(57)【要約】【課題】徐放性薬剤や超音波造影剤の有効成分の形成に好適に利用し得るマイクロカプセル等の、外相部に内相部が内包され、かつ磁性体を含有する構造体を提供する。【解決手段】ポリヒドロキシアルカノエート及び磁性体を含有する構造体の構成を、ポリヒドロアルカノエートを含む外相部と、外相部に内包される内相部とを有し、磁性体が外相部及び内相部の少なくともどちらか一方に含有されている構造とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエート及び磁性体を含有する構造体であって、
前記ポリヒドロアルカノエートを含む外相部と、
前記外相部に内包される内相部とを有し、
前記磁性体は、前記外相部及び前記内相部の少なくともどちらか一方に含有されていることを特徴とする構造体。
【請求項２】
前記外相がシェルを形成し、前記内相がコアを形成するマイクロカプセルの形態を有する請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、下記式［１］から式［１０］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを有するポリヒドロキシアルカノエートである、請求項１または２に記載の構造体。
【化１】
2004331750.tif 000062
（ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。
Ｒ１が水素原子（Ｈ）であり、ａが０から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がハロゲン原子であり、ａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が発色団であり、ａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が、
【化２】
2004331750.tif 000063
であり、ａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）；
【化３】
2004331750.tif 000064
（ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【化４】
2004331750.tif 000065
（ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【化５】
2004331750.tif 000066
（ただし、式中ｄは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【化６】
2004331750.tif 000067
（ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５及び−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【化７】
2004331750.tif 000068
（ただし、式中ｆは０から７の整数のいずれかを表す。）；
【化８】
2004331750.tif 000069
（ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表す。）；
【化９】
2004331750.tif 000070
（ただし、式中ｈは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’、−ＳＯ２Ｒ’’、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）；
【化１０】
2004331750.tif 000071
（ただし、式中ｉは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’及び−ＳＯ２Ｒ’’からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）；及び
【化１１】
2004331750.tif 000072
（ただし、式中ｊは１から９の整数のいずれかを表す。）
【請求項４】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの数平均分子量が５，０００〜１，０００，０００である請求項１〜３のいずれかに記載の構造体。
【請求項５】
前記ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成が前記構造体の内側から外側へ向う方向において変化している請求項１〜４のいずれかに記載の構造体。
【請求項６】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、化学修飾されたポリヒドロキシアルカノエートである請求項１〜５のいずれかに記載の構造体。
【請求項７】
前記の化学修飾されたポリヒドロキシアルカノエートが、少なくともグラフト鎖を有するポリヒドロキシアルカノエートである請求項６に記載の構造体。
【請求項８】
前記グラフト鎖が、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートの化学修飾によるグラフト鎖である請求項７に記載の構造体。
【請求項９】
前記グラフト鎖が、アミノ基を有する化合物のグラフト鎖であることを特徴とする請求項７または８に記載の構造体。
【請求項１０】
前記アミノ基を有する化合物が、末端アミノ変性化合物であることを特徴とする請求項９に記載の構造体。
【請求項１１】
前記末端アミノ変性化合物が、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン及び末端アミノ変性ポリシロキサンからなる群より選択される少なくとも一つである請求項１０に記載の構造体。
【請求項１２】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートである請求項６に記載の構造体。
【請求項１３】
前記架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートが、エポキシ基を有するモノマーユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートが架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートである請求項１２に記載の構造体。
【請求項１４】
前記架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートが、ジアミン化合物、無水コハク酸及び２−エチル−４−メチルイミダゾールの少なくとの１つを利用した反応及び電子線照射からなる群より選択される少なくとも一つにより架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートである請求項１２または１３に記載の構造体。
【請求項１５】
前記ジアミン化合物がヘキサメチレンジアミンである請求項１４に記載の構造体。
【請求項１６】
ポリヒドロアルカノエートを含む外相部と、前記外相部に内包される内相部とを有し、磁性体が前記外相部及び前記内相部の少なくともどちらか一方に含有されている構造体の製造方法であって
ポリヒドロキシアルカノエートおよび有機溶媒を含む油相と、水相と、磁性体と、を含む液状原料を用意する工程と、
前記液状原料から前記有機溶媒及び／または水を除去する工程と、
を有し、
前記油相及または水相に由来するＰＨＡを含む外相部に内相部が内包され、これらの外相部及び内相部の少なくとも一方に磁性体が含有された構造体を得る
ことを特徴とする構造体の製造方法。
【請求項１７】
前記水相と前記油相とによってエマルションを調製する工程をさらに有する請求項１６に記載の構造体の製造方法。
【請求項１８】
前記油相に、前記水相を分散させてＷ／Ｏ型エマルションを調製する工程と、該Ｗ／Ｏ型エマルションから有機溶媒および／または水を除去する工程とを有する請求項１７に記載の構造体の製造方法。
【請求項１９】
前記油相に前記水相を分散させてＷ／Ｏ型エマルションを調製する工程と、前記Ｗ／Ｏ型エマルションを第二の水相に分散することでＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション中から有機溶媒および／または水を除去する工程とを有する請求項１７に記載の構造体の製造法。
【請求項２０】
前記水相に前記油相を分散させてＯ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、前記Ｏ／Ｗ型エマルションから有機溶媒および／または水を除去する工程とを有する請求項１７に記載の構造体の製造方法。
【請求項２１】
前記有機溶媒および／または水の除去が、少なくとも液中乾燥法、相分離法及び噴霧乾燥法の１つの方法により行われる請求項１６から２０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２２】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、式［１］から式［１０］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートである、請求項１６から２１のいずれかに記載の製造方法。
【化１２】
2004331750.tif 000073
（ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。Ｒ１が水素原子（Ｈ）であり、ａが０から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がハロゲン原子であり、ａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が発色団であり、ａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が、
【化１３】
2004331750.tif 000074
でありａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）；
【化１４】
2004331750.tif 000075
（ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【化１５】
2004331750.tif 000076
（ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【化１６】
2004331750.tif 000077
（ただし、式中ｄは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【化１７】
2004331750.tif 000078
（ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５及び−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【化１８】
2004331750.tif 000079
（ただし、式中ｆは０から７の整数のいずれかを表す。）
【化１９】
2004331750.tif 000080
（ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表す。）；
【化２０】
2004331750.tif 000081
（ただし、式中ｈは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’、−ＳＯ２Ｒ’’、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）；
【化２１】
2004331750.tif 000082
（ただし、式中ｉは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’及び−ＳＯ２Ｒ’’からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）；及び
【化２２】
2004331750.tif 000083
（ただし、式中ｊは１から９の整数のいずれかを表す。）
【請求項２３】
前記ポリヒドロキシアルカノエートを該ポリヒドロキシアルカノエートの生産能を有する微生物を使って生産する、請求項１６から２１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２４】
前記ポリヒドロキシアルカノエートを該ポリヒドロキシアルカノエートの生産能に関与する遺伝子を導入した形質転換体により生産する、請求項２３に記載の製造方法。
【請求項２５】
前記遺伝子は該ポリヒドロキシアルカノエートの生産能を有する微生物から得られた遺伝子である請求項２４に記載の製造方法。
【請求項２６】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの生産能を有する微生物が、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、ラルストーニャ属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．）及びアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）に属する微生物からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である、請求項２３に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、ラルストーニャ属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．）及びアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）に属する微生物が、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｐ９１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７３）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  Ｈ４５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  ＹＮ２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７５）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｊｅｓｓｅｎｉｉ  Ｐ１６１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７６）、バークホルデリア・セパシア・ＫＫ０１株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  ＫＫ０１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２３５）、バークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＯＫ３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３７０）、バークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＯＫ４、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３７１）、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ６４株（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＴＢ６４、ＦＥＲＭＢＰ−６９３３）、アルカリゲネス属・ＴＬ２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．  ＴＬ２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４２）からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である、請求項２６に記載の製造方法。
【請求項２８】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの生産能を有する形質転換体の宿主微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項２４に記載の製造方法。
【請求項２９】
ポリヒドロアルカノエートを含む外相部と、前記外相部に内包される内相部とを有し、磁性体が前記外相部及び前記内相部の少なくともどちらか一方に含有されている構造体の製造方法であって、
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを含む水相を用意する工程と、
有機溶媒を含む油相を用意する工程と、
前記水相、前記油相および磁性体を含むエマルションを調製する工程と、
前記エマルション中でポリヒドロキシアルカノエート合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成する工程と、
前記エマルションから有機溶媒および／または水を除去する工程と
を有し、
前記油相及または水相に由来するＰＨＡを含む外相部に内相部が内包され、これらの外相部及び内相部の少なくとも一方に磁性体が含有された構造体を得る
ことを特徴とする構造体の製造方法。
【請求項３０】
前記水相を、前記油相に分散させてＷ／Ｏ型エマルションを調製する工程と、
前記Ｗ／Ｏ型エマルションから有機溶媒および／または水を除去する工程とを有する請求項２９に記載の構造体の製造方法。
【請求項３１】
第一の水相を、前記油相に分散させてＷ／Ｏ型エマルションを調製する工程と、前記Ｗ／Ｏ型エマルションをさらに第二の水相に分散することでＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、前記Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションから有機溶媒および／または水を除去する工程とを有する請求項２９に記載の構造体の製造方法。
【請求項３２】
前記第一の水相がポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを含む請求項３１に記載の構造体の製造方法。
【請求項３３】
前記第二の水相がポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを含む請求項３１に記載の構造体の製造方法。
【請求項３４】
前記第一及び第二の水相がポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを含む請求項３１に記載の構造体の製造方法。
【請求項３５】
前記油相を、前記水相に分散させてＯ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、
前記Ｏ／Ｗ型エマルションから有機溶媒および／または水を除去する工程とを有する請求項２９に記載の構造体の製造方法。
【請求項３６】
第一の油相を、前記水相に分散させてＯ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、前記Ｏ／Ｗ型エマルションをさらに第二の油相に分散することでＯ／Ｗ／Ｏ型エマルションを調製する工程と、前記Ｏ／Ｗ／Ｏ型エマルションから有機溶媒および／または水を除去する工程とを有する請求項２９に記載の構造体の製造方法。
【請求項３７】
前記有機溶媒及び／または水の除去が、少なくとも液中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法の１つの方法により行われる請求項２９から３６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項３８】
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、式［１］から式［１０］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートであり、前記ユニットのそれぞれに対して対応する３−ヒドロキシアシル補酵素Ａが順に式［１１］から式［２０］に示す３−ヒドロキシアシル補酵素Ａである、請求項２９から３７のいずれかに記載の製造方法。
【化２３】
2004331750.tif 000084
（ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つ以上である。
Ｒ１が水素原子（Ｈ）であり、ａが０から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がハロゲン原子であり、ａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が発色団であり、ａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がカルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が、
【化２４】
2004331750.tif 000085
であり、ａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）；
【化２５】
2004331750.tif 000086
（ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【化２６】
2004331750.tif 000087
（ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【化２７】
2004331750.tif 000088
（ただし、式中ｄは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【化２８】
2004331750.tif 000089
（ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５及び−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【化２９】
2004331750.tif 000090
（ただし、式中ｆは０から７の整数のいずれかを表す。）；
【化３０】
2004331750.tif 000091
（ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表す。）；
【化３１】
2004331750.tif 000092
（ただし、式中ｈは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’、−ＳＯ２Ｒ’’、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）；
【化３２】
2004331750.tif 000093
（ただし、式中ｉは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’及び−ＳＯ２Ｒ’’からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）；
【化３３】
2004331750.tif 000094
（ただし、式中ｊは１から９の整数のいずれかを表す。）；
【化３４】
2004331750.tif 000095
（ただし、前記式中−ＳＣｏＡはアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、式中Ｒ１およびａは前記式［１］と同様に定義される。）；
【化３５】
2004331750.tif 000096
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｂ及びＲ２は前記式［２］と同様に定義される。）；
【化３６】
2004331750.tif 000097
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｃ及びＲ３は前記式［３］と同様に定義される。）；
【化３７】
2004331750.tif 000098
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｄ及びＲ４は前記式［４］と同様に定義される。）；
【化３８】
2004331750.tif 000099
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｅ及びＲ５は前記式［５］と同様に定義される。）；
【化３９】
2004331750.tif 000100
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｆは前記式［６］と同様に定義される。）；
【化４０】
2004331750.tif 000101
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｇは前記式［７］と同様に定義される。）；
【化４１】
2004331750.tif 000102
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｈ及びＲ６は前記式［８］と同様に定義される。）；
【化４２】
2004331750.tif 000103
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｉ及びＲ７は前記式［９］と同様に定義される。）；及び
【化４３】
2004331750.tif 000104
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｊは前記式［１０］と同様に定義される。）
【請求項３９】
前記３−ヒドロキシアシル補酵素Ａの組成を経時的に変化させることにより、前記ポリヒドロキシアルカノエートの３−ヒドロキシアルカン酸ユニット組成を前記構造体の内側から外側に向かう方向において変化させる請求項２９から３８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４０】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部に化学修飾を施す工程をさらに有する請求項２９から３９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４１】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を該酵素の生産能を有する微生物を使って生産する、請求項２９から４０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４２】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を該酵素の生産能に関与する遺伝子を導入した形質転換体により生産する、請求項４１に記載の製造方法。
【請求項４３】
前記遺伝子はポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物から得られた遺伝子であることを特徴とする請求項４２に記載の製造方法。
【請求項４４】
前記ポリヒドロキシアルカノエートの生産能を有する微生物が、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、ラルストーニャ属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．）及びアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）に属する微生物からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である、請求項４１に記載の製造方法。
【請求項４５】
前記シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）、ラルストーニャ属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｐ．）及びアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）に属する微生物が、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｐ９１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７３）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  Ｈ４５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７４）、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  ＹＮ２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７５）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｊｅｓｓｅｎｉｉ  Ｐ１６１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７６）、バークホルデリア・セパシア・ＫＫ０１株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  ＫＫ０１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２３５）、バークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＯＫ３、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３７０）、バークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＯＫ４、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３７１）、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ６４株（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＴＢ６４、ＦＥＲＭＢＰ−６９３３）、アルカリゲネス属・ＴＬ２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．  ＴＬ２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１４６４２）からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である、請求項４４に記載の製造方法。
【請求項４６】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する形質転換体の宿主微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項４２に記載の製造方法。
【請求項４７】
前記内相が医薬成分を含有する請求項１に記載の構造体。
【請求項４８】
請求項４７の構造体を含んでなる製剤。
【請求項４９】
前記内相が気相部を含有する請求項１に記載の構造体。
【請求項５０】
前記気相部に、パーフルオロカーボンのガスが満たされていることを特徴とする請求項４９記載の構造体。
【請求項５１】
請求項４９または５０に記載の構造体を含有してなる超音波造影剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、３−ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとして少なくとも含有するポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと略記することもある）を含む固相からなる外相部と、この外相部に内包された内相部とを有し、これらの部分の少なくとも一方に磁性体が含有されている構造体及びその製造方法、並びにその用途に関する。
【０００２】
【背景技術】
マイクロカプセルは、医薬品、農薬、食品、接着剤、液晶等の多岐にわたる分野における種々の用途への適用が検討されている。例えば、医薬品においては、今まで薬効持続時間が短かった薬物を長時間にわたり効果を発揮できるように改良し得る徐放性製剤としての応用検討がなされてきており、薬理効果の持続はもとより薬物使用量の低減、副作用の軽減、ノンコンプライアンスの改善等の効果が期待されている。さらに近年では徐放性製剤組成物として特に一定の率で薬物を放出することができ、薬物放出速度が実質的にゼロ次である放出制御製剤組成物が種々提案されている。このような放出制御製剤としては例えば、経口製剤、注射剤、皮膚貼付剤等が開発されつつある。
【０００３】
また、医学、薬学の分野のみならず、例えば、化粧品分野においても安定性に問題のある有効成分を患部に選択的に移行させ、徐放性を持たせる材料として期待されている。さらには、農業分野においては、徐放性機能を有する農薬や肥料が、また、記録材料分野においては各種カプセルインクの応用等が検討されている。
【０００４】
薬学の分野においては、ポリヒドロキシアルカノエートを用い、薬剤内封カプセルとして形成したものとして、米国特許第６１４６６５号明細書（特許文献１）に、ポリヒドロキシアルカノエートからなる多孔性グラニュールに親水性薬剤を捕捉（Ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）した微粒子、およびコア材として親油性薬剤を溶解した油滴をポリヒドロキシアルカノエートからなるシェルに封入（Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）した、薬剤組成物の製造方法が開示されている。
【０００５】
これらのなかでも経口製剤は広範囲に研究・開発が進められ、多くの製剤が上市されてきたが、こと注射剤に関しては一部インシュリンのデポ製剤等が医療の場で使用されているに過ぎない。この理由として、徐放性を持たせるための高分子化合物の開発がなされなかったことが挙げられる。経口製剤の場合に用いられる高分子化合物は必ずしも生体内で分解される必要はないが、注射剤では生体内で毒性を発現することなく分解代謝排泄されることが実用上絶対必須条件となり、更にその投与部位での局所障害を引き起こさないこと等厳しい条件が要求される。
【０００６】
このような状況下で、近年多くの高分子化合物が検討され、それらのなかでも手術の縫合に用いられているポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体等が安全かつ有用な高分子化合物として期待されている（特公平１−５７０８７号公報（特許文献２）、ＷＯ９４／１０９８２公報（特許文献３）、特開平８−１５１３２２号公報（特許文献４）、特開平８−２１７６９１号公報（特許文献５））。実際に徐放性製剤を調製する目的でこれらの高分子化合物を用いたマイクロカプセル化の技術が多く報告されている。また、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、ＰＨＢと略記することもある）についても、活性成分放出の制御された調節性ペプチドのマイクロカプセルや、ラステッドを含有するマイクロカプセルが報告されている（特開昭６１−４３１１１９号公報（特許文献６）、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、７（５）、３６７−３７１、１９９２（非特許文献１）、同８（２）、１３１−１３６、１９９３（非特許文献２））。また、３−ヒドロキシ酪酸／４−ヒドロキシ酪酸共重合体についても、生理活性物質の放出率をモノマーユニット比により制御する徐放性製剤が開示されている（特開平１１−１９９５１４号公報（特許文献７））。
【０００７】
これらの技術の多くは易水溶性薬物を包含するものであり、例えば、特開昭６０−１００５１６号（特許文献８）および特開昭６２−２０１８１６号（特許文献９）には、水中乾燥法により、高いトラップ率で、分散性の良い水溶性薬物の徐放性マイクロカプセルを製造する方法が開示されている。また、特開平１−１５８５２９号公報（特許文献１０）、特開平２−１２４８１４号公報（特許文献１１）にはポリ乳酸−グリコール酸共重合体に水溶性薬物を含有させる方法が開示され、また特開平３−３２３０２号公報（特許文献１２）には生理活性ポリペプチドを、特開平２−３３０７４１号公報（特許文献１３）にはＥＧＦを含有させた徐放性製剤が、さらには、特開平４−３２１６２２号（特許文献１４）において、乳酸／グリコール酸の組成比が８０／２０〜１００／０で重量平均分子量７、０００〜３０、０００のコポリマーないしホモポリマーを含有し、２カ月以上にわたってポリペプチドをゼロ次放出する長期徐放型マイクロカプセルが開示されている。
【０００８】
このように、従来のマイクロカプセルの製法を、大きく分けると、界面重合法、ｉｎ−ｓｉｔｕ重合法等の化学的な方法、相分離法（コアセルベーション法）、界面沈殿法、液中乾燥法、オリフィス法等の物理化学的方法、噴霧乾燥法、乾式混合法等の機械的な方法の３つに分類され、これらの中でも、水溶性薬物をマイクロカプセル化する方法としては、界面重合法、ｉｎ−ｓｉｔｕ重合法、液中乾燥法、オリフィス法、相分離法（コアセルベーション法）等を採用することが提案されている。
【０００９】
各種の生理活性ポリペプチドや低分子水溶性薬物の徐放性マイクロカプセルについては多くの報告があるが［クリティカル  リビュー  イン  セラピューティック  ドラッグ  キャリアー  システム（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、  １２巻、  １−９頁（１９９５）（非特許文献３）；  特表平２−５０３３１５号公報（特許文献１５）；  ＥＰＡ  ０５８６２３８（特許文献１６）；ジャーナル  オブ  ファーマシューティカル  サイエンス（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．）、  ７５巻、  ７５０−７５５頁（１９８６）（非特許文献４）；  特開昭５７−１１８５１２号公報（特許文献１７）］、それらの多くが、（１）製造工程において薬物の外水相への漏出が大きく薬物の封入率が低い、（２）得られるカプセルは一般的に多孔質で初期放出が大きい、また、（３）製造工程により生理活性物質が変性し、十分な生物学的利用率が得られない、と云う点から、その用途によっては満足すべき長期の徐放性を達成できない場合があるのが現状である。
【００１０】
マイクロカプセルの徐放性の改善について、特開昭６１−６３６１３号（特許文献１８）には、ポリ乳酸を基剤とするマイクロカプセルにおける投与一定時間経過後の活性成分の放出速度低下を防止する目的で、活性成分を分散させるポリ乳酸の有機溶媒溶液中に、該溶媒に溶解しかつ生体内で消化される脂溶性の添加物（中鎖脂肪酸トリグリセリド、低級脂肪酸トリグリセリド等）を均一に溶解することが記載されている。しかしながら、他の基剤への応用や活性成分の水溶液を用いるマイクロカプセルの調製についての示唆はない。特開平８−１５１３２１号公報（特許文献１９）には、無晶型水溶性生理活性物質と高分子重合物とを含み、Ｓ／Ｏ／Ｗ型乳化物から製造されるマイクロカプセルが開示されているが、薬物の水溶液を内水相として用いるマイクロカプセルの製造法や水溶性生理活性ペプチドの金属複合体を用いる方法については一切記載されていない。また、ＥＰ  ０７６５６６０号公報（特許文献２０）には、無晶型２−ピペラジノン−１−酢酸誘導体を含有するマイクロカプセルが記載されており、その製造において、Ｓ／Ｏ／Ｗ型乳化物が用いられている。しかし薬物水溶液を内水相として用いるマイクロカプセルの製造法や水溶性生理活性ペプチドの金属複合体を用いる方法についての記載はない。一般に、水溶性生理活性物質のマイクロカプセルの製造においては、薬物含量の均質性や操作性の点で、薬物を固体状で用いる例えば、Ｓ／Ｏ型よりもＷ／Ｏ型の方が優れており、工業規模での大量生産においては、Ｗ／Ｏ型で用いることが望まれている。
【００１１】
このように、徐放性製剤を用いる薬剤の放出制御においてしばしば指摘される問題点は、徐放性製剤を体内に投与後、薬剤の放出初期段階に、多量の薬剤化合物が一度に放出されてしまう現象（初期バースト現象）の存在である。徐放性製剤において初期バーストが起きると、場合によっては体内血中の薬剤化合物濃度が許容上限を越えてしまい、患者を危険にさらすことになる。薬剤化合物の種類と生体内分解性ポリマーの構造を選択すること等によってある程度の初期バーストを回避する方法が発見されているが、初期バースト現象を防止する根本的な解決方法は未だ見いだされていない。また、一方、薬剤化合物を長期にわたって徐放させるため、あるいは高価な薬剤をできるだけ経済的に有利に少量の製剤中に含有させるために、マイクロカプセル中に薬剤化合物をできるだけ高濃度に含有させたいという要求がある。
【００１２】
しかしながら、従来から知られているマイクロカプセルの調製方法では、薬剤化合物のマイクロカプセル中に取り込まれる割合（取り込み率）が低くなりがちであった。特に、水溶性薬物を薬物として利用する場合、薬物が膜外に散逸しやすく薬物の封入率が低い点が大きな課題であった。また、取り込み率が高くなる方法で調製したマイクロカプセルは、その薬剤放出において初期バースト現象が起こり易いという欠点があった。
【００１３】
また、超音波診断または検査分野においても、超音波反射体として、ポリマーの微小球であるマイクロバルーンを生体内に投与することが提案されてきている。従来から、液体中に分散された微細な気泡、すなわちマイクロバブルは、超音波診断または検査のために非常に効果的な超音波リフレクターであることが知られている。しかしながら、マイクロバブルは、短時間に、安定剤を添加した状態でもせいぜい数分間で消失してしまう。そのため、マイクロバブルの調製後直ちに生体内に投与する必要があり、実際の医療現場での使用は困難であった。また、生体内に投与後、血管を通しての透過を容易にするためには、その気泡サイズが約１〜１０μｍの範囲にあることが必要である。マイクロバブルでは、生成される気泡の多くは４０〜５０μｍ程度であり、その点でも、生体内に投与して、超音波診断に利用する上では、必ずしも好適なものではなかった。
【００１４】
これらマイクロバブルの有する課題を解消するために、上に記したようにポリマーの微小球であるマイクロバルーンを生体内に投与することが提案されてきている（例えば、特開平３−５０３６８４号公報（特許文献２１））。ただし、従来の方法によって得られるマイクロバルーンは、より高い造影効果（コントラスト効果）が得るためには、大量に投与する必要があり、特に、心筋を造影する場合、要望される高い造影効果（コントラスト効果）を十分に満足する、有効な造影剤がない点が課題であった。その要因として、微粒子内部での中空構造がなく、多くの気泡を含んだ均一な微粒子が得にくいことが挙げられる。加えて、かかるマイクロバルーンの大量投与は、場合によっては、生体に過度の負担をかけ、安全性の点からも、なお改善すべき課題を有していた。
【００１５】
また、磁性体を含有するカプセル構造体は、磁力により容易に捕集される点から、主に生化学分野において、医療診断薬担体、細菌あるいは細胞分離担体、核酸あるいは蛋白分離精製担体、ドラッグデリバリー担体、酵素反応担体、細胞培養担体等としての優れた効果が期待されている。磁性体含有カプセル構造体の合成法については、親油化処理した磁性体を重合性モノマー中に分散し、これを懸濁重合する方法（特開昭５９−２２１３０２号（特許文献２２））、同じく親油化処理した磁性体を重合性モノマー中に分散し、ホモジナイザーで水中に均質化して重合することにより、比較的小粒子径の磁性粒子を得る方法（特公平４−３０８８号（特許文献２３））、あるいは特定の官能基を有する多孔性ポリマー粒子の存在下で、鉄化合物を析出させたのち酸化することにより、多孔性ポリマー粒子内部に磁性体を導入し、大粒径かつ均一径の磁性粒子を得る方法（特公平５−１０８０８号（特許文献２４））が挙げられる。
【００１６】
しかしながら、これらの合成法により得られた磁性体含有カプセル構造体を医療診断薬担体等に用いると、磁性体の多くがカプセル構造体内部に存在する場合でも、感度が大幅に低下したり、非特異的反応を示したりして、十分な実用性能が得られない場合が多い。これは、磁性体含有カプセル構造体表面に磁性体が部分的に露出し、あるいは構造体表面と内部の磁性体の間にミクロパスが形成されるため、磁性体成分が溶出し、実用性能を損なうためであると考えられる。一般に、磁性体はポリマー粒子よりも親水性が高く、従来の合成法では、磁性体がカプセル構造体の表面あるいは表面近傍へ局在することが、実用性能を損なう大きな原因の１つであると考えられる。このように、従来の磁性体含有カプセル構造体においては、含まれる磁性体成分の表面への露出、ミクロパスの形成等による磁性体成分の溶出を抑えることが困難であり、その溶出が問題とならない分野に限定して使用せざるをえないのが実状であった。
【００１７】
ところで、近年、生物工学的手法によって高分子化合物を製造する研究が活発に行われてきており、また、一部で実用化されている。例えば、微生物由来の高分子化合物として、ＰＨＢや３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸と３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸との共重合体（以下、ＰＨＢ／Ｖと略記することもある）等のＰＨＡ、バクテリアセルロースやプルラン等の多糖類、ポリ−γ−グルタミン酸やポリリジン等のポリアミノ酸等が知られている。特にＰＨＡは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品に利用することができるうえ、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【００１８】
これまで、多くの微生物がＰＨＡを生産し菌体内に蓄積することが報告されてきた。アルカリゲネス・ユウトロファス・Ｈ１６  株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｕｓ  Ｈ１６、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１７６９９）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）の微生物によるＰＨＢ／Ｖの生産が報告されている（特開平５−７４４９２  号公報（特許文献２５）、特公平６−１５６０４  号公報（特許文献２６）、特公平７−１４３５２号公報（特許文献２７）、特公平８−１９２２７  号公報（特許文献２８））。
【００１９】
また、コマモナス・アシドボランス・ＩＦＯ  １３８５２  株（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＩＦＯ  １３８５２）が、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸と４−ヒドロキシ−ｎ−酪酸とをモノマーユニットに持つＰＨＡを生産することが開示されている（特開平９−１９１８９３  号公報（特許文献２９））。さらに、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）により、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸との共重合体を生産することが開示されている（特開平５−９３０４９  号公報（特許文献３０）、特開平７−２６５０６５  号公報（特許文献３１））。
【００２０】
これらＰＨＢやＰＨＢ／Ｖの生合成は、種々の炭素源から、生体内の様々な代謝経路を経て生成された（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシバレリルＣｏＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。
【００２１】
この重合反応を触媒する酵素がＰＨＢ合成酵素（ＰＨＢポリメラーゼ、ＰＨＢシンターゼともいう）である。なお、ＣｏＡとは補酵素Ａ（ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ）の略称であり、その化学構造は下記式の通りである。
【００２２】
【化４４】
2004331750.tif 000002
また、近年、炭素数が３から１２程度までの中鎖長（ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ）の３−ヒドロキシアルカン酸ユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート（以下、ｍｃｌ−ＰＨＡと略す場合がある）についての研究が精力的に行われている。特許第  ２６４２９３７  号明細書（特許文献３２）では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ  ２９３４７  株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ  ＡＴＣＣ  ２９３４７）に非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から  １２  までの３−ヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。また、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５８、７４６（１９９２）（非特許文献５）には、シュードモナス・レジノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）が、オクタン酸を単一炭素源として、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸をモノマーユニットとするＰＨＡを生産し、また、ヘキサン酸を単一炭素源として、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸をユニットとするＰＨＡを生産することが報告されている。ここで、原料の脂肪酸よりも鎖長の長い３−ヒドロキシアルカン酸モノマーユニットの導入は、後述の脂肪酸合成経路を経由していると考えられる。
【００２３】
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、１６（３）、１１９（１９９４）（非特許文献６）には、シュードモナスｓｐ．６１−３株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ６１−３）が、グルコン酸ナトリウムを単一炭素源として、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸といった３−ヒドロキシアルカン酸、および、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−デセン酸、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸といった３−ヒドロキシアルケン酸をユニットとするＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２４】
上記のＰＨＡは側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ（以下、ｕｓｕａｌ−ＰＨＡと略す場合がある）である。しかし、より広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基（例えば、フェニル基、不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素、エポキシド等等）を側鎖に導入したＰＨＡ（以下、ｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡと略す場合がある）が極めて有用である。
【００２５】
フェニル基を有するｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの生合成の例としては、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２４、５２５６−５２６０（１９９１）  （非特許文献７）、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９１、１９５７−１９６５（１９９０）  （非特許文献８）、Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ、３、４９２−４９４（１９９１）  （非特許文献９）で、シュードモナス・オレオボランスが、５−フェニル吉草酸から、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。また、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２９、１７６２−１７６６（１９９６）  （非特許文献１０）で、シュードモナス・オレオボランスが、５−（４−トリル）吉草酸（５−（４−メチルフェニル）吉草酸）から、３−ヒドロキシ−５−（４−トリル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。さらに、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３２、２８８９−２８９５（１９９９）  （非特許文献１１）には、シュードモナス・オレオボランスが、５−（２、４−ジニトロフェニル）吉草酸から、３−ヒドロキシ−５−（２、４−ジニトロフェニル）吉草酸ユニットおよび３−ヒドロキシ−５−（４−ニトロフェニル）吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。
【００２６】
また、フェノキシ基を有するｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡのとしては、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、１９５、１６６５−１６７２（１９９４）  （非特許文献１２）で、シュードモナス・オレオボランスが、１１−フェノキシウンデカン酸から３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットおよび３−ヒドロキシ−９−フェノキシノナン酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。また、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２９、３４３２−３４３５（１９９６）  （非特許文献１３）には、シュードモナス・オレオボランスが、６−フェノキシヘキサン酸から３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸ユニットおよび３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡを、８−フェノキシオクタン酸から３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸ユニット、３−ヒドロキシ−６−フェノキシヘキサン酸ユニットおよび３−ヒドロキシ−８−フェノキシオクタン酸ユニットを含むＰＨＡを、１１−フェノキシウンデカン酸から３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットおよび３−ヒドロキシ−７−フェノキシヘプタン酸ユニットを含むＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２７】
さらに、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４１、３２−４３（１９９５）（非特許文献１４）では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ  ２９３４７  株及びシュードモナス・プチダ・ＫＴ  ２４４２  株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ  ２４４２）が、ｐ−シアノフェノキシヘキサン酸または  ｐ−ニトロフェノキシヘキサン酸から、３−ヒドロキシ−ｐ−シアノフェノキシヘキサン酸ユニットまたは３−ヒドロキシ−ｐ−ニトロフェノキシヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告している。特許第  ２９８９１７５  号公報（特許文献３３）には、３−ヒドロキシ−５−（モノフルオロフェノキシ）吉草酸ユニットあるいは３−ヒドロキシ−５−（ジフルオロフェノキシ）吉草酸ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３−ヒドロキシ−５−（モノフルオロフェノキシ）ペンタノエートユニットあるいは３−ヒドロキシ−５−（ジフルオロフェノキシ）ペンタノエートユニットを含有するコポリマーとその製造方法が記載されている。
【００２８】
また、シクロヘキシル基を有するｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡとしては、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３０、１６１１−１６１５（１９９７）（非特許文献１５）に、シュードモナス・オレオボランスが、シクロヘキシル酪酸またはシクロヘキシル吉草酸から該ＰＨＡを生産するとの報告がある。
【００２９】
また、置換基を側鎖に導入したＰＨＡのうち、スルフィド型（−Ｓ−）の硫黄原子を側鎖に有するＰＨＡの開発としては、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．、３２、８３１５−８３１８（１９９９）（非特許文献１６）には、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）２７Ｎ０１株を用いて、オクタン酸と１１−（フェニルスルファニル）ウンデカン酸を基質として、３−ヒドロキシ−５−（フェニルスルファニル）吉草酸と３−ヒドロキシ−７−（フェニルスルファニル）へプタン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡを生産することが報告されている。ただし、その際、シュードモナス・プチダ２７Ｎ０１株は、予め、増殖基質としてオクタン酸のみを含む培地で前培養し、その培養液を基質として１１−（フェニルスルファニル）ウンデカン酸のみを含む培地にイノキュレートする方法が用いられている。
【００３０】
更に、ＰｏｌｙｍｅｒＰｒｅｐｒｉｎｔｓ、ＪａｐａｎＶｏｌ４９、Ｎｏ．５、１０３４（２０００）（非特許文献１７）では、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）２７Ｎ０１株を用いて、１１−［（フェニルメチル）スルファニル］ウンデカン酸を基質として３−ヒドロキシ−５−ベンジルチオ吉草酸及び３−ヒドロキシ−７−［（フェニルメチル）スルファニル］へプタン酸の２つのモノマーユニットからなるＰＨＡを生産することが報告されている。但し、この場合、シュードモナス・プチダ２７Ｎ０１株は、増殖基質としてオクタン酸のみを含む培地で前培養し、その培養液を基質として１１−［（フェニルメチル）スルファニル］ウンデカン酸のみを含む培地にイノキュレートする方法が用いられている。
【００３１】
これらｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの生合成は、原料となる各種アルカン酸から、生体内の様々な代謝経路（例えば、β酸化系や脂肪酸合成経路）を経て生成された（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がＰＨＡ合成酵素（ＰＨＡポリメラーゼ、ＰＨＡシンターゼともいう）である。ここで、前述のＰＨＢ合成酵素はＰＨＡ合成酵素において基質となるモノマーが限定されているものであり、ＰＨＢ合成酵素は、ＰＨＡ合成酵素の範疇に含まれるものである。
【００３２】
以下に、β酸化系およびＰＨＡ合成酵素による重合反応を経て、アルカン酸がＰＨＡとなるまでの反応を示す。
【００３３】
【化４５】
2004331750.tif 000003
一方、脂肪酸合成経路を経る場合は、該経路中に生じた（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＡＣＰ（ＡＣＰとはアシルキャリアプロテインのことである）から変換された（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡを基質として、同様にＰＨＡ合成酵素によりＰＨＡが合成されると考えられる。
【００３４】
