(57)【要約】【課題】高い病虫害効果が安定して得られ、人体等に害が少なくかつ病害虫に薬剤耐性のつきにくい草本植物用病害虫防除剤を提供することを課題とする。【解決手段】草本植物に内部共生する放線菌を含む微生物製剤。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
草本植物に内部共生する放線菌を含む微生物製剤。
【請求項２】
放線菌が草本植物に内部共生し、宿主草本植物を病原菌及び害虫から保護し、宿主草本植物の生育を促進する機能を有する放線菌である請求項１に記載の微生物製剤。
【請求項３】
放線菌が草本植物の茎葉病害又は土壌病害を抑制する機能を有する放線菌である請求項１に記載の微生物製剤。
【請求項４】
放線菌が草本植物の害虫被害を低減する機能を有する放線菌である請求項１に記載の微生物製剤。
【請求項５】
放線菌がストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、キタサトスポラ属（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ）及びマイクロバイスポラ属（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）放線菌からなる群から選ばれる放線菌である請求項１記載の微生物製剤。
【請求項６】
ストレプトミセス属放線菌がストレプトミセス・ツイラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｕｉｒｕｓ）、ストレプトミセス・バイオラセオルーバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）、ストレプトミセス・アレナー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｒｅｎａｅ）、ストレプトミセス・フラギリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・コリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｌｌｉｎｕｓ）、ストレプトミセス・ヘイミ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｅｉｍｉ）、ストレプトミセス・フラベオラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｆｌａｖｅｏｌｕｓ）、ストレプトミセス・ミシオネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓｉｏｎｅｎｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｌｕｓ）及びストレプトミセス・グリセオフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）からなる群から選ばれる放線菌である請求項５記載の微生物製剤。
【請求項７】
草本植物がナス科、ユリ科、アカザ科、サトイモ科、イネ科、ウリ科、セリ科、マメ科、アブラナ科、ヒルガオ科、ラン科、バラ科、キンポウゲ科、イソマツ科、タデ科、ナデシコ科、キク科、アオイ科、リンドウ科、サクラソウ科およびアヤメ科植物からなる群から選ばれる植物である請求項１に記載の微生物製剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物製剤を草本植物に施用し、放線菌を草本植物内部に共生させ、宿主草本植物の生育を促進する方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物製剤を草本植物に施用し、放線菌を草本植物内部に共生させ、宿主草本植物を病原菌及び害虫から保護し、宿主草本植物の生育を促進する方法。
【請求項１０】
微生物製剤を種子浸積、土壌混和、苗浸積又は葉面散布の方法で草本植物に施用し、放線菌を草本植物内部に共生させることを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
葉面散布を水懸濁法又は煙霧法で行なう請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
葉面散布を行う際にあらかじめ植物体に傷をつけるかまたは製剤中に植物体を傷つける物質を添加することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、放線菌を含む微生物製剤に関し、詳しくは、草本植物に内部共生する放線菌を含む微生物製剤であって、草本植物の植物病害の防除効果に優れ、草本植物の生育を促進する微生物製剤に関する。本発明は、微生物農薬（殺菌剤）、微生物資材等として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、合成農薬を植物に散布することは、病虫害防除のための最も有効な手段の一つとして用いられてきた。しかし農薬を多量に散布し過ぎると、食品としての安全性が損なわれたり、作物栽培環境の悪化をまねく、あるいは病虫害の抵抗性の付与を促進するなどの問題点がある。このため、食品としての健全性を損なうことなくかつ、環境に安全な資材の開発が望まれている。
【０００３】
