(57)【要約】【課題】本発明は、大豆ホエー蛋白質の主要構成成分の内、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターが選択的に分解された大豆ホエー蛋白質分解物の製造方法を提供すること、並びに大豆ホエー蛋白質のもう一つの構成成分であるレクチンの製造方法を提供することにある。【解決手段】低変性の大豆ホエー蛋白質中のＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターを選択的に熱変性させ、次いで蛋白質分解酵素を作用させることにより、大豆ホエー蛋白質中のＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターを選択的に分解させることにより、課題を解決した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆ホエー中のＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターを選択的に熱変性させた状態で、蛋白質分解酵素を作用させることを特徴とする加工大豆ホエーの製造方法。
【請求項２】
Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターを選択的に熱変性させる温度帯が６５℃以上９０℃未満である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
大豆ホエー蛋白質中のＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターの分解前の含量に対する分解後の残存率が１０％以下、且つ大豆ホエー蛋白質中の分解前の含量に対する分解後のレクチンの残存率が３０％以上である請求項１又は２記載の加工大豆ホエーの製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかの製造法により得られた加工大豆ホエーからレクチンに富む蛋白を濃縮するレクチンの製造方法。
【請求項５】
濃縮方法が分子篩法、塩析法又は沈澱法である請求項４記載のレクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、加工大豆ホエーの製造方法及び該加工大豆ホエーからレクチンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献１】特開平６−１４５１９８号公報
【特許文献２】特公昭５７−１１６３６号公報
【特許文献３】特公昭５７−５２３８６号公報
【特許文献４】特開平７−１０７９７４号公報
【特許文献５】特開昭６１−２５４１５３号公報
【非特許文献１】大豆たん白質研究、Ｖｏｌ．２，５９−６４（１９９９）
【非特許文献２】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，３９，８６２−８６６（１９９１）
【非特許文献３】Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３，  ４８９−５０７（１９９９）
【０００３】
大豆ホエー蛋白質は、大豆ホエー中に含まれる蛋白質であり、Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビター（以下、「ＫＴＩ」と称する。）、レクチン、β−アミラーゼ等から構成されるそれぞれ固有の物理化学的特性を有する蛋白質の混合物である。
そのうち大豆に約０．１％含まれるレクチンは赤血球の凝固を起こすヘマグルチニンの１種で、大豆の有害物質の１つとされている一方で、血小板の凝集、リンパ球の活性化、腫瘍細胞の凝集など、その生体機能調節因子としても注目されつつある（非特許文献１）。
【０００４】
大豆ホエー蛋白質中の各成分を利用すべく、それぞれの成分を分離する多くの試みがなされている。例えば、大豆ホエーから限外ろ過膜と陰イオン交換樹脂を組み合わせてＫＴＩを製造する方法（特許文献１）、ＫＴＩ、レクチンを分離する研究（非特許文献２）、β−アミラーゼを製造する方法（特許文献２〜４）が知られている。
【０００５】
また大豆ホエー蛋白質は、栄養的に優れていることから、大豆ホエー蛋白質原料を酵素分解してペプチド混合物を製造する方法が開示されている（特許文献５）。しかし、この方法では得られるペプチド混合物は平均ペプチド鎖長は１０〜３０と高度に分解されてしまっているため、大豆ホエー蛋白質の特定の成分を未分解の状態で有効利用することができなくなる。
【０００６】
