(57)【要約】　　　（修正有）【課題】インビトロでＡβアミロイドの形成を阻害する化合物をスクリーニングするための迅速な方法、ならびにキットを提供する。【解決手段】インビボで使用されるこのような化合物は、アルツハイマー病およびアルツハイマー病に関するＡβアミロイド疾患、ダウン症候群、およびグアマニアン筋萎縮側索硬化症／パーキンソン痴呆症候群の症状を予防し、改善し、または反転させ得る。少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有するポリペプチドに結合してアミロイドを形成させ得る重金属カチオン（例えば、亜鉛）によりＡβアミロイドを迅速に誘導し、染色Ａβアミロイドの形成を測定し、さらに、少なくともヒトＡβペプチドを発現する細胞培養物を使用して、候補となる抗アミロイド化合物のＡβアミロイド症の予防または処置に対する有効性を決定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）Ａβペプチド中のアミノ酸番号６〜２８の領域を少なくとも含有するＡβペプチドの水性緩衝溶液を予め濾過して、第１の濾液を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた該第１の濾液中のＡβペプチドの量を測定する工程；
（ｃ）工程（ａ）で得られた該第１の濾液と、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有するペプチドに結合し得る重金属カチオンとを接触させ、反応混合物を提供する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた該反応混合物と、候補となる抗アミロイド化合物とを接触させる工程；
（ｅ）工程（ｄ）で得られた該反応混合物を濾過して、第２の濾液を提供する工程；および
（ｆ）該第２の濾液中のＡβペプチドの量を該第１の濾液中のＡβペプチドの量と比較し、それにより候補化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）第１および第２の反応混合物を調製する工程であって、各反応混合物がＡβペプチド中の少なくともアミノ酸番号６〜２８の領域を含む等量の予め濾過したＡβペプチド溶液および水性緩衝液または生理学的溶液を含むものである工程；
（ｂ）該第１および第２の各反応混合物と、等量の候補となる抗アミロイド化合物とを接触させる工程；
（ｃ）該第１の反応混合物と、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有するペプチドに結合し得る重金属カチオンとを接触させる工程；
（ｄ）該第２の反応混合物と、ＥＤＴＡとを接触させる工程；および
（ｅ）該第１の反応混合物中に形成されたアミロイドの量を、該第２の反応混合物中に形成されたアミロイドの量と比較し、それにより候補となる化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）第１および第２の反応混合物を調製する工程であって、各反応混合物がＡβペプチド中の少なくともアミノ酸番号６〜２８の領域を含む等量の予め濾過したＡβペプチド溶液および水性緩衝液または生理学的溶液を含有するものである工程；（ｂ）該第１および第２の各反応混合物と、等量の候補となる抗アミロイド化合物とを接触させる工程；
（ｃ）該第１の反応混合物のみを、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有するペプチドに結合し得る重金属カチオンと接触させる工程；および
（ｄ）該第１の反応混合物中に形成されたアミロイドの量と、該第２の反応混合物中に形成されたアミロイドの量を比較し、それにより該化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）Ａβペプチドのアミノ酸番号６〜２８の領域を少なくとも含有するヒトＡβペプチドを少なくとも発現する細胞株を含有する第１および第２の細胞培養物を調製する工程；
（ｂ）等濃度の亜鉛を各細胞培養物に接触させる工程；
（ｃ）該第１の細胞培養物と候補化合物とを接触させ、そして該第２の細胞培養物と重金属キレート剤とを接触させる工程；および
（ｄ）各細胞培養物中のアミロイドおよび亜鉛で誘導されるＡβ凝集物の量を比較し、それにより候補となる抗アミロイド化合物の有効性を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定するための方法であって、以下の工程：
ａ）Ａβペプチドのアミノ酸番号６〜２８の領域を少なくとも含有するヒトＡβペプチドを少なくとも発現する細胞株を含む第１および第２の細胞培養物を調製する工程；
（ｂ）該第１の細胞培養物と亜鉛とを接触させ、第１の反応混合物を提供する工程；
（ｃ）該第１の反応混合物および該第２の細胞培養物と、候補化合物とを接触させる工程；および
（ｄ）各細胞培養物中のアミロイドおよび亜鉛で誘導されるＡβ凝集物の量を比較し、それにより候補となる抗アミロイド化合物の有効性を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定するための方法であって、前記重金属カチオンが、亜鉛、銅、および水銀の塩化金属塩からなる群より選択されるものである、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定するための方法であって、前記重金属カチオンが塩化亜鉛である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定するための方法であって、前記Ａβペプチドが、　Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４１、Ａβ１−４２、およびＡβ１−４３からなる群より選択されるものである、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定するためのキットであって、該キットは、区分されて、その中に１つ以上のコンテナ手段を密閉して収容するキャリア手段を含み、
（ａ）第１のコンテナ手段が、Ａβペプチドのアミノ酸番号６〜２８の領域を少なくとも含有するペプチドを含有し；および
（ｂ）第２のコンテナ手段が重金属カチオンを含有する、
キット。
【請求項１０】
前記重金属カチオンが亜鉛である、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
請求項９に記載のキットであって、
（ｃ）重金属カチオンのキレート剤の標準溶液を含有する１つ以上のコンテナ手段、
をさらに含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
連邦政府により後援された研究および開発の下で
行われた発明に対する権利に関する記述
本研究の一部は本発明の進展中、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により与えられた承認番号ＲＯ１　ＮＳ３０４８−０３およびＲＯ１　ＡＧ１１８９９−０１下で、米国政府基金を利用して実施した。政府は本発明において所定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ａβアミロイドを検出するための種々のアッセイ、インビトロでＡβアミロイドの形成を防止するあるいは反転（ｒｅｖｅｒｓｅ）させる能力について候補となる化合物のスクリーニング、ならびに本発明において使用されるキットに関する。
【０００３】
関連技術
脳内におけるＡβの凝集は、アルツハイマー病（ＡＤ）の特徴である痴呆、および早発性ＡＤによって特徴付けられる状態であるダウン症候群に寄与すると考えられている。４．３ｋＤａペプチドであるＡβは、脳アミロイド沈着物の主要成分であり、アルツハイマー病（ＡＤ）の病理学的な顕徴な特徴である（Ｍａｓｔｅｒｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：４２４５〜４２４９（１９８５）；Ｇｌｅｎｎｅｒ＆Ｗｏｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２０：８８５〜８９０（１９８４））。Ａβは非常により大きなアミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）に由来し（Ｋａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ　３２５：７３３〜７３６（１９８７）；Ｔａｎｚｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：８８０〜８８４（１９８７）；Ｒｏｂａｋｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：４１９０〜４１９４（１９８７）；Ｇｏｌｄｇａｂｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：８７７〜８８０（１９８７））、その生理学的機能は不明なままである。アルツハイマー病の原因はわかりにくいままである；しかし、Ａβドメインに近接したあるいはドメイン内のＡＰＰの変異の発見（Ｇｏａｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ　３４９：７０４〜７０６（１９９１）；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：１１２４〜１１２６（１９９０）；Ｍｕｒｒｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：９７〜９９（１９９１）；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．　１：２１８〜２２１（１９９２））は、家族制ＡＤと関連しており（Ｅ．Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：１１２４（１９９０）；Ａβ　Ｇｏａｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ　３４９：７０４（１９９１）；Ｍ．Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ　３５３：８４４（１９９１）；Ｊ．Ｍｕｒｒｅｌｌ，　Ｍ．Ｆａｒｌｏｗ，　Ｂ．Ｇｈｅｔｔｉ，　Ｍ．Ｄ．Ｂｅｎｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：９７（１９９１）；Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．　１：２１８（１９９２）；Ｍ．Ｍｕｌｌａｎら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．　１：３４５（１９９２））、これらはＡβおよびＡＰＰの代謝が本疾患の病態生理に本質的に関与するようであることを示している。
【０００４】
可溶性Ａβは細胞培養物中に分泌され、そして脳脊髄液（ＣＳＦ）中に４０残基のペプチド（Ａβ１−４０）として見出される（Ｓｈｏｊｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８：１２６〜１２９（１９９２）；Ｓｅｕｂｅｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ　３５９：３２５〜３２７（１９９２）；Ｈａａｓｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３５９：３２２〜３２５（１９９２））が、散発性のＡＤの場合にはこのペプチドは上昇したレベルでは見出されていない（Ｍ．Ｓｈｏｊｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８：１２６（１９９２）；Ｐ．Ｓｅｕｂｅｒｔら，Ｎａｔｕｒｅ　３５９：３２５（１９９２））。可溶性Ａβの凝集を誘導し得る生理学的因子はＡβアミロイド形成の原因を決定するにおいて重要である。合成Ａβ１−４０は、中性リン酸緩衝液中では１６ｍｇ／ｍｌの濃度までは可溶性であり（Ｔｏｍｓｋｉ＆Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．　２９４：６３０〜６３８（１９９２））、このことは可溶性Ａβの過剰生産ではＡβ沈殿を十分に説明し得ないことを示している。それゆえ、散発性の場合、Ａβアミロイド形成を促進する生化学的機構がＡＤの病因と関わっているようである。さらに、ＡＤの場合、脳脊髄液中の可溶性Ａβは増加されず（Ｓｈｏｊｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８：１２６〜１２９（１９９２））、このことは他の病因性機構が関与するようであることを示している。
【０００５】
近年、Ａβペプチドの研究は、Ａβ、またはその前駆体タンパク質ＡＰＰを発現あるいは過剰発現する細胞株の作製に至り、あるいはそのよりアミロイド形成性の（ａｍｙｌｏｉｄｇｅｎｉｃ）Ａβ１−４２形態の量を増加させた（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３を参照のこと）。さらに、Ａβペプチドに対するモノクローナル抗体が作製されている（例えば、１９９３年７月２７日発行の特許文献１を参照）。これらのモノクローナル抗体は、Ａβアミロイドの存在の検出に使用するための試薬として有用である。
【０００６】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては次のものがある。
【特許文献１】
米国特許第５，２３１，０００号明細書
【非特許文献１】
Ｎ．Ｓｕｚｕｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６４：１３３６〜１３４０（１９９４）
【非特許文献２】
Ｘ−Ｄ　Ｃａｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：５１４〜５１６（１９９３）
【非特許文献３】
Ｆ．Ｓ．Ｅｓｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：１１２２〜１１２４（１９９０）
【０００７】
発明の要旨
本発明に記載のプロセスは、アミロイドを形成する亜鉛のような重金属カチオンによるＡβアミロイドの急速な誘導を含む。本発明の好適な実施態様において、亜鉛とのインキュベーション後も濾過性なままであるＡβ１−４０溶液の割合をアッセイし、そして候補となる薬理学的化合物のこの濾液に対する効果を測定し、生理学的溶液中でのＡβの溶解性を維持させ、それゆえＡβアミロイド形成を防止する能力を決定する。
【０００８】
Ａβアミロイドのインビトロでの誘導法が以前に記載されている（Ｊ．Ｔ．Ｊａｒｒｅｔｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．　３２：４６９３〜４６９７（１９９３））。しかし、この方法は、定量的であるよりむしろ定性的である結果を伴い、高濃度のペプチドおよびインキュベーション期間（日）の延長を必要とするような多くの不利な点を有する。対照的に、本発明の主ないくつかの利点は、本技術は信頼性があり、迅速であり（分単位で行い得る）、容易に定量化し得、そして低μＭ濃度のペプチドで達成されることである。
【０００９】
それゆえ、本発明はアルツハイマー病の特徴および関連した病理学的状態であるインビボでのアミロイド沈着の形成を、防止または反転するのに有効であるような候補となる化合物を迅速にスクリーニングするためのインビトロ方法に関する。次いで、本発明のインビトロ方法の１つによって選択される見込みのある（Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ）候補となる化合物が、アルツハイマー病に苦しむ患者、あるいはアルツハイマー病が発症する危険がある患者においてインビボでのその有効性について試験され得る。
【００１０】
本発明の１つの側面は、生物的液体中でのＡβアミロイド形成を検出するための迅速な分析方法に関し、以下の工程を包含する：
（ａ）　コントロールのヒト被験体由来の生の（ｎｅａｔ）生物的液体を含む第１のセットの反応混合物、および水性緩衝液または生理学的溶液中で作製した該反応混合物の系列希釈物を調製する工程；
（ｂ）　アミロイド症の疑いがあるヒト患者由来の生の生物的液体を含む第２のセットの反応混合物、および水性緩衝液または生理学的溶液中で作製された該反応混合物の系列希釈物を調製する工程；
