(57)【要約】【課題】他の癌疾患では検出されない大腸癌特異的なマーカーを用いた、大腸細胞の癌化の有無を検定する方法を提供する。【解決手段】被検試料中の細胞における（ａ）陰イオン交換体に捕捉され、かつ（ｂ）分子量が約１２０００Ｄａであるタンパク質の発現の有無を判別する工程を含む、大腸細胞の癌化の有無の検定方法、および被検資料中の細胞におけるプロチモシンαの発現の有無を判別する工程を含む、大腸細胞の癌化の有無の検定方法。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の大腸細胞の癌化の有無を検定するための方法であって、下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有するタンパク質の被検試料中の細胞における発現の有無を判別する工程を含む、前記検定方法。
（ａ）陰イオン交換体に捕捉される。
（ｂ）分子量が約１２０００Ｄａである。
【請求項２】
前記発現の有無を判別する工程が、被検試料中の細胞の抽出液を陰イオン交換体と接触させる工程と、前記陰イオン交換体に捕捉されたタンパク質の質量を測定して分子量約１２０００Ｄａのタンパク質の有無を判別する工程とを含む、請求項１に記載の検定方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、プロチモシンαである、請求項１に記載の検定方法。
【請求項４】
被検試料中の大腸細胞の癌化の有無を検定するための方法であって、（ａ）プロチモシンαに親和性を有する物質を固相担体表面に固定すること、（ｂ）被検試料中の大腸細胞の抽出液を前記固定化された物質と接触させインキュベートすること、（ｃ）プロチモシンαの被検試料中の細胞における発現の有無を判別することを含む、前記検定方法。
【請求項５】
前記プロチモシンαに親和性を有する物質が抗プロチモシンα抗体である、請求項４に記載の検定方法。
【請求項６】
被検試料中の大腸細胞におけるプロチモシンαの発現の有無を判別することを含む、大腸癌診断方法。
【請求項７】
抗プロチモシンα抗体を試薬として含むことを特徴とする大腸癌診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検試料中の大腸細胞の癌化の有無を検定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
大腸癌の診断では、血中の腫瘍マーカーである癌胎児性抗原（以下「ＣＥＡ」という。）やＣＡ１９−９モノクローナル抗体が認識する糖鎖抗原である「ＣＡ１９−９」などが臨床の場で利用されているが、大腸癌患者のＣＥＡ陽性率は４０〜６０％、ＣＡ１９−９陽性率は３０〜５０％と報告され、検出感度が悪く、特に早期癌の検出率は低い。また、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９ともに大腸癌特異的なマーカーではなく、胃癌、膵癌、肺癌等、他の癌疾患患者の血液からも検出されるために、大腸癌マーカーとしての信頼性が低い。そのほかにも、ＣＹＦＲＡ２１−１（シフラ）、Ｓｉａｌｙｌ  ＬｅＸ、ＣＡ７２−４、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９などの腫瘍マーカー、ＤＣＣ、癌遺伝子ｓｒｃ、ＭＭＰ、Ｅ−カドヘリン、α−カテニンなどの分子マーカーが大腸癌と関連することが知られるが、いずれも陽性率が低く大腸癌特異的ではないことが問題であった。また、大腸癌を含む多くの癌細胞においてプロチモシンαのｍＲＮＡの発現量が増加することが報告されているが、一般にｍＲＮＡとタンパク質の発現量には必ずしも相関性があるとは言えないため、それぞれ発現解析が必要とされるところ、従来プロチモシンαタンパク質の癌細胞における発現に関する報告はなかった。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｙａｍｏｒｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：  ４０４２−９  （１９９９）
【発明が解決しようとする課題】
従来知られる腫瘍マーカーを複数組み合わせても、大腸癌の早期検出率は不十分であり、進行癌であっても全てのマーカーが陰性となることも少なくなかった。また、いくつかのマーカーが陽性であっても大腸癌ではなく他の臓器の癌に罹患していることもあり、擬陽性や擬陰性のない腫瘍マーカーの開発が切望されていた。即ち本発明の目的は、早期癌においても陽性率が高く大腸癌特異的な腫瘍マーカーを見出し、これを用いた大腸癌診断方法を提供すること、にある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、大腸癌細胞中にのみ高レベルに発現し、その他の癌細胞においてはほとんど発現が確認されない分子量１２０００Ｄａのタンパク質が存在すること、及びこれがプロチモシンαであることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、
［１］被検試料中の大腸細胞の癌化の有無を検定するための方法であって、下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有するタンパク質の被検試料中の細胞における発現の有無を判別する工程を含む、前記検定方法；
（ａ）陰イオン交換体に捕捉される；
（ｂ）分子量が約１２０００Ｄａである；
［２］前記発現の有無を判別する工程が、被検試料中の細胞の抽出液を陰イオン交換体と接触させる工程と、前記陰イオン交換体に捕捉されたタンパク質の質量を測定して分子量約１２０００Ｄａのタンパク質の有無を判別する工程とを含む、前記［１］に記載の検定方法；
［３］前記タンパク質が、プロチモシンαである、前記［１］に記載の検定方法；
