(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトならびに家畜の感染症の原因菌である無芽胞グラム陰性、偏性嫌気性桿菌フソバクテリウム・ネクロホラムの両亜種を特異的かつ迅速に検出することができることに加え、両亜種をも同時に鑑別することが可能であるような遺伝子診断法を提供すること。【解決手段】フソバクテリウム・ネクロホラムの遺伝子断片の塩基配列を決定し、特異的に目的遺伝子を増幅することのできるＰＣＲ用プライマーであって、特に、特定配列に示した９２２ｂｐ又は別の特定配列に示した２５２ｂｐを増幅産物として得ることができるプライマー。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フソバクテリウム・ネクロホラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）を特異的に検出することの出来るＰＣＲ用プライマー。
【請求項２】
フソバクテリウム・ネクロホラムの２つの亜種（Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ；  Ｆｎｎ、及び、Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｕｎｄｕｌｉｆｏｒｍｅ；  Ｆｎｆ）のいずれも検出することの出来るＰＣＲ用プライマー。
【請求項３】
配列番号１に示された塩基配列又は該塩基配列と実質的に等価な塩基配列の一部を増幅することが出来る、請求項１又は２記載のプライマー。
【請求項４】
塩基配列の一部が配列番号３に示した９２２ｂｐからなることを特徴とする、請求項３記載のプライマー。
【請求項５】
塩基配列として、ｔｃｔａｃｇｔａｔｇｃｃｔｃａｃｇｇａｔ  （ＴＰ１（Ｆ））及びａｇｇａａｔａｔｇａｇｇａｔｇａｇｇａｔ  （ＴＰ２（Ｒ））を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項６】
フソバクテリウム・ネクロホラムの１つの亜種（Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ；  Ｆｎｎ）のみを特異的に検出することの出来るＰＣＲ用プライマー。
【請求項７】
配列番号２に示された塩基配列又は該塩基配列と実質的に等価な塩基配列の一部を増幅することが出来る、請求項６記載のプライマー。
【請求項８】
塩基配列の一部が配列番号４に示した２５２ｂｐからなることを特徴とする、請求項７記載のプライマー。
【請求項９】
塩基配列として、ａｇｇｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃａｃａｇｃ  （ＷＬＦ２（Ｆ））および  ｇｃａｃｃａｔｔｔｔｇａｇｃｇｃｇｔ  （ＷＬＲ１（Ｒ））を有する、請求項６〜８のいずれか一項に記載のプライマー。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のプライマーから選択された１組または２組のプライマーをＰＣＲに用いることを特徴とする、フソバクテリウム・ネクロホラムを検出する方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の１組のプライマー、及び請求項６〜９のいずれか一項に記載の１組のプライマーをＰＣＲに用いることを特徴とする、フソバクテリウム・ネクロホラムの２つの亜種を同時に検出・識別する方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１の記載の検出方法を用いて、動物におけるフソバクテリウム・ネクロホラムによる感染を検出する方法。
【請求項１３】
動物が家畜である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
動物がウシである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１０又は１１の記載の検出方法を用いて、動物に感染したフソバクテリウム・ネクロホラムの遺伝子を診断する方法。
【請求項１６】
動物が家畜である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
動物がウシである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項２〜５のいずれか一項に記載のＰＣＲ用プライマーにより増幅される、配列番号１に示された塩基配列又は該塩基配列と実質的に等価な塩基配列の一部を有するＤＮＡ。
【請求項１９】
配列番号３に示された塩基配列を有する、請求項１８記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のＰＣＲ用プライマーにより増幅される、配列番号２に示された塩基配列又は該塩基配列と実質的に等価な塩基配列の一部を有するＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号４に示された塩基配列を有する、請求項２０記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、家畜ならびにヒトの病気診断と治療対策に使用することができるＰＣＲ用プライマー、ＰＣＲ増幅産物であるＤＮＡ、及び該プライマーを用いる各種の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