（ｃ）　各系列希釈サンプルに、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有する等量のＡβペプチドを添加する工程；
（ｄ）　第１および第２のセットの各反応混合物と、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含むＡβペプチドに結合し得る３００ｎＭ以上の重金属カチオンとを接触させる工程；
（ｅ）　第１および第２のセットの各反応混合物を遠心分離し、第１および第２のセットのペレットをそれぞれ提供する工程；および
（ｆ）　第１および第２のセットのペレット中のアミロイドの量を比較し、それにより、アミロイド症の疑いがあるヒト患者由来の生物的液体中での過剰なＡβアミロイドの形成を検出する工程。
【００１１】
本発明の第２の側面は、化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定するための方法に関し、以下の工程を包含する：
（ａ）　　Ａβペプチド中のアミノ酸番号６〜２８の領域を少なくとも含有するＡβペプチドの水性緩衝液を予め濾過して、第１の濾液を提供する工程；
（ｂ）　工程（ａ）で得られた第１の濾液中のＡβペプチドの量を測定する工程；
（ｃ）　工程（ａ）で得られた第１の濾液と、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有するペプチドに結合し得る重金属カチオンとを接触させ、反応混合物を得る工程；
（ｄ）　工程（ｃ）で得られた反応混合物と候補となる抗アミロイド（ａｎｔｉ−ａｍｙｌｏｉｄｏｔｉｃ）化合物とを接触させる工程；
（ｅ）　工程（ｄ）で得られた反応混合物を濾過して、第２の濾液を提供する工程；および
（ｆ）　第２の濾液中のＡβペプチドの量を第１の濾液中のＡβペプチドの量と比較し、それにより候補の化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定する工程。
【００１２】
本発明の第３の側面は、化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するかどうか決定する方法に関し、以下の工程を含む：
（ａ）　第１および第２の反応混合物を調製する工程であって、各反応混合物がＡβペプチド中の少なくともアミノ酸番号６〜２８の領域を含む等量の予め濾過したＡβペプチド溶液、および水性緩衝液または生理学的溶液を含むものである工程；
（ｂ）　第１および第２の各反応混合物と、等量の候補となる抗アミロイド化合物とを接触させる工程；
（ｃ）　第１の反応混合物と、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有するペプチドに結合し得る重金属カチオンとを接触させる工程；
（ｄ）　第２の反応混合物と、ＥＤＴＡとを接触させる工程；および
（ｅ）　第１の反応混合物中に形成されたアミロイドの量と、第２の反応混合物中に形成されたアミロイドの量とを比較し、それにより候補となる化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定する工程。
【００１３】
本発明の第４の側面は、化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定する方法に関し、以下の工程を包含する：
（ａ）　第１および第２の反応混合物を調製する工程であって、各反応混合物がＡβペプチド中の少なくともアミノ酸番号６〜２８の領域を含む等量の予め濾過したＡβペプチド溶液、および水性緩衝液または生理学的溶液を含むものである工程；
（ｂ）　第１および第２の各反応混合物と、等量の候補となる抗アミロイド化合物とを接触させる工程；
（ｃ）　第１の反応混合物のみを、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有するペプチドに結合し得る重金属カチオンと接触させる工程；および
（ｄ）　第１の反応混合物中に形成されたアミロイドの量と、第２の反応混合物中に形成されたアミロイドの量とを比較し、それにより化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否か決定する工程。
【００１４】
本発明の第５の側面は、化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否か決定する方法に関し、以下の工程を包含する：
（ａ）　　Ａβペプチドのアミノ酸番号６〜２８の領域を少なくとも含有するヒトＡβペプチドを少なくとも発現する細胞株を含む第１および第２の細胞培養物を調製する工程；
（ｂ）　等濃度の亜鉛を、各細胞培養物に接触させる工程；
（ｃ）　該第１の細胞培養物と候補化合物とを接触させ、そして該第２の細胞培養物と重金属キレート剤とを接触させる工程；および
（ｄ）　各細胞培養物中のアミロイドおよび亜鉛で誘導されるＡβ凝集物の量を比較し、それにより候補の抗アミロイド化合物の有効性を決定する工程。
【００１５】
本発明の第６の側面は、化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定する方法に関し、以下の工程を含む：
（ａ）　　Ａβペプチドのアミノ酸番号６〜２８の領域を少なくとも含有するヒトＡβペプチドを少なくとも発現する細胞株を含む第１および第２の細胞培養物を調製する工程；
（ｂ）　第１の細胞培養物と亜鉛とを接触させ、第１の反応混合物を提供する工程；
（ｃ）　第１の反応混合物および第２の細胞培養物と、候補化合物とを接触させる工程；および
（ｄ）　各細胞培養物中のアミロイドおよび亜鉛で誘導されるＡβ凝集物の量を比較し、それにより候補となる抗アミロイド化合物の有効性を決定する工程。
【００１６】
本発明の第７の側面は、化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するか否かを決定するためのキットに関する。本キットは、区分されて、その中に１以上のコンテナ手段を密閉して収容するキャリア手段を含有し、
（ａ）　第１のコンテナ手段は、Ａβペプチドのアミノ酸番号６〜２８の領域を少なくとも含有するペプチドを含有し；および
（ｂ）　第２のコンテナ手段は、重金属カチオンを含有する。
【００１７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および請求の範囲から明白である。
【００１８】
好適な実施態様の詳細な説明
アルツハイマー病の脳内アミロイドの主要成分であるＡβ１−４０は、ＣＳＦ内に存在し、高濃度（≦３．７ｍＭ）でも比較的可溶性なままである。従って、Ａβアミロイド形成を誘導する生理学的因子は、この疾患の病因に対する貴重な手掛りを提供する。ヒトＡβは亜鉛に特異的におよび飽和して結合することが見出されている。３００ｎＭ以上の濃度の亜鉛は、ヒトＡβ１−４０を急速に不安定にし、これは着色性のアミロイド形成を含む。一方、ラットＡβ１−４０は、亜鉛に強く結合することはないのでこの効果を免れる。このことはおそらく、これらの動物が脳内Ａβアミロイドを形成することに関する不足を説明する。全体的に、これらのデータは、アルツハイマー病の神経病発生における脳の亜鉛代謝の潜在的に重要な役割を示唆している。
【００１９】
さらに、ＡＤおよびＤＳ患者には亜鉛恒常性の異常性が発生することが観察されている。Ａβは亜鉛に特異的および飽和して結合することが示されており、通常のＣＳＦ亜鉛レベルと適合性の高親和性結合（ＫＡ＝１０７ｎＭ）および低親和性結合（ＫＡ＝５．２μＭ）を明示している。ＡＤにおける異常性が報告されている脳の亜鉛恒常性（Ｄ．Ｗｅｎｓｔｒｕｐ，Ｗ．Ｄ．Ｅｈｍａｎｎ，Ｗ．Ｒ．Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｙ，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　５３３：１２５（１９９０）；Ｊ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ，Ｅｎｃｅｐｈａｌｅ　１６：２３１（１９９０）；Ｆ．Ｍ．Ｃｏｒｒｉｇａｎ，Ｇ．Ｐ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｎ．Ｉ．Ｗａｒｄ，Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ　６：１４９（１９９３）；Ｃ．Ｏ．Ｈｅｒｓｈｅｙら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　３３：１３５０（１９８３））は、亜鉛濃度の上昇がペプチドの接着性およびタンパク質分解的消化に対する耐性を増加させるため、Ａβの代謝的運命にとって重要であり得る。さらに、経口的な亜鉛の補充は、近年、年齢を合わせたコントロールではなくＡＤ被験体において、認識力に対して急性の有害な効果を有することが示され、このことは環境性または栄養性亜鉛の曝露が、ＡＤの病態生理学に対する寄与因子であり得ることを示した。
【００２０】
発明の発見はＡβが、ｐＨ依存性の様式で亜鉛に強くおよび特異的に結合することを示した。脳環境内では、これらの金属イオンは、結合および溶解性に対してこの効果を発揮するに十分な濃度で存在する。Ａβ溶解性における減少は、０．３μＭ程度の低い亜鉛濃度の存在下で生じる。Ａβ上の亜鉛結合部位の占有は、α−セクレターゼ部位でのトリプシン消化に対するペプチドの耐性を増大させる。α−セクレターゼは、未だに未同定のプロテアーゼであり、Ａβの前駆体分子であるアミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）を、Ａβドメイン内で切断し、Ａβを蓄積し得なくすることが観察されている。それゆえ、Ａβの亜鉛結合部位の占有は、このペプチドの生物学的半減期を増加させ、そして沈着のための利用性を増大させる。
【００２１】
それゆえ、Ａβ上の亜鉛の結合部位への亜鉛の結合を阻止する、あるいはＡβが過剰の亜鉛（すなわち、３００ｎＭ以上の亜鉛）に接触した後のアミロイド形成を防止する薬理学的化合物は、Ａβ沈着を阻止および／または反転させることにより、アルツハイマー病、ダウン症候群、およびＧＡＬＳ／ＰＤＣの処置に有用であり得る。現在、これらの疾患における治療的可能性を有する候補となる抗アミロイド化合物の迅速なスクリーニング手段は存在しない。本発明は、そのような候補となる薬理学的化合物をスクリーニングする手段および方法を提供する。
【００２２】
亜鉛誘導性Ａβアミロイド形成に対する候補となる抗アミロイド薬理学的化合物の効果は、本発明のフィルトレーションアッセイによって迅速にスクリーニングされ得る。亜鉛誘導性Ａβ１−４０凝集反応は、Ａβ１−４０を伴うか伴わないで（±）、候補となる化合物の存在下で実施され、そしてフィルトレーション滴定が、化合物、亜鉛、およびペプチドの濃度を変化させながら実施される（この濃度は、３Ｈ−Ａβの使用によって生理学的レベルにされる）。本アッセイはまた、観察された如何なる抗アミロイド効果も、実際の生理学的状況により近いインビトロ近似にさせるため、ヒトＣＳＦ存在下で実施され得る。
【００２３】
ヒトおよびラットＡβ１−４０のペプチドストック水溶液（１６μＭ）を、予め濾過し（Ｓｐｉｎ−Ｘ，Ｃｏｓｔａｒ，０．２μセルロースアセテート，７００ｇ）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４＋塩化亜鉛（０．３〜２５μＭ、これらの濃度限界の間で間隔をおいてサンプリングした）、±候補となる抗アミロイド化合物に入れ、インキュベートし（３０分、３７℃）、次いで再度濾過した（７００ｇ、４分）。濾液中のＡβ１−４０の画分を、濾過していないサンプルのＯＤ２１４に対する濾液のＯＤ２１４の比によって算定した。ヒトＡβ１−４０の濃度（これらの実験で用いられた緩衝液中では２０μＭまで）に対して滴定したＯＤ２１４の応答は、直線性であることが決定された。候補となる抗アミロイド化合物の効果は、亜鉛の代わりにＥＤＴＡ（５０μＭ）の存在下でインキュベーションが行われる場合に濾過されるペプチドの比率に対して比較され得る。
【００２４】
候補となる抗アミロイド化合物は、広い範囲であるが、以下のように分類され得る：
Ａβと相互作用する亜鉛の利用性を修飾する化合物：この化合物は、デスフェリオキサミン（ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ）のようなキレート化合物を含むが、遊離の亜鉛と結合するアミノ酸ヒスチジンおよびシステインもまた含み、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する血漿由来の亜鉛の運搬とに関与していると考えられる。これらの化合物は、全てのクラスの亜鉛特異的キレート化合物、およびＥＤＴＡ（エディック酸（Ｅｄｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），Ｎ，Ｎ’−１，２−エタンジイルビス［Ｎ−（カルボキシメチル）グリシン］または（エチレンジニトロ）四酢酸，Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ第１０版，　登録番号３４９０）およびＥＤＴＡの全ての塩、および／またはフィチン酸（ミオイノシトールヘキサキス（ｈｅｘａｋｉｓ）（二水素リン酸），Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ第１０版，　登録番号７２６９）およびフィチン酸塩のような亜鉛をキレート化し得る非特異的キレート剤の組合わせを包含する。
【００２５】
溶媒：ジメチルスルホキシドが、全身性アミロイド症のいくつかの形態についての処置として提案された；エタノール；グリシン（溶媒特性を有するアミノ酸）。
【００２６】
銅：高濃度において、銅はＡβ１−４０のガラスへの接着を阻止し、そして可溶性Ａβダイマーを安定化する。亜鉛で誘導されるＡβの凝集に対する銅の効果は競合的であり得る。
【００２７】
炭酸リチウム：臭化リチウムが、Ａβ合成ペプチドを溶液中で維持するために使用されている（Ｈａｌｖｅｒｓｏｎら、１９９０）。この観察は、リチウム塩それ自体が、Ａβ凝集を阻害し得るという考察をもたらす。炭酸リチウムは、双極性感情障害の処置に用いられている神経弛緩薬物であり、ここでは、全身性の治療レベルは１ｍＭに保持される。炭酸リチウムが１ｍＭでＡβ凝集に対して阻害効果を有する場合、炭酸リチウムはＡＤおよび関連した病理学的状態のための治療剤として、妥当な候補である。
【００２８】
その他：有効な抗アミロイド化合物には前例がないため、亜鉛で誘導されるＡβ凝集を阻害する能力について、脳区画に接近し得る化合物を偶然的に試験することは理にかなっている。これらの化合物は、色素化合物、ヘパリン、硫酸ヘパラン、および抗酸化剤（例えば、アスコルベート、トロロックス（ｔｒｏｌｏｘ）、およびトコフェロール）を包含する。
【００２９】
定義
Ａβペプチドはまた、Ａβ、βタンパク質、β−Ａ４およびＡ４として当該分野で知られている。
アミロイドは、当該分野で通常知られているように、そして本明細書中で意図されるように凝集タンパク質の形態である。
同様に、Ａβアミロイドは凝集したＡβペプチドである。これは、ＡＤおよびＤＳを患う患者の脳内に見出され、そして脳傷害およびＧＡＬＳ／ＰＤＣ後に蓄積し得る。
染色アミロイドとは、緩衝水溶液中に不溶であることに加え、コンゴーレッドで染色され得、そして偏光中で陽性の複屈折性を有するアミロイドをいう。
【００３０】
抗アミロイド化合物とは、アミロイドの形成を阻害する化合物をいう。
亜鉛で誘導されるＡβ凝集物は、染色アミロイドのように、緩衝水溶液に不溶であって、そしてコンゴーレッドで染まる。しかし、染色アミロイドとは異なり、偏光中で陽性の複屈折性を明確に示さない。
【００３１】
Ａβアミロイド症は、当該分野で通常知られ、そして本明細書中で意図されるように、脳のような神経組織内でＡβアミロイドの形成により特徴づけられる、ヒトおよび他の動物における発病状態をいう。
【００３２】
本明細書中で用いられるとき、予め濾過する、および予め濾過されたは、溶液（例えば、Ａβペプチド水溶液）を、任意の方法（例えば、遠心分離、重力による滴透過（ｄｒｉｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ）、または（気体の圧力のような）任意形態の圧力の適用）により、多孔性膜を通して通過させることを意味する。
【００３３】
本明細書中で使用される生理学的溶液は、ＣＳＦ、血液、血漿などのような体液または生物学的液体が示すのに近い、生理学的ｐＨ（約７．４）で化合物を含有する溶液を意味する。
【００３４】
重金属キレート剤は、例えば、重金属をキレート化する（すなわち、重金属が、例えば化合物または分子である他の試薬と、反応および／または結合し得なくする）化合物または分子である任意の試薬をいう。このような重金属キレート剤の例には、ＥＤＴＡまたはデスフェリオキサミンがある。
