(57)【要約】      （修正有）【課題】カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用したカルシウム測定方法を提供する。【解決手段】分子量約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及びホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を含有する、試料中のカルシウム測定試薬。2004298083.tif 000012【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及びホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を含有する、試料中のカルシウム測定試薬。
【化１】
2004298083.tif 000010
【請求項２】
ホスホリパーゼＤがストレプトマイセス属微生物由来であることを特徴とする、請求項１又は２記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【請求項３】
ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を含むことを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【請求項４】
コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを含むことを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【請求項５】
試料中のカルシウムを測定する方法であって、
ａ）  該試料と、分子量約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及びホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び
【化２】
2004298083.tif 000011
ｂ）  この遊離した発色性基を比色測定する工程、よりなる試料中のカルシウム測定方法。
【請求項６】
ホスホリパーゼＤがストレプトマイセス属微生物由来であることを特徴とする、請求項５記載の試料中のカルシウム測定方法。
【請求項７】
前記工程ａ）において、ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を共存させることを特徴とする、請求項５又は請求項６記載の試料中のカルシウム測定方法。
【請求項８】
前記工程ａ）において、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを共存させることを特徴とする、請求項５〜請求項７のいずれか一項に記載の試料中のカルシウム測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、試料中のカルシウムを測定するためのカルシウム測定試薬及び測定方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
カルシウムは、人体内に約１，２００ｇ存在しており、その約９９％が骨と歯に存在し、残りの約１％が血液などの体液や筋肉などに存在している。この１％のカルシウムが、出血を止めたり、神経の働きや筋肉運動など、生命の維持や活動に重要な役割を果たしている。血液中のカルシウム濃度は、カルシウムの吸収異常、骨疾患、内分泌疾患、高血圧、又は動脈硬化症等により変動し、その測定は臨床上極めて重要とされている。
【０００３】
現在、カルシウムの測定方法として使用されている方法としては、原子吸光法、電極法、ο−クレゾールフタレイン・コンプレクソン法（以下、ＯＣＰＣ法と略すこともある）がある。これらの方法は、高価な機器を必要としたり、試料の前処理を必要とする場合がある。特にＯＣＰＣ法ではマグネシウムイオンの影響を受けたり、温度や測定時間によって吸光度が変化するなどの欠点がある。
【０００４】
このため、最近では、カルシウムイオンによる酵素の活性化又は阻害を利用した測定方法として、カルシウムイオンによるピルビン酸キナーゼ活性の阻害を利用した測定（例えば、特許文献１参照。）、カルシウムイオンによるα−アミラーゼの活性化を利用した測定（例えば、特許文献２参照。）又はカルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定（例えば、特許文献３及び４参照。）等が提案されている。
また、ホスホリパーゼＤのカルシウムイオンによる活性化を利用したものは特異性に優れ、測定感度も高いものであるため、広く利用されている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平２−１４２４９８号公報
【０００６】
【特許文献２】
特開平２−２７６５９７号公報
【０００７】
【特許文献３】
特開昭６２−１９５２９７号公報
【０００８】
【特許文献４】
特開平４−１８７０９８号公報
【０００９】
ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）は、グリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸および塩基を遊離させる酵素である。
また、このホスホリパーゼＤとしては、植物組織由来、動物組織由来、又はストレプトマイセス属等の微生物由来のものなどがあり、各種アイソザイムの報告も行われている。
例えば、ストレプトマイセス族微生物由来のホスホリパーゼＤには、分子量が約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（以下、ＰＬＤ５７ということもある。）、分子量が約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（以下、ＰＬＤ４２ということもある。）、分子量が約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（以下、ＰＬＤ２０ということもある。）、及びＰＬＤ４２とＰＬＤ２０の複合体からなるホスホリパーゼＤアイソザイム（以下、ＰＬＤ４２／２０ということもある。）が存在することが知られている。また、ＰＬＤ２０には、ホスホリパーゼＤ活性がないことも知られている。
更に、分子量が約４２キロダルトンの蛋白質と約２０キロダルトンの蛋白質はＰＬＤ５７の構成成分であり、ＰＬＤ４２／２０はホスホリパーゼＤの精製過程でＰＬＤ５７から分離されてくる可能性のあることが示唆されている。（例えば、非特許文献１参照。）
【００１０】
【非特許文献１】
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１４３０巻、２３４〜２４４頁、１９９９年
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者が、市販のホスホリパーゼＤ及びホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物からなるカルシウム測定試薬を調製し、この測定試薬を用いて試料中のカルシウムの測定について検討を行ったところ、ホスホリパーゼＤの製品ロットによってカルシウム測定を行う際の検量線の直線性にバラツキがあることが分かった。
【００１２】
【化３】
2004298083.tif 000002
【００１３】
そこで、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いてホスホリパーゼＤの各製品ロットの分析を行ったところ、これらの製品ロットによってＰＬＤ５７、ＰＬＤ４２、及びＰＬＤ２０の比率が異なる結果が得られた。また、ＰＬＤ５７及びＰＬＤ２０に比べてＰＬＤ４２の比率が多い製品ロットの方が、検量線の直線性が悪く曲線となってしまうことが分かった。
【００１４】
したがって、本発明の課題は、カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定において、直線性が良好な検量線が得られ、これにより、試料中のカルシウム濃度を正確に測定することのできる、試料中のカルシウム測定試薬及び試料中のカルシウム測定方法を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の問題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定において、分子量約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及びホスホリパーゼＤの基質としての下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を使用することにより、検量線の直線性が大幅に改善され、これにより試料中のカルシウムを正確に測定できることを見出した。
