(57)【要約】【課題】ＤＮＡを基板上に効果的に固定化でき、ＤＮＡの固定化量を向上させたＤＮＡマイクロアレイを得る。【解決手段】本発明のＤＮＡマイクロアレイは、基板上に数千〜数万個の遺伝子を高密度に、且つ既知のＤＮＡ液または検体を一定量滴下して形成するもので、  基板上にナノチューブ１２の一方の端面１３を固定化させたものである。また、このナノチューブの両端の外周面には、反応活性基としてアミノ基を有する直鎖状のアルキルジアミン化合物１４を固定化させたものである。また、ナノチューブの他方端の外周面に反応活性基がチオール基および直鎖状のチオール化合物を固定化させてもよいし、また、ナノチューブの外周面に、ジビニルベンゼンまたはＮ，Ｎ−メチレンビスの架橋剤を結合させ、ナノチューブの集合体を形成してもよい。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に数千〜数万個の遺伝子を高密度に、且つ既知のＤＮＡ液または検体を一定量滴下して形成するＤＮＡマイクロアレイにおいて、
前記基板上にナノチューブの一方の端面を固定化させたことを特徴とするＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２】
前記ナノチューブの両端の外周面に反応活性基としてアミノ基（−ＮＨ２）を有する直鎖状のアルキルジアミン化合物を固定化させたことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３】
前記ナノチューブの一方端の外周面に反応活性基としてアミノ基（−ＮＨ２）を有する直鎖状のアルキルジアミン化合物を固定化させ、前記ナノチューブの他方端の外周面に反応活性基がチオール基（−ＳＨ）およびアミノ基（−ＮＨ２）である直鎖状のチオール化合物を固定化させたことを特徴とする請求項１記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項４】
前記ナノチューブの外周面に、ジビニルベンゼンまたはＮ，Ｎ−メチレンビス（アクリルアミド）などの架橋剤を結合させ、ナノチューブの集合体を形成したことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的試料中の核酸を検出するために使用されるＤＮＡマイクロアレイに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡマイクロアレイは、スライドガラスなどの基板に、異なる種類の遺伝子やＤＮＡ断片を整列して配置したものであり、遺伝子の発現解析や多型解析を飛躍的に加速させる手段として有用である。
ＤＮＡマイクロアレイを作製するには、基板表面で直接ＤＮＡを合成する方法と、予め調整したＤＮＡ断片を基板表面に固定する方法などがある。前者の方法は、光照射で選択的に除去される保護基を使用し、フォトリソグラフィー技術により高密度に多種類のＤＮＡ断片を別々に固定する方法である（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Ｆｏｄｏｒ，  Ｓ．Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，  （１９９１）    （第７６７―７７３頁）
【０００４】
また、後者の方法は、ＤＮＡマイクロアレイ作製装置に備えられたスポッティング装置を用いて、予め合成されたＤＮＡやＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）で調整されたＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物）をアミノシランやポリ−Ｌ−リシンでコーティングされたスライドガラス上（担体）に滴下して表面官能基と共有結合あるいは非共有結合（静電結合）させるもので、例えば、非共有結合させる方法（非特許文献２参照）や、共有結合させる方法（非特許文献３参照）がある。
【０００５】
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７０巻、（１９９５）  （第４６７―４７０頁）
【非特許文献３】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２２巻、（１９９４）  （第５４５６―５４６５頁）
【０００６】
後者の中、ＤＮＡマイクロアレイの代表的な作製工程および核酸検出工程について記載されたものがある（特許文献１参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１２２６１０号公報（第４―６頁、第１図）
【０００８】
この工程を図５により説明する。図５において、１はゲノムやｃＤＮＡなどの配列が登録されているデータベースで、２はクーロンコレクションである。
