(57)【要約】【課題】異常プリオンを迅速かつ的確に検出可能ならしめる、検体が大量でも対応可能である、等の利点を持つＢＳＥ検査前処理方法及びシステムを提供。【解決手段】採取した親検体Ｍの細胞をホモジネートする第１工程と、ホモジネートされた親検体Ｍから所定量分取し子検体Ｎとする第２工程と、酵素材プロティナーゼＫを試薬Ａとして所定量注入し混和する事により蛋白質を分解する第３工程と、第１レベルの温度で加温する第４工程と、試薬Ｂを所定量加え溶液が青くなるまで混和する第５工程と、遠心分離処理し上澄みを廃棄する第６工程と、試薬ＣＬを所定量注入して濃縮化する第７工程と、比較的高い第２レベルの温度で加温する第８工程と、希釈用試薬Ｄを所定量注入して混和する第９工程と、マイクロプレートのウエルに所定量分注吸着させ異常プリオン検出用のサンプルを作成する第１０工程とを備えたことを主たる特徴としている。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取した親検体の細胞を、細胞破砕装置を用いてホモジネートする第１の工程と、
前記第１の工程でホモジネートされた親検体から固形物を含まないように採取シリンジを用いて所定量分取し、これを子検体とする第２の工程と、
前記第２の工程で得た子検体に対し酵素材プロティナーゼＫを試薬Ａとして所定量注入し混和することにより蛋白質を分解する第３の工程と、
前記第３の工程で分解した子検体を第１レベルの温度で加温してインキュベートする第４の工程と、
前記第４の工程でインキュベートした子検体に対し、試薬Ｂを所定量加え、溶液が青くなるまで混和する第５の工程と、
前記第５の工程で得た子検体を冷却遠心分離機を用いて遠心分離処理を行なったのち上澄みを廃棄処分する第６の工程と、
前記第６の工程で分離された子検体に試薬ＣＬを所定量注入して濃縮化を行なったのち静止状態に保持する第７の工程と、
前記第７の工程で濃縮化した子検体を前記第１レベルの温度より高く設定された第２レベルの温度で加温してインキュベートする第８の工程と、
前記第８の工程でインキュベートした子検体に希釈用の試薬Ｄを所定量注入して混和する第９の工程と、
前記第９の工程で得た子検体をマイクロタイタープレートのウエルに所定量分注して吸着させ、病原性プリオン蛋白質を検出するための検査用サンプルを作成する第１０の工程と、
を備えたことを特徴とする牛海綿状脳症の検査前処理方法。
【請求項２】
少なくとも一対のベルトコンベア式搬送レーンを有し、容器ホルダーで保持した検体容器を上流から下流へ、又は下流から上流へ搬送可能に設けられた検体搬送コンベアと、この検体搬送コンベアの搬送経路に沿って配置され所定の前処理を各々自動的に行なう如く設けられた複数の前処理装置とを備え、前記複数の前処理装置は、
採取された親検体を収容した親検体容器を順次搬入し、前記検体搬送コンベアに搭載する搬入ユニットと、
この搬入ユニットで搬入された親検体容器の中身に応じた親検体を特定する情報を含む所定情報を記録したバーコードラベルを発行し、これを当該親検体容器の外周面に貼付する第１のバーコードラベル発行貼付ユニットと、
この第１のバーコードラベル発行貼付ユニットによりバーコードラベルを貼付された前記親検体容器内の親検体の細胞を破砕し、ホモジネートする細胞破砕装置と、
この細胞破砕装置によりホモジネートされた親検体Ｍから固形物を含まないように５００μｌ程度分取し、これを子検体Ｎとして２ｍｌ入り子検体容器に分注する分注ユニットと、
この分注ユニットで子検体を分注された子検体容器の中身に応じた所定情報を記録したバーコードラベルを発行し、これを当該子検体容器の外周面に貼付する第２のバーコードラベル発行貼付ユニットと、
前記親検体の残りが入っている親検体容器を、必要に応じて前記分注ユニットへ差し戻し可能な状態で冷凍保存する親検体冷凍庫と、
前記子検体を入れた容器を冷凍保存する子検体冷凍庫と、
前記子検体冷凍庫から取出された子検体容器に対し、酵素材プロティナーゼＫを試薬Ａとして所定量注入して混和することにより蛋白質を分解する第１の注入混和ユニットと、
