(57)【要約】【課題】本発明は、メダカを用いる毒性評価システムに使用し得る、トランスジェニックメダカ、及び上記トランスジェニックメダカを対象物と接触させる工程、及び上記トランスジェニックメダカの生物学的応答を検出する工程を含む対象物の毒性を評価する方法を提供する。【解決手段】グロビン−発光タンパク質融合遺伝子を有する、トランスジェニックメダカ、及びこのトランスジェニックメダカを用いる毒性評価方法であって、メダカを対象物と接触させる工程とメダカの生物学的応答を検出する工程とを含む対象物の毒性を評価する方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グロビン−発光タンパク質融合遺伝子を有する、トランスジェニックメダカ。
【請求項２】
上記グロビン遺伝子が、メダカのα−グロビン遺伝子である、請求項１記載のトランスジェニックメダカ。
【請求項３】
請求項１〜３のいずれか１項記載のトランスジェニックメダカを用いる毒性評価方法であって、下記工程：
メダカを対象物と接触させる工程、及び
メダカの生物学的応答を検出する工程
を含む対象物の毒性を評価する方法。
【請求項４】
生物学的応答が、循環器系に対する毒性である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
メダカが、卵、胚、稚魚、または成魚である、請求項３又は４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、メダカのグロビン遺伝子、特にα−グロビン遺伝子を有する、トランスジェニックメダカに関する。
【０００２】
また、本発明は、上記トランスジェニックメダカを対象物と接触させる工程、及び上記トランスジェニックメダカの生物学的応答を検出する工程を含む対象物の毒性を評価する方法にも関する。
【０００３】
【従来の技術】
従来は、医薬品等の化学物質の毒性評価は、マウス等のげっ歯類やイヌ・サル等の哺乳動物が主に用いられてきた。しかし、哺乳動物を用いる評価システムは、飼育施設の設立・維持管理費や飼料代などに億単位の費用が必要であり、また、世代期間が長いことから、発ガン性の評価には、１年以上の試験期間を必要とし、高費用・長期間を費やすという問題があった。さらには、動物愛護の立場からも、哺乳動物を用いる毒性評価システムに対する批判があり、哺乳動物を用いる毒性評価システムの代替システムが必要とされていた。
【０００４】
１９９９年５月に米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）で開催されたワークショップの報告書では、脊椎動物の最小単位であること、遺伝学的にヒトとの類似性が多いこと及びその解析がハイスピードで実施できかつ低コストであることから、小型魚類であるゼブラフィッシュが、ポストゲノムのツールとして挙げられ、毒性評価システム等の研究開発が始められている（非特許文献１）。しかし、今日まで、ゼブラフィッシュを用いる毒性評価システムは、未だ実用化されていない。
【０００５】
また、ゼブラフィッシュには、突然変異体が飽和状態であること、卵の観察に熟練が必要なこと、ゲノムが４倍体でありヒトの２分の１のサイズを有すること、近交系が存在しないため解析エラーが多いこと、発生過程が速く観察に熟練が必要なこと等の問題点があった。
【０００６】
これに対し、メダカは、ゼブラフィッシュとは異なり、新しい表現型の突然変異体が発見されていること、各発生ステージの卵が長期間観察し易いこと、ゲノムが２倍体であり、そのサイズはヒトの４分の１であること、近交系が存在するため配列解析エラーが少ないこと、ゼブラフィッシュに比べて受精から孵化までの卵膜内での発生が遅いため発生後期の形態観察が容易であること等の利点があることから、メダカを用いる毒性評価システムの開発を行った。
【０００７】
本発明者は、鋭意研究を行った結果、メダカのグロビン遺伝子クラスターを同定し、これと発光タンパク質との融合遺伝子を有するトランスジェニックマウスを作出し、本発明を完成させた。
【０００８】
【非特許文献１】
ゼブラフィッシュのゲノム及び遺伝学的ツールのワークショップ報告（Ｒｅｐｏｒｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．）インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｍｏｄｅｌｓ／ｚｅｂｒａｆｉｓｈ／ｒｅｐｏｒｔｓ／ｇｅｎｏｍｉｃ−ｇｅｎｅｔｉｃ．ｈｔｍｌ＞
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、メダカを用いる毒性評価システムに使用し得る、トランスジェニックメダカを提供することを目的とする。
また、本発明は、上記トランスジェニックメダカを対象物と接触させる工程、及び上記トランスジェニックメダカの生物学的応答を検出する工程を含む対象物の毒性を評価する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の１つの態様は、グロビン−発光タンパク質融合遺伝子を有する、トランスジェニックメダカである。このグロビン遺伝子は、好ましくは、α−グロビン遺伝子である。
【００１１】
発光タンパク質は、オワンクラゲ由来のエクオリン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、トビイカ由来のシンプレクチン等の市販の発光タンパク質を用いることができる。
【００１２】
この発光タンパク質と造血関連遺伝子であるグロビン遺伝子との融合遺伝子をメダカに導入すると赤血球が光るトランスジェニックメダカを得ることができる。同様に、造骨関連遺伝子と発光タンパク質との融合遺伝子をメダカに導入すると骨が光るトランスジェニックメダカを得ることもできる。
【００１３】
したがって、本発明のメダカは、心臓、血管の動き、血球数などの循環器系の毒性評価、肝機能、肝毒性などの解毒系の毒性評価、骨発生・再生などの骨組織系の毒性評価、さらに神経毒性や細胞毒性の目視による評価システムに利用することができる。
【００１４】
これらに関連するタンパク質をコードする遺伝子情報をデータベースから選択し、その遺伝子に関するプロモータ領域配列をライブラリーから取得する。この情報を基に、ＧＦＰなどの発光タンパク質をコードする遺伝子と関連させ、インジェクション用のコンストラクトを作成する。その後、メダカ卵にマイクロインジェクションしてトランスジェニックメダカを作成する。
【００１５】
本発明の別の態様は、トランスジェニックメダカを用いる毒性評価方法であって、メダカを対象物と接触させる工程、及びメダカの生物学的応答を検出する工程を含む対象物の毒性を評価する方法である。
生物学的応答は、遺伝子の発現と直接又は間接的に関連する事象であることができる。発光の強度、発光細胞数、発光細胞動態等により、定性又は定量的解析をすることができる。
本発明のトランスジェニックメダカは、疾患関連遺伝子の探索と薬剤の毒性評価に用いることができる。
【００１６】
疾患関連遺伝子の探索においては、メダカの突然変異体を作製して病態を調べることにより病原遺伝子を見つけることができる。メダカへの突然変異の導入は、エチルニトロソウレア（ＥＮＵ）、マイトマイシン（ＭＭＣ）、紫外線などの変異原性物質を用いて、メダカのＤＮＡに点突然変異を誘発することによって行うことができる。
【００１７】
得られた突然変異体の表現型を解析することによって、血管狭窄や脊椎形成異常などの病態を表すモデルメダカを作出することができる。得られたモデルメダカの遺伝子を、ポジショナルクローニングを用いて調べ、疾患関連遺伝子を同定することができる。
【００１８】
また、メダカは、卵も身体も透明であることから、内臓や血管の異常など、突然変異体の表現型を経時的に目視よって観察することができるという、他の実験動物にはない特徴がある。
【００１９】
したがって、本発明のメダカは、ガン発生・転移、老化、臓器発生・再生等のメカニズムの研究に有用である。
【００２０】
また、本発明の別の態様においては、メダカは、卵、胚、稚魚、または成魚の段階であることができる。
