡＬＰＭＨＩＲおよびＦＫＩＤＡＬＮＥ、α−ＬａからはＬＡＨＫＡＬ、ＷＬＡＨＫ、ならびにＣＥＶＦＲとＬＤＱＷＬＣＥＫのＣ残基がＳ−Ｓ結合したペプチド、そしてＬｆからはＥＴＡＥＥＶＫ、ＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲとＣＲのＣ残基がＳ−Ｓ結合したペプチド、ＷＱＷＲおよびＥＤＬＩＷＫが得られた。β−Ｌｇについては、その一次構造に基づき、ＦＫＩＤＡＬＮＥのＮ末端に隣接するＩＰＡＶ４残基とＮ末端ＦＫの２残基を結合したＩＰＡＶＦＫ、ＦＫＩＤＡＬＮＥのＮ末端のＦＫを除き一方Ｃ末端にＮＫを付加したＩＤＡＬＮＥＮＫ、ＦＫＩＤＡＬＮＥのＮ末端に隣接するＩＰＡＶの４残基をＮ末端に付加したＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥ、さらにＦＫＩＤＡＬＮＥのＣ末端に隣接するＮＫを付加したＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫを化学合成した。また、α−Ｌａについて、ＣＥＶＦＲとＬＤＱＷＬＣＥＫのＳ−Ｓ結合を切断して得られたＣＥＶＦＲとＬＤＱＷＬＣＥＫのＴＮＦ−α産生抑制活性を調べた結果、ＣＥＶＦＲには活性が認められなかった。
また、ウシＬｆについて、ＬＧＡＰＳＩＬＣＶＲとＣＲのＳ−Ｓ結合を切断して得られたＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲとＣＲのＴＮＦ−α産生抑制活性を調べた結果、ＣＲには活性が認められなかった。以上の結果をまとめると、乳タンパク質由来のＴＮＦ−α産生抑制活性を有するペプチドとして、α−ＬａからはＷＬＡＨＫ（配列番号１）、ＬＡＨＫＡＬ（配列番号２）およびＬＤＱＷＬＣＥＫ（配列番号３）が、β−ＬｇからはＡＬＰＭＨ（配列番号４）、ＡＬＰＭＨＩＲ（配列番号５）、ＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号６）、ＩＤＡＬＮＥＮＫ（配列番号７）、ＩＰＡＶＦＫ（配列番号８）、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫ（配列番号９）、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号１０）、そしてＬＦからはＷＱＷＲ（配列番号１１）、ＥＤＬＩＷＫ（配列番号１２）、ＥＴＡＥＥＶＫ（配列番号１３）、ＬＧＡＰＳＩＬＣＶＲ（配列番号１４）が得られた。
ホモロジー検索の結果、配列番号３、６、７、８、９、１０、１３および１４は新規物質であることが判明した。配列番号１、２、４および５は、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する報告（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６７：  ６５−７１，  ２０００；  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  ８４：  Ｓｕｐｐｌ．  １：  Ｓ３３−３７，  ２０００）があるが、ＴＮＦ−α産生抑制活性については報告がない。また、ＷＱＷＲは抗疱疹作用、ＥＤＬＩＷＫは抗ガン、抗アポトーシス、抗潰瘍剤、創傷治療剤、強心剤、抗ｈｅｐａｒｉｎ、抗ｉｃｈｅｍｉａ、抗酸化剤としての用途がある。
これらのペプチドのアミノ酸配列に基づいて、それぞれの対応するペプチドを合成し、合成ペプチドのＴＮＦ−α産生抑制作用を試験例１の方法に準じて調べた。その結果、これらのペプチドは全て１〜１０μｇ／ｍＬで濃度依存的にＴＮＦ−α産生抑活性を示した（図５、７、１０および１１）。これらのペプチドのＥＤ５０（５０  ％  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）を表１にまとめて示した。
【００４１】
【表１】
2004155751.tif 000016
【００４２】
［試験例４］  ＩＬ−６産生抑制作用
６週齢のＩＣＲマウス（雄）を購入し、１週間ＡＩＮ−９３Ｍ飼料および飲水を自由摂取させ馴化させた。１群７匹として、体重の平均値が等しくなるように、カゼイン分解物投与群（５ｍｇ／マウス）、β−Ｌｇトリプシン分解物投与群（５ｍｇ／マウス）、α−Ｌａトリプシン分解物投与群（５ｍｇ／マウス）、ＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号６）投与群（１ｍｇ／マウス）、ＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号６）投与群（５ｍｇ／マウス）、ＬＤＱＷＬＣＥＫ（配列番号３）投与群（１ｍｇ／マウス）、ＬＤＱＷＬＣＥＫ（配列番号３）投与群（５ｍｇ／マウス）の７群に分けた。試料は３日間連続（１３：００）してゾンデを用いて経口投与した。最終投与から２４時間後、ＬＰＳを５０μｇ／マウスで腹腔内投与した。９０分後に眼窩より採血し遠心操作により血清を得た。血清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡにより測定した（図１３）。Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＳＬＤによる統計学的処理により、カゼイン投与群に対する有意差を検定した。
