(57)【要約】【課題】ポリヌクレオチドの混合溶液から、標的塩基配列を有するポリヌクレオチドを容易に分離できる分離方法および分離装置を提供する。【解決手段】標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と有さないポリヌクレオチド（Ｂ）とを含有する混合溶液を、標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブがセルの内表面またはセル内の固相に固定されたセルに配し、混合溶液にポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブとのハイブリッド鎖の解離温度より高い第一温度に調節された第一領域、及び第一温度より低くかつポリヌクレオチド（Ａ）とプローブとのハイブリッド鎖の全量が解離する温度未満である第二温度に調節された第二領域が互いに接する温度分布を持たせ、温度分布を一方向に連続的に移動させることにより、ポリヌクレオチド（Ａ）をプローブとハイブリダイズさせて混合溶液から分離することを特徴とするポリヌクレオチドの分離方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と、前記標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）とを含有する混合溶液から、ポリヌクレオチド（Ａ）を分離するポリヌクレオチドの分離方法であって、前記標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブが、セルの内表面またはセル内の固相の少なくともいずれか一方に固定されたセルに、前記混合溶液を配し、
前記セル内に配された前記混合溶液に、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の解離温度より高い第一温度に調節された第一領域、および、前記第一温度より低く、かつポリヌクレオチド（Ａ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の全量が解離する温度未満である第二温度に調節された第二領域が互いに接する温度分布を持たせ、該温度分布を一方向に連続的に移動させることにより、ポリヌクレオチド（Ａ）を前記プローブとハイブリダイズさせて前記混合溶液から分離することを特徴とするポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項２】
前記温度分布の移動が、第一領域を先にして移動させるものである請求項１に記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項３】
前記第一温度が、前記ポリヌクレオチド（Ｂ）の全量が解離する温度以上であり、前記第二温度が、前記ポリヌクレオチド（Ｂ）の解離温度以下である請求項１または２に記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項４】
前記第二温度が、前記ポリヌクレオチド（Ｂ）の全量が解離する温度未満であり、前記温度分布の移動が、第二領域を先にして移動させるものである請求項１に記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項５】
前記混合溶液を、前記セル内で一方向に流動させつつ、前記温度分布の移動を行う請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項６】
前記溶液の流動方向が、前記温度分布の移動方向と同一の方向である請求項５に記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項７】
前記セルが毛細管であり、前記温度分布の移動が、前記毛細管の長さ方向の移動である請求項１〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項８】
前記温度分布の移動を、２回以上繰り返す請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項９】
前記温度分布が、前記第一領域と第二領域とを、温度分布の移動方向に交互に２回以上繰り返して設けられたものである請求項１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチド（Ｂ）の含有量が、前記混合溶液中の全ポリヌクレオチドに対して、５質量％以下である請求項１〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチド（Ｂ）が、前記ポリヌクレオチド（Ａ）の標的塩基配列と１塩基のみ異なる塩基配列を有するものである請求項１〜１０のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項１２】
前記温度分布の移動末端における溶液から、濃縮されたポリヌクレオチド（Ｂ）を採取する請求項１〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項１３】
前記標的塩基配列の塩基数が、１５〜３０である請求項１〜１２のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項１４】
前記プローブが、塩基数１５〜３０のオリゴヌクレオチドである請求項１から１３のいずれかに記載のポリヌクレオチドの分離方法。
【請求項１５】
標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と、前記標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）とを含有する混合溶液から、ポリヌクレオチド（Ａ）を分離するポリヌクレオチドの分離装置であって、
容器内のセルの内表面および／または該セル内の固相に、前記標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブが固定された容器と、
該容器内の前記セル内に収納された前記混合溶液に、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の解離温度より高い第一温度に調節された第一領域、および、前記第一温度より低く、かつポリヌクレオチド（Ａ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の全量が解離する温度未満である第二温度に調節された第二領域が互いに接する温度分布を持たせるための熱源と、
該熱源を移動させる移動手段とを備えることを特徴とするポリヌクレオチドの分離装置。
【請求項１６】
前記セルが、前記熱源の移動方向に対して垂直な断面の直径が１μｍ〜１ｍｍの毛細管である請求項１５に記載のポリヌクレオチドの分離装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヌクレオチド混合溶液から、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドを分離するポリヌクレオチドの分離方法および分離装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
野生型ＤＮＡと変異型ＤＮＡとの混合溶液から、変異型ＤＮＡを分離、精製する方法としては、カラム中に充填された粉体に野生型ＤＮＡに相補的なプローブを固定し、混合溶液を該カラムに流して、野生型ＤＮＡをハイブリダイゼーションにより粉体に選択的に吸着させて溶液から除去し、流出する溶液中に変異型ＤＮＡを濃縮する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
しかしながら、除去を目的とする標的ポリヌクレオチドと標的でないポリヌクレオチドの塩基配列が１塩基しか異ならない場合（例えば、一塩基多型；ＳＮＰ）には、ハイブリダイゼーションで充分高い選択性を発揮させるには、分離精製に数時間以上の長時間を要した。また、たとえ長時間かけても、ハイブリダイゼーションの選択性には限界があるため、分離率に限界がある。特に分析等の利用目的のポリヌクレオチドの全ポリヌクレオチドに対する組成比が低い場合、目的以外のものを分離し目的のポリヌクレオチドを充分に高い組成比で得ることは困難であった。
