(57)【要約】【課題】安価で簡便な核酸とペプチドの共有結合による複合体形成法を開発すること。【解決手段】下記の一般式（Ｉ）で表される化合物。【化１】2004331574.tif 000027（式中、Ａは水酸基または水素原子であり、Ｂは核酸塩基であり、Ｅはモノ−、ジ−、トリホスフェート基、ホスホロチオエート基またはボラノホスフェート基であり、Ｘはカルボニル基またはエチレン基であり、Ｙはマレイミド基、臭素が付加したマレイミド基または保護されていてもよいチオール基であり、ｍは１〜３０のいずれかの整数である。）上記化合物の合成中間体。上記化合物を核酸に導入し、さらにペプチドなどの他の化合物と反応させることにより得られる複合体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）で表される化合物。
【化１】
2004331574.tif 000019
（式中、Ａは水酸基または水素原子であり、Ｂは
【化２】
2004331574.tif 000020
（式中、＊は糖に結合する位置を示す）のいずれかで表される基であり、Ｅは下記の（ａ）〜（ｄ）  のいずれかで表される基であり、
【化３】
2004331574.tif 000021
（式中、ｎは１〜３のいずれかの整数である）
Ｘはカルボニル基またはメチレン基であり、Ｙは
【化４】
2004331574.tif 000022
のいずれかで表される基又は保護されていてもよいチオール基であり、ｍは１〜３０のいずれかの整数である。）
【請求項２】
Ｙが
【化５】
2004331574.tif 000023
のいずれかで表される基である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｙがチオール基である請求項１記載の化合物。
【請求項４】
下記の一般式（ＩＩ）で表される化合物。
【化６】
2004331574.tif 000024
（式中、Ａは水酸基または水素原子であり、Ｂは
【化７】
2004331574.tif 000025
（式中、＊は糖に結合する位置を示す）のいずれかで表される基であり、Ｘはカルボニル基またはメチレン基であり、Ｙは
【化８】
2004331574.tif 000026
のいずれかで表される基又は保護されていてもよいチオール基であり、Ｚは保護されていてもよい水酸基又はハロゲン化されたリン酸基であり、ｍは１〜３０のいずれかの整数である。）
【請求項５】
請求項１記載の化合物を付加した核酸。
【請求項６】
請求項２記載の化合物を付加した核酸。
【請求項７】
請求項３記載の化合物を付加した核酸。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を核酸に付加するためのキット。
【請求項９】
チオール基を有する化合物と請求項２記載の化合物又は請求項６記載の核酸との複合体。
【請求項１０】
マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物と請求項３記載の化合物又は請求項７記載の核酸との複合体。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の複合体を含む組成物。
【請求項１２】
化合物中に存在するチオール基を請求項２記載の化合物又は請求項６記載の核酸のマレイミド基と反応させることを特徴とする、チオール基を有する化合物に請求項２記載の化合物又は請求項６記載の核酸を結合させる方法。
【請求項１３】
化合物中に存在するマレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を請求項３記載の化合物又は請求項７記載の核酸のチオール基と反応させることを特徴とする、マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物に請求項３記載の化合物又は請求項７記載の核酸を結合させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、修飾核酸、その合成中間体およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸を細胞内に導入することを目的として、核酸と正電荷を帯びたポリマー、及びタンパクとの複合体はその生成法と共に従来から盛んに研究が行われてきた。それらの複合体の種類は大きく二種類に分けられ、核酸とポリマーとを静電的な相互作用で結合させる手法と共有結合により結合させる手法とに分けられる。複合体の安定性を考えると共有結合で結合させた方が安定であり、ここ十年ではペプチドと短いオリゴヌクレオチドとを共有結合で結合させ、細胞内に導入しアンチセンス法、アンチジーンへの応用研究が盛んに行われてきた（図１）。
【０００３】
これらのペプチドと短いオリゴヌクレオチドの複合体は、導入したい核酸が短いため化学合成で合成できる。しかしながら、昨今話題になっているようなｓｉＲＮＡを発現するような長い遺伝子をペプチドと共有結合させて導入しようと思った場合、その様な複合体形成の手法は数例しか報告されていない。一つはＮｅｖｅらによって報告された手法で（非特許文献１）、プラスミド上に三本鎖を形成するような配列を組み込み、そこをターゲットに核移行シグナル（以下ＮＬＳと略記）−  ＧＡ１９（三本鎖形成部分）−  Ｐｓｏ（ソラーレン；光を照射することによりＤＮＡと共有結合できる）からなる複合体をハイブリダイゼーションさせ、その後、光照射によりプラスミドの特定の位置にペプチドを共有結合させた系がある（図２）。しかしながらこの系はプラスミドに三本鎖形成に必要な配列を組み込む必要があり、また、ＮＬＳ−ＧＡ１９−Ｐｓｏといった複雑な化合物を合成する必要がある。さらに光照射により共有結合させているため、ＤＮＡへの損傷が起こっている可能性がある。彼らの複合体によって導入されたプラスミドの発現量は２倍程度にしか増えておらず、導入効率が劇的に上がったとは言い難い。その他にも光反応による複合体形成（非特許文献２）やＤｉａｚｏｃｏｕｐｌｉｎｇによる複合体形成があるが（非特許文献３）いずれも非特異的な反応でＤＮＡと反応するため転写が阻害されている可能性がある。
【０００４】
もう一つの方法はＺａｎｔａらによって報告され、（非特許文献４）  ダンベルタイプのＤＮＡにＮＬＳを共有結合させた（図３）。この複合体により、タンパクの発現量は劇的に増加した（１０００倍）。しかしながらこの手法の欠点は、この複合体形成法が煩雑であり量がとれない。その結果、非常にコストがかかる。
【０００５】
Ｚａｎｔａらの報告によると、ＮＬＳを核酸に共有結合させることによりその導入効率が大きく向上し、しかも低濃度でもタンパクの発現量が落ちていない。このことは遺伝子治療を考えた場合、非常に重要であり、核酸をペプチドと共有結合させることは高効率な遺伝子導入法として非常に有用であることがわかる。
【０００６】
【非特許文献１】
ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５３  （１９９９）  ４１−４５
【０００７】
【非特許文献２】
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍ  １０  （１９９９）  ４９−５５
【０００８】
【非特許文献３】
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍ  １４  （２００３）  ２８２−２８６
【０００９】
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９６，  （１９９９），  ９１−９６
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安価で簡便な核酸とペプチドの共有結合による複合体形成法を開発することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
