(57)【要約】【課題】ウイルスベクターの発現を安定化させるための新たな方法を提供することが、本発明の課題である。【解決手段】本発明により、導入遺伝子と共に、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを導入することを特徴とする、導入遺伝子のサイレンシングを回避する方法が提供された。更に本発明により、導入遺伝子のサイレンシングを回避するために、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを当該導入遺伝子と共に導入することを特徴とする、遺伝子の導入方法が提供された。更に本発明により、ベクターのサイレンシングを回避するために、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを当該ベクターに導入することを特徴とする、ベクターの作製方法が提供された。ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを有するウイルスベクターは、サイレンシングを回避することができるために、本発明は遺伝子治療において有用な新たな手段を与えるものである。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子と共に、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを導入することを特徴とする、導入遺伝子のサイレンシングを回避する方法。
【請求項２】
ウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行なうことを特徴とする、請求項１記載のサイレンシングを回避する方法。
【請求項３】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項２記載のサイレンシングを回避する方法。
【請求項４】
前記ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターが、アンチセンスの方向で導入されている、請求項１ないし請求項３のいずれか一つの請求項記載のサイレンシングを回避する方法。
【請求項５】
導入遺伝子のサイレンシングを回避するために、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを当該導入遺伝子と共に導入することを特徴とする、遺伝子の導入方法。
【請求項６】
ウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行なうことを特徴とする、請求項５記載の遺伝子の導入方法。
【請求項７】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項６記載の遺伝子の導入方法。
【請求項８】
前記ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターが、アンチセンスの方向で導入されている、請求項５ないし請求項７のいずれか一つの請求項記載の遺伝子の導入方法。
【請求項９】
ベクターのサイレンシングを回避するために、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを当該ベクターに導入することを特徴とする、ベクターの作製方法。
【請求項１０】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項９記載のベクターの作製方法。
【請求項１１】
前記ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項９又は請求項１０記載のベクターの作製方法。
【請求項１２】
前記ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターが、アンチセンスの方向で導入されている、請求項９ないし請求項１１のいずれか一つの請求項記載のベクターの作製方法。
【請求項１３】
導入遺伝子のサイレンシングを回避するために、当該導入遺伝子を導入するためのベクター内にウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを有することを特徴とする、ベクター。
【請求項１４】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１３記載のベクター。
【請求項１５】
前記ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項１３又は請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
