(57)【要約】【課題】  安定供給が可能であり、移植の際の適合性が問題にならない幹細胞を提供すること。【解決手段】  ヒト羊膜間葉細胞層から分離され、RT-PCRにおいてOct-4遺伝子、Sox-2遺伝子、FGF-4遺伝子、Rex-1遺伝子の発現が認められ、免疫細胞染色においてビメンチン陽性及びCK19陽性であるサイドポピュレーション細胞を提供した。【効果】  ヒト羊膜間葉細胞層及びヒト羊膜上皮細胞層中にＳＰ細胞が存在することが見出され、該ＳＰ細胞が初めて分離され、これが幹細胞であることが初めて確認された。本発明のＳＰ細胞は、少なくとも神経細胞に分化可能であるので、神経細胞により生産される物質の供給源として有用であり、また、パーキンソン病や代謝性神経疾患などの神経難病患者の脳に移植することにより、神経細胞により生産される物質の薬物送達システム等として用いることができる。【選択図】  図１
2004254682.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト羊膜間葉細胞層から分離され、RT-PCRにおいてOct-4遺伝子、Sox-2遺伝子、FGF-4遺伝子、Rex-1遺伝子の発現が認められ、免疫細胞染色においてビメンチン陽性及びCK19陽性であるサイドポピュレーション細胞。
【請求項２】
主要組織適合抗原クラスIIが陰性でクラスIが陰性である請求項１記載のサイドポピュレーション細胞。
【請求項３】
ヒト羊膜上皮細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞。
【請求項４】
ヒト羊膜間葉細胞層から分離され、主要組織適合抗原クラスIIが陰性でクラスIが陰性と陽性が混在しているサイドポピュレーション細胞集団。
【請求項５】
ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞から成る移植用細胞。
【請求項６】
脳に移植するためのものである請求項５記載の移植用細胞。
【請求項７】
ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞を有効成分として含有する脳代謝病治療用細胞。
【請求項８】
ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞を有効成分として含有する、β−ガラクトシダーゼ又はβ−グルコシダーゼ欠損疾患治療用細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト羊膜から分離されたサイドポピュレーション細胞に関する。本発明の細胞は、神経細胞により生産される物質の供給源として有用であり、また、パーキンソン病や代謝性神経疾患などの神経難病患者の脳に移植することにより、神経細胞により生産される物質の薬物送達システム等として有用である。また、本発明の細胞は、特定の酵素を生産するので、ライソゾーム病等の代謝病の治療用細胞として有用である。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は、種々の組織を構成するように分化し得る未分化の細胞であり、再生医学や組織工学の分野で重要なものである。幹細胞としては、従来、骨髄から得られる骨髄幹細胞や、臍帯血幹細胞が知られているが、これらは安定供給に難がある。また、ヒト胎盤から多量の多能性幹細胞が採取可能であることが発表された。しかし、胎盤は、母体由来であるので、胎盤由来の幹細胞から分化した細胞を移植する場合には、拒絶反応を防止するために適合性を調べる必要があり、適合性のない患者に対しては移植ができないという問題がある。
【０００３】
一方、幹細胞の純化方法として、Hoechst33342という蛍光色素を用いた方法が報告された(Goodell, M.A. et al., J. Exp. Med., 183:1797-1806, 1996)。Hoechst33342は、ＤＮＡのAT塩基配列に取り込まれる蛍光色素で、細胞膜透過性が強く、細胞を生きた状態のまま染色することができる。このため、Hoechst33342は、生きたままの状態で細胞周期を研究するために用いられてきた。Hoechst33342は、紫外線を照射すると、波長450 nm及び波長675 nmの２種類の蛍光を発する。Goodellらは、マウス骨髄細胞をHoechst33342で染色し、蛍光活性化セルソーター(fluorescence activated cell sorter, FACS)にかけ、横軸に波長675 nmの蛍光強度、縦軸に波長450 nmの蛍光強度をとって二次元解析を行ったところ、グラフの左下の部分、すなわち、両波長の蛍光強度が共に弱い領域に細胞集団が存在することを見出し、これをサイドポピュレーション細胞(side population cells、以下、「SP細胞」と言うことがある）と命名した。さらに、SP細胞には、造血幹細胞が高頻度に含まれることも明らかにした。その後の研究により、SP細胞は、マウス以外のヒト、サル、ブタ、イヌ、ゼブラフィッシュ等にも存在すること、また、骨髄以外の肝臓や筋肉にもSP細胞が含まれることが明らかになった（実験医学、Vol.19, No.15（増刊）2001, pp.68-73)。
