(57)【要約】【課題】ＡＭＬ細胞を分化誘導し、最終的にアポトーシス性細胞死を生じさせることのできる新しい組成物を提供する。【解決手段】マウスストローマ細胞株の培養物とその担体溶液とを含有することを特徴とする急性骨髄性白血病細胞の分化誘導組成物。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスストローマ細胞株の培養物とその担体溶液とを含有することを特徴とする急性骨髄性白血病細胞の分化誘導組成物。
【請求項２】
培養物が、マウスストローマ細胞株ＨＥＳＳ−５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７６８）の培養物である請求項１の組成物。
【請求項３】
さらにサイトカインを含有する請求項１または２の組成物。
【請求項４】
サイトカインが顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である請求項３の組成物。
【請求項５】
急性骨髄性白血病細胞の分化誘導因子を特定する方法であって、候補物質の存在下で急性骨髄性白血病細胞を培養し、請求項１または２の組成物と同程度またはそれ以上に急性骨髄性白血病細胞の分化を誘導する活性を有する候補物質を目的因子とすることを特徴とする急性骨髄性白血病細胞の分化誘導因子特定方法。
【請求項６】
サイトカインと候補物質の存在下で急性骨髄性白血病細胞を培養し、請求項３または４の組成物と同程度またはそれ以上に急性骨髄性白血病細胞の分化を誘導する活性を有する候補物質を目的因子とする請求項５の特定方法。
【請求項７】
急性骨髄性白血病細胞が、分化型骨髄芽球性白血病細胞である請求項５または６の特定方法。
【請求項８】
急性骨髄性白血病細胞が、タンパク質ＡＭＬ１−ＥＴＯ遺伝子導入細胞である請求項５または６の特定方法。
【請求項９】
サイトカインが顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である請求項６の特定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、急性骨髄性白血病細胞の分化誘導組成物に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、急性骨髄性白血病細胞を終末分化させて最終的にアポトーシスを誘導することのできる組成物と、このような分化誘導能を有する新規因子を特定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ　ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ　ｌｅｕｋｅｍｉａ：以下「ＡＭＬ」と略記することがある）は、顆粒球系骨髄芽球の分化異常によって急激に未熟な骨髄芽球が増殖し、末梢血にまで出現する急性白血病（腫瘍性疾患）である。我が国における急性白血病の発症頻度は人口１０万人に約６人であり、そのうち成人では約８０％がＡＭＬである。病因としては癌遺伝子（特にｒａｓ遺伝子）や放射線被曝が挙げられている。
【０００３】
急性白血病の病型分類（ＦＡＳ分類）に従えば、ＡＭＬは骨髄芽球性白血病（Ｍ０、Ｍ１）、分化型骨髄芽球性白血病（Ｍ２）、前骨髄球性白血病（Ｍ３）、骨髄単球性白血病（Ｍ４）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）および巨核芽球性白血病（Ｍ７）の８型に分類されている。
【０００４】
主要な症状は、発熱、出血傾向、貧血であるが、治療をせずに放置すれば合併症等により死に至る危険性がある。治療法としては、化学療法が主体であり、根治療法としての骨髄移植も確立されている。化学療法は、多剤併用による寛解導入療法、地固め療法、寛解維持療法、強化療法と一定のスケジュールに従って行われる。しかしながら、長期間に渡る薬剤投与と、薬剤による副作用（例えば、正常細胞に対する毒性等）は患者にとっては極めて負担の大きい治療法である。一方、骨髄移植は、初期寛解期での移植により極めて優れた成績が報告されているが、この方法の場合には、ドナーの確保が容易でなく、しかも移植手術による患者負担が大であるという問題を有してもいる。
【０００５】
これに対して、近年、腫瘍細胞を分化させることによって最終的にアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）性の細胞死を生じさせる腫瘍治療の可能性が提案されている。すなわち、腫瘍細胞は通常は脱分化しており、正常な細胞機能を喪失した状態で分裂増殖のみを繰り返している。一般に細胞の分化能と分裂増殖能とは相反する能力であり、分化能を有する細胞は分裂増殖能を喪失し、寿命によってアポトーシス性細胞死に至る。従って、腫瘍細胞に分化能を付与することができれば、自然な形で細胞を死滅させ、腫瘍原因を排除することができると期待されている。事実、ヒト大腸癌細胞がガングリオシドＧＭ３の増加によって成熟上皮細胞に分化し、終末分化の結果としてアポトーシス性細胞死に至ることが報告されている（非特許文献１）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｎｏｊｉｒｉ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４５３：　１４０−１４４，　１９９９。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、腫瘍細胞に分化能を付与することによってアポトーシス性細胞死を誘導する方法は、従来の化学薬剤療法による強制的な細胞死や骨髄移植による外科的治療方法に比べて、患者への負担を大幅に軽減することが可能であるなどの利点により、新しい腫瘍治療の方法として大いに期待されている。