【００３５】
本発明において、重金属塩は、任意の形態（可溶性または不溶性）における、任意の重金属または任意の遷移金属の塩である。
本明細書において、指示がなければ、亜鉛は、亜鉛の塩、すなわち任意の形態（可溶性または不溶性）におけるＺｎ２＋を示す。
【００３６】
生物学的液体は、ヒトまたは動物により産生されるヒトまたは動物から得られる液体を意味する。生物学的液体の例には、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血清、および血漿が含まれるが、これらに限定されない。本発明において、生物学的液体は、任意の手段（例えば、限外濾過またはクロマトグラフィー）による精製から派生するような液体の全体または任意の画分を含む。
生物学的液体の原液サンプルは、生物学的液体が、例えば希釈によって改変されていないことを意味する。
【００３７】
コントロールのヒト被験体とは、アミロイド症を患っていない健康なヒトをいう。
【００３８】
Ａβアミロイドの検出のための迅速な分析方法では、アミロイド症を患っていると疑われるヒト患者の、ＣＳＦ、血清または血漿のような生物学的液体を、系列希釈して滴定する。同様に、コントロールサンプル（アミロイド症を患っていない健康なヒト由来の生物学的液体）を、系列希釈により滴定する。希釈は、原液（希釈していない）サンプルから１：１０，０００以上までの範囲であり得る。アミロイド症を患うヒト由来のサンプルはより低い力価を有することと推定される。なぜならこれらの患者は、有意にアミロイドを形成しやすくする病状を患っているからである。次いで、緩衝水溶液または生理学的溶液中の等量のＡβペプチドを、各サンプルに添加する。次いで、このサンプルを、少なくともＡβペプチドのアミノ酸６〜２８を含むペプチドに結合し得る、大きな（３００ｎＭ以上の）、好ましくは２５μＭの重金属カチオンと接触させる。本発明中の好ましい重金属は亜鉛である。さらに、Ａβペプチドは、重金属カチオンの存在下でＡβアミロイドを形成する。次いで、このＡβアミロイドを、遠心分離によりそれらをペレット化することにより回収し得る。最後に、このペレットをコンゴーレッドのようなアミロイド染色色素を用いて染色し、そしてこのペレットを顕微鏡下で観察し、そして（所望であれば）グリッドを用いて定量する。（健康なヒトと比較して）アミロイド症の患者の生物学的液体はすでに、アミロイドを形成する傾向がより大きく、そして彼／彼女の生物学的液体（例えばＣＳＦ）はすでに、アミロイドを含有しており、従って、患っている患者から得られるペレット中の染色Ａβアミロイドの量は、健康なコントロールのサンプルよりも多いことが予想される。
【００３９】
あるいは、サンプルを系列希釈により滴定した後、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含む等量の滴定されたＡβペプチドを各サンプルに添加する。このサンプルは先のように遠心分離され得、そして各ペレットにおける１分間あたりのカウントを測定した。しかし、好ましくは、サンプルを濾過し、そしてフィルターのＣＰＭをシンチレーションカウンターにより測定する。
【００４０】
化合物がＡβアミロイドの形成を阻害するかを決定する本発明の方法では、亜鉛誘導または重金属誘導に曝した後の反応物中に残存する可溶性または沈澱Ａβペプチドの量を測定し、そして反応混合物に添加された可溶性ペプチドの初期量と比較し、これによって候補となる化合物がアミロイド形成を阻害し得ることを明らかにする。逆に、亜鉛または重金属で誘導される反応において形成されたＡβアミロイドの量を測定し、そして少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有するペプチドに結合し得る重金属カチオンのキレーター（例えば、ＥＤＴＡまたはデスフェリオキサミン）を含むコントロール反応混合物と比較し、候補となる化合物がアミロイドの形成を阻害し得るかを決定する。
【００４１】
さらに、上記のように、ペプチドまたはアミロイドの量を測定および比較するために、この反応混合物を濾過し得る。逆に、この反応混合物を遠心分離し、例えばコンゴーレッドでペレットを染色し、そして顕微鏡下で観察して、アミロイドの形成を検出し得る。さらに、形成されたアミロイドの量を、グリッドを用いて定量し得る。
【００４２】
本発明において、Ａβペプチドは、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有するポリペプチドに結合し得る最も好ましい重金属カチオンである亜鉛に対する結合部位を含む、少なくともＡβペプチドの６〜２８位に対応するアミノ酸を含む限り、Ａβペプチドの任意の配列を含み得る。本発明の好ましい実施態様は、ペプチドＡβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４１、Ａβ１−４２、およびＡβ１−４３を使用する。最も好ましい本発明の実施態様はＡβ１−４０を使用する。しかし、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有する任意のＡβペプチドが本発明に従って用いられ得る。アミノ酸６〜２８を含有するＡβペプチドの配列は、Ｃ．　Ｈｉｌｂｉｃｈら、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２２８：４６０〜４７３（１９９２）に示されている。
【００４３】
本発明の方法において、Ａβペプチドは、光学分光光度法を用いて検出される。これは、ペプチドの濃度とＯＤ２１４測定との間に直接の相関関係が存在するので可能である。ＯＤ測定について好ましい波長は約２１４であるが、この測定は、本発明の目的のために約１９０〜約４４０の波長で行われ得る。しかし、好適な波長は約２０８〜約２８０である。
【００４４】
さらに、Ａβペプチドを放射能標識し、そして濾液および／またはペレットの１分あたりの化合物（ＣＰＭ）を測定することにより、このペプチドを検出し得る。本発明において、好ましい放射能標識Ａβペプチドは３Ｈ−Ａβである。本発明において使用され得る他の放射能標識は、１４Ｃおよび３５Ｓである。
【００４５】
逆に、非特異的タンパク質染色、例えば、クーマシーブルー（Ｂｕｓｈら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９（１６）：１２１５２〜１２１５８（１９９４））、またはＡβアミロイドに特異的な抗体（例えば、米国特許第５，２３１，０００号、１９９３年７月２７日発行、を参照のこと）を用いて、反応中に形成されるＡβアミロイドの形成を検出し得る。それ故、本発明の方法に従って反応中のＡβアミロイド形成のレベルを測定することによって、候補となる試薬がＡβアミロイドの形成を阻害するために効果的であるかを決定し得る。Ａβアミロイドのレベルを、遠心分離後の可溶性もしくは沈澱画分中、またはＥＬＩＳＡ（Ｓｕｚｕｋｉの参照文献）による、もしくはウエスタンブロットによる濾過後の濾液中のＡβ量を測定することにより定量し得る。
【００４６】
本発明の実施に用いられ得る少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含有するポリペプチドに結合し得る他の重金属カチオンは、好ましくは、亜鉛、銅、または水銀の塩化金属塩を含む。しかし、本発明の最も好ましい実施態様は、塩化亜鉛を使用することである。
【００４７】
種々の反応混合物のｐＨは好ましくは中性付近である（約７．４）。従って、このｐＨは、約６．８〜約８の範囲であり得、より好ましくは約７〜約７．８、そして最も好ましくは約７．４であり得る。
【００４８】
本発明の方法に使用され得る緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＣｌおよびＴｒｉｓ−ｂａｓｅ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、炭酸水素塩、Ｋｒｅｂｓ、ならびにＴｙｒｏｄｅ’ｓを含むが、これらに限定されない。緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭの間であり得る。しかし、これらの緩衝液が亜鉛をキレート化することを考慮すると、これらの緩衝液の濃度は、結果を損なうことがない限りできるだけ低く保つべきである。
【００４９】
本発明中で使用されるフィルターは、Ａβペプチドを通過可能にする、例えば約０．２ミクロン〜約６０ミクロンの孔サイズを有し；好ましくは約０．２ミクロン〜約８ミクロン；そして最も好ましくは約０．２ミクロン〜約０．６５ミクロンである。本発明の好適な実施態様において、０．２ミクロンフィルターが使用される。Ａβペプチドモノマーは、４．３ｋＤａの分子量を有する。それ故、４．３ｋＤａを越える、例えば、４．４ｋＤａの粒子を保持し得るフィルターが、本発明を実施するために使用され得る。Ａβペプチドおよびフラグメントは、ダイマーおよびポリマーを形成し得る。本発明で用いられるＡβペプチドのサイズに基づいて、当業者は、Ａβペプチドの通過を可能にし、そして亜鉛で誘導されるＡβ凝集物のような重金属カチオンにより誘導される、大部分またはすべてのアミロイドおよびＡβ凝集物の通過を妨げるような、適切な孔サイズを備えたフィルターを選択し得る。
【００５０】
さらに、任意のアミロイド−染色色素が本発明の方法で用いられ、溶液中で亜鉛で誘導されるＡβ凝集物のような重金属カチオンにより誘導されるアミロイドおよびＡβ凝集物の沈着の測定を容易にし得る。このような色素には、コンゴーレッド、ビフラビン（ｂｉｆｌａｖｉｎ）ＳおよびビフラビンＴが挙げられるが、これに限定されない。このような色素の濃度は、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約５０％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。事実、色素濃度の上限は、溶液中の色素の溶解限度に制限される。
【００５１】
本発明は、Ａβペプチドをかなり低い濃度で、例えば、約０．１ｎＭ〜約３．７ｍＭ（すなわち溶解限界）で使用し得る。本発明の好適な実施態様は、約０．８μＭの濃度（光学密度により検出される最低のペプチド濃度）のＡβペプチドを用いる。以前に報告されている最低濃度（Ｊ．Ｔ．　Ｊａｒｒｅｔｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：４６９３−４６９７（１９９３））は、Ａβ１−４０について２０μＭおよびＡβ１−４２について２μＭである。従って、本発明の利点は、かなり低い濃度のペプチドを、本発明のアッセイの高感度に起因して使用し得ることである。
【００５２】
同様に、少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含むポリペプチドに結合し得るかなり低い濃度（例えば、約２００ｎＭから、重金属カチオンの溶解限界まで）の重金属カチオンが用いられ得る。最も好適な重金属カチオンである亜鉛を、約３００ｎＭもの低濃度で本発明において使用し得る。報告された使用最低濃度（Ｐ．Ｗ．　Ｍａｎｔｙｈら、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　６１：１１７１（１９９３）は１ｍＭであり、すなわち本発明で使用され得る濃度よりも３桁大きい。当業者は、ルーチンの実験だけで重金属カチオンの濃度を容易に最適化し得る。
【００５３】
本発明は、約１℃〜約９９℃の温度範囲で実施し得る。好ましい温度範囲は、約４℃〜約４０℃である。本発明の実施に最も好ましい温度は約３７℃、すなわちヒトの体温である。
【００５４】
Ａβペプチドの凝集は、ほぼ瞬時の速さで起こる。それ故、本発明の方法により、重金属とＡβペプチドとの接触に際し結果が実質的に即座に得られ得る。しかし、所望であれば、この反応は、より長く進行させ得る。本発明の好ましい実施態様において、この反応は約３０分間行われる。
【００５５】
本発明はまた、実際の生理学的条件を厳密に模倣するために生物学的液体（例えば、ＣＳＦ）の存在下で行われ得る。この生物学的液体は、反応混合物に直接添加され得、または数倍に希釈され得る。希釈は、約１：１０，０００〜約１：１倍の範囲であり得る。本発明中における好ましい生物学的液体、すなわちＣＳＦは、直接用いられ、または約１：１，０００〜約１：５倍に希釈され得る。
【００５６】
本発明のアッセイは理想的にはキットの調製に適している。このようなキットは、区分されて、その中に１つ以上のコンテナ手段（バイアル、チューブなど）を密閉して収容するキャリア手段を含み得、各々のコンテナ手段は、本発明の方法で用いられるべきアッセイの別の分離要素の１つを含む。例えば、本発明の方法に用いられる変化する量および／または所定濃度の試薬（例えば、標準溶液、または任意の形態（溶液または乾燥）の重金属カチオンの変化する量のキレート剤）を含むキャリア手段に加えてさらに、Ａβペプチドまたは凍結乾燥Ａβペプチドの標準溶液を含むコンテナ手段、および、標準溶液、または任意の形態（すなわち、溶液または乾燥、可溶性または不溶性）の、少なくともＡβペプチドのアミノ酸６〜２８を含有するペプチドに結合し得る重金属カチオンの変化する量を含有するコンテナ手段が提供され得る。Ａβペプチドの標準溶液は、好ましくは、約１０μＭ以上の濃度を有し、より好ましくは約１０μＭ〜２５μＭであり、あるいはこのペプチドが凍結乾燥形態で提供される場合、緩衝水溶液または生理学的溶液を添加することにより上記濃度に溶解し得る量で提供される。重金属カチオンの標準溶液は、好ましくは３００ｎＭ以上の濃度であり、より好ましくは約２５μＭの濃度である。分析物の標準溶液を用いて、化合物がＡβアミロイド形成を阻害するかを決定する本発明の方法に従って、比較のためにコントロールおよび試験反応混合物を調製し得る。
【００５７】
ＡＰＰエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）内の１つのＺｎ２＋結合部位がすでに記載されている（Ｂｕｓｈら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８：１６１０９−１６１１２（１９９３））。ＡＰＰ上のさらなる亜鉛結合部位の可能性を調査した。Ａβ１−４０構造は３つのヒスチジンおよびいくつかの負に荷電した残基を有し、Ｚｎ２＋結合を支持する構造的特色がある。これらの研究は、Ａβが、飽和および特異的様式で亜鉛と結合することを示す。さらに、Ｚｎ２＋の生理学的濃度が、タンパク質分解異化に対するペプチドの抵抗性を増加し、そしてアルミノケイ酸塩によるＡβ沈澱を促進することが示される。これらの知見に基づいて、過剰の亜鉛濃度が、ＡＤおよび関連する発病状態において、Ａβ沈着を促進することが発見された。
【００５８】
さらに、溶液中の合成ヒトＡβ１−４０の安定性に対する亜鉛の生理学的濃度の影響を、比較のためにラット／マウス種のペプチド（「ラットＡβ」）を用いて研究した。可溶性Ａβ１−４０はラット神経組織により産生されるが（Ｃ．　ＨａａｓｓおよびＤ．Ｊ．Ｓｅｌｋｏｅ、私信）、Ａβアミロイド沈着は、老齢ラットの脳の特徴ではない（Ｄ．Ｗ．　ＶａｕｇｈａｎおよびＡ．　Ｐｅｔｅｒｓ、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｎｅｕｒｏｌ．　４０：４７２（１９８１））。βアミロイド産生（β−ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、ヒトＡβ配列を有する他の老齢哺乳動物において起こり、この配列はラットおよびマウス以外の報告されたすべての動物種において強く保存されている（Ｅ．Ｍ．　Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，　Ｍ．Ｏ．　Ｃｈａｎｅｙ，　Ｆ．Ｈ．　Ｎｏｒｒｉｓ，　Ｒ．　Ｐａｓｃｕａｌ，　Ｓ．Ｐ．　Ｌｉｔｔｌｅ，　Ｍｏｌ．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　１０：２９９（１９９１））。ラット／マウスＡβ置換（５位、１０位および１３位のそれぞれ、Ａｒｇ→Ｇｌｙ、Ｔｙｒ→ＰｈｅおよびＨｉｓ→Ａｒｇ　［Ｂ．Ｄ．　Ｓｈｉｖｅｒｓら、ＥＭＢＯ　Ｊ．　７：１３６５（１９８８）］）は、アミロイド形成に対するその相対免疫をペプチドに与えるのに十分なペプチドの物理化学的性質の特異的変化を引き起こすようである。ヒトＡβ１−４０への亜鉛の結合は、ヒスチジンで媒介される；従って、ラットＡβは、改変された亜鉛結合性質を示すと予想され得る。
【００５９】