一方、アフィニティークロマトグラフィーやアフィニティー電気泳動は、高い分離能が期待でき、高度に分離することが容易であると考えられるが、装置の大きさの割に処理量が少ないという問題がある。また、精製したポリヌクレオチドを反応などに使用する際にも、自動化するには大型で複雑な装置を要した。
【０００３】
【特許文献１】
特表２００１−５１４５０４号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、ポリヌクレオチドの混合溶液から標的塩基配列を有するポリヌクレオチドを容易に分離する方法を提供することにあり、また、特に溶液中の全ポリヌクレオチドに対する組成比の低いポリヌクレオチドの組成比を上昇させることができる方法を提供すること、およびμ−ＴＡＳ（マイクロ・トータル・アナリティカル・システム）の一部に組み込むことが容易な分離装置を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決する方法について鋭意検討した結果、溶液中のポリヌクレオチドと、固相に固定したプローブとの間で、ハイブリダイゼーションと脱ハイブリダイゼーションを繰り返させながら一方の成分のみを移動させることにより、又は、一方の成分をより速く移動させることにより、高度分離が可能となること、及び、そのような機策は、部分的に温度の異なる領域を移動させることによって可能なことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と、前記標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）とを含有する混合溶液から、ポリヌクレオチド（Ａ）を分離するポリヌクレオチドの分離方法であって、前記標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブが、セルの内表面またはセル内の固相の少なくともいずれか一方に固定されたセルに、前記混合溶液を配し、前記セル内に配された前記混合溶液に、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の解離温度より高い第一温度に調節された第一領域、および、前記第一温度より低く、かつポリヌクレオチド（Ａ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の全量が解離する温度未満である第二温度に調節された第二領域が互いに接する温度分布を持たせ、該温度分布を一方向に連続的に移動させることにより、ポリヌクレオチド（Ａ）を前記プローブとハイブリダイズさせて前記混合溶液から分離することを特徴とするポリヌクレオチドの分離方法である。
【０００７】
また、本発明の第二の発明は、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と、前記標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）とを含有する混合溶液から、ポリヌクレオチド（Ａ）を分離するポリヌクレオチドの分離装置であって、容器内のセルの内表面および／または該セル内の固相に、前記標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブが固定された容器と、該容器内の前記セル内に収納された前記混合溶液に、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の解離温度より高い第一温度に調節された第一領域、および、前記第一温度より低く、かつポリヌクレオチド（Ａ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の全量が解離する温度未満である第二温度に調節された第二領域が互いに接する温度分布を持たせるための熱源と、該熱源を移動させる移動手段とを備えることを特徴とするポリヌクレオチドの分離装置である。
【０００８】
なお、本発明で言う「ポリヌクレオチド（Ａ）を分離する」とは、ポリヌクレオチド）（Ａ）の分離検出、濃縮、選択的除去を含み、また、ポリヌクレオチド（Ａ）を分離することによって必然的に得られる、ポリヌクレオチド（Ａ）以外のポリヌクレオチド成分であるポリヌクレオチド（Ｂ）の分離、分離検出、濃縮、選択的除去を含むものとする。ここで、「ポリヌクレオチド（Ａ）の濃縮」とは、溶液中の全ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド（Ａ）の存在比率を上昇させることをいう。
【０００９】
【発明の実施の形態】
［ポリヌクレオチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）］
標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、「ポリヌクレオチド（Ａ）」という。）、および標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（以下、「ポリヌクレオチド（Ｂ）」という。）は任意であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他、修飾ポリヌクレオチドなどであり得る。ＤＮＡは、例えば、全ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、制限酵素で切断されたＤＮＡ断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等により増幅されたＤＮＡ断片等であり得る。これらの中で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等により増幅されたＤＮＡ断片であることが、特に有用であり好ましい。
【００１０】
ポリヌクレオチド（Ａ）および（Ｂ）の長さは、好ましくは塩基数１０〜１０００、さらに好ましくは１５〜３００である。この範囲とすることによって、選択性を高めると同時に分離速度を高くできるため好ましい。ＰＣＲや制限酵素により調製される場合には、プライマーや制限酵素の選択により、これらのポリヌクレオチドの塩基数を設定できる。
【００１１】
ポリヌクレオチド（Ｂ）は、ポリヌクレオチド（Ａ）と長さが異なっていてもよいが、同じであることが、本発明の効果が発揮され、好ましい。ポリヌクレオチド（Ｂ）は、ポリヌクレオチド（Ａ）の標的塩基配列部分においてポリヌクレオチド（Ａ）と１塩基のみ異なる塩基配列を有するものであることが、本発明の効果が発揮され好ましい。そのような例としては、一塩基多型（ＳＮＰ）や突然変異遺伝子が挙げられる。
また、ポリヌクレオチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）は、各々一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖であることが有用であり好ましい。
【００１２】
本発明の分離方法に供されるポリヌクレオチドの混合溶液において、ポリヌクレオチド（Ｂ）の混合溶液中の全ポリヌクレオチドに対する割合は任意であるが、５質量％以下、さらに２質量％以下であることが好ましい。従来の方法では、混合溶液中の微量成分であるポリヌクレオチドの組成比を向上させることは非常に困難であったが、本発明の方法を適用するとポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比が５質量％以下であっても、多数成分であるポリヌクレオチド（Ａ）を分離してポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比が高い溶液を容易に得ることができる。
【００１３】
［標的塩基配列］
標的塩基配列は、分離目的とするポリヌクレオチド（Ａ）が有している特徴的な塩基配列をいう。例えば、分離が一塩基多型（ＳＮＰ）の野生型（正常型）ポリヌクレオチドと変異型（異常型）ポリヌクレオチドとの分離である場合には、変異の生じる部分（ホットスポット）を含む塩基配列部分を標的塩基配列とする。この場合、標的塩基配列は、野生型の塩基配列であってもよいし、変異型の塩基配列であってもよい。多量の野生型ポリヌクレオチドと混合している微量の変異型ポリヌクレオチドを分離する場合には、標的塩基配列を野生型の塩基配列として、野生型ポリヌクレオチドを選択的に除去することにより、変異型ポリヌクレオチドを分離することが好ましい。
