(57)【要約】【課題】包埋剤によって包埋された組織が、その微細構造が保持されるのみならず、目的となる分子、特に蛋白質の抗原性が長期に亘って保持され、長期保存後、組織を包埋した包埋剤の除去が可能であり、包埋剤が除去された組織においてインシトゥハイブリダイゼーション法や組織免疫化学法などの組織学的な機能解析が可能であり、しかも、運搬や保管取扱い時の安全性を確保することができる組織の包埋剤や、これを用いた樹脂包埋体や組織標本を提供すること。【解決手段】メタクリル酸エステルと、フタル酸ジエステルと、重合開始剤とを含有する包埋剤とし、この包埋剤に、固定・脱水後の組織を浸漬し、次いで包埋剤を硬化させて組織の樹脂包埋体を作製し、該樹脂包埋体における樹脂をキシレンにより除去し、切片化して組織標本を調製し、得られた組織標本をインシトゥハイブリダイゼーション法や、組織免疫化学法による組織の分析に用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタクリル酸エステルと、フタル酸ジエステルと、重合開始剤とを含有することを特徴とする組織の包埋剤。
【請求項２】
メタクリル酸エステルとフタル酸ジエステルとの混合比が、体積比１〜５：１であることを特徴とする請求項１記載の組織の包埋剤。
【請求項３】
メタクリル酸エステルが、メタクリル酸メチルであることを特徴とする請求項１又は２記載の組織の包埋剤。
【請求項４】
フタル酸ジエステルが、フタル酸ジブチルであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の組織の包埋剤。
【請求項５】
重合開始剤が、過酸化ベンゾイルであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の組織の包埋剤。
【請求項６】
過酸化ベンゾイルを３〜７Ｗ／Ｖ％含有することを特徴とする請求項５記載の組織の包埋剤。
【請求項７】
硬化することにより生成する樹脂で組織が包埋された樹脂包埋体を作製することができることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の組織の包埋剤。
【請求項８】
樹脂包埋体における樹脂が溶媒により除去できることを特徴とする請求項７記載の組織の包埋剤。
【請求項９】
溶媒がキシレンであることを特徴とする請求項８記載の組織の包埋剤。
【請求項１０】
組織を固定・脱水し、固定・脱水後の組織と、請求項１〜９のいずれか記載の組織の包埋剤とを接触させ、次いで包埋剤を硬化させることを特徴とする組織の樹脂包埋体の製造方法。
【請求項１１】
蛍光タンパク質で標識された組織の脱水は、アセトンを用いることを特徴とする請求項１０記載の組織の樹脂包埋体の製造方法。
【請求項１２】
包埋剤を組織に浸透させた後、包埋することを特徴とする請求項１０又は１１記載の樹脂包埋体の製造方法。
【請求項１３】
包埋剤に硬化促進剤を添加して、包埋剤を硬化させることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか記載の樹脂包埋体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか記載の製造方法により作製されたことを特徴とする組織の樹脂包埋体。
【請求項１５】
請求項１４記載の樹脂包埋体における樹脂を溶媒により除去することを特徴とする組織標本の調製方法。
【請求項１６】
溶媒がキシレンであることを特徴とする請求項１５記載の組織標本の調製方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６記載の調製方法により作製されたことを特徴とする組織標本。
【請求項１８】
請求項１７記載の組織標本を、インシトゥハイブリダイゼーション法（ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｉｔｏｎ）、又は組織免疫化学法により機能解析を行なうことを特徴とする組織の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織を包埋するための組織の包埋剤や、これを用いて作製される組織の樹脂包埋体及びその製造方法や、組織標本及びその調製方法や、組織の分析方法等に関し、より詳しくは、メタクリル酸エステルと、フタル酸ジエステルと、重合開始剤とを含有し、これを硬化することにより生成する樹脂で組織が包埋された樹脂包埋体における樹脂が溶媒により除去でき、組織を長期に亘り保存した後の組織の分析を可能とする組織の包埋剤やその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、電子顕微鏡や走査電子顕微鏡による組織や細胞の観察においては、組織をホルムアルデヒド等により固定した後脱水し、包埋剤で包埋し、次いで切片を切り取って組織標本を作製している。