(57)【要約】【課題】遺伝子操作により変異を入れたり、他のタンパク質を融合させたりすることが容易にでき、抗原との親和性、抗原特異性、安定性および応用性が高い、変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応するヒト型一本鎖抗体、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを用いた腫瘍細胞の検出方法、腫瘍細胞の検出用キットなどを提供する。【解決手段】イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域とＶＬ領域とを有する一本鎖抗体を発現するベクターを構築した。このベクターを有する第二の宿主を培養して当該宿主に一本鎖抗体を提示させ、変異型Ｅ−カドヘリンの一部からなるペプチドに反応する一本鎖抗体を提示する宿主を回収した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応し、正常型Ｅ−カドヘリンには反応しないことを特徴とするヒト型一本鎖抗体。
【請求項２】
クローン化された免疫グロブリン遺伝子をインビトロで発現させることによって得られることを特徴とする請求項１に記載のヒト型一本鎖抗体。
【請求項３】
前記免疫グロブリン遺伝子を含むＤＮＡを宿主に導入した後、当該宿主を培地中で培養し、その培地中に放出された当該免疫グロブリンを回収することにより得られることを特徴とする請求項２に記載のヒト型一本鎖抗体。
【請求項４】
変異型Ｅ−カドヘリンは、欠失突然変異を有する変異型Ｅ−カドヘリン遺伝子にコードされることを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１項に記載のヒト型一本鎖抗体。
【請求項５】
変異型Ｅ−カドヘリンは、正常型Ｅ−カドヘリン遺伝子においてエクソン９が欠失した変異型Ｅ−カドヘリン遺伝子にコードされることを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１項に記載のヒト型一本鎖抗体。
【請求項６】
下記の（ａ）〜（ｎ）のステップを含む方法により得られうるヒト型一本鎖抗体。
（ａ）ｃＤＮＡライブラリーに含まれるイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を有する断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｂ）前記イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域のＣＤＲ３領域を含む断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｃ）イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を有する断片を、（ａ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、（ｂ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ３領域を含む断片とを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｄ）（ｃ）のステップにより得られたイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域をベクターに組み込むステップ
（ｅ）ｃＤＮＡライブラリーのイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｆ）前記イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域のＣＤＲ３領域を含む断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅するステップ
（ｇ）イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を有する断片を、（ｅ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、（ｆ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ３領域を含む断片とを鋳型としてＰＣＲにより増幅するステップ
（ｈ）（ｇ）のステップにより得られたイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域をベクターに組み込みステップ
（ｉ）（ｄ）と（ｈ）のステップにより作製されたベクターをともに第一の宿主に導入して宿主内でイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域とＶＬ領域とを融合し、イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域とＶＬ領域とを有する一本鎖抗体を発現するベクターを構築するステップ
（ｊ）（ｉ）のステップにより作製された一本鎖抗体発現ベクターを有する第二の宿主を培養して当該宿主に一本鎖抗体を提示させるステップ
（ｋ）前記一本鎖抗体を提示する第二の宿主と、変異型Ｅ−カドヘリンの全部または一部からなるポリペプチドとを接触させるステップ
（ｌ）前記変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に結合した一本鎖抗体を提示する宿主を回収するステップ
（ｍ）前記一本鎖抗体をコードするイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域とＶＬ領域とを有する第三の宿主を培養し、一本鎖抗体の発現を誘導するステップ
（ｎ）前記一本鎖抗体を回収するステップ
【請求項７】
配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を有し、変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応することを特徴とするポリペプチド。
【請求項９】
請求項７または８に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
以下の塩基配列からなる群から選択される塩基配列を有するポリヌクレオチド、またはその一部を有するポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応することを特徴とするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号６〜１０に示される塩基配列からなる群から選択される塩基配列
（ｂ）配列番号６〜１０に示される塩基配列からなる群から選択される塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列
【請求項１１】
請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の一本鎖抗体、または請求項７若しくは８に記載のポリペプチド、または請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする腫瘍細胞の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の一本鎖抗体、請求項７若しくは８に記載のポリペプチド、または請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする腫瘍細胞の検出用キット。
【請求項１３】
請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の一本鎖抗体、請求項７若しくは８に記載のポリペプチド、または請求項９または１０に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする癌の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト型一本鎖抗体、腫瘍細胞の検出方法、腫瘍細胞の検出用キット、癌の治療剤などに関する。
【０００２】
【用語の定義】
インビトロとは、試験管内あるいは生体外を意味し、多細胞生物などの高等生物の遺伝子またはタンパク質に対しては、試験管内だけでなく、バクテリア、酵母、培養細胞、組織培養などを用いることも含まれる。
【０００３】
変異型Ｅ−カドヘリンとは、正常型Ｅ−カドヘリン遺伝子中に欠失突然変異、点突然変異、あるいはフレームシフト突然変異が起こることにより生じる変異型タンパク質において、正常型Ｅ−カドヘリンが有さないエピトープ（抗原決定基）を有するＥ−カドヘリンをいう。
【０００４】
シャッフリングとは、ある遺伝子領域とある遺伝子領域とを領域間で交換して遺伝子の多様性を生み出すことをいう。本発明においては、ＶＨ領域とＶＬ領域を領域間で交換して一本鎖抗体遺伝子の多様性を生み出すことをいう。
【０００５】
変異型Ｅ−カドヘリン活性とは、癌細胞の浸潤又は転移を促進する活性をいうが、その機構は、正常型Ｅ−カドヘリンを欠損したことによる受動的なものであっても、変異型Ｅ−カドヘリンが積極的に癌細胞の浸潤又は転移を促進する能動的なものであっても構わない。通常、前者の場合は劣性突然変異、後者の場合は優性突然変異となると考えられるが、中間遺伝を示す場合もある。従って、変異型Ｅ−カドヘリン活性を抑制する物質は、その抑制の結果、癌細胞を死滅させたり、原発巣から遊離するのを防いだり、癌細胞を組織内に侵入させることを防いだりする。
【０００６】
【従来の技術】
ヒトの腫瘍の九割は上皮組織に由来し、悪性化が進行すると、腫瘍細胞は上皮組織の基底膜を破り周辺組織に浸潤し、リンパ節などを介して転移する。転移は悪性腫瘍の一つの指標とされており、悪性腫瘍の治癒率は良性腫瘍の治癒率に比べかなり低い。
【０００７】
近年の研究により、癌の浸潤・転移においてＥ−カドヘリン分子が深く関わっていることが明らかにされている。Ｅ−カドヘリンは、膜貫通型の糖タンパク質であり、細胞間の接着装置ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ（ＡＪ）に局在して、上皮細胞間の接着や上皮組織の維持において中心的役割を果たす接着分子である。Ｅ−カドヘリンには、細胞間接着が低下した浸潤性のヒト胃癌など多数の癌において変異が生じており、そのため、変異型Ｅ−カドヘリンを特異的に認識する抗体は、癌の診断や、抗癌抗体医薬などの開発などの癌の治療に極めて有用であると考えられる。これまで、変異型Ｅ−カドヘリンを特異的に認識する抗体として、変異型Ｅ−カドヘリンを特異的に認識するモノクローナル抗体が知られている（例えば、特許文献１及び２）。
