(57)【要約】【課題】フェノール分解菌の一つであり、フェノールではなくＴＣＥのみであっても基質誘導されるラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６  株菌のフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子を解明することは、ＴＥ２６株のモニタリング手法開発、さらには、汚染物質除去能に優れた微生物の開発にも有用である。【解決手段】既知フェノール分解菌のフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子に高く保存されたアミノ酸配列をもとにプライマーを合成し、ＰＣＲ法によりラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６  株由来のフェノールヒドロキシラーゼの調節遺伝子及び構造遺伝子をコードする核酸の塩基配列を決定し、該解明配列を既存の菌株の間で相同性解析し特異的な配列を見いだし、特異的な菌検出法及び試薬が開発できた。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のタンパク質をコードする遺伝子：
（１）    配列番号：  ８，  ９，  １０，  １１，  １２および１３から成る群から選ばれたものに記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質、
（２）    配列番号：  ８，  ９，  １０，  １１，  １２および１３から成る群から選ばれたものに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるタンパク質。
【請求項２】
以下のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）      配列番号：  ６  に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質、
（ｂ）      配列番号：  ６  に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子に対する調節因子としての作用を有するタンパク質。
【請求項３】
塩基配列が配列番号：  １９，  ２０，  ２５，  ２６，  ２９，  ３０，  ３３，  ３４，  ３７及び３８から成る群から選ばれたもので示される核酸断片をプライマーとして使用してポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とするラスルトニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌の特異的な検出方法。
【請求項４】
請求項３の方法を用いることを特徴とする環境中に存在するラスルトニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌の特異的な検出方法。
【請求項５】
塩基配列が配列番号：  １９，  ２０，  ２５，  ２６，  ２９，  ３０，  ３３，  ３４，  ３７及び３８から成る群から選ばれたもので示される核酸断片をプライマーとして使用してポリメラーゼ連鎖反応を行う場合に、配列番号：  １５，  １７，  １６，  １８，  ２１，  ２３，  ２２，  ２４，  ２７，  ２８，  ３１，  ３２，  ３５及び３６から成る群から選ばれたもので示されるプライマーの中の競合ＰＣＲプライマーの配列を含むプライマーを用いて競合ＤＮＡ用コンペティターを作製し、このコンペティターを添加し、ＤＮＡの定量を行う競合ポリメラーゼ連鎖反応（競合ＰＣＲ）を行うことを特徴とするラスルトニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌の特異的な検出方法並びに定量法。
【請求項６】
請求項５の方法を用いることを特徴とする環境中に存在するラスルトニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌の特異的な検出方法並びに定量法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）  ｓｐ．  ＴＥ２６  株由来のフェノールヒドロキシラーゼをコードする遺伝子及び調節遺伝子並びにその利用技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
機械、金属系の工場等で脱脂洗浄剤として利用されているトリクロロエチレン（ＴＣＥ）などは、ほ乳類における試験で発ガン性を有することが複数の報告で明らかになっており、我が国では平成５年３月水質汚濁防止法において環境基準が設定された。ところが、ＴＣＥはこれ以前に土壌・地下水中に蓄積され、環境庁が実施した全国の地下水質調査においても、環境基準値を越えた事例が多数報告されており、最近においても、土壌・地下水の高濃度汚染が見つかった事例が新聞等で報道されている。
【０００３】
従来、ＴＣＥ  で汚染された土壌・地下水の物理的浄化法としては、主に土壌ガス吸引法と揚水ばっ気法がある。これらは多大な動力が必要で、低濃度では効率が悪く、完全な浄化は困難である。近年、欧米では、ＴＣＥを分解する微生物などを用いた有害化学物質の生物的環境修復（バイオレメディエーション）が一部実用化されており、我が国においてもこのようなＴＣＥを分解する微生物による土壌修復に関する報告が多数なされている。ＴＣＥ分解菌の例としてはＭｅｔｈｙｒｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＯＢ３  （特許文献１、特許文献２）、Ｍｅｔｈｙｒｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｏｓｐｏｒｉｕｍ  ＴＵＫＵＢＡ  （特許文献３、特許文献４、特許文献５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｆ１  （特許文献６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＢＨ  （非特許文献１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＵＣ−Ｒ５，  ＵＣ−Ｐ２  （特許文献７）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＷＩ−９  （特許文献８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ  ＫＲ−１  （特許文献９、特許文献１０）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４  （特許文献１１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ  ｃｅｐａｃｉａ  ＫＫ０１  （特許文献１２）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  Ｎ１６−１  （特許文献１３）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＫＳ０１  （特許文献１４）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｕｓ  ＪＭＰ１３４  （非特許文献２）  、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｕｓ  ＫＳ０１  （特許文献１５）、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ  （非特許文献３）  などが知られている。これら菌株によるＴＣＥ  分解のメカニズムは、フェノール、トルエンなどの基質により酵素誘導がかかり、基質認識の緩さから、ＴＣＥ  も分解されるものと考えらている。
【０００４】
最近、千葉県君津市においてトルエン資化性菌であるＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＫＴ−１を用いて野外実証テストが行われた。しかしながら、既に知られているＴＣＥ分解菌は、誘導物質としてメタン、トルエン、フェノールなど環境や人体に影響する物質を必要とする。このような場合、有害な物質は地下水・土壌に添加できないことから、分解酵素をこのような物質で誘導した後、遠心分離して、培地成分を除いて菌体を地下水や土壌に添加しなければならないため、操作が非常に煩雑となる。
また、このような有害な誘導物質を必要としない菌として、人為的な突然変異によって酵素を構成的に発現する菌の取得方法及びその菌を用いた環境修復法（特許文献１６）やトリクロロエチレンなどによって酸化酵素が誘導させた例などのいくつかが報告されているが、いずれも実用化には至っていない。このような中、分解物であるトリクロロエチレン自身で酵素の誘導がかかりトリクロロエチレンを分解する新規な微生物としてラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株が自然界より分離され報告されている（特許文献１７、非特許文献４）。なお、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター：ＩＰＯＤ）（旧名称：経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））にＦＥＲＭ  Ｐ−１８３５３として寄託されている（寄託日：  平成１３年５月２４日）。
【０００５】
ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株を用いたならば、トリクロロエチレン自身でトリクロロエチレンの誘導がかかり、トリクロロエチレンを分解でき非常に実用的である。このような、有用な菌株を実際に汚染環境の地下水や土壌に投入するバイオオーギュメンテーションを行う場合には、環境中に導入した菌株がその環境中でどのような挙動を示すか、その菌株の生存状況、すなわち菌数をモニタリングすることが、環境修復作業の管理や安全面から極めて重要である。このことは、環境省の微生物を用いた環境浄化の実施に伴う環境影響の防止のための指針（Ｈ１１．３．２４）や、経済産業省の組換えＤＮＡ技術工業化指針（第二種利用）でも記載されている重要な項目である。モニタリングの方法は両指針ともに定めはないが、一般的に培養法、抗体を用いる方法、ＤＮＡを用いる方法の利用が考えられる。
バイオオーギュメンテーションにおいては、環境中に投入した微生物を検出する方法としては、選択培地を用いた培養法（特許文献１８、特許文献１９）が知られている。これは、選択培地として薬剤耐性、培地条件、特異的な代謝物の生産性を指標にしたもの、酵素活性を指標としたものなどが知られているが、いずれも培養を要するため時間がかかり、また特定の菌のみを特異的に検出、定量できる培地を開発することは極めて難しい。なお、ＴＥ２６株用の選択培地は存在しない。
【０００６】
抗体を用いた検出法は特異性に優れた方法であるが、抗体の作製は時間がかかり、また検出に適した抗体が得られるとは限らない。なお、ＴＥ２６株の特異抗体は、未だ存在しない。
一方、ＤＮＡを用いる方法としては、ハイブリダイゼーションによる方法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法がある。共に、特異的配列がわかっていれば、必要なプローブもしくはプライマーは容易に作製できる。特に、ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖に対して正方向と逆方向の２種類の特異的なプライマーを用いることにより、２種類のプライマーに挟まれた目的とする核酸断片を増幅することができる容易な方法である。さらに、ＰＣＲ法は特異性に優れるものの定量性に乏しいため、競合用のＤＮＡと競争的にプラーマーを取り合いながらＰＣＲを行い定量性を加味した方法として競合ＰＣＲ法が知られている。定量的なＰＣＲ法としては、他にリアルタイムＰＣＲ法があるが、こちらはやや高価な装置を必要とする。
以上より、ＤＮＡレベルでのモニタリングが最も有力な方法である。また、遺伝子の解明は、高発現株を作製する際にも極めて有力な情報となる。
しかしながら、ＴＥ２６株のトリクロロエチレン分解の係わる酵素の遺伝子に関しては未解明であった。
【０００７】
【特許文献１】
特開平４−５０１６６７号公報
【特許文献２】
特開平５−２１２３７１号公報
【特許文献３】
特開平２−９２２７４号公報
【特許文献４】
特開平３−２９２９７０号公報
【特許文献５】
特開平６−２２６２３０号公報
【特許文献６】
特開昭６４−３４４９９号公報
【特許文献７】
特開昭６２−８４７８０号公報
【特許文献８】
特開平６−７０７５３号公報
【特許文献９】
特開平２−５０３８６６号公報
【特許文献１０】
特開平５−５０２５９３号公報
【特許文献１１】
特開平４−５０２２７７号公報
【特許文献１２】
特開平６−２９６７１１号公報
【特許文献１３】
特開平１０−５２２５９号公報
【特許文献１４】
特開２０００−１０２３７７号公報
【特許文献１５】
特開平７−１２３９７６号公報
【特許文献１６】
特開平８−２９４３８７号公報
【特許文献１７】
特願２００１−３４７７８号
【特許文献１８】
特開平７−７３５０９号公報
【特許文献１９】
特開平７−２１３２９７号公報
【非特許文献１】
ケミカルエンジニアリング，  ３９，（６）：  ４９４−４９８，  １９９４
【非特許文献２】
Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５６  （４）：  １１７９−１１８１，  １９９０
【非特許文献３】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １５９  （２）：  ６４０−６４３，  １９８９
【非特許文献４】
影山ら、日本農芸化学会２００２年度大会講演要旨集、ｐ．２３３
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６  は、フェノール分解菌の一つであり、この菌株の他の菌株との相違は、フェノールではなくＴＣＥ  のみであっても基質誘導される点にある。ＴＥ２６株由来のフェノールヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を単離できれば、任意の微生物にこの菌株と同様のフェノール分解能を付与でき、フェノール分解酵素によってもたらされるトリクロロエチレン等を分解することが可能となる。本発明の第一の目的は、このような有用性の高いＴＥ２６株由来のフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子を単離し、そのＤＮＡ配列を決定することにある。第二の目的は、ＤＮＡ配列を利用してＰＣＲプライマーを設計し、競合ＰＣＲ法等を構築することによるＴＥ２６株のモニタリング手法開発への利用である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＴＥ２６株由来のフェノールヒドロキシラーゼの構造遺伝子及び調節遺伝子を得るために、既知フェノール分解菌のフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子に高く保存されたアミノ酸配列をもとにプライマーを合成し、ＰＣＲ法により前記菌株由来のフェノールヒドロキシラーゼの構造遺伝子断片を取得し、これをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、前記菌株由来のフェノールヒドロキシラーゼの調節遺伝子及び構造遺伝子をコードするクローンを取得し塩基配列を決定した。決定した配列を既存の菌株との相同性を比べることで特異的な配列を見いだし本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、
〔１〕    以下のタンパク質をコードする遺伝子：
（１）    配列番号：  ８，  ９，  １０，  １１，  １２および１３から成る群から選ばれたものに記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質、
（２）  配列番号：  ８，  ９，  １０，  １１，  １２および１３から成る群から選ばれたものに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるタンパク質；
〔２〕    以下のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）      配列番号：  ６  に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質、
（ｂ）      配列番号：  ６  に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子に対する調節因子としての作用を有するタンパク質；
〔３〕    塩基配列が配列番号：  １９，  ２０，  ２５，  ２６，  ２９，  ３０，  ３３，  ３４，  ３７及び３８から成る群から選ばれたもので示される核酸断片をプライマーとして使用してポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とするラスルトニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌の特異的な検出方法；
〔４〕    上記〔３〕記載の方法を用いることを特徴とする環境中に存在するラスルトニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌の特異的な検出方法；
〔５〕    塩基配列が配列番号：  １９，  ２０，  ２５，  ２６，  ２９，  ３０，  ３３，  ３４，  ３７及び３８から成る群から選ばれたもので示される核酸断片をプライマーとして使用してポリメラーゼ連鎖反応を行う場合に、配列番号：  １５，  １７，  １６，  １８，  ２１，  ２３，  ２２，  ２４，  ２７，  ２８，  ３１，  ３２，  ３５及び３６から成る群から選ばれたもので示されるプライマーの中の競合ＰＣＲプライマーの配列を含むプライマーを用いて競合ＤＮＡ用コンペティターを作製し、このコンペティターを添加し、ＤＮＡの定量を行う競合ポリメラーゼ連鎖反応（競合ＰＣＲ）を行うことを特徴とするラスルトニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌の特異的な検出方法並びに定量法；  及び
〔６〕    上記〔５〕記載の方法を用いることを特徴とする環境中に存在するラスルトニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌の特異的な検出方法並びに定量法を提供するものである。
【００１１】
さらに、本発明は、
〔７〕    （ａ）  配列番号：  １９，  ２０，  ２５，  ２６，  ２９，  ３０，  ３３，  ３４，  ３７及び３８から成る群から選ばれたもので示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、
（ｂ）  配列番号：  １５，  １７，  １６，  １８，  ２１，  ２３，  ２２，  ２４，  ２７，  ２８，  ３１，  ３２，  ３５及び３６から成る群から選ばれた塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、あるいは
（ｃ）  前記核酸断片と競合ＰＣＲにおいて実質的に同等な機能を有するオリゴヌクレオチド；
〔８〕    上記〔７〕記載のオリゴヌクレオチドから選ばれたものを有しており、フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子を有し且つトリクロロエチレンで酵素誘導がかかり、トリクロロエチレンを分解する菌、例えばラスルトニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌の特異的検出のために使用されることを特徴とする微生物検出キット；
〔９〕    競合ＰＣＲ  に適したものである上記〔７〕記載の微生物検出キット；  及び
