(57)【要約】【課題】霊長類のＥＳ細胞に分化を誘導することで水晶体細胞を安定して作製する方法、および、この方法によって作製される水晶体細胞を提供する。【解決手段】本発明の水晶体細胞の作製方法は、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−２を２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する培地を用いてＥＳ細胞を維持するＥＳ細胞維持工程と、上記ＥＳ細胞維持工程の後に、上記ＥＳ細胞をマウス頭蓋骨髄細胞ＰＡ６上に２〜６．５コロニー／ｃｍ２の細胞密度で植え付けて培養することによって、上記ＥＳ細胞から水晶体細胞への分化を誘導する分化誘導工程とを含んでなるものである。また、上記ＥＳ細胞維持工程と上記分化誘導工程との間に、ＥＳ分化培地を用いて未分化のＥＳ細胞を１回のみ洗浄する工程をさらに含むことが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−２を２〜５０（ｎｇ／ｍｌ）の濃度で含有する培地を用いてＥＳ細胞を維持するＥＳ細胞維持工程と、
上記ＥＳ細胞維持工程の後に、上記ＥＳ細胞をマウス頭蓋骨細胞ＰＡ６上に２〜６．５（コロニー／ｃｍ２）の細胞密度で植え付けて培養することによって、上記ＥＳ細胞から水晶体細胞への分化を誘導する分化誘導工程とを含んでなることを特徴とする水晶体細胞の作製方法。
【請求項２】
上記ＥＳ細胞維持工程と上記分化誘導工程との間に、維持された上記ＥＳ細胞を、ＥＳ分化培地を用いて１回洗浄する洗浄工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の水晶体細胞の作製方法。
【請求項３】
上記ＥＳ細胞は、霊長類由来のものであることを特徴とする請求項１または２に記載の水晶体細胞の作製方法。
【請求項４】
上記ＥＳ細胞は、カニクイザル由来のものであることを特徴とする請求項３記載の水晶体細胞の作製方法。
【請求項５】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の水晶体細胞の作製方法によって得られる水晶体細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、白内障などの眼疾患の治療に応用でき、胚性幹細胞（ＥＳ）細胞から水晶体細胞への分化を誘導することで水晶体細胞を作製する新規の方法、および、この作製方法によって得られる水晶体細胞に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
白内障は、種々の原因で水晶体に混濁を生ずる疾患であり、水晶体の混濁によって視力低下を引き起こす重大な眼疾患である。現在の白内障の治療法としては、混濁した水晶体を水晶体嚢内から切除し、後嚢上に人工の眼内レンズを固定するという手術によるものが一般的である。この治療法に用いられる眼内レンズは、眼球の切開を小さくするためによりソフトなものへと改良が進められている。
【０００３】
しかしながら、この人工の眼内レンズでは、レンズ厚の調節は行えず本来生体の水晶体が有するような調節力を再現することができないのが現状である。そのため、眼内レンズを移植するという白内障手術では、水晶体の弾力性が低下して近くを見るときの焦点を合わせる調節機能が低下した状態である、所謂老眼（老視）状態を改善することはできない。また、若年者の白内障では、手術により一挙に老視化するために手術に踏み切れない例も多く存在する。
【０００４】
そこで、近年注目されている組織培養技術を利用してヒトの水晶体細胞を培養し、移植用の生体材料として使用すれば、上述の問題点が解決できると考えられるため、昨今盛んに研究が行われている。その一例として、特許文献１には、ヒト水晶体上皮細胞にハイブリッドアデノウィルスＳＶ４０を感染させることによって、また、特許文献２にはヒト水晶体上皮細胞に不死化遺伝子（ＳＶ４０のラージＴ抗原をコードする遺伝子）を導入することによって、不死化したヒト水晶体上皮細胞を作製する方法が記載されている。
【０００５】
しかしながら、この特許文献１および２のように、細胞を不死化するということは、細胞が常に腫瘍化するという危険性もはらんでいる。また、アデノウィルス感染では、炎症を引き起こすという危険性も有している。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第５，６４３，７８２号明細書
【０００７】
【特許文献２】
米国特許第５，８８５，８３２号明細書
【０００８】
【特許文献３】
米国特許第５，８４３，７８０号明細書
【０００９】
【特許文献４】
米国特許第６，２００，８０６号明細書
【００１０】
【非特許文献１】
Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ．，  Ｍｉｚｕｓｅｋｉ  Ｋ．，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｆｒｏｍ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ，  Ｎｅｕｒｏｎ  ，  ２０００年、２８巻、３１−４０頁