β−Ｌｇトリプシン分解物投与群、ＦＫＩＤＡＬＮＥ（配列番号６）投与群およびＬＤＱＷＬＣＥＫ（配列番号３）投与群のＩＬ−６濃度は、カゼインに対して濃度依存的に有意に低下（＊＊ｐ＜０．０５）し、後者２群の低下は濃度依存的であった。
【００４３】
【配列表】
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【発明の効果】
本発明により、ＴＮＦやＩＬ−６などの炎症性サイトカイン産生に刺激を加えることなく、それを抑制しつつ、免疫能を賦活化する作用を有する、経口摂取可能なペプチドを提供することができた。また、生体侵襲時の代謝異常や臓器障害を防止しかつ免疫能を亢進させる経口・経腸栄養剤の製造に使用する該ペプチドを提供することができた。さらにまた、栄養補給や健康維持などに有用な保健機能食品（特定保健用食品および栄養機能食品）の製造に使用する該ペプチドを提供することができた。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＨＰ−１細胞の単球・マクロファージへの分化誘導後における、未分解のＷＰＩ、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンあるいはカゼインの、ＬＰＳ誘導ＴＮＦ−α産生抑制効果を示す。
【図２】ＷＰＩ、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンおよびカゼインのトリプシン加水分解物の、同上ＴＮＦ−α産生抑制効果を示す。
【図３】ＷＰＩのトリプシン（ブタ膵臓由来、Ｗａｋｏ社）加水分解物、ＷＰＩのＡアマノＧ加水分解物、ＷＰＩのトリプシンとＡアマノＧの組み合わせによる加水分解物、およびＡアマノＧとトリプシンの加水分解物の、同上ＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図４】β−ラクトグロブリンのトリプシン加水分解物のＵＦパーミエイトの逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図５】β−ラクトグロブリン由来のペプチドＡＬＰＭＨ、ＡＬＰＭＨＩＲおよびＦＫＩＤＡＬＮＥの同上ＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図６】α−ラクトアルブミンのトリプシン加水分解物のＵＦパーミエイトの逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図７】α−ラクトアルブミン由来のペプチドＷＬＡＨＫ、ＬＡＨＫＡＬ、ＣＥＶＦＲおよびＬＤＱＷＬＣＥＫの同上ＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図８】β−ラクトグロブリンのトリプシン加水分解物の各濃度における同上ＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図９】α−ラクトアルブミンのトリプシン加水分解物の各濃度におけるＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図１０】β−ラクトグロブリン由来のペプチドＩＤＡＬＮＥＮＫ、ＩＰＡＶＦＫ、ＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥおよびＩＰＡＶＦＫＩＤＡＬＮＥＮＫの、同上ＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図１１】ウシラクトフェリンのトリプシン加水分解物の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【図１２】ウシラクトフェリン由来のペプチドＷＱＷＲ、ＥＤＬＩＷＫ、ＥＴＡＥＥＶＫおよびＬＧＡＰＳＩＬＣＶＲの各濃度におけるＴＮＦ−α産生抑制作用を示す。
【図１３】カゼイントリプシン加水分解物、β−Ｌｇトリプシン分解物、α−Ｌａトリプシン加水分解物、β−Ｌｇ由来のペプチドＦＫＩＤＡＬＮＥ、あるいはα−Ｌａ由来のＬＤＱＷＬＣＥＫマウスにおける経口摂取後の血清中のＬＰＳ誘導ＩＬ−６の産生抑制作用を示す。


【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】
2004155751.tif 000025