(57)【要約】      （修正有）【課題】できるだけ迅速でコスト効率が良い工業的生産規模で有効化されたマイクロアレイ、特にＤＮＡマイクロアレイの調製を可能にすることを目的とする。【解決手段】本システムは、マイクロアレイによって分析されるターゲット分子に関する情報を入力するように設計されている少なくとも１つまたはそれ以上の装置と、分析されるターゲット分子に関する情報に基づいて、潜在的にターゲット分子と相互作用するプローブ分子を決定するように設計されている１つの装置と、１つのレイアウト提供装置と、プローブ分子の外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成のために設計されている１つのプローブ分子合成用装置と、プローブ分子を支持体に適用するように設計されているマイクロアレイ提供装置とを有する。レイアウト提供装置は、高密度でテストプローブ分子を合成するための装置、マイクロアレイ・テスト装置、及びマイクロアレイ読み取り装置からなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、
−マイクロアレイを介して分析されるターゲット分子に関する情報を入力するように設計されている１つ以上の装置と、
−分析されるターゲット分子に関する情報に基づいて、潜在的にターゲット分子と相互作用するプローブ分子(テストプローブ分子)を決定するように設計されている装置と、
−高密度でテストプローブ分子をその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成するための装置、ターゲット分子をテストプローブ分子と接触させるように設計されているマイクロアレイ・テスト装置、及びターゲット分子がテストプローブ分子と接触する間に修正された信号を記録するように設計されているマイクロアレイ読み取り装置を含むレイアウト提供装置と、
−プローブ分子の外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成のために設計されているプローブ分子合成用装置と、
−プローブ分子を支持体に適用するように設計されているマイクロアレイ提供装置
を有する、有効化されたマイクロアレイの分離した調製のためのシステム。
【請求項２】
マイクロアレイを介して分析されるターゲット分子に関する情報入力用の装置が、１つ又はそれ以上のデータ・ファイルに情報を記憶するコンピューターを含む請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
テストプローブ分子を決定するための装置が、ターゲット分子に関する情報に基づきテストプローブ分子をプログラム制御で選択するコンピューターを含む請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
レイアウト提供装置が、データ・ファイルの形態でレイアウトを記憶するコンピューターを含む請求項１乃至３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５】
プローブ分子合成用装置が、固相合成用の装置を含む請求項１乃至４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
マイクロアレイ提供装置が、スポッティング装置を含む請求項１乃至５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７】
マイクロアレイ提供装置及び／又はレイアウト提供装置が、多数の反応領域に支持体を分割するように適応されているパターニング装置を含む請求項１乃至６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８】
各装置がデータ移送装置を介してネットワーク内で接続されている請求項１乃至７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９】
ネットワークがインターネットである請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
各装置が、研究共同体内の相互作用のためにプラットホームで共に連結されている請求項８又は９に記載のシステム。
【請求項１１】
以下の工程：
（ａ）、入力装置により、分析されるターゲット分子に関する情報をマイクロアレイを介して提供し、
（ｂ）情報に基づき、テストプローブ分子決定装置によって、テストプローブ分子を決定し、
（ｃ）−その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成用装置により、決定されたテストプローブ分子を高密度でその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成することにより、少なくとも1つのテスト・マイクロアレイを調製し、
−マイクロアレイ・テスト装置により、ターゲット分子を用いるテスト・マイクロアレイをテストし、そして
−ターゲット分子を用いるテストマイクロアレイをテストした時に修正された少なくとも1つの信号を、マイクロアレイ読み取り装置により記録する
ことからなり、レイアウト装置により、有効化されたマイクロアレイ用レイアウトを提供し、
（ｄ）プローブ分子合成用装置により、有効化されたレイアウトに対応するプローブ分子（有効化されたプローブ分子）を外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成し、そして
（ｅ）有効化されたレイアウトに従って、有効化されたプローブ分子をマイクロアレイ提供装置により支持体へ適用する
からなり、前記請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のシステムを用いる、有効化されたマイクロアレイの分離された調製方法。
【請求項１２】
工程（ａ）における情報及び／又は工程（ｃ）において有効化されたレイアウトが、電子データ移送装置によりデータ・ファイルの形態で提供される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）においてテストプローブ分子がコンピュータ・プログラムによって決定される請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）において有効化されたレイアウトの提供が、以下のサブ工程：
（１）ターゲット分子のプローブ分子との相互作用の場合にマイクロアレイから予測される少なくとも１つの信号を特定すること（予測信号）、
（２）決定されたテストプローブ分子のその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成により高密度でテスト・マイクロアレイを調製すること、
（３）ターゲット分子を用いるテスト・マイクロアレイをテストし、少なくとも１つのテスト信号を記録すること、
（４）少なくとも１つのテスト信号を少なくとも１つの予測信号と比較すること、
（５）テスト信号が本質的に予測信号に相当するまで工程（２）〜（４）を繰り返してテスト・マイクロアレイを適応させ、工程（２）においてプローブ分子、それらの量、結合、数、密度、配向及び／又はマイクロアレイ上の配置を修正すること、及び
（６）少なくとも１つのテスト信号が本質的に少なくとも１つの予測信号に相当するマイクロアレイ・レイアウトを提供すること、
を含む請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
予測信号及びテスト信号が蛍光信号である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）における決定されたテストプローブ分子が、潜在的にターゲット分子と相互作用する分子の合計数を表わす請求項１１乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
テスト分子又は有効化されたプローブ分子及び／又はターゲット分子が、核酸、ペプチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、多糖類及び／又は低分子量の有機物質である請求項１１乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
テスト分子又は有効化されたプローブ分子が、オリゴヌクレオチドである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドが、約８〜約８０のヌクレオチドの長さである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）におけるオリゴヌクレオチドが、有機体の全ゲノム、有機体の１つ以上の染色体の遺伝物質、ｃＤＮＡライブラリー、結合変形、プロモーター領域、ＳＮＰ、突然変異又は高度に反復性のあるＤＮＡ領域を表わす請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
ターゲット分子が、単一又は複合の蛍光ラベルを含んでいる請求項１１乃至２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）及びサブ工程（２）におけるその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成が、それぞれ電気化学的方法によって又はプローブ分子形成ブロックのその場スポッティングにより行なわれる請求項１１乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）及びサブ工程（２）において、それぞれ約２５×７５ｍｍ当り約１，０００以上のテストプローブ分子種が合成される請求項１１乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
