(57)【要約】【課題】アンチセンス医薬など遺伝子が関与する各種用途に核酸を使用するに際して、核酸と安定性の高い複合体を形成し、かつ毒性の少ない多糖系のキャリアーを提供する。【解決手段】β−１，３−グルカンを核酸と複合体化させるに際し、β−１，３−グルカン（例えば、シゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカン）の側鎖に存在する糖残基の少なくとも一部を緩和スミス法で除去し、側鎖率を低減させたものを使用することにより、安定性に優れた複合体を提供する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
側鎖に存在する糖残基の少なくとも一部が除去されたβ−１，３−グルカンと核酸の複合体。
【請求項２】
β−１，３−グルカンの側鎖の位置が６位であることを特徴とする請求項１の複合体。
【請求項３】
β−１，３−グルカンがシゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカンである請求項２の複合体。
【請求項４】
β−１，３−グルカンの側鎖の糖残基が化学的もしくは酵素的に除去されていることを特徴とする請求項１の複合体。
【請求項５】
側鎖の除去方法が緩和スミス分解であることを特徴とする請求項４の複合体。
【請求項６】
核酸が天然または非天然のＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの一部の配列を含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１の複合体。
【請求項７】
複合体の構造がβ−１，３−グルカンの２本鎖と核酸１本鎖から形成される３重螺旋状であることを特徴とする請求項１の複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学の分野で利用する多糖と核酸との複合体を調製する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子工学の進歩に対応して、核酸を医療分野で活用する研究が行われている。中でも、アンチセンス医薬に関する文献・特許が多数報告され、既に開発段階に入っている医薬品の候補として、各種の癌や白血病、エイズや肝炎などのウイルス性疾患、乾癬、クローン病、喘息、リウマチなどの治療薬、ならびに免疫刺激剤など多岐に及んでいる。
【非特許文献１】横山勇生他，  日経バイオビジネス，  ２００２年，  １月号，  ｐ４０
【非特許文献１９】大津敬他，  実験医学，  １８，  Ｎｏ．１２（増刊），  １７２（２０００）
【０００３】
アンチセンス医薬として使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、疾患に関係する標的核酸に見いだされる特異的な配列に対し相補的な配列を有するように設計されている。その配列特異性の他にも、実用化に当たっては、解決すべき問題が幾つか挙げられる。血清、細胞、組織由来のヌクレアーゼに耐性があること、無毒性で、製造コストが安価であること、標的組織や細胞へ送達できるような適当な薬物動態を有すること、細胞膜、小胞オルガネラ膜、核膜を通過できること、高い特異性と親和性をもって高次構造を有するＲＮＡ分子の標的領域へ侵入すること、そして、標的蛋白質の翻訳過程を最大限、阻止できるようにすることなどである。
【非特許文献２】横山和尚，  医学の歩み，  １８４，  Ｎｏ．３，  ２２５（１９９８）
【０００４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのような核酸を治療薬として使用する場合、細胞内への導入（トランスフェクション）効率をあげるため、一般に、当該核酸と複合体を形成して細胞内に輸送されるようにする遺伝子キャリアーが併用される。当初、レトロウイルスまたはアデノウイルスが、遺伝子キャリアーとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでは極めて見込みのある結果を与えたが、これら天然由来のウイルスの炎症性、免疫原的性質、ならびに突然変異誘発および細胞ゲノム中への組み込みの危険性が原因して、これらのｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用は制限されている。