〔１０〕    フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子を有し且つトリクロロエチレンで酵素誘導がかかり、トリクロロエチレンを分解する菌の検出方法において、
（ｉ）    被検試料からＤＮＡを抽出する工程、
（ｉｉ）  該抽出ＤＮＡを
（ａ）    配列番号：  ５  又は７  の塩基配列を利用して作製され且つ検出対象に対して特異的且つ有効なハイブリダイゼーションを行うのに必要最低限の塩基配列長さ以上の長さの塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は該オリゴヌクレオチドに対して相補的なオリゴヌクレオチドから成る群から選ばれたプローブ、
（ｂ）    （１）  配列番号：  ６  及び  ８〜１３から成る群から選ばれたアミノ酸配列により表されるタンパク質をコードする遺伝子又は（２）  該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるタンパク質をコードする遺伝子をを利用して作製され且つ検出対象に対して特異的且つ有効なハイブリダイゼーションを行うのに必要最低限の塩基配列長さ以上の長さの塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、又は該オリゴヌクレオチドに対して相補的なオリゴヌクレオチドから成る群から選ばれたプローブ、又は
（ｃ）        配列番号：  １９，  ２０，  ２５，  ２６，  ２９，  ３０，  ３３，  ３４，  ３７及び３８から成る群から選ばれたもので示される核酸断片をプライマーとして使用してポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより調製されるプローブ
とハイブリダイゼーション可能な条件下に置く工程、
（ｉｉｉ）    ハイブリダイゼーション形成の有無を検査する工程
を有することを特徴とするフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子を有し且つトリクロロエチレンで酵素誘導がかかり、トリクロロエチレンを分解する菌の検出方法を提供する。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明では、「遺伝子組換え技術」を利用して所定の核酸・ポリヌクレオチドなどを単離・配列決定したり、組換え体を作製したり、所定のタンパク質・ペプチドを得ることができる。本明細書中使用できる遺伝子組換え技術としては、当該分野で知られたものが挙げられ、例えば  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９  ＆  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）；  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  ”ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  １  ｔｏ  ３，  （Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）；  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  ｓｅｒｉｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、例えば  Ｒ．  Ｗｕ  ｅｄ．，  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  ６８  （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）；  Ｒ．  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  １００  （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｐａｒｔ  Ｂ）  ＆  １０１  （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｐａｒｔ  Ｃ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８３）；  Ｒ．  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  １５３  （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｐａｒｔ  Ｄ），  １５４  （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｐａｒｔ  Ｅ）  ＆  １５５  （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｐａｒｔ  Ｆ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８７）；  Ｒ．  Ｗｕ  ｅｄ．，  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  ２１６  （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｐａｒｔ  Ｇ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９２）；  Ｒ．  Ｗｕ  ｅｄ．，  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  ２１７  （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｐａｒｔ  Ｈ）  ＆  ２１８  （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｐａｒｔ  Ｉ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）；  Ｐ．  Ｍ．  Ｃｏｎｎ  ｅｄ．，  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  ３０２  （Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９）；  Ｓ．  Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ｅｄ．，  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  ３０３  （ｃＤＮＡ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９）  などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法��改変法が挙げられる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）  。
【００１３】
本明細書中、「フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群」とは、ＴＣＥ自身で酵素の誘導がかかりＴＣＥを分解する活性を有する微生物が保有するフェノールヒドロキシラーゼ活性に関与する構造遺伝子群を意味してよい。また、「フェノールヒドロキシラーゼ調節遺伝子」とは、上記フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群の発現を制御する遺伝子領域であることを意味してよい。本明細書中、「フェノールヒドロキシラーゼ」とは、代表的にはトリクロロエチレン自身で酵素の誘導がかかりトリクロロエチレンを分解する活性を有する微生物が保有するフェノールヒドロキシラーゼ活性を担う酵素タンパク質の全てあるいはその一部を意味してよい。該遺伝子あるいは遺伝子群は、核酸からなるもので、通常ゲノム上では、ＤＮＡ  であるが、本明細書中で説明するいかなる形態のものであってよい。
該フェノールヒドロキシラーゼ構造遺伝子群は、代表的には配列表の配列番号：  ７  あるいは配列番号：  ３９のＤＮＡのＯＲＦ  に対応する塩基配列、配列番号：  ８  〜１４のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列、又はその一部のフラグメントを包含する。該フェノールヒドロキシラーゼ調節遺伝子は、代表的には配列表の配列番号：  ５  のＯＲＦ  に対応する塩基配列、配列番号：  ６  のアミノ酸配列をコードする塩基配列、又はその一部のフラグメントを包含する。
本発明のタンパク質は、代表的には配列番号：  ８，  ９，  １０，  １１，  １２および１３から成る群から選ばれたアミノ酸配列あるいはそれと実質的に同等なアミノ酸配列により表されるタンパク質、配列番号：  ８，  ９，  １０，  １１，  １２および１３から成る群から選ばれたアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるタンパク質、好ましくはＴＣＥ自身で酵素の誘導がかかりＴＣＥを分解する活性を担う酵素活性に関与するタンパク質、さらにはその一部のフラグメントが挙げられるし、また、配列番号：  ６  に記載のアミノ酸配列あるいはそれと実質的に同等なアミノ酸配列により表されるタンパク質、配列番号：  ６  に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるタンパク質、好ましくはフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子に対する調節因子としての作用を有するタンパク質、さらにはその一部のフラグメントが挙げられる。
【００１４】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子（それに関連する核酸又はオリゴヌクレオチドを含む）としては、代表的には配列番号：  ８，  ９，  １０，  １１，  １２および１３から成る群から選ばれたアミノ酸配列により表されるタンパク質をコードする核酸、配列番号：  ８，  ９，  １０，  １１，  １２および１３から成る群から選ばれたアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるタンパク質をコードする核酸、さらにはその一部のフラグメント、配列番号：  ７  の塩基配列から選択された且つ連続した塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、例えば、５  個以上の連続した塩基、さらには１０個以上の連続した塩基からなるオリゴヌクレオチド、さらには好ましくは１５個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは１８〜１００  個の塩基からなるオリゴヌクレオチド、代表的には２０〜３０個の塩基からなるオリゴヌクレオチドあるいは３０〜５５個の塩基からなるオリゴヌクレオチドなど、配列番号：  ６  に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質をコードする核酸、配列番号：  ６  に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるタンパク質をコードする核酸、さらにはその一部のフラグメント、配列番号：  ５  の塩基配列から選択された且つ連続した塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、例えば、５  個以上の連続した塩基、さらには１０個以上の連続した塩基からなるオリゴヌクレオチド、さらには好ましくは１５個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは１８〜１００  個の塩基からなるオリゴヌクレオチド、代表的には２０〜３０個の塩基からなるオリゴヌクレオチドあるいは３０〜５５個の塩基からなるオリゴヌクレオチドなど、配列番号：  ３９の塩基配列から選択された且つ連続した塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、例えば、５  個以上の連続した塩基、さらには１０個以上の連続した塩基からなるオリゴヌクレオチド、さらには好ましくは１５個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは１８〜１００  個の塩基からなるオリゴヌクレオチド、代表的には２０〜３０個の塩基からなるオリゴヌクレオチドあるいは３０〜５５個の塩基からなるオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。該塩基配列と相同性を有するが、上記ＴＣＥ分解活性能に関し実質的に同等なタンパク質をコードしているといったそれと同効の塩基配列を含有するＤＮＡ  配列でコードされるものであることができるし、さらにそれらと相補的なヌクレオチドなどであってよい。
【００１５】
本発明では、ＴＣＥ自身で酵素の誘導がかかりＴＣＥを分解する活性を持つ酵素フェノールヒドロキシラーゼの活性に関与する構造タンパク質及び該構造タンパク質の活性制御タンパク質、あるいはそれと実質的に同等な機能（あるいは活性）を有するタンパク質またはその塩、そのタンパク質の特徴的な部分ペプチドまたはその塩、それらをコードする遺伝子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなど、その遺伝子を遺伝子組換え技術で操作することが可能なように含有しているベクターあるいはプラスミド、こうしたベクターなどで形質転換された宿主細胞、さらにはその宿主細胞を培養して該タンパク質またはその塩を製造する方法、こうして得られた該タンパク質またはその塩やそのタンパク質の特徴的な部分ペプチドまたはその塩を用いて得られた抗体、特にはモノクローナル抗体、その抗体を産生するハイブリドーマ細胞、該単離された遺伝子、例えばＤＮＡ  、ＲＮＡ  などをプローブとして用いたり、該配列情報に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドを使用する核酸増幅技術、例えば競合ＰＣＲ定量法などあるいは該抗体やオリゴヌクレオチドを用いた測定手段並びに試薬が提供される。
【００１６】
本明細書で用いる用語「ポリペプチド」としては、以下に記載するような如何なるポリペプチドを指すものであってもよい。ポリペプチドの基本的な構造は周知であり、当該技術分野において非常に数多くの参考書及びその他の刊行物に記載がある。こうしたことに鑑み、本明細書で用いる用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は修飾したペプチド結合により互いに結合しているような２個又はそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又は任意のタンパク質を意味する。本明細書で用いる用語「ポリペプチド」としては、当該分野において、例えばペプチド、オリゴペプチドあるいはペプチドオリゴマーとも称せられる短い鎖のもの、及びタンパク質と一般的に言われ、多くの形態のものが知られている長い鎖のものの両方を通常意味してよい。ポリペプチドは、しばしば、通常、天然型アミノ酸（天然に存在しているアミノ酸：  あるいは遺伝子でコードされるアミノ酸）と称されるアミノ酸以外のアミノ酸を含有していてもよい。ポリペプチドは、また末端アミノ酸残基を含めて、その多くのアミノ酸残基が翻訳された後にプロセッシング及びその他の改変（あるいは修飾）されるといった天然の工程によるのみならず、当業者に周知の化学的改変技術によっても、上記のポリペプチドはそれが改変（修飾）できることは理解されよう。該ポリペプチドに加えられる改変（修飾）については、多くの形態のものが知られており、それらは当該分野の基礎的な参考書及びさらに詳細な論文並びに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知である。幾つかのとりわけ常套的な改変・修飾としては、例えばアルキル化、アシル化、エステル化、アミド化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、リン酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、水酸化及びＡＤＰ−リボシル化等が挙げられ、例えばＴ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９９３）；  Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  （Ｅｄ．），  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９８３）  （Ｗｏｌｄ，  Ｆ．，  ”Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”，  ｐｐ．１−１２）；  Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １８２：  ６２６−６４６  （１９９０）；  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ”，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ６６３：  ｐ．４８−６２  （１９９２）等の記載を参照できる。
【００１７】
本明細書中、「相同性」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周知である  （例えば、Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．  （Ｅｄ．），  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９８８）；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．  （Ｅｄ．），  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９９３）；  Ｇｒｉｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．  ＆  Ｇｒｉｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．  （Ｅｄ．），  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ：  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  （１９９４）；  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９８７）；  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ＆  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．  （Ｅｄ．），  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｍ−Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （１９９１）  等）  。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Ｍａｒｔｉｎ，  Ｊ．  Ｂｉｓｈｏｐ  （Ｅｄ．），  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  （１９９４）；  Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：  １０７３  （１９８８）  等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。相同性を測定するための好ましい方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンピュータープログラムとして組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、ＧＣＧ  プログラムパッケージ  （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２（１）：  ３８７  （１９８４））  、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ  （Ａｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：  ４０３  （１９９０））  等が挙げられるが、これらに限定されるものでなく、当該分野で公知の方法を使用することができるし、市販のものを使用できる。本明細書で「高い相同性」といった場合当該対象配列の長さにもよるが、例えば  ７０％以上、好ましくは８０％  以上���そして特定の場合には９５％  以上で、特に好ましくは９０％  以上であってよい。
