(57)【要約】      （修正有）【課題】固形癌の診断に有効な複数の新規抗原ペプチドと、この抗原ペプチドに対する抗体、これらを用いた大腸癌診断方法を提供する。【解決手段】２２種類の各塩基配列からなるポリヌクレオチドが発現するヒト固形癌抗原ペプチドと、被験者の血清中に、前記の抗原ペプチドと結合する抗体が存在するか否かを試験する固形癌診断方法。前記の抗原ペプチドと結合する抗体と被験者の生体試料中に、その抗体と結合する抗原ペプチドが存在するか否か試験する固形癌診断方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４０および４１の各塩基配列を有するポリヌクレオチドが発現するヒト固形癌抗原ペプチド。
【請求項２】
請求項１の抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２のポリヌクレオチドの発現制御領域を構成するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１の抗原ペプチドと結合する抗体。
【請求項５】
被験者の血清中に、請求項１の抗原ペプチドのそれぞれと結合する抗体が存在するか否かを試験し、血清中にその抗体が１種類以上存在する被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト固形癌診断方法。
【請求項６】
１種類以上の抗原ペプチドを固定化したプレートまたはメンブレン上において被験者血清の抗体と抗原ペプチドとの結合を試験する請求項５の診断方法。
【請求項７】
被験者の生体試料に、請求項４の抗体のそれぞれと結合する抗原ペプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原ペプチドが１種類以上存在する被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト固形癌診断方法。
【請求項８】
１種類以上の抗体を固定化したプレートまたはメンブレン上において、抗体と抗原ペプチドの結合を試験する請求項７の診断方法。
【請求項９】
被験者の生体試料における請求項２のポリヌクレオチドのそれぞれの存在量を試験し、１以上のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれらと比較して多い被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト固形癌診断方法。
【請求項１０】
少なくとも以下の要素：
（ａ）    請求項１の抗原ペプチドの１種類以上；および
（ｂ）    血清中抗体に特異的に結合する標識化抗体
からなることを特徴とする固形癌診断キット。
【請求項１１】
少なくとも以下の要素：
（ａ）    請求項１の抗原ペプチドの１種類以上を固定化したプレートまたはメンブレン；および
（ｂ）    血清中抗体に特異的に結合する標識化抗体
からなることを特徴とする固形癌診断キット。
【請求項１２】
少なくとも、請求項４の抗体および／またはその標識化抗体の１種類以上を含むことを特徴とする固形癌診断キット。
【請求項１３】
少なくとも以下の要素：
（ａ）    請求項４の抗体の１種類以上；および
（ｂ）    前記（ａ）の抗体を標識化した標識化抗体
からなることを特徴とする固形癌診断キット。
【請求項１４】
少なくとも以下の要素：
（ａ）    請求項４の抗体の１種類以上を固定化したプレートまたはメンブレン；および
（ｂ）    前記（ａ）の抗体を標識化した標識化抗体
からなることを特徴とする固形癌診断キット。
【請求項１５】
請求項２のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセット。
【請求項１６】
請求項３のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いることを特徴とする固形癌治療方法。
【請求項１７】
請求項４の抗体を用いることを特徴とする固形癌治療方法。
【請求項１８】
請求項１の抗原ペプチドの発現量を抑制することを特徴とする固形癌治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ヒト固形癌の抗原ペプチドと、このペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらを用いた固形癌診断方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
食道癌、胃癌、肺癌、腎癌、甲状腺癌、耳下腺癌、頭頚部癌、骨・軟部肉腫、尿管癌、膀胱癌、子宮癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、卵管癌等の固形癌はいずれも悪性の腫瘍であり、特に進行性の固形癌は治療が困難であり、多くの場合に致命的となる。従って、固形癌に対する対策としては癌腫の早期発見が最も重要な課題である。
【０００３】
従来、固形癌の診断には、α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＥＡ、ＳＣＣ、ＣＡ１９−９、ＣＹＦＲ２１−１等の癌組織特異的血清マーカーによる診断、並びに治療経過の診断が行われている。この方法は大がかりな設備を必要とせず、被験者への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験者に対しても広範囲に実施することが可能である。しかしながら、これらの癌マーカーはいずれも、陽性率は２０−３０％程度にすぎず、特に早期癌においてはほとんどの場合に陰性であって、固形癌の早期発見のための手段としては不十分であった。
【０００４】
一方、固形癌の治療方法としては、癌組織の外科的な切除や全身性の抗癌剤投与等が行われている。しかしながら、前記のとおり、進行性に移行した固形癌の場合にはこれらの治療法も効果は少なく、また早期に発見した場合であっても、これらの治療法は患者の身体的負担がきわめて大きいという問題を有している。
【０００５】
なお、抗原タンパク質マーカーを用いた分子生物学的診断方法としては、例えば特許文献１−３が知られている。また、担癌患者の腫瘍細胞のｍＲＮＡから作製したタンパク質を患者の自己血清でスクリーニングするＳＥＲＥＸ法（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）が報告され（非特許文献１；特許文献４）、悪性黒色腫、腎癌、食道癌、大腸癌、肺癌等においてＩｇＧ抗体が認識する癌抗原を、上記ＳＥＲＥＸ法により単離した報告もなされている（非特許文献２−７）。また、特許文献５には、ＳＥＲＥＸ法によって特定した悪性黒色腫抗原タンパク質とそれをコードするＤＮＡ配列、並びにこれらを使用した悪性黒色腫の診断方法が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】