【非特許文献３】Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６０，  ９２６−９３２（１９９３）
【非特許文献４】Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５７，  ４５５−４６０（１９９２）
【非特許文献５】Ｃｒｙｓｔａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７０，  ４０４−４１０（１９９５）
【０００５】
そこで、天然由来の遺伝子キャリアーの代替物として、ウイルス系よりも取り扱いが簡単であるのみならず、細胞へＤＮＡを確実に効率良く集中させることが可能な人工材料の非ウイルスキャリアーの使用が提示された。
【非特許文献６】Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｌｌａｎｄ，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒ．  Ｒｅｌ．，  ３９，  ３５７−３７２（１９９６）
【０００６】
現在、非ウイルス性の人工キャリアーとしてよく検討されているのはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。多数の異なった付着細胞および浮遊細胞ライン中では、３次元的分岐構造のカチオンポリマーであるＰＥＩは、ある場合には平均以上のトランスフェクション率を引き起こす結果になった。
【非特許文献７】Ｂｏｕｓｓｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ３，  １０７４−１０８０（１９９６）
【０００７】
また、ＰＥＩと同様、窒素の置換基で修飾された、種々のカチオン性ポリマー、カチオン性脂質などが遺伝子キャリー、トランスフェクション剤、薬物担体などという名称で、多数の特許が出願されるようになってきた。
【０００８】
しかしながら、ＰＥＩのようなカチオン性ポリマーの安全性についてはほとんど確認されていないのが現状である。カチオン性を付与するには、通常、アミノ基の存在が不可欠であるが、アミノ基を有する物質は生理活性が高く、体内毒性等の危険性が考えられる。事実、今まで検討されたいかなるカチオン性ポリマーも未だ実用に供されておらず、医薬品添加物辞典等に記載されていない。
【非特許文献８】医薬品添加物辞典
【非特許文献９】日本医薬品添加剤協会編集、薬事日報社
【０００９】
一方、筋肉内注射製剤の臨床薬として実際に使用されている多糖類に、β−１，３−グルカンが存在する。この多糖は天然では３重螺旋構造をとっていることが古くから知られている。
【非特許文献１０】Ｔｈｅｒｅｓａ  Ｍ．  ＭｃＩｎｔｉｒｅ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ａ．  Ｂｒａｎｔ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２０，  ６９０９（１９９８）
【００１０】
さらに、この多糖は、既に生体内での安全性が確認されており、筋肉内注射薬として約２０年の使用実績がある。
【非特許文献１１】清水，  陳，  荷見，  増淵，  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，  ４，  １３９０（１９９０）
【非特許文献１２】長谷川，  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ８，  ２２５（１９９２）
【００１１】
このようなβ−１，３−グルカンを化学修飾して、ＤＮＡ等の生体材料とのコンジュゲイトを作成し、これを遺伝子キャリアーに使用できることが見出され、天然のβ−１，３−グルカン、すなわち、３重螺旋構造を有するβ−１，３−グルカンをそのまま使用し、これと生化学活性のある材料を、共有結合を介して、β−１，３−グルカン／生体材料のコンジュゲイトを製造する方法が提案されている。
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４８００
【００１２】
