(57)【要約】【課題】哺乳類の癌、特にヒト癌、特に乳癌の癌検出、診断、予防、治療薬として優れた働きをする新規ペプチド、該ペプチドからなる抗原、該抗原に対する抗体を提供する。特に乳癌に対して癌細胞の転位を妨げる働きをするとともに、副作用の少ない哺乳類の癌、特にヒト癌、特に乳癌の癌診断、予防、治療薬を提供する。【解決手段】下記（Ａ）のペプチド、またはその薬理活性を示す誘導体。一般式（１）で表されるペプチド、または、その薬学的に許容される誘導体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式一般式（１）で表されるペプチド、または、その薬学的に許容される誘導体。
【化１】
2004155745.tif 000021
［式中、Ａはアラニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｎはアスパラギン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｖはバリン、Ｙはチロシン、Ｘはアスパラギン酸のカルボキシルに結合している直鎖状、または分岐状ペプチドを表す］
【請求項２】
直鎖状、または分岐状ペプチドがリジン３個とグリシン１個との結合体であることを特徴とする請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１〜２のペプチドからなることを特徴とする抗原。
【請求項４】
請求項１〜２のペプチドを含むことを特徴とする抗癌ワクチン。
【請求項５】
アジュパントを更に含むことを特徴とする請求項４記載の抗癌ワクチン。
【請求項６】
癌が乳癌であることを特徴とする請求項５記載の抗癌ワクチン。
【請求項７】
請求項３記載の抗原に対する抗体。
【請求項８】
抗体がヒト型抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗体。
【請求項９】
請求項７〜８の抗体を含むことを特徴とする癌の検出、診断、予防、治療薬。
【請求項１０】
癌が乳癌であることを特徴とする請求項９記載の検出、診断、予防、治療薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチド、該ペプチドからなる抗原、該抗原を含む抗癌ワクチン、該抗原に対する抗体、該抗体を含む癌診断、予防、治療薬に関する。本発明は特に乳癌に対する抗癌ワクチン、癌診断、予防、治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アメリカの癌学会の発表では、２００１年アメリカにおいて癌と診断された患者１３０万人のうち約１５％が乳癌の患者であると言われている。乳癌は女性に多い癌であるが、患部を切除した場合、スタイルを損なうことから切除しなくてもよい癌診断、予防、治療薬が望まれている。
【０００３】
現在までに乳癌に効果的な癌診断、予防、治療薬としては、ピリミジン代謝拮抗剤、ナイトロジェンマスター系薬剤、アリジリン系薬剤、抗生物質系薬剤、ホルモン作用薬剤などが使用されているが、これらはいずれも副作用があり、かつ癌細胞の転移を妨げる働きに劣るため、外科的切除部分を大きくとる必要がある等の問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ＨＩＶの研究において７回膜貫通型のケモカインレセプターＣＸＣＲ４に関する研究を行ってきた過程において、癌細胞と非癌細胞でＣＸＣＲ４の高次構造が異なっていることを見出した。本発明は、この事実をヒントに乳癌における新規分子標的薬への展開を行ったものである。
【０００５】
本発明の目的は、哺乳類の癌、特にヒト癌、特に乳癌に効果的な癌診断、予防、治療薬、その癌診断、予防、治療薬のベースとなる抗原、および抗体を提供することにある。本発明は特に乳癌に対して癌細胞の転位を妨げる働きをする癌診断、予防、治療薬、そのベースとなる抗原、および抗体を提供することにある。本発明の他の目的は副作用の少ない癌診断、予防、治療薬、そのベースとなる抗原、および該抗原に対する抗体を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、乳癌細胞に特異的なケモカインレセプター（ＣＸＣＲ４）を構成するペプチドの一部のアミノ酸配列に相同するペプチドを人為的に作製した。そしてこのペプチドを抗原とする抗体が特に乳癌に対する抗癌作用に優れていることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
【０００７】
（１）下記式一般式（１）で表されるペプチド、または、その薬学的に許容される誘導体。
【化２】
2004155745.tif 000002
［式中、Ａはアラニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｎはアスパラギン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｖはバリン、Ｙはチロシン、Ｘはアスパラギン酸のカルボキシルに結合している直鎖状、または分岐状ペプチドを表す］
【０００８】
（２）直鎖状、または分岐状ペプチドがリジン３個とグリシン１個との結合体であることを特徴とする上記（１）記載のペプチド。
【０００９】
（３）（１）または（２）記載のペプチドからなることを特徴とする抗原。
【００１０】
（４）（１）または（２）記載のペプチドを含む抗癌ワクチン。
【００１１】
（５）アジュパントを更に含む（４）記載の抗癌ワクチン。
【００１２】
（６）癌が乳癌である（４）または（５）記載の抗癌ワクチン。
【００１３】
（７）（３）記載の抗原に対する抗体。
【００１４】
（８）抗体がヒト型抗体である（７）記載の抗体。
【００１５】
（９）（７）または（８）記載の抗体を含むことを特徴とする検出、診断、予防、治療薬。
【００１６】
（１０）癌が乳癌であることを特徴とする（９）記載の検出、診断、予防、治療薬。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態につき詳しく説明する。
（１）本発明のペプチド
本発明のペプチドは、下記（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのペプチドである。
ペプチド（Ａ）：下記一般式（１）で表されるペプチド
【化３】
2004155745.tif 000003
［式中、Ａはアラニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｎはアスパラギン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｖはバリン、Ｙはチロシン、Ｘはアスパラギン酸のカルボキシルに結合している直鎖状、または分岐状ペプチドを表す］
ペプチド（Ｂ）：下記一般式（１）において、薬理的に許容される誘導体。
【００１８】
［ペプチド（Ａ）］
本発明におけるペプチド（Ａ）は、下記一般式（２）
【化４】
2004155745.tif 000004
で示される１２個のアミノ酸（の誘導体）が環状構造を形成してなるペプチド（ａ）に直鎖状、または分岐状ペプチド（ｂ）を結合させた構造を有する。
【００１９】
本発明のペプチド（Ａ）における環状ペプチド（ａ）の部分が上記構造をしていることは、後述の実施例で示すように、マススペクトルにおいて、１３１７．７ｍ／ｚに強いピークが出ることより確認することができる。
【００２０】