【００２１】
本発明のトランスジェニックメダカを用いることによって、毒性評価のための動物飼育費用を、哺乳動物に比べて、格段に安くすることができる。
【００２２】
【実施例】
本発明で解析されたヌクレオチド配列は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド配列データベースに受入番号ＡＢ０８３０７７及びＡＢ０８３０７８で登録されている。
【００２３】
グロビン遺伝子のゲノム構成は、哺乳類、鳥類及び両生類において広く特徴付けられている。哺乳類α及びβグロビン遺伝子は、異なる染色体に位置しており、動物の発生の間に発現される遺伝子の順序で縦一列に整列している（１〜３）。ヒトにおいては、βグロビン遺伝子は、５′−ＬＣＲ−ε−Ａγ−Ｇγ−Ψη−δ−β−３′の順序で１１番染色体上に位置しており、αグロビン遺伝子は、５′−ＨＳ４０−ζ２−ζ１−Ψα−Ψα−α２−α１−θ−３′の順序で１６番染色体上に位置している。ニワトリでは、βグロビンは、αグロビン遺伝子のそれとは異なり染色体上に５′−ＨＳｓ−ρ−βＨ−βＡ−Ｅｎ−ε−３′の順序で整列している。ＬＣＲ、ＨＳ４０、ＨＳｓ及びＥｎは、細胞特異的及び又はステージ特異的グロビン遺伝子発現を制御するシス調節領域として周知である。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）のような両生類では、９つのグロビン遺伝子からなる３つのクラスターが同定されている（非特許文献３、５）。クラスターは、オタマジャクシ（Ｌ）及びカエル（Ａ）については、３つのαグロビン遺伝子及び２つのβグロビン遺伝子からなり、そして遺伝子は、全てが同一の転写方向性で５′−α１ａ（Ｌ）−α１ｂ（Ｌ）−α１（Ａ）−β１（Ａ）−β１ａ（Ｌ）−３′の順序で同一の染色体上に位置している。約７．７Ｋｂｐの配列が、中央のα１（Ａ）とβ１（Ａ）との間にある（６）。グロビン遺伝子座位のこの全長構造は、硬骨魚類では分類されていなかった。タイセイヨウサケ、コイ及びゼブラフィッシュでは、成体αグロビン遺伝子が、対向する転写方向性でβグロビン遺伝子と近接して連結していることが報告されているのみである（７〜９）。硬骨魚類におけるグロビン遺伝子座位の全長構造を特徴付けることが、本件球の第１の目的である。
【００２４】
グロビン遺伝子座位の一次構造に加えて、それぞれのグロビン遺伝子の発生中の発現に対応するシス調節領域の構造及び機能をいくつかの脊椎動物において分類した。哺乳類におけるグロビン遺伝子発現は、プロモーター、エンハンサー及び遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）のようなシス調節領域で制御されていることは周知である。特に、ＤＮアーゼＩ過敏（ＨＳ）部位からなるＬＣＲは、グロビン遺伝子の位置非依存的、コピー数依存的、そして組織又は細胞／発生ステージ特異的転写を与えると考えられている（１０）。ヒトにおいては、βグロビン遺伝子発現のＬＣＲは、５つのＨＳ部位からなり、そしてβグロビン遺伝子クラスターから遠く離れた８−２２Ｋｂｐ５′上流に位置している（１１）。各ＨＳは、遺伝子発現において異なる役割を果たしている。例えば、ＨＳ３は、胚でのグロビン遺伝子発現を活性化することが見出されており、ＨＳ４は、胎仔での低レベルのグロビン発現及び成体での高レベルのグロビン発現を活性化することが見出されている（１２）。魚類におけるグロビン遺伝子発現のシス調節領域の候補を検索することが、本研究の別の目的である。
【００２５】
両生類、鳥類及び哺乳類の場合のように、胎性ヘモグロビン又はグロビンは、２種類の硬骨魚類、ニジマス及びゼブラフィッシュで同定されており、そして良く特徴付けられている（１３、１４）。ｃＤＮＡから推定されたアミノ酸配列の比較は、これらの魚類における胎性グロビンが、成体グロビンとは全く違うことを示した（１３）。ニジマスでは、胎性グロビンは、受精後６−７日目に胚の脊索の下に位置する内部細胞塊（ＩＣＭ）において最初に発現し（１５℃）、また、成体グロビンは、孵化後に血液、脾臓及び腎臓の赤血球系細胞内で発現を開始する（１３、１５、１６）。前者のグロビン発現は、いわゆる「胎仔型造血（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）」に含まれ、後者は、「成体型造血（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ）」という概念が一般的に受け入れられている。
【００２６】
最近、他の硬骨魚類（メダカＯｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）の５日目の胚（ステージ３７）から胎性グロビンｃＤＮＡを、また完全成長成魚の腎臓から成体グロビンｃＤＮＡを単離し、そしてそのアミノ酸配列を推定した（１８）。分子系統発生学的分析は、メダカの胎性グロビンが、ニジマスやゼブラフィッシュの胎性グロビンの群に属すること、及び既に調べられた全ての硬骨魚類グロビンの中で単一系統を形成することを示した。硬骨魚類胎性グロビンは、おそらく直系分子である。これに対して、メダカの成体グロビンは、胎性グロビン群からは系統発生学的に区別された。メダカの「胎性グロビン」又は「成体グロビン」の定義は、ニジマス及びゼブラフィッシュのそれと同様である。しかし、メダカグロビンの発生中の発現は、かなり複雑である。特に、成体グロビンの１つであるａｄ．β１は、初期胚から完全成長成体まで生涯を通じて高く発現されている。したがって、胎性及び成体グロビン間の一次構造の差異は、発生間の発現パターンの差異を必ずしも反映しない。これは、ある程度、グロビン遺伝子発現を制御するシス調節領域の構造及び機能に帰することもできる。
【００２７】
本研究は、硬骨魚類における全長グロビン遺伝子座を初めて明らかにしたものであり、そしてグロビン遺伝子の５′上流配列が、赤血球系細胞及び発生ステージ特異的グロビン遺伝発現の促進又は増加のためのシス調節領域としての役割を果たすこと示唆する予備的な研究でもある。
【００２８】
実験方法
動物
本実験を通して、近交系（Ｈ−ｄｒＲ、ＡＡ２及びＨＮＩ株）及び非近交系のメダカＯｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓの胚及び完全成長成魚を用いた。胚は、（１９）に記載されたように３０℃で、振盪インキュベーター中で孵化日（６日目）まで成長させた。発生ステージは、岩松にしたがって決定した（２０）。孵化後の幼生すなわち雑魚にはＡｒｔｅｍｉａ  ｌａｒｖａｅすなわちスーパーゴールド０（オリエンタル酵母）を給餌し、稚魚及び完全成長成熟成魚には、テトラフィン（テトラ）を給餌した。
【００２９】
プライマー
下記のプライマーをＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲに用いた。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
胎性グロビン及び成体グロビンのゲノムクローンの単離及び配列決定  −  ゲノムＤＮＡライブラリーをＹａｓｕｍａｓｕ等に従ってｄｒＲ株から構築した（２１）。胎性及び成体グロビンｃＤＮＡフラグメント（１８）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（ロシュ）を用いてジゴキシゲニン−ｄＵＴＰでラベルし、そしてプローブとしてスクリーニング又はサザンブロッティングに用いた。陽性クローンをベーリンガーマンハイム指示書の方法にしたがって化学ルミネセンスを用いて検出した。ゲノムライブラリーから全部で０．８×１０６ｐｆｕをスクリーニングした。スクリーニング後に、陽性クローンのＤＮＡを制限酵素マッピング及びサザンハイブリダイゼーションによって特徴付けた。精製ファージ中のゲノムＤＮＡインサートを制限酵素、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ又はＢａｍＨＩ（タカラ）での消化によって切り出した。２重鎖テンプレートをＤＮＡ熱サイクラーを用いるＢｉｇＤｙｅシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。自動配列決定を３７７ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。
