(57)【要約】【課題】シナモンタンパク質をコードする遺伝子、その遺伝子産物およびそれらの用途の提供。【解決手段】毛色、血小板機能、糸球体腎炎の発症進展に関与するシナモンタンパク質、並びにシナモンタンパク質をコードする遺伝子が得られ、これらのタンパク質および遺伝子は、眼・皮膚アルビニズム、血小板機能異常の疾患及び腎疾患を始めとする疾患の診断に有用である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）または（９）に示すシナモンタンパク質をコードする遺伝子：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列を有する、マウス変異型シナモンタンパク質をコードする遺伝子；
（２）配列表の配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号４に示すマウス変異型シナモンタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４のアミノ酸配列を有するマウス変異型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（３）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号４に示すマウス変異型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（４）配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するマウス野生型シナモンタンパク質をコードする遺伝子；
（５）配列表の配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号５に示すマウス野生型シナモンタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号５のアミノ酸配列を有するマウス野生型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（６）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号５に示すマウス野生型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（７）配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する、ヒトシナモンタンパク質をコードする遺伝子；
（８）配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号６に示すヒトシナモンタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号６のアミノ酸配列を有するヒトシナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（９）配列表の配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号３に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号６に示すヒトシナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
請求項１の遺伝子を含むことを特徴とする組換え体ベクター。
【請求項３】
請求項２の組換え体ベクターを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項４】
請求項１の遺伝子のノックアウト動物またはトランスジェニック動物。
【請求項５】
請求項１の遺伝子の全部又は一部分からなる核酸プローブ。
【請求項６】
請求項５の核酸プローブを用いることを特徴とするシナモンタンパク質遺伝子の類似遺伝子及び転写調節領域のクローニング方法。
【請求項７】
請求項１の遺伝子の全体又は一部分に対してアンチセンスであり、シナモンタンパク質の発現を上昇あるいは阻害できる遺伝子。
【請求項８】
請求項３の形質転換体又は形質導入体、もしくは請求項４のトランスジェニック動物又はノックアウト動物を用いた薬剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１の遺伝子、その一部分、またはその部分オリゴヌクレオチド配列を含む診断薬。
【請求項１０】
眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患又は糸球体腎炎を診断するための請求項９の診断薬。
【請求項１１】
診断対象者から得られた検体中のシナモン遺伝子の有無あるいはレベルを、請求項１の遺伝子、その一部分、またはその部分オリゴヌクレオチド配列を用いて調べることにより、眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患または糸球体腎炎の診断を行うことを特徴とする診断方法。
【請求項１２】
請求項１の遺伝子、その一部分、それらのアンチセンス遺伝子を含む医薬製剤。
【請求項１３】
眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患又は糸球体腎炎に対する請求項１２の医薬製剤。
【請求項１４】
以下の（１）、（２）、（３）、（４）、（５）または（６）に示すシナモンタンパク質：
（１）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するマウス変異型シナモンタンパク質；
（２）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４に示すアミノ酸配列を有するマウス変異型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質；
（３）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列を有するマウス野生型シナモンタンパク質；
（４）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号５に示すアミノ酸配列を有するマウス野生型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質；
（５）配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列を有するヒトシナモンタンパク質；
（６）配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号６に示すアミノ酸配列を有するヒトシナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質。
【請求項１５】
請求項１４のタンパク質の一部分からなるペプチド。
【請求項１６】
請求項１４のタンパク質または請求項１５のペプチドに対する抗体。
【請求項１７】
請求項１６の抗体を用いることを特徴とするシナモンタンパク質の類似タンパク質遺伝子のクローニング方法または類似タンパク質の精製法。
【請求項１８】
請求項１４のタンパク質、請求項１５のペプチドまたは請求項１６の抗体を用いた薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１６の抗体を含む診断薬。
【請求項２０】
眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患もしくは糸球体腎炎を診断するための請求項１９の診断薬。
【請求項２１】
診断対象者から得られた検体中のシナモンタンパク質の有無もしくはそのレベルを、請求項１６の抗体を用いて調べることにより、眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患または糸球体腎炎の診断を行うことを特徴とする診断方法。
【請求項２２】
請求項１４のタンパク質、請求項１５のペプチドまたは請求項１６の抗体を含む医薬製剤。
【請求項２３】
眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患もしくは糸球体腎炎に対する請求項２２の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症の発症に関与し、腎炎の発症進展を制御し得るシナモンタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、およびこれらの蛋白質並びに遺伝子の一連の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＥＯＤマウスは、自己免疫疾患マウスであるＭＲＬ／Ｍｐ−ＦａｓｌｐｒとＢＸＳＢを先祖とし、交配で得られる子孫世代の中から、腎機能の急速な低下を指標に兄妹交配を繰り返して樹立された近交系マウスである（特許文献１、非特許文献１を参照）。ＥＯＤマウスの毛色は通常野生色（茶褐色）であるが、ＥＯＤマウスの繁殖継代時に、突然変異によると思われるシナモン毛色（薄茶色）のマウスが誕生した。これらのシナモン毛色のマウスを掛け合わることにより、ＥＯＤマウスとは異なる系統を確立し、この系統のマウスをＥＯＤ毛色変異マウスと名づけた。ＥＯＤ毛色変異マウスは、ＥＯＤマウスと比較して末梢血小板数が少なく、また血中に抗血小板抗体が存在することから、血小板減少症等の自己免疫疾患のモデルマウスとして報告がある（特許文献１参照）。その後のＥＯＤ毛色変異マウスに関する研究により、毛色の異常はメラノソームの未成熟が原因であり、さらに眼色の喪失、出血時間の延長、血小板のデンスボディーの消失が認められ、ＥＯＤ毛色変異マウスはヒトの疾患であるヘルマンスキー−パドラック症候群に見られる病態を示すことが見出された。ＥＯＤマウスでは上記のような毛色、眼色、血小板の特徴は認められず、ＥＯＤ毛色変異マウスにおける変異遺伝子は、ヘルマンスキー−パドラック症候群の原因遺伝子であることが示唆された。
