(57)【要約】      （修正有）【課題】  伝達性海綿状脳症(TSE)疾患に関連する病原性プリオンタンパク質を単離し、濃縮し、そしてモニタリングする、非侵入的な方法を提供すること。【解決手段】  感染性プリオンと非感染性プリオンとを区別する方法であって、最初に試料を抗核酸抗体と接触させ、続いてプリオン特異的抗体を添加して、抗核酸抗体と、プリオンと、プリオン特異的抗体との間で複合体を形成させ、そして複合体を検出することを含んでなる方法。本方法は、患者から試料を抽出し、患者の伝達性海綿状脳症を診断することができる。【選択図】      図１
2004340924.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性プリオンと非感染性プリオンとを区別するための方法であって：
最初に試料を抗核酸抗体と接触させ、
続いて、プリオン特異的抗体を添加して、抗核酸抗体と、プリオンと、プリオン特異的抗体との間で複合体を形成させ、そして
当該複合体を検出すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
患者の伝達性海綿状脳症を診断するための方法であって：
患者から試料を抽出し、
試料を抗核酸抗体と接触させ、
続いて、プリオン特異的抗体を添加して、抗核酸抗体と、プリオンと、プリオン特異的抗体との間で複合体を形成させ、そして
当該複合体を検出し、それによって当該複合体が患者の伝達性海綿状脳症の兆候を提供すること、
を含んで成る方法。
【請求項３】
感染性プリオンを検出するためのイムノアッセイであって：
抗核酸抗体を結合させた固体の支持体を提供し、
固体の支持体を試料と接触させ、
当該支持体を洗浄してあらゆる結合していない試料を除去し、
固体の支持体をプリオン特異的抗体と接触させ、そして
プリオンが固体の支持体に結合するか否かを決定するための検出段階を実施すること、
を含んで成るイムノアッセイ。
【請求項４】
感染性プリオンの検出のためのキットであって、
抗核酸抗体を結合させた固体の支持体、及び
標識されたプリオン特異的抗体、
を含んで成るキット。
【請求項５】
感染性プリオンを検出するためのイムノアッセイであって：
抗核酸抗体を結合させるための因子でコートした固体の支持体を提供し、
固体の支持体を試料と接触させ、
支持体を洗浄してあらゆる結合していない試料を除去し、
固体の支持体をプリオン特異的抗体と接触させ、そして
プリオンが固体の支持体に結合するか否かを決定するための検出段階を実施すること、
を含んで成るイムノアッセイ。
【請求項６】
前記因子がアビジン又はストレプトアビジンであり、そして抗核酸抗体がビオチン化されている、請求項５に記載のイムノアッセイ。
【請求項７】
抗核酸抗体及び医薬として許容される担体を含んで成るワクチン組成物。
【請求項８】
患者のプリオン疾患を処置するための方法であって、抗核酸抗体及び医薬として許容される担体を含んで成る、治療的に有効な量のワクチン組成物を投与することを含んで成る方法。
【請求項９】
プリオン疾患にかかりやすい、又はそれに苦しんでいる患者における感染性プリオンの中和を誘導するための方法であって、抗核酸抗体及び医薬として許容される担体を含んで成る、治療的に有効な量のワクチン組成物を投与することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明において、我々は、プリオンの検出並びに動物及びヒトにおける伝達性海綿状脳症（TSE）の診断のための抗DNA抗体（以後「抗核酸抗体」とも称する）の使用を記載した。
【背景技術】
【０００２】
伝達性海綿状脳症（TSE）は、ヒト及び動物の両方に影響を与える、急速に進行する神経変性の致死的疾患のグループを含んで成る。TSEは、壊滅的な痴呆、ミオクローヌスを伴う錐体路兆候及び錐体外路兆候、多発性海綿状変性、アストログリオーシス、アミロイド班、ニューロンの欠損、炎症反応の不在、を含む臨床的且つ神経病理学的特徴を有し、そして通常長期の潜伏期間を特徴とする。
【０００３】
動物において、２００年にわたり認識されてきたTSE疾患の一般的に知られている例は、ヒツジ及びヤギにおいて見られるスクレイピーである(McGowan 1922)。他の動物のTSE疾患も説明されており、例えば伝達性ミンク脳症(TME, Marsh 1976)、ミュールジカ及びエルクの慢性消耗病(CWD, Williams 1980)、ウシ海綿状脳症（BSE、一般的には「狂牛」病として知られている）(Wells 1987)であり、そして更に最近では、飼いネコ、ピューマ及びチーターのネコ海綿状脳症が説明されている(Wyatt 1911)。
【０００４】
ヒトにおいて、TSEは、伝統的にクロイツフェルトヤコブ病（CJD）、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（GSS）及び致死性家族性不眠症（FFI）に分類されてきた。それらの中でも、クールー病は、ニューギニアのフォレ語族においてのみ説明されている。１９５７年のその最初の認識から長年、クールー病は、罹患した個体群の中で最も一般的な死因であったが、その発症は、疾患の伝達を早めてきた食人の中止により低下してきた。今日現在、ごくわずかな症例が、この症状に典型的な長期の潜伏期間に起因して尚も発生している。
【０００５】
これらのまれな神経変性障害は世界中で１００万人に約０．５〜１人において発症するが(Brown 1987)、TSEが、その独特の生物学並びに、新しく認識されたウシ海綿状脳症（BSE)の流行の開始及びそのヒトに対する潜在的作用についての関心により、かなりの世間的注目を集めた。BSE感染組織に対する食事による曝露を介して、それは公衆衛生に対して深刻な脅威をもたらし、そして、新たに認識されたCJDの変異型（vCJD）の発生数の増大をもたらしたという山のような証拠が存在している。現在までに、vCJDの症例が１００以上報告されており、これらの多くが英国に存在している。
【０００６】
プリオンが、TSEを引き起こす病原物質であると考えられる。TSEを引き起こす病因物質を同定することに対し、たくさんの努力がなされてきた。初期に、TSE疾患の伝染性が多くの症例において証明され、クールー病及びCJDがヒトからチンパンジーへと(Gajdusek 1966, Gibbs 1968)、海綿状スクレイピーがヒツジからヒツジへと(Cuille 1936)、そして複数の種を介してヤギへと(Pattison 1957)伝達することが証明されてきた。最も重大なブレイクスルーは、１９６１年のRichard Chandlerによるマウスへのスクレイピーの伝達の成功であった(Chandler 1961)。Chandlerの発見は、より安価で且つより操作しやすい実験モデルを提供することにより、TSEの研究をかなり容易にした。伝達の上記形態の全てが実験的に証明されたが、ウシにおける近年のBSE及びヒトにおける新規変異型CJD（vCJD）の原因が、BSEの場合には動物飼料に与えられたスクレイピーのヒツジの死骸の混合物(Brown 1997)、そしてvCJDの場合にはBSEに罹患したウシ由来の牛肉に対する食事による曝露の結果であると考えられた(Bruce 1997)。
【０００７】
TSE疾患が、「スローウイルス」又はウイロイドによっても発症しうることが示唆された(Gajdusek 1977)。しかしながら、放射線、ヌクレアーゼ、及び遺伝物質を損傷させるほかの試薬に対するスクレイピーの感染力の極度の耐性は、「ウイルス」説とは一致しない。更に、感染性のTSE物質は、最高レベルの熱及び高濃度のホルムアルデヒドに耐え(Pattison 1965)、同時に、数ヶ月から一年以上へと変化する「潜伏期間」で尚も複製することができる(Alper 1966)。
