(57)【要約】【課題】副作用のない血小板凝集抑制剤及び血小板凝集抑制に有効な保健食品を提供すること。【解決手段】血小板凝集抑制剤はナットウキナーゼを有効成分とすることからなり、又ビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下であるナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキスを有効成分とすることからなる。血小板凝集抑制に有効な保健食品はナットウキナーゼを主成分とすることからなり、又ビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下であるナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキスを主成分とすることからなる。【選択図】　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナットウキナーゼを有効成分とする血小板凝集抑制剤。
【請求項２】
ビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下であるナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキスを有効成分とする血小板凝集抑制剤。
【請求項３】
ナットウキナーゼを主成分とする血小板凝集抑制に有効な保健食品。
【請求項４】
ビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下であるナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキスを主成分とする血小板凝集抑制に有効な保健食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は血小板凝集抑制剤、特にナットウキナーゼを有効成分とする血小板凝集抑制剤、その保健食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、ナットウキナーゼは血栓溶解酵素として知られており、ナットウキナーゼの血栓溶解能力は血栓症の予防だけでなく治療においても優れていることが知られている（高岡晋作：ジャパンフードサイエンス、３９　（９）、５５−６０、２０００）。
【０００３】
ナットウキナーゼは大豆には含まれず、納豆菌が大豆に作用し、醗酵する過程でつくられるものであるが、このナットウキナーゼは血液凝固因子のビタミンＫ２が同時に含まれているので、血栓予防等を目的として、血栓溶解酵素であるナットウキナーゼを含む納豆あるいは納豆菌培養エキスを摂取すると、ビタミンＫ２も同時に摂取することになり、ビタミンＫ依存性凝固因子合成抑制剤の効果が打ち消される、という問題があったのでこのビタミンＫ２の含有量を１μｇ／ｇ乾燥重量以下にした納豆菌培養エキスを製造する技術が開発されている（特開２００１−２９９２７７号参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、ナットウキナーゼは血栓溶解作用の他にも人体に有用な作用があるのではないかと考え、鋭意研究した結果、ナットウキナーゼに血小板凝集抑制作用があることを見出した。血小板凝集抑制剤、即ち、抗血小板剤として臨床的に実用されている例としては、アスピリンやチクロピジンなどが経口に使用されている例があるが、これらの薬剤には副作用が存在する。例えば、アスピリンの場合、胃腸障害やアスピリン喘息などが見られ、チクロピジンの場合には血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、無顆粒球症、重篤な肝障害などが知られている。
【０００５】
そこで、本発明は、副作用のない血小板凝集抑制剤及び血小板凝集抑制に有効な保健食品を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、本発明の血小板凝集抑制剤は、ナットウキナーゼを有効成分とするものであり、又ビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下であるナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキスを有効成分とするものである。
