(57)【要約】【課題】ウイルスの増殖に関与する植物の内在性遺伝子の発現を抑制して、ウイルスに対する抵抗性を有する植物を生産する方法、および当該生産方法によって生産されたウイルス抵抗性植物を提供する。【解決手段】ウイルスの増殖に関連する宿主因子をコードする遺伝子の発現を、ＲＮＡｉによって抑制することにより、上記ウイルスに対して抵抗性を有する植物を生産することができる。さらに、上記宿主因子が複数ある場合は、これら複数の宿主因子の発現を全て抑制することにより、ウイルスに対してより強力な抵抗性を有する植物を生産できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの増殖に関連する宿主因子をコードする遺伝子の発現を、ＲＮＡｉによって抑制することにより、上記ウイルスに対して抵抗性を有する植物を生産することを特徴とするウイルス抵抗性植物生産方法。
【請求項２】
上記ウイルスが、トバモウイルスであることを特徴とする請求項１に記載のウイルス抵抗性植物生産方法。
【請求項３】
上記ウイルスが、タバコモザイクウイルスであることを特徴とする請求項１または２に記載のウイルス抵抗性植物生産方法。
【請求項４】
上記植物がシロイヌナズナである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のウイルス抵抗性植物生産方法。（ａ）配列番号２、または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【請求項５】
上記植物がタバコである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のウイルス抵抗性植物生産方法。
（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【請求項６】
さらに、上記宿主因子である、以下の（ｅ）または（ｆ）のタンパク質をコードする遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制することにより、ウイルスに対してより強い抵抗性を有する植物を生産することを特徴とする請求項５に記載のウイルス抵抗性植物生産方法。
（ｅ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｆ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【請求項７】
上記植物がトマトである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ｇ）または（ｈ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のウイルス抵抗性植物生産方法。
（ｇ）配列番号１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｈ）配列番号１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【請求項８】
上記植物がメロンである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ｉ）または（ｊ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のウイルス抵抗性植物生産方法。
（ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｊ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のウイルス抵抗性植物生産方法によって生産されることを特徴とするウイルス抵抗性植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルス（例えば、トバモウイルス）に対して抵抗性を示す植物の生産方法、およびこの方法により生産されるウイルス抵抗性植物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トバモウイルス（ｔｏｂａｍｏ  ｖｉｒｕｓ）グループは、幅広い種類の植物に感染するウイルスグループであり、種々の植物病に対する疾病の原因として知られている。なかでも特に、タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、以下、単にＴＭＶと称する）によって引き起こされる植物病がよく知られている。
【０００３】
ＴＭＶの感染によって引き起こされるタバコモザイク病は、古くから知られた植物病の一つで、葉にモザイク症状が生じ、成長が悪くなったり葉に奇形を生じたりする植物病である。このＴＭＶは、単子葉植物を含む数多くの植物に対して寄生性を有することが知られている。
【０００４】
このようなＴＭＶ等のトバモウイルスによって引き起こされる植物病の防除手段としては、従来から農薬の散布等が知られている。さらに、近年では、遺伝子工学的手法により、ウイルス抵抗性植物の分子育種が試みられている。このような分子育種としては、ウイルス遺伝子等の外来遺伝子の導入によって植物ウイルス感染を阻害する方法が一般的に行われている。例えば、ＴＭＶのＣＰ（ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を導入したウイルス抵抗性植物は、５％程度のみがウイルス感染によって病徴を示す（例えば、非特許文献１参照）。また、この他にも弱毒ウイルス株のゲノム遺伝子を植物体に発現させて、ウイルス抵抗性を付与する方法が知られている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
ところで、このようなＴＭＶ等のウイルスが有するウイルスゲノムは、限られた遺伝情報しかコードしていないため、ウイルスの増殖にはウイルス自身がコードする因子の他に、宿主細胞（宿主生物）内の宿主因子が必要不可欠であることが知られている。
【０００６】
かかる宿主因子として、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＴＯＭ１（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １）遺伝子、ＴＯＭ３（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ３）遺伝子が知られている（例えば、非特許文献３、４参照）。ＴＯＭ１遺伝子、ＴＯＭ３遺伝子は、シロイヌナズナのゲノムから、ＴＭＶ等のトバモウイルスの増殖に関与する宿主因子をコードする遺伝子として同定、単離されたものである。これらの遺伝子は互いにホモログの関係にあり、いずれも７回膜貫通タンパク質をコードしていると予測されている。
【０００７】
そして、上記ＴＯＭ１遺伝子を欠損するシロイヌナズナ突然変異株では、ＴＭＶの増殖が野生型に比べて低く抑えられることが知られている。さらに、そのホモログであるＴＯＭ３遺伝子をも欠損する二重突然変異株では、ＴＭＶの増殖が完全に抑えられることがわかっている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｐｏｗｅｌｌ−Ａｂｅｌ，  Ｐ．他著、「Ｄｅｌａｙ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２、ｐ．７３８−７４３、（１９８６）
【０００９】
【非特許文献２】
Ｙａｍａｙａ  Ｊ．他著、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ」、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３１５，  ｐ．１７３−１７５、１９８８
【００１０】
【非特許文献３】
Ｔａｋｕｙａ  Ｙａｍａｎａｋａ他著、「ＴＯＭ１，  ａｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ，  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、Ａｕｇｕｓｔ  ２９，  ２０００、ｖｏｌ．９７、ｎｏ．  １８、ｐ．１０１０７−１０１１２
【００１１】
【非特許文献４】
Ｔａｋｕｙａ  Ｙａｍａｎａｋａ他著、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｔｗｏ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｈｏｓｔ  Ｇｅｎｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７６、Ｎｏ．５、Ｍａｒ．  ２００２，  ｐ．２４９１−２４９７
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のような農薬による植物病の防除では、残留農薬の問題や環境、動植物、および人に対する安全上の問題がある。
【００１３】
また、上述のような外来遺伝子、特にウイルス遺伝子を植物体に導入してウイルス抵抗性植物を作製する場合は、例えば、ウイルス遺伝子を導入した形質転換植物において、植物体内で発現するウイルスＲＮＡの一部が外から感染してくるウイルスＲＮＡと組換えを起こし、自然界に存在し得ない新たなウイルスが出現するという問題がある。また、ウイルス遺伝子を導入した植物が、長期的に人体や環境へどのような影響を及ぼすのか不明であるといった安全性や環境への問題もある。
【００１４】
したがって、環境、植物、動物、および人への安全性がより高いウイルス抵抗性植物、およびその生産方法が強く望まれていた。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ウイルスの増殖に関与する植物の内在性遺伝子の発現を抑制して、ウイルスに対する抵抗性を有する植物を生産する方法、および当該生産方法によって生産されたウイルス抵抗性植物を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ｃＤＮＡライブラリーから、シロイヌナズナＴＯＭ１遺伝子およびＴＯＭ３遺伝子のホモログＮｔＴＯＭ１（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ−ＴＯＭ１  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）遺伝子およびＮｔＴＯＭ３（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ−ＴＯＭ３  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）遺伝子を単離・同定し、ＲＮＡｉにより当該遺伝子の発現を抑制したところ、当該形質転換タバコ体内におけるＮｔＴＯＭ１遺伝子、ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現抑制に伴って、ＴＭＶの増殖が抑制されることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、ウイルスの増殖に関連する宿主因子をコードする遺伝子の発現を、ＲＮＡｉによって抑制することにより、上記ウイルスに対して抵抗性を有する植物を生産することを特徴としている。
