(57)【要約】【課題】本発明は、受容体がメディエータを含む包接錯体に固定化されたターゲット認識素子を提供することを目的とする。【解決手段】親水基１９ａおよび包接部位２１ａを有する第１ホスト分子１３ａと、親水基１９ｂおよび包接部位２１ｂを有する第２ホスト分子１３ｂと、前記第２ホスト分子１３ｂの親水基１９ｂに結合され、ターゲット２３と反応する受容体１５と、前記第１ホスト分子１３ａの包接部位２１ａと前記第２ホスト分子１３ｂの包接部位２１ｂとにより包接され、前記ターゲット２３と前記受容体１５との反応により発生した電荷を伝達するゲスト分子１３ｃとを含むターゲット認識素子を提供する。【選択図】      図１
2004264052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水基および包接部位を有する第１ホスト分子と、
親水基および包接部位を有する第２ホスト分子と、
前記第２ホスト分子の親水基に結合され、ターゲットと反応する受容体と、
前記第１ホスト分子の包接部位と前記第２ホスト分子の包接部位とにより包接され、前記ターゲットと前記受容体との反応により発生した電荷を伝達するゲスト分子と、
を含むターゲット認識素子。
【請求項２】
前記第１ホスト分子は第１カリックスアレーンであり、前記第２ホスト分子は第２カリックスアレーンであり、前記ゲスト分子はフラーレンである、請求項１に記載のターゲット認識素子。
【請求項３】
前記受容体は、酵素、抗体、ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）及びペプチドからなるグループから選ばれる１または複数の組み合わせである、請求項１に記載のターゲット認識素子。
【請求項４】
前記第２ホスト分子と前記受容体との間に、少なくとも１層の高分子膜をさらに含む、請求項１または２に記載のターゲット認識素子。
【請求項５】
前記高分子膜はポリ塩化ジアリルジメチルアンモニウム層とポリビニル硫酸カリウム層とを含む、請求項４に記載のターゲット認識素子。
【請求項６】
前記受容体を覆うポリイオンコンプレックス膜をさらに含む、請求項１に記載のターゲット認識素子。
【請求項７】
前記受容体は、ｐＨ４〜８かつ温度が１５〜４５℃の条件下で前記第２ホスト分子の親水基に結合されている、請求項１に記載のターゲット認識素子。
【請求項８】
親水基および包接部位を有する第１ホスト分子と、
親水基および包接部位を有する第２ホスト分子と、
前記第１ホスト分子の親水基が結合された電極と、
前記第２ホスト分子の親水基に結合され、ターゲットと反応する受容体と、
前記第１ホスト分子の包接部位と前記第２ホスト分子の包接部位とにより包接され、前記ターゲットと前記受容体との反応により発生した電荷を、前記電極に伝達するゲスト分子と、
を含むバイオセンサ。
【請求項９】
前記電極に接続された検出手段をさらに含む、請求項８に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記第１ホスト分子は第１カリックスアレーンであり、前記第２ホスト分子は第２カリックスアレーンであり、前記ゲスト分子はフラーレンである、請求項８に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記受容体は、酵素、抗体、ＤＮＡ及びペプチドからなるグループから選ばれる１または複数の組み合わせである、請求項８に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
前記第２ホスト分子と前記受容体との間に、少なくとも１層の高分子膜をさらに含む、請求項８〜１０のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
前記高分子膜はポリ塩化ジアリルジメチルアンモニウム層とポリビニル硫酸カリウム層とを含む、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１４】
前記受容体を覆うポリイオンコンプレックス膜をさらに含む、請求項８に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
前記受容体は、ｐＨ４〜８かつ温度が１５〜４５℃において前記第２ホスト分子の親水基に結合されている、請求項８に記載のバイオセンサ。
【請求項１６】
請求項９に記載のバイオセンサを用い、前記ターゲットと前記受容体との反応により生じる電荷を検出する、検出方法。
【請求項１７】
前記ゲスト分子がフラーレンであって、前記フラーレンを光励起する励起ステップをさらに含む、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１８】
請求項８に記載のバイオセンサの製造方法であって、
前記第１ホスト分子及び前記第２ホスト分子を含む溶液と前記ゲスト分子を含む溶液とを混合及び攪拌し、前記第１ホスト分子、前記第２ホスト分子及び前記ゲスト分子を含む包接錯体を生成する包接錯体生成ステップと、
電極の表面にアニオン性またはカチオン性の分子を結合させる電極形成ステップと、
前記電極形成ステップで形成された電極と、前記包接錯体内の前記第１ホスト分子の親水基とを結合させる包接錯体結合ステップと、
前記包接錯体内の前記第２ホスト分子の親水基と前記受容体とを結合させる受容体結合ステップとを含み、
前記包接錯体生成ステップで生成される包接錯体では、前記第１ホスト分子の包接部位と前記第２ホスト分子の包接部位とにより前記ゲスト分子が包接されている、バイオセンサの製造方法。
【請求項１９】