植物、特に根圏においては根粒菌などの窒素固定菌が共生し、窒素成分を植物に供給する微生物やＶＡ菌根菌のように根の内部に共生し、植物の成長を促進する微生物が知られている。その他にもきのこの仲間の外生菌根菌が樹木の生長や耐乾燥性を向上させる働きが知られている。また、アクレモニウム属糸状菌が芝草などに共生し、植物に強い耐虫、耐病性を付与することが知られている（特許文献１）。
【０００４】
一方、放線菌についてはフランキア属菌がヤシャブシ、ヤマハンノキ、ヤマモモ、モクマオウなどの木本類に共生し、植物の成長を促進することが知られている。さらに木本科に属するシャクナゲに共生するストレプトミセス属菌が、シャクナゲに耐病性、ファイトアレキシン誘導活性を付与することが報告されている（特許文献２）。しかしながら、草本植物に共生する放線菌が耐病性、成育促進等の機能を付与することは知られていない。
【０００５】
【特許文献１】
特開平０７−２６７８１２号公報
【特許文献２】
特開平１３−３２２９０６号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高い病虫害効果が安定して得られ、人体等に害が少なくかつ病害虫に薬剤耐性のつきにくい草本植物用病害虫防除剤を提供することを課題とする。詳しくは、本発明は、草本植物体内に共生し、病害抵抗性、生育促進活性、耐虫性等の機能を付与することができる共生型放線菌を、効率良く、大量に、簡便に感染させる微生物製剤を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく、草本植物に病害抵抗性、生育促進活性、耐虫性等の機能を付与することができる菌を鋭意探索した結果、病害多発地区において健全に生育する草本植物から共生型放線菌を分離し、該共生型放線菌が草本植物に病虫害抵抗性、生育促進活性等を付与することを見いだし、発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）　草本植物に内部共生する放線菌を含む微生物製剤。
（２）　放線菌が草本植物に内部共生し、宿主草本植物を病原菌及び害虫から保護し、宿主草本植物の生育を促進する機能を有する放線菌である（１）に記載の微生物製剤。
（３）　放線菌が草本植物の茎葉病害又は土壌病害を抑制する機能を有する放線菌である（１）に記載の微生物製剤。
（４）　放線菌が草本植物の害虫被害を低減する機能を有する放線菌である（１）に記載の微生物製剤。
（５）　放線菌がストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、キタサトスポラ属（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ）及びマイクロバイスポラ属（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）放線菌からなる群から選ばれる放線菌である（１）記載の微生物製剤。
（６）　ストレプトミセス属放線菌がストレプトミセス・ツイラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｕｉｒｕｓ）、ストレプトミセス・バイオラセオルーバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）、ストレプトミセス・アレナー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｒｅｎａｅ）、ストレプトミセス・フラギリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・コリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｌｌｉｎｕｓ）、ストレプトミセス・ヘイミ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｅｉｍｉ）、ストレプトミセス・フラベオラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｆｌａｖｅｏｌｕｓ）、ストレプトミセス・ミシオネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓｉｏｎｅｎｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトミセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｌｕｓ）及びストレプトミセス・グリセオフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）からなる群から選ばれる放線菌である（５）記載の微生物製剤。
（７）　草本植物がナス科、ユリ科、アカザ科、サトイモ科、イネ科、ウリ科、セリ科、マメ科、アブラナ科、ヒルガオ科、ラン科、バラ科、キンポウゲ科、イソマツ科、タデ科、ナデシコ科、キク科、アオイ科、リンドウ科、サクラソウ科およびアヤメ科植物からなる群から選ばれる植物である（１）に記載の微生物製剤。
（８）　（１）〜（７）のいずれかに記載の微生物製剤を草本植物に施用し、放線菌を草本植物内部に共生させ、宿主草本植物の生育を促進する方法。
（９）　（１）〜（７）のいずれかに記載の微生物製剤を草本植物に施用し、放線菌を草本植物内部に共生させ、宿主草本植物を病原菌及び害虫から保護し、宿主草本植物の生育を促進する方法。
