(57)【要約】【課題】　歯周病などの治療により除去された歯周組織を効果的に回復することのできる歯周組織再生剤を提供する。【解決手段】　哺乳類由来であって、例えばブタの場合、ＶＰＡＦＰＲＱＰＧＴＰＧＶＡＳＬＳＬＥＴＭＲＱＬＧＳＬＱＧＬＮＭＬＳＱＹＳＲＦＧＦＧＫＳＦＮＳＬＷＭＨＧＬＬＰＰＨＳＳＦＱＷＭＲＰＲＥＨＥＴＱＱＹＥＹＳＬＰＶＨＰＰＰＬＰＳＱＰＳＬＱＰＱＱＰＧＱＫＰＦＬＱＰＴＶＶＴＳＩＱＮＰＶＱＫＧＶＰＱＰＰＩＹＱＧＨＰＰＬＱＱＶＥＧＰＭＶＱＱＱＶＡＰＳＥＫＰＰＥＡＥＬＰＧＬＤＦＡＤＰＱＤＰＳＭＦＰＩＡＲのアミノ酸配列を有するシースプロテインを有効成分として含有する。有効成分を、歯周組織再生剤１００ｍｇ中、０．０００１〜３ｍｇ含有する。　シースプロテインは、アメロゲニン、エナメリンを会合したものであってもよい。この場合の有効成分は、歯周組織再生剤１００ｍｇ中、０．０００３〜１０ｍｇ含有する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　哺乳類由来のシースプロテインを有効成分として含有することを特徴とする歯周組織再生剤。
【請求項２】
　ブタ由来であって、ＶＰＡＦＰＲＱＰＧＴＰＧＶＡＳＬＳＬＥＴＭＲＱＬＧＳＬＱＧＬＮＭＬＳＱＹＳＲＦＧＦＧＫＳＦＮＳＬＷＭＨＧＬＬＰＰＨＳＳＦＱＷＭＲＰＲＥＨＥＴＱＱＹＥＹＳＬＰＶＨＰＰＰＬＰＳＱＰＳＬＱＰＱＱＰＧＱＫＰＦＬＱＰＴＶＶＴＳＩＱＮＰＶＱＫＧＶＰＱＰＰＩＹＱＧＨＰＰＬＱＱＶＥＧＰＭＶＱＱＱＶＡＰＳＥＫＰＰＥＡＥＬＰＧＬＤＦＡＤＰＱＤＰＳＭＦＰＩＡＲのアミノ酸配列を有するシースプロテインを有効成分として含有することを特徴とする歯周組織再生剤。
【請求項３】
　ヒト由来であって、VPFFPQQSGTPGMASLSLETMRQLGSLQRLNTLSQYSRYGFGKSFNSLWMHGLLPPHSSLPWMRPREHETQQYEYSLPVHPPPLPSQPSLKPQQPGLKPFLQSAAATTNQATALKEALQPPIHLGHLPLQEGELPLVQQQVAPSDKPPKPELPGVDFADPQGPSLPGMDFPDPQGPSLPGLDFADPQGSTIFQIARのアミノ酸配列を有するシースプロテインを有効成分として含有することを特徴とする歯周組織再生剤。
【請求項４】
　有効成分を、歯周組織再生剤１００ｍｇ中、０．０００１〜５ｍｇ含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の歯周組織再生剤。
【請求項５】
　シースプロテインが、アメロゲニン、エナメリンを会合したものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の歯周組織再生剤。
【請求項６】
　有効成分を、歯周組織再生剤１００ｍｇ中、０．０００３〜１０ｍｇ含有することを特徴とする請求項５記載の歯周組織再生剤。
【請求項７】
　請求項１〜３のいずれかに記載のシースプロテイン由来のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする歯周組織再生剤。
【請求項８】
　（１）哺乳類の歯胚から幼若エナメル質を調製し、（２）これに中性緩衝液を加え、低温下にてホモジナイズして中性不溶性画分を得る、（３）これにアルカリ性緩衝液を加えて低温下にてホモジナイズし、アルカリ可溶性画分を得る、（４）アルカリ可溶性画分を限外濾過膜により濃縮し、（５）クロマトグラフィーにかけ、最初に溶出してくる画分を分取する、（６）この画分についてイオン交換を行い、最初に溶出してくる画分を分取する、という操作を行うことを特徴とする歯周組織再生剤の有効成分抽出法。
【請求項９】
　（１）哺乳類の歯胚から幼若エナメル質を調製し、（２）これにアルカリ性緩衝液を加えて撹拌抽出し、遠心分離して沈殿物を除き、低温下にて硫安分画を行う、（３）得られた試料を限外濾過膜により脱塩する、という操作を行うことを特徴とする歯周組織再生剤の有効成分抽出法。
【請求項１０】
　シースプロテインをコードするＤＮＡを有することを特徴とするプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、歯周病などの治療により除去された歯周組織、特にセメント質、歯根膜を効果的に回復することのできる歯周組織再生剤、およびその有効成分抽出法、さらにはその有効成分の生産に用いることのできるプラスミドに関する。
【背景技術】
【０００２】
　口内における細菌やそれらの生産物が歯に付着することにより生成する歯垢や歯石は虫歯の原因となるほか歯周病の原因ともなる。歯周病は歯根膜やセメント質を冒して、これが進行すると歯槽骨が失われて歯が抜け落ちてしまうということは従来より知られており、日本における成人の約８割もが歯周病に冒されているといわれている。
　歯周病の治療としては、原因となる歯垢や歯石、不良肉芽などを除去して新しい歯周組織を再生回復させるという方法が採られているが、歯垢や歯石、不良肉芽を除去するのみでは、歯周病の進行を阻止することは可能であっても、除去された歯周組織を再生することは難しい。
【０００３】
　さて、本発明者らは、ブタ幼若エナメル質からエナメル質形成に関わる成分について、４２１アミノ酸からなるエナメル蛋白質であるシースリンを分離するのに成功し、その遺伝子配列についても明らかにしている（Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．７６（２）：６４８−６５７）。
　また、このシースリンのうち、さらにエナメル質形成の一旦を担う部分について検討を進めた結果、例えばブタの場合には、シースリンを構成する４２１アミノ酸配列のうち、２７〜１９６段目のアミノ酸配列を有する分子量１３〜１７ｋＤａのエナメル蛋白質にその活性があることを発見し、これをシースプロテインと命名した。
【０００４】
　ところで、これらのエナメル質形成に関わる作用のあるエナメル蛋白質は、歯周組織の再生にも関わっていることが最近明らかになり、ブタの永久歯歯胚から幼若エナメル質を調製し、それを０．５Ｍ酢酸溶液で可溶化して素早く透析し、酢酸可溶性画分として凍結乾燥してさらに処理することにより得られた標品が、歯周病の治療などにより失われた歯周組織を再生させることのできる薬剤（生化学工業社製商品名“エムドゲイン”）として開発されている。この薬剤の主成分はアメロゲニンであり、歯周病治療後の歯周組織の再生を目的として用いられてはいるが、歯周組織の再生に作用する部分以外の蛋白質もマルチで含んでいるために、用いる個体によっては副作用などを生じる虞があるなどの問題があった。また、エムドゲイン単位量当たりに含まれる有効成分の含量が少なく、歯周組織の再生に有効な十分量を治療箇所に施すことができないなどの問題を有していた。
