(57)【要約】【課題】マイクロチャネル内に結合している酵素が能力低下して効率が悪くなったとき、容易に新らしい酵素と交換することができ、長時間にわたって優れた効率を維持したまま使用することが可能な新規なマイクロリアクターを提供する。【解決手段】マイクロチャネル表面に導入されたチオール基を介して、触媒分子が可逆的に結合されているマイクロリアクターであって、ガラス、石英又はシリカ系セラミックスで構成されたマイクロチャネルを化学修飾してその表面にアミノ基又は水酸基をもつアルキルシラン残基を導入し、次いでメルカプトカルボン酸を反応させてチオール基をもつマイクロチャネル表面を形成させたのち、酵素分子又はチオール基をもつ有機金属錯体分子を加えて反応させ、可逆的に結合させることにより製造する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチャネル表面に導入されたチオール基を介して、触媒分子が可逆的に結合されていることを特徴とするマイクロリアクター。
【請求項２】
触媒分子が酵素分子である請求項１記載のマイクロリアクター。
【請求項３】
触媒分子がチオール基をもつ有機金属錯体分子である請求項１記載のマイクロリアクター。
【請求項４】
マイクロチャネルの担体が、ガラス、石英又はシリカ系セラミックスである請求項１、２又は３記載のマイクロリアクター。
【請求項５】
ガラス、石英又はシリカ系セラミックスで構成されたマイクロチャネルを化学修飾してその表面にアミノ基又は水酸基をもつアルキルシラン残基を導入し、次いでメルカプトカルボン酸を反応させてチオール基をもつマイクロチャネル表面を形成させたのち、酵素分子又はチオール基をもつ有機金属錯体分子を加えて反応させ、可逆的に結合させることを特徴とするマイクロリアクターの製造方法。
【請求項６】
マイクロチャネルの化学修飾をアミノアルキルトリアルコキシシラン及びアルキルトリアルコキシシランの混合物を用いて行う請求項５記載のマイクロリアクターの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素を可逆的に結合したマイクロリアクター及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
最近、化学分野、電気機械的分野において、径１０〜１００μｍのキャピラリーやマイクロチャネルを利用して、微量分析、微量合成、微量微生物培養、微量電気泳動、微量電気浸透などの化学的・電気的又は機械的操作を行うことが試みられている（非特許文献１参照）。これらは、少量の試料を用いて、迅速にそれぞれの方法の結果を確認しうるという利点があるため、各方面への応用がはかられている。
【０００３】
ところで、これらの中で化学反応を効率的に行うための装置、いわゆるマイクロリアクターについては、流体化学反応の制御性が向上し、反応生成物の収率、純度の改善が予想される上に、リアクターの幅を狭くすることができ、普通サイズのリアクターに比べ、体積当りの表面積の比率を大きくしうるので、化学反応の効率化の手段として注目されている。
【０００４】
他方、化学、生化学の分野においては、反応効率を向上させるために触媒を使用する場合が多く、この際触媒効率を向上させることが課題となっている。例えば光学活性化合物の不斉合成に際し、酵素や有機金属錯体などの有機分子を用いる場合、これらは無機触媒に比べコスト高になるのを免れないので、触媒効率を改善し、使用量の減少や再利用をはかることが実用化の上で必要になってくる。
したがって、マイクロリアクターについても触媒反応を効率よく行わせるためのマイクロチャネル構造を組み立てることが、これを実用化するために必要な要件となっている。
【０００５】
ところで、マイクロチャネル表面に酵素を固定化したマイクロリアクターにおいては、経時的な触媒能力の低下が避けられないので、効率的にマイクロリアクターを利用するには、能力の低下した酵素を適宜交換することが必要になってくる。しかしながら、従来のマイクロリアクターにおいて、マイクロチャネル内の酵素を交換しようとすれば、能力の低下した酵素を完全に除去したのち、再び煩雑な操作により新らしい酵素を固定させなければならないため、ほとんど実用化は不可能であった。
【０００６】
【非特許文献】
「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，第２８５巻，ｐ８３〜８５
