(57)【要約】      （修正有）【課題】示差的に発現される遺伝子を伴う疾患の処置のための治療ストラテジーを開発するために、示差的に発現される遺伝子における調節因子結合部位を同定及び特徴付けるための方法の開発。【解決手段】示差的に発現される遺伝子の統計的分析方法であって：（ａ）示差的に発現される遺伝子のセットを得る工程；（ｂ）該示差的に発現される遺伝子の調節領域を含むゲノム配列を、調節因子結合部位の存在についてスクリーニングする工程；および（ｃ）ゲノム規模のバックグラウンドまたは組織規模のバックグラウンドと比較して、該示差的に発現される遺伝子のセット内で富化された少なくとも１つの調節因子結合部位を同定する工程、を包含する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
示差的に発現される遺伝子の統計的分析方法であって：
（ａ）示差的に発現される遺伝子のセットを得る工程；
（ｂ）該示差的に発現される遺伝子の調節領域を含むゲノム配列を、調節因子結合部位の存在についてスクリーニングする工程；および
（ｃ）ゲノム規模のバックグラウンドまたは組織規模のバックグラウンドと比較して、該示差的に発現される遺伝子のセット内で富化された少なくとも１つの調節因子結合部位を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ）における富化が、前記遺伝子セット内で該工程（ｃ）において同定された前記調節結合部位または結合部位の発生の頻度または可能性と、ゲノム規模のバックグラウンドまたは組織規模のバックグラウンドでのそれらの発生の頻度または可能性とを比較する工程により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記示差的に発現される遺伝子のセットを得る前に、示差的に発現されるタンパク質のセットのタンパク質工学プロフィールが得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記示差的に発現される遺伝子のセットが、疾患、障害、または生物学的プロセスに特徴的な遺伝子発現プロフィールの一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患が、腫瘍、発癌、神経学的疾患、心臓血管疾患、腎臓疾患、感染疾患、消化疾患、代謝疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、皮膚疾患、および外傷または異常な骨の発達に伴う疾患からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍が癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳癌からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記障害が発達障害である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的プロセスが老化に関連する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記セットが、コントロールと比較して少なくとも約２倍の示差的な発現を示す遺伝子からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記セットが、コントロールと比較して少なくとも約４倍の示差的な発現を示す遺伝子からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記セットが、コントロールと比較して少なくとも約１０倍の示差的な発現を示す遺伝子からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記調節因子結合部位が、５’上流コアプロモーター領域、５’上流エンハンサー領域、イントロン領域、および３’調節領域からなる群より選択される領域内で同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記調節因子結合部位が、転写因子結合部位である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記転写因子が、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＰ−１、Ｅｌｋ、ＡＴＦ、ｃ−Ｅｔｓ−１、ｃ−Ｒｅｌ、ＣＲＦ、ＣＴＦ、ＧＡＴＡ−１、ＰＯＵ１Ｆ１、ＮＦ−κＢ、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＯＵ２Ｆ２、ｐ５３、Ｐａｘ−３、Ｓｐ１、ＴＣＦ、ＴＡＲ、ＴＦＥＢ、ＴＣＦ−１、ＴＦＩＩＦ、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３、Ｅ２Ｆ−４、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−１α、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、Ｓｐ３、Ｓｐ４、ＴＣＦ−４、ＡＰＣ、およびＳＴＡＴ５Ａからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記転写因子が、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３、ＮＦ−κＢ、Ｅｌｋ、ＡＰ−１、ｃ−Ｆｏｓ、およびｃ−Ｊｕｎからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも５０個の示差的に発現される遺伝子が分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１００個の示差的に発現される遺伝子が分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも５００個の示差的に発現される遺伝子が分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記富化された調節因子結合部位の同定に基づき、処置ストラテジーを設計する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記富化された調節因子結合部位が、少なくとも１つの転写因子により結合される転写因子結合部位である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
コンセンサス結合部位が、前記富化された転写因子結合部位に基づき同定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記処置ストラテジーが、二本鎖オリゴヌクレオチドデコイの設計に基づき、該デコイは、前記富化された結合部位と、対応する転写因子への結合について競合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記処置ストラテジーが、前記富化された結合部位に結合するよう設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
コンセンサス調節因子結合部位を設計する方法であって、ゲノム規模のコントロールまたは組織規模のコントロールと比較して示差的に発現される遺伝子のセット内で富化された調節因子結合部位を同定する工程、および該示差的に発現される遺伝子のセット内で富化された該調節因子結合部位により共有されるヌクレオチドから本質的になるコンセンサス調節因子結合部位を設計する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
示差的に発現される遺伝子のセットを含む生物学的サンプル中の調節因子結合部位の富化を分析する方法であって、該遺伝子セット内での該調節結合部位の発生の頻度または可能性と、参照サンプル中でのその発生の頻度または可能性を比較する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記生物学的サンプルが組織サンプルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組織が腫瘍細胞を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記組織が癌細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌が、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳癌からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記参照サンプルが、同一組織型の正常組織である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記参照サンプルがヒトゲノムである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物学的サンプルが生物学的流体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記富化が、超幾何学的分布分析を使用することによって決定される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、差示的に発現される遺伝子の調節因子結合部位の統計的分析に関する。