(57)【要約】【課題】ＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】（ａ）ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片および被験物質を緩衝液に入れ、あるいは、対照としてＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片のみを緩衝液に入れ；（ｂ）（ａ）の各混合物に細胞外基質蛋白質またはその断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；（ｃ）それらの混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と該細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量し；ついで（ｄ）被験物質を加えた場合に形成される複合体量が、被験物質を加えない場合に形成される複合体量と比較して少ない場合に、その被験物質をＩｇＡ腎症の候補治療薬とする、工程からなることを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片、および細胞外基質蛋白質またはその断片を用い、それらの間の複合体の生成率に影響を与える被験物質を検出することを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片が合成由来またはＩｇＡ腎症患者由来であることを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＩｇＡ１断片がＰｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒであることを特徴とする請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＩｇＡ１断片がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＨＰ）、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰまたは４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰであることを特徴とする請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞外基質蛋白質がフィブロネクチンまたはラミニンであることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
細胞外基質蛋白質の断片がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇであることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片とをモル比で１／２〜２の混合比率で用いた場合において、複合体の生成率が、その用いたＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片のモル数の３％以上となる両者の組み合わせを選択することを特徴とする請求項１〜６いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
組み合わせが、ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、ＨＰとＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇまたは４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇであることを特徴とする請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
複合体の生成率を、エレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析計を用いて測定することを特徴とする請求項１〜８いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
（ａ）ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片および被験物質を緩衝液に入れ、あるいは、対照としてＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片のみを緩衝液に入れ；
（ｂ）（ａ）の各混合物に細胞外基質蛋白質またはその断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）それらの混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と該細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量し；ついで
（ｄ）被験物質を加えた場合に形成される複合体量が、被験物質を加えない場合に形成される複合体量と比較して少ない場合に、その被験物質をＩｇＡ腎症の候補治療薬とする、工程からなることを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
（ａ）ＨＰ、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、９−
ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰおよび４，　７，　９，　１１，　１５−
ＧａｌＮＡｃ−ＨＰよりなる群から選択される１のＩｇＡ１断片および被験物質を緩衝液に入れ、あるいは、対照としてＩｇＡ１断片のみを緩衝液に入れ；
（ｂ）（ａ）の各混合物にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇおよびＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇよりなる群から選択される１のフィブロネクチンまたはラミニンの断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）それらの混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１断片と該フィブロネクチンまたはラミニンの断片との間に形成される複合体量を定量し；ついで
（ｄ）被験物質を加えた場合に形成される複合体量が、被験物質を加えない場合に形成される複合体量と比較して少ない場合に、その被験物質をＩｇＡ腎症の候補治療薬とする、工程からなることを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１２】
（ａ）細胞外基質蛋白質またはその断片および被験物質を緩衝液に入れ、あるいは、対照として細胞外基質蛋白質またはその断片のみを緩衝液に入れ；
（ｂ）（ａ）の各混合物にＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）それらの混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と該細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量し；ついで
（ｄ）被験物質を加えた場合に形成される複合体量が、被験物質を加えない場合に形成される複合体量と比較して少ない場合に、その被験物質をＩｇＡ腎症の候補治療薬とする、工程からなることを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１３】
（ａ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇおよびＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇよりなる群から選択される１のフィブロネクチンまたはラミニンの断片および被験物質を緩衝液に入れ、あるいは、対照としてそのフィブロネクチンまたはラミニンの断片のみを緩衝液に入れ；