特開平７−５１０６５号公報
【特許文献２】
再表００／０６００７３号公報
【特許文献３】
特表２０００−５１１５３６号公報
【特許文献４】
米国特許Ｎｏ．  ５６９８３９６号
【特許文献５】
特開２００１−３３３７８２号公報
【非特許文献１】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：１１８１０−１１８１３，  １９９５
【非特許文献２】
Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７２：  ９６５−９７１，  １９９７
【非特許文献３】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８：１０３４−１０４１，  １９９８
【非特許文献４】
Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２９：６５２−６５８，  １９９８
【非特許文献５】
Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．  １４：７０３−７０８，  １９９９
【非特許文献６】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６：４７６６−４７７２，  １９９６
【非特許文献７】
Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ  ６：３３−３９，  １９９７
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、固形癌の早期診断のための方法として、癌組織特異的な抗原タンパク質マーカーを用いた分子生物学的診断方法の有効性が指摘されており、そのための新しい抗原タンパク質マーカーも幾つか提案されている。しかしながら、その診断精度をさらに向上させるためには、抗原性の高いタンパク質マーカーをより多く準備し、それらを組合せて使用することが不可欠である。
【０００８】
また、それらの抗原タンパク質マーカーは固形癌組織で優性に発現するため、癌組織のみを標的とする治療法への応用も期待される。
【０００９】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、固形癌の診断と治療に有効な新規抗原ペプチドを提供することを課題としている。
【００１０】
またこの出願の発明は、前記の抗原ペプチドをコードする遺伝子材料と、抗原ペプチドに対する抗体を提供することを課題としている。
【００１１】
さらにこの出願の発明は、前記のペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体等を用いた固形癌診断方法、並びに固形癌治療方法を提供することを課題としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１８）の発明を提供する。
（１）    配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４０および４１の各塩基配列を有するポリヌクレオチドが発現するヒト固形癌抗原ペプチド。
（２）    前記発明（１）の抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（３）    前記発明（２）のポリヌクレオチドの発現制御領域を構成するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。
（４）    請求項１の抗原ペプチドと結合する抗体。
（５）    被験者の血清中に、前記発明（１）の抗原ペプチドのそれぞれと結合する抗体が存在するか否かを試験し、血清中にその抗体が１種類以上存在する被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト固形癌癌診断方法。
（６）    １種類以上の抗原ペプチドを固定化したプレートまたはメンブレン上において被験者血清の抗体と抗原ペプチドとの結合を試験する前記発明（５）の診断方法。
（７）    被験者の生体試料に、前記発明（４）の抗体のそれぞれと結合する抗原ペプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原ペプチドが１種類以上存在する被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト固形癌診断方法。
（８）    １種類以上の抗体を固定化したプレートまたはメンブレン上において、抗体と抗原ペプチドの結合を試験する前記発明（７）の診断方法。
（９）    被験者の生体試料における前記発明（２）のポリヌクレオチドのそれぞれの存在量を試験し、１以上のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれらと比較して多い被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト固形癌診断方法。
（１０）  少なくとも以下の要素：
（ａ）    前記発明（１）の抗原ペプチドの１種類以上；および
（ｂ）    血清中抗体に特異的に結合する標識化抗体
からなることを特徴とする固形癌診断キット。
（１１）  少なくとも以下の要素：
（ａ）    前記発明（１）の抗原ペプチドの１種類以上を固定化したプレートまたはメンブレン；および
（ｂ）    血清中抗体に特異的に結合する標識化抗体
からなることを特徴とする固形癌診断キット。
（１２）  少なくとも、前記発明（４）の抗体および／またはその標識化抗体の１種類以上を含むことを特徴とする固形癌診断キット。
（１３）  少なくとも以下の要素：
（ａ）    前記発明（４）の抗体の１種類以上；および
（ｂ）    前記（ａ）の抗体を標識化した標識化抗体
からなることを特徴とする固形癌診断キット。
（１４）  少なくとも以下の要素：
（ａ）    前記発明（４）の抗体の１種類以上を固定化したプレートまたはメンブレン；および
（ｂ）    前記（ａ）の抗体を標識化した標識化抗体
からなることを特徴とする固形癌診断キット。
（１５）  前記発明（２）のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセット。
（１６）  前記発明（３）のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いることを特徴とする固形癌治療方法。
