(57)【要約】【課題】所期の大きさの区画された複数の細胞培養領域を有し、その各々において好適な細胞接着性の表面が形成され、工業的に有利に製造できる細胞培養床チップ、その製造方法およびそれによる細胞培養方法を提供すること。【解決手段】細胞培養床チップは、細胞接着性表面を有する基板と、基板の表面を覆う、接着依存性細胞に対して接着阻害性を示す材質よりなる細胞培養領域区画膜とを有してなる。細胞培養領域区画膜は、感光性樹脂組成物による被膜が露光されて現像されることにより形成され、基板の表面が露出する複数の微小な細胞培養領域を区画する。細胞培養方法は、当該細胞培養床チップの細胞培養領域区画膜が形成されている外表面の全面に接着依存性細胞を播種して細胞培養領域に固定する工程を有する。生体反応方法では、この細胞培養方法によって接着依存性細胞が培養された細胞培養床チップが用いられる。【選択図】    図２
2004321040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性表面を有する基板と、この基板の表面を覆うよう設けられた、接着依存性細胞に対して接着阻害性を示す材質よりなる細胞培養領域区画膜とを有してなり、
前記細胞培養領域区画膜は、感光性樹脂組成物による感光性被膜が露光された後に現像されてその一部が除去されることにより形成された、前記基板の表面が露出する複数の微小な細胞培養領域を区画するものであることを特徴とする細胞培養床チップ。
【請求項２】
細胞培養領域区画膜は、当該細胞培養領域区画膜の表面における接着依存性細胞の接着率が１０％以下のものであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養床チップ。
【請求項３】
基板が、細胞接着性物質からなる非処理基板、表面処理されることにより表面が細胞接着性とされた表面処理基板、または、表面に細胞接着性物質からなる被膜が形成されてなる表面被覆基板であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞培養床チップ。
【請求項４】
細胞接着性表面を有する基板の当該表面を覆うよう設けられた、硬化されて接着依存性細胞に対して接着阻害性を示すものとなる感光性樹脂組成物による感光性被膜を選択的に露光した後に現像してその一部を除去することにより、前記基板の表面を露出させる複数の微小な細胞培養領域を区画する細胞培養領域区画膜を形成する工程を有し、
請求項１または請求項２に記載の細胞培養床チップが製造されることを特徴とする細胞培養床チップの製造方法。
【請求項５】
基板が、細胞接着性物質からなる非処理基板、表面処理されることにより表面が細胞接着性とされた表面処理基板、または、表面に細胞接着性物質からなる被膜が形成されてなる表面被覆基板であることを特徴とする請求項４に記載の細胞培養床チップの製造方法。
【請求項６】
細胞培養領域区画膜のための感光性被膜を形成する感光性樹脂組成物は、アルカリ可溶性重合体成分と、光によりラジカルを生成する光重合開始剤と、ラジカル重合により前記アルカリ可溶性重合体成分と共重合してアルカリ水溶液よりなる現像液に不溶な架橋共重合体を形成する架橋性単量体成分とを含有してなり、
前記架橋性単量体成分は、複数の不飽和二重結合を有するポリエチレングリコール変性単量体よりなることを特徴とする請求項４または請求項５に記載の細胞培養床チップの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の細胞培養床チップを用い、当該細胞培養床チップの細胞培養領域区画膜が形成されている外表面の全面に接着依存性細胞を播種して細胞培養領域に固定する工程を有し、当該細胞培養領域において当該接着依存性細胞の培養が行われることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞培養方法によって接着依存性細胞が培養された細胞培養床チップを用い、当該接着依存性細胞に特異的な生体反応を生じさせることを特徴とする生体反応方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に接着依存性細胞のための細胞培養床チップおよびその製造方法並びに細胞培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近における細胞工学の進展に伴い、診断や検査のために、細胞の生体反応を利用する試みが種々の方面において活発となっている。このような診断や検査に用いられる細胞の種類は、目的に応じて適宜のものが選択されるが、一般に、血管内皮細胞、実質細胞および神経細胞などの接着依存性胞が高い有用性を有するものである。接着依存性細胞は、細胞接着性表面を有する基材の表面に接着した状態で生活し、増殖し、分化し、生体としての機能を維持するものであり、基板から遊離すると短時間の内に死滅してしまう。そして、このような事情から、現在においては、接着依存性細胞の培養のための細胞接着性表面を有する基板の提供が求められている。
