(57)【要約】【課題】解決しようとする問題点は、アデノウイルスの変異型を確実に決定し、検出する手段を提供することである。【課題を解決するための手段】この課題解決のために全てのヒトアデノウイルス遺伝子をＰＣＲで増幅し、変異株をサザンハイブリダイゼーションにて検出するために、アデノウイルス１から５１血清型の標準株および、流行性角結膜炎より分離された分離ウイルスを用い、ヘキソン領域の一部の塩基配列を解析した。そして、これら分離ウイルスの特異プローブを設計し、変異株の検出を試みた。その結果、アデノウイルスの変異型を確実に決定し、検出する手段を完成した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、３、９の何れか一に記載の塩基配列を含むヒトアデノウイルス変異株。
【請求項２】
以下の少なくとも一を含むＤＮＡ断片；
１）配列番号１〜３６の何れか一に記載の塩基配列。
２）配列番号１〜３６の何れか一に記載の塩基配列と相補配列からなるもの。
３）配列番号１〜３６の何れか一に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる配列からなるもの。
４）前記１）〜３）の配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列。
【請求項３】
以下の配列の何れか一に記載のプローブ配列；
１）配列番号４１
２）配列番号４２
３）配列番号４３
４）配列番号４１〜４３の何れか一に記載の配列における少なくとも各変異株特異配列部分を含む相同配列。
【請求項４】
以下の工程を含むヒトアデノウイルス変異株の検出用プローブの設計方法；
１）候補変異株のｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の塩基配列を解読する。
２）標準株（全５１血清株）及び既知の変異株との塩基配列の比較をする。
３）比較に基づき候補変異株特異配列を決定し、その決定をもとにプローブを設計する。
【請求項５】
ｈｅｘｏｎ領域が、ｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の約９１６ｂｐ又は略同一の塩基配列を解読する請求項４のプローブの設計方法。
【請求項６】
比較情報が、少なくとも配列番号１〜３６の何れか一に記載の塩基配列、該塩基配列の少なくとも１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列、又はそれらの相同配列を利用する請求項４又は５に記載のプローブの設計方法。
【請求項７】
請求項４〜６の何れか一に記載のプローブの設計方法で得られたプローブ又は請求項３に記載のプローブを使い変異株を特異的に検出するヒトアデノウイルス変異株の検出方法。
【請求項８】
請求項７に記載の検出法を利用する感染症の検査又は診断方法。
【請求項９】
候補変異株のｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の塩基配列を解読することを特徴とするヒトアデノウイルス変異株の検出方法。
【請求項１０】
ｈｅｘｏｎ領域が、ｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の約９１６ｂｐ又は略同一の塩基配列を解読する請求項９に記載のヒトアデノウイルス変異株の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ヒトアデノウイルス変異株及びその検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトアデノウイルスは、眼感染症や呼吸器感染症を引き起こす、ヒトに対する重要な病原ウイルスである。ヒトアデノウイルスは物理化学的特徴や造腫瘍性などの指標により、現在Ａ〜Ｆの６種類の亜群、さらに５１種類の血清型に分類されている。その多様な血清型から、それぞれ多彩な感染像を示す。その中でもＢ亜群の３型、７型、１１型、Ｃ亜群の１型、２型、６型、Ｄ亜群の８型、１９型、３７型、更にＥ亜群の４型の１０血清型は、ヒトの目に感染し、結膜炎、角膜炎等を発症させる。異なる血清型のウイルスは、異なる抗原性を示すことから、一度特定の血清型のウイルスに罹患していても、再び感染、さらには大流行へと繋がることがある。このため、ウイルスの血清型の同定は疫学的に非常に重要である。
