(57)【要約】【課題】強力なレーザ光源や高感度のカメラを使用しなくても蛍光検出をできるようにする。【解決手段】スライドガラス１の片面に、イオンビームスパッタ堆積法により銀薄膜（厚さ５０ｎｍ）２とＳｉＯ２膜（厚さ１０ｎｍ）７を順に堆積したものを試料溶液の支持基板とする。その支持基板のＳｉＯ２膜７上に蛍光分子５を含む試料溶液３を載せ、その上にカバーガラス８を載せる。銀薄膜２とＳｉＯ２膜７の界面に５９〜６０°の入射角で光を入射させると、その界面で表面プラズモン共鳴が励起されてエバネセント場が増強され、試料溶液３中の蛍光分子５からの効率よく蛍光が発生する。【選択図】　　　図２
2004061211.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光分子を含む試料溶液を基板で支持し、その基板の裏面側から基板と試料溶液との界面で全反射が起こる入射角度範囲で光を入射させ、その界面付近で発生する近接場により励起された蛍光分子から発生した蛍光を検出する蛍光検出方法において、
前記基板として誘電体基材層／金属薄膜層／誘電体被覆層の積層構造を持つものを使用してその誘電体被覆層と試料溶液とを接触させるようにし、かつ前記金属薄膜層と誘電体被覆層の界面で表面プラズモン共鳴を励起する特定の入射角をもって前記光を入射させることを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
蛍光分子を含む試料溶液を支持する基板と、該基板と試料溶液との界面で全反射が起こる入射角度範囲で光を入射させる照明手段と、前記界面付近で発生する近接場により励起された蛍光分子から発生した蛍光を検出する検出手段とを有する蛍光検出装置において、
前記基板は誘電体基材層／金属薄膜層／誘電体被覆層の積層構造を持ち、その誘電体被覆層が試料溶液と接触するようになっており、
かつ前記照明手段は前記金属薄膜層と誘電体被覆層の界面で表面プラズモン共鳴を励起する特定の入射角をもって光が入射させるように設定されていることを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項３】
前記照明手段は励起光源として半導体レーザ又は発光ダイオードを備えている請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記検出手段はＣＣＤ又はフォトダイオードである請求項２又は３に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
請求項２から４のいずれかに記載の蛍光検出装置からなる全反射蛍光顕微鏡。
【請求項６】
請求項２から４のいずれかに記載の蛍光検出装置からなる生体分子検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主に生化学分野において用いられる蛍光検出方法と、そのような蛍光検出方法を利用した全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ：ｔｏｔａｌ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）や生体分子検出装置に関わるものである。
【０００２】
【従来の技術】
全反射蛍光顕微鏡は、観察試料層とガラス（スライドガラス又はカバーガラス）界面で入射光を全反射させることにより界面付近に形成される近接場（エバネセント場）を用いて照明を行う、一種の暗視野照明顕微鏡である。全反射蛍光顕微鏡は、主に生化学分野において、生体分子の蛍光観察の目的に用いられる。
【０００３】
全反射蛍光顕微鏡は、しばしば単一分子の蛍光を観察する目的に使用されるので、高い検出感度を要求される。このため、従来の全反射蛍光顕微鏡では光源として強力なレーザ光源や、検出器として高感度なカメラ（ＩＣＣＤ（イメージ・インテンシファイアＣＣＤ））やＰＭＴ（光電子増倍管）を使用する必要があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
強力なレーザ光源や高感度のカメラは、構成部品として高価で大型であるので、全反射蛍光顕微鏡装置全体としても高価で大型になる。
