(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答の双方を惹起する腎臓細胞カルシノーマ抗原Ｇ２５０由来ペプチドの提供。【解決手段】当該ペプチドは、特定のアミノ酸配列を有する、腎臓細胞カルシノーマなどの免疫原性の腫瘍に頻繁に発現されるＧ２５０腫瘍抗原に由来するものである。Ｇ２５０抗原を発現している細胞に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の双方を惹起する能力に対して、特定のペプチドが選択される。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＧ２５０蛋白質以外のペプチドであって、配列番号１５のアミノ酸配列、または配列番号１５のアミノ酸配列において多くとも３アミノ酸置換したアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドであって、配列番号１５のアミノ酸配列、または配列番号１５のアミノ酸配列において多くとも３アミノ酸置換したアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドであって、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２のアミノ酸配列において多くとも４アミノ酸置換したアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載のペプチドであって、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２のアミノ酸配列において多くとも３アミノ酸置換したアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のペプチドであって、前記アミノ酸置換が保存的な置換であり、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列におけるアミノ酸置換であって、ポジション４におけるＬ、Ｐ、Ａ、Ｆ、ＷもしくはＭでの置換；  ポジション７におけるＭでの置換；  ポジション１４におけるＬ、Ｐ、Ａ、Ｆ、ＷもしくはＭでの置換からなる群から選択されるペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項で定義されたペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の薬学的組成物であって、該組成物がワクチンであり、更にアジュバンドを含む組成物。
【請求項８】
抗原提示細胞を含む組成物であって、該抗原提示細胞が請求項１〜５の何れか１項で定義したペプチドをロードされた組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、前記抗原提示細胞が樹状細胞である組成物。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の組成物であって、前記抗原提示細胞がヒト細胞である組成物。
【請求項１１】
癌の治療または予防のための組成物の製造における、請求項１〜５の何れか１項で定義されたペプチドの使用。
【請求項１２】
請求項１１に記載の使用であって、前記癌が腎臓細胞カルシノーマ、或いは腎臓、前立腺、頭部、頸部、胃腸管もしくはその任意の部位、または膀胱の癌である使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用であって、前記癌が腎臓細胞カルシノーマ、或いは結腸、胃、または膀胱の癌である使用。
【請求項１４】
請求項１〜５の何れか１項で定義されたペプチドの使用であって、配列番号１６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する、または該蛋白質の免疫原性の部分を発現する腫瘍の治療もしくは予防のための組成物の調製における使用。
【請求項１５】
患者の癌の治療もしくは予防のための方法であって、該方法は、前記癌を治療もしくは予防する効果的な量の請求項６〜１０の何れか１項で定義した組成物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記癌が腎臓細胞カルシノーマ、或いは腎臓、前立腺、頭部、頸部、胃腸管もしくはその任意の部位、または膀胱の癌である方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記癌が腎臓細胞カルシノーマ、または結腸、胃、もしくは膀胱の癌である方法。
【請求項１８】
患者の腫瘍を治療もしくは予防する方法であって、該方法は、前記腫瘍を治療もしくは予防する効果的な量の請求項６〜１０の何れか１項で定義した組成物を前記患者に投与することを含み、前記腫瘍が、配列番号１６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する、または前記蛋白質の免疫原性の部分を発現する腫瘍である方法。
【請求項１９】
請求項１〜５の何れか１項で定義したペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびオプションとして既知の遺伝子治療剤の１以上の更なる成分を含む遺伝子治療剤。
【請求項２０】
遺伝子治療による癌の治療のための組成物の製造における、請求項１〜５の何れか１項で定義したペプチドをコードするヌクレオチド配列の使用。
【請求項２１】
患者の癌の治療もしくは予防のための方法であって、該方法は、前記癌を治療もしくは予防する効果的な量の請求項１９で定義した遺伝子治療剤を前記患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、ヒトもしくは動物で免疫応答を惹起するために使用できるペプチドに関する。特に、本発明は免疫原性のペプチドに関するものであり、該ペプチドは腫瘍、特に免疫原性の腫瘍に対し、ヒトもしくは動物において免疫応答を惹起するために使用できる。とりわけ特に、本発明は腎臓細胞カルシノーマ（ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の免疫治療に使用できる腫瘍抗原に由来するペプチドに関する。
【０００２】
【発明の背景】
腫瘍分類の１形式に従って、免疫原性および非免疫原性の腫瘍が区別される。免疫原性腫瘍は、それらの表面のある種の抗原を発現する腫瘍として記載できる。それらの例は、メラノーマ、腎臓細胞カルシノーマもしくは腎臓の他の腫瘍、同様に前立腺、頭部および／または頸部、結腸、胃、および膀胱の腫瘍を含む。免疫原性腫瘍がそれらの表面上に特定の抗原を発現するとの発見は、免疫学的な方法を用いてかかる腫瘍を治療する可能性を切り開いた。
【０００３】
腎臓細胞カルシノーマ（ＲＣＣ）も比較的免疫原性腫瘍である。ＲＣＣ患者のかなりの症例数において、部分的もしくは完全な「自然」寛解が観察されており、そして何らかの形態の免疫治療がＲＣＣに対する免疫系の反応性を増加することを示した（Ｆｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７，  Ｊ．Ｕｒｏｌ．１１８：５３８−５４２；  Ｍａｒｃｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：４６３−４６６；  Ｇｌｅａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：１２６５−１２７１）。しかしながら、これまで自己ＲＣＣに対する特定の細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）株は数種のみ同定されているに過ぎない（Ｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１０：３４７−３５４；  Ｆｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１１：１−１１；  Ｓｃｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４２０９−４２２０；  Ｇａｕｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４４：３２３−３３０；  Ｂｒａｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５０１−２５０８）。かかるＣＴＬにより定義された１つのＲＣＣ特異的抗原はＲＡＧＥ−１であり、それは原発性ＲＣＣのほんの２％で発現しており、そして網膜を除く正常組織においてはサイレントである（Ｇａｕｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  上記）。２番目のＣＴＬ定義されたＲＣＣ抗原は、変異したＨＬＡ−Ａ２蛋白質であるようだ（Ｂｒａｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  上記）。
【０００４】
免疫治療でのＲＣＣ患者の効果的な治療において、ＲＣＣの全てにおける高抗原発現は第一の必要条件である。我々は以前にモノクローナル（ｍＡｂ）Ｇ２５０がＲＣＣの８５％において表面上に発現するＲＣＣ関連抗原を認識するが、正常組織上のものを認識しないことを示した（Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３８：４８９−４９４）。加えて、Ｇ２５０発現は、結腸、卵巣、および頸部のカルシノーマの細胞表面上に検出できる。正常組織の分析は、Ｇ２５０  ｍＡｂの反応性がいくつかの胃粘膜細胞に、および、より大きな胆管の細胞に限局していることを示した。それらの正常組織で観察された染色性は比較的弱いもので、天然状態では細胞質に存在している（Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，  上記；  Ｐａｓｔｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：２８７７−２８８８；  Ｓａａｒｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３：２７９−２８５）。ＲＣＣ患者の臨床研究は、ＲＣＣへの放射性標識  ｍＡｂＧ２５０の限定的なターゲッティングを示した（Ｏｏｓｔｅｒｗｉｊｋ  ｅｔａｌ．，  １９９５，  Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：３４−４１）。
