(57)【要約】【課題】１，４−ジオキサンやその類縁化合物などの環状エーテル化合物を分解する能力を有する微生物、ならびに該微生物および／またはその由来物を用いて該化合物を分解する、環状エーテル化合物の分解方法を提供すること。【解決手段】環状エーテル化合物を分解する能力を有するブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）に属する微生物、ならびにブレブンディモナス属に属する微生物および／または該微生物由来物を用いて環状エーテル化合物を分解する、環状エーテル化合物の分解方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状エーテル化合物を分解する能力を有するブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）に属する微生物。
【請求項２】
環状エーテル化合物が、酸素原子を少なくとも１つ含む飽和もしくは不飽和の複素環式化合物である請求項１記載の微生物。
【請求項３】
複素環式化合物が、複素環の炭素原子に少なくとも一つの置換基が結合した構造を有してなるものである請求項２記載の微生物。
【請求項４】
微生物がブレブンディモナス・ベシクラリスＯＯＣ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７５）である請求項１〜３いずれか記載の微生物。
【請求項５】
ブレブンディモナス属に属する微生物および／または該微生物由来物を用いて環状エーテル化合物を分解する、環状エーテル化合物の分解方法。
【請求項６】
環状エーテル化合物が、酸素原子を少なくとも１つ含む飽和もしくは不飽和の複素環式化合物である請求項５記載の方法。
【請求項７】
複素環式化合物が、複素環の炭素原子に少なくとも一つの置換基が結合した構造を有してなるものである請求項６記載の方法。
【請求項８】
微生物がブレブンディモナス・ベシクラリスに属する微生物である請求項５〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
ブレブンディモナス・ベシクラリスに属する微生物がブレブンディモナス・ベシクラリスＯＯＣ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７５）である請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環状エーテル化合物を分解する能力を有する微生物、ならびに該微生物および／またはその由来物を用いて環状エーテル化合物を分解する、環状エーテル化合物の分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、世界保健機構（ＷＨＯ）において飲料水水質ガイドラインの改訂作業が進められており、新たに１，４−ジオキサンがガイドライン対象物質として検討されている。米国環境保険庁（Ｕ．Ｓ．ＥＰＡ）では、３０μｇ／Ｌの１，４−ジオキサンを含んだ飲料水を一生涯飲み続けたときの発癌性のリスクは１０万人に１人の割合以下としている。また、１，４−ジオキサンは「化審法」では指定化学物質とされ、難分解性であることが示されている。なお、「化審法」とは、「化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律」の略称である。
【０００３】
このように発癌性の恐れが指摘され、しかも難分解性である１，４−ジオキサンは、実際、河川水、特に汚染された地下水でしばしば検出されている。従って、水を浄化する観点からも、１，４−ジオキサンやその類縁化合物を分解除去する方法の開発が望まれている。当該方法としては、例えば、促進酸化法、逆浸透膜処理および加熱分解処理法という方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
【非特許文献１】
平成１１年度次世代廃棄物処理技術基盤整備事業成果報告、６．学校法人福岡大学、日本技術開発株式会社、株式会社クボタ、株式会社荏原製作所、ユニチカ株式会社、神鋼パンテック株式会社、（平成１５年３月２８日検索）、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｅｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｓｙｍ          ｐｏ／＞
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、１，４−ジオキサンやその類縁化合物などの環状エーテル化合物を分解する能力を有する微生物、ならびに該微生物および／またはその由来物を用いて該化合物を分解する、環状エーテル化合物の分解方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する微生物が環状エーテル化合物を分解し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）  環状エーテル化合物を分解する能力を有するブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒｉｓ）に属する微生物、
