(57)【要約】【課題】生体内に局所的に外来物質を導入する方法、及びその利用を提供する。【解決手段】細胞と相互作用を行う物質と外来物質との複合体を含んだ複合体含有液を、管状部材の先端から生体内の目的の領域に、注入または、吹きつけることにより、目的の領域の細胞内に上記外来物質を導入する。これは、効率、再現性、安全性、簡便性が高く、安価で行うことのできる、確実に外来物質を目的の領域に導入することのできる実用的な導入方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内に局所的に外来物質を導入するときに、
細胞表面と相互作用を起こす物質と上記外来物質との複合体を含んだ複合体含有液を、管状部材の先端から生体内の目的の領域に、注入する、または吹きつけることにより、上記目的の領域の細胞内に上記外来物質を導入することを特徴とする導入方法。
【請求項２】
上記生体内の目的の領域とは、生体内の細胞空間であるとともに、
上記複合体含有液を生体内の目的の領域に注入する場合には、上記管状部材を生体内の細胞空間に突き刺し、上記複合体含有液を充填した構造が、生体内の細胞空間に形成されるように、上記管状部材の先端から生体内の目的の領域に注入することを特徴とする請求項１に記載の導入方法。
【請求項３】
上記複合体含有液を生体内の目的の領域に吹きつける場合には、上記管状部材の先端を上記生体の表面にあてがい、上記複合体含有液を上記管状部材の先端から上記生体の表面に吐出させることを特徴とする請求項１に記載の導入方法。
【請求項４】
１７０μｍ３以上１４００μｍ３以下の微細領域に対して、上記外来物質を導入することを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の導入方法。
【請求項５】
上記管状部材の先端の内径が、上記複合体の大きさ以上であることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載の導入方法。
【請求項６】
上記管状部材の先端の内径が、５０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載の導入方法。
【請求項７】
上記外来物質が、核酸、タンパク質、化学物質の少なくとも何れかであることを特徴とする請求項１ないし６の何れか１項に記載の導入方法。
【請求項８】
上記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、染色体そのものの少なくとも何れかであることを特徴とする請求項７に記載の導入方法。
【請求項９】
上記外来物質には、生体内へ導入したい外来物質に加え、さらに、導入したい外来物質が導入されたことを確認するための指標となりうる指示物質が含まれることを特徴とする請求項１ないし８の何れか１項に記載の導入方法。
【請求項１０】
上記細胞表面と相互作用を起こす物質が、リポソームであることを特徴とする請求項１ないし９の何れか１項に記載の導入方法。
【請求項１１】
上記生体が、哺乳動物の胚または成体であることを特徴とする請求項１ないし１０の何れか１項に記載の導入方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１の何れか１項に記載の導入方法で外来物質を導入してなる形質転換体。
【請求項１３】
哺乳動物の胚または成体である請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項１ないし１１の何れか１項に記載の導入方法を行うための導入用キット。
【請求項１５】
請求項１ないし１１の何れか１項に記載の導入方法を用いた疾患の治療方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の治療方法に使用され、請求項１記載の複合体含有液を含んでなる治療薬。
【請求項１７】
請求項１５に記載の治療方法を行うための治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内における目的の領域の細胞に外来物質を導入する方法であって、外来物質を高効率で安全で簡便に導入する方法、その方法に関する一連の技術、およびその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
昨今のバイオテクノロジーの発展は目覚しく、このような状況下、細胞への核酸等の物質の導入は、細胞を操作するための有用な方法であって、分子生物学や臨床医学等において大きな可能性を有している。
【０００３】
例えば、生体において、細胞に遺伝子を導入するための遺伝子導入法には、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターを用いる生物学的方法、エレクトロポーレーション（電気穿孔）法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等がある。
【０００４】
遺伝子導入において、特に生体に対して実験的、更には臨床的に利用するとき、「導入効率」「安全性」「再現性」「簡便性」「実用性」などが重要なキーワードとしてあげられ、これらが高いことが望まれる。また「安価である」ことも重要である。ここでいう「安全性」とは導入により遺伝子以外の物理的及び化学的影響を細胞に与え無いという意味である。
【０００５】