また、近年、上記のＰＨＢ合成酵素やＰＨＡ合成酵素を菌体外に取り出して、無細胞系（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でＰＨＡを合成しようとする試みが始まっている。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、６２７９−６２８３（１９９５）（非特許文献１８）では、アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）由来のＰＨＢ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。また、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、２５、５５−６０（１９９９）（非特許文献１９）では、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素に、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡや３−ヒドロキシバレリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットや３−ヒドロキシ−ｎ−吉草酸ユニットからなるＰＨＡの合成に成功している。さらにこの報告では、ラセミ体の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させたところ、酵素の立体選択性によって、Ｒ体の３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットのみからなるＰＨＢが合成されたとしている。Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２１、７７−８４（２０００）（非特許文献２０）においても、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素を用いた細胞外でのＰＨＢ合成が報告されている。
【００３５】
また、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１６８、３１９−３２４（１９９８）（非特許文献２１）では、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）由来のＰＨＢ合成酵素に３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシ−ｎ−酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。
【００３６】
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５４、３７−４３（２０００）（非特許文献２２）では、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＰＨＡ合成酵素に３−ヒドロキシデカノイルＣｏＡを作用させることにより、３−ヒドロキシデカン酸ユニットからなるＰＨＡを合成している。
【００３７】
【特許文献１】
米国特許第６１４６６５号明細書
【特許文献２】
特公平１−５７０８７号公報
【特許文献３】
ＷＯ９４／１０９８２公報
【特許文献４】
特開平８−１５１３２２号公報
【特許文献５】
特開平８−２１７６９１号公報
【特許文献６】
特開昭６１−４３１１１９号公報
【特許文献７】
特開平１１−１９９５１４号公報
【特許文献８】
特開昭６０−１００５１６号公報
【特許文献９】
特開昭６２−２０１８１６号公報
【特許文献１０】
特開平１−１５８５２９号公報
【特許文献１１】
特開平２−１２４８１４号公報
【特許文献１２】
特開平３−３２３０２号公報
【特許文献１３】
特開平２−３３０７４１号公報
【特許文献１４】
特開平４−３２１６２２号公報
【特許文献１５】
特表平２−５０３３１５号公報
【特許文献１６】
ＥＰＡ  ０５８６２３８
【特許文献１７】
特開昭５７−１１８５１２号公報
【特許文献１８】
特開昭６１−６３６１３号公報
【特許文献１９】
特開平８−１５１３２１号公報
【特許文献２０】
ＥＰ  ０７６５６６０号公報
【特許文献２１】
特開平３−５０３６８４号公報
【特許文献２２】
特開昭５９−２２１３０２号公報
【特許文献２３】
特公平４−３０８８号公報
【特許文献２４】
特公平５−１０８０８号公報
【特許文献２５】
特開平５−７４４９２  号公報
【特許文献２６】
特公平６−１５６０４  号公報
【特許文献２７】
特公平７−１４３５２号公報
【特許文献２８】
特公平８−１９２２７  号公報
【特許文献２９】
特開平９−１９１８９３  号公報
【特許文献３０】
特開平５−９３０４９  号公報
【特許文献３１】
特開平７−２６５０６５  号公報
【特許文献３２】
特許第  ２６４２９３７  号明細書
【特許文献３３】
特許第  ２９８９１７５  号公報
【非特許文献１】
Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、７（５）、３６７−３７１、１９９２
【非特許文献２】
Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、８（２）、１３１−１３６、１９９３
【非特許文献３】
クリティカル  リビュー  イン  セラピューティック  ドラッグ  キャリアー  システム（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、  １２巻、  １−９頁（１９９５）
【非特許文献４】
；ジャーナル  オブ  ファーマシューティカル  サイエンス（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．）、  ７５巻、  ７５０−７５５頁（１９８６）
【非特許文献５】
Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５８、７４６（１９９２）
【非特許文献６】
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、１６（３）、１１９（１９９４）
【非特許文献７】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２４、５２５６−５２６０（１９９１）
【非特許文献８】
Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９１、１９５７−１９６５（１９９０）
【非特許文献９】
Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ、３、４９２−４９４（１９９１）
【非特許文献１０】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２９、１７６２−１７６６（１９９６）
【非特許文献１１】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３２、２８８９−２８９５（１９９９）
【非特許文献１２】
Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、１９５、１６６５−１６７２（１９９４）
【非特許文献１３】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２９、３４３２−３４３５（１９９６）
【非特許文献１４】
Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４１、３２−４３（１９９５）
【非特許文献１５】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３０、１６１１−１６１５（１９９７）
【非特許文献１６】
Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．、３２、８３１５−８３１８（１９９９）
【非特許文献１７】
ＰｏｌｙｍｅｒＰｒｅｐｒｉｎｔｓ、ＪａｐａｎＶｏｌ４９、Ｎｏ．５、１０３４（２０００）
【非特許文献１８】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、６２７９−６２８３（１９９５）
【非特許文献１９】
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、２５、５５−６０（１９９９）
【非特許文献２１】
Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２１、７７−８４（２０００）
【非特許文献２２】
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５４、３７−４３（２０００）
【００３８】
【発明が解決しようとする課題】
発明者らは高分子化合物に大きな付加価値を与えるための要素技術として、高分子化合物で薬物を被覆したマイクロカプセルに着目してきた。このように高分子化合物で特定の薬物を被覆することによって、極めて有用な機能性、特には徐放性を有するマイクロカプセルを得ることができる。前記の如きマイクロカプセルを作出する試みは従来、有機合成的手法によって多くなされてきた。
【００３９】
仮に、かかるマイクロカプセルを前述のような生物工学的手法により製造することができれば、新たな高分子化合物の利用や、新たな機能・構造の付与が可能になると期待できるうえ、より環境低負荷かつ資源循環型の製造プロセスを低コストで実現できるものと考えられる。例えば、生物の触媒作用に特有の極めて厳密な分子認識能や立体選択性を利用して、新たな機能性高分子化合物や、極めてキラリティーの高い高分子化合物により被覆されたマイクロカプセルを、極めて簡便かつ環境低負荷なプロセスで製造することが可能になる。
【００４０】
また、生分解性高分子であるポリ乳酸あるいは乳酸−グリコール酸共重合体マイクロカプセル等に水溶性薬物を含有せしめることには薬物放出特性の点で多くの課題が残されているのが現状である。また、水溶性薬物については薬物が散逸しやすく、従って、薬物が有効にマイクロカプセル等の構造体内に保持されなかったり、マイクロカプセル化されない点も大きな課題である。
【００４１】
よって本発明は、前記課題を解決するために創案されたものであり、薬物、特には水溶性薬物を含有させたマイクロカプセル等の構造体、あるいは実質的に水に溶解しない薬物（この中には、一般的に難水溶性薬物と言われる薬物を包含する）を含有させたマイクロカプセル等の構造体であっても、実質上支障となるような初期放出を示さず、更に一定期間実用上許容されるゼロ次放出を示し、かつ磁性特定を有し、徐放性製剤として有用な構造体およびその製造方法を提供することにある。また、薬物、特には水溶性薬物を安定性よくカプセル等の構造体中に内包した高薬物含量であり、かつ磁性特定を有する徐放性製剤およびその製造方法を提供することにある。
【００４２】
また、ＵＳＰ６１４６６５に開示されたポリヒドロキシアルカノエートからなる多孔性グラニュールに親水性薬剤を捕捉した微粒子は、毒性がなく、生分解性を有し、ｉｎ    ｓｉｔｕで薬剤を捕捉出来るものの、多孔性の構造であることから拡散により速やかに親水性薬剤が放出されてしまい、徐放性を制御することは困難であった。
【００４３】
よって本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートの構造を最適化することにより、薬剤保持能力・徐放性の最適化を図り、親水性薬剤その他水溶性物質や親油性薬剤その他疎水性物質に対しても保持性に優れ、徐放性を制御することが可能な磁性薬剤保持粒子を提供することでもある。
【００４４】
また、従来の方法によって得られるマイクロバルーンでは、微粒子内部での中空構造がなく、多くの気泡を含んだ均一な微粒子が得にくいために、超音波診断や検査において、高い造影効果（コントラスト効果）を達成する上では、大量に投与しなければならず、特には、心筋を造影する上では、要望される高い造影効果（コントラスト効果）を十分に満足できる、有効な造影剤がない点が大きな課題であった。また、かかるマイクロバルーンの大量投与は、場合によっては、生体に過度の負担をかけ、安全性の点からも、改善すべき課題を残すものであった。
【００４５】
よって本発明は、微粒子中に多くの気泡を含ませるために、ＰＨＡの一枚膜をもつマイクロカプセル状の中空構造をもつ微粒子を選択的に多く得ることができる中空マイクロカプセル等の中空磁性構造体の製造方法を提供し、かかる中空マイクロカプセル等の中空磁性構造体を利用して、高い造影効果を発揮する超音波造影剤およびその製造方法を提供するものである。より具体的には、本発明は、心筋、心腔または肝臓の超音波診断や検査に利用可能な、造影効果の高い超音波造影剤を提供するものである。特には、磁性を活用することで、生体中での移動を制御できる医療診断薬剤保持粒子ならびに超音波診断に利用可能な造影粒子、薬剤を患者の疾患部に移動させるドラックデリバリー粒子を提供することである。
【００４６】
また、従来の合成法により得られる磁性体含有カプセル構造体は、金属イオンの外部への溶出という課題を有するために、金属イオンの溶出による影響を受けない用途・分野にしか適用することができないのが現状である。よって本発明は、磁性体の分散性および磁気応答性に優れ、金属イオンが外部に溶出されにくく、種々の用途・分野に幅広く適用することのできる、磁性体を含有するマクロカプセル等の構造体ならびにその製造方法を提供するものである。
【００４７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含有するＰＨＡを用いることにより、ＰＨＡを主体とする固相からなる外相部と、それに内包された内相部を有し、これらの部分の少なくとも一方に磁性体が含有され、例えばマイクロカプセルの形態とし得る磁性構造体を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００４８】
本発明にかかる構造体は、ポリヒドロキシアルカノエート及び磁性体を含有する構造体であって、
前記ポリヒドロアルカノエートを含む外相部と、
前記外相部に内包される内相部とを有し、
前記磁性体は、前記外相部及び前記内相部の少なくともどちらか一方に含有されていることを特徴とする構造体である。
【００４９】
この構造体では、外相部はＰＨＡを含み、内相部は固相、液相及び気相の少なくとも１つから構成される。例えば、外相部がシェル部を形成し、内相部がコア部を形成しているマイクロカプセルの形態とすることができる。また、ＰＨＡを含む外相部の内側に薬剤などを含む内相部の複数が分散しているマイクロスフェアの形態とすることもできる。磁性体は、構造に応じて、外相部と内相部の少なくとも一方に含有させることができる。
【００５０】
さらに、本発明にかかる構造体の製造方法の一態様は、ポリヒドロアルカノエートを含む外相部と、前記外相部に内包される内相部とを有し、磁性体が前記外相部及び前記内相部の少なくともどちらか一方に含有されている構造体の製造方法であって
ポリヒドロキシアルカノエートおよび有機溶媒を含む油相と、水相と、磁性体と、を含む液状原料を用意する工程と、
前記液状原料から前記有機溶媒及び／または水を除去する工程と、
を有し、
前記油相及または水相に由来するＰＨＡを含む外相部に内相部が内包され、これらの外相部及び内相部の少なくとも一方に磁性体が含有された構造体を得る
ことを特徴とする構造体の製造方法である。
【００５１】
また、本発明に係る構造体の製造方法の他の態様は、ポリヒドロアルカノエートを含む外相部と、前記外相部に内包される内相部とを有し、磁性体が前記外相部及び前記内相部の少なくともどちらか一方に含有されている構造体の製造方法であって、
ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを含む水相を用意する工程と、
有機溶媒を含む油相を用意する工程と、
前記水相、前記油相および磁性体を含むエマルションを調製する工程と、
前記エマルション中でポリヒドロキシアルカノエート合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成する工程と、
前記エマルションから有機溶媒および／または水を除去する工程と
を有し、
前記油相及または水相に由来するＰＨＡを含む外相部に内相部が内包され、これらの外相部及び内相部の少なくとも一方に磁性体が含有された構造体を得る
ことを特徴とする構造体の製造方法である。
【００５２】
上記の各態様にかかる製造方法の好ましい具体的な態様には、以下のものが含まれる。
ア）上記構成の構造体の製造方法であって、水相を、少なくともポリヒドロキシアルカノエート、有機溶媒および磁性体を含む油相に分散させてＷ／Ｏ型のエマルションを調製する工程と、該エマルションから有機溶媒を除去して、前記構造体を形成する工程と、を有することを特徴とする製造方法。
イ）前記Ｗ／Ｏ型エマルションを更に水相に分散してＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、該Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションから有機溶媒を除去して、前記構造体を形成する工程と、を有することを特徴とする構造体の製造方法。
ウ）前記水相に前記油相を分散させてＯ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、前記Ｏ／Ｗ型エマルションから有機溶媒および／または水を除去する工程とを有することを特徴とする構造体の製造方法。
エ）上記構成の構造体の製造方法であって、
１）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを少なくとも含む水相を、磁性体を含む油相に分散させてＷ／Ｏ型エマルションを調製する工程と、
２）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成する工程と、
３）該Ｗ／Ｏ型エマルションから有機溶媒を除去して前記構造体を得る工程と、
を有することを特徴とする構造体の製造方法。
オ）上記構成の構造体の製造方法であって、
１）水相を、磁性体を含む油相に分散させてＷ／Ｏ型エマルションを調製する工程と、
２）該Ｗ／Ｏ型エマルションをさらに、少なくともポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを含む水相に分散することでＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、
３）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成する工程と、
４）該Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションから有機溶媒を除去して前記構造体を得る工程と、
を有することを特徴とする構造体の製造方法。
カ）上記構成の構造体の製造方法であって、
１）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを含む水相を、磁性体を含む油相に分散させてＷ／Ｏ型エマルションを調製する工程と、
２）該Ｗ／Ｏ型エマルションをさらに、少なくともポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを含む水相に分散することでＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、
３）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成する工程と、
４）該Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションから有機溶媒を除去して前記構造体を得る工程と、
を有することを特徴とする構造体の製造方法。
キ）上記構成の構造体の製造方法であって、
１）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを含む水相を、磁性体を含む油相に分散させてＷ／Ｏ型エマルションを調製する工程と、
２）該Ｗ／Ｏ型エマルションをさらに、水相に分散することでＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、
３）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成する工程と、
４）該Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションから有機溶媒を除去して前記構造体を得る工程と、
を有することを特徴とする構造体の製造方法。
ク）上記構成の構造体の製造方法であって、
１）磁性体を含む油相を、少なくともポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを含む水相に分散させてＯ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、
２）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成する工程と、
３）該Ｏ／Ｗ型エマルションから前記構造体を得る工程と、
を有することを特徴とする構造体の製造方法。
ケ）上記構成の構造体の製造方法であって、
１）磁性体を含む油相を、少なくともポリヒドロキシアルカノエート合成酵素および３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを含む水相に分散させてＯ／Ｗ型エマルションを調製する工程と、
２）該Ｏ／Ｗ型エマルションをさらに、油相に分散することでＯ／Ｗ／Ｏ型エマルションを調製する工程と、
３）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成する工程と、
４）該Ｏ／Ｗ／Ｏ型エマルションから有機溶媒を除去して前記構造体を得る工程と、
を有することを特徴とする構造体の製造方法。
【００５３】
上記製造方法における磁性体の分散相については、磁性体の表面性質（親水性であるか、親油性であるか）により、有機溶媒を含む油相でなく、水相に懸濁することも可能である。
【００５４】
前記構造体に担持される物質は水溶性物質及び脂溶性物質のいずれでもよい。このような物質としては、例えば、薬剤においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏで不安定なもの、体内で徐々に放出され、あるいは特定の臓器に速やかに分布することが所望される薬物等が挙げられるが、これら以外にもバイオマーカー、あるいはプラスミドやＤＮＡ、ＲＮＡ等、生体内に投与して有効なものであれば特に制約されることはない。
【００５５】
本発明にかかる製剤は、上記の構造体を用いた製剤である。また、本発明にかかる製剤の製造方法は、上記の構造体の製造工程を含む製剤の製造方法である。この製剤は、薬物、特には実質的に水に溶解しない薬物について初期放出が少なく、長期間にわたる良好な徐放性を示す高薬物含量の徐放性製剤として好適である。また、かかる製剤は、薬物、特には水溶性薬物について初期放出が少なく、長期間にわたる良好な徐放性を示す高薬物含量の徐放性製剤として好適である。
【００５６】
さらに本発明者らは、造影効果（コントラスト効果）の高い超音波造影剤を開発する目的で鋭意研究を行った結果、本発明の内相が気相を有する中空構造体が、内相部に多くの気泡を含ませることが可能な構造を有し、超音波造影剤の有効成分としての中空構造体として好適であること、さらには、上記中空構造体を水中に分散させた後、減圧下で乾燥し、乾燥機内にパーフルオロカーボンのガスを充満させることにより、前記ガスを中空構造体の中空構造内部すなわち気泡内に充満させたときは、生体での超音波造影効果がより高い造影剤が得られることを明らかにし、本発明にかかる超音波造影剤を完成した。すなわち、本発明の超音波造影剤は前記中空構造体を含有する超音波造影剤である。また、本発明の超音波造影剤は、心筋造影用、心腔（心臓を構成する心室、心房等の空間）造影用または肝臓造影用として有用である。
【００５７】
【発明の実施の形態】
本発明の構造体としては、例えば、置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡにより、あるいはＰＨＡを主体とした固相で外相部を構成し、外相部内に内相部が内包された構造を有する。この構造体は、マイクロカプセルの形態を採り得るが、二層構造に限定されず、要は固相、液相及び気相の少なくとも１つの相が固相に内包されていればよい。内相は、固相、液相及び気相の少なくとも１つの相から構成できる。磁性体は構造体の構造に応じて、外相部とうち相の少なくとも一方に含有させることができる。また、この構造体におけるＰＨＡは固相部に内包される内相部にも含有されてもよい。本発明にかかる構造体は、高機能性マイクロカプセルとして極めて有用である。
【００５８】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００５９】
＜マイクロカプセル＞
本出願の明細書において用いる「マイクロカプセル」なる語の概念には、これらの語がドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）や高分子化学において一般的に有する概念を完全に包含するが、必ずしも等価なものではない。本出願の特許請求の範囲及び明細書において用いる「マイクロカプセル」の走査電子顕微鏡的形態の態様に関しては、例えば、ラズベリー状又は金米糖（こんぺいとう、ポルトガル語のｃｏｎｆｅｉｔｏ）状の多くの突起を有するような態様、赤血球状の偏平な態様、ラグビーボール状の回転楕円体様の態様、大腸菌状の紡錘形様の態様等をも包含する。本出願の明細書において言及する「マイクロカプセル」は、通常、例えば、ポリマーエマルション、ラテックス、ポリマーサスペンジョンを構成するマイクロスフィアとしての特性をも有する。このように、本出願の特許請求の範囲及び明細書において用いる「マイクロカプセル」なる語は、これらの語がドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）や高分子化学において一般的に有する概念と、必ずしも等価なものではないのではあるが、本発明に係るヘテロポリマー系の本質的「態様」について言及するに当たり便宜的に用いるものとする。
【００６０】
例えば、本発明のマイクロカプセルにおける、固相、液相及び気相の少なくとも１つの相およびＰＨＡの相互関係の態様としては、例えば、
１）微小球中の固相を形成するＰＨＡ内に、固相、液相及び気相の少なくとも１つの相が分散・混合された混合相１相からなるモノリシック型、
２）ＰＨＡの薄い膜（被覆層）の内部に、固相、液相及び気相の少なくとも１つの相を含有・保護した形で、外膜とその内部といった２相からなるリザーバー型等を包含する。
【００６１】
本発明においてはマイクロカプセル内に、多量の固相、液相及び気相の少なくとも１つの相および磁性体を内在させるという観点からは、２）の形態がより好ましい。例えば液相を内包する場合、液相としては油相及び水相があり、同一カプセル内に水相と油相が混在した構成を採ることもできる。ここで、「油相」及び「水相」とはエマルションを形成する場合の「油相としての性質を有するもの」、及び「水相としての性質を有するもの」にそれぞれ相当し、本発明において、特には薬剤等の保持において、好適に用い得る油相成分について、特に代表的なものを非限定的に例示しておくと、例えば植物油（例えば大豆油、ゴマ油、綿実油、オリーブ油、サフラワー油、コーン油、菜種油、落花生油等）、中鎖脂肪酸トリグリセリド類［例えば日本油脂株式会社製のパナセート８００，８１０，１０００，１２００等の様な炭素数６〜１２の脂肪酸（例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸等）のトリグリセリド類］、液状炭化水素（例えば流動パラフィン、スクワレン、スクワラン等）等の水とエマルションを形成できる油相成分が利用できる。なお、ＰＨＡを油相に溶解させてマイクロカプセル化を行いマイクロカプセル中に油相を内包させる場合の油相としては、後述するＰＨＡを溶解する油相を用いることができる。水相の形成には水を主体とする水性の溶媒が利用できる。これらの相に所望とする物質を溶解させて所望の機能を有するマイクロカプセルとする。
【００６２】
本発明にかかるマイクロカプセルとしては、直径が１〜１０μｍの範囲の微小球状マイクロカプセルが挙げられる。
【００６３】
また薬物等を固形物として保持する場合、モノリシック型粒状体（マイクロスフェア）についても好適に利用可能である。例えば、本発明の徐放性製剤組成物に含有させる構造体における薬物（Ａ）およびＰＨＡ（Ｂ）の相互関係の態様としては、例えば、以下の１）〜４）が挙げられる。
１）薬物（Ａ）が単一のコア部に含まれ、ＰＨＡ（Ｂ）がシェルに含まれる、コア／シェル構造を有するマイクロカプセルとしての態様。
２）薬物（Ａ）が複数のコアに含まれ、ＰＨＡ（Ｂ）がシェルに含まれる、コア／シェル構造を有するマイクロカプセルとしての態様。
３）薬物（Ａ）が複数の島状部分にふくまれ、島状部分を内包するＰＨＡ（Ｂ）が海状部分に含まれる、コア／シェル構造を有するマイクロカプセルとしての態様。
４）薬物（Ａ）およびＰＨＡ（Ｂ）が相溶化したミクロ相分離構造を有する態様。
【００６４】
なお、これらの態様におけるコア部は薬物の単独で、あるいはその他の成分との組合せから形成されるものであってもよく、またシェル部はＰＨＡ単独で、あるいはその他の成分との組合せから形成されるのもであってもよい。
【００６５】
磁性体の含有形態についても、上と同様な態様が挙げられる。
【００６６】
本発明にかかる構造体としては、例えば、少なくとも薬効を有する薬物、ＰＨＡおよび磁性体を含有する組成物により、構成される、直径が１０ｎｍ（ナノメートル）〜１００μｍの範囲の微小球状製剤が挙げられる。自己乳化性の観点からは、通常、サブミクロンの大きさ（平均粒径１μｍ以下）が好ましく採用される。
【００６７】
さらに本発明における中空構造体は、微粒子の外形となる、少なくともＰＨＡからなる部分と、その内部に、少なくとも中空である部分を有し、内部において、ＰＨＡからなる隔壁部分と中空部分、あるいは磁性体とが混在する場合も含むものである。この場合、磁性体は固相及び中空部分の少なくも一方に含有させることができる。
【００６８】
ＰＨＡを含む固相部分とこれに内包される気相部分との関係について述べると、その一態様として、例えば、
１）ＰＨＡで形成される微小球であり、その内部に中空部分が分散した基本的に１相であるモノリシック型の中空微粒子（マイクロスフェアとも呼ばれる）、
２）ＰＨＡを含む薄い外膜（外被またはシェル）の内部に中空部分（コア）を内包し、保護した形で、外膜とその内部といった明確な２相からなるリザーバー型等の中空マイクロカプセルを挙げることができる。
【００６９】
本発明にかかる「中空構造体」の態様としては、例えば、少なくともＰＨＡを含有する組成物により、その外被が構成され、前記した態様にて磁性体が保持される、直径が１〜１０μｍの範囲の微小球状中空微粒子が挙げられる。
【００７０】
さらに、本発明の中空構造体における、中空部とＰＨＡを含んでなる外被の形態、より具体的には、気泡（Ａ）およびＰＨＡ（Ｂ）の相互関係の態様としては、例えば、以下の１）〜４）が挙げられる。
１）気泡（Ａ）が単一のコア部に含まれ、ＰＨＡ（Ｂ）がシェルに含まれる、コア／シェル構造を有するマイクロカプセルとしての態様。
２）気泡（Ａ）が複数のコアに含まれ、ＰＨＡ（Ｂ）がシェルに含まれる、コア／シェル構造を有するマイクロカプセルとしての態様。
３）気泡（Ａ）が複数の島状部分にふくまれ、島状部分を内包するＰＨＡ（Ｂ）が海状部分に含まれる、コア／シェル構造を有するマイクロカプセルとしての態様。
４）気泡（Ａ）およびＰＨＡ（Ｂ）が相溶化したミクロ相分離構造を有する態様。
【００７１】
磁性体の含有形態についても、上と同様な態様が挙げられる。
【００７２】
なお、これらの態様におけるコア部は気泡の単独で、あるいはその他の成分との組合せから形成されるものであってもよく、またシェル部はＰＨＡ単独で、あるいはその他の成分との組合せから形成されるのもであってもよい。
【００７３】
さらに、本発明の構造体では、前記ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成は、前記構造体の外被の内側から外側へと向かう方向において変化していることを特徴とする構造体とすることもできる。
【００７４】
また、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部は、化学修飾が施されてなるポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする構造体としてもよい。例えば、前記の化学修飾が施されてなるポリヒドロキシアルカノエートは、少なくとも、その化学修飾としてグラフト鎖を有するポリヒドロキシアルカノエートを含むことができる。その際、前記グラフト鎖は、少なくともエポキシ基を有するモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートに対して、そのエポキシ基に対する化学修飾により導入されたグラフト鎖であることができる。また、前記グラフト鎖は、アミノ基を有する化合物からなるグラフト鎖であることができる。例えば、前記アミノ基を有する化合物は、末端アミノ変性化合物であることが好ましい。一例として、前記末端アミノ変性化合物は、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、末端アミノ変性ポリシロキサンからなる群より選択される少なくとも一つのポリマーであることができる。
【００７５】
その他、上記の化学修飾が施されてなるポリヒドロキシアルカノエートとして、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部は、架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートとすることもできる。例えば、前記架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートは、少なくともエポキシ基を有するモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートに対して、そのエポキシ基に対して架橋化がなされてなるポリヒドロキシアルカノエートであるであることができる。その際、一例として、前記架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートは、ジアミン化合物、無水コハク酸、２−エチル−４−メチルイミダゾール、電子線照射処理からなる群より選択される少なくとも一つの手段により、架橋化がなされているポリヒドロキシアルカノエートであってもよい。前記ジアミン化合物が、ヘキサエチレンジアミンであることが好ましい。
【００７６】
上記のマイクロカプセルは、一般的には、Ｗ／Ｏ／Ｗ（Ｗａｔｅｒ  ｉｎ  Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型エマルション法、Ｏ／Ｗ（Ｏｉｌ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）型エマルション法等によって調製することができる。
【００７７】
より具体的には、ＰＨＡと磁性体とを含むマイクロカプセルの製造方法の第１の態様は、
１）ＰＨＡならびに磁性体をクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、そこへ水溶液を添加して乳化させ、Ｗ／Ｏ型エマルションを得、
２）必要に応じて、該エマルションを多量の水中へ投入して乳化させてＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを得た後、
３）減圧条件下での蒸発等により、有機溶剤を除去することにより、微小球状の沈澱物を生成させ、必要に応じて回収及び乾燥を行い、マイクロカプセルを調製する方法である。
【００７８】
また、ＰＨＡと磁性体とを含むマイクロカプセルの製造方法の第２の態様は、１）ＰＨＡならびに磁性体をクロロホルム等の有機溶剤中に溶解させ、
２）該有機相を多量の水中に投入して乳化させ、Ｏ／Ｗ型エマルションを得、
３）減圧条件下での蒸発等により、ＰＨＡの溶解度を超える範囲まで有機溶剤を除去することにより、微小球状の沈澱物を生成させ、必要に応じて回収及び乾燥を行い、マイクロカプセルを調製する方法である。
【００７９】
また、ＰＨＡと磁性体とを含むマイクロカプセルの製造方法の第３の態様は、１）磁性体を含む有機溶媒へ、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む水溶液を添加して乳化させ、Ｗ／Ｏ型エマルションを得、
２）ＰＨＡ合成反応を行うことにより、微小球状の沈澱物を生成させ、必要に応じて回収及び乾燥を行い、マイクロカプセルを調製する方法である。
【００８０】
また、ＰＨＡと磁性体とを含むマイクロカプセルの製造方法の第４の態様は
１）磁性体を含む有機溶媒へ、水溶液を添加して乳化させ、Ｗ／Ｏ型エマルションを得、
２）該エマルションを、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む多量の水中へ投入して乳化させてＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを得た後、
３）ＰＨＡ合成反応を行うことにより、微小球状の沈澱物を生成させ、必要に応じて回収及び乾燥を行い、マイクロカプセルを調製する方法である。
【００８１】
さらに、ＰＨＡと磁性体とを含むマイクロカプセルの製造方法の第５の態様は、
１）磁性体を含む有機溶媒へ、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む水溶液を添加して乳化させ、Ｗ／Ｏ型エマルションを得、
２）該エマルションを、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む多量の水中へ投入して乳化させてＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを得た後、
３）ＰＨＡ合成反応を行うことにより、微小球状の沈澱物を生成させ、必要に応じて回収及び乾燥を行い、マイクロカプセルを調製する方法である。
【００８２】
さらに、ＰＨＡと磁性体とを含むマイクロカプセルの製造方法の第６の態様は、
１）磁性体を含む有機溶媒へ、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む水溶液を添加して乳化させ、Ｗ／Ｏ型エマルションを得、
２）該エマルションを、多量の水中へ投入して乳化させてＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを得た後、
３）ＰＨＡ合成反応を行うことにより、微小球状の沈澱物を生成させ、必要に応じて回収及び乾燥を行い、マイクロカプセルを調製する方法である。
【００８３】
また、ＰＨＡと磁性体とを含むマイクロカプセルの製造方法の第７の態様は、１）磁性体を含む有機溶媒を、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む多量の水中に投入して乳化させてＯ／Ｗ型エマルションを得、
２）ＰＨＡ合成反応を行うことにより、微小球状の沈澱物を生成させ、必要に応じて回収及び乾燥を行い、マイクロカプセルを調製する方法である。
【００８４】
さらに、ＰＨＡと磁性体とを含むマイクロカプセルの製造方法の第８の態様は、
１）磁性体を含む有機溶媒を、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む多量の水中に投入して乳化させてＯ／Ｗ型エマルションを得、
２）該エマルションを、多量の油中へ投入して乳化させてＯ／Ｗ／Ｏ型エマルションを得た後、
３）ＰＨＡ合成反応を行うことにより、微小球状の沈澱物を生成させ、必要に応じて回収及び乾燥を行い、マイクロカプセルを調製する方法である。
【００８５】
磁性体の分散相については、その表面性質（親水性であるか、親油性であるか）により、有機溶媒を含む油相でなく、水相に懸濁することも可能である。
【００８６】
＜ＰＨＡの例示とその製造方法について＞
本発明に利用可能なＰＨＡとしては、下記式［１］から［１０］で表されるモノマーユニットを少なくとも含むＰＨＡを例示することができる。
【００８７】
【化４６】
2004331750.tif 000004
（ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。Ｒ１が水素原子（Ｈ）であり、ａが０から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１がハロゲン原子であり、ａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が発色団でありａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、Ｒ１が、カルボキシル基あるいはその塩であり、ａが１から  １０  の整数のいずれかであるモノマーユニット、
Ｒ１が、
【００８８】
【化４７】
2004331750.tif 000005
であり、ａが１から７の整数のいずれかであるモノマーユニット。）
【００８９】
【化４８】
2004331750.tif 000006
（ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【００９０】
【化４９】
2004331750.tif 000007
（ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【００９１】
【化５０】
2004331750.tif 000008
（ただし、式中ｄは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ４は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５及び−Ｃ３Ｆ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
【００９２】
【化５１】
2004331750.tif 000009
（ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ５は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５及び−Ｃ３Ｈ７からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）；
【００９３】
【化５２】
2004331750.tif 000010
（ただし、式中ｆは０から７の整数のいずれかを表す。）；
【００９４】
【化５３】
2004331750.tif 000011
（ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表す。）；
【００９５】
【化５４】
2004331750.tif 000012
（ただし、式中ｈは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ６は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、  −ＣＯＯＲ’、−ＳＯ２Ｒ’’、−ＣＨ３、−Ｃ２Ｈ５、−Ｃ３Ｈ７、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）３からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）；
【００９６】
【化５５】
2004331750.tif 000013
（ただし、式中ｉは１から７の整数のいずれかを表し、Ｒ７は水素原子（Ｈ）、ハロゲン原子、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯＯＲ’及び−ＳＯ２Ｒ’’からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、ここでＲ’は水素原子（Ｈ）、Ｎａ、Ｋ、−ＣＨ３及び−Ｃ２Ｈ５のいずれかであり、Ｒ’’は−ＯＨ、−ＯＮａ、−ＯＫ、ハロゲン原子、−ＯＣＨ３及び−ＯＣ２Ｈ５のいずれかである。）；及び
【００９７】
【化５６】
2004331750.tif 000014
（ただし、式中ｊは１から９の整数のいずれかを表す。）
本発明において使用するＰＨＡは、３−ヒドロキシアルカノエートをモノマー単位とするポリエステル樹脂である。ここで、このような化合物を微生物を利用して生産した場合、該ポリエステル樹脂はＲ体のみからなるアイソタクチックなポリマーであるが、物性／機能の両面において本発明の目的を達成しうるならば、特にアイソタクチックなポリマーである必要はなく、アタクチックなポリマーについても利用することが可能である。また、ラクトン化合物を有機金属系触媒（例えば、アルミニウム、亜鉛、スズ等を含む有機触媒）を用いて開環重合を行う化学合成法によりＰＨＡを得ることも可能である。
【００９８】
また、Ｗ／Ｏ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｏ／Ｗ型エマルション、あるいはＯ／Ｗ／Ｏ型エマルションの調製とともに、ＰＨＡ合成酵素による３−ヒドロキシアシルＣｏＡの重合反応を利用してＰＨＡを合成する場合、ＰＨＡの合成反応に関与するＰＨＡ合成酵素によって合成され得るＰＨＡであれば、特に限定はされない。前述の通り、ＰＨＡ合成酵素は、生物体内でのＰＨＡ合成反応系における最終段階を触媒する酵素であり、従って、生物体内において合成され得ることが知られているＰＨＡであれば、いずれも該酵素による触媒作用を受けて合成されていることになる。よって、所望のＰＨＡに対応する３−ヒドロキシアシルＣｏＡを、ＰＨＡ合成酵素に作用させることによって、生物体内において合成され得ることが知られているあらゆる種類のＰＨＡで固相、液相及び気相の少なくとも１つの相と磁性体を含有せしめた、さらには被覆したマイクロカプセルを作成することが可能である。
【００９９】
また、本発明においては、側鎖構造Ｒ１〜Ｒ７について種々の原子あるいは官能基からなる群から選ばれる１種以上の原子あるいは官能基を選択することが可能である。また、Ｒ２〜Ｒ７の置換位置については、オルト、メタあるいはパラ位の何れにおいても対応するモノマーユニットからなるＰＨＡを取得することが可能であるが、機能性、物性等が何れの異性体においても大きな相違が無い場合、収率あるいはポリマー中への取り込まれ易さにおいてメタ位あるいはパラ位における置換体を好適に用い得る。
【０１００】
なお、前記のハロゲン原子の具体例としては、フッ素、塩素、臭素等を挙げることができる。また、前記の発色団としては、発色団を含む原料化合物からＰＨＡが合成され得るものであれば特に限定はされないが、高分子合成時の立体障害等を考慮すると、原料化合物であるアルカノエートの末端カルボキシル基と発色団との間に炭素数１から５のメチレン鎖があるほうが望ましい。また、発色団の光吸収波長が可視域にあれば着色した構造体が得られ、可視域以外に光吸収波長があっても種々の電子材料として利用することができる。このような発色団の例として、ニトロソ、ニトロ、アゾ、ジアリールメタン、トリアリールメタン、キサンテン、アクリジン、キノリン、メチン、チアゾール、インダミン、インドフェノール、ラクトン、アミノケトン、ヒドロキシケトン、スチルベン、アジン、オカサジン、チアジン、アントラキノン、フタロシアニン、インジゴイド等を挙げることができる。
【０１０１】
本発明において用いられるＰＨＡとしては上記モノマーユニットを複数含むランダム共重合体やブロック共重合体を用いることも可能であり、各モノマーユニットや含まれる官能基の特性を利用したＰＨＡの物性制御や複数の機能の付与、官能基間の相互作用を利用した新たな機能の発現等が可能となる。さらに、モノマー化合物の添加量や添加順序を適宜制御することによって、任意の順序および組成比のブロック共重合体を合成することも可能である。また必要に応じて、ＰＨＡを合成したのち、あるいは、合成中に、さらに化学修飾等を施しても良い。
【０１０２】
例えば、基質である３−ヒドロキシアシルＣｏＡの種類や濃度等の組成を経時的に変化させることによって、マイクロカプセルの内側から外側へ向かう方向においてＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることも可能である。マイクロカプセル表層のＰＨＡと内層のＰＨＡを適宜選択することで、本発明の効果、例えば液相あるいは気相の保持機能、徐放性の制御、水溶液中での自己分散性等をさらに高めることができる。より具体的には、適宜、ＰＨＡのモノマーユニットを選択し、マイクロカプセルの内側から外側へ向かう方向に変化、例えば多層構造あるいはグラディエント構造とすることが可能である。
【０１０３】
また、マイクロカプセル表層のＰＨＡにグラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する、例えば液相あるいは気相の保持機能、水溶液中での自己分散性、徐放性の制御等の機能性の発現が可能となる。また、マイクロカプセル表層のＰＨＡを架橋化せしめることにより、例えば、液相あるいは気相の保持機能の向上、マイクロカプセルの機械的強度の向上、徐放性の制御等が可能となる。
【０１０４】
このように、ＰＨＡを微生物（ｉｎ  ｖｉｖｏ）合成あるいは無細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）合成を用いて生産する場合、前記の各種モノマーユニットを含み得るが、必要とするポリマーの機能性、物性等を考慮の上、適当数を含むように設計すると良い。一般には前記の６種類程度までのモノマーユニットを含むことで本発明の目的を十分に達成することが期待できるが、微妙な機能性、物性の制御を望む場合、より多くの種類のモノマーユニットで構成することも可能である。
【０１０５】
なお、本発明のマイクロカプセルに用いる、ＰＨＡ生産微生物あるいはＰＨＡ合成酵素によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成により合成されるＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【０１０６】
これら所望の物性のＰＨＡは、本発明におけるＰＨＡを合成可能な微生物の培養条件等を選択することによって得られる。例えば、培養時間等の制御により、数平均分子量の制御が可能である。また、溶媒抽出、再沈殿等の手段を用いた低分子量成分の除去により、数平均分子量の制御が可能である。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成においては反応溶液の組成、反応時間等の条件を適宜選択することにより、各種物性の制御が可能である。
【０１０７】
ＰＨＡの分子量は、数平均分子量で１，０００から１，０００万程度、好ましくは５，０００から１００万程度とするのが望ましい。また、これらのＰＨＡの分散度（重量平均分子量／数平均分子量）は、好ましくは１〜１０である。分散度は、特に好ましくは１〜５である。
【０１０８】
本発明におけるマイクロカプセルにおいて、例えば、液相を含有せしめた場合、液相の保持および徐放機能、あるいは水溶液中での自己分散性等が重要になる。本発明のマイクロカプセルはこうした問題を解決した点に最大の特徴を有する。つまり、液相の保持および徐放機能、あるいは水溶液中での自己分散性等は上述のようにＰＨＡのモノマーユニットの種類／組成比／分子量／結晶性を制御することにより制御可能である。
【０１０９】
また、徐放性製剤として薬物、特には水溶性薬物を含有せしめた場合、放出特性の制御には初期の放出速度制御とそれ以降の放出速度制御の両方が必要になる。
【０１１０】
本発明の徐放性製剤はこうした問題を解決した点に最大の特徴を有する。つまり、薬物の初期放出量は上述のようにＰＨＡのモノマーユニットの種類／組成比／分子量／結晶性を制御することにより制御可能であり、また、薬物の放出期間についてもＰＨＡのモノマーユニットの種類／組成比／分子量／結晶性を制御することにより初期放出量同様に制御が可能である。また本発明の徐放性製剤は、薬物放出特性を単にゼロ次放出した徐放性製剤に限らず、初期の放出量を任意に高く設定することや薬物の放出時間にタイムラグを有する徐放性製剤を調製することも可能であり、その応用範囲は極めて広いものである。
【０１１１】
さらに、徐放性製剤として薬物、特には実質的に水に溶解しない薬物を含有せしめた場合についても、放出特性の制御には初期の放出速度制御とそれ以降の放出速度制御の両方が必要になる。本発明の徐放性製剤はこうした問題を解決した点に最大の特徴を有する。つまり、薬物の初期放出量は上述のようにＰＨＡのモノマーユニットの種類／組成比／分子量／結晶性を制御することにより制御可能であり、また、薬物の放出期間についてもＰＨＡのモノマーユニットの種類／組成比／分子量／結晶性を制御することにより初期放出量同様に制御が可能である。また本発明の徐放性製剤は、薬物放出特性を単にゼロ次放出した徐放性製剤に限らず、初期の放出量を任意に高く設定することや薬物の放出時間にタイムラグを有する徐放性製剤を調製することも可能であり、その応用範囲は極めて広いものである。
【０１１２】
また、超音波造影剤として利用する上では、中空構造体に含有される気泡の量とともに、その気泡の保持機能が重要になる。本発明の超音波造影剤は、この気泡の保持機能が向上した、本発明の中空構造体を超音波反射体として利用した点に最大の特徴を有する。つまり、気泡の保持機能は上述のようにＰＨＡに含まれるモノマーユニットの種類／組成比／分子量／結晶性を制御することにより制御可能である。
【０１１３】
ＰＨＡを微生物生産により得る具体的方法としては、式（１）〜（１０）のモノマーユニットの１種以上を含むＰＨＡを式（１）〜（１０）のモノマーユニットに対応するアルカン酸から製造し得る微生物を、該対応するアルカン酸を含んだ培地中で培養することで可能となる。ＰＨＡを製造し得る微生物としては、ＰＨＡを生産する微生物から適宜選択された微生物、あるいは、それら微生物のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体等が挙げられる。培養方法等については後述する。
【０１１４】
例えば、下記式［２２］で表される５−（４−フルオロフェニル）吉草酸（ＦＰＶＡ）から、下記式［２１］で表される３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）吉草酸（３−ＨＦＰＶ）モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３ＨＦＰＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１１５】
【化５７】
2004331750.tif 000015
また、下記式［２４］で表される４−フェノキシ酪酸（ＰｘＢＡ）から、下記式［２３］で表される３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３ＨＰｘＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１１６】
【化５８】
2004331750.tif 000016
また、下記式［２６］で表される４−シクロヘキシル酪酸（ＣＨＢＡ）から、下記式［２５］で表される３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸（３ＨＣＨＢ）モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３ＨＣＨＢモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１１７】
【化５９】
2004331750.tif 000017
また、下記式［２８］で表される５−ベンゾイル吉草酸（ＢｚＶＡ）から、下記式［２７］で表される３−ヒドロキシ−５−ベンゾイル吉草酸（３ＨＢｚＶ）モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３ＨＢｚＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１１８】
【化６０】
2004331750.tif 000018
また、下記式［３０］で表される５−（４−フルオロベンゾイル）吉草酸（ＦＢｚＶＡ）から、下記式［２９］で表される３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロベンゾイル）吉草酸（３ＨＦＢｚＶ）モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３ＨＦＢｚＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１１９】
【化６１】
2004331750.tif 000019
また、下記式［３２］で表される５−チエニル吉草酸（ＴＶＡ）から、下記式［３１］で表される３−ヒドロキシ−５−チエニル吉草酸（３ＨＴＶ）モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３ＨＴＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１２０】
【化６２】
2004331750.tif 000020
また、下記式［３４］で表される５−チエノイル吉草酸（ＴｏＶＡ）から、下記式［３３］で表される３−ヒドロキシ−５−チエノイル吉草酸（３ＨＴｏＶ）モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３ＨＴｏＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１２１】
【化６３】
2004331750.tif 000021
また、下記式［３６］で表される５−（４−フルオロチオフェノキシ）吉草酸（ＦＴＰｘＶＡ）から、下記式［３５］で表される３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロチオフェノキシ）吉草酸（３ＨＦＴＰｘＶ）モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３ＨＦＴＰｘＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１２２】
【化６４】
2004331750.tif 000022
また、下記式［３８］で表される５−［（４−フルオロフェニルメチル）スルファニル］吉草酸から、下記式［３７］で表される３−ヒドロキシ−５−［（４−フルオロフェニルメチル）スルファニル］吉草酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３−ヒドロキシ−５−［（４−フルオロフェニルメチル）スルファニル］吉草酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１２３】
【化６５】
2004331750.tif 000023
また、下記式［４０］で表される５−チオチエノキシ吉草酸（ＴＴｘＶＡ）から、下記式［３９］で表される３−ヒドロキシ−５−チオチエノキシ吉草酸（３ＨＴＴｘＶ）モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３ＨＴＴｘＶモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１２４】
【化６６】
2004331750.tif 000024
また、下記式［４２］で表されるオクタン酸（ＯＡ）から、下記式［４１］で表される３−ヒドロキシオクタン酸（３ＨＯ）モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３ＨＯモノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１２５】
【化６７】
2004331750.tif 000025
また、下記式［４４］で表されるオクテンから、下記式［４３］で表される３−ヒドロキシ−７、８−エポキシオクタン酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造し得る微生物を培養することにより、３−ヒドロキシ−７、８−エポキシオクタン酸モノマーユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートを製造することが可能である。
【０１２６】
【化６８】
2004331750.tif 000026
＜微生物＞
本発明の方法で用いる微生物は、式（１）〜（１０）に示されるユニットを少なくとも１種含むＰＨＡの生産を、対応するアルカン酸を含む培地中で培養することにより行いうる微生物であれば如何なる微生物であってもよい。
【０１２７】
ＰＨＡを合成する微生物としては、ＰＨＢやＰＨＢ／Ｖ生産菌を用いることができ、このような微生物として、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、クロマチウム属（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｓｐ．）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）の等の他に、本発明者らにより分離された、バルクホルデリア・セパシア・ＫＫ０１株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  ＫＫ０１）、ラルストーニャ・ユートロファ・ＴＢ６４株（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＴＢ６４）、アルカリゲネス属・ＴＬ２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．ＴＬ２）等を用いることができる。なお、ＫＫ０１  株は寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４２３５として、ＴＢ６４株は寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９３３  として、ＴＬ２株は寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９１３  として寄託されている。
【０１２８】