【００３２】
遺伝子型決定及び連鎖解析
メダカの２つの近交系株、日本の南方集団から確立したＡＡ２及び北方集団から確立したＨＮＩを遺伝的連鎖解析に用いた。β１、β３及びａｄ．β１グロビン遺伝子に特異的なＰＣＲプライマーを第一エキソンと第３エキソンの異なる配列からデザインした。これらは、それぞれβ１（ｆ）、β１（ｒ）、β３（ｆ）、β３（ｒ）、ａｄ．β１（ｆ）及びａｄ．β１（ｒ）である。欠失／挿入多型をＨＮＩ及びＡＡ２のβ３遺伝子中で同定した。ＲｓａＩ及びＳａｃＩＩでの制限酵素認識部位多型をＨＮＩのβ１遺伝子及びＡＡ２のａｄ．β１遺伝子中でそれぞれ検出した。この多型を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって同定した。遺伝型及び連鎖群を、１０００を超える遺伝子を用いて構築された戻し交配パネルを用いて決定した（２２、２３）。ＡＡ２及びＦ１（ＡＡ２×ＨＮＩ）を交配することによって得られた３９の戻し交配子孫を解析した。
【００３３】
サザンブロット分析
ゲノムＤＮＡを上記のように全ての成体メダカから調製した（２１）。５μｇのＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで一晩消化し、０．７％アガロースゲル電気泳動で分離した。陽性シグナルの検出を上記のゲノムクローンのスクリーニングと同様の方法で行った。
【００３４】
転写開始部位の決定
プライマー伸長法をＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ  ＲＬＭ−ＲＡＣＥ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて行った。成体血液から調製したＲＮＡ（１０μｇ）又は５日胚（ステージ３７）から精製したｍＲＮＡ（２５０ｎｇ）のキャップ構造を取り除き、次いで５′ＲＡＣＥアダプターに結合させた。その後、産物を逆転写させ、指示書に記載の条件下でＰＣＲ／ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲに適用した。５′ＲＡＣＥ遺伝子特異的インナー及びアウタープライマーをフォワードプライマーとして用い、またコード領域からデザインされたα０（ｒ）、β４（ｒ）、ａｄ．α２（ｒ）及びａｄ．β１（ｒ）をリバースプライマーとして用いた。
【００３５】
グロビン遺伝子発現の解析のための逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＮＡの精製のために胚から十分な量の赤血球（ＲＢＣ）を得ることは極めて困難である。したがって、ステージ３０の胚、ステージ３８の胚、孵化後３０日の稚魚又は完全成長成魚からの赤血球１００個をＱＩＡＧＥＮ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の反応混合物に直接加えた。ＰＣＲのプライマーは、α２（ｆ）、α２（ｒ）、α３（ｆ）、α３（ｒ）、α４（ｆ）、α４（ｒ）、β２（ｆ）、β２（ｒ）、β３（ｆ）、β３（ｒ）、β４（ｆ）、β４（ｒ）、ａｄ．α２（ｆ）及びａｄ．α２（ｒ）であった。グロビンｍＲＮＡ  α２、α３、α４、ａｄ．α２、β２、β３、β３、β４から増幅されたＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ４１５、３７４、５１５、２００、３５２、３６１、１６７及び２５２塩基対であり、ゲノムグロビン遺伝子から増幅されたＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ９３５、５１５、２８０、１５２２、６１６、５２３及び２５１であることが予想された（図６Ａ）。反応条件は、下記：９４℃で３０秒、２５又は３５サイクル、６０℃で３０秒、７２℃で１分であった。ＰＣＲ産物の５μｌをエチジウムブロマイド（５０μｇ／ｌ）を含む２％アガロースゲル上で電気泳動した。ＰＣＲバンドの密度をＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ（Ｍｏｌｏｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）プログラムを用いて算出した。
【００３６】
ＧＦＰレポーター遺伝子の構築
ＥＭ１−ＧＦＰ（ｆ）、ＥＭ２−ＧＦＰ（ｆ）及びＥＭ１−ＧＦＰ（ｒ）のプライマーセットを用いるＰＣＲによってα０遺伝子の５′上流領域を増幅した。図７に示すように、Ｅ１クラスターの位置５７５３〜６８６０の１１０７ｂｐを増幅し、ＥＭ１と、６７００〜６８６０からの１６０ｂｐの配列をＥＭ２と名づけた。プライマーの末端をＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ認識部位を含むようにデザインした。ＰＣＲ産物をＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＧＦＰ−１プロモーターレオポーターベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に挿入した。
【００３７】
ＧＦＰレポーター遺伝子の微量注入、ＧＦＰ蛍光の検出、及びＧＦＰトランスジェニック系統の確立
メダカのＨ−ｄｒＲから得られた受精卵を１０〜１５℃でインキュベーションした。この温度は、卵外皮の急速な固化が起こらないようにする。マイクロピペットを、水平プラー（ＰＢ−７、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）を用いて、滅菌し、シリコン処理した繊維充填ガラスキャピラリー管（１×９０ｍｍ、ＧＤ−１、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）から作成した。ＤＮＡ溶液（１０ｎｇ／μｌ）を、マイクロピペットを用いて１又は２細胞期胚に注入した。ＧＦＰ陽性赤血球系細胞を有する胚を受精４〜５日後に計数した。これを２８℃で培養し、成熟繁殖性魚体に成長させた。成熟魚をＨ−ｄｒＲと交配し、赤血球系細胞内にＧＦＰシグナルを安定的に発現するＥＭ１−１ＧＦＰ−トランスジェニックメダカの系統を確立した。ＧＦＰ蛍光は、蛍光顕微鏡（ＭＺ  ＦＬＩＩＩ、ライカ）で観察した。
【００３８】
結果
メダカの胎性グロビン遺伝子のゲノム構成
最近、５日胚（３０℃、ステージ３７）のｃＤＮＡライブラリーから２つのグロビンｃＤＮＡ、ｅｍ．α−０とｅｍ．α−１、及び１つのβグロビンｃＤＮＡ、ｅｍ．β−１がクローニングされた。さらに、α及びβグロビンの２つのｃＤＮＡ、ａｄ．α−１及びａｄ．β−１が、成体腎臓ｃＤＮＡから単離された。既述の通り（１８）、ｅｍ．α−０、ｅｍ．α−１及びｅｍ．β−１は、「胚性グロビン」ｃＤＮＡとして、また、ａｄ．α−１及びａｄ．β−１は、「成体グロビン」ｃＤＮＡとして特徴付けられている。プローブとしてＤＮＡを用いるために、メダカのｄｒＲから構築されたゲノムＤＮＡライブラリーからグロビン遺伝子を単離した。遺伝子座の全長構造を決定するため、染色体をウォーキングした。２つの遺伝子クラスターが同定された（図１及び２）。
【００３９】
１つのクラスターを「胚性遺伝子クラスター（Ｅ１）」と命名した。図１に示すように、Ｅ１は、長さ約３６ｋｂｐであり、６個のαグロビン遺伝子及び５個のβグロビン遺伝子からなる。α０、α１及びβ１のコーディング領域は、胚性グロビンｃＤＮＡ、ｅｍ．α−０、ｅｍ．α−１及びｅｍ．β−１のそれとそれぞれ一致した。α２、α３、α４のような他の遺伝子は、それぞれアミノ酸同一性が８５．９％。８３．８％及び８１．７％であり、α０及びα１と高い相同性を示した。遺伝子β３及びβ４も、それぞれアミノ酸同一性が８５．７％及び８３．６％であり、β１と高い相同性を示した。分子系統解析は、これらの遺伝子は共通してニジマス及びゼブラフィッシュの胚性グロビンの群に属することを示した（１８，２４）。