かかる組織の包埋処理において、組織をその微細構造や分子を保持して保存するために、凍結切片法、パラフィン包埋法、親水性樹脂包埋法等が用いられている。凍結切片法は組織を凍結温度下に置き凍結させる方法であり、ＲＮＡの保持や抗原性の保持能は高いが、凍結による組織の破壊が生じるため微細構造の保持が困難であることに加え、切片作製が初心者には難しい。また、パラフィン包埋法はパラフィンにより組織を包埋する方法であり、微細構造の観察は可能であるが、包埋時に熱をかけるため、蛋白質の変性が生じその抗原性を変えてしまうことが多い。また、パラフィン包埋用の機械を使うと大量の廃液が出るという問題がある。更に、親水性樹脂包埋法は親水性樹脂により組織を包埋する方法であり、熱をかけずに硬化して組織を包埋でき、微細構造の保持も可能であるが、ほとんどの親水性樹脂は包埋後に脱樹脂ができないため、その利用範囲が制限されていた。親水性樹脂としてメタクリル酸樹脂（ＭＭＡ）を用いた場合は、親水性樹脂の利点に加え、脱樹脂が可能であるが、重合時に重合開示剤として使用する過酸化ベンゾイルが爆発性であり、運搬や保管取扱い時の安全性確保のためその取扱い方法が煩雑であり、また、再現性よく重合させることは困難であった。
【０００３】
特に、近年、ポストゲノム時代に入り、遺伝子機能解析を行う上で、インシトゥハイブリダイゼーション法（ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｉｔｏｎ）や組織免疫化学法等の組織学的な機能解析の比重が大きくなりつつある。インシトゥハイブリダイゼーション法は、スライドガラス上に展開した染色体標本あるいは細胞や組織標本にプローブを加えて核酸のハイブリダイズ形成を検出する方法であり、スライドガラス上の染色体を熱処理あるいはアルカリ処理してＤＮＡを変性させた後プローブを加え、このプローブが光学顕微的な染色体の形態を維持したまま変性したＤＮＡ中の相補鎖と結合して発するシグナルにより、染色体のどの位置にプローブと相補的な配列が存在するかを検出する方法として、また、組織免疫化学法は、放射性同位元素や蛍光物質又は酵素で標識した特異性の高い抗体を用い、組織の抗原を検出する方法としてよく知られているが、このような機能解析を目的とした組織解析においては、組織の微細構造の保持のみならず、目的となる分子の保持、特に蛋白質ではその抗原性の保持の重要性が増加している。
【０００４】
その他、特開平８−１５７３０１号公報には、対象物を、少なくとも一部が親水性アクリロイル基含有光反応性化合物である光硬化型樹脂液中に埋め込むか混合して被照射物となし、その被照射物を容器に充填した状態で冷却器本体内に置くと共に、−１０℃〜１０℃の冷媒により冷却しつつ、紫外線ランプにより被照射物に紫外線照射する包埋包接体の製造方法が開示され、特開平７−１５１６５９号公報には、気圧を利用し、処理槽において均等で安定した圧力を生じ、入れ換え溶液を徐々に標本溶液に注入して余った混合液の溶液を廃水瓶へ排出して標本溶液の濃度を徐々に増加して標本萎縮変形を防ぐ組織標本の処理方法が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記特開平８−１５７３０１号公報に記載される包埋包接体の製造方法においては、対象物が損傷ないし変形しやすい物質であっても樹脂硬化物中にもとの形態・色調のままで包埋することができ、また対象物が揮発性物質であっても樹脂硬化物中にそのまま包接することができるが、組織が紫外線の照射により変質を生じる可能性がある上に、硬化した樹脂を除去することができず、組織を包埋後、長期保存した後に、インシトゥハイブリダイゼーション法や組織免疫化学法等の操作が困難である。また、特開平７−１５１６５９号公報に記載される組織標本の処理方法においては、組織の固定後脱水処理における各種濃度の処理液を用い、徐々に濃度の高いエタノールによってなされる脱水処理を不要とし、一定圧の処理槽内に一定の濃度の溶液を徐々に注入する処理とすることにより、大きな組織であっても萎縮を防止して標本を作製することができるが、組織の微細構造を保持し、且つ、保存後包埋剤を除去できるものではない。
【０００６】
