(57)【要約】【課題】  澱粉から多量のマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースを生成する新規アミラーゼとその製造方法並びに用途を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明は、澱粉から主としてマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースを生成する作用を有し、かつ、マルトヘキサオース以下の低分子オリゴ糖には実質的に分解作用を有さないことを特徴とする微生物由来のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼ、それを産生する微生物、この微生物からの該アミラーゼの製造、澱粉質に該アミラーゼを作用させて得られる糖質並びにこの糖質を含有せしめた組成物を提供することによって上記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
澱粉質に対し、澱粉から主としてマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースを生成する作用を有し、マルトヘキサオース以下の低分子オリゴ糖には実質的に分解作用を示さないマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを作用させるか、又は当該マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼとともに澱粉枝切り酵素を作用させ得られるマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質。
【請求項２】
マルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオースが、夾雑糖質を分離して得られたマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース高含有糖質であることを特徴とする請求項１記載のマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質。
【請求項３】
マルトヘキサオースを２０質量％以上含有し、かつ、マルトヘキサオースに対するマルトヘプタオースの質量比が０．５以上である請求項１又は２に記載のマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質。
【請求項４】
澱粉から主としてマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースを生成する作用を有し、マルトヘキサオース以下の低分子オリゴ糖には実質的に分解作用を示さないマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼが、アルカリゲネス属の微生物に由来する、ＳＤＳ−ゲル電気泳動で４３，０００±３，０００ダルトンの分子量を有するものであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質。
【請求項５】
アルカリゲネス属の微生物が、アルカリゲネス  ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）Ｄ２２７１（工業技術院生命工学工業技術研究所、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７８）である請求項４記載のマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載のマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質をさらに水素添加して得られるマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール含有糖質。
【請求項７】
マルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトールが、夾雑糖質を分離して得られたマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール高含有糖質であることを特徴とする請求項６記載のマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール含有糖質。
【請求項８】
請求項１乃至５のいずれかに記載のマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質、又は、請求項６又は７記載のマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール含有糖質を含有せしめた組成物。
【請求項９】
組成物が、飲食物、化粧品、医薬品又は成形物であることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼとその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、澱粉から主にマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースを生成するマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼとその製造方法、それを産生する微生物、並びに、このマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを用いて製造されるマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質、又は、これを水素添加して得られるマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール含有糖質、更には、これらを含有せしめた組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
澱粉に特定のアミラーゼを作用させることによって、マルトース、マルトテトラオースなどの特定のマルトオリゴ糖を特異的に生成せしめる方法は、工業的規模で実施されており、食品、医薬品などの組成物に広く利用されている。
【０００３】
近年、マルトオリゴ糖の中でも比較的分子量の高い糖質が低甘味で消化吸収され易いという理由から、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどのマルトオリゴ糖を多量に含む糖質が望まれている。
【０００４】
澱粉からマルトヘキサオースを多く生成するアミラーゼとしては、微生物起源の酵素がいくつか知られているが、マルトヘプタオース以上のマルトオリゴ糖を特異的に生成するアミラーゼは知られていない。
【０００５】
澱粉から主にマルトヘキサオースを生成するアミラーゼは、その作用性から大きくふたつに分類され、ひとつは、澱粉糖鎖の非還元性末端から順次マルトヘキサオースを切り出していくエキソ型のマルトヘキサオース生成アミラーゼ、すなわちマルトヘキサオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９８）、もうひとつは、澱粉糖鎖の内部にも作用して、マルトヘキサオースを比較的多く生成するエンド型マルトヘキサオース生成アミラーゼ、いわゆるエンド型α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）である。
【０００６】
エキソ型マルトヘキサオースアミラーゼについては、非特許文献１にアエロバクター  アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が菌体内に産生することが報告されているが、この酵素は至適温度、安定温度が低く、工業的に利用する上で耐熱性が不十分である。
【０００７】
エンド型マルトヘキサオース生成アミラーゼについては、非特許文献２にバチラス  サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）が産生することが報告され、また、非特許文献３にバチラス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｇ−６が産生することが報告され、また、非特許文献４にバチラス  サーキュランス  Ｆ−２が産生することを報告され、更に、非特許文献５にバチラス・スピーシーズ  Ｈ−１６７が産生することが報告されている。これらのうち、バチラス  サーキュランス  Ｇ−６、バチラス  サーキュランス  Ｆ−２、及びバチラス・スピーシーズ  Ｈ−１６７由来のアミラーゼは、澱粉からマルトヘキサオースを最大約２５乃至３０質量％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、質量％を％と略称する。）生成するが、マルトヘプタオースを全く生成せず、しかも、反応が進むにつれ、生成したマルトヘキサオースをマルトース及びマルトテトラオースに分解することが知られている。