約２５×７５ｍｍ当り少なくとも約４，０００のテストプローブ分子種が合成される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｃ）において、１つの支持体上に多重テストマイクロアレイが作製され、及び／又は工程（ｅ）において、有効化されたプローブ分子が多重マイクロアレイに適用される請求項１１乃至２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１１乃至２５のいずれか一項に記載の方法によって得られる、有効化されたマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、実験的に有効化されたマイクロアレイ、特に実験的に有効化されたＤＮＡマイクロアレイを調製するためのシステム、対応する調製方法、及び本発明の方法によって得られるマイクロアレイに関する。本発明のシステム及び方法は、有効化されたマイクロアレイのためのレイアウトの調製と最終生成物自体の調製の分離により特に識別される。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジーにおいては、用語「マイクロアレイ」は、できるだけ小さなスペースへの多数の生体分子サンプルの規則正しい配置を指す。マイクロアレイは、一般に、研究下のサンプル分子と潜在的に相互作用する非常に多くの既知の分子に対する、その同一性及び／又は量が未知のサンプル分子の相互作用を研究する目的に供される。Ｐｈｉｍｉｓｔｅｒ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２１，Ｓｕｐｐｌ．：１−６０の命名法に従い、以下において、研究下の分子は「ターゲット分子」と呼び、一方、規則正しい配置で存在する既知の分子は「プローブ分子」と呼ぶ。プローブ分子は、一般にガラス支持体上に配列されるが、プラスチック、ナイロンあるいは金等の貴金属で作製された支持体も使用される。
マイクロアレイにおいては、プローブ分子を含有するスポット（点滴）は代表的には直径２００μｍ未満であり、通常、何千ものターゲット分子を含んでいるスポットがそのようなアレイに配列される。
【０００３】
マイクロアレイは、多数のプローブ分子／ターゲット分子対のために使用され、特定のプローブ分子／ターゲット分子の組合せの範囲内で多種多用の用途に用いられる。そのため、例えば、ターゲット蛋白質との相互作用を研究するために、様々なペプチドがプローブ分子として配列されるマイクロアレイがある。さらに、蛋白質プローブは様々な潜在的な配位子（リガンド）との結合を研究するために不動化できる。しかしながら、一方、多数の潜在的な有機薬品、低分子量配位子をアレイに配列し、特定のターゲット蛋白質、例えば抑制されるべき酵素の潜在的な配位子に対する結合をテストすることも可能である。他のマイクロアレイ・システムは、同様に糖分子を含んでいる対応するシステムを用いる。
【０００４】
しかしながら、最も一般的なアレイシステムは、核酸とその類似物質、例えばペプチド核酸との間の相互作用の研究に関する。このタイプでは、一般に、例えば１００未満のヌクレオチドを含む比較的短いオリゴヌクレオチドがアレイに配列され、一方、未知のターゲット核酸あるいは未知の量のターゲット核酸が、公知の塩基対法則に従ってハイブリッド化に関してテストされることになっている。
特にＤＮＡマイクロアレイ技術の可能な適用範囲は、遺伝子の検出、疾病の診断による遺伝子型化（例えば、単一ヌクレオチド多形性（ＳＮＰ）に関する研究）、薬剤検出（薬理ゲノム）から、毒物学（毒性ゲノム）の分野に及ぶ（これに関連するＷＯ  ０１／３１３３３の記載も参照）。
【０００５】
特定の問題に適したマイクロアレイを製造するためには、原則的にマイクロアレイ・システムを設計することに加えて、プローブの選択、支持体（支持板又は会話用語では「チップ」）上への初期アレイの調製、ターゲット分子の準備、テストの実行、データの記録と処理が必要であり、特に、これらの工程の全てが実行された後、マイクロアレイ・システムの有効化、即ち、例えば、潜在的な活発物質の機能を実際に同定できるようにするために、最初に準備したプローブ分子の配置がサンプル材料中のターゲット分子に適切な特異性で結合するかどうかに関して引き続きチェックすることが必要である。
【０００６】
提供されるべき各マイクロアレイ・システムにはこの有効化が必要であり、何故ならば、所定のマイクロアレイの調製中に、第１に、合成中及び／又はプローブ分子を適用中に誤りが頻繁に生じ、第２に、特にＤＮＡマイクロアレイの場合に、コンピューター制御されたイン−シリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）方法は最適のオリゴヌクレオチドを選択することができず、特に、遺伝子中の位置も選択することができず、各スポットに位置するプローブ分子の長さ及び量は、最適の信号を与えるために所与の適用に適応されねばならない。
【０００７】
マイクロアレイを調製するための幾つかのシステム及び方法は従来知られている。一般に、２つの異なる手順があり、第１の方法では、プローブ分子が、特定の支持体上でその場で（例えば、適切なフォトリソグラフィーのマスク露光法により）合成され、第２の方法では、プローブ分子が、まず最初に適切な合成方法（例えば、慣用の固相合成）によって外部で（ｅｘ−ｓｉｔｕ）調製され、次に、特定の支持体に塗布される（例えばスポッティング又は印刷される）。
【０００８】
有効化された、即ちできるだけエラーのないマイクロアレイの外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成及びその後のスポッティングによる調製は、非常に長期間、一般に数週間、通常５週間よりはるかに長い期間を要し、例えば５ヶ月まで達する。何故ならば、マイクロアレイの初期のデザインは、有効化中の幾つかの評価サイクルにおける所与の問題に適応しなければならないためである。各評価サイクルにおいて、各場合に適応させたアレイ配置のための多くの異なるプローブ分子種（「特徴」）の準備及びそのスポッティングは、従って、初期から有効化されたアレイまでに要する時間に関しては不利である。現在、約６００ゲノムのシーケンスがその最終局面にあり、遺伝子情報の量が急激に増加し続けることを考慮すれば、マイクロアレイによって遺伝子機能を検討する本質的により迅速な方法が、ますます不可欠になっている。さらに、その適用は増加する知識でより特定的になり、またマイクロアレイ開発に対する時間的ブレッシャーは増大している。長期間を要することは、迅速な適応が望まれる活発物質に関する研究にとって特に不利である。特に診断学では、可能な活発物質又は活発物質の組合せの迅速な患者に特定的な評価がしばしば期待される。それと対照的に、マイクロアレイ調製のためのその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）方法及び適切な装置を含む適切なシステムは、通常、多くの異なる特徴を適用することになれば優れたものとなる。しかしながら、その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）方法は、特に有効化されたマイクロアレイの大量生産の場合に、前記した方法（外部合成／スポッティング）よりも非常に多くの複雑な設備を要し、またより高価であるという点で不利である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、できるだけ迅速でコスト効率が良い工業的生産規模で有効化されたマイクロアレイの調製を可能にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、特許請求の範囲で特徴付けられる本発明の実施態様によって達成される。
特に、本発明によれば、少なくとも、
−マイクロアレイを介して分析されるターゲット分子に関する情報を入力するように設計されている１つ以上の装置と、
−分析されるターゲット分子に関する情報に基づいて、潜在的にターゲット分子と相互作用するプローブ分子(テストプローブ分子)を決定するように設計されている装置と、
−高密度でテストプローブ分子をその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成するための装置、ターゲット分子をテストプローブ分子と接触させるように設計されているマイクロアレイ・テスト装置、及びターゲット分子がテストプローブ分子と接触する間に修正された信号を記録するように設計されているマイクロアレイ読み取り装置を含むレイアウト提供装置と、
−プローブ分子の外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成のために設計されているプローブ分子合成用装置と、
−プローブ分子を支持体に適用するように設計されているマイクロアレイ提供装置
を有する、有効化されたマイクロアレイの分離した調製のためのシステムが提供される。
【００１１】
本発明のシステムは、好ましくはコンピューターに基づいた技術を組み込んでいる。この好適な態様によれば、例えば、マイクロアレイを介して分析されるターゲット分子に関する情報入力用の各装置は、好ましくは、１つ又はそれ以上のデータ・ファイルに情報を記憶する１つ（あるいはそれ以上）のコンピューターを含む。同様に、テストプローブ分子を決定するための装置は、好ましくは、ターゲット分子に関する情報に基づきテストプローブ分子をプログラム制御で選択するコンピューターを含む。さらに、前記レイアウト提供装置も、好ましくは、、１つ又はそれ以上のデータ・ファイルの形態でレイアウトを記憶するコンピューター（あるいは適当であれば幾つかのコンピューター）を含む。従って、例えば、レイアウトを提供する装置は、前記プローブ分子合成用装置によって調製されるべきプローブ分子に関する情報を含む１つ（あるいはそれ以上）のデータ・ファイル（適切なフォーマットで）を生成することができ、一方、別の（あるいはいくつかの他の）データ・ファイルはマイクロアレイ上への適用方法、密度、数、配向、配置などに関する情報を含んで生成される（マイクロアレイ提供装置のために）。本発明に従って用いることができるコンピューター及び適切な制御プログラムは、当業者にとっては公知である。
