(57)【要約】【課題】  試料中に含まれるコリンエステラーゼ活性阻害の性質を示す残留農薬の測定方法であり、簡便、迅速かつ選択性よく農薬を測定する方法を提供する。【解決手段】  比較的容易なクリーンアップ工程で農作物中からの農薬成分の精製・抽出を行った測定溶液について、帰属農作物により変化する因子を補正するためのデータベースと、被検農薬毎に変化する因子を補正するためのデータベースと、被検農薬毎のコリンエステラーゼ阻害能に関するデータベースとを用意し、検出成分への影響と測定ノイズが極力少ない反応・検出系を用いてコリンエステラーゼ活性測定を行った測定結果と、理想溶液中での測定結果との比較値からミカエリス・メンテンスの動力学的処理に基づいた該農薬成分の定量計算を行う。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリンエステラーゼ活性低下の程度から農作物中に含まれるコリンエステラーゼ阻害性農薬を測定する方法において、（１）比較的簡易な前処理方法で得られる試料の抽出溶液中でコリンエステラーゼ活性測定を行い、農薬非共存下の理想溶液中で同様の測定を行った結果との比較を行うことで求まるコリンエステラーゼ活性阻害の程度示す測定値を、（２）予め求めデータベース化した帰属農作物毎に決まる第１と第２の補正係数：αとβとにより補正した数値と、（３）予め求めデータベース化した農薬毎に異なるコリンエステラーゼ阻害能を示す定数：Kiと、（４）予め求めたコリンエステラーゼの触媒特性に関する定数：Kmと、（５）測定溶液中での基質の濃度とを、ミカエリス・メンテンス型酵素の拮抗阻害反応に基づく動力学的計算式に代入することで、抽出溶液中に含まれる前記農薬濃度を一時的に算出し、さらに、（６）予め求めデータベース化した被検農薬毎に決まる第３の補正係数：γを使用して補正する技術的手段を講じることによって、農作物中に残留するコリンエステラーゼ阻害性農薬の定量分析、半定量分析を行うことを特徴とする残留農薬測定方法。
【請求項２】
帰属農作物中からの前記農薬の抽出・精製方法が、有機溶媒での抽出後、大夾雑物のろ過分離、順層クロマトグラフィーとその通過物の減圧乾固のみを施した程度の比較的簡易なもので構成される前処理方法を備えてなる請求項１記載の残留農薬測定方法。
【請求項３】
前記理想溶液は、測定系におけるpHをコリンエステラーゼ活性の至適pHに調整するための緩衝液と、試料に元々含まれるイオン種が測定系に混入した場合のイオン強度変化の影響を緩和するための多量の電解質を含むものを使用してなる請求項１記載の残留農薬測定方法。
【請求項４】
前記抽出溶液は、前記比較的簡易な前処理方法により得られる減圧乾固成分を、前記理想溶液に溶解したものを使用してなる請求項２記載の残留農薬測定方法。
【請求項５】
前記第１と第２の補正係数：αとβは、前記測定溶液中に含まれる、帰属農作物由来の被検農薬以外のコリンエステラーゼ活性を変化させる成分に係わり、帰属農作物毎にコリンエステラーゼ酵素触媒特性をLineweaver-Burk plots法による解析により調べ、データベース化したもので、αは農薬非共存下の抽出溶液中での酵素触媒反応の最大反応速度を理想溶液中での酵素触媒反応の最大反応速度で除した値で、βは農薬非共存下の抽出溶液中でのコリンエステラーゼのミカエリス定数を理想溶液中でのコリンエステラーゼのミカエリス定数で除した値とする請求項１記載の残留農薬測定方法。
【請求項６】
前記第３の補正係数：γは、前記比較的容易な前処理方法により、前記コリンエステラーゼ阻害性農薬が、前記抽出溶液に回収される率を農薬毎に調べ、データベース化してなる請求項１記載の残留農薬測定方法。
【請求項７】
前記農薬毎に異なるコリンエステラーゼ阻害能を示す定数は、農薬を添加した理想溶液中でコリンエステラーゼ活性測定し、Dixon plots法による解析結果より得られたものを使用してなる請求項１記載の残留農薬測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農作物中の残留農薬測定方法に関し、詳しくは、コリンエステラーゼ阻害性農薬の定量分析を被検農薬標準品の使用なしで、簡便かつ迅速に定量分析する。
