(57)【要約】【課題】コラーゲンの変性を生じさせることなく、無菌性や低抗原性のコラーゲン溶液を得ることができる、新規なコラーゲン溶液の改質方法を提供する。【解決手段】コラーゲン溶液の改質方法は、コラーゲン溶液を高圧で噴出して衝突させる処理を施すこととし、その際、衝突時に発生する熱によってコラーゲン溶液の温度がコラーゲンの変性温度よりも高くならないような条件で処理を行い、前記処理後にポアサイズ０．２０〜０．６５μｍのメンブレンフィルターで濾過する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン溶液を高圧で噴出して衝突させる処理を施すこととし、その際、衝突時に発生する熱によってコラーゲン溶液の温度がコラーゲンの変性温度よりも高くならないような条件で処理を行い、前記処理後にポアサイズ０．２０〜０．６５μｍのメンブレンフィルターで濾過する、コラーゲン溶液の改質方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、化粧品、食品、生体材料、細胞培養基質、組織再生工学における基材など、無菌性や低抗原性が要求される用途に有用なコラーゲン溶液を得ることができるコラーゲン溶液の改質方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コラーゲン溶液は、従来から幅広い用途において汎用されているが、中でも、例えば、化粧品、食品、生体材料、細胞培養基質、組織再生工学における基材などの用途に用いられるコラーゲン溶液には、無菌性や低抗原性が要求されている。
従来、コラーゲン溶液を無菌化するには、加熱処理、紫外線照射、γ線等の放射線照射による方法（例えば、特許文献１、特許文献２参照）などが一般に知られている。しかし、加熱処理による場合、コラーゲンが変性してしまうといった問題があった。紫外線照射や、γ線等の放射線の照射による場合にも、殺菌に有用であるが変性が生じ易く、しかも、紫外線照射の場合には殺菌効果が照射表面のみに認められることが多く溶液全体に効果が及び難いといった欠点があり、放射線照射の場合には人体への影響があり、設備上の問題があった。
【０００３】
一方、コラーゲン溶液の抗原性の低減するには、従来から、コラーゲン会合体のテロペプチドを除去すればよいことが知られており、そのための不溶性コラーゲン繊維の可溶化方法としては、コラーゲン溶液を酵素やアルカリで処理する方法が採用されていた（例えば、特許文献３、特許文献４参照）。しかし、コラーゲン会合体に存在するテロペプチドは酵素処理やアルカリ処理によっては充分に除去することが難しいのが実情であった。
【０００４】
【特許文献１】
特公昭６０−２９４９３号公報
【０００５】
【特許文献２】
特公平４−２５０２０号公報
【０００６】
【特許文献３】
特公昭４３−２５８２９号公報
【０００７】
【特許文献４】
特公昭４６−１５０３３号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、コラーゲンの変性を生じさせることなく、無菌性や低抗原性のコラーゲン溶液を得ることができる、新規なコラーゲン溶液の改質方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決するべく、コラーゲン溶液に特定のフィルターを用いた精密濾過を施して無菌化することを考え、実験を重ねた。その結果、濾過により菌の除去および抗原性の低減は可能であるが、いずれも充分に満足しうるレベルには達しないことが判った。しかも、濾過の際、濾過性が極めて悪く、濾過剤（フィルター）に目詰まりが生じやすく、多段階で濾過を行なうか、濾過剤を多数回にわたり交換しながら濾過を行なうなど煩雑な対策が必要となったり、濾過剤に多量のコラーゲンが付着してコラーゲン濃度の低下（すなわち、コラーゲンの収率低下）を招くといった問題が起こることが判った。
