(57)【要約】【課題】ＬＣ−ＭＳにおいて、ペプチドや塩基性薬物などを分析する際に、感度と分離性能の両立を実現できるようにする。【解決手段】移動相にジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、３，３，３−トリフルオロプロピオン酸（ＴｒｉＦＰＡ）及び３，３，３−トリフルオロメチル−２−トリフルオロメチルプロピオン酸（ＴＦＴＦＰＡ）のうちのいずれかの部分フッ素化カルボン酸をイオンペアー試薬として添加する。ＤＦＡ、ＴｒｉＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡは、ＬＣにおいて、トリフルオロ酢酸と同様に揮発性のペアードイオンとして機能し、塩基性化合物（アテノロール、スルピリド、ナドロール、テトラヒドロゾリン）、ペプチド（アンギオテンシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）に対して、酢酸、ギ酸に比べ、高い理論段数（Ｎ）と良好な保持比（ｋ）を与え、これらの酸を用いた場合の化合物のＥＳＩ−ＭＳシグナル強度はトリフルオロ酢酸よりも高く、ギ酸、酢酸と同等であった。【選択図】　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリーにおいて、
移動相にジフルオロ酢酸、３，３，３−トリフルオロプロピオン酸及び３，３，３−トリフルオロメチル−２−トリフルオロメチルプロピオン酸のうちのいずれかを添加することを特徴とするＬＣ−ＭＳ分析方法。
【請求項２】
液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリーで使用される移動相において、
ジフルオロ酢酸、３，３，３−トリフルオロプロピオン酸及び３，３，３−トリフルオロメチル−２−トリフルオロメチルプロピオン酸のうちのいずれかを添加したことを特徴とするＬＣ−ＭＳ用移動相。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）を用いた分離分析分野に関し、例えばペプチドやタンパク質を分析するプロテオーム解析や細胞内代謝物を分析するメタボローム解析など、ＬＣ−ＭＳを使って分析する方法と、その分析方法で使用される移動相に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ＬＣ−ＭＳでペプチドなどを分析する場合、試料成分の高分離と高感度検出が要求されるため、ＬＣでの高分離効率とＭＳでの高イオン化効率を両立させる移動相添加剤として、主にギ酸とトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が用いられてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ギ酸を用いた場合は、ＭＳの感度向上という点では効果があるものの、試料成分の分離が悪い場合が多く、分離性能の点で課題がある。
一方、ＴＦＡは、試料成分の分離という点では効果があるものの、検出感度がギ酸に比べて低くなってしまうので、高感度化という点で課題がある。
【０００４】
そこで、感度と分離性能の両立を実現できるような移動相添加剤が望まれている。
本発明は、ＬＣ−ＭＳにおいて、ペプチドや塩基性薬物などを分析する場合、適当な添加剤を移動相に添加することにより、感度と分離性能の両立を実現できるようにすることを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の分析方法は、ＬＣ−ＭＳにおいて、移動相にジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、３，３，３−トリフルオロプロピオン酸（ＴｒｉＦＰＡ）及び３，３，３−トリフルオロメチル−２−トリフルオロメチルプロピオン酸（ＴＦＴＦＰＡ）のうちのいずれかを添加することを特徴とする。
また、本発明の移動相は、ＬＣ−ＭＳで使用される移動相であり、上記の試薬を添加した移動相である。
【０００６】
本発明では、移動相に上記の部分フッ素化カルボン酸をイオンペアー試薬として添加したことにより、ＬＣでの高い分離効率を維持した状態で、ＭＳでの高イオン化効率を保持した高感度検出が可能になり、例えばペプチドやタンパク質などの高感度精密分離が可能となる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ＬＣ−ＭＳとして液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）システムを用いて、ＬＣでの高分離効率と、ＭＳでの高イオン化効率を両立させる移動相添加剤として、ジフルオロ酢酸（ＤＦＡ）、３，３，３−トリフルオロプロピオン酸（ＴｒｉＦＰＡ）及び３，３，３−トリフルオロメチル−２−トリフルオロメチルプロピオン酸（ＴＦＴＦＰＡ）を見出し、その有用性を確認した。
【０００８】
【実施例】
（液体クロマトグラフィー）