ペプチドＢは、上記ペプチドＡを構成するアミノ酸の遊離基の一部もしくは全部が保護されている誘導体である。すなわち、ペプチドＢはペプチドＡを構成する１２のアミノ酸のうち、アミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸の場合は、遊離カルボキシル基が低分子アルコールまたはフェノール類によりエステル基として保護されている誘導体、アミノ酸がアスパラギンの場合は、遊離カルボン酸アミド基が低分子量アルコールによりアルキルアミド基として保護されているアスパラギン、アミノ酸がアルギニンの場合は、グアニジル基がペンタメチルヒドロベンゾフラン−５−スルフォニル（ｐｄｆ）等によりスルホアミド基として保護されているアルギニン、アミノ酸がセリンの場合は、遊離アルコール基がエーテル基またはエステル基として保護されているセリン、アミノ酸がチロシンの場合は、そのベンゾール基が低分子量アルコールにより保護されているチロシン等の誘導体で構成されているペプチドである。
【００２１】
本発明のペプチド（Ａ）を構成する環状ペプチド（ａ）は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、チロシン（Ｔｙｒ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）を原料とし、合成される。
【００２２】
ペプチド（ａ）合成に用いるアミノ酸のうち、分子中に遊離カルボン酸基を有するアミノ酸であるアルギニン、グルタミン酸を用いて合成する場合、これらのアミノ酸の合成に関与しない遊離カルボン酸基を低分子量アルコール、またはフェノール類でエステル基として保護しているものを用いることが好ましい。
【００２３】
このようなカルボン酸基の保護のために用いることのできる低分子量アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、イソペンタノール等を挙げることができる。これらのうちではｔｅｒｔ−ブタノールが最も好ましい。
【００２４】
フェノール類とは、フェノール、トルオール、クレゾール、キシレノール、クミルアルコール、ベンジルアルコ−ル、レゾルシン等を挙げることが出来る。これらの中ではベンジルアルコールが最も好ましい。
【００２５】
ペプチド（ａ）合成に用いるアミノ酸のうち、分子中に遊離ベンゾール基を有するアミノ酸であるチロシンを用いて合成する場合、これらのアミノ酸の合成に関与しない遊離ベンゾール基をエーテル基として保護しているものを用いることが好ましい。この保護に用いることのできる低分子量アルコールとしては、具体的には前記したアルコール類を用いることが出来る。
【００２６】
ペプチド（ａ）合成に用いるアミノ酸のうち、分子中に遊離アミノ基を有するアスパラギン、あるいは遊離グラニジール基を有するアルギニンを用いて合成する場合、アミノ基を酸アミド基として、あるいは遊離グラニジール基をスルホアミド基として保護しておくことが好ましい。このような、アミド基を形成するため用いられるアルコールとしては、前記したアルコール等を挙げることができる。これらのうちではアミド基形成の場合はｔｅｒｔ−ブタノールが、遊離グラニジール基のスルホアミド化の場合はペンタメチルヒヒドロベンゾフランー５−スルフォニル（ｐｄｆ）が最も好ましい。
【００２７】
ペプチド（ａ）合成に用いるアミノ酸のうち、分子中に遊離水酸基を有するセリン、チロシンを用いて合成する場合、水酸基を有機弱酸でエステル基として、またはアルコールでエーテル基として保護しておくことが好ましい。このような、有機弱酸あるいはアルコールとしては、具体的には前記した酸またはアルコール等を挙げることができる。これらのうちでは  ターシャルブチル（ｔｅｒｔ−Ｂｕ）アルコールによりエーテル基として保護する方法が最も好ましい。
【００２８】
《本発明のペプチドの合成》
本発明のペプチド（Ａ）の製造において、環状ペプチド（ａ）を合成するには、まず１２個のアミノ酸からなる直鎖状ペプチドを合成する。この１２個のアミノ酸からなる直鎖状ペプチド（ａ）を合成するには、各種の市販のペプチド合成器、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のペプチド合成器等を用いてを用いて、公知の合成方法によりことができる。例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる。
【００２９】
ペプチド（ａ）の合成において、直鎖状ペプチドの合成に用いることの出来る溶媒としては、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）アセトニトリル、塩化メチレン等を挙げることができる。これらのうちでは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリルが好ましい。
【００３０】
上記方法において、本発明の環状ペプチド（ａ）を合成する際のアミノ酸の重合手順としては、例えば、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙの順に合成する。
【００３１】
上記反応により１２個のアミノ酸からなる直鎖状ペプチドが合成される。次に本発明のペプチドの製造においては、この直鎖状ペプチドを環化する。
環状ペプチド（ａ）の環化反応に用いることの出来る触媒としては、カルボジイミド、ベンゾトリアゾールオキシジメチルアミノホスフォニュウム  ヘキサフルオロフォスフェート（ＢＯＰ）等を挙げることができる。これらのうちではベンズトリアゾールオキシジメチルアミノホスフォニュウムヘキサフルオロフォスフェート（ＢＯＰ）が好ましい。
【００３２】
環化反応はジメチルフォルムアミドを溶媒とし、上記触媒の存在下、室温で縮重合することにより行うことができる。
【００３３】
本発明のペプチド（Ａ）を構成する直鎖状または分岐状ペプチド（ｂ）は、抗体にペプチド（ａ）を抗原として認識させるペプチドタグおよび免疫活性化剤としての役割を果たす。このようなペプチドタグは市販されており、例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓタグなどを具体的に例示することができる。本発明で用いるペプチドタグとしては、リジン３個とグリシン１個との結合体であることが好ましい。このようなペプチドからなるタグは、例えばノババイオケム社からＭＡＰ−ｒｅｓｉｎ（マルチ抗体樹脂）として購入することができる。
【００３４】
上記したペプチド（ｂ）とペプチド（ａ）との結合は、例えばピペリジンを含有するジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）やアセトニトリル等の溶媒中で、ペプチド（ａ）のアルギニンの保護基であるＦｍｏｃ基の脱保護を行い、ベンゾトリアゾールオキシジメチルアミノホスフォニュウムヘキサフルオロフォスフェート（ＢＯＰ）等の触媒を用いて縮重合することにより行うことができる。ペプチド（ａ）とペプチド（ｂ）との結合はＰＩＣＯ−ＴＡＧアミノ酸組成分析により確認することができる。
【００３５】
《本発明の抗原》
本発明は上記ペプチドからなる抗原である。本発明における抗原とは、哺乳動物に投与すると特異的に結合する抗体が産生される免疫誘導活性を有する物質をいう。
【００３６】
《本発明の抗原からなる検出・診断・予防・治療薬》
本発明の抗原は、乳癌をはじめとする膵臓癌、脳腫瘍（グリオーマ）、悪性黒色腫（メラノーマ）、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、乳癌、大腸癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、肉腫等の各種癌の診断、予防、治療に有用であり、免疫誘導活性の促進又は抑制物質のスクリーニングや、検出の試薬などに用いることができる。
【００３７】
本発明の抗原は、特に、そのままあるいはアジュパントに分散させた状態で、特に乳癌に対する抗癌ワクチンとして人体に投与することができる。
【００３８】
本発明のペプチドを有効成分として含有する抗原を経口、静脈、皮内、皮下注射等により投与すると、インビボにおける抗体誘導活性が増大することによる抗癌効果が期待できる。また本件乳癌抗原を強力な抗原提示細胞である樹状細胞にインビボあるいはインビトロで発現させて、その抗原発現樹状細胞投与により免疫誘導を行うことができる。