より詳細には、本発明は、差示的に発現される遺伝子を伴う疾患の処置のための治療ストラテジーを開発するために、差示的に発現される遺伝子における調節因子（例えば、転写因子）結合部位を同定および特徴付けるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新規治療標的を同定するための主要なアプローチの１つは、差示的遺伝子発現の研究であり、このアプローチは、代表的に、正常サンプルと、罹患した生物学的サンプルとを、または異なる段階の特定の疾患または病理学的状態を示す生物学的サンプルとを、比較する。一般に、差示的遺伝子発現を研究するために使用される方法は、ハイブリダイゼーション分析および／またはポリヌクレオチドの配列決定に基づき得る。サンプル中の差示的遺伝子発現の定量化のための、当該分野で公知の最も一般的に使用される方法としては、ノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーション（ＰａｒｋｅｒおよびＢａｒｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７−２８３（１９９９））；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３−２６４（１９９２））（例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ）およびマイクロアレイ分析が挙げられる。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体が使用され得る。配列決定ベースの遺伝子発現分析のための代表的な方法としては、遺伝子発現の連続分析（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）および大規模並列シグネチャー配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析が挙げられる。
【０００３】
差示的遺伝子発現研究は、種々の生物学的プロセス（例えば、種々の癌、神経疾患、発達障害、加齢プロセス、感染症など）を示す、種々のヒト組織および生物学的サンプルに対して実施されてきた。
【非特許文献１】ＰａｒｋｅｒおよびＢａｒｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７−２８３（１９９９）
【非特許文献２】Ｗｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３−２６４（１９９２）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１．示差的に発現される遺伝子の統計的分析方法であって：
（ａ）示差的に発現される遺伝子のセットを得る工程；
（ｂ）該示差的に発現される遺伝子の調節領域を含むゲノム配列を、調節因子結合部位の存在についてスクリーニングする工程；および
（ｃ）ゲノム規模のバックグラウンドまたは組織規模のバックグラウンドと比較して、該示差的に発現される遺伝子のセット内で富化された少なくとも１つの調節因子結合部位を同定する工程、
を包含する、方法。
【０００５】
２．上記工程（ｃ）における富化が、上記遺伝子セット内で該工程（ｃ）において同定された上記調節結合部位または結合部位の発生の頻度または可能性と、ゲノム規模のバックグラウンドまたは組織規模のバックグラウンドでのそれらの発生の頻度または可能性とを比較する工程により決定される、項１に記載の方法。
【０００６】
３．上記示差的に発現される遺伝子のセットを得る前に、示差的に発現されるタンパク質のセットのタンパク質工学プロフィールが得られる、項１に記載の方法。
【０００７】
４．上記示差的に発現される遺伝子のセットが、疾患、障害、または生物学的プロセスに特徴的な遺伝子発現プロフィールの一部である、項１に記載の方法。
【０００８】
５．上記疾患が、腫瘍、発癌、神経学的疾患、心臓血管疾患、腎臓疾患、感染疾患、消化疾患、代謝疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、皮膚疾患、および外傷または異常な骨の発達に伴う疾患からなる群より選択される、項４に記載の方法。
【０００９】
６．上記腫瘍が癌である、項５に記載の方法。
【００１０】
７．上記癌が、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳癌からなる群より選択される、項６に記載の方法。
【００１１】
８．上記障害が発達障害である、項４に記載の方法。
【００１２】
９．上記生物学的プロセスが老化に関連する、項４に記載の方法。
【００１３】
１０．上記セットが、コントロールと比較して少なくとも約２倍の示差的な発現を示す遺伝子からなる、項１に記載の方法。
【００１４】
１１．上記セットが、コントロールと比較して少なくとも約４倍の示差的な発現を示す遺伝子からなる、項１に記載の方法。
【００１５】
１２．上記セットが、コントロールと比較して少なくとも約１０倍の示差的な発現を示す遺伝子からなる、項１に記載の方法。
【００１６】
１３．上記調節因子結合部位が、５’上流コアプロモーター領域、５’上流エンハンサー領域、イントロン領域、および３’調節領域からなる群より選択される領域内で同定される、項１に記載の方法。
【００１７】
１４．上記調節因子結合部位が、転写因子結合部位である、項１３に記載の方法。
【００１８】
１５．上記転写因子が、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＰ−１、Ｅｌｋ、ＡＴＦ、ｃ−Ｅｔｓ−１、ｃ−Ｒｅｌ、ＣＲＦ、ＣＴＦ、ＧＡＴＡ−１、ＰＯＵ１Ｆ１、ＮＦ−κＢ、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＯＵ２Ｆ２、ｐ５３、Ｐａｘ−３、Ｓｐ１、ＴＣＦ、ＴＡＲ、ＴＦＥＢ、ＴＣＦ−１、ＴＦＩＩＦ、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３、Ｅ２Ｆ−４、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−１α、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、Ｓｐ３、Ｓｐ４、ＴＣＦ−４、ＡＰＣ、およびＳＴＡＴ５Ａからなる群より選択される、項１４に記載の方法。
【００１９】
１６．上記転写因子が、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３、ＮＦ−κＢ、Ｅｌｋ、ＡＰ−１、ｃ−Ｆｏｓ、およびｃ−Ｊｕｎからなる群より選択される、項１５に記載の方法。
【００２０】
１７．少なくとも５０個の示差的に発現される遺伝子が分析される、項１に記載の方法。
【００２１】
１８．少なくとも１００個の示差的に発現される遺伝子が分析される、項１に記載の方法。
【００２２】
１９．少なくとも５００個の示差的に発現される遺伝子が分析される、項１に記載の方法。
【００２３】
２０．上記富化された調節因子結合部位の同定に基づき、処置ストラテジーを設計する工程をさらに包含する、項１に記載の方法。
【００２４】
２１．上記富化された調節因子結合部位が、少なくとも１つの転写因子により結合される転写因子結合部位である、項２０に記載の方法。
【００２５】
２２．コンセンサス結合部位が、上記富化された転写因子結合部位に基づき同定される、項２１に記載の方法。
【００２６】
２３．上記処置ストラテジーが、二本鎖オリゴヌクレオチドデコイの設計に基づき、該デコイは、上記富化された結合部位と、対応する転写因子への結合について競合する、項２０に記載の方法。
【００２７】
２４．上記処置ストラテジーが、上記富化された結合部位に結合するよう設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく、項２０に記載の方法。
【００２８】
２５．コンセンサス調節因子結合部位を設計する方法であって、ゲノム規模のコントロールまたは組織規模のコントロールと比較して示差的に発現される遺伝子のセット内で富化された調節因子結合部位を同定する工程、および該示差的に発現される遺伝子のセット内で富化された該調節因子結合部位により共有されるヌクレオチドから本質的になるコンセンサス調節因子結合部位を設計する工程を包含する、方法。
【００２９】
２６．示差的に発現される遺伝子のセットを含む生物学的サンプル中の調節因子結合部位の富化を分析する方法であって、該遺伝子セット内での該調節結合部位の発生の頻度または可能性と、参照サンプル中でのその発生の頻度または可能性を比較する工程を包含する、方法。
【００３０】
２７．上記生物学的サンプルが組織サンプルである、項２６に記載の方法。
【００３１】
２８．上記組織が腫瘍細胞を含む、項２７に記載の方法。
【００３２】
２９．上記組織が癌細胞を含む、項２８に記載の方法。
【００３３】
３０．上記癌が、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳癌からなる群より選択される、項２８に記載の方法。
【００３４】
３１．上記参照サンプルが、同一組織型の正常組織である、項２８に記載の方法。
【００３５】
３２．上記参照サンプルがヒトゲノムである、項２８に記載の方法。
【００３６】
３３．上記生物学的サンプルが生物学的流体である、項２６に記載の方法。
【００３７】
３４．上記富化が、超幾何学的分布分析を使用することによって決定される、項２６に記載の方法。
【００３８】
本発明は、生物学的サンプル（これは、種々の疾患、疾患状態および他の異常を示してもよいが、必ずしも示している必要はない）において同定された、多数の差示的に発現される遺伝子が、少数の調節因子（例えば、転写因子（ＴＦ））の転写活性における変化の結果であるという認識に基づく。