【０００３】
近年、アデノウイルスの変異型が眼感染症を引き起こすことが明らかとなってきている。これら変異型は、従来のアデノウイルス標準株と塩基配列が異なるため、Ｓａｉｔｏｈら（非特許文献）のＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では、型判別不能となった。一例として、ＡｄＶ−４型変異株（ＡｄＶ−４ｖ）の制限酵素Ｈａｅ  ＩＩＩの切断パターンは、ＡｄＶ−４標準株の切断パターンに一致する一方で、制限酵素Ｈｉｎｆ  ＩとＥｃｏＴ１４  Ｉは、ウイルスの遺伝子変異によりその切断部位が変わり、ＡｄＶ−４標準株と切断パターンが異なる結果となった。
【０００４】
【先行文献】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９６  ；  ３４  ：２１１３−２１１６
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
解決しようとする問題点は、アデノウイルスの変異型を確実に決定し、検出する手段を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、この課題解決のためにヒトアデノウイルス遺伝子を検出するために、アデノウイルス１から５１血清型の標準株および、流行性角結膜炎より分離された分離ウイルスを用い、ヘキソン領域の一部の塩基配列を解析した。そして、これら分離ウイルスの特異プローブを設計し、変異株の検出を試みた。その結果、アデノウイルスの変異型を確実に決定し、検出する手段を完成した。
【０００７】
本発明は、以下からなる。
１．配列番号２、３、９の何れか一に記載の塩基配列を含むヒトアデノウイルス変異株。
２．以下の少なくとも一を含むＤＮＡ断片。
１）配列番号１〜３６の何れか一に記載の塩基配列。
２）配列番号１〜３６の何れか一に記載の塩基配列と相補配列からなるもの。
３）配列番号１〜３６の何れか一に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる配列からなるもの。
４）前記１）〜３）の配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列。
３．以下の配列の何れか一に記載のプローブ配列又は以下の配列の何れか一に記載のプローブ配列の一部を含む実質的に同一機能を発揮できる配列。
１）配列番号４１
２）配列番号４２
３）配列番号４３
４）配列番号４１〜４３の何れか一に記載の配列における少なくとも各変異株特異配列部分を含む相同配列。
４．以下の工程を含むヒトアデノウイルス変異株の検出用プローブの設計方法；１）候補変異株のｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の塩基配列を解読する。
２）標準株（全５１血清株）及び既知の変異株との塩基配列の比較をする。
３）比較に基づき候補変異株特異配列を決定し、その決定をもとにプローブを設計する。
５．ｈｅｘｏｎ領域が、ｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の約９１６ｂｐ又は略同一の塩基配列を解読する前項４のプローブの設計方法。
６．比較情報の一部が、少なくとも配列番号１〜３６の何れか一に記載の塩基配列、該塩基配列の少なくとも１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列、又はそれらの相同配列を利用する前項４又は５に記載のプローブの設計方法。
７．前項４〜６の何れか一に記載のプローブの設計方法で得られたプローブ又は請求項３に記載のプローブを使い変異株を特異的に検出するヒトアデノウイルス変異株の検出方法。
８．前項７に記載の検出法を利用する感染症の検査又は診断方法。
９．候補変異株のｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の塩基配列を解読することを特徴とするヒトアデノウイルス変異株の検出方法。
