(57)【要約】【課題】より効果的なＨＩＶの感染治療及び／又は感染予防を可能とする、抗ＨＩＶ剤の有効成分として有用な新規アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びそれを含有する抗ＨＩＶ剤（ＨＩＶ治療及び／又は予防剤）を提供する。【解決手段】前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１のＤＩＳ（Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ）領域を標的とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における、連続する少なくとも１５塩基からなる配列に相補的な塩基配列からなる、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における、連続する少なくとも１５塩基からなる配列に特異的にハイブリダイズ可能な塩基配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのインターヌクレオチド結合が、ホスホロチオエート型結合である、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、抗ＨＩＶ剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規アンチセンスオリゴヌクレオチド及び抗ＨＩＶ剤（ＨＩＶ治療及び／又は予防剤）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト免疫不全ウイルス（以下、ＨＩＶと略称する）に対する抗ウイルス剤として、遺伝子を標的とするアンチセンス法に基づくアプローチが知られている。アンチセンス法とは、標的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、標的遺伝子の転写、スプライシング、及び／又はタンパク質への翻訳を阻害して、ウイルスタンパク質の発現を特異的に抑制する技術である。こうしたアンチセンス法の開発で最も重要な課題の１つは、標的部位の選択である。
【０００３】
抗ＨＩＶ剤の有効成分として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＣＸＣＲ４遺伝子又はＣＣＲ５遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド［特開平１１−２９２７９５号公報（特許文献１）］、あるいは、ｅｎｖ部分、ｅｎｖ及びｐｏｌ部分、又はｅｎｖ、ｐｏｌ、及びｇａｇ部分の各部分に対するアンチセンスＲＮＡ［特表２００１−５０２８８４号公報（特許文献２）］などが公知である。
【０００４】
【特許文献１】
特開平１１−２９２７９５号公報
【特許文献２】
特表２００１−５０２８８４号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、より効果的なＨＩＶの感染治療及び／又は感染予防を可能とする、抗ＨＩＶ剤の有効成分として有用な新規オリゴヌクレオチド、及びそれを含有する抗ＨＩＶ剤（ＨＩＶ治療及び／又は予防剤）を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における、連続する少なくとも１５塩基からなる配列に相補的な塩基配列からなる、オリゴヌクレオチドによって解決することができる。
また、本発明は、配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における、連続する少なくとも１５塩基からなる配列に特異的にハイブリダイズ可能な塩基配列を含む、オリゴヌクレオチドに関する。
更に、本発明は、前記オリゴヌクレオチドを有効成分として含む、抗ＨＩＶ剤に関する。
【０００７】
本明細書において、「ＨＩＶ」とは、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）を意味し、ＨＩＶ−１及びその変異体を含む。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］本発明のオリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドには、
（１）配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における、連続する少なくとも１５塩基からなる配列に相補的な塩基配列からなる、オリゴヌクレオチド、及び
（２）配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における、連続する少なくとも１５塩基からなる配列に特異的にハイブリダイズ可能な塩基配列を含む、オリゴヌクレオチド
が含まれる。
【０００９】
配列番号１で表される塩基配列は、ＨＩＶ−１のＤＬＳ（Ｄｉｍｅｒ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）領域に存在するＤＩＳ（Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ）領域及びその近傍の塩基配列であり、配列番号１で表される塩基配列の第９番目〜第４３番目がＤＩＳ領域である（図６及び図７参照）。
【００１０】