【００１１】
【非特許文献２】
Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ．，  Ｓｕｅｍｏｒｉ  Ｈ．，  Ｍｉｚｕｓｅｋｉ  Ｋ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａ  ｆｒｏｍ  ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ，  ２００２年、９９巻、１５８０−１５８５頁
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、生体材料として水晶体細胞を培養する技術に関する研究は盛んに行われているものの、今のところ、実際に生体材料として使用できるヒト水晶体細胞を作り出す方法は確立されていないのが現状である。
【００１３】
ところで、最近、霊長類やヒトにおいて胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が単離され、これからの医療として再生医学が注目されている（特許文献３、４参照）。この再生医学を利用することによって、ＥＳ細胞から水晶体細胞への誘導方法が確立できれば、水晶体細胞を嚢内へ注入することによって、調節力を持ったレンズを再生できる可能性があり、白内障と同時に老眼の治療も可能となる。また、このようなＥＳ細胞由来の水晶体細胞は、上述の特許文献１および２のような細胞操作を行うものではなく、より本来の水晶体細胞に近いものであるため、生体材料への応用の可能性も高い。
【００１４】
非特許文献１、２には、ＥＳ細胞への分化誘導法としてＳＤＩＡ法を用いて、神経細胞や網膜色素上皮細胞を産生することができると報告されている。しかしながら、上記文献に記載の方法では、均質な細胞群を再生することはできない。
【００１５】
このように、これまでのところ、実用に供する目的で、霊長類での水晶体の再生に成功した例はなく、その生産方法の確立が待たれている。そこで本発明は、ＥＳ細胞に分化を誘導することで水晶体細胞を安定して作製する方法、および、この方法によって作製される水晶体細胞を提供する。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上記の問題点について鋭意検討した結果、上記非特許文献１、２に記載のＳＤＩＡ（Ｓｔｒｏｍａｌ−ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）法を応用し、そのＥＳ細胞維持条件や分化誘導条件を様々に変更することによって、水晶体細胞を安定して生産できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明の水晶体細胞の作製方法は、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−２を２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する培地を用いてＥＳ細胞を維持するＥＳ細胞維持工程と、上記ＥＳ細胞維持工程の後に、上記ＥＳ細胞をマウス頭蓋骨細胞ＰＡ６上に２〜６．５コロニー／ｃｍ２の細胞密度で植え付けて培養することによって、上記ＥＳ細胞から水晶体細胞への分化を誘導する分化誘導工程とを含んでなることを特徴とするものである。
【００１８】
上記の方法によれば、ＥＳ細胞から水晶体細胞を安定して作製することができ、移植用生体材料としての利用可能性を有する水晶体細胞およびその水晶体細胞からなる水晶体線維組織を得ることができる。なお、この水晶体細胞およびその組織は、本明細書ではレントイドとも呼ぶ。上記の方法で作製された水晶体細胞およびその組織（レントイド）を移植用の生体材料として用いれば、従来の白内障の治療などに用いられる人工の眼内レンズとは異なって、本来の生体が有する水晶体厚の調節力と同様の調節力を有することができる。
【００１９】
さらに、上記の方法によって作製されるＥＳ細胞由来の水晶体細胞は、上述の特許文献１および２のような細胞操作を行うものではなく、より本来の水晶体細胞に近いものであるため、生体材料への応用の可能性も高い。また、上記の方法によって得られた水晶体細胞は、ＥＳ細胞を利用した分化誘導に関する種々のメカニズムの解明に繋がるとともに、再生医療の発展に貢献することが期待され、非常に有用である。
【００２０】
また、本発明の水晶体細胞の作製方法は、上述の工程に加えて、上記ＥＳ細胞維持工程と上記分化誘導工程との間に、維持された上記ＥＳ細胞を、ＥＳ分化培地を用いて１回洗浄する洗浄工程をさらに含むことが好ましい。
【００２１】
上記の方法によれば、ＥＳ細胞からの水晶体細胞への分化誘導をより良好に引き起こさせ、水晶体細胞を均質な細胞群として得ることができる。それゆえ、上記の方法によって得られた水晶体細胞は、生体材料としての利用可能性を有し、再生医療の発展に貢献することができる。
【００２２】
