(57)【要約】【課題】医薬品、農薬、および各種工業薬品の製造中間体として非常に重要な光学活性なＬ−ペニシラミンを安価に製造する方法を提供する。【解決手段】ＤＬ−ペニシラミンアミドに、Ｌ−ペニシラミンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有する微生物の菌体または菌体処理物を作用させＬ−ペニシラミンを製造する。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬ−ペニシラミンアミドに、Ｌ−ペニシラミンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有する微生物の菌体または菌体処理物を作用させて、Ｌ−ペニシラミンを生成せしめることを特徴とする、Ｌ−ペニシラミンの製造方法。
【請求項２】
Ｌ−ペニシラミンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有する微生物が、シュードモナス属、ブレビバクテリウム属、およびクレブシエラ属に属する細菌である、請求項１記載のＬ−ペニシラミンの製造方法。
【請求項３】
シュードモナス属に属する細菌が、シュードモナス  アゼライカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｅｌａｉｃａ）２−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１８）、ブレビバクテリウム属に属する細菌が、ブレビバクテリウム  ｓｐ．（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）２−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１９）、クレブシエラ属に属する細菌が、クレブシエラ  ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）２−３株（自己寄託菌株）である、請求項１、２の何れかに記載のＬ−ペニシラミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−ペニシラミンの製造方法に関する。詳しくは、ＤＬ−ペニシラミンアミド
を生化学的に不斉加水分解してＬ−ペニシラミンを製造する方法に関する。
Ｌ−ペニシラミンは、医薬品、農薬、および各種工業薬品の製造中間体として重要な物質である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−ペニシラミンの製造方法としては、ラセミ体のペニシラミン誘導体をジアステレオマー塩法により光学分割した後、Ｌ−ペニシラミンに誘導する方法が種々知られている。例えば、ラセミ体のペニシラミンをＮ−アセチルペニシラミンに誘導した後、ブルシン等を使用して分割する方法（例えば、非特許文献１参照）が、また、ラセミ体のペニシラミンを３−ホルミル−２，２，５，５−テトラメチル−４−チアゾリジンカルボン酸に誘導した後に光学分割する方法（例えば、非特許文献２、特許文献１参照）が提案されている。しかしながら、これらのジアステレオマー法による光学分割では、使用する分割剤が高価なため、経済的な方法とはいえない。
一方、ＤＬ−ペニシラミンアミドを微生物が有する酵素を利用して不斉加水分解し、Ｌ−ペニシラミンを製造する方法は、未だ報告されていない。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｈ．Ｔ．Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ  、Ｔｈｅ    Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ    Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ、ｐ４６６、１９４９
【非特許文献２】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｒｅｐａｒ．、３、ｐ１１６、１９５３
【特許文献１】
特公昭５５−３０７１１号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来技術における上記のような課題を解決し、医薬品、農薬、および各種工業用薬品の製造中間体として非常に重要な光学活性なＬ−ペニシラミンを安価に製造する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、安価にＬ−ペニシラミンを製造する方法に関して鋭意検討を行った結果、ＤＬ−ペニシラミンアミドを生化学的に不斉加水分解してＬ−ペニシラミンを製造する本発明に到達した。
【０００６】
即ち、本発明は、ＤＬ−ペニシラミンアミドに、Ｌ−ペニシラミンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有する微生物の菌体または菌体処理物を作用させて、Ｌ−ペニシラミンを生成せしめることを特徴とする、（１）から（３）に示すＬ−ペニシラミンの製造法に関する。
（１）ＤＬ−ペニシラミンアミドに、Ｌ−ペニシラミンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有する微生物の菌体または菌体処理物を作用させて、Ｌ−ペニシラミンを生成せしめることを特徴とする、Ｌ−ペニシラミンの製造方法。
（２）Ｌ−ペニシラミンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有する微生物が、シュードモナス属、ブレビバクテリウム属、およびクレブシエラ属に属する細菌である、（１）記載のＬ−ペニシラミンの製造方法。
