(57)【要約】【課題】グリコサミノグリカン結合性物質をスクリーニングするための新たな手段を提供する。【解決手段】グリコサミノグリカンに脂質が結合してなる「脂質結合グリコサミノグリカン」をグリコサミノグリカン結合性物質捕捉材として使用し、下記（１）及び（２）の工程を有するグリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法。（１）検体中の「グリコサミノグリカン結合性物質」と「脂質結合グリコサミノグリカン複合体」とを接触させる工程；（２）前記接触により生じた「グリコサミノグリカン結合性物質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体」を検出する工程。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカンに脂質が結合してなる「脂質結合グリコサミノグリカン」をグリコサミノグリカン結合性物質捕捉材として使用することを特徴とする「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法」。
【請求項２】
少なくとも下記（１）及び（２）の工程を有する請求項１記載の「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法」。
（１）検体中の「グリコサミノグリカン結合性物質」とグリコサミノグリカン結合性物質捕捉材としての「脂質結合グリコサミノグリカン」とを接触させる工程；
（２）前記接触により生じた「グリコサミノグリカン結合性物質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体」を検出する工程。
【請求項３】
「グリコサミノグリカン結合性物質」がタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２記載の「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法」。
【請求項４】
「検体」が「生体由来の検体」であることを特徴とする請求項１〜３何れか一項記載の「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法」。
【請求項５】
「脂質結合グリコサミノグリカン」が、固相に結合した状態の「固相化脂質結合グリコサミノグリカン」であることを特徴とする請求項１〜４何れか一項記載の「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法」。
【請求項６】
下記（１）〜（４）の工程の全ての工程を少なくとも有することを特徴とする「グリコサミノグリカン結合性タンパク質をコードする核酸のスクリーニング方法」。
（１）「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」をコードする核酸を使用して細胞内において前記タンパク質を発現させ、前記タンパク質を含む検体を得る工程；
（２）検体中の前記タンパク質と、グリコサミノグリカン結合性タンパク質捕捉材としての「脂質結合グリコサミノグリカン」とを接触させる工程；
（３）前記接触により生じた「前記タンパク質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体」を検出する工程；
（４）前記検出工程により、グリコサミノグリカンへの結合性を有すると判定された、前記核酸がコードする「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」を「グリコサミノグリカン結合性タンパク質」として選択する工程。
【請求項７】
「脂質結合グリコサミノグリカン」が、固相に結合した状態の「固相化脂質結合グリコサミノグリカン」であることを特徴とする請求項６記載の「グリコサミノグリカン結合性タンパク質をコードする核酸のスクリーニング方法」。
【請求項８】
下記（１）乃至（３）の工程を含むことを特徴とする「グリコサミノグリカン結合性物質の製造方法」。
（１）「グリコサミノグリカン結合性物質を含む試料」と、グリコサミノグリカン結合性物質捕捉材としての「脂質結合グリコサミノグリカンが固相に結合してなる『固相化脂質結合グリコサミノグリカン』」とを接触させて、試料中の「グリコサミノグリカン結合性物質」と前記「固相化脂質結合グリコサミノグリカン」とを結合させる工程；
（２）固液分離手段により「グリコサミノグリカン結合性物質が結合した固相化脂質結合グリコサミノグリカン」を分離する工程；
（３）「グリコサミノグリカン結合性物質が結合した固相化脂質結合グリコサミノグリカン」から「グリコサミノグリカン結合性物質」を単離する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は脂質が結合したグリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン結合性物質捕捉材として用いた、「グリコサミノグリカン結合性を有する物質のスクリーニング方法」に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グリコサミノグリカンに脂質が結合した脂質結合グリコサミノグリカンが知られており、例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献等に開示されている。
【０００３】
グリコサミノグリカンの還元末端にリン脂質であるホスファチジルエタノールアミンを共有結合で結合させる方法が開発され、更に、このような方法で得られたリン脂質結合グリコサミノグリカン誘導体を、プラスチック製培養皿に培養基質として固相化させて肝細胞を培養し、球状集塊化（スフェロイド化）して、人工肝臓等を作成するために用いたり（特許文献４）、ヒアルロン酸に対する抗体を作る為に、抗原としてＨＡとホスファチジルエタノールアミンが共有結合したＨＡ−ホスファチジルエタノールアミンでマウスを免疫したり、免疫したマウスの血清中に存在する抗体の力価測定の為に、ＨＡ−ホスファチジルエタノールアミンを蒸留水に溶解した物を抗原液として用いた例（特許文献５）がある。
【０００４】
また、特許文献６には、固相に脂質結合グリコサミノグリカンを固着させ、これと抗体を用いてグリコサミノグリカン結合性物質の測定を行なう方法が開示されている。しかし、未知の検体からグリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニングをする方法や、或いはグリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質をコードする核酸を用いて遺伝子工学的に該タンパク質を発現させて、グリコサミノグリカン結合性タンパク質をコードする核酸をスクリーニングする方法については開示されておらず、また示唆もされていない。
【０００５】
【特許文献１】特開平４−８０２０１号公報
【特許文献２】特開平４−８０２０２号公報
【特許文献３】特開平９−３０９７９号公報
【特許文献４】特開平５−２３６９５１号公報
【特許文献５】特開平９−１２６０００号公報
【特許文献６】特開２０００−６５８３７号公報
【非特許文献】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，（１９９３）  ２６８，  １５７７９−１５７８７
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
近年、未知のタンパク質をコードする核酸が大量に発見されている。一方、生体内において極めて重要な働きをするグリコサミノグリカン親和性（結合性）物質を見つけだすことは、生体内でのグリコサミノグリカンの働きを解明する上でも重要であり、また、未知のタンパク質、核酸の機能を解明する上でも極めて重要である。
【０００７】
そこで、検体からグリコサミノグリカン結合性を有する物質を効率よくスクリーニングする方法の開発が強く望まれていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、上記脂質結合グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン結合性物質捕捉材として使用することで、極めて簡易な操作で「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング」が達成されることを見い出し、この方法を用いることで未知のタンパク質をコードする核酸をスクリーニングし、その機能の解明に役立てることができることを見い出して本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）グリコサミノグリカンに脂質が結合してなる「脂質結合グリコサミノグリカン」をグリコサミノグリカン結合性物質捕捉材として使用することを特徴とする「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法」。