（ｂ）（ａ）の各混合物にＨＰ、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、９−
ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰおよび４，　７，　９，　１１，　１５−
ＧａｌＮＡｃ−ＨＰよりなる群から選択される１のＩｇＡ１断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）それらの混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１断片と該フィブロネクチンまたはラミニンの断片との間に形成される複合体量を定量し；ついで
（ｄ）被験物質を加えた場合に形成される複合体量が、被験物質を加えない場合に形成される複合体量と比較して少ない場合に、その被験物質をＩｇＡ腎症の候補治療薬とする、工程からなることを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１４】
（ａ）ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片および被験物質を緩衝液に入れ；
（ｂ）（ａ）の混合物に細胞外基質蛋白質またはその断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）その混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と該細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量することを特徴とするＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片との複合体の定量的測定方法。
【請求項１５】
（ａ）細胞外基質蛋白質またはその断片および被験物質を緩衝液に入れ；
（ｂ）（ａ）の混合物にＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）その混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と該細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量することを特徴とするＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片との複合体の定量的測定方法。
【請求項１６】
（ａ）ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片を緩衝液に入れて混和し、その後一定時間反応させ；ついで
（ｂ）その混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と該細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量することを特徴とするＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片との複合体の定量的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＩｇＡ腎症の治療に有効な治療薬をスクリーニングする方法、詳細には、ＩｇＡ１のヒンジ部断片を用いることを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法に関する。また、ＩｇＡ１のヒンジ部断片に結合する物質、前記結合を増強または阻害させる物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩｇＡ腎症は１９６８年にＢｅｒｇｅｒらにより報告され、糸球体メサンギウム領域にＩｇＡが優位に沈着することが特徴とされ（Ｃｏｎｌｅｙ，　Ｍ．　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　６６，　１４３２−１４３６，　１９８０）、慢性糸球体腎炎のうち最も高頻度に起こる疾患である。またＩｇＡ腎症患者の約４０％が２０年以内に腎不全に移行すると報告され、また、血液透析に導入された症例の原疾患の約２３％をＩｇＡ腎症が占めていることも報告されていることから、年間約６０００〜７０００人のＩｇＡ腎症患者が末期腎不全となり透析に導入されていると考えられる。現在、ＩｇＡ腎症に対する治療薬として、ステロイド薬、抗血小板薬、ＡＣＥ阻害薬、免疫抑制薬などが用いられているが、ＩｇＡ腎症において末期腎不全への移行を阻止する有効な治療薬は未だ開発されていない。
【０００３】
ヒトＩｇＡにはヒンジ部構造が異なるＩｇＡ１とＩｇＡ２の２種のサブクラスが存在しており、ＩｇＡ腎症において糸球体メサンギウム領域に沈着するのは主にＩｇＡ１であることが知られている（Ｃｏｎｌｅｙ，　Ｍ．　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　６６，　１４３２−１４３６，　１９８０）。ヒトＩｇＡ２のヒンジ部構造には、プロリンのみが含まれるＯ−結合型糖鎖が存在しないのに対し、ヒトＩｇＡ１のヒンジ部構造には以下の配列に示す通り、セリンおよび／またはスレオニン残基の水酸基にＮ−アセチルガラクトサミン（以下、ＧａｌＮＡｃと称する）を介したＯ−結合型糖鎖が存在することが報告されている（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２４９，７２６０−７２６９，　１９７４、　Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２４９，　７２７０−７２８１，　１９７４、Ｔｏｒａｎｏ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７４，　２３０１−２３０５，　１９７７）。ＩｇＡ１はＯ−結合型糖鎖を有するという点でヒト血清糖蛋白のなかで例外的な分子であり、またＩｇＡ１のヒンジ部アミノ酸配列には霊長類の中でもチンパンジーやゴリラしか共通性を見いだせない（Ｋａｗａｍｕｒａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　２１５，　２０１−２０６，　１９９０）。
【０００４】
かかる糖蛋白質ＩｇＡ１の糖鎖を構成する単糖として、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、シアル酸（Ｓｉａ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）などが挙げられる。これら単糖により構成される糖鎖構造は、１−２結合、１−３結合、１−４結合、１−６結合、アノマー構造（α、β）、枝分かれ構造などにより多様性（糖鎖の微小不均一性）が認められる（Ｉｗａｓｅ，　Ｈ．；　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２０，　４７９−４９１，　１９８８）。特にＩｇＡ１ヒンジ部におけるＯ−結合型糖鎖構造は、ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，　３ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＮＡｃα２，　３Ｇａｌβ１，　３ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＮＡｃα２，　３Ｇａｌβ１，　３（ＮｅｕＮＡｃα２，　６）ＧａｌＮＡｃ、ＮｅｕＮＡｃα２，　６ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，　３（ＮｅｕＮＡｃα２，　６）ＧａｌＮＡｃ、Ｓｉａなどの組み合わせにより多様性が現れるが、主としてＮ−アセチルガラクトサミンの外側にガラクトース（以下、Ｇａｌという）が結合し、最外側にシアル酸（特にＮｅｕＮＡｃ）が結合している（下記配列を参照されたし）。
【０００５】
2004061357.tif 000002
（上記アミノ酸番号１９のセリン残基はＩｇＡ１のアミノ酸番号２４０に対応している）
＊：　−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａｌｉｃ　ａｃｉｄ
【０００６】
