(57)【要約】【課題】安全で、食品素材として利用可能であり、入手が容易でかつ安価な原料から抽出される抽出物を有効成分とするシステインプロテアーゼ阻害剤を提供する。【解決手段】カカオ豆、カカオ豆外皮、カカオ豆ニブのうち１種または２種以上からなる物質または茶葉の水、アルコール類またはそれらの混合物による抽出物を有効成分とするシステインプロインプロテアーゼ阻害剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カカオ豆、カカオ豆の外皮、カカオ豆のニブ、これらの加工調製品、及び茶葉よりなる群から選ばれる１種または２種以上の混合物の水、アルコール類またはアルコール類水溶液による抽出物を有効成分とするシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
前記加工調製品がココアパウダーである、請求項１に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を製造する方法であって、
水を、カカオ豆、カカオ豆の外皮、カカオ豆のニブ、これらの加工調製品、及び茶葉よりなる群から選ばれる１種または２種以上の混合物に加えてアルカリ性条件下で抽出液を調製するステップと、
抽出液のｐＨを酸性側に調整して、ポリフェノールオキシダーゼで酵素処理を行うステップと、
酵素処理後の抽出液のｐＨを９〜１２に調整して沈殿物を生じさせて上澄液を回収するステップとを含む前記製造方法。
【請求項４】
請求項１または２のシステインプロテアーゼ阻害剤を製造する方法であって、
アルコール類水溶液を、カカオ豆、カカオ豆の外皮、カカオ豆のニブ、これらの加工調製品、及び茶葉よりなる群から選ばれる１種または２種以上の混合物に加えて抽出液を調製するステップと、
前記ステップにおいて抽出された物質を含む水溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに適用し、通過液を回収するステップと、
通過液をさらに合成吸着剤を用いる吸着処理に適用し、非吸着画分と吸着画分をそれぞれ回収するステップとを含む、
前記方法。
【請求項５】
合成吸着剤への吸着画分の回収を、アルコール濃度が１５％（ｖ／ｖ）以上のエタノール水溶液で溶出させて行うことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
吸着画分の回収を、アルコール濃度が１５％　（ｖ／ｖ）未満のエタノール水溶液を用いてカラムへの吸着画分を排出させた後、さらに、５０％　（ｖ／ｖ）以上のエタノール水溶液を用いて溶出させて行う、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
請求項１または２のシステインプロテアーゼ阻害剤を製造する方法であって、
カカオ豆、カカオ豆の外皮、カカオ豆のニブ、これらの加工調製品、及び茶葉よりなる群から選ばれる１種または２種以上の混合物に水を加えて、加熱することによって抽出液を調製するステップと、
抽出液にポリビニルポリピロリドンを加えてフェノール性物質を吸着させた後、ポリビニルポリピロリドンを除去し、上澄液を得るステップとを含む前記方法。
【請求項８】
茶葉の抽出物を有効成分とするシステインプロテアーゼ阻害剤を製造する方法であって、
茶葉のアルコール類水溶液による抽出液を調製するステップと、
抽出液にポリビニルポリピロリドンを加えてフェノール性物質を吸着させた後、ポリビニルポリピロリドンを除去し、上澄液を得るステップとを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はカカオ豆、カカオ豆外皮、カカオ豆ニブ（胚乳）、もしくはそれらの加工調製品、または茶葉から抽出される新規なシステインプロテアーゼ阻害物質およびその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
システインプロテアーゼは、その活性中心にチオール基を有する蛋白質分解酵素の総称であり、このグループに含まれる酵素は動植物組織など、天然に広く存在している。よく知られているシステインプロテアーゼとして、パパイン、ブロメライン、カテプシンＢ、カテプシンＬなどがある。これらの酵素は、免疫調節、種々の代謝系の調節、恒常性の維持など、生体において様々な役割を果たしている。また、食品加工の分野においても、食肉の軟化剤として適度な食感を得る目的で、システインプロテアーゼの一種であるパパインが使用されている。
