(57)【要約】【課題】細胞への遺伝子導入効率をあげること。【課題解決手段】。培養細胞への遺伝子導入として用いられているリン酸カルシウム（ＣａＰ）法に注目し、この方法においては、負電荷のＤＮＡはＣａＰ微小顆粒への親和性が高いのでＣａＰ微小顆粒と複合体を形成し、これがエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、ＤＮＡが細胞の核へ移行することにより遺伝子導入が起きることから、本発明者は、マトリックス物質とＣａＰ法を組み合わせることにより、生体内での遺伝子導入効率を増加できる可能性は高いと考え、種々の検討をおこない本発明を完成した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム法において、遺伝子導入用ベクターをマトリックス物質との共存において、使用することを特徴とする遺伝子導入法。
【請求項２】
マトリックス物質が、コラーゲンである請求項１の導入法。
【請求項３】
生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム法において、遺伝子導入用ベクターの保持剤としてのマトリックス物質の用途。
【請求項４】
生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム法においての用途である、遺伝子導入用ベクターとマトリックス物質の共存組成物。
【請求項５】
生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム法用試薬とマトリックス物質を含む試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は改良された生体内での細胞内への効率的な遺伝子導入法に関し、より詳しくは、リン酸カルシウム法による遺伝子導入法の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子導入法は、外来の遺伝子（ＤＮＡ）を細胞に入れ、その遺伝子にコードされたタンパクを細胞に発現させる方法である。遺伝子導入法を疾患の治療に用いる遺伝子治療は、従来の治療法にない治療効果が期待できるため注目されている。ウイルスベクターは遺伝子導入効率が良いことから頻用されているが、遺伝子治療に使用する場合の安全性が問題となっている。ウイルスベクターに比較してプラスミドベクターは安全性が高いが、プラスミド単体では導入効率が低いため遺伝子導入効率を上げるための種々の手法が考案されている。
【０００３】
１９９６年に米国のＢｏｎａｄｉｏ等は、骨誘導因子であるＢＭＰ４  （Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ４）あるいは骨増加作用を示すＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）をコードするプラスミドベクターをコラーゲンと混合したものを、ラット大腿骨の完全離断した骨欠損部に埋入することにより、骨離断部に骨が新生し治癒することを報告した（非特許文献１）。さらに１９９９年にビーグル犬の同様の骨欠損モデルにおいて、ＰＴＨをコードするプラスミドベクターとコラーゲンを混合したものを埋入することにより、離断部に新生骨が形成され治癒することを報告した（非特許文献２）。彼等は、遺伝子を含むポリマー（この場合コラーゲン）をＧｅｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｍａｔｒｉｘ  （ＧＡＭ）と呼称している。ＧＡＭを骨欠損部に埋入すると、周囲組織から由来した主に線維芽細胞がプラスミドベクターを取り込み、コードしてあるタンパク（上記の場合、ＢＭＰ４、ＰＴＨ）を発現して、産生されたタンパクが周囲の細胞に作用することにより、組織再生を促進すると考えられている。
【０００４】
上記のラットの実験において、大腿骨の骨離断距離は５ｍｍで、そこに０．５−１ｍｇのプラスミドＤＮＡを含むＧＡＭを埋入している。また、イヌの実験において骨離断距離は１、  １．６、  ２  ｃｍと様々であり、プラスミドＤＮＡの量も変えて実験をおこなっているが、１００ｍｇのプラスミドＤＮＡを埋入した場合に離断部が癒合する。これらの実験において多量のプラスミドＤＮＡを含有するＧＡＭが用いられていることは、遺伝子導入効率が非常に低いことを示している。
【０００５】
【先行文献】
【非特許文献１】
Ｆａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．
Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｇｅｎｅｓ．
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．  ９３（１２）：５７５３−５７５８，  １９９６
【非特許文献２】
Ｂｏｎａｄｉｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．
Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ，  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．
Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ５（７）：７５３−７５９，  １９９９
【０００６】
【発明の課題】
本発明は、生体内での細胞への遺伝子導入効率をあげることを課題とする。
【０００７】
【発明の課題解決手段】。
本発明者は、培養細胞への遺伝子導入法として用いられているリン酸カルシウム（ＣａＰ）法に注目した。この方法においては、負電荷のＤＮＡはＣａＰ微小顆粒への親和性が高いのでＣａＰ微小顆粒と複合体を形成し、これがエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、ＤＮＡが細胞の核へ移行することにより遺伝子導入が起きる。本発明者は、ＧＡＭとＣａＰ法を組み合わせることにより、生体内での遺伝子導入効率を増加できる可能性は高いと考え、種々の検討をおこない本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、
１．生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム（ＣａＰ）法において、遺伝子導入用ベクターをマトリックス物質（ＧＡＭ）との共存において、使用することを特徴とする遺伝子導入法。
２．マトリックス物質が、コラーゲンである請求項１の導入法。
３．生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム法において、遺伝子導入用ベクターの保持剤としてのマトリックス物質の用途。
４．生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム法においての用途である、遺伝子導入用ベクターとマトリックス物質の共存組成物。
５．生体内での細胞内への遺伝子を直接導入するに際して使用するリン酸カルシウム法用試薬とマトリックス物質を含む試薬キット。
からなる。
【０００９】
【発明の実施の態様】
本発明において「リン酸カルシウム法」とは、遺伝子とリン酸カルシウムを共沈殿させ、細胞膜の透過性を変化させて細胞内への遺伝子導入をおこす１９７３年頃より行われている古典的な方法である。この方法は、これまで特殊な装置を必要としない利点がある一方、導入効率が低いことが欠点とされていた。リン酸カルシウム法は培養細胞への遺伝子導入法として用いられてきたが、生体内での細胞への遺伝子導入法としては用いられていなかった。
【００１０】
本発明で使用される遺伝子導入用ベクターとは、ＢＡＣ、ＹＡＣ、組換えウイルス、トランスポゾン等、通常の組み換え実験によって挿入ＤＮＡ断片を導入することが可能な全ての組換えベクターに適用することができる。ベクターは、当然に自体公知の組合せが好適であるプロモーター、エンハンサーと共に構築することができる。例えば、通常宿主に適したプロモーターが挿入されている市販あるいは特別に作成された蛋白質発現ベクターを用いることができる。
具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）等が挙げられる。
ベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、該ポリヌクレオチドまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモーターの制御下におかれるように連結して行う。また、プロモーターと遺伝子との間にコザック配列（Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．，  Ｇｅｎｅ，  ２３４，  １８７，  （１９９９））を挿入したり、遺伝子の下流にタグとなるポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとしては特に制限はないが、例えば、ＦＬＡＧタグ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ７，  ５８０，  （１９８９））等が挙げられる
