(57)【要約】【課題】動物細胞の分化誘導を的確に行う手段の提供。【解決手段】動物細胞の適切な生育フェーズのみにおいて、該細胞をサイトカインと接触させる、細胞の分化誘導方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を発育させる過程で、該細胞と作用剤との接触を介することによる該細胞の分化誘導方法であって、
該細胞と作用剤との接触が、該細胞の  ｉ）第一発育段階、ｉｉ）第二発育段階、ｉｉｉ）第三発育段階前期、ｉｖ）第三発育段階後期、ｖ）第四発育段階前期およびｖｉ）第四発育段階後期からなる発育フェーズの最大で４つのフェーズにおいて実施され、そして
該作用剤が該細胞を少なくとも２つの方向への細胞の分化を促進および／または抑制しうる物質であることを特徴とする細胞の分化誘導方法。
【請求項２】
多能性幹細胞が、骨髄間質細胞である請求項１記載の細胞の分化誘導方法。
【請求項３】
骨髄間質細胞が、温度感受性ＳＶ−４０  Ｔ抗原遺伝子を担持するトランスジェニックマウス由来である請求項２記載の細胞の分化誘導方法。
【請求項４】
細胞の分化が、少なくとも平滑筋細胞、骨形成細胞および脂肪細胞のいずれか２つの分化細胞に向かう請求項１または２記載の細胞の誘導方法。
【請求項５】
作用剤が、細胞の分化の促進または抑制をもたらしうるサイトカインである請求項１〜３のいずれかの一つに記載の細胞の誘導方法。
【請求項６】
サイトカインが、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、骨形成因子−２（ＢＭＰ−２）、骨形成因子−４（ＢＭＰ−４）、グロース・ディファレンシエーション・ファクター５（ＧＤＦ−５）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β２）からなる群より選ばれる請求項４記載の細胞の誘導方法。
【請求項７】
多能性幹細胞を発育させる過程で、該細胞と作用剤との接触を介することによる該細胞の分化誘導方法を用いる作用剤についての細胞分化の促進または抑制能の評価方法であって、
該細胞と作用剤との接触が、該細胞の  ｉ）第一発育段階、ｉｉ）第二発育段階、ｉｉｉ）第三発育段階前期、ｉｖ）第三発育段階後期、ｖ）第四発育段階前期およびｖｉ）第四発育段階後期からなる発育フェーズの最大で４つのフェーズにおいて実施され、そして
該作用剤が該細胞を少なくとも２つの方向への細胞の分化を促進および／または抑制することが期待される候補作用物質であることを特徴とする評価方法。
【請求項８】
多能性幹細胞が、温度感受性ＳＶ−４０  Ｔ抗原遺伝子を担持するトランスジェニックマウス由来である請求項７記載の評価方法。
【請求項９】
候補作用剤による該細胞の分化の程度が、多能性幹細胞を発育させる過程で該細胞が該細胞の分化の促進または抑制をもたらしうるサイトカインと接触されてもたらされる分化の程度と比較される請求項７または８記載の評価方法。
【請求項１０】
サイトカインが、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、骨形成因子−２（ＢＭＰ−２）、骨形成因子−４（ＢＭＰ−４）、グロース・ディファレンシエーション・ファクター５（ＧＤＦ−５）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β２）からなる群より選ばれる請求項９記載の評価方法。
【請求項１１】
請求項１、２および４〜６のいずれかの一つに記載の細胞の誘導方法により誘導された細胞を主体とする再生医療用調製物。
【請求項１２】
細胞が哺乳動物由来である請求項１１記載の調製物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は動物細胞の培養、より具体的には、多能性幹細胞の培養による分化誘導方法および該誘導方法を用いるある物質の該細胞に対する分化能の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
再生医療に利用しうる技術の開発または基本的な知見の収集を目差し、動物細胞の増殖・分化の促進や抑制について精力的な研究が行われている。このような増殖・分化の重要な制御因子として、サイトカインの各種細胞への作用も調べられている。こうして、サイトカイン機能の多様性（サイトカインは同一のレセプターを介して細胞ごとに異なる作用を示す。例えば、Ｂ細胞活性化因子としてクローニングされたＩＬ−６は、Ｂ細胞のみならず肝細胞、神経細胞、血液幹細胞などに幅広く作用し、プラズマ細胞の増殖を強く促進するが、Ｍ１マクロファージ細胞に作用すると増殖を抑制し分化を促進する。）、並びにサイトカイン機能の重複（異なるサイトカインのレセプターが同一のシグナル伝達サブユニットを共有することで、同じシグナル伝達経路を活性化して同じ作用を示す。）ことも周知である（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
