(57)【要約】【課題】試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えない。【解決手段】試料分画部に層流で導入される試料を含む流体が導入される流路と、その両脇に、対称な形で配置された１対の流体のみが導入される流路と、試料分画部において観察試料を排出するときにのみ試料分画部に外力を導入する手段と、試料分画部から選択された試料のみが層流で回収される試料を含む流体が流れ出るよう前記試料を導入する流路の下流に配置された試料回収流路と、その両脇に、対称な形で配置された必要ない試料が排出される１対の流体の流路を有する細胞分析分離装置とする。【選択図】　　　　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料分画部に層流で導入される試料を含む流体が導入される流路と、その両側に対称に配置されて試料分画部において合流される１対の流体が導入される流路と、試料分画部において観察試料を排出するときにのみ試料分画部に外力を導入する手段と、試料分画部から選択された試料を含む流体が層流で流れ出るように前記試料を導入する流路の下流に配置された試料回収流路と、その両側に、対称に配置された必要ない試料が排出される１対の流体の流路を有することを特徴とした細胞分析分離装置。
【請求項２】
試料を光学顕微鏡で観察するときに同時に少なくとも１つの実体顕微鏡像と１つの蛍光顕微鏡像を、互いの位置関係を参照して対応付けできる手段を有することを特徴とする請求項１の細胞分析分離装置。
【請求項３】
流体の流速を、導入した液滴の高さの差によって、重力によって生じる流れを利用する手段を有することを特徴とする請求項１の細胞分析分離装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、細胞試料に損傷を与えることなしに簡便に細胞の分析分離を行うことを可能とする新しい細胞分析分離装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
培養液中の特定の細胞を分離し回収することは生物学・医学的な分析においては重要な技術である。細胞の比重の違いで細胞を分離する場合には速度沈降法によって分離することができる。しかし、未感作の細胞と感作した細胞とを見分けるような、細胞の違いがほとんど無い場合には、蛍光抗体で染色した情報あるいは目視の情報を基に細胞を１つ１つ分離する必要がある。この技術についてはたとえばセルソーターがある。セルソーターは蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である。この技術について詳しくは、Ｋａｍａｒｃｋ，Ｍ．Ｅ．がＭｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　第１５１　巻第１５０頁から１６５頁（１９８７年）に報告している。
【０００３】
しかし、この技術は高価であること、装置が大型であること、数千ボルトという高電界が必要であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接試料を観察できないことなどの課題があることから、近年、マイクロ加工技術を用いて作った微細な流路にできた層流中を流れる微粒子を直接顕微鏡観察しながら分離するセルソーターが発明され、たとえばＭｉｃｒｏ　Ｔｏｔａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　　’９８，　ｐｐ．７７−８０　（Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　１９９８）　、あるいはＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　７０，　ｐｐ．１９０９−１９１５　（１９９８）　などに報告されているが、観察手段に対する試料分離の応答速度が遅く、実用化するためには、試料に損傷を与えず、かつ、より応答の速い処理方法が必要であった。また、この出願の発明者らによっても従来の問題点を解決する試みがなされてきている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
発明者らによる試みは蛍光観察によって分離を行おうとするものであって、従来法に比べて特徴のある有利なものであるが、光学的計測手段、試料の導入手段、分離方法などについてはまだ詳細な検討が為されていないのが実情である。このため、たとえば、ただ蛍光観察するのみでは、蛍光を発する試料が識別することはできるが、蛍光を発しない試料が通過することを認識することができず、蛍光標識した試料のみを回収する場合に、誤って蛍光を発しない試料を回収する可能性があった。
【０００５】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりのこれまでの問題点を解消し、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えることなく、簡便に細胞試料を分析分離することのできる新しい細胞分析分離装置を提供することを課題としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、試料分画部に層流で導入される試料を含む流体が導入される流路と、その両側に、対称に配置されて試料分画部において合流される１対の流体が導入される流路と、試料分画部において観察試料を排出するときにのみ試料分画部に外力を導入する手段と、試料分画部から選択された試料を含む流体が層流で流れ出るように前記試料を導入する流路の下流に配置された試料回収流路と、その両側に対称に配置された必要ない試料が排出される１対の流体の流路を有する細胞分析分離装置を提供し、これによって回収する細胞試料に損傷を与えることがないようにする。