図６及び図７に示すように、ＨＩＶ−１のＤＬＳは、５’ＬＴＲの下流からｇａｇ開始コドン領域に位置している。この何のタンパク質も翻訳しないフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列が、１９９５年当初、ＨＩＶ−１の複製過程において重要であるという報告がされた（Ｍｕｒｉａｕｘ，  Ｄ．ら，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７０，  ８２０９−１６，  １９９５）。また、同時期にイン・ビトロでの研究でＤＬＳ領域に存在するＤＩＳがＨＩＶ−１の複製に欠かすことのできない部位であると報告された（Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，  Ｂ．及びｖａｎ  Ｗａｍｅｌ，  Ｊ．  Ｌ．，  ＲＮＡ，  ６，  ２８２−９５，  ２０００；  Ｄａｍｇａａｒｄ，  Ｃ．  Ｋ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｓｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２６，  ３６６７−７６，  １９９８）。ＤＩＳは、ｇａｇの開始コドン及びＳＤ（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｄｏｎｏｒ  Ｓｉｔｅ）の上流に位置しており、ステム−ループ構造を形成していると考えられている。
しかし、ＤＩＳ領域を標的とするアンチセンス法については、これまで全く報告がなく、有効であるか否かについても全く報告がなかった。アンチセンス法においては、標的配列がウイルスの複製又は増殖に必須であったとしても、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが必ずしも抗ウイルス剤として有効でないことは周知の事実であり、ＨＩＶの産生に重要であると考えられていたＤＩＳ領域についてもその有効性は当業者といえども予想することができないことであった。
【００１１】
本発明者は、後述の実施例に具体的に示すように、前記ＤＩＳ領域及びその近傍の塩基配列（配列番号１で表される塩基配列）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、５種類のホスホロチオエート型オリゴデオキシヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮ；  Ａｎｔｉ−６９２，  Ａｎｔｉ−６９４，  Ａｎｔｉ−７０３，  Ａｎｔｉ−７１３，  及びＡｎｔｉ−７１５）を設計し、そのＨＩＶ−１産生阻害効果を検討したところ、５種類の中の３種類のアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉ−６９４，  Ａｎｔｉ−７０３，  及びＡｎｔｉ−７１３）のみが、投与量依存的に、優れたＨＩＶ−１産生阻害作用を示すことを見出した。
この際、ＨＩＶの産生に重要であると考えられる他の標的領域として、ｇａｇ領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（２８ＡＳ）、及びウイルス遺伝子の逆転写に重要なポリプリントラック領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＰＴ−ＡＳ）についても、ＨＩＶ−１産生阻害効果を検討したが、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドには効果がなかった。
このように、ＨＩＶの産生に重要であると考えられる複数の標的領域の内、ＤＩＳ領域のみが標的として有効であったことは、実験前には全く予想することのできない、予想外の結果であった。更に、ＤＩＳ領域がＨＩＶの産生に重要であることについては、種々の報告があったが、ＤＩＳ領域を標的配列として含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉ−６９２及びＡｎｔｉ−７１５）であってもＨＩＶ−１産生を阻害することができないことは、ＤＩＳ領域の重要性を考慮すると、予想外の結果であった。
【００１２】
配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における、連続する少なくとも１５塩基からなる配列に相補的な塩基配列からなる、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５塩基からなる限り、その塩基数は特に限定されるものではない。標的領域への特異的なハイブリダイズを保証するためには、塩基数は、好ましくは１５塩基以上であり、より好ましくは１８塩基以上であり、更に好ましくは２０塩基以上である。また、膜透過性を保証するためには、好ましくは３０塩基以下であり、より好ましくは２８塩基以下であり、更に好ましくは２５塩基以下である。本発明の前記オリゴヌクレオチドは、１５〜３０塩基であることが好ましく、１８〜２８塩基であることがより好ましく、２０〜２５塩基であることが更に好ましく、２０塩基であることが特に好ましい。
【００１３】
配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における、連続する少なくとも１５塩基からなる配列に特異的にハイブリダイズ可能な塩基配列を含む、本発明のオリゴヌクレオチドは、生体内と同じ条件下（例えば、３７℃の液体培地中）で前記塩基配列にハイブリダイズすることができ、しかも、抗ＨＩＶ活性を示すオリゴヌクレオチドである限り、特に限定されるものではないが、例えば、
配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における、連続する少なくとも１５塩基からなる配列に相補的な塩基配列を含み、しかも、抗ＨＩＶ活性を示すオリゴヌクレオチド、あるいは、
配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における連続する少なくとも１５塩基からなる配列において、１又は数個（好ましくは１又は２個、より好ましくは１個）の塩基が置換、挿入、及び／又は欠失した塩基配列に相補的な塩基配列を含み、しかも、抗ＨＩＶ活性を示すオリゴヌクレオチド
