(57)【要約】【課題】一細胞の培養観察装置において、マイクロチャンバアレイ基板上の任意の方向に配列した複数のマイクロチャンバアレイを連続的に観察、計測する。【解決手段】マイクロチャンバアレイ基板上の任意の方向に配列した複数のマイクロチャンバをその配列方向に合わせて周期的に移動させて連続計測するために、基板を固定するＸＹステージの２つの軸方向と基板上のマイクロチャンバアレイのなす角度を計測する手段と、この角度に合わせてＸＹステージの２つの軸を連動させて動かす手段と、この角度に合わせて観察するカメラを傾ける手段とを有する一細胞長期観測装置とする。【選択図】　　　　図３
2004085833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチャンバアレイ基板上の任意の方向に配列した複数のマイクロチャンバをその配列方向に合わせて周期的に移動させて連続計測するために、前記基板を固定するＸＹステージの２つの軸方向と基板上のマイクロチャンバアレイのなす角度を計測する手段と、この角度に合わせてＸＹステージの２つの軸を連動させて動かす手段と、この角度に合わせて観察するカメラを傾ける手段とを有することを特徴とする一細胞長期観察装置。
【請求項２】
基板の凹凸によって生じる焦点位置のずれを補正するために、マイクロチャンバを位相差法あるいは微分干渉法を用いて顕微鏡計測する手段と、計測したマイクロチャンバの形状の輝度分布を測定する手段と、この輝度分布の傾きが最も急峻になる位置に対物レンズの焦点位置を移動させる手段とを有することを特徴とする請求項１の一細胞長期観察装置。
【請求項３】
観察光によって生体試料に損傷を与えることを防ぐために、光学観察をするための光源の波長を特定の波長帯域に制限する手段を有し、計測するために必要な最小限の時間のみ光を照射する手段を有することを特徴とする請求項１または２の一細胞長期観察装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、一細胞長期観察装置に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、微生物や細胞を用いるバイオテクノロジーの研究分野において、特定の細胞の状態で一細胞単位で培養し、これを連続して観察、測定することのできる、一細胞観察装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の生物学、医学、薬学の分野では、細胞の状態の変化、あるいは細胞の薬物等に対する応答を観察するのに、細胞集団の値の平均値をあたかも一細胞の特性であるかの様に観察してきた。しかし、実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質を発現している。これらの問題を解決するべく、同調培養等の手法が編み出されているが、培養された細胞の由来が全く同一の一細胞からではないことから、培養前の由来細胞各々の遺伝子の違いがタンパク質発現の違いを生み出す可能性があり、実際に刺激に対する応答の結果を解析するときに、そのゆらぎが細胞の反応機構自体が普遍的に持つ応答のゆらぎに由来するものなのか、細胞の違い（すなわち遺伝情報の違い）に由来するゆらぎなのか明らかにすることは難しかった。また、同様の理由から細胞株についても、一般には完全に一細胞から培養したものではないため、刺激に対する応答の再現性が細胞各々の遺伝子の違いによってゆらぐものか明らかにするのは難しかった。また、細胞に対する刺激（シグナル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞との物理的接触によるものの２種類がある。従来、バイオテクノロジーの研究分野において細胞の観察を行う場合は、大型培養器にて培養された細胞群の一部を一時的に培養器から取り出して顕微鏡にセットし、観察を行っていた。あるいは、顕微鏡全体をプラスチックの容器で囲い温度を管理し、その中に小さい別の容器を用い二酸化炭素濃度、及び湿度を管理しつつ、顕微鏡観察を行っていた。このとき、細胞を培養しながら、古くなった培養液と新鮮な培養液を交換することで溶液条件を一定にする方法として多数の発明がある。例えば特開平１０−１９１９６１に開示されている方法では、循環ポンプが、基材表面に対する培地のレベルを基材の上端縁高さより高いレベルと下端縁高さより低いレベルとの間で上げ・下げ操作し、上記低レベルに下がると培地を供給し、上記高レベルに上がると培地を排出する機構によって栄養状態を一定に保っている。