【００４０】
Ｅ１クラスターは、いくつかの特有のグロビン遺伝子、β２、Ψα及びΨβを含む。分子系統樹は、β２のアミノ酸配列が、胚性グロビン／ヘモグロビン群に位置しないが、ウナギＡｎｇｕｉｌｌａ  ａｎｇｕｉｌｌａ  ＨｂＣ、アマゾンナマズＨｏｐｌｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｉｔｔｏｒａｌｅ  ＨｂＣ、ウツボＭｕｒａｅｎａ  ｈｅｌｅｎａ  ＨｂＣ、ニジマスＯｎｃｏｒｈｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ  ＨｂＩ及び太平洋サケＳａｌｍｏ  ｓａｌａｒクローン４からなる成体ヘモグロビン群に位置することを示した。さらに、メダカ成体βグロビンａｄ．β１とは、かなり異なる。β２は、グロビン遺伝子展開のより初期ステージに存在する遺伝子からの派生物であるかもしれない（２４）。Ｅ１中のその他の２つの遺伝子、Ψα及びΨβは、後述のように疑似遺伝子であった。
【００４１】
他の硬骨魚類グロビン遺伝子においてしばしば見出されるように、α及びβ遺伝子の４対（α１とβ１、α３とβ３、α４とβ４、ΨαとΨβ）は、転写方向性について対向して配置されていた。しかし、α０、α２及びβ２遺伝子は、対向ルールから除外されていた。
【００４２】
Ｅ１クラスターの内部又は外部の他の遺伝子を見出した。コンピューター介在ホモロジーサーチは、α０遺伝子の５′側の４．５Ｋｂｐ上流にＥＳＴクローン、以前にヒト未成熟ミエロイド細胞系ＫＧ−１から単離されたＫＩＡＡ０１７２に相同な配列が含まれることを示した（２５）。それは、ａｎｋｙｒｉｎ−３と相同である（遺伝子のコード領域の１３９ｂｐで３４．５％同一）。このメダカのＫＩＡＡ０１７２様相同物は、ヒトＫＩＡＡ０１７２の３７５アミノ酸と約６０％同一であった。α２とα３の間の遺伝間スペース内で、フグ（Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）のゲノムにしばしば現れるレトロトランスポゾンＳｕｓｈｉ−１に相同性の配列が見出された（２６）。このＳｕｓｈｉ−１様相同物は、逆転写酵素／ＲＮアーゼブラフィッシュＨドメインをコードするが、ｇａｇドメインのコードを欠いていると推測された。その予想コード領域における少しの挿入／欠失の存在のため、疑似遺伝子であると考えられる。フグＳｕｓｈｉ−１との同一性は、アミノ酸で５８．５％であった。
【００４３】
ヒトタンパク質−１４（２７）に相同な配列が、図１に示すようにΨβ遺伝子の３′側下流に見出された。このメダカ配列は、ヒトタンパク質−１４の第２〜第１１エクソンを保存しており、同一性は、アミノ酸で７８％であった。タンパク質−１４様遺伝子は、ヒト及びニワトリゲノム中のαグロビン遺伝子クラスターに隣接することが知られている。ヒトゲノムにおいて、タンパク質−１４遺伝子は、その第５イントロン中のαグロビン遺伝子のシス調節領域（ＨＳ−４０）を含み、ＨＳ−４０は、ＧＡＴＡやＮＦ−Ｅ２のような赤血球系細胞特異的転写因子結合部位を含む（２８）。このような遺伝子相同性は、メダカゲノムに保存されており、すなわち、メダカタンパク質−１４遺伝子は、その第５イントロン内にそのような結合部位を含む。メダカＨＳ−４０の機能は、近く研究され刊行されるだろう。メダカタンパク質−１４様遺伝子の第４イントロンにおいて、別のＣＲ−１ファミリーに属するトランスポゾンＭａｕｉの部分に相同（４１．２％）な配列が見出された（２９）。
【００４４】
メダカにおける成体グロビン遺伝子のゲノム構成
図２において、３つのグロビン遺伝子からなる他の遺伝子クラスターを示した。２つの遺伝子のコード配列は、成体グロビンｃＤＮＡであるａｄ．α−１及びａｄ．β−１のそれと同一であり、それぞれａｄ．α１及びａｄ．β１と命名された。ａｄ．α１及びａｄ．β１の遺伝子は、分子系統学的関連において胚性グロビン遺伝子と完全に区別される（１８、２４）。したがって、このクラスターは、「成体グロビン遺伝子クラスター（Ａ１）」と命名された。他の硬骨魚類グロビン遺伝子のように、ａｄ．α１及びａｄ．β１の対は、対向していた。
ａｄ．α２と命名された特有のグロビン遺伝子がこのクラスター内に見出された。この遺伝子のイントロンは、他のα遺伝子の対応するイントロンに比べて約２倍長い（表１）。予測アミノ酸配列は、ａｄ．α１グロビンのそれに比べて２アミノ酸短く、α０／１グロビンのそれに比べて３アミノ酸短い。さらに、多くのアミノ酸置換を含み、他のメダカの胚性や成体αグロビンと相当低い相同性を示した。更なる研究は、ａｄ．α２グロビンが他のあらゆる硬骨魚類グロビンと相同ではないが、種々の鳥類のヘモグロビンＤを構成するαグロビンと高度に類似すること、そしてこのグロビンの系統学的位置が全ての硬骨魚類αグロビンの外側であることを示した。ａｄ．α２遺伝子は、グロビン遺伝子展開のより初期のステージに存在する遺伝子の派生物であるかもしれない（２４）。
【００４５】
表１．メダカα及びβグロビン遺伝子のエクソン−イントロン接合部の機構
エクソンとイントロンのヌクレオチド配列をそれぞれ大文字及び小文字で示した。アミノ酸をエクソンのヌクレオチド配列の下に示した。疑似遺伝子Ψα及びΨβのエクソン及びイントロンを他の機能的胚性グロビン遺伝子との相同性に基づき推定した。アステリスクは、Ψα中の推定第２エクソンのエクソン−イントロン接合部の配列である。
【００４６】
【表２】
2004298093.tif 000003
【００４７】
Ａ１クラスターは、２つの特徴的な配列を含んでいる。１つは、ＴＡ反復からなる３００ｂｐ配列であり、ａｄ．α２遺伝子の５′側８００ｂｐ上流に位置し、もう１つは、３０個のデオキシグアノシン残基（Ｇ３０）からなる配列であり、ａｄ．α１遺伝子の３′側８００ｂｐ下流に位置する。ニワトリゲノムでは、成体βグロビン遺伝子のプロモーター領域は、１６個のデオキシグアノシン残基を含むことが知られており、このポリ（ｄＧ）領域が、ＢＧＰ（ベータグロビンタンパク質）と呼ばれる赤血球特異的タンパク質の結合部位であることが示唆される（３０）。
【００４８】
図に示すように、ヒト水チャンネルタンパク質の遺伝子の相同物であるアクアポリン−８（３１）がａｄ．α１遺伝子の３′側下流で同定された。染色体歩行によりａｄ．α２からさらに５′側１０ｋｂｐ長上流を決定した。しかし、グロビン遺伝子も他の遺伝子も見出されなかった。
【００４９】
メダカにおけるグロビン遺伝子クラスターの連鎖解析
日本において確立されたメダカ系列におけるグロビン遺伝子多型を同定するために、実験方法において記載したようないくつかの特定プライマーセットを用いるＰＣＲを行った。図３Ｂに示すように、β３遺伝子から増幅されたＰＣＲフラグメントは、ＡＡ２とＨＮＩの間で、サイズで、多型であった。これは、この２種のβ３グロビン遺伝子の第１エクソンから第３エクソンの配列決定によって確認され、この多型がイントロン内の挿入／欠失突然変異の存在に依存することを意味する。β１及びａｄ．β１遺伝子におけるこのような多型は、２つの系列間で検出されなかった。したがって、β１及びａｄ．β１に由来するＰＣＲフラグメントをそれぞれ制限酵素Ｒｓａ−Ｉ又はＳａｃ−ＩＩを用いて切断した。図３Ａ及び３Ｃに示すように、制限酵素認識部位多型は、２系列間で検出された。この多型をＡＡ２とＦ１（ＡＡ２×ＨＮＩ）との交配によって得られた３９の戻し交配子孫で観察した。タイピングパネルを用いる解析により、連鎖群（ＬＧ）８のβ１及びβ３グロビン遺伝子、及びＬＧ１９のａｄ．β１遺伝子をマップした（図３Ｄ）。これは、胚性グロビン遺伝子クラスター（Ｅ１）及び成体遺伝子クラスター（Ａ１）がメダカゲノムの異なる染色体に存在することを意味する。したがって、メダカのグロビン遺伝子構成は、両生類、鳥類及び哺乳類のそれとは全く異なる。これは、脊椎動物の中でも特有である。
【００５０】
ゲノムのサザンブロット分析
