(57)【要約】【課題】病原性システインプロテアーゼ、中でもアルギニン特異的システインプロアテーゼ（Ｒｇｐ）やリジン特異的システインプロアテーゼ（Ｋｇｐ）の活性を有効に阻害する新たな病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤を提供する。【課題解決手段】カテキン又はカテキン混合物を有効成分とする病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤を提供する。中でも、Ｒｇｐに対しては、（−）ガロカテキン（ＧＣ）及び（−）ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）が活性阻害効果が特に強く、Ｋｇｐに対しては、（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、（−）ガロカテキン（ＧＣ）及び（−）ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）が活性阻害効果が強い。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテキンを有効成分とする病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤。
【請求項２】
カテキン混合物を有効成分とする病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤。
【請求項３】
上記のカテキン又はカテキン混合物とは、（−）エピカテキン（ＥＣ）、（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、（−）エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、（−）カテキン（Ｃ）、（−）ガロカテキン（ＧＣ）、（−）カテキンガレート（Ｃｇ）及び（−）ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）のいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物である請求項１又は２に記載の病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤。
【請求項４】
病原性システインプロテアーゼが、アルギニン特異的システインプロアテーゼ（Ｒｇｐ）又はリジン特異的システインプロアテーゼ（Ｋｇｐ）であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤。
【請求項５】
（−）ガロカテキン（ＧＣ）及び（−）ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）のいずれか、或いはこれらの混合物を有効成分とするアルギニン特異的システインプロアテーゼ（Ｒｇｐ）活性阻害剤。
【請求項６】
（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、（−）ガロカテキン（ＧＣ）、（−）ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）のいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物を有効成分とするリジン特異的システインプロアテーゼ（Ｋｇｐ）活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、病原性システインプロテアーゼ、中でもアルギニン特異的システインプロアテーゼ（Ｒｇｐ）やリジン特異的システインプロアテーゼ（Ｋｇｐ）の活性を有効に阻害する病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤に関する。
【０００２】
【発明の背景】
プロテアーゼとは、タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）を分解する酵素の総称であり、タンパク質のペプチド結合を加水分解反応によって切断し、より小さいペプチド分画やアミノ酸に分解する。そしてこのプロテアーゼは、活性原基によって、１）セリンプロテアーゼ、２）システインプロテアーゼ、３）アスパラギン酸プロテアーゼ、４）メタロプロテアーゼなどに分類される。
【０００３】
システインプロテアーゼは、その活性亢進が様々な疾患に関与していることが知られ、これら疾患において亢進したシステインプロテアーゼを阻害することができれば、疾患の治療・予防に有効である可能性がある（現代化学増刊　プロテアーゼの生体機能、東京化学同人　１９９３年；　プロテアーゼとそのインヒビターなど）。
【０００４】