【００１０】
そこで、まず前記濾過性の問題を回避するために、鋭意検討を行った結果、濾過性不良の原因が溶液中に存在するコラーゲン会合体にあることを付きとめ、濾過に供する前に、コラーゲン溶液を高圧で噴出し、コラーゲン溶液同士または衝突板などの壁面に衝突させ、物理的な力でコラーゲン会合体を解離させるようにすれば、濾過性を向上させることができることを見出した。ところで、コラーゲン溶液を高圧で噴出させる際の条件によってはコラーゲンに変性が生じることがあることも判った。本発明者は、このコラーゲンの変性は、衝突時に発生する熱によってコラーゲン溶液の温度が上昇し、コラーゲン溶液の温度がコラーゲンの変性温度を超えることが原因で起こることを確認し、コラーゲン溶液の温度がコラーゲンの変性温度よりも高くならないような条件で、コラーゲン溶液を高圧で噴出させることが重要であることをも見出した。本発明者は、これらの知見に基づき、前述のようにしてコラーゲン会合体を解離させる処理を行なった後に特定の精密濾過を施すことを試みたところ、濾過性が向上するばかりか、菌の除去や抗原性の低減についても著しい効果が現れることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明にかかるコラーゲン溶液の改質方法は、コラーゲン溶液を高圧で噴出して衝突させる処理を施すこととし、その際、衝突時に発生する熱によってコラーゲン溶液の温度がコラーゲンの変性温度よりも高くならないような条件で処理を行い、前記処理後にポアサイズ０．２０〜０．６５μｍのメンブレンフィルターで濾過する。なお、対象となるコラーゲンは、牛、豚、鶏などの陸上動物に何ら限定されるものではなく、動物種に関係なくあらゆるコラーゲン（たとえば、水性動物など）に適用できる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のコラーゲン溶液の改質方法においては、まず、コラーゲン溶液を高圧で噴出して衝突させる処理（以下、「衝突処理」と称することもある。）を施す。詳しくは、前記衝突処理は、コラーゲン溶液を２箇所以上のノズルから高圧で噴出させ、噴出したコラーゲン溶液同士を衝突させるか、もしくは、コラーゲン溶液をノズルから高圧で噴出させ、噴出したコラーゲン溶液を衝突板や受器底面などの壁面に衝突させるようにして行なえばよい。このように、コラーゲン溶液を高圧で噴出して衝突させることにより、物理的な力（噴出された溶液に生じる剪断流や、衝突する際に生じる衝撃力）でコラーゲン溶液中に存在するコラーゲン会合体を解離させることができ、これによって、続いて行なう濾過の際の濾過性を向上させるとともに、抗原性を低減させることができるのである。
【００１３】
前記衝突処理は、例えば、図１または図２に示すような装置を用いて行なうことができる。図１および図２において、処理に供するコラーゲン溶液は、まず原料タンク１に収容される。次いで、該原料タンク１内のコラーゲン溶液は、原料タンク１に連通する加圧ポンプ２（２’）に導かれここで加圧されたのち、加圧ポンプ２（２’）に連通したノズル３（３’）から噴出される。このとき、図１の場合は、ノズル３とノズル３’とが対向して配されており、各ノズルから噴出したコラーゲン溶液同士が破線で示すように衝突するようになっている。一方、図２の場合は、ノズル３に対面した位置に衝突板４が設けられており、ノズル３から噴出したコラーゲン溶液が破線で示すように衝突板４に衝突するようになっている。そして、衝突したのちのコラーゲン溶液は、いずれの場合も受器５に収容される。
【００１４】