（２）少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を有する（１）記載の「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法」。
（ａ）検体中の「グリコサミノグリカン結合性物質」とグリコサミノグリカン結合性物質捕捉材としての「脂質結合グリコサミノグリカン」とを接触させる工程；
（ｂ）前記接触により生じた「グリコサミノグリカン結合性物質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体」を検出する工程。
（３）「グリコサミノグリカン結合性物質」がタンパク質であることを特徴とする（１）又は（２）記載の「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法」。
（４）「検体」が「生体由来の検体」であることを特徴とする（１）〜（３）何れか記載の「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法」。
（５）「脂質結合グリコサミノグリカン」が、固相に結合した状態の固相化脂質結合グリコサミノグリカンであることを特徴とする（１）〜（４）何れか記載の「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法」。
（６）下記（ａ）〜（ｄ）の工程の全ての工程を少なくとも有することを特徴とする「グリコサミノグリカン結合性タンパク質をコードする核酸のスクリーニング方法」。
（ａ）「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」をコードする核酸を使用して細胞内において前記タンパク質を発現させ、前記タンパク質を含む検体を得る工程；
（ｂ）検体中の前記タンパク質と、グリコサミノグリカン結合性タンパク質捕捉材としての「脂質結合グリコサミノグリカン」とを接触させる工程；
（ｃ）前記接触により生じた「前記タンパク質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体」を検出する工程；
（ｄ）前記検出工程により、グリコサミノグリカンへの結合性を有すると判定された、前記核酸がコードする「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」を「グリコサミノグリカン結合性タンパク質」として選択する工程。
（７）「脂質結合グリコサミノグリカン」が、固相に結合した状態の「固相化脂質結合グリコサミノグリカン」であることを特徴とする（６）記載の「グリコサミノグリカン結合性タンパク質をコードする核酸のスクリーニング方法」。
（８）下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含むことを特徴とする「グリコサミノグリカン結合性物質の製造方法」。
（ａ）「グリコサミノグリカン結合性物質を含む試料」と、グリコサミノグリカン結合性物質捕捉材としての「脂質結合グリコサミノグリカンが固相に結合してなる『固相化脂質結合グリコサミノグリカン』」とを接触させて、試料中の「グリコサミノグリカン結合性物質」と前記「固相化脂質結合グリコサミノグリカン」とを結合させる工程；
（ｂ）固液分離手段により「グリコサミノグリカン結合性物質が結合した固相化脂質結合グリコサミノグリカン」を分離する工程；
（ｃ）「グリコサミノグリカン結合性物質が結合した固相化脂質結合グリコサミノグリカン」から「グリコサミノグリカン結合性物質」を単離する工程。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、発明の実施の形態により本発明を詳説する。
１．本発明スクリーニング方法１
本発明スクリーニング方法１とは、脂質結合グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン結合性物質捕捉材として使用することを特徴とするグリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法である。
【００１１】
ここで、脂質結合グリコサミノグリカンとは、グリコサミノグリカンに脂質が結合した物質、好ましくはグリコサミノグリカンに脂質が化学的に結合した物質であり、例えば特開平４−８０２０１、特開平４−８０２０２、特開平９−３０９７９等に開示されている。
【００１２】
本発明スクリーニング方法１にグリコサミノグリカン結合性物質捕捉材として使用される「脂質結合グリコサミノグリカン」に含まれるグリコサミノグリカンは、Ｄ−グルコサミン又はＤ−ガラクトサミンと、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−イズロン酸及び／又はＤ−ガラクトースの２糖の繰り返し単位を基本骨格として構成される多糖であり、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的若しくは酵素的に合成されたもの等のいずれを使用することができる。具体的には、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（いわゆるコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋ等）、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂとも一般的には呼ばれている）、ヘパリン、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのグリコサミノグリカンは通常使用される塩であってもよい。
【００１３】
また、上述のグリコサミノグリカンに結合させる脂質としては、動物、植物、微生物等の天然物由来、又は化学的若しくは酵素的に合成若しくは部分的に分解された複合脂質又は単純脂質を使用することができ、リン脂質等のグリセロ脂質、長鎖の脂肪酸、長鎖の脂肪酸アミン、コレステロール類、スフィンゴ脂質、セラミド等いずれも使用できる。特にホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルトレオニン、エタノールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシトール等のリン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の中性脂質等のグリセロ脂質が好ましい。この中でも特に１級アミノ基を有するリン脂質が好ましい。脂質中のアシル基の鎖長及び不飽和度は特に限定されないが、炭素数６以上のものが好ましい。アシル基としては例えばパルミトイル（ヘキサデカノイル）又はステアロイル（オクタデカノイル）などが例示される。また、これらの脂質は通常使用される塩であってもよい。
【００１４】
グリコサミノグリカンの脂質との結合位置は特に限定されるものではないが、グリコサミノグリカン結合性物質をスクリーニングするという本発明の目的に照らすとそれらの結合を妨げる可能性が低い「グリコサミノグリカンの末端部」が好ましく、特に反応のさせやすさの観点から「グリコサミノグリカンの還元末端」への結合が好ましい。また、結合の形態は、特に化学結合が好ましく、その中でも共有結合による結合が最も好ましい。
【００１５】
グリコサミノグリカンと脂質とが共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの場合、グリコサミノグリカンのカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホルミル基（ヘミアセタール基も含む）、水酸基若しくは１級アミノ基、又はグリコサミノグリカンに別途導入された前記基と、脂質のカルボキシル基、ホルミル基若しくは１級アミノ基、又は脂質に別途導入された前記基との間で形成される酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、エステル結合又はアミノアルキル結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）によって共有結合したものが好ましい。