（１７）  前記発明（４）の抗体を用いることを特徴とする固形癌治療方法。
（１８）  前記発明（１）の抗原ペプチドの発現量を抑制することを特徴とする固形癌治療方法。
【００１３】
すなわち、この出願の発明者らは、大腸癌患者の手術標本の正常部と癌部から患者本人の了解を得てタンパク質を抽出し、二次元電気泳動法（例えば、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２２：３０１９−３０２５，  ２００１）により解析することによって、固形癌細胞において特異的に発現し、従来は腫瘍マーカーとしての機能が知られていなかった１０種の抗原ペプチド（表１の上１０種）を見出した。また食道癌患者の了解を得て採取した血清をＳＥＲＥＸ法によって解析し、食道癌患者の血清中にのみ存在する１２種の特異的抗体（表１の下１２種）を見出した。
【００１４】
【表１】
2004298112.tif 000002
この出願の発明は、以上のとおりの新規抗原ペプチドと、そのペプチドに対する抗体、それらをコードするポリヌクレオチドを基礎とするものである。
【００１５】
なお、この発明において、「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１００個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個連結した分子を言う。
【００１６】
また、表１にそれぞれ示した塩基配列およびアミノ酸配列については、１以上の塩基の付加、欠失、他の塩基への置換、あるいはこれらの塩基変異に基づく１以上のアミノ酸残基の付加、欠失および他のアミノ酸への置換をも包含するものである。
【００１７】
さらに、「血清中抗体」とは、固形癌患者の血清中に存在し、発明（１）の抗原ペプチドと結合する抗体ＩｇＧを意味する。また、発明（４）の「抗体」は、発明（１）の抗原ペプチドを免疫原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を意味する。
【００１８】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の治療方法等に使用可能な薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｄ．  Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９９０に、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等に記載されている。
【００１９】
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
発明（１）の抗原ペプチドは、表１に示した２２種の遺伝子またはＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）が発現するタンパク質またはペプチドである。これらの遺伝子産物については様々な機能が知られているが、固形癌における特異的発現は知られていない。またはＥＳＴについてはアミノ酸配列も特定されておらず、当然のこととして、その機能は知られていない。なお、この発明のおいては、ＥＳＴの発現産物は「配列番号３９−４１に示した塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードするペプチド」、または「当該ポリヌクレオチドがハイブリダイズするゲノムＤＮＡが発現するペプチド」と定義する。
【００２１】
なお、後記の実施例に示したように、配列番号１−２０に示した遺伝子は２次元電気泳動法によって、配列番号２１−４１の遺伝子およびＥＳＴはＳＥＲＥＸ法によって特定されたものである。
【００２２】
これら発明（１）の抗原ペプチドは、この発明によって提供される固形癌診断に使用することができる。
【００２３】
これらの抗原ペプチドは、例えば、発明（２）のポリヌクレオチドを保有する組換え発現ベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでペプチドを発現できる。また組換え発現ベクターを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞に導入して形質転換細胞を作製すれば、この形質転換細胞からペプチドを発現させることができる。
【００２４】
抗原ペプチドをインビトロ翻訳で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、抗原ペプチドをインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  １８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。
【００２５】
抗原ペプチドを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有するベクターにポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作製し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、そのポリヌクレオチドがコードしている抗原ペプチドを微生物から発現させることができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００２６】
抗原ペプチドを、真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、抗原ペプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として抗原ペプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この発明の抗原ペプチドを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２７】
抗原ペプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的ペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２８】
なお、以上の方法によって得られる組換え抗原ペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドも第１発明の抗原ペプチドの範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【００２９】
