(57)【要約】【課題】  微量の核酸試料を使用して正確、かつ再現性に優れた塩基置換、例えばＳＮＰを検出する手段を提供すること。【解決手段】  遺伝子上の塩基置換の検出に有用なヌクレオチド、該ヌクレオチドを使用する遺伝子上の塩基置換の検出方法、ならびにそのためのキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の有無を検出する方法であって、
（１）標的核酸を含有する試料とヌクレオチドとを混合する工程：ここで当該ヌクレオチドは、
Ａ）その３’末端が当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
Ｂ）標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
Ｃ）当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな３’末端を生じるような配列を含有しており、
（２）前記混合物をヌクレアーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼで処理する工程：および
（３）ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、
を包含することを特徴とする塩基置換の検出方法。
【請求項２】
ヌクレアーゼとしてミスマッチ特異的ヌクレアーゼが使用される請求項１記載の塩基置換の検出方法。
【請求項３】
標的核酸に塩基置換が存在しない場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有するヌクレオチドが使用される請求項１記載の塩基置換の検出方法。
【請求項４】
標的核酸に塩基置換が存在する場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有するヌクレオチドが使用される請求項１記載の塩基置換の検出方法。
【請求項５】
ＤＮＡポリメラーゼの作用によって生成する伸長産物の有無によってヌクレオチドの切断が検出される請求項１記載の塩基置換の検出方法。
【請求項６】
ヌクレアーゼの作用によって生成する遊離したヌクレオチドの３’側断片の有無によってヌクレオチドの切断が検出される請求項１記載の塩基置換の検出方法。
【請求項７】
ヌクレオチドに標識化合物が付加されており、該標識を用いてヌクレオチドの切断が検出される請求項１記載の塩基置換の検出方法。
【請求項８】
標識化合物が、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所の３’側部分に付加されていることを特徴とする請求項７記載の塩基置換の検出方法。
【請求項９】
標識化合物が、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所の５’側部分に付加されていることを特徴とする請求項７記載の塩基置換の検出方法。
【請求項１０】
ヌクレオチドに標識化合物として蛍光物質が付加されている請求項７記載の塩基置換の検出方法。
【請求項１１】
さらに、蛍光を消光しうる物質がヌクレオチドに付加されており、ヌクレアーゼによる切断に伴って蛍光が発生する請求項１０記載の塩基置換の検出方法。
【請求項１２】
蛍光偏光法によってヌクレオチドの切断を検出することを特徴とする請求項１０記載の塩基置換の検出方法。
【請求項１３】
ヌクレオチドの３’末端の修飾が、リボースの３位の水酸基の修飾である請求項１記載の塩基置換の検出方法。
【請求項１４】
ヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含有することを特徴とする請求項１記載の塩基置換の検出方法。
【請求項１５】
ヌクレオチドアナログが、デオキシリボイノシンヌクレオチドあるいはデオキシリボウラシルヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（α−Ｓ）リボヌクレオチドである請求項１４記載の塩基置換の検出方法。
【請求項１６】
ＤＮＡポリメラーゼの作用によって生成する伸長産物を鋳型とした核酸増幅の工程をさらに包含する請求項１記載の塩基置換の検出方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の塩基置換の検出方法を用いた対立遺伝子の遺伝子型を解析する方法。
【請求項１８】
請求項１記載の塩基置換の検出方法に使用されるヌクレオチドであって、
Ａ）その３’末端が当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
Ｂ）標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
Ｃ）当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな３’末端を生じるような配列を含有する、
ことを特徴とするヌクレオチド。
【請求項１９】
標的核酸と形成される複合体において標的核酸との間にミスマッチが存在する場合にミスマッチ特異的ヌクレアーゼにより切断される請求項１８記載のヌクレオチド。
【請求項２０】
標的核酸に塩基置換が存在しない場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有する請求項１８記載のヌクレオチド。
【請求項２１】
標的核酸に塩基置換が存在する場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有する請求項１８記載のヌクレオチド。
【請求項２２】
標識化合物が付加されている請求項１８記載のヌクレオチド。
【請求項２３】
標識化合物が、ヌクレアーゼによる切断箇所の３’側部分に付加されていることを特徴とする請求項２２記載のヌクレオチド。
【請求項２４】
標識化合物が、ヌクレアーゼによる切断箇所の５’側部分に付加されていることを特徴とする請求項２２記載のヌクレオチド。
【請求項２５】
標識化合物として蛍光物質が付加されている請求項２２記載のヌクレオチド。
【請求項２６】
さらに、蛍光を消光しうる物質が付加されており、ヌクレアーゼによる切断、もしくはそれに続くＤＮＡの伸長によって蛍光を発する請求項２５記載のヌクレオチド。
【請求項２７】
３’末端の修飾が、リボースの３位の水酸基の修飾である請求項１８記載のヌクレオチド。
【請求項２８】
ヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含有することを特徴とする請求項１８記載のヌクレオチド。
【請求項２９】
ヌクレオチドアナログが、デオキシリボイノシンヌクレオチドあるいはデオキシリボウラシルヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（α−Ｓ）リボヌクレオチドである請求項２８記載のヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項１記載の塩基置換の検出方法に使用されるキットであって、下記Ａ）〜Ｃ）記載のヌクレオチドを含有することを特徴とするキット：
Ａ）その３’末端が当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
Ｂ）標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
Ｃ）当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな３’末端を生じるような配列を含有する。
【請求項３１】
ヌクレアーゼおよび／またはＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
ＤＮＡ伸長の有無を検出するための試薬をさらに含有する請求項３０記載のキット。
【請求項３３】
核酸増幅法を実施するための試薬をさらに含有する請求項３０記載のキット。
【請求項３４】
請求項１記載の塩基置換の検出方法に使用される反応液であって、下記Ａ）〜Ｃ）記載のヌクレオチドを含有することを特徴とする反応液：
Ａ）その３’末端が当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
Ｂ）標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
Ｃ）当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな３’末端を生じるような配列を含有する。
【請求項３５】
ヌクレアーゼおよび／またはＤＮＡポリメラーゼを含有することを特徴とする請求項３４記載の反応液。
【請求項３６】
標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の有無を検出する方法に使用されるヌクレオチドであって、該方法は以下の工程：
（１）標的核酸を含有する試料とヌクレオチドとを混合する工程：ここで当該ヌクレオチドは、
Ａ）その３’末端が当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
Ｂ）標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
Ｃ）当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな３’末端を生じるような配列を含有しており、
（２）前記混合物をヌクレアーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼで処理する工程：および
（３）ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、
を包含し、ここでヌクレアーゼは制限酵素であり、該ヌクレオチドは前記Ａ）〜Ｃ）の特徴を有し、かつ前記特定の塩基に対応する塩基を含有する領域に制限酵素の認識配列を含有することを特徴とするヌクレオチド。
【請求項３７】
標的核酸に塩基置換が存在しない場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有する請求項３６記載のヌクレオチド。
【請求項３８】
標的核酸に塩基置換が存在する場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有する請求項３６記載のヌクレオチド。
【請求項３９】
標識化合物が付加されている請求項３６記載のヌクレオチド。
【請求項４０】
標識化合物が、ヌクレアーゼによる切断箇所の３’側部分に付加されていることを特徴とする請求項３９記載のヌクレオチド。
【請求項４１】
標識化合物が、ヌクレアーゼによる切断箇所の５’側部分に付加されていることを特徴とする請求項３９記載のヌクレオチド。
【請求項４２】
標識化合物として蛍光物質が付加されている請求項３９記載のヌクレオチド。
【請求項４３】
さらに、蛍光を消光しうる物質が付加されており、ヌクレアーゼによる切断、もしくはそれに続くＤＮＡの伸長によって蛍光を発する請求項４２記載のヌクレオチド。
【請求項４４】
３’末端の修飾が、リボースの３位の水酸基の修飾である請求項３６記載のヌクレオチド。
【請求項４５】
ヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含有することを特徴とする請求項３６記載のヌクレオチド。
【請求項４６】
ヌクレオチドアナログが、デオキシリボイノシンヌクレオチドあるいはデオキシリボウラシルヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（α−Ｓ）リボヌクレオチドである請求項４５記載のヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子上の塩基置換の検出に有用なヌクレオチド、該ヌクレオチドを使用する遺伝子上の塩基置換の検出方法、ならびにそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
同一種に属する生物個体のゲノム上に含有される遺伝暗号は同一ではなく、多型（polymorphism）と呼ばれる塩基配列上の差違が存在することが知られている。多型には１〜数十塩基の欠失や挿入、特定の塩基配列が重複するものなどが知られているが、１個の塩基が他の塩基に置換されているものは一塩基置換多型（single nucleotide polymorphism、ＳＮＰ）と呼ばれている。
【０００３】
一塩基置換多型は数百塩基から１０００塩基に１ヶ所程度の割合で存在するといわれ、ヒトのゲノム上には３００万〜１０００万のＳＮＰがあると推定されている。ＳＮＰは疾病に関連する遺伝子の探索、疾病へのかかりやすさ、薬に対する感受性（作用、副作用）の違いを知るための指標として注目されており、その検出方法についても研究が進められている。
【０００４】
従来のＳＮＰの検出手段は、ハイブリダイゼーションに基づくもの、プライマー伸長に基づくものあるいは酵素の基質特異性を利用するものに大別される。
【０００５】
ハイブリダイゼーション法は、塩基置換の有無を核酸試料とプローブとのハイブリダイゼーションによって検出するものである。該方法は一塩基の違いによってハイブリダイゼーションが左右されるようなプローブ、ならびにハイブリダイゼーション条件を見出す必要があり、高い再現性を有する検出系の構築が困難である。
【０００６】
例えば、米国特許第５６６０９８８号公報記載のサイクルプローブ反応（ｃｙｃｌｅ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いた変異検出方法が挙げられる。該方法においては、開裂し易い結合を有する核酸プローブを目的とする核酸分子にハイブリダイズさせる。目的とする核酸分子中に塩基置換がない場合には、当該プローブは開裂し、塩基置換がある場合には、当該プローブは開裂しない。その後、開裂したプローブ由来の遊離断片の発生度合いを検出、定量することにより塩基置換を検出することを特徴とする。しかしながら、該方法では標的核酸が微量の場合、該プローブの開裂化物の量が少ないため開裂化物量が検出できるレベルに到達するまでに相当のタイムラグがある。
【０００７】
