(57)【要約】【課題】経口摂取することによりＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）活性、ＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）活性が図られ、腫瘍又はウィルス感染症又は炎症性疾患に対して効能を有するＮＫ細胞活性化剤や、ＣＴＬ活性化剤や、腫瘍又はウィルス感染症又は炎症性疾患の治療薬やＮＫ細胞活性化促進物質やＣＴＬ活性か促進物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】グリアジンに被覆されたメロン由来のＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）を含有し、好ましくは、経口用であり、ソルビット及び／又はグリセリンを含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリアジンに被覆されたメロン由来のＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）を含有することを特徴とするＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）活性化剤。
【請求項２】
経口用であることを特徴とする請求項１記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項３】
ソルビット及び／又はグリセリンを含有することを特徴とする請求項１又は２記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項４】
グリアジンに被覆されたメロン由来のＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）を含有することを特徴とするＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）活性化剤。
【請求項５】
経口用であることを特徴とする請求項４記載のＣＴＬ活性化剤。
【請求項６】
ソルビット及び／又はグリセリンを含有することを特徴とする請求項４又は５記載のＣＴＬ活性化剤。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか記載のＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）活性化剤を含有することを特徴とする腫瘍、ウィルス感染症又は炎症性疾患の治療薬。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか記載のＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）活性化剤を含有することを特徴とする腫瘍又はウィルス感染症又は炎症性疾患の治療薬。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか記載のＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）活性化剤と、被験物質とを接触させることを特徴とするＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ
ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）活性化促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項４〜６のいずれか記載のＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）活性化剤と、被験物質とを接触させることを特徴とするＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）活性化促進物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）活性化剤、ＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）活性化剤や、これらを用いた腫瘍やウィルス感染症の治療薬や、ＮＫ細胞活性化促進物質のスクリーニング方法、ＣＴＬ活性化促進物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