【０００８】
TSE感染物質のこれら全ての「普通でない」特徴は、Stanley Prusiner博士に「プリオン」の概念を提唱させた(Prusiner 1982)。核酸を含まないタンパク質性の感染性粒子（proteinaceous indectious particle）を意味するプリオン（PrP）は、ヒト及び動物に存在する糖タンパク質である。ヒトにおいて、それは第２０染色体上のPRNPによってコードされている(Robakis 1986)。このタンパク質の細胞型(PrPc)は、C末端に２つのN結合グリコシル化部位及びGPIアンカーを有している。これは最も一般的にはニューロンにおいて見られ、そしてかなり少ない範囲で、それは他の細胞、例えば、白血球、単球及び血小板においても見いだされている(Holada, 2000)。更に、糖脂質アンカーを欠いているPrPの可溶性型は、マウス及びヒトの血清において検出された。プリオンタンパク質の伝達性スクレイピー疾患型（PrPsc)は、その細胞性前駆体のプロテアーゼ耐性のイソ型であり、そして脳において支配的に見られる。はるかに低いレベルで、それはvCJD患者において、扁桃腺、脾臓、及びリンパ節においても発見されている(Parizsk 2001)。PrPcからPrPscへの変換は、当該タンパク質内での高次構造の変化を介して達成されると考えられる。尚も変換機構に関するあいまいさが存在するが、多くの実験的な証拠が、PrPscの存在下で、正常なPrPcが、基質として働いて、高次構造の変化を受け、そしてPrPscとなることを示唆している。この伝播の過程は、PrPcにおけるPrPscの高次構造を複製することを包含し、そしてのPrPscの凝集及びアミロイドロッドの形成をもたらして、その結果細胞死を招く(Hope 1986, Horwich 1997)。スクレイピー疾患の原因である感染物質としての「プリオン」のPrusinerの概念の結果、及び拡大解釈により、全てのTSE疾患のそれが、このタンパク質に関連すると考えられている疾患のクラスを説明するために、一般的にどのようなものがプリオン疾患と言及されるかという観念をもたらした。
【０００９】
PrPc及びPrPscの特徴
PrPcとPrPscを区別する主な特性は、それらの異なる高次構造である。PrPcからPrPscの構造的な変化は、不可欠な高次構造の変化によって最も支持されており、これは当該タンパク質のβ−シート構造の量の実質的な増大と、α−ヘリックスのわすかな減少の可能性を関連付けたものであり、これらは円二色性及び赤外分光法によって示されている(Pan 1993, Caughey 1991)。マウスPrPcのフラグメントの溶液構造は、NMRによるPrPcの一部（１２１−２３１）の二次構造の内容の直接的な決定を可能にした(Riek 1996)。
【００１０】
プロテアーゼ耐性は、PrPscをPrPcと区別する別の特徴である。培養細胞及び脳において、又はGSSを有する多くの患者由来の試料において、PrPscはその細胞性前駆体PrPcよりも小さい。細胞性プリオン及びスクレイピープリオンが同一のPRNPゲノム産物の２つのイソ型であっても、PrPcはプロテイナーゼK処理によって完全に分解されるが、PrPscはごく限られた消化を受ける。当該消化は、N末端が除去されたPrP27-30と称されるタンパク質の型をもたらす。PrP27-30は、PrPcをホストとするPrPscの複製に必要とされるPrPscコアであると仮定されている。プロテアーゼで処理されたプリオン分子であるPrP27-30又はPrPresは、スクレイピーの感染力にはっきりと関連しており(Gabizon 1988)、そしてPrPscが感染性のタンパク質であるという追加の証拠を提供する。
【００１１】
β−シート構造の有意な増大及び付随のプロテアーゼ耐性に恐らく関連している、追加の特性は、PrPscとPrPcの間の溶解性において観察される差異である。PrPcは可溶性タンパク質であるが、PrPscイソ型は高度に不溶性である。更に、PrPcは膜内に固着されたGPIテイルを介してニューロンの表面に付着した状態で見られる (Shyng 1994)、一方、PrPresは罹患細胞の細胞質において見られ(Taraboulos 1990)、これは大概後期エンドソーム及びリソソーム画分と会合しており(Arnold 1995)、そしてPrPscはまた、感染した脳由来の豊富な画分中の不定形の凝集体中に局在する(Meyer 1986)。興味深いことに、疾患関連の変異体PrPであるPrP159stop変異体は、核において極端に見られた(Lorenz 2002)。
【００１２】
スクレイピーの感染力とPrp27-30との間の密接な関係を示唆する山のような証拠が存在している。純粋な試料中であっても、感染性の単位に対するPrP分子の推定比は、104〜105未満である(Horwich 1997, Bolton 2001)。そのような低レベルの感染力では、他の成分、補因子、又は共有結合修飾が感染力に必要とされる可能性がある。キメラヒト−マウスPrPcを発現しているマウスの感受性についてのトランスジェニックな研究は、PrPc以外の少なくとも１つのホスト因子の存在を示唆し、これは仮にX因子と称され、PrPscの形成において分子シャペロンとして機能しうる(Telling 1995)。
【００１３】
プリオン病原体と会合するほかの分子
約１５〜２０のスクレイピー株が、近交系マウスにおけるそれらの潜伏期間及び病変パターンを基に同定されている。単一のPRNPの遺伝子型についてホモ接合性の近交系マウスにおける連続接種継代後の、全てのスクレイピー株がそれらの本来の疾患プロファイルを保持した。これらの観察は、多様な表現型の株が、同一の細胞性プリオン前駆体の異なる高次構造のイソ型によって左右されるか否かという疑問を研究者に抱かせ、これは高次構造依存性のイムノアッセイにより可能性が示唆されており(Safar 1998)、又はこれらの株が種々のPrPsc会合分子の結果であるか否かという疑問を研究者に抱かせた。
【００１４】
多くの研究者が、プリオンタンパク質に結合する種々の非タンパク質分子を同定してきた。正確な生物学的及び生理学的役割は、更なる研究の主題として残されている。銅及び亜鉛は、PrPcと結合することが証明されている。In vitroで、これらの二価の金属は、プリオンのスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)様活性に寄与しうる。そのようなSOD様活性及び銅含量は、スクレイピー感染した脳において劇的に減少する(Wong 2001)。
【００１５】
尚、主にN末端短縮型のプリオンタンパク質(PrP27-30)の不溶性凝集体から構成されるプリオンロッドは、１，４結合型のグルコース単位と会合することが明らかとなっている。スフィンゴ脂質、多糖及び他の膜成分も、プリオン凝集体中で発見された(Appel 1999, Klein 1998)。プリオンタンパク質と脂質膜との間の相互作用は、PrPの変換において役割を果たしうる。例えば、負電荷脂質膜が挿入されたPrPの高次構造はβシート中に豊富であるが、ラフト様膜に対するPrPの結合は、αヘリックス構造の形成を誘導する(Sanghera 2002)。
【００１６】
