(57)【要約】【課題】組織におけるＩ型コラーゲン遺伝子の発現量を減少させ、コラーゲン蓄積量を低下させることにより、組織の線維化を改善させる薬剤等を開発・提供すること。【解決手段】式（Ｉ）2004123621.tif 000011（式中、Ｘはメトキシ基又はエトキシ基を示す。）で示される４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物、当該化合物を有効成分として含有することを特徴とするＩ型コラーゲン遺伝子転写抑制剤、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量を減少させてコラーゲン蓄積量の低下を導くことにより組織の線維化を改善するための前記Ｉ型コラーゲン遺伝子転写抑制剤の使用、前記化合物を有効成分として含有することを特徴とする組織の線維化を改善させる薬剤、線維症であると診断されうる哺乳動物に対して有効量の前記化合物を投与する工程を有することを特徴とする組織の線維化を改善させる方法等が提供可能となった。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
2004123621.tif 000010
（式中、Ｘはメトキシ基又はエトキシ基を示す。）
で示される４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物。
【請求項２】
Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制するための、請求項１記載の４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物の使用。
【請求項３】
請求項１記載の４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物を有効成分として含有することを特徴とするＩ型コラーゲン遺伝子転写抑制剤。
【請求項４】
Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量を減少させてコラーゲン蓄積量の低下を導くことにより組織の線維化を改善するための、請求項３記載のＩ型コラーゲン遺伝子転写抑制剤の使用。
【請求項５】
請求項１記載の４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物を有効成分として含有することを特徴とする組織の線維化を改善させる薬剤。
【請求項６】
線維症であると診断されうる哺乳動物に対して、有効量の請求項１記載の４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物を投与する工程を有することを特徴とする組織の線維化を改善させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物及びその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥る疾患）、炎症後の過形成痕跡、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、強皮症、動脈硬化、高血圧等の疾患や異状においては、コラーゲンに代表されるような細胞外マトリックスの過度の集積により組織が線維化して硬化し、その結果、臓器・組織の機能低下や瘢痕形成等に至る。このような細胞外マトリックスの過度の集積は、コラーゲン等の生合成と分解とのバランスの破綻に基づくコラーゲンの産生亢進により導かれる。実際、線維化した組織においては、コラーゲン遺伝子、特にＩ型コラーゲン遺伝子の発現量が増加していることが観察されている（非特許文献１及び非特許文献２参照）。また、線維化した組織においては、サイトカインの１種であるＴＧＦ−βの量が上昇していることも観察されている（非特許文献１及び非特許文献２参照）。ＴＧＦ−βは、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量を増加させ、コラーゲンの産生亢進、ひいては、組織の線維化に関与していることが示されている（非特許文献３及び非特許文献４参照）。
一方、種々の動物線維症モデルにおいて、インターフェロンγの投与により、組織におけるＩ型コラーゲン遺伝子の発現量が低下し、コラーゲンの量が低下することにより組織の線維化が改善されることが報告されている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７及び非特許文献８参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０）
【非特許文献２】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，６６４２，（１９９１）
【非特許文献３】
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６３，１７１，（１９９０）
【非特許文献４】
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０）
【非特許文献５】
Ｅｘｐ．Ｌｕｎｇ　Ｒｅｓ．，２１，７９１−８０８，（１９９５）
【非特許文献６】
Ｋｉｄｎｅｙ　Ｉｎｔ．，４７，６２−６９，（１９９５）
【非特許文献７】
Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，２８，４７１−４７９，（１９９８）
【非特許文献８】
Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，２６，８９４−９０３，（１９９７）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、組織におけるＩ型コラーゲン遺伝子の発現量を減少させ、コラーゲン蓄積量を低下させることにより、組織の線維化を改善させる薬剤（即ち、コラーゲン蓄積抑制剤や線維症治療剤）の開発・提供が切望されている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、下記の式（Ｉ）で示される４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物がＩ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有することを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．式（Ｉ）
2004123621.tif 000002
（式中、Ｘはメトキシ基又はエトキシ基を示す。）
で示される４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物（以下、本発明化合物（Ｉ）と記すこともある。）；
