(57)【要約】【課題】本発明の課題は、１個以上のアミノ酸を置換・欠失・挿入・化学修飾したＰａａＩの変異体の作製、ＰａａＩの塩素結合能力を利用したイオンキレート剤の開発およびＰａａＩのチオエステラーゼ活性の改変を利用した生分解性プラスチックの生合成・分解の改良の方法を提供することである。【解決手段】この課題は、ＰａａＩポリペプチドの結晶（リガンド非結合型結晶）、同ポリペプチドと還元型コエンザイムＡとの複合体の結晶（ＣｏＡ−ＳＨ結合型結晶）、同ポリペプチドとヘキサノイルＣｏＡとの複合体の結晶（ヘキサノイルＣｏＡ結合型結晶）、およびそれらの結晶からＸ線回折を用いた結晶構造解析の手法を用いて決定される各原子の３次元構造座標を用いることにより解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるフェニル酢酸分解タンパク質（ＰａａＩ）、または
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加された配列からなり、該ＰａａＩと同等のチオエステラーゼ活性および／または塩素イオン結合能力を有する、ＰａａＩ変異体タンパク質。
【請求項２】
前記ＰａａＩが真正細菌由来であることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記ＰａａＩが  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  由来であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のタンパク質において、配列番号１のＭ１・Ｒ２・Ｄ３・Ｐ４・Ｆ５・Ａ８・Ｌ９・Ａ２９・Ｄ３０・Ｈ３１・Ｌ３２・Ｎ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｆ４２・Ｙ４４・Ａ４５・Ｄ４８・Ｓ４９・Ｌ５３・Ｎ５６・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｖ８７・Ｎ８８・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｔ９５・Ｒ９７・Ｅ９９・Ｋ１０５・Ｌ１０６・Ｌ１０９・Ｔ１１１・Ｔ１１３・Ｆ１１５に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されている、変異体タンパク質。
【請求項５】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のタンパク質において、配列番号１のＮ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｔ３７・Ａ３８・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｄ４８・Ｆ５１・Ａ５２・Ｓ５５・Ｎ５６・Ｐ６０・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｌ７４・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｋ１０５・Ｖ１１４・Ｆ１１５・Ｌ１１７に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されている、変異体タンパク質。
【請求項６】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のタンパク質において、配列番号１のＮ３３・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｄ４８に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されている、変異体タンパク質。
【請求項７】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のタンパク質において、配列番号１のＳ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｔ１１１・Ｔ１１３に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されている、変異体タンパク質。
【請求項８】
リガンド非結合型ＰａａＩである、請求項１ないし７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項９】
ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩである、請求項１ないし７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１０】
ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩである、請求項１ないし７のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパク質の二量体。
【請求項１２】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパク質の四量体。
【請求項１３】
請求項１ないし請求項７のいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項１４】
配列番号２に記載の塩基配列を含む、請求項１３の核酸。
【請求項１５】
請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載のタンパク質の結晶。
【請求項１６】
結晶学的対称がＰ４３２２であり、ａ軸およびｂ軸の方向に５８±５Å、ｃ軸の方向に１４０±５Åの大きさの単位格子を持つか、または結晶学的対称がＩ４１２２であり、ａ軸およびｂ軸の方向に７７±５Å、ｃ軸の方向に１５６±５Åの大きさの単位格子を持つ、請求項８に記載のタンパク質の結晶である、請求項１５に記載の結晶。
【請求項１７】
結晶学的対称がＰ１であり、ａ軸の方向に８３±５Å、ｂ軸の方向に８７±５Å、ｃ軸の方向に５９±５Å、ｂ軸とｃ軸のなす角度αが９２°±２°、ａ軸とｃ軸のなす角度βが９０°±２°、ａ軸とｂ軸のなす角度γが９０°±２°の大きさの単位格子を持つ、請求項９に記載のタンパク質の結晶である、請求項１５に記載の結晶。
【請求項１８】
結晶学的対称がＰ１であり、ａ軸の方向に８２±５Å、ｂ軸の方向に８７±５Å、ｃ軸の方向に５９±５Å、ｂ軸とｃ軸のなす角度αが９２°±２°、ａ軸とｃ軸のなす角度βが９０°±２°、ａ軸とｂ軸のなす角度γが９０°±２°の大きさの単位格子を持つ、請求項１０に記載のタンパク質の結晶である、請求項１５に記載の結晶。
【請求項１９】
請求項１に記載のＰａａＩの１個またはそれ以上のアミノ酸残基を欠失、置換および／または付加した変異体タンパク質を、設計、同定、検索および／または評価する方法に利用される、請求項１５ないし請求項１８のいずれかに記載の結晶から得られた３次元構造座標データベース。
【請求項２０】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のタンパク質において、配列番号１のＭ１・Ｒ２・Ｄ３・Ｐ４・Ｆ５・Ａ８・Ｌ９・Ａ２９・Ｄ３０・Ｈ３１・Ｌ３２・Ｎ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｆ４２・Ｙ４４・Ａ４５・Ｄ４８・Ｓ４９・Ｌ５３・Ｎ５６・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｖ８７・Ｎ８８・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｔ９５・Ｒ９７・Ｅ９９・Ｋ１０５・Ｌ１０６・Ｌ１０９・Ｔ１１１・Ｔ１１３・Ｆ１１５に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ酸で置換することを含む、ＰａａＩタンパク質の四量体形成能の改変方法。
【請求項２１】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のタンパク質において、配列番号１のＮ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｔ３７・Ａ３８・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｄ４８・Ｆ５１・Ａ５２・Ｓ５５・Ｎ５６・Ｐ６０・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｌ７４・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｋ１０５・Ｖ１１４・Ｆ１１５・Ｌ１１７に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ酸で置換することを含む、ＰａａＩのＣｏＡ−ＳＨまたはヘキサノイルＣｏＡとの相互作用能の改変方法。
【請求項２２】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のタンパク質において、配列番号１のＮ３３・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｄ４８に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ酸で置換することを含む、チオエステラーゼ活性の改変方法。
【請求項２３】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のタンパク質において、配列番号１のＳ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｔ１１１・Ｔ１１３に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ酸で置換することを含む、ＰａａＩの塩素イオン結合能の改変方法。
【請求項２４】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパク質を含む、イオンキレート剤。
【請求項２５】
アミノ酸配列ＳＣＲＭＤからなるペンタペプチドまたはその１個または数個のアミノ酸残基を欠失、置換および／または付加したペプチドを含む、イオンキレート剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フェニル酢酸分解タンパク質ＰａａＩ（以下、ＰａａＩと略す）に関するものである。また、本発明は、該タンパク質の結晶および３次元構造座標に関するものである。ＰａａＩと還元型コエンザイムＡ（以下ＣｏＡ−ＳＨと略す）またはヘキサノイルコエンザイムＡ（以下ヘキサノイルＣｏＡと略す）との複合体の結晶および３次元構造座標もまた本発明に含まれる。上記の３次元構造座標を用いたイオンキレート剤の開発および生分解性プラスチックの生合成・分解の改良も本発明に含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
フェニル酢酸分解タンパク質ＰａａＩは、フェニル酢酸生分解関連遺伝子群のメンバーとして大腸菌で同定された（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  ２５９７４−２５９８６）。大腸菌由来のＰａａＩと比較的高い配列相同性を持つタンパク質は、現在のところ１０種程度の真正細菌および古細菌において公知である。そのため、本発明では特に断りがない場合、ＰａａＩを由来生物種によらない一般的な名詞として扱う。ＰａａＩの機能は不明であるが、チオエステラーゼと同一残基率２０％程度の弱い配列相同性を示すことが報告されている（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  前出）。このことから、ＰａａＩはフェニル酢酸生分解経路中のアシルＣｏＡのどれかを基質とするチオエステラーゼである可能性が考えられるが、はっきりと指摘されたことは現在に至るまでなかった。
【０００３】
最近、フェニル酢酸骨格を持つ生分解性プラスチックを細菌を用いて生産する技術が報告された（Ｇａｒｃｉａ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ２９２２８−２９２４１）。この報告では生分解性プラスチックの生合成または生分解におけるＰａａＩタンパク質の役割については述べられていないが、ＰａａＩはフェニル酢酸生分解関連遺伝子群のメンバーであるから、少なくともこの生分解性プラスチックの生合成および生分解に関与しうると考えられる。従ってＰａａＩの結晶構造が解明されれば、その情報に基づいて機能改変したＰａａＩタンパク質遺伝子を組み込んだ細菌株を用いて、より高品質な生分解性プラスチックを生産したり同プラスチックの生分解効率を高めたりすることができる可能性がある。
【０００４】
陰イオン、特に塩素イオンのキレート剤に関する従来技術としては、ビスチオウレア骨格を持つ化合物が知られている（Ｂｕｅｈｌｍａｎｎ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３，  １６４７−１６５４．    Ｘｉａｏ，  Ｋ．  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６９，  １０３８−１０４４）。しかし、現在のところ塩素イオンとの親和性・選択性ともに低く（Ｋｄ：  １．２  ｍＭ）、分析化学等への適用範囲も限られている。
【０００５】
【非特許文献１】
フェルランデス・エー（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚ，  Ａ．）、ほか６名、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９８年１０月、第２７３巻、ｐ．２５９７４−２５９８６
【非特許文献２】
ガルシア・ビー（Ｇａｒｃｉａ，  Ｂ．）、ほか８名、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９９年１０月、第２７４巻、ｐ．２９２２８−２９２４１
【非特許文献３】
ブエルマン・ピー（Ｂｕｅｈｌｍａｎｎ，  Ｐ．）、ほか３名、「テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）」、（英国）、１９９７年、第５３巻、ｐ．１６４７−１６５４
【非特許文献４】
キャオ・ケー・ピー（Ｘｉａｏ，  Ｋ．  Ｐ．）、ほか４名、「アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９７年、第６９号、ｐ．１０３８−１０４４
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の技術的課題は、イオンキレート剤の開発および生分解性プラスチックの生合成・分解を改良する方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高度好熱菌  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  由来の機能未知タンパク質ＰａａＩをクローニングし、研究を重ねた結果、ＰａａＩが塩素イオン結合能力およびチオエステラーゼ活性を有することを解明した。上記の目的は、ＰａａＩタンパク質の結晶（リガンド非結合型結晶）、同タンパク質と還元型コエンザイムＡとの複合体の結晶（ＣｏＡ−ＳＨ結合型結晶）、同タンパク質とヘキサノイルＣｏＡとの複合体の結晶（ヘキサノイルＣｏＡ結合型結晶）、およびそれらの結晶からＸ線回折による結晶構造解析の手法を用いて決定される各原子の３次元構造座標を用いて、ＰａａＩの塩素結合能力を利用したイオンキレート剤の開発あるいはＰａａＩのチオエステラーゼ活性の改変を利用した生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を実施することにより、解決される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、高度好熱菌  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  由来のＰａａＩを初めてクローニングした。該ＰａａＩは、フェニル酢酸生分解関連遺伝子群のメンバーとして大腸菌で同定されたＰａａＩタンパク質と同一残基率３１．１％の配列相同性があり、同一機能を持つと予想された。高度好熱菌  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  は７５℃で生育するため、一般的にその構成タンパク質は耐熱性が高い（Ｋａｔｏ，  Ｒ．  ＆  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，  Ｓ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４４，  ９２６−９２９）。従って、本発明の好熱菌由来ＰａａＩは高温で活性があるチオエステラーゼとしての価値が認められる。
【０００９】
本発明者らは、大腸菌の発現系を用いて可溶性のポリペプチドとして大量に生産することに成功し、続いてこのＰａａＩポリペプチドを精製・結晶化し、ＰａａＩの３次元構造座標を初めて明らかにした。さらにＰａａＩとコエンザイムＡ誘導体（ＣｏＡ−ＳＨおよびヘキサノイルＣｏＡ）との複合体の結晶化も行い、その３次元構造座標も同時に初めて明らかにした。このことにより、三者の詳細な３次元構造の比較ができた。更に、得られた構造に基づく生化学的実験により、ＰａａＩがフェニル酢酸分解経路の中間産物であるフェニルアセチルＣｏＡを特異的基質とするチオエステラーゼであることがわかった。また、反応速度は低下するが、ＰａａＩは、フェニルアセチルＣｏＡのみならず、ヘキサノイルＣｏＡなどのアシルＣｏＡ類も基質にできた。
【００１０】
これらの知見から、ＰａａＩがフェニル酢酸骨格を有する生分解性プラスチックの生合成および生分解に関与しうること、また、ＰａａＩのチオエステラーゼ反応の機構と活性部位周辺のアミノ酸残基の果たす役割についての情報が得られた。これらの情報を基にしてチオエステラーゼ活性を改変したＰａａＩの変異体を設計することができる。このＰａａＩ変異体の遺伝子を組み込んだ細菌株を用いることにより、より高品質な生分解性プラスチックを生産したり同プラスチックの生分解効率を高めたりすることが可能である。
【００１１】
また、ＰａａＩの３次元構造座標を明らかにした結果、本タンパク質は塩素イオンを強固に結合していることがわかった。この塩素イオンの周囲は４残基のアルギニンで取り囲まれており、塩素イオンに対する親和性・選択性ともに高いと考えられる。従って、本タンパク質そのものもしくは塩素イオン結合部位と類似する立体構造を持つ有機化合物、低分子化合物を利用することで、塩素イオンまたはその他のイオンに対し高親和性・高選択性を持つ新しいタイプのイオンキレート剤を開発することが可能になった。このキレート剤は工業用試薬・分析化学用試薬・分子生物学用試薬・医薬など広範囲への応用が期待できる。
【００１２】
本発明のある態様では、（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＰａａＩ、または（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列からなり、該ＰａａＩタンパク質と同等のチオエステラーゼ活性および塩素イオン結合能力を有する、ＰａａＩ変異体タンパク質が提供される。好ましくは、該ＰａａＩは真正細菌由来であり、より好ましくは  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  由来である。
【００１３】
本明細書におけるチオエステラーゼ活性とは、アシルＣｏＡを分解してＣｏＡ−ＳＨを生成する活性を意味する。本明細書におけるＰａａＩタンパク質と同等のチオエステラーゼ活性とは、フェニルアセチルＣｏＡに対するＫｍが２０００μＭ以下、Ｋｃａｔが０．２以上、好ましくはＫｍが５００μ以下、Ｋｃａｔが１．０以上、最も好ましくはＫｍが１８５．５８以下、Ｋｃａｔが１１．７４以上の触媒能力を指す。
【００１４】
本明細書におけるＰａａＩタンパク質と同等の塩素イオン結合能力とは、少なくともＫｄが１ｍＭ以下、好ましくは０．１ｍＭ以下で塩素イオンと結合する能力を意味する。現在のところＰａａＩタンパク質の塩素イオンに対するＫｄを実測する有効な手段が見つからないが、それが１ｍＭよりはるかに小さいことは、塩素イオンを全く加えていない結晶条件で塩素イオンを結合したＰａａＩの結晶構造が得られることから明らかである。
【００１５】
本発明はまた、上記タンパク質において、配列番号１のＰａａＩの四量体形成に関与する、配列番号１のＭ１・Ｒ２・Ｄ３・Ｐ４・Ｆ５・Ａ８・Ｌ９・Ａ２９・Ｄ３０・Ｈ３１・Ｌ３２・Ｎ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｆ４２・Ｙ４４・Ａ４５・Ｄ４８・Ｓ４９・Ｌ５３・Ｎ５６・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｖ８７・Ｎ８８・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｔ９５・Ｒ９７・Ｅ９９・Ｋ１０５・Ｌ１０６・Ｌ１０９・Ｔ１１１・Ｔ１１３・Ｆ１１５、配列番号１のＰａａＩとＣｏＡ−ＳＨまたはヘキサノイルＣｏＡとの相互作用に関与する、配列番号１のＮ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｔ３７・Ａ３８・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｄ４８・Ｆ５１・Ａ５２・Ｓ５５・Ｎ５６・Ｐ６０・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｌ７４・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｋ１０５・Ｖ１１４・Ｆ１１５・Ｌ１１７、配列番号１のＰａａＩの活性部位近傍に存在し活性に関与すると考えられる、配列番号１のＮ３３・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｄ４８、または配列番号１の由来ＰａａＩへの塩素イオンの結合に関与する、配列番号１のＳ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｔ１１１・Ｔ１１３に相当するアミノ酸残基の、少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されている、ＰａａＩ変異体タンパク質を提供する。これらのアミノ酸は、後述のＰａａＩ結晶の解析から、上記の機能を有すると解明されたものである。
【００１６】
本発明はさらに、リガンド非結合型、ＣｏＡ−ＳＨ結合型またはヘキサノイルＣｏＡ結合型である、上記ＰａａＩタンパク質またはその変異体を提供する。
上記ＰａａＩタンパク質またはその変異体の二量体および四量体も、本発明の範囲内である。
【００１７】
また、本発明は、上記ＰａａＩタンパク質またはその変異体をコードする塩基配列を含む核酸を提供する。該核酸は、配列番号２に記載の塩基配列を含んでもよい。本発明における核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味し、これらは１本鎖でも２本鎖でもよく、ヌクレオチド類似体を含んでもよい。
【００１８】
本発明では、上記ＰａａＩタンパク質またはその変異体の結晶が提供される。好ましくは、リガンド非結合型ＰａａＩの結晶は、結晶学的対称がＰ４３２２であり、ａ軸およびｂ軸の方向に５８±５Å、ｃ軸の方向に１４０±５Åの大きさの単位格子を持つか、または結晶学的対称がＩ４１２２であり、ａ軸およびｂ軸の方向に７７±５Å、ｃ軸の方向に１５６±５Åの大きさの単位格子を持ち、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶は結晶学的対称がＰ１であり、ａ軸の方向に８３±５Å、ｂ軸の方向に８７±５Å、ｃ軸の方向に５９±５Å、ｂ軸とｃ軸のなす角度αが９２°±２°、ａ軸とｃ軸のなす角度βが９０°±２°、ａ軸とｂ軸のなす角度γが９０°±２°の大きさの単位格子を持ち、そしてヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶は、結晶学的対称がＰ１であり、ａ軸の方向に８２±５Å、ｂ軸の方向に８７±５Å、ｃ軸の方向に５９±５Å、ｂ軸とｃ軸のなす角度αが９２°±２°、ａ軸とｃ軸のなす角度βが９０°±２°、ａ軸とｂ軸のなす角度γが９０°±２°の大きさの単位格子を持つ。
【００１９】
本発明はまた、上記ＰａａＩタンパク質の１個またはそれ以上のアミノ酸残基を置換、付加および／または欠失した変異体タンパク質を、設計、同定、検索および／または評価するために利用する、上記結晶から得られた３次元構造座標データベースを提供する。好ましくは、該３次元構造座標は、表１、２、５または９のいずれかに示すものであるか、あるいは表１、２、５または９のいずれかに示す３次元構造座標に基づいて求められたものである。これらのデータベースを記録した各種記憶媒体は、本発明に包含される。これらのデータベースを利用して設計、同定、検索および／または評価したタンパク質およびそのようなタンパク質をコードする核酸も、本発明の範囲内である。
【００２０】
上記のデータベースは、イオンキレート作用を有する変異体タンパク質を得るためのものであり得る。そのような変異体は、塩素イオンまたはその他のイオンに対する親和性・特異性を変化させるようなアミノ酸変異をＰａａＩタンパク質に導入して作成できる。変異体タンパク質のみならず、薬剤設計の方法を用いて、イオンキレート作用を有する化合物を設計、同定、検索および／または評価するための方法に利用してもよい。これらのデータベースを利用して作成されたイオンキレート剤も、本発明の範囲内である。
【００２１】
本明細書におけるイオンキレート作用とは、塩素イオンまたはその他のイオンへの高親和性・高選択性を有することを意味する。そのような作用を有する化合物をイオンキレート剤またはキレート剤と呼ぶ。本発明のイオンキレート剤は、タンパク質、ポリペプチド、有機高分子化合物および有機低分子化合物などのあらゆる化合物であり得、本発明のタンパク質またはその塩素イオン結合部位と類似する立体構造を持つ。このようなイオンキレート剤は、工業用試薬・分析化学用試薬・分子生物学用試薬・医薬など広範囲への応用が期待できる。イオンキレート剤がタンパク質、ポリペプチドの場合、ＰａａＩタンパク質のチオエステラーゼ活性を保持しても保持しなくてもよい。
【００２２】
上記のデータベースは、生分解性プラスチックの生合成・分解のために使用するタンパク質を得るためのものであり得る。本明細書における生分解プラスチックとは、Ｇａｒｃｉａ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ２９２２８−２９２４１  に記載さているような、細菌を用いて生産および／または分解できる、フェニル酢酸骨格を持つプラスチックを意味する。生分解性プラスチックの生合成・分解の改良は、例えば、基質・生成物・またはその他のリガンドに対する親和性を変化させたり、チオエステラーゼ活性を変化させたり、生物的または物理的安定性を変化させたりするようなアミノ酸変異をＰａａＩタンパク質に導入することにより達成される。そのようなアミノ酸変異は、本発明のデータベースを使用して設計、同定、検索および／または評価することができる。
【００２３】
本発明はまた、上記結晶から得られた３次元構造座標データベースを利用して、上記ＰａａＩタンパク質の１個またはそれ以上のアミノ酸残基を置換、付加および／または欠失した変異体タンパク質を、設計、同定、検索および／または評価する方法を提供する。好ましくは、該３次元構造座標は、表１、２、５または９のいずれかに示すものであるか、あるいは１、２、５または９のいずれかに示す３次元構造座標に基づいて求められたものである。本方法で設計、同定、検索および／または評価したタンパク質およびそのようなタンパク質をコードする核酸も、本発明の範囲内である。本方法は、イオンキレート作用を有するタンパク質または生分解性プラスチックの生合成・分解のために使用するタンパク質を得るためのものであり得る。本方法により、変異体タンパク質のみならず、イオンキレート作用を有する化合物を設計、同定、検索および／または評価することができる。このようにして作成されたイオンキレート剤も、本発明の範囲内である。
【００２４】
上記の結晶構造解析から判明した各アミノ酸の機能に基づき、本発明は、ＰａａＩタンパク質またはその変異体において、配列番号１のＭ１・Ｒ２・Ｄ３・Ｐ４・Ｆ５・Ａ８・Ｌ９・Ａ２９・Ｄ３０・Ｈ３１・Ｌ３２・Ｎ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｆ４２・Ｙ４４・Ａ４５・Ｄ４８・Ｓ４９・Ｌ５３・Ｎ５６・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｖ８７・Ｎ８８・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｔ９５・Ｒ９７・Ｅ９９・Ｋ１０５・Ｌ１０６・Ｌ１０９・Ｔ１１１・Ｔ１１３・Ｆ１１５に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ酸で置換することを含む、ＰａａＩタンパク質の四量体形成能の改変方法、配列番号１のＮ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｔ３７・Ａ３８・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｄ４８・Ｆ５１・Ａ５２・Ｓ５５・Ｎ５６・Ｐ６０・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｌ７４・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｋ１０５・Ｖ１１４・Ｆ１１５・Ｌ１１７に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ酸で置換することを含む、ＰａａＩのＣｏＡ−ＳＨまたはヘキサノイルＣｏＡとの相互作用能の改変方法配列番号１のＮ３３・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｄ４８に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ酸で置換することを含む、チオエステラーゼ活性の改変方法、および配列番号１のＳ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｔ１１１・Ｔ１１３に相当するアミノ酸残基の少なくとも１つを他のアミノ酸で置換することを含む、ＰａａＩの塩素イオン結合能の改変方法を提供する。
【００２５】
上記のタンパク質を含むイオンキレート剤は、本発明の範囲内である。本発明のＰａａＩタンパク質は塩素イオンを結合する能力を有するので、後述の方法などにより塩素イオンを除去したＰａａＩタンパク質を、強い塩素イオンキレート剤として使用できる。また、本発明によりＰａａＩタンパク質のイオン選択性、親和性を改変することが可能であり、そのようにして作成された変異体タンパク質を各種イオンのキレート剤として使用できる。
