(57)【要約】      （修正有）【課題】新生血管特異的ペプチドにリン脂質−ＰＥＧを結合した新規の化合物及びそれを含有するリポソームを提供する。【解決手段】一般式（１）Ａ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−Ｂ（１）〔式中、Ａはジアシルホスファチジルエタノールアミン残基を示し、ｎは１０〜２５０の整数を示し、Ｂは特定ののアミノ酸配列を部分配列としてもつＮ末端ペプチド残基を示す。〕で表される化合物およびそれを含有するリポソーム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
Ａ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−Ｂ  （１）
〔式中、Ａはジアシルホスファチジルエタノールアミン残基を示し、ｎは１０〜２５０の整数を示し、Ｂはアミノ酸配列番号１又は２のアミノ酸配列を部分配列としてもつＮ末端ペプチド残基を示す。〕で表される化合物。
【請求項２】
一般式（１）におけるＡがジステアリルホスファチジルエタノールアミン残基である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
一般式（１）におけるＢがアミノ酸配列番号３〜５のいずれかのペプチド残基である請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいづれかに記載の化合物を少なくとも１種以上を含有するリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なＰＥＧ結合ペプチドおよびそれを含有するリポソームに関する。
【０００２】
【従来の技術】癌治療の分野においては、リポソーム内に薬物を封入したドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）製剤が利用されている。リポソームは天然の細胞膜によく似た二重層の脂質分子から構成される小胞であり、その構成膜は生体適合性に優れたものである。脂溶性の薬物は膜の脂質相に、水溶性薬物は膜内の水相に化学結合でなく高濃度に封入することが可能であり、薬物の送達手段として非常に優れた特徴をもっている。小胞はエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれると考えられており、そこで薬物が放出される。しかしながらリポソームといえども非自己粒子であり、目的の患部までに到達せずに肝臓、膵臓などに取り込まれてしまうことも多い。これを防止する目的で小胞をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾することも行われている。また、選択的に薬物を送達するために癌細胞や新生血管などの癌組織に選択的に結合しやすいリガンドをリポソームに修飾することも試みられており、このようなリガンドとしてＷＯ００／２３４７６には新生血管特異的ペプチドが開示されているが、このペプチドにリン脂質−ＰＥＧが結合したものは示されていない。
【０００３】
この出願の発明に関する先行技術文献としては次のものがある。
【特許文献１】ＷＯ００／２３４７６
【特許文献２】特表２００２−５４１０８９
【特許文献３】特表２００２−５１８３１３
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新生血管特異的ペプチドにリン脂質−ＰＥＧを結合した新規の化合物及びそれを含有するリポソームを提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は一般式（１）
Ａ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−Ｂ（１）
〔式中、Ａはジアシルホスファチジルエタノールアミン残基を示し、ｎは１０〜２５０の整数を示し、Ｂはアミノ酸配列番号１又は２のアミノ酸配列を部分配列としてもつＮ末端ペプチド残基を示す。〕で表される化合物およびそれを含有するリポソーム
【発明の実施の形態】
【０００５】
一般式（１）の化合物において、Ａはジアシルホスファチジルエタノールアミン残基である。１位、２位のアシル基はそれぞれ独立してＣ１２−Ｃ２２の炭素数の脂肪酸残基を示し、このようなものとしてラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、オレイル、エライジル、リノレイルなどを例示できる。このうちパルミチル、ステアリル、オレイルが好ましい。最も好ましいのはジステアリル、ジオレイルである。
【０００６】
一般式（１）中、ｎは１０〜２５０の整数である。このうち１０〜１００が好ましく、そしてより好ましくは２０〜５０である。
【０００７】
