(57)【要約】【課題】抗酸化物質が生体細胞内において発揮する抗酸化能を、より正確に評価することが可能な抗酸化物質の抗酸化能評価方法を提供すること。【解決手段】被検物質の抗酸化性の有無を評価する抗酸化能評価方法であって、前記被検物質の存在下において培地で培養した癌細胞の、細胞死に伴って発生する活性酸素に起因する発光の強度と、前記被検物質の非存在下において前記培地で培養した前記癌細胞の、細胞死に伴って発生する活性酸素に起因する発光の強度と、を比較することを特徴とする方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の抗酸化性の有無を評価する抗酸化能評価方法であって、
前記被検物質の存在下において培地で培養した癌細胞の、細胞死に伴って発生する活性酸素に起因する発光の強度と、
前記被検物質の非存在下において前記培地で培養した前記癌細胞の、細胞死に伴って発生する活性酸素に起因する発光の強度と、を比較することを特徴とする方法。
【請求項２】
被検物質の抗酸化性の有無を評価する抗酸化能評価方法であって、
前記被検物質及び化学発光物質の存在下において培地で培養した癌細胞の、細胞死に伴って発生する活性酸素と該化学発光物質との反応により生じる発光の強度と、
前記被検物質の非存在下で且つ前記化学発光物質の存在下において前記培地で培養した前記癌細胞の、細胞死に伴って発生する活性酸素と該化学発光物質との反応により生じる発光の強度と、を比較することを特徴とする抗酸化物質の抗酸化能評価方法。
【請求項３】
前記化学発光物質が、ルシジェニンであることを特徴とする請求項２記載の抗酸化物質の抗酸化能評価方法。
【請求項４】
前記癌細胞がＢ１６メラノーマ細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗酸化物質の抗酸化能評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物細胞が発する光を用いたラジカル捕捉能評価方法、すなわち、抗酸化能評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中に存在する好中球の食菌等により産生されるスーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）等の活性酸素は、過剰に存在すると生体内において発癌、老化等を引き起こす一因となることが知られている。抗酸化物質は、かかる活性酸素の捕捉、消去が可能な物質であり、活性酸素が生体に及ぼす悪影響を低減することができる。従って、物質が有する抗酸化能を評価することは極めて重要である。
【０００３】
抗酸化能を評価する方法としては、試験管内でヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系等の酵素反応により活性酸素種を発生させ、抗酸化物質により活性酸素種を捕捉し、チトクロムＣ法、ニトロブルーテトロゾリウム（ＮＢＴ）法、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法等により評価する方法や、ＮＯを産生する細胞又は酵素と、Ｏ２−を産生する細胞又は酵素とを含む試料に刺激剤を添加して、ＮＯとＯ２−との反応により生じた活性酸素種であるＯＮＯＯ−による発光を検出する方法（例えば、特許文献１参照。）が知られている。
【０００４】
【特許文献１】
特開平１１−２６６８９５号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の方法は、生体細胞の活動によって発生する活性酸素種を直接用いるのではなく、生体細胞外の特殊な条件で発生させた活性酸素種を用いて抗酸化能を評価しているため、得られた評価結果が生体細胞内において抗酸化物質が発揮する抗酸化能とは直接結びつかない場合があった。また、上記チトクロムＣ法やＮＢＴ法でプローブとして用いられるチトクロムＣやＮＢＴは、抗酸化物質として用いられる天然植物中に含まれている還元剤によっても還元され得るため、抗酸化物質の抗酸化能を正確に評価することが困難であるという問題を有していた。
【０００６】
