(57)【要約】【課題】活性が高く、安定な酵素活性を有し、さらに、バイオリアクターとして用いる場合に速い流速が得られる固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼを提供すること。【解決手段】Ｌ−ラムノースイソメラーゼを菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿あるいは精製結晶化した後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドを添加し、これにより共有結合の架橋を起こさせ、さらにリジンを添加することで架橋密度をあげて強度を増すことを特徴とするＬ−ラムノースイソメラーゼの固定化法。前記の方法で得られた、バイオリアクターを構築した場合の送液圧力が低く、安定で長期間連続使用可能な形態にした固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼ。前記の固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼのＤ−アロースの連続製造方法への使用。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−ラムノースイソメラーゼの固定化法であって、Ｌ−ラムノースイソメラーゼを結晶化したものを固定化することを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｌ−ラムノースイソメラーゼをポリエチレングリコールを用いて結晶化させる請求項１のＬ−ラムノースイソメラーゼの固定化法。
【請求項３】
Ｌ−ラムノースイソメラーゼの結晶をまず分子内架橋させ、ある程度分子内架橋が進行した段階で、Ｌ−ラムノースイソメラーゼ同士を分子間架橋させる請求項１または２のＬ−ラムノースイソメラーゼの固定化法。
【請求項４】
Ｌ−ラムノースイソメラーゼを菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿あるいは結晶化した後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドを添加し、これにより共有結合の架橋を起こさせ、さらにリジンを添加することで架橋密度をあげて強度を増すことを特徴とするＬ−ラムノースイソメラーゼの固定化法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかの方法で得られた、バイオリアクターを構築した場合の送液時の圧力が低く、安定で長期間連続使用可能な形態にした固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼ。
【請求項６】
請求項６の固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼのＤ−アロースの連続製造方法への使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業の属する技術分野】
本発明は、Ｄ−アロースという希少糖研究の中で、特に各種生理活性を有することが判明してきた希少糖を製造する場合に使用するバイオリアクターを作るのに利用するＬ−ラムノースイソメラーゼの固定化法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−プシコース等のＤ−アロースへの変換に関する酵素反応法による本発明者らによるこれまでの製造法は、商業的生産には完全に満足できるものではなく、今までのところ、固定化系による系は安定性（活性維持）の点で連続生産には耐えられないという問題があった。
従って、産業的に希少糖を大量に生産するには、安定な、高活性の固定化法に関して、改良する必要性が残っている（特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００２−１７３９２号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らのＤ−アロースという希少糖研究の中での従来例の特徴と問題点は、従来は固定化にイオン交換法を用いており活性が安定ではなく数週間で活性が低下するという問題点を持っていた。
本発明の目的は、こうした基質をＤ−アロースに変換することに関する従来技術の不利な点を克服することであり、安定な、高活性の固定化法を開発し、産業的に希少糖を大量に生産することを実現しようとするものである。本発明の技術はバイオ産業の分野に属するもので、希少糖をバイオテクノロジーを用いて生産する技術の中で、バイオリアクターとして安定なものを作ることは基本的に重要な解決課題である。本発明は、安定な、高活性の固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼを提供することにより、この課題を解決して希少糖Ｄ−アロースを生産できる基盤を作ろうとするものである。