別法として、米国特許第５２１００１５号、第５４８７９７２号公報記載のＴａｑＭａｎ法を用いた変異検出方法が挙げられる。該方法では、蛍光色素及びクエンチャーが付加したＴａｑＭａｎプローブを使用する。該プローブは、塩基置換を含むものと、塩基置換を含まないものの２種類を使用する。該プローブを目的とする核酸分子にハイブリダイズさせ、その上流からプライマーが伸長してくると、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、目的とする核酸分子が塩基置換を含まない場合のみ、当該プローブが分解され、発生する蛍光を検出することにより塩基置換を検出することを特徴とする。しかしながら、該方法において、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ならびに３’末端がブロックされた標識ヌクレオチドを用いてＰＣＲを行う必要があり、厳密な温度調整が必要であり、検出するまでに要する時間も長いという問題がある。
【０００８】
酵素を利用する方法としては、まずＤＮＡポリメラーゼを使用する方法があり、該方法にはさらに（１）米国特許第５１３７８０６号公報記載の塩基置換を検出しようとする塩基部分に３’末端がアニーリングするプライマーを使用し、プライマー伸長反応の有無から塩基置換を検出する方法、（２）国際公開パンフレット第０１／４２４９８号記載の３’末端から２番目のヌクレオチドに検出しようとする塩基置換部位が位置するプライマーを使用し、プライマー伸長反応の有無から塩基置換を検出する方法、（３）塩基置換を検出しようとする塩基の３’側に隣接する塩基に３’末端がアニーリングするプライマーを使用し、当該プライマーに取り込まれる塩基を判別して目的部分の変異の有無とその塩基を決定する方法、の３つがある。
【０００９】
次に、ＤＮＡリガーゼを使用する方法がある。当該方法はプローブの末端部分を塩基置換を検出しようとする塩基部分に対応させることにより、ここに隣接したプローブとのライゲーションの有無から塩基置換を検出する。
【００１０】
ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼを使用する方法は、塩基置換に基づくプライマーもしくはプローブと標的核酸の間のミスマッチを正確に検出できない可能性がある。すなわち、これらの酵素はミスマッチを有するプライマー、プローブの場合でも酵素反応を開始し、誤った結果を与えることがある。
【００１１】
すなわち、標的核酸と当該プライマーとのアニーリングエラー及び使用するリガーゼあるいはポリメラーゼのエラーに起因する擬陽性の場合があり、反応条件特に反応温度等を非常に厳密にコントロールする必要があり、再現性に問題がある。
【００１２】
最後に、米国特許第５８４６７１７号記載のインベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法のように、二本鎖核酸の特殊な構造を認識して切断する活性を有する酵素を利用する方法が挙げられる。このような酵素としてはcleavaseが知られており、塩基置換が存在する（あるいは存在しない）場合に当該酵素に認識されるような構造を形成するプローブを設計し、当該プローブの切断を調べることによって塩基置換を検出することが可能である。しかしながら、二本鎖核酸の特殊な構造を認識して切断する活性を有する酵素を使用する方法はその感度に問題を有する。すなわち、当該方法は異分子の標的核酸から１つのシグナルが生成する方法であり、微量の核酸試料からでは塩基置換の検出に十分なシグナルを得られない。もちろんプローブ切断反応を反復してシグナルを増強することも可能であるが、強いシグナルを得るためには前もって標的核酸を増幅する必要がある。すなわち、該方法では標的核酸が微量の場合、該プローブの切断物の量が少ないため該切断物量が検出できるレベルに到達するまでに相当のタイムラグがある。
【００１３】
以上のように、上記の方法はいくつかの問題点を有しており、塩基置換を正確に検出できる方法が求められていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って本発明の目的は、上記方法の問題を解決し、微量の核酸試料を使用して正確、かつ再現性に優れた塩基置換、例えばＳＮＰを検出する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するためには、塩基置換を正確に検出し、かつその結果を強いシグナルとして得ることが可能な方法が望まれている。
【００１６】
本発明者らは、塩基置換を検出しようとする標的核酸にアニーリング可能であり、インタクトな状態ではその３’末端からはＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応が開始されることがなく、かつ、アニーリングした鋳型鎖の塩基配列に応じてヌクレアーゼによる切断が左右されるようなヌクレオチドを作成した。さらに、当該ヌクレオチドを使用した、標的核酸上の塩基置換を正確、かつ高感度に検出可能な方法を構築し、本発明を完成させた。
【００１７】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の有無を検出する方法に関し、
（１）標的核酸を含有する試料とヌクレオチドとを混合する工程：ここで当該ヌクレオチドは、
Ａ）その３’末端が当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
Ｂ）標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
Ｃ）当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな３’末端を生じるような配列を含有しており、
（２）前記混合物をヌクレアーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼで処理する工程：および
（３）ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００１８】
第１の発明の塩基置換の検出方法としては、ヌクレアーゼとしてリボヌクレアーゼＨ、ヌクレオチドとして特定の塩基に対応する塩基を含有する領域にリボヌクレオチドを含有するヌクレオチドを使用する方法、ヌクレアーゼとして制限酵素、ヌクレオチドとして特定の塩基に対応する塩基を含有する領域に制限酵素の認識配列を含有するヌクレオチドを使用する方法が例示される。
【００１９】
本発明の第２の発明は標的核酸の塩基置換の検出方法に関し、
（１）標的核酸を含有する試料とヌクレオチドとを混合する工程：ここで当該ヌクレオチドは、
Ａ）その３’末端が当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
Ｂ）標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
Ｃ）当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな３’末端を生じるような配列を含有しており、
（２）前記混合物をヌクレアーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼで処理する工程：および
（３）ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、
を包含することを特徴とする。
【００２０】
第２の発明の検出方法としては、ヌクレアーゼとしてミスマッチ特異的ヌクレアーゼを使用する方法が例示される。
【００２１】
第１、第２の発明の検出方法に使用されるヌクレオチドは、標的核酸に塩基置換が存在しない場合に標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有するヌクレオチド、標的核酸に塩基置換が存在する場合に標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有するヌクレオチドのいずれであってもよい。
【００２２】
第１、第２の発明の態様としては、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって生成する伸長産物の有無によって塩基置換の有無を判定する方法、ヌクレアーゼの作用によって生成する遊離したヌクレオチドの３’側断片の有無によって塩基置換の有無を判定する方法が例示される。また、標識されたヌクレオチドを使用し、当該標識を利用して前記伸長産物、もしくは前記のヌクレオチドの３’側断片を検出することが可能である。前記標識には蛍光物質を使用することができる。さらに、蛍光物質、蛍光を消光しうる物質が付加されており、ヌクレアーゼによる切断、もしくはそれに続くＤＮＡの伸長によって蛍光を発するヌクレオチドを使用することも可能である。前記蛍光標識されたヌクレオチドを使用する態様においては、検出に蛍光偏光法を利用することができる。
【００２３】
第１、第２の発明の塩基置換の検出方法に使用されるヌクレオチドにおいて、３’末端の修飾としてはリボースの３位の水酸基の修飾が例示される。また、本発明の塩基置換の検出方法に使用されるヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。該ヌクレオチドアナログとしては特に限定はされないが例えば、デオキシリボイノシンヌクレオチドあるいはデオキシリボウラシルヌクレオチド等が、修飾リボヌクレオチドとしては（α−Ｓ）リボヌクレオチドが好適に使用できる。さらに、第１、第２の発明の方法には、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって生成する伸長産物を鋳型とした核酸増幅の工程をさらに包含することができる。
【００２４】
本発明の第３の発明は、本発明の第１、第２の発明の塩基置換の検出方法を用いた対立遺伝子の遺伝子型を解析する方法に関する。
【００２５】
本発明の第４の発明は標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の検出に使用されるヌクレオチドに関し、
Ａ）その３’末端が当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
Ｂ）標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
Ｃ）当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな３’末端を生じるような配列を含有する、
ことを特徴とするヌクレオチドに関する。
【００２６】
第４の発明のヌクレオチドとしては、標的核酸上の特定の塩基に対応する塩基を含有する領域にリボヌクレオチドを含有し、当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはリボヌクレアーゼＨによって切断されるもの、標的核酸上の特定の塩基にに対応する塩基を含有する領域に制限酵素の認識配列を含有し、当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合には制限酵素によって切断されるものが例示される。
【００２７】
本発明の第５の発明は標的核酸上の特定の塩基における塩基置換の検出に使用されるヌクレオチドであって、
Ａ）その３’末端が当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されており、
Ｂ）標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有しており、
Ｃ）当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな３’末端を生じるような配列を含有する、
ことを特徴とするヌクレオチド。
【００２８】
第５の発明のヌクレオチドとしては、標的核酸と形成される複合体において標的核酸との間にミスマッチが存在する場合にミスマッチ特異的ヌクレアーゼにより切断されるヌクレオチドが例示される。
【００２９】
第４、第５の発明のヌクレオチドは、標的核酸に塩基置換が存在しない場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有するもの、標的核酸に塩基置換が存在する場合に、標的核酸と形成される複合体にミスマッチを生じないような配列を有するもののいずれであってもよい。
【００３０】
また、第４、第５の発明のヌクレオチドは標識化合物が付加されたものでもよく、その位置はヌクレアーゼによる切断箇所の３’側部分あるいは５’側部分のいずれであってもよい。前記標識化合物としては、例えば蛍光物質を使用することができ、さらに、蛍光を消光しうる物質が付加することにより、ヌクレアーゼによる切断、もしくはそれに続くＤＮＡの伸長によって蛍光を発するヌクレオチドとすることができる。
【００３１】
第４、第５の発明のヌクレオチドにおいて、３’末端の修飾としてはリボースの３位の水酸基の修飾が例示される。また、本発明のヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。該ヌクレオチドアナログとしては特に限定はされないが例えば、デオキシリボイノシンヌクレオチドあるいはデオキシリボウラシルヌクレオチド等が、修飾ヌクレオチドとしては（α−Ｓ）リボヌクレオチドが好適に使用できる。
【００３２】
本発明の第６の発明は標的核酸上の塩基置換の検出に使用されるキットに関し、第４、第５の発明のヌクレオチドを含有することを特徴とする。
【００３３】
第６の発明のキットとしては、ヌクレアーゼおよび／またはＤＮＡポリメラーゼを含有するもの、ＤＮＡ伸長の有無を検出するための試薬をさらに含有するもの、核酸増幅法を実施するための試薬をさらに含有するものが挙げられる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明のヌクレオチド、ならびに該ヌクレオチドを使用する塩基置換の検出方法は、天然に存在する、あるいは人為的に導入された塩基置換の検出に有用である。
【００３５】
本発明によれば、標的核酸上の塩基置換の有無を簡便、かつ再現性よく検出することができる。本発明の方法は公知の核酸増幅方法と容易に組み合せることができ、高感度に塩基置換を検出することが可能である。さらに、適切な配列のヌクレオチドを組み合わせて使用することにより、塩基置換の有無と同時にどのような塩基への置換が起こっているかを知ることもできる。