前記ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターが、アンチセンスの方向で導入されている、請求項１３ないし請求項１５のいずれか一つの請求項記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、導入遺伝子と共に、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを導入することを特徴とする、導入遺伝子のサイレンシングを回避する方法に関する。更に本発明は、導入遺伝子のサイレンシングを回避するために、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを当該導入遺伝子と共に導入することを特徴とする、遺伝子の導入方法に関する。更に本発明は、ベクターのサイレンシングを回避するために、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを当該ベクターに導入することを特徴とする、ベクターの作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子治療は遺伝子を導入することによって病気を治すという治療方法であって、将来の医療技術として注目を集めている。遺伝子治療の技術によれば、例えばある遺伝子の異常によってその遺伝子の機能が損なわれるために疾患が生じている場合において、患者に正常な遺伝子を導入することにより、その疾患を治療することが可能であると考えられる。遺伝子治療の方法の一つとして、患者の細胞を採取して体外で目的の遺伝子を導入した後、再移植する手法（ｅｘ  ｖｉｖｏ法）がある。この方法を用いてアデノシン・デアミネース欠損症の遺伝子治療が行われて社会的にも大きな注目を集めた。遺伝子治療のもう一つの方法は遺伝子直接導入法（ｉｎ  ｖｉｖｏ法）であり、例えばＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の殻蛋白質（ｅｎｖ）とｇａｇ遺伝子の一部を組み込んだベクターをＨＩＶ感染者に投与することなどが試みられている。
【０００３】
ところで、遺伝子治療の実用化において最も鍵となる技術は遺伝子の導入方法である。遺伝子を導入するための手段は、ウイルスベクターを用いたものと非ウイルスベクターを用いたものに大別することができる。ウイルスベクターを用いた方法はウイルスの感染性を利用したもので、導入効率という点で優れているために、実際の遺伝子治療ではウイルスベクターがより多く用いられている。なお、ウイルスベクターにはいくつかの種類があって必要に応じて使い分けられている。現在使用されているウイルスベクターの例として、具体的には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターやレンチウイルスベクターなどを挙げることができる。
【０００４】
レトロウイルスのゲノムＤＮＡは宿主染色体に組み込まれるために、組み込まれたＤＮＡは安定して次世代へ伝えられる。よって、レトロウイルスベクターは遺伝子を運ぶ運搬体として信頼性が高く、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入系は疾患の永続的な治療法を与える可能性がある。なお、代表的なレトロウイルスベクターにはマウス白血病ウイルスのような単純レトロウイルスがある。また、アデノウイルスベクターは、ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスに由来するベクターであり、これまでの遺伝子治療で２番目に汎用されている遺伝子導入系である。アデノウイルスベクターは、受容体を介したエンドサイトーシスによって細胞に侵入するために導入効率が高く、かなり大きな遺伝子を導入できるという利点も有する。また、ＨＩＶはレンチウイルスに含まれるが、レンチウイルスはマクロファージやリンパ球が感染する複雑なレトロウイルスである。レンチウイルスは上記のレトロウイルスとは異なって、神経細胞、筋肉細胞、幹細胞等の非分裂細胞に導入することができるという利点を有する。また、レンチウイルスは発現がレトロウイルスより安定しているという特徴を有し、遺伝子疾患の長期にわたる治療において使用するのに適していると考えられている。
【０００５】
一方非ウイルスベクターによる方法は感染の危険がないために、安全性という点でウイルスベクターより優れている。ウイルスベクターにおいては、典型的にはウイルスの複製に必要とされるいくつかの遺伝子を欠損させて、その場所に治療のための遺伝子を挿入する。そのために、投与されるウイルスベクターは感染性を失っているが、内因性のレトロウイルスと組み換えを起こした結果として、ウイルスが増殖能を取り戻す可能性を否定することはできない。よって、ウイルスベクターを用いない導入方法が検討されており、そのような試みの例としては、リポソームを用いた方法、粒子照射による直接注入や受容体を介したエンドサイトーシスを用いた方法などを挙げることができるが、まだ実用の段階には至っていない。
【０００６】