【００１８】
上記の方法によれば、ＲＮＡｉによってウイルスの増殖に関連する宿主因子をコードする遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。このため、植物に感染したウイルスが植物体内で増殖することを抑制できる。したがって、ウイルスに対して抵抗性を有する植物を容易に生産することが可能となる。さらに、本発明によれば、外来遺伝子、特にウイルス遺伝子等を植物体に導入することがないため、環境、動植物、および人に対する安全性の高い植物を生産することが可能となる。
【００１９】
なお、上記宿主因子が複数ある場合は、複数の宿主因子をコードする遺伝子の発現を共に抑制することにより、ウイルスに対してより強力な抵抗性を有する植物を生産できる。
【００２０】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記ウイルスが、トバモウイルスであることを特徴としている。
【００２１】
上記の方法によれば、幅広い植物に感染するトバモウイルスに対する抵抗性を有する植物を容易に生産することができる。
【００２２】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記ウイルスが、タバコモザイクウイルスであることを特徴としている。
【００２３】
上記の方法によれば、トマト、メロン、タバコ等の多くの農業的に有用な植物資源に感染するＴＭＶに対する抵抗性を有する植物を容易に生産することができる。
【００２４】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記植物がシロイヌナズナである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴としている。（ａ）配列番号２、または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号２、または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【００２５】
上記の方法によれば、例えば、ウイルス（例えば、トバモウイルス、ＴＭＶ等）の増殖に関連する宿主因子であるＴＯＭ１遺伝子またはＴＯＭ３遺伝子の発現を確実に抑制することができる。これによって、シロイヌナズナに感染したウイルスの増殖を効果的に抑制することができるため、ウイルスに対して高い抵抗性を有するシロイヌナズナを容易に生産することができる。
【００２６】
なお、ＴＯＭ１遺伝子の発現を抑制した上で、さらにＴＯＭ３遺伝子の発現を抑制することがより好ましい。これによってより強力にウイルス抵抗性を有するシロイヌナズナを生産できる。
【００２７】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記植物がタバコである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴としている。（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【００２８】
上記の方法によれば、例えば、ウイルス（例えば、トバモウイルス、ＴＭＶ等）の増殖に関連する宿主因子であるＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現を確実に抑制することができる。これによって、タバコに感染したウイルスの増殖を効果的に抑制することができるため、ウイルスに対して高い抵抗性を有するタバコを容易に生産することができる。
【００２９】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、さらに、上記宿主因子である、以下の（ｅ）または（ｆ）のタンパク質をコードする遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制することにより、ウイルスに対してより強い抵抗性を有する植物を生産することを特徴としている。（ｅ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｆ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【００３０】
上記の方法によれば、例えば、ウイルス（例えば、トバモウイルス、ＴＭＶ等）の増殖に関連する宿主因子であるＮｔＴＯＭ１遺伝子とＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を同時に抑制することができるため、ウイルスに対してより強い抵抗性を有するタバコを容易に生産することができる。
【００３１】
なお、ＲＮＡｉによりＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制された植物個体を生産する具体的な方法としては、例えば、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されている個体（タバコ）と、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されている個体とを掛け合わせる方法、または一個体に、ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現とＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現とを抑制するためのＲＮＡｉプラスミド（１または複数のプラスミドでもかまわない）を導入する方法等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００３２】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記植物がトマトである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ｇ）または（ｈ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴としている。（ｇ）配列番号１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｈ）配列番号１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【００３３】
上記の方法によれば、例えば、ウイルス（例えば、トバモウイルス、ＴＭＶ等）の増殖に関連する宿主因子であるＬｅＴＨ１遺伝子、ＬｅＴＨ２遺伝子、またはＬｅＴＨ３遺伝子の発現を確実に抑制することができる。これによって、トマトに感染したウイルスの増殖を効果的に抑制することができるため、ウイルスに対して抵抗性を有するトマトを容易に生産することができる。
【００３４】
なお、ＬｅＴＨ３遺伝子の発現を抑制した上で、さらにＬｅＴＨ１遺伝子、及び／またはＬｅＴＨ２遺伝子の発現を抑制することがより好ましい。これによってより強力にウイルス抵抗性を有するトマトを生産できる。
【００３５】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記植物がメロンである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ｉ）または（ｊ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴としている。（ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｊ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【００３６】
上記の方法によれば、例えば、ウイルス（例えば、トバモウイルス、またはＴＭＶ等）の増殖に関連する宿主因子であるＣｍＴＨ１遺伝子の発現を確実に抑制することができる。これによって、メロンに感染したウイルスの増殖を効果的に抑制することができるため、ウイルスに対して抵抗性を有するメロンを容易に生産することができる。
【００３７】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物は、上記の課題を解決するために、上記いずれかウイルス抵抗性植物生産方法によって生産されることを特徴としている。
【００３８】
上記の構成によれば、本発明にかかるウイルス抵抗性植物（例えば、タバコ、シロイヌナズナ、トマト、またはメロン等）は、ウイルスに対して高い抵抗性を有する。さらに、外来遺伝子、特にウイルス遺伝子等を植物体に導入していないため、環境、動植物、および人に対して非常に安全性が高い。
【００３９】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＲＮＡｉを利用し、ウイルスの増殖に必要な宿主因子をコードする遺伝子の発現を抑制することによって、ウイルスが植物に感染しても当該植物体内で増殖できないウイルス抵抗性植物を生産することができる方法、およびこの方法によって生産されるウイルス抵抗性植物を提供するものである。そこで以下では、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法、およびウイルス抵抗性植物について説明することとする。
【００４０】
本発明のウイルス抵抗性植物生産方法、およびウイルス抵抗性植物に関する実施の一形態について図１〜図１３に基づいて説明すれば以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４１】
（１）ウイルス抵抗性植物生産方法
本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、ウイルスの増殖に関連する宿主因子をコードする遺伝子の発現を、ＲＮＡｉによって抑制することにより、上記ウイルスに対して抵抗性を有する植物を生産する方法であればよく、その他の工程、条件等は特に限定されるものではない。
ＲＮＡｉとは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡ干渉）によって特定の遺伝子の発現を抑制する技術である。ＲＮＡｉは、例えば、短鎖の二本鎖ＲＮＡを細胞、組織、器官、個体等に導入することにより、引き起こすことができる。短鎖の二本鎖ＲＮＡが細胞内に導入されると、それとハイブリダイズするｍＲＮＡの分解が促進されるために、標的遺伝子の発現が抑制されることになる。細胞への二本鎖ＲＮＡ注入法は、リポソーム法、電気穿孔方、マイクロインジェクション等が挙げられるが、特に限定されるものではない。なお、注入する二本鎖ＲＮＡは、２１〜２３塩基対であることがより好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４２】