【０００３】
ヘルマンスキー−パドラック症候群は、上記に示した毛色、眼色、血小板の特徴に加え、肺線維症、炎症性腸疾患を特徴とする疾患である（非特許文献２参照）。プエルトリコ人は１８００人に１人の割合で発症し、遺伝的保因者は約２０人に１人と考えられている。ヘルマンスキー−パドラック症候群の患者は、健常人に比べ止血にかかる時間が長く、外科手術、出産、切傷に伴う出血により死亡する危険性が高い。ヘルマンスキー−パドラック症候群原因遺伝子は単一ではなく、現在までに、原因遺伝子としてＨＰＳ１〜４が同定されている。
また、ＥＯＤマウスは、急速進行性の糸球体腎炎を自然発症し、急速に腎機能が低下して、雄では生後８２日で、雌では生後１０８日で５０％のマウスが死亡する。これに対して、ＥＯＤ毛色変異マウスは、ＥＯＤマウスに比べ糸球体腎炎の発症進展が緩やかで、５０％生存生後日数が雄では１９６日、雌では２３８日である（特許文献２参照）。したがって、ＥＯＤ毛色変異マウスにおける変異遺伝子は、糸球体腎炎の発症進展を制御できる遺伝子である。
急速進行性の糸球体腎炎は急速な腎機能の低下を特徴とし、既存の薬剤であるステロイド、サイクロフォスファミドで十分な効果は得られていない。また、発症機作及び進展の要因も明らかとなっていない。
【０００４】
【特許文献１】
特開平０５−１０３５６２号公報
【特許文献２】
特開平０９−２７１２９４号公報
【非特許文献１】
Ｈｏｎｄａ  Ｓ，  Ｎｅｍｏｔｏ  Ｋ，  Ｍａｅ  Ｔ，  Ｋｉｎｊｏｈ  Ｋ，  Ｋｙｏｇｏｋｕ  Ｍ，  Ｋａｗａｍｕｒａ  Ｈ，
Ｍｉｙａｚａｗａ  Ｓ，  Ｗｅｅｒａｓｈｉｎｇｈｅ  Ａ，  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｈ，  Ｎａｒｉｔａ  Ｊ，  Ｋｏｙａ  Ｔ，
Ａｒａｋａｗａ  Ｍ，  Ａｂｏ  Ｔ．：  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９  Ａｐｒ；  １１６（１）：１５３−６３
【非特許文献２】
Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ  Ｆ，  Ｐｕｄｌａｋ  Ｐ．：  Ａｌｂｉｎｉｓｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ
ｄｉａｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ
ｍａｒｒｏｗ：ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．：  Ｂｌｏｏｄ
１９５９：  １４：１６２−１６９
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＥＯＤ毛色変異マウスの変異遺伝子を同定し、本遺伝子機能が、眼・皮膚のメラニン色素形成過程、血小板凝集能に深く関係し、また腎炎の発症進展を制御し得る遺伝子であることを明らかにし、さらにヒトでの遺伝子を同定し、これら遺伝子及びタンパク質を用いた新規薬剤探索方法を提供すること、さらにこれら遺伝子及びタンパク質を用いた新規治療方法及び診断方法を提供すること等である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ＥＯＤ毛色変異マウスの変異遺伝子を遺伝連鎖解析により染色体上の位置を同定し、この染色体位置の近傍に有するＥＯＤマウス及びＥＯＤ毛色変異マウスの遺伝子を比較して、変異を受けた遺伝子を見出すべく鋭意研究し、その遺伝子配列、並びにＥＯＤ毛色変異マウスの特徴的な表現型がこの遺伝子により規定されていることを示し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明者は、シナモン毛色のＥＯＤ毛色変異マウスと野生毛色を有するＭＳＭ／Ｍｓｆマウスを交配し、交配マウスにおいて、各個体で毛色と染色体マーカーの遺伝子型が一致している割合（交叉率）を求め、遺伝子マーカーＤ５Ｍｉｔ２８８の染色体位置の近傍に毛色変異遺伝子が存在することを示した。この染色体の位置近傍にある各遺伝子のｃＤＮＡを合成し、ＥＯＤ毛色変異マウスとＥＯＤマウスの遺伝子の塩基配列を比較した。その結果、ＥＮＳＭＵＳＴ００００００３９４９８と称される仮想遺伝子のエクソン上に、ＥＯＤ毛色変異マウスでは一塩基の欠落があることを見出した。ＥＮＳＭＵＳＴ００００００３９４９８遺伝子の変異が毛色変異の原因であると考えられ、発明者は、ＥＮＳＭＵＳＴ００００００３９４９８遺伝子をシナモン遺伝子、そのタンパク質産物をシナモンタンパク質と称した。さらに、発明者は、ＥＯＤ毛色変異マウスではシナモンタンパク質を発現していないこと、並びに毛色変異と血小板機能異常及び腎炎発症が遺伝学的に関連することを示し、シナモン遺伝子変異が正常なシナモンタンパク質の発現を阻害し、血小板機能異常、腎炎発症を規定していることを示した。また、シナモン遺伝子と接続したプラスミドを構築し、哺乳動物細胞内で強制発現することにより、シナモンタンパク質の発現と細胞内局在を確認した。さらに、マウスシナモン遺伝子をデータベース上で検索することにより、ヒト相同遺伝子と考えられるＥＮＳＧ０００００１７８９８３遺伝子を見出した。
【０００８】
従って、本発明は、以下の（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）または（９）に示すシナモンタンパク質をコードする遺伝子に関する。
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列を有する、マウス変異型シナモンタンパク質をコードする遺伝子；
（２）配列表の配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号４に示すマウス変異型シナモンタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４のアミノ酸配列を有するマウス変異型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（３）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号４に示すマウス変異型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（４）配列表の配列番号２に示す塩基配列を有するマウス野生型シナモンタンパク質をコードする遺伝子；
（５）配列表の配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号５に示すマウス野生型シナモンタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号５のアミノ酸配列を有するマウス野生型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（６）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号５に示すマウス野生型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（７）配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する、ヒトシナモンタンパク質をコードする遺伝子；
（８）配列表の配列番号３に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号６に示すヒトシナモンタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号６のアミノ酸配列を有するヒトシナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（９）配列表の配列番号３に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号３に示す塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号６に示すヒトシナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
更に、上記の遺伝子を含むことを特徴とする組換え体ベクターに関する。
更に、上記の組換え体ベクターを含む形質転換体又は形質導入体に関する。
更に、上記の遺伝子のノックアウト動物またはトランスジェニック動物に関する。
更に、上記の遺伝子の全部又は部分からなる核酸プローブに関する。
更に、上記の核酸プローブを用いることを特徴とするシナモンタンパク質遺伝子の類似遺伝子及び転写調節領域のクローニング方法に関する。
更に、上記の遺伝子の全体又は部分に対してアンチセンスであり、シナモンタンパク質の発現を上昇あるいは阻害できる遺伝子に関する。
更に、上記の形質転換体又は形質導入体、もしくはトランスジェニック動物又はノックアウト動物を用いた薬剤のスクリーニング方法に関する。
更に、上記の遺伝子、その一部分または、その部分オリゴヌクレオチド配列を含む診断薬に関する。