例えば、ｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡの生産菌を用いることができ、このような微生物として、前述のシュードモナス・オレオボランス、シュードモナス・レジノボランス、シュードモナス属６１−３株、シュードモナス・プチダ・ＫＴ２４４２株、シュードモナス・アエルギノーサ等のほかに、本発明者らにより分離された、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｐ９１）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｉｃｈｏｒｉｉＨ４５）、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｉｃｈｏｒｉｉＹＮ２）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｊｅｓｓｅｎｉｉ  Ｐ１６１）等のシュードモナス属微生物や、特開２００１−７８７５３号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｓｐ．ＯＫ３、ＦＥＲＭＰ−１７３７０）、特開２００１−６９９６８号公報に記載のバークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＯＫ４、ＦＥＲＭＰ−１７３７１）等のバークホルデリア属微生物を用いることができる。また、これら微生物に加えて、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｓｐ．）等に属し、ｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【０１２９】
なお、Ｐ９１株は寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７３として、Ｈ４５株は寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７４として、ＹＮ２株は寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７５として、Ｐ１６１株は寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７６として、寄託されている。また、上記のＦＥＲＭ番号の寄託は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（旧名：経済産業省産業技術研究所（通商産業省工業技術院）生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター）での寄託であり、ＢＰは特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づく寄託である。
【０１３０】
なお、前記のＰ９１株、Ｈ４５株、ＹＮ２株およびＰ１６１株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。
【０１３１】
（シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株の菌学的性質）
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ：桿菌、０．６μｍ×１．５μｍ
細胞の多形性：なし
運動性：あり
胞子形成：なし
グラム染色性：陰性
コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色
（２）生理学的性質
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：陽性
Ｏ／Ｆ試験：酸化型
硝酸塩の還元：陰性
インドールの生成：陰性
ブドウ糖酸性化：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陽性
ウレアーゼ：陰性
エスクリン加水分解：陰性
ゼラチン加水分解：陰性
β−ガラクトシダーゼ：陰性
Ｋｉｎｇ’ｓ  Ｂ寒天での蛍光色素産生：陽性
（３）基質資化能
ブドウ糖：陽性
Ｌ−アラビノース  ：陰性
Ｄ−マンノース  ：陰性
Ｄ−マンニトール  ：陰性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性
マルトース：陰性
グルコン酸カリウム：陽性
ｎ−カプリン酸  ：陽性
アジピン酸：陰性
ｄｌ−リンゴ酸：陽性
クエン酸ナトリウム：陽性
酢酸フェニル：陽性
（シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株の菌学的性質）
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ：桿菌、０．８μｍ×１．０〜１．２μｍ
細胞の多形性：なし
運動性：あり
胞子形成：なし
グラム染色性：陰性
コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、クリーム色
（２）生理学的性質
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：陽性
Ｏ／Ｆ試験：酸化型
硝酸塩の還元：陰性
インドールの生成：陰性
ブドウ糖酸性化：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
ウレアーゼ：陰性
エスクリン加水分解：陰性
ゼラチン加水分解：陰性
β−ガラクトシダーゼ：陰性
Ｋｉｎｇ’ｓＢ寒天での蛍光色素産生  ：陽性
４％ＮａＣｌでの生育  ：陰性
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陰性
（３）基質資化能
ブドウ糖：陽性
Ｌ−アラビノース  ：陰性
Ｄ−マンノース  ：陽性
Ｄ−マンニトール  ：陽性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陽性
マルトース：陰性
グルコン酸カリウム：陽性
ｎ−カプリン酸  ：陽性
アジピン酸：陰性
ｄｌ−リンゴ酸：陽性
クエン酸ナトリウム：陽性
酢酸フェニル：陽性。
【０１３２】
（シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株の菌学的性質）
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ：桿菌、０．８μｍ×１．５〜２．０μｍ
細胞の多形性：なし
運動性：あり
胞子形成：なし
グラム染色性：陰性
コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、光沢、半透明
（２）生理学的性質
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：陽性
Ｏ／Ｆ試験：酸化型
硝酸塩の還元：陰性
インドールの生成：陽性
ブドウ糖酸性化：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
ゼラチン加水分解：陰性
β−ガラクトシダーゼ：陰性
Ｋｉｎｇ’ｓ  Ｂ寒天での蛍光色素産生：陽性
４％ＮａＣｌでの生育  ：陽性（弱い生育）
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陰性
Ｔｗｅｅｎ  ８０の加水分解：陽性
（３）基質資化能
ブドウ糖：陽性
Ｌ−アラビノース  ：陽性
Ｄ−マンノース  ：陰性
Ｄ−マンニトール  ：陰性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性
マルトース：陰性
グルコン酸カリウム：陽性
ｎ−カプリン酸  ：陽性
アジピン酸：陰性
ｄｌ−リンゴ酸：陽性
クエン酸ナトリウム：陽性
酢酸フェニル：陽性
（シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株の菌学的性質）
（１）形態学的性質
細胞の形と大きさ：球状  φ０．６μｍ、桿状  ０．６μｍ×１．５〜２．０μｍ
細胞の多形性：あり（伸長型）
運動性：あり
胞子形成：なし
グラム染色性：陰性
コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめらか、淡黄色
（２）生理学的性質
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：陽性
Ｏ／Ｆ試験：酸化型
硝酸塩の還元：陽性
インドールの生成：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陽性
ウレアーゼ：陰性
エスクリン加水分解：陰性
ゼラチン加水分解：陰性
β−ガラクトシダーゼ：陰性
Ｋｉｎｇ’ｓＢ寒天での蛍光色素産生  ：陽性
（３）基質資化能
ブドウ糖：陽性
Ｌ−アラビノース  ：陽性
Ｄ−マンノース  ：陽性
Ｄ−マンニトール  ：陽性
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陽性
マルトース：陰性
グルコン酸カリウム：陽性
ｎ−カプリン酸  ：陽性
アジピン酸：陰性
ｄｌ−リンゴ酸：陽性
クエン酸ナトリウム：陽性
酢酸フェニル：陽性。
【０１３３】
＜培養工程＞
本発明にかかるＰＨＡの製造方法においては、上記するＰＨＡ生産能を有する微生物を利用して、原料のアルカン酸から、対応する前記一般式（１）から（１０）で表される、側鎖末端に各種官能基を有する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを生産させ、細胞内に蓄積させる。
【０１３４】
微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作製、ＰＨＡの生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖等には、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地、酵母エキス等）や、栄養源を添加した合成培地等、いかなる種類の培地をも用いることができる。温度、通気、攪拌等の培養条件は、用いる微生物に応じて適宜選択する。
【０１３５】
一方、前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、目的とする３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含むＰＨＡを製造する際には、培地として、ＰＨＡ生産用の原料として、このモノマーユニットに対応するアルカン酸に加えて、微生物の増殖用炭素源を少なくとも含んだ無機培地等を用いることができる。原料のアルカン酸は、培地あたり０．０１％〜１％（質量／容量）の範囲、より好ましくは、０．０２％〜０．２％（質量／容量）の範囲に初期の含有率を選択することが望ましい。原料のアルカン酸の種類によっては、その水溶性が良好でないものもあるが、本発明においては、上記の微生物を用いる場合、培地中に懸濁された状態であっても何ら問題とはならない。
【０１３６】
なお、原料のアルカン酸の培地への溶解性を高めるため、場合によっては、１−ヘキサデセンやｎ−ヘキサデカンのような溶媒に溶解、あるいは、微細な懸濁物とした形状で培地中に添加することも可能である。その際には、利用する１−ヘキサデセンやｎ−ヘキサデカンのような溶媒の添加濃度は、培地に対して、その濃度は３％（容量／容量）以下にすることが必要である。
【０１３７】
培地には、微生物が増殖に利用する増殖基質を別途添加することが好ましい。この増殖基質は、酵母エキスやポリペプトン、肉エキスといった栄養素を用いることが可能である。更に、糖類、ＴＣＡ回路中の中間体として生じる有機酸ならびにＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生化学反応を経て生じる有機酸またはその塩、アミノ酸またはその塩等から、用いる菌株に応じて、増殖基質としての有用性を考慮して、適宜選択することができる。また、目的とするモノマーの割合が低くてもよい場合は、炭素数４から１２の直鎖アルカン酸あるいはその塩等を基質として用いてもよい。但しこの場合は直鎖で置換基のない単純なモノマー（以下ｍｃｌと略する）の割合が高くなることに留意する必要がある。
【０１３８】
これらのうち、糖類としては、グリセロアルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースといったアルドース、グリセロール、エリスリトール、キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルドン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【０１３９】
また、有機酸或いはその塩としては、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸等がその例であり、或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【０１４０】
また、アミノ酸或いはその塩としては、グルタミン酸、アスパラギン酸或いはその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。
【０１４１】
一般に、これら種々の増殖基質の中でも、ポリペプトンや糖類を用いるのがより好ましい。原料化合物と共存させる、これらの増殖基質は、通常、培地あたり０．１％〜５％（質量／容量）の範囲、より好ましくは、０．２％〜２％（質量／容量）の範囲にその含有率を選択することが望ましい。
【０１４２】
微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる培養方法としては、一旦十分に増殖させた後に、塩化アンモニウムのような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニットの基質となる化合物を加えた状態でさらに培養すると生産性が向上する場合がある。例えば、前記の異なる培養条件からなる工程を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。
【０１４３】
その際、培養温度は、上記の菌株が良好に増殖可能な温度であればよく、例えば、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃の範囲、より好ましくは２０℃〜３０℃の範囲に選択することが適当である。
【０１４４】
培養は、液体培養、固体培養等、利用する微生物が増殖し、培地中に含有される原料のアルカン酸から、前記一般式（１）から（１０）で示されるユニットを含むＰＨＡを生産する培養方法ならば、いかなる培養方法をも用いることができる。さらには、原料、増殖基質、さらには酸素の供給が適正に行われるならば、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。例えば、液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。
【０１４５】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源（例えば、リン酸塩等）、窒素源（例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等）等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２１８、９７〜１０６（１９５６））、Ｍ９培地等を挙げることができる。なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
［Ｍ９培地］
Ｎａ２ＨＰＯ４  ：  ６．２ｇ
ＫＨ２ＰＯ４  ：  ３．０ｇ
ＮａＣｌ  ：  ０．５ｇ
ＮＨ４Ｃｌ  ：  １．０ｇ
（培地１リットル中、ｐＨ  ７．０）
さらに、良好な増殖及びＰＨＡ合成酵素の生産のためには、上記の無機塩培地に以下に示す微量成分溶液を  ０．３％（容量／容量）程度添加するのが好ましい。
【０１４６】
（微量成分溶液）
ニトリロ三酢酸：１．５ｇ  ＭｇＳＯ４：３．０ｇ、ＭｎＳＯ４：０．５ｇ、ＮａＣｌ：１．０ｇ、ＦｅＳＯ４：０．１ｇ、ＣａＣｌ２：０．１ｇ、ＣｏＣｌ２：０．１ｇ、  ＺｎＳＯ４：０．１ｇ、  ＣｕＳＯ４：０．１ｇ、ＡｌＫ（ＳＯ４）２：０．１ｇ、  Ｈ３ＢＯ３：０．１ｇ、  Ｎａ２ＭｏＯ４：０．１ｇ、ＮｉＣｌ２：０．１ｇ
（１リットル中）
＜ＰＨＡの回収＞
本発明にかかる培養液からのＰＨＡの取得には、通常行なわれている方法を適用することができる。ＰＨＡが培養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からのＰＨＡの回収には、通常行なわれているクロロホルム等の有機溶媒による抽出が最も簡便ではあるが、クロロホルム以外にジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンが用いられる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、アンモニア等の薬剤による処理によってＰＨＡ以外の菌体成分を除去して、菌体内成分を除去することによってＰＨＡのみを回収する方法を採ることもできる。
【０１４７】
なお、微生物の培養、微生物によるＰＨＡの生産と菌体内への蓄積、ならびに、菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限定されるものではない。例えば、本発明にかかるＰＨＡの生産方法に利用される微生物は上記の４種の菌株以外でも、これら４種の菌株と同様の本発明にかかるＰＨＡ生産の生産能を有する微生物を用いることができる。
【０１４８】
＜形質転換体を用いた生合成＞
また、前述のＰＨＡ生産菌の持つＰＨＡ合成酵素遺伝子を他の微生物に導入した形質転換体を用いて、所望のＰＨＡを生産することも可能である。ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製、および、形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体においては、培養に用いる培地として、天然培地あるいは合成培地、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は  ２５  〜  ３７℃の範囲で、好気的に８〜２７時間培養することにより、微生物の増殖を図る。その後集菌し、菌体内に蓄積されたＰＨＡの回収を行うことができる。培地には、必要に応じて、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加しても良い。また、発現ベクターにおいて、誘導性のプロモーターを用いている場合は、形質転換体を培養する際に、該プロモーターの対応する誘導物質を培地に添加して発現を促しても良い。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等が誘導物質として挙げられる。
【０１４９】
＜３−ヒドロキシアシルＣｏＡ＞
本発明の生物工学的手法を利用したカプセル化方法において、ＰＨＡ合成酵素の基質として用いる３−ヒドロキシアシルＣｏＡとして、具体的には、下記式［１１］から［２０］で表される３−ヒドロキシアシルＣｏＡを例示することができる。
【０１５０】
【化６９】
2004331750.tif 000027
（ただし、前記式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、式中Ｒ１およびａは、前記式［１］と同様に定義される。）
【０１５１】
【化７０】
2004331750.tif 000028
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｂ及びＲ２は前記式［２］と同様に定義される。）
【０１５２】
【化７１】
2004331750.tif 000029
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｃ及びＲ３は前記式［３］と同様に定義される。）
【０１５３】
【化７２】
2004331750.tif 000030
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｄ及びＲ４は前記式［４］と同様に定義される。）
【０１５４】
【化７３】
2004331750.tif 000031
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｅ及びＲ５は前記式［５］と同様に定義される。）
【０１５５】
【化７４】
2004331750.tif 000032
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｆは前記式［６］と同様に定義される。）
【０１５６】
【化７５】
2004331750.tif 000033
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｇは前記式［７］と同様に定義される。）
【０１５７】
【化７６】
2004331750.tif 000034
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｈ及びＲ６は前記式［８］と同様に定義される。）
【０１５８】
【化７７】
2004331750.tif 000035
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、Ｉ及びＲ７は前記式［９］と同様に定義される。）
【０１５９】
【化７８】
2004331750.tif 000036
（ただし、式中−ＳＣｏＡ  はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｊは前記式［１０］と同様に定義される。）
これらの３−ヒドロキシアシルＣｏＡは、例えば、酵素を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法、微生物や植物等の生物体を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ合成法、化学合成法等の中から適宜選択した方法で合成して用いることができる。特に、酵素合成法は該基質の合成に一般に用いられている方法であり、市販のアシルＣｏＡシンセターゼ（アシルＣｏＡリガーゼ、Ｅ．Ｃ．６．２．１．３）を用いた下記反応、
【０１６０】
【化７９】
2004331750.tif 000037
を用いた方法等が知られている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５４、３７−４３（２０００）等）。酵素や生物体を用いた合成工程には、バッチ式の合成方法を用いても良く、また、固定化酵素や固定化細胞を用いて連続生産してもよい。
【０１６１】
＜ＰＨＡ合成酵素およびその生産菌＞
本発明に用いるＰＨＡ合成酵素は、該酵素を生産する微生物から適宜選択された微生物、あるいは、それら微生物のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体等により生産されたものを用いることが可能であり、前述のＰＨＡ生産菌を好適に用いることができる。
【０１６２】
＜ＰＨＡ合成酵素の取得＞
本発明にかかるＰＨＡ合成酵素の生産に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡ合成酵素の生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖等には、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いることが可能である。
【０１６３】
培養は液体培養や固体培養等、該微生物が増殖する方法であればいかなる方法をも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェドバッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【０１６４】
前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、ＰＨＡ合成酵素を生産する場合は、例えば、オクタン酸やノナン酸等のアルカン酸を含む無機培地で該微生物を増殖させ、対数増殖期から定常期初期にかけての微生物を遠心分離等で回収して所望の酵素を抽出する方法等を用いることができる。なお、上記のような条件で培養を行うと、添加したアルカン酸に由来するｍｃｌ−ＰＨＡが菌体内に合成されることになるが、この場合、一般に、ＰＨＡ合成酵素は菌体内に形成されるＰＨＡの微粒子に結合して存在するとされている。しかし、本発明者らの検討によると、上記の方法で培養した菌体の破砕液を遠心分離した上清液にも、相当程度の酵素活性が存在していることがわかっている。これは、前記の如き対数増殖期から定常期初期にかけての比較的培養初期には、菌体内で該酵素が活発に生産され続けているため、遊離状態のＰＨＡ合成酵素も相当程度存在するためと推定される。
【０１６５】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源（例えば、リン酸塩等）、窒素源（例えば、アンモニウム塩、硝酸塩等）等、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地、Ｅ培地（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２１８、９７−１０６（１９５６））、Ｍ９培地等を挙げることができる。なお、Ｍ９培地の組成は前述の通りである。さらに、良好な増殖及びＰＨＡ合成酵素の生産のためには、上記の無機塩培地に培地に前述の微量成分溶液を０．３％（容量／容量）程度添加するのが好ましい。培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば  １５〜４０℃、好ましくは  ２０〜３５℃程度が適当である。
【０１６６】
また、前述のＰＨＡ生産菌の持つＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いて、所望のＰＨＡ合成酵素を生産することも可能である。ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製、および、形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体においては、培養に用いる培地として、天然培地あるいは合成培地、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は２５から３７℃の範囲で、好気的に８〜２７時間培養することにより、微生物の増殖を図る。その後集菌し、菌体内に蓄積されたＰＨＡ合成酵素の回収を行うことができる。培地には、必要に応じて、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加しても良い。また、発現ベクターにおいて、誘導性のプロモーターを用いている場合は、形質転換体を培養する際に、該プロモーターの対応する誘導物質を培地に添加して発現を促しても良い。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、テトラサイクリン、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等が誘導物質として挙げられる。
【０１６７】
ＰＨＡ合成酵素としては、微生物の菌体破砕液や、硫酸アンモニウム等によりタンパク質成分を沈殿・回収した硫安塩析物等の粗酵素を用いても良く、また、各種方法で精製した精製酵素を用いても良い。該酵素には必要に応じて、金属塩、グリセリン、ジチオスレイトール、ＥＤＴＡ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の安定化剤、付活剤を適宜添加して用いることができる。
【０１６８】
ＰＨＡ合成酵素の分離・精製方法は、ＰＨＡ合成酵素の酵素活性が保持される方法であればいかなる方法をも用いることができる。例えば、得られた微生物菌体を、フレンチプレス、超音波破砕機、リゾチームや各種界面活性剤等を用いて破砕したのち、遠心分離して得られた粗酵素液、またはここから調製した硫安塩析物について、アフィニティクロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等の手段を単独または適宜組み合わせることによって精製酵素を得ることができる。特に、遺伝子組換えタンパク質は、Ｎ末端やＣ末端にヒスチジン残基等の「タグ」を結合した融合タンパク質の形で発現させ、このタグを介して親和性樹脂に結合させることによって、より簡便に精製することができる。融合タンパク質から目的のタンパク質を分離するには、トロンビン、血液凝固因子Ｘａ等のプロテアーゼで切断する、ｐＨを低下せしめる、結合競合剤として高濃度のイミダゾールを添加する等の方法を用いると良い。あるいは、発現ベクターとしてｐＴＹＢ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎ  Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いた場合のようにタグがインテインを含む場合はｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ等で還元条件として切断する。アフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能とする融合タンパク質には、ヒスチジンタグの他にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、あるいはチオレドキシン（ＴＲＸ）等も公知である。ＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ親和性レジンによって精製することができる。
【０１６９】
ＰＨＡ合成酵素の活性測定は、既報の各種方法を用いることができるが、例えば、３−ヒドロキシアシルＣｏＡがＰＨＡ合成酵素の触媒作用により重合してＰＨＡになる過程で放出されるＣｏＡを、５、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）で発色させて測定することを測定原理とする、以下に示す方法によって測定することができる。試薬１：ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）  に３．０  ｍｇ／ｍｌ溶解、試薬２：３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）  に３．０  ｍＭ溶解、試薬３：トリクロロ酢酸を０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）  に１０  ｍｇ／ｍｌ溶解、試薬４：５、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）  に２．０  ｍＭ溶解。第１反応（ＰＨＡ合成反応）：試料（酵素）溶液１００μｌに試薬１を１００μｌ添加して混合し、３０℃で１分間プレインキュベートする。ここに、試薬２を１００μｌ添加して混合し、３０℃で１〜３０分間インキュベートしたのち、試薬３を添加して反応を停止させる。第２反応（遊離ＣｏＡの発色反応）：反応停止した第１反応液を遠心分離（１５、０００×ｇ、１０分間）し、この上清５００μｌに試薬４を５００μｌ添加し、３０℃で１０分間インキュベートしたのち、４１２  ｎｍの吸光度を測定する。酵素活性の算出：１分間に１μｍｏｌのＣｏＡを放出させる酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【０１７０】
なお、該酵素により合成されるＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【０１７１】
＜磁性体＞
本発明の構造体に含有させる磁性体は、構造体の目的とする用途や特性に応じてその種類や構造を選択して用いることができる。
【０１７２】
磁性体としては、例えば、磁性を有する金属または金属化合物が挙げられ、さらに具体的には、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、ＭｎＺｎフェライト、ＮｉＺｎフェライト、  ＹＦｅガーネット、ＧａＦｅガーネット、Ｂａフェライト、Ｓｒフェライト等各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル、クロム等の金属、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル等の合金を挙げることができ、これらに限定されるものではない。ここで、例えば生体物質を固定する場合、あるいは生体内に投与する場合等については、生体に対する適合性の良好なマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）のほか、必要に応じてマグネタイトの金属元素の一部を少なくとも１種類の他の金属元素で置換した各種フェライト組成等が好適に適用可能である。これら磁性体の形状は、生成条件によって変化し、多面体、８面体、６面体、球状、棒状、燐片状等等があるが、異方性の少ない構造が機能の安定発現のためにはより好ましい。本発明の構造体を構成する磁性体の一次粒子の粒子径は、その用途に応じて適宜選択可能であるが、例えば、０．００１〜１０μｍの範囲内の粒径を有する粒子を用いると良い。
【０１７３】
また、磁性体としては、超常磁性を有するものについても好ましく用いることができる。例えば、フェライトの粒子径が２０ｎｍ程度以下と小さい場合には、フェライトは熱擾乱影響を受け超常磁性を示すようになり、残留磁化や保磁力を持たなくなる。超常磁性であっても磁界を印加することにより磁気的操作が可能であり、また超常磁性であれば残留磁化や保磁力を持たないので、磁界のないときに磁気的な凝集の生じるおそれがない。
【０１７４】
また、磁性体は金属または金属化合物を含むマトリックス等のような複合材料であってもよく、マトリックスは有機または無機の各種材料から構成されるものである。
【０１７５】
その他、粒子表面を脂肪酸で被覆する方法、シランカップリング剤処理に代表される各種カップリング剤処理を行う方法等、各種手法により疎水化処理を行った磁性体についても、本発明の磁性体として好ましく利用することができる。
【０１７６】
本発明にかかる構造体における磁性体の含有量は１〜８０質量％、好ましくは５〜７０質量％、さらに好ましくは１０〜６０質量％である。磁性体の量が１質量％より少ないと磁気性能が不足して構造体としての性能が不十分となるおそれがあり、また、磁性体含量が８０質量％を越えると磁性体が多すぎるため、構造体本来の機能が損なわれ、実用性能の面で満足できなくなるおそれがある。
【０１７７】
＜構造体およびその製造方法  −  親水性薬物を内包  −＞
本発明における構造体の一態様は、少なくとも薬物、磁性体ならびにＰＨＡを含有する構造体であり、マイクロスフェアの形態やマイクロカプセルの形態等種々の形態をとり得る。その具体例としては、例えばＰＨＡを含むシェル内のコア部に薬物を含むマイクロカプセル、または薬物を含む部分が内相部としてＰＨＡを含む外相内に分散しているような構造体（マイクロスフェア）等が挙げられる。磁性体は構造体の構成に応じて外相部及び内相部の少なくとも一方に含有させる。
【０１７８】
本発明の徐放性製剤は、上記の薬物を含有する構造体を有効成分として調製することができる。この徐放性製剤は、例えば、薬物を含む溶液を内水相とし、ＰＨＡおよび磁性体を含む溶液を油相とするＷ／Ｏ型エマルション、あるいは、該Ｗ／Ｏ型エマルションをさらに外水相に乳化したＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを粒状体化して得られた構造体単独で、あるいは構造体と必要に応じて添加される各種の添加剤とにより調製することができる。
【０１７９】
該粒状体は、例えば液中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法またはこれらに準ずる方法によって行うことができる。
【０１８０】
また、薬物、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む溶液を内水相とするＷ／Ｏ型エマルション、あるいは、内水相と油相からなるＷ／Ｏ型エマルションをさらに外水相に乳化したＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション（ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡは内水相と外水相の少なくとも一方に含有される）を得、ＰＨＡ合成反応を行うことにより、構造体を調製する方法（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ合成法）についても好適に用いることができる。
【０１８１】
さらには、薬物を含む溶液を内水相とするＷ／Ｏ型エマルションを、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む外水相に乳化したＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを得、ＰＨＡ合成反応を行うことにより、構造体を調製する方法についても好適に用いることができる。
【０１８２】
＜Ｗ／Ｏ型エマルションの調製    −  親水性薬物を内包  −＞
薬物を含む溶液を内水相とし、ＰＨＡ及び磁性体を含む溶液を油相とするＷ／Ｏ型エマルションは、以下のようにして製造することができる。
【０１８３】
まず、水に水溶性薬物を加え溶解または分散し、これに必要であればゼラチン、寒天、ポリビニルアルコールあるいは塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、ヒスチジン、リジン）等の薬物保持物質を加えて溶解もしくは懸濁し、内水相とする。内水相における薬物の濃度は、約０．００１〜９０質量％、好ましくは約０．０１〜８０質量％である。該薬物保持物質の添加量は、生理活性物質に対して、通常約０．０１〜約１００重量倍、より好ましくは約０．０５〜約５０重量倍である。これらの薬物保持物質は、あらかじめ任意の濃度に生理活性物質と共に水に溶解し、除菌・除塵フィルターを用いてろ過した後、凍結乾燥して保存し、調製時に溶解して用いることもできる。なお、本発明の徐放性製剤においては、内水相に薬物保持物質を用いない場合でも、生理活性物質の取り込み率が十分満足なものである。
【０１８４】
内水相には、薬物の安定性、溶解性を保つためのｐＨ調整剤として、炭酸、酢酸、シュウ酸、クエン酸、リン酸、塩酸等、水酸化ナトリウム、アルギニン、リジンおよびそれらの塩等を添加してもよい。また、さらに薬物の安定化剤として、アルブミン、ゼラチン、トレハロース、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、デキストリン、シクロデキストリン（α−、β−、γ−）およびそれらの誘導体（例、マルトシールβ−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンスルフォブチルエーテル等）、亜硫酸水素ナトリウム、ポリエチレングリコール等のポリオール化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル［例、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ６０（花王、日本）］、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体［例、ＨＣＯ−６０、ＨＣＯ−７０（日光ケミカルズ、日本）］等の界面活性剤、等を、あるいは保存剤として、一般に用いられるパラオキシ安息香酸エステル類（メチルパラベン、プロピルパラベン等）、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チメロサール等を添加してもよい。
【０１８５】
このようにして得られる内水相とＰＨＡおよび磁性体を含む溶液（油相）を混合し、ついで乳化操作を行いＷ／Ｏ型エマルションを調製する。該乳化操作としては、公知の方法が用いられる。例えば、断続振盪法、プロぺラ型攪拌機、タービン型攪拌機等のミキサーを用いる攪拌法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法等が挙げられる。本発明では、これらの方法を適宜組み合わせて使用してもよい。このＷ／Ｏ型エマルションは、その乳化の程度で薬物の放出が影響を受け、乳化の程度が不十分であると初期バーストが大きくなる傾向にあり、内水相がある程度以上に微細な程、薬物とＰＨＡの相互作用が強く、ＰＨＡによる放出制御がＰＨＡの種類／組成比／分子量／結晶性に依存して長期の放出制御をより正確にできるので好ましい。
【０１８６】
上記したＰＨＡおよび磁性体を含む溶液（油相）は、水と実質的に混和しない有機溶媒に、ＰＨＡおよび磁性体を含有させたものが用いられる。該有機溶媒の水に対する溶解度は、好ましくは、常温（２０℃）で３質量％以下である。また有機溶媒の沸点は１２０℃以下であることが好ましい。有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、ケトン類（例、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等）、エーテル類（例、テトラヒドロフラン、エチルエーテル、イソプロピルエーテル等）、エステル類（例、酢酸エチル、酢酸ブチル等）、芳香族炭化水素（例、ベンゼン、トルエン、キシレン等）等が挙げられる。これらは２種以上適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒は、さらに好ましくはハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）である。油相におけるＰＨＡの濃度は、該ＰＨＡの種類、分子量、溶媒の種類によって異なるが、好ましくは約０．０１〜８０質量％である。さらに好ましくは約０．１〜７０質量％である。特に好ましくは約１〜６０質量％である。
油相に分散する磁性体としては、例えば、磁性を有する金属または金属化合物が挙げられ、さらに具体的には、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、ＭｎＺｎフェライト、ＮｉＺｎフェライト、  ＹＦｅガーネット、ＧａＦｅガーネット、Ｂａフェライト、Ｓｒフェライト等各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル、クロム等の金属、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル等の合金が挙げられる。また、油相における磁性体の処方量は、該磁性体の種類、溶媒の種類、ＰＨＡの処方量、等により異なるが、構造体の含有する磁性体の量が１〜８０質量％、好ましくは５〜７０質量％、さらに好ましくは１０〜６０質量％になるように処方するとよい。
【０１８７】
なお、内水相との相溶性、後述する外水相への有機溶媒の分配、揮散等を変化させるため、油相に一部親水性の有機溶媒、例えばエタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン等を添加してもよい。また、内部の薬物を溶解あるいは安定化させるために、ショ糖脂肪酸エステル等の界面活性剤を添加してもよい。また、ＰＨＡの安定性に依存するが、ＰＨＡを含む溶液を室温ないし冷所で密閉容器の中で保存してもよい。
【０１８８】
薬物を含む水溶液とＰＨＡおよび磁性体を含む有機溶媒溶液との混合割合は、前者１重量部当たり、後者が約０．１〜１０００重量部、好ましくは約１〜１００重量部である。また、
徐放性製剤における薬物の配合量は、薬物の種類、所望の薬理効果および効果の持続期間等によって異なるが、ＰＨＡに対して約０．０１〜５０質量％用いられる。好ましくは、約０．１〜４０質量％用いられる。特に好ましくは、約１〜３０質量％用いられる。
【０１８９】
＜Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションの調製及び液中乾燥法  −  親水性薬物を内包  −＞
ついで、このようにして得られるＷ／Ｏ型エマルションを粒状体化工程に付す。例えば液中乾燥法等により粒状体化を行う場合、Ｗ／Ｏ型エマルションをさらに水相（以下、外水相と略記する）に加え、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションを製造した後、油相中の有機溶媒を除去し、マイクロカプセル等の構造体を調製する。
【０１９０】
外水相の体積は、一般的には油相体積の約１ないし約１０、０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２ないし約５、０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５ないし約２、０００倍から選ばれる。
【０１９１】
外相の水相中には乳化剤を加えてもよく、その例としては、一般に安定なＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを形成するものであればいずれでもよいが、たとえば、アニオン界面活性剤（例、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等）、非イオン性界面活性剤〔ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、アトラスパウダー社製、米国）、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体（ＨＣＯ−７０、ＨＣＯ−６０、ＨＣＯ−５０、日光ケミカルズ社製）等〕、あるいはポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸それらの誘導体等が挙げられ、これらの中の一種類か、いくつかを組み合わせて使用してもよい。外水相における乳化剤の濃度は、約０．０１〜２０質量％、好ましくは約０．０５〜１０質量％の範囲から適宜決定される。
【０１９２】
上記外水相中に浸透圧調節剤を加えてもよい。本発明で用いられる浸透圧調節剤としては、水溶液とした場合浸透圧を示すものであればいかなる物質であってもよい。該浸透圧調節剤の具体例としては、例えば水溶性の多価アルコール類、水溶性の一価アルコール類、水溶性の単糖類、二糖類およびオリゴ糖あるいはそれらの誘導体、水溶性のアミノ酸、水溶性のペプチド、タンパク質あるいはそれらの誘導体等が挙げられる。
【０１９３】
上記水溶性の多価アルコール類としては、例えばグリセリン等の二価アルコール類、アラビトール、キシリトール、アドニトール等の五価アルコール類、マンニトール、ソルビトール、ズルシトール等の六価アルコール類等が挙げられる。これらのうち六価のアルコール類が好ましい。なかでも、マンニトールが特に好ましい。上記水溶性の一価アルコール類としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等が挙げられる。これらのうちエタノールが好ましい。上記水溶性の単糖類としては、例えばアラビノース、キシロース、リボース．２−デオキシリボース等の五炭糖類、ブドウ糖、果糖、ガラクトース、マンノース、ソルボース、ラムノース、フコース等の六炭糖類が挙げられる。これらのうち六炭糖類が好ましい。上記水溶性の二糖類としては、例えば麦芽糖、セロビオース、α、α−トレハロース、乳糖、ショ糖等が挙げられる。これらのうち乳糖、ショ糖が好ましい。上記水溶性のオリゴ糖としては、例えばマルトトリオース、ラフィノース等の三糖類、スタキオース等の四糖類等が挙げられる。これらのうち三糖類が好ましい。上記水溶性の単糖類、二糖類およびオリゴ糖の誘導体としては、例えばグルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、ガラク
ツロン酸等が挙げられる。
【０１９４】
上記水溶液のアミノ酸としては、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、システイン、メチオニン等の中性アミノ酸、アイパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等が挙げられる。またこれらの水溶性アミノ酸の酸（例、塩酸、硫酸、リン酸等）またはアルカリ（例、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等）との塩を用いてもよい。水溶性のペプチド、タンパク質あるいはそれらの誘導体としては、例えばカゼイン、グロブリン、プロラミン、アルブミン、ゼラチン等が挙げられる。
【０１９５】
上記浸透圧調節剤のうち水溶性の多価アルコール類、ならびに水溶性の単糖類、二糖類およびオリゴ糖あるいはそれらの誘導体が好ましい。水溶性の多価アルコール類、水溶性の単糖類が更に好ましい。特に好ましくは水溶性の多価アルコール類である。これら浸透圧調節剤は、単独で使用しても、１種以上を混合して使用してもよい。これらの浸透圧調節剤は、外水相の浸透圧が生理食塩水の浸透圧の約１／５０ないし約５倍、好ましくは約１／２５ないし約３倍となる濃度で用いられる。具体的には、これらの浸透圧調節剤の外水相中での濃度は、浸透圧調節剤が非イオン性物質の場合、約０．００１〜６０質量％、好ましくは約０．０１〜４０質量％、より好ましくは約０．０５〜３０質量％、特に好ましくは約１〜１０質量％である。また、浸透圧調節剤がイオン性物質の場合、上記の濃度を全体のイオン価で除した濃度が用いられる。浸透圧調節剤の添加濃度は、溶解度以下である必要はなく、一部が分散状態であってもよい。
【０１９６】
本発明の製造法において、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させる際にＷ／Ｏ型乳化物の粘度を５０ｃｐから１０、０００ｃｐの範囲内に調整することが好ましい。粘度を調整する方法としては、例えば（１）油相のＰＨＡおよび磁性体の濃度を調整する、（２）水相と油相との量比を調整する、（３）Ｗ／Ｏ型乳化物の温度を調整する、（４）外水相の温度を調整する、（５）Ｗ／Ｏ型乳化物を外水相に注入する際に、例えばラインヒーター、クーラー等でＷ／Ｏ型乳化物の温度を調整する等の方法が挙げられ、これらの方法は単独でも、組み合わせて使用してもよい。上記方法においては、要は、Ｗ／Ｏ型乳化物がＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物になる時のＷ／Ｏ型乳化物の粘度が５０ｃｐから１０、０００ｃｐの範囲内になるようにしさえすればよい。上記（１）において、油相のＰＨＡの濃度を調整する場合の濃度は、ＰＨＡの種類、有機溶媒の種類等で変化するので一義的に決定されるものではないが、好ましくは約１０〜８０質量％である。上記（２）において、水相と油相との量比を調整する場合の量比は、薬物の種類および量、油相の性質によって一義的に決定されるものではないが、好ましくはＷ／Ｏ＝約１〜５０体積％である。上記（３）において、Ｗ／Ｏ型乳化物の温度を調整する場合の温度は、例えば約−２０℃ないし有機溶媒の沸点の範囲、好ましくは約０〜３０℃、更に好ましくは約１０〜２０℃である。Ｗ／Ｏ型乳化物の粘度調整の時期は、上記（１）および（２）の場合は、Ｗ／Ｏ型乳化物を製造する時点で行うことができる。また、上記（４）において、例えば外水相にＷ／Ｏ型乳化物を添加する際に外水相の温度をあらかじめ調整しておくことにより、上記（３）と同様の結果となるようにすればよい。外水相の温度は、例えば約５〜３０℃、好ましくは約１０〜２５℃、更に好ましくは約１２〜２０℃である。
【０１９７】
有機溶媒を除去する方法は、公知の方法に従って行うことができる。例えばプロペラ型撹拌機あるいはマグネチックスターラー等で撹拌しながら常圧もしくは徐々に減圧にして有機溶媒を蒸発させる方法、ロータリーエバポレーター等を用いて真空度、温度を調節しながら有機溶媒を蒸発させる方法等が挙げられる。
【０１９８】
この後、構造体を遠心分離あるいはろ別により分取し、構造体の表面に付着している遊離の薬物、薬物保持物質、乳化剤等を蒸留水で数回繰り返し洗浄し、さらに減圧乾燥、あるいは蒸留水に再分散後に凍結乾燥等により残存した溶媒・水分の除去を行う。
【０１９９】
＜相分離法  −  親水性薬物を内包  −＞
相分離法により粒状体化を行う場合、攪拌下、Ｗ／Ｏ型エマルションにコアセルベーション剤を徐々に加え、ＰＨＡを析出、固化させることにより、構造体を調製する。コアセルベーション剤としては、ＰＨＡの溶剤に混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合物で、粒状体化用のＰＨＡを溶解しないものであればよく、例えばシリコーン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、メタノール、エタノール等が挙げられる。これらは２種以上を混合して用いてもよい。コアセルベーション剤の使用量は、Ｗ／Ｏ型エマルションに対し、例えば約０．０１〜１、０００容量倍、好ましくは約０．１〜２００容量倍である。このようにして得られる構造体を、遠心分離あるいはろ過により分取した後、ヘキサン、ヘプタン等の洗浄液で繰り返し洗浄して、コアセルベーション剤を除去し、その後、加温ないし減圧して洗浄液を蒸発させる。さらに、所望により、上記した水中乾燥法の場合と同様にして、遊離の薬物および有機溶媒の除去を行う。
【０２００】
＜噴霧乾燥法  −  親水性薬物を内包  −＞
噴霧乾燥法により粒状体化を行う場合、Ｗ／Ｏ型エマルションまたは水中乾燥法の場合と同様にして製造したＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを、ノズルを用いてスプレードライヤー装置（噴霧乾燥機）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒および水を揮発させることにより、微粒状のマイクロカプセル等の構造体を調製する。ノズルとしては、例えば二液体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型が挙げられる。このようにして得られる構造体を、所望により、蒸留水で数回繰り返し洗浄して、マイクロカプセル等の構造体の表面に付着している遊離の薬物、薬物保持物質、乳化剤等を除去する。ついで、洗浄されたマイクロカプセルを、減圧乾燥するか、あるいは蒸留水に再分散後凍結乾燥して、さらに有機溶媒の除去を行ってもよい。
【０２０１】
＜マイクロカプセル等の構造体およびその製造方法  −  親油性薬物を内包  −＞
以下に、親油性薬物を内包させた構造を有する構造体について説明する。なお、この構造体の構造は、先に親水性薬物について説明したものと同じようにマイクロカプセルやマイクロスフェアの形態をとり得る。この場合も、磁性体は構造体の構成に応じて外相部及び内相部の少なくとも一方に含有させる。
【０２０２】
親油性薬物を内包する構造体は、薬物、磁性体、ＰＨＡおよび有機溶媒を含む油相から有機溶媒を除去することで製造することができる。本発明の製造法において、（ａ）薬物及び（ｂ）ＰＨＡを含有する有機溶媒液を製造する方法としては、最終的に（ａ）及び（ｂ）が溶媒系で溶解状態あるいは均一な分散液となる方法であれば如何なる方法も用い得る。該方法としては、例えば（１）（ａ）を溶媒で溶液又は分散液状態としたものと、（ｂ）を溶媒で溶液又は分散液状態としたものとを混合、（２）（ａ）を溶媒で溶液又は分散液状態としたものと、（ｂ）とを混合、（３）（ｂ）を溶媒で溶液又は分散液状態としたものと、（ａ）とを混合、（４）（ａ），（ｂ）及び溶媒を混合し、（ａ）及び（ｂ）を溶媒系で溶液状態とする方法が挙げられる。上記の溶媒は、各溶媒を混合後、（ａ）及び（ｂ）を溶解状態とし得る溶媒系となるように適宜選択される。上記の溶媒は具体的には、例えば上記の有機溶媒の一種または二種以上を適宜の割合で混合した溶媒に、所望により（ａ）及び（ｂ）の溶解を阻害しない程度に上記有機溶媒を加えた溶媒が用いられる。
【０２０３】
このようにして製造された、薬物、磁性体とＰＨＡの溶液あるいは分散液からなる油相から有機溶媒を除去することにより、本発明のマイクロカプセル等の構造体を作製することができる。
【０２０４】
具体的には、公知のマイクロカプセル等の構造体の調製方法、例えば、溶媒を蒸散させて構造体を固化させる方法（液中乾燥法）、あるいは上記溶液あるいは懸濁液にこの液と混和するがＰＨＡを溶解しない溶媒（いわゆる貧溶媒）を添加しながら攪拌してＰＨＡを相分離させることによって固化した構造体を調製する方法（相分離法）、あるいは噴霧乾燥法等により固化した構造体を得る方法、あるいは前記油相の有機溶媒を除去後の固体をジェットミル等の方法を用いて構造体に粉砕する気体粉砕法、あるいは、これらに準ずる方法が用いられる。
【０２０５】
また、薬物および磁性体を有機溶剤中に溶解及び／又は懸濁させ、該有機相をＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む多量の水中に投入して乳化させてＯ／Ｗ型エマルションを得、ＰＨＡ合成反応を行うことにより、マイクロカプセル等の構造体を調製する方法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法）についても好適に用いることができる。
【０２０６】
＜有機溶媒具体例  −  親油性薬物を内包  −＞
前記有機溶媒としては、水に対する溶解度が、常温（２０℃）で３％（質量／質量）以下である有機溶媒が好ましい。また有機溶媒の沸点は１２０℃以下であることが好ましい。このような有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、ケトン類（例、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等）、エーテル類（例、テトラヒドロフラン、エチルエーテル、イソプロピルエーテル等）、エステル類（例、酢酸エチル、酢酸ブチル等）、芳香族炭化水素（例、ベンゼン、トルエン、キシレン等）等が挙げられる。これらは２種以上適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒は、さらに好ましくはハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）である。
【０２０７】
＜薬物／ＰＨＡの濃度  −  親油性薬物を内包  −＞
薬物の使用量は、薬物の種類、所望の持続性付与期間により異なるが、溶液中の濃度としては、約０．００１％ないし約２００％（質量／質量）、より好ましくは０．００１％ないし１００％（質量／質量）、とりわけ好ましくは０．０１％ないし５０％（Ｗ／Ｗ）から選ばれる。また、薬物の配合量としては、薬物の種類、所望の薬理効果および効果の持続期間等によって異なるが、ＰＨＡに対して約０．０１から約６０％（質量／質量）用いられる。好ましくは、約０．１から約５５％（質量／質量）用いられる。特に好ましくは、約１から約５０％（質量／質量）用いられる。ＰＨＡの濃度は、分子量、溶媒の種類によって異なるが、好ましくは約０．０１ないし約８０％（質量／質量）である。さらに好ましくは約０．１ないし約７０％（質量／質量）である。特に好ましくは約１ないし約６０％（質量／質量）である。
【０２０８】
＜液中乾燥法  −  親油性薬物を内包  −＞
液中乾燥法によりマイクロカプセル等の構造体を製造する場合は、通常、薬物、磁性体、ＰＨＡおよび有機溶媒を含む油相を水相中に分散させて、Ｏ／Ｗ型エマルションを形成させた後、油相中の溶媒を除去することにより行われる。水相の体積は、一般的には油相体積の約１ないし約１０，０００倍から選ばれる。好ましくは、約２ないし約５，０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約５ないし約２，０００倍から選ばれる。特に好ましくは約５０〜約１０００倍である。該水相の温度は予め例えば約５℃ないし約３０℃、好ましくは約１０℃ないし約２５℃、更に好ましくは約１０℃ないし約２０℃に調整しておいてもよい。上記水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般に安定なＯ／Ｗ型エマルションを形成できるものであればいずれでもよい。
【０２０９】
乳化剤としては、非毒性、非抗原乳化剤を用いることが好ましく、具体的には、例えばアニオン性界面活性剤（オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等）、カチオン性界面活性剤（ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等）、両性イオン性界面活性剤（Ｎ−ラウリルグリシン等）、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル〔ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、ツイーン６０、ツイーン４０、ツイーン２０、アトラスパウダー社〕、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体〔ＨＣＯ−７０、ＨＣＯ−６０、ＨＣＯ−５０、日光ケミカルズ〕等）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ハイドロオキシエチルセルロース、レシチン、澱粉、カゼイン、ペクチン、ゼラチン、アルギン酸、アルギン酸塩、ローカストビーンガム、グァーガム、アラビアガム、キサンタンガム、寒天、カラギーナン、ヒアルロン酸、胆汁酸塩、コール酸ナトリウム、ポリオキシエチレンエーテル等が挙げられる。これらの乳化剤は、２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。
【０２１０】
使用の際の乳化剤の濃度は、約０．００１〜約２０％（質量／容量）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０．０１〜約１０％（質量／容量）の範囲で用いられる。特に好ましくは約０．０５〜約５％（質量／容量）の範囲で用いられる。乳化工程には公知の混合装置が種々使い得る。例えば、断続振とう法、プロペラ型攪拌機あるいはタービン型攪拌機等のミキサーによる方法、回転子と固定子の間隔を狭くし、高速に回転する方法、超音波振動による方法、狭い間隔を音速以上の高速で通過させる方法、シラスバルーンを焼結した微細孔を有する無機質膜を通過させる方法等が挙げられる。