しかし、ウイルスベクター等を用いる生物学的方法では、成熟リンパ球などの特定の細胞にしか遺伝子を導入することはできず、導入できる遺伝子の大きさにも限界がある。また、抗原性、宿主に対する毒性の心配があったり、ベクター作製に大変時間や労力がかかるといった問題もある。
【０００６】
また、エレクトロポーレーション法では、細胞に電気的なショックを与えて細胞に変形を起こして遺伝子を導入するため危険であり、遺伝子導入効率がよい時の条件は細胞の瀕死状態であるため、安全性が確保されない。さらに、他の遺伝子導入方法を用いても、高い導入効率、高い安全性、及び高い再現性を持って導入することは難しく、問題点は多い。
【０００７】
上記問題点を改善するために、人口ベクターとしてリポソームを用いたリポフェクション法が研究開発されている。リポフェクション法は、細胞膜に類似したリポソームと遺伝子とからなる複合体を細胞に取り込ませて、遺伝子を導入する方法である。そのため、上記の他の遺伝子導入法と比較し、遺伝子導入時の細胞へのダメージが少なく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養細胞への遺伝子導入に用いられてきた。
【０００８】
リポフェクション法の利点として、例えば、（１）リポソームを構成するリン脂質は、生体膜の主要構成成分であるため毒性が低い、（２）操作が比較的簡便で様々な細胞に適用することができる、（３）導入する核酸等の物質のサイズや、導入先である標的細胞、導入目的、導入方法等に対応して、リポソームの粒子サイズをコントロールしたり、リポソームを標的細胞と相互作用を起こしやすいように改良できる、（４）導入時に電圧印加する必要がなく安全である、といった点が挙げられる。
【０００９】
リポフェクション法は、上記のように、主としてｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養細胞への遺伝子導入に用いられてきた。また、このリポフェクション法用いた生体内への遺伝子導入方法については、下記の特許文献１〜７等において提案されている。
【００１０】
【特許文献１】
国際公開ＷＯ９７／１７８４４号公報（国際公開１９９７年５月２２日）
【００１１】
【特許文献２】
特表２００２−５０８３３７号（公表２００２年３月１９日）
【００１２】
【特許文献３】
特開２００２−２４１３１３号公報（公開２００２年８月２８日）
【００１３】
【特許文献４】
特表２００１−５２３４６８号（公表２００１年１１月２７日）
【００１４】
【特許文献５】
特表平９−５０５５９３号（公表１９９７年６月３日）
【００１５】
【特許文献６】
国際公開ＷＯ９７／１７８４３号公報（国際公開１９９７年５月２２日）
【００１６】
【特許文献７】
特表２００２−５２５２７０号（公表２００２年８月１３日）
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のようなリポフェクション法を用いた従来の遺伝子導入法では、未だに実用性に欠ける点が残されているという問題がある。例えば、リポフェクション法を用いた従来の生体内への遺伝子導入方法では、静脈、動脈、腹腔内、羊水、等に遺伝子と結合したリポソームを注入することで遺伝子導入を行っている。そのため、生体内において目的の領域に確実に遺伝子を導入することは困難であり、導入の効率が低い。
【００１８】
また、最近は遺伝子のみにとどまらず、薬剤としての低分子化合物やタンパク質などをリポソームと結合させた複合体を細胞内に導入する方法も提案されているが、このような遺伝子以外の物質を生体内の微細領域に局所的に導入する方法は開発されていない。
【００１９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、高い導入効率を持って、さらに安全に簡便で再現性よく、安価に、つまり高い実用性を持って、生体内の目的の領域に確実に外来物質を導入する方法を提供することにある。さらに本発明は、当該方法の様々な利用方法等についても提供する。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、従来の技術が抱える上記技術的困難さを克服するために、鋭意研究を重ねた結果、リポフェクション法を用いて、マウス胚の微細領域に局所的に高効率で遺伝子導入を実現する新たな方法を開発した。その結果、医学上または産業上有用な方法・物質として、下記Ａ）〜Ｑ）の発明を完成するに至った。
【００２１】
Ａ）  生体内に局所的に外来物質を導入するときに、細胞表面と相互作用を起こす物質と上記外来物質との複合体を含んだ複合体含有液を、管状部材の先端から生体内の目的の領域に、注入する、または吹きつけることにより、上記目的の領域の細胞内に上記外来物質を導入することを特徴とする導入方法。
【００２２】
Ｂ）  上記Ａ）の導入方法において、上記生体内の目的の領域とは、生体内の細胞空間であるとともに、上記複合体含有液を生体内の目的の領域に注入する場合には、上記管状部材を生体内の細胞空間に突き刺し、上記複合体含有液を充填した構造が、生体内の細胞空間に形成されるように、上記管状部材の先端から生体内の目的の領域に注入することを特徴とする導入方法。
【００２３】
Ｃ）  上記Ａ）の導入方法において、上記複合体含有液を生体内の目的の領域に吹きつける場合には、上記管状部材の先端を上記生体の表面にあてがい、上記複合体含有液を上記管状部材の先端から上記生体の表面に吐出させることを特徴とする導入方法。
