(57)【要約】【課題】鋳型核酸中の所望の位置および所望の鎖長の一本鎖ＤＮＡを合成する方法を提供すること。【解決手段】（１）合成すべき標的核酸配列を含む鋳型核酸に対して、該標的核酸配列の３’末端側のヌクレオチド鎖に相補的な配列を有し、かつ標的核酸配列の伸長反応の起点となるプライマーと、該標的核酸配列の５’末端の塩基の直前の上流側のヌクレオチド配列に相補的な配列を有し、かつ該伸長反応を終結させるブロッカーとを、アニーリングさせる工程；及び、（２）上記工程（１）の後に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に示さない核酸合成酵素を使用して、該プライマーを起点として標的核酸配列の相補鎖の合成を行う工程；を含む、核酸の合成方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）合成すべき標的核酸配列を含む鋳型核酸に対して、該標的核酸配列の３’末端側のヌクレオチド鎖に相補的な配列を有し、かつ標的核酸配列の伸長反応の起点となるプライマーと、該標的核酸配列の５’末端の塩基の直前の上流側のヌクレオチド配列に相補的な配列を有し、かつ該伸長反応を終結させるブロッカーとを、アニーリングさせる工程；及び、
（２）上記工程（１）の後に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に示さない核酸合成酵素を使用して、該プライマーを起点として標的核酸配列の相補鎖の合成を行う工程；
を含む、核酸の合成方法。
【請求項２】
鋳型核酸がＲＮＡであり、核酸合成酵素が逆転写酵素である、請求項１に記載の核酸の合成方法。
【請求項３】
標的核酸配列の相補鎖を合成後、鋳型核酸を分解する、請求項１又は２に記載の核酸の合成方法。
【請求項４】
ブロッカーがＤＮＡである、請求項１から３の何れかに記載の核酸の合成方法。
【請求項５】
ブロッカーの塩基配列の３’末端が置換されて、核酸合成酵素による核酸伸長反応が阻害される構造を有している、請求項１から４の何れかに記載の核酸の合成方法。
【請求項６】
ブロッカー配列の３’末端がダイデオキシリボヌクレオチドである、請求項５に記載の核酸の合成方法。
【請求項７】
標識されているデオキシリボヌクレオチドを用いて核酸の合成を行う、請求項１から６の何れかに記載の核酸の合成方法。
【請求項８】
請求項１から７の何れかに記載の核酸の合成方法によって得られた核酸をプローブとして用いて他の核酸とハイブリダイゼーションを行う、核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の合成方法に関する。さらに詳細には、本発明は、鋳型核酸に対して相補的を有するプライマーおよびブロッカーを用いて、所望の位置及び鎖長の核酸を合成する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
遺伝子工学分野において、ＤＮＡの合成は多様な目的に利用されている。ＤＮＡの合成方法としては、オリゴヌクレオチドのような短鎖のＤＮＡを化学合成する方法と、ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法とが挙げられる。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法としては、例えば、以下の▲１▼から▲３▼に記載の方法がある。
▲１▼ＤＮＡを鋳型としたＤＮＡ合成反応（非特許文献の第３２頁）
鋳型ＤＮＡに対して、相補的なプライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラーゼにより鋳型の配列に相補的なＤＮＡを合成する。
【０００４】
▲２▼逆転写反応（非特許文献の第３２頁）
鋳型ＲＮＡに対して、相補的なプライマーを結合させ、逆転写酵素により鋳型の配列に相補的なｃＤＮＡを合成する。
【０００５】
▲３▼ＰＣＲ反応（非特許文献の第５１頁）
鋳型ＤＮＡに対して、相補的なプライマー（２種）を結合させ、ＤＮＡポリメラーゼにより鋳型ＤＮＡを増幅し、２本鎖のＤＮＡを合成する。このＤＮＡ合成方法では、目的とするＤＮＡ領域を増幅させるために、通常、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応を行う。
【０００６】
上記▲１▼に記載のＤＮＡを鋳型としたＤＮＡ合成反応および▲２▼に記載の逆転写反応では一本鎖ＤＮＡを合成できるが、その鎖長を制御することができなかった。また、上記▲３▼に記載のＰＣＲ反応では、鎖長を制御することはできるが、一本鎖ＤＮＡを合成することはできない。即ち、上記のいずれの方法においても、所望の鎖長の１本鎖ＤＮＡを合成することができなかった。上記▲１▼及び▲２▼記載の鎖長制御のできていない１本鎖ＤＮＡをＤＮＡプローブとして使用した場合、クロスハイブリが生じる可能性があり、正確な測定ができないという問題があった。