【０００８】
一方、バチラス  サブチリス由来のアミラーゼは、生成したマルトヘキサオースの分解を示さないものの、澱粉からのマルトヘキサオースの生成率は最大でも約２５％止まりである。更には、これら微生物由来の酵素は、実際、澱粉の糖化条件においてマルトヘキサオース含量はあまり高くならず低分子オリゴ糖が多くなることに加えて、微生物からの産生量が低いことなどの理由から、現実に、これら微生物の産生するアミラーゼを用いたマルトヘキサオース高含有糖質の工業的製造は行われていない。
【０００９】
一方、麦芽から調製された精製α−アミラーゼは、澱粉への作用において、反応初期には主にマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースを生成することが、非特許文献６に記載されている。しかしながら、その反応が進むにつれ、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースはさらにマルトース、マルトテトラオースなどの低分子オリゴ糖にほぼ完全に分解されることも同時に記載されており、したがって、澱粉から主としてマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースを含有する糖化物を製造することはできなかった。
【００１０】
【非特許文献１】貝沼ら、『フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）』、第２６巻、第２８１乃至２８５頁（１９７２年）
【非特許文献２】ゼイ・エフ・ケネディ（Ｊ．Ｆ．Ｋｅｎｎｅｄｙ）等、『スターチ（Ｓｔａｒｃｈ）』、第３１巻、第２３５乃至２４１頁（１９７９年）
【非特許文献３】高崎、『アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』、第４６巻、第１５３９乃至１５４７頁（１９８２年）
【非特許文献４】谷口ら、『澱粉科学』、第２９巻、第１０７乃至１１６頁（１９８２年）
【非特許文献５】林ら、『アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー』、第５２巻、第４４３乃至４４８頁（１９８８年）
【非特許文献６】『アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー』、第４２巻、第２５９乃至２６７頁（１９７８年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、澱粉からマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースを高含量に生成し、生成したマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースをほとんど分解しないアミラーゼと該アミラーゼを利用したマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質の製造方法並びにその用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、上記課題を解決するために澱粉からマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースを生成する新規なアミラーゼを求めて、その酵素を産生する微生物を広く検索した。その結果、山梨県駒ヶ岳付近の土壌から分離したアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する新規微生物アルカリゲネス  ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）Ｄ２２７１が澱粉からマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースを高含量に生成する新規アミラーゼ（本明細書では、本アミラーゼを「マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼ」と略称することがある。）を産生することを見いだし、本酵素を澱粉質に作用させ得られるマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質の製造方法を確立し、併せて、これら糖質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品、成形物などの組成物を確立して本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼは、至適温度、安定温度における温度が高く、また、至適ｐＨ、安定ｐＨにおけるｐＨ域が広く、更に産生微生物からの酵素生産量も高く、澱粉質からのマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース高含有糖質及びマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール高含有糖質の製造に有利に利用しうることが判明し、その工業的意義はきわめて大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の新規微生物アルカリゲネス  ラタス  Ｄ２２７１の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準拠して行った。
【００１５】
＜Ａ  細胞形態＞
（１）ポテト・デキストロース寒天培養、２７℃：０．７乃至１．３×１．３乃至２．４μｍの桿菌。単独、希に対をなし、連鎖した細胞も観察される。周鞭毛による運動性あり。無胞子。非抗酸性。グラム陰性。ポリ−β−ヒドロキシブチレートを蓄積する。
（２）酵母エキス・麦芽エキス寒天培養、３７℃：培養１日の細胞の大きさは、０．５乃至１．０×１．３乃至２．４μｍ、培養３日で０．５乃至１．０×１．０乃至２．５μｍ。単独。
【００１６】
＜Ｂ  培養的性質＞
（１）ポテト・デキストロース寒天平板培養、３７℃
形状  ：円形  大きさは１日で約１ｍｍ。４日で３乃至４ｍｍ。
周縁  ：全縁
隆起  ：臍状
光沢  ：鈍光
表面  ：しわ状
色調  ：不透明、白〜黄土色
（２）酵母エキス・麦芽エキス寒天平板培養、３７℃
形状  ：円形  大きさは４日で約３乃至５ｍｍ
周縁  ：全縁
隆起  ：半レンズ状  
光沢  ：湿光
表面  ：平滑
色調  ：白〜クリーム色
（３）ポテト・デキストロース寒天斜面培養、３７℃
生育度  ：良好
形状    ：糸状
（４）酵母エキス・麦芽エキスゼラチン穿刺培養、３７℃
：液化
【００１７】
＜Ｃ  生理学的性質＞
（１）硝酸塩の還元性        ：陽性（コハク酸培地）
（２）脱窒反応              ：陰性
（３）メチルレッド試験      ：陰性
（４）ＶＰ試験              ：陰性
（５）インドールの生成      ：陰性
（６）硫化水素の生成        ：陰性
（７）澱粉の加水分解        ：陽性
（８）クエン酸の利用        ：陰性
（９）無機窒素源の利用      ：アンモニウム塩及び硝酸塩ともに利用できる。
（１０）色素の生成            ：陰性
（１１）ウレアーゼ            ：陽性
（１２）オキシダーゼ          ：陽性
（１３）カタラーゼ            ：陽性
（１４）生育の範囲            ：ｐＨ５乃至８、温度１０乃至４１℃。
（１５）酸素に対する態度      ：好気性
（１６）炭素源の利用と酸生成の有無
利用性            酸生成能
Ｄ−グルコース        利用する          陰性
Ｄ−ガラクトース      利用する          陰性
Ｄ−マンノース        利用する          陰性
Ｄ−フラクトース      利用する          陰性
Ｌ−アラビノース      利用する          陰性
Ｄ−キシロース        利用する          陰性
Ｌ−ラムノース        利用する          陰性
マルトース            利用する          陰性
スクロース            利用する          陰性
ラクトース            利用する          陰性
トレハロース          利用する          陰性
ラフィノース          利用する          陰性
マンニトール          利用しない        陰性
デキストリン          利用する          陰性
ズルチトール          利用しない        陰性
（１７）アミノ酸の脱炭酸試験  ：Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、オルニチン、いずれに対しても陰性。