１９９０年代前半において、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クロイツフェルトヤコブ病及びスクレイピーを研究していたSnow等は、プリオンタンパク質のアミロイド班に対する、硫酸化プロテオグリカンの会合を文書で示した(Snow 1990)。ヘパラン硫酸抗体（抗HS）及びヘパラン硫酸プロテオグリカン抗体（抗HSPG)を用いる免疫組織化学研究において、McBrideは、スクレイピー感染したマウスの脳におけるHSPGと異常なPrPとの相関関係及び会合を文書で示した。この相関関係及び会合は、感染後７０日ほどで、且つ当該疾患の経過を通じて、観察された(McBride 1998)。PrPcからPrPscへのin vitroでの変換において、そしてプリオンの感染力の再構成実験において、硫酸化グリカンは、当該変換を容易にするか、又は感染力を増大させることが示されている(Wong 2001, Shaked 2001a)。組換えGST：：完全長プリオン及びGST：：プリオンフラグメントを用いて、Warnerは近年、ヘパリン及びヘパラン硫酸に対する組換えプリオンの直接的な結合を証明した(Warner, 2002)。プリオン配列のペプチド領域23-52は、全てのHS及びHSPGの結合試験においてポジティブであった。当該ペプチドがヘパリンに対する結合に関して完全長のプリオンとの競合に失敗したので、上記筆者は、完全なPrPcにおける別の主要なGAG結合部位が存在しうることを示唆した。別の特筆すべき観察は、異なる種（ウシ及びブタ）由来又は異なる器官（肺、腎臓及び腸）由来のGAGが、プリオン結合についての異なる親和性を示したことである。親和性の差異は、プリオン配列自体によるものであるか、又は試験したGAGにおける特定の糖単位の存在に依存するものと考えられる。
【００１７】
グリカンがPrPcからPrPscへの変換に参加するのと恐らくは異なる機構を通じて、DNAも細胞性プリオンタンパク質をβシートの高次構造に変換させうる(Cordeiro 2001)。Nandiは、プリオンペプチド106-126が、核酸−プリオン複合体の会合に参加した領域であることを証明した(Nandi 1998)。興味深いことに、PK耐性アミロイド凝集体がプリオンタンパク質と核酸との間の相互作用から得られただけでなく、当該核酸の形態も凝縮した球状の構造に変化し、これはHIV NCp7タンパク質によって誘導される核酸構造に類似していたが、ヒストンによって誘導される構造には類似していなかった(Nandi 2001)。in vitroでの高次構造及び変換研究を基に、DNAが、PrPscの変換及び凝集を容易にする触媒としてだけでなく、PrPscの高次構造の保護者として働くと仮定された(Cordeiro 2001)。
【００１８】
「タンパク質単独」説又は「プリオン単独」説が受け入れられようとも否定されようとも、遺伝情報をTSE疾患又はTSE疾患と会合する遺伝的構成(genetic make up)についての研究と関連させる努力が終わることはなかった。プリオン粒子における強固に結合したRNA又はDNA分子の存在は、PRNP遺伝子についてホモ接合性の動物において異なる表現型を有するスクレイピー因子の異なる株の伝播を説明するために提唱された(Weissmann 1991)。リターンリフォーカシングゲル電気泳動により高度に精製されたスクレイピープリオンの解析は、小さいサイズの残りの核酸を明らかにしたが、抽出されたヌクレオチドのサイズは、なんらかの意味のあるタンパク質をコードするには小さすぎた(Kellings 1992)。しかしながら、最近の報告において、Narangは、非病原性プリオンと混合した、スクレイピーハムスターの脳から精製したssDNAを接種した動物が臨床的疾患を発症したことを示した(Narang 2002)。この発見を基に、彼は、当該ssDNAによってコードされる「アクセサリータンパク質」が、PrPcからPrPscへの変換に関与しうると仮定した。プリオン関連疾患における核酸の役割は意見の分かれるところであるが、PrPscの凝集体がこれらの小分子と強固に会合していることは明らかである。
【００１９】
プリオン疾患の感染性及び伝達性
ヒトの古典的なCJDは、３つの病因学的タイプ：散発性(CJD)、遺伝性(GSS又はFFI)、及び、非常にまれで、且つクールー病を含む後天性、及び医原性CJDに分類されてきた。いずれのCJD疾患が種の壁を越えたと思われる動物のTSEに関連するかという確かな証拠は存在していない。クールー病の流行は、後天性のヒトプリオン疾患の最も大きな一連の証拠を提示してきた。散発性CJDの患者における感染の危険因子及び考えられる原因の探究は、食餌、輸血又は他の血液産物の授受に対する疾患の有意な相関関係がないことを明らかにした。しかしながら、マウスに対する脳内接種後、CJD患者から得られた血液の感染力が、CJD因子の存在の可能性を示唆した(Manuelidis 1985, Tateishi 1985)。
【００２０】
BSEは、食事による曝露から生じたものと思われる。スクレイピー疾患に感染した死体に由来する加工肉及び骨粉の栄養補給剤は、蓄牛及び他の家畜動物に給餌するために使用された。BSEがスクレイピー起源であるにもかかわらず、新規感染又はウシ間の伝達の症例は報告されてない。
【００２１】
しかしながら、vCJDをBSEと結びつける山のような証拠が存在している。疫学的データの増大は、vCJDの大部分がイギリスにおけるものであり、BSEの症例の圧倒的大部分もここで報告されている。vCJDとBSEの関係は、ヒトに最も近いモデルである、BSE適合型のサル(Bruce 1997)、BSE及びvCJDを引き起こす因子を接種された近交系マウスについての研究(Lasmezas 1996)から得られた神経病理学的証拠によって更に支持される。
【００２２】
ヒト間の伝達の犠牲者としてのvCJD患者は証明されていないが、BSEとvCJDとの密接な関係は、かなりの注目を集めた。ヒトの感染についての関心は、PrPscがBSE及びvCJDのリンパ細網組織において容易に検出されうるが、古典的CJDにおいては観察されず(Hill 1997)、これを受けて、ヒツジからウシへのスクレイピー病原の伝達が宿主域を変化させ、そして更にヒトに対して適合可能となったと考えられるという推測がある。そのような挙動についての実験的な前例は周知であり：ハムスターを経たスクレイピーのマウス適合株の継代は、マウスに戻す継代に対するそれらの伝達性を変化させ(Kimberlin 1987, Kimberlin 1989)；クールー病又はCJDのヒト株は、霊長類又はネコを経て継代しない限り、フェレット又はヤギに伝達しなかった(Foster 1994)。あるいは、BSEがウシにおける自然突然変異から発生したとする場合、この伝達性海綿状脳症（TSE）の新規株にかかりやすい種の実験的な研究は、ヒトが罹らないかを推測するのに十分なほどには進展してなかった。
【００２３】
上述の血液におけるCJDの感染力に加えて、血液における他のTSEの感染力が、種々の実験動物においても証明された。感染力の研究についての大部分の血液は、TSE適合型げっ歯類、例えばマウス及びハムスターから得られた。唯一の例外は、ヒツジモデルにおいて実施された研究であった。この実験において、BSE脳のライゼートを接種された別のヒツジから採取した全血を輸血されたヒツジは、BSEの症状を発症した(Houston 2000, Hunter 2002)。しかしながら、これらの実験結果は、十分に評価されることがまだ必要である。血液における感染力は、マウス適合型BSE、マウス適合型vCJD及び他のげっ歯類動物適合型TSE株を用いて、脳内及び静脈内を介してげっ歯類動物において確立されている。リンパ球が豊富な軟膜における感染力は、血漿中でより大きいが、それは、全血の接種材料と比較した場合に比較的小さい部分についてのみ説明する。血液中に存在するこの感染因子の分子的な定義は、現在検討中である。血液におけるそのような感染因子の発見が、PrPscとTSE疾患との間の関係を我々がよりよく理解するのを助けると予想される。ヒトCJD及びvCJDの研究は、ゲノムの感受性(genomic susceptibility)が、尚もヒトにおけるTSEの拡散に影響しうる別の因子でありうることを示唆した。散発性CJD患者の大部分が、コドン１２９のMet/Met又はVal/Valについてホモ接合性であることが明らかと成った(Belay 1999)。それにもかかわらず、全ての既報のvCJDの症例がMet/Metについてホモ接合性であることが明らかとなってきた。
