(57)【要約】      （修正有）【課題】  フマル酸ヒドラターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質を提供する。【解決手段】  特定のアミノ酸配列からなるタンパク質は、フマル酸ヒドラターゼ活性を有する。このタンパク質は、超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)種７（JCM１０５４５）の遺伝子配列から、フマル酸ヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードすると推定される遺伝子をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより得たものである。【選択図】  図１
2004298189.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）または（ｂ）の耐熱性タンパク質。
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、フマル酸ヒドラターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
【請求項２】
前記フマル酸ヒドラターゼ活性が、フマル酸を可逆的に加水分解してＬ−リンゴ酸を生成する機能である請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
超好熱性古細菌由来である請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
超好熱性古細菌が、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii) （JCM１０５４５）である請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質の製造方法であって、請求項６記載の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法。
【請求項８】
酵素反応により、フマル酸を可逆的に加水分解してＬ−リンゴ酸を製造する方法であって、前記酵素として請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質を用い、温度８０〜８５℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法。
【請求項９】
酵素反応により、Ｌ−リンゴ酸を可逆的に加水分解してフマル酸を製造する方法であって、前記酵素として請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質を用い、温度８０〜８５℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法。
【請求項１０】
前記酵素反応のｐＨが、ｐＨ６．５〜８．５の範囲である請求項８または９記載の製造方法。
【請求項１１】
一定時間酵素反応を行った後、温度を９０℃以上にして前記酵素反応を停止させる請求項８から１０のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フマル酸ヒドラターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質に関する。本出願は、国の委託に係る成果の出願である。
【背景技術】
【０００２】
フマル酸ヒドラターゼ（EC4.2.1.2）は、フマル酸を可逆的に加水分解してＬ−リンゴ酸を生成する酵素であり、植物、微生物および動物のクエン酸回路に関与している。このような酵素としては、大腸菌（Escherichiacoli）由来のもの（非特許文献１Biochemistry, 1992 Oct 27;31(42):10331-7）、などが公知である。フマル酸ヒドラターゼは、バイオリアクターなどに用いられリンゴ酸の工業的な製造に使用されている（非特許文献２Biotechnol.Prog.2002,May-Jun;18(3):445-50）。しかしながら、耐熱性のフマル酸ヒドラターゼは知られていない。耐熱性のフマル酸ヒドラターゼは、工業的用途を広げるものと期待されている。
【０００３】
他方、超好熱性古細菌（非特許文献３参照）についての研究があり、スルホロブス属細菌の１種であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）（非特許文献４参照）は、その遺伝子が既に解析されている（非特許文献５参照）。したがって、この超好熱古細菌が、フマル酸ヒドラターゼを産生するとすれば、それは優れた耐熱性を有すると予想される。
【非特許文献１】Biochemistry, 1992 Oct 27;31(42):10331-7
【非特許文献２】Biotechnol.Prog.2002,May-Jun;18(3):445-50
【非特許文献３】Advances in Protetin Chemistry, Volume 48, Enzymes and Proteins from Hyperthermophilic Microorganisms (M.Adams ed.), Academic Press (1996)
【非特許文献４】Suzuki, T. et al., Extremophiles, 2002 Feb;6(1):39-44
