(57)【要約】【課題】水中病原ウイルスを特異的かつ強固に吸着除去する手法を開発することである。【解決手段】ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質、好ましくは、ウイルスのキャプシドタンパク質ＶＰ１に対する親和性を有する該タンパク質、特に、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：（ａ）配列番号１に示したアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１に示したアミノ酸配列において、一つ若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードするＤＮＡ、並びに、その用途、特に、該タンパク質を用いて水中病原ウイルスを特異的かつ強固に吸着除去する方法。【選択図】  図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質。
【請求項２】
ウイルスのキャプシドタンパク質ＶＰ１に対する親和性を有する、上記請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ウイルス粒子表面から外側に突出し抗原抗体反応に関与するペプチドに対する親和性を有する、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が、９４ｋＤａ、４３〜６７ｋＤａ又は１４．４〜３０ｋＤａのいずれかであることを特徴とする、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
ウイルスがピコルナウイルス科に属するウイルスである、上記請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
ウイルスがエンテロウイルス属に属するウイルスである、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
ウイルスがポリオウイルスに属するウイルスである、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量２５ｋＤａを有し、そのＮ末端の２２個のアミノ酸配列が「ＡＤＹＳＧＤＩＨＫＮＤＹＫＷＦＱＦＮＬＭＧＴ」であることを特徴とする、ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質。
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示したアミノ酸配列において、一つ若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ：
（ａ）配列番号１に示したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示したアミノ酸配列において、一つ若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示した塩基配列、
（ｂ）配列番号２に示した塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項１３】
活性汚泥細菌のゲノムＤＮＡであることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５記載の組換えベクターを含む形質転換大腸菌。
【請求項１７】
請求項１５又は１６記載の形質転換体を培養し、形質転換体の不溶性画分からタンパク質を抽出し、抽出物からアフィニティクロマトグラフィを用いて目的タンパク質を精製することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１８】
タンパク質変性剤を含む溶解緩衝液を用いて、細菌の不溶性画分から細菌タンパク質を抽出することを特徴とする、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質を活性成分として含有するウイルス吸着材。
【請求項２０】
水中の病原ウイルスを除去することが出来る、請求項１９に記載のウイルス吸着材。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載のウイルス吸着材を含む液体処理装置。
【請求項２２】
ウイルスを含む可能性のある液体を請求項１９又は２０に記載のウイルス吸着材で処理することからなる、該液体からウイルスを除去する方法。
【請求項２３】
請求項１９又は２０に記載のウイルス吸着材を充填したカラムにウイルスを含む可能性のある液体を通過させることを特徴とする、該液体からウイルスを連続的に除去する方法。
【請求項２４】
ウイルスが病原ウイルスである、請求項２２又は２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質（以下、「ウイルス吸着タンパク質（ＶＢＰ）」ともいう）、及びそれをコードするＤＮＡ、並びに、その用途、特に、該タンパク質を用いて水中病原ウイルスを特異的かつ強固に吸着除去する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、水環境における病原ウイルス汚染が数多く報告されている（非特許文献１）。病原ウイルスは感染者の糞便を介して下水へ流入するが、下水処理場において塩素消毒がなされても完全には不活化されず、下水処理水に混入した形で水環境中へ放出される。その結果、病原ウイルスは河川、海洋、地下水といった様々な水環境を汚染することになる。さらに、病原ウイルスに汚染された水源から取水し、浄水処理の過程で十分なウイルス不活化がなされなかった場合、水道水からも病原ウイルスが検出される状況が生じうる。
【０００３】
以上のような水環境における病原ウイルス汚染により、ウイルスによる水系感染症発生のリスクが生じる。検出が困難なほど低濃度のウイルス汚染であっても、ウイルスは細菌と比較して非常に少ない量の摂取でも感染を引き起こすため（非特許文献２）、感染症発生リスクは大きくなる。さらに、高齢化による抵抗力の低下した人々の増加、国際化・地球温暖化による外来ウイルスの出現等の社会構造や環境の変化に伴って、病原ウイルスによる感染症発生リスクが増加することも懸念されている。
【０００４】
水中病原ウイルスによる水系感染症発生のリスクを十分に低減させることは容易ではない。なぜなら、水中病原ウイルスは比較的高い塩素耐性を持っており（非特許文献３）、塩素消毒のみでは十分な不活化は難しいからである。他の消毒手法としてオゾンおよび紫外線消毒等が実用化されているが、ウイルスの種類や汚染のレベルにより不活化の効力が変動し、さらに高い運転コストが要求される。また、精密ろ過膜（ＭＦ）や限外ろ過膜（ＵＦ）がウイルス除去に利用できる可能性があるが、膜分離はエネルギー消費が大きいことやメンテナンスが煩雑であるといった短所がある。
【０００５】
既往の研究により、ウイルスが活性汚泥によく吸着することが知られており（非特許文献４）、特にバイオポリマーと呼ばれる細菌菌体外のタンパク質や多糖類などの高分子物質がウイルス吸着に関与していると考えられている（非特許文献５）。このバイオポリマーの構成成分としてタンパク質の占める割合が大きいことから（非特許文献４）、活性汚泥中にウイルスを吸着するタンパク質が存在している可能性が高いと考えた。このようなタンパク質をウイルスの吸着材として用いることが可能であれば、水中ウイルスを特異的に吸着除去する新たな技術を開発することが可能である。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｇｏｒｄｏｎ  Ａ．  Ｍｃｆｅｔｅｒｓ編、金子光美監訳：飲料水の微生物学、  技報堂出版、  １９９２
【非特許文献２】
Ｒｏｓｅ，  Ｊ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｇｅｒｂａ，  Ｃ．  Ｐ．：Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｈｅａｌｔｈ  ｒｉｓｋｓ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｌａｉｍｅｄ  ｗａｔｅｒｉｎ  Ａｒｉｚｏｎａ  ａｎｄ  Ｆｌｏｒｉｄａ、  ＵＳＡ  ．  Ｗａｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，  Ｖｏｌ．２３，  ｐｐ２０９１−２０９８，  １９９１
【非特許文献３】
Ｋｒｕｓｅ．  Ｃ．  Ｗ．，  Ｖ．  Ｐ．  Ｏｌｉｖｉｅｒｉ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｋａｗａｔａ．：Ｔｈｅ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈａｌｏｇｅｎｓ．  Ｗａｔｅｒ  ＆  Ｓｅｗａｇｅ  Ｗｏｒｋｓ．，  Ｖｏｌ．１１８，  ｐｐ１８７−１９３，  １９７１
【非特許文献４】
Ｋｉｍ  Ｔ．  ａｎｄ  Ｕｎｎｏ．  ：Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ａｎｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｗａｓｔｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｗａｔ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈ．  Ｖｏｌ．３３，  Ｎｏ．１０，  ｐｐ２４３−２５０，  １９９６
【非特許文献５】
Ｐａｎｃｏｒｄｏ  Ｏ．，  Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎ  Ｐ．，  Ｆａｒｒａｈ  Ｓ  ａｎｄ  Ｂｉｔｔｏｎ  Ｇ．：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｌｕｄｇｅ  ｔｙｐｅ  ｏｎ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｓｌｕｄｇｅ  ｓｏｌｉｄ．  Ｃａ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．２７，  ｐｐ．２７９−２８７，    １９８１