【００１４】
標的塩基配列の長さは、例えばポリヌクレオチド（Ａ）が１０〜１００塩基（対）である場合には、塩基数６以上であればよい。この長さであれば、ポリヌクレオチド（Ａ）が偶然プローブに相補的な塩基配列を持つ確率は無視できるほど小さいため、充分な精度と信頼性が得られる。ポリヌクレオチド（Ａ）の塩基（対）数がそれ以上である場合には、塩基数に応じて、プローブの塩基数も増やすことが、選択エラーを防ぐために好ましい。例えば、ポリヌクレオチド（Ａ）の塩基（対）数が１００〜１０００である場合には、標的塩基配列の長さは塩基数が１０以上であることが好ましく、ポリヌクレオチド（Ａ）の塩基（対）数が数千以上である場合には、１５以上であることが好ましい。標的塩基配列の塩基数の上限は任意であり、好ましい上限はポリヌクレオチド（Ｂ）の塩基配列と標的塩基配列との違いの程度により異なる。上記配列の違いが大きいほど、それに応じて標的塩基配列の塩基数の上限も大きくてよく、例えば上記上限は１０００であってもよいが、５０以下であることが好ましく、３０以下であることがさらに好ましい。上記配列の違いが１塩基である場合には、３０以下が好ましく、２５以下がさらに好ましい。この好ましい上限以下とすることで、充分な選択性を維持しつつ分離の迅速化が図れる。
【００１５】
［プローブ］
プローブは、ポリヌクレオチド（Ａ）に対して相補的な塩基配列を有し、ポリヌクレオチド（Ａ）と選択的にハイブリダイゼーションする化合物であれば任意であり、例えば、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、糖部分や燐酸基部分が修飾或いは置換されたオリゴＤＮＡやオリゴＲＮＡ、その他の任意の化合物であり得る。このようなプローブは、合成可能であるし、また、マイクロアレイ用などとして市販されている。
プローブは、ポリヌクレオチド（Ａ）やポリヌクレオチド（Ｂ）が一本鎖（対立鎖の一方）であるか対立鎖の両方であるか、また、対立鎖の両方である場合には、対立鎖の一方のみを分離するか両方を分離するかと言った分離の目的に応じて設計できる。例えば、ポリヌクレオチド（Ａ）やポリヌクレオチド（Ｂ）が対立鎖の一方である場合には、該対立鎖に相補的な一本鎖とすることが好ましい。ポリヌクレオチド（Ａ）やポリヌクレオチド（Ｂ）が対立鎖の両方であっても、その対立鎖の一方のみを分離すればよい場合にも同様である。ポリヌクレオチド（Ａ）やポリヌクレオチド（Ｂ）がそれぞれ対立鎖の両方を含み、ポリヌクレオチド（Ｂ）の対立鎖の両方とポリヌクレオチド（Ａ）の対立鎖の両方とを分離する場合には、プローブはポリヌクレオチド（Ａ）の両対立鎖にそれぞれ相補的な一本鎖を、後述のように、異なる位置に固定することで目的を達することができるし、相補的な二本鎖を使用することもできるが、それぞれの一本鎖を独立して固定することが、分離効率が高く好ましい。
プローブは、ポリヌクレオチド（Ａ）の全配列と相補的である必要はなく、ポリヌクレオチド（Ａ）の標的塩基配列に相補的な塩基配列を有していればよい。従って、プローブの長さの下限は、ポリヌクレオチド（Ａ）の標的塩基配列の長さである。
【００１６】
プローブは上記標的塩基配列以外の部分を有していてよい。この場合には、ポリヌクレオチド（Ａ）と相補的な塩基配列部分のみがハイブリダイゼーションに寄与する。但しこの場合、ポリヌクレオチド（Ａ）と相補的でない塩基配列部分は、標的塩基配列以上の塩基数でもってポリヌクレオチド（Ｂ）と相補的でない必要がある。
プローブの長さは任意であり、標的塩基配列の長さに適したものとすることが好ましい。ハイブリダイゼーションの選択エラーを防ぐためには塩基数１５以上のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。塩基数の上限は、特に限定する必要はないが、ポリヌクレオチド（Ａ）の塩基数以下であることが好ましく、５０以下であることが好ましく、３０以下であることがさらに好ましい。この好ましい上限以下とすることによって、分離時間を短縮できる。ポリヌクレオチド（Ｂ）が、前記標的塩基配列と一塩基のみ異なる塩基配列を有する場合には、プローブの塩基数は２５以下が好ましく、２２以下がさらに好ましい。この上限以下とすることによって、選択性が向上する。
プローブは、さらに、塩基配列とは無関係な部分を有していてもよい。例えば該プローブを固相合成する際に固相に固定するためのアミノ基などの官能基、塩基配列部分と前記固定用官能基の間のスペーサーとなるアルキレン基やポリエチレングリコール基、等を挙げることができる。
【００１７】
プローブは、ポリヌクレオチド混合溶液を入れるセルの内表面またはセル内の固相の少なくともいずれか一方に固定される。プローブを固定するセルの内表面または固相は、例えば、セルの内壁面、セル内に形成された柱や杭などの何らかの構築物の表面、セル内部に装填されたビーズや繊維などの表面、セルの内壁面に付着して形成された、セルの断面を塞ぐ或いは塞がない形状の多孔質体の細孔表面等であり得る。これらの中で、セルの内表面が好ましい。このような形状とすることによって、ポリヌクレオチドの量が微量であっても分離可能な微小なセルの製造が容易となり、伝熱速度が高いため分離の迅速化が図れ、セルに溶液を流しつつ分離する場合に、圧力損失が小さいため送液が容易となる。また、セルの内表面にセルの断面を塞がない多孔質層を形成することがさらに好ましい。このような形状とすることによって、上記の特徴に加えて、プローブの固定密度を高くすることが可能であるため、同一量のポリヌクレオチドを分離する場合にセルを小形化できる。固定方法は任意であり、例えばＤＮＡマイクロアレイなどで使用される公知の方法を利用できる。
プローブが対立鎖の双方である場合には、混合状態で固定してもよいし、互いに独立に固定してもよいが、互いに独立した固定部分に固定することが、分離効率が高くなるため好ましい。互いに独立した固定部分は、中心間距離が０．１μｍ〜０．５ｍｍの微小な領域であることが好ましく、１μｍ〜０．１ｍｍであることが更に好ましい。
【００１８】
［セル］
セルは、容器内に形成され、その中にポリヌクレオチド溶液を配する空洞状の部分であり、その形状は任意である。中でも、セルは毛細管状又は断面がスリット状であることが、ポリヌクレオチド溶液の温度追従性が高くなり、迅速な分離が可能となるため好ましく、一方向に長い形状であることが好ましい。また、処理量を増すためには、セルの内部に表面積を増すための構造物、例えば、杭状物、柱状物、板状物、断面を塞ぐ形状に多孔質体、粉体や繊維などの充填物、セル内に断面を塞がない形状に形成されたが多孔質層、等を形成したり、粉体状や繊維状などの充填物を充填することが好ましい。
【００１９】
セルの寸法も任意であるが、後述の温度分布の移動方向をセルの長手方向とすることが好ましい。セルの長さは０．３〜１０００ｍｍであることが好ましく、３〜１００ｍｍであることが更に好ましい。この好ましい範囲の下限以上とすることによって、後述の温度分布の形成が容易となり、また、分離率を上げることが出来る、この好ましい範囲の上限以下とすることによって、分離時間の短縮が計れる。セルの長さ方向に直角な面内に、互いに直角な「幅」方向と「厚さ」方向をとると、幅或いは厚さの少なくとも一方は０．０１〜１ｍｍであることが好ましく、０．１〜０．５ｍｍであることが更に好ましい。この好ましい下限以上とすることによって、製造の困難さを免れ、処理量を増すことが出来る。また、この好ましい上限以下とすることによって、温度追従性を高めてセル内の各部分の昇温速度と降温速度を高めることが出来、分離時間の短縮と分離効率の向上が図れる。幅若しくは厚さ方向の他方の寸法は任意である。上記の長手方向の寸法と同様であってもよいし、上記の長さ方向の寸法以上であってもよい。
【００２０】
［容器］
上記セルを内部に有する容器の形状は任意であるが、セルの中に配せられたポリヌクレオチド溶液の温度変化の追従性を増すために、容器の器壁は薄いことが好ましい。そのため、厚さの薄いチューブ、表面から浅い位置に表面と平行にセルが形成された任意の形状のマイクロ流体素子であることが好ましく、特にチューブ状又は板状であることが好ましい。
