(57)【要約】【課題】遺伝子チップを用いた検査法をより簡便に迅速に達成するための手段を提供することを課題とする。【解決手段】遺伝子チップを用いた遺伝子の検出に際し、従前の遺伝子を標識化した後にハイブリダイズさせていたものを、ハイブリダイズさせた後に標識することで、遺伝子チップを用いてより簡便に迅速に遺伝子を検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。遺伝子チップを用いた遺伝子検出法であって、遺伝子プローブが固定化された遺伝子チップを調製し、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーション反応を遺伝子チップで行った後、別途調製した検出試薬と当該遺伝子チップを接触させ、目的遺伝子を検出する遺伝子検出法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子チップを用いた遺伝子検出法であって、遺伝子プローブが固定化された遺伝子チップを調製し、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーション反応を遺伝子チップで行った後、別途調製した検出試薬と当該遺伝子チップを接触させ、目的遺伝子を検出する遺伝子検出法。
【請求項２】
請求項１の遺伝子検出法に使用される遺伝子チップ及び検出用標識化合物を含む検出試薬を構成の一にする遺伝子検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子チップを利用した遺伝子の検出方法に関し、その検出に用いられる遺伝子検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子チップを用いた遺伝子の検出は、既に確立され広く繁用されている。その構成は、プローブの調製、プローブのスライド上への固定、試料の調製、ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションスポットの検出という工程からなる。そして、検出のためには、一般的に蛍光物質が利用され、画像をＧｅｎｅＰｉｘ　Ｐｒｏ解析ソフト等で解析・算出される。この際、蛍光物質の導入には検出対象遺伝子のＰＣＲ反応に際しプライマー末端を蛍光物質等で標識化したものを用い、遺伝子の標識化を達成していた。
【０００３】
しかし、この方法は、ハイブリダイズの前に、プライマー修飾等の格別の工程を経る必要があり、処理が煩雑、無駄が多いものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、遺伝子チップを用いた検査法をより簡便に迅速に達成するための手段を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、遺伝子チップを用いた遺伝子の検出に際し、従前の遺伝子を標識化した後にハイブリダイズさせていたものを、ハイブリダイズさせた後に標識することで、遺伝子チップを用いてより簡便に迅速に遺伝子を検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、
１．遺伝子チップを用いた遺伝子検出法であって、遺伝子プローブが固定化された遺伝子チップを調製し、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーション反応を遺伝子チップで行った後、別途調製した検出試薬と当該遺伝子チップと接触させ、目的遺伝子を検出する遺伝子検出法。
２．前項１の遺伝子検出法に使用される遺伝子チップ及び検出用標識化合物を含む検出試薬を構成の一にする遺伝子検出用キット。
からなる。
【０００７】
【発明の実施の態様】
本発明において「遺伝子チップ」とは、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）ともいい、スライドガラス等の担体上にオリゴＤＮＡが固定されたものをいう。その製法には限定されず、ガラス表面上でオリゴＤＮＡを合成していくタイプも、或はＤＮＡをスタンプしていくタイプでもよい。これらは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社或はＳｔａｎｆｏｒｄ大学の技術が著名である。
通常、ＤＮＡマイクロアレイの作成・処理手順は、完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成、末端配列情報によるクローンの均一化、ＰＣＲ反応によるインサートの増幅、スライドガラス上へのＰＣＲ産物のスポット、ｍＲＮＡの調製及び蛍光標識、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション及び洗浄、シグナルの取込み、データ解析と進む。ここで、スライドガラス上へのＰＣＲ産物のスポットはプローブＤＮＡとも呼ばれ、またｍＲＮＡの調製及び蛍光標識されたものはターゲットＤＮＡ〔サンプルより得られた核酸（ＲＮＡ）を蛍光標識したｃＤＮＡ〕とも呼ぶ。
本発明では、この蛍光標識がターゲットＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）にされるのではなく、前記マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション後に蛍光標識がなされる。つまり、本発明において、ＤＮＡマイクロアレイの作成・処理手順は、完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成、末端配列情報によるクローンの均一化、ＰＣＲ反応によるインサートの増幅、スライドガラス上へのＰＣＲ産物のスポット、ｍＲＮＡの調製、マイクロアレイ上でハイブリダイゼーション、蛍光標識及び洗浄、シグナルの取込み、データ解析と進む。
【０００８】