【００３６】
本発明は、多型やバリエーションのような生物のゲノムＤＮＡ上に生じた塩基置換、例えばＳＮＰの検出、同定に使用することができ、ヒトにおける疾患遺伝子の検索、薬剤感受性の解析など、ゲノム創薬、ゲノム医療の分野においても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本明細書に記載の「塩基置換」とは、核酸上の特定の部位において、その一部の塩基が他の塩基に置換されていることを指す。「塩基置換」により生物個体間の遺伝情報の違いが生じ、この遺伝情報の違いは多型（polymorphism）、もしくはバリエーション（variation）と呼ばれている。本明細書において「塩基置換」とは、上記の多型、バリエーションにおける塩基置換を包含する。また、核酸に人為的に導入された塩基置換も本明細書における「塩基置換」に含まれる。
【００３８】
本明細書に記載の「塩基置換」において、置換されている塩基の数には特に限定はなく、１塩基もしくはそれ以上の置換が存在してもよい。
【００３９】
本発明は、ゲノム多型やバリエーションの検出、特に、遺伝子上のＳＮＰ（一塩基置換多型）の検出に特に好適である。
以下に本発明を詳細に説明する。
【００４０】
（１）本発明のヌクレオチド
本発明のヌクレオチドは標的核酸上の塩基置換を検出しようとする箇所を含む領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。インタクトな状態ではＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長のプライマーとして機能することはないが、ヌクレアーゼによって切断を受けた後に初めてプライマーとして機能することができる。上記のような性質を有するものであればその鎖長には特に限定はなく、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドのいずれもが本発明に使用できる。通常、８〜５０塩基、好ましくは１０〜４０塩基、特に好ましくは１２〜３０塩基のオリゴヌクレオチドが本発明のヌクレオチドとして使用される。
【００４１】
本発明のヌクレオチドは、通常、デオキシリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドである。必要に応じ、リボヌクレオチド、ヌクレオチドのアナログや誘導体（修飾物）を含有することができる。ヌクレオチドのアナログとしては、例えば塩基部分にイノシン、７−デアザグアニン等の塩基を有するヌクレオチドアナログあるいはリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログを使用することができる。また、修飾ヌクレオチドとしてはリン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）ヌクレオチドや標識化合物が付加されたヌクレオチド等が例示される。さらに、本発明のヌクレオチドはペプチド核酸［ＰＮＡ、Peptide Nucleic Acid、ネイチャー（Nature）、第３６５巻、第５６６〜５６８頁（１９９３）］を含有するものであってもよい。本発明を特に限定するものではないが、好ましくは、上記のヌクレオチドのアナログや誘導体等は使用されるヌクレアーゼの作用に影響を与えない部位に導入される。本発明のヌクレオチドへのヌクレオチドアナログの導入は、ヌクレオチド自身の高次構造形成の抑制、標的核酸とヌクレオチドとのアニーリングの安定化の観点から有効である。すなわち、本発明の塩基置換の検出方法に用いることのできるヌクレオチドとしての機能を保持する範囲で、ヌクレオチドアナログ及び／又は修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００４２】
本発明において使用されるヌクレオチドは、標的核酸上の特定の塩基における塩基置換を検出するために、下記に示すような性質を有している。
Ａ）その３’末端が当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されている。
Ｂ）標的核酸上の前記特定の塩基を含有する領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。
Ｃ）当該ヌクレオチドと標的核酸とから形成される複合体において、前記特定の塩基と該塩基に対応する、すなわち該塩基と水素結合を形成するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在する（または存在しない）場合にはヌクレオチドはヌクレアーゼによる切断を受けず、かつ、前記特定の塩基と該塩基に対応するヌクレオチド上の塩基との間にミスマッチが存在しない（または存在する）場合にはヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて新たな３’末端を生じるような配列を含有している。
【００４３】
ここで、ヌクレアーゼにより切断されたヌクレオチドの５’側断片は標的核酸とアニーリングした状態を保持することができる。また、このヌクレオチドの５’側断片の３’末端ではリボースまたはデオキシリボースの３位に水酸基が存在しており、該末端からのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長が可能である。すなわち、上記ヌクレオチドはヌクレアーゼによって切断される塩基配列を有する場合にはプライマーの前駆体として機能する。
【００４４】
上記のように、本発明のヌクレオチドはその３’末端がＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長反応に使用できない形に修飾されている。上記目的を達成可能であればその修飾手段には特に限定はないが、例えば、３’末端にジデオキシヌクレオチド、リボースの３位の水酸基が修飾されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長が立体障害により妨害されるような修飾を付されたヌクレオチド等を付加することがあげられる。上記のヌクレオチドのリボースの３位の水酸基の修飾方法としては、アルキル化やその他の公知の修飾方法を利用することができ、例えばアミノアルキル化することにより、ＤＮＡ伸長反応を防ぐことができる。
【００４５】
また、本発明のヌクレオチドは、使用される条件において標的核酸の塩基置換を検出しようとする領域にアニーリングしうる塩基配列を有している。すなわち、標的核酸と実質的に相補的な配列を有していればよく、目的とする塩基における置換の検出に支障をきたさない範囲であれば標的核酸に完全に相補的な塩基配列を有している必要はない。
【００４６】
上記の本発明のヌクレオチドを標的核酸とアニーリングさせ、適切なヌクレアーゼとＤＮＡポリメラーゼの存在下にインキュベートを行った場合、標的核酸に塩基置換が存在するか否か、すなわち当該ヌクレオチドと標的核酸とがアニーリングして形成された二本鎖核酸にミスマッチ部位が存在するか否かでヌクレオチドの切断が左右される。ヌクレオチドが切断されて新たな３’末端が生じた場合にのみ標的核酸を鋳型としたＤＮＡ伸長が起こることから、ＤＮＡ伸長の有無によってミスマッチの有無、すなわち塩基置換の有無を知ることができる。
【００４７】
本発明においては、検出しようとする塩基置換が存在する場合にミスマッチが生じるように前記ヌクレオチドを作成すること、逆に塩基置換が存在した場合にはミスマッチが生じないように作成することのどちらも可能である。さらに、目的の塩基に対応する位置に４種の塩基のいずれかを配置した４種のヌクレオチドを作成して使用し、どの塩基を有するプライマーで伸長が起こるかを調べることにより、塩基置換の存在と置換している塩基の種類とを同時に知ることもできる。
【００４８】
本発明のヌクレオチドは、上記のようにヌクレアーゼによる切断によってＤＮＡ伸長が可能なプライマーに変換される。ここで、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所より５’側の部分がＤＮＡ伸長におけるプライマーとして機能する。当該ヌクレアーゼとしては、ヌクレオチドと標的核酸とがアニーリングして形成された二本鎖核酸中のミスマッチの存在に対応して前記ヌクレオチドを切断もしくは切断しないものであれば特に限定はないが、例えば、リボヌクレアーゼＨ、制限酵素、ミスマッチ特異的ヌクレアーゼ等があげられる。
【００４９】
リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）はＤＮＡとＲＮＡから形成された二本鎖核酸を認識し、ＲＮＡ鎖を選択的に切断する酵素である。本発明のヌクレオチドの置換を検出しようとする塩基に対応する部分にリボヌクレオチドを配置しておくことにより、ミスマッチが存在しない場合にのみリボヌクレアーゼＨで切断されるヌクレオチドとすることができる。
【００５０】
本発明に使用されるリボヌクレアーゼとしては、上記のリボヌクレオチドを含有する本発明のヌクレオチドと、これと相補的なＤＮＡから形成された二本鎖核酸を認識し、当該リボヌクレオチド部分を選択的に切断する活性を有していれば特に限定はない。このような酵素としては、例えば、大腸菌由来のリボヌクレアーゼＨの他、好熱性バチルス属細菌、サーマス属細菌、ピロコッカス属細菌、サーモトガ属細菌あるいはアルカエオグロバス属細菌等由来のリボヌクレアーゼＨ等も好適に使用できる。リボヌクレアーゼＨは、同時に使用されるＤＮＡポリメラーゼと同じ反応条件で高い活性を示すものが好ましいが、特に限定されるものではない。本発明のヌクレオチドを核酸増幅反応と組み合わせて使用する場合には、当該反応の実施される条件において活性を示すリボヌクレアーゼＨを使用することが好ましく、例えば、ＰＣＲ法のような高温での反応、処理を含む核酸増幅反応を利用する場合には耐熱性リボヌクレアーゼＨを使用することが有利である。耐熱性リボヌクレアーゼＨとしては、例えばバチルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、ピロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）、アルカエオグロバス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）、メタノコッカス・ヤナシ（Methanococcus jannashi）由来のリボヌクレアーゼＨ等を使用することができる。
【００５１】
制限酵素はＤＮＡの特定の塩基配列（４〜８塩基）を認識し、当該配列内部、もしくはその周辺部を切断する酵素である。置換を検出しようとする塩基部分が制限酵素の認識配列と重複する場合には、当該配列を含むヌクレオチドを作成し、塩基置換の検出に使用することができる。ヌクレオチドと標的核酸との間にミスマッチが生じる場合には制限酵素による切断が起こらず、これによって塩基置換の有無を知ることができる。このようなヌクレオチドを使用するにあたっては標的核酸側が制限酵素によって切断を受けないようにする必要があるが、使用する制限酵素に対応する修飾メチラーゼを使用して特定の塩基をメチル化するなどの方法により、標的核酸特異的に制限酵素への耐性を付与することが可能である。
【００５２】
上記の２種のヌクレアーゼとは逆に、標的核酸とヌクレオチドとの間のミスマッチを認識して切断するような酵素を使用してもよい。このような酵素としてはＭｕｔＨ等を使用することができる。
【００５３】
本発明のヌクレオチドが上記のヌクレアーゼによる切断を受け、新たな３’末端が生じると、当該末端よりＤＮＡの伸長が開始される。この工程に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、鋳型ＤＮＡの配列に依存してプライマーの３’末端よりＤＮＡ伸長が可能なものであれば特に限定はない。例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ・フラグメント、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ）、サーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等）、好熱性古細菌由来α型ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ等）が挙げられる。
【００５４】
本発明のヌクレオチドを遺伝子増幅反応と組み合わせて使用する場合には、それぞれの遺伝子増幅反応に適したＤＮＡポリメラーゼを選択して使用すればよい。
【００５５】
本発明のヌクレオチドがヌクレアーゼにより切断されて生じる３’側部分の断片は、その鎖長が短い場合には標的核酸から遊離するが、十分な鎖長を有している場合には標的核酸とのアニーリングを維持することが可能である。ＤＮＡポリメラーゼとして鎖置換活性を有するものを使用した場合には、当該断片はＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの伸長とともに標的核酸から解離させられる。また、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用した場合には、当該断片はＤＮＡポリメラーゼによって分解される。
【００５６】
上記の、ヌクレアーゼとしてリボヌクレアーゼＨを使用する本発明のヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを本発明に使用することができる。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−Ｎ’−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド、Ｎ：リボヌクレオチド、Ｎ’：ＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないように修飾されたヌクレオチド。）
【００５７】
上記一般式において、Ｎｂで表される部位は置換の検出の対象となる塩基に対応する塩基を含んでいる。また、上記の各ヌクレオチドはその機能を損なわない範囲でヌクレオチドのアナログや誘導体（修飾ヌクレオチド）を含有していてもよい。