更に、眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患及び糸球体腎炎の診断薬に関する。
更に、眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患及び糸球体腎炎の診断方法に関する。
更に、上記の遺伝子、その一部分、またはそれらのアンチセンス遺伝子を含む医薬製剤に関する。
更に、眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患又は糸球体腎炎に対する医薬製剤に関する。
【０００９】
更に、本発明は、以下の（１）、（２）、（３）、（４）、（５）または（６）に示すシナモンタンパク質に関する。
（１）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するマウス変異型シナモンタンパク質；
（２）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４に示すアミノ酸配列を有するマウス変異型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質；
（３）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列を有するマウス野生型シナモンタンパク質；
（４）配列表の配列番号５に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号５に示すアミノ酸配列を有するマウス野生型シナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質；
（５）配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列を有するヒトシナモンタンパク質；
（６）配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号６に示すアミノ酸配列を有するヒトシナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質。
更に、上記のシナモンタンパク質の一部分からなるペプチドに関する。
更に、上記のタンパク質、ペプチドに対する抗体に関する。
更に、上記の抗体を用いることを特徴とするシナモンタンパク質の類似タンパク質遺伝子のクローニング方法もしくは類似タンパク質の精製法に関する。
更に、上記のタンパク質、ペプチド、または抗体を用いた薬剤のスクリーニング方法に関する。
更に、上記の抗体を含む診断薬に関する。
更に、眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患もしくは糸球体腎炎の診断薬に関する。
更に、上記の抗体を用いた眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患もしくは糸球体腎炎の診断方法に関する。
更に、上記のタンパク質、ペプチド、または抗体を含む医薬製剤に関する。
更に、眼・皮膚アルビニズム並びに血小板機能不全症を主訴とするヘルマンスキー−パドラック症候群類似疾患及び糸球体腎炎に対する医薬製剤に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００１１】
（１−１）シナモンタンパク質をコードする遺伝子
本発明で用いるＥＯＤマウスについては特開平５−１０３５６２号公報に記載の生産方法により作成、供給される。また、本発明で用いるＥＯＤ毛色変異マウスについては、特開平０９−２７１２９４号公報の記載の方法によって作成される。なお、本出願人は、ＥＯＤ毛色変異マウスの受精卵を特許法施行規則第２７条の３第１項の規定に準じて分譲する用意がある。
本発明のＥＯＤ毛色変異マウスの変異遺伝子を同定するためには、シナモン毛色のＥＯＤ毛色変異マウスとＭＳＭ／Ｍｓｆマウスを交配し、退交配第１世代、退交配第２世代、退交配第２世代のインタークロスによる次世代を作出し、ゲノムワイド遺伝連鎖解析及びマイクロサテライトマーカーを用いた遺伝解析（Ｌｅｅ  Ｍ．  Ｓｉｌｖｅｒ編．  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （１  ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９５），  ｐｐ１３３−２８４  及び  Ｌａｎｄｅｒ  Ｅ，  Ｋｒｕｇｌｙａｋ  Ｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｉｔｓ：  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９５  Ｎｏｖ；１１（３）：２４１−７）により、変異遺伝子の染色体位置を決定することができる。この染色体位置近傍の遺伝子をＥＯＤマウス及びＥＯＤ毛色変異マウスで比較することで、ＥＯＤ毛色変異マウスの遺伝子変異を同定することができる。
【００１２】
ＥＯＤ毛色変異マウスに由来する、本発明の変異型マウス遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号１に示したとおりである。また、ＥＯＤマウスの正常型マウス遺伝子の配列番号１に相当する部分の塩基配列は配列表の配列番号２に示したとおりである。正常型マウス遺伝子から予想されるアミノ酸配列全長を、アミノ酸対核酸の検索プログラムを用いて、全核酸データベースに対して相同性検索を行った。得られた結果から、最も高い７７．４％の相同性を示したヒト遺伝子クローンをヒト相同遺伝子候補と考え、ヒト単球性白血病細胞株ＴＨＰ−１より精製したゲノムＤＮＡをもとにＰＣＲ法で翻訳領域全長をクローニングした。ヒト遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号３に示したとおりである。これら遺伝子は、現在までにヘルマンスキー−パラドック症候群の原因遺伝子と同定されているＨＰＳ１〜４と同一でなく、また相同でもなかった。
【００１３】
更に、配列表の配列番号１、２、３に示される塩基配列を有する遺伝子のタンパク質発現を確認する目的で、以後の実施例に示すように、配列表の配列番号１、２に示される塩基配列を有する遺伝子を接続した発現系プラスミドを構築し、哺乳類細胞株２９３Ｔ細胞に導入した形質転換体を作製した。この形質転換体は分子量３５Ｋ及び３０Ｋのタンパク質を発現し、遺伝子から想定される分子量のタンパク質を合成した。この結果より、配列表の配列番号１、２、３に示される塩基配列を有する遺伝子が、タンパク質をコードする遺伝子であることを明らかにした。本タンパク質をシナモンタンパク質と名づけた。
【００１４】
（１−２）シナモンタンパク質をコードする遺伝子の変異体
配列表の配列番号１、２及び３に示すそれぞれの塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号４、５及び６に示されるそれぞれのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４、５及び６のそれぞれのアミノ酸配列を有するシナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も、変異体の遺伝子として本発明の範囲内のものである。ここで同様の生物学的機能とは、より具体的には、配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を有するそれぞれのシナモンタンパク質が発現されるに際して、あるいは発現後において、メラニン色素形成と血小板機能に関係する機能及び腎炎の進展発症を制御し得る機能と同様の機能を有することを意味する。これらのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加の程度は、もとのアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９９％以上のものが許容し得る。
これらの遺伝子の変異体は、通常の部位特異的変異導入などの方法により構築することができる。
【００１５】
更には、配列表の配列番号１、２及び３に示すそれぞれの塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号１、２および３に示すそれぞれの塩基配列を有する遺伝子によりコードされる、配列番号４、５および６に示すそれぞれのシナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も、変異体の遺伝子として本発明の範囲内のものである。ここで同様の生物学的機能とは、上記したと同じ意味である。このようなハイブリダイズする遺伝子の変異体としては、部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異、欠失、連結等により部分的にＤＮＡ配列が変化したものが挙げられる。これらの変異体が配列番号１、２および３に示すコード遺伝子とハイブリダイズする程度としては次のようなものが挙げられる。ストリンジェントな条件下、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１Ｍ  塩化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％デキストラン硫酸、０．２ｍｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ、０．２ｍｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ）中で上記メンブランを６５℃にて、１時間保温し、プレハイブリダイゼーションとし、次に、放射性同位体標識した  ｃＤＮＡ断片を放射性同位体量にして１００万ｄｐｍ／ｍｌ  となるように添加し、６５℃にて、１６時間保温することにより、ハイブリダイゼーションを行う。続いて、このメンブランを、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム  を含む２×ＳＳＣ溶液（３００ｍＭ  塩化ナトリウム、３０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）中で、６５℃にて、３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーで解析した際にＸ線フィルム上でハイブリダイズが確認されるものである。
