(57)【要約】【課題】タンパク質、ワクチン、核酸、多糖類などの分離に広く用いられているイオン交換クロマトグラフィー及び、リン酸エステルに特異的な吸着を利用するアフィニティークロマトグラフィーの担体及びその製造方法の提供。【解決手段】イオン交換容量として０．３ｍｅｑ／ｍＬ以上の交換容量をもち、膨潤度として８ｍＬ以下である、多孔質リン酸エステル化多糖粒子による。該多孔質リン酸エステル化多糖粒子は有機溶剤中で適量の水と五酸化リンを用いる反応により製造できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン交換容量が水膨潤体積当たり０．３ｍｅｑ／ｍＬ以上で、且つ、膨潤度が８ｍＬ／ｇ以下の多孔質リン酸エステル化多糖粒子。
【請求項２】
形状が球状又は粒状あるいはそれらの混合物である請求項１に記載の多孔質リン酸エステル化多糖粒子。
【請求項３】
ポリエチレングリコール換算排除限界分子量が２０，０００〜４０，００００である請求項１に記載の多孔質リン酸エステル化多糖粒子。
【請求項４】
五酸化リン１モルに対して０．２６〜２．９０モルの水を含有する有機溶媒に五酸化リンを溶解したのち多孔質多糖粒子を投入し、反応させる多孔質リン酸エステル化多糖粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主にクロマトグラフィー用カラム充填剤として有用な多孔質リン酸多糖粒子（以下本発明の多糖粒子と略称する）及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多糖のリン酸化の研究は、古くからセルロースについて多くの研究がなされてきた。リン酸エステルを含有するセルロース繊維は、イオン交換やアフィニティークロマトグラフィーのクロマト剤として広く知られており、容易に入手することが可能である。例えば繊維状のリン酸セルロースとしてＷｈａｔｍａｎ  Ｐａｐｅｒ  Ｌｔｄ製のＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｐ１１，Ｐ１が挙げられる。これらの繊維状リン酸セルロースは、繊維であるために、カラム充填効率が悪く、カラムの流速性能も悪いことが知られている。
【０００３】
一方、球状のものとしては  ＩＯＮＴＯＳＯＲＢ社（チェコ）の  ＩＯＮＴＯＳＯＲＢ−Ｐ（商品名）が知られている。このものは、非特許文献１によれば、イオン交換容量が  ０．２ｍｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙ−ｍａｔｔｅｒであり、水含有量が７２％から８３％であり、１ｇの乾燥物は３．５７ｇから５．８８ｇの含水物になる。通常、含水のセルロースゲル１ｇは１ｍＬ以上の体積となるため、水膨潤単位体積当たりのイオン交換容量を推定すると０．０３ｍｅｑ／ｍＬ〜０．０６ｍｅｑ／ｍＬとなるため、吸着容量が著しく小さい。
【０００４】
また、リン酸化された糖類、多糖類はクロマトグラフィーの用途以外にも、紙、パルプに難燃性を付与するためや、結石の治療（非特許文献２及び３参照）においてカルシウム吸着材として使用されている。また歯石の制御のためにもリン酸化多糖の使用が研究されてきた（特許文献１参照）。
【０００５】
これらのリン酸エステル含有セルロースは、リン酸エステル導入反応を行うに際して、尿素−リン酸−水の混合液中にセルロースを加えて高温（１３０〜２５０℃）で攪拌するものや（例えば非特許文献４及び５参照）、ポリリン酸ナトリウムとデキストランを水中で１０５℃で５時間反応させる（特許文献１参照）ような過酷な反応であった。従って、リン酸エステルを高密度に導入するため、温度を上げたり、反応時間を延長することにより、セルロース鎖が分解を受けることが知られている。
【０００６】
また、この反応で得られるリン酸エステル含有セルロースは褐色に着色することが多い。実際に、市販のリン酸セルロースは、黄色に着色しているものが多く、初めての使用に際しては洗浄が必要である。また、繊維の壊れた微細な粒子が混入しておりデカンテーションによりこれを除去しないと、カラムの流速が著しく遅くなることが知られている。これらの、セルロース鎖の分解や着色を避けるために、反応温度の低減や時間の短縮を行えば、目的とするリン酸エステル導入量を達成できない可能性がある。
【０００７】
クロマトグラフィー用の担体として用いる際に、担体の強度は流速性能の影響を及ぼす重要な要因であるが、上記のような高温中、リン酸が共存する反応ではセルロースの分解反応が進行するため、その機械的強度が低下する。そのため、カラムに充填した場合に、圧密化がおこり流量が大にならない問題がある。