核酸とペプチドを共有結合で結合させるには反応性の低い核酸側に反応点を導入するのがよい。その手法として、本発明者らは、Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（以下ＴｄＴと略記）という酵素を用いることにした。この酵素はＤＮＡの３’末端にトリリン酸を取り込むことができる酵素である（図４）。この酵素を用いて修飾核酸を３’末端に導入し、ペプチドと共有結合させようと考えた。そこで、修飾核酸として、核酸塩基にリンカーを介してマレイミド基またはチオール基を結合させたヌクレオチドを設計した。この修飾核酸中のマレイミド基は、ペプチド中に存在するチオール基と反応して、共有結合を形成することができる。また、修飾核酸中のチオール基は、ペプチドに導入したマレイミド基、又はマレイミド基、ジスルフィド結合若しくはハロゲン化メチル基を有する化合物と反応して、共有結合を形成することができる。また、３’位の水酸基を除くことにより、ヌクレオチドの伸長反応を１残基で止めることもできた。ＴｄＴにより、この修飾核酸を核酸の３’末端に付加させることができ、その結果、核酸の３’がマレイミドで修飾されることになる。この手法により３’末端を修飾した核酸は、アミノ酸及びペプチドと反応した。本発明は、これらの知見により完成されたものである。本発明の手法は、核酸とペプチドを共有結合で結合させる場合のみならず、核酸とアミノ酸、タンパク質、蛍光物質、カラムの充填剤、ビーズ、ポリスチレン、炭素電極、金、シリコンやガラス等の表面などを共有結合で結合させる場合にも利用可能である。
【００１２】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  下記の一般式（Ｉ）で表される化合物。
【００１３】
【化９】
2004331574.tif 000002
（式中、Ａは水酸基または水素原子であり、Ｂは
【００１４】
【化１０】
2004331574.tif 000003
（式中、＊は糖に結合する位置を示す）のいずれかで表される基であり、Ｅは下記の（ａ）〜（ｄ）  のいずれかで表される基であり、
【００１５】
【化１１】
2004331574.tif 000004
（式中、ｎは１〜３のいずれかの整数である）
Ｘはカルボニル基またはメチレン基であり、Ｙは
【００１６】
【化１２】
2004331574.tif 000005
のいずれかで表される基又は保護されていてもよいチオール基であり、ｍは１〜３０のいずれかの整数であり、ｎは１〜３のいずれかの整数である。）
（２）  Ｙが
【００１７】
【化１３】
2004331574.tif 000006
のいずれかで表される基である（１）記載の化合物。
（３）  Ｙがチオール基である（１）記載の化合物。
（４）  下記の一般式（ＩＩ）で表される化合物。
【００１８】
【化１４】
2004331574.tif 000007
（式中、Ａは水酸基または水素原子であり、Ｂは
【００１９】
【化１５】
2004331574.tif 000008
（式中、＊は糖に結合する位置を示す）のいずれかで表される基であり、Ｘはカルボニル基またはメチレン基であり、Ｙは
【００２０】
【化１６】
2004331574.tif 000009
のいずれかで表される基又は保護されていてもよいチオール基であり、Ｚは保護されていてもよい水酸基又はハロゲン化されたリン酸基であり、ｍは１〜３０のいずれかの整数である。）
（５）  （１）記載の化合物を付加した核酸。
（６）  （２）記載の化合物を付加した核酸。
（７）  （３）記載の化合物を付加した核酸。
（８）  （１）〜（３）のいずれかに記載の化合物を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物を核酸に付加するためのキット。
（９）  チオール基を有する化合物と（２）記載の化合物又は（６）記載の核酸との複合体。
（１０）  マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物と（３）記載の化合物又は（７）記載の核酸との複合体。
（１１）  （９）又は（１０）記載の複合体を含む組成物。
（１２）  化合物中に存在するチオール基を（２）記載の化合物又は（６）記載の核酸のマレイミド基と反応させることを特徴とする、チオール基を有する化合物に（２）記載の化合物又は（６）記載の核酸を結合させる方法。
（１３）  化合物中に存在するマレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を（３）記載の化合物又は（７）記載の核酸のチオール基と反応させることを特徴とする、マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物に（３）記載の化合物又は（７）記載の核酸を結合させる方法。
【００２１】
本発明は、一般式（Ｉ）で表される化合物を提供する。
【００２２】
一般式（Ｉ）において、Ａは水酸基または水素原子である。合成の容易さの点からは、Ａが水酸基であることが好ましいが、ＴｄＴによる核酸への付加の効率の点からは、Ａが水素原子であることが好ましい。
【００２３】
Ｂはいかなる核酸塩基であってもよい。核酸塩基としては、シトシン、チミン、グアニン、アデニン、その修飾体、類似体などを例示することができるが、それらに限定されるわけではない。
【００２４】
Ｅは、モノ−、ジ−、トリホスフェート基、ホスホロチオエート基またはボラノホスフェート基である。
【００２５】
（ａ）で表される基のｎは１〜３のいずれかの整数である。ｎが３であると、ＴｄＴがよく作用して、核酸の３’末端に導入されやすいという利点がある。
【００２６】
Ｘはカルボニル基またはメチレン基である。
【００２７】
Ｙはマレイミド基、マレイミド基に臭素が付加した基または保護されていてもよいチオール基である。一般式（Ｉ）で表される化合物（修飾核酸）を核酸に付加させると、このＹが、他の化合物（例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、蛍光物質、カラムの充填剤を構成する化合物、ビーズ、ポリスチレン、炭素電極、金、シリコンやガラス等の表面を構成する化合物など）との反応点になる。Ｙがマレイミド基またはマレイミド基に臭素が付加した基である場合には、チオール基を有する化合物と共有結合で結合させることができる。Ｙがチオール基である場合には、マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物と共有結合で結合させることができる。
【００２８】
Ｙのチオール基が保護されている場合の保護基としては、以下のものを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００２９】
【化１７】
2004331574.tif 000010
ｍは１〜３０のいずれかの整数であるが、好ましくは１〜２５、より好ましくは１〜６のいずれかの整数である。
【００３０】
本発明は、一般式（ＩＩ）で表される化合物を提供する。一般式（ＩＩ）で表される化合物は一般式（Ｉ）で表される化合物の合成中間体として有用である。
【００３１】
一般式（ＩＩ）において、Ｚは保護されていてもよい水酸基又はハロゲン化されたリン酸基である。保護されていてもよい水酸基としては、以下のものを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００３２】
【化１８】
2004331574.tif 000011
ハロゲン化されたリン酸基としては、ジクロロフォスフェート基などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００３３】
本発明は、一般式（Ｉ）で表される化合物を付加した核酸を提供する。
【００３４】
本明細書において、「核酸」とは、プリン又はピリミジン塩基、糖（ペントース）、リン酸から成るヌクレオチドを基本単位とし、各ヌクレオチド間が糖の３’位と５’位炭素のリン酸ジエステル結合で結ばれて重合したものを意味する。糖部分がリボースであるか、デオキシリボ−スであるかによって、ＲＮＡとＤＮＡに大別されるが、それらに限定されるわけではない。プリン又はピリミジン塩基、糖（ペントース）、リン酸は種々の置換、修飾などがなされていてもよい。