また、本発明の水晶体細胞の作製方法において、上記ＥＳ細胞は霊長類由来のものであることが好ましい。
【００２３】
上記の方法によれば、ヒトも霊長類に属するため、よりヒトの水晶体に近い水晶体細胞を容易かつ豊富に作製することができる。そのため、上記の方法によって作製された水晶体細胞は、ヒトにおける種々の眼疾患の治療薬の研究開発に有用である。なお、本発明の水晶体細胞の作製方法は、ヒトを含む霊長類のＥＳ細胞から水晶体細胞への分化誘導を成功させた初めての方法である。
【００２４】
なお、上記霊長類として具体的には、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、カニクイザルなどが挙げられる。後述の実施例においては、カニクイザルのＥＳ細胞について、本発明の方法を用いて水晶体細胞が実際に分化誘導されており、霊長類の生体における水晶体の分化過程と同じような分化過程をたどることが確認されている。そのため、本発明の水晶体方法の作製方法は、カニクイザル由来のものであることがより好ましい。
【００２５】
また、本発明の水晶体細胞は、上述の方法によって作製されたものである。
【００２６】
上記の水晶体細胞は、ＥＳ細胞から均質な細胞群として再生されたものであるため、再生医療における移植用の生体材料の開発に有効利用することができる。本発明の水晶体の利用方法として具体的には、該水晶体細胞を水晶体嚢内に注入し、水晶体厚の調節が可能なソフトな水晶体を再生するという方法が考えられる。この方法は、白内障の治療に有用であるとともに、白内障と老眼を同時に治療できるという利点も有している。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてより具体的に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００２８】
本発明の水晶体細胞の作製方法は、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−２を２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する培地を用いてＥＳ細胞を維持するＥＳ細胞維持工程と、上記ＥＳ細胞維持工程の後に、上記ＥＳ細胞をマウス頭蓋骨細胞ＰＡ６上に２〜６．５コロニー／ｃｍ２の細胞密度で植え付けて培養することによって、上記ＥＳ細胞から水晶体細胞への分化を誘導する分化誘導工程とを含んでなることを特徴とするものである。
【００２９】
この水晶体細胞の作製方法は、ＥＳ細胞を利用した分化誘導において、フィーダー細胞としてマウス頭蓋骨髄細胞ＰＡ６を用いるＳＤＩＡ法を利用したものであり、特にヒトなどを含む霊長類のＥＳ細胞に対して適用することができる。そして、本発明の水晶体細胞の作製方法は、特に以下の３つの点に特徴を有している。
（１）未分化状態のＥＳ細胞の維持に使用する培地に添加するＦＧＦ−２の最終濃度
（２）ＥＳ細胞をＰＡ６に植え付けるときの細胞密度
（３）ＥＳ細胞をＰＡ６に植え付ける前に実施されるＥＳ細胞の洗浄の回数
ここで、上記３つの特徴点について順に説明する。先ず、（１）の未分化状態のＥＳ細胞の維持に使用する培地に添加するＦＧＦ−２の最終濃度について説明する。
【００３０】
本発明の水晶体細胞の作製方法においては、上記ＥＳ細胞維持工程において、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−２を２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含む培地を用いてＥＳ細胞を維持する。ここでＥＳ細胞を維持するとは、ＥＳ細胞を未分化状態のまま維持することを意味し、このＥＳ細胞維持工程には、適宜ＥＳ細胞を継代することも含まれる。また、上記培地には、細胞を培養・維持することが可能な種々の培地が含まれるものとする。
【００３１】
そして、上記ＥＳ細胞維持工程においては、培地中の線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−２の最終濃度を２ｎｇ／ｍｌ以上とすることで、後述の実施例にも示されるようにレントイドの分化を誘導することができる。また、上記ＥＳ細胞維持工程において、ＦＧＦ−２の培地中の最終濃度が高くなり過ぎると、細胞増殖が強くなり維持が困難になるという弊害が発生するため、本発明では、ＦＧＦ−２の最終濃度は５０ｎｇ／ｍｌ以下とする。
【００３２】
また、後述の実施例には、ＦＧＦ−２の濃度が２ｎｇ／ｍｌの場合よりも４ｎｇ／ｍｌの場合の方が、レントイドの分化誘導がより促進され、さらに、４ｎｇ／ｍｌの場合よりも８ｎｇ／ｍｌの場合の方が、レントイドの分化誘導がより一層促進されること示されている。それゆえ、ＥＳ細胞維持工程における線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−２の維持培地中の濃度は、４〜５０ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、より良好な分化を誘導するためには、８〜３２ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。
