(57)【要約】【課題】筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症候群（ＳＭＡ）、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳血管障害後の痴呆、その他の神経脱落を伴なう痴呆症等の神経変性疾患の治療及び予防に有用な薬剤を提供する。【解決手段】３−［［４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル］メチル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン、５−（４−クロロフェニル）−４−メチル−３−（１−（２−フェニルエチル）ピペリジン−４−イル）イソキサゾール、３−（４−クロロフェニル）−４−メチル−５−（１−（２−フェニルエチル）ピペリジン−４−イル）イソキサゾール及びＮ−メチル−４−（２−シアノフェニル）ピペラジニル−３−メチルベンズアミン並びにこれらの混合物からなる群より選択される化合物又はこれらの塩を含む抗神経変性薬。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−［［４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル］メチル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン、５−（４−クロロフェニル）−４−メチル−３−（１−（２−フェニルエチル）ピペリジン−４−イル）イソキサゾール、３−（４−クロロフェニル）−４−メチル−５−（１−（２−フェニルエチル）ピペリジン−４−イル）イソキサゾール、及びＮ−メチル−４−（２−シアノフェニル）ピペラジニル−３−メチルベンズアミン並びにこれらの混合物からなる群より選択される化合物又はこれらの塩を含む抗神経変性薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、抗神経変性薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症候群（ＳＭＡ）、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳血管障害後の痴呆、その他の神経脱落を伴なう痴呆症等、神経の細胞群の変性が関与する一群の疾患は、神経変性疾患と総称されている。神経変性疾患は、根本的治療法の確立していないものがほとんどであり、治療法の探索が求められている。
【０００３】
神経変性疾患の治療のためのアプローチとして、神経細胞の変性を抑制する因子を投与することが考えられる。神経変性を抑制する因子を投与することにより、このような疾患の治療及び予防に対して有利な作用をもたらすことが期待される。しかしながら、そのような因子で実際に有効に治療薬として用いることができるものはほとんど見つかっていないのが現状である。
【０００４】
神経細胞の変性を抑制する因子としては、例えば、ある種のドパミン受容体アゴニストがそのような作用を有する可能性があることが知られている。しかしながら、ドパミン拮抗と神経細胞の変性の抑制との因果関係は不明であり、また全てのドパミン受容体アゴニストにおいてそのような作用があるというわけではない。また、有効に治療薬として用いることができる物質を得るため、抗神経変性薬として用いうる、さらに他のクラスの物質を見出すことが求められている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１１−１１６５９９号公報
【非特許文献１】
Ｒｏｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　８０：　１６７−１７８，　１９９５
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症候群（ＳＭＡ）、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳血管障害後の痴呆、その他の神経脱落を伴なう痴呆症等の神経変性疾患の治療及び予防に有用な薬剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、家族性の遺伝病であるＳＭＡの原因遺伝子として、ヒト染色体５ｑ１３．１領域より神経細胞アポトーシス抑制蛋白質（Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：　ＮＡＩＰ）遺伝子を単離し（Ｒｏｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　８０：　１６７−１７８，　１９９５）、ＮＡＩＰの全アミノ酸配列とＮＡＩＰをコードするｃＤＮＡを単離している（特開平１１−１１６５９９号公報）。