【０００４】
SP細胞は、Hoechst33342の排出能が高いために、Hoechst33342によりあまり染色されないと考えられており、ABCトランスポーターであるMDR(multi drug resistance gene)がコードするタンパク質(MDR分子)を代表とする、ポンプ状の分子によってHoechst33342が細胞外に排出されると考えられている。幹細胞では、MDRの発現が活発なためにHoechst33342が細胞外に排出されると考えられており、Hoechst33342の排出能は幹細胞に共通の性質であることも示唆されている（実験医学、上掲）。尚、このSP細胞分画はMDR分子の機能阻害剤であるベラパミル(verapamil)を添加後完全に消失する（第117回日本医学会シンポジウム記録集pp.67-74（2000年8月））。
【０００５】
一方、各種のライソゾーム内の酵素が欠損するライソゾーム病が知られている。ライソゾーム病では、脳などの神経系が障害され易く、進行性の知能低下、発育遅延、痙攣等が引き起こされる。ライソゾーム病の治療としては、欠損している酵素を補充する治療法が採用されているが、酵素を補充し続ける必要があり、根本的な治療法はない。
【０００６】
【非特許文献１】Goodell, M.A. et al., J. Exp. Med., 183:1797-1806, 1996
【非特許文献２】実験医学、Vol.19, No.15（増刊）2001, pp.68-73
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、安定供給が可能であり、移植の際の適合性が問題にならない幹細胞を提供することである。また、本発明の目的は、ライソゾーム病等の代謝病の治療に有用な細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ヒト羊膜間葉細胞層及びヒト羊膜上皮細胞層中にSP細胞が存在し、これがいくつかの幹細胞マーカーを発現していることを見出し、本発明を完成した。また、本願発明者らは、ヒト羊膜間葉細胞層から得られたＳＰ細胞が、βガラクトシダーゼ及びβグルコシダーゼ等の酵素を多く生産しており、また、脳に移植可能であることを見出し、該ＳＰ細胞が移植用細胞又は脳代謝病治療用細胞として有用であることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離され、RT-PCRにおいてOct-4遺伝子、Sox-2遺伝子、FGF-4遺伝子、Rex-1遺伝子の発現が認められ、免疫細胞染色においてビメンチン陽性及びCK19陽性であるサイドポピュレーション細胞を提供する。また、本発明は、ヒト羊膜上皮細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞を提供する。さらに、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離され、免疫細胞染色においてビメンチン陽性及びCK19陽性であり、主要組織適合抗原クラスIIが陰性でクラスIが陰性と陽性が混在しているサイドポピュレーション細胞集団を提供する。さらに、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞から成る移植用細胞を提供する。さらに、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞を有効成分として含有する脳代謝病治療用細胞を提供する。さらに、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞を有効成分として含有する、βガラクトシダーゼ又はβグルコシダーゼ欠損疾患治療用細胞を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ヒト羊膜間葉細胞層及びヒト羊膜上皮細胞層中にＳＰ細胞が存在することが見出され、該ＳＰ細胞が初めて分離され、これが幹細胞であることが初めて確認された。本発明のHAMC層由来ＳＰ細胞は、少なくとも神経細胞に分化可能であるので、神経細胞により生産される物質の供給源として有用であり、また、パーキンソン病や代謝性神経疾患などの神経難病患者の脳に移植することにより、神経細胞により生産される物質の薬物送達システム等として用いることができる。また、ＨＬＡ  ＣｌａｓｓIIは陰性でＨＬＡ  ＣｌａｓｓI陰性である本発明のHAMC層由来ＳＰ細胞は、移植免疫のうえで、拒絶を惹起しない細胞である。
【００１１】