無芽胞グラム陰性、偏性嫌気性桿菌であるフソバクテリウム・ネクロホラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）は、人や動物の消化管内に生息し、宿主の免疫力などが低下した際に日和見感染症として化膿性疾患等の病原性を示すことが知られている。本菌はさらに２つの亜種（Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ；  Ｆｎｎ、及び、Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｕｎｄｕｌｉｆｏｒｍｅ；  Ｆｎｆ）に分類され、両亜種とも人と家畜に対して病原性を示す。家畜ではウシでの発生が多いが、生前診断ができないため、本菌の感染で起こる肝膿瘍は食肉処理場で発見されることが多い。そのため肝病変部は廃棄され、経済的損失も大きい。また人では敗血症や化膿性疾患、さらにはルミエール症候群にも関連しているといわれるが、現在簡便な診断法がないことから、その発生状況の詳細は不明である。
【０００３】
本菌は偏性嫌気性菌であり、空気に触れると死んでしまうために、培養して診断するためには特殊な技術や培養装置が必要である。また、培養には長時間を要する。本菌種を同定するための生化学的性状が乏しく、さらに両亜種を鑑別するには、鶏赤血球を用いた凝集反応、牛血液を用いた溶血活性、マウスに対する病原性などを検査しなければならず、これらの手技は煩雑かつコストのかかる検査法であるため汎用性に欠けている。
【０００４】
本発明者らはこれまで、ＰＣＲを用いて本菌を迅速かつ簡便に同定する方法の開発を目指し、Ｒｒａｎｄｏｍｌｙ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ＤＮＡ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＲＡＰＤ−ＰＣＲ）という遺伝子増幅法を用いた研究を行ってきた（非特許文献１）。その結果、用いた１２種類のランダムプライマーのうち２つのプライマーからＦｎｎのみに増幅される約１．２ｋｂと２．４ｋｂの遺伝子断片を検出することができた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらのランダムプライマーは任意の塩基配列からなり、鋳型ＤＮＡと必ずしも完全に相補的にマッチするものではない。そのため、純粋な菌のみを反応させる実験的条件においても複数の遺伝子が増幅されてしまう問題が生じる。従って、臨床的に夾雑物の多い条件で本法を応用し実用化するには更にこれらの遺伝子断片の塩基配列を決定し、特異的に目的遺伝子を増幅することのできるプライマーを作製することが必要であった。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００１−４６０６３
【非特許文献１】
Ｎａｒｏｎｇｗａｎｉｃｈｇａｒｎ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ８２：３８３−３８８  （２００１）
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、新たに、ＲＡＰＤ−ＰＣＲでＦｎｎのみに検出された遺伝子の塩基配列を決定し、これらの遺伝子情報を基に特異的なプライマーを作製して、迅速かつ特異的にＦ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍを検出できるな遺伝子診断法が可能であるかを精査、検証した。
【０００８】
即ち、本発明者は、Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍの２亜種（Ｆｎｎ、Ｆｎｆ）のＤＮＡを用いて増幅された１．２ｋｂならびに２．４ｋｂの遺伝子の塩基配列を決定し、それらの配列情報に基づき、これらの塩基配列の一部（遺伝子断片）を特異的に増幅することが出来るプライマーを作成し、本発明を完成した。更に、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｆｎｎ及びＦｎｆ両亜種を特異的な上記の遺伝子断片を増幅することが出来た。
【０００９】
即ち、本発明は、フソバクテリウム・ネクロホラムを特異的に検出することの出来る、即ち、フソバクテリウム・ネクロホラムの２つの亜種（Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ；  Ｆｎｎ、及び、Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｕｎｄｕｌｉｆｏｒｍｅ；  Ｆｎｆ）のいずれも検出することの出来るＰＣＲ用プライマーに係る。
かかるプライマーの一例としては、配列番号１に示された塩基配列（１，２１５ｂｐ）又は該塩基配列と実質的に等価な塩基配列の一部を増幅することが出来るプライマーがある。この塩基配列の一部としては、例えば、上記塩基配列の内部領域に位置する配列番号３に示した９２２ｂｐを挙げることが出来る。
このようなプライマーの好適な例として、塩基配列として、「ｔｃｔａｃｇｔａｔｇｃｃｔｃａｃｇｇａｔ  （ＴＰ１（Ｆ））」（配列番号５）及び「ａｇｇａａｔａｔｇａｇｇａｔｇａｇｇａｔ  （ＴＰ２（Ｒ））」（配列番号６）を有するプライマーがある。
【００１０】
更に本発明は、フソバクテリウム・ネクロホラムの１つの亜種（Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ；  Ｆｎｎ）のみを特異的に検出することの出来るＰＣＲ用プライマーに係る。
かかるプライマーの一例としては、配列番号２に示された塩基配列（２，４４５ｂｐ）又は該塩基配列と実質的に等価な塩基配列の一部を増幅することが出来るプライマーがある。この塩基配列の一部としては、例えば、上記塩基配列の内部領域に位置する配列番号４に示した２５２ｂｐを挙げることが出来る。