本発明の目的は、低い流れ抵抗を有し、充填されたカラムを通る基質溶液の流速が速い固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｌ−ラムノースイソメラーゼの固定化法であって、Ｌ−ラムノースイソメラーゼを結晶化したものを、好ましくはポリエチレングリコールを用いて結晶化したものを固定化することを特徴とする方法を要旨とする。
【０００６】
また、本発明は、Ｌ−ラムノースイソメラーゼの固定化法であって、Ｌ−ラムノースイソメラーゼを結晶化したものを、好ましくはポリエチレングリコールを用いて結晶化したものを、まず分子内架橋させ、ある程度分子内架橋が進行した段階で、Ｌ−ラムノースイソメラーゼ同士を分子間架橋させて固定化することを特徴とする方法を要旨とする。
【０００７】
本発明は、Ｌ−ラムノースイソメラーゼを菌体から抽出したものを用いる場合は沈殿させた後に、菌体そのものを用いる場合はそのまま、グルタルアルデヒドを添加し、これにより共有結合の架橋を起こさせ、さらにリジンを添加することで架橋密度をあげて強度を増すことを特徴とするＬ−ラムノースイソメラーゼの固定化法を要旨とする。
【０００８】
また、本発明は上記のいずれかの方法で得られた、バイオリアクターを構築した場合の送液時の圧力が低く、安定で長期間連続使用可能な形態にした固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼを要旨とする。
【０００９】
また、本発明は、上記の固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼのＤ−アロースの連続製造方法への使用を要旨とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の固定化の対象とするＬ−ラムノースイソメラーゼは、「ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」第８５巻、５３９乃至５４１頁（１９９８年）で発表された公知酵素である。Ｌ−ラムノースからＬ−ラムニュロースへの異性化反応ならびにＬ−ラムニュロースからＬ−ラムノースへの異性化を触媒する酵素である。Ｌ−ラムノースイソメラーゼは、Ｄ−アロースとＤ−プシコースの間の異性化にも作用するので、Ｄ−プシコースからＤ−アロースを生産することができる酵素である。
Ｌ−ラムノースイソメラーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ  由来の酵素を好ましいものとして例示できるが、その由来、起源を問わず、天然であろうと遺伝子組換え型であろうと、何れの酵素も利用できる。上記のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉｉに属する菌株  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ  ＬＬ１７２ａ  は、上記文献に記載された公知菌であり、香川大学農学部生物資源食糧化学科の何森健研究室に保存されている。財団法人発酵研究所から同一のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ  は得られる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ  ＩＦＯ  ３７７３，  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉｉ  ＩＦＯ  １３５９６  が同一の活性を持っていると思われる。Ｌ−ラムノースイソメラーゼは各種の微生物から容易に入手が可能であり、Ｌ−ラムノースが存在する培養条件の時に、誘導的に生産される。通常、Ｌ−ラムノースイソメラーゼ産生能を有する微生物を培養して得ることができる。
例えば、Ｌ−ラムノースイソメラーゼは各種の微生物をＬ−ラムノースを炭素源として培養すると、Ｌ−ラムノースが誘導剤となって菌体内に生産される。酵素を大量に構成的に産生する変異株を用いることは、Ｌ−ラムノースなどの高価な炭素源を必要としないので特に有利である。
【００１１】
得られた培養菌体からＬ−ラムノースイソメラーゼを抽出したもの、または菌体そのものを用いる。Ｌ−ラムノースイソメラーゼは、使用目的に応じて、必ずしも高純度に精製されたものでなくてもよく、粗酵素であっても用いることができる。粗酵素の具体的例としては、上記のＬ−ラムノースイソメラーゼ産生能を有する微生物自体を、また、その培養物や部分精製した培養物を用いることができる。
本発明では特定の固定化法による固定化酵素または固定化菌体の形態で用いることにより、送液圧力が低く安定で長期間連続使用可能なリアクターを構築することができる。