【００１６】
特に、グリコサミノグリカンの還元末端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成されたグリコサミノグリカンのカルボキシル基（ラクトンを含む）と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、グリコサミノグリカンのウロン酸部分のカルボキシル基と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、又はグリコサミノグリカンの還元末端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成されたグリコサミノグリカンのホルミル基と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成されたシッフ塩基を還元して形成されたアミノアルキル結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）により結合されたものが好ましい。
【００１７】
なお、上記共有結合に関与するアミノ基、カルボキシル基、ホルミル基（ヘミアセタール基を含む）、水酸基はグリコサミノグリカン又は脂質に元来存在するもの、これらに化学的処理を施すことによって形成されたもの、或いは上記官能基を末端に有するスペーサー化合物を、予めグリコサミノグリカン又は脂質と反応させることによって別途導入されたもののいずれであってもよい。
【００１８】
特に好ましい脂質結合グリコサミノグリカンである、脂質がグリコサミノグリカンの還元末端に共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの製造法としては、例えば特開平４−８０２０１号、特開平４−８０２０２号及び特開平９−３０９７９号に開示された方法が挙げられ、より具体的には例えば以下のような方法が使用できる。
【００１９】
還元末端限定酸化法
この方法は、グリコサミノグリカンの還元末端の糖残基であるガラクトース残基、ウロン酸残基またはヘキソサミン残基を還元し、限定酸化（部分酸化）することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）させるとともに、該グリコサミノグリカンの還元末端にホルミル基を形成させてアルデヒド化合物とし、このアルデヒド化合物のホルミル基と脂質の１級アミノ基とを反応させてシッフ塩基を形成させ、次いでシッフ塩基を還元し、アミノアルキル結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）を形成させて、グリコサミノグリカンと脂質とを共有結合させる方法である。
【００２０】
グリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の還元は、グリコサミノグリカンに対して５〜５０当量程度、好ましくは２５〜３０当量の還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、ホウ酸塩緩衝液等）中、通常１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃で行うことができる。
【００２１】
上記還元後、限定酸化を行ってグリコサミノグリカンの還元末端に特異的にホルミル基を有するアルデヒド化合物を製造する。限定酸化は、上記還元後のグリコサミノグリカンに対して１〜１０当量、好ましくは３〜６当量の酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム等の過ヨウ素酸アルカリ塩等）を用い、通常０〜１０℃、好ましくは０〜４℃で行うことができる。
【００２２】
得られたアルデヒド化合物と１級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質等）とを反応させてシッフ塩基を形成させる反応は、水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）又は適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）に上記アルデヒド化合物を溶解した溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、通常１５〜６０℃の温度で反応させることができる。この反応時又は反応終了後に適当な還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩等）を作用させてシッフ塩基を還元することができる。
【００２３】
なお、脂質結合グリコサミノグリカンを製造する際に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ基を有する２価官能性のスペーサー化合物（例えば、エチレンジアミン等のアルキレンジアミン、又はリジン等のアミノ酸等）と上記アルデヒド化合物とを反応させて、アミノアルキル結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）を形成させ、次いで上記スペーサー化合物の他方の官能基（例えばアミノ基）と反応し得る官能基（例えば、カルボキシル基）を有する脂質（例えば、モノアシルグリセロールコハク酸エステル等のモノアシルグリセロールジカルボン酸エステル）と反応させてもよい。
【００２４】
還元末端ラクトン化法
この方法は、グリコサミノグリカンの還元末端の糖残基であるガラクトース残基、ウロン酸残基又はヘキソサミン残基を酸化することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）させて該グリコサミノグリカンの還元末端にカルボキシル基を形成させて、次いでラクトン形成反応に付すことによって該グリコサミノグリカンの還元末端をラクトン構造とし、このラクトンと脂質の１級アミノ基とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させることによって、グリコサミノグリカンと脂質とを共有結合させる方法である。
【００２５】
グリコサミノグリカンの還元末端の糖残基の酸化は、グリコサミノグリカンに対して２〜２０当量程度、好ましくは５〜１５当量程度の酸化剤（ヨウ素、臭素等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、リン酸塩緩衝液等）中、通常０〜４０℃、好ましくは１５〜３０℃で行うことができる。
【００２６】
上記酸化反応後、強酸性陽イオン交換樹脂、例えばダウエックス５０（商品名；ダウケミカル社製）、アンバーライトＩＲ−１２０（商品名；オルガノ社製）及び／又は酸（塩酸、硫酸等の無機酸、または酢酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸の酸無水物）で処理することによって、グリコサミノグリカンの還元末端が特異的にラクトン化されたラクトン化合物を製造することができる。
【００２７】
得られたラクトン化合物と１級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質）との反応は、適当な水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）又は適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）にラクトン化合物を溶解した溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、５〜８０℃、好ましくは３０〜６０℃の温度で反応させればよい。
【００２８】
なお、還元末端限定酸化法の場合と同様に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ基を有する２価官能性のスペーサー化合物と上記ラクトン化合物とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させ、スペーサー化合物の他方の官能基と脂質の官能基（例えばカルボキシル基）とを反応させてもよい。
【００２９】
