(57)【要約】      （修正有）【課題】低温回避作物の開発、生体酸化ストレスの抑制機能の付加、環境浄化微生物等の呼吸増大等に有用な新規発熱植物Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来の新規ＡＯＸ遺伝子を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来発熱関連遺伝子産物Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸと、これをコードするＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ遺伝子Ｈｍ−ａｏｘ、及び上記Ｈｍ−ｐｒｅーＡＯＸの一部であり、別の特定アミノ酸配列を有するミトコンドリア移行シグナルペプチドＨｍ−ｍｉｔ−１と、これをコードするＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来遺伝子。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来発熱関連遺伝子産物Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸをコードするＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ遺伝子Ｈｍ−ａｏｘ。
【請求項２】
請求項１の遺伝子Ｈｍ−ａｏｘのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列、またはその一部連続配列を有する請求項２のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２または３のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
請求項２または３のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項６】
請求項２または３のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６の組換えベクターによる形質転換細胞。
【請求項８】
請求項１のＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ遺伝子Ｈｍ−ａｏｘの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来発熱関連遺伝子産物Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸ。
【請求項９】
請求項８のタンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸの一部であり、配列番号３のアミノ酸配列を有するミトコンドリア移行シグナルペプチドＨｍ−ｍｉｔ−１。
【請求項１０】
請求項８のタンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸの一部であり、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア内膜に移行して機能するタンパク質Ｈｍ−ｍ−ＡＯＸ。
【請求項１１】
請求項９のシグナルペプチドＨｍ−ｍｉｔ−１をコードするオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０のタンパク質Ｈｍ−ｍ−ＡＯＸをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、近年新しく同定された発熱植物であるＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ（Ｈｅｌｉｃｏｄｉｃｅｒｏｓ  ｍｕｓｃｉｖｏｒｕｓ）由来の発熱関連遺伝子とその翻訳産物に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、発熱による低温回避植物の開発等の植物育種分野、糖尿病や肥満の治療に関する医学分野、植物由来の新規発熱素材開発の工学分野、環境浄化微生物開発のための遺伝子工学分野において有用な新規発熱植物Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来の発熱関連遺伝子とその発現産物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
一般に植物は発熱能力がなく、その体温は気温の変化とともに変動するものと考えられているが、ある種の植物には自ら発熱し、その体温を外気温より高い温度に保つことができるものがある。従来、このような発熱植物としては、早春に花を咲かせるザゼンソウが知られていたが、近年、ザゼンソウとは異なる新しい発熱植物であるＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅが同定されており（非特許文献１、非特許文献２）、発熱植物が有する熱産生関連遺伝子を用いた発熱デバイスの開発等が期待され始めている。従来、発熱能力を持たない作物においては、低温障害あるいは凍結障害がその生産性を制限する最も重要な因子であるとされており（非特許文献３）、熱産生に関わる遺伝子を用いた、“発熱による低温回避作物の開発”は、農業分野における食糧問題に対する多大な貢献が予想される。
【０００３】
Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅの発熱現象の最大の特徴は、本植物の２つの異なった部位が発熱するという点である（図１、図２）。より具体的には、植物体地上部に存在する付属体と呼ばれる部位と、雄の肉穂花序部分が発熱する（図２）。このように、ひとつの植物個体において、２つの明確に異なる発熱部位が存在する例は、Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ以外に報告がない。群落地に自生するＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅの雄の部分の肉穂花序の体温変動を測定した結果を図３に示す。この図からも明らかなように、Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅは、外気温度が１２℃程度の条件で、その体温を２３℃程度に上昇させる能力を有していることが明らかである。
【０００４】
