(57)【要約】【課題】血管新生阻害作用を有する物質の提供【解決手段】ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）に属する植物から抽出した成分からなることを特徴とする血管新生阻害用組成物。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）に属する植物から抽出した成分からなることを特徴とする血管新生阻害用組成物。
【請求項２】
ミカン属に属する植物が、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）であることを特徴とする請求項１記載の血管新生阻害用組成物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の血管新生阻害用組成物を含むことを特徴とする抗リウマチ用組成物。
【請求項４】
キャッツクロー（Ｕｎｃａｒｉａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、ヤナギ樹皮（Ｓａｌｉｘ  ｓｐｐ．）、アスピリン、サリチル酸、インドメタシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、エテンザミド、イソプロピルアンチピリン、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、コラーゲンあるいはそのペプチドから選ばれる少なくとも１つ以上を添加したことを特徴とする請求項３記載の抗リウマチ用組成物。
【請求項５】
請求項１又は２記載の血管新生阻害用成分を含むことを特徴とする抗腫瘍用組成物。
【請求項６】
アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）、メシマコブ（Ｐｅｌｌｉｎｕｓ  ｙｕｃａｔｅｎｓｉｓ）、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓｅ）、プロポリス、ビタミンＥ、βカロチン、カテキン類から選ばれる少なくとも１つ以上添加したことを特徴とする請求項４記載の抗腫瘍組成物。
【請求項７】
血管内皮細胞の増殖、遊走、又は血管の新生に起因する疾患の予防または治療用である請求項１又は請求項２記載の血管新生阻害用組成物。
【請求項８】
血管内皮細胞の増殖、遊走、又は血管の新生に起因する疾患が糖尿病性網膜症、動脈硬化症、歯周病、強皮症、乾癬、加齢黄斑変性症、皮膚疾患、緑内障または炎症であることを特徴とする請求項７記載の血管新生阻害用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ミカン属に属する植物から抽出した成分を有効成分とする血管新生阻害用組成物に関する。また、その血管新生阻害用組成物を利用した抗リウマチ用組成物、抗腫瘍組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血管新生とは元々ある血管から新しい血管が形成されることを指す。血管形成を指す用語として脈管形成があるが、脈管形成は胚形成期の初期の段階にみられる最初の血管形成の過程を指し、既存の血管から発生するものではなく中胚葉性の胎生細胞である血管芽細胞の分化によって発生するものである。
これに対して、血管新生は成人の正常な人体にみられる生理的な現象や、特定の疾患にみられる「新しい血管が形成されるプロセス」である。血管新生には、種々の分子や細胞のメカニズムによる、複雑なプロセスがあって、解剖学的にいうと、血管は、典型的な血管の外包膜（基底膜と呼ばれ主にコラーゲン繊維で構成されている）の内側にある内皮細胞（血管の主な細胞構成要素）がひとつの層をなしている。血管内には赤血球や炎症細胞（白血球）、さらにさまざまな可溶性の栄養が循環している。
【０００３】
血管は、外傷などにより損傷を受けると、新しく血管を形成することによって修復される。したがって、血管新生自体は、生体維持には必要不可欠である。血管新生の形成は血管新生因子（ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子やｂＦＧＦ：塩基性繊維芽細胞増殖因子等）によって血管新生のスイッチがオンにされるとプロテアーゼ（プラスミノーゲンやマトリックスメタロプロテアーゼ等）によって基底膜の消化が起き、そこに内皮細胞が遊走・定着・増殖し、増殖した内皮細胞が管腔を形成し、最終的に毛細管網を形成することによって完了する。
【０００４】
血管新生のプロセスを概略すると次のような例が挙げられる。
（１）ステップ１
酸欠などの低酸素状態の間、血管の形成を促進する血管新生促進因子（成長因子、サイトカイン）が最寄りの血管にそのシグナルを送る。
（２）ステップ２
血管新生のプロセスでそのシグナルの発生源に向かって炎症細胞が血管外遊走して移動する最初の細胞現象がここでみられる。さらに血管新生促進因子が分泌されて炎症細胞がシグナル発生源に向かって増殖してゆく。
（３）ステップ３
内皮細胞の反応により、血管の基底膜を形成するコラーゲン繊維を消化するマトリクスメタロプロテナーゼという特別な酵素の分泌が促進される。増殖する内皮細胞がシグナル発生源に向かって移動し、ブリーチを形成する。
（４）ステップ４
このブリーチに沿って内皮細胞が細胞外マトリクスを作り、その細胞外マトリクスと基底膜とで構成された、機能的な新しい血管を完成させる。
【０００５】
このような血管新生が生体にとって不適切になされると、身体の障害の発生や病気の原因となると考えられており、血管新生の制御に関心が大きくなっている。腫瘍化した組織においてこの血管新生のプロセスが進むと、腫瘍に新生血管を形成させ、腫瘍のさらなる成長を促してしまうのである。専門雑誌のメディカルレポートで、ガンやリウマチ様関節炎に血管新生の関連が報告されており、現在血管新生依存症疾患として、固形腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、歯周病、強皮症、緑内障、尋常性乾癬、加齢黄斑変性症、皮膚疾患等、多数の疾病が確認されている。