また、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞は、下記実施例において具体的に記載するように、脳への移植が可能であり、種々のライソゾーム内酵素を生産する。従って、本発明のＳＰ細胞を脳に移植することにより、ライソゾーム病等の脳代謝病の治療が可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のＳＰ細胞は、ヒト羊膜間葉細胞層又はヒト羊膜上皮細胞層から、自体公知のＳＰ細胞分離法を適用することにより得られる。すなわち、下記実施例において具体的に記載するように、ヒト羊膜間葉細胞層又はヒト羊膜上皮細胞層を回収し、これを細胞単位に分離してHoechst33342で染色し、紫外線の照射下、FACSにかける。横軸に波長675 nmの蛍光強度、縦軸に波長450 nmの蛍光強度をとって各細胞をプロットする。このグラフにおいて、左下側の部分、すなわち、上記両方の蛍光強度が弱い領域、すなわち、主な細胞集団の位置から角のように突き出した領域に存在する細胞がＳＰ細胞である。図１には、ヒト羊膜間葉細胞(HAMC)層及びヒト羊膜上皮細胞(HAEC)層から分離した細胞についての上記グラフを示すが、それぞれ四角形の実線で囲まれた部分の領域中の細胞がＳＰ細胞である。このようなＳＰ細胞は、FACS装置を用いて通常の方法により回収できる。なお、本明細書において、「ＳＰ細胞」には、図１の四角形の実線で囲まれた部分の領域中の細胞集団の全体のみならず、この細胞集団全体の中の部分的な細胞集団、さらには、該細胞集団に含まれる１つの細胞をも意味し、さらには、これらの細胞集団又は１つの細胞を継代培養して得られる子孫の細胞集団であって、ＳＰ細胞の性質を示すものをも意味する。もっとも、特に細胞の集団を限定的に指す場合には、「細胞集団」という語を用いることもある。
【００１３】
本発明のHAMC層由来ＳＰ細胞は、RT-PCRにおいてOct-4遺伝子(POU5遺伝子)を発現する。Oct-4遺伝子は、体外培養可能な未分化細胞株であるES細胞、EC細胞やEG細胞にのみ発現する未分化状態維持に働くマスター遺伝子（分化抑制遺伝子）であることが知られている（文献：Nichols, J et al.:  Cell, 95, 379-391(1998)）。さらに、本発明のHAMC層由来ＳＰ細胞は、Sox-2遺伝子、FGF-4遺伝子、Rex-1遺伝子を発現する。これらの遺伝子は、Oct-4遺伝子の下流遺伝子であり、Sox-2と Rex-1はそれぞれFGF-4とRox-1（コファクター）との協同で活性化される未分化状態維持分子モデルが報告されている（文献名：Niwa, H et al.: Nature Genetics, 24, 372-376(2000)。したがって、本発明のHAMC層由来ＳＰ細胞では、上記遺伝子が未分化状態維持に働いている。したがって、本発明のHAMC層由来ＳＰ細胞は多能性幹細胞である。また、免疫細胞染色において、間葉系細胞マーカー抗原であるビメンチン陽性であり、また、上皮系細胞マーカー抗原であるCK19陽性である。
【００１４】
HAMC層から分離されたままの本発明のＳＰ細胞は、主要組織適合抗原(HLA)クラスIIが陰性でクラスIが陰性と陽性が混在している。細胞移植に用いるためには、クラスIが陰性であることが好ましいので、クラスIが陰性の細胞のみを回収して用いることが好ましい。本発明は、上記本発明のHAMC層由来ＳＰ細胞集団に含まれ、HLA-Class Iが陰性であるＳＰ細胞をも提供する。クラスIが陰性の細胞は、後述する免疫細胞染色において、HLA-Class I抗体により染色されなかった細胞を回収することにより容易に行うことができる。この回収は、市販のフローサイトメトリーを用いる常法により行うこともできるし、磁気ビーズによるnegative selection等で回収することもできる。
【００１５】
本発明のＳＰ細胞は、次の条件下培養することにより継代培養可能である。培養条件：10％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ/Ｆ-１２（1：1）培養液中に（ヒト白血病阻害因子（ｈＬＩＦ，イスラエル国alomone labo社製） 10ng/ｍｌ、及び0.2mM   2-メルカプトエタノール（2-ＭＥ、Ｓｉｇｍａ社製）を加え、コラーゲンコートした培養ディッシュ上で37℃、5％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。現時点で２０代の継代培養を完了しており、２０代継代後の細胞も、ＳＰ細胞としての性質並びに上記したマーカーの発現も維持しているので、幹細胞としての増殖能を有している。
【００１６】
本発明のHAMC層由来ＳＰ細胞は、少なくとも神経幹細胞マーカーを発現しているので、少なくとも神経幹細胞として利用することができる。すなわち、本発明の細胞は、少なくとも、神経細胞により生産される物質の供給源として有用であり、また、パーキンソン病や代謝性神経疾患などの神経難病患者の脳に移植することにより、神経細胞により生産される物質の薬物送達システム等として有用である。
【００１７】
