(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来遺伝子を構成的に発現し得る発現ベクターの提供。【解決手段】ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの−１０領域配列に変異を導入したプロモーターであって、チオストレプトン非依存的に構成的に下流に存在する遺伝子を発現し得る変異ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの有する塩基配列からなるＤＮＡおよび外来遺伝子を構成的に発現するためのプロモーター配列が特定のＤＮＡの有する塩基配列であって、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用構成型発現ベクター。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの−１０領域配列に変異を導入したプロモーターであって、チオストレプトン非依存的に構成的に下流に存在する遺伝子を発現し得る変異ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの有する塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
−１０領域配列の変異が、ＣＡＧＣＧＴ配列のＴＡＴＡＡＴ配列への変異である請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１０７で表される塩基配列を有する、請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
外来遺伝子を構成的に発現するためのプロモーター配列が請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡの有する塩基配列であって、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用構成型発現ベクター。
【請求項５】
配列番号１０１に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＴ１、配列番号１０２に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＴ２、配列番号１０５に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＣ１、配列番号１０６に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＣ２、配列番号９９に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ１、配列番号１００に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ２、配列番号１０３に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ１、配列番号１０４に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ２、からなる群から選択される請求項４記載のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用構成型発現ベクター。
【請求項６】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌がＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．  ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．  ｏｐａｃｕｓからなる群から選択される、請求項４または５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ領域を含み、大腸菌中で複製可能な請求項４から６のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項４から７のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項４から７のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いて４℃から３５℃の温度で組換えタンパク質を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来遺伝子を発現し得る発現ベクターに関する。
【０００２】
また、本発明は、宿主細胞中で組換えタンパク質を発現することができる誘導型発現ベクターおよび構成型発現ベクター、および該ベクターを用いて組換えタンパク質を発現させる方法に関する。さらに、本発明はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細胞内で異なるベクター上にコードされる複数の遺伝子を同時に共発現する方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
現在、真核生物由来のタンパク質を組換え体として大量調製するためには大腸菌を宿主とした発現システムが広く用いられている。これは該システムが扱いが容易でかつ最も研究が進んでいるからである（Ｗｅｉｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７：  ４９４−４９９  ［１９９６］）。
【０００４】
一方、本発明者は以前にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓも組換えタンパク質生産の宿主として用いることができることを示した（特願２００２−２３５００８）。Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓは４  ℃から３５  ℃まで増殖可能な放線菌の一種で、この菌を宿主とした発現システムの最大の特徴は４  ℃など１０  ℃以下での組換えタンパク質生産が可能な点である。他の大腸菌やバチルス属細菌、酵母菌、Ｓｆ９昆虫細胞（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ａｎｄ  Ｃｒｅｇｇ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０  ４２２−４２７  ［１９９９］、  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  ３  ９７−１０１  ［１９９３］）を用いたシステムでは、１０  ℃以下での組換えタンパク質生産は極めて困難である。１０  ℃以下で組換えタンパク質を生産させることで、それまでは生産困難だったタンパク質、例えば宿主細胞の増殖を阻害するものや３０  ℃前後では不溶化するもの、低温に適応した生物由来のタンパク質、などを生産することが可能になった。
【０００５】
本発明者等は、ｐＴｉｐベクターと呼ばれる一群のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用発現ベクターを構築し、組換えタンパク質生産に用いていた（特願２００２−２３５００８）。これらベクターは、抗生物質チオストレプトンでその発現が誘導されるＴｉｐＡ遺伝子のプロモーターを含み、その下流に外来遺伝子（発現させるべき遺伝子）をクローン化するためのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含む。従ってｐＴｉｐベクターは、チオストレプトン誘導型発現ベクターであり、これら発現ベクターで形質転換されたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌においては、チオストレプトンが培養液中に添加されたときにのみ、外来タンパク質の生産が誘導される。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｗｅｉｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７：  ４９４−４９９  ［１９９６］
【非特許文献２】
Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  ａｎｄ  Ｃｒｅｇｇ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０  ４２２−４２７  ［１９９９］
【非特許文献３】
Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  ３  ９７−１０１  ［１９９３］
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように本発明者らは、ｐＴｉｐベクターと呼ばれる一群のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターを構築し、組換えタンパク質生産に用いていたが、未だ２点開発すべき点が残されていた。
【０００８】
第１に、前記ｐＴｉｐベクターはすべて、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で自律複製するために必要なＤＮＡ領域（複製起点等）が一つの内在性プラスミドに由来していたために、別々の外来遺伝子を含む複数の発現ベクターを同時に、安定に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内に共存させることは困難であった。これは同一の自律複製起点を持つ異種プラスミドが細菌内で共存できない、プラスミド不和合性（ｐｌａｓｍｉｄ  ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）と呼ばれる現象によるもので、多くの細菌でこの現象が報告されている（Ｎｏｖｉｃｋ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５１  ３８１−３９５  ［１９８７］）。異種プラスミドを単一の細菌の菌体内で共存させることが出来れば、複数の組換えタンパク質を同時に生産することが出来る。例えば、２０Ｓプロテアソームと呼ばれるタンパク質複合体はαサブユニットとβサブユニットの２つのポリペプチドから構成されており、機能的な２０Ｓプロテアソーム複合体を組換え体として生産する場合には、これら２つのポリペプチドを共発現させなければならない。２つのポリペプチドを単一細胞内で共発現させる際には、１つの発現ベクターに複数の外来遺伝子を導入することによって、達成することも出来るが、ベクターのサイズが大きくなったり、制限酵素部位の都合上クローニング過程が複雑になったり、不便であることが多い。現在までＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌において、複数の発現ベクターを用いた組換えタンパク質の共発現系はＷＯ０２／０５５７０９に記載されたものが存在した。
【０００９】
第２に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌の研究のためには、誘導型発現ベクターのみならず、構成型発現ベクターも重要なツールであるが、構成型発現ベクターが未開発であったことである。なお、既知のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌における構成型発現ベクターとしては、変異型ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターを用いたものや（特開平９−２８３８２、特開平１０−２４８５７８）、ｒｒｎプロモーターを用いたものが知られている（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４５  ２４０−２４４  ［２００２］）。
【００１０】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌の中には、ＰＣＢ（ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  ｂｉｐｈｅｎｙｌ）や農薬等、様々な難分解性化合物を分解する菌株が多数知られており（バイオレメディエーション）（Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ８５  １９５−２１０  ［１９９８］）、また、ある菌株はアクリルアミド等有用な化合物を菌体内に蓄積させる事も知られていて、すでに工業生産に利用されている（バイオプロセス、バイオリアクター）（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６０  １３９１−１４００  ［１９９６］）。従って、上述した２点の改良点が克服されれば、組換えタンパク質生産時のみならず、バイオレメディエーション、バイオプロセスの研究時においてもＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用発現ベクターの利用性が増すと考えられる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
まず、プラスミド不和合性の問題を解決するためには、本発明者らが先に構築したｐＴｉｐベクターに用いていたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で自律複製するために必要なＤＮＡ領域とは配列が違う同等の配列を新たに分離し、利用する必要がある。前記ｐＴｉｐベクターでは全てＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ２８９５株から分離した内在性プラスミドｐＲＥ２８９５（５．４キロベースペアー；以下ｋｂと略）のうち、自律複製に必要最小限なＲｅｐＡＢ遺伝子を含む領域（１．９  ｋｂ）を用いていた。従って、他のＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ株からＤＮＡ配列の異なる内在性プラスミドを分離し、新規発現ベクターを構築することとした。また、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌の形質転換体選択マーカーとして、前記ｐＴｉｐベクターにおいてはテトラサイクリン耐性遺伝子のみ開発していたが、複数のプラスミドで形質転換するためには、別の抗生物質に対する耐性遺伝子を新規に開発する必要がある。本発明者は、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ  ３１３株がクロラムフェニコールに対して耐性であることを見出し、耐性を付与している遺伝子を分離し、利用することとした。
【００１２】
さらに、構成型発現ベクター開発のため、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターに変異を導入し、構成的に、即ち、チオストレプトン非依存的に、外来遺伝子を発現せしめる変異体を作製することとした。
【００１３】
このようにして、ｐＲＥ２８９５が有する自律複製に必要な領域および誘導型のＴｉｐＡ遺伝子プロモーターを有する前記ｐＴｉｐベクターの他に、新たに異なる自律複製するために必要なＤＮＡ領域を有するベクターであって、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターを有しており誘導発現が可能なベクター、前記ｐＴｉｐベクターとは異なる自律複製するために必要なＤＮＡ領域を有するベクターであって、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターに変異を導入したプロモーターを有しており構成的に発現が可能なベクター、および前記ｐＴｉｐベクターと同じ自律複製するために必要なＤＮＡ領域およびＴｉｐＡ遺伝子プロモーターに変異を導入したプロモーターを有しており構成的に発現が可能なベクターを構築した。これらのベクターのうち自律複製するために必要なＤＮＡ領域が異なる２種類のベクターであって、それぞれ異なる外来タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで一つの宿主を共形質転換することが可能であり、該共形質転換した宿主で該異なる外来タンパク質を同時に共発現させることが可能である。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］    ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの−１０領域配列に変異を導入したプロモーターであって、チオストレプトン非依存的に構成的に下流に存在する遺伝子を発現し得る変異ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの有する塩基配列からなるＤＮＡ、
［２］    −１０領域配列の変異が、ＣＡＧＣＧＴ配列のＴＡＴＡＡＴ配列への変異である［１］のＤＮＡ、
［３］    配列番号１０７で表される塩基配列を有する、［２］のＤＮＡ、
［４］    外来遺伝子を構成的に発現するためのプロモーター配列が［１］から［３］のいずれかのＤＮＡの有する塩基配列であって、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用構成型発現ベクター、
［５］    配列番号１０１に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＴ１、配列番号１０２に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＴ２、配列番号１０５に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＣ１、配列番号１０６に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＣ２、配列番号９９に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ１、配列番号１００に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ２、配列番号１０３に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ１、配列番号１０４に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ２、からなる群から選択される［４］のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用構成型発現ベクター、
［６］    Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌がＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．  ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．  ｏｐａｃｕｓからなる群から選択される、［４］または［５］の発現ベクター、
［７］    さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ領域を含み、大腸菌中で複製可能な［４］から［６］のいずれかの発現ベクター、
［８］    ［４］から［７］のいずれかの発現ベクターを含む形質転換体、および
［９］    ［４］から［７］のいずれかの発現ベクターを用いて４℃から３５℃の温度で組換えタンパク質を生産する方法。
さらに、本発明は以下の通りである。
［１０］    Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌から単離された、ローリングサークル型の複製様式で複製し得る環状プラスミド、
［１１］    Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌から単離された、ローリングサークル型の複製様式に必須なＲｅｐ遺伝子、２本鎖複製起点領域ＤＳＯ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）および１本鎖複製起点領域ＳＳＯ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）を有する［１０］の環状プラスミド、
［１２］    ローリングサークル型の複製様式に必須なＤＮＡの塩基配列が配列番号９０に表される塩基配列の第３８４５位から第５８４９位の塩基配列である、［１１］の環状プラスミド、
［１３］    配列番号９０に表される塩基配列を有するＤＮＡまたは配列番号９０に表される塩基配列を有するＤＮＡに相補的な配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する［１０］から［１２］のいずれかのプラスミド、
［１４］    ［１０］から［１２］のいずれかの環状プラスミドを含む形質転換体、
［１５］    ローリングサークル型の複製様式で複製し得るベクターであって、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来遺伝子を４℃から３５℃の温度条件下で発現しうる発現ベクター、
［１６］    Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌から単離された、ローリングサークル型の複製様式に必須なＲｅｐ遺伝子、２本鎖複製起点領域ＤＳＯ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）および１本鎖複製起点領域ＳＳＯ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）を有する［１５］の発現ベクター、
［１７］    ローリングサークル型の複製様式に必須なＤＮＡの塩基配列が配列番号９０に表される塩基配列の第３８４５位から第５８４９位の塩基配列である、［１６］の発現ベクター、
［１８］    外来遺伝子を発現誘導するための誘導型プロモーター配列、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む［１５］から［１７］のいずれかの発現ベクター、
［１９］    発現誘導のための誘導型プロモーターがＴｉｐＡ遺伝子プロモーターで、誘導物質がチオストレプトンである、［１８］の発現ベクター、
［２０］    プロモーターの塩基配列が［１］から［３］のいずれかのＤＮＡの有する塩基配列からなる［４］の発現ベクター、
［２１］    配列番号９３に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＴ１、配列番号９４に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＴ２、配列番号９７に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＣ１、配列番号９８に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＣ２からなる群から選択される［１５］から［１９］のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター、
［２２］    Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来遺伝子を構成的に発現し得る発現ベクターであって、プラスミドｐＲＥ２５８５由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中でのプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列および［１］から［３］のいずれかのプロモーター配列ＤＮＡを含む、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で４℃から３５℃の温度条件下で外来遺伝子を構成的に発現し得る発現ベクター、
［２３］    プラスミドｐＲＥ２５８５由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中でのプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列がＲｅｐＡおよびＲｅｐＢ遺伝子を含む１．９ｋｂの領域のＤＮＡ配列である［２２］の発現ベクター、
［２４］    構成型プロモーター配列の下流に、さらにリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む［２２］または［２３］の発現ベクター、
［２５］    配列番号９９に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ１、配列番号１００に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ２、配列番号１０３に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ１、配列番号１０４に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ２、からなる群から選択される［２２］から［２４］のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用構成型発現ベクター、