（１０）　微生物製剤を種子浸積、土壌混和、苗浸積又は葉面散布の方法で草本植物に施用し、放線菌を草本植物内部に共生させることを特徴とする（８）または（９）に記載の方法。
（１１）　葉面散布を水懸濁法又は煙霧法で行なう（１０）に記載の方法。
（１２）　葉面散布を行う際にあらかじめ植物体に傷をつけるかまたは製剤中に植物体を傷つける物質を添加することを特徴とする（１０）に記載の方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、草本植物に内部共生する能力を有する放線菌を含む微生物製剤である。好ましくは該放線菌は宿主草本植物を病原菌及び害虫から保護する機能を有し、より好ましくは該放線菌はさらに宿主草本植物の生育を促進する機能を有する。本発明の微生物製剤が含む放線菌は、草本植物に内部共生することができ、草本植物において病原菌及び害虫の感染を予防する又は病原菌及び害虫を除去する機能を付与することができ、好ましくはさらに草本植物の生育を促進する機能を付与することができる。
【００１０】
１．本発明に用いられる放線菌の分離・純化
放線菌の分離源としては、野外で生育させた草本植物が挙げられる。特に、病原菌等に犯された草本植物群の中で例外的に病気に犯されてない植物体から耐病性付与・生育促進等に優れた機能を有する放線菌を得ることができる。
【００１１】
例えば、本発明に用いられる放線菌は、植物体からは以下のようにして分離することができる。すなわち、野外で土壌栽培した植物体の組織（例えば、葉、茎、根など）の一部を水道水等で洗浄後、次亜塩素酸等に浸漬することにより殺菌処理する。次いで、滅菌水で十分濯いだ後、エタノール溶液（例えば、７０％エタノール）等に浸漬し再度殺菌処理する。植物小片を十分乾燥後、放線菌分離用平板培地上に置床し、２０〜６０℃好ましくは３０〜４０℃で、１０〜６０日好ましくは３０日程度培養する。ここで、放線菌分離用の培地としては、水寒天培地（寒天１５ｇ、水道水１Ｌ）、ＩＭＡ−２培地（グルコース０．５ｇ、可溶性デンプン５．０ｇ、牛肉エキス１．０ｇ、ＮＺ−カゼイン２．０ｇ、食塩２．０ｇ、炭酸カルシウム１．０ｇ、寒天１５．０ｇ、蒸留水１Ｌ）、ＩＳＰ−２培地（Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌ社製又は酵母エキス４ｇ、麦芽エキス１０ｇ、グルコース４ｇ、蒸留水１Ｌ、寒天２０ｇ）、ＹＭＡ培地（ペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、ブドウ糖１０ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１Ｌ）、Ｂｅｎｎｅｔｔ培地（酵母エキス１ｇ、牛肉エキス１ｇ、ＮＺ　Ａｍｉｎｅ，　ｔｙｐｅ　Ａ（Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）２ｇ、グルコース１０ｇ、蒸留水１Ｌ、寒天２０ｇ）、グルコースアスパラギン寒天培地（Ｌ−アスパラギン０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ブドウ糖１０ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水１Ｌ）などが挙げられる。また、これらの培地には必要に応じて、抗生物質を添加することができる。
【００１２】
次いで、培地上に置いた植物小片から伸長した放線菌の菌糸を、新鮮な培地に移植し培養することにより、放線菌を純粋分離することができる。
【００１３】
また、別の方法として、例えば、以下のようにして分離・純化することができる。表面殺菌した野外で土壌栽培した植物体を前記と同様の放線菌分離用平板培地上に置床し、５〜６０℃好ましくは１０〜５０℃で２〜３０日好ましくは３〜１４日程度培養すると、植物体表面に放線菌が生育する。生育した放線菌は殺菌した爪楊枝で釣菌する。得られた放線菌の純化には、分離用平板培地に乗せたメンブランフィルター（０．２ミクロン）上に放線菌のコロニーを移植する。３０℃で１週間程度培養後、メンブランフィルターは取除き、分離平板をさらに１週間程度培養すると、混在する細菌類を排除し、放線菌を選択的に純化することができる。
【００１４】
分離された放線菌は、滅菌済グリセロール溶液（例えば、２０％グリセロール）中に懸濁し、凍結保存することができる。また、菌糸や胞子をスキムミルク懸濁液に分散し、凍結乾燥する方法や、液体窒素中で保存することもできる。
【００１５】
分離された放線菌を目的とする草本植物に施用し、内部共生させ、病虫害に汚染された圃場などで栽培し、同様に栽培した放線菌を施用していない草本植物に対し、発病率、病害の程度等を比較することにより前記放線菌の宿主草本植物を病原菌及び害虫から保護する機能を確認することができる。また、分離された放線菌を目的とする草本植物に施用し、内部共生させ、栽培し、同様に栽培した放線菌を施用していない草本植物に対し、生育の程度等を比較することにより前記放線菌の宿主草本植物の生育を促進する機能を確認することができる。
【００１６】