【００２４】
vCJDの流行の大きさ及び期間は尚も不明のままである。行われた推測及び適用されたモデル計算に依存して、異なる予測が提案された。合計のvCJDの一つの見積もりは、２０５ほどの症例であることを予測する(Valleron 2001)。他方では、今後８０年間のvCJDの死亡についての別の予測は、感染がBSEのみに由来するならば、５０〜５０，０００に及ぶ。BSEがヒツジに感染することが証明され、且つその後それがヒトの食物連鎖に進むことが認められるならば、それは最大で１５０，０００に達しうる(Ferguson 2002)。必要なパラメーターが間違っているか、又は利用できない場合、正確な予測をすることは不可能であるが、vCJDの感染力が血液に存在する場合、どの予測も過小評価であることは確かである。更に、vCJDが、新規疾患の本質であり、且つ単にヒトにおけるCJDの増大した調査結果ではないことが証明されている(Hillier 2002)。
【００２５】
政府によって、BSE発生の拡散を排除するための対抗策がとられてきた。反芻動物のタンパク質飼料は米国及び英国において禁止された（１９８８年）。潜在的に感染した肉がヒトの食物連鎖に侵入することを防ぐための一連の施策もとられている。更にヒトへの危険性を低下させるために、FDA及びCBERは、１９８０年から１９９６年の間に６ヶ月以上英国に連続して滞在したあらゆるヒトの血液提供者を無期限に延期する新しい政策を２００１年の８月に発令した。
【００２６】
プリオン疾患の診断的アッセイ
プリオン疾患の臨床的症状はほかの神経変性疾患のものとしばしば重複し、これが診断を困難にする。これまでのところ、PK耐性PrP27-30は、TSE疾患に結び付けられる唯一のタンパク質マーカーである。それ故に、この因子の検出は、アッセイの開発の焦点となってきた。しかしながら、PrPscに特異的なモノクローナル抗体の開発は、病原性PrPscのイソ型及び正常な細胞性PrPcが同一の一次配列を有する同一のタンパク質の２つの配座異性体であるだけでなく、プリオンが弱い免疫原のようであるために、極度に困難であった。PrPscを特異的に認識することができると報告された唯一の抗体は実用的ではない(Korth 1997)。他のプリオン配列特異的モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、PrPcからPrPscを識別することができない。それにもかかわらず、これらの抗体（例えば、US4806627及びEP0861900に記載の3F4、6H4）は、試料処理とPrPcからPrPscを単離する分離技術とを組み合わせたプリオンタンパク質の捕捉又は検出のための使用において尚一般的である(Korth 1997, Kascsak 1987)。
【００２７】
１９８６年のBSEの発生から、プリオン疾患のための全ての利用可能な試験は、それらの試料の起源として、死後の動物及びヒトから採取した組織を使用している。これらの中でも、DELFIA(Dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay)と称される、組織のホモジェネートを基にしたPrPscアッセイが、スクレイピープリオンの検出のために開発された(Barnard 2000及びUS20020137114A1に記載の方法)。それは、任意の試料PK処理及びリンタングステン酸ナトリウム(NaPTA)沈殿によるPrPscの濃縮と組み合わせた、GdnHClを用いるプリオン変性段階を必要とする。PrPcからPrPscへの変換がPrPのN末端付近にあるエピトープの埋没(burial)によって達成されるので、DELFIAにおいて、PrPのN末端に対するモノクローナル抗体は、変性を測定するために使用される(Peretz 1997)。ELISA及び蛍光検出と組み合わせた別の高次構造依存性イムノアッセイ（CDI）(Safar 1998, US 20010001061A1, US20020001817A1)は、PrPsc株の高次構造の研究において説明された。
【００２８】
vCJD患者におけるPrPscの組織分布研究において、脳及び他の末梢組織のホモジェネートからのPrPscを濃縮するために改良されたNaPTA沈殿が説明された(Wadsworth 2001)。当該改良は、NaPTA沈殿の前に試料の粘度を低下させるためにエンドヌクレアーゼ処理を利用した。沈殿したペレット中のPrPscの回収は一定して９０％以上であることが報告されたが、PrPcの回収は約５％であった。PK消化の後、PK耐性プリオンの存在が、3F4モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットにおいて確認された。
【００２９】
別の類似のイムノブロットアッセイにおいて、PK消化は、PrPcを排除するためにも使用された。続いて、6H4が、PrPscの存在を決定するために使用された(Schaller 1999)。この第一世代のアッセイを基に、6H4が捕捉抗体としてプレート上にコーティングされた第二世代の発光イムノアッセイが開発された。使用したセイヨウワサビペルオキシダーゼ(POD)複合検出抗体は、6H4に結合したPrP27-30と複合体を形成することができるマウスモノクローナル抗PrP抗体であった(Biffiger 2002)。
【００３０】
欧州委員会は、１９９９年に異なる製造業者の４つのBSEキットを評価した(Moynagh 1999)。それらは全て、試料の起源としてウシの脳組織を使用し、そして全てのものが別々の試料調製手段を必要とした。キットの説明書に依存して、脳組織のホモジェネートは、変性、PK消化又はPrPsc濃縮を含む処理を必要とした。アッセイの検出システムは、DELFAにおいてはイムノブロットを利用し、あるいは、プレートELISAフォーマットにおいては化学発光又は比色定量用の基質のいずれかを使用した。
【００３１】
生きている動物のスクリーニング試験を行わずに当該疾患の拡散を制御するために、一旦罹患した動物が群れの中で同定されると、多数のウシの屠殺が実施された。生きている動物の診断アッセイについての緊急性は、変異型クロイツフェルトヤコブ病の第一例が１９９６年に報告されたときに高まった。
【００３２】
生前のTSE診断の開発は、３つの主要な困難を提示した：（１）不十分な感度−脳組織中を除き、他の組織又は体液中のPrPsc濃度は非常に低いと考えられる。従って、高感度の技術が検出に必要とされる。（２）適切な試料の処理−あらゆるタンパク質変性法又はPK消化法が、病原性PrPscの構造に対する潜在的な影響を与えることがあり、これは偽陰性の結果をもたらす可能性がある。例えば、PrPscの中間型がPK耐性でないこともあることが示唆されている(Horiuchi 1999, Jackson 1999, Swietnicki 2000)。そして、（３）PrPsc特異的抗体の不在及び病原因子と血中のPrPscとの間の不完全に特徴付けられている分子の関係−これが生前診断のためのアッセイフォーマットを設計することを困難にしている。
【００３３】