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、水中病原ウイルスを特異的かつ強固に吸着除去する手法を開発することである。本発明者は、鋭意研究の結果、ウイルス吸着タンパク質（Ｖｉｒｕｓ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＶＢＰ）、即ち、ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質を活性汚泥中の細菌から分離することに成功し、更に、ＶＢＰ  の特性及びアミノ酸配列、及びそれをコードする遺伝子の塩基配列等を実験的に明らかにし、本発明を完成させた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は第一の態様として、ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質に係る。ここで、「ウイルスに対する吸着活性」とは、ウイルスに特異的に吸着又は結合する性質、又は、ウイルスのキャプシドに特異的に結合する性質を意味し、具体的には、本明細書の実施例に示したように、ウイルス粒子を用いたＥＬＩＳＡによるウイルス吸着能評価方法により、ウイルスに対する有意な吸着能として評価されたものである。
【０００９】
このように、本発明のウイルス吸着タンパク質はウイルスのキャプシドに特異的に結合する性質を有しているために、本発明のタンパク質が吸着することができるウイルスの種類としては、特に、エンベロープがなく、キャプシド（ウイルスゲノムを包むタンパク質）がコートタンパク質として機能しているようなウイルスが好適である。このようなウイルスとしては数多くの種類が知られており、その代表的なものとしては、ＤＮＡ２本鎖ゲノムを有するアデノウイルス、及び、７．２〜８．３ｘ１０３塩基よりなる一本鎖ＲＮＡで（＋）鎖（ｍＲＮＡとして機能できる）を有するピコルナウイルス科に属するウイルス（ピコルナウイルス）等を挙げることができる。これらウイルスのキャプシドはいずれも正二十面体の立体対称構造を有している。
【００１０】
更に、ピコルナウイルスにおいては、ウイルスタンパク質ＶＰｇがｍＲＮＡゲノムの５’末端に共有結合しており、ウイルスＲＮＡの転写によりポリタンパク質が生成され、それが分断されて全てのウイルスタンパク質となる。その結果、ピコルナウイルス粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４と呼ばれるキャプシドタンパク質がそれぞれ６０個と１個のＶＰｇを末端に有するＲＮＡで構成されている。
【００１１】
ピコルナウイルスの代表的な例として、エンテロウイルス（エンテロウイルス属に属するウイルス）及びＡ型肝炎ウイルスなどを挙げることが出来る。更に、エンテロウイルスの例として、ポリオウイルス、エコーウイルスやコクサッキーウイルス等の水系ウイルス感染症を引き起こす種が数多く存在する。
【００１２】
その中でも、弱毒ポリオウイルスＩ型（ＰＶ１）はエンテロウイルスの中で最もよく研究がなされており、物理的性質、化学的性質、ＲＮＡ  配列、外殻タンパク質（キャプシドタンパク質）のアミノ酸配列および３次元構造、並びに抗原サイト等が明らかになっている。ＰＶ１  外殻タンパク質はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４  の４種類のタンパク質で構成されている（Ｈｏｇｌｅ  Ｊ．，  Ｃｈｏｗ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｆｉｌｍａｎ  Ｄ．：Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ａｔ  ２．９  Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９，  ｐｐ．１３５８−１３６５，  １９８５。）。このようなＰＶ１とエンテロウイルスに属する他のウイルスとは構造上の類似している点（例えば、キャプシドタンパク質が正二十面体の立体対称をとること）があるために、ＰＶ１を用いて行われた実験はこれらの病原ウイルスへも適用できる。
【００１３】
従って、本発明のウイルス吸着タンパク質の好適な例として、ウイルスのキャプシドタンパク質ＶＰ１、好適には、ウイルス粒子表面から外側に突出し抗原抗体反応に関与するペプチド、より具体的には、ポリオウイルスＩ型キャプシドタンパク質ＶＰ１の９３〜１０４番目のアミノ酸から成るペプチドに対する親和性を有するタンパク質を挙げることが出来る。ここで、本発明に係る所望のウイルス吸着タンパク質の「親和性」とは、該タンパク質と該ペプチドとの間に、該タンパク質を、例えば、該ペプチドを結合させたアフィニティクロマトグラフィによって有意に分離することが可能な相互作用が働くことを意味する。
【００１４】
更に、本発明のウイルス吸着タンパク質の好適例として、以下の実施例に示すようなＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて示される分子量が、９４ｋＤａ、４３〜６７ｋＤａ又は１４．４〜３０ｋＤａのいずれかであることを特徴とするタンパク質を挙げることが出来る。更に、本発明のウイルス吸着タンパク質には、これら各分子量を有する複数の種類のタンパク質を任意の割合で含む混合物も含まれるものである。
【００１５】
上記ウイルス吸着タンパク質の一例として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量２５ｋＤａを有し、そのＮ末端の２２個のアミノ酸配列が「ＡＤＹＳＧＤＩＨＫＮＤＹＫＷＦＱＦＮＬＭＧＴ」（表２中のスポット４のタンパク質のＮ末端アミノ酸配列）であることを特徴とするタンパク質を挙げることができる。
【００１６】
本発明のウイルス吸着タンパク質のより好適な例として、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示したアミノ酸配列において、一つ若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質、がある。
【００１７】
上記（ｂ）のタンパク質は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的同一のタンパク質であり、例えば、配列番号：１で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるアミノ酸配列からなり、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るタンパク質と実質的に同質の生物学的活性を有するタンパク質を挙げることが出来る。ここで、実質的に同質とは、それらの活性が性質として同一であって、具体的には、ウイルスに対する吸着活性を示す。
【００１８】
本発明のタンパク質は、以下の実施例に示されるように、活性汚泥細菌（活性汚泥中に含まれる細菌）から調製することが出来る。更に、本明細書中の実施例にも示されるように、以下に示す本発明のＤＮＡを用いて、当業者に公知の遺伝子工学的手段により大量に製造することも可能である。
【００１９】
したがって、本発明は第二の態様として、上記タンパク質をコードするＤＮＡにかかる。本発明ＤＮＡの好適例としては、
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ：
（ａ）配列番号１に示したアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示したアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質、又は、
以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示した塩基配列、
（ｂ）配列番号２に示した塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ウイルスに対する吸着活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、を挙げることが出来る。
【００２０】
配列番号２に示した塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることが出来る。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  （ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ  Ｎｏ．  １１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ  Ｎｏ．  １６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、４０℃の０．１ｘＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ヒトＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。
【００２１】
本発明のＤＮＡとしては、前述した本発明のタンパク質をコードする塩基配列から成るものであればいかなるものであってもよい。例えば、活性汚泥細菌を好気培養し、培養された任意の細菌ゲノムに由来するＤＮＡライブラリー、或いは、該細菌よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することにより得られたｃＤＮＡライブラリー等から当業者に公知のクローニング手段を用いて、同定・単離された各種ＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡのいずれでもよい。尚、ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
【００２２】
本発明のＤＮＡのクローニング手段としては、本発明のタンパク質の末端部分等の適当な部分の塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを含むライブラリーと本発明のタンパク質のＮ末端等の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したプローブとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素キット（ギブコＢＲＬ社）等を用いて、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、ヘキサヒスチジンペプチド等のリンカー及び適当な制限酵素部位等を付加したりして使用することができる。
【００２３】
尚、本発明ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２４】
本発明は、更なる態様として、上記ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体を培養し、それから本発明タンパク質を製造する方法に係る。
【００２５】
本発明の組換えベクターは形質転換体中で複製し、そこに含まれる本発明ＤＮＡを発現することが出来る構造を有するものである。
【００２６】