［４］  被検試料中の大腸細胞の癌化の有無を検定するための方法であって、
（ａ）プロチモシンαに親和性を有する物質を固相担体表面に固定すること、（ｂ）被検試料中の大腸細胞の抽出液を前記固定化された物質と接触させインキュベートすること、（ｃ）プロチモシンαの被検試料中の細胞における発現の有無を判別することを含む、前記検定方法；
［５］  前記プロチモシンαに親和性を有する物質が抗プロチモシンα抗体である、前記［４］に記載の検定方法；
［６］  被検試料中の大腸細胞におけるプロチモシンαの発現の有無を判別する工程を含む、大腸癌診断方法；
［７］抗プロチモシンα抗体を試薬として含むことを特徴とする大腸癌診断用キット、に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に、本願明細書において記載する記号、用語等の意義、本発明の実施の形態等を示して、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
本発明にかかる大腸細胞の癌化の有無の検定方法は、被検試料中の大腸細胞における、（ａ）陰イオン交換体に捕捉され、かつ（ｂ）分子量が約１２０００Ｄａであるタンパク質の発現の有無を判別する工程を含む。大腸細胞は、大腸から分取することにより得られ、例えば外科的手術や内視鏡によって摘出することができる。該大腸細胞中における前記（ａ）および（ｂ）の特徴を有するタンパク質の有無は、自体公知またはそれに準じたタンパク質検出方法や測定方法に従って判別することができる。
被検細胞中における陰イオン交換体に捕捉されるタンパク質の有無は、例えば被検試料中の大腸細胞の抽出液を陰イオン交換体に接触させた後、適当な条件で洗浄し、該陰イオン交換体に結合したタンパク質の有無を検出することによって、判別することができる。陰イオン交換体とは、正の荷電基をもち、陰イオンを捕捉するイオン交換体をいい、その性状により強陰イオン交換体（例えば、Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｍｏｎｉｕｍ（Ｑ）、Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ（ＱＡＥ）等）、および弱陰イオン交換体（例えば、Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ（ＤＥＡＥ）等）に分けられる。本発明の検定方法においては、いずれの交換体でもよく、特に限定されないが、より好ましくは強陰イオン交換体に捕捉されるタンパク質の発現の有無を判別する。
被検細胞中における分子量１２０００Ｄａのタンパク質の有無は、例えば大腸細胞を破壊し、これを必要に応じて希釈し、各タンパク質を適宜分離し、分離されたタンパク質の分子量を測定することによって行うことができる。分子量の測定は、例えば、被検試料をゲル電気泳動にかけて標準物質の移動度と比較する方法や、各種の分離精製法、イオン化法、質量分析計を組み合わせる方法が用いられる。分離精製法としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。イオン化法としては、電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化法などが挙げられる。
質量分析計としては、二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計などが挙げられる。分子量約１２０００Ｄａとは各測定方法の誤差の範囲を考慮した値を意味し、本発明にかかる検定方法では、特に分子量が１１９７０Ｄａ＋／−０．２％のタンパク質の発現の有無を判別することが好ましい。
【０００７】
本発明における分子量約１２０００Ｄａのタンパク質の分析において、最も好ましい測定法として、陰イオン交換クロマトグラフィーと飛行時間型質量分析計を組み合わせて陰イオン交換体に捕捉されるすべてのタンパク質の質量を一括して測定する方法、飛行時間型質量分析計に使用するプローブの表面に陰イオン交換体を固定し、このプローブ表面と被検試料を接触させ、適当な条件で洗浄した後、該プローブ表面に捕捉されたタンパク質の質量を該飛行時間型質量分析計で測定する方法などが挙げられる。
【０００８】
また、本発明は、被検試料中の細胞におけるプロチモシンαの発現の有無を判別する工程を含む大腸細胞の癌化の有無の検定方法も包含する。本発明者らは、種々の臓器の癌細胞におけるプロチモシンαタンパク質の発現を測定して比較した結果、タンパク質レベルでは大腸癌細胞においてのみ発現が増加しており、他の臓器の癌細胞にはプロチモシンαタンパク質が発現していないことを見出した。
プロチモシンαの発現の有無は、通常のタンパク質の検出方法に従って行うことができ、例えば各種呈色反応や、プロチモシンαを認識する抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどが用いられる。具体的には、例えば（ａ）プロチモシンαに親和性を有する物質を固相担体表面に固定すること、（ｂ）被検試料中の大腸細胞の抽出液を前記固定化された物質と接触させインキュベートすること、（ｃ）プロチモシンαの被検試料中の細胞における発現の有無を判別すること、により行うことができる。
「プロチモシンαに親和性を有する物質」としては、プロチモシンαに特異的な親和性を持つものが好ましく、例えば抗プロチモシンα抗体、プロチモシンαの生理的リガンドまたはプロチモシンα受容体、プロチモシンαに親和性を有する化合物などが挙げられる。
プロチモシンαに親和性を有する物質を、ガラスプレート、ビーズ、グラスファイバー、テープ等の固相担体表面に固定し、被検試料を該固相担体表面に接触させ、固相担体表面に固定された物質に結合した物質を検出・定量することによって、プロチモシンαが被検試料中に存在するかどうかを確認することができる。
【０００９】