［２６］    互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来のプラスミドを含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌であって、少なくとも２種類のプラスミドが、プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列として、それぞれローリングサークル型複製様式をもつＤＮＡ配列と、ｐＲＥ２５８５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列を有する、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［２７］    互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来の発現プラスミドベクターであり外来タンパク質をコードする遺伝子を含む発現プラスミドベクターを含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌であって、少なくとも２種類のプラスミドベクターが、プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列として、それぞれＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来のローリングサークル型複製様式をもつＤＮＡ配列と、ｐＲＥ２５８５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列を有し、外来タンパク質をコードする遺伝子を４  ℃から３５  ℃の温度条件下で共発現し得るＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［２８］    ２種類のプラスミドベクターが外来タンパク質を生産せしめるためのプロモーター配列、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列、をそれぞれ全て含む、［２７］のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［２９］    少なくとも２種類のプラスミドベクターの一方が、［４］、［５］、［１５］〜［１９］、［２０］および［２１］のいずれかのベクターであり、もう一方が、［２２］から［２５］のいずれかのベクターもしくは［２２］から［２５］のベクターにおいて少なくともプロモーターを誘導型プロモーターであるＴｉｐＡ遺伝子プロモーターに置換した誘導発現し得るベクターである、［２７］または［２８］のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［３０］    少なくとも２種類のプラスミドベクターの一方が、［４］、［５］、［１５］〜［１９］、［２０］および［２１］のいずれかのベクターであり、もう一方が、配列番号４９に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ１、配列番号５０に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ２、配列番号５１に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ１、配列番号５２に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ２、配列番号５３に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、配列番号５４に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、配列番号５５に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ１、配列番号５６に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ２、配列番号９１に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＴ１、配列番号９２に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＴ２、配列番号９５に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＣ１、配列番号９６に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＣ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１、［２２］から［２５］のいずれかのベクターまたは［２２］から［２５］のいずれかのベクターにおいて少なくともプロモーターを誘導型プロモーターであるＴｉｐＡ遺伝子プロモーターに置換した誘導発現し得るベクターからなる群から選択されるベクターである、［２７］から［２９］のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［３１］    ローリングサークル型の複製様式に必須なＤＮＡ配列が配列番号９０に表される塩基配列の第３８４５位から第５８４９位のＤＮＡであり、ｐＲＥ２５８５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列がＲｅｐＡおよびＲｅｐＢ遺伝子を含む１．９  ｋｂの領域のＤＮＡである［２６］から［３０］のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［３２］    互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来の発現プラスミドベクターであり外来タンパク質をコードする遺伝子を含む発現プラスミドベクターを含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌であって、少なくとも２種類のプラスミドベクターが、プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列として、それぞれＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来のローリングサークル型複製様式をもつＤＮＡ配列と、ｐＲＥ２５８５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列を有する少なくとも２種類のベクターでＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌を形質転換し、培養しそれぞれの発現ベクターが含む外来タンパク質をコードする遺伝子を４℃から３５℃の温度条件下で共発現させて該外来タンパク質を産生させる方法、
［３３］    ２種類のプラスミドベクターが外来タンパク質を生産せしめるためのプロモーター配列、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列、をそれぞれ全て含む、［３２］の方法、
［３４］    少なくとも２種類のプラスミドベクターの一方が、［４］、［５］、［１５］〜［１９］、［２０］および［２１］のいずれかのベクターであり、もう一方が、配列番号４９に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ１、配列番号５０に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ２、配列番号５１に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ１、配列番号５２に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ２、配列番号５３に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、配列番号５４に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、配列番号５５に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ１、配列番号５６に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ２、配列番号９１に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＴ１、配列番号９２に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＴ２、配列番号９５に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＣ１、配列番号９６に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＣ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１、［２２］から［２５］のいずれかのベクターまたは［２２］から［２５］のいずれかのベクターにおいて少なくともプロモーターを誘導型プロモーターであるＴｉｐＡ遺伝子プロモーターに置換した誘導発現し得るベクターからなる群から選択されるベクターである、［３２］から［３４］のいずれかの方法、
［３５］    ローリングサークル型の複製様式に必須なＤＮＡの塩基配列が配列番号９０に表される塩基配列の第３８４５位から第５８４９位の塩基配列であり、ｐＲＥ２５８５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列がＲｅｐＡおよびＲｅｐＢ遺伝子を含む１．９  ｋｂの領域のＤＮＡである［３２］から［３４］のいずれかの方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌から単離された、ローリングサークル型の複製様式で複製し得る環状プラスミドおよび該環状プラスミドから構築された発現ベクターを包含する。ローリングサークル型の複製様式とは、二本鎖環状ＤＮＡの複製の一様式であり、特異的エンドヌクレアーゼの作用により特定のＤＮＡ鎖上の特定の位置にニックが入り、そのニックの３’−ＯＨ端からＤＮＡ合成が開始され、ニックの入っていない環状ＤＮＡ鎖を鋳型として一回りする形で進む複製様式をいう。このような複製様式をとるためには、ローリングサークル型の複製様式に必要なＤＮＡ領域が必要であり、例えばＲｅｐ遺伝子が挙げられる。さらに、２本鎖複製起点領域ＤＳＯ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）および１本鎖複製起点領域ＳＳＯ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）が必要である。従って、本発明のローリングサークル型の複製様式で複製し得る環状プラスミドおよび該環状プラスミドから構築された発現ベクターは、ローリングサークル型の複製様式に必要なＤＮＡ領域、すなわちＲｅｐ遺伝子、２本鎖複製起点領域ＤＳＯ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）および１本鎖複製起点領域ＳＳＯ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）を含むプラスミドおよび発現ベクターである。このようなプラスミドは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌から単離することができ例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ８４２４株から単離したｐＲＥ８４２４が挙げられ、その全長配列を配列番号９０に示す。配列番号９０中、第３８４５位から５８４９位までがローリングサークル型の複製様式に必要なＤＮＡ領域、すなわちＲｅｐ遺伝子のＤＮＡ、２本鎖複製起点領域ＤＳＯ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）および１本鎖複製起点領域ＳＳＯ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）を表す。
【００１６】
本発明は、配列番号９０で表されるプラスミドを構成するＤＮＡに相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡから構成されるプラスミドであって、ローリングサークル型の複製様式で複製し得るプラスミドも包含する。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が５００〜１０００  ｍＭ、好ましくは７００  ｍＭであり、温度が５０〜７０  ℃、好ましくは６５  ℃での条件をいう。このようなプラスミドはその全長塩基配列が配列番号９０で表される塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列からなるプラスミドである。
【００１７】
該プラスミドから得られたローリングサークル型の複製様式に必要なＤＮＡ領域であるＲｅｐ遺伝子、２本鎖複製起点領域ＤＳＯ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）および１本鎖複製起点領域ＳＳＯ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）を含み、さらにプロモーター配列、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む発現ベクターも本発明に包含される。さらに、外来遺伝子および転写終結配列を含んでいてもよく、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列、外来遺伝子および転写終結配列は発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を構成する。ここで、プロモーター配列は薬剤等の誘導因子によりその下流に導入した外来遺伝子を誘導的に発現し得るプロモーターも、誘導因子に依存することなく構成的に外来遺伝子を発現し得るプロモーターも含まれる。前者の誘導的に外来遺伝子を発現し得るプロモーターとして、例えばＴｉｐＡ遺伝子プロモーターが挙げられ、チオストレプトンの存在下でその下流の外来遺伝子を誘導的に発現する。さらに、本発明のベクターは、ＴｉｐＡタンパク質をコードするＴｉｐＡ遺伝子、ＴｉｐＡ遺伝子の発現を誘導するＴｈｃＡ遺伝子プロモーター等の適当なプロモーターを含んでいてもよい。ＴｉｐＡ遺伝子およびＴｉｐＡ遺伝子発現用プロモーターは誘導カセット（Ｉｎｄｕｃｅｒ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を構成する。宿主細胞がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌である場合、該細菌はチオストレプトンに対して感受性であるため、チオストレプトンに対しての耐性を付与するチオストレプトン耐性遺伝子等を組込む。さらに、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター等のその配列を改変させたものでもよい。ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの配列は図１２に示される。
【００１８】
また、後者の構成的に外来遺伝子を発現し得るプロモーターとして、前記ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターを改変したプロモーターが挙げられる。このような改変ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターとしては、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの−１０領域配列に変異を導入したプロモーターが挙げられ、具体的には、−１０領域配列の変異が、ＣＡＧＣＧＴ配列のＴＡＴＡＡＴ配列への変異であるプロモーターが挙げられる。さらに、このようなプロモーターの一例として、図１９に示す配列に含まれるプロモーターが例示できる。
【００１９】
また、図１２に示すプロモーターの配列を有するＤＮＡまたは図１９に示す配列に含まれるプロモーターの配列を有するＤＮＡに相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、それぞれのプロモーター活性と同等の活性を有するポリヌクレオチドもプロモーターとして用いることができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が５００〜１０００  ｍＭ、好ましくは７００  ｍＭであり、温度が５０〜７０  ℃、好ましくは６５  ℃での条件をいう。このようポリヌクレオチドはその全長塩基配列が上記プロモーターの塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列からなるプロモーターである。
【００２０】
本発明は、さらに前記ベクターにさらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ領域ならびに大腸菌の形質転換体選択マーカーを含むベクターも含まれ、このようなベクターはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌と大腸菌とのシャトルベクターとして利用できる。この際、大腸菌では構成型発現ベクターとして利用することができる。大腸菌用プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ領域としてはＣｏｌＥ１、ＣｏｌＥ２配列等、大腸菌の形質転換体選択マーカーとしてはアンピシリン耐性遺伝子などの公知のものを使用することができ、これらは公知の大腸菌用クローニングベクターから得ることができる。
【００２１】
ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター、ローリングサークル型の複製様式に必要なＤＮＡ領域、２本鎖複製起点領域ＤＳＯ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）および１本鎖複製起点領域ＳＳＯ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）を含み、さらに前記プロモーター配列の下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列および大腸菌用プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ領域を含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ用発現ベクターとして、配列番号９３に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＴ１、配列番号９４に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＴ２、配列番号９７に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＣ１、配列番号９８に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＣ２が例示できる。また、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの代わりにＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの−１０領域配列の変異がＣＡＧＣＧＴ配列のＴＡＴＡＡＴ配列への変異であるプロモーターを有するベクターとしては、配列番号１０１に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＴ１、配列番号１０２に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＴ２、配列番号１０５に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＣ１、配列番号１０６に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＣ２が例示できる。これらの、配列番号で表される塩基配列からなる構成するＤＮＡに相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡから構成されるベクターであって、外来遺伝子を宿主微生物中で発現し得るベクターも本発明に包含される。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が５００〜１０００  ｍＭ、好ましくは７００  ｍＭであり、温度が５０〜７０  ℃、好ましくは６５  ℃での条件をいう。このようなベクターはその全長塩基配列が上記ベクターの配列番号で表される塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列からなるベクターである。配列番号で示される以下のベクターについても同様である。
【００２２】
本発明は、さらに上記のローリングサークル型の複製様式に必要なＤＮＡ領域（Ｒｅｐ遺伝子、ＤＳＯおよびＳＳＯ）ではなく、他の自律複製に必要なＤＮＡ領域を含む発現ベクターをも包含する。このように複製に必要なＤＮＡ領域が異なる発現ベクター同士は、一つの宿主に同時に導入し、安定に保持することができる。他の自律複製に必要なＤＮＡ領域として例えば、ＲｅｐＡ遺伝子およびＲｅｐＢ遺伝子が挙げられる。ＲｅｐＡ遺伝子およびＲｅｐＢ遺伝子を含むＤＮＡ領域は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、例えばＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ２８９５株から分離した内在性プラスミドｐＲＥ２８９５から単離することができる。ＲｅｐＡ遺伝子およびＲｅｐＢ遺伝子を含む１．９  ｋｂの領域は、配列番号４９の第６２３３位から第８１６６位であり、このうちＲｅｐＡ  ＯＲＦは６７６５位から７６５２位、ＲｅｐＢ  ＯＲＦは７６５２から７９３６位である。また、ＲｅｐＡ遺伝子およびＲｅｐＢ遺伝子を含むＤＮＡ領域は後述の参考例に記載のベクターｐＨＮ１２９の制限地図（図１）を参照すれば得ることができる。また、配列番号４９の第６２３３位から第８１６６位で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ベクターに自律複製能を付与するＤＮＡも本発明のＲｅｐＡ遺伝子およびＲｅｐＢ遺伝子を含む１．９  ｋｂの領域として用いることができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が５００〜１０００  ｍＭ、好ましくは７００  ｍＭであり、温度が５０〜７０  ℃、好ましくは６５  ℃での条件をいう。このようなＤＮＡはその全長塩基配列が配列番号４９の第６２３３位から第８１６６位で表される塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡである。この自律複製に必要なＤＮＡ領域およびＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの−１０領域配列がＣＡＧＣＧＴ配列のＴＡＴＡＡＴ配列へ変異したプロモーター、さらにその下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む発現ベクターを含む発現ベクターはマルチクローニング部位に組込まれた外来遺伝子を誘導因子に依存することなく構成的に発現することができる。このような発現ベクターとして、配列番号９９に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ１、配列番号１００に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ２、配列番号１０３に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ１、配列番号１０４に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ２、からなる群から選択されるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用構成型発現ベクターが挙げられ、さらにチオストレプトンの存在下で、導入された外来遺伝子を誘導的に発現し得る配列番号４９に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ１、配列番号５０に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ２、配列番号５１に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ１、配列番号５２に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ２、配列番号���３に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、配列番号５４に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、配列番号５５に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ１、配列番号５６に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１およびｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１の誘導性プロモーターを前記のＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの−１０領域配列の変異がＣＡＧＣＧＴ配列のＴＡＴＡＡＴ配列への変異であるプロモーターに置換したベクターが挙げられる。なお、誘導型発現ベクターはＴｉｐＡ遺伝子もしくはその変異体およびＴｉｐＡ遺伝子発現用プロモーターを含む誘導カセットならびにチオストレプトン耐性遺伝子も含んでいる必要がある。
【００２３】
本発明の上記発現ベクターに外来遺伝子を組み込み、宿主微生物に導入し該宿主微生物を培養することにより、該外来遺伝子を発現させることができる。発現ベクターへの外来遺伝子の組込みは公知の遺伝子工学的手法により行うことができ、宿主微生物への発現ベクターの導入も公知の手法で行うことができる。さらに、宿主微生物の培養も、それぞれの微生物に適合した培地を用いて適当な条件下で培養を行えばよい。ベクターを組込む宿主生物としては、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌および大腸菌が挙げられる。ここで、外来遺伝子とは、本発明のベクターを用いて発現させようとする標的タンパク質をコードする遺伝子であり、宿主細胞以外の生物由来のタンパク質をコードする遺伝子をいう。本発明のベクターを用いて発現産生させるタンパク質は限定されず、いかなるタンパク質も対象となり得る。本発明の発現ベクターを導入する宿主生物が低温で増殖可能な微生物、例えばＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．  ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．  ｏｐａｃｕｓ等のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌である場合、通常の微生物の増殖に適した温度条件、即ち約１５  ℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質を発現産生させることができる。このようなタンパク質として、宿主細胞の至適生育温度範囲内の温度で発現できないが同一のまたは異なる種類の宿主細胞を用いた場合にその微生物の好適生育温度範囲内の温度よりも低温で発現できるタンパク質、宿主微生物の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝集を作るが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温でそれらの宿主細胞で発現させた場合に活性のある可溶性タンパク質となるタンパク質、好適生育温度範囲が２０  ℃以下である好冷菌、低温環境下に生存する変温動物、低温環境下に生存する植物由来のタンパク質が挙げられる。
【００２４】
発現ベクターが含んでいるプロモーターが誘導型のプロモーターの場合、誘導物質の宿主微生物の培養系に添加することにより、外来遺伝子の発現産生を誘導することができる。本発明の発現ベクターが含む誘導型プロモーターとして、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターが挙げられ、該遺伝子プロモーターを含んでいる場合、チオストレプトンの添加により発現産生が誘導される。この際チオストレプトンは、終濃度０．１  μｇ／ｍｌ以上、好ましくは１  μｇ／ｍｌ以上となるように添加すればよい。ただし、１０  μｇ／ｍｌを越えると生育が悪くなる。また、本発明の発現ベクターが構成型のプロモーターを含んでいる場合は、誘導物質を添加することなく外来遺伝子が発現産生される。