更に、測定系に金属イオン、又はキレート剤を共存させることによって試料中のカルシウム濃度の測定範囲を拡大できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
【化４】
2004298083.tif 000003
【００１７】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）  分子量約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及びホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を含有する、試料中のカルシウム測定試薬。
【００１８】
【化５】
2004298083.tif 000004
【００１９】
（２）  ホスホリパーゼＤがストレプトマイセス属微生物由来であることを特徴とする、前記（１）記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【００２０】
（３）  ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を含むことを特徴とする、前記（１）又は前記（２）記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【００２１】
（４）  コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを含むことを特徴とする、前記（１）〜前記（３）のいずれかに記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【００２２】
（５）  試料中のカルシウムを測定する方法であって、
ａ）  該試料と、分子量約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及びホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び
【化６】
2004298083.tif 000005
ｂ）  この遊離した発色性基を比色測定する工程、よりなる試料中のカルシウム測定方法。
【００２３】
（６）  ホスホリパーゼＤがストレプトマイセス属微生物由来であることを特徴とする、前記（５）記載の試料中のカルシウム測定方法。
【００２４】
（７）  前記工程ａ）において、ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を共存させることを特徴とする、前記（５）又は前記（６）記載の試料中のカルシウム測定方法。
【００２５】
（８）  前記工程ａ）において、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを共存させることを特徴とする、前記（５）〜前記（７）のいずれかに記載の試料中のカルシウム測定方法。
【００２６】
【発明の実施の形態】
（１）  分子量約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ
本発明においては、分子量約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（ＰＬＤ５７）の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤを使用する。
ここで、ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）とは、グリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸及び塩基を遊離させる酵素である。
【００２７】
本発明におけるホスホリパーゼＤとしては、ストレプトマイセス属微生物から調製されたものを使用することが好ましい。なお、このストレプトマイセス属微生物から調製されたホスホリパーゼＤとしては、ストレプトマイセス属微生物の遺伝子を大腸菌等の微生物等に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は遺伝子の改変等により性質を改良したストレプトマイセス属微生物から調製したホスホリパーゼＤ等も含まれる。
【００２８】
本発明で使用するホスホリパーゼＤは、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のものである。例えば、本発明で使用する、ホスホリパーゼＤにおけるＰＬＤ５７の存在比率が５０％以上であればよい。この存在比率としては、例えば、モル濃度比、蛋白濃度比等を挙げることができる。また、本発明においては、ＰＬＤ５７の比率が７５％以上のものを使用することが好ましい。
なお、本発明で使用するホスホリパーゼＤにおけるＰＬＤ５７の活性比率が５０％以上であってもよい。この場合、ホスホリパーゼＤにおいて、ＰＬＤ５７、ＰＬＤ４２、ＰＬＤ２０又はＰＬＤ４２／２０が混在しているときに、ＰＬＤ５７の活性を増加させたり及び／又はＰＬＤ４２、ＰＬＤ４２／２０の活性を低下させるような条件を設定することにより、ＰＬＤ５７の活性比率を５０％以上となるようにしてもよい。更に、本発明においては、ＰＬＤ５７の活性比率が７５％以上のホスホリパーゼＤを使用することが好ましい。
【００２９】
このＰＬＤ５７の比率が５０％以上であるホスホリパーゼＤを、試料及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値は、０．０５〜１０Ｕ／ｍＬの範囲にあることが好ましく、０．１〜５Ｕ／ｍＬの範囲が特に好ましい。
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるＰＬＤ５７の比率が５０％以上であるホスホリパーゼＤの活性値は、試料並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値が０．０５〜１０Ｕ／ｍＬとなるように、好ましくは０．１〜５Ｕ／ｍＬとなるように設定すればよい。
例えば、ホスホリパーゼＤを、０．０５〜１０Ｕ／ｍＬとなるように、好ましくは０．１〜５Ｕ／ｍＬとなるように含有させればよい。
【００３０】
（２）  ホスホリパーゼＤの基質
本発明においては、下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を、ホスホリパーゼＤの基質として使用する。
【００３１】
【化７】
2004298083.tif 000006
【００３２】
前記の一般式（Ｉ）で表される化合物において、発色性基としては、リン酸基にエステル結合した状態と、加水分解によりリン酸基より遊離した状態での吸光度又は透過率等のシグナルに差がある発色性基であればどのようなものでもよい。
【００３３】
なお、この発色性基としては、リン酸基にエステル結合した状態と、リン酸基から遊離した状態での吸光度又は透過率等のシグナルの差が大きいものが好ましい。
【００３４】
そして、発色性基Ｘ１と発色性基Ｘ２とは、それぞれ同じものであってもよく、あるいは異なるものであってもよい。
この発色性基Ｘ１と発色性基Ｘ２が異なるものである場合には、各々の測定波長域、すなわち極大吸収波長が同一であるか又は近傍にあるものであることが好ましい。
【００３５】
前記の一般式（Ｉ）で表される化合物における発色性基としては、例えば、４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−アセチルフェニル基、又はアセチルフェニル基等を挙げることができる。
【００３６】
また、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物において、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、又はイソプロピル基等を挙げることができる。
更に、置換アルキル基及び置換フェニル基の置換基としては、同一又は異なる、置換数１〜３の、例えば、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、アミノ基、又はハロゲン基等を挙げることができる。
【００３７】