【００３５】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、核酸のいかなる位置に付加されてもよい。例えば、ＴｄＴを用いる場合には、核酸の３’末端に付加される。また、適当な官能基を付加することにより光反応やジアゾカップリング反応によって核酸の塩基部位に付加することもできる。例えば、光反応については、ソラーレンを一般式（Ｉ）で表される化合物に結合させることで、核酸の塩基部分と反応し、結合が生じる。また、ジアゾカップリング反応については、シアゾニウム塩を一般式（Ｉ）で表される化合物に結合させることで、核酸の塩基部分と反応し、結合が生じる。
【００３６】
本発明は、一般式（Ｉ）で表される化合物を含む、一般式（Ｉ）で表される化合物を核酸に付加するためのキットも提供する。キットは、一般式（Ｉ）で表される化合物以外の要素を含んでもよい。例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物を核酸に付加することができる酵素（例えば、ＴｄＴ、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  （ｅｘｏ−）など）、緩衝液（例えば、トリスバッファー、リン酸バッファー、カコジル酸バッファーなど）、キットの使用方法を記載した説明書、コバルト塩、マグネシウム塩、マンガン塩などを含んでもよい。コバルト塩は、例えば、０．１〜０．５  ｍＭ、好ましくは０．２５  ｍＭの濃度で添加するとよい。
【００３７】
このキットにおいて、キットを構成する要素は、各々あるいは組み合わせてあるいはひとまとめにして、バイアル，  チューブなどのような容器に包含されていてもよく、さらに、それらの容器はひとまとめにして納めるための区画化された担持手段に納められていてもよい。
【００３８】
本発明は、チオール基を有する化合物とマレイミド基若しくはマレイミド基に臭素が付加した基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物を付加した核酸との複合体も提供する。
【００３９】
本明細書において、「チオール基を有する化合物」とは、化合物分子中に少なくとも１個のチオール基が存在する限り、いかなる化合物であってもよく、化合物としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、蛍光物質、カラムの充填剤を構成する化合物、ビーズ、ポリスチレン、炭素電極、金、シリコンやガラス等の表面を構成する化合物などを例示することができる。
【００４０】
本明細書において、「複合体」とは、一般に分子と分子の間に何らかの相互作用があって生じる結合物を意味する。相互作用を生じる分子の数は２個に限定されるわけではなく、２個以上であってもよい。分子間相互作用の種類としては、特に限定されるわけではないが、共有結合、水素結合、静電相互作用、疎水相互作用などをあげることができる。本発明の複合体を用いて、目的の核酸を細胞内に導入する場合には、安定性の点から、共有結合で結合させた複合体が好ましい。
【００４１】
本発明は、マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物とチオール基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物又は該化合物を付加した核酸との複合体も提供する。
【００４２】
本明細書において、「マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物」とは、化合物分子中に少なくとも１個のマレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基が存在する限り、いかなる化合物であってもよく、化合物としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、蛍光物質、カラムの充填剤を構成する化合物、ビーズ、ポリスチレン、炭素電極、金、シリコンやガラス等の表面を構成する化合物などを例示することができる。
【００４３】
「ジスルフィド結合」とは、一般に−Ｓ−Ｓ−で表される結合であり、以下のものを例示することができるが、これに限定されるわけではない。
【００４４】
【化１９】
2004331574.tif 000012
「ハロゲン化メチル基」としては、下記の式で表される基を例示することができるが、これらに限定されるわけではない。なお、下記の式において、Ｘはハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ａｔ）である。
【００４５】
【化２０】
2004331574.tif 000013
本発明の上記複合体を含む組成物としては、疾病の予防や治療に用いられる医薬組成物、試薬組成物、核酸の細胞内での挙動観察などに用いられる実験用組成物、疾病の診断用組成物、カラム充填剤組成物、ビーズ組成物などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００４６】
なお、本明細書において、「〜」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明するが、これは、本発明の好ましい態様を説明するものであって、本発明の範囲はこれに限定されるわけではない。
【００４８】
１．一般式（Ｉ）で表される化合物の製造
（１）マレイミド基又は臭素が付加したマレイミド基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物の製造
マレイミド基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｅ＝（ａ）の化合物については、以下に示す反応式に従って製造することができる。
Ａ  ＝  −ＯＨの場合
【００４９】
【化２１】
2004331574.tif 000014
Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入した核酸１（無保護）をピリジン（Ｗａｋｏ）で共沸した後、ピリジン中に溶解させＤＭＴｒＣｌ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．９〜１．２ｅｑ加え３時間〜一日室温で撹拌してＤＭＴｒ化する（化合物２）。その後、（Ｒ’＝ＣＯＯＨの場合）カルボシキル基をＨＯＢＴ（同仁）１．２〜２．４  ｅｑ，  ＤＣＣ（Ｗａｋｏ）  １．２  〜２．４ｅｑ，  ＤＭＡＰ  （Ｗａｋｏ）  ０．１〜０．５  ｅｑでジクロロメタン又はＤＭＦ中（室温、１５〜１８０分）で活性化したマレイミド化合物とＴＥＡ  （Ｗａｋｏ）  ２〜４  ｅｑを加えジクロロメタン又はＤＭＦ中で反応させ（室温、１〜３時間）化合物３を得る。カラム精製したのち、ジクロロメタン中に溶解させ、ＴＦＡ  （Ｗａｋｏ）を０℃で体積比で１％の割合で加え１〜１５分撹拌し、その後飽和した炭酸水素ナトリウム溶液（Ｗａｋｏ）を加え反応を止める。クロロホルム（Ｗａｋｏ）で抽出したのちカラムで精製し化合物４を得る。得られた化合物４にｐｒｏｔｏｎ  ｓｐｏｎｇｅ  （Ｗａｋｏ）  １．５〜３  ｅｑ，  ＰｏＸ３１．１〜２．０  ｅｑ，  を加え０℃でリン酸トリメチル（Ｗａｋｏ）中で２〜３時間撹拌し化合物５を得る。その溶液にトリブチルアミン（Ｗａｋｏ）（核酸１ｍｍｏｌにつき１ｍＬ）と０．５Ｍ  ｂｉｓ−ｎ−ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅのＤＭＦ（Ｗａｋｏ）溶液を加え１〜２分０℃で撹拌する。反応を１ＭのＥＴ３Ｎ・Ｈ２ＣＯ３水溶液で止めて溶媒をとばし乾燥させ、カラムで精製し化合物６を得る。
Ａ  ＝  −Ｈの場合
【００５０】
【化２２】
2004331574.tif 000015