【００５８】
例えば、上記一般式において、Ｎ’が修飾デオキシリボヌクレオチドであり、ａが１１以上の任意の整数、ｂ＝１〜３、ｃ＝０〜２のキメラオリゴヌクレオチドであるヌクレオチドが例示される。塩基置換の検出の対象となる塩基に対応する塩基は、Ｎｂで表される部分に位置していれば特に限定はない。本発明の実施態様の一つとしては、例えば（ｄＮｃ−Ｎ’）で表される部分の長さが３塩基であり、塩基置換を検出しようとする塩基に対応する塩基をＮｂで表される部分の最も３’側に設定したヌクレオチドが好適に使用でき、該ヌクレオチドは塩基置換の検出に関する良好な特異性を示す。
【００５９】
本発明のヌクレオチドに適切な標識を施すことにより、ヌクレアーゼによる切断、あるいはそれに続くＤＮＡ伸長反応により生じる産物（伸長産物）によってヌクレオチドから分離した３’側断片の検出を容易にし、塩基置換の存在を簡便に確認することができる。
【００６０】
ヌクレオチドの標識方法には限定はなく、例えば放射性同位体（32Ｐ等）、色素、蛍光物質、発光物質、種々のリガンド（ビオチン、ジゴキシゲニン等）、酵素等が使用できる。標識されたヌクレオチド由来の産物は当該標識に応じた検出方法でその存在を確認することができる。直接検出できないリガンドの場合には、検出可能な標識を付されたリガンド結合性の物質と組み合わせればよい。例えば、リガンド標識したヌクレオチド由来の産物と酵素標識した抗リガンド抗体とを組み合せ、シグナルを増幅することによって標的核酸を高感度に検出することが可能である。
【００６１】
ヌクレオチドを蛍光標識する態様としては、例えば当該ヌクレオチドを蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質の両者で、適当な間隔をとって標識したものが包含される。このようなプライマーはインタクトな状態では蛍光を発することはないが、ヌクレアーゼにより切断されて蛍光物質と消光物質との距離が離れた場合には蛍光を発するようになる。このようなヌクレオチドはＤＮＡ伸長反応の開始と同時に蛍光が発せられるため、反応中の反応液を直接観察することによって塩基置換の有無を知ることができる。
【００６２】
（２）本発明の塩基置換の検出方法
本発明の塩基置換の検出方法は、上記（１）に記載された本発明のヌクレオチドを使用し、下記の工程；
１）標的核酸を含有する試料と前記ヌクレオチドとを混合する工程：
２）前記混合物をヌクレアーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼで処理する工程：および
３）ヌクレアーゼによるヌクレオチドの切断の有無を検出する工程、
により実施されることを特徴とする。上記（１）に記載された本発明のヌクレオチドの特徴に従い、ヌクレアーゼによるその切断の有無から塩基置換が存在するか否かを判定する。
【００６３】
本発明の塩基置換の検出方法に使用される標的核酸としては一本鎖、二本鎖の核酸、すなわちＤＮＡ、ＲＮＡを使用することができる。使用するヌクレアーゼによってはＲＮＡを標的核酸とすることが困難な場合もあるが、その場合には当該ＲＮＡを鋳型として調製したｃＤＮＡを標的核酸として使用することにより、ＲＮＡ上の塩基置換を検出することが可能である。
【００６４】
本発明においては、標的核酸を含有する試料を検出反応に使用することができる。
【００６５】
上記試料には特に限定はなく、核酸、もしくは生物を含む可能性のあるあらゆる試料、例えば、細胞、組織（生検試料等）、全血、血清、脳脊髄液、精液、唾液、喀痰、尿、糞便、毛髪、細胞培養物等を使用することができる。上記の検体は、特に限定するものではないが、好ましくは適切な処理によって、例えばＤＮＡポリメラーゼの反応を実施が可能な形態としたうえ、本発明の方法に供することができる。このような処理には細胞の溶解や試料からの核酸の抽出、精製が包含される。
【００６６】
本発明の塩基置換の検出方法においては、使用されるヌクレオチドの切断の有無、ならびにそれに続いて起こるＤＮＡ伸長反応の有無から塩基置換の存在が判定される。その方法には特に限定はなく、公知の核酸分析手法を使用することができる。例えば、ＤＮＡ伸長反応の有無を調べる方法としては、生成した伸長産物をゲル電気泳動法（アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等）あるいはキャピラリー電気泳動法によって分離して確認する方法、伸長産物の鎖長の増加をマススペクトルによって測定する方法等を挙げることができる。また、別の態様としては、例えば、伸長産物へのヌクレオチドの取り込みを調べる方法がある。当該方法では、適切な標識を付加したヌクレオチド３リン酸が高分子の伸長産物に取り込まれる量として伸長産物の合成量を知ることができる。伸長産物は、例えば酸による沈殿処理やゲル電気泳動によって未反応のヌクレオチドと分離し、その生成量を測定することができる。さらに、ＤＮＡ伸長反応によって生成するピロリン酸を酵素的に検出する方法を使用してもよい。
【００６７】
本発明の検出方法において、さらに公知の核酸増幅反応を用いて当該伸長産物を増幅してもよい。このような態様は、高感度に塩基置換を検出する観点から有用である。
【００６８】
上記の核酸増幅反応には特に限定はなく、鋳型核酸に相補的な配列を有するプライマーが使用される種々の核酸増幅方法が使用できる。例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ；polymerase chain reaction、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号）、鎖置換型増幅法（ＳＤＡ；strand displacement amplification、特公平7-114718号）、自立複製法（３ＳＲ；self-sustained sequence replication）、ＮＡＳＢＡ法（nucleic acid sequence based amplification、特許第2650159号）、ＴＭＡ法（transcription-mediated amplification）、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids、国際公開第00/56877号パンフレット）等の公知の増幅方法を使用することができる。これらの方法において、鋳型ＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡを合成する際のプライマーとして本発明のヌクレオチドを使用することにより、標的核酸上の塩基置換を検出することができる。
【００６９】
上記のような核酸増幅法を利用して本発明の塩基置換の検出方法を実施する場合には、各方法に使用されるプライマーの少なくとも一つとして本発明のヌクレオチドを使用し、さらに反応系中に当該ヌクレオチドに適したヌクレアーゼを共存させればよい。
【００７０】
上記のような、核酸増幅反応を利用した塩基置換の検出においては、当該反応による特異的な増幅産物の生成から塩基置換の存在を判定することができる。増幅産物の生成は、特に限定するものではないが、例えばゲル電気泳動、増幅産物に相補的な配列を有するプローブを使用したハイブリダイゼーション法、蛍光標識ヌクレオチドを利用した蛍光偏光法、タックマン法等が使用でき、さらに各遺伝子増幅方法に特有の検出反応も利用することができる。
【００７１】
本発明の検出方法を用いてゲノムレベルでの塩基置換を解析する場合には、大量の塩基配列を解析するために反応系を微量化し、さらに集積度を高める手段を組み合わせてもよい。その手段の一つとして、最先端の超微細加工技術を駆使して、本発明の検出方法あるいは解析方法の基本プロセス、例えば、ＤＮＡの細胞からの抽出、核酸増幅反応、目的ＤＮＡの検出等のプロセスを数ｃｍ角〜指先大のマイクロチップ上に集積化したものを組み合わせてもよい。さらに、必要に応じてゲル或いはキャピラリー電気泳動、検出用プローブとのハイブリダイゼーションのプロセスを組み合わせてもよい。該システムは、マイクロチップ、マイクロＣＥ（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）チップあるいはナノチップとも呼ばれている。
【００７２】
このようなシステムにおける核酸増幅反応としては目的のＤＮＡ断片が増幅されるものであればいずれの核酸増幅反応も利用することができる。特に限定はされないが例えば、ＩＣＡＮ法のような等温条件下で核酸を増幅できる方法が好適に使用できる。該方法を組み合わせることにより、当該システムの単純化が可能となり、上記のような集積化されたシステムでの利用に非常に好適である。さらに、本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの構築が可能となる。
【００７３】
本発明の方法において、本発明のヌクレオチドに修飾ヌクレオチドを含ませること及び／又は反応温度を適宜調整することにより塩基置換の検出の特異性を向上させることができる。
【００７４】
上記（１）に記載された、標識が付加された本発明のヌクレオチドは、ＤＮＡ伸長反応の有無の確認を容易にすることができ、本発明の塩基置換の検出方法に有用である。この場合、当該ヌクレオチド由来の標識物質を上記のような各標識に適した方法で検出し、伸長反応の有無を確認すればよい。
【００７５】
例えば、蛍光物質が付加された本発明のヌクレオチドを使用する場合、標識がプライマーとして利用される部分に付加されていれば、伸長産物をその蛍光を利用して検出することができる。また、ヌクレオチドのヌクレアーゼによる切断箇所よりも３’側に付加されていれば、３’側断片の標的核酸からの解離やＤＮＡポリメラーゼの有する５’→３’エキソヌクレアーゼによる該断片の低分子化等に基づいて伸長反応の有無を検出することができる。このような、蛍光標識されたヌクレオチドの分子量の変化を伴う態様においては蛍光偏光法の利用が好適である。
【００７６】
また、蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質とを付加して蛍光を発することのないように標識した本発明のヌクレオチドを使用する場合、伸長反応が起こると同時に蛍光が発せられるようになるため、極めて容易に塩基置換を検出することができる。
【００７７】
上記の各態様において、塩基置換を検出しようとする位置に対応してアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）あるいはウラシル（Ｕ）のそれぞれを有し、かつそれぞれが互いに区別可能な異なる標識を付されたヌクレオチドを利用することにより、塩基置換の存在とともに、塩基置換がある場合には置換している塩基の種類を同時に知ることができる。
【００７８】
本発明のヌクレオチドを使用し、ＰＣＲ法によって塩基置換を使用することもできる。この場合、ＰＣＲ法の一方のプライマーのかわりに本発明のヌクレオチドを使用し、通常のＰＣＲ用反応液にさらに前記ヌクレオチドに応じたヌクレアーゼを添加すればよい。この場合、ヌクレアーゼとしてＰＣＲの条件において失活しないものを選択することにより、高感度に塩基置換を検出することができる。
【００７９】
ヒトを含む高等動物の細胞は、通常１対の染色体を有する二倍体である。そのため、染色体上の特定の塩基について塩基置換が存在する可能性がある場合、当該細胞は両染色体ともに塩基置換を有しないホモ接合体（ホモ型）、両染色体ともに塩基置換が存在するホモ接合体（ホモ型）、あるいは一方の染色体のみに塩基置換を有するヘテロ接合体（ヘテロ型）の３通りの可能性がある。
【００８０】
二倍体の細胞より調製した核酸試料について本発明の塩基置換の検出方法を適用することにより、遺伝子上の任意の塩基について当該細胞、すなわち当該細胞を有する個体の遺伝子型がホモ型あるいはヘテロ型のいずれかであるかを調べることができる。特に限定はないが例えば、４通りの塩基のそれぞれに対応し、ミスマッチが存在しない場合に切断を受けるタイプのヌクレオチドを使用して本発明の方法を実施した場合、遺伝子型がヘテロ型である細胞由来の核酸試料では２種のヌクレオチドについてヌクレオチドの切断にともなうシグナルが検出される。一方、遺伝子型がホモ型である細胞由来の核酸試料では１種のヌクレオチドのみでシグナルが検出され、さらにこのホモ型が塩基置換を有する、あるいは有しないことも同時に判定することができる。このように、本発明の方法は、上記のような対立遺伝子上の塩基置換の検出にも有用である。
【００８１】
（３）本発明の塩基置換の検出に使用されるキット
本発明は、上記の本発明の塩基置換の検出に使用されるキットを提供する。１つの実施態様において、該キットは本発明のヌクレオチドを含有することを特徴とする。塩基置換の有無と同時に置換した塩基を特定できるような、４種の塩基それぞれを含有するヌクレオチドのセットを含有するものでもよい。さらに、当該ヌクレオチドに適したヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼやその基質（ｄＮＴＰ）、反応に適した緩衝液等を含有するものやプライマー伸長産物の検出のための試薬を含有するものであってもよい。核酸増幅法と組み合わせて塩基置換を検出するためのキットとしては、当該増幅法に使用される反応液を調製するための試薬を含有するものが好適である。
【実施例】
【００８２】
以下に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００８３】