【００１２】
本発明の特定の固定化法について、従来法と対比しながら説明する。
Ｌ−ラムノースイソメラーゼの固定化法について、従来のイオン結合法を用いた固定化法では十分な活性を保ったままの固定化酵素を得ることができない。イオン結合法によると、固定化による活性収率が１０％以下である。十分な活性を得るためには大量の酵素を用意する必要があるが、精製酵素は価格の点で現実的ではなく、粗酵素を用いる場合は、酵素以外の蛋白質も大量に固定化されるため高活性が得られない。
【００１３】
そこで、定法の架橋法の適用が考えられるが、酵素を結晶化させずリジンを用いない定法の架橋法では活性収率が低く均一な固定化酵素の粒子が得られない。
安定で均一な粒子を得るための至適化が必要である。まず、架橋に用いる酵素は溶液の状態で架橋すると固まりになって沈殿するので、酵素をＰＥＧ２００００で結晶化させる。均一な結晶を得るためにＰＥＧ２００００溶液を徐々に加えて静置する（最終濃度４−５．５％）。得られた結晶を分子内架橋させると安定な固定化酵素は得られるが、バイオリアクターを構築すると固定化酵素の大きさが小さいため送液に高い圧力が必要である。
【００１４】
本発明では、安定なバイオリアクターを構築するべく、さらに粒子を大きくすることとした。そこで、ある程度分子内架橋が進行した段階でリジン溶液を添加し、架橋試薬で酵素同士を分子間架橋させ、高活性であり、送液圧力が低く安定で長期間連続使用可能な形態に不溶化した固定化酵素を得た。固定化菌体についても同様に得られた。
【００１５】
高活性であり、送液圧力が低く安定で長期間連続使用可能なバイオリアクターの構築について説明する。Ｌ−ラムノースイソメラーゼおよび／または菌体の固定化粒子を用いてバイオリアクターを構築する。Ｄ−アロースに変換可能な基質であるＤ−プシコースを含む溶液を通液する。前記基質の一部をＤ−アロースに変換するために、前記基質を含む溶液と固定化粒子を前記基質をＤ−アロースに変換するのに適当な条件下で、例えば反応時は４２℃と温度をコントロールした条件下で接触させる。通液後の前記基質の約３０％をＤ−アロースに変換した溶液からＤ−アロースのアルコールに難溶性の性質を利用してＤ−アロースを結晶化させる。結晶化後、Ｄ−アロース結晶を分離回収し、そのろ液に基質を追加した後、アルコール除去、濃縮することなしにバイオリアクターに再添加する。高純度Ｄ−アロースを連続的に製造することができるバイオリアクターを構築できる。
【００１６】
本発明の固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼおよび／または菌体は、低い流れ抵抗を有し、充填されたカラムを通る基質溶液の流速が速い前記カラムのバイオリアクターを用いて、Ｄ−アロースを連続的に製造することができる。送液圧力が低いためかなり高い供給速度で溶液を供給することができるし、安定であるため長期間連続使用が可能である。Ｄ−アロースを連続的に製造することができることは、本発明の固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼの顕著な効果である。
【００１７】
【作用】
ある程度分子内架橋が進行した段階でリジン溶液を添加し分子間架橋させることにより、バイオリアクターを構築した場合に流速が速く、安定で長期間連続使用可能な固定化酵素となる。
すなわち、上記の方法で得られる固定化酵素は、
（１）ＰＥＧ２００００を用いた結晶化による部分精製と架橋試薬による架橋を同時に進行させるため、簡単で高い活性の固定化酵素が得られる。イオン結合法では高い活性で、安定な固定化酵素が得られない。
（２）イオン結合法に比べコストが非常に安い。イオン結合法では￥１５，０００／ｒｅａｃｔｏｒに対し、架橋法では￥３，０００／ｒｅａｃｔｏｒ程度のコストである。
（３）一般には架橋法は過激な固定化条件を必要とするが、本発明が採用する特定の固定化法は架橋法の中では酵素活性の損失が少ない、すなわち７０％維持できるという利点がある。これはイオン結合法（１０％の活性を固定化）と比較して大である。
（４）速い流速が得られるという利点がある。
（５）ｐＨの変化がない。この点はイオン結合法より優れる。
（６）高い温度で使用できる。この点はイオン結合法より優れる。
（７）長期間の使用が可能で粒子が崩れたり酵素が脱離することがない。この点はイオン結合法より優れる。
（８）固定化菌体を用いた場合でも安定に反応する。この点はイオン結合法では不可能である。
【００１８】
【実施例】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００１９】
参考例
（従来の固定化酵素の作製例）
Ｉ  従来の固定化（イオン結合法）
（１）菌体２００ｇを破砕し粗酵素液を得る。
