(57)【要約】【課題】ポストカラム誘導体化法を用いた液体クロマトグラフにおいて、溶離液の変化により生ずるベースライン変動を低減することを目的とする。【解決手段】溶離液のグラジエント溶出プログラムに伴い変化する検出ベースライン変動を抑えるために、誘導体化試薬を送液する第２のポンプの流量をそのプログラムに連動して大なり小なり変化させる。ここでは、予め設定したプログラムにより第２のポンプの流量を変化させ、分析注入サイクルごとに再現性よく反応環境条件を成立させる。【効果】変動の最小限化された平坦な検出ベースラインが得られる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶離液を送液する第１のポンプと、誘導体化試薬を送液する第２のポンプを有する液体クロマトグラフにおいて、
測定対象試料の注入から次の測定対象試料の注入までの間に、前記第２のポンプの流量を変化させることを特徴とする液体クロマトグラフ。
【請求項２】
請求項１において、
二段階の流量を接続する間、任意の時間内に流量を傾斜変化させて接続することを特徴とする液体クロマトグラフ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はポストカラム誘導体化法を用いた反応系を備えた液体クロマトグラフに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来からポストカラム誘導体化法を用いた液体クロマトグラフの代表的な装置としてアミノ酸分析計がある。
【０００３】
下記特許文献１に述べられているように、従来のアミノ酸の検出方法は、緩衝液ポンプにより送液する分離カラムで分離したアミノ酸成分を含む緩衝液（溶離液）に、ニンヒドリン試薬を合流させ、その混合液を加熱した反応コイルまたは反応カラムを通すことによって反応させ、可視検出器で連続的に検出していた。
【０００４】
この反応コイルは、反応混合液を流す間、一定の反応時間を得るために、通常０．２５ｍｍＩＤ  ×７〜２０ｍの細くて長いテフロン（登録商標）チューブを使用する。反応カラムの場合は、１０から１００μｍのイナートなビーズを充填したカラム状の円筒を用いて反応時間を得る。
【０００５】
【特許文献１】
特開平４−１９４７５０号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ステップワイズ溶出法にせよ、リニアグラジエント溶出法にせよ、クロマトグラフィーの分離改善のため分離カラムに送り込む溶離液の液性，流量を変化させる場合が多々ある。液性は、ｐＨ，塩濃度，有機溶媒濃度、その他モディファイアの濃度などにより特徴付けられる。ポストカラム誘導体化法の場合、溶離液の液性、または流量が変化する場合、検出信号値が影響を受け、ベースラインが変動することが多い。これは、溶離液と誘導体化試薬の反応環境，反応時間などが変化することで、混合液の吸光度や蛍光強度などが影響を受けるため、吸光度検出や蛍光検出の信号値が変化するためである。
【０００７】
本発明は、ポストカラム誘導体化法を用いた液体クロマトグラフにおいて、溶離液の変化により生ずるベースライン変動を低減することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、溶離液のグラジエント溶出プログラムに伴い変化する検出ベースライン変動を抑えるために、誘導体化試薬を送液する第２のポンプの流量をそのプログラムに連動して大なり小なり変化させる。ここでは、予め設定したプログラムにより第２のポンプの流量を変化させ、分析注入サイクルごとに再現性よく反応環境条件を成立させる。
【０００９】
例えば、反応混合液の吸光度が若干大きくなる場合、第２のポンプの流量をやや下げる。逆の場合は、流量をやや上げることになる。
【００１０】
また、第２のポンプで反応試薬および反応最適条件を作る緩衝液を混合送液することがある。このときは第２のポンプを変化させる方法以外に、例えば反応混合液の吸光度が若干大きくなる場合、緩衝液の混合比を増すこともできる。また逆に吸光度等検出信号が若干小さく変化する場合は反応試薬のほうの混合比率を増すことになる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００１２】
図１はアミノ酸分析装置の構成図である。溶離液送液機構１１，試料導入部３，分離機構１２，反応液送液機構１３，Ｔ字ジョイント７，反応装置８，可視検出器９、およびこれらをつなぐ流路１４，１５とデータ処理装置１０を備える。
【００１３】
溶離液送液機構１１は、複数の溶離液槽と溶離液を送液するためのポンプ１を備え、更に、ポンプ１内あるいは溶離液槽とポンプ１の間に溶離液層を選択するための電磁弁を有しており、データ処理装置１０からの信号あるいはポンプ１への直接入力により電磁弁を切り替え、選択された溶離液をポンプ１により送液する。
【００１４】
溶離液は試料導入部３を経由して分離機構１２へと送られる。分離機構１２は、ガードカラム５と分離カラム６から構成されており、試料導入部３より導入された試料はガードカラム５を通過し、分離カラム６で分離される。