【０００６】
現在、上記列挙した疾病の予防や治療のために、血管新生を阻害する物質の探索研究が活発に推進されている。
例えば、これまで見出されてきた薬剤には、内皮細胞の増殖阻害を示す微生物代謝産物のフマギリン類縁体、コラゲナーゼ活性阻害作用を有するテトラサイクリン系抗生物質、ヘパリン結合性血管新生因子の受容体への結合抑制作用を有する微生物由来Ｄ−グルコ−ガラクタン硫酸等が知られている。また、既に広く用いられているアスピリン等の非ステロイド抗炎症剤が腫瘍発生のリスクを軽減することが知られていたが、その作用がインテグリンを介した内皮細胞の拡散と移動に関与し、繊維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）による血管新生誘導を阻害することが最近新たに解明された（非特許文献１：Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２００１，  Ｖｏｌ７，１０４１−１０４７）。しかし、こうした薬剤候補もヒト臨床試験において効果が認められなかったり、副作用により実用化が難しいと言った諸問題を抱えているのも事実である。
【０００７】
特開２００３−９６０７８号公報（特許文献１）には、  血管内皮細胞の走化性を阻害することにより血管新生阻害活性、抗腫瘍活性、及び転移抑制活性を発揮する新規化合物として、次の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、及び該化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む血管新生阻害剤や抗腫瘍剤などの医薬が提案されている。
【化１】
2004331567.tif 000002
【０００８】
特開２００３−３８１８８号公報（特許文献２）には、  血管新生阻害活性を有し、抗癌剤、リウマチ性関節炎、及び網膜症治療剤等として有用な新規ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離・同定し、前記ポリペプチドの簡便な生産系を構築し、組換えタンパク質を提供するために、新規のＡＤＡＭＴＳポリペプチドであるとして、「  配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２４５番〜第１１１７番のアミノ酸配列を含み、しかも、血管新生阻害活性を有するポリペプチド、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２４５番〜第１１１７番のアミノ酸配列の１又は数個の箇所において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、血管新生阻害活性を有するポリペプチド」を提案している。
【０００９】
特開２００２−３０８７７７号公報（特許文献３）には、血管新生阻害作用を有する組成物として、「エルゴステロールとサイクロデキストリンを含有しており、エルゴステロールが椎茸、ヒラタケ、ナメコ、マイタケ、エノキタケ、ブナシメジ、ハタケシメジ、アガリクス茸、メシマコブ茸、マンネン茸（霊芝）、松茸、カワラ茸およびチヨレイマイ茸よりなる群から選ばれた少なくとも１種の茸に由来するものであって、サイクロデキストリンがβ−サイクロデキストリン、マルトシル−β−サイクロデキストリンまたはこれらを含む混合物」が提案されている。
【００１０】
特開２００１−３３５５７５号公報（特許文献４）には、ＭＭＰ酵素阻害剤は、癌や炎症性疾患の治療または予防に用いられる血管新生阻害剤、制癌剤、癌浸潤抑制剤、癌転移抑制剤；慢性関節リウマチ、変形性関節症やリウマチ様関節炎などの関節炎の治療・予防剤；歯肉炎、糸球体腎炎、間質性腎炎、脳脊髄炎、動脈硬化、肝硬変、血管再閉塞・再狭窄、糖尿病性網膜症、血管新生性緑内障、角膜潰瘍、表皮水泡症、椎間板ヘルニア、骨粗鬆症等の骨吸収疾患、多発性硬化症、気管支喘息、アルツハイマー型痴呆症、自己免疫疾患（クローン病、シェグレン病等）などの各種疾患の治療・予防剤として、ニトロエテンアミン誘導体またはその塩、ならびにそれらを含有する医薬組成物が提案されている。
【００１１】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２００１，  Ｖｏｌ７，１０４１−１０４７
【特許文献１】特開２００３−９６０７８号公報
【特許文献２】特開２００３−３８１８８号公報
【特許文献３】特開２００２−３０８７７７号公報
【特許文献４】特開２００１−３３５５７５号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、このような様々な病気や症状の原因となる血管新生を抑制する新規な血管新生阻害用組成物を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記諸目的を解決すべく鋭意検討した結果、ミカン属であるウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）がヒト血管内皮細胞の増殖を特異的に抑制し管腔形成を阻害する作用を見出し、血管新生阻害用組成物として極めて有用であるという知見から本発明を完成するに至った。
すなわち、ここで提案する解決手段は、次の構成をとる。
１．ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）に属する植物から抽出した成分からなることを特徴とする血管新生阻害用組成物。