【０００３】
接着依存性細胞のための細胞培養床を形成するためには、細胞接着性の表面を有する基板を利用すればよいが、そのような細胞接着性表面は、例えば細胞接着因子を表面に有するものや、適度な親水性を有するものであって、そのような細胞接着性表面を形成する材料の開発が、現在、精力的に継続して行われている。
【０００４】
然るに、近年においては、診断、検査や劇薬スクリーニング、毒性試験の実行件数が飛躍的に増大していると共に、試験に供される検体の量が微量であることが求められており、このような要請に対しては、１枚の基板に多数の細胞培養領域が形成され、その各々において接着依存性細胞を接着固定することができるものが有利である。
【０００５】
一方、或る種の接着依存性細胞の接着および増殖においては、その培養床において実際に接着に供される面領域が、当該細胞の種類によって異なる適正な大きさの面積部分とされることが重要である。例えば、肝スフェロイド細胞の場合には、培養床に、直径が５０〜５００μｍ程度の細胞培養領域が単位培養領域として区画されて形成されていることが実際上必要とされている。これは、単位培養領域の面積が大きいものであると、当該細胞の接着領域が播種細胞に比して多大となり、結果的に接着領域毎の接着細胞数が一様とならず、結局、実用的な利用価値が低いものとなるからである。
【０００６】
以上のような事情から、各々所期の大きさの面積または形状を有する微小な細胞培養領域の多数が、パターン化されて区画された状態で基板の表面に形成されてなる細胞培養床チップが注目されている。
【０００７】
現在において、このような細胞培養床チップを得るための方法としては、基板の表面を、マイクロリソグラフィーの手法を利用して親水性領域と疎水性領域とにパターン化し、区画された親水性領域を細胞培養領域とする方法が提案されており、例えば、基板材料の表面にパターンマスクを介して金を蒸着し、この金の蒸着膜を、チオール基を有する化合物によってパターン化する方法が提案されている（非特許文献１参照。）。
また、ポリ乳酸などの高分子物質を基板に塗布し、その後、プラズマエッチングによってその一部を除去することにより、パターン化した細胞培養領域を形成する方法が提案されている。
【０００８】
【非特許文献１】
第３１回医用高分子シンポジウムの発表論文（藤井ら）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のような従来の方法は、蒸着工程またはプラズマエッチングの工程において、減圧雰囲気または真空雰囲気を形成することが必要となり、所要の処理工数が多く、従って工業的に有利な方法ではない。しかも、これらの方法では、形成される細胞培養領域が、必ずしも十分に高い細胞接着性表面を有するものとならない、という問題点がある。
【００１０】
本発明は、以上のような事情に基づいてなされたものであって、その目的は、所期の大きさの区画された複数の細胞培養領域を有し、各細胞培養領域において好適な細胞接着性の表面が形成されており、しかも工業的に有利な方法で製造することのできる細胞培養床チップを提供することにある。
本発明の他の目的は、所期の大きさの区画された複数の細胞培養領域を有し、各細胞培養領域において好適な細胞接着性表面を有する細胞培養床チップを、工業的に有利に製造することのできる方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、接着依存性細胞の培養を有利に行うことのできる細胞培養方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の細胞培養床チップは、細胞接着性表面を有する基板と、この基板の表面を覆うよう設けられた、接着依存性細胞に対して接着阻害性を示す材質よりなる細胞培養領域区画膜とを有してなり、
前記細胞培養領域区画膜は、感光性樹脂組成物による感光性被膜が露光された後に現像されてその一部が除去されることにより形成された、前記基板の表面が露出する複数の微小な細胞培養領域を区画するものであることを特徴とする。
【００１２】
以上において、細胞培養領域区画膜は、当該細胞培養領域区画膜の表面における接着依存性細胞の接着率が１０％以下のものであることを特徴とする。
【００１３】
また、基板は、細胞接着性物質からなる非処理基板、表面処理されることにより表面が細胞接着性とされた表面処理基板、または、表面に細胞接着性物質からなる被膜が形成されてなる表面被覆基板であることを特徴とする。
【００１４】
本発明の細胞培養床チップの製造方法は、細胞接着性表面を有する基板の当該表面を覆うよう設けられた、硬化されて接着依存性細胞に対して接着阻害性を示すものとなる感光性樹脂組成物による感光性被膜を選択的に露光した後に現像してその一部を除去することにより、前記基板の表面を露出させる複数の微小な細胞培養領域を区画する細胞培養領域区画膜を形成する工程を有し、上記の細胞培養床チップが製造されることを特徴とする。
【００１５】