（１８）ＤＮａｓｅ            ：陰性
（１９）３−ケトラクトースの生成    ：陰性
（２０）ＤＮＡのＧ−Ｃ含量    ：６７％
【００１８】
以上の菌学的性質に基づいて、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー  第１巻（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １）』、（１９８４年）を参考にして公知菌との異同を検討した。その結果、本菌は、アルカリゲネス  ラタスに属する菌株であることが判明した
【００１９】
これらの結果から、本発明者等は、本微生物をアルカリゲネス  ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）Ｄ２２７１と命名し、平成６年２月２３日付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託し、『受託番号、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７８』として受託された。
【００２０】
本発明では、上記菌のみならずアルカリゲネス  ラタスに属し、マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼ産生能を有する他の菌株やこれらの変異株なども使用することができる。
【００２１】
本発明の微生物の培養に用いる培地は、本微生物が生育でき、本発明の酵素を産生するものであればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、本菌株が資化できる物であればよく、例えば、マルトース、デキストリン、澱粉などの糖類、糖蜜、及び酵母エキスなどの糖含有物などの天然物なども使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。例えば、培養液の澱粉の濃度は、２０重量％以下が望ましく、菌の生育及び増殖からは、通常、５％以下が好ましい。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物及び、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが必要に応じて適宜用いられる。
【００２２】
培養は、通常、温度１０乃至４０℃、好ましくは２５乃至３７℃、ｐＨ５乃至８、好ましくはｐＨ６乃至７．５から選ばれる条件で、好気的に行われる。培養時間は本微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０乃至１００時間である。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、酸素を使用したり、また、培養槽内の圧力を高めるなどの手段が採用される。また、培養方式は、回分培養又は連続培養のいずれでもよい。
【００２３】
このようにして、微生物を培養した後、得られる培養物から本発明の酵素を採取する。本酵素活性は、培養物の菌体外培養液に認められ、菌体外培養液を粗酵素として採取すればよく、また、培養物全体を粗酵素として用いることもできる。菌体外培養液と菌体との分離には通常の固液分離手段が採用される。例えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する手段、培養物に濾過助剤を加えたり、あるいは、プレコートすることにより濾過分離する手段、平膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する手段などを適用し得る。菌体外培養液をそのまま粗酵素液として用いることもできるが、好ましくは通常の手段で濃縮する。例えば、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濃縮法などが採用される。
【００２４】
更に、菌体外培養液及びその濃縮物は、通常の手段で固定化することもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが採用される。
【００２５】
粗酵素はそのまま用いてもよいが、通常の手段によって精製することもできる。一例として、菌体外培養液を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、ブチルトヨパール樹脂を用いた疎水カラムクロマトグラフィー、フェニル  スーパーローズ  ＨＲ５／５樹脂を用いた疎水カラムクロマトグラフィーにて電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００２６】
このようにして得られる本発明のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼは、下記の理化学的性質を有する。
（１）  作用
澱粉に作用して、主としてマルトヘキサオース、マルトヘプタオースを生成する。マルトヘキサオース以下の低分子オリゴ糖を実質的に分解せず、マルトヘプタオースにも作用しにくい。
（２）  分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、４３，０００±３，０００ダルトン
（３）  等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、７．６±０．５
（４）  至適ｐＨ 
約５．０（カルシウムイオン存在下）
（５）  至適温度
７０℃付近（カルシウムイオン存在下） 
（６）  ｐＨ安定性 
約４．５乃至１０．５（カルシウムイオン存在下） 
（７）  温度安定性 
６０℃付近まで安定（カルシウムイオン存在下） 
（８）  活性促進、安定化
カルシウムイオンによって活性促進及び安定化される。
（９）  阻害
銅イオン、鉛イオン、亜鉛イオン、水銀イオン、又はＥＤＴＡで阻害を受ける。
【００２７】
本発明のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼの活性は次のようにして測定する。基質として可溶性澱粉０．３ｗ／ｖ％（２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．５、１ｍＭＣａＣｌ２を含む）５ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え 、４０℃で１０分間反応させた後、反応液０．５ｍｌを０．０２Ｎ硫酸水溶液１５ｍｌに加えて反応を停止させる。この反応停止液に０．１Ｎヨウ素溶液０．２ｍｌを添加、撹拌し、２５℃に１５分放置した後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性１単位は、４０℃、１０分の反応で可溶性澱粉１５ｍｇのヨウ素呈色を完全に消失させる酵素量とする。
【００２８】
本発明のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを利用してマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質を製造するに際しては、工業的には、澱粉、アミロペクチン、アミロース、澱粉加水分解物などの澱粉質を基質として反応させるのが好ましい。
【００２９】
また、必要ならば、澱粉質含有飲食物の製造に際して、マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを作用させ、飲食物にマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオースを含有せしめ、澱粉質の老化を防止し、飲食物の日持ちを延長することもできる。
【００３０】
一般的には、５乃至４５％程度の澱粉質溶液に、望ましくは、これに塩化カルシウムなどのカルシウム塩を濃度０．５乃至５０ｍＭ程度共存させた溶液に、本発明のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを澱粉質グラム当たり約０．５乃至２０単位の割合で加え、ｐＨ３乃至８、反応温度４０乃至９０℃で１乃至１００時間反応させる。
【００３１】
また、反応物中のマルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含量をできるだけ高めるためには、澱粉質の酸又はα−アミラーゼによる液化の程度をできるだけ低く、ＤＥ１０未満、好ましくはＤＥ５未満にとどめたものに、マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを作用させるのが好ましい。
【００３２】