【０００７】
又、本発明の血小板凝集抑制に有効な保健食品は、ナットウキナーゼを主成分とするものであり、又ビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下であるナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキスを主成分とするものである。
【０００８】
ナットウキナーゼは納豆として、何百年も前から食されており、その安全性は経験上証明されているが、納豆菌培養エキス（粉末タイプ）においても、マウスを用いた急性毒性試験で一般状態に何ら影響は見られず、ＬＤ５０は２，０００ｍｇ／ｋｇ以上とされている。また復帰突然変異試験も陰性であることが証明されている（高岡晋作：ジャパンフードサイエンス、３９　（９）、５５−６０、２０００）。
【０００９】
又、ナットウキナーゼにおけるビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下である場合はビタミンＫ２による前記の障害も生じない。
ナットウキナーゼはこのように安全性が証明されているため、薬剤としてだけでなく食品（保健食品）としても用いることが出来る。
【００１０】
このように本発明によれば副作用等の問題が生じない血小板凝集抑制剤、及び安全な血小板凝集抑制に有効な保健食品を提供することが出来、本発明を使用することにより、血管内に血栓が出来にくくなり、また、血栓の成長が抑えられることから心筋梗塞や脳梗塞の治療および予防をすることが出来るものである。
【００１１】
【実施例】
以下、製造例、加工例、実施例について述べる。
【００１２】
ビタミンＫ２の含有量が１μｇ／ｇ乾燥重量以下であるナットウキナーゼ高含有納豆菌培養エキスの製造例は以下の通りである。
（製造例）
大豆を主原料とした液体培地に納豆菌を摂取し培養することで、ナットウキナーゼを高含有する培養液を製造する。その後、キトサン溶液を用いた凝集沈澱ろ過により、納豆菌およびＫ２を取り除く、そして、メンブランフィルターにより無菌ろ過した培養液を、乾燥し、粉末加工する。
【００１３】
（加工例）
前記納豆菌培養エキスは、カプセル、錠剤、ドリンク、顆粒、ペーストなどの形態に加工できるものであり、以下加工実施例を示す。
【００１４】
ソフトカプセルは、例えば、納豆菌培養エキス粉末（２００００ＦＵ／ｇ）を３６．７ｍｇ、大豆レシチンを１０ｍｇ、大豆油を１３３．３ｍｇ、ミツロウを１５ｍｇ、グリセリン脂肪酸エステルを１５ｍｇの計２１０ｍｇを混合乳化したものを内容液とし、ゼラチン１００ｍｇ、グリセリン３０ｍｇの計１３０ｍｇで構成された皮膜に充てんし、総重量３４０ｍｇのソフトカプセルが出来る。これを１日あたり、３〜６粒飲めば、市販納豆１〜２パック（５０〜１００ｇ）のナットウキナーゼを摂取したことになる。
【００１５】
同様にハードカプセルの場合、納豆菌培養エキス粉末（２００００ＦＵ／ｇ）を３６．７ｍｇ、デキストリンを２０９．８ｍｇ、ショ糖脂肪酸エステルを１３．５ｍｇの計２６０ｍｇを混合したものを内容物とし、２号ゼラチンハードカプセル（７０ｍｇ）に充てんし、総重量３３０ｍｇのハードカプセルが出来る。これを１日あたり、３〜６粒飲めば、市販納豆１〜２パック（５０〜１００ｇ）のナットウキナーゼを摂取したことになる。
【００１６】
腸溶カプセル（耐酸性コートを含む）は、例えば、納豆菌培養エキス粉末（２００００ＦＵ／ｇ）を３６．７ｍｇ、大豆レシチンを１０ｍｇ、大豆油を１３３．３ｍｇ、ミツロウを１５ｍｇ、グリセリン脂肪酸エステルを１５ｍｇの計２１０ｍｇを混合乳化したものを内容液とし、ゼラチン１００ｍｇ、グリセリン３０ｍｇの計１３０ｍｇで構成された皮膜に充てんし、総重量３４０ｍｇのソフトカプセルを作成する。これに、ゼインを３０ｍｇコーティングし、総重量３７０ｍｇの腸溶カプセルを作成する。これを１日あたり、３〜６粒飲めば、市販納豆１〜２パック（５０〜１００ｇ）のナットウキナーゼを摂取したことになる。
【００１７】
その他、打錠品、ドリンク、顆粒、ペースト等に応用出来る。
【００１８】
（実施例１）
実験方法：