発明（２）は、発明（１）の抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片）である。具体的には、各ペプチド（タンパク質）をコードするゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡである。また、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。さらに、これらのゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖も含まれる。またさらに、ゲノムＤＮＡの場合には、その発現制御領域（プロモーター、エンハンサー、サプレッサー領域）をも含む。
【００３０】
これらのポリヌクレオチドは、それぞれ公知の方法によって容易に取得することができる。例えば、ｃＤＮＡの場合には、公知の方法（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２，  １６１−１７０，  １９８２；  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  ２５，  ２６３−２６９，  １９８３；  Ｇｅｎｅ，  １５０，  ２４３−２５０，  １９９４）を用いてｃＤＮＡを合成し、配列番号１または３の塩基配列に基づいて作製したプローブＤＮＡを用いて、それぞれのｃＤＮＡを単離する方法によって取得することができる。また、この発明によって提供されるプライマーセットを用い、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によっても各ｃＤＮＡを得ることができる。得られたｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００３１】
発明（３）は、前記発明（２）のポリヌクレオチド（特にゲノムＤＮＡ）の発現制御領域を構成するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、公知のヒトゲノムデータベースを検索するなどの方法によって取得することができる。またこの発明（３）のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、例えばこの発明の固形癌治療方法に使用することができる。
【００３２】
発明（４）の抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、それぞれ発明（１）の抗原ペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、抗原ペプチドやその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。
【００３３】
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；  ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”  Ｊａｍｅｓ  Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６）に従い作製することができる。
【００３４】
またこの発明（４）の抗体には、標識物質によって標識化された抗体も含まれる。標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のＥＩＡに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。
【００３５】
さらにまた、この発明の標識化抗体には、マンガンや鉄等の金属を結合させたものも含まれる。このような金属結合抗体を体内に投与し、ＭＲＩ等によって金属を測定することによって、抗体が結合した抗原ペプチドを産生する癌細胞の存在を検出することができる。
【００３６】
発明（５）のヒト固形癌診断方法は、被験者の血清中に、前記発明（１）の抗原ペプチドのそれぞれと結合する抗体が１種類以上存在か否かを試験し、血清中にその抗体が存在する被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定する。すなわち、発明（１）の各抗原ペプチドは、固形癌患者の血清中の抗体（ＩｇＧ）と結合するペプチドであるから、被験者の血清と反応させ、これらの抗原ペプチドと結合する抗体を含む血清を、固形癌患者またはそのハイリスク患者の血清として判定することができる。なおその際に、２種類以上、好ましくは５種類以上、さらに好ましくは１０種類以上、最も好ましくは１５−２２種類の抗原ペプチドについて血清中抗体との結合を判定する。またさらに、すでに知られている他の固形癌マーカーを併用することもできる。
【００３７】
具体的な診断は、例えば抗原ペプチドに被験者血清を接触させ、抗原ペプチドと被験者血清中のＩｇＧ抗体とを液相中において反応させる。さらに血清中のＩｇＧ抗体と特異的に結合する標識化ＩｇＧ抗体を反応させて、標識化ＩｇＧ抗体のシグナルを検出すればよい。標識化ＩｇＧ抗体の標識物質は、前記の標識化抗体において例示したような酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。
【００３８】
シグナルの検出は、例えば、ウエスタンブロット分析を採用することができる。あるいは、抗原ペプチド＋血清中抗体＋標識化ＩｇＧ抗体の結合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等）によって分離し、標識化ＩｇＧ抗体のシグナルを検出するようにしてもよい。
【００３９】
なお、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１０）の診断キットが提供される。
【００４０】
発明（５）の診断方法はまた、抗原ペプチドの１種類以上をプレートまたはメンブレン上に固定化し、この基板上において被験者血清の抗体との結合を試験する方法（発明（６））として実施することもできる。抗原ペプチドを基板上に固定化することによって、未結合の標識化結合分子を容易に除去することができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１１）の診断キットが提供される。また特に、数十種類の抗原ペプチドを固定化したメンブレンを用いるプロテインアレイ法では、０．０１ｍｌ程度の被験者血清を用いて多種類の抗体の発現を短時間で解析することができる。
【００４１】