【０００３】
システインプロテアーゼの活性を特異的に阻害する物質としては、従来から、微生物が産生するＥ―６４（例えば、非特許文献１参照）、Ｔｈｉｏｌｓｔａｔｉｎ（例えば、非特許文献２参照）、Ｅｓｔａｔｉｎｓ（例えば、非特許文献３参照）やＡＭ４２９９（例えば、特許文献１参照）などが知られている。また、合成的手法により得られた化合物としては、Ｅ−６４物質の誘導体（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６参照）や特許文献７に開示された物質が知られている。
【０００４】
さらに、シスタチンと総称される、内在性の蛋白性物質であるシステインプロテアーゼ阻害剤のグループが知られている。このグループに属するインヒビターとして、乳由来のシスタチン（例えば、特許文献８参照）などが知られており、これらのインヒビターは動植物組織、細胞、体液中など天然に広く見出されている。しかし、細胞内在性のプロテアーゼ阻害剤は含量が低いことが知られている。例えばラット肝におけるシステインプロテアーゼ阻害剤であるシスタチンβの含量は８〜１２ｎｇ／ｍｇ肝細胞（例えば、非特許文献４参照）であり、卵白中のシスタチンの含量は０．０１％（例えば、非特許文献５参照）、乳由来のシスタチンは０．４７ｍｇおよび０．６８ｍｇ／９Ｌ乳（例えば、特許文献９参照）、コメのシスタチンは種子１ｋｇ当り数ｍｇの含有量（例えば、非特許文献６参照）に過ぎない。したがって、こうしたインヒビターを多量に得ることは困難である。さらには、これらの阻害剤のほとんどがペプチド性であり、耐熱性についても、問題があるものと考えられてきた。
【０００５】
生体内で様々な役割を果たすシステインプロテアーゼを阻害する阻害剤は、疾患の治療や予防など医療、農業、食品加工などの分野において有用と考えられる。システインプロテアーゼ阻害剤の有用な作用として、抗ウィルス作用、抗アレルギー作用、骨吸収の抑制作用、昆虫生育阻害効果、ストレプトコッカス属に対する抗菌作用などが知られている。これらの効果をもとにして抗アレルギー剤（例えば、特許文献１０参照）、骨疾患治療剤（例えば、特許文献１０、特許文献１１、特許文献９参照）、筋ジストロフィーあるいは白内障治療薬（例えば、特許文献７参照）や抗ウィルス剤（例えば、特許文献１２参照）として用いること、食品加工分野では、食肉の処理用に添加したプロテアーゼの阻害や、魚のすり身のプロテアーゼの阻害（例えば、非特許文献７参照）などに用いることが提案されている。
【０００６】
しかしながら、現在までに、医薬として実用的な治療剤の提供には至っておらず、また、食品加工において使用し得る安全な物質を安価に得ることについては十分な検討もされていなかった。特に、食品加工においては、加熱工程や殺菌温度に十分耐え得る、耐熱性のシステインプロテアーゼ阻害剤は従来見出されていなかった。
【０００７】
【特許文献１】特開平７−１１５９８５号公報
【特許文献２】特開昭５２−３１０２４号公報
【特許文献３】特開昭５３−１０８９２３号公報
【特許文献４】特開昭５４−１４１７３４号公報
【特許文献５】特開昭５５−３５０１２号公報
【特許文献６】特開平２−３０４０７５号公報
【特許文献７】特開平１−１２１２５７号公報
【特許文献８】特開平７−１２６２７４号公報
【特許文献９】特開平７−１２６２９４号公報
【特許文献１０】特開平２−２２３５２９号公報
【特許文献１１】特開平７−１１５９８５号公報
【特許文献１２】特開昭６１−２２５１３０号公報
【非特許文献１】Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌｕｍｅ　４２，　５２３　（１９７８）
【非特許文献２】Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌｕｍｅ　４９，　８９５　（１９８５）
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，　Ｖｏｌ．　４２，　１３６２　（１９８９）
【非特許文献４】蛋白質核酸酵素，　Ｖｏｌｕｍｅ　３４，　９７２　（１９８９）
