(57)【要約】【課題】酸化処理等を必要とすることなく、安全で簡便な、水溶液中でも安定な酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した、酸化型グルタチオン高含有酵母エキス及びその製造方法を提供する。【解決手段】酵母菌体を熱水抽出する酵母エキスの製造方法において、該酵母が、キャンディダ属に属し、ポリエン系抗生物質存在下で生育可能であり、酸化型グルタチオンを多量に、好ましくは１重量％以上、含有することのできる酵母変異株を用いる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酸化型グルタチオン高含有酵母エキス。
【請求項２】
酵母菌体を熱水抽出する酵母エキスの製造方法において、該酵母が、キャンディダ属に属し、ポリエン系抗生物質存在下で生育可能であり、酸化型グルタチオンを多量に含有することのできる酵母変異株であることを特徴とする、酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酵母エキスの製造方法。
【請求項３】
酵母菌体が、酵母変異株を炭素源が消失した状態で引き続き培養したものである、請求項２記載の酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酵母エキスの製造方法。
【請求項４】
酵母変異株が、酸化型グルタチオンの菌体内含量が１％以上である、請求項２乃至３記載の酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酵母エキスの製造方法。
【請求項５】
酵母変異株が、キャンディダ・ウチリス１４５３Ｂ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７８９）である、請求項２乃至４のいずれか１項記載の、酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酵母エキスの製造方法。
【請求項６】
酵母変異株が、キャンディダ・ウチリス１４８３Ａ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７９０）である、請求項２乃至４のいずれか１項記載の、酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酵母エキスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酸化型グルタチオン高含有酵母エキス及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般にグルタチオンは酵母及び動物の肝臓等に広く分布しており、生体内の酸化還元反応に深く関与しているトリペプチドであり、肝機能回復作用や解毒作用さらには活性酸素の消去による細胞の老化を防ぐ作用などの重要な役割を果たすものとして、極めて有用な物質である。グルタチオンにはその形態として還元型グルタチオン（以下、ＧＳＨと略称する。）と、２つの還元型グルタチオンがシステイン残基でジスルフィド結合した酸化型グルタチオン（以下、ＧＳＳＧと略称する。）が存在する。両者とも生体内で生合成されており、酸化還元反応において重要な働きをしている。ＧＳＳＧは生体内ではグルタチオン還元酵素により一旦ＧＳＨになり、リサイクルしながら働いている。従って、ＧＳＳＧを投与した場合はＧＳＨと同様の作用が見込まれるといわれている（例えば、ジャーナルオブ  ニュートリショナル  サイエンス  アンド  ビタミノロジー  ４４巻、６１３ページ、１９９８年、等）。
これらの物質は、主として酵母菌体中に多く蓄積されることが見いだされており、特にＧＳＨは、キャンディダ・ウチリスで多量の蓄積量を示す変異株を培養することにより、工業的規模での生産が行われている（例えば、特許文献１）。
しかしながら、ＧＳＨは、割合に不安定な物質であり、使用方法によっては、その効果が十分に発揮できない場合がある。特に水分の多い環境下での加熱処理により分解しやすい。
【０００３】
一方、ＧＳＳＧは、水分の多い環境中でも安定であり、加熱処理にも比較的安定である。グルタチオンは、通常、生体内で還元型の形で存在している場合が多く、ＧＳＳＧを高濃度に含有にする生物は従来あまり知られていない。そのため、ＧＳＳＧを取得するには、一旦生成したＧＳＨを物理的・化学的あるいは生物的に酸化して製造されている。
