(57)【要約】  【課題】  N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の生理的役割及び病態との関わりの解明、またN-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素を標的とした薬の開発に有用な動物モデルが求められている。  【解決手段】  本発明は、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失するようにゲノムが改変されたマウスまたはその子孫を提供する。    【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミン
の６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下また
は欠失するように、ゲノムが改変されたマウスまたはその子孫。
【請求項２】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミン
の６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子が
ノックアウトされた、請求項１に記載のマウスまたはその子孫。
【請求項３】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミン
の６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立
遺伝子のすべてがノックアウトされた、請求項１または２に記載のマウスまたは
その子孫。
【請求項４】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミン
の６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α1,6-フコシ
ルトランスフェラーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマウスまた
はその子孫。
【請求項５】
α1,6-フコシルトランスフェラーゼが、以下の (a)または(b)か
ら選ばれるDNAがコードする蛋白質である、請求項４に記載のマウスまたはその
子孫。
(a)   配列番号2で表される塩基配列からなるDNA；
(b)   配列番号2で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハ
イブリダイズし、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を
コードするDNA。
【請求項６】
α1,6-フコシルトランスフェラーゼが、以下の (a)、(b)及び(c)
からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項４に記載のマウスまたはその子孫
。
(a)   配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b)   配列番号1で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、
置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6-フコシ
ルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(c)   配列番号1で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ
酸配列からなり、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの
６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または
欠失するように、ゲノムが改変されたマウスまたはその子孫に関する。
【背景技術】
【０００２】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコ
ースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、哺乳動物では、α1,
6-フコシルトランスフェラーゼが知られている（非特許文献１）。α1,6-フコシ
ルトランスフェラーゼの遺伝子（非特許文献２）の構造は1996年に明らかにされ
ている（非特許文献３;非特許文献４;特許文献１）。α1,6-フコシルトランスフ
ェラーゼの酵素活性は多くの臓器で確認されているが、脳や小腸において比較的
高いことが報告されている（非特許文献５；非特許文献６）。生理的な機能とし
ては、網膜形成においてフコース修飾糖鎖が重要な役割を担っていることが指摘
されており、網膜形成とα1,6-フコシルトランスフェラーゼの発現調節との関わ
りが注目されている（非特許文献７）。血液凝固においても血小板由来のα1,6-
フコシルトランスフェラーゼの役割が指摘されている（非特許文献８）。また、
免疫グロブリンIgG1の糖鎖構造へのフコースの修飾がIgG1とFcγRIIIaとの結合
を変化させ、抗体自身の抗体依存性細胞障害活性が変化することも報告されてい
る（非特許文献９、非特許文献１０）。病態との関わりに関しても、肝臓癌や嚢
胞性繊維症などいくつかの疾病において、α1,6-フコシルトランスフェラーゼ活
性の上昇及び該酵素反応生成物の割合の増加が観察されており、これら疾患との
関連が指摘されている（非特許文献１１、非特許文献１２）。α1,6-フコシルト
ランスフェラーゼの過剰発現トランスジェニックマウスも作製され、作製された
トランスジェニックマウスにおいては肝臓や腎臓で脂肪症様の変性が観察される
ことが報告されている（非特許文献１３）。
【０００３】
しかしながら、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミ
ンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が低下または欠
失するようにゲノムが改変されたトランスジェニック非ヒト動物については、特
許文献２に開示されているが、該ゲノムが改変されたマウスについてはこれまで
に実際に作製されたという報告はない。
【非特許文献１】Biochem．Biophys. Res. Commun., 72, 909 (1976)
【非特許文献２】EC 2.4.1,68
【非特許文献３】J. Biol. Chem., 271, 27817 (1996)
【非特許文献４】J. Biochem., 121, 626, (1997)
【非特許文献５】Int. J. Cancer, 72, 1117 (1997)
【非特許文献６】Biochim. Biophys. Acta., 1473, 9 (1999)
【非特許文献７】Glycobiology, 9, 1171 (1999)
【非特許文献８】Biochem. Soc. Trans., 15, 603 (1987)
【非特許文献９】J. Biol. Chem., 277, 26733 (2002)
【非特許文献１０】J. Biol. Chem., 278, 3466 (2003)
【非特許文献１１】Hepatology, 13, 683 (1991)
【非特許文献１２】Hepatology, 28, 944 (1998)
【非特許文献１３】Glycobiology, 11, 165, (2001)
【特許文献１】WO92/27303
【特許文献２】WO02/31140
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサ
ミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素（以下、α1,
6-フコース修飾酵素と略記する）の活性が低下または欠失するように、ゲノムが
改変されたマウス及びその子孫を提供することにある。
本発明のマウス及びその子孫は、α1,6-フコース修飾酵素の生理的役割及び該
酵素との病態との関わりの解明に有用である。また、α1,6-フコース修飾酵素を
標的とした医薬の開発にも有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の(1)〜(6)に関する。
（１）  N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位
にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失
するように、ゲノムが改変されたマウスまたはその子孫。
（２）  N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位
にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノック
アウトされた、上記（１）に記載のマウスまたはその子孫。
（３）  N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位
にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子
のすべてがノックアウトされた、上記（１）または（２）に記載のマウスまたは
その子孫。
（４）  N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位
にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α1,6-フコシルトラ
ンスフェラーゼである、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のマウスまた
はその子孫。
（５）  α1,6-フコシルトランスフェラーゼが、以下の (a)または(b)から選ば
れるDNAがコードする蛋白質である、上記（４）に記載のマウスまたはその子孫
。
(a) 配列番号2で表される塩基配列からなるDNA；
(b) 配列番号2で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズし、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコ
ードするDNA。
（６）  α1,6-フコシルトランスフェラーゼが、以下の (a)、(b)及び(c)からな
る群から選ばれる蛋白質である、上記（４）に記載のマウスまたはその子孫。
(a) 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号1で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置
換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6-フコシル
トランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(c) 配列番号1で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸
配列からなり、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、α1,6-フコース修飾酵素の活性が低下または欠失するように
、ゲノムが改変されたマウス及びその子孫が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のマウスまたはその子孫とは、α1,6-フコース修飾酵素の活性が低下ま
たは欠失するように、ゲノムが改変されたマウスまたはその子孫であれば、いか
なるマウスまたはその子孫も包含される。
本発明において、α1,6-フコース修飾酵素としては、N-グリコシド結合複合型
糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反
応に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。α1,6-フコース修飾酵素
としては、具体的には、α1,6-フコシルトランスフェラーゼがあげられる。
【０００８】
本発明において、α1,6-フコシルトランスフェラーゼとしては、
下記(a)または(b)のDNAがコードする蛋白質、
(a) 配列番号2で表される塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号2で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズし、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコ
ードするDNA
または下記(c)、(d)または(e)の蛋白質があげられる。
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(d)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換
、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6-フコシルト
ランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
(e)配列番号1で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配
列からなり、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは
、例えば配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡなどのＤＮＡまたはその
一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク
・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法
等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいは
プラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩
化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２
倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウ
ム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルター
を洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼ
ーションは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989（以下、モレキュラー・クローニング第
２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,
1987-1997（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー
と略す）、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second E
dition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことが
できる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号２で表される
塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以
上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは
９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることが
できる。
【０００９】
本発明において、配列番号1で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ
酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα
1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、モレキュラー・クロ
ーニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジ
ー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA
, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 443
1 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的
変異導入法を用いて、例えば、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白
質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することがで
きる蛋白質を意味する。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の
数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法
等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば
、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ま
しくは１〜５個である。
【００１０】
また、本発明において、配列番号1で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相
同性を有し、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、
ＢＬＡＳＴ〔J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)〕やＦＡＳＴＡ〔Methods in Enz
ymology, 183, 63 (1990)〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号1
に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも８０％以上、好ましくは８５
％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好まし
くは９７％以上、最も好ましくは９９％以上である蛋白質であることを意味する
。
【００１１】
本発明において、α1,6-フコース修飾酵素の活性が低下または欠失するように
ゲノムが改変されたとは、該酵素の発現を低下または欠失させるように該遺伝子
の発現調節領域に変異を導入したり、あるいは該酵素の機能を低下させるように
該遺伝子のアミノ酸配列に変異を導入することを意味する。変異を導入するとは
、ゲノム上の塩基配列に欠失、置換、挿入および／または付加といった塩基配列
の改変を行うことを意味し、改変したゲノム遺伝子の発現または機能を完全に抑
制することをノックアウトするという。ゲノム遺伝子をノックアウトする具体的
な例としては、標的となる遺伝子のすべてまたは一部がゲノムから削除された例
が挙げられる。このようなマウスまたはその子孫を取得する方法としては、目的
とするゲノムの改変を行うことができれば、いずれの手法でも用いることができ
る。具体的には、酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法、酵素について突
然変異を導入する方法、目的とした遺伝子改変を施した細胞の核を用いたクロー
ン個体の作製方法などがあげられる。
【００１２】
以下、本発明のマウス及びその子孫の作出方法と利用方法について詳細に説明
する。
１．本発明のマウス及びその子孫の作出方法
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明のマウス及びその子孫は、α1,6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし
、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。α1,6-フコース
修飾酵素としては、具体的には、α1,6-フコシルトランスフェラーゼがあげられ
る。
【００１３】
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる
方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、相同組換え法、ＲＤ
Ｏ法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられ
る。以下これらを具体的に説明する。
（ａ）相同組換え法による本発明のマウス及びその子孫の作製
本発明のマウス及びその子孫は、α1,6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし
、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製するこ
とができる。
【００１４】
染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo A Laborato
ry Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)（
以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュ
アル」と略す）、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford
University Press (1993)、バイオマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティ
ング, ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社 (1995)（以下、「ＥＳ細胞を
用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の染色体工学の手法を用い、例えば
以下のように行うことができる。
【００１５】
α1,6-フコース修飾酵素のｃＤＮＡを取得する。
取得したｃＤＮＡの塩基配列に基づき、α1,6-フコース修飾酵素のゲノムＤＮ
Ａを調製する。
該ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、α1,6-
フコース修飾酵素の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えす
るためのターゲットベクターを作製する。
【００１６】
作製したターゲットベクターを胚性幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲット
ベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択する。
選択した胚性幹細胞を公知の注入キメラ法あるいは集合キメラ法に従って、受
精卵に導入し、導入した受精卵を偽妊娠雌性マウスの卵管あるいは子宮に移植す
ることで生殖系列キメラを選択する。
【００１７】
選択した生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、導入したターゲットベ
クターが、α1,6-フコース修飾酵素をコードするゲノム上の遺伝子領域と相同組
換えを起こして挿入された染色体を有する個体を選択する。
選択した個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、
導入したターゲットベクターが、α1,6-フコース修飾酵素をコードするゲノム上
の遺伝子領域と相同組換えを起こして挿入された染色体を有するホモ接合体を選
択する。
【００１８】
得られたホモ接合体同士を交配させ、その子孫を得ることにより、本発明のマ
ウス及びその子孫を作製することができる。
α1,6-フコース修飾酵素のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを取得する方法としては
、例えば、以下に記載の方法があげられる。  
ｃＤＮＡの調製方法
改変を施したいマウスの細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。
【００１９】
調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
α1,6-フコース修飾酵素の既知アミノ酸配列、例えばヒトのアミノ酸配列に基
づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリ
ーを鋳型としてＰＣＲ法にて、α1,6-フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片
を取得する。
【００２０】
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングし、α1,6-フコース修飾酵素をコードするｃＤＮＡを取得することができ
る。
マウスの細胞のｍＲＮＡは、市販のもの(例えばClontech社)を用いてもよいし
、以下のごとく全ＲＮＡを調製し、これからｍＲＮＡを調製してもよい。細胞か
ら全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢
酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology), 1
54, 3 (1987)］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（Ａ
ＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry),
162, 156 (1987); 実験医学、9, 1937 (1991)］などがあげられる。
【００２１】
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法と
しては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニン
グ第２版）等があげられる。
さらに、Fast Track mRNA Isolation Kit（Invitrogen社）、Quick Prep mRNA
Purification Kit（Pharmacia社）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを
調製することができる。
【００２２】
調製したマウスの細胞のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤ
ＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレン
ト・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、A Laboratory Manua
l, 2 nd Ed.(1989)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばSuperSc
ript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Life Technol
ogies社）、ZAP-cDNA Synthesis Kit（STRATAGENE社）を用いる方法などがあげ
られる。
【００２３】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸
菌K12株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベク
ター等いずれでも使用できる。具体的には、ZAP Express［STRATAGENE社、スト
ラテジーズ(Strategies), 5, 58 (1992)］、pBluescript II SK(+)［ヌクレイッ
ク・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research), 17, 9494 (1989)］、Lambd
a ZAP II（STRATAGENE社）、λgt10、λgt11［ディーエヌエー・クローニング・
ア・プラクティカル・アプローチ(DNA cloning, A Practical Approach),1, 49 
(1985)］、λTriplEx（Clontech社）、λExCell（Pharmacia社）、pT7T318U（Ph
armacia社）、pcD2［モレキュラー・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.