ところで、ウイルスベクターを用いた遺伝子治療において導入された遺伝子の発現効率に関与する因子としては、発現効率が宿主内における導入された位置に関係するポジション効果や、後生的（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）変化によって発現効率が低下するといういわゆるサイレンシングなどが挙げられる。サイレンシングの現象のために、宿主体内に治療の目的で遺伝子を導入しても長期的には遺伝子の発現が抑制されてしまう。遺伝的な疾患については生涯にわたっての治療が必要であることを考えると、上記のサイレンシングは遺伝子治療の大きな障害となっていた。この遺伝子サイレンシングが起こる機構はまだ解明されていないが、ＤＮＡのメチル化やヒストン修飾のような現象が関係している可能性が示唆されている。
【０００７】
ところで近年、異なった制御を受ける遺伝子の間の仕切りとして働くＤＮＡ配列である、クロマチンインスレーターの存在が明らかとなってきた。種々のインスレーターがショウジョウバエや、ニワトリ、マウス、ヒトなどの脊椎動物において見出されているが、これらのインスレーターには共通した２つの作用があると言われている。その一つはエンハンサーとプロモーター間に置かれた際に、エンハンサーの作用を阻害する活性である。なお、エンハンサーとはプロモーターの転写活性を強める働きを有する特異的な配列であるが、インスレーターはその様なエンハンサーの機能を遮断すると言われている。
【０００８】
もう一つのインスレーターの働きはポジション効果を抑制する効果である。ポジション効果とは、その遺伝子が導入された染色体上の位置によって転写効率が変化するという現象であるが、そのポジション効果の原因となっている周囲の転写環境の影響をインスレーターは抑制する。上記の理由により一対のインスレーターによって挟まれた領域は宿主の染色体の環境から単離されることになり、それによって導入された遺伝子はポジション効果から防御され、その遺伝子が発現する際の独立性を保証するといわれている。よって、これまで述べてきたインスレーターの特性を考えると、ウイルスベクターにインスレーターを導入することにより、効率的かつ安定な遺伝子発現を達成できる可能性がある。
【０００９】
これまでに最も検討がなされてきた脊椎動物のインスレーターは、ニワトリβグロビン遺伝子座の制御部位から得られたｃＨＳ４インスレーターである。モロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ−ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ：  ＭｏＭＬＶ）に由来するレトロウイルスベクターに導入されると、ｃＨＳ４インスレーターは、導入した遺伝子をポジション効果から保護するという知見がＲｉｖｅｌｌａらにより報告されている（非特許文献１）。しかし、遺伝子を送達するウイルスベクターとしての実用性を考えると、ｃＨＳ４インスレーターが活性を有する細胞の型は限られるという欠点があった。よってウイルスベクターの有効性を高めるための新たな手段が、更に必要とされていた。
【００１０】
【非特許文献１】
Ｒｉｖｅｌｌａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｃＳＨ４  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｔ  ｒａｎｄｏｍ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ．”  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ２０００；  ４６７９−４６８７
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、ウイルスベクターの発現を安定化させるための新たな方法を提供することが本発明の課題である。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターに注目して検討を行った。ウニアリルスルファターゼの遺伝子座から得られた５７５遺伝子対の断片は、インスレーターとしての典型的な特徴を示し、エンハンサー／プロモーター間の相互作用を遮断してポジション効果を防ぐ作用を有する。また、ウニアリルスルファターゼインスレーター（Ａｒｓ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  ：  ＡｒｓＩ）は種を超えて種々の型の細胞において働くことが知られているために、ヒトの組織においても一般的なインスレーターとして機能することが予想される。ＡｒｓＩの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００１３】