そこで、本発明は強力なレーザ光源や高感度のカメラを使用しなくても全反射蛍光顕微鏡のような蛍光検出装置や蛍光検出方法を実現できるようにすることを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の蛍光検出方法は、蛍光分子を含む試料溶液を基板で支持し、その基板の裏面側から基板と試料溶液との界面で全反射が起こる入射角度範囲で光を入射させ、その界面付近で発生する近接場光により励起された蛍光分子から発生した蛍光を検出する蛍光検出方法であるが、試料溶液を支持する基板として誘電体基材層／金属薄膜層／誘電体被覆層の積層構造を持つものを使用してその誘電体被覆層と試料溶液とを接触させるようにし、かつ金属薄膜層と誘電体被覆層の界面で表面プラズモン共鳴を励起する特定の入射角をもって前記光を入射させることを特徴としている。
【０００６】
また、この蛍光検出方法を実現する本発明の蛍光検出装置は、蛍光分子を含む試料溶液を支持する基板と、この基板と試料溶液との界面で全反射が起こる入射角度範囲で光を入射させる照明手段と、前記界面付近で発生する近接場光により励起された蛍光分子から発生した蛍光を検出する検出手段とを有し、前記基板は誘電体基材層／金属薄膜層／誘電体被覆層の積層構造を持ち、その誘電体被覆層が試料溶液と接触するようになっており、かつ前記照明手段は金属薄膜層と誘電体被覆層の界面で表面プラズモン共鳴を励起する特定の入射角をもって光が入射させるように設定されていることを特徴とするものである。
【０００７】
表面プラズモン共鳴は、誘電体（真空や気体、液体も含む）に接している金属の表面付近の電子のプラズマ振動（表面プラズモン）が、外部からの入射光の交番電場に共鳴する現象であり、その共鳴効果により表面付近のエバネセント場のエネルギー密度（電界強度の２乗）が、金属薄膜がない場合の１０倍以上に増強される。
【０００８】
基板と試料溶液層との界面に特定の入射角範囲で光を入射し、その界面で表面プラズモン共鳴を励起してエバネセント場を増強することにより、蛍光の発生効率が高まる。その結果、強力なレーザ光源や高感度なカメラを使用しなくても蛍光検出が可能になる。
【０００９】
本発明において、照明手段として強力なレーザ光源などの光出力の大きいものを使用することを除外するものではない。そのような高出力の照明手段を使用すれば蛍光強度が大きくなってより好ましい。しかし、本発明ではエバネセント場を増強して蛍光の発生効率が高められているので、励起光源として半導体レーザや発光ダイオードのような安価な光源を使用することができる。その結果、装置コストを下げることができる。
【００１０】
検出器に関しても同様に、本発明は高感度なカメラを使用することを除外するものではない。そのような高感度な検出器を使用すれば蛍光検出感度が大きくなってより好ましい。しかし、本発明ではエバネセント場を増強して蛍光の発生効率が高められているので、ＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｄｅｖｉｃｅ：電荷結合素子）やフォトダイオードのような安価な検出器を使用することができる。その結果、装置コストを下げることができる。
【００１１】
励起光源として半導体レーザや発光ダイオードを使用し、検出器としてＣＣＤやフォトダイオードを使用すれば、小型の装置を実現することもできる。
【００１２】
本発明の蛍光検出装置は、全反射蛍光顕微鏡や生体分子検出装置に適用するのに適する。励起光、蛍光ともに使用される光の波長範囲は特に限定されるものではなく、紫外、可視、赤外など、蛍光が発生する波長領域であれば全て適用することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
表面プラズモン共鳴を励起するための光学配置のうち、最も一般的で有名なものは、図１に示されるＫｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置と呼ばれるものであり、ガラスなどの誘電体基材層１と、誘電体基材層１より誘電率の小さい第２の誘電体（水溶液や空気など）３が金属の薄膜２を介して接している構造をもっている。９は屈折率整合媒質又はプリズムである。
【００１４】
Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置に光４を入射すると、金属薄膜２がない場合の全反射臨界角より大きい特定の入射角において表面プラズモン共鳴が励起される。表面プラズモン共鳴が励起されると、反射光の強度が急激に減少するので、反射光の強度をモニターすることにより共鳴条件を確認できる。金属薄膜２の材質は一般に銀、金、銅などの高導電率材料が好適であるがこれに限らない。ただし、入射光の波長によっては、金属の電子遷移による吸収が顕著になり表面プラズモン共鳴のエネルギー密度増強効果が小さくなるので、これを避ける必要がある。その点から銀は可視域の広い波長範囲において吸収が小さく、最も好適な材料であるといえる。金属薄膜２の厚さは、通常１０〜１００ｎｍが好適である。
【００１５】
Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置をそのまま全反射蛍光顕微鏡に適用して、カバーガラスやスライドガラスなどの誘電体基材層１上に形成した金属薄膜２に誘電体３である試料溶液を直接接触させた構造で表面プラズモン共鳴を励起することも可能であるが、いくつかの問題をともなう。
【００１６】
１）金属薄膜の化学的不安定性。
銀や銅は、観察前に空気にふれて酸化してしまう。また、溶液試料の種類によっては溶液と反応してしまう。
【００１７】
２）蛍光分子が数ｎｍ以下の距離で金属に近接していると蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）が起こり、蛍光が観測できなくなる。
本発明は、誘電体基材層１の上に設けられた金属薄膜２上に誘電体被覆層を設けて、上記の問題点の解決を図るものである。
【００１８】
（実施例１）
実施例の１つは、図２に示されるように、誘電体基材層としての市販のスライドガラス（ＢＫ７）１の片面に、イオンビームスパッタ堆積法により金属薄膜としての銀薄膜（厚さ５０ｎｍ）２と誘電体被覆層としてのＳｉＯ２膜（厚さ１０ｎｍ）７を順に堆積したものを試料溶液の支持基板として用いるものである。
【００１９】
支持基板のＳｉＯ２膜７上に試料溶液３を載せ、その上にカバーガラス８を載せる。試料溶液３には蛍光分子５が含まれている。
ここで、スライドガラス１とカバーガラス８を入れ替えて、カバーガラス８に銀薄膜２とＳｉＯ２膜７を堆積してもよい。
【００２０】
銀薄膜２及びＳｉＯ２膜７の表面は、観察時に背景光となる入射光の直接散乱光を抑えるために、極力平滑である方が望ましく、具体的には二乗平均粗さで２ｎｍ以下であることが望ましい。このような薄膜を得る方法として、イオンビームスパッタ堆積法は好適であるがこれに限らない。
【００２１】
金属薄膜２としては、銀の代わりに金、銅などの他種金属を用いることも可能である。
ＳｉＯ２膜７の製膜方法は各種の方法が可能であるが、銀薄膜２の酸化を防ぐ目的から銀薄膜作成後、同じ製膜装置内でＳｉＯ２の製膜を行うのが望ましい。また、誘電体被覆層７の材質としては、ＳｉＯ２の代わりに、ＴｉＯ２やＡｌ２Ｏ３などの無機誘電体材料のほか、有機透明誘電体材料を用いることも可能である。
【００２２】
支持基板のＳｉＯ２膜７上に試料溶液３を載せ、その上にカバーガラス８を載せた状態で支持基板の裏面側から基板と試料溶液３との界面で全反射が起こる入射角度範囲で光を入射させると、その界面付近で発生するエバネセント場により励起された蛍光分子５から蛍光６が発生する。
【００２３】
図３には、本実施例のスライドガラス１が屈折率１．３５の試料水溶液３に接している系に波長４８８ｎｍのレーザー光を入射したときの、スライドガラス１の表面でのエネルギー密度の入射角依存性の計算結果（Ａ）と、エネルギー反射率の入射角依存性の計算結果（Ｂ）を示す。入射角はスライドガラス１の表面の法線とのなす角度である。
それぞれの図で、（ａ）はこの実施例のものである。対比のために、銀薄膜がない、通常の全反射照明顕微鏡の計算結果（ｂ）と、ＳｉＯ２膜がないＫｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置での計算結果（ｃ）も示している。実施例を示す（ａ）でも表面プラズモンによるエネルギー密度増強効果は見られるが、エネルギー密度はＳｉＯ２膜がない場合にくらべて小さくなっていることがわかる。
【００２４】
本発明で、「金属薄膜層と誘電体被覆層の界面で表面プラズモン共鳴を励起する特定の入射角」とは、この実施例の場合、図３でエネルギー密度増強効果がみられる５９〜６０°である。