を挙げることができる。
【００１４】
配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における、連続する少なくとも１５塩基からなる配列に相補的な塩基配列を含み、しかも、抗ＨＩＶ活性を示すオリゴヌクレオチドとしては、例えば、
配列番号１で表される塩基配列の第６番目〜第４４番目の塩基からなる配列における、連続する少なくとも１５塩基からなる配列に相補的な塩基配列の５’末端及び／又は３’末端において、１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が付加された塩基配列からなり、しかも、抗ＨＩＶ活性を示すオリゴヌクレオチド
を挙げることができる。
より具体的には、
配列番号３〜５のいずれかの塩基配列（但し、各ヌクレオシド間のインターヌクレオチド結合は、それぞれ独立に、リン酸ジエステル結合又は修飾リン酸ジエステル結合であるものとする）からなるオリゴヌクレオチド、あるいは、
前記塩基配列の５’末端及び／又は３’末端において、１又は数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が付加された塩基配列からなり、しかも、抗ＨＩＶ活性を示すオリゴヌクレオチド
を挙げることができる。
なお、５’末端及び／又は３’末端に付加する塩基は、配列番号１で表される塩基配列の相当する塩基に対する相補的塩基であることが好ましい。
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用することができる限り、例えば、デオキシヌクレオシド、リボヌクレオシド、及び／又はそれらの修飾ヌクレオシド（例えば、２’−Ｏ−修飾リボヌクレオシド）から形成することができる。修飾リボヌクレオシドとしては、標的となる塩基配列との結合力の強さの点から、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドが好ましい。
従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオシド及び／又は修飾リボヌクレオシドからなるオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、デオキシリボヌクレオシドのみからなるオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、あるいはリボヌクレオシド（及び／又は修飾リボヌクレオシド）とデオキシリボヌクレオシドとの両方からなるキメラオリゴリボ／デオキシリボヌクレオチド（ＲＮＡ／ＤＮＡ）であることができる。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、各ヌクレオシド間のインターヌクレオチド結合は、それぞれ独立に、リン酸ジエステル結合又は修飾リン酸ジエステル結合である。修飾リン酸ジエステル結合としては、例えば、リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子２個の内の酸素原子１個をメチル基に置換したメチルホスホネート結合、リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子２個の内の酸素原子１個をアミノ基若くは置換アミノ基に置換したホスホロアミダイト結合、又はリン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子２個の内の酸素原子１個を硫黄原子に置換したホスホロチオエート型結合などを挙げることができ、それらの１種又はそれ以上を、ヌクレオシド間の結合の１箇所又はそれ以上の箇所に導入することができる。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、配列特異的結合性、簡便な調製法、及び合成コストなどの点からは、リン酸ジエステル結合体であることが好ましく、二重鎖安定性、抗ヌクレアーゼ耐性、細胞膜透過性、及び低細胞毒性と適度な代謝性などの点からは、修飾されたリン酸ジエステル結合体であることが好ましい。生体内での安定性が良いことから、ホスホロチオエート型結合であることが特に好ましい。
【００１８】
本発明において用いるオリゴヌクレオチドは、公知の方法で合成することができる。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド又はホスホロチオエート結合を導入する部位を除いては、例えば、通常のホスホジエステル法又はホスホトリエステル法、例えば、Ｈ−ホスホネート法、又はホスホロアミダイト法によるＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を利用して合成することができる。
【００１９】
ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、例えば、通常のポリヌクレオチド合成に用いる酸化剤である水／ヨウ素／ピリジン溶液の代わりに、１５  ％のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルチオラムジスルフィド／アセトニトリル溶液を用いて合成することができる。
【００２０】
２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、例えば、５’−ジメトキシトリエチル−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド−３’−〔（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）〕−ホスホロアミダイトユニットを用いて、ホスホロアミダイト法によるＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を利用して合成することができる。