これまでの検討において、ＡｒｓＩはエンハンサー機能を遮断することやポジション効果を抑制することは知られていたが、サイレンシングを抑制できるかについては知られていなかった。言い換えると、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターの存在は知られていたが、ＡｒｓＩの抗サイレンシング活性については不明であったために、遺伝子治療において有用であるかどうかは判らなかった。そこで本発明者は、ヒト白血病由来のＨＬ−６０細胞などにおいてＡｒｓＩがサイレンシングを防ぐ活性を有しているかについて検討を行った、その結果、ＡｒｓＩはサイレンシングを防ぐことができるという知見が得られ、ＡｒｓＩが遺伝子治療においてウイルスベクタ−の発現を安定化させるのに有効であることが示唆された。また、ＡｒｓＩは作製できるウイルス量を減らすということもないことを考えると、遺伝子治療におけるＡｒｓＩの有用性は高い。更に現在発生工学の分野で胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）が注目されているが、そのＥＳ細胞にも効果があるインスレーターはＡｒｓＩのみである。
【００１４】
よって本発明は、導入遺伝子と共に、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを導入することを特徴とする、導入遺伝子のサイレンシングを回避する方法を提供するものである。更に本発明は、導入遺伝子のサイレンシングを回避するために、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを当該導入遺伝子と共に導入することを特徴とする、遺伝子の導入方法を提供するものである。更に本発明は、ベクターのサイレンシングを回避するために、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを当該ベクターに導入することを特徴とする、ベクターの作製方法を提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
下記の実施例において本発明者らは、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーター（ＡｒｓＩ）が、レンチウイルスベクターにおいてサイレンシングとポジション効果に及ぼす影響を検討した。その検討のために、ＡｒｓＩを３’−Ｕ３領域に、センス方向とアンチセンス方向に有するレンチウイルスベクター（それぞれ、ＨＲ／Ａ＋、ＨＲ／Ａ−）をそれぞれ構築した。更にコントロールベクター（ＨＲ／ｃＨＧ）も構築した。レポーター遺伝子としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子と促進緑色蛍光蛋白質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ：ＥＧＦＰ）との融合遺伝子（ＨｙｇＥＧＦＰ）を使用した。
【００１６】
ＨＬ−６０細胞を用いてＡｒｓＩがサイレンシングに及ぼす影響を検討したところ、ＨＲ／ｃＨＧ（コントロールベクター）とＨＲ／Ａ＋（センス方向ベクター）においてはＥＧＦＰの発現は経時的に低下したが、一方、ＨＲ／Ａ−（アンチセンス方向ベクター）においてはＥＧＦＰの発現は試験期間を通じて維持されていた。よってＡｒｓＩの抗サイレンシング効果はアンチセンス方向の場合にのみ認められ、よって方向依存性を有していた。更にＡｒｓＩをセンス方向及びアンチセンス方向に有するレトロウイルスベクター（モロニーマウス白血病ウイルスベクター）においても、ＡｒｓＩがサイレンシングに及ぼす影響を検討した。その結果、レンチウイルスベクターの場合と同様にアンチセンス方向特異的に抗サイレンシング効果が認められた。
【００１７】
ＡｒｓＩのポジション効果に対する影響を検討するために、ＥＧＦＰの発現レベルのバラツキを検討しところ、ＨＲ／ｃＨＧ（コントロールベクター）においては発現レベルにバラツキがあり、変動係数（ＣＶ）は３９．８であった。一方ＨＲ／Ａ＋（センス方向ベクター）とＨＲ／Ａ−（アンチセンス方向ベクター）ではクローン間の発現差は小さく、ＣＶ値はそれぞれ８．３  及び２３．３であった。この結果は、ＡｒｓＩのポジション効果抑制には方向依存性がないことを示している。この知見から、ＡｒｓＩの抗サイレンシング効果とポジション効果の抑制には直接的な関係はないものと考えられる。長期的なサイレンシングはポジション効果から保護された結果であるという説もあったが、この結果から、両者の現象に関与するメカニズムは異なっていると考えられる。
【００１８】
これまでＡｒｓＩのポジション効果抑制作用やエンハンサー機能遮断作用は知られていたが、抗サイレンシング効果は知られていなかった。よって本発明は、ＡｒｓＩが優れた抗サイレンシング効果を有することを初めて見出したものである。その抗サイレンシング効果のために、ＡｒｓＩをアンチセンス方向に組み込んだウイルスベクターを用いると、サイレンシングによって導入遺伝子の発現効率が低下することを防ぐことができると考えられる。またＡｒｓＩはウイルス産生を減少させることもなかった。よってＡｒｓＩを導入したウイルスベクターの効果は長期に渡って安定であって遺伝子治療に適した特性を有している。
