(57)【要約】【課題】試料中の特定成分の測定結果の信頼性が高い免疫学的測定方法を提供する。【解決手段】本発明の免疫学的測定方法は、試料中の被測定物質の含有量を測定する免疫反応測定方法であって、図１に示すように、試料と、被測定物質に対して特異的に結合可能な第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含む抗体溶液とを混合することによって混合溶液を調製する工程Ｓｔ１と、上記混合溶液の光学特性を測定する工程Ｓｔ２とを含む。【選択図】　図１
2004045384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の被測定物質の含有量を測定する免疫反応測定方法であって、
上記試料と、上記被測定物質に対して特異的に結合可能な第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含む抗体溶液とを混合することによって混合溶液を調製する工程（ａ）と、
上記混合溶液の光学特性を測定する工程（ｂ）とを含み、
上記第１モノクローナル抗体は、上記被測定物質の第１エピトープに結合可能であり、
上記第２モノクローナル抗体は、上記被測定物質の上記第１エピトープとは異なる第２エピトープに結合可能であり、
上記第１エピトープおよび上記第２エピトープは、それぞれ上記被測定物質に１つずつ存在する、免疫学的測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫反応測定方法において、
上記光学特性は、散乱光強度または透過光量である、免疫反応測定方法。
【請求項３】
請求項１に記載の免疫学的測定方法において、
上記工程（ａ）において、上記第１モノクローナル抗体および上記第２モノクローナル抗体のインヒビションの半値は、１×１０−９Ｍ〜１×１０−７Ｍの範囲内にあるものの中から選択される、免疫学的測定方法。
【請求項４】
請求項１に記載の免疫学的測定方法において、
上記抗体溶液中における上記第１モノクローナル抗体と上記第２モノクローナル抗体との分子数比を変更する、免疫学的測定方法。
【請求項５】
請求項１に記載の免疫学的測定方法において、
上記被測定物質は、アルブミンである免疫学的測定方法。
【請求項６】
請求項５に記載の免疫学的測定方法において、
上記工程（ａ）において、上記抗体溶液は、第３モノクローナル抗体をさらに含み、
上記第１モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号から産生されるモノクローナル抗体であり、
上記第２モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号から産生されるモノクローナル抗体であり、
上記第３モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０７号から産生されるモノクローナル抗体である、免疫比濁測定方法。
【請求項７】
請求項５に記載の免疫学的測定方法において、
上記工程（ａ）において、上記抗体溶液は、第３モノクローナル抗体をさらに含み、
上記第１モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号より産生されるモノクローナル抗体であり、
上記第２モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０８号より産生されるモノクローナル抗体であり、
上記第２モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０９号から産生されるモノクローナル抗体である、免疫比濁測定方法。
【請求項８】
試料中の被測定物質の含有量を測定するための免疫反応測定装置であって、
上記試料と、上記被測定物質に対して特異的に結合可能な第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含む抗体溶液とを混合することによって混合溶液を調製する調製手段と、
上記混合溶液の光学特性を測定する光学的測定手段とを備え、
上記第１モノクローナル抗体は、上記被測定物質の第１エピトープに結合可能であり、
上記第２モノクローナル抗体は、上記被測定物質の上記第１エピトープとは異なる第２エピトープに結合可能であり、
上記第１エピトープおよび上記第２エピトープは、それぞれ上記被測定物質に１つずつ存在する、免疫学的測定装置。
【請求項９】
排泄物中の被測定物質の含有量を測定するための生体成分測定トイレであって、
排泄物または洗浄水と排泄物との混合物を、試料として採取する排泄物採取手段と、
上記試料と、上記被測定物質に対して特異的に結合可能な第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含む抗体溶液とを混合することによって混合溶液を調製する調製手段と、
上記混合溶液の光学特性を測定する光学的測定手段とを備え、
上記第１モノクローナル抗体は、上記被測定物質の第１エピトープに結合可能であり、
上記第２モノクローナル抗体は、上記被測定物質の上記第１エピトープとは異なる第２エピトープに結合可能であり、
上記第１エピトープおよび上記第２エピトープは、それぞれ上記被測定物質に１つずつ存在する、生体成分測定トイレ。
【請求項１０】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号である細胞株により産生される抗アルブミンモノクローナル抗体。
【請求項１１】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号である細胞株により産生される抗アルブミンモノクローナル抗体。
【請求項１２】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０７号である細胞株により産生される抗アルブミンモノクローナル抗体。
【請求項１３】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０８号である細胞株により産生される抗アルブミンモノクローナル抗体。
【請求項１４】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０９号である細胞株により産生される抗アルブミンモノクローナル抗体。
【請求項１５】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号である細胞株。
【請求項１６】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号である細胞株。
【請求項１７】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０７号である細胞株。
【請求項１８】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０８号である細胞株。
【請求項１９】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０９号である細胞株。
【請求項２０】
試料中のアルブミンを検出するためのアルブミン検出キットであって、
第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含み、
上記第１モノクローナル抗体は、抗アルブミンモノクローナル抗体であり、
上記第２モノクローナル抗体は、抗アルブミンモノクローナル抗体で、且つ、標識物質により標識されており、
上記第１モノクローナル抗体および上記第２モノクローナル抗体の少なくともいずれか一方は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号である細胞株、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号である細胞株、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０７号である細胞株、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０８号である細胞株、および独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０９号である細胞株からなる群から選択される、細胞株から産生される抗アルブミンモノクローナル抗体である、アルブミン検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の特定成分の測定を行なう免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、試料中の特定成分（被測定物質）を、試料液の希釈や撹拌などを行なうことなく簡易に測定する方法として、抗体を用いた様々な免疫学的測定方法が提案されている。
