(57)【要約】【解決手段】海藻類を糖質分解酵素により処理した後又は該処理と同時に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓからなる群から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌を用いて発酵させることを特徴とする魚介類用飼料の製造方法。【効果】海藻類の微粒子を特定の乳酸菌を用いて発酵させると、食塩の添加の有無にかかわらず、発酵工程で腐敗することなく、生産効率が高く、保存性がよい安全な動物性プランクトン、魚類仔魚、二枚貝類、その他水産動物の飼料を得ることができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
海藻類を糖質分解酵素により処理した後又は該処理と同時に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓからなる群から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌を用いて発酵させることを特徴とする魚介類用飼料の製造方法。
【請求項２】
海藻類を糖質分解酵素により処理すると同時に乳酸菌を用いて発酵させる請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓの群から選ばれるものである請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
海藻類を糖質分解酵素により処理した後又は該処理と同時にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓからなる群から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌を用いて発酵させて得た発酵物を含有する魚介類用飼料。
【請求項５】
乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓの群から選ばれるものである請求項４記載の魚介類用飼料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物プランクトン又は海藻デトライタスを餌料とする二枚貝類、動物性プランクトン類、並びに魚類稚魚等の水産動物に用いる魚介類用飼料及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
二枚貝類は、海水中に存在する珪藻類等の植物プランクトンやデトライタスと呼ばれる生物の遺骸や糞に由来する懸濁粒子を捕食しており、養殖にあたっては、植物プランクトンを培養して投与するか、或いはネットに収容した貝を海水中に垂下し、天然海水中の植物プランクトンや懸濁物を捕食させているのが現状である。しかしながら、植物プランクトンの培養は、照明設備、水温調節設備、人手等に多大のコストがかかる上不安定な部分があり問題が多い。一方、天然海水中に垂下して行うアコヤガイやカキ等の二枚貝類の養殖においては、餌料密度、海水温度等が自然任せになるため、成長速度や生残率が不安定になることが避けられない。これらの問題が、二枚貝の種苗生産・養殖の規模拡大にとっての大きな障壁となっている。そこで、安価で、安定供給できる人工プランクトン餌飼料あるいは、人工デトライタス餌飼料の開発が求められている。
【０００３】
一方、雑食性コペポーダ等の動物プランクトンやウナギなど口径の比較的小さな魚類仔魚の一部は、天然で利用している餌料が、未解明ながらも、直径１０μｍ程度のデトライタス粒子を捕食している可能性が高いとされている。そこで、半消化の状態にある天然デトライタスの性状を模した人工飼料を開発することにより、これらの水産動物の養殖あるいは培養が実現することが期待される。
【０００４】
しかし、これまでに直径１０μｍ  程度で安定供給できるという条件を満たすデトライタス餌飼料が開発された例は少ない。海藻を原料とするデトライタス餌飼料が知られている（例えば、特許文献１参照）が、海藻をただ物理的に破砕して粒径１０μｍ以下の海藻粒子を得ているので、セルロースの破片等消化の悪い微小な粒子が多数混入することが避けられず、これを飼料として用いた場合、水質の悪化をもたらすという欠点を有していた。
【０００５】
また、本発明者等は、アルテロモナス属（現在の分類体系ではシュードアルテロモナス属）細菌を利用して海藻を好気的に分解し、均一な粒子サイズを有する単細胞性のデトライタス粒子（Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅｔｒｉｔｕｓ  ；  以下、ＳＣＤと記載する）に変換して飼料として利用することを提案した（特許文献２参照）が、実用化に向けては、１）ＳＣＤ粒子の生成効率の向上、２）飼料価値の減耗の抑制（すなわち、保存性の改良）、３）飼料調製の目的に使用している海藻分解細菌を環境中に放出した場合の安全性の確認という３つの問題を解決することが求められていた。