このような発熱現象については、発熱植物自体が例外的な存在であったため、その研究は多くはないが、細胞における呼吸反応が重要であるとされてきた。例えば、発熱植物の一つであるＰｈｉｌｏｄｅｎｄｒｏｎにおいては、発熱時においては、組織の酸素消費量が有意に増加することから、ミトコンドリアにおける呼吸活性の増大が発熱反応と密接に関連するものと推定されていた（非特許化文献４）。
【０００５】
このような発熱植物の呼吸活性の増大に関わる因子としては、わが国に自生する発熱植物であるザゼンソウから得られた脱共役タンパク質（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ＵＣＰ）の重要性が指摘されている（非特許文献５）。ＵＣＰはミトコンドリア内膜内外に生じたＨ＋をＡＴＰ合成と共役することなく、マトリックス内に流入させる機能を有する。ザゼンソウは少なくとも２種類のＵＣＰ関連タンパク質（ＳｆＵＣＰａおよびＳｆＵＣＰｂ）を持つことが明らかになっているおり（特許文献１）、そのうちの１種であるＳｆＵＣＰｂは、植物および哺乳動物において従来知られているいずれのＵＣＰとも異なるトポロジーを持つ因子であった（非特許文献５）。一方、Ｄｅａｄ  ＨｏｒｓｅからもザゼンソウのＳｆＵＣＰａに相当する因子（ＨｍＵＣＰａ）が同定されているが、その転写産物は、発熱組織において特異的な発現が認められないことから、熱産生に直接関与している可能性は低いと考えられている（非特許文献２）。
【０００６】
ミトコンドリアで機能する熱産生因子として、脱共役タンパク質以外に、シアン耐性呼吸酵素（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｏｘｉｄａｓｅ：  ＡＯＸ）の関与も示唆されている（非特許文献６）。またこの出願の発明者らも、ザゼンソウのシアン耐性呼吸酵素遺伝子（Ｓｆａｏｘ）を特許出願している（特願２００３−０３８８７４号）。ＡＯＸは、ミトコンドリアにおいてユビキノンから供与された電子用いて酸素を還元することにより呼吸活性を上昇させる機能を持つ因子である（非特許文献７）。発熱反応におけるミトコンドリアにおける呼吸量の増大は、ユビキノン電子のＡＯＸ分子による酸化能力に依存すると考えられている。ＡＯＸによる酸化反応は、シアンなどのチトクロームｃ酸化経路の阻害剤に耐性をもつことから、本因子は、シアン耐性呼吸酵素とも呼ばれている。これまでの研究により、非発熱植物であるタバコやシロイヌナズナにおいてもＡＯＸタンパク質が存在しており、タバコＡＯＸタンパク質を過剰発現させるタバコが作成されているが、この形質転換タバコにおける発熱現象は確認できなかった旨の報告がなされている（非特許文献８）。
【０００７】
一方、新規発熱植物であるＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅにおいては、従来、ＡＯＸ遺伝子自身が単離されておらず、その翻訳産物の構造も不明のまま残されていた。しかしながら、本植物が２箇所の明確な発熱部位を持つという特徴は、本植物由来のＡＯＸ遺伝子の発熱関連遺伝子としての意義を明確にできるという有利な効果をもたらすものと考えられた。
【０００８】
【特許文献１】
特開２０００−３５４４８９号公報
【非特許文献１】
Ｓｅｙｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｏｔ．  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献２】
Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｏｔ．  ５４，  １１１３−１１１４．
【非特許文献３】
Ｌｅｖｉｔｔ  （１９８０）  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓｔｒｅｓｓｅｓ．  ２ｎｄ  ｅｎｄ
【非特許文献４】
Ｓｅｙｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）  Ｐｌａｎｔａ  １６１，  ２２９−２３２．
【非特許文献５】
Ｉｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）    Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １４２，  ５７−６５．
【非特許文献６】
ＭｃＩｎｔｏｓｈ  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０５，  ７８１−７８６．
【非特許文献７】
Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ  ＆  ＭｃＩｎｔｏｓｈ  （１９９７）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８，  ７０３−７３４．
【非特許文献８】
Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０６，  １５０３−１５１０．
【非特許文献９】
Ｉｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）    Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  ２０３６−２０４１．
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
植物の発熱に関与する遺伝子は、例えば、遺伝子組み換え技術を用いた低温回避作物等の開発に極めて有用である。この点について、この出願の発明者は、植物の新規発熱遺伝子として、ザゼンソウ由来の脱共役タンパク質（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ＵＣＰ）の一種（ＳｆＵＣＰａおよびＳｆＵＣＰｂ）を特許出願している（特許文献１）。
【００１０】
しかしながら、新規発熱植物Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅにおいては、ＵＣＰとは異なるメカニズムで機能するＡＯＸも複数の異なる組織における発熱現象に重要に関与している。従って、対象植物の種や、個体における発熱部位（Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅのような複数の発熱部位の誘導など）、あるいは、発熱の用途に応じて最も有効な低温回避作物等を開発するためには、ＵＣＰとは異なるメカニズムで機能する特殊なＡＯＸ遺伝子が不可欠である。