本発明にかかる大腸癌診断方法は、被検試料中の大腸細胞におけるプロチモシンαの発現の有無を判別する工程を含む。本願明細書において「診断」とは、治療効果の判定や再発のモニタリングも意味し、ある患者が大腸癌に罹患しているかどうかを判断することに限定されない。プロチモシンαの発現の有無の判別は既に述べた通常のタンパク質検出方法に従って行うことができる。
【００１０】
本発明にかかる大腸癌診断用キットは、プロチモシンαに親和性を有する物質を含む。好ましくは、前記親和性のある物質は固相担体表面に固定されており、これを被検試料と接触させ、適当な条件で洗浄することにより容易にプロチモシンαを該固相担体表面に捕捉することができる。
【００１１】
以下に示す本発明の実施例は例示的なものであり、本発明は以下の例に制限されるものではない。当業者はいかに示す実施例に様々な変更を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
［実施例１］  プロテインチップシステム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）を使用して、ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｐａｎｅｌ（非特許文献１）の８臓器、計３９株に由来する癌細胞における蛋白質の発現解析を行い、大腸癌細胞に特異的に発現している蛋白質を探索した。
（１）チップの選択
予備的な実験の結果、大腸癌細胞にのみ発現し、他の臓器の癌に発現していない約１２０００Ｄａの蛋白質の存在が示唆されたため、プロテインチップシステム用の６種類のチップ（陰イオン交換チップＳＡＸ−２、陽イオン交換チップＷＣＸ−２、金属修飾チップＩＭＡＣ３−ＮｉおよびＩＭＡＣ３−Ｃｕ、逆相チップＮＰ１、順相チップＨ４）を使用して、大腸癌の同一細胞に由来するサンプルを測定した。結果を図１に示す。約１２０００Ｄａの蛋白質のピークは、強陰イオン交換チップであるＳＡＸ−２を用いた場合にのみ見られたため、以降の実験では本チップを用いることとした。
（２）様々な細胞を用いた発現プロファイリング比較
８臓器、計３９株に由来する癌細胞における蛋白質の発現解析を、陰イオン交換チップＳＡＸ−２を用いてプロテインチップシステムにより測定した。サンプルとして、各細胞の抽出液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）で３倍に希釈して用いた。Ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８）とし、これでチップを洗浄後、サンプル５０μＬを加えて２０分反応させ、Ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで再び５分×３回洗浄し、さらに純水で２回洗浄した。これにより、チップ表面には陰イオン交換体に親和性を有する蛋白質のみが捕捉されることとなる。乾燥後、マトリックスとしてシナピン酸を加え、測定した。結果を図２に示す。４種類の株に由来する大腸癌細胞では、そのすべてにおいて約１２０００Ｄａの蛋白質が発現していたが、他の癌細胞にはこのピークは見られず、この蛋白質が大腸癌細胞に特異的に発現していることが確認された。このピークの分子量は１１９７０Ｄａ（＋／−０．２％）であった。
（３）大腸癌細胞特定的発現タンパク質の精製・同定
まず、大腸癌細胞（ＫＭ−１２）および肺癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ２２６）抽出液をＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣｏｌｕｍｎおよびＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃｏｌｕｍｎを用いて精製した。
Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃｏｌｕｍｎでは、細胞抽出液を０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液で５倍に希釈してサンプルとし、Ｃｏｌｕｍに０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）溶液、１．６Ｍ  Ｕｒｅａ、０．４％  ＣＨＡＰＳを充填して、このサンプル２ｍｌをＣｏｌｕｍｎに流した。０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）溶液に、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭのＮａＣｌをそれぞれ加えたものを溶出液として、各フラクションをプロテインチップシステムにて測定した。大腸癌細胞の結果の図３に示す。目的のピークが含まれるフラクションは、３００ｍＭ  ＮａＣｌによって溶出したフラクションであった。
３００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出したフラクションを２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  （ｐＨ７）に置換し、５０倍濃縮した。これをさらに３．４Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４で２倍に希釈し、Ｐｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃｏｌｕｍｎでさらに精製した。Ｃｏｌｕｍｎに１．７Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４／２０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  （ｐＨ７）を充填し、サンプル８０μｌを流し、各フラクションをプロテインチップシステムにて測定した。大腸癌細胞の結果を図４に示す。目的のピークが含まれるフラクションはＦｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈフラクションであった。図５に大腸癌細胞と肺癌細胞のそれぞれのフラクションの測定結果の比較を示す。約１２０００Ｄａのピークは大腸癌細胞に大きく出現し、肺癌細胞サンプルではほとんど検出されない。