【００２１】
［２］本発明の抗ＨＩＶ剤
本発明のオリゴヌクレオチドは、抗ＨＩＶ作用を有し、本発明の抗ＨＩＶ剤の有効成分として有用である。本明細書における「抗ＨＩＶ作用」とは、特に限定されるものではないが、例えば、ＨＩＶ（特にはＨＩＶ−１）の産生阻害作用、又はＨＩＶ（特にはＨＩＶ−１）のｍＲＮＡ若しくはタンパク質の発現抑制作用などを挙げることができる。
【００２２】
本発明の抗ＨＩＶ剤は、有効成分である本発明のオリゴヌクレオチドを単独で、あるいは、所望により薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる公知の担体又は希釈剤と共に、含有することができ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする公知の医薬組成物の製剤技術（例えば、特開平１１−２９２７９５号公報）を利用して調製することができる。
本発明の抗ＨＩＶ剤としては、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドを含む抗ＨＩＶ剤、本発明のオリゴヌクレオチドに加え、血中で安定なリポソームを更に含有する抗ＨＩＶ剤、あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドを含むベクターを含有する抗ＨＩＶ剤を挙げることができる。
【００２３】
本発明の抗ＨＩＶ剤は、例えば、経口、非経口、又は局所的な経路のいずれかにより投与することができる。投与量は、治療対象動物（哺乳類、特にはヒト）の種及びその薬剤に対する個体の応答性、並びに選択される製剤の剤形及び投与時間や間隔などに依存して変化するが、一般には、約５００ｍｇから約５０００ｇ／日の範囲の用量で投与することができる。
【００２４】
本発明の抗ＨＩＶ剤は、本発明のオリゴヌクレオチド、血中で安定なリポソーム、又は本発明のオリゴヌクレオチドを含むベクター以外に、場合により医薬的に許容することのできる公知の担体又は希釈剤との組合せで、経口、非経口、又は局所的な経路のいずれかにより、単回又は複数回で投与することができる。本発明の抗ＨＩＶ剤は、種々の異なる剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、トローチ剤、ハードキャンディー、粉末剤、スプレー剤、クリーム剤、軟膏剤、坐剤、ゼリー剤、ゲル剤、ペースト剤、ローション剤、軟膏剤、水性懸濁剤、注射用溶液剤、エリキシル剤、又はシロップ剤などにすることができる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製》
本実施例では、図１に示すように、ＨＩＶ−１のＤＬＳ（Ｄｉｍｅｒ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）領域に存在するＤＩＳ（Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ）の塩基配列から、３種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドと２種類のランダムオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、インターヌクレオチド結合が全てホスホロチオエート型結合のＤＮＡ、すなわち、ホスホロチオエート型オリゴデオキシヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮ）である。
なお、図１において、配列番号１で表される塩基配列における各数値（例えば、「６９０」又は「７００」）は、ＨＩＶ−１  ＮＬ４３２株の５’ＬＴＲ中のＵ３領域を起点として数えた塩基番号である。また、記号「Ｓｔｅｍ」、「Ｌｏｏｐ」、及び「Ｂｕｌｇｅ」は、それぞれ、ステム領域、ループ領域、及びバルジ領域を意味する。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドとして、「Ａｎｔｉ−７０３」（配列番号４で表される塩基配列）を合成した。比較用オリゴヌクレオチドとして、「Ａｎｔｉ−６９２」（配列番号２で表される塩基配列）及び「Ａｎｔｉ−７１５」（配列番号６で表される塩基配列）を合成した。ＨＩＶ−１のＲＮＡと相捕的な配列を有しないコントロールオリゴヌクレオチドとして、「Ｒａｎｄｏｍ」（配列番号７で表される塩基配列）及び「７０３−Ｓｃｒａｍｂｌｅ」（配列番号８で表される塩基配列）を合成した。「７０３−Ｓｃｒａｍｂｌｅ」は、本発明のオリゴヌクレオチドである「Ａｎｔｉ−７０３」と同じＧＣ含量を示す。
【００２７】
【実施例２】
《プラスミドｐＮＬ４−３を用いたＳ−ＯＤＮの抗ＨＩＶ作用の評価》
（１）Ｓ−ＯＤＮ及びプラスミドｐＮＬ４−３の遺伝子導入
本実施例では、ヒト腎臓細胞由来の２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１１２６８）に、ＨＩＶ−１発現ベクターであるプラスミドｐＮＬ４−３（Ａｄａｃｈ，  ａ．ら，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ５９，  ２４８，  １９８６）を遺伝子導入した系を用いて、実施例１で調製したＳ−ＯＤＮのＨＩＶ−１産生阻害効果を評価した。
プラスミドｐＮＬ４−３は、２９３Ｔ細胞に遺伝子導入されると、自身のＬＴＲプロモーターにより遺伝子発現がおこり、ＨＩＶ−１が産生される。本実施例では、細胞内及び培養上清に産生されるＨＩＶ−１タンパク質ｐ２４抗原の量を測定した。
【００２８】