前記受容体結合ステップにおいて、ｐＨ４〜８かつ温度が１５〜４５℃の条件下で、前記第２ホスト分子の親水基と前記受容体とを結合する、請求項１８に記載のバイオセンサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、測定対象の物質と特異的に結合するターゲット認識素子及びそのターゲット認識素子を利用したバイオセンサ関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
バイオセンサは、酵素センサ、免疫センサ、微生物センサなどのセンサがあり、医療、食品、工業の分野など多くの分野において、物質の特定や対象物質（以下、ターゲットという）の各種測定のために重要視されている。
例えば、血液中のグルコース濃度から血糖値を測定するグルコースセンサがある。グルコースセンサは、電極と電極を覆うように設けられた酵素膜とを有している。酵素膜には、グルコースと特異的に反応する受容体としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）が固定化されている。
【０００３】
グルコースセンサでは、反応式（１）のようにグルコースがＧＯＤにより酸化され、グルコン酸とＨ２Ｏ２に分解される。
【０００４】
【化１】
2004264052.tif 000003
次に、反応式（１）において発生したＨ２Ｏ２は、電極と酵素膜との間の溶液中を電極面まで拡散し、電極において反応式（２）のように電気分解し電子が電極に移動する。
【０００５】
【化２】
2004264052.tif 000004
酵素膜へのグルコースの拡散及びＨ２Ｏ２の溶液中での拡散とグルコース濃度とは比例関係にあり、反応式（２）の電極反応による電流値を測定することでグルコースの濃度を得ることができる。しかし、このようなグルコースセンサは、酵素膜から電極への電子の移動がＨ２Ｏ２の電極への拡散速度や拡散濃度などに依存するため、高速かつ大電流での測定が困難である。
【０００６】
そこで、受容体と電極との間の電荷の移動をメディエータを介して行うバイオセンサの開発が行われている。図７はメディエータ型バイオセンサの動作原理を示したものであり、メディエータＭ、酵素Ｅ及び酵素Ｅと反応する基質Ｓの間で次のような反応が行われている。
酸化された酵素Ｅｏｘと基質Ｓとの酸化還元反応により電子の授受が行われ、還元された酵素Ｅｒｅｄと生成物Ｐが生成される。次に、還元された酵素Ｅｒｅｄと酸化されたメディエータＭｏｘとの酸化還元反応により、酸化された酵素Ｅｏｘと還元されたメディエータＭｒｅｄが生成される。最後に、還元されたメディエータＭｒｅｄと電極との酸化還元反応により、酸化されたメディエータＭｏｘ生成され、電極に電子が移動する。つまりこの酵素反応で発生した電子は、メディエータを介して酵素から電極まで高速かつ大量に移動する。このとき、酵素Ｅ及びメディエータＭでは、酸化・還元が繰り返し行われる。上記の酵素反応では、基質Ｓが酸化されて電子が電極に移動する場合であったが、基質Ｓが還元され電子を消費する場合には、逆のサイクルにより電子は電極から酵素へ移動する。
【０００７】
図８は、非特許文献１に記載のＣ６０フラーレンを用いたメディエータ型バイオセンサの電極部の構成を示す。メディエータであるＣ６０フラーレン２は、−ｓＳ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２からなる自己組織化単分子膜３を介して電極１に固定化されている。このとき、Ｃ６０フラーレン２と自己組織化単分子膜３とを結合するために、Ｃ６０フラーレン２の表面は、＝ＣＨ−ＣＯＯＨで修飾されている。また、酵素４とＣ６０フラーレン２とは結合されておらず、酵素４は液体中に浮遊している。
【０００８】
非特許文献１に示すバイオセンサでは、基質５であるグルコースと酵素４であるＧＯＤとの酸化還元反応により電子が発生し、この電子がＣ６０フラーレン２を介して電極１に伝達され、グルコース濃度が測定される。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５４，９−１３，１９９８
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
非特許文献１に記載のメディエータ型バイオセンサは、電子吸引性及び電子供与性の点で優れた特性を有するＣ６０フラーレン２を用いている。しかし、酵素４は液体中に浮遊しており、Ｃ６０フラーレン２と結合されていない。そのため、酵素４と基質５との間の酸化還元反応により電子の授受が行われた場合でも、酵素４とＣ６０フラーレン２とが結合されなければ、Ｃ６０フラーレン２が酵素４から電極１に高速かつ大量に電子を移動することができない。
【００１１】
さらに、Ｃ６０フラーレンを電極１上に固定するために、Ｃ６０フラーレン２の表面に修飾基が必要である。そのため、電気伝導に寄与するπ結合の電子分布が不均一となり、Ｃ６０フラーレン２が有する、電子吸引性、電子供与性などの特性を損なうという問題がある。
そこで、本発明は、受容体がメディエータを含む包接錯体に固定化されたターゲット認識素子を提供することを目的とする。
また、メディエータの表面に修飾基を用いることなく、電極に対するメディエータの位置を安定化することのできるバイオセンサを提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本願第１発明は、親水基および包接部位を有する第１ホスト分子と、親水基および包接部位を有する第２ホスト分子と、前記第２ホスト分子の親水基に結合され、ターゲットと反応する受容体と、前記第１ホスト分子の包接部位と前記第２ホスト分子の包接部位とにより包接され、前記ターゲットと前記受容体との反応により発生した電荷を伝達するゲスト分子とを含むターゲット認識素子を提供する。