また、特許公開平８−１７２９５６では、培養容器内に、新たな培地を培養容器に導入する導入管と、培養容器の培地を外部に排出する排出管と、培養容器の気体部分とポンプとを連通する気管の各一端を挿入し、前記導入管、排出管及び気管の夫々の管路に培養容内への菌の侵入を阻止するフィルターを設けており、培養槽の栄養状態を一定に保つ構成になっている。しかし、いずれの発明の場合も、培養細胞の溶液環境と、細胞間の物理的接触を制御しながら培養する公知例は無い。そこでこの出願の発明者らは、これらの問題点を解決し、新たに特定の一細胞のみを選択し、その一細胞を細胞株として培養する技術や、細胞を観察する場合に、細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、さらには、相互作用する細胞を特定しながら培養観察する技術を発明し、特願２０００−３５６８２７として出願した。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記発明者らの出願した発明は、従来技術の問題の解決に向けて大きく前進するものであったが、基板上に構築した多数のマイクロチャンバを連続的に観察し測定するための手段に関しては、まだ充分な検討が為されていなかった。たとえば、１つのマイクロチャンバのみを継続して観察し続ける場合には問題にはならないが、基板上に構築した多数のマイクロチャンバアレイを連続して光学的に観察する場合には、合焦点範囲が狭い高倍率の観察を行いつつ観測位置を移動させなければならないため、幾つもの問題が生じることになる。たとえば、（ｉ）ステージ上にステージのＸ軸、Ｙ軸方向に完全に揃えて固定できなかった場合には、ステージ移動によってマイクロチャンバアレイを見失ってしまうこと、　（ｉｉ）　基板の微小なゆがみや、顕微鏡ステージ上に固定した基板の微小な傾きのために生じた微小な基板面の高さの変化によって、ステージ移動によって観測する位置を移動させたときに顕微鏡の焦点面にあったはずのマイクロチャンバの位置が焦点外にずれてしまい観察位置によってはピントがぼけてしまうこと、　（ｉｉｉ）観察のために長時間白色光を当て続けていると生体試料が損傷を受ける、などの問題が生じる。
【０００４】
そこで、この出願の発明は、上記の問題点を解消し、マイクロチャンバアレイ基板上の任意の方向に配列した複数のマイクロチャンバアレイを連続的に観察、計測することができ、しかも、生体試料に損傷を与えることもない、改良された新しい一細胞長期観察装置を提供することを課題としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、マイクロチャンバアレイ基板上の任意の方向に配列した複数のマイクロチャンバをその配列方向に合わせて周期的に移動させて連続計測するために、前記基板を固定するＸＹステージの２つの軸方向と基板上のマイクロチャンバアレイのなす角度を計測する手段と、この角度に合わせてＸＹステージの２つの軸を連動させて動かす手段と、この角度に合わせて観察するカメラを傾ける手段とを有する一細胞長期観察装置を提供する。
【０００６】
また、この出願の発明は、第２には、前記の基板の凹凸によって生じる焦点位置のずれを補正するために、マイクロチャンバを位相差法あるいは微分干渉法を用いて顕微鏡計測する手段と、計測したマイクロチャンバの形状の輝度分布を測定する手段と、この輝度分布の傾きが最も急峻になる位置に対物レンズの焦点位置を移動させる手段とを有する。一細胞長期観察装置を提供し、第３には、観察光によって生体試料に損傷を与えることを防ぐために、光学観察をするための光源の波長を特定の波長帯域に制限する手段を有し、計測するために必要な最小限の時間のみ光を照射する手段を有する一細胞長期観察装置を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【０００８】