さらに、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたＳＰ細胞は、複数の種類の細胞が混在した細胞集団であると考えられるが、これらは、上記遺伝子の発現や免疫染色、腫瘍組織適合抗原の発現等によるさらなる選別を行なわなくても、そのままで移植可能であり、また、ライソゾーム内酵素を生産するので、ライソゾーム病等の代謝病治療用細胞等として有用である。従って、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離され、主要組織適合抗原クラスIIが陰性でクラスIが陰性と陽性が混在しているサイドポピュレーション細胞集団をも提供するものである。このＳＰ細胞集団も、上記本発明のＳＰ細胞と同様な条件で培養することができる。
【００１８】
下記実施例に具体的に記載されるように、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞は、脳に移植可能であることが確認された。従って、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞から成る移植用細胞をも提供する。また、下記実施例に具体的に記載されるように、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたＳＰ細胞は、βガラクトシダーゼ及びβグルコシダーゼのような、ライソゾーム内酵素を多く産生する。ライソゾーム病は、脳に好発し、代表的な脳代謝病の１種である。したがって、本発明は、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたサイドポピュレーション細胞を有効成分として含有する脳代謝病治療用細胞をも提供する。さらに、ヒト羊膜間葉細胞層から分離されたＳＰ細胞は、βガラクトシダーゼ及びβグルコシダーゼを、他の細胞に比べて特に多く生産するので、代謝病の中でも特にβガラクトシダーゼ又はβグルコシダーゼ欠損疾患のための治療用細胞として利用することができる。
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
実施例１    ＳＰ細胞の分離
１．  羊膜細胞の分離及び初代培養
(1)  インフォームドコンセント施行してから、予定帝王切開分娩の胎盤より、羊膜上皮細胞層と間葉細胞層を絨毛層から剥離して分離した。
(2)  0.25％トリプシン溶液/1.3ｍM  EDTAで37℃、15分間処理を行った。これを4回繰り返し、トリプシン溶液分画を遠心処理して細胞を集め、リン酸緩衝液（PBS）で3回洗浄した(HAEC)。
(3)  未消化細胞分画をリン酸緩衝液で洗浄後、混合酵素（0.01％パパイン、１ｍｇ/ｍｌコラゲナーゼ、0.01％DNase、0.1％中性プロテアーゼ）で３７℃、１時間振とう処理を行った。
(4)  2000ｒｐｍ、１０分間遠心し、沈さをＰＢＳで３回洗浄し、40μｍフィルターに通して混合酵素処理分画を得た(HAMC)。
(5)  両分画（HAEC及びHAMC）を、10％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ/Ｆ-１２（1：1）培養液中（ヒト白血病阻害因子（ｈＬＩＦ，イスラエル国alomone labo社製）10ng/ｍｌ、及び0.2mM 2-メルカプトエタノール（2-ＭＥ、Ｓｉｇｍａ社製）で、コラーゲンコートした培養ディッシュ上で37℃、5％ＣＯ２インキュベーター中で初代培養した。
【００２１】
２．  ＳＰ細胞の検出
(1)  初代培養細胞を0.125％トリプシン溶液/1.3ｍM  EDTAで37℃、10分間処理を行い、2000ｒｐｍ、 5分間遠心し、沈さをＰＢＳで2回洗浄した。
(2)  ＨＢＳＳ+（Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｇｉｂｃｏ社製に２％ＦＣＳ，10ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液，Ｇｉｂｃｏ社製）に懸濁し、有核細胞をカウントした。
(3)  細胞を遠心して、氷中で冷やしておいたＤＭＥＭ+（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ社製に２％ＦＣＳ，10ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液，Ｇｉｂｃｏ社製）に１ｘ106細胞/ｍＬの濃度で懸濁させ、よく混合した。
(4)  Ｈｏｅｃｈｓｔ33342色素最終濃度5μｇ/ｍＬを加えた。
(5)  細胞を混合して、37℃のウォーターバス中で、１２0分間インキュベートした。
(6)  インキュベート後、70μｍフィルターに通して冷却したまま遠心して、冷ＨＢＳＳ+（Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｇｉｂｃｏ社製に２％ＦＣＳ，10ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液，Ｇｉｂｃｏ社製）に再懸濁させた。