【００１２】
本発明のレイアウト提供装置は、調製されるべき有効化されたマイクロアレイの配置を決定する役目をする。本発明によれば、マイクロアレイの用語「レイアウト」は、マイクロアレイに設計、即ち、タイプ、性質（特にオリゴヌクレオチド、ペプチドなどのシーケンス）、量、密度、結合（例えば、その結合物はマイクロアレイのために使用された支持体上のプローブ分子の結合のために使用される）、配向（例えば、核酸についての５´から３´への又はその逆、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質などの場合のＮ−末端からＣ−末端へのあるいはその逆）及びマイクロアレイ上のプローブ分子の配置などのマイクロアレイを特徴付けるパラメーターに関する。
【００１３】
レイアウト提供装置は、高密度でのテストプローブ分子のその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成用の装置を含む。そのような装置は、多数、例えば１，０００以上、好ましくは少なくとも４，０００の異なる（テスト）プローブ分子種を、マイクロアレイに典型的な面積、例えば、約１，２００ｍｍ2から約３，０００ｍｍ2まで、好適なマイクロアレイ配置は例えば約２０×６０ｍｍから約３８×７５ｍｍ、好ましくは約２５×７５ｍｍの寸法を有する領域で、マイクロアレイ用に選択された支持体上で直接（即ち、その場で）合成によって特徴付けられる。
【００１４】
この点において、「（テスト）プローブ分子種」は、各々の場合において、特定の構造のプローブ分子、例えば、特定のヌクレオチド・シーケンスの核酸、特にＤＮＡ、又は特定のアミノ酸シーケンスを有する（ポリ又はオリゴ）ペプチドをいう。（テスト）プローブ分子種はまた、一般には「特徴」ともいう。
適切なその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成装置は当業者にとって公知であり、通常、フォトリソグラフィー的に生産される露光装置あるいは湿式化学印刷又は電気化学的に作動する装置である。
【００１５】
とくに、有効化されたＤＮＡマイクロアレイは、本発明に従って使用でき、例えば、クロンディアグ・チップ・テクノロジーズ・ゲーエムベーハー（Ｃｌｏｎｄｉａｇ  Ｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ）（ドイツ連邦共和国、イエナ）から入手できる湿式化学印刷によるその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成用の装置によって調製される。例えばＤＮＡのその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成用のフォトリソグラフィー装置は、本発明にとって好適であり、例えば、ニンブルゲン・システムズ・インク（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）（アメリカ合衆国、ＷＩ、マディソン）、アフィメトリックス・インク（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．）（アメリカ合衆国、ＣＡ、サンタクララ）、キセオトロン・コーポレーション（Ｘｅｏｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）（アメリカ合衆国、ＴＸ、ハウストン）、コンビネイチュアー・バイオファーム・アーゲー（Ｃｏｍｂｉｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ＡＧ）（ドイツ連邦共和国、ベルリン）及びフェビット・アーゲー（Ｆｅｂｉｔ  ＡＧ）（ドイツ連邦共和国、マンハイム）から市販されている。特に多数あるいは特に高密度で（テスト）プローブ分子を低コストで短時間にその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成する可能性のために、特に（テスト）プローブ分子のＭＡＳ（マスクレス・アレイ・システム）合成装置が好適である。この装置を用いれば、１つのアレイで日常的に４００，０００以上、特定の位置においては例えば７５０，０００（ＤＮＡ）特徴を合成することが可能である。ＭＡＳ技術は、例えばＷＯ  ９９／４２８１３に記載されており、その開示内容は本発明中へその全体を引用加入する。さらに、ＭＡＳ合成に適した装置及びこの技術の特定の形態は、ＷＯ  ０１／３４８４７及びＷＯ  ０２／０４５９７に記載されており、それらの開示内容はこの点において同様に本発明中に引用加入する。さらに、その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成用に好適な装置は、その場スポッティングを用いることによって電気化学的に作動する装置である。
【００１６】
マイクロアレイ・テスト装置、マイクロアレイ読み取り装置などのレイアウト提供装置に含まれる他の装置は、同様に当該技術状況にあり、市販されている。完全に統合された装置も供給する関連製造業社の例は、アジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ）（アメリカ合衆国）、ゲノミック・ソルーションズ社（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（アメリカ合衆国）、アフイメトリックス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）（アメリカ合衆国）、アクソン・インストルーメンツ・インク（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）（アメリカ合衆国）及びパッカード・バイオサイエンス社（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（アメリカ合衆国）である。
【００１７】
本発明のシステムの一部であるプローブ分子の外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成用の装置は、最終生成物として提供されるべきマイクロアレイ用のプローブ分子を合成するのに供し、好ましくは当該技術分野で公知の固相合成用の装置である。プローブ分子、例えばオリゴヌクレオチドの外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）固相合成用装置、特にメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）合成タイプ(エイチ．ジー．ガッセン（Ｈ．Ｇ．Ｇａｓｓｅｎ）ら（１９８２）遺伝子フラグメントの化学的及び酵素的合成、フェルラーク・ケミー社（Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ）、ヴァインハイム；ガイト（Ｇａｉｔ）（１９８７）オリゴヌクレオチド合成：実際的なアプローチ、ＩＲＬプレス社（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、オクスフォード）の固相合成用装置、、あるいは異なるタイプ(ベイヤー（Ｂｅｙｅｒ）及びウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）（１９８４）レールブッフ・デル・オーガニッシェン・ケミー（Ｌｅｈｒｂｕｃｈ  ｄｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ）、８１６頁以降、第２０版、エス・ヒルツェル・フェルラーク（Ｓ．Ｈｉｒｚｅｌ  Ｖｅｒｌａｇ）、シュツットガルト）の固相合成用装置は一般に知られており、例えばダーマコン・リサーチ・インク（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）、アメリカ合衆国及びシンセゲン社（Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ）アメリカ合衆国によって供給されている。プローブ分子の固相合成、特にオリゴヌクレオチドの場合、通常サービスとして提供され、例えば特にプロリゴ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ）（アメリカ合衆国）、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）（ドイツ連邦共和国）、ＭＷＧビオテックＡＧ（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）（ドイツ連邦共和国）によってサービスとして提供される。このような固相合成用装置により、有利には、大量の所定のプローブ分子あるいは所定のプローブ分子種（特徴）、例えば所定のシーケンスのオリゴヌクレオチドなどを、低コストで及び良好な収率で比較的短時間に提供することが可能になる。
【００１８】