本発明において、前記衝突処理は、衝突時に発生する熱によってコラーゲン溶液の温度がコラーゲンの変性温度よりも高くならないような条件で処理を行うことが重要である。すなわち、衝突時に発生する熱によってコラーゲン溶液の温度は上昇することとなるので、衝突時のコラーゲン溶液の温度がコラーゲンの変性温度よりも高くならないようにすることが重要となる。具体的には、衝突時に発生する熱は、例えば、コラーゲン溶液を噴出させる際の圧力、衝突処理に用いる装置（ノズルから衝突する位置までの距離など）によって決まるので、コラーゲン溶液の温度がコラーゲンの変性温度よりも高くならないようにするには、処理に供するコラーゲン溶液の温度を考慮してこれらを適宜調整するようにすればよい。また、コラーゲン溶液を噴出させる際の圧力、衝突処理に用いる装置（ノズルから衝突する位置までの距離など）を適当に定め、衝突時に発生する熱が大きくなる場合には、例えば、処理に供するコラーゲン溶液自体を冷却しておくか、衝突が生じる部分の雰囲気を冷却しておくなどの方法により、コラーゲン溶液の温度がコラーゲンの変性温度よりも高くならないように制御すればよい。
【００１５】
前記衝突処理において、コラーゲン溶液を噴出させる際の圧力は、前述したようにコラーゲンの変性が生じないように考慮して適宜設定することが好ましい。
すなわち、コラーゲン溶液を噴出させる際の圧力が高すぎると衝突時に発生する熱が大きくなるので、処理に供するコラーゲン溶液の温度、衝突処理に用いる装置のノズルから衝突する位置までの距離、衝突が生じる部分の雰囲気の温度など、他の諸条件によっては、低く設定することが必要となる。しかし、コラーゲン溶液を噴出させる際の圧力が低すぎると、噴出された溶液に生じる剪断流や、衝突する際に生じる衝撃力が不充分となり、コラーゲン溶液中に存在するコラーゲン会合体を充分に解離させることができなくなるので、コラーゲン溶液を噴出させる際の圧力は、５０ＭＰａ以上の範囲で設定することが好ましい。
【００１６】
本発明のコラーゲン溶液の改質方法においては、前記衝突処理後に、ポアサイズ０．２０〜０．６５μｍのメンブレンフィルターで濾過する。これにより、コラーゲン溶液を無菌化することができる。しかも、濾過前に前記衝突処理を施していることにより、前記のような細かなフィルターであっても、濾過剤（フィルター）の目詰まりや濾過前後の濃度低下などを招くことなく、良好な濾過性で濾過することできる。濾過に用いるメンブレンフィルターのポアサイズは、好ましくは０．２０〜０．４５μｍであるのがよい。
本発明のコラーゲン溶液の改質方法は、例えば、酸可溶性コラーゲン溶液、酵素可溶化コラーゲン溶液、アルカリ処理コラーゲン溶液、化学修飾コラーゲン溶液など、あらゆるコラーゲン溶液に適用することができる。
【００１７】
【実施例】
以下に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。以下、特に断りのない限り「％」は「重量％」を表すものとする。
なお、得られた改質コラーゲン溶液の菌数および抗原性については、下記のように測定・評価した。
＜菌数＞    衛生試験法の微生物試験法に従い、試料液（得られた改質コラーゲン溶液）と寒天培地とをシャーレ中で混和凝固させ、培養後発生した集落数から、試料中の生菌数を算出した。
【００１８】
＜抗原性＞    ＥＬＩＳＡ法にて抗原性を評価した。すなわち、得られた改質コラーゲン溶液に希塩酸溶液（ｐＨ３．０）を加えて０．２％コラーゲン溶液に調製し、該０．２％コラーゲン溶液とＦＣＡ（フロインドコンプリードアジュバント）とを混合した混合液を、正常マウス（Ｂａｌｂ／Ｃマウス）の腹腔内に注射した（第１回目）。次いで、この正常マウス（Ｂａｌｂ／Ｃマウス）の腹腔内に、第１回目の注射から２週間後、前記と同様にして調製した０．２％コラーゲン溶液とＦＩＡ（フロインドインコンプリーンアジュバント）とを混合した混合液を注射した（第２回目）。さらに、この第２回目の注射から２週間毎に計５回、第１回目の注射と同様の混合液を前記正常マウス（Ｂａｌｂ／Ｃマウス）の腹腔内に注射した。最終の注射（第７回目の注射）から７日後に採血し、該血液から採取した血清を、所定の希釈倍率（２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍）に希釈したときの４９０ｎｍにおける吸光度を各々測定した。ブランクとして、前記混合液を注射しない正常マウス（Ｂａｌｂ／Ｃマウス）の血液から採取した血清についても同様に希釈したときの４９０ｎｍにおける吸光度を各々測定した。そして、それぞれ希釈倍率に対する吸光度から抗原性を相対評価した。
