(57)【要約】      （修正有）【課題】特定の可視光波長領域内で任意選択された条件によりスペクトル励起が行える顕微鏡用の、特に蛍光顕微鏡用の新型検査標本【解決手段】対象物用スライドガラスおよびその上にセットされた生物合胞体から成る顕微鏡用の合胞体が、特定波長領域内１００ｎｍ以上の幅から任意選択された条件で蛍光励起を起こすことのできる化合物により固定されている検査標本【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物用スライドガラスおよびその上にセットされた生物合胞体から成る顕微鏡用の、特に光学顕微鏡用の検査標本であって、合胞体が、特定波長領域内１００ｎｍ以上の幅から任意選択された条件で蛍光励起を起こすことのできる化合物により固定されている検査標本
【請求項２】
合胞体が、４５０〜６５０ｎｍの波長領域内で任意選択された条件により蛍光励起を起こすことのできる化合物によって固定されている、請求項１に記載の顕微鏡用検査標本
【請求項３】
合胞体が、３５０〜７００ｎｍの波長領域内で任意選択された条件により蛍光励起を起こすことのできる化合物によって固定されている、請求項１に記載の顕微鏡用検査標本。
【請求項４】
合胞体がグルタルジアルデヒドによって固定されている、請求項１から３のうちの１つに記載の顕微鏡用検査標本。
【請求項５】
化合物に退色防止剤が添加されている、請求項１から４のうちの１つに記載の顕微鏡用検査標本。
【請求項６】
合胞体が、好ましくは顕微鏡の視野全体に亘って密な構造を有している、請求項１から５のうちの１つに記載の顕微鏡用検査標本。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の対象は、蛍光特性を持ち、顕微鏡の機能および／または性能の検証に用いることのできる顕微鏡用検査標本である。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡検査では蛍光標本として、これまではある程度の固有蛍光を持ったあるいは特殊な色素処理の施された標本が使用されている。
【０００３】
１つには、製造時に色素分子の混和により色素の蛍光特性を本質的に受継いだ人工の標本（例えば、ナノメータ〜マイクロメータ・クラスの球状体プラスチック）が公知である。そのようないわゆる微小球体またはマイクロビーズは、例えば特許文献１〜４等から公知である。そのほか、自然光のもとで見ることのできる、あるいはしかるべき光学フィルタ付き顕微鏡により色素剤の蛍光放出を観察することで認めることのできる生物組織からの検査標本も公知である。
【０００４】
さらには、内部に持ち込んだ色素分子を化学結合によって特に官能基に固定させて、その同定を可能にするという方法で、分子の特殊官能基または組織に照準して蛍光マーキングした標本も使用されている。このような検査標本は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ／ＵＳＡからＦｌｕｏＣｅｌｌｓの名称で製造販売されている。
【０００５】
最後に付け加えるが、自然界にも組織体の部類として何らかの固有蛍光を有するものが存在する。その代表がすずらん（Ｃｏｎｖａｌｌａｒｉａ  ｍａｊａｌｉｓ）であり、その横断面は際立った３次元ハニカム状構造になっているので、その部分はレーザ走査型顕微鏡用検査標本の製造に用いられる。
【特許文献１】ＵＳ  ４，３３６，１７３
【特許文献２】ＵＳ  ４，２４７，４３４
【特許文献３】ＵＳ  ４，７１４，６８２
【特許文献４】ＵＳ  ４，８６８，１２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記種類の蛍光標本は次のような一連の欠点を持っている：
まず第一に、特殊色素剤使用下の製造はコスト高である。特に、特殊化学結合によるマーキングでは、マーキング対象の試料自体について高度な知識が要求される。すべての試料がこの方法で色素の別なくマーキングできるわけではない。例えば、細胞核はアクチン以外の色素が必要である。最終標本の調製には、場合によっては複数過程の化学合成が必要である。
【０００７】
しかも重大な欠点は、標本の蛍光励起および蛍光放出がそれに対応する使用色素分子の特性によって惹き起こされる点である。すなわち、試料が光によって励起されるのは、それぞれの色素につきごく狭いスペクトル領域においてだけであり、しかもそれに加えて、蛍光放出も限られたスペクトル領域でしか行われない。それらの領域は波長スケールにして、通例数１０ナノメータ程度の範囲である。固有蛍光が存在する場合でもこのスペクトル領域の幅は極めて制限されていて、それは基礎構成組織および合胞体に依存する。