最近、ＩｇＡ腎症において、ＩｇＡ１ヒンジ部のＯ−結合型糖鎖構造の不全が関与しているという報告がされている。例えば、ＩｇＡ腎症患者の血清または組織より単離されたＩｇＡ１は糖鎖不全分子の割合が高いことが報告されている（Ｈｉｋｉ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ａｍ．　Ｓｏｃ．　Ｎｅｐｈｒｏｌ．，　７，　９５５−９６０，　１９９６、Ｈｉｋｉ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ａｍ．　Ｓｏｃ．　Ｎｅｐｈｒｏｌ．，　９，　５７７−５８２，　１９９８、Ｏｄａｎｉ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２７１，　２６８−２７４，　２０００、Ｋｏｋｕｂｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｎｅｐｈｒｏｌ．　Ｄｉａｌ．　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，　１４，　８１−８５，　１９９９、Ｔｏｍａｎａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．，　５２，５０９−５１６，　１９９７、Ｔｏｍａｎａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　１０４，　７３−８１，　１９９９、Ａｌｌｅｎ，　Ａ．　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｃｌｉｎ．　Ｅｘｐ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１００，　４７０−４７４，　１９９５、Ａｌｌｅｎ，　Ａ．　Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ａｍ．　Ｓｏｃ．　Ｎｅｐｈｒｏｌ．，　１０，　５０６Ａ，　１９９９）。また、ＩｇＡ腎症患者血清中でＩｇＡ−フィブロネクチン複合体の存在が報告され（Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍ，　Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８５，　４８６５−４８６８，　１９８８）、またＩｇＡ１のヒンジ部Ｏ−結合型糖鎖不全がメサンギウム基質構成成分であるフィブロネクチン、ラミニン、ＩＶ型コラーゲンとの結合に関与している可能性が報告されている（Ｃｏｐｐｏ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｃｏｎｔｒ．　Ｎｅｐｈｒｏｌ．，　１１１，　８５−９２，　１９９５、Ｋｏｋｕｂｏ，　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ａｍ．　Ｓｏｃ．　Ｎｅｐｈｒｏｌ．，　９，　２０４８−２０５４，　１９９８）。
【０００７】
このようにＩｇＡ１のＯ−結合型糖鎖不全がＩｇＡ腎症の発症に関与するという報告は多数存在し、糖鎖不全ＩｇＡ１を利用したＩｇＡ腎症の診断方法が報告されてきた（特開平９−３１１３２、特開平１０−１１１２９０、特開平１０−１１１２９１）。しかしながら、糖鎖不全をターゲットとするＩｇＡ腎症治療薬の開発は、ＩｇＡ腎症の根本的治療薬となる可能性があるにも拘わらず、実験動物やスクリーニング方法の問題により困難を極めている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
すなわち、ＩｇＡ腎症においては、糸球体メサンギウム領域にＩｇＡ１が有意に沈着すること、ＩｇＡ１ヒンジ部のＯ−結合型糖鎖構造の不全が関与していること、患者血清中には糖鎖不全ＩｇＡ１分子の割合が高いこと、患者血清中でフィブロネクチンと複合体を形成していること、ＩｇＡ１のヒンジ部Ｏ−結合型糖鎖不全がフィブロネクチンなどの細胞外基質蛋白質との結合に関与していることなどが報告されている。ゆえに、糖鎖不全ＩｇＡ１が腎組織中の細胞外基質蛋白質と結合することで腎組織に沈着すると予想できる。
【０００９】
従って、糖鎖不全ＩｇＡ１と細胞外基質蛋白質との複合体形成を阻害または抑制する化合物は、糖鎖不全ＩｇＡ１が腎組織に沈着するのを阻害または抑制し、ＩｇＡ腎症治療薬となる可能性がある。
【００１０】
しかしながら、糖鎖不全ＩｇＡ１と細胞外基質蛋白質との複合体を定量的に測定できる方法は存在しないため、複合体形成に影響を及ぼす化合物を評価することができなかった。さらに、糖鎖の微小不均一性により如何なる糖鎖が複合体形成に影響を与えるのか、またどの程度複合体が形成されるのか全く不明であった。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記従来技術に鑑み、ＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質断片とが複合体を形成することを初めて定量的に証明し、その定量的測定方法を開発した。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片、および細胞外基質蛋白質またはその断片を用い、それらの間の複合体の生成率に影響を与える被験物質を検出することを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法；
（２）ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片が合成由来またはＩｇＡ腎症患者由来であることを特徴とする（１）記載のスクリーニング方法；
（３）ＩｇＡ１断片がＰｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒであることを特徴とする（３）記載のスクリーニング方法；
（４）ＩｇＡ１断片がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＨＰ）、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰまたは４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰであることを特徴とする（１）または（２）記載のスクリーニング方法；
（５）細胞外基質蛋白質がフィブロネクチンまたはラミニンであることを特徴とする（１）〜（４）いずれか１に記載のスクリーニング方法；
（６）細胞外基質蛋白質の断片がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇであることを特徴とする（１）〜（４）いずれか１に記載のスクリーニング方法；
（７）ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片とをモル比で１／２〜２の混合比率で用いた場合において、複合体の生成率が、その用いたＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片のモル数の３％以上となる両者の組み合わせを選択することを特徴とする（１）〜（６）いずれか１に記載のスクリーニング方法；
（８）組み合わせが、ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｓｅｒ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇまたは４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ａｒｇであることを特徴とする（７）記載のスクリーニング方法；
（９）複合体の生成率を、エレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析計を用いて測定することを特徴とする（１）〜（８）いずれか１に記載のスクリーニング方法；
（１０）（ａ）ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片および被験物質を緩衝液に入れ、あるいは、対照としてＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片のみを緩衝液に入れ；