一方、吸着による目的物質の分離を行う吸着クロマトグラフィー用の担体においては、吸着に関与する官能基の密度が、その性能に影響及ぼす。セルロース鎖の分解を避けるために、より温和な条件（例えば反応温度の低減やリン酸濃度の低下）を採用した場合では、担体のリン酸エステル密度が十分でない可能性がある。
【０００８】
温和な反応方法としては、特許文献２に記載されている。これは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に五酸化リンを溶解した後に、フリー水酸基をもつセルロース誘導体と４５℃から７０℃で一時間反応させて、リン酸化する方法であり、従来のリン酸／尿素／水系やポリリン酸／水系に比較して格段に温和な条件である。
【０００９】
【非特許文献１】
ＩＯＮＴＯＳＯＲＢ社の技術資料（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｏｎｔｏｓｏｒｂ．ｃｚ／）
【非特許文献２】
Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ２０００  Ｍａｒ；  １（３）  ：４３５−４１          ”Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ    ｆｏ  ｒｅｎａｌ  ｃａｌｃｕｌｉ．”  Ｂｌａｉｒ  Ｂ，Ｆａｂｒｉｚｉｏ  Ｍ．
【非特許文献３】
Ｍｉｎｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｅｔａｂ  １９９４；２０（６）：３２８−３９          ”Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｃａｌｃｉｕｒｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｋｉｔｈｉａｓｉｓ”            Ｂｒｅｓｌａｕ  ＮＡ．
【非特許文献４】
Ｊ．  Ｄ．  Ｇｕｔｈｒｉｅ，  Ｉｎｄ．  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ．４４，  ２１８７  （１９５２），
【非特許文献５】
日本化学会誌，  １９７５，  （１１），  Ｐ２０４０−２０４２「オルトリン酸、尿素、ジシアンジアミドによるセルロースの難燃化」
【特許文献１】
ＵＳＰ  ５，２０２，１１１    Ｓｐａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．
【特許文献２】
ＵＳＰ  ３，５６５，８８６  Ｌｏｕｉｓｅ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記特許文献２の方法を本発明者等が追試したところでは、ＤＭＦに五酸化リンを溶解させることが困難であった（参考例参照）。これでは有効なイオン交換基を効率的に導入できない。本発明者等は、上述した従来技術の欠点であるセルロース鎖の分解による担体の機械強度低下や、吸着に関与する官能基密度の低減がなく、且つ、カラムに充填した場合に高流速で送液が可能な多孔質球形であるクロマトグラフィー用担体の提供を目的としたのである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記特許文献２の方法では、前述したようにＤＭＦに五酸化リンを溶解させることができない。そこで、本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、有機溶媒に五酸化リンを溶解させるためには、適量の水が必要であることと、五酸化リンをそのような水含有有機溶媒に溶解した後、球状多孔質セルロースと反応させることに本発明の目的を達成することが可能であることを見出し本発明に到達した。
【００１２】
本発明は下記の構成からなる。
（１）  陽イオン交換容量が水膨潤体積当たり０．３ｍｅｑ／ｍＬ以上で、且つ、膨潤度が８ｍＬ／ｇ以下の多孔質リン酸エステル化多糖粒子。
（２）  形状が球状又は粒状あるいはそれらの混合物である（１）項に記載の多孔質リン酸エステル化多糖粒子。
（３）  ポリエチレングリコール換算排除限界分子量が２０，０００〜４０，００００である（１）項に記載の多孔質リン酸エステル化多糖粒子。