【非特許文献１】Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．７６（２）：６４８−６５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　本発明は、少量塗布するのみで、速やかに、かつ優れた歯周組織の再生作用を発揮し、有効成分として歯周組織の再生に直接関与するエナメル蛋白質のほかには余分な蛋白質を含まないため、これによる副作用などが殆ど起こらない歯周組織再生剤、その有効成分抽出法、およびその有効成分の生産に用いることのできるプラスミドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、シースリンを構成するアミノ酸配列のうちの、特定の段数で構成されるシースプロテインに、エナメル質形成に関わる作用のみならず、優れた歯周組織再生作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、哺乳類由来のシースプロテインを有効成分として含有することを特徴とする歯周組織再生剤、ブタ由来であって、ＶＰＡＦＰＲＱＰＧＴＰＧＶＡＳＬＳＬＥＴＭＲＱＬＧＳＬＱＧＬＮＭＬＳＱＹＳＲＦＧＦＧＫＳＦＮＳＬＷＭＨＧＬＬＰＰＨＳＳＦＱＷＭＲＰＲＥＨＥＴＱＱＹＥＹＳＬＰＶＨＰＰＰＬＰＳＱＰＳＬＱＰＱＱＰＧＱＫＰＦＬＱＰＴＶＶＴＳＩＱＮＰＶＱＫＧＶＰＱＰＰＩＹＱＧＨＰＰＬＱＱＶＥＧＰＭＶＱＱＱＶＡＰＳＥＫＰＰＥＡＥＬＰＧＬＤＦＡＤＰＱＤＰＳＭＦＰＩＡＲのアミノ酸配列を有するシースプロテインを有効成分として含有することを特徴とする歯周組織再生剤、およびヒト由来であって、VPFFPQQSGTPGMASLSLETMRQLGSLQRLNTLSQYSRYGFGKSFNSLWMHGLLPPHSSLPWMRPREHETQQYEYSLPVHPPPLPSQPSLKPQQPGLKPFLQSAAATTNQATALKEALQPPIHLGHLPLQEGELPLVQQQVAPSDKPPKPELPGVDFADPQGPSLPGMDFPDPQGPSLPGLDFADPQGSTIFQIARのアミノ酸配列を有するシースプロテインを有効成分として含有することを特徴とする歯周組織再生剤をその要旨とし、該有効成分を該再生剤１００ｍｇ中、０．０００１〜５ｍｇ含有することが好ましい。
　また、本発明は、上記のシースプロテインが、アメロゲニン、エナメリンを会合したものであってもよく、この場合の有効成分は、歯周組織再生剤１００ｍｇ中、０．０００３〜１０ｍｇ含有することが好ましい。さらに、本発明はシースプロテイン由来のペプチドからなる歯周組織再生剤をもその要旨とする。
【０００７】
　加えて、本発明は、（１）哺乳類の歯胚から幼若エナメル質を調製し、（２）これに中性緩衝液を加え、低温下にてホモジナイズして中性不溶性画分を得る、（３）これにアルカリ性緩衝液を加えて低温下にてホモジナイズし、アルカリ可溶性画分を得る、（４）アルカリ可溶性画分を限外濾過膜により濃縮し、（５）クロマトグラフィーにかけ、最初に溶出してくる画分を分取する、（６）この画分についてイオン交換を行い、最初に溶出してくる画分を分取する、という操作を行うことを特徴とする歯周組織再生剤の有効成分抽出法、および（１）哺乳類の歯胚から幼若エナメル質を調製し、（２）これにアルカリ性緩衝液を加えて撹拌抽出し、遠心分離して沈殿物を除き、低温下にて硫安分画を行う、（３）得られた試料を限外濾過膜により脱塩する、という操作を行うことを特徴とする歯周組織再生剤の有効成分抽出法もその要旨とし、シースプロテインをコードするＤＮＡを有することを特徴とするプラスミドをもその要旨とする。
【０００８】
　本発明において歯周組織とは、歯茎、セメント質、歯根膜、歯肉、歯槽骨などを意味する。したがって、本発明の歯周組織再生剤は、それらの組織を再生するという目的を有するものであるが、主にセメント質、歯根膜の再生作用に特に優れ、その他の歯周組織については二次的な再生作用を有するものである。
　本発明の歯周組織再生剤は、哺乳類の歯胚から調製する幼若エナメル質に由来するエナメル蛋白質であるシースリンのうち、歯周組織の再生作用を有する部分、すなわちシースプロテインを有効成分とするものである。具体的には、ブタの場合、シースリンを構成する４２１アミノ酸配列のうちの２７〜１９６段目であるＶＰＡＦＰＲＱＰＧＴＰＧＶＡＳＬＳＬＥＴＭＲＱＬＧＳＬＱＧＬＮＭＬＳＱＹＳＲＦＧＦＧＫＳＦＮＳＬＷＭＨＧＬＬＰＰＨＳＳＦＱＷＭＲＰＲＥＨＥＴＱＱＹＥＹＳＬＰＶＨＰＰＰＬＰＳＱＰＳＬＱＰＱＱＰＧＱＫＰＦＬＱＰＴＶＶＴＳＩＱＮＰＶＱＫＧＶＰＱＰＰＩＹＱＧＨＰＰＬＱＱＶＥＧＰＭＶＱＱＱＶＡＰＳＥＫＰＰＥＡＥＬＰＧＬＤＦＡＤＰＱＤＰＳＭＦＰＩＡＲからなるアミノ酸配列を有する分子量１３〜１７ｋＤａのエナメル蛋白質がシースプロテインであり、ヒトの場合、シースリンを構成する４４７アミノ酸配列のうちの２７〜２２２段目であるVPFFPQQSGTPGMASLSLETMRQLGSLQRLNTLSQYSRYGFGKSFNSLWMHGLLPPHSSLPWMRPREHETQQYEYSLPVHPPPLPSQPSLKPQQPGLＫPFLQSAAATTNQATALKEALQPPIHLGHLPLQEGELPLVQQQVAPSDKPPKPELPGVDFADPQGPSLPGMDFPDPQGPSLPGLDFADPQGSTIFQIARからなるアミノ酸配列を有する分子量１３〜１９ｋＤａのエナメル蛋白質がシースプロテインである。
　なお、シースプロテインは、例えばシースリンなどと比較すると、歯周組織の再生に必要な箇所を効率良く含んでいることは事実であるが、歯周組織再生に直接関わる箇所以外の部分を含んでいる可能性もあり、その全てのアミノ酸配列が必ずしも必要ではない場合もある。すなわち、シースプロテインを構成するアミノ酸配列は、より歯周組織再生作用の強い部位を包含している可能性があり、そのような箇所、すなわちシースプロテイン由来のペプチドを用いることにより、更に効率的に歯周組織再生作用を得ることができる場合もある。
【０００９】
　シースプロテインは、本発明の歯周組織再生剤１００ｍｇに有効成分として、０．０００１〜５ｍｇ、好ましくは０．００１〜３ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１ｍｇ程度含有させることにより、その歯周組織の再生作用を十分に発揮することができる。
　また、本発明の歯周組織再生剤の有効成分であるシースプロテインは、アメロゲニンやエナメリンなどのエナメル蛋白質を会合していてもよく、これらのエナメル蛋白質が会合したシースプロテインを用いる方が優れた歯周組織再生作用を発揮することもある。シースプロテインがアメロゲニンやエナメリンを会合した複合体を用いる場合において、該複合体からなる有効成分の含有量は、本発明の歯周組織再生剤１００ｍｇに、０．０００３〜１０ｍｇ、好ましくは、０．００３〜５ｍｇ、より好ましくは、０．０３〜３ｍｇ程度とする。
　有効成分の量が上記未満では、歯周組織の再生作用が十分に得られないことがあり、上記より多いと、効果が飽和しているにもかかわらず、コストが高くなり経済的に不利となる。
【００１０】
　本発明の歯周組織再生剤の有効成分であるシースプロテインは、哺乳類の歯胚から抽出することにより調製しても良いし、シースプロテインをコードするＤＮＡを有するプラスミドを用いることによりリコンビナントタンパク質として調製しても良い。由来として相応しい哺乳類としては、ブタ、ウシ、サル、ラット、ウマ、ヒトなどが挙げられ、なかでもブタ、ヒトなどを好ましく用いることができる。上記のいずれの方法においても、シースプロテインの調製には歯胚、および／または萌出歯を要するため、いずれについても幼少期の個体を用いるのが好ましく、具体的には、例えばブタの場合、生後５〜７ヶ月程度の個体を用いるのが好ましい。
【００１１】