以上において、細胞培養領域区画膜のための感光性被膜を形成する感光性樹脂組成物は、アルカリ可溶性重合体成分と、光によりラジカルを生成する光重合開始剤と、ラジカル重合により前記アルカリ可溶性重合体成分と共重合してアルカリ水溶液よりなる現像液に不溶な架橋共重合体を形成する架橋性単量体成分とを含有してなり、
前記架橋性単量体成分は、複数の不飽和二重結合を有するポリエチレングリコール変性単量体よりなることが好ましい。
【００１６】
本発明の細胞培養方法は、上記の細胞培養床チップを用い、当該細胞培養床チップの細胞培養領域区画膜が形成されている外表面の全面に接着依存性細胞を播種して細胞培養領域に固定する工程を有し、当該細胞培養領域において当該接着依存性細胞の培養が行われることを特徴とする。
【００１７】
本発明の生体反応方法は、以上の細胞培養方法によって接着依存性細胞が培養された細胞培養床チップを用い、当該接着依存性細胞に特異的な生体反応を生じさせることを特徴とする。
【００１８】
【作用】
本発明の細胞培養床チップは、細胞接着性表面を有する基板の表面に、接着依存性細胞に対して接着阻害性の材質よりなる細胞培養領域区画膜が形成され、この細胞培養領域区画膜によって細胞培養領域が区画されて形成されたものであるところ、当該細胞培養領域は、細胞培養領域区画膜の一部がいわゆるフォトリソグラフィーの技法によって除去されることにより形成されることにより、確実に好適な大きさのものとされることができ、しかも各細胞培養領域では基板の表面による細胞接着性が発揮されるので十分な細胞接着性を有するものであり、従って工業的に有利に製造することができる。
【００１９】
本発明の細胞培養床チップの製造方法によれば、細胞培養領域は、細胞培養領域区画膜の一部がいわゆるフォトリソグラフィーの技法によって除去することにより形成されるので、確実に好適な大きさのものとすることができ、しかも各細胞培養領域では基板の表面による細胞接着性が発揮されるので十分な細胞接着性を有するものとすることができ、従って工業的に有利に所期の細胞培養床チップを製造することができる。
【００２０】
本発明の細胞培養方法によれば、上記の細胞培養床チップにおいて細胞培養領域が所期の微小な面領域とされており、他の領域は接着阻害性領域とされているので、当該細胞培養床チップを用いることにより、所期の接着依存性細胞の培養を有利に行うことができる。
【００２１】
そして、上記のようにして接着依存性細胞が培養された細胞培養床チップを用いることにより、当該接着依存性細胞に特異的な生体反応を生じさせることができるので、目的とする診断や検査などを有利に実行することができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
図１〜図３は、本発明による細胞培養床チップを製造する具体的な方法を工程順に説明する説明用断面図である。
【００２３】
図において、１０は基板であって、この基板１０の表面は細胞接着性のものとされている。この基板１０は、細胞接着性物質からなる非処理基板、表面処理されることにより細胞接着性とされた表面処理基板、または、表面に細胞接着性物質からなる被膜が形成されてなる表面被覆基板である。
【００２４】
基板１０の表面上には、硬化されて接着依存性細胞に対して接着阻害性を示すものとなる感光性樹脂組成物による感光性被膜１２が、当該基板１０の表面を覆うよう設けられる。
【００２５】
この感光性被膜１２に対して、図２に示すように、パターンマスク１４を介して、光、例えば紫外線を照射することにより感光性被膜１２を選択的に露光して照射領域において共重合体を生成させ、その後、図３に示すように、現像して未露光領域の被膜部分を除去することにより、当該除去領域において基板１０の表面を露出させ、その結果残存した被膜部分により、多数の微小な細胞培養領域Ｓを区画する細胞培養領域区画膜１６が形成される。ここに、個々の細胞培養領域Ｓは、露出した基板１０の表面によって形成されており、その周囲が細胞培養領域区画膜１６によって区画された状態となる。
【００２６】
〔基板〕
以上において、基板１０は、例えば、培養対象とされる特定の接着依存性細胞に対して好適な接着依存性を示す細胞接着性物質により形成された非処理基板である。この非処理基板を形成する物質としては、例えば、ガラス、（メタ）アクリル酸スチレン共重合体、コラーゲンシートなどを挙げることができる。
【００２７】
基板１０は、適宜の基板材料の表面を処理することにより、当該表面が細胞接着性とされた表面処理基板によって構成することもできる。この場合には、基板材料として用いることのできる材質の選択の自由度が大きくなる。
基板材料の表面処理の具体例としては、例えば、スルホン化親水化処理、コロナ放電処理、プラズマ酸化処理、接着因子ビトロネクチンあるいはフィブロネクチンの固定化処理などを挙げることができる。
【００２８】
基板１０は、適宜の基板材料の表面に、当該接着依存性細胞に対して好適な接着依存性を示す細胞接着性物質による被膜によって被覆されてなる表面被覆基板であってもよい。この場合にも、基板材料として用いることのできる材質の選択の自由度が大きくなる。