【００３３】
ＥＳ細胞の維持工程におけるＦＧＦ−２の濃度条件以外の各条件については、従来公知の方法に従って行えばよい。この維持方法の具体的な例としては、実施例に記載の方法を挙げることができる。
【００３４】
続いて、本発明の第２の特徴点である（２）のＥＳ細胞をＰＡ６に植え付けるときの細胞密度について説明する。
【００３５】
通常、ＳＤＩＡ法によるＥＳ細胞の分化誘導においては、ＥＳ細胞の維持工程の後に、フィーダー細胞としてマウス頭蓋骨髄細胞ＰＡ６を用いてＥＳ細胞を植え付け、分化の誘導を行う。本発明の水晶体細胞の作製方法においては、この分化誘導工程において、未分化状態が維持されたＥＳ細胞の細胞密度を２〜６．５（コロニー／ｃｍ２）として、フィーダー細胞ＰＡ６への植え付けを行う。なお、この細胞密度２〜６．５（コロニー／ｃｍ２）とは、ＰＡ６細胞を保有する内径１０ｃｍの培養皿１枚におけるコロニー数に換算すると、約１５０〜５００コロニーとなる。すなわち、本発明の水晶体細胞の作成方法では、分化誘導工程におけるＰＡ６細胞へのＥＳ細胞植え付け時の細胞密度を、１５０〜５００（コロニー／内径１０ｃｍの培養皿）とすると言い換えることもできる。
【００３６】
上記のように、ＰＡ６への植え付け時のＥＳ細胞密度を２（コロニー／ｃｍ２）以上とすることで、後述の実施例にも示されるように、特に霊長類などのＥＳ細胞から、水晶体細胞を分化誘導することができる。また、上記ＥＳ細胞密度が高くなり過ぎると、ＦＧＦ−２の濃度の場合と同様に細胞の維持が困難になるという弊害が発生するため、本発明では、上記ＥＳ細胞密度の上限は６．５（コロニー／ｃｍ２）以下とする。
【００３７】
また、本発明の水晶体細胞の作製方法における、ＰＡ６細胞上へのＥＳ細胞植え付け時の細胞密度は、２．５〜４．０（コロニー／ｃｍ２）とすることがより好ましい。この細胞密度２．５〜４．０（コロニー／ｃｍ２）とは、ＰＡ６細胞を保有する内径１０ｃｍの培養皿１枚におけるコロニー数に換算すると、約２００〜３００コロニーとなる。すなわち、本発明の水晶体細胞の作成方法では、分化誘導工程におけるＰＡ６細胞へのＥＳ細胞植え付け時の細胞密度を、２００〜３００（コロニー／内径１０ｃｍの培養皿）とすることが好ましい、と言い換えることもできる。なお、この細胞密度２００〜３００（コロニー／内径１０ｃｍの培養皿）という値は、神経誘導時における細胞密度の約１．５〜２倍である。上記の細胞密度で植え付けを行うことによって、均質な水晶体細胞群をより安定して得ることができる。
【００３８】
なお、本発明の水晶体細胞の作製方法における分化誘導工程において、ＥＳ細胞をＰＡ６上に植え付けた後の培養条件については、従来公知のＥＳ細胞における分化誘導時の培養条件に従えばよい。具体的には、培養温度は３４〜３８℃が好ましく、培養ｐＨはｐＨ６．０〜８．０が好ましい。また、培養系については、静置培養、回転培養、浸透培養等を適宜選択することができる。
【００３９】
続いて、本発明のもう一つの特徴点である（３）のＥＳ細胞をＰＡ６に植え付ける前に実施されるＥＳ細胞の洗浄の回数について説明する。
【００４０】
このＥＳ細胞の洗浄については、本発明の水晶体細胞の作製方法において、ＥＳ細胞維持工程と分化誘導工程との間に実施される。そして、本発明では、ＥＳ細胞維持工程において未分化状態が維持されたＥＳ細胞を、ＥＳ分化培地を用いて１回のみ洗浄し、維持培地を洗い流すことが好ましい。
【００４１】
従来のＳＤＩＡ法における未分化ＥＳ細胞の洗浄では、その回数は３回であったが、本発明では、この洗浄回数を３回から１回にすることによって、ＥＳ細胞からの水晶体細胞への分化誘導をより良好に引き起こさせ、水晶体細胞を均質な細胞群として得ることができる。
【００４２】
上記ＥＳ細胞の洗浄工程に用いられるＥＳ分化培地としては、分化誘導時に用いる分化誘導培地と同じものを使用することが好ましい。そして、使用される上記ＥＳ分化培地の量は、未分化ＥＳ細胞ペレットの体積の３０〜１００倍であることが好ましい。
【００４３】
上述の水晶体細胞の作製方法によって、ＥＳ細胞から水晶体細胞の分化誘導を行えば、ＰＡ６細胞上での２〜３週間の培養によって、水晶体細胞およびその組織（レントイド）を安定して得ることができる。
【００４４】
なお、後述の実施例においても示されるように、ＥＳ細胞維持培地におけるＦＧＦ−２の濃度、および、植え付け時のＥＳ細胞の細胞密度をともに増加させれば、分化の誘導は相乗的に高まる。それゆえ、上記ＦＧＦ−２の濃度および上記ＥＳ細胞の細胞密度を、上述の範囲内でともに高くすれば、より良質な水晶体細胞を安定して作製することができる。
【００４５】
本発明の水晶体細胞の作製方法は、ヒトを含む霊長類のＥＳ細胞において実施されることが好ましい。本発明を霊長類のＥＳ細胞に適用すれば、ヒトの水晶体に近い水晶体細胞を容易かつ豊富に作製することができるため、ヒトにおける種々の眼疾患の治療薬の研究開発に有用である。
【００４６】