【０００３】
免疫学的測定方法の１つに免疫比濁法が知られている。免疫比濁法に用いられる測定用キット（マイクロアルブミン−ＨＡテストワコー、和光純薬製）が市販されている。この測定用キットの構成は、緩衝液（５０ｍＭグッド緩衝液ｐＨ７．４）と抗体溶液とから構成されている。抗体溶液には、ウサギ由来抗ヒトアルブミンポリクローナル抗体（１．５ｍｇＡｂ／ｍｌ）とマウス由来抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（４．０ｍｇＡｂ／ｍｌ）とが含まれている。測定の際には、緩衝液中で試料と抗体溶液とを作用させる。このとき、試料中にアルブミンが含まれる場合、アルブミンが抗ヒトアルブミン抗体と特異的に抗原抗体反応を起こして濁りを生じる。濁りの度合い（濁度）は試料中のアルブミン濃度に比例するので、濁度を測定することにより試料中のアルブミン量を求めることができる。
【０００４】
上述の測定用キットで、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを同時に用いるのは、前者の「濁度が高くなる」という特徴と、後者の「プロゾーン現象を起こしにくい」という特徴を組み合わせるためであると言われている。つまり、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを組み合わせて同時に用いることによって、免疫比濁法の弱点である抗原過剰領域のプロゾーン現象を回避しながら、広い測定範囲を実現している（非特許文献１を参照）。
【０００５】
上記のような免疫比濁法は、測定対象物質ごとに結合する抗体を選択することによって、様々な物質を測定することが原理的には可能である。例えば、抗体として、抗ヒトアルブミン抗体を選択すると、試料液中のアルブミン濃度を測定するセンサを作製することができる。
【０００６】
アルブミンは、血液から血球などの有形成分を除いた残りである血漿中のタンパク質の約５０％を占めるタンパク質である。アルブミンは、血液の浸透圧の維持、イオン、脂肪酸、一部のビタミン、色素および薬物の運搬、および末梢組織へのアミノ酸供給等の作用があることが知られている。しかし、糖尿病の合併症のひとつである糖尿病性腎症などによって腎機能に障害がおこると、アルブミンが尿中に漏出することが知られている。
【０００７】
従って、尿中のアルブミン量を測定すれば、病態スクリーニング、治療効果の確認、予後の判定などが可能となる。このため、尿中のアルブミン量の測定が、糖尿病性腎症の早期発見のため、ならびに糖尿病の予後を診断するための重要な日常検査として近年広く普及している。尿中のアルブミン量の測定は、アルブミンに特異的に結合する抗体を用いる免疫学的手法によって実施することができる。
【０００８】
従来、アルブミンに対する抗体として、ポリクローナル抗体である抗ヒトアルブミン血清が用いられてきた。従来のアルブミンの測定法のほとんどは、抗血清とアルブミンとの凝集反応による沈降線の有無または濁度の増加によってアルブミンを測定するものである。しかし、未精製の抗血清は、血清中の種々の抗原に対する種々の抗体を含むことが多いため、アルブミン以外の抗原に結合する可能性がある。そこで、測定において、アルブミン以外の抗原に誤って結合することを防ぐために、抗血清の精製を行ない、ヒト標準血清においてアルブミン以外の抗原に由来する反応が起こらないようにする。抗血清の精製は、未精製の抗血清中からヒト標準血清中のタンパク質に結合する抗体を取り除くために、通常、アフィニティークロマトグラフィーなどの手法を用いる。
【０００９】
【非特許文献１】初田和由ほか、第２８回日本臨床化学会要旨集、６３、１２５ページ、（１９８８）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述のような構成の免疫比濁法では、ポリクローナル抗体（つまり、抗血清）が使われている。通常、ポリクローナル抗体は免疫した動物の血液より採取した血清を精製したものである。そのため、作製方法は簡便であるが免疫した動物の系統、環境、体調などに抗体の特性が影響を受ける可能性が大きい。例えば、抗ヒトアルブミン血清を用いる場合、作製される抗ヒトアルブミン血清毎に含まれる抗ヒトアルブミン抗体の種類が異なる（例えば、エピトープが異なる）可能性があり、抗ヒトアルブミン血清毎にアルブミンとの反応性が変動するおそれがある。
【００１１】
新たにポリクローナル抗体を作製するたびに得られる抗体の反応性が変動すれば、継続して同質の抗体を得ることが困難になる。従って、免疫比濁法により被検物質の測定を試みても、再現性のある結果が得られないおそれがある。
【００１２】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、試料中の特定成分の測定結果の信頼性が高い免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の免疫反応測定方法は、試料中の被測定物質の含有量を測定する免疫反応測定方法であって、上記試料と、上記被測定物質に対して特異的に結合可能な第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含む抗体溶液とを混合することによって混合溶液を調製する工程（ａ）と、上記混合溶液の光学特性を測定する工程（ｂ）とを含み、上記第１モノクローナル抗体は、上記被測定物質の第１エピトープに結合可能であり、上記第２モノクローナル抗体は、上記被測定物質の上記第１エピトープとは異なる第２エピトープに結合可能であり、上記第１エピトープおよび上記第２エピトープは、それぞれ上記被測定物質に１つずつ存在する。
【００１４】
モノクローナル抗体を産生する細胞株は、ほぼ永久に同一の抗体を作り続ける。このため、常に特性の均質な抗体が得られ、抗体溶液のロット間の差による特性のバラツキが抑制される。従って、本発明によれば、被測定物質の測定結果の再現性が高く、得られる測定値の信頼性も向上する。
【００１５】
上記光学特性は、散乱光強度または透過光量である構成としてもよい。
【００１６】
上記工程（ａ）において、上記第１モノクローナル抗体および上記第２モノクローナル抗体のインヒビションの半値は、１×１０−９Ｍ〜１×１０−７Ｍの範囲内にあるものの中から選択される構成としてもよい。
【００１７】
上記抗体溶液中における上記第１モノクローナル抗体と上記第２モノクローナル抗体との分子数比を変更する構成としてもよい。
【００１８】
このことによって、測定可能な被測定物質の濃度範囲、検出感度を必要に応じて変更することができる。従って、測定可能な被測定物質の濃度範囲、検出感度を自在に設計することが可能となる。
【００１９】
上記被測定物質は、アルブミンである構成としてもよい。
【００２０】
上記工程（ａ）において、上記抗体溶液は、第３モノクローナル抗体をさらに含み、上記第１モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号から産生されるモノクローナル抗体であり、上記第２モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号から産生されるモノクローナル抗体であり、上記第３モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０７号から産生されるモノクローナル抗体である構成としてもよい。
【００２１】
上記工程（ａ）において、上記抗体溶液は、第３モノクローナル抗体をさらに含み、上記第１モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号より産生されるモノクローナル抗体であり、上記第２モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０８号より産生されるモノクローナル抗体であり、上記第３モノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０９号から産生されるモノクローナル抗体である構成としてもよい。
【００２２】