【０００７】
【非特許文献１】
「知っておきたいＤＮＡ、遺伝子、遺伝子工学の基礎知識」、Ｇ．Ｒ．カーター、Ｓ．Ｍ．ボイル著、加藤郁之進監訳、宝酒造株式会社発行、ＩＳＢＮ  ４−９２４８６２−１５−０
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、鋳型核酸中の所望の位置および所望の鎖長の一本鎖ＤＮＡを合成する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、（少なくともプライマー部分とブロッカー部分の塩基配列が既知である）鋳型核酸に対して相補的な配列を有するプライマーとブロッカーを使用することによって、鋳型核酸中の所望の位置および所望の鎖長の一本鎖核酸を合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、（１）合成すべき標的核酸配列を含む鋳型核酸に対して、該標的核酸配列の３’末端側のヌクレオチド鎖に相補的な配列を有し、かつ標的核酸配列の伸長反応の起点となるプライマーと、該標的核酸配列の５’末端の塩基の直前の上流側のヌクレオチド配列に相補的な配列を有し、かつ該伸長反応を終結させるブロッカーとを、アニーリングさせる工程；及び、
（２）上記工程（１）の後に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に示さない核酸合成酵素を使用して、該プライマーを起点として標的核酸配列の相補鎖の合成を行う工程；
を含む、核酸の合成方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、鋳型核酸はＲＮＡであり、核酸合成酵素は逆転写酵素である。
好ましくは、標的核酸配列の相補鎖を合成後、鋳型核酸を分解する。
好ましくは、ブロッカーはＤＮＡである。
【００１２】
好ましくは、ブロッカーの塩基配列の３’末端は置換されて、核酸合成酵素による核酸伸長反応が阻害される構造を有している。
好ましくは、ブロッカー配列の３’末端はダイデオキシリボヌクレオチドである。
好ましくは、標識されているデオキシリボヌクレオチドを用いて核酸の合成を行う。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、上記した何れかの核酸の合成方法によって得られた核酸をプローブとして用いて他の核酸とハイブリダイゼーションを行う、核酸の検出方法が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明では、先ず始めに、合成すべき標的核酸配列を含む鋳型核酸に対して、該標的核酸配列の３’末端側のヌクレオチド鎖に相補的な配列を有し、かつ標的核酸配列の伸長反応の起点となるプライマーと、該標的核酸配列の５’末端の塩基の直前の上流側のヌクレオチド配列に相補的な配列を有し、かつ該伸長反応を終結させるブロッカーとを、アニーリングさせる。
【００１５】
合成すべき標的核酸配列を含む鋳型核酸の種類は特に限定されず、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、合成ＲＮＡのいずれであってもよく、さらに当該核酸を含む可能性のある任意の試料から調製又は単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の方法において使用することもできる。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、尿、糞便、髄液、精液、唾液、組織又は細胞培養物のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料などが挙げられる。また、前記した各種の試料を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物を使用することもできる。核酸含有調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の特定の核酸（例えば、ｍＲＮＡなど）を濃縮した試料等が挙げられる。
【００１６】
核酸含有調製物の調製方法は特に限定されず、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスを用いた方法等により行うことができる。この場合、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離などの公知方法を単独又は組み合わせて使用することにより行うことができる。
【００１７】