本発明は上記に鑑みてなされたものであり、物質が生体細胞内において発揮する抗酸化能を、より正確に評価することが可能な抗酸化能評価方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために本発明は、被検物質の抗酸化性の有無を評価する抗酸化能評価方法であって、前記被検物質の存在下において培地で培養した癌細胞の、細胞死に伴って発生する活性酸素に起因する発光の強度と、前記被検物質の非存在下において前記培地で培養した前記癌細胞の、細胞死に伴って発生する活性酸素に起因する発光の強度と、を比較することを特徴とする方法（以下、「第１の方法」という。）を提供する。
【０００８】
上記方法は、活性酸素の発生源として生体細胞を起源とする癌細胞を用い、かかる癌細胞の活動によって生じた活性酸素を被検物質が捕捉し得るかどうかを発光強度の測定により評価する。すなわち被検物質を加えた状態で発生する活性酸素に起因する発光の強度と、被検物質を未添加の状態で発生する活性酸素に起因する発光の強度とを比較するものであるため、生体内においてかかる被検物質が発揮し得る抗酸化能をより反映した評価結果を得ることが可能となる。また、得られた発光の強度は、癌細胞の細胞死に伴って発生する活性酸素のみに基づくものであるため、他の条件に影響されないより正確な評価結果を得ることが可能となる。
【０００９】
本発明はまた、被検物質及び化学発光物質の存在下において培地で培養した癌細胞の、細胞死に伴って発生する活性酸素と該化学発光物質との反応により生じる発光の強度と、前記被検物質の非存在下で且つ前記化学発光物質の存在下において前記培地で培養した前記癌細胞の、細胞死に伴って発生する活性酸素と該化学発光物質との反応により生じる発光の強度と、を比較することを特徴とする抗酸化能評価方法（以下、「第２の方法」という。）を提供する。
【００１０】
化学発光物質は、活性酸素と反応して発光を生じ得る物質である。本方法は、上述の方法と原理的に略同等の測定法であるが、活性酸素に起因する発光を直接測定するのではなく、生じた活性酸素と反応した化学発光物質の発光を測定することを特徴としている。従って、活性酸素のみに起因する発光よりも強度の大きな発光を生じさせることができ、生体内において被検物質が発揮し得る抗酸化能を更に反映した評価結果を得ることが可能となる。また、かかる評価は、癌細胞の細胞死に伴って発生する活性酸素のみに基づいて行うことができるため、他の条件に影響されない正確な評価結果を得ることが可能となる。
【００１１】
化学発光物質はルシジェニンであることが好ましい。化学発光物質としてルシジェニンを用いることにより、より大きな発光強度を得ることができ、抗酸化能の評価を更に正確に行うことができる。
【００１２】
癌細胞はＢ１６メラノーマ細胞であることが好ましい。癌細胞としてＢ１６メラノーマ細胞を用いることにより、抗酸化物質の抗酸化能をより正確に評価することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
まず、本発明において用いることができる癌細胞及びかかる癌細胞の培養方法について説明する。
【００１４】
本発明の抗酸化能評価方法は、細胞死に伴って発生する活性酸素を利用するため、癌細胞は、コンフルエント（細胞が単層状に増殖してシャーレの底を埋め尽くした状態）になった後、細胞死に至るまでの期間が長期にわたるものでないことが実験上の観点から好ましい。本発明において用いる癌細胞は、Ｂ１６メラノーマ細胞（Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ）であることが好ましく、かかるＢ１６メラノーマ細胞は、ＪＣＲＢ０２０２としてＨＳＲＲＢより分譲可能である。Ｂ１６メラノーマ細胞のＢ１６−１Ｇ５（以下、「Ｂ１６細胞」という。）は特にメラニン産性能が高く、抗酸化能の評価に用いるための癌細胞としてより好ましい。
【００１５】
かかる癌細胞の培養方法は、癌細胞を培養可能な公知の培養方法を適宜選択して用いることができる。例えば、癌細胞としてＢ１６細胞を用いる場合、培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）が好適であり、かかる培地にウシ胎仔血清（ＦＣＳ）等の血清を１０％含有させて用いることができる。
このような培地中で上記の癌細胞を０．５〜１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度の密度に調整し、調整された癌細胞をプラスチックシャーレ等に播種した後、予備培養を行うことにより癌細胞の培養を行うことができる。予備培養を行う期間は、癌細胞がコンフルエントにならない程度の期間である必要があり、１〜５日間であることが好ましく、２〜３日間であることがより好ましい。なお、予備培養中又は予備培養後、癌細胞がコンフルエントになるまで培養条件を維持するための培地交換を定期的に行ってもよい。