本発明の免疫反応測定装置は、試料中の被測定物質の含有量を測定するための免疫反応測定装置であって、上記試料と、上記被測定物質に対して特異的に結合可能な第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含む抗体溶液とを混合することによって混合溶液を調製する調製手段と、上記混合溶液の光学特性を測定する光学的測定手段とを備え、上記第１モノクローナル抗体は、上記被測定物質の第１エピトープに結合可能であり、上記第２モノクローナル抗体は、上記被測定物質の上記第１エピトープとは異なる第２エピトープに結合可能であり、上記第１エピトープおよび上記第２エピトープは、それぞれ上記被測定物質に１つずつ存在する。
【００２３】
本発明の生体成分測定トイレは、排泄物中の被測定物質の含有量を測定するための生体成分測定トイレであって、排泄物または洗浄水と排泄物との混合物を、試料として採取する排泄物採取手段と、上記試料と、上記被測定物質に対して特異的に結合可能な第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含む抗体溶液とを混合することによって混合溶液を調製する調製手段と、上記混合溶液の光学特性を測定する光学的測定手段とを備え、上記第１モノクローナル抗体は、上記被測定物質の第１エピトープに結合可能であり、上記第２モノクローナル抗体は、上記被測定物質の上記第１エピトープとは異なる第２エピトープに結合可能であり、上記第１エピトープおよび上記第２エピトープは、それぞれ上記被測定物質に１つずつ存在する。
【００２４】
本発明の抗アルブミンモノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号である細胞株により産生される。
【００２５】
本発明の別の抗アルブミンモノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号である細胞株により産生される。
【００２６】
本発明の別の抗アルブミンモノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０７号である細胞株により産生される。
【００２７】
本発明の別の抗アルブミンモノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０８号である細胞株により産生される。
【００２８】
本発明の別の抗アルブミンモノクローナル抗体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０９号である細胞株により産生される。
【００２９】
本発明の細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号である。
【００３０】
本発明の別の細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号である。
【００３１】
本発明の別の細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０７号である。
【００３２】
本発明の別の細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０８号である。
【００３３】
本発明の別の細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０９号である。
【００３４】
本発明の試料中のアルブミンを検出するためのアルブミン検出キットは、第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含み、上記第１モノクローナル抗体は、抗アルブミンモノクローナル抗体であり、上記第２モノクローナル抗体は、抗アルブミンモノクローナル抗体で、且つ、標識物質により標識されており、上記第１モノクローナル抗体および上記第２モノクローナル抗体の少なくともいずれか一方は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号である細胞株、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号である細胞株、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０７号である細胞株、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０８号である細胞株、および独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０９号である細胞株からなる群から選択される、細胞株から産生される抗アルブミンモノクローナル抗体である。
【００３５】
モノクローナル抗体を産生する細胞株は、ほぼ永久に同一の抗体を作り続ける。このため、常に特性の均質なモノクローナル抗体が得られる。従って、本発明のアルブミン検出キットによれば、キットのロット間での特性のバラツキが抑制され、被測定物質の検出結果の再現性、信頼性が向上する。
【００３６】
【発明の実施の形態】
以下、図を参照しながら本発明の実施の形態を説明する。図１は、本実施形態の免疫学的測定方法を表すフローチャートである。なお、本明細書中では、「免疫学的測定方法」との用語は、免疫比濁法および免疫比ろう法を含む測定方法の総称である。
【００３７】
本実施形態の免疫学的測定方法は、試料中の被測定物質の含有量を測定する免疫反応測定方法であって、図１に示すように、試料と、被測定物質に対して特異的に結合可能な第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含む抗体溶液とを混合することによって混合溶液を調製する工程Ｓｔ１と、上記混合溶液の光学特性を測定する工程Ｓｔ２とを含む。
【００３８】
次に、各工程を詳細に説明する。
【００３９】
まず、工程Ｓｔ１では、試料と抗体溶液を用意する。
【００４０】
試料としては、特に限定されないが、種々の疾病の診断のためには、尿、血液、排泄物、唾液などが挙げられる。
【００４１】
抗体溶液は、被測定物質に対して特異的に結合可能な第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含む。第１モノクローナル抗体は、被測定物質の第１エピトープに結合可能であり、第２モノクローナル抗体は、被測定物質の第１エピトープとは異なる第２エピトープに結合可能である。また、第１エピトープおよび第２エピトープは、それぞれ被測定物質に１つずつ存在し、複数箇所に存在するものではない。
【００４２】
このことによって、被測定物質が試料中に含まれているときには、被測定物質と第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体との抗原抗体反応による凝集複合体が生じる。被測定物質が試料中に含まれていないときには、被測定物質と第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体との抗原抗体反応による凝集複合体が生じない。
【００４３】
次に、工程Ｓｔ２では、混合溶液の光学特性を測定する。このとき、上記工程Ｓｔ１で凝集複合体が生じる場合には、上記反応系に濁りが生じ、散乱光強度および透過光量などに変化が生じる。従って、散乱光強度または透過光量などを測定することによって、混合溶液の濁りの程度を見積もることができる。ここで上記反応系から特異結合物質が除かれているものを基準にしながら、上記反応系の光学的変化量、つまり散乱光強度または透過光量の変化量を測定することが好ましい。また、反応系から試料が除かれているものを基準としてもよい。なお、混合溶液の光学特性は、散乱光強度または透過光量である。混合溶液の散乱光強度を測定すれば免疫比濁法、透過光量を測定すれば免疫比ろう法となる。
【００４４】
一般に、ポリクローナル抗体は、ヤギやウサギなどの大型動物に免疫して、抗体価、アフィニティーが飽和したのを確認後、数ヶ月間、数回に分けてその血清を採取しこれを精製することによって得られる。従って、飽和アフィニティー以上のポリクローナル抗体ではもちろんのこと、飽和アフィニティー以下のポリクローナル抗体でもまた、品質を維持するのは難しい。このため、ポリクローナル抗体を用いる従来の方法では、抗体溶液の品質にバラツキが生じ、測定結果の再現性および測定値の信頼性も低くなる。
【００４５】
一方、モノクローナル抗体を産生する細胞株は、ほぼ永久に同一の抗体を作り続ける。このため、常に特性の均質な抗体が得られ、抗体溶液のロット間の差による特性のバラツキが抑制される。従って、本実施形態では、被測定物質の測定結果の再現性が高く、得られる測定値の信頼性も向上する。
【００４６】