一般式（１）のＢはアミノ酸配列番号１又は２のアミノ酸配列を部分配列としてもつＮ末端ペプチド残基を示す。ペプチドの鎖長としては３から１０のアミノ酸からなるものが好ましく、五アミノ酸のものが最も好ましい。このようなものとしてはアミノ酸配列番号３〜５のペプチドを例示でき、このうち特に配列番号５のペプチドは好ましい。ペプチドはＮ末端にてコハク酸とアミド結合をしてＰＥＧと連結している。
【０００８】
本発明の化合物は一般的な有機合成の方法により製造することができる。
【０００９】
【化１】
2004331630.tif 000002
【００１０】
例えば、ジアシルホスファチジルエタノールアミン（スキム１の化合物１）にカルボニルジイミダゾール、トリエチルアミンを有機溶媒に懸濁させ、そこへ脱水したＰＥＧ（化合物２）を加えて反応することにより、ジアシルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ結合物（化合物３）が得られる。化合物３はシリカゲルクロマトグラフィーなどにより精製後、無水コハク酸と反応させ、化合物３のハーフエステルを得る（化合物４）。
ここで、原料のジアシルホスファチジルエタノールアミンは大豆レシチン、水添大豆レシチンから抽出して得ることもできるし、ジアシルホスファチジルコリンとエタノールアミンの塩基交換反応などの有機合成反応により得ることもでき、市販のものを使用してもよい。ＰＥＧも市販品を用いることができる。
本発明の原料ペプチドはＤＣＣ法などにより逐次アミノ酸を連結することにより得ることができる。ペプチドのＮ末端アミノ基以外の官能基をＢｏｃ、ベンジル基、ＮＯ２などで保護したものと化合物４とでアミド化を行いＰＥＧとペプチドを連結させる。ついで保護基を接触還元法などにより脱離させて本発明の化合物５を得る。本化合物はイオン交換樹脂、クロマトグラフィーなどにより精製することができる。
【００１１】
本発明のリポソームは本発明の化合物を固形分中に１〜９０重量％含有させることが好ましく、より好ましくは５〜３０重量％である。
【００１２】
本発明のリポソームにはステロール類、例えばコレステロール、シトステロールなど、リン脂質類、例えばジパルミチルホスファチジルコリン、ジステアリルホスファチジルコリン、卵黄レシチン、水素添加大豆レシチン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルセリンなど、糖類、例えばトレハロース、グリセリン、マルトースなどを含有させることができる。
【００１３】
本発明のリポソームには薬剤として例えばアドリアマイシン、シスプラチン、ダウノマイシンなどの制ガン剤を含有させ、ガン治療の用途に利用できる。
【００１４】
本発明のリポソームは公知の方法によって製造できる。以下にその一例を挙げる。
【００１５】
まず本発明の化合物、必要に応じてリン脂質類、ステロール類などを適当な溶剤に溶解する。次いで得られた溶液を、例えばロータリーエバポレーターに入れて溶媒を留去し、エバポレータの内壁面に脂質のフィルムを形成する。この中に薬物水溶液や緩衝液などの水溶液を加え、激しく振とうすることにより、本発明のリポソームを得ることができる。振とう後に必要に応じて凍結融解、超音波処理を行ってもよい。また、エクストルーダーなどを用いてリポソーム粒径のサイシングを行ってもよい。
【００１６】
溶媒としては使用する脂質を溶解するものが何れも使用でき、例えば、クロロホルム、メチルクロロホルム、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類、ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジシソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類等を挙げることができる。溶媒を留去し脂質のフィルムを形成させる際の温度条件は特に制限されず、０〜１００℃程度の広い範囲から適宜選択できるが、脂質の酸化を防ぐことを考慮すると２５〜６５℃程度が好ましい。またリポソーム調製時のＰＨ、塩濃度は、脂質、リポソームの変性が起こらない範囲であれば特に制限されないが、通常ＰＨ７程度、オスモラリティ０．３程度とすればよい。
【００１７】
得られたリポソーム分散液を、ゲル濾過、遠心分離等の公知の方法に準じて精製することにより、リポソームとリポソームに内封されなかった薬剤等を分離することができる。
【００１８】
本発明のリポソームの粒径は特に制限されないが、通常０．０３〜０．８ｎｍ程度、好ましくは０．０５〜０．５ｎｍ程度、より好ましくは０．１〜０．３ｎｍ程度とするのがよい。
【００１９】
本発明の制ガン剤を内封させたリポソームは注射により生体に投与する。投与法としては、腫瘍の存在部位により静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射などをいずれも用いることができるが、好ましくは静脈内注射がよい。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって何ら制限されるものではない。