ヘミアセタール法
糖鎖の還元末端糖は、環状構造と開環構造の平衡状態にあり、開環構造ではアルデヒド基が生じ、そこにアミノ基を有する脂質を加えるとシッフ塩基が形成される。この反応も平衡反応であり、その割合は反応条件により大きく変わる。ここに選択的還元剤を添加するとシッフ塩基が還元（水素付加）され、アミノアルキル型結合体が形成されることも基づく方法である。
【００３０】
具体的には、グリコサミノグリカンがナトリウム塩等のアルカリ金属塩である場合等、以下の方法で有機溶媒溶解性塩とすることができる。すなわち、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ１２、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ４（いずれも室町化学社製）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ−５０（いずれもオルガノ社製）、Ｄｕｏｌｉｔｅ  ２２５、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｃ２６Ｃ（いずれもダイアプロシム社製）、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ  ７０、Ｃｈｅｌｅｘ  １００、ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８（いずれもバイオラド社製）、ＳＥ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ワットマン社製）等のＨ＋型の陽イオン交換樹脂に通して脱陽イオン化して遊離型とし、ただちにテトラブチルアンモニウム等の有機アミンあるいはその水溶液を添加し、ｐＨを弱酸性から中性に調整する。この溶液を減圧濃縮し、室温で約３日間凍結乾燥して有機溶媒溶解性のグリコサミノグリカン有機アミン塩乾燥粉末を得ることができる。
【００３１】
次いでグリコサミノグリカンの有機溶媒溶解性塩と１級アミノ基を有する脂質とを、該グリコサミノグリカンの有機溶媒溶解性塩および該脂質の双方を溶解しうる極性有機溶媒中、無水条件下、還元剤の存在下において反応させ、該グリコサミノグリカンの還元末端糖アルデヒド基と該脂質の１級アミノ基とのアミノアルキル型結合を形成させることにより脂質結合グリコサミノグリカンを合成する。具体的には、例えば上記の有機アミン塩乾燥粉末に無水極性有機溶媒を溶解し、その溶液をホスファチジルエタノールアミン等脂質の無水極性有機溶媒溶液に添加する。得られた混合液を窒素雰囲気下、２０〜１２０℃で１〜２４時間撹拌後、還元剤を加え更に２０〜１２０℃で１〜２４時間撹拌を続ける。上記還元剤を更に約２４時間おきに２回添加し、２０〜１２０℃で１〜７２時間反応させ、シッフ塩基形成、還元アミノ化反応を完結させる。
【００３２】
ただし、脂質がグリコサミノグリカンの還元末端に共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの製造方法はこれらの方法に限定されるものではなく、グリコサミノグリカンの還元末端に脂質を結合しうる方法であれば他の任意の方法によっても製造することができる。
【００３３】
グリコサミノグリカンの末端以外に脂質を導入する方法としては、例えばグリコサミノグリカンのウロン酸部分のカルボキシル基と脂質の１級アミノ基とを反応させて、酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させる方法が挙げられる。
【００３４】
上記反応に際し、縮合剤（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド等）を用いて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させるか、或いはウロン酸部分のカルボキシル基を該縮合剤の存在下、活性化剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール等）と反応させて活性エステルとした後、該脂質と反応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させることができる。
【００３５】
なお、上記反応においてはグリコサミノグリカンのウロン酸部分を有機溶媒に溶解可能な塩（トリエチルアミン、トリブチルアミン等のアミンの塩等）とし、反応を有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン等）中で行うことが好ましい。
【００３６】
脂質結合グリコサミノグリカンの塩としては、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩；トリアルキルアミン等のアミン塩；及びピリジン等の有機塩基との塩等が挙げられ、特に限定されないが、特にアルカリ金属塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
【００３７】
上記のような脂質結合グリコサミノグリカンの具体例としては、ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸、ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合コンドロイチン硫酸、ステアロイルパルミトイルホスファチジルセリン結合コンドロイチン硫酸、モノステアロイルグリセロール・コハク酸エステル結合コンドロイチン硫酸、ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸等が挙げられ、これらの脂質結合グリコサミノグリカンのより具体的な構造、製造方法の詳細等については、特開平４−８０２０１、特開平４−８０２０２及び特開平９−３０９７９等に記載されている。
【００３８】
本発明スクリーニング方法１は、より具体的には、少なくとも下記（１）及び（２）の工程を有することを特徴とする。
（１）検体中の「グリコサミノグリカン結合性物質」とグリコサミノグリカン結合性物質捕捉材としての「脂質結合グリコサミノグリカン」とを接触させる工程；
（２）前記接触により生じた「グリコサミノグリカン結合性物質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体」を検出する手段。
【００３９】
すなわち、「脂質結合グリコサミノグリカン」の「グリコサミノグリカンの部分」に、それに親和性を有する検体中の物質を結合させて複合体を形成させ、当該複合体の存否を確認し、当該複合体が形成されてそれが検出された検体は、グリコサミノグリカン結合性物質が含まれていたと結論づけるのが、本発明スクリーニング方法１の特徴である。
【００４０】
本発明スクリーニング方法１によってスクリーニングされる「グリコサミノグリカン結合性物質」は特に限定はされないが、タンパク質であることが好ましい。
【００４１】
上記工程（１）における「検体」は、液体の検体であることが好ましく、水を含む検体であることがより好ましい。グリコサミノグリカンは生体物質であり、それに結合性を有する物質も、水の共存下で結合性を示すことが多いと考えられるからである。具体的には、細胞や組織の培養液等の検体、血液、尿、涙液などの生体から取り出した検体が挙げられ、特に限定はされないが、細胞や組織の培養液が好ましい。
【００４２】
本発明スクリーニング方法１における上記工程（１）の「接触」とは、検体に脂質結合グリコサミノグリカンを添加しても良いが、好ましくは固相に固着させた脂質結合グリコサミノグリカンと検体を接触させて行われ、例えばゲル等の担体に結合させた脂質結合グリコサミノグリカンを、担体ごと検体に混合したり、上記担体を充填したカラムに検体を通筒したり、またマイクロプレートなどに脂質結合グリコサミノグリカンを固着させて、そこに検体を分注することで行うことができる。
【００４３】
本発明スクリーニング方法１における上記工程（２）の「グリコサミノグリカン結合性物質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体の検出」は、例えば脂質結合グリコサミノグリカンの脂質部分に結合性を有する抗体等を用いて可視化する方法、或いは紫外線等の吸収等によって検出する方法等が挙げられる。脂質結合グリコサミノグリカンを固相に固着させておく方法を用いる場合は、予め検体中の物質を標識しておくことで、固相に固着した標識物質を検出して上記検出を行うことが可能となる。このような標識は、公知の物質を用いて常法で行うことができる。