【００１３】
第２ホスト分子と受容体とが結合され受容体が固定化されているので、受容体とターゲットとの反応を、常に第１ホスト分子と第２ホスト分子とにより包接されたゲスト分子の近くで行わせることができる。よって、この反応により生じる電荷を、ゲスト分子によって高速かつ大量に移動させることができる。また、第１及び第２ホスト分子は親水基を有しているので、ゲスト分子が不溶性であっても、ターゲット認識素子を溶液中で取り扱うことができ、例えば基板上にターゲット認識素子を容易に配列することができる。
【００１４】
本願第２発明は、前記第１発明において、前記第１ホスト分子は第１カリックスアレーンであり、前記第２ホスト分子は第２カリックスアレーンであり、前記ゲスト分子はフラーレンであるターゲット認識素子を提供する。
第１及び第２カリックスアレーンの包接部位が疎水性相互作用およびπ−π相互作用によりフラーレンを包接することで、メディエータである水不溶性のフラーレンを特別の修飾基を用いずに水溶性に変えることができる。よって、電気伝導に関与するπ電子の分布が均一に保たれるため、電子親和力が大きくイオン化エネルギーが小さいというフラーレンの有する特性が損なわれない。そのため、フラーレンによって高速かつ大量に電荷を移動させることができる。
【００１５】
本願第３発明は、前記第１発明において、前記受容体は、酵素、抗体、ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）及びペプチドからなるグループから選ばれる１または複数の組み合わせであるターゲット認識素子を提供する。
酵素、抗体、ＤＮＡまたはペプチドにより、生体物質を特異的に捕捉することができる。
本願第４発明は、前記第１または第２発明において、前記第２ホスト分子と前記受容体との間に、少なくとも１層の高分子膜をさらに含むターゲット認識素子を提供する。
【００１６】
高分子膜が第２ホスト分子と受容体との接着界面に平坦性を与え受容体の立体構造を壊すことがないので、受容体の失活を防ぐことができる。また、接着面積を増加させることができるので、第２ホスト分子と受容体とをより強く接着することができる。
本願第５発明は、前記第４発明において、前記高分子膜はポリ塩化ジアリルジメチルアンモニウム層とポリビニル硫酸カリウム層とを含むターゲット認識素子を提供する。
【００１７】
本願第６発明は、前記第１発明において、前記受容体を覆うポリイオンコンプレックス膜をさらに含むターゲット認識素子を提供する。
ポリイオンコンプレックス膜により受容体と第２ホスト分子との結合を強化することができるので、ターゲット認識素子の耐久性を高めることができる。
本願第７発明は、前記第１発明において、前記受容体は、ｐＨ４〜８かつ温度が１５〜４５℃の条件下で前記第２ホスト分子の親水基に結合されているターゲット認識素子を提供する。
【００１８】
前記条件下で受容体と第２ホスト分子を結合させることで、受容体の失活を防ぐことができる。
本願第８発明は、親水基および包接部位を有する第１ホスト分子と、親水基および包接部位を有する第２ホスト分子と、前記第１ホスト分子の親水基が結合された電極と、前記第２ホスト分子の親水基に結合され、ターゲットと反応する受容体と、前記第１ホスト分子の包接部位と前記第２ホスト分子の包接部位とにより包接され、前記ターゲットと前記受容体との反応により発生した電荷を、前記電極に伝達するゲスト分子とを含むバイオセンサを提供する。
【００１９】
受容体が第２ホスト分子に固定化されているので、常にゲスト分子の近くで受容体とターゲットとの反応を行わせることができる。よって、この反応により生じる電荷を、ゲスト分子によって受容体から電極へ高速かつ大量に移動させることができる。さらに、ゲスト分子を第１及び第２ホスト分子により包接して電極に安定に固定するので、電極に固定するための修飾基がゲスト分子に必要でない。よって、ゲスト分子が有する、電荷を高速かつ大量に移動させる性質が損なわれない。また、第１及び第２ホスト分子は親水基を有しているので、ゲスト分子が不溶性であっても、バイオセンサを溶液中で容易に取り扱うことができる。
【００２０】
本願第９発明は、前記第８発明において、前記電極に接続された検出手段をさらに含むバイオセンサを提供する。
電極に移動した電荷を検出手段により測定することができる。
本願第１０発明は、前記第８発明において、前記第１ホスト分子は第１カリックスアレーンであり、前記第２ホスト分子は第２カリックスアレーンであり、前記ゲスト分子はフラーレンであるバイオセンサを提供する。前記第２発明と同様の効果を有する。
【００２１】
本願第１１発明は、前記第８発明において、前記受容体は、酵素、抗体、ＤＮＡ及びペプチドからなるグループから選ばれる１または複数の組み合わせであるバイオセンサを提供する。前記第３発明と同様の効果を有する。
本願第１２発明は、前記第８から第１０発明のいずれかにおいて、前記第２ホスト分子と前記受容体との間に、少なくとも１層の高分子膜をさらに含むバイオセンサを提供する。前記第４発明と同様の効果を有する。
本願第１３発明は、前記第１２発明において、前記高分子膜はポリ塩化ジアリルジメチルアンモニウム層とポリビニル硫酸カリウム層とを含むバイオセンサを提供する。前記第５発明と同様の効果を有する。
【００２２】
本願第１４発明は、前記第８発明において、前記受容体を覆うポリイオンコンプレックス膜をさらに含むバイオセンサを提供する。前記第６発明と同様の効果を有する。