核酸１に公知の手法で保護を加え（化合物１２）、ピリジン（Ｗａｋｏ）で共沸した後、ピリジン中に溶解させＤＭＴｒＣｌ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．９〜１．２ｅｑ加え３時間〜一日室温で撹拌してＤＭＴｒ化する（化合物１３）。得られた化合物３をアセトリトリル（Ｗａｋｏ）に０．１  Ｍ  の濃度になるように溶解させ、ＰＴＣＣｌ（Ｗａｋｏ）  １〜２  ｅｑ，  ＤＭＡＰ  （Ｗａｋｏ）  １〜２  ｅｑ，  を加え室温で半日〜一日撹拌する。溶媒をエバポレーションで除いた後、５％炭酸水素ナトリウム（Ｗａｋｏ）で抽出し化合物１４を得る。得られた化合物１４をトルエン（Ｗａｋｏ）に濃度が０．１〜０．０３Ｍになるように溶解させ、ＡＩＢＮ（Ｗａｋｏ）  ０．１〜０．２  ｅｑ，  トリブチルチンハイドライド（Ｗａｋｏ）１〜３  ｅｑを加え１１０℃で還流させて反応させる。１時間後反応を終了させ、５％炭酸水素ナトリウム（Ｗａｋｏ）で抽出しカラムで精製し化合物１５を得る。公知の手法で核酸塩基の保護を除き化合物１６を得る。その後、（Ｒ’＝ＣＯＯＨの場合）カルボシキル基をＨＯＢＴ（同仁）１．２〜２．４  ｅｑ，  ＤＣＣ（Ｗａｋｏ）  １．２  〜２．４ｅｑ，  ＤＭＡＰ  （Ｗａｋｏ）  ０．１〜０．５  ｅｑでジクロロメタン又はＤＭＦ中（室温、１５〜１８０分）で活性化したマレイミド化合物とＴＥＡ  （Ｗａｋｏ）  ２〜４  ｅｑを加えジクロロメタン又はＤＭＦ中で反応させ（室温、１〜３時間）化合物１７を得る。カラム精製したのち、ジクロロメタン中に溶解させ、ＴＦＡ  （Ｗａｋｏ）を０℃で体積比で１％の割合で加え１〜１５分撹拌し、その後飽和した炭酸水素ナトリウム溶液（Ｗａｋｏ）を加え反応を止める。クロロホルム（Ｗａｋｏ）で抽出したのちカラムで精製し化合物１８を得る。得られた化合物１８にｐｒｏｔｏｎ  ｓｐｏｎｇｅ  （Ｗａｋｏ）  １．５〜３  ｅｑ，  ＰｏＸ３１．１〜２．０  ｅｑ，  を加え０℃でリン酸トリメチル（Ｗａｋｏ）中で２〜３時間撹拌し化合物１９を得る。その溶液にトリブチルアミン（Ｗａｋｏ）（核酸１ｍｍｏｌにつき１ｍＬ）と０．５Ｍ  ｂｉｓ−ｎ−ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅのＤＭＦ（Ｗａｋｏ）溶液を加え１〜２分０℃で撹拌する。反応を１ＭのＥＴ３Ｎ・Ｈ２ＣＯ３水溶液で止めて溶媒をとばし乾燥させ、カラムで精製し化合物２０を得る。
【００５１】
なお、上記の２つの合成スキームにおいては、糖の５’位の炭素に結合している水酸基を保護するために、ＤＭＴｒＣｌを用いたが、それ以外の保護剤（例えば、他のトリチル系の保護剤、シリル系の保護剤など）を用いてもよい。
【００５２】
化合物６及び２０のマレイミド基に臭素を付加するには、公知のいかなる方法を用いてもよい。あるいは、臭素化されたマレイミド化合物を原料として用い、マレイミド基に臭素が付加されている化合物６及び２０を合成してもよい。
【００５３】
化合物６及び２０のリン酸基の数（ｎ）は、公知の手法で制御することができる。
【００５４】
なお、一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｅ＝（ｂ）の化合物については公知の手法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  １９９８，  ５４，  ５１１９−５１２８）で合成可能であり、Ｅ＝（ｃ）の化合物については公知の手法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９８２，  ２１，  １９８３−１９８９）で合成可能であり、Ｅ＝（ｄ）の化合物については公知の手法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９８２，  ２１，  １９８３−１９８９及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９２，  ３１，  １０５４４−１０５５５）で合成可能である。
【００５５】
（２）保護されていてもよいチオール基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物の製造
保護されていてもよいチオール基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｅ＝（ａ）の化合物は、以下に示す反応式に従って製造することができる。
【００５６】
【化２３】
2004331574.tif 000016
Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入した核酸１（無保護）をピリジン（Ｗａｋｏ）で共沸した後、ピリジン中に溶解させＤＭＴｒＣｌ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．９〜１．２ｅｑ加え３時間〜一日室温で撹拌してＤＭＴｒ化する（化合物３２）。その後、（Ｒ’＝ＣＯＯＨの場合）カルボシキル基をＨＯＢＴ（同仁）１．２〜２．４  ｅｑ，  ＤＣＣ（Ｗａｋｏ）  １．２  〜２．４ｅｑ，  ＤＭＡＰ  （Ｗａｋｏ）  ０．１〜０．５  ｅｑでジクロロメタン又はＤＭＦ中（室温、１５〜１８０分）で活性化したチオール及びそれを保護した化合物とＴＥＡ  （Ｗａｋｏ）  ２〜４  ｅｑを加えジクロロメタン又はＤＭＦ中で反応させ（室温、１〜３時間）化合物３３を得る。カラム精製したのち、ジクロロメタン中に溶解させ、ＴＦＡ  （Ｗａｋｏ）を０℃で体積比で１％の割合で加え１〜１５分撹拌し、その後飽和した炭酸水素ナトリウム溶液（Ｗａｋｏ）を加え反応を止める。クロロホルム（Ｗａｋｏ）で抽出したのちカラムで精製し化合物３４を得る。得られた化合物３４にｐｒｏｔｏｎ  ｓｐｏｎｇｅ  （Ｗａｋｏ）  １．５〜３  ｅｑ，  ＰｏＸ３１．１〜２．０  ｅｑ，  を加え０℃でリン酸トリメチル（Ｗａｋｏ）中で２〜３時間撹拌し化合物３５を得る。その溶液にトリブチルアミン（Ｗａｋｏ）（核酸１ｍｍｏｌにつき１ｍＬ）と０．５Ｍ  ｂｉｓ−ｎ−ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅのＤＭＦ（Ｗａｋｏ）溶液を加え１〜２分０℃で撹拌する。反応を１ＭのＥＴ３Ｎ・Ｈ２ＣＯ３水溶液で止めて溶媒をとばし乾燥させ、カラムで精製し化合物３６を得る。
【００５７】
なお、上記の合成スキームにおいては、糖の５’位の炭素に結合している水酸基を保護するために、ＤＭＴｒＣｌを用いたが、それ以外の保護剤（例えば、他のトリチル系の保護剤、シリル系の保護剤など）を用いてもよい。
【００５８】
化合物３６のリン酸基の数（ｎ）は、公知の手法で制御することができる。
【００５９】
化合物３６のチオール基の脱保護は、ＤＴＴにより行うことができる。
【００６０】
なお、一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｅ＝（ｂ）の化合物については公知の手法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  １９９８，  ５４，  ５１１９−５１２８）で合成可能であり、Ｅ＝（ｃ）の化合物については公知の手法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９８２，  ２１，  １９８３−１９８９）で合成可能であり、Ｅ＝（ｄ）の化合物については公知の手法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９８２，  ２１，  １９８３−１９８９及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９２，  ３１，  １０５４４−１０５５５）で合成可能である。
【００６１】
２．核酸への一般式（Ｉ）で表される化合物の付加
一般式（Ｉ）で表される化合物を核酸に付加するには、いかなる公知の方法を用いてもよい。
【００６２】