【００４４】
２．本発明スクリーニング方法２
本発明スクリーニング方法２は、下記（１）〜（４）の全ての工程を少なくとも有することを特徴とするグリコサミノグリカン結合性タンパク質をコードする核酸のスクリーニング方法である。
（１）「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」をコードする核酸を使用して細胞内において前記タンパク質を発現させ、前記タンパク質を含む検体を得る工程；
（２）検体中の前記タンパク質と、グリコサミノグリカン結合性タンパク質捕捉材としての「脂質結合グリコサミノグリカン」とを接触させる工程；
（３）前記接触により生じた「前記タンパク質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体」を検出する工程；
（４）前記検出工程により、グリコサミノグリカンへの結合性を有すると判定された、前記核酸がコードする「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」の「グリコサミノグリカン結合性タンパク質」として選択する工程。
【００４５】
本発明スクリーニング方法２における、「グリコサミノグリカン」、「脂質結合グリコサミノグリカン」、前記「脂質結合グリコサミノグリカン」における「脂質」は、全て本発明スクリーニング方法１における語と同義である。
【００４６】
本発明スクリーニング方法２における上記工程（１）の「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であってもリボ核酸（ＲＮＡ）であっても良いが、取扱の容易さの点からＤＮＡであることが好ましい。このような核酸は、常法に従って調製することが可能である。ｃＤＮＡは、ＤＮＡの発現の際に生ずるｍＲＮＡから調製するが、イントロンを含まない構造をしており、コードされるタンパク質の遺伝暗号を、容易に発現できる態様で含んでいるため、上記核酸の調製にはｃＤＮＡを用いるのが好ましい。
【００４７】
上記核酸がコードする「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」の発現は、常法に従って当業者であれば容易に行うことができる。例えばこのような核酸のコード領域のみを増幅して、増幅産物を発現に使用する宿主細胞に適したベクターに挿入して発現ベクターを調製し、当該発現ベクターを上記宿主細胞に導入して組換体として発現を行わせることができる。また、ベクターの構築の際に、予め標識ペプチドとの融合タンパク質として上記「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」を発現するように構築されたベクターを用いることで、融合タンパク質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体の検出が容易となるためより好ましい。
【００４８】
このような「識別ペプチド」としては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のＮ末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している１５〜３０アミノ酸残基からなるペプチド：例えばＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、Ｄｓｂ等）、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約４２，０００のタンパク質）、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ（ヒスチジン残基を６乃至１０個並べて配した配列）、ｍｙｃタグ（ｃＭｙｃタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、ＦＬＡＧペプチド（８アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、Ｔ７タグ（ｇｅｎｅ１０タンパク質の最初の１１アミノ酸残基からなる）、Ｓタグ（膵臓ＲＮａｓｅＡ由来の１５アミノ酸残基からなる）、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ（大腸菌外膜タンパク質ｐｅｌＢの２２アミノ酸配列）、ＨＡタグ（ヘマグルチニン由来の１０アミノ酸残基からなる）、Ｔｒｘタグ（チオレドキシン配列）、ＣＢＰタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＣＢＤタグ（セルロース結合ドメイン）、ＣＢＲタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β−ｌａｃ／ｂｌｕ（βラクタマーゼ）、β−ｇａｌ（βガラクトシダーゼ）、ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、ＨＰ−Ｔｈｉｏ（Ｈｉｓ−ｐａｔｃｈチオレドキシン）、ＨＳＰ（熱ショックペプチド）、Ｌｎγ（ラミニンγペプチド）、Ｆｎ（フィブロネクチン部分ペプチド）、ＧＦＰ（緑色蛍光ペプチド）、ＹＦＰ（黄色蛍光ペプチド）、ＣＦＰ（シアン蛍光ペプチド）、ＢＦＰ（青色蛍光ペプチド）、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２（赤色蛍光ペプチド）、ＭＢＰ（マルトース結合ペプチド）、ＬａｃＺ（ラクトースオペレーター）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）、アビジン、プロテインＧ等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧペプチド、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ３、ｐｅｌＢ又はＨＡタグが、遺伝子工学的手法による本発明スクリーニング方法２におけるタンパク質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体の検出がより容易となることから好ましく、特にＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ３等の蛍光ペプチドとの融合タンパク質とし「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」を発現させるのが、検出の容易性において優れるため好ましい。
【００４９】
なお、上記「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」への「標識ペプチド」の結合位置は、「標識ペプチド」が上記タンパク質と「脂質結合グリコサミノグリカン」との結合を妨げない限りにおいて、Ｃ末端であってもＮ末端であってもよい。
【００５０】
このような工程に用いられる宿主細胞は、原核細胞（例えば枯草菌、大腸菌等）であってもよく、また真核細胞（例えば酵母、哺乳動物由来の培養細胞、昆虫由来の培養細胞等）であってもよい。当業者であれば、これらの宿主細胞の選択は目的に応じて容易に行うことが可能であり、また宿主細胞に適合したベクターの選択も容易に行うことができる。
【００５１】
更に「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」をコードする核酸の上記ベクターへの挿入も、ベクターの構造に応じて適当な制限酵素末端等を核酸の末端に形成させて、常法に従って行うことが可能である。
【００５２】
本発明スクリーニング方法２における上記工程（２）の「接触」とは、例えば工程（１）において細胞内で発現された「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」を含む培養液等を検体として、脂質結合グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン結合性タンパク質捕捉材として添加して行うことができ、また脂質結合グリコサミノグリカンの溶液等に対して上記培養液等を加えて行うこともできる。しかし、好ましくは固相に固着させた脂質結合グリコサミノグリカンと上記培養液等を接触させて行われ、例えばゲル等の担体に結合させた脂質結合グリコサミノグリカンを、担体ごと培養液に混合・懸濁したり、上記担体を充填したカラムに培養液を通筒したり、またマイクロプレート等に脂質結合グリコサミノグリカンを固着させて、そこに培養液を分注することで行うことができる。