（４）  五酸化リン１モルに対して０．２６〜２．９モルの水を含有する有機溶媒に五酸化リンを溶解したのち多孔質多糖粒子を投入し、反応させる多孔質リン酸エステル化多糖粒子の製造方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の多孔質リン酸エステル化多糖粒子は陽イオン交換容量は０．３ｍｅｑ／ｍｌ以上であり、好ましくは、０．３〜１．５ｍｅｑ／ｍｌである。また、膨潤度は８ｍＬ／ｇ以下であり、好ましくは  １〜８ｍＬ／ｇである。球状セルロースであって、リン酸エステル含有のセルロースとしては、前記  ＩＯＮＴＯＳＯＲＢ社（チェコ）の  ＩＯＮＴＯＳＯＲＢ−Ｐ（商品名）が知られているが、このものはイオン交換容量として乾燥重量当たり０．２ｍｅｑ／ｇであり、通常体積は重量１ｇ当たり１ｍｌ以上になるので、イオン交換容量は０．２ｍｅｑ／ｍｌ以下になることは明らかであり、本発明のイオン交換容量よりも小さい値のイオン交換容量しか示していない。
【００１４】
本発明で使用される多糖粒子は、分子中にリン酸エステル形成が可能な水酸基をもつ糖類である、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトース、アルロース、フルクトース、ソルボース、タガロースあるいはこれらのウロン酸誘導体、アミノ糖誘導体、デオキシ糖誘導体等を構成要素として１種類以上含有する以下に示す多糖粒子である。
【００１５】
本発明で使用される多糖粒子は、デンプン、グリコーゲン、プルラン、デキストラン、ニゲラン、セルロース、ラミナラン、カードラン、ジェラン、マンナン、カラゲナン、イヌリン、レバン、キシラン、アラビナン、ペクチン、キチン、キトサンから選ばれた少なくとも１種類を構成単位とするが、生化学的親和性を吸着の駆動力に利用する、いわゆるアフィニティークロマトグラフィーにおいては、球状多孔性粒子としてセルロース、キチン、キトサン、デキストラン、アガロース、マンナン、その他水に不溶のゲルを形成可能である多糖類が、合成系の高分子に比べてより好ましく利用できる。勿論、本発明のリン酸化方法は多糖類だけでなく、遊離の水酸基を持つものに対して適用可能である。
【００１６】
形状が球状粒子である不溶性担体の中でも、球状セルロース粒子は、安価で生体適合性が高く、強度も大きく、カラム耐圧性が良好で、さらにオートクレーブも可能なことから、本発明において好ましく使用することができる。
【００１７】
液体クロマトグラフィーにおいて、粒子の形状はカラムへの充填密度や流速性能や分離性能に大きく影響を与えるが、本発明の多糖粒子は球状又は粒状あるいはそれらの混合物である。ここで球状とはほぼ真球状をいい、粒状とは球面が一部内側に陥没したものをいう。これにより本発明の多糖粒子は、従来の繊維状のリン酸化セルロースに比べて、カラム充填効率が高く且つ高流速である。
【００１８】
液体クロマトグラフィーにおいては、また多孔質性も分離性能に大きく影響する因子である。本発明の多孔質リン酸エステル化多糖粒子は、形状が球状又は粒状あるいはそれらの混合物で、ポリエチレングリコール換算の排除限界分子量が２０，０００〜４００，０００である多糖粒子である。排除限界分子量は、経験的にポリエチレングリコールなどの線状高分子に比べて、球状タンパク質ではおよそその５倍程度の値になることが知られている。従って、本発明の多糖粒子はタンパク質は１００，０００〜２，０００，０００の排除限界分子量を有するタンパク質である。
【００１９】
本発明で使用される有機溶媒としては、ジオキサン、ジエチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミドなどのアミド類、ジメチルスルホキサイドなどが使用可能であるが、特にＤＭＦは本発明で好ましく使用できる。
【００２０】
本発明において、水含有有機溶媒の水含有量は、五酸化リン１モルに対して水０．２６〜２．９０モルであり、好ましくは０．４〜１．３０モルである。五酸化リンは水と反応することにより、リン酸に変化することが知られている。その反応式を以下に示す。
【化１】
Ｐ２Ｏ５  ＋  ３Ｈ２Ｏ    ――――＞    ２Ｈ３ＰＯ４        （１）
上式に示すように五酸化リン１モルに対して水３モルを加えると２モルのリン酸が生成する。リン酸になってしまうと、多糖類との間にリン酸エステルを形成させることは非常に困難になってしまうため３モル以上の水を添加することは好ましくない。
【００２１】
以下、本発明について実施例及び比較例を用いて詳細の説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
【実施例】
１．本発明の多糖粒子の調製
実施例１