本願第１５発明は、前記第８発明において、前記受容体は、ｐＨ４〜８かつ温度が１５〜４５℃において前記第２ホスト分子の親水基に結合されているバイオセンサを提供する。前記第７発明と同様の効果を有する。
本願第１６発明は、請求項９に記載のバイオセンサを用い、前記ターゲットと前記受容体との反応により生じる電荷を検出する検出方法を提供する。
【００２３】
第９発明のバイオセンサを用いて効率よく電荷を検出することができる。
本願第１７発明は、前記第１６発明において、前記ゲスト分子がフラーレンであって、前記フラーレンを光励起する励起ステップをさらに含む検出方法を提供する。
フラーレンに光を照射することによりフラーレンが光励起されるので、電子親和力が大きくイオン化エネルギーが小さいというフラーレンの性質を高めることができる。よって、バイオセンサとしての反応速度を速くし、反応感度を高めることができる。
【００２４】
本願第１８発明は、請求項８に記載のバイオセンサの製造方法であって、前記第１ホスト分子及び前記第２ホスト分子を含む溶液と前記ゲスト分子を含む溶液とを混合及び攪拌し、前記第１ホスト分子、前記第２ホスト分子及び前記ゲスト分子を含む包接錯体を生成する包接錯体生成ステップと、電極の表面にアニオン性またはカチオン性の分子を結合させる電極形成ステップと、前記電極形成ステップで形成された電極と、前記包接錯体内の前記第１ホスト分子の親水基とを結合させる包接錯体結合ステップと、前記包接錯体内の前記第２ホスト分子の親水基と前記受容体とを結合させる受容体結合ステップとを含み、前記包接錯体生成ステップで生成される包接錯体では、前記第１ホスト分子の包接部位と前記第２ホスト分子の包接部位とにより前記ゲスト分子が包接されている、バイオセンサの製造方法を提供する。
【００２５】
前記第８発明と同様の効果を有するバイオセンサを製造することができる。
本願第１９発明は、前記第１８発明において、前記受容体結合ステップにおいて、ｐＨ４〜８かつ温度が１５〜４５℃の条件下で、前記第２ホスト分子の親水基と前記受容体とを結合するバイオセンサの製造方法を提供する。前記第７発明と同様の効果を有する。
【００２６】
【発明の実施の形態】
＜基本構成＞
図１（ａ）は本発明に係るメディエータ型バイオセンサの電極部の基本構成を示す。メディエータ型バイオセンサは、電極１１及び電極１１に固定されたターゲット認識素子１０を有している。ターゲット認識素子１０は、包接錯体１３と、包接錯体１３に固定された受容体１５とを有している。包接錯体１３は、第１ホスト分子１３ａ、第２ホスト分子１３ｂ及びゲスト分子１３ｃを有している。第１ホスト分子１３ａは親水基１９ａと包接部位２１ａを有しており、同様に第２ホスト分子１３ｂも親水基１９ｂと包接部位２１ｂを有している。包接錯体１３は、第１ホスト分子１３ａの包接部位２１ａと第２ホスト分子１３ｂの包接部位２１ｂとによりゲスト分子１３ｃを包接するように構成されており、全体として親水基１９ａ及び１９ｂとに取り囲まれている。ここで、包接されたゲスト分子１３ｃは、受容体１５から電極へ電荷を伝達するメディエータとして働く。例えば、ゲスト分子１３ｃとしてはフラーレン、第１及び第２ホスト分子１３ａ、１３ｂとしてはカリックスアレーンが挙げられる。また、第１及び第２ホスト分子１３ａ、１３ｂは、異なる物質であっても良い。なお、同一の物質であると、包接錯体１３の作成が容易であり好ましい。例えば、第１及び第２ホスト分子１３ａ、１３ｂの材料としてＡ、Ｂの２種類の物質を用いて包接錯体１３を作成する場合、調製中に３種類の複合体（ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ）が生成される。そのため、これらの複合体を分離する必要があり包接錯体１３の作成が困難となる。一方、同一物質を用いる場合は分離する必要はないため、作成が容易である。さらに、同一物質であると、電極１１側の第１ホスト分子１３ａの物質と電極１１の反対側の第２ホスト分子１３ｂの物質とを区別する必要がなく、包接錯体１３の固定化の制御が容易である。
【００２７】
電極１１は、第１ホスト分子１３ａの親水基１９ａと静電相互作用によりイオン結合している。電極１１と包接錯体１３との結合は、イオン結合に限定されず、共有結合、配位結合など種々の結合が考えられる。電極１１としては、不活性な電極であれば良く、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、ＩＴＯ、カーボンなどの電極が使用される。カーボンを使用すると、安価、加工が容易、比較的安定な電極を得ることができるので好ましい。
受容体１５は、第２ホスト分子１３ｂの親水基１９ｂにより包接錯体１３に固定されている。受容体１５と親水基１９ｂとの結合は、イオン結合、共有結合などにより結合されている。受容体１５は酵素、抗体、ＤＮＡ、細胞またはペプチドのいずれか、あるいはそれらの組み合わせであると、生体物質を特異的に捕捉することができるので好ましい。
【００２８】
図１（ｂ）は、図１（ａ）のバイオセンサの動作を説明する模式図である。ターゲット２３は、受容体１５により捕捉される物質である。このバイオセンサは、次のように動作する。ターゲット２３は受容体１５により捕捉され、ターゲット２３と受容体１５との間で酸化還元反応が生じる。この酸化還元反応により電子ｅ−が発生し、この発生した電子ｅ−は例えば、第１及び第２ホスト分子１３ａ、１３ｂにより包接されたゲスト分子により電極１１に伝達される。電極１１での電荷の変化を測定することによりターゲット２３の存在、含有量等を測定することができる。図１（ｂ）では、マイナスの電荷が移動する場合を説明しているが、プラスの電荷が移動しても良い。
【００２９】