また、本発明の水晶体細胞は、本発明の水晶体細胞の作製方法によって作製されたものであり、本発明の範囲内で条件を適宜変更させて作製された種々の水晶体細胞が含まれる。
【００４７】
本発明の水晶体細胞は、ＥＳ細胞の分化に関するメカニズムを解明や、白内障治療薬の研究開発に有用であるとともに、人工の眼内レンズよりもレンズ厚の調節能に優れた眼内レンズとして使用できる可能性を有している。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。本実施例では、霊長類のＥＳ細胞の一例として、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ）のＥＳ細胞を用いて水晶体細胞の分化誘導が実施された。
【００４９】
〔１〕実験方法
本実施例は、以下の（１）から（４）に記載の方法で行われた。
【００５０】
（１）ＥＳ細胞の維持
先ず、本実験に用いられるカニクイザルのＥＳ細胞の入手方法について説明する。
【００５１】
ＥＳ細胞系は、従来文献〔Ｓｕｅｍｏｒｉ  Ｈ．，  Ｔａｄａ  Ｔ．，  Ｔｏｒｉｉ  Ｒ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＩＶＦ  ｏｒ  ＩＣＳＩ，  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．，  ２００２年、２２２巻、２７３−２７９頁〕に記載に基づいて、カニクイザルの胚盤胞から得られた。そして、その多能性が確認された。
【００５２】
未分化のＥＳ細胞は、マイトマイシンＣによって不活性化されたマウス胚性幹線維芽（ＳＴＯ細胞）のフィーダー層上に保持された。細胞は０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（シグマ製）、１０００Ｕ／ｍｌ  白血病抑制因子（ＥＳＧＲＯ、ケミコン製）、２０％  ノックアウト血清代替物（ギブコ製）、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸（ギブコ製）、８ｎｇ／ｍｌ  線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２、アップステート製）が補われたＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（シグマ製）で培養された。培地は毎日交換された。
【００５３】
その後、ＥＳ細胞の継代は、０．２５％トリプシンを含む１ｍＭ  ＣａＣｌ２ＰＢＳ溶液、２０％  ノックアウト血清代替物で処理された。そして、マウス頭蓋骨髄由来のＰＡ６上に植え付ける３〜４日前から、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−２が濃度２、４、８ｎｇ／ｍｌでそれぞれ添加された。
【００５４】
（２）レントイドの誘導
続いて、ＦＧＦ−２を各濃度で含有する培地上で維持されたＥＳ細胞について、以下のような手順で分化の誘導が実施された。
【００５５】
ＰＡ６はフィーダー細胞層として使用するために、ゼラチンコートされた培養皿に植え付けられた。トリプシン処理に続いて、部分的に分離されたＥＳ細胞群（３０−５０個／１群）は、ゼラチンでコートされた１０％  ＦＢＳ（ハイクローン製）を含むＧＭＥＭ培地（ギブコ製）上に播かれた。３７℃で３０分間のインキュベートの後、ＥＳ細胞はピペッティングによって分散された。遠心分離によって集められた細胞ペレットは、ＥＳ分化培地〔１０％  ノックアウト血清代替物、１ｍＭ  ピルビン酸（シグマ製）、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（和光製）〕とともに洗浄された。
【００５６】
その後、洗浄されたＥＳ細胞は、ＰＡ６フィーダー細胞層上に植え付けられ、分化の誘導が試みられた。なお、この植え付け工程では、ＰＡ６細胞上に植え付けられるＥＳ細胞の細胞密度が、高密度（２００コロニー以上／内径１０ｃｍの培養皿）のものと、低密度（１５０コロニー以下／内径１０ｃｍ培養皿）のものの２種類が作製された。植え付けられたＥＳ細胞は、分化培地で少なくとも６週間培養された。培地は３日間ごとに交換された。
【００５７】
（３）培養細胞の免疫組織化学的調査
上記（２）の方法で培養された細胞について、免疫組織化学的な調査が実施された。
【００５８】
細胞は４％  パラホルムアルデヒド（和光製）中で１時間保持され、その後２５％  スクロースＰＢＳ中に浸された。０．１Ｍ  リン酸バッファー（ＰＢ）で洗浄された後、試料は０．００５％  サポニン（０．１ＭＰＢ−ｓａｐｏｎｉｎ、メルク製）を含む０．１Ｍ  ＰＢ中で２０％  脱脂粉乳とともに１時間インキュベートされ、非特異的な抗体結合をブロックした。５％  脱脂粉乳を含む０．１Ｍ  ＰＢ−ｓａｐｏｎｉｎで希釈された一次抗体とともに、試料は４℃で２４時間インキュベートされた。ウサギのポリクローナル抗クリスタリンアルファＡ（１：１０００、ストレスジェン製）が一次抗体として使用された。この抗体の活性は、ポジティブコントロールとしてラットのレンズを使用して確認された。０．１Ｍ  ＰＢでの洗浄後に、試料は、５％  脱脂粉乳を含む０．１Ｍ  ＰＢ−ｓａｐｏｎｉｎで希釈されたフルオレセイン共役ロバ抗ウサギ免疫グロブリン（１：１００、アマシャム製）二次抗体とともに室温で１時間インキュベートされた。０．１Ｍ  ＰＢで洗浄した後、試料はグリセロール−ＰＢＳ（１：１）とともにスライドに固定され、レーザー自動読み取り共焦点顕微鏡（ライカ製）で観察された。
