(57)【要約】【課題】被検物質が植物細胞内において発揮する抗酸化能を、より正確に評価することが可能な抗酸化能評価方法を提供すること。【解決手段】植物組織に被検物質を吸収させた後に易還元物質を吸収させ、発生する活性酸素種に起因する発光を測定する第１のステップと、前記植物組織に前記被検物質を吸収させずに前記易還元物質を吸収させ、発生する活性酸素種に起因する発光を測定する第２のステップと、前記第１のステップ及び前記第２のステップでそれぞれ得られた発光の強度を比較することにより前記被検物質の抗酸化性の有無を評価する第３のステップと、を備えることを特徴とする抗酸化能評価方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組織に被検物質を吸収させた後に易還元物質を吸収させ、発生する活性酸素種に起因する発光を測定する第１のステップと、
前記植物組織に前記被検物質を吸収させずに前記易還元物質を吸収させ、発生する活性酸素種に起因する発光を測定する第２のステップと、
前記第１のステップ及び前記第２のステップでそれぞれ得られた発光の強度を比較することにより前記被検物質の抗酸化性の有無を評価する第３のステップと、を備えることを特徴とする抗酸化能評価方法。
【請求項２】
前記被検物質の吸収を、減圧下で行うことを特徴とする請求項１記載の抗酸化能評価方法。
【請求項３】
前記発光の測定を、室温で行うことを特徴とする請求項１又は２記載の抗酸化能評価方法。
【請求項４】
前記植物組織が、植物の葉であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗酸化能評価方法。
【請求項５】
前記易還元物質が、１，１’−ジメチル−４，４’−ビピリジウムジクロライドであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗酸化能評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物細胞を用いた抗酸化力評価方法（抗酸化能評価方法）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
活性酸素種は、人体において癌や老化を引き起こし、また、植物等を枯渇させる一因となることが知られている。抗酸化物質は、かかる活性酸素種の捕捉、消去が可能な物質であり、活性酸素種が及ぼす悪影響を低減することができる。従って、物質が有する抗酸化能を評価することは極めて重要である。
【０００３】
抗酸化能を評価する方法としては、ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ等の酵素反応により活性酸素種を発生させ、かかる活性酸素種を植物から溶媒で抽出した成分等の被検物質により捕捉させて、チトクロムＣ法、ニトロブルーテトロゾリウム（ＮＢＴ）法、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）法等により評価する方法が知られている。
【０００４】
また、発光を測定することにより抗酸化物質の抗酸化能を評価する方法も知られており、かかる方法には、活性酸素種、被検物質及び受容体を混合することにより発生する光を定量することにより、被検物質の抗酸化能を評価するＸＹＺ−ｄｉｓｈ法等がある（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００５】
【非特許文献１】
岩井邦久、阿部馨、松江一，「フォトン検出による新規抗酸化活性評価法としてのＸＹＺ−ｄｉｓｈ法の確立」，日本食品工学会誌，２０００年，第４７巻，ｐ．１８１−１９０
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の方法は、植物組織が発する活性酸素種を直接用いるのではなく、植物組織外の特殊な条件で発生させた活性酸素種を用いて被検物質の抗酸化能を評価しているため、得られた評価結果が、植物において被検物質が発揮し得る抗酸化能とは直接結びつかない場合があった。また、上記チトクロムＣ法やＮＢＴ法でプローブとして用いられるチトクロムＣやＮＢＴは、抗酸化物質として用いられる天然植物中に含まれている還元剤によっても還元され得るため、被検物質の抗酸化能を正確に評価することが困難であるという問題を有していた。