これら事情は、ＧＳＳＧを含有した酵母エキスの生産に関しても同様であり、例えば、特許文献２には、サッカロマイセス属の酵母で蓄積させたＧＳＨを抽出して酵母エキスとした後、ｐＨ６以上１１未満に調整し、溶存酸素の存在下で保持することによりＧＳＨをＧＳＳＧに変換する方法が、また、特許文献３には、ＧＳＨを含有した酵母エキスにアスコルビン酸とアスコルビン酸を酸化する酵素を添加するＧＳＳＧを含有した酵母エキスの製造方法が提案されている。
【０００４】
【特許文献１】
特公平３−１８８７２号公報
【特許文献２】
特開平５−１４６２７９号公報
【特許文献３】
特開平７−１７７８９６号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このように、安定な化合物であるＧＳＳＧを含有した酵母エキスを製造するためには、一旦生成したＧＳＨを酸化する必要があり、試薬、設備類が必要となるばかりでなく、条件によっては雑菌汚染等の恐れもあった。更に、酵母エキス中のＧＳＳＧ含有量も十分ではなく、更に高含有の酵母エキスが求められていた。
従って、本発明は、酸化工程等を必要とすることなく、安全で簡便な、かつ、ＧＳＳＧを多量に含有した酵母エキス、及びその製造方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等はかかる課題を解決するため鋭意研究の結果、特定の変異株を使用することにより、ＧＳＳＧを多量に含有した酵母エキスを取得できることを見いだし、本発明に到達した。
すなわち本発明は、
（１）酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酸化型グルタチオン高含有酵母エキス、
（２）酵母菌体を熱水抽出する酵母エキスの製造方法において、該酵母が、キャンディダ属に属し、ポリエン系抗生物質存在下で生育可能であり、酸化型グルタチオンを多量に含有することのできる酵母変異株であることを特徴とする、酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酵母エキスの製造方法、
（３）酵母菌体が、酵母変異株を炭素源が消失した状態で引き続き培養したものである、上記（２）記載の酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酵母エキスの製造方法、
（４）酵母変異株が、酸化型グルタチオンの菌体内含量が１％以上である、上記（２）乃至（３）記載の酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酵母エキスの製造方法、
（５）酵母変異株が、キャンディダ・ウチリス１４５３Ｂ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７８９）である、上記（２）乃至（４）のいずれか一記載の、酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酵母エキスの製造方法、
（６）酵母変異株が、キャンディダ・ウチリス１４８３Ａ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７９０）である、上記（２）乃至（４）のいずれか一記載の、酸化型グルタチオンを１０重量％以上含有した酵母エキスの製造方法、
を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵母エキスは、ＧＳＳＧを１０重量％以上含有したものである。
かかる酵母エキスは、特定の酵母変異株を用い培養し、得られた菌体を分離洗滌した後、熱水抽出し、該抽出液を乾燥することにより製造される。
【０００８】
本発明で用いられる酵母変異株は、キャンディダ属（好ましくはキャンディダ・ウチリス）に属するもので、ポリエン系抗生物質存在下で生育可能なものであり、ＧＳＳＧを多量に含有できるものであれば、いずれであってもよい。
具体的には、キャンディダ・ウチリスＫＪ２３９Ｄ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０１７）を親株とし、変異処理によって得られたキャンディダ・ウチリス１４５３Ｂ５（独立行政法人産業技術総合研究所寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７８９）及びキャンディダ・ウチリス１４８３Ａ６（独立行政法人産業技術総合研究所寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８７９０）が挙げられる。