（２）  環状エーテル化合物が、酸素原子を少なくとも１つ含む飽和もしくは不飽和の複素環式化合物である前記（１）記載の微生物、
（３）  複素環式化合物が、複素環の炭素原子に少なくとも一つの置換基が結合した構造を有してなるものである前記（２）記載の微生物、
（４）  微生物がブレブンディモナス・ベシクラリスＯＯＣ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７５）である前記（１）〜（３）いずれか記載の微生物、
（５）  ブレブンディモナス属に属する微生物および／または該微生物由来物を用いて環状エーテル化合物を分解する、環状エーテル化合物の分解方法、
（６）  環状エーテル化合物が、酸素原子を少なくとも１つ含む飽和もしくは不飽和の複素環式化合物である前記（５）記載の方法、
（７）  複素環式化合物が、複素環の炭素原子に少なくとも一つの置換基が結合した構造を有してなるものである前記（６）記載の方法、
（８）  微生物がブレブンディモナス・ベシクラリスに属する微生物である前記（５）〜（７）いずれか記載の方法、ならびに
（９）  ブレブンディモナス・ベシクラリスに属する微生物がブレブンディモナス・ベシクラリスＯＯＣ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７５）である前記（８）記載の方法、
に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の環状エーテル化合物の分解方法に用いられるブレブンディモナス属に属する微生物は、１，４−ジオキサンやその類縁化合物などの環状エーテル化合物を分解し得る能力を有する。分解メカニズムの詳細は未だ不明であるが、前記化合物を酸化的に開裂するものと推定される。該微生物が当該能力を有することは、本発明において初めて見出されたことである。
【０００９】
前記微生物が分解する能力を有する環状エーテル化合物とは、例えば、酸素原子を少なくとも１つ含む飽和もしくは不飽和の複素環式化合物である。該複素環式化合物としては、複素環の炭素原子に少なくとも一つの置換基が結合した構造を有してなるものであってもよい。これらの環状エーテル化合物の詳細については、後述する。
【００１０】
本発明のブレブンディモナス属に属する微生物としては、たとえば、ブレブンディモナス・ベシクラリスに属する微生物を挙げることができる。また、本発明においては、環状エーテル化合物を分解し得る能力を有するブレブンディモナス・ベシクラリスＯＯＣ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７５）を初めて単離した。本発明は、ブレブンディモナス・ベシクラリスに属する微生物、および該微生物に属する新規菌株であるブレブンディモナス・ベシクラリスＯＯＣ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７５）を包含する。これらの微生物は、本発明の環状エーテル化合物の分解方法において特に好ましく用いられる。
【００１１】
本発明において新たに単離された前記菌株は、大阪府内各地で採取した土壌を分離源として得られたものである。すなわち、該土壌をサンプルとして１，４−ジオキサンを唯一の炭素源とする選択培地で集積培養を行い、１，４−ジオキサン分解菌のスクリーニングを行った結果、２か所の土壌で１，４−ジオキサンの良好な分解活性が認められた。次いで、当該土壌より１，４−ジオキサンの分解活性を有する菌を単離した。また、得られた菌の同定は以下に示す方法により行った。
【００１２】
検体である前記菌をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ社製）に植菌して３０℃で２日間培養し、培養後の菌体からＰｒｅｐＭａｎ  Ｍｅｔｈｏｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）のうち５’末端側約５００ｂｐの領域を増幅した。その後、増幅された塩基配列をシーケンシングし、該菌の１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列を得た。ＰＣＲ産物の精製、サイクルシークエンスにはＭｉｃｒｏＳｅｑ  ５００  １６ＳｒＤＮＡ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。サーマルサイクラーにはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、ＤＮＡシーケンサーにはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。なお、ゲノムＤＮＡの抽出からサイクルシークエンスまでの基本的操作はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプロトコルに従った。
