(57)【要約】【課題】セラミックス材料により、生体為外性がなく、生体内においても使用可能であり、かつ、細胞全体に培養液等を満遍なく供給することができる細胞培養用部材を提供する。また、人体においても実用可能である人工肝臓等の人工臓器を提供する。【解決手段】円筒状に形成された毛管現象を生じる部材１の外周面または内周面に接触して、三次元網状気孔構造からなる気孔率８５％以上９９％以下のセラミックス多孔体２が円筒状に形成されている細胞培養用部材を用いる。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛管現象を生じる部材と、三次元網状気孔構造からなる気孔率８５％以上９９％以下のセラミックス多孔体とが、面接触していることを特徴とする細胞培養用部材。
【請求項２】
前記毛管現象を生じる部材は、アルミナ、シリカ、ジルコニア、アルミナ−シリカ、アルミナ−ジルコニア、リン酸カルシウム系セラミックスのうちのいずれかからなることを特徴とする請求項１記載の細胞培養用部材。
【請求項３】
前記毛管現象を生じる部材は、気孔率が５０％以上８５％以下であり、平均気孔径５０μｍ以上５００μｍ以下の連球状開気孔を有するセラミックスからなることを特徴とする請求項１または請求項２記載の細胞培養用部材。
【請求項４】
前記毛管現象を生じる部材は、気孔率が２０％以下の緻密質なセラミックスに、孔径０．２μｍ以上５００μｍ以下の微細貫通孔が複数形成されたものであることを特徴とする請求項１または請求項２記載の細胞培養用部材。
【請求項５】
前記毛管現象を生じる部材は、粒径０．０５μｍ以上２０μｍ以下の粒子が結合したセラミックスであって、孔径０．１μｍ以上１０μｍ以下の気孔を有していることを特徴とする請求項１または請求項２記載の細胞培養用部材。
【請求項６】
円筒状に形成された前記毛管現象を生じる部材の外周面または内周面に接触して、前記セラミックス多孔体が円筒状に形成されていることを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれかに記載の細胞培養用部材。
【請求項７】
請求項１から請求項６までのいずれかに記載の細胞培養用部材と、血漿分離器とが組み合わせていることを特徴とする人工臓器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養用部材およびそれを用いた人工臓器に関し、より詳細には、微生物培養用基材、バイオリアクタ、細胞培養用基材等に広く利用することができる細胞培養用部材、および、それを用いた人工肝臓等の人工臓器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物や細胞の中には、単独では機能を発揮し難く、例えば、球状組織体またはスフェロイドと呼ばれるような複数の個体が凝集した状態において、初めて能力を発揮するものがある。また、このような凝集体の中には、細胞等が付着するための足場、すなわち、培養基材がなければ、活性化しないものもある。
【０００３】
例えば、肝細胞が、上記のような細胞に該当し、その凝集体においては、その中心部にまで、酸素や栄養分が行き渡るようにすることが必要であり、すなわち、肝細胞の場合には、培養液や血液に相当するものが十分に供給されることが必要とされる。
【０００４】
しかしながら、前記凝集体が高密度で分布している場合には、全体に満遍なく、培養液や血液を行き渡らせることは困難であった。
すなわち、細胞培養用基材は、細胞、栄養分等を全体に満遍なく行き渡らせることができる材料、構造等を有していなければならない。
【０００５】
これに対しては、従来、細胞を三次元的に高密度で培養させるための培養基材として、例えば、ポリウレタンフォーム、その他、多孔質の有機化合物等が用いられている。
また、例えば、特開２００１−１２８６６０号公報には、半透膜構造を有する多数の合成樹脂からなる中空糸を規則的に配管させた構造体を用いて、該中空糸内腔または外腔に充填させた細胞に、該中空糸外腔または内腔から該中空糸膜を介して、培養液が十分に供給されるように構成された装置が開示されている。