【０２１１】
このＯ／Ｗ型エマルションは、その乳化の程度で薬物の放出が影響を受け、乳化の程度が不十分であると初期バーストが大きくなる傾向にあり、内油相がある程度以上に微細な程、薬物とＰＨＡの相互作用が強く、ＰＨＡによる放出制御がＰＨＡの生分解性に依存して長期の放出制御をより正確にできるので好ましい。
【０２１２】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションを製造する際の構成成分を供給する態様も公知の技術に従い、種々の方法が取り得る。例えば、予めＰＨＡおよび磁性体溶液を容器に仕込み、そこへ乳化剤を含む水相成分を添加する方法、その添加順番を逆にする方法、あるいは両者を一定比率で連続的に供給する方法等が挙げられる。回転による混合の場合は、最初に示した順序が好ましく、この場合、初期にはＰＨＡおよび磁性体が連続相を成し、水相が分散相を形成するいわゆるＷ／Ｏ型エマルションであり、水相成分の添加量の増加に伴い、Ｗ／Ｏ型からＯ／Ｗ型への転相が生じ、油相の粒状体化が促進される。
【０２１３】
有機溶媒を除去する方法は、自体公知の方法に従って行うことができる。例えばプロペラ型撹拌機あるいはマグネチックスターラー等で撹拌しながら常圧もしくは徐々に減圧にして有機溶媒を蒸発させる方法、ロータリーエバポレーター等を用いて真空度を調節しながら有機溶媒を蒸発させる方法等が挙げられる。このＯ／Ｗ型エマルションから液中乾燥する際に、有機溶媒が揮発し、マイクロカプセル等の構造体が固化してその構造が決定される。このようにして得られた構造体は遠心分離あるいは瀘過して分取した後、構造体の表面に付着している遊離の薬物、薬物保持物質、乳化剤等を蒸留水で数回繰り返し洗浄し、蒸留水等に再分散して凍結乾燥する。
【０２１４】
＜相分離法  −  親油性薬物を内包  −＞
相分離法によりマイクロカプセル等の構造体を製造する場合は、薬物、磁性体及びＰＨＡとの有機溶媒溶液にコアセルベーション剤を一定速度で撹拌下徐々に加え、ＰＨＡを析出、固化させる。該コアセルベーション剤は、薬物とＰＨＡとの有機溶媒溶液の体積の約０．０１倍ないし約１，０００倍の体積量が加えられる。さらに好ましくは、約０．０５倍ないし約５００倍の体積量である。特に好ましくは、約０．１倍ないし約２００倍の体積量である。コアセルベーション剤としては、ＰＨＡの溶媒に混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合物で、ＰＨＡを溶解しないものであればよい。具体的には、例えばシリコーン油，ゴマ油，大豆油，コーン油，綿実油，ココナツ油，アマニ油，鉱物油，ｎ−ヘキサン，ｎ−ヘプタン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
【０２１５】
これらは２種以上混合して用いてもよい。このようにして得られたマイクロカプセル等の構造体は、瀘過して分取した後、ヘプタン等により繰り返し洗浄し、コアセルベーション剤を除去し、さらに、遊離薬物および溶媒の除去を行う。
【０２１６】
＜マイクロカプセルおよびその製造方法  −  液相を内包  −＞
本発明におけるマイクロカプセルは、シェル部にＰＨＡが含有され、コア部に少なくとも液相を有し、更に磁性体をシェル部及び／またはコア部に含有する微粒子状の構造体としての形態を有することができ、その形態は、先に詳細に説明した。
【０２１７】
このマイクロカプセルは、例えば、内水相と、ＰＨＡおよび磁性体を含む油相とからなるＷ／Ｏ型エマルション、あるいは、該Ｗ／Ｏ型エマルションをさらに外水相に乳化したＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション、ＰＨＡおよび磁性体を含む油相、および、外水相からなるＯ／Ｗ型エマルションをマイクロカプセル化することにより製造される。該マイクロカプセル化は、例えば液中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法またはこれらに準ずる方法によって行われる。
【０２１８】
また、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む溶液を内水相とするＷ／Ｏ型エマルション、あるいは、内水相と油相とからなるＷ／Ｏ型エマルションをさらに外水相に乳化したＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション（ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡは内水相及び外水相の少なくとも一方に含まれる）、あるいは、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む溶液を外水相とするＯ／Ｗ型エマルション、あるいは、該Ｏ／Ｗ型エマルションをさらに、外油相に乳化したＯ／Ｗ／Ｏ型エマルションを得、ＰＨＡ合成反応を行うことにより、マイクロカプセルを調製する方法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法）についても好適に用いることができる。
【０２１９】
＜Ｗ／Ｏ型エマルションの調製  −  液相を内包  −＞
内水相と、ＰＨＡおよび磁性体を含む油相とからなるＷ／Ｏ型エマルションは、以下のようにして製造することができる。
【０２２０】
まず、内水相における水は、外油相の有機溶剤溶液と比重を合わせるために無機塩または有機塩を溶解させた水溶液の形態とすることができる。前記無機塩としては、例えば塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化カルシウム、臭化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等があげられる。
【０２２１】
また、有機塩としては、例えば酢酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、リン酸、アスコルビン酸等の有機酸のナトリウム塩、カリウム塩等があげられる。これらのうち、本発明では、特に、経済性、比重の合わせ易さ、洗浄の容易さの点から塩化カルシウム水溶液を使用するのが望ましい。これらの無機塩または有機塩は、ＰＨＡおよび磁性体の有機溶剤溶液との比重を合わせるうえで、約１〜６０（重量／容量）％、好ましくは約２０〜５０（重量／容量）％の濃度となるように水に添加される。これにより油相内に水滴が均一に分散したＷ／Ｏ型エマルションを得ることができる。
【０２２２】
このようにして得られる内水相とＰＨＡおよび磁性体を含む溶液（油相）を混合し、ついで乳化操作を行いＷ／Ｏ型エマルションを調製する。該乳化操作としては、公知の方法が用いられる。例えば、断続振盪法、プロぺラ型攪拌機、タービン型攪拌機等のミキサーを用いる攪拌法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法等が挙げられる。本発明では、これらの方法を適宜組み合わせて使用してもよい。特に、このＷ／Ｏ型エマルションを調製する一次乳化は、最終目的であるマイクロカプセル構造の均一性を保証するために重要であり、この段階で内水相をできる限りＰＨＡの有機溶剤溶液内に均一に分散させることが必要である。このためには、内水相の水滴径をできるだけ小さくするのが好ましいので、超音波照射法を他の分散法と組み合わせる方法が好適に採用される。
【０２２３】
上記したＰＨＡおよび磁性体を含む溶液（油相）としては、該ＰＨＡを水と実質的に混和しない有機溶媒に溶解したものが用いられる。該有機溶媒の水に対する溶解度は、好ましくは、常温（２０℃）で３質量％以下である。また有機溶媒の沸点は１２０℃以下であることが好ましい。有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、ケトン類（例、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等）、エーテル類（例、テトラヒドロフラン、エチルエーテル、イソプロピルエーテル等）、エステル類（例、酢酸エチル、酢酸ブチル等）、芳香族炭化水素（例、ベンゼン、トルエン、キシレン等）等が挙げられる。これらは２種以上適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒は、さらに
好ましくはハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）である。油相におけるＰＨＡの濃度は、該ＰＨＡの種類、分子量、溶媒の種類によって異なるが、好ましくは約０．０１〜８０質量％である。さらに好ましくは約０．１〜７０質量％である。特に好ましくは約１〜６０質量％である。
【０２２４】
油相に分散する磁性体としては、例えば、磁性を有する金属または金属化合物が挙げられ、さらに具体的には、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、ＭｎＺｎフェライト、ＮｉＺｎフェライト、  ＹＦｅガーネット、ＧａＦｅガーネット、Ｂａフェライト、Ｓｒフェライト等各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル、クロム等の金属、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル等の合金が挙げられる。また、油相における磁性体の処方量は、該磁性体の種類、溶媒の種類、ＰＨＡの処方量、等により異なるが、構造体の含有する磁性体の量が１〜８０質量％、好ましくは５〜７０質量％、さらに好ましくは１０〜６０質量％になるように処方するとよい。
【０２２５】
なお、内水相との相溶性、後述する外水相への有機溶媒の分配、揮散等を変化させるため、油相に一部親水性の有機溶媒、例えばエタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン等を添加してもよい。また、ＰＨＡの安定性に依存するが、ＰＨＡを含む溶液を室温ないし冷所で密閉容器の中で保存してもよい。
【０２２６】
水溶液とＰＨＡを含む有機溶媒溶液との混合割合は、前者１重量部当たり、後者が約０．１〜１０００重量部、好ましくは約１〜１００重量部である。
【０２２７】
＜Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションの調製＆液中乾燥法  −  液相を内包  −＞
ついで、このようにして得られるＷ／Ｏ型エマルションをマイクロカプセル化工程に付す。例えば液中乾燥法等によりマイクロカプセル化を行う場合、Ｗ／Ｏ型エマルションをさらに水相（外水相）に加え、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションを製造した後、油相中の有機溶媒を除去し、マイクロカプセルを調製する。
【０２２８】
外水相の体積は、一般的には油相体積の約１ないし約１０、０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２ないし約５、０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５ないし約２、０００倍から選ばれる。
【０２２９】
外相の水相中には乳化剤を加えてもよく、その例としては、一般に安定なＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを形成するものであればいずれでもよいが、たとえば、アニオン界面活性剤（例、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等）、非イオン性界面活性剤〔ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、アトラスパウダー社製、米国）、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体（ＨＣＯ−７０、ＨＣＯ−６０、ＨＣＯ−５０、日光ケミカルズ社製）等〕、あるいはポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸それらの誘導体等が挙げられ、これらの中の一種類か、いくつかを組み合わせて使用してもよい。外水相における乳化剤の濃度は、約０．０１〜２０質量％、好ましくは約０．０５〜１０質量％の範囲から適宜決定される。
【０２３０】
上記外水相中に浸透圧調節剤を加えてもよい。本発明で用いられる浸透圧調節剤としては、水溶液とした場合浸透圧を示すものであればいかなる物質であってもよい。該浸透圧調節剤の具体例としては、例えば水溶性の多価アルコール類、水溶性の一価アルコール類、水溶性の単糖類、二糖類およびオリゴ糖あるいはそれらの誘導体、水溶性のアミノ酸、水溶性のペプチド、タンパク質あるいはそれらの誘導体等が挙げられる。
【０２３１】
上記水溶性の多価アルコール類としては、例えばグリセリン等の二価アルコール類、アラビトール、キシリトール、アドニトール等の五価アルコール類、マンニトール、ソルビトール、ズルシトール等の六価アルコール類等が挙げられる。これらのうち六価のアルコール類が好ましい。なかでも、マンニトールが特に好ましい。上記水溶性の一価アルコール類としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等が挙げられる。これらのうちエタノールが好ましい。上記水溶性の単糖類としては、例えばアラビノース、キシロース、リボース．２−デオキシリボース等の五炭糖類、ブドウ糖、果糖、ガラクトース、マンノース、ソルボース、ラムノース、フコース等の六炭糖類が挙げられる。これらのうち六炭糖類が好ましい。上記水溶性の二糖類としては、例えば麦芽糖、セロビオース、α、α−トレハロース、乳糖、ショ糖等が挙げられる。これらのうち乳糖、ショ糖が好ましい。上記水溶性のオリゴ糖としては、例えばマルトトリオース、ラフィノース等の三糖類、スタキオース等の四糖類等が挙げられる。これらのうち三糖類が好ましい。上記水溶性の単糖類、二糖類およびオリゴ糖の誘導体としては、例えばグルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、ガラクツロン酸等が挙げられる。
【０２３２】
上記水溶液のアミノ酸としては、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、システイン、メチオニン等の中性アミノ酸、アイパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等が挙げられる。またこれらの水溶性アミノ酸の酸（例、塩酸、硫酸、リン酸等）またはアルカリ（例、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等）との塩を用いてもよい。水溶性のペプチド、タンパク質あるいはそれらの誘導体としては、例えばカゼイン、グロブリン、プロラミン、アルブミン、ゼラチン等が挙げられる。
【０２３３】
上記浸透圧調節剤のうち水溶性の多価アルコール類、ならびに水溶性の単糖類、二糖類およびオリゴ糖あるいはそれらの誘導体が好ましい。水溶性の多価アルコール類、水溶性の単糖類が更に好ましい。特に好ましくは水溶性の多価アルコール類である。これら浸透圧調節剤は、単独で使用しても、１種以上を混合して使用してもよい。これらの浸透圧調節剤は、外水相の浸透圧が生理食塩水の浸透圧の約１／５０ないし約５倍、好ましくは約１／２５ないし約３倍となる濃度で用いられる。具体的には、これらの浸透圧調節剤の外水相中での濃度は、浸透圧調節剤が非イオン性物質の場合、約０．００１〜６０質量％、好ましくは約０．０１〜４０質量％、より好ましくは約０．０５〜３０質量％、特に好ましくは約１〜１０質量％である。また、浸透圧調節剤がイオン性物質の場合、上記の濃度を全体のイオン価で除した濃度が用いられる。浸透圧調節剤の添加濃度は、溶解度以下である必要はなく、一部が分散状態であってもよい。
【０２３４】
Ｗ／Ｏ型エマルションの水への乳化にあたっては、Ｗ／Ｏ型エマルションを水に分散させた後、攪拌操作を加える。攪拌操作としては、前述の乳化方法がいずれも採用可能であるが、特にホモジナイザーを用いるのが単一層の有機溶剤溶液相で水を包み込んだ構造を有する有機溶剤溶液のマイクロカプセルを得るうえで好ましい。ホモジナイザーを用いる場合は、１００  〜１００、０００ｒｐｍ、好ましくは１、０００  〜５０、０００ｒｐｍ  で０．１  〜３０分間、好ましくは０．５  〜２０分間操作するのがよい。
【０２３５】
かかる操作により外部水相中でのＷ／Ｏ型エマルション滴の径を小さくする。つまり、このホモジナイザーによる攪拌はＷ／Ｏ型エマルション滴内の水相の分散状態を変えることなく、Ｗ／Ｏ型エマルション滴の径を低下させるのに有効である。ここで、Ｗ／Ｏ型エマルション滴の径を１  〜２０μｍ  にまで低下させることが最終的に得られるマイクロカプセルを高分子一枚膜構造とするためには重要である。次にこの状態で、プロペラ攪拌機等で攪拌下放置する。この際、Ｗ／Ｏ型エマルション滴中の内水相は不安定であるため、ＰＨＡの固化以前に互いに合一して混ざり合い、大きな一つの水滴になる。一方、Ｗ／Ｏ型エマルション自体は外水相内の乳化剤によって安定化されているため、結果として、内水相が単一層であるＰＨＡの有機溶剤溶液相で囲まれたカプセル構造が形成されることになる。
【０２３６】
かかるカプセル構造をもつＷ／Ｏ型エマルション滴の形成を促すうえで、内水相の塩の種類およびその量、油相内のポリマーの濃度、油相（Ｗ／Ｏ型エマルション滴）およびこれを乳化させる外水相の各温度、さらに油相と水相の量比を適宜調節するのが好ましい。特に内水相内に無機塩を用いることで内水相の表面張力が増大し、水相の不安定化が促進され、粒子作成過程でＷ／Ｏ型エマルション滴内の水相がお互いに合一し、一枚膜構造のエマルションの割合が増加する。
【０２３７】
本発明の製造法において、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させる際にＷ／Ｏ型乳化物の粘度を５０ｃｐから１０、０００ｃｐの範囲内に調整することが好ましい。粘度を調整する方法としては、例えば（１）油相のＰＨＡおよび磁性体の濃度を調整する、（２）水相と油相との量比を調整する、（３）Ｗ／Ｏ型乳化物の温度を調整する、（４）外水相の温度を調整する、（５）Ｗ／Ｏ型乳化物を外水相に注入する際に、例えばラインヒーター、クーラー等でＷ／Ｏ型乳化物の温度を調整する等の方法が挙げられ、これらの方法は単独でも、組み合わせて使用してもよい。上記方法においては、要は、Ｗ／Ｏ型乳化物がＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物になる時のＷ／Ｏ型乳化物の粘度が５０ｃｐから１０、０００ｃｐの範囲内になるようにしさえすればよい。上記（１）において、油相のＰＨＡの濃度を調整する場合の濃度は、ＰＨＡの種類、有機溶媒の種類等で変化するので一義的に決定されるものではないが、好ましくは約１０〜８０質量％である。上記（２）において、水相と油相との量比を調整する場合の量比は、油相の性質等によって一義的に決定されるものではないが、好ましくはＷ／Ｏ＝約１〜５０体積％である。上記（３）において、Ｗ／Ｏ型乳化物の温度を調整する場合の温度は、例えば約−２０℃ないし有機溶媒の沸点の範囲、好ましくは約０〜３０℃、更に好ましくは約１０〜２０℃である。Ｗ／Ｏ型乳化物の粘度調整の時期は、上記（１）および（２）の場合は、Ｗ／Ｏ型乳化物を製造する時点で行うことができる。また、上記（４）において、例えば外水相にＷ／Ｏ型乳化物を添加する際に外水相の温度をあらかじめ調整しておくことにより、上記（３）と同様の結果となるようにすればよい。外水相の温度は、例えば約５〜３０℃、好ましくは約１０〜２５℃、更に好ましくは約１２〜２０℃である。
【０２３８】
有機溶媒を除去する方法は、公知の方法に従って行うことができる。例えばプロペラ型撹拌機あるいはマグネチックスターラー等で撹拌しながら常圧もしくは徐々に減圧にして有機溶媒を蒸発させる方法、ロータリーエバポレーター等を用いて真空度、温度を調節しながら有機溶媒を蒸発させる方法等が挙げられる。
【０２３９】
この後、必要に応じて、マイクロカプセルを遠心分離あるいはろ別により分取し、マイクロカプセルの表面に付着している乳化剤等を蒸留水で数回繰り返し洗浄し、さらに減圧乾燥、あるいは蒸留水に再分散後に凍結乾燥等により残存した溶媒・水分の除去を行っても良く、また、前記工程にて調製したマイクロカプセルスラリーを、そのまま適当な分散媒に分散し用いても良い。  蒸留水に再分散する際には分散剤を加えても良い。前記分散剤はマイクロカプセルの凝集を防止する作用を有する。分散剤としては、例えばＴｗｅｅｎ８０  系界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル、マンニトール、ソルビトール、グルコース、ガラクトース、ショ糖等が挙げられる。この分散剤は約０．００１  〜３０質量％濃度で水に溶解して使用される。
【０２４０】
また、生成したＰＨＡ一枚膜構造をもつマイクロカプセルはそのまま再分散させてもよいが、その中には多孔質構造をもつものが含まれるため、洗浄後、低速で遠心分離して非沈澱物と沈澱物とに分けてもよい。この遠心分離は約５０〜３、０００ｒｐｍの範囲の回転数で１〜６０分間行うのが適当である。また、遠心分離は数回行うのが好ましい。
【０２４１】
遠心分離により非沈澱物相にはＰＨＡからなる一枚膜構造のマイクロカプセルが回収される。また、乾燥したマイクロカプセルを得るために、必要ならば加温して行う減圧乾燥法、凍結乾燥法等が使用可能であるが、凍結乾燥法を使用するのが好ましい。
【０２４２】
かくして粒径が１  〜１０μｍ  のマイクロカプセルが得られる。このマイクロカプセルは後述の実施例に記載のようにカプセル表面に孔のない球形である。
【０２４３】
＜相分離法  −  液相を内包  −＞
相分離法によりマイクロカプセル化を行う場合、攪拌下、Ｗ／Ｏ型エマルションにコアセルベーション剤を徐々に加え、ＰＨＡを析出、固化させることにより、マイクロカプセルを調製する。コアセルベーション剤としては、ＰＨＡの溶剤に混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合物で、カプセル化用のＰＨＡを溶解しないものであればよく、例えばシリコーン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、メタノール、エタノール等が挙げられる。これらは２種以上を混合して用いてもよい。コアセルベーション剤の使用量は、Ｗ／Ｏ型エマルションに対し、例えば約０．０１〜１、０００容量倍、好ましくは約０．１〜２００容量倍である。このようにして得られるマイクロカプセルを、遠心分離あるいはろ過により分取した後、ヘキサン、ヘプタン等の洗浄液で繰り返し洗浄して、コアセルベーション剤を除去し、その後、加温ないし減圧して洗浄液を蒸発させる。さらに、所望により、上記した水中乾燥法の場合と同様にして、有機溶媒の除去を行う。
【０２４４】
＜噴霧乾燥法  −  液相を内包  −＞
噴霧乾燥法によりマイクロカプセル化を行う場合、Ｗ／Ｏ型エマルションまたは水中乾燥法の場合と同様にして製造したＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを、ノズルを用いてスプレードライヤー装置（噴霧乾燥機）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒および水を揮発させることにより、微粒状のマイクロカプセルを調製する。ノズルとしては、例えば二液体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型が挙げられる。このようにして得られるマイクロカプセルを、所望により、蒸留水で数回繰り返し洗浄して、マイクロカプセルの表面に付着している乳化剤等を除去する。ついで、洗浄されたマイクロカプセルを、減圧乾燥するか、あるいは蒸留水に再分散後凍結乾燥して、さらに有機溶媒の除去を行ってもよい。
【０２４５】
＜Ｏ／Ｗ型エマルションの調製  −  液相を内包  −＞
Ｏ／Ｗ型エマルションから液中乾燥法によりマイクロカプセルを製造する場合は、通常、ＰＨＡ、磁性体および有機溶媒を含む油相を水相中に分散させて、Ｏ／Ｗ型エマルションを形成させた後、油相中の溶媒を除去することにより行われる。水相の体積は、一般的には油相体積の約１ないし約１０、０００倍から選ばれる。好ましくは、約２ないし約５、０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約５ないし約２、０００倍から選ばれる。特に好ましくは約５０〜約１０００倍である。該水相の温度は予め例えば約５℃ないし約３０℃、好ましくは約１０℃ないし約２５℃、更に好ましくは約１０℃ないし約２０℃に調整しておいてもよい。上記水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般に安定なＯ／Ｗ型エマルションを形成できるものであればいずれでもよく、前述の乳化剤を好適に用いることができる。使用の際の乳化剤の濃度は、約０．００１〜約２０％（質量／容量）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０．０１〜約１０％（質量／容量）の範囲で用いられる。特に好ましくは約０．０５〜約５％（質量／容量）の範囲で用いられる。また、乳化工程についても、前述した公知の混合装置が種々使い得る。
【０２４６】
特に、このＯ／Ｗ型エマルションを調製する乳化は、最終目的であるマイクロカプセルの構造の均一性を保証するために重要であり、この段階でＰＨＡおよび磁性体を含む内油相をできる限り外水相内に均一に分散させることが必要である。このためには、内油相の液滴径をできるだけ小さくするのが好ましいので、超音波照射法を他の分散法と組み合わせる方法が好適に採用される。
【０２４７】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションを製造する際の構成成分を供給する態様も公知の技術に従い、種々の方法が取り得る。例えば、予めＰＨＡ溶液を容器に仕込み、そこへ乳化剤を含む水相成分を添加する方法、その添加順番を逆にする方法、あるいは両者を一定比率で連続的に供給する方法等が挙げられる。回転による混合の場合は、最初に示した順序が好ましく、この場合、初期にはＰＨＡおよび磁性体が連続相を成し、水相が分散相を形成するいわゆるＷ／Ｏ型エマルションであり、水相成分の添加量の増加に伴い、Ｗ／Ｏ型からＯ／Ｗ型への転相が生じ、油相の微粒子化が促進される。
【０２４８】
有機溶媒を除去する方法は、前述の方法に従って行うことができる。このようにして得られたマイクロカプセルは、必要に応じて、遠心分離あるいは瀘過して分取した後、マイクロカプセルの表面に付着している乳化剤等を蒸留水で数回繰り返し洗浄し、蒸留水等に再分散して凍結乾燥して用いても良く、また、前記工程にて調製したマイクロカプセルスラリーを、そのまま適当な分散媒に分散し用いても良い。
【０２４９】
＜中空構造体およびその製造方法＞
本発明における中空マイクロカプセル等の中空構造体は、少なくとも、内部に気泡を含む、そのカプセル外被にＰＨＡを含有する微粒子としての形態をとることができ、その形態は、先に詳細に説明した。
【０２５０】
本発明の超音波造影剤に利用可能な中空構造体は、例えば、内水相、および、有機溶媒、磁性体とＰＨＡとを含む溶液を油相とするＷ／Ｏ型エマルション、または、該Ｗ／Ｏ型エマルションをさらに外水相に乳化したＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション、あるいは、有機溶媒、磁性体とＰＨＡとを含む溶液の内油相、および、外水相からなるＯ／Ｗ型エマルションを基に、その油相中のＰＨＡを固化することで、中空マイクロカプセル化することにより製造される。該中空マイクロカプセル化は、例えば、液中乾燥法、相分離法、噴霧乾燥法またはこれらに準ずる方法によって行われる。
【０２５１】
また、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む溶液を内水相とするＷ／Ｏ型エマルション、または、内水相と油相からなるＷ／Ｏ型エマルションをさらに外水相に乳化したＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション（ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡは内水相と外水相の少なくとも一方に含有される）、あるいは、ＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む溶液を外水相とするＯ／Ｗ型エマルション、または、該Ｏ／Ｗ型エマルションをさらに外油相に乳化したＯ／Ｗ／Ｏ型エマルションを作製した上で、水相においてＰＨＡ合成反応を行い、これをカプセル化することにより、中空構造体を調製する方法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法）も好適に用いることができる。
【０２５２】
＜Ｗ／Ｏ型エマルションの調製  −  中空構造体  −＞
本発明の中空構造体を製造する際に利用する、内水相と、ＰＨＡおよび磁性体を含む油相とからなるＷ／Ｏ型エマルションは、以下のようにして調製することができる。
【０２５３】
まず、内水相に用いる水は、外油相の有機溶剤溶液と比重を合わせるため、必要に応じて、無機塩または有機塩を溶解させた水溶液の形態とすることができる。前記無機塩としては、例えば、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化カルシウム、臭化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等があげられる。また、有機塩としては、例えば、酢酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、リン酸、アスコルビン酸等の有機酸のナトリウム塩、カリウム塩等があげられる。
【０２５４】
これらの水溶性塩のうち、本発明では、特に、経済性、比重調整の容易さ、洗浄の容易さの点から、塩化カルシウムを使用することが望ましい。これらの無機塩または有機塩は、ＰＨＡの有機溶剤溶液との比重を合わせる上では、約１〜６０（質量／容量）％、好ましくは、約２０〜５０（質量／容量）％の濃度となるように水に添加される。これにより、水溶液の比重と、ＰＨＡおよび磁性体を含む油相の比重との差異を無くすことで、油相内に水滴が均一に分散したＷ／Ｏ型エマルションを得ることができる。
【０２５５】
内水相とする、前記の比重調整を施した水溶液と、ＰＨＡおよび磁性体を含む溶液（油相）とを混合し、ついで乳化操作を行いＷ／Ｏ型エマルションを調製する。この乳化操作では、公知の方法が用いられる。例えば、断続振盪法、プロぺラ型攪拌機、タービン型攪拌機等のミキサーを用いる攪拌法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法等が挙げられる。本発明では、これらの方法を適宜組み合わせて使用してもよい。特に、このＷ／Ｏ型エマルションを調製する一次乳化は、そのＷ／Ｏ型エマルションの内水相の水滴径が、形成される中空構造体の中空部の大きさ、さらには、中空構造体の外径をも規定するので、最終目的である中空構造体の中空構造の均一性を保証するために重要である。すなわち、いずれの中空構造体にも同程度の一枚膜中空構造をもたせるためには、この段階で内水相をできる限りＰＨＡおよび磁性体を含む有機溶剤溶液内に均一に分散させることが必要である。加えて、作製された中空構造体を超音波造影剤として使用する上では、中空構造体の外径を、例えば、１０μｍ以下に留めることが望ましい。これをも考慮すると、内水相の水滴径をできるだけ小さくするのが好ましいので、超音波照射法を他の分散法と組み合わせる方法が好適に採用される。
【０２５６】
上記したＰＨＡおよび磁性体を含む溶液（油相）は、該ＰＨＡを水と実質的に混和しない有機溶媒に溶解したものが用いられる。該有機溶媒の水に対する溶解度は、好ましくは、常温（２０℃）で３質量％以下である。また有機溶媒の沸点は１２０℃以下であることが好ましい。有機溶媒としては、例えば、ハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン，クロロホルム，クロロエタン，ジクロロエタン，トリクロロエタン，四塩化炭素等）、ケトン類（例、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等）、エーテル類（例、テトラヒドロフラン、エチルエーテル、イソプロピルエーテル等）、エステル類（例、酢酸エチル、酢酸ブチル等）、芳香族炭化水素（例、ベンゼン，トルエン，キシレン等）等が挙げられる。これらの有機溶媒は、２種以上適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒は、さらに好ましくは、ハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン，クロロホルム，クロロエタン，ジクロロエタン，トリクロロエタン，四塩化炭素等）である。油相におけるＰＨＡの濃度は、該ＰＨＡの種類、分子量、溶媒の種類によって異なるが、好ましくは、約０．０１〜８０質量％である。さらに好ましくは、約０．１〜７０質量％である。特に好ましくは、約１〜６０質量％である。
【０２５７】
油相に分散する磁性体としては、例えば、磁性を有する金属または金属化合物が挙げられ、さらに具体的には、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、ＭｎＺｎフェライト、ＮｉＺｎフェライト、  ＹＦｅガーネット、ＧａＦｅガーネット、Ｂａフェライト、Ｓｒフェライト等各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル、クロム等の金属、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル等の合金が挙げられる。また、油相における磁性体の処方量は、該磁性体の種類、溶媒の種類、ＰＨＡの処方量、等により異なるが、構造体の含有する磁性体の量が１〜８０質量％、好ましくは５〜７０質量％、さらに好ましくは１０〜６０質量％になるように処方するとよい。
【０２５８】
なお、内水相との相溶性、外水相への有機溶媒の分配、揮散等を変化させるため、油相に一部親水性の有機溶媒、例えば、エタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン等を添加してもよい。また、ＰＨＡの安定性に依存するが、ＰＨＡを含む溶液を調製した後、それを室温ないし冷所で密閉容器の中で保存してもよい。
【０２５９】
水溶液とＰＨＡを含む有機溶媒溶液との混合割合は、前者１質量部当たり、後者が約０．１〜１０００質量部、好ましくは約１〜１００質量部である。
【０２６０】
＜Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションの調製、ならびに液中乾燥法  −  中空構造体  −＞
ついで、得られたＷ／Ｏ型エマルションを中空マイクロカプセル化工程に付す。例えば、液中乾燥法等により中空マイクロカプセル化を行う場合、Ｗ／Ｏ型エマルションを、さらに水相（以下、外水相と略記する）に加え、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションを製造した後、油相中の有機溶媒を除去し、中空構造体を調製する。
【０２６１】
外水相の容量は、一般的には、油相容量の約１ないし約１０，０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２ないし約５，０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５ないし約２，０００倍から選ばれる。
【０２６２】
外水相中には乳化剤を加えてもよく、その例としては、一般に安定なＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを形成するものであればいずれでもよいが、たとえば、アニオン界面活性剤（例、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等）、非イオン性界面活性剤〔ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ  ８０，Ｔｗｅｅｎ  ６０，アトラスパウダー社製，米国）、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体（ＨＣＯ−７０，ＨＣＯ−６０，ＨＣＯ−５０，日光ケミカルズ社製）等〕、あるいはポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ヒアルロン酸それらの誘導体等が挙げられ、これらの中の一種類か、いくつかを組み合わせて使用してもよい。外水相における乳化剤の濃度は、約０．０１〜２０質量％、好ましくは、約０．０５〜１０質量％の範囲から適宜決定される。
【０２６３】
上記外水相中に浸透圧調節剤を加えてもよい。本発明の製造方法で用いられる浸透圧調節剤としては、水溶液とした場合、浸透圧を示すものであればいかなる物質であってもよい。該浸透圧調節剤の具体例としては、例えば、水溶性の多価アルコール類、水溶性の一価アルコール類、水溶性の単糖類、二糖類およびオリゴ糖あるいはそれらの誘導体、水溶性のアミノ酸、水溶性のペプチド，タンパク質あるいはそれらの誘導体等が挙げられる。
【０２６４】
上記水溶性の多価アルコール類としては、例えば、グリセリン等の二価アルコール類、アラビトール，キシリトール，アドニトール等の五価アルコール類、マンニトール，ソルビトール，ズルシトール等の六価アルコール類等が挙げられる。これらのうち六価のアルコール類が好ましい。なかでも、マンニトールが特に好ましい。上記水溶性の一価アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等が挙げられる。これらのうちエタノールが好ましい。上記水溶性の単糖類としては、例えば、アラビノース，キシロース，リボース．２−デオキシリボース等の五炭糖類、ブドウ糖，果糖，ガラクトース，マンノース，ソルボース，ラムノース，フコース等の六炭糖類が挙げられる。これらのうち、六炭糖類が好ましい。上記水溶性の二糖類としては、例えば、麦芽糖、セロビオース、α，α−トレハロース、乳糖、ショ糖等が挙げられる。これらのうち、乳糖、ショ糖が好ましい。上記水溶性のオリゴ糖としては、例えば、マルトトリオース，ラフィノース等の三糖類、スタキオース等の四糖類等が挙げられる。それらのうちでは、三糖類が好ましい。上記水溶性の単糖類、二糖類およびオリゴ糖の誘導体としては、例えば、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、ガラクツロン酸等が挙げられる。
【０２６５】
上記水溶性のアミノ酸としては、例えば、グリシン，アラニン，バリン，ロイシン，イソロイシン，フェニルアラニン，チロシン，トリプトファン，セリン，トレオニン，プロリン，ヒドロキシプロリン，システイン，メチオニン等の中性アミノ酸、アイパラギン酸，グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン，アルギニン，ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等が挙げられる。またこれらの水溶性アミノ酸の酸（例、塩酸，硫酸，リン酸等）またはアルカリ（例、ナトリウム，カリウム等のアルカリ金属等）との塩を用いてもよい。水溶性のペプチド，タンパク質あるいはそれらの誘導体としては、例えばカゼイン，グロブリン，プロラミン，アルブミン，ゼラチン等が挙げられる。
【０２６６】
上記浸透圧調節剤のうち水溶性の多価アルコール類、ならびに水溶性の単糖類、二糖類およびオリゴ糖あるいはそれらの誘導体が好ましい。水溶性の多価アルコール類、水溶性の単糖類が更に好ましい。特に好ましくは水溶性の多価アルコール類である。これら浸透圧調節剤は、単独で使用しても、１種以上を混合して使用してもよい。これらの浸透圧調節剤は、外水相の浸透圧が生理食塩水の浸透圧の約１／５０ないし約５倍、好ましくは約１／２５ないし約３倍となる濃度で用いられる。具体的には、これらの浸透圧調節剤の外水相中での濃度は、浸透圧調節剤が非イオン性物質の場合、約０．００１〜６０質量％、好ましくは約０．０１〜４０質量％、より好ましくは約０．０５〜３０質量％、特に好ましくは約１〜１０質量％である。また、浸透圧調節剤がイオン性物質の場合、上記の濃度を全体のイオン価で除した濃度が用いられる。ただし、浸透圧調節剤の添加濃度は、溶解度以下である必要はなく、一部が分散状態であってもよい。
【０２６７】
Ｗ／Ｏ型エマルションの水への乳化にあたっては、Ｗ／Ｏ型エマルションを水に分散させた後、攪拌操作を加える。攪拌操作としては、前述の乳化方法がいずれも採用可能であるが、特にホモジナイザーを用いることが、単一層の有機溶剤溶液相で水を包み込んだ構造を有する有機溶剤溶液のエマルション粒子（マイクロカプセル）を得る上で好ましい。ホモジナイザーを用いる場合は、１００  〜１００，０００ｒｐｍ、好ましくは１，０００  〜５０，０００ｒｐｍ  で０．１  〜３０分間、好ましくは０．５  〜２０分間操作するのがよい。
【０２６８】
かかる操作により、外部水相中でのＷ／Ｏ型エマルション滴の外径を小さくする。つまり、このホモジナイザーによる攪拌はＷ／Ｏ型エマルション滴内の水相の分散状態を変えることなく、Ｗ／Ｏ型エマルション滴の外径を低下させるのに有効である。ここで、Ｗ／Ｏ型エマルション滴の外径を１  〜２０μｍにまで低下させることが、最終微粒子を高分子一枚膜構造とするためには重要である。次に、この状態で、プロペラ攪拌機等で攪拌下放置する。この際、Ｗ／Ｏ型エマルション滴中の内水相は不安定であるため、ＰＨＡの固化以前に、微細な水滴が互いに合一して混ざり合い、より大きな一つの微小水滴になる。一方、Ｗ／Ｏ型エマルション自体は外水相内の乳化剤によって安定化されているため、結果として、内水相が単一層であるＰＨＡおよび磁性体の有機溶剤溶液相で囲まれたカプセル構造が形成されることになる。
【０２６９】
かかるカプセル構造をもつＷ／Ｏ型エマルション滴の形成を促すうえで、内水相の塩の種類およびその量、油相内のポリマーの濃度、油相（Ｗ／Ｏ型エマルション滴）およびこれを乳化させる外水相の各温度、さらに油相と水相の量比を適宜調節するのが好ましい。特に、内水相内に無機塩を用いることで内水相の表面張力が増大し、水相の不安定化が促進され、粒子作成過程でＷ／Ｏ型エマルション滴内の水相がお互いに合一し、一枚膜構造のエマルションの割合が増加する。
【０２７０】
本発明の製造方法において、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させる際に、Ｗ／Ｏ型乳化物の粘度を５０ｃｐから１０，０００ｃｐの範囲内に調整することが好ましい。粘度を調整する方法としては、例えば、（１）油相のＰＨＡおよび磁性体の濃度を調整する、（２）水相と油相との量比を調整する、（３）Ｗ／Ｏ型乳化物の温度を調整する、（４）外水相の温度を調整する、（５）Ｗ／Ｏ型乳化物を外水相に注入する際に、例えば、ラインヒーター、クーラー等でＷ／Ｏ型乳化物の温度を調整する等の方法が挙げられ、これらの方法は単独でも、組み合わせて使用してもよい。上記方法を用いて、Ｗ／Ｏ型乳化物を、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳化物にする際、そのＷ／Ｏ型乳化物の粘度を５０ｃｐから１０，０００ｃｐの範囲内になるように、一時的に粘度を調整しさえすればよい。上記（１）において、油相のＰＨＡの濃度を調整する場合、そのＰＨＡの濃度は、ＰＨＡの種類、有機溶媒の種類等で変化するので一義的に決定されるものではないが、好ましくは、約１０〜８０質量％である。上記（２）において、水相と油相との量比を調整する場合の量比は、油相の性質等によって一義的に決定されるものではないが、好ましくは、Ｗ／Ｏ＝約１〜５０（容量／容量）％である。上記（３）において、Ｗ／Ｏ型乳化物の温度を調整する場合、その温度は、例えば、約−２０℃ないし有機溶媒の沸点の範囲、好ましくは約０〜３０℃、更に好ましくは約１０〜２０℃である。Ｗ／Ｏ型乳化物の粘度調整の時期は、上記（１）および（２）の場合は、Ｗ／Ｏ型乳化物を製造する時点で行うことができる。また、上記（４）において、例えば、外水相にＷ／Ｏ型乳化物を添加する際に、外水相の温度を予め調整しておくことにより、上記（３）と同様の結果となるようにすればよい。外水相の温度は、例えば、約５〜３０℃、好ましくは約１０〜２５℃、更に好ましくは約１２〜２０℃である。
【０２７１】
有機溶媒を除去する方法は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、プロペラ型撹拌機あるいはマグネチックスターラー等で撹拌しながら常圧もしくは徐々に減圧にして有機溶媒を蒸発させる方法、ロータリー・エバポレーター等を用いて真空度、温度を調節しながら有機溶媒を蒸発させる方法等が挙げられる。
【０２７２】
この後、微粒子状の中空構造体を遠心分離あるいはろ別により分取し、中空構造体の表面に付着している乳化剤等を蒸留水で数回繰り返し洗浄し、さらに減圧乾燥、あるいは蒸留水に再分散後に凍結乾燥等により残存した溶媒・水分の除去を行う。
【０２７３】
蒸留水に再分散する際に分散剤を加えても良い。前記分散剤は中空構造体の凝集を防止する作用を有する。分散剤としては、例えばＴｗｅｅｎ８０  系界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル、マンニトール、ソルビトール、グルコース、ガラクトース、ショ糖等が挙げられる。この分散剤は、約０．００１  〜３０質量％濃度で水に溶解して使用される。
【０２７４】
また、生成したＰＨＡ一枚膜構造をもつ微粒子はそのまま再分散させてもよいが、その中には多孔質構造をもつものが含まれるため、洗浄後、低速で遠心分離して非沈澱物と沈澱物とに分けてもよい。この遠心分離は約５０〜３，０００ｒｐｍの範囲の回転数で１〜６０分間行うのが適当である。また、遠心分離は数回行うのが好ましい。
【０２７５】
遠心分離により非沈澱物相にはＰＨＡからなる一枚膜構造の磁性体含有中空構造体が回収され、この一枚膜構造中空構造体を使用した超音波造影剤は高い超音波造影効果を発揮する。また、乾燥した微粒子を得るために、必要ならば加温して行う減圧乾燥法、凍結乾燥法等が使用可能であるが、凍結乾燥法を使用するのが好ましい。
【０２７６】
かくして粒径が１  〜１０μｍ  の中空構造体が得られる。この中空構造体は後述の実施例に記載のように微粒子表面に孔のない、内部に中空体を多く含む球形である。
【０２７７】
＜相分離法  −  中空構造体  −＞
相分離法により中空マイクロカプセル化を行う場合、攪拌下、Ｗ／Ｏ型エマルションにコア・セルベーション剤を徐々に加え、ＰＨＡを析出、固化させることにより、中空構造体を調製する。コア・セルベーション剤としては、ＰＨＡの溶剤に混和する高分子系、鉱物油系または植物油系の化合物で、カプセル化用のＰＨＡを溶解しないものであればよく、例えば、シリコーン油、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油、鉱物油、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、メタノール、エタノール等が挙げられる。これらは２種以上を混合して用いてもよい。コア・セルベーション剤の使用量は、Ｗ／Ｏ型エマルションに対し、例えば約０．０１〜１，０００容量倍、好ましくは約０．１〜２００容量倍である。このようにして得られる微粒子状の中空構造体を、遠心分離あるいはろ過により分取した後、ヘキサン，ヘプタン等の洗浄液で繰り返し洗浄して、コア・セルベーション剤を除去し、その後、加温ないし減圧して洗浄液を蒸発させる。さらに、所望により、上記した水中乾燥法の場合と同様にして、有機溶媒の除去を行う。
【０２７８】
＜噴霧乾燥法  −  中空構造体  −＞
噴霧乾燥法により中空マイクロカプセル化を行う場合、Ｗ／Ｏ型エマルションまたは水中乾燥法の場合と同様にして製造したＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを、ノズルを用いてスプレー・ドライヤー装置（噴霧乾燥機）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒および水を揮発させることにより、微粒状の中空構造体を調製する。ノズルとしては、例えば二液体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型が挙げられる。このようにして得られる中空構造体を、所望により、蒸留水で数回繰り返し洗浄して、中空構造体の表面に付着している乳化剤等を除去する。ついで、洗浄された微粒子を、減圧乾燥するか、あるいは蒸留水に再分散後凍結乾燥して、さらに有機溶媒の除去を行ってもよい。
【０２７９】
＜Ｏ／Ｗ型エマルションの調製  −  中空構造体  −＞
Ｏ／Ｗ型エマルションを基にして、液中乾燥法により中空構造体を製造する場合は、通常、ＰＨＡ、磁性体および有機溶媒を含む油相を水相中に分散させて、Ｏ／Ｗ型エマルションを形成させた後、油相中の有機溶媒を除去することにより行われる。水相の体積は、一般的には油相体積の約１ないし約１０，０００倍から選ばれる。好ましくは、約２ないし約５，０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約５ないし約２，０００倍から選ばれる。特に好ましくは約５０〜約１０００倍である。該水相の温度は予め例えば約５℃ないし約３０℃、好ましくは約１０℃ないし約２５℃、更に好ましくは約１０℃ないし約２０℃に調整しておいてもよい。上記水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般に安定なＯ／Ｗ型エマルションを形成できるものであればいずれでもよく、前述の乳化剤を好適に用いることができる。使用の際の乳化剤の濃度は、約０．００１〜約２０％（質量／容量）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０．０１〜約１０％（質量／容量）の範囲で用いられる。特に好ましくは約０．０５〜約５％（質量／容量）の範囲で用いられる。また、乳化工程についても、前述した公知の混合装置が種々使い得る。
【０２８０】
特に、このＯ／Ｗ型エマルションを調製する乳化は、油相の液滴径が中空構造体の外径を規定し、延いては、中空部の構造をも規定するので、最終目的である中空構造体の中空構造の均一性を保証するために重要である。いずれの中空構造体にも同程度の中空構造をもたせるためには、この段階でＰＨＡおよび磁性体を含む内油相をできる限り外水相内に均一に分散させることが必要である。このためには、内油相の液滴径をできるだけ小さくするのが好ましいので、超音波照射法を他の分散法と組み合わせる方法が好適に採用される。
【０２８１】
本発明の製造方法に利用するＯ／Ｗ型エマルションを製造する際の構成成分を供給する態様も公知の技術に従い、種々の方法が取り得る。例えば、予め、ＰＨＡおよび磁性体を含む溶液を容器に仕込み、そこへ乳化剤を含む水相成分を添加する方法、その添加順番を逆にする方法、あるいは両者を一定比率で連続的に供給する方法等が挙げられる。回転による混合の場合は、最初に示した順序が好ましく、この場合、初期にはＰＨＡおよび磁性体を含む油相が連続相を成し、水相が分散相を形成するいわゆるＷ／Ｏ型エマルションであり、水相成分の添加量の増加に伴い、Ｗ／Ｏ型からＯ／Ｗ型への転相が生じ、油相からの中空構造体の形成（微粒子化）が促進される。
【０２８２】
有機溶媒を除去する方法は、前述のＷ／Ｏ型エマルションに対しても適用される方法に従って行うことができる。このようにして得られた中空構造体は遠心分離あるいは瀘過して分取した後、中空構造体の表面に付着している乳化剤等を蒸留水で数回繰り返し洗浄し、蒸留水等に再分散して凍結乾燥する。
【０２８３】
＜ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法＞
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法による構造体製造工程は、前述のようにＷ／Ｏ型エマルション、あるいは該Ｗ／Ｏ型エマルションから調製した、あるいは別途調製したＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション、またはＯ／Ｗ型エマルション、あるいは該Ｏ／Ｗ型エマルションからＯ／Ｗ／Ｏ型エマルションを調製する工程、ＰＨＡ合成酵素に３−ヒドロキシアシルＣｏＡを反応させてＰＨＡを合成させる工程とを少なくとも含むものである。
【０２８４】
ＰＨＡ合成酵素等の酵素タンパク質は、アミノ酸が多数結合したポリペプチドであり、リシン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の遊離のイオン性基を有するアミノ酸によって親水性を示し、またアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン等の遊離の疎水性基を有するアミノ酸によって、また有機高分子であるという点で疎水性を有している。従って、程度の差はあるが、親水性と疎水性の両方の性質を有する水相／油相界面に存在させることが可能である。
【０２８５】
ここで、反応液（水相）のｐＨや塩濃度、温度によってＰＨＡ合成酵素の表面電荷の正負や電荷量、疎水性が変化するので、酵素活性上許容される範囲内で反応液の調整を行うことが望ましい。例えば、塩濃度を下げることにより、ＰＨＡ合成酵素の電荷量を増やすことができる。また、ｐＨを変える事により、反対電荷を増やすことができる。また、塩濃度を上げることによって疎水性を増やすことができる。また、予め電気泳動やぬれ角等を測定し、ＰＨＡ合成酵素の荷電状態や疎水性を調べることで、反応に適した溶液条件を設定をすることもできる。さらに、各エマルションにおいて水相／油相界面におけるＰＨＡ合成酵素の存在量を直接測定して条件を求めることもできる。界面における存在量の測定は、例えば、濃度既知のＰＨＡ合成酵素溶液を用いて、各エマルションを調製した後、水相中のフリーのＰＨＡ合成酵素濃度を測定することにより求めることが可能である。
【０２８６】
３−ヒドロキシアシルＣｏＡの重合によりＰＨＡが合成される反応において放出されるＣｏＡ量が１分間に１μｍｏｌとなるＰＨＡ合成酵素量を１単位（Ｕ）としたとき、反応に供する酵素の量は、例えば、油相１  ｇあたり１０  単位（Ｕ）から１、０００単位（Ｕ）、望ましくは５０  単位（Ｕ）から５００単位（Ｕ）  の範囲内に設定すると良い。
【０２８７】
前記のＰＨＡ合成酵素ならびに所望のＰＨＡの原料となる３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含む反応液中で、水相／油相界面のＰＨＡ合成酵素によりＰＨＡが合成されることにより、水相が内水相としてＰＨＡにより被覆された構造体を形成する。Ｗ／Ｏ型エマルションあるいはＯ／Ｗ型エマルションにおける水相は、ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る条件に調整された反応系として構成されるべきであり、例えば通常、ｐＨ５．５からｐＨ９．０、好ましくはｐＨ７．０からｐＨ８．５となるよう、緩衝液により調製する。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適ｐＨやｐＨ安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。緩衝液の種類は、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば、設定するｐＨ領域等に応じて適宜選択して用いることができるが、例えば、一般の生化学反応に用いられる緩衝液、具体的には、酢酸バッファー、リン酸バッファー、リン酸カリウムバッファー、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）バッファー、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳ）バッファー、トリス塩酸バッファー、グリシンバッファー、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（ＣＨＥＳ）バッファー等を用いると良い。緩衝液の濃度も、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば特に限定はされないが、通常５．０  ｍＭから１．０  Ｍ、好ましくは０．１  Ｍから０．２  Ｍの濃度のものを使用すると良い。反応温度は、使用するＰＨＡ合成酵素の特性に応じて適宜設定するものであるが、通常、４℃から５０℃、好ましくは２０℃から４０℃に設定すると良い。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適温度や耐熱性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。反応時間は、使用するＰＨＡ合成酵素の安定性等にもよるが、通常、１分間から２４時間、好ましくは３０分間から３時間の範囲内で適宜選択して設定する。反応液中の３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度は、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る範囲内で適宜設定するものであるが、通常、０．１  ｍＭから１．０Ｍ、好ましくは０．２  ｍＭから０．２  Ｍの範囲内で設定すると良い。なお、反応液中における３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度が高い場合、一般に、反応系のｐＨが低下する傾向にあるため、３−ヒドロキシアシルＣｏＡ濃度を高く設定する場合は、前記の緩衝液濃度も高めに設定することが好ましい。
【０２８８】
また、ＰＨＡ合成工程において、水系反応液中の３−ヒドロキシアシルＣｏＡの種類や濃度等の組成を経時的に変化させることによって、内側から外側に向かう方向に構造体を構成するＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることができる。マイクロカプセル構造を形成する場合には、シェルを構成するＰＨＡの内側から外側へ向かう方向でのＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることができる。
【０２８９】
このモノマーユニット組成の変化した構造体の形態として、例えば、ＰＨＡ被膜の組成変化が連続的で、内側から外側に向かう方向に組成の勾配を形成した１層のＰＨＡが薬物を被覆したマイクロカプセルとして形態を挙げることができる。製造方法としては、例えば、ＰＨＡを合成しながら反応液中に別組成の３−ヒドロキシアシルＣｏＡを添加する等の方法によればよい。
【０２９０】
また別の形態として、ＰＨＡ被膜の組成変化が段階的で、組成の異なるＰＨＡが薬物を多層に被覆したマイクロカプセルとしての形態を挙げることができる。この製造方法としては、ある３−ヒドロキシアシルＣｏＡの組成でＰＨＡを合成した後、遠心分離等によって調製中のマイクロカプセルを反応液からいったん回収し、これに異なる３−ヒドロキシアシルＣｏＡの組成からなる反応液を再度添加する等の方法によればよい。
【０２９１】
以上、Ｗ／Ｏ型エマルションおよびＯ／Ｗ型エマルションからのマイクロカプセル化を含む構造体化について説明したが、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションあるいはＯ／Ｗ／Ｏ型エマルションについても同様にして構造体を製造することができる。Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションについては、内水相および外水相それぞれにＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡを含有させることが可能であるが、薬物の取り込み率を高くするためには外水相にのみＰＨＡを合成させることも好ましい。また、磁性体をカプセルに内包し、磁性体のカプセル表面への露出を最小限とするためには、外水相においてＰＨＡを合成させることがより好ましい。さらに、Ｏ／Ｗ／Ｏ型エマルションについても、磁性体のカプセル表面への露出を最小限とするためには、磁性体は内油相にのみ含有させることがより好ましい。Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションについては、内水相および外水相におけるＰＨＡ合成酵素および３−ヒドロキシアシルＣｏＡの存在形態については３種類の組合せが考えられるが、薬物の取り込み率、その放出特性、製造工程の簡便さ、コスト等を考慮して決定すればよい。
【０２９２】
上記反応により得られた構造体は、必要に応じて、洗浄工程に供する。粒状体の洗浄方法は、マイクロカプセル等の構造体の製造の目的上好ましくない変化を、構造体に及ぼすものでない限り、特に限定はされない。例えば、瀘過して分取した後、ヘプタン等により繰り返し洗浄し、遊離薬物および溶媒の除去を行う。また、遠心分離によって該構造体を沈殿させ、上清を除去することによって、反応液に含まれる不要成分を除去することができる。ここにヘプタン等の該ＰＨＡが不溶である洗浄剤を添加し、遠心分離をする操作を行うことにより、さらに洗浄することもできる。さらに、上記構造体は、必要に応じて、乾燥工程に供することができる。さらに該構造体に各種二次加工や化学修飾等の処理を施して使用することもできる。
【０２９３】
例えば、マイクロカプセル等の構造体の表層のＰＨＡに化学修飾を施すことにより、さらに有用な機能・特性を備えた構造体を得ることができる。例えば、グラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する各種の特性、例えば徐放性の制御、液相あるいは気相の保持機能が向上したマイクロカプセル等の構造体を得ることができる。また、マイクロカプセル等の構造体の表層のＰＨＡを架橋化せしめることにより、マイクロカプセルの徐放性の制御、液相あるいは気相の保持機能の向上が可能である。