【０００８】
【特許文献１】
特開平１０−１２７２８３号公報
【０００９】
【特許文献２】
特開平１１−２９２９００号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記モノクローナル抗体はマウス由来であり、ヒト型モノクローナル抗体を作出するのは難しい。また、一般にモノクローナル抗体は遺伝子操作により変異を入れたり、他のタンパク質を融合させたりすることが困難なため、親和性、特異性、および応用性に乏しいという問題点があった。さらに、ハイブリドーマの継代によって、生成するモノクローナル抗体の機能の低下、特に結合能の低下が生じる場合が多いことも問題であった。
【００１１】
そこで、本発明は、遺伝子操作により変異を入れたり、他のタンパク質を融合させたりすることが容易にでき、抗原との親和性、抗原特異性、安定性および応用性が高い、変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応するヒト型一本鎖抗体、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを用いた腫瘍細胞の検出方法、腫瘍細胞の検出用キットなどを提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明にかかるヒト型一本鎖抗体は、変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応し、正常型Ｅ−カドヘリンには反応しないことを特徴とする。また、クローン化された免疫グロブリン遺伝子をインビトロで発現させることによって得られることを特徴としてもよい。さらに、前記免疫グロブリン遺伝子を含むＤＮＡを大腸菌に導入した後、当該大腸菌を培地中で培養し、その培地中に放出された当該免疫グロブリンを回収することにより得られることを特徴としてもよいが、宿主内から免疫グロブリンを回収することにより得られるものも本発明の範囲内である。
【００１３】
前記変異型Ｅ−カドヘリンは、欠失突然変異を有する変異型Ｅ−カドヘリン遺伝子にコードされることを特徴としてもよい。また、前記変異型Ｅ−カドヘリンは、正常型Ｅ−カドヘリン遺伝子においてエクソン９が欠失した変異型Ｅ−カドヘリン遺伝子にコードされることを特徴としてもよい。
【００１４】
本発明のヒト型一本鎖抗体は、下記の（ａ）〜（ｎ）のステップを含む方法により得られうることを特徴としてもよい。
（ａ）ｃＤＮＡライブラリーに含まれるイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を有する断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｂ）前記イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域のＣＤＲ３領域を含む断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｃ）イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を有する断片を、（ａ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、（ｂ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ３領域を含む断片とを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｄ）（ｃ）のステップにより得られたイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域をベクターに組み込むステップ
（ｅ）ｃＤＮＡライブラリーのイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｆ）前記イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域のＣＤＲ３領域を含む断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅するステップ
（ｇ）イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を有する断片を、（ｅ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、（ｆ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ３領域を含む断片とを鋳型としてＰＣＲにより増幅するステップ
（ｈ）（ｇ）のステップにより得られたイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域をベクターに組み込みステップ
（ｉ）（ｄ）と（ｈ）のステップにより作製されたベクターをともに第一の宿主に導入して宿主内でイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域とＶＬ領域とを融合し、イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域とＶＬ領域とを有する一本鎖抗体を発現するベクターを構築するステップ
（ｊ）（ｉ）のステップにより作製された一本鎖抗体発現ベクターを有する第二の宿主を培養して当該宿主に一本鎖抗体を提示させるステップ
（ｋ）前記一本鎖抗体を提示する第二の宿主と、変異型Ｅ−カドヘリンの全部または一部からなるポリペプチドとを接触させるステップ
（ｌ）前記変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に結合した一本鎖抗体を提示する宿主を回収するステップ
（ｍ）前記一本鎖抗体をコードするイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域とＶＬ領域とを有する第三の宿主を培養し、一本鎖抗体の発現を誘導するステップ
（ｎ）前記一本鎖抗体を回収するステップ
【００１５】
本発明にかかるポリペプチドは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする。また、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を有し、変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応することを特徴としてもよい。
【００１６】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードすることを特徴とする。また、以下の塩基配列からなる群から選択される塩基配列を有するポリヌクレオチド、またはその一部を有するポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応することを特徴としてもよい。
（ａ）配列番号６〜１０に示される塩基配列からなる群から選択される塩基配列（ｂ）配列番号６〜１０に示される塩基配列からなる群から選択される塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列
これらのポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、のいずれであってもよい。また、１個若しくは数個の塩基の欠失、置換、または付加などの遺伝的多型（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）をもつが、アミノ酸配列が同じポリペプチドや、もとの塩基配列がコードするタンパク質と同等の機能、例えば、変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応し、正常型Ｅ−カドヘリンには反応しない機能をもつポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。
【００１７】
本発明にかかる腫瘍細胞の検出方法は、上記の一本鎖抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを用いることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明にかかる腫瘍細胞の検出用キットは、上記の一本鎖抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含有することを特徴とする。
【００１９】
本発明にかかる治療剤は、上記一本鎖抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含有することを特徴とする。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （Ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）；  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｂｒｅｎｔ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ｊ．Ｇ．  Ｓｅｉｄｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｋ．  Ｓｔｒｕｈｌ  （Ｅｄ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２２】
（１）一本鎖抗体
本来のイムノグロブリンは、図５に示すように、２本のＬ鎖（軽鎖，ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）と２本のＨ鎖（重鎖，ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）から構成されており、Ｈ鎖及びＬ鎖（κ鎖とλ鎖がある）にはそれぞれ可変領域（Ｖ領域）と定常領域（Ｃ領域）が存在する。イムノグロブリンのＨ鎖は４つのドメイン（ＶＨ・ＣＨ１・ＣＨ２・ＣＨ３）、Ｌ鎖は２つのドメイン（ＶＬ・ＣＬ）から構成されている。
【００２３】
抗原との結合はイムノグロブリンのＨ鎖の可変領域（ＶＨ領域）とＬ鎖の可変領域（ＶＬ領域）とが関係しており、本発明の一本鎖抗体とは、イムノグロブリンのＶＨ領域とＶＬ領域とを有する最小単位で構成されている。