【０００６】
これらの問題点を解決するために、本発明者等は既に、海藻を糖質分解酵素により分解し、次いで乳酸菌や酵母によって発酵させてＳＣＤを製造し、飼料として利用することを提案した（特許文献３参照）。得られた海藻デトライタスはＳＣＤの生成効率も高く、環境中に放出した場合でも、ノリ等の有用海藻に悪影響を与える危険性が低い好適なものであった。しかしながら、工業的に海藻デトライタスを製造する場合、コスト等の点から非殺菌処理の原料を使用することも多く、海藻由来の腐敗菌等の影響により、発酵過程で腐敗を生じる危険性があった。特に食塩を添加しない条件下においては、従来報告されているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓを使用して海藻を発酵させた場合、雑菌の成育を完全に制御することが難しく、しばしば乳酸菌以外の細菌が発酵試料中に検出されるという問題があった。
【０００７】
【特許文献１】
特開平８−１４０５８８号公報
【特許文献２】
特許第２７７２７７２号公報
【特許文献３】
特開２０００−１０１８２６号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、海藻類の発酵時に食塩の添加の有無にかかわらず腐敗させることなく安価に安定に供給できる海藻デトライタスの発酵物を含有する魚介類用飼料及びその製造方法を提供することにある。
【０００９】
【発明を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、海藻類の微粒子を特定の乳酸菌、特に植物性乳酸菌とされる乳酸菌のうちホモ型乳酸発酵を行い乳酸生成量の多い乳酸菌に分類される乳酸菌を用いると、食塩添加の有無にかかわらず発酵工程において腐敗を生じさせること無く、ＳＣＤ粒子の生成効率及び保存安定性が高く、環境中に放出しても安全性の高い海藻デトライタス含有魚介類用飼料が得られることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、海藻類を糖質分解酵素により処理した後又は該処理と同時に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓからなる群から選ばれる１種又は２種以上の乳酸菌を用いて発酵させることを特徴とする魚介類用飼料の製造方法及び該製造方法で製造した魚介類用飼料を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の魚介類用飼料の製造方法の第一段階は、海藻類を糖質分解酵素により、直径１０μｍ程度の微粒子に分解して単細胞化する工程である。本発明で用いる海藻類としては、魚介類の飼料として使用可能な海藻であれば特に限定されず、例えばアオノリ、アオサ、クロレラ、ミル、アオモグサ等の緑藻類；アマノリ、ツノマタ、キリンサイ等の紅藻類；ワカメ、マコンブ、ヒバマタ、ヒジキ、オキナワモズク等の褐藻類が挙げられ、特にＳＣＤ粒子の生成効率、原料の大量調達の容易さの面から、ワカメ、アオサを用いるのが好ましい。
これらの海藻類は生、凍結、塩蔵したもの或いは乾燥粉末の形態の何れも好適に用いることができる。
【００１２】
本発明で使用する糖質分解酵素としては、セルラーゼ、アルギン酸分解酵素、アガラーゼ、キシラナーゼ、細菌由来各種ヘミセルラーゼ、アワビアセトンパウダー等海藻に含有される多糖を分解しうる諸酵素群の中から１種以上を選択して使用することができるが、多糖分解後に発酵の基質として利用されうる糖質が生成されている必要があるということと、及びコストの面から、特にセルラーゼを単独あるいは主成分として使用することが好ましい。
【００１３】
海藻を分解して単細胞化する工程で使用する酵素の濃度は、高いほど分解効率が良いが、コストの面から３．０重量／体積％（以下、％と記載する）以下の濃度で用いるのが好ましい。セルラーゼを単独使用する場合、ＳＣＤ粒子を２４時間以内という短時間のうちに得るには０．２５〜１％、１２日という中期間で得るには０．１〜０．５％の濃度で使用するのが最も好ましい。更にここで得られる飼料を使用して生物を循環型の水槽で飼育する場合、含有するセルラーゼは、飼育水のアンモニア及び亜硝酸濃度を高め、水質の悪化につながるので、できるだけセルラーゼ濃度を下げて０．０１〜０．１％で使用することが好ましい。
【００１４】
海藻を単細胞化する工程での反応温度は、５〜５０℃の範囲で分解効率に大差なく使用できるのでコストの面から、調温設備を必要としない室温で実施するのが好ましい。ただし、セルラーゼ濃度が、０．０１〜０．１％の低い場合や後述の塩分濃度が３．５％未満の低塩分条件下で反応を行う場合、最初に５℃程度の低温下で２日〜２週間程度前培養を行い、発酵基質となる糖質を充分生成させた後に、スターター微生物である乳酸菌を多めに入れて、室温下で通常の発酵処理を行うなど腐敗を避けるための工夫をすることが好ましい。