（ｂ）（ａ）の各混合物に細胞外基質蛋白質またはその断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）それらの混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と該細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量し；ついで
（ｄ）被験物質を加えた場合に形成される複合体量が、被験物質を加えない場合に形成される複合体量と比較して少ない場合に、その被験物質をＩｇＡ腎症の候補治療薬とする、工程からなることを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法；
（１１）（ａ）ＨＰ、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰおよび４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰよりなる群から選択される１のＩｇＡ１断片および被験物質を緩衝液に入れ、あるいは、対照としてＩｇＡ１断片のみを緩衝液に入れ；
（ｂ）（ａ）の各混合物にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇおよびＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇよりなる群から選択される１のフィブロネクチンまたはラミニンの断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）それらの混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１断片と該フィブロネクチンまたはラミニンの断片との間に形成される複合体量を定量し；ついで
（ｄ）被験物質を加えた場合に形成される複合体量が、被験物質を加えない場合に形成される複合体量と比較して少ない場合に、その被験物質をＩｇＡ腎症の候補治療薬とする、工程からなることを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法；
（１２）（ａ）細胞外基質蛋白質またはその断片および被験物質を緩衝液に入れ、あるいは、対照として細胞外基質蛋白質またはその断片のみを緩衝液に入れ；
（ｂ）（ａ）の各混合物にＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）それらの混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と該細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量し；ついで
（ｄ）被験物質を加えた場合に形成される複合体量が、被験物質を加えない場合に形成される複合体量と比較して少ない場合に、その被験物質をＩｇＡ腎症の候補治療薬とする、工程からなることを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法；
（１３）（ａ）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇおよびＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇよりなる群から選択される１のフィブロネクチンまたはラミニンの断片および被験物質を緩衝液に入れ、あるいは、対照としてそのフィブロネクチンまたはラミニンの断片のみを緩衝液に入れ；
（ｂ）（ａ）の各混合物にＨＰ、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、９−
ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰおよび４，　７，　９，　１１，　１５−
ＧａｌＮＡｃ−ＨＰよりなる群から選択される１のＩｇＡ１断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）それらの混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１断片と該フィブロネクチンまたはラミニンの断片との間に形成される複合体量を定量し；ついで
（ｄ）被験物質を加えた場合に形成される複合体量が、被験物質を加えない場合に形成される複合体量と比較して少ない場合に、その被験物質をＩｇＡ腎症の候補治療薬とする、工程からなることを特徴とするＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法；
（１４）（ａ）ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片および被験物質を緩衝液に入れ；（ｂ）（ａ）の混合物に細胞外基質蛋白質またはその断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）その混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と該細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量することを特徴とするＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片との複合体の定量的測定方法；
（１５）（ａ）細胞外基質蛋白質またはその断片および被験物質を緩衝液に入れ；
（ｂ）（ａ）の混合物にＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片を入れて混和し、その後一定時間反応させ；
（ｃ）その混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と該細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量することを特徴とするＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片との複合体の定量的測定方法；
（１６）（ａ）ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片を緩衝液に入れて混和し、その後一定時間反応させ；ついで
（ｂ）その混合物をエレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析に付して該ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と該細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量することを特徴とするＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片との複合体の定量的測定方法
を提供し、さらには、
（１７）ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片が合成由来またはＩｇＡ腎症患者由来であることを特徴とする（１４）〜（１６）いずれか１に記載の定量的測定方法；
（１８）ＩｇＡ１断片がＰｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒであることを特徴とする（１７）記載の定量的測定方法；
（１９）ＩｇＡ１断片がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＨＰ）、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰまたは４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰであることを特徴とする（１７）記載の定量的測定方法；
（２０）細胞外基質蛋白質がフィブロネクチンまたはラミニンであることを特徴とする（１４）〜（１９）いずれか１に記載の定量的測定方法；
（２１）細胞外基質蛋白質の断片がＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇであることを特徴とする（１４）〜（１９）いずれか１に記載の定量的測定方法；