), 3, 280 (1983)］およびpUC18［ジーン(Gene), 33, 103 (1985)］等をあげる
ことができる。
【００２４】
宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ま
しくは大腸菌が用いられる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue MRF'［ST
RATAGENE社、ストラテジーズ(Strategies), 5, 81 (1992)］、Escherichia coli
C600［ジェネティクス(Genetics), 39, 440 (1954)］、Escherichia coli Y108
8［サイエンス(Science),222, 778 (1983)］、Escherichia coli Y1090［サイエ
ンス(Science), 222, 778 (1983)］、Escherichia coli NM522［ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 166, 1 (1983)］、Escheric
hia coli K802［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol
.), 16, 118 (1966)］およびEscherichia coli JM105［ジーン(Gene), 38, 275 
(1985)］等が用いられる。
【００２５】
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全
長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、
菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン(Gene), 138, 171 (1994); ジーン(
Gene), 200, 149 (1997); 蛋白質核酸酵素, 41, 603 (1996); 実験医学, 11, 24
91 (1993); ｃＤＮＡクローニング(羊土社 )(1996); 遺伝子ライブラリーの作製
法(羊土社) (1994)］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用
いてもよい。
【００２６】
α1,6-フコース修飾酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコード
することが予測される塩基配列の5’末端および3’末端の塩基配列に特異的なデ
ジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型と
してＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ(PCR Protocols), Academic Pr
ess (1990)］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、α1,6-フコース修飾酵素
をコードする遺伝子断片を取得することができる。
【００２７】
取得した遺伝子断片がα1,6-フコース修飾酵素をコードするＤＮＡであること
は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキ
シ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(P
roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ
３７７ＤＮＡシークエンサー（PE Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用
いて分析することにより、確認することができる。
【００２８】
該遺伝子断片をＤＮＡプローブとして、改変を施したいマウスの細胞に含まれ
るｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー対してコロニー
ハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・ク
ローニング第２版）を行うことにより、α1,6-フコース修飾酵素のＤＮＡを取得
することができる。
【００２９】
また、α1,6-フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用い
たプライマーを用い、改変を施したいマウスの細胞に含まれるｍＲＮＡから合成
したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてス
クリーニングを行うことにより、α1,6-フコース修飾酵素のＤＮＡを取得するこ
ともできる。
【００３０】
取得したα1,6-フコース修飾酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を末端から、
通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキシ法
［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ３７
７ＤＮＡシークエンサー（PE Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用いて
分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００３１】
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラム
を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベー
スを検索することにより、データベース中の遺伝子の中でα1,6-フコース修飾酵
素をコードしている遺伝子を決定することもできる。
上記の方法で得られるα1,6-フコース修飾酵素をコードしている遺伝子の塩基
配列としては、例えば、配列番号２に記載の塩基配列が挙げられる。
【００３２】
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用した
パーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機model 392等のＤＮＡ合成機で化学合成す
ることにより、α1,6-フコース修飾酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
α1,6-フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以
下に記載の方法が挙げられる。
【００３３】
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版や
カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された
公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシス
テム（Genome Systems社）やUniversal GenomeWalkerTM Kits（CLONTECH社）な
どを用いることにより、α1,6-フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡを単離すること
もできる。
【００３４】
上記の方法で得られるα1,6-フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列は、
上記方法で取得された、α1,6-フコース修飾酵素のｃＤＮＡ配列が含まれている
ことから確認できる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Gene Targeting,
A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、バイ
オマニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング, ＥＳ細胞を用いた変異マウ
スの作製(羊土社)(1995)等に記載の方法にしたがって作製することができる。タ
ーゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型、ジーントラップ
型いずれでも用いることができる。
【００３５】
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを
導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーシ
ョン法［サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133 (1990)］、リン酸カル
シウム法［特開平2-227075］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),
84, 7413 (1987)］、インジェクション法[Manipulating the Mouse Embryo A L
aboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1
994)（以下、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版と略す）]、パ
ーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第2606856、特許第2517813］、
ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４―遺伝子導入と発現・
解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編(1994)］、ウイルスベクター法[マニピュ
レーティング・マウス・エンブリオ第２版]等をあげることができる。
【００３６】
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Gene Targeting, A Pr
actical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、バイオマ
ニュアルシリーズ８ ジーンターゲッティング, ＥＳ細胞を用いた変異マウスの
作製(羊土社)(1995)等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ
選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。具体的には、hprt遺伝子を
含むターゲットベクターの場合は、hprt遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導入後、
胚性幹細胞をアミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地で培養
し、アミノプテリン耐性の株を選別することにより、hprt遺伝子を含む相同組換
え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ネオマイシン耐性遺伝子
を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞をG418を含
む培地で培養し、G418耐性の株を選別することにより、ネオマイシン耐性遺伝子
を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。DT遺伝子
を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞を培養し、
生育してきた株を選別する（相同組換え以外のランダムに染色体に挿入された組
換え体は、DT遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、DTの毒性により生育
できない）ことにより、DT遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネガティブ
選択を行なうことができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を
選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法
（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコ
ールズ(PCR Protocols), Academic Press (1990)］等があげられる。
【００３７】
胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８
細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。胚性幹細胞を注入キメ
ラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期から胚盤胞の発生
段階の受精卵を用いることが好ましい。
雌マウスへ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配さ
せることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスに得られた受精卵を人工的
に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌マウスは自然交配によっても
得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、LHRHと略する）あるいはそ
の類縁体を投与後、雄マウスと交配させることにより、受精能を誘起された偽妊
娠雌マウスを得ることもできる。LHRHの類縁体としては、例えば[3,5-Dil-Tyr5]
-LHRH、[Gln8]-LHRH、[D-Ala6]-LHRH、des-Gly10-[D-His(Bzl)6]-LHRH ethylami
de等があげられる。
(ｂ)ＲＤＯ方法による本発明のマウス及びその子孫の作製
本発明のマウス及びその子孫は、α1,6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし
、ＲＤＯ（RNA-DNA oligonucleotide）法を用い、例えば、以下のように作製す
ることができる。
【００３８】
上述のようにして、α1,6-フコース修飾酵素のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡ
を調製し、調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、α1,6-フコース修飾酵素をコードする部分、
非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンスト
ラクトを設計し合成する。
【００３９】
合成したＲＤＯを胚性幹細胞に導入し、標的とした酵素、すなわちα1,6-フコ
ース修飾酵素に変異が生じた胚性幹細胞を選択する。
選択した胚性幹細胞を注入キメラ法あるいは集合キメラ法に従って、受精卵に
導入し、導入した受精卵を偽妊娠雌性マウスの卵管あるいは子宮に移植すること
で生殖系列キメラを選択する。
【００４０】
選択した生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、導入したターゲットベ
クターが、α1,6-フコース修飾酵素をコードするゲノム上の遺伝子領域と相同組
換えを起こして挿入された染色体を有する個体を選択する。
選択した個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、
導入したターゲットベクターが、α1,6-フコース修飾酵素に関与する酵素をコー
ドするゲノム上の遺伝子領域と相同組換えを起こして挿入された染色体を有する
ホモ接合体を選択する。
【００４１】
得られたホモ接合体同士を交配させ、その子孫を得ることにより、本発明のマ
ウス及びその子孫を作製することができる。
胚性幹細胞へのＲＤＯの導入には、上記１の（１）の（ａ）に記載のターゲッ
トベクターの導入方法を用いることができる。
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる
。
【００４２】
ＲＤＯを胚性幹細胞に導入し、α1,6-フコース修飾酵素の遺伝子に変異が生じ
た細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・
プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺
伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
ＲＤＯのコンストラクトは、サイエンス(Science), 273, 1386, (1996); ネイ
チャー・メディシン(Nature Medicine), 4, 285, (1998); へパトロジー(Hepato
logy), 25, 1462, (1997); ジーン・セラピー(Gene Therapy), 5, 1960, (1999)
; ジーン・セラピー(Gene Therapy), 5, 1960, (1999); ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・メディシン(J. Mol. Med.), 75, 829, (1997); プロシーディング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. 