本発明のタンパク質の組換えベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することが出来る。例えば、（１）本発明のＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な組換えベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。組換えベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、あるいはＳＶ４０、ＣＭＶウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ウシパピローマウイルスなどの動物ウイルス由来配列を使用した組換えベクター等を利用することが出来る。
【００２７】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
【００２８】
組換えベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされたタンパク質を他のタンパク質又はペプチド（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、カルモデュリンバインディングタンパク質、及びプロテインＡ等）との融合タンパク質として発現させることも可能である。このような融合タンパク質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれのタンパク質に分離することが出来る。
【００２９】
本発明のベクターにより形質転換される宿主細胞としては、当業者に公知の任意の細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：エシェリヒア属菌）、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。大腸菌の具体例としては、ＤＨ５α、ＢＬ２１、大腸菌Ｋ１２由来のＤＨ１（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、６０巻、１６０（１９６８））、ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９巻、３０９（１９８１））、ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２０巻、５１７（１９７８））、及びＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４１巻、４５９（１９６９））、あるいは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｂ株等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ、２４巻、２５５（１９８３））、２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９５巻、８７（１９８４）〕等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。
【００３０】
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことが出来る。例えば、以下に記載の文献を参照することが出来る。Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６９巻、２１１０（１９７２）；  Ｇｅｎｅ，  １７巻、１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，  １１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻、１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、７５巻、１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８  新  細胞工学実験プロトコール。２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻、４５６（１９７３）。
【００３１】
このようにして得られた、本発明の組換えベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することが出来る。例えば、形質転換体が大腸菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００３２】
本発明タンパク質は、当業者に公知の方法に従い、上記形質転換体を培養し、その培養物から製造することができる。例えば、上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る。又、目的とするタンパク質が細胞内の封入体等の不溶性画分に含まれる場合には、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤を含む溶解緩衝液を用いてこのタンパク質を可溶化することも出来る。更に、緩衝液にはトリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。このようにして得られた培養上清、あるいは細胞の封入体等の各成分からの抽出液中に含まれるタンパク質はアフィニティクロマトグラフィのようなカラムクロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィ、再結晶などの公知の分離・精製法を適切に組み合わせて精製することができる。
【００３３】
本発明の製造方法の好適例として、以下の実施例にあるように、該形質転換体を培養し、形質転換体の不溶性画分からタンパク質を抽出し、抽出物からアフィニティクロマトグラフィを用いて目的タンパク質を精製することを含む方法を挙げることが出来る。融合タンパク質として産生させた場合には、他のタンパク質又はペプチドを利用したアフィニティクロマトグラフィ用いて融合タンパク質を精製した後に、適当なタンパク質限定分解酵素を用いて不必要なタンパク質部分を除去することもできる。
【００３４】
本発明タンパク質又はその塩の存在は、以下の実施例にも示されているように、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００３５】
こうして得られた本発明のタンパク質は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に、メチオニンアミノペプチダーゼを用いてＮ−末端メチオニンを除去したり、ミリストイル転移酵素を用いてＮ−末端アミノ酸のミリストイル化を行ったり、アセチルトランスフェラーゼを用いてＮ−末端アミノ酸のアセチル化を行ったり、或いはその他の修飾酵素を用いることにより任意にアミノ酸の修飾を行うことが出来る。又、Ｃ−末端を修飾するプロセシングカルボキシルペプチダーゼ、Ｃ−末端アミド化酵素等を作用させてＣ−末端アミノ酸を修飾することも出来る。更に、トリプシン、キモトリプシン、ＦａｃｔｏｒＸａ、トロンビン、又は、ＫＥＸ２プロテアーゼのような適当な蛋白限定分解酵素を作用させることにより、タンパク質を部分的に除去することもできる。
【００３６】
こうして得られる本発明のタンパク質はピコルナウイルス科に属するウイルスに対する吸着活性を有するために、ウイルス吸着材の活性成分として利用し、特に、水中の病原ウイルスを除去することが出来る。
【００３７】
従って、本発明は、かかるタンパク質を活性成分として含有するウイルス吸着材にもかかる。このようなウイルス吸着材は、その使用環境・態様、処理する液体の種類などに応じて、当業者に公知の様々な形態をとることが可能である。例えば、適当な材質・形状の担体の表面等に直接又は適当なリンカー等を介して結合、吸着又は固定化させてこれを適当な形態のカラム等に充填して使用することが出来る。このようなカラム等の調製方法自体は当業者に公知である。
【００３８】
本発明は、このようなウイルス吸着材を含む液体処理装置にも係る。装置の構造、構成などに特に制限はない。ウイルス吸着材の種類、使用環境・態様、処理の規模、処理する液体の種類等に応じて、当業者に適宜設計することが可能である。その一例として、ウイルス吸着材を充填したカラムを構成要素の一つとして含むような装置を挙げることが出来る。
【００３９】
従って、本発明は、更に、ウイルスを含む可能性のある液体をこのようなウイルス吸着材又は該ウイルス吸着材を含む水処理装置で処理することからなる、該液体からウイルス、特に、病原ウイルスを除去する方法に係る。この方法の一例として、ウイルス吸着材を充填したカラムにウイルスを含む可能性のある液体を通過させて、該液体からウイルスを連続的に除去する方法が考えられる。
【００４０】
このようなウイルスを含む可能性のある液体としては、例えば、河川、海洋、地下水といった様々な水環境を構成する水、更に、水道水等の飲料水を挙げることが出来る。
【００４１】
【発明の実施の形態】
以下に実施例を挙げながら本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。従って、これらの実施例は本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限するものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
【００４２】
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、当該技術分野において標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとって周知で慣用的なものである。
【００４３】
尚、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、ＤＮＡ  クローニングでは  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９）及び  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｄ．，  “ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  １  ｔｏ  ４，  （Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  ＩＲＬＰｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）  ；  特にＰＣＲ  法では、Ｈ．  Ａ．  Ｅｒｌｉｃｈｅｄ．，  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９  ；  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｄ．，“ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  １，  （Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  ＩＲＬＰｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）及び  Ｍ．  Ａ．  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｄ．，“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９０）に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）  や添付の薬品等を使用している。