本発明の課題は、包埋剤によって包埋された組織が、その微細構造が保持されるのみならず、目的となる分子、特に蛋白質の抗原性が長期に亘って保持され、長期保存後、組織を包埋した包埋剤の除去が可能であり、包埋剤が除去された組織においてインシトゥハイブリダイゼーション法や組織免疫化学法などの組織学的な機能解析が可能であり、しかも、運搬や保管取扱い時の安全性を確保することができ、組織の包埋の手順・操作を容易とし、更に、再現性の良好な重合の達成と、その結果として組織標本の品質を向上させることができる組織の包埋剤や、これを用いた樹脂包埋体やその製造方法、組織標本やその調製方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、メタクリル酸エステルにフタル酸ジエステルを含有する包埋剤を使用して組織を包埋することにより、組織の包埋手順・操作の簡略化を図ることができ、長期間に亘って組織の品質を保持してその保存が可能となり、組織を包埋した樹脂包埋体から樹脂を溶媒で除去することができ、これにより組織の長期保存後において、インシトゥハイブリダイゼーション法や組織免疫化学法などの方法を適用することができ、また、包埋剤として爆発性のある過酸化ベンゾイルを重合開示剤としてメタクリル酸エステルとフタル酸ジエステルの混合液に含有させても、爆発の危険性が抑制され、運搬や保管取扱い時の安全性を確保することができるため、その取扱いを容易とすることができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、メタクリル酸エステルと、フタル酸ジエステルと、重合開始剤とを含有することを特徴とする組織の包埋剤に関し、好ましくは、メタクリル酸エステルとフタル酸ジエステルとの混合比が、体積比１〜５：１であることを特徴とする請求項１記載の組織の包埋剤（請求項２）や、メタクリル酸エステルが、メタクリル酸メチルであることを特徴とする請求項１又は２記載の組織の包埋剤（請求項３）や、フタル酸ジエステルが、フタル酸ジブチルであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の組織の包埋剤（請求項４）や、重合開始剤が、過酸化ベンゾイルであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の組織の包埋剤（請求項５）や、過酸化ベンゾイルを３〜７Ｗ／Ｖ％含有することを特徴とする請求項５記載の組織の包埋剤（請求項６）や、硬化することにより生成する樹脂で組織が包埋された樹脂包埋体を作製することができることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の組織の包埋剤（請求項７）や、樹脂包埋体における樹脂が溶媒により除去できることを特徴とする請求項７記載の組織の包埋剤（請求項８）や、溶媒がキシレンであることを特徴とする請求項８記載の組織の包埋剤（請求項９）に関する。
【０００９】
また、本発明は、組織を固定・脱水し、固定・脱水後の組織と、請求項１〜９のいずれか記載の組織の包埋剤とを接触させ、次いで包埋剤を硬化させることを特徴とする組織の樹脂包埋体の製造方法（請求項１０）に関し、好ましくは、蛍光タンパク質で標識された組織の脱水は、アセトンを用いることを特徴とする請求項１０記載の組織の樹脂包埋体の製造方法（請求項１１）や、包埋剤を組織に浸透させた後、包埋することを特徴とする請求項１０又は１１記載の樹脂包埋体の製造方法（請求項１２）や、包埋剤に硬化促進剤を添加して、包埋剤を硬化させることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか記載の樹脂包埋体の製造方法（請求項１３）や、請求項１０〜１３のいずれか記載の製造方法により作製されたことを特徴とする組織の樹脂包埋体（請求項１４）や、請求項１４記載の樹脂包埋体における樹脂を溶媒により除去することを特徴とする組織標本の調製方法（請求項１５）や、溶媒がキシレンであることを特徴とする請求項１５記載の組織標本の調製方法（請求項１６）に関する。
【００１０】
また、本発明は、請求項１５又は１６記載の調製方法により作製されたことを特徴とする組織標本（請求項１７）や、請求項１７記載の組織標本を、インシトゥハイブリダイゼーション法（ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｉｔｏｎ）、又は組織免疫化学法により機能解析を行なうことを特徴とする組織の分析方法（請求項１８）に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の組織の包埋剤としては、メタクリル酸エステルと、フタル酸ジエステルと、重合開始剤とを含有するものであれば、特に制限されるものではなく、ここで組織の包埋剤とは、組織を包埋処理することができる未硬化の液剤をいい、また、包埋処理とは、被処理物の少なくとも表面の一部又は全部に包埋剤を浸漬等により接触させ、次いで被処理物の少なくとも表面の一部又は全部に存する包埋剤を硬化させる処理をいう。上記本発明の組織の包埋剤が適用される組織としては、動植物の組織であれば特に制限されないが、動物の臓器全体やその一部、動植物の生体やその一部等いずれのものでもよく、また、放射性同位元素や、蛍光タンパク質等により標識されたＤＮＡやＲＮＡ等を含むものであってもよい。