【００２１】
実施例１：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＰＲＰＧの合成
（１）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）の合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）１５．０ｇ（２０ｍｍｏｌ）、カルボニルジイミダゾール３．９１ｇ（２４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン２．０３ｇ（２０ｍｍｏｌ）をトルエン６９ｍｌに懸濁させた液を３０分還流反応させた後、トルエンにより共沸脱水したポリエチレングリコール（ＰＥＧ；平均分子量２０００）をトルエン３５ｍｌに溶解した溶液を滴下した。１２時間後ロータリーエバポレーターにて溶媒を留去し、アセトン５０６ｍｌに対する不溶物をメンブランフィルターによりろ別した。溶媒留去後、蒸留水４００ｍｌに溶解し、燐酸二水素ナトリウム２．６７ｇとＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−２  ３０．０ｇを加え、室温で２時間撹拌し、ナトリウム塩化した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅをろ過後、トルエン２４９３ｇとイソプロパノール１１５０ｇで共沸脱水し、乾燥後、ジエチルエーテル３００ｍｌで洗浄した。乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、単一のＴＬＣスポットを示し（クロロホルム／メタノール＝４／１）、１ＨＮＭＲにより  ｛δ１．２５（ｓ，７０Ｈ，アシルＨ）、２．３５（ｍ，５Ｈ，グリセロールＨ）、３．６４（ｂｒｓ，２８０Ｈ，ＰＥＧ  Ｈ）｝同定された。
【００２２】
（２）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール−コハク酸（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＳＡ）の合成
無水状態のＤＳＰＥ−ＰＥＧ  １１．０ｇ（４．０ｍｍｏｌ）をトルエン５５ｍｌに溶解後、無水コハク酸１．９８ｇ（２０ｍｍｏｌ）とピリジン１．６ｍｌを加え、内温７０〜８０℃で３時間反応した。冷却後、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去しクロロホルム１２０ｍｌに溶解後、１％食塩水で有機層を２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去した。ジエチルエーテル１００ｍｌで粉末化した後、メンブランフィルターによりろ過して粉末を得た。デシケーターで乾燥し得られた生成物は単一のＴＬＣスポットを示し（クロロホルム／メタノール＝４／１）、９０ＭＨｚ  １Ｈ  ＮＭＲにより｛δ１．２６（ｓ，７０Ｈ，アシルＨ）、２．３２（ｓ，５Ｈ，グリセロールＨ）、２．６４（ｓ，４Ｈ，コハク酸−ＣＨ２ＣＨ２−）３．６４（ｂｒｓ，２８０Ｈ，ＰＥＧＨ）｝同定された。
【００２３】
（３）Ｈ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚ・ＨＣｌ（Ｈ−ＡＰＲ（ＮＯ２）ＰＧ−ＯＢｚ）の合成
Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨとＰｒｏ−ＯＣＨ３・ＨＣｌをジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）によりジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で縮合した後、水酸化ナトリウムでエステルを加水分解してＢｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨとした。また、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−ＯＨとＰｒｏ−ＯＣＨ３・ＨＣｌをＤＣＣ、ＨＯＢｔによりＤＭＦ中、縮合した後、水酸化ナトリウムでエステルを加水分解してＢｏｃ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＯＨとした。さらに、得られたＢｏｃ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＯＨとＧｌｙ−ＯＢｚ・ＨＣｌをＤＣＣ、ＨＯＢｔによりＤＭＦ中で縮合した後、ＨＣｌ／ジオキサンによりＢｏｃ保護の脱保護を行い、Ｈ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚ・ＨＣｌとした。