Ｓ−ＯＤＮ及びプラスミドｐＮＬ４−３の２９３Ｔ細胞への遺伝子導入は、市販のトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｌ．Ｌ．  Ｃ，  ＵＳＡ）を使用し、その添付のプロトコールに準じて実施した。
具体的には、２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに、ウェル当たり１０５細胞／２ｍＬ培地の細胞密度となるように播き、培養器（３７℃及び５％  ＣＯ２）内で一晩培養した。培地としては、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）を使用した。次の日に、細胞がウェルに接着していることを確認して以下の実験に用いた。
【００２９】
２９３Ｔ細胞から培地を除き、血清フリー（血清不含）のＲＰＭＩ−１６４０培地９００μＬを添加して培養器（３７℃及び５％  ＣＯ２）に移した。予め各Ｓ−ＯＤＮ及び前記トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６）を、血清フリーのＲＰＭＩ−１６４０培地で所定濃度［Ｓ−ＯＤＮ＝１μｍｏｌ／Ｌ，５μｍｏｌ／Ｌ，又は１０μｍｏｌ／Ｌ（３段階）；ＦｕＧＥＮＥＴＭ６＝５０倍希釈］に希釈することにより調製したＦｕＧＥＮＥＴＭ６／Ｓ−ＯＤＮ溶液１００μＬを各ウェルに更に添加し、プレートを軽く揺らして混和した後、培養器（３７℃及び５％  ＣＯ２）に移し、２時間放置した。
ＦｕＧＥＮＥＴＭ６／Ｓ−ＯＤＮ溶液添加から２時間経過した後、予めプラスミドｐＮＬ４−３及びトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６）を、血清フリーのＲＰＭＩ−１６４０培地で所定濃度［プラスミドｐＮＬ４−３＝０，０１μｇ／μＬ；ＦｕＧＥＮＥＴＭ６＝５０倍希釈］に希釈することにより調製したＦｕＧＥＮＥＴＭ６／ｐＮＬ４−３溶液１１０μＬを各ウェルに更に添加し、プレートを軽く揺らして混和した後、培養器（３７℃及び５％  ＣＯ２）に移し、２時間放置した。
ＦｕＧＥＮＥＴＭ６／ｐＮＬ４−３溶液添加から２時間経過した後、培地を除き、各ウェルをリン酸緩衝化生理食塩水［ＰＢＳ（−）］１ｍＬで３回洗浄した。各ウェルへ１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地３ｍＬを加えた後、培養器（３７℃及び５％  ＣＯ２）に移し、４８時間培養した。
【００３０】
（２）ＨＩＶ−１及び細胞内タンパク質の精製
遺伝子導入から４８時間後、上清５００μＬを０．４５μｍフィルターに通した後、１．５ｍＬチューブに移し、ＨＩＶ−１を精製した。
一方、細胞は、上清を取り除いた後、各ウェルをＰＢＳ（−）１ｍＬで２回洗浄した。０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液０．５ｍＬを加え、細胞をウェルから剥がした後、ＰＢＳ（−）０．５ｍＬを各ウェルに加え、混和した。懸濁細胞を１．５ｍＬチューブに移し、２０００ｒｐｍ及び室温にて５分間遠心分離した後、上清のＰＢＳ（−）を取り除いた。沈殿した細胞に細胞溶解液（ピッカジーン細胞溶解液；Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｌｔｄ．，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）３００μＬを加え、細胞を溶解した。３７℃で１５分間放置した後、１３０００ｒｐｍ及び室温にて、１０分間遠心分離した。上清を別の１．５ｍＬチューブに移し、これを細胞内タンパク質精製溶液とした。
【００３１】
（３）ｐ２４抗原量の測定
回収した上清及び細胞内タンパク質に含有されるＨＩＶ−１のｐ２４抗原量を、ＣＬＥＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）により測定した。
具体的には、市販の希釈液（ＬＵＭＩＰＵＬＳＥ検体希釈液；Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）で適当な濃度（１０〜１００００倍）に希釈した。溶液希釈液２５０μＬに、市販のｐ２４検体処理液（ＬＵＭＩＰＵＬＳＥ  Ｉ  ＨＩＶ−１  ｐ２４検体処理液；  Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）５０μＬを加え、軽く混和させた。市販の測定試薬（ＬＵＭＩＰＵＬＳＥ  ｆ；  Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を用いて、この溶液中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原量を測定した。
【００３２】
上清中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原量に関する結果を図２に、細胞内タンパク質中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原量に関する結果を図３に、それぞれ示す。
図２及び図３において、「ＮＬ４−３」は、コントロール（すなわち、Ｓ−ＯＤＮを添加しなかった場合）の結果である。
図２に示すように、Ｓ−ＯＤＮ「Ａｎｔｉ−７０３」によってＨＩＶ−１の産生が優位に抑制され、９９％以上の非常に高いＨＩＶ−１産生阻害効果が示された。一般的に、アンチセンス核酸は、１７ｍｅｒ以上の塩基数を必要とし、理論的にはこれ以上の長さにおける相同的な配列は、標的遺伝子以外に存在しないと言われている。しかし、実際には、アンチセンス核酸が標的遺伝子以外にも数塩基の相同性があれば結合し、標的以外の遺伝子発現を抑制することで細胞への高い毒性やその特異性が問題視されている。今回検討したＳ−ＯＤＮであるＡｎｔｉ−７０３によるウイルス産生量は、Ａｎｔｉ−７０３濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌ、０．５μｍｏｌ／Ｌ、及び１．０μｍｏｌ／Ｌと遺伝子導入量依存的に減少していることから、標的配列へのＡｎｔｉ−７０３の特異的な結合によるＨＩＶ−１産生阻害が示唆された。