このようなプライマーの好適な例として、塩基配列として、「ａｇｇｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃａｃａｇｃ  （ＷＬＦ２（Ｆ））」  （配列番号７）および  「ｇｃａｃｃａｔｔｔｔｇａｇｃｇｃｇｔ  （ＷＬＲ１（Ｒ））」（配列番号８）を有するプライマーがある。
【００１１】
本明細書の実施例に示されるように、本発明のプライマーを用いることによって、フソバクテリウム・ネクロホラムの２つの亜種（Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ；  Ｆｎｎ、及び、Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｕｎｄｕｌｉｆｏｒｍｅ；  Ｆｎｆ）においてのみ、ＰＣＲにおいて特定の塩基配列を増幅することが出来る。従って、フソバクテリウム属以外の細菌、又は、フソバクテリウム・バリウムのようなフソバクテリウム属のそれ以外の細菌からは、かかる塩基配列を有するＰＣＲ産物は増幅されない。
尚、本明細書において、「実質的に等価な塩基配列」とは、その配列の一部をＰＣＲによって増幅することによって、既に述べたフソバクテリウム・ネクロホラムの２つの亜種を特異的に検出することが出来るような、塩基配列としての特異性を有するものを意味する。
従って、このように上記２つの亜種で特異的に増幅されるＰＣＲ産物、例えば、配列番号１及び配列番号２で示された塩基配列又は該塩基配列と実質的に等価な塩基配列の一部を有するＤＮＡ、特に、配列番号３又は配列番号４に示された塩基配列を有するＤＮＡ自体も本発明の範囲である。
又、ＰＣＲ自体は、当業者には周知の反応であり、当業者であれば、適宜、反応条件を設定し実施することが出来る。このようなＰＣＲの好適条件は、本明細書の実施例に記載されたものである。
【００１２】
本発明は更に、本発明のプライマーから選択された１組または２組のプライマーをＰＣＲに用いることを特徴とする、フソバクテリウム・ネクロホラムを検出する方法に係る。特に、配列番号１に示された塩基配列（１，２１５ｂｐ）又は該塩基配列と実質的に等価な塩基配列の一部を増幅することが出来るプライマーと、配列番号２に示された塩基配列（２，４４５ｂｐ）又は該塩基配列と実質的に等価な塩基配列の一部を増幅することが出来るプライマーを同時にプライマーとして使用することによって、フソバクテリウム・ネクロホラムの２つの亜種（Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ；  Ｆｎｎ、及び、Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｕｎｄｕｌｉｆｏｒｍｅ；  Ｆｎｆ）を同時に検出し、識別することが可能となる。
【００１３】
又、本発明は、上記の検出方法を用いて、動物におけるフソバクテリウム・ネクロホラムの感染を検出する方法にも係る。動物としては、例えばウシのような家畜、及びヒトを挙げることが出来る。
【００１４】
【発明の実施の形態】
より具体的には、本発明者は、ＲＡＰＤ−ＰＣＲ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈｍ  Ｖｏｌ．  １８，  Ｎｏ．２２  ６５３１−６５３５）でＦｎｎのみに検出された遺伝子の塩基配列を決定し、これらの遺伝子情報を基に特異的なプライマーを作製して、迅速かつ特異的にＦ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍを検出できるな遺伝子診断法が可能であるかを精査、検証した。
【００１５】
Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍの２亜種（Ｆｎｎ、Ｆｎｆ）のＤＮＡを用いて増幅された１．２ｋｂ（配列番号１）ならびに２．４ｋｂ（配列番号２）の遺伝子の塩基配列を決定した。さらに両遺伝子断片の塩基配列を基にそれぞれ９２２ｂｐ（配列番号３）ならびに２５２ｂｐ（配列番号４）のＰＣＲ産物を特異的に増幅させるための２組の特異プライマー（ＴＰ１／ＴＰ２およびＷＬＦ２／ＷＬＲ１）を設計した。これらのプライマーを用いてＰＣＲを行ったところ、ＴＰ１／ＴＰ２はＦｎｎ、Ｆｎｆ両亜種において予測された９２２ｂｐの遺伝子が増幅され、ＷＬＦ２／ＷＬＲ１を用いると、Ｆｎｎのみで予測された２５２ｂｐの遺伝子が増幅された。これらの結果はＰＣＲ産物をプローブに用いたドットハイブリダイゼーションでも確認された。
【００１６】
更に、これらの遺伝子は、ＦｎｎとＦｎｆ以外のＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌、類縁菌であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌、非類縁菌である大腸菌などから両検査法では検出されなかった（図１参照）。また、２組のプライマーを混合してＰＣＲを行うと、１回の反応でＦ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍの２亜種を同時に検出、鑑別することができた（図１参照）。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００１８】
【実施例１】
