(57)【要約】【目的】簡易ながら泳動パターンの良い電気泳動用支持体ゲルの新規調製方法及び形状、電気泳動法を得る。【構成】電気泳動用支持体ゲルの新規調製法及び支持基盤・電気泳動法であって、試料を配置する部位が楔型の凹部を形成してなる電気泳動用ゲル及び当該ゲルを作成する容器【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を配置する部位が楔型の凹部を形成してなる電気泳動用ゲル。
【請求項２】
その厚さが２ｍｍ以下である電気泳動用ゲル。
【請求項３】
電気泳動用支持体ゲルを薄型に調製するための鋳型となるプラスチックケース。
【請求項４】
電気泳動用支持体ゲルを簡単に取り出せるスライド式を採用した請求項３に記載のプラスチックケース。
【請求項５】
電気泳動用支持体ゲルの楔型サンプルウェルをつくるための形状をもつコームとなるプラスチックパーツ。
【請求項６】
電気泳動用支持体ゲルの請求項３，４に記載の鋳型となるプラスチックケースに載せることができるカバー形状を合わせ持つコームとなる請求項５に記載のプラスチックパーツ。
【請求項７】
電気泳動用支持体ゲルを冷却しながら電気泳動用支持体ゲルの側面を主として通電して前記ゲル上の核酸・タンパク質を電気泳動させる方法。
【請求項８】
電気泳動用支持体ゲルの濃縮ゲルをつくるためのスペーサーとなるプラスチックパーツ。
【請求項９】
タンパク質に対して特有の分離能を持つ電気泳動用支持体アガロースゲル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はアガロースゲルを用いたタンパク質、及び核酸に関する電気泳動を行う上で、それらの構造と機能の相関に関した知見を与え、医薬品の開発、臨床検査、食品の品種検定等、生物試料を用いる各分野において利用される。
【０００２】
【従来の技術】
電気泳動分析用支持体としてゲルを用いた従来の技術を説明する。
まず電気泳動法は連続緩衝液系、及び不連続緩衝液系の二つに大別される。連続緩衝液系を以下に説明する。電極液、サンプル、ゲルは全て同じｐＨの緩衝液を用い、ゲルにつくったウェルにサンプルを直接アプライし、電場をかけるとゲル中で荷電をもったサンプルが電荷と相反する電極に向かって流れ出す。ゲルの網目構造に由来した分子ふるいの効果で流体力学的な形状が異なる混合生物試料を分離する。この方法は単一の組成の緩衝液を用いた均一なゲルで容易に調製できる。
【０００３】
反面、泳動方向に対するウェルの大きさが分離能を決める大きな要因となるため、サンプルをアプライする量が制限され、使い勝手が悪い。現在では核酸の電気泳動には支持体としてアガロースを用いた連続緩衝液系で使われるのが一般的である。また不連続緩衝液系は以下のとおりである。異なるｐＨの緩衝液、サンプル、濃縮ゲル、分離ゲルをそれぞれ用いる方法である。特にＬａｅｍｍｌｉの方法が現在広く使われている。その方法とはタンパク質の分離にＴｒｉｓ，Ｇｌｙｃｉｎｅ，ＨＣｌのｐＨの異なるイオン種の電気的特性を生かし、濃縮ゲルではサンプルを濃縮し、次の分離ゲルで濃縮したサンプルを分離する仕組みで高い分離能を実現することができる。しかし、ｐＨの異なる二つのゲルを調製することが難しくて手間がかかり、再現性の面で問題がある。また、泳動時間が９０分以上かかるケースもあり、連続系にくらべると時間がかかる。一般的に不連続緩衝液系ではポリアクリルアミドを用いている。しかしこのアクリルアミドは未重合のモノマーの状態では一過性の神経毒の作用があり、取扱いが危険である。
【０００４】
