(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物の抗菌剤に対する高度耐性化に関与する遺伝子及びその遺伝子産物を提供する。【解決手段】スタフィロコッカス属に属する微生物において発現した場合に該微生物をオキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上に薬剤耐性化する特定のポリペプチド、及びその遺伝子を提供する。又、これらを利用した薬剤耐性化を抑制する物質のスクリーニング法も提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１で特定されるポリペプチド。
【請求項２】
スタフィロコッカス属に属する微生物において発現した場合に該微生物をオキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上に薬剤耐性化する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ｍｅｃＡ遺伝子を有する微生物をオキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上に薬剤耐性化する作用を有する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
スタフィロコッカス属に属する微生物において発現した場合に該微生物をオキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上に薬剤耐性化する作用を有するポリペプチドであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項５】
ｍｅｃＡ遺伝子を有する微生物をオキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上に薬剤耐性化する作用を有する請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
スタフィロコッカス属に属する微生物が黄色ブドウ球菌である請求項２ないし５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列表の配列番号２で特定されるポリヌクレオチドである請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターで形質転換された微生物。
【請求項１１】
スタフィロコッカス属に属する微生物である請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
黄色ブドウ球菌である請求項１０に記載の微生物。
【請求項１３】
ｍｅｃＡ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌である請求項１０に記載の微生物。
【請求項１４】
微生物の内在性ゲノムＤＮＡにおいて請求項７又は８に記載のポリヌクレチドを含む遺伝子をノックアウトした微生物。
【請求項１５】
スタフィロコッカス属に属する微生物である請求項１４に記載の微生物。
【請求項１６】
黄色ブドウ球菌である請求項１４に記載の微生物。
【請求項１７】
ｍｅｃＡ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌である請求項１４に記載の微生物。
【請求項１８】
請求項７又は８に記載のポリヌクレチドを含む遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
（Ａ）請求項１０ないし１３のいずれか１項に記載の微生物を被検物質及び少なくとも１種の抗菌剤の存在下で培養する工程（ただし該抗菌剤の濃度は上記微生物の最小発育阻止濃度を下回る濃度である）；及び
（Ｂ）上記工程（Ａ）において微生物の増殖が阻止された場合には、該被検物質が上記遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質であると判定する工程
を含む方法。
【請求項１９】
さらに下記の工程：
（Ｃ）請求項１４ないし１７のいずれか１項に記載の微生物を被検物質及び少なくとも１種の抗菌剤の存在下で培養する工程（ただし該抗菌剤の濃度は上記微生物の最小発育阻止濃度を下回る濃度である）
を含む方法。
【請求項２０】
請求項７又は８に記載のポリヌクレチドを含む遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のポリペプチドに相互作用する物質をスクリーニングする工程を含む方法。
【請求項２１】
請求項１８ないし２０のいずれか１項に記載のスクリーニング方法でスクリーニングされた請求項７又は８に記載のポリヌクレチドを含む遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質。
【請求項２２】
薬剤耐性を獲得した微生物を脱薬剤耐性化させるための医薬であって、請求項２１に記載の物質を有効成分として含む医薬。
【請求項２３】
オキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上の薬剤耐性を有する黄色ブドウ球菌感染症の予防及び／又は治療に用いる請求項２２に記載の医薬。
【請求項２４】
請求項２１に記載の物質と少なくとも１種の抗菌剤とを含む医薬組成物。
【請求項２５】
オキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上の薬剤耐性を有する黄色ブドウ球菌感染症の予防及び／又は治療に用いる請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項７又は８に記載のポリヌクレチドを含む遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質をスクリーニングするためのキットであって、請求項１０ないし１３のいずれか１項に記載の微生物と請求項１４ないし１７のいずれか１項に記載の微生物とを含むキット。
【請求項２７】
さらに少なくとも１種の抗菌剤を含む請求項２６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、黄色ブドウ球菌などのスタフィロコッカス属に属する微生物の薬剤耐性化に関与する遺伝子及び該遺伝子産物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペニシリン系抗生物質、セフェム系抗生物質、カルバペネム系抗生物質などのβ−ラクタム系抗生物質に薬剤耐性を獲得したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ：ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、以下、本明細書において「ＭＲＳＡ」と略す。）は、院内感染の主要な原因菌である。ＭＲＳＡ感染症治療は、もっぱらバンコマイシンなどのグリコペプチド系抗生物質に頼ってきたが、１９９７年以降、グリコペプチド系抗生物質にも低感受性であるＭＲＳＡ株（ｌｏｗ−ｌｅｖｅｌ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ［Ｌ−ＶＲＳＡ］又はｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ［ＶＩＳＡ］）が、日本、米国、フランス、韓国、南アフリカ、ブラジルなどの世界各国で検出されるようになった（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，  Ｋ．，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  １，  １４７−１５５，  ２００１）。さらに、２００２年には米国でバンコマイシンに対しても高度薬剤耐性を示すＭＲＳＡ株（ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ［Ｈ−ＶＲＳＡ］又はｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ［ＶＲＳＡ］）が分離され、医療現場では大きな問題となっている（ＣＤＣ，  ＭＭＷＲ，  ５１，  ５６５−５６７，  ２００２）。また、近年、市中におけるＭＲＳＡ株の蔓延も問題になりつつあり（Ｎａｉｍｉ，  Ｔ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  ３３，  ９９０−９９６，  ２００１）、適正な薬剤の使用に基づく治療法や除菌法の確立が望まれている。
【０００３】
黄色ブドウ球菌においてメチシリン耐性を引き起こす主要遺伝子は、本来黄色ブドウ球菌には存在しなかった外来性のｍｅｃＡであり、その遺伝子にコードされるｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２’  （ＰＢＰ２’）の構成的な発現によって、ほとんどのβ−ラクタム系抗菌薬に対する薬剤耐性が付与される（Ｓｏｎｇ，  Ｍ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２２１，  １６７−１７１，  １９８７）。しかし、黄色ブドウ球菌に強い抗菌力を持った一部のβ−ラクタム系抗菌薬（イミペネム、セフメタゾール、フロモキセフなど）は、ＰＢＰ２’の発現があっても、なお臨床的に有効な抗菌活性を示す場合がある。それは、ＰＢＰ２’の発現のみでは高度薬剤耐性にならないことと関係する。
【０００４】
ＭＲＳＡにおける高度薬剤耐性の発現には、ｍｅｃＡ遺伝子にコードされるＰＢＰ２’の発現に加え、当該菌の染色体上の他遺伝子（あるいはそれにコードされる蛋白質）の関与が必要であるとされており（Ｒｙｆｆｅｌ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，  ３８，  ７２４−７２８，  １９９４）、その探索が種々の方策によって行われてきた。これまでに、ｆｅｍ遺伝子群やａｕｘ遺伝子群などが見出されてきたが、これらの遺伝子を感受性菌に導入することによって明らかに薬剤耐性度が亢進することは証明されていない（Ｂｅｒｇｅｒ−Ｂａｃｈｉ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｔｓｃｈｉｅｒｓｋｅ，  Ｄｒｕｇ  Ｒｓｉｓｔ．  Ｕｐｄａｔｅｓ，  １，  ３２５−３３５，  １９９８）。このような事実から、ＭＲＳＡにおける高度薬剤耐性に関与する他の遺伝子の存在が予想されるものの、その遺伝子は未だ特定されていない。
【非特許文献１】Ｒｙｆｆｅｌ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，  ３８，  ７２４−７２８，  １９９４