【００１１】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、これまでに同定されていない複数の発熱部位を有する新規発熱植物Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来のＡＯＸ遺伝子を提供することを課題としている。また、この出願は、この新規遺伝子の発現産物であるＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ  ＡＯＸタンパク質およびミトコンドリア移行シグナルを提供することを課題ともしている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するためのものとして、以下の（１）〜（１２）の発明を提供する。
（１）    配列番号２のアミノ酸配列を有するＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来発熱関連遺伝子産物Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸをコードするＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ遺伝子Ｈｍ−ａｏｘ。
（２）    前記発明（１）の遺伝子Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。
（３）    配列番号１の塩基配列、またはその一部連続配列を有する前記発明（２）のポリヌクレオチド。
（４）    前記発明（２）または（３）のポリヌクレオチドにストリンジェント条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
（５）    前記発明（２）または（３）のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
（６）    前記発明（２）または（３）のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
（７）    前記発明（６）の組換えベクターによる形質転換体細胞。
（８）    前記発明（１）のＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ遺伝子Ｈｍ−ａｏｘの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来シアン耐性呼吸酵素Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸ。
（９）    前記発明（８）の酵素Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸの一部であり、配列番号３のアミノ酸配列を有するミトコンドリア移行シグナルペプチドＨ，−ｍｉｔ−１。
（１０）  前記発明（８）の酵素Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸの一部であり、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア内膜に移行してシアン耐性呼吸酵素として機能するタンパク質Ｈｍ−ｍ−ＡＯＸ。
（１１）  前記発明（９）のシグナルペプチドＨｍ−ｍｉｔ−１をコードするオリゴヌクレオチド。
（１２）  前記発明（１０）のタンパク質Ｈｍ−ｍ−ＡＯＸをコードするポリヌクレオチド。
【００１３】
すなわち、前記発明（１）の遺伝子Ｈｍ−ａｏｘは、Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅが有する２箇所の発熱部位で特異的に発現しているＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ遺伝子である。公知の方法（非特許文献９）により抽出したＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ全ＲＮＡについてノーザン解析（非特許文献９）を行った結果、図３に示したように、発熱中の植物体においては、発熱部位である、附属体と雄の肉穂花序においてのみその発現が観察された。
【００１４】
この発明（１）の遺伝子が発現するタンパク質のうち、ミトコンドリア移行シグナルを含むと考えられるＨｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸのアミノ酸配列を５種類の異なる植物から得られているＡＯＸタンパク質のアミノ酸配列と比較した（図４）。Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸのアミノ酸配列は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ａｏｘ１ａ）、イネ（Ｒｉｃｅ  Ａｏｘ１ａ）、Ｖｏｏｄｏｏ  ｌｉｌｙ（Ｓ．  ｇｕｔｔａｔｕｍ  ＡＯＸ）、ダイズ（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ａｏｘ１）、及び、タバコ（Ｔａｂａｃｃｏ  Ａｏｘ１）に対して、それぞれ、７１  ％、７７％、９２％、７３％および７２％同一である。
【００１５】
Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸのアミノ酸配列のミトコンドリア移行シグナルをドイツ・ミュンヘン  タンパク質配列解析センターの大型計算機で解析したところ、配列３、Ｈｍ−ｍｉｔ−１と命名した領域（配列番号３）が明確な移行シグナルおよびＨｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸタンパク質の切断部位として同定された。
【００１６】
Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸは、他のミトコンドリアＡＯＸタンパク質に共通に認められる構造を有している。それは、本タンパク質の特徴であるホモダイマーの形成に必要な第１６８番目のＣｙｓ、および、酸化反応に必要な鉄原子を配位するたものモチーフである、第１２３番目のＧｌｕから始まるＥＲＭＨ配列が保存されている点である（図５）。
【００１７】
なお、この発明において、「酵素」、「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジン糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１００個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個結合した分子を言う。