この第１の注入混和ユニットで蛋白質を分解した子検体が入っている容器を、設定された第１レベルの温度で加温してインキュベートする第１のインキュベート装置と、
この第１のインキュベート装置でインキュベートした子検体に対し、試薬Ｂを所定量加え、溶液が青くなるまで混和する第２の注入混和ユニットと、
この第２の注入混和ユニットで得られた子検体を冷却遠心分離機により遠心分離処理を行ない、上澄みを廃棄処分する遠心分離処理ユニットと、
この遠心分離処理ユニットで遠心分離処理された子検体に、試薬ＣＬを所定量注入して濃縮化を行ない静止状態に保持する濃縮化ユニットと、
この濃縮化ユニットで濃縮化した子検体入りの容器を、前記第１レベルの温度より高く設定された第２レベルの温度で加温してインキュベートする第２のインキュベート装置と、
この第２のインキュベート装置でインキュベートされた子検体に試薬Ｄを所定量注入して混和することにより希釈する希釈化ユニットと、
この希釈化ユニットで希釈化した子検体をマイクロタイタープレートのウエルに所定量分注して吸着させることにより、病原性プリオン蛋白質を検出するための検査用サンプルを作成する検査用サンプル作成装置と、
この検査用サンプル作成装置で作成された検査用サンプルを、検査室へ搬出する搬出ユニットと、
を含んでいることを特徴とする牛海綿状脳症の検査前処理システム。
【請求項３】
前記複数の前処理装置は、コントローラにより関連動作制御されることを特徴とする請求項２に記載の牛海綿状脳症の検査前処理システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、牛海綿状脳症（以下ＢＳＥと略称する）の検査前処理方法及び検査前処理システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＢＳＥが人間にも感染し、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）として発症する虞のあることがイギリスで公表されている。わが国においては、感染源である牛の脳や内蔵物等につき、異常プリオンすなわち病原性プリオン蛋白質の有無を全頭検査することになっている。そこで、より正確で且つスピーディな検査手段が求められている。
【０００３】
病原性プリオン蛋白質を動物組織由来物質から検出する検出方法として、検出対象となる動物組織由来物質の種類に応じて使用する調製剤（特に界面活性剤）、調製方法、検出方法を適宜選択することによって、動物組織由来物質に含まれる病原性プリオン蛋白質が比較的低濃度でも、迅速かつ簡便にしかも高感度に検出可能な検出方法が提案されている（特許文献１参照）。
【０００４】
【特許文献１】
特開平１１−０３２７９５号公報（段落［［００２６］）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記特許文献１に示された検出方法によれば、動物組織由来物質に含まれる病原性プリオン蛋白質が、比較的低濃度でも検出可能であると思われる。しかし、その検出作業を行なうに際しては、いわゆる前処理を行なう必要がある。この前処理を如何に的確に行なうかが、総合的な検査効率を左右する。換言すれば、たとえ上記特許文献１に示されているような検出方法を採用したとしても、前処理が的確に行なわれなければ、総合的には正確で且つスピーディな検査が行なえない事になる。
【０００６】
本発明は、このような事情に基づいてなされたものであり、その目的は、下記のような利点を有するＢＳＥの検査前処理方法及び検査前処理システムを提供することにある。
【０００７】
（ａ）病原性プリオン蛋白質を迅速かつ的確に検出することを可能ならしめる。
【０００８】
（ｂ）検査対象である検体が大量であっても十分対応可能である。
【０００９】