２．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制するための、前項１記載の４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物の使用；
３．前項１記載の４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物を有効成分として含有することを特徴とするＩ型コラーゲン遺伝子転写抑制剤（以下。本発明転写抑制剤と記すこともある。）；
４．Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量を減少させてコラーゲン蓄積量の低下を導くことにより組織の線維化を改善するための、前項３記載のＩ型コラーゲン遺伝子転写抑制剤の使用；
５．前項１記載の４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物を有効成分として含有することを特徴とする組織の線維化を改善させる薬剤；
６．線維症であると診断されうる哺乳動物に対して、有効量の前項１記載の４−メトキシ−１−ベンゾピラン−２−オン化合物を投与する工程を有することを特徴とする組織の線維化を改善させる方法；
等を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、詳細に本発明を説明する。
本発明化合物（Ｉ）は新規化合物であるが、ＷＯ９７／３５５６５号公報の特許請求の範囲に包含される。しかしながら、当該文献には組織内におけるＩ型コラーゲン遺伝子の転写抑制の効果、ひいてはコラーゲン蓄積量の抑制効果についての記載は無く、また本発明化合物（Ｉ）と類似の構造を有する化合物の具体的な記載は何ら存在していない。
本発明化合物（Ｉ）の具体的な態様としては、例えば、以下の骨格を有する化合物（式中、Ｘはメトキシ基又はエトキシ基を示す。）をあげることができる。
2004123621.tif 000003
【０００７】
本発明化合物（Ｉ）は，式（ＩＩ）で示される化合物（式中、Ｘはメトキシ基又はエトキシ基を示す。）（以下、本発明中間体（ＩＩ）と記すこともある。）をメチル化することにより製造することができる。
2004123621.tif 000004
メチル化の方法としては、例えば、式（ＩＩ）で示される化合物とメチル化剤とを塩基の存在下で反応させる方法をあげることができる。
式（ＩＩ）で示される化合物にメチル化剤を塩基の存在下で作用させる反応は、通常溶媒中で行われる。当該反応に用いられる溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等の酸アミド類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、ヘキサメチルホスホラミド等のリン酸アミド化合物類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類等があげられる。
上記の反応に用いられる塩基としては、例えば、水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物類、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩類、酸化銀等の銀塩類があげられる。
上記の反応に用いられるメチル化剤としては、例えば、ジメチル硫酸、臭化メチル、沃化メチル等のメチルハライド類があげられる。
上記の反応に用いられる試剤の量は、式（ＩＩ）で示される化合物１モルに対して、塩基は通常１モル〜２モルの割合、メチル化剤は通常１モル〜２モルの割合である。
反応温度は通常０℃〜１００℃の範囲内、反応時間は通常１時間〜２００時間の範囲内である。
反応終了後、反応混合物を有機溶媒抽出し、有機層を乾燥、濃縮する等の後処理操作を行うことにより、本発明化合物（Ｉ）を単離することができる。単離された本発明化合物（Ｉ）はクロマトグラフィー、再結晶等によりさらに精製することもできる。
表１に、化合物番号（１）〜（５）で表される本発明化合物（Ｉ）を例示する。
【０００８】
表１　本発明化合物（Ｉ）
2004123621.tif 000005
【０００９】
【表１】
2004123621.tif 000006
表２に、化合物番号Ａ〜Ｅで表される本発明中間体（ＩＩ）を例示する。
【００１０】
表２　本発明中間体（ＩＩ）
2004123621.tif 000007
【００１１】
【表２】
2004123621.tif 000008
【００１２】
化合物番号Ａ、Ｂ、Ｅで表される本発明中間体（ＩＩ）は特開昭５０−４６６６６号公報に記載され、化合物番号Ｃで表される本発明中間体（ＩＩ）は特開昭５０−４６６６６号公報及びＰｈａｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏ．Ｃｏｍｍｕ．３６５（１９９８）等に記載されている。化合物番号Ｄで表される本発明中間体（ＩＩ）は、上記文献に記載された方法に準じて製造することができる。
【００１３】
本発明転写抑制剤は、例えば、本発明化合物（Ｉ）自体、或いは、本発明化合物（Ｉ）と、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、医薬品添加剤、食品添加剤若しくは化粧品添加剤等とが混合されてなる組成物等であり、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力を有する。当該能力は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量を減少させてコラーゲン蓄積量の低下を導くことにより組織の線維化を改善するために重要であり、当該目的のための医薬品、食品、化粧品等として利用が考えられる。
本発明転写抑制剤の適用可能な疾患としては、コラーゲンの過度の集積により組織が線維化して硬化し、その結果、臓器・組織の機能低下や瘢痕形成等に起因する疾患（即ち、線維症）を治療するために用いることができる。例えば、肝硬変、間質性肺疾患、慢性腎不全（又は慢性腎不全に陥る疾患）、炎症後の過形成痕跡、術後の瘢痕や熱傷性瘢痕、強皮症、動脈硬化、高血圧等の疾患や異状等をあげることができる。
用いられる薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、医薬品添加剤、食品添加剤若しくは化粧品添加剤等は、前記組成物の具体的用途に応じて適宜選択することができる。また、当該組成物の形態も、具体的用途に応じて、例えば、種々の固体、液体等の形態とすることができる。
【００１４】
例えば、本発明化合物（Ｉ）を医薬品として用いる場合には、具体的な形態として、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、カプセル剤、懸濁化剤、エマルジョン剤、エキス剤及び丸剤等の経口剤、注射剤、外用液剤、軟膏剤等の経皮吸収剤、坐剤及び局所等の非経口剤等をあげることができる。