【００２４】
ＶＨ領域は相補性を決定する部位（超可変領域；ＣＤＲ）とこれらの立体構造を保持するために働いている枠組み構造領域（ＦＷＲ）とがモザイク状に配置された構造を有している（図６中のＡ）。超可変領域においては特に多くのアミノ酸配列の変異が見つかっており、この領域の多様性が、特に抗体の多様性につながっている。一方、各イムノグロブリン遺伝子において、ＦＷＲ３は保存性が高いことが知られている。
【００２５】
本発明においては、この一本鎖抗体のライブラリーを用いて、変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応し、正常型Ｅ−カドヘリンには反応しない一本鎖抗体をスクリーニングして得た。
【００２６】
変異型Ｅ−カドヘリンとしては、正常型Ｅ−カドヘリン遺伝子において突然変異が起こり、正常型Ｅ−カドヘリンの機能が欠損したものであればどのようなものでもよいが、変異型Ｅ−カドヘリンのみを特異的に認識する抗体を作製するためには、正常型Ｅ−カドヘリンには存在しないエピトープを有した変異型Ｅ−カドヘリンが好ましい。下記の実施例では、正常型Ｅ−カドヘリン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｚ１３００９）においてエクソン９（１２３２から１４１４番目の塩基配列）が欠失した変異型Ｅ−カドヘリン遺伝子にコードされる変異型Ｅ−カドヘリンを用いる（図８）が、正常型Ｅ−カドヘリン遺伝子のエクソン８（１１０３から１２３１番目の塩基配列）が欠失した変異型Ｅ−カドヘリン遺伝子にコードされる変異型Ｅ−カドヘリンなどを用いることもできる。また、欠失突然変異だけでなく、点突然変異やフレームシフト突然変異によって、新たなエピトープを獲得した変異型Ｅ−カドヘリンでも構わない。
【００２７】
正常型Ｅ−カドヘリン遺伝子においてエクソン９が欠失した変異型Ｅ−カドヘリン遺伝子にコードされる変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応し、正常型Ｅ−カドヘリンには反応しない一本鎖抗体としては、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。また、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を有し、変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応するが、正常型Ｅ−カドヘリンに反応しないポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。また、上記一本鎖抗体またはポリペプチドが、タグ分子などのポリペプチドと融合したポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。さらに、本発明の一本鎖抗体は、タグなどのマーカー分子やフルオレセンやローダミンなどの蛍光分子と結合していても良い。
【００２８】
（２）一本鎖抗体の作製方法
本発明のヒト型一本鎖抗体は、変異型Ｅ−カドヘリンに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマからイムノグロブリンｃＤＮＡをクローニングし、遺伝子組み換えによって、ヒト型一本鎖抗体を作製する方法や、ファージ提示型ヒト型一本鎖抗体ライブラリーを用いた方法や、それを改良した特願２００１−３５８６０２号に記載の超レパートリー人工抗体ライブラリーを用いた方法などにより得ることができる。中でも、発現不能なレパートリーの混入や抗体ライブラリーの不安定性の問題がなく、また、抗体のレパートリーが多く、さらに、短時間でヒト型一本鎖抗体を得ることができる点で超レパートリー人工抗体ライブラリーを用いた方法が最も好ましい。
【００２９】
本発明のヒト型一本鎖抗体は、下記の（ａ）〜（ｎ）のステップにより得られることができる。
（ａ）ｃＤＮＡライブラリーに含まれるイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を有する断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｂ）前記イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域のＣＤＲ３領域を含む断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｃ）イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を有する断片を、（ａ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、（ｂ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ３領域を含む断片とを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｄ）（ｃ）のステップにより得られたイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域をベクターに組み込むステップ
（ｅ）ｃＤＮＡライブラリーのイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅するステップ
（ｆ）前記イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域のＣＤＲ３領域を含む断片を、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅するステップ
（ｇ）イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を有する断片を、（ｄ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、（ｅ）のステップにより得られた前記ＣＤＲ３領域を含む断片とを鋳型としてＰＣＲにより増幅するステップ
（ｈ）（ｇ）のステップにより得られたイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＬ領域をベクターに組み込みステップ
（ｉ）（ｄ）と（ｈ）のステップにより作製されたベクターをともに第一の宿主に導入して宿主内でイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域とＶＬ領域とを融合し、イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域とＶＬ領域とを有する一本鎖抗体を発現するベクターを構築するステップ
（ｊ）（ｉ）のステップにより作製された一本鎖抗体発現ベクターを有する第二の宿主を培養して当該宿主に一本鎖抗体を提示させるステップ
（ｋ）前記一本鎖抗体を提示する第二の宿主と、変異型Ｅ−カドヘリンの全部または一部からなるポリペプチドとを接触させるステップ
（ｌ）前記変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に結合した一本鎖抗体を提示する宿主を回収するステップ
（ｍ）前記一本鎖抗体をコードするイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域とＶＬ領域とを有する第三の宿主を培養し、一本鎖抗体の発現を誘導するステップ
（ｎ）前記一本鎖抗体を回収するステップ
【００３０】
上記ｃＤＮＡライブラリーは、イムノグロブリンｃＤＮＡを含むｃＤＮＡから作製され、例えば脾臓ｃＤＮＡ、末梢血ｃＤＮＡ、骨髄ｃＤＮＡ白血球などを用いて作製される。これらのｃＤＮＡライブラリーに含まれるイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域またはＶＬ領域の、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を有する断片は、ＰＣＲ法によって得ることができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例えば、図６中のＢに示されるＦＷＲ１の一部の塩基配列からなるフォワード１プライマーと、ＦＷＲ３の一部の塩基配列に相補的な塩基配列からなるリバース２プライマーとを用いることができる。一方、これらのｃＤＮＡライブラリーに含まれるイムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域またはＶＬ領域の、ＣＤＲ３領域を有する断片も、同様にＰＣＲにより得ることができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例えば、図６中のＣに示されるＦＷＲ３の一部の塩基配列からなるフォワード２プライマーと、ＦＷＲ４の一部の塩基配列に相補的な塩基配列からなるリバース１プライマーとを用いることができる。
【００３１】
また、本発明の実施の形態において、イムノグロブリンｃＤＮＡのＶＨ領域またはＶＬ領域は、上記作製したＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を有する断片と、ＣＤＲ３領域を有する断片とを鋳型として、ＰＣＲにより得ることができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例えば、上記フォワード１プライマーと、リバース１プライマーとを用いることができる。これらの操作により、一次ライブラリー（ＶＨライブラリーとＶＬライブラリー）を作製することができる。さらに多様性を増やすために、上記各断片に変異を導入する場合にはインビトロ突然変異導入などの公知の方法により容易に行うことができる。
【００３２】
ベクターは、発現系ベクターまたは非発現系ベクターのいずれを用いてもよいが、ＶＨライブラリーまたはＶＬライブラリーを安定に存在させ、これらのレパートリーの維持を容易に行うことができる点で非発現系ベクターを用いることが好ましい。
【００３３】
本実施例では非発現系ベクターとして、それ単独では宿主中で発現することはできないが、リコンビナーゼＣｒｅなどの作用により、一方のベクターにおける一部の領域を、他方のベクターにおける一部の領域に置換して当該ベクターに組み込むことにより、ＶＨ領域とＶＬ領域とを有する一本鎖抗体を宿主中で初めて発現することができるものを用いる。例えば、リコンビナーゼＣｒｅが認識するｌｏｘＰ配列（変異型ｌｏｘＰも含む）を有し、プロモーターフリーのベクターと、リコンビナーゼＣｒｅが認識するｌｏｘＰ配列（変異型ｌｏｘＰも含む）を有し、ＳＤ配列フリーのベクターとを用いることができる。