【０００６】
しかしながら、ポリウレタンフォームは、原料として、生体に有害なイソシアネートが用いられており、また、その他の合成樹脂等の有機化合物についても、生体への何らかの影響があるかも知れないと危惧されており、安全性の面から、未だに人体へは適用されておらず、人工臓器としては、実用化には至っていない。
【０００７】
そこで、上記ポリウレタン等の有機化合物に代わる材料として、既に生体為害性がないことが確認されているセラミックス等の無機材料を用いれば、人工臓器としての実用化が可能となると考えられる。
また、セラミックス材料により構成された培養基材であれば、多少のｐＨ変化、温度変化、溶剤との接触等に対しても、ポリウレタンよりも耐性に優れている。
【０００８】
本発明者らは、既に、特願２００２−２１６７１３号において、上記ポリウレタンフォームと同等の機能を発揮することができるセラミックス多孔体を作製することができることを提案した。したがって、上記ポリウレタンフォームは、該セラミックス多孔体に代替させることができる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のように、特開２００１−１２８６６０号公報に開示された細胞培養装置においては、合成樹脂からなる多数の中空糸が、細胞胞培養基材として用いられているが、焼結体であるセラミックスでは、気孔の制御が困難であり、また、脆く、崩れやすいため、該中空糸に相当するような細孔管状体を形成させることは困難である。
しかも、前記中空糸に相当するものを、狭小な間隔で、規則的に配置させ、さらに、このような複雑な構造体を維持管理することは、セラミックスの場合には極めて困難である。
【００１０】
そこで、本発明者らは、上記技術的課題を解決するために研究を重ねた結果、セラミックス自体の細孔において生じる毛管現象に着目し、前記中空糸に相当するものを、セラミックスにより形成させることができることを見出した。
【００１１】
本発明は、セラミックス材料自体の細孔において生じる毛管現象を利用することにより、生体為外性がなく、生体内においても使用可能であり、かつ、細胞全体に培養液等を満遍なく供給することができる細胞培養用部材を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、人体においても実用可能である前記細胞培養用部材を用いた人工肝臓等の人工臓器を提供することも目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る細胞培養用部材は、毛管現象を生じる部材と、三次元網状気孔構造からなる気孔率８５％以上９９％以下のセラミックス多孔体とが、面接触していることを特徴とする。
このような構成からなる細胞培養用部材を用いて、毛管現象を生じる部材の側から培養液等を導入させ、セラミックス多孔体内部に、培養する細胞を担持させることにより、培養液等を、該細胞培養用部材全体に浸透させ、セラミックス多孔体に担持させた細胞全体に、満遍なく行き渡らせることができる。
【００１３】
前記毛管現象を生じる部材は、アルミナ、シリカ、ジルコニア、アルミナ−シリカ、アルミナ−ジルコニア、リン酸カルシウム系セラミックスのうちのいずれかからなることが好ましい。
これらの材質によれば、生体為害性がなく、十分な強度を有しており、また、少なくとも水または血漿について、毛管現象を生じさせる観点から、好適である。
【００１４】
また、前記毛管現象を生じる部材は、気孔率が５０％以上８５％以下であり、平均気孔径５０μｍ以上５００μｍ以下の連球状開気孔を有するセラミックスからなることが好ましい。
このような多孔質のセラミックスは、該部材と面接触しているセラミックス多孔体全体に、培養液等を満遍なく行き渡らせるために、好適に用いることができる。
【００１５】
また、前記毛管現象を生じる部材は、気孔率が２０％以下の緻密質なセラミックスに、孔径０．２μｍ以上５００μｍ以下の微細貫通孔が複数形成されたものであってもよい。
さらにまた、前記毛管現象を生じる部材は、粒径０．０５μｍ以上２０μｍ以下の粒子が結合したセラミックスであって、孔径０．１μｍ以上１０μｍ以下の気孔を有しているものであってもよい。