【０００５】
Ｇ２５０  ｍＡｂに認識されるＲＣＣ関連抗原をコードするｃＤＮＡの分離、および推定アミノ酸配列の分析により、Ｇ２５０蛋白質が頸部カルシノーマにおいて同定され、以前に記載された腫瘍関連抗原ＭＮ／ＣＡ  ＩＸと同一の膜貫通蛋白質であることが示された（Ｇｒａｂｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８５：８６５−８７０；  Ｐａｓｔｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  上記；  ＷＯ  ９３／１８１５２；  ＥＰ−Ａ１  １２３３８７）。Ｇ２５０のＲＣＣ由来ｃＤＮＡとＧ２５０／ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ遺伝子の配列比較は、ＲＣＣのＧ２５０／ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ蛋白質が非変異であることを示した（Ｏｐａｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３３：４８０−４８７；  Ｇｒａｂｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  上記）。従って、Ｇ２５０抗原は広く発現するＲＣＣ関連抗原であり、そのようなことからＲＣＣ患者の特定の免疫治療の期待できる標的である。
【０００６】
以前、我々はＲＣＣ関連抗原Ｇ２５０がその配列内にＣＤ８＋  ＣＴＬに認識されるＨＬＡ−Ａ２．１拘束エピトープ（アミノ酸２５４から２６２）を含んでいることを示した（Ｖｉｓｓｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：５５５４−５５５９；  ＷＯ  ０１／９８３６３）。抗腫瘍免疫においてＣＴＬに次いでＴヘルパー細胞の重要性は、いくつかのマウス腫瘍モデルにおいて明確に示されている（Ｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７：１８６３−１８６６；  Ｒｏｍｅｒｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：２３２５−２３２８；  Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２３５７−２３５８）。Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ等（１９９８，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６９３−７０２）は、ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞が抗腫瘍特異的ＣＴＬの最適な誘導に必要なことを示した（多分、専門のＡＰＣを活性化することにより）。加えて、Ｔヘルパー細胞はマクロファージおよび好酸球をリクルートして、且つ活性化することにより免疫応答のエフェクター段階に関与する（Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  上記；  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，  １９９１，  Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１−３５５）。それ故、癌を治療するために設計されるワクチンは、好ましくは腫瘍関連抗原に由来するエピトープに対してＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の双方を惹起すべきである。
【０００７】
従って、本発明の課題はＧ２５０由来ペプチド含有エピトープを提供することである、該エピトープはＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の双方を惹起し、且つＧ２５０抗原を発現するＲＣＣおよび他の腫瘍の免疫療法（のためのワクチンに）に効果的に使用し得る。
【０００８】
【発明の記載】
本発明を導いた研究において、ＲＣＣ関連抗原Ｇ２５０の免疫原性は、リバース免疫学的なアプローチを用いて調査された。このアプローチにより、Ｇ２５０蛋白質のアミノ酸配列に準拠する多くの見込みのあるペプチドが開発された。特にそれらの中でＧ２５０アミノ酸配列の２５４〜２６２はＨＬＡ−Ａ２．１拘束ＣＴＬエピトープであり、それは自然にプロセスされ且つ免疫原性があり、従って癌（特にＧ２５０蛋白質を発現している癌）の免疫療法に使用できることが認められた。更なる研究において、我々はＧ２５０抗原（ＣＴＬ応答に加えて）もＴヘルパー応答を起こすかどうかを調査した。コンピュータによる予想プログラムおよび合成Ｇ２５０由来ペプチドをロードしたＤＣを使用して、我々はＧ２５０由来ペプチド（アミノ酸２４９〜２６８）に対するＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔヘルパー細胞を誘導し、該細胞は自然にプロセスされたＧ２５０蛋白質をも認識するものであった。驚くべきことに、以前同定されたＧ２５０アミノ酸配列２５４〜２６２中のＣＴＬエピトープは、Ｇ２５０アミノ酸配列２４９〜２６８中のＴヘルパー細胞エピトープ内に完全に含まれる。従って、後者はＧ２５０蛋白質を発現している癌の免疫療法に使用されるＣＴＬおよびＴヘルパー応答の双方を誘導するペプチドを導き出すことに使用し得る。
【０００９】
＜本発明のペプチド＞
第一の側面において、本発明は配列番号１５のアミノ酸配列、または配列番号１５のアミノ酸配列に関して多くとも１、２、３、もしくは４アミノ酸置換されているアミノ酸配列を含んでいるペプチドに関する。別の態様において、前記ペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列、または配列番号１５のアミノ酸配列に関して多くとも１、２、３、もしくは４アミノ酸置換されているアミノ酸配列からなる。
【００１０】
好ましくは、本発明のペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号１２からの１〜５の付加的なアミノ酸、或いは配列番号１５のアミノ酸配列に関して多くとも１、２、３、４もしくは５アミノ酸置換されているアミノ酸配列および配列番号１２からの１〜５の付加的なアミノ酸を含む。或いは、本発明のペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号１２からの１〜５の付加的なアミノ酸、或いは配列番号１５のアミノ酸配列に関して多くとも１、２、３、４もしくは５アミノ酸置換されているアミノ酸配列および配列番号１２からの１〜５の付加的なアミノ酸からなる。
【００１１】
本発明の好適なペプチドにおいて、前記アミノ酸置換は本明細書中の以下に定義されるような保存的な置換である。配列番号１２のアミノ酸配列において特に好適なアミノ酸置換は、ポジション４のＬ、Ｐ、Ａ、Ｆ、ＷもしくはＭ、ポジション７のＭおよび／またはポジション１４のＬ、Ｐ、Ａ、Ｆ、ＷもしくはＭへの置換である。
【００１２】
好ましくは本発明のペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を有するヒトＧ２５０蛋白質以外のペプチドである。同様に、好ましくは本発明のペプチドは、Ｇｒａｂｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  上記；  Ｐａｓｔｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  上記；  ＷＯ  ９３／１８１５２；  ＥＰ−Ａ１  １２３  ３８７；  Ｏｐａｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  上記；  Ｖｉｓｓｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  上記；  および  ＷＯ  ０１／９８３６３）の何れかに開示された如何なるペプチド自体（Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）もしくはその断片も含まないものであり、またはこれら文献に開示されたヌクレオチド配列によりコードされるペプチドもしくはその断片も含まないものである。
【００１３】
本明細書で使用される「ペプチド」という用語はオリゴペプチドに加えてポリペプチド（それらも蛋白質に属する）の双方を含むものと理解される。本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子の双方に特異的に認識されるエピトープを含有する。従って、本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の溝（ｇｒｏｏｖｅ）もしくは裂け目（ｃｌｅｆｔ）に結合することが可能である。それ故、本発明のペプチドは、典型的には少なくとも約９、１０、１１、１２、１５、もしくは１８残基を含むものである。一定の態様において、前記ペプチドは約１５０、１００、もしくは５０残基を超えない、そして典型的には約２０残基を超えない。他の態様において、本発明のペプチドは、（非常に）より大きなポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩおよびＩＩエピトープを含む蛋白質（例えば、融合蛋白質の一部として）であってもよい。従って、広範囲のペプチドサイズが本発明に使用し得る。