【００３４】
リコンビナーゼＣｒｅが認識するｌｏｘＰ配列（変異型ｌｏｘＰも含む）を有し、プロモーターフリーのベクターは、例えば、ｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２（図３）、ｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２Ｋ（図４）等である。また、リコンビナーゼＣｒｅが認識するｌｏｘＰ配列（変異型ｌｏｘＰも含む）を有し、ＳＤ配列フリーのベクターは、例えば、ｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ２（図１）、ｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ３（図２）等であってもよいが、ピューロマイシン−Ｒ発現ユニットが組み込まれたｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ３の方が好ましい。
【００３５】
ＶＨライブラリーが組み込まれたベクターと、ＶＬライブラリーが組み込まれたベクターとの大腸菌等の宿主への導入はトランスフェクションやエレクトロポレーション等の公知の方法により容易に行うことができる。好ましい実施の形態としては、ＶＨライブラリーが組み込まれたｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２等のベクターと、ＶＬライブラリーが組み込まれたｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ２等のベクターとをそれぞれ大腸菌に導入し、これらの大腸菌にファージをそれぞれ感染させて、ＶＨライブラリーとしてのファージとＶＬライブラリーとしてのファージを作製し、それらを共に宿主に感染させること（多重感染ともいう）により行うことができる。これにより、ＶＨ−ＶＬシャッフリングが行われる。また、多重感染させた宿主にリコンビナーゼＣｒｅを作用させることにより、ＶＨ領域とＶＬ領域とを有する一本鎖抗体を宿主において発現させるようにすることができる（図７）。
【００３６】
ＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体を提示する宿主は、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、イースト菌、動物細胞、上皮系細胞などであってもよいが、鞭毛に一本鎖抗体を提示させることができる点でサルモネラ菌が好ましい。
【００３７】
一本鎖抗体を提示するファージまたは細胞に接触させる変異型Ｅ−カドヘリンは、変異型Ｅ−カドヘリンまたは変異型Ｅ−カドヘリンの一部からなるペプチドであってもよい。合成や調製、扱いやすさの面から変異型Ｅ−カドヘリンの一部からなるペプチドが好ましい。抗原性を増大させるために、変異型Ｅ−カドヘリンの一部からなるペプチドを結合させたＭＡＰレジン（多抗原性ペプチド：リジン残基が放射状に分岐した構造で１分子のＭＡＰに８個の反応性アミノ基をもつ）や、変異型Ｅ−カドヘリンの一部からなるペプチドを結合させた巨大タンパク質ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などがより好ましい。また、取り扱いやすくするために、変異型Ｅ−カドヘリンの一部からなるペプチドにマグネチックビーズなどを結合させることが最も好ましい。
【００３８】
一本鎖抗体の単離方法としては、一本鎖抗体を提示するファージを宿主に感染させて培養したり、又は前記一本鎖抗体を提示する宿主細胞を培養したりして、一本鎖抗体の発現を誘導し、培地中に放出された一本鎖抗体を回収する方法がある。ここで、一本鎖抗体の発現を誘導する宿主としては、例えば、大腸菌、ファージ、イースト菌、サルモネラ菌などがある。
【００３９】
また、一本鎖抗体の単離方法としては、適切なエンハンサー／プロモーターをもつ発現ベクターに、Ｈｉｓタグなどをコードするヌクレオチドタグを融合した一本鎖抗体をコードするｃＤＮＡを挿入し、このタグ付き一本鎖抗体発現ベクターを、大腸菌、ファージ、イースト菌、サルモネラ菌、動物細胞などに導入して発現させたタンパク質をタグを利用して精製する方法や、インビトロ転写系で一本鎖抗体をコードするｃＤＮＡを転写させた転写物を翻訳させて得られ、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液、麦芽抽出液、小麦胚抽出液などを用いたタンパク質をタグを利用して精製する方法などがある。タグは、最終段階で除去し、ＨＰＬＣなどで、一本鎖抗体を有するポリペプチドだけを精製しても良い。
【００４０】
（３）腫瘍細胞の検出方法及びキット
本発明にかかる腫瘍細胞の検出方法には、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、蛍光抗体法などがある。
【００４１】
これらの方法において、アビジン（またはストレプトアビジン）−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法、アビジン（またはストレプトアビジン）−ビオチン複合体法（ＡＢＣ法）、及び、ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ法（ＰＡＰ法）など様々なシグナル増幅法と組み合わせることができる。また、単独又は他の診断薬と組み合わせて使用することも可能である。また、本発明の一本鎖抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドなどにおいて、これらを検出可能にするために、放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ルシフェリン等の蛍光または化学ルミネッセンス化合物、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素などを用いることができる。
【００４２】
本発明にかかる腫瘍細胞の検出用キットは、上記の一本鎖抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドなどを含み、腫瘍細胞の検出方法に必要な試薬などとが組み合わされたものである。
【００４３】
（４）治療剤
上述したように、Ｅ−カドヘリンは上皮細胞間の接着や上皮組織の維持において中心的役割を果たしているが、これに対して多くの浸潤性の腫瘍細胞には変異型Ｅ−カドヘリンが発現している。この事実を利用して、本発明の一本鎖抗体、またはポリペプチドを、抗ガン抗体医薬として利用できる可能性がある。例えば、本発明の一本鎖抗体と、ジフテリアトキシンやシュードモナスなどのポリペプチド毒素などの細胞毒性ペプチドの融合物は、腫瘍細胞を標的として腫瘍細胞特異的に細胞死を起こすことができると期待される。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドの場合は、発現ベクターに組み込んで、体内に導入することにより、体内で一本鎖抗体を発現させる。導入方法としては、アデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターなどを用いたウイルス感染法が好ましいが、これに限定されない。ポリヌクレオチドにコードされた一本鎖抗体を発現する発現ベクターを動物細胞などに導入し、その細胞を体内に導入して、体内で一本鎖抗体を発現させても良い。
【００４５】
ポリペプチドの場合、個体への導入方法としては、前記調製した一本鎖抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを有効成分として含む治療剤を、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物に対し、導入対象の腫瘍細胞の近傍に直接投与するか、治療剤によっては非経口、経口、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内に投与する方法であってもよい。この場合治療剤は、使用する部位又は目的に応じて、薬理学的に許容された適切な賦形剤又は基剤をさらに含有してもよい。
【００４６】
また、前記一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドと、細胞毒性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有するポリヌクレオチドを導入した発現ベクターをリポソームの中に入れて腫瘍細胞と融合させ、当該プラスミドを細胞内に導入させることとしてもよい。また、ＴｒａｎｓＩＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴａＫａＲａの商品名）などを用いて、インビボ・トランスフェクションを行ってもよい。この場合、治療剤を、患部に直接注射することとしてもよく、また、静脈注射することとしてもよい。インビトロの細胞培養系において治療剤を細胞内へ導入する際、調製した一本鎖抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドなどの治療剤を、対象の腫瘍細胞に対し、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、アデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターなどを用いたウイルス感染法、又はカルシウムを用いたトランスフェクション法等を用いる。
【００４７】
以下、本発明の実施例について詳細に述べる。
実施例１から実施例５では、変異型Ｅ−カドヘリンに対する抗体をスクリーニングするため、一本鎖抗体ライブラリーを作製した。
【００４８】
＜実施例１：ＶＨベクターの作製＞