【０２９４】
化学修飾の方法は、所望の機能・構造を得る目的を満たす方法であれば特に限定はされないが、例えば、反応性官能基を側鎖に有するＰＨＡを合成し、該官能基の化学反応を利用して化学修飾する方法を、好適な方法として用いることができる。
【０２９５】
前記の反応性官能基の種類は、所望の機能・構造を得る目的を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、前記したエポキシ基を例示することができる。エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡは、通常のエポキシ基を有するポリマーと同様の化学的変換を行うことができる。具体的には、例えば水酸基に変換したり、スルホン基を導入することが可能である。また、チオールやアミンを有する化合物を付加することもでき、例えば、末端に反応性官能基を有する化合物、具体的には、エポキシ基との反応性が高いアミノ基を末端に有する化合物等を添加して反応させることにより、ポリマーのグラフト鎖が形成される。
【０２９６】
アミノ基を末端に有する化合物としては、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、アミノ変性ポリシロキサン（アミノ変性シリコーンオイル）等のアミノ変性ポリマーを例示することができる。このうち、アミノ変性ポリシロキサンとしては、市販の変性シリコーンオイルを使用しても良く、また、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、７８、２２７８（１９５６）等に記載の方法で合成して使用することもでき、該ポリマーのグラフト鎖の付加による徐放性の制御、液相あるいは気相の保持機能の向上、水溶液中での自己分散性の向上等の効果が期待できる。
【０２９７】
また、エポキシ基を有するポリマーの化学的変換の他の例として、ヘキサメチレンジアミン等のジアミン化合物、無水コハク酸、２−エチル−４−メチルイミダゾール等による架橋反応が、物理化学的変換の例として電子線照射等による架橋反応が挙げられる。このうち、エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡとヘキサメチレンジアミンとの反応は、下記のスキームに示すような形で進行し、架橋ポリマーが生成する。
【０２９８】
【化８０】
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このようにして得られた構造体の、粒子全体に占める内包部の体積比率は約１０％から９０％の範囲であり、構造体の機能、機械的強度等を考慮すれば、約３５％から８５％程度がより好ましい範囲である。
【０２９９】
得られたマイクロカプセル等の構造体において、薬物がＰＨＡで被覆されていることを確認する方法としては、一般には、例えば、ガスクロマトグラフィー等による組成分析と電子顕微鏡等による形態観察とを組み合わせた方法や、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）とイオンスパッタリング技術を用いて、各構成層のマススペクトルから構造を判定する方法等を用いることができる。しかし、さらに直接的かつ簡便な確認方法として、本発明者らによって新たに開発された、ナイルブルーＡ染色と蛍光顕微鏡観察とを組み合わせた方法を用いることもできる。本発明者らは、ＰＨＡ合成酵素を用いた無細胞系（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのＰＨＡ合成を簡便に判定できる方法について鋭意検討を続けてきた結果、ＰＨＡに特異的に結合して蛍光を発する性質を有する薬剤であり、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４４、２３８−２４１（１９８２）  において微生物細胞（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＰＨＡ生産の簡易的判別に用いることができると報告されているナイルブルーＡが、適切な使用方法および使用条件の設定によって、無細胞系でのＰＨＡ合成の判定にも用いることができることを見出し、上記の方法を完成させた。即ち、本方法では、所定濃度のナイルブルーＡ溶液を濾過したのち、ＰＨＡを含む反応液に混合し、蛍光顕微鏡で一定の波長の励起光を照射しながら観察することにより、合成されたＰＨＡのみから蛍光を発せしめ、これを観察することによって、無細胞系でのＰＨＡ合成を簡易に判定することができる。上記方法を本発明の構造体の製造に応用することにより、疎水溶液の表面を被覆したＰＨＡを直接的に観察し、評価することができる。
【０３００】
＜賦形剤  −  親水性薬物を内包  −＞
本発明の徐放性製剤は、賦形剤を含有していることが好ましい。賦形剤としては、生体内に投与しても毒性が少なく、凍結乾燥または噴霧乾燥等の乾燥が容易で、生体内に投与した場合速やかに溶解するか、また、用時溶解するものであることが望まれる。このような賦形剤としては、例えば糖、セルロース誘導体、アミノ酸、タンパク質、ポリアクリル酸誘導体、有機塩、無機塩等が挙げられる。これらの賦形剤は、２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。ここにおいて、糖としては、例えばＤ−マンニトール、アルギン酸ナトリウム、果糖、デキストラン、デキストリン、白糖、Ｄ−ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖、マルトース、デンプン類、トレハロース等が挙げられる。セルロース誘導体としては、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート等が挙げられる。アミノ酸としては、例えばグリシン、アラニン、チロシン、アルギニン、リジン等が挙げられる。タンパク質としては、例えばゼラチン、フィブリン、コラーゲン、アルブミン等が挙げられる。ポリアクリル酸誘導体としては、例えばポリアクリル酸ナトリウム、メタアクリル酸／アクリル酸共重合体（オイドラギット、ローム社製、ドイツ）等が挙げられる。有機塩としては、例えばクエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等が挙げられる。無機塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等が挙げられる。賦形剤としては、上記以外に、徐放性製剤用基剤であるポリマーを溶解しない水溶性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等も用いられる。賦形剤は、好ましくは糖類であり、とりわけ凍結乾燥が容易で毒性が少ないＤ−マンニトールが好ましい。
【０３０１】
賦形剤の使用量は、賦形剤の溶解度、賦形剤を溶解して得られる溶液の張度、粘度、分散性、安定性等によって決定されるが、徐放性製剤を乾燥した場合に、乾燥徐放性製剤中の賦形剤の含量が、例えば約０．５〜９９質量％、好ましくは約１〜９０質量％、より好ましくは約２〜６０質量％となるように用いられる。賦形剤としてＤ−マンニトールを用いる場合は、乾燥徐放性製剤中の賦形剤の含量が、約２〜４０質量％となることが特に好ましい。これらの賦形剤の添加によって、１）徐放性製剤（特にマイクロスフェア）の乾燥時および乾燥後の粒子の接触および衝突の頻度が低下し、凍結乾燥または噴霧乾燥時の粒子の均一性が保たれる、２）徐放性製剤のガラス転移点以上の温度での乾燥が可能となり、より完全な水または有機溶媒の除去が可能となる、３）徐放性製剤の経時的安定性が改善され、分散性が良好で、冷所保存に限定されることなく、例えば室温での長期使用期限を有する徐放性製剤が得られる等の優れた効果が得られる。
【０３０２】
本発明において、賦形剤を含有する徐放性製剤は、例えば上記した水中乾燥法、相分離法または噴霧乾燥法によって得られる構造体と賦形剤とを混合することによって製造することができる。構造体は、洗浄後に減圧乾燥したもの、あるいは洗浄後に蒸留水に再分散し凍結乾燥したものであってもよい。混合の方法は、特に限定されず、例えば混合機等を用いて行われるが、均一な混合物を得られるような方法が好ましい。また、賦形剤を含有する徐放性製剤は、例えば噴霧乾燥法により構造体を製造する場合に、Ｗ／Ｏ型エマルションの噴霧と同時に賦形剤の水溶液を別ノズルから噴霧することによっても製造することができる。さらに、賦形剤を含有する徐放性製剤は、水中乾燥法および噴霧乾燥法において用いられるＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを製造する際に、外水相に賦形剤の水溶液を使用することによっても製造することができる。賦形剤を含有する徐放性製剤は、好ましくは水中乾燥法、相分離法または噴霧乾燥法によって得られる構造体を洗浄し、洗浄された構造体を、賦形剤を溶解または懸濁した蒸留水に分散し、ついで凍結乾燥または減圧乾燥することによって製造される。また、洗浄された構造体を蒸留水に分散し、得られる分散液に賦形剤を溶解または懸濁した後に、凍結乾燥または減圧乾燥を行ってもよい。とりわけ、洗浄された構造体を賦形剤を溶解した蒸留水に分散するか、洗浄された構造体を蒸留水に分散して得られる分散液に賦形剤を溶解した後に、凍結乾燥することにより、均一な混合物が得られる。
【０３０３】
＜加熱処理  −  親水性薬物を内包  −＞
さらに、上記した水中乾燥法、相分離法または噴霧乾燥法によって得られる構造体を、所望により、ＰＨＡのガラス転移温度  （Ｔｇ）  以上で、構造体の各粒子が互いに付着しない程度の温度に加熱することより、構造体中の水および有機溶媒の除去をより完全に行うとともに、徐放性の改善を行うことができる。この際、有機溶媒は、約１０００ｐｐｍ未満、好ましくは約５００ｐｐｍ  未満、より好ましくは約１００ｐｐｍ  未満程度まで除去することが好ましい。加熱の時期は、所望により賦形剤を添加した後、構造体を凍結乾燥または減圧乾燥した後が好ましいが、特に限定されるものではなく、例えば小分け後でもよい。
【０３０４】
加熱温度がＰＨＡのガラス転移温度未満では、水または有機溶媒の除去が充分でない場合があり、また高温過ぎると構造体の融着、変形、薬物の分解、劣化等の危険性が増大するので、加熱温度は一概に定義できないが、ＰＨＡの物性（例、分子量、安定性等）、薬物、構造体の平均粒子径、加熱時間、構造体の乾燥程度、加熱方法等を考慮し、適宜決定することができる。好ましくは、ＰＨＡのガラス転移温度以上で、該構造体の各粒子が互いに付着しない程度の温度で加熱乾燥する。より好ましくは、ＰＨＡのガラス転移温度からガラス転移温度より約３０℃高い温度以下の温度、さらに好ましくはＰＨＡのガラス転移温度からガラス転移温度より約２０℃高い温度以下の温度である。加熱時間は、加熱温度、処理する構造体量等によって異なるが、一般的には構造体自体の温度が所定の温度に達した後、約６〜１２０時間、さらに好ましくは約１２〜９６時間である。また、加熱時間の上限は、残存有機溶媒、水分が許容値以下になれば特に限定されないが、ガラス転移温度以上の条件下では構造体が軟化し、構造体同士の物理的接触あるいは構造体積層時の荷重により変形するので、有機溶媒、水分の残存が許容値以下になったら、速やかに加熱を終了することが好ましい。加熱方法は特に限定されないが、構造体が均一に加熱される方法であればいかなる方法を用いてもよい。加熱乾燥方法の好ましい具体例として、例えば恒温槽、流動槽、移動層あるいはキルン中で加熱乾燥する方法、マイクロ波で加熱乾燥する方法等が用いられる。これらの中で、恒温槽中で加熱乾燥する方法が好ましい。上記のように、凍結乾燥の後、構造体を減圧下加温することにより、構造体中の有機溶媒が効率よく除去され、生体に安全な構造体を得ることができる。このようにして得られた構造体中の有機溶媒残存量は、約１００ｐｐｍ以下である。
【０３０５】
＜凝集防止剤  −  親油性薬物を内包  −＞
水中乾燥法、コアセルベーション法およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法での製造では、洗浄中の粒子状の構造体同士の凝集を防ぐために、洗浄液である蒸留水に凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール，ラクトース，ブドウ糖，デンプン類（例、コーンスターチ等）等の水溶性多糖、グリシン，フィブリン，コラーゲン等のタンパク質、塩化ナトリウム，リン酸水素ナトリウム等の無機塩類等が挙げられる。
【０３０６】
＜噴霧乾燥法  −  親油性薬物を内包  −＞
噴霧乾燥法によってマイクロカプセル等の構造体を製造する場合には、薬物とＰＨＡとの有機溶媒溶液または分散液を、ノズルを用いてスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、極めて短時間に微粒化液滴内の有機溶媒を揮発させ、構造体を調製する。該ノズルとしては、二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型等が挙げられる。このとき、所望によって薬物とＰＨＡとの有機溶媒溶液または分散液と同時に構造体の凝集防止を目的として前述の凝集防止剤の水溶液を別ノズルより噴霧することも有効である。このようにして得られた構造体は、必要であれば加温・減圧下において構造体中の水分および有機溶媒の除去をさらに行う。
【０３０７】
＜有機溶媒除去方法  −  親油性薬物を内包  −＞
有機溶媒を除去する方法は、前述のとおり公知の方法に従って行うことができる。例えばプロペラ型撹拌機あるいはマグネチックスターラー等で撹拌しながら常圧もしくは徐々に減圧にして有機溶媒を蒸発させる方法、ロータリーエバポレーター等を用いて真空度を調節しながら有機溶媒を蒸発させる方法等が挙げられる。このＯ／Ｗ型エマルションから液中乾燥する際に、有機溶媒が揮発、固化して構造体の構造が決定される。このようにして得られた構造体は遠心分離あるいは瀘過して分取した後、構造体の表面に付着している遊離の薬物、薬物保持物質、乳化剤等を蒸留水で数回繰り返し洗浄し、蒸留水等に再分散して凍結乾燥する。
【０３０８】
＜凝集防止剤  −  親油性薬物を内包  −＞
凍結乾燥の際に、凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール，澱粉類（例、コーンスターチ等）等の水溶性多糖、無機塩類、アミノ酸、タンパク質等が挙げられる。これらのうち好ましくはマンニトールである。構造体と凝集防止剤との混合比（質量比）は、約５０：１ないし約１：１、好ましくは約２０：１ないし約１：１、更に好ましくは約１０：１ないし約５：１である。洗浄中の粒子同士の凝集を防ぐために、洗浄液である蒸留水に凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール，ラクトース，ブドウ糖，デンプン類（例、コーンスターチ等）等の水溶性多糖、グリシン，フィブリン，コラーゲン等のタンパク質、塩化ナトリウム，リン酸水素ナトリウム等の無機塩類等が挙げられる。凝集防止剤は、好ましくはマンニトールである。
【０３０９】
＜加温処理  −  親油性薬物を内包  −＞
また、凍結乾燥の後、さらに減圧下加温することにより、構造体中の水分および有機溶媒の除去をさらに行い、徐放性の改善を行なってもよい。加熱温度がＰＨＡのガラス転移温度未満では、薬物の過剰量の初期放出性改善の効果がなく、また高温過ぎると構造体の融着，変形，薬物の分解，劣化等の危険性が増大する。加熱温度は一概にいえないが、ＰＨＡの物性（例、分子量，安定性等）、薬物、マイクロカプセル等の構造体の平均粒子径、加熱時間、構造体の乾燥程度、加熱方法等を考慮し適宜決定することができる。有機溶媒は１０００ｐｐｍ未満、好ましくは５００ｐｐｍ未満、より好ましくは１００ｐｐｍ未満程度まで除くのがよい。
【０３１０】
好ましくは、ＰＨＡのガラス転移温度以上で、該構造体の各粒子が互いに付着しない程度の温度で加熱乾燥する。好ましくは、ＰＨＡのガラス転移温度からガラス転移温度より約３０℃高い温度範囲内で加熱乾燥する。より好ましくは、ガラス転移温度以上ガラス転移温度より１０℃高い温度以下の温度、さらに好ましくはガラス転移温度以上ガラス転移温度より５℃高い温度以下（特にガラス転移温度より３ないし４℃高い温度）で加熱乾燥すると徐放性が改善される。加熱乾燥時間も加熱温度，処理する構造体量等によって異なるが、一般的にはマイクロカプセル等の構造体自体の温度が所定の温度に達した後、約２４ないし約１２０時間が好ましい。さらに約４８ないし約１２０時間が好ましい。特に約４８〜約９６時間が好ましい。とりわけ、上限に関しては、加熱時間は残存有機溶媒、水分が許容値以下であれば何時間でもよいが、ガラス転移温度以上の条件下では構造体は軟化しており、構造体同志の物理的接触あるいは積層時の荷重により変形する。従って、有機溶媒、水分の残存が許容値以下になったら速やかに加熱乾燥を終了することが望ましい。
【０３１１】
加熱方法は特に限定されないが、構造体が均一に加熱される方法であればいかなる方法を用いてもよい。該加熱乾燥方法の好ましい具体例として、例えば恒温槽，流動槽，移動槽あるいはキルン中で加熱乾燥する方法、マイクロ波で加熱乾燥する方法等が用いられる。これらの中で、恒温槽中で加熱乾燥する方法が好ましい。
【０３１２】
＜油相あるいは水相含有物  −  液相を内包  −＞
上記マイクロカプセルに担持される物質は、本発明のマイクロカプセルの用途により適宜選択される。
【０３１３】
本発明のマイクロカプセルを例えば人工赤血球用マイクロカプセルとして用いる場合には、マイクロカプセルに担持される物質としては、ヘモグロビン、ヘモシアニン等を挙げることができる。
【０３１４】
本発明のマイクロカプセルを例えばインク用、トナー用あるいは塗料用マイクロカプセルとして用いる場合には、マイクロカプセルに担持される物質としては、染料水溶液や顔料分散液等、具体的にはＣ．Ｉ．アシッドレッド５２、Ｃ．Ｉ．アシッドブルー１、Ｃ．Ｉ．アシッドブラック２、同１２３等の酸性染料、Ｃ．Ｉ．ベーシックブルー７、Ｃ．Ｉ．ベーシックレッド１等の塩基性染料、Ｃ．Ｉ．ダイレクトブラック１９、Ｃ．Ｉ．ダイレクトブルー８６等の直接染料等の直接染料、Ｃ．Ｉ．ソルベントブラック７、同１２３、Ｃ．Ｉ．ソルベントレッド８、同４９、同１００、Ｃ．Ｉ．ソルベントブルー２、同２５、同５５、同７０、Ｃ．Ｉ．ソルベントグリーン３、Ｃ．Ｉ．ソルベントイエロー２１、同６１、Ｃ．Ｉ．ソルベントオレンジ３７、Ｃ．Ｉ．ソルベントバイオレット８、同２１等の油溶性染料、Ｃ．Ｉ．リアクティブイエロー１５、４２；Ｃ．Ｉ．リアクティブレッド２４、２１８；Ｃ．Ｉ．リアクティブブルー３８、２２０等の反応性染料、カーボンブラック、酸化銅、二酸化マンガン、アニリンブラック、活性炭、非磁性フェライト、マグネタイト等の黒色顔料、黄鉛、亜鉛黄、黄色酸化鉄、カドミウムイエロー、ミネラルファストイエロー、ニッケルチタンイエロー、ネーブルスイエロー、ナフトールイエローＳ、ハンザーイエローＧ、ハンザイエロー１０Ｇ、ベンジジンイエローＧ、ベンジジンイエローＧＲ、キノリンイエローレーキ、パーマネントイエローＮＣＧ、タートラジンレーキ等の黄色顔料、赤色黄鉛、モリブデンオレンジ、パーマネントオレンジＧＴＲ、ピラゾロンオレンジ、バルカンオレンジ、ベンジジンオレンジＧ、インダスレンブリリアントオレンジＲＫ、インダスレンブリリアントオレンジＧＫ等の橙色顔料、ベンカラ、カドミウムレッド鉛丹、硫化水銀、カドミウム、パーマネントレッド４Ｒ、リソールレッド、ピラゾロンレッド、ウォッチングレッド、カルシウム塩、レーキレッドＣ、レーキレッドＤ、ブリリアントカーミン６Ｂ、ブリリアントカーミン３Ｂ、エオキシンレーキ、ローダミンレーキＢ、アリザリンレーキ等の赤色顔料、紺青、コバルトブルー、アルカリブルーレーキ、ビクトリアブルーレーキ、フタロシアニンブルー、無金属フタロシアニンブルー、フタロシアニンブルー一部分塩素化合物、ファーストスカイブルー、インダスレンブルーＢＣ等の青色顔料、マンガン紫、ファストバイオレットＢ、メチルバイオレットレーキ等の紫色顔料、酸化クロム、クロムグリーン、ピグメントグリーンＢ、マラカイトグリーンレーキ、ファイナルイエローグリーンＧ等の緑色顔料、亜鉛華、酸化チタン、アンチモン白、硫化亜鉛等の白色顔料、バライト粉、炭酸バリウム、クレー、シリカ、ホワイトカーボン、タルク、アルミナホワイト等の体質顔料等を挙げることが、もちろんこれらに限定されるものではない。
【０３１５】
本発明のマイクロカプセルを例えば薬物徐放用カプセルとして用いる場合には、マイクロカプセルに担持される薬物としては、水易溶解性の薬物ならびに水難溶解性（脂溶性）の薬物の両方を挙げることができる。このような薬物としてたとえばステロール（たとえばコレステロール、シトステロール）、エストロゲン（たとえばエストロン、エストラジオールおよびそのエステル、エチニルエストラジオール等）、コルチコイドおよびそれらのエステル、カルシトニンのようなペプチドホルモン、抗生物質（たとえばゲンタマイシン、バンコマイシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ミノサイクリン、テトラサイクリン等）、クロラムフェニコール、マクロライド抗生物質（たとえばエリスロマイシンおよびその誘導体、特にそのパルミテートおよびステアレート、またはスピラマイシン等）、抗寄生菌剤および皮膚用薬剤（たとえばクロトリマゾール、ミコナゾール、ジスラノール等）、消炎鎮痛剤（たとえばインドメタシン、ジクロフェナック、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、４−ビフェニル酢酸およびそのエチルエステル等）、シアノコバラミンのようなビタミン類、ウロキナーゼのような酵素剤、フルオロウラシル、アラシチジンのような制癌制等が挙げられる。
【０３１６】
＜賦形剤  −  気相を内包  −＞
本発明の中空構造体を利用して調製される超音波造影剤は、賦形剤を含有していても良い。該賦形剤としては、生体内に投与しても毒性が少なく、凍結乾燥または噴霧乾燥等の乾燥が容易で、生体内に投与した場合速やかに溶解するか、また、用時溶解するものであることが望まれる。このような賦形剤としては、例えば、糖、セルロース誘導体、アミノ酸、タンパク質、ポリアクリル酸誘導体、有機塩、無機塩等が挙げられる。これらの賦形剤は、２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。
【０３１７】
賦形剤に利用可能な糖としては、例えば、Ｄ−マンニトール、アルギン酸ナトリウム、果糖、デキストラン、デキストリン、白糖、Ｄ−ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖、マルトース、デンプン類、トレハロース等が挙げられる。セルロース誘導体としては、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート等が挙げられる。
【０３１８】
また、アミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、チロシン、アルギニン、リジン等が挙げられる。タンパク質としては、例えば、ゼラチン、フィブリン、コラーゲン、アルブミン等が挙げられる。ポリアクリル酸誘導体としては、例えば、ポリアクリル酸ナトリウム、メタアクリル酸／アクリル酸共重合体（オイドラギット、ローム社製、ドイツ）等が挙げられる。有機塩としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等が挙げられる。無機塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等が挙げられる。
【０３１９】
賦形剤としては、上記以外に、ＰＨＡを溶解しない水溶性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等も用いられる。賦形剤は、好ましくは糖類であり、とりわけ凍結乾燥が容易で毒性が少ないＤ−マンニトールが好ましい。
【０３２０】
賦形剤の使用量は、賦形剤の溶解度、賦形剤を溶解して得られる溶液の張度，粘度，分散性，安定性等によって決定されるが、超音波造影剤を乾燥した場合に、乾燥超音波造影剤中の賦形剤の含量が、例えば約０．５〜９９質量％、好ましくは約１〜９０質量％、より好ましくは約２〜６０質量％となるように用いられる。賦形剤としてＤ−マンニトールを用いる場合は、乾燥超音波造影剤中の賦形剤の含量が、約２〜４０質量％となることが特に好ましい。これらの賦形剤の添加によって、１）超音波造影剤（特にマイクロスフェア）の乾燥時および乾燥後の粒子の接触および衝突の頻度が低下し、凍結乾燥または噴霧乾燥時の粒子の均一性が保たれる、２）超音波造影剤のガラス転移点以上の温度での乾燥が可能となり、より完全な水または有機溶媒の除去が可能となる、３）超音波造影剤の経時的安定性が改善され、分散性が良好で、冷所保存に限定されることなく、例えば室温での長期使用期限を有する超音波造影剤が得られる等の優れた効果が得られる。
【０３２１】
本発明において、賦形剤をも含有する超音波造影剤は、例えば、上記した水中乾燥法、相分離法または噴霧乾燥法によって得られる中空構造体と、賦形剤とを混合することによって製造することができる。該中空構造体は、洗浄後に減圧乾燥したもの、あるいは洗浄後に蒸留水に再分散し凍結乾燥したものであってもよい。混合の方法は、特に限定されず、例えば、混合機等を用いて行われるが、均一な混合物を得られるような方法が好ましい。
【０３２２】
また、賦形剤を含有する超音波造影剤は、例えば、噴霧乾燥法により中空構造体を製造する場合に、Ｗ／Ｏ型エマルションの噴霧と同時に賦形剤の水溶液を別ノズルから噴霧することによっても製造することができる。さらに、賦形剤を含有する超音波造影剤は、水中乾燥法および噴霧乾燥法において用いられるＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを製造する際に、外水相に賦形剤の水溶液を使用することによっても製造することができる。賦形剤を含有する超音波造影剤は、好ましくは水中乾燥法、相分離法または噴霧乾燥法によって得られる中空構造体を洗浄し、洗浄された中空構造体を、賦形剤を溶解または懸濁した蒸留水に分散し、ついで凍結乾燥または減圧乾燥することによって製造される。また、洗浄された中空構造体を蒸留水に分散し、得られる分散液に賦形剤を溶解または懸濁した後に、凍結乾燥または減圧乾燥を行ってもよい。とりわけ、洗浄された中空構造体を賦形剤を溶解した蒸留水に分散するか、洗浄された中空構造体を蒸留水に分散して得られる分散液に賦形剤を溶解した後に、凍結乾燥することにより、均一な混合物が得られる。
【０３２３】
＜加熱処理  −  気相を内包  −＞
さらに、上記した水中乾燥法、相分離法または噴霧乾燥法によって得られる中空構造体を、所望により、ＰＨＡのガラス転移温度  （Ｔｇ）  以上で、該中空構造体の各粒子が互いに付着しない程度の温度に加熱することより、中空構造体中の水および有機溶媒の除去をより完全に行うとともに、気泡の保持機能の改善を行うことができる。その際、有機溶媒は、約１０００ｐｐｍ未満、好ましくは約５００ｐｐｍ  未満、より好ましくは約１００ｐｐｍ  未満程度まで除去することが好ましい。加熱の時期は、所望により賦形剤を添加した後、中空構造体を凍結乾燥または減圧乾燥した後が好ましいが、特に限定されるものではなく、例えば小分け後でもよい。
【０３２４】
加熱温度がＰＨＡのガラス転移温度未満では、水または有機溶媒の除去が充分でない場合があり、また高温過ぎると中空構造体微粒子の融着、変形等の危険性が増大するので、加熱温度は一概に定義できないが、ＰＨＡの物性（例、分子量、安定性等）、中空構造体の平均粒子径、加熱時間、中空構造体の乾燥程度、加熱方法等を考慮し、適宜決定することができる。好ましくは、ＰＨＡのガラス転移温度以上で、該中空構造体の各粒子が互いに付着しない程度の温度で加熱乾燥する。より好ましくは、ＰＨＡのガラス転移温度からガラス転移温度より約３０℃高い温度以下の温度、さらに好ましくはＰＨＡのガラス転移温度からガラス転移温度より約２０℃高い温度以下の温度である。
【０３２５】
加熱時間は、加熱温度，処理する中空構造体量等によって異なるが、一般的には中空構造体自体の温度が所定の温度に達した後、約６〜１２０時間、さらに好ましくは約１２〜９６時間である。また、加熱時間の上限は、残存有機溶媒、水分が許容値以下になれば特に限定されないが、ガラス転移温度以上の条件下では中空構造体が軟化し、中空構造体同士の物理的接触あるいは中空構造体積層時の荷重により変形するので、有機溶媒、水分の残存が許容値以下になったら、速やかに加熱を終了することが好ましい。
【０３２６】
加熱方法は特に限定されないが、中空構造体が均一に加熱される方法であればいかなる方法を用いてもよい。該加熱乾燥方法の好ましい具体例として、例えば恒温槽，流動槽，移動層あるいはキルン中で加熱乾燥する方法、マイクロ波で加熱乾燥する方法等が用いられる。これらの中で、恒温槽中で加熱乾燥する方法が好ましい。上記のように、凍結乾燥の後、中空構造体を減圧下加温することにより、中空構造体中の有機溶媒が効率よく除去され、生体に安全な中空構造体を得ることができる。このようにして得られた中空構造体中の有機溶媒残存量は、約１００ｐｐｍ以下である。
【０３２７】
＜応用  −  親水性薬物を内包  −＞
本発明に用いられる薬物としては、その種類は特に限定されず、生理活性ポリペプチド、抗生物質、抗真菌剤、抗高脂血症剤、循環器官用剤、抗血小板薬（抗血小板凝集抑制剤）、抗脂血症剤、抗凝血剤、止血剤、抗腫瘍剤、解熱剤、鎮痛剤、消炎剤、鎮咳去たん剤、鎮静剤、筋弛緩剤、抗てんかん剤、抗潰瘍剤、抗うつ剤、抗アレルギー剤、強心剤、抗不整脈治療剤、血管拡張剤、降圧利尿剤、糖尿病治療剤、ホルモン剤、抗結核剤、麻薬拮抗剤、骨吸収抑制剤、骨形成促進剤、血管新生阻害剤等からなる群から選ばれる１種または２種以上を用いることが可能であるが、特には水溶性薬物が好ましい。
【０３２８】
＜製剤  −  親水性薬物を内包  −＞
本発明の徐放性製剤は、本発明のマイクロカプセル等の構造体をそのままあるいはそれを原料物質として種々の剤形に製剤化し、例えば注射剤、埋め込み剤、経口投与製剤（例、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等）、経鼻投与製剤、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤等）等のいずれであってもよい。これらの製剤は、製剤分野において通常一般に用いられる公知の方法によって製造することができる。例えば注射剤は、上記した構造体を、水性あるいは油性の分散媒に分散することにより製造される。水性分散媒としては、例えば蒸留水に等張化剤（例、塩化ナトリウム、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、ソルビトール、グリセリン等）、分散剤（例、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ＨＣＯ−５０、ＨＣＯ−６０、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等）、保存剤（例、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノール等）、無痛化剤（例、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカイン等）等を溶解した溶液が挙げられる。また、油性分散媒としては、例えばオリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、コーン油、中鎖脂肪酸グリセリド等が挙げられる。該注射剤は、プレフィルドシリンジのチャンバー内に充填されてもよいし、また、分散媒と構造体をいわゆるダブルチャンバープレフィルドシリンジ（ＤＰＳ）内の異なるチャンバーに分離して充填してもよい。また、注射剤を製造する際、構造体に、上記の組成以外に、さらに、賦形剤（例、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖等）を加えて、再分散した後、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥して固型化し、用時に、注射用蒸留水あるいは適当な分散媒を加えると、より安定した徐放性注射剤が得られる。この場合の粒子径は、例えば懸濁注射剤として使用する場合にはその分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば、平均粒子径として約０．１ないし約５００μｍの範囲が挙げられる。好ましくは、約１ないし約３００μｍの範囲の粒子径である。さらに好ましくは、約２ないし約２００μｍの範囲の平均粒子径である。また、前記のように浸透圧調節剤を水相中に加えることにより、構造体の形状を通針により適した球状にすることもできる。構造体を無菌製剤にするには、例えば製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線で滅菌する方法、防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【０３２９】
経口投与製剤は、例えば上記した構造体に、賦形剤（例、乳糖、白糖、デンプン等）、崩壊剤（例、デンプン、炭酸カルシウム等）、結合剤（例、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００等）等を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより製造できる。コーティング剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、ブルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合）および色素（例、酸化チタン、ベンガラ等）等が用いられる。
【０３３０】
経鼻投与製剤は、固状、半固状または液状のいずれであってもよい。固状の経鼻投与製剤は、例えば上記したマイクロカプセル等の構造体そのままであってもよいが、通常該構造体に賦形剤（例、グルコース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロース等）、増粘剤（例、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体等）等を添加、混合することにより製造できる。例えば液状の経鼻投与製剤は、上記した注射剤の場合と同様にして製造することができる。また、これらの経鼻投与製剤は、いずれも、ｐＨ調節剤（例、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム等）、防腐剤（例、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム等）等を含んでいてもよい。
【０３３１】
坐剤は、油性または水性であってよく、また、固状、半固状あるいは液状のいずれであってもよい。坐剤は、通常油性基剤、水性基剤または水性ゲル基剤を用いて製造される。油性基剤としては、例えば高級脂肪酸のグリセリド〔例、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社、ドイツ）等〕、中級脂肪酸〔例、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社、ドイツ）等〕、あるいは植物油（例、ゴマ油、大豆油、綿実油等）等が挙げられる。水性基剤としては、例えばポリエチレングリコール類、プロピレングリコール等が挙げられる。水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体等が挙げられる。
【０３３２】
本発明の徐放性製剤は、低毒性で哺乳動物（例、ヒト、牛、豚、犬、ネコ、マウス、ラット、ウサギ等）に対して安全に用いることができる。徐放性製剤の投与量は、薬物の種類と含量、剤形、薬物放出の持続時間、対象疾病〔例、前立腺癌、前立腺肥大症、子宮内膜症、子宮筋腫、子宮線維腫、思春期早発症、乳癌、膀胱癌、子宮頚部癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、胃炎、ホジキン病、悪性黒色腫、転移、多発性骨髄腫、非ホジキン性リンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、消化性潰瘍、全身性真菌感染症、小細胞肺癌、心弁膜症、乳腺症、多嚢胞性卵巣、不妊、慢性無排卵症婦人における適性排卵誘発、ざそう（アクネ）、無月経（例、続発性無月経）、卵巣および乳房の嚢胞性疾患（多嚢胞性卵巣を含む）、婦人科系の癌、卵巣性高アンドロゲン血症および多毛症、胸腺幼若化を介したＴ細胞産生によるＡＩＤＳ、男性性犯罪者の治療のための男性避妊等のホルモン依存性疾患の治療および避妊、月経前症候群（ＰＭＳ）の症状軽減、体外受精（ＩＶＦ）等〕、対象動物等によって種々異なるが、薬物の有効量であればよい。薬物の１回あたりの投与量としては、例えば徐放性製剤が１カ月製剤である場合、好ましくは、成人１人当たり約０．０１ｍｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは、約０．０５ｍｇないし約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。特に好ましくは、約０．１ｍｇないし約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。１回あたりの徐放性製剤の投与量は成人１人当たり好ましくは、約０．１ｍｇないし約５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは、約０．２ｍｇないし約３００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、数週間に１回、１か月に１回、あるいは数か月に１回等、薬物の種類と含量、剤形、薬物放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって適宜選ぶことができる。
【０３３３】
＜応用  −  親油性薬物を内包  −＞
本発明に用いられる薬物としては、その種類は特に限定されず、抗生物質、抗真菌剤、抗高脂血症剤、循環器官用剤、抗血小板薬（血小板凝集抑制剤）、抗腫瘍剤、解熱剤、鎮痛剤、消炎剤、鎮咳去たん剤、鎮静剤、抗てんかん剤、抗潰瘍剤、抗うつ剤、抗アレルギー剤、強心剤、不整脈治療剤、血管拡張剤、降圧利尿剤、糖尿病治療剤、ホルモン剤、骨吸収抑制剤からなる群から選ばれる１種または２種以上を用いることが可能であるが、特には難水溶性薬物が好ましく、例えばステロイド系統の薬物、プロテイン薬物、ペプチド薬物、５−フルオロウラシル、Ｍｅ−ＣＣＵＮ、オメプラゾル（ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）、プラチナ製剤（具体的にはシスプラチン、カルボプラチン、イソプラチン又はこれらの修飾体等）の如き抗癌剤及びその他の一般的な抗生剤等が好適に使用可能である。
【０３３４】
＜製剤  −  親油性薬物を内包  −＞
本発明の徐放性製剤は、本発明のマイクロカプセル等の構造体をそのまま、あるいは、構造体を原料物質として種々の剤形に製剤化し、例えば注射剤、埋め込み剤、経口投与製剤（例、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等）、経鼻投与製剤、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤等）等のいずれであってもよい。
【０３３５】
これらの製剤は、製剤分野において通常一般に用いられる公知の方法によって製造することができる。例えば注射剤は、上記した構造体を、水性あるいは油性の分散媒に分散することにより製造される。水性分散媒としては、例えば蒸留水に等張化剤（例、塩化ナトリウム、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、ソルビトール、グリセリン等）、分散剤（例、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ＨＣＯ−５０、ＨＣＯ−６０、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等）、保存剤（例、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノール等）、無痛化剤（例、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカイン等）等を溶解した溶液が挙げられる。また、油性分散媒としては、例えばオリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、コーン油、中鎖脂肪酸グリセリド等が挙げられる。該注射剤は、プレフィルドシリンジのチャンバー内に充填されてもよいし、また、分散媒と構造体をいわゆるダブルチャンバープレフィルドシリンジ（ＤＰＳ）内の異なるチャンバーに分離して充填してもよい。また、注射剤を製造する際、構造体に、上記の組成以外に、さらに、賦形剤（例、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖等）を加えて、再分散した後、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥して固型化し、用時に、注射用蒸留水あるいは適当な分散媒を加えると、より安定した徐放性注射剤が得られる。この場合の粒子径は、例えば懸濁注射剤として使用する場合にはその分散度、通針性を満足する範囲であればよく、例えば、平均粒子径として約０．１ないし約５００μｍの範囲が挙げられる。好ましくは、約１ないし約３００μｍの範囲の粒子径である。さらに好ましくは、約２ないし約２００μｍの範囲の平均粒子径である。また、前記のように浸透圧調節剤を水相中に加えることにより、構造体の形状を通針により適した球状にすることもできる。構造体を無菌製剤にするには、例えば製造全工程を無菌にする方法，ガンマ線で滅菌する方法，防腐剤を添加する方法等が挙げられるが、特に限定されない。
【０３３６】
経口投与製剤は、例えば上記したマイクロカプセル等の構造体に、賦形剤（例、乳糖、白糖、デンプン等）、崩壊剤（例、デンプン、炭酸カルシウム等）、結合剤（例、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００等）等を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング，腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより製造できる。コーティング剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース，エチルセルロース，ヒドロキシメチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，ポリオキシエチレングリコール，ツイーン８０，ブルロニックＦ６８，セルロースアセテートフタレート，ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート，ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート，オイドラギット（ローム社製，ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合）および色素（例、酸化チタン，ベンガラ等）等が用いられる。
【０３３７】
経鼻投与製剤は、固状、半固状または液状のいずれであってもよい。固状の経鼻投与製剤は、例えば上記したマイクロカプセル等の構造体そのままであってもよいが、通常該構造体に賦形剤（例、グルコース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロース等）、増粘剤（例、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体等）等を添加、混合することにより製造できる。例えば液状の経鼻投与製剤は、上記した注射剤の場合と同様にして製造することができる。また、これらの経鼻投与製剤は、いずれも、ｐＨ調節剤（例、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム等）、防腐剤（例、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム等）等を含んでいてもよい。
【０３３８】
坐剤は、油性または水性であってよく、また、固状、半固状あるいは液状のいずれであってもよい。坐剤は、通常油性基剤、水性基剤または水性ゲル基剤を用いて製造される。油性基剤としては、例えば高級脂肪酸のグリセリド〔例、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社、ドイツ）等〕、中級脂肪酸〔例、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社、ドイツ）等〕、あるいは植物油（例、ゴマ油、大豆油、綿実油等）等が挙げられる。水性基剤としては、例えばポリエチレングリコール類、プロピレングリコール等が挙げられる。水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体等が挙げられる。
【０３３９】
本発明の徐放性製剤は、低毒性で哺乳動物（例、ヒト，牛，豚，犬，ネコ，マウス，ラット，ウサギ等）に対して安全に用いることができる。徐放性製剤の投与量は、薬物の種類と含量、剤形、薬物放出の持続時間、対象疾病〔例、前立腺癌，前立腺肥大症，子宮内膜症，子宮筋腫，子宮線維腫，思春期早発症，乳癌，膀胱癌，子宮頚部癌，慢性リンパ性白血病，慢性骨髄性白血病，大腸癌，胃炎，ホジキン病，悪性黒色腫，転移，多発性骨髄腫，非ホジキン性リンパ腫，非小細胞肺癌，卵巣癌，消化性潰瘍，全身性真菌感染症，小細胞肺癌，心弁膜症，乳腺症，多嚢胞性卵巣，不妊，慢性無排卵症婦人における適性排卵誘発，ざそう（アクネ），無月経（例、続発性無月経），卵巣および乳房の嚢胞性疾患（多嚢胞性卵巣を含む），婦人科系の癌，卵巣性高アンドロゲン血症および多毛症，胸腺幼若化を介したＴ細胞産生によるＡＩＤＳ，男性性犯罪者の治療のための男性避妊等のホルモン依存性疾患の治療および避妊，月経前症候群（ＰＭＳ）の症状軽減，体外受精（ＩＶＦ）等〕、対象動物等によって種々異なるが、薬物の有効量であればよい。薬物の１回あたりの投与量としては、例えば徐放性製剤が１カ月製剤である場合、好ましくは、成人１人当たり約０．０１ｍｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは、約０．０５ｍｇないし約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。特に好ましくは、約０．１ｍｇないし約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。１回あたりの徐放性製剤の投与量は成人１人当たり好ましくは、約０．１ｍｇないし約５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは、約０．２ｍｇないし約３００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、数週間に１回、１か月に１回、あるいは数か月に１回等、薬物の種類と含量、剤形、薬物放出の持続時間、対象疾病、対象動物等によって適宜選ぶことができる。
【０３４０】
＜応用  −  液相を内包  −＞
本発明のマイクロカプセルを例えば人工赤血球組成物として用いる場合には、マイクロカプセル化工程で得られるスラリーを生理食塩水に懸濁し、さらにゲルろ過法、遠心分離法等公知の手段によって粗大粒子を除去する。
【０３４１】
本発明のマイクロカプセルを例えばインク組成物として用いる場合には、水性媒体に分散される。水性媒体への分散を補助する目的で、界面活性剤や保護コロイド、さらには水溶性有機溶剤等を、塗膜の耐水性を著しく低下させない範囲で添加することもできる。また防腐剤、粘度調整剤、ｐＨ調整剤、キレート化剤等を添加することもできる。本発明の水性顔料インクに添加しても良い保護コロイドとして具体的には、にかわ、ゼラチン、カゼイン、アルブミン、アラビアゴム、フィッシュグリュー等の天然タンパク質やアルギン酸、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、芳香族アミド、ポリアクリル酸、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、アクリル、ポリエステル等の合成高分子等が挙げられる。保護コロイドは、定着性や粘度調節、速乾性を挙げる目的で、必要に応じて使用されるものであり、インク中の保護コロイドの含有割合は、３０質量％以下が好ましく、２０質量％以下が特に好ましい。
【０３４２】
本発明の水性顔料インクに添加しても良い界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、両性イオン性、非イオン性のいずれの活性剤でも良い。アニオン性界面活性剤の例としては、ステアリン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、半硬化牛脂脂肪酸ナトリウム、等の脂肪酸塩類；ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸トリ（２−ヒドロキシエチル）アンモニウム、オクタデシル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸エステル塩類；ノニルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、オクタデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム等のベンゼンスルホン酸塩類；ドデシルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物等のナフタレンスルホン酸塩類；スルホコハク酸ジドデシルナトリウム、スルホコハク酸ジオクタデシルナトリウム等のスルホコハク酸エステル塩類；ポリオキシエチレンドデシルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテル硫酸トリ（２−ヒドロキシエチル）アンモニウム、ポリオキシエチレンオクタデシルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルフェニルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレン硫酸エステル塩類；ドデシルリン酸カリウム、オクタデシルリン酸ナトリウム等のリン酸エステル塩類等が挙げられる。カチオン性界面活性剤の例としては、酢酸オクタデシルアンモニウム、ヤシ油アミン酢酸塩等のアルキルアミン塩類；塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム、塩化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、塩化ドデシルベンジルジメチルアンモニウム等の第４級アンモニウム塩類が挙げられる。両性イオン性活性剤の例としては、ドデシルベタイン、オクタデシルベタイン等のアルキルベタイン類；ドデシルジメチルアミンオキシド等のアミンオキシド類等が挙げられる。非イオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレンオクタデシルエーテル、ポリオキシエチレン（９−オクタデセニル）エーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル類；ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンフェニルエーテル類；ポリ酸化エチレン、コ−ポリ酸化エチレン酸化プロピレン等のオキシラン重合体類；ソルビタンドデカン酸エステル、ソルビタンヘキサデカン酸エステル、ソルビタンオクタデカン酸エステル、ソルビタン（９−オクタデセン酸）エステル、ソルビタン（９−オクタデセン酸）トリエステル、ポリオキシエチレンソルビタンドデカン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンヘキサデカン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンオクタデカン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンオクタデカン酸トリエステル、ポリオキシエチレンソルビタン（９−オクタデセン酸）エステル、ポリオキシエチレンソルビタン（９−オクタデセン酸）トリエステル等のソルビタン脂肪酸エステル類；ポリオキシエチレンソルビトール（９−オクタデセン酸）テトラエステル等のソルビトール脂肪酸エステル類；グリセリンオクタデカン酸エステル、グリセリン（９−オクタデセン酸）エステル等のグリセリン脂肪酸エステル類が挙げられる。これらの非イオン性活性剤の中でもＨＬＢが１４以上のものが特に好ましい。本発明に用いる上記界面活性剤の配合量は、単独使用の場合又は２種以上を混合使用する場合によりその配合量は変動するが、インク組成物全量に対して０〜１０質量％、好ましくは０〜５質量％である。本発明の水性顔料インク組成物は、組成物全量に対して水が２０〜９５質量％、顔料が１〜６０体積％の範囲で含有することが好ましい。
【０３４３】
＜パーフルオロカーボン  −  気相を内包  −＞
本発明の超音波造影剤に利用される中空構造体の中空内にパーフルオロカーボンのガスを充満させるには、前記中空構造体を水中で分散させた後、減圧下で乾燥し、ついで減圧状態の乾燥機内にパーフルオロカーボンのガスを注入し、好ましくは常圧に戻せばよい。
【０３４４】
ここで、中空構造体を分散させる水は、前述の分散剤を含んでいてもよい。減圧下での乾燥は、必要ならば加温して行う減圧乾燥法、凍結乾燥法等が使用可能であるが、凍結乾燥法を使用するのが好ましい。パーフルオロカーボンとしては、造影剤を体内に投与した後も気体状態が維持されるように、沸点が体温以下、好ましくは、１０℃以下であればよい。具体的には、オクタフルオロシクロブタン、オクタフルオロプロパン、ヘキサフルオロエタン等があげられる。また、使用するパーフルオロカーボンのガスは水に難溶性であるのが好ましく、これにより、血液等の体液内に溶解することがなく、造影効果の持続時間を長くすることができる。
【０３４５】
＜水性キャリア  −  気相を内包  −＞
本発明の方法によって得られる中空構造体は、乾燥した微粒子状であるため、超音波造影剤として使用する際には、適当な水性キャリア（生理食塩水、マンニトール水溶液等）に分散させて経口的または非経口的に生体内に投与される。特に、注射による投与が望ましい。前記水性キャリアには、必要に応じて公知の分散剤を添加してもよい。また、超音波造影剤として使用する際、中空構造体は、水性キャリアを含む造影剤総量に対して０．０１〜８０質量％、好ましくは０．０１〜５０質量％の濃度となるように添加される。
【０３４６】
【実施例】
以下に実施例、比較例および実験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。なお、以下の実施例、比較例および実験例において、「％」は特記しない限り質量％を示す。なお、以下における「マイクロカプセル」には、先に述べた２つの形態、すなわち１層（モノリシック）型と２層（コア／シェル）型があり、これらを総称して「マイクロカプセル」と記載する。
【０３４７】
（参考例１）  ＰＨＢ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製
ＴＢ  ６４  株由来のＰＨＢ合成酵素の生産能を有する形質転換体の作製方法に関しては、発明者らが別途既に出願しているが、ここではその具体例を挙げる。ＴＢ  ６４  株を  １００  ｍＬのＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５  ％酵母エキス、０．５  ％塩化ナトリウム、ｐＨ  ７．４）で、３０  ℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した。ベクターはｐＵＣ  １８  を使用し、制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、１巻、５７２  頁、１９８９  年；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）の後、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造）を用いて染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分分解断片と連結した。次に、この連結ＤＮＡ断片を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ  １０１  株を形質転換し、ＴＢ  ６４  株の染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０３４８】
次に、ＴＢ  ６４  株のＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るための表現型スクリーニングを行った。選択培地には２％グルコースを含有するＬＢ培地を用い、寒天平板培地上のコロニーが適当な大きさに生育してきた時点でスダンブラックＢ溶液を噴霧し、ＵＶ光照射により蛍光を発するコロニーを取得した。取得したコロニーからアルカリ法によりプラスミドを回収することでＰＨＢ合成系酵素群遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【０３４９】
ここで取得した遺伝子断片を不和合性グループであるＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ、あるいはＩｎｃＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターｐＢＢＲ  １２２（Ｍｏ  ＢｉＴｅｃ）に組み換え、この組み換えプラスミドをラルストーニャ・ユートロファＴＢ  ６４  ｍ１株（ＰＨＢ合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、ＴＢ  ６４  ｍ１株のＰＨＢ合成能が復帰し、相補性を示した。
【０３５０】
次に、ＰＨＢ合成酵素遺伝子の開始コドン近傍の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを設計・合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク）、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ＰＨＢ合成酵素遺伝子を含む断片を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０３５１】
次に、上のようにして得られたＰＣＲ増幅断片について制限酵素ＢａｍＨＩを用いて完全分解し、発現ベクターｐＴｒｃ  ９９  Ａの制限酵素ＢａｍＨＩで切断、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、１巻、５．７．２  頁、１９８９  年；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）したものに、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造）を用いて連結した。得られた組換えプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＨＢ  １０１）を塩化カルシウム法により形質転換し（宝酒造）、得られた組換え体より回収した組換えプラスミドをｐＴＢ  ６４−ＰＨＢとした。ｐＴＢ  ６４−ＰＨＢで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ  １０１）を塩化カルシウム法に
より形質転換し、ｐＴＢ  ６４−ＰＨＢ組換え株を得た。
【０３５２】
（参考例２）  ＧＳＴ融合ＰＨＢ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製
ｐＴＢ  ６４−ＰＨＢ組換え株をＬＢ培地  ２００  ｍＬに植菌して、３７  ℃、１２５  ストローク／分で  １２  時間振盪培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離によって回収し、定法によりプラスミドＤＮＡを回収した。
【０３５３】
ｐＴＢ  ６４−ＰＨＢに対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：１）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：２）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク）。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＴＢ  ６４−ＰＨＢをテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＢ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【０３５４】
精製したＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ‐６Ｐ‐１（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて大腸菌（ＪＭ  １０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。
【０３５５】
（参考例３）  ＰＨＢ合成酵素の調製