ラットＡβ１−４０に対する亜鉛の結合親和性を、実施例１（図１）で記載されるような６５Ｚｎ競合アッセイ系で研究し、ヒトＡβ１−４０に結合する亜鉛のＫＡを測定した。ヒトＡβ１−４０とは対照的に、ラットＡβ１−４０への亜鉛の結合のスキャッチャード分析は、１：１の化学量論の１つの結合会合（ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＫＡ＝３．８μＭ）だけを示す（図５）。
【００６０】
濾過クロマトグラフィーにおけるヒトＡβ１−４０の回収率が、一部、Ａβの付着の増加のために、亜鉛の存在下で劇的に減少することが観察された。ヒトＡβ１−４０の凝集がまた、亜鉛の存在下で高められるかを決定するために、Ｚｎ２＋（２５μＭ）またはＥＤＴＡと共に、このペプチドを、種々の濃度で３０分間インキュベートし、次いで０．２μフィルターを通して溶液を濾過した。亜鉛は、利用可能なペプチドの８０％までを、＞０．２μの粒子に凝集させた（図６Ａ）（実際に濾過することなくフィルター装置中でＡβ１−４０溶液をインキュベーションしたので、プラスチックまたは膜表面へのペプチドの非特異性損失は示されなかった）。ヒトＡβペプチド濃度と、２５μＭのＺｎ２＋中の濾過可能なペプチドの割合との間に、浅い負の対数−直線（ｌｏｇ−ｌｉｎｅａｒ）関係が存在するようであるが、試験される最低濃度（０．８μＭ）でさえ、７０％を越えるヒトＡβ１−４０溶液が凝集した。対照的に、ラットＡβ１−４０に対するＺｎ２＋の効果は目立たず、０．８μＭのペプチド溶液の凝集は同じ条件下で検出されず、そして４μＭ溶液でわずか２５％の凝集が検出された。その一方、ＥＤＴＡの存在下で、ヒトおよびラットＡβ１−４０溶液では、０．８μＭで観察される検出可能な凝集がないので区別できず、そしてより高いペプチド濃度で約１５％の凝集があった。
【００６１】
次いで、＞０．２μＡβ粒子の形成を、増加する亜鉛濃度に対して滴定し（図６Ｂ）、そしてヒトＡβ１−４０（１．６μＭ）について浅い応答曲線が、亜鉛濃度が３００ｎＭ（高親和性結合の飽和に相当する）に達するまで観察された。低親和性結合に相当する３００ｎＭ以上の亜鉛濃度では、ヒトＡβ１−４０が劇的に凝集する。対照的に、ラットＡβ１−４０は１０μＭまでの亜鉛の存在下で安定であり、そして２５μＭの亜鉛でのみ凝集が観察された。
【００６２】
生理学的ペプチド濃度でＡβ１−４０に対する亜鉛の効果を測定するために、分光法よりも感度の高いアッセイが必要である。（緩衝液中、０．８μＭでヒトＡβ１−４０の１は、２１４ｎｍで０．０９０吸光度に相当する。より低い開始濃度でのペプチドの凝集研究は、感度限界での測定を含み得る）。従って、非標識ペプチドの存在下でトレーサーとして用いられる１２５Ｉ−ヒトＡβ１−４０に対するの亜鉛の効果が特徴づけられた。その非標識前駆体とは異なり、１２５Ｉ−Ａβ１−４０（１．６μＭの総ペプチドで）は、増加する亜鉛の濃度の存在下で安定に保持され、１２５Ｉ−Ａβ１−４０が適切なトレーサーでないことを示した（図６Ｂ）。このトレーサーは、ラットペプチドではフェニルアラニンである、１０位のチロシン残基上でヨード化されている。従って、このチロシン残基はヒトペプチドの安定性に必須であり得る。これらのデータはまた、最近の報告（Ｐ．Ｗ．　Ｍａｎｔｙｈら、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　６１：１１７１（１９９３））では、遠心分離研究で、１２５Ｉ−ヒトＡβ１−４０を沈澱させるために比較的高濃度のＺｎ２＋（１ｍＭ）を必要とする理由を説明し得る。図６Ａの曲線に０．６ｎＭを外挿すると、現在のところ、生理学的Ａβ濃度（Ｍ．　Ｓｈｏｊｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８：１２６（１９９２）：　Ｐ．Ｓｅｕｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３５９：３２５（１９９２））に対する亜鉛の効果の最良の評価を与え、そしてペプチドの２５％が、これらの条件下で、＞０．２μ粒子に凝集し得ることを示す。このＺｎ２＋に対するヒトＡβ１−４０の特有の結合し易さは、等モルをベースにして試験された（Ａｌ３＋を含む）いくつかの金属イオンの中で、Ｚｎ２＋がこの系におけるヒトＡβ１−４０の有意な凝集を誘導した唯一のものであるという観察（図６Ｃ）により示される。
【００６３】
次いで、亜鉛で誘導されるヒトＡβ１−４０凝集物（図６Ｄ）の会合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）の速度論を調査した（１分未満の時点測定を達成するために、サンプルを２５００ｇで遠心分離し、サンプル量を４０秒で完全に濾過するように手順を改変した）。得られたデータは、水中の保存Ａβ１−４０（１５．９μＭ、ｐＨ５．６）を、緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中のＺｎ２＋（２５μＭ）に添加した後、２相が２時間以上観察され、ペプチド（１．６μＭ最終濃度）の濾過可能な粒子への凝集がほぼ瞬時に起こることを示す。最初の相は急速であり、約０．４μＭ／分の半−最大会合速度である。第２の相の定常状態が約２分以内に達成されるとすぐに、粒子の会合は、２時間以内では飽和の証拠なしに、３．２ｎＭ／分の速度で進行する。この速度では、利用可能なペプチドは、開始から５時間以内に枯渇する。ＥＤＴＡ緩衝液の添加は、１．６μＭのＡβ１−４０溶液の２０％を＞０．２μ粒子へのほぼ瞬時の凝集を引き起こしたが、実験の時間経過にわたってさらなる粒子会合は観察されなかった。対照的に、ヒトＡβ１−４０（ＰＢＳ中２０μＭ、ｐＨ７．４）は、１０日間安定であることが報告されており（Ｊ．Ｔ．　Ｊａｒｒｅｔｔ、Ｅ．Ｐ．　Ｂｅｒｇｅｒ、Ｐ．Ｔ．　Ｌａｎｓｂｕｒｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３２：４６９３（１９９３））、そしてこの溶液に、より多くのアミロイド産生Ａβ種であるＡβ１−４２（２μＭ）を接種すると、４〜５日後にのみこの溶液の凝集を誘導した、その凝集は最大値の半分であった。従って、本明細書中で提示される結果は、分泌されたＡβ（Ａβ１−４０）の主要な種である野生型形態を用いる、インビトロでのアミロイド形成を誘導する試みの中で、大きな進歩を提示する。
【００６４】
亜鉛存在下で形成されたＡβ凝集物のサイズを推定するために、Ａβ１−４０（１．６μＭ）をＺｎ２＋（２５μＭ）またはＥＤＴＡと共にインキュベートし、次いで種々の孔サイズのフィルターを通過させた（図７ａおよび図７ｂ）。ＥＤＴＡ中でインキュベーションした後、ヒトＡβ１−４０は、不均質な粒子サイズの集団、＞０．１／μ：４７％、＞０．２２μ：４０％、＞０．６５μ：３２％に会合した。濾過されたラットＡβ１−４０粒子の匹敵する割合は、＞０．１μ：３６％、＞０．２２μ：２７％、＞０．６５μ：２５％であった。Ｚｎ２＋（２５μＭ）とのインキュベーションに際し、＞０．６５μラットペプチド粒子の割合が、わずかに増加したに過ぎなかったが、＞０．６５μヒトペプチド粒子の割合は劇的に増加し、利用可能なペプチドの８２％を利用した。興味深いことに、ヒトＡβ１−４０から形成された＞０．１μ粒子および＞０．２２μ粒子の割合はまた、Ｚｎ２＋とのインキュベーション後、それぞれ５０％および５５％に増加したが、ラットペプチドから会合したこれらの粒子の量では、同じ反応で、それぞれ２０％および３０％だけの増加を誘導した。注目すべきことに、Ｚｎ２＋とインキュベートしたヒトＡβ１−４０のわずか４％が、０．１μ濾過後の溶液に残存していた。まとめると、これらのデータは、ヒト種のＡβ１−４０は、亜鉛で誘導される粒子形成の程度およびサイズの両方において、ラット種のＡβ１−４０とは異なることを示す。
【００６５】
これらの凝集物における亜鉛：ヒトＡβの化学量論は少なくとも１：１（図７ｃ）であるが、より小さい孔サイズ（０．１μ）のフィルターを用いると、１．３：１に増加する。なぜなら、高いおよび低い親和性Ｚｎ：Ａβ結合についての化学量論は、それぞれ約１：１および約２：１であり、これらのデータは、＞０．６５μＡβ凝集物の形成が、高親和性亜鉛相互作用により仲介され、その一方低親和性亜鉛相互作用は、より小さな凝集物（＜０．２２μ）の形成に最も寄与している可能性が大きいことを示す。興味深いことに、保持された凝集物をＥＤＴＡで洗浄する場合、複合体化された亜鉛（トレーサーとして６５Ｚｎを用いる）は完全に回収されたが（図７ｄ）、このペプチドの２２％だけが、＞０．６５凝集物から回収された。このことは、亜鉛で誘導されるＡβ凝集が、キレート化により大部分不可逆的であることを示す。ＥＤＴＡ処置により再可溶化される≦０．２２μのペプチド量は７％以上であり、この量は、可逆的にキレート化したより小さなＡβ粒子形成への、低親和性亜鉛結合の寄与の増加を反映しているといってよい。
【００６６】
遠心分離による亜鉛誘導Ａβ粒子の沈澱により、染色アミロイド形成の基準に合致する、コンゴーレッドで染まり（図８ａ）、そして偏光下で緑の複屈折性を示す（図８ｂ）、ヒトＡβ１−４０の大量の沈澱が得られた。しかし、同一条件下でのＺｎ２＋とのインキュベーション後、ラットペプチドは、最小の複屈折性を有して、有意により少なくおよびより小さな粒子を形成した。１０μＭ未満のＺｎ２＋濃度で誘導されるラットＡβアミロイドは存在せず、その一方、染色基準によっては、ヒトＡβアミロイドは、３μＭもの低いＺｎ２＋濃度で誘導された。いずれの場合でも、ＥＤＴＡ含有緩衝液とのインキュベーション後にコンゴーレッド染色物質は検出されなかった。
【００６７】
併せ考えると、これらのデータは、生理学的亜鉛濃度の存在下で、可溶性ヒトＡβ１−４０が、ラットＡβ１−４０よりも、アミロイドを形成する劇的により大きな傾向を有することを示す。染色アミロイド凝集物は、しばしばＡＤ脳組織から精製された無定形アミロイドプラークコアと同程度の大きさである（Ｃ．Ｌ．　Ｍａｓｔｅｒｓら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：４２４５（１９８５））。その一方、ＥＤＴＡとのＡβ１−４０のインキュベーション後に観察される小度合（１０〜２０％）の＞０．２μＡβ１−４０粒子会合は、中性ｐＨ（Ｓ．　ＴｏｍｓｋｉおよびＲ．Ｍ．　Ｍｕｒｐｈｙ，　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　２９４：６３０（１９９２））およびＮａＣｌ（Ｃ．　Ｈｉｌｂｉｃｈ，　Ｂ．　Ｋｉｓｔｅｒｓ−Ｗｏｉｋｅ，　Ｊ．　Ｒｅｅｄ，　Ｃ．Ｌ．　Ｍａｓｔｅｒｓ，　Ｋ．　Ｂｅｙｒｅｕｔｈｅｒ，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１８：１４９（１９９１））の存在下で起こる比較的遅い凝集をおそらく反映する。それ故、ヒトＡβが亜鉛で誘導されるアミロイド形成をするその特有のし易さは、ＡＤおよび関連する発病状態の病理学的側面に対する有望な解釈である。
【００６８】
大脳皮質、および特に海馬は、体内で最も高濃度の亜鉛を含み（Ｃ．Ｊ．　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，　Ｍ．Ａ．　Ｋｌｉｔｅｎｉｃｋ，　Ｗ．Ｉ．　Ｍａｎｔｏｎ，　Ｊ．Ｂ．　Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ，　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　２７３：３３５（１９８３））、そして、例えばシナプス伝達の間（Ｓ．Ｙ．　ＡｓｓａｆおよびＳ．Ｈ．　Ｃｈｕｎｇ，　Ｎａｔｕｒｅ　３０８：７３４（１９８４）；　Ｇ．Ａ．　Ｈｏｗｅｌｌ，　Ｍ．Ｇ．　Ｗｅｌｃｈ，　Ｃ．Ｊ．　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，　Ｎａｔｕｒｅ　３０８：７３６（１９８４））に、細胞外亜鉛レベルの極端な変動（０．１５〜３００μＭ、Ｃ．Ｊ．　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，　Ｉｎｔ．　Ｒｅｖ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，　３１：１４５（１９８９））に曝される。皮質血管系は２０μＭの管内亜鉛濃度を含むが（Ｉ．Ｊ．Ｔ．　Ｄａｖｉｅｓ，　Ｍ．　Ｍｕｓａ，　Ｔ．Ｌ．　Ｄｏｒｍａｎｄｙ，　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｐａｔｈｏｌ．　２１：３５９（１９６８））、脈管周囲の間隙の亜鉛濃度は０．１５μＭである（Ｃ．Ｊ．　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，　Ｉｎｔ．　Ｒｅｖ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　３１：１４５（１９８９））。両部位の高い亜鉛濃度勾配は、ＡＤの病理学的病変により厳しくおよび一貫して影響を受ける（Ｂ．Ｔ．　Ｈｙｍａｎ，　Ｇ．Ｗ．　Ｖａｎ　Ｈｏｅｓｅｎ，　Ｌ．Ｊ．　Ｋｒｏｎｅｒ，　Ａ．Ｒ．　Ｄａｍａｓｉｏ，　Ａｎｎ．　Ｎｅｕｒｏｌ．　２０：４７２（１９８６）；　Ｇ．Ｇ．　ＧｌｅｎｎｅｒおよびＣ．Ｗ．　Ｗｏｎｇ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　１２０：８８５（１９８４））。興味深いことに、ＡＤにおける顕著な神経化学的欠損は、海馬のコリン作動性の求心路遮断で起こり、これはこの領域の亜鉛濃度を上昇させる（Ｇ．Ｒ．　Ｓｔｅｗａｒｔ，　Ｃ．Ｊ．　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，　Ｇ．Ａ．　Ｈｏｗｅｌｌ，　Ｆ．Ｈ．　Ｇａｇｅ，　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　２９０：４３（１９８４））。ＡＤにおける改変した大脳亜鉛代謝についてのさらなる証拠は、減少した側頭葉の亜鉛レベル（Ｄ．　Ｗｅｎｓｔｒｕｐ，　Ｗ．Ｄ．　Ｅｈｍａｎｎ，　Ｗ．Ｒ．　Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｙ，　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　５３３：１２５（１９９０）；　Ｊ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ，　Ｅｎｃｅｐｈａｌｅ　１６：２３１（１９９０）；　Ｆ．Ｍ．　Ｃｏｒｒｉｇａｎ，　Ｇ．Ｐ．　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，　Ｎ．Ｉ．　Ｗａｒｄ，　Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ　６：１４９（１９９３））、上昇した（８０％）ＣＳＦレベル（Ｃ．Ｏ．　Ｈｅｒｓｈｅｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　３３：１３５０（１９８３））、ＡＤ海馬における細胞外Ｚｎ２＋−メタロプロテイナーゼ活性の増加（Ｊ．Ｒ．　Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ，　Ｃ．Ａ．　Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｚ．Ａ．　Ｔｋｓ，　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５８：９８３（１９９２））、および、星状膠細胞増殖阻害因子である、亜鉛をキレート化するメタロチオネイン様タンパク質の減少したレベル（Ｙ．　Ｕｃｈｉｄａ，　Ｋ．　Ｔａｋｉｏ，　Ｋ．　Ｔｉｔａｎｉ，　Ｙ．　Ｉｈａｒａ，　Ｍ．　Ｔｏｍｏｎａｇａ，　Ｎｅｕｒｏｎ　７：３３７（１９９１））を含む。最近、臨床研究で、ＡＤ被験体および同齢のコントロールにおける知覚および血漿ＡＰＰレベルに対する、経口亜鉛補給の効果がアッセイされた（通常栄養補給物で見出される用量である推奨される１日の許可量の６．７倍）。５人の順次研究されたＡＤ被験体の各々は、亜鉛投与を受けた４８時間以内に知覚において、急速な衰退を経験した。同一条件下で、同齢のコントロール被験体は、その用量により影響を受けないままであった。ＡＤ群の受けた神経生理学的測定の異常な変化の中で、小−精神状態試験（Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ　Ｓｔａｔｅ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）では、亜鉛補給の４日後、３１％の低下を記録した（Ｍ．Ｆ．　Ｆｏｌｓｔｅｉｎ，　Ｓ．Ｅ．　Ｆｏｌｓｔｅｉｎ，　Ｐ．Ｒ．　ＭｃＨｕｇｈ，　Ｊ．　Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．　Ｒｅｓ．　１２：１８９（１９７５））。これは、疾病の通常の経過において、２〜４年後に予想されるだけの低下を示した（Ｇａｌａｓｋｏら、ＪＡＧＳ　３９：９３２（１９９１））。血漿ＡＰＰレベルもまた、ＡＤおよびコントロール群の両方で、亜鉛に応じて有意に増加した。すべての変化は、４日間の補給の停止後、急速に回復した。まとめると、これらの報告は、ＡＤ脳内の亜鉛の摂取または分配に異常が存在し得ることを示す。亜鉛代謝の浸透異常、および早発性ＡＤの病状がまた、ダウン症の共通の臨床的合併症である（Ｃ．　Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉら、Ｊ．Ｍｅｎｔ．　Ｄｅｆｉｃ．　Ｒｅｓ．　３２：１６９（１９８８）；　Ｂ．　Ｒｕｍｂｌｅら、Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３２０：１４４６（１９８９））。