【００１２】
次に、Ｐｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣｏｌｕｍｎのＦｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈフラクションを１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅで染色した。結果を図６に示す。純水で洗浄後、目的の１２０００Ｄａのタンパク質のバンドをパスツールピペットを用いて分離した。公知の方法に従って、このバンドに含まれるタンパク質をゲル内トリプシン消化した後、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍにより測定した。結果を図７に示す。
この結果を用いて、データベース（Ｍａｓｃｏｔ）検索によりペプチドマッピングをした。結果を図８に示す。
また、上述のバンドに含まれるタンパク質を公知の方法に従ってゲル内Ｖ８プロテアーゼ消化した後、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  ＴａｎｄｅｍＭＳ  （ＱＳＴＡＲ）  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  （Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）を搭載したＡＰＩ  ＱＳＴＡＲ  Ｐｕｌｓａｒ  ｉ  （ＡＢＩ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ）を使用して測定した。シングルＭＳモードで測定した結果を図９に示し、これを用いてデータベース（Ｍａｓｃｏｔ）検索によりペプチドマッピングをした結果を図１０に示す。また、タンデムＭＳモードで測定した結果を図１１に示し、この結果を用いて配列解析をした結果を図１２に示す。
【００１３】
以上の結果から、大腸癌細胞に特異的に発現していた分子量約１２０００Ｄａのタンパク質はプロチモシンαと同定された。
【００１４】
【発明の効果】
本発明により、大腸細胞の癌化の有無を検定する方法を提供することができた。かかる方法を用いることにより、大腸細胞の癌化を選択的に検定することができ、大腸癌の診断、治療効果の判定、再発のモニタリング等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種のチップを用いた大腸癌由来細胞のタンパク質発現解析の結果を示す。
【図２】８臓器、３９株に由来する癌細胞を用いたタンパク質の発現解析の結果を示す。
【図３】大腸癌細胞抽出液をＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃｏｌｕｍｎで精製した溶出フラクションをプロテインチップシステムで測定した結果を示す。
【図４】Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃｏｌｕｍｎ精製後、さらにＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃｏｌｕｍｎで精製し、プロテインチップシステムで測定した結果を示す。
【図５】大腸癌細胞および肺癌細胞抽出液をＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣｏｌｕｍｎおよびＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃｏｌｕｍｎで精製しプロテインチップシステムで測定した結果の比較を示す。
【図６】大腸癌細胞抽出液をＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃｏｌｕｍｎで精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示す。
【図７】１２０００Ｄａタンパク質をゲル内トリプシン消化し、プロテインチップシステムにより測定した結果を示す。
【図８】ゲル内トリプシン消化解析の結果を用いてデータベース（Ｍａｓｃｏｔ）検索によるペプチドマッピングをした結果を示す。
【図９】１２０００Ｄａタンパク質のゲル内Ｖ８プロテアーゼ消化断片を質量分析計（シングルＭＳモード）により測定した結果を示す。
【図１０】シングルＭＳによる測定結果を用いて、データベース（Ｍａｓｃｏｔ）検索によるペプチドマッピングをした結果を示す。
【図１１】１２０００Ｄａタンパク質のゲル内Ｖ８プロテアーゼ消化断片解析を質量分析計（タンデムＭＳモード）で測定した結果を示す。
【図１２】タンデムＭＳによる測定結果を用いてデータベース（Ｍａｓｃｏｔ）検索による配列解析をした結果を示す。
【符号の説明】
１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004254571.tif 000009
【図８】
2004254571.tif 000010
【図９】
2004254571.tif 000011
【図１０】
2004254571.tif 000012
【図１１】
2004254571.tif 000013
【図１２】
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