環状構造をとるプラスミドＤＮＡ以外に、一本鎖あるいは２本鎖のＤＮＡあるいはＲＮＡの断片を同様の手法で細胞内に導入することが可能である。
【００１１】
本発明で使用されるマトリックス物質としては、コラーゲン、特にＩ型コラーゲン等が好適に例示される。コラーゲン以外のマトリックスとしては、ヒアルロン酸、コンドロチイチン硫酸、キト酸等の多糖類、ＰＬＡ／ＰＬＧＡに代表される生体分解性合成ポリマーの使用が可能である。
マトリックス物質とベクターは、共存しておれば十分でこれらの混合物であっても十分である。配合比は、ベクターの１００重量部に対してコラーゲン等のマトリックス物質を１００〜１００００重量部で混合する。配合量は、適宜用法に応じて変化可能である。
コラーゲンの種類は、特に制限はないが、生体内に多量に存在するＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型等が望ましい。
【００１２】
なお、ベクターへの遺伝子の組み込み方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、適当な制限酵素を選択、処理してＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いるＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。
【００１３】
本発明での遺伝子の細胞への導入は、リン酸カルシウム（ＣａＰ）法である。調製はベクターをリン酸カルシウム法用の溶液に添加することでベクターをリン酸カルシウムの微粒子に吸着させ、これにコラーゲンを加え混合することで調製される。調製後、生体内に注入あるは埋入し、所望の対象細胞と接触させることで、遺伝子の導入が達成可能である。
【００１４】
本発明では、このようなリン酸カルシウム法用試薬とコラーゲンのようなマトリックス物質をキット化し、試薬キットとして調製すれば手技上便宜である。
【００１５】
【実施例】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１６】
【実施例１】
ＣａＰ法とＧＡＭの組み合わせが生体での遺伝子導入に及ぼす影響（凍結乾燥ペレットの使用）
哺乳類細胞用のＥＧＦＰ発現プラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。ｐＥＧＦＰをＰＢＳに０．５μｇ／ｍｌ  （５０  μｇ／１００μｌ）の濃度に溶解し、その溶液２００μｌと、２％の牛アテロコラーゲン溶液（ＫＯＫＥＮ社製）２００μｌを混合した（Ａ）。１００μｇ  のｐＥＧＦＰをＣａＰ法用溶液に加え（註１）、その溶液２００μｌに２００μｌ  の２％の牛アテロコラーゲン溶液を加え混合した（Ｂ）。ｐＥＧＦＰをＰＢＳに０．５μｇ／μｌ  （５０  μｇ／１００μｌ）の濃度に溶解し、その溶液２００μｌにＰＢＳ２００μｌを加え混合した（Ｃ）。Ｂと同様に１００μｇ  のｐＥＧＦＰをＣａＰ法用溶液に加え、その溶液２００μｌにＰＢＳを２００μｌ加え混合した（Ｄ）。Ａ，  Ｂ，  Ｃ，  Ｄそれぞれの溶液５０μｌ（１２．５  μｇのｐＥＧＦＰを含む）を０．５ｍｌのプラスチック遠沈管に入れ凍結乾燥した。
ネンブタール麻酔下で６週齢の雄性ＳＤ系ラットの頭部を切開剥離し、皮下に凍結乾燥したそれぞれのペレットを置き、切開部を縫合した。術後１週後と２週後にクロロホルム麻酔下で屠殺し、ペレット埋入部の頭部皮下組織を分離し、７０％エタノール溶液中に浸漬保存した。ペレット埋入部の皮下組織の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ，  Ｚｅｉｓｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観測した。また、２週後のペレット埋入部の組織を５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ２００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ｐＨ８．０の溶液中でホモジナイズした後に、超音波粉砕し、蛍光測光機を用いて蛍光強度を測定した。
結果を以下の表に示す。
【００１７】
【表１】
2004283138.tif 000002
【００１８】
Ａ，  Ｂ群は１週後と２週後それぞれｎ＝５。Ｃ，  Ｄ群は１週後と２週後それぞれｎ＝３。この結果は、ＣａＰ法とＧＡＭの組み合わせは、ＧＡＭ単独に比べて遺伝子導入効率が向上することを示している。