このように、大豆ホエー蛋白質のように複数成分が混在した混合物からレクチンのような特定成分を高濃度に簡便に分離する方法はこれまで知られていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上の実情に鑑み、本発明は、大豆ホエーから大豆ホエー蛋白質中の特定成分を高濃度に分離することが可能な加工大豆ホエーの製造方法を提供すること、並びに該加工大豆ホエーからレクチンを製造する方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、大豆ホエー蛋白質の主要構成成分のＫＴＩとレクチンの変性の程度が異なることに着目し、特定の温度範囲でＫＴＩを選択的に熱変性させ、蛋白分解酵素を作用することにより、ＫＴＩが選択的に分解された加工大豆ホエーを得ることが可能であることを見いだした。更に、ＫＴＩが選択的に分解された加工大豆ホエーから分子篩法、塩析法、沈澱法から選ばれる濃縮方法でレクチンを高濃度に得られることを見いだし本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は以下に記載の通り、
（１）大豆ホエー中のＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターを選択的に熱変性させた状態で、蛋白質分解酵素を作用させることを特徴とする加工大豆ホエーの製造方法、
（２）Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターを選択的に熱変性させる温度帯が６５℃以上９０℃未満である（１）記載の製造方法、
（３）大豆ホエー蛋白質中のＫｕｎｉｔｚ型トリプシンインヒビターの分解前の含量に対する分解後の残存率が１０％以下、且つ大豆ホエー蛋白質中の分解前の含量に対する分解後のレクチンの残存率が３０％以上である（１）又は（２）記載の加工大豆ホエーの製造方法、
（４）（１）〜（３）の何れかの製造法により得られた加工大豆ホエーからレクチンに富む蛋白を濃縮するレクチンの製造方法。
（５）濃縮方法が分子篩法、塩析法又は沈澱法である（４）記載のレクチンの製造方法。を開示するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明に適用される大豆ホエーとしては、分離大豆蛋白あるいは濃縮大豆蛋白等の製造工程で副生される、大豆ホエー蛋白質が低変性の大豆ホエーが好ましく、原料大豆の品種、産地等には限定されない。一般的には、ｎ−ヘキサンにて低温抽出処理を行った脱脂大豆、特にＮＳＩ（窒素可溶係数）が８０以上の低変性脱脂大豆を出発原料として水抽出された脱脂豆乳を塩酸等により酸沈澱させた分離大豆蛋白を分離して得られる大豆ホエーが好適に用いられる。また低変性脱脂大豆を酸性水で洗浄して製造される濃縮大豆蛋白の製造工程で副生される、大豆ホエーも適用できる。なお、大豆の種類や調製方法によって異なってくるものの、通常大豆ホエーの全蛋白質中のレクチンの純度は２０〜３０％程度であり、ＫＴＩの純度は１５〜２５％程度である。
【００１１】
大豆ホエー蛋白質が加熱等により変性を受けているか否かは、蛋白質のＤＳＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）分析を行うことにより判別することができる。低変性大豆ホエー蛋白質ではその主要構成成分である、ＫＴＩやレクチンに由来するそれぞれの吸熱ピークが観察される（非特許文献３参照）。しかし、過度の変性を受けた大豆ホエー蛋白質の場合では構成成分の吸熱ピークが認められない。したがって、それぞれの吸熱ピークの有無から蛋白質の変性を判断できる。
【００１２】
本発明では、先ず大豆ホエー中のＫＴＩを選択的に熱変性させることが重要である。すなわち大豆ホエーを６５℃以上９０℃未満、好ましくは６５〜８５℃、より好ましくは７０〜８０℃に温度調整することにより、ＫＴＩを熱変性させることが重要である。かかる温度帯においては、ＫＴＩのみ熱変性を受けやすく、一方レクチンは変性を受けにくい。６５℃未満ではＫＴＩの熱変性が不十分となり、蛋白質分解酵素によりＫＴＩを十分に分解できない。また９０℃以上ではＫＴＩとレクチンの両方が熱変性してしまい、これらの成分を分離することが困難となる。ちなみにＫＴＩの熱変性温度は７４℃であることが知られている（非特許文献３参照）が、大豆ホエー中の蛋白含量、イオン強度等により、多少変動する。
また温度調整後に上記温度帯で保持する時間は１〜６０分、好ましくは５〜３０分程度で充分であるが、実際にはＤＳＣ分析でＫＴＩの吸熱ピークから変性を確認して、適切な条件を決定することができる。
【００１３】
次にＫＴＩを選択的に熱変性させた大豆ホエーに蛋白質分解酵素を作用させることにより、大豆ホエー中のＫＴＩを選択的に分解させることが出来る。一方、レクチンは熱変性をあまり受けていないため、酵素分解されにくい。ＫＴＩの熱変性は非可逆的であるので、蛋白質分解酵素を作用させる際の大豆ホエーの温度は、前記の温度帯に保持したままでも良いし、あるいは使用する蛋白質分解酵素の最適温度範囲に冷却しても良い。特に前記温度帯に保持したまま作用させた方が、温度調整後に再度温度操作を行わずに簡便に大豆ホエー蛋白質中のＫＴＩを選択的に分解させることが可能である。
