(57)【要約】【課題】ＤＮＡマイクロアレイの遺伝子発現レベルを高い効率で検出する。【解決手段】支持体表面に、ＤＮＡを複数スポット状に固定し、次いで無水コハク酸溶液を用いて化学修飾処理を行うＤＮＡマイクロアレイの製造方法において、前記無水コハク酸を溶解している混合溶液が無水コハク酸溶解溶媒に無水コハク酸を溶解した無水コハク酸溶液１００容量部に対して非プロトン性極性溶媒０．１〜７５容量部、アルコール０〜９０容量部を混合したものであることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。非プロトン性極性溶媒としてはＤＭＳＯが好ましく、これにメタノールを加えた混合溶媒が特に好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体表面に、ＤＮＡを複数スポット状に固定し、次いで無水コハク酸溶液を用いて化学修飾処理を行うＤＮＡマイクロアレイの製造方法において、前記無水コハク酸を溶解している混合溶液が無水コハク酸溶解溶媒に無水コハク酸を溶解した無水コハク酸溶液１００容量部に対して非プロトン性極性溶媒０．１〜７５容量部、アルコール０〜９０容量部を混合したものであることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【請求項２】
アルコールが、炭素数１〜５のアルコールである請求項１に記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【請求項３】
非プロトン性極性溶媒がジメチルスルホキシドである請求項１に記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【請求項４】
無水コハク酸溶解溶媒が１−  メチル−  ２−  ピロリドンである請求項１に記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【請求項５】
無水コハク酸を溶解している混合溶液中の無水コハク酸濃度が１〜４０質量％である請求項１に記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【請求項６】
支持体がガラス製で、その表面がアミノ化処理されている請求項１に記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガラス板等の支持体上に多数の遺伝子（ＤＮＡ）を配列したマイクロアレイの製造方法に関し、更に詳述すると遺伝子発現プロファイルの解析等の各種の用途に用いて有効なマイクロアレイの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ガラス板等の支持体上に多数のポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドをスポット状に固定したマイクロアレイは、その製造方法により主として合成型ＤＮＡチップと、貼付け型ＤＮＡマイクロアレイとに大別される。
【０００３】
合成型ＤＮＡチップは、半導体製造用光リソグラフィ技術を利用することにより、ガラス板上にＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）を直接合成して製造している。この方法による場合は、合成されるＤＮＡの塩基数は比較的小さく、通常数十塩基程度と言われている。
【０００４】
貼付け型ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス板等の支持体上に多数のＤＮＡ溶液をスポット状に塗布後、支持体にＤＮＡを固定化して製造している。この方法による場合は、製造コストが前記合成型ＤＮＡチップと比較してかなり低くなる特徴がある（例えば、非特許文献１）。
【０００５】
上記ＤＮＡチップ及びＤＮＡマイクロアレイ（以後、両者を併せてマイクロアレイと表す）は、前述のように例えば遺伝子の発現変化を経時的に観察する場合等に多用される重要なものである。
【０００６】
遺伝子の発現変化を経時的に観察する場合、二蛍光標識法が通常多用されている。この二蛍光標識法は、観察する遺伝子試料を予め二色（通常赤、緑が主流である）の蛍光体で標識しておき、標識した遺伝子試料（ターゲット）を上記支持体に固定したＤＮＡ（プローブ）と競合的にハイブリダイズさせた後、支持体上に分布したスポットにおける二色の蛍光強度をそれぞれ検出し、その強度比を用いて遺伝子発現の変化を解析するものである。