【００１２】
本発明の包埋剤に含有されるメタクリル酸エステルは、重合開始剤の存在下、硬化促進剤の添加、加温等、好ましくは硬化促進剤の添加により重合するモノマーであり、メタクリル酸のエステルであれば特に制限されるものではなく、メタクリル酸の脂肪族エステルや、芳香族エステルであってもよい。かかるメタクリル酸エステルとして、具体的には、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ｓｅｃ−ブチル、メタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸アリル、メタクリル酸フェニル、メタクリル酸ベンジル等を例示することができる。これらのメタクリル酸エステルは、水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アルキルメチロール基等の置換基を有していてもよい。かかるメタクリル酸エステルのうち、メタクリル酸アルキルエステルが好ましく、特に、ＭＭＡとして知られるメタクリル酸メチルが安定性の点から好ましい。また、本発明の包埋剤は、メタクリル酸エステルと共重合体を構成するモノマーを含有するものであってもよい。かかる共重合体を構成するモノマーとしては、エチレン、プロピレンや、メタクリル酸等を挙げることができ、メタクリル酸エステル共重合体としては、エチレン・メタクリル酸メチル共重合体、メチレン・メタクリル酸・メタクリル酸メチル共重合体等を具体的に例示することができる。
【００１３】
本発明の包埋剤に含有されるフタル酸のジエステルとしては、フタル酸の脂肪族エステルや芳香族エステルであってもよく、エステル基は相互に同一のものであっても異なるものであってもよい。かかるフタル酸エステルとして、具体的に、フタル酸ジメチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジプロピル、フタル酸ジイソプロピル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジｓｅｃ−ブチル、フタル酸ジｔｅｒｔ−ブチル、フタル酸ジイソブチル、フタル酸ジオクチル、フタル酸ジイソオクチル、フタル酸ジノニル、フタル酸ジイソデシル、フタル酸ジデシル、フタル酸ジラウリル、フタル酸ブチルラウリル、フタル酸ブチルベンジル、フタル酸デシルイソオクチル等を例示することができる。これらのフタル酸ジエステルは、アルキル基、水酸基、アシル基、カルボキシル基、エポキシ基、アルキルメチロール基等の置換基を有していてもよい。これらのうち、フタル酸のアルキルエステルが好ましく、特に、フタル酸ジブチルが包埋剤の保存安定性の点から好ましい。本発明の包埋剤に含有されるフタル酸ジエステルは、可塑剤としての作用や、後述する爆発の危険性を有する重合開始剤が混在した場合であっても、その爆発の危険性を緩衝する作用などを有する。
【００１４】
本発明の包埋剤に含有される重合開始剤は、上記フタル酸エステルを含有する本発明の包埋剤中のメタクリル酸エステルの単重合や、メタクリル酸エステルと共重合体を構成するモノマーとの共重合において触媒作用を有するものであれば、特に制限されるものではないが、過酸化物であることが好ましい。かかる重合開始剤としては、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、エチルメチルケトンペルオキシド、アゾビスイソブチロニトリル等を具体的に例示することができ、このうち特に過酸化ベンゾイルを好適な重合開始剤として挙げることができる。
【００１５】