また、反応に際して、マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼとともに、他の澱粉質関連酵素、例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１９）、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、α−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０）、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）などを併用して、得られるマルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質の組成を変えたり、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含量を高めたりすることも随意である。
【００３３】
とりわけ、澱粉質にマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼとプルラナーゼ、イソアミラーゼなどの澱粉枝切酵素とを併用してマルトヘキサオース及びマルトヘプタオース生成率を高めることは有利に実施できる。このようにして得られるマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースの合計含量が固形物当たり３０乃至５０％程度のマルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質を原料として、夾雑する糖類、デキストリンなどを分離し、マルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオースを採取することも有利に実施できる。
【００３４】
分離法としては、例えば、特開昭４８−４６４７号公報に記載される半透膜の利用、特開昭４９−１０２８５４号公報に記載される有機沈澱剤の利用、特開昭５９−１４８７９４号公報に記載される塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーの利用などが適宜選択され、必要ならば、純度９０％以上のマルトヘキサオース高含有糖質、又は、マルトヘプタオース高含有糖質を採取することも可能である。とりわけ、塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いる方法により、夾雑糖質を分離除去して、マルトヘキサオース高含有液及び／又はマルトヘプタオース高含有液を採取する方法は、工業的規模で有利に実施することができる。この際、公知の固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれを採用することも随意である。
【００３５】
酵素反応液又は夾雑糖質を分離した液は、常法により、瀘過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、濃縮し、シラップ状製品にする。必要ならば、更に、噴霧乾燥などの方法で乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００３６】
このようにして得られる本発明のマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質は、通常、マルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオースを固形物当たり３０％以上、更には４０％以上含有しており、この粉末品は、その含量の程度によっても多少変動するものの、実質的に難吸湿性であり、固結せず、流動性良好であるので取扱い容易であり、その包装、輸送、貯蔵などの管理に要する物的、人的経費が大幅に削減できる。
【００３７】
また、この粉末品は、実質的に難吸湿性粉末で、耐熱性が高く、安定性も良いので、従来きわめて困難とされていた粉末混合甘味料、即席ジュース、即席スープ、顆粒、錠剤などの賦形剤、増量剤、粉末基剤などとして、更には、小麦粉、コーングリッツ、澱粉など粉類の一部又は全量に置き換えて、例えば、プリンミックス、ホットケーキミックス、製菓材料、製パン材料、シリアル材料などに利用することも有利に実施できる。更に、マルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質を還元して、化学的により安定なマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール含有糖質を製造する事も有利に実施できる。
【００３８】
例えば、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質を、濃度約４０乃至６０％水溶液にし、オートクレーブに入れ、触媒としてラネーニッケルを約８乃至１０％添加し、撹拌しながら温度を９０乃至１４０℃に上げ、水素圧を２０乃至１５０ｋｇ／ｃｍ２に上げて水素添加を完了させた後、ラネーニッケルを 除去し、次いで、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質製造の場合と同様に、脱色、脱塩して精製し、濃縮してシラップ状製品とするか、更に噴霧乾燥などにより乾燥して粉末状製品とする。
【００３９】
このようにして得られるマルトヘキサイトール及びマルトヘプタイトール含有糖質には、通常、マルトヘキサイトール及びマルトヘプタイトールを固形物当たり３０％以上含有する。このようにして得られるマルトヘキサイトール及びマルトヘプタイトール含有糖質を原料として、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースの場合と同様に、分画法などにより、夾雑糖質を分離し、更に高純度のマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトールを採取することも有利に実施できる。
【００４０】
以上述べた方法で製造されるマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質又はマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール含有糖質は、低甘味の甘味剤として、また、ホディー付与剤、粘度調節剤、保湿剤、照付与剤、保香剤、結晶防止剤、キャンディーのダレ防止剤、澱粉老化防止剤などとして、さらには、栄養補給用剤として広く飲食物、嗜好物、飼料、化粧品、医薬品、成形物など、更には、生活用品、農林水産用品、試薬、化学工業用品などの各種組成物に有利に利用される。
【００４１】
マルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質又はマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール含有糖質は、低甘味ながら、そのまま甘味付けのための調味料として使用することができるが、必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の一種又は二種以上の適量と混合して使用してもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などと混合して使用することもできる。
【００４２】
また、マルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質又はマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール含有糖質の呈味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００４３】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、たくあん漬の素、白菜漬の素、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料として有利に使用できる。また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベット、などの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、紅茶、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤などの各種飲食物への甘味付けに、呈味改良に、また、物性改良などに有利に利用できる。
【００４４】
また、家畜、家禽、魚などの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈味改良剤、矯味剤として、更には、品質改良剤として有利に利用できる。
【００４５】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適応できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキン２などのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモン、胎盤ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロール、などのビタミン含有液、リパーゼ、エステラーゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌、ロイヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の健康食品や医薬品などを容易に製造できる。