【００４４】
【実施例１】
活性汚泥細菌由来のタンパク質抽出
（１）活性汚泥細菌の培養・回収
本実施例で用いる活性汚泥サンプルとして、仙台市内の２カ所の下水処理場の最終沈殿池から返送汚泥を採取した。採取した返送汚泥中の細菌を培養するため、返送汚泥を種汚泥として液体培地中で好気培養を行った。まず、採取した返送汚泥１００ｍＬ  を遠心分離（１０分、１，０００×ｇ、４℃）し、上清を２Ｌの液体培地に混合した。液体培地には普通ブイヨン培地（極東）を用いた。培養中はポンプとガラスボールフィルターおよび滅菌済除菌用フィルター（０．４５μｍ）を用いて送気し、２０  ±  ３℃の恒温室で２４  時間好気培養を行った。培養後、５０ｍＬ  遠沈管を用いて培養液を遠心分離（１５分、３，０００×ｇ、４℃）し、上清を捨て菌体ペレットを回収した。回収したペレットは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液（ｐＨ：８．０）中に分回収散後、再び遠心分離（１５  分、３，０００×ｇ、４℃）を行い、上清を捨てることによって洗浄した。ペレットの洗浄は２回行った。洗浄した後、ペレットは−８０℃の冷凍庫中で保存した。
【００４５】
（２）活性汚泥細菌からのタンパク質抽出
細菌が産出するタンパク質を抽出する一般的な方法として、有機溶媒（ｎ−ブタノール等）を用いて細菌外膜を可溶化する方法がある。しかし、この方法では疎水性および両親媒性タンパク質を回収することは困難であることが予想された。そこで、疎水性タンパク質の水溶性を増加させる働きのある尿素を用いることで、親水性タンパク質だけでなく疎水性および両親媒性タンパク質の回収を試みた。本発明では、有機溶媒としてｎ−ブタノールを用いる方法と尿素を用いる方法の２種類の抽出法で活性汚泥細菌からのタンパク質の抽出を行った。まず、（１）で収集し、‐８０℃で凍結保存した細菌ペレットを３０℃で融解した。融解したペレットから、次の２種類の抽出法によりタンパク質を抽出した。
【００４６】
▲１▼  尿素を用いた細菌タンパク質抽出法
尿素１Ｍ  を溶解させた２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液（ｐＨ：８．０）をペレット１ｇ  当たり１ｍＬ  の割合で加え、ボルテクスミキサーで攪拌後、超音波処理（５０Ｗ、２  分）を行うことによって緩衝液中にタンパク質を誘出させた。その後、遠心分離（３０  分、２０，０００×ｇ、４℃）を行い、上清を回収して抽出タンパク質溶液とした。
▲２▼  有機溶媒を用いた細菌タンパク質抽出法
ペレット１ｇ  当たりそれぞれ１ｍＬ  の割合で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液（ｐＨ：８．０）とｎ−ブタノールを加え、ボルテクスミキサーで攪拌後、超音波処理（５０Ｗ、２  分）を行うことによって緩衝液中にタンパク質を誘出させた。その後、遠心分離（３０分、２０，０００×ｇ、４℃）を行い、ペレットとｎ−ブタノール層の中間に位置する水層を回収して抽出タンパク質溶液とした。それぞれの方法で抽出したタンパク質は直ちに２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ：８．０、４℃）中で透析（透析緩衝液は３時間後に交換後、一晩攪拌）を行い、脱塩及び有機溶媒、尿素の除去を行った。
【００４７】
【実施例２】
Ｖ  Ｂ  Ｐ  の分離
（１）アフィニティクロマトグラフィによるＶ  Ｂ  Ｐ  の分離
本実施例では、吸着除去対象ウイルスとして弱毒ポリオウイルスＩ  型（ＰＶ１）を選択した。  既に記載したように、ＰＶ１  外殻タンパク質はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４の４種類のタンパク質で構成されている。これらのキャプシドタンパク質の中で、ウイルス粒子表面から外側へ突出し、かつ抗原抗体反応に関与することが知られているＶＰ１  の９３〜１０４  番目のアミノ酸から構成されるペプチド（Ｈ２Ｎ−ＤＮＰＡＳＴＴＮＫＤＫＬ−ＣＯＯＨ）を人工的に合成し、アフィニティカラム担体に結合させた。このペプチドを固定化したカラムを用いてアフィニティクロマトグラフィを行うことにより、ＰＶ１外殻ペプチドに親和性を有するタンパク質の分離を試みた。０．４５μｍのフィルターでろ過した抽出タンパク質をアフィニティクロマトグラフィに用いるサンプルとした。開始緩衝液（２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ：８．０）でサンプルをアフィニティカラムに導入し、抽出タンパク質中のＶＢＰ  をアフィニティカラム中のリガンドに結合させた。次に、結合したＶＢＰ  を溶出緩衝液（０．０２Ｍ  酢酸、６Ｍ  尿素、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  、ｐＨ：３．０）でカラムから溶出させた。この際１ｍＬずつフラクションを回収し、リガンドに特異的に結合したタンパク質の分離回収を行った。
【００４８】
アフィニティクロマトグラフィによるＶ  Ｂ  Ｐ  の分離を図１に示した。下水処理場Ａ  で採取した汚泥において、尿素を用いた抽出タンパク質からのアフィニティクロマトグラフィによるＶＢＰ  分離結果を図１▲１▼に、有機溶媒（ｎ−ブタノール）を用いた抽出タンパク質からのアフィニティクロマトグラフィによるＶＢＰ  分離結果を図１▲２▼にそれぞれ示した。また、下水処理場Ｂ  で採取した汚泥において、尿素を用いた抽出タンパク質からのアフィニティクロマトグラフィによるＶＢＰ  分離結果を図１▲３▼に、有機溶媒（ｎ−ブタノール）を用いた抽出タンパク質からのアフィニティクロマトグラフィによるＶＢＰ  分離結果を図１▲４▼にそれぞれ示した。溶出緩衝液添加後に検出されるピークがアフィニティカラム中でＰＶ１  外殻ペプチドに結合していたタンパク質の存在を表している。
【００４９】
下水処理場Ａ  で採取した尿素抽出タンパク質からのみ大きいピークが検出された（図１▲１▼）。同じ条件で繰り返し実験を行ったところ、ピーク高さは４０  〜  ２００ｍＡＵ  の範囲で変動したものの、ピーク出現位置に関しては再現性が高かった。それに対し、ｎ−ブタノールを用いた抽出タンパク質からはピークは確認できなかった。これらの結果については以下のように考察される。尿素にはタンパク質分子内の極性部位（カルボニル基等）と強く水素結合することで、タンパク質分子全体の親水性を増加させる働きがある（堀尾武一編：タンパク質・酵素の基礎実験法、南江堂、１９９４）。すなわち、尿素を用いた抽出法では、この働きによって疎水性タンパク質の溶解度が高まり、有機溶媒を用いた抽出法では抽出されにくい疎水性および両親媒性タンパク質も抽出されると考えられる。このため、幅広い特性を持つ抽出タンパク質が得られ、その結果、ＶＢＰ  を高効率で得ることが可能であったと考えられる。
【００５０】
一方、下水処理場Ａ、Ｂ由来の抽出タンパク質における結果を比較すると、どちらの下水処理場由来の抽出タンパク質においても、尿素抽出タンパク質の場合にはピークが確認できた。しかし、下水処理場Ｂ由来の尿素抽出タンパク質において検出されるピークは、下水処理場Ａ由来の尿素抽出タンパク質において検出されるピークと比較して明らかに小さく、実験を繰り返した場合のピーク高さの変動は５〜２０ｍＡＵであった。この結果の違いに関しては明らかではないものの、下水処理場Ａ  は嫌気好気法、下水処理場Ｂは標準活性汚泥法を採用していることから、この処理方法の違いにより汚泥中細菌相に違いが生じ、上述のようなピーク高さの違いが生じたのではないかと推測された。
【００５１】
（２）ＶＢＰ  の濃縮
上記の各アフィニティクロマトグラフィの溶出フラクション２０ｍＬを１０ｍＭ  重炭酸アンモニウム（ｐＨ：８．０、４℃）で透析した。その際、透析緩衝液は３時間ごとに２  回交換し、その後一晩透析した。その後、２ｍＬ  容試験管２０  本に１ｍＬ  ずつ分注し、６０℃で真空遠心を行って溶媒を蒸発させ、各試験管内のサンプル体積を１００μＬまで減少させた。試験管１０  本分を１  本の試験管に集め、再び真空遠心を行い体積が０．５ｍＬ  になるまで溶媒を蒸発させた。２  本の試験管それぞれに対して３倍容の冷却アセトン（−２０℃）を添加し、−８０℃で１  時間静置した後、遠心分離（１５  分、１０，０００  ×  ｇ、４℃）によりＶＢＰのペレットを得た。上清を捨てた後、４５℃で１０分間真空遠心を行うことによりアセトンを蒸発させ、ＶＢＰを乾燥させた。
【００５２】
【実施例３】
Ｖ  Ｂ  Ｐ  特性評価
（  １  ）  Ｅ  Ｌ  Ｉ  Ｓ  Ａ  法によるＶ  Ｂ  Ｐ  のウイルス吸着能評価
前節までに得られたＶＢＰ  は、ＰＶ１  外殻タンパク質の一部と同じ配列を持つ合成ペプチドへの親和性により分離されたものであり、ＰＶ１粒子そのものを吸着する能力に関しては確認されていない。そこで、このＶＢＰ  がＰＶ１  粒子に対する吸着活性を持つことを確認するためにＥＬＩＳＡ法を行った。また、ウイルス吸着能力を比較するためにアフィニティクロマトグラフィに導入する前の抽出タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ  法も行った。
【００５３】
１）  ＥＬＩＳＡ  法の手順
詳細を以下に記述する。
プレートへのＶＢＰ（もしくは抽出タンパク質）の吸着とブロッキング
９６  穴プレートに５０ｍＭ  炭酸緩衝液（ｐＨ：９．０）に溶解したＶＢＰ（もしくは抽出タンパク質）を５０μＬ／ウェルずつ注入し、室温で２時間放置することでプレート表面にＶＢＰ  を吸着させた。その後ＶＢＰ  溶液を取り除き、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。洗浄後、５％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ  をウェル一杯に満たし、４℃で一晩静置することでブロッキングを行った。
ＰＶ１  とＶＢＰ（もしくは抽出タンパク質）の結合