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｅｒ−Ｂａｃｈｉ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｔｓｃｈｉｅｒｓｋｅ，  Ｄｒｕｇ  Ｒｓｉｓｔ．  Ｕｐｄａｔｅｓ，  １，  ３２５−３３５，  １９９８
【０００５】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、黄色ブドウ球菌の薬剤耐性化に関与する遺伝子及び該遺伝子の遺伝子産物を提供することにある。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、配列表の配列番号１に示すポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする遺伝子が黄色ブドウ球菌を含むスタフィロコッカス属に属する微生物における薬剤耐性化に関与していることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００６】
すなわち、本発明により、配列表の配列番号１で特定されるポリペプチドが提供される。このポリペプチドは、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物において発現した場合に該微生物をオキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上に薬剤耐性化する作用を有しており、特に、ｍｅｃＡ遺伝子を有する該微生物をオキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上に薬剤耐性化する作用を有している。スタフィロコッカスに属する微生物としては、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）又は表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）が挙げられ、これらのうち黄色ブドウ球菌が好ましい。
【０００７】
また、本発明により、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物において発現した場合に該微生物をオキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上に薬剤耐性化する作用を有するポリペプチドであって、好ましくはｍｅｃＡ遺伝子を有する微生物をオキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上に薬剤耐性化する作用を有するポリペプチドであって、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸が欠失、置換、又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供される。
【０００８】
さらに、本発明により、上記の各ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及び該組換えベクターにより形質転換された微生物が提供される。該微生物としては、好ましくはスタフィロコッカス属に属する微生物、より好ましくは黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌、さらに好ましくは黄色ブドウ球菌が例示され、これらのうちｍｅｃＡ遺伝子を有する微生物が好ましい。また、微生物の内在性ゲノムＤＮＡにおいて上記ポリヌクレチドを含む遺伝子をノックアウトした微生物、好ましくはスタフィロコッカス属に属する微生物も本発明により提供される。このような微生物として、より好ましくは黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌、さらに好ましくは黄色ブドウ球菌が例示される
【０００９】
別の観点からは、本発明により、上記のポリヌクレオチドを含む遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
（Ａ）上記の組換えベクターで形質転換された微生物、好ましくは上記の組換えベクターで形質転換され、かつｍｅｃＡ遺伝子を有する微生物を被検物質及び少なくとも１種の抗菌剤の存在下で培養する工程（ただし該抗菌剤の濃度は上記形質転換微生物の最小発育阻止濃度を下回る濃度である）；及び
（Ｂ）上記工程（Ａ）において微生物の増殖が阻止された場合には、該被検物質が上記遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質であると判定する工程
を含む方法が提供される。上記方法において、対照として、下記の工程：（Ｃ）形質転換に用いる微生物の内在性ゲノムＤＮＡにおいて上記ポリヌクレチドを含む遺伝子をノックアウトした微生物を抗菌剤及び被検物質の存在下で培養する工程（ただし該抗菌剤の濃度は上記遺伝子ノックアウト微生物の最小発育阻止濃度を下回る濃度である）を加えてもよい。この工程を付加することにより、ポリヌクレオチドを含む遺伝子を標的として選択的な抑制作用を発揮する物質をスクリーニングすることができる。
【００１０】
また、本発明により、上記工程（Ａ）及び（Ｃ）で定義された各微生物を含むキット、好ましくはさらに１種以上の抗菌剤を含むキットも提供される。さらに、本発明により、上記のポリヌクレオチドを含む遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、上記のポリペプチドと相互作用する物質をスクリーニングする工程を含む方法が提供される。