【００１６】
次に、癌細胞の細胞死に伴って発生する活性酸素に起因する発光、発光の測定方法及びかかる方法により得られる発光強度について説明する。
【００１７】
Ｂ１６細胞等の癌細胞は、培養を続けてコンフルエントになった後、自発的な細胞死を起こすことが知られている。そして、かかる細胞死の時に、癌細胞はスーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）のような活性酸素を発生し、発生した活性酸素は、自発的に、又は、後述の化学発光物質と反応することにより発光を生じる。
【００１８】
発光の測定は、第１の方法においては、培養された癌細胞に何も添加せずに行い、これと並行して、培養された癌細胞に被検物質を添加して発光の測定を行う。第２の方法においては、発光の測定は、培養された癌細胞に化学発光物質のみを添加して行い、これと並行して、培養された癌細胞に被検物質及び化学発光物質を添加して行う。
【００１９】
上記いずれの場合も、癌細胞が培養されている培養容器を発光測定用装置に導入して、発光の強度（発光強度）を測定することができる。
【００２０】
発光測定用装置としては、公知の微弱発光測定装置を用いることができ、例えばフォトンカウンタ（ＭＳＰＣ、浜松ホトニクス社製）を用いることができる。
発光測定用装置は、発光測定用サンプルを導入する試料室内が、外部からの光の入射を遮断できる暗室となっている必要があり、また、癌細胞の培養に適した環境を保持可能になっていることが好ましい。なお、癌細胞の培養に適した環境とは、例えばＢ１６細胞を培養する場合には、３７℃程度の温度、５％程度の炭酸ガス濃度を保持可能な環境であり、それに加えて高湿度（相対湿度ほぼ１００％）に保てる環境であることがより好ましい。
【００２１】
発光測定の開始後、複数の発光ピークがみられる場合は、癌細胞の細胞死に伴って生じている発光ピークの強度のみを用いて抗酸化能の評価を行う。癌細胞が死に至る際は、通常癌細胞が培養容器から急速に剥離するため、細胞死が起きているかどうかは、癌細胞の培養容器からの剥離の有無で判断することができる。
【００２２】
発光強度としては、細胞死に伴って生じる発光ピークのピーク面積を用いることが好ましいが、同種の癌細胞を用いて発光強度の測定を行う場合には、通常ピーク面積はピーク高さとほぼ比例するため、ピーク高さを発光強度とすることもできる。
【００２３】
発光測定用のサンプルを発光測定用装置に導入して発光測定を開始する時期は、かかるサンプル中の少なくとも全ての癌細胞が細胞死する前であればよいが、癌細胞が細胞死を開始する前であることが好ましい。癌細胞が細胞死を開始する前に発光測定用のサンプルを発光測定用装置に導入して発光測定を開始することにより、細胞死に伴って発生する発光を確実に検出することができ、抗酸化能の評価をより正確に行うことができるようになる。そして、細胞死が開始する前に発光測定を開始するためには、コンフルエントになる前に発光測定を開始することが好ましい。予備培養後すぐに又はコンフルエントになる直前の培地交換後すぐに、発光測定用のサンプルを発光測定用装置に導入することにより細胞がコンフルエントになる前に発光測定を開始することができる。
【００２４】
発光測定に用いるサンプルは、発光測定のために上部が開放されている限り、プラスチックシャーレ等の培養容器に入れたままの状態で測定を行うことができ、また培地の除去等を行う必要もなく、培養を行った状態のままで発光測定に用いることができる。
【００２５】
次に、抗酸化能評価方法について説明する。
本発明の抗酸化能評価方法は、第１の方法においては、被検物質の存在下において上述のようにして得られた発光強度（以下、「第１の発光強度」という。）と、被検物質の非存在下において同じく上述のようにして得られた発光強度（以下、「第２の発光強度」という。）と、を比較することにより被検物質の抗酸化能の評価を行う。一方、第２の方法においては、被検物質及び化学発光物質の存在下において上述のようにして得られた発光強度（以下、「第３の発光強度」という。）と、被検物質の非存在下で且つ化学発光物質の存在下において上述のようにして得られた発光強度（以下、「第４の発光強度」という。）と、を比較することによって被検物質の抗酸化能の評価を行う。
【００２６】