被膜を形成するための細胞接着性物質としては、基板材料のためのものとして掲げられている上記の細胞接着性物質から選ばれたものを挙げることができる。被膜の形成方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を利用することができる。
【００２９】
〔感光性樹脂組成物〕
感光性被膜１２を形成するための感光性樹脂組成物は、例えば、アルカリ可溶性重合体成分と、光によりラジカルを生成する光重合開始剤と、架橋性単量体成分とを含有してなるものである。
ここに、アルカリ可溶性重合体成分は、それ自体がアルカリ水溶液よりなる現像液に可溶な重合体成分であり、架橋性単量体成分は、ラジカル重合によりアルカリ可溶性重合体成分と共重合して、アルカリ水溶液よりなる現像液に不溶な架橋共重合体を形成するものである。また、架橋性単量体成分は、例えば、複数の不飽和二重結合を有するポリエチレングリコール変性単量体よりなるものであることが好ましい。
【００３０】
この感光性樹脂組成物は、最終的に得られる硬化被膜が、培養対象とされる特定の接着依存性細胞に対して接着阻害性を有するが、細胞培養領域における当該接着依存性細胞の生存を阻害しない程度の生体適合性を有するものであることが必要である。しかし、当該硬化被膜の接着阻害性が発現される原因が特に限定されるものではなく、例えば、形成された架橋共重合体それ自体の特性によって接着阻害性が発現されるものであってもよく、他の理由によって接着阻害性が発現されるものであってもよい。
【００３１】
細胞培養領域区画膜１６を構成する被膜は、その表面における接着依存性細胞の接着率が１０％以下のものであることが好ましい。ここに、接着率を求める方法は以下のとおりである。
〔接着率を求める方法〕
試料表面に牛血管内皮細胞をａ個／ｃｍ２  （ただしａ＝１×１０４  とする。）の密度で播種し、１０％の牛胎児血清を含有するＭＥＭ培地中で１２時間培養処理した後の未接着の細胞数ｂを計測し、下記の式（１）によって接着率αを求める。
【数１】
式（１）  接着率α＝〔（ａ−ｂ）／ａ〕×１００（単位：％）
【００３２】
感光性樹脂組成物には、架橋性単量体成分とされる単量体以外のラジカル重合性化合物（以下、「共重合性化合物」という。）を共重合成分として含有させることができる。この共重合性化合物は、その種類に応じた特性が、最終的に得られる感光性被膜に付与される結果、当該感光性被膜を好適なものとすることができる。
【００３３】
〔アルカリ可溶性重合体成分〕
感光性樹脂組成物において、アルカリ可溶性重合体成分を構成する重合体としては、例えば、ポリビニルアルコール、ノボラック樹脂、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ラクトン開環重合体およびこれらの共重合体などを挙げることができる。
【００３４】
〔少なくとも１個のエチレン性不飽和二重結合を有するポリエチレングリコール変性ラジカル重合性化合物成分〕
少なくとも１個のエチレン性不飽和二重結合を有するポリエチレングリコール変性ラジカル重合性化合物とは、例えば、ポリエチレングリコールの（メタ）アクリル酸モノエステルまたはジエステルであって、具体例には、下記のものが例示される。
【００３５】
（メタ）アクリル酸モノエステルとしては、下記式（Ａ）で表わされる化合物がある。
【００３６】
【化１】
2004321040.tif 000003
〔式（Ａ）中、ｎは０〜８の数を示し、Ｒ１  は水素原子または炭素数１〜９のアルキル基を示す。〕
【００３７】
上記式（Ａ）で表わされる化合物の具体例としては、市販品のアロニックスＭ−１０１（ｎ：約２、Ｒ１  ：Ｈ）、同Ｍ−１０２（ｎ：約４、Ｒ１  ：Ｈ）、同Ｍ−１１１（ｎ：約２、Ｒ１  ：ｎ−Ｃ８  Ｈ１９）、同Ｍ−１１３（ｎ：約４、Ｒ１  ：ｎ−Ｃ８  Ｈ１９）、同Ｍ−１１４（ｎ：約１、Ｒ１  ：ｎ−Ｃ８  Ｈ１９）、同Ｍ−１１７（ｎ：約２、Ｒ１  ：ｎ−Ｃ８  Ｈ１９）〔以上、東亜合成化学工業（株）製〕、ＫＡＹＡＲＡＤ  Ｒ−５６４（ｎ：約２．  ３、Ｒ１  ：Ｈ）〔日本化薬（株）製〕などを挙げることができる。
【００３８】
上記式（Ａ）で表わされる化合物以外の１個のエチレン性不飽和二重結合を有する化合物として、市販品のＫＡＹＡＲＡＤ  ＴＣ−１１０Ｓ、同ＴＣ−１２０Ｓ〔以上、日本化薬（株）製〕、Ｖ−１５８、Ｖ−２３１１〔以上、大阪有機化学工業（株）製〕などを挙げることができる。また、マレイン酸ジメチル、マレイン酸ジエチルなどの不飽和カルボン酸ジエステルを用いることもできる。
【００３９】
２個のエチレン性不飽和二重結合を有する化合物としては、２価のアルコールの（メタ）アクリル酸ジエステルを挙げることができる。この（メタ）アクリル酸ジエステルのうち、下記式（Ｂ）で表わされる化合物を好適に使用することができる。
【００４０】
【化２】
2004321040.tif 000004
〔式（Ｂ）中、ｎおよびｍはそれぞれ０〜８の数を示し、Ｒ２  は水素原子またはメチル基を示す。〕