【００１３】
解析では、得られた１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を用いて相同性検索を行い、まず相同率の高い上位１０株を決定した。さらに、検索された上位１０株と検体の１６ＳｒＤＮＡを用いて近隣結合法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  １９８７，  ４，  ｐ４０６−４２５）により分子系統樹を作成し、検体の近縁種および帰属分類群の検討を行った。相同性検索および系統樹の作成にはＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ１４１を、相同性検索を行う際のデータベースとしてＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ５００  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｖ００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
【００１４】
解析の結果、検体の１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列は相同率１００％でブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９９４，  ４４，  ｐ４９９−５１０）の１６ＳｒＤＮＡと一致した。また、分子系統樹でも検体の１６ＳｒＤＮＡはブレブンディモナス・ベシクラリスの１６ＳｒＤＮＡと同じ場所に位置した。これらの結果より、検体はブレブンディモナス・ベシクラリスに属する菌株であると推定された。しかしながら、環状エーテル化合物を分解し得る能力については、これまでにブレブンディモナス属に属する微生物には知られていないことから、検体である菌を新規菌株と認定し、前記の通りの菌株名を付すこととした。
【００１５】
また、ブレブンディモナス・ベシクラリスＯＯＣ−１株について常法によりその菌学的性質を調べた。その結果、該株の菌学的性質はブレブンディモナス・ベシクラリス（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９９４，  ４４，  ｐ４９９−５１０）の典型性状と一致することが明らかとなった。以下に、本発明において得られたブレブンディモナス・ベシクラリスＯＯＣ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７５）の菌学的性質を記載する。
【００１６】
【表１】
2004298116.tif 000002
【００１７】
【表２】
2004298116.tif 000003
【００１８】
【表３】
2004298116.tif 000004
【００１９】
本発明において得られたブレブンディモナス・ベシクラリスＯＯＣ−１株は、平成１５年３月２８日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７５のもとに寄託されている。
【００２０】
なお、寄託の際に提出した寄託申請書および微生物条件記録書に記載の内容は以下の通りである：
2004298116.tif 000005
2004298116.tif 000006
【００２１】
本発明の微生物は常法により培養される。培地成分の炭素源、窒素源、リン源および無機塩は、当該菌が資化し得る物質であれば特に限定されない。炭素源としては、グルコース、マルトース、サッカロース、セロビオース、デンプン加水分解液、廃糖蜜等の糖類、クエン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタール酸等の有機酸が例示される。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩等の無機態窒素、尿素、アミノ酸等の有機態窒素が例示される。リン源としては、リン酸カリウム等のリン酸塩が例示される。無機塩としては、カリウム、ナトリウム、カルシウム等の金属の塩が例示される。また、所望により、鉄、マンガン、マグネシウム、コバルト、銅、ニッケル等の微量成分、ビタミン、ホルモン等を用いることもできる。さらに、これらを含有している肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等の窒素含有有機物等を用いることもできる。
【００２２】
該微生物の培養は、通常、振盪培養または通気攪拌深部培養等下で行われる。培養温度は、通常、４〜５０℃程度、好ましくは２０〜４０℃程度に設定する。培養液のｐＨは、通常、４〜９、好ましくは６〜８程度に設定する。培養方式は、回分式、半連続式、連続式のいずれでもよい。例えば、回分式における培養時間は、培地成分の種類、濃度、培養条件等により異なるが、通常、少なくとも３日間程度、好ましくは４〜７日間程度である。