【背景技術】
【０００２】
有機リン系農薬やカルバメート系農薬は、有機塩素系の農薬等と比較して、自然界で分解され易いため、殺虫剤、殺菌剤、除草剤として古くから広く使用されている。しかしながら、これらの中でも有機リン系殺虫剤やカルバメート系殺虫剤とその代謝生成物は、コリンエステラーゼ活性阻害を引き起こす典型的な酵素毒であり、動物体内に蓄積されると神経系を著しく害するため、食品危険度管理又は環境汚染管理的な見地から、安全性確保のため、これら農薬の検査を行う機会が近年増加している。
【０００３】
従来、上記殺虫剤等の検出には、ガスクロマトグラフやガスクロマトグラフ質量分析計等の精密分析装置を用いて行っている。しかしながら、このような分析装置を用いた検出方法は、サンプル中に含まれている成分を網羅的に、精度良く検出できるものの、測定装置が高価であり、測定操作が煩雑で熟練を要し、時間がかかる。また、測定毎に機器校正のため農薬を使用せざるを得ない等の問題もある。
【０００４】
一方、前述したように、有機リン系殺虫剤やカルバメート系殺虫剤が典型的なコリンエステラーゼの阻害性物質であることから、農薬の共存によるコリンエステラーゼの酵素触媒能（加水分解速度）低下を捉え、間接的に、これら農薬の共存量を算出する簡便な農薬の検査方法がある（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照。）。
【０００５】
【非特許文献１】大西  正健  著「生物化学実験法２１，酵素反応速度論実験入門」学会出版センター、（1991年）
【非特許文献２】堀越  弘毅ら著「酵素  科学と工学」講談社サイエンティフィック、（1992年）
【０００６】
ミカエリス・メンテンス型酵素であるコリンエステラーゼは遊離した状態、又は、固定化した状態でも使用できる。前者、つまり測定溶液中へコリンエステラーゼをコリンエステラーゼに対して特異性を示す基質（以下、単に基質とも呼ぶ）と共存させた場合の方がミカエリス・メンテンスの動力学的計算が容易であるが、阻害剤非共存下での酵素反応の速度（vn）は（１）式より求まる。
【数１】
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【０００７】
一方、有機リン系殺虫剤やカルバメート系殺虫剤によるコリンエステラーゼの活性阻害は、有機リン剤の場合はコリンエステラーゼのエステル結合部位セリンのヒドロキシル基をリン酸化、カルバメート剤の場合はこれをカルバモイル化し、不活性な酵素−阻害剤複合体（EI）を形成し、酵素触媒能が低下することに起因する。また、前記農薬は酵素−基質複合体とは結合しない拮抗型阻害の特性を示すことから、前記農薬共存下での酵素反応の速度（vi）は（２）式より求まる。（ここで酵素−阻害剤複合体（EI）の解離定数を表すKiは阻害定数と呼ばれ、同一の酵素反応条件下では阻害剤によりその数値は異なる。）
【数２】
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【０００８】
（１）式と（２）式とを比較して分かるように、ミカエリス・メンテンス型酵素の拮抗阻害は阻害剤共存によるミカエリス定数（Km）の変化として反応速度に影響を及ぼす。つまり、農薬共存下と非共存で反応系に添加する酵素濃度と基質濃度とを同じにした場合、vi/
vnで表される酵素活性の比：R.A.（Relative activity）の逆数：R.A.−１は（３）式で表すことができ、（３）式を展開した（４）式により、未知の農薬濃度 [I] を知ることが可能となる。
【数３】
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【数４】
2004170392.tif 000006
【０００９】
しかしながら、viで表されるR.A.の分子項である抽出溶液中でのコリンエステラーゼ活性は、抽出溶液中に含まれる農薬以外の成分の影響により十分な活性測定の精度が得られない。主な要因は、測定溶液中に含まれる農薬以外の成分により、コリンエステラーゼが非特異的に不活性化、又は活性化されるため（多くの場合、不活性化され、見かけ上、農薬濃度が高く算出される。）である。