【００１４】
特に、本発明のペプチドが比較的短い場合、前記ペプチドは既知の方法を使用して容易に合成できる。例えば、前記ペプチドは公知のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法により合成することができ、該合成法においてアミノ酸は成長する鎖に連続的に加えられる。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−２１５６；  およびＡｔｈｅｒｔｏｎ等「固相ペプチド合成」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８９）を参照してください。自動ペプチド合成機は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの多くの供給者から市販されている。本発明のペプチドを調製するための更なる合成アプローチは、本明細書の実施例に記載されている。
【００１５】
或いは、本発明のペプチドは、本発明のエピトープを含むより大きなポリペプチドもしくは蛋白質であってもよい。かかるより大きなポリペプチドは、周知のリコンビナント技術を使用して好適に調製され、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は培養細胞中で発現される、かかる技術はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）  並びにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなどに記載されており、双方はその全体が本明細書中に参照により援用される。
【００１６】
典型的には、所望のポリペプチドをコードする核酸を発現ベクター中に用いる。一般的に「発現ベクター」という慣用句は、かかる配列に適合する宿主中の遺伝子の発現に影響可能なヌクレオチド配列を意味するものである。これらの発現ベクターは、典型的には少なくとも適切なプロモーター配列を含み、およびオプションとして転写終結シグナルを含む。発現効果に必要もしくは助けとなる付加的な因子も本明細書中に記載の通りに使用し得る。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、典型的にはインビトロ細胞培養に導入可能で、該細胞培養で発現が可能なＤＮＡ構築物に導入される。具体的には、ＤＮＡ構築物は細菌（例えば、大腸菌；Ｅ．Ｃｏｌｉ）などの原核生物宿主中での複製に適切であり、または培養した哺乳類、植物、昆虫、酵母、真菌、もしくは他の真核生物細胞株に導入し得る。
【００１７】
特定宿主への導入のために調製されるＤＮＡ構築物は、典型的には宿主に認識される複製系、所望のポリペプチドをコードした導入予定のＤＮＡセグメント、並びにポリペプチドをコードするセグメントに制御可能に連結された転写および翻訳を開始および終結する制御配列を含む。ＤＮＡセグメントは、別のＤＮＡセグメントと機能的な関連性をもって配置された際に「制御可能に連結」される。例えば、プロモーターもしくはエンハンサーは、もしそれらがコード配列の転写を促進するのであれば該配列に制御可能に連結されている。シグナル配列に対するＤＮＡは、もしそれがポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白質として発現するのであれば該ポリペプチドをコードするＤＮＡに制御可能に連結されている。一般的に、制御可能に連結されたＤＮＡ配列は、近接（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）したものであり、シグナル配列の場合においては近接し、且つ読み取り枠内にあるものである。しかしながら、エンハンサーは、それらが制御する転写のコード配列に近接する必要はない。連結は便利な制限部位、または、それらに代わって挿入されたアダプターもしくはリンカー部位でライゲーションすることにより達成される。
【００１８】
一般的に、適切なプロモーター配列の選択は、ＤＮＡセグメントの発現のために選択された宿主細胞に依存する。適切なプロモーター配列の例には、当該技術において周知の原核細胞性および真核細胞性のプロモーターが含まれる（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  ２００１、  上記を参照）。典型的には、転写制御配列は、宿主に認識される異種のエンハンサーもしくはプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は宿主に依存するが、ｔｒｐ、ｌａｃおよびファージプロモーターなどのプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター並びに糖分解酵素プロモーターは既知であり、利用可能である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  ２００１、  上記を参照）。
【００１９】
便利で利用可能な発現ベクターはポリペプチドをコードするセグメントの挿入部位と共に複製系、並びに転写および翻訳制御配列を含むものが使用し得る。細胞株と発現ベクターの機能する組み合わせの例は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１、上記）に記載されている。例えば、適切な発現ベクターは、昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、および細菌細胞（例えば、大腸菌；  Ｅ．Ｃｏｌｉ）などの中で発現し得るものである。
【００２０】
本発明のペプチドは様々な要望される属性（例えば、改善された薬理学的特性など）を提供するために修飾し得るものであるが、非修飾のペプチドの生物学的活性の実質上全ての活性を増大するか、少なくとも保持するものであることが理解されるだろう。例えば、前記ペプチドは、前記ペプチドのアミノ酸配列を伸展すること、減少することにより修飾できる。異なるアミノ酸もしくはアミノ酸模倣体（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）での置換も実行し得る。
【００２１】
本発明の免疫原性ペプチドの個々の残基は、ペプチド結合もしくは模倣ペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｍｉｍｅｔｉｃ）により前記ペプチドに導入できる。本発明の模倣ペプチド結合は、当業者に周知のペプチドバックボーン（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）修飾を含む。かかる修飾は、アミド窒素、α―炭素、アミド・カルボニル（ａｍｉｄｅ  ｃａｒｂｏｎｙｌ）、アミド結合の完全な置換、伸展（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）、削除、またはバックボーン・クロスリンクなどの修飾を含むものである。概説はＳｐａｔｏｌａ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｖｏｌ．ＶＩＩ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｄ．，  １９８３）を参照のこと。いくつかのペプチド・バックボーン修飾が知られており、これらにはψ［ＣＨ２Ｓ］、ψ［ＣＨ２ＮＨ］、ψ［ＣＳＮＨ２］、ψ［ＮＨＣＯ］、ψ［ＣＯＣＨ２］およびψ［（Ｅ）もしくは（Ｚ）ＣＨ＝ＣＨ］が含まれる。上記で使用した命名法は、上記Ｓｐａｔｏｌａの提案に従うものである。この関係において、ψはアミド結合の欠如を示すものである。アミド基を置換する構造は、角括弧内に特定される。
【００２２】
アミノ酸模倣体も前記ペプチドに導入し得る。ここで使用される「アミノ酸模倣体」は、本発明のペプチドのアミノ酸の置換物としてコンフォメーション的および機能的に作用する天然に生じるアミノ酸以外の部分（ｍｏｉｅｔｙ）である。かかる部分は、それが適切なＧ２５０蛋白質由来エピトープに対して免疫応答を惹起する前記ペプチドの能力に干渉しないならば、アミノ酸残基の置換物として作用する。アミノ酸模倣体は、非蛋白質性のアミノ酸を含み得るもので、例えばβ―、γ―、δ―アミノ酸、β―、γ―、δ――イミノ酸（例えば、ピペリジン―４―カルボキシリック  アシッドなど）など、同様にＬ―α―アミノ酸の多くの誘導体をも含み得る。多くの適切なアミノ酸模倣体は当業者に既知であり、それらにはシクロヘキシルアラニン、３―シクロヘキシルプロピオン酸、Ｌ―アダマンチルアラニン（Ｌ―ａｄａｍａｎｔｙｌ  ａｌａｎｉｎｅ）、アダマンチル酢酸などが含まれる。本発明のペプチドに適切なペプチド模倣体は、ＭｏｒｇａｎおよびＧａｉｎｏｒ（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｐｔｓ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：２４３−２５２で議論されている。
【００２３】
上記の通り、本発明に用いられるペプチドは同一である必要はないが、配列番号１２もしくは１５のアミノ酸配列と実質的に同一であってもよい。それ故、前記ペプチドは、保存的もしくは非保存的な様々な変更（例えば、挿入、削除、および置換など）を受けてもよく、かかる変更はそれらの使用にある種の利点を提供し得るものである。本発明のペプチドは、配列番号１２もしくは１５のアミノ酸配列と実質的に同一（以下に定義されるような）の配列を含む限り、多くの様式で修飾できる。
【００２４】