【００２５】
本発明の発現ベクターのうち、自律複製に必要なＤＮＡが互いに異なる発現ベクターは同一の微生物細胞に同時に共形質転換することにより、該細胞内で安定に維持され、それぞれのベクターが含んでいる外来遺伝子を同時に発現産生させることができる。この場合、それぞれのベクターが含んでいる外来遺伝子は同じタンパク質をコードするものでも、異なるタンパク質をコードするものでもよい。例えば、２つのサブユニットからなるタンパク質のそれぞれのサブユニットを自律複製に必要なＤＮＡが互いに異なる別々の発現ベクターに組込んで、同一の微生物細胞に導入することにより、一つの細胞内で各サブユニットが同時に発現され、サブユニット同士が会合して完全なタンパク質が産生される。この際、発現ベクターは構成的に外来遺伝子を発現し得るもの、誘導的に発現し得るものの何れの組合わせを用いてもよいが、自律複製に必要なＤＮＡが異なる複数の発現ベクターのすべてを誘導的に外来遺伝子を発現し得るものにし、発現誘導物質で発現誘導することにより、２種類以上の外来タンパク質を同時に発現産生させることができる。
【００２６】
さらに、本発明の発現ベクター中の大腸菌用複製起点について異なるものを選択することにより、大腸菌においても２種類のタンパク質を同時発現させることができる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔参考例１〕
（１）  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ由来の、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で自律複製可能なプラスミドの分離とその一部ＤＮＡ配列の決定
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓと大腸菌の複合ベクターを作成するために、まずＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内に存在する小型の内在性プラスミドを検索した。すると、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ２８９５  株にその存在が確認された。このプラスミドにｐＲＥ２８９５と名前を付けた。以下にプラスミドの分離と、そのＤＮＡ配列決定について具体的に述べる。
【００２８】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ２８９５株を５  ｍｌのＬＢ培地（１％  Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％  Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１．０％  塩化ナトリウム）にて、３０  ℃で３０時間培養した菌体からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｐＲＥ２８９５を精製した。この際、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐ１  ２５０  μｌに懸濁後、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐ２  ２５０  μｌを加える前に、５  μｌのリゾチーム（１００  ｍｇ／ｍｌ）を加え３７  ℃で３０分インキュベートした点を除いては、使用説明書通りに作業した。
【００２９】
上記ＤＮＡサンプルを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００  Ｖ、３０分）に供したところ、約５．４  ｋｂのＤＮＡ断片１本の存在が確認された。
【００３０】
この約５．４  ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、使用説明書通りに精製した。得られたＥｃｏＲＩ断片を常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ［１９８９］，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）に従って、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローンし、このプラスミドにｐＨＮ７９と名前を付けた。
【００３１】
ｐＨＮ７９をＲｅｖｅｒｓｅ、Ｍ１３−２０両プライマー（共にＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）を用いて、使用説明書に準じて、ｐＨＮ７９の塩基配列を約４００塩基ずつそれぞれ決定した。相同性検索の結果、ｐＨＮ７９にサブクローンされたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ２８９５株由来のＤＮＡ領域はその９９．８％の配列がＧｅｎＢａｎｋに受入番号ＡＦ３１２２１０として登録されている５４０３塩基対の環状ＤＮＡ、ｐＮ３０と一致した。
【００３２】
分離したｐＲＥ２８９５は全塩基配列を決定しなかったが、ｐＮ３０との相同性は極めて高く、また制限酵素切断地図もｐＮ３０の配列から予想されるものと一致したことから、これらの相同性はプラスミド全体にわたっていると予想された。また、ｐＮ３０はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ  ００２株から分離された内在性プラスミドｐＡＬ５０００  （Ｒａｕｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ７１  ３１５−３２１  ［１９８８］、  Ｓｔｏｌｔ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｅｒ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２  ２７９５−２８０２  ［１９９６］）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＮＩ８６／２１株から分離されたｐＦＡＪ２６００（Ｄｅ  Ｍｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３  ３１３７−３１４７  ［１９９７］）と相同性が高く、類似の機構で自律複製していると考えられた。ｐＡＬ５０００は推定ＲｅｐＡ遺伝子、推定ＲｅｐＢ遺伝子、推定複製開始点を含む領域のみで各細菌内で自律複製するために十分であるため、本発明者らが分離したｐＲＥ２８９５も同様の領域のみを発現ベクター中に組み込めば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で自律複製するために十分と考えられた。
【００３３】
（２）  ベクタープラスミドｐＨＮ１３６の構築
前記（１）で分離したｐＲＥ２８９５の一部と大腸菌内で自律複製可能なプラスミドの一部を用いて両菌の複合ベクターを作成するため以下の作業を行った（図１）。
【００３４】
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （−）  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）をテンプレートとして、配列表中の配列番号１、２に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（以下プライマーと略記）を用いて、ポリメラーゼチェーンリアクション法（以下、ＰＣＲと略記：  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９  ４８７−４９１  ［１９８８］）によるＤＮＡの増幅を行った。なお、用いたＰＣＲ用の酵素はＰｆｕ  ｔｕｒｂｏ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）である。その結果、アンピシリン耐性遺伝子（図中においてはＡｍｐｒと表記）と大腸菌内で自律複製させるために必要なＣｏｌＥ１配列領域を含む２．０ｋｂの増幅されたＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩとＢｓｒＧＩで二重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００  Ｖ、３０分）に供し、該ＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、使用説明書に準じて精製した。
【００３５】
一方、ｐＮ３０（前記（１））の配列をもとにＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で自律複製するために必要と思われる領域を増幅するプライマーを設計した。なお、同プライマーの配列は配列表中の配列番号３、４で示される。プラスミドｐＨＮ７９をテンプレートとして、両プライマーを用いてＰＣＲによる増幅を行ったところ１．９  ｋｂの増幅されたＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＳａｃＩで二重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００  Ｖ、３０分）に供し、該ＤＮＡ断片を切り出し、上述の方法と同様に精製した。
【００３６】
上記２つの精製されたＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて、使用説明書通りにライゲーションし、得られたプラスミドにｐＨＮ１２９と名前を付けた。
【００３７】
次にｐＨＮ１２９に存在する制限酵素認識部位ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩを除去するため以下の作業をおこなった。まず、ｐＨＮ１２９をテンプレートとして、配列表中の配列番号５、６に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。このＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩとＰｓｔＩで二重消化して得られた０．５  ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１２９のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ部位にサブクローンした。結果、ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで連結された部分においては推定ＲｅｐＡ遺伝子のオープンリーディングフレーム（以下ＯＲＦと略記）内であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＢａｍＨＩ認識部位が除去された。またＳａｌＩ認識部位はＢａｍＨＩ認識部位のごく近傍に存在したが、配列番号５に記載のプライマー中において、ＳａｌＩ認識部位が除かれ、かつ、コードされるアミノ酸が置換されないよう設計されていることから、ＢａｍＨＩ認識部位と同時にＳａｌＩ認識部位も除去されている。このプラスミドにｐＨＮ１３５と名前を付けた。
【００３８】
次にｐＨＮ１３５に存在する制限酵素認識部位ＢｇｌＩＩを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドｐＨＮ１３５をテンプレートとして、配列表中の配列番号５、６に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。このＰＣＲ断片をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで二重消化して得られた０．５  ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１３５のＰｓｔＩ、ＢｇｌＩＩ部位にサブクローンした。結果、ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで連結された部分においては推定ＲｅｐＢ遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＢｇｌＩＩ認識部位が除去された。この結果得られたプラスミドにｐＨＮ１３６と名前をつけた。
【００３９】
（３）  ベクタープラスミドｐＨＮ１４３の構築
タンパク質の発現誘導には抗生物質チオストレプトンを用いるが、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓは同物質に対して感受性であるために、耐性を付与させなければならない。そこでＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓが持つチオストレプトン耐性遺伝子、ｔｓｒ遺伝子（Ｂｉｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９９  ２６−３６  ［１９８５］：図中においては、Ｔｈｉｏｒと表記する）を複合ベクター中に組み込むこととした。なお、この遺伝子がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ内で機能し、チオストレプトン耐性を付与することはすでに報告されている（Ｓｈａｏ  ａｎｄ  Ｂｅｈｋｉ，  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２１  ２６１−２６６  ［１９９５］）。以下に、同遺伝子の分離について具体的に述べる（図２）。
【００４０】
まず、ＰＣＲのテンプレートに使用するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ  ＪＣＭ４２１７株のゲノムＤＮＡを以下のように調製した。５ｍｌのＳＢ培地（１％  Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％  Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％  塩化ナトリウム、０．１％  Ｇｌｕｃｏｓｅ、５  ｍＭ塩化マグネシウム、０．５％  グリシン）にて３０  ℃で培養した同菌株を５００  μｌのＳＥＴバッファー（７５  ｍＭ  塩化ナトリウム、２５  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ［ｐＨ８．０］、２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］）に懸濁した。そこに、５  μｌのリゾチーム溶液（１００  ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７  ℃で３０分インキュベートした。そして、１４  μｌのプロテアーゼＫ溶液（２０  ｍｇ／ｍｌ）と６０  μｌの硫酸ドデシルナトリウム溶液（１０％）を加え、よく混合した後５５  ℃で２時間インキュベートした。その後、２００  μｌの塩化ナトリウム溶液（５  Ｍ）と５００  μｌのクロロホルムを加え、２０分間室温で回転撹拌した。遠心分離し、７００  μｌの上清をとった。これをイソプロパノール沈殿後、乾燥させ、５０  μｌのＴＥ溶液（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ［ｐＨ８．０］）に溶解した。
【００４１】
上記のように精製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ  ＪＣＭ４２１７株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号７、８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、チオストレプトン耐性遺伝子を含む１．１  ｋｂの増幅されたＤＮＡを得た。なおこのＤＮＡ断片はプラチナ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いたため、その末端は平滑末端である。このＤＮＡ断片を精製し、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ［１９８９］，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）に従い５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からＨｉｎｄＩＩＩ認識部位−ｔｓｒ遺伝子ＯＲＦ−ＥｃｏＲＩ認識部位である）。このプラスミドにｐＨＮ１３７と名前を付けた。
【００４２】
次にｐＨＮ１３７に存在する制限酵素認識部位ＳａｌＩを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドｐＨＮ１３７をテンプレートとして、配列表中の配列番号９、１０に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた０．６  ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドｐＨＮ１３７をテンプレートとして、配列表中の配列番号１１、１２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＥｃｏＲＩで消化して得られた０．５  ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはｔｓｒ遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＳａｌＩ認識部位が除去された。このプラスミドにｐＨＮ１４３と名前を付けた。
【００４３】
（４）  ベクタープラスミドｐＨＮ６２の構築
チオストレプトンによって誘導型発現をさせるためにはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内にＴｉｐＡタンパク質を存在させなければならない。そのために、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓから構成的なプロモーターを分離し、その下流にＴｉｐＡタンパク質をコードする構造遺伝子を連結した（図３）。構成的に機能するプロモーターとしてはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓのアルデヒドデヒドロゲナーゼ様タンパク質をコードするＴｈｃＡ遺伝子（Ｎａｇｙ  ｅｔ    ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７７  ６７６−６８７  ［１９９５］）のプロモーター配列を用いた。
【００４４】
テンプレートに使用するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）株のゲノムＤＮＡはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓからゲノムＤＮＡを調製したときと同様に作業し、精製した。また、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１株のゲノムＤＮＡは５  ｍｌのＬＢ培地で培養した点を除いてはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓからゲノムＤＮＡを調製したときと同様に作業し、精製した。
【００４５】
上述のように精製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号１３、１４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子のＯＲＦ並びにその下流の転写終結配列を含むＤＮＡ（図中においてはＴｉｐＡと表記）を得た。
【００４６】
このＰＣＲ断片の片方の末端をＢｇｌＩＩで消化して得られた０．９  ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、上述のように精製したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号１５、１６に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、アルデヒドデヒドロゲナーゼ様タンパク質をコードするＴｈｃＡ遺伝子（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７７  ６７６−６８７  ［１９９５］）のプロモーター配列（図中においてはＡＬＤＨｐと表記）を含むＤＮＡを得た。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＸｂａＩで消化して得られた０．２ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ部位にサブクローンした結果、ＴｈｃＡ遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にＴｉｐＡ遺伝子のＯＲＦ並びに転写終結配列を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ３３と名前を付けた。
【００４７】
次にｐＨＮ３３に存在する制限酵素ＮｃｏＩ認識部位２カ所（以下、ＮｃｏＩ（１）、ＮｃｏＩ（２）と表記する）を除去するため以下の作業をおこなった。
【００４８】
まず、プラスミドｐＨＮ３３をテンプレートとして、配列表中の配列番号９、１７に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＸｂａＩで消化して得られた０．５  ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドｐＨＮ３３をテンプレートとして、配列表中の配列番号１８、１２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＫｐｎＩで消化して得られた０．６  ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）のＸｂａＩ、ＫｐｎＩ部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはＴｉｐＡ遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＮｃｏＩ（１）認識部位が除去された。このプラスミドにｐＨＮ５０と名前を付けた。
【００４９】
次にｐＨＮ３３に存在する制限酵素認識部位ＮｃｏＩ（２）を除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドｐＨＮ３３をテンプレートとして、配列表中の配列番号９、１９に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＸｂａＩで消化して得られた０．８  ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドｐＨＮ３３をテンプレートとして、配列表中の配列番号２０、１２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＫｐｎＩで消化して得られた０．３  ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）のＸｂａＩ、ＫｐｎＩ部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはＴｉｐＡ遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＮｃｏＩ（２）認識部位が除去された。このプラスミドにｐＨＮ５１と名前を付けた。
【００５０】
最後に以下の作業を行った。ｐＨＮ５０をＸｂａＩとＳａｃＩで二重消化して得られた０．７ｋｂのＤＮＡ断片とｐＨＮ５１をＳａｃＩとＫｐｎＩで二重消化した０．４ｋｂの断片を同時にプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）のＸｂａＩ、ＫｐｎＩ部位にサブクローンした。結果、ＮｃｏＩ（１）とＮｃｏＩ（２）両方の制限酵素部位を欠いたＴｉｐＡ遺伝子を持つプラスミドを取得し、これにｐＨＮ６２と名前をつけた。
【００５１】
（５）  ベクタープラスミドｐＨＮ１５３の構築
目的のタンパク質を誘導的に発現せしめることができるかどうか確認するために、ＴｉｐＡ遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子としてＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ由来のプロリンイミノペプチダーゼ（Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３９８  １０１−１０５  ［１９９６］：以下ＰＩＰと略記する）をコードする遺伝子のＯＲＦ（図中においてはＰＩＰ  ＯＲＦと表記）を連結し、さらにその下流に転写のリードスルーを抑制するために転写終結配列を連結した。以下に具体的に述べる（図４）。
【００５２】
前記（４）にて精製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、２２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子のプロモーター配列（図中においてはＴｉｐＡｐと表記）を含む０．２  ｋｂの増幅されたＤＮＡを得た。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。この断片を精製し、常法により５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）のＳｍａＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からＫｐｎＩ認識部位−ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列−ＳａｃＩ認識部位である）。このプラスミドにｐＨＮ１５０ｕと名前を付けた。
【００５３】
次に、プラスミドｐＲＳＥＴ−ＰＩＰ  （Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３９８  １０１−１０５  ［１９９６］：以下ＰＩＰと略記する）をテンプレートとして、配列表中の配列番号２３，２４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なお、配列表中の配列番号２４のプライマーはＰＩＰ遺伝子の終止コドンを除いて、かつタンパク質の精製を容易にするために６×ＨｉｓタグがＰＩＰタンパク質のＣ末端に付くように設計されている。６×Ｈｉｓタグは、６つの連続したヒスチジン残基から成る連続配列で、これを融合したタンパク質は、ニッケルイオン等に高い親和性を示すようになる。従って、ニッケルイオン等を用いた金属キレートクロマトグラフィーで精製が容易になる（Ｃｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３１  ３７１−３８７  ［１９９４］）。このＰＩＰ遺伝子を含む０．９  ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＨＮ１５０ｕのＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にＰＩＰ遺伝子のＯＲＦを含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ１５１ｕと名前を付けた。