また、第１エピトープおよび第２エピトープは、それぞれ被測定物質に１つずつ存在し、複数箇所に存在しないので、１種類のモノクローナル抗体では免疫学的測定方法に不可欠な抗原抗体反応による凝集複合体がほとんど形成されない。本実施形態では、被測定物質におけるエピトープが互いに異なる２種類のモノクローナル抗体を混合して抗体溶液を用いている。勿論、被測定物質におけるエピトープが互いに異なる３種類以上のモノクローナル抗体を混合して抗体溶液を用いてもよい。なお、抗体溶液の製造の観点から、抗体溶液に含まれるモノクローナル抗体の種類を、２０種類以下に抑えることがコスト的に好ましい。
【００４７】
また、本実施形態の免疫学的測定方法において用いられるモノクローナル抗体のインヒビションの半値は、１×１０−１１Ｍ〜１×１０−５Ｍの範囲内にあるものの中から選択されることが好ましい。
【００４８】
なお、「インヒビションの半値」とは、インヒビションＥＬＩＳＡ法において、固相に固定された被測定物質に結合するモノクローナル抗体の量が、競合物質（インヒビター：ここでは被測定物質と同じもの）の添加によって、インヒビターの不存在下と比較して減少するときに、インヒビターの不存在下での吸光度（抗体結合量を反映する）の半分の吸光度が測定されるインヒビターの濃度をいう。
【００４９】
さらに、被測定物質におけるエピトープおよびアフィニティーがそれぞれ互いに異なる３種類以上のモノクローナル抗体を含む抗体溶液を用いると、各モノクローナル抗体のエピトープおよびアフィニティーが複雑に絡み合って抗原−抗体複合物を形成する。このため、各モノクローナル抗体の分子数比によって凝集複合体の大きさ、濃度に差が生じる。従って、測定可能な被測定物質の濃度範囲、検出感度を必要に応じて変化させることができる。このことにより、測定可能な被測定物質の濃度範囲、検出感度を自在に設計することが可能となる。
【００５０】
具体的には、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体である、抗体独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号（以下、７９３８株と称する）である細胞株が産生するモノクローナル抗体、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０８号（以下、８３０８株と称する）である細胞株が産生するモノクローナル抗体、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０９号（以下、８３０９株と称する）である細胞株が生産するモノクローナル抗体を混合した抗体溶液を用いてヒトアルブミンを測定すると、その分子数比によりヒト血清アルブミン濃度が低濃度であるときの感度を変化させることができる。
【００５１】
なお、ＥＬＩＳＡプレートに１×１０−７Ｍにコートしたヒト血清アルブミンに対する上記各抗体の結合を阻害するアルブミン濃度の半値（インヒビションの半値）は、７９３８株由来のモノクローナル抗体（以下、７９３８抗体と称する）は３．０×１０−９Ｍ、８３０８株由来のモノクローナル抗体（以下、８３０８抗体と称する）は３．２×１０−１０Ｍ、８０３９株由来のモノクローナル抗体（以下、８３０９抗体と称する）は１．０×１０−９Ｍである。
【００５２】
また、アフィニティーが互いに異なる３種類以上のモノクローナル抗体を混合する場合、アフィニティーに互いに大きな差がある３種類以上のモノクローナル抗体を用いることがプロゾーン現象を制御しやすい。
【００５３】
具体的には、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体である、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号（以下、７９３８株と称する）である細胞株が産生するモノクローナル抗体、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号（以下、７９３７株と称する）である細胞株が産生するモノクローナル抗体、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０７号（以下、８３０７株と称する）である細胞株が生産するモノクローナル抗体を混合した抗体溶液を用いてヒト血清アルブミンを測定すると、その分子数比によって、プロゾーン現象が生じるヒト血清アルブミン濃度を、１０ｍｇ／ｄｌ〜５０ｍｇ／ｄｌの範囲内で変化させることができる。
【００５４】
なお、ＥＬＩＳＡプレートに１×１０−７Ｍにコートしたヒト血清アルブミンに対する上記各抗体の結合を阻害するアルブミン濃度の半値（インヒビションの半値）は、７９３８株由来のモノクローナル抗体（以下、７９３８抗体と称する）は３．０×１０−９Ｍ、７９３７株由来のモノクローナル抗体（以下、７９３７抗体と称する）は５．５×１０−７Ｍ、８３０７株由来のモノクローナル抗体（以下、８３０７抗体と称する）は７．０×１０−８Ｍである。
【００５５】
なお、本発明における「抗アルブミンモノクローナル抗体」には、その結合特性を保持した断片も含まれる。これらの断片は、それらが由来するインタクトな抗体とアルブミンへの特異的結合について競合し得、少なくとも１×１０７〜１×１０１０Ｍ−１の親和性で結合し得る。抗体の断片は、免疫グロブリンの重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖを含み得る。抗体の断片は、インタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的分離によって生じ得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、ＣＯＬＤ　ＳＰＲＩＮＧ　ＨＡＲＢＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されたような標準的な方法を用い、ｐＨ３．０〜３．５においてペプシンでタンパク質消化することによってＩｇＧ分子から得ることができる。Ｆａｂ断片は、限定的還元によってＦ（ａｂ’）２断片から、あるいは還元剤の存在下パパイン消化によって全抗体から得ることができる（Ｐａｕｌ、Ｗ．編、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ第２版　Ｒａｖａｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９、第７章を参照のこと）。
【００５６】
図２は、本実施形態の免疫学的測定方法に用いる測定装置を示す上面概略図である。
【００５７】
本実施形態の測定装置２０は、試料と、被測定物質に対して特異的に結合可能な第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含む抗体溶液とを混合することによって混合溶液を調製する調製手段２０ａと、上記混合溶液の光学特性を測定する光学的測定手段２０ｂとを備える。第１モノクローナル抗体は、被測定物質の第１エピトープに結合可能であり、第２モノクローナル抗体は、被測定物質の第１エピトープとは異なる第２エピトープに結合可能であり、第１エピトープおよび第２エピトープは、それぞれ被測定物質に１つずつ存在する。
【００５８】
本実施形態では、調製手段２０ａは、図２に示すように、固定ベース２とサンプルベース３とからなるサンプルセル１と、サンプルベース３にチュービングコネクタ６を介して接続された抗体溶液注入用チューブ４と、サンプルセル１内に配置された攪拌子５とから構成されている。
【００５９】
固定ベース２にはマイクロスターラー７が組み込まれており、サンプルセル１内に配置された攪拌子５が回転するようになっている。固定ベース２の上面にサンプルセル１を固定することによって液体を保持できるサンプルセル１（光路長１０ｍｍ）が形成される。サンプルセル１内には抗体溶液注入用チューブ４から、チュービングコネクタ６を介して抗体溶液を注入できる構成となっている。
【００６０】
光学的測定手段２０ｂは、半導体レーザーモジュール８と、半導体レーザーモジュール８からサンプルセル１に向けて照射されるレーザービーム（波長：６８０ｎｍ、出力１５ｍＷ、ビーム径約１．２ｍｍ）の４５度前方散乱光（Ｓｃ４５）と９０度側方散乱光（Ｓｃ９０）とを検出できるように配置されたフォトダイオードアレイ９および１０とを備える。
【００６１】
本実施形態では、それぞれの散乱光の検出感度を向上させるため、レーザービームを周波数２７０Ｈｚでパルス変調して、散乱光を検出する各フォトダイオード９および１０の出力信号を、各ロックインアンプ１１および１２で位相敏感検波する構成としている。これらのロックインアンプの出力信号を、各散乱光強度に相当する信号として測定することができる。
【００６２】
（実施形態２）