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌｕｍｅ　４４，　２５８４　（１９９６）
【非特許文献６】蛋白質核酸酵素，　Ｖｏｌｕｍｅ　３６，　２５１９　（１９９１）
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　Ｖｏｌｕｍｅ　４４，　２５８４　（１９９６）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安全でしかも食品素材として利用可能であり、入手が容易でかつ安価な原料から抽出されるシステインプロテアーゼ阻害活性を有する成分を見出すことを目的としてなされた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、カカオ豆、カカオ豆外皮、カカオ豆ニブ、それらの加工調製品より抽出した抽出物、または茶葉から抽出した抽出物からなることを特徴とするシステインプロテアーゼ阻害剤およびその製造方法が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者は、安全性が高く安価な食品である茶葉または食品原料であるカカオ豆、カカオ豆外皮、カカオ豆ニブ、それらの加工調製品からの抽出物が、高いシステインプロテアーゼ阻害活性を有すること、及び当該抽出物が簡単な抽出操作によって得られることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、カカオ豆、カカオ豆の外皮、カカオ豆のニブないしはこれらの加工調製品（たとえばココアパウダーなど）、または茶葉よりなる群から選ばれる１種または２種以上の混合物の抽出物を有効成分とするものである。
【００１１】
カカオ豆は、カカオ豆ニブとそれを覆っているカカオ豆外皮とからなり、本発明の原料としては、カカオ豆は生でも焙炒したものであってもよく、またカカオ豆外皮、カカオ豆ニブ、加工されたココアパウダーあるいはこれらの脱脂した原料およびカカオ色素のいずれでもよい。特に、カカオ豆外皮はチョコレート製造過程においてカカオ豆から分離されるものであり、現在では特に有用な用途が無くその殆んどが廃棄処分されているのが実状である。したがって、廃棄物の有効利用という観点からカカオ豆外皮より製造することが好適である。
【００１２】
カカオ豆外皮やカカオ豆ニブは、抽出効率の面から適当に破砕することが好ましい。
【００１３】
抽出時の温度等は特に限定されないが、抽出効率の面から加熱抽出することが好ましい。加熱温度は使用する溶媒によって異なるが、１００℃以上の温度を使用しても本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤の活性が損なわれることはない。特に、カカオ豆、カカオ豆のニブ、外皮、またはココアパウダーに水を加えて、システインプロテアーゼ阻害剤の抽出液を調製する場合は、１００℃もしくは加圧下の１００℃以上の加熱が好ましく、さらにオートクレーブ、高圧蒸気滅菌器、蒸気殺菌発酵タンク、レトルト用圧力釜等を用いて１００〜１３０℃で加熱すれば尚良い。同様に、水を用いて茶葉からシステインプロテアーゼ阻害剤の抽出液を調製する場合は、１００℃もしくは加圧下の１００℃以上の加熱が好ましく、さらにオートクレーブ等を用いて１００〜１３０℃で加熱すれば尚良い。なお、本願発明の阻害剤の耐熱性については、カカオ豆の抽出物については耐熱性試験例１に、茶葉の抽出物については試験例７に記載する。この様な耐熱性があることは、食品にシステインプロテアーゼ阻害剤としての有用な機能的作用を持たせるときの食品加工において、加熱工程や殺菌温度に十分耐えるものであり食品素材として極めて有利である。
【００１４】
溶媒としては水、メタノール、エタノールなどのアルコール類、およびこのアルコール類を用いたアルコール類水溶液が用いられる。
【００１５】
抽出液の吸着処理に用いられる合成吸着剤の例としては、スチレンとジビニルベンゼンを重合して製造された芳香族系合成吸着剤が挙げられ、市販品の例として、ダイヤイオンＨＰ−２０、ＨＰ−２１（三菱化学工業）、アンバーライトＸＡＤ４（米国、ローム・アンド・ハース社）等を挙げることができる。
【００１６】