【００１０】
前述した理由により、試料の抽出溶液中でのコリンエステラーゼ活性と農薬非共存下の理想溶液中でのコリンエステラーゼ活性との比較値：R.A.を用い、ミカエリス・メンテンスの動力学的処理によって農薬濃度の算出を行うことは容易ではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記問題点にかんがみ本発明は、農作物等の中に含まれるコリンエステラーゼ活性阻害の性質を示す農薬の測定方法であり、比較的容易な前処理方法により、農作物からの成分抽出を行った測定溶液中で得られる出力信号を、コリンエステラーゼ阻害性農薬の濃度として定量的に扱うための簡便な計算方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため本発明は、以下の手段を講じた。まず、前記コリンエステラーゼ阻害性農薬を全く含まない農作物を用意し、公定検査法等に比べて比較的容易な方法により農作物成分を抽出・精製した測定溶液を準備した。この測定溶液中においてコリンエステラーゼ活性測定を行い、Lineweaver-Burk plot法による解析を行ったところ、農作物由来の農薬以外の成分の影響により、コリンエステラーゼの触媒特性を決定づける最大反応速度とミカエリス定数の双方共が変化することを見出した。また、前記最大反応速度とミカエリス定数の変化率が帰属農作物固有であることについても見出した。
【００１３】
さらに、本発明者らは、比較的簡易なクリーンアップ工程で農作物中からの農薬成分の精製・抽出を行った測定溶液について、帰属農作物により変化する因子を補正するためのデータベースと、被検農薬毎に変化する因子を補正するためのデータベースと、被検農薬毎のコリンエステラーゼ阻害能に関するデータベースと、コリンエステラーゼの触媒特性に関するデータベースとを用意し、コリンエステラーゼ活性測定を行った測定結果と、理想溶液中での測定結果との比較値からミカエリス・メンテンスの動力学的処理に基づいた該農薬成分の定量計算が行えることを見出した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下のような構成から成る。
（１）まず、検査対象となる農作物の抽出成分を溶解した測定溶液中と、理想溶液中とでコリンエステラーゼ活性測定を行い、被検農薬又は、被検農薬以外の成分によるコリンエステラーゼ活性変化の程度をそれぞれの測定での活性比較から、相対活性値（R.A.：Relative activity）として求める。予め、農薬を全く含まない該農作物抽出溶液中と、理想溶液中でのコリンエステラーゼの最大反応速度、ミカエリス定数の比率により決定される活性測定を行い、Lineweaver-Burk plot法による解析結果より、それぞれの溶液中での最大反応速度の比率を第１の補正係数：α及び、その時のそれぞれの溶液中でのミカエリス定数の比率により決定される第２の補正係数：βを求める。次いで、被検農薬のコリンエステラーゼ阻害能を示す定数（阻害定数：Ki）と、反応溶液中での基質の濃度とをミカエリス・メンテンス型酵素拮抗阻害の反応速度式に基づく計算式に代入することで、測定溶液中に含まれる前記農薬濃度を一時的に算出する。さらに、農作物元体からの測定溶液に至るまでの被検農薬の回収率に係る第３の補正係数：γと、農作物元体からの測定溶液に至るまでの希釈倍率とを用いて、検査対象となる農作物中に含まれるコリンエステラーゼ阻害性農薬濃度を算出する。
（２）前記コリンエステラーゼは、厳密には、アセチルコリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼであり、該酵素の由来は特に限定されないが、好適には電気ウナギ由来のアセチルコリンエステラーゼを使用するのがよい。
（３）被検対象物質が、厳密には、アセチルコリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼに対して高い阻害能を有するN−メチルカルバメート系殺虫剤、ホスフェート型有機リン系殺虫剤、チオノ型有機リン系殺虫剤の酸化生成物及びジチオ型有機リン系殺虫剤の酸化生成物であるコリンエステラーゼ阻害性農薬であるとよい。