また、血液細胞系以外でも、温度感受性ＳＶ−４０  Ｔ抗原遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから樹立された、筋形成性、骨形成性および脂肪生成性分化を示す、骨髄間質細胞（ＴＢＲ細胞系統）のある株（ＴＢＲＢ）はオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）により骨格筋への分化が刺激され、他のある株（ＴＢＲ３１−２）は、ＯＳＭにより骨形成性分化が刺激されるが、脂肪生成性分化は抑制されることが確認されている（非特許文献２参照。）。なお、ＴＢＲ細胞株の一般的な作製方法および具体的な株についての詳細も公表されている（例えば、特許文献１、ならびに非特許文献３および４参照。）。非特許文献３および４には、ＴＢＲ細胞株はＴ抗原の不活化や増殖条件に応じて表現型変化を示し、脂肪前駆細胞が脂肪細胞および骨形成性細胞に誘導され、いくつかの脂肪前駆細胞および内皮細胞株は筋細胞および脂肪細胞に誘導される、ことも記載されている。このような性質からＴＢＲ細胞は多能性間葉系幹細胞由来であることが示唆されている。また、間葉系幹細胞から、骨細胞、軟骨細胞、腱細胞、靭帯細胞、骨格筋細胞、脂肪細胞、間質細胞等へ誘導できることも知られている（非特許文献５参照。）。
【０００４】
さらに、心筋細胞への分化能を有する骨髄由来の細胞が５−アザシチジン等のＤＮＡの脱メチル化剤の投与により、確率的（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）に心筋細胞、脂肪細胞および骨格筋細胞の系列に分化され、さらにＦＧＦ−８、ＥＴ１、Ｍｉｄｋｉｎｅ、ＢＭＰ４の４種類のうち少なくとも一種のサイトカインと５−アザシチジンとを組み合わせて添加することで心筋特異的な遺伝子の発現を促進できることが示唆されている（例えば、特許文献２参照。）。また、特許文献２には、こうして得られる細胞を用いて該細胞を増殖する因子をスクリーニングする方法も記載されている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平５−２９２９５８号公報
【０００６】
【特許文献２】
国際公開第０１／４８１５１号パンフレット、特に４頁２−１１行、５３頁−５５頁
【０００７】
【非特許文献１】
イラスト医学＆サイエンスシリーズ「サイトカインの機能を探る」１９９８、１２、１０、第１刷発行、株式会社  羊土社、１２−１９頁
【０００８】
【非特許文献２】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．−Ａｎｉｍａｌ  ３７：６９８−７０４（２００１）、要約部
【０００９】
【非特許文献３】
Ｊ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １６４：５５−６４（１９９５）
【００１０】
【非特許文献４】
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１８、４２４−４２９（１９９５）
【００１１】
【非特許文献５】
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４、１４３−１４７（１９９９）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べたとおり、当該技術分野では、ＥＳ細胞だけでなく、ある一定の骨髄由来の細胞（造血幹細胞を除く。）が多分化能を有し、特定の分化形質を発現し、機能的な細胞、さらには組織や器官になることが知られており、そしてサイトカインの使用により分化の方向性（新しい分化形質の発現性）を調節できることも示唆されている。しかしながら、分化の方向性をさらに的確に調節し得る手段が提供できることが望ましいであろう。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、多能性幹細胞の分化の方向性および分化の程度にサイトカインが及ぼす影響について、緻密に検討してきたところ、上述したようなサイトカイン機能の多様性は、異なる細胞間だけでなく、同系統細胞の異なる特定の生育フェーズにおいても観察されることを見出した。本発明はこのような知見に基いて完成されたものである。
【００１４】
したがって、本発明によれば、多能性幹細胞を発育させる過程で該細胞と作用剤との接触を介することによる該細胞の分化誘導方法であって、
該細胞と作用剤との接触が、該細胞の  ｉ）第一発育段階、ｉｉ）第二発育段階、ｉｉｉ）第三発育段階前期、ｉｖ）第三発育段階後期、ｖ）第四発育段階前期およびｖｉ）第四発育段階後期からなる発育フェーズの最大で４つのフェーズにおいて実施され、そして該作用剤が該細胞を少なくとも２つの方向への細胞の分化を促進および／または抑制しうる物質であることを特徴とする細胞の分化誘導方法が提供される。
【００１５】
また、別の態様の本発明として、前記細胞の分化誘導方法を用いる候補作用剤についての細胞分化の促進または抑制能の評価方法であって、該候補作用剤（もしくは被検物質）が多能性幹細胞の前記発育フェーズの最大４つのフェーズにおいて、該細胞と接触されることを特徴とする評価方法が提供される。このような評価方法は、限定されるものでないが、多能性幹細胞の増殖および／または分化を調節しうる後述するサイトカインと同様もしくは向上した物質（ペプチド性もしくは非ペプチド性）のスクリーニングに用いることができる。
【００１６】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１７】