【００１９】
本発明を実施するにあたり、導入しようとする外来遺伝子の５’上流にプロモーターを配置した遺伝子カセットを作製する。外来遺伝子の発現効率は一般的には高くないので、その外来遺伝子の発現量を増加させる目的で、プロモーター・エンハンサーを外来遺伝子の上流領域に配置する。そのために例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用することができるが、それに限定されるものではなく、本技術分野で通常使用されている種々のプロモーターを適宜使用することができる。そして好ましい態様においては、その遺伝子カセットを挟むようにして、５’上流と３’下流にＡｒｓＩをアンチセンスの方向で導入する。しかし、本発明はその態様に限定されるものではなく、ＡｒｓＩが抗サイレンシング効果を有する限り、ＡｒｓＩを５’上流と３’下流にセンスの方向で導入する態様や、５’上流又は３’下流の片方にのみＡｒｓＩを導入する態様も本発明の範囲内である。
【００２０】
なお、本発明において導入する外来遺伝子の範囲は特に限定されるものではなく、目的に応じて最も適切な遺伝子を選択する。本発明の好適な態様の一例として、ある特定の遺伝子の発現が欠損することによって疾患が生じる場合に、ＡｒｓＩを含むウイルスベクターを用いてその欠損遺伝子を患者に導入することにより、疾患の根本的な治療を行うことができる。その場合には、導入する外来遺伝子として、上記の疾患の原因となっている遺伝子を選択することになるであろう。
【００２１】
そしてＡｒｓＩを含むウイルスベクターを用いて、生体、生体の器官又は生体に由来する細胞に遺伝子を導入することができる。ここで生体とは任意の動物又は植物であって、特に限定されるものではない。そして、生体自身に目的とする遺伝子を導入する態様のみならず、その生体の器官やその生体に由来する細胞などを採取して、それらに目的とする遺伝子を導入するという態様も本発明の範囲内である。例えば、生体に由来する血球細胞などを採取し、ＡｒｓＩを含むウイルスベクターにより外来遺伝子をその血球細胞に導入し、遺伝子治療の目的で提供するという方法も本発明の範囲内に含まれるものである。更に各組織又は各臓器から幹細胞を採取し、ＡｒｓＩを含むウイルスベクターにより外来遺伝子を導入することで、安定的に導入遺伝子を発現する細胞を構築することができる。具体的には、血液幹細胞のみならず、神経幹細胞、肝臓幹細胞などにおいて、ＡｒｓＩを含むウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行うことができる。
以下において本発明を更に詳細に説明するが、下記の実施例はいかなる意味においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００２２】
【実施例】
（インスレーターを含むレンチウイルスベクターの作製）
２つのインスレーターによって挟まれた導入遺伝子はポジション効果とサイレンシングから保護されることが、過去の研究よって示されている。そこで、プロモーター／レポーターカセットをインスレーターで挟み込むために、３’−Ｕ３領域のＥｃｏＲＶ−  ＥｃｏＲＶ断片をインスレーターで置き換えることによって、インスレーター断片をレンチウイルスベクター（ｐＨＲ’）に導入した（図１）。
【００２３】
なお図１Ａはレンチウイルスベクターの模式図である。図１の最上段はコントロールベクターであるｐＨＲ／ｃＨＧの図である。ｐＨＲ／ｃＨＧはサイトメガウイルス前初期プロモーターによって駆動されるＨｙｇＥＧＦＰレポーターを含んでおり、３’−Ｕ３領域において７９塩基が欠損している（▽）。中段と下段は、ｐＨＲ／ｃＨＧの３’−Ｕ３領域にＡｒｓＩを含んでいるベクターである。ｐＨＲ／Ａ＋においてはＡｒｓＩを本来の遺伝子座のセンス方向で有しており、一方、ｐＨＲ／Ａ−はアンチセンス方向で有している。点線は挿入後に５’−Ｕ３領域へコピーされたＡｒｓＩを示す。矢印はインスレーターの挿入部位を示す。また、ｐＨＲ／Ｈ＋とｐＨＲ／Ｈ−は、ｐＨＲ／Ａと同様にして作製したｃＨＳ４インスレーターを含むベクターであって、ｃＨＳ４インスレーターをそれぞれセンスとアンチセンスの方向で有している。
【００２４】
この戦略により、挿入されたＡｒｓＩは逆転写の間に５’−ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）にコピーされ、それにより５‘と３’−Ｕ３領域内のＡｒｓＩは、レポーターカセット全体を挟むことになる。ここでのレポーターカセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターとその制御下にあるＨｙｇＥＧＦＰからなるものである。ポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）による５’−ＬＴＲの増幅により、予想どおりに、ＡｒｓＩはうまく５’−Ｕ３領域にコピーされていることが示された（図２）。図２において、３’−Ｕ３領域中に導入されたＡｒｓＩは、逆転写の間に５’−Ｕ３領域にコピーされた。レンチウイルスを導入したＨＬ−６０細胞由来のプロウイルスの配列を、５’−ＬＴＲに特異的なプライマーを用いて増幅した。インスレーターなしにおける予期されるＬＴＲの大きさはおよそ０．７ｋｂであり、一方、無傷のＡｒｓＩのサイズは１．３ｋｂであった。