(7)  細胞を4℃に保ち、最終濃度2μｇ/ｍＬとなるように  ＰＩ (propidium iodide)を加えた。
(8)  (1)から(3)で調整した細胞にＨｏｅｃｈｓｔ33342色素（最終濃度5μｇ/ｍＬ）と50μＭ  Ｖｅｒａｐａｍｉｌを加え、(4)から(5)の操作を行い対象試料を得た。
(9)  EPICS ALTRA HyPerSort（ベックマン・コールター株式会社）を用いてＨｏｅｃｈｓｔ33342色素はＵＶレーザー350ｎｍで励起し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｂｌｕｅ/350ｎｍとＨｏｅｃｈｓｔ  Ｒｅｄ/675ｎｍを検出した。
【００２２】
３．  ＳＰ細胞の分離
(1)  10000個のＳＰ領域細胞をソート分離した。
(2)  分離細胞は、10％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ/Ｆ-１２（1：1）培養液中に（ヒト白血病阻害因子（ｈＬＩＦ，イスラエル国alomone labo社製） 10ng/ｍｌ、及び0.2mM   2-メルカプトエタノール（2-ＭＥ、Ｓｉｇｍａ社製）を加え、コラーゲンコートした培養ディッシュ上で37℃、5％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。
(3)  培養細胞は、平均1.2×105から2.8×105細胞/ｃｍ２で播種し、３，４日おきに継代培養を行った。
【００２３】
FACSの結果を図１に示す。上記した通り、四角形の実線で囲んだ部分がＳＰ細胞領域である。HAMCの約0.6%、HAECの約1.5%がＳＰ細胞であった。また、このSP細胞分画はMDR分子の機能阻害剤であるベラパミル(verapamil)を添加すると（図１中、「+Ver」と表示）、完全に消失した。したがって、このＳＰ両域中に含まれる細胞集団がＳＰ細胞であることが確認された。
【実施例２】
【００２４】
実施例２    ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析
(1)  トータルＲＮＡは、１０継代培養細胞からＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いて抽出した。
(2)  上記、トータルＲＮＡからＭ-ＭｕＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ロシュ社製）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。
【００２５】
5 x Incubation buffer          4 μl
10 mM dNTP mix.                2 μl
0.1 M DTT                      2 μl
Random primer                  1 μl
(or Oligo dT(18) primer)        1 μl
RNase inhibitor               0.5μl
DEPC treated water            5 μl
Reverse Transcriptase         0.5μl
RNA                           5 μl    
Total                        20 μl
【００２６】
ＰＣＲ反応は、下記条件で行った。
10ｘreaction buffer             5 μl
2.5 mM dNTP mix.                5 μl
50 μM forward primer           1 μl
50 μM reverse primer           1 μl
Distilled water                32.5μl
Taq DNA polymerase              0.5μl
cDNA                            5 μl    
Total                          50 μl
【００２７】
(プライマー)
OCT-4 (アニール温度: 62℃)
5'-ctt gct gca gaa gtg ggt gga gga a-3'
5'-ctg cag tgt ggg ttt cgg gca-3'
【００２８】
ネスチン(アニール温度: 58℃)
5'-gag agg gag gac aaa gtc cc-3'
5'-tcc ctc aga gac tag cgc at-3'
【００２９】
ムサシ-1 (アニール温度: 60℃)
5'-gaa tgg acg cct tca tgc tg-3'
5'-cgc tga tgt aac tgc tga cc-3'