本発明で用いることのできる多能性幹細胞は、本発明の目的に沿うものであれば、ＥＳ細胞を初めとし、いずれかの作用剤より、生来の細胞から、２以上の新しい分化形質が発現し、機能的な細胞または組織や器官になりうる細胞であれば、骨髄、脳、肝臓、その他の臓器から単離できた細胞、さらには該細胞の初代培養細胞、継代培養細胞、不死化細胞のいずれであってもよい。しかし、好ましくは、骨髄由来の間葉系細胞である幹細胞を用いることができる。また、単離または樹立された細胞株であって、予備的に骨髄間質細胞とか、間葉系幹細胞と称されているものであっても、本発明の目的に沿う限り、本発明にいう多能性幹細胞に包含される。したがって、上記の非特許文献３〜４に記載の多能性を示す細胞がより具体的なものとして挙げられる。また、これらに記載の細胞と分化の方向性、分化される程度等について同等の特性をもっていれば、細胞の起源を問うことなく使用でき、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト等の哺乳動物由来の細胞であることができる。限定されるものでないが、本発明の作用、効果を確認する上で、都合のよい多能性幹細胞としては、前述の非特許文献３または４に記載されているような、温度感受性ＳＶ−４０  Ｔ抗原遺伝子のトランスジェニックマウスから樹立されたＴＢＲ株（または系）と称されているものが挙げられる。なお、これらの非特許文献３および４は、共著者として、本発明者の一人である帯刀益夫博士が含まれているとおり、上記のＴＢＲ株の特定の株、例えばＴＢＲ３１−２、同１０−１等は、仙台市青葉区星陵町４−１  東北大学  加齢医学研究所から、試験、研究の目的に使用することを前提に、制限なく分譲される。
【００１８】
このような多能性幹細胞を発育させる過程は、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、エクス・ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）およびイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のいずれの発育過程であることができるが、殊に、前二者における発育過程が注視されている。このような発育過程は、細胞の人工的な培養における細胞の各種発育段階（または発育フェーズ）を包含し、具体的には以下の段階からなる。
【００１９】
ｉ）  第一発育段階：若い未熟な、細胞の突起を盛んに伸長させており、かつ増殖段階に入っていない細胞が観察される；
ｉｉ）  第二発育段階：細胞数が増大する直前の段階にあり、且つ細胞の突起を盛んに伸長させ、隣接する細胞の突起同士の接触が起こる直前〜直後にあり、細胞体積の膨張が最大になった細胞が観察される；
ｉｉｉ）  第三発育段階前期：対数増殖的な発育が開始され、隣接する細胞の突起同士の接触が９０％以上起こった状態にある細胞から、細胞本体同士が完全に接触して増殖する面積がない状態を１００とした時に、細胞の密度が６０％に達した状態にある細胞、すなわち６０％コンフルエントの状態になった細胞が観察される；
ｉｖ）  第三発育段階後期：対数増殖的に活発に増殖している６０％コンフルエント状態の細胞から増殖がとまりつつある１００コンフルエント状態に向かっている細胞であり、かつ成熟した細胞に向かいつつある細胞が観察される；
ｖ）  第四発育段階前期：１００％コンフルエント状態にある細胞が、まだわずかに増殖を行っており、増殖停止直前の細胞が観察される；および
ｖｉ）  第四発育段階後期：細胞の増殖段階を終えた成熟した細胞が観察される。
【００２０】
図−２および図−３も参照されたい。
【００２１】
従来の技術によれば、サイトカインが用いられる場合には、細胞の培養は培養の全期間を通じてサイトカインを含む培地で行われるので、細胞は培養初期から培養終了時まで連続してサイトカインと接触（もしくは曝露）されるが、本発明では、上記の  ｉ）〜ｖｉ）の発育フェーズのうち、最大で４つのフェーズにおいて細胞が、少なくとも２つの方向への該細胞の分化を促進および／または抑制しうる物質（好ましくはいずれかのサイトカインである。）と接触されることが重要である。このような接触を行うか否かは、細胞を発育させる過程、典型的には細胞の培養中、例えば２〜４日毎に培地の交換が行われるが、この交換培地に前記物質を存在させるか存在させないかによって、容易に行うことができる。最大で４つのフェーズは、例えば、ｉｉｉ）第三発育段階前期とｉｖ）第三発育段階後期と  ｖ）第四発育段階前期とｖｉ）第四発育段階後期、等からなることができるが、ｉ）第一発育段階とｉｉ）第二発育段階とｉｉｉ）第三発育段階前期、等の３つのフェーズ、ｉ）第一発育段階とｉｉ）第二発育段階、ｉｖ）第三発育段階後期と  ｖ）第四発育段階、等の２つのフェーズ、さらには、前記６つのフェーズのいずれか一つのフェーズをも包含する。
【００２２】
本発明に従えば、このようないずれかのフェーズにおける培地中に、生育されている細胞に分化誘導を行いうる濃度で、好ましくは、いずれかのサイトカインが加えられる。このようなサイトカインとしては、限定されるものでないが、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、骨形成因子−２（ＢＭＰ−２）、骨形成因子−４（ＢＭＰ−４）、グロース・ディファレンシエーション・ファクター５（ＧＤＦ−５）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β２）を挙げることができる。
【００２３】