（ｃ）衛生管理上好ましく、安全性が高い。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決し目的を達成するために、本発明のＢＳＥの検査前処理方法及び検査前処理システムは下記のような特徴ある構成を有している。
【００１１】
（１）本発明のＢＳＥの検査前処理方法は、
採取した親検体Ｍの細胞を、細胞破砕装置１３を用いてホモジネートする第１の工程と、前記第１の工程でホモジネートされた親検体Ｍから固形物を含まないように採取シリンジＳを用いて所定量（５００μｌ（マイクロリットル）程度）分取しこれを子検体Ｎとする第２の工程と、前記第２の工程で得た子検体Ｎに対し酵素材プロティナーゼＫ（２５０倍に希釈したもの）を試薬Ａとして所定量注入し混和することにより蛋白質を分解する第３の工程と、前記第３の工程で分解した子検体Ｎを第１レベルの温度（３７±１℃）で加温（１０±１分間）してインキュベートする第４の工程と、前記第４の工程でインキュベートした子検体に対し、試薬Ｂを所定量（５００μｌ（マイクロリットル）程度）加え、溶液が青くなるまで混和する第５の工程と、前記第５の工程で得た子検体Ｎを冷却遠心分離機２０を用いて遠心分離処理（２０，０００Ｇで５分間、１５，０００Ｇで７分間）を行なったのち、上澄みを廃棄処分する第６の工程と、前記第６の工程で分離された子検体Ｎに試薬ＣＬを所定量（５０μｌ（マイクロリットル）程度）注入して濃縮化を行なったのち静止状態に保持する第７の工程と、前記第７の工程で濃縮化した子検体Ｎを前記第１レベルの温度より高く設定された第２レベルの温度（１００±１℃）で加温（５±１分間）してインキュベートする第８の工程と、前記第８の工程でインキュベートした子検体Ｎに希釈用の試薬Ｄを所定量（２５０μｌ（マイクロリットル）程度）注入して混和する第９の工程と、前記第９の工程で得た子検体Ｎをマイクロタイタープレートのウエルに所定量（１００μｌ（マイクロリットル）程度）分注して吸着させ、病原性プリオン蛋白質を検出するための検査用サンプルを作成する第１０の工程と、を備えたことを特徴としている。
【００１２】
（２）本発明のＢＳＥの検査前処理システムは、
少なくとも一対のベルトコンベア式搬送レーンを有し、容器ホルダーで保持した検体容器（２，４）を上流から下流（矢印ａ）へ、または下流から上流（矢印ｂ）へ搬送可能に設けられた検体搬送コンベア１０と、この検体搬送コンベア１０の搬送経路に沿って配置され所定の前処理を各々自動的に行なう如く設けられた複数の前処理装置（１１〜２５）とを備え、
前記複数の前処理装置は、採取された親検体Ｍを収容した親検体容器２を順次搬入し前記検体搬送コンベア１０に搭載する搬入ユニット１１と、この搬入ユニット１１で搬入された親検体容器２の中身に応じた親検体を特定する情報を含む所定情報を記録したバーコードラベルＲを発行しこれを当該親検体容器２の外周面に貼付する第１のバーコードラベル発行貼付ユニット１２と、この第１のバーコードラベル発行貼付ユニット１２によりバーコードラベルＲを貼付された前記親検体容器２内の親検体Ｍの細胞を破砕しホモジネートする細胞破砕装置１３と、この細胞破砕装置１３によりホモジネートされた親検体Ｍから固形物を含まないように５００μｌ程度分取しこれを子検体Ｎとして２ｍｌ入り子検体容器４に分注する分注ユニット１４と、この分注ユニット１４で子検体Ｎを分注された子検体容器４の中身に応じた所定情報を記録したバーコードラベルＲを発行しこれを当該子検体容器４の外周面に貼付する第２のバーコードラベル発行貼付ユニット１５と、前記親検体Ｍの残りが入っている親検体容器２を必要に応じて前記分注ユニット１４へ差し戻し可能な状態で冷凍保存する親検体冷凍庫１６Ｍと、前記子検体Ｎを入れた容器４を冷凍保存する子検体冷凍庫１６Ｎと、前記子検体冷凍庫１６Ｎから取出された子検体容器４に対し酵素材プロティナーゼＫ（２５０倍に希釈）を試薬Ａとして所定量注入して混和することにより蛋白質を分解する第１の注入混和ユニット１７と、この第１の注入混和ユニット１７で蛋白質を分解した子検体Ｎが入っている容器４を設