【００２６】
本発明はまた、アミノ酸配列ＳＣＲＭＤからなるペンタペプチドまたはその１個または数個のアミノ酸残基を欠失、置換および／または付加したペプチドを含む、イオンキレート剤を提供する。本発明により、塩素イオンの結合に直接的または間接的に関与するのは配列番号１のＳ６５ないしＤ６９のペンタペプチドの部分のみであることがわかった。従って、このペンタペプチドを、塩素イオンのキレート剤として使用できる。また、該ペンタペプチドのイオン選択性、親和性を改変することが可能であり、そのようにして作成されたポリペプチドを各種イオンのキレート剤として使用できる。
【００２７】
以下のものは本発明の範囲内である。
（１）フェニル酢酸分解蛋白質ＰａａＩの、リガンド非結合型ポリペプチドの結晶。
（２）真正細菌に由来するＰａａＩの、（１）に記載の結晶。
（３）高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８に由来するＰａａＩの、（２）に記載の結晶。
（４）結晶学的対称がＰ４３２２であり、ａ軸およびｂ軸の方向に５８±５Å、ｃ軸の方向に１４０±５Åの大きさの単位格子を持つ、あるいは、結晶学的対称がＩ４１２２であり、ａ軸およびｂ軸の方向に７７±５Å、ｃ軸の方向に１５６±５Åの大きさの単位格子を持つ、（３）に記載の結晶。
【００２８】
（５）還元型コエンザイムＡとＰａａＩポリペプチドの複合体（ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩ）の結晶。
（６）ＰａａＩポリペプチドが真正細菌に由来する、（５）に記載の複合体の結晶。
（７）ＰａａＩポリペプチドが高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８に由来する、（６）に記載の結晶。
（８）結晶学的対称がＰ１であり、ａ軸の方向に８３±５Å、ｂ軸の方向に８７±５Å、ｃ軸の方向に５９±５Å、ｂ軸とｃ軸の成す角度αが９２°±２°、ａ軸とｃ軸の成す角度βが９０°±２°、ａ軸とｂ軸の成す角度γが９０°±２°の大きさの単位格子を持つ、（７）に記載の結晶。
【００２９】
（９）ヘキサノイルＣｏＡとＰａａＩポリペプチドの複合体（ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩ）の結晶。
（１０）ＰａａＩポリペプチドが真正細菌に由来する、（９）に記載の複合体の結晶。
（１１）ＰａａＩポリペプチドが高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８に由来する、（１０）に記載の結晶。
（１２）結晶学的対称がＰ１であり、ａ軸の方向に８３±５Å、ｂ軸の方向に８７±５Å、ｃ軸の方向に５９±５Å、ｂ軸とｃ軸の成す角度αが９２°±２°、ａ軸とｃ軸の成す角度βが９０°±２°、ａ軸とｂ軸の成す角度γが９０°±２°の大きさの単位格子を持つ、（１１）に記載の結晶。
【００３０】
（１３）ＰａａＩの変異体を作製するため、またはイオンキレート剤の開発をするため、または生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を行うために用いる、リガンド非結合型ＰａａＩの３次元構造座標。
（１４）（１）〜（４）に記載のいずれかの結晶から得られた、（１３）に記載の３次元構造座標。
（１５）高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８に由来するＰａａＩの、（１４）に記載の３次元構造座標。
（１６）表１または表２に示した３次元構造座標に基づき、分子置換法またはホモロジーモデリングによって求められた、（１３）〜（１５）に記載の３次元構造座標。
（１７）ＰａａＩの変異体を作製するため、またはイオンキレート剤の開発をするため、または生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を行うために用いる、（１３）〜（１６）のいずれかに記載の３次元構造座標の全部または一部を格納しているコンピューター用記憶媒体。
【００３１】
（１８）ＰａａＩの変異体を作製するため、またはイオンキレート剤の開発をするため、または生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を行うために用いる、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの３次元構造座標。
（１９）（５）〜（８）項に記載のいずれかの結晶から得られた、（１８）に記載の３次元構造座標。
（２０）高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８に由来するＰａａＩの、（１９）に記載の３次元構造座標。
（２１）表５に示した３次元構造座標に基づき、分子置換法またはホモロジーモデリングによって求められた、（１８）〜（２０）に記載の３次元構造座標。
（２２）ＰａａＩの変異体を作製するため、またはイオンキレート剤の開発をするため、または生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を行うために用いる、（１８）〜（２１）のいずれかに記載の３次元構造座標の全部または一部を格納しているコンピューター用記憶媒体。
【００３２】
（２３）ＰａａＩの変異体を作製するため、またはイオンキレート剤の開発をするため、または生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を行うために用いる、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの３次元構造座標。
（２４）（９）〜（１２）に記載のいずれかの結晶から得られた、（２３）に記載の３次元構造座標。
（２５）高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８に由来するＰａａＩの、（２４）に記載の３次元構造座標。
（２６）表９に示した３次元構造座標に基づき、分子置換法またはホモロジーモデリングによって求められた、（２３）〜（２５）に記載の３次元構造座標。
（２７）ＰａａＩの変異体を作製するため、またはイオンキレート剤の開発をするため、または生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を行うために用いる、（２３）〜（２６）のいずれかに記載の３次元構造座標の全部または一部を格納しているコンピューター用記憶媒体。
【００３３】
（２８）ＰａａＩの変異体を作製するため、またはイオンキレート剤の開発をするため、または生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を行うために用いる、（１３）〜（１６）、（１８）〜（２１）、（２３）〜（２６）のいずれかに記載の３次元構造座標の全部または一部、若しくは（１７）（２２）（２７）に記載のコンピューター用記憶媒体の使用。
（２９）ＰａａＩポリペプチドが真正細菌に由来する、（２８）に記載の使用。
（３０）ＰａａＩポリペプチドが高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８に由来し、３次元構造座標が表１・２・５・９に記載のものである、（２８）に記載の使用。
【００３４】
（３１）（１３）〜（１６）、（１８）〜（２１）、（２３）〜（２６）のいずれかに記載の３次元構造座標の全部または一部、若しくは請求の範囲第１７・２２・２７項に記載のコンピューター用記憶媒体を使用することを特徴とする、ＰａａＩの１個または複数個のアミノ酸残基を置換・付加・欠失した変異体を同定・検索・評価・設計する方法。
（３２）変異を、ＰａａＩ四量体の形成に関与するアミノ酸残基またはＰａａＩとコエンザイムＡ誘導体との相互作用に関与するアミノ酸残基またはＰａａＩへの塩素イオンの結合に関与するアミノ酸残基で行う、（３１）に記載の方法。
（３３）ＰａａＩが真正細菌に由来する、（３１）〜（３２）のいずれかに記載の方法。
（３４）ＰａａＩが高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８に由来する、（３３）に記載の方法。
（３５）（３１）〜（３４）のいずれかに記載の方法を用いて得られるＰａａＩの変異体。
【００３５】
（３６）高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来ＰａａＩにおいて、ＰａａＩ四量体の形成に関与するＭ１・Ｒ２・Ｄ３・Ｐ４・Ｆ５・Ａ８・Ｌ９・Ａ２９・Ｄ３０・Ｈ３１・Ｌ３２・Ｎ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｆ４２・Ｙ４４・Ａ４５・Ｄ４８・Ｓ４９・Ｌ５３・Ｎ５６・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｖ８７・Ｎ８８・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｔ９５・Ｒ９７・Ｅ９９・Ｋ１０５・Ｌ１０６・Ｌ１０９・Ｔ１１１・Ｔ１１３・Ｆ１１５のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換された、（３５）に記載の変異体。
（３７）高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来ＰａａＩにおいて、ＰａａＩとコエンザイムＡ誘導体との相互作用に関与するＮ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｔ３７・Ａ３８・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｄ４８・Ｆ５１・Ａ５２・Ｓ５５・Ｎ５６・Ｐ６０・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｌ７４・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｋ１０５・Ｖ１１４・Ｆ１１５・Ｌ１１７のアミノ酸残基または活性部位近傍に存在し活性に関与すると考えられるＮ３３・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｄ４８のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換された、（３５）に記載の変異体。
（３８）高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来ＰａａＩにおいて、ＰａａＩへの塩素イオンの結合に関与するＳ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｔ１１１・Ｔ１１３のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換された、（３５）に記載の変異体。
【００３６】
（３９）（１３）〜（１６）、（１８）〜（２１）、（２３）〜（２６）のいずれかに記載の３次元構造座標の全部または一部、若しくは（１７）（２２）（２７）に記載のコンピューター用記憶媒体を使用することを特徴とする、ＰａａＩの塩素イオン結合様式を利用したイオンキレート剤を開発する方法。
（４０）ＰａａＩが高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来であり、３次元構造座標が表１・２・５・９に記載のものである、（３９）に記載の方法。
（４１）表１・２・５・９に記載の３次元構造座標のうち、特に塩素イオンと相互作用しているＰａａＩのアミノ酸残基およびその近傍領域のアミノ酸残基の３次元構造座標を使用する（４０）に記載の方法。
【００３７】
（４２）表１・２・５・９に記載の３次元構造座標を用いて、
（ａ）目的イオンとの相互作用がより合目的的なものになるように、ＰａａＩの塩素イオン結合部位およびその近傍領域のアミノ酸を置換・付加・欠失・化学修飾した変異体を設計すること、更に（ｂ）目的イオンとの相互作用が保持されるように、ＰａａＩの塩素イオン結合部位およびその近傍領域と類似の立体構造を持つ低分子化合物を設計すること、
を含む、（３９）〜（４１）のいずれかに記載の方法。
（４３）（３９）〜（４２）のいずれかに記載の方法を用いて得られる、イオンキレート剤である化合物。
（４４）イオンキレート剤が高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来ＰａａＩそのもの又はその変異体である、（４３）に記載の化合物。
（４５）イオンキレート剤が高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来ＰａａＩそのもの又はその変異体であり且つ、塩素イオンに対するキレート剤である、（４４）に記載の化合物。
【００３８】
（４６）（１３）〜（１６）、（１８）〜（２１）、（２３）〜（２６）項のいずれかに記載の３次元構造座標の全部または一部、若しくは（１７）（２２）（２７）に記載のコンピューター用記憶媒体を使用することを特徴とする、ＰａａＩのチオエステラーゼ活性の改変を利用し、生分解性プラスチックの生合成・分解を改良する方法。
（４７）ＰａａＩが高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来であり、３次元構造座標が表１・２・５・９に記載のものである、（４６）に記載の方法。
（４８）表１・２・５・９に記載の３次元構造座標のうち、特にＰａａＩ四量体の形成に関与するアミノ酸残基またはＰａａＩとコエンザイムＡ誘導体との相互作用に関与するアミノ酸残基の３次元構造座標を使用する（４７）に記載の方法。
（４９）表１・２・５・９に記載の３次元構造座標を用いて、
（ａ）チオエステラーゼ活性がより合目的的なものになるように、ＰａａＩ四量体の形成に関与するアミノ酸残基またはＰａａＩとコエンザイムＡ誘導体との相互作用に関与するアミノ酸残基を置換・付加・欠失した変異体を設計すること、更に（ｂ）ＰａａＩの変異体を組み込んだ菌株を、それによる生分解性プラスチックの生合成・分解がより合目的的なものになるように設計すること、
を含む、（４６）〜（４８）のいずれかに記載の方法。
【００３９】
（５０）（４６）〜（４９）のいずれかに記載の方法を用いて得られる、生分解性プラスチックの生合成あるいは生分解がより合目的的に改良された菌株。
（５１）ＰａａＩが高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来である、（５０）に記載の菌株。
（５２）分子置換の手法を用いた結晶構造解析における、（１３）〜（１６）、（１８）〜（２１）、（２３）〜（２６）のいずれかに記載の３次元構造座標の全部または一部、若しくは（１７）（２２）（２７）に記載のコンピューター用記憶媒体の使用。
【００４０】
図面の説明
図１は、リガンド非結合型ＰａａＩの空間群Ｐ４３２２に属する結晶から得られた３次元構造座標に基づいたＰａａＩ四量体の構造を、結晶学的および非結晶学的な３本の２回対称軸に沿った直交する３方向から見たリボン図で示す。各サブユニットを色分けし、塩素イオンを空間充填モデルで描いてある。
【００４１】
図２は、リガンド非結合型ＰａａＩの空間群Ｐ４３２２に属する結晶から得られた３次元構造座標に基づいた塩素イオン結合部位周辺の構造を、平行視の立体図で示す。塩素イオンの結合に関与するＳ６５〜Ｄ６９までの５残基部分（ペンタペプチド）のみを針金モデルで、塩素イオンを緑の球で描いてある。点線は、主な相互作用である、Ｒ６７と塩素イオン間の静電的相互作用を表す。
【００４２】
図３は、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶から得られた３次元構造座標に基づいたＰａａＩ四量体の構造を、図１と同じ直交する３方向から見たリボン図で示す。各サブユニットを色分けし、リガンドと塩素イオンを空間充填モデルで描いてある。上段がタイプ１の四量体、下段がタイプ２の四量体である。
【００４３】
図４は、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶から得られた３次元構造座標に基づいたＰａａＩ四量体の構造を、図１と同じ直交する３方向から見たリボン図で示す。各サブユニットを色分けし、リガンドと塩素イオンを空間充填モデルで描いてある。上段がタイプ１の四量体、下段がタイプ２の四量体である。
【００４４】
図５は、リガンド非結合型・ＣｏＡ−ＳＨ結合型・ヘキサノイルＣｏＡ結合型のそれぞれの活性部位の状態を模式的に示す。コイル状のものはＰａａＩサブユニット中央部に存在する長いへリックスを、ＢとあるのはＰａａＩのチオエステラーゼ反応において基質を求核攻撃する広義塩基を表している。
【００４５】
発明の詳細な説明
１．リガンド非結合型ＰａａＩの結晶
本発明に用いたＰａａＩは高度好熱菌  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  由来のものであり、第１番目のＭｅｔから第１３６番目のＡｌａまでの全長領域である。ＰａａＩの開始部位および終了部位は本発明において必ずしも厳密ではなく、そのチオエステラーゼ活性および塩素イオン結合能力が保持されることを条件として、Ｎ末端またはＣ末端が削れたもの、あるいはＮ末端またはＣ末端にアミノ酸が付加したものも包含される。
【００４６】
結晶化は、目的のタンパク質溶液に沈殿剤を添加する又は溶媒量を蒸発等により減少させる等の操作により、ある特定の条件下でタンパク質が結晶として析出する性質を利用している。結晶化には高純度に精製されたタンパク質が必要である。また、結晶化する条件として、タンパク質濃度・塩濃度・水素イオン濃度（ｐＨ）・沈殿剤の種類と濃度・その他の添加剤の種類と濃度・温度などの物理的および化学的な因子が関与している。更に、沈殿剤添加や溶媒量の調整方法として、バッチ法・透析法・蒸気拡散法などの結晶化の手法が数多く存在している（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，  Ｔ．  Ｌ．  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｌ．  Ｎ．  （１９７６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ５９−８２）。このように、Ｘ線結晶解析に適したタンパク質結晶を得るには、高純度のタンパク質を得ることと、結晶化における様々な条件や手法を最適化することが必要になる。
【００４７】
本発明のリガンド非結合型ＰａａＩの結晶は、以下のようにして調製される。まず、高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来のＰａａＩを高純度に精製する。精製法としては、カラムクロマトグラフィー（アフィニティー・イオン交換・ゲル濾過など）・塩析・遠心分離・電気泳動など、当業者においてタンパク質を精製する方法として一般的に行われている方法を単独で、又は組み合わせて用いる。塩濃度やｐＨを、より生体中の条件に近い状態に合わせることのできる精製方法、例えばゲル濾過クロマトグラフィー等を用いることが望ましい。
【００４８】
次いでリガンド非結合型ＰａａＩの結晶を調製する。結晶化法としてはバッチ法・透析法・蒸気拡散法などの手法を用いる。また、タンパク質濃度・塩濃度・ｐＨ・沈殿剤の種類と濃度・その他の添加剤の種類と濃度・温度などの物理的および化学的な因子の決定が必要である。例えば、タンパク質濃度５〜２０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．５、添加剤として０．１Ｍの塩化マグネシウム、沈殿剤として１５％のポリエチレングリコール４００、温度２２℃の条件下でリガンド非結合型ＰａａＩの空間群Ｐ４３２２に属する結晶を得ることができる。また、タンパク質濃度５〜２０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭのＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ９．５、沈殿剤として０．４１Ｍの酒石酸ナトリウムカリウム、温度２２℃の条件下でリガンド非結合型ＰａａＩの空間群Ｉ４１２２に属する結晶を得ることができる。ただし、当業者において、同一のタンパク質が異なる条件下でも結晶化し得ることは周知の事実であるので、本発明はここに記述された条件に限定されるものではなく、実質的に本発明と同一の結晶学的定数を与えるリガンド非結合型ＰａａＩの結晶は本発明の範囲内である。
【００４９】
２．リガンド非結合型ＰａａＩの３次元構造座標
タンパク質の３次元構造を明らかにする手法として、最も一般的に行われているのは、Ｘ線結晶構造解析の手法である。即ち、目的タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化したＸ線をあて、得られたＸ線の回折像を基にそのタンパク質の３次元構造を明らかにしていくものである。１項で得たリガンド非結合型ＰａａＩの結晶を用い、このＸ線結晶構造解析の手法により３次元構造を明らかにした。
【００５０】
高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来ＰａａＩから得られるリガンド非結合型ＰａａＩの結晶は、正方晶系の空間群Ｐ４３２２に属するもの、および、同じく正方晶系の空間群Ｉ４１２２に属するものの２種類ある。空間群Ｐ４３２２に属するものは、単位格子としてａ軸およびｂ軸の方向に５８±５Å、ｃ軸の方向に１４０±５Åの大きさを有する。一方、空間群Ｉ４１２２に属するものは、単位格子としてａ軸およびｂ軸の方向に７７±５Å、ｃ軸の方向に１１６±５Åの大きさを有する。これらの結晶を用いたＸ線結晶構造解析の手法により、本発明であるリガンド非結合型ＰａａＩの３次元構造座標（各原子間の空間的な位置関係を示す値）が初めて得られる。得られた構造座標を当業者において一般的に用いられているプロテインデータバンク（ＰＤＢ）の表記方法に従って示す（表１および表２）。
【００５１】
表１
リガンド非結合型ＰａａＩの結晶（Ｐ４３２２）から得られた３次元構造座標
【表１】
2004254621.tif 000002
【００５２】
【表２】
2004254621.tif 000003
【００５３】
【表３】
2004254621.tif 000004
【００５４】
【表４】
2004254621.tif 000005
【００５５】
【表５】
2004254621.tif 000006
【００５６】
【表６】
2004254621.tif 000007
【００５７】
【表７】
2004254621.tif 000008
【００５８】
【表８】
2004254621.tif 000009
【００５９】
【表９】
2004254621.tif 000010
【００６０】
【表１０】
2004254621.tif 000011
【００６１】
【表１１】
2004254621.tif 000012
【００６２】
【表１２】
2004254621.tif 000013
【００６３】
【表１３】
2004254621.tif 000014
【００６４】
【表１４】
2004254621.tif 000015
【００６５】
【表１５】
2004254621.tif 000016
【００６６】
【表１６】
2004254621.tif 000017
【００６７】
【表１７】
2004254621.tif 000018
【００６８】
【表１８】
2004254621.tif 000019
【００６９】
【表１９】
2004254621.tif 000020
【００７０】
【表２０】
2004254621.tif 000021
【００７１】
【表２１】
2004254621.tif 000022
【００７２】
【表２２】
2004254621.tif 000023
【００７３】
【表２３】
2004254621.tif 000024
【００７４】
【表２４】
2004254621.tif 000025
【００７５】
【表２５】
2004254621.tif 000026
【００７６】
【表２６】
2004254621.tif 000027
【００７７】
【表２７】
2004254621.tif 000028
【００７８】
【表２８】
2004254621.tif 000029
【００７９】
【表２９】
2004254621.tif 000030
【００８０】
【表３０】
2004254621.tif 000031
【００８１】
【表３１】
2004254621.tif 000032
【００８２】
【表３２】
2004254621.tif 000033
【００８３】
【表３３】
2004254621.tif 000034
【００８４】
【表３４】
2004254621.tif 000035
【００８５】
表２
リガンド非結合型ＰａａＩの結晶（Ｉ４１２２）から得られた３次元構造座標
【表３５】
2004254621.tif 000036
【００８６】
【表３６】
2004254621.tif 000037
【００８７】
【表３７】
2004254621.tif 000038
【００８８】
【表３８】
2004254621.tif 000039
【００８９】
【表３９】
2004254621.tif 000040
【００９０】
【表４０】
2004254621.tif 000041
【００９１】
【表４１】
2004254621.tif 000042
【００９２】
【表４２】
2004254621.tif 000043
【００９３】
【表４３】
2004254621.tif 000044
【００９４】
【表４４】
2004254621.tif 000045
【００９５】
【表４５】
2004254621.tif 000046
【００９６】
【表４６】
2004254621.tif 000047
【００９７】
【表４７】
2004254621.tif 000048
【００９８】
【表４８】
2004254621.tif 000049
【００９９】
【表４９】
2004254621.tif 000050
【０１００】
【表５０】
2004254621.tif 000051
【０１０１】
【表５１】
2004254621.tif 000052
【０１０２】
【表５２】
2004254621.tif 000053
【０１０３】
【表５３】
2004254621.tif 000054
【０１０４】
表１および表２において、１行目は結晶学的定数の記述で、左から単位格子の大きさ（ａ軸・ｂ軸・ｃ軸の順でÅ単位）、各軸のなす角度（α・β・γ）、空間群を表している。２行目以降ＴＥＲおよびＥＮＤで始まる行以外の行により各原子の３次元座標が記述されている。１列目のＡＴＯＭはポリペプチド部分の原子座標、ＨＥＴＡＴＭはポリペプチド以外の部分の原子座標であることを表す。ＡＴＯＭ行の２列目はその原子の識別番号を、３列目はその原子の名称を、４列目はその原子が属する残基名を、５列目はその原子が属するポリペプチド鎖名を、６列目はその原子が属する残基番号を、７・８・９列目はその原子の座標（ｘ・ｙ・ｚの順でÅ単位）を、１０列目はその原子の占有率を、１１列目はその原子の等方性温度因子を、１２列目はその原子の種名を示している。ＨＥＴＡＴＭ行の２列目はその原子の識別番号を、３列目はその原子の名称を、４列目はその原子が属する残基名または分子名を、５列目はその原子が属する残基番号または分子番号を、６・７・８列目はその原子の座標（ｘ・ｙ・ｚの順でÅ単位）を、９列目はその原子の占有率を、１０列目はその原子の等方性温度因子を、１１列目はその原子の種名を示している。ＴＥＲ行はポリペプチド鎖の区切りを示し、ＥＮＤ行はこの３次元構造座標の最終行であることを示している。
【０１０５】
これらの３次元構造座標は、結晶の非対称単位すなわちその中に結晶学的対称性を持たない最小単位中に存在する原子として、空間群Ｐ４３２２に属する結晶の場合、ポリペプチド鎖名ＡおよびＢで示される２本のＰａａＩポリペプチド鎖、分子名ＣＬで示される塩素イオン１個、分子名ＭＧで示されるマグネシウムイオン１個、分子名ＨＯＨで示される水分子２００個を、空間群Ｉ４１２２に属する結晶の場合、ポリペプチド鎖名Ａで示されるＰａａＩポリペプチド鎖１本、分子名ＣＬで示される塩素イオン１個、分子名ＧＯＨで示されるグリセロール分子１個、分子名ＨＯＨで示される水分子１６０個を含んでいる。なお、本結晶中のＰａａＩポリペプチド鎖において、Ｇ１１８〜Ａ１３６までのアミノ酸残基、およびＰ４３２２結晶中におけるＮ末端の１または２アミノ酸残基は一定の構造をとっておらず、Ｘ線結晶構造解析において考慮から除外している。
【０１０６】
リガンド非結合型ＰａａＩの結晶（Ｐ４３２２）はその非対称単位中にＡおよびＢで示される２本のＰａａＩポリペプチド鎖を含む。これら２本のポリペプチド鎖は互いにわずかに異なる構造を持ち、非結晶学的な擬似２回対称軸によって互いに関係付けられる二量体を形成している。この二量体はさらに結晶学的２回対称軸によって関係付けられる他の二量体と会合し、全体として四量体を形成している。これら２つの二量体は結晶学的対称関係にあるので、本明細書中ではこれらを厳密に同一の構造を持つものとして扱う。リガンド非結合型ＰａａＩの結晶（Ｐ４３２２）から得られた構造座標に基づき、タンパク質の構造を理解するのに当業者において一般的に用いられている表記方法であるリボン図を用いて、結晶学的および非結晶学的な３本の２回対称軸に沿った３方向から見たＰａａＩ四量体の構造を図１に示す。この図から理解されるように、リガンド非結合型ＰａａＩ四量体（Ｐ４３２２）の４本のポリペプチド鎖は、巨視的に見て点群２２２で表される擬似対称性を持って配置し、互いに認識（相互作用）し会合している。
【０１０７】
なお、リガンド非結合型ＰａａＩの結晶（Ｉ４１２２）は巨視的に見てＰ４３２２の結晶と同様なＰａａＩ四量体を含むが、その非対称単位中にはＡで示される１本のＰａａＩポリペプチド鎖しか含まない。従って、Ｉ４１２２の結晶ではＰａａＩ四量体の２２２対称が全て結晶学的対称になっており、そのため当該四量体を形成する４本のポリペプチド鎖は厳密に同一の構造を持つ。
【０１０８】
以上をまとめると、リガンド非結合型ＰａａＩのＰ４３２２結晶およびＩ４１２２結晶における四量体の４本のポリペプチド鎖は、それぞれ点群２２２の擬似対称性および点群２２２の完全対称性を持って配置し、互いに認識（相互作用）し会合している。この相互作用に関与するアミノ酸残基としては、Ｍ１・Ｒ２・Ｄ３・Ｐ４・Ｆ５・Ａ８・Ｌ９・Ａ２９・Ｄ３０・Ｈ３１・Ｌ３２・Ｎ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｆ４２・Ｙ４４・Ａ４５・Ｄ４８・Ｓ４９・Ｎ５６・Ａ６１・Ａ６３・Ｌ６４・Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｖ８７・Ｎ８８・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｔ９５・Ｒ９７・Ｅ９９・Ｌ１０６・Ｌ１０９・Ｔ１１１・Ｔ１１３・Ｆ１１５が挙げられ、当該四量体の会合はこれらのアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の相互作用で特徴付けられる（表３）。
【０１０９】
表３
リガンド非結合型ＰａａＩの結晶において四量体の会合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式
