(57)【要約】【課題】核酸分解酵素による核酸の分解を確実に防止する簡便な方法と、核酸分解酵素による核酸分解を防止しながら核酸を抽出する効果的な方法を提供する。【解決手段】少なくとも核酸分解酵素におけるジスルフィド結合部位を解裂し、スルホヒドリル基を形成する工程と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾する工程を有する核酸の分解防止方法とする。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞からの核酸の抽出時および／または保存時に、核酸分解酵素による核酸の分解を防止するための方法であって、少なくとも
核酸分解酵素におけるジスルフィド結合を解裂させ、スルホヒドリル基を形成する工程と、
該スルホヒドリル基を選択的に修飾する工程
を有することを特徴とする核酸の分解防止方法。
【請求項２】
核酸分解酵素におけるジスルフィド結合の解裂は、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される試薬を用いて行う請求項１の核酸の分解防止方法。
【請求項３】
スルホヒドリル基の選択的修飾は、モノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される修飾試薬を用いて行う請求項１または２のいずれかの核酸の分解防止方法。
【請求項４】
スルホヒドリル基の選択的修飾は、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される修飾試薬を用いて行う請求項１または２のいずれかの核酸の分解防止方法。
【請求項５】
核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から核酸を抽出する方法であって、少なくとも、
細胞を溶解する工程と、
細胞を溶解した溶解液に含まれる核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成する工程と、
該スルホヒドリル基を選択的に修飾する工程
を有することを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項６】
核酸分解酵素におけるジスルフィド結合の解裂は、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される試薬を用いて行う請求項５の核酸抽出方法。
【請求項７】
スルホヒドリル基の選択的修飾は、モノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される修飾試薬を用いて行う請求項５または６のいずれかの核酸抽出方法。
【請求項８】
スルホヒドリル基の選択的修飾は、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される修飾試薬を用いて行う請求項５または６のいずれかの核酸抽出方法。
【請求項９】
核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から抽出された核酸を保存するための方法であって、少なくとも
核酸溶液中に含まれる核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成するジスルフィド結合解裂試薬と、
該スルホヒドリル基を選択的に修飾する修飾試薬
を含有する保存液中で核酸を保存することを特徴とする核酸の保存方法。
【請求項１０】
ジスルフィド結合解裂試薬は、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される請求項９の核酸保存方法。
【請求項１１】
修飾試薬は、モノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される請求項９または１０のいずれかの核酸保存方法。
【請求項１２】
修飾試薬は、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される請求項９または１０のいずれかの核酸保存方法。
【請求項１３】
核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から核酸を抽出するためのキットであって、少なくとも
核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成するためのジスルフィド結合解裂試薬と、
該スルホヒドリル基を選択的に修飾するための修飾試薬
を含有することを特徴とするキット。
【請求項１４】
核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から抽出された核酸を保存するためのキットであって、少なくとも
核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成するためのジスルフィド結合解裂試薬と、
該スルホヒドリル基を選択的に修飾するための修飾試薬
を含有することを特徴とするキット。
【請求項１５】