【００２５】
ＨＲ／Ａ＋とＨＲ／Ａ−のベクタータイターはコントロールベクターＨＲ／ｃＨＧと類似であり、それは、ＡｒｓＩはレンチウイルスベクターのパッケージングとトランスダクションに干渉しないことを示している（表１）。ｃＨＳ４インスレーターをＬＴＲのＵ３領域へ挿入するとウイルスの産生が減少し、５’−ＬＴＲ中のｃＨＳ４配列はプロウイルス中で部分的に除去された（図２）。そこで、ＨＩＶ型のベクターのコンテクスト中でｃＨＳ４インスレーターの能力を試験することはできなかった。
【００２６】
【表１】
2004283067.tif 000002
【００２７】
（レンチウイルスベクターのサイレンシングへのＡｒｓＩの作用）
サイレンシング保護のアッセイのために、ＨＬ−６０細胞にレンチウイルスベクターを導入した。ＨＲ／ｃＨＧ，  ＨＲ／Ａ＋又はＨＲ／Ａ−のレンチウイルスベクターによって細胞を形質転換し、ハイグロマイシン耐性細胞を選択した。促進緑色蛍光蛋白質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ：ＥＧＦＰ）の発現についてほとんど全ての細胞がポジティブであることを確認した後、そのような細胞を選択してハイグロマイシン存在下で更に２週間培養し、形質転換していない細胞を除いた。その後に細胞をハイグロマイシン非存在下で培養し、ＥＧＦＰの発現について定期的に試験したところ、ＨＬ−６０細胞について長期サイレンシングが観察された。
【００２８】
ＥＧＦＰの発現の蛍光発色セルソーター（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ  ：  ＦＡＣＳ）解析を行ったヒストグラムを図３に示す。ハイグロマイシン耐性の形質転換したＨＬ−６０細胞を４週間選択し、ハイグロマイシンなしで培養した。ヒストグラムは、ハイグロマイシンを除去して２７週目のデータを図３に示す。なお、図３において、線ａは遺伝子導入なし、線ｂはハイグロマイシン選択下で培養した細胞、黒塗りのヒストグラムｃはハイグロマイシンなしで培養された細胞を示す。ハイグロマイシン除去後における一連のＥＧＦＰ発現の変化を、ＥＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ（図４）と、平均蛍光強度（図５）により示す。
【００２９】
ＨＬ−６０細胞において、ＨＲ／ｃＨＧ（黒丸）とＨＲ／Ａ＋（白三角）由来のＥＧＦＰの発現は、ハイグロマイシンを除去してすぐに減少しはじめ、ＥＧＦＰ  陽性細胞の割合と平均蛍光強度（ＭＦｌ）は、ハイグロマイシンで選抜した対応物のおよそ３０％まで減少した（図４、図５）。しかし、ＨＲ／Ａ−（黒四角）由来のＥＧＦＰの発現はアッセイ期間中にわたって維持された（図４、図５）。ＡｒｓＩがこのような方向特異的な活性を有していることは、アンチセンス方向のみがウニにおいてエンハンサーとプロモーターの相互作用を阻害し、ＨｅＬａ細胞において導入遺伝子をポジション効果から保護したという過去の報告と一致している。
【００３０】
（ＡｒｓＩとｃＨＳ４インスレーターの抗サイレンシング能力の比較）
ＡｒｓＩとｃＨＳ４の抗サイレンシング能力を比較するために、モロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ−ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ：  ＭｏＭＬＶ）ベクターを使用し、インスレーター断片を３’−Ｕ３へ挿入した。ＲＣＶ／Ａ＋とＲＣＶ／Ａ−は、ＡｒｓＩをセンス方向とアンチセンス方向で含むＭｏＭＬＶベクターである。また、ＲＣＶ／Ｈ＋とＲＣＶ／Ｈ−は、ｃＨＳ４インスレーターをセンス方向とアンチセンス方向で含むＭｏＭＬＶベクターである。なお、ＲＣＶ／ＨＧはインスレーターを含まない、ＭｏＭＬＶのコントロールベクターである。
【００３１】
図６に、ＡｒｓＩとｃＨＳ４の抗サイレンシング能力の比較を示す。ＭｏＭＬＶベクター（ＲＣＶ）をＨＬ−６０細胞に導入した。ＡｒｓＩ又はｃＨＳ４を含んでいるＲＣＶをＨＬ−６０に導入し、そしてＥＧＦＰ発現を定期的にモニターした。図６はハイグロマイシンを除去して１４週間後のＥＧＦＰ発現のヒストグラムであって、図６において、線ａは遺伝子導入なし、線ｂはハイグロマイシン選択下で培養した細胞、黒塗りのヒストグラムｃはハイグロマイシンなしで培養された細胞を示す。また、図７はＥＧＦＰ発現の経時変化を示す。
【００３２】
