(57)【要約】【課題】リボソーム再生阻害因子およびその特性を維持した誘導体は、リボソーム再生因子の阻害剤として働き、細菌類の生育を抑制することができ、また原核生物の生存または増殖に障害効果を奏する組成物として、このリボソーム再生阻害因子を有効成分として含有する組成物が提供される。さらにまたこの出願の発明は、薬学的成分を含有することにより様々な形状、投与方法が可能とすることを特徴とする、ヒト等に対して副作用の少ない前記の組成物を提供する。【解決手段】リボソーム再生因子の変異体であって、原核生物のリボソームに対して再生阻害活性を有することを特徴とする。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボソーム再生因子の変異体であって、原核生物のリボソームに対して再生阻害活性を有することを特徴とするリボソーム再生阻害因子。
【請求項２】
リボソーム再生因子が、ドメインＩ（Ａ）−ドメインＩＩ−ドメインＩ（Ｂ）からなる請求項１のリボソーム再生阻害因子。
【請求項３】
変異体が、ドメインＩＩの一部または全部を欠失している請求項２のリボソーム再生阻害因子。
【請求項４】
変異体が、ドメインＩＩの一部または全部を１個以上のアミノ酸残基に置換している請求項２のリボソーム再生阻害因子。
【請求項５】
アミノ酸残基が、１から５個のグリシン残基からなる請求項４のリボソーム再生阻害因子。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片。
【請求項７】
配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項８】
請求項１から５のいずれかのリボソーム再生阻害因子コード配列を有する発現カセットを備えたリボソーム再生阻害因子発現ベクター。
【請求項９】
請求項６のＤＮＡ断片を有する発現カセットを備えたリボソーム再生阻害因子発現ベクター。
【請求項１０】
請求項７のＤＮＡ断片を有する発現カセットを備えたリボソーム再生阻害因子発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかの発現ベクターによって発現されるリボソーム再生阻害因子。
【請求項１２】
原核生物の生存または増殖に障害効果を奏する組成物であって、請求項１から５のいずれか、または１１のリボソーム再生阻害因子を有効成分として含む組成物。
【請求項１３】
原核生物が、細菌類である請求項１２の組成物。
【請求項１４】
薬学的成分を含む請求項１２または１３の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、リボソーム再生阻害因子に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、原核生物の生存または増殖に障害効果を奏するリボソーム再生阻害因子を有効成分とする組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
リボソーム再生因子（ＲＲＦ）は、伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）とともにリボソーム再生過程において中心的な役割を果たす分子量２１ｋＤａのタンパク質であり、タンパク質の生合成装置であるリボソームに作用して、使用済みリボソームを分解・再生する役割を果たしていることが知られている。ＲＲＦはタンパク質生合成の終結反応後には、７０Ｓリボソーム、脱アシル化ＲＮＡおよびｍＲＮＡからなるポストターミネーションコンプレックスが残っている。ＲＲＦは次のタンパク質生合成サイクルにむけてそれを解離・再生するために必須である。なお、図７に上記のリボソーム再生の過程を模式的に例示した。
【０００３】
また、図８に、Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＲＲＦのアミノ酸配列と公知である他菌種のＲＲＦのアミノ酸配列との比較を例示した。この図８に例示したとおり、いずれのＲＲＦにおいても、約１８５個のアミノ酸残基を含んでおり、全てのＲＲＦと高い相同性も有している。
【０００４】
そして、このＲＲＦは古細菌を除く全ての生物に存在しており、特に細菌類の生存には必須である。このことから、ＲＲＦの作用を阻害する薬剤は新しい抗菌剤や抗生物質になる可能性がある。特に、このＲＲＦについては、ヒトなどの真核生物に副作用を及ぼさず、バクテリア（原核細菌）にのみ自殺的に働く薬剤を設計し、スクリーニングするための標的分子になることが注目されている。
【０００５】
以上のようなＲＲＦについては、その構造の解明が大きな課題であったが、最近、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  （高度好熱菌）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（好熱菌）、およびＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ（高度好熱菌）由来ＲＲＦの立体構造が、Ｘ線結晶構造解析法およびＮＭＲ法によって決定された。その結果、ＲＲＦは、αヘリックスバンドルからなるドメインＩと、β／α／βサンドイッチのβシート構造からなるドメインＩＩとの２種類のドメインからなっていることが判明した。その模式図を図９および図１０に例示した。図９は、Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＲＲＦ構造の模式図である。図１０は、Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＡ．ａｅｏｌｉｃｕｓの各菌種由来のＲＲＦ構造をそれぞれ比較例示した模式図である。図１０に例示したとおり、各菌種由来のＲＲＦの立体構造は相互に類似しており、機能等においても類似することが推測される。このように、立体構造が明らかになったことから、その情報に基づいてＲＲＦと特異的に結合し、ＲＲＦの機能を阻害する物質の設計、創出や探索に試みられてきたが、未だその成功例は報告されていない。