【００５９】
（４）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロット解析上記（２）の方法で培養された細胞について、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロット解析が実施された。
【００６０】
細胞はスクラッピングによって集められ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（和光製）を含む５００μｌの溶解バッファー（レムリサンプルバッファー、バイオラッド製）中に溶解された。細胞懸濁液は氷上で均質化された。均質化された細胞は−８０℃で保存された。ＥＳ細胞溶解物は電気泳動にかけられ、分離されたタンパク質は、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｍ−Ｐ、ミリポア製）に転写された。非特異的抗体結合は、２０％脱脂粉乳を含む０．１ＭＰＢとの１時間のインキュベーションによってブロックされた。ブロットは５％脱脂粉乳を含む０．１Ｍ  ＰＢで希釈された一次抗体とともに室温でインキュベートされた。ウサギのポリクローナル抗体、抗クリスタリンアルファＡ（１：１０００、ストレスジェン製）および、抗Ｐａｘ６（１：２００、サンタクルーズ製）が、一次抗体として使用された。一次抗体結合は、ＡＢＣ法に基づいてアルカリフォスファターゼ（１：１００、ヴェクター製）と結合した抗ウサギＩｇＧを使用して検出された。０．１ＭＰＢで洗浄された後、ブロットはプロトコルに従ってフォスファターゼ基質（コニカ免疫染色、コニカ製）とともに現像された。
【００６１】
〔２〕結果
続いて、上記の方法で行った本実験の実験結果を以下の（１）から（４）に示す。
【００６２】
（１）レントイドの誘導について
ＰＡ６細胞上での２〜３週間の培養によって、ＥＳ細胞コロニー全体が色素沈着を引き起こすことなく成長し続ける分化細胞が作製された。これらの細胞を位相差顕微鏡によって観察した結果を図１（ａ）から（ｄ）に示す。図１（ａ）は、誘導開始から３０日後の比較的小さな細胞であり、図１（ｂ）は、誘導開始から５３日後の大きな細胞を観察した結果である。図１（ａ）および（ｂ）に示すように、培養された細胞は、最終的に蓄積して大きさを変化させる透明体を形成した。なお、各図の右下に示すバーによって、その大きさがわかる。
【００６３】
図２には、分化誘導された細胞について、免疫染色を行った結果を示す。図２において白く示される部分が、免疫染色によって染色された部分である。この結果から、分化誘導された細胞が抗クリスタリンアルファＡ抗体を有していることが確認され、分化誘導された細胞がクリスタリンアルファＡを発現していることが分かった。これによって、分化誘導された細胞はレントイドとして特徴付けられた。
【００６４】
また、いくつかのコロニーが、網膜色素性上皮細胞を形成することが確認された（図１（ｃ）参照）。網膜色素性上皮細胞のほとんどが、レントイドを含むコロニーから独立したコロニーにおいて発生した。実際の眼で確認されるのと同じ形状で、レントイドと網膜色素性上皮細胞とが一つのコロニー内に存在するものも見られた（図１（ｄ）参照）。
【００６５】
なお、このレントイドは、誘導開始から１４〜１６日後に初めて確認された。レントイドを含むコロニーの比率は、誘導開始から２０日後から次第に増加した。レントイドの数は、誘導開始から４０日以内でピークに達した。
【００６６】
（２）ウエスタンブロッティングによる解析結果
レントイドによるクリスタリンアルファＡの発現が、ウエスタンブロット解析によってさらに調査された。具体的には、分化誘導から４０日後のレントイドのタンパク質がＰＶＤＦ膜に転写された後、電気泳動が行われ、抗クリスタリンアルファＡ抗体あるいは抗Ｐａｘ６抗体の探査が行われた。
【００６７】
その結果を図３に示す。図３（ａ）は、クリスタリンアルファＡの発現を調査したウエスタンブロット解析結果であり、レーン１はポジティブコントロール（ラットの水晶体タンパク質）、レーン２はネガティブコントロール（ラットの神経幹細胞）、レーン３はＳＤＩＡ法によるレントイドタンパク質の全量である。図３（ｂ）は、Ｐａｘ６の発現を調査したウエスタンブロット解析結果であり、レーン１はＰＡ６細胞のタンパク質、レーン２は未分化のＥＳ細胞の全量タンパク質、レーン３はＳＤＩＡ法によるレントイド細胞の全量タンパク質である。
【００６８】
