(57)【要約】【課題】細胞との親和性に優れ、かつ機械的強度が改良された発毛促進用複合材料を提供すること。【解決手段】繊維状の生体分解吸収性高分子を含有するスポンジ状の生体分解吸収性高分子からなる、発毛促進用複合材料。スポンジ状の生体分解吸収性高分子は好ましくはコラーゲンスポンジである。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維状の生体分解吸収性高分子を含有するスポンジ状の生体分解吸収性高分子からなる、発毛促進用複合材料。
【請求項２】
スポンジ状の生体分解吸収性高分子がコラーゲンスポンジである、請求項１記載の発毛促進用複合材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、毛再生の足場として有用な発毛促進用複合材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体組織工学では、細胞に組織の再生誘導のための環境（場）を構築することが大切である。この場の構築に必要な細胞の増殖および分化のための足場は種々の高分子材料から作製されている。また、これらの足場材料は、種々の細胞の培養基材としても利用できる。この足場材料の条件としては、１）細胞との親和性を有すること、２）生体組織の再生誘導に要する期間、十分な力学的強度が保持できること、３）生体分解吸収性を有し、組織再生の経過を妨げないように再生の進行に応じて速やかに分解消失させうること、４）細胞が入り易く、かつ入り込んだ細胞に対する酸素や栄養の供給を可能にするために多孔質であること、などが要求される。足場材料としては、コラーゲン（細胞外マトリクスの主要成分）が細胞に対する親和性が特に優れているため、これをスポンジ状に加工したものが広く用いられている。
【０００３】
しかし、コラーゲンスポンジは、細胞培養液あるいは体液などが触れたり浸漬されると強度が低下し、長期間マトリクス状の形状を維持することができないことがこれまで欠点となっていた。そこで、このコラーゲンスポンジの持つ力学的強度の問題を解決するために、コラーゲンスポンジを生体吸収性プラスチックで被覆した複合材料（特開平７−２３６６８８）や、生体吸収性材料からなる骨格用高分子材料をスポンジ状等に成形し、その内部にコラーゲンなどのゲルを含ませた医用材料（特開２００１−２０４８０７）等が提案されている。しかし、これらの複合材料は、細胞がコラーゲンに直接接触できないこと、その材料の分解が遅いことなどの短所があり、生体組織の有効な再生誘導の足場としては改良が必要であった。また、細胞との親和性が十分に高くないため、毛再生の足場材料として満足のいく性能が得られなかった。
【０００４】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【０００５】
【特許文献１】
特開平７−２３６６８８
【特許文献２】
特開２００１−２０４８０７
【非特許文献１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞との親和性に優れ、かつ機械的強度が改良された発毛促進用複合材料を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、繊維状の生体分解吸収性高分子を含有するスポンジ状の生体分解吸収性高分子からなる、発毛促進用複合材料を提供する。好ましくは、スポンジ状の生体分解吸収性高分子はコラーゲンスポンジである。本発明の複合材料は、従来のコラーゲンスポンジよりも、細胞浮遊液を加えた時に構造を保持する能力が高いため、発毛などの再生医療における細胞培養および生体組織工学のための足場材料として優れている。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の複合材料は、繊維状の生体分解吸収性高分子を含有するスポンジ状の生体分解吸収性高分子からなることを特徴とする。
【０００８】
本発明において用いるスポンジ状の生体分解吸収性高分子としては、スポンジ状に成形された、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、グルテン、フィブロイン等のタンパク質およびこれらの誘導体；ポリアミノ酸およびこれらの誘導体；キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、デキストラン等の多糖類およびこれらの誘導体；これらの２種以上からなる混合物および複合体等が挙げられる。さらに、天然高分子と合成高分子との複合体も本発明において好ましく用いられる。
【０００９】
スポンジ状とは、細胞の増殖に適した空間を提供することができる多孔質の形状であることを意味する。
【００１０】