２．ミカン属に属する植物が、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）であることを特徴とする上記１．記載の血管新生阻害用組成物。
３．上記１．又は２．記載の血管新生阻害用組成物を含むことを特徴とする抗リウマチ用組成物。
４．キャッツクロー（Ｕｎｃａｒｉａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、ヤナギ樹皮（Ｓａｌｉｘ  ｓｐｐ．）、アスピリン、サリチル酸、インドメタシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、エテンザミド、イソプロピルアンチピリン、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、コラーゲンあるいはそのペプチドから選ばれる少なくとも１つ以上を添加したことを特徴とする上記３．記載の抗リウマチ用組成物。
５．上記１．又は２．記載の血管新生阻害用成分を含むことを特徴とする抗腫瘍用組成物。
６．アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）、メシマコブ（Ｐｅｌｌｉｎｕｓ  ｙｕｃａｔｅｎｓｉｓ）、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓｅ）、プロポリス、ビタミンＥ、βカロチン、カテキン類から選ばれる少なくとも１つ以上添加したことを特徴とする上記４．記載の抗腫瘍組成物。
７．血管内皮細胞の増殖、遊走、又は血管の新生に起因する疾患の予防または治療用である上記１．又は２．記載の血管新生阻害用組成物。
８．血管内皮細胞の増殖、遊走、又は血管の新生に起因する疾患が糖尿病性網膜症、動脈硬化症、歯周病、強皮症、乾癬、加齢黄斑変性症、皮膚疾患、緑内障または炎症であることを特徴とする上記７．記載の血管新生阻害用組成物。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の詳細を説明する。
本発明のミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）には、ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）、ライム（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ）、ダイダイ（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ）、ベルガモット（Ｃｉｔｒｕｓ  ｂｅｒｇａｍｉａ）、ブンタン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｒａｎｄｉｓ）、ハッサク（Ｃｉｔｒｕｓ  ｈａｓｓａｋｕ）、イチャング（Ｃｉｔｒａｓ  ｉｃｈａｇｅｎｓｉｓ）、イヨカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｉｙｏ）、ユズ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｊｕｎｏｓ）、キシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｋｉｎｏｋｕｎｉ）、コウジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｅｉｏｃａｒｐａ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）、ブッシュカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｍｅｄｉｃａ）、ナツミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｎａｔｓｕｄａｉｄａｉ）、グレーププルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ）、ポンカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、スイートオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、カボス（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐａ）、スダチ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｕｄａｃｈｉ）、サンポウカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｕｌｃａｔａ）、タチバナ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｔａｃｈｉｂａｎａ）、カラタチ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ）が使用可能である。これら植物は、通常食用として提供されているものでも構わない。
【００１５】
ウンシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）は、中国から渡来し、日本にて改良された品種で、日本の中部、南部の暖地に広く栽培されている常緑低木である。外果皮を秋から冬に採取し、日干しにして摂取する。健胃、風邪、鎮咳等に用いるものである。
ライム（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ）は、熱帯、亜熱帯気候の地で広く栽培され、インド北東部あるいはマレーシア原産で、アラブ諸国、北アフリカを経てヨーロッパ南部に伝えられ、更に仮部会の島々と新大陸に伝播したとされている植物である。果実の酸味と芳香はレモンに似ているが、果形はいくぶん丸くて小さく、枝の刺は大きいが枝は細く葉も小さい。