この出願の発明（７）の診断方法は、被験者の生体試料中に、前記発明（４）の抗体、またはその標識化抗体と結合する抗原ペプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原ペプチドが存在する被験者を固形癌患者またはそのハイリスク者と判定する。すなわち、ここで使用する抗体または標識化抗体は、大腸癌細胞で発現している抗原ペプチドと特異的に結合する抗体であるから、この抗体と結合する抗原ペプチドを含む生体試料を、固形癌患者またはそのハイリスク患者の試料として判定することができる。なおその際に、好ましくは２種類以上、好ましくは５種類以上、さらに好ましくは１０種類以上、最も好ましくは１５−２２種類の抗体について試料中の抗原ペプチドとの結合を判定する。また、生体試料としては、血液や血液細胞（単核球等）を対象とすることができる。
【００４２】
この発明（７）の診断方法における一つの態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、発明（４）の標識化抗体と生体試料とを接触させて標識化抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体を前記発明（５）と同様の方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１２）の診断キットが提供される。
【００４３】
液相系での診断の別の方法は、発明（４）の抗体（一次抗体）と生体試料とを接触させて一次抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋抗原ペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Ｆｃ領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は前記発明（５）と同様とすることができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１３）の診断キットが提供される。
【００４４】
発明（７）の診断方法における別の態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の抗原ペプチド検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、発明（４）の抗体（一次抗体）を樹脂プレートまたはメンブレン等に固定化し、この固定化抗体に抗原ペプチドを結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体＋抗原ペプチド結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）」として広く用いられている方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は前記発明（５）と同様とすることができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１４）の診断キットが提供される。
【００４５】
発明（１０）〜（１４）の診断キットは、前記発明（５）〜（８）の診断方法を行うための試薬キットである。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、この発明の診断キットも、この発明によって提供される抗原ペプチド、抗体および／または標識化抗体を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。
【００４６】
発明（９）の診断方法は、被験者の生体試料における前記発明（２）のポリヌクレオチドのそれぞれの存在量を試験し、１以上のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれらと比較して多い被験者を固形癌患者またはそのハイリスク者と判定する。具体的な判定基準としては、被験者のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれと比較して、１０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは１００％以上である場合である。
【００４７】
生体試料としては、便や血液、血液細胞（単核球等）を対象とすることができる。ポリヌクレオチドの検出、測定は公知のＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ＲＴ−ＰＣＴ法等によって行うことができ、その場合のＰＣＲは発明（１５）のプライマーセットを用いることができる。
【００４８】
これらのプライマーセットは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４０および４１の各塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ  ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００４９】
発明（１６）は、発明（３）のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いて固形癌を治療する方法である。発明（３）のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（以下、「プロモーター配列」と記載する）は、固形癌細胞で特異的に発現する遺伝子の発現制御領域であるため、このプロモーター配列に抗癌物質をコードするポリヌクレオチドを連結して治療用遺伝子を作製し、これを遺伝子治療等の方法により体内に投与すれば、治療用遺伝子を癌細胞特異的に発現させることが可能となる。抗癌作用を有する物質あるいは抗癌作用を有する物質の前駆物質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えばｐ５３、ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２、−１２、−１７、−１８、ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ｕｒａｃｉｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ等のコードする遺伝子ＤＮＡやそのｃＤＮＡ等を利用することができる。また、このプロモーター配列は、アデノウイルスやヘルペスウイルスを癌細胞特異的に増殖させて癌細胞を融解させる治療法に使用することもできる。すなわち、例えばアデノウイルスのＥ１Ａ領域の前にプロモーター配列を挿入することによって、このアデノウイルスは癌細胞においてのみ特異的に増殖し、癌細胞を融解させる。
【００５０】
