(57)【要約】【課題】完全な水系において定量が可能であり、反応時、測定時及び試薬廃棄時の安全性が高く、可視部の領域で簡便に測定でき、何らの測定機器も要しない、ウロン酸含有多糖類の定量方法を提供せんとする。【解決手段】ウロン酸含有多糖類のヒドロキサム酸誘導体を調製すると共に、三価の鉄イオンを含む水溶液中で呈色させることを特徴とする。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロン酸含有多糖類のヒドロキサム酸誘導体を調製すると共に、三価の鉄イオンを含む水溶液中で呈色させることを特徴とするウロン酸含有多糖類の定量方法。
【請求項２】
カップリング試薬となり得る水溶性カルボジイミドでヒドロキサム酸を調製する請求項１記載のウロン酸含有多糖類の定量方法。
【請求項３】
水溶性カルボジイミドが１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド  メソパラトルエンスルフォネートである請求項２記載のウロン酸含有多糖類の定量方法。
【請求項４】
ウロン酸含有多糖類がペクチン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、ヘパリンである請求項１、２又は３記載のウロン酸含有多糖類の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウロン酸含有多糖類を比色定量する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ウロン酸含有多糖類の定量方法には、例えば特開２００２ー１３１２３３が開示されている。
この方法は、ウロン酸含有多糖類を水溶性の縮合活性化試薬と、アミノ基、ヒドラジノ基もしくはヒドラジド基を有し、かつ蛍光性若しくは紫外線吸収性を有する物質とを用いて標識し、液体クロマトグラフィーにて分離し、蛍光度若しくは紫外線吸収強度を測定するものである。
【０００３】
上記従来の方法では、試薬にアルコール等の有機溶媒を添加する必要があり、試薬中のメタノールやエタノール等が混在しているとウロン酸の沈殿、変性をおこす虞れがあり、試薬自体の分離が必要であること、そのためのクロマトグラフィー等の装置が必要となると共に、試薬廃棄時の安全性にも問題が生じるのである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は完全な水系において定量が可能であり、反応時、測定時及び試薬廃棄時の安全性が高く、可視部の領域で簡便に測定でき、何らの測定機器も要しない定量方法を提供せんとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明に係るウロン酸含有多糖類の定量方法は、ウロン酸含有多糖類のヒドロキサム酸誘導体を調製すると共に、三価の鉄イオンを含む水溶液中で呈色させることを特徴とするものである。
【０００６】
ヒドロキサム酸誘導体の調製には、カップリング試薬となり得る水溶性カルボジイミドを用いるのが好ましく、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド  メソパラトルエンスルフォネートが最適である。
【０００７】
天然多糖類はその高分子としての性質を利用し、食品添加物、医薬品等に汎用されている。
本発明は、多糖類の中でも構造中にカルボキシル基を有するウロン酸を完全な水系において速やかに誘導化し、比色定量することを可能とするものである。
【０００８】
従来、低分子のカルボン酸はカルボジイミドによりヒドロキサム酸（以下「ＨＸ」という）に誘導され、第二鉄イオン（Ｆｅ３＋）により呈色することが知られている。
本発明者らは、多糖類のような高分子化合物においても水溶液中でＨＸ誘導化が起こり、それが多糖類の定量法として利用できることを見い出したものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