定された第１レベルの温度（３７±１℃）で加温（１０±１分間）してインキュベートする第１のインキュベート装置１８と、この第１のインキュベート装置１８でインキュベートした子検体Ｎに対し試薬Ｂを所定量（５００μｌ（マイクロリットル）程度）加え、溶液が青くなるまで混和する第２の注入混和ユニット１９と、この第２の注入混和ユニット１９で得られた子検体Ｎを冷却遠心分離機により遠心分離処理（２０，０００Ｇで５分間、１５，０００Ｇで７分間）を行ない上澄みを廃棄処分する遠心分離処理ユニット２０と、この遠心分離処理ユニット２０で遠心分離処理された子検体Ｎに試薬ＣＬを所定量（５０μｌ（マイクロリットル）程度）注入して濃縮化を行ない静止状態に保持する濃縮化ユニット２１と、この濃縮化ユニット２１で濃縮化した子検体入りの容器２を前記第１レベルの温度より高く設定された第２レベルの温度（１００±１℃）で加温（５±１分間）してインキュベートする第２のインキュベート装置２２と、この第２のインキュベート装置２２でインキュベートされた子検体Ｎに試薬Ｄを所定量（２５０μｌ（マイクロリットル）程度）注入して混和することにより希釈する希釈化ユニット２３と、この希釈化ユニット２３で希釈化した子検体をマイクロタイタープレートのウエルに所定量（１００μｌ（マイクロリットル）程度）分注して吸着させることにより、病原性プリオン蛋白質を検出するための検査用サンプルを作成する検査用サンプル作成装置２４と、この検査用サンプル作成装置２４で作成された検査用サンプルを検査室へ搬出する搬出ユニット２５とを含んでいることを特徴としている。
【００１３】
【発明の実施の形態】
図１は本発明の第１実施形態に係るＢＳＥ検査前処理方法の処理手順を示す流れ図である。以下この流れ図に基づきＢＳＥ検査前処理方法について説明する。
【００１４】
ステップＳ１：親検体として牛の脳あるいは脊髄を採取シリンジを用いて３５０±４０ｍｇ程度グライディングチューブに採取する。
【００１５】
ステップＳ２：採取した親検体が入っているグライディングチューブに所定情報を記録したバーコードラベルを貼付する。
【００１６】
ステップＳ３：グライディングチューブの中の親検体の細胞を、細胞破砕装置にて十分にホモジネート（均一化）する。
【００１７】
ステップＳ４：ホモジネートされた親検体から固形物を含まないように採取シリンジを用いて５００μｌ（マイクロリットル）程度分取し、これを子検体として２ｍｌ（ミリリットル）入りチューブに分注する。
【００１８】
ステップＳ５：分注した子検体入りの上記チューブに対し所定情報を記録したバーコードラベルを貼付する。
【００１９】
ステップＳ６：親検体の残りは冷凍保存する（−２０℃にて数週間保存可能、冷凍融解は１回のみ）。
【００２０】
ステップＳ６′：子検体についてはＢＣＲ確認後、冷凍保存する（−２０℃にて数週間保存可能）。
【００２１】
ステップＳ７：取出した子検体に対し、２５０倍に希釈した酵素材プロティナーゼＫを５００μｌ（マイクロリットル）程度分取し、５分以内に前記子検体入りチューブに試薬Ａとして注入する。そして十分混和することにより蛋白質を分解する。
【００２２】
ステップＳ８：分解したものをインキュベート容器に入れて、３７±１℃で１０±１分間加温してインキュベートする。
【００２３】
ステップＳ９：インキュベートしたものに対し、２分以内に、試薬Ｂを５００μｌ（マイクロリットル）程度加え、溶液が青くなるまで混和する。
【００２４】
ステップＳ１０：冷却遠心分離機により２０，０００Ｇで５分間、１５，０００Ｇで７分間の遠心分離処理を行なったのち、５分以内に上澄みを廃棄処分（チューブを逆さまにして５分放置、又はアスピレーターで５分間吸引乾燥）する。
【００２５】
ステップＳ１１：  分離された検体に、１０分以内に試薬ＣＬを５０μｌ（マイクロリットル）程度注入する。これにより濃縮化を行なう。ただし混和は行なわないように注意する。
【００２６】