ＶＨベクターの作製には、基本ベクターとしてＡｍｐ−Ｒ部分に変異導入を加えたｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。すなわち、Ａｆｌ  ＩＩＩ−Ｓａｐ  Ｉ部位に合成したｔＨＰ（ｔＨＰ：ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  （Ｇｅｎｅ，１９９４，１４５：１４５））を含む断片を、Ｓａｐ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｖ部位にｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＰ−ｌａｃ（ｌａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｏｐｅｒａｔｏｒ）を含む断片を、ＥｃｏＲ  Ｖ−Ｘｈｏ  Ｉ部位に合成したｌｏｘＰ及びｌｏｘ５１７１を含む断片を、Ｘｈｏ  Ｉ−Ｐｖｕ  ＩＩ部位にＰＣＲ法で増幅したＧａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）のＸｈｏ  Ｉ−Ｐｖｕ  ＩＩ断片［ｃｃｄＢを含む断片］を、Ｐｖｕ  ＩＩ−  Ｐｖｕ  ＩＩ部位に合成した６×Ｈｉｓ、Ｅ−ｔａｇ、Ａｍｂｅｒ  ＳＴＯＰ  ７９、及びｇ３タンパク質を含む断片をそれぞれ挿入し、ＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ２を作製した（図１）。また、発現効率を上げるために、上記ＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ２のＥｃｏＲ  Ｖ−Ｘｈｏ  Ｉ部位に合成したｌｏｘＰ、ｒｒｎＢ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、及びｌｏｘ５１７１を含む断片を、Ｐｖｕ  ＩＩ−  Ｐｖｕ  ＩＩ部位に合成した６×Ｈｉｓ、Ｅ−ｔａｇ、アンバー翻訳終了コドン（Ａｍｂｅｒ  ＳＴＯＰ  ｃｏｄｏｎ）、ｇ３タンパク質、ｔＴｒｐ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、及びＰｕｒｏ−Ｒ（ｐｕｒｏｍｙｓｉｎ  耐性遺伝子）  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｎｉｔを含む断片を挿入し、ＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ３を作製した（図２）。
【００４９】
＜実施例２：ＶＬベクターの作製＞
ＶＬベクターの作製においても、基本ベクターとしてＡｍｐ−Ｒ部分に変異導入を加えたｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。すなわち、Ａｆｌ  ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位に合成したｔＨＰ及びｌｏｘＰを含む断片を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位にＰＣＲ法で増幅したＢＡＣ（ＳＩＭ２遺伝子を含む）由来のＣｈｌｏｒｍａｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子（ＳＤ配列部位は改変してある）断片［ｅＣＡＴ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｌｅｓｓ）を含む断片］を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｆｉ  ＩにＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｆｉ  Ｉ部位にｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｆｉ  Ｉ断片［ｇ３シグナル配列を含む断片］を、Ｓｆｉ  Ｉ−Ｓａｌ  Ｉ部位にＰＣＲ法で増幅したＧａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍのＳｆｉ  Ｉ−Ｓａｌ  Ｉ断片［ｃｃｄＢを含む断片］を、Ｓａｌ  Ｉ−Ｎｄｅ  Ｉ部位に合成したｌｏｘ５１７１を含む断片を、Ｎｄｅ  Ｉ−Ｐｖｕ  Ｉ部位にｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＮｄｅ  Ｉ−Ｐｖｕ  Ｉ断片をそれぞれ挿入し、ＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２を作製した（図３）。また、以下の実施例においてＶＨベクターとＶＬベクターとが大腸菌に組み込まれているか否かを確認するために、上記ＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２のＰｖｕ  Ｉ／ＢｓｐＥ  Ｉ−Ａｆｌ  ＩＩＩ部位をｐＥＴ２４ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮＥ社製）のＫａｎ−Ｒを含むＢｓｐＥ  Ｉ−Ａｆｌ  ＩＩＩ断片に置換したＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２Ｋを作製した（図４）。
【００５０】
＜実施例３：ＶＨライブラリーの作製＞
ヒト脾臓ｃＤＮＡ又はヒト白血球ｃＤＮＡを鋳型としてイムノグロブリン（抗体）遺伝子をＶＨ・ＶＬ領域（図５）を別個に増幅し、その際、生体内にないレパートリーを合成するため、抗原認識部位（超可変領域３：ＣＤＲ３）のシャッフリングを行った。ヒト末梢血ｃＤＮＡ及びヒト脾臓ｃＤＮＡを鋳型にして、以下のプライマーの組み合わせでＶＨ遺伝子断片の増幅をＰＣＲで行った。
【００５１】
ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む遺伝子断片（約２５０ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号１１〜１７に示される＜ＶＨ−Ｆｏｒｗａｒｄ１＞、及び配列番号１８又は１９に示される＜ＶＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ２＞を用い、ＣＤＲ３領域を含む遺伝子断片（１００ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号２０又は２１に示される＜ＶＨ−Ｆｏｒｗａｒｄ２＞、及び配列番号２２〜２７に示される＜ＶＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１＞を用いてＰＣＲを行い、約２５０ｂｐの遺伝子断片１４種類と、１００ｂｐの遺伝子断片１２種類を作製した。なお、ＰＣＲ反応は、９４℃２分間後、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃３０秒間というサイクルを３０サイクル行った。上記ＰＣＲにより得られた各増幅断片を個々にアガロースゲル電気泳動し、ゲルから切り出してＤＮＡ断片を精製した。
【００５２】
配列番号２０を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＨ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プールを作製した。配列番号２１を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＨ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プールを作製した。配列番号１８を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＨ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プールを作製した。配列番号１９を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＨ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プールを作製した。
【００５３】
上記ＶＨ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プールとＶＨ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プール、ＶＨ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プールとＶＨ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プールをそれぞれ混合し、ＶＨ１プール及びＶＨ２プールを作製した。かかるＶＨ１プール又はＶＨ２プールを鋳型とし、プライマー対＜ＶＨ−Ｆｏｒｗａｒｄ１＞と＜ＶＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１＞（７×６＝４２通り）で完全長ＶＨ遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅し、８４種類（４２種類×２種類のプール）の増幅産物を個々にアガロースゲル電気泳動し、ゲルから切り出して精製した。なお、ＰＣＲ反応は、プライマーをいれないで９４℃２分間の後、９４℃１分間、６３℃４分間というサイクルを７サイクル行った後プライマーを添加し、９４℃１分間、５５℃３０秒間、７２℃１分間というサイクルを１０サイクル行い、その後、９４℃１５秒間、６０℃３０秒間、７２℃４５秒間というサイクルを１０サイクル行い、７２℃で７分間伸長させた。
【００５４】
上記精製した完全長ＶＨ遺伝子断片を混合した後、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで二重消化し、実施例１で作製したＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ２（図１）又はｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ３（図２）でＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで二重消化し挿入・連結した。かかるＶＨベクターを大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ又はＸＬ２−Ｂｌｕｅ）に遺伝子導入し、１％のグルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有した寒天培地でコロニーを形成させ、ＶＨライブラリー（１０６個以上）を作製した。かかるＶＨライブラリーを１０％のグリセロールにより回収し、−８０℃で凍結保存した。
【００５５】
＜実施例４：ＶＬライブラリーの作製＞