感度を向上させるための有力なアプローチは、PrPscのin vitro増幅である。PrPscが存在する場合、反復的な超音波処理のサイクルが、プロテアーゼ感受性細胞性PrPにプロテアーゼ耐性凝集体を形成させうることが報告されている。この筆者は、この「タンパク質の誤った折りたたみの周期的増幅」(PMCA)法において、超音波処理が新規に形成した凝集体を破壊し、そして新規のPrPscの継続した形成のための多数のより小さい単位を生成しうると説明した(Saborio 2001, WO0204954)。４０回のPMCAサイクルの終了時に、試料はPK消化にかけられ、そしてイムノブロットによって検出された。これは、当該増幅が３０倍以上プロテアーゼ耐性のPrPを生成したと主張されている。プロテイナーゼ耐性PrPが、増幅サイクルの間に基質としての正常なプリオンタンパク質を犠牲にして生成したので、大量の同一種の正常プリオンが必要とされた。別の種由来の正常なプリオンも基質として働きうるか否か、あるいは、組換え起源由来又は脳組織以外の起源由来のプリオンタンパク質が使用されうるか否かは証明されてない。そのような証拠は、vCJDの検出が望まれる場合に有用であろう。
【００３４】
第三眼瞼のリンパ系組織の免疫組織化学は、ヒツジ(ovine)のスクレイピーの臨床前診断に説明されてきた(O'Rourke 2000, US6165784, US6261790)。小さな外科的手段に依存して、当該アッセイは、スクレイピーの検出のために、ヒツジの末梢組織、第三眼瞼のリンパを利用する。当該免疫組織化学は、あるイソ型を他のものと区別するために、全ての特異的モノクローナル抗体のカクテルを使用した。PrPcの反応性を低下させるためのホルマリン固定の後、当該試料は、PrPscの反応性を増強する、ギ酸及び熱による前処理にかけられた。当該アッセイがまだ組織を元にしたものであるという事実及び、変性剤で処理されない限り、PrPscが免疫組織化学染色においてほとんど免疫反応性を示さなかったという観察にも関わらず、この生前臨床前診断は、初期の臨床前のスクレイピーの段階にある、スクレイピーに罹患したヒツジの同定方法を提供しただけでなく、生きている動物の試験を一歩前進させた。
【００３５】
細胞性プリオンの排除、それに続く無差別な抗プリオン抗体の認識による病原性プリオンの伝統的同定に加えて、PrPcからPrPscを識別することができる他の試薬、例えばプラスミノーゲン及びフィブリノーゲンが発見された。これらのヒト血液成分であるタンパク質とPrPscとの相互作用の機構は不明である。しかしながら、磁気ビーズ上に固定された場合、プラスミノーゲンは、マウス、ウシ及びヒツジの脳のホモジェネートから、PrPscを選択的に沈殿させた。提供された証拠は、個々のPrPsc分子の一次配列又は特異的な三次構造ではない、様々な種のPrPscに共通の特性が、プラスミノーゲンに対する結合に重要であろうことを示した(Fischer 2000, Maissen 2001)。病原性プリオンタンパク質の捕捉及び検出のためのプラスミノーゲン及び他の血清／血漿タンパク質の使用のための利用は、WO0200713及びUS20010053533A1において説明されている(Aquizzi 2001)。
【００３６】
最近の研究により、プリオン疾患を有する動物及びヒトの尿中のプリオンタンパク質の新規イソ型が同定されている(Shaked 2001b, WO0233420A2)。研究者によりUPrPscと称されているこのイソ型は、沈殿可能であり、PK耐性であり、且つ感染した個体においてのみ検出可能であり、正常なコントロールにおいては検出されなかった。最も重要なことに、それらの刊行物において指摘されているように、UPrPscは、臨床的な兆候が、接種されたハムスターにおいて発症するずっと前から出現していた。しかしながら、スクレイピーハムスターの尿から単離されたUPrPscが、正常なハムスターにおいて脳内から再度接種された場合、それは、かなりの量の脳由来PrPscが接種された場合に動物が臨床的兆候を発症する潜伏期間をはるかに超す２７０日経過後であっても、疾患を引き起こさなかった。脳内からUPrPscを接種されたそれらのハムスターが、亜臨床的状態又は保因状態に尚もあったことがありえないわけではない。更に、PK耐性PrPは腎臓において見つかっておらず、これはこのUPrPscが他の器官から発生し、そして血液を介して尿に運ばれたことを意味している。この重大な観察は、間違いなくPrP代謝のよりよい理解をもたらすだろう。
【００３７】
従って、ヒト及び動物においてPrPscを検出し、そしてTSEを診断するより良い方法に関するまだ満たされていない必要性が残されている。本発明の目的は、TSE疾患に関連する病原性プリオンタンパク質を単離し、濃縮し、そしてモニタリングする、非侵入的な方法を提供することである。会合する結合パートナーの認識を介してPrPscに結合する選択的抗DNA抗体の使用を含む本発明は、細胞性プリオンタンパク質ではなく、PrPscの識別力のある捕捉を包含する。我々は、PrPscに対する核酸の高親和性の会合の証拠を提供し、そしてそのような核酸：：PrPsc複合体がPK消化及びヌクレアーゼ処理後であっても生存したことを証明する。
【発明の開示】
【００３８】
本発明の説明
本発明の裏付けにおいて提供される証拠は、PrPscが、研究により、核酸、主にDNAに対して高い親和性で会合することを示した。核酸との同様の会合は、正常な細胞性PrPcでは観察されなかった。当該証拠はまた、当該会合が強固であり、PK消化及びヌクレアーゼ処理に対し耐性があったこと、そしてPrPscが、選択的抗DNA抗体によって容易に単離されうることを証明した。
【００３９】
本発明は、PrPscの検出のための任意のプリオン配列特異的抗体と組み合わせた、高い親和性でPrPscに会合する核酸を介してPrPscを捕捉するための抗DNA抗体の使用に関する。
【００４０】
別の観点において、本発明は、上述のように、好ましくは病原性プリオンタンパク質に結合するが、プリオンタンパク質の正常な細胞型には結合しない、選択的DNA抗体に関する。
【００４１】
別の観点において、本発明は、上述のように、プリオン配列特異的抗体との組み合わせにおける、会合する核酸の高親和性の認識を介するPrPscの検出のための、選択的DNA抗体に関する。
【００４２】
別の観点において、本発明は、上述のように、生物学的試薬の製造における、PrPscの単離、精製、捕捉、排除及びモニタリングのための選択的DNA抗体に関する。
【００４３】
別の観点において、本発明は、PrPscの存在を決定するための組成物及びキットであって、上述のように、アッセイ手順における捕捉又は検出段階のいずれかのための、抗DNA抗体を含んで成る組成物及びキットに関する。
【００４４】
別の観点において、本発明は、病原性プリオンタンパク質に対する結合パートナーとしての高親和性で会合したDNAに応じて産生されるPrPsc抗体の存在を決定するための組成物及びキットに関する。
【００４５】
更に別の観点において、本発明は、抗PrPsc抗体、及びPrPscと相互作用し、そして／あるいは会合しうる前記核酸を用いるそれらの製造、並びに核酸：：PrPsc複合体及びプリオン疾患感染の検出におけるそれらの使用、に関する。
【００４６】
別の観点において、本発明は、上述のような選択的DNA抗体の使用の利益のためにヌクレアーゼ消化を包含する、過酷でない試料の処理手順に関する。
【００４７】
本発明の特定の態様の複数の例は以下の通りである：
【００４８】
感染性プリオンと非感染性プリオンとを区別するための方法であって：
最初に試料を抗核酸抗体と接触させ、
続いて、プリオン特異的抗体を添加して、抗核酸抗体と、プリオンと、プリオン特異的抗体との間で複合体を形成させ、そして
当該複合体を検出すること、
を含んで成る方法。
【００４９】
患者の伝達性海綿状脳症を診断するための方法であって：
患者から試料を抽出し、
試料を抗核酸抗体と接触させ、
続いて、プリオン特異的抗体を添加して、抗核酸抗体と、プリオンと、プリオン特異的抗体との間で複合体を形成させ、そして