【００３９】
１局面において、本発明は、差示的に発現される遺伝子の統計的分析のための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）差示的に発現される遺伝子のセットを獲得する工程；
（ｂ）調節因子結合部位の存在について、この差示的に発現される遺伝子の調節領域を含むゲノム配列をスクリーニングする工程；および
（ｃ）ゲノム規模（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ）または組織規模（ｔｉｓｓｕｅ−ｗｉｄｅ）のバックグラウンドに関して、この差示的に発現される遺伝子のセット内に富化された、少なくとも１つの調節因子結合部位を同定する工程。
【００４０】
この差示的に発現される遺伝子のセットは、差示的な遺伝子発現またはタンパク質発現の研究の結果から獲得され得、従って、例えば、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲまたはプロテオミクスアプローチによって生成され得る。
【００４１】
工程（ｃ）において、富化は、例えば、この遺伝子セット内で工程（ｃ）において同定された調節結合部位の存在の頻度または可能性を比較することによって、決定され得る。
【００４２】
特定の実施形態において、差示的に発現される遺伝子のセットは、疾患、障害または生物学的プロセスの遺伝子発現プロフィール特徴の一部であり得る。遺伝子転写にかかわる全ての疾患、障害および生物学的プロセスとしては、限定ではなく、例えば、以下が挙げられる：腫瘍、発癌、神経学的疾患、心臓血管疾患、腎臓疾患、感染症、消化疾患、代謝疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、皮膚疾患、および外傷または異常な骨の発達に関連する疾患。代謝疾患としては、特に、限定ではなく、糖尿病、ならびに脂質代謝、炭水化物代謝およびカルシウム代謝の疾患が挙げられる。皮膚科学的疾患としては、特に、限定ではなく、創傷治癒を要する疾患が挙げられる。
【００４３】
さらに特定の実施形態において、この疾患は、癌（例えば、乳癌、腎臓癌、白血病、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、黒色腫および脳の癌であり得る）である。
【００４４】
別の実施形態において、この障害は、発達障害である。
【００４５】
なお別の実施形態において、差示的に発現される遺伝子によって示される生物学的プロセスは、加齢に関連する。
【００４６】
さらなる実施形態において、この遺伝子セットは、コントロールと比較して、少なくとも約２倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約１０倍の差示的発現を示す遺伝子からなる。
【００４７】
なおさらなる実施形態において、この調節因子結合部位は、５’側の上流コアプロモーター領域、５’側の上流エンハンサー領域、イントロン領域および／または３’側の調節領域内で同定される。
【００４８】
別の実施形態において、この調節因子結合部位は、転写因子結合部位を含む。限定ではなく、単なる例示として、この転写因子は、以下からなる群より選択され得る：ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＰ−１、Ｅｌｋ、ＡＴＦ、ｃ−Ｅｔｓ−１、ｃ−Ｒｅｌ、ＣＲＦ、ＣＴＦ、ＧＡＴＡ−１、ＰＯＵ１Ｆ１、ＮＦ−κＢ、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＯＵ２Ｆ２、ｐ５３、Ｐａｘ−３、Ｓｐｌ、ＴＣＦ、ＴＡＲ、ＴＦＥＢ、ＴＣＦ−１、ＴＦＩＩＦ、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３、Ｅ２Ｆ−４、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−１α、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、Ｓｐ３、Ｓｐ４、ＴＣＦ−４、ＡＰＣおよびＳＴＡＴ５Ａ。
【００４９】
特定の実施形態において、この転写因子は、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３、ＮＦ−κＢ、Ｅｌｋ、ＡＰ−１、ｃ−Ｆｏｓまたはｃ−Ｊｕｎである。
【００５０】
代表的には、多数の差示的に発現される遺伝子が分析される。従って、この分析は、少なくとも約１００の差示的に発現される遺伝子、または少なくとも約５００の差示的に発現される遺伝子にまで、拡張され得る。
【００５１】
さらなる局面において、本発明は、上記の方法によって富化された調節因子結合部位の同定に基づいて、処置ストラテジーを設計するための方法に関する。
【００５２】
特定の実施形態において、この富化された調節因子結合部位は、少なくとも１つの転写因子が結合する、転写因子結合部位である。
【００５３】
さらなる実施形態において、コンセンサス結合部位は、この富化された転写因子結合部位に基づいて同定される。
【００５４】
処置ストラテジーは、例えば、対応する転写因子に結合するためのこの富化された結合部位と競合する二本鎖オリゴヌクレオチドデコイの設計、または富化された転写因子のｍＲＮＡに結合するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに依存し得る。
【００５５】
異なる局面において、本発明は、コンセンサス調節因子結合部位を設計する方法に関し、この方法は、全ゲノムまたは全組織コントロールと比較して、差示的に発現される遺伝子のセット内で富化された調節因子結合部位を同定する工程、ならびに差示的に発現される遺伝子のセット内で富化された調節因子結合部位によって共有されるヌクレオチドから実質的になるコンセンサス調節因子結合部位を設計する工程、を包含する。
【００５６】
なお別の局面において、本発明は、差示的に発現される遺伝子のセットを含む生物学的サンプル中の調節因子結合部位の富化を分析する方法に関し、この方法は、参照サンプル中のその存在の頻度または可能性と、この遺伝子セット内の調節結合部位の存在の頻度または可能性を比較する工程を包含する。この統計的分析は、好ましくは、超幾何分布モデルを使用して実施される。
【００５７】
（発明の詳細な説明）
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
他に規定されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本願発明の属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  １９９４）およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  １９９２）は、本願において使用される多数の用語についての一般的指針を、当業者に提供する。
【００５８】
本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
【００５９】
用語「調節因子」は、広義で使用され、そして遺伝子のｍＲＮＡ転写プロセスに影響を与え得る任意の因子を含み得る。具体的には、転写因子がこの用語に含まれる。
【００６０】
用語「遺伝子調節配列」、「シス調節エレメント」、「シス作用調節エレメント」、「シス調節配列」および「シス作用調節配列」は、相互交換可能に使用され、そして遺伝子発現を制御する任意の調節配列をいい、限定ではなく、以下が挙げられる：５’調節領域および３’調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、転写終止シグナルおよびスプライシングシグナル）；イントロン領域、および遺伝子間領域、ならびに転写を調節する配列。具体的には、転写因子が会合するＤＮＡ認識配列（転写因子結合部位ともいう）が含まれる。
【００６１】
用語「転写因子結合部位」は、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の直前に位置する短いコンセンサスゲノム配列をいう。転写調節領域は、いくつかの結合部位を含み得、従って、いくつかの転写因子によって結合され得る。
【００６２】
「トランス因子」は、シス調節配列に結合するタンパク質である。
【００６３】
「転写因子」は、遺伝子の転写開始部位の近傍のＤＮＡに結合し、そしてＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始および維持を補助または阻害するかのいずれかであるタンパク質である。
【００６４】
「ＤＮＡ結合ドメイン」は、標的遺伝子中の転写開始部位の近傍の特定の塩基を認識する、転写因子内のアミノ酸残基をいう。
【００６５】
「転写開始部位（ＴＳＳ）」は、遺伝子のｍＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによってＤＮＡから転写され始める位置である。
【００６６】
用語「転写因子デコイ」または「デコイ」は、標的転写因子に特異的に結合し、それによって転写因子がそれらの標的遺伝子の転写を開始することを防止する、短い二本鎖のオリゴヌクレオチドをいうように、本明細書中で使用される。
【００６７】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の、ハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくはポリメラーゼヌクレオチドプローブの、並べられた配置をいう。