比較的短いアミノ酸配列（約３０残基未満）のアライメントおよび比較は、典型的には直接的なものである。比較ウィンドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）を整列するための最適な配列アライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のローカル相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４３３の相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４の類似性法（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）の検索、それらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ７．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｏｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、またはインスペクション（ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）により処理し得るものであり、そして様々な方法により作成される最適アライメント（即ち、比較ウィンドウに対して配列類似性の最高パーセンテージを作成する）が選択される。
【００２５】
「配列同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列が比較ウィンドウを対して同一（即ち、アミノ酸ごとに）であることを意味している。「配列同一性パーセンテージ」という用語は、比較ウィンドウに対して２つの最適に整列された配列を比較し、適合ポジション数を算出するため同一の残基が双方の配列に出現する箇所のポジション数を決定し、比較ウィンドウ（即ち、ウィンドウサイズ）におけるポジションの総数で適合ポジション数を割り算し、そして配列同一性パーセンテージを算出するために結果に１００を掛けることで計算されるものである。
【００２６】
本発明のペプチドに適用する限り、「実質的に同一」という用語は、最適に整列された際に２つのペプチド配列が、初期設定のギャップ荷重（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔｓ）を用いてＧＡＰもしくはＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどにより、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％以上の配列同一性（例えば、９９％の配列同一性）を共有することを意味するものである。好ましくは、同一ではない残基ポジションは、保存的なアミノ酸置換で相違する。保存的アミノ酸置換は、類似する側鎖を有する残基の互換性を参照して決められる。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族―ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換グループは：バリン―ロイシン―イソロイシン、フェニルアラニン―チロシン、リジン―アルギニン、アラニン―バリン、およびアスパラギン―グルタミンである。
【００２７】
好ましくは、本発明のペプチドは、ヒトもしくは動物（哺乳類）（例えば、本願明細書の以下に記載されるような）の体内への適切な投与において、少なくとも本発明のペプチドに対してヒトもしくは動物の免疫応答を産生もしくは惹起することが可能であるものであり。好ましくは、この免疫応答は「顕著」な免疫応答であり、本願明細書中においては該応答により本発明のペプチドが投与されたヒトもしくは動物の体内に検出可能な変化を生じる応答を一般的に意味する。通常、これは前記ペプチドに対する検出可能な免疫応答であり、前記ペプチドに対する抗体産生、またはより好ましくは体（または、その一部、器官、もしくは組織）が抗原に暴露された際に出現する細胞性免疫応答などである。
【００２８】
通常、かかる顕著な免疫応答は、本発明のペプチドに対してのみ向けられるだけではなく、それらの本発明のかかる関連エピトープをアミノ酸配列の一部として含有する蛋白質もしくはペプチドに対しても向けられ、同様にかかるエピトープを含有するペプチドもしくは蛋白質を（例えば、それらの表面上に）含有、保持、もしくは発現する構造、細胞もしくは組織に対しても向けられる（例えば、治療すべき腫瘍細胞など）。
【００２９】
本発明のペプチドにより惹起される顕著な免疫応答は、例えばそれ自体は既知の免疫アッセイもしくは免疫検出技術を使用して決定し得る。かかるアッセイもしくは検出技術は、例えば抗原ベースのアッセイもしくは検出技術であり、該技術においては、例えば本発明のペプチド（もしくは、その関連エピトープ）が前記抗原として使用し得る。適切な免疫学的アッセイもしくは検出技術の例には、ウエスタンブロッティングなどのブロッティング技術、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ、などが含まれるが、それらに限定されることはなく、標準の教本（例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  １９８８，  “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）、同様に例えばＷＯ９３／１８１５２を参照してなされる。
【００３０】
前記アッセイもしくは検出技術は、患者から採取される適切な生物学的なサンプルもしくは液体に通常適用される、それらは例えば血液、リンパ液および／または組織サンプルなどであり、バイオプシーにより採取されるサンプルを含むが、これに限定されない。かかるサンプルは、例えば前記ペプチド（例えば、以下に記載の）の適切な投与の後に取得してもよい。従って、このサンプルに対して得られた結果は、顕著な免疫応答が生成されるか否かを決定するために、前記ペプチドの投与前に取得された類似のサンプルの結果と比較される（即ち、同じ免疫学的アッセイを使用して）。前記アッセイもしくは検出技術は、定量的な技術であってもよく、これは本発明の異なるペプチドにより生成される免疫応答において比較データを提供する。
【００３１】
より好ましくは、本発明のペプチドは治療上効果的な免疫応答を提供する、これは患者の体内に存在する腫瘍を攻撃もしくは破壊できる、または（即ち、体の同一の部分もしくは器官内の、および／または体の他の部分もしくは器官に対する）腫瘍の（更なる）成長および／または拡散を少なくとも阻止もしくは制限できる免疫応答を意味するものであり、該腫瘍は再発性（ｒｅｃｉｄｉｖｉｓｍ）および／または転移性のものを含むが、これに限定されない。
【００３２】
＜薬学的および他の組成物並びにそれらの投与＞
更なる側面において、本発明は上記で定義したような本発明のペプチドを含む薬学的組成物に関する。前記薬学的組成物は、好ましくは本発明のペプチドおよび本願明細書の下記に記載されるような薬学的に許容される担体を少なくとも含む。より好ましくは、前記薬学的組成物はワクチンであり、それは更に好ましくは本願明細書の下記に記載されるようなアジュバンドを含むものである。
【００３３】
別の側面において、本発明は本願明細書の下記に記載されるような抗原提示細胞を含む組成物に関するものであり、前記抗原提示細胞は上記で定義したような本発明のペプチドをロードされたものである。前記組成物は、好ましくは薬学的組成物である。好ましくは、前記抗原提示細胞は樹状細胞であり、その中でもヒトの抗原提示細胞が最も好適である。
【００３４】
本発明のペプチド及びその薬学的組成物は、Ｇ２５０蛋白質を発現する癌を治療および／または予防するための哺乳類（特にヒト）への投与に有用である。適切な処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｐａ．，  １７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に見られ、これは引用によって本願明細書中に援用される。
【００３５】
前記薬学的組成物は、非経口、経口もしくは経皮的な投与を意図するものである。好ましくは、前記薬学的組成物は、例えば皮下、皮内、筋肉内などに非経口的に投与される。従って、本発明は非経口投与のための組成物を提供するものであり、それは許容される担体（好ましくは、水性担体）中に溶解もしくは懸濁された前記免疫原性ペプチドの溶液を含むものである。水性担体の多くのものが使用でき、例えば水、緩衝水、０．４％  塩性水、０．３％  グリシン、ヒアルロン酸などである。それらの組成物は、通常の周知の滅菌技術により滅菌し得る、または滅菌濾過し得る。生産された水性溶液は使用にさいし、そのままの形態で包装されるか、または凍結乾燥される（凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液と混合される）。前記組成物は、生理的な条件に近づけるために必要な薬学的に許容される補助的物質を含有してもよく、それは緩衝剤、張度調整剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｄｊｕｓｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、湿潤剤などで、例えばソディウム  アセテート、ソディウム  ラクテート、ソディウム  クロライド、ポタジュウムクロライド、カルシウム  クロライド、ソルビタン  モノラウレート、及びトリエタノールアミン  オレアートである。
【００３６】