１０．ｈｅｘｏｎ領域が、ｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の約９１６ｂｐ又は略同一の塩基配列を解読する前項９のヒトアデノウイルス変異株の検出方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の一は、新規なヒトアデノウイルス変異株である。それらは、配列番号２、３、９にその塩基配列を示した。配列番号２は、いわゆるＡｄＶ−４標準株の変異株であり、ｈｅｘｏｎ領域９１６ｂｐに３３塩基の変異をもち、ＡｄＶ−４標準株と９６．４％のホモロジーを示した。実施例ではＡｄＶ−４ｖと表示した。配列番号３は、いわゆるＡｄＶ−８標準株の変異株であり、ｈｅｘｏｎ領域９１６ｂｐに３０塩基の変異をもち、ＡｄＶ−８標準株と９６．７％のホモロジーを示した。この変異株は、ＡｄＶ−８抗血清で中和される一方で、系統樹解析〔２−パラメータ法を用いたＵＰＧＭＡ法及びＮ−Ｊ法にて系統樹を作成、ブートストラップを１０００回行い、統計的評価を行った〕によって、ＡｄＶ−８標準株と異なる系統を示した株である。実施例ではＡｄＶ−８ｕｖと表示した。配列番号９は、いわゆるＡｄＶ−１９標準株の変異株であり、ｈｅｘｏｎ領域９１６ｂｐに２８塩基の変異をもち、ＡｄＶ−１９標準株と９６．９％のホモロジーを示した。この変異はゲノムタイピングにてＡｄＶ−１９ａと同定された株である。実施例ではＡｄＶ−１９ａと表示した。
なお、これら新規ヒトアデノウイルス変異株の塩基配列は、臨床分離株のウイルス培養液から常法によりＤＮＡを抽出、ＰＣＲを行い、直接塩基配列を解読したものである。このようなヒトアデノウイルス変異株は、その変異を原因とする各種感染症の原因ウイルスであり、その臨床診断上極めて有用である。
【０００９】
本発明の一は、以下の少なくとも一を含むＤＮＡ断片である。
１）配列番号１〜３６の何れか一に記載の塩基配列。
２）配列番号１〜３６の何れか一に記載の塩基配列と相補配列からなるもの。
３）配列番号１〜３６の何れか一に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる配列からなるもの。
４）前記１）〜３）の配列のうち１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列。
【００１０】
本発明に基づく新規なＤＮＡ断片とは、ヒトアデノウイルス株由来の配列である。それらは、配列番号１〜３６として特定される新規な配列である。本発明の新規な配列からなるＤＮＡ断片は、配列番号１〜３６の配列に対して相補な配列を有するものも対象とする。さらに、本発明の対象は、完全に相補な配列だけでなく、その殆どに相補配列をもつものであって、一部に異なる配列を有するが各配列に対してハイブリダイズすることができる塩基配列も含む。その条件は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、配列の相同性からすると約８０％以上であるものを意味し、少なくとも各変異に特徴的な部位が維持されているものを対象とする。また、本発明の対象は、配列番号１〜３６として特定される配列の１ないし数個の塩基が、置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列をも対象とし、この場合も少なくとも各変異に特徴的な部位が維持されているものを対象とする。このような新規なヒトアデノウイルス株由来の配列情報は、ヒトアデノウイルスの変異株検定のための基礎情報データベースとして有用である。なお、配列番号２，３，９は変異株の配列であり、他の配列番号１〜３６は標準株の配列である。
【００１１】
本発明の一は、以下の配列の何れか一に記載のプローブ配列又は以下の配列の何れか一に記載のプローブ配列の一部を含む実質的に同一機能を発揮できる配列を対象とする。１）配列番号４１、２）配列番号４２、３）配列番号４３、及び４）配列番号４１〜４３の何れか一に記載の配列における少なくとも各変異株の特異配列部分を含む相同配列。これらは、ヒトアデノウイルスの標準株由来の塩基配列及び既知変異株由来の塩基配列との比較から、特徴部分として区別できる配列であり、当該各変異株の同定のために極めて有用な配列である。一部を含む実質的に同一機能を発揮できる配列とは、特定された全配列でなくとも各特徴配列部位を保持している限りは、その一部を使った場合をも対象とするもので、プローブとしての機能を発揮できる限りはこれらも対象とするものである。