【０００８】
しかしながら、現時点では個々の腫瘍細胞に対して分化を誘導することのできる因子は完全に特定されている訳でなく、ＡＭＬ細胞の分化誘導因子も全く知られていない。
【０００９】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ＡＭＬ細胞を分化誘導し、最終的にアポトーシス性細胞死を生じさせることのできる新しい組成物を提供することを第１の課題としている。
【００１０】
またこの出願は、ＡＭＬ細胞の新しい分化誘導因子を特定するための方法を提供することを第２の課題としてもいる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の第１課題を解決するための第１の発明として、マウスストローマ細胞株の培養物とその担体溶液とを含有することを特徴とする急性骨髄性白血病細胞の分化誘導組成物を提供する。
【００１２】
この第１発明の組成物においては、培養物がマウスストローマ細胞株ＨＥＳＳ−５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７６８）の培養物であることを好ましい態様としている。
【００１３】
また第１発明の組成物は、さらにサイトカインを含有すること、そしてこのサイトカインが顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）であることを好ましい態様としている。
【００１４】
この出願は、前記第２課題を解決するための第２の発明として、急性骨髄性白血病細胞の分化誘導因子を特定する方法であって、候補物質の存在下で急性骨髄性白血病細胞を培養し、前記第１発明の組成物と同程度またはそれ以上に急性骨髄性白血病細胞の分化を誘導する活性を有する候補物質を目的因子とすることを特徴とする急性骨髄性白血病細胞の分化誘導因子特定方法を提供する。
【００１５】
この第２発明の方法においては、サイトカインと候補物質の存在下で急性骨髄性白血病細胞を培養し、前記第１発明の組成物と同程度またはそれ以上に急性骨髄性白血病細胞の分化を誘導する活性を有する候補物質を目的因子とすることを一つの好ましい態様としている。
【００１６】
またこの第２発明の方法においては、急性骨髄性白血病細胞が、分化型骨髄芽球性白血病細胞であること、またはタンパク質ＡＭＬ１−ＥＴＯ遺伝子導入細胞であることをそれぞれ好ましい態様としている。
【００１７】
さらに、第２発明の方法においても、前記サイトカインが顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）であることを別の好ましい態様としている。
【００１８】
なお、この出願の発明において、「ＡＭＬ細胞の分化誘導」とは、自律的増殖能を獲得したＡＭＬ細胞が、正常な顆粒球系骨髄芽球と同様に、前骨髄球、骨髄球、単球、成熟顆粒球へと分化し、末梢血へと移行して最終的にアポトーシス性細胞死に至る過程を誘導することを意味する。
【００１９】
以下、この出願の各発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
第１の発明は、マウスストローマ細胞株の培養物とその担体溶液とを含有することを特徴とするＡＭＬ細胞の分化誘導組成物である。
【００２１】
「マウスストローマ細胞株」は、マウスの骨髄、脾臓などに由来する基質細胞または間質細胞であり、例えば特開平１０−２９５３６９号公報に開示されたＨＥＳＳ−１、ＨＥＳＳ−５（国際寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７６８）、ＨＥＳＳ−１８（ＦＥＲＭ　ＢＰ−６１８７）、ＨＥＳＳ−Ｍ２８（ＦＥＲＭＢＰ−６１８６）、ＳＳＸＬ　ＣＬ．１、ＳＳＸＬ　ＣＬ３、ＳＳＸＬ　ＣＬ．７、ＳＳＸＬ　ＣＬ．９およびＳＳＸＬ　ＣＬ．１７と各々命名されたマウス由来のストローマ細胞を用いることができるが、特にＨＥＳＳ−５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５７６８）が好ましい。
【００２２】
ストローマ細胞株の培養は、正常造血幹細胞の培養条件と同一とすることができ、基本成分としてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有する液体培地を用いて行うことができる。また、例えばα−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などの公知の培地を用いて行うこともできる。
【００２３】
「培養物」とは、前記のストローマ細胞株を液体培地中で一定期間培養した培養細胞、この培養細胞と培地から培養細胞を除去して得られる培地（培養上清液）、またはこの培養上清から液体成分を除去して得られる固形成分の総称である。
【００２４】
この発明において「組成物」とは、前記の培養物とその担体溶液とからなる。培養物が培養細胞の場合、担体溶液は前記の液体培地等とすることができる。また培養物が培養上清液の場合には、ストローマ細胞が産生したタンパク質およびペプチドと液体培地との混合物が組成物となる。さらに、培養物が固形成分の場合には、固形成分中のタンパク質等の活性を変化させることがなく、かつ薬理学的に許容される液体（例えば蒸留水等）と固形成分の混合物によって組成物が構成される。