【００４６】
以上述べたように、本発明でいう組成物は、経口的又は非経口的に利用する飲食物、化粧品、医薬品のみならず、それ以外にも、例えば、生活用品、農林水産用品、試薬、化学工業用品など広範な用途を有する。
【００４７】
また、これら組成物に、本発明のマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質又はマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール含有糖質を含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程で含有せしめればよく、例えば、混和、溶解、浸漬、浸透、散布、塗布、噴霧、注入、固化などの公知の方法が適宜選ばれる。その含有せしめる量は、組成物によっても異なるが、一般的には、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトヘキサイトール又はマルトヘプタイトールとして、０．１％以上、望ましくは０．５％以上の量が好適である。次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００４８】
＜実験１：酵素の生産＞
可溶性澱粉２．０ｗ／ｖ％、ペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水塩０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．５ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、１５分間滅菌し、冷却して、アルカリゲネス  ラタス  Ｄ２２７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７８）を接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２０時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００４９】
容量３０ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度３７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度３７℃で、約２４時間通気撹拌培養した。培養液約１９ｌを遠心分離して、培養液上清約１８ｌを得た。培養液上清のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼの活性は、５８単位／ｍｌであった。
【００５０】
＜実験２：酵素の精製＞
実験１で得た培養液上清をＵＦ膜濃縮し、マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼをｍｌ当たり約１，２００単位有する濃縮酵素液約８００ｍｌを回収した。得られた濃縮酵素液のうち３００ｍｌを５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液上清（４００ｍｌ）を、ＤＥＡＥ−トヨパールゲル  ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量１００ｍｌ）を行った。
【００５１】
本発明のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼはＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着せず、素通り画分にその活性が検出された。酵素活性画分を回収した後、０．５Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、次に、ブチルトヨパール  ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量１００ｍｌ）を行った。吸着したマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを硫安０．５Ｍから０Ｍのリニアグラジエントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。続いて、フェニル  スーパーローズ  ＨＲ５／５（スウエーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量１０ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性画分を回収した。
【００５２】
以上の精製手段により得られた精製酵素標品の酵素活性の回収率は、培養液上清のそれに対して約２５％であった。また、精製酵素標品の比活性は蛋白質ｍｇ当たり１，８６０単位であった。なお、蛋白質はローリー法にしたがって牛血清アルブミンを標準にして定量した。精製した酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【００５３】
＜実験３：酵素の性質＞
実験２の方法で得たマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼ標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度１０ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラドラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量４３，０００±３，０００ダルトンであった。精製マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを２ｗ／ｖ％アンフォライン（スウェーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点は７．６±０．５であった。
【００５４】
本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を５ｍＭ塩化カルシウム存在下で、活性測定方法に準じて調べた。結果を図１（温度の影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度は７０℃付近、至適ｐＨは約５．０であった。本酵素の熱安定性は、酵素溶液（５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を各温度に１時間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を５ｍＭ塩化カルシウムを含む各ｐＨの２０ｍＭ緩衝液中で４０℃、１時間保持した後、ｐＨを６に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。それぞれの結果を図３（熱安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の熱安定性は６０℃付近までであり、ｐＨ安定性は約４．５乃至１０．５であった。なお、カルシウムイオンを酵素液及び基質溶液から除いた条件では、ほとんど澱粉分解活性を示さず、カルシウムイオンに対する依存度が顕著に高いアミラーゼであった。また、本酵素活性は、１ｍＭ銅イオン、鉛イオン、亜鉛イオン、水銀イオン、又は１０ｍＭＥＤＴＡで阻害された。
【００５５】
＜実験４：澱粉への作用＞
最終濃度２ｗ／ｖ％の可溶性澱粉（５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）に、温度４０℃にて、実験２の方法で得た精製マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを澱粉グラム当たり５０単位加えて反応させ、経時的に反応液を採取し、１００℃で、１０分間加熱して酵素を失活させた。この酵素反応液を用いて、加水分解率、青価、糖組成を分析した。
【００５６】
加水分解率は、反応液の全糖量をアントロン硫酸法で、還元糖量をソモギー・ネルソン法でグルコース換算で定量し、全糖量に対する還元糖量の割合として求めた。青価は、反応液０．１ｍｌを０．０５Ｎ硫酸水溶液１５ｍｌに加え撹拌後、０．１Ｎヨウ素溶液０．２ｍｌを加えて発色させ、６６０ｎｍにおける吸光度をヨウ素呈色度として測定し、０時間のヨウ素呈色度に対する各時間のヨウ素呈色度の百分率で求めた。
【００５７】