　本発明において、シースプロテインの抽出法には二通りある。第一の方法は、（１）哺乳類の歯胚から幼若エナメル質を調製し、（２）これに中性緩衝液を加え、低温下にてホモジナイズして中性不溶性画分を得る、（３）これにアルカリ性緩衝液を加えて低温下にてホモジナイズし、アルカリ可溶性画分を得る、（４）アルカリ可溶性画分を限外濾過膜により濃縮し、（５）クロマトグラフィーにかけ、最初に溶出してくる画分を分取する、（６）この画分についてイオン交換を行い、最初に溶出してくる画分を分取する、という方法であって、量産には向かない場合があるが、抽出されるシースプロテインの精製度は高く、抽出効果も高い。
　本抽出方法において、よりシースプロテインの精製度を上げたい場合には、必要により上記の操作に加えて、グアニジン溶液中にて、他のエナメル蛋白質の会合を抑えてゲル濾過を行うとよい。
【００１２】
　（１）で幼若エナメル質を調製するには、幼少期の哺乳類の顎骨より歯胚を取り出し、歯髄などを取り除いて洗浄した後に、チーズ様の硬さ部分、すなわち基質形成期の幼若エナメル質から表層部分だけを削り取るなどして分取すればよい。表層部分だけを分取するのは、この部分に新生幼若エナメル質（すなわち、できたばかりの幼若エナメル質）があり、強い歯周組織再生作用がこの部分に存在するからである。なお、歯胚は、永久歯、乳歯いずれについても用いることができる。この際、不要な歯の残骸などは取り除いておくとよい。（２）で用いる中性緩衝液は、幼若エナメル質のグラム当たり５〜５０ｍｌ、好ましくは１０〜３０ｍｌ加え、低温下、すなわち０〜８℃、好ましくは２〜５℃にてホモジナイズし、遠心分離して上清を除去する操作を３〜４回繰り返すことにより、プロテアーゼなどが除去された粗シースプロテインが不溶物、すなわち中性不溶性画分として残る。なお、この操作を繰り返す際は、試料の温度の上がりすぎに注意して行うのがよい。（３）で用いるアルカリ性緩衝液は、得られた中性不溶性画分にグラム当たり５〜５０ｍｌ、好ましくは１０〜３０ｍｌ加え、低温下、すなわち０〜８℃、好ましくは２〜５℃にてホモジナイズして遠心分離することによりアルカリ可溶性画分を得ることができる。
【００１３】
　上記のシースプロテインの抽出法において、（２）で用いる中性緩衝液とは、ｐＨが６〜８、好ましくは７．０〜７．６、より好ましくは７．２〜７．４の緩衝液をいい、具体的には、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ緩衝液などを用いることができるが、好ましくはリン酸緩衝液を用いるのがよく、１０〜１００ｍＭ、好ましくは４０〜６０ｍＭ程度のものを用いるのが好ましい。（３）で用いるアルカリ性緩衝液は、ｐＨが９〜１３、好ましくは１０〜１１、より好ましくは１０．５〜１０．８の緩衝液をいい、具体的には、炭酸緩衝液、アンモニア溶液などを用いることができるが、好ましくは炭酸緩衝液などの弱塩緩衝液を用いるのがよく、１０〜１００ｍＭ、好ましくは４０〜６０ｍＭ程度のものを用いるのが好ましい。なお、（２）、（３）の工程を該温度にて行うのは、シースプロテインの抽出効率を上げるためで、これ以上の温度において抽出操作を行った場合には、極度に抽出効率が下がってしまうことがある。（４）で用いる限外濾過膜としては、分子量１〜３ｋＤａ程度のものをふるい分けられるもの、具体的には、ＹＭ−１やウルトラセルＰＬＡＣ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製）などを用いればよい。（５）クロマトグラフィーとしては、セファデックスＧ−１００、セファデックスＧ−１００スーパーファインやセファロース６Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）などのカラムを用いてゲル濾過を行ってもよいし、ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＰＷ（東ソー社製）などのカラムを用いて高速液体クロマトグラフィーを行ってもよいが、好ましくはセファデックスＧ−１００スーパーファインを用いたゲル濾過を行うのがよく、（３）で用いた緩衝液と同じ緩衝液で平衡化してから用いるとよい。（６）でのイオン交換は、５〜８Ｍの尿素中（緩衝液にてｐＨを７．４付近に調整）にて、ワットマンＱ（Ｗｈａｔｍａｎ社製商品名”ＥＸＰＲＥＳＳ−ＩＯＮ　ＥＸＣＨＡＮＧＥＲ　Ｑ”）などのセルロースイオン交換体などを用いて行う。上記のアルカリ可溶性画分のうち、最大で約１５重量％がこの画分、すなわちシースプロテインとして溶出される。
【００１４】
　また、上記により得られたシースプロテインの精製度を更に上げたい場合には、必要に応じて、２〜８Ｍ、好ましくは３．５〜４．５Ｍグアニジン溶液中、または２〜１０Ｍ、好ましくは６〜８Ｍ尿素中にてゲル濾過クロマトグラフィーを行うと良い。用いるカラムとしては、セルロファインＧＣＬ−２０００（チッソ株式会社製）、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００（東ソー社製）、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＰＷ（東ソー社製）などを挙げることができる。また、この工程は、アメロゲニンやエナメリンとシースプロテインとの会合を抑えるための工程であって、上記の溶媒を用いることにより蛋白質の抽出、最初の分画のゲル濾過の代わりとしても良い。
　さらに、シースプロテインを会合体のない状態で得たい場合には、上記の工程に加えて更に、例えば担体としてRESOURCE  RPC (Pharmacia Biotech)などを用い、トリフロロ酢酸−アセトニトリル系の溶液中などにおいて逆相クロマトグラフィーを行えば良い。
　なお、上記の（３）の工程において、アルカリ可溶性画分側に移行せずに、結晶として残存するものに少量の粗シースプロテインが付着している。そこで、この結晶に酢酸を加えて、粗シースプロテインを溶出させて、取り出すことができる。この後、上記の（４）〜（６）の工程を行ってシースプロテインを採取すればよい。
【００１５】
　第二の方法は、（１）哺乳類の歯胚から幼若エナメル質を調製し、（２）これにアルカリ性緩衝液を加えて撹拌抽出し、遠心分離して沈殿物を除き、低温下にて硫安分画を行う、（３）得られた試料を限外濾過膜により脱塩する、という方法であって、シースプロテインの抽出・精製効果は第一の方法よりも低いが、量産が必要な際に有効である。
　本方法における（１）で幼若エナメル質を調製するには、第一の方法の（１）と同様にして分取してもよいが、幼少期の哺乳類の顎骨より歯胚を取り出し、チーズ様の硬さ部分、すなわち基質形成期の幼若エナメル質において、その表層のみでなくそれら全てを用いてよい。なお、歯胚は、永久歯、乳歯いずれについても用いることができる。幼若エナメル質は、取り出した歯胚の歯髄などを除去して洗浄した後に、これから削り取ったり、緩衝液中に投入してスターラーなどにより強く撹拌するなどして分取すればよい。この際、不要な歯の残骸などは取り除いておくとよい。
【００１６】
　（１）にて幼若エナメル質を調製した後は、すぐに（２）の工程に進んで構わないが、必要に応じて第一の方法における（２）の工程、すなわち中性緩衝液を用いてプロテアーゼなどを除去する工程を行ってもよい。