このようなバイオセンサは、第２ホスト分子１３ｂと受容体１５とが結合することにより、受容体１５が包接錯体１３に固定されている。よって、受容体１５とターゲット２３との反応を、常に第１ホスト分子１３ａと第２ホスト分子１３ｂとにより包接されたゲスト分子１３ｃの近傍において行わせることができる。よって、この反応により生じる電荷を、ゲスト分子１３ｃによって受容体１５から電極１１へ高速かつ大量に移動させることができる。また、第１及び第２ホスト分子１３ａ、１３ｂは親水基１９ａ、１９ｂを有しているので、ゲスト分子１３ｃが不溶性であっても、溶液中のターゲット２３を測定するなど溶液中でゲスト分子１３ｃを取り扱うことができる。また、例えば基板上にターゲット認識素子１０を容易に配列することができる。
＜第１実施形態例＞
図２は、第１実施形態例に係るバイオセンサの構成を示している。前記図１及び図２を参照して第１実施形態例のバイオセンサを説明する。
［バイオセンサの構成］
第１実施形態例に係るバイオセンサでは、包接錯体１３に受容体１５が固定化されたターゲット認識素子１０が電極１１に固定されている。ここで、ゲスト分子１３ｃがＣ６０フラーレンであり、第１及び第２ホスト分子１３ａ、１３ｂがカリックス［３］アレーンを含んでいる。カリックス［３］アレーンは、３つのフェノール誘導体をメタ位で環状に接続した構造であり、フェノール部分の酸素原子側が親水基で構成され、フェノール部分と反対のベンゼン環側の包接部位でＣ６０フラーレンを包接する。ここで、包接部位は疎水基で構成されている。図２に示すカリックス［３］アレーンの親水基は、カチオン性の４級アミンにより修飾されプラスに帯電している。また、電極１１には金が使用され、アニオン性のカルボン酸により修飾されマイナスに帯電している。よって、電極１１とカリックス［３］アレーンの親水基とが静電相互作用により結合している。受容体１５には、例えば血液中のピルビン酸をターゲットとして反応する酵素である乳酸デヒドロゲナーゼが使用されている。酸性の等電点を有する乳酸デヒドロゲナーゼは中性の水溶液中ではマイナスに帯電しており、カリックス［３］アレーンの親水基と静電相互作用により結合している。
【００３０】
上記では、カリックス［３］アレーンの親水基がプラスに、酵素の表面及び電極１１の表面がマイナスに帯電しているが、カリックス［３］アレーンの親水基をマイナスに帯電させ、酵素の表面及び電極１１の表面をプラスに帯電させても構わない。また、受容体１５と包接錯体１３との結合及び包接錯体１３と電極１１との結合は静電相互作用ではなく、共有結合などその他の結合であっても良い。
メディエータであるゲスト分子１３ｃは、Ｃ６０フラーレン以外の例えば、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８２、Ｃ８４、Ｃ８６、Ｃ８８、Ｃ９０、Ｃ９２、Ｃ９４、Ｃ９６などの高次フラーレンでもよい。また、Ｌａ原子などを内包したフラーレンであると、電子が内包原子からフラーレンに供給されフラーレンが電子過剰の状態になるので、フラーレンの電気伝導度が向上するばかりではなく、初期応答速度が速くなり好ましい。
【００３１】
また、図２においては、第１及び第２ホスト分子１３ａ、１３ｂは、同一のカリックス［３］アレーンであるが、第１ホスト分子１３ａはカリックス［４］アレーンで、第２ホスト分子１３ｂはカリックス［３］アレーンのように異なるカリックスアレーンを使用しても良い。なお、同一のカリックスアレーンを使用すると、前述のように包接錯体１３を調製し易いので好ましい。
上記では、ピルビン酸を検出するために、受容体１５として酵素である乳酸デヒドロゲナーゼを使用したが、検出するターゲットに応じて他の酵素を使い分けることができる。他の酵素として、例えばオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ）、デヒドロゲナーゼ（例えばアルコールデヒドロゲナーゼ）、レダクターゼ（例えばアドレノイドキシン）、オキシゲナーゼ、ヒドロペルオキシダーゼ（例えばカタラーゼ）、ウレアーゼ、クレアチニンデアミナーゼなどを使用しても良い。酵素としてウレアーゼを使用した場合には血中尿素窒素ＢＵＮ（Ｂｌｏｏｄ  Ｕｒｅａ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ）を、クレアチニンデアミナーゼを使用した場合にはクレアチニンを測定することができ、腎疾患の判定などをすることができる。
【００３２】
前述のバイオセンサでは、第１及び第２ホスト分子１３ａ、１３ｂであるカリックス［３］アレーンの包接部位の疎水性相互作用およびπ−π相互作用によりＣ６０フラーレンを包接し、電極１１に安定に固定している。このとき、Ｃ６０フラーレンは、カリックス［３］アレーンにより浮遊した状態で包接されており、修飾基は結合されていない。よって、電気伝導に関与するπ電子の分布が均一に保たれるため、電子親和力が大きくイオン化エネルギーが小さいというフラーレンの有する特性が損なわれない。そのため、受容体からＣ６０フラーレン及び電極へ高速かつ大量に電荷を移動させることができる。また、カリックス［３］アレーンの包接部位と反対側が、親水基のフェノールで構成されているため、水不溶性のＣ６０フラーレンをカリックス［３］アレーンで包接することで、修飾基を用いずに水溶性に変えることができる。よって、バイオセンサを溶液中で容易に取り扱うことができる。
［バイオセンサを用いた検出方法］
図３（ａ）、（ｂ）は、検出部が設けられたバイオセンサの一例を示す。図３（ａ）では、前記図２のターゲット認識素子４２が電極４０に固定され、電極４０が検出部４５に接続されている。ターゲット認識素子４２が固定化された電極４０の部分に試料を滴下し、電流を検出部４５により測定し、試料内のターゲットの濃度等に換算する。