活性酸素は、疲労やストレスあるいは加齢等による生理機能の低下などが原因となり発生することが知られている。過剰に産生された活性酸素は生体にとってダメージとなる酸化物質の一つであり、ＤＮＡ損傷の結果、細胞の癌化に寄与することが示唆されている。ＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）は、この活性酸素に作用し、宿主の免疫応答の結果、過剰に産生される活性酸素を中和することが知られている。近年、活性酸素に起因するストレス等による生体での酸化状態を緩和するために、多くのＳＯＤ含有抗酸化食品や医薬補助品等が開発されている。かかる抗酸化食品等として、例えば、ＳＯＤ等を高度に含有し、老化防止及び老化に伴う各種疾患の予防・治療作用を有する健康食品として有用である蓬の搾汁液の固形化物からなる葉類加工食品（例えば、特許文献１参照。）や、ＳＯＤ様活性及び／又は抗酸化能を有する物質、フェノール化合物、及び糖蛋白質、糖化フラボノイド等の糖化合物を含有してなる制癌・抗癌剤（例えば、特許文献２参照。）や、本質的にスーパーオキシドジスムターゼと、脂質、タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つの化合物との組み合わせと、及び任意に１以上の薬理学的に受容し得る賦形剤からなる医薬組成物（例えば、特許文献３参照。）等が知られている。しかしながら、従来の経口摂取されたＳＯＤの生体内での活性は低く、その抗酸化効果について不明な点も多い。
【０００３】
一方、ＮＫ細胞はヒト抹消血リンパ球の５〜１５％を占め、腫瘍細胞やウィルス感染細胞等を抗原感作なしにＭＨＣ非拘束に傷害して生体の恒常性維持作用を有するため、ＮＫ細胞の活性化を図った腫瘍やウィルス感染症の治療薬や補助剤が知られている。かかるＮＫ細胞活性化を図った薬剤等として、例えば、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン又はその塩と免疫増強剤を有効成分とする免疫不全治療薬（例えば、特許文献４参照。）や、亜砒素酸と亜砒素酸以外のＡＳＫ１−ＳＥＫ１−ＪＮＫカスケード活性物質を含む固形癌治療用製剤（例えば、特許文献５参照。）等が知られており、また、ＮＫ細胞の活性化のために樹状細胞又は樹状細胞から誘導された調製物とＮＫ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることを含むＮＫ細胞の活性化方法（例えば、特許文献６参照。）等が知られている。
【０００４】
また、キラーＴ細胞は、抗原特異的に標的細胞と結合し、これを破壊する細胞傷害Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（ＣＴＬ）等の細胞傷害性Ｔ細胞であり、マーカーとしてＣＤ８抗原を持ち、標的細胞表面の非自己抗原と共に自己と同一のＭＨＣクラスＩ抗原を認識してＭＨＣ拘束により破壊するため、ウィルス等の細胞内寄生体感染細胞や腫瘍細胞等の排除や、移植組織の拒絶反応の中心的役割を果たす。このようなＣＴＬ活性に関して、ＨＩＶに対する中和性抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球を誘発する複合合成ペプチド構築物（例えば、特許文献７参照。）等が提案されている。
【０００５】
しかしながら、ＳＯＤを適用し経口で摂取することにより、副作用が少なく、ＮＫ細胞活性やＣＴＬ活性を増強しうる経口ＳＯＤ製剤は知られていなかった。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１１−２０６３３３号公報
【特許文献２】
特開平６−１９９６９６号公報
【特許文献３】
特表平１０−５１１９４４号公報
【特許文献４】
特開平６−２７９２７６号公報
【特許文献５】
特開２００２−６９００５号公報
【特許文献６】
特開平１１−２９００６８号公報
【特許文献７】
特表平９−５００６１４号公報
【特許文献８】
特開平９−１７６１９２号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、副作用が少なく、ＮＫ細胞の有するＭＨＣ非拘束性細胞傷害活性を増強しうるＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬの有するＭＨＣ拘束性細胞傷害活性を増強しうるＣＴＬ活性化剤や、これらＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤を含有する治療薬や、ＮＫ細胞活性化促進物質やＣＴＬ活性化促進物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、メロン由来のＳＯＤをグリアジンで被覆したオキシカインを含む物質が、経口摂取することにより胃における分解が抑制され腸に達し、副作用による悪影響が少なく、生体内におけるＳＯＤ活性を維持し、優れたＮＫ細胞活性化作用やＣＴＬ活性化作用を有する製剤となり、マウスにオキシカイン含有物を経口摂取させることによりＮＫ細胞活性やＣＴＬ活性の向上が図られ、その結果癌細胞の除去・増殖の抑制を行うことができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、グリアジンに被覆されたメロン由来のＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ）を含有することを特徴とするＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）活性化剤に関し、好ましくは、経口用であることを特徴とする請求項１記載のＮＫ細胞活性化剤（請求項２）や、ソルビット及び／又はグリセリンを含有することを特徴とする請求項１又は２記載のＮＫ細胞活性化剤（請求項３）に関する。
【００１０】
また、本発明は、グリアジンに被覆されたメロン由来のＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）を含有することを特徴とするＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）活性化剤（請求項４）や、経口用であることを特徴とする請求項４記載のＣＴＬ活性化剤（請求項５）や、ソルビット及び／又はグリセリンを含有することを特徴とする請求項４又は５記載のＣＴＬ活性化剤（請求項６）に関する。
【００１１】
また、本発明は、請求項１〜３のいずれか記載のＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）活性化剤を含有することを特徴とする腫瘍、ウィルス感染症又は炎症性疾患の治療薬（請求項７）や、請求項４〜６のいずれか記載のＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）活性化剤を含有することを特徴とする腫瘍又はウィルス感染症又は炎症性疾患の治療薬（請求項８）に関し、また、請求項１〜３のいずれか記載のＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）活性化剤と、被験物質とを接触させることを特徴とするＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）活性化促進物質のスクリーニング方法（請求項９）に関し、好ましくは、請求項４〜６のいずれか記載のＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）活性化剤と、被験物質とを接触させることを特徴とするＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）活性化促進物質のスクリーニング方法（請求項１０）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤は、グリアジンに被覆されたメロン由来のＳＯＤ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）を含有するものであれば特に制限されるものではないが、特に、経口用であることが好ましい。
本発明のＮＫ細胞活性化剤に適用されるグリアジンで被覆されたメロン由来のＳＯＤとしては、メロン由来のＳＯＤがグリアジンで被覆されたものであれば、特に制限されるものではない。ＳＯＤは一般的に超酸化物イオンＯ２−の不均化反応２Ｏ２−＋２Ｈ＋→Ｏ２＋Ｈ２Ｏ２を触媒する酵素であり、大気中の酸素から生体内で生成しうる超酸化物イオンＯ２−・を消去することによりＯ２−・とこれから生じる他の活性酸素の毒性から生物を保護すると考えられている。
【００１３】
本発明のＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤に使用されるメロン由来のＳＯＤとしては、アムスメロン、ホームランメロン、プリンスメロン、アンデスメロン、キンショウメロン、パパイヤメロン、マスクメロン等のメロンであっても、また、メロンの果皮、果肉等の果実や、葉、根等に含有されるものであってもよいが、特に、南フランス、アヴィニョン地方で栽培されているヴォークルシアン種を品種改良したメロンの果肉から抽出したＳＯＤが好ましい。
【００１４】
かかるＳＯＤをメロンから抽出するには一般に公知の方法によることができる。例えば、粉砕したメロンに水を加えることによりＳＯＤの水溶液として容易に抽出することができる。