【０００７】
本発明は上記に鑑みてなされたものであり、被検物質が植物において発揮する抗酸化能を、より正確に評価することが可能な抗酸化能評価方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため本発明は、植物組織に被検物質を吸収させた後に易還元物質を吸収させ、発生する活性酸素種に起因する発光を測定する第１のステップと、前記植物組織に前記被検物質を吸収させずに前記易還元物質を吸収させ、発生する活性酸素種に起因する発光を測定する第２のステップと、前記第１のステップ及び前記第２のステップでそれぞれ得られた発光の強度を比較することにより前記被検物質の抗酸化性の有無を評価する第３のステップと、を備えることを特徴とする抗酸化能評価方法を提供する。
【０００９】
本発明の抗酸化能評価方法は、活性酸素種の発生源として植物組織を用い、かかる植物組織における植物細胞に易還元物質を取り込ませ、発生する活性酸素種を被検物質が捕捉し得るかどうかを発光強度の測定により評価する。すなわち被検物質の存在下で発生する活性酸素種に起因する発光の強度と、被検物質の非存在下で発生する活性酸素種に起因する発光の強度とを比較するものであるため、植物において被検物質が発揮し得る抗酸化能をより反映した評価結果を得ることが可能となる。また、得られた発光の強度は、植物組織により発生する活性酸素種のみに基づくものであるため、他の条件に影響されないより正確な評価結果を得ることが可能となる。
【００１０】
上記被検物質の吸収は、減圧下で行うことが好ましい。被検物質の植物組織への吸収を減圧下で行うことにより、被検物質の吸収をより良好に行うことができ、抗酸化能の評価をより正確に行うことが可能となる。
【００１１】
上記発光の測定は、室温で行うことが好ましい。上記発光の測定を室温で行うことにより、被検物質が自然の植物において発揮し得る抗酸化能をより反映した評価結果を得ることが可能となる。
【００１２】
上記植物組織は、植物の葉であることが好ましい。植物組織として植物の葉を用いることにより、より正確に抗酸化能の評価を行うことが可能となる。
【００１３】
上記易還元物質は、１，１’−ジメチル−４，４’−ビピリジウムジクロライドであることが好ましい。かかる化合物は、植物組織に作用して多量の活性酸素種を生じさせ得ることから、多量の活性酸素種に起因する発光による抗酸化能評価が可能となり、抗酸化能評価をより正確に行うことが可能となる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
第１のステップにおいては、植物組織に被検物質を吸収させた後に易還元物質を吸収させ、被検物質及び易還元物質が吸収された植物組織から発生する活性酸素種に起因する発光を測定する。
【００１５】
植物組織としては、植物の一部、例えば葉、茎又は枝等を用いることができるが、植物の葉を用いることが好ましい。植物の葉は、他の植物組織に比べて被検物質や易還元物質の吸収を効率的に行うことができるため、被検物質の抗酸化能評価をより正確に行うことが可能となる。
【００１６】
植物組織として植物の葉を用いる場合、植物から分離した葉をそのまま抗酸化能評価に用いてもよく、葉を更に適宜の大きさ及び形状に切断して用いてもよい。切断した際の葉の形状は例えば円形にすることができる。また、植物の葉としては、タバコの葉を用いることが好ましく、タバコの本葉を用いることがより好ましい。
【００１７】
被検物質としては、天然抗酸化物質や合成抗酸化物質等の通常抗酸化能を有するとされる物質が特に好適に用いられる。かかる物質としては、例えば、アスコルビン酸、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、β−カロテン、ビタミンＥ又は没食子酸等が挙げられる。
【００１８】
易還元物質は、植物組織中で容易に還元される物質をいい、光合成や呼吸の途中で生じた電子により還元され、フリーラジカルとなった後に活性酸素種を発生する物質である。易還元物質としては、上記のような作用により除草効果を奏する除草剤等を用いることができ、かかる除草剤としては、例えば、パラコートやジクワットとして知られる除草剤が挙げられる。本発明においては、易還元物質としてはパラコートとして知られる１，１’−ジメチル−４，４’−ビピリジウムジクロライド（メチルビオロジェン）を用いることが好ましく、かかる化合物を植物組織と作用させることにより、効果的に活性酸素種を生じさせることができる。
【００１９】
植物組織に被検物質を吸収させる方法としては、被検物質の溶液中に植物組織を浸漬させる方法、植物組織に被検物質の溶液をスプレーする方法、植物組織に被検物質の溶液を塗布する方法等が挙げられるが、被検物質の溶液中に浸漬させることが好ましく、減圧下で植物組織を被検物質の溶液中に浸漬させることがより好ましい。減圧下で植物組織を被検物質の溶液中に浸漬させることにより、植物組織の細胞に充分に被検物質を吸収させることができ、被検物質の抗酸化能評価をより正確に行うことが可能となる。
【００２０】
植物組織に吸収させる被検物質の溶液の濃度は、用いる植物組織や吸収させる被検物質に応じて適宜決定することができる。例えば被検物質としてアスコルビン酸を用いる場合は、溶液の濃度は５０ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、また、ＥＧＣＧを用いる場合は、溶液の濃度は５ｍＭ〜２０ｍＭであることが好ましい。
【００２１】
植物組織に易還元物質を吸収させる方法としては、上述の被検物質の吸収と同様に、易還元物質の溶液をシャーレ等の容器に入れ、かかる溶液中に植物組織を浸漬させる方法、植物組織に易還元物質の溶液をスプレーする方法、植物組織に易還元物質の溶液を塗布する方法等が挙げられるが、易還元物質の溶液中に植物組織を浸漬させることが好ましい。
【００２２】
特に、植物組織として植物の葉を用いる場合は、易還元物質の溶液に、葉の表面が溶液と接触するように浮かせることが好ましい。これにより、葉の細胞に充分に易還元物質を取り込ませることができ、葉の細胞と易還元物質との作用による活性酸素種の発生をより良好に行うことができる。また、生じる発光をより確実に検出することも可能となるため、被検物質の抗酸化能評価をより正確に行うことができる。
【００２３】
植物組織に吸収させる易還元物質の溶液の濃度もまた、用いる植物組織や吸収させる易還元物質に応じて適宜決定することができる。例えば易還元物質としてメチルビオロジェンを用いる場合は、溶液の濃度は１００μＭ〜２００μＭであることが好ましい。
【００２４】
発光は、活性酸素種に起因して生じるものであり、生じた発光を測定することにより発光強度を得ることができる。かかる活性酸素種の発生メカニズムは必ずしも明らかではないが、植物組織の細胞の呼吸によって生じた電子により易還元物質が還元されて易還元物質ラジカルとなり、生じた易還元物質ラジカルが易還元物質に戻る際に発生するものと推測される。第１のステップにおいては、被検物質が植物組織の細胞中に取り込まれており、活性酸素種と被検物質とは、例えば活性酸素種が被検物質に捕捉される等の相互作用を生じる。従って第１のステップで得られる発光強度（以下、「第１の発光強度」という。）は、かかる相互作用の後に植物組織中に存在する活性酸素種の量に基づくものとなる。
【００２５】
発光の測定は、公知の微弱発光測定装置を用いて行うことができ、微弱発光測定装置としては、例えばフォトンカウンタ（ＭＳＰＣ、浜松ホトニクス社製）を用いることができる。かかる微弱発光測定装置は、発光測定用サンプルを導入する試料室内が、外部からの光の入射を遮断できる暗室となっている必要がある。
【００２６】
発光の測定は、室温で行うことが好ましく、更に第２のステップと略同一の温度で発光の測定を行うことがより好ましい。従って、上記微弱発光測定装置は試料室内が室温付近でほぼ一定に保持可能であることが好ましく、２６±１℃程度に保持可能であることがより好ましい。発光の測定を室温で行うことにより、被検物質が自然の植物において発揮し得る抗酸化能をより反映した評価結果を得ることが可能となる。
【００２７】