【００２５】
「サイトカイン」は、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子で、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖・分化の調節作用などを示す物質であって、具体的にはインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１４（ＩＬ−１４）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ−１６）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、好酸球コロニー刺激因子、血小板コロニー刺激因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞増殖因子、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３−リガンド、白血病阻害（阻止）因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、マクロファージ由来炎症性タンパク１α（ＭＩＰ−１α）などが挙げられるが、この発明においては、特に顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の使用が好ましい。
【００２６】
これらのサイトカインは、前記の培養物と混合して組成物とすることができる。サイトカインの添加量は、培養物１ｍｌに対する終濃度として１０〜１００ｎｇ程度とすることができる。また、培養物が培養上清液またはその固形物である場合には、培地中にサイトカインを混合した状態でストローマ細胞株を培養し、サイトカインを含んだ状態の培養上清液またはその固形物としてこの発明の組成物を得ることもできる。
【００２７】
この出願の第２の発明は、ＡＭＬ細胞の分化誘導因子を特定する方法であって、サイトカインおよび候補物質の存在下でＡＭＬ細胞を培養し、前記第１発明の組成物と同程度またはそれ以上にＡＭＬ細胞の分化を誘導する活性を有する候補物質を目的因子とすることを特徴とするＡＭＬ細胞分化誘導因子の特定方法である。
【００２８】
この第２発明の方法において、「ＡＭＬ細胞分化誘導因子」とはＡＭＬ細胞を正常な顆粒球系骨髄芽球と同様に分化させ、最終的に末梢血においてアポトーシス性細胞死を生じさせる物質を意味する。このような因子は、未知および既知の有機または無機化合物、タンパク質、ペプチド等を含有する。従って、この第２発明における「候補物質」は、例えば既存の化合物ライブラリーやタンパク質、ペプチドライブラリー等から適宜に選択することができる。ただし、この発明においては、ストローマ細胞が産生するタンパク質を候補物質としてスクリーニングすることが好ましい。
【００２９】
このようなストローマ細胞由来のタンパク質は、ストローマ細胞の培養物から尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の公知の方法によって単離、精製することができる。また例えば、このようにして得たタンパク質の集団と、ストローマ細胞以外のマウス細胞が産生するタンパク質集団とを２次元電気泳動法等により比較することによって、ストローマ細胞株が特異的に産生するタンパク質を得ることもできる。そして、このようなタンパク質のアミノ酸配列に基づき、公知の合成法によりペプチドを化学合成することができ、またそのタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ等）を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写系や宿主−ベクター系による遺伝子工学的手法によって組換えタンパク質を得ることもできる。
【００３０】
第２発明の方法において使用する「ＡＭＬ細胞」は、急性骨髄性白血病患者の骨髄から単離した細胞（初代細胞）、またはこの初代細胞を適当な培養条件下で継代培養した細胞であってもよい。好ましくは、分化型骨髄芽球性白血病細胞（Ｍ２型ＡＭＬ細胞）、またはタンパク質ＡＭＬ１−ＥＴＯ遺伝子導入細胞を使用する。これらの細胞は、後記の実施例に示したように、第１発明の組成物存在下で培養することによって極めて効率よく分化誘導されるため、候補物質の活性に対する比較対象として好ましい。「Ｍ２型ＡＭＬ細胞」は、分化能を有する白血病芽球の比率が高いこと、しばしば染色体転座ｔ（８：１２）を有すること等を基準として選択して使用することができる。また、「ＡＭＬ１−ＥＴＯ遺伝子導入細胞」は、ＡＭＬ細胞に公知の遺伝子導入法によってＡＭＬ１−ＥＴＯ遺伝子（ＡＭＬ１−ＥＴＯをコードするｃＤＮＡ等）を導入することによって調製することができる。具体的は、例えばＡＭＬ１−ＥＴＯ　ｃＤＮＡを保有する発現ベクターを、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によってＡＭＬ細胞に導入する。ＡＭＬ１−ＥＴＯ　ｃＤＮＡは塩基配列が公知（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ／Ｓ７８１５９、Ｓ７８１５８等）であり、これらの配列情報に基づいて作製したプローブを用いてヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法や、配列情報に基づいて作製したプライマーセットを用いたＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法によって導入遺伝子を得ることができる。