【００６８】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形または複数形で使用される場合、一般に、未改変のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。従って、例えば、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチドとしては、限定ではなく、以下が挙げられる：一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖であり得るか、あるいは一本鎖領域および二本鎖領域を含み得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子。さらに、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡＯの両方を含む、三重鎖領域をいう。このような領域中の鎖は、同じ分子由来または異なる分子由来であり得る。これらの領域は、１つ以上のこれらの分子の全てを含み得るが、より代表的には、いくつかのこれらの分子の領域のみを含み得る。三重らせん領域の分子の１つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、具体的にはｃＤＮＡを含む。この用語は、１つ以上の改変塩基を含む、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。従って、安定性または他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書中で意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、通常でない塩基（例えば、イノシン）または改変塩基（例えば、トリチウム化塩基）を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で定義されるような用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、未改変ポリヌクレオチドの、化学的、酵素的および／または代謝的に改変された形態の全て、ならびにウイルスおよび細胞（単細胞および複合細胞を含む）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００６９】
用語「オリゴヌクレオチド」は、比較的短いポリヌクレオチドをいい、限定ではなく、以下が挙げられる：一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖もしくは二本鎖のリボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡ。オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド）は、しばしば、化学的方法（例えば、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用する）によって、合成される。しかし、オリゴヌクレオチドは、種々の他の方法（インビトロ組換えＤＮＡ媒介技術を含む）によって、ならびに細胞および生物におけるＤＮＡの発現によって、作製され得る。
【００７０】
相互交換可能に使用される用語「差示的に発現される遺伝子」、「差示的遺伝子発現」およびこれらの類義語は、正常サンプルまたはコントロール（参照）サンプルにおけるその発現と比較して、疾患を被っている被験体から得られたサンプルにおいてより高いかまたは低いレベルにまでその発現が活性化される遺伝子をいう。この用語はまた、同じ疾患の異なる段階においてより高いかまたは低いレベルまでその発現が活性化される遺伝子を含む。差示的に発現される遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化されるかまたは阻害されるかのいずれかであり得るか、あるいは異なるポリペプチド産物を生じるように選択的スプライシングに供され得る。このような差異は、例えば、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌または他の分割の変化によって、証明され得る。差示的遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の比較、または２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の発現の比率の比較、または同じ遺伝子の２つの差示的にプロセスされた産物（これらは、正常な被験体と疾患を被っている被験体との間でか、または同じ疾患の種々の段階の間で異なる）の比較さえも含み得る。差示的発現は、例えば、正常細胞および疾患細胞間、または異なる疾患事象もしくは疾患段階を経た細胞間での、遺伝子またはその発現産物の時間的または空間的発現パターンにおける、定量的差異ならびに定性的差異の両方を含む。本発明の目的のために、「差示的遺伝子発現」は、正常被験体および疾患被験体、または疾患被験体における疾患発症の種々の段階における所定の遺伝子の発現間に、少なくとも約１倍、好ましくは少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約４倍、より好ましくは少なくとも約６倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍の差異が存在する場合に、「有意」であるとみなされる。
【００７１】
差示的に発現される遺伝子の「セット」は、統計的分析のために充分な数の遺伝子を含む。一般に、このセットは、少なくとも約２０、または少なくとも約５０、または少なくとも約１００、または少なくとも約２００、または少なくとも約５００、または少なくとも約１０００の遺伝子を含む。
【００７２】
用語「処置」は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃまたはｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）測定の両方をいい、ここで、その目的は、標的化された病理学的状態または障害を、予防または遅延（低減）することである。処置を必要とする被験体には、すでに障害を有する被験体、ならびに障害を有する傾向がある被験体、または障害が予防されるべき被験体が挙げられる。腫瘍（例えば、癌）処置において、治療剤は、腫瘍細胞の病理を直接的に低減させ得るか、または腫瘍細胞を、他の治療剤（例えば、放射線および／または化学療法）による処置に対して、より感受性にし得る。
【００７３】
用語「腫瘍」は、本明細書中で使用される場合、悪性または良性にかかわらず、全ての新生物細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈおよびｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、ならびに全ての前癌性および癌性の細胞および組織をいう。用語「発癌」は、本明細書中で使用される場合、腫瘍の起源および発症をいう。
【００７４】
用語「癌」および「癌腫」は、調節されない細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）によって代表的に特徴付けられる、哺乳動物中の生理学的状態をいうかまたは説明する。癌の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、黒色腫、頭部および頚部の癌、ならびに脳の癌。
【００７５】
癌の「病理」は、患者の健康状態を損なう全ての現象を含む。これは、限定ではなく、以下を含む：異常な細胞増殖もしくは制御されない細胞増殖、転移、隣接細胞の正常な機能の妨害、異常なレベルでのサイトカインもしくは他の分泌産物の放出、炎症応答もしくは免疫学的応答の抑制もしくは悪化、新生物、前悪性腫瘍、悪性腫瘍、周りの組織もしくは器官または離れた組織もしくは器官（例えば、リンパ節）の浸潤、など。
【００７６】
（Ｂ．詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学および生化学の従来技術を使用し、これらは、当業者の技術範囲内である。このような技術は、例えば、以下の文献において完全に説明されている：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第四版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、１９８７）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７；）および「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）。
【００７７】
本発明は、特定の疾患、疾患状態または異常において示差的に発現すると同定されている遺伝子の調節領域の系統的比較に基づく。特に、本発明は、多数の示差的に発現される遺伝子の間で共通の関連性は、数個の調節因子（例えば、転写因子）の転写プロセスにおける変化であるという認識に基づく。
【００７８】