【００１８】
本明細書中、「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドで、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，  Ｖｏｌ．２８，  ｐ．７１６−７３４  （１９８９）  に記載されているような既知の方法、例えば、フォスフォトリエステル法、フォスフォジエステル法、フォスファイト法、フォスフォアミダイト法、フォスフォネート法などの方法により化学合成されることができる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成を便利に行うことができることが知られており、例えば、市販されている自動化された合成装置、例えば、ｍｏｄｅｌ  ３８１Ａ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  などを用いて行うことができる。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいはトリチル化された塩基などを含有していてよいし、場合によっては、マーカーの付された塩基を含有していてよい。
【００１９】
本明細書中、「ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）  」又は「ＰＣＲ  」とは、一般的に、米国特許第  ４，６８３，１９５号明細書などに記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法を指している。一般に、ＰＣＲ  法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行うようなサイクルを繰り返し行うことを含むものである。典型的には、ＰＣＲ  法で用いられるプライマーは、鋳型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用することができる。プライマーは、好ましくは  ５個以上の塩基、さらに好ましくは１０個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは１８〜２５個の塩基からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ＰＣＲ  反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えば  Ｒ．  Ｓａｉｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０：  １３５０，  １９８５；  Ｒ．  Ｓａｉｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：  ４８７，  １９８８  ；  Ｈ．  Ａ．  Ｅｒｌｉｃｈ  ｅｄ．，  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９  ；  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  ”ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  １，  （Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）  ；  Ｍ．  Ａ．  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  ”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９０））；  Ｍ．  Ｊ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  Ｑｕｉｒｋｅ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  （Ｅｄ．），  ＰＣＲ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９１）；  Ｍ．  Ａ．  Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５，  ８９９８−９００２  （１９８８）などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、ＰＣＲ  法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
【００２０】
ＰＣＲ  反応は、代表的な場合には、例えば鋳型（代表的にはＤＮＡ）と対象核酸に基づいてデザインされたプライマーとを、１０×反応緩衝液  （Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼに添付されている）  、ｄＮＴＰｓ  （  デオキシヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＴＴＰの混合物）、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。混合物を、例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ  ２４００  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ  などの自動サーマルサイクラーを用いて一般的なＰＣＲ  サイクル条件下にそのサイクルを２５〜６０回繰り返すが、増幅のためのサイクル数は適宜目的に応じて適当な回数とすることができる。ＰＣＲ  サイクル条件としては、例えば、変性９０〜９５℃  ５〜１００  秒、アニーリング４０〜６０℃  ５〜１５０  秒、伸長６５〜７５℃  ３０  〜３００  秒のサイクル、好ましくは変性  ９４  ℃  １５  秒、アニーリング  ５８  ℃  １５  秒、伸長  ７２  ℃  ４５  秒のサイクルが挙げられるが、アニーリングの反応温度及び時間は適宜実験によって適当な値を選択できるし、変性反応及び伸長反応の時間も、予想されるＰＣＲ  産物の鎖長に応じて適当な値を選択できる。アニーリングの反応温度は、通常プライマーと鋳型ＤＮＡ  とのハイブリッドのＴｍ値に応じて変えることが好ましい。伸長反応の時間は、通常１０００ｂｐの鎖長当たり１  分程度がおおよその目安であるが、より短い時間を選択することも場合により可能である。
【００２１】
所定の核酸を同定したりするには、ハイブリダイゼーション技術を利用することができる。該ハイブリダイゼーションは、上記「遺伝子組換え技術」を開示する文献記載の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ  などの核酸を含有しているサンプルをナイロンフィルターなどの膜を含めた担体に転写せしめ、必要に応じ変成処理、固定化処理、洗浄処理などを施した後、その担体（例えば、膜など）に転写せしめられたものを、必要に応じ変成させた標識プローブＤＮＡ  断片と、ハイブリダイゼーション用バッファ中で反応させて行われる。
ハイブリダイゼーション処理は、普通約３５℃〜約８０℃、より好適には約５０℃〜約６５℃で、約１５分〜約３６時間、より好適には約１  時間〜約２４時間行われるが、適宜最適な条件を選択して行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーション処理は、約５５℃で約１８時間行われる。ハイブリダイゼーション用バッファとしては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができる。転写した担体（例えば、膜など）の変成処理としては、アルカリ変性液を使用する方法が挙げられ、その処理後中和液や緩衝液で処理するのが好ましい。また担体（例えば、膜など）の固定化処理としては、普通約４０℃〜約  １００℃、より好適には約７０℃〜約９０℃で、約１５分〜約２４時間、より好適には約１  時間〜約４  時間ベーキングすることにより行われるが、適宜好ましい条件を選択して行うことができる。例えば、フィルターなどの担体を約８０℃で約２  時間ベーキングすることにより固定化が行われる。転写した担体（例えば、膜など）の洗浄処理としては、当該分野で普通に使用される洗浄液、例えば１Ｍ  ＮａＣｌ  、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび  ０．１％  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  （ＳＤＳ）  含有  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液，ｐＨ８．０  などで洗うことにより行うことができる。ナイロンフィルターなどの膜を含めた担体としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、例えば、ナイロンフィルターなどを挙げることができる。
【００２２】
上記アルカリ変性液、中和液、緩衝液としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いることができ、アルカリ変性液としては、例えば、０．５Ｍ  ＮａＯＨ  および１．５Ｍ  ＮａＣｌ  を含有する液などを挙げることができ、中和液としては、例えば、１．５Ｍ  ＮａＣｌ  含有  ０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液，ｐＨ８．０  などを挙げることができ、緩衝液としては、例えば、  ２×ＳＳＰＥ（０．３６Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４および２ｍＭ  ＥＤＴＡ）などを挙げることができる。またハイブリダイゼーション処理に先立ち、非特異的なハイブリダイゼーション反応を防ぐために、必要に応じて転写した担体（例えば、膜など）はプレハイブリダイゼーション処理することが好ましい。このプレハイブリダイゼーション処理は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液［５０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、  ５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（０．２  ％ウシ血清アルブミン、０．２  ％  ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、  ５×ＳＳＰＥ、０．１  ％  ＳＤＳ、１００  μｇ／ｍｌ    熱変性サケ精子ＤＮＡ  ］などに浸し、約３５℃〜約５０℃、好ましくは約４２℃で、約  ４〜約２４時間、好ましくは約  ６〜約８  時間反応させることにより行うことができるが、こうした条件は当業者であれば適宜実験を繰り返し、より好ましい条件を決めることができる。ハイブリダイゼーションに用いる標識プローブＤＮＡ  断片の変成は、例えば、約７０℃〜約１００  ℃、好ましくは約１００  ℃で、約１  分間〜約６０分間、好ましくは約  ５分間加熱するなどして行うことができる。なお、ハイブリダイゼーションは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で行うことができるが、本明細書でストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度に関し、約１５〜約５０ｍＭ、好ましくは約１９〜約４０ｍＭ、より好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度については約３５〜約８５℃、好ましくは約５０〜約７０℃、より好ましくは約６０〜約６５℃の条件を示す。
【００２３】
ハイブリダイゼーション完了後、フィルターなどの担体を十分に洗浄処理し、特異的なハイブリダイゼーション反応をした標識プローブＤＮＡ  断片以外の標識プローブを取り除くなどしてから検出処理をすることができる。フィルターなどの担体の洗浄処理は、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いて行うことができ、例えば、０．１  ％  ＳＤＳ含有  ０．５×ＳＳＣ  （  Ｏ．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ    クエン酸）溶液などで洗うことにより実施できる。
ハイブリダイズした核酸は、代表的にはオートラジオグラフィーにより検出することができるが、当該分野で用いられる方法の中から適宜選択して検出に用いることもできる。検出したシグナルに相当する核酸バンドを、適切な緩衝液、例えば、ＳＭ溶液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ  および１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液、ｐＨ７．５  ）などに懸濁し、ついでこの懸濁液を適度に希釈して、所定の核酸を単離・精製、そしてさらなる増幅処理にかけることができる。
【００２４】
所定の核酸を保有する、ファージ粒子、組換えプラスミドなどは、当該分野で普通に使用される方法でそれを精製分離することができ、例えば、グリセロールグラジエント超遠心分離法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ｅｄ．  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  ７８，  １９８９）などにより精製することができる。ファージ粒子などからは、当該分野で普通に使用される方法でＤＮＡ  を精製分離することができ、例えば、得られたファージなどをＴＭ溶液（１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液、ｐＨ７．８  ）などに懸濁し、ＤＮａｓｅ  Ｉ  およびＲＮａｓｅ  Ａ  などで処理後、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  、５０μｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  及び０．５  ％ＳＤＳ  混合液などを加え、約６５℃、約１  時間保温した後、これをフェノール抽出ジエチルエーテル抽出後、エタノール沈殿によりＤＮＡ  を沈殿させ、次に得られたＤＮＡ  を７０％エタノールで洗浄後乾燥し、ＴＥ溶液（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  含有１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１  緩衝液、ｐＨ８．０  ）に溶解するなどして得られる。また、目的としているＤＮＡ  は、サブクローニングなどにより大量に得ることも可能であり、例えばサブクローニングは、宿主として大腸菌を用いプラスミドベクターなどを用いて行うことができる。こうしたサブクローニングにより得られたＤＮＡ  も、上記と同様にして遠心分離、フェノール抽出、エタノール沈殿などの方法により精製分離できる。
【００２５】
本明細書において、核酸は、一本鎖ＤＮＡ  、二本鎖ＤＮＡ  、ＲＮＡ  、ＤＮＡ：ＲＮＡ  ハイブリッド、合成ＤＮＡ  などの核酸であり、またゲノムＤＮＡ  、ゲノミックＤＮＡ  ライブラリー、細胞由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ  のいずれであってもよい。核酸の塩基配列は、修飾（例えば、付加、除去、置換など）されることもでき、そうした修飾されたものも包含されてよい。核酸は、本発明で記載するペプチドあるいはその一部をコードするものであってよく、好ましいものとしてはＤＮＡ  が挙げられる。また核酸は、対象ポリペプチド（タンパク質）、あるいはそれらの部分配列と実質的に同等な抗原性などのそれと実質的に同等な生物学的活性を有するペプチド（それと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものを含むし、それと高い相同性を有するものも含まれてよい）をコードするといったそれと同効の塩基配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。該「同効の塩基配列」とは、例えばストリンジェントな条件で問題の配列を有するものにハイブリダイズするものであってよく、例えば当該塩基配列のうちの連続した５個以上の塩基配列、好ましくは１０個以上の塩基配列、より好ましくは１５個以上の塩基配列、さらに好ましくは２０個以上の塩基配列とハイブリダイズし、当該ポリペプチドと実質的に同等のアミノ酸配列をコードするものなどが挙げられる。核酸は、化学合成によって得ることも可能である。その場合断片を化学合成し、それらを酵素により結合することによってもよい。
【００２６】
（１）標的フェノールヒドロキシラーゼ酵素に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ  の単離
本発明のＴＣＥ分解活性を有する酵素ポリペプチドをコードするＤＮＡ  は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株のＴＣＥ分解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ  から製造することができる。
該ＴＣＥ分解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ  としては、例えばＴＣＥ自身で酵素の誘導がかかりＴＣＥを分解する微生物、具体的にはラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌から得られるものが挙げられる。該ＴＣＥ分解酵素遺伝子は、ＴＣＥ分解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ  を有する微生物の染色体ＤＮＡ  からライブラリーを構築し、このライブラリーをスクリーニングすることから単離取得することができる。