プレートのＢ  Ｓ  Ａ  を捨てた後、Ｐ  Ｂ  Ｓ  で２回ウェルの洗浄を行った。その後、５％ＢＳＡ  を含むＰＢＳ  で１０６  ＰＦＵ  ／  ｍｌ  に希釈したＰＶ１懸濁液（東京都立衛生研究所より分与されたもの）を１００μＬ／ウェルずつ注入し、室温で１時間反応させることでＶＢＰ（もしくは抽出タンパク質）にＰＶ１  を結合させた。
ＰＶ１  と一次抗体の結合
ＰＶ１  懸濁液を捨て、ウェルをＰＢＳ  で２回洗浄した後、マウス抗ＰＶ１（フナコシ社製）を５０μＬ／ウェルずつ注入し、室温で１時間反応させることでＰＶ１  に一次抗体を結合させた。
二次抗体結合
抗体を捨て、ウェルをＰＢＳ  で２回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）標識ウサギ抗マウス免疫グロブリン抗体（フナコシ社製）を５０μＬ  ／ウェルずつ注入し、室温で１時間反応させることで、一次抗体に二次抗体を結合させた。
発色
抗体を捨て、ウェルをＰＢＳ  で３回洗浄した後、オルソフェニレンジアミン（ＯＰＤ）発色基質溶液（クエン酸（１水）  ０．５１  ｇ，  リン酸水素二ナトリウム（１２水）  １．８４  ｇ，  ＯＰＤ  （ＳＩＧＭＡ、Ｐ−７２８８  ）を一錠、３０％過酸化水素水３０μＬ、蒸留水１００ｍＬ  ）  を１００μＬ／ウェルずつ注入し、３０  分間静置することで。二次抗体の標識を発色させた。反応後、２Ｍ  硫酸を５０μＬ／ウェルずつ加えて反応を停止させ、ＥＬＩＳＡ  プレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＳ，  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）で吸光度Ａ４９２を測定した。
【００５４】
２  ）  Ｖ  Ｂ  Ｐ  のウイルス吸着能評価方法
ＥＬＩＳＡプレート中では、  標識抗体がＰＶ１粒子、ＢＳＡ、ＶＢＰ（もしくは抽出タンパク質）と結合することで様々な複合体を形成するが、そのうちＶＢＰ  （もしくは抽出タンパク質）  に吸着したＰＶ１へ抗体が特異的に結合することで形成される、抗体−ＰＶ１−ＶＢＰ  （もしくは抽出タンパク質）  複合体の量により吸着ウイルス量を評価することができる。表１  に示す条件でＥＬＩＳＡ  を行い、以下の式（１）を用いて換算することにより、抗体−ＰＶ１−ＶＢＰ  （もしくは抽出タンパク質）  複合体による吸光度を得た（吸光度の線形性を仮定）。
抗体−ＰＶ１−ＶＢＰ  （もしくは抽出タンパク質）  複合体による吸光度Ａ４９２
＝  （▲１▼の吸光度−  ▲３▼の吸光度）−（▲２▼の吸光度−  ▲４▼の吸光度）
次に、式（１）  で得られた吸光度をＶＢＰ  （もしくは抽出タンパク質）  の濃度１％（ｗ  ／  ｖ）当たりの吸光度に換算し、この値を用いてウイルス吸着能を評価した。その結果を図２に示した。
【００５５】
【表１】
2004254627.tif 000003
【００５６】
図２に示された結果から、ＶＢＰ  は、ＶＢＰ  を含む様々な種類のタンパク質が混在している活性汚泥中からの抽出タンパク質（アフィニティクロマトグラフィに用いたサンプル）と比較して、約１５  倍の単位タンパク質当たりの吸光度を示した。このことは、ＰＶ１外殻ペプチドをリガンドとして利用したアフィニティクロマトグラフィにより、抽出タンパク質から効率的にＶＢＰ  が分離されたことを示している。さらに、外殻ペプチドへの親和性により分離されたＶＢＰ  が、ＰＶ１  粒子に対して高い吸着活性を有することが示された。この結果は、ウイルスの外殻ペプチドをリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィを利用して本発明のＶＢＰ  を分離することが可能であることを示す同時に、ＰＶ１  以外の水中ウイルスに対して親和性の高いＶＢＰ  分離への応用も可能であることも示すものである。
【００５７】
（  ２  ）  ＳＤＳ  −  ＰＡＧＥによるＶＢＰの確認および分子量推定
図１▲１▼に示されたアフィニティクロマトグラフィにおけるピークからのＶＢＰフラクションのみを用いて、実施例２（２）で濃縮した後のフラクションに対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ  を行うことで、ＶＢＰ  の分子量を推定した。はじめに上記のように濃縮したタンパク質を５０ｍＭ  炭酸緩衝液（ｐＨ：９．０）１８０μＬ  で溶解した。このタンパク質溶液１０μＬ  に対し、２×ＳＤＳ  処理緩衝液を１０μＬ  加え、９５℃で５  分間沸騰させることでタンパク質を完全に変性させ、負に帯電した状態にした。その後、サンプルを１０％  ポリアクリルアミドゲルのウェルに１０μＬ  注入し、２０ｍＡ／  ゲルの定電流により９０  分間電気泳動を行った。泳動後のタンパク質を銀染色することで、分離タンパク質の確認と分子量の推定を行った。
【００５８】
図３にＳＤＳ−ＰＡＧＥ  の結果を示した。レーンｂ  に見られるバンドはタンパク質の存在を示している。レーンａの分子量マーカーとの比較から、Ｖ  Ｂ  Ｐ  は、分子量９４．０ｋＤａ  付近に２  本のバンド、４３．０〜  ６７．０ｋＤａ  に３  本のバンド、さらに１４．４  〜  ３０．０ｋＤａ  に数本のバンドが形成されていることが明らかになった。それぞれのバンドは複数のタンパク質から成るものと考えられ、ＶＢＰ  として分離されたタンパク質は多種にわたることが確認された。
【００５９】
（  ３  ）  イオン交換クロマトグラフィによるＶ  Ｂ  Ｐ  の表面荷電評価
本発明では、ＶＢＰ  と合成ペプチドの結合はタンパク質の３  次元構造を利用した特異的な相互作用による吸着であると考えている。しかしながら、アフィニティカラムに固定化された合成ペプチドの等電点は３．８８  であり、アフィニティクロマトグラフィの開始緩衝液の条件下（ｐＨ：８．０）では負に帯電しているため、正の総電荷を持つタンパク質が静電的な引力によって非特異的に結合した可能性がある。そこで、イオン交換クロマトグラフィを用いてＶＢＰ  の表面荷電評価を行った。陽イオン交換クロマトグラフィおよび陰イオン交換クロマトグラフィのカラムとして，ＨｉＴｒａｐＴＭＳＰ（  １ｍｍ  ）、ＲＥＳＯＵＲＣＥＴＭＱ  （  １ｍｍ  ）をそれぞれ用いた。  開始緩衝液には２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ：８．０）を、溶出緩衝液には１Ｍ  ＮａＣｌ  を添加した２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ：８．０）をそれぞれ用いた。尚、上記（２）の場合と同様に、図１▲１▼に示されたアフィニティクロマトグラフィにおけるピークからのＶＢＰフラクションのみを用いた。
【００６０】
図４に陽イオン交換クロマトグラフィの結果（上）、及び、陰イオン交換クロマトグラフィの結果（下）をそれぞれ示した。陽イオン交換クロマトグラフィでは溶出緩衝液添加前にピークが検出されているが、陰イオン交換クロマトグラフィでは溶出緩衝液添加後にピークが検出されている。これらの結果から、アフィニティクロマトグラフィにおけるＶＢＰ  とリガンド（合成ペプチド）の結合時において、ＶＢＰ  のほとんどが負の表面荷電を持っていると考えられた。一方、前章で述べたように、アフィニティクロマトグラフィの条件下では、ペプチドは負に帯電している。すなわち、ペプチドとＶＢＰ  の総電荷は共に負であるため、両者の間には静電的な引力は発生せず、逆に静電的な斥力が働いているはずである。それでもなおアフィニティクロマトグラフィによりＶＢＰが分離されたことから、ペプチド−ＶＢＰ間には静電的な斥力を上回る結合力が存在していたと考えられる。そのような強い結合力を生じさせるものとしては、抗原抗体反応に見られるような特異的相互作用が考えられるだろう。
【００６１】
【実施例４】
活性汚泥細菌からのＶ  Ｂ  Ｐ  ゲノムの単離
ＶＢＰを吸着材に使用する為には、その連続的な大量生産システムを確立する必要がある。その為に、まずＶＢＰ  ゲノム（遺伝子）を活性汚泥細菌から単離することを試みた。
【００６２】
（１）Ｖ  Ｂ  Ｐの２次元（２Ｄ）電気泳動
図１▲１▼に示されたアフィニティクロマトグラフィにおけるピークからのＶＢＰフラクション（全量１６０ｍｌ）を夫々４０ｍｌずつに４つに分け、以下の手順に従い、２次元電気泳動で処理した。尚、かかる操作は、タカラバイオ社（大津、滋賀、日本）に委託した。
【００６３】
まず、室温において２６時間攪拌することによって、ＶＢＰ  をタンパク質溶解緩衝液（５．２Ｍ  Ｕｒｅａ，２Ｍ  Ｔｈｉｏｕｒｅａ，  ２％のＣＨＡＰＳ、２％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、１％  Ｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  、０．２％の  Ｂｉｏ  −  Ｌｙｔｅ  ３−１０）に溶解した。溶解したＶＢＰは等電点電気泳動にかけ、次に、ナトリウムドデシル硫酸塩含有緩衝液（ＳＤＳ）によって変性させた。変性したＶＢＰ  は  ＳＤＳ  ？ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で処理し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）によって染色した。
【００６４】
尚、等電点電気泳動及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件は以下の通りである。
等電点電気泳動
濃縮ＶＢＰ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ２０ｍｌ分）に２９０μｌのタンパク質溶解Ｂｕｆｆｅｒ（５．２Ｍ尿素，２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳ，２％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、１％Ｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、０．２％Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ  ３−１０）を加えて軽くＶｏｒｔｅｘし、室温で２６時間撹拌した。
溶解したＶＢＰに対し、等電点電気泳動を行った。ゲルはＩＰＧ  Ｒｅａｄｙ  ｓｔｒｉｐ  １７ｃｍ  ｐＨ３−１０  （ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用し、装置はプロティアン  ＩＥＦセル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用した。泳動条件は以下の通りであった。
Ｓｔｅｐ  １．コンディショニング            ２５０Ｖ  ２時間
Ｓｔｅｐ  ２．コンディショニング            ５００Ｖ  ３時間