癌細胞の細胞死に伴って生じる活性酸素に起因する発光強度は、被検物質の存在により変化する。被検物質がＯ２−のような活性酸素を捕捉、消去することが可能な物質つまり抗酸化物質である場合、癌細胞の細胞死に伴って発生する活性酸素はかかる被検物質によって捕捉、消去される。従って、被検物質の存在下において発生する活性酸素の量は非存在下の場合と比べて少なくなり、活性酸素に起因して生じる発光強度も小さくなるため、第１の発光強度は第２の発光強度に比べて小さくなり、また第３の発光強度は第４の発光強度に比べて小さくなる。
【００２７】
反対に、被検物質が抗酸化能を示さず、活性酸素の発生を促進するような物質つまりプロオキシダントである場合、プロオキシダントとして働く被検物質により、被検物質非存在下の場合と比べてより多くの活性酸素が発生する。すなわち、被検物質存在下において発生する活性酸素の量は非存在下の場合と比べて多くなり、活性酸素に起因して生じる発光強度も大きくなるため、第１の発光強度は第２の発光強度と比べて大きくなり、また第３の発光強度は第４の発光強度に比べて大きくなる。
【００２８】
従って、本発明の方法によれば、被検物質が抗酸化能を有するか否かは、第１及び第２の発光強度の大小の比較、又は第３及び第４の発光強度の大小の比較を行うことにより評価が可能である。
【００２９】
また、被検物質の濃度を変化させ、第１の発光強度と第２の発光強度の大小が逆転する濃度、第３の発光強度と第４の発光強度の大小が逆転する濃度を求め、かかる濃度により被検物質が抗酸化能を発揮し得る濃度を決定することができる。
【００３０】
また、本発明によれば、抗酸化物質のスクリーニングを行うことも可能である。すなわち、まず抗酸化物質の非存在下における発光を測定し、得られた発光強度をレファレンス強度とする。次に、複数の被検物質を用い、それぞれの被検物質の存在下における発光強度を測定する。そして、レファレンス強度未満であって、最も発光強度の小さい被検物質を、最も優れた抗酸化物質としてスクリーニングすることができる。
【００３１】
被検物質の存在下における発光強度を得る場合において、被検物質は少なくとも活性酸素と接触できるように存在していればよい。そのためには被検物質が培地と接触して存在していることが好ましく、培地中に溶解していることがより好ましい。
【００３２】
被検物質は、培養の開始時点から存在している必要はなく、癌細胞の少なくとも全てが細胞死する前から存在していればよいが、癌細胞の細胞死が開始する前には存在していることが好ましい。被検物質が細胞死の前に存在していることにより、細胞死の開始時点から発生する活性酸素を捕捉、消去することができ、被検物質の抗酸化能をより正確に評価することが可能となる。被検物質を、癌細胞がコンフルエントになる直前の培地交換と同時か又はコンフルエントになった時点で添加することにより、癌細胞の細胞死が始まる前から被検物質を存在させることが可能となる。なお、本発明において培養とは、癌細胞を培地に加えた時点から、全ての癌細胞が細胞死する時点までをいうものとする。
【００３３】
化学発光物質存在下における発光強度を得る場合において、化学発光物質も被検物質と同様に、少なくとも活性酸素と接触できるように存在していればよく、培地と接触して存在していることが好ましく、培地中に溶解して存在していることがより好ましい。
【００３４】
また、化学発光物質も被検物質と同様に、培養の開始時点から存在している必要はなく、癌細胞の少なくとも全てが細胞死する前から存在していればよいが、細胞死の始まる前から存在していることが好ましい。化学発光物質を、癌細胞がコンフルエントになる直前の培地交換と同時か又はコンフルエントになった時点で添加することにより、癌細胞の細胞死が始まる前から化学発光物質を存在させることが可能となる。なお、抗酸化物質と化学発光物質の両者を存在させる場合は、両者を同時に添加することが好ましい。
【００３５】
本発明においては、天然抗酸化物質や合成抗酸化物質等の通常抗酸化能を有するとされる物質が特に好適に用いられる。かかる物質としては、例えば、没食子酸、β−カロテン、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、ビタミンＥ又はアスコルビン酸等が挙げられる。
【００３６】