発光測定には、植物組織に易還元物質をスプレー又は塗布により吸収させた場合は、植物組織をそのまま発光測定用のサンプルとして用いることができ、また、容器に入れた易還元物質の溶液中に植物組織を浸漬するか又は溶液に植物組織を浮かせた場合は、植物組織及び易還元物質の溶液を含む容器ごと発光測定用のサンプルとして用いることができる。そして発光の測定は、かかるサンプルを上述の微弱発光測定装置の試料室内に導入し、植物組織から生じる発光を経時的に検出することにより行うことができる。
【００２８】
第２のステップにおいては、植物組織に被検物質を吸収させずに易還元物質を吸収させ、易還元物質が吸収された植物組織から発生する活性酸素種に起因する発光を測定する。
【００２９】
第２のステップに用いる植物組織は、第１のステップで用いた植物組織と同一の種類（葉、枝等）である必要があり、同一の個体から採取した植物組織を用いることが好ましい。すなわち、例えば、第１のステップにおいて植物の葉を用いた場合は、かかる葉を採取したのと同一の個体から第２のステップに用いる葉を採取することが好ましい。
【００３０】
第１のステップで得られた発光強度と第２のステップで得られた発光強度との比較のためには、第２のステップに用いる植物組織は第１のステップに用いる植物組織とほぼ同一の形状及び大きさであることが好ましい。例えば、第１のステップにおいて植物の葉を切断して発光の測定に用いた場合、第２のステップにおいても同一の形状及び大きさに切断した葉を用いて発光測定を行うことが好ましい。可能であれば、第２のステップに用いる葉は、第１のステップにおいて切断して測定に用いた葉の、残りの部分を切断して用いることがより好ましい。第１のステップに用いる植物組織と第２のステップに用いる植物組織とをほぼ同一の形状及び大きさとすることにより、得られた発光強度をそのまま比較して被検植物の抗酸化性の有無を評価することができる。
【００３１】
なお、第１のステップにおいて用いる植物組織と第２のステップにおいて用いる植物組織が異なる形状又は大きさであっても発光強度の比較を行うことは可能である。かかる場合は、例えば、発光強度を単位面積あたりの発光強度に換算することによって第１のステップで得られる発光強度と第２のステップで得られる発光強度との比較を行うことができる。
【００３２】
第２のステップにおいては植物組織に被検物質を吸収させずに易還元物質を吸収させて発光の測定を行うが、第２のステップにおいては被検物質の代わりに抗酸化性を有さない液体、例えば減菌蒸留水等を植物組織に吸収させることが好ましい。未処理の植物組織に易還元物質を吸収させるのではなく、抗酸化性を有さない液体を吸収させた植物組織に易還元物質を吸収させることにより、第２のステップにおいても第１のステップにおける場合とほぼ同量の易還元物質を吸収させることができ、抗酸化能評価をより正確に行うことが可能となる。また、第２のステップで用いる易還元物質は、第１のステップで用いたものと同一の物質である必要があり、同一の濃度であることが好ましい。
【００３３】
そして、植物組織に易還元物質を吸収させる方法もまた、第１のステップと同様に行うことが好ましく、発光測定用のサンプル及び発光測定用の装置もまた、第１のステップと同様のものを用いることが好ましい。
【００３４】
第２のステップにおいても第１のステップと同様の機構により発光が生じるものと考えられるが、第２のステップにおいては、植物組織への被検物質の吸収を行わないため両者の相互作用は生じない。従って、第２のステップにおける発光強度（以下、「第２の発光強度」という。）は、植物組織と易還元物質との作用により発生する活性酸素種の量のみに基づくものとなる。
【００３５】
第３のステップにおいては、第１の発光強度及び第２の発光強度とを比較することにより被検物質の抗酸化性の有無の評価を行う。
【００３６】
植物組織と易還元物質との作用により生じる活性酸素種に起因する発光強度は、被検物質の存在により変化する。被検物質が、活性酸素種を捕捉、消去する抗酸化性を有している物質つまり抗酸化物質である場合、発生する活性酸素種は被検物質によって捕捉、消去される。抗酸化性を有する被検物質を植物組織に吸収させた場合に得られる発光強度は被検物質に未捕捉の活性酸素種の量に基づくため、被検物質を吸収させなかった場合と比べて小さくなる。従って、かかる場合は第１の発光強度は第２の発光強度に比べて小さくなる。
【００３７】