【００２４】
Ｄ）  上記Ａ）〜Ｃ）の何れかの導入方法において、１７０μｍ３以上１４００μｍ３以下の微細領域に対して、上記外来物質を導入することを特徴とする導入方法。
【００２５】
Ｅ）  上記Ａ〜Ｄ）の何れかの導入方法において、上記管状部材の先端の内径が、上記複合体の大きさ以上であることを特徴とする導入方法。
【００２６】
Ｆ）  上記Ａ〜Ｄ）の何れかの導入方法において、上記管状部材の先端の内径が、５０ｎｍ以上であることを特徴とする導入方法。
【００２７】
Ｇ）  上記Ａ）〜Ｆ）の何れかの導入方法において、上記外来物質が、核酸、タンパク質、化学物質の少なくとも何れかであることを特徴とする導入方法。
【００２８】
Ｈ）  上記Ｇ）の導入方法において、上記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、染色体そのものの少なくとも何れかであることを特徴とする導入方法。
【００２９】
Ｉ）  上記Ａ）〜Ｈ）の何れかの導入方法において、上記外来物質には、生体内へ導入したい外来物質に加え、さらに、導入したい外来物質が導入されたことを確認するための指標となりうる指示物質が含まれることを特徴とする導入方法。
【００３０】
Ｊ）  上記Ａ）〜Ｉ）の何れかの導入方法において、上記細胞表面を相互作用を起こす物質が、リポソームであることを特徴とする導入方法。
【００３１】
Ｋ）  上記Ａ）〜Ｊ）の何れかの導入方法において、上記生体が、哺乳動物の胚または成体であることを特徴とする導入方法。
【００３２】
Ｌ）  上記Ａ）〜Ｋ）のいずれかの導入方法で外来物質を導入してなる形質転換体。
【００３３】
Ｍ）  哺乳動物の胚または成体である上記Ｌ）に記載の形質転換体。
【００３４】
Ｎ）  上記Ａ）〜Ｋ）の何れかの導入方法を行うための導入用キット。
【００３５】
Ｏ）  上記Ａ）〜Ｋ）の何れかの導入方法を用いた疾患の治療方法。
【００３６】
Ｐ）  上記Ｏ）の治療方法に使用され、上記Ａ）記載の複合体含有液を含んでなる治療薬。
【００３７】
Ｑ）  上記Ｏ）の治療方法を行うための治療用キット。
【００３８】
本発明において、「目的の領域」とは、「外来物質を導入する標的細胞が存在する領域」のことであり、これは、肺・心臓・腎臓などの特定の組織や器官であってもよいが、例えば、肺の中のガン化した細胞等のようにターゲットをしぼった細胞（群）であってもかまわない。よって、「目的の領域」を制限する範囲は、その状況下で見ることが可能な１つ以上の細胞（群）である。なお、上記状況下とは、肉眼で観察することのできる状況下でもかまわないが、顕微鏡下やＭＲＩの下等であってもかまわない。
【００３９】
また、本発明に係る導入方法を用いて「複合体含有液を充填した構造」を形成させるとは、複合体含有液が蓄積された「水たまり構造」を細胞空間に形成させることを意味する。
【００４０】
ここで、「水たまり構造」について説明する。生物は細胞の塊なので、３次元的に必ずどこかの面で細胞同士が接触している。細胞が４つ以上集まれれば、安定な構造を形成し、それらは必ず立方体のような形を全体で形成する。そのため、その立方体の重心には３次元的に細胞に取り囲まれた空間ができる。この空間に液を注入すると、周りが細胞に囲まれた、液が蓄積された空間ができる。あるいは、細胞に液を注入すると、限界以上に注入された細胞は破裂するが、破裂した細胞のあった場所は液が蓄積された空間となる。この液が蓄積された空間の構造を、「水たまり構造」と定義する。
【００４１】
複合体含有液を充填させた管状部材を生体内の細胞空間に突き刺し、「複合体含有液を充填した構造」、つまり「水たまり構造」を形成するように、上記管状部材の先端から、複合体含有液を注入すると、上記複合体を含んだ液と目的領域の細胞（標的細胞）とを接触させることができる。よって、目的の領域の細胞内に外来物質を、確実に導入することができる。なお、哺乳類を代表とする生物は、数え切れないほど多数の細胞の集団を用いて各臓器やガン細胞群などを形成している。よって、これらの細胞群中の空間、あるいは細胞に液を注入した場合、「水たまり構造」を形成することができる。
【００４２】
本発明を用いれば、高い導入効率を持って、さらに安全に簡便で再現性よく安価に、生体内の目的領域の細胞に、核酸、タンパク質、化学物質等の外来物資を確実に導入することができる。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について、以下で説明する。なお、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００４４】
（１）複合体含有液の作製
初めに、細胞表面と相互作用する物質と外来物質との複合体を含む複合体含有液を作製する。
【００４５】
本発明に係る導入方法を用いて生体に導入する外来物質の一例として、核酸、そのなかでも、遺伝子が挙げられる。しかし生体に導入する外来物質は、これに限定されず、遺伝子の他にも、抗体や酵素等のタンパク質、染色体そのものや、化学的薬剤等、細胞に導入できるものであればかまわない。
【００４６】