【００１６】
（２）本発明のシナモンタンパク質遺伝子を含む組換え体ベクター
本発明のシナモンタンパク質遺伝子を含むことを特徴とする組換え体ベクターを構築することで、該遺伝子を大腸菌や哺乳動物細胞などに安定に保持させることが可能であり、この際ベクターとして使用可能なものとして、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）等がある。以後に述べる実施例では、シナモンタンパク質遺伝子をｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ａベクター（ストラタジーン社）、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏベクター（クローンテック社）に組み込んだ組換え体ベクターが例示されている。これらベクターを必要に応じて適当な制限酵素等で切断した後、シナモンタンパク質遺伝子に接続し、シナモンタンパク質の大量発現及び機能解析を目的とするベクターとすることが出来る。
【００１７】
（３）形質転換体又は形質導入体
上記の組換え体ベクターを、適当な宿主に導入して形質転換体または形質導入体を構築することが出来る。大腸菌、酵母、哺乳動物培養細胞が使用可能である。シナモンタンパク質の大量発現及び機能解析用のベクターを保持する形質転換体は、上記のようにシナモンタンパク質遺伝子を大量発現及び機能解析用のベクターに組み込んだ組換え体ベクターを適当な宿主に形質転換することにより得られる。以後に述べる実施例では、シナモンタンパク質遺伝子をｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ａベクター（ストラタジーン社）、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏベクター（クローンテック社）に組み込んだ組換え体ベクターを導入した哺乳動物細胞株２９３Ｔ細胞、並びにｐＧＥＸ−６Ｐ−２およびｐＥＴ−３０ａベクターに組み込んだ組換え体ベクターを導入した大腸菌ＢＬ２１（インビトロージェン社）が例示されている。形質転換体又は形質導入体は適当な栄養培地で培養し、大量に発現したシナモンタンパク質を精製することやその細胞中のシナモンタンパク質のさらなる機能を解析することが出来る。以後に述べる実施例では、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２およびｐＥＴ−３０ａベクターでシナモン遺伝子導入された大腸菌ＢＬ２１（インビトロージェン社）が大量に発現したシナモンタンパク質の精製法が例示されている。
【００１８】
（４）ノックアウト動物またはトランスジェニック動物
本発明では、シナモンタンパク質遺伝子の一部を破壊した遺伝子を正常動物の染色体に相同的に組み換えることで、シナモンタンパク質を発現しないノックアウト動物が提供される。またはシナモンタンパク質遺伝子を正常動物の染色体に導入することで、生体内でシナモンタンパク質を大量に発現したトランスジェニック動物が提供される。さらに、シナモン変異遺伝子を正常動物の染色体に導入することで、シナモン遺伝子変異の表現型を有する動物が提供される。これらの動物により、生体内におけるシナモンタンパク質及びシナモン変異タンパク質のさらなる機能を解析することが出来る。
【００１９】
（５）核酸プローブ、それを用いた遺伝子のクローニング及び検出
本発明では上記のようにして得られた本発明のシナモンタンパク質遺伝子の一部又は全部を、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法による遺伝子増幅技術でのプライマー、並びに以下に述べるような遺伝子のクローニングなどに用いるための核酸プローブとして利用できる。本発明遺伝子の一部からなる核酸プローブとしては、１５ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチドからなる核酸プローブが挙げられる。該核酸プローブは上記本発明遺伝子又はその遺伝子断片を適当なベクターに接続し、細菌に導入し、複製させ、菌体破砕液からフェノールなどにより抽出、そしてベクターと接続した部位を認識する制限酵素で切断、電気泳動後、ゲルより切り出せば調製できる。また、該核酸プローブは、配列表の配列番号１、２、３の塩基配列に基づき、ＤＮＡ合成機による化学合成や、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法による遺伝子増幅技術によっても調製できる。該核酸プローブは使用時の検出感度を上げるために放射性同位体や、蛍光で標識することもできる。
【００２０】
該核酸プローブは、シナモンタンパク質と類似の機能を有する蛋白質をコードする遺伝子及び転写調節領域、プロモーター領域のクローニング方法に用いることが出来る。即ち、該核酸プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法、又は、ＰＣＲ法により、各種の生物組織のｃＤＮＡライブラリを探索すれば、本発明遺伝子と同様の機能を有するタンパク質遺伝子、または、各種の生物組織のゲノムライブラリを探索すれば、その上流及び下流に存在する転写調節領域、プロモーター領域の遺伝子を単離することができる。更に、本発明は、上記遺伝子の塩基配列の全体又は部分からなる核酸プローブに関する。
【００２１】
（６）アンチセンス遺伝子
本発明では、上記のシナモンタンパク質遺伝子のアンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡも提供される。これらのアンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを細胞に導入する、もしくは動物、ヒトに投与することにより、シナモンタンパク質遺伝子の発現を抑制すること又は上昇せしむることが可能である。導入するアンチセンスＤＮＡとしては、例えば配列表の配列番号１、２、３の対応するアンチセンスＤＮＡ又はその一部を用いることができる。また、これらのアンチセンスＤＮＡの一部を適当に切断して得た断片を用いてもよいし、これらのアンチセンスＤＮＡ配列に基づいて合成したＤＮＡを用いてもよい。
【００２２】
アンチセンスＲＮＡとしては、例えば配列表の配列番号１、２、３の対応するアンチセンスＲＮＡ又はその一部を用いることができる。アンチセンスＲＮＡとしては、例えば、これらのアンチセンスＲＮＡの一部を適当に切断して得た断片を用いてもよいし、これらのアンチセンスＲＮＡ配列に基づいて合成したＲＮＡを用いてもよい。また、例えば配列表の配列番号１、２、３のシナモンタンパク質遺伝子又はその一部を適当なベクターに接続し、細菌に導入し、複製させ、菌体破砕液からフェノールなどにより抽出したものを鋳型として、イン・ビトロ転写系でＲＮＡポリメラーゼを作用させて作製したＲＮＡを用いてもよい。アンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡは生体内で分解されにくい様に、更に、細胞膜を通過できるように化学的な修飾を施しておくことができる。このようにして調製したアンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡは、血小板機能異常に関する疾患、糸球体腎炎を始めとする各種疾患の治療に使用することができる。
【００２３】
（７）遺伝子の薬剤のスクリーニングの利用
本発明では、本発明の形質転換体、形質導入体、ノックアウト動物、トランスジェニック動物を用いた新規薬剤のスクリーニング方法が提供される。例えば、シナモンタンパク質遺伝子を接続した組換え体プラスミドを導入した培養細胞を用い、細胞内で発現したシナモンタンパク質の活性を抑制する物質をスクリーニングすることによって、シナモンタンパク質機能を抑制する物質を発見することができる。組換え体プラスミドを導入する培養細胞としては、実施例中で用いた哺乳動物細胞株２９３Ｔ細胞を始め、継代培養可能な如何なる培養細胞株も使用可能である。組換えプラスミドとしては、実施例中で用いたｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ａベクター、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏベクターを始め、あらゆるベクターが使用可能である。スクリーニング系の構築にあたっては、培養細胞株を選択し、スクリーニング用ベクターをエフェクテン試薬（キアゲン社）等を用いたリポフェクション法等を用いて導入する。これらの細胞はこのままスクリーニングに用いても良いし、クローニングすることによって、単一の細胞株として調製した後、スクリーニングに用いてもよい。これらの細胞に、サンプルを添加し、そのシナモンタンパク質の活性を測定することによって、シナモンタンパク質の機能を調節する物質を探索することができる。サンプルとしては、例えば微生物二次代謝産物を用いてもよいし、合成した化合物を用いてもよい。シナモンタンパク質の機能を活性化あるいは阻害する物質は、ヘルマンスキー−パドラック症候群等の血小板機能異常を示す疾患や糸球体腎炎等の腎疾患を始めとする各種疾患に対して効果を示し、新規治療剤になると期待される。