【０００７】
この解析方法においては、解析結果の正確さは二色の蛍光強度の測定精度及び感度に左右される。そして、蛍光強度の測定精度は、支持体上でスポット状に固定されたＤＮＡ（プローブ）にハイブリダイズされたターゲットの蛍光強度と、支持体上のＤＮＡのスポット箇所以外の箇所が発する蛍光強度（バックグラウンド）との比に比例する。
【０００８】
本来、支持体のＤＮＡ固定箇所以外の支持体表面にはＤＮＡを固定していないので、ハイブリダイゼーションは起らず、従ってこの支持体表面からは標識した遺伝子試料の発する蛍光は検出されないはずである。しかし、実際には標識した遺伝子試料が支持体表面のＤＮＡ固定箇所以外にも吸着し、バックグラウンドとしてかなりの蛍光が検出される。従来、このバックグラウンド蛍光強度を減少させるため、支持体表面をコハク酸等で処理する方法が提案されている。しかし、これらの方法によっても十分にバックグラウンド蛍光強度を減少させるに至っていない。
【０００９】
このため、従来のマイクロアレイの蛍光強度の測定においては、測定精度及び感度を十分高められない問題がある。
【００１０】
【非特許文献１】
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２０卷    ４６７頁    １９９５年）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みなされたもので、その目的とするところは支持体表面のＤＮＡ固定箇所以外の支持体表面から生じるバックグラウンド蛍光強度を小さくでき、更に測定感度を向上できるマイクロアレイの製造方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記問題を解決する本発明は、以下に記載するものである。
【００１３】
〔１〕  支持体表面に、ＤＮＡを複数スポット状に固定し、次いで無水コハク酸溶液を用いて化学修飾処理を行うＤＮＡマイクロアレイの製造方法において、前記無水コハク酸を溶解している混合溶液が無水コハク酸溶解溶媒に無水コハク酸を溶解した無水コハク酸溶液１００容量部に対して非プロトン性極性溶媒０．１〜７５容量部、アルコール０〜９０容量部を混合したものであることを特徴とするＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【００１４】
〔２〕  アルコールが、炭素数１〜５のアルコールである〔１〕に記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【００１５】
〔３〕  非プロトン性極性溶媒がジメチルスルホキシドである〔１〕に記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【００１６】
〔４〕  無水コハク酸溶解溶媒が１−  メチル−  ２−  ピロリドンである〔１〕に記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【００１７】
〔５〕  無水コハク酸を溶解している混合溶液中の無水コハク酸濃度が１〜４０質量％である〔１〕に記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【００１８】
〔６〕  支持体がガラス製で、その表面がアミノ化処理されている〔１〕に記載のＤＮＡマイクロアレイの製造方法。
【００１９】
【作用】
本発明においては、ＤＮＡをスポットして固定した支持体を、無水コハク酸溶液で処理する際に、無水コハク酸の溶媒として、少なくとも非プロトン性極性溶媒を用いることにより、プローブ非固定箇所にターゲットが吸着することを防止してプローブ非固定箇所の蛍光強度を減少させると共に、プローブ固定箇所における蛍光強度を高め、これによりプローブにハイブリダイズさせたターゲットの蛍光強度との強度比を高めることにより、測定精度を高め、感度を向上できる。前記溶媒を用いることによりこのような好ましい効果を発現できる理由は現在未解明の部分があり、検討中である。
【００２０】
【発明の実施の形態】
図１は本発明により製造するＤＮＡマイクロアレイを示す概略図である。図１中、１００は合成マイクロアレイで、支持体２の表面に種々のポリ又はオリゴヌクレオチドをスポット状に固定したプローブ固定箇所４が多数配列してある。
【００２１】