化学発光物質は、Ｏ２−等の活性酸素と反応することにより化学発光を示す物質である。かかる化学発光物質は、癌細胞の細胞死に伴って発生すると考えられるＯ２−と特異的に反応して発光する化学発光物質であることが好ましく、ルシジェニンであることがより好ましい。活性酸素と化学発光物質との反応による発光は、活性酸素の自発的な発光に比べて発光強度が大きいため、抗酸化物質の抗酸化能の評価をより正確に行うことが可能となる。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明の好適な実施例について更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
［発光ピークの検出１］
まず、癌細胞の細胞死に伴って発生する発光ピークの検出を行った。
Ｂ１６メラノーマ細胞（Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ：ＪＣＲＢ０２０２、ＨＳＲＲＢから分譲）をクローニングした。すなわち１つ１つの細胞に分けて単細胞培養を行い、形質のよい細胞を選抜して、特にメラニン産性能の高いＢ１６−１Ｇ５（以下、「Ｂ１６細胞」という。）を得た。
【００３９】
次に、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を１０％含むＤＭＥＭ培地中で、Ｂ１６細胞を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度に調整した後、６０ｍｍφプラスチックシャーレに播種して２日間予備培養を行った。予備培養の後、プラスチックシャーレ中の培地を交換すると共に化学発光物質であるルシジェニン（終濃度０．２ｍＭ）を添加して発光測定用のサンプルとし、発光測定を行った。発光測定は、発光測定用装置としてフォトンカウンタ（ＭＳＰＣ、浜松ホトニクス社製）を用い、培地の交換と同時に発光測定用サンプルを温度３７℃、炭酸ガス濃度５％に調整されたフォトンカウンタ内に導入して、サンプルが生じる発光を経時的に検出して行った。なお、以下の試験において、発光測定は全て同様にして行った。
【００４０】
図１は、被検物質は添加せずに、化学発光物質としてルシジェニンのみを添加した場合の、発光測定開始後の経過時間と発光強度との関係（「経過時間と発光強度との関係」を、以下「発光曲線」という。）を示す図である。
【００４１】
［発光ピークの検出２］
また、Ｂ１６細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度に調整し、予備培養を３日間行い、化学発光物質を添加しなかった以外は上記と同様にして得られたサンプルについても発光測定を行った。図２は、かかる場合の発光測定開始後の経過時間と１０秒間に検出された光子数との関係を示す図（発光曲線）である。
【００４２】
図１に示されるように、Ｂ１６細胞がコンフルエントになった後、発光が一時減少し、その後、鋭く強度の大きい発光ピークが生じた。かかる発光ピークが生じた時期は、Ｂ１６細胞がシャーレの底から急激に剥がれ、癌細胞が死に至る時期と一致したことから、発光ピークはＢ１６細胞の細胞死に起因したものであることが分かった。また、図１と図２との比較から、化学発光物質としてルシジェニンを添加した場合に、発光はルシジェニンにより強く増感されることが分かった。ルシジェニンは、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）による発光を特異的に増感することが知られており、発光はＢ１６細胞の細胞死に伴って生じるＯ２−に起因しているものであることが分かった。
【００４３】
［発光に及ぼす没食子酸の影響］
被検物質として抗酸化物質である没食子酸を用い、以下の試験を行った。
Ｂ１６細胞を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度に調整し、予備培養を２日間行い、更に培地交換時に表１に示す組み合わせの没食子酸及び化学発光物質を添加した以外は、上記「発光ピークの検出１」と同様にして発光測定用サンプルを得、それぞれの発光測定を行った。図３は、被検物質として没食子酸を用いた場合の発光曲線を示す図である。なお、図３における１の曲線は、Ｂ１６細胞を含まない培地に、被検物質として没食子酸（０．２ｍＭ）、化学発光物質としてルシジェニン（終濃度０．２ｍＭ）を添加したサンプルの発光曲線を示し、図３における２〜４の曲線は以下の表１の条件で得られた発光曲線をそれぞれ示している。
【００４４】
【表１】
2004233164.tif 000002
【００４５】