ａ）塩基性薬物（アテノロール、スルピリド、ナドロール、テトラヒドロゾリン）分析
高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）としてＬＣ−１０Ａｖｐシステム（株式会社島津製作所製）を使用した。
【０００９】
カラムとしてＬ−カラムＯＤＳ（登録商標：ＣＥＲＩ社）（内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ）を使用し、移動相として水−アセトニトリル混液を用い、移動相には１０ｍｍｏｌ／Ｌの酸（酢酸、ギ酸、ＤＦＡ、ＴＦＡ、２，２，３，３−テトラフルオロプロピオン酸（ＴｅｔｒａＦＰＡ）、ＴｒｉＦＰＡ、ＴＦＴＦＰＡ）をそれぞれ添加した。移動相の流速は２００μＬ／ｍｉｎとした。溶出はアセトニトリル濃度のリニアグラジエントを採用した（１０−９０％アセトニトリル／２５ｍｉｎ）。
【００１０】
試料として塩基性薬物混合試料（濃度１００μｇ／ｍＬ）２μＬをＨＰＬＣに注入し（注入量；２００ｎｇ）、検出波長ＵＶ２３１ｎｍで得たＬＣ−ＵＶクロマトグラムから各薬物のピークについて、ＵＳＰ（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）法により、理論段数（Ｎ）及び保持比（ｋ）を求めた。
【００１１】
ｂ）ペプチド（アンギオテンシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）分析
高速液体クロマトグラフとしてＬＣ−１０Ａｖｐシステムを使用した。
カラムとしてＣａｄｅｎｚａ　ＣＤ−Ｃ１８　ＯＤＳ　（内径２．０ｍｍＳＹＭＢＯＬ　１８０　￥ｆ　”Ｓｙｍｂｏｌ”　￥ｓ　１２長さ７５ｍｍ）を使用し、移動相、流速は前述の条件を適用し、アセトニトリル濃度のグラジエント条件は１０−６０％アセトニトリル／１０ｍｉｎとした。
【００１２】
試料としてペプチド混合試料（濃度；１００マイクロｇ／ｍＬ）２μＬをＨＰＬＣに注入し（注入量；２００ｎｇ）、検出波長ＵＶ２３１ｎｍでＬＣ−ＵＶクロマトグラムを得た。
【００１３】
（インフュ−ジョン−マススペクトロメトリー）
質量分析計としてＡＰＩ−ＩＩＩ（アプライドバイオシステムズ社製）を使用した。１０ｍｍｏｌ／Ｌの酸（酢酸、ギ酸、ＤＦＡ、ＴＦＡ、ＴｅｔｒａＦＰＡ、ＴｒｉＦＰＡ、ＴＦＴＦＰＡ）を含む薬物溶液及びアンギオテンシンＩＩ溶液（濃度；５００ｎｇ／ｍＬ、３０％メタノール）をシリンジポンプで５μＬ／ｍｉｎでＭＳに導入した。オリフィス電圧を６０ｋＶ、イオンスプレー電圧を５ｋＶとし、ポジティブモードで測定した。スキャンはスキャンスピード５ｍｓｅｃ／ｓｃａｎ、スキャン範囲２００−６００ａｍｕで２０回積算により、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを記録した。
【００１４】
（液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー）
試料として塩基性薬物混合試料を用い、液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）分析を行った。ＨＰＬＣカラムはＣａｄｅｎｚａ　ＣＤ−Ｃ１８（登録商標：インタクト社）（内径２．０ｍｍＳＹＭＢＯＬ　１８０　￥ｆ　”Ｓｙｍｂｏｌ”　￥ｓ　１２長さ７５ｍｍ）を用いた。
【００１５】
液体クロマトグラフィーは、前述のように、移動相として水−アセトニトリル混液を用い、移動相には１０ｍｍｏｌ／Ｌの酸を添加し、移動相の流速は２００μＬ／ｍｉｎとした。溶出はアセトニトリル濃度のリニアグラジエントを採用した（１０−９０％アセトニトリル／１０ｍｉｎ）。
【００１６】
マススペクトロメトリーは、前述のように、ＡＰＩ−ＩＩＩ（アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、オリフィス電圧を６０ｋＶ、イオンスプレー電圧を５ｋＶとし、ポジティブモードで測定した。スキャンはスキャンスピード５ｍｓｅｃ／ｓｃａｎ、スキャン範囲２００−６００ａｍｕで２０回積算により、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを記録した。
試料（濃度；３００ｎｇ／ｍＬ）２μＬをＨＰＬＣに注入し（注入量；６００ｐｇ）、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムを得た。
【００１７】
（結果）
各種の移動相添加剤を用いたＬＣクロマトグラムより得られた薬物ピークのｋ値及びＮ値をそれぞれ図１及び図２に示す。
ＤＦＡ、ＴｅｔｒａＦＰＡ、ＴｒｉＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡは、酢酸、ギ酸に比べ、ＴＦＡと同様にｋ及びＮに大きな値を示した。このことより、ＤＦＡ、ＴｅｔｒａＦＰＡ、ＴｒｉＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡはＴＦＡと同様に塩基性化合物に対し、ペアードイオンとして機能していることが示唆された。
