(57)【要約】【課題】血管新生を抑制するための徐放製剤を提供すること。【解決手段】ＮＫ４およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤、ならびにＮＫ４およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなる、血管新生を阻害するための組成物。本発明の組成物は、癌の浸潤および転移を抑制する癌治療薬として、および加齢性黄色斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症などの、血管新生をともなう疾患の治療および予防薬として有用である。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫ４およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤。
【請求項２】
ＮＫ４およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなる、血管新生を阻害するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管新生を阻害し、このことにより、癌、加齢性黄色斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症などの、血管新生をともなう疾患を治療するための徐放製剤、特に癌の浸潤および転移を抑制するための徐放製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）は、細胞の遊走、増殖促進活性および血管新生促進活性を有する増殖因子であり、癌細胞の遊走や浸潤の促進において中心的な役割を果たすことが知られている。ＮＫ４はＨＧＦのＮ末端ヘアピン構造および４個のクリングルドメインを有する分子内断片であり、ＨＧＦアンタゴニストとしての活性を有する（Ｄａｔｅ　ｅｔ　ａｌ，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　４２０，　１−６，　１９９７）。ＮＫ４はインビトロおよびインビボにおいて癌細胞の浸潤を抑制することが示されている（Ｄａｔｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１７，　３０４５−３０５４，　１９９８）。さらに、ＮＫ４は血管新生の抑制機能も有しており、ＨＧＦ、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦなどによる内皮細胞の増殖を阻害することができる（久場ら、分子癌治療第１巻第１号、２０００年、ｐ．４６−５５）。ＮＫ４は、これらの２つの機能の相乗効果により癌の浸潤および血管新生を抑制することができるため、癌の浸潤および転移を抑制する癌治療薬として、および加齢性黄色斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症などの、血管新生をともなう疾患の治療および予防への応用が期待されている。
【０００３】
しかしながら、ＮＫ４は、投与部位から拡散により排泄、酵素分解により失活するため、生体内半減期が短く、水溶液として全身投与あるいは病巣部位へ局所投与した場合、長期間にわたり十分な生理活性効果を得ることができなかった。
【０００４】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】
特開平８−３２５１６０
【特許文献２】
ＷＯ９４／２７６３０
【非特許文献１】
久場ら、分子癌治療第１巻第１号、２０００年、ｐ．４６−５５
【非特許文献２】
Ｄａｔｅ　ｅｔ　ａｌ，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　４２０，　１−６，　１９９７
【非特許文献３】
Ｄａｔｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１７，　３０４５−３０５４，　１９９８
【非特許文献４】
Ｋｕｂａ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　６０：　６７３７−６７４３，　２０００
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、ＮＫ４を長期間安定して徐放させ、ＮＫ４による血管新生の抑制効果を発揮させることにより、腫瘍の浸潤、転移および癌の悪性化を防止し、加齢性黄色斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症などの、血管新生をともなう疾患を治療および予防しうる徐放性製剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＮＫ４タンパク質を含むハイドロゲルを用いて作製したＮＫ４の徐放性製剤が、血管新生モデル動物系において血管新生を有意に抑制しうることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、ＮＫ４およびゼラチンからなるハイドロゲルを含む徐放製剤を提供する。本発明にしたがって、ＮＫ４を含浸させたゼラチンハイドロゲルを病巣およびその周辺に局所投与し、あるいは他の部位の投与してそこよりＮＫ４を徐放させることにより、血管新生の有意な抑制効果が得られる。
【０００７】