また、糖組成は反応液を脱塩処理した後、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略称する。）にて分析した。ＨＰＬＣの装置はＣＣＰＤシステム（東ソー株式会社製）、分析カラムはＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＫ０４ＳＳ（１０ｍｍφ×２００ｍｍ，三菱化成株式会社製）、溶離液は水を流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで、検出は示差屈折計で行った。それらの結果を表１、及び表２に示す。
【００５８】
【表１】
2004211097.tif 000002
【００５９】
【表２】
2004211097.tif 000003
【００６０】
表１の結果に示されるように、澱粉の加水分解率の増加に比較して、ヨウ素呈色度の減少が大きいこと、また、その反応初期から、微量ながらマルトース、マルトトリオースなどの低分子オリゴ糖が確認されることからエンド型アミラーゼであり、更に、反応生成物のアノマー型を旋光度法にて調べた結果、α型であったことから、本発明の澱粉分解酵素は、エンド型のα−アミラーゼであることが判明した。
【００６１】
また、表２の結果から明らかなように、反応初期からマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースを他のオリゴ糖よりも多く生成し、反応とともにこれらの成分は増加し、さらに反応時間を長くしてもマルトヘキサオース及びマルトヘプタオースの含量は減少しなかったことから、本発明の澱粉分解酵素は、澱粉から本質的にマルトヘキサオースとマルトヘプタオースを生成する新規なマルトヘキサオース、マルトヘプタオース生成タイプのα−アミラーゼであることが判明した。澱粉からのマルトヘキサオースとマルトヘプタオースの生成率は合計で約４５％であった。
【００６２】
＜実験５：基質特異性＞
最終濃度２ｗ／ｖ％のアミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、プルラン、デキストラン、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、あるいはマルトヘプタオースに、実験２の方法で得た精製マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを基質固形物グラム当たり５０単位ずつ加え、５ｍＭ塩化カルシウム存在下、４０℃、ｐＨ５．５で２時間作用させた。酵素反応前後の反応液をキーゼルゲル６０（メルク社製；アルミプレート，２０×２０ｃｍ）を用いた薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略称する。）にかけ、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。ＴＬＣは展開溶媒に１−ブタノール：ピリジン：水＝６：４：１（容積比）を用い、室温で１回展開した。発色は２０ｖ／ｖ％硫酸−メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で約１０分間加熱して行った。
【００６３】
その結果、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンに作用して、可溶性澱粉を基質とした場合と同様に、主としてマルトヘキサオース、マルトヘプタオースを生成し、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、プルラン、デキストラン、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースには作用せず、マルトヘプタオースからは、僅かにグルコースとマルトヘキサオースを分解物として生成していたが、きわめて作用しにくいものであることが判明した。
【００６４】
＜実験６：急性毒性試験＞
マウスを使用して、実施例７の方法で製造した粉末状マルトヘキサオース高含有糖質、粉末状マルトヘプタオース高含有糖質、実施例８の方法で製造したシラップ状マルトヘキサイトール高含有糖質及びシラップ状マルトヘプタイトール高含有糖質をそれぞれに経口投与して急性毒性テストを行った。その結果、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトヘキサイトール及びマルトヘプタイトールはいずれも低毒性の物質で、投与可能な最大投与量においても死亡例は認められなかった。したがって、正確な値はいえないが、そのＬＤ５０値は、いずれも５０ｇ／ｋｇ以上であった。
【００６５】
以下、本発明の実施例を述べる。実施例１乃至９でマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼとそれを用いたマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース含有糖質、又は、マルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール含有糖質の製造方法について述べ、実施例１０乃至２１で該糖質を含有せしめた組成物について説明する。
【実施例１】
【００６６】
アルカリゲネス  ラタス  Ｄ２２７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７８）を、培養温度を３０℃とした以外は、実験１と同じ培地組成で、実験１の方法に準じてファーメンターで約３０時間、通気撹拌培養した。この培養液上清のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼの活性は、培養液ｍｌ当たり６６単位であった。培養液をＭＦ膜濾過し、その透過液をＵＦ膜濃縮して、もとの培養液の活性に対して、約８２％の収率で、マルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼをｍｌ当たり約１，３００単位有する濃縮酵素液を得た。
【実施例２】
【００６７】
５％馬鈴薯澱粉乳（ｐＨ５．５）を加熱糊化させ、これを７０℃に冷却して濃度０．０２％になるように塩化カルシウムを加え、実施例１で調製したマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを澱粉グラム当たり２単位の割合になるように添加し、液化、糖化反応を２０時間行った。その反応液をオートクレーブ（１２０℃）で２０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法にしたがって活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップを原料固形物当たり収率約９５％で得た。本品は、固形物当たりマルトヘキサオース２４．２％、マルトヘプタオースを１７．７％含有しており、また、その甘味度は砂糖のそれの約１５％であった。本品は、低甘味剤として、またボディー付与剤、粘度調節剤、保湿剤、照付与剤、接着剤、保香剤、結晶防止剤、キャンディーのダレ防止剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例３】
【００６８】
１０％馬鈴薯澱粉乳（ｐＨ４．５）を加熱糊化させた後、温度５０℃に冷却し、これにイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり１０００単位の割合になるよう加え、２０時間反応させた。その反応液をｐＨ５．２に調整し、オートクレーブ（１２０℃）を１０分間行い、次いで、７０℃に冷却して、これに濃度０．０２％になるように塩化カルシウムを加え、実施例１で調製したマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを澱粉グラム当たり５単位の割合になるように添加し、液化、糖化反応を８時間行った。その反応液をオートクレーブ（１２０℃）で２０分間加熱した後、冷却し、実施例２と同様に精製濃縮し、濃度７５％のシラップを原料固形物当たり収率約９３％で得た。本品の糖組成は、グルコース重合度５以下の少糖類４０．３％、マルトヘキサオース２７．３％、マルトヘプタオース１９．２％、及びグルコース重合度８以上のデキストリン１３．２％であった。本品は、低甘味、低糖度甘味剤などとして実施例２の場合と同様に広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例４】
【００６９】