【００２５】
（実施例２）
実施例２は、図４に示されるように、実施例１のＳｉＯ２膜７の厚さを５００ｎｍに変更したものである。
【００２６】
図５には、本実施例でもスライドガラス１が屈折率１．３５の試料水溶液３に接している系に波長４８８ｎｍのレーザー光を入射したときの、スライドガラス１の表面でのエネルギー密度の入射角依存性の計算結果（Ａ）と、エネルギー反射率の入射角依存性の計算結果（Ｂ）を示す。この場合も、それぞれの図で、（ａ）はこの実施例のもののほか、銀薄膜がない、通常の全反射照明顕微鏡の計算結果（ｂ）と、ＳｉＯ２膜がないＫｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置での計算結果（ｃ）も示している。
【００２７】
この実施例の場合、「金属薄膜層と誘電体被覆層の界面で表面プラズモン共鳴を励起する特定の入射角」とは、図５でエネルギー密度増強効果がみられる５２．５°付近である。
【００２８】
ＳｉＯ２膜７の厚さを光の波長程度に大きくすることにより、ＳｉＯ２膜７内で多重反射が起こり、結果として表面でのエネルギー密度はＳｉＯ２膜７がない場合とほぼ同等の値が得られる（図５（Ａ））。このような誘電体被覆層内での多重反射を伴う表面プラズモン共鳴を導波路型表面プラズモン共鳴と呼ぶ。
【００２９】
なお、イオンビームスバッタ堆積法でＳｉＯ２膜を５００ｎｍも堆積するのは時間がかかるので、銀薄膜作成後同じ製膜装置で数十ｎｍ程度ＳｉＯ２膜を堆積して空気中での酸化を防いだあと、大気中でスピンコートを用いたゾルゲル法でＳｉＯ２膜をさらに製膜して、ＳｉＯ２膜の厚さが合計として５００ｎｍになるようにするのが便利である。
【００３０】
上記の実施例では誘電体被覆が単一の材質からなるものであったが、別の実施例として誘電体被覆が複数の材質の層からなるものも可能である。この場合、銀薄膜作成後に同じ製膜装置で第１の誘電体層を堆積したのち別の製膜装置で第２層以降の製膜を行うことができる。
【００３１】
本発明は全反射蛍光顕微鏡のほか、上記実施例の試料溶液支持基板と同様の基板を用いて、液体クロマトグラフィ又は電気泳動装置の検出部として用いることができる、さらに基板表面に特定の生体分子と相互作用する化学基を修飾して生体分子検出装置を構成することもできる。
【００３２】
【発明の効果】
以上のように、本発明では蛍光検出方法において、試料溶液を支持する基板で基板として誘電体基材層／金属薄膜層／誘電体被覆層の積層構造を持つものを使用してその誘電体被覆層と試料溶液とを接触させるようにし、金属薄膜層と誘電体被覆層の界面で表面プラズモン共鳴を励起する特定の入射角をもって光を入射させるようにしたので、エバネセント場を増強することができ、蛍光の発生効率が高まる。
その結果、半導体レーザや発光ダイオードなどの安価で小型の照明手段で装置を構成することができるようになる。また、検出手段もＩＣＣＤやＰＭＴなどの高価なものではなく、通常のＣＣＤやフォトダイオードなどの安価で小型のものを使用することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】代表的な表面プラズモン共鳴の励起方法（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置）を示す要部断面図である。
【図２】第１の実施例を示す要部断面図である。
【図３】同実施例における表面でのエネルギー密度及びエネルギー反射率の入射角依存性を示す図である。
【図４】第２の実施例を示す要部断面図である。
【図５】同実施例における表面でのエネルギー密度及びエネルギー反射率の入射角依存性を示す図である。
【符号の説明】
１　　　スライドガラス
２　　　金属薄膜（銀）
３　　　誘電体（観察試料層）
４　　　入射光
５　　　蛍光分子
６　　　蛍光
７　　　誘電体被覆層（ＳｉＯ２）
８　　　カバーガラス
９　　　屈折率整合媒質又はプリズム
【図１】
2004061211.tif 000003
【図２】
2004061211.tif 000004
【図３】
2004061211.tif 000005
【図４】
2004061211.tif 000006
【図５】
2004061211.tif 000007