【非特許文献５】Kawarabayashi,Y. et al., “Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strain7”,  DNA Res. 8 (4), 123-140 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、フマル酸ヒドラターゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、超好熱性古細菌であるスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）のゲノム情報について調べたところ、この細菌が、フマル酸ヒドラターゼを産生する可能性があることを突き止めた。この知見に基づき、さらに研究を重ねたところ、この細菌の遺伝子から、フマル酸ヒドラターゼ活性を持つ新規耐熱性タンパク質を発現させることに成功し、本発明に到達した。なお、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）は、理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設に保存されており、第三者の要求により分譲可能である。スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（JCM１０５４５）の生育温度は８０℃であり、生育限界温度が８７℃であるから、本発明のタンパク質は、８０〜８７℃の高温であっても活性がある。
【０００６】
すなわち、本発明のタンパク質は、下記の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である。
（ａ）  配列番号１のアミノ酸配列からなる耐熱性タンパク質。
（ｂ）  配列番号１のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、フマル酸ヒドラターゼ活性を有する耐熱性タンパク質。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、フマル酸ヒドラターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
前記フマル酸ヒドラターゼ活性は、フマル酸を可逆的に加水分解してＬ−リンゴ酸を生成する機能である。なお、本発明のタンパク質は、前記反応の逆反応を触媒してもよい。
【０００９】
前述のように、本発明の新規耐熱性タンパク質は、超好熱性古細菌由来であり、具体的には、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii) （JCM１０５４５）由来である。但し、本発明のタンパク質は、この菌が産生するものに限定されず、遺伝子工学的手法により、他の生物が産生するものであってもよい。
【００１０】
つぎに、本発明の発現ベクターは、前記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のＤＮＡを含むベクターである。
【００１１】
つぎに、本発明の形質転換体は、前記本発明のベクターにより形質転換された形質転換体である。なお、宿主は特に制限されず、例えば、大腸菌等がある。
【００１２】
つぎに、本発明のタンパク質の製造方法は、前記本発明の形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。
【００１３】
つぎに、本発明の第１の製造方法は、酵素反応により、フマル酸を可逆的に加水分解してＬ−リンゴ酸を製造する方法であって、前記酵素として前記本発明のタンパク質を用い、温度８０〜８５℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法である。
【００１４】
また、本発明の第２の製造方法は、酵素反応により、Ｌ−リンゴ酸を可逆的に加水分解してフマル酸を製造する方法であって、前記酵素として前記本発明のタンパク質を用い、温度８０〜８５℃の条件で前記酵素反応を行う製造方法である。
【００１５】
このように、前記本発明のタンパク質を用いれば、温度８０〜８５℃の高温領域で酵素反応を実施でき、この結果、フマル酸ヒドラターゼの工業的な用途が広がる。なお、この製造方法において、前記酵素反応のｐＨは、ｐＨ６．５〜８．５の範囲が好ましい。
【００１６】
前記本発明の製造方法において、一定時間酵素反応を行った後、温度を９０℃以上にして前記酵素反応を停止させることもできる。なお、前記酵素反応を停止させる温度は、例えば、９０〜１００℃の範囲であり、好ましくは９５〜１００℃の範囲である。
【００１７】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００１８】
本発明者らは、海洋底から採取された超好熱性古細菌であって、好気性thermoacidophilic crenarchaeonの１種であるスルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)種７（JCM１０５４５）の遺伝子配列からフマル酸ヒドラーゼ活性を示すと推定される遺伝子（配列番号２）をクローニングし、これを大腸菌を用いて発現させることにより、本発明の新規耐熱性タンパク質を得るに至った。遺伝子のクローニング方法は、後記した実施例１に記載した通り実施した。クローニングされた遺伝子の塩基配列は配列番号２に示す通りであり、また、その推定アミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。なお、本発明の耐熱性タンパク質は、フマル酸ヒドラーゼ活性を有していれば、配列番号１のアミノ酸配列において、一つ以上若しくは数個のアミノ酸残基が、欠質、置換、付加若しくは挿入されていてもよい。このアミノ酸配列における「アミノ酸の欠失、置換、付加若しくは挿入」は、当業者に公知の方法（例えば、突然変異誘発法）に従って実施することができる。