当該複合体を検出し、それによって当該複合体が患者の伝達性海綿状脳症の兆候を提供すること、
を含んで成る方法。
【００５０】
感染性プリオンを検出するためのイムノアッセイであって：
抗核酸抗体を結合させた固体の支持体を提供し、
固体の支持体を試料と接触させ、
当該支持体を洗浄してあらゆる結合していない試料を除去し、
固体の支持体をプリオン特異的抗体と接触させ、そして
プリオンが固体の支持体に結合するか否かを決定するための検出段階を実施すること、
を含んで成るイムノアッセイ。
【００５１】
感染性プリオンの検出のためのキットであって、
抗核酸抗体を結合させた固体の支持体、及び
標識されたプリオン特異的抗体、
を含んで成るキット。
【００５２】
感染性プリオンを検出するためのイムノアッセイであって：
抗核酸抗体に結合する因子でコートした固体の支持体を提供し、
固体の支持体を試料と接触させ、
支持体を洗浄してあらゆる結合していない試料を除去し、
固体の支持体をプリオン特異的抗体と接触させ、そして
プリオンが固体の支持体に結合するか否かを決定するための検出段階を実施すること、
を含んで成るイムノアッセイ。
【００５３】
上述のイムノアッセイの別の態様は、抗核酸抗体に結合することができる因子でコーティングされ、又はそれを担持している固体の支持体を提供する。例えば、固体の支持体上でアビジン又はストレプトアビジンを用い、アビジン又はストレプトアビジンを介して固体の支持体に結合するように、抗核酸抗体をビオチン化する。
【００５４】
本発明の更なる態様は、抗核酸抗体及び医薬として許容される担体を含んで成るワクチン組成物に関する。
【００５５】
患者のプリオン疾患を処置するための方法であって、抗核酸抗体及び医薬として許容される担体を含んで成る、治療的に有効な量のワクチン組成物を投与することを含んで成る方法。
【００５６】
プリオン疾患にかかりやすい、又はそれに苦しんでいる患者における感染性プリオンの中和を誘導するための方法であって、抗核酸抗体及び医薬として許容される担体を含んで成る、治療的に有効な量のワクチン組成物を投与することを含んで成る方法。
【００５７】
本発明の詳細な説明
用語「試料」は、本明細書で使用する場合、注目の解析物を含みうる任意の物質を言及する。試料は生物学的な液体、例えば全血又は、赤血球、白血球、血小板、血清及び血漿を含む全血の成分、腹水、尿、脳脊髄液、及び注目の解析物を含みうる身体の他の構成成分、例えば脳のホモジェネートであってもよい。任意に、試料は、水、土壌及び植物からも得られる。用語「患者」は、本明細書で使用する場合、ヒト及び／又は動物を言及する。
【００５８】
様々なイムノアッセイのプロトコールが知られており、そして本発明に適用されうる。当該アッセイは、抗プリオン抗体に付着して標識されたリガンドを形成しうる任意の酵素標識を用いて実施されうる。オキシダーゼのような酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ及びガラクトシダーゼが、好ましい標識である。所定の標識にとって適当な基質を決定することは当業者の技術範囲内である。基質は、当該標識の酵素反応に関与する一連の反応に関与する酵素標識又は材料によって直接働く材料であってもよい。検出のための他の標識及び材料は、例えば、リガンド、ヌクレオチド、又はビオチンであってもよい。標識された抗体の検出は、ポリマー複合体による酵素増幅及びイムノPCRを含む種々の方法によってもよい。以下の例は、本発明の範囲を例示するために示されているが、限定するものではない。
【００５９】
脳ホモジェネートの調製：
正常及びスクレイピーハムスターの脳のライゼートは、１０％全脳組織のホモジェネート／PBS(w/v)としてBaltimore Research and Educationから入手した。当該ライゼートは、５％デオキシコール酸ナトリウム及び５％lgpal CA-630（NP40と等しい）／PBSから構成される１/１０量の１０ｘデタージェントホモジェネート緩衝液を添加し、４℃で１時間インキュベートし、続いて１０００ｇで１０分間遠心することによって更に処理された。生じた上清は回収され、そして当該アッセイにおいて使用された。
【００６０】
正常及びBSEの脳組織は、英国のVeterinary Laboratories Agency (VLA)によって提供された。正常及びスクレイピーのヒツジの脳組織は、米国のUSDAのAnimal Disease Researchによって提供された。正常なヒトの脳組織は、米国のNational Prion Disease Pathology Surveillance Center(NPDPSC)及び英国のNational CJD Surveilance Unit (NCJDSU)によって提供された。ヒトsCJD及びvCJDの脳組織は、ハムスターの脳のホモジェネートの調製と同一（又は類似）の方法によって処理された。
【００６１】
抗DNA抗体及びDNA結合タンパク質：
業者から入手したモノクローナル抗体は、（１）ss-、ds-DNAを認識するマウスモノクローナル抗体であって、QED Bioscience社のサブクラスIgM（カタログ番号１２４０３）及びサブクラスIgG3（カタログ番号１２４０４）のモノクローナル抗体、（２）Biogenesis社の、クローンAE-2のサブクラスIg2b（カタログ番号２６６０−２３０８）のds-DNAを認識するマウスモノクローナル抗体モノクローナル抗体及びクローン４９／４A１のサブクラスIg2b（カタログ番号２６６０−２３１６）ss-、ds-DNAを認識するマウスモノクローナル抗体、であった。これらの抗体を産生するために使用された免役原は、ウシ胸腺DNA及び製造業者によって示されたラジ・バーキット(Raji Burkitts)リンパ腫細胞由来の核であった。市販のもの以外の追加のモノクローナル抗体も評価された。E.コリ由来の一本鎖結合タンパク質(SSB)はSigma(Sigma, MO, USA, Cat.#S3917)から購入した。
【００６２】
磁気ビーズに対する抗体及びタンパク質の複合：
０．３５ｍｌのDynabeads(商標)M-280 Tosylactivated (Dynal Biotech, NY, USA, Cat.#142.03/04)はPBSで二回洗浄され、そして当該ビーズはマグネット(Dynal Magnetic Particle Concentrator, MPC)を用いて緩衝液から単離された。１００μｇの精製された抗体又はタンパク質／１ｍｌのPBSを、洗浄したビーズに添加した。回転させながらのインキュベーションが、３７℃で１８〜２０時間実施された。ビーズは、MPCを用いて緩衝液から単離され、１ｍｌのPBS（０．１％BSA）を用いて２回洗浄され、そして室温で５分間回転され、同時に洗浄された。抗体複合ビーズは、続いて、０．１％BSAを含むｐH８．０の０．２M Tris-HClを用いて３７℃で３〜４時間ブロッキングされた。当該ビーズは、引き続いて、１ｍｌのPBS（０．１％BSA）で２回、そして１ｍｌのPBS（０．１％BSA）で１回、それぞれ室温で１０分間インキュベートして洗浄された。ビーズは、続いて１ｍｌのPBS（０．１％BSA）で１回洗浄され、そして１ｍｌのPBS（０．０５％アジ化ナトリウム）中で４℃で保存された。
【００６３】
プロテイナーゼK消化及びBenzonase(商標)ヌクレアーゼ消化：