【００１１】
さらに別の観点からは、本発明により、上記のスクリーニング方法によりスクリーニングされた上記の物質が提供される。この物質を有効成分として含む医薬は、薬剤耐性を獲得した微生物を脱薬剤耐性化させるための医薬として、あるいは抗菌剤の作用を増強するための医薬として有用であり、少なくとも１種の抗菌剤の投与と同時に、あるいは時間を変えて投与することにより、微生物感染症、好ましくはオキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上の薬剤耐性を有する黄色ブドウ球菌感染症の予防及び／又は治療に用いることができる。また、上記のスクリーニングによりスクリーニングされた物質と少なくとも１種の抗菌剤を含む医薬組成物は、微生物感染症の予防及び／又は治療のための医薬組成物として有用であり、特にオキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上の薬剤耐性を有する黄色ブドウ球菌感染症の予防及び／又は治療に有用である。
【００１２】
また、別の観点からは、微生物感染症の予防及び／又は治療方法であって、上記物質の有効量と少なくとも１種の抗菌剤の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；オキサシリンの最小発育阻止濃度が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上の薬剤耐性を有する微生物を脱薬剤耐性化させる方法であって、上記物質の有効量を該微生物に接触させる工程を含む方法；微生物の抗微生物薬に対する感受性を増大させる方法であって、上記物質の有効量を該微生物に接触させる工程を含む方法；及び、抗菌剤の作用を増強する方法であって、上記抑制物質の有効量を少なくとも１種の抗菌剤と同時に、又は時間を変えてヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
配列表の配列番号１のポリペプチドをコードする配列番号２のポリヌクレオチドを導入したメチシリン感受性ないし軽度メチシリン耐性の黄色ブドウ球菌は、後述の実施例に示すようにβ−ラクタム系抗生物質に対して高度薬剤耐性を獲得する。本明細書において「高度薬剤耐性」又は「高度耐性」あるいはその類義語は、ある微生物が、オキサシリンの最小発育阻止濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：  ＭＩＣ）が６４μｇ／ｍｌ以上及び／又はイミペネムの発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ以上の薬剤耐性を有する場合を意味している。また、染色体上の配列番号１のポリペプチドをコードする配列番号２のポリヌクレオチドを含む遺伝子をノックアウトした黄色ブドウ球菌株は、後述の実施例に示すようにβ−ラクタム系抗生物質に対する薬剤耐性が軽減する。これらの事実から、配列表の配列番号１により特定される本発明のポリヌクレオチドは、β−ラクタム系抗生物質に対して感受性ないし軽度の薬剤耐性を獲得した微生物を高度薬剤耐性化させる作用を有していると理解できる。
【００１４】
特に、本発明のポリペプチドは、メチシリンに対する耐性に関与するｍｅｃＡ遺伝子を有する微生物における高度薬剤耐性化に関与することが証明されている。例えば、黄色ブドウ球菌のなかにはｍｅｃＡ遺伝子を有するものの、ＰＢＰ２’を発現していない微生物の存在が知られているが（例えば実施例に示されたＮ３１５株など）、このような微生物において上記ポリペプチドが過剰発現すると、その微生物は高度薬剤耐性になる。
【００１５】
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、配列番号１のポリペプチドをコードする遺伝子は黄色ブドウ球菌の染色体に普遍的に存在しており、バイオインフォマティクス解析によると、該ポリペプチドは既知の転写制御因子蛋白質に類似し、ＭａｒＲファミリーに属するものと推察される。また、配列番号１のポリペプチドと高い相同性を有するポリペプチドは、例えば、スタフィロコッカス属に属する表皮ブドウ球菌にも見出される（アミノ酸として９４％の相同性を有する）。従って、本発明の上記ポリペプチドがスタフィロコッカス属に属する微生物において過剰発現した場合には、該微生物を高度薬剤耐性化すると考えることができる。このような微生物としては、黄色ブドウ球菌のほか、表皮ブドウ球菌を好ましい例として挙げることができる。これらのうち好ましいのは黄色ブドウ球菌であり、ｍｅｃＡ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌が最も好ましい。
【００１６】