メダカのＨ−ｄｒＲから単離されたＤＮＡをＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで切断した。電気泳動後、このＤＮＡフラグメントをトランスブロットし、β１、β２、β３及びａｄ．β１のプローブでハイブリダイゼーションさせた（図４）。ハイブリダイゼーションプロファイルは、両制限酵素を用いて得られたフラグメントのサイズがそれぞれの配列から予測される配列と同一であることを示した。この結果により、プローブと高い相同性を有する他のあらゆる配列が全ゲノム配列に存在しないことが確認された。本研究は、おそらくメダカゲノムにおけるほとんど全てのグロビン遺伝子を網羅している。
【００５１】
グロビン遺伝子の転写開始部位の決定及び予想、及び５′上流領域のいくつかの構造的特徴
転写開始部位を決定するために、ＲＬＭ−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端のＲＮＡリガーゼ介在急速増幅）を第５日胚又は成体血液ＲＮＡから精製されたｍＲＮＡを用いて行った。第５日胚ｍＲＮＡからα０、β４及びａｄ．β１、及び血液ＲＮＡからα０、ａｄ．α１、ａｄ．α２及びａｄ．β１を増幅することができた。その転写開始部位は、図５Ａ及びＢに示すように決定された。
α０遺伝子の転写開始部位は、開始コドンから−２３ｂｐと決定した（図５Ａ、矢印）。この部位の周囲の配列であるＡＣＡＧＴＴＣは、真核生物添加開始部位であるＹＣＡＹＹＹＹのモチーフと高度に一致する（３２）。推定ＴＡＴＡボックス（ＣＡＴＡＡ）が開始部位から−２５ｂｐで見出された。図５Ａに示されるａｄ．α１遺伝子の２つのスタート部位、ＴＣＡＣＣＡＴＣ（開始コドンから−３４ｂｐ）、ＧＣＡＴＣＡＣＣ（−３７ｂｐ）を決定した。ＴＡＴＡボックス（ＴＴＴＡＡ）は、２つの開始部位から−２１ｂｐ及び−２４ｂｐと推測された。ａｄ．α２の部位は、その開始コドンから−１５３ｂｐ離れて決定された。しかし、開始部位からの推定ＴＡＴＡボックスの位置は、他のα遺伝子のそれと同様であった。全てのαグロビン遺伝子の５′上流配列を整列し、図５Ａに示すように他の遺伝子の開始部位及び推定ＴＡＴＡボックスを推定した。
【００５２】
全てのα遺伝子の５′上流領域内のＣＡＣＣＣボックスやＧＡＴＡボックスのような共通配列を見出した。これらの位置は、図５Ａに示されているように高度に保存されていた。ＣＡＣＣＣボックス及びＧＡＴＡボックスは、それぞれ、赤血球系クルッペル様ファクターＥＫＬＦ（３３）及び赤血球系細胞特異的転写因子ＧＡＴＡ−１（３４）の結合部位として周知である。
【００５３】
図５Ｂに示したように、決定された転写開始部位の位置は、全てのβグロビン遺伝子における予測開始部位及び推定ＴＡＴＡボックスが互いにそしてα遺伝子のそれと高度に類似する。しかし、ＣＡＣＣＣボックスは、その中で見出されず、ＧＡＴＡボックスの位置は、遺伝子中で多少変動する。ＣＣＡＡＴボックスがヒト、ゼブラフィッシュ及びサケβグロビン遺伝子におけるＴＡＴＡボックスの５′側４０ｂｐ上流で見出されたが、メダカβグロビン遺伝子のいかなる５′上流領域でも見出されなかった。
【００５４】
メダカグロビン遺伝子のエキソン−イントロンの構造
全メダカグロビン遺伝子の各々は、他の動物のそれと類似の３個のエクソン及び２個のイントロンを有する典型的構造を示した。イントロンの位置は、全ての遺伝子で類似した。しかし、その長さは、遺伝子間で多少変動した。特に、遺伝子ａｄ．α２は、表１に示すように異常に長いイントロンを有していた。多くの遺伝子のエクソン−イントロンジャンクションの構造は、典型的ＧＡ−ＡＧルール下にあった（３５）。しかし、β２の最初のイントロンのジャンクション、β３の第２イントロン及びａｄ．α２の第２イントロンは、それぞれ、ＧＣ−ＡＧ、ＧＣ−ＡＧ及びＧＴ−ＴＡであった。
【００５５】
Ｅ１クラスターのΨα及びΨβ疑似遺伝子
配列アライメント及び配列比較は、Ｅ１クラスターの２つの遺伝子Ψα及びΨβが、それぞれ、他のα及びβグロビン遺伝子に相同な配列を含むことを示した。しかし、いかなるオープンリーディングフレームも予測できなかった。Ψα遺伝子の推定５′上流領域では、転写開始部位もＴＡＴＡボックスも決定できなかった（図５Ａ）。しかし、ＧＡＴＡボックス及びＣＡＣＣＣボックスは、他のαグロビン遺伝子とほとんど同様な位置で保存されたままであった。Ψβ遺伝子については、転写開始部位もＴＡＴＡボックスのいずれも、推測できなかったが、ＧＡＴＡボックスは、推測開始コドンＡＴＧから離れて見出された（図５Ｂ）。遺伝子Ψαにおいて別の特徴を見出した。Ψαは４つのエクソン様配列からなり（図１）、第２及び第３の配列の両者は、α０、α２、α３及びα４のような他のαグロビン遺伝子の第２エクソンと相同であった（ヌクレオチドで６０−６５％同一）。これらの２つの配列は、互いに高度に相同であり（ヌクレオチドで８０％同一）、第２エクソンの複製の進化事象の存在を意味する。ＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子Ψβがメダカにおいて現実に発現することの証明ではない。遺伝子Ψα及びΨβは、疑似遺伝子である。
【００５６】
対向させながら祖先のα及びβ遺伝子対の１つが複製される、その後、１対がα遺伝子内の第２エクソンの複製及び又は多くの挿入／欠失の蓄積によって疑似遺伝子に変化したと考えるのは興味深い。別の興味深い発見がヌクレオチドに基づく比較によって得られ、Ψα及びΨβの推定エクソンが硬骨魚類、ブリ（Ｓｅｒｉｏｌａ  ｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａ）の成体グロビンの対応するｃＤＮＡにおけるコード領域と高度に相同であった。これらの遺伝子の疑似遺伝子化をさらに研究し、その結果は、別の場所に記載されるだろう（２４）。
【００５７】
メダカのグロビン遺伝子発現
メダカの発生の間のグロビン遺伝子発現を研究するためＲＴ−ＰＣＲを行った。発現プロフィールは、下記のように複雑だった。
【００５８】
Ｅ１クラスターにおけるグロビン遺伝子、α０、β１、α１、β２及びα２の発生的発現
図６Ｂに示すように、α０及びα１遺伝子は、初期ステージ（ステージ３０）胚において強度に発現される。この発現は、胚の後期ステージ（ステージ３８）及び孵化後３０日の稚魚において徐々に減少した。しかし、完全成長成体においては、観察されなかった。β１遺伝子の発現は、α０及びα１のそれと同様であり、隣接して結合したα１の成長発現とほぼ同調した。これらのパターンは、プローブとしてｃＤＮＡであるｅｍ．α−０、ｅｍ．α−１及びｅｍ．β−１を用いる以前の研究における結果と一致した（１８）。
我々は、予想外の発現パターンを見出した。α２から推測したアミノ酸配列は、他の胚性グロビン遺伝子であるα０及びα１と高い相同性（８５．９％）を示した。さらに、分子系統分析は、α２遺伝子がα０及びα１に共通する先祖遺伝子のタンデム複製によって形成されたことを示した（２４）。しかし、α２の発生発現パターンは、孵化後の稚魚の完全成長成体への増加を示した（図６Ａ及び６Ｂ）。推測アミノ酸配列に関する胚性グロビン遺伝子の１つであるα２遺伝子は、主に、メダカの孵化後に発現した。
特有の遺伝子の１つであるβ２の発現は、本研究においては、証明されなかった（図６Ａ及びＢ）。しかし、β２遺伝子が、例えば、高温、低酸素条件のような特定環境化で発現される可能性は、否定されない。
【００５９】
Ｅ１クラスターにおけるグロビン遺伝子、α３、β３、α４、β４、Ψα及びΨβの発生的発現
図６Ａ及び６Ｂに示されるように、α３及びβ３遺伝子の両者は、初期ステージの胚において発現されている。発現は、後期ステージの胚において大幅に減少しており、稚魚のみならず完全成長成体においても見出されなかった。さらに、α４及びβ４遺伝子の両者は、初期及び後期胚で強力に発現しており、稚魚や成体では発現されなかった。対向転写方向でのα３−β３及びβ４−α４の遺伝子対は、肺性ステージで主に発現され、αグロビン発現は、βグロビン発現と高く同調した。ＲＴ−ＰＣＲは、疑似Ψβが、初期胚のみならず完全成長成体においても発現されなかったことを示した（データは示さず）。
【００６０】
Ａ１クラスターにおけるグロビン遺伝子の発生的発現：