【００３９】
用いられるアジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ＢＣＧ，トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）、リボ多糖（ＬＰＳ），ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント等が挙げられる。
【００４０】
《本発明の抗体》
本発明はまた、前記本発明のペプチドを抗原とする抗体である。
本発明における「抗体」とは、抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に産生されるタンパク質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものをいう。
【００４１】
本発明の前記ペプチドに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができる。その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点で好ましく、特に本発明のペプチドとＨＬＡとの複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体がより好ましい。
【００４２】
《抗体の製造方法１（ポリクローナル抗体の製造方法）》
本発明の抗体のうちポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを抗原として哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製する公知の方法により製造することが出来る。
【００４３】
例えば、本発明の抗原ペプチドをアジュパント中に懸濁させ、該懸濁液を
例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物の皮下または真皮内に投与することにより免疫することができる。免疫感作の方法は当業者に公知であり、例えば抗原を、例えば７〜３０日間隔で２〜３回投与すればよい。投与量は１回につき、例えば抗原を約０．０５〜２ｍｇ程度とすることができる。
【００４４】
免疫感作した哺乳動物を−定期間飼育した後、抗体価が上昇してきたら、抗原の追加免疫を行うことが出来る。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム又はポリエチレングリコールを用いて沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の常法によって、分離・精製することによりポリクローナル抗血清として、本発明の抗原ペプチドを認識するポリクローナル抗体を得ることが出来る。
【００４５】
用いられるアジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ＢＣＧ，トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）、リボ多糖（ＬＰＳ），ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント等が挙げられる。
【００４６】
《抗体の製造方法２（モノクローナル抗体の製造方法）》
本発明のモノクローナル抗体は公知のハイブリドーマ法で製造することができる。すなわち、本発明の抗原ペプチドを、懸濁し、例えば、マウスの皮下または真皮内に投与する。
【００４７】
用いられるアジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ＢＣＧ、トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント等が挙げられるが、抗体の誘導能等の関係から、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）とフロイントの不完全アユバント（ＦＩＡ）とを組み合わせて使用することが好ましい。
【００４８】
マウスは前記初回免疫後、更に、追加免疫を数回行い、適当な日数を経過した後に部分採血を行い、抗体価を測定する。この抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ方により測定することが出来る。
【００４９】
ついで、感作の終了したこれらの動物から脾臓を摘出し、得られた脾臓細胞を標準的な方法でミエローマ細胞と融合させて抗体を産生するハイブリドーマを作製する。例えば、マウスの場合には、頸椎脱臼によって屠殺し、脾臓を摘出し、摘出した脾臓を、例えば、ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中に置き、ピンセットで細胞を押し出して脾臓リンパ球を得る。こうして得られた脾臓リンパ球を、トリパンブルー等の染色液で染めてバイアブルカウントし、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマとする。
【００５０】
用いられるミエローマ細胞としては、特に限定されるものではなく，公知のものを使用できる。例えば、マウスのものとしては、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−０１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１（ＮＳ４）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２）等を挙げることができる。ミエローマ細胞を選択するに際しては、抗体産生細胞との適合性を考慮する必要がある。
【００５１】
細胞の融合は、センダイウイルス法、ポリエチレングリコール法、プロトプラスト法等、当業者に公知の方法で行えばよく、特に限定されないが、ポリエチレングリコール法で融合させる方法が、細胞毒性も比較的少なく、融合操作も簡単であるという理由から好ましい。
【００５２】
得られたハイブリドーマを、常法に従って、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン含有培地）中で適当な期間培養し、ハイブリドーマの選択を行う。次いで、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを得るためのスクリーニングを行った後、クローニングを行う。
【００５３】
スクリーニング法としては、抗体を検出するための公知の方法を用いることができる。例えば、酵素イムノアッセイ（以下「ＥＬＩＳＡ」という）法、ラジオイムノアッセイ（以下「ＲＩＡ］という）法、プラーク法、凝集反応法などを用いることができる。また、クローニング法としては、免疫学的に公知の方法を用いればよく、限界希釈法、軟寒天法およびＦＡＣＳ法などを使用できる。
【００５４】
前記のようにして得たハイブリドーマを、適当な培地中で培養するか、あるいはハイブリドーマと適合性のある、例えばマウス腹腔内に投与する。これにより得られる培養液中または腹水中から塩析、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィなどの常法により、所望のモノクロ−ナル抗体を単離精製することができる。
【００５５】
《ヒト型抗体》
ヒト以外、例えば、マウスから産生されるモノクローナル抗体は、マウスの抗体であるため、ヒトに投与すると、抗マウス抗体が出来てしまう。これを防ぐために、抗体をヒトが産生するヒト型抗体とすることが必要である。マウスからヒト型抗体を産生するためには、マウスの遺伝子にヒト遺伝子を結合させたキメラマウスを作り、このキメラマウスに本発明の抗原を投与して抗体を産生させるようにすることが好ましい。
【００５６】
《本発明の抗体からなる検出薬、診断薬》