【００５４】
次に、前記（４）にて精製したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号２５，２６に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｈｃＡ遺伝子の転写終結配列（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７７  ６７６−６８７  ［１９９５］：図中においてはＡＬＤＨｔと表記）を含むＤＮＡを得た。この０．２ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩとＸｂａＩで二重消化し、ｐＨＮ１５１ｕのＳｐｅＩ、ＸｂａＩ部位にサブクローンした。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にＰＩＰ遺伝子のＯＲＦを含み、またそのすぐ下流にＴｈｃＡ遺伝子の転写終結配列を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ１５３と名前を付けた。
【００５５】
（６）  ベクタープラスミドｐＨＮ１６９の構築
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓをプラスミドで形質転換するためには適当な形質転換マーカーが必要になる。そこでＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で機能する強力なプロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子を連結し、使用することとした。プロモーターとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌由来の  Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＴｕをコードするＴｕｆ１遺伝子プロモーターを用いることとしたが、これは同プロモーターが強力に下流の遺伝子を転写せしめるとの報告があるからである（Ｗｅｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １２１９  ５４３−５４７  ［１９９４］）。また、薬剤耐性遺伝子は入手が容易なテトラサイクリン耐性遺伝子を用いた。以下に具体的に述べる（図５）。
【００５６】
前記（４）にて精製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号２７、２８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、Ｔｕｆ１遺伝子のプロモーター配列（図中においてはＴｕｆ１ｐと表記）を含む０．２  ｋｂの増幅されたＤＮＡを得た。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。この断片を精製し、常法により５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）  のＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からＫｐｎＩ認識部位−Ｔｕｆ１遺伝子プロモーター配列−ＥｃｏＲＩ認識部位である）。このプラスミドにｐＨＮ１５８と名前を付けた。
【００５７】
次に、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｒｏｓｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６  ３５５  ［１９８８］）をテンプレートとして、配列表中の配列番号２９、３０に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、テトラサイクリン耐性遺伝子（図中においてはＴｅｔｒと表記）を含むＤＮＡを得た。この１．３ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＨＮ１５８のＳａｌＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした結果、Ｔｕｆ１遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ１５９と名前を付けた。
【００５８】
次にｐＨＮ１５９に存在する制限酵素認識部位ＢａｍＨＩを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドｐＨＮ１５９をテンプレートとして、配列表３１、３２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＤＮＡ断片はＰｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いたため、その末端は平滑末端である。このＰＣＲ断片の片方の末端をＸｈｏＩで消化して得られた０．５  ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドｐＨＮ１５９をテンプレートとして、配列表中の配列番号３３、３４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはＰｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＮｏｔＩで消化して得られた１．１ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）のＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＢａｍＨＩ部位が除去された。このプラスミドにｐＨＮ１６５と名前を付けた。
【００５９】
次にｐＨＮ１５９に存在する制限酵素認識部位ＳａｌＩを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドｐＨＮ１５９をテンプレートとして、配列表中の配列番号３１、３５に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはＰｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＸｈｏＩで消化して得られた０．８  ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドｐＨＮ１５９をテンプレートとして、配列表中の配列番号３６、３４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはＰｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＮｏｔＩで消化して得られた０．８  ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）  のＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＳａｌＩ認識部位が除去された。このプラスミドにｐＨＮ１６６と名前を付けた。
【００６０】
最後に以下の作業を行った。ｐＨＮ１６６をＳｐｈＩとＳｐｅＩで二重消化して得られた０．９  ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１６５のＳｐｈＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。結果、ＢａｍＨＩとＳａｌＩ両方の制限酵素認識部位を欠くテトラサイクリン耐性遺伝子クローンを取得し、このプラスミドにｐＨＮ１６９と名前をつけた。
【００６１】
（７）  ベクタープラスミドｐＨＮ１７０、ｐＨＮ１７１の構築
前記（２）から（６）までに分離してきた遺伝子群を連結し、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で誘導可能な発現ベクターを構築するために以下の作業を行った（図６）。
【００６２】
ｐＨＮ１４３をＳａｃＩで消化して得られた１．１  ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１３６のＳａｃＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向から推定ＲｅｐＢ遺伝子ＯＲＦ−ｔｓｒ遺伝子ＯＲＦ−アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦである）。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１４４と名前をつけた。
【００６３】
次に、ｐＨＮ６２をＸｂａＩとＫｐｎＩで二重消化して得られた１．１  ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１４４のＸｂａＩ、ＫｐｎＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１５２と名前をつけた。
【００６４】
次に、ｐＨＮ１５３をＢｓｒＧＩとＸｂａＩで二重消化して得られた１．２  ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１５２のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１５４と名前をつけた。
【００６５】
次に、ｐＨＮ１６９をＸｂａＩとＳｐｅＩで二重消化して得られた１．６  ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１５４のＸｂａＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からｔｓｒ遺伝子ＯＲＦ−テトラサイクリン耐性遺伝子ＯＲＦ−ＴｈｃＡ遺伝子プロモーター配列である）。その結果ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの制御下に置かれたＰＩＰ遺伝子を含むプラスミドが作成され、できたプラスミドにｐＨＮ１７０と名前をつけた。
【００６６】
また組み換えタンパク質の高発現化のため、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター下流のリボソーム結合部位を翻訳効率の良いとされるラムダファージｇｅｎｅ１０由来の配列（Ｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒｍｏ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５  ８９−９３  ［１９９０］）に変化させた（図６）。以下に具体的に述べる。
【００６７】
プラスミドｐＨＮ１７０をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１，３７に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターとラムダファージｇｅｎｅ１０由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドプロモーター（以下ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターと表記する：  図中に置いてはＴｉｐＡ−ＬＧ１０ｐと表記）を得た。この０．２  ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＮｃｏＩで二重消化し、ｐＨＮ１７０のＢｓｒＧＩ、ＮｃｏＩ部位にサブクローンした。その結果ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＰＩＰ遺伝子を含むプラスミドが作成され、できたプラスミドにｐＨＮ１７１と名前をつけた。図１２にＴｉｐＡプロモーター配列を、図１３にＴｉｐＡプロモーターのＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターへの改変のためのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列の改良を示す。
【００６８】
（８）  ベクタープラスミドｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１の構築前記（７）で述べたプラスミドからレポーターであるＰＩＰ遺伝子を除き、マルチクローニング部位を導入するため以下の作業を行った（図７）。
【００６９】
配列表中の配列番号３８、３９に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはマルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ。これら２つを等モル量ずつ混合し、７０  ℃で１０分処理し、２０分かけて室温に冷却し、２本鎖化させた。その結果、その末端はＮｃｏＩとＳｐｅＩで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、この２本鎖化した合成ＤＮＡ（図中においてはＭＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒ  ＮＮｃｏと表記）をｐＨＮ１７０のＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＮＨ１と名前をつけた。また、配列表中の配列番号４０、４１に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（マルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ）を同様に２本鎖化させた合成ＤＮＡ（図中においてはＭＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒ  ＣＮｃｏと表記）をｐＨＮ１７０のＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＣＨ１と名前をつけた。
【００７０】
前記（７）で述べたＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列とラムダファージｇｅｎｅ１０由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドＤＮＡを制限酵素ＢｓｒＧＩとＮｃｏＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＮＨ１とｐＴｉｐ−ＣＨ１のＢｓｒＧＩ、ＮｃｏＩ部位にそれぞれサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１とそれぞれ名前を付けた。
【００７１】
（９）  ベクタープラスミドｐＴｉｐ−ＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２の構築前記（８）で述べたプラスミドｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１
、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１において、マルチクローニング部位の最も上流のＮｃｏＩ部位をＮｄｅＩに変更するために以下の作業を行った（図８）。
【００７２】
プラスミドｐＨＮ１７０をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡを得た。この０．２  ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＮｄｅＩで二重消化し、ｐＨＮ１７０のＢｓｒＧＩ、ＮｄｅＩ部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＨＮ１８３と名前を付けた。
【００７３】
配列表中の配列番号４３、４４に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはマルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ。これら２つを等モル量ずつ混合し、７０  ℃で１０分処理し、２０分かけて室温に冷却し、２本鎖化させた。その結果、その末端はＮｄｅＩとＳｐｅＩで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、この２本鎖化した合成ＤＮＡ（図中においてはＭＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒ  ＮＮｄｅと表記）をｐＨＮ１８３のＮｄｅＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＮＨ２と名前をつけた。また、配列表中の配列番号４５、４６に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（マルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ）を同様に２本鎖化させた合成ＤＮＡ（図中においてはＭＣＳ  Ｌｉｎｋｅｒ  ＣＮｄｅと表記）をｐＨＮ１８３のＮｄｅＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＣＨ２と名前をつけた。
【００７４】
プラスミドｐＴｉｐ−ＬＮＨ１をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４７に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターとラムダファージｇｅｎｅ１０由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドＤＮＡを得た。この０．２ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＮｄｅＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＮＨ２とｐＴｉｐ−ＣＨ２のＢｓｒＧＩ、ＮｄｅＩ部位にそれぞれサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２とそれぞれ名前を付けた。
【００７５】
前記（８）、（９）で作成したプラスミドのマップと、マルチクローニング部位周辺の配列をまとめて図９に示す。該図中、実線の矢印はＴｉｐＡ遺伝子プロモーター中に存在するＩｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ配列を示す。斜線の矢印はＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列に存在するＩｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ配列を示す。また、原核生物のプロモーター領域に一般的に存在し、遺伝子の転写に重要な−１０領域、−３５領域、ＲＢＳは四角で囲んである。またＲＢＳの中でも最も重要なＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ  ａｎｄ  Ｄａｌｇａｒｎｏ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５７  ２２１−２３０  ［１９７５］）は下線を引いてある。
【００７６】
（１０）  ベクタープラスミドｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１の構築
前記（８）及び（９）で述べたプラスミドｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２において、マルチクローニング部位のＸｈｏＩ部位以降の読み枠を市販のｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の読み枠と一致させるために以下の作業を行った（図１０）。
【００７７】
プラスミドｐＴｉｐ−ＣＨ１をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターとマルチクローニング部位を含むＤＮＡを得た。この０．３  ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＣＨ１のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＣＨ１．１と名前を付けた。
【００７８】
プラスミドｐＴｉｐ−ＣＨ２をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターとマルチクローニング部位を含むＤＮＡを得た。この０．３  ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＣＨ１のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＣＨ２．１と名前を付けた。
【００７９】
プラスミドｐＴｉｐ−ＬＣＨ１をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターとマルチクローニング部位を含むＤＮＡを得た。この０．３ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＣＨ１のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１と名前を付けた。
【００８０】
プラスミドｐＴｉｐ−ＬＣＨ２をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターとマルチクローニング部位を含むＤＮＡを得た。この０．３  ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＣＨ１のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１と名前を付けた。
【００８１】
（１１）  ベクタープラスミドｐＨＮ１７２、ｐＨＮ１７３の構築
発現の誘導が厳密に調節されているかを調べるために以下のようなコントロール実験用プラスミドを作成した（図１１）。
【００８２】
ｐＨＮ１６９をＸｂａＩとＳｐｅＩで二重消化して得られた１．６  ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１４４のＸｂａＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からｔｓｒ遺伝子ＯＲＦ−テトラサイクリン耐性遺伝子ＯＲＦ−アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦである）。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１７２と名前をつけた。
【００８３】
次に、ｐＨＮ１５３をＢｓｒＧＩとＸｂａＩで二重消化して得られた１．２  ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１４４のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１６４と名前をつけた。次いで、ｐＨＮ１６９をＸｂａＩとＳｐｅＩで二重消化して得られた１．６ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１６４のＸｂａＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からｔｓｒ遺伝子ＯＲＦ−テトラサイクリン耐性遺伝子ＯＲＦ−アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦである）。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１７３と名前をつけた。
【００８４】
ｐＨＮ１７０は、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター、その下流にＰＩＰ  ＯＲＦ、さらにその下流にＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列、の３因子が連結された遺伝子カセット（以下Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅと表記）と、ＴｈｃＡ遺伝子プロモーター、その下流にＴｉｐＡ遺伝子、の２因子が連結された遺伝子カセット（以下Ｉｎｄｕｃｅｒ  ｃａｓｓｅｔｔｅと表記）両方をもつ。ｐＨＮ１７３はＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅのみをもち、ｐＨＮ１７２は両ｃａｓｓｅｔｔｅを持たない。
【００８５】
（１２）  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌の形質転換
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１株をＬＢ培地１００  ｍｌにて対数増殖期に至るまで３０  ℃で振とう培養する。培養液を３０分間氷冷し、遠心分離し、菌体を回収する。これに１００  ｍｌの氷冷滅菌水を加え、よく撹拌し、再び遠心分離し、菌体を回収する。これに１００  ｍｌの氷冷１０％グリセリン溶液を加え、よく撹拌し、遠心分離し、菌体を回収する。この氷冷１０％グリセリン溶液での洗浄をもう一度繰り返し、菌体を５  ｍｌの氷冷１０％グリセリン溶液に懸濁する。４００  μｌずつ分注し、液体窒素で瞬間冷凍し、使用するまで−８０  ℃にて保存した。−８０  ℃から菌体を取り出し、氷上にて融解し、プラスミドｐＨＮ１７０、またはｐＨＮ１７２、またはｐＨＮ１７３を３  μｌ  （それぞれ約３００  ｎｇ）加えた。この菌体とＤＮＡの混合液をエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社：０．２  ｃｍ  ギャップキュベット）に移し、同社の遺伝子導入装置ジーンパルサーＩＩを用いて、電場強度１２．５  ｋＶ／ｃｍで、パルスコントローラーの設定はキャパシタンス２５  μＦ、外部抵抗４００  Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電気パルス処理した菌体とＤＮＡの混合液を１  ｍｌのＬＢ培地に混合し、３０  ℃にて４時間培養した後集菌し、２０  μｇ／ｍｌテトラサイクリン入りＬＢ寒天培地（寒天は濃度１．８％）に塗布し、３０  ℃にて３日培養し、それぞれの形質転換体を得た。
【００８６】
〔実施例１〕
実験方法
まず、以下の実施例２から実施例１２に書かれた実験に用いた手法を列挙する。
