(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ヘパリナーゼをコードする遺伝子および大量のヘパリナーゼの生産を容易にする発現用システムと、遺伝子を改変し、改変された特異性および他の所望の特性を有する組換えヘパリナーゼの生産の方法と手段と、サイトカイン−プロテオグリカン相互作用の領域で、繊維芽細胞成長因子−ヘパリン相互作用により例証されるように、道具または診断剤として使用する純粋なヘパリナーゼとを、提供する。【解決手段】単離された核酸分子であって、以下：（ａ）ヌクレオチド配列（特定の塩基配列）からなる、ＤＮＡ；および（ｂ）（ａ）のＤＮＡまたはその相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヘパリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ、からなる群より選択されるＤＮＡからなる、核酸分子。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）ヌクレオチド配列（配列番号１の塩基対１７３〜１３２４）
【化１】
2004057201.tif 000017
からなる、ＤＮＡ；および
（ｂ）（ａ）のＤＮＡまたはその相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヘパリナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ、
からなる群より選択されるＤＮＡからなる、核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）アミノ酸配列（配列番号２）
【化２】
2004057201.tif 000018
からなる、タンパク質；および
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリナーゼ活性を有する、タンパク質、
からなる群より選択されるタンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項３】
改変された、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍからのヘパリナーゼＩ、をコードする核酸分子を得るための方法であって、以下：
配列番号２の配列をコードする核酸分子を変異させる工程、
適切な宿主において該変異した配列を発現させる工程、および
該発現したヘパリナーゼを酵素活性についてスクリーニングする工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的にヘパリナーゼの技術分野に関し、特に、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ中で発現するヘパリナーゼＩをコードする遺伝子に向けられる。
【０００２】
【従来の技術】
（発明の背景）
アメリカ合衆国政府が、国立衛生研究所の認可番号２５８１０により、本発明の権利を有する。
【０００３】
ヘパリンは、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン（ｓｅｒｐｉｎｓ））を活性化する抗凝血剤である。このヘパリンは、血液凝固カスケードにおいて、Ｄａｍｕｓら、Ｎａｔｕｒｅ　２４６：３５５−３５７（１９７３）により記載のように、鍵となる役割を演じる。Ｌｉｎｄａｈｌら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１；２２１−２２５（１９８６）によれば、ヘパリンは、現在既知である、最も酸性の天然ポリマーである。それは、Ｄ−ウロン酸１，４−β−Ｄ−グルコサミンである１，４結合ジサッカライドの主要な繰り返し単位からなり、モノサッカライド単位あたり４価の平均負電価（３つの硫酸基および１つのカルボキシラト基（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ　ｇｒｏｕｐ））を有する。ヘパリンは、Ｋｕｓｃｈｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７：６５５１−６５５５（１９８０）およびＣｏｍｐｅｒ、Ｐｏｌｙｍｅｒ
Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ　７，１９８１による報告のように、３，０００〜４５，０００ダルトンの平均分子量を有する多分散系であり、かつＤ−グルクロン酸のＬ−イズロン酸への部分的エピマー化、および不完全なＮおよびＯ−硫酸化により不均質である。
【０００４】
さらに、ヘパリンのようなプロテオグリカンは、広範囲の生物学的作用を有し、これには、血液化学、成長因子相互作用および傷治癒、細胞外マトリックスおよび免疫応答を介した細胞における塩基性構造タンパク質との相互作用を含む。タンパク質／ペプチド／ヘパリン／複合体炭水化物相互作用の基本的性質が、重要である。ヘパリンは、かなり不均質であると考えられるが、Ｃａｒｄｉｎ，Ａ．Ｄ．およびＨ．Ｊ．Ｒ．Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　９，２１−３２（１９８９）により論評されるように、異なるヘパリン画分が、その生物学的役割に対して、なんらかの組成上、そして、おそらく構造上の特異性を示唆する明瞭で独特な特性を示すことは、現在、まったく明らかである。