【００１９】
また、この発明において使用するその他の用語や概念については、発明の実施形態や実施例の記載において説明する。なお、この発明を実施するために使用する様々な遺伝子操作技術や分子生物学的技術等は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ，  １９９５  等）に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能なものである。
【００２０】
以下、各発明の形態をさらに詳しく説明する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
発明（１）のＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ遺伝子Ｈｍ−ａｏｘは、配列番号２のアミノ酸配列を有するシアン耐性呼吸酵素Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸをコードし、この遺伝子から転写されるｍＲＮＡからは配列番号１の塩基配列を有するｃＤＮＡが合成される。
【００２２】
発明（１）遺伝子Ｈｍ−ａｏｘは、例えば、配列番号１の塩基配列またはその一部配列からなる精製ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとしてＤｅａｄ  ＨｏｒｓｅのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。あるいは、染色体に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって目的の遺伝子領域を同定することもできる。
【００２３】
得られたゲノム遺伝子は、例えばＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００２４】
なお、この発明（１）の遺伝子Ｈｍ−ａｏｘには、それがコードするタンパク質の発現に対する制御領域（プロモーター／エンハンサー、サプレッサー等）も含まれる。これらの発現制御領域は、発現産物Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸやその遺伝子の更なる機能を解明するためにも有用である。また、発現制御領域に対する転写因子の検索は、例えば、植物などの真核生物に発熱機能を付加するための新たな手段を提供する可能性がある。
【００２５】
発明（２）は、前記のゲノム遺伝子Ｈｍ−ａｏｘをその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ等から精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片やＲＮＡ断片）である。このようなポリヌクレオチドの具体例として、発明（３）のｃＤＮＡが提供される。このｃＤＮＡはＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅの細胞（特にその発熱部位である附属体および雄肉穂花序由来の細胞）から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として合成することができる。ｃＤＮＡは、公知の方法（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２，  １６１−１７０，  １９８２；  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  ２５，  ２６３−２６９，  １９８３；  Ｇｅｎｅ，  １５０，  ２４３−２５０，  １９９４）を用いて合成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマーとして、細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。このようにして調製されるＨｍ−ａｏｘは、具体的には配列番号１の塩基配列またはその一部連続配列を有している。ここで、「一部連続配列」とは、例えば、タンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸをコードする領域（ＯＲＦ：  １３４−１１６８）等を意味する。なお、一般に真核生物の遺伝子は多型が頻繁に認められる。従って、配列番号１において、１または複数個のポリヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているポリヌクレオチドもこの発明の範囲に含まれる。同様に、これらの塩基の変更によって生じる１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされているタンパク質もこの発明に含まれる。
【００２６】
以上の発明（２）および（３）のポリヌクレオチドは、例えばこと発明のタンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸの遺伝子工学的な製造に使用することができる。さらに、これらのポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術を用いた低温回避作物の開発のための導入遺伝子としても有用である。
【００２７】
発明（４）のオリゴヌクレオチドプローブは、前記のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片であり、例えば、配列番号１の塩基配列もしくはその相補配列における連続１０〜９９ｂｐのＤＮＡ断片等である。ここで、ストリンジェント条件とは、前記のポリヌクレオチドとプローブとの特異的なハイブリッド形成を可能とする条件であり、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアミド等）の濃度、温度条件によって規定される。詳しくは、米国特許Ｎｏ．  ６，１００，０３７等に詳しく規定されている。
【００２８】
発明（５）のプライマーセットは、前記のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するための１対のオリゴヌクレオチドである。これらのプライマーセットは、配列番号１の塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ  （ｌｏｎｇ  ａｃｃｕｒａｔｅ）  ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販ソフトウエアー、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．  （米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウエアー開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００２９】
