(57)【要約】【課題】  ポリケタイドシンターゼ遺伝子、および紅麹菌のシトリニン合成能破壊株の作成方法。【解決手段】  紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子において、１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも１つを行うことにより得られる、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された変異遺伝子を構成するＤＮＡ。当該ＤＮＡを含む組換えベクターを紅麹菌に導入することにより、紅麹菌、特にシトリニン生産能を有する紅麹菌の、当該シトリニン合成能を破壊することが可能となる。【選択図】      なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示した塩基配列で表わされる、請求項１記載のポリケタイドシンターゼ遺伝子。
【請求項３】
請求項１または２記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項記載のポリケタイドシンターゼ遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項５】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質：
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の遺伝子において、１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも１つを行うことにより得られる、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された変異遺伝子を構成するＤＮＡ。
【請求項７】
ケトシンターゼ活性中心およびアシルキャリアータンパク質活性中心が欠失した請求項６記載のＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡ；
（ｅ）配列表の配列番号１における塩基番号３４３２〜５５５４の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｆ）配列表の配列番号１における塩基番号３４３２〜５５５４の塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡ；
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の全部または一部分からなるＤＮＡであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の全部または一部分の塩基配列に１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも１つを有する塩基配列からなるＤＮＡであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の全部または一部分からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡ；
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡ。
【請求項１０】
紅麹菌由来の請求項６〜９のいずれか１項記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１の組換えベクターが導入された紅麹菌。
【請求項１３】
請求項１１の組換えベクターが導入された紅麹菌であって、シトリニン合成能が破壊された、紅麹菌のシトリニン合成能破壊株。
【請求項１４】
請求項１１の組換えベクターが導入された紅麹菌であって、ポリケタイドシンターゼ遺伝子が破壊された紅麹菌のシトリニン合成能破壊株。
【請求項１５】
請求項１１の組換えベクターを紅麹菌に導入し、該紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子を破壊することを特徴とする、紅麹菌のシトリニン合成能破壊株の作成方法。
【請求項１６】
配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子。
【請求項１７】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質。
【請求項１８】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質：
（ａ）配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリケタイドシンターゼ遺伝子、ポリケタイドシンターゼ、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを用いた紅麹菌のシトリニン合成能破壊株の作成方法、および該方法により作成された紅麹菌のシトリニン合成能破壊株に関する。
【背景技術】
【０００２】
モナスカス属（ｇｅｎｕｓ  Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、アオカビ属（ｇｅｎｕｓ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、コウジカビ属（ｇｅｎｕｓ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の糸状菌は古来より、チーズ、酒類等の食品に使用されており、また、近現代においては、医薬、工業用酵素、食品添加物の製造などに広くもちいられている。また、現在これらの糸状菌は、生産させる物質に応じ純粋継代培養され、系統が保存されている株も多くある。
一方、これらの属に含まれる種のうちのいくつかの株では、シトリニン（Ｃｉｔｒｉｎｉｎ）という代謝物を生産することが知られている。過去には野生カビにより汚染された輸入米が大規模な中毒をひきおこした例が存在する。  
【０００３】
生物工学の分野においては、現在もこれら糸状菌類について、工業的に有望な株が探索されているが、上記シトリニンが生産されないということが、当該探索における制限条件になっている。このような工業的に有望な株を入手する方法として、例えば、シトリニン生産株から、突然変異誘導剤を用いてシトリニン非生産株を得る方法がある（例えば、特許文献１参照）。しかし、当該特許文献１に開示される方法においては、突然変異誘導剤を用いて得られた変異株について、有用性とシトリニン非生産性という２重の観点から選抜を行わなければならず、結果として偶然性に頼ることとなり、実際に工業的に有望な株を入手するには長い時間と労力が必要となる。
現状では、特許文献１に記載の方法をはじめとする従来法の様に、偶然性と労力に頼るのではなく、確実にシトリニン非生産株を得る方法は未だ公表、実現されていない。
【０００４】
【特許文献１】特開平７−２７４９７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