本発明の抗体は乳癌をはじめとする癌細胞の検出薬として用いることができる。本発明の抗体を用いて、癌細胞を検出する方法としては、免疫学的測定法、例えば、免疫沈降法、免疫凝集法、標識免疫測定法、免疫比ろう法、免疫比濁法などを用いることができる。これらのうちでは、特に標識免疫測定法が乳癌に対するモノクローナル抗体を高感度に検出できるため好ましい。
【００５７】
標識免疫法では、検体中の抗体価を標識抗体を用いて直接測定する方法のほかに、既知濃度あるいは既知抗体価の抗原ペプチドをエピトープとする抗体を標準液として用いることで相対的に表すこともできる。すなわち、標準液と検体を同測定系にて同時に測定し、標準液の値を基準にして検体中の抗体価を相対的に表すことができる。
【００５８】
前記標識免疫測定法としては、公知の測定法が応用できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法などが挙げられる。用いる標識物質は、前記の測定法に応じて、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、および化学発光化合物などを適宜選択すればよい。
【００５９】
前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどを挙げることができる。前記の標識物質はアビジン−ビオチン複合体を用いることにより、標識物質の検出感度を向上させることも可能である。また放射性同位体としては、主に１２５Ｉが、蛍光化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などが挙げられる。化学発光化合物としては、ロフィン、ルミノール、ルシゲニンなどが挙げられる。前記の標識物質は、常法に従って標識して使用することができる。
【００６０】
《標準免疫測定法》
標識免疫測定法により、本発明のペプチドからなる抗原に対する抗体を検出する測定系は、公知の非競合反応系あるいは競合反応系を用いて構築することができる。非競合反応系においては、固相が必要である（固相法）。競合反応系においては、必ずしも固相を必要としない（液相法）が、固相を用いた方が、測定操作が簡便であり好ましい。固相の材質として、ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、セルロースなどが挙げられ、固相の形状としては、球状、ウェル状、チューブ状、シート状など標識免疫測定法に用いられる公知のものを応用できる。
【００６１】
本発明の抗原または抗体を用いて乳癌等の癌を検出する場合、検査のための検体は希釈液に分散させた状態で検査を行う。本発明における希釈液とは、例えば検体を希釈するために使用するもので、例えばＰＢＳ（生理的リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）、１３７ｍＭの塩化ナトリウムおよび３ｍＭの塩化カリウムを含むｐＨ７．４で２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（以下、「ＴＢＳと」略す）、０．０５％ツイーン２０や０．１〜１％のＢＳＡを含有させたＰＢＳあるいはＴＢＳなどがあげられる。この検体用希釈液は、検体のほか抗原や抗体の希釈の場合にも用いられる。
【００６２】
《本発明の抗体からなる予防薬、治療薬》
本発明の抗体は、本発明の抗体に特異的に結合する抗原を含有する乳癌、脳腫瘍、悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、乳癌、大腸癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、肉腫等の予防・治療薬として用いることができる。
【００６３】
本発明の抗原または抗体を予防薬、治療薬として用いる場合は、そのまま、あるいは医学的に許容される担体及び／又は希釈剤とともに必要に応じて下記の補助剤も加えて、注射剤として投与することができるし、噴霧などの方法で粘膜から経皮吸収などで投与してもよい。なお、ここでいう担体とは、例えば、ヒト血清アルブミンを挙げることができ、希釈剤としては、例えば、緩衝液、食塩水、蒸留水等を挙げることができる。
【００６４】
本発明の予防薬、治療薬の投与量は、成人一人当り０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲になるように投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。製剤の形態も特に限定されず、凍結乾燥したものや、糖などの賦形剤を加えて顆粒状にしたものでもよい。
【００６５】
【発明の効果】
本発明の抗原、抗体は哺乳類の癌、特にヒト癌、特に乳癌の検出、診断、予防、治療薬として優れている。本発明の治療薬は特に乳癌に対して癌細胞の転位を妨げる働きをする。本発明の診断、予防、治療薬は生体の免疫反応を利用しているため、副作用が少ないという利点を有する。
【００６６】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明につき更に詳しく説明するが、本発明はその要旨を超えない限りこれらの実施例になんら制約されるものではない。
【００６７】
【実施例１】
１−１）  本発明の免疫抗原（ｃＤＤＸ４−ＭＡＰ）の合成と調製
１．１．  実験材料
１．１．１．  試薬
用いた試薬を下記に示す。試薬はすべてペプチド合成用、特級またはそれに準ずるものを用いた。
Ｈ−Ｇｌｙ−２−クロロトリエチルクロライト゛レシ゛ン        ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ  （ＯＢｚｌ）−ＯＨｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ  （Ｔｒｔ）−ＯＨ  ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ        ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ  （ｔＢｕ）−ＯＨ  ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ  （ＯｔＢｕ）−ＯＨｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ        ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ  （ＯｔＢｕ）−ＯＨｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ  （Ｐｍｃ）−ＯＨ  ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ  （ｔＢｕ）−ＯＨ  ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ        ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
ｍ−クレソ゛ール            和光純薬製
チオアニソール              和光純薬製
１，２−エタンシ゛チオール        和光純薬製
ＴＭＢＳ    信越シリコーン製
ＴＦＡ    Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｊａｐａｎ社製
シ゛エチルエーテル            和光純薬製
ＤＭＦ    Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｊａｐａｎ社製
ＴＦＥ    Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｊａｐａｎ社製
ＤＣＭ    Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｊａｐａｎ社製