表１に示した１２種類のランダムプライマーを用いたＲＡＰＤ−ＰＣＲによるスクリーニングから、Ｄ１１３４４（Ａｋｏｐｙａｎｚ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，  ５１３７−５１４２  （１９９２））とＷ１Ｌ−２（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｊｏｈｎ  Ｇ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，  ６５３１−６５３５  １９９３）のプライマーによってＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍから特異的に増幅された、１．２ｋｂならびに２．４ｋｂの遺伝子断片が得られることが見い出された。それに従い、Ｆｎｎ  ＡＴＣＣ  ２５２８６株を鋳型として１．２および２．４ｋｂの特異的ＲＡＰＤ−ＰＣＲフラグメントをｐＴ７  Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）にクローニングし、これで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、それぞれ、ｐＴＰ及びｐＷＬを作成した。次に、これらベクターにクローニングされた上記遺伝子断片の塩基配列をＡ３１０シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，  Ｆｏｓｔｅｒ，  ＣＡ）  により決定した。
【００１９】
ランダムプライマーＤ１１３４４で増幅された１．２ｋｂのフラグメントは、アミノ酸配列検索により、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓのｒｐｏＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ５２７６３７）と６３％の相同性を示し、さらにそのＣ末端に対しては８１％の相同性を示した。もう一つのＷ１Ｌ−２によるフラグメントでは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍのｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ５２９８８７）と３６％の相同性を示した。
スクリーニングに用いたＤ１１３４４ならびにＷ１Ｌ−２のプライマーは元来ランダムな増幅を許すものなので、目的以外の遺伝子も増幅される。そのためより特異的に目的遺伝子を増幅できるよう決定された塩基配列に基づいて、新しいプライマー、ＴＰ１（ｒｐｏＢ遺伝子の塩基配列第１７３−１９２番目に相当）及びＴＰ２（ｒｐｏＢ遺伝子の塩基配列第１０７５−１０９４番目に相当）（９２２ｂｐ増幅）、並びにＷＬＦ２（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の塩基配列第９４−１１１番目に相当）及びＷＬＲ１（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の塩基配列第３２３−３４０番目に相当）（２５２ｂｐ増幅）を設計した（表１）。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
【実施例２】
次に、このプライマーの組合せ、ＴＰ１−ＴＰ２ならびにＷＬＦ２−ＷＬＲ１により、Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍが特異的に増幅できることを確認するため、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分を３０サイクル、その後７２℃１０分の伸長反応を行った（Ｎａｒｏｎｇｗａｎｉｃｈｇａｒｎ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  ：Ｖｅｒｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ８２  ３５３  ２００１）。ＰＣＲ増幅産物は、アガロースゲルの電気泳動で解析した。
その結果、ｒｐｏＢ遺伝子に特異的なＴＰ１とＴＰ２のプライマーでは、予測された９２２ｂｐの一本のバンドが供試したＦ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍの両亜種の菌株で増幅されたが、対照のアウトグループ株の菌では増幅されなかった。それに対し、Ｗ１Ｌ−２増幅産物の塩基配列に基づいて設計したＷＬＦ２−ＷＬＲ１を用いると、供試したＦｎｎ株にのみ、予測された２５２ｂｐのバンドが増幅されたが、Ｆｎｆならびにアウトグループ株の菌では増幅されなかった。
【００２２】
【実施例３】
更に、ＰＣＲ検出法の特異性を確認するため、ドットブロットＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを行った。Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ３１株ならびにその他の菌１７株の染色体ＤＮＡ  ５００ｎｇを抽出し、ナイロン膜上にスポットした。ＴＰ１−ＴＰ２ならびにＷＬＦ２−ＷＬＲ１プライマーで増幅したＦｎｎ  ＡＴＣＣ２５２８６株のＰＣＲ産物を蛍光ラベルキットを用いて標識し、プローブとして用いた。ハイブリダイゼーションはＮＥＮ  ライフサイエンス  プロダクト社のプロトコールに従った。
ＴＰ１−ＴＰ２のプライマーによるＰＣＲ産物（９２２ｂｐ）とＷＬＦ２−ＷＬＲ１プライマーによるＰＣＲ産物（２５２ｂｐ）をそれぞれ蛍光でラベルし、本研究で検索した全ての菌株のゲノムＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを試みた。ＴＰ１−ＴＰ２プローブでは、調べたＦ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  全ての株でハイブリダイゼーションシグナルが得られたのに対し、ＷＬＦ２−ＷＬＲ１プローブでは、Ｆｎｎ株とのみ、強いハイブリダイゼーションシグナルが得られた。アウトグループの菌株については、これらの２つのプローブでは調べた株いずれからもハイブリダイゼーションシグナルは得られなかった。これらの結果は、ＰＣＲの結果と一致するものであった。
