(57)【要約】【課題】  ナノポアを通って転位するバイオポリマーの側方位置の変動性を制御する方法及び装置を提供する。【解決手段】  本発明の装置は、第１電極、第１電極に隣接する第２電極、第２電極に隣接する第３電極、第３電極に隣接する第４電極を備える。第１電極は第３電極と電気的に接続され電極の第１集合を画定し、第２電極は第４電極と電気的に接続され電極の第２集合を画定する。ＤＣ電圧及び無線周波電圧が第１集合に印加され、逆ＤＣ電圧及び移相無線周波電圧が第２集合に印加されて、第１集合と第２集合との間に電界が生じる。生じる電界を用いて、ナノポアを転位するバイオポリマーの移動を制御する。バイオポリマーの移動を制御する方法もまた開示する。【選択図】図１Ａ
2004233353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオポリマーがナノポアを通って転位するときのバイオポリマーの側方移動を制御するためのバイオポリマー転位装置であって、
（ａ）第１電極と、
（ｂ）前記第１電極に隣接する第２電極と、
（ｃ）前記第２電極に隣接しており、前記第１電極と電気的に接続されて電極の第１集合を画定する第３電極と、
（ｄ）前記第３電極に隣接しており、前記第２電極と電気的に接続されて電極の第２集合を画定する第４電極であって、前記第１電極、前記第２電極、前記第３電極及び前記第４電極がこれらの間にナノポアを画定する第４電極と、
（ｅ）電圧を前記複数の電極に印加して、前記バイオポリマーが前記ナノポアを通って転位するときの前記バイオポリマーの側方移動を制御するための電界を生成する第１電源と、
を備える装置。
【請求項２】
第２電源と、前記第１電極及び第３電極に電気的に接続されており、前記バイオポリマー、前記第１電極及び第３電極を通ってトンネルする量子を監視するための電流測定装置とをさらに備える請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記電源が、少なくとも１つの電極に直流（ＤＣ）を印加する請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記電源が、少なくとも１つの電極に交流（ＡＣ）を印加する請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記電源が、少なくとも１つの電極に直流（ＤＣ）及び交流（ＡＣ）を印加する請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記第１電極を適用するための基材をさらに備える請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記第２電極を適用するための基材をさらに備える請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記第３電極を適用するための基材をさらに備える請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記第４電極を適用するための基材をさらに備える請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記バイオポリマーが、荷電ポリマーである請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記バイオポリマーが、炭水化物、タンパク質、核酸、脂質、グリカン、バイオポリマー、プロテオグリカン及びポリペプチドからなる群から選択される請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
第５電極と、前記第５電極に隣接する第６電極と、前記第６電極に隣接する第７電極と、前記第７電極に隣接する第８電極とをさらに備え、前記第５電極が前記第１電極と電気的に接続され、前記第６電極が前記第２電極と電気的に接続され、前記第７電極が前記第３電極と電気的に接続され、前記第８電極が前記第４電極と電気的に接続されており、前記電極の各々が前記ナノポアに隣接して配置されて前記ナノポア長手方向の端から端まで４重極電界を形成している請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
上面及び下面を有する基材をさらに備え、前記第１電極、第２電極、第３電極及び第４電極が、前記基材の前記上面に適用されている請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
第５電極と、前記第５電極に隣接する第６電極と、前記第６電極に隣接する第７電極と、前記第７電極に隣接する第８電極とをさらに備え、前記第５電極が前記第１電極に電気的に接続され、前記第６電極が前記第２電極に電気的に接続され、前記第７電極が前記第３電極に電気的に接続され、前記第８電極が前記第４電極に電気的に接続されており、前記電極の各々が前記ナノポアに隣接して配置されて前記ナノポア長の端から端まで４重極電界を形成し、前記第５電極、第６電極、第７電極及び第８電極が前記基材の前記下面に適用されている請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
第５電極と、前記第５電極に隣接する第６電極と、前記第６電極に隣接する第７電極と、前記第７電極に隣接する第８電極とをさらに備え、前記第５電極が前記第１電極に電気的に接続され、前記第６電極が前記第２電極に電気的に接続され、前記第７電極が前記第３電極に電気的に接続され、前記第８電極が前記第４電極に電気的に接続されており、前記電極の各々が前記ナノポアに隣接して配置されて前記ナノポア長の端から端まで４重極電界を形成している請求項２に記載の装置。
【請求項１６】
上面及び下面を有する基材をさらに備え、前記第１電極、第２電極、第３電極及び第４電極が前記基材の前記上面に適用されている請求項２に記載の装置。
【請求項１７】