アセトニトリル              和光純薬製
ＢＯＰ    Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｊａｐａｎ社製
酢酸    和光純薬製
パラジウム炭素              片山化学製
Ｆｍｏｃ−ＭＡＰ  レジン  （４分岐）    Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｊａｐａｎ社製
Ｎ−メチルモルホリン            和光純薬製
【００６８】
１．１．２．  実験装置
ペプチド合成機  ４３１Ａ        Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｊａｐａｎ社製
【００６９】
１．２．  実験方法
《ペプチドＡ（ｃＤＤＸ４）の合成》
９−フルオレニルメトキシカルホ゛ニル  （Ｆｍｏｃ）化学に従い、
Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−レジンの合成を行なった。ペプチド合成に関しては、各アミノ酸残基の保護基を切断することなく、弱酸でペプチドをレジンから遊離できる２−クロロトリエチルクロライドレジンを用い、また合成プログラムは、ペプチド合成機４３１ＡのＦａｓｔ  ＭｏｃＴＭサイクル、０．２５  ｍｍｏｌスケールを使用した。
【００７０】
全自動合成で得られた側鎖保護直鎖ペプチドレジン３００  ｍｇに酢酸  ：  ＴＦＥ  ：  ＤＣＭ＝１：  １：  ８混液  ５  ｍｌを加え、室温で３０分間撹拌した。ガラスフィルターを用いて濾過し、濾液に冷エーテルを加えて、生じた沈殿に適当量のアセトニトリルを加えて凍結乾燥した。
【００７１】
《環化反応》
５０  ｍｌの１０％  ＴＦＥ  を含む  ＤＭＦに対して得られた側鎖保護直鎖ペプチド１００  ｍｇを加え、次に縮合剤であるＢＯＰをペプチドの５倍当量加えて、室温で２４時間撹拌し反応させた。水２ｍｌを加えて反応を停止させ、加温、減圧下３  ｍｌに濃縮した。約４０  ｍｌの水を加え、遠心して沈殿と上清に分離し、沈殿を冷水で２回洗って、アセトニトリルを用いて凍結乾燥し、ｃＤＤＸ４を得た。
【００７２】
ｃＤＤＸ４と直鎖ドデカペプチドの混合物である凍結乾燥粉末に１００％  アセトニトリル２  ｍｌを加え、２７７００  ｇで１０  分間遠心後上清を回収した。沈殿には再び１００％  アセトニトリル２  ｍｌを加えて同じ操作を行い、上清を合わせた。この上清に少量の水を加えて凍結乾燥した。
【００７３】
《ｃＤＤＸ４の構造分析結果》
ペプチド合成機で側鎖保護直鎖ドデカペプチドを合成し、環状を形成させた側鎖保護環状ドデカペプチドを常法に従い、脱保護し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  により分析した（図２）。その結果、直鎖ドデカペプチドは実測質量数１３３５．２  ［Ｍ＋Ｈ］＋（理論値  １３５３．４）及び環状ドデカペプチド  （ｃＤＤＸ４）  １３１７．７  ［Ｍ＋Ｈ］＋（理論値  １３３５．４）であった。理論値より１８低い実測値は、Ａｓｐのカルボシル基による脱水環化物形成に起因すると考えられる。従って、本研究で用いた免疫抗原ｃＤＤＸ４が目的の環状ドデカペプチドであることが確認された。
【００７４】
《ペプチドＡとペプチドＢの結合》
側鎖保護ｃＤＤＸ４をＤＭＦ１０  ｍｌに溶解し、パラジウム炭素５０  ｍｇを加えて水素ガスで１２時間接触還元し、ＡｓｐのＣＯＯＨ基の保護基ＯＢｚｌ基を除いた（側鎖保護ｃＤＤＸ４−ＣＯＯＨ）。その後、濃縮して水を加えて生じた沈殿を冷水で２回洗い、凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末に１００％  アセトニトリルを加えて、側鎖保護ｃＤＤＸ４−ＣＯＯＨを溶解し、パラジウム炭素粉末と分離させ、再び凍結乾燥して側鎖保護ｃＤＤＸ４−ＣＯＯＨ得た。
【００７５】
Ｆｍｏｃ−ＭＡＰ−（４）−レジン  １  ｇをＤＭＦで膨潤させ、２０％  ピペリジン含有  ＤＭＦ１０  ｍｌを加え室温で３０分間撹拌した。反応後、レジンをＤＭＦ１０  ｍｌで３回、イソプロパノール  １０  ｍｌで３回洗浄した。得られたＭＡＰ−（４）−レジンは４  ℃で保存し適量ずつ用いた。側鎖保護ｃＤＤＸ４−ＣＯＯＨ、ＨＯＢｔ、ＢＯＰとＮＭＭ  をペプチド：ＨＯＢｔ：ＢＯＰ：ＮＭＭ  ＝２：２：２：３となるように  １０  ｍｌのＤＭＦに溶解させ、ＤＭＦで膨潤させた当量のＭＡＰ−（４）−レジンとＢＯＰ法で結合させた。側鎖保護ｃＤＤＸ４−ＭＡＰ−レジンを常法に従って脱保護し、ｃＤＤＸ４−ＭＡＰを得た。なお、実験方法の概略を図１に示す。また、ｃＤＤＸ４の合成の確認はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  マススペクトル（図２）で行った。
【００７６】
【実施例２】
１−２）  スクリーニング用抗原作成
１．２．１    実験材料
用いた試薬を以下に示す。試薬はすべてペプチド合成用、特級またはそれに準ずるものを用いた。
Ｍｕｌｔｉ−Ｐｉｎ  Ｎｏｎ  Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ９６ヒ゜ンフ゛ロックトレイセット    ＣＨＩＲＯＮ  ＭＩＭＯＴＯＰＥＳ社製
側鎖保護ｃＤＤＸ４−ＣＯＯＨ        当研究室にて合成
ピペリジン  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｊａｐａｎ社製
ＢＯＰ    ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ社製
ＨＯＢｔ    和光純薬製
ＮＭＭ    和光純薬製
ｍ−クレソ゛ール            和光純薬製
チオアニソール              和光純薬製
ＴＦＡ    Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｊａｐａｎ社製
１，２−エタンシ゛チオール        和光純薬製
ＴＭＢＳ    信越シリコーン製
メタノール  和光純薬製
【００７７】
１．２．２    実験方法
ペプチドＡ（ｃＤＤＸ４）ピンの先端の王冠部分を２０％  ピペリジンを含むＤＭＦ溶液に浸しｃＤＤＸ４に連結しているスペーサー分子のＦｍｏｃ基の脱保護を行い、ＤＭＦ及びメタノールで洗浄した。ペプチド：ＨＯＢｔ：ＢＯＰ：ＮＭＭ  ＝２：２：２：３となるように、側鎖保護ｃＤＤＸ４−ＣＯＯＨをＨＯＢｔ、ＢＯＰ及びＮＭＭを含むＤＭＦに溶解した。この溶液を９６  ウエルプレートに加え、側鎖保護ｃＤＤＸ４−ＣＯＯＨを結合させた。常法に従い、側鎖保護ｃＤＤＸ４の保護基を脱保護し、メタノールで洗浄後、風乾し密閉容器中４℃にて保存した。ｃＤＤＸ４へのペプチドの結合はＰＩＣＯ−ＴＡＧアミノ酸組成分析により確認した。
【００７８】
１−３）  ハイブリドーマ調製
１．３．  抗原溶液の調製とマウスへの免疫
１．３．１．  実験材料
１．３．１．１．  試薬
用いた試薬を以下に示す。試薬はすべてペプチド合成用、特級またはそれに準ずるものを用いた。
ｃＤＤＸ４−ＭＡＰ    当研究室にて合成
ＦＣＡ    Ｄｉｆｃｏ社製
ＦＩＡ    Ｄｉｆｃｏ社製
ＴＥＡ    ＰＩＥＲＣＥ
【００７９】
１．３．１．２．  緩衝液の組成
用いた試薬の組成を下記に示す。
ＰＢＳ（−）０．０２％  ＫＨ２ＰＯ４，  ０．２９％  Ｎａ２  ＨＰＯ４・１２  Ｈ２Ｏ，  ０．８％  ＮａＣｌ，  ０．０２％  ＫＣｌ
【００８０】
１．３．１．３．  動物
用いた動物を以下に示す。
Ｂａｌｂ／ｃ  マウス（♀，  ３週齢）    日本チャールズリバー
【００８１】
１．３．１．４．  細胞
細胞融合にはマウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｕ１を用いた。