本発明に用いられる放線菌としては、本発明の効果を発揮することができる放線菌であれば特に限定されないが、本発明に用いられる放線菌の例として、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、キタサトスポラ属（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ）又はマイクロバイスポラ属（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）等に属する放線菌等を挙げることができ、ストレプトミセス属放線菌としては特にストレプトミセス・ツイラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｕｉｒｕｓ）、ストレプトミセス・バイオラセオルーバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）、ストレプトミセス・アレナー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｒｅｎａｅ）、ストレプトミセス・フラギリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・コリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｌｌｉｎｕｓ）、ストレプトミセス・ヘイミ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｅｉｍｉ）、ストレプトミセス・フラベオラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｆｌａｖｅｏｌｕｓ）、ストレプトミセス・ミシオネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓｉｏｎｅｎｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトミセス・アルブラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｌｕｓ）又はストレプトミセス・グリセオフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）等に属する放線菌を挙げることができる。本発明に用いられる放線菌は１種のみで用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１７】
本発明に用いられる放線菌の例として、本発明者等によってトマト萎縮病多発圃場において健全に生育したトマトから新たに分離された放線菌ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．）Ｐ−１１株およびＰ−１８株を挙げることができる。本菌株の菌学的性質は以下に示す通りである。
【００１８】
（１）培養学的性質
ＩＳＰ培地、２８℃、１０日以上の培養でよく伸長した分岐する黄色基生菌糸と灰色気菌糸を着生し、短い直線的或いは、曲状または環状連鎖の卵円形胞子を形成する。
【００１９】
（２）生理学的性質
「放線菌の分類と同定」（日本学会事務センター、２００１年）に従って本菌株の生理学的学的性質を試験した。結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
2004143102.tif 000002
【００２１】
（３）化学分類学的性質
本菌株の細胞壁のジアミノピメリン酸は、Ｐ−１１株ではｍｅｓｏ型であり、Ｐ−１８株ではＬＬ型である。なお、試験は、「微生物の化学分類実験法」［駒形和男編（１９８２）、第５−８５頁、学会出版センター］および「放線菌の分離と同定」［日本放線菌学会編（２００１）、第５０−７５頁、日本学会事務センター］に従って行った。
本菌株の主要メナキノン型は、Ｐ−１１株ではＭＫ−９（Ｈ４）、ＭＫ−９（Ｈ６）、ＭＫ−９（Ｈ８）であり、Ｐ−１８株ではＭＫ−９（Ｈ６）、ＭＫ−９（Ｈ８）である。なお、試験は、工藤等の方法（工藤卓二：メナキノン分析法、日本放線菌学会編、放線菌の分類と同定、財団法人日本学会事務センター、東京、２００１、第５８−６６頁）および山田・倉石等の方法（山田雄三、倉石衍：ユビキノンとメナキノン、駒形和男編、微生物の化学分類実験法、学会出版センター、東京、１９８２、第１４３−１５５頁）に従って行った。
Ｐ−１１株およびＰ−１８株の脂肪酸組成を表２に示す。なお、試験は、Ｍｉｌｌｅｒ等の方法［Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｌ．　Ｔ．　（１９８２），　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１６：　５８４−５８６］に準じたＳｈｅｒｌｏｃｋ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ　３．００Ｂ）（ＭＩＤＩ社，　ＤＥ，　ＵＳＡ）の菌体脂肪酸組成分析の操作マニュアル（Ｖｅｒｓｉｏｎ　６）に従って行った。
【００２２】
【表２】
2004143102.tif 000003
【００２３】
本菌株の１６Ｓ　ｒＤＮＡの５’末端部分塩基配列を、Ｐ−１１株について配列番号１に、Ｐ−１８株について配列番号２に示す。これらの部分塩基配列についてソフトウェアとしてＭｉｃｒｏＳｅｑ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｖ．１．４．１を用いて、データベースとしてＭｉｃｒｏＳｅｑ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　５００　ｌｉｂｒａｒｙ　ｖ．００２３（アプライドバイオシステムズ社，　ＣＡ，　ＵＳＡ）に対して相同性検索を行ったところ、Ｐ−１１株の１６Ｓ　ｒＤＮＡの５’末端部分塩基配列は、ストレプトミセス・ツイラスの１６Ｓ　ｒＤＮＡに対し相同率９５．８１％で最も高い相同性を示した。一方、近隣結合法により作製した分子系統樹上ではＰ−１１株の１６Ｓ　ｒＤＮＡは単独で枝を形成したが、ストレプトミセスの形成するクラスター内に含まれた。ＢＬＡＳＴをもちいたＧｅｎｂａｎｋに対する相同性の検索の結果、ストレプトミセス・エスピー　ＩＭ　１７６０株の１６Ｓ　ｒＤＮＡに対し相同率９９．１％で最も高い相同性を示した。