該容器の素材は、熱伝導係数が１０ｗ・ｍ−１・Ｋ−１以下であることが好ましく、１ｗ・ｍ−１・Ｋ−１以下であることが更に好ましく、０．３ｗ・ｍ−１・Ｋ−１以下であることが最も好ましい。この上限以下とすることによって、セル内の溶液に、セルの長手方向に大きな温度勾配をつけることが容易となり、分離装置を小型に出来ると共に、分離効率、即ち、温度分布を移動させたときの濃度の上昇率が高くなる。熱伝導係数の下限は、自ずと限界はあろうが限定する必要はなく任意であるが、例えば、０．０１ｗ・ｍ−１・Ｋ−１であり得る。そのような熱伝導係数を有する素材としては、例えば有機重合体、ガラス、炭素、セラミックなどを例示できるし、これらの発泡体や複合体であってよいが、有機重合体が、特に熱伝導率が低く、製造も容易であり、好ましい。
【００２１】
［融解温度、解離温度］
本明細書中において、「解離温度」とは、ポリヌクレオチドとプローブとが形成するハイブリッド鎖を充分遅い速度で昇温していったときに、ポリヌクレオチドとプローブの解離が始まる最低温度をいう。但し、ここで言う「解離が始まる最低温度」とは、測定誤差を含みうるし、又工業的に意味のある程度をいい、例えば、１〜３％が解離する温度を言う。
また、二本鎖状態の被検ポリヌクレオチドが一本鎖に解離する場合も同様に、解離が始まる最低温度を解離温度という。
【００２２】
「融解温度」とは、ポリヌクレオチドとプローブとが形成するハイブリッド鎖を充分遅い速度で昇温していったときに、ハイブリッド鎖の半量が解離する温度をいう。但し、次項でいう解離しないハイブリッド鎖の存在量は除いて考える。また、二本鎖状態の被検ポリヌクレオチドが一本鎖に解離する場合も同様に、半量が解離する温度を融解温度という。
「ハイブリッド鎖の全量が解離する温度」とは、ポリヌクレオチドとプローブとが形成するハイブリッド鎖を充分遅い速度で昇温していったときに、ハイブリッド鎖の全量が解離する最低温度をいう。なお、ここで言う「全量が解離する」とは、それ以上温度を上げても実質的にそれ以上解離しない温度を言う。固相に固定されたプローブとハイブリッド形成したポリヌクレオチドは、理由は不明ながら、１００℃付近まで昇温しても解離しないポリヌクレオチドが残存する場合が有るが、このような解離しないポリヌクレオチドは除いて考える。また、「実質的にそれ以上解離しない」とは、測定誤差を含みうるし、また工業的に意味のある程度をいい、例えば、９７〜９９％が解離する程度を言う。
【００２３】
融解温度および解離温度は、プローブ化合物の塩基数、塩基配列のミスマッチの数、プローブ化合物の構成塩基の種類、検体溶液の塩濃度、検体溶液中のＥＤＴＡや有機溶剤などの添加物の濃度などにより変わる。例えば、融解温度は、一般的には５０〜９５℃である。
上記の解離温度、融解温度等は、例えば、いわゆるＤＮＡマイクロアレイを用いて、温度を変化させて洗浄する実験を行い、洗浄温度対ハイブリッド残留量の曲線から求めることができる。
【００２４】
以下、本明細書中では、上述の温度について説明するために、以下のように温度や温度範囲に符号をつけて説明する。
ＴＬＢ：ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブのハイブリッドの解離温度
ＴＭＢ：ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブのハイブリッドの融解温度
ＴＨＢ：ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブのハイブリッドの全量が解離する温度
ＴＬＡ：ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブのハイブリッドの解離温度
ＴＭＡ：ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブのハイブリッドの融解温度
ＴＨＡ：ポリヌクレオチド（Ａ）とプローブのハイブリッドの全量が解離する温度
このときＴＬＢ＜ＴＭＢ＜ＴＨＢ、ＴＬＡ＜ＴＭＡ＜ＴＨＡ、ＴＭＢ＜ＴＭＡという関係にある。また、ＴＬＢ、ＴＭＢ、ＴＨＢはそれぞれ、ポリヌクレオチド（Ｂ）の標的塩基配列に対する非相補性が大きいほど低い温度になる関係にある。
【００２５】
準静的な条件、即ち検体溶液を充分に遅い昇温速度（例えば、毎時１０℃）で昇温した時のポリヌクレオチド（Ａ）とプローブのハイブリッド鎖（以下、「プローブ／（Ａ）ハイブリッド」ということがある。）、および、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブのハイブリッド鎖（以下、「プローブ／（Ｂ）ハイブリッド」ということがある。）の融解曲線を模式図として図１及び図２に示した。図１および図２において、横軸は被検ポリヌクレオチドを含有する溶液の温度を示し、縦軸はポリヌクレオチドとプローブ化合物とのハイブリッド化率を示す。各図中、破線は、ポリヌクレオチド（Ａ）の融解曲線であり、実線は、ポリヌクレオチド（Ｂ）の融解曲線である。
【００２６】
図１は、ＴＨＢ≦ＴＬＡ  なる関係（以下、「融解曲線が非重畳的」と称する場合がある。）にある場合である。この場合には、次のように温度範囲を命名する。
温度範囲α：溶液の氷結温度〜ＴＬＢ
温度範囲β：ＴＬＢ〜ＴＨＢ
温度範囲δ：ＴＬＡ〜ＴＨＡ
温度範囲ε：ＴＨＢ〜溶液の沸騰温度
【００２７】
また、図２は、ＴＬＡ≦ＴＨＢ  なる関係（以下、「融解曲線が重畳的」と称する場合がある。）にある場合である。この場合には、次のように温度範囲を命名する。
温度範囲β’：ＴＬＢ〜ＴＬＡ
温度範囲γ’：ＴＬＡ〜ＴＨＢ
温度範囲δ’：ＴＨＢ〜ＴＨＡ
ただし、図２の重畳的な温度関係の場合に於いて、温度範囲αとεは図１の場合と共通である。
【００２８】
各温度範囲における溶液中のポリヌクレオチド（Ａ）および（Ｂ）の解離率の関係は、以下の表１および表２のように表される。表１は解離曲線が非重畳的である場合であり、表２は、重畳的である場合である。
【００２９】
【表１】
2004298005.tif 000002
【００３０】
【表２】
2004298005.tif 000003
（ただし、ｘ、ｙはそれぞれ０以上１以下で、それぞれのポリヌクレオチドの解離曲線に依存する値である。）
【００３１】
［分離方法］
本発明の分離方法は、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と、標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）とを含有する混合溶液から、ポリヌクレオチド（Ａ）を分離するポリヌクレオチドの分離方法であって、標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブが、セルの内表面またはセル内の固相の少なくともいずれか一方に固定されたセルに混合溶液を配し、セル内に配された混合溶液に、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の解離温度より高い第一温度に調節された第一領域、および、前記第一温度より低く、かつポリヌクレオチド（Ａ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の全量が解離する温度未満である第二温度に調節された第二領域が互いに接する温度分布を持たせ、該温度分布を一方向に連続的に移動させることにより、ポリヌクレオチド（Ａ）をプローブとハイブリダイズさせて混合溶液から分離することを特徴とする。
【００３２】
第一温度は、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の解離温度（ＴＬＢ）より高い温度である。第一温度をＴＬＢ未満の温度範囲（α）内とすると、第一温度より低い第二温度も同領域（α）に入り、溶液中のポリヌクレオチド（Ａ）もポリヌクレオチド（Ｂ）もハイブリダイゼーションにより固相に吸着されていて、セル中のいずれの領域においても溶液中に解離したこれらポリヌクレオチドが無く、分離は行われない。
【００３３】