発明（６）の組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて最適のものを使用する。例えば、ｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域をインサートとしてこの発明のタンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸを生産する場合には、インビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法などの公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することにより調製することができる。
【００３０】
発明（８）のタンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸは、公知の方法、すなわち、Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅの附属体あるいは雄花序などから単離する方法、この出願によって提供されるアミノ酸配列に基づいて化学合成によりポリペプチドを調製する方法、あるいはこの出願によって提供される前記のポリヌクレオチドを用いて組換えＤＮＡ技術により生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってタンパク質を取得する場合には、この発明の前記組換えベクターからインビトロ転写を行うことにより、タンパク質を得ることができる。また、前記のポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組換え、この組換えベクターで大腸菌、枯草菌、酵母、動植物細胞等を形質転換すれば、これらの形質転換体でタンパク質を大量に発現させることができる。
【００３１】
この発明のタンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸを大腸菌などの微生物で発現させる場合には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターにポリヌクレオチド（Ｈｍ−ａｏｘ  ｃＤＮＡ）を組換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すればよい。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。
【００３２】
また、この発明のタンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸを大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボゾーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のポリヌクレオチドを、プロモーター組み換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換した後、得られた形質転換体を培養すればよい。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加すれば、任意の領域を含むタンパク質断片を得ることができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、この融合タンパク質を適当なプロテアーゼで切断することによって、目的とするタンパク質のみを取得することもできる。大腸菌発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００３３】
このタンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸを真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加領域等を有する真核生物発現用ベクターに組換え、真核細胞内に導入する。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞  ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞  ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵母細胞などが一般に用いられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
上記の方法により原核生物や真核生物でタンパク質を発現させたのち、培養物から目的のタンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行う。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等である。
【００３５】
なお、細胞で発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパク質もこの発明に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱落、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などである。
【００３６】
発明（９）は、前記のタンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸの一部であって、配列番号３のアミノ酸配列を有するミトコンドリア移行シグナルペプチドＨｍ−ｍｉｔ−１である。このペプチドは、例えば、公知の固相合成法によって作成する方法や、あるいは発明（１１）のオリゴヌクレオチド（具体的には、配列番号１の１−３１６ｎｔ）を前記の組換えＤＮＡ技術で発現させる方法等によって得ることができる。この発明（９）のシグナルペプチドは、例えば、任意のミトコンドリア膜内タンパク質を細胞内ターゲッティング等に使用することができる。あるいは、発明（１１）のオリゴヌクレオチドは、有用タンパク質のコード配列と連結するなどして、有用タンパク質を肉穂花序特異的に発現させるために使用することもできる。
