(57)【要約】【課題】低コスト・低環境負荷型の生体触媒の使用方法を提供すること。【解決手段】生体触媒を基質に反応させて化合物を反応槽内で連続的に製造する際に、反応槽内又は反応槽間の上流側よりも下流側の触媒量を増加させることを特徴とする、生体触媒の使用方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体触媒を基質に反応させて化合物を反応槽内で連続的に製造する際に、反応槽内又は反応槽間の上流側よりも下流側の触媒量を増加させることを特徴とする、生体触媒の使用方法。
【請求項２】
反応槽内又は反応槽間の上流側の触媒量よりも下流側の触媒量を相対重量比で１．５倍以上増加させることを特徴とする、請求項１に記載の生体触媒の使用方法。
【請求項３】
反応槽内又は反応槽間の上流側の触媒量よりも下流側の触媒量を相対重量比で２倍以上増加させることを特徴とする、請求項１に記載の生体触媒の使用方法。
【請求項４】
生体触媒が酵素を含有する微生物菌体又はその処理物である、請求項１から３のいずれかに記載の生体触媒の使用方法。
【請求項５】
生体触媒がニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体又はその処理物であって、基質がニトリル化合物である、請求項１から３のいずれかに記載の生体触媒の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体触媒の効率的な使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素を含有する微生物菌体、固定化菌体、固定化酵素などの生体触媒を用いる化合物の生成反応は、副生成物が少なく生成物純度が高いため装置プロセスが簡略化できること、また常温・常圧反応であるため省エネルギー的で安全性に優れていることから、近年多くの化合物の製造に用いられている。
しかしながら、生体触媒は反応中に触媒活性の低下（失活）を引き起こす。そのため、単位触媒量当たりの化合物の生成量、即ち触媒生産性を向上させるために触媒活性の失活を抑制する方法が検討されてきた。例えば、反応を氷点から１５℃の低温で行う方法（特許文献１）、複数の供給口から低濃度の基質を連続的に供給する方法（特許文献２）、微生物又はその処理物を有機溶媒で処理する方法（特許文献３）、高級不飽和脂肪酸存在下で反応を行う方法（特許文献４）、菌体をグルタルアルデヒド等で架橋処理する方法（特許文献５，６）、反応温度を制御する方法（特許文献７）等がある。
しかし、これらの方法のみでは触媒生産性を充分に向上させることができず、結果として化合物製造時の触媒使用量を減らすことができないため、化合物の製造原価を高めてしまうのみならず、廃触媒も多く、その処理方法が問題となっている。
【０００３】
【特許文献１】
特公昭５６−３８１１８号
【特許文献２】
特公昭５７−１２３４号
【特許文献３】
特開平５−３０８９８０号
【特許文献４】
特開平７−２６５０９０号
【特許文献５】
特開平７−２６５０９１号
【特許文献６】
特開平８−１５４６９１号
【特許文献７】
特願２００３−５０７２９６
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明は、触媒生産性を充分に向上させることによって、化合物製造時の触媒比例費を低減させ、かつ廃触媒の少ない、低コスト・低環境負荷型の生体触媒の使用方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、触媒量を反応槽内又は反応槽間の上流側よりも下流側において増加させることにより触媒生産性が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の（１）から（５）の発明を包含する。
（１）生体触媒を基質に反応させて化合物を反応槽内で連続的に製造する際に、反応槽内又は反応槽間の上流側よりも下流側の触媒量を増加させることを特徴とする、生体触媒の使用方法。
（２）反応槽内又は反応槽間の上流側の触媒量よりも下流側の触媒量を相対重量比で１．５倍以上増加させることを特徴とする、上記（１）の生体触媒の使用方法。
（３）反応槽内又は反応槽間の上流側の触媒量よりも下流側の触媒量を相対重量比で２倍以上増加させることを特徴とする、上記（１）の生体触媒の使用方法。
（４）生体触媒が酵素を含有する微生物菌体又はその処理物である、上記（１）から（３）のいずれかの生体触媒の使用方法。
（５）生体触媒がニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体又はその処理物であって、基質がニトリル化合物である、上記（１）から（３）のいずれかの生体触媒の使用方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明でいう「生体触媒」とは、目的とする反応を触媒する酵素を含有する動物細胞、植物細胞、細胞小器官、微生物菌体（生菌体又は死滅体）、又はそれらの処理物等をいう。
