(57)【要約】【課題】足場依存性付着細胞等の凍結に際しては、酵素処理等の細胞に質的変化を与えることなく細胞を簡便に凍結でき、かつ速やかに解凍により回復できる凍結保存方法、及び細胞の培養方法を提供すること。【解決手段】培養容器内の細胞を培養状態で凍結するための方法であって、凍結保存液量が培養に用いる培養液量の５体積％以上２０体積％以下である細胞凍結方法であり、好ましくは前期凍結保存液が５体積％以上２０体積％以下のジメチルスルホキシドを含有する細胞凍結方法であり、培養容器内の細胞を培養状態で凍結保存液を用いて凍結し、解凍後培養液を添加して該細胞を培養する方法であって、該凍結保存液が５体積％以上２０体積％以下のジメチルスルホキシドを含有し、かつ該凍結保存液量が解凍後の培養に用いる該培養液量の５体積％以上２０体積％以下である細胞の培養方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器内の細胞を培養状態で凍結するための方法であって、凍結保存液量が培養に用いる培養液量の５体積％以上２０体積％以下であることを特徴とする細胞凍結方法。
【請求項２】
凍結保存液が５体積％以上２０体積％以下のジメチルスルホキシドを含有する請求項１記載の細胞凍結方法。
【請求項３】
培養容器内の細胞を培養状態で凍結保存液を用いて凍結し、解凍後培養液を添加して該細胞を培養する方法であって、該凍結保存液が５体積％以上２０体積％以下のジメチルスルホキシドを含有し、かつ該凍結保存液量が解凍後の培養に用いる該培養液量の５体積％以上２０体積％以下であることを特徴とする細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞を培養状態で安定に凍結保存する方法であり、凍結融解後の培養が容易なかつ安定な細胞培養容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の細胞凍結方法では容器から剥離し分散状態で凍結するが、剥離のためにはトリプシン等の酵素処理が必要である。細胞種によってはこの酵素処理によりダメージを受け凍結解凍後、当初の性能に戻らないものも散見される。特に動物から取り出したばかりの初代系細胞や、細胞自らが出す細胞外基質により安定化する細胞などではこの傾向が強く見られた。こうした酵素処理の影響を排除するためには細胞を培養した状態で安定に凍結することが重要である。
市販の細胞培養用９６ウェルプレートは、化合物の細胞毒性試験等、各種の生物学的試験法に汎用されている。そのウェルの位置、大きさ等が標準化されていることもあって、全自動ロボットにも適用されていたり、大量に使用されている。この場合、９６ウェルプレートで培養した浮遊性動物細胞はもちろん、足場依存性の付着細胞も広く利用されているものの、長期間に渡って前培養し準備してきた細胞を各試験ごとに９６ウェルプレートに播種し、本試験に備えなければならないという煩雑さがある。もし、９６ウェルプレートにあらかじめ播種し培養された状態のまま凍結保存可能ならば、都合の良いときに前培養を行い凍結保存しておいて、随時必要な時に融解し本試験に供することができ、格段に作業性が向上する。
【０００３】
特許文献１においては、足場依存性動物細胞を培養基質上で付着培養した状態で凍結保存、融解再利用する方法が記載されている。しかし、この方法では融解して再利用する際、足場依存性細胞は剥離しやすく、融解後の培養液交換に当たって浮遊除去されてしまうという問題があった。また、血球細胞や単クローン抗体作製のための雑種細胞（ハイブリドーマ）などの浮遊細胞の系では、細胞が除去されてしまうという問題もあった。
一般的に細胞を凍結させる場合にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの結晶化防止剤を加え徐々に凍結しないと、凍結時に細胞内の水が結晶化し、その際の体積膨張により細胞膜が破壊され、解凍時に細胞が死んでしまうことになる。従って細胞を安定して凍結するには結晶化防止剤が必須である。
しかしながらジメチルスルホキシドには高濃度での細胞毒性が確認されており、そのため解凍後は速やかに遠心操作などによって除去する必要がある。
ここで、足場依存性細胞を培養器内で凍結する際にも、同じようにジメチルスルホキシドを加えることが必要であるが、通常の場合と同様、解凍直後にジメチルスルホキシドを除去する必要がある。しかしながらこの際、培養器に接着伸展している足場依存性細胞は、容器からシート状に剥がれ凍結培地中に漂い出す。従って単純に凍結保存液を除去すると浮遊した細胞シートも一緒に除去してしまうことになる。注意深く除去することは不可能ではないが、例えば９６ウェルプレートや３８４ウェルプレートなのでは作業性が著しく悪化することになる。