反対に、被検物質が抗酸化能を示さず、活性酸素種の発生を促進するような物質である場合、被検物質を植物組織に吸収させた場合において発生する活性酸素種の量は、吸収させなかった場合と比べて多くなり、活性酸素種に起因して生じる発光強度も大きくなるため、第１の発光強度は第２の発光強度と比べて大きくなる。
【００３８】
従って、本発明の方法によれば、被検物質が抗酸化能を有するか否かは、第１及び第２の発光強度の大小の比較を行うことにより評価が可能である。
【００３９】
第１及び第２の発光強度の比較は、活性酸素種の発生に起因する発光のピークを積分した値により行うことが好ましいが、発光強度は発光測定の開始から所定時間経過した後に有意の差が見られることから、かかる時点における発光強度を比較することによって行うこともできる。発光強度の比較を行う時期は、植物組織として植物の葉を用いる場合は、発光測定の開始から４０〜８０時間経過後であることが好ましく、５０〜７０時間経過後であることがより好ましい。
【００４０】
また、本発明によれば、抗酸化物質のスクリーニングを行うことも可能である。すなわち、まず植物組織に被検物質を吸収させずに易還元物質を吸収させて発光を測定し、得られた発光強度をレファレンス強度とする。次に、複数の被検物質を用い、それぞれの被検物質を植物組織に吸収させた場合における発光強度を測定する。そして、レファレンス強度未満であって、最も小さい発光強度を与えた被検物質を、最も優れた抗酸化物質としてスクリーニングすることができる。
【００４１】
【実施例】
以下、本発明の好適な実施例について更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
［アスコルビン酸の抗酸化能評価］
被検物質として抗酸化物質であるＬ−アスコルビン酸（Ｌ（＋）‐Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ）を用いて以下の試験を行った。
【００４３】
（第１のステップａ）
播種から２ヶ月経過後のタバコの本葉（タバコ：ブライトイエロー４号）を直径４．５ｃｍの円形に切り抜いた後、１００ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸溶液に入れ、３８０ｍｍＨｇで３０秒間保持して葉に溶液を吸収させた。葉表面に付着しているアスコルビン酸溶液を拭き取った後、葉を易還元物質である１００μＭ  メチルビオロジェン（Ｐａｒａｑｕａｔ  Ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ、１，１’−Ｄｉｍｅｔｈｌｙｌ−４，４’ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液が５ｍＬ入っている６０ｍｍφシャーレに、裏面が上になるようにして浮かべ、フォトンカウンタ（ＭＳＰＣ、浜松ホトニクス社製）により発光の測定を行った（測定温度２６±１℃）。
【００４４】
（第２のステップａ）
１００ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸溶液に代えて減菌蒸留水を用いた以外は第１のステップａと同様にして発光の測定を行った。
【００４５】
（対照試験１）
１００ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸溶液に代えて減菌蒸留水、１００μＭメチルビオロジェン溶液に代えて減菌蒸留水を用いた以外は第１のステップａと同様にして発光の測定を行った。
【００４６】
（対照試験２）
１００μＭ  メチルビオロジェン溶液に代えて減菌蒸留水を用いた以外は第１のステップａと同様にして発光の測定を行った。
【００４７】
図１は、被検物質としてアスコルビン酸を用いた場合の発光測定開始からの経過時間と発光強度との関係（「発光測定開始からの経過時間と発光強度との関係」を以下、「発光曲線」という。）を示す図である。図１中の曲線１は、第２のステップａの発光曲線、曲線２は対照試験１の発光曲線、曲線３は第１のステップａの発光曲線、曲線４は対照試験２の発光曲線をそれぞれ示す。
【００４８】