次に、ＶＬライブラリーを作製するために、実施例３の方法と同様にＶκ遺伝子断片を作製した。ヒト脾臓ｃＤＮＡ又はヒト白血球ｃＤＮＡを鋳型にして、ＶκのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む遺伝子断片（約２５０ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号２８〜３１に示される＜Ｖｋａｐｐａ−Ｆｏｒｗａｒｄ１＞、及び配列番号３２又は３３に示される＜Ｖｋａｐｐａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ２＞を用い、ＶκのＣＤＲ３領域を含む遺伝子断片（１００ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号３４又は３５に示される＜Ｖｋａｐｐａ−Ｆｏｒｗａｒｄ２＞、及び配列番号３６〜３９に示される＜Ｖｋａｐｐａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１＞を用いてＰＣＲを行い、約２５０ｂｐの遺伝子断片８種類と、１００ｂｐの遺伝子断片８種類を作製した。なお、ＰＣＲ反応は、９４℃２分間後、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃３０秒間というサイクルを３０サイクル行った。上記ＰＣＲにより得られた各増幅断片を個々にアガロースゲル電気泳動し、ゲルから切り出してＤＮＡ断片を精製した。
【００５６】
配列番号３４を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＫ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プールを作製した。配列番号３５を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＫ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プールを作製した。配列番号３２を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＫ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プールを作製した。配列番号３３を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＫ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プールを作製した。
【００５７】
上記ＶＫ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プールとＶＫ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プール、ＶＫ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プールとＶＫ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プールをそれぞれ混合し、Ｖκ１プール及びＶκ２プールを作製した。かかるＶκ１プール又はＶκ２プールを鋳型とし、プライマー対＜Ｖｋａｐｐａ−Ｆｏｒｗａｒｄ１＞と＜Ｖｋａｐｐａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１＞（４×４＝１６通り）で完全長ＶＨ遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅し、３２種類（１６種類×２種類のプール）の増幅産物を個々にアガロースゲル電気泳動し、ゲルから切り出して精製した。
【００５８】
また、実施例３の方法と同様にＶλ遺伝子断片を作製した。ヒト脾臓ｃＤＮＡ又はヒト白血球ｃＤＮＡを鋳型にして、ＶλのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む遺伝子断片（約２５０ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号４０〜４８に示される＜Ｖｌａｍｂｄａ−Ｆｏｒｗａｒｄ１＞、及び配列番号４９〜５２に示される＜Ｖｌａｍｂｄａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ２＞を用い、ＶλのＣＤＲ３領域を含む遺伝子断片（１００ｂｐ）を増幅するためのプライマーとして、配列番号５３〜５６に示される＜Ｖｌａｍｂｄａ−Ｆｏｒｗａｒｄ２＞、及び配列番号５７又は５８に示される＜Ｖｌａｍｂｄａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１＞を用いてＰＣＲを行い、約２５０ｂｐの遺伝子断片３６種類と、１００ｂｐの遺伝子断片８種類を作製した。なお、ＰＣＲ反応は、９４℃２分間後、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃３０秒間というサイクルを３０サイクル行った。上記ＰＣＲにより得られた各増幅断片を個々にアガロースゲル電気泳動し、ゲルから切り出してＤＮＡ断片を精製した。
【００５９】
配列番号５３を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プールを作製した。配列番号５４を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プールを作製した。配列番号５５を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ３プールを作製した。配列番号５６を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ４プールを作製した。配列番号４９を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プールを作製した。配列番号５０を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プールを作製した。配列番号５１を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ３プールを作製した。配列番号５２を用いてＰＣＲを行った精製ＤＮＡ断片をそれぞれ混合しＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ４プールを作製した。
【００６０】
上記ＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ１プールとＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ１プール、ＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ２プールとＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ２プール、ＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ３プールとＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ３プール、ＶＬ（ＦＷＲ３）Ｆｏｒ４プールとＶＬ（ＦＷＲ３）Ｂａｃｋ４プールをそれぞれ混合し、Ｖλ１プール、Ｖλ２プール、Ｖλ３プール、Ｖλ４プールを作製した。かかるＶλ１プール、Ｖλ２プール、Ｖλ３プール、又はＶλ４プールを鋳型とし、プライマー対＜Ｖｌａｍｂｄａ−Ｆｏｒｗａｒｄ１＞と＜Ｖｌａｍｂｄａ−Ｒｅｖｅｒｓｅ１＞（９×２＝１８通り）で完全長ＶＨ遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅し、７２種類（１８種類×４種類のプール）の増幅産物を個々にアガロースゲル電気泳動し、ゲルから切り出して精製した。なお、ＰＣＲ反応は、プライマーをいれないで９４℃２分間の後、９４℃１分間、６３℃４分間というサイクルを７サイクル行った後プライマーを添加し、９４℃１分間、５５℃３０秒間、７２℃１分間というサイクルを１０サイクル行い、その後、９４℃１５秒間、６０℃３０秒間、７２℃４５秒間というサイクルを１０サイクル行い、７２℃で７分間伸長させた。
【００６１】
上記作製した完全長Ｖκ及びＶλ遺伝子断片を混合した後、制限酵素ＮｃｏＩ及びＳａｌＩで二重消化し、実施例２で作製したＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２（図３）又はｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２Ｋ（図４）をＮｃｏＩ及びＳａｌＩで二重消化し挿入・連結した。かかるＶＨベクターを大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ又はＸＬ２−Ｂｌｕｅ）に遺伝子導入し、１％のグルコースと、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン又は５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有した寒天培地でコロニーを形成させ、ＶＬライブラリー（１０５以上）を作製した。かかるＶＬライブラリーを１０％のグリセロールにより回収し、−８０℃で凍結保存した。
【００６２】
＜実施例５：一本鎖抗体ライブラリーの作製＞
実施例３で作製したＶＨの大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２５ｍＬ培地に植菌し、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を多重感染力価（ＭＯＩ）１０で感染させ一晩培養した後ファージに変換し、培養上清を調製し上清中のファージ感染力価を測定した。同様に実施例４で作製したｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２Ｋ由来のＶＬファージを用いて５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２５ｍＬ培地に植菌し、ファージに変換した。得られたＶＨおよびＶＬファージをＭＯＩ＝１０で組換え用大腸菌（Ｃｒｅ１０Ｆ：自家製）を含む２５ｍＬの培地中で共感染させ、一時間後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを加え一晩培養し、組換え酵素によるＶＨ・ＶＬベクター間の組換えを起こさせた（図７）。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１Ｌの新しい培地に一晩培養液全量を加え、さらにヘルパーファージＶＣＳＭ１３をＭＯＩ＝１０で感染させ一晩培養し、上清中に組換えファージを得、ファージ力価を測定した。その後、組換えファージを８Ｌ培養液中の大腸菌（ＸＬ１Ｂｌｕｅ）にＭＯＩ＝０．５で感染させ、一時間３７℃で培養後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび抗体ファージ融合タンパクの発現を誘導するためのＩＰＴＧを１ｍＭ、およびヘルパーファージＶＣＳＭ１３（ＭＯＩ＝１０）を加えてさらに３７℃で培養した。一時間後、ＶＣＳＭ１３感染菌（ファージ産生菌）の選別のための５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと、組換え抗体発現菌の選別のための１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを加え、培養温度を３０℃に下げ一晩培養し、培養上清を回収した。上清に１／６量の２．５ＭのＮａＣｌ及び３０％のＰＥＧ６０００を含む溶液を加え、抗体提示ファージを沈殿させ遠心により回収した。沈殿したファージはＳＭ培地に懸濁し、ＤＭＳＯを７％になるように加え、−８０℃で凍結保存した。
