(57)【要約】【課題】構造生物学的実験手法によって決定された、またはモデリングにより推定された立体構造をもとに、機能未知タンパク質の生体内における機能を予測する方法を提供する。【解決手段】生体内分子のバーチャルリガンドライブラリ（データベース）を利用してタンパク質の生体内の機能を推定する方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内分子のバーチャルリガンドライブラリ（データベース）を利用してタンパク質の生体内の機能を推定する方法。
【請求項２】
物性インデックス（ディスクリプタ）を利用して候補化合物を絞り込む方法。
【請求項３】
物性インデックス（ディスクリプタ）を利用して候補化合物セットを作成し、ドッキングシミュレーションにより生体内リガンドを推定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質の生理的環境下での機能を推定する方法に関する。
【０００２】
本発明は、タンパク質の構造に基づき、生体内化合物のバーチャルライブラリを逐次結合させることによって、最終的に実地に実験での確認可能なレベルの種類のリガンド候補リストを提供する方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
１９９０年前後より各種のゲノムプロジェクトが開始され、現在では大腸菌、酵母、ショウジョウバエなどの生物における遺伝子の全配列が決定された。ヒトにおいては２０００年にドラフトシークエンスの解読完了が発表され、２００３年中にも完全解読が終了する見込みである。ゲノム研究の進展につれて配列に関するデータは膨大に蓄積されてきたが、遺伝子のコードする情報を決定することは容易ではない。
【０００４】
これまでのところ配列から機能を予測するための手段としては、類似の配列を検索する「相同性検索」、機能が共通するタンパク質の部分配列を検索する「モチーフ検索」が主な方法であったが、ゲノム研究において決定された配列のうちこれらの方法で機能が推定できる配列は全体の約半数にすぎない。また、既知のモチーフを含まないアミノ酸配列を持つタンパク質の機能推定はほとんど不可能である。
【０００５】
一般的にタンパク質の「機能」と表現される機能には様々なレベルがある。生化学的には他の分子と相互作用する「機能」、生理学的には形態・病態などに関与する「機能」、遺伝学的な「機能」などである。いずれの「機能」においても初期反応はタンパク質とその他の分子の相互作用が出発点であるので、タンパク質と相互作用する分子を推定することは機能推定において最も重要な段階である。ここで重要なことは、タンパク質−分子間相互作用にも２種類あり様式が異なることである。比較的低分子量の化合物とタンパク質が相互作用する場合は、タンパク質が化合物を包み込むような形で複合体を形成する。一方、比較的高分子量の化合物（多くは核酸、ペプチド、タンパク質）の場合には、タンパク質の表面による相互作用が大きな役割を果たしている。したがって、これら２種類の相互作用の結果生じる構造を推定することができれば、タンパク質の「生化学的」機能が推定できることになる。
【０００６】
このような分子間相互作用を検討するためにはタンパク質の立体構造が必要である。タンパク質の立体構造決定の方法にはおおまかにＸ線解析による方法とＮＭＲによる方法がある。これらの方法による構造決定は以前からなされていたが、蓄積されていたデータ件数はそれほど多くなかった。しかし、米国において数年前より１００００件のタンパク質の立体構造を決定するプロジェクトが開始され、日本においても２００２年度より「タンパク３０００」プロジェクトが開始されたことにより立体構造決定は加速的に進行しており、信頼性のある予測精度の立体構造を推定できるようになる日も近いと考えられる。
【０００７】
このように研究が進展しているにも関わらず、配列、構造のどちらに基づく機能推定法についても、これまでに知られている構造を分類し、未知タンパク質の構造をどのカテゴリーに分類するかという手法をとっていることが多く、機能推定の限界がそこにある。今後はこのようなタンパク質を類似性以外のどのような性質を利用して推定するかが非常に重要な課題である。
【０００８】
本発明者は、このような課題を解決するための方法を模索している途中でタンパク質−分子間相互作用に着目した。この相互作用を推定する目的において、最も進んでいる技術はドッキングシミュレーションである。本方法は既知構造のタンパク質に低分子化合物をコンピュータ上（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で結合させ、より安定である構造を選択する方法である。この方法は以前から製薬業界において新薬開発におけるシード化合物のスクリーニングに利用されていたが、他業界においては一般的な方法ではなかった。しかし、近年の計算機の性能向上およびゲノム研究の成果の利用の必要性に伴い、化合物の高速スクリーニング法の開発が急速にすすみ、この開発競争の結果、２０００年にＣＡＴＦＥＥ（Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｒｅｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）というタンパク質―リガンド複合体のエネルギーを予測するコンテストが開かれるに至った。
【０００９】