近年の健康志向により、健康状態を家庭でリアルタイムにチェックができるニーズは大きな高まりを見せている。このニーズに対応するために、尿、血液などの体液中の健康指標物質をワンステップで、しかもニーズに対応した測定範囲、感度で測定できることが求められている。
【００６３】
そこで、本実施形態では、健康状態を家庭でリアルタイムにチェックができる生体成分測定トイレを、図３を参照しながら説明する。
【００６４】
本実施形態の生体成分測定トイレ３０は、図３に示すように、排泄物（尿および便など）中の被測定物質の含有量を測定するための生体成分測定トイレであって、排泄物または洗浄水と排泄物との混合物を、試料として採取する排泄物採取手段３０ａと、上記実施形態２で説明した測定装置２０とを備える。
【００６５】
本実施形態では、排泄物採取手段３０ａは、洗浄水を出す洗浄ノズル３１と、洗浄ノズル３１から出た洗浄水で洗浄した中に含まれる使用者３３から排泄された排泄物（便または尿）３５を収納する排泄物収納手段３４と、排泄物３５を収納した排泄物収納手段３４から測定装置２０のサンプルセルに排泄物３５を搬送するための搬送手段３６とから構成されている。
【００６６】
また、本実施形態では、測定装置２０からの出力を、排泄物中における被測定物質の濃度に演算する演算装置３７が設けられている。
【００６７】
演算手段３７で得られた生体成分の濃度等を表示するリモコンおよび通信手段を備える表示手段４０、便座４２、便器４３、タンク４４である。なお、図３では便座４２に使用者３３が座って排尿を行なう場合を示している。
【００６８】
動作例として、本実施形態の生体成分測定トイレを使用して、尿中に含まれるアルブミンの測定を行なうための動作を説明する。
【００６９】
使用者３３からの排泄物３５は、落下途中に設けてある排泄物収納手段３４で収納され、搬送手段３６により測定装置２０のサンプルセル１に搬送され、あらかじめ抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体混合溶液（抗体の混合分子数比、７９３７抗体：７９３８抗体：８３０７抗体＝４：３：３）をセットしておいた測定装置２０でアルブミンを測定する。得られた測定値は、演算手段３７に予め記憶されている検量線に基づいて濃度に換算され、表示手段４０に表示される。
【００７０】
なお、表示手段４０に届いたアルブミン濃度は、必要に応じて、通信手段により健康管理センターなど使用者３３の健康情報を管理する医療施設等に送られ、アドバイスなどを作成し、使用者３３に健康アドバイスを送ることもできる。また、使用者３３と医療施設等との契約により、作成されたアドバイスに基づいて、健康状態に適した食事、消耗品、サービスなどを医療施設等の管理下で使用者３に届けることもできる。
【００７１】
（実施形態３）
本実施形態では、上記実施形態１で使用したモノクローナル抗体を用いたアルブミン検出キットを説明する。
【００７２】
本実施形態のアルブミン検出キットは、試料中のアルブミンを検出するためのアルブミン検出キットであって、第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体を含み、第１モノクローナル抗体は、抗アルブミンモノクローナル抗体であり、第２モノクローナル抗体は、抗アルブミンモノクローナル抗体で、且つ、当該分野で公知の方法によって標識物質により標識されている。標識物質の例としては、酵素、色素、磁性体、放射性物質および着色粒子（金コロイド、ラテックスなど）などが挙げられる。
【００７３】
また、第１モノクローナル抗体および第２モノクローナル抗体の少なくともいずれか一方は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号である細胞株、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号である細胞株、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０７号である細胞株、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０８号である細胞株、および独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０９号である細胞株からなる群から選択される、細胞株から産生される抗アルブミンモノクローナル抗体である。
【００７４】
上述の細胞株のうちのいくつかは、アルブミンに対して高い結合能を有するモノクローナル抗体を産生する。代表的な抗アルブミンモノクローナル抗体としては、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号の細胞株により産生されるモノクローナル抗体（７９３８抗体）が挙げられる。このようなモノクローナル抗体のアルブミンに対する結合能は、後述する実施例に記載されたインヒビションＥＬＩＳＡ法と実質的に同一の条件での測定においてインヒビションがかかり、インヒビションの半値が約１×１０−８Ｍ以下であり得る。本実施形態のアルブミン検出キットで、上述のようなインヒビションの半値を有するモノクローナル抗体を使用する場合、溶液中のアルブミンを高感度で検出できる。さらに、従来では検出できなかった濃度のアルブミンを測定することができるため、臨床分野において新たな知見を得る有効な手段となり得る。なおここで「溶液」とは、尿、血液のような体液を含み得るが、これらに限定されない。
【００７５】
一般には、溶液中の濃度が最高で約０．０５〜５．０ｍｇ／Ｌの範囲のアルブミンを測定できることが知られている。しかしながら、例えば、本実施形態のアルブミン検出キットで７９３８抗体を用いた場合、溶液中の濃度が約０．００６６〜０．６６ｍｇ／Ｌのアルブミンを検出可能な感度が得られる。
【００７６】
また、上記実施形態で説明した細胞株のうちのいくつかは、本実施形態のアルブミン検出キットに用いる場合に、溶液中の濃度が約３０〜３００ｍｇ／Ｌの範囲を超える濃度範囲のアルブミンの定量を可能にするモノクローナル抗体を産生する。代表的な抗アルブミンモノクローナル抗体としては、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号の細胞株により産生されるモノクローナル抗体（７９３７抗体）が挙げられる。このようなモノクローナル抗体のアルブミンに対する結合能は、後述する実施例に記載されたインヒビションＥＬＩＳＡ法と実質的に同一の条件での測定においてインヒビションがかかり、インヒビションの半値が約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−５Ｍである。特に、モノクローナル抗体のインヒビションの半値が１×１０−６Ｍ前後が好ましい。より好ましくは、インヒビションの半値は約１×１０−６．３Ｍである。本実施形態のアルブミン検出キットで、上述のようなインヒビションの半値を有するモノクローナル抗体を使用する場合、溶液中の濃度が約３０〜３００ｍｇ／Ｌの範囲を超える濃度範囲のアルブミンの測定が可能である。
【００７７】
一般には、溶液中のアルブミン濃度の測定可能な範囲は、３０〜３００ｍｇ／Ｌであることが知られている。しかしながら、例えば、本実施形態のアルブミン検出キットで７９３７抗体を用いた場合、溶液中の濃度が約６．６〜６６０ｍｇ／Ｌのアルブミンを定量することが可能である。従って、糖尿病性腎症の検査のために尿中のアルブミン濃度を測定する際に、早期腎症と顕性腎症の境界領域である濃度も十分に測定することができる。このため、臨床分野において新たな知見を得る手段となり得る。また、上述のようなインヒビションの半値を有するモノクローナル抗体を使用する場合、１種類のモノクローナル抗体でアルブミンの濃度の測定範囲を広くカバーするので、アルブミン測定にかかる費用を廉価にできる。
【００７８】
本実施形態のアルブミン検出キットは、当該分野で公知である免疫学的手法が採用される。免疫学的手法としては、具体的には、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法などが挙げられる。
【００７９】
アルブミンを高感度で検出するためには、高感度の抗体を用いたＥＬＩＳＡ法等が利用される。特にＥＬＩＳＡ法では、高アフィニティー抗アルブミン抗体が必要である。しかしながら、免疫した動物の体調や動物の周囲の環境によって、抗アルブミン抗血清の品質を一定に維持することが困難である。
【００８０】
一方、モノクローナル抗体を産生する細胞株は、ほぼ永久に同一の抗体を作り続ける。このため、常に特性の均質なモノクローナル抗体が得られ、キットのロット間での特性のバラツキが抑制される。従って、本実施形態では、被測定物質の検出結果の再現性、信頼性が向上する。