【００１６】
前記細胞培養用部材は、円筒状に形成された前記毛管現象を生じる部材の外周面または内周面に接触して、前記セラミックス多孔体が円筒状に形成されていることが好ましい。
上記のように、セラミックス多孔体に培養する細胞を担持させ、毛管現象を生じる部材の側から培養液等を導入させる構成においては、全体を円筒状に形成させることによって、培養液等の流通性が全体で均等となるように制御することが容易となる。
【００１７】
また、本発明に係る人工臓器は、上記した本発明に係る細胞培養用部材と、血漿分離器とが組み合わせていることを特徴とするものである。
血漿分離器を、前記細胞培養用部材の前段に備えることにより、血液中の血漿成分だけを、セラミックス多孔体に担持させた細胞に供給させることができるため、人工臓器、特に、肝細胞を培養させた部材を用いることにより、人工肝臓として好適に用いることができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を、一部図面を参照して、詳細に説明する。
本発明に係る細胞培養用部材は、毛管現象を生じる部材と、三次元網状気孔構造からなる気孔率８５％以上９９％以下のセラミックス多孔体とが、面接触していることを特徴とするものである。
このような構成からなる細胞培養用部材を用いて、前記毛管現象を生じる部材の側から培養液等を導入させ、一方、該毛管現象を生じる部材と面接触しているセラミックス多孔体内部に、培養する細胞を担持させることにより、該細胞培養用部材全体に培養液等を浸透させ、セラミックス多孔体に担持させた細胞全体に、培養液等を満遍なく、行き渡らせることができる。
このとき、前記毛管現象を生じる部材と、前記セラミックス多孔体とは、直接接触している状態であれば、別々に形成した後、組み合わせても、または、一体的に形成してもよい。
【００１９】
前記毛管現象を生じる部材は、生体為害性がなく、十分な強度を有しており、また、少なくとも水または血漿について、毛管現象を生じることが必要である。このような毛管現象を生じやすい材質としては、アルミナ、シリカ、ジルコニア、アルミナ−シリカ、アルミナ−ジルコニア、リン酸カルシウム系セラミックスのうちのいずれであることが好ましい。
【００２０】
前記毛管現象を生じる部材は、該部材と面接触しているセラミックス多孔体全体に、培養液等を満遍なく行き渡らせることができるように構成されていることが重要である。
このような観点から、前記毛管現象を生じる部材は、複数の隣接する気孔により、該気孔を区画する骨格壁部において三次元的に連通した連球状開気孔が形成されており、気孔率が５０％以上８５％以下、平均気孔径が５０μｍ以上５００μｍ以下であるセラミックスからなることが好ましい。
上記のような多孔質構造を有しているセラミックスは、毛管現象を生じやすく、好適に用いられる。
また、このようなセラミックスは、後述するセラミックス多孔体の製造方法と同様に、撹拌起泡によって、容易に製造することができる。
【００２１】
また、前記毛管現象を生じる部材としては、気孔率が２０％以下の緻密質なセラミックスや金属に、孔径０．２μｍ以上５００μｍ以下の微細貫通孔を複数形成したものであってもよい。
材質は金属であっても、生体為害性がなく、製造可能であれば差し支えないが、上記のように、生体為害性等の観点からは、セラミックスを用いることがより好ましい。
また、前記微細貫通孔に形成方法は、特に限定されるものではなく、例えば、レーザ、エッチング等により形成することができる。
【００２２】
さらにまた、前記毛管現象を生じる部材は、粒径０．０５μｍ以上２０μｍ以下の粒子が結合したセラミックスであって、孔径０．１μｍ以上１０μｍ以下の気孔を有しているものであってもよい。前記孔径は、０．１μｍ以上２μｍ以下であることがより好ましい。
このように、セラミックス粒子間の間隙によって、毛管現象を生じることに適した気孔が形成されているものも好適に用いることができる。
【００２３】
一方、前記セラミックス多孔体は、気孔率８５％以上９９％以下の高い気孔率を有している三次元網状気孔構造からなるものである。