【００２４】
（８）遺伝子の診断薬および医薬製剤の利用
上記した遺伝子、その一部分、その部分配列であるオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡは、ヘルマンスキーパドラック症候群等の眼・皮膚アルビニズムと血小板機能異常を示す各種疾患や糸球体腎炎等の腎疾患を始めとする各種疾患の診断薬および治療薬となりうる。
例えば、診断対象者から得た組織、血液、血清、細胞などの検体中のシナモン遺伝子の有無あるいはレベルを調べることにより、ヘルマンスキーパドラック症候群等の眼・皮膚アルビニズムと血小板機能異常を示す各種疾患や糸球体腎炎等の腎疾患を始めとする各種疾患の診断を行うことができる。例えば、シナモン遺伝子そのもの、あるいはシナモン遺伝子の発現の際に生成してくるシナモン遺伝子に対応するｍＲＮＡなどを測定することにより、または発現したシナモンタンパク質のレベルを測定することにより診断できる。即ち、組織、血液、血清、細胞などの生物学的試料を調製し、核酸を抽出し、シナモン遺伝子そのもの、あるいはシナモン遺伝子に対応するｍＲＮＡなどを分析するか、あるいは後述するシナモンタンパク質に対する抗体を用いてシナモンタンパク質を分析することにより診断が可能である。
より具体的には、例えば、上記したようにして、シナモン遺伝子の塩基配列からデザインし調製した１５以上のヌクレオシドからなるプローブを用いて、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法などにより試料中のシナモン遺伝子あるいはその対応するｍＲＮＡなどを分析することができる。更にはＤＮＡチップを用いて発現の際に生じるｍＲＮＡを測定することも可能である。
また、シナモンタンパク質に対する抗体を用いてシナモンタンパク質を分析するには、後に説明するように、シナモンタンパク質もしくはその断片で動物を免疫して動物から得られる抗血清、抗血清から精製されるポリクローナル抗体、あるいは免疫した動物からの脾細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させて得られるハイブリドーマ細胞が産生するモノクロ−ナル抗体で、ウエスタンブロティング法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、組織染色などを行うことにより、シナモンタンパク質の発現レベルを測定し、シナモン遺伝子の有無等を分析することができる。
【００２５】
また、シナモンタンパク質遺伝子、その一部分、そのアンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡなどをを細胞に導入する、もしくは動物、ヒトに投与することにより、シナモンタンパク質遺伝子の発現を抑制すること又は上昇せしむることが可能であり、それによって、ヘルマンスキーパドラック症候群等の眼・皮膚アルビニズムと血小板機能異常を示す各種疾患や糸球体腎炎等の腎疾患を始めとする各種疾患を治療薬することができる。これらのアンチセンスＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとしては、例えば配列表の配列番号１、２、３に対応するアンチセンスＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ又はその一部を用いることができる。また、これらのアンチセンスＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの一部を適当に切断して得た断片を用いてもよいし、これらのアンチセンスＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ配列に基づいて合成したＤＮＡおよびＲＮＡを用いてもよい。
【００２６】
（９−１）シナモンタンパク質
本発明のＥＯＤ毛色変異マウスの変異型シナモン遺伝子から想定される変異型シナモンタンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４に示したとおりである。また、同様にＥＯＤマウスの正常型シナモン遺伝子及びヒトシナモン遺伝子から想定されるマウス正常シナモンタンパク質及びヒトシナモンタンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５及び６に示したとおりである。
【００２７】
（９−２）シナモンタンパク質の変異体
配列表の配列番号４、５および６に示すそれぞれのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４、５および６に示すそれぞれのアミノ酸配列を有するシナモンタンパク質と同様の生物学的機能を有するタンパク質も、シナモンタンパク質の変異体として本発明の範囲内のものである。ここで同様の生物学的機能とは、より具体的には、上記したように、配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を有するそれぞれのシナモンタンパク質が発現されるに際して、あるいは発現後において、メラニン色素形成と血小板機能に関係する機能及び腎炎の進展発症を制御し得る機能と同様の機能を有することを意味する。これらのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加の程度は、もとのアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９９％以上のものが許容し得る。
【００２８】
（１０）シナモンタンパク質またはその一部分に対する抗体
本発明では上記のようにして得られた本発明のシナモンタンパク質の一部又は全部を、以下に述べるような抗体作成などに用いるための抗原として利用できる。
シナモンタンパク質の一部からなる抗原としては、５アミノ酸以上のペプチドからなる抗原が挙げられる。該抗原をマウス、ラット等に感作して抗体産生細胞を採取し、抗体産生細胞とハイブリドーマ細胞と融合し、この融合細胞の培養上清から、シナモンタンパク質に対するモノクローナル抗体が得られる。または、該抗原は完全フロイドアジュバントまたは不完全フロイドアジュバント等のアジュバントを用いて懸濁し、ウサギ、ラット等の動物に皮下投与もしくは筋肉内投与を数回行った後、採取した血液から血清を分離し、シナモンタンパク質に対する抗血清が得られ、さらに抗血清をアフィニティカラム等により精製することにより、ポリクローナル抗体が得られる。以後に述べる実施例では、ウサギを用いたポリクローナル抗体作製が例示されている。また、該抗原は、配列表の配列番号４、５、６のアミノ酸配列に基づき、ペプチド合成機による化学合成によっても調製できる。
【００２９】
上記抗体は、シナモンタンパク質と類似の機能を有する蛋白質のクローニング方法に用いることが出来る。即ち、該抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法により、各種の生物組織のｃＤＮＡライブラリを探索すれば、本発明タンパク質と類似のタンパク質遺伝子を単離することができる。更に、該抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法等によりシナモンタンパク質を検出及び定量したり、細胞及び生体内の局在を検出することができる。以後に述べる実施例では、該抗体を用いたウェスタンブロッティング法及びＥＬＩＳＡ法によるシナモンタンパク質の検出法及び定量法が例示されている。該抗体は使用時の検出感度を上げるために放射性同位体や、蛍光で標識することもできる。更に、該抗体を細胞と共培養する、もしくは動物、ヒトに投与することにより、シナモンタンパク質の機能を抑制すること又は上昇せしむることが可能である。更に、該抗体及び該抗血清は、血小板機能異常に関する疾患、糸球体腎炎を始めとする各種疾患の治療に使用することができる。
【００３０】
（１１）タンパク質、ペプチド、抗体の薬剤のスクリーニングの利用
本発明では、本発明のタンパク質、ペプチド、抗体を用いた新規薬剤のスクリーニング方法が提供される。例えば、シナモンタンパク質もしくはペプチドを用い、シナモンタンパク質と結合する物質もしくは活性を調節する物質をスクリーニングすることによって、シナモンタンパク質機能を抑制もしく促進する薬剤を発見することができる。また、抗体を用いたＥＬＩＳＡ法やフローサイトメトリー法により、シナモンタンパク質の発現を調節する物質をスクリーニングすることによって、シナモンタンパク質発現を抑制もしく促進する薬剤を発見することができる。サンプルとしては、例えば微生物二次代謝産物を用いてもよいし、合成した化合物を用いてもよい。シナモンタンパク質の機能を活性化あるいは阻害する物質は、ヘルマンスキー−パドラック症候群等の血小板機能異常を示す疾患や糸球体腎炎等の腎疾患を始めとする各種疾患に対して効果を示し、新規治療剤になると期待される。
【００３１】
（１２）タンパク質、ペプチド、抗体の医薬製剤及び診断薬の利用
上記したタンパク質、ペプチド、抗体は、ヘルマンスキー−パドラック症候群等の眼・皮膚アルビニズムと血小板機能異常を示す各種疾患や糸球体腎炎等の腎疾患を始めとする各種疾患の治療薬剤となりうる。