【００５３】
本発明スクリーニング方法２における上記工程（３）の「タンパク質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体の検出」は、上記標識ペプチドとの融合タンパク質を工程（１）で発現させた場合には、標識ペプチドを検出することで容易に行うことができる。例えば挿入された遺伝子を「ＧＦＰ」との融合タンパク質として発現するベクターに、「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質をコードする核酸」を導入して、そのベクターによって遺伝子を導入した組換体を使って融合タンパク質を工程（１）で発現させた場合には、工程（３）における「検出」は、蛍光の検出によって行うことが可能である。
【００５４】
本発明スクリーニング方法２における上記工程（４）は、上記工程（３）により「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質と脂質結合グリコサミノグリカンとの複合体」が検出された場合には、当該「グリコサミノグリカンへの結合性が未知のタンパク質」はグリコサミノグリカンへの結合性を有することとなり、当該タンパク質をコードしていた核酸は「グリコサミノグリカンへの結合性を有するタンパク質」をコードする核酸であるとすることができる。
【００５５】
３．本発明製造方法
本発明製造方法は、下記（１）〜（３）の全ての工程を有することを特徴とする「グリコサミノグリカン結合性物質の製造方法」である。
（１）「グリコサミノグリカン結合性物質を含む材料」と、「グリコサミノグリカン結合性物質捕捉材としての『固相化脂質結合グリコサミノグリカン』」とを接触させて、試料中の「グリコサミノグリカン結合性物質」と前記「固相化脂質結合グリコサミノグリカン」とを結合させる工程；
（２）固液分離手段により「グリコサミノグリカン結合性物質が結合した固相化脂質結合グリコサミノグリカン」を分離する工程；
（３）「グリコサミノグリカン結合性物質が結合した固相化脂質結合グリコサミノグリカン」から「グリコサミノグリカン結合性物質」を単離する工程。
【００５６】
本発明製造方法における、「グリコサミノグリカン」、「脂質結合グリコサミノグリカン」、前記「脂質結合グリコサミノグリカン」における「脂質」は、全て本発明スクリーニング方法１における語と同義である。
【００５７】
本発明方法における工程（１）の固相とは、例えばゲル（アガロース等）、マイクロプレート等の担体例示される。特に本発明方法の操作が容易となる点からゲルが好ましいが、これに限定はされない。
【００５８】
本発明製造方法の工程（１）における「試料」とは、グリコサミノグリカン結合性物質が含まれている限りにおいて特に限定はされないが、例えば、グリコサミノグリカンへの結合性が知られているタンパク質（線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒアルロン酸結合性タンパク質（ＨＡＢＰ）、ミッドカイン（ＭＫ）等）を分泌する培養細胞の培養上清などが例示される。また、上記本発明スクリーニング方法２によって得られた「グリコサミノグリカンへの結合性を有するタンパク質をコードする核酸」を導入し、当該核酸がコードする「グリコサミノグリカンへの結合性を有するタンパク質」を大量発現するように調製した組換体の培養上清であっても使用することができるのは言うまでもない。
【００５９】
なお、脂質結合グリコサミノグリカンの調製に使用するグリコサミノグリカンの種類によって、本発明製造方法によって得られる「グリコサミノグリカン結合性物質」が異なるのは当業者にとっては容易に理解されうるところであり、当業者であれば入手したい物質のグリコサミノグリカン結合性に応じて、グリコサミノグリカン結合性物質捕捉材として使用する脂質結合グリコサミノグリカンを適宜選択することが可能である。
【００６０】
本発明製造方法における上記工程（１）の「接触」とは、例えばゲル担体に結合させた脂質結合グリコサミノグリカンを、担体ごと培養液に混合・懸濁したり、上記ゲル担体を充填したカラムに培養液を通筒したり、またマイクロプレート等に脂質結合グリコサミノグリカンを固着させて、そこに培養液を分注することで行うことができる。
【００６１】
本発明製造方法における工程（２）の固液分離手段は、常法を用いることが可能であるが、例えば濾過、遠心分離などの手法を、脂質結合グリコサミノグリカンを固着させる固相に応じて適宜選択して行うことができる。脂質結合グリコサミノグリカンが、マイクロプレートに固着している場合には、マイクロプレートと溶液とを分離し、好ましくは洗浄等の固液分離手段に付することにより、当該固相の回収は極めて容易に行うことができ、好ましいが、これに限定はされない。
【００６２】
本発明製造方法における工程（３）の「固相からグリコサミノグリカン結合性物質の溶出」は、例えばｐＨの変化、塩濃度の変化等を用いて行うことができる。好ましくは通常のアフィニティーカラムで用いられる手法である、塩濃度の変化を用いて溶出を容易に行うことができる。
【００６３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
調製例１：脂質結合グリコサミノグリカンの調製
ヘパリン（ブタ小腸由来：サイエンティフィック  プロテイン  ラボラトリーズ社製）、ヘパラン硫酸（牛腎臓由来：生化学工業株式会社製）、ヒアルロン酸（鶏冠由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ａ（クジラ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、デルマタン硫酸（鶏冠由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、コンドロイチン硫酸Ｄ（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）、及びコンドロイチン硫酸Ｅ（イカ軟骨由来：生化学工業株式会社製）を用いて脂質結合グリコサミノグリカンを調製した。脂質としてはホスファチジルエタノールアミンを用いた。具体的には以下の方法により合成を行なった。
【００６４】
特開平４−８０２０１の実施例１に記載された方法に従い、例えば以下のようにして脂質結合グリコサミノグリカンを調製した。
【００６５】
５００ｍｇのヒアルロン酸（ナトリウム塩：鶏冠由来、分子量約２３，０００、ＨＡ）を水１０ｍｌに溶解し、０．１ｍｏｌ／ｌヨウ素のメタノール溶液５ｍｌを加えて室温で６時間反応させた。その後、反応液に０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化カリウムを約５ｍｌ加えて遊離のヨウ素の色を消失させた。この溶液に酢酸カリウム飽和エタノールを加えて生じた沈澱を濾取し、充分にエタノールで洗浄し、減圧乾燥し、重量平均分子量約２３，０００の還元末端酸化ヒアルロン酸（ナトリウム塩）４２３ｍｇを得た。
【００６６】
４００ｍｇの上記の還元末端酸化ヒアルロン酸を水１０ｍｌに溶解し、５０ｍｌの強酸性イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ  ５０  （Ｈ＋））を１時間かけて通過させ、３９０ｍｇの還元末端ラクトンヒアルロン酸を含む水溶液を得た。
【００６７】
上記の水溶液をトリ−ｎ−ブチルアミン中で中和し、凍結乾燥して４００ｍｇの還元末端ラクトンヒアルロン酸のトリ−ｎ−ブチルアミン塩を得た。
【００６８】
４００ｍｇの上記で製造した還元末端ラクトンヒアルロン酸トリ−ｎ−ブチルアミン塩を２００ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解し、２７．６ｍｇのＬ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・ジパルミトイルのクロロホルム溶液を加えて、７０℃で２時間反応させ、クロロホルムを溜去し、過剰の酢酸ナトリウム水溶液を加えてナトリウム塩にした後、酢酸ナトリウム飽和エタノールを加えた。生じた沈澱を濾取し、０．３ｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム溶液に溶解し、疎水クロマトグラフィーカラム（ＴＳＫｇｅｌフェニルトヨパール６５０Ｍ、４００ｍｌ）に吸着させ、０．３ｍｏｌ／ｌ酢酸アンモニウム水溶液で充分に洗浄し、３０％メタノール水溶液で目的とする上記物質を溶出した。３０％メタノール水溶液溶出画分を減圧下濃縮し、凍結乾燥して精製し、３６ｍｇのＬ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・ジパルミトイル結合ヒアルロン酸（以下「ＨＡ−ＰＥ」と略記する）を得た。