また、上記の方法以外にＲＮＡｉを実施する方法として、発現を抑制したい遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖とが転写されるようにリンカー配列を介して接続した遺伝子カセットを宿主細胞内でｉｎ  ｖｉｖｏ  転写させ、分子内で２本鎖を形成するようなＲＮＡ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＲＮＡ）を生成させることによって、当該ＲＮＡに相当する宿主遺伝子の発現を抑制する方法が挙げられる。この方法によれば、前述の方法に比べて、より継続的に細胞、組織、器官、個体等においてＲＮＡｉを発生させることができ、その結果としてより持続的に標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００４３】
具体的には、例えば、図２（ａ）に示すように、図中Ｐ３５Ｓで示すカリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡプロモーター下流に、ウイルスの増殖に関与する宿主因子であるＴＯＭ１ホモログ（例えば、ＮｔＴＯＭ１遺伝子）の逆向きｃＤＮＡ、リンカー配列としてのＧＵＳ（β−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子断片、ＴＯＭ１ホモログ（例えば、ＮｔＴＯＭ１遺伝子）の順向きｃＤＮＡを順に挿入したコンストラクト（ＲＮＡｉプラスミド）を作製する。そして、このＲＮＡｉプラスミドを植物内に導入して、ｉｎ  ｖｉｖｏ  転写させることにより、図２（ｂ）に示すような分子内で２本鎖を形成するｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＲＮＡを生成させる。これによって、植物体内の当該ＲＮＡ（遺伝子）に相当する内在性ＴＯＭ１ホモログ遺伝子の発現が抑制されることになる。
【００４４】
なお、上記ＲＮＡｉプラスミドに用いる宿主因子をコードする遺伝子としては、ＴＯＭ１ホモログ遺伝子に限られるものではなく、シロイヌナズナのＴＯＭ１遺伝子、ＴＯＭ３遺伝子、および種々の植物のＴＯＭ１ホモログ遺伝子、ＴＯＭ３ホモログ遺伝子であってもよいことはいうまでもない。また、上記ＲＮＡｉプラスミドに組み込まれるアンチセンス鎖の遺伝子とセンス鎖の遺伝子との並ぶ順序、向き等は、植物体内でｉｎ  ｖｉｖｏ  転写され生成されるＲＮＡが、ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＲＮＡとして分子内で２本鎖を形成するような順序、向き等であればよく、特に限定されるものではない。
【００４５】
また、上記ＲＮＡｉの実施方法およびベクター等の材料は、植物体内の目的遺伝子の発現を抑制できる方法、材料等であればよく、上記の方法、材料等に限定されるものではなく、従来公知のＲＮＡｉの実施方法、材料等を利用することができる。具体的には、例えば、ＴＯＭ１ホモログアンチセンス鎖とＴＯＭ１ホモログセンス鎖とを接続するリンカー配列は、β−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ遺伝子断片に限られるものではなく、ｉｎ  ｖｉｖｏ  転写で生成されるＲＮＡが、分子内で２本鎖を形成するｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＲＮＡ構造をとることができる従来公知のリンカー配列であればよく、そのリンカー配列の塩基配列、長さ、向き等は特に限定されるものではない。また、プロモーター配列もカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターに限られるわけではなく、分子内で２本鎖を形成することになるｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏ  転写で生成できる従来公知のプロモーター（強力で恒常的に読まれるもの）であればよい。なお、特定の発生時期あるいは特定の組織、器官等で機能するプロモーター、または特定の条件で機能するプロモーター等を用いることも可能である。
【００４６】
また、上記ＲＮＡｉプラスミドを作製する方法も、従来公知の方法を利用することができ、特に限定されるものではない。例えば、ＰＣＲ、制限酵素処理等の従来公知の遺伝子工学的方法が利用できる。
【００４７】
また、上記プラスミドを植物体内に導入する方法としては、従来公知の遺伝子工学的方法、物理的方法、または化学的方法等が挙げられる。例えば、後述する実施例に示すように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いたリーフディスク法、微小ガラス管で顕微鏡下に直接ＤＮＡを注入するマイクロインジェクション法、瞬時の高電圧によって細胞膜に微小な穴を開けるエレクトロポレーション法、金粒子にＤＮＡを結合させ特殊な銃で組織に撃ち込む粒子銃を利用した方法等の従来公知の方法が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００４８】
また、上記ウイルスは、トバモウイルスであることが好ましい。トバモウイルスグループは、アルファ様ウイルススーパーグループに分類される、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスである。また、トバモウイルスの中でも、特に、ＴＭＶであることが好ましい。ＴＭＶをはじめとするトバモウイルスは、多くの植物に感染し、植物病の原因となるウイルスである。このため、ＴＭＶ等のトバモウイルスの植物体内での増殖を抑えることにより、ＴＭＶ等のトバモウイルスの感染、増殖によって引き起こされる植物病の発生を確実に抑制することができる。
【００４９】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする遺伝子は、上記植物がシロイヌナズナである場合、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であればよい。（ａ）配列番号２、または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号２、または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。これらの遺伝子として、例えば、配列番号１に示されるＴＯＭ１ｃＤＮＡ、配列番号３に示されるＴＯＭ３  ｃＤＮＡ等が挙げられる。
【００５０】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする遺伝子は、上記植物がタバコである場合、以下の（ｃ）または（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子であればよい。（ｃ）配列番号６、または８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｄ）配列番号６、または８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。これらの遺伝子として、例えば、配列番号５で示されるＮｔＴＯＭ１  ｃＤＮＡ等が挙げられる。なお、上記タバコは、ウイルス（ＴＭＶ）抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子を有していることが好ましいが、特に限定されるものではない。
【００５１】
また、ＲＮＡｉにより、上記（ｃ）または（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制し、さらに、以下の（ｅ）または（ｆ）のタンパク質をコードする遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制することによって、ウイルスに対してより強い抵抗性を有する植物を生産する方法であることが好ましい。（ｅ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｆ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。これらの遺伝子として、例えば、配列番号７で示されるＮｔＴＯＭ３  ｃＤＮＡ等が挙げられる。
【００５２】
すなわち、ＲＮＡｉにより、ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現を抑制したうえで、さらに、ＲＮＡｉにてＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を抑制する場合等が挙げられる。これは、後述する実施例に示すように、ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現のみを抑制した場合は、十分なウイルス増殖抑制効果が得られなかったが、ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現のみを抑制した場合は十分なウイルス増殖抑制効果が得られ、さらに、ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を同時に抑制すると、より強力なウイルス増殖抑制効果を得ることができるためである。
【００５３】
なお、ＲＮＡｉによって複数のＴＯＭ１ホモログ遺伝子の発現を同時に抑制された植物個体を生産する具体的な方法としては、例えば、後述する実施例に示すように、ＲＮＡｉによって一つのＴＯＭ１ホモログ遺伝子の発現が抑制されている植物個体と、ＲＮＡｉによって他のＴＯＭ１ホモログ遺伝子の発現が抑制されている植物個体とを掛け合わせる方法、または複数のＴＯＭ１ホモログ遺伝子の発現を同時に抑制するためのＲＮＡｉプラスミド（１または複数のプラスミドでもかまわない）を一植物個体に導入する方法等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００５４】
ここで、ＮｔＴＯＭ１遺伝子、ＮｔＴＯＭ３遺伝子について詳細に説明する。ＮｔＴＯＭ１遺伝子、ＮｔＴＯＭ３遺伝子は、シロイヌナズナのＴＯＭ１遺伝子、ＴＯＭ３遺伝子のタバコホモログとして見出された遺伝子であり、トバモウイルスのタバコ内での増殖に関与する宿主因子をコードしている。シロイヌナズナのＴＯＭ１遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列のうち、１３９〜１０１４番目の塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有する１２１５塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号２に示される２９１残基のアミノ酸配列からなるＴＯＭ１タンパク質をコードしている。また、ＴＯＭ３遺伝子は、配列番号３に示される塩基配列をＯＲＦとして有する９１２塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号４に示される３０３残基のアミノ酸配列からなるＴＯＭ３タンパク質をコードしている。