USA), 96, 8774, (1999); プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768, (1999); ヌクレイ
ック・アシッド・リサーチ(Nuc. Acids. Res.), 27, 1323, (1999); インベステ
ィゲーション・オブ・ダーマトロジー(Invest. Dematol.), 111, 1172, (1998);
ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.), 16, 1343, (1998); ネイ
チャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.), 18, 43, (2000); ネイチャー
・バイオテクノロジー(Nature Biotech.), 18, 555, (2000)等の記載に従って設
計することができる。
（ｃ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明のマウス及びその子孫の作製
本発明のマウス及びその子孫は、ネイチャー・ジェネティク(Nature Genet.)
，25, 35, (2000)等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、α1,6-フコース
修飾酵素の突然変異体を選択することで作製することができる。
【００４３】
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させ
ることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれ
た外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体
上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞
の中に導入する。
【００４４】
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいか
なるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺
伝子も用いることができる。
細胞への遺伝子の導入には、上記１の（１）の（ａ）に記載のターゲットベク
ターの導入方法を用いることができる。
（２）酵素についての突然変異を導入する手法
本発明のマウス及びその子孫は、α1,6-フコース修飾酵素の遺伝子について突
然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望のマウスを選択する手法を用い
ることにより作製することができる。
【００４５】
具体的には、突然変異誘発処理で処理した生殖細胞より出産した突然変異体あ
るいは自然発生的に生じた突然変異体から、α1,6-フコース修飾酵素の遺伝子に
変異が生じた所望のマウスを選択する方法が挙げられる。
生殖細胞としては、精子や卵あるいは胚性幹細胞などの個体を形成しうる能力
を有する細胞があげられる。
【００４６】
突然変異誘発処理としては、細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレー
ムシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アク
リジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル
化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物
質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術 第三版（朝倉書
店）日本組織培養学会編(1996)、ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genet.),
24, 314, (2000)等に記載の方法を挙げることができる。
【００４７】
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さない
で、通常の飼育を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げるこ
とができる。  
（３）目的とした遺伝子改変を施した細胞の核を用いたクローン個体の作製方法
本発明のマウス及びその子孫は、文献に記載されたクローンマウス（T. Wakay
amaら; Nature, 394, 369, 1998、T. Wakayamaら; Nature Genetics, 22, 127, 
1999）の作製方法を用い、例えば以下のように作製することができる。
【００４８】
上記１．の（１）または（２）に記載した方法を用い、マウスの任意の細胞の
染色体上の、α1,6-フコース修飾酵素遺伝子に変異を導入する。
次に、得られた細胞の核を初期化（核を再び発生を繰り返すことができるよう
な状態に戻す操作）する。
初期化した細胞の核を除核したマウスの未受精卵に注入することによって発生
を開始させる。
【００４９】
発生を開始した卵を雌マウスに人工的に移植および着床させることによって、
α1,6-フコース修飾酵素遺伝子に変異が導入されたヘテロ接合体を得る。
得られたヘテロ接合体同士を交配することにより、ホモ接合体を得る。
得られたホモ接合体同士を交配し、その子孫を得ることにより、本発明のマウ
ス及びその子孫を作製することができる。
【００５０】
細胞の核を初期化する方法は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なるこ
とが知られているが、マウスなどの場合は、同種の非ヒト哺乳動物の除核した未
受精卵に、外来性遺伝子を導入した細胞の核を注入し数時間、好ましくは約１〜
６時間培養することで初期化することが好ましい。
初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法も、非ヒト哺
乳動物の種類によりそれぞれ異なることが知られているが、マウスなどの場合は
、外来性遺伝子を導入した細胞の核を注入した未受精卵を、卵子活性化物質（例
えば、ストロンチウムなど）で刺激し細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラ
シンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることが
好ましい。
【００５１】
発生を開始した卵を雌マウスに人工的に移植および着床させる方法としては、
上記１．の（１）の（ａ）に記載の方法などがあげられる。
２．本発明のマウス及びその子孫の利用
（１）本発明のマウス及びその子孫を用いた、α1,6-フコース修飾酵素の生理機
能の解析
本発明のマウス及びその子孫では、α1,6-フコース修飾酵素の活性が低下または
欠失するようにゲノムが改変されているため、１）発生の過程における該酵素の
生理的な役割、２）発生後から成体に至る過程での該酵素の生理的な役割、３）
成体での該酵素の生理的な役割等を調べることが可能である。
また、α1,6-フコース修飾酵素としては、α1,6-フコシルトランスフェラーゼが
知られているが、同様な酵素活性を有するアイソザイムが存在しないかを各種臓
器レベルで明らかにすることができる。
また、正常個体、ヘテロ接合体、ホモ接合体を比較することで、α1,6-フコース
修飾酵素の量的な変化が及ぼす生理的な影響を観察することもできる。
（２）本発明のマウスまたはその子孫を用いた物質の薬理評価方法
本発明のマウスまたはその子孫は、α1,6-フコース修飾酵素との関連が疑われ
ている疾患において、該病気との因果関係を明確にし、その対処療法あるいは根
本療法を見出すためのツールとして有用である。
【００５２】
具体的には、本発明のマウスまたはその子孫に試験物質を投与し、試験物質を
投与しない動物と比較して、該動物の血圧、呼吸数、体重等の種々の身体的パラ
メーターの測定、外見や行動の観察、病理組織学的検討等の薬理作用を調べるこ
とにより、該試験物質の薬理評価を行なうことができる。時に、ヒトの疾患にお
いて観察されている症状と同様な症状についての知見は重要であり、治療薬開発
への重要なデータをとることができる。