【００６３】
＜実施例６：変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応する一本鎖抗体のスクリーニング＞
本願発明者らは、ヒト遺伝子の変異情報を体系的にデータベース化して構築したソフトウェア−Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｖｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｍｕｔｖｉｅｗ．ｄｍｂ．ｍｅｄ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ）を用いて、ヒトの浸潤性胃ガン細胞株（ＨＳＣ４５−Ｍ２：ｓｉｇｎｅｔ  ｒｉｎｇ−ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ）で見出されているＥ−カドヘリン遺伝子の変異を解析した。その結果、ｄｉｆｆｕｓｅ−ｔｙｐｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａに分類される胃癌は、浸潤性のもの（転移などを起こし、悪性のもの）に限ると半分近くがＥ−カドヘリン遺伝子のスプライシング異常のあることがわかった。また、このスプライシング異常のほとんどがエクソン８あるいはエクソン９の欠損であることもわかった。
【００６４】
そこで、本願発明者らは、エクソン９が欠損した変異型Ｅ−カドヘリン遺伝子に着目し、この変異型Ｅ−カドヘリン遺伝子にコードされる変異型Ｅ−カドヘリンを特異的に認識する一本鎖抗体を作製することを試みた。なお、抗原としては、エクソン８とエクソン１０との結合部における１３アミノ酸（ＰＩＦＮＰＴＴＧＬＤＦＥＡ：配列番号５９）を用いた（図８）。この配列は正常型Ｅ−カドヘリンに存在しないため、得られる抗体は癌細胞特異的であることが予想された。また、抗原性を増大させるために変異型Ｅ−カドヘリンペプチドをＭＡＰレジンに結合して抗原として用いた（図９）。
【００６５】
以下、この抗原を用いた一本鎖抗体のスクリーニング手順（パニング）についてのフローを述べることとする。
（１）抗原をイムノチューブに４℃で一晩吸着させた。
（２）ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、２％  スキムミルク／ＴＢＳを用いてブロッキングを室温で３時間行った。
（３）ＰＢＳ（−）で３回洗浄して、実施例１〜５により作製した一本鎖抗体ライブラリーを加え、室温で３時間反応させた。
（４）ＰＢＳ（−）−０．０５％  ｔｗｅｅｎで１０回洗浄して、非特異的に結合しているファージを除いた。１００ｍＭ  トリエチルアミンを１ｍｌ加え、１０分間よく回転させて吸着しているファージをはがした。
（５）ファージ溶液に直ぐに１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を０．５ｍｌ加えて中和した。
（６）ファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに３７℃で３０分間感染させた。アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加後、吸光度がＯＤ６００＝０．８になるまで培養した。
（７）ヘルパーファージを加え３７℃で３０分間感染させた。その後、カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、３７℃で一晩振とう培養した。
（８）遠心チューブに移し、２０分間遠心し（４℃、８０００ｒｐｍ）、培地と沈殿物に分けた。
（９）培地に３０％  ＰＥＧ６０００／１．６Ｍ  ＮａＣｌを１／４量加えてミキシングを行い、２時間氷中に置き、ファージを塩析した。
（１０）３０分間遠心し（４℃、１５０００ｒｐｍ）、上清と沈殿物に分けた。
（１１）沈殿をＳＭ培地で溶解した。
（１２）上記溶解ファージを１回パニング操作が終了したライブラリーとして用い、（３）からのパニング操作をさらに４回繰り返した。なお、４回目のパニング操作では、ブロッキング剤として２％  スキムミルクの代わりに３％  ＢＳＡを用いることにより、スキムミルクに結合するファージを除去し、確実に目的とする抗原に吸着する一本鎖抗体だけを選択するようにした。
（１３）５回目のパンニング操作の（６）のステップで、ファージ感染大腸菌をＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン入り）に塗布し、３７℃で一晩培養した。
（１４）形成されたコロニーをランダムに５０個選択し、クローン１から５０の番号を付け、それぞれのクローンをＬＢ培地３ｍｌ用いて３７℃で培養を行った。
（１５）ヘルパーファージ、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、３７℃一晩培養を行った。
（１６）それぞれの培養液を遠心し（１５０００ｒｐｍ，４℃）、その上清を使用して以下のＥＬＩＳＡを行った。
（１７）９６穴ＥＬＩＳＡプレートに変異型Ｅ−カドヘリンペプチドを吸着させた。
（１８）オブアルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）を用いたブロッキングを３７℃２時間行った。
（１９）ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で３回洗浄し、（１６）で得られた上清を一次抗体として加え、３７℃で１時間半反応させた。
（２０）ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で５回洗浄し、二次抗体として、マウス抗Ｍ１３ファージ抗体を加え、３７℃で１時間半反応させた。
（２１）ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で５回洗浄し、三次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体／ＡＰ（アルカリフォスファターゼ）を加え、３７℃で１時間半反応させた。
（２２）ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で５回洗浄後、ｐ−ニトロフェニルフォスフェートを加え、４１５ｎｍで吸光度の測定を行った。
【００６６】
クローンごとに測定した吸光度をグラフ化したところ（図１０）、多数のファージで高い反応が見られ、変異型Ｅ−カドヘリンに反応すると思われるファージの存在が確認された。
【００６７】
＜実施例７：一本鎖抗体のＤＮＡを保持しているクローンの選択＞
実施例６により変異型Ｅ−カドヘリンに反応すると思われるファージ（ファージクローン２，１０，１５，４２，４９）において、実際に組み込んだ一本鎖抗体のＤＮＡを保持しているかどうかについて、コロニーＰＣＲを行った。その結果、一本鎖抗体のＤＮＡのサイズに相当する約８３０ｂｐ前後に単一バンドが検出された。
【００６８】
なお、ＰＣＲ反応は、プライマー（５’−ＣＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＣＣ−３’（配列番号６０）および５’−ＡＣＧＣＧＧＴＴＣＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＡ−３’（配列番号６１））１μＭおよびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、反応時間は（９４℃１０分）→（９４℃４５秒−５５℃４５秒−７２℃１分：１０サイクル）→（９４℃３０秒−６０℃４５秒−７２℃１分：２０サイクル）→７２℃７分行った。
【００６９】
＜実施例８：ファージクローンの抗原に対する親和性および特異性＞
ファージクローンの抗原に対する親和性および特異性を調べるために、上記５種類のファージクローンと、変異型Ｅ−カドヘリンペプチドまたはスキムミルクとを用いてＥＬＩＳＡを行った。以下に手順を示す。
【００７０】
（１）９６穴ＥＬＩＳＡプレートに変異型Ｅ−カドヘリンペプチドまたは２％スキムミルク／ＴＢＳを吸着させた。
（２）オブアルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）を用いたブロッキングを３７℃で２時間行った。
（３）ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で３回洗浄し、１ｗｅｌｌあたり１０１１個となるように一次抗体としての各ファージクローンを加え、３７℃で１時間半反応させた。
（４）ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で５回洗浄後、二次抗体としてマウス抗Ｍ１３ファージ／ＨＲＰ（西洋わさびパーオキシダーゼ）抗体を加え、３７℃で１時間半反応させた。
（５）ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で５回洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、４５０ｎｍで吸光度の測定を行った。
【００７１】
その結果、どのクローンもスキムミルクに比べ、変異型Ｅ−カドヘリンペプチドに対して高い反応を示したが、クローン１０は特に高い反応を示した（図１１）。また、クローン４２、４９においても１ｗｅｌｌあたりのファージ数を増加させると、変異型Ｅ−カドヘリンペプチドに対する結合能は増加した。