また、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｘ２が発色性基でない場合の化合物としては、例えば、４−ニトロフェニルリン酸〔以下、４−ＮＰＰということもある〕、４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、４−ＮＰＰＰということもある〕、２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸〔以下、４−ＣＮＰＰということもある〕、２−クロロ−４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、４−ＣＮＰＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＮＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＮＰＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−アセチルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＡＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−アセチルフェニルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＡＰＰＰということもある〕、アセチルフェニルリン酸〔以下、ＡＰＰということもある〕、若しくはアセチルフェニルフェニルリン酸〔以下、ＡＰＰＰということもある〕、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００３８】
更に、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｘ２が発色性基である場合の化合物としては、例えば、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−４−ＮＰＰということもある〕、ビス（２−クロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−４−ＣＮＰＰということもある〕、ビス（２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−２，６−ＤＣＮＰＰということもある〕、ビス（２，６−ジクロロ−アセチルフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−２，６−ＤＣＡＰＰということもある〕、若しくはビスアセチルフェニルリン酸〔Ｂｉｓ−ＡＰＰ〕、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００３９】
本発明における前記の一般式（Ｉ）で表される化合物としては、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２−クロロ−４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２，６−ジクロロ−アセチルフェニル）リン酸、若しくはビスアセチルフェニルリン酸、又はこれらの塩等のＸ２が発色性基であるものが好ましい。
それは、カルシウムにより活性化されるホスホリパーゼＤの触媒作用によりリン酸基から遊離する発色性基が、Ｘ２が発色性基でない場合にはＸ１だけであるのに対し、Ｘ２も発色性基である場合にはＸ１とＸ２の両方であって得られるシグナルが２倍となり、これにより高感度に測定を行うことが可能となるからである。
【００４０】
なお、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を、試料及びＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤと混合し反応させる際の濃度は、０．２〜２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、１〜１００ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の一般式（Ｉ）で表される化合物の濃度は、試料及びＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤと混合し反応させる際の濃度が０．２〜２００ｍＭとなるように、好ましくは１〜１００ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を、０．２〜２００ｍＭとなるように、好ましくは１〜１００ｍＭとなるように含有させればよい。
【００４１】
なお、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物は、市販品として容易に入手することができるが、当業者に周知の合成方法を適宜組み合わせることにより、容易に製造することもできる。
【００４２】
（３）  ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を含むことが好ましい。
そして、見掛けのＫｍ値を０．１〜３ｍＭに調節する物質を含むことがより好ましい。
【００４３】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を共存させることが好ましい。
そして、見掛けのＫｍ値を０．１〜３ｍＭに調節する物質を共存させることがより好ましい。
【００４４】
このＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質を測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００４５】
このＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質としては、例えば、金属イオン等を挙げることができる。
ここで、金属イオンとしては、例えば、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオン等を挙げることができる。
これらの金属イオンは１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００４６】
なお、この金属イオンを、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．００５〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましい。
例えば、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭの範囲にあることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭの範囲にあることが好ましい。
【００４７】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の金属イオンの濃度は、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．００５〜５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記の金属イオンを、０．００５〜５０ｍＭとなるようにカルシウム測定試薬に含有させればよい。
例としては、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭとなるようにすることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭとなるようにすることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭとなるようにすることが好ましい。
【００４８】
また、本発明においては、前記のＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質として、キレート剤を使用することもできる。
【００４９】
ここで、キレート剤としては、例えば、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、若しくはリンゴ酸などのカルボン酸又はその塩等を挙げることができる。
これらのキレート剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００５０】
なお、このキレート剤を、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．１〜２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜１５０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００５１】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記のキレート剤の濃度は、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記のキレート剤を、０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