ダイダイ（Ｃｉｔｒｕｓ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ）は、赤橙色の野球のボール大の果実がなる柑橘類。インドのアッサムを中心とする地域が原産地と言われている。橙の成熟果皮は橙皮と呼ばれ、健胃、消化不良時に用いるものである。
ベルガモット（Ｃｉｔｒｕｓ  ｂｅｒｇａｍｉａ）は、レモンに近い柑橘類で、ダイダイの近縁種。ダイダイとレモンあるいはシトロンとの雑種と考えられている。イタリア南部、シチリア島等が主産地で、同地方では数百年以前から利用されており、ベルガモット油として世界各地に輸出されている。
ブンタン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｒａｎｄｉｓ）は、柑橘類でもっとも大きな果実をつける植物で、別名、ザボン、ボンタン、ウチムラサキ等とも呼ばれている。マレーシア半島からインドネシアが原産と言われている。
【００１６】
ハッサク（Ｃｉｔｒｕｓ  ｈａｓｓａｋｕ）は、ブンタン類縁の柑橘類で樹体の耐寒性も強く、日本では、ウンシュウミカン、ナツミカンに次いで生産されている植物である。主産県は和歌山、愛媛、広島、徳島等である。
イチャング（Ｃｉｔｒａｓ  ｉｃｈａｇｅｎｓｉｓ）は、中国大陸西部から中南部に分布し、耐寒性の強い柑橘類の植物である。花は紫と白のものがある。品種改良の交配親や接木の台木に利用されている。
イヨカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｉｙｏ）は、１〜３月に出荷される赤橙色の果実で独特の風味を持つ柑橘である。１８８６年ころ、現在の日本の山口県萩市で発見されたが、名は育ちの地、伊予にちなんでつけられた。樹高は３〜５ｍで葉は小さく、白色の花を咲かせる。主産地は愛媛県で７割を占め、主に生食されているが、一部果汁原料にされている。
【００１７】
ユズ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｊｕｎｏｓ）は、日本の代表的調味用柑橘類で、原産は中国長江とされているが、現在では日本以外ではほとんど栽培されていない。また、近縁種も多く、スダチ、カボス、ハナユ、キズ、ナオシチ、ジャバラ、キヨオカダイダイ、サンズ、ソボノカオリ等が知られている。日干しにしたユズの果皮は、健胃、発汗、鎮咳去痰及び浴湯料として利用されている。
キシュウミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｋｉｎｏｋｕｎｉ）は、マンダリン群のミカンで、中国原産の常緑広葉樹。日本には室町時代からあり、江戸時代の主要品種であった。ウンシュウミカンが普及するまでは生食用の主要品種であったが、現代はわずかに栽培されているものである。
コウジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｅｉｏｃａｒｐａ）は、日本では古くから栽培されているが、現在ではきわめて少ない小高木。日本在来のタチバナからできた園芸種と考えられる。成熟した果実をとり乾燥させた果皮は健胃、風邪、鎮咳等に用いられている。
レモン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）は、特有の芳香と酸味がある柑橘類で樹勢強く生長は早いが、寒さに弱く、雨の多いところでは病害にも弱い。インド北東部が原産と言われているが、主産国は、イタリア、スペイン、アメリカ、アルゼンチン等である。古くから航海、遠征時のビタミンＣの補給として利用されてきたものである。
【００１８】
ブッシュカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｍｅｄｉｃａ）は、インドヒマラヤ地方原産の常緑低木で、日本へは中国を経て江戸時代初期に渡来し、鑑賞用に栽培されてきた植物である。別名シトロンと言う。果実のエキスには腸管運動の抑制、新機能抑制、血圧降下等の作用があることが知られている。他、健胃、去痰として用いられてきた。
ナツミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｎａｔｓｕｄａｉｄａｉ）は、暖地に広く栽培される雑柑類で常緑低木。山口県長門市青海島の原産で、現在では愛媛県、和歌山県に多産している。生薬の夏皮はナツミカンの未熟果の果皮を日干ししたもので、健胃、香味薬として利用されている。
グレーププルーツ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｐａｒａｄｉｓｉ）は、暖地で栽培される常緑高木で、多汁でやや酸味が強く、さわやかな苦味のある柑橘である。１８世紀前半に西インド諸島のバルバドスでブンタン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）と多胚性品種の自然雑種として生じたと言われている。アメリカ、イスラエル、キューバ、アルゼンチン、キプロス、南アフリカが主原産国である。
【００１９】
ポンカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）は、インド北部の原産で、中国南部、台湾、インド、ビルマ、スリランカ、フィリピン等で栽培され、日本でも鹿児島、宮崎、高知等で栽培される常緑小高木。成熟果実のエタノールエキスは、血管拡張、刺激性去痰作用、鎮咳作用が認めれる。
スイートオレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）は、熱帯から亜熱帯地方で広く栽培されている。日本では和歌山県等でわずかに栽培されるが、温度不足のため優良品の生産は難しいとされている。