【０００６】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ＲＲＦの機能を阻害するリボソーム再生阻害因子を設計・創出し、このリボソーム再生阻害因子を有効成分とすることを特徴とする原核生物の生存または増殖に障害効果を奏する組成物を提供することを課題としている。
【０００７】
またこの出願の発明は、薬学的成分を含有することにより様々な形状、投与方法が可能とすることを特徴とする前記の組成物を提供する。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、１９８９
【非特許文献２】
Ｋｕｒｏｓａｗａ，  Ｋ．ら著、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ｖｏｌ．９、ｐ１６４−１６５、１９９８
【非特許文献３】
Ｈｉｒａｓｈｉｍａ，  Ａ．およびＫａｊｉ，  Ａ．著、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、ｖｏｌ６５、ｐ４６−５８、１９７２
【非特許文献４】
Ｎａｖａｚａ，  Ｊ著、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ａ５０、ｐ１５７−１６３、１９９４
【非特許文献５】
Ｎａｋａｎｏ，  Ｈ．ら著、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ｄ５８、ｐ１２４−１２６、２００２
【非特許文献６】
Ｂｒｕｎｇｅｒ，  Ａ．  Ｔ．、Ｘ−ＰＬＯＲ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１、Ａ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｘ−ｒａｙ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ＮＭＲ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９９２
【非特許文献７】
Ｂｒｕｎｇｅｒ，  Ａ．  Ｔ．ら著、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ｄ５０、ｐ７６０−７６３、１９９４
【非特許文献８】
Ｃａｍｂｉｌｌａｕ，  Ｃ．ら著、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｇｒａｐｈ．、ｖｏｌ２、ｐ５３−５４、１９８４
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、前記の課題を解決するための第１の発明として、リボソーム再生因子の変異体であって、原核生物のリボソームに対して再生阻害活性を有することを特徴とするリボソーム再生阻害因子を、第２には、リボソーム再生因子が、ドメインＩ（Ａ）−ドメインＩＩ−ドメインＩ（Ｂ）からなるリボソーム再生阻害因子を提供する。
【００１０】
またこの出願の発明は、第３には、変異体が、ドメインＩＩの一部または全部を欠失しているリボソーム再生阻害因子を提供し、第４には、変異体が、ドメインＩＩの一部または全部を１個以上のアミノ酸残基に置換しているリボソーム再生阻害因子を、第５には、アミノ酸残基が、１から５個のグリシン残基からなるリボソーム再生阻害因子を提供する。
【００１１】
さらにこの出願の発明は、第６には、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、第７には、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片を提供し、第８には、前記第１の発明から第５の発明のいずれかのリボソーム再生阻害因子コード配列を有する発現カセットを備えたリボソーム再生阻害因子発現ベクターを、第９には、前記第６の発明のＤＮＡ断片を有する発現カセットを備えたリボソーム再生阻害因子発現ベクターを、第１０には、前記第７の発明のＤＮＡ断片を有する発現カセットを備えたリボソーム再生阻害因子発現ベクターを提供し、第１１には、前記第８の発明から第１０の発明のいずれかの発現ベクターによって発現されるリボソーム再生阻害因子を提供する。
【００１２】
第１２には、原核生物の生存または増殖に障害効果を奏する組成物であって、前記第１の発明から第５の発明のいずれか、または第１１の発明のリボソーム再生阻害因子を有効成分として含む組成物を、第１３には、原核生物が、細菌類である組成物を、第１４には、薬学的成分を含む組成物を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１４】