【００２４】
Ｐ−１８株の１６Ｓ　ｒＤＮＡの５’末端部分塩基配列は、ストレプトミセス・バイオラセオルーバーおよびストレプトミセス・ツイラスの１６Ｓ　ｒＤＮＡに対し相同率９９．４０％で最も高い相同性を示した。一方、近隣結合法により作製した分子系統樹上ではＰ−１８株の１６Ｓ　ｒＤＮＡはストレプトミセス・バイオセオルーバーの１６Ｓ　ｒＤＮＡとクラスターを形成し近縁であることが示された。
【００２５】
以上のような菌学的性質を有する本菌株をストレプトミセス属放線菌と同定し、ストレプトミセス・エスピー　Ｐ−１１株およびＰ−１８株と命名した。本菌株はストレプトミセス・エスピー　Ｐ−１１株およびＰ−１８株として独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６　茨城県つくば市東１−１−１　　中央第６）に平成１４年１０月１８日付でそれぞれＦＥＲＭ　Ｐ−１９０７５およびＦＥＲＭ　Ｐ−１９０７６として寄託されている。
【００２６】
２．放線菌の大量製造
本発明に用いられる放線菌は、例えば、以下のようにして大量製造することができる。
例えば、ストレプトミセス属放線菌の固体培養物は、例えばストレプトミセス属放線菌をグルコース・スターチ・ソイフラワー培地やその他の滅菌した放線菌用の液体培地を使用して約２５〜３０℃の温度で約３〜３０日間程度培養して増殖させ、必要によりこの操作を繰り返し、増殖・胞子化した放線菌を集菌することにより大量製造することができる。
固体培養により大量製造する場合、貝化石（富山県高岡市から採取）の微粉末、窒素源、ふすま、すそこ（小麦のかす）の混合物を加水、殺菌した固体培地に植菌し、時々攪拌し胞子形成を促進する。
【００２７】
３．本発明の微生物製剤
本発明の微生物製剤は、草本植物に内部共生する放線菌を含む微生物製剤であって、好ましくは該放線菌は宿主草本植物を病原菌及び害虫から保護し、より好ましくはさらに宿主草本植物の生育を促進する微生物製剤である。本発明の微生物製剤は、草本植物に施用することができ、宿主草本植物の病原菌及び害虫の防除好ましくはさらに生育の促進に有用である。
【００２８】
本発明の微生物製剤は、本発明に用いられる放線菌の胞子又は培養菌体を水などの液体に単に懸濁することにより製造することもできるが、他の成分を配合し、液剤、粉剤、粒剤、煙霧剤等の製剤として製造することもできる。他の配合成分としては、液体担体、固体担体、界面活性剤（乳化剤、分散剤、消泡剤等）、補助剤等が挙げられる。
【００２９】
より具体的には、液体担体としては、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。また、固体担体としては、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の高分子性天然物が挙げられ、これらの１種又は２種以上を混合して使用することができる。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン−脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−脂肪アルコールエーテル、アルキルアリールポリグリコールエーテル、アルキルスルホネート、アルキルサルフェート、アリールスルフォネート等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を混合して使用することができる。補助剤としては、カルボキシメチルセルロース、ポリオキシアチレングリコール、アラビアゴム、デンプン、乳糖、大豆加水分解物、スキムミルクなどが挙げられ、これらの１種又は２種以上を混合して使用することができる。
【００３０】
また、水系溶媒を担体とする液剤として製造する場合、溶媒中での菌体の水和性を向上させるために、水溶性高分子を添加することも可能である。水溶性高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミドなどが挙げられる。さらに、放線菌の植物への付着性を改善し、製剤中での放線菌の安定性を向上させるために、キシログルカン、グアーガムなどの多糖類を配合させることもできる。水性高分子、多糖類についてもそれぞれ１種又は２種以上を混合して使用することができる。
【００３１】
放線菌の含有量は、製剤として１０４〜１０１１ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｇ、好ましくは１０５〜１０１０ＣＦＵ／ｇであるが、これらの濃度は適宜変更してもよい。粒剤及び粉剤の場合には、使用に際して水で希釈して、製品重量の１０〜　５０，０００倍に希釈して使用することができ、好ましくは１００〜１０，０００倍希釈で使用することができる。
【００３２】
４．本発明の微生物製剤の施用法（放線菌が共生した草本植物の作成）