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に鑑み、マイクロチャネル内に結合している酵素が能力低下して効率が悪くなったとき、容易に新らしい酵素と交換することができ、長時間にわたって優れた効率を維持したまま使用することが可能な新規なマイクロリアクターを提供することを目的としてなされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、触媒を固定化したマイクロリアクターについて種々研究を重ねた結果、ガラス、石英又はシリカ系セラミックスで構成されたマイクロチャネル表面には、化学修飾によりチオール基を導入しうること、このチオール基を利用すれば酵素又はチオール基をもつ有機金属錯体のような触媒を着脱可能に結合しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、マイクロチャネル表面に導入されたチオール基を介して、触媒分子が可逆的に結合されていることを特徴とするマイクロリアクター、及びガラス、石英又はシリカ系セラミックスで構成されたマイクロチャネルを化学修飾してその表面にアミノ基又は水酸基をもつアルキルシラン残基を導入し、次いでメルカプトカルボン酸を反応させてチオール基をもつマイクロチャネル表面を形成させたのち、酵素分子又はチオール基をもつ有機金属錯体分子を加えて反応させ、可逆的に結合させることを特徴とするマイクロリアクターの製造方法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のマイクロリアクターの基材としては、触媒反応において、触媒、反応体、溶媒及び反応生成物に対し、不活性な材料を用いることが必要である。このような材料としては、例えばガラス、石英、又はシリカ、Ｓｉ／ＳｉＯ２、マグネシア、ジルコニア、アルミナ、アパタイト、窒化ケイ素、及びチタン、アルミニウム、イットリウム、タングステンのような金属の酸化物、炭化物、窒化物、ホウ化物、ケイ化物などのセラミックスを挙げることができる。
このほか上記の要件を満たすものである限り、金属、プラスチックなども用いることができる。このベースの形状としては、板状体が普遍であるが、所望ならば弧状体、球体、粒体などのものを用いることができる。
【００１１】
次に、これらの不活性材料に設けるマイクロチャネルはマイクロドリルやレーザを用いる加工やエッチング処理により簡単に刻設することができる。このマイクロチャネルは幅１０〜５００μｍ、好ましくは５０〜４００μｍ、深さ１０〜５００μｍ、好ましくは５０〜４００μｍのサイズで刻設される。このマイクロチャネルの長さには特に制限はなく、使用される不活性材料のサイズに依存するが、通常１００〜３００ｍｍの範囲で選ばれる。
【００１２】
次に、本発明においては、このように刻設されたマイクロチャネルの表面に、化学修飾により導入されたチオール基を介して触媒分子例えば酵素分子又はチオール基をもつ有機金属錯体分子を結合させることが必要であるが、化学修飾によりチオール基を導入するには、活性水素含有官能基をもつアルキルトリアルコキシシランを結合させ、次いでさらに化学修飾してチオール基を導入するのが有利であるので、マイクロリアクターのマイクロチャネル部分、少なくともその表面部分にアルキルトリアルコキシシランと反応しやすいシラノール基をもつ不活性材料、例えばガラス、石英又はシリカ系セラミックスで構成するのが好ましい。
【００１３】
そして、シラノール基をもつ不活性材料の表面に化学修飾によりチオール基を導入するには、例えば上記の活性水素含有官能基として、アミノ基をもつアルキルトリアルコキシシランを用い、これを基材のシラノール基と結合させたのち、メルカプトカルボン酸を反応させてアミド化してチオール基を導入するか、あるいは無水コハク酸のようなジカルボン酸無水物を結合させ、次いでシステアミンのようなチオール基をもつアミン類によりアミド化してチオール基を導入するか、あるいは水酸基をもつアルキルシランを用い、これを基材のシラノール基と結合させたのちメルカプトカルボン酸でエステル化してチオール基を導入することにより行うことができる。
そのほか、ハロゲン化アルキルシランを用いて基材にハロゲンを導入し、それにチオール基をもつアミン類を反応させてイミン形成によりチオール基を導入することもできる。
【００１４】
次に、このようにしてチオール基を導入したマイクロチャネル表面にこのチオール基を介して酵素分子又は有機金属錯体分子を結合させるには、このチオール基又はこのチオール基からさらに変換された非対称ジスルフィド基をもつマイクロチャネル表面に酵素分子又はチオール基をもつ有機金属錯体分子を分散させた液を流し、マイクロチャネル表面にこれらの分子を接触させながら酸化反応させる。これにより、マイクロチャネル表面のチオール基と酵素分子又は触媒能をもつ有機金属錯体分子中のチオール基との間でジスルフィド結合が形成され、酵素分子又は触媒能を有する有機金属錯体分子がマイクロチャネル表面に固定される。このジスルフィド結合による酵素分子又は触媒能を有する有機金属錯体分子の固定化方法には、特に制限はないが、非対称型ジスルフィドによる活性化を利用する方法が有利である。
また、酸化剤としては、ジメチルスルホキシド、臭素酸塩などが好ましい。