【００１５】
本発明のＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤に使用されるメロン由来のＳＯＤを被覆するグリアジンとしては、特に限定されるものではないが、種々の穀類、小麦、ライ麦、大麦、エンバク、米、キビ及びトウモロコシ等から得ることができ、特に小麦から得たグリアジンや、小麦粉又は上記穀類に含有される新鮮なグルテンからグルテニンを除去して誘導される非変性のものが好ましい。小麦等からグリアジンを得るには、公知の方法により抽出することができる。例えば、小麦から常法により分離されたグルテン（生グルテン）又はその乾燥粉末（バイタルグルテン）を、クエン酸、乳酸、リンゴ酸又は酢酸等の有機酸を含有する１〜２０容量％エタノール水溶液を抽出溶媒として用い、プロペラ等の付いた抽出槽で７〜１０倍量の抽出溶媒と共に、溶液温度を２０〜３０℃に保ちながら、１〜３時間攪拌した後、遠心分離操作又は濾過操作等の操作により沈澱物（不溶性物）と上澄液（可溶性物）とに分離し、上澄液に含有されたグリアジンを得ることができる（例えば、特許文献８参照。）。本発明に使用されるグリアジンとしてはかかる上澄液をそのまま、又は、乾燥後水溶液としたものを適用することができる。
【００１６】
本発明のＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤には、ソルビットやグリセリンを含有させることが、ＳＯＤの安定性等の点で好ましい。
【００１７】
かかるグリアジンによりメロン由来ＳＯＤを被覆して本発明のＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤を調製する方法としては、８０％エタノールを０〜５０℃の温度、好ましくは４０℃前後とし、ソルビトール、グリセリン、メロン由来ＳＯＤを順次添加し、溶解するまで攪拌し、その後、例えば、３７℃、湿度２％下でフィルム状固体となるまで乾燥し、得られたフィルム状固体を粉砕して粉末とする方法等を挙げることができる。また、上記方法においてグリアジン被覆メロン由来ＳＯＤとしてオキシカイン（商品名：ＳＴＩＭＥＯＳ、コンビ（株）社製）等を適用することができる。
【００１８】
本発明のＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分、例えば、デキストリン等を添加することができる。また本発明のＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤は、経口用又は非経口用とすることができるが、経口用であることがより好ましい。経口用としては通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型とすることができる。ヒトにおける用量は、１日１０〜１０００ＩＵ、１日１〜３回の服用等とすることができる。また、非経口用としては、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型とすることができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与用とすることもできる。
【００１９】
本発明のＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤は、グリアジンにより被覆されたメロン由来のＳＯＤが、経口投与によっても胃で分解されず腸にまで達することが可能となり、副作用が少なくＮＫ細胞やＣＴＬの活性化を図ることができると考えられる。本発明のＮＫ細胞活性化剤においては、腫瘍細胞やウィルス感染細胞等を抗原感作なしにＭＨＣ非拘束的に傷害するＮＫ細胞の活性化を図り、腫瘍細胞やウィルス感染細胞、炎症部位における活性酸素の発生を抑制し、活性酸素に起因する生体細胞の阻害を抑制し生体の恒常性の維持に有効に作用する。
【００２０】
また、本発明のＣＴＬ活性化剤においては、グリアジンにより被覆されたメロン由来のＳＯＤを一定量以上経口投与することによって、ＣＤ８陽性αβ型Ｔ細胞の増加が認められ、これによりＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ）の活性化が確認される。しかしながら、ＣＤ８陽性αβ型Ｔ細胞の活性の誘導にはＴｈ１型Ｔ細胞の活性化によるサイトカインヘルプが必須であり、グリアジンにより被覆されたメロン由来のＳＯＤによる直接的なＣＤ８陽性αβ型Ｔ細胞のＣＴＬ活性の誘導は考えにくい。