中でも、アルギニン特異的システインプロアテーゼ（以下「Ｒｇｐ」という。）及びリジン特異的システインプロアテーゼ（以下「Ｋｇｐ」という。）は、どちらの酵素も、歯周病原性細菌であるグラム陰性嫌気性細菌Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ジンジバリス菌）が産生する主要な酵素として知られているが、歯周病のビルレンス因子としての機能を備えているのみならず、様々な病原性機能を備えている。例えば、Ｋｇｐ及びＲｇｐは、互いに共同して歯周組織の直接破壊や生体防御系の破壊する病原性機能を有するほか、Ｋｇｐは独自に線溶系の亢進などの病原性機能を発揮し、Ｒｇｐは独自に血液凝固系の亢進などの病原性機能を発揮することが知られている（化学と生物、ｖｏｌ．４０、Ｎｏ．２、７２−７４、２００２）。よって、これらの病原性機能を阻害することができれば、様々な疾患の治療・予防を期待することができる。
【０００５】
なお、Ｒｇｐは、アルギニン残基を特異的に認識してそのＣ末端側で切断するＡｒｇ−ジンジパインであり、Ｋｇｐは、リジン残基を特異的に認識してそのＣ末端側で切断するＬｙｓ−ジンジパインである。
【０００６】
【従来の技術】
病原性システインプロテアーゼ、中でもＫｇｐやＲｇｐの活性を阻害する物質としては、ＫＹＴ−１がＣｂｚ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｏ−Ｌｙｓ−ＮＭｅ２（Ｃｂｚ：カルボベンジルオキシ，Ｍｅ：メチル）の構造を有し、Ｒｇｐを特異的に阻害し、また、ＫＹＴ−３６はＣｂｚ−Ｇｌｕ（ＮＨＮＭｅＰｈ）−　Ｌｙｓ−ＣＯ−ＮＨＣＨ２Ｐｈの構造を有し、Ｋｇｐを特異的に阻害することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００７】
また、特許文献１記載の発明は、緑茶抽出物を含む各種天然物の抽出物についてプロテアーゼ阻害効果を検討しており、その実施例１では、各種天然物の抽出物の水溶液にプロテアーゼを産生する嫌気性細菌であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体懸濁液を加えて攪拌し、３５℃、５分間インキュベートし、これにカゼイン溶液を加え、３５℃、１０分間インキュベートし、その後、トリクロロ酢酸溶液を加えて反応を停止し、フォリン試薬を加え発色させた後６６０ｎｍの吸光度を測定し、予め作製した検量線よりプロテアーゼの力価を求めており、その結果、緑茶抽出物のプロテアーゼ阻害率１００％という結果を示す一方、その実施例２では、カテキンのプロテアーゼ阻害率０％という結果を示している。
【０００８】
なお、ＲＧＰを阻害する物質として、特許文献２には高分子量ポリフェノールが報告されている。そのほか、本発明には関連しないと思われるが、システインプロテアーゼ阻害剤としては、特開２００１−２４７４７５、特開平１１−２２８５２６、特開平０９−２９５９９６、特開平０９−１６５３６０、特表２００２−５１５９０２、特表２００２−５１５４１１、特表２００２−５１４１９２、特表２００２−５１２６２１、特表２００１−５２５８０９、特表２００１−５２５８０４、特表２００１−５１８５１３、特表２００１−５１４５０６、特表２００１−５０６５９６、特表２００１−５０１１７８、特表平１１−５０９５４３、特表平１１−５０９２３１などに開示されている。
【０００９】
【非特許文献１】
化学と生物、ｖｏｌ．４０、Ｎｏ．２、７３−７４、２００２
【特許文献１】
特開２００２−３３５３号公報
【特許文献２】
特開平８−８１３８０号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、天然物である茶の抽出成分の病原性システインプロテアーゼ阻害作用、特にＫｇｐやＲｇｐに対する活性阻害作用について鋭意研究し、茶の抽出成分に由来し、特にＫｇｐやＲｇｐの活性を阻害する作用に優れた病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤を提供せんとするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、カテキン又はカテキン混合物を有効成分とする病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤を提案する。
【００１２】
カテキンとしては、（−）エピカテキン（ＥＣ）、（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、（−）エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、（−）カテキン（Ｃ）、（−）ガロカテキン（ＧＣ）、（−）カテキンガレート（Ｃｇ）及び（−）ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）のいずれかを用いることができ、カテキン混合物としては、前記カテキンのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物を用いることができる。
【００１３】
カテキン又はカテキン混合物を有効成分とする病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤は、病原性システインプロテアーゼの中でもＲｇｐ及びＫｇｐの活性を有効に阻害する。中でも特に、ＧＣ及びＧＣｇのいずれか或いはこれらの混合物は、他のカテキンに比べてＲｇｐに対する活性阻害効果がより一層優れており、ＥＧＣ、ＥＧＣｇ、ＧＣ、ＧＣｇのいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物は、他のカテキンに比べてＫｇｐに対する活性阻害効果がより一層優れている。