次に、Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨとＨ−  Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚ・ＨＣｌをＤＣＣ、ＨＯＢｔによりＤＭＦ中で縮合した後、ＨＣｌ／ジオキサンによりＢｏｃ保護の脱保護を行い、Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚとした。さらに得られた生成物をＨＣｌ／ジオキサンでＢｏｃ保護の脱保護を行い、Ｈ−ＡＰＲ（ＮＯ２）ＰＧ−ＯＢｚとし、ＦＡＢ−ＭＳｍ／ｚ：  ６３２［Ｍ＋Ｈ］＋の生成物を得た。
【００２４】
（４）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール−コハク酸−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＰＲＰＧ）の合成
上記液相法で合成したＨ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＢｚ・ＨＣｌ  １．８０ｇ（２．７ｍｍｏｌ）、クロロホルム１３０ｍｌ、トリエチルアミン０．４５ｇ（４．５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．３７ｇ（２．７ｍｍｏｌ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＳＡ  ７．０ｇ（２．５ｍｍｏｌ）の混合液を４℃に冷却し、ジシクロヘキシルカルボジイミド０．５９ｇ（２．７ｍｍｏｌ）をクロロホルム１０ｍｌに溶解した溶液を滴下し、４℃以下１時間反応した。１時間後に室温まで戻し、トリエチルアミン１．０４ｇを追加後、室温で７．５時間反応した。不溶物を加圧ろ過後、５％硫酸水素ナトリウム水溶液で洗浄を行った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、ロータリーエバポレーターにより溶媒を留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分取後、酸性イオン交換樹脂により高極性物質を除いた。精製された生成物はヨウ素発色法、リンモリブデン酸発色法で単一のＴＬＣスポットを示し（クロロホルム／メタノール＝４／１）、ニンヒドリン試薬、坂口試薬に対しては陰性であったが、ＵＶ発色法には陽性であった。
上記で得られた生成物４．９ｇをメタノール１００ｍｌに溶解し１０％  パラジウム−炭素０．４９ｇを加え常圧水添反応を行った。５．５時間後触媒をろ過し、溶媒を留去した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製し得られた生成物はヨウ素発色法、リンモリブデン酸発色法で単一のＴＬＣスポットを示し（クロロホルム／メタノール／水＝６０／３０／５）、ニンヒドリン試薬、ＵＶ発色法に対しては陰性であったが、坂口試薬には陽性であったことからグリシンのＣ末端のベンジル保護基、アルギニンのＮＯ２保護基が脱保護されたと同定した。
【００２５】
実施例２    アドリアマイシン（ＡＤＲ）封入リポソームの調製
ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン：日本精化株式会社製）、コレステロール（シグマ社製）および実施例１のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＰＲＰＧを、モル比が１０：５：１となる割合で含むクロロホルム溶液を調製した。即ち、９０μｌの１００ｍＭ  ＤＳＰＣ、４５μｌの１００ｍＭコレステロールおよび４５μｌの２０ｍＭ本発明ペプチドを加えて、モル比が１０：５：１となる割合で含むクロロホルム溶液を調製した。次いで前記調製液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターで減圧条件下にクロロホルムを除去して脂質薄膜を調製した。さらに減圧下にクロロホルムを完全に除去して乾燥させた。６０分間真空乾燥した後、１．５ｍｌの０．３Ｍクエン酸溶液（ｐＨ４．０）で水和した（ＤＳＰＣ濃度；６ｍＭ）。
上記調製液について、凍結と６０℃加温による融解を３回繰り返した後、調製液を温浴型の超音波処理装置（商品名：ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＫ２５０：ラボスコ株式会社製）にて１０分間超音波処理して攪拌を行った。次いでエクストルーダー（ライペックス社製）にて、１００ｎｍの孔径を持つポリカーボネート膜（ヌクレオポアポリカーボネート：コースター社製）を３回通過させ、リポソーム分散液を得た。
【００２６】
このリポソーム分散液に０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液を加え、リポソーム外水相のｐＨを７．５に調整した。次いで２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈し、全量３．０ｍｌとした。さらに、１．５ｍｇ／ｍｌアドリアマイシン（シグマ社製）溶液を０．７５ｍｌ加え、６０℃で３０分間インキュベーションし、リポソーム内水層にアドリアマイシンを封入した。