【００１９】
本発明のタンパク質は、前述の本発明のタンパク質の製造方法により製造可能であるが、これに限定されず、他の製造方法で製造されてもよい。例えば配列番号１に示すように、そのアミノ酸配列が決定されているタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、個々のアミノ酸を化学的に重合してタンパク質を合成する方法に従って調製することができる。
【００２０】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の一例としては、配列番号２に示す遺伝子がある。前記遺伝子は、例えば、後記する実施例２に示すように超好熱性古細菌スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)（JCM１０５４５）のゲノムから、例えば配列番号２で示される塩基配列の一部をプライマーとして用いるＰＣＲ法あるいは該ＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により調製することができる。また、その塩基配列をもとに、当業者に公知である核酸化学合成法等に従って前記遺伝子を得ることもできるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明の発現ベクターは、前記遺伝子もしくは配列番号２のＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロウイルスなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法またはその変法などにより調製することができる。また、市販プラスミドとして、例えばｐＥＴ-１１ａ（Novagen社製）あるいはバチルス属の宿主を用いて分泌型のプラスミドなどを用いてもよい。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが含まれていてもよい。
【００２２】
ベクターへの遺伝子等の挿入は、例えば、精製された遺伝子の塩基配列を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これらに限定されない。また、本発明の遺伝子の機能が発揮されるように、本発明の発現ベクターには本発明の遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでいてもよい。さらに、本発明の遺伝子も他のタンパク質のコードする配列を融合したものを挿入してもよい。
【００２３】
前記発現ベクターで宿主生物を形質転換すれば、本発明の形質転換体が得られる。宿主生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、大腸菌などの原核生物細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。形質転換法としては、既に公知である塩化カルシウム法などを使用することができるが、これらの方法に限定されない。
【００２４】
本発明のタンパク質の製造方法は、前記形質転換体を培養する工程と、前記培養工程において発現した前記タンパク質を回収する工程とを含む製造方法である。前記培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行えるものであれば、天然培地、合成培地などのいずれを用いてもよい。本発明のタンパク質の回収は、特に制限されない。前記タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することによって前記タンパク質を回収する。また、本発明の前記タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体または細胞を除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。なお、培養液をそのまま使用する場合、熱処理をすることにより、本発明のタンパク質以外のタンパク質が失活するので、実質上、本発明のタンパク質のみの酵素液として使用できる。
【実施例１】
【００２５】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されない。
【００２６】
染色体ＤＮＡの調製
スルフォロブス・トコダイイ(Sulfolobustokodaii(ＪＣＭ１０５４５))をＬ培地中で37℃にて一晩培養して集菌したものに、ＳＳＣ溶液 (０．１５Ｍ ＮａＣｌ, ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム)１０ｍＬ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１００ｍｇ／ｍｌ ニワトリ卵白リゾチーム ０．１ｍＬおよび１０％非イオン性界面活性剤Ｂｒｉｊ-５８を０．５ｍＬ加え、０℃で３０分間放置した後、プロテイナーゼＫ(Ｍｅｒｃｋ社製)５ｍｇを１０％ＳＤＳ ０．２ｍＬに溶かした溶液を加え、３７℃で２、３日間放置した。この溶液に水飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合溶液を加えて、３７℃で１時間放置した後、水層を分取し、そこへエタノールを加えてＤＮＡを沈殿濃縮した。このＤＮＡの沈殿をＴＥ溶液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０))１０ｍＬに溶解し、リボヌクレアーゼ０．２５ｍＬ(最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ)を加えて、３７℃で一晩放置した後、へエタノールで沈殿させた。次いで、ＤＮＡをＴＥ溶液５ｍＬに溶解した後、２６０ｎｍの吸光度より、ＤＮＡ濃度を決定した（Clarke,L.& Carbon,J.(1979) Methods Enzymol.68,396-408）。