（２）１Ｍ塩化マンガンを全量の１％添加した後３０分間撹拌する。
（３）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を終濃度１０％になるように徐々に加え撹拌する。
（４）生じた沈殿を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃、３０ｍｉｎ）により除去し、さらに終濃度が２０％になるようにＰＥＧを徐々に添加する。
（５）生じた沈殿を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４℃、３０ｍｉｎ）により回収後、０．０５Ｍグリシン‐ＮａＯＨ緩衝液に懸濁して部分精製酵素を得る。
（６）１００ｇの陰イオン交換樹脂キトパールＢＣＷ２５０３（富士紡績社製）を０．０５Ｍグリシン‐ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９）で洗浄した後、同緩衝液中で一晩浸し平衡化する。
（７）緩衝液を除き樹脂に部分精製酵素を加え、室温で固定化する。随時サンプリングを行い、上清のタンパク量の減少を確認し、固定化を確認する。
以上の条件で活性回収率は約８０％が得られる。
【００２０】
ＩＩ  従来の固定化酵素の評価
一般的なイオン交換法による酵素の固定化は、活性の最大で約８０％を固定化できる。しかし、このイオン交換法をＬ−ラムノースイソメラーゼに用いると活性の約１０％しか固定化できないという大きな問題があった。しかも、固定化酵素を用いたＤ−アロースの生産活性は約２週間のバイオリアクターの反応で活性はほぼ０となりＤ−アロースの連続生産には使用できない。
従来のイオン交換法による酵素の固定化は、固定化できる活性が低いこと、及びバイオリアクターとして連続運転することが不可能であった。
【００２１】
実施例
（本発明の固定化酵素の作製例）
Ｉ  新規の固定化（グルタルアルデヒド−リジン架橋法）
（Ａ）  酵素結晶の固定化
（１）菌体１０ｇを破砕し粗酵素液を得る。
（２）４−５．５％のＰＥＧ２００００を撹拌しながら徐々に添加し酵素の均一な結晶が得られるまで静置する（２４−４８時間）。
（３）結晶を生じた粗酵素液に１２．５％グルタルアルデヒドを撹拌しながら、終濃度１％になるように添加し３０分間撹拌した後、３時間以上放置する。
（４）２０％Ｌ−リジンを終濃度１％になるように添加し３０分間撹拌し、３時間以上放置する。
（５）遠心分離により架橋結晶を回収し、グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液で２回洗浄する。
以上の条件で活性回収率は約７０％が得られる。
【００２２】
（Ｂ）微生物菌体の固定化
（１）菌体１０ｇを適量のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させる。
（２）結晶を生じた粗酵素液に１２．５％グルタルアルデヒドを撹拌しながら、終濃度１％になるように添加し３０分間撹拌した後、３時間以上放置する。
（３）２０％Ｌ−リジンを終濃度１％になるように添加し３０分間撹拌し、３時間以上放置する。
（４）遠心分離により架橋結晶を回収し、グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液で２回洗浄する。
以上の条件で活性回収率は約７０％が得られる。
【００２３】
ＩＩ  本発明の固定化酵素の評価
（Ａ）固定化酵素結晶、（Ｂ）固定化微生物菌体とも、活性の約７０％を固定化することができ、１ヶ月以上バイオリアクターに使用できる。すなわち、Ｌ−ラムノースイソメラーゼの固定化酵素結晶および固定化微生物菌体ともに、従来最も広く用いられているイオン交換法と比較するとＤ−アロースなど希少糖の生産法として大きな改善が進んだ。
イオン交換法による固定化法では、活性は約１０％しか固定化できず、しかもバイオリアクターを用いるＤ−アロースの生産には約２週間のみの使用で活性がなくなった。
一方、本発明による固定化法では活性の約７０％が固定化することが可能であり、５０％Ｄ−プシコースをｐＨ９グリシン緩衝液中でのバイオリアクター反応において一ヶ月以上の安定した反応を行うことが可能であった。また、本発明によるＬ−ラムノースイソメラーゼの固定化酵素結晶および固定化微生物菌体ともに粒の大きさが従来法に比べて大きいため、バイオリアクターの送液時の圧力が低いものであった。これらのことよりＤ−アロースをＤ−プシコースから連続生産が可能となった。
【００２４】
【発明の効果】
産業的に希少糖を大量に生産するのに有効に利用できる安定な、高活性の固定化固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼを提供することができる。
低い流れ抵抗を有し、充填されたカラムを通る基質の流速が速い固定化Ｌ−ラムノースイソメラーゼを提供することができる。