鋳型核酸としてＲＮＡを使用する場合には、合成すべき標的核酸配列を含むという観点から、少なくともｍＲＮＡを含む試料を用いることが好ましく、例えば、細胞から抽出した全ＲＮＡからオリゴｄＴカラムなどを用いて単離したｍＲＮＡを使用することができる。
【００１８】
また、鋳型核酸の長さも特に限定されず、数十ｂｐから数百ｋｂ以上の任意の長さの核酸を使用することができる。鋳型核酸の配列は、以下に説明するプライマーおよびブロッカーを設計できるように、標的核酸配列の３’末端側のヌクレオチド配列と、標的核酸配列の５’末端の塩基の上流側のヌクレオチド配列が既知であることが望ましい。但し、プライマーおよびブロッカーを設計できる限り、標的核酸配列の全塩基配列は必ずしも既知でなくてもよい。
【００１９】
プライマーは、標的核酸配列の３’末端側のヌクレオチド鎖に相補的な配列を有し、標的核酸配列の伸長反応の起点となる一本鎖核酸であり、好ましくは一本鎖のオリゴヌクレオチドである。プライマーが鋳型核酸にアニールする位置は、ブロッカーが鋳型核酸にアニールする位置に対して、鋳型核酸の３’末端側である。このプライマーを起点として標的核酸配列の相補鎖の伸長反応を行うことにより、目的とする一本鎖核酸を合成することができる。
【００２０】
プライマーの長さは鋳型核酸の対応する位置に特異的にアニーリングすることができる限り特に限定されない。一般的には、１０〜１００ヌクレオチド程度であり、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド程度であり、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度であり、例えば、２０〜２５ヌクレオチドに設計することができる。プライマーの長さが短すぎると特異性が低下するため好ましくなく、また長すぎるプライマーの使用は合成に手間がかかるため好ましくない。本発明で用いるプライマーは、市販のＤＮＡ合成器などを用いて当業者に公知の方法で合成することができる。具体的には、本発明で用いるプライマーは、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等を使用することもできる。
【００２１】
ブロッカーは、標的核酸配列の５’末端の塩基の直前の上流側のヌクレオチド配列に相補的な配列を有し、かつ該伸長反応を終結させることができる一本鎖核酸である。ブロッカーが鋳型核酸にアニールする位置は、プライマーが鋳型核酸にアニールする位置に対して、鋳型核酸の５’末端側である。プライマーを起点として標的核酸配列の相補鎖の伸長反応を行い、相補鎖の伸長がブロッカーの位置に達することにより伸長反応は停止し、目的とする所望の長さの一本鎖核酸を合成することができる。
【００２２】
ブロッカーは鋳型核酸にアニーリングすることができる限り、ＤＮＡ又はＲＮＡの何れでもよい。好ましくは、ブロッカーの塩基配列の３’末端は置換されて、核酸合成酵素による核酸伸長反応が阻害される構造を有している。このような構造の一例としては、３’末端がダイデオキシリボヌクレオチドであるブロッカー配列が挙げられる。
【００２３】
ブロッカーの長さは鋳型核酸の対応する位置に特異的にアニーリングすることができる限り特に限定されない。一般的には、５〜５０ヌクレオチド程度であり、好ましくは５〜３０ヌクレオチド程度であり、さらに好ましくは７〜２０ヌクレオチド程度であり、例えば、７〜１５ヌクレオチドに設計することができる。ブロッカーの長さが短すぎると特異性が低下するため好ましくなく、また長すぎるブロッカーの使用は合成に手間がかかるため好ましくない。本発明で用いるブロッカーは、プライマーの合成と同様に、市販のＤＮＡ合成器などを用いて当業者に公知の方法で合成することができる。
【００２４】
本発明では、上記した鋳型核酸に対して、上記のプライマーとブロッカーとをアニーリングさせる。アニーリングは、鋳型核酸、プライマー及びブロッカーを溶液中に混合して、アニーリングに適した所定の温度（一般的には、６０〜８０℃程度、好ましくは６５〜７５℃程度、例えば、７０〜７２℃程度）で一定時間（例えば、数分から１時間程度）インキュベーションすることにより行うことができる。アニーリング終了後、混合物を急冷し、次の伸長反応へと操作を進めることができる。
【００２５】
本発明では、上記したアニーリング工程の後に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に示さない核酸合成酵素を使用して、上記プライマーを起点として標的核酸配列の相補鎖の合成を行う。
【００２６】