本発明の包埋剤に含有されるメタクリル酸エステルとフタル酸エステルの混合比は、体積比１〜５：１であることが好ましく、更に、約３：１であることがより好ましい。かかる割合でメタクリル酸エステルとフタル酸エステルを含有する包埋剤を包埋処理に用いることにより、組織の包埋を再現性よく適切に容易に行なうことができ、包埋した組織の品質を保持して長期に亘って保存が可能であり、保存後、硬化した樹脂の除去を容易に行なうことができる。また、本発明の包埋剤に含有される重合開始剤は、３〜７Ｗ／Ｖ％であることが好ましく、約５Ｗ／Ｖ％であることがより好ましい。かかる割合で重合開始剤を含有する包埋剤は、取扱いが容易であり上記モノマーを再現性よく重合させることができ、また、組織を包埋した樹脂を溶剤等を用いて容易に除去することができる。本発明の組織の包埋剤は、例えば、上記メタクリル酸エチルとフタル酸エステルとを上記の割合で混合した液に、重合開始剤を上記の含有量となるように添加、攪拌して調製することができる。また、本発明の包埋剤としては、その機能を阻害しない範囲で紫外線防止剤等他の成分を含有するものであってもよい。このようにして得られる本発明の組織の包埋剤は、重合開始剤として爆発性を有する過酸化ベンゾイル等を含有していても、爆発性を抑制することができ、保存安定性を確保することができ、取扱いが容易であり、例えば、４℃で１ヶ月以上安定に保存することができる。
【００１６】
本発明の包埋剤は、硬化することにより生成する樹脂で組織が包埋された樹脂包埋体を作製することができるという特徴を有し、本発明の包埋剤の中でも、特に硬化することにより生成する樹脂で組織が包埋された樹脂包埋体における樹脂がキシレン等の溶媒により除去できる包埋剤が好ましい。そして、本発明の包埋剤は組織の包埋に使用するものであって、本発明の包埋剤は組織を長期に亘って保存可能とし、保存後の組織において包埋された樹脂を除去し、インシトゥハイブリダイゼーション法や組織免疫化学法などの組織学的な機能解析を可能とする。
【００１７】
本発明の包埋剤を用いて樹脂包埋体を作製する本発明の樹脂包埋体の製造方法としては、組織を固定・脱水し、固定・脱水後の組織と、上記本発明の組織の包埋剤とを浸漬、塗布等により接触させ、次いで包埋剤を硬化させる方法であれば、特に制限されるものではなく、組織を固定・脱水後、本発明の包埋剤を浸漬等により浸透させた後、該包埋剤の硬化を行なう方法が好ましい。
【００１８】
本発明の樹脂包埋体の製造方法における組織の固定は、組織の外形、内部構造、組成を生存状態に近い状態で保存するため、あるいは、研究目的に合致するように一部の物質を溶出させて選択的に内部構造や、生物体を保存することにより、生存状態を推察可能とし、その後の処理を容易にするために行なわれる。組織の固定に用いる固定液としては、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドや、これらとの酸化オスミニウム、酢酸、アルコール等との混合液、例えば、グルタルアルデヒドと四酸化オスミウムの混合液であるカルノフスキー固定液や、ホルムアルデヒド５・飽和ピクリン酸１５・氷酢酸１のブアン固定液等を挙げることができるが、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液食塩水（ｐＨ７．４）が好ましい。これら固定液を用いての組織の固定は、固定液に切り出された生体組織を浸漬して行なうことができ、例えば、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液食塩水を用いる場合は、低温、例えば、４℃前後で所定時間浸漬することが好ましく、固定処理時間は構成する組織の大きさ等により適宜選択することができ、例えば、１〜１６時間、好ましくは４〜８時間である。固定液は、組織に対して濃度勾配が生じないように、攪拌、循環されることが好ましい。さらに、組織を固定した後、洗浄を行なうことが好ましく、洗浄はリン酸緩衝液食塩水等を洗浄液として用い、具体的には、洗浄液に組織を浸漬したり、組織を浸漬した洗浄液を攪拌、循環させるなどの方法によることができる。洗浄により、組織に残存する余剰のパラホルムアルデヒド等の固定に用いた固定液成分を除去し、組織が過剰な変性等を受けることを抑制することができる。洗浄液や洗浄時間は、標識された組織の種類や大きさなどにより適宜選択することができるが、例えば、リン酸緩衝液食塩水等を洗浄液として使用し、１〜６時間、好ましくは４〜６時間洗浄することができる。
【００１９】
本発明の樹脂包埋体の製造方法において、上記方法により固定された組織の脱水はエタノール等で処理することにより行なうことができる。また、組織が蛍光タンパク質等で標識されている場合は、エタノール易溶である蛍光タンパク質がエタノール処理により組織から脱落することを抑制するため、アセトンを用いて脱水を行なうことが好ましい。アセトンによる脱水においては、組織の脱水が十分でないと包埋剤が十分に組織に浸透しない場合が生じ、かかる場合包埋剤で包埋した樹脂包埋体の組織において蛍光が観察されなくなる場合がある。このため、蛍光タンパク質で標識された組織については、アセトンにより十分な脱水を行なうことにより、蛍光タンパク質の蛍光強度の減弱を比較的軽度に留めた樹脂包埋体を製造することができる。尚、上記蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ｂｌｕｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ｃｙａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＦＰ）等を挙げることができ、このうち、緑色蛍光タンパク質が安定した蛍光を長期に亘って発光できるため好ましい。