生体に導入する遺伝子は、構造遺伝子や相同組換えに必要な塩基配列を付加した遺伝子、それらを含有するベクターのようなものであってもよいし、プローブやアンチセンスのようなものでもよい。各種疾患治療用遺伝子など、あらゆる種類の遺伝子であってかまわない。また、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡは１本鎖であっても２本鎖であってもかまわない。なお、遺伝子に、指標物質（選択マーカー）が組み込まれていると、遺伝子が生体内の目的の領域の細胞に導入されたことを確認するのに便利である。また、実験等においては、指標物質そのものを外来物質として、本発明に係る導入方法を用いて導入を行ってもよい。
【００４７】
本発明に係る導入方法を用いる際に使用される細胞表面と相互作用を起こす物質の一例として、リポソーム（脂質小胞）が挙げられる。外来物質を導入するための、リポソームとして使用するものは、例えば、小胞内に外来物質を封入するリポフェクトアミンや、表面に外来物質を結合させて複合体を形成する陽イオンリポソーム、外来物質を内部に保持させ、表面には標的細胞の抗原に結合する特定の抗体を結合させるイムノリポソーム等が挙げられる。なお、これらに限定されることはない。
【００４８】
さらに、特定の温度やｐＨで保持した外来物質を放出する、温度感受性リポソームやｐＨ感受性リポソーム、体内で異物認識されにくいようにシアル酸やポリエチレングリコールで表面修飾した血中滞留型リポソーム等のように様々な特性を持っていてもよいし、導入する遺伝子のサイズや、導入先である細胞、導入目的、導入方法等に応じてリポソームを改良してもよい。
【００４９】
なお、細胞表面と相互作用を起こす物質としては、リポソームに限られず、これ以外にも、細胞と融合することのできる外来物質運搬体を用いて、外来物質を導入してもかまわない。
【００５０】
上記のように、細胞表面と相互作用を起こす物質としてリポソームを用いた場合には、複合体含有液はリポソーム液に相当する。もちろん、複合体含有液はこれに限定されない。複合体含有液は、血清を含有していなければ、細胞への外来物質の導入効率を上げることができるため好ましい。
【００５１】
リポソームと遺伝子との複合体を含む複合体含有液であるリポソーム液は、公知の方法を用いて調製すればよい。例えば、リポソームを懸濁用溶媒に入れて懸濁し、遺伝子を懸濁用溶媒に入れて懸濁し、これら２つの溶液を混合して放置することで、リポソームに遺伝子を取り込ませ、リポソームと遺伝子との複合体を形成させ、リポソーム液を調製する。この懸濁用の溶媒として、例えば、Ｈ２Ｏや、５％グルコース等があげられるが、これに限定されない。また、リポソーム液の調製方法も、上記方法には限定されない。また、リポソームと遺伝子（ＤＮＡ）の複合体を形成させる際に、リポソームと遺伝子（ＤＮＡ）との重量比は１：０．８であることが好ましいが、これらに限定はされない。また、リポソーム液中の複合体の割合は１．８μｇ／５０μｌであることが好ましいが、これに限定はされない。
【００５２】
なお、リポフェクション法に用いられる試薬等は、様々なキットとして入手可能であり、比較的簡単に、再現性良く様々な細胞に適用できることがうたわれているので、これらキットを用いてもかまわない。
【００５３】
（２）遺伝子導入
本発明に係る導入方法を用いて核酸等の物質を導入する個体の組織に関して、規制はない。よって、核酸等の物質を導入する「目的の領域」とは、肺・心臓・腎臓などの特定の組織や器官であってもよいが、例えば、肺の中の癌化した細胞等のターゲットをしぼった細胞でもかまわない。なお、「目的の領域」を制限する範囲は、その状況下で見ることが可能な１つの細胞以上の細胞（群）である。ここで、上記状況下とは、肉眼で観察することのできる状況下でもかまわないが、顕微鏡下やＭＲＩの下等であってもかまわない。よって、本発明に係る導入方法を用いると、「目的の領域」として、１７０μｍ３以上の領域、特に好ましくは、１７０μｍ３以上１４００μｍ３以下の領域に対して外来物質を導入することができる。
【００５４】
本発明に係る導入方法を用いて遺伝子導入を行う目的の領域の細胞は、全ての動植物の細胞膜を持つあらゆる細胞が対象とすることができる。また、上記目的の領域の細胞は単一のものでも、種々の細胞が混在したものであってもかまわない。例えば、実験として用いるには、分化全能性を持つ受精卵や胚内の細胞が好ましい。なお、胚の時期についても特に限定されないが、全ての脊椎動物で特徴がほぼ同じである初期胚が好ましい。
【００５５】
また、本発明に係る導入方法を用いて核酸等の物質の導入を行う対象となる動物は、特に限定されるものではないが、例えば、実験動物として用いるには小動物が好ましく、特に、モルモット、マウス、ラット等が好ましい。
【００５６】
よって、以下で、本発明に係る導入方法を用いて遺伝子を導入する生体として、哺乳動物の初期胚を用いて説明するが、これに限定されることはない。
【００５７】
哺乳動物の初期胚に遺伝子導入を行うために、上記リポソームと遺伝子との複合体を含んだ複合体含有液を、管状部材に封入し、哺乳動物の初期胚の目的の領域に管状部材の先端をあてがい、上記複合体を含んだ液を目的の領域に上記複合体含有液を注入する。または、哺乳動物の初期胚にあてがって、上記複合体を初期胚の周りに上記複合体含有液を吹きつける。なお、上記哺乳動物の初期胚は、培養液中にあることが好ましい。培養液の一例として、５０％ラット血清５０％ＤＭＥＭ液が挙げられるがこれに限らない。また、初期胚への「注入」または「吹きつけ」は顕微鏡下で行うのが好ましいが、これには限定されない。
【００５８】