ライブラリー構築に用いるドナーＤＮＡ  は、例えば微生物細胞を培養して得られた培養物を遠心分離（例えば１，５００  ×ｇ  で遠心）して細胞ペレットを得、次に緩衝液に懸濁（例えば５  〜１０倍量の氷冷リン酸緩衝生理食塩水  （ＰＢＳ）などに懸濁）してから遠心分離するという処理を加えて洗浄し、次にこうして得られた細胞ペレットをＴＥ緩衝液〔１０  ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスまたはＴｒｉｓと略す）−塩酸（以下、ＨＣｌと略す）（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５））  、１  ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（以下、ＥＤＴＡと略す）（１  ｍＭ  ＥＤＴＡ）  〕に懸濁し、必要に応じリゾチームなどで処理し、ＤＮＡ  抽出緩衝液〔例えば、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０），  ０．１  Ｍ  ＥＤＴＡ，  ０．５％  ＳＤＳ〕に添加した後、必要に応じＲＮａｓｅ  などで処理し、プロティナーゼＫ  （例えば、終濃度  １００μｇ／ｍｌ）  で処理し（例えば、約５０℃で約３時間インキュベートし）、次に抽出分離精製処理して得られる〔例えば、ＤＮＡ  含有処理液にフェノールを加えて、液を混合し、次いでクロロホルム／イソアミルアルコール（例えば、２４：１）を加えて混合し、遠心分離機を用いて、例えば２，５００  ｒｐｍ  で１５分間遠心し、ＤＮＡ  を含有する水層（上層）  を採取するなどし、次に抽出されたＤＮＡ  を含有する水層を、例えば酢酸アンモニウムやイソプロパノールを使用して処理し、含まれるＤＮＡ  を沈殿化せしめ、必要に応じ遠心分離機を用いて、例えば２，５００  ｒｐｍ  で５  分間遠心し、ＤＮＡ  を沈殿として得る。沈殿として得られたＤＮＡ  は、例えば７０％  のエタノールで洗浄された後、ＴＥ緩衝液に溶解される。必要に応じて密度勾配超遠心法、ゲル電気泳動法などを用いて精製される〕。得られた染色体ＤＮＡ  は、適宜適当な制限酵素を用いて部分分解してライブラリー構築に適した断片（例えば、約２０  ｋｂｐ程度までの大きさ）  にし、必要に応じて密度勾配超遠心法、ゲル電気泳動法などを用いて分離される。
【００２７】
ＤＮＡ  ライブラリーは、ファージベクター、プラスミドベクターを使用するなどして構築できる。例えばλファージ由来ベクター、Ｐ１ファージベクター、コスミドファージベクターなどを好ましく使用できる。好ましくは市販された試薬、あるいは調製済のベクターＤＮＡ  （例えば、酵素切断され、脱リン酸化されたものなど）、パッケージングエキストラクト、宿主菌株、さらには最初から最後までのステップをすべて行えるキットなどを用いて行うことができる。具体的には、ＤＮＡ  ライブラリーは、例えば、ｐＬＡＦＲ３，  λｇｔ１０、λＺａｐＩＩ，  ｐＵＣ１８，  ｐＢＲ３２２などに構築することができ、それを大腸菌Ｃ６００ｈｆｌ  株などの宿主大腸菌に感染させ、プラークを形成させて得ることができる。
またファージベクターを使用する以外で、大腸菌などの宿主細胞の形質転換をするには、例えばカルシウム法、ルビジウム／カルシウム法、カルシウム／マンガン法、ＴＦＢ  高効率法、ＦＳＢ  凍結コンピテント細胞法、迅速コロニー法、エレクトロポレーションなど当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができる（Ｄ．  Ｈａｎａｈａｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １６６：  ５５７，  １９８３  など）。
【００２８】
本発明の代表的な手法では、既知フェノール分解菌のフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子に高く保存されたアミノ酸配列をもとに、プライマーを合成する。次に該プライマーと、ＴＣＥ自身で酵素の誘導がかかりＴＣＥを分解する微生物、具体的にはラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌から得られた鋳型ＤＮＡ  を使用しＰＣＲ法により前記菌株由来のフェノールヒドロキシラーゼの構造遺伝子断片を取得する。得られた核酸断片をプローブとして、構築されたゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、前記菌株由来のフェノールヒドロキシラーゼの調節遺伝子及び構造遺伝子をコードするクローンを取得する。
また、本発明の酵素遺伝子であるＤＮＡ  は、それが一旦単離取得されたならば、慣用方法に従ってそのＤＮＡ  中の塩基配列の大部分あるいは一部分を利用して、それをプローブとして用いて、他の生物を検索して、その生物の保有する遺伝子のうちに、ＴＣＥ自身で酵素の誘導がかかりＴＣＥを分解するといった活性に関与する遺伝情報を担うものを見つけ出し、次にそのようにして同定された遺伝子を遺伝子組換え技術の手法を応用して切り出して、それを大量に得、それを本微生物に由来するものと同様に用いることは、当業者であれば容易に理解し得るところのものである。なお、プローブなどを放射性同位体などによって標識するには、市販の標識キット、例えばランダムプライムドＤＮＡ  ラベリングキット  （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈａｉｍ）などを使用してプローブ用ＤＮＡ  を  ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ）などを用いて標識し、放射活性を持つプローブを得ることにより行うことが出来る。
また、本発明のＴＣＥ分解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ源としては、上記したような手法の適用できるグラム陰性あるいはグラム陽性細菌であってフェノールヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を有するものがあげられる。この他にも、独特のＴＣＥ  分解酵素遺伝子を有するものであれば、下等生物、高等生物の区別なく利用することが可能である。
ＴＣＥ  分解酵素遺伝子源として使用しうる微生物としては、ラルストニア属に属するものが挙げられる。
【００２９】
（２）ＤＮＡ  の塩基配列の決定
単離取得された所定の遺伝子をコードするＤＮＡ  領域を含む部分は、これを当業者によく知られたベクターに結合し大腸菌などの宿主細胞を用い、得られた組換え体コロニーをハイブリダイゼーションの手法など、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、ハイブリダイゼーション・トランスレーションアッセイ法、プラス・マイナス法などによって同定して、当該染色体由来のフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ  を大量に調製できる。ハイブリダイゼーションは、上記したようにして実施できる。
目的の遺伝子を保持するクローンの選択には、フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子に隣接して存在するカテコール  ２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子の産物であるカテコール  ２，３−ジオキシゲナーゼがカテコールを代謝して黄色の代謝産物を生産することを利用しもよい。すなわち、例えばカテコールを噴霧して黄色を呈するクローンを選択すると、カテコール  ２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子と同時に目的の遺伝子を得られる可能性が高いことから、これを選別に利用できる。
こうして得られたＤＮＡ  の塩基配列、例えば１本鎖ＤＮＡ  の塩基配列は、シークエンシングすることができ、例えば、蛍光ＤＮＡ  シーケンサＭｏｄｅｌ  ３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔａｑ  ダイプライマーサイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などを使用しその配列を決定することができる。
次にこうして得られた所定のポリペプチドをコードするＤＮＡ  部分を再度当業者によく知られたベクターに結合し大腸菌などの宿主細胞に導入し、得られた組換え体をＴＣＥ分解酵素活性測定系にかけ、得られたクローンを検定して、ＴＣＥ分解酵素活性を有する形質転換体をうる。次にこの形質転換体からＴＣＥ分解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ  領域を含む部分を制限酵素を用いて切りだすことが可能である。
該形質転換体からの組換え体ＤＮＡ  および目的の酵素遺伝子を持つＤＮＡ  断片の調製は通常の方法を用いて行うことができる。例えば、培地中で増殖させた該形質転換体を収穫し、細胞壁をリゾチーム処理等の細胞破壊法として知られた方法により壊し、次に核酸画分を分離した後、密度勾配遠心などの方法により所望の画分に分ける。こうして得られたプラスミドを含有する画分は、次に適当な制限酵素で処理することにより、適度な断片にすることができると共にまた選択的に所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ  断片とすることができる。得られた断片は、例えばゲル電気泳動などにより、所望のものに分離でき、適当なサイズのＤＮＡ  断片を含むゲルは、例えばフェノール抽出−エタノール沈殿などによりＤＮＡ  抽出処理される。抽出されたＤＮＡ  は必要に応じ適当な制限酵素で切断し、さらに必要に応じ精製処理したり、また必要に応じ５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどによりリン酸化した後、ｐＵＣ１８  などのｐＵＣ  系ベクターといった適当なプラスミドベクターにライゲーションし、適当なコンピテント細胞を形質転換する。クローニングされたＤＮＡ  断片はその塩基配列を解析される。
【００３０】
ＤＮＡ  の塩基配列を決定するのに適した程度まで断片化されたＤＮＡ  は、次に当該分野でよく知られた方法により処理されて、その塩基配列を決定することができる。ＤＮＡ  断片のＤＮＡ  塩基配列の決定法としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ  法、ジデオキシ法、例えばジデオキシ・チェイン・ターミネーション法  （Ｓａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２１４，  １２０５  （１９８１））、Ｍ１３  ジデオキシ法等が挙げられる。また、市販のシークエンシングキット、例えば  Ｔａｑダイプライマーサイクルシークエンシングキット、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖ  ２．０  ｋｉｔ  などを用いたり、自動塩基配列決定装置、例えば蛍光ＤＮＡ  シーケンサー装置などを用いて行うことが出来る。ジデオキシ法に用いられるポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡ  ポリメラーゼ  Ｉのクレノー・フラグメント、ＡＭＶ  逆転写酵素、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、修飾  Ｔ７  ＤＮＡ  ポリメラーゼなどが挙げられる。このような方法の内には、適当な制限酵素を作用させ、制限酵素地図を作製した上で、必要な断片をサブクローン化する方法や、ショットガン・クローニング法、ＰＣＲ  により遺伝子を増幅する方法、核酸分解酵素によりディリーションする方法などの様々な手法が含まれていることはもちろんである。次に、こうしてＤＮＡ  塩基配列の決定されたＤＮＡ  のうちから所定のポリペプチドをコードしているＤＮＡ  領域を決定する。決定したＤＮＡ  塩基配列の中でオープン・リーディング・フレームを検索する。その中でＴＣＥ分解酵素をコードすると思われるＤＮＡ  領域を制限酵素で切り出し、再度これを用いて発現ベクターを構築し、それを適当な宿主中で発現させ、こうして得られた発現物中の活性をＴＣＥ分解活性測定系にかけて検討し、最終的に確認されることもできる。
【００３１】
また該解析された新規な酵素遺伝子の有しているＤＮＡ  配列を基にセンスプライマーとアンチセンスプライマーを合成することができる。オリゴヌクレオチドプライマーの作製は、上記したように当該分野で知られた方法で行うことができる。さらに、競合ＰＣＲ  に適した、コンペティターオリゴヌクレオチドを作製できる。競合ＰＣＲ  は、所定の遺伝子の定量に有効に使用できる。
上記のようにして構造解析されたＤＮＡ  から、所定の遺伝子をコードするＤＮＡ  以外の領域を除くには、様々な方法で不必要な領域を欠失させることによってなすことができる。このような方法としては、ＢＡＬ３１  ヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼＩＩＩ  による欠失法、制限酵素切断サイトを利用した組換え法などがあげられる。この際、本発明に従えば遺伝子の固有のプロモーターを他のものに変更したり、部位特異的変異を導入してプロモーターの強度を変化させることが、現在の遺伝子操作技術を用いることにより、容易に行いうる。従って、そのように一部を変更したＤＮＡ  断片であっても、所定のＴＣＥ分解活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ  を含むＤＮＡ  断片であれば、全て本発明に含まれることは明白である。また、本発明のＴＣＥ分解活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ  を含むＤＮＡ  断片としては、構造遺伝子をコードするＤＮＡ  に加えて、その遺伝子を生体内で発現させるのに重要な役割を担う制御領域、例えば、遺伝子の転写プロモーター、リボソーム結合部位、転写のターミネーターなどをコードするＤＮＡ  をも含んだものがあげられる。
【００３２】
本発明に従えば、一旦そのＴＣＥ分解活性に関与するポリペプチドをコードするＤＮＡ  の塩基配列が明らかにされることにより、その塩基の置換あるいは欠失を当該分野においてよく知られた方法を適用して容易に行なうことができる。
例えば、相当するアミノ酸をコードする遺伝暗号の縮重を利用したもの、生物の遺伝暗号の利用率を考慮した変換あるいはＴＣＥ分解の機能に悪影響を及ぼさないようなアミノ酸配列の変換のための塩基の置換、付加または欠失処理などがあげられる。更にまた、このような改変のうちには、ＴＣＥ分解に関与する酵素の活性中心のみを保存し、その他の部分を大幅に変化させるようにそのＤＮＡ  の配列及び長さを変えることも含まれる。従って、本発明の遺伝子をコードするＤＮＡ  としては、以上のような改変を施したものすべてが含まれることは当業者であれば容易に理解し得るところのものである。
以上のような事情に鑑み、本発明の構造タンパク質や制御タンパク質をコードする遺伝子は、本発明の思想を実質的に利用して得られ、本発明の該遺伝子と実質的に同一の機能（あるいは活性）を有するものすべてを含有するものである。
【００３３】
さらに、本発明に係わる遺伝子の塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を用いることにより、所定のポリペプチドのアミノ酸配列中に適宜、１個ないし複数個以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導入した相当するポリペプチドを製造することができる。こうした変異・変換・修飾法としては、例えば日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法  ＩＩ  」、ｐ１０５（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）；  日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸  ＩＩＩ（組換えＤＮＡ  技術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９２）；  Ｒ．  Ｗｕ，  Ｌ．  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  ｅｄ．，  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  １５４，  ｐ．  ３５０  ＆  ｐ．  ３６７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８７）；  Ｒ．  Ｗｕ，  Ｌ．  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  ｅｄ．，  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  １００，  ｐ．  ４５７  ＆  ｐ．  ４６８，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８３）；  Ｊ．  Ａ．  Ｗｅｌｌｓ    ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ３４：  ３１５，  １９８５；  Ｔ．  Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３：  ３３０５，  １９８５；  Ｊ．  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３：  ８７６５，  １９８５；  Ｒ．  Ｗｕ  ｅｄ．，  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  １５５，  ｐ．  ５６８，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８７）；  Ａ．  Ｒ．  Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ４４：  １７７，  １９８６  などに記載の方法が挙げられる。例えば、ＰＣＲ  、合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）  （Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １０：  ６４８７，  １９８７；  Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３：  ４３３１，  １９８６），  カセット変異導入法  （ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ３４：  ３１５，  １９８５），  制限部位選択変異導入法  （ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｉｌｏｓ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｓｅｒ  Ａ，  ３１７：  ４１５，  １９８６），アラニン・スキャンニング法  （Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｗｅｌｌｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：  １０８１−１０８５，  １９８９），  ＰＣＲ  変異導入法，  Ｋｕｎｋｅｌ法，    ｄＮＴＰ［αＳ］法（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ），亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
【００３４】