【００４１】
上記式（Ｂ）で表わされる化合物の具体例としては、市販品のアロニックスＭ−２１０（ｎ：約２、ｍ：約２、Ｒ２  ：ＣＨ３  ）〔東亜合成化学工業（株）製〕、ＫＡＹＡＲＡＤ  Ｒ５５１（ｎ＋ｍ：約４、Ｒ２  ：ＣＨ３  ）、同Ｒ−７１２（ｎ＋ｍ：約４、Ｒ２  ：Ｈ）、〔日本化薬（株）製〕を挙げることができる。
【００４２】
また、下記式（Ｃ）で表わされる化合物も好適に使用することができる。
【化３】
式（Ｃ）  ＣＨ２  ＝ＣＨＣＯＯ−Ｒ３  −ＣＯＣＨ＝ＣＨ２  
〔式（Ｃ）中、Ｒ３  はエチレングリコール残基、プロピレングリコール残基が１〜１０繰り返した基を示す。〕
【００４３】
上記式（Ｃ）で表わされる化合物の具体例としては、市販品のアロニックスＭ−２４０〔Ｒ３  ：  −（ＣＨ２  ＣＨ２  Ｏ）ｎ  −、ｎ：約４〕、同Ｍ−２４５〔Ｒ３  ：  −（ＣＨ２  ＣＨ２  Ｏ）ｎ  −、ｎ：約９〕〔以上、東亜合成化学工業（株）製〕、同ＰＥＧ４００ＤＡ〔Ｒ３  ：  −（ＣＨ２  ＣＨ２  Ｏ）ｎ  −、ｎ：約８〕〔以上、日本化薬（株）製〕などを挙げることができる。
【００４４】
〔光重合開始剤〕
光重合開始剤は、光の照射を受けてラジカルを生成する光ラジカル生成化合物であって、例えば、ベンジル、ジアセチルなどのα−ジケトン類；ベンゾインなどのアシロイン類；ベンゾインメチルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、ベンゾインイソプロピルエーテルなどのアシロインエーテル類；チオキサントン、２，４−ジエチルチオキサントン、チオキサントン−４−スルホン酸、ベンゾフェノン、４，４’  −ビス（ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、４，４’  −ビス（ジエチルアミノ）ベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類；アセトフェノン、ｐ−ジメチルアミノアセトフェノン、α，α’  −ジメトキシアセトキシベンゾフェノン、２，２’  −ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、ｐ−メトキシアセトフェノン、２−メチル〔４−（メチルチオ）フェニル〕−２−モルフォリノ−１−プロパノン、２−ベンジル−２−ジメチルアミノ−１−（４−モルフォリノフェニル）−ブタン−１−オンなどのアセトフェノン類；アントラキノン、１，４−ナフトキノンなどのキノン類；フェナシルクロライド、トリブロモメチルフェニルスルホン、トリス（トリクロロメチル）−ｓ−トリアジンなどのハロゲン化合物；ジ−ｔ  −ブチルパーオキサイドなどの過酸化物；２，４，６−トリメチルベンゾイルジフェニルフォスフィンオキサイドなどのアシルフォスフィンオキサイド類などが挙げられ、また、市販品としては、イルガキュア１８４、６５１、５００、９０７、ＣＧＩ３６９、ＣＧ２４−６１（チバガイギー（株）製）、ルシリンＬＲ８７２８、ＴＰＯ（ＢＡＳＦ（株）製）、ダロキュア１１１６、１１７３（メルク（株）製）、ユベクリルｐ３６（ＵＣＢ（株）製）などを挙げることができる。
【００４５】
上述した種々の光重合開始剤の中で好ましい化合物としては、２−メチル〔４−（メチルチオ）フェニル〕−２−モルフォリノ−１−プロパノン、２−ベンジル−２−ジメチルアミノ−１−（４−モルフォリノフェニル）−ブタン−１−オンなどのアセトフェノン類またはフェナシルクロライド、トリブロモメチルフェニルスルホン、２，４，６−トリメチルベンゾイルジフェニルフォスフインオキサイドなどを挙げることができる。これらの化合物は単独でまたは併用することができる。これらの光重合開始剤は、放射線増感剤と共に使用することも可能である。
【００４６】
光重合開始剤は、その全部または一部が、光増感作用を有する炭素クラスターおよび／またはその誘導体、光ラジカル重合開始剤、光カチオン重合開始剤などであってもよい。
ここに、炭素クラスターおよび／またはその誘導体としては、例えばフラーレンおよびその誘導体を挙げることができ、また光カチオン重合開始剤としては、例えば、ジアゾニウム塩であるアデカウルトラセットＰＰ−３３（旭電化工業（株）製）、スルホニウム塩であるオプトマーＳＰ−１５０、１７０（旭電化工業（株）製）、メタロセン化合物であるイルガキュア２６１（チバ・スペシャルティ・ケミカルズ（株）製）などの市販品を挙げることができる。
【００４７】
〔共重合性化合物〕