そして、このＮＡＩＰ産生量を増加させる物質を探索する過程において、意外にも、ある種のドパミン受容体アゴニストに加えてある種のドパミン受容体アンタゴニストが、ＮＡＩＰ産生量を増加させることを見出し、さらにこれらが実際に神経の変性を抑制しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明によれば、３−［［４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル］メチル］−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（以下「化合物１」と称する。）、５−（４−クロロフェニル）−４−メチル−３−（１−（２−フェニルエチル）ピペリジン−４−イル）イソキサゾール（以下「化合物２」と称する。）、３−（４−クロロフェニル）−４−メチル−５−（１−（２−フェニルエチル）ピペリジン−４−イル）イソキサゾール（以下「化合物３」と称する。）、及びＮ−メチル−４−（２−シアノフェニル）ピペラジニル−３−メチルベンズアミン（以下「化合物４」と称する。）並びにこれらの混合物からなる群より選択される化合物又はこれらの塩を含む抗神経変性薬が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の抗神経変性薬は、化合物１〜４並びにこれらの混合物からなる群より選択される化合物又はこれらの塩を含む。
【００１０】
化合物１〜４は、それぞれ下記式（１）〜（４）で表わされる構造式を有する。
【００１１】
【化１】
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【００１２】
【化２】
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【００１３】
【化３】
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【００１４】
【化４】
2004123562.tif 000005
【００１５】
化合物１〜３は、ドパミンＤ４アンタゴニストとして、化合物４はドパミンＤ４アゴニストとして既知の物質であり、例えばＴｏｃｒｉｓ　Ｃｏｏｋｓｏｎ　Ｌｔｄ．（英国）等から、市販品を入手することが可能である。
【００１６】
化合物１〜４の塩としては、薬剤学的に許容しうる各種の化合物との塩を挙げることができ、塩酸塩、マレイン酸塩等を挙げることができる。より具体的には例えば、化合物１の場合、三塩酸塩、化合物２及び３の場合一塩酸塩、化合物４の場合マレイン酸塩とすることができる。
【００１７】
抗神経変性薬とは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症候群（ＳＭＡ）、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳血管障害後の痴呆、その他の神経脱落を伴なう痴呆症等の、中枢神経の細胞群の変性が関与する疾患をいう。本発明の抗神経変性薬は、これらの疾患の治療又は予防が必要な投与対象に対し投与し、これらを治療又は予防することができる。
【００１８】
本発明の抗神経変性薬の投与対象は、特に限定されないが、ヒト及びその他の哺乳動物等の動物を挙げることができる。
【００１９】
本発明の抗神経変性薬の投与量は、特に限定されず、投与対象の症状等に応じて適宜増減することができるが、通常、１〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲内とすることができる。
【００２０】
本発明の抗神経変性薬の投与経路は、特に限定されないが、血管内への注入、経口投与、皮下投与等の投与経路により投与することができる。本発明の抗神経変性薬の投与剤型は、特に限定されないが、これらの投与経路による投与に適した、注射剤等の液体状の剤型、錠剤、散剤、顆粒剤等の固体の剤型等とすることができる。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の抗神経変性薬は、投与対象に投与した場合、ＮＡＩＰ産生量を増加させ、さらには神経の変性を抑制する効果を奏する。したがって、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症候群（ＳＭＡ）、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、外傷・脳血管障害を伴なう脳脊髄麻痺、脳血管障害後の痴呆、その他の神経脱落を伴なう痴呆症等の神経変性疾患の治療及び予防に有用である。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例を参照してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００２３】
【実施例１】