上記のようにして調製した抽出液に、ポリビニルポリピロリドンを添加してフェノール性物質を吸着させた後、該物質を除去し、その上澄液をシステインプロテアーゼ阻害物質を含有する抽出液としてもよい。
【００１７】
以上のようにして得られたシステインプロテアーゼ阻害物質を含有する抽出液を所望に応じて水溶液または噴霧乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥等の公知の方法により乾燥して粉末状にしたり、さらに精製を行い不純物を除去し、システインプロテアーゼ阻害物質を含有する組成分を得ることができる。ここに得られるシステインプロテアーゼ阻害剤は、パパイン、フィシン、ブロメライン（「ブロメリン」ともいう）などのシステインプロテアーゼに作用する。一方、米のシスタチンはブロメラインに対しては作用せず（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，２７０３（１９８７））、また一般に食品用に使用されるプロテアーゼ阻害剤である牛血漿タンパク質（ＢＰＰ）、卵白、ポテト粉末はシステインプロテアーゼのみならずセリンプロテアーゼも阻害する（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４４，２５８４（１９９６））。したがって、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、これらの阻害剤とは相違するものである。
【００１８】
【実施例】
以下の実施例１〜１２において本発明を具体的に説明する。しかし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
水洗した焙炒カカオ豆外皮５０ｇに水１０００ｍｌを加え、１２１℃、１５分間抽出を行った。抽出後、固液分離を行い抽出液を得、減圧濃縮により濃縮してカカオ豆外皮抽出液１００ｍｌを得た。
【００２０】
実施例２
水洗した焙炒カカオ豆外皮５０ｇにエタノール５００ｍｌを加え、室温で１５時間抽出を行った。抽出後、固液分離を行いエタノール抽出液を得た。この抽出液の溶媒を除去しさらに減圧乾燥し、乾燥物０．７ｇを得た。乾燥物を水５０ｍｌに溶解してカカオ豆外皮抽出液を得た。
【００２１】
試験例１　抽出物の各種プロテアーゼ活性におよぼす影響
実施例１、２で得られた抽出物質が各種プロテアーゼの活性を阻害する度合いを測定した。試験は以下のように各種プロテアーゼに対する阻害活性の有無について水と比較することによって行った。プロテアーゼ活性は、カゼインーフォリン（Ｃａｓｅｉｎ−Ｆｏｌｉｎ）呈色法により測定した。すなわち、試験管に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて調製したプロテアーゼ液１ｍｌをとり、実施例１および２で得られたカカオ豆外皮抽出液または水０．５ｍｌをそれぞれ別々に加え混合し、４０℃で５分間放置後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製した０．６％カゼイン溶液５ｍｌ（システインプロテアーゼ活性を測定するときは６．５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む）を加えよく混合し、４０℃で１５分間反応させた。直ちに、０．４４Ｍ三塩化酢酸５ｍｌを加え混合し、反応を止めた。さらに恒温水槽内に約３０分放置後、硬質濾紙にてろ過した。ろ液２ｍｌを試験管にとり、０．５５Ｍ炭酸ナトリウム５ｍｌとフォリン−チオカルトー試薬１ｍｌを加えてよく攪拌した後、３０℃で３０分間放置し、６６０ｎｍで吸光度を測定した。対照は０．４４Ｍ三塩化酢酸添加後、０．６％カゼイン溶液を加えた以外は同様に操作した。
【００２２】
上記のようにして得られたカカオ豆外皮抽出物質によるプロテアーゼ活性の阻害の度合い（阻害活性）の試験結果を表１に示す。阻害活性は次式により求めた。
【００２３】
阻害活性（％）＝｛（Ａ０−Ａ１）／Ａ０｝×１００　・・・・・・　（１）
Ａ０：水を用いたときの吸光度で表したプロテアーゼ活性
Ａ１：カカオ豆外皮抽出液等の試験液を用いたときの吸光度で表したプロテアーゼ活性
【００２４】
【表１】
2004143122.tif 000002
【００２５】