また、最近、本発明者らにより、β−１，３−グルカンまたはβ−１，３−キシラン系の多糖類が、人工的に処理されることで、各種の核酸と共有結合によらない、新しいタイブの複合体を形成することが見出された。
【特許文献２】ＰＣＴ／ＪＰ００／０７８７５
【非特許文献１３】櫻井，  新海，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２２，  ４５２０（２０００）
【非特許文献１４】木村，  甲元，  櫻井，  新海，  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １２４２（２０００）
【００１３】
もともと天然もしくは水中で３重螺旋として存在するこの多糖を、極性溶媒に溶解して１本鎖に解いた後、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、核酸１本・多糖２本からなる、３重螺旋型の複合体が形成されるのである。このような多糖と遺伝子の複合体は、水素結合と疎水性相互作用を介して形成されるものと考えられる。
【非特許文献１５】櫻井和朗，  井口律子，  木村太郎，  甲元一也，  水雅美，  新海征治，  Ｐｏｌｙｍ．  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ  Ｊｐｎ．，  ４９，  ４０５４（２０００）
【００１４】
天然の多糖類をそのまま使用した場合の核酸との複合体における結合エネルギーは、通常、さほど強くなく、比較的容易に複合体が解離する。また、予め多糖類に各種官能基を導入して核酸との複合体の安定性をより強くする方法も開発されている。さらに、これらの多糖類と核酸の３重螺旋型複合体は、細胞膜の透過性およびヌクレアーゼ耐性があり、遺伝子キャリアーとして使える可能性が高いことが本発明者らによって明らかにされた。
【特許文献３】ＰＣＴ／ＪＰ０２／０２２２８
【００１５】
また、このような多糖と核酸の複合体化を利用した生体物質の分離用クロマト吸着剤の開発も行われている。
【特許文献４】特願２００１−３５７０９５
【００１６】
β−１，３−結合を有する多糖には、β−１，３−グルカンやβ−１，３−キシランなどがある。そしてβ−１，３−グルカンに属する物質としてはシゾフィラン、カードラン、パーキマン、グリホラン、スクレログルカン、レンチナンまたはラミナランなどが知られ、それらの分子量は数百から数百万の広範囲にわたる。その中で、遺伝子キャリアー向けに適するものは分子量２０００以上のものである。
【００１７】
上記の多糖類は、天然のままで遺伝子キャリアーとして使用すれば、通常、トランスフェクション効果が必ずしも十分ではないため、適当な化学修飾を行う必要がある。アニオン性の核酸と結合性のある官能基としては、アミノ基で代表されるカチオン性官能基、アミノ酸官能基、インターカレーター性官能基などの導入が特許文献３に提示されている。それらの導入は核酸に対する糖の親和性を高め、糖と核酸の複合体の安定化に好影響を及ぼす。また、無機イオン添加による複合体の安定性向上策なども検討されている。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、アンチセンス医薬など遺伝子が関与する各種用途に核酸を使用するに際して、核酸と安定性の高い複合体を形成し、かつ毒性の少ない多糖系のキャリアーを提供することにある。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、このたび、β−１，３−グルカンが元来保有していた側鎖を除くという簡単な処理を施すことで、未調整のβ−１，３−グルカン（側鎖を除去しないβ−１，３−グルカン）を使用する場合に比べて、核酸との複合体の生理条件下における熱力学的安定性および加水分解酵素に対する核酸の耐性が著しく向上するということを発見し本発明を導き出した。
かくして、本発明は、側鎖に存在する糖残基を少なくとも一部が除去されたβ−１，３−グルカンと核酸複合体を提供するものである。
【００２０】
【発明を実施するための最良の形態】
本発明が対象とするβ−１，３−グルカンとは、よく知られているように、グルコースがβ１→３グルコシド結合により結合された多糖であり、主鎖のグルコース残基数に対する側鎖のグルコース残基数の割合（以下、側鎖率と略記する）の異なる各種のものが知られている。本発明においては、下述のように、特に、側鎖率の比較的高いβ−１，３−グルカンが好適に使用される。