また、遺伝子組換え法で製造する時に融合ポリペプチド（融合タンパク質）として発現させ、生体内あるいは生体外で、所望のポリペプチドと実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合ポリペプチドはその融合部を利用してアフィニティクロマトグラフィーなどで精製することも可能である。こうした融合ポリペプチドとしては、ヒスチジンタグに融合せしめられたもの、あるいは、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）  、マルトース結合タンパク  （ＭＢＰ），グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ  （ＧＳＴ）、チオレドキシン  （ＴＲＸ）又は  Ｃｒｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅのアミノ酸配列に融合せしめられたものなどが挙げられる。同様に、ポリペプチドは、ヘテロジーニアスなエピトープのタグを付加され、該エピトープに特異的に結合する抗体を用いてのイムノアフィニティ・クロマトグラフィーによる精製をなし得るようにすることもできる。より適した実施態様においては、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ）又はポリヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ）タグ、また該エピトープタグとしては、例えば  ＡＵ５，  ｃ−Ｍｙｃ，  ＣｒｕｚＴａｇ  ０９，  ＣｒｕｚＴａｇ  ２２，  ＣｒｕｚＴａｇ  ４１，  Ｇｌｕ−Ｇｌｕ，  ＨＡ，  Ｈａ．１１，  ＫＴ３，  ＦＬＡＧ  （ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ  ｔｒａｄｅｍａｒｋ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），  Ｏｍｎｉ−ｐｒｏｂｅ，  Ｓ−ｐｒｏｂｅ，  Ｔ７，  Ｌｅｘ  Ａ，  Ｖ５，  ＶＰ１６，  ＧＡＬ４，  ＶＳＶ−Ｇ  などが挙げられる  （Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ８：  ｐｐ．２１５９−２１６５  （１９８８）；  Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ５：  ｐｐ．３６１０−３６１６  （１９８５）；  Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ３（６）：  ｐｐ．５４７−５５３  （１９９０）；  Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６：  ｐｐ．１２０４−１２１０  （１９８８）；  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５５：  ｐｐ．１９２−１９４  （１９９２）；  Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６６：  ｐｐ．１５１６３−１５１６６  （１９９１）；  Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：  ｐｐ．６３９３−６３９７  （１９９０）  など）  。
【００３５】
さらに融合ポリペプチドとしては、検出可能なタンパク質となるようなマーカーを付されたものであることもできる。より好適な実施態様においては、該検出可能なマーカーは、ビオチン／ストレプトアビジン系のＢｉｏｔｉｎ  Ａｖｉ  Ｔａｇ、螢光を発する物質などであってよい。該螢光を発する物質としては、オワンクラゲ  （Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｅａ）などの発光クラゲ由来の緑色螢光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ＧＦＰ）、それを改変した変異体（ＧＦＰバリアント）  、例えば、ＥＧＦＰ  （Ｅｎｈａｎｃｅｄ−ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＧＦＰ），  ｒｓＧＦＰ  （ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔ  ＧＦＰ），  黄色螢光タンパク質  （ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ＹＦＰ），  緑色螢光タンパク質  （ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ＧＦＰ），藍色螢光タンパク質  （ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ＣＦＰ），  青色螢光タンパク質  （ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ＢＦＰ），  ウミシイタケ  （Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）  由来のＧＦＰ  などが挙げられる（宮脇敦史編、実験医学別冊ポストゲノム時代の実験講座３−ＧＦＰ  とバイオイメージング、羊土社  （２０００年））。また、上記融合タグを特異的に認識する抗体（モノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む）を使用して検出を行うこともできる。こうした融合ポリペプチドの発現及び精製は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。本発明の所定のペプチドは、天然に存在する形態に加えて、そのペプチドの機能と同等、又はより強力な、又はよりプラスの機能を有するペプチド類縁体のような他のポリペプチドも含む。
【００３６】
かくして本発明の細菌由来のタンパク質は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよい。本発明のラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌由来のタンパク質は、当該タンパク質に特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個など）欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜４０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特には１〜２個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１〜４０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特には１〜２個など）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体も包含する。該フェノールヒドロキシラーゼ  Ａ〜Ｆ  、Ｃ２３０及び制御タンパク質の内に見出される共通の特徴であるドメイン構造が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明に包含される。また本発明のタンパク質は天然の当該分解酵素あるいは制御タンパクと実質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さらに天然のラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株細菌由来の所定のタンパク質と実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。本発明の細菌由来のタンパク質は、例えば、配列表の配列番号：  ６  及び８  〜１４のいずれかで示されるアミノ酸配列に対し、７０％  より高い相同性を有しているものが挙げられ、より好ましくは８０％  以上、特に好ましくは９０％  以上の相同アミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【００３７】
アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、しばしばポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化を生ぜしめないし、こうした場合、その置換、欠失、あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失、あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされるであろう。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換体としては、そのアミノ酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられ、極性（中性）としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３８】
（３）ＴＣＥ分解関与遺伝子を持つ組換え体ＤＮＡ  の作製
ＴＣＥの分解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ  を含む断片から、適当な手段を施して不必要な領域を欠失させたＤＮＡ  は、それを適当なベクターＤＮＡ  に再び組み込むことにより、宿主細胞に再び導入することが出来る。
本発明の上記酵素などをコードするＤＮＡ  を宿主細胞に導入し、そしてそれをその導入された宿主細胞内で発現させるために用いられるベクターＤＮＡ  としては、適当な宿主細胞内で、所定の酵素遺伝子などを発現できるものであれば特に制限なく使用し得る。
このようなベクターＤＮＡ  としては、上記酵素などをコードするＤＮＡ  を組み込むことの出来るものであり、組換えたベクターＤＮＡ  で宿主細胞を形質転換できるものであり、そして得られた形質転換体の細胞内で導入された遺伝子産物をコードするＤＮＡ  の発現ができるものであれば特に限定されず、如何なるものも使用することが出来る。
このようなベクターＤＮＡ  としては、宿主細胞中で自律複製可能であり、さらに組換え宿主細胞のみを選別できるような適当な選択マーカーなどが付与されたものがあげられる。さらにまた、このようなベクターＤＮＡ  は公知のベクターＤＮＡ  等から当業者が容易に製造し得るようなものであってもよい。
このようなベクターＤＮＡ  としては、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターから選ばれたものがあげられる。また、このようなベクターＤＮＡ  は他の宿主株との間で遺伝子交換が可能なシャトルベクターであってもよいし、ランナウェイベクターやスリーパーベクターなど遺伝子産物の発現効率を向上せしめるために特別に工夫されたものであってもよい。
さらに、このようなベクターＤＮＡ  は、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等の制御因子を適宜付与されたものであってもよい。このような形質発現などに係わる因子等を導入するためには、遺伝子組換え技術の分野でよく知られた方法を適宜選択して適用することにより行うことができる。代表的な発現ベクターとしては、例えば、ｐＬＡＦＲ３，  ｐＲ０１６１４  などを挙げることができる。
【００３９】
大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、例えばｐＢＲ３２２，  ｐＵＣ１８，  ｐＵＣ１９，  ｐＵＣ１１８，  ｐＵＣ１１９，  ｐＳＰ６４，  ｐＳＰ６５，  ｐＴＺ−１８Ｒ／−１８Ｕ，  ｐＴＺ−１９Ｒ／−１９Ｕ，  ｐＧＥＭ−３，  ｐＧＥＭ−４，  ｐＧＥＭ−３Ｚ，  ｐＧＥＭ−４Ｚ，  ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−），  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＴＭ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）  などが挙げられる。大腸菌での発現に適したプラスミドベクターとしては、例えばｐＡＳ，  ｐＫＫ２２３  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ），  ｐＭＣ１４０３，  ｐＭＣ９３１，  ｐＫＣ３０，  ｐＲＳＥＴ−Ｂ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  なども挙げられる。上記ベクターＤＮＡ  に、上記所定タンパク質をコードするＤＮＡ  を組み込むには、まず、上記ベクターＤＮＡ  に適当な制限酵素を作用させ、得られたベクターＤＮＡ  断片を、目的タンパク質をコードするＤＮＡ  断片とを混合し、これにＤＮＡ  リガーゼを作用させることによりなしうる。この際、必要に応じ当該分野で知られたリンカー付与、ブラントエンド化等の処理を加えることもできる。このようにして得られた組換え体ＤＮＡ  は次に適当な宿主細胞の中に導入される。
同一のプラスミド上に複数の所定遺伝子を組み込めば、より良好な結果が得られる。複数の酵素遺伝子などを組み込む際のその様式は、固有のプロモーターを持つ当該遺伝子が複数個導入されていてもよいし、複数の酵素遺伝子がポリシストロニックに転写されるオペロンとして導入されていてもよいし、またこれらの組み合わせであってもよい。導入する遺伝子の数に特に制限はなく、組換え体ＤＮＡ  及びそれを含む形質転換体の安定性を損なわない範囲であればよい。
組換え体ＤＮＡ  を作製する場合、このための技術としては制限酵素による切断、リガーゼによる連結、化学合成ＤＮＡ  の利用、ヌクレアーゼによる欠失、部位特異的変異による塩基置換など、通常の遺伝子操作で用いられる技術を適宜選択して適用することにより行なうことができるが、この際に、プロモーターの変更やその他の所定酵素遺伝子を発現させるための塩基配列の改変を行ってもよい。このようにして得られた組換え体ＤＮＡ  は次に適当な宿主細胞の中に導入される。
【００４０】
（４）組換え体ＤＮＡ  の宿主細胞への導入
上記のようにして作製した組換え体ＤＮＡ  を導入するための宿主細胞としては、上記で得られた組換えベクターでもって形質転換されて、当該遺伝子を発現させることができるようなものであれば、特に制限なく使用することが出来き、例えば大腸菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｌｍｏｎａｓ）属細菌、例えば  Ｐｓｅｕｄｏｌｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１ｃなど、Ｍｅｔｈｙｒｏｓｉｎｕｓ属細菌、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  属細菌、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ）  属細菌、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎｕｓ属細菌、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）属細菌、コマモナス（Ｃｏｍａｎｏｎａｓ）属細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌など、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属真菌、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属真菌など、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）  属などの酵母などが挙げられる。このような宿主細胞としては、本発明の目的に沿ってＴＣＥ分解酵素遺伝子の発現を達成し得る限り、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく使用できる。
宿主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例えば大腸菌Ｋ１２  株に由来するものが挙げられ、例えばＮＭ５３３  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｃ６００、ＤＨ１  、ＤＨ５  、ＤＨ１１Ｓ  、ＤＨ１２Ｓ  、  ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ  、ＨＢ１０１  、ＭＣ１０６１、ＪＭ１０９  、ＳＴＢＬ２  、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳなどが挙げられる。組換え体ＤＮＡ  を導入するためには、組換え体ＤＮＡ  をコンピテント細胞に接触せしめる、エレクトロポレーション、インビトロパッケージング法などを用いて適当な増殖期にある宿主に、組換えファージベクターを感染させる方法等など当業者によく知られた方法から適宜選択して用いることが出来る。
【００４１】
本発明の遺伝子工学的手法においては、当該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆転写酵素、ＤＮＡ  断片をクローン化するのに適した構造に修飾したりあるいは変換するための酵素であるＤＮＡ  修飾・分解酵素、ＤＮＡ  ポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ  リガーゼなどを用いることが出来る。制限酵素としては、例えば、Ｒ．  Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３：  ｒ１６５，  １９８５；  Ｓ．  Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，  ｐ．  １０９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８２；  Ｒ．  Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｄ．  Ｍａｃｅｌｉｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９：  Ｓｕｐｐｌ．  ２０７７，  １９９１などに記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、例えばマウスモロネイ白血病ウイルス  （ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ；  ＭＭＬＶ）  由来の逆転写酵素  （ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス  （ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ；  ＡＭＶ）由来の逆転写酵素などが挙げられる。逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ  Ｈ  欠損体などは好ましく用いることができ、特にはＲＮａｓｅ  Ｈ  活性を欠いた修飾ＭＭＬＶ  ＲＴ  が好ましく使用でき、さらには熱安定性の高いものが好ましい。適した逆転写酵素としては、ＭＭＬＶ  ＲＴ  （Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）  、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｐｌｕｓ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）  などが挙げられる。
【００４２】