本発明のシステムのマイクロアレイ提供装置は、このようにマイクロアレイを仕上げるために、適当な支持体に外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成されたプローブ分子を適用するために使用される。本発明によって使用できる外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成されたプローブ分子適用装置は、同様に当該技術状況にあり、例えばバイオロボティクス社（Ｂｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓ）（アメリカ合衆国）、ジェネマシーンズ社（Ｇｅｎｅｍａｃｈｉｎｅｓ）（アメリカ合衆国）、パーキン・エルマー・ライフサイエンス社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）（アメリカ合衆国）、ＭＷＧビオテックＡＧ（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）（ドイツ連邦共和国）あるいはジェネスキャン・ヨーロッパ・アーゲー（ＧｅｎｅＳｃａｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＡＧ）（ドイツ連邦共和国）から市販されている。本発明に従って好適な外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成されたプローブ分子を適用するための装置は、適切なスポッティング装置あるいは印刷装置である。
【００１９】
本発明のシステムの前記構成要素は、好ましくはコンピューター制御され、従って半自動又は完全自動で操作される。構成要素、特に適切なレイアウト提供装置、プローブ分子合成用装置及びマイクロアレイ提供装置は、典型的には当業界で公知の一般に入手可能な、マイクロ流体の及びマイクロメカニカルな構成要素を装備している。
【００２０】
従って、本発明のシステムに使用される発明的に好適な配置は、さらに、データ入力及びデータ処理を実質的に単純化するコンピューターを装備している。システムにおいては、好ましくは、データの交換（例えば、入力装置とレイアウト提供装置との間、及びレイアウト提供装置とプローブ分子合成用装置及びさらにマイクロアレイ提供装置との間）に必要な構成要素が、データ移送装置を介してネットワークに接続される。ネットワークは、例えば、ほんの少数のコンピューターが他のコンピューターと通信する、例えばローカル・ネットワークでもよい。有利には、ネットワークはインターネットである。「ワールドワイド・ウェブ」及び通信アルゴリズムの基本配置に関しては、例えばこの点に関するＷＯ  ０１／３１３３３の記載を参照できる。ネットワークはまた、データ移送装置を介して通信するコンピューター同士の他の地域的、全国的、又は国際的な接続でもよい。
【００２１】
ネットワーク、例えばインターネットを介して本発明の装置と組み合わせる観点から見れば、本発明のさらに好適な配置は、装置が研究協会又は研究共同体における相互作用（通信、相互のデータ交換、など）のプラットホームを提供するシステムである。ジョイントプロジェクトで仕事をするそのような研究共同体においては、特にまた異なる地域間においては、実験的に有効化されたマイクロアレイを利用した後、知識の増加による新しい要望のために、マイクロアレイの構成（即ち、レイアウト）の再設計を要求することも可能である。有効化されたマイクロアレイの地域性を排除された設計（レイアウト決定）及び地域的生産の助けにより、このようにして知識増加の効率を急激に増大させることも可能である。そのようなプラットホーム・システムの効率的な利用のための具体化の例は、ウェブ・ベースの（特に、インターネット・ベースの）研究所情報管理システム（ＬＩＭＳ）であり、そこでは会員（例えば、研究協会又は研究共同体のメンバー）のだれでも、マイクロアレイ・レイアウト、再設計されたレイアウト及びマイクロアレイの管理を共有する。そのようなＬＩＭＳの例は、クローンディアグ社（Ｃｌｏｎｄｉａｇ）による「パルチザン（Ｐａｒｔｉｓａｎ）」である。
【００２２】
本発明はさらに、以下の工程：
（ａ）好ましくは前記入力装置により、マイクロアレイを介して、分析されるターゲット分子に関する情報を提供し、
（ｂ）情報に基づき、例えば本発明のテストプローブ分子決定装置によって、テストプローブ分子（即ち、潜在的にターゲット分子と相互作用する分子）を決定し、
（ｃ）−好ましくは前記その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成用装置により、決定されたテストプローブ分子を高密度でその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成することにより、少なくとも1つのテスト・マイクロアレイを調製し、
−好ましくは前記マイクロアレイ・テスト装置により、ターゲット分子を用いるテスト・マイクロアレイをテストし、そして
−ターゲット分子を用いるテストマイクロアレイをテストした時に修正された少なくとも1つの信号を、特に前記マイクロアレイ読み取り装置により記録する
ことからなり、特に前記定義されたレイアウト装置により、有効化されたマイクロアレイ用レイアウトを提供し、
（ｄ）特に前記プローブ分子合成用装置により、有効化されたレイアウトに対応するプローブ分子（有効化された分子）を外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成し、そして
（ｅ）有効化されたレイアウトに対応する有効化されたプローブ分子を、好ましくは本発明のマイクロアレイ提供装置により、支持体へ適用する
からなり、特に前記定義されたシステムを用いる、有効化されたマイクロアレイ・レイアウトの分離された調製方法に関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のシステム及び方法は、有効化されたマイクロアレイ・レイアウトを提供するために必要な１つ以上のテストマイクロアレイを調製する過程が、適切な装置によりその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成法により行なわれる一方、実際の（有効化された）マイクロアレイが、（有効化されたレイアウトに対応する）プローブ分子の外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成、好ましくは固相合成により行なわれ、これは次いで、再び適切なシステム構成要素により、適切な支持体に適用（スポッティング）される、という知見に基づいている。本発明のシステム及び方法においては、従って、有効化プロセスが、最終生成物、即ち有効化されたマイクロアレイの調製から分離されている。本発明のコンビネーションは、各方法原理が使用されるように可能な最良の方法で前記２つの方法原理を互いに結び付けており、それによって、特に、高密度のその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成は特にフレキシブルであり、従って、潜在的にターゲット分子と相互作用する（テスト）プローブ分子の非常に大きなプールから出発してテストマイクロアレイを調製するのに適している、という特別の利点が得られる。マイクロアレイの有効化されたレイアウトが得られれば、マイクロアレイは、有効化されたレイアウトに従って各々の場合に、プローブ分子の迅速でコスト効率の良い外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成及びその後の支持体への適用によって調製される。有効化プロセスが既にプローブ分子の数を比較的低レベルに制限するので、異なるプローブ分子種を最終生成物のために外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成で調製する必要が比較的に殆どなく、その結果、従来の慣用的なプロセスに比べて、有効化されたマイクロアレイを調製するためのコストは本発明の方法のおかげで著しく低減し得る。最終生成物用のためのプローブ分子の外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成は、特に工業的規模でのマイクロアレイ生産に適しており、従って、本発明の方法の利点は特に多数の有効化されたマイクロアレイが要求される場合に明白である。本発明の調製方法においては、従って、前記手順は共同的に作用し、有効化されたマイクロアレイを急速に、コスト効率良く、かつ低い誤差率で提供することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明によれば、その好適な点は、工程（ａ）は、例えば１人以上のマイクロアレイ・ユーザにより行なわれ、工程（ｂ）及び（ｃ）はそこから空間的に離されて、例えばレイアウト・プロバイダにより行なわれ、工程（ｄ）は、例えばプローブ分子製造業者により行なわれ、そして工程（ｅ）は、例えばマイクロアレイ製造業者により行なわれるように、方法を実行することにある。各場合において、工程（ｂ）及び（ｃ）を互い空間的に離れた所で行なうことも、勿論可能である。従って、例えば、マイクロアレイ・ユーザもテストプローブ分子を決定してもよく、このようにしてレイアウト・プロバイダのためにテストプローブ分子を決定してもよい。
【００２５】
本発明に従って特に前記した空間的に離れて方法の各工程を行なうことによる好適な点は、電子データを転送することにより情報の必要な流れを実行することにある。従って、工程（ａ）における情報は、好適には電子データ移送装置によりデータ・ファイルの形態で供給される。同様に、有効化されたレイアウトは、工程（ｃ）において好適には電子データ移送装置によりデータ・ファイルの形態で供給される。従って、例えば、ユーザは、ターゲット分子に関する情報を本発明の入力装置へ電子形式で入力し、次いで、この情報は例えばレイアウト・プロバイダに配置されているテストプローブ分子を決定するための装置に転送される。レイアウト・プロバイダは、次いで、マイクロアレイの有効化されたレイアウトを作製した後、プローブ分子に関する情報、好適には有効化されたマイクロアレイを特徴付ける上述のさらなるデータを含む完全なレイアウトを、データ・ファイルとして、（好適にはプローブ分子製造業者に配置されている）プローブ分子合成用装置へ転送する。さらに、マイクロアレイ提供装置（これは、例えば適切なマイクロアレイ・製造業者に配置されている）の有効化されたレイアウト・データは、好適には１つ以上のデータ・ファイルの形態で提供される。