なお、本発明においては、前記の金属イオンとキレート剤を同時に用いてもよい。
【００５２】
（４）  コバルトイオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを含むことが好ましい。
【００５３】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを共存させることが好ましい。
【００５４】
このコバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００５５】
これらは１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００５６】
なお、これらの金属イオンを、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭの範囲にあることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭの範囲にあることが好ましい。
【００５７】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の金属イオンの濃度は、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が各々前記の濃度となるように設定すればよい。
例えば、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭとなるように含有させればよく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭとなるように含有させればよく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭとなるように含有させればよい。
【００５８】
（５）  キレート剤
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、キレート剤を含むことが好ましい。
【００５９】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、キレート剤を共存させることが好ましい。
【００６０】
このキレート剤を測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００６１】
ここで、キレート剤としては、例えば、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、若しくはリンゴ酸などのカルボン酸又はその塩等を挙げることができる。
【００６２】
これらのキレート剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００６３】
なお、このキレート剤を、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．１〜２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜１５０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００６４】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるこのキレート剤の濃度は、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、このキレート剤を、０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
【００６５】
（６）  試料中のカルシウム測定時のｐＨ
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際のｐＨとして、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０を挙げることができる。
【００６６】
ところで、試料が体液等の場合、この試料中にホスフォジエステラーゼが混在する可能性があり、そうすると例え試料中にカルシウムが存在しなくともこのホスフォジエステラーゼが前記の一般式（Ｉ）で表される化合物より発色性基を遊離させ、シグナルを生じさせ、測定値に正の誤差を与えてしまうことになる。
そして、このホスフォジエステラーゼの酵素活性の至適ｐＨ域は、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０である。
【００６７】
よって、このホスフォジエステラーゼによる誤差のことを考えると、前記の混合し反応させる際のｐＨとしては、ｐＨ５．５〜ｐＨ８．０が好ましく、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が特に好ましい。
【００６８】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬のｐＨとしては、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際のｐＨがｐＨ５．０〜ｐＨ９．０、好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ８．０、特に好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５となるように設定すればよい。
【００６９】
なお、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝液としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝液を適宜使用することができる。
このような緩衝液としては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、イミダゾール、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ等の各緩衝液を挙げることができる。
【００７０】
（７）  非イオン性界面活性剤
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、反応のタイムコースを安定化するため、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、非イオン性界面活性剤を共存させることが好ましい。
また、同じ理由により、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、非イオン性界面活性剤を含ませることが好ましい。
【００７１】
このような非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレンエーテル化合物。
【００７２】
（ｂ）  グリセリン脂肪酸部分エステル、ソルビタン脂肪酸部分エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、又はショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価アルコール部分エステル化合物。
【００７３】
（ｃ）  ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、又はポリオキシエチレン化ひまし油などのポリオキシエチレン化多価アルコール脂肪酸エステル。
【００７４】
（ｄ）  脂肪酸ジエタノールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、トリエタノールアミン脂肪酸エステル、又はトリアルキルアミンオキシドなどのアミド若しくはアミン化合物。
【００７５】
なお、この非イオン性界面活性剤としては、例えば、トライトンＸ−１００（和光純薬工業社）又はＢＯ−１０ＴＸ（日光ケミカルズ社）等が好ましい。
【００７６】
そして、この非イオン性界面活性剤を、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．０００１〜１％の範囲にあることが好ましく、０．００１〜０．５％の範囲にあることが特に好ましい。
【００７７】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の非イオン性界面活性剤の濃度は、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるように設定すればよい。