このため、該セラミックス多孔体内部に担持された細胞の酸素、栄養素の供給および老廃物の除去等の物質交換を円滑に行うことができ、細胞を均等かつ高密度で培養させることができる。
【００２４】
また、前記セラミックス多孔体は、気孔相互の連通孔径も大きく、また、気孔径が１００μｍ以上２０００μｍ以下の気孔がセラミックス多孔体の体積の５０％以上を占めるものであることが好ましい。
このように、均等に大きな気孔の割合を大きくすることにより、セラミックス多孔体内部まで均等に細胞を導入することができ、また、培養液等をよどみなく、整流させることがきる。
【００２５】
前記セラミックス多孔体は、上記のような細胞の足場としての機能を十分に発揮させるためには、気孔率は９１％以上であり、かつ、気孔径が１００μｍ以上１０００μｍ以下の気孔がセラミックス多孔体の体積の５０％以上を占めることが好ましい。さらに、気孔率は９３％以上、特に、９５％以上と高いほど好ましいが、９９％を超えるものは、実際上、形成困難である。
【００２６】
また、前記セラミックス多孔体を構成するセラミックスの材質は、生体為害性、強度等の観点から、前記毛管現象を生じる部材に用いられるセラミックスと同様の材質、すなわち、アルミナ、シリカ、ジルコニア、アルミナ−シリカ、アルミナ−ジルコニア、リン酸カルシウム系セラミックスのうちのいずれが用いられることが好ましい。
【００２７】
また、前記セラミックス多孔体と毛管現象を生じる部材とは、異なる材質で別々に形成した後、組み合わせてもよいが、一体的に成形させる場合には、同一材質により、成形時に、セラミックス多孔体と毛管現象を生じる部材とを層構造とし、その後、焼成させることが好ましい。
【００２８】
上記のようなセラミックス多孔体は、例えば、特願２００２−２１６７１３に開示された製造方法により製造することができる。
具体的には、平均粒径０．０５μｍ以上２μｍ以下のセラミックス原料粉末と、界面活性剤と、分散媒と、セラミックス原料粉末に対して４０重量％以上３００重量％以下の架橋重合性樹脂とを、撹拌して起泡させ、泡沫スラリーを調製する工程と、前記泡沫スラリーに架橋剤を添加して成形し、架橋重合させる工程と、前記成形体を焼成して、気孔率８５％以上のセラミックス多孔体を得る工程とを備えている製造方法を用いることが好ましい。
このような撹拌起泡により製造すれば、８５％以上の高い気孔率を有するセラミックス多孔体が容易に得られる。
【００２９】
なお、前記セラミックス多孔体は、細胞の定着性を向上させる観点から、その少なくとも一部に、細胞付着性を有する有機化合物が形成されていてもよい。
このような細胞付着性を有する有機化合物としては、分子量により細胞付着性を制御することができる観点から、高分子材料であることが好ましく、例えば、乳酸および／またはグリコール酸の重合体、乳酸および／またはグリコール酸の重合体とポリエチレングリコールとのブロック共重合体、コラーゲン等が好適に用いられる。
これらの有機化合物を多孔体の骨格表面にコーティング等によって形成させることにより、細胞培養用部材に対する細胞の定着性の向上を図ることができる。
【００３０】
さらに、前記細胞付着性を有する有機化合物には、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ；ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ；ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、肝実質細胞成長因子（ＨＧＦ；ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）等の血管増殖因子やその他必要なサイトカイン等を含有させて徐放させてもよい。
これにより、生体細胞培養においては、毛細血管の形成が促進され、細胞の活性化を図ることができる。
【００３１】
上記のような毛管現象を生じる部材とセラミックス多孔体とを面接触させる方法としては、上述のように、別個に形成したものを組み合わせる方法、一体成形させる方法、一方を形成した後に積層させる方法等、いずれの方法でもよい。