組織の脱水は、上述のようにエタノール、アセトン等の脱水液に組織を浸漬したり、浸漬した脱水液を攪拌、循環させる方法等によることができるが、濃度の異なる脱水液を交換しながら所定時間浸漬する方法によることが好ましい。脱水する時間は組織の大きさ、種類等により適宜選択できるが、１時間程度とすることができる。また、上記蛍光タンパク質で標識された組織の場合は、例えば、アセトンを１時間毎に交換しながら、６時間浸漬して脱水することができる。
【００２０】
本発明の樹脂包埋体の製造方法において、かかる脱水後包埋処理前に、組織を本発明の包埋剤に浸漬し、包埋剤を組織に十分浸透（浸潤）させることが、組織の長期保存性の点で好ましい。かかる浸透のための包埋剤に組織を浸漬する時間は、組織の大きさ等により適宜選択することができるが、４〜１６時間、好ましくは６〜８時間である。包埋剤に組織を浸漬する時間が、４〜１６時間であれば、包埋剤が組織に十分に浸透し、且つ、包埋剤の硬化が生じることがなく、６〜８時間であればかかる効果をより高く得ることができる。
【００２１】
本発明の標識の製造方法において、組織の包埋処理、好ましくは包埋剤を浸透させた組織の包埋処理は、包埋剤に含有されるメタクリル酸エステルを硬化重合させることにより行われる。包埋剤の硬化は、硬化促進剤を添加することにより、あるいは加温すること等により行なうことができる。上記硬化促進剤としては、特に限定されるものではなく、ジメチルアニリンのスチレン溶液、ナフテン酸コバルトのスチレン溶液等を用いることができ、このうちＮ，Ｎ−ジメチルアニリンを包埋剤の０．１〜１０％、特に１〜３％用いることが好ましい。また、組織の包埋処理方法としては、上記硬化促進剤を本発明の包埋剤に添加、攪拌し、混合して得られた混合液剤を、包埋剤に浸漬した組織を載置したトレイ等に流し込み、室温で包埋剤を硬化させる方法により、組織のタンパク質等の熱による変性をほとんど起さずに硬化させることができるが、４℃の低温下で組織のタンパク質等への影響をより抑えた状態で硬化させることも可能である。包埋剤を硬化させるに際し、ポリエチレンフォイル（ＰＥフィルム）、パラフィルム等のカバーフォイルで表面を覆い、空気を遮断して重合を促進して硬化させることが好ましいが、パラフィルムは伸張し剥離が困難となる場合があるため、ＰＥフィルムを用いることが好ましい。重合時間は組織の大きさ等に伴う包埋剤の使用量により適宜選択することができるが、例えば、２、３時間で行なうことができる。このように組織を包埋した包埋剤の重合により組織の樹脂包埋体を製造することができる。
【００２２】
本発明の組織の樹脂包埋体は、上記樹脂包埋体の製造方法によって作製された組織であればどのようなものでもよく、特に、包埋剤が硬化した樹脂がキシレン等の溶媒により除去でき、樹脂の除去後、インシトゥハイブリダイゼーション法、又は組織免疫化学法の機能解析を行なうことができるものであることが好ましい。本発明の樹脂包埋体は、例えば、室温で１年以上、組織の微細構造のみならず、分子の保持、特に蛋白質においてはその抗原性を長期に亘って保持することができるため、長期保存後、包埋した樹脂を除去し、インシトゥハイブリダイゼーション法や組織免疫化学法などの組織学的な機能解析に適用される手法の適用を可能とする。
【００２３】
本発明の組織標本の調製方法は、上記のように、樹脂包埋体における樹脂を溶媒により除去する方法であれば特に制限されないが、組織の樹脂包埋体を所定の薄切用の刃を取り付けたミクロトームに固定し、面出しをした後、目的に応じて２〜５μｍの厚さで薄切し、切り取られた切片を、例えば、５０〜６０℃の水に浮かべ、シランコートされたスライドガラス上等に掬い取り、例えば、３７℃の伸展板上で乾燥し、乾燥によりスライドガラスに張り付いた切片を、スライドガラスごと３７℃のキシレン等の溶媒に、例えば、１０〜６０分等浸漬することにより除去する方法を好適に例示することができる。脱樹脂用の溶媒としては、メタクリル酸エステル樹脂の溶媒となり得るものであれば、いずれのものであってもよいがキシレンが好ましく、また、このような溶媒は複数回使用することができる。かかる調製方法により得られる本発明の組織標本を用いると、本発明の組織の分析方法、すなわち、インシトゥハイブリダイゼーション法や組織免疫化学法などの組織学的な機能解析の分析方法を、有利に行なうことができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１：包埋剤の調製