先ず、データベース１とクーロンコレクション２からＰＣＲ法による増幅あるいは化学合成により既知ＤＮＡ断片３を調整する。そして、既知ＤＮＡ断片３を水溶液に、増粘剤ともに分散、溶解させる。その増粘させたＤＮＡ断片溶液をポリ陽イオンがコーティングされたスライドガラス４上に、スポット装置を用いて点着し、次いで増粘剤を水洗除去することにより、ＤＮＡ断片３が固定化されたＤＮＡマイクロアレイ５が得られる。
一方、血液や組織などの検体６からｍＲＮＡやゲノムＤＮＡ７を抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡやターゲットＤＮＡ８を生成する。これを蛍光分子９により標識することで、ターゲットＤＮＡ８を得ている。ターゲットＤＮＡ８は、ＤＮＡマイクロアレイ５上のＤＮＡ断片３とターゲットＤＮＡ８とのハイブリダイゼーション（反応）を行う。ハイブリダイゼーションによって二本鎖が形成されたＤＮＡ分析用マイクロアレイ１０について、イメージスキャナー装置を用いて各スポットの蛍光強度を測定し、画像データ１１が得られる。
上記のようなＤＮＡマイクロアレイで得られたデータから、ターゲットＤＮＡの塩基配列を決定したり、遺伝子発現プロファイルを作成することができる。
また、データ解析ソフトや外部データベースを利用することにより、遺伝子の変異や多型などの煩雑なデータ解析を行うことができる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記従来のＤＮＡマイクロアレイにおいては、ハイブリダイゼーションの反応過程や、その後の洗浄工程で、相当数のＤＮＡが基板から剥離したり、ＤＮＡがポリ陽イオンの膜中に潜りこんだりする。
また、スポッティング装置を用いて、単位面積当たりの基板に多種類のＤＮＡ断片を整列配置させる場合、一つのスポット領域に滴下されるＤＮＡ溶液の量が極めて微量となり、ＤＮＡ溶液が担体表面に拡散する前に乾燥し、不均一なスポット領域が形成される恐れがある。
したがって、本発明の目的は、ＤＮＡを基板上に効果的に固定化できるとともに、ＤＮＡの固定化量を向上させることができるＤＮＡマイクロアレイを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記問題を解決するため、本発明は次のように構成したものである。
請求項１に記載の発明は、基板上に数千〜数万個の遺伝子を高密度に、且つ既知のＤＮＡ液または検体を一定量滴下して形成するＤＮＡマイクロアレイにおいて、前記基板上にナノチューブの一方の端面を固定化させたものである。
このようになっているため、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸をスライドガラスなどの基板に対して高密度に固定化することができる。
請求項２に記載の発明は、前記ナノチューブの両端の外周面に反応活性基としてアミノ基（−ＮＨ２）を有する直鎖状のアルキルジアミン化合物を固定化させたものである。
このようになっているため、基板表面の水酸基（−ＯＨ）とナノチューブの端面のアミノ基（−ＮＨ２）とが化学反応して結合し、ナノチューブを基板上に固定化できできるとともに、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸をナノチューブにも強く結合させることができるので、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸が基板上から剥離することを防止できる。
請求項３に記載の発明は、前記ナノチューブの一方端の外周面に反応活性基としてアミノ基（−ＮＨ２）を有する直鎖状のアルキルジアミン化合物を固定化させ、前記ナノチューブの他方端の外周面に反応活性基がチオール基（−ＳＨ）およびアミノ基（−ＮＨ２）である直鎖状のチオール化合物を固定化させたものである。
このようになっているため、チオール化合物によりＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を金薄膜がコーティングされたスライドガラスや電気化学測定用の金電極上にも固定化することができる。
請求項４に記載の発明は、前記ナノチューブの外周面に、ジビニルベンゼンまたはＮ，Ｎ−メチレンビス（アクリルアミド）などの架橋剤を結合させ、ナノチューブの集合体を形成したものである。
このようになっているため、ナノチューブをハニカム状にすることにより、より強固に固定化できるので、溶液中に浸漬してもナノチューブ同士が乖離することを防ぐことができる。また、ナノチューブの端面の表面積を大きくすることができるので、ＤＮＡ断片の固定化量が増加し、より一層感度が向上する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施形態を図に基づいて説明する。
（第１の実施形態）