ジメチルスルホキシド使用による細胞毒性を防ぐため、ジメチルスルホキシド以外の物質を結晶化防止材に用いる材料はメチルセルロースなど種々使用されているが、毒性の存在にもかかわらずジメチルスルホキシドが多用されていることからもわかるように、その機能を完全に代替できるものは未だに開発されていない。
【０００４】
【特許文献１】特公平５−７７３８９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、例えば動物細胞培養用９６ウェルプレートのような多数の培養用ウェルを持つ容器で培養された状態でも、培養液交換に当たって、浮遊細胞であっても簡単には除去されにくく、また、足場依存性付着細胞の凍結に際しては、酵素処理等の細胞に質的変化を与えることなく細胞を簡便に凍結でき、かつ速やかに解凍により回復できる状態にした細胞とその製造法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、培養容器内の細胞を培養状態で凍結するための方法であって、凍結保存液量が培養に用いる培養液量の５体積％以上２０体積％以下であることを特徴とし、凍結保存液が５体積％以上２０体積％以下のジメチルスルホキシドを含有する細胞凍結方法である。
又、本発明は、培養容器内の細胞を培養状態で凍結保存液を用いて凍結し、解凍後培養液を添加して該細胞を培養する方法であって、該凍結保存液が５体積％以上２０体積％以下のジメチルスルホキシドを含有し、かつ該凍結保存液量が解凍後の培養に用いる該培養液量の５体積％以上２０体積％以下であることを特徴とする細胞の培養方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
細胞の凍結保存において結晶化防止剤としてジメチルスルホキシドが使用されており、その使用時の濃度である５〜２０％（ｖ／ｖ）、特に１０％（ｖ／ｖ）以上の濃度で細胞毒性が見られことは従来技術に記載した通りである。しかしながら、発明者は種々の株細胞を用いた検討の結果、１％（ｖ／ｖ）以下の濃度であれば、多くの足場依存性細胞への毒性はほとんど無視できるレベルになることを見出した。従って、解凍後、凍結保存液を除去するのではなく、凍結保存液はそのままにジメチルスルホキシドの濃度を１％（ｖ／ｖ）以下になる様に培養液を添加すれば培地交換せず、細胞毒性のないジメチルスルホキシド濃度にすることが可能であり、かつ剥離、浮遊している細胞を吸引除去してしまうことは回避できる。
【０００８】
凍結保存液に使用されるジメチルスルホキシドの濃度は、５〜２０％（ｖ／ｖ）であるので、培養液で２０倍以上に希釈すれば、ジメチルスルホキシド濃度が１％（ｖ／ｖ）以下になることになる。一般的に最も良く使用するときのジメチルスルホキシドの濃度は１０％（ｖ／ｖ）である。従ってこの場合は、１０倍量の培養液で希釈してやれば１％（ｖ／ｖ）になり毒性を無視できる。
【０００９】
この内容に準じれば、細胞凍結保存液量を少なくして細胞を凍結させ、解凍後は直ちに新しい培養液を加えて凍結培地を希釈すれば細胞に悪影響を与えずに、また、培養液の交換作業がないため剥離した細胞を吸引しせっかくの生存細胞をロスすることがなくなる。剥離した細胞シートは、３７℃の炭酸ガス培養器で培養すれば、生細胞は、再び培養器に接着、伸展するので、その時点で新鮮な培養液に交換すればより安定した通常の培養状態に戻すことが可能である。また、その時点で培養細胞を用いたアッセイに使用することも可能である。炭酸ガス培養器で培養する時間は用いる細胞種によって異なるが、早い細胞で１時間、遅くとも２４時間で再接着が完了する。従って２４時間以内に培養液の交換を行えば、解凍時のダメージで死滅した細胞は浮遊したままでありその時点で除去されることになる。また、培養容器にコラーゲンやファイブロネクチン、ラミニン等の細胞接着因子類をあらかじめ塗布しておくことにより細胞の接着を安定させ、剥離浮遊細胞の再接着化を促進することも可能である。
【００１０】
その後は、プレートに培養状態のまま、通常使用している細胞と同じように細胞を用いたアッセイに用いることができる。例えば、薬剤候補による細胞毒性評価、細胞機能抑制または亢進評価などである。
【００１１】