【００２１】
天然のβ−１，３−グルカンで、パーキマンとラミナランは側鎖率が数百分の１程度と小さい。このような側鎖率が低いβ−１，３−グルカンは、水溶性に乏しく、使いづらいところがある。一方、シゾフィラン、スクレログルカンおよびレンチナンは側鎖率が３３〜４０％と比較的高く、水溶性で、利用し易い。本発明者らは、そのような側鎖率の比較的高いβ−１，３−グルカンを遺伝子キャリアーとして用いるに際し、核酸との複合体の安定性を高める条件を鋭意研究した結果、側鎖率の調整によって核酸との親和性を大きく変えうることを見出し、目的を達成したものである。
【００２２】
本発明における、多糖と核酸の複合体の安定性とは、▲１▼化学結合論的な相互作用の強さ、▲２▼熱力学的安定性、ならびに▲３▼生理条件下でのヌクレアーゼ耐性などで示される総合的な性質を指す。それらの各要素に対する評価は、▲１▼：円偏光二色性スペクトル（ＣＤ）の強度、▲２▼：融解温度（Ｔｍ）、および▲３▼：加水分解酵素による耐性試験で測定可能である。それらの測定の詳細は実施例において述べる。
【００２３】
β−１，３−グルカンの側鎖の糖残基（グルコース残基：以下、単にグルコースということがある）は、通常、６位の炭素を介し、グルコシド結合している。本発明の特徴は、このグルコシド結合を開裂し、その糖残基の一部を除去したβ−１，３−グルカンを核酸との複合体形成に用いることにある。本発明に従い、グルコース側鎖を除く方法としては、糖を化学的または酵素的に分解し除去し得る従来から知られた各種の方法が適用できるが、主鎖のβ−１，３−結合に影響を与えず、側鎖のグルコースを選択的に開裂・除去することができる点から、緩和スミス分解が特に好ましい。よく知られているように、緩和スミス分解とは、スミス分解、すなわち、過ヨウ素酸酸化、還元および酸加水分解から成る糖質の分解反応であって酸加水分解反応が比較的穏和な条件で行なわれるものを指称し、その一般的な方法は、β−１，３−グルカンを過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化した後、弱塩基性下に水素化ホウ素ナトリウムで定量的に還元してから、希酸加水分解（条件例：０．１Ｎ硫酸、室温）するという一連の反応を進行させることから成り、これによって、側鎖のグルコース残基の一部が選択的に分解、除去される（図１参照）。各ステップの詳細な反応条件については、実施例に記述する。
【非特許文献１６】中村道徳他編、生物化学実験法１９「澱粉・関連糖質実験法」ｐ１１９、３刷（１９９８年１月１０日）、（株）学会出版センター
【００２４】
緩和スミス分解の反応率の制御は、１段目の過ヨウ素酸酸化における側鎖の酸化率が重要である。試料によって異なるが、シゾフィランを処理する場合の一例（実施例３、表１）では、側鎖酸化率（過ヨウ素酸の当量）が約５０％のときで主鎖のグルコース残基数に対する側鎖のグルコース残基数割合（側鎖率）は３３％から約２３％へ、側鎖酸化率が約１００％のとき側鎖率は約１９％へ、側鎖酸化率が約２５０％のとき側鎖率は約９％へ、さらに側鎖酸化率が約５００％のとき側鎖率は約２％へと低下した。
【００２５】
緩和スミス分解によって得られる、β−１，３−グルカン生成物の側鎖の糖残基置換率をどの程度まで低減させると、核酸との複合体の安定性をどれだけ改善できるかという目標設定に関しては、特に厳密な基準は存在しない。安定性の評価を複合体の融解温度の上昇で行うと、シゾフィラン／ポリ（Ｃ）の複合体を対象とした場合（実施例６、図４）、主鎖のグルコース残基数に対する側鎖のグルコース残基数の割合（側鎖の糖残基置換率：以下、側鎖率と略記する）が２３％付近まで低下する間は、かなり急激に融解温度が上昇し、それ以下になると上昇率は徐々に緩やかとなる。そして、側鎖率が１０％以下になるとほぼ飽和するように見えるが、側鎖率を２％付近まで低下させても融解温度が降下する兆しは認められない。従って、側鎖率は下げれば下げるほど複合体の安定性は改善されるということになるが、実際問題としては、反応試薬を大過剰に要し、生成物の水に対する溶解性も徐々に低下して使いにくくなるため、側鎖率は例えば１５〜１０％程度までに留めるのが現実的と考えられる。
【００２６】