次に支持体であるアガロースゲルとポリアクリルアミドの特有の性質を説明する。アガロースは分子の構造上、ゲル化した際の網目構造がアクリルアミドとくらべて大きくなるため分子ふるいの効果が小さく低分子の分離には不向きである。アガロースを支持体とした核酸の電気泳動は、流体力学的形状と電気的特性が比較的均一であるため、ＤＮＡ塩基対数の違いにより分けることができる。一方タンパク質はその流体力学的形状、分子の荷電状態が個々のタンパク質によって異なるため、分子量の違いでタンパク質を分離する場合、ＳＤＳという界面活性剤を利用してタンパク質を変性させて電気泳動で分離する方法がとられてきた。ＳＤＳを添加することにより一様な電荷と流体力学的形状をもつようになることで、分子ふるい効果が顕著になるためである。
【０００５】
他に重要な点はゲル・緩衝液の熱対策である。温度が上昇するとバンドが拡散したり、ゲルの物性がかわることで分子ふるい効果が温度により異なってくる。この問題に対し、現在では電気泳動装置に対し空冷か全く熱対策をおこなってないかのどちらかである。ゲルの形状に対しては熱の不均一を避けるためゲルの厚みを薄くすることで熱対策を行っている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
連続緩衝液系ではゲルの調製が容易である。しかし連続緩衝液系にではサンプルの濃縮過程がないことでの分離能の低下は余儀なくされる。本研究の目的はタンパク質、核酸共に電気泳動が行える毒性のない支持体として用いることを前提として電気泳動用ゲル及び、その支持基盤の形状と電気泳動法を発明することにより分離能の改良を施すことである。また不連続緩衝液系でも高品質なゲルの調製が容易となるためのパーツの発明を行うことを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
連続緩衝液系であってもサンプルウェルの形状を楔型することでサンプルのアプライがしやすく、かつ濃縮ゲルを作成せずとも高い分離能の泳動パターンを得ることができる。また温度上昇を抑えるためにプレキャストゲルの形状や電気泳動装置を工夫することで再現性があり、バンドの拡散を少なくした電気泳動を行うことができる。
【０００８】
次に濃縮ゲルを容易に作ることができるスペーサーを考案する。アガロースには毒性はなく、現在では低分子も分離できるようその化学構造を変更したものが開発されており、これを用いれば低分子のタンパク質の分離も可能である。逆にアクリルアミドでは分離ができない高分子のタンパク質においてはアガロースの大きな網目構造の方が有利である。従って、タンパク質、核酸共にアガロースを支持体として用いた連続緩衝液系の電気泳動により高い分離能をもち、かつ毒性がなく取扱いの容易な新規なアガロースプレキャストゲルを開発することで上記問題点を解決できる。
【０００９】
【実施例】
以下本発明の実施例を詳細に分説する。
１、サンプルウェルを形成するコームについて
連続緩衝液系ではサンプルを十分濃縮できないことが分離能を低下させる要因であった。そこで楔型のサンプルウェルを作ることができるコームを作成した（図１）。
図１の（ａ）　は、プラスチック製のカバー型コームの一例であり、カバー２の一縁部に、楔型を有する凸状のコームの歯１が形成されている。
このカバー型コームを用いて、ゲルを生成する。具体的には、図１（ｃ）に示すようにゲル溶液にまずゲルカバー６をかぶせ、ゲルカバー６上のコーム対応小窓５を通じて歯１がゲル溶液内に新入するようにコーム型カバー２をかぶせる。ゲル溶液は、ゲルカバー６とゲルトレイ７の間隙に存在するので、ゲル化した際にはその間隙の厚さに調整される。
得られたものが、図１（ｂ）に示すゲル基材である。（ｄ）は、（ｂ）における　Ａ−Ａの断面図である。
３は、ゲル基材４上に形成された楔型の凹部（ウエル）である。
ゲルカバー６をつけて作成したことにより、コーム対応小窓５内にゲルが進入しているため、ウェル３の壁は、ゲル４の厚みよりも高くなっている。