【００５３】
また、本発明のマウス及びその子孫に各種の疾患を誘発させた病態モデル動物
を作製し、該病態モデル動物に試験物質を投与し、該病態モデル動物の血圧、呼
吸数、体重等の種々の身体的パラメーターの測定、病態や、外見、行動の観察、
病理組織学的検討等を、試験物質を投与しない該病態モデル動物と比較して行な
うことにより、α1,6-フコース修飾酵素の活性が低下または欠失した動物におけ
る、該試験物質の該疾患に対する有効性および副作用等の薬理評価を行なうこと
ができる。また、この評価に基づき、該疾患の治療薬として好ましい物質を選択
することができる。
【００５４】
本発明のマウス及びその子孫に誘発させる疾患としては、心疾患（例えば、急
性心不全、慢性心不全、心筋炎など）、呼吸器系疾患、関節疾患（例えば、関節
リュウマチ、変形性関節症など）、腎疾患（例えば、腎不全、糸球体腎炎、Ｉｇ
Ａ腎症など）、動脈硬化症、乾癬症、高脂血症、アレルギー疾患（例えば、喘息
、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎など）、骨疾患（例えば、骨粗鬆症、く
る病、骨軟化症、低カルシュウム血症など）、血液疾患、脳血管性傷害、外傷性
脳障害、感染症、痴呆症、癌、糖尿病、肝疾患、皮膚疾患、神経変性疾患および
慢性炎症性疾患などがあげられる。病態モデル動物の作製は、「マニュアル疾患
モデルマウス」〔Molecular Medicine, 31 臨時増刊号, 中山書店  (1994)〕、
「図説・薬理学のための病態動物モデル」〔西村書店  (1984)〕、「関節炎モデ
ル動物」〔医歯薬出版  (1985)〕、「神経・筋疾患モデル動物」〔医歯薬出版  
(1982)〕、「活性酸素と病態  疾患モデルからベッドサイドへ」〔学会出版セン
ター  (1992)〕等に記載の方法を用いることができる。
（３）本発明のマウス及びその子孫から得られる細胞を用いた物質の薬理評価方
法
本発明のマウス及びその子孫から得られる種々の細胞と、試験物質とを接触さ
せ、試験物質非存在下での細胞と比較して、細胞内のCa2+濃度の上昇等の種々の
細胞の応答や細胞の形態の変化等の薬理作用を調べることにより、試験物質の該
細胞に対する薬理評価を行なうことができる。
【００５５】
また、本発明のマウス及びその子孫から得られる胚性幹細胞を分化誘導するこ
とにより、さまざまな種類の細胞を得ることができる。分化の誘導方法としては
、胚性幹細胞を同種同系統の動物の皮下に移植することにより、様々な組織が混
じりあった奇形腫瘍（テラトーマ）を誘導する方法（マニピュレーティング・マ
ウス・エンブリオ第２版）、適当な条件でインビトロ培養することにより、内胚
葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、血液細胞、内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞
、平滑筋細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケ
ラチノサイトに分化誘導する方法（Reprod. Fertil. Dev., 10, 31, 1998）をあ
げることができる。この分化後の細胞と、試験物質とを接触させ、試験物質非存
在下での細胞と比較して、細胞内のCa2+濃度の上昇等の種々の細胞の応答や細胞
の形態の変化等の薬理作用を調べることにより、試験物質の該細胞に対する薬理
評価を行なうことができる。これらの方法によって、ヒト患者の生体から摘出し
にくい細胞や少数しか存在しない細胞などに対する薬理評価を行うことができる
。
（４）本発明のマウス及びその子孫の胚性幹細胞、卵、精子、核を用いた遺伝子
改変動物の作製
本発明のマウス及びその子孫から得られる胚性幹細胞、卵、精子または核を用
いて、上記１．に記載の方法により、α1,6-フコース修飾酵素の活性が低下また
は欠失するようにゲノムが改変され、かつさらなる染色体上の遺伝子の改変を行
った遺伝子改変マウスを得ることができる。特に、その遺伝子の機能を破壊する
ことである病態が惹起されることが公知になっている遺伝子を上記１．に記載し
た相同組換えの手法を利用して欠損させたノックアウトマウスや、該遺伝子の機
能を阻害するドミナントネガティブ体の遺伝子を導入し発現させたトランスジェ
ニックマウスは、病態モデル動物として有用である。
（５）本発明のマウスまたはその子孫と同種他系統の動物との交配による遺伝子
改変動物の作製と作製された該遺伝子改変動物の利用
本発明のマウスまたはその子孫と同種他系統の動物（例えば、ヒト疾患モデル
動物）とを交配させることにより、α1,6-フコース修飾酵素の活性が低下または
欠失するようにゲノムが改変され、かつある表現系（例えば、ヒト病態と類似の
症状）を示す遺伝子改変マウスを得ることができる。交配するマウスが、ヒト疾
患モデル動物であれば、α1,6-フコース修飾酵素の活性が低下または欠失するよ
うにゲノムが改変され、かつヒト病態と類似の症状を表現系として示す病態モデ
ル動物が得られる。交配の方法としては、自然交配以外に体外受精の方法があげ
られる。疾患モデル動物としては、先天性および後天性を疾患を問わずいかなる
疾患モデル動物も用いることができる。例えば後天性の病態モデル動物は、「マ
ニュアル疾患モデルマウス」〔Molecular Medicine, 31 臨時増刊号, 中山書店
(1994)〕、「図説・薬理学のための病態動物モデル」〔西村書店  (1984)〕、
「関節炎モデル動物」〔医歯薬出版  (1985)〕、「神経・筋疾患モデル動物」〔
医歯薬出版  (1982)〕、「活性酸素と病態  疾患モデルからベッドサイドへ」〔
学会出版センター  (1992)〕等に記載の方法により作製することができる。
（６）遺伝子改変動物を用いた物質の薬理評価方法
上記（４）および（５）に記載の方法で得られた遺伝子改変病態モデル動物に
試験物質を投与し、該病態モデル動物の血圧、呼吸数、体重等の種々の身体的パ
ラメーターの測定、病態や、外見、行動の観察、病理組織学的検討等を、試験物
質を投与しない該病態モデル動物と比較して行なうことにより、該試験物質の該
疾患に対する有効性および副作用等の薬理評価を行なうことができる。また、こ
の評価に基づき、該病態の治療薬として好ましい物質を選択することができる。
【００５６】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単な
る例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５７】
実施例１．α1,6-フコシルトランスフェラーゼ両対立遺伝子を欠失したトラン
スジェニックマウスの作出
α1,6-フコシルトランスフェラーゼ（以下、FUT8とも呼ぶ）両対立遺伝子の翻
訳開始コドンを含むゲノム領域を欠失したマウスの作出を以下のようにして行っ
た。
【００５８】
１．マウスα1,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8）遺伝子翻訳開始コドン
を含むゲノム領域の単離
ブタFUT8 cDNA全長[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. B
iol. Chem., 271, 27810 (1996) ]のうち、5’末端側非翻訳領域39bpから翻訳領
域373bpを含む断片（412bp）を制限酵素SacI消化により調製した。これをプロー
ブとして、モレキュラー・クローニング 第二版[Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual, 2 nd Ed. (1989) ]に記載の公知の方法に従い、129SVJ系統マウス
由来l-ファージゲノムライブラリー（STRATEGENE社）よりマウスFUT8翻訳開始コ
ドンの位置するエクソンを含む13.9Kbのゲノムクローンを単離した（図１）。
【００５９】
次に、取得したゲノムクローンを各種制限酵素を用いて消化した後、上記ブタ
FUT8 cDNA部分断片412bpをプローブとして、モレキュラー・クローニング 第二
版[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd Ed. (1989) ]に記載の公知
の方法に従いサザンブロットを行った。その結果陽性を示した制限酵素断片のう