　第二の方法において、アルカリ性緩衝液、および必要に応じて用いる中性緩衝液は、第一の方法と同様でよいが、中性緩衝液は、幼若エナメル質のグラム当たり１０〜５０ｍｌ、好ましくは２０〜４０ｍｌ、アルカリ性緩衝液は、幼若エナメル質のグラム当たり、または第一の方法における（２）の工程を行った場合には、得られた沈澱のグラム当たり１０〜５０ｍｌ、好ましくは２０〜４０ｍｌ用いる。また、本方法においての抽出はホモジナイザーを用いる必要はなく、必要に応じて行う第一の方法における（２）の工程、および本方法の（２）の工程の各工程においては、緩衝液を加えて一晩、すなわち１６〜２４時間程度撹拌を行えばよい。
【００１７】
　続いて行う硫安分画は、低温下、すなわち０〜８℃、好ましくは２〜５℃にて行うのがよく、具体的には氷水中などで行えばよい。硫安分画は、具体的には次のように行う。まず飽和硫安の５〜１０重量％、好ましくは６〜７重量％になるように硫安を加え、生じた沈澱を除去する。次に４０〜５０重量％、好ましくは４５〜４６重量％になるように硫安を加え、生じた沈澱を集める。硫安の脱塩は、１０〜５０ｍＭ程度の酢酸などに溶解し、第一の方法で用いるものと同様の限外濾過膜を用いるなどして行う。また、必要に応じて得られた標品を凍結乾燥してもよい。
　本抽出方法において、よりシースプロテインの精製度を上げたい場合には、必要により上記の操作に加えて、第一の方法における、（５）以下の操作を行ってもよい。
【００１８】
　上記のいずれの方法により得られたシースプロテインも、アメロゲニンやエナメリンと会合した複合体で得られる場合があるが、本発明の歯周組織再生剤の有効成分としてこの複合体を用いても、何ら差し障りはない。
　なお、製剤化する際、抽出により調製したシースプロテインについては、抽出後、必要に応じて得られたシースプロテイン中に含まれるプロテアーゼを失活させ、個体が有するウイルスなどの感染を防ぐため、滅菌処理を行うことが好ましい。具体的には、例えばブタの有するＥ型ウイルスの滅菌処理は、８０℃程度の加熱を３０分程度行えば良く、その他の哺乳類の有するウイルスなどについても、それぞれに合致した滅菌処理を行えばよいが、一般的には６０〜１００℃程度において、１０〜６０分程度の滅菌処理を行うとよい。必要以上に高温、長時間の滅菌処理を行うと、有効成分となるシースプロテインが変性して失活する虞があるので上記の範囲とするものであるが、上記の処理により、むしろ歯周組織の再生作用が向上する場合もある。
　このようにして抽出したシースプロテインは、本発明の歯周組織再生剤の有効成分であって、エナメル質形成に関わる作用を有することはもちろんであるが、優れた歯周組織再生作用を有するため、主に歯周病などの歯科系疾患を治療した後に、除去した歯周組織を再生することを目的とした治療薬として用いることができ、ブラッシングによる歯肉の退縮や、治療した際に用いた義歯による歯根露出などに対処して歯周組織を再生することを目的とする治療薬として用いることもできるほか、インプラント表面を構成するバイオマテリアルなどとしても用いることができる。
【００１９】
　上記のようにして抽出したシースプロテインは、そのまま用いたり、純水などに溶解して用いたりしても構わないが、口内に入れても差し障りのないものであって、高い粘度を有するＰＧＡ（プロピレングリコールアルギン酸塩）やヒアルロン酸などに溶解させて用いると、塗布したい部位に保持され定着しやすくなる。また、上記のような用途に用いやすくするために、有効成分であるシースプロテインのほかに、抗炎症剤、増量剤、香料、細胞成長増殖因子（ＴＧＦ）や骨形成因子（ＢＭＰ）などの増殖因子などを添加して歯周組織再生剤としてもよい。
　また、本発明の歯周組織再生剤を用いる治療と、ＧＴＲ法などの治療とを組み合わせることにより、さらに効果的に歯周組織再生作用を得ることも期待できる。
【００２０】
　また、本発明の歯周組織再生剤の有効成分であるシースプロテインは、表１（ヒトのシースリン（下線部はシースプロテイン）のアミノ酸配列（シースプロテインは２７〜２２２段目）、および塩基配列（シースプロテインをコードするＤＮＡは１５４〜７４１段目））、および表２（ブタのシースリン（下線部はシースプロテイン）のアミノ酸配列（シースプロテインは２７〜１９６段目）、および塩基配列（シースプロテインをコードするＤＮＡは１６７〜６７６段目））のように遺伝子レベルでのクローニングもなされており、遺伝子工学的に、あるいは培養工学的に大量に生産することもできる。すなわち、シースプロテインをコードするＤＮＡを有するプラスミドにより大腸菌などの細菌や酵母などの真菌、あるいは哺乳類や昆虫などの動物細胞などを形質転換させ、得られた細胞を適切な条件において培養することにより、シースプロテインをリコンビナントタンパク質として大量に調製することもできる。
【００２１】
〔表１〕
　　　　　10　　　　20　　　　30　　　　40　　　　50　　　　60
　gtcctgaaaaaaattttaatcttcttttcttagaactatcttggttggcatcatcaggcc
　　　　　70　　　　80　　　　90　　　 100　　　 110　　　 120
　ctgagggcacagtgcatgtcagcatctaagattccacttttcaaaatgaaggacctgata
　　　　　　　　 M　S　A　S　K　I　P　L　F　K　M　K　D　L　I　
　　　　 130　　　 140　　　 150　　　 160　　　 170　　　 180
　ctgatcctatgcctcctggaaatgagttttgcagtgccgttctttcctcagcaatctgga
　L　I　L　C　L　L　E　M　S　F　A　V　P　F　F　P　Q　Q　S　G　
　　　　 190　　　 200　　　 210　　　 220　　　 230　　　 240
　acaccgggtatggctagtttgagccttgagacaatgagacagttgggaagtctgcagaga
　T　P　G　M　A　S　L　S　L　E　T　M　R　Q　L　G　S　L　Q　R　
　　　　 250　　　 260　　　 270　　　 280　　　 290　　　 300
　ttaaacacactttctcagtattctagatacggctttggaaaatcatttaattctttgtgg
　L　N　T　L　S　Q　Y　S　R　Y　G　F　G　K　S　F　N　S　L　W　
　　　　 310　　　 320　　　 330　　　 340　　　 350　　　 360
　atgcacggtctcctcccaccacattcctctcttccatggatgaggccaagagaacatgaa
　M　H　G　L　L　P　P　H　S　S　L　P　W　M　R　P　R　E　H　E　
　　　　 370　　　 380　　　 390　　　 400　　　 410　　　 420
　actcaacagtatgaatattctttgcctgtgcatcccccacctctcccatcacagccatcc
　T　Q　Q　Y　E　Y　S　L　P　V　H　P　P　P　L　P　S　Q　P　S　
　　　　 430　　　 440　　　 450　　　 460　　　 470　　　 480
　ttgaagcctcaacagccaggactgaaaccttttctccagtctgctgctgcaaccaccaac
　L　K　P　Q　Q　P　G　L　K　P　F　L　Q　S　A　A　A　T　T　N　
　　　　 490　　　 500　　　 510　　　 520　　　 530　　　 540