表１から明らかなように、焙炒カカオ豆外皮から水またはエタノールで抽出して得られた抽出物はともに、システインプロテアーゼであるブロメリン、フィシンおよびパパインの活性を阻害したが、他のプロテアーゼの活性の阻害は弱かったことから、カカオ豆外皮からの抽出物はシステインプロテアーゼ阻害作用を有することが明らかになった。また、これら抽出物は、ビューレット反応、ニンヒドリン反応の呈色反応で陰性を示すことよりペプチド性の物質ではないと考えられる。
【００２６】
実施例３
生カカオ豆より外皮とニブを分離し、外皮３ｇ、カカオニブ５ｇにそれぞれ別々に１００ｍｌの水を加え、８０℃で３０分間抽出した。固液分離を行い抽出液を得た。
試験例２　得られた抽出液のパパイン（システインプロテアーゼ）阻害活性を試験例１に示した方法により測定し、その結果を表２に示す。比較例としてセリンプロテアーゼであるトリプシンに対する阻害活性を示す。
【００２７】
【表２】
2004143122.tif 000003
【００２８】
表２から明らかなように、外皮抽出液およびニブ抽出液ともにパパイン活性を阻害した。一方、トリプシンに対しては、ニブからの抽出液が弱い活性を示したのに対し、外皮からの抽出液はまったく阻害活性を示さなかった。したがって、システインプロテアーゼ阻害剤の活性は、外皮抽出物とニブ抽出物とでは異なる因子に起因する可能性も考えられる。
【００２９】
実施例４
実施例３で得られたカカオ豆外皮３ｇおよびカカオニブ５ｇにそれぞれ別々に１００ｍｌの水を加え、１２１℃で１５分間抽出を行った。固液分離後、カカオ豆外皮抽出液およびカカオニブ抽出液を得た。これらの各抽出液５０ｍｌにポリビニルポリピロリドン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）を各々１ｇずつ加え、時々攪拌しながら３０分間放置した後、遠心分離を行い、上澄液を得た。
【００３０】
試験例３
実施例４で得られた上澄液のシステインプロテアーゼ阻害活性を試験例１と同様に測定した。結果を表３に示す。比較例としてトリプシン（セリンプロテアーゼ）阻害活性も示した。なお、カカオニブの上澄液は３倍に希釈して測定に用いた。
【００３１】
【表３】
2004143122.tif 000004
【００３２】
表３から明らかなように、いずれの上澄液も強いシステインプロテアーゼ阻害活性を示したが、トリプシン阻害活性はほとんどなかった。
【００３３】
実施例５
カカオ豆外皮５ｇおよびカカオニブ５ｇにそれぞれ別々に５０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液１００ｍｌを加え、室温で２４時間抽出した。固液分離後、抽出液５０ｍｌを減圧濃縮、乾固後、水５０ｍｌに溶解し、抽出液を得た。
【００３４】
実施例６
焙炒したカカオニブから得られたカカオマスより調製されたナチュラルココアパウダー５ｇおよびアルカリゼーションによって得られたカカオマスより調製されたアルカライズドココアパウダー５ｇに５０％　（ｖ／ｖ）メタノール水溶液１００ｍｌを加え、室温にて２４時間抽出した。抽出後、固液分離を行い、抽出液５０ｍｌを減圧濃縮、乾固した後、水５０ｍｌに溶解し、抽出液を得た。
【００３５】
試験例４　　実施例５および６で得られた抽出液のシステインプロテアーゼ阻害の度合いを表４に示す。比較例としてトリプシン阻害活性も示す。阻害活性は試験例１に示した方法により測定した。
【００３６】
【表４】
2004143122.tif 000005
【００３７】
表４から明らかなように、実施例５および６で得たいずれの抽出物についても、強いシステインプロテアーゼ阻害活性が認められた。一方、トリプシン阻害活性は弱かった。
【００３８】
実施例７
アルカライズドココアパウダー３ｇに水を加え、１２１℃で１５分抽出を行った。固液分離後、抽出液を得た。この抽出液５０ｍｌにポリビニルポリピロリドンを１ｇ加え、時々攪拌しながら３０分間放置した後、遠心分離を行い、上澄液を得た。
【００３９】
試験例５
実施例７で得られた上澄液のシステインプロテアーゼ阻害活性を試験例１と同様に測定した。結果を表５に示す。比較例としてトリプシン（セリンプロテアーゼ）阻害活性も示す。なお、上澄液は３倍に希釈して測定に用いた。
【００４０】
【表５】
2004143122.tif 000006
【００４１】