【００１５】
このようにして、マイクロチャネル表面に固定化しうる酵素としては、例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼなどがあり、また触媒能をもつ有機金属錯体としては、チタン、ジルコニウム、クロム、モリブデン、鉄、ルテニウム、コバルト、ロジウム、ニッケル、パラジウム、白金などの金属の触媒能をもつ有機金属錯体がある。
【００１６】
このマイクロチャネル表面にジスルフィド結合により固定されている酵素分子又は触媒能をもつ有機金属錯体分子は、還元することにより、それぞれのチオール基が復元し、マイクロチャネル表面から容易に脱離するので、触媒能が低下した場合には、簡単に新らしい酵素又は触媒能をもつ有機金属錯体と交換することができる。この際の還元剤としては、例えばチオグリコール酸塩やジチオトレイトールやトリアルキルホスフィンを用いることができる。
【００１７】
ガラス、石英又はシリカ系セラミックスのようなシラノール基をもつ材料で構成されたマイクロチャネル表面に触媒分子を可逆的に結合させる好適な方法においては、先ずω‐アミノ又はω‐ヒドロキシアルキルトリアルコキシシランとアルキルトリアルコキシシランとの混合物を有機溶媒、例えばエチルアルコールに溶かした溶液にマイクロチャネルを浸し、室温で３０〜１２０分間反応させたのち、これを取り出し、洗浄後不活性雰囲気中で乾燥させることにより、化学修飾してマイクロチャネルの表面にω‐アミノアルキル基又はω‐ヒドロキシアルキル基を導入する。
【００１８】
次いで、無水コハク酸を有機溶媒、例えばＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に前記の処理物を浸して２０〜６０分間反応させたのち、縮合剤例えば１‐エチル‐３‐（３‐アミノプロピル）カルボジイミドとＮ‐ヒドロキシスクシンイミドを有機溶媒例えばＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を反応させることにより、マイクロチャネル表面にＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを形成させる。
【００１９】
次に、これをシスタミンのような含硫黄化合物のリン酸緩衝液とトリアルキルホスフィン、例えばトリ‐ｎ‐ブチルホスフィンの溶液で処理して遊離チオール基をもつマイクロチャネル表面を形成させる。この際のトリアルキルホスフィンの溶媒としては、例えば水とアルコールとの混合液が用いられる。この遊離チオール基を場合により、さらに有機アミンの存在下、ジスルフィド化剤、例えば３‐ニトロ‐２‐ピリジンスルフェニルクロリドを反応させて非対称ジスルフィド基に変えたのち、酵素分子又はチオール基をもつ有機金属錯体分子と反応させる。
【００２０】
酵素分子は、タンパク質部分を有し、このタンパク質はシステイン又はシスチンを含んでいるので、これが上記の非対称ジスルフィド基と反応して、マイクロチャネル表面に酵素分子又はチオール基をもつ有機金属錯体分子が可逆的に結合する。
【００２１】
このようにして得られるマイクロリアクターを用いて触媒反応を行えば、マイクロチャネルのもつ体積に対する表面積の比率の大きさにより、著しく反応効率を高めることができ、しかもマイクロチャネル表面に触媒分子が可逆的に固定化しているため、反応終了後、反応液から触媒分子を分離、回収することなく、マイクロチャネルに基質分子を継続的に導入し、連続的に反応させることができるという利点がある。そして、触媒能力が低下した場合は、還元剤をマイクロチャネル内に流すことにより、触媒を脱離させ、新らしい触媒と簡単に交換しうるという利点もある。
【００２２】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例により何ら限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
Ｓｉ／ＳｉＯ２ウエハー基板（３０×３０×５ｍｍ）上に、マイクロドリルを用いて、幅４００μｍ、深さ４００μｍ、長さ２００ｍｍのチャネルを８回屈曲蛇行させて刻設し、このチャネル上をガラス板で被覆することにより、マイクロチャネル構造をもつマイクロリアクター基板を製造した。
次に、これを濃硫酸と３０％過酸化水素水との混合物（体積比７：３）１リットル中に１２時間浸漬してチャネル内を洗浄し、壁面に付着した有機物を分解、除去したのち、超純水で洗浄した。
【００２４】
次いで、３‐アミノプロピルトリエトキシシランとメチルトリエトキシシランとの混合物（体積比２：８）を９５％エチルアルコールに溶解して、３体積％溶液１リットルを調製し、この中に上記のマイクロリアクター基板を浸漬し、１時間処理したのち、エチルアルコールで洗浄し、窒素気流下１１５℃で１時間乾燥した。