別の観点においては、本発明は、ＮＫ４およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなる、血管新生を抑制するための組成物を提供する。本発明の組成物は、癌の浸潤および転移を抑制する癌治療薬として、および加齢性黄色斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症などの、血管新生をともなう疾患の治療および予防薬として有用である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明においてゼラチンハイドロゲルを作製するために使用されるゼラチンは、牛、豚、魚類などを始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの身体のあらゆる部位から採取できるコラーゲン、あるいはコラーゲンとして用いられている物質から、アルカリ加水分解、酸加水分解、および酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。遺伝子組換え型コラーゲンの変性体ゼラチンを用いてもよい。ゼラチンの性質は、用いる材料および処理方法により様々であるが、そのいずれの性質をもつゼラチンも本発明においてＮＫ４の徐放のためのハイドロゲル材料として利用することができる。
【０００９】
本発明においてＮＫ４含有ゼラチンハイドロゲルを作製するためには、カルボキシル基の導入により改変されているゼラチンを用いることが好ましい。カルボキシル基導入ゼラチンは、ＤＭＳＯ等の適当な溶媒中で上述の各種ゼラチンをアシル化剤と反応させることにより製造することができる。アシル化剤としては、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水グルタル酸、無水フタル酸等を用いることができる。あるいは、カルボキシル基に加えて、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、チオール基などの反応性官能基を分子内に有する化合物をゼラチン分子のカルボキシル基、アミノ基、水酸基などと化学結合することによっても、ゼラチンのカルボキシル基導入反応が可能である。これらの官能基間の化学反応は既知の方法を用いて行うことができる。ゼラチンのカルボキシル基導入率を確認するためには、当該技術分野において知られる種々の方法を用いることができ、例えば、ＴＮＢＳ法により求めたアミノ基の減少率から算出することができる。カルボキシル基導入ゼラチンを用いることにより、クーロン力、疎水性相互作用、あるいは水素結合によなどの分子間相互作用力を介して、ＮＫ４がゼラチンハイドロゲル中により安定に固定化され、ハイドロゲルが分解してゼラチン分子が水可溶化してハイドロゲルから遊離しない限り、ゼラチンハイドロゲルのマトリクス中からＮＫ４が脱離することを防止することができる。好ましくは、ゼラチンのカルボキシル基導入率は１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上である。カルボキシル基導入率の上限としては特に制限はないが、用いられるゼラチン材料の性質や化学反応の種類によって、反応の平衡や立体障害のために１００％の導入率を得ることができない場合もある。
【００１０】
本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルは、上記ゼラチンを用いて種々の化学的架橋剤とゼラチン分子間に化学架橋を形成させることにより得られる。化学的架橋剤としては、例えばグルタルアルデヒド、例えばＥＤＣ等の水溶性カルボジイミド、例えばプロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基などの間に化学結合を作る縮合剤を用いることができる。好ましいものは、グルタルアルデヒドである。また、ゼラチンは、熱処理又は紫外線照射によっても化学架橋することもできる。また、これらの架橋処理を組み合わせて用いることもできる。さらに、塩架橋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用などを利用した物理架橋によりハイドロゲルを作製することも可能である。
【００１１】
ゼラチンの架橋度は、所望の含水率、すなわちハイドロゲルの生体吸収性のレベルに応じて適宜選択することができる。ゼラチンハイドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度の好ましい範囲は、ゼラチン濃度１〜２０ｗ／ｗ％、架橋剤濃度０．０１〜１ｗ／ｗ％である。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、０〜４０℃、１〜４８時間で行うことができる。一般に、ゼラチンおよび架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。
【００１２】
ゼラチンハイドロゲルの形状は、特に制限はないが、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状などがある。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、通常埋込片として用いられることが多く、あるいは細かく砕いて粒子状にして用いることも可能である。また、球状、粒子状、ペースト状のものは注射投与も可能である。
【００１３】
円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のゼラチンハイドロゲルは、ゼラチン水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、あるいは、架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、所望の形状の鋳型に流し込んで、架橋反応させることにより調製することができる。また、成形したゼラチンゲルにそのまま、あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいは、ｐＨ２．５以下の水溶液を添加する。反応に用いられた架橋剤および低分子物質を完全に除去する目的で、得られたゼラチンハイドロゲルは、蒸留水、エタノール、２−プロパノール、アセトン等により洗浄し、製剤調製に供される。