【０００７】
また、この出願の発明は、第２には、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画するために、装置中の試料を光学顕微鏡で観察するときに同時に少なくとも１つの実体顕微鏡像と１つの蛍光顕微鏡像を、互いの位置関係を参照して対応付けできる手段を有するものとし、第３には、脈流の生じない流速の遅い流れをポンプ等の手段を用いることなく装置内に発生させる手段を提供するため、流体の流速を、装置に導入した液滴の高さの差によって、重力によって生じる流れを利用する手段を有するものとする。
【０００８】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【０００９】
図１に、この出願の発明の細胞分析分離装置のシステム構成の１例を模式的に示す。１０１は実体顕微鏡の光源であり、一般にハロゲン系のランプが用いられる。１０２は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタである。１０３はコンデンサレンズであり、位相差観察をする場合は位相差リングを導入し、微分干渉観察をする場合は、偏光子を導入する。１０４のステージ上に載っているのは１００細胞分析分離チップであり、１１７の駆動装置によって前記ステージを移動させることで前記チップの最適な位置を観察する。前記チップ内の流路内の状態は、１０５対物レンズで観察される。このとき対物レンズから観察されるのは、光源１０１から透過された光による流路内の試料の実体像と、１０８の光源からの光を１０９バンドパスフィルタで励起光波長のみ１０６ダイクロイックミラーによって対物レンズから照射された励起光によって試料が発した蛍光像である。このとき、実体顕微鏡像観察に用いる光の波長は、観察する蛍光波長領域より十分短いか、あるいは十分長い波長であり、かつ、可能であれば励起光波長領域とも異なることが望ましい。前記１０２バンドパスフィルタを透過するのと同波長の光を反射する１１０ダイクロイックミラーおよび、１１２バンドパスフィルターによって、流路内の実体顕微鏡像のみが１１３カメラによって観察される。他方、蛍光像は、対物レンズを通過した光のうち１１１ミラーおよび１１４バンドパスフィルターによって、蛍光観察の波長帯のみを選択的に透過させて、１１５カメラで観察される。２つのカメラ１１３と１１５で撮った像は、１１６画像処理部において解析され、２つの像の相対位置関係を比較することで、試料の微細構造と、蛍光の発光位置を比較同定することができる。なお、この実施例では、１つの波長帯域の実体像と、１つの波長帯域の蛍光像を観察して比較解析したが、同様に、２つ以上の波長帯域の実体像を比較しても良いし、２つ以上の蛍光像を比較解析してもよい。また、そのためには、さらに１個以上のダイクロイックミラーおよび、光源、あるいはカメラ観測系を光路中に上記実施例と同様に配置すればよい。
【００１０】
図２は、さらに１つの観測カメラの受光面を用いて複数の異なる波長の像を同時に計測する、この出願の発明の細胞分析分離装置の光学系の構成の１例を示す模式図である。対物レンズから送られてきた異なる波長の光２０１、２０２、２０３が含まれる２００光の進行方向に複数のダイクロイックミラー２１１、２１２および２１３ミラーが配置されている。それぞれの波長で分離された光はそれぞれ同じ光路長の位置にある合焦点面に配置されたスリット２２１、２２２、２２３によって観察する視野領域を選択する。次に、バンドパスフィルター２３１、２３２、２３３および減光フィルター２４１、２４２、２４３によって同程度の強度でかつ観察したい特定の波長の光を調整する。そして、シャッター２５１、２５２、２５３によって特定の波長の光を遮光したい場合は遮ることができる。このシャッターを通過した光は、再び、２６１ミラーおよび、ダイクロイックミラー２６２、２６３を通過した後、２７１レンズによって２７２カメラの受光面に結像する。ここで、各ミラー２６１、２６２、２６３は可動で、カメラの受光面のどの領域に結像させるかを任意に選択することができる。ここで、以上の実施例では３つの異なる波長の光の分析手法を述べたが、同様に４つ以上の異なる波長の光についても用いることができる。また、この実施例のように１つのカメラの受光面を用いることで、高価な高感度カメラを複数用意する必要が無くなる。さらにまた、高速カメラのように複数のカメラの同期が難しい場合に、１つの受光面で得られたデータを解析するのみで、実態顕微鏡像や蛍光顕微鏡像などの複数の異なった波長での画像を同時に解析することができる。
【００１１】
図３は、この発明の細胞分析分離装置の試料分離部の構成の１例を示す模式図である。３０２は試料を含む流体が試料分画部に流れ込む流路、流路３０１と３０３は試料を含まない流体が試料分画部に流れ込む流路、３２１、３２２は前記３つの流路が合流する試料分画部に超音波を照射して前記試料分画部内の試料３１１に超音波による外力を作用するために用いる超音波源である。流路３０１、３０２、３０３から導入される流体は脈流が無く、流速が一致するように調整されているため、試料分画部では層流が維持され、流路３０２から試料分画部に導入された試料３１１は外力を受けない限り、流路３０５に進行する。逆に超音波による外力が作用した場合には、流路３０４あるいは流路３０５に廃棄される。このとき、試料を導入する流路３０２と試料を回収する流路３０５は流れの方向に対して一直線上に配置され、この流路の軸に関して軸対称な形で１対の流体のみを試料分画部に導入する流路３０１および３０３と、同様に、不要な試料を廃棄する１対の流路３０４と３０６が流路３０５に対して軸対称な形で配置されている。ここで、少なくとも流路３０１と３０３の流れに対する断面積は等しく、また、流路３０４と３０６の流れに対する断面積は等しい。