複合体の安定性を示すもう一つの尺度である加水分解酵素への核酸の耐性も、実施例８（図６）に示すように、側鎖率の低い糖を用いるほど向上することが認められる。しかしながら、この酵素耐性は比較的低い側鎖酸化率で大きく向上するため、側鎖酸化率１００％（側鎖率１９％）を超えると向上幅はあまりない。
【００２７】
本発明に従い上述のように側鎖に存在する糖残基の少なくとも一部を除去したβ−１，３−グルカン、すなわち、側鎖率を低下させたβ−１，３−グルカン（好ましくは、シゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカン）は、天然または非天然のＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの一部の配列を含むオリゴヌクレオチドである核酸と複合体を形成することによってアンチセンス薬剤などとして使用することができる。ここで、本発明の好ましい態様に従えば、当該複合体はβ−１，３−グルカンの２本鎖と核酸１本鎖から形成される３重螺旋状の構造を呈するようにする。すなわち、本発明者らにより先に開示されたように（特許文献３、非特許文献１５）、本来は、天然もしくは水中で３重螺旋として存在するβ−１，３−グルカンを、極性溶媒に溶解して１本鎖に解いた後、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、核酸１本、多糖２本からなる、３重螺旋型の複合体として使用する（後述の実施例４参照）。
【００２８】
【実施例】
以下に本発明の特徴をさらに具体的に明らかにするため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１
β−１，３−グルカン（シゾフィラン：ＳＰＧ）の調製  ３重螺旋構造のシゾフィランを文献記載の定法に従って製造した。すなわち、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手したＳｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ．  Ｆｒｉｅｓ（ＡＴＣＣ  ４４２００）を、最小培地を用いて７日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量４５万の３重螺旋シゾフィランを得た。
【非特許文献１７】Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｇ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｆ．  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｃ．  Ｃａｎｎｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｌ．  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒ．，  ３８（１），  ２５３−２５４（１９９７）
【非特許文献１８】Ｋｅｎｇｏ  Ｔａｂａｔａ，  Ｗａｔａｒｕ  Ｉｔｏ，  Ｔａｋｅｍａｓａ  Ｋｏｊｉｍａ，  Ｓｈｏｚｏ  Ｋａｗａｂａｔａ  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ  Ｍｉｓａｋｉ，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ８９，  １２１−１３５（１９８１）
【００２９】
実施例２
側鎖調整β−１，３−グルカン（シゾフィラン）の合成  図１のスキームに従い、本発明に従う、脱側鎖処理を施した糖（以下、側鎖調整多糖、側鎖調整シゾフィランまたは側鎖調整β−１，３−グルカンのように記述）を合成した。側鎖率の制御は、加える過ヨウ素酸ナトリウムの当量数により制御することが可能である。従って、種々の側鎖率のサンプルを合成する場合においても合成法に相違は生じない。ここでは、側鎖率３３．３％のシゾフィランの側鎖に存在する糖残基の一部を除去して側鎖率２２．９％、１８．８％、８．９％および２．１％に調整した側鎖調整シゾフィランの合成法を示す。
【００３０】