よって、本発明はまた、ＧＣ及びＧＣｇのいずれか、或いはこれらの混合物を有効成分とするＲｇｐ活性阻害剤、並びに、ＥＧＣ、ＥＧＣｇ、ＧＣ、ＧＣｇのいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物を有効成分とするＫｇｐ活性阻害剤を提案するものである。
【００１４】
なお、本発明において「特定のカテキン（例えば（−）エピカテキン（ＥＣ）或いは（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）、或いはこれらの混合物など、限定されたカテキン）を有効成分とする」とは、当該特定のカテキンの病原性システインプロテアーゼ活性阻害効果を阻害しなければ、その他の成分、例えば当該特定のカテキン以外のカテキンなどの成分を含んでいてもよいという意を包含する。
また、ＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ、ＥＧＣｇ、Ｃ、ＧＣ、Ｃｇ及びＧＣｇそれぞれのカテキンの重合体、並びに、当該それぞれのカテキンと他のカテキンとの共重合体、或いはそれらの二種類以上の組合わせからなる混合物は、「カテキン又はカテキン混合物」「ＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ、ＥＧＣｇ、Ｃ、ＧＣ、Ｃｇ及びＧＣｇのいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物」の均等物であると考えることができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤は、カテキン又はカテキン混合物を適宜濃度で配合することによって製造することができる。但し、カテキン又はカテキン混合物の薬理活性を阻害しない範囲でその他の成分を配合したり、その他の処理を施すことは適宜可能である。
【００１６】
上記のカテキンとしては、ＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ及びＥＧＣｇ、これらのエピマーであるＣ、ＧＣ、Ｃｇ及び　ＧＣｇの８種類のカテキンのいずれかを用いることができる。
また、上記のカテキン混合物としては、上記８種類のカテキンのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物を用いることができる。
８種類全てのカテキンに病原性システインプロテアーゼ、中でもＲｇｐ及びＫｇｐに対する活性阻害効果が認められているが、各カテキンの活性阻害能には大きな差が見られる。
例えば、Ｒｇｐに対する活性阻害効果は、効果の大きい順に
ＧＣ、ＧＣｇ＞ＥＧＣｇ、ＥＧＣ＞Ｃｇ、ＥＣｇ＞ＥＣ、Ｃ
であり、
Ｋｇｐに対する活性阻害効果は、効果の大きい順に
ＧＣ、ＧＣｇ、ＥＧＣｇ、ＥＧＣ＞Ｃｇ、ＥＣｇ＞ＥＣ、Ｃ
であることが確かめられている。
（ちなみに、上記の「ＧＣ、ＧＣｇ＞ＥＧＣｇ、ＥＧＣ」という表示は、ＧＣとＧＣｇの効果は同程度であり、かつ、ＧＣやＧＣｇの効果は、ＥＧＣｇやＥＧＣの効果に比べて大きいという意を表しており、本明細書における同様の表示は同様の意を有している。）
【００１７】
ＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ及びＥＧＣｇは、天然物、特に茶葉中に多く含有されているから、従来公知の方法或いは今後公知となる方法によって抽出及び精製などによって得ることができる。
【００１８】
他方、これらのエピマーであるＣ、ＧＣ、Ｃｇ及び　ＧＣｇは、茶葉を含めて天然植物中にはほとんど存在しないが、ＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ及びＥＧＣｇのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物を加熱処理することにより熱異性化（エピマー化）させて得ることができる。例えば、精製したＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ及びＥＧＣｇのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物、又は、茶の抽出液或いは浸出液を、好ましくはｐＨ５〜６に調整した上で、８０℃以上の加熱処理することによりカテキンの熱異性化を促してＣ、ＧＣ、Ｃｇ及び　ＧＣｇの含有濃度を高め、このような加熱処理後物からＣ、ＧＣ、Ｃｇ及び　ＧＣｇのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物を分離・精製して得ることができる。
カテキンを熱異性化（エピマー化）させるための加熱処理としては、カテキンを含有する溶液（カテキン溶液）を少なくとも８０℃以上に加熱処理すればよい。例えば、１００℃×１５分加熱、１１５℃×２０分加熱、１２０℃×３〜３０分加熱、１２３℃×１０分加熱、１３１℃×３０秒加熱、１３３℃×４５秒のいずれにおいても、カテキン類の熱異性化が認められている。