５０％過酸化ベンゾイルペーストを２００ｍｇ量り取り、そこにメチルメタクリル酸モノマー１５００μｌとフタル酸ジブチル５００μｌとを添加・混合し、包埋剤２ｍｌを調製した。
【００２５】
実施例２：組織の包埋処理による樹脂包埋体の調製
マウス精巣（約１００ｍｇ）を４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．４）により４℃で４〜８時間固定した。リン酸緩衝食塩液での４時間〜６時間洗浄を行なった後、５０％、７０％、９５％濃度のエタノールにて、各１時間程度づつ浸漬し、更に１００％濃度のエタノールで２時間程度浸漬し脱水を行なった。その後、実施例１と同様の割合で別途調製した包埋剤に４℃で６〜８時間浸透した。その後、包埋板にマウス精巣を移した。実施例１で調製した包埋剤２ｍｌに、硬化促進剤液として２０μｌ（包埋剤の１％）のＮ，Ｎ−ジメチルアニリンを添加し、５分程チューブローテーターで混合した液剤を包埋板上のマウス精巣に流し込み、カバーフォイルで空気を遮断し、４℃〜室温で２、３時間重合させ、樹脂で包埋した樹脂包埋体を得た。
【００２６】
実施例３：組織標本の作製
実施例２で調製された樹脂包埋体を固定台にとりつけミクトームで厚さ２〜５μｍに薄切した。切片を５５℃程度の温水に浮かべ、シランコートされたスライドガラスに掬い取り、３７℃で乾燥させた。キシレン中３７℃で２０分間インキュベートして包埋した樹脂の除去を行った。次いで、１００％エタノールで３分間の脱水処理を３回、９５％エタノールで３分間の脱水処理を１回、８０％エタノールで３分間の脱水処理を１回、７０％エタノールで３分間の脱水処理を１回行なった後、ＰＢＳで３回洗浄を行い、組織標本を作製した。
【００２７】
比較例：凍結切片法による標本の作製
比較例として、実施例２と同様にして、組織を固定洗浄した後、凍結切片用の水溶性包埋剤であるＯＣＴコンパウンド中に組織片を置き、−７０℃で凍結させ、その後実施例３と同様に、マウス精巣の組織標本（凍結切片）を作製した。
【００２８】
実施例４：インシトゥハイブリダイゼーション法による組織標本の観察
実施例３で作製されたマウス精巣の組織標本（切片）について、ヒストンＨ２Ａ．ＸｍＲＮＡの発現パターンをインシトゥハイブリダイゼーションにより調べた。Ｈ２Ａ．Ｘプローブを作製するために、マウスＨ２Ａ．ＸのｃＤＮＡから制限酵素ＡｐａＩ−ＳａｃＩサイトで切り出した２３１ｂｐの断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋プラスミドベクターにサブクローニングした。アンチセンスプローブは、これを制限酵素Ａｓｐ７１８で切断して直鎖化し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより、センスプローブは制限酵素Ｅｃｌｌ３６ＩＩで切断して直鎖化し、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼによりそれぞれジゴキシゲニンラベルして作製した。これらのプローブを用い、文献（ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｙ　＆　Ｓｏｎｓ．　Ｉｎｃ．）記載の方法に準じて、インシトゥハイブリダイゼーションを行い、発色に際しては、ＴＳＡＴＭ　Ｐｌｕｓ　ＤＮＰ　ｓｙｓｔｅｍ（ＭＥＮＴＭ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｉｎｃ．）を用い、シグナルを増強し、ヒストンＨ２Ａ．ＸｍＲＮＡの発現パターンを観察した。結果を図１（参考写真１参照）に示す。また、同様にして、比較例１で作製されたマウス精巣の組織標本（凍結切片）におけるヒストンＨ２Ａ．ＸｍＲＮＡの発現パターンを観察した。結果を図２（参考写真２参照）に示す。図１と図２の比較結果からも明らかなように、本発明の組織標本（切片）は、細胞の微細構造まで保たれており、容易にＨ２Ａ．ＸｍＲＮＡの発現パターンの識別ができたが、凍結切片ではＨ２Ａ．ＸｍＲＮＡの発現パターンは不明瞭であった。
【００２９】
実施例５：ＴＵＮＥＬ法による組織標本の観察