また、この細胞上清中のｐ２４量の減少が、図３に示す細胞内ｐ２４量の減少と相関していることから、Ａｎｔｉ−７０３によるＨＩＶ−１産生阻害効果が、ＨＩＶ−１のＤＩＳ配列を特異的に認識してＨＩＶ−１の産生及びタンパク質の翻訳を阻害していることが示された。
【００３３】
【実施例３】
《プラスミドｐＮＬ−ｌｕｃを用いたＳ−ＯＤＮの抗ＨＩＶ作用の評価》
（１）Ｓ−ＯＤＮ及びプラスミドｐＮＬ４−３の遺伝子導入
実施例２において、Ａｎｔｉ−７０３によるＨＩＶ−１産生阻害が示され、それらが高いアンチセンス効果によるＨＩＶ−１タンパク質であるｐ２４量の産生を優位に抑制しているものであることが示された。ＨＩＶ−１  ｐ２４タンパク質は、図８に示すように、Ｇａｇ前駆体タンパク質から作られる構造タンパク質であり、そのｍＲＮＡはＨＩＶ−１ゲノム  ＲＮＡと同一のＲＮＡから翻訳される。今回標的としたＨＩＶ−１のＤＩＳ領域が、ＳＤの上流に位置している（図７参照）ため、すべてのＨＩＶ−１のｍＲＮＡに存在することから、本実施例では、選定したＳ−ＯＤＮが他のｍＲＮＡにも効果的に作用するのかをプラスミドｐＮＬ−ｌｕｃを利用して検討した。
【００３４】
プラスミドｐＮＬ−ｌｕｃは、ＨＩＶ−１遺伝子のｎｅｆ領域とｅｎｖ領域を欠損させ、その領域にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドである（図８参照）。核内で転写されたＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡは、細胞核内のスプライス機構を受け、それぞれ固有のタンパク質を発現するｍＲＮＡになる。実施例２で評価したｐ２４抗原は、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡから翻訳される遺伝子産物であるのに対して、ルシフェラーゼタンパク質は、核内で一度スプライシングされたｍＲＮＡから翻訳される。このプラスミドｐＮＬ−ｌｕｃを利用することで、ＨＩＶ−１のＤＩＳを標的とする優位性について評価した。
【００３５】
具体的には、２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに、ウェル当たり５ｘ１０５細胞／２ｍＬ培地の細胞密度となるように播き、培養器（３７℃及び５％  ＣＯ２）内で培養した。細胞を播いてから１４時間後に、細胞がウェルに接着していることを確認して以下の実験に用いた。この時点での細胞は、約３０％程度の細胞密度であった。
２９３Ｔ細胞から培地を除き、血清フリーのＤ−ＭＥＭ  ９００μＬを添加して培養器（３７℃及び５％  ＣＯ２）に移した。１５分後、予め各Ｓ−ＯＤＮ及びトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６）を、血清フリーのＤ−ＭＥＭで所定濃度［Ｓ−ＯＤＮ＝１０μｍｏｌ／Ｌ；  ＦｕＧＥＮＥＴＭ６＝５０倍希釈］に希釈することにより調製したＦｕＧＥＮＥＴＭ６／Ｓ−ＯＤＮ溶液１００μＬを各ウェルに更に添加し、プレートを軽く揺らして混和した後、培養器（３７℃及び５％  ＣＯ２）に移し、２時間放置した。
ＦｕＧＥＮＥＴＭ６／Ｓ−ＯＤＮ溶液添加から２時間経過した後、予めプラスミドｐＮＬ−ｌｕｃ及びトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６）を、血清フリーのＤ−ＭＥＭで所定濃度［プラスミドｐＮＬ−ｌｕｃ＝０．０１μｇ／μＬ；ＦｕＧＥＮＥＴＭ６＝５０倍希釈］に希釈することにより調製したＦｕＧＥＮＥＴＭ６／ｐＮＬ−ｌｕｃ溶液１００μＬを各ウェルに更に添加し、プレートを軽く揺らして混和した後、培養器（３７℃及び５％  ＣＯ２）に移し、２時間放置した。
ＦｕＧＥＮＥＴＭ６／ｐＮＬ−ｌｕｃ溶液添加から２時間経過した後、培地を除き、各ウェルへ１０％  ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ  ２ｍＬを加えた後、培養器（３７℃及び５％  ＣＯ２）に移し、４８時間培養した。
【００３６】
（２）細胞内タンパク質の精製
遺伝子導入から４８時間後、上清を取り除き、各ウェルをＰＢＳ（−）１ｍＬで２回洗浄した。０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液０．５ｍＬを加え、培養器（３７℃及び５％  ＣＯ２）内で５分間放置することにより、細胞をウェルから剥がした後、ＰＢＳ（−）５００μＬを各ウェルに加え、混和した。懸濁細胞を１．５ｍＬチューブに移した。この細胞懸濁液の内、５０μＬは、細胞数を数えるために使用した。細胞懸濁液を２０００ｒｐｍ及び室温にて３分間遠心分離した後、上清のＰＢＳ（−）を取り除いた。ＰＢＳ（−）３００μＬに細胞を懸濁した後、１５０μＬを別の１．５ｍＬチューブに移し、後述の実施例３（４）で使用した。残る細胞懸濁液１５０μＬを２０００ｒｐｍ及び室温にて５分間遠心分離した後、上清のＰＢＳ（−）を取り除いた。沈殿した細胞にピッカジーン細胞溶解液（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｌｔｄ．，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）１００μＬを加え、細胞を溶解した。１３０００ｒｐｍ及び室温にて、１０分間遠心分離した。上清を別の１．５ｍＬチューブに移し、これを細胞内タンパク質精製溶液とした。
【００３７】
（３）細胞内タンパク質中のルシフェラーゼ活性の測定
