(57)【要約】【課題】ＧｎＴ−Ｖ以外の酵素で、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  からＧｌｃＮＡｃをコア構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６腕のαマンノースの６位に付加し、β１−６鎖を生合成する活性を持つ酵素及びそれをコードする核酸を提供すること。【解決手段】ＧｎＴ−Ｖとはアミノ酸配列が異なる新規な酵素であって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  からＧｌｃＮＡｃをコア構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６腕のαマンノースの６位に付加し、β１−６鎖を生合成する活性を持つ酵素及びそれをコードする核酸を提供した。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンをドナー基質として、アスパラギン結合型糖鎖の分岐鎖構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６腕のαマンノースにＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，６結合で転移する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
配列番号２に示される塩基配列を有する核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項６記載の核酸。
【請求項８】
請求項６又は請求項７のいずれかに記載の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター。
【請求項９】
請求項６又は７のいずれかに記載の核酸が導入され、該核酸を発現する細胞。
【請求項１０】
請求項６又は７のいずれかに記載の核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定用核酸。
【請求項１１】
請求項６又は７記載の核酸中の部分領域と相補的な配列を有する請求項１０記載の測定用核酸。
【請求項１２】
プローブ又はプライマーである請求項１１記載の測定用核酸。
【請求項１３】
塩基数が１５塩基以上である請求項１２記載の測定用核酸。
【請求項１４】
採取された組織又は細胞について、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンをドナー基質として、アスパラギン酸結合型糖鎖の分岐鎖構造の１−６位のαマンノースにＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，６結合で転移する活性を測定することにより癌の存在を予測する方法。
【請求項１５】
前記癌が神経系細胞の癌又は肺癌である請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンをドナー基質として、アスパラギン結合型糖鎖の分岐鎖構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６腕のαマンノースにＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，６結合で転移する活性を有する新規な酵素及びそれをコードする核酸、並びに酵素活性を測定するための核酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖タンパク質の糖鎖は、アスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ−結合型糖鎖とセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）に結合するＯ−結合型糖鎖に大別され、それぞれ特徴のある糖鎖構造を示す（辻宗一、１９９６年、細胞工学  １５．  ７２６−７３４）。これらの糖鎖の単位となる単糖は、それぞれに特有な糖転移酵素によって付加され、このうちのＮ−結合型糖鎖を合成するＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴ）は細胞増殖に伴って活性が変化することが知られており、注目されている。
【０００３】
Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は６種類あることが知られており、特にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  からＧｌｃＮＡｃをコア構造のＭａｎα１−６鎖の６位に付加し、β１−６鎖を生合成するＶ型（ＧｎＴ−Ｖ）（図１）では癌化との関連を示唆する報告が多い。例えば胎児ハムスターの腎臓細胞を腫瘍ウイルスで形質転換させるとＧｎ−Ｖの活性が増加して細胞表面のグリコシル化を変化させることや（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｍ．  ら、１９８６年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１、１０７７２−１０７７７、Ａｒａｎｇｏ，  Ｊ．  ら、１９８８年、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３７、２２５−２３１）、マウスのメラノーマ細胞にＴＧＦβ  （ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂ）  を導入するとＧｎＴ−Ｖの発現が増えて活性が増加することが示されている（Ｍｉｙｏｓｈｉ，  Ｅ．  ら、１９９５年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０、６２１６−６２２０）。更にはＧｎＴ−Ｖと基質受容体との間に競合状況を作り出すＧｎＴ−ＩＩＩとの間で癌転移の容易さを相殺していることも報告されている（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １４５５、２８７−３００）。
【０００４】