曲線１及び曲線３より、発光測定開始から４８時間経過時点では、第２のステップａで得られた発光強度に対して、第１のステップａで得られた発光強度はほぼ半分であった。これにより、アスコルビン酸はタバコの本葉により発生する活性酸素種を捕捉可能であり、抗酸化性を有していることが判明した。また、第１のステップａに用いた葉は、第２のステップａに用いた葉に比べて枯れの程度が低かったことから、活性酸素種を捕捉することにより葉の枯れを低減できることも判明した。
【００４９】
なお、アスコルビン酸及びメチルビオロジェンの両方の処理を行わなかった対照試験１（曲線２）では発光強度の変化がほとんど見られなかったが、アスコルビン酸の処理のみ行った対照試験２（曲線４）では、発光強度の上昇が見られた。
【００５０】
［エピガロカテキンガレートの抗酸化能評価］
被検物質として抗酸化物質であるエピガロカテキンガレート（（‐）‐Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  Ｇａｌｌａｔｅ：ＥＧＣＧ）を用いて以下の試験を行った。
【００５１】
（第１のステップｂ）
播種から２ヶ月経過後のタバコの本葉（タバコ：ブライトイエロー４号）を直径４．５ｃｍの円形に切り抜いた後、１０ｍＭ  ＥＧＣＧ溶液に入れ、３８０ｍｍＨｇで３０秒間保持して葉に溶液を吸収させた。葉表面に付着しているＥＧＣＧ溶液を拭き取った後、かかる葉を易還元物質である１００μＭメチルビオロジェン溶液が５ｍＬ入っている６０ｍｍφシャーレに、裏面が上になるようにして浮かべ、フォトンカウンタ（ＭＳＰＣ、浜松ホトニクス社製）により発光の測定を行った（測定温度２６±１℃）。
【００５２】
（第２のステップｂ）
１０ｍＭ  ＥＧＣＧ溶液に代えて減菌蒸留水を用いた以外は第１のステップｂと同様にして発光の測定を行った。
【００５３】
（対照試験３）
１０ｍＭ  ＥＧＣＧ溶液に代えて減菌蒸留水、１００μＭメチルビオロジェン溶液に代えて減菌蒸留水を用いた以外は第１のステップｂと同様にして発光の測定を行った。
【００５４】
（対照試験４）
１００μＭメチルビオロジェン溶液に代えて減菌蒸留水を用いた以外は第１のステップｂと同様にして発光の測定を行った。
【００５５】
図２は、被検物質としてＥＧＣＧを用いた場合の発光曲線を示す図である。図２中の曲線１は第２のステップｂの発光曲線、曲線２は対照試験３の発光曲線、曲線３は第１のステップｂの発光曲線、曲線４は対照試験４の発光曲線をそれぞれ示す。
【００５６】
曲線１及び曲線３より、発光測定開始から５８時間経過時点では、第２のステップｂで得られた発光強度に対して、第１のステップｂで得られた発光強度はほぼ３分の１であることが分かった。これにより、ＥＧＣＧはタバコの本葉により発生する活性酸素種を捕捉可能であり、抗酸化性を有していることが判明した。
また、上記「アスコルビン酸の抗酸化能評価」と同様に第１のステップｂに用いた葉は、第２のステップｂに用いた葉に比べて枯れの程度が低かったことから、活性酸素種を捕捉することにより葉の枯れを低減できることも判明した。
【００５７】
なお、ＥＧＣＧ及びメチルビオロジェンの両方の処理を行わなかった対照試験３（曲線２）では発光強度の変化がほとんど見られず、また、ＥＧＣＧの処理のみ行った対照試験４（曲線４）においても発光強度の変化はほとんど見られなかった。
【００５８】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、植物組織により生じる活性酸素種のみを反映した発光強度を得る事ができ、そして、被検物質を植物組織に吸収させた場合に生じる発光強度と、被検物質を植物組織に吸収させなかった場合に生じる発光強度とを比較することにより、かかる被検物質の抗酸化能の評価を正確に行うことが可能となる。そして、活性酸素種の発生源が植物組織であり、かかる植物組織により発生した活性酸素種を用いて抗酸化能の評価を行うことができることから、植物において抗酸化物質が発揮し得る抗酸化能をより反映した評価結果を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】被検物質としてアスコルビン酸を用いた場合の発光曲線である。
【図２】被検物質としてＥＧＣＧを用いた場合の発光曲線である。
【図１】
2004233162.tif 000002
【図２】
2004233162.tif 000003