第５電極と、前記第５電極に隣接する第６電極と、前記第６電極に隣接する第７電極と、前記第７電極に隣接する第８電極とをさらに備え、前記第５電極が前記第１電極に電気的に接続され、前記第６電極が前記第２電極に電気的に接続され、前記第７電極が前記第３電極に電気的に接続され、前記第８電極が前記第４電極に電気的に接続されており、前記電極の各々が前記ナノポアに隣接して配置されて前記ナノポア長の端から端まで４重極電界が形成され、前記第５電極、第６電極、第７電極及び第８電極が前記基材の前記下面に適用されている請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
ナノポア内におけるバイオポリマーの側方移動を防止するための方法であって、
（ａ）電界を印加して、前記ナノポア内における前記バイオポリマーの側方移動を防止するステップ、
を包含する方法。
【請求項１９】
バイオポリマーがナノポアを通って転位するときのバイオポリマーの側方移動を制御するための方法であって、
（ａ）電極の第１集合及び第２集合を用いて前記バイオポリマーに電界を印加して、バイオポリマーが前記ナノポアを通って転位するときの前記バイオポリマーの側方移動を防止するステップ、
を包含する方法。
【請求項２０】
バイオポリマーがナノポアを通って転位するときのバイオポリマーの移動を制御するための方法であって、
（ａ）ＤＣ電圧及び無線周波電圧を、電極の第１集合に印加するステップと、
（ｂ）逆ＤＣ電圧及び移相無線周波電圧を、電極の第２集合に印加して、前記電極の第１集合と前記電極の第２の集合との間に電界を生成するステップと、
（ｃ）前記バイオポリマーが前記ナノポアを通って転位するときに、前記電界を用いて前記バイオポリマーの移動を制御するステップと、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概してバイオポリマーの分野に関し、より詳細には、本発明はナノポアを通って転位するときのバイオポリマーの移動を制御するための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
物質をナノメートルスケールで操作することは、多くの電子工学、化学及び生物学的進歩のために重要である（非特許文献１参照）。ヒトゲノムプロジェクトに呼応して、マイクロメートル及びナノメートルスケールでの配列技術が数多く提案されてきた。これらの技術は、主に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子の発現をキャラクタリゼーションし、理解するのを促進するために開発されてきた。一般的な技術においては、ｃＤＮＡのマイクロアレイ及びハイブリダイゼーションを用いて、特定のターゲット遺伝子の有無を決定する。ターゲット遺伝子及びプローブは、溶液中に暴露され、相対的なハイブリダイゼーション配列が一致すると結合する。ハイブリダイゼーションは、配列又はターゲット遺伝子の存在の指標となる。色素をターゲット又はプローブと共に用いて、ハイブリダイゼーションの開始及び効率を測定することができる。当該技術は、ターゲットｃＤＮＡ中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在を測定することにおいて、その使用が増えてきた。マイクロアレイによって、特定の患者の様々な疾患を正確且つ同時に選別できる見込みがもたらされている。理論上は、患者は、入院し、採血され、ＤＮＡ抽出及び遺伝子配列決定を受けることができるであろう。この配列決定法によって、個人の遺伝子の青写真がもたらされる。本方法によって、罹患性あるいは遺伝的異常の存在に関する、患者に固有の情報が医師に提供される。マイクロアレイ技術のいくつかの主要な欠点は、製造が難しく、プローブとターゲットとの効果的なハイブリダイゼーションに長い時間（高度の特異性を維持するには、ほぼ一晩）を要すことである。さらに、患者のゲノムＤＮＡは多量であり、非常に多くの時間及び労働が必要となるであろう。それ故、現在、より迅速にバイオポリマーを配列決定するための新しい技術が探索されている。ナノスケール規模のシステムは、資源（材料は有限）に効果的であると共に、生体細胞中に既に存在するプロセス（つまり、転位プロセス）をより似た形態で模倣することにも効果的である。従って、ナノポア技術は、分子生物学者及び生化学者などにとって、興味深い（研究対象となる）基本的領域となった。
【０００３】
電圧勾配によって、単鎖バイオポリマーを、膜貫通チャネル又はナノポアを通過させ得ることが実証された（非特許文献２参照）。転位プロセスでは、伸長したバイオポリマー分子が、ナノポアチャネルの大部分を閉塞させる（バイオポリマーが通過しないときには、ナノポアチャネルは開放している）。この閉塞によって、バイオポリマーの転位時には、ナノポアを介する緩衝溶液のイオン電流が減少する。この転位時間及び閉塞電流を記録し、予測可能な確率論的な感知パターンを用いてプロットを得ることによって、単一のバイオポリマーの通過をモニタし得る。均一に制御された転位条件によって、個々のバイオポリマーの長さは、転位時間から決定し得る。さらに、バイオポリマー鎖の個々の塩基の物理的及び化学的特性が異なると、原則として、測定可能且つ再現可能な閉塞電流の変調が起こり、その結果、転位するバイオポリマーの特定の基本的な配列を識別することができる。
【０００４】
ナノポアを通って転位するバイオポリマーを検知するためのもう１つの方法が、既に提案されている。その方法は、鎖が一対の電極間を通過する時の、該転位鎖の一部分を通る量子力学的トンネル電流に基づいている。トンネル電流の大きさを測定することは、転位バイオポリマーの存在を検知する電子的な方法となり得て、条件が適切に制御され、測定感度が十分に高ければ、構成成分の塩基配列を決定することも可能である。この方法の主な動機付けの１つは、走査型トンネル顕微鏡における代表的なトンネル電流が１〜１０ｎＡ台であり、これは、２ｎｍのナノポアをポリマーが転位する時に観察されるイオン電流よりも２〜３桁大きいということである（非特許文献１参照）。