実施例３で作製されたマウス精巣の組織標本を６ヶ月保存の後に、Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＰＯＤ（ロッシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を用い、ＴＵＮＥＬ法によりアポトーシスを組織化学的に検出した。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ存在下においてフルオレセインで標識したｄＵＴＰを使ったＤＮＡ鎖の切断の標識化（ＴＵＮＥＬ反応；ＴｄＴ−　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄＵＴＰ−　ｂｉｏｔｉｎ　ｎｉｃｋ　ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ）を行った。結果を図３（参考写真３参照）に示す。図３からわかるように、ＤＮＡが断片化している細胞の核が茶色（ＤＡＢによる発色）に、ＤＮＡが断片化していない細胞の核が青紫色（対比染色として行っているヘマトキシリン）に、それぞれ明確に観察することができた。尚、上記キット（Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）は、凍結切片法あるいはパラフィン包埋法により作製された組織標本を対象とするものであるが、本発明により作製された組織標本もその対象となることが認められた。
【００３０】
実施例６：免疫染色法による組織標本の観察
実施例３で作製されたマウス精巣の組織標本を６ヶ月保存の後に、蛍光抗体法を用い、文献（ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｙ　＆　Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．）記載の方法に準じて、免疫染色を行い、ＰＯＵドメイン蛋白Ｏｃｔ−３／４（＋）精原細胞を観察した（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１３　（２００２）　ｐ．２９−３０）。結果を図４（参考写真４参照）に示す。図４からわかるように、Ｏｃｔ−３／４（＋）精原細胞（矢印）を明確に観察することができた。
【００３１】
実施例７：免疫染色法による組織標本の観察
実施例３で作製されたマウス精巣の組織標本を６ヶ月保存の後に、蛍光抗体法を用い、文献（ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｙ　＆　Ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．）記載の方法に準じて、免疫染色を行い、精原細胞における受容体型チロシンキナーゼ（Ｒｅｔ）をコードする遺伝子の発現パターンを調べた（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１３　（２００２）　ｐ．２９−３０）。結果を図５（参考写真５参照）に示す。図５からわかるように、Ｒｅｔの発現（矢頭）を明確に観察することができた。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の組織の包埋剤によれば、爆発性が抑制され、運搬や保管取扱い時の安全性を確保することができ、組織の包埋の手順・操作が容易であり、更に、再現性の良好な重合の達成を可能とし、その結果として本発明の組織の包埋剤を適用した本発明の樹脂包埋体によれば、組織の微細構造の保持のみならず、目的となる分子の保持、特に蛋白質の抗原性の保持を長期に亘って可能とし、長期保存後、包埋した樹脂を除去して作製した本発明の組織標本において、インシトゥハイブリダイゼーション法や組織免疫化学法等により組織化学的な機能解析を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組織標本のインシトゥハイブリダイゼーション法によるマウス精巣におけるＨ２Ａ．ＸｍＲＮＡの発現パターンを示す図である。
【図２】凍結切片法による組織標本のインシトゥハイブリダイゼーション法によるマウス精巣におけるＨ２Ａ．ＸｍＲＮＡの発現パターンを示す図である。
【図３】本発明の組織標本のＴＵＮＥＬ法によるマウス精巣におけるアポトーシスの組織化学的な検出結果を示す図である。
【図４】本発明の組織標本の免疫染色法によるマウス精巣におけるＯｃｔ−３／４（＋）精原細胞の検出結果を示す図である。
【図５】本発明の組織標本の免疫染色法によるマウス精巣の精原細胞におけるＲｅｔ発現パターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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