ＧｎＴ−Ｖが発現されない細胞ではＮ−グリカンのポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンが極端に減ることが観察されている（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９８４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９、６２５３−６２６０、Ｙｏｕｓｅｆｉ，  Ｓ．ら、１９９１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６、１７７２−１７８３）。これは、ＧｎＴ−Ｖの活性減少が、交感神経細胞のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン量を減少させ、交感神経細胞の移動に影響することを示唆している（Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｒ．ら、１９８６年、  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５，  ３４６３−３４６８、Ｆｕｋｕｚｕｍｉ，  Ｍ．ら、２００１年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１，  ４８１−４９４）。さらにポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンは初期嗅覚神経突起の伸長を促すことが示されている（Ｐｕｃｈｅ，  Ａ．  Ｃ．ら、１９９６年、Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ３６４，  ２６７−２７８）。これらのことから、ＧｎＴ−Ｖは、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖とそのレセプターを介して、脳における神経の分化に重要な役割を果たしていることが示唆されている。
【０００５】
ところが、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子（Ｍｇａｔ５）欠損マウスではＧｎＴ−Ｖ活性とＬ−ＰＨＡ反応性が低下しているにもかかわらず、神経作用においては正常であった（Ｇｒａｎｏｖｓｋｙ，  Ｍ．ら、２０００年、  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６，  ３０６３１２）。このことはＧｎＴ−Ｖと同様の活性を持つ他の酵素の存在やその他の機構によって、ＧｎＴ−Ｖの活性が補われていることを示唆するものであったが、一方、ＧｎＴ−Ｖと相同的な遺伝子はこれまで見出されておらず、ＧｎＴ−Ｖは進化的に独立した起源を持つことが推定されていた（Ｓｈｏｒｅｉｂａｈ，  Ｍ．ら、１９９３年、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８，  １５３８１−１５３８５、Ｓａｉｔｏ，  Ｈ．ら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９８，  ３１８−３２７）。
【０００６】
【非特許文献１】辻宗一、１９９６年、細胞工学  １５．  ７２６−７３４
【非特許文献２】Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｍ．  ら、１９８６年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１、１０７７２−１０７７７
【非特許文献３】Ａｒａｎｇｏ，  Ｊ．  ら、１９８８年、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３７、２２５−２３１
【非特許文献４】Ｍｉｙｏｓｈｉ，  Ｅ．  ら、１９９５年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０、６２１６−６２２０
【非特許文献５】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １４５５、２８７−３００
【非特許文献６】Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９８４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９、６２５３−６２６０
【非特許文献７】Ｙｏｕｓｅｆｉ，  Ｓ．ら、１９９１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６、１７７２−１７８３
【非特許文献８】Ｍａｒｇｏｌｉｓ，  Ｒ．ら、１９８６年、  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５，  ３４６３−３４６８
【非特許文献９】Ｐｕｃｈｅ，  Ａ．  Ｃ．ら、１９９６年、Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ３６４，  ２６７−２７８
【非特許文献１０】Ｇｒａｎｏｖｓｋｙ，  Ｍ．ら、２０００年、  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６，  ３０６３１２
【非特許文献１１】Ｓｈｏｒｅｉｂａｈ，  Ｍ．ら、１９９３年、  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８，  １５３８１−１５３８５
【非特許文献１２】Ｓａｉｔｏ，  Ｈ．ら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９８，  ３１８−３２７
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、ＧｎＴ−Ｖは細胞の癌化や増殖と密接な関係にあり、さらに神経の分化にも関与していることが示されている。しかしこれまでの報告ではＧｎＴ−Ｖと同様の活性を持つ遺伝子は見出されておらず、一部の報告と矛盾する結果となっている。
【０００８】
また、蛋白質Ａｓｎ残基への糖鎖修飾は最も頻繁に行われている動物蛋白質の翻訳後修飾の形式で、細胞および組織が本来の生体機能を維持するためには必須のものである。しかしながら、そのような糖鎖修飾・糖鎖合成を生体外で行うことは容易ではないため、特に近年発達してきた再生医療の分野では糖鎖修飾が課題の一つとなっている。