３３％のとうもろこし澱粉乳に最終濃度０．１重量％となるように炭酸カルシウムを加えた後、ｐＨ６．０に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社製、商品名ターマミール６０Ｌ）を澱粉グラム当たり０．２重量％になるよう加え、９５℃で１５分間反応させた。その反応液をオートクレーブ（１２０℃）を３０分間行った後、５０℃に冷却し、これにイソアミラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり５００単位及び実施例１で調製したマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼを澱粉グラム当たり１．８単位の割合になるように加え、４０時間反応させた。本反応液を、実施例２と同様に加熱、冷却した後、精製濃縮し、噴霧乾燥して水分２％未満の粉末状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質を原料固形物当たり収率約９０で得た。本品の糖組成は、グルコース重合度５以下の少糖類３８．８％、マルトヘキサオース２６．７％、マルトヘプタオース１５．７％、及びグルコース重合度８以上のデキストリン１８．８％であった。本品は、低甘味、低糖度甘味剤などとして実施例２の場合と同様に広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例５】
【００７０】
実施例３の方法で得たマルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質を強酸性カチオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーで分画し、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含量を高めた。実施例３の方法で製造したマルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質を、濃度５５％にして原糖液とした。樹脂は、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（三菱化成工業株式会社製、商品名ダイヤイオンＳＫ  １０４  Ｋ＋型、架橋度４％）を使用 し、内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本を連結して、樹脂層全長を２０ｍとした。カラム内温度を６０℃に維持しつつ、原糖液を樹脂に対して７ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１２の流速で流して分画し、マルトヘキサオース３５％あるいはマルトヘプタオース２５％以上のマルトヘキサオース及びマルトヘプタオース高含有画分を採取し、実施例２と同様に精製し、濃縮して、濃度７５％のシラップ状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質を原糖液固形物当たり約５０％の収率で得た。本品はマルトヘキサオースを固形物当たり約４５％、マルトヘプタオースを同じく約３１％含有しており、また、その甘味度は砂糖のそれの１０％未満であった。本品は、低甘味、低糖度甘味剤などとして、実施例２の場合と同様に広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例６】
【００７１】
実施例５の方法で得たシラップ状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース高含有糖質を更に噴霧乾燥して、水分約２％未満の粉末状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース高含有物を原料シラップ固形物当たり約９８％の収率で得た。本品は、低甘味、低糖度甘味剤などとして、実施例２の場合と同様に広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例７】
【００７２】
実施例５の方法で製造したマルトヘキサオース及びマルトヘプタオース高含有糖質を濃度５０％にして原糖液とした。樹脂は、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（三菱化成工業株式会社製、商品名ダイヤイオンＳＫ  １０４  Ｋ＋型、架橋度４％）を使用し、実施例５と同様にカラムに充填した。カラム 内温度を６０℃に維持しつつ、原糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１０の流速で流して分画し、マルトヘキサオース８０％以上の高含有画分及びマルトヘプタオース７０％以上の高含有画分をそれぞれ採取し、次いで、実施例２と同様に精製し、濃縮し、噴霧乾燥して、水分約２％未満の粉末状マルトヘキサオース高含有糖質及び粉末状マルトヘプタオース高含有糖質を原糖液固形物当たりそれぞれ収率約３０％及び２０％で得た。このようにして得られた粉末状マルトヘキサオース高含有糖質及び粉末状マルトヘプタオース高含有糖質の純度はそれぞれ約８９％、約８１％で、その甘味度は砂糖のそれの１０％未満であった。本品は、低甘味、低糖度甘味剤などとして、実施例２の場合と同様に広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例８】
【００７３】
実施例３の方法で製造したシラップ状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質を濃度５０％にし、オートクレーブに入れ、触媒としてラネーニッケル１０％を添加し、撹拌しながら温度を９０乃至１２５℃に上げ、水素圧を２０乃至１００ｋｇ／ｃｍ２に上げて水素化を完了させた。次いでラネーニッ ケルを除去した後、実施例２と同様に精製し、濃縮して、水分２５％のマルトヘキサイトール及びマルトヘプタイトール含有糖質を原料シラップ固形物当たり約９０％の収率で得た。本品は、マルトヘキサイトールを固形物当たり約２７％、マルトヘプタイトールを同じく約１９％含有しており、また、その甘味度は砂糖のそれの約２０％であった。本品は、低甘味、非還元性甘味剤として、また、ボディー付与剤、粘度調節剤、保湿剤、照付与剤、接着剤、保香剤、結晶防止剤、キャンディーのダレ防止剤などとして広く飲食物に利用される。
【実施例９】
【００７４】
実施例５の方法で製造したマルトヘキサオース及びマルトヘプタオース高含有糖質を実施例８の方法で水素添加し、精製、濃縮し得られるマルトヘキサイトール及びマルトヘプタイトール高含有糖質を濃度５０％にして原糖液とした。この糖液を実施例７の方法に準じて、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけ、マルトヘキサイトール８０％以上の高含有画分及びマルトヘプタイトール７０％以上の高含有画分をそれぞれ採取し、次いで、実施例２と同様に精製し、濃縮し、濃度約７５％のシラップ状マルトヘキサイトール高含有糖質及びシラップ状マルトヘプタイトール高含有糖質を原糖液固形物当たりそれぞれ収率約３０％及び２０％で得た。このようにして得られたシラップ状マルトヘキサイトール高含有糖質及びシラップ状マルトヘプタイトール高含有糖質の純度はそれぞれ約９０％、約８２％で、その甘味度は砂糖のそれの１０％未満であった。本品は、低甘味、低糖度甘味剤などとして、実施例２の場合と同様に広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１０】
【００７５】
＜甘味料＞
実施例２の方法で得たシラップ状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質１質量部にα−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社製、商品名α−Ｇスィート）０．０２質量部を均一に混合して得たシラップ状甘味料は、甘味の質がすぐれ、砂糖の約２倍の甘味を有し、カロリーは甘味度当たり砂糖の約２分の１となる。したがって、本甘味料は、低カロリー甘味料として、カロリーの摂取を制限している人、例えば、肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物などに対する甘味付けに好適である。また、本甘味料は、虫歯誘発菌によって酸の生成も少なく、不溶性グルカンの生成も少ないことにより、虫歯を抑制する飲食物などの甘味付けにも好適である。
【実施例１１】
【００７６】
＜カスタードクリーム＞
コーンスターチ５００質量部、実施例６の方法で得た粉末状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース高含有糖質４００質量部、マルトース５００質量部及び食塩５質量部を、篩を通して充分に混合し、鶏卵１，４００質量部を加えて撹拌し、これに沸騰した牛乳５，０００質量部を徐々に加え、更にこれをとろ火にかけて、撹拌を続け、コーンスターチが完全に完全に糊化して全体が半透明になったとき火を止め、これを冷却して少量のバニラ香料を加えることによりカスタードクリームを製造した。本品は、なめらかで光沢を有し、甘味が強すぎず美味である。
【実施例１２】
【００７７】
＜ういろう＞
米粉９０質量部にコーンスターチ２０質量部、砂糖２０質量部、抹茶粉末１質量部、実施例８の方法で得たシラップ状マルトヘキサイトール及びマルトヘプタイトール含有糖質９０質量部及び水の適量を加えて混練した後、これを容器に入れて６０分間蒸して抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当たりも良好で、風味もよかった。また、澱粉の老化も抑制され、長時間安定であった。