核酸合成酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に示さない酵素であれば、その種類は特に限定されない。例えば、Ｔｏｙｏｂｏ社製のＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及びΔＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどを使用することができる。また、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に示さない逆転写酵素を使用することもできる。逆転写酵素の例としては、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅ）等を挙げることができ、一例としては、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）などが挙げられる。
【００２７】
核酸合成酵素による標的核酸配列の合成は、適当な基質（即ち、４種類のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの混合物）の存在下で常法により行うことができる。合成された一本鎖核酸をプローブとして使用する場合には、標的核酸配列の合成の際に、基質として、標識されているデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを用いて核酸の合成を行うことにより標識プローブを合成することができる。
【００２８】
標識の種類は特に限定されないが、放射標識の他、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン又はローダミンなど）、ケミルミネッセンス、およびバイオルミネッセンス、ビオチン標識、ＤＩＧ標識などが挙げられる。
【００２９】
具体的には、アニーリング後の混合物に、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に示さない核酸合成酵素を添加し、得られた混合物を核酸合成を行う酵素反応に適した温度（例えば、３７℃又は４２℃まど）で一定時間（例えば、数分から数時間程度）インキュベーションすることによって、標的核酸配列の相補鎖の合成を行うことができる。
【００３０】
本発明では、標的核酸配列の相補鎖を合成後、鋳型核酸を分解することによって、合成した所望の鎖長の一本鎖核酸を取得することができる。鋳型核酸の分解は、当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、鋳型核酸としてＲＮＡを使用した場合には、ＲＮａｓｅを添加し、所定の温度でＲＮＡ分解反応を行えばよい。
【００３１】
上記した本発明の一例の概要を図１に示す。図１では、鋳型としてｍＲＮＡを使用し、核酸伸長反応の酵素として逆転写酵素を使用した場合の例である。
一番上の図は、鋳型ｍＲＮＡの構造を示し、該ｍＲＮＡの中に合成したＤＮＡ領域（太線部分：標的核酸配列）が存在することを示す。
上から２番目の図は、プライマーとブロッカーのアニーリングを示す。プライマーは標的核酸配列の３’末端にアニーリングし、ブロッカーは標的核酸配列の５’側の外側にアニーリングすることが示されている。
【００３２】
上から３番目の図は、伸長反応を示す。アニーリングしたプライマーを起点として標的核酸配列の相補鎖が、ブロッカー配列の位置まで伸長されていく（点線部分）。
一番下の図はＲＮａｓｅによる鋳型ＲＮＡの分解、及びカラムによる低分子成分の除去を示す。
上記した一連の操作により、標的核酸配列の相補鎖から成る所望の長さの一本鎖核酸を合成することができる。
【００３３】
さらに、上記した核酸の合成方法によって得られた核酸をプローブとして用いて他の核酸とハイブリダイゼーションを行う、核酸の検出方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００３４】
ハイブリダイゼーションによる標的核酸配列を検出する方法は当業者に公知である。試料中における標的核酸配列を検出する方法の一例としては、（１）該試料より標的核酸を含む可能性のある核酸試料を調製し、（２）得られた核酸試料を、本発明の方法で合成した標識された一本鎖核酸（標識プローブ）と接触させてハイブリダイゼーションを行い、（３）上記標識プローブとハイブリダイズした該核酸試料中の標的核酸を検出することにより行うことができる。上記した（１）核酸試料の調製、（２）ハイブリダイゼーション、及び（３）標的核酸の検出方法は全て当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９、並びに、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３５】
本発明の方法で合成した核酸の利用法の一つとして、特開２００２−３５５０３６号公報に記載のシステムでの利用が挙げられる。特開２００２−３５５０３６号公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。
【００３６】