健常人、男：１を対象に前記加工例によるソフトカプセルを６粒（納豆２パック分、１００ｇに相当するナットウキナーゼの力価）服用前、服用後２時間、４時間後、６時間後、８時間後に採血して血小板凝集能を測定した。血液採取はいずれも３．８％クエン酸ナトリウム加チューブを用い、２１Ｇ針にて上腕正中静脈より行った。採血量は１回１１　ｍｌ、計５５　ｍｌである。実際に服用される状況に近い状態での血小板凝集能を知るために、あえて絶食としなかったが、検査の性質上、朝食後２時間以上経過していることを条件とした。得られた血液検体は１８０×ｇ、１０分間遠心分離し、その上清を多血小板血漿（ＰＲＰ）とし、残りの検体は１６００×ｇ、１５分間遠心分離して、乏血小板血漿（ＰＰＰ）とした。ＰＲＰをＰＰＰにて希釈し、血小板数２５±３×１０４／μｌに調整して検体とした。凝集惹起剤にはコラーゲン［エム・シー・メディカル（株）］とＡＤＰ［エム・シー・メディカル（株）］を使用し、コラーゲンの最終濃度は１μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌ、ＡＤＰの最終濃度は２μＭとした。
血小板凝集能測定には、レーザー散乱光を用いた粒子計測型血小板凝集能測定装置［ＰＡ−２０：興和（株）］を用いた。ＰＡ−２０は、直進する光が細かい粒子にあたって生じる散乱光強度が、粒子径の２乗に比例して増大するという原理を応用して開発された装置で、血小板凝集率のほか血小板凝集塊の大きさとその生成数も算定できる。また、従来の吸光度法では数千個の血小板からなる凝集塊が形成されてはじめて吸光度が低下したが、この装置では、血小板数１０個からなる小凝集塊でも測定でき検出感度に優れる。なお、血小板凝集塊サイズは散乱光強度により、２５ｍＶ＜小凝集塊（粒径９〜２５μｍ）＜２００ｍＶ、２００ｍＶ＜中凝集塊（粒径２５〜５０μｍ）＜６００ｍＶ、６００ｍＶ＜大凝集塊（粒径５０〜７０μｍ）　＜２，０４７ｍＶの３つに分類した［Ｈｏｓｈｉ　Ｋ．，Ｚｈｏｕ　Ｘ．，Ｔｅｒａｚｏｎｏ　Ｍ．，　Ｓａｔｏｕ　Ｙ．，Ｙａｍａｚａｋｉ　Ｍ．，　Ｍｉｙａｋｅ　Ｆ．，　Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｈｅｒ．，　３２，　２２３−２３０（２００１）］。
次の式を用い血小板抑制率を計算した。
血小板抑制率（％）＝（１−Ｘ／Ｙ）×１００
Ｘ：ナットウキナーゼ摂取後のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ（吸光度）
Ｙ：ナットウキナーゼ摂取前のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
実験結果：
摂取後４時間後から強い抑制作用が、コラーゲン１．０μｇ／ｍｌを凝集剤として添加したケースに見られた。（図１）また、血小板の凝集塊のサイズも８時間後には最も小さくなり、ナットウキナーゼ血小板の抑制作用が見られた（下記の表１Ａ，１Ｂ，１Ｃ）。
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【００１９】
（実施例２）
実験方法：
健常人、男：１を対象に前記加工例によるソフトカプセルを６粒（納豆２パック分、１００ｇに相当するナットウキナーゼの力価）服用前、服用後２時間、４時間後、６時間後、８時間後に採血して血小板凝集能を測定した。血液採取はいずれも３．８％クエン酸ナトリウム加チューブを用い、２１Ｇ針にて上腕正中静脈より行った。採血量は１回１１　ｍｌ、計５５　ｍｌである。実際に服用される状況に近い状態での血小板凝集能を知るために、あえて絶食としなかったが、検査の性質上、朝食後２時間以上経過していることを条件とした。得られた血液検体は１８０×ｇ、１０分間遠心分離し、その上清を多血小板血漿（ＰＲＰ）とし、残りの検体は１６００×ｇ、１５分間遠心分離して、乏血小板血漿（ＰＰＰ）とした。ＰＲＰをＰＰＰにて希釈し、血小板数２５±３×１０４／μｌに調整して検体とした。凝集惹起剤にはコラーゲン［エム・シー・メディカル（株）］とＡＤＰ［エム・シー・メディカル（株）］を使用し、コラーゲンの最終濃度は２μｇ／ｍｌ、ＡＤＰの最終濃度は２μＭと５μＭとした。