また、上記の観点から、本発明により、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１ないし数個（例えば１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、さらに好ましくは１ないし５個、特に好ましくは１ないし３個程度）のアミノ酸が欠失、置換、又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「改変ポリペプチド」と呼ぶ場合がある）であって、スタフィロコッカス属に属する微生物において過剰発現した場合に該微生物を高度薬剤耐性化する作用を有するポリペプチドが提供される。このような微生物として、例えば黄色ブドウ球菌のほか、表皮ブドウ球菌を好ましい例として挙げることができる。これらのうち好ましいのは黄色ブドウ球菌であり、ｍｅｃＡ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌が最も好ましい。改変ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上のホモロジーを有することが望ましい。改変ポリペプチドが所望の作用を有するか否かは、実施例に具体的に記載された方法に従って該改変ポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えベクターを調製し、該組換えベクターにより微生物を形質転換してその微生物の性質を調べることにより容易に確認可能である。
【００１７】
本発明の範囲には、配列表の配列番号１により特定されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び上記の改変ポリペプチドのほか、これらのポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドも包含される。このようなポリペプチドは、好ましくは全長（アミノ酸残基数）が１５０ないし１，０００程度、より好ましくは１５０ないし５００程度である。特定のアミノ酸配列を部分配列として有する蛋白質の発現方法は当業者に周知かつ慣用であり、当業者は本発明の上記ポリペプチドを部分配列として含むポリペプチドを容易に入手可能である。
【００１８】
配列表の配列番号１により特定されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一例を配列表の配列番号２に示すが、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはこの特定の態様に限定されるものではなく、該ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドはすべて本発明の範囲に包含されることを理解すべきである。また、上記の改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される（以下、配列表の配列番号１に示されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び改変ポリペプチドをコードする任意のポリペプチドを「本発明のポリヌクオチド」と呼ぶ場合がある）。本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ及びＲＮＡを包含する概念である。さらに、本発明のポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される、その好ましい例として、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを挙げることができる。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターの製造方法は、本明細書の実施例に具体的に記載されており、当業者は容易に所望の組換えベクターを調製することができる。ベクターの種類は特に限定されないが、微生物、とりわけスタフィロコッカス属に属する微生物の形質転換に用いられるベクターを選択するのがよい。また、組換えベクターにより微生物を形質転換する方法も当業者に周知かつ慣用であり、例えば、エレクトロポレーション法、超音波法、界面活性剤法などの遺伝子導入方法として利用可能ないかなる方法により形質転換体を製造してもよい。これらの方法の一例は本明細書の実施例に具体的に示されており、当業者は本発明の形質転換体を容易に製造できる。形質転換すべき微生物の種類は特に限定されないが、スタフィロコッカス属に属する微生物であることが好ましく、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌がより好ましく、特に好ましいのは黄色ブドウ球菌である。これらのうち、ｍｅｃＡ遺伝子を有する微生物は形質転換のための好ましい対象である。
【００２０】
また、スタフィロコッカス属に属する微生物の内在性ゲノムＤＮＡにおいて、配列表の配列番号１により特定されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び上記の改変ポリペプチドをコードする遺伝子をノックアウトした微生物も本発明により提供される。このような微生物として、より好ましくは黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌、さらに好ましくは黄色ブドウ球菌が例示される。ｍｅｃＡ遺伝子を有する微生物を対象とすることが好ましい。
【００２１】