前述のように、研究者らは、差示的な遺伝子発現を研究するために自由に使用できる様々な技術を有する。最も頻繁に使用されるアプローチは、マイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲであるが、他の技術（例えば、ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、示差的プラークハイブリダイゼーション、減法ハイブリダイゼーション、遺伝子発現の連続分析（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４−４８７（１９９５）；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ  ８８：２４３−５１（１９９７））、遺伝子発現の即時分析（ｒａｐｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＲＡＧＥ；Ｗａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７：４６０９−１８（１９９９））、および大量並行シグナチャー配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：６３０−６３４（２０００）））が、同様に、示差的遺伝子発現の研究に適切である。ますます多くの研究が、示差的遺伝子発現について行われている。図２は、マイクロアレイ技術に基づく全ての生体医療研究または癌に特定の研究の刊行物に関する概要を示す。
【００７９】
マイクロアレイ方法において、目的のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリヌクレオチドを含む）を、マイクロチップ基板上で、プレートするかまたは整列させる。この整列した配列を、次いで、目的の細胞または組織由来の特定のＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる。ｃＤＮＡベースのマイクロアレイ技術の特定の実施形態において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅された挿入物を、高密度アレイ（代表的には、少なくとも約１０，０００のヌクレオチド配列を含む）中の基板に適用する。この固定化された微小整列された遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適切である。チップに適用された蛍光標識したｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントな洗浄を行い、非特異的に結合したプローブを除去した後、このチップを、共焦点レーザー顕微鏡、または別の検出方法（例えば、ＣＣＤカメラ）によりスキャンする。各整列したエレメントのハイブリダイゼーションの定量により、対応するｍＲＮＡの量の評価が可能となる。二色蛍光を用いて、ＲＮＡの２つの供給源から作製された別々に標識したｃＤＮＡプローブを、このアレイに対でハイブリダイズさせる。各特定された遺伝子に対応する２つの供給源由来の転写物の相対量を、このように同時に決定し、それにより、示差的遺伝子発現データを提供する。マイクロアレイ分析は、市販の装置により、製造者のプロトコールに従って（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ技術またはＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイ技術（これらは、オリゴベースのマイクロアレイシステムである）を使用することによって）、実施され得る。
【００８０】
ＲＴ−ＰＣＲはまた、異なるサンプル集団（例えば、正常および罹患した（例えば、腫瘍）組織）におけるｍＲＮＡレベルを比較して、遺伝子発現のパターンを特徴付けし、密接に関連したｍＲＮＡ間を区別し、そしてＲＮＡ構造を分析するために、使用され得る。
【００８１】
第１の工程は、標的サンプルからｍＲＮＡを単離することである。ＲＮＡは、ＰＣＲのためのテンプレートとして働き得ないので、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングにおける第１の工程は、ｃＤＮＡへのＲＮＡテンプレートの逆転写、その後に続くＰＣＲ反応におけるその指数増幅である。２つの最も一般的に使用される逆転写酵素は、鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程は、代表的に、発現プロファイリングの状況および目的に依存して、特異的プライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴ−ｄＴプライマーを使用して開始される。例えば、抽出したＲＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、製造者の説明書に従って、逆転写し得る。この誘導されたｃＤＮＡを、次いで、引き続くＰＣＲ反応において、テンプレートとして使用し得る。
【００８２】
より最近のＲＴ−ＰＣＲ技術のバリエーションは、リアルタイム定量的ＰＣＲであり、これは、二重標識蛍光性（ｆｌｕｏｒｉｇｅｎｉｃ）プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を介して、またはただ二本鎖特異的Ｃｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ蛍光色素中で、ＰＣＲ産物の蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、定量競合的ＰＣＲ（各標的配列の内部コンペティターが正規化に使用される）、およびサンプルに含まれる規格化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量競合的ＰＣＲの両方に適合性である。さらなる詳細については、例えば、Ｈｅｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４（１９９６）を参照のこと。
【００８３】
示差的遺伝子発現はまた、プロテオミクス技術を使用して、タンパク質レベルで研究され得る。プロテオームは、特定の時点で、サンプル（例えば、組織、生物または細胞培養物）中に存在するタンパク質の総計である。プロテオミクスとしては、とりわけ、サンプル中のタンパク質発現の全体的な変化の研究（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）が挙げられる。プロテオミクスは、代表的に、以下の工程を包含する：（１）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）によるサンプル中の個々のタンパク質の分離；（２）ゲルから回収されたこれらの個々のタンパク質の同定（例えば、質量分光法および／またはＮ末端配列決定）；および（３）バイオインフォマティクスを使用するデータの分析。プロテオミクス方法は、遺伝子発現プロファイリングの他の方法に対して貴重な補足であり、そして単独でか、または他の方法と組み合わせて、示差的遺伝子発現を研究するために使用され得る。さらなる詳細については、例えば、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒ．Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００２を参照のこと。
【００８４】
代表的に、遺伝子発現研究は、正常なサンプルに対して、試験サンプル中の数百〜数千の示差的に発現された遺伝子を同定する。例えば、正常な生物学的プロセス（例えば、ＨｅＬａ細胞サイクル）、および異常な生物学的表現型（例えば、ロタウイルス感染組織）における研究により、少なくとも約５００個の遺伝子が、その正常な対応物と比べて有意な変化を示すことが示されている。遺伝子発現データのほとんどは、公的データベースおよび商業的データベース（例えば、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＳＭＤ）、Ｙａｌｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＩＥＢＩ）に寄託されている。これらおよび他の公的に利用可能な遺伝子発現データベースを、以下の表１に列挙する。
【００８５】
【表１−１】
2004298178.tif 000002
【００８６】
【表１−２】
2004298178.tif 000003
【００８７】
【表１−３】
2004298178.tif 000004
この分野における広範な研究および多量の蓄積されたデータにもかかわらず、遺伝子発現の複雑さの点で、示差的遺伝子発現データベースは、解釈が困難である。
【００８８】
多数の示差的に発現された遺伝子の各々が変異またはいくつかの他の欠損を有する可能性は非常に低いことが十分に認められている。反対に、多数の示差的に発現された遺伝子は、数個の鍵となる現象または機構における変化の結果である可能性が高く、これは、多くの遺伝子の発現レベルに同時に影響を与え得る。本発明は、種々の疾患、疾患状態または他の異常における多数の示差的に発現された遺伝子は、数個の調節因子（例えば、転写因子（ＴＦ））変化から生じるという認識に基づく。
【００８９】
転写因子（ＴＦ）は、ＤＮＡによりコードされる遺伝情報をｍＲＮＡに転写するプロセスを制御しそして初期化するクラスのタンパク質である。現在公知の全てのＴＦは、少なくとも５個の異なるサブファミリー（すなわち、その機能的ドメインにちなんで、塩基性ドメイン、亜鉛配位ＤＮＡ結合ドメイン、へリックス−ターン−へリックスドメイン、浅い溝と接触したβ骨格因子、および他の転写因子）に分類される。通常、少なくとも数個の転写因子が、遺伝子の調節領域に結合する転写複合体を形成するのに必要であり、結果として、ｍＲＮＡの転写機構を制御および初期化する。これらの結合プロセスは、ＴＦタンパク質のＤＮＡ結合ドメインにより媒介される。これらの転写因子のいくつかのみが、ＤＮＡに直接結合し得、一方、他の転写因子は、標的遺伝子の調節領域に直接結合する必要なく、機能的転写機構を形成するのに必要であることが知られている。
【００９０】