得られた発現用菌株をアンピシリン（１００  μｇ／Ｌ）を添加した２×ＹＴ培地（ポリペプトン  １６  ｇ／Ｌ、酵母エキス  １０  ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、ＰＨ  ７．０）１００  ｍＬで  ３０  ℃にて一晩前培養した。
【０３５６】
これをアンピシリン（１００  μｇ／Ｌ）を添加した２×ＹＴ培地（ポリペプトン  １６  ｇ／Ｌ、酵母エキス  １０  ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、ＰＨ  ７．０）１０  リットルに添加し、３０℃にて３時間培養後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとなるように添加し、３０  ℃にて３時間培養した。
【０３５７】
回収した培養液を４℃、７８０００ｍ／ｓ２（＝８０００Ｇ）で  １０  分間遠心処理し、上清を取り除いた後、菌体ペレットを４℃のＰＢＳ溶液  ５００  ｍＬに再懸濁した。この菌液をあらかじめ４℃に冷却しておいたベッセルに各回  ４０  ｍＬずつ注入し、フレンチプレスによって  ２１６ＭＰａ（＝２２００  ｋｇ／ｃｍ２）に加圧しながら少しずつノズルから菌液を解放することで菌体破砕処理を行った。菌体破砕液を４℃、７８０００ｍ／ｓ２（＝８０００Ｇ）で  １０  分間遠心処理した後、上清を回収した。この上清を  ０．４５  μｍのフィルターで濾過し、固形夾雑物を取り除き、上清中に目的のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合したＰＨＢ合成酵素が存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【０３５８】
次に、このＧＳＴ融合ＰＨＢ合成酵素をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ：アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。グルタチオン・セファロース４Ｂの  ７５  ％スラリー  ６．６５  ｍＬを４℃、４９００ｍ／ｓ２（＝５００Ｇ）で５分間遠心処理し、上清を取り除いた後、４℃のＰＢＳ溶液  ２００  ｍＬに再懸濁し、さらに４℃、４９００ｍ／ｓ２（＝５００Ｇ）で５分間遠心処理し、上清を取り除いた。さらに４℃のＰＢＳ溶液５ｍＬに再懸濁し、グルタチオン・セファロース４Ｂ  の  ５０  ％スラリーとした。
【０３５９】
このグルタチオン・セファロース４Ｂの  ５０  ％スラリー  １０  ｍＬに先ほど調整した上清全量を添加し、室温で  ３０  分間緩やかに振とうしてグルタチオン・セファロース４Ｂに上清中の目的とする融合たんぱく質をアフィニティ吸着させた。その後、４℃、４９００ｍ／ｓ２（＝５００Ｇ）で５分間遠心処理し、上清を取り除いた後、４℃のＰＢＳ溶液５ｍＬに再懸濁し、再び同様の遠心処理を行い、上清を除いた。このＧＳＴ融合ＰＨＢ合成酵素を固定化したグルタチオン・セファロース４Ｂについて、ＰＢＳ溶液への再懸濁と遠心処理を２回繰り返して洗浄した後、最後に５℃のクリベージ緩衝液（Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０  ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ１ｍＭ、ＰＨ７）５ｍＬに懸濁した。これに４％  のプレシション・プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ；アマシャムファルマシアバイオテク社製）のクリベージ緩衝液溶液  ０．５  ｍＬを添加し、５℃で４時間緩やかに振とうした。これを４℃、４９００ｍ／ｓ２（＝５００Ｇ）で５分間遠心処理し、上清を回収した。次に上記と同様に調整したグルタチオン・セファロース４Ｂの  ５０  ％スラリー１ｍＬを、４℃、４９００ｍ／ｓ２（＝５００Ｇ）で５分間遠心処理し、上清を除いた後のグルタチオン・セファロース４Ｂに先ほど回収した上清を添加し、緩やかに攪拌して上清中に残留したプレシション・プロテアーゼをグルタチオン・セファロース４Ｂに吸着させた。次いで４℃、４９００ｍ／ｓ２（＝５００Ｇ）で５分間遠心処理して上清を回収した。この上清はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示し、精製されていることを確認した。
【０３６０】
また、含有するＰＨＢ合成酵素活性を以下の方法で測定した。まず、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を  ０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ  ８．０）に  ３．０ｍｇ／ｍＬ溶解した溶液  １００  μＬを酵素溶液  １００  μＬに添加して混合し、３０  ℃で１分間プレインキュベートした。これに、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを  ０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ  ８．０）に  ３．０  ｍＭ溶解した溶液  １００  μＬを添加して混合し、３０  ℃で１〜  ３０  分間インキュベートしたのち、トリクロロ酢酸を  ０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ  ８．０）に  １０  ｍｇ／ｍＬ溶解した溶液  ３００  μＬを添加して反応を停止させた。反応停止したこの溶液を遠心分離（１４７、０００ｍ／ｓ２（＝１５、０００Ｇ）、１０  分間）し、５、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を  ０．１  Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ  ８．０）に  ２．０  ｍＭ溶解した溶液  ５００  μＬを上清  ５００  μＬに添加し、３０  ℃で  １０  分間インキュベートしたのち、４１２  ｎｍの吸光度を測定した。そして１分間に１μｍｏｌのＣｏＡを放出させる酵素量を１単位（Ｕ）として、酵素活性を計算した。その結果、比活性として  ７．５  Ｕ／ｍＬが得られた。この液を、ライホゲルを添加して限外濾過濃縮し、１０  Ｕ／ｍＬとしたものを精製酵素液（１）とした。
【０３６１】
（参考例４）  ＰＨＢ合成酵素含有粗酵素液の調製方法
ＫＫ  ０１  及びＴＬ２株を、酵母エキス  ０．５  ％、ミネラル溶液（下記参照）０．３％を含有したＭ９培地（下記組成）１０  リットルで  ３０  ℃、２４  時間培養し、回収した培養液を４℃、７８０００ｍ／ｓ２（＝８０００Ｇ）で  １０  分間遠心処理し、上清を取り除いた後、菌体ペレットを４℃のＰＢＳ溶液  ５００  ｍＬに再懸濁した。この菌液をあらかじめ４℃に冷却しておいたベッセルに各回  ４０  ｍＬずつ注入し、フレンチプレスによって  ２２００  ｋｇ／ｃｍ２に加圧しながら少しずつノズルから菌液を解放することで菌体破砕処理を行った。得られた菌体破砕液を４℃、７８０００ｍ／ｓ２（＝８０００Ｇ）で１０  分間遠心処理した後、上清を回収した。この上清を  ０．４５  μｍのフィルターで濾過し、固形夾雑物を取り除き、含有するＰＨＢ合成酵素活性を前述の方法で測定した。その結果、比活性としてＫＫ  ０１  株については  １．６  Ｕ／ｍＬ、ＴＬ２株については  １．２  Ｕ／ｍＬが得られた。この液を、生体溶液試料濃縮剤（商品名：みずぶとりくん、アトー社製）を添加して限外濾過濃縮し、１０  Ｕ／ｍＬとした粗酵素液を、ＫＫ  ０１  株由来のものを粗酵素液（１）、ＴＬ２株由来のものを粗酵素液（２）とした。
【０３６２】
［Ｍ９培地］
Ｎａ２ＨＰＯ４  ：  ６．２ｇ
ＫＨ２ＰＯ４  ：  ３．０ｇ
ＮａＣｌ  ：  ０．５ｇ
ＮＨ４Ｃｌ  ：  １．０ｇ
（培地１リットル中、ｐＨ  ７．０）
（ミネラル溶液）
ニトリロ三酢酸：１．５ｇ  ＭｇＳＯ４：３．０ｇ  ；ＭｎＳＯ４：０．５ｇ；ＮａＣｌ：１．０ｇ；；ＦｅＳＯ４：０．１ｇ；ＣａＣｌ２：０．１ｇ；ＣｏＣｌ２：０．１ｇ；ＺｎＳＯ４：０．１ｇ  ；ＣｕＳＯ４：０．１ｇ；ＡｌＫ（ＳＯ４）２：０．１ｇ；Ｈ３ＢＯ３：０．１ｇ；Ｎａ２ＭｏＯ４：０．１ｇ；ＮｉＣｌ２：０．１ｇ；（１リットル中、ｐＨ  ７．０）
（参考例５）  ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製
ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体を作製した。
【０３６３】
ＹＮ２株を  １００  ｍＬのＬＢ培地（１％ポリペプトン（日本製薬（株）製）、０．５  ％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５  ％塩化ナトリウム、ｐＨ  ７．４）で  ３０  ℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで完全分解した。ベクターにはｐＵＣ  １８  を使用し、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断した。末端の脱リン酸処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、１、５７２、（１９８９）；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）ののち、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造（株）製）を用いて、ベクターの切断部位（クローニングサイト）と染色体ＤＮＡのＨｉｎｄ  ＩＩＩ完全分解断片とを連結した。この染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドベクターを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ  １０１  株を形質転換し、ＹＮ２株のＤＮＡライブラリーを作製した。
【０３６４】
次に、ＹＮ２株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号：３および配列番号：４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））、このオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅されてきたＤＮＡ断片をプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販の標識酵素系ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔ（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）を利用して行った。
【０３６５】
得られた標識化プローブを用いて、ＹＮ２株の染色体ＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法によってＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【０３６６】
ここで取得した遺伝子ＤＮＡ断片を、不和合性グループであるＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ、あるいはＩｎｃＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターｐＢＢＲ  １２２（Ｍｏ  Ｂｉ  Ｔｅｃ）に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍＬ株（ＰＨＡ合成能欠損株）にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、ＹＮ２ｍＬ株のＰＨＡ合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ断片は、シュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍＬ株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【０３６７】
このＤＮＡ断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド鎖をコードする、配列番号：５および配列番号：６で示される塩基配列が存在することが確認された。これらのＰＨＡ合成酵素遺伝子について、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。
【０３６８】
即ち、配列番号：５で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：７）および下流側プライマー（配列番号：８）、配列番号：６で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー（配列番号：９）および下流側プライマー（配列番号：  １０）をそれぞれ合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。これらのプライマーを用いて、配列番号：５および配列番号：６で示される塩基配列それぞれについてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造（株）製）。
【０３６９】
次に、得られたＰＣＲ増幅断片および発現ベクターｐＴｒｃ  ９９  Ａを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断し、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、１巻、５７２  頁、１９８９年；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）したのち、この発現ベクターｐＴｒｃ  ９９  Ａの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造（株）製）を用いて連結した。
【０３７０】
得られた組換えプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ  １０１  ：宝酒造）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドをそれぞれ回収した。配列番号：５の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをｐＹＮ２−Ｃ１、配列番号：６の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをｐＹＮ２−Ｃ２とした。ｐＹＮ２−Ｃ１、ｐＹＮ２−Ｃ２で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ  １０１  ｆＢ  ｆａｄＢ欠損株）を塩化カルシウム法により形質転換し、それぞれの組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株、ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株、ｐＹＮ２−Ｃ２組換え株を得た。
【０３７１】
（参考例６）  ＰＨＡ合成酵素の生産１
ｐＹＮ２−Ｃ１に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：  １１）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：  １２）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＹＮ２−Ｃ１をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造（株）製）。
【０３７２】
同様にｐＹＮ２−Ｃ２に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：  １３）および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド（配列番号：  １４）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク（株））。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ｐＹＮ２−Ｃ２をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造（株）製）。
【０３７３】
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて大腸菌（ＪＭ  １０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地  １０  ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その  ０．１  ｍＬを、１０  ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７  ℃、１７０  ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加（終濃度  １  ｍＭ）し、３７  ℃で４から  １２  時間培養を続けた。
【０３７４】
ＩＰＴＧ  誘導した大腸菌を集菌（７８０００ｍ／ｓ２（＝８０００Ｇ）、２分、４℃）し、１／  １０  量の  ４℃  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；８  ｇ  ＮａＣｌ、１．４４  ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４  ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２  ｇ  ＫＣｌ、１、０００  ｍＬ精製水）に再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（７８０００ｍ／ｓ２（＝８０００Ｇ）、１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製）で精製した。
【０３７５】
使用するグルタチオン・セファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオン・セファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（７８０００ｍ／ｓ２（＝８０００Ｇ）、１分、４℃）した後、４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。
【０３７６】
前処理したグルタチオン・セファロース  ４０  μＬを、無細胞抽出液１  ｍＬ  に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ１およびＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ２をグルタチオン・セファロースに吸着させた。吸着後、遠心（７８０００ｍ／ｓ２（＝８０００Ｇ）、１分、４℃）してグルタチオン・セファロースを回収し、４００  μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０  ｍＭグルタチオン  ４０  μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心（７８０００ｍ／ｓ２（＝８０００Ｇ）、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを確認した。
【０３７７】
各ＧＳＴ融合タンパク質  ５００  μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク（株）製、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴとを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ  ２００  カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１およびＹＮ２−Ｃ２の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそれぞれ  ６０．８  ｋＤａ、および  ６１．５  ｋＤａのシングルバンドを確認した。
【０３７８】
該酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０  Ｕ／ｍＬの精製酵素溶液を得た。
【０３７９】
各精製酵素活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。各精製酵素の活性測定の結果を表１に示した。
【０３８０】
【表１】
2004331750.tif 000039
（参考例７）  ＰＨＡ合成酵素の生産２
Ｐ  ９１  株、Ｈ  ４５  株、ＹＮ２株およびＰ  １６１  株を、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５  ％、オクタン酸  ０．１  ％とを含むＭ９培地  ２００  ｍＬに植菌して、３０  ℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。２４  時間後、菌体を遠心分離（９８、０００ｍ／ｓ２（１０、０００Ｇ）、４℃、１０  分間）によって回収し、０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ  ８．０）２００  ｍＬに再懸濁して再度遠心分離することによって洗浄した。菌体を  ０．１  Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ  ８．０）２．０  ｍＬに再懸濁し、超音波破砕機にて破砕したのち、遠心分離（１１８、０００ｍ／ｓ２（＝１２、０００Ｇ）、４℃、１０  分間）して上清を回収して粗酵素溶液を得た。各粗酵素活性は前述の方法で測定し、その結果を表２に示した。
【０３８１】
【表２】
2004331750.tif 000040
該粗酵素溶液を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０  Ｕ／ｍＬの粗酵素溶液を得た。
【０３８２】
（参考例８）３−ヒドロキシアシルＣｏＡの合成
（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイル−ＣｏＡは、Ｒｅｈｍ  ＢＨＡ、  Ｋｒｕｇｅｒ  Ｎ、  ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌＡ  （１９９８）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３  ｐｐ２４０４４−２４０５１に基づき、若干の変更を加え次のように行った。ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を、２  ｍＭ  ＡＴＰ、  ５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、  ２  ｍＭ  ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、  ２ｍＭ  （Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏａｔｅを含むトリス塩酸緩衝液（５０  ｍＭ、  ｐＨ  ７．５）に溶解し、０．１ミリユニット／マイクロリットルとした。３７℃の温浴中で保温し、適時サンプリングし反応の進行をＨＰＬＣで分析した。サンプリングした反応溶液に硫酸を０．０２  Ｎになるように添加して酵素反応を止めた後、ｎ−ｈｅｐｔａｎｅで未反応の基質である（Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｎｏａｔｅを抽出して除去した。ＨＰＬＣによる分析には、ＲＰ１８カラム（ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ１８、  ７μｍ、  Ｋｎａｕｓｅｒ）を用い、２５  ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ  ５．３）を移動相として、アセトニトリルの直線濃度勾配をかけて溶出し、ダイオードアレイ検出器で２００から５００  ｎｍの吸光スペクトルをモニターすることによって、酵素反応によって生成したチオエステル化合物を検出した。同様にして、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡおよび（Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロフェニル）バレリルＣｏＡを調製した。
【０３８３】
（参考例９）
Ｄ−グルコース  ０．５％と、５−（４−フルオロフェニル）吉草酸（ＦＰＶＡ）０．１％とを含むＭ９培地  ２０Ｌにシュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  ＹＮ２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３７５）を植菌し、３０℃、８０回転／分、通気量  ２．５Ｌ／分で通気攪拌培養した。４８時間後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ−グルコース  ０．５％と、ＦＰＶＡ  ０．１％とを含み、窒素源（ＮＨ４Ｃｌ）を含まないＭ９培地  ２０Ｌに再懸濁して、更に  ３０℃、８０回転／分、通気量  ２．５Ｌ／分で通気攪拌培養した。４８時間後、菌体を遠心分離によって回収し、回収した湿菌体より分析評価用に１ｇを分取、冷メタノールで一度洗浄の後、凍結乾燥して凍結乾燥ペレットを得た。
【０３８４】
残りの湿菌体については、約  １．７％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液  ５００ｍＬに懸濁し、約４℃で２時間振盪してＰＨＡを抽出した。遠心分離によりＰＨＡを回収し乾燥した結果、培地液量１Ｌ当たり  ０．８７ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物１とした。
【０３８５】
この凍結乾燥ペレットを  ２０ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０℃で  ２０時間攪拌してＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５μｍメンブレンフィルターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿のみを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。
【０３８６】
得られたＰＨＡの組成は以下のようにして分析した。すなわち、約  １０ｍｇのＰＨＡを  ２５ｍＬ容ナス型フラスコに入れ、クロロホルム２ｍＬに溶解させ、３％硫酸を含むメタノール溶液２ｍＬを加えて、１００℃で還流しながら  ３．５時間反応させた。反応終了後、脱イオン水  １０ｍＬを加えて激しく  １０分間振盪した後に、２層に分離した下層のクロロホルム層を取り出し、硫酸マグネシウムで脱水したのち、このクロロホルム層をガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（Ｊ＆Ｗ社、０．３２ｍｍ×３０ｍ）、ＥＩ法）にかけて、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、９６％が３ＨＦＰＶであり、４％が３−ヒドロキシ酪酸のユニットであり、ＦＰＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＦＰＶモノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。
【０３８７】
また、このＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソー  ＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；（クロロホルム、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝７１，５００、Ｍｗ＝１５８，０００  であった。
【０３８８】
（参考例１０）
ＦＰＶＡの替わりに４−フェノキシ酪酸（ＰｘＢＡ）を用いた以外は参考例９と全く同じ条件で、３−ヒドロキシ−４−フェノキシ酪酸（３ＨＰｘＢ）モノマーユニットを含むＰＨＡを合成したところ、培地液量１Ｌ当たり  ０．１５ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物２とした。
【０３８９】
得られたＰＨＡについて参考例９と同様に分析評価を行ったところ、ＰＨＡモノマーユニットとしては、９５％がＰｘＢＡであり、５％が３−ヒドロキシ酪酸のユニットであり、ＰｘＢＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＰｘＢモノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。また、分子量はＭｎ＝７１、５００、Ｍｗ＝１５８、０００  であった。
【０３９０】
（参考例１１）
ＦＰＶＡの替わりに４−シクロヘキシル酪酸（ＣＨＢＡ）を用いた以外は参考例９と全く同じ条件で、３−ヒドロキシ−４−シクロヘキシル酪酸（３ＨＣＨＢ）モノマーユニットを含むＰＨＡを合成したところ、培地液量１Ｌ当たり  ０．７９ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物３とした。
【０３９１】
得られたＰＨＡについて参考例９と同様に分析評価を行ったところ、ＰＨＡモノマーユニットとしては、９８％が３ＨＣＨＢであり、２％が３−ヒドロキシ酪酸のユニットであり、ＣＨＢＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＣＨＢモノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。また、分子量はＭｎ＝９２，２００、Ｍｗ＝２１８，０００  であった。
【０３９２】
（参考例１２）
ＦＰＶＡの替わりに５−ベンゾイル吉草酸（ＢｚＶＡ）を用いた以外は参考例９と全く同じ条件で、３−ヒドロキシ−５−ベンゾイル吉草酸（３ＨＢｚＶ）モノマーユニットを含むＰＨＡを合成したところ、培地液量１Ｌ当たり  ０．５５ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物４とした。
【０３９３】
得られたＰＨＡについて参考例９と同様に分析評価を行ったところ、ＰＨＡモノマーユニットとしては、８８％が３ＨＢｚＶであり、１２％が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上のユニットであり、ＢｚＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＢｚＶモノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。また、分子量はＭｎ＝３２５，０００、Ｍｗ＝１，２４０，０００  であった。
【０３９４】
（参考例１３）
ＦＰＶＡの替わりに５−（４−フルオロベンゾイル）吉草酸（ＦＢｚＶＡ）を用いた以外は参考例９と全く同じ条件で、３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロベンゾイル）吉草酸（３ＨＦＢｚＶ）モノマーユニットを含むＰＨＡを合成したところ、培地液量１Ｌ当たり  ０．３５ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物５とした。
【０３９５】
得られたＰＨＡについて参考例９と同様に分析評価を行ったところ、ＰＨＡモノマーユニットとしては、７９％が３ＨＦＢｚＶであり、２１％が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上のユニットであり、ＦＢｚＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＦＢｚＶモノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。また、分子量はＭｎ＝２８５，０００、Ｍｗ＝８３３，０００  であった。
【０３９６】
（参考例１４）
ＦＰＶＡの替わりに５−チエニル吉草酸（ＴＶＡ）を用いた以外は参考例９と全く同じ条件で、３−ヒドロキシ−５−チエニル吉草酸（３ＨＴＶ）モノマーユニットを含むＰＨＡを合成したところ、培地液量１Ｌ当たり  ０．８５ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物６とした。
【０３９７】
得られたＰＨＡについて参考例９と同様に分析評価を行ったところ、ＰＨＡモノマーユニットとしては、９７％が３ＨＴＶであり、３％が３−ヒドロキシ酪酸のユニットであり、ＴＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＴＶモノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。また、分子量はＭｎ＝７５，０００、Ｍｗ＝１８５，０００  であった。
【０３９８】
（参考例１５）
ＦＰＶＡの替わりに５−チエノイル吉草酸（ＴｏＶＡ）を用いた以外は参考例９と全く同じ条件で、３−ヒドロキシ−５−チエノイル吉草酸（３ＨＴｏＶ）モノマーユニットを含むＰＨＡを合成したところ、培地液量１Ｌ当たり  ０．１５ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物７とした。
【０３９９】
得られたＰＨＡについて参考例９と同様に分析評価を行ったところ、ＰＨＡモノマーユニットとしては、６２％が３ＨＴｏＶであり、３８％が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上のユニットであり、ＴｏＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＴｏＶモノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。また、分子量はＭｎ＝１０５，０００、Ｍｗ＝２５２，０００  であった。
【０４００】
（参考例１６）
ＦＰＶＡの替わりに５−（４−フルオロチオフェノキシ）吉草酸（ＦＴＰｘＶＡ）を用いた以外は参考例９と全く同じ条件で、３−ヒドロキシ−５−（４−フルオロチオフェノキシ）吉草酸（３ＨＦＴＰｘＶ）モノマーユニットを含むＰＨＡを合成したところ、培地液量１Ｌ当たり  ０．９２ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物８とした。
【０４０１】
得られたＰＨＡについて参考例９と同様に分析評価を行ったところ、ＰＨＡモノマーユニットとしては、８２％が３ＨＦＴＰｘＶであり、１８％が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上のユニットであり、ＦＴＰｘＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＦＴＰｘＶモノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。また、分子量はＭｎ＝９５，０００、Ｍｗ＝２８２，０００  であった。
【０４０２】
（参考例１７）
ＦＰＶＡの替わりに５−［（４−フルオロフェニルメチル）スルファニル］吉草酸を用いた以外は参考例９と全く同じ条件で、３−ヒドロキシ−５−［（４−フルオロフェニルメチル）スルファニル］吉草酸モノマーユニットを含むＰＨＡを合成したところ、培地液量１Ｌ当たり  ０．３５ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物９とした。
【０４０３】
得られたＰＨＡについて参考例９と同様に分析評価を行ったところ、ＰＨＡモノマーユニットとしては、８９％が３−ヒドロキシ−５−［（４−フルオロフェニルメチル）スルファニル］吉草酸モノマーユニットであり、１１％が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上のユニットであり、５−［（４−フルオロフェニルメチル）スルファニル］吉草酸に由来する所望のモノマーユニットである３−ヒドロキシ−５−［（４−フルオロフェニルメチル）スルファニル］吉草酸モノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。また、分子量はＭｎ＝３５，０００、Ｍｗ＝９２，０００  であった。
【０４０４】
（参考例１８）
ＦＰＶＡの替わりに５−チオチエノキシ吉草酸（ＴＴｘＶＡ）を用いた以外は参考例９と全く同じ条件で、３−ヒドロキシ−５−チオチエノキシ吉草酸（３ＨＴＴｘＶ）モノマーユニットを含むＰＨＡを合成したところ、培地液量１Ｌ当たり１．１ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物１０とした。
【０４０５】
得られたＰＨＡについて参考例９と同様に分析評価を行ったところ、ＰＨＡモノマーユニットとしては、９０％が３ＨＴＴｘＶであり、１０％が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上のユニットであり、ＴＴｘＶＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＴＴｘＶモノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。また、分子量はＭｎ＝２０５，０００、Ｍｗ＝５５０，０００  であった。
【０４０６】
（参考例１９）
ＦＰＶＡの替わりにオクタン酸（ＯＡ）を用いた以外は参考例９と全く同じ条件で、３−ヒドロキシオクタン酸（３ＨＯ）モノマーユニットを含むＰＨＡを合成したところ、培地液量１Ｌ当たり  ０．７５ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物１１とした。
【０４０７】
得られたＰＨＡについて参考例９と同様に分析評価を行ったところ、ＰＨＡモノマーユニットとしては、６５％が３ＨＯであり、３５％が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上のユニットであり、ＯＡに由来する所望のモノマーユニットである３ＨＯモノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。また、分子量はＭｎ＝１３２，０００、Ｍｗ＝３１２，０００  であった。
【０４０８】
（参考例２０）
酵母エキス０．１％を含むＭ９寒天培地上のＹＮ２株のコロニーを、ＯＤ（６００ｎｍ）＝１．０となるように滅菌した生理食塩水に懸濁した。予め作成しておいた、炭素源を含まない１／１０Ｎ−Ｍ９寒天培地１００枚に、参考例９における菌株の懸濁液を塗布し、１−オクテン雰囲気中下、３０℃で静置培養した。
【０４０９】
４日後、菌体を集め、メタノールで洗浄して遠心分離によって集菌し、減圧乾燥した。
【０４１０】
乾燥菌体にクロロホルム５０ｍＬを加え、３０℃で４８時間攪拌してＰＨＡを抽出した。クロロホルム層をろ過し、エバポレーターで濃縮した後、冷メタノールに注加し、沈殿を回収して減圧乾燥したところ、０．２６ｇのＰＨＡが得られた。このＰＨＡを例示化合物１２とした。
【０４１１】
得られたＰＨＡについて参考例９と同様に分析評価を行い、さらに１Ｈ−ＮＭＲ分析を行った（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ、使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））。側鎖末端のメチン、側鎖の末端二重結合およびエポキシに関わるプロトンの帰属はＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３１、  １４８０−１４８６（１９９８）に従って行った。この結果、ＰＨＡモノマーユニットとしては、１７％がエポキシユニットであり、３０％が飽和ユニット、５３％が不飽和ユニットであった。飽和、不飽和ユニットは３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシヘキセン酸、３−ヒドロキシヘプテン酸、３−ヒドロキシオクテン酸、３−ヒドロキシドデセン酸のうち１種以上のユニットであり、１−オクテンに由来する所望のモノマーユニットであるエポキシモノマーユニットの比率が高いＰＨＡが高収率で得られた。また、分子量はＭｎ＝２５１，０００、Ｍｗ＝５５０，０００であった。
【０４１２】
（参考例２１）  磁性体の調製１
硫酸第一鉄水溶液中に、鉄イオンに対してｌ．０〜１．１当量の苛性ソーダ溶液を混合し、水酸化第一鉄を含む水溶液を調製した。この水溶液のｐＨを８前後に維持しながら、空気を吹き込み、８０〜９０℃で酸化反応を行い、種晶を生成させるスラリー液を調製した。
次いで、このスラリー液に当初のアルカリ量（苛性ソーダのナトリウム成分）に対し０．９〜１．２当量となるよう硫酸第一鉄水溶液を加えた後、スラリー液をｐＨ８前後に維持して、空気を吹き込みながら酸化反応をすすめ、酸化反応後に生成した磁性酸化鉄粒子を洗浄、濾過、乾燥し、凝集している粒子を解砕し、平均粒径が０．１μｍの粒状の磁性体１を得た。
【０４１３】
（実施例１）
Ｎ−（Ｓ）−２−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒｏｙｌ−Ｇｌｙ−Ｄ２Ｎａｌ−Ｄ４ＣｌＰｈｅ−Ｄ３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−ＮＭｅＴｙｒ−ＤＬｙｓ（Ｎｉｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｎｉｓｐ）−Ｐｒｏ−ＤＡｌａＮＨ２（以下ペプチドＡと略記する）の酢酸塩（ＴＡＰ社製）５００ｍｇを、蒸留水  ０．６ｍｌ  に溶解した。得られる溶液を、４．５ｇの例示化合物１および１．５ｇの磁性体１をジクロロメタン５．８ｍｌに含有させた溶液に加え、小型ホモジナイザー（キネマチカ社製）で６０秒間混合してＷ／Ｏ型乳化物を得た。このＷ／Ｏ型乳化物を１６℃に冷却した後、予め１６℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）水溶液１０００ｍｌ中に注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００  ｒｐｍ  でＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物とした。このＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物を室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、Ｗ／Ｏ型乳化物を固化させた後、遠心分離機（０５ＰＲ−２２、日立製作所）を用いて  ２０００  ｒｐｍ  で遠心分離した。得られる沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、分散液にＤ−マンニトール０．３ｇを加え、凍結乾燥し、粉末として磁性マイクロカプセル１を得た。マイクロカプセル中のペプチドＡの含有率を表３に示す。
【０４１４】
（実施例２〜１２）
例示化合物１の替わりに例示化合物２〜１２を用いた以外は実施例１と全く同様にして磁性マイクロカプセル２〜１２を得た。マイクロカプセル中のペプチドＡの含有率を表３に示す。
【０４１５】
（実施例１３）
上記の磁性マイクロカプセル１２の５０質量部を精製水５０質量部に懸濁したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した後、７０℃で１２時間反応させることで磁性マイクロカプセル１３を得た。マイクロカプセル中のペプチドＡの含有率を表３に示す。
【０４１６】
磁性マイクロカプセル１３について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが磁性マイクロカプセル１３では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることで、架橋ポリマーにより被覆された磁性マイクロカプセル１３が得られたことがわかる。
【０４１７】
（実施例１４）
上記の磁性マイクロカプセル１２について５０質量部に、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルＴＳＦ４７００、ＧＥ東芝シリコーン（株）製）を１０質量部添加し、７０℃で２時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（１０、０００×ｇ、４℃、２０分間）する操作を繰返すことで洗浄、乾燥し、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する磁性マイクロカプセル１４を得た。マイクロカプセル中のペプチドＡの含有率を表３に示す。
【０４１８】
磁性マイクロカプセル１４について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが磁性マイクロカプセル１４では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡと末端アミノ変性ポリシロキサンを反応させることにより、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する磁性マイクロカプセル１４が得られたことがわかる。
【０４１９】
（比較例１）
例示化合物１の替わりに乳酸−グリコール酸共重合体（以下、ＰＬＧＡと略記する）（和光純薬製、ｌｏｔ．９４０８１０、乳酸／グリコール酸（モル比）：７４／２６、ＧＰＣ重量平均分子量：１０，０００、ＧＰＣ数平均分子量：３，９００、末端基定量法による数平均分子量：３，７００）を用いる以外は実施例１と同様にして磁性マイクロカプセル１５を調製した。マイクロカプセル中の薬物含量を表３に示す。
【０４２０】
【表３】
2004331750.tif 000041
（実施例１５）
ペプチドＡの酢酸塩（ＴＡＰ社製）５００ｍｇを、０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）  ０．６ｍｌ  に溶解し、さらに精製酵素液（１）６０μｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）６０ｍｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）５ｍｇを加え溶解した。得られる溶液を、１．５ｇの磁性体１を分散したジクロロメタン５．８ｍｌに加え、小型ホモジナイザー（キネマチカ社製）で６０秒間混合してＷ／Ｏ型乳化物を得た。このＷ／Ｏ型乳化物を１６℃に冷却した後、予め１６℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）水溶液１０００ｍｌ中に注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００  ｒｐｍ  でＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物とした。このＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物を室温で３時間撹拌して、ＰＨＡを合成するとともにジクロロメタンを揮散させ、Ｗ／Ｏ型乳化物を固化させた後、遠心分離機（０５ＰＲ−２２、日立製作所）を用いて  ２０００  ｒｐｍ  で遠心分離した。得られる沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、分散液にＤ−マンニトール０．３ｇを加え、凍結乾燥し、粉末として磁性マイクロカプセル１６を得た。マイクロカプセル中のペプチドＡの含有率を表４に示す。
【０４２１】
また、磁性マイクロカプセル１６を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０  ℃で  ２０  時間攪拌して外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが標品であるヒドロキシ酪酸のメチル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた磁性マイクロカプセル１６の外被の主成分はＰＨＢであることを確認した。
【０４２２】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝  ７３、０００  であった。
【０４２３】
（実施例１６）
実施例１５における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（１）を用いた点以外は、実施例１５と全く同様にして磁性マイクロカプセル１７を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表４に示す。
【０４２４】
実施例１５と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル１７の外被の主成分が
ＰＨＢであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル１７に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ７１、０００  であった。
【０４２５】
（実施例１７）
実施例１５における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（２）を用いた点以外は、実施例１５と全く同様にして磁性マイクロカプセル１８を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表４に示す。
【０４２６】
実施例１５と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル１８の外被の主成分がＰＨＢであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル１８に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ７３、０００  であった。
【０４２７】
（実施例１８）
実施例１５における精製酵素液（１）の替わりに精製酵素液（２）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例１５と全く同様にして磁性マイクロカプセル１９に含まれるＰＨＡを得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表４に示す。
【０４２８】
実施例１５と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル１９の外被の主成分が３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル１９に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２４、０００  であった。
【０４２９】
（実施例１９）
実施例１５における精製酵素液（１）の替わりに精製酵素液（３）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ（Ｒｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応により得られた３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸を得たのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）  に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例１５と全く同様にして磁性マイクロカプセル２０を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表４に示す。
【０４３０】
実施例１５と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル２０の外被の主成分が
３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル２０に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２１、０００であった。
【０４３１】
（実施例２０）
実施例１５における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（３）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５５、１４９０−１４９２（１９９０）に記載の方法で合成した３−フェノキシプロパナール及びブロモ酢酸エチルを原料とし、亜鉛によるＲｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応で得られた３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸を得たのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）  に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例１５と全く同様にして磁性マイクロカプセル２１を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表４に示す。
【０４３２】
実施例１５と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル２１の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル２１に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２４、０００  であった。
【０４３３】
（実施例２１）
実施例１５における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（４）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡを用いた点以外は、実施例１５と全く同様にしてＰＨＡ合成反応を行った。ここで室温において１時間反応を行った後、さらに（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ６０ｍｇを添加し、室温においてさらに２時間反応を行った。以降の処理は実施例１５と全く同様にして磁性マイクロカプセル２２を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表４に示す。
【０４３４】
このカプセル構造体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ  ＩＶ、ＣＡＭＥＣＡ製）により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体表面のＰＨＡは主に３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットで構成されていることが確認された。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体の表面を少しずつ削りながら同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、ある時点でカプセル構造体を構成するＰＨＡのモノマーユニットの主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットに置き換わることが確認された。これより、本実施例のカプセル構造体は、薬物１を被覆した、ポリ（３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸）の上を、ポリ（３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸）が被覆した、所望のカプセル構造体であることがわかった。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル２２に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２１、０００  であった。
【０４３５】
（実施例２２）
実施例１５における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（５）を用いた点と６０ｍｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに４８ｍｇの（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ、１２ｍｇの（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−７、８−エポキシオクタノイルＣｏＡ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、１２、８５−９１（１９９０）に記載の方法で合成した３−ヒドロキシ−７−オクテン酸の不飽和部分を３−クロロ安息香酸でエポキシ化したのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例１５と全く同様にして磁性マイクロカプセル２３を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表４に示す。
【０４３６】
１Ｈ−ＮＭＲ（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ、使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル２３の外被は、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットが７５％、３−ヒドロキシ−７、８−エポキシオクタン酸ユニットが２５％からなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル２３に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２２、０００  であった。
【０４３７】
（実施例２３）
上記の磁性マイクロカプセル２３について５０質量部を精製水５０質量部に懸濁したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した後、７０℃で１２時間反応させることで磁性マイクロカプセル２４を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表４に示す。
【０４３８】
磁性マイクロカプセル２４について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが磁性マイクロカプセル２４では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることで、架橋ポリマーにより被覆された磁性マイクロカプセル２４が得られたことがわかる。
【０４３９】
（実施例２４）
上記の磁性マイクロカプセル２３について５０質量部に、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルＴＳＦ４７００、ＧＥ東芝シリコーン（株）製）を１０質量部添加し、７０℃で２時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（１０、０００×ｇ、４℃、２０分間）する操作を繰返すことで洗浄、乾燥し、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する磁性マイクロカプセル２５を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表４に示す。
【０４４０】
磁性マイクロカプセル２５について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが磁性マイクロカプセル２５では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡと末端アミノ変性ポリシロキサンを反応させることにより、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する磁性マイクロカプセル２５が得られたことがわかる。
【０４４１】
【表４】
2004331750.tif 000042
（実施例２５）