例えば、非特許文献２によれば、前記のＴＢＲ３１−２の全培養期間（前記のｉ）〜ｖｉ）の発育フェーズ）を通じて該細胞株を連続してＯＳＭと接触させた場合には、上述のごとく、骨形成性分化が刺激（または骨形成細胞への分化誘導が促進）される。しかし、脂肪生成性分化は抑制（または脂肪細胞への分化誘導は抑制）される。これに対し、本発明によれば、ＯＳＭを前記のｉｖ）〜ｖｉ）の発育フェーズのみならず前記のｖｉ）の発育フェーズのみにおいて存在させたときですらＴＢＲ３１−２から脂肪細胞への分化誘導は抑制される。さらに重要な知見は、非特許文献２に記載のごとく、ＴＢＲ３１−２を、前記の  ｉ）〜ｖｉ）の発育フェーズを通じてＯＳＭの存在下で培養すると、平滑筋への分化誘導は抑制されるのに対し、逆に、ｉ）〜ｉｉｉ）の発育フェーズ、またはｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖ）の発育フェーズのいずれか一つの発育フェーズにおいてＯＳＭの存在下でＴＢＲ３１−２を培養すると平滑筋への分化誘導は促進されることである。
【００２４】
すなわち、多能性幹細胞の発育系において、該細胞に対するサイトカインの作用を評価しようとする場合には、該細胞とサイトカインの接触のタイミングによって分化誘導の方向性が逆になることがあるのである。かくして、多能性幹細胞に対するサイトカイン等の作用剤の作用を的確に確認するためには、前記のｉ）〜ｖｉ）の６つの発育フェーズにおけるいずれか適当な１〜４の発育フェーズにおいて、該作用剤の作用を確認することが好ましい。
【００２５】
それ故、本発明に従う、多能性幹細胞の分化誘導方法を、該細胞に対する各種候補作用剤（または被検物質）の評価に応用すると、かような作用剤の的確な分化誘導能についての評価が可能になる。このような、評価方法においては、培養が容易で、培養結果の評価を容易に行うことのできる、温度感受性ＳＶ−４０  Ｔ抗原遺伝子を担持するトランスジェニックマウス由来の骨髄間質細胞（ＴＢＲ系細胞）を用いることが便宜である。このような評価方法の好ましく、またはより具体的な態様は、次のように記載することもできる。
【００２６】
Ａ）  ＴＢＲ系細胞をそれらの栄養培地で生育させる際に、生育過程もしくは培養における該細胞の  ｉ）第一発育段階、ｉｉ）第二発育段階、ｉｉｉ）第三発育段階前期、ｉｖ）第三発育段階後期、ｖ）第四発育段階前期およびｖｉ）第四発育段階後期からなる発育フェーズの最大で４つのフェーズにおいて、適当な濃度の被検物質の存在下で培養し、
Ｂ）  培養細胞がいずれかの分化形質を有する細胞に転換するか否か（または培養細胞に分化誘導が生じたか否か）を検出し、
Ｃ）  検出の結果に基づいて、被検物質が多能性幹細胞に対する分化誘導能または細胞の分化の促進もしくは抑制作用を有するか否かを判断する、
ことを特徴とする評価方法。
【００２７】
このような評価方法では、比較またはポジティブ対照として、被検物質を含まず、骨形成因子−２（ＢＭＰ−２）、骨形成因子−４（ＢＭＰ−４）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、グロース・ディファレンシエーション・ファクター（ＧＤＦ−５）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β２）からなる群より選ばれるサイトカインの存在下で上記の培養を行った結果と比較する工程を含めることにより、被検物質の多能性幹細胞に対する作用を、より具体的に評価することができる。
【００２８】
以上の分化誘導方法および評価方法では、ＴＢＲ系細胞株を初めとする動物細胞を培養することのできる、それ自体公知の培養条件をそのまま、あるいは改良して用いることができる。例えば、培地としては、基本的には、必須栄養源が添加してあり、アミノ酸では、動物（哺乳類）が合成できない必須アミノ酸のＬ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミンを基本として加えてあり、場合によっては生育を良くする目的で、非必須アミノ酸のＬ−グリシン、Ｌ−セリンも添加したものであれば、どのような培地でも利用できる。培養温度、等のその他の条件は、温度条件など、そのほかに、ＣＯ２インキュベーター中の気相のＣＯ２と共同して培地のｐＨを安定化させるために添加するバッファー剤として、細胞が炭酸水素イオンを必要とすることから、一般的には炭酸水素系の重炭酸ナトリウム溶液を加えるか、さらにＨＥＰＥＳなど添加して、ＣＯ２インキュベーターから外に取り出してもｐＨが安定に保てるように工夫してよい。また、適宜、雑菌の汚染を防ぐために、抗生物質を加えてもよい。本発明に従えば、培地から必要に応じて、血清その他の作用剤を除去し、サイトカインが添加される。他方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  では、生理学的または使用するサイトカインに悪影響を及ぼさない媒体中にサイトカインを含有せしめた形態が採用できる。かような媒体の例としては、限定されるものでないが、無菌水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水であることができる。
【００２９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  および  ｅｘ  ｖｉｖｏ  で使用する場合の各サイトカインの使用量は、後述する実施例における使用量を参照して、必要があれば、さらに小実験を行って最適量を決定すればよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ  で使用する場合は通常０．１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの用量であることができる。他方、培養温度は、３３℃〜３７℃であることができる。