支持体１００は前記合成ＤＮＡを固定できるものであれば何れのものでも使用でき、具体的にはガラス板；ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、シリコーン等のプラスティク板；ニトロセルロース、セルロースアセテート等のセルロース板等が例示できる。これらの支持体の中でも、ガラス板が取扱が容易で安価なため、特に好ましい。
【００２２】
前記支持体２の表面は表面処理をしたものが好ましい。表面処理としては、アミノ化処理、ポリＬ−リジン処理等の公知の陽電荷付与処理が例示できる。
【００２３】
市販品で陽電荷付与処理をした支持体としては、松浪ガラス社製スライドガラス（型式Ｓ９１１５）が例示できる。
【００２４】
前記支持体２の表面のプローブ固定箇所４にスポット状に多数配列する核酸としては、特に制限はなく、具体的には生物由来又は合成した各種のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等を例示できる。
【００２５】
ＤＮＡとしては、染色体由来のＤＮＡ断片、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、制限酵素切断処理ＤＮＡ、疾患と関連する染色体位置に由来するＤＮＡ断片やｃＤＮＡ、特定の遺伝子の一部を含むＤＮＡ、転写レベルの異常が見られるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に由来するｃＤＮＡ等が例示できる。これらのＤＮＡとしてはオリゴヌクレオチド及びそれ以上の塩基数のポリヌクレオチドが例示できる。
【００２６】
合成ＤＮＡとしては、１２〜１２０の塩基数のポリヌクレオチドが例示できる。
【００２７】
支持体上にスポット状にＤＮＡを固定する固定箇所の１スポットの大きさは特に制限がないが、直径が１ｃｍ以下が好ましく、１μｍ〜３ｍｍがより好ましく、特に５μｍ〜１ｍｍが望ましい。
【００２８】
支持体上のプローブ固定箇所の密度は５〜２００００スポット／ｃｍ２が好ましく、１０〜１００００スポット／ｃｍ２がより好ましく、１００〜８０００スポット／ｃｍ２が特に好ましい。
【００２９】
上記ＤＮＡを支持体２に固定する方法としては、前述のように公知の合成型ＤＮＡチップ又は貼付け型ＤＮＡマイクロアレイの製造方法が利用できる。この固定方法自体は周知のものである。すなわち、合成型の場合は半導体製造技術が利用される。また、貼付け型の場合は、例えば、支持体表面に合成ＤＮＡ溶液をスポット状に塗布し、気相恒温器中にて８０℃で１時間加熱する。その後、ＵＶクロスリンカーを用いて紫外線を照射することによりＤＮＡを支持体表面に固定することができる。
【００３０】
本発明においては、上記のようにしてＤＮＡを表面にスポット状に固定した支持体を無水コハク酸溶液で処理することにより、ＤＮＡおよび支持体表面のアミノ基の化学修飾を行う。
【００３１】
無水コハク酸を溶解する混合溶媒は、少なくとも非プロトン性極性溶媒を含む。
【００３２】
非プロトン性極性溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド；ジメチルスルホラン、ジエチルスルホラン等のアルキルスルホラン；テトラヒドロフラン；ジオキサン等を例示できる。これらの非プロトン性極性溶媒のうち、ＤＭＳＯが特に好ましい。これら非プロトン性極性溶媒を含有させることにより無水コハク酸処理が効率よく進む。
【００３３】
無水コハク酸を溶解している混合溶液は、上記非プロトン性極性溶媒に加えて、更にアルコールを配合したものも好ましい。
【００３４】
アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−又はｉｓｏ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ｔｅｒ−ブタノール、ペンタノール等の炭素数１〜５のアルコールが使用できる。炭素数１又は２のアルコールが好ましく、メタノールが特に好ましい。炭素数が６以上のアルコールを用いても本発明の効果である検出感度の向上は認められない。
【００３５】
無水コハク酸を溶解している混合溶液は、上記非プロトン性極性溶媒及び必要により加えたアルコール以外に、無水コハク酸溶解溶媒を含む。無水コハク酸溶解溶媒は、無水コハク酸の良溶媒であり、具体的には、１−メチル−２−ピロリドン、ジメチルホルムアミド、トリフルオロエタノール、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル等が好ましい。
【００３６】