リボソーム再生因子（以下、ＲＲＦとする）は、リボソーム再生過程において中心的な役割を果たすタンパク質である。タンパク質の生合成装置であるリボソームに作用して、使用済みリボソームを分解・再生する役割を果たしており、特に原核生物（細菌類等）の生存に必須である。そのため、細菌類に対する生存・増殖の阻害効果が期待できるＲＲＦのリボソーム再生活性を阻害するＲＲＦ変異体を作製した。この出願の発明におけるＲＲＦは、αへリックスバンドル構造からなるドメインＩとβ／α／β構造からなるドメインＩＩとの２種類のドメイン構造から構成されているものが好ましい。発明者らは、このＲＲＦのドメインＩが有する特異的なαヘリックスバンドル構造に注目した。ＲＲＦは１８５残基のアミノ酸からなるが、ドメインＩはアミノ酸配列上Ｎ末端から３０残基（領域Ｉ−Ｎ）とＣ末端から８０残基（領域Ｉ−Ｃ）の２つの離れた領域から形成され、この２つのドメインＩ間にドメインＩＩが存在している（すなわち、ドメインＩ（Ａ）−ドメインＩＩ−ドメインＩ（Ｂ）の構造）。したがって、アミノ酸配列上の特定の領域を切断したり、部分的に合成したりする方法では、ドメインＩの部分を取り出すことは、現時点では困難である。なお、この出願の発明における、「ドメインＩ（Ａ）」とは、前記領域Ｉ−Ｎを、「ドメインＩ（Ｂ）」とは、前記領域Ｉ−Ｃをそれぞれ示す。また、天然由来のＲＲＦの構造は、前記のとおりドメインＩ（Ａ）−ドメインＩＩ−ドメインＩ（Ｂ）の構造を形成しているが、たとえば、ドメインＩ（Ａ）−ドメインＩ（Ｂ）−ドメインＩＩ、あるいはドメインＩＩ−ドメインＩ（Ａ）−ドメインＩ（Ｂ）等のような構造を有したＲＲＦを人工的に作製し、この出願の発明に用いてもよい。
【００１５】
そこで、発明者らは、ドメインＩの領域Ｉ−Ｎ（ドメインＩ（Ａ））のＣ末端部分と領域Ｉ−Ｃ（ドメインＩ（Ｂ））のＮ末端部分が空間的に近い（約１０Å）ことに着眼して、ドメインＩ（Ａ）およびドメインＩ（Ｂ）の両者を連結するため、ドメインＩＩの一部または全部を１個以上のアミノ酸残基で置換したアミノ酸配列を設計し、リボソーム再生因子の変異体を作製した。このアミノ酸残基の種類や長さ等は、この出願の発明の効果を発揮することができるのであれば、適宜に選択・改変することができるが、３個のグリシン残基が特に好ましい。もちろん、この出願の発明は、ドメインＩＩの一部または全部を欠失させた変異体とすることやドメインＩＩの任意箇所に１個以上のアミノ酸残基を付加させた変異体としてもよいが、前記のような置換変異体が好ましい。また、これら変異体は、この出願の発明の効果であるリボソームとの親和性およびリボソームの再生阻害効果を有するのであれば、ドメインＩ（Ａ）（Ｂ）の一部を欠失または置換させた変異体としてもよい。
【００１６】
なお、上記のようないずれの付加変異体または置換変異体においての付加物質または、置換物質はアミノ酸に限定されない。
【００１７】
これら変異体（すなわち、リボソーム再生阻害因子（以下、ＲＲＦ−ＤＩとする））は、ＲＲＦ−ＤＩをコードするＤＮＡ断片（たとえば、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片や配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片）を有した発現カセットを備えた発現ベクターを大腸菌等に導入することによって、大量、かつ、簡便に製造することができる。しかも、菌体から回収したこのＲＲＦ−ＤＩは高純度で収率良く、精製することができる。得られたＲＲＦ−ＤＩは、円偏光二色性測定（ＣＤ）によって、ＲＲＦ−ＤＩは、野生型ＲＲＦのドメインＩと同様の立体構造を保持していることが確認され、またＲＲＦ−ＤＩのリボソーム再生活性およびリボソーム結合能を、ポリソーム分解アッセイおよび表面プラスモン共鳴センサーにより測定したところ、ＲＲＦ−ＤＩは野生型ＲＲＦと同様にリボソームと結合できることが確認された。その一方で、ＲＲＦ−ＤＩはリボソーム再生活性が失われていた。すなわち、ＲＲＦ−ＤＩは野生型ＲＲＦと競合的にリボソームと結合し、ＲＲＦの活性を妨害すると考えられた。実際、ＲＲＦ−ＤＩの共存下において野生型ＲＲＦのリボソーム結合およびリボソーム再生活性を阻害することを確認した。
【００１８】
この出願の発明における「発現ベクター」は、リボソーム再生阻害因子コード配列を有する発現カセットをベースベクター内に挿入結合することによって作製することができる。したがって、発現カセットは、ベースベクターの任意のクローニングサイトに対応した制限酵素配列を有することが好ましい。「ベースベクター」は、たとえば動物細胞用ベクター、昆虫細胞用ベクター、酵母用ベクター、大腸菌用ベクター、また酵母・大腸菌等といった複数種用のシャトルベクター等の種々のベースベクターがあるが、これらベースベクターは宿主細胞や目的に応じて適宜に選択することができる。また、適当な宿主細胞で外来タンパク質を発現させるための既存のベクターＤＮＡを一部改変して使用することもできる。たとえば、宿主細胞として大腸菌等の微生物を利用する場合には、オリジン、プロモータ、ターミネータ等を有するｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩやｐＥＴ系システム等が使用することができる。
【００１９】
原核生物は、上記のとおり生存や成長、増殖にＲＲＦの作用が必要であるため、リボソーム再生活性を阻害する効果を有するＲＲＦ−ＤＩは、原核生物の生存や成長、増殖に対しての障害効果が期待できる。すなわち、ＲＲＦ−ＤＩを有効成分として含有させた組成物は、抗菌剤や抗生物質として利用することができる。
【００２０】
「原核生物」とは、細菌類等が例示できる。この出願の発明のＲＲＦ−ＤＩは、特に細菌類のＲＲＦの阻害活性が高いため、標的対象は細菌類であることが好ましい。また「細菌類」とは、マイコプラズマや光合成細菌、大腸菌をはじめ、Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓやＡ．ａｅｏｌｉｃｕｓ等が例示できる。そして、ＲＲＦは、真核生物の細胞質におけるタンパク質合成には関与していないため、この出願の発明のＲＲＦ−ＤＩによる真核生物に対する影響は少ないと考えられる。すなわち、ＲＲＦ−ＤＩを有効成分とし、かつ、薬学的成分を含ませた組成物は、薬剤（抗菌剤、抗生物質）としてヒト等に投与しても副作用が少ないことが期待できる。