例えば、前記の非イオン性界面活性剤を、０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるようにカルシウム測定試薬に含有させればよい。
【００７８】
（８）  陰イオン性界面活性剤
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、カルシウム測定の感度が向上するため、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、陰イオン性界面活性剤を共存させることが好ましい。
また、同じ理由により、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、陰イオン性界面活性剤を含ませることが好ましい。
【００７９】
このような陰イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  脂肪族モノカルボン酸塩、Ｎ−アシロイルサルコシン塩、Ｎ−アシロイル−β−アラニン塩、若しくはＮ−アシロイルグルタミン酸塩などの脂肪族化合物カルボン酸塩；又はアビエチン酸塩などの環式化合物カルボン酸塩。
【００８０】
（ｂ）  ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、若しくはヒドロキシアルカンスルホン酸塩などの脂肪族化合物スルホン酸塩；直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルフェノキシポリオキシエチレンプロピルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸塩、若しくはナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物などの環式化合物スルホン酸塩；又はＮ−メチル−Ｎ−オレイルタウリンナトリウム、若しくはＮ−アルキルスルホコハク酸モノアミド二ナトリウム塩などの含窒素化合物スルホン酸塩。
【００８１】
（ｃ）  硫酸化ひまし油、硫酸化牛脚油、脂肪酸アルキルエステル・硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、脂肪酸モノグリセリド硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキロイルアミド硫酸塩などの脂肪族化合物硫酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル硫酸エステル塩などの環式化合物硫酸エステル塩。
【００８２】
（ｄ）  アルキルリン酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩などの脂肪族化合物リン酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸エステル塩などの環式化合物リン酸エステル塩。
【００８３】
（ｅ）  スチレン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物、又はオレフィン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物などの重合型高分子化合物のけん化物。
【００８４】
（ｆ）  ナフタレンスルホン酸塩−ホルマリン縮合物などの重縮合型高分子化合物。
【００８５】
なお、この陰イオン性界面活性剤としては、例えば、スルホン酸塩化合物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、又はＮ−アシルタウリン塩等が好ましい。
例えば、このスルホン酸塩化合物としてはスルホコハク酸ジオクチルナトリウム（ＯＴＰ−１００）〔日光ケミカルズ社〕等を、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩としてはＳＢＬ−２Ｎ−２７〔日光ケミカルズ社〕等を、そして、Ｎ−アシルタウリン塩としてはＣＭＴ−３０又はＬＭＴ〔日光ケミカルズ社〕等を挙げることができる。
【００８６】
この陰イオン性界面活性剤を、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．０００１〜１％の範囲にあることが好ましく、０．００１〜０．５％の範囲にあることが特に好ましい。
【００８７】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の陰イオン性界面活性剤の濃度は、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるように設定すればよい。
例えば、前記の陰イオン性界面活性剤を、０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるようにカルシウム測定試薬に含有させればよい。
【００８８】
（９）  測定試薬等の構成成分
本発明の試料中のカルシウム測定試薬又はカルシウム測定方法においては、前記の成分の他に、公知の防腐剤等を必要に応じて適宜含ませ又は共存させることができる。
【００８９】
（１０）  試薬等の構成
本発明の試料中のカルシウム測定方法及びカルシウム測定試薬は、１ステップ法（１試薬系）で実施、構成することもできるが、測定試薬を長期間保存して用いる場合には２ステップ法（２試薬系）等の多ステップ法（多試薬系）で実施、構成することが測定試薬の安定性の面からより好ましい。
【００９０】
なお、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤと、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物とは、別々の測定試薬に含有させておくことが好ましい。
それは、共存させた場合、微量でもカルシウムが混入することにより、長期保存されるうちに、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物がホスホリパーゼＤにより分解されてしまうからである。
【００９１】
（１１）  リン酸モノエステル化合物に作用する酵素
本発明の試料中のカルシウム測定方法において、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ２が発色基である場合、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、リン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を共存させることが好ましい。
【００９２】
それは、試料中にカルシウムが存在する場合、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ１（発色性基）及びＸ２（発色性基）を加水分解して遊離させるのであるが、反応時の条件によっては、一つ目の発色性基の加水分解から二つ目の発色性基の加水分解までに時間が掛かることがある。
【００９３】
このときにリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素が共存していると、一つ目の発色性基の加水分解により生成したリン酸モノエステル化合物にリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素が作用して、二つ目の発色性基を短時間のうちに加水分解することができるからである。
【００９４】
なお、この酵素はリン酸ジエステル化合物には作用しないので、試料中にカルシウムが存在せず、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが前記の一般式（Ｉ）で表される化合物に作用しない（加水分解しない）場合には、この酵素も発色性基を加水分解することはないので、測定値に正の誤差を生じさせることはない。
【００９５】
同じ理由により、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ２が発色基である場合、リン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を含ませることが好ましい。
【００９６】
このリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素としては、例えば、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）又は酸性ホスファターゼ（ＡＣＰ）等を挙げることができる。
【００９７】
このリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値は、０．０１〜１０Ｕ／ｍＬの範囲にあることが好ましく、０．１〜５Ｕ／ｍＬの範囲が特に好ましい。
【００９８】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素の活性値は、試料、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際に０．０１〜１０Ｕ／ｍＬとなるように、好ましくは０．１〜５Ｕ／ｍＬとなるように設定すればよい。
例えば、このリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を、０．０１〜１０Ｕ／ｍＬとなるように、好ましくは０．１〜５Ｕ／ｍＬとなるように含有させればよい。
【００９９】
（１２）  試料中のカルシウム測定の一例
本発明の試料中のカルシウム測定方法は、
ａ）  試料と、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及びホスホリパーゼＤの基質としての前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び
ｂ）  この遊離した発色性基を比色測定する工程、よりなるものである。
【０１００】
なお、本発明の試料中のカルシウム測定方法は、コリンオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又は酸性ホスファターゼ等の共役酵素を介在させなくとも測定が行えるという点で特徴的である。
【０１０１】
本発明の試料中のカルシウム測定方法及び測定試薬を用いて試料中のカルシウムを測定する場合の一例をより具体的に説明すると、例えば、試料中に含まれるカルシウムとＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤとが接触すると、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤがこのカルシウムによって活性化される。
【０１０２】
このカルシウムによって活性化されたＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と接触すると、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤは、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ１及びＸ２を加水分解して遊離させる。
【０１０３】
すなわち、４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−アセチルフェニル基又はアシルフェニル基等の発色性基が遊離される。
【０１０４】
ここで遊離した４−ニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジクロロ−アセチルフェニル基又はアシルフェノール等が吸収を示す任意の波長において、分光光度計を用いて吸光度などを測定すること等により、遊離した発色性基の量を求め、これよりＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤの活性値を求め、更には試料中のカルシウム濃度の算出を行うことができる。
【０１０５】
本発明の測定原理を、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物としてビス（４−ニトロフェニル）リン酸を用いた場合を例として示すと下記のようになる。
【０１０６】
【化８】
2004298083.tif 000007
【０１０７】
本発明において前記の一般式（Ｉ）で表される化合物として基質としてビス（４−ニトロフェニル）リン酸を用いた場合は、試料中のカルシウムイオンによって活性化されたＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸のリン酸基と２つの４−ニトロフェニル基との間のエステル結合をそれぞれ加水分解して、２分子の４−ニトロフェノールを遊離させる。
【０１０８】
この遊離した４−ニトロフェノールの吸光度を測定波長４０５ｎｍ等において分光光度計等を用いて測定することによって、試料中のカルシウム濃度を測定することが可能となる。
【０１０９】
（１４）  試料
本発明において、試料とは、試料中のカルシウム濃度の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液；植物の抽出液；食品又はこれの抽出液；農林水産物又はこれの抽出物；飲料水；飲料；環境試料（土壌、海水、河川水、湖沼水、地下水など）；あるいは薬剤等が挙げられる。
【０１１０】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。
【０１１１】
〔実施例１〕
（市販ホスホリパーゼＤの各製品ロットによるカルシウム測定の直線性の確認）市販ホスホリパーゼＤを用いたカルシウム測定試薬において、ホスホリパーゼＤの各製品ロットによるカルシウム測定を行う際の直線性の相違を確認した。
【０１１２】
（１）  試薬の調製
▲１▼  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、ホスホリパーゼＤの製品ロットが異なる４種類の第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ      ６０ｍＭ
トライトンＸ−１００〔非イオン性界面活性剤〕    ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕    ０．０５％
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕  １．５単位／ｍＬ
・製品ロットＡ
・製品ロットＢ
・製品ロットＣ、又は
・製品ロットＤ
【０１１３】
▲２▼  第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、第２試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ      ６０ｍＭ
トライトンＸ−１００〔非イオン性界面活性剤〕    ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕    ０．０５％
ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔基質〕（和光純薬工業社）  ４ｍＭ
クエン酸  ６ｍＭ
【０１１４】
（２）  試料の調製
カルシウム標準液〔１，０００ｍｇ／ｍＬの炭酸カルシウムを含む０．１Ｍ硝酸水溶液；原子吸光用〕（和光純薬工業社）を純水で希釈して、下記の濃度のカルシウムを含む試料をそれぞれ調製した。
【０１１５】
▲１▼  ２０．０ｍｇ／ｄＬ
▲２▼  １５．０ｍｇ／ｄＬ
▲３▼  １０．０ｍｇ／ｄＬ
▲４▼  ５．０ｍｇ／ｄＬ
▲５▼  ２．５ｍｇ／ｄＬ
【０１１６】
また、純水を、カルシウムを含まない試料すなわち「▲６▼カルシウム濃度０ｍｇ／ｄＬの試料」とした。
以上６種類の試料を調製した。
【０１１７】
（３）  試料中のカルシウム濃度の測定
日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて試料中のカルシウム濃度の測定を行った。
【０１１８】
▲１▼  前記（２）で調製した６種類の試料をそれぞれ試料とし、この６μＬに前記（１）の▲１▼で調製した４種類の第１試薬の一つを１２０μＬ添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。
【０１１９】
▲２▼  その後、これに前記（１）の▲２▼で調製した第２試薬の１２０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０１２０】
▲３▼  そして、主波長４０５ｎｍ及び副波長６６０ｎｍにおける吸光度を、第２試薬添加後１分５５秒目（２３ポイント目）から５分８秒目（３４ポイント目）まで測定した。
【０１２１】
▲４▼  前記▲３▼において測定した吸光度より、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を算出した。
なお、試料▲６▼（０ｍｇ／ｄＬ）の吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を試薬盲検値として差し引いた。
【０１２２】
▲５▼  以上の操作を４種類の第１試薬の全てについて行った。
【０１２３】
（４）  測定結果
以上の測定結果を図１に示した。
なお、この図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０１２４】