図１は、本発明の第１の実施形態を示すＤＮＡマイクロアレイの平面図、図２は、図１におけるナノチューブの詳細を示す模式図である。図において、４は基板であるスライドガラス、１２はナノチューブ、１４はアルキルジアミン化合物である。
ＤＮＡマイクロアレイの作製方法について述べる。
（１）カーボンナノチューブを合成する。
合成方法は、アーク放電法、レーザアブレーション法、プラズマ合成法、炭化水素触媒分解法などを用いる。これらの方法によりカーボンナノチューブを合成すると、ナノチューブの端面１３は閉じた状態となる。そこで、ナノチューブの端面１３を開いた状態にし、端面１３の反応性を高めるために強酸中で超音波処理する。この処理により、端面１３は、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）で修飾された構造になる。
次に、端面を処理されたそに両末端の反応活性基にアミノ基（−ＮＨ２）を有する直鎖状のアルキルジアミン化合物１４を反応させる。そうすると、以下の反応スキーム（１）に従ってナノチューブ１２が合成される。
【００１２】
【数１】
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【００１３】
（２）スライドガラス４上に円筒状のナノチューブ１２を垂直に固定化する。
先ず、長さが１μｍと極端に短いナノチューブを、エタノール、アセトン、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解させる。つぎに、図示しないスポッティング装置により、ナノチューブ１２をスライドガラス４の基板上に点着させる。そうすると、スライドガラス４上に表面の水酸基（−ＯＨ）とナノチューブ１２の端面１３に修飾されたアルキルジアミン化合物１４のアミノ基（−ＮＨ２）が化学反応する。これにより、基板上にナノチューブ１２を垂直に固定化させることができる。
（３）次に、合成されたＰＣＲ法による増幅あるいは化学合成されたＤＮＡ断片３を同様に図示しないスポッティング装置によりスライドガラス４上の水酸基（−ＯＨ）とナノチューブ１２の端面１３に修飾されたアルキルジアミン化合物１４のアミノ基（−ＮＨ２）とが化学反応することにより、ＳＳＣ（塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム）やＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ    Ｄｏｄｅｃｙｌ    Ｓｕｌｆａｔｅ）などの洗浄液で洗浄した後でもＤＮＡ断片３がスライドガラス４の基板上から剥離することを防止できる。
【００１４】
（第２の実施形態）
図３は、本発明の第２の実施形態を示すナノチューブの模式図である。図において、１５はチオール化合物である。本実施形態のＤＮＡマイクロアレイは、電気化学測定およびＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）センサーなどによるリアルタイム計測用のセンサーチップを作製することである。
ナノチューブ１２の片方の端面１３に、反応活性基がアミノを有するアルキルジアミン化合物１４を化学修飾し、もう片方の端面に、両端の反応活性基がチオール基およびアミノ基であるチオール化合物１５を化学修飾している。
この実施の形態によれば、図示していないスポッティング装置により両端面を化学修飾されたナノチューブの水溶液を、スライドガラスの表面にクロム（Ｃｒ）やチタン（Ｔｉ）を介してコーティングされた金（Ａｕ）薄膜や金電極上に点着すると、金表面とナノチューブ１２に修飾されたチオール化合物１５のチオ−ル基（−ＳＨ）とが化学反応して結合し、金薄膜や金電極上に容易に固定化できる。
尚、薄膜を形成する金属として、銀、銅、白金なども用いることができるが、金を用いることが好ましい。
例えば、金薄膜の裏面から任意の角度で６００〜８００ｎｍのレーザやＬＥＤを入射させ、全反射してきた光の角度を高感度ＣＣＤカメラで測定し、血液や組織などの検体６から抽出されたターゲットＤＮＡやｃＤＮＡ８の溶液を図示しないマイクロポンプを用いて送液してハイブリダイゼーション（反応）を行わせた後、ＳＳＣ（塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム）やＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ    Ｄｏｄｅｃｙｌ    Ｓｕｌｆａｔｅ）などの洗浄液を流して未反応のターゲットＤＮＡやｃＤＮＡ８を洗い流した後、再度、金薄膜の裏面からレーザやＬＥＤを入射して全反射してきた光の角度の測定して、その角度のシフト値から遺伝子発現の量（各ＤＮＡ断片にハイブリしたｃＤＮＡやターゲットＤＮＡの量）を算出することができる。