【０００５】
ヘパリナーゼは、ヘパリンリアーゼとも呼ばれ、詳細にわたって特徴づけられているヘパリンを分解し得る唯一の既知の酵素である。ヘパリナーゼは、酵素委員会により、ＥＣ４．２．２．７と命名されている。Ｇａｌｌｉｈｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：２５２（１９８２）によれば、本酵素は、グラム陰性土壌単離菌であるＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍのペリプラズム空間に見出されるポリサッカライドリアーゼである。ＨｏｖｉｎｇおよびＬｉｎｋｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：６１７０（１９７０）に記載のように、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍは、ヘパリンを、炭素および窒素の唯一の供給源として利用する。ヘパリナーゼは、ヘパリン異化の最初の酵素である。構成的には小量しか分泌されないが、Ｇａｌｌｉｈｅｒら、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：３６０（１９８１）は、酵素発現が、ヘパリンにより誘導され、培地中の硫化物により可逆的に抑制されることが発見された。Ｌｉｎｄｂａｒｄｔら、Ａｐｐｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４１（１９８４）は、ヘパリナーゼが他のポリアニオン性ポリサッカライドにより阻害されることを示した。
【０００６】
ヘパリナーゼは、標準的クロマトグラフ技術により精製され、その酵素特性が詳細にわたって明らかになった。これは、Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１８４９（１９８５）を含む科学者により記載されている。本酵素は、４４，０００ダルトンの単量体タンパク質で約９のｐＩを有する。
【０００７】
ヘパリナーゼは、エリミナーゼとして作用し、不飽和二重結合を非還元末端基に残す。この二重結合は、不飽和産物の２３２ｎｍでの吸光度によるヘパリナーゼ活性のアッセイにおいて使用される。本酵素は、塩類に対する耐性が低く、ヘパリンに対し非常に特異的であり、３０ｎＭのＫｄを有する。ヘパリナーゼは、４．５Ｋｃａｌ／ｍｏｌの活性化エネルギー、８ｘ１０−６のｋｍ値および４ｘ１０−７Ｍ／分の最大反応速度（Ｖｍａｘ）を有する。
【０００８】
ヘパリンは、しばしば外科的に使用され、血液凝固を防止し、心肺および腎臓透析機のような３０の体外装置の適合性を高める。ヘパリナーゼによるヘパリンの酵素的な分解は、外科手術において、ヘパリンの抗凝血特性を除去するのに十分である。Ｌａｎｇｅｒら、ｉｎ　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：「界面の現象および適用」、Ａｄｖ．ｉｎ　Ｃｈｅｍ、Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ，Ｃｈａｐ．１３，４９３頁−５０９頁（１９８２）に記載のように、この特性により、ヘパリナーゼは、固定化バイオリアクターとして心肺および腎臓透析機と組み合わせられ、血液を脱ヘパリン化するために使用されてきた。ヘパリナーゼバイオリアクターの商業上の適用は、臨床試験中である。
【０００９】
ヘパリナーゼバイオリアクター使用における主要な問題は、表面上に固定化される十分な量の純粋なヘパリナーゼの入手可能性にある。この理由は、主に、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ中で、構成的に発現されるヘパリナーゼの量が、非常に低いからである。Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ中での、ヘパリンによるヘパリナーゼ発現の誘導は、必要とされるヘパリンの量と、どんな実際の用途に対しても合理的な量のヘパリナーゼを生産するための発酵の規模とのために非常に高価である。
【００１０】
ヘパリナーゼ遺伝子のクローニングおよび発現は、いくつかの方法において重要である。第１に、現在までに、クローニングされ、特徴が明らかであり、プロテオグリカンを脱重合する唯一の酵素は、ヘパリナーゼである。第２に、ヘパリンは、外科手術に一般的に使用される唯一の抗凝血剤である。したがって、血液の脱ヘパリン化は、重要な医学上の問題点である。さらに、ＲｏｓｅｎｆｅｌｄおよびＤａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：６３９−６４６（１９８６）に記載のように、ヘパリナーゼに触媒されたヘパリンの、さらに低分子量のヘパリン分子への分解は、特異的抗凝血活性を有する生産物を生成するために使用され得る。
【００１１】