【実施例２】
【００２７】
発現プラスミドの構築と遺伝子発現
１．発現プラスミドの構築
耐熱性フマル酸ヒドラターゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩサイトを含むＤＮＡを構築する目的で下記のＤＮＡプライマーを合成し、このプライマーを用いたＰＣＲで耐熱性フマル酸ヒドラターゼ遺伝子の翻訳領域の後ろに制限酵素サイトを導入した。用いたＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ-ｐｌｕｓ-（東洋紡社製）であった。
Forward primer（配列番号３）：5'-TGATGAAATATACCGAAACTGCACCAAAACTT-3'
Reverse primer（配列番号４）：5'-ATATGGATCCGCGGCCGCTTATTATTTTGCAGGAAAACCTGG-3'
ＰＣＲ反応後、増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、その遺伝子断片を精製した。ｐＥＴ-１１ａ（Novagen社製）を制限酵素ＮｄｅＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ ｆrａｇｍｅｎｔで末端を平滑化した後，制限酵素ＢａｍＨＩでさらに切断したものを精製し、上記の構造遺伝子とＴ４リガーゼで１５℃、３０分間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体のコロニーを得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地(１８ｍＬ)で２４時間培養し、その培養液から発現プラスミドを改変アルカリSDS法で精製した。精製プラスミドのインサートの塩基配列は，ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔ(登録商標：Applied Biosystems社製)とＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ(登録商標：Applied Biosystems社製)を用いて決定し、インサートの塩基配列が耐熱性フマル酸ヒドラターゼ遺伝子の正しい配列であることを確認した。
【００２８】
２．組換え遺伝子の発現
大腸菌 Ｒｏｓｅｔｔａ-ｇａｍｉ(ＤＥ３)(Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに０．１ｍＬ移した。その中に上記１．の精製発現プラスミドの溶液０．００２ｍＬを加え氷中に２０分間放置した後、４２℃でヒートショックを９０秒間行い、氷中に1分間放置した後、クロラムフェニコールとアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに適量まき、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地(５ｍＬ)で18時間培養し、耐熱性フマル酸ヒドラターゼ遺伝子を発現した。培養後、遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）で集菌した。
【００２９】
集菌した菌体に，破砕液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５)を０．２ｍＬ加え，超音波発生器で細胞を破砕し，その懸濁液を０．１ｍＬずつ２本のサンプルチューブに分けた。一方のサンプルチューブは遠心分離(１３，０００Ｇ、１０分)して上清と沈殿に分け，沈殿は破砕液  ０．１ｍＬで懸濁した。もう一方のサンプルチューブは，熱処理（７０℃，１０分）を施した後，遠心分離（１３，０００Ｇ、１０分）して上清と沈殿に分け，沈殿は破砕液０．１ｍＬで懸濁した。これらの試料の一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析し，発現を確認できた。この結果を図１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真に示す。
【００３０】
耐熱性フマル酸ヒドラターゼの発現が見られた試料についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後，エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写し，染色によって可視化された目的組換えタンパク質である耐熱性フマル酸ヒドラターゼのバンドを切り出し，プロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ４９２Ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて，アミノ末端配列を解析した結果、配列番号５に示すように１０残基のアミノ末端配列が決定できた。この配列により，発現タンパク質が耐熱性フマル酸ヒドラターゼであることを確認できた。この発現タンパク質は、４３９アミノ酸残基より構成されており、その推定分子量は４８．２ｋＤａであり、図１の結果とほぼ一致した。