カボス（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐａ）は、初秋から冬季にかけて出荷される大分県特産の調味用柑橘類の一つ。元祖樹は樹齢２００年以上と推定されている。ユズ近縁種と思われるが、起源は明らかではない。主に果汁を搾って利用し、日本料理の調味用に用いられている。
スダチ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｕｄａｃｈｉ）は、徳島県特産の酢ミカンで夏から秋にかけ緑色果を収穫し、果汁と香りを調味に用いられている。ユズの近縁種として３００年以上前に阿波で作出され、同地を中心に広まったものと考えられている。幼果はすりおろし、そうめんやそばの薬味に、緑果の果汁は刺身、焼魚、鍋物等に搾りかけて利用している。
【００２０】
サンポウカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｕｌｃａｔａ）は、独特の果形をした柑橘類で、その名称は三宝（三方）にのせて殿様に献上したことに由来している。江戸時代、和歌山城内に原木があり、同時は門外不出とされていたが、明治時代に入り禁制が解け一般に栽培されるようになったと言われている。和歌山、三重県で栽培されているが、生産量は少ない。耐寒性、耐病性に優れ、栽培容易で豊産である。
タチバナ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｔａｃｈｉｂａｎａ）は、日本原産とされる柑橘類で別名ヤマトタチバナとも呼ばれ、文化勲章はこの花をかたどっている。常緑の小高木で、高さ３〜５ｍになる。枝は緑色無毛で葉は光沢があり、花は白色で芳香がある。黄色に熟す果実は小さく、扁球形である。
カラタチ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ）は、中国南部の暖温帯に分布し、日本ではミカン類の台木として栽植され、まれに山中に野生化する落葉低木である。未熟または成熟果実を日干したものを、健胃作用、利尿作用、消化作用等の目的で服用する。カラタチの名は唐から渡来した橘と言う意味による。
【００２１】
上記列挙した植物は、葉、茎、芽、花、木質部、木皮部（樹皮）等の地上部、及び、根、塊茎等の地下部、種子、樹脂等すべての部位が使用可能である。
上記列挙した植物は、そのまま、抽出物、抽出物の加水分解物、又は植物の加水分解物として使用可能である。
本発明の組成物を植物から得るための抽出方法としては、例えば、ウンシュウミカンの葉を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、ウンシュウミカンの葉を圧搾して得られる搾汁等を適当な溶媒で抽出し、場合によっては加水分解処理を施し、不溶部分を濾過等で取り除きこの液から溶媒を除去した後にカラムクロマトグラフィー等の通常の精製手段を用いて目的物を得る方法が挙げられる。その際、バイオアッセイを並行して行い、血管内皮細胞の増殖あるいは管腔形成の阻害を指標として精製を進めることが望ましい。
【００２２】
抽出に用いる溶媒としてはメタノール、エタノール、プロパノール、１，３ブチレングリコール等のアルコール類、エーテル、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン、シクロヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等の有機溶媒、水等が挙げられる。これら溶媒は単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。抽出条件は、特に限定されないが、例えば、温度は５〜９５℃、好ましくは１５〜８５℃で常温でも好適に抽出することが出来る。
圧力は常圧、加圧、減圧の何れでも良い。
抽出時間は選定した溶媒によっても異なるが数分〜数時間であり、反復抽出、振とう抽出、抽出時間の延長等により抽出効率を高めることができる。
【００２３】
また、加水分解を行う場合、グリコシダーゼやエステラーゼのような酵素による分解や、乳酸菌や酵母等の微生物による分解、塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、リンゴ酸等の酸による分解、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリによる分解等が挙げられる。加水分解の条件は、特に限定されないが酵素や微生物を用いる場合は使用する酵素や微生物の至適温度、ｐＨに合わせ、通常、１０〜５５℃、ｐＨ３〜８、５〜２４時間程度、加水分解を行う。酸やアルカリを用いて加水分解を行う場合、通常、２〜１５重量％の濃度で常温〜６０℃にて０．５〜２４時間程度、加水分解を行う。
これら抽出物や抽出加水分解物は、必要に応じてｐＨ調整を行った後、凍結乾燥、減圧蒸留、減圧・真空乾燥、スプレードライ等の公知の方法で濃縮乾燥物を得ことが出来る。精製処理の方法については特に限定されないが、例えば、順相及び逆相クロマトグラフィーによる精製、再結晶、再沈殿、脱色処理、脱臭処理等を組み合わせて精製することができる。
【００２４】
上記方法より抽出されたミカン属のウンシュウミカンは、ヒト血管内皮細胞を用いた増殖阻害及び管腔形成阻害における血管新生阻害作用確認試験において、ヒト血管内皮細胞の特異的な増殖阻害活性と管腔形成阻害活性を示した。このことから、本発明の組成物は、リウマチや腫瘍をはじめとする血管新生に関わる疾患の予防及び治療に極めて有用な血管新生阻害用組成物である。
【００２５】