【００２１】
「薬学的成分」とは、一般に薬剤製造に利用される各種の担体であり、担体は薬剤の種類や注射や経口等の投与形態等に応じて、適宜に選択できる。たとえば、懸濁剤やシロップ剤等のような経口液体状の薬剤は、水、シュクロース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ごま油や大豆油等の油類、その他、防腐剤、ペパーミント等の各種フレーバー類等を使用して製造することができる。また、散剤や丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュクロース等の賦形剤、デンプン等の崩壊剤、マグネシウムステアレート等の潤沢剤、また各種結合剤や表面活性剤、可塑剤等を用いて製剤化することができる。
【００２２】
以下に実施例（Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＲＲＦからＲＲＦ−ＤＩを作製）を示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。もちろん、以下の例によってこの出願の発明が限定されることはない。すなわち、Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ以外の菌種由来（たとえば、Ｔ．  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓやＡ．ａｅｏｌｉｃｕｓ等）のＲＲＦからでもＲＲＦ−ＤＩを作製することができる。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）大腸菌株、プラスミドおよび培養条件
Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ株  ＫＸＶ２３７（Ｏ３：Ｋ６）をモレキュラークローニングに用いた。大腸菌株ＤＨ５αは、クローニングしたプラスミドＤＮＡの宿主菌株として用いた。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）は、タンパク質発現に利用した。Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（Ｎａｋａｌａｉｔｅｓｑｕｅ社）は、細菌培養の液体培地および１．５％の寒天培地に使用し、培養した。なお、これら培地には、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した。
（実施例２）モレキュラークローニング
Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＲＲＦ  ＤＮＡ  （ｆｒｒ）クローンを選択するため、大腸菌ｆｒｒ断片の一部をＤＮＡプローブとして用いた。このＤＮＡプローブの標識にＤＩＧシステム（Ｒｏｃｈｅ社）を利用した。プライマー（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲにて、大腸菌ＲＲＦのＭｅｔ  １３−Ｇｌｕ  １７９残基をコードするＤＮＡ断片を設計・増幅させた。大腸菌ｆｒｒを保有しているｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、このＰＣＲにおける鋳型として用いた。
【００２４】
Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＫＸＶ２３７のゲノムＤＮＡにおけるＮｏｔＩ断片は、前記のプローブとハイブリダイズした。ＩＩｄａ，  Ｔ．らによって、以前に報告された、ゲル電気泳動法を行い、次いでサザンブロッティングハイブリダイゼーション法を利用した。約１６８ｋｂｐの発光断片を収集し、ＰｓｔＩで酵素処理を行った。酵素処理を行って得られた試料は、アガロースゲル（０．８％）による電気泳動法に用いられ、再びハイブリダイゼーションを行った。４．１ｋｂｐのＰｓｔＩ断片を収集し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（Ｔｏｙｏｂｏ社）のＰｓｔＩサイトに挿入した。
【００２５】
４．１ｋｂｐ  ＰｓｔＩ断片の制限地図は、公知の方法（非特許文献１）にしたがって作成した。１．２ｋｂｐの断片のＳｐｅＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイト間には、ｆｒｒ遺伝子が含まれている。この断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）ベクター内に組込み、再構築し、シークエンシングを行った。ＤＮＡシークエンシングには、蛍光色素プライマー法を用いて、自動ＤＮＡシークエンサー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社）によって行った。ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｅ  ＷｅｂＩＩプログラム（非特許文献２）にて解析し、目的のＤＮＡ配列であることが確認することができた。
【００２６】