管状部材の一例として、先端の外径が１０μｍのガラス製毛細管（毛細管ガラス）が挙げられる。しかし、これに限定されず、注射針等でもかまわない。また、管状部材は、ガラス素材だけでなく、シリコン素材等から形成されていてもかまわない。管状部材の内径は、上記複合体が通り抜けることのできる大きさ以上であればかまわない。つまり、上記複合体の直径と同じ大きさ以上であれば、かまわない。上記複合体が、リポソームと外来物質のとの複合体であると、この複合体の大きさは、数１０ｎｍ以上であることから、管状部材の内径は、数１０ｎｍ以上、特には、５０ｎｍ以上であることが好ましいが、これに限定されない。また、管状部材の外径は、少なくとも導入の対象とする範囲程度に小さくなくてはならない。例えば、哺乳動物の初期胚に用いる場合には、管状部材の先端の外径は、１２μｍ以下、特に１０μｍ以上１２μｍ以下のものが好ましいが、これに限定されない。生体内の広い範囲に注入する場合には、上記に示す数値よりも大きな口径の管状部材を用いてもよいが、細胞の破壊損傷などを考慮した口径の管状部材であることが好ましい。
【００５９】
また、管状部材を用いて複合体液を目的の領域に注入する、または、吹きつける際、管状部材をマニピュレーター、注射器本体等の公知の器具に取り付けて吐出させて、「注入」や「吹きつけ」を行うのが好ましい。しかし、管状部材からの、複合体含有液の吐出方法はこれらには限定されない。また、「注入」や「吹きつけ」は、哺乳動物の初期胚を固定して行うのが好ましい。固定には、ガラス管等を用いればよいが、これには限定されない。
【００６０】
上記複合体含有液を注入する際には、上記管状部材を生体内の細胞空間に突き刺し、管状部材の先端から生体内の目的の領域に上記複合体含有液を注入して、細胞空間に上記複合体含有液を充填した構造が形成されるようにすると好ましい。この「複合体含有液を充填した構造」を形成させる際の条件は、例えば、１つの「複合体含有液を充填した構造」に含まれる複合体含有液を基準にすることができる。１つの哺乳動物の初期胚に対して、上記複合体含有液を０．１ｐｌ〜１ｐｌ注入し、１７０μｍ３〜１４００μｍ３の範囲に「複合体含有液を充填した構造」を形成させるのが好ましい。しかし、「複合体含有液を充填した構造」を形成させる際の条件は、これには限定されない。
【００６１】
ここで、「複合体含有液を充填した構造」を形成させるとは、上述した「水たまり構造」を細胞空間に形成させるものである。この「水たまり構造」を形成させることで、後述する実施例からもわかるように、以下の推測が裏付けられた。
【００６２】
これまでに、リポフェクション法において、遺伝子導入の過程の前および同過程進行中に形成される構造については、解明されていない。
【００６３】
遺伝子導入に関しては、遺伝子を結合したリポソーム（周りが脂質構造）が同じ構造を持つ細胞膜にしばらくの時間（正確な時間は不明）接触することにより、このリポソームと細胞膜が融合し、その結果リポソームに結合した遺伝子が細胞膜の中に取り込まれ、取り込まれた細胞中で上記遺伝子が働きだして遺伝子導入が完了すると推測される。ここで、重要なポイントはリポソームと細胞膜が「しばらく接触している」ことであると考えられる。培養細胞の場合、接触、浮遊性の細胞を問わずしばらくディッシュの中に培養液と共に入れておくとディッシュの底に溜まる。同様にリポソームもしばらく培養液の中に入れておくと底に溜まってきて、底になるほど濃度が高くなる。
【００６４】
よって、これらから推測されることはｉｎ  ｖｉｔｒｏでリポフェクションするときに、培養細胞ではディッシュの底で培養細胞とリポソームは互いに「しばらく接触している」と考えられる。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、細胞は、色々な方向を向いており、周りに存在する液も動いている。このような状況下ではリポソームを細胞塊の周りに入れるだけではリポソームと細胞膜とは「しばらく接触している」状況ができるとは考えにくい。よってこれまでｉｎ  ｖｉｖｏにおいて行うリポフェクション法は、遺伝子導入効率が低いと推測される。
【００６５】
これに対して、本発明では、哺乳動物の初期胚へリポソーム液を注入する際に、細胞空間に「水たまり構造」を形成させると、この水たまりはしばらく動きのない液胞としてその場に留まる。よって、この「水たまり構造」に接する細胞はリポソームと「しばらく接触している」ことが可能となる。従って、「水たまり構造」を形成することで、遺伝子導入効率が上がったと推測することがでる。
【００６６】
つまり、本発明に係る導入方法を用いると、細胞とリポソームとを「しばらく接触」させることができるため、従来行われていた方法よりも、確実に目的の領域に遺伝子を導入することができる。
【００６７】
なお、哺乳類を代表とする生物は、数え切れないほど多数の細胞の集団を用いて各臓器やガン細胞群などを形成している。よって、これらの細胞群中の空間、あるいは細胞に液を注入した場合、「水たまり構造」を形成することは可能である。そのため、本発明を、実験時のみならず、臨床時や治療時に用いることも可能である。
【００６８】
なお、臨床時や治療時等に、本発明に係る導入方法を用いた場合において、「水たまり構造」ができているか否かの確認は、次のように行うことができる。すなわち、治療など再現性の必要なものは、複合体含有液の注入に関する処置時に、例えば、ＣＴスキャン等の既存の装置を用いることにより、実際にその処置部位で「水たまり構造」が形成されているか否かを確認することができる。この「水たまり構造」の確認をするための方法は、上記に限定されることはない。