【００８１】
【実施例】
以下に、具体的な実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。なお、本発明は本実施例に限定されるものではない。なお、本実施例で記載される用語「ＡＬＢ」は、アルブミンを指す。
【００８２】
（実施例１）
上記実施形態１で説明した図２の測定装置２０を用いて、サンプルセル１内に抗原として９μｌのｈＳＡ（ヒト血清アルブミン）溶液を撹拌しながら注入した後、５０ｍＭコハク酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０、含５％ＰＥＧ６０００）を１４５μｌ注入する。３０秒以上経過後、測定を開始し、１０秒後に４０μｌの抗体溶液を注入し、２０秒後にスターラーを止め、開始から３００秒までセル内溶液の濁度を測定した。抗体溶液の抗体濃度は０．１ｍｇ／ｍｌを保ちながら、７９３７株：８３０７株：７９３８株が、９０：５：５、８０：１０：１０、７０：１５：１５、６０：２０：２０、４０：３０：３０、２０：４０：４０および１０：４５：４５の割合でそれぞれ混合した。抗原は最終濃度で０、５、１０、３０、５０、１００、３００および５００（ｍｇ／ｄｌ）になるように調製し、各分子数比の抗体について７種類の抗原濃度で測定を行なった。結果を図４に示す。
【００８３】
７９３７株の濃度が９０％のとき、プロゾーンは１０ｍｇ／ｄｌから始まり、４０％では５０ｍｇ／ｄｌまでアルブミン濃度が上がるにつれて、比濁も上昇した。また、２０％のときは３０ｍｇ／ｄｌまで比濁が上昇し、低濃度の感度が非常に高いことがわかった。この結果から、アフィニティーに差がある複数のモノクローナル抗体の混合される分子数比を変化させることにより、測定範囲および感度を制御することができることがわかる。
【００８４】
（実施例２）
混合抗体の濃度を０．３ｍｇ／ｍｌを保ちながら、８３０８抗体：８３０９抗体：７９３８抗体の分子数比を１：１：１、１：１：２または１：１：８の３種類について、抗原の最終濃度は０〜３０ｍｇ／ｄｌになるように調製した。他は上記実施例１の条件と同様に、各分子数比の混合抗体溶液を用いて、免疫比濁測定を行なった。結果を図５に示す。図５に示すように、７９３７抗体の分子数比を増加させることによって、アルブミン３０ｍｇ／ｄｌまでの感度を上昇することができることがわかる。
【００８５】
（実施例３）
＜酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）＞
以下の実施例においては、得られた抗血清、培養上清およびモノクローナル抗体の評価は、ＥＬＩＳＡ法により行なった。その操作法を以下に記載する。
【００８６】
（Ａ）抗原（ＡＬＢ）のコーティング
ＡＬＢ溶液を、ＰＢＳ−Ａｚ（０．０４重量％ナトリウムアジドＰＢＳ溶液）を用いて１×１０−７Ｍの濃度に調製した。マイクロプレート（ポリスチレン製高結合型平底＃２５８０、コスター社製）にＡＬＢ溶液を１００μｌ／ウェル注入し、室温で飽和水蒸気中に一晩保存した。実験直前に、アスピレータでＡＬＢ溶液を除去した。
【００８７】
（Ｂ）ブロッキング
１重量％ＣＡＳＥＩＮ−ＰＢＳ−Ａｚ溶液を２００μｌ／ウェル注入し、３０分間室温で放置した。その後、アスピレータで１重量％ＣＡＳＥＩＮ−ＰＢＳ−Ａｚ溶液を除去した。以降の実験を即日に行わないときは、この状態で、飽和水蒸気中に室温で保存した。
【００８８】
（Ｃ）抗体の反応
１重量％ＣＡＳＥＩＮ−ＰＢＳ−Ａｚ溶液で種々の濃度に希釈した抗体溶液（抗血清、培養上清、精製抗体等）を５０μｌ／ウェル、および１重量％ＣＡＳＥＩＮ−ＰＢＳ−Ａｚ溶液を５０μｌ／ウェルで注入した。相対的なアフィニテー（親和性）を測定する目的でインヒビション（阻害）実験を行なう際には、インヒビター溶液（ＡＬＢを含む溶液）を５０μｌ／ウェル注入した後、抗体溶液５０μｌ／ウェルをさらに加え、振盪した。常温で１時間半放置した後、ＰＢＳで３回洗浄し、アスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【００８９】
（Ｄ）標識抗体の反応
０．２μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識したヤギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＣＡＳＥＩＮのＰＢＳ溶液に溶解したもの、または０．２μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識したヤギ由来の抗マウスＩｇＭ抗体（ＫＰＬ社製）を１重量％ＣＡＳＥＩＮのＰＢＳ溶液に溶解したものを１００μｌ／ウェル注入し、常温で３０分放置した。ＰＢＳで３回洗浄し、さらにアスピレータで残存するＰＢＳを除去した。
【００９０】
（Ｅ）基質の反応と停止
Ｏ−フェニレンジアミン（生化学用）４０ｍｇを１０ｍｌのクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）に溶解し、使用直前に３０重量％過酸化水素水４μＬを加えた溶液（基質溶液）を１００μｌ／ウェル注入し、室温放置した。約２分後、４Ｎ硫酸を２５μｌ／ウェル注入して反応を停止した。
【００９１】
（Ｆ）測定
マイクロプレートリーダ（東洋ソーダ社製）を用いて波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。得られた結果は、インヒビター濃度と固相抗原への結合率（％）との相関を示した。なお、固相抗原への結合率（％）は、吸光度の相対値（％）として求められる。
【００９２】
また、本実施例では免疫測定法として酵素免疫測定法を用いたが、他にＲＩＡ法、蛍光抗体法等を用いてもよい。
【００９３】
（実施例４）
本実施例においては、本発明者らの研究所で実績があることを考慮に入れ、Ａ／Ｊ系統マウスを免疫に使用した。
【００９４】
（免疫）
免疫原であるアルブミン（ＡＬＢ）（Ｓｉｇｍａ　ＩＮＣ．製）を、生理食塩濃度リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて２ｍｇ／ｍｌに調製した。このＡＬＢのＰＢＳ溶液に、同体積のアジュバント（ヒト結核死菌含有完全フロイントアジュバント、和光純薬製、Ｈ３７Ｒｖ）を添加し、ホモジナイザで回転数１０００ｒｐｍで充分に乳化することにより、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを得た。
【００９５】
生後約７週間の雌のマウス（Ａ／Ｊ）５匹に、免疫原を合むアジュバントエマルジョンを１００μｌずつ腹腔内、あるいは皮下に注射した。３週間後、ＰＢＳを用いて２ｍｇ／ｍｌに調製したＡＬＢ溶液およびこれと同体積の不完全フロイントアジュバントをホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをＡ／Ｊマウスに前回と同じ部位に１００μｌずつ注射した。
【００９６】
その後、免疫開始より４週間後、６週間後、１２週間後に、２週間後の免疫と同じ組成、濃度のＡＬＢを含む不完全フロイントアジュバントエマルジョンを、マウスに１００μｌずつ前回と同じ部位に注射した。２、３、４回目の注射の１週間後にそれぞれ採血し、以下に示す抗体産生を確認した。
【００９７】
（抗体産生の確認）
採取した血液から血清を分離し、得られた血清を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により抗体産生の確認をした。１×１０−７ＭのＡＬＢを、１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で一晩コートしたマイクロプレートを使用した。第２の抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体、またはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体を使用した。ウェル中での発色により、抗体サンプル中にＡＬＢに結合する抗体が存在することが確認される。
【００９８】
その結果、５匹すべてのマウスにおいて抗ＡＬＢ抗体の産生が認められた。さらに、いずれのマウスにおいても、２回目の注射後に抗体産生がＩｇＧからＩｇＭへシフトしていることが確認され、３回目の注射後にはＩｇＧ／ＩｇＭ比が１００以上でありクラススイッチが充分起こっていることを確認した。
【００９９】
（細胞融合）