カテキン溶液をｐＨ５〜６に調製した上で加熱処理するのが好ましいとするのは、ｐＨ４．５以下ではカテキン類はほとんど熱異性化しないことが報告されているからである（末松伸一ら、：日食工誌、３９，１７８（１９９２））。
【００１９】
なお、カテキンの分離・精製方法は、従来公知の方法或いは今後公知となる方法によって行えばよい。例えば、茶の抽出液を、例えば水−アセトニトリル−リン酸の混合液を移動相とした逆相ＨＰＬＣにかけ、アセトニトリル濃度でグラジエントをかけることによってそれぞれ分離できることが知られている。
【００２０】
本発明の「カテキン混合物」として、カテキン濃度２０重量％以上、好ましくは２５％以上、中でも特に３０％以上の茶抽出物を用いることができる。
茶抽出物は、茶を水、温水または熱水、好ましくは４０℃〜１００℃の温熱水、中でも９０〜１００℃の熱水、或いは人体に無害なエタノール水溶液またはエタノールなどの有機溶媒で抽出して得ることができ、好ましくは、この茶抽出物を溶媒抽出法、樹脂吸着法、限外濾過・逆浸透濾過等の濾過などの精製手段によってカテキンの含有量を高める方向に精製して得ることができる。抽出の際、カテキン含有量を高めるべく塩酸等を添加した酸性条件下で抽出を行ってもよい。また、市販の茶抽出物を用いることがもできる。例えば、テアフラン３５及び３０Ａ（商品名；伊藤園社製）のいずれも、緑茶を熱水抽出処理し、この抽出物を乾燥させてカテキン濃度を約３０％とした緑茶抽出物（組成（重量％）：ＥＧＣ７．６２、ＥＧＣｇ１３．７０、ＥＣ２．１３、ＥＣｇ２．６１、ＧＣ２．６１、ＧＣｇ０．４９、（＋）Ｃ０．４３、Ｃｇ０．２８）であり、テアフラン９０Ｓ（商品名；伊藤園社製）は、緑茶を熱水抽出処理して得た抽出物を、水と低・高濃度アルコールを使って吸着カラムにて分離し乾燥させ、茶ポリフェノール濃度を約８５〜９９．５％とした緑茶抽出物（組成（重量％）：ＥＧＣｇ５０．１８、ＥＣ０．５７、ＥＣｇ１７．１１、ＧＣｇ３．９６、Ｃｇ０．９１）である。
【００２１】
本発明の病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤において、カテキン又はカテキン混合物は、それぞれ単独で本発明の有効成分として配合することも可能であるが、既に或いは将来的に病原性システインプロテアーゼ、中でもＲｇｐ及びＫｇｐに対する活性阻害効果が認められた物質と混合し、これらの有効成分と併用することも可能である。
なお、単独で本発明の有効成分として配合する場合、例えばカテキン又はカテキン混合物を、精製水や生理食塩水などに溶解して病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤（例えば経口投与剤、腹腔内投与剤等）とすることも可能である。
【００２２】
本発明の病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤は、経口投与剤または非経口投与剤（筋肉注射、静脈注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など）とすることができ、それぞれの投与に適した配合及び剤型とするのが好ましい。
剤型について言えば、例えば経口投与剤用としては液剤、錠剤、散剤、顆粒、糖衣錠、カプセル、懸濁液、乳剤、丸剤などの形態に調製することができ、非経口投与剤用としては注射剤、アンプル剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などの形態に調製することができる。
配合（製剤）について言えば、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。また、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどの無毒性の添加剤を配合することも可能である。
【００２３】
また、本発明の病原性システインプロテアーゼ活性阻害剤は、医薬品のほか、医薬部外品、薬理効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品、食品添加剤、その他ヒト以外の動物に対する薬剤や餌、餌用添加剤などとして提供することが可能である。
例えば、医薬部外品として調製し、これを瓶ドリンク飲料等の飲用形態、或いはタブレット、カプセル、顆粒等の形態とすることにより、より一層摂取し易くすることができる。
【００２４】
病原性システインプロテアーゼ活性阻害効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品としては、例えば、カテキン又はカテキン混合物、或いはこの混合物を含むカテキン溶液（例えばカテキン抽出液や浸出液）などを、炭酸、賦形剤（造粒剤含む）、希釈剤、或いは更に甘味剤、フレーバー、小麦粉、でんぷん、糖、油脂類等の各種タンパク質、糖質原料やビタミン、ミネラルなどの飲食品材料群から選ばれた一種或いは二種以上と混合したり、或いは、現在公知の飲食品、例えばスポーツ飲料、果実飲料、乳飲料、茶飲料、野菜ジュース、乳性飲料、アルコール飲料、ゼリー、ゼリー飲料、炭酸飲料、チューインガム、チョコレート、キャンディ、ビスケット、スナック、パン、乳製品、魚肉練り製品、畜肉製品、冷菓、乾燥食品、サプリメントなどに添加して製造することができる。