　caggccacagcactgaaagaagcacttcagcctccaattcacctgggacatctgcccttg
　Q　A　T　A　L　K　E　A　L　Q　P　P　I　H　L　G　H　L　P　L　
　　　　 550　　　 560　　　 570　　　 580　　　 590　　　 600
　caggaaggagaactgcctctggttcagcagcaggtggcaccatcagataagccaccaaag
　Q　E　G　E　L　P　L　V　Q　Q　Q　V　A　P　S　D　K　P　P　K　
　　　　 610　　　 620　　　 630　　　 640　　　 650　　　 660
　cctgagctcccaggagtagattttgctgatccacaaggtccatcactcccaggaatggat
　P　E　L　P　G　V　D　F　A　D　P　Q　G　P　S　L　P　G　M　D　
　　　　 670　　　 680　　　 690　　　 700　　　 710　　　 720
　tttcctgatccacaaggtccatcactcccaggattggattttgctgatccacaaggttca
　F　P　D　P　Q　G　P　S　L　P　G　L　D　F　A　D　P　Q　G　S　
　　　　 730　　　 740　　　 750　　　 760　　　 770　　　 780
　acaattttccaaatagcccgtttgatttctcacggaccaatgccacaaaataaacaatct
　T　I　F　Q　I　A　R　L　I　S　H　G　P　M　P　Q　N　K　Q　S　
　　　　 790　　　 800　　　 810　　　 820　　　 830　　　 840
　ccactttatccaggaatgttgtacgtgccttttggagcaaatcaattgaatgcccctgcc
　P　L　Y　P　G　M　L　Y　V　P　F　G　A　N　Q　L　N　A　P　A　
　　　　 850　　　 860　　　 870　　　 880　　　 890　　　 900
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　R　L　G　I　M　S　S　E　E　V　A　G　G　R　E　D　P　M　A　Y　
　　　　 910　　　 920　　　 930　　　 940　　　 950　　　 960
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　G　A　M　F　P　G　F　G　G　M　R　P　G　F　E　G　M　P　H　N　
　　　　 970　　　 980　　　 990　　　1000　　　1010　　　1020
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　P　A　M　G　G　D　F　T　L　E　F　D　S　P　V　A　A　T　K　G　
　　　　1030　　　1040　　　1050　　　1060　　　1070　　　1080
　cctgagaacgaagaaggaggtgcacaaggctcccctatgccggaggccaacccagacaat
　P　E　N　E　E　G　G　A　Q　G　S　P　M　P　E　A　N　P　D　N　
　　　　1090　　　1100　　　1110　　　1120　　　1130　　　1140
　ctagaaaacccagctttccttacagagctagaacctgctccccacgcagggctccttgct
　L　E　N　P　A　F　L　T　E　L　E　P　A　P　H　A　G　L　L　A　
　　　　1150　　　1160　　　1170　　　1180　　　1190　　　1200
　ctccctaaggatgacattcccggcctgccaaggagcccttcagggaagatgaagggactc
　L　P　K　D　D　I　P　G　L　P　R　S　P　S　G　K　M　K　G　L　
　　　　1210　　　1220　　　1230　　　1240　　　1250　　　1260
　cccagcgtcaccccagcagctgctgacccactgatgacccctgaattagctgatgtttat
　P　S　V　T　P　A　A　A　D　P　L　M　T　P　E　L　A　D　V　Y　
　　　　1270　　　1280　　　1290　　　1300　　　1310　　　1320
　aggacctacgatgctgacatgaccacatccgtggatttccaggaagaagcaaccatggat
　R　T　Y　D　A　D　M　T　T　S　V　D　F　Q　E　E　A　T　M　D　
　　　　1330　　　1340　　　1350　　　1360　　　1370　　　1380
　accacgatggccccaaactctctgcaaacatccatgccaggaaacaaagcccaggagccc
　T　T　M　A　P　N　S　L　Q　T　S　M　P　G　N　K　A　Q　E　P　
　　　　1390　　　1400　　　1410　　　1420　　　1430　　　1440
　gagatgatgcatgacgcatggcatttccaagagccctgacagctctaagatattagctac
　E　M　M　H　D　A　W　H　F　Q　E　P　*　
　　　　1450　　　1460　　　1470　　　1480　　　1490　　　1500
　tttctgtatgcacaagcttcccagctttgtccccacagtgtacctttttgctaaaacact
　　　　1510　　　1520　　　1530　　　1540　　　1550　　　1560
　tattacccttctgcagcaaaggcattaaaagcgctaagcatatattaataaatgcaagtg
　　　　1570　　　1580　　　1590　　　1600　　　1610　　　1620
　gctagaaatagtgtaggtccccttcttgctttcaatatcttgttgaaataaaatgtgtca
　　　　1630　　　1640　　　1650
　attgtctctgtgaaaaaaaaaaaaaaaaa
【００２２】
〔表２〕
　　　　　10　　　　20　　　　30　　　　40　　　　50　　　　60
　gtcccaggctacagtccagaaaaaaaatttaatcttcttttcttagagctatcttggttg
　　　　　70　　　　80　　　　90　　　 100　　　 110　　　 120
　gcatcaccaggccctgagagcactgtgcatgccagcattgaagattccacttttcaaaat
　　　　　　　　　　　　　　　M　P　A　L　K　I　P　L　F　K　M　
　　　　 130　　　 140　　　 150　　　 160　　　 170　　　 180
　gaaggacatggtactgatcctgtgcctcctgaaaatgagttctgcagtgccggcatttcc
　 K　D　M　V　L　I　L　C　L　L　K　M　S　S　A　V　P　A　F　P　
　　　　 190　　　 200　　　 210　　　 220　　　 230　　　 240
　tcggcaacctggaaccccaggtgtggctagtttgagccttgagacaatgagacagttggg
　 R　Q　P　G　T　P　G　V　A　S　L　S　L　E　T　M　R　Q　L　G　
　　　　 250　　　 260　　　 270　　　 280　　　 290　　　 300