【００１５】
海藻を単細胞化する工程での海藻基質の濃度は、高い濃度で調製するほどコストの面から有利である。海藻粉末を原料として使用する場合、最大で１０％乾物重量濃度までが好ましい。このとき試料は、ペースト状の強い粘性を有するため、取り扱いに不便を感じる場合は、３〜７％濃度で調製するのが最も好ましい。
【００１６】
海藻を単細胞化する工程において塩分濃度は、０〜１０％の範囲で使用することができるが、塩分濃度が５％を越えると浸透圧の影響で海藻粒子内部の水分が奪われ、海藻固形分と液層の分離が著しく好ましくない。一方、塩分濃度が１％以下の場合には、海藻を水溶液に対して懸濁させにくくダマになり易いという不都合を生じ好ましくない。更に陸生の菌及び海洋性の菌による腐敗を避け、微生物相をコントロールするという効果を考慮して、海水中の塩分濃度より少し高めの３．５〜５％の濃度に設定するのが最も好ましい。
【００１７】
海藻類を単細胞化した後の本発明の発酵工程で用いる乳酸菌は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ又はＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓであって、植物系乳酸菌が好ましい。中でも雑菌制御の点から、ホモ型乳酸発酵を行うＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．  ｃａｓｅｉ、Ｌ．  ｒｈａｍｎｏｓｕｓが好適に使用できる。
これらの菌株は単独で用いても良いが、複数の菌株を組み合わせて用いることもでき、特に混合菌株を使用する場合は、発酵液中の優占能力の高いＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．  ｃａｓｅｉ、Ｌ．  ｒｈａｍｎｏｓｕｓより選ばれる１種又は２種以上が含まれたものを使用することが好ましい。
【００１８】
これらの乳酸菌は、特に非殺菌処理原料を用いた低塩濃度下での発酵の場合では、従来知られていたＬ．  ｂｒｅｖｉｓに比べ発酵液中の優占能力が高く、変敗あるいは腐敗を起こし難い点で特に好適である。ここでいう変敗とは、海藻の乳酸発酵を行った場合に、その菌相からは雑菌がほとんど検出されず概ね良好な乳酸発酵が達成したにもかかわらず、少数存在する雑菌のために試料が、腐敗臭とは異なるチーズのような又は納豆のような独特の臭気を有する状態を呈することを指す。また腐敗とは、菌相的に乳酸菌以外の雑菌が多数計数され、その臭気もアミン系のいわゆる腐敗臭又はイオウ系の不快臭を有する状態のことを指す。
【００１９】
使用する微生物の接種量としては、少量接種するだけで充分であるが、菌体の懸濁液を濁度ＯＤ（６６０ｎｍ）＝１の濃度で調製したものを海藻懸濁液に対して０．１〜１％程度の量で接種するのが特に好ましい。
【００２０】
乳酸菌を添加する時期は、海藻をＳＣＤ化した後でもよいが、糖質分解酵素を加える工程で同時に添加した方が、時間の節約になり好ましい。このように酵素とスターター微生物を同時に加えると、海藻のＳＣＤ化と乳酸菌の生育による乳酸の生成が同時進行し、（試料のｐＨが低下し、）腐敗しにくくなるという長所もある。このようにして製造した海藻デトライタスの発酵物は、直径が５〜１０μｍ前後で二枚貝類等の植物プランクトン捕食水産動物及びデトライタス捕食水産動物にとって丁度良い大きさを有し、良い飼料となる。
【００２１】
本発明の海藻デトライタスの発酵物を用いた魚介類用飼料は、海藻を１０％濃度で懸濁して製造した場合、最大で３億個／ｍＬ以上の濃度で調製できる。これは同じサイズの餌料植物プランクトンを培養する場合に比べ１０倍から１００倍高い濃度に相当する。すなわち、本発明によれば、従来の１／１０から１／１００の大きさの空間で等量の飼料を調製することが可能であるため、種苗生産・養殖の規模拡大のために極めて有利である。
【００２２】
本発明の魚介類用飼料は、このようにして製造された海藻デトライタスの発酵物をそのまま用いてもよいが、炭水化物、蛋白質、ビタミン、ミネラル等の公知の飼料成分と混合して製造するのが好ましい。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
乳酸菌液の調製
供試菌としては表１に示した１０種１２菌株を用い、ＭＲＳ液体培地（ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ、Ｍｅｒｃｋ社製）にて２０℃下で２〜３日培養した。培養後、各々を集菌しＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）＝１．０になるよう調整したものを各々菌液として使用した。
【００２５】
【表１】
2004298080.tif 000002
【００２６】
市販のワカメ乾燥粉末（若みどりＬＳ、理研ビタミン社製）２．０ｇを４０ｍｇのセルラーゼ（セルラーゼ１２Ｓ、ヤクルト薬品工業社製）、４０ｍＬの蒸留水とともに発酵槽（ポリプロピレン製遠沈管）に収容し、よく混合し、無塩海藻液とした。一方、蒸留水の替わりに４０ｍＬの滅菌済３．５％食塩水を用いた混合物を作成し、有塩海藻液とした。