【００５５】
また、タバコのＮｔＴＯＭ１遺伝子は、配列番号５に示される塩基配列のうち、１２４〜９９０番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１１０６塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号６に示される２８８残基のアミノ酸配列からなるＮｔＴＯＭ１タンパク質をコードしている。ＮｔＴＯＭ３遺伝子は、配列番号７に示される塩基配列のうち、９８〜９８２番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１１２２塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号８に示される２９４残基のアミノ酸配列からなるＮｔＴＯＭ３タンパク質をコードしている。
【００５６】
これらＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＮｔＴＯＭ１タンパク質、およびＮｔＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１に示す。図中、線で囲んでいる領域は、これらのタンパク質相互間で相同性の高い領域を示す。この図１に示すように、ＴＯＭ１タンパク質とＮｔＴＯＭ１タンパク質とは高い相同性を示し、ＴＯＭ３タンパク質とＮｔＴＯＭ３タンパク質とは高い相同性を示している。また、これら４つのタンパク質はそれぞれ高い相同性を示している。さらに、タンパク質構造予測プログラムＳＯＳＵＩによれば、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、およびＮｔＴＯＭ３タンパク質は、７回膜貫通型のタンパク質であると予測され、ＮｔＴＯＭ１タンパク質は、６回膜貫通型のタンパク質であると予測される。
【００５７】
上述のように、ＴＯＭ１とＮｔＴＯＭ１とは相同性が高く、ＴＯＭ３とＮｔＴＯＭ３とは相同性が高いことから、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法において、植物がシロイヌナズナである場合、ＲＮＡｉによりＴＯＭ１遺伝子の発現を抑制することによって、効率的に高いウイルス抵抗性シロイヌナズナを生産することができると思われる。また、ＲＮＡｉによるＴＯＭ１遺伝子の発現抑制とともに、さらに、ＴＯＭ３遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することによって、ほぼ完全にウイルスの増殖を抑制できるウイルス抵抗性シロイヌナズナを生産することができると考えられる。
【００５８】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする遺伝子は、上記植物がトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）である場合、以下の（ｇ）または（ｈ）のタンパク質をコードする遺伝子であればよい。（ｇ）配列番号１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｈ）配列番号１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。これらの遺伝子としては、例えば、配列番号９で示されるＬｅＴＨ１（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ−ＴＯＭ１  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  １）ｃＤＮＡ、配列番号１１で示されるＬｅＴＨ２（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ−ＴＯＭ１  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ２）ｃＤＮＡ、配列番号１３で示されるＬｅＴＨ３（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ−ＴＯＭ１  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ３）ｃＤＮＡ等を挙げることができる。
【００５９】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする遺伝子は、上記植物がメロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）である場合、以下の（ｉ）または（ｊ）のタンパク質をコードする遺伝子であればよい。（ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｊ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。これらの遺伝子としては、例えば、配列番号１５に示されるＣｍＴＨ１（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ−ＴＯＭ１  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  １）ｃＤＮＡ等が挙げられる。
【００６０】
上記ＬｅＴＨ１遺伝子、ＬｅＴＨ２遺伝子、およびＬｅＴＨ３遺伝子は、シロイヌナズナのＴＯＭ１遺伝子のトマトホモログとして単離、同定された遺伝子である。また、ＣｍＴＨ１遺伝子は、シロイヌナズナのＴＯＭ１遺伝子のメロンホモログとして単離、同定された遺伝子である。これらの遺伝子はいずれも、トバモウイルスのトマトまたはメロン内での増殖に関与する宿主因子をコードしている。ＬｅＴＨ１遺伝子は、配列番号９に示される塩基配列のうち、１６０〜１０４７番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１３５３塩基対のｃＤＮＡに対応し、配列番号１０に示される２９５残基のアミノ酸配列からなるＬｅＴＨ１タンパク質をコードしている。また、ＬｅＴＨ２遺伝子は、配列番号１１に示される塩基配列のうち、１５６〜１０４９番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１３１６塩基対のｃＤＮＡに対応し、配列番号１２に示される２９７残基のアミノ酸配列からなるＬｅＴＨ２タンパク質をコードしている。また、ＬｅＴＨ３遺伝子は、配列番号１３に示される塩基配列のうち、３１〜８９７番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１２７８塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号１４に示される２８８残基のアミノ酸配列からなるＬｅＴＨ３タンパク質をコードしている。
【００６１】
また、ＣｍＴＨ１遺伝子は、配列番号１５に示される塩基配列のうち、２２４〜１１０２番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１２４２塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号１６に示される２９２残基のアミノ酸配列からなるＣｍＴＨ１タンパク質をコードしている。
【００６２】
これらＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質のアミノ酸配列と、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列とを比較したアライメントを図９に示す。また、ＣｍＴＨ１タンパク質とＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１０に示す。また、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１１に示す。なお、図中線で囲む領域は、相同性が高い領域を示す。
【００６３】
これらの結果から、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質は、ＴＯＭ３タンパク質とより相同性が高く、ＬｅＴＨ３タンパク質は、ＴＯＭ１タンパク質とより相同性が高いことがわかった。このため、ＬｅＴＨ３タンパク質はＴＯＭ１タンパク質のトマトホモログ、ＬｅＴＨ１タンパク質はＴＯＭ３タンパク質のトマトホモログ、ＣｍＴＨ１タンパク質はＴＯＭ３タンパク質のメロンホモログである可能性がある。なお、タンパク質構造予測プログラムＳＯＳＵＩによれば、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質は６回膜貫通型タンパク質と予測され、ＬｅＴＨ３タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質は７回膜貫通型のタンパク質と予測された。
【００６４】
さらに、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＮｔＴＯＭ１タンパク質、ＮｔＴＯＭ３タンパク質、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１２に示す。図中、線で囲んだ範囲は、同一のアミノ酸残基であることを示し、色（グレー）を付した箇所は、類似のアミノ酸残基であることを示す。また、図中の矢印は、ＴＯＭ１タンパク質、ＮｔＴＯＭ１タンパク質、およびＬｅＴＨ２タンパク質と比較して、ＬｅＴＨ３タンパク質が有する独特のアミノ酸残基を示す。同図に示すように、これら８つのタンパク質は、相互に高い相同性を有していることがわかる。
【００６５】
また、上記のタンパク質のアライメントの結果に基づいて作成したＴＯＭ１ホモログのアミノ酸配列に基づいた系統樹を図１３に示す。なお、上記系統樹は、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｍａｃ  （Ｍｅｔｈｏｄ：  ＵＰＧＭＡ）を用いて作成した。この図に示すように、ＬｅＴＨ３タンパク質とＮｔＴＯＭ１タンパク質とが近縁であり、いずれもＴＯＭ１ホモログと考えられる。また、ＬｅＴＨ１タンパク質とＮｔＴＯＭ３タンパク質とが近縁であり、いずれもＴＯＭ３ホモログと考えられる。また、ＣｍＴＨ１タンパク質もＴＯＭ３ホモログと考えられる。なお、ＬｅＴＨ２タンパク質は、ＴＯＭ３タンパク質よりもＴＯＭ１タンパク質に近縁であることがわかった。