経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸等の担体や賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、安定化剤、保湿剤、防腐剤、酸化防止剤等の医薬品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明転写抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合にはヒト成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
非経口剤のうち、注射剤は、生理食塩水、滅菌水リンゲル液等の水溶性溶剤、植物油、脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の医薬品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。外用液剤、ゲル状軟膏等の経皮吸収剤、直腸内投与のための坐剤等も通常の方法に従って製造することができる。このような非経口剤を投与するには、注射（皮下、静脈内等）、経皮投与、直腸投与すればよい。局所剤は、例えば、本発明化合物（Ｉ）をエチレンビニル酢酸ポリマー等の徐放性ポリマーのペレットに取り込ませて製造することができる。このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植すればよい。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明転写抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は注射の場合にはヒト成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明化合物（Ｉ）を化粧品として用いる場合には、具体的な形態としては、例えば、クリーム、ローション剤等をあげることができる。ローション剤は、例えば、懸濁剤、乳化剤、保存剤等の化粧品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。
本発明化合物（Ｉ）を化粧品として用いる場合には、具体的な形態としては、例えば、クリーム、ローション剤等をあげることができる。ローション剤は、例えば、懸濁剤、乳化剤、保存剤等の化粧品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明転写抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常ヒト成人で有効成分量として約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明化合物（Ｉ）を食品として用いる場合には、具体的な形態としては、例えば、粉末、錠剤、飲料、摂取可能なゲル若しくはシロップとの混合液状物、例えば、調味料、和菓子、洋菓子、氷菓、飲料、スプレッド、ペースト、漬物、ビン缶詰、畜肉加工品、魚肉・水産加工品、乳・卵加工品、野菜加工品、果実加工品、穀類加工品等の一般的な飲食物や嗜好物等をあげることができる。また、家畜、家禽、蜜蜂、蚕、魚等の飼育動物のための飼料や餌料への食品添加物等もあげられる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明転写抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は注射の場合にはヒト成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明する。
実施例１　（本発明化合物（Ｉ）の製造方法及び取得（その１））
クロロホルム１４２ｍｌに３−アセチル−４−ヒドロキシクマリン３９．００ｇ、３−エトキシベンズアルデヒド２８．７０ｇ及びピペリジン１２．７６ｇを溶解し、得られた混合物をモレキュラーシーブスを充填したソックスレー抽出器で水分を除去しつつ、還流下に４時間１５分加熱した。室温に冷却後、当該反応液を氷水に注加し、さらに１０％塩酸、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付して結晶を得た。この結晶をクロロホルムとヘキサンとの混合液（クロロホルム溶液へ結晶が析出するまでヘキサンを加える）で再結晶することにより、３−［３−（３−エトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物番号Ｄ）の淡黄色結晶３９．５９ｇを得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．０９（ｑ，２Ｈ，　Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．９９（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，７．４Ｈｚ），７．２０〜７．４０（ｍ，５Ｈ，），７．６９（ｄｔ，　１Ｈ，Ｊ＝１．５，８．５Ｈｚ），８．０２（ｄ，　１Ｈ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ），８．１０（ｄｄ，　１Ｈ，Ｊ＝１．５，８．１Ｈｚ），８．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ），１１．４（ｓ，１Ｈ）
【００１６】
実施例２　（本発明化合物（Ｉ）の製造方法及び取得（その２））
ヘキサメチルホスホラミド５８ｍｌに水素化ナトリウム（６０％油性）０．８７ｇを懸濁し、約０℃で３−［３−（２−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物番号Ａ）７．００ｇを加え、室温に昇温して２時間攪拌した。次いで、ジメチル硫酸３．２９ｇを加えて、１００℃迄で昇温した。その後、反応混合物を氷水に注加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、得られた結晶をクロロホルムとヘキサンとの混合液で再結晶し、更にトルエンで再結晶することにより、３−［３−（２−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−メトキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物番号（１））の淡黄色結晶０．９５ｇを得た。
融点：１３６〜１３６．５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３．８６（ｓ，３Ｈ），４．０５（ｓ，３Ｈ），６．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．９７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ），７．２８〜７．４２（ｍ，３Ｈ），７．５６〜７．６３（ｍ，２Ｈ），７．８８〜７．９４（１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ）