改変された活性を有する組換えヘパリナーゼをデザインすることは，学術上および商業的に興味深い。例えば、ヘパリナーゼは、この酵素がＡＴ−ＩＩＩ結合オリゴマーを正確に開裂するため、血液を脱ヘパリン化するのに使用される。他方、酵素結合の機構およびヘパリンの脱重合をさらに理解すれば、改変された特異性を有する組換えヘパリナーゼがデザインされ得る。すなわち、ＡＴ−ＩＩＩ結合ヘパリンは、組換え酵素により開裂されない。これは、ＡＴ−ＩＩＩ結合ヘパリンオリゴサッカライドを生産する非常に有用な方法で有り得る。そして、現在、このＡＴ−ＩＩＩ結合ヘパリンオリゴサッカライドは、抗凝血剤としての使用のために、大量には入手し得ない。酵素の精製または固定化を、補助および／または改善し得るヘパリナーゼの生産もまた、非常に重要である。例えば、標識（特定のペプチド配列）を、酵素の活性を変えないが、固定化の化学的作用を非常に効果的にする領域に付加し得る。これは、酵素の固定化基質上への装着の改善を助ける。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
それゆえ、本発明の１つの目的は、ヘパリナーゼをコードする遺伝子および大量のヘパリナーゼの生産を容易にする発現用システムの提供である。
【００１３】
本発明のもう１つの目的は、遺伝子を改変し、改変された特異性および他の所望の特性を有する組換えヘパリナーゼの生産の方法と手段の提供である。
【００１４】
本発明のもう１つの目的は、サイトカイン−プロテオグリカン相互作用の領域で、繊維芽細胞成長因子−ヘパリン相互作用により例証されるように、道具または診断剤として使用する純粋なヘパリナーゼを提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
１つの局面において、本発明は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍから単離されたヘパリナーゼＩをコードする、単離された核酸分子を提供する。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、本質的に以下の配列：
【００１７】
【化３】
2004057201.tif 000002
から成るヌクレオチド配列（配列番号：１、塩基対１７３から１３２４を含む）を有し得る。
【００１８】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、本質的に以下の配列：
【００１９】
【化４】
2004057201.tif 000003
から成るアミノ酸配列（配列番号：２）をコードし得る。
【００２０】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、発現ベクターをさらに包含し得る。
【００２１】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、シグナルペプチドをコードする核酸フラグメントをさらに包含し得る。好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸は、上記シグナルペプチドが、本質的に以下の配列：
【００２２】
【化５】
2004057201.tif 000004
から成る核酸（配列番号：１、塩基対１から１７２を含む）にコードされ得る。より好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸は、上記シグナルペプチドが、細胞質からペリプラズムへのタンパク質の輸送を支配し得る。
【００２３】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号：１にコードされるヘパリナーゼと異なる親和力のヘパリン結合能を有するヘパリナーゼをコードし得る。
【００２４】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号：１にコードされるヘパリナーゼの特異活性と異なる特異活性を有するヘパリナーゼをコードし得る。
【００２５】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、その分子を発現し得る、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ以外の原核細胞中にあり得る。好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、その分子を発現し得る低硫酸塩条件下での培養原核細胞中にあり得る。
【００２６】
【発明の実施の形態】
（発明の要旨）
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼ遺伝子の、ポリメラーゼ連鎖反応を用いるクローニングを記載する。精製されたヘパリナーゼのトリプシンペプチド起源のアミノ酸配列に基づく２種の縮重オリゴヌクレオチドが、ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ中で使用され、６００塩基対のプローブが生成された。このプローブは、ｐＵＣ１８　Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのゲノムライブラリをスクリーニングするのに使用された。このオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、分子量が４３，８００ダルトンの前駆体タンパク質をコードする１１５２塩基対に対応する。１１の異なるトリプシンペプチド（全アミノ酸の約４８％）が、ＯＲＦ中にマッピングされた。このアミノ酸配列は、２０残基のリーダーペプチドを示す。