【００１４】
本発明に使用する蛋白質分解酵素としては、動物由来のパンクレアチン、ペプシン、トリプシン等、植物由来のパパイン、ブロメライン等、或いはかび、細菌、乳酸菌等の微生物由来の「アルカラーゼ」（ノボ社製）、「プロテアーゼＳ」（天野製薬（株）製）、「プロテアーゼＭ」（天野製薬（株）製）、「プロチンＡＣ−１０」（大和化成（株）製）等が例示できる。
【００１５】
加水分解の条件は用いる蛋白分解酵素の種類により異なるが、概してその蛋白分解酵素の作用ｐＨ域、作用温度域で、加水分解するに充分な量を用いる。通常、未変性大豆ホエー蛋白質を含む水性懸濁液の粗蛋白質量に対して、０．００１〜０．５重量％、好ましくは０．０１〜０．１％の範囲で添加し、酵素反応を実施する。反応ｐＨは特に限定されず、使用する蛋白質分解酵素が作用する最適なｐＨ範囲であれば良い。作用する時間は、通常５分〜２時間、好ましくは、１０〜３０分程度反応させればよく、固定化酵素を充填したカラムに通液することにより連続処理も実施できる。６５℃以上９０℃未満でＫＴＩの選択的分解反応を行う場合でも、６５℃以上９０℃未満で分解活性を有する酵素であれば、その起源も特に限定されない。
【００１６】
酵素分解による大豆ホエー蛋白質中の各成分の変化は、ＳＤＳ電気泳動法により各成分を分離し、クマシーブルー染色したバンドの濃淡から簡単に調べることが出来る。本発明によれば、大豆ホエー蛋白質中のＫＴＩの分解前の含量に対する分解後の残存率が１０％以下、好ましくは５％以下であり、且つ大豆ホエー蛋白質中のレクチンの分解前の含量に対する分解後の残存率が３０％以上、好ましくは５０％以上となることが好ましい。
【００１７】
以上のようにして得られた加工大豆ホエーはＫＴＩが選択的に分解されており、一方、レクチンは多くが分解されずに残存するものである。
【００１８】
次に大豆ホエー蛋白質分解物からレクチンを製造する方法を説明する。レクチンは上記製造方法により得られた大豆ホエー蛋白質分解物からレクチンに富む蛋白質を濃縮することにより得ることができる。濃縮方法としては、分子篩法、塩析法又は沈澱法を用いることができる。
【００１９】
分子量の差を利用した分子篩法、具体的には限外ろ過法では、大豆ホエー蛋白質分解物を限外ろ過膜で、透過液側（ＫＴＩの分解物が主体）を除き、保留側（未分解のレクチンが主体）を分離することで、未分解のレクチンが得られる。使用する限外ろ過膜の孔径は分画分子量として２，０００〜３０，０００程度が適当であり、材質は特に限定されず、ポリスルフォン、ポリアクリロニトリルなどの有機膜或いはセラミックなどの無機膜のいずれを使用してもよい。分画分子量が低すぎると濃縮効率が低く、逆に分画分子量が大きすぎると目的蛋白の収量が低下する。また、分子量差によるゲルろ過カラムクロマトグラフィー法も適用可能であり、レクチンにアフィニティーを持つリガンドを固定したアフィニティーカラムクロマトグラフィーも可能である。
【００２０】
塩析法では得られた大豆ホエー蛋白質分解物に、例えば硫酸アンモニウムを３０〜７０％飽和となるように加えることで、レクチンを塩析させて濃縮できる。沈殿法では、得られた大豆ホエー蛋白質分解物にメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒を加えて沈殿を生じさせて、レクチンを濃縮する。次いで得られた沈殿物を必要があれば水に溶解させた後、水に対して透析を行い、通風乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥などの方法により乾燥することも可能である。
【００２１】
以上説明したように大豆ホエー蛋白質の主要構成成分のＫＴＩが選択的に分解された大豆ホエー蛋白質分解物が得られる。また、ホエー蛋白質の構成成分である未分解のレクチンを濃縮することにより高濃度、例えば純度８０重量％以上のレクチンが得られ、様々な分野での素材として利用が期待される。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明の実施様態を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例にその技術範囲が限定されるものではない。
【００２３】
〔実施例１〕
低変性脱脂大豆（窒素可溶指数；ＮＳＩ≧８０）１００ｇに１２倍量の水を加え、室温、ｐＨ７において１時間抽出後、遠心分離し、脱脂豆乳１，１００ｇを得た。この脱脂豆乳に塩酸を加え、ｐＨ４．５とし、遠心分離して大豆ホエー１，０００ｇを得た（粗蛋白量０．６％  ａｓ  ｉｓ）。該大豆ホエーを苛性ソーダで中和し（ｐＨ７．０）、温度を７０℃に調整して、３０分保持し、その後４０℃に冷却して、粗蛋白量当たり０．１重量％の「プロテアーゼＳ」（天野製薬（株）製）を加え、３０分酵素反応を行った。酵素反応物を１４０℃，１５秒加熱した溶液を噴霧乾燥し、加工大豆ホエー２０ｇを得た。