【０００９】
即ち、本発明の目的は、ＧｎＴ−Ｖ以外の酵素で、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  からＧｌｃＮＡｃをコア構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６腕のαマンノースの６位に付加し、β１−６鎖を生合成する活性を持つ酵素及びそれをコードする核酸を提供することである。また、本発明の目的は、該核酸を宿主細胞内で発現する組換えベクター及び該核酸が導入され、前記核酸および酵素タンパク質を発現する細胞を提供することである。当該発現タンパク質は、抗体作製用に利用でき、該酵素タンパク質の精製方法や検出方法及び免疫組織染色法を提供するものである。さらに、本発明の目的は、上記本発明の酵素をコードする核酸を測定するための核酸を提供することである。
【００１０】
最近のＥＳＴデータの蓄積によって、かつては相同性のある遺伝子はないとされていたＧｎＴ−Ｖのホモローグの検索がさらに広範囲に可能となった。本願発明者は上述のように、ＧｎＴ−Ｖの生体内での作用がＧｎＴ−Ｖのみで説明できないことに注目し、ＧｎＴ−Ｖと同様の活性を持つ酵素の存在を予想し、当該ヒトＧｎＴ−Ｖの遺伝子の塩基配列をもとにヒトゲノムデータベースを検索した結果、相同なＤＮＡ断片が見つかった。そこで、この相同領域にプライマーを設定してｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲでクローニングすることを基本として種々検討した結果、該酵素の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列及び推定アミノ酸配列を決定することができ、さらにＧｎＴ−Ｖと同様の活性及び新たな活性を見出し、本発明に至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンをドナー基質として、アスパラギン結合型糖鎖の分岐鎖構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６腕のαマンノースにＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，６結合で転移する活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、アスパラギン結合型糖鎖の分岐鎖構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３腕のαマンノースにＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，６結合で転移する新たな活性を有するタンパク質を提供する。さらに、本発明は、該タンパク質をコードする核酸及び該核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、該組換えベクターにより形質転換され、前記核酸を発現する細胞を提供する。さらに、本発明は、核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定用核酸を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
下記実施例において詳述する方法によりクローニングされた、本発明のタンパク質をコードする核酸は、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有し、それがコードする推定アミノ酸配列が、該塩基配列の下に記載されている。配列番号１には、該アミノ酸配列のみを取り出して示す。
【００１３】
下記実施例で得られた本発明のタンパク質（「ＧｎＴ−Ｖｂ」と命名）は、次の性質を有する酵素である。なお、各性質及びその測定方法は下記実施例において詳述されている。
作用：  ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンをドナー基質として、アスパラギン結合型糖鎖の分岐鎖構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６腕のαマンノースにＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，６結合で転移する活性を有する。触媒する反応を反応式で記載すると、図１の通りである。なお、単一の酵素が複数の作用を有する場合があることは周知であり、本発明のタンパク質も上記作用以外の他の酵素作用を有している可能性があるが、他の酵素作用を有しているタンパク質であっても、上記作用を有し、かつ、本発明に規定されるアミノ酸配列を有するタンパク質は本発明の範囲内に含まれる。例えば、下記実施例で実際に発現されたタンパク質は、図６に示す他の反応、すなわち、アスパラギン結合型糖鎖の分岐鎖構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３腕のαマンノースにＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，６結合で転移する活性をも有すると考えられるが、先に述べた酵素作用を有する限り、このような他の酵素作用を有する場合であっても、アミノ酸配列が本発明で規定されるものであれば、本発明の範囲内に含まれる。
【００１４】
なお、一般に、酵素のような生理活性を有するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。従って、配列番号１に示されるアミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンをドナー基質として、アスパラギン結合型糖鎖の分岐鎖構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６腕のαマンノースにＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，６結合で転移する活性を有するタンパク質（以下、便宜的に「修飾タンパク質」）も本発明の範囲に含まれる。このような修飾タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有することが好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピューターソフトを用いて容易に算出することができ、このようなソフトはインターネットによっても利用に供されている。さらに、該修飾タンパク質としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を有するものが特に好ましい。