このことは、ウエル内に注入できるサンプルの量を増やすことを意味しており、ゲルを薄くすることによるサンプル量の減少という問題点を解決している。
また歯１の先端をとがらせていることによりサンプルをウェルにアプライした場合、ゲル下端の方向にサンプルが集まる形となり泳動後もシャープなバンドを形成することができる。さらに電気泳動に負荷するサンプル量も十分確保できる。
【００１０】
２、カバー型コームについて
図１（ａ）に楔型の凸部１を有するカバー型コームの形状を示す。この形状の利点は以下のとおりである。１つ目は図１（ｃ）で示すようにカバー型コーム４がゲルカバー６と同じサイズであるため、両者を重ねあわすことにより一定の位置でウェルをつくれるという点である。２つ目は１つ目のようにしてカバー型コーム２とゲルケース６を重ねれば、縦でも横でもどちらでもプレキャストゲルを作ることができるという点である。３つ目は２つめのカバー型コーム２をゲルトレイ７と、ゲルカバー６を組み合わせて得られるゲルケースに重ねたもの同士で隙間なく重ねることができる点である。
５は、コーム対応の小窓で、この部分に、カバー型コーム２上に形成された楔型凸部２が進入することで、ゲルケース内に、楔型の凸状の歯２が突出し、ゲルケース内のゲル基材に、楔型の凹状の試料（サンプル）を配置するためのウエル部分が形成される。
【００１１】
これらの３つの利点からゲルメーカーなくしても方法次第でプレキャストゲルの量産が可能となる。（例えば、ゲルトレイ７とゲルケース６を重ね合わせて得られるゲルケース内に、ゲル化前の液状体を注入し、固化後または、固化の前に、カバー型コーム２を、小窓５から、歯１が突出するように重ね合わせて、電気泳動用のゲルを製造する。）
【００１２】
３．超薄型のゲルを形成する支持基盤について
従来のアガロースゲルを用いた連続緩衝液系の電気泳動では比較的ゲルに厚みを持たせ、サンプルのアプライ量を確保することで泳動の安定性を保たせている。しかしタンパク質での電気泳動はゲル中の熱の不均一やブロッディングの転写効率の悪さなどの問題があり、ゲルに厚みがあることは好ましくない。　そこで図２（ａ）に示すようなゲルを支持する２枚の基盤（ゲルカバー６及びゲルトレイ７）を作成し、ゲルの厚み１ミリから２ミリ程度のゲルを作成する。また、ウェル付近だけ盛り上がった形となるため、サンプルを十分にアプライすることができる。
【００１３】
４，ゲルについて
ここに使用したアガロースは伊那食品工業社製が好ましく、これをトリスグリシン、もしくはトリスホウ酸系の緩衝液に２．０から６．０重量％の範囲で溶解し、冷却、ゲル化した後に電気泳動に使用する。
【００１４】
５、スライド式を採用したゲルケース
核酸やタンパク質の電気泳動後、分離したバンドを検出するために染色作業が必要となってくる。その染色作業では染色液がゲル全体に充分浸透するよう、ゲルケースなしで染色液の入った容器に沈めなければならない。そこで重要になってくるのはゲルの取り扱いである。特にゲルの濃度が比較的低いとゲルの物性は緩くもろいものとなる。
そこで図２（ａ）から（ｃ）に示すようなゲルケースを容易にとりだせるような仕組みを提案する。
これはゲルトレイ７とゲルカバー６をスライド構成としてゲル４を取り出すのである。図２（ａ）は、ゲルカバー６と、ゲルトレイ７を分離した状態を示し、図２は、ゲルカバー６と、ゲルトレイ７を、スライドさせて結合した状態を示す。
図２（ｃ）は、ゲルカバー６と、ゲルトレイ７を結合した方向とは、逆の方向にスライドさせて、内部のゲル基材４をとりだそうとするところである。
スライドによるゲルカバー６と、ゲルトレイ７との結合分離構成は、特に限定するものではなく、適宜選択される。