【００６９】
同様に特開平４−８０２０１の実施例１に記載された方法に従って、Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・ジパルミトイル結合コンドロイチン硫酸Ａ（以下「ＣＳＡ−ＰＥ」と略記する）、Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・ジパルミトイル結合コンドロイチン硫酸Ｃ（以下「ＣＳＣ−ＰＥ」と略記する）、Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・ジパルミトイル結合デルマタン硫酸（以下「ＤＳ−ＰＥ」と略記する）、Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・ジパルミトイル結合コンドロイチン硫酸Ｄ（以下「ＣＳＤ−ＰＥ」と略記する）、Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・ジパルミトイル結合コンドロイチン硫酸Ｅ（以下「ＣＨＥ−ＰＥ」と略記する）、Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・ジパルミトイル結合ヘパリン（以下「Ｈｅｐ−ＰＥ」と略記する）、Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・ジパルミトイル結合ヘパラン硫酸（以下「ＨＳ−ＰＥ」と略記する）を合成した。
【００７０】
調製例２：脂質結合グリコサミノグリカンが結合したプレートの調製
上記調製例１で調製した各脂質結合グリコサミノグリカンが結合したプレートを調製した。すなわち、上記脂質結合グリコサミノグリカンを２０μｇ／ｍｌ濃度でＰＢＳに溶解した溶液を、ＥａｓｙＶｉｅｗ  ｇｌａｓｓ−ｂｏｔｔｏｍ  ９６穴プレート（岩城硝子株式会社製）の各ウェルに５０μｌずつ添加し、これを４℃で１０時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、１％で牛血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」とも記載する）を含むＰＢＳ（−）を用いてプレートをブロッキングして、各脂質結合グリコサミノグリカンが固着したプレートを調製した。
【００７１】
調製例３：発現ベクターの構築
タンパク質を発現させるためのプラスミドを作成した。
（１）ｐＣＩｋａｎａの作製
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック社製）をＮｄｅＩサイト及びＮｏｔＩサイトにて切断し、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子を含む断片を精製した。また、ｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＮｄｅＩサイト及びＮｏｔＩサイトにて切断し、イントロンを含む断片を精製した。このイントロンを含む断片を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子を含む断片のＮｄｅＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａを得た。
【００７２】
（２）ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃの作製
ｈｒＧＦＰ  ｃＤＮＡを増幅するために、ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−２ａ（ストラタジーン社製）を鋳型とし、配列番号１に示す塩基配列からなる５’プライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなる３’プライマーを用いてポリメラーゼチェインリアクション（以下「ＰＣＲ」とも記載する）を行った。
【００７３】
上記５’プライマーは、ｈｒＧＦＰ  ｃＤＮＡの翻訳開始コドンから１コドン分３’側にあるＧＴＧ配列を含み、さらに、マルチクローニングサイトを５’側に配置したものである。また、上記３’プライマーは、ｈｒＧＦＰ  ｃＤＮＡの停止コドンから１コドン分上流域側にあるＧＴＧ配列を含んだ１９塩基、１０個のアミノ酸からなるｍｙｃ  ｔａｇを２つタンデムにコードする配列、及び、上記プラスミドｐＣＩｋａｎａに遺伝子断片を組み込むためのＰｓｐＯＭＩサイトをタンデムに配したものである。
【００７４】
上記のプライマーを用いたＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュ社製）を用い、そのプロトコールに従って行った。このＰＣＲによって得られた増幅断片をｐＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）に挿入し、大腸菌（Ｏｎｅ  ＳｈｏｔＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ，インビトロジェン社製）の形質転換を行った。形質転換した大腸菌から、増幅断片が挿入されたｐＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｐＯＭＩで切断して、ｈｒＧＦＰと２つのＭｙｃタグとがつながったｃＤＮＡを含む断片を精製した。このＤＮＡ断片を常法に従って上記（１）で得たプラスミドｐＣＩｋａｎａのＥｃｏＲＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃを得た。
【００７５】
（３）ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃの作製
ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを増幅するために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１を鋳型として、配列番号３に示す５’プライマー及び配列番号４に示す３’プライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００７６】
上記５’プライマーは、ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡの、翻訳開始コドンから１コドン分３’側にあるＧＴＧ配列を含み、上記（２）にて得たプラスミドｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組込むためのＢｓｔＢＩサイトを５’側に配置したものである。また、３’プライマーは、ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡの、停止コドンから１コドン分上流域にあるＣＴＧ配列を含み、さらに、１０個のアミノ酸からなるｍｙｃ  ｔａｇをコードする配列、及び、上記（２）にて得たｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組み込むためのＢｓｔＢＩサイトをタンデムに配したものである。
【００７７】
上記プライマーを用いたＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュ社製）を用い、そのプロトコールに従って行った。このＰＣＲによって得られた増幅断片をｐＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）に挿入し、大腸菌（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ，インビトロジェン社製）の形質転換を行った。形質転換した大腸菌から、ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を精製した。この断片を、上記ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃの２つのＢｓｔＢＩサイト間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃを作製した。