プラスミドは全て、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ［１９８９］，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）に従って構築した。ポリメラーゼチェーンリアクション法（以下、ＰＣＲと略記；  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９  ４８７−４９１  ［１９８８］）には全てＰｆｕ  ｔｕｒｂｏ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた。プラスミドから切り出したＤＮＡ断片は１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、使用説明書に準じて精製した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）株、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ３１３株のゲノムＤＮＡの分離法、並びにＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌からのプラスミドＤＮＡの精製方法は参考例１に記載したものと同一である。大腸菌ＥＲ２５０８株（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）のゲノムＤＮＡはＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用い、使用説明書に準じて精製した。ＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化する必要のある場合は東洋紡社製Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅを用いた。塩基配列決定にはＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（Ｒ）  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）を用いた。リガーゼ反応にはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製のＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを用いた。
【００８７】
用いた主なプラスミド、菌株を表１，２に示す。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）株、大腸菌の培養はＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ；  １％  Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎ，  ０．５％  Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，  １％  塩化ナトリウム）で行った。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌のコンピテントセル作成法、並びに形質転換法は参考例１に記されているが、予めプラスミドを保持しているＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌のコンピテントセルを作成する際には、適当な抗生物質を含んだＬＢ培地で培養した菌体から行った。形質転換体を選択する際には、テトラサイクリン（液体培地では、８μｇ  ／  ｍｌ、固体培地では２０  μｇ  ／  ｍｌ）、  クロラムフェニコール（３４  μｇ  ／  ｍｌ）、アンピシリン（５０  μｇ  ／  ｍｌ）を用いた。
【００８８】
誘導型ベクターを用いてＰｒｏｌｉｎｅ  ｉｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  （以下ＰＩＰ）または、蛍光緑色タンパク質（以下ＧＦＰ）をＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌にて発現させる際には、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌の形質転換体を適当な抗生物質を含むＬＢ培地で３０  ℃にて培養し、６００  ｎｍの波長で測定したオプティカルデンシティー（Ｏ．Ｄ．６００）が０．６になった時点で、終濃度１μｇ  ／  ｍｌになるようにチオストレプトン（溶媒はジメチルスルホオキサイド）を加え、さらに１６時間培養を続けた。構成型ベクターを用いて発現させる際には、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌の形質転換体を適当な抗生物質を含むＬＢ培地で３０  ℃にてＯ．Ｄ．６００が２．０になるまで培養した。
【００８９】
ＰＩＰのペプチダーゼ活性を測定する方法を以下に詳述する。上記のようにＰＩＰを発現させたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌の培養液を、８  μｇ  ／  ｍｌの適当な抗生物質を含むＬＢ培地で２００  μｌにメスアップし、６０  ℃にて１分加温する。そこにＰＩＰの基質として２  μｌのＨ−Ｐｒｏ−βＮＡ（１００  ｍＭ；溶媒はジメチルスルホオキサイド）を加え６０  ℃にて２０分インキュベートする（ＰＩＰは６０  ℃が至適温度）。ＰＩＰによってＨ−Ｐｒｏ−βＮＡから加水分解されて遊離したβＮＡを観察するために、発色剤として１３４  μｌのＦａｓｔ  Ｇａｒｎｅｔ  ＧＢＣ  Ｓａｌｔ  溶液（和光純薬社製で濃度０．５  ｍｇ  ／  ｍｌ  ：  １  Ｍ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．２）、１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が溶媒）を加える。ＰＩＰが発現していなければ上記混合液は黄色を呈するが、発現していれば赤色を呈する。また、呈色した赤色を吸光分光光度計を用い、５５０  ｎｍでの吸光度（Ａ５５０）を測定し、ＰＩＰ活性を定量した。測定はＦａｓｔ  Ｇａｒｎｅｔ  ＧＢＣ  Ｓａｌｔを加えた後、滅菌水６６６  μｌを加え希釈して行った。
【００９０】
その際、５５０  ｎｍでは細胞のオプティカルデンシティーも測定してしまうので、５５０  ｎｍでの細胞のオプティカルデンシティー（Ｏ．Ｄ．５５０）は別測定し、測定時に使用したＯ．Ｄ．５５０に相当する値をＡ５５０の値から差し引いて補正した値をＡｃ５５０とする。すなわち、Ａｃ５５０＝Ａ５５０−Ｏ．Ｄ．５５０×ＰＩＰの活性測定に使用した培養液量（ｍｌ）で計算される。ユニット値は「２０分間の測定で得られる、培養液１  ｍｌあたり、Ｏ．Ｄ．６００＝１あたりのＡｃ５５０の値」とし、「Ａｃ５５０÷ＰＩＰの活性測定に使った培養液量（ｍｌ）÷Ｏ．Ｄ．６００」で計算した。
【００９１】
〔実施例２〕
Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓに存在する新規内在性プラスミドｐＲＥ８４２４の分離
本発明者はＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓに存在する新規内在性プラスミドを探索し、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ２８９３、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ２８９４、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ４３２００、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ８４２４の４株から小型の環状プラスミドを分離し、それぞれｐＲＥ２８９３、ｐＲＥ２８９４、ｐＲＥ４３２００、ｐＲＥ８４２４と名前を付けた。
【００９２】
これらのうち、ｐＲＥ２８９３、ｐＲＥ２８９４、ｐＲＥ４３２００のＤＮＡ配列を一部決定したところ、本発明者が以前にＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ２８９５株から分離していたｐＲＥ２５８５（参考例１を参照）とほぼ同一の配列を有していた。ｐＲＥ２８９５はプラスミドの複製に関与するＲｅｐＡ、ＲｅｐＢタンパク質をコードする遺伝子をＲｅｐＡＢオペロンとして有しているが、これらのタンパク質はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍから分離されたｐＡＬ５０００プラスミドがコードするＲｅｐＡ、ＲｅｐＢタンパク質と高度に類似しており、ｐＲＥ２８９５とｐＡＬ５０００が類似の様式で自律複製していることが示唆された（Ｓｔｏｌｔ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｅｒ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２  ２７９５−２８０２  ［１９９６］，  参考例１）。ｐＲＥ２８９５とｐＡＬ５０００の複製様式は明らかでないが、両プラスミドのＲｅｐＡタンパク質がＣｏｌＥ２プラスミドのＲｅｐタンパク質に相同性があるため、ＣｏｌＥ２プラスミド同様「θ型」の自律複製様式を有することが考えられた（Ｈｉｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７６  ７２３３−７２４３  ［１９９４］）。
【００９３】
一方、ｐＲＥ８４２４はｐＲＥ２５８５と全く異なるＤＮＡ配列を有していた（配列表中の配列番号９０、図１）。このプラスミドは６つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；ＯＲＦ１からＯＲＦ６）を持ち、うちＯＲＦ６がコードするタンパク質（図１４）はローリングサークル様式で自律複製する一群のプラスミドが持つＲｅｐ遺伝子がコードするタンパク質と相同性が高かった（Ｋｈａｎ，  Ｍｉｃｒｏｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６１  ４４２−４５５  ［１９９７］）。中でも、  Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ由来ｐＡＰ１（Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８０  ３２３３−３２３６  ［１９９８］）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ由来ｐＩＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７０  ４６３４−４６５１  ［１９８８］）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ由来ｐＪＶ１（Ｓｅｒｖｉｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１  ２４９９−２５１０  ［１９９５］）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ由来ｐＢＬ１（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７６  ３１５４−３１６１  ［１９９４］）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ由来ｐＳＮ２２（Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｓｍｉｄ  ３２  ５５−６９  ［１９９４］）と相同性が高かった（図１５）。これらのプラスミドは、いずれもローリングサークル型プラスミドの中でもｐＩＪ１０１／ｐＪＶ１ファミリーに属するもので（Ｋｈａｎ，  Ｍｉｃｒｏｉｏｌ．  Ｍｏｉ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６１  ４４２−４５５  ［１９９７］）、ｐＲＥ８４２４もこのファミリーに属するローリングサークル型プラスミドである可能性が示唆された。以下、ＯＲＦ６はＲｅｐと記載する。
【００９４】
一般に、ローリングサークル型プラスミドが宿主細胞内で自律複製するためには、前出のＲｅｐの他に、２本鎖複製起点（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ；以下ＤＳＯ）、１本鎖複製起点（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ；以下ＳＳＯ）となるＤＮＡ配列が必要である。本発明者は様々なｐＲＥ８４２４の変異体を作成し、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを形質転換し、様々な解析を行い、ＤＳＯ、ＳＳＯ配列の所在を同定した（図１４）。ＤＳＯは配列表中の配列番号９０のうちヌクレオチド番号５５１４から５９７０内に存在すると考えられたが、他のローリングサークル型プラスミドのＤＳＯ配列との比較から、配列表中の配列番号９０のヌクレオチド番号５７０５から５７３４の配列が最もＤＳＯの機能に重要だと考えられた（図１６）。また、同定したＳＳＯ配列を図１７に示す。ＳＳＯ配列は一般に、ステム  −  ループ構造など高度な二次構造を持ち、さらに、ｐＩＪ１０１／ｐＪＶ１ファミリーのプラスミドの場合、ステム  −  ループ構造のループ部分にＴＡＧＣＧＴなどからなる共通配列が存在する場合が多い。ｐＲＥ８４２４のＳＳＯも高度な二次構造を持ち、ループ部分にＴＡＧＣＧＧ配列を持つ（図１７）。
【００９５】
本発明者は、上記ＴＡＧＣＧＧに変異を持つｐＲＥ８４２４の派生プラスミドがＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ細胞内に大量に一本鎖ＤＮＡとして蓄積していたことを見いだした。一本鎖ＤＮＡの蓄積はローリングサークル型プラスミドのホールマークであることから（Ｋｈａｎ，  Ｍｉｃｒｏｉｏｌ．  Ｍｏｉ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６１  ４４２−４５５  ［１９９７］）、ｐＲＥ８４２４はローリングサークル様式で自律複製していることが明らかとなった。
【００９６】
ｐＲＥ８４２４の派生プラスミドが宿主細胞であるＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ内で自律複製するためには、Ｒｅｐ、ＤＳＯ、ＳＳＯを含む２．０  ｋｂの領域、すなわち配列表中の配列番号９０のうちヌクレオチド番号３８４５から５８４９までの領域、で十分であった（以下の実施例３参照）。
【００９７】
図１４はｐＲＥ８４２４のマップを示す。図１４中には主な制限酵素認識部位が示されていて、６つのＯＲＦが矢印で示されている。ＤＳＯとＳＳＯの位置が四角で示されている。
【００９８】
図１５はｐＲＥ８４２４、ｐＡＰ１、ｐＢＬ１、ｐＪＶ１、ｐＩＪ１０１、ｐＳＮ２２のＲｅｐタンパク質の５カ所の保存された領域（Ｍｏｔｉｆ  ＩＶ、Ｍｏｔｉｆ  Ｉ、Ｍｏｔｉｆ  ＩＩ、Ｍｏｔｉｆ  ＩＩＩ、Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｏｔｉｆ；Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８０  ３２３３−３２３６  ［１９９８］参照）のアミノ酸配列を示す。数字は各領域間に存在するアミノ酸残基の数、即ちギャップのアミノ酸残基の数を示す。完全に保存されたアミノ酸残基は星（＊）、高度に保存された領域は２つの点（：）、比較的保存された領域は１つの点（．）で示した。Ｒｅｐタンパク質の機能に重要とされるチロシン残基は四角で囲ってある。
【００９９】
図１６はｐＲＥ８４２４、ｐＡＰ１、ｐＢＬ１、ｐＪＶ１、ｐＩＪ１０１、ｐＳＮ２２のＤＳＯと考えられる配列のうち、特に保存されたＤＮＡ部分を示す。更にＤＳＯの機能に特に重要なＧＧジヌクレオチドは下線を引いてある（Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８０  ３２３３−３２３６  ［１９９８］参照）。
【０１００】
図１７はｐＲＥ８４２４のＳＳＯ、即ち配列表中の配列番号９０のうちヌクレオチド番号５２６８から５５３８の配列と、その取りうる二次構造を示した。二次構造の予測はｍｆｏｌｄ  ｐｒｏｇｒａｍ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０  （Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｚｕｋｅｒ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ．；  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｏｌｄ／ｄｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ）によって行った。上述のＴＡＧＣＧＧ配列を黒丸で示した。
【０１０１】
〔実施例３〕
ｐＨＮ３７２の構築
ｐＲＥ８４２４の自律複製に必須な２．０  ｋｂの領域には、不必要な制限酵素認識部位ＢａｍＨＩが存在していたので、これを除去する作業を以下のように行った。
【０１０２】
ｐＲＥ８４２４をテンプレートとし、配列表中の配列番号５７（ｓＨＮ３８９）、５８（ｓＨＮ３９０）に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（以下プライマーと略記）を用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた１．０  ｋｂの断片はＲｅｐの５’末端側の一部を含む。この断片の５’末端をリン酸化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＨｉｎｃＩＩ部位に導入し、できたプラスミドにｐＨＮ３７１と名前を付けた。ｐＲＥ８４２４をテンプレートとし、配列表中の配列番号５９（ｓＨＮ３９１）、６０（ｓＨＮ３２１）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた１．０  ｋｂの断片はＲｅｐの３’末端側の一部を含む。この断片をＢａｍＨＩで消化した後、５’末端をリン酸化し、ｐＨＮ３７１のＥｃｏＲＶ  ／  ＢｇｌＩＩ部位に導入した。できたプラスミドにｐＨＮ３７２と名前を付けた。ｐＨＮ３７２は、ｐＲＥ８４２４の自律複製に必須な２．０  ｋｂの領域を持ち、かつ、ｐＲＥ８４２４には存在したＢａｍＨＩ部位は除去されている。また、ＢａｍＨＩ部位の除去は、ｐＲＥ８４２４の自律複製の機能には影響しなかった。
【０１０３】
〔実施例４〕
ｐＨＮ３４６の構築
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌の形質転換体選択マーカーとして、参考例に示すベクターの構築においてはテトラサイクリン耐性遺伝子のみ開発していたが、複数のプラスミドで形質転換するためには、別の抗生物質に対する耐性遺伝子を新規に開発する必要がある。本発明者は、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ  ３１３株がクロラムフェニコールに対して耐性をであることを見いだし、耐性を付与している遺伝子を分離することとした。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌からは、すでに２つのクロラムフェニコール耐性遺伝子が分離されており（ｃｍｒＡ遺伝子、ならびにｃｍｒ遺伝子）、これらの遺伝子は互いに高い相同性を有している（Ｄｅ  Ｍｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３  ３１３７−３１４７  ［１９９７］、Ｄｅｓｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６  ２３７７−２３８５  ［１９９２］）。
【０１０４】
Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ  ３１３株のクロラムフェニコール耐性遺伝子もこれらに相同であることが予想されたので、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ  ３１３株ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、配列表中の配列番号６１（ｓＨＮ３３５）、６２（ｓＨＮ３３６）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。なお、該プライマーはｃｍｒＡ遺伝子とｃｍｒ遺伝子において最も相同性が高かった配列をもとにデザインした。その結果、０．７  ｋｂの増幅されたバンドが確認された。このＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を決定したところ、ｃｍｒＡ遺伝子に極めて高い相同性を有していた。決定された配列を元に、配列表中の配列番号６３（ｓＨＮ３４９）、６４（ｓＨＮ３５１）に記載のプライマーを設計し、インバースＰＣＲ（Ｏｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２０  ６２１−６２３［１９８８］）にてＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ  ３１３株のクロラムフェニコール耐性遺伝子の全長を分離した。テンプレートとして用いたＤＮＡはＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ３１３株のゲノムＤＮＡ  ０．１  μｇをＳａｌＩで切断し、リガーゼにより自己閉環化したものである。得られたＰＣＲ産物は２．３  ｋｂで、この断片の全ＤＮＡ配列を決定した。この断片中には１つのＯＲＦが存在し、この遺伝子にＣｈｌＡと名前を付けた（図中ではＣｈｌｒと表記）。
【０１０５】
Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ  ３１３株ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、配列表中の配列番号６５（ｓＨＮ３６１）、６６（ｓＨＮ３６２）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた０．５  ｋｂの断片はクロラムフェニコール耐性遺伝子の５’末端部分を含む。この断片をＳａｃＩで消化し、その５’末端をリン酸化した。一方、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＤＳＭ  ３１３株ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、配列表中の配列番号６７（ｓＨＮ３６３）、６８（ｓＨＮ３６４）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた１．３  ｋｂの断片はクロラムフェニコール耐性遺伝子の３’末端部分を含む。この断片をＳｐｅＩで消化し、その５’末端をリン酸化した。これら２つのＤＮＡ断片を同時にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）のＳａｃＩ  ／  ＳｐｅＩ部位に導入し、できたプラスミドにｐＨＮ３４６と名前を付けた。ｐＨＮ３４６は全長のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むが、該ＯＲＦ中にもともと存在していたＥｃｏＲＩ部位が除かれている（ただし、コードするタンパク質のアミノ酸配列は変化しない）。
【０１０６】
〔実施例５〕
Ｐｒｏｌｉｎｅ  ｉｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ＰＩＰ）をレポーター遺伝子として有する誘導型発現ベクターの構築；ｐＨＮ１７１、ｐＨＮ３７９、ｐＨＮ３４８、ｐＨＮ３８０の構築
ｐＨＮ３４６（実施例４）から１．８  ｋｂのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む断片をＸｂａＩとＳｐｅＩで切り出し、ｐＨＮ１５４（特願２００２−２３５００８）のＸｂａＩ部位に導入した。この結果できたプラスミドにｐＨＮ３４７と名前を付けた。ｐＨＮ１７１（参考例を参照）から１．１  ｋｂの断片をＢｓｒＧＩとＳｐｅＩで切り出し、ｐＨＮ３４７のＢｓｒＧＩ  ／  ＳｐｅＩ部位に導入した。出来たプラスミドにｐＨＮ３４８と名前を付けた。
【０１０７】
ｐＨＮ１７１もｐＨＮ３４８もｐＴｉｐベクター（参考例を参照）のＭＣＳにレポーター遺伝子、ＰＩＰが導入された発現ベクターであるが、ｐＨＮ１７１がテトラサイクリン耐性遺伝子を形質転換マーカーとして持つのに対して、ｐＨＮ３４８がクロラムフェニコール耐性遺伝子を持っていることのみが異なる。また、いずれのプラスミドもＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの下流に元来存在していたリボソーム結合部位配列（ＴｉｐＡ−ＲＢＳ）は翻訳効率の良い、バクテリオファージｇｅｎｅ  １０由来のリボソーム結合部位配列に変更されている（ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター；参考例を参照）。ＰＩＰのＣの末端側には、タンパク質の精製を容易にするために６×Ｈｉｓタグが付くように設計されている。６×Ｈｉｓタグは、６つの連続したヒスチジン残基から成る連続配列で、これを融合したタンパク質は、ニッケルイオン等に高い親和性を示すようになる。従って、ニッケルイオン等を用いた金属キレートクロマトグラフィーで精製が容易になる（Ｃｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３１  ３７１−３８７  ［１９９４］）。
【０１０８】
上述のｐＨＮ１７１とｐＨＮ３４８のＤＮＡ配列のうち、ｐＲＥ２５８５に由来するプラスミドの自律複製に必須な１．９  ｋｂの領域を、ｐＲＥ８４２４に由来するプラスミドの自律複製に必須な２．０  ｋｂの領域に変更するために以下の作業を行った。
【０１０９】
ｐＨＮ１７１をテンプレートとし、配列表中の配列番号６９（ｓＨＮ３６８）、７０（ｓＨＮ３７３）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた０．２  ｋｂの断片はチオストレプトン耐性遺伝子（ｔｓｒ遺伝子；図中ではＴｈｉｏｒと表記）（Ｂｉｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．  １９９  ２６−３６  ［１９８５］）の５’末端部分を含む。この断片をＢｓｒＧＩとＣｌａＩで消化し、ｐＨＮ１７１とｐＨＮ３４８のＢｓｒＧＩ  ／  ＣｌａＩ部位にそれぞれ導入した。この結果出来たプラスミドにそれぞれｐＨＮ３５７とｐＨＮ３５８と名前を付けた。ｐＨＮ３７２（実施例３）から２．０  ｋｂのｐＲＥ８４２４に由来するプラスミドの自律複製に必須な領域を含む断片をＢｓｒＧＩとＨｐａＩで切り出し、ｐＨＮ３５７とｐＨＮ３５８のＢｓｒＧＩ  ／  ＨｐａＩ部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにｐＨＮ３７９、ｐＨＮ３８０とそれぞれ名前を付けた。
【０１１０】
〔実施例６〕
ｐＴｉｐベクターの構築