【００１２】
本発明の一は、上記のような新規なヒトアデノウイルス変異株の同定に使用しうるプローブの設計方法を対象とする。
【００１３】
本発明の設計方法の工程１は、候補変異株のｈｅｘｏｎ領域の塩基配列を解読することである。特に本発明は、ｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の約９１６ｂｐを確認すれば特徴部分の同定に有用であることを見出した意義をもつ。ｈｅｘｏｎ領域とは、アデノウイルスの外郭を構成するｈｅｘｏｎタンパク質をコードする遺伝子領域である。また、このｈｅｘｏｎタンパク質は、アデノウイルスの抗原性に関与するタンパク質である。
そして、本発明では好ましい態様としてｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の９１６ｂｐを対象としたが、必ずしもその完全長である必要はなく、少なくとも、ｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の部分を含む限りはこの限りでない。本発明では、測定対象のｈｅｘｏｎ領域の新規な配列として配列番号１〜３６を開示した。無論、この配列も次々と変異の可能性もありそれらの何れか一に記載の塩基配列の少なくとも１又は数個の塩基が置換、欠失、付加、誘導された配列及びその相同配列も測定対象となりうる。本発明の工程では、これらの配列、既知標準株配列（全５１血清型）及び既知変異株配列について解読をする。なお、既知変異株配列には、漸次更新されるＧｅｎＢａｎｋ等の登録機関に登録された株も対象とする。
【００１４】
次の工程は、この解読に続いて、候補変異株特異配列と、各標準株（全５１血清株）及び既知の変異株との塩基配列の比較をする。比較は、塩基数、相同性、変異、置換、挿入、欠失等についておこなう。それにより、各変異の特徴として、配列及び部位を同定する。
【００１５】
この比較に基づき候補変異株特異配列を決定し、その決定をもとにプローブを設計する。例えば、実施例に開示したＡｄＶ−４ｖはＡｄＶ−４標準株に対してｎｔ６０７−ｎｔ６２８までの２２塩基中に４塩基が変異していたので、この部位を変異株特異配列のプローブの単位として設計した（配列番号４１）。ＡｄＶ−８ｕｖはＡｄＶ−８標準株に対してｎｔ６７２−ｎｔ６９１までの２０塩基中に２塩基が変異していたので、この部位を変異株特異配列のプローブの単位として設計した（配列番号４２）。ＡｄＶ−１９ａはＡｄＶ−１９標準株に対してｎｔ２７７−ｎｔ２９８までの２２塩基中に３塩基が変異していたので、この部位を変異株特異配列のプローブとして設計した（配列番号４３）。
プローブの長さは一般的に使用される長さであるかぎり特にその長短は限定されないが、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基である。このようにして設計されたプローブを使い、変異株を特異的に検出可能となる。
【００１５−２】
本発明のその他の一は、候補変異株のｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の塩基配列を解読することを特徴とするヒトアデノウイルス変異株の検出方法である。そしてそのｈｅｘｏｎ領域が、ｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３の約９１６ｂｐ又は略同一の塩基配列を解読するヒトアデノウイルス変異株の検出方法である。上記のように本発明では、ｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３を解析すれば、ヒトアデノウイルス変異株の同定に有効であることを証明した。その結果、この領域での配列分析を行えば、プローブ法だけでなく、系統樹解析、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法といった既知手段と組合わせて、容易にヒトアデノウイルス変異株の同定が可能である。
【００１６】
以上のような塩基配列、プローブ、及び検出法を利用したヒトアデノウイルス変異株の同定方法は、感染症の検査又は診断方法として極めて実用性高い意義あるものである。
【００１７】