【０００５】
上記の技法は共に、バイオポリマーの転位を検知し、鎖の長さをキャラクタリゼーションし、最終的にバイオポリマーの成分塩基の配列決定を行うことに関して、多大な実施上の問題を有する。主な問題の１つは、バイオポリマーがナノポアの中心を通過するように強制できないことである。それ故、別々の転位事象間において固有の変動性があり、ナノポア内を側方（通過軸に垂直な面方向）に移動する可能性を仮定すると、単一の転位時に潜在的な変動性もある。こうした側方変位の影響は、上記の２種類の検知方式に関して多くの方法で明らかにすることができる。
【０００６】
第１の検知方式は、転位時に減少するイオン電流の大きさを測定することからなり、この場合、転位するバイオポリマーの側方変位は、２つの著しい影響を及ぼし得る。第１に、バイオポリマーがナノポアの中心から離れる場合、ナノポア自体の壁部との相互作用によってさらに抵抗が生じ、転位速度が低下する。こうした変動性によって、校正された転位時間から決定されるバイオポリマー長の測定には誤差が生じる。実際、転位するバイオポリマーが、ナノポアの中心から十分に離れて、分子の相互作用又は純粋にバイオポリマー鎖の立体配座結合により、ポアチャネルの壁部に沿って実際に断続的に結合することは考えられないことではない。転位する分子の側方変位が与える第２の重要な影響は、イオン閉塞電流の潜在的な変化である。開口部の形状は、流体力学的流れに著しい影響を与える可能性がある。こうした影響は、分子のサイズが開口部程度である分子流の状況では、さらに著しくなることも自明である。このため、転位するバイオポリマーがナノポア内で側方に変位すると、測定されるイオン閉塞電流の大きさに著しい変動性を生じ、その結果、上記のとおり、塩基の閉塞効果により種々の塩基を区別する作業が困難になる。
【０００７】
第２の検知方式は、転位するバイオポリマーが一対の電極の間を通過する時にバイオポリマーの一部分を介する量子力学的トンネル電流を測定することからなり、この場合、転位鎖の側方変位は２つの著しい影響を及ぼし得る。第１の検知方式に関して説明したとおり、バイオポリマーがナノポアの中心から離れている場合、ナノポア自体の壁部との相互作用により、さらに抵抗が生じ、転位速度が減少するであろう。こうした変動性によって、校正された転位時間から決定したバイオポリマー長の測定には誤差が生じると思われる。第２に、トンネル電流が、トンネル過程に対する量子力学的電位障壁の高さ及び幅に指数関数的に依存することは周知である。こうした依存は、転位分子のポア内の厳密な位置に極端に敏感であることを暗示する。トンネル電極に対する立体作用及び物理的近接性により、トンネル電流の大きさが変化する可能性があり、電流の大きさは、理想的な条件下で塩基の種類間において予想される固有の差異をはるかに超えるであろう。従って、転位するバイオポリマーがナノポア内で側方変位することにより、測定されるトンネル電流の大きさに著しい変動性が生じ、上記のとおり、塩基のトンネル特性により種々の塩基を区別する作業がより困難になる。
【０００８】
【非特許文献１】Ｌｉらによる、「Ｉｏｎ  ｂｅａｍ  ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ  ａｔ  ｎａｎｏｍｅｔｅｒ  ｌｅｎｇｔｈ  ｓｃａｌｅｓ」，Ｎａｔｕｒｅ，４１２，１６６−１６９，２００１．
【非特許文献２】Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚらによる、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈａｎｎｅｌ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１３７７０−１３７７３，１９９６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の全ての理由から、ナノポアを通って転位するバイオポリマーの側方位置の変動性は、検知方式に関係なく重大な問題を引き起こし得る。転位プロセスのダイナミクスを制御する方法は、現状に多大な利点をもたらすであろう。先行技術の当該プロセスに関する上記及び他の問題は、本発明により回避される。上記及び下記で本明細書において引用する参考文献は、参照することでその内容の全てを本明細書に取り入れることとする。しかしながら、引用された参考文献又は技術が、本願の先行技術であると認めるものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ナノポアを介するバイオポリマーの移動を制御するための方法及び装置を提供する。本発明の装置は、第１電極と、第１電極に隣接する第２電極と、第２電極に隣接する第３電極と、第３電極に隣接する第４電極とを備える。第１電極及び第３電極は電気的に接続されており、電極の第１集合を画定する。第２電極及び第４電極は電気的に接続されており、電極の第２集合を画定する。ＤＣ電圧及び無線周波電圧が電極の第１集合に印加され、逆ＤＣ電圧及び移相無線周波電圧が電極の第２集合に印加されて、電極の第１集合と電極の第２集合との間に電界が生成する。生成される電界は、バイオポリマーがナノポアを通って転位する時のバイオポリマーの移動を制御するために用いられる。本発明では、複数の電極又は電極の集合を使用し得る。電極を多様な構成又は位置にて配置しナノポアを画定するか、又は少なくとも１つのナノポアを含む任意選択の基材を使用することができる。
【００１１】