　aagtttgcagggactaaacatgctttctcagtattcaagatttggctttgggaaatcatt
　 S　L　Q　G　L　N　M　L　S　Q　Y　S　R　F　G　F　G　K　S　F　
　　　　 310　　　 320　　　 330　　　 340　　　 350　　　 360
　taattctctgtggatgcatggtctccttccaccacactcctccttccaatggatgagacc
　 N　S　L　W　M　H　G　L　L　P　P　H　S　S　F　Q　W　M　R　P　
　　　　 370　　　 380　　　 390　　　 400　　　 410　　　 420
　aagggaacatgaaactcaacagtatgaatattctttgcctgtgcaccccccacctctccc
　 R　E　H　E　T　Q　Q　Y　E　Y　S　L　P　V　H　P　P　P　L　P　
　　　　 430　　　 440　　　 450　　　 460　　　 470　　　 480
　atcgcagccatccttgcagcctcaacagccgggacagaagcctttcctccagcccactgt
　 S　Q　P　S　L　Q　P　Q　Q　P　G　Q　K　P　F　L　Q　P　T　V　
　　　　 490　　　 500　　　 510　　　 520　　　 530　　　 540
　cgtaacctccatccagaacccagtccagaagggagtacctcagcctccaatttaccaggg
　 V　T　S　I　Q　N　P　V　Q　K　G　V　P　Q　P　P　I　Y　Q　G　
　　　　 550　　　 560　　　 570　　　 580　　　 590　　　 600
　acatccgcccttgcagcaagtagaggggccaatggttcagcagcaggtggcaccatcaga
　 H　P　P　L　Q　Q　V　E　G　P　M　V　Q　Q　Q　V　A　P　S　E　
　　　　 610　　　 620　　　 630　　　 640　　　 650　　　 660
　aaagccaccagaggccgagctaccaggactggattttgctgatccacaagatccatcgat
　 K　P　P　E　A　E　L　P　G　L　D　F　A　D　P　Q　D　P　S　M　
　　　　 670　　　 680　　　 690　　　 700　　　 710　　　 720
　gtttccaatagcccgtttgatatctcagggaccagtgccacaagataagccatctccact
　 F　P　I　A　R　L　I　S　Q　G　P　V　P　Q　D　K　P　S　P　L　
　　　　 730　　　 740　　　 750　　　 760　　　 770　　　 780
　ttatccaggaatgttttacatgtcctacggagcaaatcaattgaactctcctgccagact
　 Y　P　G　M　F　Y　M　S　Y　G　A　N　Q　L　N　S　P　A　R　L　
　　　　 790　　　 800　　　 810　　　 820　　　 830　　　 840
　tggcatcctgagctcagaagaaatggcgggaggaagaggaggccccttggcctatggagc
　 G　I　L　S　S　E　E　M　A　G　G　R　G　G　P　L　A　Y　G　A　
　　　　 850　　　 860　　　 870　　　 880　　　 890　　　 900
　catgttcccaggatttggaggcatgaggcccaaccttggagggatgccccccaactcagc
　 M　F　P　G　F　G　G　M　R　P　N　L　G　G　M　P　P　N　S　A　
　　　　 910　　　 920　　　 930　　　 940　　　 950　　　 960
　caagggtggggactttactctggagtttgactccccagctgctggaaccaaaggccccga
　 K　G　G　D　F　T　L　E　F　D　S　P　A　A　G　T　K　G　P　E　
　　　　 970　　　 980　　　 990　　　1000　　　1010　　　1020
　gaagggagaaggaggtgcagaaggctctccagtggcggaggccaacacagctgatcctga
　 K　G　E　G　G　A　E　G　S　P　V　A　E　A　N　T　A　D　P　E　
　　　　1030　　　1040　　　1050　　　1060　　　1070　　　1080
　aagcccagctctcttttcagaggtagcatctggtgtcctcggagggcttcttgctaatcc
　 S　P　A　L　F　S　E　V　A　S　G　V　L　G　G　L　L　A　N　P　
　　　　1090　　　1100　　　1110　　　1120　　　1130　　　1140
　aaagggcaaaattcccaacctggcaagaggccctgcagggcggagcaggggaccccccgg
　 K　G　K　I　P　N　L　A　R　G　P　A　G　R　S　R　G　P　P　G　
　　　　1150　　　1160　　　1170　　　1180　　　1190　　　1200
　ggtgaccccagcagatgctgacccactgatgacccccggattagctgatgcttatgagac
　 V　T　P　A　D　A　D　P　L　M　T　P　G　L　A　D　A　Y　E　T　
　　　　1210　　　1220　　　1230　　　1240　　　1250　　　1260
　ctacggtgctgatgagaccacaactctgggtctccaggaagaaatgaccatggattccac
　 Y　G　A　D　E　T　T　T　L　G　L　Q　E　E　M　T　M　D　S　T　
　　　　1270　　　1280　　　1290　　　1300　　　1310　　　1320
　agcgaccccatacagtgagcatacatcaatgccaggcaacaaagcccagcagccccagat
　 A　T　P　Y　S　E　H　T　S　M　P　G　N　K　A　Q　Q　P　Q　I　
　　　　1330　　　1340　　　1350　　　1360　　　1370　　　1380
　taagcgtgatgcgtggcgtttccaagagccctgagagccttgaaatatcggctactttct
　 K　R　D　A　W　R　F　Q　E　P　*　
　　　　1390　　　1400　　　1410　　　1420　　　1430　　　1440
　gtatgcacaagctccccagctttgtccccatagtatatctttttgcaaaaacacttatta
　　　　1450　　　1460　　　1470　　　1480　　　1490　　　1500
　cccttctgcagcaaaggcattaaaagcgctaagcacatattaataaatacaagtggctag
　　　　1510　　　1520　　　1530　　　1540　　　1550　　　1560
　aaatagtataggtcctcttcttgctttcattctcttattgaaataaaatgtgtcacctgt
　　　　1570　　　1580　　　1590　　　1600　　　1610　　　1620
　cactgtgatttagaaacacttttaatgacatgagagcaagtctaagggtctctgcattca
　　　　1630　　　1640　　　1650　　　1660　　　1670　　　1680