また、上記したシナモンタンパク質またはそのペプチドに対する抗体を用いて、検体中のシナモンタンパク質の有無もしくはレベルを調べることにより、ヘルマンスキー−パドラック症候群等の眼・皮膚アルビニズムと血小板機能異常を示す疾患や糸球体腎炎等の腎疾患を始めとする各種疾患の診断を行うことができる。具体的には、診断対象者から、組織、血液、血清、細胞などの生物学的試料を調製し、上記した抗体で、ウエスタンブロティング法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、組織染色などを行うことにより、シナモンタンパク質の有無もしくはレベルを測定し、診断することができる。
【００３２】
また、シナモンタンパク質遺伝子、その一部分、そのアンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡなどをを細胞に導入する、もしくは動物、ヒトに投与することにより、シナモンタンパク質遺伝子の発現を抑制すること又は上昇せしむることが可能であり、それによって、ヘルマンスキーパドラック症候群等の血小板機能異常を示す疾患や糸球体腎炎等の腎疾患を始めとする各種疾患を治療薬することができる。これらのアンチセンスＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡとしては、例えば配列表の配列番号１、２、３に対応するアンチセンスＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ又はその一部を用いることができる。また、これらのアンチセンスＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの一部を適当に切断して得た断片を用いてもよいし、これらのアンチセンスＤＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ配列に基づいて合成したＤＮＡおよびＲＮＡを用いてもよい。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
シナモンタンパク質の遺伝子
（１−１）ＥＯＤ毛色変異マウスの変異遺伝子の染色体位置の同定
ＥＯＤ毛色変異マウスの変異遺伝子の染色体位置を同定した。ＥＯＤ毛色変異マウスについては、特開平０９−２７１２９４号公報の記載の方法によって作成される。以下に実験手順を示す。
ＥＯＤ毛色変異マウスの毛色（シナモン色、常染色体劣性遺伝）の責任遺伝子座を同定するため、ＥＯＤ毛色変異マウスの雌（シナモン色）とＭＳＭ／Ｍｓｆマウスの雄（野生色）を交配し、退交配第１世代（Ｎ２、１３５匹）を作出した。さらに、Ｎ２の野生色マウス（ヘテロ接合体）を用いて、退交配第２世代（Ｎ３、５６匹）とインタークロスによる次世代（Ｎ２Ｆ１、１９５匹）を作出した。第１段階の責任染色体の同定は、Ｎ２マウスを対象に、全染色体領域を平均２０センチモルガン幅間隔で網羅するマウス遺伝子多型マーカー（マイクロサテライトマーカー）を用いたゲノムワイド遺伝連鎖解析により行った。ゲノムワイド遺伝連鎖解析により、ＥＯＤ毛色変異マウスの毛色責任遺伝子座が第５染色体に位置することが見出され、第２段階の責任染色体領域の絞り込みは、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ２Ｆ１の全マウスを対象に、第５染色体に位置するマイクロサテライトマーカー１３種を用いた遺伝連鎖解析により行った。結果を表１に示す。上記マウス３８４匹において、毛色（表現型）と遺伝子マーカーのＤ５Ｍｉｔ２８８（遺伝型）が完全に一致し、Ｄ５Ｍｉｔ２８８から離れた位置にある遺伝子マーカーほど毛色と一致するマウス数が減少した。
【００３５】
【表１】
2004283066.tif 000002
【００３６】
表１の結果から、毛色責任遺伝子はＤ５Ｍｉｔ２８８の近傍、すなわち第５染色体の２０ｃＭの近傍に位置することを見出した。
【００３７】
（１−２）ＥＯＤ毛色変異マウスのシナモンタンパク質の変異及び遺伝子配列の決定
遺伝連鎖解析の結果にもとづき、Ｄ５Ｍｉｔ７６とＤ５Ｍｉｔ２３０のマイクロサテライトマーカーの間に存在する位置的候補遺伝子を選出した。なお、この過程はＥｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザおよびＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚゲノムブラウザ上に公開されたマウスゲノム情報を参考に行った。
各位置的候補遺伝子に関して、ＥＯＤ毛色変異マウスと非変異系統マウスからの脳、皮膚、脾臓ｍＲＮＡに対して、逆転写酵素依存性ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、得られた各増幅断片を塩基配列の決定に供した。なお、位置的候補遺伝子に関するＰＣＲ用プライマーは、既知のｍＲＮＡ配列情報あるいはＥｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザ上に公開されている予想エクソン情報を参考に作製した。該変異遺伝子の変異部位の同定に用いられたプライマーは配列番号７及び配列番号８に示した。胚遺伝子上での変異実在の証明は、同プライマーを用いたゲノムＰＣＲ法で変異部位を含む遺伝子断片を増幅し、その塩基配列決定により行った。ＥＯＤ毛色変異マウス及び非変異系統マウスの脳、皮膚、脾臓のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２．５  μｇを鋳型に、配列表の配列番号７及び８に示されるプライマーセットを用いて、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。逆転写酵素として、ＭＭｏＬＶ由来のリバーストランスクリプターゼＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（インビトロージェン社）を用い、４２℃で１時間反応した。反応を７０℃で１０分の熱処理で停止した後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス−塩酸ｐＨ８，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）で５倍に希釈し、ＰＣＲの鋳型とした。ＤＮＡポリメラーゼは、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた。第１次ＰＣＲは、配列表の配列番号７並びに８に示されるプライマーセットを用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（３０秒）を１サイクルとし、３５サイクル増幅した。ＰＣＲ増幅産物は、一部をｐＣＲベクター（インビトロージェン社）にクローニングした。残りのＰＣＲ産物を用いて、その５’，  ３’両側から塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ  （ＰＥ  ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるサイクルシークエンス法とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ  （ＰＥ  ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
この結果、ＥＯＤ毛色変異マウスの遺伝子で、非変異系統マウスの遺伝子の１塩基の欠損が認められるシナモンタンパク質遺伝子が同定された。
【００３８】
ＥＯＤ毛色変異マウス由来の変異型シナモンタンパク質遺伝子を配列表の配列番号１に示す。また、非変異系統マウスの野生型シナモンタンパク質遺伝子を配列表の配列番号２に示す。変異型シナモンタンパク質遺伝子及び野生型シナモンタンパク質遺伝子は、ともに１５〜１７番目に開始コドンａｔｇがあり、この位置からタンパク質翻訳領域が始まる。変異型シナモンタンパク質遺伝子では、野生型遺伝子の４７１番目のグアニン（Ｇ）が欠損している。この変異は翻訳領域内にあり、この１塩基の欠損によりフレームシフトが起こり、変異マウスでは異なるタンパク質が翻訳される。この変異型遺伝子及び野生型遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号４及び５に示す。変異遺伝子のコードするタンパク質は、正常遺伝子のコードするタンパク質の１６１番目のアミノ酸から、異なるアミノ酸配列となる。また、変異遺伝子では７４１〜７４３番目、正常遺伝子では６６０〜６６２番目に終始コドンｔｇａが現れるため、変異遺伝子からは２４２残基の、正常遺伝子からは２１５残基の異なるタンパク質が翻訳される。
【００３９】
（１−３）ヒトシナモンタンパク質遺伝子の塩基配列の決定
該変異遺伝子に対応するマウス正常遺伝子から予想されるアミノ酸配列全長を、アミノ酸対核酸の検索プログラムＢｌａｓｔを用いて、全核酸データベースに対して相同性検索を行った。得られた結果から、最も相同性の高いヒト遺伝子クローンをヒト相同遺伝子候補と考え、ヒト単球性白血病細胞株ＴＨＰ−１より精製したゲノムＤＮＡをもとにＰＣＲ法で翻訳領域全長をクローニングした。
【００４０】
ヒトの野生型遺伝子の塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号３及び６に示す。
【００４１】