更に、リウマチに対してはキャッツクロー（Ｕｎｃａｒｉａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、ヤナギ樹皮（Ｓａｌｉｘ  ｓｐｐ．）、アスピリン、サリチル酸、インドメタシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、エテンザミド、イソプロピルアンチピリン等の抗炎症剤や、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、コラーゲンあるいはそのペプチド等と併用することにより、更に優れた効果を発揮し、抗リウマチ用組成物として利用可能である。本発明における「リウマチ」とは、慢性関節リウマチ、変形性関節症などを挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。
また、腫瘍に対しては既に抗腫瘍活性が知られているアガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）、メシマコブ（Ｐｅｌｌｉｎｕｓ  ｙｕｃａｔｅｎｓｉｓ）、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓｅ）、プロポリス、ビタミンＥ、βカロチン、カテキン類等と併用することにより、更に優れた効果を発揮し、抗腫瘍用組成物として利用可能である。
【００２６】
本発明における「腫瘍」とは、良性及び悪性腫瘍を含み、例えば、胃癌、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌、脳腫瘍、神経鞘腫、直腸癌、結腸癌、非小細胞肺癌、肺小細胞癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、胆管癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、肺癌、大腸癌、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌、骨腫瘍、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、小児固形癌、カボジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組識球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、白血病などを挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。
本発明における「血管内皮細胞の増殖、遊走、又は血管の新生に起因する疾患」とは、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、未熟児網膜症、鎌状赤血球網膜症、角膜汚濁、動脈硬化症、歯周病、強皮症、乾癬、加齢黄斑変性症、皮膚疾患、緑内障、肥厚性瘢痕、虚血を来たす病態、粥状動脈降下巣外膜の異常毛細血管網、アレルギー性炎症、気道性炎症、腎炎、慢性炎症などを挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。
本発明の組成物は、食品、医薬品等として使用できる。栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等として使用しても良い。投与に関しては、有効成分を経口投与、非経口摂取の場合、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体として混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル、等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これらの製剤は常套手段により調製することが可能である。上記の医薬品用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチレンデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の添加剤を適宜添加することも可能である。また、食品としては、ジュースのような飲料に配合することもできる。
【００２７】
本発明により選定されたミカン属ウンシュウミカンの乾燥物または抽出物の有効投与量は、対象者の年齢、体重、症状、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、素材の活性の強さ等により、適宜選択決定されるが、例えば、経口用の場合、ウンシュウミカンの投与量は、１日あたり０．０１〜５０００ｍｇが好ましく、特に好ましくは１００〜１０００ｍｇである。抗リウマチ用組成物としては、例えば、併用がヤナギ樹皮抽出物の場合、１日あたり５〜５０００ｍｇが好ましく、特に好ましくは、５０〜１６００ｍｇである。また、抗腫瘍用組成物としては、例えば、併用がアガリクス抽出物の場合、１日あたり１００〜５０００ｍｇが好ましく、特に好ましくは５００〜２０００ｍｇである。これらは、１日に数回に分けて投与しても良い。
【００２８】
また、本発明の組成物は皮膚外用として、薬事法の言う化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれる製品とすることができる。乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品、軟膏等に用いられる。特に限定されるものではないが、その剤型は水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水―油２層系、水―油―粉末３層系等、幅広い剤型を取り得る。