【００１４】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルは、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、ＥＹＥＬＡ　ｍｉｎｉＤ．Ｃ．　スターラー等）とテフロン（登録商標）用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置にゼラチン溶液を入れ、ここにオリーブ油等の油を加えて２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架橋剤水溶液を添加するか、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中にて前乳化（例えば、ボルテックスミキサーＡｄｖａｎｔｅｃ　ＴＭＥ−２１、ホモジナイザー、ｐｏｌｙｔｒｏｎ　ＰＴ１０−３５等を用いて）しておいたものをオリーブ油中に滴下し、微粒子化したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加して架橋反応させ、遠心分離によりゼラチンハイドロゲルを回収した後、アセトン、酢酸エチル等で洗浄し、さらに２−プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋反応を停止させることにより、調製することができる。得られたゼラチンハイドロゲル粒子は、２−プロパノール、Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄し、製剤調製に供される。ゼラチンハイドロゲル粒子が凝集する場合には、例えば、界面活性剤などの添加あるいは超音波処理（冷却下、１分以内程度が好ましい）等を行ってもよい。
【００１５】
得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は、上述の粒子作製時におけるゼラチン濃度、ゼラチン水溶液とオリーブ油との体積比、および撹拌スピードなどにより変化する。一般には粒径は１〜１０００μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。さらに、前乳化することによって、粒子サイズが２０μ以下の微粒子状のゼラチンハイドロゲルを得ることができる。
【００１６】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルを調製する別法として以下の方法も挙げられる。上記の方法と同様の装置にオリーブ油を入れ、２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下してＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これを冷却後、アセトン、酢酸エチル等を加えて攪拌し、遠心分離により未架橋ゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子を、さらにアセトン、酢酸エチル等、次いで２−プロパノール、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。この乾燥ゼラチン粒子を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００ｍＭグリシン水溶液又は０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ　ＨＣ１等にて洗浄し、架橋反応を停止することによりゼラチンハイドロゲル粒子を調製することができる。本法で得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は上記の方法の場合と同様である。
【００１７】
本発明のゼラチンハイドロゲルは適宜、適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンハイドロゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以上、又は−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行うことができる。
【００１８】
本発明において徐放性製剤を製造するために使用されるＮＫ４は、ＨＧＦの分子内断片であり、その構造はＤａｔｅら（上掲）に記載されている。ＮＫ４は、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。例えば、遺伝子工学的手法によりＮＫ４をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＮＫ４を得ることができる。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、昆虫、かいこ、または動物細胞などを用いることができる。ＮＫ４タンパク質は、ＨＧＦアンタゴニストとしての活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。
【００１９】