【００２７】
ヘパリナーゼは、上記遺伝子から発現され得る。さらに、上記遺伝子は、改変された酵素活性、または、特には改変された結合特性を有するヘパリナーゼを生産するように改変され得る。上記配列は、他の関連する酵素をコードする遺伝子の単離において、プローブとしてもまた使用され得る。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍのヘパリナーゼをコードする遺伝子をクローニングした。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、以下に示す：
以下の配列（配列番号：１、塩基対１から１７２を含む）は、リーダーペプチドをコードする：
【００２９】
【化６】
2004057201.tif 000005
以下の配列（配列番号：１、塩基対１７３から１３７９を含む）は、ヘパリナーゼをコードする：
【００３０】
【化７】
2004057201.tif 000006
以下はヘパリナーゼのアミノ酸配列（配列番号：２）である：
【００３１】
【化８】
2004057201.tif 000007
【００３２】
【実施例】
（実施例１：Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍのヘパリナーゼをコードするｃＤＮＡの単離および分析）
他者による、以下を用いた予備的なクローニングの試みが不成功だったため、ポリメラーゼ連鎖反応を、ヘパリナーゼ遺伝子のクローニングに使用した：１）抗体のスクリーニング、２）Ｅ．ｃｏｌｉ中の機能的に活性なヘパリナーゼのスクリーニング、および３）臭化シアン（ＣＮＢｒ）化学消化により再生されたタンパク質配列起源のプローブを用いたヘパリナーゼ遺伝子のスクリーニング。逆層精製ヘパリナーゼを、還元し、アルキル化し、そしてトリプリンで消化し、以下に記載のように、２１０ｎｍおよび２７７ｎｍで（チロシンおよびトリプトファンについて）モニターして、約６０ペプチドのピークを、逆層ＨＰＬＣにより分離採取した。
【００３３】
（トリプシン消化およびタンパク質配列分析）
ヘパリナーゼを、Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８：６４０８（１９７３）、Ｏｔａｔａｎｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．８８：２９１（１９８１）、およびＹａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２６０：１８４９（１９８５）に記載のように、精製した。これらの文献は、本明細書中に参考として援用した。最終精製段階は、タンパク質の疎水性残基を利用する逆層カラムを使用して高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により実施した。１ナノモル（約４５μｇ）の精製酵素を、５０μｌの８Ｍ尿素、０．４Ｍ炭酸アンモニウム溶液中で変性し、５０℃、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元し、室温に冷却し、そして、１０ｍＭヨードアセトアミドを用いて１５分間暗黒中でアルキル化した。総反応容積は、２００μｌだった。この反応混合液に、１／２５（ｗ／ｗ）のトリプシンを添加し、３７℃で２４時間消化を行った。反応は、サンプルを、６５℃で２分間加熱することで停止した。消化物を、逆層ＨＰＬＣで、０から８０％のアセトニトリルのグラジエントを用いて分離した。トリプシンペプチドを、２１０ｎｍおよび２７７ｎｍでモニターした。
【００３４】
トリプシン消化に関するピークを、エッペンドルフチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ　ｔｕｂｅ）に採取した。ペプチドピークの均質性に基づき、８つの異なるピークを、ＭＩＴの癌研究センターのバイオポリマー実験室にあるＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製シークエンサー、モデル４７７を、モデル１２０ＰＴＨアミノ酸分析装置とオンラインで共に用いて配列決定した。この配列を、以下の表Ｉに示す。（Ｋ，Ｒ）の記号は、表Ｉ中に使用され、トリプシンがリシンまたはアルギニン残基の一方を切断することを示す。表Ｉ中のアスタリスクは、決定し得なかったアミノ酸配列を表す。ｔｄ　Ｌｘと記号化されるペプチドは、配列決定された最長のペプチドであり、３８残基を有する。未変性のヘパリナーゼもまた、配列決定され、Ｎ末端アミノ酸を決定した。
【００３５】
（表Ｉ：ヘパリナーゼのトリプシンペプチドの配列）
【００３６】
【化９】
2004057201.tif 000008