【００２６】
この目的のために、本発明のシステムに含まれる構成要素は、既に説明したように、コンピューター・ネットワークを介して、特にインターネットを介して互いに有利に接続される。提供装置（工程（ａ））、決定装置（工程（ｂ））、レイアウト提供装置（工程（ｃ））、プローブ分子合成用装置（工程（ｄ））、マイクロアレイ提供装置（工程（ｅ））間の、好適には適切なシステムソフトウェアを使用する特にインターネットを介して可能な通信方法は、当該技術状況にあり、例えばＷＯ  ０１／３１３３３に記載されており、その開示内容は全体的に本発明へ引用加入する。
【００２７】
本発明の方法の工程（ａ）において、システムにはまず最初に、そのレイアウトが提供されるべきマイクロアレイによって分析されるターゲット分子、即ちそれらを特徴付ける特性に関する情報が供給される。この情報は、例えば、ターゲット分子のタイプ及び性質、例えば分析されるターゲット分子が核酸であるか、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド及び蛋白質を含む）であるか、ペプチド核酸であるか、低分子量有機物質であるか、蔗糖類（例えばオリゴ糖及び多糖類）であるかなど（上記分子種の混合物が存在してもよい）を含む。さらに、この情報は、ターゲット分子の表層構造、容積などに関する情報（例えば、立体特性に関する情報を含む）、及び／又は、適当な場合、恐らく使用されるプローブ分子及び／又は計画されている支持体材料との潜在的に非特異的な相互作用を含めて、マイクロアレイのために使用される支持体もしく基板材料の、ターゲット分子の接着性あるいは結合挙動についての情報を含み、これらの結合パラメーターは、特に、結合定数、協同パラメーターなどの結合挙動の動力学についての情報を含み、さらに、存在し得る構造的な柔軟性が考慮に入れられる。さらに他の情報は、温度、緩衝条件（ｐＨ、塩含有量、洗剤、補助剤等）などのマイクロアレイで実行される実験中に存在する反応条件に関する。この情報は、それによって生じ得る問題を基礎として、潜在的にターゲット分子と相互作用する、マイクロアレイに適用されるプローブ分子につながる。これらの最初に決定されたプローブ分子は、しかしながら、有効化プロセスにおいてマイクロアレイ配置を適応させることにより調製されるべきマイクロアレイのためのそれらの実際の適切性に関してチェックされねばならない。従って、これらの最初に決定されたプローブ分子は、本発明に従って「テストプローブ分子」と標識される。
【００２８】
既に前記に説明したように、ターゲット分子に関する情報、特に提供されるべきレイアウトが基づく分析的な問題、及び／又は有効化されたレイアウトは、電子データ移送装置によりデータ・ファイルの形態で供給される。そのようなデータ移送装置は、例えば、電子メールによって互いに通信する２台のコンピューターからなる。この場合、ユーザは、典型的には分散して配置されたコンピューターから中央のコンピューターに、ターゲット分子に関する必要な情報を、好適には電子データ移送によって、例えば電子メールによって転送する。勿論、情報は、他の可能なデータ担体（例えばフレキシブルディスク、ＣＤ  ＲＯＭなど）に供給することもできる。そこで、このように「予め最適化された」マイクロアレイ・レイアウトを決定するために、特定のデータセットを、例えば、既に作製されたマイクロアレイあるいはマイクロアレイ・レイアウトのデータセット（例えば、予め行なわれた研究からのデータセットで、これは一層の最適化のために「トレーニング・セット」として使用することもできる）と比較することも可能である。データセットは、最初にそれらを好適には一定のフォーマットに変換し、次に、これらのフォーマットされたデータから作製されたテンプレートを介して、及び／又はニューロン・ネットワークによって、既に得られたデータセットと比較することにより最適化され、適当な場合にはそれに従って適応される。
【００２９】
本発明の方法は、テストプローブ分子あるいは有効化されたプローブ分子又はターゲット分子のタイプに関して制限されない。従って、これらの分子は、例えば核酸、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチド及びさらに蛋白質、特にそれらの抗体あるいはフラグメントを含む）、ペプチド核酸、低分子量有機物質、蔗糖（例えば、オリゴ糖、多糖類等）などであってよく、また、上記分子種の混合物も存在してよい。
【００３０】
本発明の調製方法は、特にターゲット分子として核酸を研究するのに供されるマイクロアレイを有効化するために非常に適している。従って、本発明の方法を、例としてこの変形例に基づいて以下に説明する。しかしながら、それは当業者にとって明白である。本発明の方法が基づく全体的な概念は、他のあらゆる可能なマイクロアレイ問題、特に他の構造的に異なるプローブ分子及びターゲット分子に自由に転換できる。
【００３１】
ＤＮＡマイクロアレイの場合には、工程（ａ）で提供されるターゲット分子に関する情報は、従って典型的にはマイクロアレイ・テストが基づくゲノムの問題である。これは、例えば、分析されるターゲット分子、即ちＤＮＡが由来する有機体に関する情報を含む。しかしながら、分析されるＤＮＡターゲット分子に関する情報は、分析されるＤＮＡ分子の数をより正確に特徴付ける、より詳細な情報でもよい。特に、この情報は、典型的には、好適にはデータ・ファイルに提供されるターゲット核酸のシーケンスであり、適切なフォーマットは当業者にとって公知である。シーケンスのための周知の標準的データ・フォーマットの例は、FASTAフォーマットである。さらに、情報は、特定の細胞タイプに関してもよく、例えば、細胞が一般に癌細胞であるか否か、あるいは他の病気の状態にある細胞であるか否か、さらに例えば、特定の細胞ラインが研究されるべきか否か、などに関するものであってもよい。他の情報は、しばしば有機体、例えば特定の細胞、器官、器官部品などに対する影響、マイクロアレイ・テストを行ない、例えば有機体あるいはそれの一部を特定の物質、例えば薬、毒物学的に関連のある物質などに曝す事案あるいは処理に関係する。
【００３２】
基礎的な問題に関する情報、即ち分析されるターゲット分子に関する情報が、好適にはデータ移送装置によって、例えばレイアウト供給者に配置されている中心コンピューターのような中心サイトに供給された後、潜在的にターゲット分子と相互作用するテストプローブ分子は、本発明の方法の工程（ｂ）において決定される。好ましい態様によれば、これは、当業者にとってなじみのコンピュータ・プログラム、例えばアレイデザイナー２（Ａｒｒａｙｄｅｓｉｇｎｅｒ  ２）（プライマー・バイオソフト・インターナショナル社（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂｉｏｓｏｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）製）及び他に多くのプログラムによって実行される。本発明の調製方法の好適な態様においては、従って、そのシーケンスが工程（ｂ）でその（ゲノム）問題に基づいて決定された、テストプローブ分子として使用される核酸、特に例えば長さが約４〜約８０、好ましくは約８〜約８０のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのシーケンスが供給される。
【００３３】
特に好適な態様によれば、工程（ｂ）において例えば特別のコンピューターソフトによって決定されたテストプローブ分子は、そのレイアウトが提供されるマイクロアレイによって、研究されるターゲット分子と潜在的に相互作用する分子の合計数を表わす。特にＭＡＳ技術を用いるその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成においてオリゴヌクレオチドがプローブ分子として使用される場合、その合計数は、例えば有機体の全ゲノムとしてよい。有機体の例は、ヒト、ハツカネズミ、ネズミ、ヤギ、ブタ、牛、モルモット、ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）などの動物、有用な植物、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）などの植物、原虫類、大腸菌などのバクテリア、菌類、例えばエス・セレビザエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）等の酵母菌などであるが、さらにまた本発明に従ってウィルス、ウイロイドなどを含んでもよい。しかしながら、プローブ分子、特にオリゴヌクレオチドも大きな合計数の部分を表わしてもよい。オリゴヌクレオチドの場合には、ここで適当な（部分）合計数の例は、有機体、例えば前記有機体の１つ以上の染色体の遺伝物質である。さらに（部分）合計数は個々のｃＤＮＡライブラリーでもよい。さらに、テストプローブ分子は、結合変形例（例えば、遺伝子の特定のグループ又はサブグループの主要な転写体の全ての結合変形例）、プロモーター領域、ＳＮＰｓ（例えば、特定の遺伝子に、あるいは遺伝子のグループ又はサブグループの（現在まで）公知の全てのＳＮＰ）、突然変異体（ＳＮＰにおけるように）、高度に反復性のＤＮＡ領域などであってもよい。
【００３４】
本発明によれば、有効化されたレイアウトの提供は、好ましくは以下のサブ工程を含む。
（１）ターゲット分子のプローブ分子との相互作用の場合にマイクロアレイから予測される少なくとも１つの信号を特定すること（予測信号）、