固形組成物に対しては、通常の毒性のない固形担体が使用でき、これには例えば、薬剤グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、マグネシウム  ステアレート、ソディウム  サッカリン、タルカム（ｔａｌｃｕｍ）、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム  カルボネートなどが含まれる。経口投与に対し、薬学的に許容される毒性のない組成物は、通常使用される任意の賦形剤（以前に記載された担体など）、及び一般的に１０〜９５％の活性成分（それは１以上の本発明のペプチドである）、より好ましくは２５％〜７５％の濃度を混入することにより形成される。上記で記載したように、前記組成物は前記ペプチドに対する免疫応答を誘導することを意図している。従って、前記免疫応答を最大化するのに適切な組成物および投与方法が好ましい。例えば、ペプチドは担体と結合して、または活性ペプチド単位のホモポリマーもしくはヘテロポリマーとして宿主（ヒトを含む）に導入し得る。またはペプチドの「カクテル」が使用できる。１ペプチドを越える混合物は、免疫応答を増強する利点（異なるペプチドがポリマーを形成するために使用される）および、多くのエピトープに対する抗体を誘導する付加的な能力を有している。例えば、αおよびβ鎖の高可変領域の配列を含んでいるペプチドを組み合わせて使用し得る。有用な担体は、当該技術分野において周知であり、例えばチログロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、テタヌストキソイド、ポリ（リジン：グルタミン酸）などのポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスのコア蛋白質、Ｂ型肝炎ウイルスの組換え型ワクチンなどを含むものである。
【００３７】
前記組成物は、好ましくはアジュバンドをも含む。アジュバンドの多くは当業者に周知である。適切なアジュバンドには、不完全フロインドアジュバンド、アルム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、Ｎ―アセチル―ムラミル―Ｌ―スレオニル―Ｄ―イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ―アセチル―ノル―ムラミル―Ｌ―アラニル―Ｄ―イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰとして参照される）、Ｎ―アセチルムラミル―Ｌ―アラニル―Ｄ―イソグルタミル―Ｌ―アラニン―２―（１’―２’―ジパルミトイル―ｓｎ―グリセロ―３―ヒドロキシホスホリロキシ）―エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとして参照される）、及びＲＩＢＩ〔これは細菌から抽出した３つの成分、モノホスホリル  リピッドＡ、トレハロース  ジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０  エマルジョン中に含有するものである〕が含まれる。アジュバンドの有効性は、免疫原性ペプチドに対する抗体の量を測定して決定し得る。特に有効なアジュバンドおよび免疫スケジュールは、Ｋｗａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７−１２０９−１２１５（１９９２）に記載されており、これは参照によって本願明細書中に援用される。そこで記載される免疫学的アジュバンドは、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクアレン、２．５％プルロニック  Ｌ１２１ポリマーおよび０．２％ポリソルベートをリン酸緩衝塩類溶液中に含む。
【００３８】
薬学的処方における本発明の免疫原性ペプチドの濃度は、広範に変異し得る（即ち重量で約０．１％未満、通常は約２％もしくは少なくとも約２％から、２０％程度から５０％以上まで）、そして選択された特定の投与様式に基づいて第一に液体容量、粘性などにより選択される。
【００３９】
様々な投与形態に対しての適切な処方に関する更なる指針は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ．，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）の記載中に見つけることができる。薬剤デリバリー法の簡単なレビューはＬａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照のこと。これらの参考文献の双方は、その全体が引用によって本願明細書中に援用される。例えば、経皮デリバリー系は、パッチ、ゲル、テープおよびクリームを含み、そして溶解補助剤、透過性増強剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸など）、親水性ポリマー〔例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニル  ピリリジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｉｌｌｉｄｉｎｅ）など〕および付着および粘着性付与剤（例えば、ポリイソブチレン、シリコンベースの付着剤、アクリレートおよびポリブテンなど）などの賦形剤を含有することができる。経粘膜デリバリー系は、パッチ、錠剤、坐剤、ペッサリー、ゲルおよびクリームを含み、そして溶解補助剤および増強剤（例えば、プロピレン  グリコール、胆汁酸塩およびアミノ酸など）、並びに他のベヒクル（例えば、ポリエチレン  グリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒアルロン酸などの親水性ポリマー）などの賦形剤を含有することができる。注射可能なデリバリー系は、溶液、懸濁液、ゲル、微小球体およびポリマー性の注射可能な剤を含み、そして溶解性変更剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ―ａｌｔｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、エタノール、プロピレン  グリコールおよびスクロース）、およびポリマー（例えば、ポリカプリラクトン、およびＰＬＧＡ’ｓ）などの賦形剤を含むことができる。移植可能な系は、ロッド（ｒｏｄｓ）およびディスク（ｄｉｓｃｓ）を含み、そしてＰＬＧＡおよびポリカプリルラクトンなどの賦形剤を含有することができる。本発明の薬学的組成物の投与に使用できる他のデリバリー系は、スプレーおよびパウダーなどの鼻内デリバリー系、舌下デリバリー系、並びに吸入によるデリバリー系などを含む。吸入による投与に対し、本発明の薬学的組成物は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適切なガス）を使用した加圧パックもしくはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、用量単位は一定量を送達するためのバルブを提供することにより決定し得る。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）もしくは散布器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）に使用するゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジは、本発明のペプチドの粉状混合物およびラクトースもしくはデンプンなどの適切な粉状基剤を含有するように処方し得る。本発明の薬学的組成物は、例えば合衆国特許番号６，３５８，５３０に記載のような吸入による投与のために更に処方され得る。
【００４０】
本発明のペプチドは、ワクシニアもしくは鶏痘などの弱毒化ウイルス宿主によっても発現できる。このアプローチは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。宿主への導入に際し、組換え型ワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それにより免疫応答を惹起する。ワクシニアベクターおよび免疫プロトコールに有用な方法は、例えば合衆国特許番号４，７２２，８４８に記載されており、引用によって本願明細書中に援用される。別のベクターはＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ等（Ｎａｔｕｒｅ  ３５１；４５６−４６０（１９９１））に記載されており、これは本願明細書中に引用によって援用される。本発明のペプチドの治療的投与もしくは免疫に有用な他のベクターの多岐にわたる種類（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  ベクターなど）は、当業者に明白に理解される。これらは例えば（粘膜性）細菌宿主を含み、該宿主は本発明のペプチドをコードし、且つヒトもしくは動物の胃腸管に通常は経口投与される際に前記ペプチドを発現可能である核酸を含有する。かかる細菌宿主には、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉが含まれる。従って、本発明に含まれるものは、本発明のペプチドをコードする核酸を含むＤＮＡワクチン、遺伝子治療ベクター、ウイルスもしくは細菌を含む組成物であり、それはＧ２５０蛋白質を発現する癌を治療もしくは予防する本発明の方法に使用し得る。
【００４１】
本発明のペプチドを投与するための更に別の方法は、抗原提示細胞と組み合わせた投与を含み、該方法により前記ペプチドが、適切な抗原提示細胞によって保持され、該細胞に付着し、もしくは該細胞に関連している期間投与されることを意味する。この目的において、適切な抗原提示細胞は、好ましくは投与の前に、例えば抗原提示細胞（例えば、抗原提示細胞のインビトロ培養物など）を含む組成物に本発明のペプチドを添加することにより本発明のペプチドをインビトロでロード／プライムし得る。このようにして本発明のペプチドをロードされた前記抗原提示細胞は、（例えば皮内注射を介して）患者の体に投与し得るものであり、その際にそれらは前記ペプチドに対する免疫応答を（更に）惹起し得る（例えば、Ｔ細胞に前記ペプチドを提示することによって）。この態様において、好ましくは自己の抗原提示細胞が使用され、このことは前記抗原提示細胞が、ロードされた形で該細胞が戻される患者から取得される（または該患者から取得される細胞に由来する）ことを意味している。好ましくは、前記抗原提示細胞は樹状細胞である。好ましくは、前記抗原提示細胞もしくは樹状細胞は、ヒト細胞である。抗原提示細胞もしくは樹状細胞を取得もしくは誘導（ｄｅｒｉｖｉｎｇ）する方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，  Ｉｎ：Ｃｏｉｃｏ  Ｒ，  ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ７：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ａｎｄ  ｐａｇｅｓ  ７３２１−７３２６などのハンドブックから）。