【０００９】
キャンディダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）１４５３Ｂ５及び１４８３Ａ６の菌学的性質は以下の通りである。
１．キャンディダ・ウチリス１４５３Ｂは、アンフォテリシンＢ１０ｐｐｍを含む培地に生育し、キャンディダ・ウチリス１４８３Ａ６は、ナイスタチン３５ｐｐｍを含む培地に生育する。
２．ＤＬ−メチオニン１０ｇ／Ｌ及び亜硫酸ナトリウム６００ｍｇ／Ｌを含む培地に生育する。
３．一般に良く生育し、多量のＧＳＳＧ、ＧＳＨを蓄積できる。
４．ニコチンアミドを培地に添加すると、多量のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドをも蓄積できる。
５．ＹＭ寒天培地上で全縁、半レンズ状隆起、表面滑らかで鈍い光沢、クリーム色で軟質のコロニーを形成する。
６．グルコース、シュクロース、マルトース、セルビオース、トレハロース、ラフィノース、メレジトース、キシロース、エタノール、マンニトール、乳酸、クエン酸、ＫＮＯ３  を同化する。
７．ビタミンフリー培地での生育良好。
【００１０】
本発明で用いられる酵母変異株は、ＧＳＳＧを多量に含有することができるもので、その菌体内含量は、ＧＳＳＧを１％以上、好ましくは２％以上含有するものが望ましく、かつ、ＧＳＳＧの他に、ＧＳＨを多量に含有できるものが更に好ましい。ＧＳＳＧ及びＧＳＨの合計菌体内含量としては、５〜１２％であることが好ましい。
ＧＳＨとＧＳＳＧの菌体内含有比としては、ＧＳＨ：ＧＳＳＧ＝１：５〜５：１が好ましく、ＧＳＨ：ＧＳＳＧ＝１：５〜３：１がより好ましい。
【００１１】
酵母変異株は、適当な培地を調製し、接種し、培養される。
培地組成は、炭素源としては通常微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等が用いられるが、グルコースが好ましい。窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸塩等が使用される。リン酸、カリウム、マグネシウム源としては、リン酸カルシウム、リン酸アンモニウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等が用いられる。その他、微量金属としては、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩が有効である。さらに必要に応じて、コーンスチープリカー、カゼイン、酵母エキス、ペプトン等の有機物を添加することもできる。
【００１２】
培養温度は２０〜３３℃の範囲で生育可能であるが、好ましくは２２〜３０℃である。ｐＨは３．５〜７．５、好ましくは４．０〜６．０である。
培養時間は炭素源の濃度、培養温度により異なるが、通常４８〜７２時間である。
【００１３】
培養は、通常、炭素源が消失した時点で終了するが、本発明においては、炭素源がない状態で引き続き培養時間を延長することが望ましい。培養時間を延長することにより、菌体内のＧＳＳＧ含有量を増加させることができる。延長できる培養時間としては、２時間から２４時間程度である。
【００１４】
培養終了後、得られた菌体を遠心分離機等で分離し、洗滌した後、熱水で抽出する。
抽出条件としては、公知の熱水抽出の条件が用いられ、例えば、固形分として５〜１５％程度の菌体懸濁液を、８０〜１００℃に加熱し、１〜１０分間程度その温度に保持することにより抽出することができる。
【００１５】
抽出液は濃縮後、乾燥することにより、本発明の酵母エキスが製造される。
抽出液の濃縮前後に例えばデキストリン等の賦形剤を加えることが好ましく、添加量としては酵母エキス固形分当たり５〜５０重量％程度である。
乾燥は、噴霧乾燥、凍結乾燥等が挙げられるが、噴霧乾燥が好ましい。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例を上げて本発明を詳細に説明する。
なお、ＧＳＳＧ及びＧＳＨの定量並びに純度検定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。測定条件は以下の通りである。
・カラム：マイティシルＲＰ−１８ＧＰ（関東化学製）４．６ｍｍ−１５０ｃｍ
・移動相：５％リン酸水素二アンモニウム（ｐＨ３．２にリン酸で調整）
・測定波長：２１０ｎｍ