（４）農作物からの該コリンエステラーゼ阻害性農薬の抽出・精製方法が、有機溶媒での抽出後、大夾雑物のろ過分離、順層クロマトグラフィーとその通過物の減圧乾固のみを施した程度の比較的簡易な前処理方法を備えるとよい。
（５）理想溶液は、コリンエステラーゼ活性測定におけるpHを、コリンエステラーゼ活性の至適pHに調整するための緩衝液と、適量な電解質のみを含むのがよい。
（６）測定溶液は、前記前処理方法により得られる減圧乾固成分を前記理想溶液により溶解し、調製するとよい。
（７）前記測定溶液中に含まれる帰属農作物由来のコリンエステラーゼの最大反応速度を変化させる成分に係り、Lineweaver-Burk plot法による解析結果により求められ、帰属農作物毎に異なる第１の補正係数：αと、帰属農作物毎に作成したαのデータベースを構築するのがよい。
（８）前記測定溶液中に含まれる帰属農作物由来のコリンエステラーゼのミカエリス定数を変化させる被検農薬以外の成分に係り、Lineweaver-Burk plot法による解析結果により求められ、帰属農作物毎に異なる第２の補正係数：βと、帰属農作物毎に作成したβのデータベースを構築するのがよい。
（９）農薬を添加した理想溶液中で、前記方法によりコリンエステラーゼ活性測定し、Dixon plots法による解析結果より得られた被検農薬のコリンエステラーゼ阻害能を示す定数：Kiと、該コリンエステラーゼ阻害性農薬毎に作成したKiのデータベースを構築するのがよい。
（１０）一時的に算出された測定溶液中での該被検農薬濃度を、元体中での該濃度に補正せしめるために適用され、前記前処理方法により検査対象となる農作物から測定溶液に回収されるまでの被検農薬の回収率に係る第３の補正係数：γと、該被検農薬毎に作成したγのデータベースを構築するのがよい。
【発明の効果】
【００１５】
以上のように本発明によれば、公定検査法等と比較して、簡便かつ迅速に行える測定前処理方法を実施するとともに、被検農薬と帰属農作物とにより変動する因子の影響を取り除くための３種の補正係数と、被検農薬毎のコリンエステラーゼ阻害能に関する定数と、コリンエステラーゼの触媒能に関する定数とをデータベース化することにより、該コリンエステラーゼ阻害性農薬の濃度算出及び定量分析が容易に行えることとなる。また、本発明によれば、機器校正のため被検農薬を使用せざるを得ないという従来あった課題の克服までも可能にする簡易な優れた測定方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明による農薬測定を実施する形態について、図表を参照して詳細に説明する。
【００１７】
図１は本発明による農薬測定を実施するための検査対象となる農作物から前記被検農薬成分を抽出・精製し、測定溶液とするまでの工程を示すフロー図である。ステップ１は農作物からの該被検農薬成分の抽出速度、抽出効率を高めるための農作物の粉砕、又は磨砕を行う第一工程であり、ステップ２は農作物中の該被検農薬成分をメタノール等の有機溶媒中に溶解、抽出するために振とうを行う第二工程であり、ステップ３は該有機溶媒層に残余する大夾雑物を除去するためのろ過を行う第三工程であり、ステップ４は第三工程後の該有機溶媒層に混入する該被検農薬成分以外の農作物抽出成分を固層吸着させ、極力、該被検農薬成分のみを該有機溶媒層に回収するため固液分離を行う第四工程である。該固液分離方法は、ケイ酸マグネシウム（商品名：フロリジル）等を充填剤に用いた順層カラムクロマトグラフィーで行うとよい。ステップ５は第四工程で回収される流出液中からロータリーエバポレータ等を用いて農作物の抽出成分を乾固物として回収する第五工程であり、ステップ６は第五工程で回収された乾固物を理想溶液に溶解する第六工程である。以上の方法により、検査対象となる農作物から被検農薬成分を抽出した測定溶液が調製されることになる。なお、この例では、測定溶液1 ml中当たり、帰属農作物の抽出成分0.1ｇが含まれることになる。
【００１８】