上記調製液を１５分間遠心（日立工機社製、ＣＳ１２０ＥＸ；１００，０００ｇ）してリポソームを沈殿させ、封入されなかったアドリアマイシンを含む上清を除去した。沈殿を１．５ｍｌの０．３Ｍグルコース溶液で再分散し、以下に記述した定量法によりアドリアマイシン内封量を算出した。次いで、アドリアマイシンが０．５ｍｇ／ｍｌ（５ｍｇ／ｋｇ）となるように希釈し、アドリアマイシンを封入した本発明のリポソーム分散液を得た。かくして、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび本発明ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＰＲＰＧを１．５ｍｌ中に６μＭ、３μＭおよび０．６μＭとなるようにそれぞれ有するリポソーム（分散液）を得た（ＤＳＰＣ濃度；６ｍＭ）。
【００２７】
比較例１：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＰＲＰＧを用いない以外は実施例２と同様にしてアドリアマイシン封入リポソームを得た。
【００２８】
比較例２：実施例２のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＰＲＰＧに代えて実施例１の（１）で得られた中間原料ＤＳＰＥ−ＰＥＧを用いた以外は実施例２と同様にしてアドリアマイシン封入リポソームを得た。
【００２９】
評価方法
（１）リポソーム内水層のアドリアマイシンの定量
１０μｌのリポソーム分散液、１００μｌの１０％還元トライトンＸ−１００および８９０μｌの０．３Ｍグルコース溶液を混合後、６０℃にて加温し、４８４ｎｍにおける吸光度を測定した。
かくして求めた測定値および検量線よりアドリアマイシンのリポソーム内水層への封入率を算出したところ、９０％以上の内封率であった。
（２）  腫瘍効果の測定
Ｃｏｌｏｎ２６  ＮＬ１７細胞（１×１０６細胞／マウス）を５週齢雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールスリバー社製）の左腹側部に皮下投与して固形癌担癌マウスを作成した。移植した日をＤａｙ０とし、１０、１３および１６日目に各群に対してアドリアマイシンが５ｍｇ／Ｋｇ（マウス）になるように下記のものを尾静脈に投与した。
（ａ）群  ０．３Ｍグルコース溶液
（ｂ）群  アドリアマイシン  ＋０．３Ｍグルコース溶液
（ｃ）群  比較例１のアドリアマイシン封入リポソーム
（ｄ）群  比較例２のアドリアマイシン封入リポソーム
（ｅ）群  実施例２のアドリアマイシン封入リポソーム
試験に供した担癌マウスは各群６匹とした。投与した各薬物の抗腫瘍効果は、腫瘍移植９日後から腫瘍増殖、副作用の一指標として体重変化を調べると共に、腫瘍の短径および長径を測定し、以下に示す式に従って腫瘍体積を算出した。該計算式により算出される腫瘍容積は、腫瘍を摘出して量った腫瘍重量ときわめて高い相関性を示す（ｒ２＝０．９８０）。
腫瘍体積＝０．４×ａ×ｂ２（ａ：長径  ｂ：短径）
【００３０】
その結果を表１、２に示す。
表中、表１の縦軸は腫瘍体積（ｃｃ）を、横軸は腫瘍移植後の日数を示す。
表２の縦軸は体重変化（ｇ）を、横軸は腫瘍移植後の日数を示す
【００３１】
【表１】
2004331630.tif 000003
【００３２】
【表２】
2004331630.tif 000004
【００３３】
表１、表２から分かるように、ＰＥＧで修飾されたリポソームを投与した（ｄ）群は通常のリポソーム（ｃ）群より効果がすぐれているが、本発明の（ｅ）群はそれらよりさらにガン抑制の効果が優れていることがわかる。（表中、＊は（ｅ）が（ｂ）（ｃ）（ｄ）それぞれに対して有意（ｐ＜０．０５）、＊＊は（ｅ）が（ａ）に対して有意（ｐ＜０．００１）であることを示す）
この結果より、本発明の新生血管特異的ペプチドを有効成分として含むＰＥＧ−ＰＲＰ修飾リポソームに抗癌剤を封入したリポソーム製剤では、封入された抗癌剤の副作用が軽減され且つ腫瘍増殖抑制効果が著しく増強されることが確認された。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の新生血管特異的ペプチドにリン脂質−ＰＥＧを結合した新規の化合物はリポソーム剤として利用することができる。そしてこのリポソームは血中滞留性を向上させ、また、癌組織の新生血管内皮細胞のリガンドとしての分子医薬として、標的組織に選択的に薬物送達を可能とするＤＤＳ製剤への応用が可能となる。
【００３５】
【配列表】
2004331630.tif 000005
2004331630.tif 000006
2004331630.tif 000007