【００６９】
本明細書中に表されたデータは、生理学的濃度の亜鉛存在下の安定性により、アミロイドを形成するヒトおよびラットＡβ１−４０ペプチド種の傾向が明らかに区別されることを示す。染色ヒトＡβアミロイドの急速な誘導が、生理学的に相当する条件下で、Ａβ１−４０凝集のために従前に達成された最低レベルよりも１桁以上低いペプチド濃度（１分未満での時点測定を達成するために、サンプルを２５００ｇで遠心分離し、４０秒で完全に濾過されるサンプル量にするように手順が改変された）、および２分以内のインキュベーションは、Ａβアミロイド症の研究のための新規アッセイ系を確立する。さらに重要なことに、これらの知見は、アルツハイマー関連の神経病発生における亜鉛の可能な役割のために重要な示唆を有し得る。
【００７０】
以下の実施例では、本発明の特定の好適な実施態様をさらに記載するために例示によって提供され、特定しなければ、本発明を限定することを意図しない。
【００７１】
実施例
実験手順
特に示さない限り、以下の実験手順、材料、および試薬を本発明に使用した。
試薬。亜鉛の混在を避けるためにとられた予備措置としては、分析グレード試薬、電気泳動用Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、および高度の脱イオン水の使用を含めた。Ａβ１−１７は、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＩＴで合成された。Ａβ４０−１（逆ペプチド）をＢａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，　ＣＡ）から購入した。他の試薬はＳｉｇｍａから購入した。Ａβ１−４０およびＡβ１−２８合成物を、ＢａｃｈｅｍおよびＳｉｇｍａのペプチドから複製した。Ａβ１−４０合成物はまた、Ｙａｌｅ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＷ．　Ｍ．　Ｋｅｃｋ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって合成されたペプチドでも複製可能であった。６５ＺｎをＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ．より購入した。
【００７２】
６５Ｚｎ２＋結合の研究。溶解ペプチド（１．２ｎＭ、特に記述しない限り）を０．２μｍポリビニリデンジフルオリド膜（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）上にドットブロットし、キレート緩衝液（２００μｌ×１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、次いでブロック緩衝液（２００μｌ×１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．４）で５回洗浄し、そして６５Ｚｎ（特に記述しない限り、１３０，０００ｃｐｍ、７４ｍＭ６５ＺｎＣｌ２を含むブロック緩衝液２００μｌ±競合金属イオン塩化物）とともにインキュベート（６０分、２０℃）した。次いで、ドットブロットをブロック緩衝液（５×２００μｌ）で洗浄し、ドットを切り出し、テストチューブに入れ、そしてγ−計測（１１％の有効度）によりアッセイした。化学量論推定値についての平衡容量を６×２００μｌとみなした。非結合の透過物の２１４ｎｍにおける紫外線吸光をアッセイし、フィルター上に結合したペプチド残留物の全量を決定した。ペプチドストックの濃度をアミノ酸分析により確認した。ｐＨを変えるために、６５Ｚｎのインキュベーションを１００ｍＭ緩衝液（ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５〜７．０）、ＭＥＳ（ｐＨ５．０〜６．０）、酢酸（ｐＨ３．５〜４．５））の存在下で行った。ドットブロット装置を界面活性剤およびＥＤＴＡ（５０ｍＭ）で洗浄し、次いで濯ぎ、そして使用の合間にシリコン化した。
【００７３】
Ａβのクロマトグラフィー。Ａβ（５５μｇ）を、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を含むシリコン化１．５ｍｌ容プラスチック反応容器中で、金属塩溶液またはＥＤＴＡとともにインキュベートした。（「ＴＢＳ」、１００μｌ、１時間、３７℃）。Ａβを、水中で０．５２ｍｇ／ｍｌのアリコートで−２０℃で保存し、次いで溶解するときには４℃に保った。試薬をボルテックスミキサーを使用せずに撹拌した。インキュベートしたＡβを、　ＴＢＳ中で２０℃で、金属塩溶液またはＥＤＴＡ（５０μＭ）であらかじめ平衡化されたＧ５０　ＳＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｅｃｏｎｏ−Ｃｏｌｕｍｎ、３０×０．７ｃｍ）へ直接載せ、そして８ｍｌ／ｈで溶出した（Ｗｉｚ　ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ　ｐｕｍｐ、Ｉｓｃｏ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）。吸光度を、２５４および２１４ｎｍにおいて測定した（Ｔｙｐｅ６　ｏｐｔｉｃａｌ　ｕｎｉｔ、Ｉｓｃｏ）。種々のピークで溶出するＡβの量を、曲線より下の面積から推定した。このことは、これらの研究で用いられたＡβ希釈物の範囲にわたって紫外線吸光の関係が直線的であることが決定されたことにより可能で、吸光度は、ポリマー化状態に関わらず、ペプチドの存在量に比例することを示す（以下を参照のこと）。Ａβの最大の回収はＥＤＴＡの存在下で起こる。サンプルを約１５ｍｌの容量で溶出したので、カラム上のペプチドの平均濃度は０．８μＭであった。
【００７４】
クロマトグラフィーカラムへのＡβの吸着を阻止するタンパク質の影響を研究するために、以前にＡβの挙動について特徴付けられたＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０　ＳＦ　カラムを３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴＢＳ（５０ｍｌ）で溶出し、そしてＢＳＡを含まない緩衝液で平衡化し、続いてＡβ実験を繰り返した。
【００７５】
スペクトルアッセイ。測定を、１ｃｍ透過長石英キュベットを用いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　８４５２Ａ二極管配列分光分析器で行った。濃度に対する吸光度曲線を、２１４ｎｍ、２５４ｎｍ、２８０ｎｍ、および全波長において行った。ペプチドの検出において、２１４ｎｍの読みとり値は２５４ｎｍの読みとり値と比較して５０倍高い感受性であった。その一方、低マイクロモル濃度Ａβ溶液の２８０ｎｍにおける読みとり値は感受性限界よりも低く、これゆえに、これらの研究において使用し得なかった。作成された標準曲線は、０．１ｍｇ／ｍｌより低い濃度では直線であった。さらに、吸光度に対するＣｕ２＋、Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、およびＴＢＳの影響を試験した。０．１ｍｇ／ｍｌより低い濃度において、水中のペプチドのＴＢＳへの調製は１５％の減少をもたらした。　Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、およびＥＤＴＡを含有するＡβ溶液で、２１４ｎｍ吸光曲線の直線範囲にわたる人工的吸光度について研究した。１ｍＭ　ＥＤＴＡは６０％の減少をもたらし、これゆえ、５０μＭ　ＥＤＴＡを用い、Ｃｕ２＋およびＺｎ２＋で観察される減少と同程度の減少の一因である。
【００７６】
Ａβのカオリン（珪酸アルミニウム）への結合。カオリン懸濁液を高速液体クロマトグラフィー水（Ｆｉｓｈｅｒ）中で調製し、５０％（ｖ／ｖ）に規定し、そして調製した。Ａβ（４０μｇ）を、シリコン化反応容器中で、カオリンまたはＣｕ２＋、Ｚｎ２＋、もしくはＥＤＴＡを含むＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０　ＳＦ（１０μｌ×５０％（ｖ／ｖ））のいずれかとインキュベートした（ＴＢＳ中１００μｌ、５分、室温）。次いで、懸濁液をペレット化（１５００×ｇ、３分）し、上清を除去し、そして水で２０倍希釈して紫外線吸光読みとり値を直線範囲内に入れた。サンプルを、カオリンまたはＳｅｐｈａｄｅｘとのインキュベーション前後に、２１４ｎｍでアッセイした。
【００７７】
Ａβのトリプシン消化。Ａβ１−４０（１３．９μｇ）をＺｎ２＋とともにインキュベート（ブロック緩衝液中１２μｌ、１時間、３７℃）し、次いでトリプシン（１２ｎｇ、３時間、３７℃）で消化した。反応を、フェニルメチルスルホニルフルオリド（１ｍＭ）を含有するＳＤＳサンプル緩衝液の添加により停止し、サンプルを煮沸し（５分）、そしてサンプルをＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅゲル電気泳動にかけ、そしてトランスファーした。ブロットをＥＤＴＡで洗浄し、クーマシー染色し、６５Ｚｎ２＋とともにインキュベートし、個々のバンドを切り出し、６５Ｚｎ２＋結合をアッセイし、そしてＮ末端配列決定をして消化産物の同定を確実にした。トリプシン活性に対するＺｎ２＋（ＴＢＳ中で１００μＭまで）自身の影響をＺ−Ａｒｇ−アミド−４−メチルクマリン（ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）蛍光切断産物アッセイによりアッセイし、そして無視できるものとみなされた。しかし、２００μＭ　Ｚｎ２＋がトリプシン活性を１２％阻害することが見出された。
【００７８】
実施例１：６５Ｚｎ２＋のＡβへの結合の分析
Ａβのアリコートを、異なる濃度の非標識Ｚｎ２＋（全体で０．０１〜５０μＭ）の存在下で６５Ｚｎ２＋とともにインキュベート（６０分）した。固定化ペプチド（１．０ｎｍｏｌ）に結合する６５Ｚｎ２＋の割合は、図１ａに示される２つの結合曲線に記載した（スキャッチャードプロット）。示された値は平均±標準偏差、ｎ＞３である。高親和性結合曲線は、低親和性成分を引くことにより補正されており、そして低親和性曲線は高親和性成分を引いている。（図１ｂ）は、種々の金属に対して特異的なＺｎ２＋結合部位を表す。Ａβを、６５Ｚｎ２＋（１５７ｎＭ、１３８，０００ｃｐｍ）および競合非標識金属イオン（全体で５０μＭ）とともにインキュベート（６０分）した。（図１ｃ）は、陰性コントロールタンパク質（アプロチニン、インスリンα鎖、逆ペプチド４０−１）および陽性コントロールタンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、ならびにＡβフラグメント（Ａβ配列内の残基番号により同定される。ｇｌｎ１１は残基１１がグルタミンのＡβ１−２８を言う）に結合する６５Ｚｎ２＋（７４ｎＭ、１０４，０００ｃｐｍ）を表す。添加された６５Ｚｎ２＋／分の全カウントの結合率は、膜に付着するペプチドの量（ナノモルで）によって訂正されている。（図１ｄ）は、図１ａに関して、Ａβ１−４０の代わりにＡβ１−２８ペプチドを用いた場合を表す。１５７ｎＭ　６５Ｚｎ（１３８，０００ｃｐｍ）が本実験で、固定化ペプチド（１．６ｎｍｏｌ）をプローブするために用いられる。（図１ｅ）は、Ａβ１−４０に結合する６５Ｚｎ２＋のｐＨ依存性を表す。
【００７９】
実施例２：Ｇ５０ゲル濾過クロマトグラフィーを使用する、Ａβポリマー化におけ　るＺｎ２＋および他の金属の影響
５５μｇのＡβをカラムに載せ、そして１５ｍｌで溶出し、２５４ｎｍの吸光度をモニターしたｎ＞３の実験の結果が示される。（図２ａ）は、５０μＭ　ＥＤＴＡ、０．４μＭ　Ｚｎ２＋；２５μＭ　Ｚｎ２＋；および２５μＭ　Ｃｕ２＋の存在下でのＡβのクロマトグラムを表す。分子量標準物の溶出点およびＡβピーク溶出物の相対的な割り当てが示される。分子量標準物は、ブルーデキストラン（２×１０６ｋＤａ、Ｖ０はボイド容積）、ＢＳＡ（６６ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）、シトクロムＣ（１２．４ｋＤａ）、およびアプロチニン（６．５ｋＤａ）であった。Ａβの分子量は４．３ｋＤａである。（図２ｂ）は、種々の金属イオン（２５μＭ）、異なる濃度のＺｎ２＋またはＣｕ２＋（Ｔｒｉｓのキレート化の見込みは上限推定値で示される）、およびＥＤＴＡの存在下で、モノマー、ダイマー、またはポリマーとして溶出された可溶性Ａβの比較量（曲線の下の面積より推定した）を表す。銅の存在下で行われた実験のデータは２１４ｎｍの読みとり値より得られ、そして比較のために校正された。図２ｃは、亜鉛（２５μＭ）、銅（２５μＭ）、またはキレート剤の存在下での、ＢＳＡによるクロマトグラフィーカラムのプレブロックのＡβ種の収量に対する影響を表す。
【００８０】
実施例３：カオリン（珪酸アルミニウム）へのＡβ結合：亜鉛（２５μＭ）、銅（　２５μＭ）、およびＥＤＴＡ（５０μＭ）の影響
（図３ａ）は、Ｇ５０　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　１０ｍｇとインキュベートした後の上清中に残留するＡβの濃度（２１４ｎｍの吸光度）を表す。（図３ｂ）は、カオリン１０ｍｇとインキュベートした後の上清中に残留するＡβの、開始吸光度の百分率として表される濃度（２１４ｎｍの吸光度）を表す。
【００８１】
実施例４：トリプシン消化に耐性のＡβに対するＺｎ２＋の影響
（図４ａ）は、亜鉛の濃度を増加して（標識レーン、μＭ）インキュベートした後の、クーマシーブルー染色されたＡβ（１３．９μｇ）のトリプシン消化物のブロットを表す。３．６ｋＤａ（Ａβ６−４０）、および２．１ｋＤａ（Ａβ１７−４０）の消化産物、ならびに非消化Ａβ１−４０（４．３ｋＤａ）を左側に示した。低分子サイズマーカー（ＳＴＤ）の移動度を右側に示す（キロダルトン）。（図４ｂ）は、Ａβのトリプシン消化産物に結合する６５Ｚｎ２＋を表す。図４ａ中のブロットを６５Ｚｎ２＋とインキュベートし、目に見えるバンドを切り出し、そしてそれぞれのバンドの結合カウントを測定した。これらのデータは、ｎ＝３の反復の実験の代表値である。
【００８２】
Ａβが亜鉛と結合するか否かを決定するために、分泌Ａβ１−４０の代わりである合成ペプチドを６５Ｚｎ２＋とともにインキュベートした。１時間で平衡に達した、迅速な結合（１分で６０％　Ｂｍａｘ）が観察された。６５Ｚｎ２＋結合のスキャッチャード分析は、２つの飽和結合曲線（高親和性曲線（Ｋａ＜１０７ｎＭ）、および低親和性曲線（Ｋａ＜５．２μＭ））を表す（図１ａ）。推定親和定数は、Ｔｒｉｓ緩衝液が亜鉛に結合しないという仮定により校正され得る。実際は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは亜鉛および銅と、それぞれ安定定数４．０および２．６で結合する（Ｄａｗｓｏｎら、Ｄａｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８６））。より高濃度のＴｒｉｓ（１５０ｍＭおよび５００ｍＭ）の存在下でのＡβのインキュベートは６５Ｚｎ２＋のＡβへの結合を阻止し（それぞれ約５０％および約９５％）、Ｔｒｉｓ誘発のＺｎ２＋キレート化は無視し得ないことを示す。本発明者が算定した親和定数は、それゆえ、上限推定値である。
【００８３】
６５Ｚｎ２＋結合は非常に特異的であり、試験された非標識金属イオンで唯一Ｚｎ２＋が標識と競合し得る（図１ｂ）。亜鉛結合に関与するＡβの特異的領域を決定するため、およびドットブロット結合系を確証するために、Ａβ１−４０フラグメントの代わりになる種々のペプチドおよびペプチドコントロールの等量を、６５Ｚｎ２＋結合についてこの系でアッセイした（図１ｃおよび図１ｄ）。