【実施例１３】
【００７８】
＜ハードキャンディー＞
実施例３の方法で得たシラップ状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質７０質量部に砂糖９０質量部を混合溶解し、減圧下で水分約２％未満になるまで加熱濃縮して、これにクエン酸０．１５質量部及び少量のレモン香料と着色料とを混和し、次いで、常法にしたがって成形し、ハードキャンディーを製造した。本品は、吸湿性少なく、ダレを起こしにくい歯切れのよいハードキャンディーである。
【実施例１４】
【００７９】
＜べったら漬＞
実施例２の方法で得たシラップ状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質１質量部、マルトース３質量部、甘草製剤０．０５質量部、リンゴ酸０．００８質量部、グルタミン酸ナトリウム０．０７質量部、ソルビン酸カリウム０．０３質量部及びプルラン０．２質量部を均一に混合してべったら漬の素を製造した。大根３０ｋｇを常法にしたがって食塩により下漬けし、次いで砂糖で中漬けしたものを、本べったら漬の素４ｋｇで調製した調味液に漬けて、べったら漬を製造した。本品は、色艶、香気共に良好で、適度の甘味を有し歯切れもよかった。
【実施例１５】
【００８０】
＜経管栄養剤＞
実施例４の方法で得た粉末状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質２０質量部、グリシン１．１質量部、グルタミン酸ナトリウム１質量部、乳酸カルシウム０．４質量部、炭酸マグネシウム０．１質量部、チアミン０．０１質量部及びリボフラビン０．０１質量部からなる配合物を調製する。この配合物２４ｇずつをラミネートアルミ製小包に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１袋分を約３３乃至５００ｍｌの水に溶解して栄養補給液とし、経管方法により、鼻腔、胃腸などへ投与して使用する。本品は、ヒトのみならず、家畜などへの非経口的栄養補給液としても有利に利用できる。
【実施例１６】
【００８１】
＜経管栄養剤＞
実施例６の方法で得た粉末状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース高含有糖質８０質量部、乾燥卵黄１９０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部塩化カリウム１．８５質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部及びニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製する。この配合物２５ｇずつをラミネートアルミ製小包に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に溶解して栄養補給液とし、経管方法により、鼻腔、食道、胃などへ投与して使用する。
【実施例１７】
【００８２】
＜錠剤＞
アスピリン５０質量部に、マルトース１０質量部、コーンスターチ４質量部及び実施例６の方法で得た粉末マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース高含有糖質４質量部を均一に混合した後、直径１２ｍｍ、２０Ｒ杵を用いて１錠６８０ｍｇ、錠剤の厚さ５．２５ｍｍ、硬度８ｋｇ±１ｋｇで打錠した。本品は、適度の甘味を有する飲み易い錠剤である。
【実施例１８】
【００８３】
＜乳液＞
ポリオキシエチレンベヘニルエーテル０．５質量部、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール１質量部、親油型モノステアリン酸グリセリン１質量部、ベヘニルアルコール０．５質量部、アボガド油１質量部、実施例９の方法で得たシラップ状マルトヘキサイトール高含有糖質３．５質量部、α−グリコシルルチン１質量部、ビタミンＥ及び防腐剤の適量を、常法にしたがって加熱溶解し、これに１，３−ブチレングリコール５質量部、カルボキシビニルポリマー０．１質量部及び精製水８５．３質量部を加え、ホモゲナイザーにかけて乳化し、乳液を製造した。本品は、保湿性ある乳液で、日焼け止め、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例１９】
【００８４】
＜スキンクリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２質量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５質量部、α−グリコシルルチン２質量部、流動パラフィン１質量部、トリオクタン酸グリセリル１０質量部、実施例７の方法で得た粉末状マルトヘキサオース高含有糖質４質量部及び防腐剤の適量を、常法にしたがって加熱溶解し、これに１，３−ブチレングリコール５質量部、及び精製水６６質量部を加え、ホモゲナイザーにかけて乳化し、更に、香料の適量を加えて撹拌混合し、クリームを製造した。本品は、伸びの良いクリームで、日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例２０】
【００８５】
＜練歯磨＞
第二リン酸カルシウム４５質量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５質量部、グリセリン２５質量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５質量部、実施例５の方法で得たシラップ状マルトヘキサオース及びマルトヘプタオース高含有糖質１５質量部、サッカリン０．０２質量部及び防腐剤０．０５質量部を水１３質量部と混合して練歯磨を得た。本品は、光沢、洗浄力も良好で、練歯磨として好適である。
【実施例２１】
【００８６】
＜肥料杭＞
配合肥料（Ｎ＝１４％、Ｐ２Ｏ５＝８％、Ｋ２Ｏ＝１２％）、プルラン、実施例３の方法で得たマルトヘキサオース及びマルトヘプタオース含有糖質、硫酸カルシウム及び水の割合を重量でそれぞれ７０、５、５、１５及び５として充分混合した後、押出機（Ｌ／Ｄ＝２０、圧縮比＝１．８、ダイスの口径＝３０ｍｍ）で８０℃に加熱して肥料杭を製造した。本品は、肥料用容器が不要で取扱い容易であり、全層施肥に適した強度を有し、更に配合割合を変えることにより肥料成分の溶出速度を調節できる。必要ならば、この肥料杭に植物ホルモン、農業用薬剤及び土壌改良剤等の混合も容易である。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
上記から明らかなように、本発明のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼは、至適温度、安定温度における温度が高く、また、至適ｐＨ、安定ｐＨにおけるｐＨ域が広く、更に産生微生物からの酵素生産量も高く、澱粉質からのマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース高含有糖質及びマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール高含有糖質の製造に有利に利用しうることが判明し、その工業的意義はきわめて大きい。
【００８８】
更に、このようにして製造されるマルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオース高含有糖質及び、それを水素添加して得られるマルトヘキサイトール及び／又はマルトヘプタイトール高含有糖質は、低甘味性の甘味剤として、またボディー付与剤、粘度調節剤、保湿剤、照付与剤などとして、さらには、栄養補給用剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に供しうることも大きな特徴である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼの酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】本発明のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼの酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】本発明のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼの安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明のマルトヘキサオース・マルトヘプタオース生成アミラーゼの安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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