免疫したマウスの中で特に力価の高かった３匹の脾臓を肥大させるために、最終免疫を行なった。免疫開始から１０週間後、免疫原のＡＬＢを、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、アジュバントを加えずにマウスに１００μｌずつ注射した。
【０１００】
最終免疫後３日を経過したマウスのうち１匹の脾臓細胞を摘出した。平均分子量１，５００のポリエチレングリコールを用いて、常法により、脾臓細胞とマウス骨髄腫由来細胞株（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とを融合させ、融合細胞を得た。
【０１０１】
融合細胞を、１５重量％のウシ胎児血清（以下、ＦＣＳ）を含むイシコフ培地で調製したヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地に浮遊させた後、９６ウェルプレート１枚にまいた（２００μｌ／ウェル）。この際、フィーダー細胞（培養開始時に成長因子を供給する細胞）は同じマウス個体の脾臓細胞を用いた。ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度：５体積％、温度：３７℃、湿度：９５％）内で培養を開始した。以下の培養では、他に示さない限り、これと同じ条件で培養を行なった。
【０１０２】
（細胞選別およびクローニング）
１０日後、融合細胞の培養上清を１００μｌ採取した後、融合細胞を含む残りの培養液を４枚の２４ウェルプレートに継代し、各ウェルに１ｍｌの１５重量％のＦＣＳを含むヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を加えた。
【０１０３】
融合細胞を２４ウェルプレートに継代した４日後、細胞培養上清を１５０μｌ／ウェルずつ採取した。この培養上清と、培養開始後１週間目に採取した培養上清を用いて以下に示すＥＬＩＳＡ法により、ＡＬＢに対する結合能を測定した。
【０１０４】
固相としてＰＢＳ−Ａｚで１×１０−７Ｍの濃度に調製したＡＬＢを、１００μｌ／ウェルずつ使用した。抗体液として、細胞培養上清を使用した。第２の抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。
【０１０５】
２回採取した培養上清のＥＬＩＳＡ法結果を合わせて、ＡＬＢに対して高い結合能を有する、増殖状態の良い３０ウェルを確認した。第１段階の選択として、これらのウェルの細胞を、すべて５枚の６ウェルプレートに継代し、各ウェルに４ｍｌの１５重量％のＦＣＳを合むＨＴ培地を加えた。
【０１０６】
第１段階の細胞選別の２日後、培養上清を採取し、以下に示すＥＬＩＳＡ法（インヒビションＥＬＩＳＡ法）によりＡＬＢに対する結合能を測定した。
【０１０７】
固相としてＰＢＳ−Ａｚで１×１０−７Ｍの濃度に調製したＡＬＢを、１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＡＬＢを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。標識抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、ＡＬＢに結合する抗体が存在すると、インヒビターとして添加された可溶性ＡＬＢと結合してインヒビションがかかる（固相ＡＬＢへの結合が阻害される）ので、ウェル中の発色は確認されない。
【０１０８】
この結果、第２段階の選択として、ＡＬＢに対して高い結合能を有し、インヒビションＥＬＩＳＡ法においてインヒビションがかかったウェルを、５ウェル選別した。これらのウェルの細胞を、それぞれ、中フラスコ（容量５０ｍｌ）に継代した。培地は１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を４５ｍｌずつ加えた。
【０１０９】
第２段階の選択を受けた細胞の継代３日後、培養上清を採取し、以下に示すＥＬＩＳＡ法によりＡＬＢに対する結合能を測定した。
【０１１０】
固相として、ＰＢＳ−Ａｚで１×１０−７Ｍの濃度に調製したＡＬＢを、１００μｌ／ウェルずつ使用し、インヒビターとしてＡＬＢを使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。第２の抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を使用した。細胞培養上清中に、インヒビターに結合する抗体が存在するとインヒビションがかかるので、ウェル上の発色は確認されない。ＡＬＢでのみインヒビションがかかった１３ウェル選別した。
【０１１１】
上記１３ウェルの細胞について、４回に分けてクローニングを行った。１５重量％のＦＣＳを含むＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり１個の細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、９６ウェルのマイクロプレート各１３枚に分注した。フィーダーとして生後４週の雌のマウス（Ａ／Ｊ）の胸腺細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時細胞培養上清について上記のＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングを繰り返した。ＡＬＢに対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している細胞株を最終的に選別し、２００ｍｌの培地中で５×１０５細胞／ｍｌの濃度に至るまで培養を進めた。
【０１１２】
最終的に、ＡＬＢに対して高い結合能を有した株を１株選定した。この細胞株を１３−３Ｂと命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年３月７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３８号）。本明細書中では、１３−３Ｂ株（７９３８株）の産生する抗体を、７９３８抗体と称する。
【０１１３】
また、最終的に、ＡＬＢに対して１×１０−７Ｍ〜１×１０−５Ｍの間のＡＬＢ濃度で、固相アルブミンとの結合度の変化を生じる結合能を有する株を１株選定した。この細胞株を１１−４Ｂと命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年３月７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７９３７号）。本明細書中では、１１−４Ｂ株（７９３７株）の産生する抗体を、７９３７抗体と称する。
【０１１４】
またさらに、最終的に、ＡＬＢに対して１×１０−１０Ｍ〜１×１０−７Ｍの間のＡＬＢ濃度で、固相アルブミンとの結合度の変化を生じる結合能を有する（つまり、インヒビションの半値が、１×１０−１０Ｍ〜１×１０−７Ｍの範囲内）株を３株選定した。これらの細胞株をそれぞれ４２ＤＢ１、５６Ｅ’６１および５６ＦＴ４と命名した。
【０１１５】
４２ＤＢ１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年２月２７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０７号）。本明細書中では、４２ＤＢ１株（８３０７株）の産生する抗体を、８３０７抗体と称する。
【０１１６】
５６Ｅ’６１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年２月２７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０８号）。本明細書中では、５６Ｅ’６１株（８３０８株）の産生する抗体を、８３０８抗体と称する。
【０１１７】
５６ＦＴ４株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年２月２７日に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３０９号）。本明細書中では、５６ＦＴ４株（８３０９株）の産生する抗体を、８３０９抗体と称する。
【０１１８】
（細胞の保存）
最終的に選別された細胞株は、遠心分離して上清を取り除き、１×１０７細胞／ｍｌの濃度でＦＣＳ：ジメチルスルフォキシド＝９：１（体積比）の溶液１ｍｌに浮遊させ、−８０℃で予備凍結した後、液体窒素中に移して長期保存状態にした。
【０１１９】
（抗体の精製）
選択した各株を、１５重量％ＦＣＳを含むイシコフ培地で大量培養し、遠心分離して培養上清を得た。この培養上清を、プロテインＡ結合ゲル（プロテインＡセファロース４ＦＦ、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィにかけ、以下の条件で各モノクローナル抗体（７９３８抗体および７９３７抗体）を精製した。