相互作用様式の略号
ＨＹＤ：  水素結合  （相互作用距離≦３．４Å）
ＷＭＨ：  水を介した水素結合
ＧＭＨ：  グリセロールを介した水素結合
ＶＤＷ：  ファンデルワールス相互作用  （相互作用距離≦４．０Å）
ＥＳＩ：  静電的相互作用  （３．４Å＜相互作用距離≦５．０Å）
ＣＭＥ：  塩素イオンを介した静電的相互作用
ＭＭＥ：  マグネシウムイオンを介した静電的相互作用
【０１１０】
2004254621.tif 000055
【０１１１】
2004254621.tif 000056
【０１１２】
2004254621.tif 000057
【０１１３】
2004254621.tif 000058
【０１１４】
2004254621.tif 000059
【０１１５】
2004254621.tif 000060
【０１１６】
2004254621.tif 000061
【０１１７】
2004254621.tif 000062
【０１１８】
2004254621.tif 000063
【０１１９】
2004254621.tif 000064
【０１２０】
2004254621.tif 000065
【０１２１】
2004254621.tif 000066
【０１２２】
2004254621.tif 000067
【０１２３】
2004254621.tif 000068
【０１２４】
2004254621.tif 000069
【０１２５】
2004254621.tif 000070
【０１２６】
2004254621.tif 000071
【０１２７】
2004254621.tif 000072
【０１２８】
2004254621.tif 000073
【０１２９】
2004254621.tif 000074
【０１３０】
2004254621.tif 000075
【０１３１】
2004254621.tif 000076
【０１３２】
2004254621.tif 000077
【０１３３】
2004254621.tif 000078
【０１３４】
2004254621.tif 000079
【０１３５】
2004254621.tif 000080
【０１３６】
2004254621.tif 000081
【０１３７】
2004254621.tif 000082
【０１３８】
2004254621.tif 000083
【０１３９】
2004254621.tif 000084
【０１４０】
2004254621.tif 000085
【０１４１】
2004254621.tif 000086
【０１４２】
2004254621.tif 000087
【０１４３】
2004254621.tif 000088
【０１４４】
2004254621.tif 000089
【０１４５】
2004254621.tif 000090
【０１４６】
2004254621.tif 000091
【０１４７】
2004254621.tif 000092
【０１４８】
2004254621.tif 000093
【０１４９】
2004254621.tif 000094
【０１５０】Ｉ４１２２結晶
2004254621.tif 000095
【０１５１】
2004254621.tif 000096
【０１５２】
2004254621.tif 000097
【０１５３】
2004254621.tif 000098
【０１５４】
2004254621.tif 000099
【０１５５】
2004254621.tif 000100
【０１５６】
2004254621.tif 000101
【０１５７】
2004254621.tif 000102
【０１５８】
2004254621.tif 000103
【０１５９】
2004254621.tif 000104
【０１６０】
2004254621.tif 000105
【０１６１】
2004254621.tif 000106
【０１６２】
2004254621.tif 000107
【０１６３】
2004254621.tif 000108
【０１６４】
2004254621.tif 000109
【０１６５】
2004254621.tif 000110
【０１６６】
2004254621.tif 000111
【０１６７】
2004254621.tif 000112
【０１６８】
2004254621.tif 000113
【０１６９】
2004254621.tif 000114
【０１７０】
2004254621.tif 000115
【０１７１】
2004254621.tif 000116
【０１７２】
2004254621.tif 000117
【０１７３】
2004254621.tif 000118
【０１７４】
2004254621.tif 000119
【０１７５】
表３は、リガンド非結合型ＰａａＩの結晶において四量体の会合に関与する各ポリペプチド鎖のアミノ酸残基の原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式を示す。Ｐ４３２２結晶を前半に、Ｉ４１２２結晶を後半に示してある。１列目は一方のポリペプチド鎖のアミノ酸残基名・残基番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、２列目は他方のポリペプチド鎖のアミノ酸残基名・残基番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、３列目はその相互作用の原子間距離をÅ単位で、４列目は相互作用の様式を記述している。相互作用の様式は、ＨＹＤは水素結合、ＷＭＨは水を介した水素結合、ＧＭＨはグリセロールを介した水素結合、ＶＤＷはファンデルワールス相互作用、ＥＳＩは静電的相互作用、ＣＭＥは塩素イオンを介した静電的相互作用、ＭＭＥはマグネシウムイオンを介した静電的相互作用を示している。なお、Ｐ４３２２結晶のポリペプチド鎖名でＳｙｍＡあるいはＳｙｍＢとあるのは、それぞれポリペプチド鎖Ａおよびポリペプチド鎖Ｂの結晶学的対称関係にあるポリペプチド鎖のことを示している。一方、Ｉ４１２２結晶のポリペプチド鎖名でＳｙｍＢ・ＳｙｍＣ・ＳｙｍＤとあるのは、それぞれＰ４３２２結晶のポリペプチド鎖名でＢ・ＳｙｍＡ・ＳｙｍＢにあたる。
【０１７６】
リガンド非結合型ＰａａＩのＰ４３２２結晶およびＩ４１２２結晶の結晶構造において、塩素イオンは、それぞれ点群２２２の擬似対称性および点群２２２の完全対称性を持って配置したＰａａＩ四量体の４本のポリペプチド鎖の対称中心に１個存在しており、四量体の構造保持に寄与している（図１）。この塩素イオン結合部位の詳細構造を、タンパク質の構造を理解するのに当業者において一般的に用いられている表記方法である針金モデルを用いて図２に示す。この図から理解されるように、塩素イオンは、四量体中の各々のＰａａＩポリペプチド鎖に属するＲ６７合計４残基で取り囲まれており、四量体中の各々のＰａａＩポリペプチド鎖と互いに認識（相互作用）し結合している。この相互作用を特徴付けているアミノ酸残基としては、Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｔ１１１・Ｔ１１３が挙げられる（表４）。即ち、リガンド非結合型ＰａａＩの塩素イオン結合部位は、点群２２２で表される対称関係にある４つの同一構造部分を持ち、これら４つの同一構造部分で取り囲むことにより対称中心に存在する塩素イオンを結合しており、その結合は表４に挙げたアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基との相互作用で特徴付けられる。
【０１７７】
表４
リガンド非結合型ＰａａＩの結晶において塩素イオンの結合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式
相互作用様式の略号
ＨＹＤ：  水素結合  （相互作用距離≦３．４Å）
ＷＭＨ：  水を介した水素結合
ＶＤＷ：  ファンデルワールス相互作用  （相互作用距離≦４．０Å）
ＥＳＩ：  静電的相互作用  （３．４Å＜相互作用距離≦５．０Å）
【０１７８】
2004254621.tif 000120
【０１７９】
2004254621.tif 000121
【０１８０】
2004254621.tif 000122
【０１８１】
2004254621.tif 000123
【０１８２】
2004254621.tif 000124
【０１８３】
2004254621.tif 000125
【０１８４】
2004254621.tif 000126
【０１８５】
2004254621.tif 000127
【０１８６】
2004254621.tif 000128
【０１８７】
2004254621.tif 000129
【０１８８】
2004254621.tif 000130
【０１８９】
2004254621.tif 000131
【０１９０】
表４は、リガンド非結合型ＰａａＩの結晶において塩素イオンの結合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式を示す。Ｐ４３２２の結晶を前半に、Ｉ４１２２の結晶を後半に示してある。１列目は一方の原子の残基または分子名・残基または分子番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、２列目は他方の原子の残基または分子名・残基または分子番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、３列目はその相互作用の原子間距離をÅ単位で、４列目は相互作用の様式を記述している。相互作用の様式は、ＨＹＤは水素結合、ＷＭＨは水を介した水素結合、ＶＤＷはファンデルワールス相互作用、ＥＳＩは静電的相互作用を示している。なお、Ｐ４３２２結晶のポリペプチド鎖名でＳｙｍＡあるいはＳｙｍＢとあるのは、それぞれポリペプチド鎖Ａおよびポリペプチド鎖Ｂの結晶学的対称関係にあるポリペプチド鎖のことを示している。一方、Ｉ４１２２の結晶のポリペプチド鎖名でＳｙｍＢ・ＳｙｍＣ・ＳｙｍＤとあるのは、それぞれＰ４３２２結晶のポリペプチド鎖名でＢ・ＳｙｍＡ・ＳｙｍＢにあたる。以上の結果から、リガンド非結合型ＰａａＩにおいて、塩素イオンは主にＲ６７のグアニジン基との静電的相互作用によりＰａａＩ分子に結合しており、その他の相互作用により当該結合がさらに安定化される。
【０１９１】
本発明であるリガンド非結合型ＰａａＩ以外のタンパク質の３次元構造座標において、リガンド非結合型ＰａａＩの３次元構造座標と実質的に一致するものは本発明の範囲内である。実質的に一致とは、両タンパク質分子間で分子進化的に対応するＣα炭素原子の重ねあわせを行った時の２乗平均平方根誤差が１．５Å以下である構造を指す。例えば、ＰａａＩの変異体または化学修飾体さらにＰａａＩと分子進化的に関連している他のタンパク質を含む結晶に由来する３次元構造座標などがこれにあたる。また、ＰａａＩポリペプチド鎖におけるアミノ酸配列の開始位置および終了位置は必ずしも本発明にとって厳密に規定されたものではなく、そのチオエステラーゼ活性および塩素イオン結合能力が保持されることを条件として、Ｎ末端またはＣ末端が削れたもの、あるいはＮ末端またはＣ末端にアミノ酸が付加したものも本発明に包含される。
【０１９２】
また、リガンド非結合型ＰａａＩの３次元構造座標を基にホモロジーモデリング（中村春木，中井謙太（１９９５）バイオテクノロジーのためのコンピューター入門，コロナ社，１８６〜２０４）により導き出したタンパク質の３次元構造座標も本発明に含まれる。さらに、リガンド非結合型ＰａａＩの塩素イオン結合部位の類似構造をその一部として含む化合物（類似化合物）もまた本発明に含まれる。類似化合物とは、ＰａａＩの塩素イオン結合部位およびその近傍のアミノ酸残基について作製したＰａａＩの変異体のこと、あるいはＰａａＩ又はその変異体の構造を基に設計した低分子化合物のことを指す。これらの化合物は、ＰａａＩの塩素結合部位に見られるものと類似した、点群２２２で表される対称関係にある４つの同一構造部分を持ち、これら４つの同一構造部分で取り囲むことにより対称中心に存在する目的イオンを結合する。
【０１９３】
３．ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶
本発明はＣｏＡ−ＳＨ（還元型コエンザイムＡ）とＰａａＩとの複合体の結晶に関するものである。本発明に用いたＰａａＩは高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来のものであり、第１番目のＭｅｔから第１３６番目のＡｌａまでの全長領域である。ＰａａＩの開始部位および終了部位は本発明において必ずしも厳密ではなく、そのチオエステラーゼ活性および塩素イオン結合能力が保持されることを条件として、Ｎ末端またはＣ末端が削れたもの、あるいはＮ末端またはＣ末端にアミノ酸が付加したものも包含される。
【０１９４】
結晶化は、目的のタンパク質溶液に沈殿剤を添加する又は溶媒量を蒸発等により減少させる等の操作により、ある特定の条件下でタンパク質が結晶として析出する性質を利用している。結晶化には高純度に精製されたタンパク質が必要である。また、結晶化する条件として、タンパク質濃度・塩濃度・水素イオン濃度（ｐＨ）・沈殿剤の種類と濃度・その他の添加剤の種類と濃度・温度などの物理的および化学的な因子が関与している。更に、沈殿剤添加や溶媒量の調整方法として、バッチ法・透析法・蒸気拡散法などの結晶化の手法が数多く存在している（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，  Ｔ．  Ｌ．  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｌ．  Ｎ．  （１９７６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ５９−８２）。このように、Ｘ線結晶解析に適したタンパク質結晶を得るには、高純度のタンパク質を得ることと、結晶化における様々な条件や手法を最適化することが必要になる。
【０１９５】
本発明のＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶は、以下のようにして調製される。まず、高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来のＰａａＩを高純度に精製する。精製法としては、カラムクロマトグラフィー（アフィニティー・イオン交換・ゲル濾過など）・塩析・遠心分離・電気泳動など、当業者においてタンパク質を精製する方法として一般的に行われている方法を単独で、又は組み合わせて用いる。塩濃度やｐＨを、より生体中の条件に近い状態に合わせることのできる精製方法、例えばゲル濾過クロマトグラフィー等を用いることが望ましい。次いでＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶を調製する。結晶化法としてはバッチ法・透析法・蒸気拡散法などの手法を用いる。
【０１９６】
また、タンパク質濃度・塩濃度・ｐＨ・沈殿剤の種類と濃度・その他の添加剤の種類と濃度・温度などの物理的および化学的な因子の決定が必要である。例えば、タンパク質濃度５〜２０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．１の酢酸−ＮａＯＨ緩衝液、添加剤として２．５ｍＭのＣｏＡ−ＳＨ、沈殿剤として１３．８％のイソプロピルアルコール、温度２２℃の条件下でＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶化を行うことができる。ただし、当業者において、同一のタンパク質が異なる条件下でも結晶化し得ることは周知の事実であるので、本発明はここに記述された条件に限定されるものではなく、実質的に本発明と同一の結晶学的定数を与えるＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶は本発明の範囲内である。また、ＣｏＡ−ＳＨ以外のコエンザイムＡ誘導体とＰａａＩの複合体の結晶についても、実質的に本発明と同一の結晶学的定数を与える結晶は本発明の範囲内である。
【０１９７】
４．ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの構造座標
タンパク質の３次元構造を明らかにする手法として、最も一般的に行われているのは、Ｘ線結晶構造解析の手法である。即ち、目的タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化したＸ線をあて、得られたＸ線の回折像を基にそのタンパク質の３次元構造を明らかにしていくものである。３項で得たＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶を用い、このＸ線結晶構造解析の手法により３次元構造を明らかにした。
【０１９８】
高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来ＰａａＩから得られるＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶は三斜晶系の空間群Ｐ１に属するもので、単位格子としてａ軸の方向に８３±５Å、ｂ軸の方向に８７±５Å、ｃ軸の方向に５９±５Å、ｂ軸とｃ軸の成す角度αが９２°±２°、ａ軸とｃ軸の成す角度βが９０°±２°、ａ軸とｂ軸の成す角度γが９０°±２°の大きさを有する。この結晶を用いたＸ線結晶構造解析の手法により、本発明であるＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの３次元構造座標（各原子間の空間的な位置関係を示す値）が初めて得られる。得られた構造座標を当業者において一般的に用いられているプロテインデータバンク（ＰＤＢ）の表記方法に従って示す（表５）。
【０１９９】
表５
ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶から得られた３次元構造座標
【表５４】
2004254621.tif 000132
【０２００】
【表５５】
2004254621.tif 000133
【０２０１】
【表５６】
2004254621.tif 000134
【０２０２】
【表５７】
2004254621.tif 000135
【０２０３】
【表５８】
2004254621.tif 000136
【０２０４】
【表５９】
2004254621.tif 000137
【０２０５】
【表６０】
2004254621.tif 000138
【０２０６】
【表６１】
2004254621.tif 000139
【０２０７】
【表６２】
2004254621.tif 000140
【０２０８】
【表６３】
2004254621.tif 000141
【０２０９】
【表６４】
2004254621.tif 000142
【０２１０】
【表６５】
2004254621.tif 000143
【０２１１】
【表６６】
2004254621.tif 000144
【０２１２】
【表６７】
2004254621.tif 000145
【０２１３】
【表６８】
2004254621.tif 000146
【０２１４】
【表６９】
2004254621.tif 000147
【０２１５】
【表７０】
2004254621.tif 000148
【０２１６】
【表７１】
2004254621.tif 000149
【０２１７】
【表７２】
2004254621.tif 000150
【０２１８】
【表７３】
2004254621.tif 000151
【０２１９】
【表７４】
2004254621.tif 000152
【０２２０】
【表７５】
2004254621.tif 000153
【０２２１】
【表７６】
2004254621.tif 000154
【０２２２】
【表７７】
2004254621.tif 000155
【０２２３】
【表７８】
2004254621.tif 000156
【０２２４】
【表７９】
2004254621.tif 000157
【０２２５】
【表８０】
2004254621.tif 000158
【０２２６】
【表８１】
2004254621.tif 000159
【０２２７】
【表８２】
2004254621.tif 000160
【０２２８】
【表８３】
2004254621.tif 000161
【０２２９】
【表８４】
2004254621.tif 000162
【０２３０】
【表８５】
2004254621.tif 000163
【０２３１】
【表８６】
2004254621.tif 000164
【０２３２】
【表８７】
2004254621.tif 000165
【０２３３】
【表８８】
2004254621.tif 000166
【０２３４】
【表８９】
2004254621.tif 000167
【０２３５】
【表９０】
2004254621.tif 000168
【０２３６】
【表９１】
2004254621.tif 000169
【０２３７】
【表９２】
2004254621.tif 000170
【０２３８】
【表９３】
2004254621.tif 000171
【０２３９】
【表９４】
2004254621.tif 000172
【０２４０】
【表９５】
2004254621.tif 000173
【０２４１】
【表９６】
2004254621.tif 000174
【０２４２】
【表９７】
2004254621.tif 000175
【０２４３】
【表９８】
2004254621.tif 000176
【０２４４】
【表９９】
2004254621.tif 000177
【０２４５】
【表１００】
2004254621.tif 000178
【０２４６】
【表１０１】
2004254621.tif 000179
【０２４７】
【表１０２】
2004254621.tif 000180
【０２４８】
【表１０３】
2004254621.tif 000181
【０２４９】
【表１０４】
2004254621.tif 000182
【０２５０】
【表１０５】
2004254621.tif 000183
【０２５１】
【表１０６】
2004254621.tif 000184
【０２５２】
【表１０７】
2004254621.tif 000185
【０２５３】
【表１０８】
2004254621.tif 000186
【０２５４】
【表１０９】
2004254621.tif 000187
【０２５５】
【表１１０】
2004254621.tif 000188
【０２５６】
【表１１１】
2004254621.tif 000189
【０２５７】
【表１１２】
2004254621.tif 000190
【０２５８】
【表１１３】
2004254621.tif 000191
【０２５９】
【表１１４】
2004254621.tif 000192
【０２６０】
【表１１５】
2004254621.tif 000193
【０２６１】
【表１１６】
2004254621.tif 000194
【０２６２】
【表１１７】
2004254621.tif 000195
【０２６３】
【表１１８】
2004254621.tif 000196
【０２６４】
【表１１９】
2004254621.tif 000197
【０２６５】
【表１２０】
2004254621.tif 000198
【０２６６】
【表１２１】
2004254621.tif 000199
【０２６７】
【表１２２】
2004254621.tif 000200
【０２６８】
【表１２３】
2004254621.tif 000201
【０２６９】
【表１２４】
2004254621.tif 000202
【０２７０】
【表１２５】
2004254621.tif 000203
【０２７１】
【表１２６】
2004254621.tif 000204
【０２７２】
【表１２７】
2004254621.tif 000205
【０２７３】
【表１２８】
2004254621.tif 000206
【０２７４】
【表１２９】
2004254621.tif 000207
【０２７５】
【表１３０】
2004254621.tif 000208
【０２７６】
【表１３１】
2004254621.tif 000209
【０２７７】
【表１３２】
2004254621.tif 000210
【０２７８】
【表１３３】
2004254621.tif 000211
【０２７９】
【表１３４】
2004254621.tif 000212
【０２８０】
【表１３５】
2004254621.tif 000213
【０２８１】
【表１３６】
2004254621.tif 000214
【０２８２】
【表１３７】
2004254621.tif 000215
【０２８３】
【表１３８】
2004254621.tif 000216
【０２８４】
【表１３９】
2004254621.tif 000217
【０２８５】
【表１４０】
2004254621.tif 000218
【０２８６】
【表１４１】
2004254621.tif 000219
【０２８７】
【表１４２】
2004254621.tif 000220
【０２８８】
【表１４３】
2004254621.tif 000221
【０２８９】
【表１４４】
2004254621.tif 000222
【０２９０】
【表１４５】
2004254621.tif 000223
【０２９１】
【表１４６】
2004254621.tif 000224
【０２９２】
【表１４７】
2004254621.tif 000225
【０２９３】
【表１４８】
2004254621.tif 000226
【０２９４】
【表１４９】
2004254621.tif 000227
【０２９５】
【表１５０】
2004254621.tif 000228
【０２９６】
【表１５１】
2004254621.tif 000229
【０２９７】
【表１５２】
2004254621.tif 000230
【０２９８】
【表１５３】
2004254621.tif 000231
【０２９９】
【表１５４】
2004254621.tif 000232
【０３００】
【表１５５】
2004254621.tif 000233
【０３０１】
【表１５６】
2004254621.tif 000234
【０３０２】
【表１５７】
2004254621.tif 000235
【０３０３】
【表１５８】
2004254621.tif 000236
【０３０４】
【表１５９】
2004254621.tif 000237
【０３０５】
【表１６０】
2004254621.tif 000238
【０３０６】
【表１６１】
2004254621.tif 000239
【０３０７】
【表１６２】
2004254621.tif 000240
【０３０８】
【表１６３】
2004254621.tif 000241
【０３０９】
【表１６４】
2004254621.tif 000242
【０３１０】
【表１６５】
2004254621.tif 000243
【０３１１】
【表１６６】
2004254621.tif 000244
【０３１２】
【表１６７】
2004254621.tif 000245
【０３１３】
【表１６８】
2004254621.tif 000246
【０３１４】
【表１６９】
2004254621.tif 000247
【０３１５】
【表１７０】
2004254621.tif 000248
【０３１６】
【表１７１】
2004254621.tif 000249
【０３１７】
【表１７２】
2004254621.tif 000250
【０３１８】
【表１７３】
2004254621.tif 000251
【０３１９】
【表１７４】
2004254621.tif 000252
【０３２０】
【表１７５】
2004254621.tif 000253
【０３２１】
【表１７６】
2004254621.tif 000254
【０３２２】
【表１７７】
2004254621.tif 000255
【０３２３】
【表１７８】
2004254621.tif 000256
【０３２４】
【表１７９】
2004254621.tif 000257
【０３２５】
【表１８０】
2004254621.tif 000258
【０３２６】
【表１８１】
2004254621.tif 000259
【０３２７】
【表１８２】
2004254621.tif 000260
【０３２８】
【表１８３】
2004254621.tif 000261
【０３２９】
【表１８４】
2004254621.tif 000262
【０３３０】
【表１８５】
2004254621.tif 000263
【０３３１】
【表１８６】
2004254621.tif 000264
【０３３２】
【表１８７】
2004254621.tif 000265
【０３３３】
【表１８８】
2004254621.tif 000266
【０３３４】
【表１８９】
2004254621.tif 000267
【０３３５】
【表１９０】
2004254621.tif 000268
【０３３６】
【表１９１】
2004254621.tif 000269
【０３３７】
【表１９２】
2004254621.tif 000270
【０３３８】
【表１９３】
2004254621.tif 000271
【０３３９】
【表１９４】
2004254621.tif 000272
【０３４０】
【表１９５】
2004254621.tif 000273
【０３４１】
【表１９６】
2004254621.tif 000274
【０３４２】
【表１９７】
2004254621.tif 000275
【０３４３】
【表１９８】
2004254621.tif 000276
【０３４４】
【表１９９】
2004254621.tif 000277
【０３４５】
【表２００】
2004254621.tif 000278
【０３４６】
【表２０１】
2004254621.tif 000279
【０３４７】
【表２０２】
2004254621.tif 000280
【０３４８】
【表２０３】
2004254621.tif 000281
【０３４９】
【表２０４】
2004254621.tif 000282
【０３５０】
【表２０５】
2004254621.tif 000283
【０３５１】
【表２０６】
2004254621.tif 000284
【０３５２】
【表２０７】
2004254621.tif 000285
【０３５３】
【表２０８】
2004254621.tif 000286
【０３５４】
【表２０９】
2004254621.tif 000287
【０３５５】
【表２１０】
2004254621.tif 000288
【０３５６】
【表２１１】
2004254621.tif 000289
【０３５７】
【表２１２】
2004254621.tif 000290
【０３５８】
【表２１３】
2004254621.tif 000291
【０３５９】
【表２１４】
2004254621.tif 000292
【０３６０】
【表２１５】
2004254621.tif 000293
【０３６１】
【表２１６】
2004254621.tif 000294
【０３６２】
【表２１７】
2004254621.tif 000295
【０３６３】
【表２１８】
2004254621.tif 000296
【０３６４】
【表２１９】
2004254621.tif 000297
【０３６５】
【表２２０】
2004254621.tif 000298
【０３６６】
【表２２１】
2004254621.tif 000299
【０３６７】
【表２２２】
2004254621.tif 000300