【００２３】
本発明の環状エーテル化合物の分解方法は、前記のような微生物を用いて環状エーテル化合物を分解するものであり、該方法によれば、穏和な条件で効率的に環状エーテル化合物、特に１，４−ジオキサンを分解除去することができる。また、前記微生物に替えて、または前記微生物と共に前記微生物由来物を用いて環状エーテル化合物を分解してもよい。
【００２４】
本発明の微生物は、例えば、当該微生物を培養して得られた培養液から濾過、遠心分離等の通常の固液分離手段により回収し、後述するようにして環状エーテル化合物の分解に使用することができる。
【００２５】
微生物由来物としては、前記微生物に由来する物を含むものであれば特に限定されるものではない。例えば、該微生物を培養して得られた培養液および／または微生物に処理を施した処理物を用いることができる。培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、乾燥物、界面活性剤および／または有機溶剤添加物、溶菌酵素処理物等が例示される。微生物の処理物としては、微生物の乾燥物、界面活性剤および／または有機溶剤添加物、溶菌酵素処理物、固定化微生物または微生物からの抽出酵素標品等が例示される。
【００２６】
また、培養微生物もしくは培養液から酵素等を精製して用いることもできる。微生物もしくは培養液から酵素等を単離精製するには、通常の単離精製法を用いればよい。酵素等が菌体内に存在する場合には、例えば、遠心分離等により集菌された菌体を破砕機、超音波、フレンチプレス、リゾチームによる消化等により破砕する。通常は緩衝液中で破砕され、菌体の破砕物を除去して抽出液を得る。抽出液から酵素等を単離するには、おおまかに除蛋白した後、またはしないで、例えば、硫安飽和あるいは溶媒沈澱法等により、酵素などを沈殿させて沈澱物を回収する。得られた沈殿物を、所望により緩衝液に溶解し、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法、塩析法、水性二相分配法等により精製する。酵素等が菌体外に産生される場合には、菌体の破砕を要せず、培養液を遠心分離して菌体を沈澱させ、その上清から酵素を上記と同様にして精製する。
【００２７】
本発明の微生物を使用するに際しては、該微生物、または培養液、微生物および／または培養液の処理物、酵素等の微生物由来物をそのまま、あるいは水溶液に懸濁または溶解して分解剤として用いてもよい。また、多孔性物質を併用して分解剤とすることもできる。多孔性物質としては、該微生物の環状エーテルの分解活性を阻害しないものであればよく、例えば、硅藻土、タルク、バーミキュライト、多孔性ガラス、酸性白土、漂白土、ピートモス、パーライト、カオリナイト、アルミナ、ベントナイト、ゼオライト、トバモライト、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、セラミックス、金属酸化物、軽石、砂、レンガ、活性炭、シリカゲル等が例示される。これらの多孔性物質と該微生物および／または微生物由来物を混合ないし混練して、これらの多孔性物質の表面に付着させるか、あるいはこれらの多孔性物質に吸着担持させて分解剤とすることができる。
【００２８】
また、微生物および／または微生物由来物を担体に固定化して分解剤とすることもできる。担体としては、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、澱粉等の多糖類、その誘導体、ゼラチン、アルブミン、コラーゲン、グルテン、絹糸等のタンパク質、コンニャク粉、κ（カッパー）−カラギーナン、アルギン酸、ローカストビーンガム等の天然高分子物質、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシアクリレート、エチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリスチレン、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリイソブチレン、アクリルアミド−ヒドロキシエチルメタクリレート共重合体、シリコーン樹脂等の合成高分子物質等が例示される。これらの担体に固定化するには、担体結合法、架橋法、包括法、吸着法等を採用することができる。
【００２９】
かかる分解剤における微生物および／または微生物由来物の含有量は、用いる微生物または微生物由来物の活性の強さ、多孔性物質の種類、担体の種類、固定化方法、使用方法、使用条件等により適宜設定することができる。当該含有量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００３０】
本発明の微生物（以下、微生物由来物の意を含む場合がある）は、前記の通り、１，４−ジオキサンやその類縁化合物などの環状エーテル化合物を分解し得る。
【００３１】