（２）好適には前記その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成用装置によって、決定されたテストプローブ分子のその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成により高密度でテスト・マイクロアレイを調製すること、
（３）特に本発明のマイクロアレイ・テスト装置によって、ターゲット分子を用いるテスト・マイクロアレイをテストし、好適には前記マイクロアレイ読み取り装置の使用により少なくとも１つのテスト信号を記録すること、
（４）少なくとも１つのテスト信号を少なくとも１つの予測信号と比較すること、
（５）テスト信号が予測信号に本質的に相当するまで工程（２）〜（４）を繰り返してテスト・マイクロアレイを適応させ、工程（２）においてプローブ分子、それらの量、結合、数、密度、配向及び／又はマイクロアレイ上の配置を修正すること、及び
（６）少なくとも１つのテスト信号が本質的に少なくとも１つの予測信号に相当するマイクロアレイ・レイアウトを提供すること。
【００３５】
本発明の方法の好適な態様のサブ工程（１）では、ターゲット分子のプローブ分子との相互作用の場合にマイクロアレイから予測される、１つ以上の予測信号が決定される。そのような信号は、（前記マイクロアレイ・テスト装置を用いて）ターゲット分子がプローブ分子と接触されるテストにおいて、適当なマイクロアレイ読み取り装置（即ち、測定装置）によって適切なマイクロアレイから読み取ることができる、すべての実験的に測定可能ないかなる化学的パラメーターあるいは物理的パラメーターであってもよい。本発明の方法においては、ターゲット分子、例えば核酸は、好適には１以上の適切な蛍光体（例えばＦＩＴＣ、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５等のシアニン染料など）で蛍光的にラベル付けされる。この場合、従って、予測信号は、マイクロアレイに適する蛍光計、ＣＣＤカメラと組み合わされた適切に設計された共焦点を有する蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレイ蛍光検知に適する他の測定装置を使用して決定される蛍光信号である。マイクロアレイ技術で用いられる、例えば支持体材料に及び／又は適切なマーカー、例えば酸化還元反応マーカーにより、例えばプローブ分子とターゲット分子の間の相互作用によって引き起こされる電気的信号（特に電流変化）を測定する、他の予測信号及びテスト信号も、同様に本発明の方法のために利用することができることは勿論である。
【００３６】
さらに、決定されたテストプローブ分子（好ましくはオリゴヌクレオチド）のマイクロアレイは、サブ工程（２）（あるいは本発明の調製方法の前記工程（ｃ））に従って、適切な支持体（好適には例えばシラン化によって機能化されたガラス）上に高密度でその場で（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成される。このテストプローブ分子のその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成は、例えば本発明のその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成用装置に関して既に先にリストしたサプライヤーの方法によって、当業者にとって公知の異なる方法で行なっても構わない。特に好適なのは、ＭＡＳ技術によってその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成を行なうことであり、この点に関しては再びＷＯ  ９９／４２８１３、ＷＯ  ０１／３４８４７及びＷＯ  ０２／０４５９７を参照されたい。
【００３７】
本発明の好適な態様に従って、高密度でテストプローブ分子をその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成することは、１，０００以上、好ましくは少なくとも４，０００の異なる（テスト）プローブ分子種が、マイクロアレイのために選択された支持体上に、例えば約１，２００ｍｍ2〜約３，０００ｍｍ2のエリア上に直接合成されることを意味する。この点において、好適なマイクロアレイ寸法は、約２０×６０ｍｍから約３８×７５ｍｍの範囲にわたり、特に約２５×７５ｍｍである。ＭＡＳ法により、例えば７５０，０００以上のプローブ分子種（特徴）のプローブ分子のその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成が可能となる。
【００３８】
本発明の方法の好適な態様のサブ工程（３）によれば、このように調製されたテストマイクロアレイのテストはターゲット分子を用いて行なわれ、また、少なくとも１つのテスト信号が記録される。予測信号に関する前記説明は、特に蛍光信号で記録されるテスト信号にも当てはまる。
【００３９】
本発明の方法の好適な態様の次のサブ工程（４）においては、記録されたテスト信号及び／又は記録されたテスト信号類が、予め決定された予測信号と（及び複数の予測信号とそれぞれ)比較される。この比較は、既知のプログラムによって、典型的には予測信号及び測定信号が読み取られるコンピューターを使用して行なわれる。
【００４０】
テストプローブ分子の選択、支持体上でのプローブ分子のその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成、そして不確実性を持つ方法の他の手順のために、サブ工程（３）で最初に得られたテスト信号は、予測信号に相当しない。注意すべき点は、特にプローブ分子としての核酸、例えばオリゴヌクレオチドの場合、その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成は１００％の収率を達成することができず、従って、特定のスポットで幾つかのオリゴヌクレオチドは予測されたあるいは決定された長さを持っておらず、あるい他のシーケンスを持っていることである。何故なら、正確なヌクレオチドの代わりに、その場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成で他のヌクレオチドが組み込まれたためである。さらに、１つのスポット当たり適用されたプローブ分子の量は、適応されるとしても、しばしば特定の適用に最良に適応されていない。
【００４１】
サブ工程（３）に従ってテストを行なう手順の１例は、アレイの蛍光写真撮影法の記録をその後提供するために、適用されたプローブ分子、特にＤＮＡにラベル付けし、特にそれらに１つ以上の蛍光性のラベルを付することである。この目的のために、各々の適用されたプローブ分子、例えば各オリゴヌクレオチドに、ラベルを付けることは必要ではないが、本発明によれば、例えば、１００番目、５００番目、あるいは１，０００番目毎にプローブ分子にラベル付けすることで充分である。オリゴヌクレオチドの場合には、例えば、サブ工程（２）によるオリゴヌクレオチド合成の最初に、未標識ヌクレオチドと例えば蛍光ラベル付けされたヌクレオチドの１０００：１混合物を用いて１，０００番目のオリゴヌクレオチド毎にのみラベル付けすることが可能である。ほんの少数のプローブ分子のみにラベル付けすることは、ラベル付けにそれほどコストがかからないという利点を有する。さらに、可能な蛍光消失結果（例えば蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ））は従って回避されるか、あるいはそれほどでなくなる。理想的には、マイクロアレイに適用されたオリゴヌクレオチドの蛍光ラベル付けは、測定された蛍光が、適用されたプローブ分子がラベル付けされたターゲット分子とハイブリッド化されるときに生ずる蛍光レベルにほぼ相当するように調節される。
【００４２】
さらに好適な態様によれば、サブ工程（３）におけるテストは、以下に示すようなテストプローブ分子としてのオリゴヌクレオチドについて本発明に従って行なわれる。このテストは、本質的に、アレイに適用され、決定されたテストプローブ分子が確かにターゲット分子とハイブリッド化できるかをチェックするのに供される。
【００４３】
この目的のために、アレイに適用されたオリゴヌクレオチドは、最初の段階でおよそ１，０００（例えば、マイクロ滴定プレート当り３×３８４溜め）のセットに分割される。第二段階で、１０〜１５のヌクレオチドを含むシーケンスは、組み立てられたオリゴヌクレオチドの３'端末に結び付けられる。この延長は補足的なヌクレオチド・シーケンス（同様に１０〜１５のヌクレオチドからなる）をハイブリッド化させるために使用される。その後、補足的な基礎シーケンス（第２のストランド）はＴａｑポリメラーゼを用いて延長される。これに続いて、テンプレート・ストランドと第２のストランドを分離するための変性工程が行なわれる。ハイブリッド化、延長及び変性の各工程は、テンプレート・ストランドのラベル付けされた第２のストランドを過剰に生成させるためにＰＣＲにおけるのと同様に繰り返される。最後に、このように生成された第２のストランドに蛍光体によりラベル付けされ（末端に）、マイクロアレイでハイブリッド化される。
【００４４】
この方法は、蛍光信号を測定するとき、どのオリゴヌクレオチドが非効率的にのみハイブリッド化するか、あるいは全くハイブリッド化しないかを同定することが可能になる。これらは次いで変性され、適当な場合には、再びテストすることができる。この手順の他の態様においては、主ストランドは、第２のストランドの精製及びテンプレートの再使用の両方を促進するために、ストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）をコーティングしたマイクロ滴定プレートにビオチンによって結合することができる。同様に、５'末端に蛍光体が既に供給された１０〜１５のヌクレオチドからなる補足的なシーケンスを合成することが可能であり、それによって第２のストランドの合成の後にラベル付けする必要がないようらすることができる。さらに、このコントロール材料のために第４の蛍光体を使用し、マイクロアレイが使用される場合は常に、それを実際の例えばＣｙ３ラベル付けされまたＣｙ５ラベル付けされたターゲット分子と共にハイブリッド化させることが可能である。これは、マイクロアレイのプローブ分子とのハイブリッド化が各製品ユニットに対して同じままであることを保証する。