本発明は、ナノポアを通るバイオポリマーの移動を制御する方法であって、ＤＣ電圧及び無線周波電圧を電極の第１集合に印加し、逆ＤＣ電圧及び移相無線周波電圧を電極の第２集合に印加して、電極の第１集合と電極の第２集合との間に電界を生成し、バイオポリマーがナノポアを通って転位する時のバイオポリマーの移動を制御する方法を提供する。当該方法には、１つ以上の電極の集合又は基材が包含される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、バイオポリマーがナノポアを介して転位するときの移動を制御する方法及び装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の構成、方法ステップ、あるいは機器に限定されず、これらは変更し得ることを理解されたい。また、本明細書で用いる用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的としており、本発明を制限する意図はないこともまた、理解されたい。本明細書に記載される方法は、記載された順序で実施し得るだけでなく、理論上可能な任意の順序で実施し得る。さらに、ある範囲の数値が記載されているが、当該範囲の上限と下限との間にある任意の数値、記載された他の任意の数値、あるいは記載された範囲内にある数値は、何れも本発明の範囲に含まれる。また、説明されている本発明の変形形態の任意の他の特徴は、個々に、又は本明細書に記載の１つ以上の任意の特徴に関連して記載し、特許請求されている。
【００１４】
以下で特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明に関連する当業者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。それでもなお、特定の要素に関しては、簡単のために本明細書では定義する。
【００１５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形は複数形の意味を含むが、文脈上、明らかに異なる場合はこの限りではない。従って、例えば「バイオポリマー」と記載した場合は、１つ以上のバイオポリマーが含まれ、「電源」には複数の電源が含まれる。本発明について説明し特許請求するのに際して、以下の用語は、以下に記載する定義に従って使用する。
【００１６】
「バイオポリマー」とは、１種類以上の繰り返し単位からなるポリマーである。バイオポリマーは、一般に生体組織中に存在し、特に、多糖類（炭水化物など）、ペプチド（この用語は、ポリペプチド及びタンパク質を含むために使用する）、バイオポリマー、及びそれらの類似体（例えば、アミノ酸類似体もしくは非アミノ酸基、又はヌクレオチド類似体もしくは非ヌクレオチド基から成るか、又はこれらを含む化合物など）が含まれる。これには、従来の主鎖が、非自然的に発生する主鎖あるいは合成主鎖と置き換えられたバイオポリマー、又は１種類以上の従来の塩基が、例えばワトソン−クリック型、ウォブル型などの水素結合相互作用に関与し得る基（天然もしくは合成）と置き換えられた核酸（又は合成類似体もしくは自然発生類似体）が含まれる。バイオポリマーには、単鎖又は複鎖構造のものが含まれ、そこでは１種類以上の鎖は他の鎖と完全に整列してもよいし、整列していなくてもよい。
【００１７】
「ヌクレオチド」とは核酸のサブユニットを意味し、ホスフェート基、５炭素糖及び窒素含有基と、こうしたサブユニットの機能類似体（合成あるいは自然発生のもの）とを有する。該機能類似体は、ポリマー形態（バイオポリマーとして）において、２種類の自然発生バイオポリマーの場合と同様の配列特異的方法で、自然発生バイオポリマーとハイブリダイズし得る。バイオポリマーには、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、及び源に関わらず、米国特許第５、９４８、９０２号及び該特許に引用されている参考文献（参照することで、その内容の全てを本明細書に取り入れることとする）に記載の他のポリヌクレオチド、が含まれる。「オリゴヌクレオチド」とは、一般に、長さがヌクレオチド約１０〜１００個分のヌクレオチドマルチマーを意味し、「バイオポリマー」は、任意の数のヌクレオチドを有するヌクレオチドマルチマー１つを含んでいる。「バイオモノマー」は、同一の又は他のバイオモノマーと結合してバイオポリマーを形成し得る単一ユニットを指す（例えば、その一方又は両方が除去可能な保護基を有する２つの結合基を含む単一アミノ酸あるいはヌクレオチド）。
【００１８】
「基材」又は「基材表面」は同義語であり、電極を取り付けるか、内部に含むか又は埋め込むことができる材料を意味する。
【００１９】
「移動」は、広範な意味を有する。当該用語は、ナノポアを通るバイオポリマー又はバイオポリマーの一部分が側方、前方、後方、直線状及び横斜め方向へ前進又は変位することを包含する。
【００２０】
「内」という語は、「範囲内」及び／又は外側のある一部分を意味する。例えば、ナノポア「内」のバイオポリマーとは、バイオポリマー全体が、ナノポア開口部の範囲内にあるか、又はバイオポリマーの小部分のみがナノポア付近に位置し、大部分がナノポアの外側に突出していることを意味する。
【００２１】
「ナノポア」という用語は、少なくとも一対の電極間にある任意の孔もしくは穴、又は固体基材内の孔を意味する。ナノポアの寸法は様々であり、１ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲にある。最も効果的なナノポアは約２〜２０ｎｍの寸法のものであった。
【００２２】
「転位」又は「転位する」という用語は、ある側から別の側に移動するか、又は画定された方向に移動することを意味する。
【００２３】
「部分」又は「バイオポリマーの部分」という用語は、一部、サブユニット、モノマーユニット、モノマーユニットの一部、原子、原子の一部、原子のクラスター、電荷又は荷電ユニットを意味する。
【００２４】
「隣接する」という用語は、何かが付近にあるか、隣にあるか、又は接触していることを意味する。例えば、ナノポアが電極の付近にある場合、電極の隣にある場合、電極と接触している場合がある。これは、１次、２次及び３次空間をおいて隔置されている状態を含む。
【００２５】