【００３３】
一方、図３（ｂ）ではターゲット認識素子４２が固定された電極４０の先端を試料溶液に浸漬し、検出部４５により電流の測定を行う。
なお、測定の際に、外部からターゲット認識素子４２に光を照射すると、Ｃ６０フラーレンが光励起されるので、電子親和力が大きくイオン化エネルギーが小さいというフラーレンの性質を高めることができる。よって、ターゲット認識素子としての反応速度を速くし、反応感度を高めることができる。フラーレンが光励起される波長は広いが、特に６２０ｎｍ以下の波長に対して効率良く励起される。このような波長を有する光源として、赤色ＬＥＤやＡｒレーザーが用いられる。
［バイオセンサの製造方法］
第１実施形態例のバイオセンサは次のように製造される。カリックス［３］アレーンとＣ６０フラーレンとを水溶液中に混合し、この混合液を攪拌する。攪拌に超音波処理を用いると好ましい。この処理により、Ｃ６０フラーレンがカリックス［３］アレーンの包接部位である疎水基に包接され、包接錯体１３が生成される。電極１１、カリックス［３］アレーンの親水基をアニオン性またはカチオン性の分子で修飾する。このとき、電極１１とカリックス［３］アレーンとの結合およびカリックス［３］アレーンと乳酸デヒドロゲナーゼとの結合が静電相互作用で結合するように修飾する。修飾された包接錯体１３、電極１１及び乳酸デヒドロゲナーゼを結合し、ターゲットであるピルビン酸を測定可能なバイオセンサを得る。このとき、乳酸デヒドロゲナーゼと包接錯体１３との結合を、ｐＨ４〜８かつ温度が１５〜４５℃の条件下で行うと、酵素の失活を防ぐことができるので好ましい。
＜実験例１＞
Ｃ６０フラーレンを、カリックス［３］アレーンで包接した包接錯体を作成し、包接錯体に受容体として乳酸デヒドロゲナーゼを固定化する場合の実験例を以下に示す。
（１）カリックス［３］アレーンの合成
まず、カリックス［３］アレーンのトリエステル体を原料として、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンジアミンを過剰に添加し、アミノリシスによりカリックス［３］アレーンの前駆体を合成した。この前駆体をジメチル硫酸を用いてＮ−メチル化することにより、４級アミンを末端に持つカリックス［３］アレーンを合成した。
（２）カリックス［３］アレーン及びＣ６０フラーレンの調製
上記のように合成したカリックス［３］アレーンの水溶液（１０ｍｌ、０．５ｍｍｏｌ／ｄｍ３）とＣ６０フラーレン（７２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を混合して、攪拌と超音波処理を繰り返し、溶け残ったフラーレンを遠心分離により取り除き、カリックス［３］アレーン及びＣ６０フラーレンの錯体である包接錯体水溶液を調製した。このとき生成された包接錯体の横幅は約１ｎｍ、高さは約２ｎｍであった。
（３）電極の準備
一方、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを含有するエタノール溶液に金電極を浸して表面にアニオン性の分子がついた電極１１を作成した。
（４）包接錯体の固定
前記（３）で準備した電極を包接錯体の水溶液（０．２５ｍｍｏｌ／ｄｍ３）に浸すことで、包接錯体を電極上に緻密に配列し、バイオセンサを製造した。このとき包接錯体は電極と静電相互作用によって接続した。
（５）受容体の固定
その後、乳酸デヒドロゲナーゼ（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含有するＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ＝７．０）に、包接錯体が配列された電極を室温で２０分間浸して酵素を静電相互作用により包接錯体上に固定化した。
【００３４】
上記の製造方法によって得られた第１実施形態例のバイオセンサのサイクリックボルタンメトリー測定法で得られた電気特性を図６に示す。１２５μＭの還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤＨ）と０〜２５０μＭのピルビン酸とを混合した溶液に、乳酸脱水酵素（ＬＤＨ）を固定化したバイオセンサチップを浸漬したときの特性図である。微量なピルビン酸を感度良く測定できるバイオセンサチップを得ることができた。
＜第２実施形態例＞
受容体１５が抗体、ＤＮＡ、細胞及びまたはペプチドである第１実施形態例に示す構成のバイオセンサについて説明する。
［抗体］
受容体１５が抗体である場合、受容体１５が特異的に反応する抗原をターゲットとし、その存在、濃度などを測定することができる。抗原の種類は、ウィルス、細菌、花粉、カビ、ダ二などが挙げられる。例えば、抗体が「マウスＩｇＧ」、抗原が「プロテインＡ」である場合を説明する。
【００３５】
まず、マウスに抗原である「プロテインＡ」を注射し、マウス生来の免疫応答を利用して「マウスＩｇＧ」抗体を作る。この抗体「マウスＩｇＧ」を抽出，精製して、包接錯体１３に固定化する。静電相互作用や共有結合によって固定化するためには、マウスＩｇＧのＦｃ部をカルボキシル基やアミノ基などで修飾しておく。ここにプロテインＡを注入すると、プロテインＡとマウスＩｇＧは特異的に結合する。極性分子からなるプロテインＡから発生した電荷は、抗体、包接錯体１３を介して電極１１に至る。この電極１１に流れる電流を測定することで、抗原であるプロテインＡの定量を行うことができる。
［ＤＮＡ］
受容体１５がターゲットであるＤＮＡと特異的に反応するプローブＤＮＡの場合、ターゲットＤＮＡを検知する方法を説明する。