【００３０】
Sox-2 (アニール温度: 60℃)
5'-ccc ccg gcg gca ata gca-3'
5'-tcg gcg ccg ggg aga tac at-3'
【００３１】
FGF-4 (アニール温度: 55℃)
5'-cta caa cgc cta cga gtc cta ca-3'
5'-gtt gca cca gaa aag tca gag ttg-3'
【００３２】
Rex-1 (アニール温度: 56℃)
5'-gcg tac gca aat taa agt cca ga-3'
5'-cag cat cct aaa cag ctc gca gaa t-3'
【００３３】
RT-PCRの結果、HAMC層由来のＳＰ細胞は、Oct-4陽性、ネスチン陽性、Sox-2陽性、FGF-4陽性、Rex-1陽性であった（ムサシ−１は、第６継代細胞では陰性、第１１代継代細胞では陽性）。Oct-4は、体外培養可能な未分化細胞株であるES細胞、EC細胞やEG細胞にのみ発現する未分化状態維持に働くマスター遺伝子であるから、本発明のHAMC層由来ＳＰ細胞が多能性幹細胞であることが明らかになった。また、ネスチンは、神経幹細胞マーカーであるから、本発明の細胞は、少なくとも神経幹細胞である、すなわち、神経細胞に分化可能であることが明らかになった。また、Oct-4遺伝子の下流遺伝子のうち、Sox-2とRox-1（コファクター）との協同で Rex-1が活性化されていることが報告されている。したがって、上記結果は未分化状態維持に働いていることが明らかになった。
【実施例３】
【００３４】
実施例３    免疫染色
(1)  培養細胞を4％パラホルムアルデヒドで1分間固定し、一次抗体で室温2時間インキュベートした。
(2)  0.3％  ＴｒｉｔｏｎＸ100（商品名）で希釈した二次抗体で2時間インキュベートした。
(3)  免疫ブロットした細胞は、オリンパス社製ＩＸ１０蛍光顕微鏡で観察し、オリンパス社製Ｆｌｕｏｖｉｅｗレーザー走査顕微鏡を用いた共焦点画像により分析した。
(4)  各細胞マーカーは、一次抗体として、抗ヒトネスチンポリクローナル抗体（Dr. Okano供与）、抗ヒトムサシ-1モノクローナル抗体（Dr. Okano供与）、ＣＫ１９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）、ビメンチン（ＰＲＯＧＥＮ社製）、ＣＤ４（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ８（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ１３（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ１５（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ２９（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ３４（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ３８（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ４３（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ４４（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ４５（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ４９ｂ（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ５０（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ５６（IMMUNOTECH社製）、Thy-1（IMMUNOTECH社製）、ＣＤ１０６（IMMUNOTECH社製）、c-kit（IMMUNOTECH社製）、ＨＬＡ−ＤＲ（Ancell社製）、ＨＬＡ  ＣｌａｓｓＩ（社製）、Flt-1（SANT CRUZ社製）、AFP（DAKO社製）を用い、二次抗体としては、抗ラビットＩｇＧローダミン（１：１００  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）および抗ラビットＩｇＧ  ＦＩＴＣ（ＺＹＭＥＤ社製）を用いて常法にしたがって行った。
【００３５】
その結果、本発明のHAMC層由来ＳＰ細胞は、ビメンチン陽性、CK19陽性であり、ＣＤ２９、ＣＤ４４、Flt-1、ネスチン弱陽性である。ＨＬＡ  ＣｌａｓｓIIは陰性であるが、ＨＬＡ  ＣｌａｓｓI陽性細胞と陰性細胞が混在しており、その他は陰性であった。
【実施例４】
【００３６】
実施例４    ＳＰ細胞の脳内移植