参考例１  ピロコッカス  フリオサスのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ピロコッカス フリオサス  ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）  １％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）  ０．５％、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製）  １％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）  ３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）  ０．５％、ＭｇＳＯ４  ０．００３％、ＮａＣｌ  ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＣｏＳＯ４  ０．０００１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＺｎＳＯ４  ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０.１ｐｐｍ、ＫＡｌ(ＳＯ４)２  ０.１ｐｐｍ、Ｈ３ＢＯ４  ０.１ｐｐｍ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０.１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０.２５ｐｐｍの組成の培地２リットルを２リットル容のメジュウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus、ドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメンより購入：ＤＳＭ３６３８）を接種して、９５℃、１６時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
【００８４】
次に、得られた菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に２４ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。
【００８５】
反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
【００８６】
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
ピロコッカス  ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）の全ゲノム配列が公開されており〔ＤＮＡ  リサーチ（DNA Research）、第５巻、第５５−７６頁（１９９８）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＰＨ１６５０）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号１、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  ホームページ：http://www.nite.go.jp/）。
【００８７】
そこで、このＰＨ１６５０遺伝子（配列番号１）と一部公開されているピロコッカス  フリオサス(Pyrococcus furiosus)のゲノム配列（University of Utah, Utah Genome Center  ホームページ：http://www.genome.utah.edu/sequence.html）でホモロジー検索をおこなった。その結果、非常にホモロジーの高い配列が見つかった。
【００８８】
得られた配列をもとにプライマー１６５０Ｎｄｅ（配列番号２）及び１６５０Ｂａｍ（配列番号３）を合成した。
【００８９】
参考例１−（１）で得たピロコッカス  フリオサス  ゲノムＤＮＡ  ２００ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌの１６５０Ｎｄｅ及び２０ｐｍｏｌの１６５０Ｂａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、３０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ(ともに宝酒造社製)で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＰＦＵ２２０を作製した。
【００９０】
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定 
参考例１−（２）で得られたｐＰＦＵ２２０の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
【００９１】
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレーム(open resding frame ; ORF)が見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号４に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。
【００９２】
なお、プラスミドｐＰＦＵ２２０で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Escherichia coli JM109／pPFU220と命名、表示され、平成１２年９月５日より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０２０として寄託され、また前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６５４［国際寄託への移管請求日：平成１３年７月９日］として寄託されている。
【００９３】
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
参考例１−（２）で得られたｐＰＦＵ２２０を大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ノバジェン社製）に形質転換し、得られたｐＰＦＵ２２０を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を６６．０ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を６０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、６１．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
【００９４】
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。
【００９５】
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分６０．０ｍｌをバッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
【００９６】
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分２．０ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、１７キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
【００９７】
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＰｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。上記で得られたＰｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて下記の方法によりＲＮａｓｅＨ活性を測定した。
【００９８】
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ジチオスレイトール（ナカライテスク社製）、０．００３％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、シグマ社製）、４％グリセロール、２０μｇ／ｍｌ  ポリ（ｄＴ）（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌ  ポリ（ｒＡ）（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を混合し、３７℃で１０分間保温した。これをＲＮａｓｅＨ活性を測定するための基質液として使用した。
【００９９】
１００μｌの基質液に１μｌの１Ｍ  ＭｎＣｌ２を加えて４０℃で保温し、これに上記のＰｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ標品を適当に希釈したものを加えて反応を開始した。４０℃で３０分間反応を行った後、１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加えて反応を停止し、２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１００】
その結果、上記のＰｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ標品を添加した反応液では、先に１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加えた後にこれを添加したものに比べて２６０ｎｍにおける吸光度の値が高かった。よって、当該標品がＲＮａｓｅＨ活性を有することが明らかになった。
【０１０１】
（５）精製ＲＮａｓｅＨ活性の測定
ａ）使用する試薬液の調製
力価測定用反応液：最終濃度がそれぞれ４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７、３７℃）、４ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．００３％  ＢＳＡ、４％グリセロール、２４μＭ  ポリ（ｄＴ）になるように滅菌水で調製した。
【０１０２】
ポリ［８−3Ｈ］アデニル酸溶液：３７０ｋＢｑのポリ［８−3Ｈ］アデニル酸溶液を２００μｌの滅菌水に溶解した。
ポリアデニル酸溶液：ポリアデニル酸を３ｍＭになるように滅菌超純水で希釈した。
酵素希釈液：最終濃度がそれぞれ２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、３７℃）、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５、３７℃）、３０ｍＭ  塩化ナトリウム、５０％グリセロールになるように滅菌水で調製した。
熱変性子牛胸腺ＤＮＡの調製：子牛胸腺ＤＮＡ  ２００ｍｇをＴＥバッファー  １００ｍｌに懸濁し、膨潤させた。該溶液のＵＶ２６０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌの濃度に滅菌超純水で希釈した。次に、該溶液を１００℃で１０分間加熱後、氷浴中で急冷した。
【０１０３】
ｂ）活性測定方法
上記ａ）で調製した力価測定用反応液  ９８５μｌにポリ［８−3Ｈ］アデニル酸溶液 ７μｌを加え３７℃で１０分間保持した。次にポリアデニル酸を最終濃度が２４μＭになるように８μｌ加え、さらに３７℃で５分間保持した。このようにしてポリ［８−3Ｈ］ｒＡ−ポリｄＴ反応液  １０００μｌを調製した。  次に、該反応液 ２００μｌを分取し、３０℃で５分間保持した後、任意の希釈系列で希釈した酵素液 １μｌを加え、これらの反応液を経時的に５０μｌずつサンプリングして、後の測定に用いた。酵素添加からサンプリングまでの間の時間をＹ分とした。また、全ＣＰＭ用反応液  ５０μｌおよびブランク用反応液  ５０μｌは、酵素液の代わりに酵素希釈液を１μｌ加えて調製した。該サンプリング溶液に１００ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム  １００μｌ、熱変性子牛胸腺ＤＮＡ溶液  ５０μｌおよび１０％トリクロロ酢酸  ３００μｌ（全ＣＰＭ測定の場合は、超純水  ３００μｌ）を加え、０℃で５分間保持後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心後、得られた上清  ２５０μｌをバイアルに入れ、アクアゾル−２（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社製）  １０ｍｌを加え、液体シンチレーションカウンターでＣＰＭを測定した。
【０１０４】
ｃ）ユニット計算
各酵素のユニット（Unit）数は、以下の計算式で算出した。
Unit/ml ={（測定したＣＰＭ−ブランクＣＰＭ）×１．２*×２０×１０００×希釈率}×２００（μｌ）／（全ＣＰＭ×Ｙ分×５０（μｌ）×９**）
１．２*：全ＣＰＭ中に含まれるポリ［８−3Ｈ］ｒＡ−ポリｄＴの５０μｌ当たりのｎｍｏｌ数
９**：補正係数
【０１０５】
参考例２  アルカエオグロバス  フルギダスのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）アルカエオグロバス  フルギダス  ゲノムＤＮＡの調製
アルカエオグロバス  フルギダス（Archaeoglobus  fulgidus、ドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメン  ウント  ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ４１３９）  ８ｍｌ相当分の菌体を集め、１００μｌの２５％ショ糖、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、２０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に８００μｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び５０μｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に５０μｌのＴＥに溶解してゲノムＤＮＡ溶液を得た。
【０１０６】
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