【００４２】
別の側面において、本発明は本発明の（ポリ）ペプチドを含む薬学的組成物を生産する方法に関する。前記方法は、少なくとも上記方法で取得された本発明の（ポリ）ペプチドを、薬学的に許容される担体および上記のアジュバンドなどの更なる成分と混合する工程を含むものである。
【００４３】
＜治療的な使用および方法＞
更なる側面において、本発明は癌を治療もしくは予防する組成物の製造のための上記の本発明のペプチドの使用に関する。好ましくは、前記癌は腎臓細胞カルシノーマ、或いは腎臓、前立腺、頭部、頸部、胃腸管もしくはその任意の領域、または膀胱の癌である。より好ましくは、前記癌は腎臓細胞カルシノーマ、或いは結腸、胃もしくは膀胱の癌である。しかしながら最も好ましくは、本発明は腫瘍の治療もしくは予防のための組成物の調製における、上記で定義したような本発明のペプチドの使用に関し、該腫瘍は配列番号１６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現するか、または該蛋白質の免疫原性部分を発現する。
【００４４】
更に別の側面において、本発明は患者の癌を治療もしくは予防する方法に関し、該方法は前記癌を治療もしくは予防するのに効果的な量の組成物（上記で定義したような）の前記患者への投与を含む。好ましくは、前記組成物は薬学的組成物である。好ましくは、前記癌は腎臓細胞カルシノーマ、或いは腎臓、前立腺、頭部、頸部、胃腸管もしくはその任意の領域、または膀胱の癌である。より好ましくは、前記癌は腎臓細胞カルシノーマ、或いは結腸、胃もしくは膀胱の癌である。しかしながら最も好ましくは、本発明は患者の腫瘍を治療もしくは予防する方法に関し、該方法は前記腫瘍を治療もしくは予防するのに効果的な量の組成物（上記で定義したような）の前記患者への投与を含むものであり、前記腫瘍は配列番号１６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を発現する、または該蛋白質の免疫原性部分を発現する腫瘍である。
【００４５】
本発明の免疫原性ペプチドは、予防的に、または既に疾患に罹患している個体に投与される。上記で定義したような治療上効果的な（または顕著な）免疫応答を惹起するのに十分な量の前記組成物が患者に投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療効果用量」または「免疫原性効果用量」と定義される。この使用に対して効果的な量は、例えばペプチド組成物、投与の様式、治療する疾患のステージおよび重症度、患者の体重および総合的な健康状態、および処方する医者の判断などに依存する。一般的に、患者の治療は通常は前記ペプチドに対して生成される免疫応答に十分な量の本発明のペプチド（もしくは組成物）の１以上の投与（「ワクチン接種」とも呼称される）を伴うものである。好ましくは、かかる治療は、前記ペプチド（もしくは組成物）の１以上の「プライミング」投与を伴うものであり、前記ペプチド（もしくは組成物）の１以上の「ブースター」投与が続いて施される。通常後者は、プライミング後に適切な期間を経過した後、（もし、複数のブースター投与が使用されるならば）適切な時間間隔をおいて施される。
【００４６】
使用するペプチド（もしくは組成物）に依存して、これらは通常は初回もしくはプライミング免疫（これは治療的もしくは予防的投与のためである）に対して、７０キログラム患者において約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇの範囲であり、より一般的には７０ｋｇ体重において約０．１ｍｇ〜約０．７５ｍｇの範囲である。ブースター用量は、典型的には約０．０５ｍｇ〜約０．７５ｍｇのペプチド／７０キログラム患者であり、より一般的には約０．１ｍｇ〜約０．５ｍｇ／７０ｋｇ体重であり、患者の反応および状態に応じて数週間を越え数ヶ月にわたるブースター投与計画を使用する。適切なプロトコールは、０、２、６、１０および１４週での注射、続いて２４および２８週でのブースター注射を含むようなものであろう。或いは適切な投与計画は、第１日に初回のプライミング投与を伴うものであってもよい、オプションとして以後の８週間に１以上の更なるプライミング投与が引き続き、該投与は例えば１４から２８日以上離れていてもよい。これらのプライミング投与は、その後１以上のブースター投与（例えば、８から５２週において）を伴うものであってもよく、そのブースター投与は通常１４から２８日以上離される。通常、前記１以上のプライミングおよび前記１以上のブースター投与は、同じ投与ルート（例えば、経皮下および／または経皮内に）を介し、前記ペプチドに対して同一（タイプの）の薬学的処方を使用して投与される。本発明は、任意の適切な様式において、本発明のペプチドの単一種のみの使用、同様に本発明の異なるペプチドの任意の適切な組み合わせの使用の双方を網羅する。
【００４７】
本発明の好適な態様において、患者の癌の治療もしくは予防のための方法は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩハプロタイプ特異的様式で適用される。従って、前記患者のＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩハプロタイプが決定され、前記方法は本発明のペプチドを認識するＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩハプロタイプを有する患者に好適に適用される。かかる好適なＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩハプロタイプは、ＨＬＡ−Ａ２．１および／またはＨＬＡ−ＤＲ、その中でも好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４もしくはＨＬＡ−ＤＲ１１またはそれらの組み合わせから選択される。同様に、本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩハプロタイプ特異的な様式で癌を治療もしくは予防する組成物の製造に好適に使用し得る。
【００４８】
本発明のペプチドが抗原提示細胞と共に投与される場合（即ち、上記のように）、前記ペプチドを保持する細胞は、患者の体に細胞を導入する既知の様式で投与し得る。同様にこの投与は、好ましくは免疫応答、特に顕著な免疫応答、および好ましくは治療上効果的な免疫応答を生じるものである。前記ペプチドを保持する細胞は、例えば経皮的、経静脈的もしくは経動脈的な注射を介して投与し得る。この目的のために、前記細胞は適切な液体培地中に細胞懸濁液の形で通常提供され、該培地は最も好ましくは薬学的に効果的なものであり、前記細胞をインビトロで維持、培養および／またはローディング／プライミングするために使用される培地と同じであってもよい。リン酸緩衝塩類溶液などの生理的溶液が実例である。投与のためのかかる細胞調製において、ペプチドをロードした細胞は、１０２−１０８細胞／ｍｌ、好ましくは１０４−１０５細胞／ｍｌの量／濃度で通常存在する。或いは、前記細胞は、例えばアポプトーティックボディーの形で投与し得る。
【００４９】
前記細胞は、例えばプライミングおよびブースティング（例えば、基本的には上記のような）を伴う投与計画にしたがい１もしくは数回投与し得るが、本発明はそれに限定されない。そのように実施する場合、好ましくは適切な量の前記細胞が投与される、即ち免疫応答、特に顕著な免疫応答、および好ましくは治療上効果的な免疫応答が得られる量である。投与される特定量は、本明細書中に記載される記述を基に臨床医によって通常決定され、治療する腫瘍、患者の全般的な状態、使用する細胞および／またはペプチド、ワクチン接種のタイプ（例えば、プライミングもしくはブースティング）および所望の投与計画などの要素を考慮して決定される。
【００５０】
更に、好ましくはないのだが、本発明は前記ペプチドをインビトロでロード／プライムした細胞、および特に上記に記載した細胞から得られる分画、ライセートおよび／または断片の投与をも包含する。特に、（例えば、上記のように適切な様式、適切な量および／または適切な投与計画に従って投与された際に）顕著な免疫応答、および好ましくは治療上効果的な免疫応答を提供できる分画、ライセートもしくは断片を使用し得る。かかる細胞の分画、ライセートもしくは断片は、薬学的製剤の形態であるか、または薬学的製剤に導入し得るもので、該製剤は基本的に本発明のペプチドとして上記に記載したようなものであってもよい。
【００５１】
最後に、本発明のペプチドの前駆体が使用し得る。本発明のペプチドの前駆体は、本願明細書中においてプロセッシングにより本発明のペプチドを産生する能力のある任意の分子を意味すると理解される。本発明のペプチドの前駆体は、好ましくは（例えば、上記のような適切な様式、適切な量および／または適切な投与計画に従って投与された際に）、それらが顕著な免疫応答、および好ましくは治療上効果的な免疫応答を提供できるものである。それら前駆体も本発明のペプチドとして本質的に上記記載の通り処方および投与し得る。
【００５２】
＜遺伝子治療＞
本発明の更に別の側面は、上記に定義されたような本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびオプション的に既知の遺伝子治療剤の１以上の更なる因子を含む遺伝子治療剤に関する。従って、本発明は上記で定義されたような本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を開示するものであり、該配列は遺伝子治療による癌の治療のための組成物の製造に使用し得る。更なる側面において、本発明は患者の癌の治療もしくは予防のための方法に関し、該方法は癌を治療もしくは予防するのに効果的な量の遺伝子治療剤（上記で定義したような本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびオプション的に既知の遺伝子治療剤の１以上の更なる因子を含む）を患者に投与することを含む。