次に図１〜図２を参照すると、本発明は、ナノポア３を通って転位するバイオポリマー５が側方に移動するのを防止できるバイオポリマー転位装置１を提供する。バイオポリマー転位装置１は、第１電極７と、第２電極８と、第３電極９と、第４電極１０と、第１電源１１とを備える。第２電極８は、第１電極７に隣接している。第３電極９は第２電極８に隣接し、第４電極１０は第３電極９に隣接している。第１電極７及び第３電極９は、電極の第１集合を画定し、電気的に接続されている。第２電極８及び第４電極１０は電極の第２集合を画定し、電気的に接続されている。本発明は、以下にさらに詳細に説明するように、複数の電極又は電極の集合を使用することができる。
【００２６】
第１電極７、第２電極８、第３電極９及び第４電極１０は、ナノポア３を画定するように配置されている。任意の基材１２は、ナノポア３も含んでいる。第１電極７、第２電極８、第３電極９及び第４電極１０は、任意の基材１２上に配置あるいは付着しているか、任意の基材１２の一部分を構成している。
【００２７】
基材１２は、上面１７及び下面１９を有する。基材１２は、ナノポアを設計するための当分野において既知の種々の材料から構成し得る。こうした材料としては、シリコン、シリカ、例えばＳｉ３Ｎ４などの固体材料、カーボン系材料、プラスチック、金属、又は当分野で既知の半導体もしくは導電性材料をエッチングあるいは製造するための他の材料が挙げられる。基材１２は、種々の形状及び寸法にて構成することができる。しかし、基材１２を貫通するナノポア３を形成できるように十分に大きく、十分な幅がなければならない。
【００２８】
第１電極７、第２電極８、第３電極９及び第４電極１０は、種々の導電性材料から構成し得る。そのような材料としては、導電性金属、及びスズ、銅、亜鉛、鉄、マグネシウム、コバルト、ニッケル、バナジウムの合金が挙げられる。当分野において既知の導電性を与える他の材料を使用することもできる。第１電極７が固体基材１２上に配置されているか、又は固体基材１２の一部を構成している場合、第２電極８及び第４電極１０に対して任意の位置に配置することができる。電極７、８、９及び１０は、様々な形状及び寸法にて設計し得る。
【００２９】
第１電源１１は、第１電極７、第２電極８、第３電極９及び第４電極１０に電気的に接続されている。一部の実施形態では、個々の電極は、直流（ＤＣ）電圧及び重畳無線周波（ＲＦ）電位の長手方向軸に沿って隔置されている。第１電極７と第３電極９は電気的に接続されて電極の第１集合を画定しており、同一のＤＣ及びＲＦ電位が印加される。一方、第２電極８と第４電極１０は電気的に接続されて電極の第２集合を画定しており、逆のＤＣ電圧及び１８０°移相したＲＦ電位が印加されている。本発明は、２つの電極の集合に限定されると考えられるべきではない。本発明では、電極の他の集合あるいは電極の複数の集合を使用し得る。例えば、４、６、８つ又はそれ以上の電極を装置が含む場合には、異なる設計が用いられる。例えば、振幅Ｖ及び周波数ω／２πのＲＦ電圧Ｖｃｏｓωπが第１電極７に印加され、交互の電極が等しい振幅及び逆位相を有する。しかしながら、上記のように４つの電極を装置が有する場合、４重極マスフィルタに関して当分野で既知のように、Ｕ＋Ｖｃｏｓωπ及び−［Ｕ＋Ｖｃｏｓωπ］の電圧を交互の電極に印加することにより任意に作動させることができる。この実施形態では、ＵはＤＣ電圧である。Ｕ、Ｖ及びωは、４重極マスフィルタに関して当分野で周知の方法によって、所与の寸法、及びバイオポリマーの質量電荷比の範囲に応じて選択される。
【００３０】
前述のように、ナノポア３は、基材１２上の任意の位置に配置し得る。ナノポアの寸法は、１ｎｍから３００ｎｍにも及ぶ。殆どの場合において、バイオポリマーを同定及び配列決定するために効果的なナノポアは、約２〜２０ｎｍであろう。これらの寸法のナノポアは、バイオポリマーの転位を可能にするのにちょうどよい大きさである。ナノポア３は、当分野において周知の任意の方法を用いて形成できる。例えば、ナノポア３は、イオンアルゴンビームスパッタリング、エッチング、光リソグラフィ、又は当分野において周知の他の方法及び技法を用いて基材１２上に形作ることが可能である。
【００３１】
バイオポリマー５は、種々の形状、寸法及び材料から構成される。例えば、バイオポリマー５は、ヌクレオチド、バイオポリマー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ヌクレオシド、炭水化物、グリカン、脂質、スフィンゴ脂質、プロテオグリカン、抗体などとすることができる。分子の形状又は寸法は重要ではないが、ナノポア３を貫通して転位できなければならない。例えば、単鎖及び二重鎖ＲＮＡ及びＤＮＡは、どちらもバイオポリマー５として使用できる。さらに、バイオポリマー５は、帯電している基又は官能基を含み得る。さらに、正味の双重極及び電荷をもたらすために、又は生体分子を介する伝導を可能にするために、金属あるいは物質をバイオポリマー５内に添加、ドープもしくは挿入することができる。
【００３２】
次に図１Ａを参照すると、本発明の第１の実施形態が示されている。第１電極７、第２電極８、第３電極９及び第４電極１０は全て、ナノポア３に隣接する基材１２の上面上に配置されている。電極７は、電極８に隣接して配置されている。電極８は、電極９に隣接して配置されている。電極９は、電極１０に隣接して配置されている。電極７〜１０の各々は、ナノポア３に隣接する同一平面に配置されている。上記のとおり、電極７及び電極９は、電気的に接続されて電極の第１集合を画定する。さらに、電極８及び電極１０は、電気的に接続されて電極の第２集合を画定する。
【００３３】
次に、図１Ｂを参照すると、本発明の第２の実施形態が示されている。本発明のこの実施形態では、追加の電極を基材１２上に用いている。追加の電極は、第５電極７’、第５電極７’に隣接する第６電極８’、第６電極８’に隣接する第７電極９’、第７電極９’に隣接する第８電極１０’からなる。電極７’、８’、９’及び１０’は、基材１２を構成するか、基材１２の一部であるか、又は基材１２に取り付けることができる。本発明のこの実施形態では、電極７’、８’、９’及び１０’は、ナノポア３に隣接する基材１２の下面１９上に配置され、前記電極の各々は、ナノポア３に隣接して配置され、前記ナノポア３の長さ方向に沿って４重極電界を生成する。第１電極７は、第５電極７’に電気的に接続されている。第２電極８は、第６電極８’に電気的に接続されている。第３電極９は、第７電極９’に電気的に接続されている。第４電極１０は、第８電極１０’に電気的に接続されている。上記の構造と同様に、電極７、７’は、電極９、９’に電気的に接続されて、電極の第１集合を画定している。さらに、電極８、８’及び１０、１０’が電気的に接続されて、電極の第２集合を画定している。