【００１８】
一方、インフュ−ジョンＥＳＩ−ＭＳで得られたＥＳＩ−ＭＳシグナル強度比（ＴＦＡを１．００）を図３に示す。
ＤＦＡ、ＴｒｉＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡは、酢酸、ギ酸と同様にＴＦＡに比べ、各薬物、ペプチドに対し、高いＥＳＩ−ＭＳシグナル強度を与えた。
【００１９】
ＴｒｉＦＰＡを用いた分析例として、塩基性薬物混合試料のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムを図４に示す。図４の各図の左上の数値は質量数、右上の数値はピーク強度を表す。化合物とも良好なピーク形状とシグナル／ノイズ比を示している。
【００２０】
さらに、図５に示されるように、酢酸、ＴｒｉＦＰＡ、ＴＦＡをそれぞれ移動相に添加したときのアンギオテンシン混合試料のＬＣ−ＵＶクロマトグラムにおいて、良好な分離が確認された。
【００２１】
図６に１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉＦＰＡを移動相に添加したときのアンギオテンシン混合試料（試料濃度；３００ｎｇ／ｍＬ）２μＬをＨＰＬＣに注入し（注入量；６００ｐｇ）、得たＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムを示す。図７にそのとき分離された各アンギオテンシンのマススペクトルを示す。このように、各アンギオテンシンの良好な分離が確認された。
【００２２】
以上のように、ＤＦＡ、ＴｒｉＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡは、ＬＣにおいて、トリフルオロ酢酸と同様に揮発性のペアードイオンとして機能し、塩基性化合物（アテノロール、スルピリド、ナドロール、テトラヒドロゾリン）、ペプチド（アンギオテンシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）に対して、酢酸、ギ酸に比べ、高い理論段数（Ｎ）と良好な保持比（ｋ）を与えた。更に、これらの酸を用いた場合の化合物のＥＳＩ−ＭＳシグナル強度はトリフルオロ酢酸よりも高く、ギ酸、酢酸と同等であった。
このことから、塩基性化合物やペプチドのＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる分析にとって、ＤＦＡ、ＴｒｉＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡは高感度と高分離効率を両立させる有用なイオンペアー試薬であることが明らかとなった。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、部分フッ素化化合物であるＤＦＡ、ＴｒｉＦＰＡ及びＴＦＴＦＰＡをＬＣ−ＭＳの移動相に用いることで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と同様に揮発性のペアードイオンとして機能し、塩基性化合物（アテノロール、スルピリド、ナドロール、テトラヒドロゾリン）、ペプチド（アンギオテンシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）に対して、酢酸、ギ酸に比べ、高い理論段数（Ｎ）と良好な保持比（ｋ）を与えることができる。更に、これらの酸を用いた場合の化合物のＥＳＩ−ＭＳシグナル強度はＴＦＡよりも高く、ギ酸、酢酸と同等であった。
今後、ペプチドの高感度ＬＣ−ＭＳ分析において広く利用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種の移動相添加剤を用いたＬＣクロマトグラムより得られた薬物ピークのｋ値を示す図である。
【図２】各種の移動相添加剤を用いたＬＣクロマトグラムより得られた薬物ピークのＮ値を示す図である。
【図３】各種の移動相添加剤を用いたインフュ−ジョンＥＳＩ−ＭＳで得られたＥＳＩ−ＭＳシグナル強度比（ＴＦＡを１．００）を示す図である。
【図４】添加剤としてＴｒｉＦＰＡを用いたときの塩基性薬物混合試料のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムを示す図である。
【図５】酢酸、ＴｒｉＦＰＡ、ＴＦＡをそれぞれ移動相に添加したときのアンギオテンシン混合試料のＬＣ−ＵＶクロマトグラムを示す図である。
【図６】ＴｒｉＦＰＡを移動相に添加したときのアンギオテンシン混合試料のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムを示す図である。
【図７】そのときの各アンギオテンシンのマススペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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