多孔性セルロース球状粒子ＣＰＣ（商品名、チッソ株式会社製）を真空乾燥（４０℃〜６０℃）して、乾燥ＣＰＣ（水分１重量％）を得た。別に４００ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、水分含量０．０３３容量％）に、０．６５ｇの純水を添加した後、五酸化リンを２２．７ｇ加えて溶解した（酸化リンに対する水のモル比０．４４）。この溶液に乾燥ＣＰＣ  ５０ｇを加えて、反応温度６５℃で一時間反応させた。反応後、反応溶媒をろ過により取り除き、次いでゲルを純水で十分に洗浄することで本発明の多糖粒子を得た。収量１１８ｇ湿重量、（乾燥重量５１ｇ）、イオン交換容量が０．３７ｍｅｑ／ｍｌ、膨潤度２．８ｍＬ／ｇであった。
【００２３】
実施例２
実施例１と同様にして乾燥ＣＰＣ（水分５．２６重量％）を調製した。別に３００ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、水分含量０．０４４容量％）に、１．３５ｇの純水を添加した後、五酸化リンを２５．０ｇ加えて溶解した（酸化リンに対する水のモル比１．３）。この液に乾燥ＣＰＣ  ５０ｇを加えて、反応温度６５℃で一時間反応させた。反応後、反応溶媒をろ過により取り除き、次いでゲルを純水で十分に洗浄することで本発明の多糖粒子を得た。収量１１７ｇ湿重量、（乾燥重量５５ｇ）、イオン交換容量が０．８４ｍｅｑ／ｍｌ、膨潤度２．７ｍＬ／ｇであった。
【００２４】
実施例３
実施例１と同様にして乾燥ＣＰＣ（水分２．５重量％）を調製した。別に１１９５ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、水分含量０．０４４容量％）に、１４．９ｇの純水を添加した後、五酸化リンを１７０ｇ加えて溶解した（五酸化リンに対する水のモル比０．９１）。この液に乾燥ＣＰＣ１７０ｇを加えて、反応温度６５℃で一時間反応させた。反応後、反応溶媒をろ過により取り除き、次いでゲルを純水で十分に洗浄することで本発明の多糖粒子を得た。収量１０５７ｇ湿重量、（乾燥重量２０６ｇ）、イオン交換容量が０．４４ｍｅｑ／ｍｌ、膨潤度６．７ｍＬ／ｇであった。
【００２５】
参考例
五酸化リンのＤＭＦの溶解性に対する水の影響を調べるため以下の実験を行った。
五酸化リン１．２５ｇ  にＤＭＦ（水分含有量０．０３３容量％）１０ｍＬ毎添加して撹拌した。ＤＭＦが１２０ｍＬになった時点で初めて五酸化リンが完全に溶解した。従って、この時点でのＤＭＦへの五酸化リンの溶解量は０．０１１ｇ／１００ｇ−溶液であり、０．０１１％（ｗ／ｗ）の溶液である。
【００２６】
比較例
比較例として以下のリン酸化セルロースを使用した。
比較例１
Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  Ｐ１１（商品名、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．４０７１０５０：Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ）
比較例２
Ｓｅｌｅｃｔａｃｅｌ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＳＴＤ．  （商品名、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．    Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．１９７９３）
比較例３
Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｆｏｒｍ  （商品名、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏ．    Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．Ｃ−３１４５）
【００２７】
２．測定方法
イオン交換容量の測定
本発明の多糖粒子または比較例のリン酸化セルロース（以後これらセルロースと略称する）を０．５Ｎ塩酸中で約３０分攪拌した後、純水でろ過液が中性になるまでろ過洗浄を行う。これらセルロースの嵩の２倍量のメタノールを加えてろ過洗浄を３回繰り返した後に、真空乾燥機（６０℃）で乾燥させた。
乾燥したこれらセルロース１ｇに０．１Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬを加えてしばらく攪拌した後、２４時間静置した。その後、ろ過によって液を回収して、この液の１０ｍＬをフェノールフタレインを指示薬として、０．１Ｎ塩酸で滴定した。
【００２８】
イオン交換容量（ｍｅｑ／ｇ）＝（１０×ｆ１−Ｖ×ｆ２）×０．１×５÷Ｗ
ここで、ｆ１は０．１Ｎ水酸化ナトリウムのファクター、ｆ２は０．１Ｎ塩酸のファクター、Ｖは０．１Ｎ塩酸の滴定量（ｍＬ）、Ｗは粒子の秤量値（ｇ）を表す。イオン交換容量を体積で表す場合は、下記式で計算した。