紅麹菌が生産するシトリニンはポリケタイドの構造を有しており、紅麹菌をはじめとする真菌類におけるポリケタイドの生合成には、ポリケタイドシンターゼが関与していることが知られている。よって、シトリニンの生合成に関与するポリケタイドシンターゼをコードする遺伝子を紅麹菌から取得できれば、該ポリケタイドシンターゼ遺伝子の全部もしくは一部、または当該ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された遺伝子を構成するＤＮＡを含むベクターを作成し、該ベクターをシトリニン合成能を有する紅麹菌に導入し、該ベクター中のポリケタイドシンターゼ遺伝子部分と紅麹菌ゲノムのポリケタイドシンターゼ遺伝子部分との相同組換えを生じさせることにより、紅麹菌ゲノムのポリケタイドシンターゼ遺伝子を破壊できると考えられる。本発明者らは、この考えに基づき本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子、特にシトリニン合成に関与しているポリケタイドシンターゼ遺伝子、並びに紅麹菌のポリケタイドシンターゼを提供することを目的とする。さらに、ベクターとして紅麹菌に導入された場合に、紅麹菌ゲノムのポリケタイドシンターゼ遺伝子と相同組換えすることにより該遺伝子を破壊できるＤＮＡ、および該ＤＮＡを含むベクターを提供することを目的とする。また、本発明は、前記ベクターが導入された紅麹菌、特に、前記ベクターが導入された紅麹菌であって、ポリケタイドシンターゼ遺伝子が破壊された紅麹菌のシトリニン合成能破壊株を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記紅麹菌のシトリニン合成能破壊株の作成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は請求項１として、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質を提供する。
本発明は請求項２として、配列表の配列番号１に示した塩基配列で表わされる、請求項１記載のポリケタイドシンターゼ遺伝子を提供する。
本発明は請求項３として、請求項１または２記載の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子を提供する。
本発明は請求項４として、請求項１〜３の何れか１項記載のポリケタイドシンターゼ遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
本発明は請求項５として、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質：
（ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質を提供する。
本発明は請求項６として、請求項１〜３のいずれか１項記載の遺伝子において、１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも１つを行うことにより得られる、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された変異遺伝子を構成するＤＮＡを提供する。
本発明は請求項７として、ケトシンターゼ活性中心およびアシルキャリアータンパク質活性中心が欠失した請求項６記載のＤＮＡを提供する。
本発明は請求項８として、以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡ；
（ｅ）配列表の配列番号１における塩基番号３４３２〜５５５４の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｆ）配列表の配列番号１における塩基番号３４３２〜５５５４の塩基配列からなるＤＮＡを含むＤＮＡ；
（ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡを提供する。
本発明は請求項９として、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の全部または一部分からなるＤＮＡであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の全部または一部分の塩基配列に１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも１つを有する塩基配列からなるＤＮＡであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の全部または一部分からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡ；
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡを提供する。
本発明は請求項１０として、紅麹菌由来の請求項６〜９のいずれか１項記載のＤＮＡを提供する。
本発明は請求項１１として、請求項６〜１０のいずれか１項記載のＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。
本発明は請求項１２として、請求項１１の組換えベクターが導入された紅麹菌を提供する。
本発明は請求項１３として、請求項１１の組換えベクターが導入された紅麹菌であって、シトリニン合成能が破壊された、紅麹菌のシトリニン合成能破壊株を提供する。
本発明は請求項１４として、請求項１１の組換えベクターが導入された紅麹菌であって、ポリケタイドシンターゼ遺伝子が破壊された紅麹菌のシトリニン合成能破壊株を提供する。
本発明は請求項１５として、請求項１１の組換えベクターを紅麹菌に導入し、該紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子を破壊することを特徴とする、紅麹菌のシトリニン合成能破壊株の作成方法を提供する。
本発明は請求項１６として、配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子を提供する。
本発明は請求項１７として、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質を提供する。
本発明は請求項１８として、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのタンパク質：
（ａ）配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、紅麹菌のポリケタイドシンターゼ、特に紅麹菌においてシトリニン合成に関与しているポリケタイドシンターゼを提供すること、および当該ポリケタイドシンターゼをコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子を提供することを可能にする。
また、本発明は、前記ポリケタイドシンターゼ遺伝子において、１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも１つを行うことにより得られる、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された遺伝子を構成するＤＮＡをはじめとする、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡを含む組換えベクターを紅麹菌に導入することにより、紅麹菌、特にシトリニン生産能を有する紅麹菌の、当該シトリニン合成能を破壊できるという有利な効果を有する。また、少なくとも当該ＤＮＡを含む組換えベクターによる、紅麹菌のシトリニン合成能の破壊は、紅麹菌の赤色色素生産を妨げることなく達成できるという有利な効果を有する。