Ｓｔｅｐ  ３．電圧ランピング            １００００Ｖ  ２時間
Ｓｔｅｐ  ４．フォーカシング        ６００００ＶＨ  （１００００Ｖ  ＊  ６時間）
Ｓｔｅｐ  ５．ホールド                      ５００Ｖ  ２時間
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
等電点電気泳動後のゲルをＳＤＳ平衡バッファー▲１▼（６Ｍ  尿素，２％  ＳＤＳ，０．３７５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．８），２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２％  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）中で２５分間静かに揺らしながら浸し、次にＳＤＳ平衡バッファー▲２▼（６Ｍ  尿素，２％  ＳＤＳ，０．３７５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．８），２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２．５％  Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）中で１０分間静かに揺らして浸した。その後、１０％ポリアクリルアミドゲルで，２４ｍＡ定電流によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００６５】
その結果得られたＶＢＰの２次元電気泳動のプロフィールの一つを図５に示す。多くのスポットが観察され、アフィニティクロマトグラフィによって多数のタンパク質が分離されていたこと示されている。特に、多数の微細なスポットがｐＨ５と６の間において得られた。
【００６６】
（２）ＶＢＰ  のＮ末端のアミノ酸配列の決定
次に、ＶＢＰ  として分離されたタンパク質の種類を明らかにするために、これらのＶＢＰ  のアミノ酸の配列が決定されなければならない。そのために、同様に、タカラバイオ社（大津、滋賀、日本）に委託し、以下の手順で、これらのＶＢＰのＮ末端配列を分析した。
【００６７】
濃い色を有する５つのスポットに１〜５の番号を付して、ゲルからこれらの５つのスポットを３７℃において一晩、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の０．１％  ＳＤＳにて抽出した。抽出されたＶＢＰ  を膜フィルター（０．４５μｍ）に吸着させ、そして５０％の  アセトニトリル（一回目）及び１００％の  アセトニトリル（２回目）によって２度洗浄した。アセトニトリルを蒸発させた後ＶＢＰの溶媒をＭｉｌｌｉＱ  水に変えた。そして、ＶＢＰ  をタンパク質  シークエンサー（ＨＰ  ＧｌＯＯ５Ａ  タンパク質シークエンシングシステム、ヒューレット・パッカード）で処理した。
【００６８】
こうして得られた、図５において１〜５の番号を付された５つのＶＢＰのＮ末端配列を以下の表２に示した。表中、アミノ酸は所定の一文字標記で表わされている（「Ｘ」は同定不能）。２次元電気泳動ゲルから抽出されたそれぞれの  ＶＢＰ  の量が配列を分析するのに十分ではなかったので、ＶＢＰ  を抽出した４枚のゲルを合わせてタンパク質配列決定のために使用した。表２に示されるように、スポット１と４のＶＢＰのＮ末端の２２個のアミノ酸の配列が決定された。しかしながら、スポット２、３及び５の  ＶＢＰは十分に配列決定することは出来なかった。スポット２については、異なる種類のＶＢＰ  が重なり合っていたことがその理由と考えられる。一方、スポット３と５については、抽出されたＶＢＰ  の量がアミノ酸配列を決定するのには未だ十分ではなかったことが理由である。
【００６９】
【表２】
2004254627.tif 000004
【００７０】
これらの配列に関して、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のタンパク質データベースによるホモロジー検索（２００２年９月２１実施）を行った結果、スポット１のＶＢＰ（推定分子量７５ｋＤａ）に対して５つのタンパク質が８０％以上のホモロジーを示した。互いにタンパク質の分子量には明白な差があるけれども、グラム陰性の通性嫌気性細菌であり、腸内細菌に属する棒状のアレモナスヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ）の外膜タンパク質（受託番号：ＡＡＦ８７７２５）（アミノ酸数：３５５）が９０％と最も高いホモロジー（高ホモロジー範囲：アミノ酸２１‐４２）を有していた。他方、スポット４の  ＶＢＰ（推定分子量２５ｋＤａ）  に対しては２つのタンパク質がホモロジー検索で見出された。一本の極性鞭毛を有する腸内細菌であり、コレラの病原であるビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）の外膜タンパク質であるＯｍｐＫ  （受託番号：  ＮＰ＿２３  １９３６）（アミノ酸数：２９６）は８１％と最も高いホモロジー（高ホモロジー範囲：アミノ酸５１‐７７）を有していた（表３）。尚、表３中、実線は一致するアミノ酸を示し、破線は類似するアミノ酸を示す。
【００７１】
ビブリオコレラは伝染病これらの病原菌であり、ＯｍｐＫ  は  Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ  のＴ４様ウイルスに属する広範囲の宿主レンジを有する  ｖｉｂｒｉｏｐｈａｇｅ  ＫＶＰ４０に対する受容体として知られている。ＯｍｐＫ  の分子量はスポット４でのＶＢＰ  のそれに類似していた。従って、２２のアミノ酸の内で３つの明白な不一致がスポット４のＶＢＰ  と  ＯｍｐＫ  タンパク質との間に観察されたけれども、スポット４のＶＢＰ  が  ＯｍｐＫ  タンパク質に関連していることが予想される。又、ビブリオファミリーには多くの種が含まれているので、スポット４のＶＢＰはこれらのビブリオ種又はそれに関連する細菌によって産生されたものである可能性がある。
【００７２】
【表３】
2004254627.tif 000005
【００７３】
（３）ＶＢＰ  ゲノムの単離のためのＤＮＡプローブの構築
決定されたＮ末端の配列に基づき、コロニーハイブリダイゼーション技術によってＶＢＰ  ゲノムを単離するための、ＤＮＡプローブが組み立てられた。表４にスポット１と４の  ＶＢＰ  のために組み立てられたＤＮＡプローブの配列を示す。スポット１の  ＶＢＰ  の遺伝子用のミックスプローブとしては、最大コドン数（６つ）を有するアミノ酸をミックスプローブの配列から除外することが不可能であった為に、２シリーズのミックスプローブ（長さ３３ｂｐ  ）が構築された。これらのミックスプローブにおけるプローブの数は合計３６８６４（２４５７６  ＋  １２２８８）になる。これらの２つのミックスプローブを併せて、そしてコロニーハイブリダイゼーションによってスポット１のＶＢＰの遺伝子の単離のために使用した。
【００７４】
他方、スポット４からのＶＢＰ  の遺伝子のためのミックスプローブはコドンの最大の数を持っているアミノ酸なしで組み立てられることができる。かかるプローブの長さは３９ｂｐであり、その数は６１４４になる。尚、表４中において、「ｙ」シトシン又はチミンを意味し、「ｒ」はアデニン又はグアニンを意味し、「ｎ」はアデニン、シトシン、グアニン又はチミンを意味し、「ｈ」はアデニン、チミン又はシトシンを意味する。
【００７５】
【表４】
2004254627.tif 000006
【００７６】
（４）活性汚泥細菌からのＤＮＡライブラリーの構築
ＶＢＰ  の分離のために使われた活性化汚泥細菌の培養物（実施例２に記載された下水処理場Ａで採取したもの）１００μＬを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  −  ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）中の５０ｍＭ  エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）溶液２ｍＬに懸濁した。この懸濁液を−８０℃で１０分間凍結させ、３７℃で融解した。リゾチーム（１．０５２８１．０００１，  メルク  ダムシュタット、ドイツ）（１０ｍｇ  ／ｍＬ）  を含有する０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ  −  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００μＬをそれぞれの試験管に添加し、細胞の懸濁物を３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後に、ＳＴＥＰ溶液（０．５％  ＳＤＳ，  ０．４Ｍ  ＥＤＴＡ  ，  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  −  ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）中の  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋの１ｍｇ  ／ｍＭ（シグマ））の  ４００ｍＬ  を各試験管に加えて、激しく攪拌した。フェノールとクロロホルムの混合物（１：１）３ｍｌを添加し、３０秒間激しく手で振った。細胞の懸濁物を遠心分離機（６９００、クボタ、東京、日本）で室温において１５分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を遠心菅に移した。等量の１００％のエタノール（−８０℃）を加え、良く混合し、そして、４℃、２０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清をデカンテーションし、残たものをピペットで出来るだけ多く取り出した。ペレット（抽出されたゲノムＤＮＡ）はＴＥ（５００ｍＬ）に溶解した。次に、ＤＮａｓｅ  を含まないＲＮａｓｅ  Ａ（７０１９４Ｚ，  アマーシャム・ファーマシア・バイオテック）（１０ｍｇ／ｍＬ）の１０ｍＬ  を各試験管に添加し、充分に混合し、３７℃で１０分間インキュベーションした。等量のフェノールとクロロホルム（１：１）を添加し、充分に混合し、室温において１５分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を（４００ｍＬ  ）を新しい試験管に移した。３Ｍ酢酸（ｐＨ５．２）４０μＬと１００％のエタノール（−８０℃）８８０ｍＬを添加し、充分に混合し、４℃で２０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心後、上清を出来る限り除去した。８０％のエタノール（−８０℃）４００ｍＬを添加し、軽く混合し、４℃で３分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を出来る限り除去した。ペレット（抽出されたゲノムＤＮＡ）をＴＥ（１００ｍＬ）に溶解させ、−２０℃で保存した。