（３）シュードモナス属に属する細菌が、シュードモナス  アゼライカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｅｌａｉｃａ）２−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１８）、ブレビバクテリウム属に属する細菌が、ブレビバクテリウム  ｓｐ．（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）２−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１９）、クレブシエラ属に属する細菌が、クレブシエラ  ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）２−３株（自己寄託菌株）である、（１）、（２）の何れかに記載のＬ−ペニシラミンの製造方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の詳細について説明する。
本発明において使用される微生物としては、Ｌ−ペニシラミンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有する微生物であればよく、特に制限はないが、かかる微生物として、例えばシュードモナス属、ブレビバクテリウム属、およびクレブシエラ属に属する細菌、具体的には、シュードモナス  アゼライカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｅｌａｉｃａ）２−１株、ブレビバクテリウム  ｓｐ．（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）２−２株、クレブシエラ  ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）２−３株が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、これらの微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、もしくは細胞融合または遺伝子組換え法等の遺伝子工学的手法により誘導される組換え株等のいずれの株であっても上記能力を有するものであれば本発明に使用できる。
【０００８】
シュードモナス  アゼライカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｅｌａｉｃａ）２−１株、ブレビバクテリウム  ｓｐ．（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）２−２株、クレブシエラ  ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）２−３株は、本発明者らにより土壌中から分離された細菌であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、シュードモナスアゼライカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｅｌａｉｃａ）２−１株は寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１８（寄託日平成１５年２月１８日）にて、ブレビバクテリウム  ｓｐ．（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）２−２株は寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１９（寄託日平成１５年２月１８日）にてそれぞれ寄託されている。また、クレブシエラ  ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）２−３株については該細菌が同センターにおける受託拒否の対象微生物に属することから自己寄託菌株（受託拒否証明書発行日平成１５年２月１８日）として自ら保存している（以下、それぞれの菌株を単に２−１株、２−２株、２−３株と記すことがある）。
【０００９】
次に、本発明の３菌株の菌学的性質について説明する（表１，２，３）。なお、表中、＋は該当する試験項目に陽性であった場合、−は陰性であった場合、Ｗは陽性反応が微弱であった場合を示す。
2004254647.tif 000002
【００１０】
2004254647.tif 000003
【００１１】
2004254647.tif 000004
2004254647.tif 000005
2004254647.tif 000006
【００１２】
上記の菌学的性状から、２−１株はシュードモナス属と同定された。また、脂肪酸組成分析の結果、シュードモナス属のＲＮＡグループ１と同定された。さらに、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の部分塩基配列を解析した結果、シュードモナス  アゼライカと１００％の相同率を示し、２−１株はシュードモナス  アゼライカと同定された。
２−２株は、グラム染色陽性、カタラーゼ反応陽性、無芽胞、桿菌、ゼラチン加水分解試験項目で陽性、カゼインの加水分解性陽性、６％ＮａＣｌ存在下での生育性陽性を示したことから、ブレビバクテリウム属と同定された。
２−３株は、グラム染色陰性、オキシダーゼ反応陰性、ブドウ糖を発酵的に分解する桿菌など、腸内細菌様の性状を示し、リシンデカルボキシラーゼ、クエン酸の利用性、ウレアーゼ、アセトイン産生の試験項目で陽性、アルギニンジヒドロラーゼ、インドール産生の試験項目で陰性を示したことからクラブシエラ  ニューモニアエと同定された。
【００１３】
本発明の微生物の培養は、通常資化し得る炭素源、窒素源、各微生物に必須の無機塩、栄養等を含有させた培地を用いて行われる。炭素源としては、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、麦芽糖、デキストリン、でん粉、グリセリン、およびマンニトールなどが、また窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、ペプトン、尿素、およびアンモニアなどが用いられる。無機塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムなどを含む塩類、並びに鉄、マンガン、亜鉛、およびコバルトなどの金属塩類などが用いられる。その他に、アミノ酸、ペプチド、各種ビタミン類等も必要により用いられる。培養時のｐＨは、４〜１０の範囲であり、温度は２０〜５０℃である。培養は、１日〜１週間程度好気的に行われる。このようにして培養した微生物は、生菌体または該生菌体処理物、例えば培養液、分離菌体、菌体破砕物、さらには精製した酵素として反応に使用される。また、常法に従って菌体または酵素を固定化して使用することもできる。