また、本発明は、紅麹菌のポリケタイドシンターゼの一部と推察される配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の塩基配列を有するＤＮＡ、または当該塩基配列の一部分を有するＤＮＡであって紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡ、好ましくは配列番号１における塩基番号３４３２〜５５５４の塩基配列を有するＤＮＡ、を含む組換えベクターを紅麹菌に導入することにより、紅麹菌、特にシトリニン生産能を有する紅麹菌の、当該シトリニン合成能を破壊できるという有利な効果を有する。また、当該ＤＮＡを含む組換えベクターによる、紅麹菌のシトリニン合成能の破壊は、紅麹菌の赤色色素生産を妨げることなく達成できるという有利な効果を有する。
さらに、本発明は、紅麹菌において多剤排出トランスポーターとして機能すると考えられる遺伝子、特に、菌体内で生産されたシトリニンの菌体外への排出に関与すると考えられる遺伝子を提供することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において紅麹菌とは、モナスカス・パーピュレウス；Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓをいう。
本発明の第１の態様は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子である。当該遺伝子は紅麹菌におけるポリケタイドシンターゼをコードする遺伝子であり、詳細には、紅麹菌におけるシトリニンの生合成に関与するポリケタイドシンターゼをコードする遺伝子である。
紅麹菌ゲノムから得られた配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを日本ＤＮＡデータバンク提供のＦＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴによる相同性検索により解析した結果、当該ＤＮＡはポリケタイドシンターゼ遺伝子を含むものと推定された。特に、配列表の配列番号１における塩基番号３４３２〜５５５４の部分の塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクターを紅麹菌に導入することにより、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊することができたことから、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡは、シトリニン生合成に関与するポリケタイドシンターゼ遺伝子（以降、ｐｋｓＣＴとも称する）を含むものと推定された。
好ましくは、当該ポリケタイドシンターゼ遺伝子は、配列表の配列番号１の塩基番号１６８４〜９５２０（途中、塩基番号２２６５〜２３４８のイントロンを含む）で、配列表の配列番号２に示される２５８４アミノ酸からなるタンパク質をコードする。
また、本発明のポリケタイドシンターゼ遺伝子は、その配列中に任意のイントロンを含んでいても良いし、イントロンを含んでいなくても良い。
【００１０】
また、配列表の配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子も本発明の範囲内のものである。かかる遺伝子は、任意の公知の方法で、適宜、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、挿入等を行うことにより得ることができる。
さらに、配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子；配列表の配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子；並びに配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であって配列表の配列番号１に示した塩基配列で表わされるポリケタイドシンターゼ遺伝子のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつポリケタイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリケタイドシンターゼ遺伝子も本発明の範囲内のものである。
【００１１】
本明細書中で使用する用語「ストリンジェントな条件」とは、特異的な配列にはハイブリダイズするが、非特異的な配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件の設定は当業者に周知であるが、例えば、上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１の塩基番号３４０５〜６８３０で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１の塩基番号８６１８〜９１０７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００１２】
本発明のポリケタイドシンターゼ遺伝子は、紅麹菌からトータルＲＮＡを抽出し、当該トータルＲＮＡを鋳型にして、各種糸状菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子のコンセンサス配列を基にしたプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ処理を行い、得られた増幅産物のうち紅麹菌のシトリニン合成能破壊作用を有するものをスクリーニングすることにより得ることができる。また、前記配列からなる遺伝子は、紅麹菌のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型として、前記方法により得ることも可能である。
前記遺伝子の取得方法においては、好ましくは、シトリニンを生合成している状態の紅麹菌からトータルｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを調製するのが好ましい。また、前記遺伝子の取得方法においては、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲを含む）に使用されるプライマーとしては、
ＫＳ１ＦＲＴ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＣＣ−３’
ＬＣ５ＲＲＴ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＴＧＴＣＡＴＴＡＧＧ−３’
の組み合わせが好ましい。
また、他のプライマーとしては、
Ｆ：５’−ＡＴＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧ−３’
Ｒ：５’−ＡＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣ−３’