【００６６】
これらのことから、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法において、植物がトマトである場合、ＲＮＡｉによりＬｅＴＨ３遺伝子の発現を抑制することによって、効率的に高いウイルス抵抗性トマトを生産することができると思われる。また、ＲＮＡｉによるＬｅＴＨ３遺伝子の発現抑制とともに、さらに、ＬｅＴＨ１遺伝子、及び／またはＬｅＴＨ２遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することによって、ほぼ完全にウイルスの増殖を抑制できるウイルス抵抗性トマトを生産することができると思われる。
【００６７】
また、本発明のウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。さらに、本発明のウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする「遺伝子」は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００６８】
以上のように、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法によれば、植物体内でウイルスの増殖に関連する宿主因子の発現がＲＮＡｉによって抑制されることにより、当該植物に感染したウイルスは増殖することができなくなる。このため、環境、動植物、および人に対して危険の大きい、ウイルス由来の遺伝子等の外来性遺伝子を導入することなく、ウイルスの増殖を効率的に抑制することが可能である。このため、ＴＭＶ等のウイルスに対して優れた抵抗性を有するとともに、環境、動植物、および人に対して安全性の高い植物を容易に生産することが可能である。
【００６９】
さらに、本発明は、ＲＮＡｉを利用して、ウイルスの増殖に関連する宿主因子をコードする遺伝子の発現を抑制しているため、例えば、当該宿主因子をノックアウトする場合（例えば、当該宿主因子をコードする遺伝子に変異を導入して機能欠損植物を作製する場合等）に比べて、植物に対する負荷も少なくてすむ。さらに、植物の特定遺伝子をノックアウトする場合よりも、簡単に特定遺伝子の機能を抑えた植物を生産できる。したがって、本発明にかかるウイルス抵抗性生産方法は、簡便かつ安全性の高い技術であるといえる。
【００７０】
（２）本発明にかかるウイルス抵抗性植物
本発明にかかるウイルス抵抗性植物は、上記のウイルス抵抗性植物生産方法によって生産される植物であればよく、その他の構成等は特に限定されるものではない。
【００７１】
本発明にかかるウイルス抵抗性植物は、ＲＮＡｉによって、ウイルスの増殖に関与する宿主因子の発現が抑制されるため、当該植物にウイルスが感染した場合でも、ウイルスの増殖が効率的に抑制されることになる。したがって、本発明にかかるウイルス抵抗性植物は、ウイルスに対して高い抵抗性を有する植物である。さらに、ウイルス由来の遺伝子等の外来性遺伝子を有しないため、環境、動植物、および人に対して非常に安全性の高い植物でもある。
【００７２】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７３】
【実施例】
〔１〕実験材料および方法
まず、本実施例に用いた実験材料および実験方法について説明する。まず、植物としてタバコを使用した。より具体的には、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ．  Ｓａｍｓｕｎ、およびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ．  Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮを用いた。上記Ｓａｍｓｕｎ系統は、ＴＭＶ抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子をもたず、ＴＭＶが全身感染する系統であり、上記Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ系統は、ＴＭＶ抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子を有し、ＴＭＶ感染によって壊死病斑を形成する系統である。
【００７４】
植物体への接種に使用したウイルスは、ＴＭＶ−Ｌ株（タバコモザイクウイルス，トマト系統）（Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ９６，  ｐ．１９１５−１９２３）、ＣＭＶ−Ｙ株（キュウリモザイクウイルス，黄斑系統）（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ３  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １８３，  ｐ．１０６−１１３）である。また、タバコにＲＮＡｉを引き起こすプラスミドを導入するためのリーフディスク法に使用した菌株は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０５株である。
【００７５】
タバコの生育条件は、育苗用培養土を用いて、１６時間日長、２３℃での温室で水道水を与えて育てた。タバコの交雑は、雌親にするつぼみを選び，そのつぼみから花弁および雄しべをピンセットを用いて取り除き，雌しべを露出させた。そして、雄親にする花から雄しべをピンセットで取り出し、雌しべの柱頭に接触させて花粉を付着させた。ピンセットは７０％エタノールで消毒しながら行った。また、タバコのＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）  を使用し、方法は添付の説明書に従った。
【００７６】
〔２〕シロイヌナズナＴＯＭ１、ＴＯＭ３のタバコホモログの単離
シロイヌナズナＴＯＭ１遺伝子（配列番号１参照）、ＴＯＭ３遺伝子（配列番号３参照）のタバコにおけるホモログを同定、単離した。具体的には、シロイヌナズナＴＯＭ１遺伝子、ＴＯＭ３遺伝子のホモログのｃＤＮＡ断片を、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲ  法を用いてタバコｃＤＮＡライブラリーから増幅し、クローン化した後、シークエンスにより塩基配列を決定した。さらに、得られた２種類の塩基配列情報をもとに、５’末端および３’末端ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ  （ＲＡＣＥ）  法を用いて完全長のｍＲＮＡ配列を決定した。それぞれの配列上には、図１に示すように、シロイヌナズナＴＯＭ１遺伝子、ＴＯＭ３遺伝子と相同性の高いアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、それらに対応する遺伝子をそれぞれＮｔＴＯＭ１遺伝子（配列番号５参照）、ＮｔＴＯＭ３遺伝子（配列番号７参照）と命名した。
【００７７】
〔３〕ＲＮＡｉによるＮｔＴＯＭ１遺伝子、ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現抑制
タバコにおいてＮｔＴＯＭ１遺伝子、ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を抑制することにより、ＴＭＶ耐性を付与できるのではないかと考え、ＲＮＡｉにより、上記遺伝子の発現抑制を試みた。
【００７８】
具体的には、図２（ａ）に示すように、ベクターｐＢＩ１２１の３５Ｓプロモーター下流に、ＮｔＴＯＭ１の逆向きｃＤＮＡ、ＧＵＳフラグメント（図中、ＧＵＳ  ｆｒ．で示すβ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅの遺伝子断片）、ＮｔＴＯＭ１の順向きｃＤＮＡを順に挿入したＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を従来公知のＰＣＲ、制限酵素処理等によって作製した。また、同様に、ベクターｐＢＩ１２１の３５Ｓプロモーター下流に、ＮｔＴＯＭ３の逆向きｃＤＮＡ、ＧＵＳフラグメント、ＮｔＴＯＭ３の順向きｃＤＮＡを順に挿入したＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を作製した。これらのＲＮＡｉプラスミドをタバコに導入することによって、図２（ｂ）に示すように、分子内で当該遺伝子の配列が２本鎖を形成するようなＲＮＡが  ｉｎ  ｖｉｖｏ  転写で生成され、タバコ体内でｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＲＮＡが生じる。
【００７９】
なお、ここで使用したベクターｐＢＩ１２１は、１３ｋｂの大きさを持つＴ−ＤＮＡベクターであり、抗生物質耐性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を有しており、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターと、このプロモーターにドライブされるＧＵＳフラグメント、およびポリＡ（アデニル酸）付加配列を有する。
【００８０】
その後、このＲＮＡｉプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いたリーフディスク法によりタバコに導入した。アグロバクテリウムを用いたリーフディスク法によるタバコの形質転換は、基本的にＨｏｌｓｔｅｒらの方法に従った（Ｈｏｌｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １６３，  ｐ．１８１−１８７）。詳細には、ＲＮＡｉプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの溶液中に葉の断片を入れた後、ディスクを植物ホルモン（０．１ｍｇ／Ｌ  ａ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄｓ  （ＮＡＡ  （ＢＡ））、１ｍｇ／Ｌ  ６−ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ）と５０ｍｇ／Ｌ  カナマイシンを含むＭＳ培地に静置した。この培地上で出芽した形質転換体シュートを選択し、この形質転換体シュートを選択培地（５０ｍｇ／Ｌ  カナマイシン）で生育させた。なお、形質転換にはＴＭＶに全身感染するＳａｍｓｕｎ系統と、ＴＭＶ抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子を有するＳａｍｓｕｎＮＮ系統の２種類のタバコを用いた。そこで、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を導入し形質転換した系統を、それぞれＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）と示して説明し、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を導入し形質転換した系統を、それぞれＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）と示して以下説明する。