【００１４】
ＤＬ−ペニシラミンアミドの生化学的不斉加水分解反応の条件は、ＤＬ−ペニシラミンアミド濃度０．０１〜２０ｗｔ％、ＤＬ−ペニシラミンアミドに対する微生物の使用量は、乾燥菌体として重量比０．０００１〜１０、反応温度１０〜６０℃、ｐＨ４〜１３の範囲である。
ＤＬ−ペニシラミンアミドの生化学的不斉加水分解反応で生成したＬ−ペニシラミンの、反応終了液からの単離は、例えば遠心分離あるいは濾過膜などの通常の固液分離手段により微生物菌体を除いた後、溶媒抽出やカラムクロマトグラフィー等の公知の方法を利用でき、特に制限はないが、イオン交換電気透析法や、イオン交換樹脂による吸脱着を利用した分離方法も有効である。
本発明の方法によって、ＤＬ−ペニシラアミドより、医薬品、農薬、および各種工業薬品の製造中間体として非常に重要な光学活性なＬ−ペニシラミンを安価に製造することができる。
【００１５】
【実施例】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
シュードモナス  アゼライカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｅｌａｉｃａ）２−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１８）をＴＧＹ培地（トリプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１ｇ、リン酸水素二カリウム１ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．０）２０ｍｌに接種し、２４時間、３０℃で振とう培養した。この培養液１．５ｍｌを次の組成を有する培地２５０ｍｌに接種し、２４時間、３０℃で振とう培養した。以下に、使用した培地組成、並びにビタミン混液および微量ミネラル混液の詳細を示す。
培地組成（ｐＨ７．０）
ソルビトール            ５ｇ        ＮＺアミン、タイプＡ    ５ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                ２ｇ        ＮａＣｌ                １ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ      ５０ｍｇ      ビタミン混液          １０ｍｌ
微量ミネラル混液      １０ｍｌ      蒸留水                  １Ｌ
ビタミン混液組成
塩酸チアミン            ４ｍｇ      リボフラビン            ２ｍｇ
パントテン酸カルシウム  ４ｍｇ      ピリドキシン            ４ｍｇ
ビオチン              ２０μｇ      ｐ−アミノ安息香酸      ２ｍｇ
ニコチン酸              ４ｍｇ      葉酸                ０．１ｍｇ
イノシトール          ２０ｍｇ      蒸留水                  １Ｌ
微量ミネラル混液組成
Ｔｉｔｒｐｌｅｘ  ＩＶ      ５００ｍｇ      ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    ２００ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      １０ｍｇ      ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ      ３ｍｇ
Ｈ３ＢＯ４                ３０ｍｇ      ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ    ２０ｍｇ
ＣｕＳＯ４・２Ｈ２Ｏ        １ｍｇ      ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ      ２ｍｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ    ３ｍｇ      蒸留水                  １Ｌ
培養終了後、培養液１００ｇを８０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離することにより、集菌し、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８）を用いて調製した５０ｍＭのＤＬ−ペニシラミンアミド５ｍｌを加えて懸濁し、窒素気流下、３０℃で２４時間振とうした。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分）後の上澄み液をＨＰＬＣにかけて生成したＬ−ペニシラミンを定量した結果、光学純度１００％のＬ−ペニシラミンが、ＤＬ−ペニシラミンアミド基準の収率４６％、Ｌ−ペニシラミンアミド基準の収率９２％で得られた。
【００１６】
実施例２
ブレビバクテリウム  ｓｐ．（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）２−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２１９）を用いて、実施例１と同様に操作した結果、光学純度１００％のＬ−ペニシラミンが、ＤＬ−ペニシラミンアミド基準の収率４２％、Ｌ−ペニシラミンアミド基準の収率８４％で得られた。
【００１７】
実施例３
クレブシエラ  ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）２−３株（自己寄託菌株）を用いて、実施例１と同様に操作した結果、光学純度１００％のＬ−ペニシラミンが、ＤＬ−ペニシラミンアミド基準の収率４１％、Ｌ−ペニシラミンアミド基準の収率８２％で得られた。
【００１８】
本発明の方法によれば、医薬品、農薬、および各種工業薬品の製造中間体として非常に重要な光学活性なＬ−ペニシラミンを反応が穏和かつ簡便で、経済的に有利な方法で製造することが可能となる。