このＶ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｆｒｒを含んだ１．２ｋｂｐあるＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、一つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のみを有しており、またこの断片のＯＲＦの上流にはプリブナウ配列、−３５エレメントおよびＳＤ配列も含まれていた。このＯＲＦは、１８５アミノ酸で構成されるタンパク質をコードする５５５ｂｐで構成されていた。分子量は、２０５７０．４５であった。Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓと大腸菌ＲＲＦ間での相同性はアミノ酸レベルで７０．１％であった。なお、Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｆｒｒのＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０６４３１９）にて、データベース化されており、公知である。
（実施例３）ＲＲＦ−ＤＩ（大腸菌ドメインＩ）の構築
ＲＲＦのドメインＩの役割を明らかにするため、発明者らは、大腸菌ＲＲＦ、すなわちドメインＩに相当する、Ｍｅｔ  １−Ｇｌｙ  ３０の領域およびＴｈｒ  １０６−Ｐｈｅ  １８５の領域からなる組換えタンパク質をコードする発現ベクターを構築した。この２つの領域は、グリシン残基によって構成された柔軟性を有するリンカーによって、連結されている。大腸菌Ｒ１３２Ｇ変異体における予備試験の結果では、Ｇｌｙ  ３０およびＴｈｒ  １０６間の距離は、９．８Åであった。そのため、前記の２つの領域を連結するためには、３つのグリシン残基を用いた。発現ベクター（（１−３０）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（１０６−１８５））は、大腸菌ＲＲＦを保有したプラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）を鋳型として用いて、ＰＣＲによって合成された。２種類のオリゴヌクレオチド（配列番号３および配列番号４）をプライマーとして用いた。このドメインＩを連結した試料を「ＲＲＦ−ＤＩ」とした。なお、タンパク質発現を行う前に、ＲＲＦ−ＤＩのＤＮＡ配列を解析した結果、ＲＲＦ−ＤＩであることが確認することができた。
【００２７】
図１は、この出願の発明のＲＲＦ−ＤＩの模式図であり、ドメインＩ（Ａ）（Ｂ）間を連結させている３つのグリシン残基を模式的に例示した。また、図２は、ＲＲＦ−ＤＩの発現プラスミドの作製手順の概略を例示した模式図である。
【００２８】
ほとんどのＲＲＦは、前記の図８に例示したとおり、１８５のアミノ酸を含んでいる。そして、このアミノ酸残基は他菌種において保存されているものは、Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＲＲＦにおいても保存されており、全てのＲＲＦと高い相同性を有している（たとえば、大腸菌では７０．１％、緑膿菌では６３．２％、黄色ブドウ球菌では４５．４％、高度好熱菌では４２．７％）。このような高い相同性は、各菌種由来のＲＲＦは類似した三次構造を呈することを強く示唆する。
（実施例４）タンパク質の発現およびその精製
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ  （−）ベクターを鋳型として用いて、ＲＲＦ配列をコードするＶ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのＤＮＡ断片をＰＣＲで合成した。ＰＣＲプライマーでは、クローン配列のＧＴＧ開始コドンはＡＴＧに変換した。得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターに組込んだ。これを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。この形質転換体を３７℃で培養した。６６０ｎｍにおいて、培養物の吸光度が０．６に達した時、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えて、タンパク質発現を誘導させた。誘導から３時間の培養後、菌体を収集し、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中でソニケーションにて菌体を粉砕した。ホモゲナイズ後の遠心は、３００，０００×ｇで３時間行い、緩衝液Ａによって平衡化した５ｍｌ  Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｑカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に上清液を加えた。この流出通過したＲＲＦを含んだ分留物を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌおよび６ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）で透析を行った。そして、緩衝液Ｂで平衡化した、５ｍｌ  Ｈｉ−Ｔｒａｐ  ＳＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加えた。得られたＲＲＦを含んだ抽出分留物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて濃縮し、さらにこの濃縮物を、３００ｍＭの酢酸ナトリウムを含んだ緩衝液Ａにて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて精製した。この生産物の均質性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、また分子量をマトリックス支援レーザー脱離／イオン化ＴＯＦ質量分析法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって確認した。