【００８１】
〔４〕Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）の解析
次に、上記〔３〕で作製したＳａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）について詳細に解析した。具体的には、Ｎ遺伝子をもち、ＴＭＶの感染に伴って局所壊死病斑を形成するタバコＳａｍｓｕｎ  ＮＮ系統に、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を導入し、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子を発現抑制した株について、ノザンハイブリダイゼーション解析、およびＴＭＶローカルリージョンアッセイを行った。
【００８２】
まず、野生型Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ（ｗｔ）、およびＳａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）からそれぞれＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｉによって、内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されているか否かをノザンハイブリダイゼーション解析により調べた。ノザンハイブリダイゼーションによる解析は、基本的には、Ｉｓｈｉｋａｗａらの方法に従った（Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｍｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ」、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６７，  ｐ．５３２８−５３３８，  （１９９３））。具体的には、ＲＮＡ量は１サンプルにつき、１０μｇを用いた。また、プローブは、ＮｔＴＯＭ１ｃＤＮＡのＯＲＦ領域を鋳型として、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片を用いた。
【００８３】
その結果、図３（ｂ）に示すように、野生型Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ（図中ｗｔで示す）で確認された内在性ＮｔＴＯＭ１  ｍＲＮＡが、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）１、２、４〜７では確認できなかった（図中ＮｔＴＯＭ１  ｍＲＮＡで示す位置）。一方、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）１、２、４〜７では、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）由来のＲＮＡ（ＮｔＴＯＭ１  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＲＮＡ）が検出された（図中ＩＲで示す位置）。なお、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）３は、ＲＮＡｉプラスミドが導入できていないか、またはＲＮＡｉが十分に発生していないことによって、内在性のＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されていないと考えられた。これらのことから、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）では、ＲＮＡｉによって内在性のＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
【００８４】
続いて、ＴＭＶローカルリージョンアッセイについて説明する。ＴＭＶローカルリージョンアッセイとは、ウイルス抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子を有するタバコを用いたウイルスアッセイであり、具体的には以下のように行った。
【００８５】
ＴＭＶ抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子を有するタバコはウイルスを接種した場合、局所病斑（葉中の白い斑点）ができるが、この病斑の大きさや数によってウイルスの増殖の程度を観察できる。この性質を利用して、播種後約２ヶ月のタバコＳａｍｓｕｎ  ＮＮおよびＳａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）の約１０〜１５ｃｍの若い葉に、精製したＴＭＶ−Ｌを０．０５μｇ／ｍｌの濃度で接種した後、５日目または７日目に感染後の局所病斑を観察した。観察時にデジタルカメラで記録を保持した。
【００８６】
その結果、図３（ａ）に示すように、野生型Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ（ｗｔ）の葉には、ＴＭＶの感染によって局所壊死病斑が形成されたが、ＲＮＡｉによって内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されたＳａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）１、２、４〜７の葉には、局所壊死病斑がほとんど形成されなかった。このことから、ＲＮＡｉによるＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現抑制によって、ＴＭＶ感染による局所病斑の形成がほぼ完全に抑えられたと考えられる。なお、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）３の葉には、野生型Ｓａｍｓｕｎと同様に局所壊死病斑が形成された。これは、上述したように、内在性のＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されていないためと考えられた。
【００８７】
以上のことから、ＲＮＡｉによるＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現抑制にともなって、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体タバコ内でのＴＭＶの増殖を抑制することができることが明らかになった。
【００８８】
〔５〕Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）の解析
次いで、上記〔３〕で作製したＳａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）について詳細に解析した。具体的には、Ｎ遺伝子を有するＳａｍｓｕｎ  ＮＮ系統に、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を導入し、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ３遺伝子を発現抑制した株について、上記〔４〕と同様な方法で、ノザンハイブリダイゼーション解析、およびＴＭＶローカルリージョンアッセイを行った。
【００８９】
ノザンハイブリダイゼーション解析の結果を図４（ｂ）に示す。プローブには、ＮｔＴＯＭ３  ｃＤＮＡのＯＲＦ領域を用いた。この図４（ｂ）に示すように、野生型Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ（ｗｔ）で確認された内在性ＮｔＴＯＭ３  ｍＲＮＡが、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）１、３〜５では確認できなかった（図中ＮｔＴＯＭ３  ｍＲＮＡで示す位置）。一方、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）１、３〜５では、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）由来のＲＮＡ（ＮｔＴＯＭ３  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＲＮＡ）が検出された（図中ＩＲで示す位置）。また、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）２は、ＲＮＡｉプラスミドが導入できていないか、またはＲＮＡｉが十分に発生していないことによって、内在性のＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されていないと考えられた。これらのことから、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）において、ＲＮＡｉによって内在性のＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
【００９０】
続いて、ＴＭＶローカルリージョンアッセイの結果を図４（ａ）に示す。同図に示すように、野生型Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ（ｗｔ）も、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ３を発現抑制したＳａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）も、いずれも局所壊死病斑形成がほぼ同様に起こった。
【００９１】
以上の結果から、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ３の発現を単独で抑制しても、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体においては、それほどＴＭＶの増殖抑制効果が認められないことがわかった。
【００９２】
〔６〕Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）の解析