このようにして得たマイクロリアクター基板のチャネル内に無水コハク酸のＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド溶液（１ミリモル／リットル）を満たし、３０分間反応させたのち、この溶液を排出させ、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドで十分に洗浄した。
【００２５】
次に１‐エチル‐３‐（３‐アミノプロピル）カルボジイミドとＮ‐ヒドロキシスクシンイミドとをＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド中に、それぞれ濃度１ミリモル／リットルで混合して処理液を調製し、これをマイクロチャネル内に注入し、反応させることによりＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを壁面に形成させた。
【００２６】
次に、このようにして得たマイクロチャネルにシスタミン二塩酸塩をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を送液して固定化した。これをリン酸緩衝液で洗浄後、トリ‐ｎ‐ブチルホスフィンを水とメチルアルコールとの混合液（体積比１：５）で希釈した溶液で処理して遊離チオール基を形成させた。次いで、ここに３‐ニトロ‐２‐ピリジンスルフェニルクロリドとトリエチルアミンのＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド溶液を流通させて非対称ジスルフィドを形成させた。
【００２７】
このマイクロチャネルに、システイン残基をもつ酵素ククミシンのリン酸緩衝液溶液を流通させ、固定化を行った。次に、このククミシンを固定化したマイクロリアクターを用いて、基質ペプチドの加水分解反応を行った。１００マイクロモル／リットルの濃度に調製した基質ペプチド（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）のリン酸緩衝溶液をシリンジポンプでマイクロチャネル内に注入し、得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフで分離・分析した。この際の反応時間はチャネル内の滞留時間として評価した。シリンジポンプによる送液速度を変化させ、異なった滞留時間における反応収率を調べた。この結果を図１に示す。
【００２８】
このマイクロリアクターをトリ‐ｎ‐ブチルホスフィンを水とメチルアルコールとの混合液（体積比１：５）で希釈した溶液で再度処理したのち、３‐ニトロ‐２‐ピリジンスルフェニルクロリドとトリエチルアミンのＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド溶液を流通させて非対称ジスルフィドを形成させてククミシンを固定化し、基質の加水分解反応を行った。この操作を数度繰り返して反応を行った結果を図１に示す。この図から分るように、１回目、２回目、３回目の固定化でも同等の反応効率を得ることができた。
【００２９】
実施例２
実施例１と同様の方法でマイクロチャネル内を表面処理したのち、予め調製しておいた３‐ニトロ‐２‐ピリジンスルフェニル化したメルカプトプロピオン酸のＮ‐ヒドロキシスクシンイミド活性エステルをリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かし、上記表面処理したマイクロリアクターに注入し、１２時間反応させ、固定を行った。
上記の操作で得られたマイクロリアクターに実施例１同様ククミシンを固定化した。このマイクロリアクターを用いて、実施例１同様基質の加水分解反応を行ったところ、同様の結果を得た。
【００３０】
実施例３
実施例１と同様の方法でマイクロチャネル内をヒドロキシプロピルシランで表面処理した後に、予め調製しておいた３‐ニトロ‐２‐ピリジンスルフェニル化したメルカプトプロピオン酸を光延反応によりエステル結合を形成させ導入した。得られたマイクロリアクターにククミシンの溶液を注入し、２時間反応させ、ククミシンの固定を行った。
上記の操作で得られたククミシンを固定化したマイクロリアクターを用いて、基質の加水分解反応を行ったところ、実施例１及び２と同等の結果を得た。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、触媒分子が可逆的に結合したマイクロリアクターが提供されるので、触媒の活性が低下したり、他の作用を有する触媒を必要とする場合など、簡単に触媒分子を交換することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における滞留時間、繰り返し回数と収率との関係を示す棒グラフ。
【図１】
2004160273.tif 000002