(57)【要約】【課題】本発明の課題は励起光や散乱光による測定誤差を起こさないストークスシフトの大きい蛍光キレート試薬を提供することである。【解決手段】キレート生成能を有する蛍光団とその蛍光団の発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有する蛍光団を同一分子内に持ち、スムーズな蛍光共鳴エネルギー移動を行わせることで、蛍光強度の増加と大きなストークスシフトが得られ、上記課題を解決した。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式
【化１】
2004061476.tif 000008
（Ｄはキレート生成能をもち、ＤおよびＡは、それぞれ、蛍光を発することができ、ＳはＤとＡを連結するスペーサーを示す）で示され、金属イオンとキレートを生成した後のＤの発光スペクトルとＡの励起スペクトルが重なることを特徴とする新規蛍光物質。
【請求項２】
ＤがＮ−（３−カルボキシ−２−ナフチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリ酢酸誘導体で、Ａが４−アミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール誘導体で、Ｓがポリ（エチレンイミン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンスルフィド）から選ばれる下記構造式
【化２】
2004061476.tif 000009
（式中、ＸはＯ、ＮＨ、Ｓから選ばれ、ｎは０以上の整数から選ばれ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立に水素、アルキル基、アシルオキシメチル基から選ばれ、Ｒ４、Ｒ５はそれぞれ独立に水素あるいはアルキル基から選ばれる）で示される請求項１記載の新規蛍光物質。
【請求項３】
請求項２記載の蛍光物質において、ＸがＮＨ、ｎが１、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３が水素、Ｒ４およびＲ５がメチル基である下記構造式
【化３】
2004061476.tif 000010
で示された新規蛍光物質。
【請求項４】
下記構造式
【化４】
2004061476.tif 000011
で示される新規蛍光物質と金属イオンとの反応により形成される金属錯体を励起させ、発する蛍光を利用して金属イオンを測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、新規蛍光キレート試薬及びその試薬を用いる亜鉛イオンの定量法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内には、生理活性物質の代謝や合成など生体機能の維持に関与している多数の金属が存在している。その中でも亜鉛は鉄に次いで含量の多い必須金属元素であり、細胞内のほとんどの亜鉛イオンは蛋白質と強固に結合し、蛋白質の構造保持や機能発現に関与している。また、亜鉛はアポトーシスとの関係やシナプス終盤より神経伝達物質などと共に放出されていることが報告されている。既存の酵素の補因子としての役割に加えて種々の役割を担っていると推測されており、生体内亜鉛イオンを正確に定量することは極めて重要な分析課題となっている。
【０００３】
亜鉛イオンの定量法として、原子吸光光度法、ＩＣＰ（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｐｌａｓｍａ）法、蛍光キレート試薬による方法が報告されている。その中でも蛍光キレート試薬を用いる測定法は操作が簡便であり、また、生細胞中の亜鉛イオンの動的な解析が可能なため、非常に有効な測定法である。
【０００４】
これまでに報告されている蛍光キレート試薬として、可視光励起型の蛍光団であるローダミンやフルオレセインが挙げられる。また、亜鉛イオンに対して優れた選択性を有する蛍光キレート試薬として、Ｎ−（６−メトキシ−８−キノリニル）−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ＴＳＱ）、ダンシルアミノエチルシクレン［Ｔ．Ｋｏｉｋｅ，Ｔ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．Ａｏｋｉ，Ｅ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．Ｓｈｉｒｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，１２６９６（１９９６）］や６−ヒドロキシ−９−［４−（４，７，１０−トリメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル）］フェニル−３Ｈ−キサンテン−３−オン（ＡＣＦ）誘導体が報告されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ローダミンやフルオレセインはストークスシフトが小さいため、励起光やその散乱光による測定誤差が生じやすい。また、亜鉛に特異的な蛍光キレート試薬であるＴＳＱは脂溶性が高いため細胞膜等に吸着されやすく、測定誤差が生じやすい。ダンシルアミノエチルシクレンは測定時に試薬が存在する環境の違い、すなわち、溶媒の種類、あるいは細胞外、細胞内もしくは細胞膜などにおける水溶性、脂溶性などの環境の違いにより、蛍光量子収率と蛍光の色調が大きく変化するという欠点がある。［平塚寿章，蛋白質　核酸　酵素，４２，１０６９（１９９７）］ＡＣＦ誘導体は、亜鉛イオンと特異的に錯体を形成するが、ｐＨ１０で測定するため、塩基性に耐性のある試料以外は測定できないという問題点を有している。［Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ，Ｋ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．Ｕｒａｎｏ，Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｎａｇａｎｏ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３９，１０５２（２０００）］
【０００６】