【００３０】
また、分化誘導の生じた細胞の同定方法は、それ自体既知の方法によることができ、具体例としては後述する実施例に記載の方法によればよい。
【００３１】
さらなる別の態様の本発明として、前記の分化誘導方法により得られた分化細胞を主体とする再生医療用調製物も提供できる。こうして、本発明によれば、心臓、毛細血管、動脈及び静脈などの血管系の臓器、胃、食道、結腸、直腸、小腸、大腸などの消化器系の臓器、手足の筋肉、気管、子宮、膣や脂肪組織などの再生医療に利用できる手段が提供できる。
【００３２】
また、上記の評価方法によれば、各分化の程度を制御できる作用剤のスクリーニング系を構築できる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでない。
（１）：分化誘導された細胞または分化細胞の同定または検出
（１−１）  平滑筋細胞については、６０ｍｍプラスチックディッシュに培養した細胞集団のなかに顕微鏡学的に単核で紡錘形（ｓｐｉｎｄｌｅ  ｓｈａｐｅ）を示す細胞を観察し、その培養細胞集団から抽出した蛋白質混合物から平滑筋細胞に特異的に発現するミオシン軽鎖キナーゼ（ｓｍ−ＭＬＣＫ）またはα−アクチン（α−ｓｍ−Ａｃｔｉｎ）を検出するために、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって蛋白質を分離し、分離したゲル上の蛋白質をメンブレンに転写し（ＷＢ法）、メンブレン上のｓｍ−ＭＬＣＫに特異的に反応する一次抗体（Ｓｉｇｍａ  製、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−Ｍｙｏｓｉｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ、  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ，ｃｌｏｎｅ  Ｋ３６，ＰｒｏｄｕｃｔＮｏ．Ｍ７９０５）またはα  ｓｍ−Ａｃｔｉｎに特異的に反応する一次抗体（Ｓｉｇｍａ  製、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−α  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ａｃｔｉｎ，  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ  ｉｓｏｔｙｐｅ，  ｃｌｏｎｅ  １Ａ４，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ａ２５４７）とそれを検出するための  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）で標識した二次抗体（ＩＣＮ製、Ｇｏａｔ、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ′）２，ＩｇＧ、カタログＮｏ．５５５５３）を使用することによって同定した。
（１−２）  培養ディッシュ中の細胞核の観察は培養液の除去後、濃度１μｇ／ｍｌに調製した染色液ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加し、染色液との反応処理を室温で５分間行い、染色液を除去しリン酸バッファ緩衝液（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。ＰＢＳによる洗浄処理は各々５分間、３回行った。
（１−３）  骨化細胞については、骨芽細胞にはアルカリホスファターゼ（以下ＡＬＰ）が比較的高濃度に存在し、さらにヒドロキシアパアイトの形をとったカルシウムが沈着していることが知られているので、前者のＡＬＰ染色法、及び後者のコッサ反応によって骨化細胞を同定した。このＨＲＰ標識の二次抗体の検出は化学発光検出試薬（アマシャム製、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  ウェスタンブロッティング検出キットによる化学発光をＸ線フィルム（コダック製、ＸＡＲ−５）で行った。まずＡＬＰ法について、６０ｍｍプラスチック培養ディッシュ中の培養液を除去しディッシュ底に付着した細胞をＰＢＳで３分間づつ３回洗浄した後、７０％冷エタノール溶液を用いて、氷上で１０分間静置して固定し、次いで蒸留水で３回洗浄した後に、表−１に示したＡＬＰ反応液を注加し３７℃下で４時間静置した。
【００３４】
【表１】
2004298087.tif 000002
【００３５】
この間、顕微鏡でピンク色に細胞が染色されているかの観察を適宜行った。蒸留水で３回洗浄した後、マイヤーのヘマトキシリン溶液（和光純薬工業株式会社製  病理研究用Ｎｏ．１３１−０９６６５）を注加し、室温に５分間放置して核染色を行った。軽く水洗いし、ぬるま湯に漬けて色だしを行った。最後に蒸留水で３回洗浄した。コッサ反応について、６０ｍｍプラスチック培養ディッシュ中の培養液を除去しディッシュ底に付着した細胞をＰＢＳで３分間づつ３回洗浄した後、１０％冷ホルマリン溶液を用いて、氷上で１０分間静置して固定し、次いで蒸留水で２回洗浄した。５％硝酸銀溶液を注加し、部屋の間接光下でカルシウム沈着部が黒褐色になるまで反応させた後、蒸留水で３回洗浄した。ついで５％チオ硫酸ナトリウム溶液に注加し、３分間静置して定着処理を行った後、蒸留水による洗浄を３回行った。さらに、対比染色のために、表−２に示したケルンエヒトロート液（を加え５分間静置した後に、蒸留水で３回洗浄した。骨化細胞の評価は顕微鏡による観察によって行った。