図３に示されるように、没食子酸を添加したものは（曲線３、４）、添加しなかったもの（曲線２）に比べて発光強度が小さく、また、没食子酸の濃度が大きいほど発光強度が小さくなった。これにより、没食子酸は、抗酸化能を有しており、また、濃度の大きいものほど高い抗酸化能を発揮することが分かった。なお、培地にＢ１６細胞を含まないサンプル（曲線１）は細胞死に伴う発光ピークを示さなかった。
【００４６】
［発光に及ぼす抗酸化物質の影響］
被検物質として抗酸化物質であるβ−カロテン、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、ビタミンＥ及び没食子酸を用い、以下の試験を行った。
Ｂ１６細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度に調整し、予備培養を３日間行い、更に培地交換時に表２に示す組み合わせの抗酸化物質及び化学発光物質を添加した以外は、上記「発光ピークの検出１」と同様にして発光測定用サンプルを得、それぞれの発光の測定を行った。図４は、各被検物質を用いた場合の発光曲線を示す図である。なお、図４における１〜８の曲線は、以下の表２の条件で得られた発光曲線をそれぞれ示している。
【００４７】
【表２】
2004233164.tif 000003
【００４８】
図４に示されるように、いずれの被検物質においても、被検物質を添加したもの（曲線２〜８）は、添加しなかったもの（曲線１）に比べて発光強度が小さく、また、被検物質の濃度が大きくなるほど発光強度が小さくなることが分かった。これにより、用いた被検物質は全て抗酸化能を有しており、また、それぞれ濃度の大きいものほど高い抗酸化能を発揮することが分かった。
【００４９】
［発光に及ぼすアスコルビン酸の影響］
被検物質として抗酸化物質であるアスコルビン酸を用い、以下の試験を行った。
Ｂ１６細胞を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度に調整し、予備培養を２日間行い、更に培地交換時に表３に示す組み合わせのアスコルビン酸及び化学発光物質を添加した以外は上記「発光ピークの検出１」と同様にして発光測定用サンプルを得、それぞれの発光の測定を行った。図５は、被検物質としてアスコルビン酸を用いた場合の発光曲線を示す図である。なお、図５における１の曲線は、Ｂ１６細胞を含まない培地に、被検物質として０．２ｍＭアスコルビン酸、化学発光物質として０．２ｍＭルシジェニンを添加した場合の発光曲線を示し、２〜５の曲線は以下の表３の条件で得られた発光曲線をそれぞれ示している。
【００５０】
【表３】
2004233164.tif 000004
【００５１】
図５に示されるように、０．１ｍＭ及び０．２ｍＭのアスコルビン酸を添加したもの（曲線３又は４）は、添加しなかったもの（曲線２）に比べて発光強度が大きくなり、０．４ｍＭのアスコルビン酸を添加したもの（曲線５）は、添加しなかったもの（曲線２）に比べて発光強度が大きくなることが分かった。従って、アスコルビン酸は０．２ｍＭ以下の濃度では抗酸化能を示さず、活性酸素の発生を促進するプロオキシダントとして働き、０．４ｍＭ以上の濃度では抗酸化能を示し、抗酸化物質として働くと考えられる。なお、培地にＢ１６細胞を含まないもの（曲線１）は細胞死に伴う発光ピークを示さなかった。
【００５２】
［発光に及ぼすＢ１６細胞の播種密度の影響］
Ｂ１６細胞の播種密度を０．５×１０５、１．０×１０５又は１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬと変化させて以下の試験を行った。
Ｂ１６細胞をそれぞれの播種密度に調整し、２日間予備培養を行い、更に培地交換時に表４、表５及び表６に示す組み合わせの抗酸化物質及び化学発光物質を添加した以外は、上記「発光ピークの検出１」と同様にして発光測定用サンプルを得、それぞれの発光を測定した。図６、図７及び図８はそれぞれ癌細胞の播種密度が０．５×１０５、１．０×１０５及び１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬである場合の、各条件における発光曲線を示す図である。なお、図６、図７及び図８において、それぞれ１及び２で示される曲線は、Ｂ１６細胞を含まない培地で得られた発光曲線を示し、図６における３〜５の曲線、図７における３〜７の曲線及び図８における３〜８の曲線は、それぞれ表４、表５及び表６の条件で得られた発光曲線をそれぞれ示している。
【００５３】
【表４】