【００３２】
また、上記のようにして形成される細胞培養用部材の形状は、特に制限されるものではなく、例えば、板状、多角形筒状、円筒状とすることができる。
培養液等の流通性等の観点からは、特に、円筒状に形成された前記毛管現象を生じる部材の外周面または内周面に接触して、前記セラミックス多孔体が円筒状に形成されていることが好ましい。
本発明に係る細胞培養用部材においては、上記のように、セラミックス多孔体に培養する細胞を担持させ、一方、毛管現象を生じる部材の側から培養液等を導入させるが、全体が円筒状に形成されていることによって、培養液等を、細胞培養用部材全体に浸透させ、細胞に満遍なく行き渡らせるように制御することが容易となる。
なお、培養液等は、流通効率の向上を図るため、毛管現象を生じる部材と接触させる際には、加圧状態としてもよい。
また、同様に、培養液が流れる一連の系内に、圧力差を設けるようにしてもよい。セラミックス多孔体内の細胞が毛管内を逆流することがないように、培養液は常に一定方向へ流れるように制御することが好ましい。
【００３３】
図１に、本発明に係る細胞培養用部材の一例として、下記実施例１に係る細胞培養用部材の概略図を示す。なお、本発明は、この実施例により限定されるものではない。
図１においては、円筒状に形成された毛管現象を生じる部材１の外周面に接触して、セラミックス多孔体（外筒）２が円筒状に形成されている。
このような構成からなる円筒体の中心部の貫通孔３内を、径方向に対して垂直な方向（矢印４方向）に、培養液を流す。
【００３４】
また、図２に、本発明に係る細胞培養用部材の他の実施態様として、下記実施例４に係る細胞培養用部材の概略図を示す。
図２においては、円筒状に形成された気孔を有するセラミックスからなる外筒５の内周面に、気孔径が異なるセラミックスからなる中間層６および内層７が形成されている。これらの外筒５、中間層６、内層７によって、内側に向かって順次気孔径が小さくなるような三層構造を有する毛管現象を生じる部材１が構成されている。そして、この円筒状体の中心部の貫通孔内に、前記内層７の内周面に接触して、すなわち、円筒状に形成された前記毛管現象を生じる部材１の内周面に接触して、セラミックス多孔体８の粒状体が充填されている。
このような構成からなる円筒体の外周において、径方向に対して垂直な方向（矢印４方向）に、培養液を流す。
【００３５】
前記細胞培養用部材は、上記のように全体を円筒状に形成する場合には、円筒外周部を細胞導入部分とし、円筒内を培養液流通路としても、これとは逆に、円筒内を細胞導入部分とし、円筒外周部を培養液流通路としても、いずれの構成としてもよい。
また、培養液の流れを制御したり、ケーシングに設置するために、必要に応じて、端面をガラス等により封止し、無気孔化させてもよい。
【００３６】
また、本発明に係る人工臓器は、上記したような本発明に係る細胞培養用部材と、血漿分離器とが組み合わせていることを特徴とするものである。
血漿分離器を、前記細胞培養用部材の前段に備えることにより、血液中の血漿成分だけを、該細胞培養用部材のセラミックス多孔体に担持させた細胞に供給させることができるため、人工臓器として用いることができる。
【００３７】
特に、本発明に係る細胞培養用部材は、肝細胞の培養部材として好適に用いることができ、これを用いて、人工肝臓とすることも可能である。
人工肝臓としての具体的な使用態様としては、まず、前記セラミックス多孔体に肝細胞を担持させて培養し、該細胞培養用部材に、血漿分離器から分離採集した血漿を流し、血漿をセラミックス多孔体に担持させた肝細胞全体に行き渡らせる。
そして、前記セラミックス多孔体内部において、肝細胞と血漿との接触部分で、血漿中の有害物質の分解、アミノ酸の合成等が行われる。
次いで、該セラミックス多孔体から滲出した血漿を回収し、前記血漿分離器で分離された血漿以外の成分と併せて、生体内に戻す。
【００３８】
本発明に係る細胞培養用部材と血漿分離器とを組み合わせて、このようなサイクルを形成することにより、人工肝臓としての機能を発揮させることができる。