（２２）ＩｇＡ１断片および細胞外基質蛋白質の断片としてＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、
７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇまたは４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇを用いることを特徴とする（１４）〜（１７）、（１９）または（２１）いずれか１に記載の定量的測定方法
も提供する。
【００１３】
本発明によれば、糖鎖不全を有するかまたは有しないＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片との複合体形成を定量的に測定できることから、複合体形成に影響を与える化合物について正確な評価を行うことができ、ＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法が提供される。また、当該定量的測定方法は複合体形成のメカニズムの解明にも有用である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のスクリーニング方法および定量的測定方法で用いるＩｇＡ１は、健常人、すなわちＩｇＡ腎症に罹患していない人の血清または組織より抗ヒトＩｇＡ１抗体またはジャカリンを使用して単離することができるＩｇＡ１である（特開平９−３１１３２、特開平１０−１１１２９０、特開平１０−１１１２９１）。ここで、ジャカリン（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，　Ｂ．　Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１０，　３２１−３２７，　１９７９）は、Ｏ−結合型糖鎖構造を認識することにより（Ａｈｍｅｄ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６４，　９３６５−９３７２，　１９８９）、ＩｇＡ１に特異的に結合することが報告されているジャックフルーツの種子より抽出されたレクチンである（Ｒｏｑｕｅ−Ｂａｒｒｅｉｒａ，　Ｍ．　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１３４，　１７４０−１７４３，　１９８５）。
【００１５】
また、本発明のスクリーニング方法および定量的測定方法で用いるＩｇＡ１断片は、上記ＩｇＡ１のヒンジ部に存在するセリン残基およびスレオニン残基を少なくとも５残基以上含むペプチドを有する断片であり、ヒンジ部ペプチドのアミノ酸長として少なくとも９アミノ酸残基以上を含むものが好ましい。より好ましいＩｇＡ１断片はＩｇＡ１のヒンジ部に存在するセリン残基およびスレオニン残基全てを含むアミノ酸長を含有するＩｇＡ１断片が好ましい。
【００１６】
また、本発明のスクリーニング方法および定量的測定方法で用いるＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片には、ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片のヒンジ部のセリン残基および／またはスレオニン残基の一部または全部の位置においてＯ−結合型糖鎖の結合数が健常人のものと比較して減少しているか、または、ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片のヒンジ部のセリン残基および／またはスレオニン残基の一部または全部の位置に結合しているＯ−結合型糖鎖構造において糖残基が健常人のものと比較して減少しているか、あるいはそれらの組合せからなるＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片も包含される。かかるＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片は人工的に合成してもよく、ＩｇＡ腎症患者の血清または組織より単離したものであってもよい。
【００１７】
ＩｇＡ１断片を合成するにあたっては、公知の固相法を用いて行うことができるが、Ｃ末端側にシステイン残基が存在する場合には、合成の都合、安定性および−ＳＨに由来する相互作用などを考慮して合成する配列から削除するのが好ましい。また、Ｃ末端側に遊離の−ＣＯＯＨが存在する場合には、Ｃ末端側をアミド化するのが好ましい。さらに、Ｎ末端側にプロリン残基が存在する場合、相互作用解析のための糖ペプチドの固定化およびＨＰＬＣ解析のための蛍光標識を行える官能基がＮ端のみとなる関係上、反応効率の悪くなる可能性のあるプロリンを削除するのが好ましい。
【００１８】
Ｏ−結合型糖鎖ペプチドを人工的に合成する方法は、例えば公知の固相法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法など）を用いてペプチドを合成し、化学的および／または酵素的に糖鎖を付加させる方法が挙げられる。エンド型グリコシダーゼを用いてＯ−結合型糖鎖ペプチドを合成するには、１．化学的方法と酵素的方法を組み合わせた化学−酵素合成法、および２．酵素だけを用いた酵素合成法が挙げられる。酵素合成法を用いる場合、酵素（エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、ｅｎｄｏ−α−Ｇａ１ＮＡｃ−ａｓｅ）を用いてＯ−結合型糖鎖ペプチドを合成する。ｅｎｄｏ−α−Ｇａ１ＮＡｃ−ａｓｅは、糖タンパク質のセリンおよび／またはスレオニン残基に結合するＯ−結合型糖鎖とタンパク質との結合部位に作用して糖鎖を遊離するエンド型グリコシダーゼである。この酵素は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．の培養液から見出されたが、これらの酵素の基質特異性やアグリコン特異性は異なることが知られている。特に、Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．由来およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．由来のｅｎｄｏ−α−Ｇａ１ＮＡｃ―ａｓｅは、加水分解活性により糖タンパク質のＯ−結合型糖鎖を遊離するとともに、さまざまな受容体（単糖、２糖、糖アルコール、Ｔｒｉｓ、グリセロール、パラニトロフェノール、セリン、スレオニン、ペプチドなど）の存在下では、遊離した糖鎖を転移付加する糖転移活性を有している。また、これらの酵素の糖転移活性の供与体特異性と受容体特異性は異なることが報告されている。
【００１９】
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．由来ｅｎｄｏ−α−Ｇａ１ＮＡｃ―ａｓｅの糖転移活性を用いて、糖ペプチドを酵素合成するには、ｅｎｄｏ−α−Ｇａ１ＮＡｃ−ａｓｅの糖転移活性を用いて糖鎖供与体（糖タンパク質、糖ペプチド、糖鎖誘導体）からペプチドにＯ−結合型糖鎖を転移付加して糖ペプチドを合成する方法が挙げられる。反応生成物は逆相カラムを用いたＨＰＬＣによって分離、精製するのが好ましい。この糖ペプチドの構造について確認するために、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルやマススペクトルで解析してもよい。
【００２０】
また、化学−酵素合成法により合成するには、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＧａｌＮＡｃまたはＦｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＧａｌＮＡｃを用いて固相法によりＧａｌＮＡｃ結合ペプチドを合成し、グリコシダーゼの糖転移活性を用いて糖鎖供与体（糖タンパク質、糖ペブチド、糖鎖誘導体）から前記ＧａｌＮＡｃ結合ペプチドに糖鎖を転移付加して糖ペプチドを合成する方法が挙げられる。この場合も反応生成物は逆相カラムを用いたＨＰＬＣによって分離、精製するのが好ましい。この糖ペプチドの構造について確認するために、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルやマススペクトルで解析してもよい。
【００２１】