ステップＳ１２：濃縮化した検体をインキュベート容器に入れて、１００±１℃で５±１分間加温してインキュベートする。
【００２７】
ステップＳ１３：検出用のＳＥキットの希釈液（Ｒ６）を試薬Ｄとして２５０μｌ（マイクロリットル）程度注入し、良く混和する。
【００２８】
ステップＳ１４：上記キットのマイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏ−ｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）のウエルに１００μｌ（マイクロリットル）程度分注し吸着させ、病原性プリオン蛋白質検出のための検査用サンプルを作成し提供する。上記検査用サンプルは５〜８℃で５時間保存可能である。
【００２９】
図２は上記ＢＳＥ検査前処理方法を実施する際に用いられるＢＳＥ検査前処理システムの構成を示す斜視図である。図３の（ａ）は親検体採取手段を示す図であり、図３の（ｂ）は検体容器の一例を示す図である。図４はインキュベート装置の構成例を示す断面図である。
【００３０】
検体搬送コンベア１０は、少なくとも一対のベルトコンベア式搬送レーンを有し、容器ホルダーで保持した検体容器（２，４）を矢印ａで示すように上流から下流へ、又は矢印ｂで示すように下流から上流へ搬送可能に設けられている。
【００３１】
搬入ユニット１１は、予め、図３の（ａ）に示すような構造の採取シリンジＳで牛の脳あるいは脊髄を３５０±４０ｍｇ程度採取し、これを図３の（ｂ）に示すような構造の試験管タイプの検体容器Ｔ（グライディングチューブ）に親検体Ｍとして収容した親検体容器２を順次搬入し、検体搬送コンベア１０に搭載する。
【００３２】
第１のバーコードラベル発行貼付ユニット１２は、搬入された親検体容器２の中身に応じた所定情報を記録した図３の（ｂ）に示すようなバーコードラベルＲを発行し、これを当該親検体容器２の外周面に貼付する。
【００３３】
細胞破砕装置１３は、バーコードラベルＲを貼付された親検体容器２内の親検体Ｍの細胞を破砕し、均一化（ホモジネート）する。
【００３４】
分注ユニット１４は、ホモジネートされた親検体Ｍから固形物を含まないように前記同様の構造を有する採取シリンジＳで５００μｌ（マイクロリットル）程度分取し、これを図３の（ｂ）に示すような構造の試験管タイプの検体容器Ｔ（２ｍｌ（ミリリットル）入りチューブ）に子検体Ｎとして分注した子検体容器４を送り出す。
【００３５】
第２のバーコードラベル発行貼付ユニット１５は、送り出された子検体容器４の中身に応じた所定情報を記録した図３の（ｂ）に示すようなバーコードラベルＲを発行し、これを当該子検体容器４の外周面に貼付する。
【００３６】
親検体冷凍庫１６Ｍは、親検体Ｍの残りが入っている親検体容器２を冷凍保存する（−２０℃にて数週間保存可能、冷凍融解は１回のみ）。親検体冷凍庫１６に冷凍保存された親検体Ｍは、必要に応じて適時取出され、上流側に位置する分注ユニット１４まで搬送される。そこで再度、所要の分注操作が行なわれる。
【００３７】
子検体冷凍庫１６Ｎは、子検体ＮについてＢＣＲ確認を行なった後、その子検体容器４を冷凍保存する（−２０℃にて数週間保存可能）。
【００３８】
第１の注入混和ユニット１７は、子検体冷凍庫１６Ｎから取出された子検体容器４に対し、２５０倍に希釈された酵素材プロティナーゼＫを５００μｌ（マイクロリットル）程度を分取し、５分以内に前記子検体入りの容器４に試薬Ａとして注入する。そして十分混和することにより蛋白質を分解する。
【００３９】
第１のインキュベート装置１８は、蛋白質を分解した子検体入りの容器４を、図４に示すような構造の容器Ｖで、３７±１℃で１０±１分間加温することによりインキュベートする。図４における符号５は、容器Ｖの内部温度を検知する温度センサである。
【００４０】
第２の注入混和ユニット１９は、インキュベートした子検体Ｎに対し、２分以内に、試薬Ｂを５００μｌ（マイクロリットル）加え、溶液が青くなるまで混和する。
【００４１】