【００１９】
註１：プラスミド１００  μｇを６９  μｌのＨ２Ｏに溶解し、２．５Ｍ  ＣａＣｌ２溶液  ３１  μｌを加える。次に、２ｘＨＢＳ  （４２ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，  ２９０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，  ｐＨ  ７．２）を１００μｌ加え、丁寧に混合する。
【００２０】
【実施例２】
ＣａＰ法とＧＡＭの組み合わせが生体での遺伝子導入に及ぼす影響（ゲルを使用）
ｐＥＧＦＰを１μｇ／μｌの濃度で含む１％の牛アテロコラーゲンを調整した（Ａゲル）。ｐＥＧＦＰをＣａＰ法溶液に２μｇ／μｌの濃度になるように調整し、同用量の２％の牛アテロコラーゲンを混合した（Ｂゲル）。それぞれのゲルの４０μｌ（２０μｇの  ｐＥＧＦＰを含む）を、１９Ｇの注射針を用い、ラットの脛骨の近心端より骨髄内に注入した。注入して１週後と、２週後にラットを屠殺し、脛骨を７０％エタノール溶液中に浸漬保存した。共焦点顕微鏡を用いて脛骨の骨髄内を観察した。
結果を以下の表に示す。
【００２１】
【表２】
2004283138.tif 000003
【００２２】
２週後の組織標本は図１及び２に示した。図１は、「ＧＡＭ，  ｐＥＧＦＰ」群、図２は、「ＧＡＭ，  ＣａＰ，  ｐＥＧＦＰ」群である。
【００２３】
ＧＡＭとして凍結乾燥したコラーゲンではなく、ゲル状のコラーゲンを用いることで、切開をすることなく注射によって遺伝子導入が可能となる。上記の結果は、ＣａＰ法とＧＡＭの組み合わせは、ＧＡＭ単独に比べて遺伝子導入効率が向上することを示している。
【００２４】
【実施例３】
ＣａＰ法とＧＡＭを組み合わせた場合のＤＮＡ保持作用
実施例１と同様にＡとＢの２種類の溶液１ｍｌを調整し、その溶液２００μｌ  （５０μｇのｐＥＧＦＰを含む）を凍結乾燥しペレットを作成した。それぞれのペレットを１．５ｍｌのプラスチックチューブに入れ、１ｍｌのＰＢＳを加え、室温で２４時間振盪後、遠心分離し、上清を回収して溶液中のＤＮＡ量を分光光度計により測定した。
結果を以下の表に示す。
【００２５】
【表３】
2004283138.tif 000004
【００２６】
この結果は、ＣａＰ法とＧＡＭの組み合わせは、ＧＡＭ単独に比べてｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡの保持力が高いこと示している。
【００２７】
【実施例４】
ＣａＰ法を用いた場合のＤＮＡａｓｅに対する抵抗性
２０μｇ  のｐＥＧＦＰを５０μｌのＨ２Ｏに溶解し、ＤＮａｓｅを含む１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（註２）５０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートし、その溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した。一方、ｐＥＧＦＰ１００  μｇを６９  μｌのＨ２Ｏに溶解し、２．５Ｍ  ＣａＣｌ２溶液  ３１μｌを加えた。次に、２ｘＨＢＳ  （４２ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，  ２９０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，  ｐＨ  ７．２）を１００μｌ加え、丁寧に混合した。この溶液４０μｌ（２０μｇ  のｐＥＧＦＰ  を含む）に１０μｌのＨ２Ｏを加え、  ＤＮａｓｅを含む１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（註２）５０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。さらに０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ８．１）で一晩処理し、微量透析装置を用いて脱塩透析後、凍結乾燥し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した。結果は図３に示した。  この結果は、ＣａＰとｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを組み合わせることにより、ＤＮＡａｓｅに対する抵抗性が示すことを示している。
【００２８】
2004283138.tif 000005
【００２９】
【実施例５】
ＣａＰ法とＧＡＭを組み合わせたＢＭＰ２遺伝子導入による骨組織の誘導（ゲルを使用）