本発明の特に好ましい形態においては、スポンジ状の生体分解吸収性高分子はコラーゲンである。本発明において用いるのに好ましいコラーゲンとしては、特に制限はなく、動物の骨や皮等を原料として得られる公知の酸可溶化コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、またはこれら可溶化コラーゲンの化学修飾コラーゲンや、可溶化コラーゲンからコラーゲン繊維を再生させた再生コラーゲン等のコラーゲン溶液を用いることができる。具体的には、例えば、豚皮由来Ｉ型コラーゲン、豚腱由来Ｉ型コラーゲン、牛鼻軟骨由来ＩＩ型コラーゲン、魚から抽出したＩ型コラーゲン等が挙げられる。あるいは、コラーゲンは遺伝子組換え操作により得られるものであってもよく、化学合成により製造されるものであってもよい。
【００１１】
生分解性高分子としては、好ましくはゼラチンが用いられる。ゼラチンは、牛、豚、魚類などを始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの身体のあらゆる部位から採取できるコラーゲン、あるいはコラーゲンとして用いられている物質から、アルカリ加水分解、酸加水分解、および酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。遺伝子組換え型コラーゲンの変性体ゼラチンを用いてもよい。
コラーゲン溶液の濃度としては、特に制限はないが、０．１−４重量％とすることが好ましく、０．３−２重量％とすることがより好ましい。
【００１２】
コラーゲンスポンジはコラーゲン溶液を凍結乾燥することにより容易に形成することができる。スポンジ孔径を変えるためには、凍結温度を変化させるなどの公知の技術を利用することもできる。また、コラーゲンスポンジの孔径を最適な範囲にする目的で、コラーゲン溶液に水と混合しない性質をもつ有機溶媒を添加して凍結乾燥してもよい。このような有機溶媒としては、例えば、クロロホルム、四塩化炭素、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素；酢酸エチル、プロピオン酸エチル等のエステル類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；等が挙げられ、これらは１種類のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。また、コラーゲン溶液に各種の添加剤を加える方法や、凍結乾燥する前にコラーゲン溶液を泡立てる方法等も知られている。
【００１３】
本発明において用いる繊維状の生体分解吸収性高分子としては、生体分解吸収性を有する天然または合成の高分子を用いることができ、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリ−β−リンゴ酸、ポリオルソエステル、ポリジアミノホスファゼンおよびこれらの共重合体等が挙げられる。これらの中でも特に、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ−ε−カプロラクトン、あるいはこれらの共重合体が好ましい。生体分解吸収性高分子は１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１４】
本発明にしたがって、スポンジ状の生体分解吸収性高分子に繊維状の生体分解吸収性高分子を含有させることにより、優れた細胞との親和性を保持すると同時に、十分な力学的強度を得ることができる。繊維は長繊維であっても短繊維であってもよく、不織布を適宜ほぐしたものであってもよい。繊維の径は、特に限定されないが、１−１００μｍ径のものを好ましく用いることができる。繊維状生体分解吸収性高分子の含有量は、繊維状生体分解吸収性高分子／スポンジ状生体分解吸収性高分子の重量比が０．２−１０．０となるようにすることが好ましい。前記スポンジ状の生体分解吸収性高分子としてコラーゲンを用いる場合、繊維状生体分解吸収性高分子は前記コラーゲン溶液（前記有機溶媒、各種添加剤の添加前）に対して０．０１−１０重量％とすることが好ましく、０．４−１重量％とすることがより好ましい。
【００１５】
繊維状の生体分解吸収性高分子を含有するスポンジ状の生体分解吸収性高分子は、凍結乾燥させた後、架橋処理を施すことにより、さらに力学的強度を高めることができる。架橋の程度を調節することにより、スポンジ状の生体分解吸収性高分子の生分解の速度を制御することができる。架橋処理の方法には、特に制限はなく、例えば、化学架橋法、真空下での熱脱水架橋法、紫外線、ガンマ線、電子線等の照射による架橋法を用いることができる。また、これらの方法を組み合わせて用いることもできる。例えば、化学架橋を行う場合には、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、カルボニルイミダゾール、ジエポキシ化合物、ジ酸無水物、エピクロルヒドリン等の架橋剤を用いることができる。真空下で熱脱水架橋させる場合には、例えば、架橋温度１００−１７０℃で２−１２０時間行うことができる。