表５から明らかなように、この上澄液は強いシステインプロテアーゼ阻害活性を示したが、トリプシン阻害活性はなかった。
【００４２】
耐熱性試験例１
実施例４および７で得られたポリビニルポリピロリドン処理前の各抽出液を１２１℃、１５分間加熱処理し、耐熱性を検討した。阻害活性は試験例１と同様に測定した。結果を表６に示す。なお、カカオニブおよびアルカライズドココアパウダーの抽出液は３倍に希釈して測定に用いた。
【００４３】
【表６】
2004143122.tif 000007
【００４４】
表６より加熱処理により各抽出液の阻害活性に大きな変化はなく、耐熱性が認められた。
【００４５】
実施例８
特公昭６１−５３９３号に記載の実施例３および４と同様の操作を行い、粉末（特許公報昭６１−５３９３号に記載の色素粉末）を得た。
【００４６】
特公昭６１−５３９３号の実施例３の操作：２００ｇのカカオ豆外皮に４ｌの水を加え、苛性ソーダでｐＨ１０とした後９５℃で１時間抽出し遠心分離により抽出液を分離後、残渣に３．５ｌの水を加えｐＨを１０とした後９５℃で１時間抽出した。抽出液を遠心分離後、合併して７ｌの抽出液を得た。この抽出液のｐＨを４．７に塩酸で調整して５０００単位／ｍｌのチロシナーゼ（ＥＣ１．１４．１８．１、シグマ社製）を５％添加し３５℃で４時間作用させた。酵素処理後、減圧濃縮して２．５ｌとした後５ｌのアセトンを加えて多糖類や蛋白質などの不純物を析出させた後、濾過して得た濾液のｐＨを苛性ソーダで１１に調整して色素物質を沈殿させた。遠心分離により得た色素物質を１００ｍｌの水に溶解後、塩酸でｐＨ６．５に調整して濃厚色素液を得た。この色素液を凍結乾燥し１４．４ｇの色素粉末を得た。
【００４７】
特公昭６１−５３９３号の実施例４の操作：上記と同様にカカオ豆外皮抽出液を得、この抽出液のｐＨを４．７に塩酸で調整して、アルテルナリア・テヌイス（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｔｅｎｕｉｓ）Ａ−２菌（微工研菌寄第３３２号）の生産するポリフェノールオキシダーゼ（５０００単位／ｍｌ）を５％添加し３５℃で４時間作用させた。酵素処理後、減圧濃縮して２．５ｌとした後、５ｌのエタノールを加えて沈殿してくる不純物を除去し、得られた色素液のｐＨを苛性ソーダで１１に調整し、沈殿した色素物質を１００ｍｌの水に溶解後、塩酸でｐＨ６．５に調整して濃厚色素液を得た。この色素液を凍結乾燥し１５ｇの色素粉末を得た。
【００４８】
試験例６　　実施例８で得られた粉末２０ｍｇを１０ｍｌの水に溶解し、試験例１と同様にパパイン（システインプロテアーゼ）阻害活性を測定した。結果を表７に示す。比較例としてトリプシン阻害活性を示した。
【００４９】
【表７】
2004143122.tif 000008
【００５０】
表７から明らかなように、特公昭６１−５３９３の実施例３および４の粉末は、パパインに対し強い阻害活性を示した。トリプシンに対する阻害活性は弱かった。
実施例９
焙炒カカオ豆外皮２００ｇに５０％　（ｖ／ｖ）メタノール水溶液２０００ｍｌを加え、室温で２４時間抽出した。固液分離後、抽出液１５２０ｍｌを減圧で溶媒を除去し，残留物２３．４３ｇを得た。これに蒸留水２０００ｍｌを加え水溶液とし、シリカゲルクロマトグラフィー（カラム、２．５×７３．０ｃｍ）を行い、通過液２６９０ｍｌを得た。この通過液をダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化成）でカラムクロマトグラフィー（カラム、２．７×４６．０ｃｍ）を行い、通過液２５９０ｍｌを減圧で溶媒を除去し，残留物１７．１８ｇを得た。この残留物を蒸留水３００ｍｌに溶解し不溶物を除去後、減圧乾燥し、乾燥物（フラクション−１）１５．４ｇを得た。次に、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムに吸着された画分をアルコール濃度が１５％　（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液で溶出し、活性画分を集め減圧で溶媒を除去し、残留物２．６ｇを得た。この残留物２．６ｇにアルコール濃度が３５％　（ｖ／ｖ）の含水エタノール１５０ｍｌを加え、熱水中で溶解した。室温まで冷却した後、生成した沈でん物を除去し、減圧下で溶媒を除去、乾燥した。この乾燥物に蒸留水５０ｍｌを加え、不溶物を除去後、減圧乾燥し、乾燥物（フラクション−２）１．４ｇを得た。さらに、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムを５０％　（ｖ／ｖ）のエタノール水溶液で溶出し、活性画分を集め、減圧で溶媒を除去し，残留物０．６３ｇを得た。この残留物０．６３ｇを蒸留水５０ｍｌに溶解し、不溶物を除去後、減圧乾燥し、乾燥物（フラクション−３）０．２１ｇを得た。