凍結保存液には、ジメチルスルホキシド以外の物質も使用されているが（例えば、メチルセルロースなど）、細胞毒性の観点からこれらの結晶化防止剤を見るとジメチルスルホキシドより細胞毒性が強い物質はない。従って他の凍結保存液においても本方法は適用可が能である。
【００１２】
また、本発明によると、細胞の形態観察が可能であり、形態観察を必要とする上皮細胞系、表皮細胞系、神経細胞系の細胞培養に適するものである。
さらに本技術は９６ウェルや３８４ウェルなどの微量な系のマルチウェルプレートに限定されるものでなく、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェルなどのマルチウェルプレートや、シャーレ類、およびフラスコ類にも適用可能なものである。
【００１３】
【実施例】
（実施例１）
肉薄の細胞培養用９６ウェルプレートを準備した。
市販のヒト子宮頚部癌細胞株ＨｅＬａ細胞（理化学研究所細胞開発銀行より入手）をフラスコに播種し、３７℃、炭酸ガス濃度５％の炭酸ガス培養器に入れセミコンフレントになるまで２日おきに培養液を交換し培養を続けた。培養液には１０％ウシ血清含有の最小必須培地（ＭＥＭ）を用いた。
培養細胞がセミコンフレントに成った段階で、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞をフラスコから剥がし回収した。血球計算板で細胞数を計測し、１ｘ１０５細胞／ｍＬになるように調整した。先の９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注し、３７℃５％炭酸ガス培養器中で培養した。培養２日後、各ウェルの培地を全量除去し、凍結保存液（１０％ジメチルスルホキシドを含む培養液（１０％ウシ血清含有ＭＥＭ））を各ウェル２０μＬずつ分注し、放射線滅菌済みプレートシール（住友ベークライト製、ＭＳ−３００２０）をプレート上部にはりつけた後プレートカバーを取り付け、直ちに−８０℃の冷凍庫に入れ、凍結、保存した。
冷凍保存１週間後、プレートを取り出し、３７℃の加温器で加温し解凍した。解凍後直ちに、２００μＬの培養液を添加し、３７℃５％炭酸ガス培養器で培養した。翌日培養液交換後、ＭＴＴ法にて細胞数を測定した。
【００１４】
（比較例１）
実施例１と同様、市販のヒト子宮頚部癌細胞株ＨｅＬａ細胞（理化学研究所細胞開発銀行より入手）をフラスコに播種し、３７℃、炭酸ガス濃度５％の炭酸ガス培養器に入れセミコンフレントになるまで２日おきに培養液交換し培養を続けた。培養液には１０％ウシ血清含有の最小必須培地（ＭＥＭ）を用いた。
培養細胞がセミコンフレントに成った段階で、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞をフラスコから剥がし回収した。血球計算板で細胞数を計測し、１ｘ１０５細胞／ｍＬになるように調整した。先の９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注し３７℃５％炭酸ガス培養器中で培養した。培養２日後、各ウェルの培養液を全量除去し、凍結保存液（１０％ジメチルスルホキシドを含む培養液（１０％ウシ血清含有ＭＥＭ））を各ウェル１００μＬずつ分注し、放射線滅菌済みプレートシール（住友ベークライト製、ＭＳ−３００２０）をプレート上部にはりつけた後プレートカバーを取り付け、直ちに−８０℃の冷凍庫に入れ、凍結、保存した。
冷凍保存１週間後、プレートを取り出し、３７℃の加温器で加温し解凍した。解凍後直ちに、凍結保存液を除去した後、新たに２００μＬの培養液を添加し、３７℃５％炭酸ガス培養器で培養した。翌日培養液交換後、ＭＴＴ法にて細胞数を測定した。
【００１５】
（結果）
実施例、比較例のＭＴＴ法の測定結果は表１の通りである。
【００１６】
【表１】
2004254597.tif 000002
【００１７】
比較例に比べると実施例は解凍後生存している細胞の割合が多くまた、変動係数も低いことから解凍後の細胞が安定していることがわかる。比較例で生存細胞が少なく変動係数が大きいのは解凍時に細胞がダメージを受けているというより解凍時に剥離浮遊した細胞を解凍後即の培地交換時に吸引除去いてしまうことが原因と考えられ、本発明によりそれは回避できることが明らかとなった。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、マルチウェルプレートなどの培養容器で培養された状態の細胞を凍結保存、解凍した場合、剥離浮遊する簡便に細胞を接着させ凍結前の培養状態に復帰させることを可能とした。