ｐＨＮ１７１、ｐＨＮ３４８、ｐＨＮ３７９、ｐＨＮ３８０（実施例５）のＰＩＰ遺伝子の代わりに、ＭＣＳを導入し、８種類のｐＴｉｐベクターを構築した過程を示す。なお、今回作成した、ｐＴｉｐベクターのうち、４つ（ｐＴｉｐ−ＲＴ１、ｐＴｉｐ−ＲＴ２、ｐＴｉｐ−ＲＣ１、ｐＴｉｐ−ＲＣ２；後述）は、参考例１に記載のｐＴｉｐベクターとは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌でプラスミドが自律複製するのに必要なＤＮＡ領域が異なり、参考例１に記載のｐＴｉｐベクター全てとＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内での不和合性を起こさない（後述）。また、残りの４つ（ｐＴｉｐ−ＱＴ１、ｐＴｉｐ−ＱＴ２、ｐＴｉｐ−ＱＣ１、ｐＴｉｐ−ＱＣ２；後述）は、参考例１に記載のｐＴｉｐベクターとはＭＣＳの配列が一部異なっている。
【０１１１】
配列表中の配列番号７１、７２に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはＭＣＳ部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ。これら２つを等モル量ずつ混合し、７０  ℃で１０分処理し、２０分かけて室温に冷却し、２本鎖化させた（ＭＣＳ  ｔｙｐｅ  １）。その結果、その末端はＮｃｏＩとＳｐｅＩで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、この２本鎖化した合成ＤＮＡをｐＨＮ３７９、ｐＨＮ３８０のＮｃｏＩ  ／  ＳｐｅＩ部位にそれぞれサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＲＴ１、ｐＴｉｐ−ＲＣ１とそれぞれ名前をつけた。配列表中の配列番号７３、７４に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを同様に２本鎖化させ（ＭＣＳ  ｔｙｐｅ  ２）、一方、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２（参考例１を参照）から０．２  ｋｂのＴｉｐＡ遺伝子プロモーターとＬＧ１０−ＲＢＳを含む断片をＢｓｒＧＩとＮｄｅＩで切り出した。これら２つのＤＮＡ断片を同時に、ｐＨＮ３７９とｐＨＮ３８０のＢｓｒＧＩ  ／  ＳｐｅＩ部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＲＴ２、ｐＴｉｐ−ＲＣ２と名前を付けた。ｐＴｉｐ−ＲＴ１から０．３  ｋｂのＴｉｐＡ遺伝子プロモーター、ＬＧ１０−ＲＢＳ、ＭＣＳ  ｔｙｐｅ  １を含む断片をＢｓｒＧＩとＳｐｅＩで切り出し、ｐＨＮ１７１とｐＨＮ３４８のＢｓｒＧＩ  ／  ＳｐｅＩ部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＱＴ１、ｐＴｉｐ−ＱＣ１と名前を付けた。ｐＴｉｐ−ＲＴ２から０．３  ｋｂのＴｉｐＡ遺伝子プロモーター、ＬＧ１０−ＲＢＳ、ＭＣＳ  ｔｙｐｅ  ２を含む断片をＢｓｒＧＩとＳｐｅＩで切り出し、ｐＨＮ１７１とｐＨＮ３４８のＢｓｒＧＩ  ／  ＳｐｅＩ部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＱＴ２、ｐＴｉｐ−ＱＣ２と名前を付けた。
【０１１２】
図１８−１にｐＴｉｐベクター（ｐＴｉｐ−ＱＴ１、ｐＴｉｐ−ＱＴ２、ｐＴｉｐＲＴ１、ｐＴｉｐ−ＲＴ２、ｐＴｉｐ−ＱＣ１、ｐＴｉｐ−ＱＣ２、ｐＴｉｐ−ＲＣ１、ｐＴｉｐ−ＲＣ２）のマップを示す。該図中、Ｔｈｉｏｒはチオストレプトン耐性遺伝子を、Ｔｕｆ１ｐはＴｕｆ１遺伝子プロモーターを、Ｔｅｔｒはテトラサイクリン耐性遺伝子を、Ｃｈｌｒはクロラムフェニコール耐性遺伝子を（各ｐＴｉｐ−ベクターはＴｕｆ１ｐ−ＴｅｔｒまたはＣｈｌｒいずれか一つを持つ）、ＡＬＤＨｐはＴｉｐＡ遺伝子（ＴｉｐＡ）を転写せしめるＴｈｃＡプロモーターを、Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を、ＣｏｌＥ１は大腸菌の複製起点を、ＡＬＤＨｔ  はＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列を、ＭＣＳはマルチクローニング部位を（各ｐＴｉｐ−ベクターはＭＣＳ  ｔｙｐｅ１またはＭＣＳ  ｔｙｐｅ  ２のいずれか一つを持つ）、ＴｉｐＡｐはＴｉｐＡ遺伝子プロモーターを、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０ｐはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターをを、ＲｅｐＡ＆ＢはｐＲＥ２８９５由来のプラスミドのＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ内での自律複製に必須な領域を、ＲｅｐはｐＲＥ８４２４由来のプラスミドのＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ内での自律複製に必須な領域を（各ｐＴｉｐ−ベクターはＲｅｐＡ＆ＢまたはＲｅｐのいずれか一つを持つ）示す。なお、実施例９に書かれたｐＮｉｔベクター（後述）の図が該図、右半分に記してあり、記号などは上記のものと同じである。
【０１１３】
図２０は、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター  −  ＭＣＳ  −  ＴｈｃＡ遺伝子ターミネーターのＤＮＡ配列を示す。該図中、実線の矢印はＴｉｐＡ遺伝子プロモーター中に存在するＩｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ配列を示す。斜線の矢印はＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列に存在するＩｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ配列を示す。また、原核生物のプロモーター領域に一般的に存在し、遺伝子の転写に重要な−１０領域、−３５領域は四角で囲んである。また、四角で囲まれたＴＡＴＡＡＴ配列はＴｉｐＡ遺伝子プロモーターからＮｉｔプロモーターを作成したときに導入した変異を示す（実施例７に詳述）。
【０１１４】
〔実施例７〕
ｐＨＮ２３１の構築
まず本発明者は、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターに変異を導入して、誘導型から構成型プロモーターに改変することとした。ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列中の「Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ」領域にチオストレプトン  −  ＴｉｐＡタンパク質複合体が結合し、自らの遺伝子の転写を促進することは以前から知られていた（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２  ３１８３−３１９１  ［１９９３］）。そこで、本発明者は該ＤＮＡ領域に、ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ構造を破壊する変異を導入したら、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの転写活性に何らかの変化が現れるのではないかと考え、様々なＴｉｐＡ遺伝子プロモーター変異体を作成した。それらのうち、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの所謂−１０領域（Ｆｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｒａｌｌａ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８  ９０２０−９０２５  ［２００１］）に変異を導入したもの（図１９；ＣＡＧＣＧＴからＴＡＴＡＡＴへの変異）では、チオストレプトン非存在下でも、レポーター遺伝子の発現が観察された（図２０；実施例１０に詳述）。なお、このＴＡＴＡＡＴからなるＤＮＡ配列は、大腸菌において非常に強力なプロモーターとして機能するＤＮＡ配列中の−１０領域によく見られる配列である。以上のことからこの変異ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターは構成型プロモーターであると結論された。また、この構成型プロモーターにＮｉｔ（Ｎｏｎ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＴｉｐＡ；図中ではＮｉｔｐと表記）プロモーターと名前を付けた。
【０１１５】
Ｎｉｔプロモーターを構築した過程を以下に示す。ｐＨＮ１５０ｕ（参考例１を参照）をテンプレートとし、配列表中の配列番号７５（ｓＨＮ２１７）、７６（ｓＨＮ２１８）に記載のプライマーを用いてインバースＰＣＲにてＤＮＡの増幅を行った。なお、ｐＨＮ１５０ｕは、ｐ  Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）  のＭＣＳに、野生型ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターがクローン化されたプラスミドで、また上記２つのプライマーはその５’末端がそれぞれリン酸化されている。このインバースＰＣＲ断片をリガーゼ反応により自己閉環化し、結果出来たプラスミドにｐＨＮ２３１と名前を付けた。ｐＨＮ２３１はＮｉｔプロモーターがｐ  Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）  のＭＣＳにクローン化された形になっている。
【０１１６】
〔実施例８〕
ＰＩＰをレポーター遺伝子として有する構成型発現ベクターの構築；ｐＨＮ４０７、ｐＨＮ３８５、ｐＨＮ４０９、ｐＨＮ３８９の構築
ｐＴｉｐ−ＮＨ１（参考例１を参照）をテンプレートとし、配列表中の配列番号７７（ｓＨＮ３９５）、７８（ｓＨＮ３９６）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた１．６  ｋｂの断片はテトラサイクリン耐性遺伝子を含む。この断片をＨｐａＩとＫｐｎＩで消化し、ｐＨＮ３７９（実施例５）のＨｐａＩ  ／  ＫｐｎＩ部位に導入した。この結果出来たプラスミドにｐＨＮ３８１と名前を付けた。ｐＨＮ３４６（実施例４）をテンプレートとし、配列表中の配列番号７９（ｓＨＮ３９７）、８０（ｓＨＮ３９８）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた１．８  ｋｂの断片はクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。この断片をＨｐａＩとＫｐｎＩで消化し、ｐＨＮ３８０（実施例５）のＨｐａＩ  ／  ＫｐｎＩ部位に導入した。この結果出来たプラスミドにそれぞれｐＨＮ３８２と名前を付けた。ｐＨＮ２３１（実施例７）から０．２  ｋｂのＮｉｔプロモーターを含む断片をＢｓｒＧＩとＮｃｏＩで切り出し、ｐＨＮ３８１とｐＨＮ３８２のＢｓｒＧＩ  ／  ＮｃｏＩ部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにｐＨＮ３８３、ｐＨＮ３８７とそれぞれ名前を付けた。ｐＨＮ２３１（実施例７）をテンプレートとし、配列表中の配列番号８１（ｓＨＮ１４７）、８２（ｓＨＮ３７６）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた０．２  ｋｂの断片はＮｉｔプロモーターのうちＲＢＳ部分は含んでいない。この断片をＢｓｒＧＩとＸｂａＩで消化し、ｐＨＮ３８１とｐＨＮ３８２のＢｓｒＧＩ  ／  ＸｂａＩ部位にそれぞれ導入した。この結果出来たプラスミドにｐＨＮ３８５、ｐＨＮ３８９とそれぞれ名前を付けた。また、このＮｉｔプロモーター（ＲＢＳ部分除く）  −  ＬＧ１０ＲＢＳのハイブリッドＤＮＡをＮｉｔ−ＬＧ１０プロモーターとする。ｐＨＮ１７１をテンプレートとし、配列表中の配列番号８３（ｓＨＮ３８８）、８４（ｓＨＮ１２０）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた１．９  ｋｂの断片はｐＲＥ２８９５由来のＲｅｐＡＢオペロンを含む。この断片をＢｓｒＧＩとＨｐａＩで消化し、ｐＨＮ３８７とｐＨＮ３８９のＢｓｒＧＩ  ／  ＨｐａＩ部位にそれぞれ導入した。この結果出来たプラスミドにｐＨＮ４０７、ｐＨＮ４０９とそれぞれ名前を付けた。
【０１１７】
またコントロール実験用プラスミドとして、ｐＨＮ３８７から、０．２  ｋｂのＮｉｔプロモーターをＢｓｒＧＩとＮｃｏＩで切り出した。このＤＮＡ断片をｐＨＮ３８０（実施例５）のＢｓｒＧＩ  ／  ＮｃｏＩ部位に導入した。この結果できたプラスミドにｐＨＮ４１０と名前を付けた。
【０１１８】
〔実施例９〕
ｐＮｉｔベクターの構築
ｐＨＮ４０７、ｐＨＮ３８５、ｐＨＮ４０９、ｐＨＮ３８９（実施例８）のＰＩＰ遺伝子の代わりに、ＭＣＳを導入し、８種類のｐＮｉｔベクターを構築した過程を示す。
【０１１９】
ｐＴｉｐ−ＲＴ１（実施例６）から２．２  ｋｂの断片をＮｃｏＩとＫｐｎＩで切り出し、ｐＨＮ４０７、ｐＨＮ３８５、ｐＨＮ４０９、ｐＨＮ３８９のＮｃｏＩ  ／  ＫｐｎＩ部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにｐＮｉｔ−ＱＴ１、ｐＮｉｔ−ＲＴ１、ｐＮｉｔ−ＱＣ１、ｐＮｉｔ−ＲＣ１とそれぞれ名前を付けた。ｐＨＮ３８５（実施例８）をテンプレートとし、配列表中の配列番号８１（ｓＨＮ１４７）、８５（ｓＨＮ１６０）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた０．２  ｋｂの断片はＮｉｔ−ＬＧ１０プロモーターを含む。この断片をＢｓｒＧＩとＮｄｅＩで消化した。一方、ｐＴｉｐ−ＲＴ２（実施例６）から、２．０  ｋｂのＭＣＳ  ｔｙｐｅ  ２、アンピシリン耐性遺伝子、ＣｏｌＥ１を含む断片をＮｄｅＩとＫｐｎＩで切り出した。上記２つのＤＮＡ断片を同時に、ｐＨＮ４０７、ｐＨＮ３８５、ｐＨＮ４０９、ｐＨＮ３８９（実施例８）のＢｓｒＧＩ  ／  ＫｐｎＩ部位にそれぞれ導入した。この結果できたプラスミドにｐＮｉｔ−ＱＴ２、ｐＮｉｔ−ＲＴ２、ｐＮｉｔ−ＱＣ２、ｐＮｉｔ−ＲＣ２とそれぞれ名前を付けた。
【０１２０】
図１８−２にｐＮｉｔベクター（ｐＮｉｔ−ＱＴ１、ｐＮｉｔ−ＱＴ２、ｐＮｉｔ−ＲＴ１、ｐＮｉｔ−ＲＴ２、ｐＮｉｔ−ＱＣ１、ｐＮｉｔ−ＱＣ２、ｐＮｉｔ−ＲＣ１、ｐＮｉｔ−ＲＣ２）のマップを示す。略号等は実施例６に記された通りである。
【０１２１】
〔実施例１０〕
ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター、ＮｉｔプロモーターからのＰＩＰの発現
ｐＨＮ３８０、ｐＨＮ４１０、ｐＨＮ３８１、ｐＨＮ３８７、ｐＨＮ３８９を用いて、ｐＴｉｐ、ｐＮｉｔベクター群からの遺伝子発現様式を観察した。以下に、その過程と結果を示す。
【０１２２】
まず、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１株をｐＨＮ３８０、ｐＨＮ４１０、ｐＨＮ３８１、ｐＨＮ３８７、ｐＨＮ３８９で、形質転換した。これら形質転換体を用いてＰＩＰのペプチダーゼ活性を測定した。結果を図２０に示す。
【０１２３】
図２０中、形質転換に用いたプラスミドの名前とそれぞれの簡単な特徴が示してあり、黒いバーはチオストレプトンで該形質転換体を処理したとき、網掛けのバーはチオストレプトンで該形質転換体を処理しなかったときのＰＩＰのペプチダーゼ活性を示す。ｐＨＮ３８０（ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター  −  ＰＩＰからなる遺伝子カセットをｐＴｉｐベクターの骨格に持つ）での形質転換体はチオストレプトンによる遺伝子発現制御が働いているが、ｐＨＮ４１０（Ｎｉｔプロモーター  −  ＰＩＰからなる遺伝子カセットをｐＴｉｐベクターの骨格中に持つ）での形質転換体はチオストレプトンによる遺伝子発現制御が働いていない。また、ｐＨＮ３８７はｐＨＮ４１０からチオストレプトン耐性遺伝子と、ＴｈｃＡ遺伝子プロモーター  −  ＴｉｐＡ遺伝子からなる遺伝子カセットを取り除いた形のプラスミドであるが、このプラスミドでの形質転換体もチオストレプトンがなくても、ＰＩＰが発現していた。つまり、ＴｉｐＡタンパク質がなくても、Ｎｉｔプロモーターからの遺伝子発現がおこることを意味する。ｐＨＮ３８７、ｐＨＮ３８９による形質転換体を用いた結果から、ＲＢＳの配列はチオストレプトンによる遺伝子発現制御には関係ないことが示唆された。ｐＨＮ３８１はｐＨＮ３８９のＮｉｔ−ＬＧ１０プロモーターをＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターに置換したものであるが、ｐＨＮ３８１での形質転換体ではＰＩＰの発現は構成的になっていない。以上のことから、Ｎｉｔプロモーター、Ｎｉｔ−ＬＧ１０プロモーターが構成型のプロモーターで、その発現にＴｉｐＡタンパク質を必要としないことがわかる。
【０１２４】
なお、ｐＴｉｐ、ｐＮｉｔベクターからのＰＩＰの発現は３０  ℃ばかりでなく、４  ℃でも可能であったことを確認した。
【０１２５】
〔実施例１１〕
ｐＲＥ２５８５、ｐＲＥ８４２４由来プラスミドの自律複製に必須な領域の比較
ｐＴｉｐベクターとｐＮｉｔベクター群を用いて、ｐＲＥ２５８５、ｐＲＥ８４２４由来プラスミドの自律複製に必須な領域の特徴を調べた。
【０１２６】
まず、ｐＮｉｔ−ＱＣ２とｐＮｉｔ−ＲＣ２のＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１，  Ｒ．  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＪＣＭ１０００２，  Ｒ．  ｏｐａｃｕｓ  ＤＳＭ４４１９３，  Ｒ．  ｒｕｂｅｒ  ＪＣＭ３２０５  ａｎｄ  Ｒ．  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＪＣＭ３２０２に対する形質転換効率を調べた。結果を表３に示す。表３では各１  μｇのプラスミドＤＮＡを用いて形質転換した時に、クロラムフェニコールを含む固体培地上に出現したコロニー数を示す。この結果から、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１，  Ｒ．  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＪＣＭ１０００２，  Ｒ．  ｏｐａｃｕｓ  ＤＳＭ４４１９３では、効率の差はあるものの、ｐＮｉｔ−ＱＣ２とｐＮｉｔ−ＲＣ２、いずれでも形質転換が可能であることがわかった。なお、Ｒ．  ｒｕｂｅｒ  ＪＣＭ３２０５、Ｒ．  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＪＣＭ３２０２では形質転換体は得られなかった。
【０１２７】
次にｐＨＮ４０９とｐＨＮ３８９（実施例９）でＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１、Ｒ．  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＪＣＭ１０００２、Ｒ．  ｏｐａｃｕｓ  ＤＳＭ４４１９３を形質転換した。なお、ｐＨＮ４０９とｐＨＮ３８９の違いは自律複製に必須な領域がｐＲＥ２５８５に由来するかｐＲＥ８４２４に由来するか、だけである。Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１において、ｐＨＮ４０９で形質転換した細胞と、ｐＨＮ３８９で形質転換した細胞とで、ＰＩＰペプチダーゼ活性を比較したところ、ほとんど差がないか、若干ｐＨＮ４０９で形質転換した細胞の方が高かった。この結果は、Ｒ．  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＪＣＭ１０００２、Ｒ．  ｏｐａｃｕｓ  ＤＳＭ４４１９３を宿主とした場合でもほぼ同様であった。また、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１でのＰＩＰペプチダーゼ活性よりもＲ．  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＪＣＭ１０００２、Ｒ．  ｏｐａｃｕｓ  ＤＳＭ４４１９３でのＰＩＰペプチダーゼ活性の方がいずれのプラスミドを用いた場合でも低かった。
【０１２８】
次にｐＮｉｔ−ＱＣ２とｐＮｉｔ−ＲＣ２のＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１細胞内でのプラスミドコピー数を調べた。実験手法はＰｒｏｊａｎらの方法（Ｐｒｏｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｓｍｉｄ  ９  １８２−１９０  ［１９８３］）に従った。この方法でプラスミドコピー数を計算するためにはＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１のゲノムサイズを知る必要があるが、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅらによれば、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＡＴＣＣ４２７７株から派生した株、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＲＧ１株のゲノムサイズが６メガベースペアー（Ｍｂｐ）であり、かつ、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＡＴＣＣ４２７７株とＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１株がほぼ同等の菌株であることから、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１株のゲノムサイズも６  Ｍｂｐとして計算した。結果は、ｐＮｉｔ−ＱＣ２が、４７  ±  ５、ｐＮｉｔ−ＲＣ２が、６４  ±  ５のコピー数であった。
【０１２９】
〔実施例１２〕
プラスミド不和合性
細菌では一般に、同一の複製起点を持つ異種プラスミドは細胞内に共存できないことが多い。これはプラスミド不和合性（ｐｌａｓｍｉｄ  ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）と呼ばれる現象によるもので（Ｎｏｖｉｃｋ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５１  ３８１−３９５  ［１９８７］）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌と近縁のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属でも報告されている（Ｓｔｏｌｔ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｅｒ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２  ２７９５−２８０２  ［１９９６］）。本発明者は、配列の異なる２つのＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ内在性プラスミドを分離したことから（ｐＲＥ２８９５とｐＲＥ８４２４）、複数のプラスミドを単一細胞内に共存させ、組換えタンパク質生産に利用できると考えた。そこで、まず、ｐＴｉｐ−、ｐＮｉｔ−ベクター群のプラスミド不和合性について調べた。
【０１３０】
Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１に対して、ｐＮｉｔ−ＱＣ２またはｐＮｉｔ−ＲＣ２で第一の形質転換を行い、さらに、これらの形質転換体細胞に対してｐＮｉｔ−ＱＴ２またはｐＮｉｔ−ＲＴ２で第二の形質転換を行った。第二の形質転換後は、テトラサイクリンのみを含むＬＢ固体培地で形質転換体を選択した。結果を表４に示す。表４中、右から二番目のカラムは、各１  μｇのプラスミドＤＮＡを用いて第二の形質転換した時に、テトラサイクリンを含む固体培地上に出現したコロニー数を示す。一番右のカラムは、第二の形質転換後に、第一の形質転換に用いたプラスミドが残っていたコロニーの確率（％）、即ち、第二の形質転換後にテトラサイクリン耐性だったコロニーの出現率を示す。その際、調べたコロニー数は各２０コロニー（ｎ  ＝  ２０）である。表４に示されたように、同じ複製起点を持つ２つのプラスミドを用いた場合、第二の形質転換効率が極端に低下したこと、第二の形質転換後に第一の形質転換プラスミドが高頻度に消失していることから、不和合性を引き起こしたといえる。それに対して、別種の複製起点を持つ２つのプラスミドでは、第二の形質転換効率が低下しなかったこと、第二の形質転換後にも第一の形質転換プラスミドが安定に存在していることから不和合性を起こさなかったことが示唆された。つまり、ｐＲＥ２５８５から派生したプラスミドと、ｐＲＥ８４２４から派生したプラスミドは完全に「ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ」であるといえる。
【０１３１】
〔実施例１３〕
組換えタンパク質の単一細胞内での共発現
実施例１２に書かれたようにｐＲＥ２５８５から派生したプラスミドと、ｐＲＥ８４２４から派生したプラスミドは完全にｃｏｍｐａｔｉｂｌｅで、一つのＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ細胞内に共存可能であった。このことを利用して、ＰＩＰとＧＦＰの単一細胞内での共発現を試みた。
【０１３２】
まず、ｐＨＮ１８７（参考例１を参照）をテンプレートとし、配列表中の配列番号８６（ｓＨＮ３３７）、８７（ｓＨＮ３３８）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた０．２  ｋｂの断片はＧＦＰ遺伝子の５’末端側を含む。この断片をＮｃｏＩで消化し、この断片の５’末端をリン酸化した。一方、ｐＨＮ１８７をテンプレートとし、配列表中の配列番号８８（ｓＨＮ３３９）、８９（ｓＨＮ３４０）に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行った。得られた０．５  ｋｂの断片はＧＦＰ遺伝子の３’末端側を含む。この断片をＢｇｌｌＩで消化し、その５’末端をリン酸化した。これら２つのＤＮＡ断片を同時にｐＮｉｔ−ＱＴ１とｐＮｉｔ−ＲＴ１のＮｃｏＩ  ／  ＢｇｌＩＩ部位にそれぞれ導入し、できたプラスミドにそれぞれｐＨＮ４２５、ｐＨＮ４２６と名前を付けた。ｐＨＮ４２５、ｐＨＮ４２６は全長のＧＦＰ遺伝子含み、ＧＦＰのＣ末端側に６×Ｈｉｓタグが付加されるような配列が融合されている。また、ＧＦＰ遺伝子内部に存在していたＮｃｏＩ部位は上記作業中に除かれているが、ＧＦＰの機能に変化はない。
【０１３３】
ｐＨＮ４２５とｐＨＮ３８９で、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１を共形質転換し、形質転換体をテトラサイクリンとクロラムフェニコール両方を含む培地で選択した。また、ｐＨＮ４２６とｐＨＮ４０９で、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１を形質転換し、共形質転換体をテトラサイクリンとクロラムフェニコール両方を含む培地で選択した。また、対照実験として、ｐＨＮ４２５、ｐＨＮ４２６、ｐＨＮ３８９、ｐＨＮ４０９でＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１をそれぞれ形質転換した。これら６種類の形質転換体を実施例１に記載されたようにしてＰＩＰとＧＦＰを発現させ、ニッケルイオンを用いた金属キレートクロマトグラフィーで精製した。組換えタンパク質の精製、精製前並びに精製後のサンプルのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動は以下の方法で行った。ＰＩＰのＣ末端には６×Ｈｉｓタグがついており、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、その使用説明書に準じて精製を行った。