【００８２】
１．３．２．  実験方法
《マウスへの免疫》
抗原溶液の調製及びマウスへの免疫は常法に従って行った。基礎免疫は、免疫抗原ｃＤＤＸ４の凍結乾燥品を適量の７０％エタノールに溶解させ乾燥後、１  ｍｇ／ｍｌの濃度で０．５％  ＴＦＡを含むＰＢＳ（−）溶液に溶解し、これを免疫賦活剤であるＦｒｅｕｎｄ完全アジュバンド（ＦＣＡ）またはＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバンド（ＦＩＡ）と１：１．２〜１：１．４の比率で混和し、混和したエマルジョンを用いた。このエマルジョンを１週間毎に１回、計４回４００ｌ／マウスの用量で腹腔投与を行った。最初の２回はＦＣＡ、後の２回はＦＩＡとのエマルジョンを用いた。最終免疫は、基礎免疫終了後１ヵ月経過してから免疫抗原ｃＤＤＸ４の凍乾品を適量の７０％エタノールに溶解させ乾燥後、２００ｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（−）に溶解したものを用い、２００  ｌ／マウスの用量で尾静脈より投与した。
【００８３】
《ハイブリドーマ調製》
さらに、脾細胞の調製及び細胞融合は常法に従って行った。最終免疫から３〜４日後にマウスを瀉血致死させ、脾臓を摘出し、ＨＢＳＳ緩衝液中でほぐして溶血緩衝液処理及び遠沈により赤血球を除去したものを脾細胞とした。Ｐ３Ｕ１：脾細胞  ＝  １：５〜１：１０の比率で混合および遠心を行い、得られた沈殿物にＰＥＧ溶液を添加することで融合を行った。融合処理後、ＨＡＴ培地で緩やかに懸濁し、４８ウエルプレートに播種し、５％  ＣＯ２存在下、３７  ℃で融合細胞がコロニーを形成するまで培養した。
【００８４】
１−４）クリーニング及びクローニング
１．４．１  実験材料
１．４．１．１  試薬及び器具
本実験に用いた試薬を下記に示す。試薬はすべて特級またはそれに準ずるものを用いた。
Ｍｕｌｔｉ−Ｐｉｎ  ペプチド        当研究室に合成
Ｔｒｉｓ    和光純薬製
ＭｇＣｌ２ 和光純薬製
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート  和光純薬製（ツイーン  ８０相当）
ＮａＣｌ    和光純薬製
ＢＳＡ    シグマ社製
ＰＯＤ−結合やぎ抗マウス  ＩｇＧ            Ｊａｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｒｉｓｅ，Ｉｎｃ．製
ＴＭＢＺ    同仁化学製
ＥＤＴＡ・２Ｎａ            和光純薬製
３５％  過酸化水素            和光純薬製
Ｈ２ＳＯ４ 和光純薬製
【００８５】
１．４．１．２  試薬組成
本実験に用いた試薬の組成を下記に示す。
2004155745.tif 000005
2004155745.tif 000006
2004155745.tif 000007
６  Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ  ７．２に調製し、４  ℃に保存し、  使用時に精製水で１０倍希釈し、使用時に調整した。
2004155745.tif 000008
2004155745.tif 000009
2004155745.tif 000010
2004155745.tif 000011
2004155745.tif 000012
【００８６】
2004155745.tif 000013
2004155745.tif 000014
2004155745.tif 000015
【００８７】
１．４．３．  実験方法
《スクリーニング》
Ｍｕｌｔｉ−Ｐｉｎ  ペプチドを固相化抗原として用いるスクリーニングを連続して行うことにより、特異抗体産生ハイブリドーマが存在するウエルを選別した。ＥＬＩＳＡでは一次抗体としてハイブリドーマの培養上清、二次抗体としてぺルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇＧ抗体、発色基質としてＴＭＢＺ、及び発色停止液として０．３  Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用い、主波長４５０  ｎｍ、参照波長６３０  ｎｍで吸光度を測定した。また、クローニングにフィーダー細胞として３〜５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（♀）より摘出した胸腺から調製した細胞を用いた。
【００８８】
《クローニング》
抗体産生ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法により行った。スクリーニングアッセイで高い抗体価を示したウエルのハイブリドーマが１セル／ウエルになるように限界希釈を行い、マウス胸腺より調製したフィーダー細胞をあらかじめ播種した９６  ウエルプレートに播種し培養した。クローニング操作により得られたモノクローナルなハイブリドーマの培養上清でＭｕｌｔｉ−Ｐｉｎ  ＥＬＩＳＡを行い、高い抗体力価を示したハイブリドーマをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして確立した。確立したハイブリドーマは、常法に従い培地を５％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に移行後、液体窒素タンク中に保存した。
【００８９】
１−６）  抗ｃＤＤＸ４抗体の調製及び精製
常法に従い得られた抗体産生ハイブリドーマの培養上清でｃＤＤＸ４を連結させたＭｕｌｔｉ−Ｐｉｎ  ＢｌｏｃｋＴＭを用いてスクリーニング及びクローニングを行った結果，高い反応性を示すＩＡ２−Ｆ９株を得た  （図３）。また、ＩＡ２−Ｆ９株は最も増殖能が優れていた。従って，このＩＡ２−Ｆ９株を抗ｃＤＤＸ４モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして確立した。
なお、抗体精製は塩析及びゲルろ過を組み合わせた方法により行った。
【００９０】
２）抗ｃＤＤＸ４抗体ＩＡ２−Ｆ９の細胞表面ＣＸＣＲ４に対する結合性
ｃＤＤＸ４を免疫抗原として作出されたモノクローナル抗体ＩＡ２−Ｆ９の細胞表面ＣＸＣＲ４に対する結合を調べる為、ＣＤ４がトランスフェクトされたＮＰ２／ＣＤ４細胞、ＣＤ４及びＣＣＲ５がトランスフェクトされたＮＰ２／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４がトランスフェクトされたＮＰ２／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞を用いてフローサイトメータ分析及びトランスウエルを用いたケモタキシスアッセイを行った。その結果、本抗体はＮＰ２／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞にのみ結合し、また、ＣＸＣＲ４のリガンドであるＳＤＦ−１の誘導する乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  細胞に対するケモタキシスを有意に阻害した。従って、本抗体が細胞表面ＣＸＣＲ４に対して特異的に結合することが示された。
【００９１】
また、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いて、抗ＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５と本抗体の親和性の比較をフローサイトメータ分析で行った。１２Ｇ５は世界中で最も汎用されている抗ＣＸＣＲ４抗体で、ＣＸＣＲ４のＥＣＬ−１及びＥＣＬ−２を認識すると報告されている。フローサイトメータ分析の結果、本抗体は１２Ｇ５とは細胞間で異なった反応を示し、ＩＡ２−Ｆ９が１２Ｇ５とは異なるエピトープを持つとことが示唆された。