イオン交換容量（ｍｅｑ／ｍＬ）＝イオン交換容量（ｍｅｑ／ｇ）÷膨潤度（ｍＬ／ｇ）
【００２９】
膨潤度
リン酸基の対イオンをナトリウムとした脱気済みのこれらセルロースを２５ｇ（湿重量）を５０ｍＬのメスシリンダーに入れて、体積が変化しなくなるまで、時々タッピングを行いながら静置した。一定になった体積を読み取ってから、メスシリンダー内の全部の粒子をビーカーに移してから８０℃で乾燥させ、その時の重量を測定した。
膨潤度（ｍＬ／ｇ）  ＝  （一定になった体積（ｍＬ））／（乾燥重量（ｇ））
【００３０】
流速
内径０．８２ｃｍ長さ３０ｃｍ、あるいは内径１．１ｃｍ長さ２３ｃｍのカラムにこれらセルロースを充填した後、カラムに純水を流してその時の圧力と流速を測定して行った。この際、カラムに流す純水の流速を少しずつ上げていき、圧力が一定になった時の流速を測定した。この流速と圧力の関係を散布図にして、流速を比較した。
【００３１】
較正曲線
内径０．８２ｃｍ長さ３０ｃｍ、あるいは内径１．１ｃｍ長さ２３ｃｍのカラムにこれらセルロースを充填した後、分子量の既知であるポリエチレングリコール；ＰＥＧ（およそ１％濃度）を０．１ｍＬ流す。この溶出状態を視差屈折計でモニターしそのピークの位置を溶出体積Ｖｅ（ｍＬ）とする。ＰＥＧの分子量とＶｅの散布図を作成した。溶出位置の表現はＶｅ／Ｖｔ（％）で表した、ここでＶｔはカラム体積である。
【００３２】
混合サンプルの分離
内径１．１ｃｍ長さ１０ｃｍのカラムにこれらセルロースを充填した。０．０１ｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）（バッファーＡ）で平衡化した。下記の混合サンプル１ｍＬをカラムに添加したのち下記の送液条件によって展開した。混合サンプルの溶出挙動はＵＶ２８０ｎｍの吸収によってモニターした。
【００３３】
混合サンプルの組成
ＡＴＰ  ０．７ｍｇ／Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ  ２０ｍｇ／Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ８ｍｇ／Ｃｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ  １０ｍｇ  を１ｍＬのバッファーＡに溶解し混合サンプルとした。この溶液１ｍＬをカラムに注入して測定した。
【００３４】
送液条件
バッファーＡ：０．０１ｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）
バッファーＢ：１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ含有０．０１ｍｏｌ／Ｌ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）
送液速度（流速）：２ｍＬ／ｍｉｎ
直線的濃度勾配：１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ濃度が５０分の間に０％→１００％に直線的に増加する様に下記の割合でバッファーＡとバッファーＢを送液した。
バッファーＡ：１００％→  ０％
バッファーＢ：０％  →１００％
【００３５】
理論段数と分離能の計算
理論段数は各成分のピーク検出時間を（Ｒｔ）、ピークの幅を（Ｗ）としたとき、下記計算式によって求めた。
理論段数＝１６×（Ｒｔ／Ｗ）２
分離能はＯｖａｌｂｕｍｉｎのピーク検出時間を（Ｒｔ−Ｏｖ）、ピーク幅を（Ｗ−Ｏｙ）とし、Ｌｙｓｏｚｙｍｅのピーク検出時間を（Ｒｔ−Ｌｙ）、ピーク幅を（Ｗ−Ｌｙ）とし、Ｃｈｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃのピーク検出時間を（Ｒｔ−Ｃｙ）、ピーク幅を（Ｗ−Ｃｙ）として、ＯｖａｌｂｕｍｉｎとＬｙｓｏｚｙｍｅの分離能（Ｒｓ−Ｏｖ−Ｌｙ）とし、ＬｙｓｏｚｙｍｅとＣｈｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃの分離能を（Ｒｓ−Ｌｙ−Ｃｙ）としたとき、下記計算式によって求めた。
分離能（Ｒｓ−Ｏｖ−Ｌｙ）  ＝  （（Ｒｔ−Ｌｙ）−（Ｒｔ−Ｏｖ））／（１／２（（Ｗ−Ｌｙ）＋（Ｗ−Ｏｖ）））
分離能（Ｒｓ−Ｌｙ−Ｃｙ）  ＝  （（Ｒｔ−Ｃｙ）−（Ｒｔ−Ｌｙ））／（１／２（（Ｗ−Ｃｙ）＋（Ｗ−Ｌｙ）））
【００３６】
形状の観察
顕微鏡によって観察した。
【００３７】
各実施例及び比較例についてのイオン交換容量及び膨潤度の分析値を以下に示す。
【表１】