遺伝子ノックアウトを行うためには、例えば、微生物の内在性ゲノムＤＮＡの所望の部位を人為的に修飾する遺伝子ターゲティング法を利用することができる。この方法は、微生物の生体内で自然に起こり得る遺伝子相同組換えを微生物の染色体上に存在する内在性ゲノムＤＮＡと外来性ターゲティングＤＮＡ（ターゲティングベクター）との間で人為的に起こさせることにより、内在性ゲノムＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列中に該外来性ターゲティングＤＮＡ中に含まれる所望の外来性遺伝子を組込むことを基本原理としている。ターゲティングＤＮＡの構造を適切に設計することにより、例えば、該標的ＤＮＡ配列と外来性遺伝子との置換により該標的ＤＮＡ配列を欠失させると同時に該外来性遺伝子を挿入することができ、その結果、該標的ＤＮＡを含む遺伝子のｍＲＮＡへの転写が阻害され、該遺伝子がコードする蛋白質の発現が阻害される。本発明の遺伝子のノックアウトは、上記の相同組換え法により行うことができ、その具体例は本明細書の実施例に詳細に説明されているので、当業者は所望の遺伝子ノックアウト微生物を容易に調製することが可能である
【００２２】
本発明により提供されるスクリーニング方法は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質をスクリーニングする方法として利用可能であり、典型的には以下の工程：
（Ａ）本発明のポリヌクレオチドを含む上記の組換えベクターで形質転換された微生物を被検物質及び少なくとも１種の抗菌剤の存在下で培養する工程（ただし該抗菌剤の濃度は上記形質転換微生物の最小発育阻止濃度を下回る濃度である）；及び
（Ｂ）上記工程（Ａ）において微生物の増殖が実質的に阻止された場合には、該被検物質が上記遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質であると判定する工程
を含んでいる。また、上記の工程に加えて、下記の工程：（Ｃ）工程（Ａ）の形質転換に用いる微生物の内在性ゲノムＤＮＡにおいて本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をノックアウトした微生物を被検物質及び少なくとも１種の抗菌剤の存在下で培養する工程（ただし該抗菌剤の濃度は上記遺伝子ノックアウト微生物の最小発育阻止濃度を下回る濃度である）
を対照のために加えてもよい。
【００２３】
上記のスクリーニング方法において、該微生物はスタフィロコッカス属に属する微生物であることが好ましく、黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌がより好ましく、特に好ましいのは黄色ブドウ球菌である。これらの微生物のうち、ｍｅｃＡ遺伝子を有する微生物が特に好ましく用いられる。上記方法に用いる抗菌剤としては、例えば、微生物のＰＢＰ２’による薬剤耐性獲得に伴って抗菌力が低下する抗菌剤を好ましく用いることができ、例えば、β−ラクタム系抗生物質（セフェム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、ペネム系抗生物質、カルバペネム系抗生物質などを包含する）を例示することができる。工程（Ａ）において培養に用いる抗菌剤の濃度としては、形質転換微生物の最小発育阻止濃度を下回る濃度を選択する必要があるが、最小発育阻止濃度は、ディスク法などの通常の抗菌力判定方法により容易に決定することができる。好ましくは、最小発育阻止濃度を下回り、かつなるべく高い濃度となるように抗菌剤の濃度を選択することができる。工程（Ｃ）における抗菌剤の濃度も同様である。例えば、形質転換微生物の最小発育阻止濃度を測定するために抗菌剤の２倍希釈系列を用いる場合には、最小発育阻止濃度を与えた濃度の１／２希釈濃度の抗菌剤を用いることができる。もっとも、このような濃度が当業者に適宜選択可能であることは言うまでもない。
【００２４】
上記スクリーニング方法の工程（Ａ）において微生物の増殖が実質的に阻止された場合には、該被検物質が上記遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質であると判定できる。薬剤耐性化の抑制とは、薬剤耐性の獲得の抑制、薬剤耐性の軽減などを含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。また、上記工程（Ｃ）において微生物の増殖が阻止されないことを確認することがさらに好ましい。工程（Ｃ）を含むスクリーニング方法によりスクリーニングされた物質は、上記遺伝子を直接又は間接の作用点としており、上記遺伝子が関与する薬剤耐性化を選択的に抑制する物質である。
【００２５】
上記の抑制作用を有する物質は、微生物の薬剤耐性化を抑制することができるほか、薬剤耐性を獲得した微生物を脱薬剤耐性化させ、及び／又は薬剤耐性を獲得した微生物の抗菌剤に対する感受性を回復させる。従って、上記抑制物質を有効成分として含む医薬は、微生物の薬剤耐性化の抑制のための医薬、又はすでに獲得された薬剤耐性の軽減のための医薬などとして、少なくとも１種の抗菌剤とともに微生物感染症の予防及び／又は治療のために用いることができる。
【００２６】
また、本発明のポリヌクレチドを含む遺伝子が関与する薬剤耐性化の抑制物質をスクリーニングする別の方法として、本発明のポリペプチドと物理化学的な相互作用を有する物質をスクリーニングする方法を挙げることでできる。このようなスクリーニングによりスクリーニングされた物質は、本発明のポリペプチドを直接又は間接の作用点とする物質であって、本発明のポリヌクレチドを含む遺伝子が関与する薬剤耐性化を抑制する物質の候補として有用である。本発明のポリペプチドと核酸、蛋白質、又は低分子化合物との物理化学的相互作用を確認する方法としては当業界で利用可能な蛍光偏光解消法や表面プラズモン共鳴法等の手法を適宜利用することができる（例えば国際公開ＷＯ  ０１／１６６００に説明されている相互作用確認法などを利用可能である）。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