本発明において、「処理物」とは、動物細胞、植物細胞、細胞小器官、微生物菌体（生菌体又は死滅体）から抽出された粗酵素又は精製酵素、前記細胞又は菌体破砕物、微生物菌体を固定化した固定化微生物、抽出された酵素を固定化した固定化酵素をいう。微生物菌体又は酵素を固定化する方法としては、担体結合法、架橋法、包括法が挙げられる。ここで、担体結合法は、水不溶性の固定化担体に微生物菌体又は酵素を化学的又は物理的に結合させる方法であり、架橋法は、微生物菌体又は酵素を２個又はそれ以上の官能基を持った試薬（多官能性架橋剤）で架橋する方法であり、包括法は微生物菌体又は酵素をアルギン酸やカラギーナンの高分子ゲルの微細な格子の中に包み込むか、半透膜性の高分子の皮膜によって被覆する方法である。上記担体結合法において、固定化に用いられる固定化担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸、寒天、ゼラチン等が挙げられる。
【０００７】
菌体を固定化する方法のうち、包括法は菌体濃度の高い固定化菌体が得られるため、工業的に多く用いられている。例えば、アクリルアミド及び／又はアクリルアミドの誘導体を包括固定化用モノマーとして用いられている例が、特公昭５８−３５０７８や特開平７−２０３９６４に示されている。
【０００８】
本発明の方法は、生体触媒を用いるあらゆる化合物の製造、例えば、アルコール類やアミド類などの汎用化学品、アミノ酸や抗生物質・生理活性物質などの食品・香粧品・医薬品あるいはその原料や中間体などの製造に適用できる。なかでも、ニトリルヒドラターゼを用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する際に用いるのが特に好ましい。
【０００９】
ここで、ニトリル化合物としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、イソブチロニトリル、ピバロニトリル等の脂肪族ニトリル化合物；アクリロニトリル、クロトノニトリル、メタクリロニトリルのような脂肪族不飽和ニトリル化合物；ベンゾニトリル、フタロジニトリル、シアノピリジン（２−シアノピリジン、３−シアノピリジン、４−シアノピリジン）のような芳香族ニトリル化合物；サクシノニトリル、アジポニトリル、マロノニトリル等のジニトリル化合物などが挙げられる。本発明の方法はこれらのニトリル化合物から対応するアミド化合物に製造する際のいずれにも用いることができるが、アクリロニトリルからアクリルアミド、３−シアノピリジンからニコチンアミドの製造に用いることが特に好ましい。
【００１０】
上記の合成反応を触媒するニトリルヒドラターゼを含有する微生物としては、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属等に属する微生物が挙げられ、特に限定はされないが、ロドコッカス・ロドクロウス  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ、シュードモナス・クロロラフィス  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ    ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓが好ましい。
【００１１】
本発明でいう「連続的に製造する」とは、いわゆる連続反応によって生体触媒と原料化合物（基質）から化合物を製造することをいい、原料（生体触媒と原料化合物（基質）を両方を含む）を反応槽内に連続的あるいは断続的に添加しつつ、反応槽内の反応液を全量抜き取ることなく、連続的あるいは断続的に反応液を抜き取りつつ生成された化合物を取得することをいう。すなわち、定期的に反応液を全量抜き取って化合物を製造する、いわゆる回分反応や半回分反応（バッチあるいはセミバッチ反応）による製造ではないことを意味する。このような連続反応による化合物の製造では、操作性及び経済性の面から、生体触媒と原料化合物及び生成化合物を同一方向に進行させる反応操作が一般的である。
【００１２】
生体触媒を用いて化合物を製造するための反応様式は、用いる反応器の形式によって固定層型（充填層型）、移動層型、流動層型、撹拌槽型等があるが、本発明方法はこれらのいずれの様式にも適用できる。このような様式においては、何れの場合でも生体触媒は経時的に失活するため、生体触媒を連続的あるいは断続的に反応槽内に添加し、同時に反応槽から抜出していく必要がある。
【００１３】
本発明でいう「上流側」とは反応槽内に触媒が添加される側であり、「下流側」とは反対に触媒が抜き出される側をいう。
例えば、反応様式ごとにより具体的に説明すると、固定層の場合は、反応系が複数の固定層を用いる疑似移動層式の反応槽から構成されていること、流動層、攪拌槽の場合は、反応系が複数の連続する（直列に連結された）反応槽から構成されていることが前提で、「上流側」とは触媒が添加される側に位置する反応槽であり「下流側」とは触媒が反応系から抜き取られる側に位置する反応槽である。
また、ひとつの反応槽内で反応液の流れに伴い生体触媒が移動していく移動層の場合には、上流側とは触媒が添加されるいわゆる反応槽入り口付近であり、下流側とは触媒が反応系から抜き取られる反応槽出口付近である。なおここで言う移動層には、流通管型反応器による反応様式も含まれる。