【００５３】
前記遺伝子治療剤は、好ましくは上記で記載したような「顕著」な免疫応答、および好ましくは上記で記載したような「防御的」免疫応答を〔ヒトもしくは動物（哺乳類）に適切に投与することにより〕産生するために使用され；該応答は上記で記載したような本発明のペプチドの投与によって誘導される顕著／防御的な免疫応答に本質的に類似するものである。通常、かかる遺伝子治療剤は、投与に際してヒトもしくは動物の体内で、或いは治療する腫瘍（の細胞）を含む、かかるヒトもしくは動物の任意の部分、器官、組織もしくは細胞で配列番号１２のペプチド（または、上記で定義したようなそのバリアントもしくはアナログ）の発現を許容もしくは提供するものである。前記遺伝子治療剤により提供される前記ペプチドの発現は、更に（少なくとも）前記ペプチドに対する顕著（及び、好ましくは防御的）な免疫応答を生じるために、発現したペプチドが上記で定義したような抗原提示細胞との接触に参加することができるか、さもなければ免疫系に関与している細胞との接触に参加することができるようなものであるべきである。通常、本発明のかかる遺伝子治療剤は、単一もしくは二重鎖ヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列）を含むもので、少なくとも本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むものである。通常、かかる遺伝子治療剤は、少なくとも本発明のペプチドをコードする適切なベクター（例えば、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクター）の形態である。かかるベクターは、既知の遺伝子治療ベクターにおける全ての他の因子を含み得るものである。前記因子は、前記ペプチドをコードする配列に制御可能に連結する適切なプロモーター、適切なターミネーターもしくは他の制御因子などの遺伝的因子；同様に遺伝子治療剤が細胞内に侵入し、〔例えば、細胞内に存在する（ゲノム）ＤＮＡ内に統合されることにより〕発現することを許容する統合因子（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）もしくは他の因子を含むが、それらに限定されない。かかるベクターはまたウイルス粒子を提供するため（例えば、１以上の適切なカプシド蛋白質と）適切に「パッケージ」され得る。また、かかる遺伝子治療剤は、より大きなアミノ酸配列の部分（例えば、蛋白質もしくはポリペプチド）として、または１以上の更なるペプチド配列との融合体として本発明のペプチドを発現し得る。
【００５４】
前記遺伝子治療剤は、前記遺伝子治療剤に対してヒトもしくは動物の体〔または治療する腫瘍（の細胞）を含む、ヒトもしくは動物の任意の部分、器官、組織もしくは細胞〕を暴露する既知の様式で投与し得る。また、かかる遺伝子治療剤は適切な細胞（例えば、患者に由来する細胞および／または治療する腫瘍の細胞など）を感染させるためインビトロで使用し得る、そして、これらの細胞は本願明細書の上記で定義したような所望の顕著な免疫応答、および好ましくは防御的免疫応答を提供するためにヒトもしくは動物の体に導入し得る。
【００５５】
また前記遺伝子治療剤は、例えば１以上の薬学的に許容される担体、アジュバンド、および／または賦形剤などを使用した薬学的製剤（遺伝子治療製剤）を提供することなどの既知の様式でも処方し得る。かかる製剤は本発明の更なる側面を形成する。
【００５６】
＜本発明のペプチドの他の適用＞
上記の治療上の適用の他に、本発明のペプチドは、配列番号１６の蛋白質もしくはそのバリアントに相当する代表的な抗原としても使用し得るもので、例えばＷＯ  ９３／１８１５２に記載されているような免疫学的、診断的および／または分析的な適用などに使用し得る。本課題において、本発明のペプチドは、免疫学的、診断的および／または分析的なキットのために、例えば他の成分と組み合わせてキットの部分をも形成し得る。
【００５７】
【実施例】
＜１．      材料及び方法＞
《１．１．  蛋白質、ライセート及びペプチド》
Ｇ２５０蛋白質（＞９５％  ピュア）及びロドプシン（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）蛋白質（７５％  ピュア）を、記載（Ｇｒａｂｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  上記；  Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７０：１１２２２−１１２２９）の通りにそれぞれＧ２５０バキュロウイルスおよびロドプシンバキュロウイルスを感染させたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞（ＡＴＣＣ．  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ．  ＭＤ）から精製した。ペプチドをマルチプルペプチド合成機（Ｊ．Ｗ．Ｄｒｙｆｈｏｕｔ，  Ｌｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｌｅｉｄｅｎ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用したＦｍｏｃ化学で合成した。逆相ＨＰＬＣで決定したかぎり、ペプチドは＞９０％ピュアであった。
【００５８】
《１．２．  ペプチドをロードしたＤＣを用いたＣＤ４＋  Ｔ細胞の誘導》
−８日に、健常者個体のＰＢＭＣをパーコール密度遠心を使用して分離し、７５ｃｍ２組織培養フラスコ（Ｃｏｓｔｅｒ，  Ｂａｄｈｏｅｖｅｄｏｒｐ，  ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の２％ヒト血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）中で３７℃、１時間接着させた。接着したモノサイトは、ＩＬ−４（５００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ；  双方ともＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，  Ａｒｎｓｔｅｌｖｅｅｎ，  ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓより）存在下、１％自己血清を添加したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）中で６日間培養した。新鮮なサイトカイン含有の培養培地を−５日に添加した。−２日に、未成熟ＤＣを１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α（Ｂｅｎｄｅｒ，  Ｖｉｅｎｎａ，  Ａｕｓｔｒｉａ）および１０μｇ／ｍｌ  プロスタグランジン  Ｅ２（Ｓｉｇｍａ．  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）で刺激した。２つのＭＨＣクラスＩＩ拘束エピトープ予測ソフトウェアプログラム（Ｄｒ．  Ｓ．  Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃにより実施された；  文献は：Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５０：２１３−２１９；  ｄｅ  Ｌａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：１７２５−１７２９；  Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７：５５５−５６１を参照のこと）、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩおよびＴＥＰＩＴＯＰＥに基づいて、１４のＧ２５０由来ペプチドが選択された（表２）。−１日に、１０μｇ／ｍｌの各Ｇ２５０由来ペプチドを前記ＤＣ（４もしくは５ペプチド／ＤＣプール）に添加した。０日に、ペプチドをロードした成熟ＤＣを再度１０μｇ／ｍｌの各Ｇ２５０由来ペプチドで３７℃、４時間ロードした。ペプチドをロードしたＤＣ（５ｘ１０４／ウェル）を、１，０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｂｉｎｇｄｏｎ，  ＵＫ）の存在下、１％自己血清を添加したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地中で５ｘ１０５の濃縮した自己ＣＤ４＋  Ｔ細胞〔磁気ソーティング（Ｄｙｎａｌ，  Ｏｓｌｏ，  Ｎｏｒｗａｙ）により、ＣＤ８＋およびＣＤ５６＋細胞を欠乏させた〕と共培養した。７および１４日に、レスポンダーＴ細胞を、ペプチドをロードした未成熟ＤＣ（３７℃、４時間）および２０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ，  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，  ＣＡ）で再刺激した。２１および３５日に、バルクのＴ細胞のペプチド特異性を、ペプチドをロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を刺激細胞とした増殖アッセイおよびＩＦＮ−γ分泌アッセイの双方において試験した。加えて、これらのＴ細胞培養におけるＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージは、マウス抗ヒトＣＤ４  ＭＡｂ  ＲＩＶ−７（Ｌｅｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．  ７１：１９１−２００）およびＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス２次抗体（Ｚｙｍｅｄ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）、続くフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ；  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）を用いた間接的免疫蛍光により明らかにされる。７日毎に、Ｔ細胞は交互に、２０  ＩＵ／ｍｌＩＬ−２を与えられるか、或いはペプチドをロードしたＥＢＶ−Ｂ細胞（３７℃、４時間）および２０  ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２で再刺激された。