【実施例３】
【００３１】
組換え大腸菌の大量培養
実施例２と同様にして調製したプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ−１１ａベクター） を用いて、大腸菌ＤＨ５α株を常法に従い形質転換した。形質転換された大腸菌ＤＨ５αからアルカリＳＤＳ法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡを用いて、大腸菌ロゼッタ・ガミ(Rosetta-Gami)（ＤＥ３）株を形質転換した。プレート上に生えてきたコロニーを３白金耳量とり、５ｍＬのＬＢＬ培地(１％ペプトン、０．５％酵母抽出液、０．５％ＮａＣｌ、０．１％ラクトース、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、４０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール)に植菌して、培養開始直前まで約６時間、３７℃で前培養した。この前培養液を全量、３Ｌの４×ＬＢＬ培地(４％ペプトン、２％酵母抽出液、 ２％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍＬアンピシリン)に加え、高密度培養槽(ABLE社製)にて３７℃、ｐＨ７．２、圧力０．０２Ｐａでコンピュータプログラム制御し、培養した。ｐＨは、オートクレーブ済みの２Ｍ  ＨＣｌ(和光純薬社製)および２Ｍ  ＮａＯＨ(和光純薬社製)で調整した。集菌約２５時間前にオートクレーブ済みの３００ｍＬ発現誘導液（１０％ラクトース、２０％グリセロール）を加えた。大腸菌の生育度が定常期に入ったところ（培養開始４８時間後）で大型遠心分離機(Beckman社製AvantiHP-30I)を用い集菌した。回収した菌体は、−３０℃で保存した。この時、菌体を少量、別に取り、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ β-メルカプトエタノール(和光純薬社製)に溶解・懸濁し、超音波破砕装置（TOMY社製UD-201）で破砕した。この溶液を２等分し、一方を９１００Ｇ 、４℃で１０分間、遠心分離し、上清と沈殿に分け、他方を７５℃に設定した恒温槽（TAITEC社製DryThermounit  DTU-1C）で１０分間、加熱した後、９１００Ｇ 、４℃で１０分間、遠心分離し、上清と沈殿に分けた。これら４種の上清および沈殿（沈殿は、菌体破砕液にて再縣濁）に変性剤（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２．４％β−メルカプトエタノール、０．００５％ ブロムフェノールブルー（和光純薬社製））を加え、９５℃で５分間加熱し、変性させた。これらの変性させたタンパク質溶液を１２．５％または１５％(発現させるタンパク質の分子量により異なる)ポリアクリルアミドゲルに加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行った。染色液(Quick-CBB、和光純薬社製)を用い、電気泳動後のゲルを染色・脱色し、目的タンパク質の発現を確認した。
【実施例４】
【００３２】
組換えタンパク質の精製
実施例３において、−３０℃で保存してあった菌体を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭ  β−メルカプトエタノールに溶解・懸濁し、超音波破砕装置（TOMY社製UD-201）で破砕し、７５℃に設定した恒温槽（TAITEC社製、DryThermoUnit DTU-1C）で１０分間、加熱した後、すばやく冷却した。次に、この破砕菌体液を大型遠心分離機（Beckman社製Avanti HP-30I）を用いて、１００，０００Ｇで１時間、遠心分離し、上清を回収した。
【００３３】
次に、この上清をタンパク質精製装置（Amersham Biosciences社製、AKTA explorer）を用いて、１．５Ｍ  硫安、 ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  β-メルカプトエタノールの緩衝溶液に置換した後、疎水交換カラム(Amersham Biosciences 社製, RESOURCETMPhe 6ml)に通した。１．５Ｍ→０の硫安濃度勾配で溶出させ、各画分をSDS-PAGEにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
【００３４】
次に、回収した画分を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  β−メルカプトエタノールの緩衝溶液に置換した後、陰イオン交換カラム（Amersham Biosciences社製、RESOURCETM Q  ６ｍｌ）に通した。塩化ナトリウムで溶出を行い、溶出してきた各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、目的タンパク質の画分を回収した。
【００３５】