【００４５】
本発明によれば、マイクロアレイは、テスト信号が本質的に予測信号に一致するまでサブ工程（２）〜（４）を繰り返すことにより、テスト信号と予測信号との間の比較により相応して適応される。この点において、マイクロアレイ・レイアウトのパラメーターは、サブ工程（３）におけるテスト結果及びサブ工程（４）における比較の結果に従って、サブ工程（２）の各場合において修正される。即ち、テストプローブ分子、例えばオリゴヌクレオチドなどの核酸の場合、シーケンス、長さ、ラベル付け、タイプ（例えば、自然に生じるヌクレオチドの代わりにヌクレオチド類似体の使用）、量、数、密度、支持体への結合、配向及び／又はそれられのマイクロアレイ上の配置が修正される。修正できるさらに他のパラメーターは、温度、ｐＨ、イオン強度、それに関連して特に溶液の組成及び緩衝剤、例えば塩含有量、洗剤含有量などの反応条件、プローブ分子及びターゲット分子としての核酸の場合には特にハイブリッド化条件に関係してもよい。（適当な場合には修正されたパラメーターでの）テスト・マイクロアレイの調製工程（サブ工程（２））、ターゲット分子を使用してマイクロアレイをテストする肯定（サブ工程（３））、及びテスト信号と予測信号を比較する工程（サブ工程（４））は、テスト信号が本質的に予測信号に一致するまでマイクロアレイの適切な適応をもって繰り返される。
【００４６】
（テスト）マイクロアレイを有効化するときさらに好適な点は、適応の各ラウンドにおいて又は幾つかのラウンド後に、好ましくは本発明の入力装置の使用により、テスト・マイクロアレイのテストから得られ読み出されたデータを、システムへターゲット分子に関する情報を入力したユーザへ転送することにある。これらのデータに基づいて、次いでユーザは、有効化プロセスに干渉し、かつさらなる有効化に、その間に得られる特定のターゲット分子に関する知見、及び／又は特定の時間にテストにおいて存在するプローブ分子に関する知見、及び／又は相互作用の間に維持される反応条件に関する知見（それ自体実験滴なデータ、文献データなど）などの更なる知見も利用可能となる。この場合、さらに好適な点は、前記した装置、ネットワークなどによって電子データ移送を使用することにある。本発明の方法のこの好ましい変形を使用して、ループ状のプロセスが提供され、それによって、特に効率的な方法で最適化されたレイアウトを提供でき、従って特定の段階に存在するプローブ分子、ターゲット分子及びテストで選択される条件に関する情報ベースを広げることによるエラーのない注文作りのマイクロアレイを提供できる。
【００４７】
本発明の方法の好適な態様の最後のサブ工程（６）は、このように有効化されたテスト信号が本質的に予測信号に一致するマイクロアレイのレイアウトを提供する。また、電子データ移送装置により、マイクロアレイ・ユーザへ、好適にはプローブ分子製造業者に配置されたプローブ分子合成用装置へ及び／又は好適にはマイクロアレイ製造業者に配置されたマイクロアレイ提供装置へ、このレイアウトをデータ・ファイルの形態で提供することが可能であり、これには本発明の方法の工程（ａ）に関する前記説明が類似的に当てはまる。従って、例えば、決定されたマイクロアレイ・レイアウトに関する情報は、１つ又はそれ以上のデータ・ファイルに記録され、好ましくは中央のコンピューターを介して電子メールによってプローブ分子製造業者（特にオリゴヌクレオチド製造業者）及びマイクロアレイ又はバイオチップ製造業者に分散して配置されたコンピューターに転送される。
【００４８】
プローブ分子は、前記工程において提供されるレイアウトに従って、好適には先行技術に記述された固相合成方法により、特に（本発明のシステムに関して既に前述したように）メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）合成（エイチ．ジー．ガッセン（Ｈ．Ｇ．Ｇａｓｓｅｎ）ら（１９８２）、前掲；ガイト（Ｇａｉｔ）（１９８７）、前掲）の方法で、あるいは異なる方法（ベイヤー（Ｂｅｙｅｒ）及びウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）（１９８４）前掲）で外部（ｅｘ  ｓｉｔｕ）で合成される。オリゴヌクレオチド合成のための好ましい方法は、フォスフォラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法に基づいており、典型的には（好ましくはアミノアルキル変性された、特にアミノプロピル変性された）多孔質ガラス支持体（ＣＰＧ、制御された多孔質ガラス）の使用に基づいている。そのような方法の利点は、大量の所与の（有効化された）プローブ分子あるいは所与の（有効化された）プローブ分子種（特徴）、例えば所与のシーケンス、好ましくは長さが約８から約８０のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドなどを、低コストで、及び良好な収率で比較的短時間に提供することが可能であるということにある。
【００４９】
本発明による最終生成物（有効化されたマイクロアレイ）は、本発明の方法の工程（ｃ）で決定されたレイアウトに従って、外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成されたプローブ分子を再び適切な支持体へ適用することにより提供される。本発明で用いることができる外部（ｅｘ−ｓｉｔｕ）合成されたプローブ分子を適用するための手順は当該技術状況にあり、例えば適当なスポッティング法（これは例えば「印刷法」あるいは「インクジェット法」とも呼ばれる）からなる。
従って、前記した工程は、可能な限り最初の問題、特にＤＮＡマイクロアレイを使用する場合にはゲノムの問題に適応されており、従ってエラーが特に低いものとして分類することができる有効化されたマイクロアレイを提供する。
【００５０】
本発明のさらに他の好ましい実施態様によれば、多数のマイクロアレイが支持体上に提供され、これは「アレイの配列」あるいは「多重アレイ」配置と呼ばれる。勿論、各々同じあるいは異なる設計を持っているマイクロアレイが、多重アレイ配置の中に存在しても構わない。
【００５１】
この態様においては、支持体は、好ましくは、対応する親水性ポリマーもしくはポリマー組成物などの適当な疎水化剤（例えばシリコーン、テフロン（登録商標）あるいは他の多フッ素化されたポリマーもしくはポリマー組成物、例えばパーフルオロコート（ＰｅｒＦｌｕｏｒｏＣｏａｔ−登録商標）などのサイトニックス社（Ｃｙｔｏｎｉｘ）の製品）によって疎水性パターンを設けることもできる（所謂パターン化）。対応する方法は先行技術で知られており、そこで、本発明によれば、対応するポリマー組成物を使用するスクリーン印刷法が好ましい。これによって、例えば、各々疎水性被膜によって囲まれそれによって互いに分離している２、８（２×４）、１２（２×６）、１６（２×８）、４８（４×１２）、あるいは１９２（８×２４）の反応コンパートメントもしくは領域（溜め）を、支持体、例えば好ましくは２５×７５ｍｍの寸法（典型的な顕微鏡用スライドの寸法に対応する）を有するスライドガラス上に生成できる。支持体をコーティングする代わりに、適当な支持体へそのような反応コンパートメントを型押しで形成できることは自ずと明らかである。支持体上の反応コンパートメントのデザイン、特に数、形状（丸、楕円形、角型）及び配置と支持体の寸法は絶対的に自由に選択することができ、顧客のニーズに個々に適応することができる。典型的なマイクロ滴定プレート（例えば８５．４８×１２７．７６ｍｍ）の寸法を持っている支持体は、好ましい例と言える。そのような多重アレイ配置は、有利には、特に単純なやり方で、液体処理用の高い処理能力プロセスのための典型的な自動システムへ統合することができる。
【００５２】
多重アレイの利点は、特に、再現性の増大（全てのマイクロアレイは同じ支持体に適用され、同一条件下でターゲット分子と接触し（例えば、ハイブリッド化される）；ターゲット分子の抽出、逆転写、増幅及びラベル付けも各マイクロアレイについて同時に行なうことができ；単一の支持体上で単一のターゲット分子を数回特徴付けることが可能である（統計の改良））、コストの低減（例えば、多重アレイのコスト増加は典型的には１／［アレイの数］に比例し、例えば、多重アレイのコストは単一のマイクロアレイの５倍未満であるが、多重アレイは例えば８〜２００のテストの特性付けのために使用することができる）、及び処理能力の増大（多重アレイがテスト溶液と同時に接触される（例えば、ハイブリッド化される）ので、サンプル取り扱いが減少し；特にマイクロ滴定プレートの形態の支持体が使用される場合、オートメーションの可能性）にある。
【００５３】
さらに、本発明によるマイクロアレイあるいはアレイの配列は、溶液の蒸発（ほとんど水あるいは緩衝剤であり；低いサンプル容積を使用するマイクロアレイ類の試験において特に重要）及び隣接するマイクロアレイの相互汚染（多重アレイの場合）を最小限にするために、粘着性の上部構造（グレース・バイオラブズ社（Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ,  Ｉｎｃ．）、ベンド、ＯＲ、アメリカ合衆国から市販されている）を有利に設けることができる。
【００５４】