第二温度は、第一温度より低く、かつポリヌクレオチド（Ａ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の全量が解離する温度（ＴＨＡ）未満である。第二温度を温度範囲ε、即ち、ＴＨＡ以上にすると、第二温度より高い第一温度も温度範囲εに入り、セル内の全領域に於いてポリヌクレオチド（Ａ）もポリヌクレオチド（Ｂ）もハイブリダイゼーションせず、全量が溶液に溶解していることになる。このため、この条件では本発明の分離は行われない。
【００３４】
従って、本発明では、第一温度をＴＬＢを越える温度とし、かつ第二温度を第一温度より低く、ＴＨＡ未満の温度とする。この条件では、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）とに関する二つの解離曲線が非重畳的である場合にも重畳的である場合にも、第一領域に於ける両ポリヌクレオチドの全吸着量は、第二領域に於けるそれと同等以下であり、かつ、第一領域の溶液中に於けるポリヌクレオチド（Ｂ）が溶解している割合（溶解している量／全量）は、ポリヌクレオチド（Ａ）が溶解している割合（溶解している量／全量）と同等以上である。
【００３５】
本発明の分離機構はまだ明確ではないが、次のように推定される。
セル内の任意の部分が第一温度に成されたときに、ポリヌクレオチド（Ｂ）の少なくとも一部が解離（脱ハイブリダイゼーション）した状態となる。この際、第一温度がＴＨＡ未満であると、ポリヌクレオチド（Ａ）の少なくとも一部がプローブとのハイブリッド鎖を形成して固相に吸着されるため溶液中のポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比が上昇する。従って、該第一領域から、拡散や送液によって温度分布の移動方向や下流方向に流出する割合は、ポリヌクレオチド（Ａ）よりポリヌクレオチド（Ｂ）の方が高くなる。その後、同部分が連続的な温度変化により第二温度となることで、プローブとポリヌクレオチド（Ａ）とが優先的にハイブリダイゼーションすることにより、溶液中のポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比がさらに上昇する。従って、この領域に於いても、拡散や送液によって該領域から温度分布の移動方向や下流方向に流出する割合は、ポリヌクレオチド）Ａ）よりポリヌクレオチド（Ｂ）ぼ方が高くなる。またこの時、第一温度がＴＨＡ以上であっても、第一温度から第二温度への連続的な温度変化の際に、固定されたプローブがポリヌクレオチド（Ａ）を吸着する速度がポリヌクレオチド（Ｂ）を吸着する速度より速いため、温度の変化する領域において、溶液中のポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比が上昇することで分離されるが、第一温度がＴＨＡ未満であるとより効率よくポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）とを分離できるため好ましい。
【００３６】
さらに、第一温度はポリヌクレオチド（Ｂ）の全量が解離する温度（ＴＨＢ）以上であり、第二温度はポリヌクレオチド（Ｂ）の融解温度（ＴＭＢ）以下であることが好ましい。第一温度がＴＨＢ以上であると、セル内の任意の部分が第一領域に入ったとき、ポリヌクレオチド（Ｂ）がほぼ全量が解離されるため溶液中のポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比を上昇させることができ、セル内での移動量が大きくなって、分離効率、即ち第一温度から第二温度への一回の変化による分離の程度が向上する。また、第二温度がＴＭＢ以下であるとポリヌクレオチド（Ｂ）を充分高い割合でプローブにハイブリダイゼーションさせることができるため、第一領域と第二領域との溶液中のポリヌクレオチドの濃度差が大きくなって、分離効率が向上する。この時、第二温度は、ポリヌクレオチド（Ｂ）の解離温度ＴＬＢ以下（温度範囲α）であることが、同じ理由でさらに好ましい。
また、第二温度が温度範囲αにあり、第一温度がＴＭＢ以上であることが、第一領域と第二領域との溶液中のポリヌクレオチドの濃度差が大きくなって、分離効率が向上するため好ましく、第一温度が温度範囲β、γ、β’、又はγ’にあることが、さらに好ましい。
【００３７】
これとは逆に、セル内の任意の部分が第二温度から第一温度に変化する場合には、上記した場合とは逆に、セル内の任意の部分が第二温度に成されたときに、ポリヌクレオチド（Ａ）の少なくとも一部がハイブリダイゼーションによって固相に吸着される。この際、第二温度がＴＬＢより高いと、ポリヌクレオチド（Ｂ）の少なくとも一部がプローブから解離して溶液中に溶出するため、第二領域において溶液中のポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比が上昇する。従って、該第二領域から、拡散や送液によって温度分布の移動方向や下流方向に流出する割合は、ポリヌクレオチド（Ａ）よりポリヌクレオチド（Ｂ）の方が高くなる。その後、同部分が連続的な温度変化により第一温度となることで、プローブとポリヌクレオチド（Ｂ）のハイブリッド鎖が優先的に解離することにより、溶液中のポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比がさらに上昇する。従って、この領域に於いても、拡散や送液によって該領域から温度分布の移動方向や下流方向に流出する割合は、ポリヌクレオチド（Ａ）よりポリヌクレオチド（Ｂ）の方が高くなる。また、第一温度がＴＬＢ以下であっても、第二温度から第一温度への連続的な温度変化の際に、プローブとポリヌクレオチド（Ｂ）とのハイブリダイゼーションが優先的に解離することで、該温度の変化する領域において、溶液中のポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比が上昇することで分離されるが、第二温度がＴＬＢ未満であるとより効率よくポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）とを分離できるため好ましい。
【００３８】
さらにまた、第一温度がＴＨＡ以上であり、かつ、第二温度がＴＬＢ未満であっても、第一温度から第二温度への連続的な温度変化の際に、固定されたプローブにポリヌクレオチド（Ａ）が吸着される速度は、ポリヌクレオチド（Ｂ）が吸着される速度より速く、また、第二温度から第一温度への連続的な温度変化の際に、固定されたプローブに吸着されたポリヌクレオチド（Ｂ）が解離する速度は、ポリヌクレオチド（Ａ）が解離する速度より速いことで、温度の変化する領域において、溶液中のポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比が上昇し、分離される。
【００３９】
勿論、上記の説明は概念的な原理であり、実際の系ではもっと複雑な現象が生じていると推定される。例えば、第一温度から第二温度への変化やその逆の変化は中間温度を経由すること、ハイブリッド形成も脱ハイブリダイゼーションも、所定温度に達してから時間的な遅れがあること、等の速度的な効果である。よって、第一領域と第二領域の移動方向の長さ、温度分布の移動速度、プローブの長さ、ポリヌクレオチド（Ａ）やポリヌクレオチド（Ｂ）の長さ、溶液の流量などによって、上記の速度的な関係が変化して、複雑な様相を呈しうる。
【００４０】
従来技術（特許文献１）においては、固相に固定されたオリゴヌクレオチド（本発明で言うプローブ）に溶液中の野生型ポリヌクレオチドを選択的にハイブリッド形成させるが、一定温度での処理では、野生型のみを充分な選択性でハイブリッド形成させるには、長時間、例えば１〜１０時間を要した。これに対し、本発明に於いては、各第一温度及び第二温度の保持時間は１分未満でよく、このような短時間でも充分な選択性が発揮されて分離される。その理由は、第一に、ハイブリッド形成時より脱ハイブリダイゼーション時の方が選択性が高いこと、第二に、各段階での分離度は低くても、それを繰り返すことで、分離度が累乗的に増加することによると考えられる。
【００４１】