現在、４０００個を越える既知のＴＦが存在し、そのうちの約２０００個が、哺乳動物種由来である。例示的なＴＦとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＰ−１、ＡＴＦ、ｃ−Ｅｔｓ−１、ｃ−Ｒｅｌ、ＣＲＦ、ＣＴＦ、ＧＡＴＡ−１、ＰＯＵ１Ｆ１、ＮＦ−κＢ、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＯＵ２Ｆ２、ｐ５３、Ｐａｘ−３、Ｓｐ１、ＴＣＦ、ＴＡＲ、ＴＦＥＢ、ＴＣＦ−１、ＴＦＩＩＦ、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３、Ｅ２Ｆ−４、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−１α、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ５、Ｓｐ３、Ｓｐ４、ＴＣＦ−４、ＡＰＣおよびＳＴＡＴ５Ａ。
【００９１】
哺乳動物ＴＦのうち数百個が、標的遺伝子の調節領域（シス調節結合部位）に直接結合する能力を有することが示されており、そしてわずか２〜３百のＴＦ結合部位しか、現在まで特徴付けされていない。遺伝子のＴＦ結合部位は、遺伝子の調節領域に位置するＤＮＡ配列の短いストレッチである。これらの部位は、異なるＤＮＡ結合ＴＦに特異的であり、そして通常は、約６〜約１６塩基長である。所定の結合部位内において、対応するＴＦによる特異的結合に絶対的に必要な特定の位置に、塩基が存在し、一方、他のものは、いくつかの塩基変化バリエーションに耐性であり得ることが知られている。さらなる詳細については、例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅ．Ｈ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ  ０−１２−２０５３５１−６、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００１および例えば、Ｍｉｃｈｅａｌ  Ｃａｒｅｙ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｔ．Ｓｍａｌｅ，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５３７−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照のこと。
【００９２】
いくつかの転写因子に関連するデータベースがあり、それらを以下の表２に列挙する。
【００９３】
【表２】
2004298178.tif 000005
これらの列挙したデータベースの中で、ＴＲＡＮＳＦＡＣは、ＴＦ結合部位の数においてほとんどを収集し、そしてアップデートされそして頻繁に引用されている（Ｈｅｉｎｅｍｅｙｅｒら、１９９８，Ｈｅｉｎｅｍｅｙｅｒら，１９９９，Ｋａｒａｓら、１９９７，Ｋｎｕｐｐｅｌら、１９９４，Ｍａｔｙｓら、２００３，Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒら、１９９６，Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒら、１９９７，Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒら、１９９７，Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒら、２０００，Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒら、２００１）。タンパク質経路の評価のためのＴＦ結合部位の使用法が、最近報告された（Ｋｒｕｌｌら、２００３）。
【００９４】
最も広い意味において、本発明は、初めて、このような遺伝子により共有される共通の調節機構および／またはコンセンサス調節因子結合部位を同定するために、多数の遺伝子の調節領域の比較分析のための方法を提供する。従って、本発明は、このような遺伝子間の現在まで発見されていない関係に関する新たな識見を提供し、そして現時点で利用可能であるかまたは将来作製される大量の遺伝子発現データからの有意な調節因子の同定を可能にする。
【００９５】
本発明の根底にある概念は、種々の疾患、疾患状態または異常において同定される示差的に発現される遺伝子のほとんどにより共有される特定のコンセンサス調節因子結合部位（例えば、ＴＦ結合部位）が同定され得るか否かということである。特定の調節因子（例えば、ＴＦ結合部位）が、このような示差的に発現された遺伝子間で、その組織ワイドまたはゲノムワイドに存在する量と比較して多量に見出される場合、これらの同定された結合部位は、生じた示差的発現において主な役割を果たしている可能性が非常に高く、従って、疾患または異常（例えば、癌または腫瘍において見られる最終の細胞運命の変化）の原因であり得る。
【００９６】
１つの特定の局面において、本発明は、このような遺伝子中で富化されたコンセンサス調節領域を同定するために、示差的に発現される遺伝子の調節領域を比較分析するための新規のアプローチを提供し、このアプローチは、次いで、その発現の調節において役割を果たす１つ以上の調節因子を同定するために使用され得る。
【００９７】
別の局面において、本発明は、調節因子（例えば、転写因子（ＴＦ））を同定するための方法を提供し、その調節領域の系統的比較により、疾患、疾患状態または異常において示差的に発現される多数の遺伝子の間の関連性を提供する。
【００９８】
疾患プロセスに関連する必須の調節機構におけるその関与の結果として、共有された調節因子結合部位および対応する調節因子は、価値のある治療剤開発の標的である。例えば、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドアプローチ（ＴＦのｍＲＮＡを結合し、次いで、対応するタンパク質発現を変更するための）によって同定されたＴＦを変更することによって、または例えば、転写デコイ方法（対応するＴＦに競合的に結合するための）を使用することによってこのようなＴＦの転写効果を変化させることによって、種々の疾患、障害および異常の処置（予防を含む）のため、または特定の有害なもしくは所望しない生物学的プロセス（例えば、加齢）を妨害するための新たなアプローチが、開発され得る。より一般的な意味において、本発明は、一般に、生物医学的研究および検索の試みのための価値のある手段を提供し、そしてこのようなプロセスを理解するための特有の手段を提供する。一般に、本発明により提供される情報は、種々の異なる目的および用途のために使用され得、これらの目的および用途としては、生物医学的研究、前臨床開発、薬物スクリーニング用途、標的発見および標的確認、異なる遺伝子の調節プロフィールの間のゲノムワイドまたは組織ワイドな関連性の構築、種々の既知の調節因子のゲノムバックグラウンドまたは組織バックグラウンドの理解、種々の既知の転写因子のゲノムバックグラウンドまたは組織バックグラウンドの理解などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
従って、本発明は、示差的に発現された遺伝子の調節因子（例えば、ＴＦ）結合部位の統計的分析のための方法に関する。特定の局面において、本発明は、例えば、疾患、障害または特定の生物学的プロセスに代表的な生物学的サンプル中に見出される多数の遺伝子の示差的発現を担っている調節（例えば、転写）因子を同定することによって、新しい治療標的を提供する。
【０１００】
特定の実施形態において、本発明の方法は、以下の工程を包含する：（１）有意な示差的発現を有する遺伝子のリストの作成；（２）その示差的に発現される遺伝子のシス調節領域の同定；（３）その同定されたシス調節領域に対する転写因子結合部位のマッピング；および（４）その同定されたＴＦ結合プロフィールの統計学的分析。
【０１０１】
（（１）有意な示差的発現を有する遺伝子のリストの作成）
遺伝子発現データは、種々の遺伝子発現関連データベースから検索され得る。これらのデータベースは、マイクロアレイ技術によって作成されたデータベースに制限されない。これらとしてはまた、実時間定量ＰＣＲ、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、および他の遺伝子発現関連方法（プロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）を含む）によって得られる遺伝子発現データが挙げられる。遺伝子発現データの例示的なデータベースが、上記表１に列挙される。これらのすでに利用可能なデータセットに加えて、示差的に発現される遺伝子リストはまた、上で議論される任意の技術を使用してか、またはそうでなければ当該分野で公知の任意の技術を使用して、プロジェクトに指向される任意の特定の実験によって作成され得る。本発明に従って、このようなデータベースまたは任意の他の供給源から検索されるデータは、特にそのデータが多数の遺伝子または遺伝子セットを含む場合、集中的に分析される（例えば、ＳＡＭ分析、Ｔｕｓｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：５１１６（２００１））。有意な示差的発現を示す遺伝子のリストが作成され、そしてそのリストは、自己作成スクリプトを使用して、国際命名法委員会および他のゲノムデータベースに基づいて、それぞれの遺伝子識別子を割り当てられる。前記のように、試験中の所定の遺伝子の発現と、例えば、正常な被験体および病変した被験体、または病変した被験体の疾患が発症する種々の段階における参照サンプルの発現との間に、少なくとも約２倍、好ましくは、少なくとも約４倍、より好ましくは、少なくとも約６倍、最も好ましくは、少なくとも約１０倍の差異が存在する場合、示差的遺伝子発現は、「有意である」とみなされる。