【００９２】
２−１）フローサイトメータ分析
２．１  実験材料
２．１．１  試薬及び器具
用いた試薬を以下に示す。試薬はすべて培養用、特級またはそれに準ずるものを用いた。
ＤＭＥＭ基礎培地                            日水製薬製
ＦＣＳ                            Ｈｙｃｌｏｎ社製
Ｇ４１８                            Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製
ゼオシン                      Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製
プロマイシン                シグマ社製
ペニシリン  Ｇ                              明治製菓製
ストレプトマイシン              明治製菓製
Ｌ−グルタミン                              和光純薬製
ゼンタマイシン                              シグマ製
ＥＤＴＡ・２Ｎａ                            同仁化学製
Ｌ−１５培地                シグマ社製
ＮａＯＨ                            和光純薬製
パラホルムアルデヒド                      和光純薬製
炭酸ソーダ                      和光純薬製
トリプシン                      ＤＩＦＣＯ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製
１２Ｇ５  （抗ヒトＣＸＣＲ４  抗体）        Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製
ＯＰＡ１−０１１００  （抗ヒトＣＸＣＲ４  Ｎ−末端抗体）        Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔ社製
マウスＩｇＧ２ａ，κ  （マウスイソタイプコントロール純化免疫グロブリン）                                      シグマ社製
マウス  ＩｇＭ    （マウスイソタイプコントロール純化免疫グロブリン）                                            シグマ社製
ＦＩＴＣ共役ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  やぎ抗マウスＩｇＭ
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製
ＦＩＴＣ共役ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ    やぎ抗マウスＩｇＧ
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製
【００９３】
２．１．２  試薬組成
用いた試薬の組成を以下に示す。なお、培養試薬は無菌的に調整、保存した。
ＮＰ２／ＣＤ４細胞用ＤＭＥＭ培地  （１０００  ｍｌ中数量）
ＤＭＥＭ基礎培地                    ９．５  ｇ
ゼンタマイシン                      ６２．５  ｍｇ
Ｌ−グルタミン                ０．３ｇ
Ｇ４１８                            ０．１  ｇ
ペニシリン  Ｇ                      １０万単位
ストレプトマイシン    ０．１  ｇ力価
ＦＣＳ                        １００  ｍｌ
炭酸ソーダ                  適量  （ｐＨ  ７．２−７．４）
【００９４】
ＮＰ２／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞及びＮＰ２／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞用
ＤＭＥＭ培地  （１０００  ｍｌ中数量）
ＤＭＥＭ基礎培地                    ９．５  ｇ
ゼンタマイシン          ６２．５  ｍｇ
Ｌ−グルタミン              ０．３ｇ
Ｇ４１８                      ０．１  ｇ
ゼオシン                  ０．１  ｇ
ペニシリン  Ｇ                        １０万単位
ストレプトマイシン        １  ｇ力価
ＦＣＳ                      １００  ｍｌ
炭酸ソーダ                適量  （ｐＨ  ７．２−７．４）
洗浄用緩衝液
緩衝液  （−）                    濃度  ２％  ＦＣＳ，  ０．０２％  ＮａＮ３
【００９５】
４）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞用Ｌ−１５培地  （１０００  ｍｌ中数量）
Ｌ−１５基礎培地                  １４．７  ｍｇ
ＦＣＳ                                      １００  ｍｌ
１Ｎ  ＮａＯＨまたはＨＣｌ適量  （ｐＨ７．２〜７．４）
【００９６】
《細胞》
ＣＤ４がトランスフェクトされたＮＰ２／ＣＤ４細胞、ＣＤ４及びＣＣＲ５がトランスフェクトされたＮＰ２／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４がトランスフェクトされたＮＰ２／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞を用いた。さらにヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた。
【００９７】
《実験装置》
ＥＰＩＣＳＴＭＸＬ                  Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ社製を用いた。
【００９８】
《実験方法》
回収した細胞  （１×１０６  セル）に一次抗体として１．０ｇ／１００ｌの精製抗体またはイソタイプコントロールアルブミンを加え４  ℃で３０分間インキュベートし、冷洗浄用緩衝液１  ｍｌで洗浄した。次に、二次抗体として任意のＦＩＴＣ  共役第二抗体を加え４  ℃で３０分間インキュベートし、冷洗浄用緩衝液１  ｍｌで洗浄した。１％  パラホルムアルデヒドを含む緩衝（−）溶液１  ｍｌで懸濁、固定化し、４２メッシュでろ過後、フローサイトメータで分析した。
【００９９】
２−２）ＳＤＦ−１が誘導するヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のケモタキシス活性へ抗ｃＤＤＸ４抗体ＩＡ２−Ｆ９の影響
２．２．１．  実験材料
《試薬及び器具》
用いた試薬及び器具を以下に示す。試薬はすべて培養用、特級またはそれに準ずるものを用いた。
ケモタキセル  （８メッシュ−ホ゜アサイス゛）                クラボウ製
フィブロネクチン                    シグマ社製
ギムザ液                          メルク社製
メタノール                          和光純薬製
緩衝液                              シグマ社製
ＨＥＰＥＳ                              同仁化学製
２４  ウエルプレート                    コーニング社製