【００１５】
本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする核酸及び上記修飾タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸も提供する。核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有するものも本願発明の範囲に含まれる。なお、下記実施例において実際にクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列が配列番号２に示されている。配列番号２に示す塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下（すなわち、５  ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ，  ６  ｘ  ＳＳＣ，０．５％  ＳＤＳ又は０．１％  ＳＤＳといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて５０〜６５℃で反応を行なう）において、ハイブリダイズし、かつ、上記修飾タンパク質をコードする核酸も本発明の範囲内に入る。
【００１６】
上記本発明の核酸は、下記実施例に詳述する方法により調製することもできるし、また、本発明によりその塩基配列が明らかにされたので、下記実施例に記載の通りヒト脳細胞を材料として用い、常法であるＲＴ−ＰＣＲ法を行うことにより容易に調製することができる。また、上記本発明のタンパク質は、例えば下記実施例に詳述するように、上記本発明の核酸を発現ベクターに組み込み、宿主細胞中で発現させ、精製することにより容易に調製することができる。
【００１７】
上記本発明の核酸を、発現ベクターのクローニング部位に挿入することにより、宿主細胞中で上記核酸を発現させることができる組換えベクターを得ることができる。発現ベクターとしては、種々の宿主細胞用の種々のプラスミドベクター及びウイルスベクターが周知であり、市販もされている。本発明では、このような市販の発現ベクターを好ましく用いることができる。また、このような組換えベクターで宿主細胞を形質転換又は形質導入する方法も周知である。本発明はまた、該核酸が形質転換、形質導入又はトランスフェクション等により宿主細胞に導入され、該核酸を発現する細胞を提供する。宿主細胞に外来遺伝子を導入する方法自体は周知であり、上記組換えベクターを用いること等により容易に行うことができる。宿主細胞としては、特に限定されず、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等を用いることができる。なお、組換えベクターの構築及びそれを用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が下記実施例に詳述されている。
【００１８】
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上記した通りのものであり、上記した酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。すなわち、本発明の「タンパク質」は「糖タンパク質」をも包含する。
【００１９】
本発明により、本発明の新規酵素のｃＤＮＡの塩基配列が明らかになったので、該酵素のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする、前記本発明の測定用核酸（以下、単に「測定用核酸」）が本発明により提供された。ここで、「特異的」とは、検査対象となる細胞中に存在する他の核酸とハイブリダイズせず、上記本発明の核酸とのみハイブリダイズするという意味である。測定用核酸は、上記本発明の核酸、とりわけ配列番号２に示される塩基配列を有する核酸中の部分領域と相同的な配列を有することが一般的に好ましいが、１〜２塩基程度の不一致があっても差し支えないことが多い。測定用核酸は、プローブ又は核酸増幅法におけるプライマーとして用いることができる。特異性を確保するために、測定用核酸の塩基数は１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上である。サイズは、プローブとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上、コード領域の全長（２３７６塩基）以下が好ましく、プライマーとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上、５０塩基以下が好ましい。被検核酸の部分領域と相補的な配列を有する核酸をＰＣＲのような遺伝子増幅法のプライマー、又はプローブとして用いて被検核酸を測定する方法自体は周知であり、下記実施例には、ヒト細胞中の本発明の酵素のｍＲＮＡをノーザンブロット及びインサイチューハイブリダイゼーションにより測定した方法が具体的に詳述されている。なお、本明細書において、「測定」には、検出、定量、半定量のいずれもが包含される。
【００２０】
ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのための試薬キット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。上記した本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
【００２１】
プローブとしては、上記測定用核酸に蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。
【００２２】