更にＧＳＨ及びＧＳＳＧを合わせたトータルのグルタチオンの定量は、Ｔｉｅｔｚｅの方法（「アナリティカル  バイオケミストリー」  第２７巻、５０２ページ、１９６９年）に従って測定した。
【００１７】
参考例１
キャンディダ・ウチリスＫＪ２３９Ｄ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０１７）をＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン２％、イーストエキス１％）を含む試験管で対数増殖期まで培養した。この菌体を回収し定法に従いニトロソグアニジン（以下、「ＮＴＧ」と略称する。）による変異処理を行った。変異処理した菌体を洗浄後、ＹＰＤ培地で４８時間培養したものをＮＴＧ処理菌体とした。次いで、ＮＴＧ処理菌体を適当に希釈し、アンフォテリシンＢを含む生産培地（グルコース２％、硫酸アンモニウム０．１％、リン酸１カリウム２．０％、尿素０．２％、塩化カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０２％、硫酸第一鉄２ｐｐｍ、硫酸マンガン２ｐｐｍ、硫酸銅０．４ｐｐｍ、硫酸亜鉛２ｐｐｍ、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ５に調整）に塗抹培養した。生育してきたコロニーをＹＰＤ培地に接種し、２４℃で４８〜７２時間振とう培養し種菌とした。
次いで生産培地３０ｍｌを含む三角フラスコをオートクレーブ滅菌したものに、この種菌を３〜５ｍｌ接種し、約３０時間２４〜２６℃で振とう培養した。菌体を遠心分離により集菌し、１回水洗後、２５ｍｌにメスアップし、５ｍｌを菌体重量測定に使用し、残りの菌体懸濁液を９０℃、２分間保持して抽出した。この抽出液の上清についてＨＰＬＣによりＧＳＨ及びＧＳＳＧの定量を行った。
この中から、ＧＳＨまたはＧＳＳＧの生成量が増加したものをスクリーニングした。
スクリーニングした株を更に変異処理して、アンフォテリシンＢ含有培地に塗抹し、更にスクリーニングを行った。この様な操作を繰り返して、アンフォテリシンＢ１０ｐｐｍに耐性になるキャンディダ・ウチリス１４５３Ｂ５株を得た。
本菌株を三角フラスコで培養し、熱水抽出により菌体内ＧＳＳＧ含量を測定したところ、２．３％であった。
本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所に平成１４年３月２０日付けで寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１８７８９である。
【００１８】
参考例２
キャンディダ・ウチリスＫＪ２３９Ｄ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０１７）をＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン２％、イーストエキス１％）を含む試験管で対数増殖期まで培養した。この菌体を回収し定法に従いＮＴＧによる変異処理を行った。変異処理した菌体を洗浄後、ＹＰＤ培地で４８時間培養したものをＮＴＧ処理菌体とした。次いで、ＮＴＧ処理菌体を適当に希釈し、ナイスタチンを含む生産培地（グルコース２％、硫酸アンモニウム０．１％、リン酸１カリウム２．０％、尿素０．２％、塩化カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０２％、硫酸第一鉄２ｐｐｍ、硫酸マンガン２ｐｐｍ、硫酸銅０．４ｐｐｍ、硫酸亜鉛２ｐｐｍ、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ５に調整）に塗抹培養した。生育してきたコロニーをＹＰＤ培地に接種し、２４℃で４８〜７２時間振とう培養し種菌とした。
次いで生産培地３０ｍｌを含む三角フラスコをオートクレーブ滅菌したものに、この種菌を３〜５ｍｌ接種し、約３０時間２４〜２６℃で振とう培養した。菌体を遠心分離により集菌し、１回水洗後、２５ｍｌにメスアップし、５ｍｌを菌体重量測定に使用し、残りの菌体懸濁液を９０℃、２分間保持して抽出した。この抽出液の上清についてＨＰＬＣによりＧＳＨ及びＧＳＳＧの定量を行った。
この中から、ＧＳＨまたはＧＳＳＧの生成量が増加したものをスクリーニングした。
スクリーニングした株を更に変異処理して、ナイスタチン含有培地に塗抹し、更にスクリーニングを行った。この様な操作を繰り返して、ナイスタチン３５ｐｐｍに耐性になるキャンディダ・ウチリス１４８３Ａ６株を得た。
