(57)【要約】【課題】内分泌撹乱化学物質の量が微量であっても検出及び定量可能な手段を提供する。【解決手段】多くの内分泌攪乱化学物質に対しリセプターとしての機能を持つエストロジェンリセプターを認識することのできるペプチド、及びそれをコードするポリヌクレオチド。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチド。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつエストロジェンリセプターを認識するペプチド
【請求項２】
請求項１記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
以下の工程を含む内分泌撹乱化学物質の定量方法。
（１）エストロジェンリセプターを、被検試料及び標識した請求項１記載のペプチドと接触させる工程
（２）エストジェンリセプターと結合した請求項１記載のペプチドの量を測定する工程
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エストロジェンリセプターを認識するペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド、並びに前記ペプチドを利用した内分泌撹乱化学物質の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
環境中に存在する内分泌攪乱化学物質の多くはエストロジェンリセプターと結合することにより作用する。近年、内分泌攪乱化学物質の有害性が問題視されてきているが、微量の内分泌攪乱化学物質を検出定量する有効な手段は開発されていない。内分泌攪乱化学物質は、エストロジェンとエストロジェンリセプターとの結合を競合的に阻害するため、内分泌攪乱化学物質の測定は、この阻害活性を指標として行われることが多い。しかし、この方法では、エストロジェンの結合活性が強すぎるため、内分泌撹乱化学物質の量が少ない場合には、阻害活性が発揮されず、内分泌撹乱化学物質を検出定量できないことがある。
【０００３】
また、エストロジェンリセプターのエストロジェン結合部位以外の部位と結合する物質は、内分泌撹乱化学物質のリセプターとの結合をブロックする薬剤と利用できると考えられるが、そのような物質は今のところ知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、内分泌撹乱化学物質の量が微量であっても検出及び定量可能な手段並びに内分泌攪乱化学物質をブロックする手段とを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、上述した阻害活性を指標とした内分泌撹乱化学物質の測定法において、エストロジェンの代わりに、より結合活性の弱いペプチドを用いることにより、微量の内分泌撹乱化学物質を検出できることを見出した。また、このようなペプチドのうち、エストロジェンリセプターのエストロジェン結合部位以外の部位と結合するものは、内分泌撹乱化学物質のリセプターとの結合をブロックする薬剤としても利用できる。
【０００６】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドである。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつエストロジェンリセプターを認識するペプチド
また、本発明は、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０００８】
更に、本発明は、以下の工程を含む内分泌撹乱化学物質の定量方法である。
（１）エストロジェンリセプターを、被検試料及び標識した上述の本発明のペプチドと接触させる工程
（２）エストジェンリセプターと結合した前記ペプチドの量を測定する工程
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明のペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すものである。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつエストロジェンリセプターを認識するペプチド
（ｂ）のペプチドにおける欠失等されたアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常は７個以下であり、好ましくは５個以下であり、更に好ましくは２個以下である。
【００１１】
本発明のペプチドは、エストロジェンリセプターと特異的に結合することから、エストロジェンリセプターの検出に利用することができる。
【００１２】
また、本発明のペプチドは、内分泌撹乱化学物質の定量にも利用できる。即ち、エストロジェンリセプターを、被検試料及び標識した本発明のペプチドと接触させた後、エストロジェンリセプターと結合した本発明のペプチドの量を測定することにより、被検試料中の内分泌撹乱化学物質を定量できる。
【００１３】