発明（１７）は、前記発明（４）の抗体を用いて固形癌を治療する方法である。発明（４）の抗体は、癌細胞で特異的に発現する抗原ペプチドに結合するため、この抗体に公知の抗癌物質や抗癌剤を結合させて患者体内に投与することによって、抗癌物質や抗癌剤を癌細胞特異的に作用させることができる。また、抗体が癌細胞に対する殺傷作用を有するものであれば、抗体の単独投与によっても治療効果を得ることができる。
【００５１】
発明（１８）は、前記発明（１）の抗原ペプチドの発現量を制御することによって固形癌を治療する方法に関するものである。すなわち、発明（１）の抗原ペプチドは癌細胞で特異的に発現しているため、その発現が細胞の癌化の原因となっている可能性が高い。そのため、この抗原ペプチドの発現を抑制すれば、細胞の癌化やその進行に対する治療効果が期待される。具体的には、発明（２）のポリヌクレオチド（特にｍＲＮＡ）に対するアンチセンスＤＮＡ鎖を用いたアンチセンス療法や、２本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法によってこの治療法を行うことができる。
【００５２】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００５３】
【実施例】
実施例１：二次元電気泳動による抗原ペプチドの同定
［１］材料と方法
患者（６名）の了解のもと、大腸癌提出直後の癌部および非癌部組織のそれぞれから凍結標本を採取し、―８０℃に保存した。この凍結標本の適量を９．５Ｍ  Ｕｒｅａ、２％  ＣＨＡＰＳ、１％  ＤＴＴ、プロテアーゼインヒビターコンプリート（ロッシュ）溶液中でホモジェナイズした後、超高速遠心器（日立）で１００，０００ｇにて遠心し、上清（タンパク質溶液）を抽出し、吸光度によりタンパク質濃度を同定した。
【００５４】
癌部および非癌部組織から得られたタンパク質それぞれを４００μｇを一次元目はアガロース等電点電気泳動で、二次元目は１２％  Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。分離されたタンパク質をクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色し、非癌部組織に比較して癌部組織で発現量が増大しているスポットを検出した。このスポットからゲルを切り出し、ゲル中に含まれているタンパク質をトリプシン（ロッシュ）により消化し、得られたペプチドを回収し、イオントラップ型質量分析器（サーモクエスト社ＬＣＱ  ＤＥＣＡ  ＸＰ    ）によりアミノ酸配列を決定した。
［２］結果
６名中、４名以上の大腸癌患者の癌組織において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０のアミノ酸配列を有するタンパク質の特異的発現が確認された。
【００５５】
これらのタンパク質のコード配列は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９であり、それぞれの遺伝子は表１に示したとおりである。
実施例２：ＳＥＲＥＸ法による抗原ペプチドの特定
［１］ｃＤＮＡライブラリーの作製
食道癌、大腸癌、乳癌患者の了解を得て、癌摘出直後の癌部組織の細胞を単離し、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。これらの培養細胞からｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ抽出法によりトータルＲＮＡ（２５０μｇ）を単離し、ｏｌｉｇｏ−ｄＴ（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ｓｕｐｅｒ，  ＴＡＫＡＲＡ社）を用いたポリ（Ａ）セレクションを２回行い、ｍＲＮＡを精製した。この得られたｍＲＮＡ（５．７μｇ）を用いて各細胞のｃＤＮＡライブラリーを構築した。一本鎖ｃＤＮＡは、Ｘｈｏ  Ｉリンカープライマーと５−ｍｅｔｈｙｌ  ｄＣＴＰを用いて合成した。この一本鎖ｃＤＮＡからＴ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより平滑末端を有する二本鎖ｃＤＮＡを合成し、この二本鎖ｃＤＮＡの両端に制限酵素サイト（Ｅｃｏ  ＲＩ／λＺＡＰ  ＩＩ）を含むリンカーを付加した。ｃＤＮＡフラグメントをバクテリオファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入し、それぞれの癌細胞について、約１．８×１０６個のクローンからなるｃＤＮＡライブラリーを作製した。
［２］ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記で作製した各癌細胞のｃＤＮＡライブラリーの各ファージベクターを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させ、ＮＺＹアガロースプレート上でプラークを形成させた。各感染大腸菌に対して、１０ｍＭのＩＰＴＧ処理により発現誘導し、各ｃＤＮＡがコードするペプチドを発現させた。このペプチドをニトロセルロース膜（ＮｉｔｒｏＢｉｎｄ：  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社）に転写し、ＴＢＳ［０．５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．５）］で膜を洗浄して吸着したバクテリオファージを除去した後、１％のアルブミンを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎにて非特異反応を抑制した。このフィルターを２０００倍希釈した１６名の食道癌患者血清と室温でそれぞれ２時間反応させた。
【００５６】
血清は、患者から単離した後、−８０℃で保存し、使用直前に１重量％のアルブミンを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．５％のｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）溶液で５００倍に最終的に希釈したものを用いた。この希釈した血清を、大腸菌のライセートと１：５の割合で混合し、４℃で８時間放置後、１５，０００回転にて２０分間遠心し、上清を回収したものを用いた。また、必要に応じて無処理の血清を２０００倍に希釈して用いた。
【００５７】