【００３７】
発明（１０）のタンパク質Ｈｍ−ｍ−ＡＯＸは、前記タンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸの一部であって、配列番号４のアミノ酸配列を有し、ミトコンドリア内膜に移行してシアン耐性呼吸酵素として機能する成熟タンパク質である。このタンパク質Ｈｍ−ｍ−ＡＯＸは、例えば、公知の固相合成法によって作成する方法や、あるいは発明（１２）のポリヌクレオチド（具体的には、配列番号１の３１７−１１６８  ｎｔ）を前記の組換えＤＮＡ技術で発現させる方法等によって得ることができる。
【００３８】
この発明（１０）のタンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸやその成熟タンパク質Ｈｍ−ｍ−ＡＯＸ、あるいはこれらをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ユビキノンから供給される電子を水に酸化する機能として、呼吸鎖電子伝達系のバイパス経路を提供し、熱産生反応の誘導や、過剰電子による生体酸化ストレスの抑制効果が期待される。さらに、このような呼吸鎖の人為的制御は、環境浄化微生物等の呼吸増大に伴う代謝活性の賦活化にも有望である。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１：ｃＤＮＡのクローニング
Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅの発熱部位のひとつである付属体から全ＲＮＡを抽出し、１．０％アガロース電気泳動によりＲＮＡの精製度を確認した（非特許文献５）。得られた全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により部分的なＡＯＸクローンを単離した。第１鎖ｃＤＮＡは、全ＲＮＡ（１．０μｇ）に２０ｐｍｏｌのオリゴｄＴプライマー（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）をアニールし、次いで、１０ユニットの逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、３７℃で３０分間、１０ｍＭ  １，４−ジチオトレイトールおよび０．５ｍＭ  ｄＮＴＰを含有する２０μｌの１ｘ  ＲＴ緩衝液で伸長した。さらに、得られた第１鎖ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った。その際の反応溶液の組成は以下のとおりである。
【００４０】
・１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）；
・５０ｍＭ  ＫＣｌ；
・１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ；
・４  ｍＭ  ｄＮＴＰ  ；
・０．２ユニットのＥｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）；および
・ＡＯＸファミリー遺伝子の保存されたアミノ酸配列に対応する１０ｐｍｏｌの２つのプライマー：
Ｆ１（５’−ＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＣＧ−３’：配列番号５）
Ｒ１（５’−ＡＴＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣＧＡＧＧＧＧＣＧＣ−３’：配列番号６）
また、ＰＣＲサイクルは以下のとおりとした。
【００４１】
（９４℃：０．５分間、５５℃：１分間、７２℃：１分間）ｘ３５
以上の方法により得られたＰＣＲ産物のうち、約４５０ｂｐのｃＤＮＡフラグメントの配列から推定されるアミノ酸配列は、ＡＯＸ遺伝子群の一つのリーディングフレームと極めて高いホモロジーを示したので、このフラグメントをＴ−ベクターにクローニングし（クローンｐＤＨａｏｘ）、５’および３’ＲＡＣＥのためのプライマー設計に用いた。
【００４２】
肉穂花序から調製した全ＲＮＡを公知の方法で５’および３’−ＲＡＣＥを行った。詳細な反応組成は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに従った。その際、用いたプライマー配列は以下のとおりである。
【００４３】
５’−ＲＡＣＥ用プライマー：
ＮＮＧＳＰ１（５’−ＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣ−３’：配列番号７）；
ＮＵＰ    （５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３’：配列番号８）
３’−ＲＡＣＥ用プライマー：
ＮＮＧＳＰ２（５’−ＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＧＡＣＡ−３’：配列番号９）；
ＮＵＰ    （５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３’：配列番号１０）
それぞれの反応により、特異的なＤＮＡフラグメントが増幅された。５’−ＲＡＣＥ反応において増幅されたＤＮＡフラグメントはおよび０．５ｋｂであり、３’−ＲＡＣＥ反応で増幅されたＤＮＡフラグメントはおよそ１．１ｋｂであった。それぞれのＤＮＡフラグメントの塩基配列を解析したところ、いずれもＡＯＸ遺伝子と高い相同性を示すことが明らかになった。
【００４４】
５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥから得られた塩基配列情報に基づき、全長ｃＤＮＡを単離するためのプライマーを以下のように設計した。
【００４５】
Ｆｕｌｌ  ５’−２（５’−ＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＡ−３’：配列番号１１）
Ｆｕｌｌ  ３’−２（５’−ＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＧＣＴ−３’：配列番号１２）
その後、ＲＴ−ＰＣＲ法により合成した第１鎖ｃＤＮＡを用いて、以下のようなＰＣＲ反応を行った。
【００４６】
（９４℃：５秒、６８℃：１０秒間、７２℃：３分間）×３１
以上の方法により得られたおよそ１．４ｋｂの産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングし（ｐＤｈＡＯＸｆｕｌｌ１）、全塩基配列を解読した。また、得られた配列データはＧＥＮＥＴＹＸ−Ｈｏｍｏｌｏｇｙソフトウエアシステム・バージョン５．０（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を使用して解析した。