本発明の組成物の皮膚外用における含有量は、症状の違いにより適宜選択されるが、例えば、ウンシュウミカンの場合、全重量の０．００１〜５０重量％程度、好ましくは０．０１〜１０重量％である。また、抗炎症剤を併用する場合、例えばインドメタシンでは、含有量は０．００１〜２０重量％が好ましく、特に好ましくは、０．１〜１重量％である。これを１〜４回／日に分けて塗布することももちろん差し支えない。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
実施例１（植物の抽出）
ウンシュウミカンの葉（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）１０００ｇに９９．５％エタノール液５Ｌを加え、室温で一晩浸漬して抽出した後、葉を除去し、次いでエバポレーターを用いて減圧濃縮し、エタノールを取り除いた。その結果、抽出物を２０．４ｇ得た。
【００３０】
実施例２（細胞増殖阻害試験）
ヒト血管内皮細胞増殖阻害試験にはＫＴ４−Ｔ１正常ヒト臍帯由来静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた。ゼラチンをコートした２４マルチウェルプレート（ファルコン社）にＫＴ４−Ｔ１を５×１０３  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２に播種し、１０％のウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略す）含有ＭＣＤＢ１０４培地に成長因子カクテル（ＥＥＰ；ＥＣＧＦ１００ｎｇ／ｍｌ＋ＥＧＦ１０ｎｇ／ｍｌ＋ヘパリン１００μｇ／ｍｌ）を添加した条件にて２４時間培養した。その後、実施例１で抽出物したウンシュウミカン葉エキスを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるよう添加し７２時間培養後、コルターカウンター（ベックマン・コルター社）にて生存する細胞数を計測した。
【００３１】
また、細胞増殖阻害が血管内皮細胞特異的であることを検証するため、繊維芽細胞の増殖阻害試験と比較検討した。繊維芽細胞増殖阻害試験にはＡＳＦ４−１（正常ヒト上腕内側部由来繊維芽細胞）を用いた。２４マルチウェルプレート（ファルコン社）にＡＳＦ４−１を５×１０３  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２播種し、１０％  ＦＢＳ含有ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）培地にて２４時間培養した。その後、実施例１で抽出したウンシュウミカン葉エキスを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるよう添加し７２時間培養後、コルターカウンター（ベックマン・コルター社）にて生存する細胞数を計測した。結果を表１に示す。
表１より無添加対照と比べ、ウンシュウミカン葉エキスには、血管内皮細胞、線維芽細胞における増殖率がそれぞれ３４％、６６％となり、共に細胞増殖阻害活性が認められた。血管内皮細胞における増殖阻害活性は特に強く、繊維芽細胞における増殖阻害活性と比較して、その高い特異性が確認された。
【００３２】
【表１】細胞増殖試験結果（細胞数）
2004331567.tif 000003
【００３３】
実施例３（管腔形成阻害試験）
０．２１％コラーゲンゲル（高研社）を２４マルチプレートに下層２００μｌ／ｗｅｌｌ、上層１５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、その間にＫＴ４−Ｔ１を１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種してサンドイッチした。これに、１０ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と８ｎＭのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）を添加した培養液を加えて管腔形成を誘導し、更に同時に実施例１により抽出したウンシュウミカン葉エキスを最終濃度３．１２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌとなるよう添加し、４８時間後に顕微鏡下においてその阻害活性を観察した。
【００３４】
培養血管内皮細胞における管腔形成は、細胞が細長く伸長し、互いに融合し合って個々の細胞の境界が判別できないような網目状のネットワークを形成した状態として観察することができる。この複雑な網目状のネットワークが維持されていれば管腔形成が充分に行われており、ネットワークが細くなったり途切れたりしていれば管腔形成が弱く阻害され、個々の細胞が融合せずに丸くなって一個一個区別できれば、管腔形成が強く阻害されていることになる。そこで、管腔形成の阻害評価は、網目状ネットワークの維持や細胞の伸展の程度、個々の細胞が区別できるか等の基準から、▲１▼全く阻害しない、▲２▼低度に阻害する、▲３▼中度に阻害する、▲４▼高度に阻害する、の４段階で評価した。その結果を表２に示し、実際の阻害活性の様子を図１に示す。結果より、実施例１より抽出したウンシュウミカン葉エキスは濃度依存的に血管内皮細胞の管腔形成を阻害した。
【００３５】
【表２】管腔形成阻害活性
2004331567.tif 000004
【００３６】
処方例１
［錠剤の製造］
実施例１で得たウンシュウミカンの葉（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）のエタノール抽出物とヤナギ樹皮（Ｓａｌｉｘ  ｓｐｐ．）抽出物を用いて常法に従って、下記組成の錠剤を製造した。
（組成）                                                              （配合；重量％）
ウンシュウミカン葉エキス                                        ２５