遠心分離処理ユニット２０は、冷却遠心分離機により２０，０００Ｇで５分間、１５，０００Ｇで７分間の遠心分離処理を行なう。しかる後、５分以内に上澄みを廃棄処分（チューブを逆さまにして５分放置、又はアスピレーターで５分間吸引乾燥）する。
【００４２】
濃縮化ユニット２１は、遠心分離処理された子検体Ｎに、１０分以内に試薬ＣＬを５０μｌ（マイクロリットル）注入して濃縮化を行なう。ただし混和は行なわないように注意する。
【００４３】
第２のインキュベート装置２２は、濃縮化した子検体入りの容器４を、図４に示すような構造の容器Ｖで、１００±１℃で５±１分間加温することによりインキュベートする。
【００４４】
希釈化ユニット２３は、検出用のＳＥキットの希釈液（Ｒ６）を試薬Ｄとして２５０μｌ（マイクロリットル）だけ注入し、良く混和する。
【００４５】
検査用サンプル作成装置２４は、上記検出用のＳＥキットのマイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏ−ｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）のウエル（通常９６穴のプレートを使用）に１００μｌ（マイクロリットル）分注し吸着させることにより、病原性プリオン蛋白質検出のための検査用サンプルを作成する。上記検査用サンプルは５〜８℃で５時間保存可能である。
【００４６】
搬出ユニット２５は、作成された検査用サンプルを、検査室（不図示）へ搬出する。
【００４７】
なお上記各前処理装置は、図示してないホストコンピュータからの指令に基づいて作動するようにシステムの略中央部位に配置されたコントローラ３０により関連動作制御されるものとなっている。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、下記のような作用効果を有するＢＳＥの検査前処理方法及び検査前処理システムを提供できる。
【００４９】
（ａ）親検体をホモジネートした均一化物から子検体を作成するようにしているため、均一な子検体について処理を進めることが出来る。また着色された子検体につき遠心分離処理がなされるので、分離結果が目視でも確認可能である。更に検査に適した態様の検査用サンプルが作成され提供される。従って病原性プリオン蛋白質を迅速かつ的確に検出することを可能ならしめる。
【００５０】
（ｂ）親検体採取を除く前処理の殆どが、検査前処理システムにより自動的に行なわれる。このため検査対象である検体が大量であっても十分対応可能である。
（ｃ）人手による作業が著しく少ないので、衛生管理上好ましく安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施形態に係るＢＳＥ検査前処理方法の処理手順を示す流れ図。
【図２】本発明の第１実施形態に係るＢＳＥ検査前処理システムの構成を示す斜視図。
【図３】本発明の第１実施形態に係る親検体採取手段を示す図で、（ａ）は親検体採取手段を示す図、（ｂ）は検体容器の一例を示す図。
【図４】本発明の第１実施形態に係るインキュベート装置の構成例を示す断面図。
【符号の説明】
２  親検体容器
４  子検体容器
５  温度センサ
１０  検体搬送コンベア
１１  搬入ユニット
１２  第１のバーコードラベル発行貼付ユニット
１３  細胞破砕装置
１４  分注ユニット
１５  第２のバーコードラベル発行貼付ユニット
１６Ｍ  親検体冷凍庫
１６Ｎ  子検体冷凍庫
１７  第１の注入混和ユニット
１８  第１のインキュベート装置
１９  第２の注入混和ユニット
２０  遠心分離処理ユニット
２１  濃縮化ユニット
２２  第２のインキュベート装置
２３  希釈化ユニット
２４  検査用サンプル作成装置
２５  搬出ユニット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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