【００３４】
次に、図２Ａ及び図２Ｂを参照すると、本発明のさらに他の実施形態が示されている。これらの実施形態は、図１Ａ及び図１Ｂに類似しているが、相対する電極を介してトンネルする量子をモニタし、バイオポリマー５の部分を検知するための電流測定装置１３に接続されている第２電源１５を備えている。これらの第２電源１５及び電流測定装置１３は、静電圧状態又は勾配電圧状態にてトンネルする量子をモニタするために使用される。
【００３５】
以上、本発明の装置を詳細に説明したので、以下に方法について説明する。本発明の方法は、バイオポリマーがナノポアを転位する時のバイオポリマーの側方移動を制御するための方法を提供する。当該方法は、ＤＣ電圧及び無線周波電圧を電極の第１集合に印加し、逆ＤＣ電圧及び移相無線周波電圧を電極の第２集合に印加して、電極の第１集合と電極の第２集合との間に電界を生成し、この電界を使用して、バイオポリマーがナノポアを転位する時のバイオポリマーの移動を制御することを包含する。次に、実際の装置及び方法が、バイオポリマーの側方移動をどのように防止するかについて、詳細に説明する。
【００３６】
ＲＦ４重極電界を使用すると、指定の伝播方向に沿って荷電粒子を集中させて誘導し得ることは、周知である。この現象の代表的な用途は、質量分析の分野であり、ＲＦ４重極電界を使用する装置は、特定の電荷対質量比の粒子を伝播チャネルの下流に誘導し、異なる電荷対質量比の粒子をこの領域から排除する。特定の電荷対質量比は、ＲＦ電界の幾何学的形状及びパラメータにより決定される。典型的な装置では、４本のロッドが断面に４重極電界を形成する。後述する付録にてさらに詳細に説明するように、適切なパラメータが選択されると、ＲＦ電界は、荷電粒子を中心軸方向に押しやるのに効果的な電位を生成する。消散効果が存在しない場合には、粒子は、横断方向の効果的な調和ポテンシャルの影響下、横断方向に振動運動しながら、軸の下流に移動する。消散効果が存在する場合、粒子が伝播軸の下流に移動するとき、横断方向の振動は減衰し、軌道は軸上で円滑に安定する。
【００３７】
この物理的現象を利用すると、ナノポアを通って転位するバイオポリマーを制御して、バイオポリマーをポアの中心に円滑に誘導することができる。図１〜図２は、こうした効果を実現するために使用される本発明の装置を示す。４つの電極は、ナノポア開口部にほぼ４重極電界を生成するために使用される。ＲＦ電界パラメータ（後述する）は、バイオポリマーの電荷対質量比で粒子を誘導するために選択される。効果的な電位が生成されると、転位する鎖をナノポアの中心に誘導する連続的な力がもたらされる。これは、上記の一連の問題を緩和する。詳細には、側方への移動を制限することにより、妨げられない均一な転位、及び対称且つ制御されたトンネル電流環境を実現できる。任意選択的に、４重極電界の生成に寄与する相対する電極対上にＤＣトンネル電圧を重畳し得ることに注目されたい。
【００３８】
荷電バイオポリマー鎖が、伝播方向に範囲が制限されているＲＦ４重極電界を通過することからなる物理的システムは、先行技術によって示されている物理的システムとは明らかに異なる。しかしながら、移動する粒子を軸方向に誘導する効果的な復元（位置修正）力を生成する物理的な機構が同じであることは、やはり明確である。付録の方程式（Ａ６）及び（Ａ７）は、荷電粒子、又は荷電バイオポリマー鎖のセグメント上に加わる横断方向の力を表す。単一粒子の場合、当該方程式は、粒子が装置の長さ方向に沿って下流に移動する時の横断方向の力を表す。バイオポリマーの場合、当該方程式は、一定の空間上の点において移動する鎖上に加わる復元力を表す。
【００３９】
方程式（Ａ１０）は、バイオポリマー鎖に対して最終的に収束させるのに効果的な力を得るために必要なＲＦ電圧パラメータを概算するために使用することができる。ＤＣ電圧がゼロ（ａｕ＝０）であると仮定すると、安定性のプロット（図４）から、安定した軌道、即ち最終的な収束を得るためには、ｑｕ＜０．９１である必要があることが分かる。
【００４０】
【数１】
2004233353.tif 000003
【００４１】
式中、それぞれ、ｅは電荷、ｍはバイオポリマー鎖の対応部分の有効質量、ｒ０は４重極アパーチャの半径、Ω及びＶは、ＲＦ電圧の角周波数及び振幅である。本発明のナノポアは、約１０Åのｒ０を与えるであろう。連続鎖部分である塩基の有効質量は著しく大きく、全体の構造の剛性に依存するが、典型的なヌクレオチド塩基は約４００ａｍｕの質量を有する。概算上は、有効質量は、個々の塩基の有効質量の約５倍であると仮定する。これらのパラメータ値を用いて、方程式（１）で表される安定性（収束）の要件は、以下により与えられる。
【００４２】
【数２】
2004233353.tif 000004
【００４３】
式中、Ｖはボルトで与えられ、ＦはＭＨｚで与えられる。１．０ＧＨｚのＲＦ周波数が印加されるた場合、４重極は、ＲＦ電圧の振幅が制限を満たすように、ポリヌクレオチド鎖をナノポアの中心方向に誘導する傾向がある。
【００４４】
（数３）
Ｖ≦２００μＶ   （３）
【００４５】