【００５９】
《１．３．  ＩＦＮ−γ放出アッセイおよび増殖アッセイ》
自己ＡＰＣをＧ２５０由来ペプチドで３７℃、４時間ロードした。抗原をロードしたＡＰＣを放射線照射（５，５００  ｒａｄ）し、１％自己血清を添加したＸ−ＶＩＶＯ  １５培地を含む９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔｅｒ）に３．５ｘ１０５細胞／ウェルで播種した。バルクＴ細胞を５ｘ１０５細胞／ウェルで添加した。ＨＬＡブロッキング実験に対しては、抗体Ｂ７／２１（抗ＨＬＡ−ＤＰ）、ＴＹ２２（抗ＨＬＡ−ＤＱ）およびＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）（Ｄｒ．Ｇ．Ｐａｗｅｌｅｃより提供された抗体）を２５％（Ｖ／Ｖ）の終濃度で各ウェルに添加した；  この濃度で増殖は完全にブロックできた。抗原特異的な刺激において、Ｔ細胞カルチャーがＩＦＮ−γを放出することができるかどうかを試験するため、これらのカルチャーの上清が１６時間後に採取された。続いて、上清中のＩＦＮ−γの量がＩＦＮ−γ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定された。レスポンダーＴ細胞の増殖は、培養７２時間後、１μＣｉ／ウェル［３Ｈ］ＴｄＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ，  ＵＫ）でもう１６時間パルスすることにより決定された。チミジンの取り込みは、液体シンチレーションカウンター（ＬＫＢ  Ｗａｌｌａｃ，  ＵＫ）を用いて測定された。
【００６０】
表２：予測のＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをカバーするＧ２５０由来ペプチド（２０  ｍｅｒ）（＊オーバーラップするアミノ酸は太字で表す）
【表２】
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＜２．      結果＞
《２．１    Ｇ２５０由来ペプチド特異的Ｔヘルパー応答の誘導》
ＣＴＬの抗腫瘍反応性は、抗原特異的Ｔヘルパー応答により増強される。ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を誘導するＲＣＣ関連抗原Ｇ２５０の潜在性を調査するために、我々は２つの予測ソフトウエア、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩおよびＴＥＰＩＴＯＰＥに基づいて１４のＧ２５０由来ペプチドを選択した。選択された２０ｍｅｒペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４およびＨＬＡ−ＤＲ１１に対する予測結合モチーフの高密度を有するＧ２５０蛋白質の領域に位置していた。抗Ｇ２５０Ｔヘルパー細胞の誘導のため、我々は健常者個体の専門（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）の抗原提示ＤＣを使用した。ドナーごとに、各々４もしくは５種類のＧ２５０由来ペプチドを含有する３グループ内のうちの１グループでＤＣの３プールが別々にロードされた（表２）。ペプチドをロードしたＤＣを自己ＣＤ４＋  Ｔ細胞と共培養した。図１に示したように、我々はグループＩおよびＩＩＩのＧ２５０由来ペプチドをロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞で刺激した際に特異的に増殖するＴ細胞株を得た。対照的に、８健常人ドナー中で、グループＩＩのペプチドに対する如何なるペプチド特異的Ｔ細胞増殖も得ることができなかった。グループＩＩＩのＧ２５０由来ペプチドに対して上昇したＴ細胞株は最大の増殖応答を示し、最も効率的に増幅できたので、それらのＴ細胞を更なる分析に供した。
【００６１】
グループＩＩＩのどのＧ２５０由来ペプチドがＴヘルパー細胞株ＩＩＩに認識されたかを試験するために、グループＩＩＩの各Ｇ２５０由来ペプチドを別々にロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞が刺激細胞として増殖アッセイに使用された。図２ａは、このＴ細胞カルチャー（＞９８％  ＣＤ４＋）がペプチド  Ｇ２５０：２４９−２６８を特異的に認識するが、他の如何なるＧ２５０由来ペプチドも認識しないことを示している。続いて、ペプチドＧ２５０：２４９−２６８をＴ細胞に提示するＭＨＣクラスＩＩ分子が調査された。図２ｂは、ペプチドＧ２５０：２４９−２６８がＴヘルパー細胞株ＩＩＩによるＩＦＮ−γの分泌を特異的に誘導し、そしてＩＦＮ−γ産生がＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）に対する抗体でブロックされるが、ＨＬＡ−ＤＰ（Ｂ７／２１）もしくはＨＬＡ−ＤＱ（ＴＹ２２）に対する抗体によってはブロックされないことを示している。これらの結果は、Ｔヘルパー細胞株ＩＩＩによるペプチドＧ２５０：２４９−２６８の認識はＨＬＡ−ＤＲ拘束であることを示している。
【００６２】
《２．２．  Ｇ２５０：２４９−２６８特異的Ｔヘルパー細胞株は自然にプロセスされたＧ２５０を認識する》
Ｇ２５０由来ペプチド２４９−２６８が自然にプロセスされ、そして提示されるかどうかを決定するため、自己ＤＣは精製Ｇ２５０蛋白質（５μｇ／ｍｌ）をロードされ、そしてＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞株ＩＩＩを刺激するために使用された。この目的のために、バキュロウイルス産生Ｇ２５０蛋白質が使用され、ネガティブコントロール蛋白質として組換え型ロドプシン（同じバキュロウイルス系で産生された）を含めた。Ｇ２５０蛋白質をロードした自己ＤＣとの相互作用に際し、Ｔ細胞は特異的に増殖し（図３ａ）、特異的にＩＦＮ−γを分泌した（図３ｂ）、しかしロドプシン蛋白質をロードした自己ＤＣとの相互作用においては認められなかった。ロドプシン蛋白質の分画は２５％  バキュロウイルス蛋白質を含有しているので、観察された増殖およびＩＦＮ−γ分泌はＧ２５０特異的である。図３ａに示したように、自然にプロセスされたＧ２５０の認識は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体によりブロックできたが、抗ＨＬＡ−ＤＰおよび抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体ではブロックできなかった。これらのデータは、ペプチド２４９−２６８がＧ２５０蛋白質から自然にプロセスされ、ＨＬＡ−ＤＲにより提示されることを示している。
【００６３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｇ２５０由来ペプチドに応答して特異的に増殖するＴヘルパー細胞株Ｉ及びＩＩＩ。
Ｇ２５０由来ペプチドの非関連プール（オープン  カラム）及び関連プール（クローズド  カラム）をロードした自己のＥＢＶ−Ｂ細胞が、増殖アッセイに刺激細胞として使用された。１ドナーから３つのＣＤ４＋  Ｔ細胞培養（Ｇ２５０由来ペプチドの３グループの１つがロードされた自己ＤＣに対して誘導された）がレスポンダー細胞として使用された。
【図２】Ｔヘルパー細胞株ＩＩＩはＨＬＡ−ＤＲ背景でペプチドＧ２５０：２４９−２６８を認識する。
（ａ）Ｔヘルパー細胞株ＩＩＩに認識されるＧ２５０由来ペプチドが、増殖アッセイを用いて試験され、そこでＥＢＶ−Ｂ細胞は別々にプールＩＩＩの各ペプチドをロードされる。
（ｂ）ペプチドＧ２５０：２４９−２６８をＴヘルパー細胞株ＩＩＩに提示するＭＨＣクラスＩＩ分子を同定するために、ペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生がＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）、ＨＬＡ−ＤＰ（Ｂ７／２１）およびＨＬＡ−ＤＱ（ＴＹ２２）に対するブロッキング抗体の存在もしくは非存在の条件下で測定された。
【図３】自然にプロセスされるＧ２５０はＴヘルパー細胞株ＩＩＩによって認識される。
ロドプシン蛋白質（２５％バキュロウイルス蛋白質を含有）をロードした自己ＤＣ、またはＧ２５０蛋白質（＞９５％  ピュア）をロードした自己ＤＣとの反応における、ペプチドＧ２５０：２４９−２６８特異的Ｔヘルパー細胞の増殖能（ａ）およびＩＦＮ−γ分泌能（ｂ）を試験した。３つの代表的実験の１つが示される。ＭＨＣクラスＩＩ拘束が、Ｇ２５０特異的増殖を抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｌ２４３）並びに抗ＨＬＡ−ＤＰ（Ｂ７／２１）および抗ＨＬＡ−ＤＱ（ＴＹ２２）の双方でブロッキングすることにより検査された（ａ）。２つの代表的実験の１つが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【外国語明細書】
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