（１）ＴＨＰ−１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎよりＡＴＣＣ　ＴＩＢ２０２株として入手；１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ　１６４０培地に、候補化合物の水溶液（１０ｍＭ、最終濃度３００μＭ）を３０μｌ／ｍｌの割合で添加し、これを２４ウェルプレートの各ウェルに、１０００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で３日間インキュベートした後菌体を回収し、菌体を試料溶解液（組成：５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ及び１％　ＮＰ−４０に、プロテアーゼ阻害剤混合物（商品名Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を添付プロトコルに従い添加したもの）１５０μｌに溶解し、さらに４℃にて１４０００ｇで１５分間遠心して不溶物を除いたものを試料溶液とした。
【００２４】
（２）　　試料溶液として（１）で得たものを用い、特開２０００−１２５８６１号公報の実施例３及び４の記載の方法に従って、試料溶液中のＮＡＩＰ濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。但し前記試料溶液は抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体固相化プレートの各穴に５０μｌずつ分注し、固相化抗体としては、抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであるＦＥＲＭ　ＢＰ−６９２１株（独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）寄託番号、平成１１年１０月９日に寄託）より得た抗ＮＡＩＰ抗体ｈｎｍｃ８４１を用いた。測定は各候補化合物について３回行ない、平均を求めた。また、対照として、候補化合物の水溶液の代わりに、同量の蒸留水を添加した他は（１）と同様に操作した試料溶液（未処理標準）について、同様にＥＬＩＳＡによる測定を行なった。その結果、候補化合物として化合物１を用いた場合の試料溶液は、未処理標準の１〜３倍のＮＡＩＰを含んでいることが分かった。
【００２５】
【実施例２】
（１）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎよりＡＴＣＣ　ＣＲＬ２２６６株として入手；１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ−ＨＧ培地を６ウェルプレートの各ウェルに３ｍｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で２日間インキュベートした。その後、全トランス型レチノイン酸の水溶液（２ｍＭ）を、３μｌ／ウェル（レーン２）又は１５μｌ／ウェル（レーン４）添加し、３７℃で３日間インキュベートした。
【００２６】
（２）その後、候補化合物の水溶液（１０ｍＭ）を３０μｌ／ｍｌの割合で各ウェルに添加し、３７℃で１日間インキュベートした。インキュベート終了後、０．１５Ｍ　ＮａＣｌでウェルを洗浄した後、氷上でウェルを１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で満たして１０分間放置した。その後、スクレーパーで菌体を回収し、遠心した（１４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）。得られたペレットに、尿素ＴＸ溶液（２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び５％　２−メルカプトエタノールを含む９Ｍ尿素水溶液）１００μｌ、１０％ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）水溶液２５μｌおよび２Ｍトリス水溶液２μｌを添加し、泳動用試料を調製し、−８０℃で保存した。
【００２７】
（３）（２）で調製した泳動用試料を、ホモジナイズした後に１０μｌとり、ＲＥＡＤＹＧＥＬＳＪ　（Ｂｉｏ　Ｌａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に乗せ、１２０Ｖで７５分間泳動し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。泳動終了後、Ｓｑｕｉ−Ｂｌｏｔ　ＰＶＤＦ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｂｉｏ　Ｌａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に、１００Ｖで７５分間転写を行ない、１０％スキムミルクを含むＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ−２０（シグマ社製）を０．０５％含むトリス緩衝生理食塩水，ｐＨ７．４）で１日間ブロッキングし、ＴＢＳＴで洗浄した。