2004233164.tif 000005
【００５４】
【表５】
2004233164.tif 000006
【００５５】
【表６】
2004233164.tif 000007
【００５６】
図６、図７及び図８に示されるように、播種密度を大きくするに従って、発光ピーク出現までの時間が短くなることが分かった。従って、播種密度と発光ピーク出現までの時間とは対応しており、Ｂ１６細胞の細胞死の時期は培地中の栄養状態には依存していないことが判明した。なお、Ｂ１６細胞を含まないものは細胞死に伴う発光ピークを示さなかった。
【００５７】
［培地中のラジカルスペクトル］
発光ピークが見られる時点における培地の電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分析を行った。
上記「発光ピークの検出１」と同様にして得られたＢ１６細胞を、ＦＣＳを１０％含むＤＭＥＭ培地中で、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度に調整した後、６０ｍｍφプラスチックシャーレに播種して２日間予備培養を行った。次に、被検物質として抗酸化物質であるアスコルビン酸（０．１ｍＭ）、アスコルビン酸（０．２ｍＭ）、アスコルビン酸（０．４ｍＭ）又は没食子酸（０．２ｍＭ）を、培地の交換と共に添加した。そして、それぞれのシャーレ中の培地の一部を静かに採取し、それぞれをスピントラップ剤（ＤＭＰＯ：終濃度１０％）と混合してラジカルスペクトル測定用供試液を得た。なお、培地の採取は、上記と同様にして別途準備したサンプルを用いて発光ピークの検出を行い、各サンプルが発光ピークを示したのと同じ時点で行った。その後、得られた供試液を速やかに電子スピン共鳴装置（ＥＳＲ：ＪＡ−ＦＡ１００、ＪＥＯＬ社製）にかけ、それぞれのラジカルの同定及び強度の測定を行った。図９は、発光ピークが見られる時点における培地中のラジカルスペクトルを示す図であり、各条件において得られたＥＳＲスペクトルを合わせて示したものである。
【００５８】
その結果、発光ピークの見られる時点において、培地中ではヒドロキシラジカルのみが検出された。このことから、培地中にはＯ２−は存在しておらず、生じた発光はＢ１６細胞の細胞死に伴って発生した細胞内のＯ２−の発生量を反映しているものであることが確認された。
【００５９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の抗酸化物質の抗酸化能評価方法によれば、癌細胞の細胞死に伴って生じる細胞内の活性酸素のみを反映した発光強度を得る事ができ、そして、抗酸化物質存在下における癌細胞の細胞死に起因する発光強度と、抗酸化物質非存在下における発光強度とを比較することにより、かかる抗酸化物質の抗酸化能の評価を正確に行うことが可能となる。そして、活性酸素の発生源が生体細胞を起源とする癌細胞であり、かかる癌細胞から発生した活性酸素を用いて抗酸化能の評価を行うことができることから、生体内において抗酸化物質が発揮し得る抗酸化能をより反映した評価結果を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】化学発光物質としてルシジェニンのみを添加した場合の発光曲線である。
【図２】化学発光物質を添加しなかった場合の発光曲線である。
【図３】被検物質として没食子酸を用いた場合の発光曲線である。
【図４】被検物質として、β−カロテン、ＥＧＣＧ、ビタミンＥ及び没食子酸を用いた場合の発光曲線である。
【図５】被検物質としてアスコルビン酸を用いた場合の発光曲線である。
【図６】Ｂ１６細胞の播種密度が０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬである場合の発光曲線である。
【図７】Ｂ１６細胞の播種密度が１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬである場合の発光曲線である。
【図８】Ｂ１６細胞の播種密度が１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬである場合の発光曲線である。
【図９】発光ピークが見られる時点における培地中のラジカルスペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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