アルカエオグロバス  フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）は全ゲノム配列が公開されており〔Ｋｌｅｎｋ，ＨＰら、ネイチャー（Nature）、第３９０巻、第３６４−３７０頁（１９９７）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＡＦ０６２１）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号１３、http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html）。
【０１０７】
そこで、このＡＦ０６２１遺伝子（配列番号１３）の配列をもとにプライマー  ＡｆｕＮｄｅ（配列番号１４）及びＡｆｕＢａｍ（配列番号１５）を合成した。
【０１０８】
参考例２−（１）で得たアルカエオグロバス  フルギダス  ゲノムＤＮＡ  ３０ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＡｆｕＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＡｆｕＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．６ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ(ともに宝酒造社製)で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＡＦＵ２０４を作製した。
【０１０９】
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
参考例２−（２）で得られたｐＡＦＵ２０４の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
【０１１０】
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号１６に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号１７に示す。
【０１１１】
なお、プラスミドｐＡＦＵ２０４で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Escherichia coli JM109／pAFU204と命名、表示され、平成１３年２月２２日より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２２１として寄託され、また前記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６９１［国際寄託への移管請求日：平成１３年８月２日］として寄託されている。
【０１１２】
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
参考例２−（２）で得られたｐＡＦＵ２０４で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたｐＡＦＵ２０４を含む大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３７．１ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、４０．３ｍｌの熱処理上清液を得た。
【０１１３】
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｑカラムを素通りした。
【０１１４】
バッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ  Ｓカラムを素通りした。
【０１１５】
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分  ４０．０ｍｌを５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＢ〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕２リットルを外液として、２時間の透析を３回行なった。透析後の酵素液  ４０．２ｍｌを５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約２４０ｍＭ  ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
【０１１６】
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分７．８ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、約６００μｌの濃縮液を４回に分けて１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、３０．０キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
【０１１７】
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＡｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
【０１１８】
上記で得られたＡｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、参考例１−（５）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＡｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
【０１１９】
以下の実施例における耐熱性ＲＮａｓｅＨのｕｎｉｔ数は、以下の方法により算出した。
【０１２０】
ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）（ともにアマシャム  ファルマシア  バイオテク製）１ｍｇをそれぞれ１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒＡ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
【０１２１】
次に、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．００３％ＢＳＡ、４％グリセロールを含む４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｒＡ）溶液、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｄＴ）溶液を加え、３７℃で１０分間反応後、４℃に冷却し、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製した。このポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液１００μｌに任意に希釈した酵素液１μｌを加え、４０℃で１０分間反応させ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを加えて反応を停止させた後、２６０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを加えた後、４０℃で１０分間反応させ、吸光度を測定した。その後、ＥＤＴＡ非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。ＲＮａｓｅＨの１単位は、１ｎｍｏｌのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するＡ260を１０分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。
単位（unit）＝〔吸光度差×反応液量（ｍｌ）〕／０．０１５２×（１１０／１００）×希釈率
【０１２２】
実施例１  ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子上の塩基置換の検出
（１）テンプレートの作成
ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓエクソン１のコドン１２にそれぞれＧＧＴ（Ｇｌｙ）、ＣＧＴ（Ａｒｇ）、ＴＧＴ（Ｃｙｓ）、ＡＧＴ（Ｓｅｒ）の配列を有したＤＮＡ断片を調製した。すなわち、ラス・ミュータント・セット（ras Mutant Set c-Ki-ras codon 12、宝酒造社製）中の上記のコドンに対応するテンプレートＤＮＡとラス・ジーン・プライマーセット（ras Gene Primer Set c-Ki-ras/12、宝酒造社製）を用いたＰＣＲによって得られた増幅産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅベクター（ノバジェン社製）にクローニングした。こうして得られた組換えプラスミドを鋳型とし、Ｍ１３プライマーＭ４、ＲＶ（いずれも宝酒造社製）を用いたＰＣＲを実施し、得られた増幅断片を回収してそれぞれテンプレート１２Ｇ、１２Ｒ、１２Ｃ、１２Ｓとした。
【０１２３】
（２）塩基置換の検出
ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓエクソン１の塩基配列に従って、上記テンプレート１２Ｇを特異的に検出するためのフォワード側ヌクレオチドとして、それぞれ配列番号７〜９記載の塩基配列を有する３種のキメラオリゴヌクレオチドを合成した。これらは３’末端のヌクレオチドのリボース部分の３位の水酸基がアミノヘキシル化されたキメラオリゴヌクレオチドである。また、該ヌクレオチドは、コドン１２がＧｌｙをコードしているヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓエクソン１の塩基配列に相補的な配列を有している。また、核酸増幅のためのアンチセンスプライマーとして配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１２４】
それぞれ５０ｐｍｏｌのフォワード側ヌクレオチドとアンチセンスプライマー、１μｌの０．２５％プロピレンジアミン水溶液、鋳型としてテンプレート１２Ｇ、１２Ｃ、１２Ｒ、１２Ｓのいずれか１ｐｇを含む全量５μｌの反応液を調製し、サーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）で９８℃、２分間加熱処理の後、５３℃の加熱処理を行って鋳型にプライマー側ヌクレオチドならびにアンチセンスプライマーをアニーリングさせた。上記加熱処理を行った各溶液に０．６２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液、４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１２５ｍＭ  酢酸カリウム、５ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．０１２５％ウシ血清アルブミン、１．２５％ジメチルスルホキシド、１６Ｕの参考例１に記載のＰｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ及び、５．５ＵのＢｃａＢｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）及び滅菌水を含む全液量  ２０μｌを添加し、最終容量を２５μｌとした。該反応液は５３℃、１時間保持した。反応終了後、該反応液  ５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。この結果を図１に示す。図１−１〜３に示されたアガロースゲルにおいて、レーン１〜４はそれぞれテンプレート１２Ｇ、１２Ｃ、１２Ｒ、１２Ｓを用いた場合の反応液がアプライされている。また、図１−１、２、３は、それぞれ配列番号７、８、９のヌクレオチドを使用した反応の結果を示す。
【０１２５】
図１に示されるように、配列番号７〜９記載のヌクレオチドを用いた場合には、いずれもテンプレート１２Ｇを使用した場合のみ、すなわち標的核酸がコドン１２にＧｌｙをコードしている場合のみに増幅産物が観察された。このことから、本発明のヌクレオチドを使用することにより、標的核酸上の塩基置換の判別が可能であることが示された。さらに、イノシンを含有したヌクレオチドを用いることにより、特異的増幅を向上させることができることを確認した。
【０１２６】
実施例２  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓコドン１２の他のアレルの検出
実施例１の結果を基に、実施例１−（１）で調製した、１２Ｒ、１２Ｃ、１２Ｓ上のコドン１２の塩基を特異的に判別可能なヌクレオチドとして、それぞれ配列番号１０〜１２に示す塩基配列をするキメラオリゴヌクレオチドを合成した。配列番号１０、１１、１２はそれぞれコドン１２がＣｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒであるアレルに対応する塩基配列を有している。また、これらはいずれも３’末端のヌクレオチドのリボース部分の３位の水酸基がアミノヘキシル化されたヌクレオチドである。これらのヌクレオチドと配列番号６記載のアンチセンスプライマーとを使用し、実施例１−（２）と同一反応条件下、反応を行なった。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。この結果を図２に示す。図２−１〜３に示されたアガロースゲルにおいて、レーン１〜４はそれぞれテンプレート１２Ｇ、１２Ｃ、１２Ｒ、１２Ｓを用いた場合の反応液がアプライされている。また、図２−１、２、３は、それぞれ配列番号１０、１１、１２のヌクレオチドを使用した反応の結果を示す。
【０１２７】
図２に示されるように、配列番号１０、１１、１２のヌクレオチドを用いた場合には、それぞれテンプレート１２Ｃ、１２Ｒ、１２Ｓと組み合わせた場合のみに特異的な増幅産物が認められた。すなわち、本発明のヌクレオチドは目的とする塩基を正確に判別する能力を有していた。さらに、イノシンを含有したオリゴヌクレオチドを用いる事により、特異的増幅を向上させることができることを確認した。
【０１２８】