【００２９】
ＲＲＦ−ＤＩの発現と精製は、以下のとおりに行った。すなわち、ＲＲＦ−ＤＩを保有するプラスミドを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ）に形質転換し、この形質転換体を最初は５ｍｌ、次に１ｌの１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で、培養した。６６０ｎｍにおいて、培養物の吸光度が０．６に達した時に、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えて、タンパク質発現を誘導させ、３時間の培養した。菌体を収集し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）および６ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）中でソニケーションにて菌体を粉砕した。ホモゲナイズ後の遠心は、１４，０００×ｇで３０分間行い、緩衝液Ｃによって平衡化した５ｍｌ  Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｑカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に上清液を加えた。このＲＲＦを含んだ抽出分留物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて濃縮し、またこの濃縮物を、１５０ｍＭの酢酸ナトリウムを含んだ緩衝液Ｃにて平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて精製した。図には示していないが、ＲＲＦ−ＤＩの精製の均質性（＞９８％）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて判断した。
（実施例５）円偏光二色性（ＣＤ）測定
大腸菌ＲＲＦおよびＲＲＦ−ＤＩにおける円偏光二色性スペクトルは、各試料５μＭを緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．６および５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に入れ、波長１ｍｍおよび温度１０℃の条件下で、ＡＶＩＶモデル２０２分光光度計（ＡＶＩＶ）を使用して測定した。
【００３０】
結果は、図３に示したとおりである。大腸菌野生型ＲＲＦとＲＲＦ−ＤＩとの間で、ほぼ同じパターンが観察され、高い相同性を有することが確認できた。
（実施例６）ＲＲＦの機能解析
各々精製済の組換えＶ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＲＲＦ、大腸菌ＲＲＦおよびＲＲＦ−ＤＩをピューロマイシン処理済ポリソームを基質として、解析した。公知文献（非特許文献３）にあるように、このポリソーム分留物は、大腸菌Ｑ１３株より調整し、ポストターミネーション複合体ＲＲＦによる分解反応に用いた。この反応混合物（１５０μｌ）は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．４）、８．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１６ｍＭ  ＧＴＰ、０．０５ｍＭ  ピューロマイシン、１．３  Ａ２６０のポリソーム、１．６μＭ  ＥＦ−Ｇおよび任意な量のＲＲＦを含有する。この混合物を３０℃で２０分間で反応させ、次いで５〜４５％の範囲のショ糖による密度勾配超遠心（２５０，０００×ｇ、４℃、４５分間）によって、ポリソームとモノソームに分離させた。解離物の定量測定は、吸光度２６０ｎｍの条件下でＰｉｓｔｏｎ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｒ（Ｂｉｏｃｏｍｐ  Ｉｎｃ．社）を用いて測定した。大腸菌ＲＲＦの再生活性に対するＲＲＦ−ＤＩの阻害効果は、１μＭの大腸菌ＲＲＦに対して過剰量のＲＲＦ−ＤＩを添加することによって、証明した。
【００３１】
図４、図５および図６は、ＲＲＦ−ＤＩのリボソーム再生活性、野生型ＲＲＦ阻害活性を示した図である。図４は野生型ＲＲＦの場合を、図５は野生型ＲＲＦが１に対してＲＲＦ−ＤＩが５０含む場合を、図６はＲＲＦ−ＤＩの場合をそれぞれ示した。図４において、特に７０Ｓの部分では、野生型ＲＲＦは高い波形データを示していたが、図５および図６においては、ＲＲＦ−ＤＩの存在下ではコントロール（ＲＲＦを含まない、ネガティブコントロール）とほぼ同じ波形データが確認された。このことは、ＲＲＦ−ＤＩは、ＲＲＦとしての機能を有さないことを示している。
（実施例７）結晶化およびデータ集積
Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＲＲＦの結晶は、４℃の条件で懸垂滴下気化拡散法を利用して結晶化させた。液滴は、２μｌの保存溶液（５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  （ｐＨ  ６．２）、２００ｍＭ  酢酸ナトリウムおよび２３〜２５％ｗ／ｖの範囲のＰＥＧ８０００）と２μｌのタンパク質溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）から構成されている。この液滴に最終濃度０．７５ｍＭのフシジン酸および最終濃度５ｍＭのＧＴＰをそれぞれ添加した。この条件で、複数の結晶が１日ほどで生産され、また最大サイズ（典型的なサイズとして、０．２ｍｍ×０．２ｍｍ×０．２ｍｍ）の結晶は約３日で得られる。この結晶を、５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  （ｐＨ  ６．２）、２００ｍＭ  酢酸ナトリウム、２５％ｗ／ｖのＰＥＧ８０００、１５％ｖ／ｖ  ２−ｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｌおよび５％ｖ／ｖ  ２−ｐｒｏｐａｎｏｌを含む細胞保護剤内に移し、液化窒素で瞬間凍結した。高エネルギー加速器研究機関（筑波、日本）の放射光研究施設に設置されたＢＬ１８Ｂにて、２．２Åの解像度でＸ線回折データを、結晶と検出器間の距離４３０ｍｍの条件でのシンクロトロン放射で集積した。データは、ワイセンベルグ型カメラと高分子結晶構造解析に用いるイメージングプレートを使用して集積した。このデータの解析には、ＨＫＬパッケージのＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫプログラムによって行った。Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＲＲＦの結晶は、ユニットセルパラメータ、ａ＝ｂ＝８４．８０およびｃ＝１２４．７３Åにおいて三方晶系間のグループＲ３２に属する。仮に１分子につき不均一な単位において、計算したＭａｔｔｈｅｗｓ係数ＶＭ値は、２．４０Å３／Ｄａである。そのため、結晶の溶媒内容物は、４８．８％と算出された。表１に集積したデータ統計を示した。
【００３２】
なお、表１において、括弧内の数値は、最大解像シェルである。Ｒｍｅｒｇｅ＝ΣｈΣｊ｜＜Ｉ（ｈ）＞−Ｉ（ｈ）ｊ｜ΣｈΣｊの＜Ｉ（ｈ）＞は、対称相当反射平均強度を示している。
【００３３】
【表１】
2004298159.tif 000003
【００３４】
（実施例８）構造決定および精査
Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＲＲＦにおける分子置換予測には、ＣＣＰ４組中のプログラムＡｎｏＲｅ（非特許文献４）を利用した。探索モデルとして、公知の大腸菌ＲＲＦ変異体（Ｒ１３２Ｇ）（非特許文献５）の結晶構造を用いた。探索モデルを生成する際に、配列間で同一でない残基はＡｌａ残基と置換された。その結果、唯一の解決は、翻訳機能予測の後に、０．３１６の相関係数および５５．２％（８．０−４．０Å）のＲ因子により発見した。この解決の正確さを改善するため、この合成構造は８．０〜３．０Åの解像度からのデータを使用して、厳正な主部分精査を４０サイクル行った。Ｒ因子は、４６．２％までに精練した。
【００３５】
構造の精練には、プログラムＸ−ＰＬＯＲ（非特許文献６）、ＣＮＳ（非特許文献７）およびＴＯＭ（非特許文献８）を利用して行った。モデルの適合性および精査の多くのサイクル後、ほとんど全ての分子をトレースすることが可能だった。このステップでは、アラニンに置換された残基は、オリジナルのアミノ酸残基に戻された。その後、精査ステップは、グループ化された温度要因あるいは個々の温度要因の精査を含んでいた。モデルのチェックのためオミットマップを用いた。ＣＮＳプログラム中のｗａｔｅｒｐｉｃｋ手順を利用することにより、水分子を識別した。
【００３６】
最終モデルは、１８５アミノ酸および２２７水分子の全てを含んでいた。結晶化の状況下での溶液には、フシジン酸およびＧＴＰが含有している。これら化合物は、Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＲＲＦの結晶化に必須と考えられているにもかかわらず、電子密度地図において、タンパク質および水分子のみが観察された。最終的なＲ因子は、２０．３％、Ｒｆｒｅｅは２７．３％であった。なお、平均位置エラー値は０．２４１Åであった。このモデルは、プログラムのＰＲＯＣＨＥＣＫにて評価した場合、優れた立体化学性を有していた。Ｒａｍａｎｃｈａｎｄｒａｎプロットにおいて、非グリシン残基の９４．７％は、最も適した領域にある。また、どの残基においても大量に許容領域および非許容領域にない。化学結合における長さおよび角度の二乗平均平方根偏差（ｒｍｓｄ）は、長さは０．００５Å、角度は１．０７８°である。表２にこの構造精査における統計結果をまとめて、示した。最終調整したものおよび構造データは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに登録・蓄積した（ＰＤＢ  ♯１ＩＳ１）。
【００３７】
なお、表２におけるＲ  ｆａｃｔｏｒ＝Σ｜｜Ｆｏｂｓ｜−｜Ｆｃａｌｃ｜｜／Σ｜ＦｏｂｓのＦｏｂｓは、構造要因の観察値を、またＦｃａｌｃは、構造要因の計算値をそれぞれ示している。Ｒｆｒｅｅ値は、データのおよそ５％を用いて計算され、二乗平均平方根はＥｎｇｈとＨｕｂｅｒパラメータと関連している。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
（実施例９）リボソーム結合試験