ち、翻訳開始コドンの位置するエクソンおよび上流イントロン領域をコードする
XbaI-XbaI断片(約2.9Kb)、および翻訳開始コドンの位置するエクソンおよび下流
イントロン領域をコードするSacI-SacI断片(約6.6Kb)を選択し、pBluescriptII 
KS(+)（Strategene社）へ各々挿入した（図１）。
【００６０】
２．マウスα1,6-フコシルトランスフェラーゼFUT8）遺伝子翻訳開始コドンを
破壊するためのターゲティングベクタープラスミドの構築
本実施例第１項で得たXbaI-XbaI領域(約2.9Kb)のうち、5’末端側のXbaI-SacI
領域(2.6Kb)を5’末端側相同領域とする一方、本実施例第１項で得たSacI-SacI
領域(約6.6Kb) のうち、3’末端側のHindIII-XhoI領域(約6.1Kb)を3’末端側相
同領域として各々配置することにより、翻訳開始コドンを含むSacI-HindIII領域
(184bp)を欠失したターゲティングベクタープラスミドを構築した。以下にその
詳細を示す。
【００６１】
まず、プラスミドpMC1DTpA［トランスジェニック・リサーチ(Transgenic Rese
arch), 8, 215 (1999) ］を制限酵素XhoIおよびNotIで消化し、得られたジフテ
リア毒素A鎖(DT-A)遺伝子を含む1.5Kbの断片にNotI-XhoIアダプターを連結する
ことにより、両端をXhoI認識部位に置換した。一方、本実施例第１項で得たFUT8
3’末端側SacI-SacI領域(約6.6Kb)を含むpBluescriptII KS(+)に対し制限酵素X
hoIを反応させ、HindIII-XhoI領域(約6.1Kb)を含む8.3Kbの断片を得た。上記で
得たFUT8 3’末端側相同領域を含むXhoI-XhoI断片（8.3Kb）およびDT-A遺伝子を
含むXho-Xho断片(1.5Kb)を連結し、プラスミドIを構築した。
【００６２】
次に、pGT1.8IresBgeo［プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 91, 4303 (1994) ］
を制限酵素SalIで完全消化した後、さらに制限酵素SacIで部分消化することによ
り、内部リボソーム翻訳開始部位(IRES)、β‐ガラクトシダーゼ遺伝子(LacZ)、
ネオマイシン耐性遺伝子(Neor)およびポリA付加シグナル(pA)を連結させた薬剤
選抜用発現ユニット(以下、IRES-LacZ-Neor-pAカセットと称す)を含む4.9Kbの断
片を得た。一方、本実施例第１項で得たFUT8 5’末端側XbaI-XbaI領域(約2.9Kb)
を含むpBluescriptII KS(+)に対し、制限酵素SacIおよびSalIを反応させ、XbaI-
SacI領域(2.6Kb)を含む5.3Kbの断片を得た。上記で得たFUT8 5’末端側相同領域
を含むSacI-SalI断片（5.3Kb）およびIRES-LacZ-Neor-pAカセットを含むSacI-Sa
lI断片(4.9Kb)を連結し、プラスミドIIを構築した。
【００６３】
最後に、プラスミドIを制限酵素NotIおよびSalIで消化して得られる9.4Kbの断
片へ、プラスミドIIを制限酵素NotIおよびSalIで消化して得られる7.6Kbの断片
を連結させることにより、マウスFUT8遺伝子破壊用ターゲティングベクタープラ
スミド(17.0Kb)を構築した（図２）。
３．マウス胚性幹細胞におけるα1,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8）遺
伝子ゲノム領域の相同組換え
（１）フィーダー細胞の調製
相同組換えに用いるマウス胚幹細胞は、マウス初代繊維芽細胞（EMFI細胞）を
フィーダーとして用い培養維持した。胚性幹細胞の培養維持に用いた該フィーダ
ー細胞は以下の記述に従って調製した。
【００６４】
まず、ジーン・ターゲティング［Gene Targeting ,IRL PRESS at Oxford Univ
ersity Press (1993)］の記載に従って、８週齢以上の雌のネオマイシン耐性遺
伝子導入マウス（大阪大学遺伝情報実験センター・岡部 勝教授より供与）より
受精後13.5日から15.5日の胎児を摘出し、これを材料として初代繊維芽細胞（EM
FI細胞）を調製した後、マイトマイシンC処理により増殖能を不活化させた。続
いてマイトマイシン処理したEMFI細胞をFM培地［10％ ウシ胎児血清（Invitroge
n社）、55μmol/l β-メルカプトエタノール（Invitrogen社）、1mmol/l MEMピ
ルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）、0.1mmol/l MEM非必須アミノ酸（Invitro
gen社）、3mmol/l アデノシン（SIGMA社）、3mmol/l グアノシン（SIGMA社）、3
mmol/l シチジン（SIGMA社）、3mmol/l ウリジン（SIGMA社）、1mmol/l チミジ
ン（SIGMA社）、2mmol/l L-グルタミン（Invitrogen社）、100単位/ml ペニシリ
ンおよび100μg/ml ストレプトマイシン（Invitrogen社）を含むダルベッコ改変
イーグル培地（DMEM; Invitrogen社）］に2.5×105個/mlとなるように懸濁した
後、0.1% ゼラチンコート処理済み細胞培養用ディッシュ（6cm径、10cm径；旭テ
クノグラス社）または0.1% ゼラチンコート処理済み平底プレート（96穴、24穴
、６穴；旭テクノグラス社）に播種し、5%CO2、37℃の条件下で24時間培養する
ことによりフィーダープレートを作製した。作製したフィーダープレートは作製
後１週間以内に用いた。なお、フィーダー細胞としては、上述のフィーダー細胞
を用いる他に、例えば、ライフテックオリエンタル株式会社市販のNeo耐性初代
培養細胞（カタログ番号YE9284100）を用いることもできる。
【００６５】
（２）胚性幹細胞へのターゲティングベクターの導入
マウス胚性幹細胞D3（名古屋大学医学部・村松 喬教授より供与され、大阪大
学遺伝情報実験センターにて維持）の培養は、ESM培地［20％ ウシ胎児血清（In
vitrogen社）、55μmol/l β-メルカプトエタノール（Invitrogen社）、1mmol/l
MEMピルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）、0.1mmol/l MEM非必須アミノ酸（I
nvitrogen社）、3mmol/l アデノシン（SIGMA社）、3mmol/l グアノシン（SIGMA
社）、3mmol/l シチジン（SIGMA社）、3mmol/l ウリジン（SIGMA社）、1mmol/l 
チミジン（SIGMA社）、2mmol/l L-グルタミン（Invitrogen社）、100単位/ml ペ
ニシリンおよび100μg/ml ストレプトマイシン（Invitrogen社）、1000単位/ml 
ESGROTM（マウス組換え型白血病阻害因子；SIGMA Invitrogen社）を含むダルベ
ッコ改変イーグル培地（DMEM; Invitrogen社）］を用いて行った。まず、6cm径
ディッシュを用いて作製したフィーダープレートへ凍結融解したD3p11細胞を播
種し、5%CO2、37℃の条件下で培養した。24時間後、10cm径ディッシュを用いて
作製したフィーダープレート３枚へD3細胞を継代した。
【００６６】
本実施例第２項で得たターゲティングベクタープラスミドのD3細胞への遺伝子
導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 1
33 (1990)］に準じて以下の手順で行った。まず、ターゲティングベクタープラ
スミド 20μgを制限酵素NotIで消化することにより線状化した後、フェノール/
クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、1μg/μl溶液とした。一方
、10cm径ディッシュへの継代培養後48時間経過したD3p11細胞より培養上清を除
去し、新鮮なESM培地へ交換した。D3細胞が70%コンフレントに達したことを確認
した後、PBS緩衝液（Invitrogen社）に懸濁して1×107個/mlとした。細胞懸濁液