ドッキングシミュレーションの方法はタンパク質とリガンドの構造の多様性に応じて次の３種類に分類できる。（１）タンパク質、リガンドの双方ともに形が変わらない（リジッドな）ものと仮定して扱う。（２）タンパク質の形は固定とし、リガンドの形のみを変化させる。（３）タンパク質、リガンドのどちらの形も変化させる。分子の構造の多様性を考慮すると計算量が膨大になるため、１分子当たりに要する時間は（１）→（３）と増大するが、分子の初期構造によらない複合体構造を検出することが可能となる。方法の選択はスクリーニングに使用するデータベースのデータ件数に依存することになるが、現実的にはこれらの複数の方法を組み合わせて最も安定な構造をとる化合物を選び出すことが多い。創薬現場においては、ターゲットとなるタンパク質に結合する薬物をこの方法によって選び出し、その構造をもとにより安定な化合物を設計、合成、活性検出する（リードジェネレーション）ことによって、新規薬物を作り出している。
【００１０】
以上のようにドッキングシミュレーションの技術は多種多様な方法が考案・開発されてきており、人工的な化合物設計の分野では着実に実績を出しつつある技術である。この方法を用いて生理的な化合物をスクリーニングすれば、構造の相同性とは異なる視点から機能不明なタンパク質の生理的条件での機能を推定できると考えられる。
【００１１】
一方で、ドッキングシミュレーションを用いたスクリーニングのキーとなるのは対象となるデータベースライブラリである。すなわちデータベースに収録されていない化合物はドッキングで検出できないからである。これまでのドッキングシミュレーションの応用技術においては薬物の設計が最終目的であったので、対象となるデータベースは工業的に容易に入手できる化合物がメインに収録されていた。このため、既存のデータベースでは生体内における化合物をスクリーニングするという用途において適当ではなく、これらの成果を統合的にタンパク質の機能予測のために使用した例はない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明では、生体内分子のバーチャルリガンドライブラリ（データベース）を利用したドッキングシミュレーションによる機能未知タンパク質のリガンド推定法を供することを目的として、本システムの開発を行った。
【００１３】
具体的には、本発明における第一の課題は、ドッキングシミュレーションに供すための生体内化合物を収録したリガンドライブラリを作成することであり、第二の課題は当該データベースをドッキングのために簡便に利用可能にする検索・データセットの作成システムである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記第一の課題を実行するために、図１のようなデータベーススキーマを設計した。本データベースはＳＱＬをＤＢＭＳ（データベース・マネージメント・システム）として採用し、ＳＹＢＹＬ  ｍｏｌ２形式、Ｇａｕｓｓｉａｎ  ＸＹＺ形式、物性インデックスの３つのテーブルからなるリレーショナルデータベースとした。ここで立体構造の記述形式としてｍｏｌ２形式を採用したのは、ドッキングシミュレーションにおいてよく使用されているＦｌｅｘＸ，  Ａｆｆｉｎｉｔｙ，  Ｌｕｄｉ，  ＭＯＥなどのプログラムがｍｏｌ２形式の入力をカバーしていることによる。各々のテーブルは唯一のエントリ番号（主キー）によって対応づけられるようになっている。データ例としてメチルグリオキサールの例を図２〜図５に示す。
【００１５】
本データベースをタンパク質の生体内における機能予測に応用するためには、生体内に存在する化合物を網羅的に収録している必要がある。そのため収録するデータは代謝マップに収録されている化合物、および酵素の基質・生成物を主体とし、そのほかにこれらに未収録の生体内物質の候補化合物も加えている。本発明の中心はこのデータベース、及びこれを記録した記録媒体である。
【００１６】
次に第二の課題を実行するために、図６〜図９に示すようなデータベース検索・データ統合システムを作成した。データベース検索システムは図６に示すような初期画面からなり、物性インデックスの検索をおこなうことができる。具体的には物性インデックスに収録されているデータのうち、分子の名称、示性式、ＳＭＩＬＥＳ（分子の構造を示す式）、体積、分子量、双極子モーメント（分子の分極の指標）、ＣＡＳ番号などについて、カラムの属性に応じて、文字列の部分一致検索、範囲検索などを実行することができるようになっている。この結果、名称がわかっている化合物（例えば糖を検索するような場合は”ＮＡＭＥ”キーの検索カラムに”ｏｓｅ”と入力する）、特定の分子量範囲に含まれる化合物（”ＷＥＩＧＨＴ”キーの検索カラムに適当な数値を入力する）などの条件に合致した化合物のセットを作成することが容易になる。検索を実行すると図７に示すような画面が現れる。この画面によって全検索エントリが表示され、エントリ番号の左側にあるチェックボックスのＯＮ／ＯＦＦにより、不要なデータを削除するなどのデータセットの詳細なカスタマイズができる。図７の下に示す操作選択カラムの中は図８で示すような操作ができるようにし、使用するプログラムに応じて個別の構造ファイルあるいは１つの構造ファイルの両方が任意に作成できるようにした。必要に応じたデータセットを作成できるようになっている。
【００１７】
現時点でのドッキングシミュレーションによる化合物のスクリーニング手法においては、多数の化合物からヒットする化合物を選択することは可能であるが、必ずしも結合すると考えられる化合物すべてがヒットするとは限らない。そのため、この検索システムでは特性インデックスをもとに化合物を絞り込み、最初に候補化合物数を減らした上で、リガンド結合ポケット周辺に対する精密なドッキングを適用できるようにすることがその主目的である。
【００１８】