１次抗体ＭＥ１−３（特開平１１−１１６５９９号公報及び特開２０００−１２５８６１号公報記載の方法に従って調製した、特開平２０００−１２５８６１号公報実施例３（２）のビオチン化ニ次抗体と同一のもの）をＴＢＳＴで３０００倍に希釈し、これに前記メンブランを室温で２時間浸漬し、ＴＢＳＴで洗浄した後、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ　Ｉｇ，　ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（商品名；Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）をＴＢＳＴで３０００倍に希釈したものに室温で１時間浸漬し、化学発光試薬（ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）により発光させ、Ｘ線フィルム（商品名「バイオマックス」、コダック社製）に、露光時間３０分で露光した。また、対照として、候補化合物を添加しなかった他は上記（１）〜（２）と同様に調製した泳動用試料についても、同様に分析した（レーン１及び３）。また、比較のため、ＴＨＰ−１細胞菌体内容物について、同様に泳動した（レーン５）。結果を図１に示す。候補化合物として化合物１を試料とした場合、低濃度及び高濃度レチノイン酸で処理した場合のいずれにおいても（レーン２及び４）、ＮＡＩＰに由来すると見られる１６０ｋＤａのバンドが、対照（レーン１及び３）に比べて顕著に強く発現した。
【００２８】
【実施例３】
（１）Ｔ７５フラスコ中、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎよりＡＴＣＣ　ＣＣＬ２株として入手；１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ−ＨＧ培地を、５％ＣＯ２存在下３７℃で１０時間インキュベートした。この培養液２５ｍｌ中に、候補化合物の水溶液（１０ｍＭ）を、２５０μｌ添加し、５％ＣＯ２存在下３７℃でさらに１．５日間インキュベートした。細胞を回収し、前記培地にて洗浄し、細胞数を計測し、１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう調整して新しい前記培地に懸濁した。
【００２９】
（２）（１）で得た懸濁液を１５０μｌずつ９６穴プレートに添加し、３７℃で４時間培養後、細胞死誘導試薬（メナジオン（重亜硫酸ナトリウム塩、１０ｍＭ水溶液）、α−ナフトキノン（１０ｍＭ　ＤＭＳＯ溶液）又は２，３−ジメトキシ−１，４−ナフトキノン（１０ｍＭ　ＤＭＳＯ溶液）のいずれか）を添加し、３７℃で４時間インキュベートした。細胞を前記培地で洗浄した後、各ウェルに１５０μｌの新しい前記培地を入れ、さらに３７℃で６時間インキュベートした後、Ａｌａｍａｒ　Ｂｌｕｅ（商標名、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　Ｉｎｃ（米国）製）を各ウェルに１５μｌ添加し、１０時間経過後に、励起波長５３０ｎｍ、検出波長５６０ｎｍにおける蛍光を蛍光検出器にて測定し、生細胞数を判定した。また、対照として、候補化合物の水溶液を添加しなかった他は同様に操作したものについても、同様に生細胞数を判定した。細胞死誘導試薬の濃度を種々に変化させて試験を行ない、細胞死誘導試薬濃度と生細胞数との相関が、候補化合物の有無によりどのように変化するかを調べた。候補化合物として化合物１を用いた場合の結果を図２〜４に示す。なお、図２〜６において、横軸に示される数値は各細胞死誘導試薬の濃度を表わし、縦軸は、細胞死誘導試薬の代わりにＴｒｉｔｏｎＸ−１００の１０％水溶液１５μｌを添加した他は上記と同様に操作したものを０とした蛍光の相対値を表わす。「ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照について、「化合物１」は化合物１を用いた場合についての結果をそれぞれ表わす。
【００３０】
種々の候補化合物について本実施例の試験を行なった結果の一部を表１に示す。なお、表１に示す試験は、インキュベート時の化合物の最終濃度はいずれも１０μＭとして行なったものである。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
【実施例４】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、１０％ＦＢＳ、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ−ＨＧ培地を６ウェルプレートの各ウェルに３ｍｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で２日間インキュベートした。その後、全トランス型レチノイン酸の水溶液（２ｍＭ）を、１５μｌ／ウェル添加し、３７℃で３日間インキュベートした。その後、候補化合物の水溶液（１０ｍＭ）を３０μｌ／ｍｌの割合で各ウェルに添加し、３７℃で１日間インキュベートした。細胞を回収し、前記培地にて洗浄し、細胞数を計測し、１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう調整して新しい前記培地に懸濁した。この懸濁液を、実施例３（２）と同様に操作し、細胞死誘導試薬濃度と生細胞数との相関が、候補化合物の有無によりどのように変化するかを調べた。候補化合物として化合物１を用い、細胞死誘導試薬としてメナジオンを用いた際の結果を図５に示す。