これらの溶媒の混合比は、無水コハク酸溶解溶媒に無水コハク酸を溶解した無水コハク酸溶液１００容量部に対して、非プロトン性極性溶媒が０．１〜７５容量部、アルコールが０〜９０  容量部が好ましい。
【００３７】
無水コハク酸溶液にＤＭＳＯのみを混合して無水コハク酸処理をする場合は、ＤＭＳＯの混合量は、無水コハク酸溶液１００容量部に対して１０容量部以下が好ましい。１０容量部以上混合すると、無水コハク酸処理が妨げられる場合がある。
【００３８】
一方、無水コハク酸溶液にＤＭＳＯとメタノールとを混合する場合は、無水コハク酸溶液にＤＭＳＯを加えた溶液１００容量部に対し、メタノールは９０容量部以下が好ましい。無水コハク酸溶液中の無水コハク酸濃度にもよるが、メタノールを過度に混合すると、無水コハク酸が析出する場合がある。
【００３９】
好ましい溶媒組成の具体例は、無水コハク酸を溶解している１−メチル−２−ピロリドン１００容量部に対し、ＤＭＳＯ  ０．１  〜７０容量部、メタノール０〜８０  容量部、より好ましくは無水コハク酸を溶解している１−  メチル−  ２−  ピロリドン１００容量部に対し、ＤＭＳＯ  ０．２〜６０容量部、メタノール０〜６５容量部を添加したものである。
【００４０】
混合溶液中の無水コハク酸の濃度は、１〜４０  質量％が好ましい。
【００４１】
無水コハク酸溶液による化学修飾処理温度は、２〜８０℃が好ましく、特に１５〜６０℃が好ましい。化学修飾処理時間は処理温度により異なるが、通常１０〜１８０分が好ましく、４５〜９０分がより好ましい。
【００４２】
上記のようにして無水コハク酸溶液により処理した支持体は、次いで、必要により通常行う各種後処理、例えば熱処理、洗浄処理等を経て、ＤＮＡマイクロアレイを得ることができる。
【００４３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【００４４】
実施例１
１  マイクロアレイの作製
マイクロアレイ用合成ＤＮＡ（マイクロダイアグノスティック社製、２０Ｋ遺伝子セット）をアレイヤー（マイクロダイアグノスティック社製、ＧｅｎｅＭａｔｒｉｘＭａｋｅｒ−Ｒ）を用いてスライドガラス（松浪硝子工業社製、Ｓ９１１５）上に２１，６３２個／５７６  ｍｍ２の密度でスポットし、マイクロアレイを作製した。該マイクロアレイスライドガラスをスライド染色バスケット（松浪ガラス社製、Ｂ−６０）に挿入し、気相恒温器（Ｓｔｏｖａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ）内にて８０℃で１時間静置した状態で保温し、さらにＵＶ  クロスリンカー（Ｈｏｅｆｅｒ社製、ＵＶＣ５００）を用いて１２０ｍＪの紫外線を照射し、スポットした合成ＤＮＡをスライドガラス表面に固定化した。
【００４５】
２  マイクロアレイのポストプロセッシング
２−１  第１次熱変性
９５℃に熱した２Ｌの純水中に、スライド染色バスケット（松浪硝子工業社製、Ｂ−６０）に格納した３０枚のスライドガラスを入れ、ただちに１秒間に１回の頻度で３０秒間にわたり激しく上下に震盪させた。
【００４６】
その後、１分３０秒間にわたりそのまま熱純水中で放置した後、スライドガラスをバスケットごと取り出し、ただちにステンレス製角型ポット中のエタノール（８００  ｍＬ）（和光純薬工業、０５５−００４５７）に浸し、室温で１分間放置した。さらに、別の容器に新たにエタノール（約２００  ｍＬ）およびその中に沈めた染色用スライドガラスケースを準備し、上記ステンレス製角型ポットの中にあるスライドガラスを一枚ずつ染色用トレイ（Ｋａｒｔｅｌｌ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｌａｂ．  Ｗａｒｅｓ社製、＃３５４）に移し、エタノール中に浸した。
【００４７】
すべてのスライドガラスを移した後、染色用トレイごとエタノール中より取り出し、ただちに低速遠心機（佐久間製作所製、Ｍ２００−ＩＶＤ）を用いて１，５００  ｒｐｍで３分間遠心を行い、エタノールを完全に除去した。
【００４８】
２−２  アミノ基の化学修飾（無水コハク酸処理）
当該マイクロアレイスライドガラスを以下の方法で作製したポストプロセッシング溶液を用いて、ガラス表面およびマイクロアレイ化した合成ＤＮＡの塩基の側鎖に存在するアミノ基をスクシニル化した。
【００４９】