ＲＦ電圧のパラメータは、上記の構成で得られる。本発明は、前述した問題を回避するように設計される。誘導（安定）モードで作動する場合、４重極の電界は、バイオポリマーをナノポアの中心方向に押しやる。その結果、バイオポリマーとナノポア壁部との断続的な相互作用による不均一な転位現象という問題が緩和される。また、部分的に閉塞されるポア形状の不規則な変化によるイオン電流変化の影響を最小限にすることにより、分析されるバイオポリマーの部分の検知を改善する。こうした不規則な変化は、主に、バイオポリマーが転位する時に側方に変位するためである。電子トンネル検知方式に関しては、バイオポリマーをナノポアの中心に制限すると、トンネル電極に対するバイオポリマーの近接（距離）の変動性が最小限となるため、測定電流の大きさが潜在的に大きく変化することがなくなる。
【００４６】
本発明の４重極構造のもう１つの用途は、図４に示すように、鎖のダイナミクスが不安定な状況になるようにパラメータを選択して４重極を作動させることを基礎とする。これは、上記実施例にて特定したパラメータの場合においては、ＲＦ電圧の振幅が方程式（３）のレベルを超えるように調節することに相当する。即ち、以下の範囲である。
【００４７】
（数４）
Ｖ＞２００μＶ   （４）
【００４８】
この電圧の場合、転位するバイオポリマーの側方移動は不安定になり、バイオポリマーはナノポアの中心から離れる。適切なパラメータを選択すると、バイオポリマーは、ナノポアの壁部に「釘付け」になる。その結果、ナノポア壁部の構造に応じて、転位プロセスは制御された方法で停止される。バイオポリマーの転位を制御された方法で停止及び再開し得る性能によって、多くの有用な用途がある。それは、転位速度を遅くさせるために用いられ、それによって塩基検出測定により長い時間を割り当てることができる。また、バイオポリマーの一部分を所定の位置に保持し、バイオポリマーのある特定部分に測定を集中させることにも用いられる。
【００４９】
本発明を図１及び図２に示すが、本発明は、特定の実施形態に限定されるものではない。その他の実施形態及び構造に関しても実施し得る。例えば、電極は、ナノポア内にほぼ４重極電界を生成する一般的な任意の形状のものを用いることができる。また、４重極−バイオポリマー相互作用が生じる領域の長さを増すために、複数の電極の集合を使用することができる。例えば、電極の集合をナノポアの両面に使用すると、４重極電界をより正確にナノポアの全長にわたって維持することができる。さらに、８重極電界など、より多数の多極電界を使用することができる。これらの実施形態は、前述したものに類似する安定性プロットを有し、且つ前述したものと同様の方法によって使用することができる。これは、これらの実施形態の安定性プロットがあまり厳密に画定されない場合においても同様である。
【実施例１】
【００５０】
上記装置の一実施例は、当分野において既知の方法を用いて製造することができる。例えば、ナノポアは、シリコン構造物上に支持されている薄い（５００ｎｍ）自立窒化ケイ素（ＳｉＮ３）膜内に形成することができる。収束イオンビーム（ＦＩＢ）装置を使用すると、直径約５００ｎｍの単一の初期ポアを膜内に形成することができる。次いで、３ＫｅＶのアルゴンイオンビームによるポア領域への照射によって、材料がスパッタリングされ、直径約２ｎｍの所望の寸法まで徐々に孔が閉塞する（非特許文献１参照）。金属電極は、パターニング及び蒸着又は他の付着手段により形成されて、４重極構造を形成する。金属電極に対するワイヤボンディングにより、ＲＦ電源に接続することができる。ＲＦ電源は、１．０ＧＨｚの周波数にて数百マイクロボルトという適度な要件を有する。
【実施例２】
【００５１】
本発明の第２の実施例は、第１の実施例と類似するが、４つの電極からなる追加の集合が基材の対向面上に配置されている。電極の第２集合はＲＦ電源と並列にワイヤボンディングされ、ナノポアの全長にわたって４重極電界のコヒーレントな生成を可能にする。
【００５２】
付録
ナノポアを通るポリマーの転位を制御するためのＲＦ４重極電界の使用法を理解するためには、関連する周知のシステムにおける現象を概説するのが最もよい。付録の第１項では、ＲＦ４重極の基本を概説し、従来の多数の質量分析用途について論じる。第２項では、収束レンズと発散レンズが交互に組合わさって成る光学システムから類推することによって、物理的効果に関する直感的基盤を説明する。第３項では、ＲＦ４重極有効電位を導出する。
【００５３】
Ａ１．ＲＦ４重極の基礎
質量分析分野における典型的ＲＦ４重極の応用形態では、４つの並列ロッド電極の集合を使用する。４重極電界は、イオンの軌道方向に沿って並進的に不変である。断面では、等電位表面の形状を容易に決定することができる。断面の２次元電位は、以下で表される。
【００５４】
【数５】
2004233353.tif 000005
【００５５】
ここで、パラメータの定義は、図３により与えられる。電界は、本説明では割愛するロッドの端部付近の領域を除いて、ｚ軸に沿って均一である。
【００５６】
これらの電界が、質量ｍ、電荷ｅのイオンに加える力は、以下により表される。
【００５７】
【数６】
2004233353.tif 000006
【００５８】
これは、以下の成分式を有する。
【００５９】
【数７】
2004233353.tif 000007
【００６０】
ここで、「点（・・）」は、時間に関する微分を表す。印加電位が、以下のようにＤＣ及びＲＦ成分を含むように一般化されると、
【００６１】
【数８】
2004233353.tif 000008
【００６２】
移動方程式は以下のようになる。
【００６３】
【数９】
2004233353.tif 000009
【００６４】
これらの方程式は、ξ＝Ωｔ／２と定義することで、一般式で書くことができる。
【００６５】
【数１０】
2004233353.tif 000010
【００６６】
これは、よく研究されているマシュー方程式の一般式として認識される。ｕ＝ｘの場合、
【００６７】
【数１１】
2004233353.tif 000011
【００６８】
そして、ｕ＝ｙの場合、
【００６９】
【数１２】
2004233353.tif 000012
【００７０】