【００３３】
【実施例５】
ＨｅＬａ細胞に代えてＣｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｉｎｃ．より正常ヒト繊維芽細胞培養キットとして購入したヒト繊維芽細胞（カタログ番号＃１０６−０５）を用いた他は、実施例３と同様に操作し、細胞死誘導試薬濃度と生細胞数との相関が、候補化合物の有無によりどのように変化するかを調べた。候補化合物として化合物１を用い、細胞死誘導試薬としてメナジオンを用いた際の結果を図６に示す。
【００３４】
【実施例６−１〜６−４】
候補化合物を生理食塩水に溶解し、必要に応じて１Ｎ　ＮａＯＨ等を用いてｐＨを調整し、ｐＨ３〜４、濃度１００ｍＭの溶液を調整し、保存した。これを用時生理食塩水で希釈し、０．５ｍｌ中に候補化合物を８ｍｇ（実施例６−１）、４０ｍｇ（実施例６−２）、８０ｍｇ（実施例６−３）又は２４０ｍｇ（実施例６−４）含む溶液とした。これを、スナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ　Ｇｅｒｂｉｌ）に投与した。実施例６−１〜６−３においては、溶液を２４時間間隔で０．５ｍｌずつ経口投与し、実施例６−４においては溶液を１回投与した。なお、用量２４０ｍｇｘ２回投与した場合においてカタレプシー様症状を認めた他は、投与による異常は認められず、血圧、体温及び心電図をモニターした結果も全て正常であった。
【００３５】
実施例６−１〜６−３のスナネズミは２回目の投与の２時間後両総頚動脈を１０分間閉塞させ、その５日後屠殺した。実施例６−４のスナネズミは投与２時間後に両総頚動脈を１０分間閉塞させ、その３日後屠殺した。脳の海馬ＣＡ１領域の組織をヘマトキシリン・エオシンで染色した切片を作成し、染色像を観察した。また、化合物投与及び閉塞を行なわなかった他は同様に操作したスナネズミ、及び化合物投与のみを行なわなかった他は同様に操作したスナネズミについても、同様に屠殺し、切片を作成し、対照とした。化合物１を候補化合物として用いた場合の結果及び対照の結果を図７〜１３に示す。図７〜１３に示す通り、化合物１を候補化合物として用いた場合、用量依存的にＣＡ１領域の細胞の変形・脱落が抑制されていることが認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２における、化合物１によるＮＡＩＰ産生量の変化を示す泳動図である。図中レーン１〜５は、それぞれ以下の試料の泳動結果を示す。
レーン１：低濃度レチノイン酸処理し、候補化合物不添加
レーン２：低濃度レチノイン酸処理し、候補化合物添加
レーン３：高濃度レチノイン酸処理し、候補化合物不添加
レーン４：高濃度レチノイン酸処理し、候補化合物添加
レーン５：ＴＨＰ−１細胞
【図２】実施例３において、細胞死誘導試薬としてメナジオンを用いた場合の、化合物１の細胞死抑制効果を示すグラフである。
【図３】実施例３において、細胞死誘導試薬としてα−ナフトキノンを用いた場合の、化合物１の細胞死抑制効果を示すグラフである。
【図４】実施例３において、細胞死誘導試薬として２，３−ジメトキシ−１，４−ナフトキノンを用いた場合の、化合物１の細胞死抑制効果を示すグラフである。
【図５】実施例４において、細胞死誘導試薬としてメナジオンを用いた場合の、化合物１の細胞死抑制効果を示すグラフである。
【図６】実施例５において、細胞死誘導試薬としてメナジオンを用いた場合の、化合物１の細胞死抑制効果を示すグラフである。
【図７】実施例６における、化合物投与及び閉塞を行なわなかった対照スナネズミの脳海馬ＣＡ１領域の組織切片の顕微鏡写真である。
【図８】実施例６における、化合物投与を行なわなかった他は実施例６−１〜６−３と同様に操作した対照スナネズミの脳海馬ＣＡ１領域の組織切片の顕微鏡写真である。
【図９】実施例６−１のスナネズミの脳海馬ＣＡ１領域の組織切片の顕微鏡写真である。
【図１０】実施例６−２のスナネズミの脳海馬ＣＡ１領域の組織切片の顕微鏡写真である。
【図１１】実施例６−３のスナネズミの脳海馬ＣＡ１領域の組織切片の顕微鏡写真である。
【図１２】実施例６における、化合物投与を行なわなかった他は実施例６−４と同様に操作した対照スナネズミの脳海馬ＣＡ１領域の組織切片の、図８より拡大した顕微鏡写真である。
【図１３】実施例６−４のスナネズミの脳海馬ＣＡ１領域の組織切片の、図１２と同倍率の顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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