次に、上記〔３〕で作製したＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）について詳細に解析した。具体的には、Ｎ遺伝子を有しない、ＴＭＶの全身感染を許容するＳａｍｓｕｎ系統タバコに、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を導入し、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子を発現抑制した株について、上記〔４〕と同様な方法でノザンハイブリダイゼーション解析を行い、さらに、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積について解析を行った。
【００９３】
ノザンハイブリダイゼーション解析の結果を図５のパネルＢに示す。プローブには、ＮｔＴＯＭ１  ｃＤＮＡのＯＲＦ領域を用いた。同図に示すように、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコ（図中Ｓ  ｗｔで示す）で確認された内在性ＮｔＴＯＭ１  ｍＲＮＡが、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）１〜７では確認できなかった（図中ＮｔＴＯＭ１  ｍＲＮＡで示す位置）。一方、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）１〜７では、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）由来のＲＮＡ（ＮｔＴＯＭ１  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＲＮＡ）が検出された（図中ＩＲで示す位置）。これらのことから、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体において、ＲＮＡｉによって内在性のＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
【００９４】
続いて、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた。具体的には、ＴＭＶ接種後４日目の接種葉を刈り取り、抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ＣＢＢにて染色しＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた。
【００９５】
その結果を図５のパネルＡに示す。Ｓ  ｗｔは、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコを示し、Ｓ  ｗｔ（１／１０）は、１０倍希釈したＳ  ｗｔのタンパク質抽出物を示す。同図に示すように、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）では、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコに比較して、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積が少ないが、全く蓄積されていないわけではないことがわかった。
【００９６】
以上のことから、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）において、ＲＮＡｉによりＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現を抑制することによって、ＴＭＶの増殖を抑制することができるが、完全には抑制できないことがわかった。
【００９７】
〔７〕Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）の解析
続いて、上記〔３〕で作製したＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）について詳細に解析した。具体的には、Ｎ遺伝子を有しない、ＴＭＶの全身感染を許容するＳａｍｓｕｎ系統タバコに、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を導入し、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ３遺伝子を発現抑制した株について、上記〔４〕と同様な方法でノザンハイブリダイゼーション解析を行い、さらに上記〔６〕と同様の方法でＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積について解析を行った。
【００９８】
ノザンハイブリダイゼーション解析の結果を図６のパネルＢに示す。プローブには、ＮｔＴＯＭ３  ｃＤＮＡのＯＲＦ領域を用いた。同図に示すように、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコ（図中Ｓ  ｗｔで示す）で確認された内在性ＮｔＴＯＭ３  ｍＲＮＡが、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）１〜４、６では確認できなかった（図中ＮｔＴＯＭ３  ｍＲＮＡで示す位置）。一方、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）１〜４、６では、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）由来のＲＮＡ（ＮｔＴＯＭ３  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＲＮＡ）が検出された（図中ＩＲで示す位置）。また、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）５は、ＲＮＡｉプラスミドが導入できていないか、またはＲＮＡｉが十分に発生していないことによって、内在性のＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されていないと考えられた。これらのことから、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体において、ＲＮＡｉによって内在性のＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
【００９９】
続いて、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた。その結果を図６のパネルＡに示す。Ｓ  ｗｔは、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコを示し、Ｓ  ｗｔ（１／１０）は、１０倍希釈したＳ  ｗｔのタンパク質抽出物を示す。同図に示すように、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）では、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコに比較して、ほぼ同様にＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質が蓄積されることがわかった。
【０１００】
以上のことから、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）において、ＲＮＡｉによりＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を単独で抑制しても、十分にＴＭＶの増殖を抑制することができないことがわかった。
【０１０１】
〔８〕ＲＮＡｉによるＮｔＴＯＭ１、ＮｔＴＯＭ３の同時抑制の効果
次に、ＲＮＡｉによって、内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子が共に発現抑制される個体を作製し、その性質を解析した。具体的には、図７に示すように、ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制したＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）と、ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制したＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）とを掛け合わせたタバコを作製した。なお、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）では，ＴＭＶ感染による局所病斑の形成がほぼ完全に見られなくなったため、掛け合わせにはＳａｍｓｕｎ形質転換体のみ用いた。また、掛け合わせには形質転換当代の株同士を用い、交雑によって得られたＦ１個体にＳｄ１−１、Ｓｄ１−２、・・・、Ｓｄ１−ｘと名前をつけた。ここで、Ｆ０植物個体である、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）とＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）とが、トランスジーンを独立な遺伝子座にそれぞれヘテロに有する場合、Ｆ１植物個体（Ｓｄ１−ｘ）の約１／４が、内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制された個体となると考えられる。
【０１０２】
そこで、掛け合わされたタバコ（Ｓｄ１−ｘ）について、ノザンハイブリダイゼーション解析を行い、内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制された個体の有無を調べた。
【０１０３】
その結果を図８（ｂ）に示す。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、全体のＲＮＡ量を示す。ｗｔは野生型Ｓａｍｓｕｎタバコを示す。同図に示すように、Ｓｄ１−８、Ｓｄ１−１１、およびＳｄ１−１４以外の個体が、ＲＮＡｉによって内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されている個体であった。一方、ＲＮＡｉによって内在性ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されている個体は、Ｓｄ１−２、Ｓｄ１−４、Ｓｄ１−９、およびＳｄ１−１６のみであった。以上の結果から、Ｓｄ１−２、Ｓｄ１−４、Ｓｄ１−９、およびＳｄ１−１６が、ＲＮＡｉによって内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制された個体であることがわかった。これらの株を図中に○（まる）をつけて示す。
【０１０４】