３セットのプライマーを、表ＩＩに示すようにデザインし、合成した。プライマーを、ＭＩＴの癌研究センターのバイオポリマー実験室にあるＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製シークエンサーモデル４７７を、モデル１２０ＰＴＨアミノ酸分析装置とオンラインで共に用いて合成した。これらのプライマーセットを、ヘパリナーゼ遺伝子をクローニングするために、ＰＣＲ増幅系で使用した。シンボル”Ｉ”は、イノシンヌクレオチドを表わす。各ペプチドのアミノ酸は、太字で書いているが、プライマーデザインのために選択された残基を表す。２つの異なるプライマーセットを、トリプシンペプチド３３用に構築し、プライマーの３’末端でのイソロイシン置換の程度を減少した。
【００３７】
（表ＩＩ：ヘパリナーゼプライマーのデザイン）
【００３８】
【化１０】
2004057201.tif 000009
【００３９】
【化１１】
2004057201.tif 000010
【００４０】
【化１２】
2004057201.tif 000011
最初に配列決定されたＲＨＰＬＣの６つのピーク（表Ｉ）のうち、３つを、プライマーのデザインのために使用した。プライマーの３つのセットをデザインした（表ＩＩ）。このプライマーｔｄ４３およびｔｄ３３の組み合せのＰＣＲ生産物は、約１５０塩基対の長さだった。ｔｄ４およびｔｄ３３プライマーの組み合せでは、約６００塩基対だった。プライマーｔｄ４３は、プライマーｔｄ３３に対して５’にあり、そしてプライマーｔｄ４は、プライマーｔｄ４３に対して５’にあった。このｔｄ４およびｔｄ３３のＰＣＲ生産物をテンプレートとして、そしてｔｄ４３およびｔｄ４をプライマーとして使用して、予想した１５０塩基対生産物を得、ｔｄ４３が、ｔｄ４とｔｄ３３との間にあることを確認した。
【００４１】
ヘパリナーゼを４３，０００ダルトン、そして、平均的にアミノ酸分子量を１１０ダルトンとすると、３９０アミノ酸に対応し、そして、その３倍で１１７０塩基と仮定すると、図１に示す６００塩基対生産物は、ヘパリナーゼ遺伝子の約１１７０の総塩基対の約５１％を示す。
【００４２】
６００塩基対プローブを、高ストリンジェンシーのコロニーハイブリダイゼーションによりｐＵＣ１８ライブラリをスクリーニングするために選択した。３回のコロニー精製で残った２つの陽性クローンを同定した。
【００４３】
（ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびプラスミドライブラリ）
Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍゲノムＤＮＡを、以下の改変をしたＡ．Ｓ．Ａ．Ｐ．ＴＭキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で単離した。単離したＤＮＡを、セファデックスＴＭＧ−５０カラム（Ｎｉｃｋ　ｃｏｌｕｍｎ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で脱塩し、セントリコンＴＭＰ−３０（Ａｍｉｃｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて最終容積１００ｌに濃縮した。典型的には、１ｘ１０９の細胞から、１０５ｇから１１５ｇのＤＮＡをえた。全細胞ｍＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ技術情報出版ＴＢ　０８７　１２／８９，Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ　５３７１１に説明されるグアニジンチオシアネート手法を用いて単離した。ｐＵＣ１８プラスミドは、マサチューセッツ工科大学の生物学部のＡ．Ｊ．Ｓｉｎｓｋｅｙ博士から得た。上記ライブラリは、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍゲノムＤＮＡを用いて構築した。ゲノムＤＮＡを、超音波処理し、ＥｃｏＲＩリンカーを添加して改変し、次いでｐＵＣ１８ベクターに連結した。ＤＨ５ａを、ｐＵＣ１８ゲノムライブラリで形質転換した。
【００４４】
（ＰＣＲ生産物の増幅）
ヘパリナーゼのトリプシン消化プライマーの増幅を、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１，５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．０１％のゼラチンに、４種のデオキシリボースヌクレオチド３リン（ｄＮＴＰｓ）を２００Ｍで加え、０．５Ｍのプライマーおよび３ｌのゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、そして、２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を含有する２５ｌの反応容積および２５ｌの鉱物油で実行した。サンプルを、９２℃（２分）、５０℃（１分）および７２℃（３分）のステップサイクルにプログラムした自動加熱ブロック（ＤＮＡサーマルサイクラー、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）上に置いた。このサイクルを、３５回繰り返した。最終サイクルは、７２℃で１０分間の延長を加えた。ＰＣＲ生産物を、０．６μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する０．８％のアガロースゲル上で分析した。コントロール反応は、Ｃｅｔｕｓキットで行った。