【００７７】
得られたゲノム  ＤＮＡ混合は  Ｓａｕ３ＡＩで断片化し、０．７％アガロースゲルで分離し、１〜３ｋｂｐの長さの範囲のＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ＫＩＴ（  ＧＬ  −１１３１−０５、  ＢＩＯ  １０１システム）で抽出した。断片をプラスミドベクターｐＵＣ１１８（３３２１、タカラ、滋賀、日本）の  ＢａｍＨＩ  サイトの中にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット  Ｖｅｒ  ．２（６０２２、タカラ、滋賀、日本）を用いて連結した。その後に、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ  ）ＤＨ５α（９０５２、タカラ、滋賀、日本）を得られたプラスミドで形質転換した。得られた形質転換体をＸ−ｇａｌ（０２７−０７８５４、  和光、東京、日本）と０．７％アガーを含んでいる  Ｌｕｒｉａ  −  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に蒔いた。
【００７８】
プラスミドベクターｐＵＣ１１８に含まれるｌａｃＺ遺伝子のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）に外来遺伝子（活性汚泥細菌のゲノム遺伝子）挿入されたベクターを有する形質転換体においてはｌａｃＺタンパク質が生産されずに、その結果Ｘ−ｇａｌを分解することができない為に、コロニーの色は青く変化せずに白色を呈する。
【００７９】
一般的に、細菌のゲノムは４Ｍｂｐである。上記のように、活性汚泥細菌由来ＤＮＡは消化されて、その平均長は約２ｋｂｐであった。従って、理論的には２０００個のクローンが活性汚泥細菌のゲノムＤＮＡの全長をカバーする為に必要である。以上の操作によって得られた４種類のＤＮＡライブラリーを表５に示した。表中、左欄は白色コロニー数、真中欄は青色コロニー数、右欄は形質転換の割合（白色コロニー数／青色コロニー数）を示す。その内の３つのライブラリーは２０００以上のクローンを有するものである。ＤＨ５α−ｐＵＣ１１８  Ａ  ライブラリーは２０００未満のクローンしかないが、青色コロニー数に対する白色コロニー数の割合が最も高かった。これら４種類のライブラリーをＶＢＰゲノムの単離に使用した。
【００８０】
【表５】
2004254627.tif 000007
【００８１】
（５）ＶＢＰゲノム単離のためのコロニーハイブリダイゼーション及び遺伝子配列決定
（４）で構築された活性汚泥細菌からのＤＮＡライブラリーの大腸菌ＤＨ５αコロニーをニトロセルロース膜フィルター（１  ４１７  ２４０，  ロシュダイアグノスティック  ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）に移した。形質転換体内のプラスミドを５Ｍ  ＮａＣｌ  含有０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で１５分間で変性させ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ含有１Ｍ  Ｔｒｉｓ  −  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で各５分間で２回中性化した。室温において、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ  −  ＨＣｌ  中で１５分間インキュベーションした後に、膜フィルター上のＤＮＡを８０℃で２時間固定した。固定されたＤＮＡを、ＤＩＧ修正プローブ「ＤＩＧ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｂｅ」（上記（３）でＶＢＰ  のＮ末端のために設計された２種類のミックスプローブプローブの５’末端にジゴキシゲニンを共有結合により結合させたプローブ）と共に４０℃において一晩溶液中でハイブリダイズさせた。フィルターは０．１ｘ  ＳＳＣ  と０．１％のＳＤＳ  溶液で４０℃において１５分間で２度洗浄し、発色試薬（１  ０９３  ６５７、  ロシュダイアグノスティック  ＧｍｂＨ  、マンハイム、ドイツ）で発色させた。
【００８２】
ＤＨ５α−ｐＵＣ１１８  Ａ  ライブラリーから、スポット４におけるＶＢＰのゲノムを有するクローン候補として７つのクローンが分離された。これらのクローンを取り出し、３７℃で一晩培養し、培養した大腸菌からプラスミドをＭｉｎｉ  ｐｒｅｐ（９０８５，  タカラ、滋賀、日本）を用いて抽出し、最列決定の際の鋳型として使用した。こうして分離されたＶＢＰ  ゲノムの２本鎖の両方の鎖の配列を、ＰＣＲサイクルシークエンシングｂｉｇ−ｄｙｅ  ターミネータープロトコールを用いたＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３  １０  遺伝子アナライザー（アプライドバイオシステムズ日本社、東京、日本）によって分析した。反応は製造業者の指示に従って実施された。Ｍ１３プライマーＭ１（５’−ａｇｔｃａｃｇａｃｇｔｔｇｔａ  −  ３  ‘）とＭ１３プライマーＲＶ（５’−  ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃ  −  ３  ‘）は  ＰＣＲサイクルシークエンシングにおけるシークエンシングプライマーとして使用した。
【００８３】
その結果、ＤＨ５α−ｐＵＣ１１８  Ａ  ライブラリーから分離された７つのコロニーの内の一つのコロニーから得られたただ一つの読み取り枠（ＯＲＦ）が、スポット４のＶＢＰに似たタンパク質に対する遺伝子と推定された。これは２６８個のアミノ酸（配列番号１）をコードする８０７個のヌクレオチド（配列番号２）から成る。この配列を図６に示す。この中で、３７〜３９番目の残基が使用したプローブの配列と同一である。
【００８４】
こうして単離された遺伝子から推論されたタンパク質（Ｄｅｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とスポット４の  ＶＢＰ  の間のＮ末端のアミノ酸の配列の比較を図７に示す。最大限に一致するアライメントを得るためには、スポット４のＶＢＰ  においてＳｅｒ４  とＧｌｙ５  の間に一つのスペースが必要であったけれども、これらの両者の間で２２個のアミノ酸残基の内の２０個がお互いと全く同じであった。更に、２つの不一致な組合わせがあった。一つはスポット４のＶＢＰのＰｈｅ１５と推定されたタンパク質のＭｅｔ３６の間にあった。これらのアミノ酸は互いに類似のアミノ酸の範疇の入るものであり、これらのアミノ酸のコドンの一つあるいは２つの残基がお互いに同じであることを意味する。即ち、上述のように、ＭｅｔとＰｈｅのコドンはそれぞれ  ａｔｇ  及び  ｔｔｔ  又は  ｔｔｃであるので、２番目の２番目の残基は一致していた。もう一つの不一致な組合わせはスポット４の  ＶＢＰ  のＴｈｒ２２と推定されたタンパク質のＡｌａ４３  の間にあった。これらのアミノ酸も互いに類似したものであり、Ａｌａのコドンは  ｇｃａ，  ｇｃｔ，  ｇｃｇ又はｇｃｃであり、他方  Ｔｈｒ  のコドンは  ａｃａ，  ａｃｔ，  ａｃｇ  又はａｃｃである。従って、後の２つの  残基は互いに一致していた。
このように、単離された遺伝子から推論されたタンパク質はスポット４の  ＶＢＰと高いホモロジーを有することから、このタンパク質もウイルス吸着活性を有することが推測される。
【００８５】
次に、ホモロジー検索はＮＣＢＩにおけるＢＬＡＳＴサーバーを使って行われた。スポット４のＶＢＰのアミノ酸配列のホモロジー検索の場合と同様に、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）のＯｍｐＫ  がＤＮＡレベルにおいて８２．３％と最も高いホモロジーを示した。図８には、上記の分離された遺伝子のＯＲＦとビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）のＯｍｐＫとの遺伝子のアライメントを示した。特に、中間部において、これらの２つの配列連続の間に相違が見られるものの、高いホモロジーは分離された遺伝子がＯｍｐＫに関連していることを示している。
【００８６】
図９では、分離された遺伝子から推定されるタンパク質のアミノ酸配列（図６）とＯｍｐＫの配列を比較した。最初の２０個のアミノ酸残基はバクテリアのシグナルペプチドに共通の特徴を持っていた（Ａｒｋｏｗｉｔｚ，  Ｒ．Ａ．，  Ｍ．  Ｂａｓｓａｉｌａｎａ．  １９９４，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．  Ａｃｔａ  １１９７：３１１−３４３）。ＯｍｐＫ  のこの領域が合成後にインビボで消化され、２１番目のアミノ酸及びそれに続くアミノ酸が成熟したＯｍｐＫのＮ末端のアミノ酸配列であることが知られている（Ｉｎｏｕｅ，  Ｔ．，  Ｓ．  Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，  Ｓ．  Ｔａｎａｋａ，  １９９５，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １３４：２４５−２４９）。
【００８７】
因みに、スポット１のＶＢＰのタンパク質に対する遺伝子が同定出来なかった理由の一つは、スポット１の  ＶＢＰ遺伝子に対するプローブの数がこの方法で遺伝子を単離するにはあまりにも大きかったということであろう。表４に示されているように、スポット１のＶＢＰ  に対するプローブの数はスポット４の  ＶＢＰ  用のおよそ６倍であった。従って、その結果、コロニーハイブリダイゼーションにおけるシグナルが損なわれた可能性がある。
【００８８】
【実施例５】
活性汚泥細菌からのＶ  Ｂ  Ｐ  ゲノムの発現及びタンパク質の機能の解明
次に、実施例４で単離された遺伝子がコードするタンパク質の機能を実際に検証した。
【００８９】
（１）ＶＢＰクローニング用ベクターの構築
実施例４で単離された遺伝子を、その５’  末端にＢａｍＨＩ  部位、及び３’  末端にＸｈｏＩ部位を有する８００ｂｐＤＮＡ断片として増幅した。ＰＣＲ  のマスター（１  ６３６  １０３、ロシュダイアグノスティック  ＧｍｂＨ  、マンハイム、ドイツ）をｃＤＮＡ  増幅のために使用した。表６に示したプライマーを使用した。ＰＣＲ  プロフィールは、９４℃で１０分を１回、９４℃で１分、５０℃で１分、及び７２℃で１分を夫々４０回、７２℃で１５分を１回、そして、２０℃で５分を１回であった。ＰＣＲ  プロダクトとタンパク質クローニングベクー、ｐＲＳＥＴ  （インビトロジェン株式会社、カールスバット、ＣＡ、ＵＳＡ）をＸｈｏＩ（１０９４Ａ  、タカラ、滋賀、日本）と  ＥｃｏＲＩ（  １０４０Ａ  、タカラ、滋賀、日本）で消化し、フェノール  −  クロロホルム（１：１）で精製した。エタノール沈殿後に、ＰＣＲ  プロダクトは０．７％の  アガロースゲル（５０３３、タカラ、滋賀、日本）上の電気泳動で処理した。