血小板凝集能測定には、レーザー散乱光を用いた粒子計測型血小板凝集能測定装置［ＰＡ−２０：興和（株）］を用いた。ＰＡ−２０は、直進する光が細かい粒子にあたって生じる散乱光強度が、粒子径の２乗に比例して増大するという原理を応用して開発された装置で、血小板凝集率のほか血小板凝集塊の大きさとその生成数も算定できる。また、従来の吸光度法では数千個の血小板からなる凝集塊が形成されてはじめて吸光度が低下したが、この装置では、血小板数１０個からなる小凝集塊でも測定でき検出感度に優れる。なお、血小板凝集塊サイズは散乱光強度により、２５ｍＶ＜小凝集塊（粒径９〜２５μｍ）＜２００ｍＶ、２００ｍＶ＜中凝集塊（粒径２５〜５０μｍ）＜６００ｍＶ、６００ｍＶ＜大凝集塊（粒径５０〜７０μｍ）　＜２，０４７ｍＶの３つに分類した［Ｈｏｓｈｉ　Ｋ．，Ｚｈｏｕ　Ｘ．，Ｔｅｒａｚｏｎｏ　Ｍ．，　Ｓａｔｏｕ　Ｙ．，Ｙａｍａｚａｋｉ　Ｍ．，　Ｍｉｙａｋｅ　Ｆ．，　Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｈｅｒ．，　３２，　２２３−２３０（２００１）］。
次の式を用い血小板抑制率を計算した。
血小板抑制率（％）＝（１−Ｘ／Ｙ）×１００
Ｘ：ナットウキナーゼ摂取後のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
Ｙ：ナットウキナーゼ摂取前のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
実験結果：
摂取後４時間後から強い抑制作用が、コラーゲン１．０μｇ／ｍｌを凝集剤として添加したケースに見られた（図２）。
【００２０】
（実施例３）
実験方法：
健常人、女：１を対象に前記加工例によるソフトカプセルを６粒（納豆２パック分、１００ｇに相当するナットウキナーゼの力価）服用前、服用後２時間、４時間後、６時間後、８時間後に採血して血小板凝集能を測定した。血液採取はいずれも３．８％クエン酸ナトリウム加チューブを用い、２１Ｇ針にて上腕正中静脈より行った。採血量は１回１１　ｍｌ、計５５　ｍｌである。実際に服用される状況に近い状態での血小板凝集能を知るために、あえて絶食としなかったが、検査の性質上、朝食後２時間以上経過していることを条件とした。得られた血液検体は１８０×ｇ、１０分間遠心分離し、その上清を多血小板血漿（ＰＲＰ）とし、残りの検体は１６００×ｇ、１５分間遠心分離して、乏血小板血漿（ＰＰＰ）とした。ＰＲＰをＰＰＰにて希釈し、血小板数２５±３×１０４／μｌに調整して検体とした。凝集惹起剤にはコラーゲン［エム・シー・メディカル（株）］とＡＤＰ［エム・シー・メディカル（株）］を使用し、コラーゲンの最終濃度は１μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌ、ＡＤＰの最終濃度は２μＭと５μＭとした。
血小板凝集能測定には、レーザー散乱光を用いた粒子計測型血小板凝集能測定装置（ＰＡ−２０：興和（株））を用いた。ＰＡ−２０は、直進する光が細かい粒子にあたって生じる散乱光強度が、粒子径の２乗に比例して増大するという原理を応用して開発された装置で、血小板凝集率のほか血小板凝集塊の大きさとその生成数も算定できる。また、従来の吸光度法では数千個の血小板からなる凝集塊が形成されてはじめて吸光度が低下したが、この装置では、血小板数１０個からなる小凝集塊でも測定でき検出感度に優れる。なお、血小板凝集塊サイズは散乱光強度により、２５ｍＶ＜小凝集塊（粒径９〜２５μｍ）＜２００ｍＶ、２００ｍＶ＜中凝集塊（粒径２５〜５０μｍ）＜６００ｍＶ、６００ｍＶ＜大凝集塊（粒径５０〜７０μｍ）　＜２，０４７ｍＶの３つに分類した［Ｈｏｓｈｉ　Ｋ．，Ｚｈｏｕ　Ｘ．，Ｔｅｒａｚｏｎｏ　Ｍ．，　Ｓａｔｏｕ　Ｙ．，Ｙａｍａｚａｋｉ　Ｍ．，　Ｍｉｙａｋｅ　Ｆ．，　Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｈｅｒ．，　３２，　２２３−２３０（２００１）］。
次の式を用い血小板抑制率を計算した。
血小板抑制率（％）＝（１−Ｘ／Ｙ）×１００
Ｘ：ナットウキナーゼ摂取後のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
Ｙ：ナットウキナーゼ摂取前のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
実験結果：