【００２４】
〔実施例２〕
実施例１と同様に調製した大豆ホエーを中和後、温度を７０℃に調整し、この温度に保持したまま粗蛋白量当たり０．１重量％のパパイン（シグマ社製）を加え、３０分酵素反応を行った。酵素反応物を１４０℃，１５秒加熱した溶液を噴霧乾燥し、加工大豆ホエー２０ｇを得た。得られた加工大豆ホエーをＳＤＳ電気泳動に供したところ、全蛋白質中のレクチンの純度は４３％、ＫＴＩの純度は０％であった。
【００２５】
〔対照区〕
また実施例１及び２の対照区として、実施例１と同様に調製した大豆ホエーを苛性ソーダで中和後、温度調整をせず、またパパインを加えず、１４０℃，１５秒加熱した溶液を噴霧乾燥したものを調製した。得られた未分解大豆ホエーをＳＤＳ電気泳動に供したところ、全蛋白質中のレクチンの純度は２４％、ＫＴＩの純度は２１％であった。
【００２６】
〔実施例３〕
実施例１と同様に調製した大豆ホエーを中和後、温度を８５℃に調整し、この温度に保持したまま粗蛋白量当たり０．１重量％のパパイン（シグマ社製）を加え、３０分酵素反応を行った。酵素反応物を１４０℃，１５秒加熱した溶液を噴霧乾燥し、加工大豆ホエーを調製した。
【００２７】
〔比較例１〕
実施例１と同様に調製した大豆ホエーを中和後、温度を６０℃に調整し、この温度に保持したまま粗蛋白量当たり０．１重量％のパパイン（シグマ社製）を加え、３０分酵素反応を行った。酵素反応物を１４０℃，１５秒加熱した溶液を噴霧乾燥し、加工大豆ホエーを調製した。
【００２８】
〔比較例２〕
実施例１と同様に調製した大豆ホエーを中和後、予め１００℃、１０分加熱した。これを６０℃に調整して粗蛋白量当たり０．１重量％のパパイン（シグマ社製）を加え、３０分酵素反応を行った。酵素反応物を１４０℃，１５秒加熱した溶液を噴霧乾燥し、加工大豆ホエーを調製した。
【００２９】
対照区、実施例１〜３並びに比較例１及び２で得られた加工大豆ホエー２５μｇをＳＤＳ電気泳動で分離し、クマシーブルー染色後バンドの濃淡をデンシトメーターで調べた。各サンプルのＫＴＩ及びレクチンの分解前の含量に対する分解後の残存率を求めた（表１）。また対照区、実施例２及び３並びに比較例１及び２のＳＤＳ電気泳動パターンを図１に示した。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
実施例１及び２では大豆ホエー蛋白質中のＫＴＩのみが選択的に分解され、レクチンは全く分解されなかった。実施例３では、実施例２と同様に大豆ホエー蛋白質中のＫＴＩが選択的に分解されているが、レクチンも若干分解を受けていた。比較例１のように、調整温度を６０℃にするとＫＴＩ、レクチン共に殆ど分解されず、また比較例２のように分解に先立ち予め過度の加熱変性を受けたものは、ＫＴＩのみならずレクチンも共に分解され、選択的分解物は得られなかった。
【００３２】
〔実施例４〕
低変性脱脂大豆（窒素可溶指数；ＮＳＩ≧８０）１０Ｋｇに１２倍量の水を加え、室温、ｐＨ７において１時間抽出後、遠心分離し、脱脂豆乳１１０Ｋｇを得た。この脱脂豆乳に塩酸を加え、ｐＨ４．５とし、遠心分離してホエー画分１００Ｋｇを得た（粗蛋白量０．６％  ａｓ  ｉｓ）。該ホエー画分を苛性ソーダで中和し（ｐＨ＝７．０）、温度を７０℃に調整し、粗蛋白量当たり０．１重量％のパパイン（シグマ社製）を加え、３０分酵素反応を行った。次に酵素反応物を１４０℃，１５秒加熱した溶液を限外ろ過モジュール；ＡＣＰ−１０５０（旭化成（株）製、分画分子量１３，０００）を用いて、濃縮を行った（平均圧力１．０ｋｇ／ｃｍ２、流量５００リットル／ｈｒ、温度５０℃）。得られた濃縮液を噴霧乾燥し、レクチン画分１，２００ｇを得た。得られたレクチン画分をＳＤＳ電気泳動で蛋白質の純度を分析したところ、全蛋白質中のレクチンの純度は８５％と極めて高純度であった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、大豆製品の副産物である大豆ホエーを原料として、ＫＴＩが選択的に分解された加工大豆ホエー並びに大豆ホエー蛋白質の構成成分であるレクチンが極めて高濃度で簡単に得られることが可能となった。したがって、従来廃棄せざるを得なかった大豆ホエーの高度利用が期待できる。特に血小板の凝集、リンパ球の活性化、腫瘍細胞の凝集など、その生体機能調節因子として免疫機能を高める働き等が近年期待されているレクチンの製造技術の向上にも貢献しうるものである。
【００３４】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２及び３並びに比較例１及び２において製造された加工大豆ホエーのＳＤＳ電気泳動パターンである。
【符号の説明】
Ｍ  分子量マーカー
１  対照区（未分解）
２  比較例１
３  実施例２
４  実施例３
５  比較例２
【図１】
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