無水コハク酸（和光純薬工業、１９８−０４３５５）  ２００  ｇを三角フラスコに入れ、１−メチル−２−ピロリドン（和光純薬工業、１３６−０７６１６）５００  ｍＬを加え、室温で撹拌しながら完全に溶解させ、最終容量  ６７０  ｍＬの無水コハク酸溶液を得た（最終濃度  ３０  質量％）。この溶液より１２５  ｍＬを分取し、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業、０４３−０７２１６）を  ７５  ｍＬ加えた。さらにメタノール（和光純薬工業、１３１−０１８２６）５０  ｍＬを加えてよく混合した。最後に、０．２Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）を１３．２  ｍＬ加えてすばやく混合し、ただちにスライド染色バット（松浪硝子工業社製、ＢＴ−２１０）に溶液全体を移した。
【００５０】
この溶液中に、あらかじめスライド染色バスケット（松浪硝子工業社製、Ｂ−２０）に格納したスライドガラス１０枚を浸し、室温で６０分間放置した。但し、放置開始後１０分ごとに、２秒間に１回の頻度で１０回上下に震盪させた。
【００５１】
６０分間放置後、エタノール（８００  ｍＬ）を満たしたステンレス製角型ポットの中にスライド染色用バスケットごと移し、２秒間に１回の頻度で１０回上下に振った後、室温で１０分間放置した。
【００５２】
上記の操作を新たに準備したエタノールを用いて再度繰り返した。その後、別の容器に新たにエタノール（２００  ｍＬ）およびその中に沈めた染色用トレイを準備し、上記ステンレス製角型ポットの中にあるスライドガラスを一枚ずつ染色用トレイ（Ｋａｒｔｅｌｌ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｌａｂ．  Ｗａｒｅｓ社製、＃３５４）に移し、エタノール中に浸した。
【００５３】
すべてのスライドガラスを移した後、染色用トレイごとエタノール中より取り出し、ただちに低速遠心機（佐久間製作所製、Ｍ２００−ＩＶＤ）を用いて１，５００  ｒｐｍで３分間遠心を行い、エタノールを完全に除去した。
【００５４】
２−３  第２次熱変性
９５℃に達した２Ｌの純水中に、スライド染色バスケットに格納したスライドガラスを入れ、２分間にわたりそのまま熱純水中で放置した後、バスケットごと取り出し、ただちにステンレス製角型ポット中のエタノール（８００  ｍＬ）に浸し、室温で１分間放置した。
【００５５】
該スライドガラスをバスケットごと取り出し、ただちに新たに準備したエタノール（８００  ｍＬ）に浸し、もう一度室温で１分間放置した。さらに、別の容器に新たにエタノール（２００  ｍＬ）およびその中に沈めた染色用スライドガラスケースを準備し、上記ステンレス製角型ポットのエタノール中にあるスライドガラスを一枚ずつ染色用トレイに移し、エタノール中に浸した。
【００５６】
すべてのスライドガラスを移した後、染色用トレイごとエタノール中より取り出し、ただちに低速遠心機を用いて１，５００ｒｐｍで３分間遠心を行い、エタノールを完全に除去した。
【００５７】
３  核酸検体の調製
検体用ｍＲＮＡは、ＨＬ６０細胞およびＲａｊｉ細胞からトリゾル試薬（インビトロジェン社製、  ＃１５５９６−０２６）を用いて抽出した全ＲＮＡから、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｅキット（Ａｍｂｉｏｎ社製、＃１９１５）を用いてポリアデニル酸  ［ポリ（Ａ）］＋  ＲＮＡを抽出して得た。
【００５８】
４  核酸検体の蛍光標識
このｍＲＮＡをそれぞれ１．５  ｍｇ分取し、ラベリング＆ハイブリダイゼーションキット（マイクロダイアグノスティック社製、＃ＬＨ１−０１）、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（インビトロジェン社製、＃１８０６４−０１４）、さらにはＨＬ６０細胞検体にＣｙａｎｉｎｅ  ５−  ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  （ｄＵＴＰ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂ社製、＃ＮＥＬ５７９）、Ｒａｊｉ細胞検体にＣｙａｎｉｎｅ  ３−  ｄＵＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂ社製、＃ＮＥＬ５７８）を用い、標識ｃＤＮＡを作製した。
【００５９】
５  標識プローブの作製