　aaaatcagtttcttagctgtcttggcattatgaatttctcttactagcatgacactgtta
　　　　1690　　　1700　　　1710　　　1720　　　1730　　　1740
　tatccaggaaatgtgacactgctttggaaattttactctaagcaaaggcacatattctta
　　　　1750　　　1760　　　1770　　　1780　　　1790　　　1800
　gaattataagttatttcactcaaacgttattaaacagggtttggtggacaatccctgact
　　　　1810　　　1820　　　1830　　　1840　　　1850　　　1860
　ggtattactgggtttggtatattggattttaaattctcatttgtagagtattttatttaa
　　　　1870　　　1880　　　1890　　　1900　　　1910
　tctactaaaaacatttagcctattttaaataaagaatttttctcactg
【００２３】
　シースプロテインをコードするＤＮＡを有するプラスミドは、下記の要領で作製することができる。まず、哺乳類の歯胚、および／または萌出歯を調製して、基質形成期、あるいは成熟期のエナメル芽細胞、および／または象牙芽細胞を含む細胞群を調製する。歯胚、および／または萌出歯は、永久歯、乳歯いずれのものを用いても良い。得られた細胞群から定法により総ＲＮＡを抽出して、それらのｃＤＮＡを調製する。適切なプライマーを用いて、シースプロテインをコードするＤＮＡをＰＣＲ法などにより増幅させ、これから制限酵素切断部位などを付加した適切なプライマーを用いたＰＣＲ法などにより目的遺伝子を作製し、所望のベクターと上記にて得られた目的遺伝子とを制限酵素を用いて切断部位にて切断した後、両者をライゲーションすることにより目的のプラスミド、すなわちシースプロテインをコードするＤＮＡを有するプラスミドを得ることができる。具体的には、例えば、ヒトの場合、表１に記載の塩基配列のうち、１５４〜７４１段目の塩基配列を有するプラスミドであり、ブタの場合、表２に記載の塩基配列のうち、１６７〜６７６段目の塩基配列を有するプラスミドである。
　なお、上記のシースプロテインをコードするＤＮＡは、歯周組織再生に直接関わる箇所以外の部分をコードするＤＮＡを含んでいる可能性もあり、その全ての塩基配列が必ずしも必要ではない場合もある。すなわち、上記のシースプロテインをコードするＤＮＡは、より歯周組織再生作用の強い部位、すなわちシースプロテイン由来のペプチドをコードするＤＮＡを包含している可能性もあるが、そのような箇所を目的遺伝子として上記と同様にしてプラスミドを作製することもでき、このようなプラスミドを用いることにより、更に効率的にリコンビナントタンパク質を得ることができる場合もある。
【００２４】
　用いるベクターとしては、宿主が大腸菌などの場合、ｐＥＴベクターなど、パン酵母などの場合、Ｐｉｃｈｉａ　エクスプレッションベクターなど、哺乳類の培養細胞の場合、ｐｃＤＮＡ３ベクターなどが適当である。
　宿主としては、大腸菌、パン酵母、ヒト由来２９３株細胞などの動物細胞などを用いることができる。
　上記のようにして得られたプラスミドは、宿主となる細胞に導入して適切な培養を行うことにより、培養液から大量のシースプロテインを抽出することができる。
【発明の効果】
【００２５】
　本発明の歯周組織再生剤は、少量塗布するのみで、速やかに、かつ優れた歯周組織の再生作用を発揮するうえ、有効成分として歯周組織の再生に直接関与するエナメル蛋白質のほかには余分な蛋白質を含まないため、これによる副作用などが殆ど起こらないなどの効果をも併せ持つ。
　また、本発明の有効成分抽出法やプラスミドを用いれば、大量のシースプロテインを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
実施例１
　生後６ヶ月のブタの下顎骨から、切歯の永久歯歯胚を取り出し、周囲の軟組織や歯髄を除去した。これを生理食塩水で洗って水分を拭き取った後、チーズ様の硬さ部分の表面（すなわち、基質形成期の新生幼若エナメル質）を約６０μｍ削り集めた。歯胚の成熟度によって収量にばらつきはあるが、ブタ５０頭分の切歯から約１５０ｍｇの新生幼若エナメル質が取れた。この新生幼若エナメル質にグラム当たり２０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、ホモジナイザー（ポリトロン社製）を用い、４℃にて６０００回転でトータルで３０秒間撹拌（なお、この操作の際に温度が上がるため、攪拌をときどき停止したり、氷水浴を用いるなどして）抽出し、遠心分離して上清を除去した。この操作を３回繰り返した。得られた不溶物にグラム当たり２０ｍｌの５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．８）を加え、２℃にてホモジナイズし、遠心分離することによりアルカリ可溶性画分３５ｍｇを得た。アルカリ可溶性画分は、そのまま限外濾過膜ＹＭ−１を使用して濃縮し、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．８）で平衡化してあるセファデックスＧ−１００カラムを用いてゲル濾過による分画を行い、最初に溶出してくる画分を分取した。この画分をさらに６Ｍ尿素中（５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）にてワットマンＱのセルロースイオン交換体でイオン交換し、最初に溶出してくる画分を分取することにより、シースプロテインにアメロゲニン、エナメリンが少量会合した複合体が４．５ｍｇ抽出された（このうち、シースプロテインは０．５〜１．５ｍｇ）。
【００２７】
実施例２
　生後約６か月のブタの下顎骨から永久歯歯胚を取り出し、周りの軟組織や歯髄を除去した。これを生理食塩水で洗って水分を拭き取った後、チーズ用の硬さ部分（すなわち、基質形成期の幼若エナメル質）を削り集めた。ブタ一頭分の切歯から約１２０ｍｇの幼若エナメル質が取れた。集めた試料に、グラム当たり３０ｍｌの５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７〜７．４）を加え、４℃で一晩撹拌した。遠心分離して沈澱を集め、沈澱に同じ容量の５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．８）を加えて一晩撹拌した。遠心分離して沈殿物を除き、氷水中にて下記の硫安分画を行った。まず飽和硫安の６重量％になるように硫安を加え、生じた沈澱は除去する。次に４５重量％になるように硫安を加え、生じた沈澱を集める。集めた沈澱は硫安を除くために５０ｍＭ酢酸で溶かし、限外濾過膜ＹＭ−１にて脱塩し、凍結乾燥して３．５ｍｇのシースプロテインにアメロゲニン、エナメリンが会合した複合体を得た。
【００２８】
実施例３