ＤＮＡ  ポリメラーゼとしては、例えば大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼ、その誘導体であるクレノウ・フラグメント、大腸菌ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱菌ＤＮＡ  ポリメラーゼなどが挙げられる。末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼとしては、例えばＲ．  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  １００，  ｐ．  ９６，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８３）  に記載の３’−ＯＨ末端にデオキシヌクレオチド（ｄＮＭＰ）を付加するＴｄＴａｓｅなどが挙げられる。ＤＮＡ  修飾・分解酵素としては、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼなどが挙げられ、例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、大腸菌ＤＮＡ  エキソヌクレアーゼ  Ｉ、大腸菌ＤＮＡ  エキソヌクレアーゼＩＩＩ  、大腸菌ＤＮＡ  エキソヌクレアーゼ  ＶＩＩ、λエキソヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ヌクレアーゼＳ１、ミクロコッカス  （Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）    ヌクレアーゼなどが挙げられる。ＤＮＡ  リガーゼとしては、例えば大腸菌ＤＮＡ  リガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼなどが挙げられる。  ＤＮＡ  遺伝子をクローニングしてＤＮＡ  ライブラリーを構築するのに適したベクターとしては、プラスミド、λファージ、コスミド、Ｐ１ファージ、Ｆ因子、ＹＡＣ  などが挙げられ、好ましくはλファージ由来のベクターが挙げられ、例えばＣｈａｒｏｎ  ４Ａ  、Ｃｈａｒｏｎ  ２１Ａ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＤＡＳＨＩＩ、λＦＩＸＩＩ  、λＥＭＢＬ３  、λＺＡＰＩＩ  ＴＭ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）  などが挙げられる。
【００４３】
本発明に従い、ポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、必要に応じて適当な選択マーカーを用い、繰り返しクローニングを行うことにより、高い発現能を安定して有する細胞株を得ることができる。形質転換体を用いる場合、使用する菌株に応じてアンピシリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添加してもよい。本発明の形質転換体は、適当な栄養培地中で本発明のポリペプチドをコードする核酸が発現可能な条件下で培養し、それを大量に得ることができるし、さらに目的物を生成、蓄積せしめることもできる。該形質転換体は、当該分野で汎用されている培地中で培養することができる。例えば、大腸菌等の原核細胞宿主などを宿主としている形質転換体は、液体培地を好適に使用することができる。培地中には、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、麦芽エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては，例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム、炭酸カルシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、カザミノ酸、生長促進因子などを添加してもよい。また、必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル  アクリル酸のような薬剤を加えることができる。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００４４】
培養は、例えば大腸菌では通常約１５〜約４５℃で約３〜約７５時間行い、必要により、通気や攪拌を加えることもできる。培養は通常約３０℃〜約４０℃で約１５〜約７２時間行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。所定の遺伝子産物を発現している形質転換体はそのまま利用可能であるが、その細胞ホモジュネートとしても利用できるが、所定の遺伝子産物を単離して用いることもできる。上記培養細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩衝液の中には尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤や、トリトン  Ｘ−１００（商品名）、ツウィーン−２０  （商品名）などの界面活性剤を加えてあってもよい。培養液中に目的生成物が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる目的生成物は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせてその精製を行なうことができ、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、例えばジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブチル基、オクチル基、フェニル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、逆相クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ることができる。好ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、リガンドなどを固定化したアフィニティー・クロマトグラフィーなどで処理し精製分離処理できる。例えば、ゼラチン−アガロース・アフィニティー・クロマトグラフィー、ヘパリン−アガロース・クロマトグラフィーなどが挙げられる。それらの方法は、単独あるいは適宜組み合わせて用いて適用することにより行うことが出来る。
得られたタンパク質（ペプチドあるいはポリペプチドを包含していてよい）は、それを酵素免疫測定法など知られた手法で、適当な担体あるいは固相に結合せしめて固相化することができる。固相化タンパク質、固相化ペプチドは、便利に結合アッセイや物質のスクリーニングに使用できる。精製されたリコンビナントタンパク質は、モノクローナル抗体作製のための免疫抗原として好適に使用できる。
【００４５】
該ポリペプチドは、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどの酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体などにすることができる。場合によっては、該ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ  あるいは  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  グルコシレーション又は脱グルコシレーションをしたり、グルコシル化される位置を変えることもできる  （ＷＯ８７／０５３３０；  Ａｐｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ｐｐ．２５９−３０６  （１９８１）；  Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  ２５９：  ｐｐ．５２  （１９８７）；  Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１８：  ｐｐ．１３１  （１９８１）；  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  １３８，  ｐｐ．  ３５０，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）  等）  。
タンパク質・ポリペプチドの構造の修飾・改変などは、例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパク質  ＶＩＩ、タンパク質工学」、東京化学同人（１９９３）を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができる。またその生物学的活性のうちには、免疫的に活性、例えば抗原性を有するということも含まれてよい。該修飾・改変のうちには、脱アミノ化、ヒドロキシル化、リン酸化、メチル化、アセチル化、開環、閉環、含有糖鎖の種類を違うものに変えること、含有糖鎖の数を増減すること、Ｄ−体アミノ酸残基への置換などであってもよい。それらの方法は、当該分野で知られている（例えば、Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ｐｐ．７９−８６  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＵＳＡ  （１９８３），等）  。
【００４６】
本明細書において、「実質的に同等」とはポリペプチドの活性、例えば、ＴＣＥ  分解活性、それに対応する生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。さらにまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性を有する場合を包含していてよく、該実質的に同質の活性としては、例えば、ＴＣＥ  により誘導されて発揮する酵素活性などを挙げることができる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、環境浄化的に、あるいは生物学的に同質であることを示す。例えば、該フェノールヒドロキシラーゼ活性とか、該酵素の誘導活性などの活性が、同等  （例えば、約  ０．０００１  〜１００００  倍、好ましくは約０．００１  〜１０００倍、より好ましくは約  ０．０１  〜２００  倍、さらに好ましくは約  ０．５〜１０倍）  であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的な要素は異なっていてもよい。
【００４７】
本発明に従えば、ＴＣＥを分解するフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群及びその制御遺伝子が明らかにされたので、ＤＮＡ  配列は、例えば各種の微生物におけるＴＣＥを分解するフェノールヒドロキシラーゼ及び関連タンパク質をコードする、微生物、例えばラルストニア属微生物などの、ゲノムＤＮＡ  及びｃＤＮＡのスクリーニング及びＴＣＥ分解能などの検知のためのプローブの設計などに使用できる。プローブは、必要に応じて、当該分野で広く利用されている標識を付与しておくことができる。遺伝子の単離にあたっては、ＰＣＲ  法、さらには逆転写酵素  （ＲＴ）  を用いたＰＣＲ  法  （ＲＴ−ＰＣＲ）  を利用することが出来る。例えば、所定のｃＤＮＡをプローブとして用いれば、例えばノーザン・ブロティング、サザン・ブロティング、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションなどにより細胞中でのフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群及びその制御遺伝子などを検出・測定できる。
【００４８】
本明細書中で開示した関連したタンパク質あるいはポリペプタイド、そのフラグメント、さらにはＤＮＡ  を含めた核酸（ｍＲＮＡ  やオリゴヌクレオチドを含む）  は、それらを単独あるいは有機的に使用し、更にはアンチセンス技術、モノクローナル抗体を含めた抗体、組換え微生物などとも適宜組合わせて、ゲノミックス及びプロテオミックス技術に応用できる。また、二本鎖ＲＮＡ  （ｄｓＲＮＡ）  を使用してのＲＮＡｉ  （ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）  技術への応用の途もある。かくして、一塩基多型（ＳＮＰ；  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）を中心とした遺伝子多型解析、核酸アレイ、タンパク質アレイを使用した遺伝子発現解析、遺伝子機能解析、タンパク質間相互作用解析、関連遺伝子解析、環境アセスメント解析をすることが可能となる。例えば、核酸アレイ技術では、ｃＤＮＡライブラリーを使用したり、ＰＣＲ  技術で得たＤＮＡ  を基板上にスポッティング装置で高密度に配置して、ハイブリダイゼーションを利用して試料の解析が行われる。
【００４９】
該アレイ化は、針あるいはピンを使用して、あるいはインクジェトプリンティング技術などでもって、スライドガラス、シリコン板、プラスチックプレートなどの基板のそれぞれ固有の位置にＤＮＡ  が付着せしめられることによりそれを実施することができる。該核酸アレイ上でのハイブリダイゼーションの結果得られるシグナルを観察してデータを取得する。該シグナルは、螢光色素などの標識（例えば、Ｃｙ３，  Ｃｙ５，  ＢＯＤＩＰＹ，  ＦＩＴＣ，  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ｄｙｅｓ（商品名），  Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ（商品名）  など）  より得られるものであってよい。検知にはレーザースキャナーなどを利用することもでき、得られたデータは適当なアルゴリズムに従ったプログラムを備えたコンピューターシステムで処理されてよい。また、タンパク質アレイ技術では、タグを付された組換え発現タンパク質産物を利用してよく、二次元電気泳動（２−ＤＥ）、酵素消化フラグメントを含めての質量分析  （ＭＳ）（これにはエレクトロスプレーイオン化法（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：  ＥＳＩ），  マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：  ＭＡＬＤＩ）などの技術が含まれ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  分析計、ＥＳＩ−３  連四重極分析計、ＥＳＩ−イオントラップ分析計などを使用してよい）  、染色技術、同位体標識及び解析、画像処理技術などが利用されることができる。したがって、本発明には上記で得られるあるいは利用できるフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子系（制御遺伝子を含む）など及びそれに対する抗体に関連したソフトウエア、データベースなども含まれてよい。
【００５０】
本明細書中、「抗体」との用語は、広義の意味で使用されるものであってよく、所望のフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子系（制御遺伝子を含む）などのタンパク質、その構成ポリペプチド及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、Ｆ（ａｂ’）２，  Ｆａｂ’  及びＦａｂ  といったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原又はエピトープ  （ｅｐｉｔｏｐｅ）結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又は、例えば、クワドローム（ｑｕａｄｒｏｍｅ），  トリオーム（ｔｒｉｏｍｅ）などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合又はハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、ＤＮＡ  組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含していてよい。
【００５１】
抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基（エピトープ）  に対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の（ポリクローナル）抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来やイムノグロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる（例えば、米国特許第４８１６５６７  号；  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．７９−９７，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７  など）  。
【００５２】
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、ハイブリドーマ法  （Ｇ．  Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，  ｐｐ．４９５−４９７  （１９７５））；  ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法  （Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  ４，  ｐｐ．７２−７９  （１９８３）；  Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３，  ｐｐ．３００１  （１９８４）；  Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．５１−６３，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８７）；トリオーマ法；  ＥＢＶ−ハイブリドーマ法  （Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．７７−９６  （１９８５））（ヒトモノクローナル抗体を産生するための方法）；米国特許第４９４６７７８  号  （単鎖抗体の産生のための技術）  が挙げられる他、抗体に関して以下の文献が挙げられる：  Ｓ．  Ｂｉｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ，  ９，  ｐｐ．１０１−１０８  （１９９０）；  Ｒ．Ｅ．  Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２，  ｐｐ．４２３−４２６  （１９８８）；  Ｍ．Ａ．  Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２，  ｐｐ．３７９１−３８０６  （１９８４）；  Ｊ．  Ｂｕｋｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，  ６，  ｐｐ．２１９−２２８  （１９８７）；  Ｍ．  ＤＡＩＮＯ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６６，  ｐｐ．２２３−２２９  （１９８７）；  Ｊ．Ｓ．  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５，  ｐｐ．５８７９−５８８３  （１９８８）；  Ｐ．Ｔ．  Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１，  ｐｐ．５２２−５２５  （１９８６）；  Ｊ．Ｊ．  Ｌａｎｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄ．），  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  １２１  （Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｐａｒｔ  Ｉ：  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８６）；  Ｓ．  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１，  ｐｐ．６８５１−６８５５  （１９８４）；  Ｖ．Ｔ．  Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ４，  ｐｐ．２１４−２２１  （１９８６）；  Ｌ．  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２，  ｐｐ．３２３−３２７  （１９８８）；  Ａ．  Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８３，  ｐｐ．６７３６−６７４０  （１９８６）；  Ｃ．  Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１４，  ｐｐ．４４６−４４９  （１９８５）；  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１４，  ｐｐ．４５２−４５４  （１９８５）  あるい���そこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）  。本発明の抗体は、当該遺伝子発現物の解析、検知などに利用できる他、様々な利用が可能である。