これらの標識  ｃＤＮＡ、すなわち、Ｃｙａｎｉｎｅ  ５で標識されたＨＬ６０細胞検体およびＣｙａｎｉｎｅ  ３で標識されたＲａｊｉ細胞検体を、同一試験管内で混合し、ラベリング＆ハイブリダイゼーションキット（マイクロダイアグノスティック社製、  ＃ＬＨ１−０１）付属のスピンカラムによって精製し、最終的にラベリング＆ハイブリダイゼーションキット（マイクロダイアグノスティック社製、＃ＬＨ１−０１）付属のハイブリダイゼーションバッファーおよび純水を用いて１０  μＬに調製した。
【００６０】
６  ハイブリダイゼーション
この溶液を９９℃で５分間加熱して熱変性させ、室温で５分間放置した後、マイクロアレイスライドガラスのＤＮＡがスポットされている領域上に滴下し、２４  ｍｍ  Ｘ  ４０  ｍｍのカバーガラス（松浪硝子工業社製、ＮＥＯカバーガラス  ２４ｘ４０−２００  ）を被せ、さらに、マイクロアレイ上のカバーガラスにおおわれていない領域、すなわち、マイクロアレイスライドガラスの４隅に純水を１０  μＬずつ滴下し、ハイブリダゼーションカセット（マイクロダイアグノスティック社製、＃ＨＣ１−０２）に格納した。このマイクロアレイを格納したハイブリダゼーションカセットを、気相恒温器（三洋電機バイオメディカ社製、ＭＩＲ２６２）に入れ、４２℃で  １８  時間、静置した状態で保温した。
【００６１】
７  洗浄
該ハイブリダゼーションカセットを気相保温器からとりだし、ストッパーをはずした後、ただちに  ０．１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２Ｘ  ＳＳＣ（０．３  Ｍ塩化ナトリウム、０．０３  Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．０）をスポイトでカバーがラス上から静かに滴下し、マイクロアレイスライドガラス全体をこの溶液に浸した。次ぎに、マイクロアレイスライドガラスを取り出し、静かに傾けることにより、カバーガラスを取り除いた。
【００６２】
該マイクロアレイスライドガラスをスライドガラスホルダーに入れ、  ２００  ｍＬの２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ溶液中に４２℃で１分間、２００  ｍＬ  の  ２Ｘ  ＳＳＣ  溶液中に室温で１分間、０．２Ｘ  ＳＳＣ  溶液中に室温で１分間、さらに純水中に室温で１分間浸し、数回上下に静かに震盪ながら洗浄した後、スライド染色トレイに入れ、低速遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  社製、Ａｌｌｅｇｒａ  ２１Ｒ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１５００  ｒｐｍで５分間遠心し、水分を取り除いた。
【００６３】
８  ハイブリダイゼーションの検出および数値化
このようにしてハイブリダイゼーションと洗浄を行ったマイクロアレイスライドガラスを、スキャナ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ａ）を用いて波長６３５ｎｍおよび５３２  ｎｍの蛍光シグナルを同時測定した。スキャナ付属の解析ソフトウエア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ）を用いて、蛍光シグナルから遺伝子発現レベルを算出し、検出限界以上の発現レベルを示した遺伝子を特定した。
【００６４】
本実施例によるポストプロセッシングを施したマイクロアレイでは、ＨＬ６０細胞およびＲａｊｉ細胞サンプルから、１２，８２７個の遺伝子の発現を検出した。これは、マイクロアレイ化した１９，５８４遺伝子の６５．５％に相当する。
【００６５】
実施例２
無水コハク酸  ２００  ｇ  を三角フラスコに入れ、１−メチル−２−ピロリドン  ５００  ｍＬ  を加え、室温で撹拌しながら完全に溶解させ、最終容量  ６７０  ｍＬの無水コハク酸溶液を得た（最終濃度  ３０  質量％）。この溶液より  １２５  ｍＬ  を分取し、ＤＭＳＯ  ２５  ｍＬ  とメタノール  １００  ｍＬ  を加え、よく混合した。最後に、０．２  Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）を  １３．２  ｍＬ  加えてすばやく混合し、ただちにスライド染色バットに溶液全体を移した。これら以外は実施例１と同様に操作して、マイクロアレイを得た。
【００６６】