【００４７】
Ｈｍ−ａｏｘのｃＤＮＡは、塩基配列１に示した、１，３９５ｂｐの塩基配列を有しており、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、３４５個のアミノ酸を含んでおり、このＯＲＦには、配列番号２で示したアミノ酸配列を有する３８．６ｋＤａのタンパク質Ｈｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸがコードされていた。また、この配列には、ミトコンドリア移行シグナルが存在しており、ミトコンドリアで成熟したタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有する３２．０ｋＤａのタンパク質Ｈｍ−ｍ−ＡＯＸであると推定された。なお、ミトコンドリア移行シグナルと考えられる配列番号４に示されるアミノ酸配列（Ｈｍ−ｍｉｔ−１）は、６．６ｋＤａのペプチドをコードしていた。
実施例２：ｃＤＮＡのインビトロ転写
実施例１で得たプラスミド（ｐＤｈＡＯＸｆｕｌｌ）を直線化し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、センスまたはアンチセンスＲＮＡを転写した。等量のＲＮＡ（２μｇ）を３５Ｓ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下で小麦胚芽抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたインビトロ翻訳反応に供した。翻訳産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲルを固定し、Ａｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中でインキュベーションした後に、乾燥し、蛍光分析を行った。
【００４８】
その結果、図６に示したように、センスＲＮＡを鋳型とした際、ある特定の濃度の酢酸カリウム濃度の反応条件で特異的な翻訳産物が生成されることが判明した。したがって、実施例１で単離したｃＤＮＡの開始コドンおよび終止コドンが正しく機能していることが示された。
【００４９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって新規に発見されたＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来のシアン耐性呼吸酵素遺伝子Ｈｍ−ａｏｘ、およびその翻訳産物であるＨｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸ、Ｈｍ−ｍ−ＡＯＸ、ならびに、Ｈ−ｍｉｔ−１、さらにはこれらのタンパク質を遺伝子工学的に大量生産するための遺伝子ｃＤＮＡが提供される。これらの遺伝子およびタンパク質によって、恒温性を持つ低温耐性植物の開発、過剰電子による生体酸化ストレスの抑制機能の付加さらに、環境浄化微生物等の有用微生物の呼吸増大に伴う代謝活性の賦活化などの開発が可能である。
【００５０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ  （Ｈｅｌｉｃｏｄｉｃｅｒｏｓ  ｍｕｓｃｉｖｏｒｕｓ）の近影写真である。図内には２つの個体が写っている。本植物の自生は、主として、地中海性気候を有する地域に限定されている。このような地域としては、オーストラリア・アデレード市郊外などを挙げることができる。
【図２】発熱中のＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅの各器官における発熱の程度を赤外線熱画像測定装置で解析した結果である。本植物の発熱は、付属体および雄花序においてのみ特異的に観察される。
【図３】群落地におけるＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅの体温および気温の変動図。雄花序および外気温をそれぞれ１分ごとに記録し、グラフ化した。
【図４】Ｄｅａｄ  ＨｏｒｓｅＡＯＸ（ＤｅａｄＨｏｒｓｅＡＯＸ．ｐｔｎ）と、既存のシロイヌナズナＡＯＸ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ａｏｘ１ａ．ｐｔｎ）、イネＡＯＸ（Ｒｉｃｅ  Ａｏｘ１ａ．ｐｔｎ）、Ｖｏｏｄｏｏ  ｌｉｌｙ  ＡＯＸ（Ｓ．  ｇｕｔｔａｔｕｍ  ＡＯＸ．ｐｔｎ）、ダイズＡＯＸ（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ａｏｘ１．ｐｔｎ）、および、タバコＡＯＸ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｏｘ１．ｐｔｎ）のアミノ酸配列と比較した図である。配列下段の星記号（＊）は同一アミノ残基を示し、点記号（．）は全ての配列内での保存的なアミノ酸の変化を示す。配列アライメントを最適化するために導入したギャップをダッシュ記号（−）で示す。枠で囲まれたＣは酸化反応による２量体形成に必要なしステイン残基を示す。また、枠で囲まれたＥＲＭＨ配列は、酸化反応に必要な鉄原子が配位する領域を示す。
【図５】遺伝子Ｈｍ−ａｏｘのｃＤＮＡを鋳型とするインビトロ翻訳の結果である。一定量のセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを以下の異なる酢酸カリウム濃度の条件で翻訳した。酢酸カリウム濃度は、１：０  ｍＭ，  ２：  ６０  ｍＭ，  ３：  １２０  ｍＭである。矢印は、予想されるＨｍ−ｐｒｅ−ＡＯＸの分子量に一致する翻訳産物のバンドを示す。
【図６】発熱中のＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅの各器官におけるＨｍ−ａｏｘ  ｍＲＮＡの発現を示したノーザンブロッティングの結果である。Ｈｍ−ａｏｘの発現は、本植物の発熱部位である雄花序および付属体で特異的であることが明らかである。コントロール遺伝子として、本植物から得られた脱共役タンパク質遺伝子（ＨｍＵＣＰａ）の発現を示した。それぞれの下側の図は、用いた全ＲＮＡが分解されていないことをｒＲＮＡのエチジウムブロマイド染色により示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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