【００４５】
（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍのｐＵＣ１８ゲノムライブラリのスクリーニング）
ｐＵＣ１８ライブラリを、約１５００コロニーを得るように、タイタープレートで培養し、ＰＣＲにより生成したプローブによりテストした。各プレートは、直接にニトロセルロース上で適切な小さなサイズに成長した約１００のコロニーを有した。次いで、このコロニーを１晩さらに成長するように複製した。
【００４６】
上記ＰＣＲプローブを、Ｒａｎｄｏｍ　ＨｅｘａｕｃｌｅｏｔｉｄｅＴＭキット（ＲＨＮ）（ＩＢＩ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ．）を用いて標識した。以下簡単に記載する。低温融解アガロースゲルから泳動したＰＣＲ生産物由来の１μｇのＤＮＡを単離し、９５℃で１０分間煮沸し変性し、次いで氷冷した。反応緩衝液中の変性ＤＮＡに、１０ｍＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、ランダムヘキサヌクレオチド類、および５０μＣｉの３２ＰｄＣＴＰ（３０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を添加した。この反応を、３０分間３７℃で、クレノウと共に実施し、０．２ＭのＥＤＴＡを用いて停止した。標識反応後、標識プローブを、遊離ヌクレオチドから、セファデックスＧ−５０カラム（Ｎｉｃｋ　Ｃｏｌｕｍｎ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して精製した。上記コロニーを、上記標識プローブで、本明細書中に参考として援用するＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載のような標準コロニーハイブリダイゼーション手法を用いて、スクリーニングした。
【００４７】
２つの陽性クローンを単離し、そのプラスミドを６００塩基ＰＣＲ生産物を生成する能力についてテストした。両クローンとも、テストの結果は陽性であり、そして制限マッピングでさらに特徴を明らかにした。クローンｐＲＳ　Ｈｅｐ５１は、約１．６ｋｂのＫｐｎ−Ｋｐｎフラグメントを伴うｐＵＣ１８中の２．３ｋｂの挿入断片（図２に示す）である。このフラグメントは６００塩基対のＰＣＲ生産物を生成するための陽性テンプレートだった。ｐＲＳ５１のＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、Ｍ１３中にサブクローニングし、配列決定した。
【００４８】
（ＤＮＡ配列決定）
ＤＮＡ配列決定は、Ｍ１３ファージを用い、ジデオキシアデノシン５’−アルファー３５Ｓ−三リン酸およびシーケネース（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を、製造者により記載されるように使用して実施した。配列データを、サイクロンＩバイオシステムズ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）によりＴ４のＤＮＡポリメラーゼを使用して、Ｍ１３の継続的に入れ子状に重なった欠失を使用して得、あるいは、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定した。
【００４９】
この配列は、３８４のアミノ酸および約２１アミノ酸のリーダー配列に対応する１１５２塩基対の単一の連続するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を明らかにした。このＰＣＲ生産物は、開始部位から５６６塩基から１２１６塩基にわたり、全遺伝子の約５７％に相当する。
【００５０】
まず、６つの異なるトリプシンペプチドをＯＲＦ中にマッピングした。次いで、５つの他のペプチドを、構造研究のために配列決定し、それらの全てをＯＲＦ中にマッピングし、全部で全３６７アミノ酸の約４８％であった。全部で３つのシステインが存在する。その１つは、シグナルペプチドに結合していた。このシグナルペプチドは、原核生物の配列に典型的であり、電荷を持つＮ末端領域、中心の疎水性領域、および開裂する標準的なＡｌａ．ｘｘｘ．Ａｌａ部位を含む開裂領域を有する。
【００５１】
（実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉでのヘパリナーゼ遺伝子の発現）
Ｅ．ｃｏｌｉでのヘパリナーゼ発現について２つの異なる発現系を選択した：Ｏｍｐ　Ａ発現系およびｐＫＫ高発現系である。両方の発現系のためにデザインしたプラスミドを表ＩＩＩに示す。
【００５２】
３０　Ｏｍｐ　Ａ発現系