本発明の多重アレイは、本発明の有効化されたマイクロアレイのための有効化されたレイアウトの提供（本発明に係る方法の工程（ｃ）による）及び有効化されたプローブ分子の支持体（好ましくは疎水性である対応するパターニングを備えている）上への適用（本発明の方法の工程（ｅ）による）の両方で使用できる。有効化されたプローブ分子を適用する対応する方法（例えば、スポッティング、インクジェット印刷など）がこの場合に最も適しているので、マイクロアレイの提供は多重アレイ配置の形態で本発明に従って有効化されることが好ましい。従って、本発明のこの好適な実施態様によれば、本発明に係る方法の前記工程（工程（ｃ）及び／又は工程（ｅ）、好ましくは工程（ｅ））は、１つ以上のテスト・マイクロアレイの生成工程（本発明に係る方法の工程（ｃ）を参照）及び有効化されたプローブ分子を多重マイクロアレイの形態で適用する工程（本発明に係る方法の工程（ｅ）を参照）からなる。未だ有効化されていないテストマイクロアレイ（工程（ｃ））あるいは有効化されたレイアウトを有するマイクロアレイ（工程（ｅ））は各々同一でも異なっていてもよい。支持体の分割は、先行技術により公知のパターン化装置により、好ましくはインクジェット印刷（例えばシステマティック・オートメーション社（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．）ファーミントン、ＣＴ、アメリカ合衆国から入手可能）に適応されているスクリーン印刷装置によって行なうことができる。上記に既に概説したように、さらに、それは、本発明の方法の工程（ｃ）の情況に顧客によって確立された情報、あるいは本発明によるマイクロアレイのデザイン中に予め存在する情報を、多重アレイ配置に統合することも好ましい。
【００５５】
本発明はさらに、本発明の方法によって入手可能な有効化されたマイクロアレイ（即ち、有効化されたレイアウトを備えたマイクロアレイ）に関する。前述したように、これらは多重アレイ配置内に存在することができる。
図面は以下のことを示している：
図１は、ＤＮＡマイクロアレイの例の上に有効化されたマイクロアレイを調製するための従来の慣用的な手順を示している。慣用的な方法の第１の部分は、ＤＮＡマイクロアレイの予備調製及び設計に関する。この目的のために、第１に、コードン（暗号単位）が選択される。これに続いて、必要なオリゴヌクレオチドの数を必要最小限の数に減少する目的で、公知のアルゴリズムを使用して、イン−シリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）オリゴヌクレオチド設計が行なわれる。さらに他のパラメーターは、チップ当たりのスポットの数の最適化に関する。これらの最適化は、本質的にその後のオリゴヌクレオチド合成の間に生じるコストを低減するのに供される。オリゴヌクレオチドは、しばしば精製工程を含む固相合成により、ユーザによって通常外部で合成される。この点において、合成は約１０％のエラー率を持っていると推定され、適切な品質チェックあるいは適切な品質管理が必要になる。これはさらに高いコストを生じ、このオリゴヌクレオチドの合成だけでも１〜２週間かかる（例えば１，０００〜２，０００オリゴヌクレオチドのために）。外部的にこのように合成されたオリゴヌクレオチドは、適切な支持体、特にガラスに適用（スポット）されねばならない。スポッティングは、特にスポッティング溶液の調製工程、９６、３８４などの溜めを有するマイクロ滴定プレートへの、マイクロアレイに従ったフォーマット化工程、及び溶液の実際のスポッティング工程からなる。ここでもまた、調製される溶液等の多様性に起因して、個々の工程が比較的エラーの傾向があるので、対応する品質管理問題が生じる。さらに、このスポッティング工程は、共通のマイクロアレイ用に約１週を必要とする。その後、このように調製されたマイクロアレイは、ハイブリッド化、分析及び評価の各工程によって有効化されねばならない。アルゴリズムによるオリゴヌクレオチドの選択（それは既にエラーを含んでいる）に起因して、マイクロアレイのデザイン（レイアウト）が必要条件を満たすまで、イン−シリコのオリゴヌクレオチドの選択以降の全方法が繰り返されるべきであり、これには数週間無乃至数ケ月かかる。
【００５６】
図２は、対照的に、本発明の方法に従った手順を示しており、最初にコードンが選択され（ユーザによって提供されるターゲットとされる核酸に関する情報に基づいて）、引き続いて選択されたプローブ・オリゴヌクレオチドのＭＡＳその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成がガラス支持体（ガラススライド）上で行なわれる。この合成方法は非常に速く（およそ３時間／スライド）、また非常に広範囲なマイクロアレイ（数１００，０００オリゴ／スライド）の場合でも実行することができる。これは、恐らくまた決定され適用されたプローブ・オリゴヌクレオチドが有機体の完全な遺伝子情報を表わすことができることを意味している。続いて、最初に提供されたマイクロアレイは、ハイブリッド化、分析及び評価のサブ工程において有効化され、適当な場合、例えばオリゴヌクレオチドの長さ及びシーケンスを適応して再び修正合成が実行される。プローブ・オリゴヌクレオチドは、好ましくはインターネットを介してユーザ、特に所望のマイクロアレイ（チップ）の製造業者によって提供される情報に従って、所望のマイクロアレイ・レイアウト（チップ設計）の特異性及び設計に関して選択される。引き続き、マイクロアレイ製造業者サイドでスポッティング法あるいは印刷法を用いて、有効化されたレイアウトに従って有効化されたプローブ分子を適用することにより、慣用的な固相合成方法を用いて、有効化されたレイアウトに従って同定されたオリゴヌクレオチドの合成が行なわれる。この手順の本質的な利点は、一方では、レイアウト作製のために従来の手順に必要な時間がおよそ５〜１０週間（利用可能な情報の範囲に依存して）かかっていたものが、１日から１週間（検討されるターゲット分子に関する情報の提供から、有効化されたマイクロアレイ・レイアウトに至るまで）までダウンでき、著しい時間節約となり、さらに、本発明の方法は有効化されたマイクロアレイを調製するための大量生産に特にふさわしい慣用的な方法の使用によって相当にコストを低減できる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のシステム及び方法の可能な適用は、特に、活性物質の選択のために特定のマイクロアレイ、特にＤＮＡマイクロアレイの調製に供される。さらに、本発明の方法により、特に本発明のシステムの使用により提供されるマイクロアレイは、活性物質の患者特異的な選択に使用できる。経験によれば、この場合、患者が彼の臨床状況のために薬剤を受け取る最適化された率が重要である。さらに、本発明によって調製されたレイアウトに基づいて提供されるマイクロアレイは、同様に短い反応時間が必要とする毒性テストのベースとして供することができる。さらに、本発明によって提供されるマイクロアレイはまた、バイオテクノロジーにより生成された製品用の生産プラントの評価及び最適化のためにも使用できる。そのようなプラントは、最適化されている所望の製品の生産のために使用されたバクテリアの生物学的活動により、通常、オンライン・プロセス制御によって制御される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ＤＮＡマイクロアレイの例の上に有効化されたマイクロアレイを調製するための従来の慣用的な手順を示すフローチャートである。
【図２】低いエラーの有効化されたチップデザインを作製するための本発明の方法による手順を示すフローチャートである。
【図１】
2004198404.tif 000002
【図２】
2004198404.tif 000003
【外国語明細書】
2004198404.tif 000004
2004198404.tif 000005
2004198404.tif 000006
2004198404.tif 000007
2004198404.tif 000008
2004198404.tif 000009
2004198404.tif 000010
2004198404.tif 000011
2004198404.tif 000012
2004198404.tif 000013
2004198404.tif 000014
2004198404.tif 000015
2004198404.tif 000016
2004198404.tif 000017
2004198404.tif 000018
2004198404.tif 000019
2004198404.tif 000020
2004198404.tif 000021
2004198404.tif 000022
2004198404.tif 000023
2004198404.tif 000024
2004198404.tif 000025
2004198404.tif 000026
2004198404.tif 000027
2004198404.tif 000028
2004198404.tif 000029
2004198404.tif 000030
2004198404.tif 000031
2004198404.tif 000032
2004198404.tif 000033
2004198404.tif 000034
2004198404.tif 000035
2004198404.tif 000036
2004198404.tif 000037
2004198404.tif 000038
2004198404.tif 000039
2004198404.tif 000040
2004198404.tif 000041
2004198404.tif 000042
2004198404.tif 000043
2004198404.tif 000044
【図１】
2004198404.tif 000045
【図２】
2004198404.tif 000046