【００１９】
（実施例１）
新鮮な豚の真皮層４ｋｇを原料とし、これを裁断し１５℃以下の水で数回洗浄した後、１０％塩化ナトリウム水溶液５０Ｌ中で２４時間攪拌する操作を３回繰り返し、血液などの夾雑物を除去した。次に、５％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム）水溶液５０Ｌ中で２４時間攪拌し、カルシウムなどの無機物を除去した。次に、５℃のエタノール５０Ｌ中で２４時間攪拌する操作を２回繰り返し、油脂分を除去した後、水洗を行ってエタノールを除去した。次いで、夾雑物、無機物、油脂分を除去して得られた原料を、希塩酸溶液（ｐＨ２．２）１００Ｌ中に入れ、３時間静置して膨張させた後、高速ホモジナイザー（日本特殊機化製）を用いて７０００ｒｐｍで６０分間攪拌することにより原料を分散させた。次いで、得られた分散液に、コラーゲン（用いた豚の真皮層）１００重量部に対して約４重量部のペプシンを加え、２０℃で２４時間攪拌することによって、酵素可溶化コラーゲン溶液１００Ｌを得た。
【００２０】
次に、前記酵素可溶化コラーゲン溶液をポアサイズ５０μｍのポリプロピレン製濾過機にて濾過した後、水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ７．４に調整し、コラーゲン繊維を含む溶液を得た。次いで、得られた溶液を６０００ｒｐｍ、２Ｌ／分の条件で連続遠心することにより粗製コラーゲン繊維を回収した。回収したコラーゲン繊維を希塩酸溶液（ｐＨ３．０）１００Ｌに溶解させ、５０μｍのポリプロピレン製濾過機にて濾過した後、希水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ７．４に調整し、コラーゲン繊維を含む溶液とし、この溶液を６０００ｒｐｍ、２Ｌ／分の条件で連続遠心してコラーゲン繊維を回収する操作を２回繰り返すことにより、精製酵素可溶化コラーゲン繊維を得た。次に、得られた精製酵素可溶化コラーゲン繊維を、希塩酸溶液（ｐＨ３．０）に溶解させて０．６％の酵素可溶化コラーゲン溶液とした。この酵素可溶化コラーゲン溶液の変性温度は、３７℃であった。
【００２１】
以上のようにして得られた酵素可溶化コラーゲン溶液に、図１に示す装置を用いて衝突処理を施した。衝突処理に際しては、処理に供するコラーゲン溶液の温度は４℃とし、コラーゲン溶液を噴出させる際の圧力は１５０ＭＰａとし、前記装置におけるノズルから衝突する位置までの距離は５０ｃｍとし、衝突が生じる部分の雰囲気の温度は２５℃とした。このとき、衝突時のコラーゲン溶液の温度は２８℃であった。
次いで、前記衝突処理を施したコラーゲン溶液をポアサイズ０．４５μｍのメンブレンフィルター（濾過面積０．６ｍ２）を備えた濾過機にて濾過し、目的とする改質コラーゲン溶液を得た。このとき、濾過性は良好であり、メンブレンフィルター１本当たりのコラーゲン溶液の濾過液量は１０５Ｌであった。また、濾過前後の溶液濃度の変化は殆ど見られなかった（濾過前の溶液濃度０．６２％、濾過後の溶液濃度０．６１％）。
【００２２】
得られた改質コラーゲン溶液は、比旋光度−３９１°であり変性は生じていなかった。また、該コラーゲン溶液は、菌数０個／ｍＬであり、抗原性については、各希釈倍率における吸光度は表１に示す通りとなり、これをプロットしたグラフは図３の（Ａ）のようになったことから、抗原性が低いものであることが判った。