Ｏｍｐ　Ａ　発現系は、参照として、本明細書中に援用される、Ｇｈｒａｙｅｂら、ＥＭＢＯ　Ｊ．３：２４３７（１９８４）に記載されるように、Ｏｍｐ　Ａシグナル配列に支配されて、ペリプラズム空間に目的のタンパク質を分泌する。ヘパリナーゼは通常、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍのペリプラズム空間へ発現されるので、この系を選択した。上記プラスミドは、ｌａｃレプレッサーの制御下にあり、そして培地へのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄチオガラクトシド）の付加によって誘導される。上記プラスミドをｐＩＮ−ＩＩＩ　Ｏｍｐ　Ａ−３ベクターに挿入した。
【００５３】
上記ヘパリナーゼ挿入断片は、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位へのクローン化に適合する、２つの適切な制限部位を伴うようにヘパリナーゼのＮ末端およびＣ末端を利用するＰＣＲにより、作成した。２つのプライマーを表ＩＩで示すように構築した。上記挿入断片はＰＣＲの５サイクルで増幅し、そしてＥ．ｃｏｌｉのペリプラズミックリーダー配列と共に、Ｏｍｐ　Ａ　ｐＩＮベクターに連結した。ＤＨ５αを形質転換し、そして発現を３〜５時間、１ｍＭのＩＰＴＧで、誘導した。
【００５４】
表ＩＩＩに示すように、Ｏｍｐ　Ａ発現系の構築物はヘパリナーゼ遺伝子のアミノ末端に、ＧｌｙおよびＩｌｅである、２つの余分なアミノ酸を生じる。ヘパリナーゼ配列はＧｌｎで始まる。
ｐＫＫ発現系
ｐＫＫ発現系は、参照として本明細書中に援用する、ＢｒｏｓｉｕｓおよびＨｏｌｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６９２９（１９８４）ならびにＪａｆｆｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：１８６９（１９８８）の方法に従い、タンパク質の過剰発現に用いられる。この系は、Ｏｍｐ　Ａ系のように、適当な宿主中で、ｌａｃレプレッサーによって調節され、そしてＩＰＴＧの付加によって誘導される、強いｔａｃプロモーターを含有する。プラスミドｐＫＫ２２３−３は、ｐＵＣ　８マルチクローニングサイトおよび隣接してｔａｃプロモーターにつづく、強いｒｒｎＢリボソームターミネーターを有する。上記プラスミドのリボソーム結合部位（開始コドンＡＴＧから約１２塩基）は、ＳｍａＩ部位へのヘパリナーゼ遺伝子のクローニングにより利用される。Ｏｍｐ　Ａの構築物のように、ヘパリナーゼ挿入断片は、該タンパク質のＮおよびＣ末端に、ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを有するように、ＰＣＲによって得られる。表ＩＩＩに示すように、未変性ヘパリナーゼのリーダー配列をペリプラズムに過剰生産するように用いた。
【００５５】
（表ＩＩＩ：Ｅ．ｃｏｌｉでの組換えヘパリナーゼ発現のための、ｏｍｐＡプラスミドのデザイン）
【００５６】
【化１３】
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Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムタンパク質を、浸透圧ショックで単離した。簡単に言えば、１．５ｍｌの細胞を誘導後に遠心分離し、そして１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）で、洗浄した。そして細胞を２０％スクロース、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）および０．５ＭのＥＤＴＡ、５μｌ中で懸濁した。氷上で５分間インキュベートした後、細胞を遠心分離し、そして約１５０μｌの水を加えて浸透圧ショックを行った。ペリプラズム抽出物を酵素活性の測定のために用いた。ヘパリナーゼ活性は、波長２３２ｎｍでモニタリングして測定し、そして参照として、本明細書中に援用した、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１３７：５１５（１９８８））のアズールＡ法によって測定した。
【００５７】
ペリプラズム抽出物は、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６９０（１９７４）の方法を用いて、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、そしてクーマシーブルーを用いて染色した。さらに、ウエスタンブロット法でヘパリナーゼモノクローナル抗体を用いて、ヘパリナーゼの存在の確認を行った。ヘパリナーゼは、ＧｅｒｓｈｏｎｉおよびＰａｌａｄｅ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：１（１９８３）の方法を用いて、電気泳動的にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロースに移動させ、そしてモノクローナル抗体と共にインキュベートした。この抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした２次抗体を用いて染色した。
【００５８】
（ＲＮＡドットブロットアッセイ）