【００８４】
逆配列（４０−１）コントロールペプチドのみが、Ａβ１−４０と比較して５０％のＢｍａｘで結合し（図１ｃ）、亜鉛結合が単に好適な残基の存在の結果でないことを示している。Ａβ１−２８は３０％　Ｂｍａｘで結合した。これは、カルボキシル末端が、亜鉛との結合の促進において重要な役割を果たしていることを示している。Ａβ１−２８の１１位のグルタミンのグルタミン酸への置換（ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　１２０：８８５−８９０　（１９８４）により報告されたダウン症候群に関するＡβ配列）は、６５Ｚｎ２＋の結合を妨害しない。Ａβ１−２８に結合する６５Ｚｎ２＋のスキャッチャードプロットは、Ａβ１−４０の場合と同様の低親和性結合状態（Ｋａ＜１５μＭ）および高親和性結合状態（Ｋａ＜３３４ｎＭ）を表すが（図１ｄ）、Ａβ１−２８ペプチド全体がより低めの親和性で亜鉛と結合する。Ａβ１−２８ペプチドは明らかに亜鉛と結合するが、この領域（１〜１７および１２〜２８）に重複するペプチドは亜鉛と個々に結合しない。さらに、カルボキシル末端（２５〜３５）領域をカバーするペプチドはまた、亜鉛と結合し得ない（図１ｃ）。
【００８５】
スキャッチャードプロット（図１ａおよびｄ）上のｘ軸切片より導びかれた高親和性Ｚｎ２＋結合のＡβに対する算定化学量は、０．７：１（Ａβ１−４０）および１：４（Ａβ１−２８）である。低親和性結合の場合、Ｚｎ２＋：Ａβ比は、２．５：１（Ａβ１−４０）および４：１（Ａβ１−２８）である。
【００８６】
６５Ｚｎ２＋の配列決定されたＡβのトリプシン消化産物との結合（図４ｂ）は、６〜４０フラグメントは亜鉛と結合するが、その他の見られる消化１７〜４０フラグメント（図４ｂ）（分泌酵素（Ｅｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：１１２２−１１２４　（１９９０）；Ｓｉｓｏｄｉａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：４９２−４９５　（１９９０））処理後のカルボキシル末端産物を表す）は亜鉛と結合しないことを示す。Ｚｎ２＋結合に対するヒスチジン（残基６、１３、および１４）の寄与が、低ｐＨでの結合の低下により示される（３０％　Ｂｍａｘ、ｐＨ６．０、図１ｅ）。まとめて考慮すると、これらのデータは、亜鉛配位は３つのヒスチジン残基すべてを含む領域であり、残基６〜２８の間の隣接配列を必要とするが、最適な亜鉛結合はまた、カルボキシル末端ドメインの存在を必要とすることを示す。
【００８７】
次に、ゲル濾過クロマトグラフィーでの移動によりアッセイされるように、亜鉛結合がＡβ構造に影響し得るか否かを試験した。モノマー、ダイマー、およびポリマー形態に対応すると考えられる主要なＡβ種が観察された（図２ａ）。０．４μＭと同程度に低い総Ｚｎ２＋濃度は、ＥＤＴＡおよび他の金属の存在下で得られた溶出プロフィールと比較したときに、カラムより溶出する回収可能なＡβを減少させる（図２ａおよび図２ｂ）。全量２５μＭのＺｎ２＋では、２０％より低いＡβが溶出する。この損失は、明らかにゲルに侵入しない高次のポリマーおよびダイマー種に主に影響する。一方で、モノマーＡβの相対的な量が保持される。いくつかの金属の系統的な評価は、クロマトグラフィーにより回収可能なＡβの減少は、Ｚｎ２＋に対して最も感受性であり、遷移金属であるＣｏ２＋、Ｎｉ２＋、およびＦｅ２＋（２５μＭ）に関しては、１０μＭ　Ｚｎ２＋のみで得られた場合と同様のクロマトグラフィーにおける影響を示すことを示唆する（図２ｂ）。他の遷移金属、重金属、およびＡｌ３＋（２５μＭ）は、　Ａβの可溶性に対して、全量３μＭのＺｎ２＋の場合に匹敵する部分的影響を有する。一方、４０％より少ない全ペプチドが溶出すると考えられるが、Ｂａ２＋、Ａｇ２＋、Ｍｇ２＋、およびＣａ２＋（２５μＭ）は、ＥＤＴＡプロフィールと比較してＡβに最少の影響を有している。Ｐｂ２＋（２５μＭ）はモノマーペプチドの溶出を最も強く促進して、高次ポリマーを阻止している：全収量は全量０．４μＭのＺｎ２＋で得られた場合と同様である。これらの金属イオンの影響を比較した場合に、再度重要なことは、先に述べたＴｒｉｓとは異なる金属イオンのキレート化の影響を考慮することである。
【００８８】
Ａβのダイマー化において劇的な増加が、Ｃｕ２＋（全量２５μＭ）で観察される。この金属はまた、２１４ｎｍの吸光度と比較して過大なＡβ吸光度（４倍）を２５４ｎｍで誘導し、そしてモノマー種にネガティブな読みとり値（図２ａ）（２１４ｎｍにおいては比例してポジティブである（図２ｂ））を引き起こす明白な蛍光発光を２５４ｎｍで誘導する。より高濃度のＣｕ２＋（全量８０μＭ）は、Ａβの収量の増加を促進し、これはこの系においてＣｕ２＋の存在が可溶性に好ましいことを示している。
Ａβの可溶性に最も好ましい金属イオン（Ｍｇ２＋、２５μＭおよびＣｕ２＋、全量２５μＭ）を、全量２５μＭのＺｎ２＋の存在下で、可溶形態にあるＡβを安定化するそれらの能力について試験した。これらの組み合わせは、Ｚｎ２＋で誘導されるＡβの収量の損失を奪回する、または悪化することのいずれもしない（図２ｂ）。総体的に、これらのデータはＺｎ２＋結合はＡβの収量を減少するが、その一方キレート剤がこの影響を減少させることを示唆する。
【００８９】
クロマトグラフィーの間に亜鉛で誘導されるＡβの損失が、装置表面へのＡβの沈澱により生じるか否かを決定するために、影響の阻止を試みた。吸着ブロッカーとして３％のＢＳＡで前処理したカラムは、カラムより回収されるＡβの量を著しく増加し、これはペプチドがカラム構成物上に沈澱することを示している（図２ｃ）。カラムをブロックすることにより、Ｚｎ２＋（全量２５μＭ）の存在下ではＡβの回収量が２００％増加し、Ｃｕ２＋（全量２５μＭ）の存在下では７５％増加するが、ＥＤＴＡ（５０μＭ）の存在下では１０％の増加のみである。このことは、カラム上への沈澱が、亜鉛により最も特異的に促進されることを確証する。
【００９０】
Ａβが沈澱していたカラムの部分を決定するために、Ａβ溶液を種々のカラム成分とともにインキュベートし、そして紫外線吸光によりインキュベートの前後のＡβの濃度についてアッセイした。クロマトグラフィー実験条件を模倣し、Ａβ（平衡化緩衝液中に１００μＭ）をプラスチック反応容器中で１時間、Ｓｅｐｈａｄｅｘの存在下または非存在下でインキュベートした。プラスチックによる損失は、観察された沈澱の５％より少ない量であり、シリコン化プラスチックでは１％より少なく、そしてＳｅｐｈａｄｅｘに結合する量は１％よりも少ない。これにより、Ａβの沈澱物は、Ｓｅｐｈａｄｅｘまたはプラスチック支持体には吸着していないと考えられる。しかし、ホウ珪酸ガラス試験管においての同様のインキュベートでは２０％が吸着し、さらに亜鉛（２５μＭ）の存在下で３５％まで増加する。
【００９１】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｅｃｏｎｏ　Ｃｏｌｕｍｎのガラスは、７７４０　Ｐｙｒｅｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，　Ｐａｒｋ　Ｒｉｄｇｅ，　ＩＬ）からなり、そしてＳｉＯ２、８０．６％；Ｂ２Ｏ３、１３．０％；Ｎａ２Ｏ、４．０％；およびＡｌ２Ｏ３、２．３％で構成される。アルミノ珪酸塩がβアミロイド沈澱物と会合するという報告（Ｍａｓｔｅｒｓら、ＥＭＢＯ　Ｊ．　４：２７５７−２７６３　（１９８５ａ）；Ｃａｎｄｙら、Ｌａｎｃｅｔ１：３５４−３５７　（１９８６））により、Ａβが珪酸アルミニウムに結合するか否かを試験する実験を行った。急速かつ大量のＡβのカオリンへの結合、および不溶性珪酸アルミニウム水和物が観察された。さらに、亜鉛、銅、またはＥＤＴＡの存在下でのＡβ（０．４ｍｇ／ｍｌ）のＳｅｐｈａｄｅｘ（５％、ｖ／ｖ）とのインキュベーションは、溶解性にわずかな変化をもたらすのみであり、これは反応容器内のプラスチックへの結合が原因であり得る（図３ａ）。Ａβ（０．４ｍｇ／ｍｌ）のカオリン（５％、ｖ／ｖ、５分、室温）とのインキュベーションは、存在するペプチドの８７％までの沈澱をもたらす。この沈澱は亜鉛（２５μＭ）の存在下で最大であり、亜鉛インキュベーション上清から回収されるＡβの量は、ＥＤＴＡインキュベーション上清から回収される量のほぼ半分である（図３ａ）。カオリンで誘導されるＡβ沈澱への銅（２５μＭ）の影響は、ＥＤＴＡの影響と同様である（図３ａ）。Ａβのカオリンへの結合は、その後の１０ｍＭ　ＥＤＴＡでの処置に対して可逆的でないが、２Ｍ　ＮａＯＨにより溶出され得る。
【００９２】
亜鉛が、カオリンの非存在下で、Ａβの非可逆的な沈澱を誘導するか否かをさらに試験するために、Ｚｎ２＋とともにインキュベートされた（２００μＭ、１〜２４時間、２０℃）Ａβを、ＳＤＳ　Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅゲル電気泳動にかけた。モノマー種は、クーマシー染色ゲル上で検出される主要なバンドであり、そしてインキュベートしていないＡβと同様に移動した。このことは、亜鉛が、共役性またはＳＤＳ耐性のＡβのポリマー形態化をもたらさないことを示している。
【００９３】
ＡβのＡＰＰ分泌酵素部位Ｌｙｓ−１６位（Ｅｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：１１２２−１１２４　（１９９０）；Ｓｉｓｏｄｉａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：４９２−４９５　（１９９０））は必須亜鉛結合領域内にあることから、亜鉛により影響されない活性が見出されたセリンプロテアーゼであるトリプシンによる分泌酵素型切断からＡβを保護するＺｎ２＋の能力を、次に試験した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に続いてポリビニリデンジフルオリド膜に移されたＡβのトリプシン消化産物のアミノ末端配列は、残基６〜４０および１７〜４０に対応する２つの検出可能なフラグメントを示した（図４ａ）。残基２９〜４０を表す予測されたトリプシン消化切断産物はブロット上に出現せず、そして移動および処置の間にポリビニリデンジフルオリド膜により保持され得ない。消化は、増加する濃度のＺｎ２＋の存在により阻害される。２００μＭでは、Ｚｎ２＋はＡβの加水分解の完全な阻害をもたらす；しかし、この亜鉛レベルでは、トリプシン活性もまたわずかに阻害される。６５Ｚｎ２＋でブロットをプローブする工程は、ペプチドフラグメントの亜鉛結合同一性を確実にし、そして亜鉛結合部位の加水分解の定量を容易にした（図４ｂ）。Ａβ１−４０およびＡβ６−４０フラグメントの消化率は、亜鉛の存在により阻害される。しかし、Ａβ１７−４０フラグメントの消化は、増加する亜鉛濃度により阻害されない。これにより、Ａβの完全な亜鉛結合ドメイン（残基６〜２８）を有するペプチドのみ、そしてそれゆえＺｎ２＋に結合し得るペプチド（図４ｂ）のみが、この実験において、亜鉛により阻害される消化率を有する。これらのデータは、Ａβの分泌酵素型切断がＡβ基質に結合するＺｎ２＋により阻害され得ることを示す。
【００９４】
上記のデータは、可溶性Ａβ１−４０が高親和性および低親和性亜鉛結合親和力を有することを示す。Ａβ上の亜鉛結合部位は残基６〜２８にマップされ、おそらく構造的な、およびヒスチジン依存性の特性を有する。亜鉛結合の親和定数は、両方の結合会合が生理学的亜鉛濃度範囲内にあることを示すが、低親和性結合部位の占有が珪酸アルミニウム（カオリン）によるＡβの促進された沈澱に関連し得ることを示す。高親和性部位の占有は、Ａβの沈澱にほとんど影響しないようであり、そして非常に高い特異性である。しかしデータは、Ａβ上の他の部位における代替金属に特異的な結合部位の可能性を排除し得ない。銅のＡβとの強い構造的相互作用（ダイマー化および蛍光発光）は、銅がまた直接ペプチドと相互作用し得、そして珪酸アルミニウム上のＡβの沈澱を防ぐ役割を有し得ることを示す。
【００９５】
細胞外の亜鉛は、ＡＰＰの細胞外マトリクスエレメントへの接着性を改変することにより、ＡＰＰ機能の生理学において役割を果たし得る（Ｂｕｓｈら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６８：１６１０９−１６１１２　（１９９３））。これは、ＡＰＰが、細胞接着（Ｓｈｉｖｅｒｓら、ＥＭＢＯ　Ｊ．　７：１３６５−１３７０　（１９８８））および神経突起伸長（Ｍｉｌｗａｒｄら、Ｎｅｕｒｏｎ９：１２９−１３７　（１９９２））において役割を果たし得ることから重要である。Ａβ−亜鉛相互作用の生理学的機能は不明瞭さが残るが、しかし、亜鉛の存在下で、Ａβのタンパク質分解切断に対して増加した耐性は、ペプチドの生物学的半減期を延長し、そして増加した接着性がまた、細胞外マトリクスエレメントへのその結合を促進し得る。細胞外マトリクスにおいてラミニンおよびフィブロネクチンと複合体化することにより、Ａβが神経突起伸長を促進することが最近報告されている（Ｋｏｏら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：４７４８−４７５２　（１９９３））。これにより、ＡＰＰおよびＡβの両方が、細胞接着を調整するために細胞外マトリクスと相互作用し得る。亜鉛がこの相互作用を調整する局所環境コファクターである可能性をさらに調査する価値がある。
【００９６】
ＡＰＰは血小板および脳において大量に存在し（Ｂｕｓｈら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５：１５９７７−１５９８３　（１９９０））、そこでは亜鉛はまた高度に濃縮されている（Ｂａｋｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　３９：３６０−３６５　（１９７８）；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，　Ｃ．Ｊ．、Ｉｎｔ．　Ｒｅｖ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　３１：１４５−３２８　（１９８９））。ＡＰＰはこれら両方の組織の小胞体中で濃縮されており（Ｂｕｓｈら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６５：１５９７７−１５９８３　（１９９０）；Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　５６３：１８４−１９４　（１９９１））、亜鉛は活発に摂取され（Ｗｏｌｆら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｌｅｔｔ．　５１：２７７−２８０　（１９８４））、そして終脳各所の神経末端のシナプス小胞中に蓄積されている（Ｐｅｒｅｚ−ＣｌａｕｓｅｌｌおよびＤａｎｓｃｈｅｒ、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　３３７１：９１−９８　（１９８５））が、これらの小胞においてＡＰＰと亜鉛との同時局在化はまだ示されていない。小胞の亜鉛蓄積は、不溶性の小胞内沈澱物であるＮＧＦおよびインスリンのような機能性分子を安定化する役割を果たすと考えられる（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．　３５：５７９−５８３　（１９８７））。亜鉛は、同様に、ＡＰＰおよびＡβを安定化する役割を果たし得る。
【００９７】
Ａβと亜鉛との間の相互作用は、亜鉛結合特性がよく特徴付けられているペプチドであるインスリンとの相互作用と比較され得る。Ａβのように、インスリンは、ヒスチジン依存性の高親和性亜鉛結合（Ｋａ＝５μＭ）および低親和性亜鉛結合（Ｋａ＝１４０μＭ）を、それぞれ、化学量論的に１：１（インスリン：亜鉛）および１：２で示す（ＧｏｌｄｍａｎおよびＣａｒｐｅｎｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：４５６６−４５７４　（１９７４））。さらに、金属を含有しないインスリンは、ｐＨ依存性の、モノマー、ダイマー、テトラマー、ヘキサマー、およびより高い凝集状態からなるポリマー化パターンを動力学的平衡において示す。中性ｐＨでは、亜鉛および他の２価金属イオンは、平衡をより高い凝集状態へシフトする。Ｚｎ２＋：インスリンの化学量論的な比が０．３３を超える場合、ペプチドは沈澱し（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｑ，　Ｅ．、Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　６５：２１８−２２８　（１９５６））、連想させる亜鉛のＡβに対する影響が本研究において観察された。