ｅｎｄｏ−α−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅの糖転移活性だけで合成した糖ベプチドの収率は、化学的方法と酵素的方法を組み合わせて合成した糖ペプチドの収率よりも高く、また、糖鎖を転移付加したペプチドについて各種プロテアーゼによる加水分解の違いを比較すると、糖鎖を付加したペプチドは糖鎖をもたないペプチドより各種プロテアーゼに対する抵抗性は高いことが報告されている。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．由来ｅｎｄｏ−α−ＧａｌＮＡｃ―ａｓｅは幅広い基質特異性を有しているので、この酵素の糖転移反応を使って種々のＯ−結合型糖鎖ペプチドを合成すればよい。
【００２２】
また、大腸菌などの糖鎖修飾能力を有さない宿主を用いて全く糖鎖を有していない組換えＩｇＡ１を製造することもできる。さらに、この様にして製造した組換えＩｇＡ１に適当な糖化酵素または糖転移酵素、例えばグリコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼなどを使用することにより所望の糖鎖不全ペプチドからなるＩｇＡ１を作製することができる。また、糖鎖修飾能力を有する動物細胞などを宿主として用いた場合には、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、シアリダーゼなどの分解酵素および前記糖転移酵素などを使用することにより糖鎖不全ペプチドからなる所望の組換えＩｇＡ１を製造することができる。これら製造または単離したＩｇＡ１は、パパインまたはペプシンなどの酵素により断片化することもできる。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法および定量的測定方法で用いるＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片としては、例えば、前記したＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片のヒンジ部配列のセリン残基および／またはスレオニン残基の一部または全部に結合するＯ−結合型糖鎖構造の一部または全部において、シアル酸残基のみが減少したもの、ガラクトース残基のみが減少したもの、シアル酸残基およびガラクトース残基が減少したもの、ガラクトース残基およびＮ−アセチルガラクトサミン残基が減少したもの、またはシアル酸残基、ガラクトース残基およびＮ−アセチルガラクトサミン残基が減少したものなどが挙げられ、ここにおける糖残基間の結合様式は限定されない。かかるＩｇＡ１断片の例としては、例えば、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−ＳｅｒおよびＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＨＰ）などの糖鎖が全く結合していないペプチドが挙げられ、また、３−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１２−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、３，　４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、３，　４，　７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、３，　４，　７，　１２，　１７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰなどが挙げられる。
【００２４】
さらに、本発明のスクリーニング方法および定量的測定方法で用いるＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片は、それぞれ高親和性を示すものが好ましい。高親和性を示す前記ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片を選択するには、下記の実施例１〜１１に示すのと同様の方法を用いて行うことができる。ここで高親和性とは、ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片との複合体が、エレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析計にて明確に判定できる程度、例えば、これらを１／２〜２のモル比で混合する場合において、使用したＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片のモル数のうち少なくとも３％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上生成することをいう。
【００２５】
さらに、本発明のスクリーニング方法および定量的測定方法で用いる細胞外基質蛋白質には、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、エンタクチンなどの公知の細胞外基質蛋白質が含まれ、天然由来のもの、合成由来のものいずれも使用できる。また、これらの断片を使用することもできる。断片を使用するには、該断片がＩｇＡ１またはＩｇＡ１のヒンジ部に存在するセリン残基および／またはスレオニン残基を少なくとも５残基含むペプチドを含有するＩｇＡ１断片と相互作用できる部位を選択する必要がある。例えば、フィブロネクチンの場合、接着活性を発現するアルギニン（Ａｒｇ）−グリシン（Ｇｌｙ）−アスパラギン酸（Ａｓｐ）を含むアミノ酸配列が挙げられる（Ｎａｔｕｒｅ，　３０９，　３０−３３，　１９８４）。例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（Ｓｉｇｍａ　Ａ９０４１）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ（Ｓｉｇｍａ　Ａ６６７７）、その他のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含むいずれのアミノ酸配列を有するフィブロネクチンの断片も使用することができる。また、ラミニンの場合、ラミニンのＢ１鎖の中で親水性の高い部位、例えばＴｙｒ−
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇを含むアミノ酸配列が挙げられる（Ｉｗａｍｏｔｏ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３８，　１１３２，　１９８７）。例えば、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　（Ｓｉｇｍａ　Ｔ７１５４）、Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃ０６６８）、その他の
Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇを含むいずれのアミノ酸配列を有するラミニンの断片も使用することができる。
【００２６】
かかるＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片との組み合わせは、上記の複合体を形成する要件を満たすものであれば特に限定されるものではないが、例えば、複合体が３％以上生成する組み合わせ、ＨＰとＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、４，　７，　９，　１１，　１５−
ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇなどが挙げられるが、特に被験物質の効力を正確に評価するためには、複合体が５％以上生成する組み合わせが好ましい。
【００２７】
本発明のＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法は、例えば、