ジスルフィド結合解裂試薬は、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される請求項１３または１４のいずれかのキット。
【請求項１６】
修飾試薬は、モノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される請求項１３ないし１５のいずれかのキット。
【請求項１７】
修飾試薬は、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される請求項１３ないし１５のいずれかのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、細胞から核酸を抽出する際、あるいは細胞から抽出した核酸を保存する際に、溶解液中に含まれる核酸分解酵素により核酸が分解されることを防止するための核酸の分解防止方法に関するものである。また、この出願の発明は、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から核酸を抽出する方法と抽出された核酸を保存する方法に関するものである。さらに、この出願の発明は、核酸抽出用キットと核酸保存用キットに関するものである。
【０００２】
【従来技術とその課題】
近年、遺伝子工学の発展とともに、細胞や組織から核酸、とくにＲＮＡを抽出し、解析、診断、変異、増幅等の処理を行う技術が確立されてきている。しかし、細胞や組織には、リボヌクレアーゼなどの核酸分解酵素が存在するため、しばしば抽出操作中に核酸が分解されるという問題があった。
【０００３】
そこで、核酸の抽出操作においては、グアニジンイソチオシアネートを用いて核酸分解酵素を変性可溶化した後、ラウリルザルコシンナトリウム等の界面活性剤を加え、β−メルカプトエタノールで核酸分解酵素を還元することにより核酸分解酵素を変性させて核酸の分解を防止していた。しかし、このような従来の核酸の抽出方法では、核酸分解酵素の変性が可逆的な還元反応によるため、時間の経過や核酸の精製により核酸分解酵素が再び活性化し、核酸の分解が進行するという問題があった。つまり、時間の経過に伴い、空気中の酸素等の作用により酸化−還元反応が平衡に達したり、精製工程において還元剤等が除去されて還元反応よりも酸化反応が優位となったりするために、核酸分解酵素が再構成され、活性を示すようになって核酸が分解されてしまうのである。
【０００４】
さらに、核酸分解酵素は空気中の細菌、作業者の毛髪や皮膚等からも混入するため、抽出操作には慎重を要し、抽出後は速やかに次工程へと移行することが不可欠であった。したがって、とくに貴重な試料からの核酸抽出操作においては、核酸分解酵素から試料を保護することが最大の課題となっていた。
【０００５】
共存あるいは混入する核酸分解酵素を失活させる方法として、プロテアーゼＫによる消化が知られているものの、プロテアーゼＫも蛋白質であるために、核酸分解酵素と同様に可溶化や還元を受け、失活するという問題があった。そのため、プロテアーゼＫによる消化は、一般に可溶化剤や還元剤を微量のみ含む希釈条件下で行うが、そのような希釈溶液中では核酸分解酵素も活性を示すようになるため、核酸の分解を防止する上で有効な手段とは言い難かったのが実情である。
【０００６】
この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、核酸分解酵素による核酸の分解を確実に防止する簡便な方法を提供することを課題としている。この出願の発明は、また、核酸分解酵素による核酸分解を防止しながら核酸を抽出する効率的な方法や抽出された核酸を保存するための効果的な方法を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するものとして、まず、第１には、細胞からの核酸の抽出時および／または保存時に、核酸分解酵素による核酸の分解を防止するための方法であって、少なくとも、核酸分解酵素におけるジスルフィド結合を解裂させ、スルホヒドリル基を形成する工程と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾する工程を有することを特徴とする核酸の分解防止方法を提供する。
【０００８】
また、この出願の発明は、第２には、核酸分解酵素におけるジスルフィド結合の解裂をβ−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される試薬を用いて行う前記の核酸分解防止方法を、第３には、スルホヒドリル基の選択的修飾をモノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される修飾試薬を用いて行う前記の核酸分解防止方法を、そして第４には、スルホヒドリル基の選択的修飾をヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される修飾試薬を用いて行う前記の核酸分解防止方法を提供する。
【０００９】