したがって、試料の結像には特定の光学フィルタしか使用できない。そのため、各種フィルタ・セットのテストには、それに対応して様々な標本が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の課題は現状技術の困難を克服し、多面的に使用可能な検査標本を提供することにある。
この課題は本発明に従えば請求項１の特徴によって解決される。その他有利な実施態様は従属請求項に列挙されている。
【０００９】
驚いたことに、グルタルジアルデヒド（ペンタンジアルデヒド）によりスライドガラス上に固定された合胞体は、非常に幅広い蛍光スペクトルを有することが明らかになった。蛍光の励起および放出は、近紫外領域（約３５０ｎｍ）から可視領域（約７００ｎｍ）にわたるスペクトル領域全体を通じて起こすことができる。それゆえ、この標本の結像を確実にするに当って、フィルタ・セットを任意に組み合わせて使用することができる。
【００１０】
本発明に基づく標本は、たとえば共焦点顕微鏡法、広視野エピ蛍光法、構造化照明法などの光学的方法を較正するための蛍光顕微鏡法において有利に利用することができる。本発明の標本はそのうえ僅かな退色性向しかないことが明らかになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下では本発明を好ましい実施例に基づき説明する。標本自体は動物またはヒトの組織から成っている。細胞構造および組織構造はグルタルジアルデヒドで固定する。グルタルジアルデヒド濃度並びに固定時間は組織もしくは細胞タイプに依存する。典型的な値はＰＢＳ（燐酸塩で緩衝された食塩溶液）中、２ないし５％グルタルジアルデヒドで、作用時間は３０分である。固定によって組織内のたんぱく質はグルタルジアルデヒドとの化学反応により変性されて、その結果試料の構造関係が確定される。余剰のグルタルジアルデヒドは続いて何回かの洗浄ステップにより組織から除去される。
【００１２】
顕微鏡観察に適合した組織断面を準備するため、組織はさらに処理される。たとえば急速凍結させるか、パラフィン内へ逐次埋め込むことができる。組織ブロックが得られるが、適当な裁断装置（例、マイクロトーム）により裁断することができる。断面の厚さは決まっておらず―典型的な断面厚さは２ないし２０μｍである。例えば構造化された照明などいくつかの利用法においては特に、どちらかと言えば薄い断面、つまり厚さ＜１０μｍのものが適している。
【００１３】
断面はスライドガラス上に載せられるが、好ましくは標準サイズ（たとえば２６ｍｍ×７６ｍｍ）とする。スライドガラス上での断面の粘着力は、たとえばポリＤリシンによるスライドガラスのコーティングによって、高めることができる。
この方法で作製された試料は、本発明の結果に現われた広域スペクトル蛍光特性を示している。埋め込み媒質に、過度の蛍光退色を防止するためのいわゆる「退色防止」剤を添加することが提案されている。この反応薬剤は、通例、遊離酸素基の結合を通じて作用するので、その結果存在する分子の発色団基は破壊されることがない。当薬剤の一例としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社からＰｒｏＬｏｎｇという名称で製造販売されている製品がある。
【００１４】
好ましくは標準厚さ（０.１７ｍｍ）を持つカバーガラスにより、標本は周辺環境の影響から遮断され、永続保存が可能になる。そのうえ、カバーガラス補正付き標準対物レンズによる観察も可能となる。
【００１５】
いくつかの利用法（たとえば構造化照明法）においては、光学機器の全視野にわたる結像を可能にするために、同時にできる限り欠落部分のない像を確保するために、密な組織構造を使用するのが有利である。他の利用法（たとえば共焦点顕微鏡法）では、適用方法特有の性能上の特徴を記録できるように、どちらかと言えば微細な構造を使用することが提案される。
透明ラッカを使って標本をカバーガラスの縁にシーリングすると有利になる場合がある。
本発明は記述された実施例に限定されるものではなく、したがって固定には他の化合物も利用することができ、その場合十分に広いスペクトル幅の蛍光励起が可能である。