実施例１で調製したシゾフィラン１００ｍｇを水１００ｍｌに溶解させ、所定量の過ヨウ素酸ナトリウム（実施例３の表１に記載）を加え、遮光下、４℃で２日間撹拌した。反応溶液にエチレングリコールを加えた後、室温で３時間程度撹拌し、透析膜（排除限界１２０００）で透析を行った。反応溶液へ２５％アンモニア水溶液（５ｍｌ）を加え、弱塩基性にした後、水素化ホウ素ナトリウム１００ｍｇを加え、室温で２日間放置した。過剰の水素化ホウ素ナトリウムを酢酸で失活させた後、透析膜（排除限界１２０００）で３日間透析し、凍結乾燥した。
【００３１】
得られた白色に０．１Ｎ硫酸水溶液２０ｍｌを加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液を炭酸水素ナトリウムで中和した後、透析膜（排除限界１２０００）で５日間透析した。不溶物を遠心分離により取り除き、上清を凍結乾燥することで側鎖調整シゾフィランを得た。
【００３２】
実施例３
側鎖調整多糖のキャラクタリゼーション（側鎖率と分子量）  実施例２にて得られた側鎖調整シゾフィランのキャラクタリゼーションを行った。表１にはサンプル名、添加した過ヨウ素酸の側鎖に対する当量、β−１，３−グルカナーゼにより加水分解することで得られるグルコース／ゲンチオビオース比より決定された側鎖率、ゲル浸透クロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ−α−４０００、溶離液：［ＬｉＢｒ］＝２０ｍＭ／ＤＭＦ、スタンダード：ＰＥＯ）により得られた分子量（Ｍｗ）を示す。表１より、加えた過ヨウ素酸の当量数に応じて残存する側鎖の割合は減少しているが、分子量の低下はほとんど見られず、主鎖の分解は実質的に起こっていない。
【００３３】
【表１】
2004331758.tif 000003
【００３４】
実施例４
側鎖調整多糖とポリ（Ｃ）との複合体の調製  実施例２で合成され、実施例３で特性化された側鎖調整シゾフィランをそれぞれ、極性溶媒であるＤＭＳＯに０．５ｇ／ｄＬとなるように溶解させて１本鎖にし、これに、純水９００μＬ、１０ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）１００μＬ、０．１ｇ／ｄＬのポリ（Ｃ）１００μＬのそれぞれを混合した溶液へ１００μＬ添加し、２日間以上冷蔵庫内にて熟成させた。この方法で調製された溶液はすべて透明で、均一であった。
【００３５】
比較例１
３７％アミノ基修飾シゾフィランとポリ（Ｃ）との複合体の調製  実施例１で調製したシゾフィランを過ヨウ素酸酸化し，ついで２−アミノエタノールと反応させることにより，３７％アミノ基修飾シゾフィランを得た（合成法の詳細は本発明者らによる特許文献３を参照）。その生成物を用いて実施例４と同様の複合体混合溶液を作成した。得られた溶液は透明で、均一であった。
【００３６】
実施例５
側鎖調整多糖とポリ（Ｃ）との複合体形成の確認  実施例４において得られた溶液を円二色性分散計（ＪＡＳＣＯ製）を用いてＣＤスペクトル測定（５℃）を行った。得られた円偏光二色性の値は文献例に従って分子楕円率（［θ］）に変換した。
【非特許文献３】日本生化学会編、生化学実験講座二巻、核酸の化学ＩＩＩ、東京化学同人
【００３７】
また、本発明者らによる既述の非特許文献１３に記載の情報からβ−１，３−グルカン／ポリ（Ｃ）複合体が形成されると２７５ｎｍの分子楕円率の増大と２４５ｎｍへの新しいバンドの出現が観察されることが明らかとなっている。
【００３８】
得られたスペクトルを図２に示す。図２に表されたスペクトルはこの複合体形成に伴う変化を明瞭に示しており、側鎖調整シゾフィランとポリ（Ｃ）の間で同様の複合体が形成されたことが確認された。
【００３９】
実施例６
側鎖調整多糖とポリ（Ｃ）複合体の融解挙動  実施例４において調製した溶液のＣＤスペクトルの温度依存性測定を行った。図３に得られたＣＤスペクトルの２７５ｎｍにおける分子楕円率を温度に対してプロットしたデータを示す。●はポリ（Ｃ）のみの場合、○はポリ（Ｃ）／ＳＰＧ複合体の場合、▲はポリ（Ｃ）／ＳＰＧ５０複合体の場合、△はポリ（Ｃ）／ＳＰＧ１００複合体の場合、■はポリ（Ｃ）／ＳＰＧ２５０複合体の場合、□はポリ（Ｃ）／ＳＰＧ５００複合体を示す。
【００４０】