【０３６８】
【表２２３】
2004254621.tif 000301
【０３６９】
【表２２４】
2004254621.tif 000302
【０３７０】
【表２２５】
2004254621.tif 000303
【０３７１】
【表２２６】
2004254621.tif 000304
【０３７２】
【表２２７】
2004254621.tif 000305
【０３７３】
【表２２８】
2004254621.tif 000306
【０３７４】
【表２２９】
2004254621.tif 000307
【０３７５】
【表２３０】
2004254621.tif 000308
【０３７６】
【表２３１】
2004254621.tif 000309
【０３７７】
【表２３２】
2004254621.tif 000310
【０３７８】
【表２３３】
2004254621.tif 000311
【０３７９】
【表２３４】
2004254621.tif 000312
【０３８０】
【表２３５】
2004254621.tif 000313
【０３８１】
【表２３６】
2004254621.tif 000314
【０３８２】
【表２３７】
2004254621.tif 000315
【０３８３】
【表２３８】
2004254621.tif 000316
【０３８４】
【表２３９】
2004254621.tif 000317
【０３８５】
【表２４０】
2004254621.tif 000318
【０３８６】
【表２４１】
2004254621.tif 000319
【０３８７】
【表２４２】
2004254621.tif 000320
【０３８８】
【表２４３】
2004254621.tif 000321
【０３８９】
【表２４４】
2004254621.tif 000322
【０３９０】
【表２４５】
2004254621.tif 000323
【０３９１】
【表２４６】
2004254621.tif 000324
【０３９２】
【表２４７】
2004254621.tif 000325
【０３９３】
【表２４８】
2004254621.tif 000326
【０３９４】
【表２４９】
2004254621.tif 000327
【０３９５】
【表２５０】
2004254621.tif 000328
【０３９６】
【表２５１】
2004254621.tif 000329
【０３９７】
【表２５２】
2004254621.tif 000330
【０３９８】
【表２５３】
2004254621.tif 000331
【０３９９】
【表２５４】
2004254621.tif 000332
【０４００】
【表２５５】
2004254621.tif 000333
【０４０１】
【表２５６】
2004254621.tif 000334
【０４０２】
【表２５７】
2004254621.tif 000335
【０４０３】
【表２５８】
2004254621.tif 000336
【０４０４】
【表２５９】
2004254621.tif 000337
【０４０５】
【表２６０】
2004254621.tif 000338
【０４０６】
【表２６１】
2004254621.tif 000339
【０４０７】
【表２６２】
2004254621.tif 000340
【０４０８】
【表２６３】
2004254621.tif 000341
【０４０９】
【表２６４】
2004254621.tif 000342
【０４１０】
【表２６５】
2004254621.tif 000343
【０４１１】
【表２６６】
2004254621.tif 000344
【０４１２】
【表２６７】
2004254621.tif 000345
【０４１３】
【表２６８】
2004254621.tif 000346
【０４１４】
【表２６９】
2004254621.tif 000347
【０４１５】
【表２７０】
2004254621.tif 000348
【０４１６】
【表２７１】
2004254621.tif 000349
【０４１７】
【表２７２】
2004254621.tif 000350
【０４１８】
【表２７３】
2004254621.tif 000351
【０４１９】
【表２７４】
2004254621.tif 000352
【０４２０】
【表２７５】
2004254621.tif 000353
【０４２１】
【表２７６】
2004254621.tif 000354
【０４２２】
【表２７７】
2004254621.tif 000355
【０４２３】
【表２７８】
2004254621.tif 000356
【０４２４】
【表２７９】
2004254621.tif 000357
【０４２５】
【表２８０】
2004254621.tif 000358
【０４２６】
【表２８１】
2004254621.tif 000359
【０４２７】
【表２８２】
2004254621.tif 000360
【０４２８】
【表２８３】
2004254621.tif 000361
【０４２９】
【表２８４】
2004254621.tif 000362
【０４３０】
【表２８５】
2004254621.tif 000363
【０４３１】
【表２８６】
2004254621.tif 000364
【０４３２】
【表２８７】
2004254621.tif 000365
【０４３３】
【表２８８】
2004254621.tif 000366
【０４３４】
【表２８９】
2004254621.tif 000367
【０４３５】
【表２９０】
2004254621.tif 000368
【０４３６】
【表２９１】
2004254621.tif 000369
【０４３７】
【表２９２】
2004254621.tif 000370
【０４３８】
【表２９３】
2004254621.tif 000371
【０４３９】
【表２９４】
2004254621.tif 000372
【０４４０】
【表２９５】
2004254621.tif 000373
【０４４１】
【表２９６】
2004254621.tif 000374
【０４４２】
【表２９７】
2004254621.tif 000375
【０４４３】
【表２９８】
2004254621.tif 000376
【０４４４】
【表２９９】
2004254621.tif 000377
【０４４５】
【表３００】
2004254621.tif 000378
【０４４６】
【表３０１】
2004254621.tif 000379
【０４４７】
【表３０２】
2004254621.tif 000380
【０４４８】
【表３０３】
2004254621.tif 000381
【０４４９】
【表３０４】
2004254621.tif 000382
【０４５０】
【表３０５】
2004254621.tif 000383
【０４５１】
【表３０６】
2004254621.tif 000384
【０４５２】
【表３０７】
2004254621.tif 000385
【０４５３】
【表３０８】
2004254621.tif 000386
【０４５４】
表５において、１行目は結晶学的定数の記述で、左から単位格子の大きさ（ａ軸・ｂ軸・ｃ軸の順でÅ単位）、各軸のなす角度（α・β・γ）、空間群を表している。２行目以降ＴＥＲおよびＥＮＤで始まる行以外の行により各原子の３次元座標が記述されている。１列目のＡＴＯＭはポリペプチド部分の原子座標、ＨＥＴＡＴＭはポリペプチド以外の部分の原子座標であることを表す。ＡＴＯＭ行の２列目はその原子の識別番号を、３列目はその原子の名称を、４列目はその原子が属する残基名を、５列目はその原子が属するポリペプチド鎖名を、６列目はその原子が属する残基番号を、７・８・９列目はその原子の座標（ｘ・ｙ・ｚの順でÅ単位）を、１０列目はその原子の占有率を、１１列目はその原子の等方性温度因子を、１２列目はその原子の種名を示している。ＨＥＴＡＴＭ行の２列目はその原子の識別番号を、３列目はその原子の名称を、４列目はその原子が属する残基名または分子名を、５列目はその原子が属する残基番号または分子番号を、６・７・８列目はその原子の座標（ｘ・ｙ・ｚの順でÅ単位）を、９列目はその原子の占有率を、１０列目はその原子の等方性温度因子を、１１列目はその原子の種名を示している。ＴＥＲ行はポリペプチド鎖の区切りを示し、ＥＮＤ行はこの３次元構造座標の最終行であることを示している。
【０４５５】
この３次元構造座標は、当結晶の非対称単位すなわちその中に結晶学的対称性を持たない最小単位中に存在する原子として、ポリペプチド鎖名ＡからＰで示される１６本のＰａａＩポリペプチド鎖、分子名ＣＬで示される塩素イオン４個、分子名ＣＯＡで示されるＣｏＡ−ＳＨ分子８個、分子名ＨＯＨで示される水分子２５３個を含んでいる。なお、本結晶中の１６本のＰａａＩポリペプチド鎖のうち、全てのポリペプチド鎖におけるＧ１１８〜Ａ１３６までのアミノ酸残基、およびいくつかのポリペプチド鎖におけるＮ末端の１または２アミノ酸残基は一定の構造をとっておらず、Ｘ線結晶構造解析において考慮から除外している。
【０４５６】
ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶の非対称単位は互いにわずかに異なる構造を持つ４個の四量体を含んでいる。これらの四量体は、リガンドを無視して考えると、巨視的に点群２２２で表される擬似対称関係で４本のポリペプチド鎖が配置し、リガンド非結合型で見られたものと似た様式で会合している。しかし、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ではこの２２２擬似対称が結晶学的対称を含まないため、四量体を形成する４本のポリペプチド鎖全てが互いにわずかに異なる構造を持つ。更に、ポリペプチド鎖Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄで形成される四量体とポリペプチド鎖Ｅ・Ｆ・Ｇ・Ｈで形成される四量体は結晶内で良く似た環境にあるため、構造が特に良く似ている（対応するＣα炭素原子の重ね合わせを行った時の２乗平均平方根誤差が０．０１Å以下）。同様にポリペプチド鎖Ｉ・Ｊ・Ｋ・Ｌで形成される四量体とポリペプチド鎖Ｍ・Ｎ・Ｏ・Ｐで形成される四量体も特に良く似ている。
【０４５７】
従って、本明細書では前者２つをタイプ１四量体、後者２つをタイプ２四量体、と２つのタイプに分類して表す。ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶から得られた構造座標に基づき、タンパク質の構造を理解するのに当業者において一般的に用いられている表記方法であるリボン図を用いて、図１と同じ３方向から見たこれら２つのタイプの四量体を図３に示す。この図から理解されるように、リガンドを無視して考えると、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩ四量体の４本のポリペプチド鎖は、リガンド非結合型のそれと同様に巨視的に見て点群２２２で表される擬似対称性を持って配置し、互いに認識（相互作用）し会合している。
【０４５８】
この相互作用に関与するアミノ酸残基としては、Ｍ１・Ｒ２・Ｄ３・Ｐ４・Ｆ５・Ａ８・Ｌ９・Ａ２９・Ｄ３０・Ｈ３１・Ｌ３２・Ｎ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｆ４２・Ｙ４４・Ａ４５・Ｄ４８・Ｓ４９・Ｌ５３・Ｎ５６・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｖ８７・Ｎ８８・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｔ９５・Ｒ９７・Ｅ９９・Ｋ１０５・Ｌ１０６・Ｌ１０９・Ｔ１１１・Ｔ１１３・Ｆ１１５が挙げられ、当該四量体の会合はこれらのアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の相互作用で特徴付けられる（表６）。
【０４５９】
表６
ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶において四量体の会合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式
相互作用様式の略号
ＨＹＤ：  水素結合  （相互作用距離≦３．４Å）
ＷＭＨ：  水を介した水素結合
ＬＭＨ：  リガンドを介した水素結合
ＶＤＷ：  ファンデルワールス相互作用  （相互作用距離≦４．０Å）
ＥＳＩ：  静電的相互作用  （３．４Å＜相互作用距離≦５．０Å）
ＣＭＥ：  塩素イオンを介した静電的相互作用
ＬＭＥ：  リガンドを介した静電的相互作用
【０４６０】
2004254621.tif 000387
【０４６１】
2004254621.tif 000388
【０４６２】
2004254621.tif 000389
【０４６３】
2004254621.tif 000390
【０４６４】
2004254621.tif 000391
【０４６５】
2004254621.tif 000392
【０４６６】
2004254621.tif 000393
【０４６７】
2004254621.tif 000394
【０４６８】
2004254621.tif 000395
【０４６９】
2004254621.tif 000396
【０４７０】
2004254621.tif 000397
【０４７１】
2004254621.tif 000398
【０４７２】
2004254621.tif 000399
【０４７３】
2004254621.tif 000400
【０４７４】
2004254621.tif 000401
【０４７５】
2004254621.tif 000402
【０４７６】
2004254621.tif 000403
【０４７７】
2004254621.tif 000404
【０４７８】
2004254621.tif 000405
【０４７９】
2004254621.tif 000406
【０４８０】
2004254621.tif 000407
【０４８１】
2004254621.tif 000408
【０４８２】
2004254621.tif 000409
【０４８３】
2004254621.tif 000410
【０４８４】
2004254621.tif 000411
【０４８５】
2004254621.tif 000412
【０４８６】
2004254621.tif 000413
【０４８７】
2004254621.tif 000414
【０４８８】
2004254621.tif 000415
【０４８９】
2004254621.tif 000416
【０４９０】
2004254621.tif 000417
【０４９１】
2004254621.tif 000418
【０４９２】
2004254621.tif 000419
【０４９３】
2004254621.tif 000420
【０４９４】
2004254621.tif 000421
【０４９５】
2004254621.tif 000422
【０４９６】
2004254621.tif 000423
【０４９７】
2004254621.tif 000424
【０４９８】
2004254621.tif 000425
【０４９９】
2004254621.tif 000426
【０５００】
2004254621.tif 000427
【０５０１】
2004254621.tif 000428
【０５０２】
2004254621.tif 000429
【０５０３】
2004254621.tif 000430
【０５０４】
2004254621.tif 000431
【０５０５】
2004254621.tif 000432
【０５０６】
2004254621.tif 000433
【０５０７】
2004254621.tif 000434
【０５０８】
2004254621.tif 000435
【０５０９】
2004254621.tif 000436
【０５１０】
2004254621.tif 000437
【０５１１】
2004254621.tif 000438
【０５１２】
2004254621.tif 000439
【０５１３】
2004254621.tif 000440
【０５１４】
2004254621.tif 000441
【０５１５】
2004254621.tif 000442
【０５１６】
2004254621.tif 000443
【０５１７】
2004254621.tif 000444
【０５１８】
2004254621.tif 000445
【０５１９】
2004254621.tif 000446
【０５２０】
2004254621.tif 000447
【０５２１】
2004254621.tif 000448
【０５２２】
2004254621.tif 000449
【０５２３】
2004254621.tif 000450
【０５２４】
2004254621.tif 000451
【０５２５】
2004254621.tif 000452
【０５２６】
2004254621.tif 000453
【０５２７】
2004254621.tif 000454
【０５２８】
2004254621.tif 000455
【０５２９】
2004254621.tif 000456
【０５３０】
2004254621.tif 000457
【０５３１】
2004254621.tif 000458
【０５３２】
2004254621.tif 000459
【０５３３】
2004254621.tif 000460
【０５３４】
2004254621.tif 000461
【０５３５】
2004254621.tif 000462
【０５３６】
2004254621.tif 000463
【０５３７】
2004254621.tif 000464
【０５３８】
2004254621.tif 000465
【０５３９】
2004254621.tif 000466
【０５４０】
2004254621.tif 000467
【０５４１】
2004254621.tif 000468
【０５４２】
2004254621.tif 000469
【０５４３】
2004254621.tif 000470
【０５４４】
2004254621.tif 000471
【０５４５】
2004254621.tif 000472
【０５４６】
2004254621.tif 000473
【０５４７】
2004254621.tif 000474
【０５４８】
2004254621.tif 000475
【０５４９】
2004254621.tif 000476
【０５５０】
2004254621.tif 000477
【０５５１】
2004254621.tif 000478
【０５５２】
2004254621.tif 000479
【０５５３】
2004254621.tif 000480
【０５５４】
2004254621.tif 000481
【０５５５】
2004254621.tif 000482
【０５５６】
2004254621.tif 000483
【０５５７】
2004254621.tif 000484
【０５５８】
2004254621.tif 000485
【０５５９】
2004254621.tif 000486
【０５６０】表６は、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶において四量体の会合に関与する各ポリペプチド鎖のアミノ酸残基の原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式を示す。タイプ１の四量体（ポリペプチド鎖Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄで代表）を前半に、タイプ２の四量体（ポリペプチド鎖Ｉ・Ｊ・Ｋ・Ｌで代表）を後半に示してある。１列目は一方のポリペプチド鎖のアミノ酸残基名・残基番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、２列目は他方のポリペプチド鎖のアミノ酸残基名・残基番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、３列目はその相互作用の原子間距離をÅ単位で、４列目は相互作用の様式を記述している。相互作用の様式は、ＨＹＤは水素結合、ＷＭＨは水を介した水素結合、ＬＭＨはリガンドを介した水素結合、ＶＤＷはファンデルワールス相互作用、ＥＳＩは静電的相互作用、ＣＭＥは塩素イオンを介した静電的相互作用、ＬＭＥはリガンドを介した静電的相互作用を示している。
【０５６１】
図３から理解されるように、タイプ１および２のどちらの四量体もＣｏＡ−ＳＨを２分子結合している。そのため、ＣｏＡ−ＳＨを含めたＰａａＩ四量体全体として考えると、点群２２２の擬似対称が崩れ、点群２で表される擬似対称に変化している。ＣｏＡ−ＳＨは四量体中の４本のポリペプチド鎖のうち３本と互いに認識（相互作用）し結合している。この相互作用を特徴付けているアミノ酸残基としては、Ｎ３３・Ｈ３５・Ａ３８・Ｇ４０・Ｐ６０・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｌ７４・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｋ１０５・Ｆ１１５・Ｌ１１７が挙げられる（表７）。即ち、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの四量体は、点群２で表される擬似対称関係で２つのＣｏＡ−ＳＨを結合し、その結合は表７に挙げたアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基との相互作用で特徴付けられる。
【０５６２】
表７
ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶においてＣｏＡ−ＳＨの結合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式
相互作用様式の略号
ＨＹＤ：  水素結合  （相互作用距離≦３．４Å）
ＷＭＨ：  水を介した水素結合
ＶＤＷ：  ファンデルワールス相互作用  （相互作用距離≦４．０Å）
ＥＳＩ：  静電的相互作用  （３．４Å＜相互作用距離≦５．０Å）
【０５６３】
2004254621.tif 000487
【０５６４】
2004254621.tif 000488
【０５６５】
2004254621.tif 000489
【０５６６】
2004254621.tif 000490
【０５６７】
2004254621.tif 000491
【０５６８】
2004254621.tif 000492
【０５６９】
2004254621.tif 000493
【０５７０】
2004254621.tif 000494
【０５７１】
2004254621.tif 000495
【０５７２】
2004254621.tif 000496
【０５７３】
2004254621.tif 000497
【０５７４】
2004254621.tif 000498
【０５７５】
2004254621.tif 000499
【０５７６】
2004254621.tif 000500
【０５７７】
2004254621.tif 000501
【０５７８】
2004254621.tif 000502
【０５７９】
2004254621.tif 000503
【０５８０】
2004254621.tif 000504
【０５８１】
2004254621.tif 000505
【０５８２】
2004254621.tif 000506
【０５８３】
2004254621.tif 000507
【０５８４】
2004254621.tif 000508
【０５８５】
2004254621.tif 000509
【０５８６】
表７は、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶においてＣｏＡ−ＳＨの結合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式を示す。タイプ１の四量体（ポリペプチド鎖Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄで代表）を前半に、タイプ２の四量体（ポリペプチド鎖Ｉ・Ｊ・Ｋ・Ｌで代表）を後半に示してある。１列目は一方の原子の残基または分子名・残基または分子番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、２列目は他方の原子の残基または分子名・残基または分子番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、３列目はその相互作用の原子間距離をÅ単位で、４列目は相互作用の様式を記述している。相互作用の様式は、ＨＹＤは水素結合、ＷＭＨは水を介した水素結合、ＶＤＷはファンデルワールス相互作用、ＥＳＩは静電的相互作用を示している。
【０５８７】
以上の結果から、ＣｏＡ−ＳＨは主にＡ６３・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｋ１０５との極性相互作用によりＰａａＩ分子に結合しており、その他の相互作用により当該結合がさらに安定化される。ＣｏＡ−ＳＨが四量体構造を安定化するように結合しているのは特に重要な点であり、ＰａａＩのＣｏＡ−ＳＨ結合および酵素機能における四量体構造の重要性が示唆される。
【０５８８】
また、活性部位周辺のアミノ酸残基Ｎ３３・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｄ４８はチオエステラーゼ活性に直接的または間接的に関与している可能性が高い。更に、ＣｏＡ−ＳＨとＰａａＩとの相互作用様式を四量体の両タイプ間で詳細に比較すると、ＣｏＡ−ＳＨ分子中のアデノシン二リン酸部分において相互作用様式が異なる（表７）。
【０５８９】
この事実は、ＣｏＡ−ＳＨとＰａａＩの相互作用において、ＣｏＡ−ＳＨ分子中のアデノシン二リン酸部分が少なくとも２種類のコンフォーメーションをとり得ることを示している。また、ＰａａＩ四量体中でＣｏＡ−ＳＨが結合可能な部位が４箇所存在するにもかかわらず２分子しかＣｏＡ−ＳＨを結合しない理由は、リガンド非結合型（Ｉ４１２２）の四量体とＣｏＡ−ＳＨ結合型の四量体を比較することにより明らかになった。完全な２２２対称を持つリガンド非結合型（Ｉ４１２２）の四量体を基準とすると、タイプ１四量体、例えば四量体ＡＢＣＤでは、ポリペプチド鎖ＡおよびＢの空間配置が１．５°程度、タイプ２四量体、例えば四量体ＩＪＫＬでは、ポリペプチド鎖ＫおよびＬの空間配置が２°程度、ＣｏＡ−ＳＨ結合型四量体全体における点群２の擬似対称をそれぞれ保つようにずれている。これらのずれにより、四量体に４箇所存在するＣｏＡ−ＳＨ結合部位のうち２箇所はＣｏＡ−ＳＨの結合に不都合な環境になっている。
【０５９０】
これは、いわゆる誘導適合（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｉｔ）と呼ばれる現象であるが、ＰａａＩ四量体の構造上の制約から、４箇所存在するＣｏＡ−ＳＨ結合部位のうち２箇所をリガンド結合または酵素反応に都合の良い環境にするために他の２箇所が犠牲になっているといえる。以上に述べた相互作用様式で特徴付けられる構造がＰａａＩの酵素機能に重要であると考えられる。各アミノ酸残基の更に詳細な役割については、これらの情報に基づいた変異体作製およびそれらの変異体の機能解析で明らかにすることができる。
【０５９１】
ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶構造において結合したＣｏＡ−ＳＨを除外して考えると、塩素イオンは、リガンド非結合型ＰａａＩの場合と同様、巨視的に見て点群２２２で表される擬似対称性を持って配置したＰａａＩ四量体の４本のポリペプチド鎖の対称中心に１個存在しており、四量体の構造保持に寄与している（図２および図３）。これらの図から理解されるように、塩素イオンは、四量体中の各々のＰａａＩポリペプチド鎖に属するＲ６７合計４残基で取り囲まれており、四量体中の各々のＰａａＩポリペプチド鎖と互いに認識（相互作用）し結合している。
【０５９２】
この相互作用を特徴付けているアミノ酸残基としては、Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｔ１１１・Ｔ１１３が挙げられる（表８）。即ち、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの塩素イオン結合部位は、リガンド非結合型ＰａａＩのそれと同様に、点群２２２で表される対称関係にある４つの同一構造部分を持ち、これら４つの同一構造部分で取り囲むことにより対称中心に存在する塩素イオンを結合しており、その結合は表８に挙げたアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基との相互作用で特徴付けられる。
【０５９３】
表８
ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶において塩素イオンの結合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式
相互作用様式の略号
ＨＹＤ：  水素結合  （相互作用距離≦３．４Å）
ＷＭＨ：  水を介した水素結合
ＶＤＷ：  ファンデルワールス相互作用  （相互作用距離≦４．０Å）
ＥＳＩ：  静電的相互作用  （３．４Å＜相互作用距離≦５．０Å）
【０５９４】
2004254621.tif 000510
【０５９５】
2004254621.tif 000511
【０５９６】
2004254621.tif 000512
【０５９７】
2004254621.tif 000513
【０５９８】
2004254621.tif 000514
【０５９９】
2004254621.tif 000515
【０６００】
2004254621.tif 000516
【０６０１】
2004254621.tif 000517
【０６０２】
2004254621.tif 000518
【０６０３】
2004254621.tif 000519
【０６０４】
2004254621.tif 000520
【０６０５】
2004254621.tif 000521
【０６０６】
2004254621.tif 000522
【０６０７】
2004254621.tif 000523
【０６０８】
2004254621.tif 000524
【０６０９】
2004254621.tif 000525
【０６１０】
2004254621.tif 000526
【０６１１】
2004254621.tif 000527
【０６１２】
2004254621.tif 000528
【０６１３】
2004254621.tif 000529
【０６１４】
2004254621.tif 000530
【０６１５】
2004254621.tif 000531
【０６１６】