本実施例によるポストプロセッシングを施したマイクロアレイでは、ＨＬ６０細胞およびＲａｊｉ細胞サンプルから、１１，２４６  個の遺伝子の発現を検出した。これは、マイクロアレイ化した  １９，５８４  遺伝子の  ５７．４％に相当する。
【００６７】
実施例３
無水コハク酸  ２００  ｇ  を三角フラスコに入れ、１−メチル−２−ピロリドン  ５００  ｍＬ  を加え、室温で撹拌しながら完全に溶解させ、最終容量  ６７０  ｍＬの無水コハク酸溶液を得た（最終濃度  ３０  質量％）。この溶液より  １２５  ｍＬ  を分取し、１−メチル−２−ピロリドンを追加し、全量を  ２３７．５  ｍＬとした。さらにジメチルスルホキシドを  １２．５  ｍＬ  加え、よく混合した。最後に、０．２  Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）を  １３．２  ｍＬ  加えてすばやく混合し、ただちにスライド染色バットに溶液全体を移した。これら以外は実施例１と同様に操作して、マイクロアレイを得た。
【００６８】
本実施例によるポストプロセッシングを施したマイクロアレイでは、ＨＬ６０細胞およびＲａｊｉ細胞サンプルから、１２，０００  個の遺伝子の発現を検出した。これは、マイクロアレイ化した  １９，５８４  遺伝子の  ６１．３％に相当する。
【００６９】
比較例１
１  マイクロアレイのポストプロセッシング
１−１  アミノ基の化学修飾
当該マイクロアレイスライドガラスを、公知のポストプロセッシング溶液を用いた公知の方法（ｈｔｔｐ／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／３＃ｐｏｓｔ＃ｐｒｏｃｅｓｓ．ｈｔｍｌ；  小原雄治  上杉裕子  著、  細胞工学  Ｖｏｌ．１８  Ｎｏ．９  １３９２−１３９８  １９９９、  秀潤社；  林崎良英  監修、  必ずデータが出る  ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル  ｐ５７−６０、羊土社）を一部改変し、ガラス表面およびマイクロアレイ化した合成ＤＮＡの塩基の側鎖に存在するアミノ基をスクシニル化した。
【００７０】
無水コハク酸  ２００  ｇ  を三角フラスコに入れ、１−メチル−２−ピロリドン  ５００  ｍＬ  を加え、室温で撹拌しながら完全に溶解させ、最終容量  ６７０  ｍＬ  の無水コハク酸溶液を得た（最終濃度  ３０  質量％）。この溶液より  １２５  ｍＬ  を分取して  １−メチル−２−ピロリドンを追加し、全量を  ２５０ｍｌ  とした。さらに、０．２  Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）を  １３．２  ｍＬ  加えてすばやく混合し、ただちにスライド染色バットに溶液全体を移した。
【００７１】
この溶液中に、あらかじめスライド染色バスケット（松浪硝子工業社製、Ｂ−２０）に格納したマイクロアレイスライドガラス１０枚を浸し、ただちに１秒間に１回の頻度で２分間にわたり激しく上下に震盪させた後、室温で６０分間放置した。但し、放置開始後１０分ごとに、２秒間に１回の頻度で１０回上下に震盪させた。
【００７２】
６０分間放置後、エタノール（８００  ｍＬ）を満たしたステンレス製角型ポットの中にスライド染色用バスケットごと移し、２秒間に１回の頻度で１０回上下に振った後、室温で１０分間放置した。上記の操作を新たに準備したエタノールを用いて再度繰り返した。
【００７３】
その後、別の容器に新たにエタノール（２００  ｍＬ）およびその中に沈めた染色用トレイを準備し、上記ステンレス製角型ポットの中にあるスライドガラスを一枚ずつ染色用トレイに移し、エタノール中に浸した。すべてのスライドガラスを移した後、染色用トレイごとエタノール中より取り出し、ただちに低速遠心機（佐久間製作所製、Ｍ２００−ＩＶＤ）を用いて１，５００  ｒｐｍで３分間遠心を行い、エタノールを完全に除去した。
【００７４】
１−２  熱変性
実施例の第２次熱変性と同一の方法でマイクロアレイ上のＤＮＡに熱変性を加えた。
【００７５】
２  ハイブリダイゼーションと洗浄
上記比較例の方法で処理したマイクロアレイ上に、実施例と同様に作製したプローブ溶液を滴下し、ハイブリダイゼーション、洗浄し、同一検出条件のもとで各遺伝子に対するスポットの蛍光強度をスキャナにて測定し数値化した。スキャナ付属の解析ソフトウエア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ）を用いて、蛍光シグナルから遺伝子発現レベルを算出し、検出限界以上の発現レベルを示した遺伝子を特定した。