ウロン酸含有多糖類には、ペクチン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン及びヘパリンが含まれる。
【００１０】
（１）水溶性カルボジイミドの選択と反応系中のｐＨ
ウロン酸含有多糖類である、例えばペクチンとＨＸ誘導化のためのヒドロキシルアミンとの反応は、カップリング試薬である水溶性カルボジイミドの共存により水系において起こり得る。
しかし、ペプチド合成で広く用いられている塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下「ＥＤＣ」という）では三価の鉄イオンを加えても呈色は見られず、カップリング系のｐＨを４．５〜６．０まで変化させても反応がなかった。
【００１１】
一方、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド  メソパラトルエンスルフォネート（以下「ＣＭＥＣ」という）では呈色反応が認められ、ペクチンのＨＸ誘導化が可能であることが判明した。
そして、ＣＭＥＣの系中のｐＨによって変化する呈色反応が認められ、その最大値はｐＨ４．８〜５．０で得られた（図１）。
このことは、ペクチンのカルボキシル基の状態とＣＭＥＣの水溶液中での安定性によるものと考えられる。
そこで、カップリング反応は緩衝液のｐＨ５．０が最適の選択であることが確認できた。
【００１２】
そこで、試薬を塩酸ヒドロキシルアミン（Ｗａｋｏ特級）、塩化第二鉄（片山化学一級）及びＣＭＥＣ（Ａｌｄｒｉｃｈ）とし、次の試薬溶液に調製した。
（Ａ）塩酸ヒドロキシルアミン溶液を蒸留水により調製する。
（Ｂ）ＣＭＥＣ溶液を２％ピリジンー塩酸緩衝液（ｐＨ５．０）により調製する。
（Ｃ）塩化第二鉄溶液を塩酸により調製する。
【００１３】
次に、定量操作は試料水溶液（ブランクは蒸留水）に（Ａ）（Ｂ）を加えて撹拌して加熱し、その後（Ｃ）を加えて撹拌し、分光光度計により吸光度（４８０ｎｍ）を測定せんとするものであり、そのための他の条件設定を以下の通り行った。そして、条件設定には２ｍｇのペクチン（０．２％、１ｍＬ）をサンプルとして用いた。
【００１４】
（２）試薬濃度と反応時間の設定
カップリング反応に関する塩酸ヒドロキシルアミンとＣＭＥＣの濃度の影響並びに反応時間について検討した結果、塩酸ヒドロキシルアミンは添加濃度２０ｍＭ（系中６．７ｍＭ）でほぼ一定となり（図２）、ＣＭＥＣは至適濃度が０．１Ｍ（系中３３ｍＭ）となった（図３）。
そして、このカップリング反応は４０℃において速やかに進行し、１５〜２０分で一定の値となった（図４）。
そこで、反応時間については反応温度の上昇により短縮可能であるが、汎用性やＣＭＥＣの分解を考慮して、４０℃が妥当と判断される。
【００１５】
（３）キレート発色のための塩化第二鉄濃度の影響
ＨＸは塩酸酸性下において、Ｆｅ３＋の存在により、キレートを形成し呈色するが、その濃度の増加と共に吸光度が増加した（図５）。
しかし、試薬ブランク値も塩化第二鉄濃度と共に増加したため、呈色のための添加試薬濃度としては２０ｍＭ（系中１０ｍＭ）を選択した。
又、塩酸の濃度としては発色の系が十分酸性になる０．１Ｎを選択した。
【００１６】
（４）呈色の安定性
ペクチンのＨＸの呈色は比較的安定であり、吸光度測定に支障はないと思われる（図６）。
ただし、室温においてもその吸光度はゆっくりと減少し、３０分後には９７．９％、６０分後には９４．４％に低下した。
【００１７】
（５）確立した試薬溶液及び定量操作
以上の結果、試薬溶液は
（Ａ）２０ｍＭ  塩酸ヒドロキシルアミン溶液を蒸留水により調製する。
（Ｂ）０．１Ｍ  ＣＭＥＣ溶液を２％ピリジンー塩酸緩衝液（ｐＨ５．０）により調製する。
（Ｃ）２０ｍＭ  塩化第二鉄溶液を０．１Ｎ塩酸により調製する。
定量操作