表８は、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶において塩素イオンの結合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式を示す。タイプ１の四量体（ポリペプチド鎖Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄで代表）を前半に、タイプ２の四量体（ポリペプチド鎖Ｉ・Ｊ・Ｋ・Ｌで代表）を後半に示してある。１列目は一方の原子の残基または分子名・残基または分子番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、２列目は他方の原子の残基または分子名・残基または分子番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、３列目はその相互作用の原子間距離をÅ単位で、４列目は相互作用の様式を記述している。相互作用の様式は、ＨＹＤは水素結合、ＷＭＨは水を介した水素結合、ＶＤＷはファンデルワールス相互作用、ＥＳＩは静電的相互作用を示している。以上の結果から、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩにおいて、塩素イオンは主にＲ６７のグアニジン基との静電的相互作用によりＰａａＩ分子に結合しており、その他の相互作用により当該結合がさらに安定化される。
【０６１７】
本発明であるＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩ以外のタンパク質の３次元構造座標において、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの３次元構造座標と実質的に一致するものは本発明の範囲内である。実質的に一致とは、両タンパク質分子間で分子進化的に対応するＣα炭素原子の重ねあわせを行った時の２乗平均平方根誤差が１．５Å以下である構造を指す。例えば、ＰａａＩの変異体または化学修飾体さらにＰａａＩと分子進化的に関連している他のタンパク質を含む結晶に由来する３次元構造座標などがこれにあたる。また、ＰａａＩポリペプチド鎖におけるアミノ酸配列の開始位置および終了位置は必ずしも本発明にとって厳密に規定されたものではなく、そのチオエステラーゼ活性および塩素イオン結合能力が保持されることを条件として、Ｎ末端またはＣ末端が削れたもの、あるいはＮ末端またはＣ末端にアミノ酸が付加したものも本発明に包含される。
【０６１８】
また、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの３次元構造座標を基にホモロジーモデリング（中村春木，中井謙太（１９９５）バイオテクノロジーのためのコンピューター入門，コロナ社，１８６〜２０４）により導き出したタンパク質の３次元構造座標も本発明に含まれる。さらに、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの塩素イオン結合部位の類似構造をその一部として含む化合物（類似化合物）もまた本発明に含まれる。類似化合物とは、ＰａａＩの塩素イオン結合部位およびその近傍のアミノ酸残基について作製したＰａａＩの変異体のこと、あるいはＰａａＩ又はその変異体の構造を基に設計した低分子化合物のことを指す。これらの化合物は、ＰａａＩの塩素結合部位に見られるものと類似した、点群２２２で表される対称関係にある４つの同一構造部分を持ち、これら４つの同一構造部分で取り囲むことにより対称中心に存在する目的イオンを結合する。
【０６１９】
５．ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶
本発明はヘキサノイルＣｏＡとＰａａＩとの複合体の結晶に関するものである。本発明に用いたＰａａＩは高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来のものであり、第１番目のＭｅｔから第１３６番目のＡｌａまでの全長領域である。ＰａａＩの開始部位および終了部位は本発明において必ずしも厳密ではなく、そのチオエステラーゼ活性および塩素イオン結合能力が保持されることを条件として、Ｎ末端またはＣ末端が削れたもの、あるいはＮ末端またはＣ末端にアミノ酸が付加したものも包含される。
【０６２０】
結晶化は、目的のタンパク質溶液に沈殿剤を添加する又は溶媒量を蒸発等により減少させる等の操作により、ある特定の条件下でタンパク質が結晶として析出する性質を利用している。結晶化には高純度に精製されたタンパク質が必要である。また、結晶化する条件として、タンパク質濃度・塩濃度・水素イオン濃度（ｐＨ）・沈殿剤の種類と濃度・その他の添加剤の種類と濃度・温度などの物理的および化学的な因子が関与している。更に、沈殿剤添加や溶媒量の調整方法として、バッチ法・透析法・蒸気拡散法などの結晶化の手法が数多く存在している（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，  Ｔ．  Ｌ．  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｌ．  Ｎ．  （１９７６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ５９−８２）。このように、Ｘ線結晶解析に適したタンパク質結晶を得るには、高純度のタンパク質を得ることと、結晶化における様々な条件や手法を最適化することが必要になる。
【０６２１】
本発明のヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶は、以下のようにして調製される。まず、高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来のＰａａＩを高純度に精製する。精製法としては、カラムクロマトグラフィー（アフィニティー・イオン交換・ゲル濾過など）・塩析・遠心分離・電気泳動など、当業者においてタンパク質を精製する方法として一般的に行われている方法を単独で、又は組み合わせて用いる。塩濃度やｐＨを、より生体中の条件に近い状態に合わせることのできる精製方法、例えばゲル濾過クロマトグラフィー等を用いることが望ましい。
【０６２２】
次いでヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶を調製する。結晶化法としては透析法を用いる。また、タンパク質濃度・塩濃度・ｐＨ・沈殿剤の種類と濃度・その他の添加剤の種類と濃度・温度などの物理的および化学的な因子の決定が必要である。例えば、タンパク質濃度５〜２０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．１の酢酸−ＮａＯＨ緩衝液、添加剤として２．５ｍＭのヘキサノイルＣｏＡ、沈殿剤として１３．８％のイソプロピルアルコール、温度２２℃の条件下でヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶化を行うことができる。ただし、当業者において、同一のタンパク質が異なる条件下でも結晶化し得ることは周知の事実であるので、本発明はここに記述された条件に限定されるものではなく、実質的に本発明と同一の結晶学的定数を与えるヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶は本発明の範囲内である。また、ヘキサノイルＣｏＡ以外のコエンザイムＡ誘導体とＰａａＩの複合体の結晶についても、実質的に本発明と同一の結晶学的定数を与える結晶は本発明の範囲内である。
【０６２３】
６．ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの構造座標
タンパク質の３次元構造を明らかにする手法として、最も一般的に行われているのは、Ｘ線結晶構造解析の手法である。即ち、目的タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化したＸ線をあて、得られたＸ線の回折像を基にそのタンパク質の３次元構造を明らかにしていくものである。５項で得たヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶を用い、このＸ線結晶構造解析の手法により３次元構造を明らかにした。
【０６２４】
高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来ＰａａＩから得られるヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶は三斜晶系の空間群Ｐ１に属するもので、単位格子としてａ軸の方向に８２±５Å、ｂ軸の方向に８７±５Å、ｃ軸の方向に５９±５Å、ｂ軸とｃ軸の成す角度αが９２°±２°、ａ軸とｃ軸の成す角度βが９０°±２°、ａ軸とｂ軸の成す角度γが９０°±２°の大きさを有する。この結晶を用いたＸ線結晶構造解析の手法により、本発明であるヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの３次元構造座標（各原子間の空間的な位置関係を示す値）が初めて得られる。得られた構造座標を当業者において一般的に用いられているプロテインデータバンク（ＰＤＢ）の表記方法に従って示す（表９）。
【０６２５】
表９
ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶から得られた３次元構造座標
【表３０９】
2004254621.tif 000532
【０６２６】
【表３１０】
2004254621.tif 000533
【０６２７】
【表３１１】
2004254621.tif 000534
【０６２８】
【表３１２】
2004254621.tif 000535
【０６２９】
【表３１３】
2004254621.tif 000536
【０６３０】
【表３１４】
2004254621.tif 000537
【０６３１】
【表３１５】
2004254621.tif 000538
【０６３２】
【表３１６】
2004254621.tif 000539
【０６３３】
【表３１７】
2004254621.tif 000540
【０６３４】
【表３１８】
2004254621.tif 000541
【０６３５】
【表３１９】
2004254621.tif 000542
【０６３６】
【表３２０】
2004254621.tif 000543
【０６３７】
【表３２１】
2004254621.tif 000544
【０６３８】
【表３２２】
2004254621.tif 000545
【０６３９】
【表３２３】
2004254621.tif 000546
【０６４０】
【表３２４】
2004254621.tif 000547
【０６４１】
【表３２５】
2004254621.tif 000548
【０６４２】
【表３２６】
2004254621.tif 000549
【０６４３】
【表３２７】
2004254621.tif 000550
【０６４４】
【表３２８】
2004254621.tif 000551
【０６４５】
【表３２９】
2004254621.tif 000552
【０６４６】
【表３３０】
2004254621.tif 000553
【０６４７】
【表３３１】
2004254621.tif 000554
【０６４８】
【表３３２】
2004254621.tif 000555
【０６４９】
【表３３３】
2004254621.tif 000556
【０６５０】
【表３３４】
2004254621.tif 000557
【０６５１】
【表３３５】
2004254621.tif 000558
【０６５２】
【表３３６】
2004254621.tif 000559
【０６５３】
【表３３７】
2004254621.tif 000560
【０６５４】
【表３３８】
2004254621.tif 000561
【０６５５】
【表３３９】
2004254621.tif 000562
【０６５６】
【表３４０】
2004254621.tif 000563
【０６５７】
【表３４１】
2004254621.tif 000564
【０６５８】
【表３４２】
2004254621.tif 000565
【０６５９】
【表３４３】
2004254621.tif 000566
【０６６０】
【表３４４】
2004254621.tif 000567
【０６６１】
【表３４５】
2004254621.tif 000568
【０６６２】
【表３４６】
2004254621.tif 000569
【０６６３】
【表３４７】
2004254621.tif 000570
【０６６４】
【表３４８】
2004254621.tif 000571
【０６６５】
【表３４９】
2004254621.tif 000572
【０６６６】
【表３５０】
2004254621.tif 000573
【０６６７】
【表３５１】
2004254621.tif 000574
【０６６８】
【表３５２】
2004254621.tif 000575
【０６６９】
【表３５３】
2004254621.tif 000576
【０６７０】
【表３５４】
2004254621.tif 000577
【０６７１】
【表３５５】
2004254621.tif 000578
【０６７２】
【表３５６】
2004254621.tif 000579
【０６７３】
【表３５７】
2004254621.tif 000580
【０６７４】
【表３５８】
2004254621.tif 000581
【０６７５】
【表３５９】
2004254621.tif 000582
【０６７６】
【表３６０】
2004254621.tif 000583
【０６７７】
【表３６１】
2004254621.tif 000584
【０６７８】
【表３６２】
2004254621.tif 000585
【０６７９】
【表３６３】
2004254621.tif 000586
【０６８０】
【表３６４】
2004254621.tif 000587
【０６８１】
【表３６５】
2004254621.tif 000588
【０６８２】
【表３６６】
2004254621.tif 000589
【０６８３】
【表３６７】
2004254621.tif 000590
【０６８４】
【表３６８】
2004254621.tif 000591
【０６８５】
【表３６９】
2004254621.tif 000592
【０６８６】
【表３７０】
2004254621.tif 000593
【０６８７】
【表３７１】
2004254621.tif 000594
【０６８８】
【表３７２】
2004254621.tif 000595
【０６８９】
【表３７３】
2004254621.tif 000596
【０６９０】
【表３７４】
2004254621.tif 000597
【０６９１】
【表３７５】
2004254621.tif 000598
【０６９２】
【表３７６】
2004254621.tif 000599
【０６９３】
【表３７７】
2004254621.tif 000600
【０６９４】
【表３７８】
2004254621.tif 000601
【０６９５】
【表３７９】
2004254621.tif 000602
【０６９６】
【表３８０】
2004254621.tif 000603
【０６９７】
【表３８１】
2004254621.tif 000604
【０６９８】
【表３８２】
2004254621.tif 000605
【０６９９】
【表３８３】
2004254621.tif 000606
【０７００】
【表３８４】
2004254621.tif 000607
【０７０１】
【表３８５】
2004254621.tif 000608
【０７０２】
【表３８６】
2004254621.tif 000609
【０７０３】
【表３８７】
2004254621.tif 000610
【０７０４】
【表３８８】
2004254621.tif 000611
【０７０５】
【表３８９】
2004254621.tif 000612
【０７０６】
【表３９０】
2004254621.tif 000613
【０７０７】
【表３９１】
2004254621.tif 000614
【０７０８】
【表３９２】
2004254621.tif 000615
【０７０９】
【表３９３】
2004254621.tif 000616
【０７１０】
【表３９４】
2004254621.tif 000617
【０７１１】
【表３９５】
2004254621.tif 000618
【０７１２】
【表３９６】
2004254621.tif 000619
【０７１３】
【表３９７】
2004254621.tif 000620
【０７１４】
【表３９８】
2004254621.tif 000621
【０７１５】
【表３９９】
2004254621.tif 000622
【０７１６】
【表４００】
2004254621.tif 000623
【０７１７】
【表４０１】
2004254621.tif 000624
【０７１８】
【表４０２】
2004254621.tif 000625
【０７１９】
【表４０３】
2004254621.tif 000626
【０７２０】
【表４０４】
2004254621.tif 000627
【０７２１】
【表４０５】
2004254621.tif 000628
【０７２２】
【表４０６】
2004254621.tif 000629
【０７２３】
【表４０７】
2004254621.tif 000630
【０７２４】
【表４０８】
2004254621.tif 000631
【０７２５】
【表４０９】
2004254621.tif 000632
【０７２６】
【表４１０】
2004254621.tif 000633
【０７２７】
【表４１１】
2004254621.tif 000634
【０７２８】
【表４１２】
2004254621.tif 000635
【０７２９】
【表４１３】
2004254621.tif 000636
【０７３０】
【表４１４】
2004254621.tif 000637
【０７３１】
【表４１５】
2004254621.tif 000638
【０７３２】
【表４１６】
2004254621.tif 000639
【０７３３】
【表４１７】
2004254621.tif 000640
【０７３４】
【表４１８】
2004254621.tif 000641
【０７３５】
【表４１９】
2004254621.tif 000642
【０７３６】
【表４２０】
2004254621.tif 000643
【０７３７】
【表４２１】
2004254621.tif 000644
【０７３８】
【表４２２】
2004254621.tif 000645
【０７３９】
【表４２３】
2004254621.tif 000646
【０７４０】
【表４２４】
2004254621.tif 000647
【０７４１】
【表４２５】
2004254621.tif 000648
【０７４２】
【表４２６】
2004254621.tif 000649
【０７４３】
【表４２７】
2004254621.tif 000650
【０７４４】
【表４２８】
2004254621.tif 000651
【０７４５】
【表４２９】
2004254621.tif 000652
【０７４６】
【表４３０】
2004254621.tif 000653
【０７４７】
【表４３１】
2004254621.tif 000654
【０７４８】
【表４３２】
2004254621.tif 000655
【０７４９】
【表４３３】
2004254621.tif 000656
【０７５０】
【表４３４】
2004254621.tif 000657
【０７５１】
【表４３５】
2004254621.tif 000658
【０７５２】
【表４３６】
2004254621.tif 000659
【０７５３】
【表４３７】
2004254621.tif 000660
【０７５４】
【表４３８】
2004254621.tif 000661
【０７５５】
【表４３９】
2004254621.tif 000662
【０７５６】
【表４４０】
2004254621.tif 000663
【０７５７】
【表４４１】
2004254621.tif 000664
【０７５８】
【表４４２】
2004254621.tif 000665
【０７５９】
【表４４３】
2004254621.tif 000666
【０７６０】
【表４４４】
2004254621.tif 000667
【０７６１】
【表４４５】
2004254621.tif 000668
【０７６２】
【表４４６】
2004254621.tif 000669
【０７６３】
【表４４７】
2004254621.tif 000670
【０７６４】
【表４４８】
2004254621.tif 000671
【０７６５】
【表４４９】
2004254621.tif 000672
【０７６６】
【表４５０】
2004254621.tif 000673
【０７６７】
【表４５１】
2004254621.tif 000674
【０７６８】
【表４５２】
2004254621.tif 000675
【０７６９】
【表４５３】
2004254621.tif 000676
【０７７０】
【表４５４】
2004254621.tif 000677
【０７７１】
【表４５５】
2004254621.tif 000678
【０７７２】
【表４５６】
2004254621.tif 000679
【０７７３】
【表４５７】
2004254621.tif 000680
【０７７４】
【表４５８】
2004254621.tif 000681
【０７７５】
【表４５９】
2004254621.tif 000682
【０７７６】
【表４６０】
2004254621.tif 000683
【０７７７】
【表４６１】
2004254621.tif 000684
【０７７８】
【表４６２】
2004254621.tif 000685
【０７７９】
【表４６３】
2004254621.tif 000686
【０７８０】
【表４６４】
2004254621.tif 000687
【０７８１】
【表４６５】
2004254621.tif 000688
【０７８２】
【表４６６】
2004254621.tif 000689
【０７８３】
【表４６７】
2004254621.tif 000690
【０７８４】
【表４６８】
2004254621.tif 000691
【０７８５】
【表４６９】
2004254621.tif 000692
【０７８６】
【表４７０】
2004254621.tif 000693
【０７８７】
【表４７１】
2004254621.tif 000694
【０７８８】
【表４７２】
2004254621.tif 000695
【０７８９】
【表４７３】
2004254621.tif 000696
【０７９０】
【表４７４】
2004254621.tif 000697
【０７９１】
【表４７５】
2004254621.tif 000698
【０７９２】
【表４７６】
2004254621.tif 000699
【０７９３】
【表４７７】
2004254621.tif 000700
【０７９４】
【表４７８】
2004254621.tif 000701
【０７９５】
【表４７９】
2004254621.tif 000702
【０７９６】
【表４８０】
2004254621.tif 000703
【０７９７】
【表４８１】
2004254621.tif 000704
【０７９８】
【表４８２】
2004254621.tif 000705
【０７９９】
【表４８３】
2004254621.tif 000706
【０８００】
【表４８４】
2004254621.tif 000707
【０８０１】
【表４８５】
2004254621.tif 000708
【０８０２】
【表４８６】
2004254621.tif 000709
【０８０３】
【表４８７】
2004254621.tif 000710
【０８０４】
【表４８８】
2004254621.tif 000711
【０８０５】
【表４８９】
2004254621.tif 000712
【０８０６】
【表４９０】
2004254621.tif 000713
【０８０７】
【表４９１】
2004254621.tif 000714
【０８０８】
【表４９２】
2004254621.tif 000715
【０８０９】
【表４９３】
2004254621.tif 000716
【０８１０】
【表４９４】
2004254621.tif 000717
【０８１１】
【表４９５】
2004254621.tif 000718
【０８１２】
【表４９６】
2004254621.tif 000719
【０８１３】
【表４９７】
2004254621.tif 000720
【０８１４】
【表４９８】
2004254621.tif 000721
【０８１５】
【表４９９】
2004254621.tif 000722
【０８１６】
【表５００】
2004254621.tif 000723
【０８１７】
【表５０１】
2004254621.tif 000724
【０８１８】
【表５０２】
2004254621.tif 000725
【０８１９】
【表５０３】
2004254621.tif 000726
【０８２０】
【表５０４】
2004254621.tif 000727
【０８２１】
【表５０５】
2004254621.tif 000728
【０８２２】
【表５０６】
2004254621.tif 000729
【０８２３】
【表５０７】
2004254621.tif 000730
【０８２４】
【表５０８】
2004254621.tif 000731
【０８２５】
【表５０９】
2004254621.tif 000732
【０８２６】
【表５１０】
2004254621.tif 000733
【０８２７】
【表５１１】
2004254621.tif 000734
【０８２８】
【表５１２】
2004254621.tif 000735
【０８２９】
【表５１３】
2004254621.tif 000736
【０８３０】
【表５１４】
2004254621.tif 000737
【０８３１】
【表５１５】
2004254621.tif 000738
【０８３２】
【表５１６】
2004254621.tif 000739
【０８３３】
【表５１７】
2004254621.tif 000740
【０８３４】
【表５１８】
2004254621.tif 000741
【０８３５】
【表５１９】
2004254621.tif 000742
【０８３６】
【表５２０】
2004254621.tif 000743
【０８３７】
【表５２１】
2004254621.tif 000744
【０８３８】
【表５２２】
2004254621.tif 000745
【０８３９】
【表５２３】
2004254621.tif 000746
【０８４０】
【表５２４】
2004254621.tif 000747
【０８４１】
【表５２５】
2004254621.tif 000748
【０８４２】
【表５２６】
2004254621.tif 000749
【０８４３】
【表５２７】
2004254621.tif 000750
【０８４４】
【表５２８】
2004254621.tif 000751
【０８４５】
【表５２９】
2004254621.tif 000752
【０８４６】
【表５３０】
2004254621.tif 000753
【０８４７】
【表５３１】
2004254621.tif 000754
【０８４８】
【表５３２】
2004254621.tif 000755
【０８４９】
【表５３３】
2004254621.tif 000756
【０８５０】
【表５３４】
2004254621.tif 000757
【０８５１】
【表５３５】
2004254621.tif 000758
【０８５２】
【表５３６】
2004254621.tif 000759
【０８５３】
【表５３７】
2004254621.tif 000760
【０８５４】
【表５３８】
2004254621.tif 000761
【０８５５】
【表５３９】
2004254621.tif 000762
【０８５６】
【表５４０】
2004254621.tif 000763
【０８５７】
【表５４１】
2004254621.tif 000764
【０８５８】
【表５４２】
2004254621.tif 000765
【０８５９】
【表５４３】
2004254621.tif 000766
【０８６０】
【表５４４】
2004254621.tif 000767
【０８６１】
【表５４５】
2004254621.tif 000768
【０８６２】
【表５４６】
2004254621.tif 000769
【０８６３】
【表５４７】
2004254621.tif 000770
【０８６４】
【表５４８】
2004254621.tif 000771
【０８６５】
【表５４９】
2004254621.tif 000772
【０８６６】
【表５５０】
2004254621.tif 000773
【０８６７】
【表５５１】
2004254621.tif 000774
【０８６８】
【表５５２】
2004254621.tif 000775
【０８６９】
【表５５３】
2004254621.tif 000776
【０８７０】
【表５５４】
2004254621.tif 000777
【０８７１】
【表５５５】
2004254621.tif 000778
【０８７２】
【表５５６】
2004254621.tif 000779
【０８７３】
【表５５７】
2004254621.tif 000780
【０８７４】
【表５５８】
2004254621.tif 000781
【０８７５】
【表５５９】
2004254621.tif 000782
【０８７６】
【表５６０】
2004254621.tif 000783
【０８７７】
【表５６１】
2004254621.tif 000784
【０８７８】
【表５６２】
2004254621.tif 000785
【０８７９】
【表５６３】
2004254621.tif 000786
【０８８０】
【表５６４】
2004254621.tif 000787
【０８８１】
【表５６５】
2004254621.tif 000788
【０８８２】
【表５６６】
2004254621.tif 000789
【０８８３】
【表５６７】
2004254621.tif 000790
【０８８４】
表９において、１行目は結晶学的定数の記述で、左から単位格子の大きさ（ａ軸・ｂ軸・ｃ軸の順でÅ単位）、各軸のなす角度（α・β・γ）、空間群を表している。２行目以降ＴＥＲおよびＥＮＤで始まる行以外の行により各原子の３次元座標が記述されている。１列目のＡＴＯＭはポリペプチド部分の原子座標、ＨＥＴＡＴＭはポリペプチド以外の部分の原子座標であることを表す。ＡＴＯＭ行の２列目はその原子の識別番号を、３列目はその原子の名称を、４列目はその原子が属する残基名を、５列目はその原子が属するポリペプチド鎖名を、６列目はその原子が属する残基番号を、７・８・９列目はその原子の座標（ｘ・ｙ・ｚの順でÅ単位）を、１０列目はその原子の占有率を、１１列目はその原子の等方性温度因子を、１２列目はその原子の種名を示している。ＨＥＴＡＴＭ行の２列目はその原子の識別番号を、３列目はその原子の名称を、４列目はその原子が属する残基名または分子名を、５列目はその原子が属する残基番号または分子番号を、６・７・８列目はその原子の座標（ｘ・ｙ・ｚの順でÅ単位）を、９列目はその原子の占有率を、１０列目はその原子の等方性温度因子を、１１列目はその原子の種名を示している。ＴＥＲ行はポリペプチド鎖の区切りを示し、ＥＮＤ行はこの３次元構造座標の最終行であることを示している。
【０８８５】
この３次元構造座標は、当結晶の非対称単位すなわちその中に結晶学的対称性を持たない最小単位中に存在する原子として、ポリペプチド鎖名ＡからＰで示される１６本のＰａａＩポリペプチド鎖、分子名ＣＬで示される塩素イオン４個、分子名ＨＣＡで示されるヘキサノイルＣｏＡ分子８個、分子名ＡＣＥで示される酢酸分子２個、分子名ＨＯＨで示される水分子３６０個を含んでいる。なお、本結晶中の１６本のＰａａＩポリペプチド鎖のうち、全てのポリペプチド鎖におけるＧ１１８〜Ａ１３６までのアミノ酸残基、およびいくつかのポリペプチド鎖におけるＮ末端の１または２アミノ酸残基は一定の構造をとっておらず、Ｘ線結晶構造解析において考慮から除外している。