細胞内タンパク質精製溶液中のルシフェラーゼ活性は、細胞内タンパク質精製溶液１０μＬに発光基質液（東洋インキ株式会社）１００μＬを添加し、ルミノメーター（ＬＵＭＡＴ  ＬＢ  ９５０７；  ＢＥＲＴＨＯＬＤ）により測定した。
結果を図４に示す。図４において、「Ｒａｎ」は、Ｓ−ＯＤＮ「Ｒａｎｄｏｍ」の結果であり、「７０３−Ｓｃｒ」は、Ｓ−ＯＤＮ「７０３−Ｓｃｒａｍｂｌｅ」の結果であり、「ＮＬ−ｌｕｃ」は、コントロール（すなわち、Ｓ−ＯＤＮを添加しなかった場合）の結果である。
【００３８】
図４に示すように、細胞内ＨＩＶ−１遺伝子発現量をルシフェラーゼ活性にて評価した結果、ＨＩＶ−１のＤＩＳを標的としたＳ−ＯＤＮにおいてその阻害効果がみられた。特にＡｎｔｉ−７０３においては、ＨＩＶ−１タンパク質ｐ２４抗原の発現を抑制したのと同様に、ルシフェラーゼ活性試験においても顕著にタンパク質の発現を阻害していた。従来、アンチセンス核酸の機能として、標的ＲＮＡとアンチセンス核酸との結合が、翻訳過程においてリボソームの進行を阻害することでタンパク質合成を抑制することが知られている。今回検討したＳ−ＯＤＮのＡｎｔｉ−７０３による効果的なＨＩＶ−１産生阻害効果は、ＨＩＶ−１のＤＩＳに効果的に作用してアンチセンス核酸の機能を充分に発揮したものであると考えられる。しかし、ＨＩＶ−１  ＲＮＡのＤＩＳを標的とした他のＳ−ＯＤＮによる効果的なＨＩＶ−１阻害効果がみられなかったことから、標的ＲＮＡへのアンチセンス核酸の部位選定が重要であることが示唆された。
なお、アンチセス核酸は、その配列内にあるＧＣ含量により非特異的なＲＮＡとの相互作用による細胞毒性が知られている。本実施例ではＨＩＶ−１産生阻害効果のあったＡｎｔｉ−７０３とＧＣ含量を同様にした７０３−Ｓｃｒａｍｂｌｅ（７０３−Ｓｃｒ）についても同様に試験をおこなったが、このアンチセンスによる遺伝子発現の阻害機構は見られなかった。
【００３９】
これらの結果から、Ａｎｔｉ−７０３によるＨＩＶ−１の産生量の減少が、ＨＩＶ−１タンパク質合成量の減少に寄与していること、また、ＨＩＶ−１  ＲＮＡのＤＩＳ配列を特異的に認識することで、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡのみならずｍＲＮＡにも効果的に作用してＨＩＶ−１の産生及び遺伝子発現を効率よく阻害していることが示され、このＨＩＶ−１のＤＩＳ領域がＨＩＶ−１抑制において効果的な標的部位となりうることが示唆された。
【００４０】
（４）細胞内ＨＩＶ−１  ＲＮＡの発現量の解析
これまで述べたように、Ａｎｔｉ−７０３が効果的にＨＩＶ−１タンパク質の発現を効果的に抑制していることが示されたが、アンチセンス核酸の機能としてＳ−ＯＤＮや天然型アンチセンス核酸による標的ＲＮＡとの二重鎖形成が、細胞内ＲＮａｓｅ  Ｈの基質となり、標的ＲＮＡが分解されることが知られている。そこで、本実施例で選定したＳ−ＯＤＮによる標的ＲＮＡへのＲＮａｓｅ  Ｈ活性の検討を行なうために、細胞内ＨＩＶ−１のＲＮＡ量を解析した。
【００４１】
具体的には、実施例３（２）で得られた細胞懸濁液から、市販のＲＮＡ抽出試薬〔ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．〕を用いて細胞内ＲＮＡを抽出し、更にＤＮａｓｅ  Ｉ処理した総ＲＮＡを用いて逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーとしては、ＨＩＶ−１  ＲＮＡのｇａｇ領域を特異的に増幅するプライマーを用いた。また、内部コントロール用のプライマーとして、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）を増幅するプライマーを用いた。
【００４２】
結果を図５に示す。図５において、「Ｍ」は、ＤＮＡマーカーを意味し、「ＮＬ−ｌｕｃ」は、プラスミドｐＮＬ−ｌｕｃを添加し、Ｓ−ＯＤＮを添加しなかった場合の結果であり、「Ｎ．Ｃ．」は、プラスミドｐＮＬ−ｌｕｃ及びＳ−ＯＤＮを添加しなかった場合の結果であり、「ＲＴ（−）ｐＮＬ−ｌｕｃ」は、プラスミドｐＮＬ−ｌｕｃを添加し、逆転写酵素を添加しなかった場合の結果である。
図５に示すように、Ｓ−ＯＤＮ「Ｒａｎｄｏｍ」若しくはＳ−ＯＤＮ「７０３−Ｓｃｒａｍｂｌｅ」、又はプラスミドｐＮＬ−ｌｕｃを単独に遺伝子導入した細胞においてはバンドの蛍光変化が見られないのに対して、ＨＩＶ−１のＤＩＳを標的としたＳ−ＯＤＮにおいてはＨＩＶ−１  ＲＮＡ遺伝子発現量の減少がみられ、特にＡｎｔｉ−７０３においては、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ遺伝子増幅がまったくみられなかった。
以上の結果より、今回検討したＡｎｔｉ−７０３による効果的なＨＩＶ−１産生阻害効果が、細胞内タンパク質の合成阻害と標的ＲＮＡへの結合によるＲＮＡの分解によるものであり、Ａｎｔｉ−７０３によるアンチセンス核酸としての機能によるものであると考えられる。
【００４３】
以上の結果から、今回選定したＳ−ＯＤＮによるＨＩＶ−１産生阻害効果がＨＩＶ−１タンパク質の発現及びＲＮＡ量の減少によるものであり、Ｓ−ＯＤＮ（Ａｎｔｉ−７０３）が、ＨＩＶ−１のＤＩＳに対して配列特異的に標的ＲＮＡへ結合してウイルス粒子の産生を阻害したことが明らかになった。また、ＨＩＶ−１タンパク質の発現解析より、今回標的としたＨＩＶ−１のＤＩＳ領域が、ゲノムＲＮＡのみならずｍＲＮＡにおいても重要な配列であり、アンチセンス法における効果的な標的部位であることが証明された。
【００４４】
【実施例４】
《ヒト末梢血リンパ球を用いた抗ＨＩＶ−１活性の検証（１）》
実施例２及び３で評価したＡｎｔｉ−７０３と、Ｓ−ＯＤＮの標的を前記Ａｎｔｉ−７０３から５’側又は３’側に１０残基ずらした配列であるＡｎｔｉ−６９４（配列番号３で表される塩基配列）又はＡｎｔｉ−７１３（配列番号５で表される塩基配列）の抗ＨＩＶ−１活性をヒト末梢血リンパ球を用いて評価した。