実施例３  ゲノムＤＮＡ上のアレル特異的なＤＮＡ増幅
ｃ−Ｋｉ−ｒａｓエクソン１のコドン１２がＧｌｙ（ＧＧＴ）である事を確認されている、ヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）１５０ｎｇ、または３０ｎｇを用い、実施例１、２においてコドン１２の４種のアレルを特異的に検出する事が示された配列番号７、１０、１１、１２記載のヌクレオチド（それぞれコドン１２がＧｌｙ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒの場合に対応）、ならびに配列番号６記載のアンチセンスプライマーを使用し（２）と同一条件下、反応を行った。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図３に示す。
【０１２９】
図３−１、２に示されたアガロースゲルにおいて、レーン１〜４はそれぞれ配列番号７、１０、１１、１２記載のヌクレオチドを用いた場合の反応液がアプライされている。また、図３−１、２は、それぞれ１５０ｎｇ、３０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを使用した反応の結果を示す。
【０１３０】
図３に示されるように、上記のヒトゲノムＤＮＡの使用量にかかわらず、配列番号７のヌクレオチドのみにおいてＤＮＡ断片の増幅が認められ、他のヌクレオチドでのＤＮＡ断片の増幅は見られなかった。このことから、本発明の塩基置換の検出方法により、ゲノムＤＮＡ上の特定のアレルを検出可能であることが確認された。
【０１３１】
実施例４  種々のＲＮａｓｅＨを用いた検出
実施例１に示された塩基置換の検出を、種々のＲＮａｓｅＨを使用して試みた。
すなわち、Ｐｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩにかえて参考例２に記載のＡｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ、ストラクチャー（Structure）、第８巻、第８９７〜９０４頁に記載の方法で調製したメタノコッカス・ヤナシ（Methanococcus jannashi）由来のＲＮａｓｅＨであるＭｊａ  ＲＮａｓｅＨＩＩをそれぞれ使用した。フォワード側ヌクレオチドとして配列番号７のヌクレオチド、アンチセンスプライマーとして配列番号６のオリゴヌクレオチドを使用し、実施例１と同じ条件で反応を行なった。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。この結果を図４に示す。図４−１〜２に示されたアガロースゲルにおいて、レーン１〜４はそれぞれテンプレート１２Ｇ、１２Ｃ、１２Ｒ、１２Ｓを用いた場合の反応液がアプライされている。また、図４−１、２は、それぞれＡｕｆ  ＲＮａｓｅＨＩＩ、Ｍｊａ  ＲＮａｓｅＨＩＩを使用した反応の結果を示す。
【０１３２】
図４に示されるように、Ａｕｆ  ＲＮａｓｅＨＩＩ、Ｍｊａ  ＲＮａｓｅＨＩＩを用いた場合には、いずれもテンプレート１２Ｇを使用した場合のみ、すなわち標的核酸がコドン１２にＧｌｙをコードしている場合のみに増幅産物が観察されており、これらのＲＮａｓｅＨによって標的核酸上の塩基置換の判別が可能であることが示された。
【０１３３】
実施例５  変性操作の必要なＤＮＡ増幅反応系（ＰＣＲ）を用いたＳＮＰの検出
変性操作の必要なＤＮＡ増幅反応系における本発明の方法について検討した。まず、ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ エクソン１の塩基配列に従って、上記テンプレート１２Ｇを特異的に検出するためのセンス側ヌクレオチドとして配列表の配列番号２５記載のキメラオリゴヌクレオチドを合成した。該ヌクレオチドは、３’末端のヌクレオチドのリボース部分の３位の水酸基がアミノヘキシル化されたヌクレオチドである。また、同様にアンチセンスプライマーとして配列番号１８の塩基配列を有するプライマーを合成した。上記各５０ｐｍｏｌの上記合成ヌクレオチド及びプライマー（センス方向ヌクレオチドとアンチセンス方向プライマー）と２．５μｌのＥｘ  Ｔａｑバッファー（宝酒造社製）、２μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液、５０ＵのＡｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ、０．６２５ＵのＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む全量２４μｌの反応液を調製した。この反応液に、実施例１で調製したテンプレート１２Ｇ、１２Ｃ、１２Ｒ、１２Ｓの１０ｎｇ／μｌ溶液をそれぞれ１μｌ添加し、サーマルサイクラー（宝酒造社製）を用い、９４℃  ５秒、５９℃  ２分、７２℃  ５秒のＰＣＲ反応を２５、３０サイクル行った。反応終了後、得られた各反応液１μｌをアジレント２１００バイオアナライザ（ヒューレットパッカード社製）で分析した。その結果を図５に示す。図５は、各テンプレートにおける目的の増幅産物量を示すグラフであり、縦軸は目的の増幅産物量、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。図５に示した用に、検出に用いたプライマーとａｌｌｅｌｅの一致するテンプレート１２Ｇを用いた場合にのみ特異的に目的のＤＮＡの増幅が確認された。すなわち、本発明の方法が、鋳型となる核酸の変性操作が必要なＤＮＡ増幅反応系においても有効であることが確認できた。
【０１３４】
実施例６  Ｋ−ｒａｓコドン６１のアレル特異的な検出
別の塩基置換の検出の場合について検討した。すなわち、ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  エクソン２のコドン６１にそれぞれＣＡＡ（Ｇｌｕ）、ＡＡＡ（Ｌｙｓ）、ＧＡＡ（Ｇｌｎ）の配列を有したＤＮＡ断片を、配列表の配列番号１９、２０に記載のＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＴ７−Ｂｌｕｅベクターにクローニングした。これらのＤＮＡ断片がクローニングされたベクターのそれぞれを常法で精製し、それぞれ６１Ｑ、６１Ｋ、６１Ｅとした。次に実施例１−（２）の結果を基に、ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  エクソン２の塩基配列に基いて６１Ｑ、６１Ｋ、６１Ｅの各ベクターを特異的に検出するヌクレオチドとして、それぞれ配列表の配列番号２１、２２、２３記載のキメラオリゴヌクレオチドを合成した。これらはいずれも３’末端のヌクレオチドのリボース部分の３位の水酸基がアミノヘキシル化されたヌクレオチドである。これらのヌクレオチドをセンスプライマーとして、配列表の配列番号２４記載のプライマーをアンチセンスプライマーとして用いて以下の反応を行った。上記各５０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドプライマー（センス方向とアンチセンス方向プライマー）と１μｌの０．０５％プロピレンジアミン水溶液、６１Ｑ、６１Ｋ、６１Ｅの各テンプレートＤＮＡ  １０ｐｇを含む全量５μｌの反応液をサーマルイクラーパーソナル（宝酒造社製）で９８℃で２分間の後、５３℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に０．６２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液、４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１２５ｍＭ  酢酸カリウム、５ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．０１２５％ウシ血清アルブミン、１．２５％ジメチルスルホキシド、１１ＵのＡｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ（宝酒造社製）及び、５．５ＵのＢｃａＢｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）及び滅菌水を含む全液量２０μｌを添加し、最終容量を２５μｌとした。該反応液は５８℃、1時間保持した。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図６に示す。すなわち、図６Ａは、配列番号２１記載の６１Ｑ検出用プライマーを用いた場合の検出結果を示す電気泳動パターンであり、レーン１はテンプレート６１Ｑ、レーン２はテンプレート６１Ｋ、レーン３はテンプレート６１Ｅをそれぞれ鋳型に用いた場合を示す。また、図６Ｂは、配列番号２２記載の６１Ｋ検出用プライマーを用いた場合の検出結果を示す電気泳動パターンであり、レーン１はテンプレート６１Ｑ、レーン２はテンプレート６１Ｋ、レーン３はテンプレート６１Ｅをそれぞれ用いた場合を示す。さらに、図６Ｃは、配列番号２３記載の６１Ｅ検出用プライマーを用いた場合の検出結果を示す電気泳動パターンであり、レーン１はテンプレート６１Ｑ、レーン２はテンプレート６１Ｋ、レーン３はテンプレート６１Ｅをそれぞれ用いた場合を示す。
【０１３５】
図６Ａ、Ｂ、Ｃに示したように配列表の配列番号２１，２２，２３を用いた場合に各ａｌｌｅｌｅ特異的にＩＣＡＮ反応によって目的のＤＮＡ増幅産物が得られる事を確認した。すなわち、塩基置換の対象が変わっても本発明の方法が有効であることを確認した。
【０１３６】
実施例７  ＣＹＰ２Ｃ１９（６３６）のアレル特異的な検出
（１）  遺伝子的にホモ型あるいはヘテロ型であるかの検出方法について検討した。対象として、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９の６３６番目の塩基のａｌｌｅｌｅを選択した。まず、ヒトＣＹＰ２Ｃ１９の６３６番目の塩基がＧあるいはＡであるＤＮＡ断片を、配列表の配列番号２６、２７に記載のＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ反応で増幅し、ｐＴ７−Ｂｌｕｅベクターにクローニングした。これらＤＮＡ断片がクローニングされたプラスミドをそれぞれ常法で精製し、それぞれプラスミド６３６Ｇ、６３６Ａとした。
【０１３７】
上記プラスミド６３６Ｇ、６３６Ａならびにプラスミド６３６Ｇと６３６Ａを１：１に混合したプラスミド６３６Ｇ/Ａを鋳型として用いた。すなわち、プラスミド６３６Ｇならびにプラスミド６３６Ａは遺伝子的にホモ型、プラスミド６３６Ｇ/Ａが遺伝子的にヘテロ型のモデルである。次に、上記６３６Ｇならびに６３６Ａを特異的に検出するヌクレオチドとして、それぞれ配列表の配列番号２８、２９記載のヌクレオチドを合成した。これらのヌクレオチドをセンスプライマー、配列表の配列番号３０記載のプライマーをアンチセンスプライマーとして用い、以下の反応を行った。上記各５０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドプライマー（センス方向とアンチセンス方向プライマー）と１μｌの０．０５％プロピレンジアミン水溶液、プラスミド６３６Ｇ、６３６Ａならびに６３６Ｇ/Ａの各テンプレートＤＮＡ  １ｐｇ含む全量５μｌの反応液をサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）で９８℃で２分間の後、５３℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。上記熱処理をした各溶液に０．６２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液、４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１２５ｍＭ  酢酸カリウム、５ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．０１２５％ウシ血清アルブミン、１．２５％ジメチルスルホキシド、１１ＵのＡｆｕ  ＲＮａｓｅＨＩＩ、５．５ＵのＢｃａＢｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼおよび滅菌水を含む全液量２０μｌを添加し、最終容量を２５μｌとした。該反応液は、５３℃、1時間保持した。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図７Ａ及び７Ｂに示す。すなわち、図７Ａは、ヌクレオチド６３６Ｇを用いた場合の検出結果を示す電気泳動パターンであり、レーン１はテンプレートがプラスミド６３６Ｇの場合、レーン２はプラスミド６３６Ａの場合、レーン３はプラスミド６３６Ｇ/Ａを用いた場合を示す。
【０１３８】
また、図７Ｂは、ヌクレオチド６３６Ａを用いた場合の検出結果を示す電気泳動パターンであり、レーン１はテンプレートがプラスミド６３６Ｇの場合、レーン２はプラスミド６３６Ａの場合、レーン３はプラスミド６３６Ｇ/Ａを用いた場合を示す。図７Ａ及び７Ｂに示したように、いずれのヌクレオチドを用いた場合でもａｌｌｅｌｅ特異的な検出が行えることが確認できた。
【０１３９】
（２）  ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートに用いた場合について、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法と解析の比較を行った。まず、ヒトゲノムＤＮＡ（クローンテック社製）を１５０ｎｇを鋳型として上記（１）と同様の方法でＳＮＰタイピングを行った。その結果を図７Ｃに示す。すなわち、図７Ｃは、ヒトゲノムＤＮＡのＳＮＰタイピングした結果を示す電気泳動パターンであり、レーン１はヌクレオチド６３６Ｇを用いた場合、レーン２はヌクレオチド６３６Ａを用いた場合である。
【０１４０】
図７Ｃに示したようにヌクレオチド６３６Ｇを用いた場合にのみ目的の増幅ＤＮＡが検出され、このゲノムＤＮＡのＣＹＰ２Ｃ１９  ６３６塩基目のａｌｌｅｌｅは、（６３６Ｇ/Ｇ）のホモ型であると判断された。
【０１４１】