【０１２０】
プロテインＡ結合ゲルを充填したカラムを、結合緩衝液（１．５Ｍ　グリシン・３Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）で平衡化した。培養上清あるいは腹水を、結合緩衝液で約３倍に希釈した後、平衡化したカラムにアプライした。カラムからの溶出液を２８０ｎｍでモニターしながら、不純物の溶出が終了するまで、カラムを結合緩衝液で洗浄した。洗浄後、溶出緩衝液（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ４）をカラムにアプライ（線流速：約２０ｃｍ／時間）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。回収したＩｇＧ含有溶出液について、吸光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体の濃度を決定した。
【０１２１】
（抗体の評価）
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製したモノクローナル抗体のうち７９３８抗体について、種々の濃度のＡＬＢ溶液を用いて、上記第２段階の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法の固相抗原濃度（１×１０−８Ｍ）と抗体濃度（１×１０−１０Ｍ）以外は同一条件で抗体評価を行なった。
【０１２２】
図６は、７９３８抗体について、ＡＬＢに対する結合能を測定した結果を示すグラフである。図６において、縦軸は吸光度の相対値（％）を、横軸はＡＬＢ抗原の濃度（ｍｏｌｅ／Ｌ（以下Ｍで表す））の対数値を示す。抗原の濃度と吸光度の相対値（％）との関連を実線に示した。
【０１２３】
図６に示すように、７９３８抗体では、インヒビションの半値が約１×１０−９．８Ｍであり、約１×１０−９〜１×１０−１１ＭのＡＬＢを検出できる可能性が示された。
【０１２４】
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製したモノクローナル抗体のうち７９３７抗体については、ＡＬＢの希釈系列を用いて、上記第２段階の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法の固相抗原濃度（１×１０−７Ｍ）と抗体濃度（１×１０−７Ｍ）以外は同一条件で抗体評価を行った。
【０１２５】
図７は、７９３７抗体について、ＡＬＢに対する結合能を測定した結果を示すグラフである。図７において、縦軸は吸光度の相対値（％）を、横軸はＡＬＢ抗原の濃度（Ｍ）の対数値を示す。抗原の濃度と吸光度の相対値（％）との関連を実線に示した。
【０１２６】
図７に示すように、７９３７抗体では、インヒビションの半値が約１×１０−６．３Ｍであり、約１×１０−７Ｍ（６．６ｍｇ／Ｌ）から約１×１０−５Ｍ（６６０ｍｇ／Ｌ）の範囲でＡＬＢを検出し得る可能性が示された。
【０１２７】
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製したモノクローナル抗体のうち８３０７抗体については、ＡＬＢの希釈系列を用いて、上記第２段階の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法の固相抗原濃度（１×１０−７Ｍ）と抗体濃度（１×１０−７Ｍ）以外は同一条件で抗体評価を行った。
【０１２８】
図８は、８３０７抗体について、ＡＬＢに対する結合能を測定した結果を示すグラフである。図８において、縦軸は吸光度の相対値（％）を、横軸はＡＬＢ抗原の濃度（Ｍ）の対数値を示す。抗原の濃度と吸光度の相対値（％）との関連を実線に示した。
【０１２９】
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製したモノクローナル抗体のうち８３０８抗体については、ＡＬＢの希釈系列を用いて、上記第２段階の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法の固相抗原濃度（１×１０−７Ｍ）と抗体濃度（１×１０−７Ｍ）以外は同一条件で抗体評価を行なった。
【０１３０】
図９は、８３０８抗体について、ＡＬＢに対する結合能を測定した結果を示すグラフである。図９において、縦軸は吸光度の相対値（％）を、横軸はＡＬＢ抗原の濃度（Ｍ）の対数値を示す。抗原の濃度と吸光度の相対値（％）との関連を実線に示した。
【０１３１】
上記のアフィニティークロマトグラフィにより精製したモノクローナル抗体のうち８３０９抗体については、ＡＬＢの希釈系列を用いて、上記第２段階の選択におけるインヒビションＥＬＩＳＡ法の固相抗原濃度（１×１０−７Ｍ）と抗体濃度（１×１０−７Ｍ）以外は同一条件で抗体評価を行なった。
【０１３２】
図１０は、８３０９抗体について、ＡＬＢに対する結合能を測定した結果を示すグラフである。図１０において、縦軸は吸光度の相対値（％）を、横軸はＡＬＢ抗原の濃度（Ｍ）の対数値を示す。抗原の濃度と吸光度の相対値（％）との関連を実線に示した。
【０１３３】
以上に述べた実施例では、ヒトアルブミンを被測定物質としているが、これに限定されない。例えば、ヒト以外のほ乳類のアルブミン、尿中ホルモンで女性の健康管理の指標となるｈＬＨ（ヒト黄体形成ホルモン）およびｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナトトロピン）などを被測定物質として測定することもできる。ｈＬＨまたはｈＣＧを測定する際に、高い濁度が得られるように、コハク酸バッファーを試料に添加することが好ましい。このことによって、ｈＬＨまたはｈＣＧを測定する際にプロゾーン現象を抑えることができる。特に、コハク酸バッファーを試料に添加することによって、試料をｐＨ５．０に調製すると、最も濁度が高くなる。また、ＭＯＰＳバッファーも、用いられるモノクローナル抗体によっては用いることができる。ＭＯＰＳバッファーを用いる場合、試料をｐＨ７．４に調製することが特に好ましい。
【０１３４】
【発明の効果】
本発明によれば、試料中の特定成分の測定結果の信頼性が高い免疫学的測定方法を提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の免疫学的測定方法を表すフローチャートである。
【図２】図２は、本発明の免疫学的測定方法に用いる測定装置を示す上面概略図である。
【図３】図３は、本発明の生体成分測定トイレを表す模式図である。
【図４】図４は、被測定物質（ヒトアルブミン）の濃度に対する濁度を３種類のモノクローナル抗体を混合して得た、抗体溶液の分子数比を変えたものについて比較したグラフである。
【図５】図５は、被測定物質（ヒトアルブミン）の濃度に対する濁度を３種類のモノクローナル抗体を混合して得た、抗体溶液の分子数比を変えたものについて比較したグラフである。
【図６】図６は、７９３８抗体を用いた、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、７９３７抗体を用いた、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、８３０７抗体を用いた、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、８３０８抗体を用いた、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、８３０９抗体を用いた、インヒビションＥＬＩＳＡ法の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
１　サンプルセル
２　固定ベース
３　サンプルベース
４　抗体溶液注入用チューブ
５　攪拌子
６　チュービングコネクタ
７　マイクロスターラー
８　半導体レーザーモジュール
９、１０　フォトダイオードアレイ
１１、１２　ロックインアンプ
２０　測定装置
２０ａ　調製手段
２０ｂ　光学的測定手段
３０　生体成分測定トイレ
３０ａ　排泄物採取手段
３１　洗浄ノズル
３３　使用者
３４　排泄物収納手段
３５　排泄物（便または尿）
３６　搬送手段
３７　演算装置
４０　表示手段
４２　便座
４３　便器
４４　タンク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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