図６Ｂに示すように、成体グロビン遺伝子であるａｄ．α１は、初期及び後期胚において僅かに発現された。孵化後、この発現は、稚魚から完全成長成体で増加した。この発現パターンは、α２のそれと同様であった。
予想外にも、他の成体グロビン遺伝子であるａｄ．β１の発現は、初期胚において高く、稚魚から完全成長成体まで持続していることが見出された。メダカ成体βグロビン遺伝子であるａｄ．β１の発現パターンが、ヒトαグロビン遺伝子のそれとほぼ同様であったことは興味深い。さらに、胚形成期でのａｄ．β１の発現は、隣接して連結するａｄ．α１の発現と同調しなかった。これらの発現パターンは、以前の研究における結果と一致した（１８）。
遺伝子ａｄ．α２は、メダカの初期胚において発現した。しかし、図６Ａ及び６Ｂに示すように、その発現は、ステージ３８後に徐々にかつ連続的に減少した。
【００６１】
メダカにおけるシス調節的領域制御グロビン遺伝子発現の候補
図１及び７に示すように、α０遺伝子の５′上流の１１０７ｂｐ配列（ＥＭ１）は、７つのＧＡＴＡボックス、１つのＣＡＣＣＣボックス及び１つの推定ＴＡＴＡボックスを含む領域であった。この領域は、比較的ＧＣリッチであった（データは示さず。）。メダカゲノムにおけるシス調節的領域制御グロビン遺伝子発現を調べるために、最初に、ＥＭ１に注目した。ＥＭ１及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の融合遺伝子を構築し、１又は２細胞期の胚に注入した。半分以上の注入胚が、受精後４又は５日間生存した（表２）。蛍光顕微鏡観察によって、ＧＦＰシグナルが、生存胚の約３８％の循環赤血球系細胞同じく脾臓のような造血器官で見出された（表２）。いくつかの胚は、卵黄嚢、尾体節、尾びれ、皮膚等において異所性発現を示した。ＧＦＰ陽性胚は、成魚に成長し繁殖性となった。しかし、完全成長成体は、ＧＦＰ蛍光を一切示さなかった。ＧＦＰシグナルの発現プロフィールは、胚性グロビン遺伝子α０、β１及びα１のそれとほぼ同様であった。注入された成体メダカとＨ−ｄｒＲ株のメダカを交配し、いくつかの子孫を得、赤血球系細胞及び造血器官においてＧＦＰシグナルを安定して発現するＥＭ１−ＧＦＰトランスジェニックメダカの系統を樹立した。
【００６２】
表２  １又は２細胞期での融合遺伝子構築物（ＥＭ１又はＥＭ２−ＧＦＰ）を注入した胚の生存、及び胚の赤血球系細胞におけるＧＦＰ蛍光の検出
生存胚及びＧＦＰ蛍光陽性胚の数を孵化４又は５日後に計数した。括弧内の％及び％＊は、それぞれ、注入胚中の生存胚数の百分率及び生存胚中のＧＦＰ陽性赤血球系細胞を有する胚の百分率を示す。
【００６３】
【表３】
2004298093.tif 000004
【００６４】
このＧＦＰシグナルは、樹立系統から得られた２日齢（２２−２３ステージ）胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）において最初に検出され（図８Ｂ）、次いで３日齢胚の血管内を循環する赤血球系細胞において検出された（３０ステージ、図８Ｄ）。ＧＦＰ陽性赤血球系細胞は、３０日齢稚魚において検出された（図８Ｅ）。孵化後の稚魚における造血器官の１つである腎臓も、高度にＧＦＰ陽性であった（図８Ｄ）。しかし、多くの陽性細胞が、完全成長成魚において消失した（図８Ｇ）。このＧＦＰの発現パターンは、胚性グロビン遺伝子α０、α１及びβ１のそれとほぼ同様であった。成体表皮における発現を除き、いかなる異所性発現も、胚から成体まで、この系統の生涯を通じて観察されなかった。
【００６５】
図７に示すように、ＥＭ１から５つのＧＡＴＡボックスを含む配列を削除し、残る配列（ＥＭ２）をＧＦＰ遺伝子と融合し、１又は２細胞期の胚に注入した。しかし、注入胚及び稚魚は、いくつかの異所性発現を示し、ＧＦＰの赤血球系細胞特異的発現は、全く認められなかった（表２）。この結果は、ＥＭ１から削除された５つのＧＡＴＡ配列が、その下流遺伝子の赤血球系細胞及び発生段階特異的発現を促進又は亢進する能力を有することを示唆する。今後は、グロビン遺伝子の他のシス調節領域制御細胞／ステージ特異的発現を検索及び研究するつもり
である。
【００６６】
考察
本研究は、硬骨魚類におけるグロビン遺伝子座の全長構造の最初の証明である。α及びβグロビン遺伝子の大多数の対向構成に加えて、メダカグロビン遺伝子座の最も特徴的な特性の１つは、胚性グロビン（Ｅ１）及び成体グロビン（Ａ１）の遺伝子クラスターの異なる染色体位置であった。この特徴は、脊椎動物の中でもかなり独特であった。祖先硬骨魚類から現在のメダカまでの種分化の間のグロビン遺伝子進化の経路を解析した。この結果は、他で発表するつもりである（２４）。
本研究において、硬骨魚類に特徴的な発生的グロビン遺伝子発現（メダカＯｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）及びその発現を担うシス調節領域のいくつかの構造的特性を主に検討する。
【００６７】
メダカにおけるグロビン遺伝子発現を担うシス調節領域
高等脊椎動物のグロビン遺伝子座においては、近接又は５′フランキング領域、遺伝子のキャップ部位から約２００ｂｐ５′上流がプロモーターとして周知であり、ＴＦＩＩＤ（３６）、ＧＡＴＡ（３４）、ＥＫＬＦ（３３）及びＣＰ１（３７）のような良く特徴付けられたタンパク質の多くの結合性部位を含む。メダカグロビン遺伝子座については、上記の推定プロモーター領域であるそれぞれのグロビン遺伝子の５′上流約３００ｂｐにおいて、たった１つのＴＡＴＡ、１又は２つのＧＡＴＡ及び１つのＣＡＣＣＣが見出された。さらに、高等脊椎動物の５′フランキング領域、特にマウスにおいて見出されるαグロビン遺伝子は、極めて高度にＧＣリッチである“ＣｐＧ島”からなる（３、３８）。しかし、このようなＣｐＧ島は、メダカグロビン座においては見出されなかった。
【００６８】
グロビン遺伝子のエンハンサーは、高等脊椎動物グロビン遺伝子座の５′及び３′フランキング領域において同定されている。ヒトβ、ヒトγ及びトリβグロビン遺伝子の配列は、それぞれ、ＧＡＴＡ（３４）、ＨＯＸＢ２（３９）、ＰＡＬ（４０）及びＮＦ−Ｅ２（４１）のようないくつかの転写因子結合部位を含むことが知られている。いくつかのＧＡＴＡボックスは、メダカの多くのαグロビン遺伝子の３′下流領域で見出された。しかし、それらは、βグロビンの対応する領域内ではなかった。メダカグロビン遺伝子のプロモーター及びエンハンサーを同定するさらなる解析が必要であるが、それぞれの遺伝子から３′下流約１０００ｂｐでＧＡＴＡボックスを除く有望な結合部位の共通配列を推定できなかった。
【００６９】
高等脊椎動物におけるグロビン遺伝子の赤血球系細胞及び発生段階特異的発現は、哺乳類βグロビン遺伝子のＬＣＲ（１１）、哺乳類αグロビン遺伝子のＨＳ−４０（４２）及びトリβグロビン遺伝子のＥｎ（エンハンサー）（４３）のような別の特異的シス調節領域によって調節されている。これらは、それぞれのグロビン遺伝子から遠く離れて同定されている。例えば、ヒトＨＳ−４０は、αグロビン遺伝子クラスターのζ遺伝子から５′上流４０Ｋｂｐに位置し、また、ヒトβグロビン遺伝子発現のＬＣＲ内のＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ３及びＨＳ４は、βグロビン遺伝子クラスターのεグロビン遺伝子から５′上流８〜２２Ｋｂｐに位置する。本研究において、メダカグロビン遺伝子座におけるこのようなシス調節領域を検索した。ＧＦＰレポーター遺伝子を用いる遺伝子導入実験によって、α０遺伝子（ＥＭ１）の５′上流１．１Ｋｂｐ領域の５つのＧＡＴＡ領域が、ＧＦＰの細胞／ステージ特異的発現を促進又は亢進する能力を有することを明らかにした。このメダカグロビン遺伝子発現を担うシス調節領域は、哺乳類ＬＣＲより簡単である可能性がある。
【００７０】
硬骨魚類α及びβグロビン遺伝子の対向機構、及びこの遺伝子の発現