従って、上記の９２２ｂｐ  及び２５２ｂｐＰＣＲ増幅産物は、Ｆｎｎ及びＦｎｆ両亜種に固有の塩基配列であり、これらの特異的な検出に利用することが出来ることが判明した。
【００２３】
【実施例４】
一回のＰＣＲ反応でＦ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍの２つの亜種の検出と同定を可能にするため、ＴＰ１−ＴＰ２ならびにＷＬＦ２−ＷＬＲ１のプライマーを混合してワンステップ  デュプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  の供試株より抽出した鋳型ＤＮＡ  １μｌ、１０ＸＰＣＲバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）２．５μｌ、１６０ｎＭの各プライマー、０．６２５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、２５０μＭの各デオキシヌクレオチド３リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含んだ２５μｌの反応で行った。ＰＣＲのプログラムは、上述の特異的ＰＣＲ増幅反応と同じ条件で行った。
デュプレックスＰＣＲの結果を図１に示す。２種類の特異的プライマーセットを用いることで、Ｆｎｎ株からは９２２ｂｐと２５２ｂｐの２本のバンドが得られたのに対し、Ｆｎｆ株では９２２ｂｐのバンドのみが観察できた。アウトグループの対照株からは増幅産物は得られなかった。
尚、実施例３及び４で用いた細菌の種類及び取得源を以下の表２及び表３に示す。又、本明細書の各表中の「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」の詳細は以下の引用文献に示した。
【００２４】
【表２】
2004254517.tif 000004
【００２５】
【表３】
2004254517.tif 000005
【００２６】
引用文献
１．  Ａａｌｂａｅｋ，  Ｂ．，  １９７１．  Ｓｐｈａｅｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｓ  ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ２３ｓｔｒａｉｎｓ．  Ａｃｔａ  Ｖｅｔ．  Ｓｃａｎｄ．  １２，  ３４４−３６４．
２．  Ａｋｏｐｙａｎｚ，  Ｎ．，  Ｂｕｋａｎｏｖ，  Ｎ．Ｏ．，  Ｗｅｓｔｂｌｏｍ，  Ｔ．Ｕ．，  Ｋｒｅｓｏｖｉｃｈ，  Ｓ．，  Ｂｅｒｇ，  Ｄ．Ｅ．，  １９９２．  ＤＮＡ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｍｏｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ＲＡＰＤ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０，  ５１３７−５１４２．
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４．  Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，  Ｊ．，  Ｆａｙｏｓ，  Ａ．，  Ｆｅｒｒｕｓ，  Ｍ．Ａ．，  Ｏｗｅｎ，  Ｒ．Ｊ．，  １９９５．  Ｒａｎｄｏｍ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ａｎｄ  Ｃ．  ｃｏｌｉ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｆａｅｃｅｓ，  Ｓｅａｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｐｏｕｌｔｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｒｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １４６，  ６８５−６９６．
５．  Ｍｉｙａｚａｔｏ，  Ｓ．，  Ｓｈｉｎｊｏ，  Ｔ．，  Ｙａｇｏ，  Ｈ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｎ．，  １９７８．  Ｆｉｍｂｒｉａｅ  （ｐｉｌｉ）  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ．  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｓｃｉ．  ４０，  ６１９−６２１．
６．  Ｓｈｉｎｊｏ，  Ｔ．，  Ｍｉｙａｚａｔｏ，  Ｓ．，  １９８１．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  Ａ  ａｎｄ  ｂｉｏｖａｒ  Ｂ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ．  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｓｃｉ．  ４３，  ２３３−２４１．