【０１０２】
（（２）示差的に発現される遺伝子のシス調節領域の同定）
（１）において作成された遺伝子リストに基づいて、これらの遺伝子の全長配列は、種々の全長遺伝子データベース（例えば、ＮＣＢＩベースのｒｅｆＳｅｑ、ＮＩＨベースのＭＧＣコンソーシアム、Ｊａｐａｎ  ＤＢＴＳＳなど）から検索される（Ｐｒｕｉｔｔら（２００１）、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇら（１９９９）、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ＲＬら（２００２）、Ｙａｍａｓｈｉｔａら（２００１））。次いで、これらの全長配列は、例えば、ＢＬＡＴソフトウェア（Ｋｅｎｔ、２００２）を使用してそれらの染色体位置をマッピングするために、アップデートされた最新のヒトゲノム配列データベース（Ｌａｎｄｅｒら（２００１）、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（２００１））（例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｄｒａｆｔ，ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３１（２００２年１１月）、またはＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３４（２００３年７月））と比較される。特定の目的に依存して、このシス調節領域（例えば、その５’上流コアプロモーター領域、その５’上流エンハンサー領域、イントロン領域、および／または３’調節領域）が規定され、そしてその対応するゲノム配列が、アップデートされた最新のゲノム配列データベース（ＵＣＳＣゲノムブラウザ）から検索される（Ｋｅｎｔら（２００２）、Ｋａｒｏｌｃｈｉｋら（２００３））。必要に応じて、この配列検索プロセスは、自己開発スクリプトを使用することによって容易にされ得る。
【０１０３】
（（３）同定されたシス調節領域に対する調節因子結合プロフィールのマッピング）
同定された調節領域に対するゲノム配列は、任意の推定調節因子結合部位（例えば、ＴＦ結合部位）についてスクリーニングされる。例えば、示差的に発現される遺伝子のコアプロモーター領域は、既知の転写因子結合部位を使用して分析され得る。この種類の分析に利用可能なソフトウェアは、例えば、以下の刊行物に開示されている：Ｇｒａｂｅ（２００２）、Ｋｅｌ−Ｍａｒｇｏｕｌｉｓら（２０００）、Ｋｅｌら（１９９５）、Ｌｉｅｂｉｃｈら（２００２）、Ｐｅｒｉｅｒら（２０００）、Ｐｒａｚら（２００２）、Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ（１９９６）、Ｑｕａｎｄｔら（１９９５）、Ｔｓｕｎｏｄａら（１９９９）、およびＷｉｎｇｅｎｄｅｒ（１９９４）。調節領域のこれらのゲノム配列は、種々のモチーフ決定ソフトウェアを使用して、推定シス調節結合部位についてさらにスクリーニングされ得る。これは、未知の転写因子結合部位および未知の調節因子コンセンサスモチーフをマッピングする際に役立ち得る。
【０１０４】
（（４）調節因子結合プロフィールの統計学的分析）
示差的に発現される遺伝子において同定された推定調節因子結合部位は、それらのゲノムにわたる発生（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）または組織にわたる発生（ｔｉｓｓｕｅ−ｗｉｄｅ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）に関して比較される。このような結合部位の数、このような結合プロフィールの頻度、ならびに発生の分布および頻度は、統計学的分析を使用して算出される。統計学的分析は、例えば、超幾何分布モデル（これは、有限母集団から、置き換えなしに抜き取った固定サイズサンプルの成功の総数を決定する）を使用して行われ得る。特に、（自己開発スクリプトと組み合わせて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ結合機能を使用することによる）超幾何分布分析を使用して、特定の調節因子（例えば、ＴＦ）結合部位の出現がその示差的発現遺伝子リストにおいて有意に富化されるか否かが試験され得る。このような富化は、ゲノムまたは組織のバックグラウンドと比較した場合、腫瘍（例えば、癌）のような異常を生じ得る。必要に応じて、この調節因子（例えば、ＴＦ）は同定され得、そしてその配列が、このような統計学的分析に基づいて提供され得る。このような調節因子（例えば、ＴＦ）は、疾患、障害、または望ましくない生物学的プロセスの防止または処置に指向される治療処置のために価値のある標的である。
【０１０５】
他の統計学的方法が、任意の２つの遺伝子セットにおいて同定される遺伝子の調節領域の発生の頻度または確率の比較に適切である限り、これらもまた利用され得ることは、当業者に明らかである。
【０１０６】
特定の実施形態において、示差的に発現される遺伝子のシス調節領域（例えば、調節因子結合部位）は、同時係属出願番号１０／４０２，６８９（２００３年３月２８日出願）（代理人整理番号３９７５３−０００１）に開示される方法によって同定される。簡潔には、このアプローチに従って、遺伝子調節領域のゲノム配列が、公的なデータベースおよび／または専用のデータベースから検索され、検索された各遺伝子調節領域についてのＤＮＡ情報が、推定調節因子結合部位を同定するためにスクリーニングされ、その推定調節因子結合部位がプロファイリングされ、そして、確率マッピングが、このプロファイリングした結合部位に適用される。この確率マッピングは、遺伝子セット（例えば、特定の疾患、疾患状態、異常性などにおいて示差的に発現される遺伝子のセット）における全ての遺伝子の調節領域の、特定の調節因子結合部位（例えば、全ての推定Ｅ２Ｆ−１転写因子結合部位）の同定を含む。この確率マッピングは、示差的に発現されるどれだけの遺伝子が、特定の調節因子によって転写制御される可能性があるかということを識別する。特定の調節因子が、どの程度のゲノムにわたる効果、細胞にわたる効果、または組織にわたる効果を有することが予測されるかもまた、示される。
【０１０７】
同定された各結合部位について、保護スコアが作成され得る。この保護スコア、および２つの種（マウスおよびヒトを含むがこれらに限定されない）の間の保護レベルを示す任意の他の測定値は、その調節因子（例えば、ＴＦ）結合部位が同定される領域を覆うように選択される。より高い保護スコアを有する結合部位またはより高い発現レベルを有するその対応する遺伝子は、より低いスコアを有するものよりも、より有意な役割を果たし得る。
【０１０８】
作成されたデータは、データバンクに収集および編成され得、これは、検索および薬物開発の努力において、情報の使用を容易にし得る。
【０１０９】
しかし、本発明を実施するためにこの専用のアプローチを使用する必要はないことが強調される。遺伝子調節領域のマッピング情報を含むデータベースは、多数の種々の方法において開発され得る。従って、本発明は、示差的に発現される遺伝子の調節因子結合部位をマッピングおよび分析することに決して限定されない。
【０１１０】
本発明に従って同定され得る調節因子結合部位の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：転写因子ＮＦ−κＢに対する結合部位（ＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡ；配列番号１）およびＥ２Ｆ−１に対する結合部位（ＴＴＴＧＧＣＧＧ；配列番号２）。
【０１１１】
開始情報が、示差的タンパク質発現レベルを示すプロテオミック（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）プロフィール（例えば、質量スペクトル）である場合、その対応する遺伝子が位置決定されそして同定され、遺伝子リストおよびそれらの対応するタンパク質発現レベルは、その後の分析に使用される。
【０１１２】
（Ｃ．治療同定および転写因子デコイ（ｄｅｃｏｙ）設計）
１つの特定の用途において、本発明に従って行われる調節因子結合部位の統計学的分析は、治療薬物設計のための標的を同定するため、およびその同定された標的に指向される種々の治療アプローチを開発するため（オリゴヌクレオチドデコイの設計を含むがこれに限定されない）の、容易な方法を提供する。
【０１１３】
ヒト疾患を含む全ての疾患が、遺伝子転写プロセスになにかしら関連している可能性がある。転写因子コード遺伝子における生殖系列変異は、複数の身体構造の発達に影響を及ぼす奇形症候群を生じることが周知である。転写因子コード遺伝子の体細胞変異体は、腫瘍形成に寄与することが示されている。さらに、生前発育および生後生理学は、単一の転写因子が、発育の間の前駆細胞の増殖、および特定の生理学的応答に関与する遺伝子産物の分化型細胞内での発現を制御し得ることを示している。例によって、十分に研究された転写因子（例えば、ｐ５３、ならびにＳｍａｄタンパク質およびＳＴＡＴタンパク質）は、多くの癌において重要な役割を果たすことが知られている。転写因子はまた、種々のニューロン疾患、心臓血管疾患、腎臓疾患および感染症、骨発達の疾患、消化性疾患、異常な骨格発達に関連する疾患などに関与するものとして同定されている。さらなる詳細については、例えば、Ｇｒｅｇｇ  Ｌ．Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ  １９９８を参照のこと。