周知のように、α及びβグロビン遺伝子の対向機構は、コイ、サケ及びゼブラフィッシュのような硬骨魚類に特徴的である。メダカにおいても、α及びβ遺伝子の４対は、対向機構であり、α及びβグロビン遺伝子両者の５′末端の間を介在する約１Ｋｂｐ配列があった。これらの介在配列は、相互にいかなる相同性を有していなかった。しかし、いくつかのＧＡＴＡ及びＣＡＣＣＣボックスを含んだ。これらのボックスを含む介在配列は、αグロビン遺伝子及び近接して連結するβグロビン遺伝子の同調した転写を促進する役割を果たすと考えられる。この遺伝子の３対、β１−α１、α３−β３及びβ４−α４については、αグロビン遺伝子発現が近接するβグロビン遺伝子の発現と同調した。しかし、ａｄ．α１の発現は、近接するａｄ．β１のそれとかならずしも同調しなかった。どの関連も未知のままである。
【００７１】
造血とグロビン遺伝子発現
脊椎動物は、２つの造血システム、すなわち、それぞれ胚と成体における血液細胞分化システムである初期及び最終造血を有する。グロビンの異なるタイプの切替え及び異なるタイプの赤血球系細胞の移行は、造血の変更の間に生ずる（４４、４５）。一方、グロビン遺伝子のゲノム構成は、動物間で異なる。異なるグロビン遺伝子機構を有する異なる脊椎動物がグロビン遺伝子の切替のための共通するメカニズムを有するか否かを明らかにすることは極めて興味深い。
以前に研究したニジマスにおいては（１３、１５）、グロビンではなく、胚性から成体ヘモグロビンへの切替は、胚の孵化と非常に密接である。この切換えは、胚性から成体赤血球系細胞はの孵化後の置換に起因する。細胞は、互いに形態的に全く相違する。しかし、本研究において解明されたように、メダカグロビン遺伝子発現の発生の高まりは、相当に複雑である。特に、Ｅ１クラスターの９つの胚性グロビン遺伝子の１つであるα２遺伝子は、稚魚と成魚において主に発現されたが、２つの成体グロビン遺伝子であるａｄ．β１遺伝子は、胚から成体までの生涯を通じて発現された。初期及び後期胚、稚魚及び完全成長成魚における赤血球系細胞は、相互に明らかに識別することができなかった。メダカにおけるグロビン切換えは、造血の変化と単純に関連するとは思えない。
近い将来に、ＧＡＴＡ−３（４６）、ｃ−ｍｙｂ（４７）及びＡＭＬ−１（４８）のような造血特異的マーカーを用いて、他のシス調節領域の更なる究明に加えて、「胚から成体グロビンへの切換え」及び「初期造血から最終造血への変化」の間の関連を研究するつもりである。
【００７２】
参考文献
【表４】
2004298093.tif 000005
【００７３】
【表５】
2004298093.tif 000006
【００７４】
【表６】
2004298093.tif 000007
【配列表】
2004298093.tif 000008
2004298093.tif 000009
2004298093.tif 000010
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2004298093.tif 000015
2004298093.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、胚性グロビン遺伝子クラスター（Ｅ１）の構造である。クラスターＥ１の配列をＳａｕ３Ａ１部位（１、胚性グロビン遺伝子α０の５′上流の６８４０ｂｐ）から別のＳａｕ３Ａ１部位（４７１１５、Ψβ遺伝子の３′上流９１２０ｂｐ）までを図解して示した。グロビン遺伝子及び他の遺伝子をそれぞれ大矢印及び小矢印で示した。ａは、図７に示すＥＭ１の位置を意味する。矢印の方向は、転写方向性を示す。白抜き矢印で示した遺伝子Ψα及びΨβは、疑似遺伝子である。制限酵素地図をゲノムクローン、λｇ−１、λｇ−２、λｇ−４、λｇ−５及びλｇ−７と一緒に示した。制限酵素：ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）及びＳａｌＩ（Ｓ）。
【図２】図２は、成体グロビン遺伝子クラスター（Ａ１）の構造である。クラスターＡ１の配列をＥｃｏＲＩ部位（１、成体グロビン遺伝子ａｄ．α−１の３′下流４４２９ｂｐ）からＳａｕ３Ａ１部位（２４４４８、ａｄ．α２遺伝子の５′上流１０３８４ｂｐ）までを図解して示した。グロビン遺伝子及び他の遺伝子をそれぞれ大矢印及び小矢印で示した。矢印の方向は、転写方向性を示す。制限酵素地図をゲノムクローン、λｇ−３、λｇ−６、λｇ−８及びλｇ−９と一緒に示した。制限酵素：ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）。
【図３Ａ】β１、β３及びａｄ．β１遺伝子のゲノムの連鎖解析
パネルＡ、Ｂ及びＣのレーン１−８、レーンＡＡ２、レーンＨＮＩ及びレーンＦ１は、それぞれＡＡ２とＦ１（ＡＡ２×ＨＮＩ）、ＡＡ２、ＨＮＩ及びＦ１（ＡＡ２×ＨＮＩ）の戻し交配子孫から得られたＰＣＲフラグメントのパターンを示す。３９子孫の８例を図に示す。それぞれのパネルの下の＋と−のマークは、それぞれＡＡ２とＨＮＩ株のパターンと同一のパターンを示す。電気泳動を１２％ポリアクリルアミドゲル上で行い、ゲルをエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色した。Ａ：β１遺伝子多型。これは、制限酵素部位多型である。β１遺伝子からのＰＣＲ増幅したフラグメントをＲｓａ−Ｉで消化した。ＡＡ２株のβ１遺伝子からのＰＣＲフラグメント中に２つのＲｓａ−Ｉ部位とＨＮＩ株のそれに１つのＲｓａ−Ｉ部位があった。
【図３Ｂ】β１、β３及びａｄ．β１遺伝子のゲノムの連鎖解析
パネルＡ、Ｂ及びＣのレーン１−８、レーンＡＡ２、レーンＨＮＩ及びレーンＦ１は、それぞれＡＡ２とＦ１（ＡＡ２×ＨＮＩ）、ＡＡ２、ＨＮＩ及びＦ１（ＡＡ２×ＨＮＩ）の戻し交配子孫から得られたＰＣＲフラグメントのパターンを示す。３９子孫の８例を図に示す。それぞれのパネルの下の＋と−のマークは、それぞれＡＡ２とＨＮＩ株のパターンと同一のパターンを示す。電気泳動を１２％ポリアクリルアミドゲル上で行い、ゲルをエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色した。
Ｂ：β３遺伝子多型。β３遺伝子からのＰＣＲフラグメントは、ＡＡ２とＨＮＩ株の間で多型であり、挿入／欠失多型を示す。
【図３Ｃ】
β１、β３及びａｄ．β１遺伝子のゲノムの連鎖解析
パネルＡ、Ｂ及びＣのレーン１−８、レーンＡＡ２、レーンＨＮＩ及びレーンＦ１は、それぞれＡＡ２とＦ１（ＡＡ２×ＨＮＩ）、ＡＡ２、ＨＮＩ及びＦ１（ＡＡ２×ＨＮＩ）の戻し交配子孫から得られたＰＣＲフラグメントのパターンを示す。３９子孫の８例を図に示す。それぞれのパネルの下の＋と−のマークは、それぞれＡＡ２とＨＮＩ株のパターンと同一のパターンを示す。電気泳動を１２％ポリアクリルアミドゲル上で行い、ゲルをエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色した。
Ｃ：ａｄ．β１遺伝子多型。これは、制限酵素多型である。ａｄ．β１遺伝子からのＰＣＲ増幅フラグメントをＳａｃ−ＩＩで消化した。ＨＮＩ株のａｄ．β１遺伝子の第２のイントロン内に１つのＳａｃ−ＩＩ部位があったが、ＡＡ２株にはＳａｃ−ＩＩ部位がなかった。
【図３Ｄ】β１、β３及びａｄ．β１遺伝子のゲノムの連鎖解析
パネルＡ、Ｂ及びＣのレーン１−８、レーンＡＡ２、レーンＨＮＩ及びレーンＦ１は、それぞれＡＡ２とＦ１（ＡＡ２×ＨＮＩ）、ＡＡ２、ＨＮＩ及びＦ１（ＡＡ２×ＨＮＩ）の戻し交配子孫から得られたＰＣＲフラグメントのパターンを示す。３９子孫の８例を図に示す。それぞれのパネルの下の＋と−のマークは、それぞれＡＡ２とＨＮＩ株のパターンと同一のパターンを示す。電気泳動を１２％ポリアクリルアミドゲル上で行い、ゲルをエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色した。
Ｄ：β１、β３及びａｄ．β１遺伝子の連鎖地図。戻し交配パネルＡ、Ｂ及びＣ上で検出された挿入／欠失多型又は制限酵素多型に基づき、β１遺伝子（ＧＢＥ−ｂ１）及びβ３遺伝子（ＧＢＥ−ｂ３）の両者を連鎖群（ＬＧ）８上に決定し、ａｄ．β１遺伝子（ＧＢＡ−ｂ１）をＬＧ１９上に決定した。他の遺伝子の略語は、Ｎａｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ（２３）に記載されている。この遺伝的連鎖地図は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｍｂａｓｅ．ｂｉｏｗｅｂ．ｎｅ．ｊｐ／￣ｄｃｌｕｓｔ／ｍｌ＿ｂａｓｅ．ｈｔｍｌにおいて見ることができる。