感光性樹脂組成物に含有させることのできる共重合性化合物は、少なくとも１個の不飽和二重結合を有し、ポリエチンレングリコール構造を有しないラジカル重合性化合物であって、その具体例としては、例えば、メチルメタクリレート、メチルアクリレート、などの（メタ）アクリル酸エステル、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸などのモノカルボン酸；マレイン酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸、イタコン酸などのジカルボン酸、２−サクシノロイルエチルメタクリレート、２−マレイノロイルエチルメタクリレート、２−ヘキサヒドロフタロイルエチルメタクリレートなどのカルボキシル基およびエステル結合を有するメタアクリル酸誘導体、並びに、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２−メチルシクロヘキシル（メタ）アクリレート、ジシクロペンタニルオキシエチル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート、ジシクロペンタニル（メタ）アクリレート、スチレン、α−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｐ  −クロロスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルピリジンなどの芳香族ビニル化合物、その他を挙げることができる。
【００４８】
感光性樹脂組成物を構成する各成分の割合は、例えば、アルカリ可溶性重合体成分が２０〜９０質量％、ポリエチレングリコール変性ラジカル重合性化合物成分が１０〜５０質量％、共重合性化合物が０〜５０質量％であることが好ましい。
【００４９】
また、光重合開始剤の使用量は、アルカリ可溶性重合体成分１００重量部に対して１〜５０重量部とされることが好ましく、特に１０〜４０重量部とされることが好ましい。この光重合開始剤の割合が１重量部未満の場合には、酸素によるラジカルの失活の影響を受けやすくて感度が低下したものとなり、一方、５０重量部を超えると、他の成分との相溶性が悪くなったり、感光性樹脂組成物の保存安定性が低下する傾向がある。
【００５０】
〔感光性樹脂組成物溶液の調製〕
上記の感光性樹脂組成物を適宜の溶剤に溶解して組成物溶液を調製し、この組成物溶液を、基板１０の表面上に塗布し、加熱により溶媒を除去することによって所望の感光性被膜１２が形成される。
【００５１】
〔有機溶剤〕
感光性樹脂組成物溶液を調製するための溶剤としては、各組成成分の種類に応じて、適宜の有機溶剤を用いることができる。
この有機溶剤は、感光性樹脂組成物の各成分を溶解するもの、または均一に分散するものであればよい。有機溶剤の具体例としては、例えば、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−ヘプタノン、シクロヘキサノン、エチレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、３−メトキシプロピオン酸メチル、３−エトキシプロピオン酸エチル、乳酸エチル、γ−ブチロラクトンなどを挙げることができ、これらから選ばれる少なくとも１  種を用いることができる。
【００５２】
これらの有機溶剤うち、塗膜に均一性が得られる特性および安全性の点から、エチレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、３−メトキシプロピオン酸メチル、シクロヘキサノン、３−エトキシプロピオン酸エチル、乳酸エチル、γ−ブチロラクトンなどを好ましく用いることができる。
【００５３】
有機溶剤の使用量は、感光性樹脂組成物の溶液または分散液が、所望の粘度あるいは濃度となる量とすればよい。
【００５４】
〔感光性被膜の形成〕
感光性樹脂組成物溶液を基板１０の表面に塗布することにより、感光性被膜が形成される。
感光性樹脂組成物溶液を基板１０の表面に塗布する方法としては、例えば、スピンコート法、ロールコート法、スクリーン印刷法、アプリケーター法などの方法を用いることができる。
組成物溶液による塗膜の乾燥条件は、当該組成物における各成分の種類、配合割合、塗布膜厚などによって異なるが、通常は７０〜１２０℃で５〜２０分間程度であり、好ましくは８０〜１００℃である。乾燥時間が短すぎると、現像時の密着状態が悪くなり、一方、長すぎると熱かぶりによる解像度の低下を招くようになる。
【００５５】
〔露光処理〕
感光性被膜１２にパターンのマスク１４を介して照射される光は、例えば、波長が３００〜５００ｎｍの紫外線または可視光線である。このような光の光源として、低圧水銀灯、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、メタルハライドランプ、アルゴンガスレーザーなどを用いることができる。また、紫外線または可視光線の代わりに、遠紫外線、Ｘ線、電子線などを用いることもでき、これらも露光処理のための光として有効である。
露光処理における光の照射量は、感光性樹脂組成物における各成分の種類、配合量、塗膜の膜厚などによって異なるが、例えば超高圧水銀灯を使用する場合には、１００〜５００ｍＪ／ｃｍ２  である。
【００５６】
〔現像処理〕