再結合ヒト型  ＳＤＦ−１α              Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈｅｃ  社製
【０１００】
《試薬組成》
用いた試薬の組成を以下に示す。なお、培養試薬は無菌的に調製、保存した。１）  ケモタキシス緩衝液
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【０１０１】
《細胞》
乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた。
【０１０２】
《実験方法》
１）ケモタキシ細胞のフィブロネクチンコーティング
緩衝液  （−）で１０ｇ／ｍｌに調整したフィブロネクチン溶液を２４  ウエルプレートに６００μｌづつ加えた。８．０ミリポアサイズのケモタキシセルをそのフィブロネクチン溶液に浸し、３０分間室温で震盪した。その後ケモタキシセルを２４ウエルプレートから出し、室温で風乾させた。
【０１０３】
２）細胞遊走
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をケモタキシス緩衝液で洗浄後、ケモタキシス緩衝液で希釈した抗体溶液を加え３７  ℃で３０  分間プレインキュベートした後、この細胞（４×１０４  セル／２００ｌ）をフィブロネクチンでコーティングしたケモタキシセルに播種し、低チャンバー  （２４  ウエルプレート）には２０  ｎＭの再結合ヒトＳＤＦ−１を含む６００ｌのケモタキシス緩衝液を加え３７  ℃で３時間インキュベートした。
【０１０４】
３）  固定化、染色
３時間のインキュベート終了後、ケモタキシセルを低チャンバーから取り外し、ケモタキシセル上面の細胞を綿棒で除去した。ケモタキシセル下面の細胞を１００％メタノールで固定化後、ギムザ溶液に３０分間浸し染色した。余分な染色液を水で洗浄後、ケモタキシセルのポリカーボネート膜を外し、スライドガラスにのせ、顕微鏡で遊走した細胞数をカウントした。結果はコントロールにおける自発的な細胞遊走を基準として、ＳＤＦ−１に対する遊走細胞数が何倍増加したかを示す、ケモタキシスインデックスとして表した。
【０１０５】
２−３）抗ｃＤＤＸ４抗体ＩＡ２−Ｆ９の細胞表面ＣＸＣＲ４に対する反応特異性について
ＮＰ２／ＣＤ４細胞、ＮＰ２／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞およびＮＰ２／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞を用いてフローサイトメータ分析を行った。なお、コントロールとしてマウスイソタイプ  ＩｇＭを用いた。その結果、ＮＰ２／ＣＤ４細胞及びＮＰ２／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞において、コントロールと比較して本抗体処理した細胞の蛍光強度の増加が認められなかった。一方、ＮＰ２／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞においてはコントロールと比較して蛍光強度の増加が認められた  （図４）。
【０１０６】
２−４）抗ｃＤＤＸ４抗体ＩＡ２−Ｆ９のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１発現ＣＸＣＲ４に対する結合性について
ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＣＸＣＲ４発現及び本抗体の親和性をフローサイトメータで分析した。はじめに本細胞のＣＸＣＲ４発現の確認を抗ＣＸＣＲ４−Ｎ末端抗体で行なった。
【０１０７】
その結果、抗ＣＸＣＲ４−Ｎ末端抗体処理の細胞はコントロールと比較して蛍光強度の増加が認められ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＣＸＣＲ４を発現していることが確認された。次に本細胞に発現するＣＸＣＲ４に対するＩＡ２−Ｆ９及び１２Ｇ５の結合性をフローサイトメータで分析した。その結果、ＩＡ２−Ｆ９処理の細胞はコントロールと比較して蛍光強度の増加が認められ平均蛍光強度は１．１７であった。一方、１２Ｇ５処理の細胞の蛍光強度は、コントロールの蛍光強度と比較して有意な差は認められず、平均蛍光強度は０．５７２であった  （図５）。従って、これらの結果から乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の発現するＣＸＣＲ４が、１２Ｇ５に認識されにくく、かつＩＡ２−Ｆ９に高い結合性を示す立体構造  （コンホーメーション）を形成して細胞表面に発現していると考えられる。
【０１０８】
２−５）抗ｃＤＤＸ４抗体ＩＡ２−Ｆ９の乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のケモタキシス活性における影響
乳癌転移の１つのモデルは、白血球がケモカインに対して走化作用を持つのと同様に、ＣＸＣＲ４を発現している転移性乳癌細胞がＳＤＦ−１発現部位に引き付けられることによって成立すると考えられる。したがって、ＳＤＦ−１が誘導するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のケモタキシス活性に対する本抗体の影響は、本抗体の乳癌転移制御に密接に関連すると予想される。
【０１０９】
ＳＤＦ−１の誘導する乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のケモタキシス活性に対する本抗体の阻害活性をケモタキシスアッセイにより検討した。抗体未処理の場合、ケモタキシスインデックスが１．４であったのに対し、１  ｇ／ｍｌの本抗体で処理するとケモタキシスインデックスが０．９に低下し、９５％以上の顕著な抑制効果が認められた（図６）。この抑制効果は、ヒト細胞株モルト４＃８細胞のケモタキシス阻害と比較して、低濃度でかつ高い阻害効果を示した。この結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が本抗体に認識されやすい立体構造のＣＸＣＲ４を発現している為だと考えられ、２−５）のフローサイトメータの結果とも一致する。従って、本発明の抗体は乳癌細胞に発現している立体構造のＣＸＣＲ４に特に高い結合性を持つため、乳癌転移を制御することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のペプチドの合成手順の１例を表した図である。
【図２】図２は、本発明のペプチドの環状ペプチド（ａ）の部分のマススペクトル測定結果を示したチャートである。
【図３】図３は、本発明の実施例において、本発明の抗原ペプチドを用いてスクリーニングした抗体産生ハイブリドーマの反応性を示したグラフである。
【図４】図４は、本発明の抗体の一般表皮細胞ＣＸＣＲ４に対する結合特異性を示したサイトメータ分析結果である。
【図５】図５は、本発明の抗体のヒト乳癌表皮細胞ＣＸＣＲ４に対する結合特異性を示したサイトメータ分析結果である。
【図６】図６は本発明の抗体と市販抗癌剤のケモキタシス活性の測定結果を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月3日(2004.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2004155745.tif 000028
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
2004155745.tif 000029
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
2004155745.tif 000030
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
2004155745.tif 000031