第５には、この出願の発明は、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から核酸を抽出する方法であって、少なくとも、細胞を溶解する工程と、細胞を溶解した溶解液に含まれる核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成する工程と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾する工程
を有することを特徴とする核酸抽出方法を提供する。
【００１０】
この出願の発明は、第６には、核酸分解酵素におけるジスルフィド結合の解裂をβ−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される試薬を用いて行う前記の核酸抽出方法を、第７には、スルホヒドリル基の選択的修飾をモノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される修飾試薬を用いて行う前記いずれかの核酸抽出方法を、そして、第８には、スルホヒドリル基の修飾をヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される修飾試薬を用いて行う前記の核酸抽出方法を提供する。
【００１１】
さらに、第９には、この出願の発明は、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から抽出された核酸を保存するための方法であって、少なくとも、核酸溶液中に含まれる核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成するジスルフィド結合解裂試薬と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾する修飾試薬を含有する保存液中で核酸を保存することを特徴とする核酸の保存方法を提供する。
【００１２】
この出願の発明は、第１０には、ジスルフィド結合解裂試薬がβ−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される前記核酸保存方法を、第１１には、修飾試薬がモノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される前記核酸保存方法を、また、第１２には、修飾試薬がヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される前記いずれかの核酸保存方法を提供する。
【００１３】
この出願の発明は、また、第１３には、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から核酸を抽出するためのキットであって、少なくとも、核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成するためのジスルフィド結合解裂試薬と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾するための修飾試薬を含有することを特徴とするキットを、第１４には、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から抽出された核酸を保存するためのキットであって、少なくとも、核酸分解酵素のジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基を形成するためのジスルフィド結合解裂試薬と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾するための修飾試薬を含有することを特徴とするキットを提供する。
【００１４】
さらに、この出願の発明は、第１５には、ジスルフィド結合解裂試薬がβ−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、水素化ホウ素ナトリウムおよび亜硫酸塩から選択される前記いずれかのキットを、第１６には、修飾試薬がモノハロゲン化酸およびその酸アミドから選択される前記いずれかのキットを、そして第１７には、修飾試薬がヨード酢酸、ヨードアセトアミド、クロロ酢酸、クロロアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド、およびブロモコハク酸からなる群より選択される前記いずれかのキットを提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
この出願の発明者は、核酸分解酵素を失活させるためには、そのコンホメーションを変化させることが有効である点に着目し、そのようなコンホメーション変化を不可逆的に起こす方法を検討した。そして、蛋白質である核酸分解酵素に作用し、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸には作用しない方法を見出し、本願発明に至ったのである。
【００１６】
核酸分解酵素等の蛋白質は、システイン（Ｃｙｓ）を有する。システインは、側鎖にスルホヒドリル（ＳＨ）基を有するアミノ酸であり、蛋白質配列中に存在する二つのシステインは互いにジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成することにより複雑な立体構造を構築し、安定化させる。また、このような立体構造によって各蛋白質に応じた活性が発現される。