この発明によりゲルを壊すことなくスムーズに染色作業に移れる。
【００１５】
６、電気泳動装置に対する冷却手段の適用について
図４は、電気泳動装置の一例を示す。これは例えば特願２００１−５５８１８号に開示された構成である。
４１は、蓋部であり、泳動用ゲル基材４２の付近に凹部４６が形成され、蓋部４１は、泳動槽４０と結合する際、泳動槽４０の泳動用ゲル基材４２据え置き部４７に据え置かれた泳動用ゲル基材４２を挟み込む様にして装着される。
４３は、緩衝液で、４５が、電極対である。両電極間には、適宜直流、半波乃至全波整流、その他のパルス波が加えられる。
蓋の凹部４６に冷却水４４を入れることでゲル及びｂｕｆｆｅｒの温度上昇を抑える。これによりアガロースゲル支持体の体積的な変化やバンドの拡散を防げるため、分離能が高く、かつ高い再現性で電気泳動を行うことができる。
【００１６】
７、アガロースゲルを使用する利点
（ウェスタンブロッティングにおける転写効率の向上）
アガロースゲルはその化学構造がアクリルアミドとは異なるためゲル化した際の網目構造がより大きな孔径をとる。したがってタンパク質をＰＶＤＦ膜等に転写する効率が良い。逆にアクリルアミドゲルでは網目が小さいため転写しにくい。したがってアガロースゲルは膜への転写時間をより短時間にすることができ、かつ分子量の大きなタンパク質も転写が可能となる利点をもつ。
【００１７】
８、アガロースゲルによる変性タンパク質の泳動によるバンド移動度の特徴
アガロースゲルはその物理的特性のため変性系のタンパク質電気泳動におけるバンドの移動度と分子量の関係が均一なアクリルアミドゲルのそれとくらべて異なる。バンドの移動度と分子量の関係を均一なアガロースゲル、均一なアクリルアミドゲルで比較したものを図８に示す。図８から分かるように均一なアガロースゲルにおいては泳動度と分子量の対数の間に直線関係が成り立つ範囲が広い。これは均一なアクリルアミドにくらべより広範囲にわたってタンパク質を分離できる利点をもつことを意味する。
【００１８】
９、アガロースゲルの染色効率の高さ
アガロースゲルにおいては上記５で指摘したようにアクリルアミドよりも大きな網目構造をもつため、ＣＢＢ染色等の通常のタンパク質のゲル染色がより効率的に短時間で行うことができる利点をもつ。
【００１９】
１０、濃縮ゲル作成スペーサーについて
電気泳動の分解能を向上させるため、Ｌａｅｍｍｌｉの方法等により分離ゲルに加え濃縮ゲルを追加することが好ましい。しかし組成が異なるゲルを順序よく鋳型に支持体として固定しなければならないので、手間と質がその調製方法に問われる。そこでプレキャストゲルを作成する際、図３のような濃縮ゲル作成スペーサーを使用する実施例を示す。
図３（ａ）で示すゲルスペーサーは、スペーサー本体３１に、ゲルカバーの小窓（例えば図３（ｂ）でしめすゲルカバー３３の小窓３４）に勘合可能な形状を有する連続した凸体３２を組み合わせて形成されたものである。
方法はまずゲルカバー３３の小窓３４にゲルスペーサーの凸体３２をはめ込む。そしてゲルメーカー用トレイ３５に溶かしたアガロース水溶液またはアクリルアミド−ＢＩＳ−ＴＥＭＥＤ−ＡＰＳ水溶液等を流し込みゲルスペーサー本体３１が結合したゲルカバー３３を気泡がはいらないようにかぶせ分離ゲルを調製する。
それらの水溶液がゲル化したらそのカバー３３を外し、前回とは異なる組成のゲル化前の溶液をスペーサー本体３１が取り去られた後のくぼみの部分に流し込み、ゲルスペーサー本体３１を取り外したゲルカバー３３を再び被せ、コームを立てることにより濃縮ゲルを調製する。尚、ゲルスペーサーのと伝い３２を歯状構造とすることで、ゲルスペーサーとカバー型コームを一体化しても良い。
【００２０】