本発明の微生物製剤の施用の方法としては、剤型等の使用形態、作物や病害によって適宜選択され、例えば、地上液剤散布、地上固形散布、空中液剤散布、空中固形散布、水面施用、施設内施用、土壌混和施用、土壌潅注施用、表面処理（種子粉衣、塗布処理等）育苗箱施用法、単花処理、株元処理等の方法を挙げることができるが、好ましくは、各種剤型の農園芸用殺菌剤組成物を栽培植物の種子にコートする、栽培植物の花に単花処理する、栽培植物の茎葉に処理する、栽培植物の傷口箇所、剪定部に塗布処理する、土壌潅注する、土壌混和する等の方法が挙げられる。
本発明の微生物製剤を植物体葉面に散布して施用する場合は、植物体への放線菌の内部共生を促進させるために、あらかじめ植物体に傷をつけるかまたは製剤中に植物体を傷つける物質を添加することができる。
【００３３】
また、栽培植物への農園芸用殺菌剤組成物の施用に際して、殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、除草剤、殺菌剤、植物生長調節剤、肥料、土壌改良資材（泥炭、腐植酸資材、ポリビニルアルコール系資材等）等を混合施用、あるいは混合せずに交互施用、または同時施用することも可能である。
【００３４】
本発明の農園芸用殺菌剤組成物の施用量は、病害の種類、適用植物の種類、殺菌剤組成物の剤型等によって異なるため一概には規定できないが、例えば、液剤の農園芸用殺菌剤組成物を地上散布する場合には、その施用の胞子濃度は、通常１０４〜１０１１ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍＬ、好ましくは１０５〜１０１０ＣＦＵ／ｍＬであり、施用量は、０．５〜　２００Ｌ／ａである。また、粒剤、粉剤等はなんら希釈することなく製剤のままで施用することも可能であり、地上散布する場合、胞子の施用量が、１０２〜１０９ＣＦＵ／ａ程度となるように散布することが好ましい。
【００３５】
更に、特に限定するわけではないが、特定の草本植物から分離された耐病性等を有する放線菌は、同じ種類の草本植物に感染・共生させることで耐病性等の特徴をよりよく発現させることが可能となる。例えば、トマトから分離した放線菌を、再び別のトマトに感染・共生させることで、その放線菌が元来保有している耐病性等の特徴をよりよく発現させることが可能となる。
【００３６】
なお、本発明の微生物製剤を施用される植物の栽培については、本発明の微生物製剤を施用する以外は常法により行うことができる。
【００３７】
本発明の微生物製剤を施用される草本植物としては、本発明の微生物製剤により病虫害防除効果が付加される好ましくはさらに生育が促進される植物であれば限定されないが、例えば、ナス科、ユリ科、アカザ科、サトイモ科、イネ科、ウリ科、セリ科、マメ科、アブラナ科、ヒルガオ科、ラン科、バラ科、キンポウゲ科、イソマツ科、タデ科、ナデシコ科、キク科、アオイ科、リンドウ科、サクラソウ科またはアヤメ科等の植物好ましくはナス、トマト等を挙げることができる。
【００３８】
本発明の微生物製剤の対象となる病原菌としては、草本植物に感染して病害を引き起こす原因菌であり、例えば、茎葉病、土壌病等の原因菌、具体的には青枯れ病の原因菌であるシュードモナス・ソラナセアルム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、灰色かび病の原因菌であるボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）、立ち枯れ病の原因菌であるリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ）、白紋羽病の原因菌であるロセリニア・ネカトリックス（Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘ）、紫紋羽病の原因菌であるヘリコバシディウム・モムパ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｍｏｍｐａ）、そうか病の原因菌であるストレプトミセス・スキャナビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｃａｂｉｅｓ）、うどん粉病の原因菌であるレベイルラ・タウリカ（Ｌｅｖｅｉｌｌｕｌａ　ｔａｕｒｉｃａ）、白絹病の原因菌であるセレロチウム・ロルフシ（Ｓｅｌｅｒｏｔｉｕｍ　ｒｏｌｆｓｉｉ）、根腐れ病の原因菌であるフサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）等が挙げられる。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
＜実施例１＞　耐病性、生育促進機能を有する放線菌の分離
植物からの放線菌の分離
トマト萎縮病多発圃場５カ所から罹病していないトマトを入手し、これら健全なトマトを十分洗浄後、葉、茎、根を３−５ｃｍに切断し、１％次亜塩素酸ソーダー溶液に５分間浸漬し、殺菌水で洗浄後、７０％エタノ−ルに１分間浸漬して、クリ−ンベンチ内で、表面を十分乾燥させた。
【００４１】
トマト内部に共生する放線菌は、以下のようにしてトマトの葉、茎または根から分離した。すなわち、まずトマトの葉、茎または根から採取した約１×２ｍｍ２の小片を水道水流水でよく洗浄した。これらの小片を０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０に数秒間浸漬した後、１％次亜塩素酸に５分間浸漬し、殺菌蒸留水で数分間よく洗浄した。続いて、７０％エタノールに１分間浸漬した後、クリーンベンチ内で表面を十分乾燥させた。