グリアジンにより被覆されたメロン由来のＳＯＤの生体における作用の一つとして、マクロファージのＮＯ産生の亢進が報告されていることより、グリアジンにより被覆されたメロン由来のＳＯＤにより生じた宿主のＳＯＤ活性の亢進とそれに伴い代謝されたＮＯにより、Ｔ細胞の活性化が促進されたものと思われる。すなわち、ＮＯの過剰産生により、Ｔ細胞のＮＦＡＴの機能亢進が起こりＴＣＲ抗原認識した際の細胞内シグナル伝達機構が速やかに行われ、ＮＦ−κＢを介した転写活性が増強されたものと推測される。サイトカインおよびシグナル伝達機構を解析することでグリアジンにより被覆されたメロン由来のＳＯＤの生体防御機構における作用機序がさらに解明されると思われる。このようなＣＴＬ活性化効果を有する本発明のＣＴＬ活性化剤によれば、免疫細胞の誘導が促進され、腫瘍細胞やウィルス等の細胞内寄生体感染細胞の破壊や、移植組織の拒絶反応が促進され、腫瘍細胞やウィルス感染細胞、炎症部位における活性酸素の発生を抑制し、活性酸素に起因する生体細胞の阻害を抑制し生体の恒常性の維持に有効に作用する。
【００２１】
かかるＮＫ細胞活性やＣＴＬ活性は、５１Ｃｒで標識した標的細胞がＮＴ細胞やＣＴＬにより傷害され、その結果培養液中に漏洩してくる５１Ｃｒの放射能を測定することにより、算出することができる。
【００２２】
本発明のＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤は、ＮＫ細胞活性やＣＴＬ活性を必要とする多くの疾病に対して有効に作用し、例えば、腫瘍又はウィルス感染症の治療薬として用いることができ、脳腫瘍、上顎癌、上咽頭癌、肺癌、食堂癌、直腸癌、大腸癌、肝臓癌、胃癌、胆嚢癌、すい臓癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病等の腫瘍や、ＨＩＶ感染等のウイルス感染症、リューマチ、線維症等の炎症性疾患、その他、多量の酸素の存在と関連している中枢神経系、虚血、非血管性胃腸障害、眼性傷害、抗癌治療の望ましくない効果を抑制する作用や毒性症状に対して効能を有する。
【００２３】
本発明のＮＫ細胞活性化促進物質やＣＴＬ活性化促進物質のスクリーニング方法としては、上記ＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤と被験物質とを接触させる方法であれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの実施など特に制限されるものではなく、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法としては、被験物質の存在下、ＮＫ細胞活性化剤やＣＴＬ活性化剤を標的細胞と、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養し、ＮＫ細胞活性やＣＴＬ活性を上記方法等によって測定する方法を例示することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１：腫瘍細胞株の調製
液体窒素容器に冷凍保存してある線維肉腫型腫瘍細胞株Ｍｅｔｈ  Ａ（ＲＣＢ０４６４：理化学研究所製）を非動化済み１０％ＦＢＳ（ＩＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、０．２％ＮａＣＯ３（和光純薬工業（株）社製）含有Ｈａｎｋｓ  ＢＳＳ洗浄用培地にて３回遠心洗浄後、１０％ＦＢＳ、０．２％ＮａＣＯ３、１００μ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、１００μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業（株）社製）及び２×１０−３Ｍ  Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）含有ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）増殖培地を用いて、５％ＣＯ２存在下３７℃で培養を行った。ＢＡＬＢ／ｃ７週齢雌マウスにＭｅｔｈ  Ａ細胞を１×１０６／マウスの濃度で腹腔内接種し、腫瘍接種後１週間目に腹水より無菌的に細胞を回収した。洗浄用培地で３回遠心洗浄後、ＲＰＭＩ−１６４０増殖用培地にて５％ＣＯ２存在下３７℃で培養を行い、所定の腫瘍細胞接種量に調製した。
【００２５】
実施例２：若齢担癌マウスにおける腫瘍増殖を指標とした抗腫瘍抑制効果の検討