インフォームドコンセントを実施し、提供された胎盤組織から羊膜を剥離し、実施例１と同様にしてＳＰ細胞集団を分離した。得られたSP細胞集団をPKH26色素で染色、標識した。これは具体的には次のようにして行なった。すなわち、PKH26色素に緩衝液500μlを加え、室温に５分放置した。その後血清500μlを加えて遠心し、リン酸緩衝液で洗浄した。次いで、染色後の細胞約5 x 104〜2 x 105個を、ラット（Wistar Rat 8W オス）の脳内（海馬）に移植した。これは具体的には次のようにして行なった。ラットをネンブタール注射による麻酔を施し、片側の頭骸骨に小穴を形成して、脳内に細胞を注入した。細胞移植後１週間して、ラットをエーテルで麻酔した。4%パラホルムアルデヒドで環流固定をおこなってから脳を取り出し、脳を組織固定した後、薄切標本を作製した。薄切標本を蛍光顕微鏡で観察した。
【００３７】
結果
ラット脳内に移植したSP細胞は脳梁に沿って遊走し、反対側の脳へ至る広範囲な移動を認めた。さらに歯状回に生着した一部のSP細胞は、当初の類円形から突起を周囲の組織に進展する神経細胞様の形態に変化していた。このように、移植したＳＰ細胞は、脳に生着し、その形態を神経細胞様に変化させることから、本発明のＳＰ細胞は脳に移植可能であることが確認された。
【実施例５】
【００３８】
実施例５    ＳＰ細胞によるライソゾーム内酵素の生産
インフォームドコンセントを実施し、提供された胎盤組織から羊膜を剥離し、実施例１と同様にしてＳＰ細胞集団を分離した。得られたSP細胞による、下記表１に示す１７種類の酵素の生産を次のようにして調べた。
【００３９】
【表１】
2004254682.tif 000003
【００４０】
(1)  酵素試料作製
凍結保存した培養細胞ペレットに蛋白濃度0.5〜1mg/mLになるように精製水を加え、超音波ホモジナイザー(ブランソン モデル250)にてソニケーションし、酵素試料とした。
【００４１】
(2)  蛋白濃度測定
ピロガロールレッド法(マイクロTPテストワコー(和光純薬工業)）にて酵素液中の総蛋白を定量した。
【００４２】
(3)  酵素活性の測定
〔酵素1〕
酵素試料に基質を加え、37℃で1時間インキュベーションした後、停止液を加えた。
〔酵素2〕
酵素試料に基質を加え、37℃で4時間インキュベーションした後、LEBTを加え、更に37℃で24時間インキュベーションし、停止液を加えた。
〔酵素3〕
酵素試料に基質を加え、37℃で17時間インキュベーションした後、α-グルコシダーゼを加え、更に37℃で24時間インキュベーションし、停止液を加えた。
〔酵素5〕
酵素試料に基質を加え、37℃で17時間インキュベーションした後、停止液を加えた。
〔酵素6〕
酵素試料に基質を加え、37℃で17時間インキュベーションした後、β-グルコシダーゼを加え、更に37℃で24時間インキュベーションし、停止液を加えた。
酵素1〜3、5、6は停止液を加えた後、プレートリーダー(モレキュラーデバイス Spectra max)にて、EX：365nm、EM：450nmにおける蛍光強度を測定した。
〔酵素8〜16〕
酵素試料に基質を加え、37℃で1時間インキュベーションした後、停止液を加えた。その後、蛍光分析システム(日本分光)にて、EX：365nm、EM：450nmにおける蛍光強度を測定した。
〔酵素7、17〕
酵素試料に基質を加え、37℃で30分間インキュベーションした後、停止液を加えた。酵素7は37℃で30分間と90分間インキュベーションした後、それぞれ、停止液を加えた。その後、分光光度計(日立U3300)にて、515nmにおける吸光度を測定した。
〔酵素4〕
酵素試料に基質を加え、37℃で18時間インキュベーションした後、停止液を加えた。その後、プレートリーダー(モレキュラーデバイス Spectra max)にて400nmにおける吸光度を測定した。
（「酵素」の後の数字は、表１に示す、各酵素に付された番号を示す）
【００４３】
結果を下記表２に示す。表２に示されるように、７種類の酵素（イズロネート-2-スルファターゼ、ヘパラン-N-スルファターゼ、β-グルコシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-フコシダーゼ、アリルスルファターゼA) で白血球又は線維芽細胞における酵素活性の２倍を超えた。特に、β−ガラクトシダーゼとβ−グルコシダーゼは、それぞれ4.2倍、２５倍と非常に活性が高かった。従って、本発明のＳＰ細胞は、これらの酵素の欠損疾患治療用細胞として有用である。
【００４４】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例において、ヒト羊膜間葉細胞(HAMC)層及びヒト羊膜上皮細胞(HAEC)層から分離した細胞についてのFACSの結果を示す図である。
【図１】
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【配列表】
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