図３（ａ）に示すように、ウサギ抗クリスタリンアルファＡポリクローナル抗体は、２２ｋＤａのタンパク質を検知した。クリスタリンアルファタンパク質を示すシングルバンドは、レーン３のＳＤＩＡ法によって分化誘導されたＥＳ細胞溶解液中では検出されたが、レーン２のネガティブコントロール（ラットの神経幹細胞）においては検出されなかった。レーン１のポジティブコントロール（ラット水晶体タンパク質）においては、２つのバンド（２２ｋＤａと２５ｋＤａ）が検出された。２５ｋＤａのバンドは、ラットのα−クリスタリンで発現し得るＡｉｎｓと思われる。
【００６９】
図３（ｂ）に示すＰａｘ６の発現に関して言えば、ウサギ抗Ｐａｘ６抗体は、４８ｋＤａのＰａｘタンパク質を検出した。Ｐａｘ６は合成したレントイド内（レーン３）においては発現するが、ＰＡ６フィーダー細胞（レーン１）や未分化のＥＳ細胞（レーン２）においては発現しないことが確認された。
【００７０】
従来文献〔Ｆｕｒｕｔａ  Ｙ．，  Ｈｏｇａｎ  ＢＬ．，  ＢＭＰ４  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｌｅｎｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  １９９８年、１２巻、３７６４−３７７５頁〕に報告されているように、Ｐａｘ６は水晶体の形成に必須である。眼胞と表皮外胚葉との相互作用におけるＰａｘ６の発現は、水晶板の形成と、嵌入を誘導する。水晶体の前駆体にＰａｘ６が欠如すると、水晶体の形成において欠陥が生じる。
【００７１】
本実験において、ＥＳ細胞の分化からレントイドにおけるＰａｘ６の発現が導かれるということが確認された。Ｐａｘ６は、ＥＳ細胞からのレントイドの形成と、通常の発達の両方の機能を担う重要な因子であることが示唆される。また、この結果から、ＳＤＩＡ法によるＥＳ細胞の分化誘導によって、水晶体が形成されたことが裏付けられた。
【００７２】
（３）レントイド誘導における外因性ＦＧＦ−２の影響について
続いて、霊長類のＥＳ細胞からのレントイドを誘導する場合におけるＦＧＦ−２濃度の影響を評価した。その結果を図４に示す。図４は、未分化ＥＳ細胞を維持する際の培地中のＦＧＦ−２の濃度が、２、４、８ｎｇ／ｍｌの各場合における誘導開始からの経過日数とレントイドの誘導割合（％）との関係を示すグラフである。なお、図４では、ＦＧＦ−２の濃度が２ｎｇ／ｍｌの場合を◆で示し、４ｎｇ／ｍｌの場合を■で示し、８ｎｇ／ｍｌの場合を△で示している。
図４に示すように、誘導開始から２０日間は、濃度の違いによる有意な差は見られなかった。誘導開始から３０日以上経過後には、レントイドを含むコロニーのパーセンテージは、ＦＧＦ−２濃度の増加に伴って用量依存的に増加した。本願発明者等はまた、ＦＧＦ−２をＥＳ分化培地へ添加することを試みた。しかし、ＰＡ６細胞の成長があまりにも早すぎるため、分化するＥＳ細胞を維持することはできなかった（データ示さず）。
【００７３】
ＦＧＦが水晶体の分化と発達において重要な役割を果たし得るということは、いくつかの研究で報告されている。例えば、哺乳類においては、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、水晶体線維の分化を促進する（参考文献〔Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ＣＧ．，  ＭｃＡｖｏｙ  ＪＷ．，  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｌｅｎｓ  ｆｉｂｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ，  １９８７年、６巻、１１６５−１１６９頁〕）。ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、発達段階においてマウスの神経網膜と水晶体細胞で発現し、ＦＧＦＲ（ＦＧＦレセプター）−１、および−２も水晶体細胞で発現する。
【００７４】
本実験では、未分化ＥＳ細胞維持培地におけるＦＧＦ−２濃度の増加が、レントイドの分化に影響を及ぼすことが示された。つまり、ＦＧＦ−２の濃度を維持培地中に２ｇ／ｍｌよりも多く含有させることで、その後のレントイドの分化誘導を促進させることができるということが確認された。この結果から、ＦＧＦ−２は、ＳＤＩＡ培地での分化因子のレセプターを上方制御することによって、未分化ＥＳ細胞を分化因子に上手く応答させる可能性が示唆される。
【００７５】
（４）レントイド誘導におけるコロニー密度の影響について
次に、ＰＡ６フィーダー細胞にＥＳ細胞を植え付ける場合のＥＳ細胞の細胞密度とレントイド誘導との関係を調べた結果を図５に示す。図５は、ＥＳ細胞密度が高密度（２００コロニー以上／１０ｃｍの培養皿：図５では■で示す）の場合、低密度（１５０コロニー以下／内径１０ｃｍ培養皿：図５では◆で示す）の場合、それぞれの誘導開始からの経過日数とレントイドの誘導割合（％）との関係を示すグラフである。
【００７６】
図５に示すように、レントイドを含むコロニーのパーセンテージは、培養段階の開始時に添加されたＥＳコロニーの密度に比例して増加した。
【００７７】