【０８８６】
ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶の非対称単位は互いにわずかに異なる構造を持つ４個の四量体を含んでいる。これらの四量体は、リガンドを無視して考えると、巨視的に点群２２２で表される擬似対称関係で４本のポリペプチド鎖が配置し、リガンド非結合型で見られたものと似た様式で会合している。しかし、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ではこの２２２擬似対称が結晶学的対称を含まないため、四量体を形成する４本のポリペプチド鎖全てが互いにわずかに異なる構造を持つ。更に、ポリペプチド鎖Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄで形成される四量体とポリペプチド鎖Ｅ・Ｆ・Ｇ・Ｈで形成される四量体は結晶内で良く似た環境にあるため、構造が特に良く似ている（対応するＣα炭素原子の重ね合わせを行った時の２乗平均平方根誤差が０．０１Å以下）。同様にポリペプチド鎖Ｉ・Ｊ・Ｋ・Ｌで形成される四量体とポリペプチド鎖Ｍ・Ｎ・Ｏ・Ｐで形成される四量体も特に良く似ている。
【０８８７】
従って、ＣｏＡ−ＳＨ結合型と同様に、本明細書では前者２つをタイプ１四量体、後者２つをタイプ２四量体、と２つのタイプに分類して表す。ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶から得られた構造座標に基づき、タンパク質の構造を理解するのに当業者において一般的に用いられている表記方法であるリボン図を用いて、図１と同じ３方向から見たこれら２つのタイプの四量体を図４に示す。この図から理解されるように、リガンドを無視して考えると、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩ四量体の４本のポリペプチド鎖は、リガンド非結合型のそれと同様に巨視的に見て点群２２２で表される擬似対称性を持って配置し、互いに認識（相互作用）し会合している。
【０８８８】
この相互作用に関与するアミノ酸残基としては、Ｍ１・Ｒ２・Ｄ３・Ｐ４・Ｆ５・Ａ８・Ｌ９・Ａ２９・Ｄ３０・Ｈ３１・Ｌ３２・Ｎ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｆ４２・Ｙ４４・Ａ４５・Ｄ４８・Ｓ４９・Ｌ５３・Ｎ５６・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｖ８７・Ｎ８８・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｔ９５・Ｒ９７・Ｅ９９・Ｋ１０５・Ｌ１０６・Ｌ１０９・Ｔ１１１・Ｔ１１３・Ｆ１１５が挙げられ、当該四量体の会合はこれらのアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基の相互作用で特徴付けられる（表１０）。
【０８８９】
表１０
ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶において四量体の会合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式
相互作用様式の略号
ＨＹＤ：  水素結合  （相互作用距離≦３．４Å）
ＷＭＨ：  水を介した水素結合
ＬＭＨ：  リガンドを介した水素結合
ＶＤＷ：  ファンデルワールス相互作用  （相互作用距離≦４．０Å）
ＥＳＩ：  静電的相互作用  （３．４Å＜相互作用距離≦５．０Å）
ＣＭＥ：  塩素イオンを介した静電的相互作用
ＬＭＥ：  リガンドを介した静電的相互作用
【０８９０】
2004254621.tif 000791
【０８９１】
2004254621.tif 000792
【０８９２】
2004254621.tif 000793
【０８９３】
2004254621.tif 000794
【０８９４】
2004254621.tif 000795
【０８９５】
2004254621.tif 000796
【０８９６】
2004254621.tif 000797
【０８９７】
2004254621.tif 000798
【０８９８】
2004254621.tif 000799
【０８９９】
2004254621.tif 000800
【０９００】
2004254621.tif 000801
【０９０１】
2004254621.tif 000802
【０９０２】
2004254621.tif 000803
【０９０３】
2004254621.tif 000804
【０９０４】
2004254621.tif 000805
【０９０５】
2004254621.tif 000806
【０９０６】
2004254621.tif 000807
【０９０７】
2004254621.tif 000808
【０９０８】
2004254621.tif 000809
【０９０９】
2004254621.tif 000810
【０９１０】
2004254621.tif 000811
【０９１１】
2004254621.tif 000812
【０９１２】
2004254621.tif 000813
【０９１３】
2004254621.tif 000814
【０９１４】
2004254621.tif 000815
【０９１５】
2004254621.tif 000816
【０９１６】
2004254621.tif 000817
【０９１７】
2004254621.tif 000818
【０９１８】
2004254621.tif 000819
【０９１９】
2004254621.tif 000820
【０９２０】
2004254621.tif 000821
【０９２１】
2004254621.tif 000822
【０９２２】
2004254621.tif 000823
【０９２３】
2004254621.tif 000824
【０９２４】
2004254621.tif 000825
【０９２５】
2004254621.tif 000826
【０９２６】
2004254621.tif 000827
【０９２７】
2004254621.tif 000828
【０９２８】
2004254621.tif 000829
【０９２９】
2004254621.tif 000830
【０９３０】
2004254621.tif 000831
【０９３１】
2004254621.tif 000832
【０９３２】
2004254621.tif 000833
【０９３３】
2004254621.tif 000834
【０９３４】
2004254621.tif 000835
【０９３５】
2004254621.tif 000836
【０９３６】
2004254621.tif 000837
【０９３７】
2004254621.tif 000838
【０９３８】
2004254621.tif 000839
【０９３９】
2004254621.tif 000840
【０９４０】
2004254621.tif 000841
【０９４１】
2004254621.tif 000842
【０９４２】
2004254621.tif 000843
【０９４３】
2004254621.tif 000844
【０９４４】
2004254621.tif 000845
【０９４５】
2004254621.tif 000846
【０９４６】
2004254621.tif 000847
【０９４７】
2004254621.tif 000848
【０９４８】
2004254621.tif 000849
【０９４９】
2004254621.tif 000850
【０９５０】
2004254621.tif 000851
【０９５１】
2004254621.tif 000852
【０９５２】
2004254621.tif 000853
【０９５３】
2004254621.tif 000854
【０９５４】
2004254621.tif 000855
【０９５５】
2004254621.tif 000856
【０９５６】
2004254621.tif 000857
【０９５７】
2004254621.tif 000858
【０９５８】
2004254621.tif 000859
【０９５９】
2004254621.tif 000860
【０９６０】
2004254621.tif 000861
【０９６１】
2004254621.tif 000862
【０９６２】
2004254621.tif 000863
【０９６３】
2004254621.tif 000864
【０９６４】
2004254621.tif 000865
【０９６５】
2004254621.tif 000866
【０９６６】
2004254621.tif 000867
【０９６７】
2004254621.tif 000868
【０９６８】
2004254621.tif 000869
【０９６９】
2004254621.tif 000870
【０９７０】
2004254621.tif 000871
【０９７１】
2004254621.tif 000872
【０９７２】
表１０は、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶において四量体の会合に関与する各ポリペプチド鎖のアミノ酸残基の原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式を示す。タイプ１の四量体（ポリペプチド鎖Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄで代表）を前半に、タイプ２の四量体（ポリペプチド鎖Ｉ・Ｊ・Ｋ・Ｌで代表）を後半に示してある。１列目は一方のポリペプチド鎖のアミノ酸残基名・残基番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、２列目は他方のポリペプチド鎖のアミノ酸残基名・残基番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、３列目はその相互作用の原子間距離をÅ単位で、４列目は相互作用の様式を記述している。相互作用の様式は、ＨＹＤは水素結合、ＷＭＨは水を介した水素結合、ＬＭＨはリガンドを介した水素結合、ＶＤＷはファンデルワールス相互作用、ＥＳＩは静電的相互作用、ＣＭＥは塩素イオンを介した静電的相互作用、ＬＭＥはリガンドを介した静電的相互作用を示している。
【０９７３】
図４から理解されるように、タイプ１およびタイプ２のどちらの四量体もヘキサノイルＣｏＡを２分子結合している。そのため、ヘキサノイルＣｏＡを含めて考えると、点群２２２の擬似対称が崩れ、点群２で表される擬似対称に変化している。ヘキサノイルＣｏＡは四量体中の４本のポリペプチド鎖のうち３本と互いに認識（相互作用）し結合している。この相互作用を特徴付けているアミノ酸残基としては、Ｎ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｔ３７・Ａ３８・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｄ４８・Ｆ５１・Ａ５２・Ｓ５５・Ｎ５６・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｌ７４・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｋ１０５・Ｖ１１４・Ｆ１１５・Ｌ１１７が挙げられる（表１１）。即ち、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの四量体は、点群２で表される擬似対称関係で２分子のヘキサノイルＣｏＡを結合し、その結合は表１１に挙げたアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基との相互作用で特徴付けられる。
【０９７４】
表１１
ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶においてヘキサノイルＣｏＡの結合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式
相互作用様式の略号
ＨＹＤ：  水素結合  （相互作用距離≦３．４Å）
ＷＭＨ：  水を介した水素結合
ＶＤＷ：  ファンデルワールス相互作用  （相互作用距離≦４．０Å）
ＥＳＩ：  静電的相互作用  （３．４Å＜相互作用距離≦５．０Å）
【０９７５】
2004254621.tif 000873
【０９７６】
2004254621.tif 000874
【０９７７】
2004254621.tif 000875
【０９７８】
2004254621.tif 000876
【０９７９】
2004254621.tif 000877
【０９８０】
2004254621.tif 000878
【０９８１】
2004254621.tif 000879
【０９８２】
2004254621.tif 000880
【０９８３】
2004254621.tif 000881
【０９８４】
2004254621.tif 000882
【０９８５】
2004254621.tif 000883
【０９８６】
2004254621.tif 000884
【０９８７】
2004254621.tif 000885
【０９８８】
2004254621.tif 000886
【０９８９】
2004254621.tif 000887
【０９９０】
2004254621.tif 000888
【０９９１】
2004254621.tif 000889
【０９９２】
2004254621.tif 000890
【０９９３】
2004254621.tif 000891
【０９９４】
2004254621.tif 000892
【０９９５】
2004254621.tif 000893
【０９９６】
2004254621.tif 000894
【０９９７】
2004254621.tif 000895
【０９９８】
2004254621.tif 000896
【０９９９】
2004254621.tif 000897
【１０００】
2004254621.tif 000898
【１００１】
2004254621.tif 000899
【１００２】
2004254621.tif 000900
【１００３】
2004254621.tif 000901
【１００４】
2004254621.tif 000902
【１００５】
表１１は、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶においてヘキサノイルＣｏＡの結合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式を示す。タイプ１の四量体（ポリペプチド鎖Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄで代表）を前半に、タイプ２の四量体（ポリペプチド鎖Ｉ・Ｊ・Ｋ・Ｌで代表）を後半に示してある。１列目は一方の原子の残基または分子名・残基または分子番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、２列目は他方の原子の残基または分子名・残基または分子番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、３列目はその相互作用の原子間距離をÅ単位で、４列目は相互作用の様式を記述している。相互作用の様式は、ＨＹＤは水素結合、ＷＭＨは水を介した水素結合、ＶＤＷはファンデルワールス相互作用、ＥＳＩは静電的相互作用を示している。
【１００６】
以上の結果から、ヘキサノイルＣｏＡは主にＡ６３・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｋ１０５との極性相互作用によりＰａａＩ分子に結合しており、その他の相互作用により当該結合がさらに安定化される。ヘキサノイルＣｏＡが四量体構造を安定化するように結合しているのは特に重要な点であり、ＰａａＩのヘキサノイルＣｏＡ結合および酵素機能における四量体構造の重要性が示唆される。また、活性部位周辺のアミノ酸残基Ｎ３３・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｄ４８はチオエステラーゼ活性に直接的または間接的に関与している可能性が高い。更に、ヘキサノイルＣｏＡとＰａａＩとの相互作用様式を四量体の両タイプ間で詳細に比較すると、ヘキサノイルＣｏＡ分子中のアデノシン二リン酸部分およびヘキサノイル基部分において相互作用様式が異なる（表１１）。
【１００７】
この事実は、一つにはＣｏＡ−ＳＨ結合型と同様、ヘキサノイルＣｏＡとＰａａＩの相互作用において、ヘキサノイルＣｏＡ分子中のアデノシン二リン酸部分が少なくとも２種類のコンフォーメーションをとり得ることを示している。また一方では、タイプ１とタイプ２のそれぞれの四量体の酵素反応における役割を示唆している。タイプ１四量体では、ヘキサノイルＣｏＡ分子のチオエステル部分のカルボニル酸素はＡｌａ６３の主鎖の窒素と水素結合している。また、求核攻撃の的であるカルボニル炭素と触媒に関係すると考えられる水分子（以後、反応水と呼ぶ）とは、反応水によるカルボニル酸素の求核攻撃に都合が良い位置関係にある。
【１００８】
一方、タイプ２四量体では、ヘキサノイルＣｏＡ分子のチオエステル部分のカルボニル酸素は反応水と水素結合しており、結果的に、反応水によるカルボニル酸素の求核攻撃には都合が悪い。従って、タイプ２四量体はＰａａＩと基質と反応水Ｈ２Ｏとの複合体の状態を反映しており、タイプ１四量体はＰａａＩと基質とヒドロキシルイオンＯＨ−（活性化された反応水）との複合体の状態を反映していることが示唆される。また、ＰａａＩ四量体中でヘキサノイルＣｏＡが結合可能な部位が４箇所存在するにもかかわらず２分子しかヘキサノイルＣｏＡを結合しない理由は、リガンド非結合型（Ｉ４１２２）の四量体とＣｏＡ−ＳＨ結合型の四量体を比較することにより明らかになった。完全な２２２対称を持つリガンド非結合型（Ｉ４１２２）の四量体を基準とすると、タイプ１四量体、例えば四量体ＡＢＣＤでは、ポリペプチド鎖ＡおよびＢの空間配置が１．５°程度、タイプ２四量体、例えば四量体ＩＪＫＬでは、ポリペプチド鎖ＫおよびＬの空間配置が２°程度、ヘキサノイルＣｏＡ結合型四量体全体における点群２の擬似対称をそれぞれ保つようにずれている。これらのずれにより、四量体に４箇所存在するヘキサノイルＣｏＡ結合部位のうち２箇所はヘキサノイルＣｏＡの結合に不都合な環境になっている。
【１００９】
これは、いわゆる誘導適合（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｉｔ）と呼ばれる現象であるが、ＰａａＩ四量体の構造上の制約から、４箇所存在するヘキサノイルＣｏＡ結合部位のうち２箇所をリガンド結合または酵素反応に都合の良い環境にするために他の２箇所が犠牲になっているといえる。以上に述べた相互作用様式で特徴付けられる構造がＰａａＩの酵素機能に重要であると考えられる。各アミノ酸残基の更に詳細な役割については、これらの情報に基づいた変異体作製およびそれらの変異体の機能解析で明らかにすることができる。
【１０１０】
ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶構造において結合したヘキサノイルＣｏＡを除外して考えると、塩素イオンは、リガンド非結合型ＰａａＩの場合と同様、巨視的に見て点群２２２で表される擬似対称性を持って配置したＰａａＩ四量体の４本のポリペプチド鎖の対称中心に１個存在しており、四量体の構造保持に寄与している（図２および図４）。これらの図から理解されるように、塩素イオンは、四量体中の各々のＰａａＩポリペプチド鎖に属するＲ６７合計４残基で取り囲まれており、四量体中の各々のＰａａＩポリペプチド鎖と互いに認識（相互作用）し結合している。
【１０１１】
この相互作用を特徴付けているアミノ酸残基としては、Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｔ１１１・Ｔ１１３が挙げられる（表１２）。即ち、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの塩素イオン結合部位は、リガンド非結合型ＰａａＩのそれと同様に、点群２２２で表される対称関係にある４つの同一構造部分を持ち、これら４つの同一構造部分で取り囲むことにより対称中心に存在する塩素イオンを結合しており、その結合は表１２に挙げたアミノ酸残基およびその近傍のアミノ酸残基との相互作用で特徴付けられる。
【１０１２】
表１２
ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶において塩素イオンの結合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式
相互作用様式の略号
ＨＹＤ：  水素結合  （相互作用距離≦３．４Å）
ＷＭＨ：  水を介した水素結合
ＶＤＷ：  ファンデルワールス相互作用  （相互作用距離≦４．０Å）
ＥＳＩ：  静電的相互作用  （３．４Å＜相互作用距離≦５．０Å）
【１０１３】
2004254621.tif 000903
【１０１４】
2004254621.tif 000904
【１０１５】
2004254621.tif 000905
【１０１６】
2004254621.tif 000906
【１０１７】
2004254621.tif 000907
【１０１８】
2004254621.tif 000908
【１０１９】
2004254621.tif 000909
【１０２０】
2004254621.tif 000910
【１０２１】
2004254621.tif 000911
【１０２２】
2004254621.tif 000912
【１０２３】
2004254621.tif 000913
【１０２４】
2004254621.tif 000914
【１０２５】
2004254621.tif 000915
【１０２６】
2004254621.tif 000916
【１０２７】
2004254621.tif 000917
【１０２８】
2004254621.tif 000918
【１０２９】
2004254621.tif 000919
【１０３０】
2004254621.tif 000920
【１０３１】
2004254621.tif 000921
【１０３２】
2004254621.tif 000922
【１０３３】
2004254621.tif 000923
【１０３４】
2004254621.tif 000924
【１０３５】
表１２は、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶において塩素イオンの結合に関与する原子、原子間距離、およびそれらの相互作用様式を示す。タイプ１の四量体（ポリペプチド鎖Ａ・Ｂ・Ｃ・Ｄで代表）を前半に、タイプ２の四量体（ポリペプチド鎖Ｉ・Ｊ・Ｋ・Ｌで代表）を後半に示してある。１列目は一方の原子の残基または分子名・残基または分子番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、２列目は他方の原子の残基または分子名・残基または分子番号・原子名・ポリペプチド鎖名を、３列目はその相互作用の原子間距離をÅ単位で、４列目は相互作用の様式を記述している。相互作用の様式は、ＨＹＤは水素結合、ＷＭＨは水を介した水素結合、ＶＤＷはファンデルワールス相互作用、ＥＳＩは静電的相互作用を示している。以上の結果から、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩにおいて、塩素イオンは主にＲ６７のグアニジン基との静電的相互作用によりＰａａＩ分子に結合しており、その他の相互作用により当該結合がさらに安定化される。
【１０３６】
本発明であるヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩ以外のタンパク質の３次元構造座標において、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの３次元構造座標と実質的に一致するものは本発明の範囲内である。実質的に一致とは、両タンパク質分子間で分子進化的に対応するＣα炭素原子の重ねあわせを行った時の２乗平均平方根誤差が１．５Å以下である構造を指す。例えば、ＰａａＩの変異体または化学修飾体さらにＰａａＩと分子進化的に関連している他のタンパク質を含む結晶に由来する３次元構造座標などがこれにあたる。また、ＰａａＩポリペプチド鎖におけるアミノ酸配列の開始位置および終了位置は必ずしも本発明にとって厳密に規定されたものではなく、そのチオエステラーゼ活性および塩素イオン結合能力が保持されることを条件として、Ｎ末端またはＣ末端が削れたもの、あるいはＮ末端またはＣ末端にアミノ酸が付加したものも本発明に包含される。
【１０３７】
また、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの３次元構造座標を基にホモロジーモデリング（中村春木，中井謙太（１９９５）バイオテクノロジーのためのコンピューター入門，コロナ社，１８６〜２０４）により導き出したタンパク質の３次元構造座標も本発明に含まれる。さらに、ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの塩素イオン結合部位の類似構造をその一部として含む化合物（類似化合物）もまた本発明に含まれる。類似化合物とは、ＰａａＩの塩素イオン結合部位およびその近傍のアミノ酸残基について作製したＰａａＩの変異体のこと、あるいはＰａａＩ又はその変異体の構造を基に設計した低分子化合物のことを指す。これらの化合物は、ＰａａＩの塩素結合部位に見られるものと類似した、点群２２２で表される対称関係にある４つの同一構造部分を持ち、これら４つの同一構造部分で取り囲むことにより対称中心に存在する目的イオンを結合する。
【１０３８】
７．ＰａａＩの変異体を作製するための構造座標の使用
本発明で得た構造座標を用いてＰａａＩの１個または複数個のアミノ酸残基が置換・付加・又は欠失した変異体を同定・検索・評価または設計する方法を説明する。
【１０３９】
本発明によるリガンド非結合型ＰａａＩの結晶およびコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの結晶から得られる構造座標を、分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムが動作するコンピューター又はそのコンピューターの記憶媒体に入力することで、コエンザイムＡ誘導体とＰａａＩの３次元的な化学的相互作用の様式を詳細に表現することが可能になる。この時、リガンド非結合型およびコエンザイムＡ誘導体結合型の両者の構造座標を使用して比較することにより、コエンザイムＡ誘導体結合時のＰａａＩの構造変化が明らかになり、目的とする変異体の設計が容易になる。コンピューターの記憶媒体としては、リガンド非結合型ＰａａＩの結晶およびコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの結晶から得られる構造座標をコンピューター上の当該プログラムに導くことができるものであれば特に限定されるものではない。例えば、メモリーやハードディスクと呼ばれる電気的な一時記憶媒体でも、フロッピーディスク（登録商標）・ＣＤ・ＭＯ・磁気テープなどの半永久的な記憶媒体でも良い。
【１０４０】
また、本発明によるリガンド非結合型ＰａａＩの結晶あるいはコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの結晶から得られる構造座標を分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムが動作するコンピューター又はその記憶媒体に入力し、視覚的検討またはエネルギー計算をすることで、有用なＰａａＩ変異体の論理的設計が初めて可能になる。有用なＰａａＩ変異体とは、その変異導入により、基質・生成物・またはその他のリガンドに対する親和性が変化したり、チオエステラーゼ活性が変化したり、生物的または物理的安定性が変化したり、塩素イオンまたはその他のイオンに対する親和性・特異性が変化したり、そのＰａａＩ変異体を持つ細菌による生分解性プラスチックの生合成または生分解効率が変化したりして、ＰａａＩタンパク質の３次元構造座標を用いたイオンキレート剤の開発または生分解性プラスチックの生合成・分解の改良に関して有用なＰａａＩ変異体のことを指す。
【１０４１】
タンパク質分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムは多数開発されている。これらのプログラムは、一般に、分子の３次元構造座標の入力手段、同座標のコンピューター画面への視覚的表現、表現された分子内における各原子間の距離や結合角などを測定する手段、同座標の修正を行う手段などを提供する。更に、分子の座標を基に分子の構造エネルギーを計算する手段、水分子などの溶媒分子を考慮した自由エネルギーを計算する手段を提供することができるように作成されたプログラムを用いることも可能である。アクセルリス社から市販されているコンピューター・プログラムであるＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩやＱＵＡＮＴＡは、当該目的に好適なプログラムの例であるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【１０４２】
また、これらのプログラムは通常、シリコングラフィクス社やサンマイクロシステムズ社などから供給されているワークステーションと呼ばれるコンピューターに導入して使用されるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。当業者は、当該目的に適するプログラムが作動するように調整されているコンピューターを用い、本発明であるリガンド非結合型ＰａａＩの結晶およびコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの結晶から得られる構造座標を同コンピューター又はそのコンピューターの記憶媒体に導入することによって、コエンザイムＡ誘導体とＰａａＩの結合様式あるいはコエンザイムＡ誘導体結合時のＰａａＩの構造変化を原子レベルで且つ３次元的に捉えることができ、その結果、有用なＰａａＩ変異体の論理的設計が初めて可能になる。
【１０４３】
有用なＰａａＩ変異体とは、その変異導入により、基質・生成物・またはその他のリガンドに対する親和性が変化したり、チオエステラーゼ活性が変化したり、生物的または物理的安定性が変化したり、塩素イオンまたはその他のイオンに対する親和性・特異性が変化したり、そのＰａａＩ変異体を持つ細菌による生分解性プラスチックの生合成または生分解効率が変化したりして、ＰａａＩタンパク質の３次元構造座標を用いたイオンキレート剤の開発または生分解性プラスチックの生合成・分解の改良に関して有用なＰａａＩ変異体のことを指す。
【１０４４】