【００７８】
上記プラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃは、５１２２塩基対からなるプラスミドで、ｐＵＣｏｒｉ、ＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｋａｎｒ／Ｎｅｏｒ、ＨＳＴＫｐｏｌｙＡ、ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、イントロン、マルチクローニングサイト、ＥＧＦＰ、３ｘＭｙｃ  ｔａｇ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡを有している。上記ｐＵＣｏｒｉは、プラスミドを複製させるために必要な配列である。上記Ｋａｎｒ／Ｎｅｏｒは、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子である。上記ＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒは、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子を発現させるためのプロモーター配列である。
【００７９】
また、上記マルチクローニングサイトは、制限酵素領域を複数有した配列であり、発現させたい遺伝子やｃＤＮＡ等を挿入するためのものである。マルチクローニングサイトに配された制限酵素領域は、５’側から順に、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＢＩである。
【００８０】
上記ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒは、マルチクローニングサイトに挿入された遺伝子やｃＤＮＡを発現させるためのプロモーター配列である。上記ＥＧＦＰは、蛍光標識タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子である。３ｘＭｙｃ  ｔａｇは、標識タンパク質であるＭｙｃタグをコードする塩基配列が３つ連続して設けられているものであり、この３ｘＭｙｃ  ｔａｇの下流領域に停止コドンが設けられている。したがって、マルチクローニングサイトに挿入された遺伝子を発現されると、このタンパク質のＣ末端の下流域にＥＧＦＰと３ｘＭｙｃタグとが融合した形態でタンパク質が生ずることとなる。
【００８１】
実施例
グリコサミノグリカン結合性タンパク質をコードするＤＮＡのスクリーニング
（１）ベクターの構築と組換体の調製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０日齢胎児）を使用して常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製した。このｃＤＮＡライブラリーからＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＫ０１３３２３（以下「クローン１」と記載する）及びＡＫ０１２１６９（以下「クローン２」と記載する）をポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）法により増幅した。各々を増幅させるための５’プライマー及び３’プライマーの組み合わせとして、配列番号５と配列番号６、及び配列番号７と配列番号８を使用した。これらを増幅するためのＰＣＲ法の反応条件は、９４℃３分を行なった後、９４℃３０秒、６０℃６０秒及び７２℃４分のサイクルを３０回繰り返して行なった。得られたＰＣＲ産物を常法に従って回収し、各々制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩを用いて消化した。
【００８２】
このように処理したＰＣＲ産物を、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＰＣＲ９６ウェルプレート（ミリポア社製）を用いて精製し、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩで消化したプラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃ（調製例３参照）のＢｇｌＩＩ領域とＮｏｔＩ領域との間に情報により挿入し、各々のｃＤＮＡを発現する組換ベクターを調製した。
【００８３】
この組換ベクターを使用して、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ．（インビトロジェン社製）を説明書に従って形質転換させた。この形質転換した大腸菌を培養して増殖させ、導入した発現ベクターを増幅し、これを抽出、精製し、ＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ社製）を用いてヒト２３９Ｔ細胞に導入して組換体を得た。
【００８４】
この組換体を０．３％（ＣＯ２／Ａｉｒ）、３７℃条件下、ＤＭＥＭ培地（ＦＣＳを１０％、ペニシリンを５μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシンを５μｇ／ｍｌで含む）中で培養し、培養上清を回収した。３，０００×ｇで遠心処理をし、上清のみを回収して検体としてスクリーニングに用いた。
【００８５】
（２）プレートを用いた検体のスクリーニング
調製例２で調製したプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、（１）で調製した検体を５０μｌずつ添加し、４℃で１０時間インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、プレートに固着した「各クローンとＧＦＰ蛍光タンパク質との複合体」を、フルオロアセント（大日本製薬株式会社製）を用いて説明書に従って測定した。陰性対照としては細胞外分泌型のＧＦＰタンパク質遺伝子を発現させて、この発現産物をプレートに添加した測定値を使用し、陰性対照の測定値と各検体の測定値との対比を行なった（クローン１：図１、クローン２：図２）。対照として各種脂質結合グリコサミノグリカンを使わずにブロッキングで使用したＢＳＡを固着させた実験群を使用した。
【００８６】
その結果、クローン１はヒアルロン酸に強い結合性を示すことが判明した。クローン２は、コンドロイチン硫酸Ｃ（サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸）に結合性を示すことが明らかとなり、またヒアルロン酸にも若干の結合性を有することが明かとなった。
【００８７】
この結果から、本発明スクリーニング法を用いることで、グリコサミノグリカンに対する結合性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの検出が効率よく行えることが明らかとなった。
【００８８】
【配列表】
2004170194.tif 000002
2004170194.tif 000003
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【００８９】
【発明の効果】
本発明により、グリコサミノグリカンに脂質が結合してなる「脂質結合グリコサミノグリカン」をグリコサミノグリカン結合性物質捕捉材として使用した「グリコサミノグリカン結合性物質のスクリーニング方法」が提供され、グリコサミノグリカン結合性を有する物質のスクリーニングを容易に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】クローン１の発現産物のグリコサミノグリカンへの結合性を示す図である。図中、Ｈｅｐ−ＰＥ、ＨＳ−ＰＥ、ＨＡ−ＰＥ、ＣＳＡ−ＰＥ、ＤＳ−ＰＥ、ＣＳＣ−ＰＥ、ＣＳＤ−ＰＥ、ＣＳＥ−ＰＥ、及びＢＳＡは実施例中に記載した略号と同義である。
【図２】クローン２の発現産物のグリコサミノグリカンへの結合性を示す図である。図中、Ｈｅｐ−ＰＥ、ＨＳ−ＰＥ、ＨＡ−ＰＥ、ＣＳＡ−ＰＥ、ＤＳ−ＰＥ、ＣＳＣ−ＰＥ、ＣＳＤ−ＰＥ、ＣＳＥ−ＰＥ、及びＢＳＡは実施例中に記載した略号と同義である。
【図１】
2004170194.tif 000012
【図２】
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