【００６９】
また、上記複合体含有液を吹きつける際には、上記管状部材の先端を生体の表面にあてがい、上記複合体含有液を上記管状部材の先端から生体の表面に吐出させると好ましい。上記「吹きつけ」の条件は、例えば、吹きつける時間と吹きつける複合体含有液と吹きつける範囲とを基準にすることができる。この場合、１つの哺乳動物の初期胚に対して上記複合体含有液を毎秒０．１ｐｌ〜１ｐｌで、３０〜１２０秒間、８μｍ２〜１２μｍ２の範囲に吹きつけるのが好ましい。しかし、「吹きつけ」の条件は、これには限定されることはない。
【００７０】
リポソームと遺伝子との複合体含有液の注入が行われた哺乳動物の初期胚、あるいは、上記複合体を吹きつけられた哺乳動物の初期胚を、公知の方法に従い培養すると、初期胚の目的の領域に遺伝子導入が行われる。培養の公知の方法として、初期胚を培養液に入れ、５％二酸化炭素、３７℃で２４時間インキュベートする方法があるが、培養方法は、これに限定はされることはない。
【００７１】
（３）本発明に係る導入方法の利用（有用性）
本発明に係る導入方法は、外来物質を目的の領域に確実に導入できるものであるため、本発明に係る導入方法を用いれば、どのような動植物に対しても、どのような発生段階においても、生体内のどのような部位でも、目的の領域に局所的に外来物質の導入を行うことが可能である。また、本発明に係る導入方法を用いれば、様々な実験、研究、開発において、高効率で、再現性があり、安全性に、安価で、外来物質を導入することが可能である。よって、本発明は、種々の研究上においても、産業上においても利用性（有用性）を発揮することができる。例えば、以下で説明するように、遺伝子導入技術及びその関連技術に利用することができる。
【００７２】
近年、医学、薬学、遺伝子工学、分子生物学等のさまざまな分野において、遺伝子組換え、遺伝子治療、薬物評価や新薬開発等のために動植物の細胞内に遺伝子を導入することが盛んに行われている。
【００７３】
従来の遺伝子導入に関する技術は、導入した遺伝子が生体で目的の領域で発現する確率は、非常に低く、偶然を待つ様なものもあり、そのために実現不可能な実験がほとんどであるということであり、特に、発生段階で異常を来す遺伝子に関しては、生体内での働きを解明することは困難であったが、本発明に係る導入方法を用いることで、これらの問題点を改善することができる。
【００７４】
本発明に係る導入方法を利用することで、例えば、
▲１▼生体内での遺伝子の発生、分化、成長、老化などの時間的変化に伴う遺伝情報の発現の解析、
▲２▼細胞あるいは組織特異的な遺伝情報の発現に関与する遺伝子構造の解析、
▲３▼遺伝子産物の個体レベルでの生理的・病理的役割の解析、
▲４▼疾患モデル動物の作成、
▲５▼外来遺伝子導入に伴って生じた挿入突然変異などを利用した未知の遺伝子の解析、
▲６▼未知の遺伝子の直接的な機能の評価、
といった様々な遺伝子発現の調節機構の解明を、安全に、確実に行うことができる。
【００７５】
また、遺伝子導入の技術を応用発展させ、特定の遺伝子を不活化したノックアウト動物やトランスジェニック動物等を作成することにより、遺伝子の発生段階における役割または生体内での機能を同定することにも、本発明にかかる導入方法を利用することで、安全、確実に行うことができる。
【００７６】
よって、以上のように本発明に係る導入方法は、生命工学の発展に大いに貢献することができる。
【００７７】
また、本発明に係る導入方法を農作物や家畜等へ遺伝子導入の技術を応用することによって、有用な生理活性物質の生産や品種の改良などに利用することも可能である。
【００７８】
また、本発明に係る導入方法は、遺伝子治療、癌治療などの異常細胞への治療的処理等の医学的応用にも有用性を発揮する。
【００７９】
遺伝子治療の標的疾患として、癌、単一遺伝子疾患、感染症、血管系疾患、免疫・炎症系疾患、その他の疾患等ある。これら遺伝子治療は、対象疾患の責任遺伝子が明らかにされていることが前提であり、基本的に、責任遺伝子が劣性なら、異常細胞の欠損遺伝子のかわりに正常な遺伝子を導入して補充させ機能的に正常化させたり、あるいは逆に、責任遺伝子が優性なら、アポトーシス誘導遺伝子を導入して細胞死を導かせたり、異常な遺伝子の発現を妨害する遺伝子を導入する。
【００８０】
本発明に係る導入方法を用いると、臨床時や治療時等において、上記遺伝子治療をｅｘ  ｖｉｖｏでなくても、ｉｎ  ｖｉｖｏで直接的に行うことができる。また、本発明に係る方法を用いると、目的の領域に遺伝子導入を行うことができるので、エコーやＣＴスキャン等を用いた画像診断等を用いることで、異常細胞に焦点をあわせて遺伝子治療を行うことができる。また、安全に、高効率で、さらには、導入する物質のサイズにとらわれずに、遺伝子治療を行うことができる。
【００８１】
また、本発明に係る導入方法は、どのような細胞にも様々な外来物質を導入することが可能であるので、通常、上記のような責任遺伝子がクローニングされていれば、その遺伝子をベクターに組み込み標的細胞内に導入することができる。このような責任遺伝子のクローニングにも、標的細胞内にベクターを導入するのにも、本発明は有用である。
【００８２】