検疫・検収の終了後、ＢＡＬＢ／ｃ７週齢雌マウス（日本エスエルシー（株）社製）に、被験物質をマウス１匹あたり２００μＬずつ１日１回１週間連続経口投与した。被験物質には小麦グリアジン包摂メロン抽出ＳＯＤとしてオキシカイン（ＳＴＩＭＥＯＳ：コンビ（株）社製）の３ｍｇ／ｍＬ（高濃度）、０．３ｍｇ／ｍＬ（低濃度）のＰＢＳ溶液を使用した。１群あたりの動物の匹数は８匹とし、試験群Ａ；オキシカイン高濃度投与群（３０ｍｇ／ｋｇ／日）、試験群Ｂ；オキシカイン低濃度投与群（３ｍｇ／ｋｇ／日）、被験物質の対照群として、対照群Ｃ；ＰＢＳ溶液投与群とした。その後、マウスの背部皮下に実施例１で調製した線維肉腫細胞を１匹当たり２×１０６ｃｅｌｌｓ接種した。接種後、腫瘍を測定し、生存率を求めた。腫瘍の測定は、生着した腫瘍の大きさを経日的にマイクロメーターで測定し、体積（長径×短径×幅；ｍｍ３）を求めた。結果を、表１及び図１に示す。尚、腫瘍の大きさに関しては、各群毎に平均値および標準誤差を算出した。生存率は、経過観察中生存した個体数を群当たりの総数で除した値に１００を乗じた値として求めた。結果を表２及び図２に示す。
【００２６】
【表１】
2004155707.tif 000002
【００２７】
【表２】
2004155707.tif 000003
【００２８】
結果からも明らかなように、オキシカイン非投与群Ｃ及びオキシカイン投与群Ａ、Ｂともに腫瘍細胞接種１０日目頃より経日的に腫瘍細胞の増殖が認められたが、オキシカイン投与群ではオキシカイン非投与群と比較して増殖は緩徐であった。オキシカイン非投与群Ｃにおいては腫瘍増殖にともない、腫瘍接種後３０日目から徐々に死亡個体が認められ、４０日目までに全例が死亡したのに対し、オキシカイン投与群においては、死亡個体は認められず生存率は１００％であった。オキシカインは腫瘍細胞増殖抑制効果があり、その効果は濃度依存であることが判明した。
【００２９】
実施例３：老齢担癌マウスにおける腫瘍増殖を指標とした抗腫瘍抑制効果の検討
検疫・検収の終了後、自己腫瘍の認められないＢＡＬＢ／ｃ４０週齢雌マウス（日本エスエルシー（株）社製）に、１群当たりの匹数を６匹とした以外は、実施例２と同様に、被験物質を経口投与した後、実施例１で調製した線維肉腫細胞を摂取した。その後、実施例２と同様に腫瘍の大きさを測定し生存率を求めた。腫瘍の大きさを表３及び図３に、生存率を表４及び図４に示す。
【００３０】
【表３】
2004155707.tif 000004
【００３１】
【表４】
2004155707.tif 000005
【００３２】
結果からも明らかなように、オキシカイン非投与群Ｃ及びオキシカイン投与群Ａ、Ｂともに腫瘍細胞接種１０日目頃より経日的に腫瘍細胞の増殖が認められたが、オキシカイン投与群においては、腫瘍の増殖はオキシカイン非投与群に比して緩徐であった。オキシカイン非投与群Ｃにおいては腫瘍増殖にともない、腫瘍接種後２４日目から徐々に死亡個体が認められ、４０日目までに全例が死亡したのに対し、オキシカイン投与群Ａ、Ｂでは生存率はそれぞれ１００％、８３％であった。老齢マウスにおいてもオキシカインは腫瘍細胞増殖抑制効果があり、その効果は濃度依存であることが判明した。
【００３３】
実施例４：ＮＫ活性の測定
１群当たりのマウスの匹数を２１匹とした他は、実施例２と同様の若齢マウスについて、実施例２と同様に被験物質を連続経口投与した後、実施例１で得られた線維肉腫細胞を接種した。腫瘍細胞接種前、腫瘍細胞接種後、逐日的に３匹ずつ動物を屠殺し、腸間膜リンパ節、腫瘍接種部位反対側所属リンパ節および脾臓を回収した。回収した脾臓より、リンパ球を調製し、活性化ＮＫ細胞（エフェクター細胞；Ｅ）とした。このエフェクター細胞を、５１Ｃｒを標識したＹａｃ−ｌ細胞を標的細胞（Ｔ）として、Ｙａｃ−ｌ細胞に対して３０倍、１００倍の割合で混合し、それぞれ４時間培養した後、培養液の放射能を液体シンチレーションカウンターにて測定し、培養液中に放出された５１Ｃｒの量から、次式によりＮＫ活性を求めた。結果を図５（ａ）に示す。
【００３４】
【式１】
2004155707.tif 000006
【００３５】
同様の実験方法を実施例３における老齢マウスと同様のマウスについても行い、同様にＮＫ活性を求めた。結果を図５（ｂ）に示す。
【００３６】
結果から、若齢マウスにおいて、オキシカイン高濃度投与群Ａは、オキシカイン低濃度投与群Ｂ、オキシカイン非投与群に比してＮＫ活性が高い傾向を示したがＮＫ活性自体は低かった。一方、老齢マウスにおいては、オキシカイン高濃度投与群Ａはオキシカイン低濃度投与群Ｂ及びオキシカイン非投与群に比してＮＫ活性が高い傾向を示し、活性自体は高いことが分かった。
【００３７】
実施例５：ＣＴＬ活性誘導
実施例４と同様にして、回収した脾臓より、リンパ球を調製し、５１Ｃｒを標識したＭｅｔｈ  Ａ細胞を標的細胞として４時間混合培養を行った後、培養液の放射能を液体シンチレーションカウンターにて測定し、培養液中に放出された５１Ｃｒ量から、若齢マウス、老齢マウスについて、式１によりＣＴＬ活性を求めた。結果をそれぞれ図６（ａ）、（ｂ）に示す。