本発明の酵素を、ドナー基質であるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン及びアスパラギン酸結合型糖鎖に作用させることにより、アスパラギン結合型糖鎖の分岐鎖構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６腕のαマンノースにＮ−アセチルグルコサミンがβ−１，６結合で転移される。従って、本発明の酵素は、糖タンパク質の糖鎖の修飾、糖脂質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、この酵素を免疫原として動物に投与することにより、該酵素に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該酵素を測定することが可能になる。従って、本発明の酵素及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。また、下記実施例に具体的に記載されているように、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する本発明の酵素は、癌細胞、特に、神経芽腫やグリア芽腫等の神経系の癌細胞や肺小細胞癌のような肺癌細胞で発現が亢進しており、本発明の酵素又はそれをコードする核酸を定量することにより癌の存在を予測することができる。上記した本発明の測定用核酸は、本発明の酵素をコードする核酸の定量に有用であり、ひいては、癌の存在の予測に有用である。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２４】
（１）  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＧｎＴ−Ｖ）のホモログ（ＧｎＴ−Ｖｂ）のクローニング
ヒトＧｎＴ−Ｖのアミノ酸配列  （非特許文献１２）をもとに、ＢＬＡＳＴＰによるＤＤＢＪ  （ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）の相同性検索を行い、ヒトの推定タンパク質断片Ｔ５０６０６を見出した。そのアミノ酸配列をもとにしてＥＳＴデータベースを探索して７つのクローン（ＡＬ５２４１５１，  ＢＦ５６９３４０，  ＢＥ７８５２５３，  ＢＥ７８９９４５，  Ｒ８７５８０，  ＢＦ０３３７４３，  Ｒ８７６１７）を得た。
【００２５】
ヒト脳のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社）１  μｇを鋳型とし、３  μｇのランダムヘキサマー、０．５  ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０  ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液で５０  μｌ  とし、４２度で４０分逆転写反応を行った（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社）。この反応液１  μｌをとり、さらにＥＳＴクローン配列に基づいて作製したプライマーＳ１  （５’−ａｇｇｇａ  ｃｃａｇａ  ａｇｃａｇ  ａｔ−３’、塩基番号８４１−８５７）  と  ＡＳ１  （５’−ｇａａｃｃ  ｔｇｃｔｇ  ｇｔｇｃｔ  ｔｔ−３’、塩基番号２４３５−２４５１）を各５０  ｐｍｏｌ用い、  ｄＮＴＰを各０．４  ｍＭ、  ＭｇＣｌ２を２．５  ｍＭとして  ＬＡ  ＰＣＲ  緩衝液とＬＡ  Ｔａｑ  （宝酒造）  を加え全量５０  μｌとして反応させた。反応はステップダウンサイクルで行った。すなわち、変性を９５度３０秒、アニーリング温度を３サイクル毎に７４℃から４℃ずつ５８℃まで下げていき、最後に５４℃で３０サイクル行った。伸長反応は７２℃２分で行った。
【００２６】
得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動を行ったところ、１．５  ｋｂのバンドが確認された。このＤＮＡ断片をｐＴＢｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し、常法により塩基配列を決定した。
【００２７】
上記Ｔ５０６０６はＧｎＴ−Ｖと高い相同性を示したが、ＧｎＴ−ＶのＮ末端に相当する部分を含んでいなかった。そこで、５’  ＲＡＣＥシステムキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社）を用いて５’末端の探索を行った。即ち、ヒト脳のＲＮＡ  ５  μｇを、特異的なアンチセンスプライマーＧＳＰ１  （５’−ｔａｃｔｃ  ｔｇｃａｇ  ｃｔｃｃｔ  ｔ−３’、塩基番号１０１２−１０２７）で、メーカーのプロトコールに従って逆転写反応させた。得られた一本鎖ＤＮＡの３’末端には、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼとｄＣＴＰを用いてｄＣポリマーを付加した。その後５’  ＲＡＣＥ  用のアンカープライマー（５’−ｇｇｃｃａ  ｃｇｃｇｔ  ｃｇａｃｔ  ａｇｔａｃ  ｇｇｇｉｉ  ｇｇｇｉｉ  ｇｇｇｉｉ  ｇ−３’）  と  ＧＳＰ１プライマーそれぞれ２０  ｐｍｏｌ  を用いてＰＣＲを行った（変性９４度３０秒、アニーリング５５度３０秒、伸長７２度２分、３５サイクル）。ＰＣＲはＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造）、Ｅｘ  Ｔａｑ  緩衝液、  ｄＮＴＰを各０．２  ｍＭ  とし、全量  ５０  μｌ  で行った。
【００２８】
ＰＣＲ産物のうち約０．５から１ｋｂのものを電気泳動後のアガロースゲルから抽出することで選別し、ユニバーサルプライマー（５’−ｇｇｃｃａ  ｃｇｃｇｔ  ｃｇａｃｔ  ａｇｔａｃ−３’）  と特異的アンチセンスプライマーＧＳＰ２  （５’−ｃｃａｇｇ  ａｃａｔａ  ｇａｇｔｇ  ｃａｇｔｃ−３’、  塩基番号９６３−９８２）を各２０  ｐｍｏｌ用いてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った（変性９４度３０秒、アニーリング５５度３０秒、伸長７２℃２分、３５サイクル）。ＰＣＲ産物は電気泳動後のゲルから抽出した後、上記と同様サブクローニングし、常法により塩基配列を決定した。これらの作業により得られた配列を用いて再度ＥＳＴデータベース検索を行い、推定される開始コドンを含むＥＳＴクローン（ＢＥ２７６０６６，  ＢＥ３９１９４３，  ＢＥ７３０３６０，  ＢＧ４７８７２４）を見出した。
【００２９】