例えば、ＴｄＴを用いる場合には、以下のような条件で酵素反応を行うとよい。３’末端に修飾を試みたい核酸（〜２００ｐｍｏｌ）をニューイングランドバイオラボ社、プロメガ社、アマシャム・ファルマシア社等から発売されているＴｄＴ（４Ｕから５０Ｕ）を用いてトリス緩衝液又はリン酸緩衝液又はカコジル酸緩衝液中、一般式（Ｉ）で表される化合物を０．１ｍＭから５ｍＭの濃度で加え、２０℃から４０℃において３０分から一日反応させる。生成した物質はゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー等で精製する。
【００６３】
一般式（Ｉ）で表される化合物を付加する核酸としては、いかなる核酸を用いてもよい。例えば、医薬として有用なＤＮＡ、ＲＮＡなどを挙げることができる。医薬として有用なＤＮＡとしては、ｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡ，リボザイム、ｐ５３などアポトーシス関連遺伝子、デコイＤＮＡ、ＤＮＡのリン酸部位に硫黄原子を含むホスホロチオエートやホウ素原子を含むボラノホスフェートをＤＮＡ中に組み込んだものなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。医薬として有用なＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００６４】
一般式（Ｉ）で表される化合物を付加する核酸は、医薬以外の用途に用いられる核酸であってもよく、医薬以外の用途とそれに用いられる核酸としては、ＤＮＡワイヤー、ＳＮＰｓ検出用のオリゴＤＮＡを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００６５】
３．マレイミド基又は臭素が付加したマレイミド基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物とチオール基を有する化合物との反応（共有結合で結合させた複合体の形成）
マレイミド基又は臭素が付加したマレイミド基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物とチオール基を有する化合物とを反応させるには、いかなる公知の方法を用いてもよい。
【００６６】
例えば、チオール基を有する物質がアミノ酸である場合には、以下のような条件で反応を行うとよい。ＴｄＴによる反応をした後、システィン（Ａｌｄｒｉｃｈ等で販売）を５０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度で加えトリス緩衝液又はリン酸緩衝液又はカコジル酸緩衝液中、４℃〜４０度で３時間から一日、振動させながら反応させる。生成した物質はゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー等で精製する。
【００６７】
また、チオール基を有する化合物がペプチドである場合には、以下のような条件で反応を行うとよい。ＴｄＴによる反応をした後、余分な一般式（Ｉ）で表される化合物をミリポア社から発売されているＭｉｃｒｏｃｏｎで除き、システィンを含むペプチド（ジーンネット等で販売）を核酸とのチャージ比が０．５〜０．９及び１．５〜５の割合で加えトリス緩衝液又はリン酸緩衝液又はカコジル酸緩衝液中、４℃〜４０度で３時間から一日、振動させながら反応させる。生成した物質はミリポア社から発売されているＭｉｃｒｏｃｏｎで余分なペプチドを除いた後、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー等で精製する。
【００６８】
チオール基を有する化合物としては、化合物分子中に少なくとも１個のチオール基が存在する限り、いかなる化合物であってもよく、化合物としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、蛍光物質、カラムの充填剤を構成する化合物、ビーズ、ポリスチレン、炭素電極、金、シリコンやガラス等の表面を構成する化合物などを例示することができる。
【００６９】
具体的には、システイン、システィンを含む天然のアミノ酸からなるペプチド及びクロスリンカー等でチオール基を付加させたペプチド、固相合成法によりチオール基を付加したペプチド、システィン残基を含むタンパク質、ＤＴＴ等により部分的に還元したことにより生じたチオール基を有するタンパク質、クロスリンカー等でチオール基を付加させたタンパク質、カラム充填剤Ｔｈｉｏｐｒｏｐｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャム・ファルマシア社）等を例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００７０】
なお、チオール基を持たない化合物にチオール基を導入することにより、マレイミド基又は臭素が付加したマレイミド基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物と反応させることができる。
【００７１】
一般に、ある化合物にチオール基を導入するには、以下の反応を利用することができる。
・ジスルフィド結合のＤＴＴ等による還元。
・保護されたチオール基を持つｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ基等の活性エステル化合物と別の化合物中のアミノ基との反応。
・アミノ基と２−ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅとの反応。
・ＥＤＡＣを介したｃｙｓｔａｍｉｎｅとカルボキシル基との反応後ＤＴＴ等による還元。
【００７２】
これらの反応を利用することにより、チオール基を持たないアミノ酸、ペプチド、タンパク質、蛍光物質、カラムの充填剤を構成する化合物、ビーズ、ポリスチレン、炭素電極、金、シリコンやガラス等の表面を構成する化合物などにチオール基を導入することができる。
【００７３】
４．チオール基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物とマレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物との反応（共有結合で結合させた複合体の形成）
チオール基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物とマレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物とを反応させるには、いかなる公知の方法を用いてもよい。
【００７４】
例えば、マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物がアミノ酸である場合には、以下のような条件で反応を行うとよい。ＴｄＴによる反応をした後、マレイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ等で販売）、スルフィド結合を有する化合物又はハロゲン化メチル基を有する化合物を５０ｍＭ〜３００ｍＭの濃度で加えトリス緩衝液又はリン酸緩衝液又はカコジル酸緩衝液中、４℃〜４０度で３時間から一日、振動させながら反応させる。生成した物質はゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー等で精製する。
【００７５】
また、マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物がペプチドである場合には、以下のような条件で反応を行うとよい。ＴｄＴによる反応をした後、余分な一般式（Ｉ）で表される化合物をミリポア社から発売されているＭｉｃｒｏｃｏｎで除き、マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を含むペプチド（ジーンネット等で販売）を核酸とのチャージ比が０．５〜０．９及び１．５〜５の割合で加えトリス緩衝液又はリン酸緩衝液又はカコジル酸緩衝液中、４℃〜４０度で３時間から一日、振動させながら反応させる。生成した物質はミリポア社から発売されているＭｉｃｒｏｃｏｎで余分なペプチドを除いた後、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー等で精製する。