なお、前記細胞培養用部材は、人工肝臓等、比較的大きな臓器の代用として用いられる場合には、円筒状体に形成した複数の該部材を、直列および／または並列に配置し、ケーシングに収めること等により構成してもよい。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により制限されるものではない。
［実施例１］
気孔率７５％、平均気孔径１５０μｍのアルミナセラミックスからなる内径１０ｍｍ、外径１６ｍｍ、長さ２００ｍｍのパイプ状の内筒（毛管現象を生じる部材）を作製した。
そして、この内筒の外周に、気孔率９５％、平均気孔径８００μｍのアルミナセラミックス多孔体を厚さ３ｍｍで形成し、細胞培養用部材とした。
図１に、この細胞培養用部材の構成を表す概略図を示す。
得られた細胞培養用部材の内筒の貫通孔内に培養液を流通させたところ、該内筒は、全体に渡って、培養液が浸潤し、さらに、外筒も満遍なく浸潤したことが確認された。
【００４０】
［実施例２］
気孔率１％のアルミナセラミックスからなる内径１０ｍｍ、外径１４ｍｍ、長さ５０ｍｍのパイプ状の内筒を作製した。
そして、この内筒の外周に、気孔率９５％、平均気孔径８００μｍのアルミナセラミックス多孔体を厚さ３ｍｍで形成した。
その後、前記内筒に、孔径０．４ｍｍの穿孔を、レーザ加工により、ほぼ等間隔に５００個形成して、毛管現象を生じる部材とし、細胞培養用部材を作製した。
得られた細胞培養用部材の内筒の貫通孔内に培養液を流通させたところ、該内筒は、全体に渡って、培養液が浸潤し、さらに、外筒も満遍なく浸潤したことが確認された。
【００４１】
［実施例３］
実施例１と同様にして、内筒および外筒を形成した後、これらの一端をアルミナセラミックス板とガラスにより封止し、細胞培養用部材を作製した。
得られた細胞培養用部材の内筒の貫通孔内に培養液を流通させたところ、該内筒は、全体に渡って、培養液が浸潤し、さらに、外筒も満遍なく浸潤したことが確認された。
【００４２】
［実施例４］
気孔率３５％、平均気孔径１５μｍのアルミナセラミックスからなる内径１５ｍｍ、外径１９ｍｍ、長さ５０ｍｍのパイプ状の外筒を作製した。
そして、この外筒の内側に、気孔率３０％、平均気孔径０．８μｍのアルミナセラミックスからなる中間層を厚さ２５μｍで形成した。
さらに、前記中間層の内側に、毛管現象を生じる部材として、気孔率３０％、平均気孔径０．２μｍのアルミナセラミックスからなる内層を厚さ５μｍで形成し、三層構造を有する毛管現象を生じる部材（アルミナセラミックスフィルタ）を作製した。
そして、このアルミナセラミックスフィルタの貫通孔内に、気孔率９６％、平均気孔径８００μｍのアルミナセラミックス多孔体の粒状体を充填し、細胞培養用部材を作製した。
図２に、この細胞培養用部材の構成を表す概略図を示す。
得られた細胞培養用部材の外周に培養液を流通させたところ、前記貫通孔内のセラミックス多孔体は、十分に浸潤していることが確認された。
【００４３】
【発明の効果】
以上のとおり、本発明に係る細胞培養用部材は、セラミックス材料自体の細孔において生じる毛管現象を利用することにより、微生物培養用基材、バイオリアクタ、細胞培養用基材等に広く利用することができる。
また、本発明に係る細胞培養用部材は、生体為外性がなく、生体内においても使用可能であり、かつ、細胞全体に培養液等を満遍なく供給することができるため、生体細胞を培養するために好適に用いることができる。
さらに、このような細胞培養用部材を用いることにより、人体においても実用可能である人工肝臓等の人工臓器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に係る細胞培養用部材の概略構成を示した図である。
【図２】実施例４に係る細胞培養用部材の概略構成を示した図である。
【符号の説明】
１　　　毛管現象を生じる部材
２、８　セラミックス多孔体
３　　　貫通孔
４　　　培養液流方向
５　　　外筒
６　　　中間層
７　　　内層
【図１】
2004057028.tif 000003
【図２】
2004057028.tif 000004