次に、回収した画分を１０ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ    β−メルカプトエタノールに置換した後、遠心濃縮チューブ（ミリポア社製VIVASPIN10000）を用いて遠心分離して濃縮し、活性測定に供した。
【実施例５】
【００３６】
活性測定
１．測定方法
実施例４の精製タンパク質のフマル酸ヒドラターゼ活性を、下記の種々の条件下、Ｌ−リンゴ酸（Sodium L(-1)-Malate、和光純薬社製）からＬ−フマル酸への変換による２４０ｎｍの吸光度の減少をU-3000 分光光度計（HITACHI社製）によってモニターすることで測定した。反応は、基質（Ｌ−リンゴ酸：濃度は後述）と、１００ｍＭのＫＣｌと、５００ｎＭの実施例４の精製タンパク質とを含む５０ｍＭの緩衝溶液（後述のとおり、測定によって種類が異なる）中において、得られた２４０ｎｍの吸光度の減少量から、反応により分解されたリンゴ酸の濃度を求めた。濃度の計算には、各温度でのＬ−リンゴ酸のモル吸光係数を用いた。なお、反応は、実施例４で精製したタンパク質を溶液に加えることで開始した。
【００３７】
２．各温度での基質濃度−初速度ｖ０プロット、ＫＭ、Ｖｍａｘおよびｋcat
２５、５０、７０、８０、８５、９５℃の各温度での基質濃度−初速度v０プロットを作成した。基質濃度０．１、０．２、０．５、１、３、５、７、１０ｍＭで測定を行った。反応は、緩衝溶液には、９５℃では５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、９５℃以外では５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）を用いた。反応時間は、２５、５０℃では２０秒、それ以外の温度では１０秒とした。図２に、作成した各温度での基質濃度−初速度ｖ０プロットのグラフを示す。活性は８０〜８５℃で最大となった。なお、測定時間範囲内では、どの反応温度においても基質の自然分解は観測されなかった。
【００３８】
３．各温度でのＫＭ、Ｖｍａｘおよびｋcat
前記各温度での測定の際のＫＭ、Ｖｍａｘおよびｋcatを、表１に示す。
【００３９】
【表１】
2004298189.tif 000003
【００４０】
４．至適温度
前記各温度での測定の際のｋcatを、図３のグラフに示す。図示のとおり、８０〜８５℃で最大の活性を示した。
【００４１】
５．至適ｐＨ
ｐＨ３．９６、５．１６、５．６４、６．３２、６．８４、７．６９、７．９、８．５の各条件で、前記測定を行った。緩衝溶液には、ｐＨ３．９６、５．１４、５．６４ではＭＥＳ−ＨＣｌを、ｐＨ６．３２、６．８４、７．６９ではＴｒｉｓ−ＨＣｌを、ｐＨ７．９、８．５ではグリシン−ＨＣｌを用いた。反応温度は８５℃、反応時間は１０秒、基質濃度は１０ｍＭとした。測定結果を、図４のグラフに示す。図示のとおり、ｐH６．５〜８．５の範囲で一定の活性が認められ、至適ｐＨが８程度であることが分かった。
【００４２】
６．熱安定性
前記測定に先立ち、実施例４において精製したタンパク質溶液を、８０℃および９０℃で、０．５、１、１．５、２、２．５、３時間前処理した。前記前処理物を用いて前記測定を行い、kappを求めた。反応温度は８０℃、反応時間１０秒、基質濃度は１０ｍＭとした。なお、前処理時間０時間は、前処理を行っていないものである。測定結果を、図５のグラフに示す。図示のとおり、８０℃で前処理したものは、３時間処理したものでも活性を保持していたが、９０℃で前処理したものでは、徐々に活性を失っていくことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明により、フマル酸ヒドラターゼ活性を有する新規耐熱性タンパク質が提供できる。本発明のタンパク質は、高温下で使用することが可能であり、工業的用途が広がると共に、基質濃度の増加、反応効率の向上、混入微生物の除去、保存期間および耐用期間の延長などの多くの利点がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、本発明の一実施例における組換えタンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧＥ写真である。
【図２】図１は、本発明の一実施例における各温度での基質濃度−初速度ｖ０プロットである。
【図３】図３は、本発明の一実施例における温度−ｋａｐｐの関係を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の一実施例におけるｐＨ−ｋａｐｐの関係を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の一実施例における８０℃および９０℃における前処理時間−ｋａｐｐの関係を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列番号１：耐熱性フマル酸ヒドラターゼのアミノ酸配列
配列番号２：耐熱性フマル酸ヒドラターゼの塩基配列
配列番号３：耐熱性フマル酸ヒドラターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための順方向プライマーを示す。
配列番号４：耐熱性フマル酸ヒドラターゼの構造遺伝子の末端に制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを導入するための逆方向プライマーを示す。
配列番号５：Ｎ末端アミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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