（１）０．０１〜０．０５ＭのＰＢＳ、ｐＨ５．０〜８．０、１ｍＬ中で上記のＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片を種々の量のＩｇＡ腎症治療薬の候補とされる被験物質と混合した後に、上記の細胞外基質蛋白質またはその断片を加えるか、あるいは細胞外基質蛋白質またはその断片を被験物質と混合した後に、上記のＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片を加えて混和し、あるいは被験物質を加えないで両者を混和し［ここに実施例においてはＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片は３０〜５０ｎＭとなる量、細胞外基質蛋白質またはその断片は６０〜１００ｎＭとなる量を使用しており、両者の混合比率（ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片）／（細胞外基質蛋白質またはその断片）がモル比で１／１０〜１０、好ましくは１／２〜２となる量で加えるのがよい］；
（２）室温、好ましくは２５℃位にて３０〜９０分間放置し；
（３）そのうちの１０μＬをとり、エレクトロスプレイ型ＬＣ連結質量分析計（ＥＳＩ／ＭＳ：ＴＳＱ７０００トリプルステージ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ社））に注入して、ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片、細胞外基質蛋白質またはその断片、およびそれらの間に形成される複合体のイオンマススペクトルをとってＩｇＡ１およびＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片との間に形成される複合体量を定量し；ついで
（４）被験物質を加えた場合に形成される複合体量が、被験物質を加えない場合に形成される複合体量と比較して少ない場合に、その被験物質をＩｇＡ腎症の候補治療薬とすることによって行う。
【００２８】
例えば、実施例１に示す実験系において、被験物質をＨＰと混合した後にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒを加え、または被験物質をＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒと混合した後にＨＰを加えた後、同様の操作を行う。ＨＰ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ複合体の生成率を計算し、被験物質の影響を調べる。生成率が２１．５％より低ければ、被験物質はＨＰ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ複合体の生成を抑制することができ、ＩｇＡ腎症治療薬となる可能性がある。
【００２９】
また、実施例１〜１３に示した実験をＭＡＬＤ−ＴＯＦ型（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｌａｚｅｒ　ｄｉｓｓｏｒｐｔｉｏｎ飛行時間測定型）質量分析計Ｖｏｙｅｒ　ＤＥ（ＰＥバイオシステムズ）を用いて同様に行うと、会合体の分子量に相当するピークは全くみられなかった。ゆえに、エレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析計を用いるのが好ましい。また、イオントラップ型ＬＣ連結質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ社）も使用できる。
【００３０】
つぎに、実施例において本発明をさらに詳細に説明するが、これは説明目的のものであって、いかなる場合においても本発明がこれらに限定されることを意図するものではない。
【００３１】
【実施例】
１．　ＩｇＡ１ヒンジ部断片の設計と合成
糖鎖を結合させる位置は、前記ＨＰのセリン残基（アミノ酸番号３、９、１１、１７、１９）およびスレオニン残基（アミノ酸番号４、７、１２、１５）の合計９カ所うち、５カ所（アミノ酸番号４、７、９、１１、１５）とした。結合させる糖鎖としてＧａｌＮＡｃを用い、前記ＨＰの５カ所の各位置にＧａｌＮａｃが１個ずつ結合した誘導体５種（４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、９−ＧａｌＮＡｃ−
ＨＰ、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ）および５ケ所全てに結合した誘導体１種（４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ）を豊島ら（Ｔｅｓｈｉｍａ，　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９９６　（Ｋｉｔａｄａ，　Ｃ．　ｅｄ．），　ｐｐ　２５−２８，　Ｔｅｓｈｉｍａ，　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９９８　（Ｋｏｎｄｏ，　Ｍ．　ｅｄ．），　ｐｐ　１５７−１６０．）の方法に従い合成した後、Ｃ末端側をアミド化した。また、糖鎖を持たないコアヒンジペプチド（ＨＰ）を合成し、これらの分子間相互作用の比較を行った。
【００３２】
2004061357.tif 000003
【００３３】
2004061357.tif 000004
【００３４】
2004061357.tif 000005
【００３５】
2004061357.tif 000006
【００３６】
2004061357.tif 000007
【００３７】
2004061357.tif 000008
【００３８】
２．　細胞外基質蛋白質の選択
ＩｇＡ腎症において関与していると予想される細胞外基質蛋白質であるフィブロネクチンおよびラミニンを選択した。さらに、フィブロネクチンについては
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ　（Ｓｉｇｍａ　Ａ９０４１）またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　（Ｓｉｇｍａ　Ａ６６７７）の断片を用い、ラミニンについてはＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　（Ｓｉｇｍａ　Ｔ７１５４）またはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃ０６６８）の断片を用いた。
【００３９】
３．　複合体の分析条件
ＨＰＬＣ（ＹＯＫＯＧＡＷＡアナリティカル　モデルＨＰ１１００　システム）における分析条件
１ｍＭ濃度になるようにトリフルオロ酢酸を加えた水溶液で、流速０．３ｍＬ／ｍｉｎでＭｏｎｉｔｏｒ　Ｃ１８カラムを平衡化した後、試料（１０μＬ）注入後５分間平衡化バッファーで固定した。その後、３０分間で０〜６０％濃度になるように移動相用バッファーアセトニトリルを加える。その後、２０分間で１００％となるようにアセトニトリルの濃度勾配をあげた。
【００４０】
エレクトロスプレイ型液体クロマトグラフィー連結質量分析計（ＥＳＩ／ＭＳ：ＴＳＱ７０００トリプルステージ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ社））における分析条件
測定はｍ／ｚ５００〜４０００までをスキャンタイム４．５秒でフルスキャンモードにて行った。すべてポジティブイオンモードで検出し、フラグメンターボルテージは４５Ｖ、ネブライザーガスはＮ２を７０ｐｓｉ／ｍｉｎでＥＳＩプローブ中に注入し、同時にドライイングガスとしてＮ２を１５ｐｓｉ／ｍｉｎで注入した。なお、分析用加熱キャピラリーの温度は、２５０℃とした。
【００４１】
実施例１
ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏとの相互作用の測定
ＨＰ　１００μｇとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料であるＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2004061357.tif 000009
【００４３】
実施例２
ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇとの相互作用の測定