【０１３４】
以下に具体的な精製法を示すが、精製の作業は４  ℃で行った。タンパク質を発現させた菌体  （２０  ｍｌ培養液分）  を回収し、１  ｍｌのＮＴ−Ｂｕｆｆｅｒ（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）、１００  ｍＭ塩化ナトリウム、１  ｍＭジチオスレイトール）に懸濁し、１  ｇのガラスビーズ（直径０．１０５−０．１２５ミリメートル）を加えた。これをＦａｓｔ−ｐｒｅｐ  ＦＰ１２０（ＳＡＶＡＮＴ社製）にて６  ｍ／秒の速度、２０秒間往復振とう運動させることで、細胞を破壊した。２０，０００×ｇにて遠心し、その上清７００  μｌに、予めＮＴ−Ｂｕｆｆｅｒで平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗをベッド体積４０  μｌになるように加えた。これを１時間回転撹拌しながらＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズと６×Ｈｉｓタグのついたタンパク質とを結合させた。このビーズをＮＴ−Ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄した後、１２０  μｌのＮＴＥ−Ｂｕｆｆｅｒ  （５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．０）、  １００  ｍＭ塩化ナトリウム、１  ｍＭジチオスレイトール、４００  ｍＭイミダゾール）に３回懸濁することで、ビーズから６×Ｈｉｓタグのついたタンパク質を溶出させた。上記サンプルのうち１０  μｌを常法に従い、１２％  ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供した。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動結果後、ゲルをクマシーブリリアントグリーンＧ−２５０で染色した結果を図２１に示した。
【０１３５】
図２１中、奇数番号のレーンは細胞の粗抽出液（即ち、精製前のサンプル）、偶数番号のレーンは金属キレートクロマトグラフィーで精製した後のサンプルを示す。また、レーン１，２はｐＨＮ４２５とｐＨＮ３８９で共形質転換したＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１からのサンプル、レーン３，４はｐＨＮ４２６とｐＨＮ４０９で共形質転換した細胞からのサンプル、レーン５，６はｐＨＮ４２５で形質転換した細胞からのサンプル、レーン７，８はｐＨＮ４２６で形質転換した細胞からのサンプル、レーン９，１０はｐＨＮ３８９で形質転換した細胞からのサンプル、レーン１１，１２はｐＨＮ４０９で形質転換した細胞からのサンプルである。
【０１３６】
図２１のレーン２と４に２本のバンドが見られることから、ＰＩＰ、ＧＦＰが、単一の細胞内で共発現され、精製されたことが示された。また、共発現させたとき（レーン２、４）と、それぞれ単独で発現させたとき（レーン６、８、１０、１２）のＰＩＰ、ＧＦＰの発現量に大きな差異は見られなかった。
【０１３７】
表１に実施例で用いた各プラスミドのリストを、表２に実施例で用いた菌株のリストを、表３にｐＮｉｔ−ＱＣ２とｐＮｉｔ−ＲＣ２のＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１，  Ｒ．  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＪＣＭ１０００２，  Ｒ．  ｏｐａｃｕｓ  ＤＳＭ４４１９３に対する形質転換効率を、表４にｐＮｉｔ−ＱＣ２、ｐＮｉｔ−ＲＣ２、ｐＮｉｔ−ＱＴ２、ｐＮｉｔ−ＲＴ２によるＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１への共形質転換の結果を示す。
【０１３８】
【表１】
2004321013.tif 000002
2004321013.tif 000003
【０１３９】
【表２】
2004321013.tif 000004
【０１４０】
【表３】
2004321013.tif 000005
【０１４１】
【表４】
2004321013.tif 000006
【０１４２】
【発明の効果】
本発明の新規なローリングサークル型の複製様式で複製し得るベクターであって、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来遺伝子を４  ℃から３５  ℃の温度条件下で誘導物質により誘導発現しうる発現ベクターおよび外来遺伝子を誘導物質非依存的に構成的に発現し得るベクターを用いることにより、効率的にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌で外来タンパク質を産生させることができ、特に宿主微生物として低温でも増殖し得る微生物を用いることにより、通常の微生物の増殖に適した温度条件、即ち約１５℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質を発現産生させることが可能である。さらに、互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来の発現プラスミドベクターであって、少なくとも２種類のプラスミドが、プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列として、それぞれローリングサークル型複製様式をもつＤＮＡ配列と、ｐＲＥ２５８５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列を有するベクターは不和合性の問題を起こすことなく、同一の微生物細胞中で安定に維持され、それぞれのベクターが含む外来遺伝子がコードするタンパク質を同一の微生物細胞中で共発現させることが可能である。
【０１４３】
【配列表】
2004321013.tif 000007
2004321013.tif 000008
2004321013.tif 000009
2004321013.tif 000010
2004321013.tif 000011
2004321013.tif 000012
2004321013.tif 000013
2004321013.tif 000014
2004321013.tif 000015
2004321013.tif 000016
2004321013.tif 000017
2004321013.tif 000018
2004321013.tif 000019
2004321013.tif 000020
2004321013.tif 000021
2004321013.tif 000022
2004321013.tif 000023
2004321013.tif 000024
2004321013.tif 000025
2004321013.tif 000026
2004321013.tif 000027
2004321013.tif 000028
2004321013.tif 000029
2004321013.tif 000030
2004321013.tif 000031
2004321013.tif 000032
2004321013.tif 000033
2004321013.tif 000034
2004321013.tif 000035
2004321013.tif 000036
2004321013.tif 000037
2004321013.tif 000038
2004321013.tif 000039
2004321013.tif 000040
2004321013.tif 000041
2004321013.tif 000042
2004321013.tif 000043
2004321013.tif 000044
2004321013.tif 000045
2004321013.tif 000046
2004321013.tif 000047
2004321013.tif 000048
2004321013.tif 000049
2004321013.tif 000050
2004321013.tif 000051
2004321013.tif 000052
2004321013.tif 000053
2004321013.tif 000054
2004321013.tif 000055
2004321013.tif 000056
2004321013.tif 000057
2004321013.tif 000058
2004321013.tif 000059
2004321013.tif 000060
2004321013.tif 000061
2004321013.tif 000062
2004321013.tif 000063
2004321013.tif 000064
2004321013.tif 000065
2004321013.tif 000066
2004321013.tif 000067
2004321013.tif 000068
2004321013.tif 000069
2004321013.tif 000070
2004321013.tif 000071
2004321013.tif 000072
2004321013.tif 000073
2004321013.tif 000074
2004321013.tif 000075
2004321013.tif 000076
2004321013.tif 000077
2004321013.tif 000078
2004321013.tif 000079
2004321013.tif 000080
2004321013.tif 000081
2004321013.tif 000082
2004321013.tif 000083
2004321013.tif 000084
2004321013.tif 000085
2004321013.tif 000086
2004321013.tif 000087
2004321013.tif 000088
2004321013.tif 000089
2004321013.tif 000090
2004321013.tif 000091
2004321013.tif 000092
2004321013.tif 000093
2004321013.tif 000094
2004321013.tif 000095
2004321013.tif 000096
2004321013.tif 000097
2004321013.tif 000098
2004321013.tif 000099
2004321013.tif 000100
2004321013.tif 000101
2004321013.tif 000102
2004321013.tif 000103
2004321013.tif 000104
2004321013.tif 000105
2004321013.tif 000106
2004321013.tif 000107
2004321013.tif 000108
2004321013.tif 000109
2004321013.tif 000110
2004321013.tif 000111
2004321013.tif 000112
2004321013.tif 000113
2004321013.tif 000114
2004321013.tif 000115
2004321013.tif 000116
2004321013.tif 000117
2004321013.tif 000118
2004321013.tif 000119
2004321013.tif 000120
2004321013.tif 000121
2004321013.tif 000122
2004321013.tif 000123
2004321013.tif 000124
2004321013.tif 000125
2004321013.tif 000126
2004321013.tif 000127
2004321013.tif 000128
2004321013.tif 000129
2004321013.tif 000130
2004321013.tif 000131
2004321013.tif 000132
2004321013.tif 000133
2004321013.tif 000134
2004321013.tif 000135
2004321013.tif 000136
2004321013.tif 000137
2004321013.tif 000138
2004321013.tif 000139
2004321013.tif 000140
2004321013.tif 000141
2004321013.tif 000142
2004321013.tif 000143
2004321013.tif 000144
2004321013.tif 000145
2004321013.tif 000146
2004321013.tif 000147
2004321013.tif 000148
2004321013.tif 000149
2004321013.tif 000150
2004321013.tif 000151
2004321013.tif 000152
2004321013.tif 000153
2004321013.tif 000154
2004321013.tif 000155
2004321013.tif 000156
2004321013.tif 000157
2004321013.tif 000158
2004321013.tif 000159
【０１４４】
【配列表フリーテキスト】
配列１〜４８：プライマー、リンカー
配列４９〜５６：ベクター
配列５７〜８９：プライマー、リンカー
配列９０：内在性プラスミド  ｐＲＥ８４２４
配列９１〜１０６：ベクター
配列１０７：改変Ｔｉｐ  Ａ  遺伝子プロモーター
【図面の簡単な説明】
【図１】誘導型発現ベクターのバックボーンになるプラスミドｐＨＮ１３６の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。
【図２】チオストレプトン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＨＮ１４３の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。ＣＩＡＰはＣａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを、Ｂｌｕ．は平滑末端（Ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）を意味する。
【図３】Ｉｎｄｕｃｅｒ  ｃａｓｓｅｔｔｅを持つプラスミドｐＨＮ６２の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。Ｂｌｕ．は平滑末端（Ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）を意味する。
【図４】Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅを持つプラスミドｐＨＮ１５３の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。ＣＩＡＰは（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  ＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅをＢｌｕ．は平滑末端（Ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）を意味する。
【図５】テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＨＮ１６９の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。ＣＩＡＰはＣａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを、Ｂｌｕ．は平滑末端（Ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）を意味する。
【図６】ＰＩＰをレポーター遺伝子として持つ誘導型発現ベクタープラスミドｐＨＮ１７０、ｐＨＮ１７１の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を示す。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。ＣＩＡＰはＣａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを意味する。
【図７】マルチクローニング部位を持つ誘導型発現ベクタープラスミドｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。
【図８】マルチクローニング部位を持つ誘導型発現ベクタープラスミドｐＴｉｐ−ＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。
【図９ａ】ｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２のマップを示す図である。各領域の機能と、プラスミドのマップを示す。
【図９ｂ】ｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１のＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、またはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列までのＤＮＡ配列を示す。
【図９ｃ】ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１のＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、またはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列までのＤＮＡ配列を示す。
【図９ｄ】ｐＴｉｐ−ＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２のＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、またはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列までのＤＮＡ配列を示す。
【図９ｅ】ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２のＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、またはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列までのＤＮＡ配列を示す。
【図１０】ｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１およびｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１のマップを示す図である。
【図１１】ＰＩＰ活性測定のためのコントロールプラスミドｐＨＮ１７２、ｐＨＮ１７３の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を示す。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。また、ＣＩＡＰはＣａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを意味する。ｐＨＮ１７０は、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ」と「Ｉｎｄｕｃｅｒ  ｃａｓｓｅｔｔｅ」両方をもつのに対して、ｐＨＮ１７３は「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ」のみをもち、ｐＨＮ１７２は両ｃａｓｓｅｔｔｅを持たない。
【図１２】ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列を示す図である。
【図１３】ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターのＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターへの改良を示す図である。
【図１４】ｐＲＥ８４２４のマップを示す図である。図中には主な制限酵素認識部位が示されていて、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が矢印で示されている。ＤＳＯとＳＳＯの位置が四角で示されている。
【図１５】ｐＲＥ８４２４、ｐＡＰ１、ｐＢＬ１、ｐＪＶ１、ｐＩＪ１０１、ｐＳＮ２２のＲｅｐタンパク質の５カ所の保存された領域（Ｍｏｔｉｆ  ＩＶ、Ｍｏｔｉｆ  Ｉ、Ｍｏｔｉｆ  ＩＩ、Ｍｏｔｉｆ  ＩＩＩ、Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｏｔｉｆ）のアミノ酸配列を示す図である。Ｒｅｐタンパク質の機能に重要とされるチロシン残基は四角で囲ってある。
【図１６】ｐＲＥ８４２４、ｐＡＰ１、ｐＢＬ１、ｐＪＶ１、ｐＩＪ１０１、ｐＳＮ２２のＤＳＯと考えられる配列のうち、特に保存されたＤＮＡ配列を示す図である。
【図１７】ｐＲＥ８４２４のＳＳＯ、即ち配列表中の配列番号９０のうちヌクレオチド番号５２６８から５５３８の配列と、その取りうる二次構造を示す図である。
【図１８−１】ｐＴｉｐベクターのマップを示す図である。
【図１８−２】ｐＮｉｔベクターのマップを示す図である。
【図１９】ＴｉｐＡ−ＬＧ１０ｐ  −  ＭＣＳ  −  ＡＬＤＨｔ、Ｎｉｔ−ＬＧ１０  −  ＭＣＳ  −  ＡＬＤＨｔのＤＮＡ配列を示す図である。ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの野生型−１０領域配列はＣＡＧＣＧＴで、Ｎｉｔプロモーターの−１０領域配列はＴＡＴＡＡＴで、おのおの四角で囲まれている。
【図２０】Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１株をｐＨＮ３８０、ｐＨＮ４１０、ｐＨＮ３８１、ｐＨＮ３８７、ｐＨＮ３８９で、形質転換し、ＰＩＰのペプチダーゼ活性を測定した結果を示す図である。
【図２１】ＰＩＰ、ＧＦＰを不和合性を起こさない２つのベクターに組込み、単一のＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１細胞で、発現、精製し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動結果後、ゲルをクマシーブリリアントグリーンＧ−２５０で染色した結果を示す図である。
【図１】
2004321013.tif 000160
【図２】
2004321013.tif 000161
【図３】
2004321013.tif 000162
【図４】
2004321013.tif 000163
【図５】
2004321013.tif 000164
【図６】
2004321013.tif 000165
【図７】
2004321013.tif 000166
【図８】
2004321013.tif 000167
【図９ａ】
2004321013.tif 000168
【図９ｂ】
2004321013.tif 000169
【図９ｃ】
2004321013.tif 000170
【図９ｄ】
2004321013.tif 000171
【図９ｅ】
2004321013.tif 000172
【図１０】
2004321013.tif 000173
【図１１】
2004321013.tif 000174
【図１２】
2004321013.tif 000175
【図１３】
2004321013.tif 000176
【図１４】
2004321013.tif 000177
【図１５】
2004321013.tif 000178
【図１６】
2004321013.tif 000179
【図１７】
2004321013.tif 000180
【図１８−１】
2004321013.tif 000181
【図１８−２】
2004321013.tif 000182
【図１９】
2004321013.tif 000183
【図２０】
2004321013.tif 000184
【図２１】
2004321013.tif 000185
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月27日(2003.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］    ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの−１０領域配列に変異を導入したプロモーターであって、チオストレプトン非依存的に構成的に下流に存在する遺伝子を発現し得る変異ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの有する塩基配列からなるＤＮＡ、
［２］    −１０領域配列の変異が、ＣＡＧＣＧＴ配列のＴＡＴＡＡＴ配列への変異である［１］のＤＮＡ、
［３］    配列番号１０７で表される塩基配列を有する、［２］のＤＮＡ、
［４］    外来遺伝子を構成的に発現するためのプロモーター配列が［１］から［３］のいずれかのＤＮＡの有する塩基配列であって、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用構成型発現ベクター、
［５］    配列番号１０１に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＴ１、配列番号１０２に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＴ２、配列番号１０５に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＣ１、配列番号１０６に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＲＣ２、配列番号９９に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ１、配列番号１００に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ２、配列番号１０３に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ１、配列番号１０４に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ２、からなる群から選択される［４］のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用構成型発現ベクター、