【００１６】
このようにして得られる本発明の発毛促進用複合材料は、生体分解吸収性高分子からなる架橋された多孔性スポンジの中に、繊維状の生体分解吸収性高分子がランダムに埋入された構造を有している。すなわち、スポンジ実質は細胞親和性の高いコラーゲンであり、それを力学的に補強するために繊維が組み込まれている。このため、細胞との親和性に優れ、皮膚組織の再生および発毛に必要な期間十分な力学的強度を保持するスポンジが得られる。さらに、このスポンジは、発毛促進に負の効果を与えることなく、時間とともに生体内で分解吸収されることができる。したがって、発毛の足場材料として有用である。
【００１７】
以下の実施例に示されるように、本発明の発毛促進用複合材料と従来のコラーゲンスポンジとを用いて発毛実験を行ったところ、従来のコラーゲンスポンジでは、表皮嚢胞および異所性毛がしばしば形成され、正常な毛再生が妨害されるのに対し、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）繊維で補強したコラーゲンスポンジを用いた場合には、移植部位において正常な毛成長が認められ、発毛本数も有意に多かった。これは、コラーゲンは機械的強度が高くないため、孔構造サイズが縮小し、細胞の移動を阻害するとともに細胞懸濁液の漏洩が生じ、このことにより表皮嚢胞および異所性毛形成が生ずるためであると考えられる。これに対し、本発明にしたがってＰＧＡ繊維を取り込ませたコラーゲンスポンジは、機械的に補強されるため、細胞播種の際にスポンジ中の孔構造のサイズを維持することができる。このため、異所性毛形成はほとんど観察されず、表皮嚢包の形成が抑制され、毛包が正常に再生することができる場を与えることができたと考えられる。したがって、本発明の発毛促進用複合材料は、発毛等の再生医療において足場材料として有用である。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
培養細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび無胸腺ヌードマウスＢＡＬＡ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕはクレアジャパン社から購入した。妊娠１６−１７日のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの子宮から胎児マウスを取り出し、ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で洗浄した。この時点で胎児マウスから単離した皮膚細胞は、毛再生アッセイにおいて毛包を形成する能力を保持している。胎児の背中皮膚をハサミで採取し、摂子で皮膚を皮下組織から分離した。皮膚は０．０５％コラゲナーゼＩＶを加えたＫＧＭ−２（クロネティック社より購入）中で４℃で１６時間おいた後、表皮と真皮に分離した。表皮はＫＧＭ−２中で、真皮はインスリン、表皮細胞増殖因子、牛脳下垂体抽出液を添加しないＫＧＭ−２中で、それぞれピペティングにより細胞を解離させた。解離させた細胞をそれぞれ７０μｍのナイロンフィルターを通して濾過し、細胞数を測定した。表皮と真皮より得られた細胞を合わせて約１ｘ１０７個となるように調製し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、約６０μｌのＫＧＭ−２による浮遊液とした。細胞は使用するまで氷上に保存した。
【００１９】
コラーゲンスポンジの調製
ＰＧＡ繊維を有するものと有しないものとの２種類のコラーゲンスポンジを調製した。３ｍｇ／ｍｌのコラーゲン溶液（新田ゼラチン社製）を直径２０μｍのポリグリコール酸（ＰＧＡ）繊維（グンゼ社製）が配置された鋳型の中に流し込み、次に凍結乾燥して、乾燥重量比でＰＧＡ繊維１．３３ｗｔ％／コラーゲンのポリグリコール酸繊維含有コラーゲンスポンジ（ＰＧＡ（＋））を得た。これを１４０℃で１２時間熱脱水架橋した。ＰＧＡ繊維を含まないコラーゲンスポンジは、コラーゲン溶液のみを用いて同様に調製した（ＰＧＡ（−））。次に、これらのコラーゲンスポンジをガス滅菌した。ポリグリコール酸繊維含有コラーゲンスポンジはコラーゲンスポンジと比べて若干疎水性であるため、使用直前に７０％エタノールで１度洗浄し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）とＫＧＭ−２で１回ずつ洗浄した。