【００１７】
核酸の抽出操作においては、一般的に、核酸分解酵素を還元し、ジスルフィド結合を切断してスルホヒドリル基（ＳＨ）とすることにより立体構造を変化させ、不活性化させている。しかし、前記のとおり、還元によりシステイン側鎖のＳＨが形成されても、反応平衡や還元剤の除去により酸化反応が進行するようになるため、再びジスルフィド結合が形成されて核酸分解酵素が活性を示してしまう。
【００１８】
そこで、この出願の発明の核酸の分解防止方法では、ジスルフィド結合の再形成を阻止することにより、核酸分解酵素を不可逆的に不活性化させる。
【００１９】
すなわち、この出願の発明の核酸の分解防止方法は、少なくとも
（ａ）核酸分解酵素におけるジスルフィド結合を解裂させ、スルホヒドリル基を形成する工程と、
（ｂ）該スルホヒドリル基を選択的に修飾する工程
を有することを特徴とするものである。
【００２０】
本発明の核酸の分解防止方法において、ジスルフィド結合を解裂させ、スルホヒドリル基を形成する工程は、各種の試薬により行うことができる。具体的には、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸、および水素化ホウ素ナトリウムによりジスルフィド結合を還元し、解裂させる方法や亜硫酸塩によりジスルフィド結合を解裂する方法が例示される。とくに、ジチオスレイトールやジチオエリスリトールはジスルフィド結合を効率よく解裂する。また、β−メルカプトエタノールやβ−メルカプトエチルアミンも効率よくジスルフィド結合を解裂できる。中でもβ−メルカプトエタノールは安価で扱い易いことから好ましい。
【００２１】
また、本発明の核酸分解防止方法では、該スルホヒドリル基を選択的に修飾するための試薬もとくに限定されない。一般に、蛋白質の修飾試薬にはアミノ基を標的とするものが多いが、アミノ基は核酸にも存在することから、この出願の発明の方法においては適さない。また、カルボキシル基、グアニジル基、イミダゾール基、酸アミド基等も考慮されるが、これらを反応させるとアミノ基も同時に反応してしまうことが多く、さらに、これらの官能基を修飾しても核酸分解酵素の構造に著しい影響を与えて完全に失活させられるとはいい難いため、標的としては好ましくない。一方、蛋白質に含まれるシステイン残基のスルホヒドリル（ＳＨ）基に特異的に作用する修飾試薬の場合、核酸はＳＨ基を有さないことから、核酸に影響を与えることなく核酸分解酵素の立体構造を不可逆的に変性させることが可能であり、好ましい。
【００２２】
このようなＳＨ基に特異的に作用する修飾試薬は特に限定されないが、次の表１に示されるように、アルキル化、二重結合への付加、アリル化反応等を起こす各種の試薬が挙げられる。
【００２３】
【表１】
2004057064.tif 000002
【００２４】
これらの試薬による反応は、すべてがスルホヒドリル基に特異的なものではないが、ｐＨ、温度、試薬濃度等の条件を適宜設定することによりスルホヒドリル基に特異的に反応させることができる。一般に、核酸の抽出は通常ｐＨ　８〜９で室温下で行われることから、同様の条件下でスルホヒドリル基に対して特異的にアルキル化反応するアルキル化剤、具体的には、ヨード酢酸、ブロモ酢酸、クロロ酢酸、およびそれらのアミド、Ｎ−（４−ヨードフェニル）ヨードアセトアミド、４−ブロモアセトアミド−２−ニトロフェノール、２，２’−ジカルボキシ−４’−ヨードアセトアミド、α−ヨードプロピオン酸、α−ヨードプロピオンアミド、β−ブロモエチルアミン、ヨウ化メチル、エチレンイミン、ω−クロロアセトフェノン、メチル−ｐ−ニトロベンゼンスルホン酸、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ペンタメチル−１，３−プロパンジ（アンモニウムブロミド）（ＴＡＰ２−Ｂｒ）、（３−ブロモプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド（ＴＡＰ−Ｂｒ）、およびブロモコハク酸等の試薬が好ましい。以上の各種試薬の中でも、室温、ｐＨ　８付近でＳＨ基と反応するヨード酢酸やシステインプロテアーゼインヒビターとして知られるヨードアセトアミドがとくに好ましい。酸は溶液のｐＨに影響されやすいことから、入手や取扱いも比較的容易なα−ヨードアセトアミドが好ましく例示される。また、α−ヨードプロピオンアミドもＳＨ基への反応特異性が高いが、反応速度はα−ヨードアセトアミドの方が速い。
【００２５】