ペプチドＡの酢酸塩（ＴＡＰ社製）５００ｍｇを、蒸留水  ０．６ｍｌ  に溶解した。得られる溶液を、１．５ｇの磁性体１を分散したジクロロメタン５．８ｍｌに加え、小型ホモジナイザー（キネマチカ社製）で６０秒間混合してＷ／Ｏ型乳化物を得た。このＷ／Ｏ型乳化物を１６℃に冷却した後、予め１６℃に冷却しておいた０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）  、０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）水溶液１００ｍｌ中に注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００  ｒｐｍ  でＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物とした。このＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物に、さらに精製酵素液（１）５ｍｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１ｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）１００ｍｇを加え溶解した。
【０４４２】
このＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物を室温で３時間撹拌して、ＰＨＡを合成するとともにジクロロメタンを揮散させ、Ｗ／Ｏ型乳化物を固化させた後、遠心分離機（０５ＰＲ−２２、日立製作所）を用いて  ２０００  ｒｐｍ  で遠心分離した。得られる沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、分散液にＤ−マンニトール０．３ｇを加え、凍結乾燥し、粉末として磁性マイクロカプセル２６を得た。マイクロカプセル中のペプチドＡの含有率を表５に示す。
【０４４３】
また、磁性マイクロカプセル２６を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０  ℃で  ２０  時間攪拌して外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが標品であるヒドロキシ酪酸のメチル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた磁性マイクロカプセル２６の外被の主成分はＰＨＢであることを確認した。
【０４４４】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝  ７８、０００  であった。
【０４４５】
（実施例２６）
実施例２５における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（１）を用いた点以外は、実施例２５と全く同様にして磁性マイクロカプセル２７を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表５に示す。
【０４４６】
実施例２５と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル２７の外被の主成分がＰＨＢであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル２７に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ７５、０００  であった。
【０４４７】
（実施例２７）
実施例２５における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（２）を用いた点以外は、実施例２５と全く同様にして磁性マイクロカプセル２８を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表５に示す。
【０４４８】
実施例２５と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル２８の外被の主成分がＰＨＢであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル２８に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ７７、０００  であった。
【０４４９】
（実施例２８）
実施例２５における精製酵素液（１）の替わりに精製酵素液（２）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例２５と全く同様にして磁性マイクロカプセル２９を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表５に示す。
【０４５０】
実施例２５と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル２９の外被の主成分が３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル２９に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２７、０００  であった。
【０４５１】
（実施例２９）
実施例２５における精製酵素液（１）の替わりに精製酵素液（３）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ（Ｒｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応により得られた３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸を得たのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）  に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例２５と全く同様にして磁性マイクロカプセル３０を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表５に示す。
【０４５２】
実施例２５と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル３０の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル３０に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２２、０００  であった。
【０４５３】
（実施例３０）
実施例２５における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（３）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５５、１４９０−１４９２（１９９０）に記載の方法で合成した３−フェノキシプロパナール及びブロモ酢酸エチルを原料とし、亜鉛によるＲｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応で得られた３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸を得たのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）  に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例２５と全く同様にして磁性マイクロカプセル３１を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表５に示す。
【０４５４】
実施例２５と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル３１の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル３１に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２３、０００  であった。
【０４５５】
（実施例３１）
実施例２５における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（４）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡを用いた点以外は、実施例２５と全く同様にしてＰＨＡ合成反応を行った。ここで室温において１時間反応を行った後、さらに（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ１ｇを添加し、室温においてさらに２時間反応を行った。以降の処理は実施例２５と全く同様にして磁性マイクロカプセル３２を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表５に示す。
【０４５６】
このカプセル構造体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ  ＩＶ、ＣＡＭＥＣＡ製）により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体表面のＰＨＡは主に３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットで構成されていることが確認された。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体の表面を少しずつ削りながら同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、ある時点でカプセル構造体を構成するＰＨＡのモノマーユニットの主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットに置き換わることが確認された。これより、本実施例のカプセル構造体は、薬物１を被覆した、ポリ（３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸）の上を、ポリ（３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸）が被覆した、所望のカプセル構造体であることがわかった。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル３２に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２４、０００  であった。
【０４５７】
（実施例３２）
実施例２５における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（５）を用いた点と１ｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに８００ｍｇの（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ、２００ｍｇの（Ｒ、Ｓ）−３−ヒドロキシ−７、８−エポキシオクタノイルＣｏＡ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、１２、８５−９１（１９９０）に記載の方法で合成した３−ヒドロキシ−７−オクテン酸の不飽和部分を３−クロロ安息香酸でエポキシ化したのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５０、４３２−４３９（１９９７）に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例２５と全く同様にして磁性マイクロカプセル３３を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表５に示す。
【０４５８】
１Ｈ−ＮＭＲ（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ、使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル３３の外被は、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットが７８％、３−ヒドロキシ−７、８−エポキシオクタン酸ユニットが２２％からなるＰＨＡであることを確認した。
また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル３３に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２５、０００  であった。
【０４５９】
（実施例３３）
上記の磁性マイクロカプセル３３について５０質量部を精製水５０質量部に懸濁したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した後、７０℃で１２時間反応させることで磁性マイクロカプセル３４を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表５に示す。
【０４６０】
磁性マイクロカプセル３４について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークがカプセル３４では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることで、架橋ポリマーにより被覆された磁性マイクロカプセル３４が得られたことがわかる。
【０４６１】
（実施例３４）
上記の磁性マイクロカプセル３３について５０質量部に、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルＴＳＦ４７００、ＧＥ東芝シリコーン（株）製）を１０質量部添加し、７０℃で２時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（１０、０００×ｇ、４℃、２０分間）する操作を繰返すことで洗浄、乾燥し、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する磁性マイクロカプセル３５を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表５に示す。
【０４６２】
磁性マイクロカプセル３５について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが磁性マイクロカプセル３５では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡと末端アミノ変性ポリシロキサンを反応させることにより、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する磁性マイクロカプセル３５が得られたことがわかる。
【０４６３】
【表５】
2004331750.tif 000043
実験例１
約  ２０  ｍｇの磁性マイクロカプセル１２を分散溶媒（２．５  ｍｇのカルボキシメチルセルロース、０．５  ｍｇ  のポリソルベート  ８０、２５  ｍｇ  のマンニトールを溶解した蒸留水）０．５  ｍｌ  に分散して１０週齢雄性ＳＤラットの背部皮下に２２Ｇ注射針で投与した。投与後一定時間毎にラットを屠殺して投与部位に残存するマイクロカプセルを取り出し、この取り出したマイクロカプセル中のペプチドＡを定量した結果を表６に示す。
【０４６４】
実験例２〜９および比較例実験例１
磁性マイクロカプセル１２、１３、１４、１５、２３、２４、２５、３３、３４、３５をマイクロカプセルとして用いた以外は実験例１と全く同様にして、製剤を調製し、経時的にペプチドＡを定量した。残存率を表６に示す。
【０４６５】
【表６】
2004331750.tif 000044
（実施例３５）
抗生物質としてバンコマイシンを担持するマイクロカプセルを次のようにして調製した。
【０４６６】
１．５ｇの磁性体１を分散した７０ｍＬのクロロホルムに、５  ％  グルコース溶液にバンコマイシンを  ０．２  ｇ、参考例６で調製したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ  ＹＮ２由来のＰＨＡ合成酵素ＹＮ２−Ｃ２を１０Ｕ／ｍＬ、参考例８で調製した（Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡを終濃度１ｍＭになるように添加した１０ｍＬを加え、プローブ型超音波発振機（Ｏｈｔａｋｅ）で乳化し、Ｗ／Ｏ型乳化液を作成した。超音波の照射は５０ワットの条件で３０秒間、１０回くりかえして行った。このようにして調製した乳化液を３７℃で３時間インキュベートすることによって、ＰＨＡ合成反応を行った。
【０４６７】
反応液を、ゲルろ過法（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラム）によってサイズ分画して、磁性マイクロカプセルを得た。動的光散乱法によると該マイクロカプセル平均粒径は８４０ｎｍの単分散状態であった。
【０４６８】
作製した磁性マイクロカプセルの一部を、真空乾燥したのち、２０  ｍｌのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、当該ＰＨＡは３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸をモノマーユニットとするＰＨＡであることが確認された。さらに、該ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；４０℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝１５、０００、Ｍｗ＝３７、０００であった。
【０４６９】
（実施例３６）
８−［１−オキソ−３−［１−（フェニルメチル）ピペリジン−４−イル］プロピル］−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン（以下、薬物２と称する）２００ｍｇと２．０ｇの例示化合物１、さらに２．０ｇの磁性体１をジクロロメタン２ｍｌに溶解した溶液を、１６〜１８℃に冷却した後、あらかじめ１６〜１８℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）水溶液５００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００ｒｐｍでＯ／Ｗ型エマルションとした。得られたＯ／Ｗ型エマルションを室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮発させ、油相を固化させた後、１５００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、凍結乾燥し、粉末としてマイクロカプセルを得、これを磁性マイクロカプセル３６とした。マイクロカプセル中の薬物含量を表７に示す。なお、薬物含量は２５ｍｇのマイクロカプセルを６０％アセトニトリル含有リン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに溶解したサンプルをＨＰＬＣ法で定量することによって測定した。
【０４７０】
（実施例３７〜４７）
例示化合物２〜１２を用いる以外は実施例３６と同様にして磁性マイクロカプセル３７〜４７を調製した。マイクロカプセル中の薬物含量を表７に示す。
【０４７１】
（実施例４８）
上記の磁性マイクロカプセル４７の５０質量部を精製水５０質量部に懸濁したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した後、７０℃で１２時間反応させることで磁性マイクロカプセル４８を得た。
【０４７２】
磁性マイクロカプセル４８について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが磁性マイクロカプセル４８では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることで、架橋ポリマーにより被覆された磁性マイクロカプセル４８が得られたことがわかる。
【０４７３】
（実施例４９）
上記の磁性マイクロカプセル４７について５０質量部に、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルＴＳＦ４７００、ＧＥ東芝シリコーン（株）製）を１０質量部添加し、７０℃で２時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）する操作を繰返すことで洗浄、乾燥し、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する磁性マイクロカプセル４９を得た。
【０４７４】
磁性マイクロカプセル４９について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが磁性マイクロカプセル４９では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡと末端アミノ変性ポリシロキサンを反応させることにより、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する磁性マイクロカプセル４９が得られたことがわかる。
【０４７５】
（比較例２）
例示化合物の替わりに乳酸−グリコール酸共重合体（以下ＰＬＧＡと略記する）（和光純薬製、Ｌｏｔ．  Ｎｏ．Ｋ１０３０、乳酸／グリコール酸組成比（モル％）：７５／２５、ＧＰＣ重量平均分子量：１３０００）を用いる以外は実施例３６と同様にして磁性マイクロカプセル５０を調製した。マイクロカプセル中の薬物含量を表７に示す。
【０４７６】
【表７】
2004331750.tif 000045
実施例５０
薬物２を１．５ｇと４．５ｇの例示化合物１、さらに１．５ｇの磁性体１をジクロロメタン９ｍｌに溶解した溶液を、１６〜１８℃に冷却した後、あらかじめ１６〜１８℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール水溶液５００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、８０００ｒｐｍでＯ／Ｗ型エマルションとした。得られたＯ／Ｗ型エマルションを室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮発させ、油相を固化させた後、遠心分離器を用いて１５００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、凍結乾燥し、粉末としてマイクロカプセルを得、これを磁性マイクロカプセル５１とした。マイクロカプセル中の薬物含量を表８に示す。
【０４７７】
（実施例５１〜６１）
例示化合物２〜１２を用いる以外は実施例５０と同様にして磁性マイクロカプセル５２〜６２を調製した。マイクロカプセル中の薬物含量を表８に示す。
【０４７８】
（実施例６２）
磁性マイクロカプセル６２を用いる以外は実施例４８と同様にして磁性マイクロカプセル６３を調製した。マイクロカプセル中の薬物含量を表８に示す。
【０４７９】
（実施例６３）
磁性マイクロカプセル６２を用いる以外は実施例４９と同様にして磁性マイクロカプセル６４を調製した。マイクロカプセル中の薬物含量を表８に示す。
【０４８０】
（比較例３）
例示化合物の替わりに乳酸−グリコール酸共重合体（以下ＰＬＧＡと略記する）（和光純薬製、Ｌｏｔ．  Ｎｏ．Ｋ１０３０、乳酸／グリコール酸組成比（モル％）：７５／２５、ＧＰＣ重量平均分子量：１３０００）を用いる以外は実施例５０と同様にして磁性マイクロカプセル６５を調製した。マイクロカプセル中の薬物含量を表８に示す。
【０４８１】
【表８】
2004331750.tif 000046
（実施例６４）
２００ｍｇの薬物１および０．５ｇの磁性体１をジクロロメタン２ｍｌに含有させた溶液を、１６〜１８℃に冷却した後、あらかじめ１６〜１８℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）を溶解した０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）１００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００ｒｐｍでＯ／Ｗ型エマルションとした。得られたＯ／Ｗ型エマルションに、精製酵素液（１）５ｍｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１ｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１ｇを添加、溶解し、室温で３時間緩やかに撹拌してＰＨＡの合成とジクロロメタンの揮発を行い、油相を固化させた後、１５００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、凍結乾燥し、粉末としてマイクロカプセルを得、これを磁性マイクロカプセル６６とした。マイクロカプセル中の薬物含量を表９に示す。なお、薬物含量は２５ｍｇのマイクロカプセルを６０％アセトニトリル含有リン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに溶解したサンプルをＨＰＬＣ法で定量することによって測定した。
【０４８２】
また、磁性マイクロカプセル６６を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０  ℃で  ２０  時間攪拌して外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが標品であるヒドロキシ酪酸のメチル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた磁性マイクロカプセル６６の外被の主成分はＰＨＢであることを確認した。
【０４８３】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝  ７８，０００  であった。
【０４８４】
（実施例６５）
実施例６４における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（１）を用いた点以外は、実施例６４と全く同様にして磁性マイクロカプセル６７を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表９に示す。
【０４８５】
実施例６４と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル６７の外被の主成分がＰＨＢであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル６７に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ７５，０００  であった。
【０４８６】
（実施例６６）
実施例６４における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（２）を用いた点以外は、実施例６４と全く同様にして磁性マイクロカプセル６８を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表９に示す。
【０４８７】
実施例６４と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル６８の外被の主成分がＰＨＢであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル６８に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ７４，０００  であった。
【０４８８】
（実施例６７）
実施例６４における精製酵素液（１）の替わりに精製酵素液（２）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９（１９９７）に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例６４と全く同様にして磁性マイクロカプセル６９を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表９に示す。
【０４８９】
実施例６４と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル６９の外被の主成分が３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル６９に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２５，０００  であった。
【０４９０】
（実施例６８）
実施例６４における精製酵素液（１）の替わりに精製酵素液（３）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ（Ｒｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応により得られた３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸を得たのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９（１９９７）  に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例６４と全く同様にして磁性マイクロカプセル７０を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表９に示す。実施例６４と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル７０の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル７０に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２２，０００  であった。
【０４９１】
（実施例６９）
実施例６４における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（３）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５，１４９０−１４９２（１９９０）に記載の方法で合成した３−フェノキシプロパナール及びブロモ酢酸エチルを原料とし、亜鉛によるＲｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応で得られた３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸を得たのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９（１９９７）  に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例６４と全く同様にして磁性マイクロカプセル７１を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表９に示す。
【０４９２】
実施例６４と同様にして評価した結果、得られた磁性マイクロカプセル７１の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル７１に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２４，０００  であった。
【０４９３】
（実施例７０）
実施例６４における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（４）を用いた点と（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡを用いた点以外は、実施例６４と全く同様にしてＰＨＡ合成反応を行った。ここで室温において１時間反応を行った後、さらに（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ１ｇを添加し、室温においてさらに２時間反応を行った。以降の処理は実施例６４と全く同様にして磁性マイクロカプセル７２を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表９に示す。
【０４９４】
このカプセル構造体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ  ＩＶ、ＣＡＭＥＣＡ製）により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体表面のＰＨＡは主に３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットで構成されていることが確認された。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体の表面を少しずつ削りながら同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、ある時点でカプセル構造体を構成するＰＨＡのモノマーユニットの主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットに置き換わることが確認された。これより、本実施例のカプセル構造体は、薬物２を被覆した、ポリ（３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸）の上を、ポリ（３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸）が被覆した、所望のカプセル構造体であることがわかった。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル７２に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２３，０００  であった。
【０４９５】
（実施例７１）
実施例６４における精製酵素液（１）の替わりに粗酵素液（５）を用いた点と１ｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの替わりに０．８ｇの（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ、０．２ｇの（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１２，８５−９１（１９９０）に記載の方法で合成した３−ヒドロキシ−７−オクテン酸の不飽和部分を３−クロロ安息香酸でエポキシ化したのち、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０，４３２−４３９（１９９７）に記載の方法で調製）を用いた点以外は、実施例６４と全く同様にして磁性マイクロカプセル７３を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表９に示す。
【０４９６】
１Ｈ−ＮＭＲ（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ，使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル７３の外被は、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットが７６％、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸ユニットが２４％からなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた磁性マイクロカプセル７３に含まれるＰＨＡの数平均分子量は  ２０，０００  であった。
【０４９７】
（実施例７２）
上記の磁性マイクロカプセル７３について５０質量部を精製水５０質量部に懸濁したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した後、７０℃で１２時間反応させることで磁性マイクロカプセル７４を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表９に示す。
【０４９８】
磁性マイクロカプセル７４について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが磁性マイクロカプセル７４では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることで、架橋ポリマーにより被覆された磁性マイクロカプセル７４が得られたことがわかる。
【０４９９】
（実施例７３）
上記の磁性マイクロカプセル７３について５０質量部に、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルＴＳＦ４７００、ＧＥ東芝シリコーン（株）製）を１０質量部添加し、７０℃で２時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）する操作を繰返すことで洗浄、乾燥し、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する磁性マイクロカプセル７５を得た。マイクロカプセル中の薬物含量を表９に示す。
【０５００】
磁性マイクロカプセル７５について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが磁性マイクロカプセル７５では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡと末端アミノ変性ポリシロキサンを反応させることにより、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する磁性マイクロカプセル７５が得られたことがわかる。
【０５０１】
【表９】
2004331750.tif 000047
実験例１０
実施例６１で得られた磁性マイクロカプセル６２の６２．８ｍｇ（薬物として３０ｍｇ／ｋｇ体重相当）を０．５ｍｌの分散媒（２．５ｍｇのカルボキシメチルセルロース、１．０ｍｇのポリソルベート８０、２５．０ｍｇのマンニトールを溶解した蒸留水）に分散して１０週齢雄性ＳＤラットの背部皮下に２２Ｇ注射針で投与した。投与後、一定時間毎にラットを屠殺して投与部位に残存するマイクロカプセルを取り出し、この取り出したマイクロカプセル中の薬物量を定量し、投与量に対する残存率を表１０に示す。
【０５０２】
実験例１１〜１５および比較実験例２
磁性マイクロカプセル６２，６３，６４，６５，７３，７４，７５を薬物として３０ｍｇ／ｋｇ体重相当になるよう用いた以外は実験例１０と全く同様にして、製剤を調製し、経時的に薬物量を定量した。残存率を表１０に示す。
【０５０３】
【表１０】
2004331750.tif 000048
（実施例７４）
２．０ｇの例示化合物１および１ｇの磁性体１を塩化メチレン２０ｍ１に溶解した液に、精製水１２ｍｌを投入し、振盪・攪拌してＷ／Ｏ型エマルションを調製した。さらに超音波を照射することにより内水相の径を小さくした。ついで、小型ホモジナイザー（キネマチカ社（スイス）製のポリトロン）で攪拌しつつ、１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液２００ｍｌ中に前記Ｗ／Ｏ型エマルション３２ｍｌを投入し、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを攪拌機で６  時間攪拌し、油相中の有機溶媒である塩化メチレンを蒸発させ、油相中の例示化合物１を固化させた。微粒子を遠心分離により捕集し、同時に冷却した精製水で洗浄した後、０．１  ％Ｔｗｅｅｎ８０  水溶液で再分散し、凍結乾燥し、粉末状の微粒子である中空磁性マイクロカプセル１を得た。また、中空磁性マイクロカプセル１を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤１とした。得られた中空マイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１１に示す。
【０５０４】
（実施例７５〜８５）
Ｗ／Ｏ型エマルションを作製する際、その油相に溶解させるポリマーとして例示化合物２〜１２を用いる以外は、実施例７４と同様にして粉末状の微粒子である中空磁性マイクロカプセル２〜１２を得た。また、これら中空マイクロカプセルを用いる超音波造影剤を、それぞれ超音波造影剤２〜１２とした。
【０５０５】
得られた中空マイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１１に示す。
【０５０６】
（実施例８６）
上記の中空磁性マイクロカプセル１２の５０質量部を精製水５０質量部に懸濁したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した後、７０℃で１２時間反応させることで中空磁性マイクロカプセル１３を得た。架橋化処理を施した中空磁性マイクロカプセル１３を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤１３とした。得られた中空マイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１１に示す。
【０５０７】
中空磁性マイクロカプセル１３について、赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが中空磁性マイクロカプセル１３では消失していた。これより、側鎖にエポキシ基を有するユニットを含むＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることで、ジアミンとエポキシ基との開環付加で架橋化されたポリマーにより、表面が被覆された中空磁性マイクロカプセル１３が得られたことがわかる。
【０５０８】
（実施例８７）
上記中空磁性マイクロカプセル１２の５０質量部に、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルＴＳＦ４７００、ＧＥ東芝シリコーン（株）製）を１０質量部添加し、７０℃で２時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）する操作を繰返すことで洗浄した後、乾燥して、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する中空磁性マイクロカプセル１４を得た。この表面にポリシロキサンのグラフト鎖の修飾を有する中空磁性マイクロカプセル１４を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤１４とした。得られた中空マイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１１に示す。
【０５０９】
中空磁性マイクロカプセル１４について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが中空磁性マイクロカプセル１４では消失していた。これより、側鎖にエポキシ基を有するユニットを含むＰＨＡと末端アミノ変性ポリシロキサンを反応させることにより、エポキシ基と末端アミノ基との開環付加で、ポリシロキサンのグラフト鎖で修飾された中空磁性マイクロカプセル１４が得られていることがわかる。
【０５１０】
（比較例４）
Ｗ／Ｏ型エマルションを作製する際、その油相に溶解させるポリマーとしてポリＤＬ乳酸（平均分子量７０００）を用いる以外は、実施例７４と同様にして粉末状の微粒子である中空磁性マイクロカプセル１５を得た。このポリＤＬ乳酸からなる中空磁性マイクロカプセル１５を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤１５とした。得られた中空マイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１１に示す。
【０５１１】
【表１１】
2004331750.tif 000049
孔の有無：乾燥の際、内相の水、有機溶媒の蒸散により、外被に孔が生成しているか否を示す。
【０５１２】
（実施例８８）
２ｇの磁性体１を分散した２０ｍ１の塩化メチレン溶液に、１２ｍｌの０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）に精製酵素液（１）０．６ｍｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）３００ｍｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）１２ｍｇを加え溶解した水溶液を投入し、振盪・攪拌してＷ／Ｏ型エマルションを調製した。さらに超音波を照射することにより内水相の径を小さくした。ついで、小型ホモジナイザー（キネマチカ社（スイス）製のポリトロン）で攪拌しつつ、１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液２００ｍｌ  に前記Ｗ／Ｏ型エマルション３２ｍ１を投入し、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを攪拌機で６  時間攪拌しつつ、ＰＨＡを合成するとともに、油相中の塩化メチレンを蒸発させ、ＰＨＡを固化させて、マイクロカプセル状微粒子を調製した。得られた微粒子を遠心分離により捕集し、同時に冷却した精製水で洗浄した後、０．１  ％Ｔｗｅｅｎ８０  水溶液で再分散し、凍結乾燥し、粉末状のマイクロカプセル状微粒子である中空磁性マイクロカプセル１６を得た。この中空磁性マイクロカプセル１６を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤１６とした。得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１２に示す。
【０５１３】
また、中空磁性マイクロカプセル１６を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０  時間攪拌して、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレン・フィルターでろ過し、ロータリー・エバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが標品である３−ヒドロキシ酪酸のメチルエステル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた中空磁性マイクロカプセル１６の外被の主成分はＰＨＢであることが確認された。
【０５１４】
さらに、このＰＨＢの分子量をゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、数平均分子量Ｍｎ＝  ７２，０００  であった。
【０５１５】
（実施例８９）
実施例８８で用いた精製酵素液（１）に代えて、ＫＫ０１株由来の粗酵素液（１）を用いた点以外は、実施例８８と同じ条件として、中空磁性マイクロカプセル１７を得た。この中空磁性マイクロカプセル１７を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤１７とした。
【０５１６】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１２に示す。実施例８８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル１７の外被の主成分がＰＨＢであることが確認された。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル１７外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ７３，０００  であった。
【０５１７】
（実施例９０）
実施例８８で用いた精製酵素液（１）に代えて、ＴＬ２株由来の粗酵素液（２）を用いた点以外は、実施例８８と同じ条件として、中空磁性マイクロカプセル１８を得た。この中空磁性マイクロカプセル１８を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤１８とした。
【０５１８】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１２に示す。
【０５１９】
実施例８８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル１８の外被の主成分がＰＨＢであることが確認された。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル１８外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ７２，０００  であった。
【０５２０】
（実施例９１）
実施例８８で用いた精製酵素液（１）に代えて、組換えＰＨＡ合成酵素の精製酵素液（２）を用い、また、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）を用いて、その他の条件は実施例８８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル１９を得た。この中空磁性マイクロカプセル１９を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤１９とした。
【０５２１】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１２に示す。
【０５２２】
実施例８８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル１９の外被の主成分が３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル１９外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２５，０００  であった。
【０５２３】
（実施例９２）
実施例８８で用いた精製酵素液（１）に代えて、組換えＰＨＡ合成酵素の精製酵素液（３）を用い、また、  （Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ（Ｒｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応により得られた３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸を作製し、次いで、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）  に記載の方法で調製）を用いて、その他の条件は実施例８８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル２０を得た。この中空磁性マイクロカプセル２０を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤２０とした。
【０５２４】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１２に示す。
【０５２５】
実施例８８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル２０の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル２０外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２１，０００  であった。
【０５２６】
（実施例９３）
実施例８８で用いた精製酵素液（１）に代えて、組換えＰＨＡ合成酵素の精製酵素液（３）を用い、また、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ（Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５，  １４９０−１４９２  （１９９０）に記載の方法で合成した３−フェノキシプロパナール、及びブロモ酢酸エチルを原料とし、亜鉛によるＲｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応で得られた３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸を取得し、次いで、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）  に記載の方法で調製）を用いて、その他の条件は実施例８８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル２１を得た。この中空磁性マイクロカプセル２１を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤２１とした。
【０５２７】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１２に示す。
【０５２８】
実施例８８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル２１の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル２１外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２２，０００  であった。
【０５２９】
（実施例９４）
実施例８８で用いた精製酵素液（１）に代えて、Ｐ９１株由来の粗酵素液（４）を用い、また、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡを用いて、その他の条件は実施例８８と同様にして、ＰＨＡ合成反応を行った。本例では、室温において３時間反応を行った後、さらに、水相中に（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ３００ｍｇを添加し、室温においてさらに２時間反応を行った。その後、油相中の塩化メチレンの蒸発等の処理は、実施例８８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル２２を得た。この中空磁性マイクロカプセル２２を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤２２とした。
【０５３０】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１２に示す。
【０５３１】
このカプセル構造体の表面に形成されたＰＨＡポリマーに含まれるモノマーユニット・フラグメントの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳＩＶ、ＣＡＭＥＣＡ製）により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体表面のＰＨＡは、主に３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットで構成されていることが確認された。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体の表面を少しずつ削りつつ、その部分のＰＨＡポリマーに含まれるモノマーユニット・フラグメントの質量を、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、外被表面より、ある深さスパッタリングが進んだ時点でカプセル構造体を構成するＰＨＡのモノマーユニットの主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットに換わることが確認された。これより、本実施例のカプセル構造体は、当初の酵素反応で生成するポリ（３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸）の外被層上を、後半の酵素反応で生成するポリ（３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸）が被覆した二層構造の外被を有する、所望のカプセル構造体であることがわかった。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル２２の外被表面を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２３，０００  であった。
【０５３２】
（実施例９５）
実施例８８で用いた精製酵素液（１）に代えて、ＹＮ２株由来の粗酵素液（５）を用い、さらに、６０ｍｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、２４０ｍｇの（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡと、６０ｍｇの（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡ（Ｉｎｔ．Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，  １２，  ８５−９１  （１９９０）に記載の方法で合成した３−ヒドロキシ−７−オクテン酸の不飽和部分を３−クロロ安息香酸でエポキシ化した後、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）を用いて、その他の条件は実施例８８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル２３を得た。この中空磁性マイクロカプセル２３を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤２３とした。
【０５３３】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１２に示す。
【０５３４】
マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡ組成を、１Ｈ−ＮＭＲ（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ、使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））解析により評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル２３の外被は、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットが７７％、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸ユニットが２３％からなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル２３外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２５，０００  であった。
【０５３５】
（実施例９６）
上記中空磁性マイクロカプセル２３の５０質量部を、精製水５０質量部に懸濁した後、該懸濁液に、架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した後、７０℃で１２時間反応させ、表面の架橋化処理を施した中空磁性マイクロカプセル２４を得た。この架橋化処理を施した中空磁性マイクロカプセル２４を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤２４とした。
【０５３６】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１２に示す。
【０５３７】
中空磁性マイクロカプセル２４について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが中空磁性マイクロカプセル２４では消失していた。これより、側鎖にエポキシ基を有するユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることで、その表面における、ジアミンとエポキシ基との開環付加で架橋形成されたポリマーにより被覆された中空磁性マイクロカプセル２４が得られたことがわかる。
【０５３８】
（実施例９７）
上記の中空磁性マイクロカプセル２３の５０質量部に、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルＴＳＦ４７００、ＧＥ東芝シリコーン（株）製）を１０質量部添加し、７０℃で２時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）する操作を繰返すことで洗浄し、次いで、乾燥して、ポリシロキサンのグラフト鎖が付加修飾された中空磁性マイクロカプセル２５を得た。この表面にポリシロキサンのグラフト鎖が付加修飾された中空磁性マイクロカプセル２５を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤２５とした。
【０５３９】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１２に示す。
【０５４０】
中空磁性マイクロカプセル２５について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが中空磁性マイクロカプセル２５では消失していた。これより、側鎖にエポキシ基を有するユニットを含むＰＨＡに末端アミノ変性ポリシロキサンを反応させることにより、エポキシ基と末端アミノ基との開環付加により、その表面ＰＨＡにポリシロキサンのグラフト鎖による化学修飾がなされた中空磁性マイクロカプセル２５が得られたことがわかる。
【０５４１】
【表１２】
2004331750.tif 000050
（実施例９８）