【００３８】
結果から、若齢マウス、老齢マウスともに、オキシカイン高濃度投与群Ａにおいてオキシカイン低濃度投与群Ｂ及びオキシカイン非投与群に比して高いＣＴＬ活性を示すことが分かった。
【００３９】
実施齢６：フローサイトメトリー（ＦＣＭ）による解析
腫瘍接種１０日後にリンパ節を回収した他は実施例４と同様にして、若齢マウス、老齢マウスそれぞれから回収した各リンパ節よりリンパ球を分離し、１サンプルあたり細胞数が２×１０５ｃｅｌｌｓになるように調製した。各サンプルをＣｙ−Ｃｈｒｏｍｅ（ＴＭ）標識抗マウスＣＤ３ε抗体（１４５−２Ｃ１１ＢＤ：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４抗体（ＧＫ１．５：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ＰＥ標識抗マウスＣＤ８α（５３−６．７：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ＰＥ標識抗マウスＣＤ２８（３７．５１：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｂｉｏｔｉｎ標識抗マウスＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、及びＦＩＴＣ標識抗マウスＴＣＲβ抗体（Ｈ５７−５９７：  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で染色した。Ｂｉｏｔｉｎ標識抗マウスＣＤ６９抗体の二次染色はＳｔｒｅｐｔａｖｉｎｄｉｎ−ＲＥＤ６１３（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）で行った。各蛍光標識抗体で染色したサンプルは、フローサイトメーターＥＰＩＣＳＸＬ（Ｂｅｄｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）にて次に示す方法にて解析を行った。前方散乱光検出領域（ＦＳ）及び側方散乱光検出領域（ＳＳ）の二次元解析にてリンパ球集団分画に出現する１．５×１０４個の細胞について、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３陽性細胞にゲートをかけて以下に示す項目に関して３−ｃｏｌｏｒ解析を行った。結果を、若齢マウス、老齢マウスについて、それぞれ表６、表７に示す。
１．ＴＣＲαβ型Ｔ細胞におけるＣＤ４分子及びＣＤ８分子の発現比率
２．ＴＣＲＴＣＲαβ型Ｔ細胞における活性化細胞集団（ＣＤ２８分子陽性ＣＤ６９分子陽性）の発現比率
【００４０】
【表５】
2004155707.tif 000007
【００４１】
【表６】
2004155707.tif 000008
【００４２】
結果から、若齢マウス、老齢マウスともに、オキシカイン高濃度投与群Ａは、ＣＤ８陽性αβ型Ｔ細胞の増加が認められ、オキシカインは生体内取り込まれた後に免疫細胞を活性化することが示唆された。オキシカインによる免疫担当細胞への直接的な作用に関しては現段階では不明であるが、免疫賦活剤としての利用としては様々な応用が期待される。
【００４３】
【発明の効果】
本発明のＮＫ細胞活性化剤、ＣＴＬ活性化剤によれば、副作用が少なく優れたＮＫ細胞活性、ＣＴＬ活性を有し、優れた腫瘍細胞増殖抑制効果や、ウィルス感染症性疾患や炎症性疾患に効能を有し、その他、多量の酸素の存在と関連している中枢神経系、虚血、非血管性胃腸障害、眼性傷害、抗癌治療の望ましくない効果を抑制する作用や毒性症状を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の若齢マウスの腫瘍体積への効果を示す図である。
【図２】本発明の若齢マウスの腫瘍に対する生存率における効果を示す図である。
【図３】本発明の老齢マウスの腫瘍体積への効果を示す図である。
【図４】本発明の老齢マウスの腫瘍に対する生存率における効果を示す図である。
【図５】（ａ）本発明の若齢マウスに対するＮＫ活性を示す図である。
（ｂ）本発明の老齢マウスに対するＮＫ活性を示す図である。
【図６】（ａ）本発明の若齢マウスに対するＣＴＬ活性を示す図である。
（ｂ）本発明の老齢マウスに対するＣＴＬ活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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