このようなアルキル化剤は、前記のとおり核酸の抽出条件においてＳＨ基に対する特異性を示すため好適である。例えば、モノヨード酢酸とそのアミドの反応は、高濃度の試薬および高温といった過酷な条件下ではメチオニン、ヒスチジン、あるいはリジンの側鎖とも反応するが、室温、ｐＨ　９前後では主にＳＨ基と反応することが知られている。（例えば、Ａｎｆｉｎｓｅｎらは、ｐＨ　８．５、室温下、２時間の反応では、モノヨード酢酸塩がポリリジンのアミノ基やヒスチジンのイミダゾール基をアルキル化しないことを確認している（Ａｎｆｉｎｓｅｎ，　Ｃ．Ｂ．　（１９５８）　”Ｓｙｍｏｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”　ｅｄ．　ｂｙ　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，　Ａ．　ｐ．２２３，　Ｍａｔｈｕｅｎ，　Ｌｏｎｄｏｎ；　Ｓｅｌａ，　Ｍ．，　Ｗｈｉｔｅ，　Ｆ．Ｈ．　ａｎｄ　Ａｎｆｉｎｓｅｎ，　Ｃ．Ｂ．　（１９５９）　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　３１，　４１７）。）さらに、α−ヨードプロピオン酸およびα−ヨードプロピオンアミドはモノハロゲン化酸の中では最もスルホヒドリル基に対する特異性が高い。アミドは酸に比べて反応が４０倍遅くなるが、特異性は２倍になることが知られている（Ｗａｌｌｅｎｆｅｌｓ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｅｉｓｅｌｅ，　Ｂ．　（１９６８）　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　４１，　４７１）。
【００２６】
ＳＨ基を修飾する方法としては、表１に示されるように、上記のとおりのアルキル化剤を用いるアルキル化反応以外にも、有機水銀化合物を用いるメルカプチド形成、Ｎ−エチルマレイミドによる二重結合への付加反応等が挙げられる。しかし前者は試薬の多くが水銀や砒素を含有するため安全性の面で配慮を要し、後者はｐＨ　８〜９の範囲でアミノ基とも反応するためＳＨ基特異性が低い（Ｋａｌａｎ，　Ｓ．Ｂ．，　Ｎｅｉｓｔａｄｔ，　Ａ．　ａｎｄ　Ｗｅｉｌ，　Ｌ．　（１９６５）　Ｆｅｄ．　Ｐｒｏｃ．　２４，　２２５）という問題点を有する。さらに、アリル化、酸化、チオール−ジスルフィド交換反応、スルフェニル化などの反応は可逆的である場合が多い。しかし、本発明では、核酸抽出とＳＨ基に対する特異的修飾が同様の条件下で進行するような最適条件が見出せれば、これらの試薬も十分に利用可能である。
【００２７】
本発明の核酸の分解防止方法は、以上のとおりの（ａ）および（ｂ）で示される工程を有するものであればよいが、これら以外にも、洗浄工程、培養工程、攪拌工程、遠心工程、ろ過工程、吸着工程、溶出工程、分別工程、クロマトグラフィー工程等を有していてもよい。また、上記の（ａ）と（ｂ）は別々の操作として、連続的に行ってもよいし、核酸溶液を含有する容器中にジスルフィド結合解裂試薬と修飾試薬の両方を同時に添加し、核酸分解酵素の解裂反応と形成されたＳＨ基の修飾反応が同一容器内でほぼ同時に進行するようにしてもよい。
【００２８】
この出願の発明では、以上のとおりの核酸の分解防止方法に基づき、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら細胞から核酸を抽出したり、抽出された核酸を保存したりする方法も提供する。すなわち、核酸分解酵素のジスルフィド結合を予め解裂させ、スルホヒドリル基を形成させるためのジスルフィド結合解裂試薬と、該スルホヒドリル基を選択的に修飾するための修飾試薬を少なくとも１種ずつ核酸溶液中に共存させることにより、精製工程により除去しきれずに共存している核酸分解酵素や周辺環境から混入した核酸分解酵素による核酸の分解を防止することが可能となり、抽出操作中や保存期間中に貴重な核酸が分解することがなくなる。
【００２９】
もちろん、本発明の核酸の抽出操作においては、細胞を溶解し、含有される蛋白質を可溶化する工程等の通常の操作が含まれていてもよい。また、本発明の核酸の保存方法は、予め通常の操作により核酸の精製等を行った後、得られた核酸溶液に対して実施されるものであってよい。
【００３０】
この出願の発明は、さらに、以上のとおりの方法により核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら核酸を抽出するための核酸抽出用キットと、抽出された核酸が核酸分解酵素により分解されることを防止しながら該核酸を保存するための核酸保存用キットをも提供する。これらのキットは、核酸分解酵素の作用を不可逆的に抑制するために、少なくとも
（ａ）核酸分解酵素におけるジスルフィド結合を解裂し、スルホヒドリル基とすることのできるジスルフィド結合解裂試薬と
（ｂ）該スルホヒドリル基を選択的に修飾できる修飾試薬
を含有するものであればよく、その他の構成成分はとくに限定されない。例えば、抽出用キットの場合には、細胞を溶解させ、細胞内の蛋白質を可溶化するための可溶化剤を始めとする細胞溶解液や界面活性剤、ｐＨ調製のための緩衝液、溶媒としての滅菌水やアルコール等を含有していてもよい。また、保存用キットは、例えば安定化のための緩衝液や塩類、溶媒としての滅菌水やアルコール等を含むものであってもよい。さらに、これらのキットは、抽出操作のための容器やピペッター、あるいは保存のためのバイアル瓶や蓋等を含んでいてもよい。
【００３１】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細に説明する。もちろん、この出願の発明は、以下の実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００３２】