脳ライゼートのPK消化のための条件：脳のホモジェネートは、非イオン性の界面活性剤を含む、又は含まないPBS緩衝液中で懸濁された。合計のホモジェネートのタンパク質濃度は、わずかに２．５ｍｇ／ｍｌであった。PK(Roche Diagnostics, IN, USA, カタログ番号１３７３１９６）は、終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるよう添加された。インキュベーションは、３７℃で０．５〜１時間であった。消化は、Pefalboc SC(Roche Diagnostics, IN USA、カタログ番号１５８５９１６）を終濃度４ｍMとなるよう添加することによって停止された。
【００６４】
脳ライゼートのBenzonase(商標)ヌクレアーゼ消化のための条件：：脳のホモジェネートは、２ｍMのMg2+を含む、非イオン性の界面活性剤を含む、又は含まないTris-HCl緩衝液中で懸濁された。合計のホモジェネートのタンパク質濃度は、わずかに２．５ｍｇ／ｍｌであった。ヌクレアーゼ（CN Biosciences, CA, USA,  カタログ番号７０６６４）は、終濃度が１００U／ｍｌとなるよう添加された。インキュベーションは、３７℃で０．５〜１時間であった。消化は、EDTAを終濃度１０ｍMとなるよう添加することによって停止された。
【００６５】
PrPscの免役沈降(IP)、非還元電気泳動及びイムノブロット検出：
磁気ビーズと複合した抗DNA抗体は、免役沈降によって脳のホモジェネートからPrPscを捕捉するために使用された。IPの手順は以下のプロトコールから成る：ビーズと複合した１００μｌの抗体と１〜５μｌの脳のホモジェネートと全量１ｍｌのIP緩衝液（３％Tween20及び３％Ipgal CA-630／PBS）中で混合し、そして回転させながら２５℃で２．５時間インキュベートする。続いて、MPC装置を用いてビーズを分離し、そしてIP洗浄緩衝液（２％Tween20及び２％Ipgal CA-630／PBS）と一緒に３０秒間３回ボルテックスにかけてビーズを洗浄する。続いて、NuPAGE(商標)試料緩衝液と一緒に１０〜１５分間ビーズを加熱することによって捕捉したPrPscを溶出する。IP捕捉由来の溶出された試料は、４〜１２％NuPAGE(商標)Bis-Tris Gel(Invitrogen, CA, USA、カタログ番号NP0302）上に流され、そして２００Vで４５分の非還元電気泳動にかけられた。イムノブロットの手順は以下のように実施された：ゲル内で分離されたタンパク質を０．２μｍのPVDF膜(Invitrogen, カタログ番号LC2002）に３０Vで６０分間かけて移す。続いて、Blocker(商標)のカゼイン／TBS（０．０５％Tween20）(Pierce Chemical Corp., IL, USA、カタログ番号37532)を用いて振とうしながら２４℃で１時間、又は４℃で一晩膜をブロッキングする。続いて、一次抗体として、3F4(Signet, MA, USA, カタログ番号9260-02)を１：３０００に希釈して使用し、ハムスター及びヒトのPrPscを検出し、あるいは6H4(Prionics AG, Switzerland, カタログ番号01-011)を１：５０００に希釈して使用し、ウシ及びヒツジPrPscをそれぞれ検出する。１０％Blocker(商標)のカゼインTBST緩衝液(25mM Tri-HCl, 0.2M NaCl, 0.2% Tween20, pH8.0)中で希釈した一次抗体を用いて、振とうしながら２５℃で１時間膜をインキュベートする。TBST緩衝液を用いて３ｘ５分間洗浄する。続いて、５０％Blocker(商標)のカゼインTBST緩衝液中で１：１０，０００〜１：３０，０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合ヤギポリクローナル抗マウスIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, USA、カタログ番号115-035-003)を、２５℃で１時間振とうしながらインキュベートする。続いて、TBST緩衝液を用いて振とうしながら６ｘ５分間洗浄する。続いて、ECLケミルミネッセンス基質(Amersham Biosciences, NJ, USA、カタログ番号RPN2109）又はSuperSignal West Duraケミルミネッセンス基質(Pierce)を膜上に添加して５分間発色させる。続いて、Bio Max MR-2フィルム(Kodak, NY, USA)又はChemiDoc Gel Documentation System(Bio-Rad, CA, USA)のいずれかに曝露することによってイメージをとる。
【００６６】
ワクチン及び治療上の使用
本発明の別の観点は、治療上での使用としての抗核酸抗体の治療上での使用に関する。動物モデルは、例えば、vCJDに感染されうる。当業者は、感染性プリオンを結合させ、且つ中和するために、抗核酸抗体を当該動物に注射する。疾患の低下又は排除という結果になる。
【００６７】
利点
本発明は、高親和性で会合する核酸の、当該核酸：：PrPsc複合体における認識によってPrPscを捕捉するための抗DNAを使用する。核酸の強固な会合がPrPscに対してのみであって、PrPcに対するものではないため、本発明はPrPscの検出のための非侵入的手段を提供したが、PK消化又は他のタンパク質修飾手順は必要とされなかった。穏やかな条件が、病原性プリオンタンパク質の本来の構造及び高次構造を保存し、それによって真のPrPscの存在を決定する機会を提供し、一方、激しい試料の処理に起因するPrPscの産生を最小化する。
【００６８】
試料の調製における限定されたヌクレアーゼ消化を含む又は試料緩衝液に含まれるBenzonaseヌクレアーゼ消化が、核酸：：PrPscに対する選択的な抗DNA結合を危うくしないことを示した証拠は、内因性の核酸の干渉の干渉を排除しうる。
【００６９】
抗DNA抗体の使用は、それらが結合特異性を示すという利点を提供する、更に固相に対する直接コーティングにおいて容易に扱われ、同様にシグナルを与える試薬、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合するために、又は他の所望の診断アッセイフォーマットに採用されるように複合されうる。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】スクレイピーハムスターのPrPscの抗DNA IP捕捉及びイムノブロット。ハムスタースクレイピーPrPscは抗DNA抗体によってイムノキャプチャーされ、続いてSDS-PAGE及び3F4イムノブロットにかけられた。結果は、３つの別々の実験から得られた（レーン番号１−４、５−８及び９−１０）。
【図２】BSE PrPscのIP捕捉及びイムノブロット。BSE PrPscは、抗DNA抗体及びDNA結合タンパク質により、免疫沈降(IP)、続く6H4イムノブロットによって検出された（レーン番号１−１１及び１２−１４）。
【図３】様々な処理をしたハムスタープリオンのIP及びイムノブロット。IP及びイムノブロットは、各項DNA抗体について様々な条件のもと実施された。（１）スタンダード：IPは、IP緩衝液中でスクレイピー又は正常なハムスターの脳のホモジェネートを用いて実施した（レーン１，５，９，１３，１７−２０）。（２）DNA阻害：５μｇ／ｍｌの、フェノール／クロロホルム抽出し，エタノール沈殿し、そして超音波処理したサーモンDNA(Sigma, MO, USA, カタログ番号D7656)が阻害剤としてIP緩衝液中に添加された（レーン２，６，１０，１４）。（３）プロテイナーゼK消化：スクレイピーハムスターの脳のホモジェネートが、５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼKを用いて３７℃で１時間処理された。消化はPefabic SCを４ｍMの終濃度で添加することによって停止させた。消化されたホモジェネートは、IP緩衝液中、続いてスタンダードのIP中でスパイクされた（レーン３，７，１１，１５）。（４）ヌクレアーゼ消化：スクレイピーハムスターの脳ホモジェネートは、１００U/ｍｌのBenzonase(商標)ヌクレアーゼを用いて３７℃で１時間処理された。消化は、EDTAを１０ｍMの終濃度まで添加することによって停止した。消化されたホモジェネートは、IP緩衝液中、続いてスタンダードのIP中でスパイクされた（レーン４，８，１２，１６）。