（比較例１）
実施例１と同様にして、０．６％酵素可溶化コラーゲン溶液（変性温度は３７℃）を得た。得られた酵素可溶化コラーゲン溶液に、コラーゲン溶液を噴出させる際の圧力を２００ＭＰａに変更したこと以外は実施例１と同様にして衝突処理を施した。このとき、衝突時のコラーゲン溶液の温度は４２℃であった。
【００２３】
次いで、前記衝突処理を施したコラーゲン溶液をポアサイズ０．４５μｍのメンブレンフィルター（濾過面積０．６ｍ２）を備えた濾過機にて濾過し、目的とする改質コラーゲン溶液を得た。このとき、濾過性は良好であり、メンブレンフィルター１本当たりのコラーゲン溶液の濾過液量は１０８Ｌであった。また、濾過前後の溶液濃度の変化は殆ど見られなかった（濾過前の溶液濃度０．６４％、濾過後の溶液濃度０．６２％）。
得られた改質コラーゲン溶液は、比旋光度−１７６°であり、コラーゲンは変性しゼラチン化したものとなっていた。また、該コラーゲン溶液は、菌数０個／ｍＬであり、抗原性については、各希釈倍率における吸光度は表１に示す通りとなり、これをプロットしたグラフは図３の（Ｂ）のようになったことから、抗原性が低いものであることが判った。
【００２４】
（比較例２）
実施例１と同様にして、０．６％酵素可溶化コラーゲン溶液（変性温度は３７℃）を得た。
次いで、得られたコラーゲン溶液をポアサイズ０．４５μｍのメンブレンフィルター（濾過面積０．６ｍ２）を備えた濾過機にて濾過し、目的とする改質コラーゲン溶液を得た。このとき、濾過性が極めて悪く、メンブレンフィルター１本当たりのコラーゲン溶液の濾過液量は７．８Ｌであった。また、濾過前後の溶液濃度の変化は著しかった（濾過前の溶液濃度０．６１％、濾過後の溶液濃度０．３５％）。
【００２５】
得られた改質コラーゲン溶液は、比旋光度−３８１°であり、変性は生じていなかった。また、該コラーゲン溶液は、菌数４個／ｍＬであり、抗原性については、各希釈倍率における吸光度は表１に示す通りとなり、これをプロットしたグラフは図３の（Ｃ）のようになったことから、実施例１で得られた改質コラーゲン溶液よりも抗原性が高いものであることが判った。
（比較例３）
実施例１と同様にして、０．６％酵素可溶化コラーゲン溶液（変性温度は３７℃）を得た。
【００２６】
得られたコラーゲン溶液は、比旋光度−３７９°であり、変性は生じていなかった。また、該コラーゲン溶液は、菌数２３８個／ｍＬであり、抗原性については、各希釈倍率における吸光度は表１に示す通りとなり、これをプロットしたグラフは図３の（Ｄ）のようになったことから、実施例１で得られた改質コラーゲン溶液よりも抗原性が極めて高いものであることが判った。
【００２７】
【表１】
2004331611.tif 000002
【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、コラーゲンの変性を生じさせることなく、無菌性や低抗原性のコラーゲン溶液を得ることができる。また、本発明によれば、濾過性不良などによる収率低下やコスト上昇を招く恐れもない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における衝突処理に用いることのできる装置の一例を示す概略図である。
【図２】本発明における衝突処理に用いることのできる装置の他の一例を示す概略図である。
【図３】実施例および比較例で得られた改質コラーゲン溶液の抗原性評価において、各希釈倍率における吸光度をプロットしたグラフである。
【符号の説明】
１  原料タンク
２  加圧ポンプ
３  ノズル
４  衝突板
５  受器
【図１】
2004331611.tif 000003
【図２】
2004331611.tif 000004
【図３】
2004331611.tif 000005