【００３６】
ＤＮＡは二重らせん構造をとるが、バイオセンサの受容体１５として使用するときは１本鎖にして用いる。まず、ターゲットＤＮＡの塩基配列と相補性を持つＤＮＡ１本鎖を人工的に有機合成し、プローブＤＮＡを生成する。このプローブＤＮＡを包接錯体１３上に固定化する。次に、所望のＤＮＡを生体試料から抽出・精製した後、例えば９５度で加熱して１本鎖にする。このＤＮＡとプローブＤＮＡの塩基配列が相補的である場合、つまり試料内のＤＮＡが検知したいＤＮＡ塩基配列を持つ場合、両者は結合して二重らせん構造をとる。ここで、二重らせん構造に対して特異的に結合し、電荷発生源となるインターカレータを二重らせん構造の間隙挿入する。これにより二重らせん構造の有無、すなわち試料内のＤＮＡが目的の塩基配列を持つかどうかを、電極１１に流れる電流の変化により判定する。
［細胞］
受容体１５が細胞である場合、ターゲットである抗原を検知する方法を説明する。ＮＫ細胞やＢ細胞などの免疫細胞を生体から抽出・精製し、包接錯体１３に固定化する。細胞表面に結合しているタンパク質分子の末端基を利用して包接錯体１３に固定化すると、容易に固定化でき好ましい。抗原は、ウィルス、細菌、花粉、カビ、ダ二などが挙げられる。試料内に細胞を固定化したバイオセンサを導入すると、受容体１５である細胞が抗原を取り込み、細胞内部の酵素によって抗原を分解する。この分解過程で生じた電荷が、包接錯体１３を介して電極１１に移動する。このときの電極１１に流れる電流を測定することで、抗原の定量を行うことができる。
［ペプチド］
受容体１５がペプチドである場合、ターゲットであるペプチドを検知する方法を説明する。所望するターゲットと特異的に反応するプローブペプチドを遺伝子工学の手法を用いてファージに作らせる。それを抽出・精製し、包接錯体１３に固定化する。この包接錯体１３を有するバイオセンサを試料に注入すると、プローブペプチドを構成するアミノ酸の側鎖が有する荷電状態に対応したペプチドとプローブペプチドとが結合する。このとき、電極１１に流れる電流を測定することができ、目的とするターゲットペプチドを検知、定量することができる。
＜第３実施形態例＞
図４（ａ）、（ｂ）は、第３実施形態例に係るバイオセンサの構成を示している。図１と同一の符号番号は第１実施形態例と同様の構成要素を表す。図４（ａ）のバイオセンサには、図１のターゲット認識素子１０にさらに高分子膜５０が設けられている。高分子膜５０は、第２ホスト分子１３ｂと受容体１５との間に設けられている。このような高分子膜５０は、第２ホスト分子１３ｂと受容体１５との接着界面に平坦性を与え受容体１５の立体構造を壊すことがないので、受容体１５の失活を防ぐことができる。また、接着面積を増加させることができるので、第２ホスト分子１３ｂと受容体１５とをより強く接着することができる。
【００３７】
図４（ｂ）に示すように、高分子膜５０は、２層構造の高分子膜５２，５４であっても良い。例えば、包接錯体１３上にカチオン性高分子膜であるＰＤＤＡ（ボリ塩化ジアリルジメチルアンモニウム）５２を形成し、その上にアニオン性高分子膜であるＰＶＳ（ポリビニル硫酸カリウム）５４を形成して、酵素を包接錯体１３に固定化する。このように、高分子膜５０をアニオン性とカチオン性の２層構造とすることで、マイナスに帯電した酵素の代わりにプラスに帯電した酵素も固定化することができる。また、高分子膜５０は２層以上であっても良い。
＜実験例２＞
Ｃ６０フラーレンを、カリックス［３］アレーンで包接した包接錯体を作成し、包接錯体に高分子膜及び受容体として乳酸デヒドロゲナーゼを固定した場合の実験例を以下に示す。
（１）カリックス［３］アレーンの合成
まず、カリックス［３］アレーンのトリエステル体を原料として、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンジアミンを過剰に添加し、アミノリシスによりカリックス［３］アレーンの前駆体を合成した。この前駆体をジメチル硫酸を用いてＮ−メチル化することにより、４級アミンを末端に持つカリックス［３］アレーンを合成した。
（２）カリックス［３］アレーン及びＣ６０フラーレンの調製
上記のように合成したカリックス［３］アレーンの水溶液（１０ｍｌ、０．５ｍｍｏｌ／ｄｍ３）とＣ６０フラーレン（７２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を混合して、攪拌と超音波処理を繰り返し、溶け残ったフラーレンを遠心分離により取り除き、カリックス［３］アレーン及びＣ６０フラーレンの錯体である包接錯体水溶液を調製した。このとき生成された包接錯体の横幅は約１ｎｍ、高さは約２ｎｍであった。
（３）電極の準備
一方、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを含有するエタノール溶液に金電極を浸して表面にアニオン性の分子がついた電極１１を作成した。
（４）包接錯体の固定
前記（３）で準備した電極を包接錯体の水溶液（０．２５ｍｍｏｌ／ｄｍ３）に浸すことで、包接錯体を電極上に緻密に配列し、バイオセンサを製造した。このとき包接錯体は電極と静電相互作用によって接続した。
（５）高分子膜の固定
電極に固定した包接錯体を、ＰＤＤＡ（６ｍｇ／ｍｌ）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）に室温で２０分間浸し、ＰＤＤＡ層を静電相互作用により包接錯体上に成膜した。超純水で洗浄した後、ＰＶＳ（４ｍｇ／ｍｌ）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）に電極を室温で２０分間浸し、ＰＶＳ層を静電相互作用によりＰＤＤＡ層上に成膜した。