ヤナギ樹皮抽出物                                                          ３０
乳糖                                                                                  ３２
コーンスターチ                                                              １２
グァーガム                                                                      １．０
【００３７】
処方例２
［ジュースの製造］
実施例１で得たウンシュウミカンの葉（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）のエタノール抽出物を用いて常法に従って、下記組成のジュースを製造した。
（組成）                                                              （配合；重量％）
果糖ブトウ糖液糖                                                          ５．００
クエン酸                                                                          １０．４
Ｌ−アスコルビン酸                                                        ０．５０
香料                                                                                  ０．０２
色素                                                                                  ０．１０
ウンシュウミカン葉エキス                                        １．００
精製水                                                                              ８２．９８
【００３８】
処方例３
［軟膏の製造］
実施例１で得たウンシュウミカンの葉（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ）のエタノール抽出物とインドメタシンを用いて常法に従って、下記組成の軟膏を製造した。
（組成）                                                              （配合；重量％）
白色ワセリン                                                                  ２４
プロピレングリコール                                                  １２
ステアリルアルコール                                                  ２０
パラオキシ安息香酸メチル                                          ０．０５
ウンシュウミカン葉エキス                                          ５
インドメタシン                                                                １
香料                                                                                  ０．１
精製水                                                                              ４２．８５
【００３９】
【発明の効果】
以上から明らかのように本発明より得られたミカン属に属する植物から抽出した成分には、血管新生阻害作用があることが確認された。特に、温州ミカンの抽出物から顕著な作用を確認することができた。
抽出は、植物体の根、幹、皮、枝葉、種子、樹脂等の全植物体を対象とすることができる。
本抽出物の使用対象病気は、腫瘍、リウマチ等本文中に列記したとおり多数に登り、天然物由来の成分として安全性の面からも効用が期待される。
また、使用方法は、経口、外用等の投与ができ、医薬に限らず、化粧料や食品添加物、健康食品として予防的に使用することもできる。
ミカンの利用としては、果実を食用とする外、皮膚外用剤（特開２００３−０９５９１２号公報）、メラニン生成抑制素材（特開２００３−０５５２４６号公報）、育毛剤（特開２００３−０１２４７２号公報）、美白用の組成物（特開２００２−１７９５２９号公報）、ヒアルロン酸産生促進剤（特開２０００−９６０５０号公報）も研究開発され、提案されているが、血管新生阻害作用を見出したものはなく、本発明が独自に提案する新規な作用効果である。
【図面の簡単な説明】
【図１】無添加培養対照図
【図２】３．１２５μｇ／ｍｌ添加培養図
【図３】１２．５μｇ／ｍｌ添加培養図
【図４】５０μｇ／ｍｌ添加培養図
【図１】
2004331567.tif 000005
【図２】
2004331567.tif 000006
【図３】
2004331567.tif 000007
【図４】
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