800μl（8.0×106個）を上記線状化プラスミド 20μgと混和した後、細胞−DNA
混和液の全量をGene Pulser Cuvette(電極間距離4mm)(BIO-RAD社)へ移し、細胞
融合装置Gene Pulser(BIO-RAD社)を用いてパルス電圧250V、電気容量500μFの条
件で遺伝子導入を行った。導入後、細胞懸濁液をESM培地 40mlに懸濁し、10cm径
ディッシュを用いて作製したフィーダープレート３枚および6cm径ディッシュを
用いて作製したフィーダープレート２枚へ播種した。5%CO2、37℃の条件下で16
時間以上培養した後、培養上清を除去し、150μg/ml G418（Invitrogen社）を添
加したESM培地へ交換した。この培地交換作業をほぼ毎日繰り返しながら８日間
の培養を行い、薬剤耐性株を取得した。なお、マウス胚性幹細胞としては、上述
のマウス胚性幹細胞のほかに、129系統マウス由来の胚性幹細胞、例えば、ＡＴ
ＣＣより購入可能なマウス胚性幹細胞Ｄ３（CRL-11632）、米国Cell & Technolo
gies社やDNX Transgenic Sciences社製の129系統マウス由来の胚性幹細胞を用い
ることもできる。
【００６７】
（３）ターゲティングベクター導入株の取得
本項（２）で得た薬剤耐性株より任意の343個のコロニーを以下の手順で採取
した。
薬剤耐性クローンが出現したディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液
を注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（GILSON社）を用いて
コロニーを掻き取って吸い込み、丸底96穴プレートへ採取した。トリプシン処理
を行った後、平底24穴プレートを用いて作製したフィーダープレートへ各クロー
ンを播種し、ESM培地を用いてコンフレントになるまで培養した。培養後、上記
プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行って総量を350μlとした。この
うち300μlを等量の凍結培地［20% DMSO、80% FM培地］と混和してマスタープレ
ートとし、凍結保存に供した。残りの細胞懸濁液50μlはゼラチンコート処理済
み平底24穴プレート（旭テクノグラス社）へ播種してレプリカプレートとし、ES
M培地を用いて細胞がコンフレントになるまで培養した。
【００６８】
（４）FUT8ゲノム領域5’末端側プローブを用いたゲノムサザンブロットによ
る相同組換えの診断
本項（３）で取得した343クローンに対し、以下の手順で5’末端側プローブを
用いたゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を行った。
まず、本項（３）で作製したレプリカプレートより公知の方法［ヌクレイック
・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research), 3, 2303, (1976)］に従って
各クローンのゲノムDNAを調製し、TE緩衝液(pH8.0) ［10mmol/l Tris-HCl、1mmo
l/l EDTA］に溶解した。
【００６９】
一方、本実施例第１項で得た、FUT8翻訳開始コドンを含むゲノムクローン（13
.9Kb）より、5’末端部の制限酵素XbaI認識部位から上流約500bpの断片を調製し
た（図２）。
ゲノムDNAを制限酵素PstIで消化した後、上記のFUT8 5’末端断片（500bp）を
プローブとして、モレキュラー・クローニング 第二版[Molecular Cloning, A L
aboratory Manual, 2 nd Ed. (1989) ]に記載の公知の方法に従いサザンブロッ
トを行った。
【００７０】
制限酵素PstI処理により、野生型FUT8対立遺伝子から約7.5KbのDNA断片が生じ
た。一方、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起
こった対立遺伝子から約11.0KbのDNA断片が生じた（図２）。
本法により、４クローンより調製したゲノムDNAにおいて、約7.5Kbおよび約11
.0Kbの特異的断片が見出された。両断片の量比が１：１であったことから、本ク
ローンは、片方のFUT8対立遺伝子がベクター配列に置換された相同組換え体であ
ることが確認された。
【００７１】
（５）FUT8ゲノム領域3’末端側プローブを用いたゲノムサザンブロットによ
る相同組換えの診断
本項（３）で取得した343クローンに対し、以下の手順で3’末端側プローブを
用いたゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を行った。
まず、本実施例第１項で得たSacI-SacI領域(約6.3Kb)より、3’末端部の制限
酵素SacI認識部位から上流約500bpに位置する制限酵素EcoRV認識部位を含む断片
を調製した。
【００７２】
本項（４）で調製したゲノムDNAを制限酵素SacIで消化した後、上記のFUT8 3
’末端断片（500bp）をプローブとして、モレキュラー・クローニング 第二版[M
olecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd Ed. (1989) ]に記載の公知の方
法に従いサザンブロットを行った。
制限酵素SacI処理により、野生型FUT8対立遺伝子から約6.6KbのDNA断片が生じ
た。一方、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起
こった対立遺伝子から約8.6KbのDNA断片が生じた（図２）。
【００７３】
本法により、本項（４）で陽性を示した４クローンのゲノムDNAにおいて、約6
.6Kbおよび約8.6Kbの特異的断片が見出された。両断片の量比が１：１であった
ことから、本クローンは、片方のFUT8対立遺伝子がベクター配列に置換された相
同組換え体であることが確認された。
４．α1,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8）遺伝子を破壊したマウスの取
得
（１）FUT8両対立遺伝子を１コピー破壊した胚性幹細胞を用いたキメラマウス
の取得
本実施例第３項で樹立した片方のFUT8対立遺伝子が破壊された胚性幹細胞４ク
ローンのに対し、公知の方法［マニュピレーティング・ザ・マウス・エンブリオ
(Manupirating the Mouse Embryo), Cold Spring Harbor laboratory Press (1
994)］に従い、正常な核型が維持されている３クローンを選択した。次に、ガイ
ド・ツー・テクニックス・イン・マウス・ディベロプメント［Guide to Technuq
ues in Mouse Development ,Methods in Enzymology, Volume 225, Academic Pr
ess (1993)］などの記載の注入キメラ法に従って、C57BL/6系統の雌マウスより
取得した胚盤胞腔へ上記の胚性幹細胞３クローンをそれぞれ顕微注入し、偽妊娠
させたMCH系統の雌マウスの子宮内へ移植し着床させた。
【００７４】
黒色の被毛の中に茶褐色の被毛が顕れた雄のキメラ個体のうちキメラ率が50%
を超える個体は、注入した胚性幹細胞が同等のレベルで生殖細胞系列へ寄与して
いるものと判定し、C57BL/6系統の雄マウスとの交配を行った。その結果、２ク
ローンの胚性幹細胞を用いて作出したキメラ個体の中に生殖系列キメラが存在し
ていることが確認できた。
【００７５】
（２）FUT8対立遺伝子を１コピー破壊したヘテロ接合体マウスの取得
本項（１）で得た生殖系列キメラを８週齢まで飼育した後、性成熟したC57BL/
6系統の雌個体と交配し産仔を得た。該産仔のうち、茶褐色の被毛を有する個体
の尾より、公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Res
earch), 3, 2303, (1976)］に従ってゲノムDNAを調製し、本実施例第３項（４）
記載の方法に従ってサザンブロットを行った。
【００７６】
ヘテロ接合体のゲノムDNAは、制限酵素PstI処理により、野生型FUT8対立遺伝
子特異的な約7.5Kbの断片および相同組換えの起こった対立遺伝子特異的な約11.