（６）受容体の固定
その後、ＰＶＳ層の上に乳酸デヒドロゲナーゼ（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含有するＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ＝７．０）に、包接錯体が配列された電極を室温で２０分間浸して酵素を静電相互作用により包接錯体上に固定化した。
＜第４実施形態例＞
図５は、第４実施形態例に係るバイオセンサの構成を示している。図１と同一の符号番号は第１実施形態例と同様の構成要素を表す。図５のバイオセンサには、図１のターゲット認識素子１０にさらにポリイオンコンプレックス膜５６が設けられている。ポリイオンコンプレックス膜５６は受容体１５の上部に設けられており、受容体１５と第２ホスト分子１３ｂとの結合を強化する。よって、バイオセンサの耐久性を高めることができる。ポリイオンコンプレックス膜５６としては、例えばカチオン性の調ポリ−Ｌ−リジンやアニオン性のグルタミン酸やアクリル酸などのポリイオンコンプレックス膜が挙げられる。
＜実験例３＞
Ｃ６０フラーレンを、カリックス［３］アレーンで包接した包接錯体を作成し、包接錯体に受容体として乳酸デヒドロゲナーゼを固定し、ポリイオンコンプレックス膜さらに固定する場合の実験例を以下に示す。
（１）カリックス［３］アレーンの合成
まず、カリックス［３］アレーンのトリエステル体を原料として、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンジアミンを過剰に添加し、アミノリシスによりカリックス［３］アレーンの前駆体を合成した。この前駆体をジメチル硫酸を用いてＮ−メチル化することにより、４級アミンを末端に持つカリックス［３］アレーンを合成した。
（２）カリックス［３］アレーン及びＣ６０フラーレンの調製
上記のように合成したカリックス［３］アレーンの水溶液（１０ｍｌ、０．５ｍｍｏｌ／ｄｍ３）とＣ６０フラーレン（７２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を混合して、攪拌と超音波処理を繰り返し、溶け残ったフラーレンを遠心分離により取り除き、カリックス［３］アレーン及びＣ６０フラーレンの錯体である包接錯体水溶液を調製した。このとき生成された包接錯体の横幅は約１ｎｍ、高さは約２ｎｍであった。
（３）電極の準備
一方、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを含有するエタノール溶液に金電極を浸して表面にアニオン性の分子がついた電極１１を作成した。
（４）包接錯体の固定
前記（３）で準備した電極を包接錯体の水溶液（０．２５ｍｍｏｌ／ｄｍ３）に浸すことで、包接錯体を電極上に緻密に配列し、バイオセンサを製造した。このとき包接錯体は電極と静電相互作用によって接続した。
（５）受容体の固定
その後、乳酸デヒドロゲナーゼ（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含有するＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ＝７．０）に、包接錯体が配列された電極を室温で２０分間浸して酵素を静電相互作用により包接錯体上に固定化した。
（６）ポリイオンコンプレックス膜の固定
包接錯体に酵素を固定化した後、ポリイオンコンプレックス膜を、酵素の表面に１ｍＭ溶液のＰｏ１ｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅをキャスト法を用いて形成した。
【００３８】
【発明の効果】
本発明を用いれば、受容体がメディエータを含む包接錯体に固定化されたターゲット認識素子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）本発明に係るメディエータ型バイオセンサの電極部の基本構成を示す図。
（ｂ）（ａ）のバイオセンサの動作を説明する説明図。
【図２】第１実施形態例に係るバイオセンサの構成。
【図３】（ａ）検出部が設けられたバイオセンサの一例（１）。
（ｂ）検出部が設けられたバイオセンサの一例（２）。
【図４】（ａ）第３実施形態例に係るバイオセンサの構成（１）。
（ｂ）第３実施形態例に係るバイオセンサの構成（２）。
【図５】第４実施形態例に係るバイオセンサの構成。
【図６】第１実施形態のバイオセンサにおける電気特性。
【図７】メディエータ型バイオセンサの動作原理を説明する説明図。
【図８】従来のＣ６０フラーレンを用いたメディエータ型バイオセンサの電極部の構成。
【符号の説明】
１  電極
２  Ｃ６０フラーレン
３  自己組織化単分子膜
４  酵素
５  基質
１０、４２  ターゲット認識素子
１１、４０  電極
１３  包接錯体
１３ａ  第１ホスト分子
１３ｂ  第２ホスト分子
１３ｃ  ゲスト分子
１５  受容体
１９ａ、１９ｂ  親水基
２１ａ、２１ｂ  包接部位
２３  ターゲット
４５  検出部
５０、５２、５４  高分子膜
５６  ポリイオンコンプレックス膜
【図１】
2004264052.tif 000005
【図２】
2004264052.tif 000006
【図３】
2004264052.tif 000007
【図４】
2004264052.tif 000008
【図５】
2004264052.tif 000009
【図６】
2004264052.tif 000010
【図７】
2004264052.tif 000011
【図８】
2004264052.tif 000012