上記の実験から、変異マウスでは正常遺伝子の１塩基が欠損している変異遺伝子を単離し、この変異遺伝子からは、正常遺伝子とは異なるアミノ酸配列をもつタンパク質が翻訳されることが示された。また、ヒトにおいてもマウス野生型遺伝子に相当する遺伝子が単離され、マウス野生型遺伝子に対して７７．４％の相同性を示した。
【００４２】
実施例２
哺乳動物細胞でのシナモン遺伝子のタンパク質発現
配列番号１に示す変異型遺伝子および配列番号２に示す正常型遺伝子の翻訳開始コドンの上流と終始コドン下流に、それぞれＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩの制限酵素認識配列をリンカーＰＣＲ法によって導入し、ＰＣＲ増幅遺伝子断片をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩ消化後、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ａ（ストラタジーン社）ベクターのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位に導入し、該タンパク質のアミノ基末端側に人工的アミノ酸配列（ＦＬＡＧ；  ＤＹＫＤＤＤＤＫ）が付加された融合タンパク質の翻訳領域を構築した。また、これらのベクターからＮｏｔＩとＥｃｏＲＩ消化でＦＬＡＧ融合タンパク質の翻訳領域全長を切り出し、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏベクター（クローンテック社）の同部位に再挿入した。以上の発現ベクターは、エフェクテン試薬（キアゲン社）で哺乳動物細胞２９３Ｔ細胞に導入した。
タンパク質の発現および細胞内局在の同定は、蛍光抗体法とウエスタンブロティング法により行った。蛍光抗体法は、次の方法で行った。遺伝子導入２日後の細胞をメタノール・アセトン（１：１）固定液で−２０℃にて１５分固定後に風乾し、ＰＢＳバッファーで５分洗浄してから、２．５％スキムミルク（ナカライ社）、０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで室温１時間のブロッキングを行った。続いて、ビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ社）あるいは抗ヒトビメンチン抗体（ダコ社）を同ブロッキング液で希釈して、細胞と室温１時間反応した。０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで室温５分、４回洗浄後、それぞれストレプトアビジンＦＩＴＣあるいはＴＲＩＴＣ結合抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社）と室温１時間反応した。０．１％ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳにて室温５分、４回洗浄後、後者に対してはビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体とストレプトアビジン−ＦＩＴＣの反応系列を繰り返し、前者に対してはプロピジウムアイオダイドによる核染色を施した。ウエスタンブロッティング法は、次の方法で行った。遺伝子導入２日後の細胞を０．５％デオキシコール酸、０．１％ＮＰ−４０含有バッファーで２  ｘ  １０７個／ｍｌの細胞密度で溶解し、４℃２０分静置後、遠心にて上清を回収した。上清をＳＤＳサンプルバッファー（±２メルカプトエタノール）と１：１に混合して、さらに加熱後、電気泳動に供した。電気泳動は、ＳＤＳ含有１５％アクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で行った。泳動後、セミドライ転写装置でＰＶＤＦ膜（ミリポア社）にタンパク質を転写し、ビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体とストレプトアビジンＨＲＰ（アマシャム・ファルマシア社）で転写膜を反応した。最後にＥＣＬ溶液（アマシャム・ファルマシア社）で目的のタンパク質を可視化した。
【００４３】
図１に結果を示す。野生型シナモンタンパク質遺伝子は、主に細胞質に存在し、ウエスタンブロット上約３０  ｋＤのタンパク質として、一方、変異型シナモンタンパク質遺伝子は、主に核内に存在し、ウエスタンブロット上約３５  ｋＤのタンパク質として発現することが示された。ウエスタンブロットで示されたタンパク質の分子量は、配列表の配列番号４及び５で示されるアミノ酸配列から推定される分子量にほぼ一致した。
【００４４】
上記の結果から、変異型遺伝子及び正常遺伝子からタンパク質が合成され、タンパク質をコードする遺伝子であることが示された。
【００４５】
実施例３
毛色と糸球体腎炎発症進展の遺伝学的連関
マウス糸球体腎炎の評価は、１６週齢から２０週齢のマウスより得られた腎臓組織切片（ＰＡＳ染色標本）を用いて行った。糸球体腎炎の重症度の判定は、個々の糸球体を高倍率（４００倍）で観察し、下記の基準にもとづいてスコア化し、２０個の糸球体が与えたスコアの平均値を個体の糸球体腎炎重症度指数とした。スコア化の基準は、１；正常、２；軽度のメサンギウム基質および細胞の増加、あるいは軽度の炎症性細胞の浸潤を認めるもの、３；２の所見の高度化に加え、糸球体基底膜肥厚（ｍｅｍｂｒａｎｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、あるいは分葉化（ｌｏｂｕｌａｔｉｏｎ）、あるいは分節性硝子化変性（ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｈｙａｌｉｎｏｓｉｓ）のいずれかを満たすもの、４；半月体形成（ｃｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）あるいは全糸球体硬化（ｇｌｏｂａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）のいずれかを満たすもの、の４段階とした。毛色と糸球体腎炎の重症度判定は、ＥＯＤマウス、ＥＯＤ毛色変異マウス、上記２系統の仔（Ｆ１）、Ｆ１の仔（Ｆ２）に対して行い、平均指数の群間差の有意性は、マン・ホイットニー検定で判定した。
【００４６】
図２に結果を示す。ＥＯＤマウスとＥＯＤ毛色変異マウスを交配した（ＥＯＤマウス  Ｘ  ＥＯＤ毛色変異マウス）Ｆ１マウスは正常毛色を示し、また、ＥＯＤと同等の重症度の糸球体腎炎を示した。この（ＥＯＤマウス  Ｘ  ＥＯＤ毛色変異マウス）Ｆ１マウスとＥＯＤ毛色変異マウスを交配した（Ｆ１マウス  Ｘ  ＥＯＤ毛色変異マウス）Ｆ２マウスでは、正常毛色のマウスは重症の糸球体腎炎を示し、異常毛色のマウスは軽症の糸球体腎炎を示した。また、Ｆ２マウスで、正常毛色と異常毛色のマウスが６０匹と２０匹生じ、３：１の割合であった。
【００４７】
これらの結果により、毛色と糸球体腎炎が同一の劣性遺伝子で規定される形質であることを示した。したがって、毛色に関与するシナモンタンパク質の遺伝子は糸球体腎炎の発症進展に関与することが示された。
【００４８】
実施例４
毛色と血小板機能の遺伝学的連関
血小板機能に関しては、出血時間、血小板凝集能、血小板セロトニン含量測定を行った。出血時間は、尾動脈切断後の出血時間を濾紙法により測定した。血小板凝集能は、マウス血液より血小板濃縮血漿を得て、血小板濃度を一定に調整した後に、牛タイプＩコラーゲン  ５  μｇ／ｍｌ  （シグマ社）で惹起される凝集反応をアグリゴメーターで評価した。血小板セロトニン含量は、血小板濃縮血漿から回収した血小板分画を１０％ＴＣＡで除タンパクした後、上清中のセロトニン量をＨＰＬＣ法によって定量した。
【００４９】
図３に結果を示す。ＥＯＤ毛色変異マウスは、ＥＯＤマウスと比較して、血小板セロトニン含有量が少なく、牛コラーゲンで惹起される血小板凝集反応が低く、また止血時間も延長した。更に、ＥＯＤ毛色変異マウスと血小板機能が正常である非変異系統マウスを交配して得たＦ１マウスでは、野生型の毛色と非変異系統マウスと変わらない止血時間を示し、血小板機能は正常であった。
次に、Ｆ１マウスとＥＯＤ毛色変異マウスを交配したＦ２マウスでは、野生型毛色とシナモン毛色を示したマウスが３：１の割合で生まれ、シナモン毛色のマウスは野生型毛色のマウスに比べ、止血時間の著明な延長が認められた。
【００５０】
これらの結果により、毛色と血小板機能が同一の劣性遺伝子で規定される形質であることを示した。したがって、毛色に関与するシナモンタンパク質の遺伝子は血小板機能に関与することが示された。
【００５１】
実施例５
抗シナモンタンパク質ポリクローナル抗体の作製とＥＬＩＳＡ法
（５−１）形質転換体発現シナモンタンパク質の精製
マウス野生型シナモンタンパク質の全長をコードするｃＤＮＡ上の翻訳領域（配列表の配列番号２に示す塩基配列）を、制限酵素認識配列を付加したオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し、ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化後、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２およびｐＥＴ−３０ａベクターのＢａｍＨＩ，  ＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。それぞれのベクターを大腸菌ＢＬ２１（インビトロージェン社）に導入して形質転換株を得、ＩＰＴＧ（和光純薬）０．３ｍＭ存在下でＧＳＴ−シナモン融合タンパク質と６ｘヒスチジン−シナモン融合タンパク質の発現を誘導した。菌体より、グルタチオンセファロース（アマシャム・ファルマシア社ニッケルセファロース（キアゲン社）を用いて、それぞれの融合タンパク質を精製した。