前記環状エーテル化合物とは、例えば、酸素原子を少なくとも１つ含む飽和もしくは不飽和の複素環式化合物である。また、当該化合物の構造中の複素環は、その炭素原子に少なくとも１つの置換基が結合した構造を有してなるものであってもよい。かかる置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等の直鎖状および分枝鎖状の脂肪族炭化水素基、水酸基、直鎖状および分枝鎖状のアルコキシ基、ハロゲン原子、ハロゲン化された直鎖および分枝鎖状のアルキル基、その他の脂環式化合物であってもよく、炭素数１〜４の直鎖および分枝鎖状のアルキル基等が例示される。環状エーテル化合物の例を以下の表４に示す。また、複素環の炭素原子に少なくとも１つの置換基が結合した構造を有してなるもの例としては、表４に示す各化合物の複素環に任意に１つ以上の置換基が結合したものを挙げることができる。
【００３２】
【表４】
2004298116.tif 000007
【００３３】
本発明の環状エーテル化合物の分解方法においては、前記したような環状エーテル化合物の分解に本発明の微生物を使用する。環状エーテル化合物の分解は、該微生物と環状エーテル化合物とを混合ないし混練等により、両者を１つの反応系（例えば、１つの培養槽）に共存させることにより、実施することができる。共存には、該微生物と環状エーテル化合物とを接触させる態様を含む。該微生物と環状エーテル化合物との共存は、具体的には、例えば、分解対象物である環状エーテル化合物を含む培地や水溶液中にて、該微生物を該微生物の前記培養条件下に、例えば、１〜７日間程度維持することにより行うのが好適である。本発明の微生物が、例えば、環状エーテル化合物の分解に関与する酵素を菌体外に分泌するような場合には、環状エーテル化合物が直接菌体に接触することがなくとも該化合物の分解が行われることになる。また、本発明の微生物の培養液を、環状エーテル化合物の存在する土壌等に散布することにより、微生物と環状エーテル化合物とを共存させることもできる。
【００３４】
微生物と環状エーテル化合物との共存の態様としては、回収の容易性の観点から、菌体そのもの、および／または前記分解剤（特に多孔性物質や担体を用いて得られたもの）を用いて行う態様が好適である。菌体および／または分解剤の使用量としては、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
【００３５】
以上の本発明の方法によれば、一般に難分解性とされる環状エーテル化合物（特に１，４−ジオキサン）を穏和な条件下で効率的に分解除去することができる。従って、本発明は、例えば、工場廃水の処理や浄水処理に好適に使用される。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００３７】
実施例１  １，４−ジオキサン分解菌の単離
（１）スクリーニング
大阪府内各地で土壌をランダムに採取した。当該土壌を、サンプルとして、１０００μｇ／ｍＬの１，４−ジオキサン（以下、ＤＯＸという）液体培地１５ｍＬを含む試験管に少量（小さじ一杯程度）加え、２８℃にて１４日間振とうした。なお、ＤＯＸ液体培地の組成は表５の通りである。また、実施例中、単に液体培地という場合、ＤＯＸを含まないものをいう。
【００３８】
【表５】
2004298116.tif 000008
【００３９】
（２）ＤＯＸ分解の確認
振とうに供したＤＯＸ液体培地の上澄み液３ｍＬを２５ｍＬ容のバイヤル瓶に入れ、セプタムおよびアルミキャップにて蓋をし、６０℃の恒温槽で３０分間静置させた。同様に別途６０℃に加熱しておいたガスタイトシリンジを用い、該バイヤル瓶の気相部０．５ｍＬをサンプリングし、ＧＣ／ＭＳ（島津製作所  ＱＰ−２０１０）にて解析を行い、ＤＯＸが減少もしくは消失していることを確認した。なお、ＤＯＸの検出限界は１０ｐｐｂであった。図１に、特に良好にＤＯＸが分解された２つの土壌（土壌▲１▼および▲２▼）についての結果を示す。分解の程度を当初のＤＯＸの量を１００％としてその残存率として示す。
【００４０】
実施例２  菌の単離
以上の工程により、試験した土壌サンプル中、２つのもので特に良好にＤＯＸが分解され得ることが確認された。そこで、さらによりＤＯＸ分解の程度が良好であった土壌▲２▼を用いて得られた上澄み液を、減菌した０．５（Ｗ／Ｖ）％食塩水を用いて１０６倍に希釈した後、１０００μｇ／ｍＬのＤＯＸを含む寒天平板培地にストリークし、２８℃で７日間培養した。生育したコロニーを釣菌し、少量の減菌した０．５％食塩水に懸濁し、再び寒天平板培地にストリークして純化した。均一なコロニーが出現するまでこの操作を繰り返した。その結果、高いＤＯＸ分解能力を有する１種の菌が単離された。なお、寒天平板培地の組成は表５の組成に寒天を１．５重量％加えたものとした。
【００４１】
実施例３  単離された菌のＤＯＸ分解活性１
得られた菌のコロニーの一部をＤＯＸ液体培地に懸濁し、２８℃で７日間培養した。培養後、遠心分離を行い、５％食塩水で菌を洗浄した。この操作を２回行い、遠心分離後の菌に液体培地を加え、濁度が６６０ｎｍでＯＤが１０．０Ａになるように濃度を調整した（菌液）。滅菌済み液体培地１３．５ｍＬにＤＯＸ濃度が１００μｇ／ｍＬになるようにＤＯＸを１．８μＬ加え、さらに前記菌液を加えて、ＯＤが１．０、０．５、０．２５および０．１２５Ａになるように菌密度を調整し、２８℃で振とう培養を行った。実施例１と同様の操作により、ＤＯＸの減少をＧＣ／ＭＳにて確認した。図２に結果を示す。以上の結果、単離した菌はＤＯＸを分解する能力を有することが確認できた。