【００５１】
上記操作により得られた各物質のパパインに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、それぞれフラクション−１が２３．９８ｍｇ／ｍｌ、フラクション−２が０．６１ｍｇ／ｍｌ、フラクション−３が０．２８ｍｇ／ｍｌであった。この際、パパイン（和光純薬）の酵素量は試験例１に示した方法により活性を測定したとき６６０ｎｍの吸光度が約１．２になるように設定した。
【００５２】
これら各物質の紫外部吸収は、フラクション−１は２６９ｎｍ付近、フラクション−２は２７３ｎｍ付近、フラクション−３は２７７ｎｍ付近に極大吸収を有した。
【００５３】
実施例１０
市販の緑茶（伊藤園製）４ｇに水１００ｍｌを加え、９０〜９４℃で１５分間熱湯抽出を行った。得られた抽出液（８８ｍｌ、固形分１．２６％）を８倍に水で希釈し、パパイン（システインプロテアーゼ）阻害活性を測定した。
【００５４】
上記のカカオ豆抽出物の場合と同様、プロテアーゼ活性は、カゼイン−フォリン（Ｃａｓｅｉｎ−Ｆｏｌｉｎ）呈色法により測定した。なお、試験例１のカカオ豆外皮抽出液０．５ｍｌに替えて、緑茶抽出液０．５ｍｌを用いた。
【００５５】
茶葉抽出液の阻害活性の有無は水と比較することによって行い、阻害活性は次式により求めた。
【００５６】
阻害活性（％）＝｛（Ａ０−Ａ１）／Ａ０｝×１００　・・・・・・　（１）
Ａ０：水を用いたときの吸光度で表したプロテアーゼ活性
Ａ１：茶葉抽出液等の試験液を用いたときの吸光度で表したプロテアーゼ活性
結果を表８に示す。比較例としてトリプシン阻害活性を示した。なお、ここで得られた抽出液はビューレット反応およびニンヒドリン反応の呈色反応で陰性を示した。
【００５７】
【表８】
2004143122.tif 000009
【００５８】
表８より、明らかなようにシステインプロテアーゼであるパパインの活性を阻害した。
【００５９】
実施例１１
市販の緑茶（伊藤園製）５ｇに水１００ｍｌを加え、１２１℃で１５分間抽出を行った。
【００６０】
固液分離後、抽出液を得、この抽出液５０ｍｌにポリビニルポリピロリドン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）を１ｇ加え、時々攪拌しながら３０分間放置後、遠心分離を行い、上澄液を得た。
【００６１】
実施例１２
市販の緑茶（伊藤園製）４ｇに５０％　（ｖ／ｖ）メタノール水溶液１００ｍｌを加え、室温で２４時間抽出した。固液分離後、抽出液（９１ｍｌ）を減圧濃縮、乾固後、水９１ｍｌに溶解した。この水溶液５０ｍｌにポリビニルポリピロリドンを１ｇ加え、時々攪拌しながら３０分間放置後、遠心分離を行い、上澄液を得た。
【００６２】
試験例７
実施例１１および１２で得られた上澄液のシステインプロテアーゼ阻害活性を実施例１０と同様に測定した。結果を表９に示す。また、実施例１２で得られた上澄液を１２１℃、１５分間加熱処理したときのシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した結果も示した。なお、各上澄液は３倍に希釈して測定に用いた。
【００６３】
【表９】
2004143122.tif 000010
【００６４】
表９より明らかなようにシステインプロテアーゼ阻害活性を有していた。また、加熱処理によりやや阻害活性が低下したが、９０％以上の阻害活性を有していた。
【００６５】
【発明の効果】
本発明によればカカオ豆（外皮、ニブ）、カカオ豆の加工調製品の水、アルコール類抽出物、または茶葉の抽出物を主成分とするシステインプロテアーゼ阻害剤が提供される。従来のシステインプロテアーゼ阻害剤と比べると、カカオ豆または茶葉という食品素材から得られることから、安全性が高くしかも抽出法も容易であり、安価な材料から得られるシステインプロテアーゼ阻害剤である。