なお、本発明の実施例で使用する遺伝子の増幅手段は、今日多様な方法が確立され、今後も開発されていくであろうが、本発明は特に限定されるものではない。具体的にはポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４，１９８５）やＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  法、Ｎａｔｕｒｅ，３５０，９１−９２，１９９１、特許第  ２６４８８０２号公報および特許第  ２６５０１５９号公報記載）およびＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｉｔｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ増幅法、特開２００１−２４２１６９号公報）などの核酸増幅方法を適用することができる。
【００１８】
【実施例】
以下に本発明の具体例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】
【実施例１】
Ａ．試験に用いた材料は以下のように調製した。
１）ウイルス
国立感染症研究所および、ＡＴＣＣより購入した、ヒトアデノウイルス標準株全５１血清型のウイルス培養液を用いた。
２）臨床分離株
中和試験よって血清型が同定され、ＰＣＲ−ＲＦＬＰの結果、標準株と切断パターンの異なったアデノウイルス分離株ＡｄＶ−４ｖ  ：  ７株、ＡｄＶ−８ｕｖ  ：  ２１株、ＡｄＶ−１９ａ  ：  １０株（１９９５〜２００２年に日本各地の流行性角結膜炎患者より分離）を用いた。
【００２０】
Ｂ．方法
１）ウイルスＤＮＡの抽出
スマイテストＥＸ−Ｒ＆Ｄ（ゲノムサイエンス研究所）を用いて標準株および、臨床分離ウイルス液１００μｌからＤＮＡを抽出、乾固後のＤＮＡに１００μｌの滅菌蒸留水を加え溶解したものをサンプルＤＮＡ溶液とした。
２）ＰＣＲ
抽出したＤＮＡをＳａｉｔｏｈらの方法に従い、アデノウイルスｈｅｘｏｎ領域の３’末端約１／３を増幅するＡｄＴＵ７  ５’−ＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＣ−３’  （ＡｄＶ−１２  ：  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ．  Ｎｏ．  ＮＣ＿００１４６０  ｎｔ  １９，４８９  −  １９，５０８）（配列番号３７）と、ＡｄＴＵ４’  ５’−ＧＴＡＧＣＧＴＴＧＣＣＧＧＣＣＧＡＧＡＡ−３’  （ｎｔ  ２０，４７３  −  ２０，４９２）（配列番号３８）のプライマーセットで、１ｓｔ  ＰＣＲを、ＡｄｎＵ−Ｓ’  ５’−ＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＣＮＣＡＣＡＡＣＡＣ−３’  （ｎｔ  １９，４９８  −  １９，５１７）（配列番号３９）と、ＡｄｎＵ−Ａ  ５’−ＧＣＣＴＣＧＡＴＧＡＣＧＣＣＧＣＧＧＴＧ−３’  （ｎｔ  ２０，４３４  −  ２０，４５３）（配列番号４０）のプライマーセットで、２ｎｄ  ＰＣＲを行った。
３）ダイレクトシーケンス
増幅したＰＣＲ産物の塩基配列を直接解読し、プライマー配列を除いた９１６ｂｐを決定した。
【００２１】
Ｃ．結果
１）本法に用いたプライマーセットで、アデノウイルス標準株５１株および、臨床分離株は、すべての株においてｈｅｘｏｎ領域９５６ｂｐの増幅が確認された。
２）塩基配列を解析した結果、標準株および、分離株のｈｅｘｏｎ領域９１６ｂｐの塩基配列に挿入や欠失は認められられなかった。標準株５１株のホモロジーは、７４．１（ＡｄＶ−４とＡｄＶ−１８）〜１００  （ＡｄＶ−１１とＡｄＶ−３５、ＡｄＶ−２１とＡｄＶ−５１）  ％だった。
３）ＡｄＶ−４ｖの７株、ＡｄＶ−８ｕｖの２１株、ＡｄＶ−１９ａの１０株の塩基配列は、それぞれ１００％一致した。ＡｄＶ−４ｖは、ＡｄＶ−４標準株と９６．４％で最も高いホモロジーを示し、次いでＡｄＶ−３２標準株と８９．３％のホモロジーを示した。ＡｄＶ−８ｕｖは、ＡｄＶ−８標準株と９６．７％で最も高いホモロジーを示し、次いでＡｄＶ−２２標準株と９５．４％のホモロジーを示した。ＡｄＶ−１９ａは、ＡｄＶ−２５標準株と９７．９％で最も高いホモロジーを示し、次いでＡｄＶ−４２標準株と９７．７％のホモロジーを示した。ＡｄＶ−１９ａとＡｄＶ−１９標準株のホモロジーは、９６．９％を示した。