ＡｒｓＩとｃＨＳ４の両者を５’−Ｕ３へコピーし、組み込んだ後もインタクトの状態に保った。インスレーターの有り無しにおいてＲＣＶベクターをＨＬ−６０細胞に導入し、それらにおけるＥＧＦＰの発現を追跡した。インスレーターなしのコントロールベクター（ＲＣＶ／ＨＧ）（黒丸）からのＥＧＦＰの発現は、ＨＩＶ型のベクター（レンチウイルスベクター）よりやや速く、アッセイ期間中に消滅した（図４、図７）。ＲＣＶ／Ａ＋（白三角）もまたサイレントであったが、一方、ＲＣＶ／Ａ−（黒四角）はサイレンシングから保護された（図７）。同様の方向依存性がｃＨＳ４含有ベクター（ＲＣＶ／Ｈ＋，  ＲＣＶ／Ｈ−）においても観察され、ｃＨＳ４の抗サイレンシング能力はＨＬ−６０細胞におけるＡｒｓＩと同等であった。
【００３３】
（ＨＬ−６０細胞におけるポジション効果に対するＡＲＳインスレーターの効果）
次に、ポジション効果に対するＡｒｓＩの効果を試験した。インスレーターによって位置に依存しない発現が保証されることは、サイレンシングに対する保護において重要な役割を果たすかもしれないからである。ＨＬ−６０細胞をＨＲ／ｃＨＧ，  ＨＲ／Ａ＋又はＨＲ／Ａ−によって形質転換し、ハイグロマイシン耐性細胞を選択し、次いで限界希釈によってクローニングした。各細胞プールから１０クローンを選択し、ＥＧＦＰ発現を試験した。図８は、遺伝子導入したＨＬ−６０細胞のクローン解析の結果である。ハイグロマイシン耐性細胞プールの限界希釈によりクローンを選択し、ハイグロマイシン存在下で維持した。点は各クローンの平均蛍光強度を示す。変動係数（ＣＶ）をベクター名の下に示す。
【００３４】
ＨＲ／ｃＨＧクローンの平均蛍光強度（ＭＦｌ）は９．６から３０．１まで変化し、変動係数（ＣＶ）は３９．８であった（図８）。驚いたことに、ＨＲ／Ａ＋とＨＲ／Ａ−のクローンは両者とも単一の発現を示した。ＨＲ／Ａ＋クローンはＨＲ／Ａ−よりもより単一的な発現を示し、それぞれの変動係数（ＣＶ）は８．３と２３．３であった（図８）。これらの結果は、ＡｒｓＩは、レンチウイルスベクターを、その方向に関わらずポジション効果から保護し、この活性はサイレンシング保護からは独立であることを示唆している。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、導入遺伝子と共に、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを導入することを特徴とする、導入遺伝子のサイレンシングを回避する方法が提供された。更に本発明により、導入遺伝子のサイレンシングを回避するために、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを当該導入遺伝子と共に導入することを特徴とする、遺伝子の導入方法が提供された。更に本発明により、ベクターのサイレンシングを回避するために、ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを当該ベクターに導入することを特徴とする、ベクターの作製方法が提供された。ウニアリルスルファターゼ由来のインスレーターを有するウイルスベクターは、サイレンシングを回避することができるために、遺伝子治療において有用な新たな手段を与えるものである。
【００３６】
【配列表】
2004283067.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＡｒｓＩを含むウイルスベクターの構造を示した模式図である。
【図２】図２は、導入されたＡｒｓＩのＰＣＲ  による検出を示した写真である。
【図３】図３は、ＡｒｓＩを含むレンチウイルスベクターを導入したＨＬ−６０細胞におけるＥＧＦＰ発現を示したＦＡＣＳ解析のヒストグラムである。
【図４】図４は、ＡｒｓＩを含むレンチウイルスベクターを導入したＨＬ−６０細胞における抗サイレンシング活性の経時変化をＥＧＦＰ発現％で示したグラフである。
【図５】図５は、ＡｒｓＩを含むレンチウイルスベクターを導入したＨＬ−６０細胞における抗サイレンシング活性の経時変化を平均蛍光強度で示したグラフである。
【図６】図６は、ＡｒｓＩ又はｃＨＳ４を含むＭｏＭＬＶベクターを導入したＨＬ−６０細胞におけるＥＧＦＰ発現を示したＦＡＣＳ解析のヒストグラムである。
【図７】図７は、ＡｒｓＩ又はｃＨＳ４を含むＭｏＭＬＶベクターを導入したＨＬ−６０細胞における抗サイレンシング活性の経時変化をＥＧＦＰ発現％で示したグラフである。
【図８】図８は、形質転換したＨＬ−６０細胞のクローン解析を行ったグラフである。
【図１】
2004283067.tif 000004
【図２】
2004283067.tif 000005
【図３】
2004283067.tif 000006
【図４】
2004283067.tif 000007
【図５】
2004283067.tif 000008
【図６】
2004283067.tif 000009
【図７】
2004283067.tif 000010
【図８】
2004283067.tif 000011