【００７６】
マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を有する化合物としては、化合物分子中に少なくとも１個のマレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基が存在する限り、いかなる物質であってもよく、化合物としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、蛍光物質、カラムの充填剤を構成する化合物、ビーズ、ポリスチレン、炭素電極、金、シリコンやガラス等の表面を構成する化合物などを例示することができる。
【００７７】
具体的には、前述のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、蛍光物質、カラムの充填剤を構成する化合物、ビーズ、ポリスチレン、炭素電極、金、シリコンやガラス等の表面を構成する化合物などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００７８】
なお、マレイミド基、ジスルフィド結合又はハロゲン化メチル基を持たない化合物にマレイミド基、スルフィド結合又はハロゲン化メチル基を導入することにより、チオール基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物と反応させることができる。
【００７９】
一般に、ある化合物にマレイミド基を導入するには、化合物中にあるアミノ基にＳＭＣＣ（モレキュラープローブ社から発売）等活性エステルを反応させればよい。
【００８０】
一般に、ある化合物にジスルフィド結合を導入するには、化合物中にあるアミノ基にＳＰＤＰ（モレキュラープローブ社から発売）等活性エステルを反応させればよい。
【００８１】
一般に、ある化合物にハロゲン化メチル基を導入するには、化合物中にあるアミノ基にＩｏｄｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ  （モレキュラープローブ社から発売）等活性エステルを反応させればよい。
【００８２】
これらの反応を利用することにより、マレイミド基、スルフィド結合又はハロゲン化メチル基を持たないアミノ酸、ペプチド、タンパク質、蛍光物質、カラムの充填剤を構成する化合物、ビーズを構成する化合物などにマレイミド基、スルフィド結合又はハロゲン化メチル基を導入することができる。
【００８３】
５．複合体の利用
上記３の複合体又は４の複合体のうち、一般式（Ｉ）で表される化合物を付加した核酸とアミノ酸、ペプチド又はタンパク質との複合体を利用して、目的とする核酸を細胞内に導入することができる。従って、これらの複合体は、医薬品として、ヒト、その他の動物に投与したり、実験用の試薬として用いたりすることができる。
【００８４】
上記核酸とアミノ酸、ペプチド又はタンパク質との複合体を細胞内に導入するには、例えば、それらを適当な膜（例えば、リポソーム、ポリリジン、ＰＥＧ、ＰＥＧとポリリジンの複合体など）に封入し、細胞内に取り込む方法（”Ｌｉｐｉｄｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ”（１９９７）  Ｒ．Ｊ．  Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌ．  Ｈｕａｎｇ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １４，  １７３−２０６；中西守ら、蛋白質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４４，  Ｎｏ．１１，  １５９０−１５９６  （１９９９））、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。これらの複合体を細胞に導入する場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取り出し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すＥｘ  ｖｉｖｏ法も可能であるし、あるいは、疾患部の組織に直接複合体を導入することもできる。
【００８５】
本発明の複合体（特に、核酸とアミノ酸、ペプチド又はタンパク質との複合体）を有効成分として含む医薬組成物は、必要により、医薬上許容される担体（例えば、生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）を含むことができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
【００８６】
また、一般式（Ｉ）で表される化合物を付加した核酸と蛍光物質との複合体を利用して、核酸の細胞内での挙動観察、それを用いた診断を行うことができる。
【００８７】
さらに、一般式（Ｉ）で表される化合物を付加した核酸とカラムの充填剤を構成する化合物との複合体を利用して、核酸の固定化、精製を行うことができる。
【００８８】
また、一般式（Ｉ）で表される化合物を付加した核酸とビーズ、ポリスチレン、炭素電極、金、シリコンやガラス等の表面を構成する化合物との複合体を利用して、核酸の固定化、精製を行うことができる。
【００８９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００９０】
［実施例１］マレイミド基を有する修飾核酸の製造
図５に示す化合物２０ｍはシチジンのＮ４にリンカーを介し、マレイミドを結合させた化合物である。このマレイミドの部分がペプチド中のシステインのチオール基（−ＳＨ）と共有結合する（図６）。また、３’の水酸基を除くことにより、ヌクレオチドの伸長反応を１残基で止めることにした。合成法を図７に示す。以下、詳細に説明する。
【００９１】
デオキシシチジン一水和物（１  ｅｑ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）をＤＭＦ中に０．１Ｍの濃度になるように溶解させ、無水酢酸１．２ｅｑ  トリエチルアミン２．０  ｅｑを加え、室温で８時間撹拌した。その後、ＤＭＦをエバポレーションでとばし、さらにもう一度ＤＭＦを加えエバポレーションでとばした。その後、ピリジンで共沸を二回行い化合物１３ａを得た。ここでの精製はこれ以上行わず、次のステップに進んだ。得られた化合物１３ａをピリジンに０．１Ｍの濃度になるように溶解させ、ＤＭＴｒＣｌを１．１ｅｑ加え室温で３時間撹拌した。その後、ピリジンをエバポレーションでとばし残留物をクロロホルムと５％の炭酸水素ナトリウムで抽出した。有機層をエバポレーションでとばしカラムで精製した。
１ＨＮＭＲ；  （ＣＤＣｌ３）．  δ２．２（ｓ，  ３Ｈ），  ２．３  （ｍ  １Ｈ），  ２．７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．４  （ｄｄ，  ２Ｈ），  ３．７  （ｓ，  ６Ｈ），  ４．１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．５  （ｍ，  １Ｈ），  ６．２  （ｔ，  １Ｈ），  ６．８−７．４  （１４Ｈ），  ８．２  （ｄ，  １Ｈ）
【００９２】
得られた化合物１３ａをアセトニトリルに０．１  Ｍの濃度になるように溶解させ、ジメチルアミノピリジンを２．０５ｅｑ  フェニルクロロチオノフォルメート（ＰＴＣＣｌ）を１．１ｅｑ加え室温で１６時間撹拌。アセトニトリルをエバポレーションでとばし残留物をクロロホルムと５％の炭酸水素ナトリウムで抽出した。ここでの精製は行わず次の反応へ進んだ。