図３に示す結果より、ポリ（Ｃ）／ＳＰＧ複合体と比較してポリ（Ｃ）／ＳＰＧ５０複合体は７．４℃、ポリ（Ｃ）／ＳＰＧ１００複合体は８．４℃、ポリ（Ｃ）／ＳＰＧ２５０複合体は１３．６℃、ポリ（Ｃ）／ＳＰＧ５００複合体は１４．１℃の安定性の上昇が確認され、側鎖率が減少するに連れて複合体の安定性が大きく向上することが明らかとなった。側鎖の割合に対して得られた複合体の融解温度（Ｔｍ）をプロットすると図４のような飽和型の曲線を示し、側鎖率を調整することで複合体の安定性を自在に制御できることが明らかとなった。
【００４１】
実施例７
側鎖調整多糖による安定化の塩濃度に対する耐性評価  本発明者らによる特許文献２および３に記載のように、β−１，３−グルカンは遺伝子キャリアーとして有用である。ここでは、生理条件下（［ＮａＣｌ］＝１４０〜１５０  ｍＭ）での側鎖調整多糖とポリ（Ｃ）複合体の安定性を評価した。０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭの３つの塩濃度において、これら複合体の融解温度と同様な複合体の安定化効果をもたらすことが知られる３７％アミノ基修飾シゾフィラン（比較例１）とポリ（Ｃ）複合体の融解温度を比較した。
【００４２】
図５に各複合体の融解温度の変化を示す。○はポリ（Ｃ）／ＳＰＧ複合体の場合、△はポリ（Ｃ）／ＳＰＧ１００複合体の場合、□はポリ（Ｃ）／ＳＰＧ５００複合体の場合、×はポリ（Ｃ）／３７％アミノ基修飾シゾフィランを示す。側鎖調整シゾフィランは生理条件下においても、さらには、それ以上の高塩濃度まで複合体の安定性が維持されているのに対してアミノ基修飾シゾフィランでは高塩濃度での安定性はそれほど維持されないことがわかる。従って、本発明に従う側鎖調整多糖は生理条件下においても有効な安定性を提供し得ることが明らかとされた。
【００４３】
実施例８
側鎖調整多糖とポリ（Ｃ）複合体の酵素耐性の評価  側鎖調整シゾフィランをそれぞれジメチルスルホキシドに０．５ｇ／ｄＬとなるように溶解させ、純水１８１２μＬ、１００ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）２４０μＬ、０．１ｇ／ｄＬのポリ（Ｃ）水溶液７８μＬ、１．２Ｍの食塩水２０μＬ、ジメチルスルホキシド１７９μＬのそれぞれを混合した溶液へ２１μＬ添加し、２日間以上冷蔵庫内にて熟成させた。この方法で調製された溶液はすべて透明で、均一であった。
【００４４】
この溶液を紫外可視分光計のセルホルダー内で１０分間、３７℃で恒温した後、１．２ｍｇ／ＬのリボヌクレアーゼＡ溶液５μＬを加え、ポリ（Ｃ）の極大吸収波長である２６０ｎｍの吸光度の時間変化測定を行った。吸光度の上昇はリボヌクレアーゼＡによるポリ（Ｃ）の加水分解による深色効果によるものである。図６に２６０ｎｍの吸光度の時間変化を示す。ここで、２６０ｎｍの吸光度変化はポリ（Ｃ）の分解により生じたシチジンモノリン酸の生成量に対応していることから、縦軸は分解の割合を示している。
【００４５】
図６よりポリ（Ｃ）／ＳＰＧはポリ（Ｃ）のみよりも大きく加水分解を抑制しているが、ポリ（Ｃ）／ＳＰＧ１００、ポリ（Ｃ）／ＳＰＧ５００と側鎖が失われるに連れてその加水分解耐性が上昇していることがわかる。すなわち、本発明に従う側鎖調整多糖と核酸の複合体は熱力学的安定性のみならず、酵素に対する耐性も向上していることがわかる。
【００４６】
【発明の効果】
以上の記述から明らかなように、本発明の複合体は、生理条件下における安定性が高く、優れた遺伝子キャリアー等として、遺伝子治療、生化学物質の分離等の遺伝子工学の分野で利用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】側鎖調整多糖の合成スキーム例を示す。
【図２】５℃におけるポリ（Ｃ）と側鎖調整多糖のＣＤスペクトルを示す。
【図３】ポリ（Ｃ）と側鎖調整多糖複合体の融解曲線を示す。
【図４】側鎖率と複合体の融解温度との関係を示す。
【図５】高塩濃度における側鎖調整多糖とポリ（Ｃ）複合体の安定性の変化、および、比較例として用いた３７％アミノ基修飾シゾフィランとポリ（Ｃ）複合体の安定性の変化の比較を示す。
【図６】側鎖調整多糖とポリ（Ｃ）複合体のリボヌクレアーゼＡに対する加水分解の様子を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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