0Kbの断片を量比１：１で生じた（図２）。サザンブロットの結果、本項（１）
において生殖系列への寄与が認められた胚性幹細胞２クローンいずれに由来する
キメラ個体からも、上記の判定基準を満たすヘテロ接合体を取得したことを確認
した（図３）。このヘテロ接合体マウスは、FUT8の片方の対立遺伝子が破壊され
たマウスであった。
【００７７】
（３）FUT8両対立遺伝子を破壊したホモ接合体マウスの取得
本項（２）で得たヘテロ接合の雄個体および雌個体を８週齢まで飼育した後、
交配させ産仔を得た。該産仔のうち、茶褐色の被毛を有する個体の尾より、公知
の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research), 3, 230
3, (1976)］に従って各クローンのゲノムDNAを調製し、実施例第３項（４）記載
の方法に従ってサザンブロットを行った。
【００７８】
ホモ接合体のゲノムDNAは、制限酵素PstI処理により野生型FUT8対立遺伝子特
異的な約7.5Kbの断片のみを生じる（図２）。サザンブロットの結果、産仔の中
に上記基準を満たすホモ接合体が含まれていることを確認した（図３）。このホ
モ接合体マウスは、FUT8両対立遺伝子が破壊されたダブルノックアウトマウスで
あった。
【００７９】
実施例２．α1,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8）両対立遺伝子を欠失し
たトランスジェニックマウスにおける該遺伝子の発現解析
１．FUT8ダブルノックアウトマウスにおける該遺伝子発現量解析
実施例１第４項で作製したFUT8ノックアウトホモ接合体マウスおよび野生型マ
ウスより小腸、肺、脳を摘出し、モレキュラー・クローニング 第二版[Molecula
r Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd Ed. (1989) ] などに記載の公知の方法
に従って、全RNAを調製した。各臓器より得た全RNA 20μgを用いて、2.2mol/l 
ホルムアミドを含む1.0%(w/v) アガロースゲル電気泳動を行った後、公知の方法
［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.
Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979) ］に従い、Zeta-probe membrane(B
IO-RAD社)へRNAを転写した。
【００８０】
一方、ヒトFUT8 cDNA全長[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J. Bioch
em., 121, 626 (1997)）を32P標識し、プローブを調製した。モレキュラー・ク
ローニング 第二版[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd Ed. (1989
) ]に記載の公知の方法に従い、上記で調製したプローブおよび膜を55℃で反応
することにより、ノーザンハイブリダイゼーションを行った。
【００８１】
ハイブリダイゼーション後、膜を2×SSC−0.1%(w/v) SDSに浸漬し、55℃で30
分間加温した。上記の洗浄操作を再度繰り返した後、洗浄した膜をＸ線フィルム
へ-80℃で３日間暴露し現像した。
本法により、マウスFUT8 mRNA全長約3.5Kbの発現を検出することができる。本
ノーザンブロットの結果、野生型マウスより得た全臓器について約3.5Kbの単一
バンドを検出した。一方、FUT8ダブルノックアウトマウスより得た臓器について
は、いずれもFUT8 mRNAに該当するバンドを検出することができなかった（図４
）。これより、FUT8ダブルノックアウトマウスでは、FUT8 mRNAの発現が消失し
ていることが確認された。
【００８２】
２．FUT8ダブルノックアウトマウスのα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性
測定
実施例１第４項で作製したFUT8ノックアウトヘテロ接合体マウス、同ホモ接合
体マウスおよび野生型マウスより脳および小腸を摘出し、４倍量の0.25mol/l ス
クロース−1.0mol/l ベンズアミジン−10mmol/l Tris-HCl緩衝液（pH7.4）中で
破砕した。900×gで10分間の遠心分離を行った後、回収した上清を粗酵素とした
。酵素反応は、30μgから90μgの粗酵素を含む35μlの反応液〔50mmol/l MES-Na
OH緩衝液（pH7.0）、0.3% Triton X-100、0.285mmol/l GDP-フコース、4.2μmol
/l 4-(2-pyridylamino)butylamine-labeled (asparagine-linked) agalacto bia
ntennary 糖鎖[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. C
hem., 271, 27810 (1996)）]を37℃で２時間インキュベーションすることで測定
した。反応の停止は、100℃で1分間加熱することで行った。また、FUT8ノックア
ウトホモ接合体マウスより調製した粗酵素を用いた反応については12時間インキ
ュベーションすることで測定した。加熱により反応を停止した後、5000×gで10
分間の遠心分離を行うことで回収した上清10μlを試料として調製した。次に、L
C-VP HPLCシステム（島津製作所社製）に装着したTSK-gel ODS-80TMカラム（4.6
×150mm, Tosoh社製）へ調製した試料を注入した後、0.15% 1-ブタノール−20mm
ol/l 酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）を用いて流速1.0ml/分、55℃の条件で展開
し、溶出される反応生成物質の蛍光強度（励起波長320nm、検出波長400nm）を測
定した。
【００８３】
この酵素活性測定の結果、FUT8ノックアウトホモ接合体マウスの小腸では、野
生型マウス由来臓器を供試した反応時間の６倍まで延長しても、α1,6-フコシル
トランスフェラーゼ活性は認められなかった。一方、FUT8ノックアウトヘテロ接
合体マウスおよび野生型マウスの脳では、FUT8遺伝子の発現量に応じたα1,6-フ
コシルトランスフェラーゼ活性が検出された（図５）。これより、FUT8ダブルノ
ックアウトマウスでは、α1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性が消失している
ことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】は、マウスFUT8遺伝子の翻訳開始コドンの位置するエクソンを含むゲノム領域を示した図である。
【図２】は、マウスFUT8遺伝子破壊用ターゲティングベクターの構造およびサザンブロットの判定法を示した図である。
【図３】は、FUT8対立遺伝子を破壊したマウスのゲノムサザンブロットを示した図である。
【図４】は、FUT8対立遺伝子を破壊したマウスの各臓器を用いたノーザンブロットを示した図である。
【図５】は、FUT8対立遺伝子を破壊したマウスにおけるα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を示した図である。
【図１】
2004298180.tif 000002
【図２】
2004298180.tif 000003
【図３】
2004298180.tif 000004
【図４】
2004298180.tif 000005
【図５】
2004298180.tif 000006
【配列表】
2004298180000001.app