まず、図１は、この出願の発明の一細胞長期観察装置のシステム構成の１例を模式的に示したものである。図中の符号１０１は位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡の光源であり、一般にハロゲン系のランプが用いられる。１０２は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタである。たとえば細胞等の試料を用いる場合には、波長７００ｎｍ近傍の狭帯域の用いることで試料の損傷を防ぐことができる。１０３はシャッターで、ＸＹステージ１０５を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮断する機能を有する。１０４はコンデンサレンズであり、位相差観察をする場合は位相差リングを導入し、微分干渉観察をする場合は、偏光子を導入する。１０５のＸＹステージ上に載っているのはマイクロチャンバアレイが加工されている基板１００であり、１１９の駆動装置によって前記ＸＹステージを移動させることで前記基板上の異なるマイクロチャンバを観察し、計測することができるようにしている。前記マイクロチャンバ内の細胞の存在状態は、対物レンズ１０６で観察される。対物レンズ１０６の焦点位置は駆動装置１０７によって移動させることができる。また、蛍光観察のために、１０８の光源からの光をバンドパスフィルタ１０９によって励起光波長のみ透過させ、シャッター１１０によって観察するときのみ励起光が試料に照射されるように制御されている。そしてシャッター１１０を通過した励起光はダイクロイックミラー１１１によって試料に照射される。このとき対物レンズで観察されるのは、光源１０１から透過された光による試料の位相差像あるいは微分干渉像と、１０８の光源からの励起光によって試料が発した蛍光像である。前記バンドパスフィルタ１０２を透過するのと同波長の光を反射するダイクロイックミラー１１２およびバンドパスフィルター１１４によって、流路内の位相差顕微鏡像あるいは微分干渉顕微鏡像のみがカメラ１１５によって観察される。このカメラの受光面は、ＸＹステージ上に固定されたマイクロチャンバの傾きに応じて回転させ、マイクロチャンバの傾きに一致させることができる。他方、蛍光像は、対物レンズを通過した光のうちミラー１１３およびバンドパスフィルター１１６によって、蛍光観察の波長帯のみを選択的に透過させて、カメラ１１７で観察することができるようにしている。このカメラ１１７の受光面もカメラ１１５と同様にマイクロチャンバの傾きに応じて回転させ、マイクロチャンバの傾きに一致させることができる。カメラ１１５で撮った位相差像あるいは微分干渉像は、画像処理部１１８において解析され、たとえばパターンマッチングに基づくマイクロチャンバの傾きの検出、ＸＹステージの移動量の制御、あるいはカメラ１１５および１１７の受光面の回転量の制御、あるいは対物レンズ１０６の高さ制御、ピント合わせ等を行うことができるようにしている。
【０００９】
図２は、実際に用いることのできるマイクロチャンバアレイの配置の１例を示した図である。この図２の例においては、基板２０１上にマイクロチャンバ２０２が周期的に配列されている。そして、実際の観察には、高倍率で各マイクロチャンバ内の細胞培養容器２０３の内部を観察する。ここで、光学顕微鏡の最高倍率である１００倍（開口数１．３５）を用いる場合には、対物レンズに接する基板の厚さは一般的に０．２ｍｍ以下であることが望ましい。
【００１０】
図３は、マイクロチャンバの観察手順の１　例を説明した図である。一般に、基板をＸＹステージ上に固定する場合、治具を工夫しても薄い基板を固定することから、完全に位置と角度を制御することは難しい。そこで目視でほぼ位置と角度を合わせた基板上のマイクロチャンバアレイを順番に計測する手順を説明すると、ＸＹステージの２　つの移動軸、Ｘ軸３１１とＹ軸３１２に対してなす角θでマイクロチャンバが配列している基板について、まず、高倍率の対物レンズによってカメラの受光面に記録される観察領域３０１は、θだけ回転させることで、視野を最大に利用した大きさのマイクロチャンバをすべて視野内において観察することができる。マイクロチャンバの視野３０１を観察した後は、隣のマイクロチャンバの視野３０２に移動量３０５で移動させる。このとき移動量Ｌ　はあらかじめ製作時にマイクロチャンバアレイの配列周期として用いられた値である。すると、ステージのＸ方向の移動量Ｘ１と、Ｙ方向の移動量Ｙ１とは、それぞれ次式；
Ｘ１＝Ｌｃｏｓθ
Ｙ１＝Ｌｓｉｎθ
で定められ、この関係を維持しながらＸ軸とＹ軸方向の移動は連動する。
【００１１】