【００９３】
得られた化合物１４ａをトルエンに０．０５Ｍの濃度になるように溶かし、トリブチルスズハイドライド（３  ｅｑ）、ＡＩＢＮを０．２ｅｑ加え１１０℃で一時間反応させた。残留物をクロロホルムと５％の炭酸水素ナトリウムで抽出した。トルエンをエバポレーションでとばし次のステップへ進んだ。
【００９４】
得られた化合物１５ａをメタノールに溶解させその溶液に０．０５Ｍの炭酸カリウムのメタノール／水溶液を滴下した。一時間後に反応を終了させた。溶液をエバポレーションでとばし残留物をクロロホルムと５％の炭酸水素ナトリウムで抽出した。有機層をエバポレーションでとばし、反応生成物（化合物１６ａ）をカラムで精製した。
１ＨＮＭＲ；  （ＣＤＣｌ３）．  δ１．９（ｓ，  ２Ｈ），  ２．１  （ｍ  １Ｈ），  ２．４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．４  （ｄｄ，  ２Ｈ），  ３．８  （ｓ，  ６Ｈ），  ４．２  （ｍ，  １Ｈ），  ５．８  （ｍ，  １Ｈ），  ６．０  （ｔ，  １Ｈ），  ６．８−７．４  （１３Ｈ），  ８．０  （ｄ，  １Ｈ）
【００９５】
β−マレイミドプロパン酸  （２  ｅｑ），  ジメチルアミノピリジン０．２ｅｑ，  ＤＣＣ（２．２ｅｑ），  ＨＯＢＴ（２．２ｅｑ）をβ−マレイミドプロパン酸の濃度が０．３Ｍになるようにジクロロメタンに溶解させ室温で３０分反応させた。生じた固形物を濾過して除き、そのろ液に化合物１６ａを加えた。３０分反応させた後、飽和食塩水で抽出し有機層をエバポレーションでとばしカラムで精製した。
【００９６】
得られた化合物１７ｍをジクロロメタンに０．０１Ｍの濃度になるように溶解させトリフルオロ酢酸を１％の体積で加えた。０℃で３分撹拌し飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を止めた。クロロホルムで抽出を行った。有機層をエバポレーションでとばしカラムで精製した。
１ＨＮＭＲ；  （ＣＤＣｌ３）．  δ２．０（ｓ，  ２Ｈ），  ２．１  （ｍ  １Ｈ），  ２．４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．４  （ｄｄ，  ２Ｈ），  ３．８  （ｓ，  ６Ｈ），  ４．０  （ｔ，  ２Ｈ），  ４．３  （ｍ，  １Ｈ），  ６．０  （ｔ，  １Ｈ），  ６．７  （ｔ，  ２Ｈ）  ６．８−７．４  （１４Ｈ），  ８．６  （ｄ，  １Ｈ）
【００９７】
得られた化合物１８ｍをリン酸トリメチルに０．５  Ｍの濃度で溶解させプロトンスポンジ１．５ｅｑ，  塩化ホスホリル１．１ｅｑ０℃で加え２時間０℃で撹拌した（化合物１９ｍが生成）。２時間後トリブチルアミンを基質（化合物１９ｍ）１ｍｍｏｌに対して１ｍｍｏｌの割合で加え０．５Ｍ  ｂｉｓ−ｎ−ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（１ｅｑ）のＤＭＦ溶液を加え０℃で３分撹拌した。反応を１ＭのＥＴ３Ｎ・Ｈ２ＣＯ３水溶液で止めて溶媒をとばし乾燥させ、カラムで精製し化合物２０ｍを得た。
【００９８】
マレイミド基を含むトリリン酸体（化合物２０ｍ）の精製及び同定は以下のようにして行った。Ｗａｔｅｒｓの逆層カラム、ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８カラムを用いて水：アセトニトリル＝１００：０（０分）〜４０：６０（６０分）の溶出液で精製したところ、トリリン酸化する前の化合物が１９分にピークが観測されたのに対し、トリリン酸体は１２分にピークが観測された。またこの１２分のピークにシステインを反応させたところ１０分にピークが移動した。逆層カラムにおいてピークが早くなった（１９から１２分）ことと、システインと反応したことから、これが望みのものと判断し、ＴｄＴの反応をしたところ、ＤＮＡに取り込まれたのでトリリン酸体と判断した。
【００９９】
本実施例で合成したトリリン酸化合物を以下「ｄｄＹＴＰ」と略記する。
【０１００】
［実施例２］短いＤＮＡ（９ｍｅｒＤＮＡ）の３’末端への修飾核酸の導入
９  ｍｅｒ  ＤＮＡ２００ｐｍｏｌ（配列ＴＴＣＧＧＡＣＣＣ）の５’末端をＲＩでラベルしＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂから購入したＴｄＴを４Ｕ，  添付バッファー１マイクロリットル、２．５  ｍＭＣｏＣｌ２を１マイクロリットル水を加えて合計１０マイクロリットルとして３７℃で１時間反応させた。
【０１０１】
結果を図８に示す。レーン１はコントロールＤＮＡ（９  ｍｅｒ）、レーン２はコントロールＤＮＡ（１０ｍｅｒ）、レーン３は、９ｍｅｒのＤＮＡにＴｄＴによりｄｄＹＴＰを付加反応を行った後である。図８のＬａｎｅ３を見ればわかるように、２００  ｐｍｏｌのＤＮＡが４ＵのＴｄＴによりｄｄＹＴＰが付加し、３’がマレイミドで修飾された。すなわち、ｄｄＹＴＰはＴｄＴにより極めて効率よく取り込まれている。
【０１０２】
［実施例３］修飾核酸を３’末端に導入した短いＤＮＡ（９ｍｅｒＤＮＡ）とシステインとの反応
実施例２で行った実験の酵素反応溶液に２００ｍＭのｐＨ７．５のリン酸バッファー溶液２マイクロリットル、５００ｍＭのシステイン水溶液１マイクロリットル、それに水を加え合計２０マイクロリットルになる様にし室温で３時間反応させた。
【０１０３】
結果を図９に示す。レーン１はコントロールＤＮＡ（９  ｍｅｒ）、レーン２はコントロールＤＮＡ（１０ｍｅｒ）、レーン３はマレイミドラベルされたＤＮＡ、レーン４−６はマレイミドラベルされたＤＮＡ（レーン２）にシステイン（１ｍＭ、１０  ｍＭ及び５０ｍＭ）と反応を行った後である。
ほぼ１００％の収率でＤＮＡとアミノ酸が共有結合により結合された。
【０１０４】
［実施例４］長いＤＮＡ（３５０残基ＤＮＡ）の３’末端への修飾核酸の導入及び修飾核酸を３’末端に導入した長いＤＮＡ（３５０残基ＤＮＡ）とペプチドとの反応
実施例２に示した方法に従い、ｓｉＲＮＡをコードする約３５０ｍｅｒ  のＤＮＡ（配列ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＧＣＧＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＴＴＴＴＴＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴ（配列番号１））をＴｄＴによる反応をした後、余分なトリリン酸化合物をミリポア社から発売されているＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ３０００で除き、システィンを含む核移行シグナルペプチド（ジーンネット社より購入、配列ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＹＣ（配列番号２））を核酸とのチャージ比０．９の割合で加え２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中、３７℃で６時間、振動させながら反応させた。生成した物質はミリポア社から発売されているＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ３０００で余分なペプチドを除いた。
【０１０５】
結果を図１０に示す。Ｌａｎｅ  １は３５０ｍｅｒ  ＤＮＡ、Ｌａｎｅ  ２はＬａｎｅ  １のＤＮＡにマレイミド化せずにペプチドを加えたものである。Ｌａｎｅ３はマレイミド化してペプチドを加えた後にペプチドを除く操作をしたものである。Ｌａｎｅ２においては全くバンドシフトしていないので核酸とペプチドとの静電的な相互作用はペプチドを除く操作をしたため見られていない。Ｌａｎｅ３ではほぼ１００％の割合でバンドがシフトしている。Ｌａｎｅ２との比較から、このバンドシフトは静電的な相互作用によって生じているのではなく核酸とペプチドが共有結合でつながっていることを示している。