【００２５】
本発明における有効成分の含有量は、使用方法によっても異なるが、医薬品であれば、カテキン或いはこれらの混合物を、乾燥重量換算で０．００１〜１重量％、特に０．０１〜０．５重量％配合するのが好ましく、　飲食品であれば、カテキン或いはこれらの混合物を０．００１〜１重量％、特に０．０１〜０．５重量％配合するのが好ましい。
なお、摂取量としては、カテキン或いはこれらの混合物を乾燥重量換算で大人一日に１０〜５０００ｍｇ、好ましくは１００〜１５００ｍｇ程度摂取するのが好ましい。
【００２６】
＜試験１＞
（細胞の培養）
黒色コロニー形成嫌気性菌は、５％緬羊脱繊維素血液（日本バイオテスト研究所）添加ブルセラＨＫ寒天培地（極東）を用い、嫌気性菌培養装置ＭＩＰ−１０２５（Ｆｏｒｍａ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて３７℃、Ｎ２８０％、ＣＯ２１０％、Ｈ２１０％の条件で培養し菌株を維持した。実験に当たり、ブレイン−ハートインフージョンブロスに０．５％イーストエキス、０．０５％システイン塩酸塩、５μｇ／ｍＬヘミン１μｇ／ｍＬ、メナジオン添加培地で上記の培養条件で培養した。本研究ではＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　ＡＴＣＣ２５６１１Ｔ，　Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ　　ＡＴＣＣ３３５６３Ｔ，ＡＴＣＣ２５２６１およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　ＡＴＣＣ３３２７７Ｔの菌株を使用した。
【００２７】
（細胞抽出液の調整）
培養された細菌は遠心分離後、リン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．２）で２度洗浄し、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、ガラスビーズ（粒子径０．１５ｍｍ）を加え、激しく攪拌して破砕した。破砕液を１２，０００回転、２０分の遠心後、上清を酵素活性測定に使用した。
【００２８】
（アルカリホスファターゼのザイモグラフ）
細胞抽出液は７．５％ポリアクリルアミドゲルと通常用いるトリス・グリシン泳動用緩衝液を用いて電気泳動し、泳動したゲルを１ｍｇ／ｍＬナフト−ルＡＳ−ＢＩホスフェート、０．１ｍｇ／ｍＬファーストブルーＢＢをトリス塩酸緩衝液（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１０．０）　、５μｍＭｇＣＬ２含む）で溶解した液中で反応させ、酵素活性を検出した。
【００２９】
（アルカリホスファターゼ活性の測定）
アルカリホスファターゼ活性は、パラニトロホスフェート（ｐＮＰ）を基質とし、９６穴マルチウェル中で反応させ、波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。すなわち、アルカリホスファターゼ活性の測定は、０．１ｍＭ　ＭｇＣＬ２、８ｍＭ　ｐＮＰを含む０．１Ｍトリス緩衝液（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ１０．０）　、５μｍＭｇＣＬ２含む）８０μＬ、種々の濃度のＥＧＣｇ１０μＬ、及び粗酵素抽出液１０μＬを攪拌し、３７℃、２０分反応させた。
【００３０】
（Ｒｇｐ活性の測定）
Ｒｇｐ活性は、Ｂｅｎｚｏｙｌ　ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ　（ＢａｐＮＡ）を基質とし、９６穴マルチウェル中で反応させ、波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。すなわち、１０ｍＭ　Ｂｅｎｚｏｙｌ　ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ　（ＨＣＬ）をＤＭＳＯに溶解して基質ストック溶液とし、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に１ｍＭシステイン塩酸塩を溶解する一方、上記基質ストック溶液を１／１０　ｂｕｆｆｅｒ２で１０倍に希釈、溶解した後、基質ストック溶液８０μＬ（最終基質濃度０．８μＭ）、種々濃度のＥＧＣｇ１０μＬ、及び粗酵素抽出液１０μＬとなるように攪拌し、３７℃、１０分反応させた。
【００３１】
（Ｋｇｐ活性の測定）
Ｋｇｐ活性は、Ｎ−ｐ−ｔｏｓｙｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅを基質とし、９６穴マルチウェル中で反応させ、波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。すなわち、１０ｍＭＮ−ｐ−ｔｏｓｙｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ　（ＨＣＬ）をＤＭＳＯに溶解して基質ストック溶液とし、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に１ｍＭシステイン塩酸塩を溶解する一方、上記基質ストック溶液を１／１０　ｂｕｆｆｅｒ２で５０倍に希釈、溶解した後、基質ストック溶液８０μＬ（最終基質濃度０．１６μＭ）、種々濃度のＥＧＣｇ１０μＬ、及び粗酵素抽出液１０μＬとなるように攪拌し、３７℃、１０分反応させた。