露光処理の後の感光性被膜１２に対して現像処理が行われる。現像処理は、アルカリ性水溶液を現像液として用いてこれに可溶な部分、すなわち露光処理において光が照射されなかった領域の膜部分を溶解除去し、光照射領域（露光領域）のみを残存させる処理であり、これにより、残存する感光性被膜によって細胞培養領域区画膜１６が形成され、同時に、目的とする区画された細胞培養領域Ｓが形成される。
【００５７】
現像液としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、アンモニア水、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ジエチルアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、トリエチルアミン、メチルジエチルアミン、ジメチルエタノールアミン、トリエタノールアミン、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、テトラエチルアンモニウムヒドロキシド、ピロール、ピペリジン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］−７−ウンデセン、１，５−ジアザビシクロ［４，３，０］−５−ノナンなどのアルカリ類の水溶液を使用することができる。また上記アルカリ類の水溶液にメタノール、エタノールなどの水溶性有機港媒や界面活性剤を適当量添加した水溶液を現像液として使用することもできる。
【００５８】
現像時間、すなわち現像液に接触する時間は、組成物における各成分の種類、配合割合、組成物の乾燥膜厚によって異なるが、通常３０〜３６０秒間であり、また現像の方法は液盛り法、ディッピング法、パドル法、スプレー現像法などのいずれでもよい。現像後は、流水洗浄を例えば３０〜９０秒間行い、エアーガンなどを用いて風乾させたり、オーブン中で乾燥させる。
【００５９】
〔後処理〕
上記の感光性樹脂組成物は、上記の露光処理のみによっても十分に硬化させることができるが、用途に応じて、追加の露光処理（以下、「後露光」という。）や加熱によってさらに硬化させることができる。後露光は、上記の露光処理と同様の方法で行なうことができ、光照射量は特に限定されるものではないが、高圧水銀灯を使用する場合には、１００〜１０００ｍＪ／ｃｍ２  の条件で行われることが好ましい。また、加熱の方法は、ホットプレート、オーブンなどの加熱装置を用いて、所定の温度、例えば１００〜２００℃で所定の時間、例えばホットプレートによる場合には５〜６０分間、オーブン中では３０〜９０分間加熱処理をすればよい。
この後処理を施すことによって、さらに良好な特性を有するパターン状の硬化物を得ることができる。
【００６０】
〔その他の成分〕
感光性樹脂組成物には、その効果を損なわない範囲において、必要に応じて上記以外の添加成分を含有させることができる。このような添加成分としては、例えば、従来公知のネガ型フォトレジスト組成物の添加剤として使用可能なものが挙げられる。
【００６１】
本発明によれば、細胞培養領域Ｓが、フォトリソグラフィの技法によって形成される細胞培養領域区画膜１６によって形成されるので、当該細胞培養領域Ｓを所期の面積および形状を有する微小領域としてパターン状に形成することができる。従って、当該細胞培養領域Ｓの面積および形状を、目的とする接着依存性細胞の種類に応じて適正なものとすることが容易であり、所期の接着依存性細胞の接着およびその増殖を確実に行うことができる細胞培養床チップを確実に得ることができる。
【００６２】
また、上記の理由により、当該細胞培養床チップを用いることにより、細胞培養領域Ｓにおいては所期の接着依存性細胞の接着をきわめて有利に行うことができる。すなわち、細胞培養領域Ｓが当該接着依存性細胞に対して好適な条件を備えているのみでなく、細胞培養領域区画膜１６の表面は、当該接着依存性細胞に対して接着阻害性を有するものであるから、当該細胞培養床チップの全面に接着依存性細胞を播種すれば、いわば自動的に細胞培養領域Ｓにのみ当該接着依存性細胞を接着させることができる。これは、細胞培養領域区画膜１６の特性によって、細胞培養領域Ｓ以外の表面における当該接着依存性細胞の接着が阻害されるからである。
【００６３】
更に、そのような細胞培養領域区画膜により区画された細胞を有する細胞培養床チップを用いることにより、当該接着依存性細胞に特異的な生体反応を行わせることができ、これを利用して、種々の検査や診断を有利に行うことができる。
【００６４】
【実施例】
以下、本発明の具体的な実施例について説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６５】
実施例１
図１〜図３の例に従い、下記の条件によって細胞培養床チップを作製した。
（１）感光性樹脂組成物溶液の調製
下記の種類および量の各成分、並びに有機溶剤を用いて感光性樹脂組成物溶液を調製した。
・アルカリ可溶性重合体成分
ポリエチレングリコール（分子量３，０００）、７０質量部
・ポリエチレングリコール変性ラジカル重合性化合物
ナノエチレングリコールジアクリレート、１３質量部
・共重合性化合物
メタクリル酸、１７質量部
・光重合開始剤