【００３６】
【表２】
2004298087.tif 000003
【００３７】
（１−４）  内皮細胞については、３５ｍｍプラスチックディッシュに培養した細胞集団のなかに顕微鏡学的に敷石（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）状の形態を示す細胞を観察し、１，１′−ジオクタデシル−３，３，３′−テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート標識アセチル低密度リポプロテイン（ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬ：製品Ｎｏ．Ｌ−３４８４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  製，ＵＳＡ）の取り込み能を確認することにより同定した。具体的には培養ディッシュ中の培養液を細胞に傷を付けないように吸い取って捨て、無血清培地で１０μｇ／ｍｌに調製したＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬを添加し４時間、３３℃で培養した。ＰＢＳにて５分間３回洗浄することによって取り込まなかったＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬを除き、３％フォルムアルデヒド溶液を添加し、２０分間室温に放置して固定した。蒸留水で洗浄した後、ローダミンフィルターを用い、蛍光顕微鏡で観察した。
（１−５）  脂肪細胞については、培養した細胞集団のなかに顕微鏡学的に脂肪球を持った細胞を観察し、オイルレッド染色法によって同定した。培養ディッシュ中の培養液を除去しディッシュ底に付着した細胞をＰＢＳで３分間づつ３回洗浄した後、３％のホルマリン溶液を用いて、１０分間室温に静置して固定し、次いで８０％のイソプロパノールによって１分間置換し、３７℃で１０分間、オイルレッドで染色した。さらに６０％イソプロパノールを使って１分間分別した後、３分間づつ２回洗浄し、最後に核染色のためにマイヤのヘマトキシリン溶液（和光製）によって１０分間処理し、２分間流水で洗浄した後に、顕微鏡学的に赤く染まった脂肪細胞を確認した。また、この脂肪細胞は成熟すると明確な脂肪球を持った細胞に発育するので、染色しなくとも脂肪細胞として容易に判定できた。
（１−６）  細胞の測定については、培養液を除去した後に、１ｍｌのＥＤＴＡ・トリプシン溶液（０．０２ｇＥＤＴＡ・３Ｎａ／１００ｍｌのＰＢＳ溶液、０．００２ｇトリプシン／１００ｍｌのＰＢＳ溶液）を添加し細胞を洗浄した。この洗浄操作は細胞が剥がれる前にすばやく２回行うが、トリプシン溶液を添加し、万辺なく細胞表面に広がった直後にトリプシン溶液をパスツールピペットですばやく吸い取り除去した。次いで顕微鏡で細胞が完全に剥がれているのを確認後、ＲＩＴＣ培地５ｍｌを６０ｍｍプラスティッシュに添加し、ピペットの出し入れで洗い剥ぎ取った細胞を１０ｍｌ遠沈管に移し、その溶液中の細胞数を６０ｍｍディッシュ当たりの数に換算した。細胞数の測定はエルマのビルケルチュルク血球計算盤を用いて行った。
【００３８】
細胞の体積（ｐａｃｋｅｄ  ｃｅｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ；ＰＣＶ）の測定については、上記のようにして調製した溶液中の細胞数を４ｍｌ当たりの数に換算した。その後、ヘマトクリット遠沈管（１メモリ＝１μ１、全容量１０μ１）に、その溶液４ｍｌを添加し、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、沈下した細胞の体積を読みとり、細胞数１０５個当たりの体積を測定した。使用した遠心機は日立工機（株）製、ＣＦ７Ｄである。
（２）：細胞の培養
（２−１）  比較培養
下記表−３に示す２％ＦＢＳのＲＩＴＣ８０−７培地（以下、ＲＩＴＣ培地）を用い、９０ｍｍプラスチックディッシュで細胞同士がくっ付き合う直前のサブコンフルエント状態（８０％程度のコンフルエント）まで培養した。培養液を除去した後に、１ｍｌのＥＤＴＡ・トリプシン溶液（０．０２ｇＥＤＴＡ・３Ｎａ／１００ｍｌのＰＢＳ溶液、０．００２ｇトリプシン／１００ｍｌのＰＢＳ溶液）を添加し細胞を洗浄した。この洗浄操作は細胞が剥がれる前にすばやく２回行うが、トリプシン溶液を添加し、万辺なく細胞表面に広がった直後にトリプシン溶液をパスツールピペットですばやく吸い取り除去した。次いで顕微鏡で細胞が完全に剥がれているのを確認後、再び表−３に示すＲＩＴＣ培地を添加し、細胞濃度を１．２×１０の４乗／ｍｌに調製した。この細胞浮遊液４．０ｍｌを６０ｍｍプラスチックディッシュに添加し、細胞を均質に分散させた後、３３℃で培養した。
【００３９】
【表３】
2004298087.tif 000004
【００４０】
細胞の分化能に及ぼすサイトカイン類の添加の効果について、細胞培養には表−３に示したＲＩＴＣ培地を用い、培養開始１２時間後に新しいＲＩＴＣ培地に交換した。培地交換を３日または４日毎に行った。サイトカイン類の添加は培地交換の都度に行い、その量は表−４に示すとおりである。
【００４１】
【表４】
2004298087.tif 000005
【００４２】