次に、コリンエステラーゼ活性測定の一手法について説明するが、これは一例でありその他の既知の手法を用いて測定しても良い。コリンエステラーゼの加水分解速度を測定する最も迅速な手段として、アセチルチオコリンやブチリルチオコリンを基質に選択し、加水分解生成物であるチオコリンをチオール官能性試薬：5,5’-ジチオ-ビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）により黄色のTNBに変換させて、この時の吸光度の経時変化を検出測定する方法がある。詳細は特開2002-62265、特開2003-298を参照。
【００１９】
該被検農薬共存下におけるコリンエステラーゼ活性を測定するための方法は以下のとおりである。まず、該測定溶液中へコリンエステラーゼ溶液を添加、30分間以上のインキュベートを行うことにより、該被検農薬によるコリンエステラーゼ阻害反応を行う。次に、前記の基質と発色剤とを添加すると同時に、吸光度の経時変化測定を開始する。該工程において、該測定溶液中へ基質を添加することにより、コリンエステラーゼ触媒活性部位において、該測定溶液中に含まれる該被検農薬による阻害と、基質の分解との競争反応が開始し、やがて該競争反応が平衡に達するため、吸光度の変化率（吸光度の時間微分値、ΔAbs.Si）が安定する。また、コリンエステラ−ゼ特異性基質の分解の方が発色反応よりも遅く、全反応での律速段階となっているため、該吸光度変化の時間微分値から該被検農薬共存下におけるコリンエステラーゼ活性（vSi）が算出できる。
【００２０】
該コリンエステラーゼ活性を測定するための工程において、アセチルコリンエステラーゼ市販品を酵素に選択した場合においては、添加する基質はアセチルチオコリンを選択することが最適で、最終濃度で0.1〜0.3 mMの範囲であり、好ましくは、0.2
mMとなるよう添加するとよい。また、アセチルチオコリンの水溶液は、常温、照射下においても緩やかに加水分解してチオコリンとなり、発色剤との共存により自然発色するため、遮光容器に入れ5 ℃以下の冷却槽中で保存することが好ましい。
【００２１】
一方、該コリンエステラーゼ活性を測定するための工程において、ブチリルコリンエステラーゼ市販品を酵素に選択した場合においては、添加する基質は、ブチリルチオコリンを選択することが最適で、最終濃度で 0.1〜 0.3 mMの範囲。好ましくは、0.2 mMとなるよう添加するとよい。また、ブチリルチオコリンの水溶液についても、常温、照射下において、緩やかに加水分解しチオコリンとなり、発色剤との共存により、自然発色するため、遮光容器に入れ、5 ℃以下の冷却槽中で保存することが好ましい。
【００２２】
また、測定セル中に、初期に該測定溶液の代わりに前記理想溶液を入れ、前記工程と同様の工程で測定を行った場合、前述した測定値：ΔAbs.Siとの比較となり得る測定値（ΔAbs.Rn）、つまりは、該被検農薬による影響を受けていないコリンエステラーゼ活性（vRn）に応答する出力信号が得られる。以上、２つの測定により、被検農薬によるコリンエステラーゼ活性阻害の程度を表す相対活性値：R.A.が一時的に算出される。
【００２３】
ところで、前記コリンエステラーゼ阻害性農薬を全く含まないキュウリを用意し、前記前処理方法により調製した測定溶液中で、添加する前記基質濃度を変化し、前記コリンエステラーゼ活性測定方法により測定を行い、Lineweaver-Burk plot法による解析を行った結果を図２−(a)に示す。一方、前記理想溶液中で同様の解析を行った結果を図２−(b)に示す。前者と後者とで、コリンエステラーゼの触媒特性を決定づける最大反応速度及び、ミカエリス定数、双方共に異なることが分かった。
【００２４】
また、前記農薬非共存下の帰属農作物抽出溶液中と理想溶液中とにおけるコリンエステラーゼ活性変化を補正するために、それぞれの反応条件における最大反応速度の比率を（５）式のα、ミカエリス定数の比率を（６）式のβとして表した。α、βの値は、産地、収穫時期により若干バラツキはあるが、表１に示すように帰属農作物毎にほぼ同じ数値を示すことが分かった。
【数５】
2004170392.tif 000007