本発明のＮＫ４徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、上記の膨潤および乾燥カルボキシル基導入ゼラチンハイドロゲルにＮＫ４の水溶液を含浸させることにより得ることができる。ＮＫ４は、カルボキシル基を導入したゼラチンハイドロゲルと主として静電的相互作用を介した複合体を形成するが、ＮＫ４−ゼラチンハイドロゲル複合体には、静電的相互作用だけでなく、疎水結合、水素結合等の他の相互作用も寄与していると考えられる。
【００２０】
本発明のＮＫ４含有徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、例えば、上記の凍結乾燥したカルボキシル基導入ゼラチンハイドロゲルにＮＫ４溶液を滴下するか、あるいはゼラチンをＮＫ４溶液中に浸漬させ、ハイドロゲル内にＮＫ４を含浸させることにより得ることができる。この含浸操作は、通常、４−３７℃で１５分間−１時間、好ましくは４−２５℃で１５−３０分間で終了し、その間にハイドロゲルはＮＫ４溶液で膨潤し、ＮＫ４がゼラチン分子と相互作用することによって複合体を形成し、ＮＫ４がゼラチンハイドロゲル内に物理的相互作用によって固定される。ＮＫ４とゼラチンとの間の複合体の形成には、両者の間の静電的相互作用だけでなく、疎水結合、水素結合等の他の相互作用も大きく寄与していると考えられる。
【００２１】
ゼラチンに対するＮＫ４の重量比は約５倍量以下であることが好ましい。さらに好ましくは、ゼラチンに対してＮＫ４は約５〜約１／１０４倍量の重量比である。
【００２２】
本発明のＮＫ４徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、ＮＫ４の徐放性効果と安定化効果を持つため、ＮＫ４の機能を少量で長時間にわたって発揮し得る。そのため、ＨＧＦアンタゴニストとしての機能および血管新生抑制機能が病巣部位において効果的に発揮され、癌の浸潤および転移を抑制する癌治療薬として、および加齢性黄色斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症などの、血管新生をともなう疾患の治療および予防薬として、有効に作用することができる。
【００２３】
この徐放のメカニズムは、ＮＫ４が、カルボキシル基を導入したハイドロゲル内のゼラチンに物理的に固定化されていることに基づく。この状態では、因子は、ハイドロゲルから放出されない。生体内でハイドロゲルが分解されるにつれて、ゼラチン分子が水可溶性となり、それに伴って、固定化されているＮＫ４が放出されるようになる。すなわち、ハイドロゲルの分解性によって、ＮＫ４の徐放性を制御することができる。ハイドロゲルの分解性は、ハイドロゲル作製時における架橋程度を調節することにより調節することができる。また、ＮＫ４がゼラチンと相互作用することによって、これらの生体内での安定性、例えば酵素分解に対する抵抗性などが向上する。
【００２４】
本発明のゼラチンハイドロゲルの架橋度を評価する指標として含水率がある。これは膨潤ハイドロゲルの重量に対するハイドロベル中の水の重量パーセントである。含水率が大きければハイドロゲルの架橋度は低くなり、分解されやすくなる。つまり、この含水率の値がＮＫ４の徐放（徐々に放出）を左右する。ハイドロゲルの生体内での酵素分解性は、この含水率によって変化する。体内の場所、動物の種類によって多少の差はあるが、分解期間が５日間から３か月間で分解するハイドロゲルの含水率は９９−８５ｗｔ％である。ハイドロゲルの分解期間はＮＫ４の徐放期間と一致するため、この場合の徐放期間も５日から３か月の間で変化する。好ましい徐放性効果を示す含水率としては約８０〜９９ｗ／ｗ％であり、さらに好ましいものとしては、約９５〜９８ｗ／ｗ％のものが挙げられる。
【００２５】
本発明のＮＫ４徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤あるいはその複合体は、それぞれの用途に応じて適宜剤型を工夫することができる。例えば、シート状、スティック状、粒子状、ロッド状、ペースト状の剤型にして投与することができる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与、結合組織内投与、骨内膜投与などが挙げられる。特に好ましくは、癌病巣内に直接投与する。
【００２６】
本発明製剤中のＮＫ４の用量は、疾患の重篤度、患者の年齢、体重等により適宜調製することができるが、通常成人患者当たり約０．０１〜約５００μｇの範囲、好ましくは、約０．１〜約２００μｇの範囲から投与量が選択され、これを病巣またはその周辺部位に留置または注入することができる。また１回の投与で効果が不十分であった場合は、該投与を複数回行うことも可能である。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１．カルボキシル基導入ゼラチンの作製
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は脱水したものを用いた。牛骨由来酸性ゼラチン（等電点５．０、新田ゼラチンから供与）２．０ｇをＤＭＳＯ　１４ｇに３７℃にて溶解し、ゼラチンの１２．５ｗｔ％溶液を得た。これに種々の量の無水コハク酸を溶解したＤＭＳＯ　９ｇを加え、３７℃にて２時間撹拌した。得られたＤＭＳＯ反応液を１Ｌのアセトンに滴下し、ゼラチンを沈澱させた。沈澱物を１Ｌのアセトンで３回洗浄し、真空下で乾燥させた。
【００２８】
ゼラチンのカルボキシル基導入率は、ＴＮＢＳ法により求めたアミノ基の減少率から算出した。ゼラチンを蒸留水中に３７℃にて溶解し、０．１２５ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。この溶液０．５ｍｌに、４％炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌおよび０．１％トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）ナトリウム塩水溶液１ｍｌを加え、３７℃で２時間反応させた。反応後、４１５ｎｍの吸光度を測定した。アラニンの段階希釈溶液を用いて作成した検量線に基づき、カルボキシル基の導入率を求めた。このようにして、カルボキシル基導入率の異なる数種のゼラチンハイドロゲルを得た。