【実施例】
＜実施例１＞
（１）膵臓組織からのＲＮＡ抽出
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雄）から膵臓を摘出し、液体窒素にて凍結した後、なるべく融解しない状態で膵臓を約３０　ｍｇの大きさに刻み、以下の組成を有する溶解液Ａを加えて組織片をホモジナイザーにより粉砕した。
【００３３】
〔溶解液Ａ〕
４　Ｍ　　グアニジンイソチオシアネート
５０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　８．０
１０　ｍＭ　　エチレンジアミン四酢酸
０．５　％（ｗ／ｖ）　ラウリルザルコシンナトリウム
０．１４　Ｍ　β−メルカプトエタノール
得られたＲＮＡ溶液に等量の７０％エタノールを加え、シリカマトリックス（ＱＩＡＧＥＮ社　Ｒｎｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｐｒｅｐ（登録商標））に吸着させ、洗浄して溶出した。
【００３４】
溶出液中のＲＮＡは、２６０　ｎｍおよび２８０　ｎｍにおける吸光度測定により定量した。
（２）ＲＮＡの静置処理
回収したＲＮＡ２０μｇに〔２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　８．４）、２　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０　ｍＭ　ＫＣｌ、２０　ｕｎｉｔ　ＤＮａｓｅ　Ｉ〕（１００μｌ）を加え、室温下で１５分間、または３７℃で１時間静置して混入している染色体由来のＤＮＡを消化した。
【００３５】
さらに２５　ｍＭエチレンジアミン四酢酸（１１μｌ）を加えて反応を停止し、６５℃で１０分間静置することによりＤＮａｓｅ　Ｉを失活させた。３　Ｍ酢酸ナトリウム（１１μｌ）を加え、さらに２．５倍量のエタノールを加えた後、ドライアイス中に１５分置いてＲＮＡを沈殿させた。
【００３６】
遠心により沈殿を回収し、該沈殿をジエチルピロ炭酸処理した超純水２０μｌに溶解した。これを一部採取して２６０　ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＮＡの定量を行った。
（３）ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動
ＲＮＡを〔３−［Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）、４　ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ　７．０）１．６　ｍＭエチレンジアミン四酢酸、６％ホルムアミド、０．１８　Ｍホルムアルデヒド、４％グリセロール〕（１６　ｍＭ）中に溶解し、６５℃で５分間処理して変性させた後、〔２０　ｍＭ　ＭＯＰＳ、５　ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ　７．０）、１　ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．２２　Ｍホルムアルデヒド、１００　ｎｇ／ｍＬエチジウムブロマイド〕を含有する１．２％のアガロースゲルを用いて、５　Ｖ／ｃｍで２時間電気泳動を行い、泳動パターンの解析を行った。
【００３７】
図１に膵臓細胞から抽出した直後のＲＮＡ（ａ）、室温下１５分のＤＮａｓｅ　Ｉ処理を行った後（ｂ）、および３７℃下１時間のＤＮａｓｅ　Ｉ処理を行った後（ｃ）の電気泳動結果を示した。また、図１（ａ）〜（ｃ）では、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｐｒｅｐ（登録商標）キットを用いて精製したＲＮＡをスタンダードとして〔＋〕で表し、溶解液Ａを用いて抽出したＲＮＡを〔−〕として比較した。さらに、溶解液Ａを用いた抽出後にヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を１０、５０、１００μＭ添加して調整したＲＮＡの電気泳動パターンを比較した。
【００３８】
膵臓細胞から抽出した直後のＲＮＡでは、市販のキットを用いて抽出した場合と溶解液Ａを用いて抽出した場合、さらに、溶解液Ａを用いて抽出した後各濃度のＩＡＭを添加した場合とで、いずれも同等の電気泳動パターンが得られた。（図１ａ）
一方、ＲＮＡを室温下１５分のＤＮａｓｅ　Ｉ処理した場合では、市販のキットで精製したＲＮＡの電気泳動パターンにおいて低分子の位置が明るく染色され、若干の断片化が進行していることが確認された。また、溶解液Ａを用いて抽出したＲＮＡの電気泳動パターンにおいて、ＩＡＭを添加しなかったものでは分解がかなり進んでいることが確認された。しかし、１０　ｍＭのＩＭＡを加えたものでは市販のキットを用いて抽出したＲＮＡと同程度に分解が抑えられ、ＩＭＡを５０　ｍＭおよび１００　ｍＭ加えた場合では市販のキットで抽出したＲＮＡよりも高分子量の位置のバンドがはっきりと認められた。（図１ｂ）