上記したように、温度分布の移動は、第一および第二領域のどちらを先にしてもよい。従来の結晶精製に於けるゾーンメルティング法においては、結晶析出の際に不純物が融液中に押し出されるので、高温部を先にしないと精製されないのに対し、本発明では、ポリヌクレオチド（Ａ）やポリヌクレオチド（Ｂ）がプローブとハイブリダイゼーションする際にも、解離する際にも精製されうるためである。しかしながら本発明においては、従来のゾーンメルティング法とは逆に、第二領域を先にして移動させるものであることが、分離効率が向上するため好ましい。第二領域を先にすることにより、セル内の任意の位置が、第二温度になされたのち、次いで第一温度になされることになる。従って、ポリヌクレオチド（Ｂ）やポリヌクレオチド（Ａ）が解離する際に分離されることになる。このような条件が好ましい理由は明確ではないが、ポリヌクレオチドはハイブリッド形成速度より解離速度の方が速く、又、解離時の方が選択性も高いことによるものと推定される。
本発明の分離方法を室温雰囲気で実施する場合には、ポリヌクレオチド（Ｂ）が極端に短い場合以外は、セルは最初第二温度にあることになり、自ずと第二領域を先にして温度分布を移動させることになる（第二領域の先端はセルの端より先にあると考える）。
【００４２】
さらに、本発明に於いては、第一領域と第二領域とを、交互に２回以上繰り返して移動させることが好ましく、その際には、第一領域と第二領域の組を一組として、それを繰り返すと考える。第一領域と第二領域の寸法が同じである場合には、セルの任意の部分を第一領域と第二領域が交互に通過するため、両者の違いは僅少と成るが、第一領域と第二領域の寸法を違える方法や、第一領域から第二領域へ移行する部分と第二領域から第一領域へ移行する部分の温度勾配に差を設けることで、順序の効果を増すことが出来る。
【００４３】
本発明の分離方法の分離メカニズムは未だ明確ではないが、ポリヌクレオチド（Ａ）および（Ｂ）が溶液の全領域で解離した状態でも、全領域で吸着された状態でも分離が行われないこと、及び、第一領域を先にした場合でも第二温度を先にした場合でも分離が行われることから、解離量の差、解離速度の差、ハイブリッド形成速度の差の少なくともいずれかが理由であると思われる。例えば、第一領域でポリヌクレオチド（Ｂ）の溶液中組成比が高い状態では、拡散、送液、電気浸透流、電気泳動などによりポリヌクレオチド（Ｂ）が第一領域から出てゆく割合が高くなることに寄るのであろう。
【００４４】
また、本発明においては、準静的な条件より速い温度変化で行うことも好ましいことから、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の解離率が同じ条件であるように見える条件であっても、速度的な差や、温度の移行部分でこれらが異なる条件があり、分離される。例えば、セル各部の溶液が第一領域に入ったとき、溶液が昇温してゆく時間の遅延と、解離に要する時間の遅延がある。一般に、解離に要する時間はハイブリッド形成に要する時間より短く、又、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の選択性も解離時の方が高い。従って、短時間だけ第一温度とし、その他の時間を第二温度とすることによって、ポリヌクレオチド（Ｂ）は、拡散によって或いは他の移動手段によって、選択的に第一領域から流出する。従って、第二温度が温度範囲αにあり、第一温度が温度範囲εにあっても、分離は可能である。
【００４５】
本発明に於いては、第一領域および第二領域が互いに接する温度分布を、セルに添って一方向に連続的に移動させる。移動の速度は、任意であり、セルの寸法、セル壁の厚さ、プローブの長さ、ポリヌクレオチド（Ａ）やポリヌクレオチド（Ｂ）の長さ、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の配列の異なり具合、セル内の溶液を移動させるか否かなどにより、適宜最適速度を選択できる。最適速度は用いる系における簡単な実験により見いだすことが出来る。
【００４６】
例えば、セル中の溶液を流動させないときであって、セルの幅又は深さ方向の直径又は短径が１０〜１００μｍであり、充填剤がない場合には、移動速度は、０．１〜１０ｍｍ／分が好ましい。この好ましい範囲の下限以上とすることで、分離時間を短くでき、この好ましい範囲の上限以下とすることで、分離能率の低下を防ぐことが出来る。セルの幅又は深さ方向の直径又は短径がこれより大である場合には、それに応じて速度を下げることが好ましい。セルの幅又は深さ方向の直径又は短径が上記より大であっても、多孔質体や充填剤が充填されていて、細孔の寸法が上記寸法より小である場合には、温度調節方法にもよるが、充分に速い昇降温速度で温度調節可能であれば、速くすることができる。また、セル内の溶液を前記温度分布の移動方向に流動させる場合などには、速くすることが好ましい。
【００４７】
セル中の溶液を第一温度及び第二温度に温度調節する方法は任意である。例えば、接触又は近接された温調ブロックとの相対的位置の移動、温度調節された気流との接触とその位置の移動、温度調節された液体との接触とその位置の移動、赤外線や電磁波の照射と照射位置の移動等を挙げることができる。
【００４８】
第一領域および第二領域が互いに接する温度分布は、勿論、その間に温度勾配を有する。第一領域と第二領域の移行部分の温度勾配は、特に強制的な（即ち、拡散以外の）ポリヌクレオチドの移送を行わないときには１〜１０００℃／ｍｍが好ましく、２〜１００℃／ｍｍがさらに好ましい。強制的なポリヌクレオチドの移送を行うときに０．１〜１００℃／ｍｍが好ましく、０．５〜１０℃／ｍｍがさらに好ましい。この範囲とすることによって、分離効率が高く、分離装置を小型に出来、また、温度調節も容易である。
【００４９】
このような大きな温度勾配を形成するために、セルを有する容器は、温度分布の移動方向における熱伝導率が１０ｗ・ｍ−１・Ｋ−１以下であることが好ましく、１ｗ・ｍ−１・Ｋ−１以下であることがさらに好ましく、０．３ｗ・ｍ−１・Ｋ−１以下であることが最も好ましい。上記方向の熱伝導率の下限は、自ずと限界はあろうが低いことそれ自体による不都合はないため下限を限定する必要はないが、例えば０．０１ｗ・ｍ−１・Ｋ−１であり得る。温度分布の移動方向における熱伝導率をこのような値にするには、該当する熱伝導率を有する素材で形成する方法、該方向に空隙や発泡体を形成することにより該方向の熱伝導率を低くする方法などにより実施できる。温度分布に直角な方向における熱伝導率は任意であるが、容器の温度分布の移動方向における熱伝導率以上であることが好ましい。そのようにすることによって、セルの第一領域及び第二領域の温度を均一にすることが容易になる。
【００５０】
本発明に於いては、セル中でポリヌクレオチドを強制的に（即ち、拡散によって自発的に移動すること以外の方法によることをいう。但し、説明の簡略化のため、以下、「強制的に」は省略する）移送しつつ行うことも好ましい。ポリヌクレオチドを移送することにより、分離の効率と速度を向上させることが出来る。ポリヌクレオチドの移送方法は任意であるが、例えば、前記溶液の送液（即ち、ポリヌクレオチドと溶媒を同時に移動させる方法）、溶液中のポリヌクレオチドの移送（即ち、溶媒は移動させない方法）、及びこれらが混合した移送（即ち、ポリヌクレオチドと溶媒の移動速度が異なる移送方法）であり得る。これらのうち、溶液の送液、すなわち、ポリヌクレオチドの混合溶液をセル内で一方向に流動させつつ温度分布の移動を行うことが、簡易な装置により行うことができるため好ましい。溶液の送液方法は任意であり、押し出し又は吸引による定量的送液、加圧気体や減圧気体による圧力差による送液、吸収体による吸収による送液、ダイヤフラムポンプなどによる間欠的な送液、電磁波による移送、振動や超音波による移送を例示できる。ポリヌクレオチドの移送は、電気泳動を例示できる。それらが混同した移送は、電気浸透流を例示できる。勿論上記の複数の方法を併用してもよい。
【００５１】
以下説明の簡略化のために、特に断らない限り、ポリヌクレオチドの移送を溶液の移送で代表させて説明する。溶液を移送する方向は温度分布の移動方向の同じでも反対方向でもよいが、同じ方向であることが、より効果的であり好ましい。温度分布の移動方向と同じ方向に溶液を移送する場合には、温度分布の移動速度の０．０１倍〜１．５倍が好ましく、０．１倍〜１倍がさらに好ましい。この範囲の速度で移送することにより、分離の効率と速度を増すことが出来る。電気泳動や電気浸透流の場合には、ポリヌクレオチドの移動速度がこの値になるように、印加電圧を調節する。
【００５２】