【００１４】
本発明でいう「反応槽内又は反応槽間の上流側よりも下流側の触媒量を増加させる」ことについて説明する。固定層型、流動層型、攪拌槽型などの複数槽連続反応様式では、反応槽を槽数により上流側と下流側の２つに分けたとき、下流側の反応槽内にある触媒総重量が上流側の触媒総重量よりも多いことを意味する。例えば４槽の連続反応では、下流側２槽内の触媒総重量が上流側２槽内の触媒総重量よりも多いことを意味する。また、反応槽の槽数が奇数の場合は、上流側と下流側の中間に位置する反応槽を除いて反応槽を上流側と下流側に分けたとき、下流側の反応槽内にある触媒総重量が上流側の触媒総重量よりも多いことを意味する。
また、移動層の場合には、触媒の流れ方向に反応槽長さを２等分したとき、下流側の反応槽内の触媒重量が上流側の触媒重量よりも多いことを意味する。
【００１５】
上記の「触媒量を増加させる」とは触媒の相対重量比で１．１倍以上増加させるこという。本発明をより効果的にするためには、相対重量比で１．５倍以上増加させることが好ましく、相対重量比で２倍以上増加させることがさらに好ましい。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
（１）生体触媒の調製
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス・ロドクロウスＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）を、グルコース２％、尿素１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、塩化コバルト０．０５％（何れも重量％）を含む培地（ｐＨ７．０）により３０℃で好気的に培養した。これを遠心分離機及び５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、集菌洗浄して菌体懸濁液（乾燥菌体１５重量％）を得た。
【００１７】
一方、アクリルアミド、メチレンビスアクリルアミド及び２−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミドが、それぞれ３０、１、４重量％となるようにモノマー混合水溶液を調製した。続いて、菌体懸濁液、モノマー混合水溶液、１０重量％のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン水溶液、１０重量％の過硫酸アンモニウム水溶液を、それぞれ５、２、０．１、０．１Ｌ／ｈｒで順々にラインミキシングして重合させた後、約１ｍｍ角の粒子に裁断し固定化菌体粒子を得た。この固定化菌体粒子を、流動化させつつ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて通液洗浄し、固定化菌体触媒とした（本触媒中、乾燥菌体重量は約８％となる）。
【００１８】
（２）３−シアノピリジンからニコチンアミドへの反応
内容積１Ｌのジャケット付セパラブルフラスコを４槽直列に繋いだ。第１槽目に１５％の３−シアノピリジンを溶解させた５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を４００ｍｌ／ｈｒの流速で、固定化菌体触媒を０．７ｇ／ｈｒの流速で連続的に添加し、攪拌を行った。
【００１９】
各反応槽出口に移動式金網メッシュを設置することで固定化菌体を槽内に留め、金網メッシュを周期的に上下に動かすことで固定化菌体を次の反応槽へ送り、第１槽目から第４槽目の固定化菌体濃度が各々１、２、３、４％となるように制御した。
【００２０】
反応温度は、第１槽目から第４槽目の槽内の液温が各々２３、２４、２５、２６℃となるように、ジャケットの冷却水（２０℃）を用いて制御した。
１日後、第４槽目から流出してくる反応液を、液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ−８０Ａ（ＧＬサイエンス社製、溶離液：５％アセトニトリル１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）、検出：２００ｎｍ）で分析したところ、３−シアノピリジンは検出されず、約１７％のニコチンアミドが検出された。
【００２１】
（比較例１）
実施例１で作成した固定化菌体を用いて、固定化菌体濃度を４槽全槽１％とした以外は、実施例１と同様に反応させた。
１日後、実施例１と同様に第４槽目から流出してくる反応液を、液体クロマトグラフィーで分析したところ、未反応の３−シアノピリジンが約１％検出され、ニコチンアミドは１６％しか生成していなかった。そこで、固定化菌体の流速を１．０ｇ／ｈｒに変えて、１日後、第４槽目から流出してくる反応液を分析したところ、３−シアノピリジンは検出されず、約１７％のニコチンアミドが検出された。
【００２２】
（比較例２）
実施例１で作成した固定化菌体を用いて、固定化菌体濃度を４槽全槽４％とした以外は、実施例１と同様に反応させた。