イオン交換容量の比較
2004331767.tif 000002
実施例のサンプルは全てイオン交換容量が０．３ｍｅｑ／ｍＬ以上であり膨潤度が８ｍＬ／ｇ以下であった。
【００３８】
実施例３で得られた本発明の多糖粒子と比較例１のリン酸化セルロースの較正曲線を図１に示した。図１において、○印が実施例３で得られらた本発明の多糖粒子を、△印が比較例１のセルロースを示す。実施例３で得られた本発明の多糖粒子の排除限界分子量は、ＰＥＧ換算の分子量としておよそ２０，００００であり、比較例１のそれはおよそ３，０００であった。実施例３の方が高度に多孔性であることが示された。またＶｅ／Ｖｔが変化しない値はカラムボイドボリュームを示すが、実施例３の２８％に比べて比較例１は５９％あり、充填効率も実施例３で得られた本発明の多糖粒子が優れていることが示された。
【００３９】
これらセルロースを充填したカラムでの流速と圧力の関係を図２及び３に示した。図２では内径０．８２ｃｍ、長さ３２ｃｍのカラムを、図３では内径１．１ｃｍ、長さ２３ｃｍのカラムを使用した。
図２及び３において、○印が実施例３で得られた本発明の多糖粒子、□印が比較例１、△印が比較例３の各セルロースを表す。
カラムの流速と圧力の関係では、実施例３が比較例に比べて、より低い圧力で高い流速が得られており、流速特性に優れていることが示されているのが解る。
【００４０】
混合サンプルで測定したこれらセルロース充填カラムの分離能と理論段数を図４と表２に示した。図４において、溶出ピークは、速い順にＡＴＰ、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃである。
【００４１】
【表２】
混合サンプルの溶出時間、ピーク幅、理論段数、分離能の比較
2004331767.tif 000003
【００４２】
表２によると、実施例２で得られた本発明の多糖粒子は理論段数が全ての混合サンプルで１０００以上と高いが、比較例１セルロースのそれはＯｖａｌｂｕｍｉｎ以外は４００以下の低い値であった。分離能についても前者の方が後者に比べて優っていることが示されている。
【００４３】
吸着剤の形状を写真に写したものを図５〜７に示した。実施例１、比較例１、比較例３で得られたこれらセルロースの３００倍の写真を図示したものである。比較例１、３のセルロースは繊維状になっているに対して、実施例１で得られた本発明の多糖粒子は球状の粒子になっていることが解る。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の多糖粒子は、球状であり従来の繊維状のものに比べて、カラム充填密度が大きく、カラム流速性能も優れている。また、クロマトグラフィーに重要な因子である分離能や理論段数も従来の繊維状のものに比べて優れている。更に、本発明の多糖粒子は、従来の繊維状のものに比べて排除限界分子量が非常に大きく、タンパク質や核酸、多糖をその細孔内に容易に入り込ませることが可能である。従って、イオン交換クロマトグラフィーや、リン酸エステルの特定的吸着現象を利用するアフィニティークロマトグラフィを行う場合、より高密度な吸着が達成でき、効率のよいクロマトグラフィー操作が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の多糖粒子及び比較例のセルロースの較正曲線を示した図面である。
【図２】本発明の多糖粒子及び比較例のセルロースを充填した内径０．８２ｃｍ、長さ３０ｃｍのカラムでの流速と圧力の関係を示した図面である。
【図３】本発明の多糖粒子及び比較例のセルロースを充填した内径１．１ｃｍ、長さ２３ｃｍでのカラムの流速と圧力の関係を示した図面である。
【図４】本発明の多糖粒子及び比較例のセルロースを充填したカラムの分離能を示した図面である。
【図５】実施例１で得られた本発明の多糖粒子の３００倍写真を図示した図面である。
【図６】比較例１で得られたセルロースの３００倍写真を図示した図面である。
【図７】比較例３で得られたセルロースの３００倍写真を図示した図面である。
【図１】
2004331767.tif 000004
【図２】
2004331767.tif 000005
【図３】
2004331767.tif 000006
【図４】
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【図５】
2004331767.tif 000008
【図６】
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【図７】
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