他方、観察方向を９０度変えて、たとえば視野３０３から視野３０４に３０６の方向に移動して一段下の行のマイクロチャンバを観察するためには、ステージのＸ方向の移動量Ｘ２とＹ軸方向の移動量Ｙ２は次式の関係を維持して連動して移動する。
【００１２】
Ｘ２＝Ｌｓｉｎθ
Ｙ２＝Ｌｃｏｓθ
図４（１）に、マイクロチャンバの位相差顕微鏡像と（２）そのＡ−Ａ断面図および（３）Ａ−Ａ断面における輝度分布図を示す。図４（１）のマイクロチャンバ４０１の位相差顕微鏡写真において、そのＡ−Ａ断面の模式図は図４（２）のようになり、基板４０２上に、構造物４０３がマイクロチャンバの形状になるように付加されている。ここで、水中で構造物内の形状を観察する場合、実体顕微鏡を用いると構造物の厚さおよび水との吸収の違いの大きさによって観察が難しいことがある。これは、光の吸収が光の通過する物体の厚さに依存するためであり、マイクロ加工品のような厚さ１マイクロメートル程度の光の波長程度の厚さのものに対しては十分なコントラストが得られないことによる。また、ゼラチンやアガロースといった含水量の多い物質などは、ほとんど水と屈折率も吸収も同じため十分なコントラストを得るのは難しい。したがって従来の実体像の微分処理に基づいてコントラストを求める画像のピント合わせの機構を用いるのは難しい。図４（３）の位相差顕微鏡画像のＡ−Ａ断面の輝度分布図を見てもわかるように、構造の境界面において輝度が大きく変化し、構築物上の輝度４０８と基板（単独）上の位置の輝度４０９の平均値はおおむね同じであることがわかる。ただし。ここで、線４０４はＡ−Ａ断面の輝度分布、線４０５は最高輝度、４０６は最低輝度、４０７はこれらの中点の位置の輝度である。輝度分布の傾きはピントが最も合ったとき最も急峻な分布となり、ピントがずれるにしたがってなだらかな傾きとなる。
【００１３】
図５は、より詳細に基板上の輝度分布を示した図である。輝度の空間分布は線５０１のようになり、最高輝度５０３と最低輝度５０２の中線５０４において、その輝度分布の幅５０５あるいは５０６は、顕微鏡画像のピントが合ったときに極小値をとることから、たとえば画像処理によって幅５０５、５０６を計測し、対物レンズの移動に伴って変化する値が極小になるところを選べは、先に述べた輝度分布の最も急峻な位置にピントを合わせることができる。なお、この実施例では位相差顕微鏡像の輝度分布の輝度の中線における幅に着目してピントを合わせる手法を示したが、微分干渉像でも同様にピントを合わせることができる。また、直接輝度曲線の傾きを計測することでピント位置を合わせることもできる。
【００１４】
【発明の効果】
以上詳述したように、この出願の発明によって、微小なマイクロチャンバが配列した基板上の複数のマイクロチャンバを連続観察することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明の一細胞長期観察装置のシステム構成の１例を示した模式図である。
【図２】この出願の発明で実際に用いることのできるマイクロチャンバアレイの配置の１例を示した図である。
【図３】この出願の発明のマイクロチャンバ観察手順の１例を説明した図である。
【図４】（１）マイクロチャンバの位相差顕微鏡像と（２）そのＡ−Ａ断面図および（３）Ａ−Ａ断面における輝度分布図である。
【図５】より詳細に基板上の輝度分布を例示した図である。
【符号の説明】
１００、２０１、４０２　基板
１０１、１０８　光源
１０２、１０９、１１４、１１６　バンドパスフィルタ
１０３、１１０　シャッター
１０４　コンデンサレンズ
１０５　ＸＹステージ
１０６　対物レンズ
１０７、１１９　駆動装置
１１１、１１２　ダイクロイックミラー
１１３　ミラー
１１５、１１７　カメラ
１１８　画像処理解析部
２０２、４０１　マイクロチャンバ
２０３　細胞培養容器
３０１、３０２、３０３、３０４　マイクロチャンバの観察領域
３０５、３０６　ＸＹステージの移動量
３１１、３１２　ＸＹステージの移動軸
４０３　構造物
４０４、５０１　Ａ−Ａ断面の輝度分布曲線
４０５、５０３　最大輝度
４０６、５０２　最小輝度
４０７、５０４　最大輝度と最小輝度の中間値
４０８　構造物の輝度
４０９　基板の輝度
５０５、５０６　最大輝度と最小輝度の中間値の幅
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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