特開２００２−３５５０３６号公報には、具体的には、放射線を減衰させる性質を有する材料によって形成され、複数の孔が形成された基板の前記複数の孔内に、それぞれ、吸着性領域が形成されて、形成された複数の吸着性領域に、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、構造または特性が既知の特異的結合物質を滴下し、放射性標識物質によって標識された生体由来の物質を、前記特異的結合物質に特異的に結合させて、前記複数の吸着性領域を選択的に標識して、生化学解析用ユニットを作製し、前記生化学解析用ユニットを、輝尽性蛍光体層が形成された蓄積性蛍光体シートに、前記輝尽性蛍光体層が前記複数の吸着性領域と対向するように、重ね合わせて、前記複数の吸着性領域に含まれた前記放射性標識物質によって、前記輝尽性蛍光体層を露光し、前記放射性標識物質によって露光された前記輝尽性蛍光体層に励起光を照射して、前記輝尽性蛍光体層に含まれた輝尽性蛍光体を励起し、前記輝尽性蛍光体層に含まれた輝尽性蛍光体から放出された輝尽光を光電的に検出して、生化学解析用データを生成し、前記生化学解析用データに基づいて、生化学解析を実行することを特徴とする生化学解析方法が記載されている。
【００３７】
上記の生化学解析方法において用いる、「構造または特性が既知の特異的結合物質」、または「放射性標識物質によって標識された生体由来の物質」として、本発明で合成した核酸を使用することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３８】
【実施例】
実施例１：転写反応を用いたオリゴヌクレオチドの合成
ヒト肝臓ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）（０．５μｇ）および表１記載のプライマーＤＮＡ（０．５μｇ）およびブロッカーＤＮＡ（１．５μｇ）を混合し、７０℃で１０分間加熱した後、氷上で急冷する。この混合物に、ＲＮａｓｅ  ＯＵＴ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）（４０Ｕ）、ｄＡＴＰ（５００μＭ）、ｄＧＴＰ（５００μＭ）、ｄＣＴＰ（５００μＭ）、ｄＴＴＰ（５００μＭ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）（４００Ｕ）、ＤＥＰＣ処理水（全量２０μｌになる量）を添加し、４２℃で２時間反応させる。反応終了後、ＥＤＴＡ及びＮａＯＨを添加し６５℃で１時間インキュベートすることで、反応の停止とｍＲＮＡの分解を行う。反応液をＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラム（ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ  ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ，ＩＮＣ）に通し、分解生成物や未反応の化合物を除去して精製する。
【００３９】
次に、精製したサンプルを電気泳動（ポリアクリルアミドゲル：１２〜２０％アクリルアミドゲル、６Ｍ−ＵＲＥＡ、１×ＴＢＥバッファー、Ｓｔａｉｎ−ａｌｌ（シグマ）、ラダー：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０ｂｐ  ＤＮＡラダー）にて鎖長をチェックする。結果を以下の表１に記載する。表１の結果から分かるように、プライマーＤＮＡおよびブロッカーＤＮＡを用いる本発明の方法により、所望の鎖長のＤＮＡを合成することができた。
【００４０】
【表１】
2004283052.tif 000002
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、鋳型核酸中の所望の位置および所望の鎖長の一本鎖ＤＮＡを合成することができる。また本発明の方法により合成した均一の鎖長のＤＮＡをプローブとして用いて他の核酸とハイブリダイゼーションを行って核酸を検出することにより、核酸の正確な検出および定量を行うことができる。
【００４２】
【配列表】
2004283052.tif 000003
【００４５】
2004283052.tif 000004
【００４６】
2004283052.tif 000005
【００４７】
2004283052.tif 000006
【００４８】
2004283052.tif 000007
【００４９】
2004283052.tif 000008
【００５０】
2004283052.tif 000009
【００５１】
2004283052.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の一例の概念を示す図である。
【図１】
2004283052.tif 000011