すべての細胞質ＲＮＡをＺｅｔａプローブＴＭメンブレン（Ｂｉｏｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）上でアルカリＲＮＡ変性および固定によって固定化し、そして６００塩基のＰＣＲ生産物を用いてプローブし、ヘパリナーゼ遺伝子をスクリーニングした。ハイブリダイゼーションはＴｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．７７：５２０１（１９８０）の方法に従って、ドットブロット装置で行った。異なる成長条件下のＲＮＡシグナルの研究は、Ｇａｌｌｉｈｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８２）によって継続している。その研究によって確立したものに、タンパク質レベルでヘパリナーゼが、低硫黄条件下で最適な発現を示し、そして誘導のためのヘパリン要求性を取り払う。従って、低硫黄成長条件下でヘパリナーゼｍＲＮＡシグナルをヘパリン誘導がある、および、ない状態で検討した。
【００５９】
Ｏｍｐ　ＡおよびｐＫＫ系のいづれも、ヘパリナーゼを発現した。Ｏｍｐ　Ａ系は効率的にヘパリナーゼをペリプラズムに輸送しなかった。理由は明らかでないが、組換えヘパリナーゼの大きな断片は、そのＯｍｐ　Ａシグナル配列と一緒に細胞質の領域に保持された。そして増殖に、より低い温度（２５〜３０℃）では、ペリプラズム空間への分泌が認められた。
【００６０】
ｐＫＫ過剰生産系はペリプラズム空間でのみ、ヘパリナーゼを生産した。上記ｐＫＫ系は、天然のＦ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍヘパリナーゼリーダー配列を用いた。それは外来のリーダー配列を伴う組換えタンパク質の輸送において問題がなかった。発現がより低い温度でさらに至適であるにもかかわらず、ｐＫＫ系は異常なプロセシングなしに、ヘパリナーゼを発現した。ペリプラズム中のヘパリナーゼの存在は、ウエスタンブロット法、および組換えヘパリナーゼのｉｎ　ｓｉｔｕトリプシン消化を天然のヘパリナーゼのそれと比較することにより、ピーク外形、および、単離および配列決定したいくつかのピークから確認した。
【００６１】
陽性シグナルを、ヘパリナーゼ遺伝子を単離するために用いられてきたＰＣＲ由来の６００塩基対プローブを用いて、単離したＦ．ｈｅｐａｒｉｕｍ　ｍＲＮＡより得た。そして単離した遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化したＦ．ｈｅｐａｒｉｕｍ遺伝子であることを確認した。
【００６２】
発現したヘパリナーゼは、少なくとも若干のヘパリナーゼ活性を有した。
【００６３】
上記配列は、ヘパリナーゼをコードする配列中に部位特異的突然変異誘発またはオリゴマー置換を用いて、特異的な酵素活性または結合特異性、あるいは１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換による親和力を改めるために改変され得る。これを行う方法および材料は、当業者に周知である。改変した遺伝子を発現し、そしてその生産物は改変された活性について機械的に選抜される。
【００６４】
２つの特異的な発現系を文献と共に記載したが、その他の発現系は充分周知であり、そして市販的に入手し得る。同様のベクターおよびシグナルペプチド、またはリーダー配列を用いることにより、これらの系でも、ヘパリナーゼ遺伝子を発現し得る。
【００６５】
本発明の修飾および改変は、当業者には自明である。そのような修飾および改変は、以下の請求の範囲に包含されるように意図される。
【００６６】
【発明の効果】
本発明により、ヘパリナーゼをコードする遺伝子および大量のヘパリナーゼの生産を容易にする発現用システムが提供される。さらに本発明により、遺伝子を改変し、改変された特異性および他の所望の特性を有する組換えヘパリナーゼの生産の方法と手段が提供される。さらに本発明により、サイトカイン−プロテオグリカン相互作用の領域で、繊維芽細胞成長因子−ヘパリン相互作用により例証されるように、道具または診断剤として使用する純粋なヘパリナーゼが提供される。
【００６７】
【配列表】
【００６８】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、それぞれ、６００および１６０塩基対である、ＰＣＲ生産物Ｙ１：ＣおよびＤ：Ｃの模式図である。この６００塩基対ＰＣＲ生産物は、プライマーであるＤおよびＣと共に、テンプレートとして使用され、１６０塩基対のＤ：Ｃ生産物を生成した。
【図２】図２は、ヘパリナーゼ遺伝子を含有する挿入断片を有するゲノムＤＮＡのｐＵ１８プラスミドである、ｐＲＳ．ＨＥＰ５１の制限マップである。このプラスミドは、５６３１塩基長であり、約２３００塩基対の挿入断片を有する。このヘパリナーゼ遺伝子は、ＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメント中にある。
【図３】図３は、オープンリーディングフレーム中での、異なるトリプシンペプチドマッピングと共にヘパリナーゼ遺伝子の構造を示すＫｐｎＩ−ＫｐｎＩフラグメントの地図である。６つの異なるペプチドをヘパリナーゼ遺伝子翻訳領域中にマッピングした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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