【００７２】
＜実施例９：ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の決定＞
上記５種類のファージクローン（ファージクローン２，１０，１５，４２，４９）についてＤＮＡ配列を解析したところ、全てのクローンにおいて、完全長一本鎖抗体のＤＮＡ配列を保持していた。ファージクローン１０、２、１５、４２、及び４９から得られた一本鎖抗体のＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号６〜１０に示す。また、上記ＤＮＡ配列をもとにアミノ酸配列を決定した。ファージクローン１０、２、１５、４２、及び４９から得られた一本鎖抗体のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１〜５に示す。
【００７３】
＜実施例１０：一本鎖抗体の単離＞
実施例８により抗原に対して最も高い反応性を示したファージクローン１０から一本鎖抗体の精製を試みた。以下にその手順を示す。
（１）アンバーストップコドンを読むことのできないアンバーサプレッサーマイナスの遺伝子型をもつ大腸菌ＨＢ２１５１を培養した。
（２）大腸菌ＨＢ２１５１にファージクローン１０を３７℃で３０分間感染させた。
（３）ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン入り）に塗布し、３７℃で一晩培養した。
（４）コロニーをＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン入り）に移し、３７℃で一晩培養した。
（５）上記大腸菌３ｍｌを３００ｍｌのＬＢ培地に加え、吸光度がＯＤ６００＝１．０になるまで培養した。
（６）ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、３０℃で３時間培養した。
（７）３０分間遠心（７０００ｒｐｍ，４℃）し、沈殿（大腸菌）と上清（培地）に分けた。
（８）沈殿画分に回収された大腸菌の菌膜をソニケーターで破砕し２０分間遠心（１５０００ｒｐｍ，４℃）を行うことにより可溶性画分と不溶性画分（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｂｏｄｙ）に分けた。
（９）大腸菌の不溶性画分を回収した。
（１０）不溶性画分にＩｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  ｃｈｅｍ．ｃｏ．ｌｔｄ）を添加し、溶解させた。
（１１）２０分間遠心（１５０００，４℃）し、沈殿と上清に分けた。
（１２）上清にジチオトレイトール（最終濃度５ｍＭ）を添加し、以下の透析を行った。
１回目：６Ｍ  尿素／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ６時間
２回目：４Ｍ  尿素／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ６時間
３回目：２Ｍ  尿素／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ６時間
４回目：２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ＋１３５ｍＭ  ＮａＣｌ  １２時間
５回目：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ＋１３５ｍＭ  ＮａＣｌ  １２時間
（１３）２０分間遠心（１５０００ｒｐｍ，４℃）を行い、上清を回収した。
（１４）Ｎｉ２＋−ＡＴＡカラムに通して、１０ｍＭ  イミダゾール溶液（１０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ）にて洗浄し、その後、４０ｍＭ  イミダゾール溶液（４０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ）を用いて溶出をした。  （１５）ポリアクリルアミド電気泳動を行った。
【００７４】
その結果、可溶化し再生操作を行った一本鎖抗体は、Ｎｉ２＋−ＡＴＡカラムから４０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌを用いて溶出された。
【００７５】
この精製した一本鎖抗体が、変異型Ｅ−カドヘリンに対して反応性を示すかどうかを確認するためにＥＬＩＳＡを行った。以下その手順を示す。
【００７６】
（１）９６穴ＥＬＩＳＡプレートに変異型Ｅ−カドヘリンペプチド、３％牛血清アルブミン／ＴＢＳ、２％スキムミルク／ＴＢＳを吸着させた。
（２）オブアルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）によるブロッキングを３７℃２時間行った。
（３）ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で３回洗浄し、精製した一本鎖抗体（１００倍希釈）を一次抗体として加え、３７℃で１時間半反応させた。
（４）ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で５回洗浄し、二次抗体として、マウス抗Ｅ−ｔａｇ抗体を加え、３７℃で１時間半反応させた。
（５）ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で５回洗浄し、三次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体／ＨＲＰを加え、３７℃で１時間半反応させた。
（６）ＴＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で５回洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、４５０ｎｍで吸光度の測定を行った。
【００７７】
その結果、変異型Ｅ−カドヘリンペプチドを抗原に使用したとき、ＢＳＡあるいはスキムミルクを用いたときに比べ、高い結合が見られ、精製した一本鎖抗体は変異型Ｅ−カドヘリンペプチドに対し高い親和性を示すことが明らかになった（図１２）。
【００７８】
なお、（７）の沈殿（大腸菌）及び上清（培地）、（８）の可溶性画分と不溶性画分をＬａｅｍｍｌｉ変法によるＳＤＳ−Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒに溶解し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇにより発現確認を行った結果、培地中にも一本鎖抗体が存在することが確認された（図１３）。
【００７９】
【発明の効果】
以上のように、本発明によると、遺伝子操作により変異を入れたり、他のタンパク質を融合させたりすることが容易にでき、抗原との親和性、抗原特異性、安定性および応用性が高い、変異型Ｅ−カドヘリンに特異的に反応するヒト型一本鎖抗体、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらの利用方法を提供することができる。
【００８０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態において、ＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ２の構造を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態において、ＶＨベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＨ３の構造を示す図である。
【図３】本発明の実施の形態において、ＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２の構造を示す図である。
【図４】本発明の実施の形態において、ＶＬベクターｐＳＡＢｃｃＢ−ＶＬ２Ｋの構造を示す図である。
【図５】本発明の実施の形態において、一本鎖抗体の構造を示す図である。
【図６】本発明の実施の形態において、免疫グロブリンの可変領域（Ａ）、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の領域を含む断片（Ｂ）、ＣＤＲ３の領域を含む断片（Ｃ）の構造を示す図である。
【図７】本発明の実施の形態において、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーとのシャッフリングによる一本鎖抗体発現ベクターの作製のイメージを示す図である。
【図８】本発明の実施の形態において、正常型Ｅ−カドヘリンの一部の構造（上）と、変異型Ｅ−カドヘリンの部分ペプチドの構造（下）とを示す図である。
【図９】本発明の実施の形態において、変異型Ｅ−カドヘリンペプチドをＭＡＰレジンに結合させた抗原の構造を示す図である。
【図１０】本発明の実施例６において、変異型Ｅ−カドヘリンの部分ペプチドに対する各ファージクローンの反応性をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例８において、変異型Ｅ−カドヘリンに反応すると思われるファージ（ファージクローン２，１０，１５，４２，４９）の抗原に対する親和性および特異性をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例１０において、ファージクローン１０から精製した一本鎖抗体の変異型Ｅ−カドヘリンに対する反応性をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
【図１３】本発明の実施例１０において、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇにより発現確認を行った結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2004254572.tif 000052
【図１０】
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【図１１】
2004254572.tif 000054
【図１２】
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【図１３】
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