本発明のモノクローナル抗体は、例えば次のような工程で作製できる。
（１）．免疫原性抗原の調製、（２）．免疫原性抗原による動物の免疫、（３）．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製、（４）．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合、（５）．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローン化、（６）．モノクローナル抗体の製造
さらに該モノクローナル抗体は、常用される方法によって適宜標識することができる。標識としては、酵素、放射性同位体（放射性物質）、化学ルミネッセンス化合物などの発光性物質、螢光性物質、金属コロイド、補欠分子類、色素物質及びビオチン等を使用することができる。本発明の抗体（モノクローナル抗体を含む）は、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）  ｓｐ．  ＴＥ２６  株あるいはそれと実質的に同等な活性、例えばフェノールではなくＴＣＥのみであっても基質誘導されるＴＣＥ分解活性を有する微生物を特異的にアッセイするために使用できる。アッセイ系は上記モノクローナル抗体製造に関連して例示された文献記載の方法あるいはそこで引用された文献に従って構築することができ、それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる。
【００５３】
本発明の一態様では、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株及びそれと実質的に同等な活性、例えばＴＣＥ自身で酵素の誘導がかかりＴＣＥを分解する活性を有する微生物を検出する方法、そのための試薬あるいは試薬セット、ＴＣＥ分解菌検出用プローブ並びにプライマーが提供される。該ＴＥ２６株あるいはそれと同等な活性を持つ微生物の特異的検出用プローブ並びにプライマーとしては、本発明で開示されたフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群及び／又はフェノールヒドロキシラーゼ調節遺伝子を特異的に検出することを可能にするものであればよい。代表的には、本発明で開示されたフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群及び／又はフェノールヒドロキシラーゼ調節遺伝子のうちの特徴的な配列部分を検出することを可能にするものが挙げられ、好ましくは特異的検出に役立つものであれば該フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群や調節遺伝子の一部を検出するものも許容される。
検出に使用されるプローブ並びにプライマーは、好適には核酸断片あるいはオリゴヌクレオチドであり、そうしたものは所定の遺伝子に特異的にハイブリダイズすることが求められる。検出に有効な場合では、ハイブリダイズ形成をして有効に結合しているものが好ましく、そうした目的では、例えば５個以上の連続した塩基を含んでいるオリゴヌクレオチド、好ましくは１０個以上の連続した塩基を含んでいるオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは２０個以上の連続した塩基を含んでいるオリゴヌクレオチドが挙げられる。標的配列に有効にハイブリダイズ形成できる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、当該選択された塩基配列の一端又は両端に別のヌクレオチドあるいはヌクレオチド鎖が付加されていてもよいし、本明細書で説明してあるような標識（マーカーあるいはレポーターなども含む）などが結合せしめてあってもよい。標識は、例えばＰＣＲ  の過程で取り込まれるものであってもよい。標識は、放射性物質、蛍光性物質、発光性物質、酵素など、さらにビオチン−アビジン系などであってよい。好適にはプローブは、検知を容易にするため標識されていてよい。
検知に際して所定の遺伝子を特異的に増幅するためには、プライマーとしては増幅すべき配列の両端を規定する一対のオリゴヌクレオチドからなるものを使用するが、本明細書で開示したオリゴヌクレオチドあるいは本発明で定義した所定の特異的オリゴヌクレオチドの一つとユニバーサルプライマーの一つとからなる一対のオリゴヌクレオチドから構成されるものを使用することもできる。
当該プライマーは、増幅すべき配列の鎖の延長の開始に使用され、ＰＣＲ法だけでなく、ＬＣＲ法、ＴＡＳ法などの増幅法で使用できる。本発明のプライマーの用途は、特定の核酸増幅法に限定されるものではなく、様々な用途・適用・目的に利用できる。
【００５４】
本発明の検出方法は、対象微生物を含有すると予想される様々な検体に適用することができ、検体の種類などは特に限定されない。典型的な場合、土壌や排水等の環境に人為的に当該微生物を添加して所要の処理を実施した場合などにおいて当該微生物の挙動や消長などを把握する必要があることに鑑み、土壌などの環境由来の試料を検体として、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株及びそれと実質的に同等な活性、例えばＴＣＥ自身で酵素の誘導がかかりＴＣＥを分解する活性を有する微生物を検出するのに特に有用である。
本発明のラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株あるいはそれと実質的に同等な活性を有する微生物を検出方法の１つの態様によれば、本明細書で開示された新規フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子（フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群及び／又はフェノールヒドロキシラーゼ調節遺伝子）を特異的に増幅することができるプライマーを用いて増幅反応を行ない、増幅が生じたか否かを検定する。
土壌中の微生物からＰＣＲ増幅用にＤＮＡを精製する方法は  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６２：ｐｐ．３１６−３２２（１９９６）等にすでに記載されている。従って、本発明の方法においては、既知のＤＮＡ抽出法又は他の適当なＤＮＡ抽出方法を用いることができる。抽出されたＤＮＡの増幅は、任意の増幅方法、例えばＰＣＲ法等により行なうことができる。増幅操作からの生成物は、例えば、電気泳動、例えばアガロースゲル電気泳動を行なった後、増幅されたＤＮＡの有無について常法により、例えばエチジウムブロマイドの染色剤で染色した後ＵＶ照射により検出することができる。あるいは、本発明のプローブにより検出することができる。本発明の方法によれば、所定のＴＣＥ分解活性保持菌が被験試料中に存在しない場合には増幅が生じないから、例えば、ブロッティング法、逆ブロッティング法等、増幅生成物の分離を伴わない検出方法を用いることもできる。
本発明の方法の他の態様によれば上記のごとき特異的増幅を用いないで、微生物自体を増殖させることにより、所定の対象菌を検出することができる。例えば、被験試料を、微生物の増殖を支持する培地中でインキュベートすれば、被験試料に目的の菌が存在すれば該培地中に増殖するから、この培養物からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡ中に当該フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子が存在するか否かを、本発明のプローブにより決定することができる。あるいは、被験試料を直接に、又は上記のごとく集積培養した後に固体培地上に塗布し、生成したコロニーを、本発明のプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーション法により検出することができる。コロニーハイブリダイゼーションは周知の技法を用いて行なうことができる。
【００５５】
明細書及び図面において、用語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。代表的な用語の意味を以下に示す。
アミノ酸配列に関しては：
Ａ：アラニン  （Ａｌａ）                      Ｍ：メチオニン  （Ｍｅｔ）
Ｃ：システイン  （Ｃｙｓ）              Ｎ：アスパラギン  （Ａｓｎ）
Ｄ：アスパラギン  （Ａｓｐ）              Ｐ：プロリン  （Ｐｒｏ）
Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）                          Ｑ：グルタミン  （Ｇｌｎ）
Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）                  Ｒ：アルギニン  （Ａｒｇ）
Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）                                  Ｓ：セリン  （Ｓｅｒ）
Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）                              Ｔ：スレオニン  （Ｔｈｒ）
Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）                          Ｖ：バリン  （Ｖａｌ）
Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）                                      Ｗ：トリプトファン  （Ｔｒｐ）
Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）                                  Ｙ：チロシン  （Ｔｙｒ）
Ｘ：上記のいずれかのアミノ酸あるいは特定の任意のアミノ酸（特別に指定した場合はその指定したアミノ酸である）（Ｘａａ）
ヌクレオチド配列に関しては：
Ａ，ａ：アデニン                                          Ｇ，ｇ：  グアニン
Ｃ，ｃ：シトシン                                          Ｔ，ｔ：  チミン
Ｎ，ｎ：アデニン又はグアニン又はシトシン又はチミン／ウラシル，不明，
又は他の如何なる塩基でもよい（特別に指定した場合はその指定した塩基である）
【００５６】
【実施例】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。以下の実施例における通常慣用されるＤＮＡ  クローニングを含めた技術としては、標準的な実験マニュアル、例えば  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）  ＆  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）に記載されるように実施できる。また特にＰＣＲ  法では、Ｒ．  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０：  １３５０，  １９８５；  Ｒ．  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：  ４８７，  １９８８；  Ｈ．  Ａ．  Ｅｒｌｉｃｈ  （ｅｄ．），  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９  ；  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄ．），  ”ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  １，  （Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）；  Ｍ．  Ａ．  Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄ．），  ”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９０））；  Ｍ．  Ｊ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  Ｑｕｉｒｋｅ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  （ｅｄ．），  ＰＣＲ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９１）  などに記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）  や添付の薬品等を使用している。
【００５７】
〔実施例１〕
フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子断片の増幅
Ｔａｋａｒａ  Ｔａｑ、又は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ  （宝醸造株会社）を用い、静岡県沼津工業技術センターで単離されたラスストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株（以下、単に「ＴＥ２６株」という）のＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ  （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）  によりＴＥ２６株のフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群の第４番目の遺伝子の断片を増幅した。プライマーはマルチコンポーネント型のフェノールヒドロキシラーゼに保存されたＤＮＡ配列に対して設計され、二又らにより発表されている（Ｈ．  Ｆｕｔａｍａｔａ，  Ｓ．Ｈａｒａｙａｍａ  ＆  Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ａｐｐｌｉｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｏｃｔ．２００１，  ｐｐ．４６７１−４６７７）  。
プライマーとしては、下記のもの、またはこれを一部改変したものを用いた。しかし、該配列は、フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子のαサブユニットに含まれるフェノールヒドロキシラーゼの保存された配列から、設計されたものであればよく、これに限定されたものではない。
一例としては、良く保存されたアミノ酸配列である  Ａｓｐ−Ｇｌｕ−ｘｘｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ  をコードする遺伝子があげられる。
【００５８】
2004298058.tif 000002
をプライマーとして用いて増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  のシステムを用いて付属のプロトコールに従って、ＰＣＲ、精製を行い、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。分析した配列より、既知のフェノールヒドロキシラーゼとの相同性が高い部分があることを確認した。
【００５９】
〔実施例２〕
ＤＮＡライブラリーの調製
ＴＥ２６株の  ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩによって部分的に処理し、約７〜１０  ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片をＴＢＥアガロースゲルより切り出し、透析チューブに入れ電気泳動でＤＮＡを溶出させて回収し、フェノール／クロロフォルム、エタノール沈殿によりＤＮＡを精製してインサートＤＮＡを得た。ベクターは、ＢａｍＨＩによって処理した  ｐＵＣ１１８  プラスミドベクターを、脱リン酸処理し、フェノール／クロロフォルム、エタノール沈殿により調製した。
前記の両者をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．  ２  （Ｔａｋａｒａ）を用いて、インサートのＤＮＡとｐＵＣ１１８のライゲーション反応を行った。ライゲーション溶液の一部は大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセルを用いて導入した。導入により形質転換させた大腸菌はアンピシリンもしくはカナベリリシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートによって選択し、約８０００の大腸菌クローンを得た。
【００６０】
〔実施例３〕
遺伝子クローンの選択
実施例２で得られた約８０００の大腸菌クローンに対して、コロニーハイブリダイゼーションを行った。コロニーハイブリダイゼーションでは、プローブの作製には、ＴＥ２６株のＤＮＡを鋳型に、前記プライマー、すなわち
【００６１】
2004298058.tif 000003
【００６２】
で増幅されたＰＣＲ産物を用い、ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いてＤＩＧ標識したプローブを作製した。メンブレンは、シャーレの径とほぼ同径のナイロンメンブレン  （Ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ；ロッシュ社製）を用いた。ＤＩＧの検出には、ＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いて化学発光検出を行った。操作は、付属のプロトコールに従いコロニーハイブリダイゼーションを行った。この結果、１つの陽性クローンを得た。この陽性クローンを”ＰＴ１”とし、含まれるプラスミドベクターを”ｐＰＴ１”とした。
さらに、ｐＰＴ１の一部をＰＣＲ増幅し、前記と同様にコロニーハイブリダイゼーションにより得られた陽性クローンを”ＰＴ２”、”ＰＴ３”、”ＰＴ４”とし、プラスミドベクターを各々”ｐＰＴ２”、”ｐＰＴ３”、”ｐＰＴ４”とした。
【００６３】
〔実施例４〕
塩基配列の決定
塩基配列の決定は、予備検討の結果より、ｐＰＴ１とｐＰＴ４のＤＮＡ配列を決定することで、フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群の全長を網羅することが予想できた。そこで、両陽性クローン中の挿入断片の塩基配列を調べ、フェノールヒドロキシラーゼの構造遺伝子とその周辺の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、ＢＩＧ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  のシステムを用いて付属のプロトコールに従って、ＰＣＲ、精製を行い、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。塩基配列の解析にはＧｅｎｅｔｙｘ遺伝解析ソフト  （Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．）  を用いた。