【０１１４】
転写因子タンパク質−ＤＮＡ相互作用は、配列特異的であるが、１つの所定の転写因子に対する結合部位は、種々の標的遺伝子内のいくつかの塩基対によって変化し得る。特定の転写因子に対する結合配列の、共通部分、または非可変性部分は、転写因子コンセンサス配列と呼ばれる。例えば、転写因子ＮＫ−κＢについてのコンセンサス配列は、ＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡ（配列番号１）であり；Ｅ２Ｆ−１についてのコンセンサス配列は、ＴＴＴＧＧＣＧＧ（配列番号２）である。ＡＰ−１転写因子は、ＴＧＡＣＴＣＡ（配列番号３）コンセンサス配列に結合する。遺伝子発現におけるＴＧＦ−β誘導変化、アクチビン誘導変化およびＢＭＰ誘導変化を媒介するＳｍａｄ−３転写因子についてのコンセンサス配列は、ＴＧＴＣＴＧＴＣＴ（配列番号４）である。
【０１１５】
このようなコンセンサス配列のいずれかが、疾患、障害または病理的状態を表わす生物学的サンプル中で富化される場合、その対応する転写因子は、このような疾患、障害または病理状態に指向される新規の治療アプローチの有望な標的である。
【０１１６】
この転写因子デコイアプローチに従って、小さい二本鎖オリゴヌクレオチドが細胞に導入され、標的転写因子に特異的に結合し、それによってこれらの因子がそれらの標的遺伝子をトランス活性化させる（すなわち、「刺激する」）のを防止する。
【０１１７】
臨床前研究において、Ｅ２Ｆ  Ｄｅｃｏｙの圧力媒介性エキソビボ送達は、静脈移植片移植の動物モデルの静脈移植における新生内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ）過形成とアテローム性動脈硬化症との両方を防止することが示されている。さらなる情報については、例えば、Ｅｈｓａｎ，Ａ．，Ｍ．Ｊ．Ｍａｎｎ  ２００１；ＭａｎｎおよびＤｚａｕ  ２０００；Ｍａｎｎら、１９９９；ならびに米国特許第５，７６６，９０１号および同第５，９９２，６８７号を参照のこと。
【０１１８】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【０１１９】
（実施例１）
本発明の方法を、１セットの細胞周期に関連した遺伝子発現データに適用した（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄら、２００２）。この細胞分裂周期の適切な調節は、全ての生物の増殖および発達のために重要であり；この調節を理解することは、多くの疾患（その代表としては、癌）の研究の中心である。
【０１２０】
ヒト癌細胞株（ＨｅＬａ）における細胞分裂周期の間の遺伝子発現のゲノムにわたるプログラムを、ｃＤＮＡマイクロアレイを使用して特徴付けた。８５０を超える遺伝子の転写物は、この細胞周期の間に周期的な変化を示した。その発現パターンの階層的クラスター形成は、以前に十分に特徴付けた同時発現される遺伝子群が、基本的な細胞周期プロセス（例えば、ＤＮＡ複製、染色体分離、および特徴付けされていない機能を有する遺伝子との細胞接着）に関連することを示した。その発現が腫瘍の増殖状態と密接に関連していることが以前に報告されている遺伝子のほとんどは、ＨｅＬａ細胞周期の間に周期的に発現されることが見出された。この報告のデータは、本発明の方法のための開始点として作用し得る細胞周期調節遺伝子の包括的カタログを提供する。さらなる分析のために、この完全なデータセットを、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ｈｕｍａｎ−ＣｅｌｌＣｙｃｌｅ／ＨｅＬａ／サイトから検索した。
【０１２１】
細胞周期において上記示差的に発現される遺伝子に関与する重要な要素を同定するために、これらの遺伝子の全長配列を、ＵＣＳＣゲノムプラウザ（Ｋａｒｏｌｃｈｉｋら（２００３）、Ｋｅｎｔら（２００２））、ＭＧＣ遺伝子収集データベースおよびＤＢＴＳＳデータベースの組み合わせを使用して検索した。その転写開始部位の位置を、ＢＬＡＴプログラムを使用して、最新のヒトゲノム設計図（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（２００１）、Ｌａｎｄｅｒら（２００１））にマッピングした。コアプロモーター領域（これは、その転写開始部位から、それぞれ約２５０ｂｐ上流および５０ｂｐ下流である）についての配列を、全ての遺伝子について自己作成ｐｅｒｌスクリプトを使用して検索した。推定ＴＦ結合プロフィールの分析を、自己作成ｐｅｒｌスクリプトと併用してＭａｔｃｈプログラム（Ｍａｔｙｓら、２００３）（これは、許可されているＴＲＡＮＳＦＡＣデータベース内部に組み込まれている）を使用して行った。
【０１２２】
開始スクリーニングを、哺乳動物種からのみ同定される、十分に研究された既知の転写因子を使用して行った。代表的な細胞周期は、Ｇ１期、Ｇ２期、Ｍ期およびＳ期から構成される。それらのうち、Ｇ２期およびＭ期は、Ｇ１期およびＳ期に比べて非常に短く、このことは、Ｇ１期およびＳ期での細胞期は規定するのが容易であることを示唆している。従って、本発明の分析は、Ｇ１期およびＳ期において見出された、示差的に発現される遺伝子（全体で１９８個）に焦点をあてている。上記の分析から同定された既知のＴＦ結合部位の頻度を、ゲノムバックグラウンドにおけるそれらの対応する頻度に対して、散布図にした。この結果を図１に示す。このプロッティングは、同定されたＴＦ結合部位が標的遺伝子リストに正常に分布される場合、その対応するスポットは、赤色線（これは、同定されたＴＦ結合頻度が、対応するゲノム頻度と同じである場合の理論値である）の周囲に位置するはずであることを示唆する。しかし、特定のＴＦ結合の富化が、実際には示差的に発現される遺伝子内に存在する場合、その対応するスポットは、赤色の理論線から離れてシフトし、ｘ軸の方へ移動する。これは、標的遺伝子リストにおけるＴＦ結合の頻度を表わす。図１に示されるように、この標的遺伝子リストにおいて最もシフトした３つのスポット（これらは、より高い出現（より高い頻度、＞０．４）を示す）は、転写因子Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−１／ＤＰ−１、およびＥ２Ｆに属する。
【０１２３】
これらの結果を、さらなる統計学的分析に供した。その標的遺伝子リストにおいて同定された、最も高い頻度を有する１４個のＴＦを、超幾何分布試験のそれらのＰ値（右端にまとめた）と一緒に、以下の表３に列挙する（表を参照のこと）。表３に示されるデータは、Ｅ２Ｆ−１、Ｅｌｋ−１、Ｅ２Ｆ、およびＥ２Ｆ−１／ＤＰ−１が、最小のＰ値を有する、最も有意な転写因子であることを示唆する。Ｅ２Ｆ−１と同様に、転写因子Ｅｌｋ−１もまた集中的に研究されており、細胞周期および細胞増殖におけるその重要な役割が示されている。
【０１２４】
（表３）
【０１２５】
【表３】
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結果として、重要な転写因子Ｅ２Ｆ−１およびＥｌｋ−１を、特定の細胞周期プロセスの間に示差的発現が見出された８５０個の遺伝子に影響を及ぼす役割を本質的に果たし得る因子として同定した。その細胞周期は、多くの異なる種類の腫瘍または癌の発症において重要であることが示されている。ここからの直接的な利点は、それらの重要な要素に基づいて治療ストラテジーを開発することができることである。（例えば、Ｅ２Ｆ−１  Ｄｅｃｏｙ（Ｃｏｒｇｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）についての）転写因子デコイまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、このような新規の処置選択肢のための例である。細胞増殖におけるＥ２Ｆ−１およびＥｌｋ−１の役割を、多数の実験および数年間の研究後に、徐々に開拓した。しかし、本発明は、この時間浪費プロセスを容易でかつ迅速な作業にする。
【０１２６】
この開示全体を通して引用される全ての参考文献、およびこれらの参考文献中で引用される全ての参考文献は、それら全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１２７】
当業者は、本明細書中に開示される方法および材料と類似または等価な、多くの方法および材料が、本発明の実施において使用され得ることを認識している。実際に、本発明は、記載されている方法および材料に決して限定されない。
【０１２８】
本発明は、示差的に発現される遺伝子の調節因子結合部位の統計学的分析に関する。より詳細には、本発明は、調節因子（例えば、示差的に発現される遺伝子の調節領域における転写因子結合部位）を同定および特徴付けして、示差的遺伝子発現が付随する疾患の処置のための治療ストラテジーを開発し、そして生物学的プロセスを研究するための方法に関する。
【０１２９】
（参考文献）
【０１３０】
【数１】
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。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】図１は、細胞周期のＧ１期およびＳ期において同定された示差的に発現される遺伝子のプロモーターと、全体のゲノムバックグラウンドのプロモーターとの間のＴＦ結合部位の頻度を示す。
【図２】図２は、１９９５年と２００２年との間の、マイクロアレイに関連した刊行物の数のグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【外国語明細書】
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