２ｇの磁性体１を分散した２０ｍ１の塩化メチレン溶液に、１２ｍｌの精製水を投入し、振盪・攪拌してＷ／Ｏ型エマルションを調製した。さらに超音波を照射することにより内水相の径を小さくした。ついで、０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に１ｗ／ｖ％のポリビニルアルコール、精製酵素液（１）５ｍｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１ｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）１００ｍｇを加え溶解した水溶液１００ｍｌに、小型ホモジナイザー（キネマチカ社（スイス）製のポリトロン）で攪拌しつつ、前記Ｗ／Ｏ型エマルション３２ｍ１を投入し、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを攪拌機で６時間攪拌し、ＰＨＡを合成するとともに塩化メチレンを蒸発させ、生成したＰＨＡを固化して、マイクロカプセル微粒子を調製した。この微粒子を遠心分離により捕集し、同時に冷却した精製水で洗浄した後、０．１  ％Ｔｗｅｅｎ８０  水溶液で再分散し、凍結乾燥し、粉末状のマイクロカプセル微粒子である中空磁性マイクロカプセル２６を得た。この中空磁性マイクロカプセル２６を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤２６とした。
【０５４２】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１３に示す。また、中空磁性マイクロカプセル２６を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０  ℃で  ２０  時間攪拌して外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが、標品であるヒドロキシ酪酸のメチルエステル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた中空磁性マイクロカプセル２６の外被の主成分はＰＨＢであることを確認した。
【０５４３】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、数平均分子量Ｍｎ＝  ７１，０００  であった。
【０５４４】
（実施例９９）
実施例９８で用いた精製酵素液（１）に代えて、ＫＫ０１株由来の粗酵素液（１）を用い、それ以外の条件は、実施例９８と同じにして、中空磁性マイクロカプセル２７を得た。この中空磁性マイクロカプセル２７を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤２７とした。
【０５４５】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１３に示す。
【０５４６】
実施例９８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル２７の外被の主成分がＰＨＢであることを確認した。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル２７外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ７６，０００  であった。
【０５４７】
（実施例１００）
実施例９８で用いた精製酵素液（１）に代えて、ＴＬ２株由来の粗酵素液（２）を用い、それ以外の条件は、実施例９８と同じにして、中空磁性マイクロカプセル２８を得た。この中空磁性マイクロカプセル２８を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤２８とした。
【０５４８】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１３に示す。
【０５４９】
実施例９８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル２８の外被の主成分がＰＨＢであることを確認した。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル２８外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ７５，０００  であった。
【０５５０】
（実施例１０１）
実施例９８で用いた精製酵素液（１）に代えて、ＴＬ２株由来の粗酵素液（２）を用い、また、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）を用いて、それ以外は、実施例９８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル２９を得た。この中空磁性マイクロカプセル２９を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤２９とした。
【０５５１】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１３に示す。
【０５５２】
実施例９８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル２９の外被の主成分が３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル２９外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２５，０００  であった。
【０５５３】
（実施例１０２）
実施例９８で用いた精製酵素液（１）に代えて、Ｐ９１株由来の粗酵素液（３）を用い、また、  （Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ（Ｒｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応により得られた３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸を得た後、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）を用いて、それ以外は、実施例９８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル３０を得た。この中空磁性マイクロカプセル３０を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤３０とした。
【０５５４】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１３に示す。
【０５５５】
実施例９８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル３０の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル３０外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２１，０００  であった。
【０５５６】
（実施例１０３）
実施例９８で用いた精製酵素液（１）に代えて、Ｐ９１株由来の粗酵素液（３）を用い、また、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ（Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５，  １４９０−１４９２  （１９９０）に記載の方法で合成した３−フェノキシプロパナール及びブロモ酢酸エチルを原料とし、亜鉛によるＲｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応で得られた３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸を得た。その後、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）  に記載の方法で調製）を用いて、その他の条件は、実施例９８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル３１を得た。この中空磁性マイクロカプセル３１を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤３１とした。
【０５５７】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１３に示す。
【０５５８】
実施例９８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル３１の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル３１外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２３，０００  であった。
【０５５９】
（実施例１０４）
実施例９８で用いた精製酵素液（１）に代えて、粗酵素液（４）を用い、また、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡを用いて、それ以外の条件は、実施例９８と同様にしてＰＨＡ合成反応を行った。本例では、室温において３時間反応を行った後、さらに（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ１ｇを水相に添加し、室温においてさらに２時間反応を行った。それ以降の処理は、実施例９８と同様にして中空磁性マイクロカプセル３２を得た。この中空磁性マイクロカプセル３２を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤３２とした。
【０５６０】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１３に示す。
【０５６１】
このカプセル構造体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ  ＩＶ、ＣＡＭＥＣＡ製）により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体表面のＰＨＡは主に３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットで構成されていることが確認された。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体の表面を少しずつ削りながら同様にＴＯＦ−ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、ある時点でカプセル構造体を構成するＰＨＡのモノマーユニットの主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットに置き換わることが確認された。これより、本実施例のカプセル構造体は、初期に生成したポリ（３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸）の外被層上に、後半に生成するポリ（３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸）が被覆した二層構造を有する、所望のカプセル構造体であることがわかった。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル３２外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２２，０００  であった。
【０５６２】
（実施例１０５）
実施例９８で用いた精製酵素液（１）に代えて、粗酵素液（５）を用い、また、１ｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、８００ｍｇの（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ、２００ｍｇの（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡ（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，  １２，８５−９１  （１９９０）に記載の方法で合成した３−ヒドロキシ−７−オクテン酸の不飽和部分を３−クロロ安息香酸でエポキシ化した後、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）を用いて、それ以外の条件は、実施例９８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル３３を得た。この中空磁性マイクロカプセル３３を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤３３とした。
【０５６３】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１３に示す。
【０５６４】
１Ｈ−ＮＭＲ（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ，使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル３３の外被は、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットが７４％、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸ユニットが２６％からなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル３３外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２３，０００  であった。
【０５６５】
（実施例１０６）
上記の中空磁性マイクロカプセル３３について５０質量部を精製水５０質量部に懸濁したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した後、７０℃で１２時間反応させることで中空磁性マイクロカプセル３４を得た。この中空磁性マイクロカプセル３４を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤３４とした。得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１３に示す。
【０５６６】
中空マイクロカプセル３４について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが中空磁性マイクロカプセル３４では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることで、架橋ポリマーにより被覆された中空磁性マイクロカプセル３４が得られたことがわかる。
【０５６７】
（実施例１０７）
上記の中空磁性マイクロカプセル３３について５０質量部に、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルＴＳＦ４７００、ＧＥ東芝シリコーン（株）製）を１０質量部添加し、７０℃で２時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）する操作を繰返すことで洗浄、乾燥し、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する中空磁性マイクロカプセル３５を得た。この中空磁性マイクロカプセル３５を用いる超音波造影剤を、中空磁性マイクロカプセル３５とした。
【０５６８】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１３に示す。
【０５６９】
中空磁性マイクロカプセル３５について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが中空磁性マイクロカプセル３５では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡと末端アミノ変性ポリシロキサンを反応させることにより、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する中空磁性マイクロカプセル３５が得られたことがわかる。
【０５７０】
【表１３】
2004331750.tif 000051
（実施例１０８）
０．２ｇの磁性体１を分散したジクロロメタン２ｍｌを、１６〜１８℃に冷却した後、予め１６〜１８℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）を溶解した０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）１００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００ｒｐｍで攪拌して、Ｏ／Ｗ型エマルションとした。得られたＯ／Ｗ型エマルションに、精製酵素液（１）５ｍｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１ｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１ｇを添加、溶解し、室温で３時間緩やかに撹拌してＰＨＡの合成とジクロロメタンの揮発を行い、油相中に溶解しているＰＨＡを固化させた後、１５００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈澱物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、凍結乾燥し、粉末として中空磁性マイクロカプセル３６を得た。この中空磁性マイクロカプセル３６を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤３６とした。
【０５７１】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１４に示す。
【０５７２】
また、中空磁性マイクロカプセル３６を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０  時間攪拌して外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレン・フィルターでろ過し、ロータリー・エバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢに含まれるモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが、標品であるヒドロキシ酪酸のメチルエステル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた中空磁性マイクロカプセル３６の外被の主成分はＰＨＢであることを確認した。
【０５７３】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、数平均分子量Ｍｎ＝  ７５，０００  であった。
【０５７４】
（実施例１０９）
実施例１０８で用いた精製酵素液（１）に代えて、粗酵素液（１）を用いて、それ以外は、実施例１０８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル３７を得た。この中空磁性マイクロカプセル３７を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤３７とした。
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１４に示す。
【０５７５】
実施例１０８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル３７の外被の主成分がＰＨＢであることを確認した。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル３７外被を構成するＰＨＢの数平均分子量は  ７３，０００  であった。
【０５７６】
（実施例１１０）
実施例１０８で用いた精製酵素液（１）に代えて、粗酵素液（２）を用い、それ以外の条件は、実施例１０８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル３８を得た。この中空磁性マイクロカプセル３８を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤３８とした。得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１４に示す。
【０５７７】
実施例１０８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル３８の外被の主成分がＰＨＢであることを確認した。また、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル３８外被を構成するＰＨＢの数平均分子量は  ７１，０００  であった。
【０５７８】
（実施例１１１）
実施例１０８で用いた精製酵素液（１）に代えて、精製酵素液（２）を用い、また、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）を用いて、それ以外の条件は、実施例１０８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル３９を得た。この中空磁性マイクロカプセル３９を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤３９とした。
【０５７９】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１４に示す。
【０５８０】
実施例１０８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル３９の外被の主成分が３−ヒドロキシオクタン酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル３９外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２３，０００  であった。
【０５８１】
（実施例１１２）
実施例１０８で用いた精製酵素液（１）に代えて、精製酵素液（３）を用い、また、  （Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ（Ｒｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応により得られた３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸エステルを加水分解して３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸を得た後、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）  に記載の方法で調製）を用いて、それ以外の条件は、実施例１０８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル４０を得た。この中空磁性マイクロカプセル４０を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤４０とした。
【０５８２】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１４に示す。
【０５８３】
実施例１０８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル４０の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル４０外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２０，０００  であった。
【０５８４】
（実施例１１３）
実施例１０８で用いた精製酵素液（１）に代えて、粗酵素液（３）を用い、また、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ（Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ５５，  １４９０−１４９２  （１９９０）に記載の方法で合成した３−フェノキシプロパナール及びブロモ酢酸エチルを原料とし、亜鉛によるＲｅｆｏｒｍａｔｓｋｙ反応で得られた３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸エステルを加水分解して、３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸を得た。その後、Ｅｕｒ．Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）  に記載の方法で調製）を用いて、それ以外の条件は、実施例１０８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル４１を得た。この中空磁性マイクロカプセル４１を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤４１とした。
【０５８５】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１４に示す。
【０５８６】
実施例１０８と同様に、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＡの組成を評価した結果、得られた中空磁性マイクロカプセル４１の外被の主成分が３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル４１外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２４，０００  であった。
【０５８７】
（実施例１１４）
実施例１０８で用いた精製酵素液（１）に代えて、粗酵素液（４）を用い、また、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡを用いて、それ以外の条件は、実施例１０８と同様にしてＰＨＡ合成反応を行った。
【０５８８】
本例では、室温において１時間反応を行った後、さらに（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェノキシバレリルＣｏＡ１ｇを水相に添加し、室温においてさらに２時間反応を行った。それ以降の処理は実施例１０８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル４２を得た。この中空磁性マイクロカプセル４２を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤４２とした。
【０５８９】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１４に示す。このカプセル構造体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ  ＩＶ、ＣＡＭＥＣＡ製）により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体表面のＰＨＡは主に３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニットで構成されていることが確認された。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体の表面を少しずつ削りつつ、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、外表面からある深さに達した時点で、カプセル構造体を構成するＰＨＡのモノマーユニットの主成分が３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットに置き換わることが確認された。これより、本実施例のカプセル構造体は、初期に生成したポリ（３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸）の外被層上に、後半に生成したポリ（３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸）が被覆した二層構造の外被を有する、所望のカプセル構造体であることがわかった。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル４２外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２１，０００  であった。
【０５９０】
（実施例１１５）
実施例１０８で用いた精製酵素液（１）に代えて、粗酵素液（５）を用い、また、１ｇの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに代えて、０．８ｇの（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−フェニルバレリルＣｏＡ、０．２ｇの（Ｒ，Ｓ）−３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタノイルＣｏＡ（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，  １２，  ８５−９１  （１９９０）に記載の方法で合成した３−ヒドロキシ−７−オクテン酸の不飽和部分を３−クロロ安息香酸でエポキシ化した後、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５０，  ４３２−４３９  （１９９７）に記載の方法で調製）を用いて、それ以外の条件は、実施例１０８と同様にして、中空磁性マイクロカプセル４３を得た。この中空磁性マイクロカプセル４３を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤４３とした。
【０５９１】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１４に示す。１Ｈ−ＮＭＲ（使用機器：ＦＴ−ＮＭＲ：Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ４００、測定核種：１Ｈ，使用溶媒：重クロロホルム（ＴＭＳ入り））解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル４３の外被は、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸ユニットが７３％、３−ヒドロキシ−７，８−エポキシオクタン酸ユニットが２７％からなるＰＨＡであることを確認した。また、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーによる解析の結果より、得られた中空磁性マイクロカプセル４３外被を構成するＰＨＡの数平均分子量は  ２１，０００  であった。
【０５９２】
（実施例１１６）
上記の中空磁性マイクロカプセル４３の５０質量部を、精製水５０質量部に懸濁したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５質量部を溶解させた。溶解を確認した後、凍結乾燥により水を除去した後、７０℃で１２時間反応させることで、表面に架橋化処理を施した中空磁性マイクロカプセル４４を得た。この中空磁性マイクロカプセル４４を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤４４とした。
【０５９３】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１４に示す。
【０５９４】
中空磁性マイクロカプセル４４について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが中空磁性マイクロカプセル４４では消失していた。これより、側鎖にエポキシ基を有するユニットを含むＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることで、表面に架橋化がなされたポリマーにより被覆された中空磁性マイクロカプセル４４が得られたことがわかる。
【０５９５】
（実施例１１７）
上記の中空磁性マイクロカプセル４３の５０質量部に、末端アミノ変性ポリシロキサン（変性シリコーンオイルＴＳＦ４７００、ＧＥ東芝シリコーン（株）製）を１０質量部添加し、７０℃で２時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）する操作を繰返すことで洗浄した後、乾燥し、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する中空磁性マイクロカプセル４５を得た。この中空磁性マイクロカプセル４５を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤４５とした。
【０５９６】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１４に示す。
【０５９７】
中空磁性マイクロカプセル４５について赤外吸収を測定した（ＦＴ−ＩＲ；パーキンエルマー社製、１７２０Ｘ）ところ、加熱処理前に観察されたアミン（３３４０  ｃｍ−１付近）及びエポキシ（８２２  ｃｍ−１付近）のピークが中空マイクロカプセル４５では消失していた。これより、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡと末端アミノ変性ポリシロキサンを反応させることにより、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する中空マイクロカプセル４５が得られたことがわかる。
【０５９８】
【表１４】
2004331750.tif 000052
実験例１６
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおける超音波造影効果の試験）
図１  に示す試験装置を用いて、中空磁性マイクロカプセルを用いた超音波造影剤における、超音波造影効果を調べた。すなわち、生理食塩水１００ｍ１  を入れたポリプロピレン製の容器１を水槽２内に固定し、容器１内に攪拌子３を入れ、マグネチックスターラーにて攪拌した。前記実施例および比較例で得た各中空磁性マイクロカプセル微粒子の所定量を１ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８０  水溶液１ｍｌに懸濁し、容器１の生理食塩水中に投入した。ついで、５ＭＨｚの中心周波数をもつセクタ式プローブを装着した超音波画像診断装置（東芝社製のＳＯＮＯＬＡＹＥＲ  αＳＳＨ  ‐１４０  ）により、容器１が画面上で中心に位置するようにスキヤンした。そして、造影画面の静止画像において、容器１の前方部分または容器１内全体の輝点の明るさを求め、超音波造影効果の指針とした。
【０５９９】
実施例８５〜８７、９５〜９７、１０５〜１０７、１１５〜１１７および比較例４で得た各微粒子状のマイクロカプセルを用いている、超音波造影剤１２〜１４、２３〜２５、３３〜３５、４３〜４５および１５について、１ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８０  水溶液１ｍｌ当たり、いくつかの添加量を選択して、前記生理食塩水１００ｍｌ  に投入し、容器１の前方部分の輝点の明るさの経時的変化を調べた。
【０６００】
その結果、超音波造影剤１２〜１４、２３〜２５、３３〜３５、４３〜４５の何れについても、添加量が２０ｍｇ以下の場合、初期の輝点の明るさの平均値は約２５〜３０と一定であった。一方、経時的な減衰速度は添加量（懸濁濃度）に依存して、異なっており、中空磁性マイクロカプセル微粒子の懸濁濃度が薄いほど減衰速度が大きく、例えば、添加量が５ｍｇあるいは２．５ｍｇの場合、投入後約５分程度で、輝点の明るさの平均値は２０以下となった。一方、添加量が１０ｍｇあるいは２０ｍｇの場合、投入後約３０分経過した時点でも、輝点の明るさの平均値は２０以上であった。
【０６０１】
一方、中空磁性マイクロカプセル微粒子の添加量が４０ｍｇ以上の場合には、初期において、音響影陰が見られ、輝点の明るさの初期値は、添加量が１０ｍｇあるいは２０ｍｇの場合に比べて低く、約２３であったが、投入後、分散が進むに伴い、その輝点の明るさは経時的に増大し、約１０分で２８程度まで上昇した。その後は、微粒子の懸濁濃度が高い場合（添加量８０ｍｇ）、高い輝点の明るさがしばらくの間持続され、懸濁濃度が低い場合（添加量４０ｍｇ）、徐々に滅衰したが、何れの濃度においても、輝点の明るさがピークに達した後、約３０分を経過した時点でも、その輝点の明るさの平均値は２５以上であった。
【０６０２】
従って、本発明のＰＨＡ製の中空マイクロカプセルを用いて、水１ｍｌ当たり、添加量を１０ｍｇ以上の懸濁濃度で使用する超音波造影剤に調製することで、長時間にわたり高い造影効果を発揮するということがわかる。
【０６０３】
一方、ポリＤＬ乳酸（平均分子量７０００）を用いて作製された中空磁性マイクロカプセル１５を利用する超音波造影剤１５では何れの懸濁濃度においても、初期の輝点の明るさの平均値は２０以上であるものの、その後は、輝点の明るさは急速に減衰し、約５分後には１０以下、約１０分以降は５程度しか示さず、投入後の造影効果の継続性は、本発明の超音波造影剤よりも劣るものであった。
【０６０４】
（実施例１１８）
ペプチドＡの酢酸塩（ＴＡＰ社製）５００ｍｇを、蒸留水  ０．６ｍｌ  に溶解した。得られる溶液を、４．５ｇの例示化合物１および１．５ｇの気相法で合成した磁性を有する金属として１次粒子径０．０２μｍニッケル粉末「Ｎｉ（２００）ＵＦＭＰ」〔真空冶金（株）製〕（磁性体２とする）をジクロロメタン５．８ｍｌに含有させた溶液に加え、小型ホモジナイザー（キネマチカ社製）で６０秒間混合してＷ／Ｏ型乳化物を得た。このＷ／Ｏ型乳化物を１６℃に冷却した後、予め１６℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）水溶液１０００ｍｌ中に注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００  ｒｐｍ  でＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物とした。このＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物を室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮散させ、Ｗ／Ｏ型乳化物を固化させた後、遠心分離機（０５ＰＲ−２２、日立製作所）を用いて  ２０００  ｒｐｍ  で遠心分離した。得られる沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、分散液にＤ−マンニトール０．３ｇを加え、凍結乾燥し、粉末として磁性マイクロカプセル７６を得た。マイクロカプセル中のペプチドＡの含有率を表１５に示す。
【０６０５】
（実施例１１９）
ペプチドＡの酢酸塩（ＴＡＰ社製）５００ｍｇを、０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）  ０．６ｍｌ  に溶解し、さらに精製酵素液（１）６０μｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）６０ｍｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）５ｍｇを加え溶解した。得られる溶液を、１．５ｇの磁性体２を分散したジクロロメタン５．８ｍｌに加え、小型ホモジナイザー（キネマチカ社製）で６０秒間混合してＷ／Ｏ型乳化物を得た。このＷ／Ｏ型乳化物を１６℃に冷却した後、予め１６℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）水溶液１０００ｍｌ中に注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００  ｒｐｍ  でＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物とした。このＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物を室温で３時間撹拌して、ＰＨＡを合成するとともにジクロロメタンを揮散させ、Ｗ／Ｏ型乳化物を固化させた後、遠心分離機（０５ＰＲ−２２、日立製作所）を用いて  ２０００  ｒｐｍ  で遠心分離した。得られる沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、分散液にＤ−マンニトール０．３ｇを加え、凍結乾燥し、粉末として磁性マイクロカプセル７７を得た。マイクロカプセル中のペプチドＡの含有率を表１５に示す。
【０６０６】
また、磁性マイクロカプセル７７を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０  ℃で  ２０  時間攪拌して外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが標品であるヒドロキシ酪酸のメチル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた磁性マイクロカプセル７７の外被の主成分はＰＨＢであることを確認した。
【０６０７】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝  ７３、０００  であった。
【０６０８】
（実施例１２０）
ペプチドＡの酢酸塩（ＴＡＰ社製）５００ｍｇを、蒸留水  ０．６ｍｌ  に溶解した。得られる溶液を、１．５ｇの磁性体２を分散したジクロロメタン５．８ｍｌに加え、小型ホモジナイザー（キネマチカ社製）で６０秒間混合してＷ／Ｏ型乳化物を得た。このＷ／Ｏ型乳化物を１６℃に冷却した後、予め１６℃に冷却しておいた０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）  、０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）水溶液１００ｍｌ中に注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００  ｒｐｍ  でＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物とした。このＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物に、さらに精製酵素液（１）５ｍｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１ｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）１００ｍｇを加え溶解した。
【０６０９】
このＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物を室温で３時間撹拌して、ＰＨＡを合成するとともにジクロロメタンを揮散させ、Ｗ／Ｏ型乳化物を固化させた後、遠心分離機（０５ＰＲ−２２、日立製作所）を用いて  ２０００  ｒｐｍ  で遠心分離した。得られる沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、分散液にＤ−マンニトール０．３ｇを加え、凍結乾燥し、粉末として磁性マイクロカプセル７８を得た。マイクロカプセル中のペプチドＡの含有率を表１５に示す。
【０６１０】
また、磁性マイクロカプセル７８を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０  ℃で  ２０  時間攪拌して外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ、島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが標品であるヒドロキシ酪酸のメチル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた磁性マイクロカプセル７８の外被の主成分はＰＨＢであることを確認した。
【０６１１】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝  ７８、０００  であった。
【０６１２】
（実施例１２１）
薬物２（２００ｍｇ）と２．０ｇの例示化合物１、さらに２．０ｇの気相法で合成した１次粒子径０．０２μｍのγ−Ｆｅ２Ｏ３微粉「ＮａｎｏＴｅｋ」〔シーアイ化成（株）製〕（磁性体３とする）をジクロロメタン２ｍｌに溶解した溶液を、１６〜１８℃に冷却した後、あらかじめ１６〜１８℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）水溶液５００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００ｒｐｍでＯ／Ｗ型エマルションとした。得られたＯ／Ｗ型エマルションを室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮発させ、油相を固化させた後、１５００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、凍結乾燥し、粉末としてマイクロカプセルを得、これを磁性マイクロカプセル７９とした。マイクロカプセル中の薬物含量を表１５に示す。なお、薬物含量は２５ｍｇのマイクロカプセルを６０％アセトニトリル含有リン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに溶解したサンプルをＨＰＬＣ法で定量することによって測定した。
【０６１３】
（実施例１２２）
薬物２を１．５ｇと４．５ｇの例示化合物１、さらに１．５ｇの磁性体３をジクロロメタン９ｍｌに溶解した溶液を、を１６〜１８℃に冷却した後、あらかじめ１６〜１８℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール水溶液５００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、８０００ｒｐｍでＯ／Ｗ型エマルションとした。得られたＯ／Ｗ型エマルションを室温で３時間撹拌してジクロロメタンを揮発させ、油相を固化させた後、遠心分離器を用いて１５００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、凍結乾燥し、粉末としてマイクロカプセルを得、これを磁性マイクロカプセル８０とした。マイクロカプセル中の薬物含量を表１５に示す。
【０６１４】
（実施例１２３）
２００ｍｇの薬物１および０．５ｇの磁性体３をジクロロメタン２ｍｌに含有させた溶液を、１６〜１８℃に冷却した後、あらかじめ１６〜１８℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）を溶解した０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）１００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００ｒｐｍでＯ／Ｗ型エマルションとした。得られたＯ／Ｗ型エマルションに、精製酵素液（１）５ｍｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１ｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１ｇを添加、溶解し、室温で３時間緩やかに撹拌してＰＨＡの合成とジクロロメタンの揮発を行い、油相を固化させた後、１５００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、凍結乾燥し、粉末としてマイクロカプセルを得、これを磁性マイクロカプセル８１とした。マイクロカプセル中の薬物含量を表１５に示す。なお、薬物含量は２５ｍｇのマイクロカプセルを６０％アセトニトリル含有リン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに溶解したサンプルをＨＰＬＣ法で定量することによって測定した。
【０６１５】
また、磁性マイクロカプセル８１を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０  ℃で  ２０  時間攪拌して外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが標品であるヒドロキシ酪酸のメチル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた磁性マイクロカプセル８１の外被の主成分はＰＨＢであることを確認した。
【０６１６】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、Ｍｎ＝  ７８，０００  であった。
【０６１７】
【表１５】
2004331750.tif 000053
（実施例１２４）
２．０ｇの例示化合物１および１ｇの湿式法で合成した粒子径０．３μｍのマグネタイト微粒子「マグネタイトＥＰＴ５００」〔戸田工業（株）製〕（磁性体４とする）を塩化メチレン２０ｍ１に溶解した液に、精製水１２ｍｌを投入し、振盪・攪拌してＷ／Ｏ型エマルションを調製した。さらに超音波を照射することにより内水相の径を小さくした。ついで、小型ホモジナイザー（キネマチカ社（スイス）製のポリトロン）で攪拌しつつ、１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液２００ｍｌ中に前記Ｗ／Ｏ型エマルション３２ｍｌを投入し、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを攪拌機で６  時間攪拌し、油相中の有機溶媒である塩化メチレンを蒸発させ、油相中の例示化合物１を固化させた。微粒子を遠心分離により捕集し、同時に冷却した精製水で洗浄した後、０．１  ％Ｔｗｅｅｎ８０  水溶液で再分散し、凍結乾燥し、粉末状の微粒子である中空磁性マイクロカプセル４６を得た。また、中空磁性マイクロカプセル４６を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤４６とした。得られた中空マイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１６に示す。
【０６１８】
（実施例１２５）
２ｇの磁性体４を分散した２０ｍ１の塩化メチレン溶液に、１２ｍｌの０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）に精製酵素液（１）０．６ｍｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）３００ｍｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）１２ｍｇを加え溶解した水溶液を投入し、振盪・攪拌してＷ／Ｏ型エマルションを調製した。さらに超音波を照射することにより内水相の径を小さくした。ついで、小型ホモジナイザー（キネマチカ社（スイス）製のポリトロン）で攪拌しつつ、１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール水溶液２００ｍｌ  に前記Ｗ／Ｏ型エマルション３２ｍ１を投入し、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを攪拌機で６  時間攪拌しつつ、ＰＨＡを合成するとともに、油相中の塩化メチレンを蒸発させ、ＰＨＡを固化させて、マイクロカプセル状微粒子を調製した。得られた微粒子を遠心分離により捕集し、同時に冷却した精製水で洗浄した後、０．１  ％Ｔｗｅｅｎ８０  水溶液で再分散し、凍結乾燥し、粉末状のマイクロカプセル状微粒子である中空磁性マイクロカプセル４７を得た。この中空磁性マイクロカプセル４７を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤４７とした。得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１６に示す。
【０６１９】
また、中空磁性マイクロカプセル４７を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０  時間攪拌して、マイクロカプセル外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレン・フィルターでろ過し、ロータリー・エバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが標品である３−ヒドロキシ酪酸のメチルエステル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた中空磁性マイクロカプセル４７の外被の主成分はＰＨＢであることが確認された。
【０６２０】
さらに、このＰＨＢの分子量をゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、数平均分子量Ｍｎ＝  ７２，０００  であった。
【０６２１】
（実施例１２６）
２ｇの磁性体４を分散した２０ｍ１の塩化メチレン溶液に、１２ｍｌの精製水を投入し、振盪・攪拌してＷ／Ｏ型エマルションを調製した。さらに超音波を照射することにより内水相の径を小さくした。ついで、０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に１ｗ／ｖ％のポリビニルアルコール、精製酵素液（１）５ｍｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１ｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）１００ｍｇを加え溶解した水溶液１００ｍｌに、小型ホモジナイザー（キネマチカ社（スイス）製のポリトロン）で攪拌しつつ、前記Ｗ／Ｏ型エマルション３２ｍ１を投入し、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとした。このＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを攪拌機で６時間攪拌し、ＰＨＡを合成するとともに塩化メチレンを蒸発させ、生成したＰＨＡを固化して、マイクロカプセル微粒子を調製した。この微粒子を遠心分離により捕集し、同時に冷却した精製水で洗浄した後、０．１  ％Ｔｗｅｅｎ８０  水溶液で再分散し、凍結乾燥し、粉末状のマイクロカプセル微粒子である中空磁性マイクロカプセル４８を得た。この中空磁性マイクロカプセル４８を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤４８とした。
【０６２２】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１６に示す。また、中空磁性マイクロカプセル４８を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０  ℃で  ２０  時間攪拌して外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが、標品であるヒドロキシ酪酸のメチルエステル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた中空磁性マイクロカプセル４８の外被の主成分はＰＨＢであることを確認した。
【０６２３】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、数平均分子量Ｍｎ＝  ７１，０００  であった。
【０６２４】
（実施例１２７）
０．２ｇの磁性体４を分散したジクロロメタン２ｍｌを、１６〜１８℃に冷却した後、予め１６〜１８℃に冷却しておいた０．１％ポリビニルアルコール（ＥＧ−４０、日本合成化学製）を溶解した０．１  Ｍリン酸バッファー（ｐＨ  ７．０）１００ｍｌに注入し、タービン型ホモミキサー（特殊機化製）を用い、７０００ｒｐｍで攪拌して、Ｏ／Ｗ型エマルションとした。得られたＯ／Ｗ型エマルションに、精製酵素液（１）５ｍｌ、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン（株）社製）１ｇ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）０．１ｇを添加、溶解し、室温で３時間緩やかに撹拌してＰＨＡの合成とジクロロメタンの揮発を行い、油相中に溶解しているＰＨＡを固化させた後、１５００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈澱物を蒸留水に再分散後、分散液をさらに遠心分離し、遊離薬物を洗浄除去した。得られたマイクロカプセルを少量の蒸留水に再分散後、凍結乾燥し、粉末として中空磁性マイクロカプセル４９を得た。この中空磁性マイクロカプセル４９を用いる超音波造影剤を、超音波造影剤４９とした。
【０６２５】
得られたマイクロカプセル微粒子を光学顕微鏡および電子顕微鏡により観察した結果を表１６に示す。
【０６２６】
また、中空磁性マイクロカプセル４９を、２０  ｍＬのクロロホルムに懸濁し、６０℃で２０  時間攪拌して外被を構成するＰＨＢを抽出した。抽出液を孔径  ０．４５  μｍのメンブレン・フィルターでろ過し、ロータリー・エバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津ＱＰ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＢに含まれるモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、得られたクロマトグラムの中で主成分であるピークが、標品であるヒドロキシ酪酸のメチルエステル化化合物との保持時間が同一であることから、得られた中空磁性マイクロカプセル４９の外被の主成分はＰＨＢであることを確認した。
【０６２７】
さらに、該ＰＨＢの分子量をゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ−８０２０、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｃ（５μｍ）、溶媒；クロロホルム、カラム温度；  ４０  ℃、ポリスチレン換算）により評価した結果、数平均分子量Ｍｎ＝  ７５，０００  であった。
【０６２８】
【表１６】
2004331750.tif 000054
実験例１７
実施例７４、８８、９８、１０８、１２４〜１２７の中空磁性カプセル粒子、１、１６、２６、３６、４６〜４９、それぞれについて１質量％水分散液をシリンジに取り、膀胱を想定したモデル装置に１ｃｃを注入し、直後から１０分間、超音波診断装置（日立製作所社製，ＥＵＢ−５６５型，３．５ＭＨｚ  リニア掃査型深触子付）で観察したところ、いずれも鮮明に、流体の流れが、共鳴散乱による強いエコーにより観察できた。
【０６２９】
実験例１８
実施例７４、８８、９８、１０８、１２４〜１２７の中空磁性カプセル粒子、１、１６、２６、３６、４６〜４９、それぞれについて１質量％水溶液をシリンジに取り、人体の血管壁モデル装置（流速２〜３ｃｍ／秒、磁束密度は磁界の中央部から１ｃｍのところで約１４０ガウス、磁気勾配２０エルステッド／ｍｍ）に１ｃｃを注入し、超音波診断装置（日立製作所社製，ＥＵＢ−５６５型，３．５ＭＨｚ  リニア掃査型深触子付）で観察した。中空磁性カプセル粒子を流し始めた時の状態を観察したところ、いずれの粒子においても、チューブ内壁に当該粒子が流れている状態を観察することができた。また、流し始めから１分後の状態を観察したところ、いずれの粒子においても、チューブ内壁面に当該粒子が集まった状態を観察することができた。
【０６３０】
実験例１９
実施例７４の中空磁性カプセル粒子１を０．２２μｍ  フィルターで濾過した後、高圧蒸気で滅菌した生理的食塩水で無菌的に洗浄、置換し、同生理的食塩水中の１０質量％分散液とした。ビーグル犬（６才、１３ｋｇ、雄）の後足付け根付近に、塩酸ケタラール注射薬（５０ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌを筋注して、局所麻酔をした。実験観察中、追加麻酔は行わず、無拘束下で行った。
尿道からカテーテルを挿入し、留置した。シリンジによりカテーテルから生理的食塩水６０ｍｌを注入し、膀胱を膨充させた後、上記フェライト被覆ガラスバルーン粒子の分散液０．５ｍｌを注入した。さらに生理的食塩水１０ｍｌを注入し、カテーテル内の分散液を完全に注入した。注入前からの状態を、超音波診断装置（横河メディカルシステムズ社製、Ｕ−ｓｏｎｉｃ    ＲＴ５０００型、５ＭＨｚ  深触子付）で観察したところ、磁石によって中空磁性カプセル粒子が集まった状態が観察された。また、磁石を外したところ、再び膀胱内に中空磁性カプセル粒子が分散した状態が観察された。観察後、カテーテルを脱離し、自由排尿させた。中空磁性カプセル粒子の黒色を呈した尿を排尿した。覚醒後、自由歩行し、正常に回復した。実験終了３０日後、特に異常な症状を示さなかった。
【０６３１】
【発明の効果】
本発明により、内部に薬物等を安定性よく内包し、初期放出を示さず所定時後に除法性を有する構造体を提供することが可能である。また、磁性を活用することで、構造体の移動を制御することが可能である。
【０６３２】
【配列表】
2004331750.tif 000055
2004331750.tif 000056
2004331750.tif 000057
2004331750.tif 000058
2004331750.tif 000059
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【図面の簡単な説明】
【図１】実験例１６における試験方法の原理を示す説明図である。
【符号の説明】
１  容器
２  水槽
３  攪拌子
【図１】
2004331750.tif 000105