その後、上記ＥＳＴクローンの配列に基づいて作製したプライマー、５’−ｃｔｇｃｔ  ｃｇｃａｃ  ｃａａｃａ  ａｇｔ−３’（塩基番号−２５−（−８））と  ＡＳ１プライマー（前述）で前述のヒト脳ＲＮＡの逆転写反応物を鋳型としてＰＣＲ増幅し（変性９８度１０秒、アニーリング５５度３０秒、伸長７２度２分３０秒、４０サイクル）、産物のＤＮＡ断片を上記と同様にｐＴＢｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し、常法により塩基配列を決定し、ｐＴＢｌｕｅ−ＧｎＴ−Ｖｂと名付けた（挿入塩基配列および推定アミノ酸配列を図２に示す）。ヒトＧｎＴ−Ｖとの間のアミノ酸配列の相同性は、全長で４１．６％であった（図３）。
【００３０】
（２）発現ベクターの構築
哺乳動物細胞においてＧｎＴ−Ｖｂ遺伝子を発現するために、ＧｎＴ−Ｖｂタンパク質（全長）のＣ末端側にＭｙｃタグと（Ｈｉｓ）６タグを導入するために、以下の手順で発現ベクターを構築した。
【００３１】
まず、ＧｎＴ−ＶｂのｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に組み換えるため、ｐＴＢｌｕｅ−ＧｎＴ−ＶｂからＧｎＴ−Ｖｂ  ｃＤＮＡの前半部分（配列番号２の塩基番号、−２５−１０３５）を制限酵素Ｋｐｎ  Ｉで、また後半部分（塩基番号、１０３６−２４５１）をＫｐｎ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉで切出し、両断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）のＫｐｎ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ部位に挿入した。次に、再び同じ前半部分をＳｍａ  Ｉ／Ｋｐｎ  Ｉで、後半部分をＫｐｎ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉで切り出し、両断片を哺乳動物細胞発現ベクターｐＳＶＫ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）のＳｍａ
Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ部位に挿入し、ｐＳＶ−ＧｎＴ−Ｖｂと命名した。
【００３２】
また一方で、ＧｎＴ−Ｖｂの推定される膜貫通領域より下流の翻訳領域部分を、センスプライマー：５’−ｇｇｔｇａ  ｇａｔｃｔ  ａｃｔｃｇ  ｃｃａｔｔ  ｃａｃｃａ  ｔｃ−３’（塩基番号、１５５−１７１、下線部分はＢｇｌ  ＩＩ認識配列）とアンチセンスプライマー：５’−ｃｃｇｔｃ  ｔａｇａｃ  ａｇａｃａ  ｇｃｃｃｔ  ｇｇｃａｃ  ａ−３’（塩基番号、２３６０−２３７６、下線部分はＸｂａ  Ｉ認識配列）を用いてＰＣＲにより増幅し、産物をＢｇｌ  ＩＩ／Ｘｂａ  Ｉで消化したのち、バキュロウイルスベクターｐＡｃＧＰ６７Ｈｉｓ（Ｃ）のＢａｍＨ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ部位に挿入し、ｐＡｃＧＰ６７Ｈｉｓ（Ｃ）−ＧｎＴ−Ｖｂと命名した。なお、ｐＡｃＧＰ６７−Ｈｉｓ（Ｃ）は、発現ベクターｐＳｅｃＴａｇＡ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からＢａｍＨ  Ｉ／Ｂｃｌ  Ｉ断片を切出し、バキュロウイルスベクターｐＡｃＧＰ６７Ｃ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎｅ社）のＢａｍＨ  Ｉ／Ｂｇｌ  ＩＩ部位に挿入することで、Ｃ末端側にＭｙｃタグと（Ｈｉｓ）６タグが導入できるように作製したベクターである。
【００３３】
さらに、ｐＳＶ−ＧｎＴ−Ｖｂからは翻訳領域前半部分をＫｐｎ  Ｉで切出し、またｐＡｃＧＰ６７Ｈｉｓ（Ｃ）−ＧｎＴ−Ｖｂからは翻訳領域後半部分をＫｐｎ  Ｉ／Ｄｒａ  Ｉで切出したものを、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＫｐｎ  Ｉ／ＥｃｏＲ  Ｖ部位に挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１−ＧｎＴ−Ｖｂと命名した。
【００３４】
（３）Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞におけるＧｎＴ−Ｖｂの発現
ｐｃＤＮＡ３．１−ＧｎＴ−Ｖｂ  ５  μｇを、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってＮｅｕｒｏ−２ａ細胞にトランスフェクト、スクリーニングし、ＧｎＴ−Ｖｂ発現株のクローン化を行った。ＧｎＴ−Ｖｂの発現は、Ｔｅｔｒａ  Ｈｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  （ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたウェスタンブロットにより解析した。
【００３５】
ＧｎＴ−Ｖｂを発現していることが確認されたＮｅｕｒｏ−２ａ／ＧｎＴ−Ｖｂ細胞を直径１０  ｃｍの培養ディッシュで培養し、コンフルエントになったものをＰＢＳで洗浄した後回収し、ＰＢＳ中で超音波破砕後、１０，０００  ｘ  ｇの遠心後の上清からさらに１００，０００  ｘ  ｇの遠心によって沈殿（ミクロソーム画分）を得た。ミクロソーム画分は１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳに懸濁し、超音波処理により可溶化した。
【００３６】
（４）ＧｎＴ−Ｖｂの活性測定
上記可溶化ミクロソーム画分を２０  ｍＭ  イミダゾール／１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）／ＰＢＳ中で、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  （ＱＩＡＧＥＮ社）  ２０  μｌ  （５０％のゲルスラリー）と４℃で一晩インキュベートした。ゲルを２０  ｍＭ  イミダゾール／０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）／ＰＢＳで４回洗浄した後、ゲルを酵素源として直接以下のＧｎＴ−Ｖｂ活性測定に用いた。また、ポジティブコントロールとして、ＧｎＴ−Ｖを過剰発現させたＣＯＳ細胞のミクロソーム画分を用いた。