従来では一つ目にゲルケースを立て、上から溶液を流し込むことで下から分離ゲル、そして濃縮ゲルを調製する方法がある。二つ目にゲルケース及びゲルメーカーを用いて均一ゲルを調製した後、濃縮ゲルを作るためカッターで切り取ることでくぼみをつくり、次いで溶液を流し込みそれを調製する方法である。前者は効率よくそれらを調製することができるが、表面張力のため分離ゲルと濃縮ゲルの界面を平たく整えることができない。また後者では逆に質自体は良いが手間がかかるという欠点がある。そこで濃縮ゲル作成スペーサーを使用することでそれら両者の問題を克服できる。アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルの両者の調製に対応しているため、ゲル濃度・ゲルの種類・濃縮部分と分離部分の区画指定といった組み合わせが多種多様である。これは核酸やタンパク質などのサンプルの条件に合わせて自由に電気泳動の分解能をある程度の幅でもって調節できるものである。
【００２１】
実験例１　（タンパク質の未変性系電気泳動）
ゲル組成
アガロース　　　　　　　　　４％
ゲル上には、図１（ｂ）で示すような楔型のウェルを形成している。
２×サンプル処理液
トリス　９０ｍＭ
ホウ酸　８７ｍＭ
グリセロール　２０％
ＢＰＢ　０．０２％
泳動用バッファー
トリス　４５ｍＭ
ホウ酸　４３．５ｍＭ
各タンパク質を１μｇ／μｌとなるように２×サンプル処理液にて調製しＭｕｐｉｄ−Ｓ（アドバンス社製）電気泳動槽で１μｌ．を１００ｖ全波整流型定電圧、３０分間電気泳動に供した。結果を図５に示す。
【００２２】
実験例２（タンパク質の変性系電気泳動）
ゲル組成
アガロース　　　　　　　　　４％
ゲル上には、図１（ｂ）で示すような楔型のウェルを形成している。
２×サンプル処理液
トリス　　　　　　　　　９０ｍＭ
ホウ酸　　　　　　　　　８７ｍＭ
ＳＤＳ　　　　　　　　　　２０％
２−メルカプトエタノール　６％
グリセロール　　　　　　２０％
ＢＰＢ　　　　　　　　　　０．０２％
泳動用バッファー
トリス　　　　　　　　　４５ｍＭ
ホウ酸　　　　　　　　　４３．５ｍＭ
ＳＤＳ　　　　　　　　　　　０．１％
各タンパク質を１００ｎｇ／μｌとなるように２×サンプル処理液にて調製しＭｕｐｉｄ−Ｓ電気泳動槽で１μｌ．を１００ｖ全波整流型定電圧、３０分間電気泳動に供した。結果を図６に示す。
【００２３】
実験例３　核酸の電気泳動
ゲル組成
アガロース　　　　　　　　　４％
ゲル上には、図１（ｂ）で示すような楔型のウェルを形成している。
泳動用バッファー
トリス　４５ｍＭ
ホウ酸　４３．５ｍＭ
０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）　１ｍＭ
１００ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ　Ｍａｒｋｅｒトータル５００ｎｇをＭｕｐｉｄ−Ｓ（アドバンス社製）電気泳動槽で１００ｖ全波整流型定電圧、３０分間電気泳動に供した。結果を図７に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例を示す図
【図２】本発明の実施例を示す図
【図３】本発明の実施例を示す図
【図４】本発明の実施例を示す図
【図５】本発明の実施例を示す図
【図６】本発明の実施例を示す図
【図７】本発明の実施例を示す図
【図８】本発明の実施例を示す図
【符号の説明】
１　歯
２　カバー型コーム
３　ウェル
４　ゲル（ウェル付）
５　コーム対応小窓
６　ゲルカバー
７　ゲルトレイ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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