【００４２】
実施例４  単離された菌のＤＯＸ分解活性２
実施例３と同様にして菌液を得、該菌液を以下のｐＨ調整液（ｐＨ４．４６〜８．９９）に濁度が１．０Ａ（λ＝６６０ｎｍ）になるまで加えた。２８℃で培養を行い、２、４および６時間の時点でサンプリングを行い、実施例１と同様の操作により、ＤＯＸの減少をＧＣ／ＭＳで分析した。結果を図３に示す。単離した菌はｐＨ７〜９でＤＯＸの分解活性が高いことが分かる。
【００４３】
ｐＨ調整液は、以下のＡ液及びＢ液を用い、表６の記載に従って両液を混合して調製した。ｐＨ８．９９のｐＨ調整液については、さらに１０％ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを調整した。
【００４４】
（Ａ液の調製）
ＮａＣｌ  ０．０５ｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇを精製水１００ｍＬに溶解させた（Ｃ液）。つぎにＫＨ２ＰＯ４  ０．０７ｇを精製水１０ｍＬに溶解させ、この水溶液に以下のＢ液１ｍＬを加え、さらにＭｇＳＯ４・４Ｈ２ＯおよびＮＨ４ＮＯ３  ０．２ｇを精製水８９ｍＬに溶解させて得た水溶液（Ｄ液）を加えて１００ｍＬのＡ液を調製した。
【００４５】
（Ｂ液の調製）
Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．０７ｇを精製水１０ｍＬに溶解させ、これにＣ液１ｍＬを加え、さらにＤ液を加えて１００ｍＬのＢ液を調製した。
【００４６】
【表６】
2004298116.tif 000009
【００４７】
実施例５  単離された菌のＤＯＸ分解活性３
実施例３と同様にして、菌密度が濁度で１．０Ａ（λ＝６６０ｎｍ）であり、ＤＯＸ濃度が１００μｇ／ｍＬである培養液を調製して、７、１５、２３、２８、３５および４２℃で単離された菌のＤＯＸ分解活性に対する温度の影響を調べた。結果を図４に示す。単離した菌は３０〜４０℃の温度でＤＯＸの分解活性が高いことが分かる。
【００４８】
実施例６  ＤＯＸ類縁化合物に対する分解活性
単離された菌を坂口フラスコで２８℃、７日間培養し、遠心分離（５℃、７０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）を行った。分離後、５％食塩水で菌を希釈し、再度、遠心分離を行い、この操作を２回繰り返し試験用の菌液を調製した。試験管に液体培地１３．５ｍＬ入れて、滅菌後、ＤＯＸ類縁化合物（ＤＯＸ、１，３−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、テトラヒドロピラン（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））を濃度が１００μｇ／ｍＬになるようにそれぞれ加え、さらに調製した菌液を加えて濁度が１．０になるように菌密度をそれぞれ調整した。２８℃で培養し、２、４および６時間の時点でサンプリングを行い、実施例１と同様な操作でＧＣ／ＭＳ分析を行った。図５に結果を示す。以上より、単離した菌はＤＯＸ以外の類縁体環状エーテルも同様に分解することが明らかである。
【００４９】
【発明の効果】
本発明は、環状エーテル化合物を分解する能力を有するブレブンディモナス属に属する微生物および／または該微生物由来物を用いて環状エーテル化合物を分解する環状エーテル化合物の分解方法を提供する。また、該分解方法に特に好適に使用される新規菌株を提供する。本発明の環状エーテル化合物の分解方法によれば、穏和な条件で効率的に環状エーテル化合物、特に１，４−ジオキサンを分解除去することができる。従って、本発明の方法は、例えば、工場廃水の処理や浄水処理に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＤＯＸ分解菌のスクリーニングに供した土壌についてのＤＯＸ分解の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、スクリーニングの結果得られた菌のＤＯＸ分解活性を示すグラフである。
【図３】図３は、スクリーニングの結果得られた菌のＤＯＸ分解活性に対するｐＨの影響を示すグラフである。
【図４】図４は、スクリーニングの結果得られた菌のＤＯＸ分解活性に対する温度の影響を示すグラフである。
【図５】図５は、スクリーニングの結果得られた菌のＤＯＸ類縁化合物に対する分解活性を示すグラフである。
【図１】
2004298116.tif 000010
【図２】
2004298116.tif 000011
【図３】
2004298116.tif 000012
【図４】
2004298116.tif 000013
【図５】
2004298116.tif 000014