【００１２】
図４は、図３と同様に試料分離部の構成の１例を示す模式図である。ここでは、超音波の替わりに静電力を用いた試料への外力の誘導手法の実施例を示す。流路４０２から導入された試料４１１を含む流体は、同様に試料分離部に導入され、光学的計測手法による計測結果に基づいて回収するか、廃棄するか判断される。回収する場合は、外力を加えず、そのまま流路４０５に進行させて回収する。そして、廃棄する場合は、電極４２１と電極４２２に電界を加えて、試料を流路４０４あるいは４０６に誘導する。このとき、電極４２３および４２４は参照電極となるように接地される。一般に、水溶液中で物質はその水溶液との境界面でゼータ電位を持ち、それに由来した電荷を持つ。したがって、電場を作用させることで廃棄する試料に外力を加えることができる。特に、この場合には、正電荷を持つものと、負電荷を持つもので、それぞれ流路４０４あるいは４０６に分離することもできる。さらに、気泡等が試料に混ざって導入された場合にも、気泡は表面電荷を持たないことから、電場による作用は受けないが、光学的にはリポソーム等と識別が困難な場合が多い。しかし、この手法を用いることで、気泡と試料微粒子とを識別することも可能である。
【００１３】
図５は、この出願の発明の細胞分析分離チップの実施例の１つの断面図である。５０１、５０３はチップ断面で、ともに観察する波長の光に対して十分な透過性がある。上面５０１の厚さは構造を維持するためにｍｍオーダーの厚さであっても良いが、対物レンズ５０４と接して液層５０２中の流体の流れ５０５を観察するチップ断面５０３については、対物レンズの倍率に応じて最大厚さが制限される。たとえば、対物レンズ５０４に開口数１．３５で１００　倍のものを用いた場合には、断面の厚さは０．２ｍｍ以下とすることが望ましい。試料液の導入部と回収部のチップ開口部端５０９は撥水処理されており、開口部の液が拡散しないように処理されている。試料導入部に試料液５１０を載せ、シール５０７を針５０８で刺してシールを破ることで、試料液５１０の液面の高さに応じた流速で試料液が流れ始める。このとき、試料液の量を厳密に制御することで流速が厳密に制御された脈流の無い流れを作り出すことができる。また、この手法においては特にポンプ等の装置を必要としない。
【００１４】
図６は、この出願の発明の細胞分析分離手順を説明した図である。先の実施例でも述べたように、流露に導入された試料は顕微鏡観察され、回収する試料か、廃棄する試料か選別される。そして、回収する試料については、外力を一切作用させずそのまま回収流路に進行させて回収する。このとき、試料は層流中を進行し、外力が一切加えられていないため可能な限り損傷ない試料が回収されると考えられる。次に、廃棄する場合には、細胞に損傷を与えることは、特に問題とならないため、任意の外力を試料に作用させて排除すればよい。
【００１５】
図７は、実際に異なる蛍光を持つ試料を、この出願の発明の細胞分析分離装置で画像解析して分離した例の顕微鏡写真である。各々の流路のサイズは、その断面として幅２０μｍ×高さ（深さ）２０μｍであり、各々の流量比は１：１：１である。また、細胞の種類はウマ赤血球であり、流体としては生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ：ｐＨ７．４）を用いた。また、外力としては電場（誘電電気泳動力）を用いた。写真１から４では赤色に蛍光を発する大きさ３マイクロメートルの細胞を回収する過程を示している。同様に写真５から８では緑色に蛍光を発する大きさ３マイクロメートルの細胞を廃棄する過程を示している。
【００１６】
【発明の効果】
以上詳述したように、この出願の発明によって、微小な試料を識別して損傷を受けないかたちで分離回収することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の細胞分析分離装置のシステム構成の１例を示す模式図である。
【図２】この発明の細胞分析分離装置の光学系の構成の１例を示す模式図である。
【図３】この発明の細胞分析分離装置の試料分離部の構成の１例を示す模式図である。
【図４】この発明の細胞分析分離装置の試料分離部の構成の１例を示す模式図である。
【図５】この発明の細胞分析分離チップの実施例の１つの断面図である。
【図６】この発明の細胞分析分離手順を説明した図である。
【図７】この発明の細胞分析分離装置を用いて細胞を分離した１例についての顕微鏡写真である。
【符号の説明】
１００　細胞分析分離チップ
１０１、１０８　光源
１０２、１０９、１１２、１１４、２３１、２３２、２３３　バンドパスフィルタ
１０３　コンデンサレンズ
１０４　ステージ
１０５、５０４　対物レンズ
１０６、１１０、２１１、２１２、２６２、２６３　ダイクロイックミラー
１１１、２１３、２６１　ミラー
１１３、１１５、２７２　カメラ
１１６　画像処理解析部
１１７　駆動装置
２００、２０１、２０２、２０３、５０６　光の進行方向
２２１、２２２、２２３　スリット
２４１、２４２、２４３　減光フィルター
２５１、２５２、２５３　シャッター
２７１　レンズ
３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６　流路
３１１、４１１　試料
３２１、３２２　超音波源
４２１、４２２、４２３、４２４　電極
５０１、５０３　チップ断面
５０２　液層
５０５　流体の流れ
５０７　シール
５０８　針
５０９　チップ開口部端
５１０　試料液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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