【００２２】
【実施例２】
プローブ設計
塩基配列を解読した変異株と標準株を比較した。ＡｄＶ−４ｖは、ＡｄＶ−４標準株とｎｔ  ６０７からｎｔ  ６２８までの２２塩基中に４塩基の変異を持っていた。ＡｄＶ−８ｕｖは、ＡｄＶ−８標準株とｎｔ  ６７２からｎｔ  ６９１までの２０塩基中に２塩基の変異を持っていた。ＡｄＶ−１９ａは、ＡｄＶ−２５および、ＡｄＶ−１９標準株とｎｔ  ２７７からｎｔ  ２９８までの２２塩基中に３塩基の変異を持っていた。以上の結果から、以下のプローブを作成した。
４ｖ−ｐ  ：  ５’−ｔｇｔｃｇｇｔｔａｃｃｔｃｇｃｇｃｃｃａｃｃ−３’  配列番号４１
８ｕｖ−ｐ  ：  ５’−ｔｔａｔｔｇｇａｇａｇａｃｃｇｃｃｇｔｇ−３’    配列番号４２
１９ａ−ｐ  ：  ５’−ｃａａａａａｇｇｔｇｔｃｃａｔｔａｔｇｔｔｃ−３’    配列番号４３
【００２３】
【実施例３】
臨床分離株を用いた試験例
Ａ．方法
塩基配列を解析したアデノウイルス１から５１血清型の標準株および、ＡｄＶ−４ｖ、ＡｄＶ−８ｕｖ、ＡｄＶ−１９ａ各臨床分離株のＰＣＲ産物を用い、上記実施例２のプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーションを行った。
Ｂ．結果
中和試験によって血清型が同定され、ＰＣＲ−ＲＦＬＰで標準株と切断パターンの異なったＡｄＶ−４ｖ、ＡｄＶ−８ｕｖ、ＡｄＶ−１９ａのＰＣＲ産物の塩基配列を基に各分離株の特異プライマーを設計した。本プライマーを用い、アデノウイルス１から５１血清型の標準株および、ＡｄＶ−４ｖ、ＡｄＶ−８ｕｖ、ＡｄＶ−１９ａ各臨床分離株のＰＣＲ産物とサザンハイブリダイゼーションを行った結果、プローブ４ｖ−ｐは、ＡｄＶ−４ｖのＰＣＲ産物と、プローブ８ｕｖ−ｐは、ＡｄＶ−８ｕｖのＰＣＲ産物と、プローブ１９ａ−ｐは、ＡｄＶ−１９ａのＰＣＲ産物とそれぞれ特異的にハイブリダイズすることが確認された。
【００２４】
【発明の効果】
ＳａｉｔｏｈらのＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、３種類の制限酵素を用いて１４血清型の同定が可能である。しかしながら、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ウイルス遺伝子の制限酵素切断部位に変異が生じることによって、切断パターンが標準株と異なり型判別不能となる。今回、サザンハイブリダイゼーションによる検出を試みた３種類の臨床分離株ＡｄＶ−４ｖ、ＡｄＶ−８ｕｖ、ＡｄＶ−１９ａは、いずれも中和試験で、それぞれの血清型に同定された一方で、ＰＣＲ−ＲＦＬＰによって標準株と制限酵素切断パターンの異なった株である。
ＰＣＲに用いたプライマーセットは、ｈｅｘｏｎ領域内のアデノウイルス血清型間で極めてよく保存されている領域に設定してあるため、すべてのアデノウイルスの遺伝子を増幅できると予測され、実際、全５１血清型の標準株と３種類の臨床分離株３１株すべて増幅が可能であった。
ＰＣＲ産物の９５６ｂｐのうち、プライマー配列を除く、９１６ｂｐの塩基配列を解読した結果、全５１血清型の標準株と３種類の臨床分離株は、遺伝子の挿入および欠失は認められなかった。ＡｄＶ−４ｖ、ＡｄＶ−８ｕｖ、ＡｄＶ−１９ａは、それぞれの分離株の塩基配列が１００％一致した。これら変異株の特異的な塩基配列から、それぞれ特異プローブを設計し、作成した３種類のプローブを用いて、全５１血清型の標準株と３種類の臨床分離株とサザンハイブリダイゼーションを試みた。その結果、各臨床分離株のＰＣＲ産物と特異的にハイブリダイズすることが確認された。
以上、本発明にてヒトアデノウイルス変異株であるＡｄＶ−４ｖ、ＡｄＶ−８ｕｖ、ＡｄＶ−１９ａを高感度迅速かつ簡易的に検出する方法が確立された。また、今後新たな変異株が出現した場合、本発明の手順に従い、変異株のｈｅｘｏｎ  ９１６ｂｐの塩基配列を解読、各標準株および、既知の変異株と塩基配列を比較し、変異株特異配列からプローブを設計することによって、新たな変異株を特異的に検出することも可能である。
【００２５】
【配列表】
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