【図４】OCD4によるsCJD及びvCJDの脳からのPrPscのイムノキャプチャー。OCD4複合ビーズが、sCJD又はvCJDのいずれかに罹患した患者、及び２人の罹患していない患者（正常なコントロール）由来の、明確にされた脳のホモジェネートにおけるPrPを免疫沈降させるために使用された。免疫沈降したものは、続いて、SDS-PAGE（１２％ゲル）及び抗PrP抗体3F4を用いるウェスタンブロットによって解析された。OCD4はsCJD（レーン１）及びvCJD（レーン３）の脳内のPrPscを特異的に捕捉したが、正常な脳（レーン５及び７）内のPrPcは捕捉しなかった。sCJD及びvCJDの脳からOCD4が捕捉してPrPは、PKによる処理（３７℃で１時間、５０μｇ／ｍｌ）がPK耐性のコアPrPresフラグメントを生成するので（レーン２及び４）、真正のPrPscである。右側のパネル。sCJD、vCJD及び正常なコントロール由来の、明確にされた脳のホモジェネートは、PKの不在下（−）又は存在下（＋）インキュベートされた（３７℃で１時間、５０μｇ／ｍｌ）。PK消化が終了した後、試料はSDS-PAGEゲル（１２％）上に直接流され、そして3F4抗体を用いるウェスタンブロットで解析された。sCJD２型及びvCJDの脳組織は、WHO由来のよく特徴付けられているTSE参照材料である。
【図５】vCJD患者の脳内のPrPscについてのOCD4を基にしたキャプチャーイムノアッセイ。vCJDの１０人の症例(v1-v10)由来の脳のホモジェネート（１０μｌ）が、OCD4/3F4捕捉免疫沈降アッセイにおいて使用された。当該実験は、好意により提供されたvCJDの症例（症例番号：95/052(1), 96/045(2), 97/049(3), 98/063(4), 98/148(5), 98/154(6), 99/082(7), 99/090(8), 00/066(9), 00/101(10)）を用いて、英国のNCJDSUにおいて実施された。
【図６】OCD4による完全長のPrPsc及びPK耐性コアフラグメント両方のイムノキャプチャー。３人のvCJDの症例由来の脳のホモジェネートのアリコートがこの実験において使用され、そして英国のNCJDSUにおいて実施された。最初のアリコートはPKで消化された(+PK)。第二のアリコートはPKで消化され、そして次にOCD4による免疫沈降にかけられた(+PK+OCD4)。第三のアリコートは、PK処理無しに直接OCD4による免疫沈降を受けた(-PK+OCD4)。上記全ての試料が、3F4抗体を用いるウェスタンブロット上で解析された。PK-resフラグメント（レーン１〜５）はOCD4で免疫沈降したもの（レーン６〜１０）において回収された。未処理試料中の完全長のPrPscは、同様にOCD4によって効率的に捕捉されうる（レーン１１〜１５）。１０％の脳のホモジェネートのインプットの量が、PrPバンドのよりよい分離のために幾つかの場合において変更されたことに注意すること。
【図７】cVJDの脾臓におけるPK耐性PrPのOCD4イムノキャプチャー。脾臓のライゼートは、１０％のホモジェネートを用い、更に細片を除去するための簡単な遠心の後、vCJDの症例（エジンバラにあるNCJDSUによって提供された症例番号96/045及び98/148）から調製された。PK処理は、反応が１０ｍMのPefablocによって終了する前に、５０μｇ/ｍｌで、３７℃で１時間実施された。消化した脾臓のライゼートの各１００μｌのアリコートは、１４，０００ｘｇでの、４℃で１時間の遠心によってペレット化されるか（レーン１）、あるいはOCD4（レーン２及び４）及び無関係のmAb（非特異的結合のためのコントロールとしてのレーン３及び５）による免疫沈降にかけられた。脾臓内のPK耐性Prpの検出は、3F4抗体を用いるウェスタンブロット上で実施された。
【図８】BSE PrPscのOCD4イムノキャプチャー。BSE又はウシのコントロール(CON)由来の脳のライゼート（１０％，ｗ/ｖ）が、溶解緩衝液中でのホモジェナイゼーション、続く簡単な遠心によって調製された。明らかになった脳のライゼートのアリコート（各１μｌ）が、PK消化の前（レーン１及び２）及び後（レーン３及び４）の免疫沈降(IP)において使用された。IP及びPK消化無しの追加のアリコート（１μｌ）（レーン５及び６）は全インプットの参照としての役割を果たした。全ての試料が、続いてSDS-PAGEによって分離され、そしてウシPrPを認識することができる6H4抗体を用いるウェスタンブロット上で検出された。この実験は、ロンドンのウェイブリッジにあるVeterinary Laboratories AgencyのP3施設で実施され、ここでは、BSEに罹患したウシ及び正常なウシが好意により提供された。OCD4は、PKの不在下又は存在下でBSE脳由来のPrPのみを免疫沈降した。
【図９】スクレイピーのヒツジにおけるPrPscのOCD4イムノキャプチャー。PKによる処理（５０μｇ/ｍｌで３７℃で１時間）前及び後の、天然のスクレイピー(Sc)及び正常なヒツジのコントロール(N)の脳由来のPrPのOCD4による免疫沈降。実験はメインテキストに記載のように実施された。OCD4複合ビーズでの免疫沈降は、ウェスタンブロット上での6H4抗体を用いるウェスタンブロット上で確認された。各アッセイは１μｌの１０％脳ホモジェネートを使用した。
【図１０】OCD4によるヒト血漿中でスパイクされたPrPscの効果的なイムノキャプチャー。スパイク材料(S)は、スクレイピーハムスター脳の１μｌの５％ホモジェネートを使用した。IP緩衝液（１ｍｌ）中での標準的なPrPscのイムノキャプチャーをレーン１及び８に示した。レーン２〜４の場合、当該スパイク（１μｌ）は、４００μｌのIP緩衝液を添加した０．６ｍｌの３つの正常なヒト血漿調製物A，B及びC（０．６ｍｌ血漿／S)に添加された。レーン５〜７は、０．４ｍｌのIP緩衝液を含むスパイクされていない血漿のアリコート（０．６ｍｌの血漿）を表すレーン９〜１１の場合、それぞれ５ｍｌの血漿A，B及びCは、OCD4ビーズを用いてプレインキュベートされ、続いてPBS中で当該ビーズを簡単に洗浄した。ビーズで処理された血漿は、続いて、１ｍｌのIP緩衝液（５ｍｌからS）中でスパイク（１μL）と一緒にインキュベートされた。OCD複合ビーズによる標準的な免疫沈降は、全量１ｍｌで実施され、続いてメインテキストに記載のように3F$抗体を用いてウェスタンブロットにかけられた。インプットのコントロール（レーン１及び８）と比較した場合、OCD4によってスパイクされたPrPscの有意な再捕捉は、大過剰に存在する血漿中で達成された（６００μLの血漿対１μLのスパイク）（レーン２〜４）。更に、大量の正常血漿とOCD4複合ビーズのプレインキュベーションが、レーン９〜１１で示されたようなPrPscを捕捉するその結合能を損なわず、又は阻害しなかったという事実は、潜在的なOCD4阻害剤がヒト血漿中に存在するという可能性を排除する。OCD4は、ヒト血漿由来のPrPc（レーン５〜７）を捕捉しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【外国語明細書】
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