また、図６には、誘導開始から３０日経過後におけるＦＧＦ−２の濃度に応じたコロニー密度の影響を示す。図６のグラフでは、左から順にＦＧＦ−２の濃度が２ｎｇ／ｍｌの場合、４ｎｇ／ｍｌの場合、８ｎｇ／ｍｌの場合のレントイドの誘導割合（％）を示し、また、各濃度のＦＧＦ−２について、白色の棒グラフがコロニー密度の低いもの（１５０コロニー以下／内径１０ｃｍ培養皿）、黒色の棒グラフがコロニー密度の高いもの（２００コロニー以上／１０ｃｍの培養皿）を示している。
【００７８】
図６に示すように、誘導から３０日後において、ＰＡ６細胞上に高密度（２００コロニー以上／１０ｃｍの培養皿）で植え付けられた培養液中のＥＳ細胞分化によって誘導されたレントイドの数は、低密度（１５０コロニー以下／１０ｃｍ培養皿）で植え付けられた場合のレントイドの数と比較して多かった。また、レントイド細胞の数は、誘導に先立って植え付けられたＥＳ細胞の密度の増加に伴って直線的に増加することがわかった。同様の結果が誘導開始から４０日後に観察された。しかしながら、２０日では有意な差は観察されなかった。
【００７９】
なお、図７（ａ）には、高コロニー密度で培養した場合のレントイドを、顕微鏡で観察した結果を示す。この図から、種々のレントイドがいくつかのコロニーによって形成されていることがわかる。右下のスケールバーは１００μｍである。図７（ｂ）には、高コロニー密度で培養した場合の網膜の色素性上皮細胞を、顕微鏡で観察した結果を示す。この図から、矢印で示す網膜の色素性上皮細胞は、いくつかのコロニーによって形成されていることがわかる。右下のスケールバーは１００μｍである。このように、網膜の色素性上皮細胞の誘導についても、コロニー密度が高い培養液で増加した。
【００８０】
以上の結果から、植え付けられたコロニーの密度は、レントイド誘導の量に影響を及ぼす可能性を示唆する。細胞間接触は、マウスの水晶体上皮細胞によるレントイドの形成に重要である。また、鶏のヒナの神経網膜の水晶体への分化転換も、幾層にも関連して混み合った状況下で起きる。このように、レントイドの形成は、混み合った状態で発生する傾向にあり、それゆえ、コロニー密度は重要な分化因子となり得る。コロニー密度は、網膜の色素性上皮細胞の分化量に影響を及ぼし得る。これらのデータは、コロニーが混み合った状態の場合に、その後に行われるＳＤＩＡ処理によって、眼球細胞がより形成されやすくなるということを示唆する。
【００８１】
本実験結果をまとめると、ＥＳ細胞の維持過程において維持培地のＦＧＦ−２濃度を高くし、ＰＡ６上に植え付けられるＥＳ細胞のコロニー密度を高くして、ＳＤＩＡ法を実施することによって、カニクイザルのＥＳ細胞から安定してレントイドを再生することができることが確認された。
【００８２】
【発明の効果】
以上のように、本発明の水晶体細胞の作製方法によれば、ＥＳ細胞から水晶体細胞を安定して作製することができ、移植用生体材料としての利用可能性を有する水晶体細胞およびその水晶体細胞からなる水晶体線維組織を得ることができる。上記の方法で作製された水晶体細胞は、ＥＳ細胞から均質な細胞群として再生されたものであるため、再生医療における移植用の生体材料の開発に有効利用することができる。
【００８３】
本発明は、ヒトを含む霊長類のＥＳ細胞から水晶体への分化誘導を成功させた初めての例であり、ＥＳ細胞の分化に関するメカニズムを解明に寄与するという学術的意義を有するだけでなく、白内障治療薬の研究開発に役立てることができるという医薬分野の発展に寄与する可能性も有している。それゆえ、本発明の有用性は高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）〜（ｄ）は、本実施例において分化誘導されたレントイドを位相差顕微鏡によって観察した結果を示す図である。
【図２】本実施例において分化誘導されたレントイドを免疫染色した結果を示す図である。
【図３】本実施例で分化誘導された細胞について、タンパク質の発現を調査したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。（ａ）はクリスタリンアルファＡの発現を、（ｂ）はＰａｘ６の発現を、それぞれ調査したものである。
【図４】未分化ＥＳ細胞を維持する際の培地中のＦＧＦ−２の濃度が、２、４、８ｎｇ／ｍｌの各場合における誘導開始からの経過日数とレントイドの誘導割合（％）との関係を示すグラフである。
【図５】ＥＳ細胞密度が高密度の場合、低密度の場合それぞれの、誘導開始からの経過日数とレントイドの誘導割合（％）との関係を示すグラフである。
【図６】ＥＳ細胞密度が高密度の場合、低密度の場合それぞれの、誘導開始から３０日経過後におけるＦＧＦ−２の濃度に応じたレントイドの誘導割合（％）示すグラフである。
【図７】（ａ）は、高コロニー密度で培養した場合のレントイドを、顕微鏡で観察した結果を示す図である。（ｂ）は、高コロニー密度で培養した場合の網膜の色素性上皮細胞を、顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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