【００３２】
（溶血活性および血球凝集活性の測定）
溶血活性の測定は、１０％ウサギ赤血球および培養菌体を９６穴マルチウェル中で混合し、３７℃で適宜反応させ、反応液２５μＬを１０倍量のＮＣＮ緩衝液（３ｍＭｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ，１５０ｍＭｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｐＨ６．８）に懸濁させ、遠心後上清の波長４１４ｎｍの吸光度を測定し、遊離するヘモグロビン量とした。
溶血の程度は、［（ＥＧＣｇとＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａを加えたサンプル）−（ＥＧＣｇのみ加えたサンプル）］／［（１００％溶血させたサンプル）−（ｂｌａｎｋ）］×１００（％）として表した。
血球凝集活性の測定は、等量の２％ウサギ赤血球と培養菌体および各濃度のＥＧＣｇをＶ底マルチウェルに加え、３０分間攪拌した後、冷蔵庫にて一夜保存し、凝集を起す最高希釈倍率から凝集価を求めた。
【００３３】
（結果および考察）
１）アルカリホスファターゼのザイモグラフ
黒色コロニー形成嫌気性菌の産生するアルカリホスファターゼのザイモグラフを図１に示す。
Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの移動度は最も少なく、次いでＰ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは最も移動度が大きく、細菌の種により異なる種類のアルカリホスファターゼを産生することが考えられた。
表１は各酵素に対するバナジン酸化合物の効果を示した。バンジン酸化合物はＰｒｅｖｏｔｅｌｌａのアルカリホスファターゼ活性は強く阻害するが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのアルカリホスファターゼ活性は阻害しなかった。
【００３４】
【表１】
2004143127.tif 000002
【００３５】
２）ＥＧＣｇのアルカリホスファターゼに及ぼす影響
ＥＧＣｇはＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの産生するアルカリホスファターゼを強く阻害し、酵素活性を５０％阻害する濃度は約５μｇ／ｍＬであった（図２）。
Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの培養上清にも本酵素は検出され、ＥＧＣｇの５０％阻害する濃度はＰ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓのアルカリホスファターゼとほぼ同程度で約５０μｇ／ｍＬであった。
しかし、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの産生するアルカリホスファターゼ活性に対しては阻害効果を示さなかった。
【００３６】
３）ＥＧＣｇのＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの溶血活性および血球凝集活性に及ぼす影響
図３は、最終濃度０−１００μｇ／ｍＬのＥＧＣｇを反応系に加え、２、４および６時間後の溶血活性を示したものである。
ＥＧＣｇの濃度が増加するにつれＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの溶血活性は阻害され、１００μｇ／ｍＬ、６時間の反応では対照の溶血活性の２３％に減少した。
【００３７】
【表２】
2004143127.tif 000003
【００３８】
表２は、ＥＧＣｇの黒色コロニー形成嫌気性菌の血球凝集活性に及ぼす影響を調べたものである。
３．６μｇ／ｍＬのＥＧＣｇを反応系に加え、細菌と血球のみ加えた対照と比較した。その結果、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａは対照の２分の１、Ｐ．ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓでは対照の８分の１に凝集活性を減少した。一方、ＥＧＣｇはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの血球凝集活性には影響を及ぼさなかった。
黒色コロニー形成嫌気性菌は溶血活性、血球凝集活性を持ち、これらの細菌の育成に必要な鉄イオンを血球凝集、溶血という形で補給していることが示唆されている。ＥＧＣｇがこれらの活性を阻害することは、これらの細菌の育成を抑制し、種々の有害な代謝産物産生を抑制する可能性が示唆される。
【００３９】