さらに、ＲＮＡを３７℃で１時間静置してＤＮａｓｅ　Ｉ処理した場合には、市販のキットを用いて抽出したＲＮＡにかなりの分解が見られた。また、溶解液Ａを用いて抽出したＲＮＡでも、ＩＡＭを添加しなかった場合にＲＮＡが著しく分解し、低分子のみとなった。ＩＡＭを１０　ｍＭを加えた場合には、市販のキットを用いて抽出したＲＮＡと同等の分解が見られた。しかし、ＩＡＭを５０　ｍＭおよび１００　ｍＭ添加した場合には、３７℃で１時間静置した後も分解がほとんど見られなかった。（図１ｃ）
膵臓のようにリボヌクレアーゼの豊富な臓器の細胞からＲＮＡを調製しようとする場合、最終調製票品にリボヌクレアーゼが非常に混入しやすく、混入したリボヌクレアーゼは抽出操作直後には活性を示さないものの、保存期間中に徐々に活性を表し、抽出したＲＮＡを損なう恐れがある。
【００３９】
以上の実施例より、この出願の発明のＲＮＡの抽出方法を適用することにより、混入するリボヌクレアーゼを完全に除去できない場合でも、リボヌクレアーゼを不可逆的に失活させることが可能となり、３７℃においても抽出されたＲＮＡを安定に保存できることが確認された。
【００４０】
【発明の効果】
以上、詳しく説明したとおり、この出願の発明により、核酸分解酵素による核酸の分解を不可逆的に阻止する簡便な方法が提供される。また、この出願の発明により、核酸分解酵素による核酸の分解を防止しながら核酸を抽出する方法や抽出された核酸を保存する有効な方法が提供される。
【００４１】
この出願の発明の核酸の分解防止方法では、核酸分解酵素に含まれ、核酸中には存在しないＳＨ基を特異的に修飾して核酸分解酵素を不可逆的に失活させるため、抽出された核酸中に微量の核酸分解酵素が残存していたり、外部環境から核酸分解酵素が混入したりしても、抽出操作後や保存期間中の核酸分解が効果的に防止される。
【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明の実施例において、本願発明の核酸の分解防止方法を用いて膵臓からＲＮＡを抽出した際の電気泳動結果を示した図である。（ａ：抽出直後、ｂ：ＤＮａｓｅ　Ｉにより室温下で１５分間処理後、ｃ：ＤＮａｓｅ　Ｉにより３７℃下で１時間処理後；＋：スタンダード、−：溶解液Ａ使用）
【図１】
2004057064.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月12日(2003.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
図１に膵臓細胞から抽出した直後のＲＮＡ（ａ）、室温下１５分のＤＮａｓｅＩ処理を行った後（ｂ）、および３７℃下１時間のＤＮａｓｅＩ処理を行った後（ｃ）の電気泳動結果を示した。また、図１（ａ）〜（ｃ）では、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＰｒｅｐ（登録商標）キットを用いて精製したＲＮＡをスタンダードとして〔＋〕で表し、溶解液Ａを用いて抽出したＲＮＡを〔−〕として比較した。さらに、溶解液Ａを用いた抽出後にヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を１０、５０、１００ｍＭ添加して調整したＲＮＡの電気泳動パターンを比較した。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
膵臓細胞から抽出した直後のＲＮＡでは、市販のキットを用いて抽出した場合と溶解液Ａを用いて抽出した場合、さらに、溶解液Ａを用いて抽出した後各濃度のＩＡＭを添加した場合とで、いずれも同等の電気泳動パターンが得られた。（図１ａ）
一方、ＲＮＡを室温下１５分のＤＮａｓｅＩ処理した場合では、市販のキットで精製したＲＮＡの電気泳動パターンにおいて低分子の位置が明るく染色され、若干の断片化が進行していることが確認された。また、溶解液Ａを用いて抽出したＲＮＡの電気泳動パターンにおいて、ＩＡＭを添加しなかったものでは分解がかなり進んでいることが確認された。しかし、１０ｍＭのＩＡＭを加えたものでは市販のキットを用いて抽出したＲＮＡと同程度に分解が抑えられ、ＩＡＭを５０ｍＭおよび１００ｍＭ加えた場合では市販のキットで抽出したＲＮＡよりも高分子量の位置のバンドがはっきりと認められた。（図１ｂ）
さらに、ＲＮＡを３７℃で１時間静置してＤＮａｓｅＩ処理した場合には、市販のキットを用いて抽出したＲＮＡにかなりの分解が見られた。また、溶解液Ａを用いて抽出したＲＮＡでも、ＩＡＭを添加しなかった場合にＲＮＡが著しく分解し、低分子のみとなった。ＩＡＭを１０ｍＭを加えた場合には、市販のキットを用いて抽出したＲＮＡと同等の分解が見られた。しかし、ＩＡＭを５０ｍＭおよび１００ｍＭ添加した場合には、３７℃で１時間静置した後も分解がほとんど見られなかった。（図１ｃ）
膵臓のようにリボヌクレアーゼの豊富な臓器の細胞からＲＮＡを調製しようとする場合、最終調製票品にリボヌクレアーゼが非常に混入しやすく、混入したリボヌクレアーゼは抽出操作直後には活性を示さないものの、保存期間中に徐々に活性を表し、抽出したＲＮＡを損なう恐れがある。