この図から明らかなように、ホスホリパーゼＤの製品ロットＡ又はＤを用いた第１試薬を使用した場合には、試料中のカルシウム濃度が高くなるにつれて各吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値を結んだ検量線が曲がってくることが分かる。
また、ホスホリパーゼＤの製品ロットＢ又はＣを用いた第１試薬を使用した場合には、試料中のカルシウム濃度の増加に伴って各吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値がほぼ直線的に増加していることが分かる。
これより、ホスホリパーゼＤの製品ロットにより、カルシウム測定値の直線性に相違があり、直線性が不良なものがあることが確かめられた。
【０１２５】
〔実施例２〕
（ホスホリパーゼＤの各製品ロットの分析）
ホスホリパーゼＤの各製品ロットの蛋白質の存在パターンをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確かめた。
【０１２６】
（１）  実施例１で第１試薬に使用したホスホリパーゼＤの各製品ロット（製品ロットＡ、製品ロットＢ、製品ロットＣ、及び製品ロットＤ）、並びに蛋白質分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ；バイオラッド社）の各々を試料とし、還元条件下で、１２．５％ポリアクリルアミドゲル〔フナコシ  イージーゲル（ＩＩ）；フナコシ社）〕を支持体とし、０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−２００ｍＭグリシン緩衝液を泳動緩衝液として使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年参照）を行った。
【０１２７】
（２）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に示した。なお、この図において、ゲルのレーンの左端は、蛋白質分子量マーカーの蛋白質のパターンを示している。また、それ以外のレーンは、ホスホリパーゼＤの各製品ロットの蛋白質のパターンを示している。
【０１２８】
図２に示すように、このＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動結果においては、主にそれぞれ分子量約５７キロダルトンの蛋白質、約４２キロダルトンの蛋白質、及び約２０キロダルトンの蛋白質のバンドが観察された。すなわち、これらのバンドは、ホスホリパーゼＤのアイソザイムとして知られているＰＬＤ５７、ＰＬＤ４２、及びＰＬＤ２０であることが分かる。
なお、製品ロットＡ及びＤでは、他のバンドに比べて分子量約４２キロダルトンの蛋白質（ＰＬＤ４２）のバンドが強く出ており、製品ロットＢ及びＣでは、他のバンドに比べて分子量約５７キロダルトンの蛋白質（ＰＬＤ５７）のバンドが強く出ていることが分かる。
【０１２９】
（３）  次に、このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果をＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ画像解析ソフト（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて画像解析し、各レーンのＰＬＤ５７、ＰＬＤ４２、及びＰＬＤ２０のバンドの「発色強度×面積」を各々測定し、ホスホリパーゼ全体の中での比率をそれぞれ求めた。この結果を表１に示した。
【０１３０】
【表１】
2004298083.tif 000008
【０１３１】
各ホスホリパーゼＤアイソザイムの比率は、（他のバンドに比べてＰＬＤ４２のバンドが強く出ていた、）製品ロットＡでは、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝２７％：５３％：２０％であり、製品ロットＤでは、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝４２％：４４％：１４％であった。
また、（他のバンドに比べてＰＬＤ５７のバンドが強く出ていた、）製品ロットＢでは、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝５３％：２８％：１９％であり、製品ロットＣでは、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝８８％：１２％：０％であった。
【０１３２】
これらの結果と実施例１の結果から、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤを用いてカルシウムの測定を行うことにより、試料中のカルシウム濃度と測定により得られる吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）との関係がより直線的となり、カルシウム測定時の直線性が向上することが推察された。
【０１３３】
〔実施例３〕
（ホスホリパーゼＤの再精製）
市販ホスホリパーゼＤについて再精製を行った。
【０１３４】
（１）  実施例１で第１試薬に使用したホスホリパーゼＤの製品ロットＤについて、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、再精製を行った。
すなわち、０．９Ｍ濃度の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＨＩＣカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に、前記の緩衝液０．８ｍＬで溶解したホスホリパーゼＤの製品ロットＤの６ｍｇを添加し、ＦＰＬＣ装置（ファルマシア社）を用いて蛋白質分画を行った。
【０１３５】
（２）  このカラムを前記の緩衝液で洗浄し、続いて５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、硫酸アンモニウム濃度を直線的に下げ、流速１ｍＬ／ｍｉｎで溶出を行った。なお、蛋白質が吸収を有する２８０ｎｍで吸光度の測定を行った。
【０１３６】
（３）  硫酸アンモニウム濃度が０Ｍに達した後、分画番号２３〜２９に蛋白質画分が溶出した（画分Ａ１）。その後、純水を流しカラムを洗浄することにより分画番号ＤＷ１及びＤＷ２に蛋白質画分が溶出した（画分Ｂ１）。
この溶出パターンを図３に示した。この図において、横軸は溶出画分の番号を表し、縦軸は各々の溶出画分の２８０ｎｍにおける吸光度測定値を表す。
【０１３７】
（４）  溶出した画分Ａ１及び画分Ｂ１を限外濾過膜（ウルトラフリー４；ミリポア社）を有する限外濾過濃縮ユニット（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ；ミリポア社）で限外濾過し、それぞれ液量を１．５ｍＬに濃縮した。
【０１３８】
（５）また、前記（１）及び（２）と同じ操作で、再度、製品ロットＤのホスホリパーゼＤの再精製を行った。硫酸アンモニウム濃度が０Ｍに達した後、分画番号１５〜１７に蛋白質画分が溶出した（画分Ａ２）。その後、純水を流しカラムを洗浄することにより分画番号ＤＷ３〜ＤＷ６に蛋白質画分が溶出した（画分Ｂ２）。
この溶出パターンを図４に示した。この図において、横軸は溶出画分の番号を表し、縦軸は各々の溶出画分の２８０ｎｍにおける吸光度測定値を表す。
【０１３９】
（６）  溶出した画分Ａ２及び画分Ｂ２を各々前記（４）と同様の方法で限外濾過し、液量を０．５ｍＬに濃縮した。
【０１４０】
（７）  これらの濃縮した蛋白質画分（Ａ１、Ａ２、Ｂ１、及びＢ２）と製品ロットＤのホスホリパーゼＤを蛋白質分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ；バイオラッド社）とともに各々１５％のポリアクリルアミドゲル〔フナコシ  イージーゲル（ＩＩ）；フナコシ社）〕に流し、実施例２の（１）と同様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０１４１】
（８）  このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図５に示した。なお、この図において、ゲルのレーンの左端は、蛋白質分子量マーカーの蛋白質のパターンを示している。また、それ以外のレーンは、ホスホリパーゼＤの製品ロットＤの蛋白質パターン及び製品ロットＤから単離された各蛋白質画分（Ａ１、Ａ２、Ｂ１、及びＢ２）の蛋白質パターンを示している。
【０１４２】