【００５２】
（５−２）抗シナモンタンパク質ポリクローナル抗体の作製
上記精製ＧＳＴ−シナモン融合タンパク質は、さらにｐｒｅｃｉｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャム・ファルマシア社）で処理し、ＧＳＴ部分を除いたシナモンタンパク質部分を回収して、これをポリクローナル抗体作製のための免疫抗原として用いた。Ｋｂｓ：ＪＷウサギ（北山ラベス、雄、２．４２〜２．４６ｋｇ）に、フロイド完全アジュバント（シグマ社）と懸濁した免疫抗原を皮下投与し、１週間後に再度皮下投与した。その１週間後、フロイド不完全アジュバントと懸濁した免疫抗原を皮下投与し、さらにその１週間後に採血した。抗血清の分離、アフィニティー精製を行い、抗シナモンタンパク質ポリクローナル抗体を得た。アフィニティー精製は、以下の方法で行った。アフィニティーカラムは、上記精製６ｘヒスチジン−シナモン融合タンパク質をＮＨＳ活性化カラム（アマシャム・ファルマシア社）に結合して作製した。ウサギ抗血清４０ｍｌを等量のリン酸バッファー  ｐＨ７．４で希釈し、濾過で不溶性沈殿物を除去後、アフィニティーカラム内に循環させた。リン酸バッファー  ｐＨ７．４で非結合タンパク質を洗浄後、グリシンバッファー  ｐＨ３．６で結合抗体を溶出した。溶出分画をリン酸バッファー  ｐＨ７．４に対して透析した。
【００５３】
（５−３）抗シナモンタンパク質ポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法
シナモンタンパク質をイムノプレート（ヌンク社）に吸着し、３％仔牛血清アルブミン（シグマ社）でブロッキングした後、１／１００、１／５００、１／２５００、１／１２５００に希釈した該ポリクローナル抗体、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識マウス抗ウサギＩｇＧ抗体（アマシャム・ファルマシア社）を順次反応させ、ＴＭＢパーオキシダーゼ基質キット（バイオラッド社）で発色し、６５５ｎｍの吸光度を測定した。
【００５４】
図４に結果を示す。該ポリクローナル抗体を用いた場合、希釈度依存的に発色が認められた。これに対して、免疫抗原感作前に採取した対照血清を用いた場合は発色しなかった。
【００５５】
この結果により、抗シナモンタンパク質ポリクローナル抗体はシナモンタンパク質と特異的に結合し、ＥＬＩＳＡ法によりシナモンタンパク質を高感度に検出できることが示された。
【００５６】
（５−４）細胞内及び生体組織におけるシナモンタンパク質の発現
ウエスタンブロッティング法は、次の方法で行った。培養細胞及びマウス組織を、０．５％デオキシコール酸、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ含有バッファーで細胞数５  ｘ  １０７個／ｍｌ及び組織量０．１ｇ／ｍＬの濃度で溶解し、４℃、２０分静置後、遠心にて上清を回収した。上清をＳＤＳサンプルバッファー（＋２メルカプトエタノール）と１：１に混合して、さらに加熱後、電気泳動に供した。電気泳動は、ＳＤＳ含有１２％アクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で行った。泳動後、セミドライ転写装置でＰＶＤＦ膜（ミリポア社）にタンパク質を転写し、該抗シナモンタンパク質ポリクローナル抗体と西洋ワサビパーオキシダーゼ標識プロテインＡ（アマシャム・ファルマシア社）で転写膜を反応した。最後にＥＣＬ溶液（アマシャム・ファルマシア社）で目的のタンパク質を可視化した。
【００５７】
図５に結果を示す。（Ａ）において、培養細胞におけるシナモンタンパク質の発現を示す。野生型シナモン遺伝子強制発現細胞（レーン１）と変異型シナモン遺伝子強制発現細胞（レーン２）において、配列表の配列番号４及び５で示されるアミノ酸配列から推定される分子量にほぼ一致した位置にバンドが検出された。また、野生型系統マウス（レーン３）および（野生型系統×ＥＯＤ変異）Ｆ１マウス（レーン５）に由来する胎児線維芽細胞においてシナモンタンパク質のバンドが認められたが、ＥＯＤ変異マウス（レーン４）由来の胎児線維芽細胞では認められなかった。（Ｂ）において、野生型系統マウス（ｗｔ）とＥＯＤ変異マウス（ｍ）の脳（ｂｒａｉｎ）、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）、骨髄（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ）におけるシナモンタンパク質の発現を示す。シナモンタンパク質の発現は、野生型系統マウスのいずれの組織においても認められたが、ＥＯＤ変異マウスでは認められなかった。
【００５８】
上記の結果から、本発明のシナモン遺伝子は、野生型生物の細胞内及び生体組織内でシナモンタンパク質を発現し、内在性タンパク質として存在することが示された。一方で、シナモン変異遺伝子は、形質転換体等での強制発現系においてタンパク質として発現するが、細胞内及び生体組織内では発現しないことが示された。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、毛色、血小板機能、糸球体腎炎の発症進展に関与するシナモンタンパク質、並びにシナモンタンパク質をコードする遺伝子が提供された。これらは、血小板機能異常の疾患及び腎疾患を始めとする疾患の診断、治療に有用である。さらに本発明により、該遺伝子のアンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ、該遺伝子にハイブリダイズ可能な核酸プローブ、その核酸プローブを用いた該遺伝子の検出方法、該遺伝子を導入させた形質転換体、該タンパク質に対する抗体及び抗血清、その抗体を用いた該タンパク質の検出方法、これらを用いた薬剤のスクリーニング法などが提供された。これらも血小板機能異常の疾患及び腎疾患等の疾患の診断、治療に有用である。更に、ＥＯＤ毛色変異マウス、シナモンタンパク質遺伝子ノックアウト動物、シナモンタンパク質遺伝子トランスジェニック動物、シナモン変異タンパク質遺伝子トランスジェニック動物は、ヘルマンスキーパドラック症候群等の血小板機能異常の疾患及び糸球体腎炎等の腎疾患を始めとする疾患のモデル動物として有用である。
【００６０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】シナモンタンパク質遺伝子を挿入したｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ａ及びｐＩＲＥＳｐｕｒｏベクターを哺乳動物細胞  ２９３Ｔ細胞に導入した。シナモンタンパク質はＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）が付加された融合タンパク質として発現され、ＦＬＡＧに対する抗体によりタンパク質を検出した。（Ａ）ウェスタンブロッティング法により、野生型シナモンタンパク質遺伝子からは３０  Ｋのバンドが、変異型シナモンタンパク質遺伝子からは３５  Ｋのバンドが検出された。（Ｂ）蛍光抗体法により、野生型および変異型シナモンタンパク質の細胞内局在を示す。野生型シナモンタンパク質は主に細胞質に、一方変異型シナモンタンパク質の発現は主に核内に認められた。
【図２】野生型ＥＯＤマウス（ｗｔ）とＥＯＤ毛色変異マウス（ｍｕｔ）を交配したＦ１マウスは正常毛色を示し、また、ＥＯＤと同等の重症度の糸球体腎炎を示した。このＦ１マウスとＥＯＤ毛色変異マウスを交配したＦ２マウスで、正常毛色を示したマウス（Ｆ２  ａｇｏｕｔｉ）は重症の糸球体腎炎を示し、変異毛色を示したマウス（Ｆ２  ｄｉｌｕｔｅｄ）は軽症の糸球体腎炎を示した。
【図３】ＥＯＤ毛色変異マウスは、野生型ＥＯＤマウスに比べ、血小板凝集率が減少し（Ａ）、止血時間の延長が認められた（Ｂ）。
【図４】抗シナモンタンパク質抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により、抗シナモンタンパク質に対して抗体希釈度依存的に発色が認められた。免疫抗原感作前ＩＩ採取した対照血清を用いた場合は発色しなかった。
【図５】抗シナモンタンパク質ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング法により内在性のシナモンタンパク質を検出した。（Ａ）野生型シナモン遺伝子強制発現細胞（レーン１）と変異型シナモン遺伝子強制発現細胞（レーン２）において、配列表の配列番号４及び６で示されるアミノ酸配列から推定される分子量にほぼ一致した位置にバンドが検出された。また、シナモンタンパク質の発現は、野生型系統マウス（レーン３）および（野生型系統×ＥＯＤ変異）Ｆ１マウス（レーン５）に由来する胎児線維芽細胞において認められたが、ＥＯＤ変異マウス（レーン４）由来の胎児線維芽細胞では認められなかった。（Ｂ）野生型系統マウス（ｗｔ）とＥＯＤ変異マウス（ｍ）の脳（ｂｒａｉｎ）、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）、骨髄（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ）におけるシナモンタンパク質の発現を示す。シナモンタンパク質の発現は、野生型系統マウスのいずれの組織においても認められたが、ＥＯＤ変異マウスでは認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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