【００４２】
このように表面殺菌した植物小片をシャーレ中の抗生物質添加放線菌分離平板培地（水寒天培地、抗生物質溶液：アンホテリシンＢ　　５０ｍｇ、蒸留水１Ｌ）上に置き、３０℃の培養器の中で１カ月培養した。
【００４３】
上記培地に置床した植物小片の表面から伸長してきた放線菌の菌糸を殺菌したガラス細管先端で採取し、新たに用意した前記平板培地に移植し、３０℃で数日間培養した。培地上で生育したコロニーを個別に、別の前記平板培地上に設置したメンブランフィルター（Ｍｉｘｅｄ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｅｓｔｅｒ，　ｆ　０．２　ｍｍ，　アドバンテック社）に植え付け、３０℃で１週間培養した。メンブランフィルターを除去後の培地表面に生育した形状が異なるコロニーを別個に２０％グリセロールに懸濁し、−８０℃のフリーザーで使用まで保存した。合計２８菌株が得られ、それらをＰ−１〜Ｐ−２８株と命名した。
【００４４】
＜実施例２＞　植物由来放線菌の大量培養例
実施例１より分離・純化した放線菌（Ｐ−１８株）を水寒天斜面培地で３０℃で２週間培養して、胞子を形成させた。この斜面培地に殺菌水を５ｍｌ加え、３０−６０秒超音波処理を行い、胞子懸濁液を調製した。一方、貝化石（富山県高岡市から採取）９０％、すそこ（小麦のかす）１０％に配合された固形培地（グルコース２％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％）４０ｇと水道水１０ｍｌを５００ｍｌ容フラスコに入れ、オ−トクレイブ殺菌する。この固形培地に前述の胞子懸濁液を１ｍｌ宛て培地表面に植菌し、３０℃で７〜１０日間静置培養する。培養中のフラスコは適宜、攪拌し、胞子が固形培地表面全体に形成促進されるようにすることにより、放線菌（Ｐ−１８株）を得た。
【００４５】
＜実施例３〜１３、比較例１＞　植物由来放線菌のトマトへの感染・定着例
トマト青枯れ病多発圃場７ヶ所から罹病せずに残ったトマト個体４４本を入手し（品種：桃太郎）、幹の部分をオスバンで殺菌したカミソリ刃を用いて１個体当たり６断片（長さ３ｃｍ）を切除し、７０％エタノール液に５分間浸積した。その後紫外線殺菌灯の下で、エタノール溶液を蒸発させ、断片を１２１℃で蒸気殺菌した高速ホモジナイザー用ステンレス容器に入れ、１５，０００回転／分で破砕処理した。
【００４６】
一方、放線菌分離用培地として、実施例１の培地を用意し、１６０℃で１時間乾熱殺菌した０．４５μのろ紙を乗せ、その上に先のホモジナイザーで破砕したトマトの液を１ｍｌ均一に広げ、２５℃の恒温槽で７日間培養した。その後ろ紙をピンセットではがし、さらに１０日間培養を続け、現れた放線菌のコロニーを分離し、ストレプトミセス属の特徴を示す株（ＩＳＰ培地、２８℃、１０日以上の培養でよく伸長した分岐する黄色基生菌糸と灰色気菌糸を着生し、短い直線的或いは、曲状または環状連鎖の卵円形胞子を形成する。）のみ保存した。
【００４７】
保存した１３４株のストレプトミセス属放線菌を５００ｍｌ容の坂口フラスコに分離に用いたと同じ培地（寒天を除く）で２５℃で７日間往復振とう培養した。その後培養液をブフナーロートを用いて１μのろ紙で吸引ろ過し、分子量１０，０００のポリエチレングリコール１％を含むりん酸バッファー（ｐＨ７．２）に懸濁し、高速ホモジナイザーにより８、０００回転／分で１分間破砕し、破砕液をそれぞれ、高さ５ｃｍのトマト幼苗６０本に噴霧した（２×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）。
【００４８】
前記トマト幼苗を１４日間育苗後、青枯れ病菌の液体培養液に３時間浸積し、その後ポットに移植し、３０日間栽培し、感染させたトマト群の枯死率の低かった１１株のストレプトミセス属放線菌を選抜した。
この１１株のストレプトミセス属放線菌を前記と同様の方法で液体培養し、それぞれトマト幼苗６０本に散布した。
前記トマト幼苗を１４日間育苗した後、汚染された圃場に、各群からそれぞれ５０本を移植し、９０日間栽培を続けた。その後発病した個体数を調べた。さらに、各群の健全個体から前記放線菌の分離時に用いた手法を用いて健全植物体から放線菌を分離した。
その結果、いずれの個体からも放線菌が分離できた。
【００４９】
なお、ストレプトミセス属放線菌未処理のトマト幼苗６０本についても同様に１４日間育苗した後、汚染された圃場に、５０本を移植し、９０日間栽培を続けた。その後発病した個体数を調べた。
結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
2004143102.tif 000004
【００５１】
＜実施例１４、１５、比較例２＞　トマトより分離した放線菌による生育促進効果例
市販の育苗用ウレタンフォーム（２×２×２ｃｍ）の切れ込みに種子を植えた後に、実施例１で分離された放線菌Ｐ−１１株、Ｐ−１８株の水寒天培地を用いて培養した培養液１０μｌを接種し、ウレタンフォームを園試処方培地［配合量（ｇ／ｔ）：硝酸カルシウム（４水塩）９５０、硝酸カリウム８１０、硫酸マグネシウム（７水塩）５００，リン酸−アンモニウム１５５、キレート鉄（ＮａＦｅ−ＥＤＴＡ）１５〜２５、ホウ酸３、硫酸マンガン（４水塩）２、硫酸亜鉛（７水塩）０．２２、硫酸銅（５水塩）０．０５、モリブデン酸ナトリウム（２水塩）０．０２、ＰＨ６．０］に浸して、２５℃で７日間催芽処理を行った。催芽した苗は、簡易水耕栽培装置に移植した。この装置は、１単位が、横９０ｃｍ×奥行１２ｃｍ×深さ７ｃｍの発泡樹脂製容器を備え、苗植え付け用に蓋に５個の穴があいており、ポンプに接続された管を液中に導入していて、通気できるようになっている。催芽処理したままの状態で、装置の蓋の穴に移植した。