【００９０】
【表６】
2004254627.tif 000008
【００９１】
ＤＮＡ断片（約８００ｂｐ長）をゲルから抽出し、ライゲーションのために使用した。消化したベクターも同様にエタノール沈殿させ、ＴＥに溶解させ、細菌性アルカリフォスファターゼ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｃ７５、２１２０Ｂ、タカラ、滋賀、日本）で脱リン酸化した。それから、  ＰＣＲ  プロダクトをＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２（６０２２，  タカラ、滋賀、日本）により脱リン酸化されたプラスミドベクター内に結合した。こうした結合産物を用いて大腸菌ＤＨ５α株（９０５７，  タカラ、滋賀、日本）を形質転換した。Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  （９０８５，  タカラ、滋賀、日本）を用いてプラスミドを抽出した後、単離した遺伝子を含有するＤＮＡクローンを制限酵素（ＥｃｏＲＩ）  で３７℃、５時間消化し、アガロースゲルによる電気泳動により同定した。電気泳動の結果、１５個のクローン中の４つのクローンがその他のものより長いことが確認され、これらの長いクローンには単離した遺伝子が挿入されていることが考えられた。
【００９２】
そこで、更に、Ｔ７  プライマー（５’−  ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’）を用いて結合領域の配列を決定して、ｐＲＳＥＴ  と適切に結合しているかについて調べた結果、４つのクローンのうちの一つにおいて、単離した遺伝子が予想されたとおりに正しくプラスミドベクター内に結合していることが確認された。このプラスミド構築物のＮ末端の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を図１０に示した。
【００９３】
（２）ＶＢＰタンパク質の製造及び精製
上記（１）で構築された単離した遺伝子を含むプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１  株を当業者に公知の方法で形質転換し、Ｎ末端にヘキサヒスチジンペプチドが結合した融合タンパク質として本発明の組換えタンパク質を発現させた。前培養としてこの形質転換体をアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地中３７℃で一晩増殖させた。この前培養物を３７℃で４時間培養し、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、９０３０，  タカラ、滋賀、日本）を最終濃度１ｍＭとなるように添加してタンパク質の発現を誘導した。３７℃で５時間培養した後、４℃における１０分間の遠心分離（１０，０００ｘｇ）で細胞を集めた。可溶性タンパク質の抽出及び封入体の精製はＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  （７０５８４−３，  ノバージェン、ダルムシュタット、ドイツ）により実施した。精製した封入体に含まれる不溶性タンパク質は溶解緩衝液（６Ｍ尿素、１Ｍ  を含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．８）に溶解した。抽出したタンパク質を製造者の指示に従い、ＨＩＳ結合精製キット（ニッケルキレートカラム：７０２３９−３，  ノバージェン、ダルムシュタット、ドイツ）を用いて精製した。
【００９４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、分離された遺伝子を含む  ｐＲＳＥＴ  によって形質転換され、且つ、ＩＰＴＧ  によって誘導された細胞由来のタンパク質試料の場合に限って、３３ｋＤａ  の位置に１本の厚いバンドが観察された。この分子量はアミノ酸数２６８から予想される分子量（約２７ｋＤａ）よりは大きいが、その理由は、図１０にも示されるように、発現ベクター由来のペプチド部分を有する融合タンパク質として発現されるためと思われる。従って、これらの結果は分離された遺伝子を含む  ｐＲＳＥＴ  により形質転換されること、及びＩＰＴＧ  による誘導の双方が分離された遺伝子を発現するために必要であったことを示す。
【００９５】
更に、タンパク質中のヘキサヒスチジンタグを補足することが出来るニッケルキレートカラムにより精製した試料の均一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果、分離された遺伝子により発現されたタンパク質とヘキサヒスチジンとの融合タンパク質は、細胞の封入体に含まれており、可溶性画分には含まれていないことが判明した（図１１）。尚、ｐＲＳＥＴにおける  Ｔ７プロモーターは強力なプロモーターとしてよく知られているので、このタンパク質は細胞の封入体に含まれていて可溶性タンパク質として得られなかったものと思われる。
【００９６】
尚、本実施例で行われたタンパク質アッセイにおいて、分析対象である画分は、変性緩衝液（２．５％  、１％のβ−メルカプトエタノール、  ０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  −  ＨＣｌ  、ｐＨ６．８、０．０１％の  ブロムフェノールブルー、３ｍＭ  ＥＤＴＡ  及び１０％グリセリン）中に混合し、９５℃で５分間加熱された。発現レベル、相対分子量、及び精製物の均一性を評価する為のＳＤＳ−ＰＡＧＥは１５％で実施した。タンパク質のバンドはＣＢＢ染色又は銀染色で視覚化した。タンパク質濃度はＤＣタンパク質アッセイキット（５００−００１６，  バイオラッド、ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたローリー法により決定した。
【００９７】
（３）タンパク質のウイルス吸着活性の評価
上記で得られた融合タンパク質の溶媒を次のように変更した。まず、精製された融合タンパク質を含む溶出液を１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３  緩衝液（ｐＨ：８．０）に対して、４℃において少なくとも１２時間透析した。真空遠心乾燥機（ＣＶＥ−１００，  ＥＹＥＬＡ  、東京理科機械（株）社）日本）を用いて１６ｍｌの溶出液を４００μｌにまで濃縮し、アセトン（‐２０℃）１．５ｍｌを添加して激しく攪拌した。この混合物を−８０℃で一晩放置し、遠心分離（１０，０００ｘｇ，  １０分間、４℃）した。デカンテーションした後、残ったアセトンを真空遠心乾燥機で除去した。ペレット状の融合タンパク質を５０ｍＭ炭酸緩衝液に溶解させ、実施例３におけるＶ  Ｂ  Ｐ  特性評価で使用したＥＬＩＳＡによってウイルス吸着活性の評価を行った。
【００９８】
得られた結果を図１２に示した。図中、バーＡは融合タンパク質及びＶＰ１の双方を含む系、バーＢはＰＶ１を含まない系、バーＣは融合タンパク質を含まない系である。明らかに、バーＡは他の２つの系よりも高い吸光度の値を示し、スチューデントｔテストによるＡとＢ又はＣの間の吸光度の有意差は０．０１の有意レベルであった。このことから、融合タンパク質は有意なウイルス吸着活性を有していることが確認された。
【００９９】
【発明の効果】
以上の結果から、本発明のウイルス吸着タンパク質（ＶＢＰ）は弱毒ポリオウイルスＩ  型（ＰＶ１）に吸着することが実際に確認された。既に記載したように、ＰＶ１が属するエンテロウイルス属には水系感染症を引き起こす多くの腸管系ウイルスが存在しており、それらのウイルスとＰＶ１  とは構造的に共通点（例えば、キャプシドタンパク質の正二十面体の立体対称構造）が多い。従って、本発明ＶＢＰは、ＰＶ１とこのような構造的な共通点を有する水中ウイルスに対しても、同じようなウイルス吸着活性を有していることが充分に予想され、これらウイルスに対する吸着材としても利用することができる。
【０１００】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】アフィニティクロマトグラフィによるＶＢＰ  分離結果を示す。
【図２】図２  ＶＢＰ  ウイルス吸着能評価の結果を示す。図中、Ｐ１：下水処理場Ａ  由来の尿素抽出タンパク質、Ｐ２：下水処理場Ａ  由来のｎ−ブタノール抽出タンパク質、Ｐ３：下水処理場Ｂ  由来の尿素抽出タンパク質、Ｐ４：下水処理場Ｂ由来のｎ−ブタノール抽出タンパク質。Ｅｒｒｏｒ  ｂａｒは単位タンパク質量当たり吸光度の標準偏差（試行回数はすべて３  回）を表わす。
【図３】ＶＢＰの分子量を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。レーンａ：分子量マーカー、レーンｂ：ＶＢＰ
【図４】ＶＢＰの陽イオン交換クロマトグラフィの結果（上）、及び、陰イオン交換クロマトグラフィの結果（下）をそれぞれ示す。
【図５】ＶＢＰの２次元電気泳動  のプロフィールを示す写真である。
【図６】ＤＨ５α−ｐＵＣ１１８  Ａ  ライブラリーから分離された７つのコロニーの内の一つのコロニー得られたただ一つの読み取り枠（ＯＲＦ）の配列を示す。
【図７】分離された遺伝子からの推論されたタンパク質とスポット４からの  ＶＢＰ
の間のＮ末端アミノ酸の配列の比較を示す。
【図８】分離された遺伝子とビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）のＯｍｐＫ遺伝子のアライメントを示す。
【図９】示されたこの遺伝子から推定されるアミノ酸配列とＯｍｐＫの配列の比較を示す。
【図１０】プラスミド構築物のＮ末の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１１】ニッケルキレートカラムにより精製した、分離された遺伝子により発現されたタンパク質とヘキサヒスチジンとの融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す（銀染色）。レーン１：分子量マーカー、レーン２：上清由来のタンパク質、レーン３：精製した細胞の封入体に含まれているタンパク質、レーン４：ニッケルキレートカラムからの溶出物。
【図１２】ＥＬＩＳＡによってウイルス吸着活性の評価の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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