【０１０６】
［実施例５］チオール基を有する修飾核酸の製造
図１２に示す化合物２４ｔはシチジンのＮ４にリンカーを介し、チオールを結合させた化合物である。このチオールの部分がペプチド中に導入したマレイミド基と共有結合する。化合物２４ｔ及び化合物２４ｔをさらにトリリン酸化した化合物２６ｔの合成法を図１２に示す。以下、詳細に説明する。
【０１０７】
デオキシシチジン一水和物（１  ｅｑ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）をピリジンで共沸を二回行いピリジンに０．１Ｍの濃度になるように溶解させ、ＤＭＴｒＣｌを１．１ｅｑ加え室温で３時間撹拌した。その後、ピリジンをエバポレーションでとばし残留物をクロロホルムと５％の炭酸水素ナトリウムで抽出した。有機層をエバポレーションでとばしカラムで化合物２ａを精製した。
１ＨＮＭＲ；  （ＣＤＣｌ３）．  δ２．２（ｍ，  １Ｈ），  ２．６  （ｍ，  １Ｈ），  ３．４  （ｄｄ，  ２Ｈ），  ３．７  （ｓ，  ６Ｈ），  ４．１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．５  （ｍ，  １Ｈ），  ５．４  （ｄ，  １Ｈ），  ６．３  （ｔ，  １Ｈ），  ６．８−７．４  （１３Ｈ），  ７．９  （ｄ，  １Ｈ）
【０１０８】
ジスルフィド化合物  （２  ｅｑ），  ジメチルアミノピリジン０．２ｅｑ，  ＤＣＣ（２．２ｅｑ），  ＨＯＢＴ（２．２ｅｑ）をジスルフィド化合物の濃度が０．３Ｍになるようにジクロロメタンに溶解させ室温で３０分反応させた。生じた固形物を濾過して除き、そのろ液に化合物２ａを加えた。３０分反応させた後、飽和食塩水で抽出し有機層をエバポレーションでとばしカラムで化合物２３ｔを精製した。得られた化合物２３ｔをジクロロメタンに０．０１Ｍの濃度になるように溶解させトリフルオロ酢酸を１％の体積で加えた。０℃で３分撹拌し飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え反応を止めた。クロロホルムで抽出。有機層をエバポレーションでとばしカラムで化合物２４ｔを精製した。
１ＨＮＭＲ；  （ＣＤＣｌ３）．  δ２．２（ｍ，  １Ｈ），  ２．６  （ｍ，  １Ｈ），  ２．９  （ｔ，  ２Ｈ），  ３．１  （ｔ，  ２Ｈ），  ３．８  （ｄｄ，  ２Ｈ），  ４．０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．４  （ｍ，  １Ｈ），  ６．３  （ｔ，  １Ｈ），  ７．２−８．４  （４Ｈ），  ７．４  （ｄ，  １Ｈ），  ８．４  （ｄ，  １Ｈ），
【０１０９】
得られた化合物２４ｔをリン酸トリメチルに０．５  Ｍの濃度で溶解させプロトンスポンジ１．５ｅｑ，  塩化ホスホリル１．１ｅｑ０℃で加え２時間０℃で撹拌した（化合物２５ｔが生成）。２時間後トリブチルアミンを基質（化合物２５ｔ）１ｍｍｏｌに対して１ｍｍｏｌの割合で加え０．５Ｍ  ｂｉｓ−ｎ−ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（１ｅｑ）のＤＭＦ溶液を加え０℃で３分撹拌した。反応を１ＭのＥＴ３Ｎ・Ｈ２ＣＯ３水溶液で止めて溶媒をとばし乾燥させ、カラムで精製し化合物２６ｔを得た。
【０１１０】
チオール基を含むトリリン酸体（化合物２６ｔ）の精製及び同定は以下のようにして行った。Ｗａｔｅｒｓの逆層カラム、ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８カラムを用いて水：アセトニトリル＝１００：０（０分）〜４０：６０（６０分）の溶出液で精製したところ、トリリン酸化する前の化合物が２６分にピークが観測されたのに対し、トリリン酸体は１８分にピークが観測された。またこの１８分のピークに脱保護材であるＤＴＴを反応させたところ１３分にピークが移動した。逆層カラムにおいてピークが早くなった（２６から１８分）ことと、ＤＴＴと反応したことから、これが望みのものと判断した。
【０１１１】
〔実施例６〕遺伝子発現の抑制
レポータージーンであるルシフェラーゼや内在性のタンパク質をターゲットにしたｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡを実施例４で示した方法でペプチドと複合体を形成し、この複合体をインビトロジェン社から発売されているトランスフェクション試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００でＨｅｌａ細胞にトランスフェクションした後にタンパク質の発現を調べれば、タンパク質の発現が抑制されていることがわかる。
【０１１２】
まとめ
今回、本発明者らは、簡便で安価な長鎖ＤＮＡとペプチドとの共有結合による複合体形成を目指し開発を行った。本発明者らが合成した新規化合物（ｄｄＹＴＰ）は極めて良く酵素ＴｄＴにより認識され、ＤＮＡに付加した。本発明者らの手法は従来の手法と異なり、修飾したいＤＮＡに化合物と酵素を混ぜるだけで修飾でき、核酸合成器による修飾核酸の導入（Ｚａｎｔａら）など煩雑な操作がいらない。また、リガーゼを使って修飾核酸を導入する（Ｚａｎｔａら）のと比べても、極めて効率が良く、少量の酵素で多くのＤＮＡが修飾されるので安価である。この手法によって修飾されたＤＮＡはシステインと共有結合することにより、ペプチドと極めて安定な複合体を形成する。この手法を用いることにより、今回示したペプチドだけでなく、様々なチオール基を有する化合物とＤＮＡが安定な複合体を形成することができる。調べた範囲ではＤＮＡに直接マレイミドラベルした系は初めてである。従来までは図１１に示すように５’末端にアミノリンカーを含むＤＮＡにスクシイミドで活性化したマレイミドエステルを反応させマレイミド化していた。この方法では修飾核酸をＤＮＡ合成機で合成するためコストがかかる上、アミノ基との反応は収率が低い。それに比べ今回示した方法は、ＤＮＡの３’末端にほぼ１００％の収率で修飾されていた。
【０１１３】
【発明の効果】
本発明により、新規な修飾核酸が提供された。この修飾核酸を核酸に導入し、さらに、他の化合物と反応させることにより、核酸と他の化合物とが共有結合で結合した安定な複合体を作製することができる。この複合体は、医薬品、実験用試薬・材料などとして利用可能である。
【０１１４】
【配列表】
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【０１１５】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１は、実施例４で用いたｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【０１１６】
配列番号２は、実施例４で用いたＳＶ４０由来の核移行シグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡ−ペプチドの複合体による応用例を示す。
【図２】Ｎｅｖｅらによって報告されたプラスミドとＮＬＳの複合体形成法を示す。
【図３】Ｚａｎｔａらが合成したＤＮＡとＮＬＳの複合体を示す。
【図４】ＴｄＴによるＤＮＡの３’末端へのヌクレオチド（ｄＮＴＰ）付加反応を示す。
【図５】実施例１で合成した化合物の構造式を示す。
【図６】マレイミドとチオールの反応を示す。
【図７】実施例１で合成した新規核酸アナログの合成法を示す。
【図８】ＤＮＡの３’末端へのｄｄＹＴＰの取り込みを示す。
【図９】マレイミドで修飾されたＤＮＡとシステインの反応の結果を示す。
【図１０】長鎖ＤＮＡとペプチドとの反応の結果を示す。
【図１１】従来までのＤＮＡのマレイミド化の方法を示す。
【図１２】実施例５で合成した新規核酸アナログの合成法を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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