【００１７】
実施例３　（本発明化合物（Ｉ）の製造方法及び取得（その３））
３−［３−（２−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの代わりに、３−［３−（３−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物番号Ｂ）７．００ｇを用いた以外は上記の実施例２と同様にして、３−［３−（３−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−メトキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物番号（２））１．８６ｇを得た。
融点：１４２〜１４２．５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３．８３（ｓ，３Ｈ），４．０４（ｓ，３Ｈ），６．９６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，８．３Ｈｚ），７．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ），７．０９（ｓ，１Ｈ），７．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．２８〜７．３８（ｍ，３Ｈ），７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ），７．６０（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．７，７．８Ｈｚ），７．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，８．１Ｈｚ）
【００１８】
実施例４　（本発明化合物（Ｉ）の製造方法及び取得（その４））
３−［３−（２−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの代わりに、３−［３−（４−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物番号Ｃ）７．００ｇを用いた以外は上記の実施例２と同様にして、３−［３−（４−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−メトキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物番号（３））１．４３ｇを得た。
融点：１８３〜１８５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３．９６（ｓ，３Ｈ），４．０６（ｓ，３Ｈ），６．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ），７．２８〜７．３８（ｍ，２Ｈ），７．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ），７．５８〜７．６３（ｍ，１Ｈ），７．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，７．８Ｈｚ）
【００１９】
実施例５　（本発明化合物（Ｉ）の製造方法及び取得（その５））
３−［３−（２−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの代わりに、３−［３−（３−エトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物番号Ｄ）３３．６０ｇを用いた以外は上記の実施例２と同様にして、３−［３−（３−エトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−メトキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物番号（４））５．４７ｇを得た。
融点：１３５〜１３５．５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４２（ｔ，３Ｈ，　Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．０５（ｑ，２Ｈ，　Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．０４（ｓ，３Ｈ），６．９６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２，８．０Ｈｚ），７．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ），７．０７〜７．２０（ｍ，２Ｈ），７．２０〜７．３７（ｍ，３Ｈ），７．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ），７．６０（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．７，７．８Ｈｚ），７．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，７．８Ｈｚ）
【００２０】
実施例６　（本発明化合物（Ｉ）の製造方法及び取得（その６））
３−［３−（２−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの代わりに、３−［３−（４−エトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物番号Ｅ）７．３０ｇを用いた以外は上記の実施例２と同様にして、３−［３−（４−エトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］−４−メトキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン（化合物番号（５））０．６６ｇを得た。
融点：１５２〜１５２．５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４３（ｔ，３Ｈ，　Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．０７（ｑ，２Ｈ，　Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．０５（ｓ，３Ｈ），６．９０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ），７．２８〜７．３８（ｍ，２Ｈ），７．５２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ），７．５８〜７．６３（ｍ，１Ｈ），７．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５，８．１Ｈｚ）