【００７６】
本比較例によるポストプロセッシングを施したマイクロアレイでは、ＨＬ６０細胞およびＲａｊｉ細胞サンプルから、７，１９３個の遺伝子の発現を検出した。これは、マイクロアレイ化した１９，５８４遺伝子の３６．７％に相当する。
【００７７】
上記実施例１と、比較例１との結果を比較すると、実施例１の場合、比較例１に比べて同一サンプルから約２倍の遺伝子の発現を検出できた。このことから、本発明によれば、マイクロアレイハイブリダイゼーションにおいて遺伝子発現レベルを高い効率で検出することが可能である。
【００７８】
比較例２
無水コハク酸  ２００  ｇ  を三角フラスコに入れ、１−メチル−２−ピロリドン  ５００  ｍＬ  を加え、室温で撹拌しながら完全に溶解させ、最終容量  ６７０  ｍＬの無水コハク酸溶液を得た（最終濃度  ３０  質量％）。この溶液より  １２５  ｍＬ  を分取して１−メチル−２−ピロリドンを追加し、全量を  ２００  ｍＬとした。さらにメタノールを  ５０  ｍＬ  加えて、よく混合した。最後に、０．２  Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）を  １３．２  ｍＬ  加えてすばやく混合し、ただちにスライド染色バットに溶液全体を移した。これら以外は実施例１と同様に操作して、マイクロアレイを得た。
【００７９】
本実施例によるポストプロセッシングを施したマイクロアレイでは、ＨＬ６０細胞およびＲａｊｉ細胞サンプルから、３，３１０  個の遺伝子の発現を検出した。これは、マイクロアレイ化した  １９，５８４  遺伝子の  １６．９％に相当する。
【００８０】
比較例３
無水コハク酸  ２００  ｇ  を三角フラスコに入れ、１−メチル−２−ピロリドン  ５００  ｍＬ  を加え、室温で撹拌しながら完全に溶解させ、最終容量  ６７０  ｍＬの無水コハク酸溶液を得た（最終濃度  ３０  質量％）。この溶液より  １２５  ｍＬ  を分取して１−メチル−２−ピロリドンを追加し、全量を  １５０  ｍＬとした。さらにメタノールを  １００  ｍＬ加え、よく混合した。最後に、０．２  Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）を  １３．２  ｍＬ  加えてすばやく混合し、ただちにスライド染色バットに溶液全体を移した。これら以外は実施例１と同様に操作して、マイクロアレイを得た。
【００８１】
本実施例によるポストプロセッシングを施したマイクロアレイでは、ＨＬ６０細胞およびＲａｊｉ細胞サンプルから、２，６９０  個の遺伝子の発現を検出した。これは、マイクロアレイ化した  １９，５８４  遺伝子の  １３．７％に相当する。
【００８２】
比較例４
無水コハク酸  ２００  ｇ  を三角フラスコに入れ、１−メチル−２−ピロリドン  ５００  ｍＬ  を加え、室温で撹拌しながら完全に溶解させ、最終容量  ６７０  ｍＬの無水コハク酸溶液を得た（最終濃度  ３０  質量％）。この溶液より  １２５  ｍＬ  を分取し、ＤＭＳＯ  １００ｍＬとメタノール  ２５  ｍＬ  を加え、よく混合した。最後に、０．２  Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．０）を  １３．２  ｍＬ  加えてすばやく混合し、ただちにスライド染色バットに溶液全体を移した。これら以外は実施例１と同様に操作して、マイクロアレイを得た。
【００８３】
本実施例によるポストプロセッシングを施したマイクロアレイでは、ＨＬ６０細胞およびＲａｊｉ細胞サンプルから、６，７９９  個の遺伝子の発現を検出した。これは、マイクロアレイ化した  １９，５８４  遺伝子の  ３４．７％に相当する。
【００８４】
【発明の効果】
本発明においては、非プロトン性極性溶媒を少なくとも含む溶媒の無水コハク酸溶液を用いて、無水コハク酸による化学修飾処理をしているので、マイクロアレイハイブリダイゼーションにおいて遺伝子発現レベルを高い効率で検出できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】マイクロアレイの一例を示す概略説明図である。
【符号の説明】
２    支持体
４    プローブ固定箇所
６    プローブ非固定箇所
１００    マイクロアレイ
【図１】
2004233105.tif 000002