上記のように、既存の蛍光キレート試薬は種々の問題点を有しており、特に生体系中の亜鉛イオンの定量においては到底満足できる結果を得ることができない。生体系においても使用できる亜鉛に特異的な蛍光キレート試薬が強く求められている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は鋭意研究を重ねた結果、下記構造式１
【０００８】
【化５】
2004061476.tif 000002
（Ｄはキレート生成能をもち、ＤおよびＡは、それぞれ、蛍光を発することができ、ＳはＤとＡを連結するスペーサーを示す）で示され、金属イオンとキレートを生成した後のＤの発光スペクトルとＡの励起スペクトルが重なることを特徴とする新規蛍光物質を開発した。すなわち、１は励起された蛍光団Ｄ（ドナー分子）が発光現象を伴わず、その遷移エネルギーを近接した発光団Ａ（アクセプター分子）に移動させ、アクセプター分子を発光させる蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）現象を利用したもので、亜鉛とＤが錯体を形成することで、よりスムーズな蛍光共鳴エネルギー移動が行える化合物である。このスムーズな蛍光共鳴エネルギー移動により、強い蛍光強度と大きなストークスシフトが得られ、精度よく亜鉛を定量することができる。
【０００９】
本発明の代表的な例として下記構造式２で示されるＤＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡを取り上げ、その製造法を例示する。
【００１０】
【化６】
2004061476.tif 000003
【００１１】
本発明の代表的な蛍光キレート試薬であるＤＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡは、Ｎ−（３−カルボキシ−２−ナフチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリ酢酸（ＣＮＥＤＴＡ）と４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−（２−アミノエチルアミノ）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（ＤＢＤ−ＥＤ）から下記反応式３にしたがって合成することができる。
【００１２】
【化７】
2004061476.tif 000004
【００１３】
ＣＮＥＤＴＡとＤＢＤ−ＥＤの反応における縮合剤としては、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などが挙げられ、使用される溶媒としては、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリルなどの有機溶媒、あるいはその混合溶媒が挙げられる。
【００１４】
以上のように本発明の代表的な蛍光キレート試薬は、極めて容易な方法で合成することができる。以下に、上記化合物２の有用性を明らかにする。
【００１５】
本発明の蛍光キレート試薬は、既知の蛍光キレート試薬と同様の手法で用いることが可能である。通常は、エタノール、アセトニトリルなどの有機溶媒、生理食塩水などの水性媒体、あるいはそれらの混合媒体などに２で示される新規蛍光物質を溶解し、この溶液を金属イオンを含む適切な緩衝液中に添加して蛍光スペクトルを測定すればよい。
【００１６】
上記化合物２は高極性化合物であり、細胞膜や細胞の脂肪組織への試薬の吸着が小さく、細胞質へ均一に拡散するため、誤差の少ない亜鉛イオンの測定ができる。また、ｐＨ５から生理条件下において蛍光強度の変化が小さいため、生細胞中などの緩衝系が存在しない場合であっても蛍光が安定し、温和な条件下で測定を行うことができる。また、２と亜鉛は１：１のキレートを形成するため、蛍光強度の変化が直線的であり、定量性の良い測定ができる。さらに、紫外線２４１ｎｍ，３３７ｎｍと可視光４３８ｎｍの三点の励起波長が選択できる。
【００１７】
また、上記化合物２のカルボキシル基をエステル化すると、膜透過性が向上する。そのため、スムーズに細胞膜を透過することができる。そして、細胞内のエステラーゼによってエステルが加水分解されて細胞内で２が生成し、亜鉛イオンと錯体を形成することができる。
【００１８】
【実施例】
以下に本発明に係る実施例を記載するが、これは例示であり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
【実施例１】
ＤＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡの合成
【００２０】
【化８】
2004061476.tif 000005
【００２１】
ＣＮＥＤＴＡ１２８ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ）にジメチルスルホキシド１ｍｌを加え、ＥＤＣ２７ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液を加えてＣＮＥＤＴＡを活性化した。そこに、ＤＢＤ−ＥＤ２９．８ｍｇ（０．１０４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液を加え、３時間縮合反応を行なった。反応終了後、アセトニトリルを留去し、塩酸酸性下、酢酸エチルで抽出し、有機層を集め酢酸エチルを留去した。残留物を溶離液、水：アセトニトリル＝１：１とした逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、ＤＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡ橙色粉末結晶４３．８ｍｇ（収率６２％）を得た。
【００２２】
得られたＤＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡの主な物性を以下に示す。
ＭＳ　ｍ／ｚ：６７０［Ｍ−Ｈ］−
ＮＭＲ（ｐｐｍ）ｉｎ　ＣＤ３Ｃｌ３＋ＣＤ３ＯＤ，８．８４５（１Ｈ，ｓ，ｆ），８．０９０（２Ｈ，ｍ，ａ＋ｅ），７．９１８（２Ｈ，ｍ，ｃ＋ｏ），７．７０８（１Ｈ，ｔ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），７．６５２（１Ｈ，ｔ，ｃ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．３２２（１Ｈ，ｄ，ｏ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），３．９８２（２Ｈ，ｓ，ｇ）