【００２１】
実施例７　（Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写調節領域と結合されたレポーター遺伝子を有するプラスミドの調製）
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＣ−２５０９）１ｘ１０８細胞を３７℃、５％　ＣＯ２雰囲気下で一晩培養した。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ　３ｍｌを加えセルスクレイパー（Ｎａｌｇｅｎ、カタログ番号１７９６９３）を用いて細胞を器壁から剥がした。剥がした細胞を遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４℃、１５分間）により集め、これをＰＢＳ　２０ｍｌに懸濁して再度遠心分離した。得られた沈殿に、ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００６００）のＳｏｌｕｔｉｏｎ２を１１ｍｌ、ｐｒｏｎａｓｅを４．８μｌそれぞれ加えて６０℃にて１時間振とうした後、得られた混合液を氷中に１０分間放置した。次に、当該混合液に上記キットのＳｏｌｕｔｉｏｎ　３を４ｍｌ加えて混合した後、これを氷中に５分間放置した。遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、上清を回収した。回収された上清に、当該上清１ｍｌ当たり２μｌのＲＮａｓｅを加え、３７℃で１５分間放置した。この混合液に、２倍容量のエタノールを加えて混合し、出現した白い糸状の物質（ゲノムＤＮＡ）を回収した。回収されたゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。風乾されたゲノムＤＮＡを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ　８．０）（以下、ＴＥと記す。）５００μｌに溶解した。
得られたゲノムＤＮＡ溶解液（ゲノムＤＮＡ　１μｇ相当量）と、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ／μｌ）各１μｌ、蒸留水　２９μｌ、ＴａＫａＲａ　ＬＡ　Ｔａｑ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）に添付されたｂｕｆｆｅｒ　５μｌ、Ｍｇ２＋溶液　５μｌ、ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ　５μｌ及びＴａＫａＲａ　ＬＡ　Ｔａｑ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）０．５μｌを混合した。得られた混合物液を９４℃、５分間保温した後、９４℃、１分間次いで６０℃、１分間さらに７２℃、１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。当該混合物液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、約０．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈殿することによりＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを超純水に溶解し、この溶解液にＮｈｅＩ　２．５μｌ及びＨｉｎｄＩＩＩ　２．５μｌを加え、３７℃で３時間保温した。次いで、当該溶解液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、約０．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することにより再びＤＮＡ（以下、コラーゲンプロモーターＤＮＡと記す。）を回収した。
一方、ホタルルシフェラーゼをコードする塩基配列を有するベクターｐＧＬ３（プロメガ、カタログ番号Ｅ１７５１）をＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、上記と同様にアガロースゲル電気泳動に供し、約５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することにより再びＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡに蒸留水４４μｌ、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造、カタログ番号２１２０Ａ）に添付されたＢｕｆｆｅｒ５μｌ及びＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造、カタログ番号２１２０Ａ）１μｌを加えて、この混合液を６５℃で３０分間保温した。次に、当該混合液を２回フェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈澱することによりＤＮＡ（以下、ＬｕｃベクターＤＮＡと記す。）を回収した。次いで、上記コラーゲンプロモーターＤＮＡ　約２０ｎｇとＬｕｃベクターＤＮＡ　約２０ｎｇとを混合した後、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　Ｖｅｒ２酵素溶液を同量添加して１６℃で一昼夜保温した。当該混合液に大腸菌５Ｈｄα（ＴＯＹＯＢＯ、カタログ番号ＤＮＡ−９０３）を加えて氷中に３０分間放置し、次いで４２℃、４５秒間保温した後、得られた大腸菌を５０μｇ／ｍｌ　アンピシリンナトリウム（ナカライ、カタログ番号０２７−３９）を含むＬＢプレートに播種し、３７℃、一昼夜放置した。出現したシングルコロニーを５０μｇ／ｍｌ　アンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌで３７℃、１２時間培養した。得られた培養液からＡＵＴＯＭＡＴＩＣ　ＤＮＡ　ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ　ＳＹＳＴＥＭ　ＰＩ−５０（ＫＵＲＡＢＯ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製されたプラスミドＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで分析した。その結果、当該プラスミド（以下、ＣＯＬ−Ｌｕｃと記す。）は、ヒトＩ型コラーゲンα２鎖遺伝子の転写調節領域の−３４２〜＋５７（転写開始点を＋１とする。）の塩基配列の下流に、ホタルルシフェラーゼをコードする塩基配列が接続されてなる塩基配列を保有していることが確認された。
【００２２】