【００９８】
Ａβは、ニューロン培養物における亜鉛の神経毒性作用の報告（Ｙａｎｋｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５０：２７９−２８２　（１９９０）；Ｋｏｈら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　５３３：３１５−３２０　（１９９０））が亜鉛の恒常性の妨害により説明され得たような高親和性で亜鉛とキレート化する。Ａβは一貫して海馬に最も蓄積し、ここでは亜鉛濃度の極端な変動（０．１５〜３００μＭ）（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，　Ｃ．Ｊ．、Ｉｎｔ．　Ｒｅｖ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　３１：１４５−３２８　（１９８９））が、例えば、シナプス伝達の間に生じる（ＡｓｓａｆおよびＣｈｕｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ　３０８：７３４−７３６　（１９８４）；Ｈｏｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ　３０８：７３６−７３８　（１９８４）；ＸｉｅおよびＳｍａｒｔ、Ｎａｔｕｒｅ　３４９：５２１−５２４　（１９９１））。Ｃｈｏｉおよび共同研究者（Ｗｅｉｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３３８：２１２　（１９８９））は、この亜鉛のシナプスを経由する移動は正常なシグナル機能を有し得、そして長期間の相乗作用に関与し得ることを提唱している。海馬は、両方が最高の亜鉛濃度を含む脳の領域であり（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　２７３：３３５−３３９　（１９８３））、そしてアルツハイマー病の病的損傷により最も激しくかつ一貫して影響される（Ｈｙｍａｎら、Ａｎｎ．　Ｎｅｕｒｏｌ．　２０：４７２−４８１　（１９８６））。アルツハイマー病の顕著な神経化学的欠失の１つは、海馬のコリン作用性求心路の遮断である。これにより、この領域の亜鉛濃度を上昇させることが示されている（Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　２９０：４３−５１　（１９８４））。
【００９９】
珪酸アルミニウム（カオリン）による急速な亜鉛促進性のＡβ沈澱は著しく、これはＡＤにおける病因因子としてのアルミニウムの候補資格によるからである（ＰｅｒｌおよびＢｒｏｄｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０８：２９７−２９９　（１９８０））。ＡβのＺｎ２＋ならびにＡｌ３＋誘導沈降（Ｍａｎｔｙｈら、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　６１：１１７１−１１７４　（１９９３））、およびアルミノ珪酸塩によるＡβ沈澱核形成（Ｃａｎｄｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｔｒａｎｓ．　２１：５３Ｓ（要約）（１９９２））の最近の報告はまた、これらの観察を支持する。
【０１００】
ＡＤにおける改変された亜鉛代謝の証拠は以下を包含する；一次的な脳葉の亜鉛レベルの減少（Ｗｅｎｓｔｒｕｐら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．　５３３：１２５−１３１　（１９９０）；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ、Ｅｎｃｅｐｈａｌｅ　１６：２３１−２３９　（１９９０）；Ｃｏｒｒｉｇａｎら、Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ　６：１４９−１５４　（１９９３））、脳脊髄液レベルの上昇（８０％）（Ｈｅｒｓｈｅｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　３３：１３５０−１３５３　（１９８３））、メタロチオネインに結合される亜鉛の減少に付随する肝臓の亜鉛の増加（Ｌｕｉら、Ｊ．　Ａｍ．　Ｇｅｒｉａｔｒ．　Ｓｏｃ．　３８：６３３−６３９　（１９９０））、ＡＤ血漿におけるＺｎ２＋で改変されたＡＰＰ異常（Ｂｕｓｈら、Ａｎｎ．　Ｎｅｕｒｏｌ．　３２：５７−６５　（１９９２））、ＡＤ海馬における細胞外Ｚｎ２＋金属タンパク質分解酵素活性の増加（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍら、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．　５８：９８３−９９２　（１９９２））、および亜鉛をキレート化するメタロチオネイン様タンパク質である、星状細胞増殖阻害因子レベルの減少（Ｕｃｈｉｄａら、Ｎｅｕｒｏｎ７：３３７−３４７　（１９９１））。集約的には、これらの報告は、亜鉛の摂取または分配の異常がＡＤ脳において存在し、脳内で細胞外高濃度および細胞内低濃度を引き起こし得ることを示す。その一方、環境的に誘導される亜鉛（Ｄｕｎｃａｎら、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　１２：１５２３−１５３７　（１９９２））およびアルミニウム（Ｇａｒｒｕｔｏら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８１：１８７５−１８７９　（１９８４）；Ｐｅｒｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１７：１０５３−１０５５　（１９８２））の両方の脳内濃度の上昇は、神経腺維のもつれによりまた特徴付けられる病気であるグアマニアン筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン痴呆症候群の病因と関連している（Ｇｕｉｒｏｙら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８４：２０７３−２０７７　（１９８７））。興味深いことに、免疫学的におよび内分泌機能不全により表される亜鉛代謝の全面的に広がる異常が、初老期のＡβ沈着およびアルツハイマー病の一定の発症により特徴付けられる症状（Ｒｕｍｂｌｅら、Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３２０：１４４６−１４５２　（１９８９））であるダウン症候群（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉら、Ｊ．　Ｍｅｎｔ．　Ｄｅｆｉｃ．　Ｒｅｓ．　３２：１６９−１８１　（１９８８）；Ｂｊｏｒｋｓｔｅｎら、Ａｃｔａ．　Ｐｅｄｉａｔｒ．　Ｓｃａｎｄ．　６９：１８３−１８７　（１９８０））の一般の合併症として記載されている。
【０１０１】
これらの結果は、異常に高い亜鉛濃度が、分泌酵素型切断に対するＡβ耐性を増加し、そしてまたアルミノ珪酸塩上へのＡβ沈澱を促進することを示す。神経網における亜鉛誘導性のＡβの蓄積は、次に、グリア炎症応答、フリーラジカル攻撃、および最終的に「成熟」アミロイドを形成するための酸化的架橋をもたらし得る。集約的には、これらの知見は、アルツハイマー病の治療におけるキレート化アプローチの生化学的合理性を支持する（Ｃｒａｐｐｅｒ　ＭｃＬａｃｈｉａｎら、Ｌａｎｃｅｔ　３３７：１３０４−１３０８　（１９９１））。なぜなら、アルミニウムおよび亜鉛両者の脳内濃度の減少はＡβの沈澱を潜在的に減速し得たからである。
【０１０２】
実施例５：ラットＡβ１−４０への６５Ｚｎの結合のスキャッチャード分析
溶解ペプチド（１．２ｎｍｏｌ）を０．２０μＰＶＤＦ膜（Ｐｉｅｒｃｅ）上にドットブロットし、そして実施例１に記載のような競合分析を行い、ヒトＡβ１−４０に結合する亜鉛のＫＡを測定した（図１）。
本発明において、ラットＡβ１−４０およびヒトＡβ１−４０を固層Ｆｍｏｃ化学により合成した。逆相ＨＰＬＣによる精製およびアミノ酸配列決定により合成を確認した。表にされた結果を図５に示す。回帰線は３．８μＭのＫＡを示す。結合の化学量論は１：１である。スキャッチャード曲線のデータの点はわずかに二相の曲線を示唆するが、二相の反復は会合定数２および９μＭを生じ、これは、生理学的に分離した結合部位の説明を正当化しない。
【０１０３】
実施例６：ヒト、１２５Ｉ−ヒトおよびラットＡβ１−４０の０．２μより大きい粒子への　凝集に対する亜鉛の影響
ヒトおよびラットＡβ１−４０ペプチドストック水溶液（１６μＭ）を予め濾過し（Ｓｐｉｎ−Ｘ、Ｃｏｓｔａｒ、０．２μ酢酸セルロース、７００ｇ）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（緩衝液１）±ＥＤＴＡ（５０μＭ）または塩化金属塩へ移し、インキュベートし（３０分、３７℃）、そして再度濾過した（７００ｇ、４分）。濾液中のＡβ１−４０画分を、濾液ＯＤ２１４の、濾過していないサンプルのＯＤ２１４に対する比率により算出した（ＯＤ２１４の応答を、ヒトおよびラットＡβ１−４０濃度に対して滴定し（本実験で使用した緩衝液中２０μＭまで）直線であることが決定された）。結果を図６で表に示した。すべてのデータは、示さない限り、３連による。（図６ａ）Ａβ１−４０の割合、±Ｚｎ２＋（２５μＭ）またはＥＤＴＡ（５０μＭ）とインキュベートし、次いで０．２μで濾過し、ペプチド濃度に対して滴定した。（図６ｂ）０．２μ濾過し、Ｚｎ２＋濃度に対して滴定したＡβ１−４０（１．６μＭ）の割合。１２５Ｉ−ヒトＡβ１−４０（１２５Ｉ−ヒトＡβ１−４０をＪ．Ｅ．　Ｍａｇｇｉｏ、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８９：５４６２−５４６６　（１９９２）の方法に従って調製した（１５，０００　ＣＰＭ、Ｊｏｈｎ　Ｍａｇｇｉｏ博士、Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌの好意的な提供））を、非標識Ａβ１−４０（１．６μＭ）にトレーサーとして添加し、インキュベートし、そして上記のように濾過した。濾液中および摘出したフィルター上に保持されるＣＰＭをγカウンターにより測定した。（図６ｃ）種々の金属イオン（３μＭ）とともにインキュベートした後に０．２μフィルターで濾過したＡβ１−４０（１．６μＭ）の割合。金属種の原子番号を示す。（図６ｄ）０．２μ濾過により測定されたヒトＡβ１−４０凝集の動力学におけるＺｎ２＋（２５μＭ）またはＥＤＴＡ（５０μＭ）の影響。データの点は２連による。
【０１０４】
実施例７：亜鉛により誘導されるＡβ凝集物のサイズの推定
（図７ａおよび図７ｂ）Ａβ１−４０（緩衝液１（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中に１．６μＭ）の割合は、±Ｚｎ２＋（２５μＭ）またはＥＤＴＡ（５０μＭ）とインキュベートし、次いで、示された孔サイズのフィルターで濾過した。（Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ，　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を本実験で使用した。従って、図２で０．２μ　Ｃｏｓｔａｒフィルターを使用して得られた値と比較して本実験で０．２２μフィルターで得られた値との間にはわずかに不一致が存在する）。（図７ｃ）６５ＺｎＣｌ２（１３０，０００　ＣＰＭ、７４ｎＭ）を、図３Ａで産生された亜鉛誘導性ヒトＡβ１−４０凝集物集合体のトレーサーとして使用した。濾液中のＡβ１−４０および６５Ｚｎの量の測定により、フィルターにより阻止された量を決定し得、そして亜鉛：Ａβ集合体の化学量論的な量を推定した。（図７ｄ）この手順に続き、亜鉛：Ａβ集合体を保持するフィルターを緩衝液１（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）＋ＥＤＴＡ（５０μＭ×３００μｌ、７００ｇ、４分）で洗浄した。濾過画分中の再溶解された亜鉛沈澱Ａβ１−４０の量をＯＤ２１４により測定し、当初各フィルターに保持された量の百分率として示した。濾液中に放出される６５Ｚｎをγカウントにより測定した。
【０１０５】
実施例８：亜鉛により誘導される着色アミロイド形成
（図８ａ）Ｃｏｎｇｏ　Ｒｅｄで染色された亜鉛誘導性ヒトＡβ１−４０沈澱物を示す。粒子の直径は４０μである。　Ａβ１−４０（２００μｌ×２５μＭ、緩衝液１（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中）を、２５μＭ　Ｚｎ２＋の存在下でインキュベートした（３０分、３７℃）。次いで、混合物を遠心分離し（１６，０００ｇ×１５分）、ペレットを緩衝液１（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）＋ＥＤＴＡ（５０μＭ）で洗浄し、再度ペレット化し、そしてコンゴーレッド（５０％エタノール中に１％、５分）中に最懸濁した。非結合色素を除去し、ペレットを緩衝液１（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄し、そして顕微鏡観察用にマウントした。（図８ｂ）同凝集物を、緑色複屈折を示す偏光下で可視化した。この実験はＥＤＴＡ（５０μＭ）をＺｎ２＋に置換して繰り返したが、目に見える物質は生じなかった。
【０１０６】
実施例９：ヒト、１２５Ｉ−ヒトおよびラットＡβ１−４０の０．２μより大きい粒子への　凝集に及ぼす亜鉛および銅の影響
ヒトおよびラットＡβ１−４０ペプチドストック水溶液（１６μＭ）を予め濾過し（Ｓｐｉｎ−Ｘ、Ｃｏｓｔａｒ、０．２μ酢酸セルロース、７００ｇ）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（緩衝液１）±ＥＤＴＡ（５０μＭ）または塩化金属塩へ移し、インキュベートし（３０分、３７℃）、そして再度濾過した（７００ｇ、４分）。濾液中のＡβ１−４０画分を、濾液ＯＤ２１４の、濾過していないサンプルのＯＤ２１４に対する割合により算出した（ＯＤ２１４の応答を、ヒトおよびラットＡβ１−４０濃度に対して滴定し（本実験で使用した緩衝液中２０μＭまで）直線であることが決定された）。すべてのデータ点は、示されていない限り３連による。（図９）Ａβ１−４０の割合を示すグラフ、±Ｚｎ２＋（２５μＭ）、Ｃｕ２＋またはＥＤＴＡ（５０μＭ）でインキュベートし、次いで０．２μフィルターで濾過し、ペプチド濃度に対して滴定した。
【０１０７】
実施例１０：細胞培養で産生されるＡβに対する亜鉛の影響
ヒトＡＰＰを発現する、好ましくは過剰発現する細胞培養、好ましくは哺乳動物細胞培養が、当該分野で周知の方法に従って調製される。例えば、Ｎ．　Ｓｕｚｕｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６４：１３３６−１３４０　（１９９４）；Ｘ−Ｄ　Ｃａｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：５１４−５１６　（１９９３）；Ｆ．Ｓ．　Ｅｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：１１２２−１１２４　（１９９０）。次に、亜鉛を、最終濃度が約２００ｎＭ〜約５μＭになるように培養培地に添加する。次いで、亜鉛を含む細胞培養物を、約１５分からそれらが培養物中で生存し得る限りインキュベートする。好ましくは、細胞を３〜４日間培養する。新鮮な培地を培養物に添加し得るが、アミロイドまたは亜鉛誘導性Ａβ凝集物を含むため消費培地は除去すべきではない。
【０１０８】
使用され得る培地は等張性または生理学的培地であり、生理学的ｐＨ（約７．４）である。好ましくは、タイロード緩衝液をカルシウム、マグネシウム、およびカリウム、ならびにグルコースとともに使用する。いかなる使用培地もシステイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびヒスチジンを欠失しなければならない。なぜなら、これらのアミノ酸は亜鉛とキレート化するからである。基本的には、亜鉛とキレート化する成分を最少にする任意の等張緩衝液または生理学的培地を使用し得る。例えば、クレブス哺乳動物リンゲル溶液（ｉｎ　Ｄａｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３版、Ｄａｗｓｏｎら、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４４６頁、Ｎ．Ｙ．１９８６）および平衡塩溶液（Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（同４４７頁）は、種々の有用な培地を調製する処方を提供する。除去すべき組成物は血清および上述の４つのアミノ酸である。