【００２３】
【実施例２】
ＡＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡの合成
【００２４】
【化９】
2004061476.tif 000006
【００２５】
ＣＮＥＤＴＡ１４５ｍｇ（０．３６ｍｍｏｌ）にジメチルスルホキシド１ｍｌを加え、ＥＤＣ２７ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液を加えてＣＮＥＤＴＡを活性化した。そこに、ＡＢＤ−ＥＤ　３１ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液を加え、３時間縮合反応を行なった。反応終了後、アセトニトリルを留去し、塩酸酸性下、酢酸エチルで抽出し、有機層を集め酢酸エチルを留去した。残留物を溶離液、水：アセトニトリル＝１：１とした逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、ＡＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡ橙色粉末結晶１１．１５ｍｇ（収率１４％）を得た。
【００２６】
得られたＡＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡの主な物性を以下に示す。
ＭＳ　ｍ／ｚ：６４４［Ｍ＋Ｈ］＋
ＮＭＲ（ｐｐｍ）ｉｎ　ＣＤ３ＯＤ，８．７６１（１Ｈ，ｓ，ｆ），８．１６９（１Ｈ，ｓ，ａ），８．０３４（１Ｈ，ｄ，ｅ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．９５９（１Ｈ，ｄ，ｂ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．８９９（１Ｈ，ｄ，ｏ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．６７１（１Ｈ，ｔ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．６１２（１Ｈ，ｔ，ｃ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．３３２（１Ｈ，ｄ，ｎ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），４．１２１（２Ｈ，ｓ，ｇ），３．６４４（６Ｈ，ｍ，ｈ＋ｉ＋ｍ），２．８６９（２Ｈ，ｍ，ｌ）
【００２７】
【実施例３】
亜鉛イオンの測定
亜鉛含有食品約２８０ｍｇをとり、１Ｍ酢酸５ｍｌを加え煮沸水浴中で３０分加熱した。これを、ＳＩＬＩＣＡＦＩＢＥＲで濾過し水を加えて全量５０ｍｌとした。この液２．５ｍｌをとり、あらかじめ１Ｍ酢酸ナトリウムで置換し十分に水で洗浄したＱＭＡ　Ｓｅｐ−Ｐａｋと、１Ｍ酢酸で洗浄した後、十分に水で酢酸を洗浄したＳｅｐ−Ｐａｋ−Ｐｌｕｓとを直結したカラムにアプライし、水で洗い込み全量２０ｍｌとした。さらに、この液２ｍｌを取り水を加えて全量１０ｍｌとし、試料溶液とした。
【００２８】
１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液は、ＨＥＰＥＳ１１．９ｍｇを秤量し、水を加えて全量５００ｍｌとし、１Ｍ水酸化ナトリウムを加え、ｐＨメーターでｐＨ７．５となるように調整した。調整した緩衝液２００μｌに試料溶液２００μｌを加え充分に混和した。これに、それぞれ１．０×１０−５Ｍ　ＺｎＣｌ２溶液２００μｌ、１．０×１０−５Ｍ　ＺｎＣｌ２溶液４００μｌ、２．５×１０５−ＭＺｎＣｌ２溶液２００μｌを加えたものを調整した。ここに５．０×１０−５Ｍ　ＤＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡ溶液２００μｌを加え充分に混和した。つづいて、それぞれに、４００，２００，４００μｌの水とアセトニトリル８００μｌを加え充分に混和し、３０分放置後、蛍光強度を測定した。比較対照液は、ＨＥＰＥＳ緩衝液２００μｌに５．０×１０−５Ｍ　ＤＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡ溶液２００μｌと水８００μｌとアセトニトリル８００μｌを加え充分に混和したものを用いた。
【００２９】
励起波長２４１ｎｍ，蛍光波長５５２ｎｍと励起波長４３８ｎｍ，蛍光波長５５６ｎｍと励起波長３３７ｎｍ，蛍光波長５５７ｎｍにおける蛍光強度変化をそれぞれ図１，２，３に示す。また、本法による測定結果とＩＣＰによるＺｎの測定結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
2004061476.tif 000007
【００３１】
【発明の効果】
以上のように本発明化合物は極めて容易に合成することができ、亜鉛イオンの蛍光キレート試薬として機能する。また、この蛍光キレート試薬はＦＲＥＴ現象を利用することで、蛍光強度の増加と大きなストークスシフトが得られ、精度よく亜鉛を定量できる。さらに、酸性から生理条件下における範囲で亜鉛イオンの測定が行える。そのため、一般的な亜鉛イオンの測定だけでなく生体系における亜鉛イオンの測定にも利用できる優れた蛍光キレート試薬である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡと様々な濃度の亜鉛イオンにおける励起波長２４１ｎｍ、蛍光波長５５２ｎｍでの蛍光強度を示した図である。
【図２】ＤＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡと様々な濃度の亜鉛イオンにおける励起波長３３７ｎｍ、蛍光波長５５７ｎｍでの蛍光強度を示した図である。
【図３】ＤＢＤ−ＥＤ−ＣＮＥＤＴＡと様々な濃度の亜鉛イオンにおける励起波長４３８ｎｍ、蛍光波長５５６ｎｍでの蛍光強度を示した図である。
【図１】
2004061476.tif 000012
【図２】
2004061476.tif 000013
【図３】
2004061476.tif 000014