摂取後４時間後から強い抑制作用が、コラーゲン１．０μｇ／ｍｌを凝集剤として添加したケースに見られた。（図３）また、血小板の凝集塊のサイズも８時間後には最も小さくなり、ナットウキナーゼ血小板の抑制作用が見られた（下記の表２Ａ、２Ｂ）。
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【００２１】
（実施例４）
実験方法：
健常人、男：１を対象に前記加工例によるナットウキナーゼ腸溶カプセルを６粒（納豆２パック分、１００ｇに相当するナットウキナーゼの力価）服用前、服用後２時間、４時間後、６時間後、８時間後に採血して血小板凝集能を測定した。血液採取はいずれも３．８％クエン酸ナトリウム加チューブを用い、２１Ｇ針にて上腕正中静脈より行った。採血量は１回１１　ｍｌ、計５５　ｍｌである。実際に服用される状況に近い状態での血小板凝集能を知るために、あえて絶食としなかったが、検査の性質上、朝食後２時間以上経過していることを条件とした。得られた血液検体は１８０×ｇ、１０分間遠心分離し、その上清を多血小板血漿（ＰＲＰ）とし、残りの検体は１６００×ｇ、１５分間遠心分離して、乏血小板血漿（ＰＰＰ）とした。ＰＲＰをＰＰＰにて希釈し、血小板数２５±３×１０４／μｌに調整して検体とした。凝集惹起剤にはコラーゲン［エム・シー・メディカル（株）］とＡＤＰ［エム・シー・メディカル（株）］を使用し、コラーゲンの最終濃度は０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌ、ＡＤＰの最終濃度は２μＭとした。
血小板凝集能測定には、レーザー散乱光を用いた粒子計測型血小板凝集能測定装置［ＰＡ−２０：興和（株）］を用いた。ＰＡ−２０は、直進する光が細かい粒子にあたって生じる散乱光強度が、粒子径の２乗に比例して増大するという原理を応用して開発された装置で、血小板凝集率のほか血小板凝集塊の大きさとその生成数も算定できる。また、従来の吸光度法では数千個の血小板からなる凝集塊が形成されてはじめて吸光度が低下したが、この装置では、血小板数１０個からなる小凝集塊でも測定でき検出感度に優れる。なお、血小板凝集塊サイズは散乱光強度により、２５ｍＶ＜小凝集塊（粒径９〜２５μｍ）＜２００ｍＶ、２００ｍＶ＜中凝集塊（粒径２５〜５０μｍ）＜６００ｍＶ、６００ｍＶ＜大凝集塊（粒径５０〜７０μｍ）　＜２，０４７ｍＶの３つに分類した［Ｈｏｓｈｉ　Ｋ．，Ｚｈｏｕ　Ｘ．，Ｔｅｒａｚｏｎｏ　Ｍ．，　Ｓａｔｏｕ　Ｙ．，Ｙａｍａｚａｋｉ　Ｍ．，　Ｍｉｙａｋｅ　Ｆ．，　Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｈｅｒ．，　３２，　２２３−２３０（２００１）］。
次の式を用い血小板抑制率を計算した。
血小板抑制率（％）＝（１−Ｘ／Ｙ）×１００
Ｘ：ナットウキナーゼ摂取後のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
Ｙ：ナットウキナーゼ摂取前のＡＤＰ又はコラーゲンを添加した散乱強度又はＯＤ
実験結果：
摂取後４時間後から強い抑制作用が、コラーゲン１．０μｇ／ｍｌを凝集剤として添加したケースに見られた。（図４）また、血小板の凝集塊のサイズも８時間後には最も小さくなり、ナットウキナーゼ血小板の抑制作用が見られた（下記の表３Ａ、３Ｂ）。
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【図面の簡単な説明】
【図１】コラーゲン及びＡＤＰを惹起剤として使用した、ナットウキナーゼ摂取後の血小板抑制率の経時変化を示す図である。
【図２】図１とは濃度の異なったコラーゲン及びＡＤＰを惹起剤として使用した、ナットウキナーゼ摂取後の血小板抑制率の経時変化を示す図である。
【図３】図１、図２とは濃度の異なったコラーゲン及びＡＤＰを惹起剤として使用した、ナットウキナーゼ摂取後の血小板抑制率の経時変化を示す図である。
【図４】図１、図２、図３とは濃度の異なったコラーゲン及びＡＤＰを惹起剤として使用した、ナットウキナーゼ摂取後の血小板抑制率の経時変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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