ＨＰ　１００μｇとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　またはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料であるＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
2004061357.tif 000010
【００４５】
実施例３
４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−　Ｐｒｏとの相互作用の測定
４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ　またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である４−
ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表３に示す。
【００４６】
【表３】
2004061357.tif 000011
【００４７】
実施例４
４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇとの相互作用の測定
４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表４に示す。
【００４８】
【表４】
2004061357.tif 000012
【００４９】
実施例５
７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏとの相互作用の測定
７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表５に示す。
【００５０】
【表５】
2004061357.tif 000013
【００５１】
実施例６
７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇとの相互作用の測定
７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表６に示す。
【００５２】
【表６】
2004061357.tif 000014
【００５３】
実施例７
９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏとの相互作用の測定
９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表７に示す。
【００５４】
【表７】
2004061357.tif 000015
【００５５】
実施例８
９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇとの相互作用の測定
９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表８に示す。
【００５６】
【表８】
2004061357.tif 000016
【００５７】
実施例９
１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏとの相互作用の測定
１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表９に示す。
【００５８】
【表９】
2004061357.tif 000017
【００５９】
実施例１０
１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇとの相互作用の測定
１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ａｒｇ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表１０に示す。
【００６０】
【表１０】
2004061357.tif 000018
【００６１】
実施例１１
１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏとの相互作用の測定
１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表１１に示す。
【００６２】
【表１１】
2004061357.tif 000019
【００６３】
実施例１２
１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇとの相互作用の測定
１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ａｒｇ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表１２に示す。
【００６４】
【表１２】
2004061357.tif 000020
【００６５】
実施例１３
４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏとの相互作用の測定
４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表１３に示す。
【００６６】
【表１３】
2004061357.tif 000021
【００６７】
実施例１４
４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇとの相互作用の測定
４，　７，　９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ　１００μｇとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　１００μｇをｐＨ７．０の０．０１Ｍ　ＰＢＳ　１ｍＬ中において室温で混和させた。３０分間そのまま放置した後、ＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳにそのうちの１０μＬを注入して、原料である４，　７，９，　１１，　１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＡｒｇまたはＣｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、および生成する物質のイオンマススペクトルを観察した。結果を表１４に示す。
【００６８】
【表１４】
2004061357.tif 000022
【００６９】
結果
実施例１〜１４全てにおいて、分子間相互作用の結果生成したと考えられる非共有結合性複合体分子の生成が、正確な分子量をもって各マススペクトル上で確認された。また、複合体の各原料に対する生成率を比較するために、それらの分子量に対するマスクロマトグラム上の面積値から各原料に対する生成複合体のパーセントを表１〜１４に示し、原料ペプチドに対する相対的な面積比の比較から半定量的な評価を行った結果、ＨＰ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＳｅｒおよびＨＰ−Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏの複合体の生成率が高いことから（２１．５％および１５．８％）、糖鎖を有さないＨＰがフィブロネクチン断片と強く相互作用することが示された（表１）。一方、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰとラミニン断片であるＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇは高親和性を示した（表６、１８．１％）。
これらの結果から、ＨＰに結合するＧａｌＮＡｃの数および位置の違いによりフィブロネクチンおよびラミニンなどの細胞外基質蛋白質との親和性に違いが生じることがＥＳＩ／ＬＣ／ＭＳを用いた分析法により、初めて定量的に証明された。
【００７０】
【発明の効果】
本発明によれば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ１断片と細胞外基質蛋白質またはその断片との複合体形成を定量的に測定できることから、複合体形成に影響を与える化合物について正確な評価を行うことができ、ＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニング方法が提供される。また、当該定量的測定方法は複合体形成のメカニズムの解明にも有用である。