さらに、本発明に係る導入方法を用いると、様々な細胞に様々な外来物質を導入することが可能であるため、標的細胞および、外来物質のレパートリーが広がる。よって、目的の領域が正常細胞でも、本発明を用いることができ、正常細胞を思い通りの性質に安全に確実に変化させることができる。例えば、美容整形の分野に応用することがでできる。一例を挙げると、豊胸手術において、脂肪の含みやすい性質に細胞を変化させる外来物質を胸の細胞に導入することで、胸の細胞の性質を脂肪の含みやすい性質に変化させるといったようなことも可能となる。
【００８３】
【実施例】
本発明の実施例について、実験１ないし実験４に基づいて以下に説明する。
【００８４】
〔実験１〕リポソーム液の作製
リポソームに遺伝子を導入し複合体を形成し、複合体含有液を調製した。ここでは、遺伝子として、乳糖をブドウ糖とガラクトースに分解する酵素であるβ−ガラクトシターゼ、及び／または、外来遺伝子組み込みの際の選択マーカーとして使用される緑色の蛍光タンパク質であるＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳを用いた。１μｌのリポソームｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを加え攪拌し５分間室温で放置した。これに、２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに０．８μｇの発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳを溶解したものを加え、攪拌し、５分間室温で放置して取り込ませた。この遺伝子が導入されたリポソームからなる複合体を含むリポソーム液が、複合体含有液である。
【００８５】
〔実験２〕マウス胚へのリポソーム液の注入
遺伝子導入を行うために、発生初期（５日から６日胚）のマウス胚に実験１で作製したリポソーム液を注入した。
【００８６】
ここでは、リポソーム液を外径１０μｍ、内径の９μｍの毛細管ガラス（ナリシゲ社）に充填し、マニピュレーター（Ｌｅｉｃａ社）に取り付けた。そして、顕微鏡下において、リポソーム液を、５０％ラット血清（ラット購入はＳＬＣ社）、５０％ＤＭＥＭ液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）の培養液中にあるマウス胚の内胚葉層の細胞空間に静かに注入した。
【００８７】
ここで、図１を用いて注入の方法の一例を説明する。
【００８８】
図１（ａ）は、リポソーム液注入前の発生初期のマウス胚（５日胚）である。初めに、図１（ｂ）に示すように、右側のガラス管により５日胚を固定し、左側のリポソーム液を充填した毛細管ガラスを、５日胚の細胞層の間にあてがう。そして、５日胚の細胞空間に「水たまり構造」を形成させるように毛細管ガラスからリポソーム液を静かに注入し充填させる。５日胚に「水たまり構造」形成させたら、図１（ｃ）に示すように、５日胚から静かに毛細管ガラスを外す。なお、本図において矢頭が示す部分に「水たまり構造」が、形成されている。図１（ｄ）は、図１（ｃ）から数分後であるが、矢頭が示す「水たまり構造」がしばらくの間維持され、リポソーム液と細胞とがしばらくの間接触していることが示されている。
【００８９】
なお、本実施例では、１つのマウス胚に対して、リポソーム液を約０．１ｐｌ注入することで、約１７０μｍ３の範囲に「水たまり構造」を形成させた。
【００９０】
このリポソーム液を注入し充填させ「水たまり構造」を形成する処理を行ったマウスの５日胚を、培養液に入れたまま、５％二酸化炭素、３７℃で２４時間インキュベートして培養した。
【００９１】
〔実験３〕遺伝子導入効率
実験２で培養したマウス胚に、遺伝子が導入されたか否かの確認を行った。選択マーカーとして導入したβ−ガラクトシターゼの発現とＧＦＰの発現との確認を行った。
【００９２】
β−ガラクトシターゼに対しては、Ｘ−ｇａｌ（ｓｉｇｍａ社）を用いて、公知の方法に従い染色し、顕微鏡下でマウス胚を観察した。遺伝子導入された細胞は青色染色されることにより、β−ガラクトシターゼを発現する遺伝子が導入されたマウス胚が目視で確認された。この遺伝子導入できたマウス胚を図２（ａ）に示す。本図のマウス胚において、遺伝子が導入された部位は矢頭で示され、線で囲まれている範囲に遺伝子が導入されている。
【００９３】
ＧＦＰに対しては、蛍光顕微鏡下でＵＶを照射し、観察を行った。遺伝子が導入された細胞は緑色であることから、ＧＦＰを発現する遺伝子が導入されたことが確認された。この遺伝子導入できたマウス胚を図２（ｂ）に示す。本図のマウス胚においても、遺伝子が導入された部位は矢頭で示され、線で囲まれている範囲に遺伝子が導入されている。
【００９４】
そして、遺伝子導入が行われた細胞を含むマウス胚の数を計数することによって、マウス胚への遺伝子導入効率を調べた。ここで、遺伝子導入効率とは、上記実験２の処理を行ったマウス胚全個数に対する、実験３で遺伝子導入が確認されたマウス胚の個数を％表示したものである。
【００９５】
上記の実験１〜実験３を繰り返し行い、それぞれ遺伝子導入効率を調べたところ、以下に示す表１のように、実験全体では、６０〜９０％の遺伝子導入効率であった。
【００９６】
【表１】
2004321115.tif 000003
【００９７】
さらに、顕微鏡下で観察した結果、マウスの胚の内胚葉に対し約１７０μｍ３範囲の細胞（２〜４細胞程度）に遺伝子を導入できたことが判明した。
【００９８】