また、細胞分化の判定は以下に記述する基準によって行った。すなわち平滑筋については、顕微鏡学的に単核で紡錘形（ｓｐｉｎｄｌｅ  ｓｈａｐｅ）を示す細胞を観察し、更にその培養細胞集団から抽出した蛋白質混合物から平滑筋細胞に特異的に発現するミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質またはα−アクチン蛋白の発現を上述のＷＢ法で判定した。脂肪細胞については、脂肪球を形成している単位当たり（３．８ｍｍ２）の細胞数を測定し、その平均値を求めた。
（２−２）  例１〜１２（例１〜５は参考例）、および比較例１〜２に使用した株化した間葉系幹細胞ＴＢＲ３１−２は上述の非特許文献３または４に記載されたとおり１９９５年に樹立され、脂肪及び骨細胞への分化能を有することが示された。本発明者らは同株と下記の表−５に示したα−ＭＥＭ培地と高い血清濃度のウシ胎仔血清（１０％ＦＢＳ）を用いて培養条件を詳細に研究し、脂肪及び骨細胞に平滑筋や内皮細胞を加えた４つの表現型に分化する能力をもつ幹細胞であることを明らかにし（図１−ａおよび表−６参照）、さらにこれらの分化の比率を、無血清または低濃度血清０．７％ＦＢＳのＲＩＴＣ培地とサイトカイン類によって自由に変えることができる技術を開発した（例１〜５）。すなわち、平滑筋細胞の分化マーカーであるα−アクチンの発現（表−６および図４（ａ）参照）と脂肪細胞への分化の結果が示すように（例１〜５）、例１のＯＳＭは平滑筋及び脂肪細胞への分化を共に抑制するが、例２のＢＭＰ−２及び例３のＢＭＰ−４は平滑筋、及び脂肪細胞への分化を共に促進する。一方、例４のＧＤＦ−５は平滑筋への分化を抑制するが、脂肪への分化を促進し、逆に例５のＴＧＦ−β２は平滑筋への分化を促進するが、脂肪細胞への分化を抑制する。
【００４３】
【表５】
2004298087.tif 000006
【００４４】
【表６】
2004298087.tif 000007
【００４５】
記号：図４（ａ）による、平滑筋の分化マーカーα−ｓｍ−Ａｃｔｉｎの発現を化学発光によって検出したときの発現量の程度を示す。＋＋＋＋：かなり強く発現、＋＋＋：強い発現、＋＋：やや強い発現、＋：明らかな発現、±：弱いが明らかな発現、−：全く発現していない。
【００４６】
このように、分化の方向をサイトカインの組合わせによって、自由に制御できる。言い方を変えれば、未分化の状態にある細胞を分化させずに、あるいは機能的に分化した細胞でも機能を維持したまま、維持・増幅も可能である。
（２−３）  これらの分化制御は連続的にサイトカイン類を与えたものであるが、必ずしも連続的にサイトカイン類を与える必要がなく、与えるタイミングを選ぶことによっても分化の制御が可能である。このことについて、ＴＢＲ３１−２とＴＢＲ１０−１株を例に具体的に述べる。
（２−３−１）  以下にＴＢＲ３１−２の発育段階を図２に従って説明する。
【００４７】
第１発育段階：若い未熟な、細胞の突起を盛んに伸長させており、かつ増殖段階に入っていない細胞。
【００４８】
第２発育段階：細胞数が増大する直前の段階にあり、且つ細胞の突起を盛んに伸長させ、隣接する細胞の突起同士の接触が起こる直前〜直後にあり、細胞体積の膨張が最大になった細胞。
【００４９】
第３発育段階前期：対数増殖的な発育が開始され、隣接する細胞の突起同士の接触が９０％以上起こった状態にある細胞から、細胞本体同士が完全に接触して増殖する面積がない状態を１００とした時に、細胞の密度が６０％に達した状態にある細胞、すなわち６０％コンフルエントの状態になる細胞。
【００５０】
第３発育段階後期：対数増殖的に活発に増殖している６０％コンフルエント状態の細胞から増殖がとまりつつある１００コンフルエント状態に向かっている細胞であり、かつ成熟した細胞に向かいつつある細胞。
【００５１】
第４発育段階前期：１００％コンフルエント状態にある細胞が、まだわずかに増殖を行っており、増殖停止直前の細胞。
【００５２】
第４発育段階後期：細胞の増殖段階を終えた成熟した細胞。
【００５３】
まず、当該株の４つの発育段階におけるＯＳＭの平滑筋及び脂肪細胞への分化に及ぼす影響について述べる。平滑筋及び脂肪細胞への分化抑制がＯＳＭによって起こることは先の例１で示したとおりであるが、平滑筋細胞と骨化細胞の分化抑制は発育段階で異なる。すなわち、平滑筋細胞の分化について、２４日間連続してＯＳＭを与えると、平滑筋細胞への分化が抑制されるが（例６、例１の繰り返し）、この抑制効果は第３発育段階後期以降のうち、特に第４発育段階の後期のみに与えるだけで得られる（例８と１２）。しかしながら、第１から第３発育段階前期の間で連続的にＯＳＭを与えると、平滑筋分化が逆に促進される（例７）。一方、脂肪細胞の分化について、２４日間連続してＯＳＭを与えると、脂肪細胞への分化が抑制されるが（例６）、この抑制効果は第３発育段階を除くすべての発育段階で抑制される（例７、８、９及び１２）。
【００５４】
しかしながら、第３発育段階の後期〜第４発育段階前期でＯＳＭを与えると、脂肪細胞への分化が促進される（例１０、１１）。
【００５５】
このように、幹細胞の発育段階における平滑筋細胞への分化抑制は増殖段階を終えた成熟した細胞で起こり（第４発育段階）、脂肪細胞への分化抑制は増殖を終えつつあり、成熟した細胞へと向かいつつある細胞で起こった（第３発育段階後期〜第４発育段階前期）。また平滑筋細胞への分化促進はまだ未熟な状態にある細胞から活発に増殖している対数増殖期にある細胞で起こり（第１〜３発育段階）、脂肪細胞への分化促進は増殖が停止する直前の成熟した細胞に向いつつある細胞で起こる（第３発育段階後期〜第４発育段階後期）。結果は表−７（または図４（ｂ））を参照されたい。
【００５６】
【表７】