【００２９】
実施例２．ゼラチンハイドロゲルの作製
実施例１で調製したカルボキシル基導入ゼラチンおよび牛骨由来酸性ゼラチン（等電点５．０、新田ゼラチンから供与）をそれぞれ蒸留水に３７℃にて溶解し、５ｗｔ％ゼラチン溶液（ｐＨ６．０）を調製した。この溶液４０ｍｌに、２５％グルタルアルデヒド水溶液２００μｌを加え、よく撹拌した。直ちに、８×８ｃｍ２バランスディッシュに流延し、４℃にて２４時間ゲル化させた。得られたハイドロゲルを１×１ｃｍ２に切り取り、成形した。これを０．１Ｍグリシン水溶液で処理して未反応のアルデヒド基をブロックし、蒸留水で洗浄後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥ゼラチンハイドロゲルはＥＯＧガス滅菌をした後に用いた。
【００３０】
実施例３．ＮＫ４の１２５Ｉ−標識
ＮＫ４溶液にクロラミンＴ（０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５Ｍ　リン酸バッファー＋０．５Ｍ　ＮａＣｌ溶液、ｐＨ７．５）溶液１００μｌとＮａ１２５Ｉ溶液（１．４８ＭＢｑ）を加え、撹拌した。２分間反応後、ピロ亜硫酸ナトリウム水溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ加え、反応を停止させた。反応溶液を陰イオン交換樹脂カラムにより未反応のＮａ１２５Ｉを除き、１２５ＩによりラベルされたＮＫ４（１２５Ｉ−ＮＫ４）溶液を得た。
【００３１】
実施例２で調製した各凍結乾燥ゼラチンハイドロゲルに１２５Ｉ−ＮＫ４溶液２０μｌを滴下し、４℃にて１２時間静置することにより、溶液をハイドロゲルに含ませた。これにより１２５Ｉ−ＮＫ４含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。
【００３２】
実施例４．インビボ徐放試験
ｄｄＹマウス（雌、６週齢）をネンブタール（１μｌ／１ｇ体重）にて麻酔し、背部皮下に実施例３で調製した１２５Ｉ−ＮＫ４含浸ゼラチンハイドロゲルを埋入した。１，３，７および１４日後にマウスを犠牲死させ、残存ハイドロゲル、背部皮膚およびゲル周辺組織の残存放射活性を測定することにより、残存しているＮＫ４量を求めた。結果を図１に示す。カルボキシル基導入率が１９．８％、２８．３％または５６．９％のゼラチンハイドロゲルを用いた場合には、カルボキシル基導入率が０％および６．７％のゼラチンハイドロゲルを用いた場合と比較して、ＮＫ４の放出が有意に抑制されていることがわかる。図２は、ハイドロゲルのインビボでの分解を示す。カルボキシル基の導入率に関係なく、いずれのハイドロゲルもインビボでの分解の時間変化はほぼ同様であることがわかる。このハイドロゲルの残存量の時間変化は、カルボキシル基導入率が１９．８％以上のハイドロゲルに関しては、ＮＫ４の残存の時間変化パターンとよく相関していた。このことは、本発明のＮＫ４含有ハイドロゲル徐放製剤においては、ＮＫ４がハイドロゲルの生体内分解とともに徐放されていることを示している。これに対して、カルボキシル基導入率の低いハイドロゲルでは、ハイドロゲルの残存に比べて、ＮＫ４の残存量が低く、ＮＫ４が単純拡散によりハイドロゲルから放出されていると考えられ、徐放パターンのコントロールができない。
【００３３】
ＮＫ４の生理活性は、角膜マイクロポケット法を用いて、ｂＦＧＦによる血管新生を阻害する作用により評価した。ＥＶＡ（エチレンビニルアセテート）の塩化メチレン溶液（５ｗｔ％）１０μｌをガラスシャーレに滴下し、風乾して、ＥＶＡフィルムを作製した。これにｂＦＧＦ溶液を１．０μｌ（３００ｎｇ）滴下し、２５℃で１時間静置することによりｂＦＧＦ溶液を含浸させた。滅菌した凍結乾燥ゼラチンハイドロゲル（１×１×０．２ｍｍ３にＮＫ４溶液を１．０μｌ（１０００ｎｇ）を滴下し、４℃で１２時間静置することによりＮＫ４を含浸させた。
【００３４】
日本白色家兎を麻酔下にて角膜にその圧さの半分の深さに切開を加えた。その傷から角膜実質を剥離し、幅２ｍｍ、長さ５ｍｍのポケットを作製した。この中にＮＫ４含浸ゼラチンハイドロゲル（カルボキシル基導入率２８．３％）とｂＦＧＦ含浸ＥＶＡフィルムを挿入した。対照には、ＰＢＳ含浸ゼラチンハイドロゲルとｂＦＧＦ含浸ＥＶＡフィルムを挿入した。
【００３５】
術後７日において、角膜組織における血管新生を顕微鏡下にて観察評価した結果を図３に示す。対照であるＰＢＳ含浸ゼラチン群では、ｂＦＧＦによる血管新生が見られ、赤くなっていることが観察された。一方、本発明にしたがうＮＫ４含浸ゼラチン群では、血管新生が見られなかった。このことから、ＮＫ４含浸ゼラチンハイドロゲルがｂＦＧＦによる血管新生を有意に阻害したことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のＮＫ４含浸ゼラチンハイドロゲルのインビボにおけるＮＫ４の残存性を示すグラフである。
【図２】図２は、ゼラチンハイドロゲルのインビボにおける分解性を示すグラフである。
【図３】図３は本発明のＮＫ４含浸ゼラチンハイドロゲルおよび対照のＰＢＳゼラチンハイドロゲルを挿入したウサギ角膜における血管新生を示す写真図面である。
【図１】
2004123650.tif 000002
【図２】
2004123650.tif 000003
【図３】
2004123650.tif 000004