【００２０】
シリコンチェンバーの挿入
無胸腺ヌードマウス（ＢＡＬＡ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ）の背面に滅菌シリコンチャンバを移植して、隣接皮膚からの細胞の移動を防止した（図１）。８週齢の無胸腺ヌードマウス（ＢＡＬＡ／ｃＡ  Ｊｃｌ−ｎｕ  日本クレアより購入）に対し、体重１ｇ当たり０．０２ｍｌの１３％ペントバルビタール（大日本製薬）を腹膜腔内に注射して麻酔した後、背中に筋膜直上までの直径１ｃｍの傷を作製した。上下１対のシリコンチェンバーのうち、下方用を皮膚と胸壁の間に挿入し、ナイロン糸で縫合し、固定した。次に、直径１ｃｍ、厚さ３ｍｍのコラーゲンスポンジをチェンバー内に装着し、先に調製した細胞浮遊液をスポンジの上に均一に滴下した。培養液の乾燥を防ぐために上方用のチェンバーをかぶせた。移植の１週間後に上方用のチェンバーを取り除き、１０−１２日後に下方用のチェンバーを取り除いた。
【００２１】
移植後最初の１０日間は毎日、その後は１日おきに３−４週間まで、移植片を観察した。３−４週経過した後、発毛した毛をすべて剃毛して本数を計測した。発毛した面積も計測して、発毛の密度を比較した（各群につき３匹ずつ）。発毛した皮膚を組織学的に検討するために１０％ホルマリン液（和光純薬）中に室温で２時間放置し、パラフィン包埋を行い、８μｍの厚さの切片を作製して、ヘマトキシリン＆エオジン染色を行った。
【００２２】
移植部位の肉眼的観察所見
コラーゲンＰＧＡ（−）スポンジおよびＰＧＡ（＋）スポンジが毛の形成に及ぼす影響を調べるために、通常は毛再生が完了する３−４週間まで、移植部位の外観を観察した。ＰＧＡ（−）スポンジの移植皮膚においては、１週間以内に毛包が観察された。しかし、図２Ａおよび２Ｂに示されるように、毛の成長は遅く、まばらであった。固定した移植部位のサイズは、元のスポンジのサイズを越えて広がっていた（図２Ａ）。さらに、異所性毛成長が移植部位のまわりの皮膚の下で肉眼で見られた（図２Ｃ）。
【００２３】
これに対し、移植片をＰＧＡ（＋）スポンジ上に適用した場合，毛の形成は、ＰＧＡ（−）スポンジよりやや遅く移植の１０−１２日後に誘導された。しかし、ＰＧＡ（＋）スポンジ上の毛は、ＰＧＡ（−）スポンジ上の毛と比較して、非常に太く、一様に正常に成長していた（図２Ｃおよび２Ｄ）。ＰＧＡ（＋）スポンジ上の移植部位のサイズおよび形状は、元のスポンジのサイズから変化しなかった。異所性毛成長はほとんど認められなかった（図２Ｅ）。
【００２４】
各移植片上の毛密度を定量的に分析したところ、ＰＧＡ（−）およびＰＧＡ（＋）スポンジ上の平均毛成長密度は、それぞれ３００および２５００本／ｃｍ２であった（図４）。このことは、毛成長にはＰＧＡ（＋）スポンジがより有利であることを示す。
【００２５】
組織学的所見
次に，移植片を組織学的に調べた。皮膚の基本構造，すなわち、表皮および真皮は再生されていたが，ＰＧＡ（−）スポンジのすべての移植部位は真皮中に表皮嚢胞を含み、皮下で異所性毛形成が認められた（図３Ａ、図５）。毛が皮膚の外に生えた場合であっても、配列はやや乱れていた。場合によっては、正常な毛形成が完全に妨害されるほど多くの表皮嚢胞が形成された（図３Ｂ）。ＰＧＡ（＋）スポンジの場合には，表皮嚢胞はほとんど観察されず、異所性毛形成はＰＧＡ（−）の場合よりはるかに少なかった（図３Ｃおよび３Ｄ）。さらに、ＰＧＡ（＋）スポンジ上では，毛配列は規則正しく頭から尾に傾斜して配列していた。皮脂腺は正常に生成していた。すなわち，このアッセイにおいて、ＰＧＡ（＋）コラーゲンスポンジは足場として正常な毛形成および生長を妨害しなかった。
【００２６】
以上の結果から、慣用のコラーゲンスポンジでは、表皮嚢胞および異所性毛がしばしば形成され、正常な毛再生が妨害されるのに対し、ＰＧＡ繊維で補強した本発明のコラーゲンスポンジを用いた場合には、前述のような現象は認められず、移植部位において正常な毛成長が認められることが示された。また、移植部位のサイズ変化も見られず、細胞親和性および力学特性ともに優れた毛再生のための足場材料であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、毛再生実験において用いたチャンバーの図解である。
【図２】図２は、移植片上の発毛を示す。
【図３】図３は、移植片の切片のヘマトキシリンおよびエオジン染色を示す。
【図４】図４は、移植部位における発毛密度を示すグラフである。
【図５】図５は、移植部位において生成した表皮嚢胞の数を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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