質的にＲＲＦへの７０Ｓリボソームあるいはそのサブユニットの結合を検討するため、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００バイオセンサー・システム（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社）を用いて、表面のプラスモン共鳴実験を２５℃の条件で実行した。ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ社）上のＲＲＦ固定には、アミン・カップリング方法（蛋白質はリシンε−アミノグループによって、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）−塩基化学で共有結合によって固定される）を利用し、メーカーの標準プロトコルに従って実行した。酢酸緩衝液（１０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５））を流速１０μｌ／ｍｉｎ．でランニング緩衝液として用いた。ＣＭ５センサーチップのフロー・セル１上にＲＲＦ−ＤＩを固定化するために、２４分間隔でＲＲＦ−ＤＩ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を注入した。ＲＲＦ−ＤＩの固定化レベルは、おおよそ５０００共鳴単位（ＲＵ）だった。ブランクのセルを準備するため、フロー・セル２も活性化されたが、ランニング緩衝液だけ注入した。上記２種のセルにおいての未反応のＮＨＳグループは、エタノールアミンハイドロクロライドによって阻害された。
【００４０】
相互作用のモニタリングのため、全ての手順を自動化にすることによって、試料の注入および再生を反復サイクルとした。濃度が６０〜９００ｎＭの範囲を超えたリボソームは、セル１およびセル２に同時に注入された。次に、セル２からの反応（すなわち、センサーチップ上のリボソームとデキストラン・マトリックス間の非特異的な相互作用）分を減じることによって、セル１からの反応を集積した。ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、８．２ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）を試料の希釈および流速１０μｌ／ｍｉｎ．で、ランニング緩衝液に利用した。
【００４１】
ＲＲＦ−ＤＩによる、野生型ＲＲＦと５０Ｓサブユニットとの結合阻害を検討するため、各種濃度のＲＲＦ−ＤＩ（０．０５〜３μＭの範囲）を調整し、５０Ｓサブユニットとともにプレインキュベートした。次に、この混合物をＣＭ５センサーチップに注入した。この実験において、野生型大腸菌ＲＲＦのセンサーチップに固定には、上記と同様の方法で行った。
【００４２】
ＲＲＦ−ＤＩと７０Ｓリボソーム、またはそのサブユニットとの結合は、フィルター技術を用いて測定した。０．２５μＭのリボソームを含む４０μｌのＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、８．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ）とともにＲＲＦ−ＤＩを３０℃、１０分間インキュベートした。次いで、この混合物をＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に入れ、３０００×ｇで５分間の遠心して、リボソームと結合したＲＲＦ−ＤＩを取得した。４０μｌの上記と同じ緩衝液をカラムに入れて、３０００×ｇで１０分間の遠心により、未結合ＲＲＦ−ＤＩを洗い出した。この洗浄操作を２回繰り返した。そして、フィルターを４０μｌの緩衝液とともに室温で１分間、インキュベートした。リボソーム結合ＲＲＦ−ＤＩは、遠心によって収集した。回収したＲＲＦ−ＤＩは、抗大腸菌ＲＲＦウサギ抗体（１：１００００希釈）を用いたウェスタン・ブロッティングによって検出した。結合ＲＲＦ−ＤＩは、既知量の標準ＲＲＦ−ＤＩとのブロッティングによって定量した。ＲＲＦ−ＤＩとフィルター装置との非特異的結合の定量のため、コントロール実験（リボソームを含まない）を行った。野生型ＲＲＦと７０Ｓリボソームまたはそのサブユニットとの結合の測定も同様に行った。
【００４３】
なお、表３は、ＲＲＦ−ＤＩおよび野生型ＲＲＦのリボソームおよびそのサブユニットからの解離定数を示した表である。
【００４４】
【表３】
2004298159.tif 000005
【００４５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ＲＲＦ−ＤＩおよびその特性を維持した誘導体は、リボソーム再生因子の阻害剤として働き、したがって細菌の細胞内に導入することによって、細菌の生育を抑制することができ、またこのリボソーム再生阻害因子を有効成分とすることを特徴とする原核生物の生存または増殖に障害効果を奏する組成物が提供される。
【００４６】
またこの出願の発明は、薬学的成分を含有することにより様々な形状、投与方法が可能とすることを特徴とする、ヒト等に対して副作用の少ない前記の組成物が提供される。
【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明のＲＲＦ−ＤＩの構造を例示した模式図である。
【図２】図１に例示したＲＲＦ−ＤＩの発現プラスミドの作製手順を例示した模式図である。
【図３】大腸菌野生型ＲＲＦとＲＲＦ−ＤＩのＣＤスペクトルの結果を示したグラフ図である。
【図４】野生型ＲＲＦにおけるリボソーム再生活性を示したグラフ図である。
【図５】野生型ＲＲＦが１に対して、ＲＲＦ−ＤＩが５０におけるリボソーム再生活性を示したグラフ図である。
【図６】ＲＲＦ−ＤＩにおけるリボソーム再生活性を示したグラフ図である。
【図７】リボソームの再生過程を例示した模式図である。
【図８】各菌種のＲＲＦのアミノ酸配列を比較例示した図である。
【図９】Ｖ．  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓのＲＲＦの構造を例示した模式図である。
【図１０】各菌種のＲＲＦの構造を比較例示した模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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