哺乳類細胞用のＥＧＦＰ発現プラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＥＧＦＰコード部分を、骨誘導作用を示すＢＭＰ２のｃＤＮＡに置き換えた。実験１と同様に、このプラスミドを０．２５μｇ／μｌの濃度で含む１％の牛アテロコラーゲンを調整した（Ａゲル：ＢＭＰ２）。実験１と同様に、このプラスミドをＣａＰ法溶液に加え、同用量の２％の牛アテロコラーゲンを混合した（Ｂゲル：ＢＭＰ２）。それぞれのゲルの８０μｌ（プラスミド２０μｇ）を、ラットの頭部皮下に注入した。注入して４週後にラットを屠殺し、注入部の組織を摘出し、通法に従い固定しパラフィン包埋後、組織学的に検討した。
結果を以下の表に示す。実験に用いた動物の数と、骨様組織形成のあった動物の数を示した。
【００３０】
【表４】
2004283138.tif 000006
【００３１】
組織標本を図４及び５に示した。
この結果は、ＧＡＭとしてゲル状のアテロコラーゲンを用い、それにＣａＰ法を組み合わせることにより、注射により骨様の組織を皮下に誘導できることを示している。
【００３２】
【実施例６】
ＣａＰ法とＧＡＭを組み合わせたＢＭＰ２遺伝子導入による骨組織の誘導（凍結乾燥ペレットを使用）
哺乳類細胞用のＥＧＦＰ発現プラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＥＧＦＰコード部分を、骨誘導作用を示すＢＭＰ２のｃＤＮＡに置き換えたプラスミドを使用した。このプラスミドをＰＢＳに０．５μｇ／μｌ  （５０μｇ／１００μｌ）の濃度に溶解しその溶液２００μｌと、２％の牛アテロコラーゲン溶液（ＫＯＫＥＮ社製）２００μｌを混合した（ＧＡＭ−ＢＭＰ２  ｐｌａｓｍｉｄ）。１００μｇ  のプラスミドをＣａＰ法用溶液に加え（註３）、その溶液２００μｌに２００μｌ  の２％の牛アテロコラーゲン溶液を加え混合した（ＧＡＭ−ＣａＰ−ＢＭＰ２  ｐｌａｓｍｉｄ）。それぞれの溶液５０μｌ（１２．５  ｍｇのプラスミドを含む）を０．５ｍｌのプラスチック遠沈管に入れ凍結乾燥した。
８週齢のＳＤ系雄性ラットの脛骨を、横に離断して、５ｍｍの骨欠損を作成し、両端の骨を固定装置を用いて固定した。６週後にラットを屠殺し、処置部位を軟Ｘ線装置を用いて撮影した。
結果を以下の表に示す。実験に用いた動物の数と、離断部の接合があった動物の数を示した。
【００３３】
【表５】
2004283138.tif 000007
【００３４】
軟Ｘ線写真を図６に示した。
【００３５】
註３：プラスミド１００μｇを６９μｌのＨ２Ｏに溶解し、２．５Ｍ  ＣａＣｌ２溶液  ３１μｌを加える。次に、２ｘＨＢＳ  （４２ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，  ２９０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，  ｐＨ  ７．２）を１００μｌ加え、丁寧に混合する。
【００３６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法により、遺伝子の細胞内導入が格段の上昇を達成した。
【図面の簡単な説明】
【図１】「ＧＡＭ，  ｐＥＧＦＰ」群の２週後の組織標本である。
【図２】「ＧＡＭ，  ＣａＰ，  ｐＥＧＦＰ」群の２週後の組織標本である。
【図３】ポリアクリルアミドゲル電気泳動図。左より、Ａ：  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  （ＤＮＡａｓｅ未処理）、Ｂ：  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡをＤＮＡａｓｅ処理、Ｃ：  ＣａＰとｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを組み合わせＤＮＡａｓｅ処理。
【図４】組織標本図である。  「ＧＡＭ，  ｐＥＧＦＰ」群では骨様組織は観察されない。
【図５】組織標本図である。  「ＧＡＭ，  ＣａＰ，  ｐＥＧＦＰ」群では骨様組織の形成が見られた。
【図６】軟Ｘ線写真図である。左は「ＧＡＭ，  ＣａＰ，  ｐＥＧＦＰ」群、右は「ＧＡＭ，  ｐＥＧＦＰ」群である。
【図１】
2004283138.tif 000008
【図２】
2004283138.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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