２−メチル〔４−（メチルチオ）フェニル〕−２−モルフォリノ−１−プロパノン、１２質量部
・有機溶剤
乳酸エチル、２５０質量部
【００６６】
（２）感光性被膜の形成
縦７５ｍｍ、横２５ｍｍ、厚さ１ｍｍのガラス板よりなる基板の表面に、感光性樹脂組成物溶液をスピンコート法によって塗布し、温度９０℃で５分間乾燥して乾燥後の膜厚が２μｍの感光性被膜を形成した。
【００６７】
（３）露光処理
形成された感光性被膜に対し、パターンマスクを介して、超高圧水銀灯より得られる波長３５０ｎｍの紫外線を１００ｍＪ／ｃｍ２  の照射量で照射した。
【００６８】
（４）現像処理
露光処理の後の感光性被膜に対して、濃度２．４質量％のテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）水溶液よりなる現像液を用いてディッピング法により６０秒間接触させて現像を行い、流水洗浄を６０秒間行い、エアーガンを用いて風乾させて未露光領域の膜部分を溶解除去することにより、各々直径１００μｍの円形の細胞培養領域（Ｓ）が縦２２５個、横１１０個で縦横に並んだパターンによる細胞培養領域区画膜（１６）によって区画された細胞培養床チップを作製した。
【００６９】
（５）後処理
乾燥後の細胞培養床チップに対し、その硬化を完全なものとするために、高圧水銀灯よりの光を１００ｍＪ／ｃｍ２  の照射量で２０分間照射した。
【００７０】
（６）培養テスト
上記のようにして得られた細胞培養床チップをエチレンオキシドガスにより滅菌した後、クリーンベンチ内において、ラット肝臓をコラゲナーゼ処理して得られた肝実質細胞を、シャーレ内の１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地中、チップ当たり５×１０６  個の数で播種し、これを温度３７℃、５％二酸化炭素ガス雰囲気のインキュベータにより培養した。
そして、２４時間経過後、当該細胞培養床チップをインキュベータより取り出して顕微鏡で観察したところ、細胞培養領域区画膜上には細胞の存在はほとんど認められないが、一方、播種した肝実質細胞のほとんど全部が、区画された細胞培養領域に、直径約８０μｍの二次元的に一様な広がりをもった細胞塊として綺麗に並んだ状態となっていることが認められた。
【００７１】
以上のように、当該細胞培養床チップによれば、所期のパターンに従って区画されて配列された細胞培養領域の各々においては肝実質細胞が当該細胞培養領域に一様に広がった状態で接着しているが、それ以外の領域では肝実質細胞が存在しておらず、従って、当該肝実質細胞の接着領域が、細胞培養領域のパターンに従ってパターン状に配列された状態を実現することができる。
【００７２】
【発明の効果】
本発明の細胞培養床チップは、細胞接着性表面を有する基板の表面に、接着依存性細胞に対して接着阻害性の材質よりなる細胞培養領域区画膜が形成され、この細胞培養領域区画膜によって細胞培養領域が区画されて形成されたものであるところ、当該細胞培養領域は、細胞培養領域区画膜の一部がいわゆるフォトリソグラフィーの技法によって除去されることにより形成されることにより、確実に好適な大きさのものとされることができ、しかも各細胞培養領域では基板の表面による細胞接着性が発揮されるので十分な細胞接着性を有するものであり、従って工業的に有利に製造することができる。
【００７３】
本発明の細胞培養床チップの製造方法によれば、細胞培養領域は、細胞培養領域区画膜の一部がいわゆるフォトリソグラフィーの技法によって除去することにより形成されるので、確実に好適な大きさのものとすることができ、しかも各細胞培養領域では基板の表面による細胞接着性が発揮されるので十分な細胞接着性を有するものとすることができ、従って工業的に有利に所期の細胞培養床チップを製造することができる。
【００７４】
本発明の細胞培養方法によれば、上記の細胞培養床チップにおいて細胞培養領域が所期の微小な面領域とされており、他の領域は接着阻害性領域とされているので、当該細胞培養床チップを用いることにより、所期の接着依存性細胞の培養を有利に行うことができる。
【００７５】
そして、上記のようにして接着依存性細胞が培養された細胞培養床チップを用いることにより、当該接着依存性細胞に特異的な生体反応を生じさせることができるので、目的とする診断や検査などを有利に実行することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による細胞培養床チップの製造に用いられる基板の一例を示す説明用断面図である。
【図２】図１に示す基板に形成された感光性被膜に対する露光処理についての説明用断面図である。
【図３】本発明の細胞培養床チップの構成の一例を示す説明用断面図である。
【符号の説明】
１０  基板
１２  感光性被膜
１４  マスク
１６  細胞培養領域区画膜
Ｓ    細胞培養領域
【図１】
2004321040.tif 000005
【図２】
2004321040.tif 000006
【図３】
2004321040.tif 000007