次に、掛け合わされたタバコ（Ｓｄ１−ｘ）について、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた。具体的には、ＴＭＶ−Ｌの接種４、７、１３、４３日後にウイルス接種葉を刈り取り、そこからタンパク質を抽出した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色によって、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた。その結果を図８（ａ）に示す。
【０１０５】
同図に示すように、Ｓｄ１−２、Ｓｄ１−４、Ｓｄ１−９、およびＳｄ１−１６のみ、ウイルス接種４〜１３日後まで、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積がみられなかった。以上のことから、ＲＮＡｉによって内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制された個体では、ＴＭＶの増殖はほぼ完全に抑制されたことがわかった。ただし、ＴＭＶ接種後４０日以上経過すると低レベルのＴＭＶの増殖が観察された。
【０１０６】
また、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制されても、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の増殖は影響を受けなかった（結果は不図示）。ＣＭＶは、アルファ様ウイルススーパーグループに属するが、トバモウイルスとは異なるウイルスである。これらのことから、ＲＮＡｉによる内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子とＮｔＴＯＭ３遺伝子との発現抑制によって、ＴＭＶの増殖が抑制される効果は、非特異的な効果ではないと考えられた。
【０１０７】
〔９〕タバコ以外の植物におけるＴＯＭ１ホモログについて
タバコの他にも、トマトに３つ、メロンに１つ、ＴＯＭ１ホモログが存在することが明らかとなり、これらを同定・単離し、それぞれＬｅＴＨ１遺伝子、ＬｅＴＨ２遺伝子、ＬｅＴＨ３遺伝子、およびＣｍＴＨ１遺伝子と名づけた。
【０１０８】
これらのＴＯＭ１ホモログ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図９に示す。同図に示すように、ＬｅＴＨ１遺伝子、ＬｅＴＨ２遺伝子、ＬｅＴＨ３遺伝子、およびＣｍＴＨ１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と、ＴＯＭ１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列とは、高い相同性を示すことがわかった。
【０１０９】
まず、これらＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質のアミノ酸配列と、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列とを比較したアライメントを図９に示す。図中線で囲む領域は、相同性が高い領域を示す。この図９に示すように、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質と、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質とは、高い相同性を示すことがわかった。また、ＬｅＴＨ１タンパク質は、ＴＯＭ３タンパク質とより相同性が高いことがわかった。
【０１１０】
また、ＣｍＴＨ１タンパク質とＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１０に示す。同図に示すように、ＣｍＴＨ１タンパク質とＴＯＭ３タンパク質とは、高い相同性を示すことがわかった。
【０１１１】
また、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１１に示す。同図に示すように、これら６つのタンパク質は、相互に高い相同性を有していることがわかった。
【０１１２】
これらの結果から、ＬｅＴＨ３タンパク質は、ＴＯＭ１タンパク質と相同性が高く、ＬｅＴＨ１タンパク質およびＣｍＴＨ１タンパク質は、ＴＯＭ３タンパク質とより相同性が高いことがわかった。このため、ＬｅＴＨ３タンパク質はＴＯＭ１タンパク質のトマトホモログ、ＬｅＴＨ１タンパク質はＴＯＭ３タンパク質のトマトホモログ、ＣｍＴＨ１タンパク質はＴＯＭ３タンパク質のメロンホモログである可能性がある。なお、タンパク質構造予測プログラムＳＯＳＵＩによれば、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質は６回膜貫通型タンパク質と予測され、ＬｅＴＨ３タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質は７回膜貫通型のタンパク質と予測された。
【０１１３】
以上のことから、トマトの内在性のＬｅＴＨ１遺伝子、ＬｅＴＨ２遺伝子、およびＬｅＴＨ３遺伝子のうち、いずれかの遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することによって、トマト内におけるＴＭＶの増殖を抑制できる可能性が極めて高いと考えられる。また、同様に、メロンの内在性のＣｍＴＨ１遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することによって、メロン内におけるＴＭＶの増殖を抑制できる可能性が極めて高いと考えられる。
【０１１４】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法によれば、高いウイルス抵抗性を有する植物を容易に生産することができるという効果を奏する。さらに、当該植物は、ウイルス遺伝子等の外来遺伝子を導入していないため、環境、植物、動物、および人に対して安全性の高い植物を提供可能であるという効果を奏する。
【０１１５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＮｔＴＯＭ１タンパク質、およびＮｔＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図２】（ａ）は、ＴＯＭ１ホモログのＲＮＡｉプラスミドの構造を模式的に示す図であり、（ｂ）は、（ａ）のＲＮＡｉプラスミドによって生成されるｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ＲＮＡを模式的に示す図である。
【図３】（ａ）は、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を導入したＳａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体におけるＴＭＶローカルリージョンアッセイの結果を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）の形質転換体におけるＮｔＴＯＭ１  ｍＲＮＡの蓄積を調べたノザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図４】（ａ）は、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を導入したＳａｍｓｕｎ  ＮＮ形質転換体におけるＴＭＶローカルリージョンアッセイの結果を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）の形質転換体におけるＮｔＴＯＭ３  ｍＲＮＡの蓄積を調べたノザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図５】パネルＡは、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を導入したＳａｍｓｕｎ形質転換体におけるＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた結果を示す図であり、パネルＢは、上記Ｓａｍｓｕｎ形質転換体におけるＮｔＴＯＭ１  ｍＲＮＡの蓄積を調べたノザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図６】パネルＡは、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を導入したＳａｍｓｕｎ形質転換体におけるＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた結果を示す図であり、パネルＢは、上記Ｓａｍｓｕｎ形質転換体におけるＮｔＴＯＭ３  ｍＲＮＡの蓄積を調べたノザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図７】ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を抑制した形質転換タバコを掛け合せにより作製した方法の説明図である。
【図８】（ａ）は、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を抑制した形質転換タバコにおけるＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた結果を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）の形質転換タバコにおけるＮｔＴＯＭ１  ｍＲＮＡおよびＮｔＴＯＭ３  ｍＲＮＡの蓄積を調べたノザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図９】ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、トマトのＴＯＭ１ホモログ（ＬｅＴＨ１〜ＬｅＴＨ３）のアミノ酸配列を比較したアライメントを示す図である。
【図１０】ＴＯＭ３タンパク質、メロンのＴＯＭ１ホモログ（ＣｍＴＨ１）のアミノ酸配列を比較したアライメントを示す図である。
【図１１】ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、トマトのＴＯＭ１ホモログ（ＬｅＴＨ１〜ＬｅＴＨ３）、およびメロンのＴＯＭ１ホモログ（ＣｍＴＨ１）のアミノ酸配列を比較したアライメントを示す図である。
【図１２】ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＮｔＴＯＭ１タンパク質、ＮｔＴＯＭ３タンパク質、トマトのＴＯＭ１ホモログ（ＬｅＴＨ１〜ＬｅＴＨ３）、およびメロンのＴＯＭ１ホモログ（ＣｍＴＨ１）のアミノ酸配列を比較したアライメントを示す図である。
【図１３】各種植物におけるＴＯＭ１ホモログのアミノ酸配列に基づいた系統樹を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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