　生後約１２ヶ月のウシの下顎骨から、切歯の永久歯歯胚を取り出し、周囲の軟組織や歯髄を除去した。これを生理食塩水で洗って水分を拭き取った後、チーズ様の硬さ部分の表面（すなわち、基質形成期の新生幼若エナメル質）を約６０μｍ削り集めた。歯胚の成熟度によって収量にばらつきはあるが、ウシ２０頭分の切歯から約２５ｍｇの新生幼若エナメル質が取れた。この新生幼若エナメル質にグラム当たり２０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、ホモジナイザー（ポリトロン社製）を用い、４℃にて６０００回転でトータルで３０秒間撹拌（なお、この操作の際に温度が上がるため、攪拌をときどき停止したり、氷水浴を用いるなどして）抽出し、遠心分離して上清を除去した。この操作を３回繰り返した。得られた不溶物にグラム当たり２０ｍｌの５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．８）を加え、２℃にてホモジナイズし、遠心分離することによりアルカリ可溶性画分６ｍｇを得た。アルカリ可溶性画分は、そのまま限外濾過膜ＹＭ−１を使用して濃縮し、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．８）で平衡化してあるＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＰＷ（東ソー社製）のカラムを用いて高速液体クロマトグラフィーでゲル濾過による分画を行い、最初に溶出してくる画分を分取した。この画分をさらに４Ｍグアニジン溶液中（５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．４）にてＴＳＫｇｅｌ　Ｇ４０００ＰＷ（東ソー社製）のカラムを用いて高速液体クロマトグラフィーでゲル濾過し、最後に溶出してくる画分を分取することにより、アメロゲニン、エナメリンを含んだシースプロテインが約０．２ｍｇ抽出された（このうち、シースプロテインは０．０５〜０．１ｍｇ）。
【００２９】
実施例４
　実施例１にて抽出したシースプロテイン０．０９ｍｇを、６％ＰＧＡ溶液１００ｍｇに溶解して歯周組織再生剤１とした。また、実施例２にて抽出したシースプロテインの凍結乾燥品０．５ｍｇを、６％ＰＧＡ溶液１００ｍｇに溶解して歯周組織再生剤２とした。
　イヌの唇面側の切歯に接する歯根膜を剥離し、歯槽骨、歯根膜、セメント質を削り取って除去した。ここに、上記で調製した歯周組織再生剤１、および２を塗布し、５６日後の歯肉の様子を光学顕微鏡（×１０）にて観察した。顕微鏡写真を、それぞれ図１、および図２に示す。
　なお、コントロールとして、何も塗布していない歯周組織の５６日後の様子を図３に、エムドゲイン３０ｍｇ／ｍｌを塗布した歯周組織の５６日後の様子を図４に示す。
　図１〜４から明らかなように、エムドゲインにより再生した歯周組織（図４）に対し、シースプロテインにより再生した歯周組織（図１、および図２）は、２〜８倍もの再生量（図１、図２、および図４中、矢印で示す部分が再生した部分を示している）を示しており、シースプロテインが歯周組織の再生作用において極めて優れた効果を有していることがわかる。
【００３０】
実施例５
　治療のために便宜抜去したヒトの第一小臼歯（萌出歯）について、周囲の軟組織や歯髄を除去した。これを生理食塩水で洗って水分を拭き取った後、歯を縦軸に沿って割って歯髄を抜き、象牙質の表面に残る象牙芽細胞を掻き取って、細胞群の試料とした。この試料から、定法により総ＲＮＡを抽出し、それらのｃＤＮＡを調製した。
　下記のプライマーを用いて、シースプロテインをコードするＤＮＡ（表１の下線部分）をＰＣＲ法により増幅させた。
　センスプライマー　　　　　5’- gtgccgttctttcctcagcaa -3’
　アンチセンスプライマー　　5’- atgggctatttggaaaattgt -3’
【００３１】
　増幅したＤＮＡについて、５’端には、制限酵素（ＨｉｎｄIII）切断部位、およびｍＲＮＡの合成に必要であるＫＯＺＡＫ配列、メチオニン（Ｍ）のコドンを、３’端には制限酵素（ＥｃｏＲI）切断部位、およびストップコドンを、それぞれ下記のプライマーを用いることによりＰＣＲ法にて付加して目的遺伝子を得た。
　付加に用いるプライマーの塩基配列
　　　　　　　　　　　　 M
　　　　5’- aagcttccaccatggtgccgttctttcctcagcaa -3’
　　　　　　HindIII KOZAK
　　　　5’- gaattctcaatgggctatttggaaaattgt-3’
　　　　　　EcoRI stop
　得られた目的遺伝子とｐｃＤＮＡ３ベクターとを制限酵素 （EcoRI、および HindIII）で切断し、リガーゼで結合してｐｃＤＮＡ３ベクターに目的遺伝子を組み込むことにより、シースプロテインをコードするＤＮＡ（ヒト）を有するプラスミドを得た。
【００３２】
実施例６
　生後６ヶ月のブタの下顎骨から、切歯の永久歯歯胚を取り出し、歯胚の周囲の軟組織の表面を除去し、その深層のエナメル芽細胞を含む細胞群を調製した。このエナメル芽細胞を含む細胞群から、定法により総ＲＮＡを抽出し、それらのｃＤＮＡを調製した。
　下記のプライマーを用いて、シースプロテインをコードするＤＮＡ（表１の下線部分）をＰＣＲ法により増幅させた。
　センスプライマー　　　　　5’- gtgccggcatttcctcggcaa -3’
　アンチセンスプライマー　　5’- acgggctattggaaacatcga -3’
【００３３】
　増幅したＤＮＡについて、５’端、および３’端の両端に、制限酵素（ＨｉｎｄIII）切断部位、および制限酵素（ＥｃｏＲI）切断部位を、下記のプライマーを用いることによりＰＣＲ法にて付加して目的遺伝子を得た。
　付加に用いるプライマーの塩基配列
　　　　5’- ccgaattcgtgccggcatttcctcggcaa -3’
　　　　　　EcoRI
　　　　5’- caagcttcacgggctattggaaacatcga -3’
　　　　　　HindIII
　得られた目的遺伝子とｐＥＴベクターとを制限酵素 （EcoRI、および HindIII）で切断し、リガーゼで結合してｐＥＴベクターに目的遺伝子を組み込むことにより、シースプロテインをコードするＤＮＡ（ブタ）を有するプラスミドを得た。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
　本発明の歯周組織再生剤は、優れた歯周組織再生作用を有するため、主に歯周病などの歯科系疾患を治療した後に、除去した歯周組織を再生することを目的とした治療薬として用いることができ、ブラッシングによる歯肉の退縮や、治療した際に用いた義歯による歯根露出などに対処して歯周組織を再生することを目的とする治療薬として用いることもできるほか、インプラント表面を構成するバイオマテリアルなどとしても用いることができる。
　また、本発明の歯周組織再生剤を用いる治療と、ＧＴＲ法などの治療とを組み合わせることにより、さらに効果的に歯周組織再生作用を得ることも期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実施例１で得たシースプロテインを使用した再生剤を塗布した歯周組織の様子を示した顕微鏡写真。
【図２】実施例２で得たシースプロテインを使用した再生剤を塗布した歯周組織の様子を示した顕微鏡写真。
【図３】何も塗布していない歯周組織の様子を示した顕微鏡写真。
【図４】エムドゲインを塗布した歯周組織の様子を示した顕微鏡写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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