【００３７】
反応液は、１２５  ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ  ７．５）、４０  ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、２００  ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ、０．５  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０  μＭアクセプター基質を含み全量２０  μｌとした。アクセプター基質にはＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ：  ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，３−（ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，６）−Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ  （２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）、またはＧｎ３−ｔｒｉ−ＰＡ：  ＧｌｃＮＡｃβ１，２−Ｍａｎα１，３−｛ＧｌｃＮＡｃβ１，２−（ＧｌｃＮＡｃβ１，６）−Ｍａｎα１，６｝−Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡを用いた。反応液を３７℃で４時間インキュベートした後、３分間沸騰させて反応を止めた。反応液に１０  μｌの水を加え、１５，０００  ｒｐｍ  で５分間遠心し、上清１０  μｌ  をＬＣ−ＶＰ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｓｈｉｍａｄｚｕ  社）上でＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＭカラム  （４．６  ｘ  ２５０  ｍｍ、ＴＯＳＯＨ社）を用いて２０  ｍＭ  の酢酸アンモニウム（ｐＨ  ４．０）で毎分１．０  ｍｌの速度で展開した。溶出は蛍光スペクトロメーターでモニター（励起３２０ｎｍ、発光４００  ｎｍ）した。
【００３８】
アクセプター基質にＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡを用いた場合、ＧｎＴ−Ｖの産物と同じ溶出位置にメジャーピーク（ｐｅａｋ  １）が、そしてさらに２つのピーク（ｐｅａｋ  ２，  ３）が見られた（図４のＡ）。一方、Ｎｅｕｒｏ−２ａ親株細胞ではこれらのピークは見られず（図４のＢ）、またＧｎＴ−Ｖでは、ｐｅａｋ  １に相当するピークのみが観察された（図  ４のＣ）。
【００３９】
次に、アクセプター基質としてＧｎ３−ｔｒｉ−ＰＡを用いたところ、前述のｐｅａｋ  ２とほぼ同じ溶出位置にピーク（ｐｅａｋ  ４）が見られたが（図４のＤ）、親株細胞（図  ４のＥ）、およびＧｎＴ−Ｖ（図４のＦ）においては観察されなかった。
【００４０】
ＧｎＴ−Ｖｂ産物のマススペクトロメトリーによる解析
ＧｎＴ−Ｖｂ産物と見られる各ピークを、ＭＡＬＤＩ  （ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−ＴＯＦ  （ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）マススペクトロメトリーにより解析した。サンプルの調製は、ＧｎＴ−Ｖｂ活性測定の際の４倍量のミクロソーム画分とＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、および２．４  ｎｍｏｌのＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡを用い、同じ組成の反応液中で３７℃、２４時間インキュベートしたものを前述と同様にＨＰＬＣで各ピークを分離、回収した。回収したサンプルを乾燥後、脱イオン水に溶解し、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＶｏｙａｇｅｒ  ＲＰ−ＤＥを用いてマススペクトロメトリー解析を行った。１０  ｍｇ／ｍｌのジヒドロキシ安息香酸をマトリクスに用い、リフレクトロンモードで２０  ｋＶの加速電圧で測定を行い、ポジティブモードにて検出した（図５）。
【００４１】
Ｐｅａｋ  １，  ｐｅａｋ  ３の測定値は、コントロールとして用いたＧｎ３−ｔｒｉ−ＰＡとよく一致し、これらのピークは反応に用いた基質であるＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡにＧｌｃＮＡｃが１分子転移したものであることがわかった。Ｐｅａｋ  １については前述のＨＰＬＣの結果を考慮すると、Ｇｎ３−ｔｒｉ−ＰＡと同一の構造であることが示唆される。一方、３つのピークの中で最も小さかったｐｅａｋ  ２は、ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡにＧｌｃＮＡｃが２分子転移しているものであった。
【００４２】
ＨＰＬＣの結果、およびマススペクトロメトリーの結果から考察すると、これらのＧｎＴ−Ｖｂ産物の構造は、図６に示すものであると推定される。図６には、推定されるＧｎＴ−ＶとＧｎＴ−Ｖｂによる生合成経路を示した。
【００４３】
この図に示すように、ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡからＰｅａｋ  １を合成する活性はＧｎＴ−Ｖと同様であったが、ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡのＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３腕のαマンノースにＮ−アセチルグルコサミンをβ−１，６結合で転移する活性（＝Ｐｅａｋ  ３  の合成）、及びＧｎ３−Ｔｒｉ−ＰＡ（Ｐｅａｋ  １及びＰｅａｋ  ３）にさらにＮ−アセチルグルコサミンを転移してＧｎ４−Ｔｅｔｒａ−ＰＡ（Ｐｅａｋ  ２）：  ＧｌｃＮＡｃβ１，２−（ＧｌｃＮＡｃβ１，６）−Ｍａｎα１，３−｛ＧｌｃＮＡｃβ１，２−（ＧｌｃＮＡｃβ１，６）−Ｍａｎα１，６｝−Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡを合成する活性はＧｎＴ−Ｖ及び他の酵素には見られないもので、Ｐｅａｋ２及びＰｅａｋ３の構造並びにＰｅａｋ２の合成ルートはまったく新規のものであった。