【０１０９】
細胞培養物は、約３７℃で、大気またはＯ２／ＣＯ２（ＣＯ２の最大濃度は５％）とともにインキュベートされるべきである。
次に、細胞および培地をともに回収する。Ｔｒｉｔｏｎ（濃度約１〜２％　ｖ：ｖ）のような界面活性剤を添加し、そして混合物を約３分から一晩インキュベートする。しかし、好ましくは、約１〜２時間インキュベートする。
【０１１０】
インキュベーション後、細胞の残骸ならびにアミロイドおよび亜鉛誘導性Ａβ凝集物を、遠心分離によりペレット化する。ペレットをペプシン（約２％）または他の任意のペプチダーゼに懸濁し、そして細胞残骸の消化を可能にするために約１時間から一晩インキュベートした。
【０１１１】
再度、ペレット化し、ＰＢＳまたは他の任意の適切な塩溶液で洗浄し、Ｃｏｎｇｏ　Ｒｅｄで染色し、再度洗浄し、非結合Ｃｏｎｇｏ　Ｒｅｄを除去するためにペレット化し、そして水溶液に最懸濁する。この時点で、サンプルは顕微鏡で視覚的に観察され得る。さらに、それはグリッドを使用して計測され得る。
【０１１２】
実施例１１：細胞培養物における候補となる試薬の有効性を予測するためのアッセイ
アッセイは、実施例１０に記載されるように、２連で設定される。しかし、候補となる試薬を２つの細胞培養物の１つに添加し、そしてＥＤＴＡを他の細胞培養物に添加した。実施例１０の最後の工程後、アミロイドおよび亜鉛誘導性Ａβ凝集物の量を顕微鏡下で比較する。候補となる試薬の影響の見込みおよびレベルを、細胞培養物中のアミロイドおよび亜鉛誘導性Ａβ凝集物形成の減少の程度に基づき評価する。
【０１１３】
実施例１２：生物学的液体におけるＡβアミロイドの形成を検出する迅速アッセイ
脳脊髄液（ＣＳＦ）を健康なヒト被験体（コントロール）およびアミロイド症を患うと考えられるヒト患者より得る。両方のＣＳＦサンプルを系列希釈物により滴定する。例えば、原液、１：２、１：４、１：６、．．．；希釈物は、１：１０，０００まで作製され得る。
【０１１４】
それぞれのサンプルに水中の等量のＡβペプチドを最終濃度が約１０μＭを超えるまで添加する。好ましくは、約１０μＭ〜約２５μＭである。
【０１１５】
次に、ペプチド（少なくともＡβのアミノ酸６〜２８を含む）との結合が可能な重金属カチオンを含む溶液、好ましくは、Ｚｎ２＋＋ＮａＣｌおよび緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を、最終（ｆｉｎａｌ）重金属カチオン（例えば、Ｚｎ２＋）に最終濃度が約３００ｎＭを超えるまで添加する。好ましくは、２５μＭである。
【０１１６】
次いで、サンプルを遠心分離しペレットを形成する。ペレットをアミロイド染色色素（例えば、Ｃｏｎｇｏ　Ｒｅｄ）で染色し、そして顕微鏡下で観察する。それにより、コントロールとアミロイド症患者由来のサンプルとのＡβアミロイドレベルを比較する。アミロイドの定量が所望される場合、グリッドを使用し得る。
【０１１７】
実施例１３：３Ｈ−Ａβを使用する生物学的液体中のＡβアミロイド形成を検出する　迅速アッセイ
アッセイを実施例１２で説明されるように設定する。ただし、添加されるＡβペプチドをあらかじめトリチウムにより標識する。さらに、遠心分離後、ペレットをシンチレーションカウンターで計測する。
【０１１８】
しかし、アミロイドの検出に好適な方法は、遠心分離の代わりに上記のような濾過手法を使用することによる。サンプルをフィルターを通して濾過した後、フィルターをシンチレーション液に添加し、そしてカウントを測定する。
コントロールサンプル由来のＣＰＭとアミロイド症と考えられる患者のサンプル由来のＣＰＭとの比較から、患者が実際にアミロイド症を患うか否かを決定し得る。即ち、コントロールサンプルと比較して患者のサンプルの増加したＣＰＭ測定値が、アミロイド症を示す。
【０１１９】
これまで本発明を十分に記載してきたが、本発明または本発明の任意の実施態様の範囲を逸脱することなく、等価の操作様式ならびに他のパラメーターの広汎な範囲内で本発明を実施し得ることが当業者に理解される。
本明細書で引用されるすべての特許および刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、および１ｅ。Ａβに結合する６５Ｚｎ２＋の分析。示した値は平均±標準偏差，ｎ≧３である。（１ａ）スキャッチャードプロット。Ａβのアリコートを種々の濃度の未標識Ｚｎ２＋（全体で０．０１〜５０μＭ）の存在下で　６５Ｚｎ２＋とともにインキュベートした（６０分）。固定化したペプチド（１．０ｎｍｏｌ）に対する６５Ｚｎ２＋の結合率は示したように２つの結合カーブを記した。高親和性結合カーブは低親和性成分を差し引くことにより校正し、低親和性カーブは差し引いた高親和性成分を有した。（１ｂ）金属に対するＺｎ２＋結合部位の特異性を示す棒グラフ．　Ａβを　６５Ｚｎ２＋（１５７ｎＭ，１３８，０００ｃｐｍ）および競合する未標識の金属イオン（全体で５０μＭ）とともにインキュベートした（６０分）。（１ｃ）ネガティブコントロールタンパク質（アプロチニン、インスリンａ鎖、逆ペプチド４０〜１）およびポジティブコントロールタンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））およびＡβフラグメント（Ａβ配列内のそれらの残基数によって同定された（ｇｌｎ１１は、残基１１がグルタミンであるＡβ１−２８をいう））に対する、　６５Ｚｎ２＋（７４ｎＭ，１０４，０００ｃｐｍ）の結合を示す棒グラフ。加えられた６５Ｚｎ２＋／分の全体のカウントの結合パーセントを、膜に接着するペプチドの量（ｎｍｏｌ）に対して校正する。（１ｄ）　（１ａ）についてのような、Ａβ１−２８をＡβ１−４０で置き換えたスキャッチャードプロット。本実験では１５７ｎＭ６５Ｚｎ（１３８，０００ｃｐｍ）を、固定したペプチド（１．６ｎｍｏｌ）をプローブするために用いる。（１ｅ）　６５Ｚｎ２＋のＡβ１−４０への結合のｐＨ依存性を示すグラフ。
【図２】図２ａ、２ｂ、および２ｃ。Ｇ５０ゲル濾過クロマトグラフィーを用いたＡβ重合に対するＺｎ２＋および他の金属の効果。示した結果はｎ≧３の実験を示し、ここでは５５μｇのＡβをカラムにアプライし、そして１５ｍｌずつ溶出して２５４ｎｍの吸光度によりモニターした。（２ａ）５０μＭ　ＥＤＴＡ、０．４μＭ　Ｚｎ２＋；２５μＭ　Ｚｎ２＋；および２５μＭ　Ｃｕ２＋の存在下でのＡβのクロマトグラムを示すグラフ。分子質量スタンダードの溶出点およびＡβピーク溶出の相対的な割当てを示す（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）。質量スタンダードは、ブルーデキストラン（２×１０６ｋＤａ，Ｖ０＝空隙容量）、ＢＳＡ（６６ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）、チトクロームｃ（１２．４ｋＤａ）、およびアプロチニン（６．５ｋＤａ）であった。Ａβの分子量は４．３ｋＤａである。（２ｂ）種々の金属イオン（２５μＭ）、種々の濃度のＺｎ２＋またはＣｕ２＋（Ｔｒｉｓキレート化の見込みは、上限推定値（ｕｐｐｅｒ　ｌｉｍｉｔ　ｅｓｔｉｍａｔｅ）で示される）、およびＥＤＴＡ存在下でのモノマー、ダイマー、またはポリマーとして溶出された可溶性Ａβの相対量（曲線下の面積から推定した）を示す棒グラフ。銅の存在下で実施された実験についてのデータは、２１４ｎｍで読み取り、そして比較のために校正した。（２ｃ）亜鉛（２５μＭ）、銅（２５μＭ）、またはキレート剤の存在下でのＡβ種の回収に対するＢＳＡを用いたクロマトグラフィーカラムのプレブロックの効果を示す棒グラフ。
【図３】図３ａおよび３ｂ。カオリン（アルミニウムケイ酸塩）へのＡβの結合：亜鉛（２５μＭ）、銅（２５μＭ）、およびＥＤＴＡ（５０μＭ）の効果。（３ａ）１０ｍｇのＧ５０セファデックスとのインキュベーション後の上清中に残存するＡβの濃度（２１４ｎｍの吸光度による）を示す棒グラフ。（３ｂ）１０ｍｇのカオリンとのインキュベーション後の上清中に残存するＡβの濃度（２１４ｎｍの吸光度による）を示す棒グラフ（初発の吸光度のパーセントで示す）。
【図４】図４ａおよび４ｂ。トリプシン消化に対するＡβの耐性に対するＺｎ２＋の効果。（４ａ）増加する濃度の亜鉛（レーンラベル、μＭ）とのインキュベーション後のＡβ（１３．９μｇ）のトリプシン消化のブロット（クマシーブルーにより染色した）。３．６ｋＤａ（Ａβ６〜４０）、および２．１ｋＤａ（Ａβ１７〜４０）の消化産物、ならびに未消化のＡβ１−４０（４．３ｋＤａ）を左側に示す。低分子量マーカー（ＳＴＤ）の移動度を右側に示す（キロダルトン）。（４ｂ）Ａβのトリプシン消化産物への６５Ｚｎ２＋の結合を示す棒グラフ。ａにおけるブロットを６５Ｚｎ２＋とともにインキュベートし、目に見えるバンドを切り取り、そして各バンドに対する結合カウントを測定した。これらのデータはｎ＝３の反復実験の代表である。
【図５】図５。ラットＡβ１−４０への６５Ｚｎ結合のスキャッチャード分析。溶解したペプチド（１．２ｎＭｏｌ）を０．２０μＰＶＤＦメンブレン（Ｐｉｅｒｃｅ）上にドットブロットし、そして実施例１（図１）に記載したように競合分析を実施した。ラットＡβ１−４０およびヒトＡβ１−４０、固層Ｆｍｏｃ化学によって合成した。逆相ＨＰＬＣによる精製およびアミノ酸配列決定によって合成を確認した。回帰線は３．８μＭのＫＡを示している。結合の化学量論は１：１である。スキャッチャード曲線のデータポイントは、僅かに２相性曲線を示唆しているが、２相の反復法（ｂｉｐｈａｓｉｃ　ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）は、２および９μＭの会合定数を生じ、これは生理学的に離れた結合部位の説明を正当化しない。
【図６】図６ａ、６ｂ、６ｃ、および６ｄ。ヒトＡβ１−４０、１２５Ｉ−ヒトＡβ１−４０、およびラットＡβ１−４０の＞０．２μ粒子への凝集に対する亜鉛の効果。ヒトおよびラットＡβ１−４０のペプチドストック水溶液（１６μＭ）を、予め濾過し（Ｓｐｉｎ−Ｘ，Ｃｏｓｔａｒ，０．２μセルロースアセテート，７００ｇ）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（緩衝液１）±ＥＤＴＡ（５０μＭ）または塩化金属塩に入れ、インキュベートし（３０分、３７℃）、次いで再度濾過した（７００ｇ、４分）。濾液中のＡβ１−４０の画分を、濾過していないサンプルのＯＤ２１４に対する濾液のＯＤ２１４の比（ヒトおよびラットＡβ１−４０の濃度に対して滴定したＯＤ２１４の応答は、直線性（これらの実験で用いられた緩衝液中では２０μＭまで）であることが決定された）によって算定した。全てのデータのポイントは、示さない限り３連である。（６ａ）±Ｚｎ２＋（２５μＭ）またはＥＤＴＡ（５０μＭ）とともにインキュベートし、次いで０．２μで濾過し、ペプチド濃度に対して滴定したＡβ１−４０の比率を示すグラフ。（６ｂ）０．２μで濾過したＡβ１−４０（１．６μＭ）のＺｎ２＋濃度に対して滴定した比を示すグラフ。１２５ＩヒトＡβ１−４０（１２５ＩヒトＡβ１−４０は、Ｍａｎｔｙｈら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ　６１：１１７１（１９９３）における方法に従って調製された（１５，０００ＣＰＭ，Ｊｏｈｎ　Ｍａｇｇｉｏ博士，Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌから恵与された））を上記のように、トレーサーとして未標識Ａβ１−４０（１．６μＭ）に添加し、インキュベートし、そして濾過した。濾液中のおよび削り取ったフィルター上に保持されたＣＰＭはγカウンターにより測定された。（６ｃ）種々の金属イオン（３μＭ）とのインキュベーション後に、０．２μで濾過したＡβ１−４０（１．６μＭ）の比を示す棒グラフ。金属種の原子番号を示す。（６ｄ）０．２μ濾過によって測定したヒトＡβ１−４０凝集のキネティックスに及ぼすＺｎ２＋（２５μＭ）またはＥＤＴＡ（５０μＭ）の効果を示すグラフ。データポイントは２連である。
【図７】図７ａ、７ｂ、７ｃ、および７ｄ。亜鉛で誘導されるＡβ凝集物のサイズの推定。（７ａおよび７ｂ）Ａβ１−４０の比率を示す棒グラフ（１００ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４（緩衝液１）中の１．６μＭのＡβ１−４０を、±Ｚｎ２＋（２５μＭ）またはＥＤＴＡ（５０μＭ）とインキュベートし、次いで示した孔サイズのフィルターで濾過した（Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ，　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を本研究では用い、それゆえ本研究で０．２２μフィルターを用いて得られた値の間には、０．２μＣｏｓｔｅｒフィルターを用いて図６で得られた値に比べて僅かな矛盾がある））。（７ｃ）図７ａおよび７ｂにおいて生成された亜鉛で誘導されるヒトＡβ１−４０の凝集物の集合のトレーサーとして用いた６５ＺｎＣｌ２（１３０，０００ＣＰＭ，７４ｎＭ）を示す棒グラフ。濾液中のＡβ１−４０および６５Ｚｎの量を決定することによって、フィルターによって阻まれた（ｒｅｔａｒｄｅｄ）量を決定し得、そしてＺｎ：Ａβ集合体の化学量論を見積もる。（７ｄ）棒グラフ。この手順の後、Ｚｎ：Ａβ集合体を保持するフィルターを、緩衝液１（１００ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）＋ＥＤＴＡで洗浄した（５０μＭ×３００μｌ，７００ｇ，４分）。濾液画分中に再可溶化された亜鉛で沈澱したＡβ１−４０の量をＯＤ２１４によって決定し、そして元来各フィルターによって保持された量のパーセントとして表した。濾液中に放出された６５Ｚｎは、γカウントによって測定した。
【図８】図８ａおよび８ｂ。亜鉛で誘導される着色性のアミロイド形成。（８ａ）コンゴーレッドで染色した亜鉛で誘導されるヒトＡβ１−４０沈澱物。粒子の直径は４０μである。Ａβ１−４０（緩衝液１（１００ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）中の２００μｌ×２５μＭ）を、２５μＭＺｎ２＋の存在下でインキュベートした（３０分、３７℃）。次いで、この混合物を遠心分離（１６，０００ｇ×１５分）、このペレットを緩衝液１（１００ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）＋ＥＤＴＡ（５０μＭ）で洗浄し、再度ペレット化し、そしてコンゴーレッド（５０％エタノール中の１％、５分）に再懸濁した。未結合の色素を除去し、このペレットを緩衝液１（１００ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）で洗浄し、そして顕微鏡用にマウントした。（８ｂ）この凝集物を、緑色複屈折を示す偏光下で可視化した。この実験をＺｎ２＋の代わりにＥＤＴＡ（５０μＭ）で繰り返したが、目に見える物質は生じなかった。
【図９】図９。ヒトＡβ１−４０、１２５Ｉ−ヒトＡβ１−４０、およびラットＡβ１−４０の＞０．２μ粒子への凝集に対する亜鉛および銅の効果を示すグラフ。ヒトおよびラットＡβ１−４０のペプチドストック水溶液（１６μＭ）を予め濾過し（Ｓｐｉｎ−Ｘ，Ｃｏｓｔａｒ，０．２μセルロースアセテート，７００ｇ）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４（緩衝液１）±ＥＤＴＡ（５０μＭ）または塩化金属塩に入れ、インキュベートし（３０分、３７℃）、次いで再度濾過した（７００ｇ、４分）。濾液中のＡβ１−４０の画分を、濾過していないサンプルのＯＤ２１４に対する濾液のＯＤ２１４の比（ヒトおよびラットＡβ１−４０の濃度に対して滴定したＯＤ２１４の応答を直線性（これらの実験で用いられた緩衝液中では２０μＭまで）であることが決定された）によって算定した。全てのデータポイントは、示さない限り３連である（図９）。このグラフは、±Ｚｎ２＋（２５μＭ）またはＣｕ２＋またはＥＤＴＡ（５０μＭ）とともにインキュベートし、次いで０．２μで濾過し、ペプチド濃度に対して滴定したＡβ１−４０の比を示す。
【図１０】図１０。ヒトＡβペプチドのアミノ酸配列。ヒトＡβペプチドのアミノ酸配列を示し、そしてアミノ酸の位置に番号を付けた。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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