［６］    Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌がＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．  ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．  ｏｐａｃｕｓからなる群から選択される、［４］または［５］の発現ベクター、
［７］    さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ領域を含み、大腸菌中で複製可能な［４］から［６］のいずれかの発現ベクター、
［８］    ［４］から［７］のいずれかの発現ベクターを含む形質転換体、および
［９］    ［４］から［７］のいずれかの発現ベクターを用いて４℃から３５℃の温度で組換えタンパク質を生産する方法。
さらに、本発明は以下の通りである。
［１０］    Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌から単離された、ローリングサークル型の複製様式で複製し得る環状プラスミド、
［１１］    Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌から単離された、ローリングサークル型の複製様式に必須なＲｅｐ遺伝子、２本鎖複製起点領域ＤＳＯ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）および１本鎖複製起点領域ＳＳＯ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）を有する［１０］の環状プラスミド、
［１２］    ローリングサークル型の複製様式に必須なＤＮＡの塩基配列が配列番号９０に表される塩基配列の第３８４５位から第５８４９位の塩基配列である、［１１］の環状プラスミド、
［１３］    配列番号９０に表される塩基配列を有するＤＮＡまたは配列番号９０に表される塩基配列を有するＤＮＡに相補的な配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する［１０］から［１２］のいずれかのプラスミド、
［１４］    ［１０］から［１２］のいずれかの環状プラスミドを含む形質転換体、
［１５］    ローリングサークル型の複製様式で複製し得るベクターであって、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来遺伝子を４℃から３５℃の温度条件下で発現しうる発現ベクター、
［１６］    Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌から単離された、ローリングサークル型の複製様式に必須なＲｅｐ遺伝子、２本鎖複製起点領域ＤＳＯ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）および１本鎖複製起点領域ＳＳＯ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｒｉｇｉｎ）を有する［１５］の発現ベクター、
［１７］    ローリングサークル型の複製様式に必須なＤＮＡの塩基配列が配列番号９０に表される塩基配列の第３８４５位から第５８４９位の塩基配列である、［１６］の発現ベクター、
［１８］    外来遺伝子を発現誘導するための誘導型プロモーター配列、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む［１５］から［１７］のいずれかの発現ベクター、
［１９］    発現誘導のための誘導型プロモーターがＴｉｐＡ遺伝子プロモーターで、誘導物質がチオストレプトンである、［１８］の発現ベクター、
［２０］    プロモーターの塩基配列が［１］から［３］のいずれかのＤＮＡの有する塩基配列からなる［４］の発現ベクター、
［２１］    配列番号９３に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＴ１、配列番号９４に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＴ２、配列番号９７に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＣ１、配列番号９８に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＲＣ２からなる群から選択される［１５］から［１９］のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター、
［２２］    Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来遺伝子を構成的に発現し得る発現ベクターであって、プラスミドｐＲＥ２８９５由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中でのプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列および［１］から［３］のいずれかのプロモーター配列ＤＮＡを含む、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で４℃から３５℃の温度条件下で外来遺伝子を構成的に発現し得る発現ベクター、
［２３］    プラスミドｐＲＥ２８９５由来のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中でのプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列がＲｅｐＡおよびＲｅｐＢ遺伝子を含む１．９ｋｂの領域のＤＮＡ配列である［２２］の発現ベクター、
［２４］    構成型プロモーター配列の下流に、さらにリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列を含む［２２］または［２３］の発現ベクター、
［２５］    配列番号９９に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ１、配列番号１００に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＴ２、配列番号１０３に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ１、配列番号１０４に表される塩基配列を有するｐＮｉｔ−ＱＣ２、からなる群から選択される［２２］から［２４］のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用構成型発現ベクター、
［２６］    互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来のプラスミドを含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌であって、少なくとも２種類のプラスミドが、プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列として、それぞれローリングサークル型複製様式をもつＤＮＡ配列と、ｐＲＥ２８９５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列を有する、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［２７］    互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来の発現プラスミドベクターであり外来タンパク質をコードする遺伝子を含む発現プラスミドベクターを含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌であって、少なくとも２種類のプラスミドベクターが、プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列として、それぞれＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来のローリングサークル型複製様式をもつＤＮＡ配列と、ｐＲＥ２８９５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列を有し、外来タンパク質をコードする遺伝子を４  ℃から３５  ℃の温度条件下で共発現し得るＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［２８］    ２種類のプラスミドベクターが外来タンパク質を生産せしめるためのプロモーター配列、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列、をそれぞれ全て含む、［２７］のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［２９］    少なくとも２種類のプラスミドベクターの一方が、［４］、［５］、［１５］〜［１９］、［２０］および［２１］のいずれかのベクターであり、もう一方が、［２２］から［２５］のいずれかのベクターもしくは［２２］から［２５］のベクターにおいて少なくともプロモーターを誘導型プロモーターであるＴｉｐＡ遺伝子プロモーターに置換した誘導発現し得るベクターである、［２７］または［２８］のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［３０］    少なくとも２種類のプラスミドベクターの一方が、［４］、［５］、［１５］〜［１９］、［２０］および［２１］のいずれかのベクターであり、もう一方が、配列番号４９に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ１、配列番号５０に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ２、配列番号５１に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ１、配列番号５２に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ２、配列番号５３に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、配列番号５４に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、配列番号５５に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ１、配列番号５６に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ２、配列番号９１に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＴ１、配列番号９２に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＴ２、配列番号９５に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＣ１、配列番号９６に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＣ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１、［２２］から［２５］のいずれかのベクターまたは［２２］から［２５］のいずれかのベクターにおいて少なくともプロモーターを誘導型プロモーターであるＴｉｐＡ遺伝子プロモーターに置換した誘導発現し得るベクターからなる群から選択されるベクターである、［２７］から［２９］のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［３１］    ローリングサークル型の複製様式に必須なＤＮＡ配列が配列番号９０に表される塩基配列の第３８４５位から第５８４９位のＤＮＡであり、ｐＲＥ２８９５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列がＲｅｐＡおよびＲｅｐＢ遺伝子を含む１．９  ｋｂの領域のＤＮＡである［２６］から［３０］のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、
［３２］    互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来の発現プラスミドベクターであり外来タンパク質をコードする遺伝子を含む発現プラスミドベクターを含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌であって、少なくとも２種類のプラスミドベクターが、プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列として、それぞれＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来のローリングサークル型複製様式をもつＤＮＡ配列と、ｐＲＥ２８９５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列を有する少なくとも２種類のベクターでＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌を形質転換し、培養しそれぞれの発現ベクターが含む外来タンパク質をコードする遺伝子を４℃から３５℃の温度条件下で共発現させて該外来タンパク質を産生させる方法、
［３３］    ２種類のプラスミドベクターが外来タンパク質を生産せしめるためのプロモーター配列、その下流にリボソーム結合部位配列、更にその下流に、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位配列、をそれぞれ全て含む、［３２］の方法、
［３４］    少なくとも２種類のプラスミドベクターの一方が、［４］、［５］、［１５］〜［１９］、［２０］および［２１］のいずれかのベクターであり、もう一方が、配列番号４９に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ１、配列番号５０に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ２、配列番号５１に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ１、配列番号５２に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ２、配列番号５３に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、配列番号５４に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、配列番号５５に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ１、配列番号５６に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ２、配列番号９１に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＴ１、配列番号９２に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＴ２、配列番号９５に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＣ１、配列番号９６に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＱＣ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１、［２２］から［２５］のいずれかのベクターまたは［２２］から［２５］のいずれかのベクターにおいて少なくともプロモーターを誘導型プロモーターであるＴｉｐＡ遺伝子プロモーターに置換した誘導発現し得るベクターからなる群から選択されるベクターである、［３２］から［３４］のいずれかの方法、
［３５］    ローリングサークル型の複製様式に必須なＤＮＡの塩基配列が配列番号９０に表される塩基配列の第３８４５位から第５８４９位の塩基配列であり、ｐＲＥ２８９５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列がＲｅｐＡおよびＲｅｐＢ遺伝子を含む１．９  ｋｂの領域のＤＮＡである［３２］から［３４］のいずれかの方法。
以下、本発明を詳細に説明する。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
これらのうち、ｐＲＥ２８９３、ｐＲＥ２８９４、ｐＲＥ４３２００のＤＮＡ配列を一部決定したところ、本発明者が以前にＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ２８９５株から分離していたｐＲＥ２８９５（参考例１を参照）とほぼ同一の配列を有していた。ｐＲＥ２８９５はプラスミドの複製に関与するＲｅｐＡ、ＲｅｐＢタンパク質をコードする遺伝子をＲｅｐＡＢオペロンとして有しているが、これらのタンパク質はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍから分離されたｐＡＬ５０００プラスミドがコードするＲｅｐＡ、ＲｅｐＢタンパク質と高度に類似しており、ｐＲＥ２８９５とｐＡＬ５０００が類似の様式で自律複製していることが示唆された（Ｓｔｏｌｔ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｅｒ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２  ２７９５−２８０２  ［１９９６］，  参考例１）。ｐＲＥ２８９５とｐＡＬ５０００の複製様式は明らかでないが、両プラスミドのＲｅｐＡタンパク質がＣｏｌＥ２プラスミドのＲｅｐタンパク質に相同性があるため、ＣｏｌＥ２プラスミド同様「θ型」の自律複製様式を有することが考えられた（Ｈｉｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７６  ７２３３−７２４３  ［１９９４］）。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
一方、ｐＲＥ８４２４はｐＲＥ２８９５と全く異なるＤＮＡ配列を有していた（配列表中の配列番号９０、図１）。このプラスミドは６つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；ＯＲＦ１からＯＲＦ６）を持ち、うちＯＲＦ６がコードするタンパク質（図１４）はローリングサークル様式で自律複製する一群のプラスミドが持つＲｅｐ遺伝子がコードするタンパク質と相同性が高かった（Ｋｈａｎ，  Ｍｉｃｒｏｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６１  ４４２−４５５  ［１９９７］）。中でも、  Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ由来ｐＡＰ１（Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８０  ３２３３−３２３６  ［１９９８］）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ由来ｐＩＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７０  ４６３４−４６５１  ［１９８８］）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ由来ｐＪＶ１（Ｓｅｒｖｉｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１  ２４９９−２５１０  ［１９９５］）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ由来ｐＢＬ１（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７６  ３１５４−３１６１  ［１９９４］）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ由来ｐＳＮ２２（Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｓｍｉｄ  ３２  ５５−６９  ［１９９４］）と相同性が高かった（図１５）。これらのプラスミドは、いずれもローリングサークル型プラスミドの中でもｐＩＪ１０１／ｐＪＶ１ファミリーに属するもので（Ｋｈａｎ，  Ｍｉｃｒｏｉｏｌ．  Ｍｏｉ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６１  ４４２−４５５  ［１９９７］）、ｐＲＥ８４２４もこのファミリーに属するローリングサークル型プラスミドである可能性が示唆された。以下、ＯＲＦ６はＲｅｐと記載する。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
上述のｐＨＮ１７１とｐＨＮ３４８のＤＮＡ配列のうち、ｐＲＥ２８９５に由来するプラスミドの自律複製に必須な１．９  ｋｂの領域を、ｐＲＥ８４２４に由来するプラスミドの自律複製に必須な２．０  ｋｂの領域に変更するために以下の作業を行った。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
〔実施例１１〕
ｐＲＥ２８９５、ｐＲＥ８４２４由来プラスミドの自律複製に必須な領域の比較
ｐＴｉｐベクターとｐＮｉｔベクター群を用いて、ｐＲＥ２８９５、ｐＲＥ８４２４由来プラスミドの自律複製に必須な領域の特徴を調べた。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
次にｐＨＮ４０９とｐＨＮ３８９（実施例９）でＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１、Ｒ．  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＪＣＭ１０００２、Ｒ．  ｏｐａｃｕｓ  ＤＳＭ４４１９３を形質転換した。なお、ｐＨＮ４０９とｐＨＮ３８９の違いは自律複製に必須な領域がｐＲＥ２８９５に由来するかｐＲＥ８４２４に由来するか、だけである。Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１において、ｐＨＮ４０９で形質転換した細胞と、ｐＨＮ３８９で形質転換した細胞とで、ＰＩＰペプチダーゼ活性を比較したところ、ほとんど差がないか、若干ｐＨＮ４０９で形質転換した細胞の方が高かった。この結果は、Ｒ．  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＪＣＭ１０００２、Ｒ．  ｏｐａｃｕｓ  ＤＳＭ４４１９３を宿主とした場合でもほぼ同様であった。また、Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ３２０１でのＰＩＰペプチダーゼ活性よりもＲ．  ｆａｓｃｉａｎｓ  ＪＣＭ１０００２、Ｒ．  ｏｐａｃｕｓ  ＤＳＭ４４１９３でのＰＩＰペプチダーゼ活性の方がいずれのプラスミドを用いた場合でも低かった。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
Ｒ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＪＣＭ  ３２０１に対して、ｐＮｉｔ−ＱＣ２またはｐＮｉｔ−ＲＣ２で第一の形質転換を行い、さらに、これらの形質転換体細胞に対してｐＮｉｔ−ＱＴ２またはｐＮｉｔ−ＲＴ２で第二の形質転換を行った。第二の形質転換後は、テトラサイクリンのみを含むＬＢ固体培地で形質転換体を選択した。結果を表４に示す。表４中、右から二番目のカラムは、各１  μｇのプラスミドＤＮＡを用いて第二の形質転換した時に、テトラサイクリンを含む固体培地上に出現したコロニー数を示す。一番右のカラムは、第二の形質転換後に、第一の形質転換に用いたプラスミドが残っていたコロニーの確率（％）、即ち、第二の形質転換後にテトラサイクリン耐性だったコロニーの出現率を示す。その際、調べたコロニー数は各２０コロニー（ｎ  ＝  ２０）である。表４に示されたように、同じ複製起点を持つ２つのプラスミドを用いた場合、第二の形質転換効率が極端に低下したこと、第二の形質転換後に第一の形質転換プラスミドが高頻度に消失していることから、不和合性を引き起こしたといえる。それに対して、別種の複製起点を持つ２つのプラスミドでは、第二の形質転換効率が低下しなかったこと、第二の形質転換後にも第一の形質転換プラスミドが安定に存在していることから不和合性を起こさなかったことが示唆された。つまり、ｐＲＥ２８９５から派生したプラスミドと、ｐＲＥ８４２４から派生したプラスミドは完全に「ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ」であるといえる。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
〔実施例１３〕
組換えタンパク質の単一細胞内での共発現
実施例１２に書かれたようにｐＲＥ２８９５から派生したプラスミドと、ｐＲＥ８４２４から派生したプラスミドは完全にｃｏｍｐａｔｉｂｌｅで、一つのＲ．  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ細胞内に共存可能であった。このことを利用して、ＰＩＰとＧＦＰの単一細胞内での共発現を試みた。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
【発明の効果】
本発明の新規なローリングサークル型の複製様式で複製し得るベクターであって、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来遺伝子を４  ℃から３５  ℃の温度条件下で誘導物質により誘導発現しうる発現ベクターおよび外来遺伝子を誘導物質非依存的に構成的に発現し得るベクターを用いることにより、効率的にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌で外来タンパク質を産生させることができ、特に宿主微生物として低温でも増殖し得る微生物を用いることにより、通常の微生物の増殖に適した温度条件、即ち約１５℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質を発現産生させることが可能である。さらに、互いにプラスミド不和合性を起こさない少なくとも２種類のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来の発現プラスミドベクターであって、少なくとも２種類のプラスミドが、プラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列として、それぞれローリングサークル型複製様式をもつＤＮＡ配列と、ｐＲＥ２８９５由来のプラスミドの自律複製に必要なＤＮＡ配列を有するベクターは不和合性の問題を起こすことなく、同一の微生物細胞中で安定に維持され、それぞれのベクターが含む外来遺伝子がコードするタンパク質を同一の微生物細胞中で共発現させることが可能である。