調整した無塩海藻液及び有塩海藻液各系について、各種菌液を０．４ｍＬ添加し、供試菌単独接種区とした。乳酸菌無添加区をコントロールとし、２０℃下で１２日間発酵処理した。発酵期間中は、一日一回各海藻液を振盪混合した。
発酵後、得られた発酵液の一部を採取し、菌数測定と、発酵状態を判定した。
【００２７】
発酵状態の判定は、発酵後容器のフタを開けて臭いを嗅ぎ官能判定した。判定は次の基準に従った。
Ａ：ほのかな酸っぱい臭いとともに海藻本来のにおいがする。
Ｂ：チーズ臭又は納豆臭がする。
Ｃ：アミン系又はイオウ系の腐敗、不快臭がする。
なお、ＡはｐＨが充分に低く、不快な臭気がなく、乳酸菌の優占率が非常に高い発酵状態；Ｂは独特の臭気をわずかに有し、乳酸菌優占率が高い発酵状態及びＣは乳酸菌以外の雑菌が多数計数される発酵状態である。
【００２８】
ｐＨの測定にはＩＳＦＥＴ  ｐＨメーター（新電元工業株式会社製）を用い、直接発酵液のｐＨを測定した。
菌数は、寒天平板法により測定した。すなわち、滅菌生理的食塩水で段階希釈した試料０．１ｍＬを寒天平板上に塗抹し、２０℃で１０日培養後のコロニー数を計数して求めた。
乳酸生成量はＦ−キット（ロシェ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。
各測定結果は、平均値を用いた。
測定結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
2004298080.tif 000003
【００３０】
表２に示したように、本発明の乳酸菌、特にホモ型乳酸発酵を行う乳酸菌を使用した場合に、食塩の添加にかかわらず、変敗・腐敗せず良好な発酵が達成される傾向にあり、特に食塩添加系では何れの乳酸菌も良好な発酵を達成した。ホモ型乳酸発酵を行う乳酸菌を使用した試験区では、乳酸生成量が多く、ｐＨが低く、特に雑菌の成育の抑制に有効であった。
【００３１】
実施例２
乳酸菌を混合接種して海藻の発酵を行った。
供試菌としてはＬ．  ｂｒｅｖｉｓ    ＮＲＩＦＳ  Ｂ５２０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０１）、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＡＴＣＣ１４９１７、Ｌ．  ｃａｓｅｉ  ＩＦＯ１５８８３、Ｌ．  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＩＡＭ１１１８、Ｌ．  ｋｅｆｉｒ  ＮＲＩＣ１６９３、Ｌ．  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１４９３１、Ｌ．  ｚｅａｅ  ＩＡＭ１２４７３、Ｌ．  ａｃｉｄｐｈｉｌｕｓ  ＩＦＯ１３９５１、Ｌ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｓ．  Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１１８４２、及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＩＡＭ１３００４を用い、実施例１と同様の方法で菌液を調製した。
実施例１と同様に無塩海藻液を調整し、各系について、全ての菌液を３６μＬずつ添加し、供試菌混合接種区とした。乳酸菌無添加区をコントロールとし、２０℃下で１２日間発酵処理した。発酵期間中は、一日一回各海藻液を振盪混合した。
【００３２】
得られた発酵海藻液について、実施例１と同様に生菌数、ｐＨ、臭気の有無、並びに無塩海藻液の菌相の占有状態を測定した。その結果を表３及び図１に示す。
【００３３】
【表３】
2004298080.tif 000004
【００３４】
表３に示したように、混合接種区では食塩の有無に関わらず発酵が安定して進んだ。試料（無塩海藻類）中の乳酸菌の菌種を同定してみると、図１に示すようにＬ．  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．  ｃａｓｅｉ、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍの占有率が高かった。
【００３５】
【発明の効果】
海藻類の微粒子を特定の乳酸菌を用いて発酵させると、食塩の添加の有無にかかわらず、発酵工程で腐敗することなく、生産効率が高く、保存性がよい安全な動物性プランクトン、魚類仔魚、二枚貝類、その他水産動物の飼料を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】無塩海藻液に混合乳酸菌を接種して発酵させた後の乳酸菌の占有率を示す図である。
【図１】
2004298080.tif 000005