代表的なＰａａＩ変異体の設計方法の一つは、本発明によるリガンド非結合型ＰａａＩの結晶あるいはコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの結晶から得られる構造座標を分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムが動作するコンピューター又はその記憶媒体に入力し、視覚的検討またはエネルギー計算をする方法である。まず、リガンド非結合型ＰａａＩあるいはコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩについて、ＰａａＩとコエンザイムＡ誘導体との相互作用に関係しているアミノ酸残基およびその近傍にあるアミノ酸残基をコンピューターの画面上に表示させる。そしてＰａａＩのアミノ酸残基において、１個または複数個のアミノ酸残基の置換・欠失・挿入などの変異、または化学修飾をコンピューター上で行い、その結果生じるＰａａＩとコエンザイムＡ誘導体との相互作用の変化をコンピューターの画面上で観察する。コンピューターの画面上でタンパク質の３次元構造を観察する際、液晶シャッター眼鏡と呼ばれる３次元表示システムを用いたり、当業者において頻繁に用いられる立体視と呼ばれる右目と左目の視野に対応する２種の画面を並べて表示する方法を用いることで、３次元空間の理解が得られ易くなるが、必ずしもこれらの方法を用いなくても視覚的検討は可能である。
【１０４５】
また、アミノ酸残基の置換・欠失・挿入などの変異または化学修飾によって局所的に変化した構造座標は、立体化学的整合性を保つように各原子の空間配置を調整することで得られる。具体的には、コンピューターに妥当なコンフォーメーションの候補群を表示させてその中から選択したり、エネルギー状態が低くなるような構造をコンピューターに計算させたりする。このような方法で、ＰａａＩとコエンザイムＡ誘導体との間により好ましい相互作用が生じるようなＰａａＩの変異または化学修飾を見い出していく。好ましい相互作用とは、ＰａａＩタンパク質の３次元構造座標を用いたイオンキレート剤の開発または生分解性プラスチックの生合成・分解の改良に関して有用なＰａａＩ変異体であることが期待されるような相互作用のことを指す。
【１０４６】
即ち、ＰａａＩタンパク質の３次元構造座標を用いたイオンキレート剤の開発に関して有用なＰａａＩ変異体を設計するには、
（１）塩素イオンと直接相互作用しているＲ６７
（２）Ｒ６７と相互作用している
Ｓ６５・Ｃ６６・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｔ１１１・Ｔ１１３
から選択されるアミノ酸残基またはその近傍領域に変異を導入することが好ましい。
【１０４７】
ここで「その近傍領域」または「近傍」とは、当該アミノ酸残基に対して、静電的相互作用・疎水性相互作用・ファンデルワールス相互作用・水素結合などに関与する領域、具体的にはおよそ５Å以内にある領域を指す。本明細書の他の部分においても同様である。なお、ここに記載した以外の残基への変異導入でイオンキレート剤の開発に関して有用なＰａａＩ変異体を設計する場合においても、本発明における構造座標を使用する限り本発明の範囲内である。この際、考慮されるべき非共有結合の相互作用は、静電的相互作用・疎水性相互作用・ファンデルワールス相互作用・水素結合などがあり、これらをコンピューター画面上で視覚的に且つ総合的に考慮して、有用な変異体の設計を行うことができる。
【１０４８】
また、ＰａａＩタンパク質の３次元構造座標を用いた生分解性プラスチックの生合成・分解の改良に関して有用なＰａａＩ変異体を設計するには、
（１）活性部位の近傍に存在し、チオエステラーゼ活性に関与すると考えられるＮ３３・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｄ４８
（２）コエンザイムＡ誘導体と相互作用しているＮ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｔ３７・Ａ３８・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｄ４８・Ｆ５１・Ａ５２・Ｓ５５・Ｎ５６・Ｐ６０・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｌ７４・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｋ１０５・Ｖ１１４・Ｆ１１５・Ｌ１１７
（３）四量体相互作用に関与しているＭ１・Ｒ２・Ｄ３・Ｐ４・Ｆ５・Ａ８・Ｌ９・Ａ２９・Ｄ３０・Ｈ３１・Ｌ３２・Ｎ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｆ４２・Ｙ４４・Ａ４５・Ｄ４８・Ｓ４９・Ｌ５３・Ｎ５６・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｖ８７・Ｎ８８・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｔ９５・Ｒ９７・Ｅ９９・Ｋ１０５・Ｌ１０６・Ｌ１０９・Ｔ１１１・Ｔ１１３・Ｆ１１５
から選択されるアミノ酸残基に変異を導入することが好ましい。
【１０４９】
なお、ここに記載した以外の残基への変異導入で生分解性プラスチックの生合成・分解の改良に関して有用なＰａａＩ変異体を設計する場合においても、本発明における構造座標を使用する限り本発明の範囲内である。この際、考慮されるべき非共有結合の相互作用は、静電的相互作用・疎水性相互作用・ファンデルワールス相互作用・水素結合などがあり、これらをコンピューター画面上で視覚的に且つ総合的に考慮して、有用な変異体の設計を行うことができる。
【１０５０】
設計の第二の方法は、ＰａａＩとコエンザイムＡ誘導体との相互作用またはＰａａＩ同士の相互作用を、コンピューターによるエネルギー計算により評価して、有用な変異体の設計を行うものである。エネルギー計算は、当業者において一般的に行われる分子力場計算を行うコンピューター・プログラムを用いることによって達成できる。この目的に適したプログラムは、例えばタンパク質に最適化されたＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュールにあるＡＭＢＥＲの力場、ＣＶＦＦなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【１０５１】
ここで、設計の第一の手法と第二の手法は厳密に区別されるものではなく、両者を組み合わせて用いても良い。即ち、視覚的検討により、より望ましい変異体であると予想されるものについて、第二の手法を用いて実際にエネルギーの計算を行い、その妥当性を評価していき、それを繰り返し行うことで更に優れた変異体を設計していく方法である。
【１０５２】
以上のように、今まで３次元構造上の理論的な支持がない状態で試行錯誤で行われていた変異体の作製を、本発明の構造座標の使用により、３次元空間内の理論的な解析に基づいて行うことが可能になる。第一および第二の設計手法に用いる構造座標は、本発明の明細書中に示したリガンド非結合型ＰａａＩの結晶およびコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの結晶から得られる構造座標でも、またこれらを基にしてそれぞれのアミノ酸配列と相同性の高い他のタンパク質の配列を用いてコンピューターを用いた計算などにより新たに作成した構造座標でも良いし、更にはこれらの座標より一部を抜き出したものでも良い。
【１０５３】
当該設計においてリガンド非結合型ＰａａＩの結晶およびコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの結晶から得られる構造座標は、通常、３次元空間に固定して使用されるが、必ずしも固定されたままである必要はない。ＰａａＩは結晶中で四量体として存在しているので、この四量体を１つの塊として３次元空間の中で並進または回転することが可能である。更に、それぞれの四量体中の原子について共有結合が切断されない範囲で移動させ、エネルギー計算を行うこともできる。このような３次元空間内での操作により変化した構造座標は本発明の範囲内である。
【１０５４】
本発明により設計された変異体は、多くの方法によって調製され得る。例えば、本発明を基にして、変異させることで塩素以外のイオンに対する特異性が生じると予想されるアミノ酸をコードしているＤＮＡ部位を、このＤＮＡ部位と相同で且つ当該アミノ酸の変異を含む合成オリゴヌクレオチドに制限酵素を用いて置換することで、本発明を基にして設計された当該変異体をコードするＤＮＡを得ることができる。得られた変異体ＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主に導入し、組み換えタンパク質として大量発現させることで前述のような変異体を得ることができる。このような調製方法は当業者において最も一般的に行われている。
【１０５５】
また、タンパク質のアミノ酸残基を化学修飾することも当業者においては一般的に行われている（Ｈｉｒｓ，  Ｃ．  Ｈ．，  ＆  Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ，  Ｓ．  Ｎ．，  ｅｄｓ．  （１９７７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ４０７−４９８）。
【１０５６】
本発明の方法によって設計された変異体については、物理化学的、生化学的あるいは生物学的な機能解析を行うことが好ましい。更に上記の変異体設計の過程で機能解析結果を逐次フィードバックすることにより、より目的に合致した変異体を得ることができる。
【１０５７】
８．イオンキレート剤の開発を行うためのリガンド非結合型ＰａａＩあるいはコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの構造座標の使用
本発明による、表１・２・５・９に示したリガンド非結合型ＰａａＩおよびコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの３次元構造座標を用いて、塩素イオンまたはその他のイオンに対するキレート剤の開発を行う方法を説明する。
【１０５８】
ＰａａＩの塩素結合部位は、４残基のアルギニン残基で取り囲むことにより塩素イオンを強固に結合しているため、水に対する透析などの方法では塩素イオンを取り除くことができない。従って、この構造をキレート剤として利用するためには、まず、塩素イオンの簡便な着脱の方法を考える必要がある。例えば、以下に述べる方法を単独でまたは組み合わせて用いることにより塩素イオンの着脱の方法を確立する。
【１０５９】
１）他のイオンへの置換による方法
ＰａａＩに対する親和性が塩素イオンより低い陰イオンを過剰に加えることにより結合している塩素イオンを別の陰イオンと置換する。置換方法は透析法が適当であるが、限外濾過などその他の方法でも構わない。本タンパク質は耐熱性があるので、置換効率を上げるために熱をかけても良い。このイオン置換したＰａａＩに塩素イオンを加えるとイオンの再交換が起こり、結果的に塩素イオンのキレート剤として働く。
【１０６０】
２）変性巻き戻しによる方法
尿素などの適当なタンパク質変性剤を用いてＰａａＩを変性させ、塩素イオンのない溶液に対する透析などの方法で徐々に変性剤を除くことにより巻き戻しを行う。このようなタンパク質の変性巻き戻しは、当業者において一般的に行われている（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８，  １４７５−１４８３）。巻き戻し後のＰａａＩは塩素イオンを含まないので、塩素イオンを加えると塩素イオンのキレート剤として働く。
【１０６１】
３）変異体を用いた方法１
塩素イオンの結合に関与するＳ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｔ１１１・Ｔ１１３の変異体を、発明の実施の形態の第７項に記載の方法に従って作製し、着脱が可能な程度まで塩素イオンに対する親和性が下がった変異体を選択する。この変異体を用いると水に対する透析などの方法で簡単に塩素イオンの除去が可能であり、塩素イオンを除去した変異体に塩素イオンを加えると塩素イオンのキレート剤として働く。
【１０６２】
４）変異体を用いた方法２
塩素イオンを結合しているＲ６７を発明の実施の形態の第７項に記載の方法に従って酸性アミノ酸残基に置換し、陽イオンを結合する変異体を作製する。この変異体と野生型ＰａａＩを等量混合して透析により脱イオンすることにより、変異体サブユニット２個と野生型サブユニット２個から成るキメラ四量体を得る。このキメラ四量体はイオン結合部位の正味電荷が消失するためイオンを結合しない。しかし、塩素イオンを含む塩を加えるともとの変異体と野生型の四量体に戻り、結果的に塩素イオンのキレート剤または脱イオン剤として働く。
【１０６３】
５）ペプチド合成による方法
塩素イオン結合部位の立体構造の視覚的方法による検討の結果、塩素イオンの結合に直接的または間接的に関与するのはＳ６５〜Ｄ６９までのペンタペプチドの部分のみであることがわかった（図２）。従って、このペンタペプチドを塩素イオンを含まない環境で化学合成することにより、塩素イオン結合能力を持つペプチドを大量に得ることができる。このペンタペプチドに塩素イオンを加えると塩素イオンのキレート剤として働く。
【１０６４】
次に、キレート剤としての付加価値を高めた化合物の開発を薬剤設計の方法を利用して行う。薬剤設計によるこれらの化合物の開発は、本発明が提供するリガンド非結合型ＰａａＩおよびコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの３次元構造座標の全て又は一部を分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムが動作するコンピューター又はそのコンピューターの記憶媒体に入力することで初めて可能になる。開発する化合物は、天然物化合物、合成化合物のいずれでも良く、高分子化合物、低分子化合物のいずれでも良い。
【１０６５】
薬剤設計を行う際に用いられるコンピューターは、例えばシリコングラフィクス社によって供給されているワークステーションＯｃｔａｎｅ２などが好適であるが、これに限定されるものではなく、必要なプログラムが動作するように調整されているコンピューターであればよい。また、コンピューターの記憶媒体にも特に制限はない。設計に用いるプログラムは、例えばアクセルリス社から市販されているコンピューター・プログラムＩｎｓｉｇｈｔＩＩ  （Ｌｕｄｉ）やＤＯＣＫなどを単独または組み合わせて用いる。これらのプログラムを用いることでより容易に薬剤設計を行うことができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【１０６６】
本発明が提供するリガンド非結合型ＰａａＩおよびコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの３次元構造座標の全て又は一部を基に、キレート剤としての付加価値を高めた化合物を設計する具体例を以下に挙げる。
【１０６７】
１）簡便に目的イオンの検出をするための方法の開発
Ｓ６５〜Ｄ６９までのペンタペプチドのうち、Ｃ６６またはＭ６８に目的イオンの結合により吸光度が大きく変化するような発色団を化学修飾により導入する。Ｃ６６またはＭ６８は必要に応じて他のアミノ酸に置換しても良い。この化学修飾したペンタペプチドを用いることにより、目的イオンの検出が吸光度測定により簡単に行える。
【１０６８】
２）イオン特異性の異なる様々なイオンキレート剤の開発
塩素イオンの結合に関与するＳ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｔ１１１・Ｔ１１３の変異体を、発明の実施の形態の第７項に記載の方法に従って作製し、目的イオンに対する特異的な親和性を持つ変異体を選択する。または、Ｓ６５〜Ｄ６９までのペンタペプチドを用いて薬剤設計の方法により目的イオンに対する特異的な親和性を持つペプチドを設計し化学合成する。
【１０６９】
３）低分子化
以上に述べた開発により得られたＰａａＩそのもの、ＰａａＩ変異体、あるいはペプチドを、薬剤設計の方法により低分子化する。これにより、イオンキレート剤の工業的な生産が可能となり、適用範囲も広がる。
【１０７０】
コンピューターを利用した具体的な薬剤設計は、例えば次のような手順で行う。まず、ＰａａＩの塩素イオン結合部位のアミノ酸残基およびその近傍にあるアミノ酸残基をコンピューターの画面上に表示させる。そしてＰａａＩのアミノ酸残基の化学修飾をコンピューター上で行い、その結果生じるＰａａＩと目的イオンとの相互作用の変化をコンピューターの画面上で観察し、視覚的検討を行う。修飾により局所的に変化した構造座標は、立体化学的整合性を保つように各原子の空間配置を調整することで得られる。具体的には、コンピューターに妥当なコンフォーメーションの候補群を表示させてその中から選択したり、エネルギー状態が低くなるような構造をコンピューターに計算させたりする。このような方法で、ＰａａＩの塩素イオン結合部位の化学構造をイオンキレート剤としてより有用な化合物に置き換えてゆく。
【１０７１】
この際、考慮されるべき非共有結合の相互作用は、静電的相互作用・疎水性相互作用・ファンデルワールス相互作用・水素結合などがあり、これらをコンピューター画面上で視覚的に且つ総合的に考慮して、薬剤設計を進める。コンピューターによるエネルギー計算を利用した薬剤設計法もある。この方法では、ＰａａＩの塩素イオン結合部位の立体構造を基に設計された新たな化合物と目的イオンとの結合のエネルギーを求め、当該設計の妥当性を判断する。更には溶媒分子などもモデルに含めて分子動力学法により自由エネルギーを求め、安定に結合できる化合物へ誘導する方法もある。分子力場計算に用いる力場は、タンパク質に最適化されたＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュールにあるＡＭＢＥＲの力場、もしくは一般有機分子に適したＣＶＦＦなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【１０７２】
設計された化合物の最適化の段階において、化合物と目的イオンの会合体の立体構造はＰａａＩの塩素イオン結合部位のそれを反映しているはずであるが、厳密に一致している必要はなく、当該化合物のイオンキレート剤としての作用が維持される限り、ある程度変化することは許される。本発明の方法によって設計された化合物については、物理化学的な検討を行うことが望ましい。この物理化学的な検討結果を上記の薬剤設計へ逐次フィードバックし、両方の作業を補完的に進めることにより、より優れたイオンキレート剤を得ることができる。
【１０７３】
９．生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を行うためのリガンド非結合型ＰａａＩあるいはコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの構造座標の使用
本発明による、表１・２・５・９に示したリガンド非結合型ＰａａＩおよびコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの３次元構造座標を用いて、生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を行う方法を説明する。
【１０７４】
生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を行うためには、まず、チオエステラーゼであるＰａａＩの反応機構において重要な働きをしているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基についての変異体から生分解性プラスチックの生合成・分解の改良に好ましいものを選択する必要がある。以下にＰａａＩタンパク質の３次元構造座標を用いて我々が実際に行った方法または行う予定の方法を例にとって説明する。
【１０７５】
我々がこれまでに得た結晶構造は、活性部位周辺の構造に注目すると３つに分類される（図５）。チオエステラーゼの反応機構は確定していない（Ｌｉ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，  ５５５−５５９）が、ＰａａＩの結晶構造解析の結果、図５から理解されるように、広義塩基による水からの水素イオン引き抜きにより生じたヒドロキシルイオンが基質を求核攻撃する反応機構が有力になった。この広義塩基となる活性残基（図５でＢと表示）は、視覚的方法による検討を行った結果、Ｄ４８である可能性が高いことがわかった。この活性残基を確定するためには、活性部位近傍に存在するＮ３３・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｄ４８の変異体を、発明の実施の形態の第７項に記載の方法に従って作製し、それらＰａａＩ変異体の活性および結晶構造を調べることが必要である。
【１０７６】
また、これらの変異体の解析により、活性残基以外の活性部位近傍アミノ酸残基の役割を知ることもできる。これら活性部位近傍のアミノ酸残基のうち、ＰａａＩの反応機構において重要な働きをしているものが同定できたら、それらのアミノ酸残基についての変異体から生分解性プラスチックの生合成・分解の改良に好ましいものを選択する。例えば、活性残基の水からの水素イオン引き抜きを促進するような活性残基またはその近傍のアミノ酸残基についての変異体を作製すれば、活性を高めた変異体を得ることができる。
【１０７７】
活性部位近傍のアミノ酸残基以外で、コエンザイムＡ誘導体との相互作用に関与しているアミノ酸残基もまた、ＰａａＩの反応機構において重要な働きをしている可能性がある。従って、コエンザイムＡ誘導体との相互作用に関与するＮ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｔ３７・Ａ３８・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｄ４８・Ｆ５１・Ａ５２・Ｓ５５・Ｎ５６・Ｐ６０・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｌ７４・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｋ１０５・Ｖ１１４・Ｆ１１５・Ｌ１１７の変異体を、発明の実施の形態の第７項に記載の方法に従って作製し、それらＰａａＩ変異体の活性および結晶構造を調べる。これらの変異体の解析により、活性部位近傍のアミノ酸残基以外で、コエンザイムＡ誘導体との相互作用に関与しているアミノ酸残基の反応機構における役割および重要性を知ることができる。
【１０７８】
これら活性部位近傍のアミノ酸残基のうち、ＰａａＩの反応機構において重要な働きをしているものが同定できたら、それらのアミノ酸残基についての変異体から生分解性プラスチックの生合成・分解の改良に好ましいものを選択する。例えば、ヒドロキシルイオンによる基質（アシルコエンザイムＡ）の求核攻撃に直接関与すると考えられるタイプ１四量体における基質の構造を安定化するような変異体を作製すれば、活性を高めた変異体を得ることができる。
【１０７９】
発明の実施の形態の第４項および第６項に記載のように、ＰａａＩの四量体構造もまたＰａａＩの反応機構において重要な働きをしている可能性がある。例えば、ＰａａＩ四量体は基質結合部位を４箇所持つにもかかわらず、同時に２分子しか基質を結合することができない。これはＰａａＩ四量体の構造上の制約から、４箇所存在する基質結合部位のうち、２箇所を基質結合または酵素反応に都合の良い環境にするために他の２箇所が犠牲になっているからである。そこで、四量体の会合に関与するＭ１・Ｒ２・Ｄ３・Ｐ４・Ｆ５・Ａ８・Ｌ９・Ａ２９・Ｄ３０・Ｈ３１・Ｌ３２・Ｎ３３・Ｌ３４・Ｈ３５・Ｈ３９・Ｇ４０・Ｇ４１・Ｆ４２・Ｙ４４・Ａ４５・Ｄ４８・Ｓ４９・Ｌ５３・Ｎ５６・Ａ６１・Ｖ６２・Ａ６３・Ｌ６４・Ｓ６５・Ｃ６６・Ｒ６７・Ｍ６８・Ｄ６９・Ｙ７０・Ｆ７１・Ｒ７２・Ｐ７３・Ｖ８７・Ｎ８８・Ｓ９０・Ｒ９１・Ｒ９２・Ｔ９３・Ｔ９５・Ｒ９７・Ｅ９９・Ｋ１０５・Ｌ１０６・Ｌ１０９・Ｔ１１１・Ｔ１１３・Ｆ１１５の変異体を、発明の実施の形態の第７項に記載の方法に従って作製し、それらＰａａＩ変異体の活性および結晶構造を調べる。そして、これらの変異体のうち、４箇所存在する基質結合部位の全てが同時に酵素反応に使われるような変異体を選び出すことにより、活性を高めた変異体を得ることができる。
【１０８０】
また、これらの変異体の解析により、四量体の会合に関与しているアミノ酸残基の反応機構におけるその他の役割および重要性を知ることもできる。これらのアミノ酸残基についての変異体から生分解性プラスチックの生合成・分解の改良に好ましいものを選択することもできる。
【１０８１】
以上のような手法で生分解性プラスチックの生合成・分解の改良に好ましい変異体を得ることができたら、その変異体をコードするＤＮＡを含む適当な細菌株に組み込み、機能を改変した細菌株を得る。このような調製方法は当業者においては最も一般的に行われている。そして、この細菌株を用いて実際に生分解性プラスチックの生合成・分解を行い、より高品質な生分解性プラスチックを生産したり同プラスチックの生分解効率を高めたりできるかどうかを検討する。その結果を変異体作製にフィードバックすることにより、より目的に合致した細菌株を得ることができる。
【１０８２】
１０．分子置換法によるＸ線結晶構造解析を行うためのリガンド非結合型ＰａａＩあるいはコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの構造座標の使用
本発明による、表１・２・５・９に示したリガンド非結合型ＰａａＩおよびコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの３次元構造座標は、ＰａａＩ関連タンパク質を含む結晶、即ちＰａａＩの一部分、変異体、化学修飾体、さらにＰａａＩと有意な相同性を持つ他のタンパク質を含む結晶のＸ線結晶構造解析において有用である。即ち、当業者においてＸ線結晶構造解析の手法の一つとして一般的に用いられている分子置換法（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，  Ｔ．  Ｌ．  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｌ．  Ｎ．  （１９７６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ４４３−４６４）によれば、本発明によるリガンド非結合型ＰａａＩの３次元構造座標の全て又はその一部、あるいはコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの３次元構造座標の全て又はその一部を利用することで、構造座標が未知の上記のようなタンパク質の結晶の構造座標を決定する際の所要時間および労働力を大幅に削減できる。
【１０８３】
分子置換法を行う際には、分子置換法に用いるプログラムが動作するように調整されているコンピューターを用いる。当該プログラムには、例えばＣＮＸ（アクセルリス社より市販）やＡＭＯＲＥ（ＣＣＰ４（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４  （１９９４）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ５０，  ６７０−６７３）のプログラム群の１つ）等があるが、その他のプログラムを用いても良い。
【１０８４】
本発明のリガンド非結合型ＰａａＩおよびコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの３次元構造座標を用いて分子置換法を適用するべき結晶としては、ＰａａＩ関連タンパク質を含む結晶、即ちＰａａＩの一部分、変異体、化学修飾体、さらにＰａａＩと有意な相同性を持つ他のタンパク質を含む結晶が挙げられる。具体的には、例えばＰａａＩ関連タンパク質とそれに結合する化合物との複合体の結晶について適用できる。ＰａａＩと有意な相同性を持つタンパク質とは、ＰａａＩとのアミノ酸同一残基率が２０％以上、好ましくは３０％以上を示すタンパク質を指す。上記以外の結晶についても、目的の結晶のＸ線回折像から抽出された構造因子と本発明のリガンド非結合型ＰａａＩもしくはコエンザイムＡ誘導体結合型ＰａａＩの３次元構造座標に基づき、分子置換法を適用して実際に結晶構造が解ければ、その結晶に対する分子置換法の適用は本発明の範囲内である。解けた結晶構造とは、当業者において一般的に用いられている結晶構造の妥当性の指標であるフリーＲ値が３５％以下であるような結晶構造を指す。
【１０８５】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
実施例１
高度好熱菌  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  由来ＰａａＩのクローニング
高度好熱菌  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  から抽出したゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法により本発明のＰａａＩ遺伝子をクローニングした。高度好熱菌の培養方法およびゲノムの抽出方法は、当業者に周知である。次のＦプライマーおよびＲプライマーを使用した。
Ｆプライマー：５’−ＡＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＧＴＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＴＴＧＧＧＣＣ−３’（下線はＮｄｅＩ部位）
Ｒプライマー：５’−ＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＣＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＡ−３’（下線はＢｇｌＩＩ部位）
【１０８６】
反応条件
１）ＰＣＲ反応液組成（５０μｌ）
【表５６８】
2004254621.tif 000925
【１０８７】
２）ＰＣＲサイクル
上記表のポリメラーゼ以外の試薬を混合し、サーマルサイクラーを使用して９８℃で５分間加熱した。ポリメラーゼを添加した後、以下のサイクルを３０回繰返した：９６℃１分間、６５℃１分間、７２℃２分間（スロープ３分間）。ここでスロープとは、６５℃から７２℃に温度を上昇させるのに３分間かけることを示す。当業者に周知のように、このことにより、ＤＮＡの増幅がかなり改善されることが多い。非特異的アニーリングを減らすために、アニーリング温度は６５℃と高めに設定した。最後に、７２℃で１０分間加熱した。得られたＰＣＲ産物を、次のライゲーション反応に使用した。
【１０８８】
３）ライゲーション反応
反応液組成（１０μｌ）
【表５６９】
2004254621.tif 000926
上記の試薬を混合し、１６℃で一夜ライゲーション反応を行い、ＰＣＲ産物をＴ−ベクターにクローニングした。ＰＣＲ産物の塩基配列を解読したところ、配列番号２の遺伝子が含まれていた。
【１０８９】
実施例２
リガンド非結合型ＰａａＩの結晶の調製