血清と、上記の発現ペプチドをブロットしたニトロセルロース膜とを室温で１０〜２０時間反応させて血清中の抗体が反応したペプチドを特定した。すなわち、二次抗体として５０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗体（Ｊａｃｈｓｏｎ社）を用いて反応させ、Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（Ｗａｋｏ社）と５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｗａｋｏ社）を用いた酵素発色反応により標識シグナルを検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ７．５）に溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、２０名の患者の血清中のＩｇＧと反応するファージクローンをスクリーニングして、陽性クローン３４７個を単離した。
［３］新規抗原の特定
得られた陽性クローンから、ＰＣＲ法によりインサートＤＮＡを増幅し、得られたＰＣＲ産物を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社）とＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）とを用いて配列決定した。既存データベースを用いて検索した結果、既知の癌関連遺伝子の発現産物である抗原ペプチドを除き、さらに複数の患者の血清中抗体と反応する１０種の新規抗原ペプチドを特定した。これら１０種の新規抗原ペプチドのアミノ酸をコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）配列は、それぞれ配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４０および４１の各塩基配列を有している。また、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５および３７の各塩基配列は、それぞれ配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８のアミノ酸配列を有している。
【００５８】
図１−１２は、これら１２種の新規抗原ペプチドと各患者血清中の抗体との結合反応を調べたウエスタンブロット分析の結果である。この図１−１２において、矢印は患者血清中の抗体と特異的に反応したポリペプチドを示す。ＩＰＴＧ処理した大腸菌抽出液において検出され、無処理の大腸菌抽出液には検出されないことから導入したｃＤＮＡ由来のポリペプチドであると確認できる。
【００５９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、大腸癌の診断用マーカーとして有用な新規抗原ペプチド２種と、これらを用いた大腸癌診断方法が提供される。これによって、大腸癌の早期かつ高精度の診断が可能となる。
【００６０】
【配列表】
2004298112.tif 000003
2004298112.tif 000004
2004298112.tif 000005
2004298112.tif 000006
2004298112.tif 000007
2004298112.tif 000008
2004298112.tif 000009
2004298112.tif 000010
2004298112.tif 000011
2004298112.tif 000012
2004298112.tif 000013
2004298112.tif 000014
2004298112.tif 000015
2004298112.tif 000016
2004298112.tif 000017
2004298112.tif 000018
2004298112.tif 000019
2004298112.tif 000020
2004298112.tif 000021
2004298112.tif 000022
2004298112.tif 000023
2004298112.tif 000024
2004298112.tif 000025
2004298112.tif 000026
2004298112.tif 000027
2004298112.tif 000028
2004298112.tif 000029
2004298112.tif 000030
2004298112.tif 000031
2004298112.tif 000032
2004298112.tif 000033
2004298112.tif 000034
2004298112.tif 000035
2004298112.tif 000036
2004298112.tif 000037
2004298112.tif 000038
2004298112.tif 000039
2004298112.tif 000040
2004298112.tif 000041
2004298112.tif 000042
2004298112.tif 000043
2004298112.tif 000044
2004298112.tif 000045
2004298112.tif 000046
2004298112.tif 000047
2004298112.tif 000048
2004298112.tif 000049
2004298112.tif 000050
2004298112.tif 000051
2004298112.tif 000052
2004298112.tif 000053
2004298112.tif 000054
2004298112.tif 000055
2004298112.tif 000056
2004298112.tif 000057
2004298112.tif 000058
2004298112.tif 000059
2004298112.tif 000060
2004298112.tif 000061
2004298112.tif 000062
2004298112.tif 000063
2004298112.tif 000064
2004298112.tif 000065
2004298112.tif 000066
2004298112.tif 000067
2004298112.tif 000068
2004298112.tif 000069
2004298112.tif 000070
2004298112.tif 000071
2004298112.tif 000072
2004298112.tif 000073
2004298112.tif 000074
2004298112.tif 000075
2004298112.tif 000076
2004298112.tif 000077
2004298112.tif 000078
2004298112.tif 000079
2004298112.tif 000080
2004298112.tif 000081
2004298112.tif 000082
2004298112.tif 000083
2004298112.tif 000084
2004298112.tif 000085
2004298112.tif 000086