１日後同様に第４槽目から流出してくる反応液を、液体クロマトグラフィーで分析したところ、ニコチンアミドは１５％しか生成しておらず、また未反応の３−シアノピリジンが２％程度検出された。そこで、固定化菌体の流速を０．８ｇ／ｈｒに変えて、１日後、第４槽目から流出してくる反応液を分析したところ、３−シアノピリジンは検出されず、約１７％のニコチンアミドが検出された。
【００２３】
（実施例２）
（１）  生体触媒の調製
実施例１と同様に、固定化菌体触媒を調製した（乾燥菌体重量８％）。
（２）  アクリロニトリルからアクリルアミドへの反応
内容積１Ｌのジャケット付セパラブルフラスコを５槽直列に繋ぎ、第１槽目に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を１５５０ｍｌ／ｈｒで、アクリロニトリルを５２５ｍｌ／ｈｒで、固定化菌体を３．９ｇ／ｈｒで連続的に添加し、２槽目及び３槽目にはアクリロニトリルのみ各々４６７ｍｌ／ｈｒ、１７５ｍｌ／ｈｒで連続的に添加し、各槽とも攪拌しつつ、実施例１と同様に、移動式金網メッシュにより、第１槽目から第５槽目の反応槽の固定化菌体濃度が各々３、５、７、８、１０％となるように制御した。
【００２４】
反応温度は、第１槽目から第５槽目の液温が２５、２６、２７、２８、３０℃となるように、ジャケットの冷却水（２０℃）を用いて制御した。
１日後、第５槽目から流出してくる反応液を、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＰｏｒａＰａｋ−ＰＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製），１ｍ，１８０℃、キャリアガス：窒素、検出器：ＦＩＤ）により測定した。約５０％のアクリルアミドのみが検出され、未反応のアクリロニトリルは検出されなかった。
【００２５】
（比較例３）
実施例２で作成した固定化菌体触媒を用いて、固定化菌体濃度を５槽全槽３％とした以外は、実施例２と同様に反応させた。
１日後、第５槽目から流出してくる反応液中に未反応のアクリロニトリルが約１０００ｐｐｍ残存し、アクリルアミド製品の品質が低下した。そこで固定化菌体触媒の連続添加量を８．５ｇ／ｈｒとして１日後、第５槽目から流出してくる反応液を分析した結果、未反応のアクリロニトリルは検出されなかった。
【００２６】
（比較例４）
実施例２で作成した固定化菌体触媒を用いて、固定化菌体濃度を５槽全槽１０％とした以外は、実施例２と同様に反応させた。
１日後、第５槽目から流出してくる反応液中に未反応のアクリロニトリルが約３００ｐｐｍ残存し、アクリルアミド製品の品質が低下した。そこで固定化菌体触媒の連続添加量を４．７ｇ／ｈｒとして、１日後、第５槽目から流出してくる反応液を分析した結果、未反応のアクリロニトリルは検出されなかった。
【００２７】
（実施例３）
（１）生体触媒の調製
実施例１と同様に菌体懸濁液（乾燥菌体１２重量％）を調製した。
（２）アクリロニトリルからアクリルアミドへの反応
内容積０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５Ｌのジャケット付セパラブルフラスコを７槽直列に繋いだ。第１槽目に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を７８０ｍｌ／ｈｒで、アクリロニトリル１７５ｍｌ／ｈｒで、菌体懸濁液１．３ｇ／ｈｒで連続的に添加し、２槽目にはアクリロニトリルのみ１７５ｍｌ／ｈｒ、３槽目にはアクリロニトリルのみ１４６ｍｌ／ｈｒ、４槽目にはアクリロニトリルのみ８８ｍｌ／ｈｒで連続的に添加し、各槽とも攪拌を行った。反応温度は、第１槽目から第７槽目の液温が２１、２２、２３、２３、２４、２５、２５℃となるように、ジャケットの冷却水（２０℃）を用いて制御した。
【００２８】
１日後、第７槽目から流出してくる反応液を、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＰｏｒａＰａｋ−ＰＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製），１ｍ，１８０℃、キャリアガス：窒素、検出器：ＦＩＤ）により測定した。約５０％のアクリルアミドのみが検出され、未反応のアクリロニトリルは検出されなかった。
【００２９】
（比較例５）
第１槽目から第７槽目の内容積を全て２Ｌとした以外は、実施例３と同様に反応させた。
１日後、第７槽目から流出してくる反応液中に未反応のアクリロニトリルが約６００ｐｐｍ残存し、アクリルアミド製品の品質が低下した。そこで固定化菌体触媒の連続添加量を１．５ｇ／ｈｒとして、１日後、第７槽目から流出してくる反応液を分析した結果、未反応のアクリロニトリルは検出されなかった。
下記表１に上記の各実施例とその比較例についてまとめる。
【００３０】
【表１】
2004321062.tif 000002
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、生体触媒を用いる各種化合物の製造に好適な生体触媒の効率的な使用方法が提供される。本発明の方法によれば、化合物製造時の生体触媒の使用量を減少させることができ、その結果、触媒比例費を低減させて低コスト化が図れ、また廃触媒が少ないので環境負荷が軽減される。