本菌株を三角フラスコで培養し、熱水抽出により菌体内ＧＳＳＧ含量を測定したところ、１．８％であった。
本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所に平成１４年３月２０日付けで寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１８７９０である。
【００１９】
実施例１
ＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン２％、イーストエキス１％）を試験管に８ｍｌ分注し、１２１℃で１５分間殺菌したものに、参考例１で得られたキャンディダ・ウチリス１４５３Ｂ５株を、１白金耳植菌し、２４℃で７２時間振とう培養し種菌とした。
次にＹＰＤ培地の１０００ｍｌを５Ｌ容の三角フラスコに分注し、１２１℃で２５分間殺菌したものに前述の種菌を接種し、２４℃で７２時間、ロータリーシェーカーで振とう培養（２５０ｒｐｍ）した。これを３０Ｌ容発酵槽に植菌した。
培地としてはグルコース６．５％、燐酸一アンモニウム０．２６％、硫酸アンモニウム０．１５％、硫酸マグネシウム０．０９％、塩化カリウム０．２％、硫酸マンガン５ｐｐｍ、硫酸亜鉛５ｐｐｍ、硫酸銅１ｐｐｍ、硫酸第一鉄５ｐｐｍを用いバッチ培養を行った。培養条件は、槽内液量１８Ｌ、培養温度２４℃、通気量１８Ｌ／分、攪拌４００ｒｐｍ、ｐＨ４．０（アンモニア添加による自動コントロール）にて行った。
培養の終了は、グルコースが消失した時点から４時間後とした。なお、グルコース消失時点以降の培養は、２４℃、ｐＨは成り行きとした。
培養時間を延長することによりＧＳＳＧの含量が増加した。
培養終了後、得られた培養液１６．５Ｌを遠心分離で集菌し、１回水洗後約６．１Ｌの菌体懸濁液とした。
この懸濁液を９０℃２分間熱水抽出した。この時の固形分は６７．４ｇ／Ｌ、ＧＳＳＧ濃度は３．３ｇ／Ｌ、ＧＳＨ濃度は４．６ｇ／Ｌであった。
この熱水抽出物を遠心分離して上清を集め、２４ｇのデキストリン（日本コーンスターチ製）を加えて溶解後、ロータリーエバポレーターで約１Ｌに濃縮した。これをスプレードライヤー（ニロ社製）で噴霧乾燥し、１３７ｇの酵母エキス粉末を得た。
この酵母エキス（乾燥物）のＧＳＳＧ含量は１１．３４％、ＧＳＨ含量は１５．８８％であった（トータルグルタチオン含量：２７．２２％）。
【００２０】
実施例２
ＹＰＤ培地（グルコース２％、ポリペプトン２％、イーストエキス１％）を試験管に８ｍｌ分注し、１２１℃で１５分間殺菌したものに、参考例２で得られたキャンディダ・ウチリス１４８３Ａ６株を、１白金耳植菌し、２４℃で７２時間振とう培養し種菌とした。
次にＹＰＤ培地の１０００ｍｌを５Ｌ容の三角フラスコに分注し、１２１℃で２５分間殺菌したものに前述の種菌を接種し、２４℃で７２時間、ロータリーシェーカーで振とう培養（２５０ｒｐｍ）した。これを３０Ｌ容発酵槽に植菌した。
培地としてはグルコース６．５％、燐酸一アンモニウム０．２６％、硫酸アンモニウム０．１５％、硫酸マグネシウム０．０９％、塩化カリウム０．２％、硫酸マンガン５ｐｐｍ、硫酸亜鉛５ｐｐｍ、硫酸銅１ｐｐｍ、硫酸第一鉄５ｐｐｍを用いバッチ培養を行った。培養条件は、槽内液量１８Ｌ、培養温度２４℃、通気量１８Ｌ／分、攪拌４００ｒｐｍ、ｐＨ４．０（アンモニア添加による自動コントロール）にて行った。
培養の終了は、グルコースが消失した時点から１６時間後とした。なお、グルコース消失時点以降の培養は、２４℃、ｐＨは成り行きとした。
培養時間を延長することによりＧＳＳＧの含量が増加した。
培養の終了は、グルコースが消失した時点から１６時間後とした。
培養終了後、得られた培養液１５．８Ｌを遠心分離で集菌し、１回水洗後約５．３Ｌの菌体懸濁液とした。
この懸濁液を９０℃２分間熱水抽出した。この時の固形分は７１．１ｇ／Ｌ、ＧＳＳＧ濃度は５．１ｇ／Ｌ、ＧＳＨ濃度は３．３ｇ／Ｌであった。
この熱水抽出物を遠心分離して上清を集め、１２ｇのデキストリンを加えて溶解後、ロータリーエバポレーターで約１．２Ｌに濃縮した。これをスプレードライヤー（ニロ社製）で噴霧乾燥し、１２６ｇの酵母エキス粉末を得た。
この酵母エキス（乾燥物）のＧＳＳＧ含量は１５．６１％、ＧＳＨ含量は１０．２９％であった（トータルグルタチオン含量：２５．９％）。
【００２１】
【発明の効果】
以上説明してきたように、本発明によれば、酸化処理等を必要とすることなく、安全で簡便な、水溶液中でも安定なＧＳＳＧを１０重量％以上含有した酵母エキス及びその製造方法が提供される。