（９）  また、このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果をＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ画像解析ソフト（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて画像解析し、各レーンのＰＬＤ５７、ＰＬＤ４２、及びＰＬＤ２０のバンドの「発色強度×面積」を各々測定し、ホスホリパーゼＤ全体の中で比率をそれぞれ求めた。この結果を表２に示した。
【０１４３】
【表２】
2004298083.tif 000009
【０１４４】
（１０）  図５に示すように、このＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動結果においては、主にそれぞれ分子量約５７キロダルトンの蛋白質（ＰＬＤ５７）、分子量約４２キロダルトンの蛋白質（ＰＬＤ４２）、及び分子量約２０キロダルトンの蛋白質（ＰＬＤ２０）のバンドが観察された。
ここで、硫酸アンモニウム濃度が０Ｍに達した後に溶出した画分Ａ１及びＡ２では、各々ＰＬＤ５７のバンドが他のアイソザイムのバンドに比べて非常に強く出ていることが分かる。各ホスホリパーゼＤアイソザイムの比率は、表２に示すように、画分Ａ１では、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝８４％：１６％：０％であり、画分Ａ２では、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝７６％：１２％：１２％であった。
また、純水を流すことにより溶出した画分Ｂ１及びＢ２では、各々ＰＬＤ４２のバンドが他のアイソザイムのバンドに比べて非常に強く出ていることが分かる。各ホスホリパーゼＤアイソザイムの比率は、表２に示すように、画分Ｂ１では、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝２０％：６８％：１２％であり、画分Ｂ２では、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝１２％：７１％：１７％であった。
【０１４５】
〔実施例４〕
（ホスホリパーゼＤのアイソザイム比率によるカルシウム測定時の直線性の確認）
実施例３でホスホリパーゼＤを再精製して得た各画分等における、カルシウム測定時の直線性を確認した。
【０１４６】
（１）  試薬の調製
▲１▼  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、６種類の本発明・第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ      ６０ｍＭ
トライトンＸ−１００〔非イオン性界面活性剤〕    ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕    ０．０５％
ホスホリパーゼＤ  １．５単位／ｍＬ
・実施例３で得た画分Ａ１
・実施例３で得た画分Ａ２
・実施例３で得た画分Ｂ１
・実施例３で得た画分Ｂ２
・実施例１及び２で用いたホスホリパーゼＤの製品ロットＣ、又は
・実施例１及び２で用いたホスホリパーゼＤの製品ロットＤ
【０１４７】
▲２▼  第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、第２試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ      ６０ｍＭ
トライトンＸ−１００〔非イオン性界面活性剤〕    ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕    ０．０５％
ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔基質〕（和光純薬工業社）  ４ｍＭ
硫酸ナトリウム  ５０ｍＭ
クエン酸  ６ｍＭ
【０１４８】
（２）  試料の調製
実施例１の（２）で調製した試料をそのまま使用した。
【０１４９】
（３）  試料中のカルシウム濃度の測定
前記（２）の各試料中のカルシウム濃度を、前記（１）で調製した第１試薬及び第２試薬を用いて、前記実施例１の（３）の▲１▼〜▲５▼の通りに操作を行い、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を求めた。
【０１５０】
（４）  測定結果
測定結果を図６に示した。
【０１５１】
なお、この図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０１５２】
この図から明らかなように、ホスホリパーゼＤとして実施例３で得た画分Ｂ１（ＰＬＤ５７比率２０％）又は画分Ｂ２（ＰＬＤ５７比率１２％）を用いた場合には、それぞれ試料中のカルシウム濃度の増加に伴って各吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値が頭打ちとなり曲線状となってしまっていることが分かる。また、これはホスホリパーゼＤの製品ロットＤ（ＰＬＤ５７比率４２％）を使用した場合も同様であった。
これに対して、ホスホリパーゼＤとして実施例３で得た画分Ａ１（ＰＬＤ５７比率８４％）又は画分Ａ２（ＰＬＤ５７比率７６％）を用いた場合には、それぞれ試料中のカルシウム濃度の増加に伴って各吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値が高濃度域まで直線的に増加していることが分かる。また、これはホスホリパーゼＤの製品ロットＣ（ＰＬＤ５７比率８８％）を使用した場合も同様であった。
【０１５３】
この結果と前記実施例１〜実施例３の結果から、ＰＬＤ５７の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤを用いてカルシウムの測定を行うことにより、試料中のカルシウム濃度と測定により得られる吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値との関係が直線的となり、これにより直線的な検量線が得られ、そして低濃度域から高濃度域までカルシウム濃度測定値がほぼ直線上に位置するようになることが分かる。
従って、低濃度域から高濃度域まで試料中のカルシウム濃度を精度よくかつ正確に測定できるようになる。
特に、ＰＬＤ５７の比率が７５％以上のホスホリパーゼＤを使用した場合、試料中のカルシウムの測定において極めて良好な直線性が得られることが確認された。
【０１５４】
【発明の効果】
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法では、カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定において、分子量約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、及びホスホリパーゼＤの基質として前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を使用することにより、直線的な検量線が得られるようになり、そして低濃度域から高濃度域までカルシウム濃度測定値が、ほぼ直線上に位置するようになるので、試料中のカルシウム濃度を低濃度域から高濃度域まで精度よくかつ正確に測定できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】市販ホスホリパーゼＤを用いて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図２】市販ホスホリパーゼＤのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示した写真である。
【図３】ホスホリパーゼＤの製品ロットＤの疎水性相互作用クロマトグラフィーの溶出のパターンを示したグラフである。
【図４】ホスホリパーゼＤの製品ロットＤの疎水性相互作用クロマトグラフィーの溶出のパターンを示したグラフである。
【図５】ホスホリパーゼＤを再精製して得た各画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示した写真である。
【図６】ホスホリパーゼＤを再精製して得た各画分を用いて試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図１】
2004298083.tif 000013
【図２】
2004298083.tif 000014
【図３】
2004298083.tif 000015
【図４】
2004298083.tif 000016
【図５】
2004298083.tif 000017
【図６】
2004298083.tif 000018