栽培に使用した養液は園試処方培地であり、液量は簡易水耕栽培装置中で苗の根が十分浸る量を用いた。栽培は、簡易水耕栽培装置を温室内に設置して行い、栽培期間中の温度は昼が２４℃、夜が１６℃で、液温は約２０℃であった。上記条件下で、移植後４０日間トマトを栽培した。
【００５２】
放線菌Ｐ−１１、Ｐ−１８株による生育促進効果を評価するために、栽培後のトマトの苗について、２株を１区として同一条件で栽培し、最大葉幅、最大葉長、茎長、地上部の生体重量を測定した。
また、放線菌培養液による処理を行わなかった区を無処理区として、試験区と同一条件で栽培し、最大葉幅、最大葉長、茎長、地上部の生体重量を測定した。
結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
2004143102.tif 000005
【００５４】
この結果から明らかなように、いずれも放線菌Ｐ−１１、Ｐ−１８株は有効な生育促進効果を安定して示した。
【００５５】
＜実施例１６、１７、比較例３、４＞　トマトより分離した放線菌による灰色かび病害防除例
トマト灰色かび病に対する実施例１で分離された放線菌Ｐ−７、Ｐ−８株の防除効果をガラス温室において試験（品種：瑞健、試験区：１２株／区、３反復）した。トマト灰色かび病菌の供給は灰色かび病菌を感染させ培養したミカン果実を温室内に吊り下げて行った。トマトの第３果房開花期に、実施例２に基づき大量製造した放線菌Ｐ−７、Ｐ−８株の胞子懸濁液をそれぞれ施用量２００Ｌ／１０ａにて７日間隔で３回散布（茎葉部噴霧処理）した。最終散布の７日後に発病果・花を測定した。また、胞子懸濁液を茎葉部噴霧処理しなかったトマトについても上記同様に実験を行い、発病果・花を測定した。防除価は以下のようにして算出した。結果を表５に示す。
【００５６】
2004143102.tif 000006
【００５７】
また、上記試験区と同様に病原菌を接種し、胞子懸濁液による処理を行なかった区を無処理区として、次式により試験区の防除価を算出した。
＊防除価（％）＝（１−（試験区の発病度／無処理区の発病度））×１００
【００５８】
更に、比較のために胞子懸濁液を市販のバシタック（主成分；メプロニル、クミアイ化学製、１５００ｐｐｍ）に替えて同様の試験を行い、発病度及び防除価を算出した。
【００５９】
【表５】
2004143102.tif 000007
【００６０】
この結果から、本微生物製剤を処理したトマトは、処理されなかった比較例のトマトに比べ防除価が非常に高く、これらのトマトが本微生物製剤により灰色かび病菌から防御されていたことが明らかである。
【００６１】
＜実施例１８、１９、比較例５、６＞　放線菌によるナス、トマトの立ち枯れ病防除例
メトロミックス（Ｗ．Ｒ．グレース社（　４　）　特開平０８−０７３３０９号に記載の培土）１０重量部にパーライト２重量部、バーミキュライト１重量部を加えて混合し、これに実施例１で分離され、実施例２に基づき大量製造した放線菌Ｐ−２２株を培土全量の１重量％混合して育苗用培土とし、これを２枚の２００穴プラグトレーに詰めた後、このプラグトレーの１枚にはトマト（品種：ハウス桃太郎）の種子を、もう１枚にはナス（品種：千両２号）の種子をそれぞれ一つの穴に付き１粒づつ播種した。一方、トマト及びナスの立枯病株からそれぞれリゾクトニア・ソラニを分離し液体培養した培養液５０ｍＬを１ｋｇの焼成赤玉土に混合した病原土壌をそれぞれ作製し、上記トマト、ナスの播種後３日目に、トマトを播種したプラグトレーには前記トマトから分離したリゾクトニア・ソラニの病原土壌を、ナスを播種したプラグトレーには前記ナスから分離したリゾクトニア・ソラニの病原土壌をそれぞれ土面よりトレー当たり１００ｇ散布した。その後、プラグトレーを温室内に置き、液肥（大塚化学製）を週に一回の割合で散布し、播種後２５日目までに立枯れた株数を測定した。なお、比較のために育苗用培土に本微生物製剤を全く加えずに同様の方法でナス、トマトの栽培実験を行い、播種後２５日目までに立枯れた株数を測定した。
＊立枯株数を発芽株数で除して１００を乗じた値を立枯率（％）として評価した。結果を表６に示した。
【００６２】
【表６】
2004143102.tif 000008
【００６３】
この結果から、ナス、トマトのいずれについても、育苗用培土に本微生物製剤が添加されなかった比較例の苗に比べ、添加した実施例の苗は立枯率が非常に低く、これらの苗は本微生物製剤により土壌病害から防御されていたことが明らかである。
【００６４】
【発明の効果】
本発明は、草本植物に内部共生する放線菌を含む微生物製剤であって、草本植物の植物病害の防除効果に優れ、草本植物の生育を促進する微生物製剤であり、本発明によって次のような効果がもたらされる。
１．化学農薬のように複数回の処理をしなくても目的を達することができる可能性がある。
２．長期に渡って共生することで効果の安定化や持続性を付与することができる。
３．一回の処理で目的が達せられ作業の手間を省けるために、コスト低減に繋がる。
４．作業者の安全性が確保できる。
【配列表】
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