【数６】
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【表１】
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【００２５】
また、前記理想溶液を用いて、前記コリンエステラーゼ阻害性農薬濃度とアセチルチオコリン濃度とを変えながら、前記コリンエステラーゼ活性測定方法により測定を行い、Dixon
plot法による解析結果より得られた、前記アセチルコリンエステラーゼに対する種々の農薬についての阻害定数：Kiは表２のとおりである。
【表２】
2004170392.tif 000010
【００２６】
次に、前記α、βの補正係数を使用した農薬濃度算出式について説明する。農薬非共存下の理想溶液中での反応速度（vRn）は（７）式で表され、吸光度変化率（ΔAbs.Rn）に応答する。
【数７】
2004170392.tif 000011
【数８】
2004170392.tif 000012
【数９】
2004170392.tif 000013
より、
【数１０】
2004170392.tif 000014
従って
【数１１】
2004170392.tif 000015
【数１２】
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【００２７】
測定対象となる帰属農作物毎のα、βの値、KmRnの値、農薬毎に異なるコリンエステラーゼ阻害能を示す定数：Kiをデータベース化しておき、上記（１２）式に代入することにより、帰属農作物中に含まれる農薬以外の成分によるコリンエステラーゼ活性への影響をキャンセルして農薬濃度を算出することができ、精度の良い測定が実現できる。
【００２８】
さらに、前記コリンエステラーゼ阻害性農薬を含まない種々の農作物を用意し、既知濃度の種々のコリンエステラーゼ阻害性農薬を添加した後、前記前処理方法により測定溶液を調製し、前記コリンエステラーゼ活性測定方法により測定して（１２）式により前記農薬の濃度算出を行った。添加農薬濃度と測定により得られた算出農薬濃度との関係について、一例として、前記コリンエステラーゼ阻害性農薬を殆ど含まない広島産トマトにフェノブカルブを添加した場合の結果を図３に示す。
【００２９】
すべての農作物と農薬との組み合わせ傾きが１以下であることが分かり、前記測定に至るまでの前記前処理工程における回収率に起因することが推測された。また、前記相関係数（以下、補正係数：γと呼ぶ）はすべての農作物において、ほぼ農薬毎に固有値であることが分かった。前記種々の農薬についてのγを表３に示す。
【表３】
2004170392.tif 000017
【００３０】
以上から、前記前処理方法と前記コリンエステラーゼ活性測定方法により求まるR.A.を（１２）式に代入して算出した測定溶液中での濃度を、さらに、測定に至るまでの希釈倍率を乗じ（又は濃縮倍率で除し）、前記補正係数：γで除せしめることにより（つまりは、（１３）式。）、元体となる農作物中での農薬濃度の算出が可能となることが分かった。
【数１３】
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【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の農薬測定を実施するための検査対象となる農作物から前記被検農薬成分を抽出・精製し、測定溶液とするまでの工程を示すフロー図である。
【図２】農薬非共存下の理想溶液と農薬非共存下の帰属農作物抽出溶液における各基質濃度とその基質濃度時の吸光度変化率の関係をプロットした図である。X軸（横軸）は基質濃度の逆数、Y軸（縦軸）は吸光度変化率の逆数である。
【図３】添加農薬濃度と測定により得られた算出濃度との関係を示す図である。
【符号の説明】
【００３２】
１  第一工程
２  第二工程
３  第三工程
４  第四工程
５  第五工程
６  第六工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
2004170392.tif 000021