一方、上記ヒトゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によるタイピングを行った。まず、ゲノムＤＮＡ  １５０ｎｇを用いて、配列表の配列番号２６および２７のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩで処理した後、該反応液を３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図７Ｄに示す。すなわち、図７Ｄは、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりタイピングを行った結果を示す電気泳動パターンであり、レーン１はＰＣＲ増幅産物、レーン２は該ＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩで処理した場合である。
【０１４２】
図７Ｄに示したように、ＰＣＲ増幅産物がＢａｍＨＩにより完全消化されたことから、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法においてもこのゲノムＤＮＡのＣＹＰ２Ｃ１９  ６３６塩基目のａｌｌｅｌｅは（６３６Ｇ/Ｇ）のホモ型であると判断された。  また、本発明の塩基置換の検出方法と従来のＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によるＳＮＰタイピングの結果が一致することが確認できた。
【０１４３】
（３）  上記（１）で調製したプラスミド６３６Ｇ、６３６Ａ、６３６Ｇ／Ａを用いて相同染色体上のジェノタイプを想定した検出方法を検討した。反応は、以下のようにして行った。まず、ヌクレオチド６３６Ｇならびにヌクレオチド６３６Ａの５’末端にお互いに識別可能な蛍光標識Ｒｏｘ（ＡＢＩ社製）、Ｆａｍ（ＡＢＩ社製）をそれぞれ結合させたものを合成した。当該蛍光標識ヌクレオチドは等量づつ混合して用いた。検出方法は、上記（１）と同様の方法で行った。反応終了後、該反応液の一部を３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物と未反応の蛍光標識ヌクレオチドが十分に分離するまで泳動を行った。電気泳動後のアガロースゲルをＦＭ−ＢＩＯ  ＩＩ  Ｍｕｌｔｉ−Ｖｉｅｗ  （宝酒造社製）にて解析した。その結果、鋳型がプラスミド６３６Ｇの場合は蛍光標識Ｒｏｘの蛍光シグナルのみが確認できた。また、鋳型がプラスミド６３６Ａの場合は蛍光標識Ｆａｍの蛍光シグナルのみが確認できた。さらに、鋳型がプラスミド６３６Ｇ／Ａの場合はＲｏｘ及びＦａｍの両方の蛍光シグナルが確認できた。以上のことから、本発明の方法が相同染色体上のジェノタイプ（ホモ型あるいはヘテロ型）を解析できる方法として有用であることを確認した。
【０１４４】
実施例８  全血から抽出したゲノムＤＮＡを用いたタイピング
インフォームドコンセントの得られた健常人全血２００μｌ（サンプル番号１〜６）よりＧｅｎとるくんＴＭ（宝酒造社製）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤＮＡ１６０ｎｇを鋳型として、６３６Ｇ、６３６Ａの各ａｌｌｅｌｅを特異的に検出するプライマーとして、それぞれ配列番号２８、２９記載のヌクレオチドを用い、実施例７−（１）と同様の方法でＳＮＰタイピングを行った。その結果を図８Ａ〜Ｆに示す。すなわち図８のＡ〜Ｆは、それぞれ血液サンプル１〜６から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし実施例７−（１）の方法でタイピングした結果を示す電気泳動パターンであり、各図のレーン１は配列番号２８（６３６Ｇ検出用）、レーン２は配列番号２９（６３６Ａ検出用）をそれぞれヌクレオチドとして用いた場合である。図８のＡ〜Ｆに示した増幅産物のパターンから、各血液サンプルのＣＹＰ２Ｃ１９  ６３６塩基目のａｌｌｅｌｅは（サンプル１：Ｇ／Ａ、２：Ｇ／Ｇ、３：Ｇ／Ａ、４：Ｇ／Ｇ、５：Ｇ／Ｇ、６：Ｇ／Ｇ）とタイピングされた。一方、同じゲノムＤＮＡを鋳型に、実施例７−（２）と同様の方法でＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりタイピングを行った。その結果を図７Ｇに示す。すなわち図７Ｇは血液サンプル１〜６から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりタイピングを行った結果を示す電気泳動パターンであり、レーン１〜６はそれぞれ血液サンプル１〜６から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とした場合である。図８Ｇに示す電気泳動結果から、これら各血液サンプルから調製したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅産物の切断パターンよりＣＹＰ２Ｃ１９  ６３６塩基目のａｌｌｅｌｅは（サンプル１：Ｇ／Ａ、２：Ｇ／Ｇ、３：Ｇ／Ａ、４：Ｇ／Ｇ、５：Ｇ／Ｇ、６：Ｇ／Ｇ）とタイピングされ、前記の結果と一致した。
【０１４５】
以上のことから、本発明の方法が実際の臨床検体を用いた場合においても有効であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
上記の、本発明のヌクレオチド、ならびに該ヌクレオチドを使用する塩基置換の検出方法は、天然に存在する、あるいは人為的に導入された塩基置換の検出に有用である。
【０１４７】
本発明によれば、標的核酸上の塩基置換の有無を簡便、かつ再現性よく検出することができる。本発明の方法は公知の核酸増幅方法と容易に組み合せることができ、高感度に塩基置換を検出することが可能である。さらに、適切な配列のヌクレオチドを組み合わせて使用することにより、塩基置換の有無と同時にどのような塩基への置換が起こっているかを知ることもできる。
【０１４８】
本発明は、多型やバリエーションのような生物のゲノムＤＮＡ上に生じた塩基置換、例えばＳＮＰの検出、同定に使用することができ、ヒトにおける疾患遺伝子の検索、薬剤感受性の解析など、ゲノム創薬、ゲノム医療の分野においても有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。
【図２】本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。
【図３】本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。
【図４】本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。
【図５】本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示すグラフである。
【図６】本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。
【図７】本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。
【図８】本発明の塩基置換の検出方法による、ヒト遺伝子上の塩基置換の検出の結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１５０】
SEQ ID NO:１: a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus horikoshii
SEQ ID NO:2: PCR primer 1650Nde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus
SEQ ID NO:3: PCR primer 1650Bam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Pyrococcus furiosus
SEQ ID NO:6: Chimeric oligonucleotide primer to amplify the DNA of a portion of human c-Ki-ras gene. nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:7: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:8: Chimeric oligonucleotide primer precursor to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. nucleotides 12 to 15 are ribonucleotides, nucleotide 17 is inosine-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:9: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. nucleotides 14 and 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:10: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:11: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:12: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides, nucleotide 17 is inosine-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:13: Nucleotide sequence of AF0621 gene from Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO:14: PCR primer AfuNde for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO:15: PCR primer AfuBam for cloning a gene encoding a polypeptide having a RNaseHII activity from Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO:16: Nucleotide sequence of ORF in RnaseHII from Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO:17: Amino acid sequence of RNaseHII from Archaeoglobus fulgidus.
SEQ ID NO:18: Designed PCR primer to amplify a portion of c-ki-ras oncogene exon 1
SEQ ID NO:19 Designed PCR primer to amplify a portion of human c-ki-ras oncogene exon 2
SEQ ID NO:20: Designed PCR primer to amplify a portion of human c-ki-ras oncogene exon 2
SEQ ID NO:21: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:22: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:23: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:24: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. nucleotides 17 to 19 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:25: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human c-Ki-ras gene. nucleotides 16 to 18 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:26: Designed PCR primer to amplify a portion of human CYP2C19 gene
SEQ ID NO:27: Designed PCR primer to amplify a portion of human CYP2C19 gene
SEQ ID NO:28: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human CYP2C19 gene. nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:29: Chimeric oligonucleotide to detect the nucleotide substitution on human CYP2C19 gene. nucleotides 13 to 15 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides and the 3'-OH group of the nucleotide at 3'end is protected with amino hexyl group
SEQ ID NO:30: Chimeric oligonucleotide primer to amplify a portion of human CYP2C19 gene. nucleotides 19 to 21 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides
【図１】
2004298200.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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