【００１５】
反応液送液機構１３は、反応液または洗浄液を送液するポンプ２と流路１５を備え、ポンプ２内あるいは反応液・洗浄液槽とポンプ２の間に電磁弁を有している。反応液送液機構１３はデータ処理装置１０からの信号あるいはポンプ２への直接入力により電磁弁を切り替え、選択された液をポンプ２により流路１５へと送液する。
【００１６】
Ｔ字ジョイント７は、分離カラム６と反応液送液機構１３との間に設けられ、分離カラム６で分離された各アミノ酸は反応液送液機構１３より送液される反応液と混合される。この混合液は、反応装置８を通過する際に反応し呈色して、可視検出器９により検出される。
【００１７】
可視検出器９は、検出信号をデータ処理装置１０に出力する。データ処理装置１０は入力した信号を処理してクロマトグラムおよびデータとして出力，記録，保存する。
【００１８】
図２に、本発明のグラジエントプログラム例を示す。「％Ｂ１」〜「％Ｂ５」は、ポンプ１が送液する各溶離液の比率、「流量１」はポンプ１が送液する流量を示す。また、「％Ｒ１」〜「％Ｒ３」は、ポンプ２が送液する各反応液の比率、「流量２」はポンプ２が送液する流量を示す。
【００１９】
本発明のグラジエントプログラムでは、「流量１」は、時刻３７．０分の０．４８０ｍｌ／ｍｉｎから時刻３９．１分の０．３５０ｍｌ／ｍｉｎへ短時間の流量リニアグラジエントが設定されている。これに連動するように「流量２」は、０．４１０ｍｌ／ｍｉｎから０．２５０ｍｌ／ｍｉｎへ変更されている。これをポンプ１とポンプ２の比で見ると、時刻３７．０分では０．４８０：０．４１０＝１．０００：０．８５４  に対し、時刻３９．１分では０．３５０：０．２５０＝１．０００：０．７１４  となっており、単に溶離液のポンプ１の流量を減少した比率で、ポンプ２の反応液流量を修正しているわけではないことが分かる。図３に示すようにポンプ１の流量に対応してポンプ２の流量を調整することで、吸光度変動をゼロにできるわけである。
【００２０】
ここでは、この混合比変化に伴うベースライン変動を抑えるために時刻３７．０分から時刻３９．１  分にポンプ１および２の流量設定を変化させている。こうすることにより、図５に示すように、α−アミノアディピックアシッド（ａ−ＡＡＡ）からプロリン（Ｐｒｏ）の間のベースライン変動を低減することができた。
【００２１】
また、同様にポンプ２の流量補正が、時刻６５．０分から６７．１分にも行われている（図２）。これは、前述のようなポンプ１の流量変化に対応するポンプ２の最適流量を選択しているということだけではなく、図４に示す従来法によるクロマトグラムに見られたベースラインの浮き上がり（網掛け部分）も低減している。つまり、時刻６０．０分から６０．１分にポンプ１の溶離液混合比を９０％Ｂ１，１０％Ｂ２から１００％Ｂ３に切換えていることにより、フェニルアラニン
（Ｐｈｅ）より後方のベースライン浮き上がりに影響を与える。時刻６５．０分から６７．１分のポンプ２の流量補正は、前述の吸光度変動をゼロ化する目的のみならず、この浮き上がり抑制にも寄与していることになる。
【００２２】
本実施例では、ポンプ１とポンプ２の流量設定を同時に変化させているが、ベースライン変動低減目的には必ずしも、両方同時である必要はない。ｐＨなど溶離液の液性が変化する場合には、ポンプ２の流量変化のみでも同様の効果が得られる。
【００２３】
また、本実施例では、ベースライン変動低減にポンプ２の流量設定を変化させているが、ポンプ２の混合比率を変更することでもベースライン変動低減を図ることができる。つまりポンプ２は、ニンヒドリン試薬Ｒ１，反応至適ｐＨを得るための緩衝液Ｒ２、および蒸留水Ｒ３（または、５％エタノール水溶液）を混合しているため、この混合比率を多少変化させることでも、ベースラインを微調整することができる。
【００２４】
本実施例では、時刻３７．０  分から３９．１  分まで、あるいは時刻６５．０  分から６７．１  分に短時間の流量リニアグラジエント溶出を行っているが、これは滑らかにベースラインを接続するための手法である。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、平坦化したベースラインが得られるため、再現性，精度の良いポストカラム誘導体化法液体クロマトグラフのデータが提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の概略構成図である。
【図２】本発明のグラジエント溶出プログラムである。
【図３】吸光度変動をゼロにするＰ２／Ｐ１比率を示す図である。
【図４】従来法による分析によって得られたクロマトグラムである。
【図５】本発明の分析によって得られたクロマトグラムである。
【符号の説明】
１，２…ポンプ、３…試料導入部、５…ガードカラム、６…分離カラム、７…Ｔ字ジョイント、８…反応装置、９…可視検出器、１０…データ処理装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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