【００４４】
ヒト組織を用いたノーザンブロッティング解析、ドットブロッティング解析
ＧｎＴ−ＶとＧｎＴ−Ｖｂの両者のヒト組織特異的発現をノーザンブロッティングとドットブロッティングによって比較した。ＧｎＴ−Ｖ、ＧｎＴ−Ｖｂのプローブとしては、それぞれｐＳＶ−ＧｎＴ−Ｖ（Ｓａｓａｉら  （２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ７５９−７６５）、ｐＳＶ−ＧｎＴ−ＶｂからそれぞれＥｃｏＲ  Ｖ  （塩基番号、４０６−１３０６）およびＰｖｕ  ＩＩ（塩基番号、１５６４−２２８６）により切り出される断片を、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルした。発現解析はＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社のＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｓ  のＨｕｍａｎ  １２−Ｌａｎｅ、およびＨｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙを用いて行った。実験の工程はメーカーのプロトコールに従った。
【００４５】
ノーザンブロッティングの結果からは、ＧｎＴ−Ｖはこれまでの報告と一致して脳、心臓、腎臓などにおいて発現が見られた。一方ＧｎＴ−Ｖｂでは脳のみで発現が見られた。また、バンドの位置もＧｎＴ−Ｖでは約９Ｋｂ、ＧｎＴ−Ｖｂでは約５Ｋｂと、相違が見られた。
【００４６】
また、ドットブロットの結果からも、やはりＧｎＴ−Ｖは広範囲の組織において発現していることが示されたが、一方ＧｎＴ−Ｖｂの発現はほとんど脳に限局されており、また脳全体において発現が見られた。
【００４７】
（４）リアルタイム検出  ＰＣＲでの各組織・細胞内での遺伝子発現解析
リアルタイム検出ＰＣＲ測定に関してはプライマーＲＴ−ＧｎＴＶｂ−Ｆ２（１１４８）：  ５’−ａａｇ  ｃｇｇ  ｃａｃ  ａｔｇ  ｇｇａ  ｃ−３’、ＲＴ−ＧｎＴ−Ｖｂ−Ｒ２（１２１２）：  ５’−ｃｃｇ  ａａｇ  ｇｔｇ  ｔｃｇ  ａｔｇ  ａｃｃ−３’、プローブＧｎＴ−Ｖｂ−ＭＧＢ１：  ５’−ＴＡＭＲＡ−ａｇａ  ａｇｔ  ａｃｃ  ｇｇｔ  ｇｃｃ  ｇａａ−ＭＧＢ−ＦＡＭ−３’を用い、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴにｈＧｎＴ−Ｖｂの配列を導入したものをｓｔａｎｄａｒｄとして比較検討する事により、各種癌細胞を用いてその中での遺伝子発現程度を測定した。補正はＧＡＰＤＨで行った。発現頻度は下記表１のような状況であった。明らかに神経細胞系で発現亢進が認められた。
【００４８】
【表１】
表１
2004321099.tif 000003
【００４９】
（５）癌患者サンプル内での遺伝子発現解析
（４）で実施したリアルタイム検出ＰＣＲ系で癌患者の組織中の遺伝子発現レベルを比較検討した所、下記表２に示す通り、正常部位からのコピー数と比較して明瞭に癌部位でのＧｎＴ−Ｖｂ発現が亢進していた。
【００５０】
【表２】
表２
2004321099.tif 000004
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、ＧｎＴ−Ｖ以外の酵素で、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  からＧｌｃＮＡｃをコア構造のＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６腕のαマンノースの６位に付加し、β１−６鎖を生合成する活性を持つ酵素及びそれをコードする核酸が提供された。また、本発明の酵素は、癌細胞、特に、神経芽腫やグリア芽腫等の神経系の癌細胞や肺小細胞癌のような肺癌細胞で発現が亢進しており、本発明の酵素又はそれをコードする核酸を定量することにより癌の存在を予測することができる。上記した本発明の測定用核酸は、本発明の酵素をコードする核酸の定量に有用であり、ひいては、癌の存在の予測に有用である。
【００５２】
【配列表】
2004321099.tif 000005
【００５３】
2004321099.tif 000006
2004321099.tif 000007
2004321099.tif 000008
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【００５４】
2004321099.tif 000010
2004321099.tif 000011
2004321099.tif 000012
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2004321099.tif 000015
【００５５】
2004321099.tif 000016
【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素が触媒する反応を示す図である。
【図２】実施例でクローニングされた本発明のタンパク質をコードする核酸の塩基配列及びそれによってコードされるアミノ酸配列を示す図である。
【図３】実施例で得られた本発明のタンパク質のアミノ酸配列を、公知のヒトＧｎＴ−Ｖ酵素のアミノ酸配列と比較して示す図である。
【図４】実施例で得られた本発明のタンパク質による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラフィーを示す図である。
【図５】実施例で得られた本発明のタンパク質による反応生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーにより解析した結果を示す図である。
【図６】実施例で得られた本発明のタンパク質が触媒する反応を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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