健常人の末梢血よりリンパ球を分離し、ＨＩＶ−１  ＮＬ４３２株（Ａｄａｃｈｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ５９，  ２８４，  １９８６）を氷上で９０分間吸着させた後、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、細胞に吸着しなかった余分なウイルスを除去した。そこに、Ａｎｔｉ−７０３を含む各種Ｓ−ＯＤＮ（０．５μｍｏｌ／Ｌ）を遺伝子導入剤ＤＭＲＩＥ−Ｃ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、細胞に添加して培養を開始した。４日ごとに培地を交換し、１４日目に細胞培養上清中に産生されたウイルスタンパク質ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原量を測定した。
【００４５】
結果を図９に示す。なお、図９において、「ＰＣ」はＳ−ＯＤＮを添加しなかった陽性対照の結果である。
図９に示したように、Ａｎｔｉ−７０３のスクランブル配列のＳ−ＯＤＮ（Ｓｃｒａｍｂｌｅ）以外の３つのＳ−ＯＤＮ（Ａｎｔｉ−７０３，  Ａｎｔｉ−６９４，  及びＡｎｔｉ−７１３）において、陽性対照と比較して非常に高い抗ウイルス活性が認められた。この結果は、これらのＳ−ＯＤＮがヒト末梢血リンパ球へのウイルス感染を阻害することを示している。
【００４６】
【実施例５】
《ヒト末梢血リンパ球を用いた抗ＨＩＶ−１活性の検証（２）》
Ｓ−ＯＤＮとして、Ａｎｔｉ−６９４及びＡｎｔｉ−７１３の代わりに、ｇａｇ領域を標的とする２８ＡＳ（配列番号９で表される塩基配列）、及びウイルス遺伝子の逆転写に重要なポリプリントラック領域を標的とするＰＰＴ−ＡＳ（配列番号１０で表される塩基配列）を用いること以外は、前記実施例４に記載の手順を繰り返した。
結果を図１０に示す。なお、図１０において、「７０３ＡＳ」はＡｎｔｉ−７０３の結果であり、「ＰＣ」はＳ−ＯＤＮを添加しなかった陽性対照の結果である。
ｇａｇ領域を標的とする２８ＡＳ、あるいは、ウイルス遺伝子の逆転写に重要なポリプリントラック領域を標的とするＰＰＴ−ＡＳは、ＤＩＳ領域を標的とするＡｎｔｉ−７０３ほどウイルスタンパク質の発現を抑制することができなかった。
【００４７】
【発明の効果】
本発明のオリゴヌクレオチドは、抗ＨＩＶ剤の有効成分として有用であり、本発明の抗ＨＩＶ剤によれば、より効果的なＨＩＶの感染治療及び／又は感染予防が可能である。
【００４８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２〜１０の配列で表される各塩基配列は、全てのインターヌクレオチド結合がホスホロチオエート型結合である。
更に、配列番号７及び８で表される各塩基配列は、人工的に合成したランダム配列である。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で使用した各種Ｓ−ＯＤＮの配列と、その標的配列であるＨＩＶ−１のＤＩＳ領域との関係を示す説明図である。
【図２】種々濃度の各種Ｓ−ＯＤＮ（０．１μｍｏｌ／Ｌ、０．５μｍｏｌ／Ｌ、及び１．０μｍｏｌ／Ｌ）及びプラスミドｐＮＬ４−３（１μｇ）をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞における、培養上清中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原量を測定した結果を示すグラフである。
【図３】種々濃度の各種Ｓ−ＯＤＮ（０．１μｍｏｌ／Ｌ、０．５μｍｏｌ／Ｌ、及び１．０μｍｏｌ／Ｌ）及びプラスミドｐＮＬ４−３（１μｇ）をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞における、細胞内タンパク質中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】各種Ｓ−ＯＤＮ（１μｍｏｌ／Ｌ）及びプラスミドｐＮＬ−ｌｕｃ（１μｇ）をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞における、細胞内タンパク質中のルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。
【図５】各種Ｓ−ＯＤＮ（１μｍｏｌ／Ｌ）及びプラスミドｐＮＬ−ｌｕｃ（１μｇ）をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞における、細胞内ＨＩＶ−１ｍＲＮＡ遺伝子発現レベルをＲＴ−ＰＣＲにより検出した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図６】ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡ及びその５’端の構造を模式的に示す説明図である。
【図７】ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの５’端の構造（Ａ）及びその２次ＲＮＡ構造モデル（Ｂ）を模式的に示す説明図である。
【図８】ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡ（Ａ）及びウイルスｍＲＮＡ（Ｂ）の翻訳機構を模式的に示す説明図である。
【図９】ヒト末梢血リンパ球を標的とした抗ウイルス活性の測定結果を示すグラフである。
【図１０】ヒト末梢血リンパ球を標的とした抗ウイルス活性の測定結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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