また、温度分布の移動は、２回以上繰り返し行われることが好ましく、５回以上、特に１０回以上繰り返して行われることがさらに好ましい。移動を２回以上繰り返すことによって、分離効率をより向上させることができる。
さらに、上記を実施するに当たって、第一領域と第二領域から成る一組の温度分布をセルの一端から他端まで移動させる操作を繰り返してもよいが、温度分布は、第一領域と第二領域とを温度分布の移動方向に交互に２回以上繰り返して設けられたものであることが好ましい。さらに５回以上、特に１０回以上繰り返して設けられることが、一回の操作で、セル中の任意の位置の溶液に多数回の温度変化を与えられるため好ましい。なお、この時、第一領域の温度は全て同一である必要はなく、第二領域の温度も全て同一である必要はない。
【００５３】
本発明の分離方法は、溶液を流動させない場合には、処理後に、セルの温度分布の移動末端にある溶液を採取し、ポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比を向上させた溶液を得ることができる。また、溶液を流動させる場合には、セルから流出する溶液を採取することによって得られる。さらに、温度分布の移動方向と溶液の流動方向を同一にして、溶液の流動方向および温度分布の移動方向の最終端から流出する溶液を採取して、ポリヌクレオチド（Ｂ）の組成比を向上させた溶液を得ることが好ましい。
【００５４】
或いは、溶液を流動させる場合も流動させない場合も、処理後に、セル内のポリヌクレオチド溶液を洗浄液に置換し、セル内、好ましくはセル内の温度分布の移動の前端若しくは上流部分にある固相に吸着されたポリヌクレオチドを溶出させて採取し、分離されたポリヌクレオチド（Ａ）を得ることも出来る。
【００５５】
［分離装置］
本発明のポリヌクレオチドの分離装置は、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）と、前記標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（Ｂ）とを含有する混合溶液から、ポリヌクレオチド（Ａ）分離するポリヌクレオチドの分離装置であって、容器内のセルの内表面および／または該セル内の固相に、前記標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブが固定された容器と、該容器内の前記セル内に収納された前記混合溶液に、ポリヌクレオチド（Ｂ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の解離温度より高い第一温度に調節された第一領域、および、前記第一温度より低く、かつポリヌクレオチド（Ａ）とプローブとが形成するハイブリッド鎖の全量が解離する温度未満である第二温度に調節された第二領域が互いに接する温度分布を持たせるための熱源と、該熱源を移動させる移動手段とを備えることを特徴とする。
【００５６】
セル内の混合溶液に第一領域および第二領域が互いに接する温度分布を持たせるための熱源としては、温調ブロック、温度調節された気流、温度調節された液体、赤外線や電磁波の照射等が挙げられる。これらのうち、装置の簡易さの観点から、温調ブロックを用いることが好ましい。これらの熱源は、セル内の溶液に所望の温度分布を持たせることができれば設置位置は任意であり、容器に直接接していてもよいし、近接されているだけでもよい。
また、熱源を移動させる移動手段としては、パルスモーター、直流モーター、交流モーターなどの電磁モーターを使用した移動機構等を挙げることができる。この熱源の移動は、熱源自体を移動させるものであってもよいし、容器の方を移動させることにより、容器と熱源との位置を相対的に移動させるものであってもよい。
【００５７】
本発明の装置に用いられる容器、およびセルとしては、それぞれ上述したものを好適に用いることができる。特にセルは、熱源の移動方向に対して垂直な断面の直径若しくは一辺が１μｍ〜１ｍｍの毛細管状であることが好ましい。この直径範囲内の毛細管とすることによって、熱伝導度に優れ所望の温度分布を達成することが容易であり、かつ製造容易な装置とすることができる。
【００５８】
【実施例】
以下本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、「部」及び「％」は、特に断りがない限り、各々「質量％」、「質量部」を表す。
【００５９】
［組成物（Ｘ１）］
容器Ｄ１の製造例で使用する紫外線硬化性の組成物（Ｘ１）の調製方法を示す。
重合性化合物として、平均分子量約２０００の大日本インキ化学工業株式会社製３官能ウレタンアクリレートオリゴマー「ユニディックＶ−４２６３」６０部、第一工業製薬株式会社製ヘキサンジオールジアクリレート「ニューフロンティアＨＤＤＡ」３０部、和光純薬工業株式会社製メタクリル酸グリシジル１０部、光重合開始剤としてチバスペシャルテッィケミカルズ社製１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」５部、及び重合遅延剤として関東化学株式会社製２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン０．５部を混合して、組成物（Ｘ１）を調製する。
【００６０】
［組成物（Ｘ２）］
容器Ｄ２の製造例で使用する紫外線硬化性の組成物（Ｘ２）の調製方法を示す。
重合性化合物として、上記「ユニディックＶ−４２６３」６０部、上記「ニューフロンティアＨＤＤＡ」２０部、上記メタクリル酸グリシジル２０部、光重合開始剤として上記「イルガキュアー１８４」」５部、及び重合遅延剤として上記２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン０．５部を混合して、組成物（Ｘ２）を調製する。
【００６１】
［製膜液（Ｙ）］
容器Ｄ１の製造例で使用する紫外線硬化性の組成物（Ｙ）の調製方法を示す。
重合性の化合物として、上記「ユニディックＶ−４２６３」７２部、日本化薬株式会社製ジシクロペンタニルジアクリレート「Ｒ−６８４」１８部、上記メタクリル酸グリシジル１０部、貧溶剤（Ｒ）として和光純薬工業株式会社製デカン酸メチル１２０部、揮発性の良溶剤としてアセトン１０部、紫外線重合開始剤として上記「イルガキュアー１８４」１３部、を均一に混合して製膜液（Ｙ）を調製する。
【００６２】
［紫外線の照射］
製造例に於ける紫外線照射は、例えば、下記の装置と方法で実施できる。
２００Ｗメタルハライドランプを光源とするウシオ電機株式会社製のマルチライト２００型露光装置用光源ユニットを用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が１００ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を、特に指定が無い限り室温、窒素雰囲気中で照射する。
【００６３】
［容器Ｄ１］
図３は、本発明の分離方法に好適に用いられる分離装置の一実施例のうち、セルを有する容器を示したもので、図３（ａ）は平面模式図、図３（ｂ）は断面模式図である。
図３に示すように、本実施例の容器１００は、平面状の支持体１上に、多孔質層２、第一樹脂層３、及び第二樹脂層４が順に積層され、これらが一体化されて概略構成されており、全体の外形は長さ７５ｍｍ、幅５０ｍｍ、厚さ約１．１８ｍｍの板状となっている。なお、外形は分離するポリヌクレオチド混合溶液の量等によって決定すればよく任意である。
【００６４】
支持体１としては、アクリル板、ポリスチレン板、ポリカーボネート板、硝子板等を用いることができるが、容器Ｄ１においてはアクリル板が使用されている。
多孔質層２は、支持体１上に固着されて形成されており、上述の製膜液（Ｙ）の塗膜を硬化させ、貧溶剤を除去したものである。その厚さは任意であるがＤ１においては約５μｍである。
第一樹脂層３は、上述の組成物（Ｘ１）を硬化させた層である。この第一樹脂層３には、層の表面から裏面に貫通するコの字型の細線状欠損部５が形成され、これが容器Ｄ１におけるセル５となっている。このセル５は、いずれの部分も幅が５００μｍ、高さが８５μｍであって、長さが３０ｍｍである直線状の欠損部５ｄと、その両端から４５度の角度で伸びたそれぞれ長さ３０ｍｍの直線状の欠損部５ｃおよび５ｅからなっている。
このセル５の内壁の各面には、長さ２０塩基の１本鎖ＤＮＡであるプローブが結合されている。