ここで使用するエストロジェンリセプターは特に限定されないが、ヒト由来のものを使用するのが好ましい。内分泌撹乱化学物質は、エストロジェン様活性を持つ化学物質であればどのようなものでもよく、例えば、ダイオキシン、ＰＣＢ、などが定量可能である。本発明のペプチドの標識方法は特に限定されず、例えば、酵素によって標識することができる。エストロジェンリセプターと、被検試料及び本発明のペプチドとの接触方法も特に限定されず、例えば、エストロジェンリセプターをプレートに固相化し、これに被検試料と本発明のペプチドを添加すればよい。エストロジェンリセプターと結合した本発明のペプチドの量の測定は、ペプチドの標識方法、エストロジェンリセプターとの接触方法に応じて決めればよい。例えば、エストロジェンリセプターをプレートに固相化し、ペプチドを酵素で標識した場合は、プレートに発色基質を添加し、比色によりエストロジェンリセプターと結合した本発明のペプチドの量を測定できる。エストロジェンリセプターと結合する本発明のペプチドの量は、被検試料中の内分泌撹乱化学物質の量が多ければ多いほど少なくなる。従って、リセプターと結合した本発明のペプチドの量を測定することにより、被検試料中の内分泌撹乱化学物質を定量できる。
【００１４】
本発明のペプチドのうち、エストロジェンリセプター中のエストロジェン結合部位以外の部位と結合するペプチドは、内分泌撹乱化学物質のリセプターとの結合をブロックする薬剤として利用できる。
【００１５】
【実施例】
〔実施例１〕　エストロジェンリセプター認識ペプチドを含むクローンの選択
精製した遺伝子組換えヒトエストロジェンリセプター（Ａｌｅｘｉｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）をポリスチレンのカラムに固相化し、次いで、２％カゼイン溶液によりエストロジェンリセプターの付着していない部分をブロッキングした。ランダムペプチドライブラリーを加え、１〜数時間反応させた。ランダムペプチドライブラリーは、ＮＥＢ社の＃８１２０Ｓ　Ｐｈ．Ｄ．　−Ｃ７ＣＴＭ　Ｋｉｔを用いた。このライブラリーでは、９アミノ酸残基からなる約１０１０種類のペプチドがファージのコートタンパク質ＰＩＩＩと融合した状態で提示される。
【００１６】
反応終了後、０．０５〜０．５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（以下、「Ｔｗｅｅｎ　２０」という）含有ＰＢＳで１０〜数十回洗浄し、その後、５％カゼイン溶液を加え１〜数時間静置した。再びＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄したのち、トリエチルアミン（１００ｍＭ）を加え、１０分間、ゆっくりと室温にて揺すった後、半量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ　７．４）を加えヴォルッテクスし、得られた画分を溶出画分とした。
【００１７】
溶出画分をＥ．ｃｏｌｉ　（ＥＲ２５３７）に感染させ、ＩＰＴＧ−Ｘ　Ｇａｌ　プレート上に生育させた。そこから１００クローンを拾い培養した後、エストロジェンリセプター固相化プレートを用いてＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡは、以下のように行った。まず、精製エストロジェンリセプター（１０μｇ／ｍｌ，　１００μｌ）をプレートに固定し、これにペプチド提示ファージ溶液（１００μｌ）を加え、室温で２時間静置した。次に、プレートを洗浄し、未結合のファージを取り除いた後、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体（ファルマシア社製抗Ｍ１３ファージ抗体、２０００倍希釈）１００μｌを加え、室温で２時間静置した。プレートを洗浄後、ＡＢＴＳ基質溶液（フナコシ社製）を加え、発色させた。ＥＬＩＳＡの結果、エストロジェンリセプターと強く反応するクローンが幾つかみつかった（クローンＮｏ．１〜７）。これらのクローンを含む溶液の吸光度、及びバックグラウンド（エストロジェンリセプターをプレートに固定せず、他は同様の操作を行った。）の吸光度を図１に示す。
【００１８】
〔実施例２〕　ペプチドのアミノ酸配列の解析
実施例１でエストロジェンリセプターに対する反応性が確認されたクローン（クローンＮｏ．１〜７）の培養上清中に含まれるＤＮＡを、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ　Ｍ１３システムにより精製した。得られたＤＮＡをエタノール沈殿し、配列解析の鋳型とした。ＡＢＩ社製３７００シークエンサーで配列を解析し、前記クローンが提示していたペプチドのアミノ酸配列を決定した。クローンＮｏ．１、２、３、４、５、６、７が提示していたペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４に示す。また、これらのペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ１、３、５、７、９、１１、１３に示す。
【００１９】
【発明の効果】
本発明のペプチドは、エストロジェンリセプターの検出に利用することができる。また、本発明のペプチドは、内分泌撹乱化学物質の定量法にも利用できる。この定量法は、試料中の内分泌撹乱化学物質が微量であっても正確に定量することができる。更に、本発明のペプチドは、内分泌撹乱化学物質のリセプターとの結合をブロックする薬剤として利用できる可能性もある。
【００２０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のペプチドとエストロジェンリセプターとの反応性を示す図である。
【図１】
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