また、金電極上にＤＮＡ断片３を固定化した後、血液や組織などの検体６から抽出されたターゲットＤＮＡやｃＤＮＡ８のリン酸にレドックス化合物（酸化・還元を行う化合物）を導入し、ＤＮＡ断片上に滴下してハイブリダイゼーションを行った後、その金電極をフェロシアン化カリウムなどの緩衝液に浸漬し、金電極と対極との間に一定の電圧を印加すると、金電極にはレドックス化合物の酸化・還元反応に比例した電流が流れるので、その電流値を計測することにより、同様に遺伝子発現の量（各ＤＮＡ断片にハイブリしたｃＤＮＡやターゲットＤＮＡの量）を算出することができる。
（第３の実施形態）
図４は、本発明の第３の実施形態を示すナノチューブの模式図である。図において、１６は架橋剤、１７はナノチューブ集合体である。
有機溶媒に溶解したナノチューブ１２の外周面にジビニルベンゼンやＮ，Ｎ−メチレンビス（アクリルアミド）などの架橋剤１６を結合させることにより、ナノチューブ集合体１７が形成される。
この実施の形態によれば、ナノチューブ１２を架橋剤１６によりハニカム状に固定化させることで、ナノチューブ１２を垂直に、且つより強固にスライドガラス４上に固定化できるとともに、ナノチューブ１２の端面の表面積を大きくすることができるので、ＤＮＡ断片３の固定化量が増加し、それに応じて血液や組織などの検体６から抽出されたターゲットＤＮＡやｃＤＮＡ８との反応する量も増すため、そのターゲットＤＮＡやｃＤＮＡ８に導入されたＣｙ−３、Ｃｙ−５などの蛍光分子から検出される蛍光強度が増大し、更なる感度向上が期待できる。
【００１５】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によればつぎの効果がある。
請求項１記載のＤＮＡマイクロアレイによれば、基板上に数千〜数万個の遺伝子を高密度に、且つ既知のＤＮＡ液または検体を一定量滴下して形成するＤＮＡマイクロアレイ５において、基板上にナノチューブの一方の端面を固定化させたので、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸をスライドガラスなどの基板に対して高密度に固定化することができる。
請求項２記載のＤＮＡマイクロアレイによれば、ナノチューブの両端の外周面に反応活性基としてアミノ基（−ＮＨ２）を有する直鎖状のアルキルジアミン化合物を固定化させたので、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸をナノチューブにも強く結合させることができ、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸が基板上から剥離することを防止できる。
請求項３記載のＤＮＡマイクロアレイによれば、ナノチューブの一方端の外周面に反応活性基としてアミノ基（−ＮＨ２）を有する直鎖状のアルキルジアミン化合物を固定化させ、ナノチューブの他方端の外周面に反応活性基がチオール基（−ＳＨ）およびアミノ基（−ＮＨ２）である直鎖状のチオール化合物を固定化させたので、チオール化合物によりＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を金薄膜がコーティングされたスライドガラスや電気化学測定用の金電極上に固定化することができる。
請求項４記載のＤＮＡマイクロアレイによれば、ナノチューブの外周面に、ジビニルベンゼンまたはＮ，Ｎ−メチレンビスなどの架橋剤を結合させ、ナノチューブの集合体を形成したので、ナノチューブをより強固に固定化でき、溶液中に浸漬してもナノチューブ同士の乖離を防ぐことができる。また、ナノチューブの端面の表面積を大きくできるので、ＤＮＡ断片の固定化量が増加し、更に感度向上ができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施形態を示すＤＮＡマイクロアレイの平面図である。
【図２】図１におけるナノチューブの構造を示す模式図である。
【図３】本発明の第２の実施形態を示すナノチューブの模式図である。
【図４】本発明の第３の実施形態を示すナノチューブ集合体の模式図である。
【図５】従来のＤＮＡマイクロアレイの作製方法を示すフロー図である。
【符号の説明】
１    データベース
２    クーロンコレクション
３    ＤＮＡ断片
４    基板（スライドガラス）
５    ＤＮＡマイクロアレイ
６    検体
７    Ｍｒｎａ・ゲノムＤＮＡ
８    ｃＤＮＡ・ターゲットＤＮＡ
９    蛍光分子
１０    ＤＮＡ分析用マイクロアレイ
１１    画像データ
１２  ナノチューブ
１３  ナノチューブの端面
１４  アルキルジアミン化合物
１５  チオール化合物
１６  架橋剤
１７  ナノチューブ集合体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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