2004298112.tif 000087
2004298112.tif 000088
2004298112.tif 000089
2004298112.tif 000090
2004298112.tif 000091
2004298112.tif 000092
2004298112.tif 000093
2004298112.tif 000094
2004298112.tif 000095
2004298112.tif 000096
2004298112.tif 000097
2004298112.tif 000098
2004298112.tif 000099
2004298112.tif 000100
2004298112.tif 000101
2004298112.tif 000102
2004298112.tif 000103
2004298112.tif 000104
2004298112.tif 000105
2004298112.tif 000106
2004298112.tif 000107
2004298112.tif 000108
2004298112.tif 000109
2004298112.tif 000110
2004298112.tif 000111
2004298112.tif 000112
2004298112.tif 000113
2004298112.tif 000114
2004298112.tif 000115
2004298112.tif 000116
2004298112.tif 000117
2004298112.tif 000118
2004298112.tif 000119
2004298112.tif 000120
2004298112.tif 000121
2004298112.tif 000122
2004298112.tif 000123
2004298112.tif 000124
2004298112.tif 000125
2004298112.tif 000126
2004298112.tif 000127
2004298112.tif 000128
2004298112.tif 000129
2004298112.tif 000130
2004298112.tif 000131
2004298112.tif 000132
2004298112.tif 000133
2004298112.tif 000134
2004298112.tif 000135
2004298112.tif 000136
2004298112.tif 000137
2004298112.tif 000138
2004298112.tif 000139
2004298112.tif 000140
2004298112.tif 000141
2004298112.tif 000142
2004298112.tif 000143
2004298112.tif 000144
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号２１に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号２２）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図２】配列番号２３に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号２４）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図３】配列番号２５に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号２６）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図４】配列番号２７に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号２８）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図５】配列番号２９に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号３０）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図６】配列番号３１に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号３２）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図７】配列番号３３に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号３４）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図８】配列番号３５に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号３６）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図９】配列番号３７に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（配列番号３８）と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図１０】配列番号３９に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図１１】配列番号４０に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図１２】配列番号４１に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチドと、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。
【図１】
2004298112.tif 000145
【図２】
2004298112.tif 000146
【図３】
2004298112.tif 000147
【図４】
2004298112.tif 000148
【図５】
2004298112.tif 000149
【図６】
2004298112.tif 000150
【図７】
2004298112.tif 000151
【図８】
2004298112.tif 000152
【図９】
2004298112.tif 000153
【図１０】
2004298112.tif 000154
【図１１】
2004298112.tif 000155
【図１２】
2004298112.tif 000156