本発明に用いたＰａａＩタンパク質は高度好熱菌  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  からクローニングし、ｐＥＴ−１１ａプラスミドベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ）を用いた大腸菌  ＢＬ２１  （ＤＥ３）  による発現系を用いて大量発現した。菌体をソニケーション後、７０℃で１０分間熱処理を行った粗精製溶液を、一連のクロマトグラフィー、ＳｕｐｅｒＱ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  （Ｔｏｓｏｈ）、ＲＥＳＯＵＲＣＥ（登録商標）  Ｑ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ＴｙｐｅＩ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）、ＨｉＬＯＡＤ（登録商標）  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）  ７５ｐｇを用いて精製し、目的タンパク質を得た。精製後のＰａａＩタンパク質溶液をＶＩＶＡＳＰＩＮ  ５０００  ｃｕｔ  （ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて２０〜３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、４℃で保存した。溶媒として５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）  ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０を用いた。２．２５リットルの培養液から約２５ｍｇのＰａａＩタンパク質が得られた。
【１０９０】
得られたタンパク質試料を、以下に示すマイクロバッチ法を用いて結晶化した。空間群Ｐ４３２２に属する結晶を得るには、このタンパク質試料液１μｌと、等量の沈殿剤溶液（０．２Ｍの塩化マグネシウムと３０（ｖ／ｖ）％のポリエチレングリコール４００を含む０．１ＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ  −Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．５）を、ピペットマンを用いてＮＵＮＣ社製７２穴ＨＬＡプレートのウェル中に注入・混合し、結晶化溶液とする。一方、空間群Ｉ４１２２に属する結晶を得るには、沈殿剤溶液に０．８３Ｍの酒石酸ナトリウムカリウムを含む０．１ＭのＣＨＥＳ（２−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏ  ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ９．５を用いて、上記と同様の操作を行う。続いてこれらの結晶化溶液の上に、１５μｌのシリコン−パラフィン混合オイル（シリコンオイルとパラフィンオイルを１：１（ｖ／ｖ）で混合したもの）をピペットマンを用いて重層した。この結晶化溶液を含むＨＬＡプレートを２２℃に保たれたインキュベーター中で保管した。Ｐ４３２２結晶の場合、およそ３日程度後に１５０μｍ×１５０μｍ×３００μｍ程度の大きさの紡錘形の結晶が結晶化溶液中に得られた。Ｉ４１２２結晶の場合、およそ１週間程度後に１００μｍ×１００μｍ×２００μｍ程度の大きさの両錐形の結晶が結晶化溶液中に得られた。
【１０９１】
実施例３
リガンド非結合型ＰａａＩの結晶構造解析
実施例２で得られた空間群Ｐ４３２２に属する結晶を、クライオループを用いてＨＬＡプレートのウェル中の２μｌのハーベスト溶液（実施例２に記載の沈殿剤溶液を蒸留水で７０（ｖ／ｖ）％に希釈したもの）に移し、その上に１５μｌのパラフィンオイルをピペットマンを用いて重層した。この結晶およびハーベスト溶液を含むＨＬＡプレートを２２℃に保たれたインキュベーター中で数時間以上保管し、平衡化を行った。なお、この状態で少なくとも数日間は安定に保存できる。この結晶を１００Ｋの窒素気流下で瞬間冷却し、同窒素気流下で振動法を用いてリガンド非結合型ＰａａＩ（Ｐ４３２２）のＸ線回折データを収録した。
【１０９２】
また、ＰａａＩを発現するように調製された大腸菌をセレノメチオニンを含む培地で培養することで、当タンパク質中のメチオニン残基がセレノメチオニン残基に置換された、セレノメチオニン置換体タンパク質を得た。このタンパク質試料を用いて実施例２に準じた方法によりＰａａＩのセレノメチオニン置換体結晶（Ｐ４３２２）を得た。この結晶を、クライオループを用いてＨＬＡプレートのウェル中の２μｌのハーベスト溶液（実施例２に記載の沈殿剤溶液を蒸留水で７０（ｖ／ｖ）％に希釈したもの）に移し、その上に１５μｌのパラフィンオイルをピペットマンを用いて重層した。この結晶およびハーベスト溶液を含むＨＬＡプレートを２２℃に保たれたインキュベーター中で数時間以上保管し、平衡化を行った。なお、この状態で少なくとも数日間は安定に保存できる。この結晶を１００Ｋの窒素気流下で瞬間冷却し、同窒素気流下で振動法を用いてリガンド非結合型ＰａａＩのセレノメチオニン置換体（Ｐ４３２２）のＸ線回折データを収録した。このＸ線回折データは、多波長異常分散（ＭＡＤ）法による位相計算に必要な３波長に対応する計３データセットである。
【１０９３】
得られた各々の回折像から、ＨＫＬ社製のプログラムＨＫＬ２０００を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。この段階で、実施例２の方法で調製したリガンド非結合型ＰａａＩの結晶（Ｐ４３２２）は、正方晶系の空間群Ｐ４１２２或いはＰ４３２２に属し、ａ＝ｂ＝５７．９Åおよびｃ＝１３９．６Åで定義される結晶格子を持つことが示された。
【１０９４】
次に、プログラムパッケージＣＣＰ４を用いて、以下の解析を行った。まず、セレノメチオニン置換体結晶から得られた回折強度の異常分散差を用いてフーリエ変換の計算を行い、異常分散差パターソン図を得た。この異常分散差パターソン図を基に、これを満足する実空間単位格子内でのセレン原子の位置を決定した。この時点で、正しい空間群はＰ４３２２であることが示された。得られたセレン原子の座標を用いて、多波長異常分散（ＭＡＤ）法によりセレノメチオニン置換体結晶の結晶構造因子の位相を決定し、同置換体結晶の電子密度図を得た。更にこの電子密度図を溶媒領域平坦化法により改善し、最終的に、アミノ酸の側鎖まで確認できる程度の良質な２．３Å分解能の電子密度図を得た。
【１０９５】
次に、この２．３Å分解能の電子密度に基づき、プログラムＡＲＰ／ｗＡＲＰを用いて自動モデリングを行った。得られたリガンド非結合型ＰａａＩの初期３次元構造座標をプログラムＱＵＡＮＴＡを用いて修正し、続いてプログラムＣＮＳを用いて構造座標の精密化を行った。このモデル修正と精密化の操作を繰り返して行い、結晶の非対称単位中に２分子存在する１３６アミノ酸残基から成るＰａａＩポリペプチドのうち、ポリペプチド鎖ＡにおいてＲ２〜Ｌ１１７のアミノ酸残基、ポリペプチド鎖ＢにおいてＤ３〜Ｌ１１７のアミノ酸残基を同定した。また、ポリペプチド以外の原子として、１個の塩素イオン、１個のマグネシウムイオン、２００個の水分子を同定した。
【１０９６】
精密化の最終段階で、当業者において構造座標の正確さの指標とされているＲ値は、３０Åから１．７Åのブラッグ反射角を持つ回折像から得られる構造因子を用いた場合、１８．１％であった。更に、精密化の計算から除外した全体の５％の構造因子から計算されるＲ値（当業者においてフリーＲ値と呼ばれる因子）は１９．３％であった。更に、各原子間の結合距離および結合角の理想状態からの２乗平均平方根誤差は、それぞれ０．００４Åおよび１．１°であった。このようにして得られたリガンド非結合型ＰａａＩ（Ｐ４３２２）の３次元構造座標を表１に示す。
【１０９７】
一方、空間群Ｉ４１２２に属するリガンド非結合型ＰａａＩ結晶の構造解析は、上記の方法により得られたＰ４３２２結晶の３次元構造座標を基に、分子置換法により行った。まず、実施例２で得られたＩ４１２２結晶を、クライオループを用いてＨＬＡプレートのウェル中の２μｌのクライオ溶液（実施例２に記載の沈殿剤溶液に３０（ｗ／ｗ）％のグリセロールを添加したもの）に移し、３０秒程度後に、結晶を１００Ｋの窒素気流下で瞬間冷却し、同窒素気流下で振動法を用いてリガンド非結合型ＰａａＩ結晶（Ｉ４１２２）のＸ線回折データを収録した。
【１０９８】
得られた回折像から、ＨＫＬ社製のプログラムＨＫＬ２０００を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。この段階で、実施例２の方法で調製したリガンド非結合型ＰａａＩ結晶（Ｉ４１２２）は、正方晶系の空間群Ｉ４１２２に属し、ａ＝ｂ＝７６．８Åおよびｃ＝１５５．７Åで定義される結晶格子を持つことが示された。
【１０９９】
得られた構造因子と表１に示したリガンド非結合型ＰａａＩの３次元構造座標を用いて、プログラムＡＭＯＲＥによる分子置換法を行った。リガンド非結合型ＰａａＩのＡ分子の３次元構造座標をサーチモデルとした。分解能範囲１５〜３．５Åの構造因子を用いた計算の結果、１種類の有意な解が得られた。次に、その解を、プログラムＣＮＳの剛体精密化の方法により分解能範囲２５〜３．０Åの構造因子を用いて精密化した。その結果、実施例２の方法で調製したリガンド非結合型ＰａａＩの結晶（Ｉ４１２２）は非対称単位中にＰａａＩポリペプチド鎖１本を含むことが示された。
【１１００】
得られたリガンド非結合型ＰａａＩ（Ｉ４１２２）の初期３次元構造座標をプログラムＱＵＡＮＴＡを用いて修正し、続いてプログラムＣＮＳを用いて構造座標の精密化を行った。このモデル修正と精密化の操作を繰り返して行い、結晶の非対称単位中に１分子存在する１３６アミノ酸残基から成るＰａａＩポリペプチドのうち、Ｍ１〜Ｌ１１７のアミノ酸残基を同定した。また、ポリペプチド以外の原子として、１個の塩素イオン、２個のグリセロール分子、１６０個の水分子を同定した。
【１１０１】
精密化の最終段階で、当業者において構造座標の正確さの指標とされているＲ値は、２５Åから１．４５Åのブラッグ反射角を持つ回折像から得られる構造因子を用いた場合、１８．８％であった。更に、精密化の計算から除外した全体の５％の構造因子から計算されるＲ値（当業者においてフリーＲ値と呼ばれる因子）は１９．４％であった。更に、各原子間の結合距離および結合角の理想状態からの２乗平均平方根誤差は、それぞれ０．００４Åおよび１．１°であった。このようにして得られたリガンド非結合型ＰａａＩ（Ｉ４１２２）の３次元構造座標を表２に示す。
【１１０２】
実施例４
ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶の調製
本発明に用いたＰａａＩタンパク質は高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８からクローニングし、ｐＥＴ−１１ａプラスミドベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ）を用いた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）による発現系を用いて大量発現した。菌体をソニケーション後、７０℃で１０分間熱処理を行った粗精製溶液を、一連のクロマトグラフィー、ＳｕｐｅｒＱ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  （Ｔｏｓｏｈ）、ＲＥＳＯＵＲＣＥ（登録商標）  Ｑ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ＴｙｐｅＩ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）、ＨｉＬＯＡＤ（登録商標）  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）  ７５ｐｇを用いて精製し、目的タンパク質を得た。精製後のＰａａＩタンパク質溶液をＶＩＶＡＳＰＩＮ  ５０００  ｃｕｔ  （ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて２０〜３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、４℃で保存した。溶媒として５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）  ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０を用いた。２．２５リットルの培養液から約２５ｍｇのＰａａＩタンパク質が得られた。
【１１０３】
得られたタンパク質試料を、以下に示すマイクロバッチ法を用いて結晶化した。まず、タンパク質試料液１μｌと等量の沈殿剤溶液（５ｍＭのＣｏＡ−ＳＨおよび２７．５（ｖ／ｖ）％イソプロピルアルコールを含む０．１Ｍの酢酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ５．１）を、ピペットマンを用いてＮＵＮＣ社製７２穴ＨＬＡプレートのウェル中に注入・混合し、結晶化溶液とした。続いてこの結晶化溶液の上に、１５μｌのシリコン−パラフィン混合オイル（シリコンオイルとパラフィンオイルを１：１（ｖ／ｖ）で混合したもの）をピペットマンを用いて重層した。この結晶化溶液を含むＨＬＡプレートを２２℃に保たれたインキュベーター中で保管した。およそ３日程度後に、結晶化溶液中に、２００μｍ×２００μｍ×２０μｍ程度の大きさの板状の結晶が得られた。なお、ＣｏＡ−ＳＨなしの条件ではこの結晶は析出しなかった。
【１１０４】
実施例５
ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶構造解析
実施例４で得られた結晶を、クライオループを用いてＨＬＡプレートのウェル中の２μｌのクライオ溶液（実施例４に記載の沈殿剤溶液に３０（ｗ／ｗ）％のグリセロールを添加したもの）に移し、３０秒程度後に、結晶を１００Ｋの窒素気流下で瞬間冷却し、同窒素気流下で振動法を用いてＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩのＸ線回折データを収録した。
【１１０５】
得られた回折像から、ＨＫＬ社製のプログラムＨＫＬ２０００を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。この段階で、実施例４の方法で調製したＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶は、三斜晶系の空間群Ｐ１に属し、ａ＝８２．６Å、ｂ＝８７．１Å、ｃ＝５９．４Å、α＝９２．２°、β＝９０．０°、γ＝９０．０°で定義される結晶格子を持つことが示された。
【１１０６】
得られた構造因子と表１に示したリガンド非結合型ＰａａＩの３次元構造座標を用いて、プログラムＡＭＯＲＥによる分子置換法を行った。まず、リガンド非結合型ＰａａＩの３次元構造座標から結晶学的２回対称操作により四量体の３次元構造座標を作成した。この四量体の３次元構造座標をサーチモデルとして分子置換法の計算を行った。分解能範囲８〜４Åの構造因子を用いた計算の結果、４種類の有意な解が得られた。次に、それぞれの解を、プログラムＣＮＳの剛体精密化の方法により分解能範囲８〜４Åの構造因子を用いて精密化した。その結果、これら４つの解を合わせるとＲ値が最も低くなり、実施例４の方法で調製したＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶は非対称単位中に４個のＰａａＩ四量体を含むことが示された。
【１１０７】
得られたＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの初期３次元構造座標をプログラムＱＵＡＮＴＡを用いて修正し、続いてプログラムＣＮＳを用いて構造座標の精密化を行った。このモデル修正と精密化の操作を繰り返して行い、結晶の非対称単位中に１６分子存在する１３６アミノ酸残基から成るＰａａＩポリペプチドのうち、ポリペプチド鎖Ｌ・ＰにおいてＭ１〜Ｌ１１７のアミノ酸残基、ポリペプチド鎖Ａ・Ｂ・Ｅ・ＦにおいてＲ２〜Ｌ１１７のアミノ酸残基、ポリペプチド鎖Ｃ・Ｄ・Ｇ・Ｈ・Ｉ・Ｊ・Ｋ・Ｍ・Ｎ・ＯにおいてＤ３〜Ｌ１１７のアミノ酸残基を同定した。また、ポリペプチド以外の原子として、４個の塩素イオン、８個のＣｏＡ−ＳＨ分子、２５３個の水分子を同定した。塩素イオンの同定は、銅Ｋα線（波長１．５４１８Å）で測定した回折データを基に計算した異常分散差フーリエ図において、同イオン近傍に存在するシステイン残基およびメチオニン残基の硫黄原子と同程度のピークを与えることを確認することで行った。
【１１０８】
精密化の最終段階で、当業者において構造座標の正確さの指標とされているＲ値は、３０Åから１．９Åのブラッグ反射角を持つ回折像から得られる構造因子を用いた場合、１９．５％であった。更に、精密化の計算から除外した全体の５％の構造因子から計算されるＲ値（当業者においてフリーＲ値と呼ばれる因子）は２１．６％であった。更に、各原子間の結合距離および結合角の理想状態からの２乗平均平方根誤差は、それぞれ０．００６Åおよび１．２°であった。このようにして得られたＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの３次元構造座標を表５に示す。
【１１０９】
実施例６
ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶の調製
本発明に用いたＰａａＩタンパク質は高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８からクローニングし、ｐＥＴ−１１ａプラスミドベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ）を用いた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）による発現系を用いて大量発現した。菌体をソニケーション後、７０℃で１０分間熱処理を行った粗精製溶液を、一連のクロマトグラフィー、ＳｕｐｅｒＱ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  （Ｔｏｓｏｈ）、ＲＥＳＯＵＲＣＥ（登録商標）  Ｑ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ＴｙｐｅＩ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）、ＨｉＬＯＡＤ（登録商標）  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）  ７５ｐｇを用いて精製し、目的タンパク質を得た。精製後のＰａａＩタンパク質溶液をＶＩＶＡＳＰＩＮ  ５０００  ｃｕｔ  （ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて２０〜３０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、４℃で保存した。溶媒として５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）  ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０を用いた。２．２５リットルの培養液から約２５ｍｇのＰａａＩタンパク質が得られた。
【１１１０】
得られたタンパク質試料を、以下に示す透析法を用いて結晶化した。まず、タンパク質試料液１０μｌを結晶化用微量透析装置（当業者において透析ボタンと呼ばれているもの。ハンプトン社の市販品）に入れ、排除分子量１万の透析膜を被せてゴムのＯリングで固定し、２ｍｌの透析外液（２．５ｍＭのヘキサノイルＣｏＡおよび１３．８（ｖ／ｖ）％イソプロピルアルコールを含む５０ｍＭの酢酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ５．１）に浸して透析した。透析ボタンおよび透析外液の容器として、ハンプトン社から市販されているＶＤＸプレートを用いた。このＶＤＸプレートを２２℃に保たれたインキュベーター中で保管した。およそ３日程度後に、透析ボタン中に２００μｍ×２００μｍ×２０μｍ程度の大きさの板状の結晶が得られた。結晶化期間中、外液を定期的にサンプリングし、そのＣｏＡ−ＳＨ濃度を実施例９に記載した方法で測定することでヘキサノイルＣｏＡの分解を確認した。その結果、結晶化期間中のヘキサノイルＣｏＡの分解は認められなかった。
【１１１１】
実施例７
ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶構造解析
実施例６で得られた結晶を、クライオループを用いてＨＬＡプレートのウェル中の２μｌのクライオ溶液（実施例６に記載の透析外液に３０（ｗ／ｗ）％のグリセロールを添加したもの）に移し、３０秒程度後に、結晶を１００Ｋの窒素気流下で瞬間冷却し、同窒素気流下で振動法を用いてヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩのＸ線回折データを収録した。
【１１１２】
得られた回折像から、ＨＫＬ社製のプログラムＨＫＬ２０００を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。この段階で、実施例６の方法で調製したヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶は、三斜晶系の空間群Ｐ１に属し、ａ＝８２．５Å、ｂ＝８７．１Å、ｃ＝５９．４Å、α＝９２．５°、β＝９０．０°、γ＝９０．０°で定義される単位格子を持つことが示された。
【１１１３】
結晶化条件および格子定数から判断して、ヘキサノイルＣｏＡ結合型の結晶はＣｏＡ−ＳＨ結合型のそれとほぼ同型であると考えられた。従って、ヘキサノイルＣｏＡ結合型の構造解析は、ＣｏＡ−ＳＨ結合型の３次元構造座標（表５）を基に、プログラムＣＮＳの剛体精密化の方法により行った。その結果、実施例６の方法で調製したヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶は非対称単位中に４個のＰａａＩ四量体を含むことが示された。
【１１１４】
得られたヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの初期３次元構造座標をプログラムＱＵＡＮＴＡを用いて修正し、続いてプログラムＣＮＳを用いて構造座標の精密化を行った。このモデル修正と精密化の操作を繰り返して行い、結晶の非対称単位中に１６分子存在する１３６アミノ酸残基から成るＰａａＩポリペプチドのうち、ポリペプチド鎖Ｌ・ＰにおいてＭ１〜Ｌ１１７のアミノ酸残基、ポリペプチド鎖Ａ・Ｂ・Ｄ・Ｅ・Ｆ・ＨにおいてＲ２〜Ｌ１１７のアミノ酸残基、ポリペプチド鎖Ｃ・Ｇ・Ｉ・Ｊ・Ｋ・Ｍ・Ｎ・ＯにおいてＤ３〜Ｌ１１７のアミノ酸残基を同定した。また、ポリペプチド以外の原子として、４個の塩素イオン、８個のヘキサノイルＣｏＡ分子、２個の酢酸分子、３６０個の水分子を同定した。
【１１１５】
精密化の最終段階で、当業者において構造座標の正確さの指標とされているＲ値は、３０Åから２．２Åのブラッグ反射角を持つ回折像から得られる構造因子を用いた場合、１９．２％であった。更に、精密化の計算から除外した全体の５％の構造因子から計算されるＲ値（当業者においてフリーＲ値と呼ばれる因子）は２２．６％であった。更に、各原子間の結合距離および結合角の理想状態からの２乗平均平方根誤差は、それぞれ０．００６Åおよび１．３°であった。このようにして得られたヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの３次元構造座標を表９に
示す。
【１１１６】
実施例８
ＰａａＩの部位特異的突然変異体の作製および精製
本発明に基づく１４種類の部位特異的突然変異体Ｎ３３Ｄ・Ｎ３３Ａ・Ｈ３５Ｑ・Ｈ３５Ａ・Ｈ３９Ｑ・Ｄ４８Ｎ・Ｄ４８Ａ・Ｒ６７Ｈ・Ｒ６７Ａ・Ｒ６７Ｅ・Ｒ６７Ｋ・Ｐ７３Ａ・Ｒ７２Ｅ−Ｋ１０５Ｑ・Ｒ７２Ｅ−Ｋ１０５Ｅを、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用いて作製した。以下に用いたプライマーを示す  （下線部分が変異部位）。
【１１１７】
2004254621.tif 000927
【１１１８】
変異導入はＤＮＡシークエンスにより確認した。作製した突然変異体は野生型ＰａａＩと同条件で発現させた後、７０℃で１０分間または６５℃で１５分間熱処理を行った。精製は、ＳｕｐｅｒＱ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  （Ｔｏｓｏｈ）、ＲＥＳＯＵＲＣＥ（登録商標）  Ｑ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＲＥＳＯＵＲＣＥ（登録商標）  １５ＰＨＥ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＨｉＬＯＡＤ（登録商標）  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）  ７５ｐｇ  の４本のカラムクロマトグラフィーにより行った。４．５リットルの培養液から約４０ｍｇの  ＰａａＩ変異体タンパク質が得られた。
【１１１９】
実施例９
ＰａａＩの活性測定
ＰａａＩの活性測定は以下の条件で行った。アシルＣｏＡ（シグマ社製）水溶液が１０μｌ、０．２ＭのＴＡＰＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）  ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）−ＮａＯＨ  緩衝液ｐＨ９．０が２０μｌ、１．６ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンが１．２５  μｌ、および蒸留水が６７．３５μｌから成る基質溶液に酵素液１０μｌを加え、８０℃で４〜５分間反応させた。反応後冷却し、生成したＣｏＡ−ＳＨのＳＨ基の定量をＤＴＮＢ（５，５’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ））法にて行った。即ち、反応液１００μｌにＤＴＮＢ試薬３μｌを加え、これを波長４１２ｎｍで比色定量した。ＳＨ基の増加量は、モル吸光係数（ε＝１３６００Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて算出した。基質に対するＫｍ値およびｋｃａｔ値は、測定した初速度のＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｒｕｋプロットにより求めた。
【１１２０】
１）野生型酵素の酵素学的性質
作用：
アシルＣｏＡ類を加水分解して、ＣｏＡ−ＳＨを生成する。
基質特異性：
フェニルアセチルＣｏＡに対する活性を主活性として有する他に、ブチリルＣｏＡ、ヘキサノイルＣｏＡ、デカノイルＣｏＡに対する活性を有している（下表）。なお、フェニルアセチルＣｏＡに対するｋｃａｔ値は、約１１．７ｓ−１である。従って、ＰａａＩはフェニルアセチルＣｏＡに特異的なチオエステラーゼである可能性が高い。
ＰａａＩの基質特異性
【表５７０】
2004254621.tif 000928
【１１２１】
２）ＰａａＩ変異体の酵素学的性質
単離精製したＰａａＩ変異体を用いて、フェニルアセチルＣｏＡを基質とした加水分解実験を行った。
ＰａａＩ変異体の活性
【表５７１】
2004254621.tif 000929
【１１２２】
Ａｓｐ４８：
Ａｓｐ４８をそれぞれＡｌａとＡｓｎに置換した変異体Ｄ４８ＡおよびＤ４８Ｎを速度論的に検討した結果、フェニルアセチルＣｏＡに対するＫｍ値はほとんど変化しなかったが、ｋｃａｔ値は著しく低下した。従ってＡｓｐ４８が本酵素の活性残基であると推定される。
【１１２３】
Ａｓｎ３３：
Ａｓｎ３３をそれぞれＡｓｐとＡｌａに置換した変異体Ｎ３３ＤおよびＮ３３Ａを速度論的に検討した結果、いずれの変異酵素もフェニルアセチルＣｏＡに対するＫｍ値は２倍以上上昇した。ｋｃａｔ値は、Ｎ３３Ａでは減少し、Ｎ３３Ｄでは著しく減少した。従って、Ａｓｎ３３は本酵素の活性残基ではないが、活性に重要な役割を持つと考えられる。Ｎ３３Ｄの結晶構造を解析した結果、Ｎ３３Ｄでは、置換したＡｓｐ残基とＨｉｓ３５の間で新たに水素結合が生じて活性部位周辺の立体構造が大きく変化していた。その結果、活性がさらに低下しているものと考えられる。
【１１２４】
Ｈｉｓ３５：
Ｈｉｓ３５をそれぞれＧｌｕとＡｌａに置換した変異体Ｈ３５ＱおよびＨ３５Ａを速度論的に検討した結果、Ｋｍ値とｋｃａｔ値は野生型酵素と比較して大きな変化はなかった。従ってＨｉｓ３５は活性にそれほど重要な役割を持たないと考えられる。
【１１２５】
Ａｒｇ６７：
Ａｒｇ６７をそれぞれＨｉｓとＡｌａに置換した変異体Ｒ６７ＨおよびＲ６７Ａを速度論的に検討した結果、いずれの変異酵素もＫｍ値が上昇した。ｋｃａｔ値はＲ６７Ｈでは低下し、Ｒ６７Ａでは著しく低下した。Ａｒｇ６７は本酵素の四量体形成に関与する残基であることから、四量体構造が活性に重要であると考えられる。
【１１２６】
【発明の効果】
リガンド非結合型ＰａａＩ、ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩおよびヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの３次元構造座標を同時に明らかにしたことにより、三者の詳細な３次元構造の比較が可能になった。そこで得られた情報を元に、ＰａａＩの塩素結合能力を利用したイオンキレート剤の開発あるいはＰａａＩのチオエステラーゼ活性の改変を利用した生分解性プラスチックの生合成・分解の改良を実施することができる。
【１１２７】
【配列表】
2004254621.tif 000930
2004254621.tif 000931
2004254621.tif 000932
2004254621.tif 000933
2004254621.tif 000934
2004254621.tif 000935
2004254621.tif 000936
2004254621.tif 000937
2004254621.tif 000938
【図面の簡単な説明】
【図１】リガンド非結合型ＰａａＩの空間群Ｐ４３２２に属する結晶から得られた３次元構造座標に基づいたＰａａＩ四量体の構造を、リボン図で示す。
【図２】リガンド非結合型ＰａａＩの空間群Ｐ４３２２に属する結晶から得られた３次元構造座標に基づいた塩素イオン結合部位周辺の構造を、平行視の立体図で示す。
【図３】ＣｏＡ−ＳＨ結合型ＰａａＩの結晶から得られた３次元構造座標に基づいたＰａａＩ四量体の構造を、リボン図で示す。
【図４】ヘキサノイルＣｏＡ結合型ＰａａＩの結晶から得られた３次元構造座標に基づいたＰａａＩ四量体の構造を、リボン図で示す。
【図５】リガンド非結合型・ＣｏＡ−ＳＨ結合型・ヘキサノイルＣｏＡ結合型のそれぞれの活性部位の状態を模式的に示す。
【図６】配列番号１のアミノ酸配列を示す。
【図７】配列番号２の塩基配列を示す。
【図１】
2004254621.tif 000939
【図２】
2004254621.tif 000940
【図３】
2004254621.tif 000941
【図４】
2004254621.tif 000942
【図５】
2004254621.tif 000943
【図６】
2004254621.tif 000944
【図７】
2004254621.tif 000945