また、５日胚に対して、内胚葉層の間にリポソーム液注入する代わりに、マウス胚の表面（内胚葉の表面）に毛細管ガラスに注入したリポソーム液を吹きつけ、それ以外は上記と同様に実験１〜実験３を行った場合には、以下の表２のような遺伝子導入効率となった。この実験では、リポソーム液を１つの５日胚に対して０．１ｐｌ／秒で、８μｍ２の範囲に吹きつけた。なお、吹きつけ時間（秒）に対する導入効率の変化も確認した。
【００９９】
【表２】
2004321115.tif 000004
【０１００】
以上の実験結果より、毛細管ガラスからリポソーム液を、マウスの初期胚の表面に吹きつけるよりも、細胞層の間に「水たまり構造」を形成するように吐出した方が、高効率で遺伝子を導入することができることが判明した。
【０１０１】
〔実験４〕８日胚への遺伝子導入効率
マウスの８日胚に対しても上記と同様に、「水たまり構造」を形成する様に、毛細管ガラスを用いてリポソーム液を細胞層間に注入し、遺伝子導入の実験を行った。８日胚に関しては、内胚葉と外胚葉の間に存在する中胚葉の細胞層の間に、上記と同様にリポソーム液を注入し「水たまり構造」を形成させ、遺伝子導入を行う実験を繰り返した。なお、１つの８日胚に対して、リポソーム液を約２０ｐｌ注入することで、約１万μｍ３の範囲に「水たまり構造」を形成させた。この「水たまり構造」を形成させたマウス胚が図３である。図３（ａ）は、リポソーム液注入前のマウスの８日胚である。図３（ｂ）は、矢頭が示す部分にリポソーム液を注入し、「水たまり構造」を形成させた直後である。図３（ｃ）は、リポソーム液を注入してから数分後のマウス胚であるが、矢頭が示す「水たまり構造」がしばらくの間維持され、リポソーム液と細胞とがしばらくの間接触していることが示されている。
【０１０２】
この８日胚に対する実験により、遺伝子導入範囲を大きくすることで、マウスの８日胚の中胚葉において、約１万μｍ３の範囲に、約９５〜１００％といった高い効率で遺伝子導入を行うことができた。この遺伝子導入できたマウス胚を図４（ａ）に示す。本図のマウス胚において、遺伝子が導入された部位は矢頭で示され、線で囲まれている範囲に遺伝子が導入されている。
【０１０３】
さらに、８日胚の中胚葉全域に遺伝子を導入することを目的に、同一の実験時に、約１万μｍ３範囲に「水たまり構造」を形成させる操作を、１つの胚に対して連続して何度も行い遺伝子導入を行った。これにより、中胚葉全域に相当する約２０万μｍ３範囲に、遺伝子を導入することができた。この遺伝子導入できたマウス胚を図４（ｂ）に示す。本図のマウス胚において、遺伝子が導入された部位は矢頭で示され、線で囲まれている範囲に遺伝子が導入されている。
【０１０４】
以上の実験結果では、導入効率が約１００％である「水たまり構造」は、最小で約１千μｍ２の範囲、高さが約１０μｍであった。理論的には、これよりもより微小の体積であっても、「水たまり構造」を形成することは可能であると考えられる。また、上記範囲よりも大きな「水たまり構造」は、注入するリポソーム液の量と注入したい細胞群の大きさとにより、無限大まで大きくすることが可能である。
【０１０５】
以上に記述したように、本発明の導入方法を用い、マウス胚の目的の領域にリポソーム液が充填した「水たまり構造」を形成するように、リポソーム液を注入し、リポソーム液とマウス胚の細胞とを接触させることで、マウス胚の目的の領域の細胞内に遺伝子をほぼ確実に導入することができた。このことは、マウスの成体、さらに将来的には、臨床的にヒトの生体に、外来物質を導入する場合に、本発明の導入方法は、利用可能であるということを示しており、十分であると考えられる。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明に係る導入方法は、以上のように、生体に局所的に外来物質の導入を行うとき、複合体含有液を、管状部材の先端から生体内の目的の領域に、注入する、または吹きつけることで、目的の領域の細胞内に外来物質を導入しているため、外来物質を確実に標的細胞に導入することができる。さらに、効率、再現性、安全性、利便性が高く安価で行うことのできる実用的な方法であるため、前述したような種々の有用性を有する。従って、本発明は、医学、生化学等の研究分野、遺伝子治療、再生医療等の医療分野において、有効に利用することができるため、非常に優れている。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）〜（ｃ）は、マウスの５日胚に、本発明に係る遺伝子導入法を用いて、リポソーム液を注入し、「水たまり構造」を形成させている模式図である。（ｄ）は、リポソーム液を注入してから、数分後のマウス胚である。
【図２】本発明に係る遺伝子導入法を用いて遺伝子を導入したマウスの５日胚の模式図であり、（ａ）はβ−ガラクトシターゼ、（ｂ）はＧＦＰが発現されたことを示す。
【図３】マウスの８日胚を示す模式図であり、（ａ）は、リポソーム液注入前、（ｂ）は、本発明に係る遺伝子導入法を用いてリポソーム液を注入し「水たまり構造」を形成した直後、（ｄ）は、リポソーム液を注入してから数分後である。
【図４】本発明に係る遺伝子導入法を用いて、（ａ）は一部、（ｂ）は広範囲にリポソーム液を注入し、ＧＦＰが発現されたことを示すマウスの８日胚の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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