【００６４】
フェノールヒドロキシラーゼの構造遺伝子の上流には、この構造遺伝子の調節遺伝子と考えられる１つの遺伝子が存在した。このフェノールヒドロキシラーゼの調節遺伝子と予想される配列を”ｐｈｔＲ”とし、配列番号：  ５に示す。また、フェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群は、６つのＯＲＦ  （Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ；読取り枠）からなると考えられ、それぞれ、”ｐｈｔＡ”、”ｐｈｔＢ”、”ｐｈｔＣ”、”ｐｈｔＤ”、”ｐｈｔＥ”及び”ｐｈｔＦ”とし、これら、構造遺伝子の塩基配列を配列番号：  ７  に示す。構造遺伝子下流に位置するカテコール  ２，３−モノオキシゲナーゼに相同性が高い塩基配列を”ｐｈｔＣ２３０”とし、さらにその下流に位置するグルタチオン関連遺伝子に相同性の高い部分配列を”ｐｈｔＧＲＰ”とし、配列番号：  ７  に示す。
なお、調節遺伝子ｐｈｔＲは、前記に示した６つのＯＲＦからなるフェノールヒドロキシラーゼ群のＤＮＡとは逆方向に位置していた。
【００６５】
〔実施例５〕
配列の相同性比較
実施例４により得られたＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の国際的なデータベースである、国立遺伝学研究所のＤＤＢＪ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ）などにより、相同性検索システムのＢＬＡＳＴを用いて解析すると、以下の結果が得られた。
その相同性はアミノ酸レベルで高い菌株は、  ｐｈｔＲ  が  Ｔｈａｕｅａ  ａｒｍａｔｉｃａ  Ｋ１７２  と  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｈａ  Ｅ２  で、共に  ５２．０％であり、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  ＫＮ１株が  ５０．７％であった。
ｐｈｔＡ  は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｈａ  Ｅ２で  ２９．７％、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  ＫＮ１株で  ２６．４％であった。  ｐｈｔＢ  は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｈａ  Ｅ２で  ４９．８％、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  ＫＮ１株で４７．４％であった。  ｐｈｔＣ  は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｈａ  Ｅ２及びＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  ＫＮ１株では共に  ５５．６％であった。  ｐｈｔＤ  は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  ＫＮ１株で  ７３．６％で、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｈａ  Ｅ２で  ７３．４％であった。  ｐｈｔＥ  は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  ＫＮ１  株で  ４９．６％、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｈａ  Ｅ２で  ４７．９％、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ＴＡ４４１とＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  Ｒ５  では  ４７．５％であった。  ｐｈｔＦ  は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．  ＫＮ１株で  ６１．４％、Ｂｕｒｋｈｏｌｉａ  ｋｕｒｕｉｎｎｅｎｓｉｓ  ＫＰ２３  で  ６０．８％であった。また、  ｐｈｔＣ２３Ｏは、Ｆｒａｔｅｕｒｉａ  ｓｐ．  ＡＮＡ−１８で  ６７．５％、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｅｒ  ｌｗｆｆｉｉ  Ｋ２４  で  ６９．１％であった。  ｐｈｔＧＲＰ  は、３６６  アミノ酸残基であって部分的と思われるが、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＧＭ１０００  と  ５４．７％であった。
【００６６】
〔実施例６〕
競合ＰＣＲ定量
実施例４により得られたＤＮＡ配列を用いて、検出用及び競合ＰＣＲ用のプローブを作製した。これにより、ＴＥ２６株を特異的に検出するＰＣＲ用プローブの設計が可能になった。プローブの例を以下に示す：
【００６７】
2004298058.tif 000004
【００６８】
2004298058.tif 000005
【００６９】
2004298058.tif 000006
【００７０】
2004298058.tif 000007
【００７１】
2004298058.tif 000008
【００７２】
上記に競合ＤＮＡ（コンペジター）プラーマーセット及び  競合ＰＣＲプライマーセットの代表例を示してあるが、実施例５の相同性の説明からも容易に推測できるようにＴＥ２６株に特異的な配列は他の箇所に存在すると思われるので、これに限定されるものではない。
競合ＰＣＲ用のＤＮＡ  コンペティター（又はコンペジター；  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）はＴａｋａｒａの  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  を用いて作製した。作製方法はＫｉｔ  付属のプロトコールに従った。
実際の実験の１例を次に示す。
（地下水からのＤＮＡ抽出）
地下水  １０  ｍｌに、ＴＥ２６株をそれぞれ１０２〜１０８  ＣＦＵ／ｍｌ  となるように添加し、試験水とした。試験水は、４０００  ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清  ９．９  ｍｌ  を捨て、沈殿をボルテックスで懸濁させた。ここから、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（ＭＯ  ＢＩＯ  社製）を用い、ＤＮＡを抽出した。
【００７３】
（競合ＰＣＲ）
本実験においては、配列番号：  １５及び１６を用いてコンペティターを作製し、配列番号：  １９及び２０を用いて、競合ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、鋳型ＤＮＡ  １２．５  マイクロリットル、２０  ｐｍｏｌ  プラーマー（センス）０．５  マイクロリットル、２０  ｐｍｏｌ  プラーマー（アンチセンス）０．５  マイクロリットル、蒸留水６．５  マイクロリットル、抽出ＤＮＡ  ２．０  マイクロリットル、コンペティター（各濃度）０．５  マイクロリットルをＰＣＲ用の０．２  ｍｌチューブに入れ、サーマルサイクラー（パーキンエルマー社製２４００型、または９７００型）により、ＰＣＲ条件：  ９５℃（３０秒）−６０℃（３０秒）−７２℃（５０秒）３０サイクルで、ＰＣＲ反応を行った。反応修了後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、アガロースゲルをエチジウムブロマイドなどのＤＮＡ染色剤で染色し、ＵＶ照射したものを、高感度ポラロイド写真をとり、既知濃度のコンペティターとの染色強度を目視で比べ、定量した。
地下水を用いたモデル試験では、添加した培養菌と、競合ＰＣＲによって検出されたＤＮＡコピー数の間には、菌数１０３〜１０７  ＣＦＵ／ｍｌの間で高い相関が認められた（相関係数  ｒ＝０．９９８）。このことから、地下水中のＴＥ２６株について少なくとも、菌数  １０３〜１０７  ＣＦＵ／ｍｌの間でモニタリングが可能であるものと判断した。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、ＴＣＥ自身で酵素の誘導がかかりＴＣＥを分解する活性を担う酵素系の遺伝子群の解明がっなされ、該解明遺伝子配列の利用が可能となり、該情報を利用しての核酸断片（オリゴヌクレオチドプライマー）の開発によりラルストニア属に含まれる菌体、とくにフェノールを分解する能力を持ち、ＴＣＥでＴＣＥ分解活性に誘導がかかるラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株及びその同等の微生物の検出及び定量が正確に行えるようになったので、これによりトリクロロエチレン汚染土壌の清浄化作業の管理に大きく貢献することができる。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【００７５】
＜配列表フリーテキスト＞
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ＰＣＲ，  ｎ  ｓｔａｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｇ  ｏｒ  Ａ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３，  ｆｏｒ  Ａ  ｏｒ  Ｇ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  １２，  ａｎｄ  ｆｏｒ  Ｃ  ｏｒ  Ｔ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  １５
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ＰＣＲ，  ｎ  ｓｔａｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｃ  ｏｒ  Ｇ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ４，  ｆｏｒ  Ａ  ｏｒ  Ｇ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ７，  ｆｏｒ  Ａ  ｏｒ  Ｔ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ９，  ａｎｄ  ｆｏｒ  Ｇ  ｏｒ  Ｔ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  １３
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ＰＣＲ，  ｎ  ｓｔａｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｇ  ｏｒ  Ａ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３，  ａｎｄ  ｆｏｒ  Ａ  ｏｒ  Ｇ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  １２
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ＰＣＲ，  ｎ  ｓｔａｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｃ  ｏｒ  Ｇ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ４，  ｆｏｒ  Ａ  ｏｒ  Ｇ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ７，  ａｎｄ  ｆｏｒ  Ａ  ｏｒ  Ｔ  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ９
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５，  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  Ｒ  （４４２  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）  ｉｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ５５６  ｔｏ  １８８４
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７，  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  Ａ  ｉｎ  ６７９  ｔｏ  ９３３，  ｇｅｎｅ  Ｂ  ｉｎ  ９８１  ｔｏ  ２００６，  ｇｅｎｅ  Ｃ  ｉｎ  ２０２３  ｔｏ  ２２９５，  ｇｅｎｅ  Ｄ  ｉｎ  ２３４５  ｔｏ  ３９３７，  ｇｅｎｅ  Ｅ  ｉｎ  ３９５８  ｔｏ  ４３２０，  ｇｅｎｅ  Ｆ  ｉｎ  ４３３７  ｔｏ  ５３９５，  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  Ｃ２３０  ｉｎ  ５４４２  ｔｏ  ６３５９
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２０，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２３，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２４，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２７，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２８，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３０，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３１，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
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ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３４，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３６，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  （ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）  ｆｏｒ  ＰＣＲ
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ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造を示す遺伝子群の配置図である。アルファベットは遺伝子名を数字はアミノ酸の数を示す。上側には、ラルストニア  ｓｐ．  ＫＮ１株のフェノールヒドロキシラーゼ遺伝子群の配置が示されており、下側にラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株の遺伝子群の配置が示されている。Ｆ：フェレドキシン様タンパク質、Ｃａ：  カテコール−２，３−ジオキシゲナーゼ。共に、調節遺伝子領域（Ｒ）と６つのＯＲＦ（Ａ〜Ｆ）からなるなるものと推測されるが、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来のものは調節領域が逆方向に位置すると推測される（なお、ラルストニア  ｓｐ．  Ｅ２  及びＫＮ１  のものは調節領域が順方向に位置する）。
【図２】図２は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の調節遺伝子領域（Ｒ）の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図３〜４に連続する。
【図３】図３は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の調節遺伝子領域（Ｒ）の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図２の続きであり、図４に連続する。
【図４】図４は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の調節遺伝子領域（Ｒ）の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図３の続きである。
【図５】図５は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図６〜１９へと連続する。
【図６】図６は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図５の続きであり、図７に連続する。
【図７】図７は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図６の続きであり、図８に連続する。
【図８】図８は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図７の続きであり、図９に連続する。
【図９】図９は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図８の続きであり、図１０に連続する。
【図１０】図１０は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図９の続きであり、図１１に連続する。
【図１１】図１１は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図１０の続きであり、図１２に連続する。
【図１２】図１２は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図１１の続きであり、図１３に連続する。
【図１３】図１３は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図１２の続きであり、図１４に連続する。
【図１４】図１４は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図１３の続きであり、図１５に連続する。
【図１５】図１５は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図１４の続きであり、図１６に連続する。
【図１６】図１６は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図１５の続きであり、図１７に連続する。
【図１７】図１７は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図１６の続きであり、図１８に連続する。
【図１８】図１８は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図１７の続きであり、図１９に連続する。
【図１９】図１９は、ラルストニア  ｓｐ．  ＴＥ２６株由来ＴＣＥ分解酵素遺伝子の構造遺伝子群の塩基配列並びにＣＤＳ  でコードされるアミノ酸配列を示す。配列は図１８の続きである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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