試料水溶液（ブランクは蒸留水）１ｍＬに（Ａ）（Ｂ）をそれぞれ１ｍＬづつ加えて撹拌し、４０℃で１５〜２０分加温する。その後、（Ｃ）を３ｍＬ加えて撹拌し、分光光度計により吸光度（４８０ｎｍ）を測定することとし、４０℃で１５〜２０分加温し、分光光度計により吸光度（４８０ｎｍ）を測定することにより、定量値を得られるものである。
【００１８】
水溶性カルボジイミドの種類によってはＥＤＣのようにＨＸ誘導化が起きないものも存在するけれど、ＣＭＥＣの他にもペクチンとヒドロキシルアミンのカップリング試薬となり得るものを用いることができることは言うまでもない。
又、呈色試薬は三価の鉄イオン（Ｆｅ３＋）を有するものであればよい。
【００１９】
【実施例】
実施例１
試薬溶液
（Ａ）２０ｍＭ  塩酸ヒドロキシルアミン溶液を蒸留水により調製する。
（Ｂ）０．１Ｍ  ＣＭＥＣ溶液を２％ピリジンー塩酸緩衝液（ｐＨ５．０）により調製する。
（Ｃ）２０ｍＭ  塩化第二鉄溶液を０．１Ｎ塩酸により調製する。
定量操作
試料水溶液（ブランクは蒸留水）１ｍＬに（Ａ）（Ｂ）をそれぞれ１ｍＬづつ加えて撹拌し、４０℃で１５〜２０分加温する。
その後、（Ｃ）を３ｍＬ加えて撹拌し、分光光度計により吸光度（４８０ｎｍ）を測定することとし、ペクチン及びペクチン構成糖であるガラクツロン酸を試料として測定した結果、図７及び図８のように定量性が確認できた。
ペクチンでは０．５〜１０ｍｇの範囲で直線性（ｒ２＝０．９９９５）が得られた（図７）。
又、本反応による呈色の変動係数Ｃ．Ｖ．は１．３％（試料：ペクチン２ｍｇ）となり、優れた再現性が示された。
【００２０】
ペクチンは水溶液中、緩和な条件で速やかにＨＸ誘導化されることが示された。このカップリング反応を用いることにより、塩化第二鉄の共存によりＨＸ誘導化はカルボキシル基とヒドロキシルアミンの脱水反応であるから、カルボキシル基を有する多糖類は呈色することとなり、定量法として利用し得ることが判明した。これは、食品添加物として汎用されているペクチンの（原料としての）簡便な定量法になると考えられ、又他の酸性多糖類にも応用し得るものである。
【００２１】
実施例２
上記実施例１と同様の条件でアルギン酸（ＡＬＧ）、コンドロイチン硫酸（ＣＨＳ）並びにヒアルロン酸（ＨＡＹ）を試料としたときにも、それぞれ試料濃度に対する本反応の直線性が確認され（図９）、これらの多糖類の比色定量法へも応用し得ることが確認できた。
ここでの結果とペクチンでのデータをあわせて考えたとき、それら多糖類中に存在するカルボキシル基の量を反映した発色率を示しているとも考えられ、この反応により試料（例えばペクチン）に存在するＦｒｅｅのカルボキシル基を推定する一方法になる可能性も推測される。
【００２２】
【発明の効果】
以上のように、本発明は多糖類のなかでも構造中にカルボキシル基を有するウロン酸を、完全な水系において速やかに誘導化し、比色定量することが可能であり、測定試料、試薬は全て水溶液で行えること、測定時及び試薬廃棄時の安全性が非常に高い利点を有し、１０分程度の素早い発色反応を呈し、可視部の領域で簡便に測定でき、有機溶媒を添加しないため、原料との分離も要しない利点をも有するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】カップリング反応における緩衝液のｐＨの影響を示すグラフである。
【図２】カップリング反応におけるヒドロキシルアミン濃度の影響を示すグラフである。
【図３】カップリング反応におけるＣＭＥＣ濃度の影響を示すグラフである。
【図４】カップリング反応における加温時間の影響を示すグラフである。
【図５】呈色時の塩化第二鉄濃度の影響を示すグラフである。
【図６】発色の安定性を示すグラフである。
【図７】ペクチンの検量線を示すグラフである。
【図８】ペクチンの検量線を示すグラフである。
【図９】多糖類の検量線を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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