ここで蛍光色素は、特に限定されないが、一般的なＣｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩＩ、ＰＯＰＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＪＯＪＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３等が使用できる。
所望により、ＤＥＰＣ処理水で蛍光染色剤を希釈する。これはＲＮＡをターゲットにした検出も行うので念のため、ＲＮａｓｅをフリーの状態にするためである。使用時の蛍光色素の濃度は、例えばＤＥＰＣ処理水で、市販蛍光色素を、０〜１００００倍、好ましくは５００〜１５００倍で希釈したものを使用する。
【０００９】
検出は、従来法では、Ｃｙ３もしくはＣｙ５で蛍光標識されたｍＲＮＡ由来のターゲットｃＤＮＡを競合的にハイブリダイズさせ、個々のスポットからの蛍光シグナルを自動検出器（スキャナー）で取込み、コンピュータで解析する。一方、本発明では、サンプルより抽出精製したＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ）をターゲット遺伝子とし、これをＤＮＡプローブ（既知遺伝子群、例えば各種病原菌特異的遺伝子、例示すれば赤痢菌、ビブリオ菌等）が固定化されたＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズさせ、洗浄・風乾後、所定のＤＮＡチップ検出試薬（蛍光物質を含む試薬）で染色させ、個々のスポットからの蛍光シグナルを自動検出器（スキャナー）で取込み、コンピュータで解析する。
本発明において、使用する測定に用いる試薬キットとしては、例えば、（１）ＤＮＡプローブが固定化されたＤＮＡチップ、（２）蛍光物質を含むＤＮＡチップ検出試薬、（３）ハイブリダイゼーション用試薬等が例示される。
【００１０】
【実施例】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１１】
【実施例１】
１．材料
（１）　ｒＲＮＡ
Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　をＳＣＤ培地（１０ｍＬ）に植菌し、３０℃で一晩培養した菌液１．５ｍＬを試料とし、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ　（キアゲン社）を用い、ｒＲＮＡを抽出精製した。そのうち、２μｇ相当をターゲットＤＮＡとした。
（２）　ＤＮＡ　ｃｈｉｐ
終濃度で２０μＭとなるように調製したＤＮＡプローブをスライドガラスにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ　４１７　Ａｒｒａｙｅｒを用いてスポッティングを行い、ＤＮＡプローブを固定化後、一晩乾燥させた。
（３）ＤＮＡ　ｃｈｉｐ　検出試薬
ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩＩ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　社）をＤＥＰＣ処理水で１，０００倍希釈したものをＤＮＡ　ｃｈｉｐ検出試薬とした。
【００１２】
２．　方法
（１）　ハイブリダイゼーション溶液の調製
２０×ＳＳＰＥ　　　　４５μＬ（終濃度　５×ＳＳＰＥ）
ｒＲＮＡ　　　　　　４μＬ（２μｇ相当）
５％　ＳＤＳ　　　　１５μＬ（終濃度　０．５％ＳＤＳ）
ＤＥＰＣ　Ｈ２Ｏ　　　　８６μＬ
からなるハイブリダイゼーション溶液を調製した。
（２）　ハイブリダイゼーション
上記（１）で調製したハイブリダイゼーション溶液を６５℃で１０分間加温後、Ｇｅｎｅ　ＴＡＣ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）　にセッティングされたＤＮＡ　ｃｈｉｐにアプライした。４５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行い、その後、２×ＳＳＣを用いて洗浄を行った後、蒸留水で洗浄した後、風乾した。
（３）　検出
ハイブリダイゼーション後のＤＮＡ　ｃｈｉｐに５０μＬのＤＮＡ　ｃｈｉｐ検出試薬を加え、カバーガラスで覆い、室温、暗所下で３分間染色を行った。その後、ＬＳＭ５　Ｐａｓｃａｌ　共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社）を用いて、Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：　４８８ｎｍ，Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：　５４３ｎｍで検出を行った。
【００１３】
３．　結果
Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓより、抽出精製したｒＲＮＡをＤＮＡチップ上でハイブリダイズさせた結果を図１に示す。図中、矢印で示した部分がハイブリダイゼーションした部位を示し、ハイブリダイズした位置においてのみ、スポットが検出された。
【００１４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法により試料を正確に簡易に測定をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡプローブレイアウトと検出結果を示す。矢印で示した部分がハイブリダイゼーションした部位を示す。
【符号の説明】
１：ＳｈＳＰ００１（赤痢菌特異的プローブ）
２：ＶＳＰ００１（ビブリオ属特異的プローブ）
３：ＶＦ００１（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｌｕｖｉａｌｉｓ特異的プローブ）
【図１】
2004061170.tif 000002