2004298087.tif 000008
【００５７】
記号：図４（ｂ）による、平滑筋の分化マーカーα−ｓｍ−Ａｃｔｉｎの発現を化学発光によって検出したときの発現量の程度を示す。＋＋＋：強い発現、＋＋：やや強い発現、＋：明らかな発現、−：全く発現していない。
【００５８】
これらの結果が示すように、幹細胞の発育過程の各段階に応じてサイトカイン類の効果が異なり、与えるタイミングを選択することによって平滑筋細胞と脂肪細胞への分化の比率を自由に制御することができる。
（２−３−２）  別の細胞株であるＴＢＲ１０−１を例に述べる。例１３〜２４（例１３〜１７は参考例）、および比較例２に使用した株化した間葉系幹細胞ＴＢＲ１０−１は前述の非特許文献３または４に記載されているとおりのものであり、平滑筋細胞へと分化することが示された（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８１：１９３−１９６、２０００）。本発明者は同株と表−５に示すα−ＭＥＭ培地と高い血清濃度のウシ胎仔血清（１０％ＦＢＳ）を用いて培養条件を詳細に研究し、平滑筋細胞のほかに骨化細胞及び内皮細胞に分化することを見出し、３つの表現型に分化する能力をもつ多能性幹細胞であることを明らかにした（図１−ｂおよび表−８参照）。さらにこれらの分化の比率を、無血清または低濃度血清０．７％ＦＢＳのＲＩＴＣ培地とサイトカイン類によって自由に変えることができる技術を開発した。
【００５９】
【表８】
2004298087.tif 000009
【００６０】
記号：図５（ａ）による、平滑筋の分化マーカーｓｍ−ＭＬＣＫの発現を化学発光によって検出したときの発現量の程度を示す。＋＋：やや強い発現、±：弱いが明らかな発現、−：全く発現していない。
【００６１】
すなわち、平滑筋細胞の分化マーカーであるミオシン軽鎖キナーゼ蛋白の発現と骨化細胞への分化の結果が示すように（例１３〜１７；表−８および図５（ａ）参照）、当該株の平滑筋への分化はＯＳＭとＴＧＦ−β２によって阻害される。しかし、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＧＤＦ−５存在下では、平滑筋への分化を促進する。一方、滑化細胞への分化はＯＳＭとＧＤＦ−５の存在下で促進される。特に、ＯＳＭによって平滑筋と骨化細胞への分化が互いに逆方向に誘導されることから、骨分化と平滑筋分化は密接な関係で制御されていることを意味し、骨化と平滑筋化の分化能を異にする幹細胞の分化段階が複数存在する可能性がある。
【００６２】
ＴＢＲ１０−１株の例では、当該幹細胞の発育過程は図３に示すとおり、大きく４つの段階に分けることが可能である。以下、各生育相についての詳細は、ＴＢＲ３２−１の生育相についての説明を参照されたい。
【００６３】
例１８〜２４（下記表−９および図５（ｂ）参照）に示すように、ＴＢＲ１０−１株の発育過程の各段階に応じてサイトカイン類を与えると、連続して与えたときと全く異なる分化方向を示す。すなわち、連続してＢＭＰ−２を与えると、平滑筋分化が優位に進行する。またＢＭＰ−２による平滑筋の分化の促進効果は、必ずしも連続して与える必要がなく、細胞増殖が盛んな第３発育段階から成熟した細胞にある第４発育段階でも優位に認められる。未成熟な細胞にある第１〜２の発育段階では、ＢＭＰ−２による平滑筋への分化促進効果は観察されない（例１９）。
【００６４】
【表９】
2004298087.tif 000010
【００６５】
記号：図５（ｂ）による、平滑筋の分化マーカーα−ｓｍ−Ａｃｔｉｎの発現を化学発光によって検出したときの発現量の程度を示す。＋＋＋：強い発現、＋＋：やや強い発現、＋：明らかな発現、±：弱いが明らかな発現、−：全く発現していない。
【００６６】
以上より、本発明に従えば、例えばＯＳＭの脂肪細胞への分化に対する効果の例（例６〜１２）に示すように、幹細胞の培養系をマイクロウェルなどを用いて分化誘導物質や抑制物質などの新薬の開発する場合、幹細胞のどの発育段階を選択して新薬を評価するかが重要であり、選択する発育段階によって、スクリーニングされる検体の評価が全く逆の結果になる。また再生医療分野における細胞移植用として細胞を提供する場合、これらサイトカイン類の種類の選択や濃度、添加のタイミングを制御して培養することにより、最適な分化段階にある細胞の提供が可能になる。例えば、血管を構成する内皮細胞と平滑筋への適度の分化度合を兼ね備えた、あるいは、内皮細胞、平滑筋及び心筋の適度の分化度合を兼ね備えた細胞の提供が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）はＴＢＲ３２−２の分化誘導の結果を示す図に代わる細胞の写真であり、（ｂ）はＴＢＲ１０−１の分化誘導の結果を示す図に代わる細胞の写真である。
【図２】ＴＢＲ３２−２の増殖曲線と発育段階を示すグラフである。
【図３】ＴＢＲ１０−１の増殖曲線と発育段階を示すグラフである。
【図４】（ａ）例１〜５および比較例１についての、そして（ｂ）は例６〜１２についてのゲル電気泳動後のウエスタン・ブロッティングの結果を示す図に代わる写真である。
【図５】（ａ）例１３〜１７および比較例２についての、そして（ｂ）は例１８〜２４および比較例３についてのゲル電気泳動後のウエスタン・ブロッティングの結果を示す図に代わる写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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