４）ＥＧＣｇのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの産生するＲｇｐ活性に及ぼす影響
ＥＧＣｇはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの産生するＲｇｐ活性を強く阻害し、酵素活性を５０％阻害する濃度は約１０μｇ／ｍＬであった（図４）。
生体蛋白質の分解や、多形核白血球の殺菌活性の抑制、さらには菌の生長などにＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＲｇｐやリジンジンジパイン（Ｋｇｐ）らの酵素が重要な役割を演じていることから、ＥＧＣｇはこれらの病原性効果を阻害できることが示唆される。
【００４０】
また、ＥＧＣｇ以外のカテキンすなわちＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ、Ｃ、ＧＣ、Ｃｇ　、ＧＣｇ及びＧＡ（表ではｇ）、さらにカテキン混合物としてのテアフラン３５（商品名；伊藤園社製）及びテアフラン９０Ｓ（商品名；伊藤園社製）についても、ＥＧＣｇと同様にＲｇｐ活性に及ぼす影響について試験し、各カテキンのＲｇｐ活性阻害率に関する結果を図５〜図７に示し、各カテキンの５０％阻害濃度を下記表３に示した。
【００４１】
８種類全てのカテキン及びカテキン混合物のいずれにもＲｇｐに対する活性阻害効果を認めることができた。ただし、各カテキンの活性阻害能には大きな差が見られ、効果の大きい順に
ＧＣ、ＧＣｇ＞ＥＧＣｇ、ＥＧＣ＞ＧＡ＞Ｃｇ、ＥＣｇ＞ＥＣ、Ｃ
であった（なお、ＧＣとＧＣｇは同程度という意である）。
また、テアフラン３５及びテアフラン９０ＳのＲｇｐ活性の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、テアフラン３５が４０μｇ／ｍＬ、テアフラン９０Ｓが４０μｇ／ｍＬであった。
【００４２】
さらにまた、ＥＧＣｇ以外のカテキンすなわちＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ、Ｃ、ＧＣ、Ｃｇ　、ＧＣｇ及びＧＡ（表ではｇ）、さらにカテキン混合物としてのテアフラン３５（商品名；伊藤園社製）及びテアフラン９０Ｓ（商品名；伊藤園社製）についても、ＥＧＣｇと同様にＫｇｐ活性に及ぼす影響について試験し、各カテキンのＫｇｐ活性阻害率に関する結果を図８〜図１０に示し、各カテキンの５０％阻害濃度を下記表３に示した。
【００４３】
８種類全てのカテキン及びカテキン混合物のいずれにもＫｇｐに対する活性阻害効果を認めることができた。ただし、各カテキンの活性阻害能には大きな差が見られ、Ｋｇｐに対する活性阻害効果は、効果の大きい順に
ＧＣ、ＧＣｇ、ＥＧＣｇ、ＥＧＣ＞ＧＡ＞Ｃｇ、ＥＣｇ＞ＥＣ、Ｃ
であった（なお、ＧＣ、ＧＣｇ、ＥＧＣｇ及びＥＧＣは同程度という意である）。
また、テアフラン３５及びテアフラン９０ＳのＫｇｐ活性の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、テアフラン３５が５０μｇ／ｍＬ、テアフラン９０Ｓが１５０μｇ／ｍＬであった。これより、Ｋｇｐに対する活性阻害については、テアフラン９０Ｓよりもテアフラン３５の方が強いことが分かった。
【００４４】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】黒色コロニー形成嫌気性菌の産生するアルカリホスファターゼのザイモグラフである。
【図２】ＥＧＣｇのＰ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの産生するアルカリホスファターゼに対する阻害効果を示したグラフである。
【図３】最終濃度０−１００μｇ／ｍＬの各ＥＧＣｇを反応系に加えた場合における、溶血活性の変化を経時的に示したグラフである。
【図４】各種濃度におけるＥＧＣｇのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの産生するＲｇｐに対する活性阻害を示したグラフである。
【図５】各種濃度におけるカテキン類のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの産生するＲｇｐに対する活性阻害を示したグラフである。
【図６】同じく、各種濃度におけるカテキン類のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの産生するＲｇｐに対する活性阻害を示したグラフである。
【図７】各種濃度における緑茶抽出物のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの産生するＲｇｐに対する活性阻害を示したグラフである。
【図８】各種濃度におけるカテキン類のＫｇｐに対する活性阻害を示したグラフである。
【図９】同じく、各種濃度におけるカテキン類のＫｇｐに対する活性阻害を示したグラフである。
【図１０】各種濃度における緑茶抽出物のＫｇｐに対する活性阻害を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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