【００３１】
第２発明の方法では、以上のＡＭＬ細胞を、サイトカインおよび候補物質の存在下で培養し、ＡＭＬ細胞の分化の程度を測定する。この分化の程度は、常法に従って、顕微鏡による形態学的観察から客観的に計測することができる。
【００３２】
ＡＭＬ細胞の培養は、通常の哺乳動物培養培地（例えば、α−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地等）を用いることができる。またサイトカインを併用する場合には、前記の様々なサイトカインから適宜に選択して用いることができるが、特にＧ−ＣＳＦの使用が好ましい。
【００３３】
以下、実施例および試験例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】
実施例１
ＨＥＳＳ−５細胞（約１０４個）とサイトカインＧ−ＣＳＦ（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）とを混合して、組成物（ＨＥＳＳ＋／Ｇ＋）を調製した。
実施例２
ＨＥＳＳ−５細胞（約１０５個）をＳｔｅｍ　Ｐｒｏ−３４　ＳＦＭ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社）中で３８℃、７または１４日間培養し、その培養上清液を得た。この培養上清液にＧ−ＣＳＦ（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を添加、混合し、組成物（ＨＥＳＳｓｕｐ／Ｇ＋）を調製した。
実施例３
ＨＥＳＳ−５細胞（約５×１０３個）をＳｔｅｍ　Ｐｒｏ−３４　ＳＦＭ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社）中で３８℃、７または１４日間培養し、その培地とともに組成物（ＨＥＳＳ＋／Ｇ−）を調製した。
試験例１
ＡＭＬ患者から単離したＡＭＬ細胞（約５×１０３個）を、実施例１、２または３の組成物存在下で培養し、分化した細胞の割合を測定した。細胞の分化は、約１０５個の細胞からサイトスピン標本を作製し、Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色して、細胞形態を観察することにより判定した。
【００３５】
また対照として、ＨＥＳＳ−／Ｇ＋、ＨＥＳＳ−／Ｇ−、ＨＥＳＳｓｕｐ／Ｇ−の各組成物のＡＭＬ細胞分化誘導活性を同様に試験した。
【００３６】
結果は図１に示したとおりである。対照組成物はＡＭＬ細胞に対して全く分化誘導活性を示さなかったのに対し、実施例１、２および３でそれぞれ調製した組成物は有意に高い分化誘導活性を示した。特に、ＨＥＳＳ−５細胞とＧ−ＣＳＦとを含有する組成物（ＨＥＳＳ＋／Ｇ＋）は全ＡＭＬ細胞の９５％以上を分化誘導した。また、８種類のＡＭＬ細胞のなかでも、特にＭ２型ＡＭＬ細胞に対して顕著な分化誘導活性を示した。
試験例２
染色体転座ｔ（８；２１）を発生させる融合タンパク質ＡＭＬ１−ＥＴＯをコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ／Ｍ２８２４６）をレトロウイルスベクターｐＬＩＮＳＸ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７：　９８０，　１９８９）に挿入し、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現ベクターを構築した。この発現ベクターを、Ｇ−ＣＳＦにより分化する白血病細胞株ＬＧＭに導入し、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞（ＬＧＭ／ＡＭＬ１−ＥＴＯ）を調製した。この細胞は、ＡＭＬ１−ＥＴＯの発現により染色体転座ｔ（８；２１）を生じ、Ｍ２型ＡＭＬ細胞型となる。
【００３７】
このＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞を、Ｇ−ＣＳＦ単独では分化が抑制される条件（１０％　Ｆｅｓ含有ＲＰＭＩ培地で３７℃７日間）培養した。
【００３８】
さらに、この培養培地に、Ｇ−ＣＳＦ単独（ＨＥＳＳ−／Ｇ＋）または実施例１〜３の各組成物をそれぞれ添加して、ＬＧＭ／ＡＭＬ１−ＥＴＯの分化の程度を測定した。対照としてはＬＧＭ細胞に対する各組成物の効果を測定した。
【００３９】
結果は図２に示したとおりである。この結果から明らかなように、Ｇ−ＣＳＦ単独では分化しにくいＬＧＭ／ＡＭＬ１−ＥＴＯ細胞が、組成物（ＨＥＳＳ＋／Ｇ＋およびＨＥＳＳｓｕｐ／Ｇ＋）の存在下では良好に分化することが確認された。
【００４０】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ＡＭＬ細胞を分化誘導し、最終的にアポトーシス性細胞死を生じさせることのできる新しい組成物と、ＡＭＬ細胞に対する分化誘導因子を特定するための方法が提供される。これによって、ＡＭＬ細胞にアポトーシス性細胞死を生じさせるＡＭＬ治療法に新たな途が拓かれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＭＬ細胞の分化誘導に対する各組成物の効果を試験した結果である。
【図２】ＬＧＭ細胞およびＬＧＭ／ＡＭＬ１−ＥＴＯ細胞の分化誘導に対する各組成物の効果を試験した結果である。
【図１】
2004123603.tif 000002
【図２】
2004123603.tif 000003