（Ａ）ＭＲＳＡの高度薬剤耐性に関与する候補遺伝子の選抜
本発明者らは、先に、黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株（ｐｒｅ−ＭＲＳＡ株：ｍｅｃＡ遺伝子を保有するが発現していない菌株）及びメチシリン高度耐性かつバンコマイシン低感受性の黄色ブドウ球菌Ｍｕ５０株のゲノム配列の決定及びその解析を報告している（Ｋｕｒｏｄａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３５７，  １２２５−  １２４０，  ２００１）。この解析に供したＮ３１５株ゲノム由来ＤＮＡ断片２１６６クローンを利用して全遺伝子を網羅するＤＮＡマイクロアレイを作製し、対数増殖期にあるＮ３１５株及びＭｕ５０株におけるｍＲＮＡ発現を網羅的に比較解析した。その結果、Ｍｕ５０株でその発現が２倍以上亢進している遺伝子の１０２種が同定された。これらをＭＲＳＡの高度薬剤耐性に関与する候補遺伝子として選抜した。
【００２８】
（Ｂ）遺伝子発現ベクターの構築と該ベクター導入黄色ブドウ球菌株の作製
上記（Ａ）で選抜した各種遺伝子のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片をそれぞれ、先に解明したゲノム配列に基づき設計したプライマーセットを用い、Ｍｕ５０株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって増幅した。次いで、得られたＤＮＡ断片を大腸菌−黄色ブドウ球菌シャトルベクターｐＹＴ３（Ｋｕｗａｈａｒａ−Ａｒａｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，  ４０，  ２６８０−２６８５，  １９９６；図１Ａ）のｔｅｔＬ遺伝子と同方向となるように、その３’側のＢａｍＨＩ部位にクローニングした（図１Ｂに例）。このようにｔｅｔＬ遺伝子下流に連結した遺伝子は、ｔｅｔＬ遺伝子のプロモーターによって発現することが確認されている。後述のＳＡ０６４１遺伝子を含むＤＮＡ断片は、５’−ＣＡＴＴＧＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＴＧ−３’の配列からなるセンスプライマー及び５’−ＣＴＡＡＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＡＴＧＧＡＡ−３’の配列からなるアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。以上のように構築した各種遺伝子発現ベクターをそれぞれＮ３１５株にエレクトロポレーション法によって導入し、ｐＹＴ３のｔｅｔＬ遺伝子の発現に基づくテトラサイクリン耐性を指標として、該ベクターを保持する菌株を獲得した。当該菌株は染色体上の遺伝子の発現に加え、導入した発現ベクター上の同遺伝子の発現が起こり、過剰発現体となる。
【００２９】
（Ｃ）各種遺伝子発現ベクター導入黄色ブドウ球菌株の薬剤感受性の解析
上記（Ｂ）で作製した各種遺伝子発現ベクター導入株の薬剤感受性は、オキサシリン及びイミペネムの最小発育阻止濃度を、Ｅｔｅｓｔ（登録商標、アスカ純薬株式会社、東京）及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ推奨の寒天平板希釈法で測定することによって解析した。その結果、ＳＡ０６４１遺伝子発現ベクターｐＹＴ６４１（図１Ｂ）を導入したＮ３１５−ｐＹＴ６４１株は、Ｎ３１５株及びｐＹＴ３のみ導入したＮ３１５−ｐＹＴ３株に比し、オキサシリンに対して８倍、及びイミペネムに対しては８ないし１６倍の薬剤耐性を示した（表１）。このように、ＳＡ０６４１遺伝子（配列番号２のポリヌクレオチド：以下、実施例においてこのポリヌクレオチドをＳＡ０６４１遺伝子と呼ぶ）がコードする蛋白質（配列番号１のポリペプチド）の過剰発現は、β−ラクタム系抗菌薬に対する高度耐性に寄与することが明らかとなった。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
例２
（Ａ）黄色ブドウ球菌ＳＡ０６４１遺伝子ノックアウト株の作成
ＳＡ０６４１遺伝子組換え用ベクターｐＹＴ△６４１（図２Ａ）を構築した。染色体上のＳＡ０６４１遺伝子両側のＤＮＡ断片、Ｌ−Ｊｕｎｃｔｉｏｎ及びＲ−Ｊｕｎｃｔｉｏｎをそれぞれ表２に示したプライマーＰ７とＰ７Ａ及びＰ８とＰ８ＳによるＰＣＲで増幅後、クロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔと共にｐＹＴ３（図１Ａ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に図２Ａのようにクローニングした。次いで、構築したベクターをＮ３１５株にエレクトロポレーション法で導入し、図２Ｂに示した染色体上遺伝子とｐＹＴ△６４１上遺伝子の組換えによって、ＳＡ０６４１遺伝子をｃａｔ遺伝子で置換した株Ｎ３１５−△６４１を作製した。その遺伝子置換（ＳＡ０６４１遺伝子ノックアウト）は、図２Ｂ中に配置を示したプライマーＰ１〜８（表２）を用いたＰＣＲによって確認した。Ｐ１とＰ６及びＰ５とＰ２の組合せによるＰＣＲでは期待される大きさのＰＣＲ産物が得られ、一方、Ｐ３とＰ４、Ｐ７とＰ４、Ｐ３とＰ８等の組合せではＰＣＲ産物は得られなかった。また、導入したベクターが残存するとｔｅｔＬ遺伝子の発現により菌株はテトラサイクリン耐性であるが、Ｎ３１５−△６４１株はテトラサイクリン感受性であることが確認された。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