本発明においてリガンド結合ポケットとは、タンパク質の立体構造の中でリガンド分子を包含する、あるいは包含することのできる部分構造をいうものとする。
【００１９】
ドッキングシミュレーションとは、コンピュータ上でタンパク質と低分子化合物を相互作用できる距離に配置し、計算的に当該複合体の安定構造を得る方法をいうものとする。
【００２０】
ホモロジーモデリングとは、配列上相同性のあるタンパク質の立体構造座標を鋳型として問題となるタンパク質の立体構造を推定する方法をいうものとする。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでない。
【００２２】
バーチャルリガンドライブラリを用いて、タンパク質の機能を推定する方法の具体的なストラテジーを図１０に示す。材料として用いるタンパク質の構造は実験的に決定されたものでも、配列から予測されたものでもよい。信頼できる精度のタンパク質立体構造座標が得られたものについて、結合ポケットの予測を行い、その部位に対して作成したリガンドライブラリに収録された構造を逐次ドッキングする。結果を注意深く検討し、得られた複合体構造をエネルギーなどの計算により評価する。最終的に多くとも数十程度の候補化合物を選択することで、実験的な検証をおこなうことができる。上記のスクリーニングによって得られた化合物群については、細胞内局在性、組織分布などの情報と照合し、タンパク質の発現・分布の情報とともに総合的に機能推定をおこなう。
【００２３】
具体例として四量体カルボニル還元酵素の例を示す。四量体カルボニル還元酵素の立体構造（１ＣＹＤ）からサブユニットＡのみの構造を抽出した。この構造はイソプロパノールとＮＡＤＰ＋をリガンドとして結合している還元反応後の構造であったので、イソプロパノールの座標を除き、ＮＡＤＰＨの結合している形に修正した構造を用いて計算に用いた。まず最初に、タンパク質のポケットの形状を楕円体と近似し、おおよその主軸の長さを計測したところ、それぞれ１０Å（＝  ２ａ），  ６Å（＝  ２ｂ），  ６Å（＝  ２ｃ）であった。この値を楕円体の体積の式（Ｖ＝４πａｂｃ／３）に代入して得られた値は１８８．４であったので、この値を結合ポケットの体積と仮定した。次にリガンド結合ポケットの周辺に存在するアミノ酸残基を観察したところ、５つの残基が存在したが、そのうち３つは疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ，  Ｖａｌ）であり、２つはＴｙｒ，  Ｓｅｒであったので、ＮＡＤＰＨのアミド基を含めて水素結の形成できる部位は３つと判定した。また、活性部位に疎水性部分が多いことからｌｏｇＰ（ｏ／ｗ）は正の値をとるものが結合に有利であろうと予想した。
【００２４】
以上の情報をもとに（１）化合物の体積が１９０以下であること、（２）構造中にカルボニル基を持つこと、（３）水素結合のアクセプターサイトが１つ以上３つ以下であること、（４）水素結合のドナーサイトは３つ以下であること、（５）ｌｏｇＰ（ｏ／ｗ）の値が正になること、の５つの条件に合致する化合物を本システムにより検索した。条件（１）と（２）のみで検索した場合はヒットした化合物は１６５５件あったが、（１）〜（４）の条件により４５３件に絞り込むことができ、さらに（５）の条件を加えることにより２９３件に候補化合物を絞り込むことができた。さらに、検索結果の中にはアセトン（イソプロパノールの酸化された化合物）が含まれていたことを確認した。
【００２５】
モデリングの結果得られた四量体カルボニル酵素の還元型立体構造に対して、ドッキングプログラムの１つであるＦｌｅｘＸを用いてアセトンの構造をドッキングさせたが、活性部位の中に適当な構造として配置することができなかった。そのため、ＮＡＤＰＨの反応部位を考慮してカルボニル基を配置し、分子力学・分子動力学計算によって構造を精密化することで本酵素とアセトンの結合構造を推定した。
【００２６】
上記の例では、モデリングによってタンパク質−リガンド複合体の推定をおこなうための前処理として本システムを利用したが、化合物の検索範囲を適当なものにすることにより、実験的に検証できる範囲の化合物数にしぼりこみ、実際のタンパク質にリガンドを結合させる試行をおこなうことができ、より確実に実際の反応を想定したスクリーニングをおこなうことができる。
【００２７】
さらに、これらのスクリーニング結果をもとにメタボローム研究によって得られる化合物の分布情報、プロテオーム研究によるタンパク質の分布情報、ゲノム研究によるタンパク質の発現情報などを総合的に照らし合わせることによりタンパク質の生体内機能を推定することが可能になると考えられる。
【００２８】
【発明の効果】
以上のように、本発明によって、構造既知あるいは構造が推定可能であるタンパク質に結合する化合物の候補を提示することができ、実験的な検証が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】データベーススキーマ
【図２】Ｂａｌｌ  ＆  Ｓｔｉｃｋ  モデルによるメチルグリオキサールの構造
【図３】メチルグリオキサールの構造式
【図４】ｍｏｌ２形式による記述
【図５】ＸＹＺ形式による記述
【図６】トップ画面
【図７】検索結果画面
【図８】データ表示画面
【図９】ファイルパス指定画面
【図１０】化合物の  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  スクリーニングによる機能予測のストラテジー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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