【００６５】
第二樹脂層４は、組成物（Ｘ１）を硬化させたものであり、その厚さは約９０μｍである。
第二樹脂層４には、層の表面から裏面に貫通する孔である流入口６および流出口７が形成されている。流入口６は、第一樹脂層３のセル５の上流端５ａに連通している。流出口７は、第一樹脂層３のセル５の下流端５ｂに連通している。
また、容器Ｄ１中心部のセル５ｄ付近にはセル５の温度測定用の熱電対８が封入されており、そのリード線９が容器外に引き出されている。
【００６６】
以下、この容器Ｄ１の製造方法について説明する。
〔工程１：多孔質層の形成〕
厚さ１ｍｍのアクリル板製支持体１の上に、スピンコーターを用いて、製膜液（Ｙ）を塗工し、紫外線を６０秒照射して硬化させ、相分離した貧溶剤（Ｒ）をｎ−ヘキサンで洗浄除去して多孔質層２を形成する。
【００６７】
〔工程２：欠損部（セル）の形成〕
上記多孔質層２の上に、バーコーターを用いて組成物（Ｘ１）を塗工して未硬化塗膜を形成し、該未硬化塗膜のセル５と成すべき部分、熱電対８装着部およびリード線９引き出し部以外の部分にフォトマスクを通して紫外線を１０秒間照射して未硬化塗膜を半硬化させて第一樹脂層３と成した。次いで、非照射部分の未硬化の組成物（Ｘ１）をエタノールで除去して、第一樹脂層３の欠損部として、多孔質層２が底面に形成されたセル５及び熱電対装着部８ａおよびリード線引き出し部９ａとなる欠損部を形成する。
【００６８】
〔工程３：蓋の固着〕
それぞれ太さ８５μｍのアルメル線、トクロメル線を電気溶接して作製し、熱電対８およびリード線９を、上記で作製した熱電対装着部８ａ及びリード線引き出し部９ａに装着する。
二村化学株式会社製二軸延伸ポリプロピレンフィルム「ＯＰＰフィルム」上に組成物（Ｘ１）を、スピンコーターを用いて塗工し、全面に紫外線を３秒間照射して半硬化させて第二樹脂層４と成し、上記工程２で作製した部材の第一樹脂層２の上に貼り合わせ、紫外線を４０秒照射して、第一樹脂層２、第二樹脂層４共に完全に硬化させたのち、ＯＰＰフィルムを剥離して、容器Ｄ１前駆体を製造した。
【００６９】
〔流入口、流出口の形成〕
容器Ｄ１前駆体のセル５の両端部５ａ，５ｂの位置に於いて、ドリルを用いて第二樹脂層４に直径１ｍｍの孔６、７を穿ち、セル５に連結した流入口６と流出口７を形成して、容器Ｄ１を製造した。
【００７０】
〔ＤＮＡの固定〕
流入部６からセル内に、５％ポリアリルアミン（日東紡株式会社）水溶液を注入し、５０℃で２時間静置した後、セルに流水を１５分間通して洗浄し余剰のポリアリルアミンを除去し、アミノ基を流路内側の固相（多孔質層及びその他のセル内壁）に導入する。
次いで、セル５に５％グルタルアルデヒド水溶液を注入し、５０℃で２時間静置した後、流水を通して１０分間洗浄して余剰のグルタルアルデヒドを除去し、乾燥窒素を通して多孔質層とセル内壁を乾燥させて、ホルミル基導入多孔質膜を得る。
次いで、セル５内にエスペックオリゴサービス株式会社製の５’末端にアミノ基を修飾した長さ２０塩基のＤＮＡの緩衝液溶液（ＤＮＡ濃度５０μＭ）を注入し、６０℃で１５時間静置した後、緩衝液を通して洗浄し、セル５内の固相にプローブとなるＤＮＡを共有結合で固定する。
【００７１】
〔接続部品Ｆの作製〕
図４に、本発明にかかる容器Ｄ１等を接続するために好適に用いられる接続部品Ｆの斜視図を示す。接続部品Ｆは、図４に示すように、５ｍｍ×５ｍｍ×厚さ２ｍｍのポリスチレン板１１の平面の中心部に、直径１．６ｍｍの貫通孔１２を穿ち、該貫通孔１２にポリエチレン製のチューブ１３を接着して、接続部材（Ｆ）を作製する。本接続部材（Ｆ）は、オーリング１４を挟んで容器Ｄ１の流入口６や流出口７にクランプ（図示せず）で密着させることによって、マイクロシリンジ（図示せず）やポンプ（図示せず）などに接続することができる。
【００７２】
［容器Ｄ２の製造例］
次に、本発明の分離装置に好適に用いられる容器の別の例として、チューブ状の容器Ｄ２を示す。
外径６ｍｍ、内径４ｍｍの硬質塩化ビニルパイプを加熱延伸して、外径１．０ｍｍ、内径０．５ｍｍの硬質塩化ビニル製のチューブ（図示せず）を作製する。
長さ１０ｃｍの前記チューブに、紫外線硬化性の組成物（Ｘ２）を注入し、加圧窒素で押し出して、チューブ内面に塗工し、紫外線を６０秒間照射して、該チューブ内面をエポキシ基導入硬化塗膜でコートする。
次いで、エスペックオリゴサービス株式会社製の５‘末端にアミノ基を修飾した長さ２０塩基のＤＮＡの緩衝液溶液（ＤＮＡ濃度５０μＭ）を前記チューブに注入し、該チューブの両端部を加熱してポリスチレンを軟化させつクランプで封じて、６０℃、で１５時間静置した後、緩衝液を前記チューブ内に流して余剰のＤＮＡを除去し、前記チューブ内面にプローブとなるＤＮＡを共有結合で固定する。
以上のようにして、硬質塩化ビニル製の長さ１０ｃｍ、外径１．０ｍｍ、内径０．５ｍｍのチューブの内面に、２０塩基の１本鎖ＤＮＡであるプローブが結合した容器Ｄ２を作製する。
【００７３】
［温調ブロック（Ｈ）］
図５に、本発明の分離装置に好適に用いられる温調ブロックＨのブロック斜視図を示す。
図５に示したように、この温調ブロックＨは、２２．５ｍｍ×２０ｍｍ×厚さ３ｍｍのアルミニウム製板状部２１ａに、１０ｍｍ×２０ｍｍ×厚さ１．５ｍｍの８枚のフィン２１ｂが１．５ｍｍの等間隔で形成されたアルミニウム製の部材２１に、板状の電気ヒーター２２とシース型の熱電対２３とが装着されてなっている。
【００７４】
［ポリヌクレオチドの分離］
例えば、マイクロシリンジ（図示せず）を用いて流入口７から混合ＤＮＡ溶液をセルに注入した容器Ｄ１又はＤ２を、室温の空気中で、例えば８５℃に調節された２つの上記温調ブロックＨ及び温調ブロックＨ’（以下、第二の温調ブロックＨ’の各部の名称には「’」を付ける）のフィン２１ｂとフィン２１ｂ’を突き合わせた間に挟んで移動させると、容器Ｄ１又はＤ２の両側からフィン２１ｂとフィン２１ｂ’で挟まれた領域が前記第一領域となり、フィン２１ｂ間の空隙２４とフィン２１ｂ’間の空隙２４’とで挟まれた領域が第二領域となる。
必要に応じて、流入口７又は流出口８にポンプを接続して、ＤＮＡ混合溶液を移動させる。
これにより、標的塩基配列を有するＤＮＡはプローブとハイブリダイズされて分離され、流出口８から、標的塩基配列を有さないＤＮＡの組成比が上昇したＤＮＡ溶液を得ることができる。
【００７５】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の分離方法によると、ポリヌクレオチドの混合溶液から、標的塩基配列を有するポリヌクレオチドを容易に分離することができ、特に全ポリヌクレオチドに対する組成比の低いポリヌクレオチドの溶液中組成比を上昇させることができる。また、本発明によると、上記分離方法に好適に用いることができ、かつμ−ＴＡＳ（マイクロ・トータル・アナリティカル・システム）の一部に組み込むことが容易な分離装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】非重畳的な場合の、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の解離曲線を示した模式図である。
【図２】重畳的な場合の、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の解離曲線を示した模式図である。
【図３】本発明の製造装置に好適に用いられる容器Ｄ１の平面模式図および断面模式図である。
【図４】本発明の製造装置に好適に用いられる接続部品Ｆの斜視図である。
【図５】本発明の製造装置に好適に用いられる温調ブロックＨの斜視図である。
【符号の説明】
Ｄ１・・容器、Ｆ・・接続部品、Ｈ・・温調ブロック
１・・支持体、２・・多孔質層、３・・第一樹脂層、４・・第二樹脂層、５・・セル（欠損部）、６・・流入口、７・・流出口、８・・熱電対、９・・リード線、１１・・ポリスチレン板、１２・・貫通孔、１３・・チューブ、１４・・オーリング、２１・・アルミニウム製部材、２１ａ・・板状部、２１ｂ・・フィン、２２・・電気ヒーター、２３・・熱電対、２４・・空隙部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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