実施例８　（レポーター遺伝子の発現量を指標とした被験化合物が有するＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能力の測定）
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞　１ｘ１０６細胞を１００ｍｍディッシュに播種し、非働化牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１１４０−０７９）を１０（ｖ／ｖ）％含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ（日水製薬、カタログ番号０５９１９）培地（以下、当該培地をＤ−ＭＥＭ（＋）と記す。）中で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下において一晩培養した。次いで培地を、ＦＢＳを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ培地（以下、当該培地をＤ−ＭＥＭ（−）と記す。）に置換した。
Ｄ−ＭＥＭ（−）　３００μｌに、ＣＯＬ−Ｌｕｃ　１２μｇが加え、得られた混合液を室温で４５分間放置した（溶液１）。また、Ｄ−ＭＥＭ（−）　３００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１８２９２−０１１）２０μｌが加え、得られた混合液を室温で４５分間放置した（溶液２）。次に、溶液１と溶液２とを混合し、これを室温で１０分間放置した後、当該混合液にＤ−ＭＥＭ（−）５．４ｍｌを加えて混合した。当該混合液を前記正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞に添加した後、当該細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で終夜培養した。翌日、ディッシュから培養上清を除き、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、０．２５％トリプシンを含むＰＢＳ　１ｍｌを添加して細胞を剥がした。当該細胞にＤ−ＭＥＭ（＋）を加えてよく混合した後、当該細胞懸濁液を１２ウエルプレートに１ｍｌずつ分注し、これを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１時間培養した。
このようにして培養された細胞に、前記の化合物番号（１）、（２）、（４）で示される本発明化合物（Ｉ）をそれぞれ０．５ｍＭとなるようジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）にそれぞれ溶解させてなる溶液を、又は、前記の化合物番号（３）、（５）　で示される本発明化合物（Ｉ）をそれぞれ１ｍＭとなるようジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）にそれぞれ溶解させてなる溶液を添加（最終濃度それぞれ０．５μＭ、１μＭ）した。また、対照としてＤＭＳＯを１μｌ添加した。
１時間後、ＴＧＦ−β（Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ）の５μｇ／ｍｌ水溶液または蒸留水を１μｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下でさらに２４時間培養した。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、これに細胞溶解剤（東洋インキ、カタログ番号ＰＤ１０）１５０μｌを加えセルスクレイパー（Ｎａｌｇｅｎ、カタログ番号１７９６９３）を用いて細胞を器壁から剥がした。得られた細胞懸濁液を回収した後、この細胞懸濁液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）することにより、上清を回収した。回収された上清各１５μｌを９６ウエルプレートに移した後、ＭＩＣＲＯＬＵＭＡＴ　ＬＢ９６Ｐ（ＥＧ＆Ｇ　ＢＥＲＴＨＯＬＤ社製）を用いて、Ｌｕｃアッセイ溶液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ７．８）、２．６７ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ　ＤＴＴ、２７０μＭ　Ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ、５３０μＭＡＴＰ、４７０μＭ　Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）５０μｌを当該プレートに自動分注した後、各ウェル内の発光量を測定した（Ｄｅｌａｙ：１．６秒、Ｍｅａｓ．Ｉｎｔｅｒｖａｌ：５秒）。
一方、回収された上清５μｌまたは細胞溶解剤５μｌを、予め９６ウエルプレートに分注された５倍希釈Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号５００−０００６）２００μｌに加えて振とう混合した後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）を用いて各ウェル内の５９５ｎｍの吸光度を測定した。得られた値を基にし、次式に従って転写活性を算出した。
転写活性＝［発光量（上清添加区）−発光量（細胞溶解剤添加区）］／［５９５ｎｍ吸光度（上清添加区）−５９５ｎｍ吸光度（細胞溶解剤添加区）］
次に、算出された転写活性を基にし、次式に従って、ＴＧＦ−βが有するＩ型コラーゲン遺伝子の転写促進能力に対する被験化合物の阻害効果を阻害度として算出した。
阻害度＝［転写活性（ＤＭＳＯ及びＴＧＦ−β添加試験区）−転写活性（化合物及びＴＧＦ−β添加試験区）］／［転写活性（ＤＭＳＯ及びＴＧＦ−β添加試験区）−転写活性（ＤＭＳＯ及びＴＧＦ−β無添加試験区）］ｘ１００
前記の化合物番号（１）〜（５）で示される本発明化合物（Ｉ）の阻害度は、いずれも７０以上であり、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を抑制する能力が確認された。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、組織におけるＩ型コラーゲン遺伝子の発現量を減少させ、コラーゲン蓄積量を低下させることにより、組織の線維化を改善させる薬剤（即ち、コラーゲン蓄積抑制剤や線維症治療剤）の開発・提供が可能となる。
【００２４】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１
コラーゲンプロモーターＤＮＡを増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２
コラーゲンプロモーターＤＮＡを増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００２５】
【配列表】
2004123621.tif 000009