方程式（Ａ８）の解の詳細な説明は、文献（ＭｏｒｓｅとＦｒｅｓｈｂａｃｈによる、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ」，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９５３）参照）内にある。パラメータａｕ及びｑｕが特定の範囲では解は振動及び安定しており、他の範囲では、解は不安定（時間の経過と共に指数関数的増加を示す）である。図４は、パラメータ空間の原点付近の領域における、方程式（Ａ８）のパラメータの安定な範囲及び不安定な範囲を示している。電圧Ｕ及びＶ、ＲＦ周波数Ω、電界のスケール係数ｒ、及び電荷対質量比ｅ／ｍに応じて、イオンは、ＲＦ４重極装置を下流に移動する時に安定（伝播）又は不安定（非伝播）な軌道を有することは明白である。こうした物理的効果は、特定の電荷対質量比のイオンを選択的に通過させるために、質量分析に利用される。本装置は、電圧パラメータの任意の組合せを調節することにより、所望の電荷対質量比に調整される。
【００７１】
Ａ２．ＲＦ４重極の作動及びイオン軌道の物理的基礎
一見して、マシューの方程式は、振動及び安定という解を有するように思われる。特に、４重極電界におけるイオンに関する成分のダイナミクス方程式の１つを見ると、
【００７２】
【数１３】
2004233353.tif 000013
【００７３】
Ｖ＞Ｕの場合、復元する電界は交互に正（収束）及び負（発散）となることが分かる。一部のパラメータ選択に関しては、最終的な効果が正味の収束であり得ることは明らかではない。
【００７４】
ＲＦ４重極のこうした交互の収束／発散電界が、どのように安定且つ収束した軌道を与え得るのかを理解するには、類似する光学システムを検討することにより最も良く分かる。交互にフォーカス（収束）及びデフォーカス（発散）するレンズのシステムが、光ビームを収束して誘導する光学構造体を形成できることは、周知である。レンズの特性は、収束（発散）レンズの屈折フォーカス（デフォーカス）が、光伝播軸からの光線の距離に比例することである。従って、交互に収束及び発散する一連のレンズに入射する幅の広いビームは、第１収束レンズを通過する時に、伝播軸方向に強度に屈折する。当該ビームは、次の発散レンズを通過する時、伝播軸ではない方向（伝播軸から離れる方向）にそれほど強度ではない程度に屈折する。なぜなら、当該ビームの変位（伝播軸からの距離）は、第１レンズを通過した時に比べて小さいためである。同様に、当該ビームは、次の収束レンズを通過するが、このビームの変位は今度は比較的大きいため、前のレンズによって伝播軸から離れて屈折した時よりも強度に、伝播軸方向に屈折する。この光学システムの正味の効果は、レンズ及び隔離距離が適切に選択された場合、入力ビームの収束であることは明らかである。
【００７５】
Ａ３．ＲＦ４重極有効電位
マシュー方程式のダイナミクスをさらに洞察するため、
【００７６】
【数１４】
2004233353.tif 000014
【００７７】
パラメータの範囲が安定領域内である場合、数値積分法により解を求めると有益である。代表的な解は、図５で表される。運動は、２つの基本的な成分を有する。ＲＦ駆動電圧の周波数の比較的小さく比較的速い成分で「微細運動」と呼ばれる成分、及びイオンと時間平均有効電位との相互作用を反映する比較的大きく比較的遅い成分で「巨視的運動」と呼ばれる成分が存在する。微細運動の成分をδ、巨視的運動の成分をＲで表すと、変位は以下で表される。
【００７８】
【数１５】
2004233353.tif 000015
【００７９】
δ≪Ｒであるが、ｄδ／ｄｔ≫ｄＲ／ｄｔと仮定する。（Ａ１５）を（Ａ１４）に代入し、主要項のみを維持すると、
【００８０】
【数１６】
2004233353.tif 000016
【００８１】
ａｕ≪ｑｕの場合、ＲはＲＦのある期間にわたってほぼ一定である。
【００８２】
【数１７】
2004233353.tif 000017
【００８３】
これは、以下を暗示する。
【００８４】
【数１８】
2004233353.tif 000018
【００８５】
マシュー方程式（Ａ１４）は以下のようになる。
【００８６】
【数１９】
2004233353.tif 000019
【００８７】
ＲＦ駆動のある期間にわたる方程式（Ａ１９）を平均すると、以下になる。
【００８８】
【数２０】
2004233353.tif 000020
【００８９】
これは、実際の単位では以下のように表すことができる。
【００９０】
【数２１】
2004233353.tif 000021
【００９１】
方程式（Ａ２１）は、ＲＦ４重極電界におけるイオンの時間平均巨視的運動に関して有効なダイナミクスを表す。その解は、調和復元力を生成する有効電位に対応する単純な調和関数である。この有効な復元力は、４極電界領域の中心において対称な軸方向にイオンを引き寄せる。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１Ａ】本発明の第１実施形態の概略図
【図１Ｂ】本発明の第２実施形態の概略図
【図２Ａ】本発明の第３実施形態の概略図
【図２Ｂ】本発明の第４実施形態の概略図
【図３】ＲＦ−４重極の断面及び本文に記載したパラメータ
【図４】マシュー方程式の解の安定性プロット（パラメータａｕ及びｑｕの関数）
【図５】安定した軌道を生成するパラメータを選択するためのマシュー方程式の代表的な解（微細運動及び巨視的運動がより詳細に示されている）
【符号の説明】
【００９３】
１  バイオポリマー転位装置
３  ナノポア
５  バイオポリマー
７  第１電極
７’第５電極
８  第２電極
８’第６電極
９  第３電極
９’第７電極
１０  第４電極
１０’第８電極
１１  第１電源
１２  基材
１７  基材上面
１９  基材下面
【図１Ａ】
2004233353.tif 000022
【図１Ｂ】
2004233353.tif 000023
【図２Ａ】
2004233353.tif 000024
【図２Ｂ】
2004233353.tif 000025
【図３】
2004233353.tif 000026
【図４】
2004233353.tif 000027
【図５】
2004233353.tif 000028