７．  Ｓｈｉｎｊｏ，  Ｔ．，  Ｈａｚｕ，  Ｈ．，  Ｋｉｙｏｙａｍａ，  Ｈ．，  １９８７．  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｂｉｏｖａｒｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ４８，  ２４３−２４７．
８．  Ｓｈｉｎｊｏ，  Ｔ．，  Ｈｉｒａｉｗａ，  Ｋ．，  Ｍｉｙａｚａｔｏ，  Ｓ．，  １９９０．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｖａｒ  Ｃ  ｏｆ  Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  （Ｆｌｕｇｇｅ）  Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｈｏｌｄｍａｎ  ａｓ  Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｐ．  ｎｏｖ．，  ｎｏｍ．  ｒｅｖ．  （ｅｘ  Ｐｒｅｖｏｔｅ，  １９４０）．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４０，  ７１−７３．
９．  Ｓｈｉｎｊｏ，  Ｔ．，  Ｆｕｊｉｓａｗａ，  Ｔ．，  Ｍｉｔｓｕｏｋａ，  Ｔ．，  １９９１．  Ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  （Ｆｌｕｇｇｅ）  Ｍｏｏｒｅａｎｄ  Ｈｏｌｄｍａｎ：  Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｏｖ．，  ｎｏｍ．  ｒｅｖ．  （ｅｘ  Ｆｌｕｇｇｅ，  １８８６），  ａｎｄ  Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｆｕｎｄｕｌｉｆｏｒｍｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｏｖ．，  ｎｏｍ．  ｒｅｖ．  （ｅｘ  Ｈａｌｌｅ，  １８９８）．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ４１，  ３９５−３９７．
１０．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｊ．Ｇ．Ｋ．，  Ｈａｎａｆｅｙ，  Ｍ．Ｋ．，  Ｒａｆａｌｓｋｉ，  Ｊ．Ａ．，  Ｔｉｎｇｅｙ，  Ｓ．Ｖ．，  １９９３．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒａｎｄｏｍ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ  ｍａｒｋｅｒｓ．  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１８，  ７０４−７４０．
【００２７】
【発明の効果】
本発明の２つの遺伝子の特異プライマーを用いたＰＣＲによる遺伝子診断法は、フソバクテリウム・ネクロホラム（Ｆ．  ｎｅｎｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）の両亜種を検出することができることに加え、両亜種をも同時に鑑別することが可能となった。さらに従来の細菌培養法に比べ診断に要する時間を飛躍的に短縮することができる。よって今回フソバクテリウム・ネクロホラムの２つの亜種から検出された遺伝子の塩基配列は、今後臨床細菌検査分野において培養法に取って代わる新しい診断法に応用されることが期待される。
即ち、ヒトならびに家畜の感染症の原因菌であるフソバクテリウム・ネクロホラムの両亜種を特異的かつ迅速に検出、鑑別するための遺伝子診断法を提供することにより、人では患者に対する早急な治療指針の決定に、家畜では早期診断、治療により疾病による畜産物の損耗防止に大きく貢献する。
【００２８】
【配列表】
2004254517.tif 000006
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2004254517.tif 000008
2004254517.tif 000009
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＰＣＲによるＦ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ２亜種の特異的検出の結果を示す電気泳動の写真である。
レーン１〜１３：Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  Ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ
レーン１４〜３１：Ｆ．  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  Ｆｕｎｄｕｌｉｆｏｒｍｅ
レーン３２〜４３：その他のＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌
レーン４４〜４５：Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌の類縁菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌）
レーン４６〜４８：Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌の非類縁菌
【図１】
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