【図４】図４は、ゲノムのサザンハイブリダイゼーションである。ＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで消化したゲノムＤＮＡ（５μｇ）を０．７％アガロースゲル上で電気泳動し、遺伝子β１、β２、β３又はａｄ．β１の別個の部分に対応するＤＩＧラベルＤＮＡフラグメントでハイブリダイズさせた。パネルの下の数字は、制限酵素地図から予想されるＤＮＡフラグメントの長さ（ｂｐ）を表す。左のパネルは、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色したゲルを示す。左のパネルの数字は、分子量マーカー（Ｍ）のサイズを表す。
【図５Ａ】図５は、グロビン遺伝子の５′上流配列の比較である。α及びβグロビン遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）から５′上流配列を（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ整列させた。α０、ａｄ．α１、ａｄ．α２及びａｄ．β１遺伝子の転写開始部位をＲＬＭ−ＲＡＣＥによって決定し、矢印によって示した。５′上流配列の類似性に基づき、遺伝子α１、α２、α３、α４、β１、β２及びβ３の開始部位を矢印先端で示すように推定した。ＴＡＴＡボックス、ＧＡＴＡボックス、ＣＡＣＣＣボックス及びＣＣＡＡＴボックスを推測し、下線、塗りつぶし四角及び白抜き四角でそれぞれ表した。疑似遺伝子部位Ψα又はΨβは、推測できなかった。ヒト（ヒトａｄ．α）及びゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ａｄ．α）の成体αグロビン遺伝子、及びヒト（ヒトａｄ．β）及びゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ａｄ．β）の成体βグロビン遺伝子の５′上流配列を参考として表した。
【図５Ｂ】
図５は、グロビン遺伝子の５′上流配列の比較である。α及びβグロビン遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）から５′上流配列を（Ａ）及び（Ｂ）にそれぞれ整列させた。α０、ａｄ．α１、ａｄ．α２及びａｄ．β１遺伝子の転写開始部位をＲＬＭ−ＲＡＣＥによって決定し、矢印によって示した。５′上流配列の類似性に基づき、遺伝子α１、α２、α３、α４、β１、β２及びβ３の開始部位を矢印先端で示すように推定した。ＴＡＴＡボックス、ＧＡＴＡボックス、ＣＡＣＣＣボックス及びＣＣＡＡＴボックスを推測し、下線、塗りつぶし四角及び白抜き四角でそれぞれ表した。疑似遺伝子部位Ψα又はΨβは、推測できなかった。ヒト（ヒトａｄ．α）及びゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ａｄ．α）の成体αグロビン遺伝子、及びヒト（ヒトａｄ．β）及びゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ａｄ．β）の成体βグロビン遺伝子の５′上流配列を参考として表した。
【図６Ａ】
図６は、グロビン遺伝子の発生発現パターンである。
（Ａ）グロビン遺伝子α２、α３、α４、β２、β３、β４及びａｄ．α２の発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を実験方法に記載のようにおこなった。解析において、ステージ３０胚（レーン１）、ステージ３８杯（レーン２）、孵化後３０日後の稚魚（レーン３）又は完全成長成魚（レーン４）から調製された１００個の血液細胞をＲＴ−ＰＣＲの反応混合物に直接加えた。２５サイクル（２５ｃｙｃ．）及び３５サイクル（３５ｃｙｃ．）からの結果を示した。グロビンｍＲＮＡα２、α３、α４、β２、β３、β４及びａｄ．α２から増幅し得るＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ、４１５、３７４、５１５、２００、３５２、３６１、１６７及び２５２ｂｐであった。予想されたサイズを有するバンドが得られた。＊は、ゲノムグロビン遺伝子から増幅されるであろうＰＣＲ産物を示す。Ｍは、分子量マーカーのパターンを示す。下のパネルの右側の数字は、分子量サイズを示す。遺伝子α０、α１、β１、ａｄ．α１、ａｄ．β１の分析は、近く公表される（１８）。ステージ３０胚、ステージ３８胚、孵化３０日後の稚魚又は完全成長成魚の１００個の赤血球系細胞内のグロビン遺伝子発現の強度をＡに示す３５サイクルのＰＣＲ反応によって得られたバンドの密度を用いて測定した。
【図６Ｂ】
図６は、グロビン遺伝子の発生発現パターンである。
（Ａ）グロビン遺伝子α２、α３、α４、β２、β３、β４及びａｄ．α２の発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を実験方法に記載のようにおこなった。解析において、ステージ３０胚（レーン１）、ステージ３８杯（レーン２）、孵化後３０日後の稚魚（レーン３）又は完全成長成魚（レーン４）から調製された１００個の血液細胞をＲＴ−ＰＣＲの反応混合物に直接加えた。２５サイクル（２５ｃｙｃ．）及び３５サイクル（３５ｃｙｃ．）からの結果を示した。グロビンｍＲＮＡα２、α３、α４、β２、β３、β４及びａｄ．α２から増幅し得るＰＣＲ産物のサイズは、それぞれ、４１５、３７４、５１５、２００、３５２、３６１、１６７及び２５２ｂｐであった。予想されたサイズを有するバンドが得られた。＊は、ゲノムグロビン遺伝子から増幅されるであろうＰＣＲ産物を示す。Ｍは、分子量マーカーのパターンを示す。下のパネルの右側の数字は、分子量サイズを示す。遺伝子α０、α１、β１、ａｄ．α１、ａｄ．β１の分析は、近く公表される（１８）。ステージ３０胚、ステージ３８胚、孵化３０日後の稚魚又は完全成長成魚の１００個の赤血球系細胞内のグロビン遺伝子発現の強度をＡに示す３５サイクルのＰＣＲ反応によって得られたバンドの密度を用いて測定した。
【図７】
図７は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子と融合させたα０遺伝子の５′上流配列の概略図である。ａは、ＧＡＴＡボックス、ＣＡＣＣＣボックス、及び推定ＴＡＴＡボックスのような赤血球系細胞特異的転写因子認識部位を含む、遺伝子α０の５′上流領域を示す。矢印は、ＡＴＧからの転写方向を示す。１１０７ｂｐ配列（ＥＭ１）又は別の１６０ｂｐ配列（ＥＭ２）をＥＧＦＰ−１ベクターと融合させ、１又は２細胞期の胚に注入した。
【図８】
図８は、樹立ＥＭ１−ＧＦＰトランスジェニック系統から得られた胚のＧＦＰの発現である。α０グロビン遺伝子（ＥＭ１）の１１０７ｂｐ５′上流配列及びＥＧＦＰ−１ベクターから構築された融合遺伝子を１又は２細胞期の胚に注入した。注入された胚を成熟成魚に成長させ、メダカのＨ−ｄｒＲ株との交配によって系統を樹立した。ＧＦＰ蛍光は、まず、系統から得られたステージ２３の胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）において検出された（矢印Ｂ）。後期ステージ（ステージ３８）では、ＧＦＰ陽性赤血球系細胞は、胚の血管内（Ｅ）及び腎臓（Ｅの矢印）を循環した。陽性細胞は、孵化１月後でも血管（Ｅ）及び腎臓（Ｄ）において観察され、孵化２月後でもひれ条（ｆｉｎ−ｒａｙ）血管において観察された（Ｆ）。しかし、細胞は、完全成長魚のひれ条血管においては見出されなかった。ＧＦＰシグナルは、ＥＭ２−ＧＦＰ構築物を注入した胚では見出されなかった（データは示さず）。Ａ及びＣは、サンプルＢ及びＤそれぞれの光学顕微鏡像である。Ｆ及びＧは、光学顕微鏡での蛍光像である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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