（Ｂ）黄色ブドウ球菌ＳＡ０６４１遺伝子ノックアウト株の薬剤感受性の解析
上記（Ａ）で作製したＳＡ０６４１遺伝子ノックアウト株に対するオキサシリン及びイミペネムのＭＩＣをＥｔｅｓｔで測定した。その結果、ノックアウト株Ｎ３１５−△６４１は親株Ｎ３１５に比し、オキサシリン及びイミペネム、いずれに対しても２倍の感受性を示した（表３）。このように、ＳＡ０６４１遺伝子がコードする蛋白質は、過剰発現によってβ−ラクタム系抗菌薬に対する高度耐性に寄与することに加え、メチシリン感受性ないし軽度耐性の黄色ブドウ球菌においてもこれらの抗菌薬に対する耐性に関与することが明らかとなった。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
また、ノックアウト株Ｎ３１５−△６４１及び関連株のナフシリン感受性を、ディスク拡散法によって試験した。円形濾紙ディスクに１、１０、１００、又は５００  ｍｇ／Ｌのナフシリンを染み込ませ、全面に被験菌株を塗布したミュラーヒントン寒天平板上にそれらを置き、３７℃で一晩培養した。その結果を図３に示した。Ｎ３１５−△６４１株ではＮ３１５株の場合に比し、いずれの薬剤濃度のディスクでも周囲の菌増殖阻止円径が大きくなり、ナフシリンに対して感受性が増大していた。さらに、Ｎ３１５株の場合には阻止円内部に、突然変異による高度薬剤耐性株の出現の結果と考えられる孤立性の集落が多数生じたが、Ｎ３１５−△６４１株ではそれがほとんど認められなかった。また、同時に試験に供したＳＡ０６４１遺伝子発現ベクター導入株Ｎ３１５−  ｐＹＴ６４１では、Ｎ３１５株及びＮ３１５−ｐＹＴ３株の場合に比べて阻止円は極めて明瞭に縮小し、ナフシリンに対する耐性が明らかに増大していることが示され、実施例３の知見が異なる方法でも確認された。
【００３６】
例３：ＳＡ０６４１遺伝子又はその遺伝子産物の機能を抑制する物質のスクリーニング例１に示したように、Ｎ３１５−ｐＹＴ６４１株はＳＡ０６４１遺伝子がコードする蛋白質の過剰発現によって、例えばイミペネムに対して耐性となり、当該薬剤のＭＩＣは８  ｍｇ／Ｌである。一方、例２に示したように、Ｎ３１５−△６４１株はＳＡ０６４１遺伝子を欠損しているため、例えばイミペネムに対して感受性を示し、当該薬剤のＭＩＣは０．２５  ｍｇ／Ｌである。従って、Ｎ３１５−ｐＹＴ６４１株におけるＳＡ０６４１遺伝子の発現若しくはその機能を抑制することにより、及び／又はその遺伝子産物（ＳＡ０６４１蛋白質と呼ぶ）の発現若しくはその機能を抑制することにより、該菌株に対するイミペネムのＭＩＣをＮ３１５−△６４１株に対するＭＩＣのレベルに低下させることができる。そして、この抑制作用を有する物質のスクリーニングは、例えばイミペネムを用いて、次の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む方法によって行うことができる。
（Ａ）Ｎ３１５−ｐＹＴ６４１株を被験物質及び８  ｍｇ／Ｌ未満、好ましくは１〜４  ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．２５〜１  ｍｇ／Ｌのイミペネム存在下で培養する。
（Ｂ）Ｎ３１５−  ｐＹＴ６４１株の増殖を阻害する被験物質を選抜する。
【００３７】
上記の方法には、さらに以下の工程（Ｃ）を加えてもよい。
（Ｃ）Ｎ３１５−△６４１株を同被験物質及び０．２５  ｍｇ／Ｌ未満、好ましくは０．０３〜０．１２５  ｍｇ／Ｌのイミペネム存在下で培養する。
この場合、Ｎ３１５−△６４１株の増殖を阻害しないが、Ｎ３１５−  ｐＹＴ６４１株の増殖を阻害する被験物質を選抜することにより、ＳＡ０６４１遺伝子の発現若しくはその機能、及び／又はＡ０６４１蛋白質の発現若しくはその機能を選択的に抑制する物質をスクリーニングすることができる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の遺伝子は、黄色ブドウ球菌を含むスタフィロコッカス属に属する微生物の高度薬剤耐性化に関与しており、この遺伝子又は遺伝子産物の発現や機能を抑制することによって、微生物を脱薬剤耐性化させ、各種の抗菌剤に対する感受性を高めることが可能になる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌−黄色ブドウ球菌シャトルベクターｐＹＴ３及びＳＡ０６４１遺伝子発現ベクターｐＹＴ６４１の概略を示した図である。図中、（Ａ）はシャトルベクターｐＹＴ３、（Ｂ）はＳＡ０６４１遺伝子発現ベクターｐＹＴ６４１を示す。
【図２】黄色ブドウ球菌の染色体上ＳＡ０６４１遺伝子の組換えに用いたベクターｐＹＴ△６４１の概略、並びにＳＡ０６４１遺伝子ノックアウトの概略及びその確認に用いたＰＣＲプライマーの配置を示した図である。図中、（Ａ）はベクターｐＹＴ△６４１、（Ｂ）はＳＡ０６４１遺伝子ノックアウト及びＰＣＲプライマーを示す。
【図３】ＳＡ０６４１遺伝子ノックアウト株Ｎ３１５−△６４１及び関連株のナフシリン感受性をディスク拡散法によって試験した結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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