の組み合わせが好ましい。
また、配列番号１の塩基配列から想定される、プライマーとして適する任意の塩基配列、例えば、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子における糸状菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子のコンセンサス配列に相当する部分を有するＤＮＡをプライマーとして使用することも可能である。
【００１３】
配列番号１の塩基配列において、塩基番号１〜３９０５の部分を有するＤＮＡは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９３の下、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されているプラスミド  ｐＳＩ１から、常法通り単離することができる（受託日：平成１５年１月２８日）。また、配列番号１の塩基配列において、塩基番号２２７８〜９１３４の部分を有するＤＮＡは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９４の下、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されているプラスミドｐＳＩ２から、常法通り単離することができる（受託日：平成１５年１月２８日）。さらに、配列番号１の塩基配列において、塩基番号８７８６〜９９９７の部分を有するＤＮＡは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６１３の下、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されているプラスミドｐＳＩ３から、常法通り単離することができる（受託日：平成１５年１２月１８日）。これら３つのＤＮＡから、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡは常法に従って調製することができる。
【００１４】
ポリケタイドシンターゼ遺伝子のＯＲＦの前後には、ＴＡＴＡボックス（配列番号１の塩基番号１６７６〜１６８０）、ポリアデニル化シグナル（配列番号１の塩基番号９５７０〜９５７４）がそれぞれ存在しているものと推定された。さらに、ポリケタイドシンターゼ遺伝子には、ケトシンターゼ（ＫＳ）活性中心（配列番号１の塩基番号３４０２〜３４０４）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）活性中心（配列番号１の塩基番号４７３７〜４７３９）、およびアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）活性中心（配列番号１の塩基番号６８３１〜６８３３）がそれぞれ存在しているものと推定された。
本発明のポリケタイドシンターゼ（ＰＫＳＣＴ）におけるケトシンターゼ活性中心周辺配列、アシルトランスフェラーゼ活性中心周辺配列、およびアシルキャリアータンパク質活性中心周辺配列のアミノ酸配列はそれぞれ、ＤＴＡＣＳＳ（ＫＳ活性中心周辺配列）、ＧＨＳＦＧＥ（ＡＴ活性中心周辺配列）およびＧＩＤＳ（ＡＣＰ活性中心周辺配列）であり、これらは、真菌類ポリケタイドシンターゼにおけるこれらの活性中心周辺配列を構成する典型的なアミノ酸配列である、ＤＸＡＣＸＳ（ＫＳ活性中心周辺配列）、ＧＨＳＸＧ（ＡＴ活性中心周辺配列）およびＧＸＤＳ（ＡＣＰ活性中心周辺配列）（Ｘは、真菌類ポリケタイドシンターゼにおいて厳密に保存されていないアミノ酸を示す。後述の場合も同様である）（Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｐｋｓＭ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ．  Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４２  （５）：４１９−４３０．１９９７．参照）に対して良好な一致が認められた。
なお、本発明のポリケタイドシンターゼ（ＰＫＳＣＴ）においては、他の真菌類ポリケタイドシンターゼに認められる場合のある、ＡＣＰドメインの下流に存在するチオエステラーゼ活性中心周辺配列（典型的なアミノ酸配列はＧＰＹＸＬＸＧＷＳＸＸＧである）または、非常に長い下流領域は認められなかった。
【００１５】
本発明の他の態様は、上記ポリケタイドシンターゼ遺伝子を含む組換えベクターである。当該組換えベクターの調製に使用可能なベクター、ベクターの調製方法などは後述される通りである。
また、本発明の他の態様は、上記ポリケタイドシンターゼ遺伝子によってコードされるタンパク質であり、すなわち、紅麹菌におけるポリケタイドシンターゼであり、特に、紅麹菌のシトリニン生合成に関与するポリケタイドシンターゼ（以降、当該タンパク質をＰＫＳＣＴとも称する）である。当該組換えタンパク質の調製は、任意の公知の方法によって行うことができ、特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明の他の態様は、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡである。ここでの破壊とは、本発明が属する技術分野の当業者が通常使用する意味での、微生物における化合物の生合成能の破壊をいう。本発明における紅麹菌のシトリニン合成能の破壊は、好ましくは、紅麹菌におけるシトリニン合成能を完全に破壊し、シトリニンの合成を完全に停止させることだけでなく、部分的な破壊、すなわち、シトリニンの合成量を低減させることも含む。より好ましくは、シトリニン合成能の破壊は、紅麹菌におけるシトリニン合成量が、実施例に示されるような、ＨＰＬＣによる検出法および／または抗体検出法において、検出限界以下となることをいう。さらにより好ましくは、シトリニン合成能の破壊は、紅麹菌においてシトリニンが全く合成されないことをいう。
【００１７】
本発明のＤＮＡによる、紅麹菌のシトリニン合成能破壊のメカニズムは不明であるが、そのメカニズムの１つとして、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターを紅麹菌に導入することにより、ベクター中の本発明のＤＮＡが、紅麹菌ゲノム中のポリケタイドシンターゼ遺伝子と相同組換えを起こすことにより、紅麹菌のシトリニン合成能が破壊されることが推定される。なお、本発明のＤＮＡによる紅麹菌のシトリニン合成能の破壊は、前記理論に拘束されるものではない。
上記理論に基づくと、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡとして、本願発明のポリケタイドシンターゼ遺伝子において、１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも１つを行うことにより得られる、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された変異遺伝子を構成するＤＮＡが挙げられる。かかるＤＮＡが紅麹菌のゲノムＤＮＡと相同組換えすることにより、ゲノム上のポリケタイドシンターゼ遺伝子が機能を有しないものに置き換えられ、その転写、翻訳産物がポリケタイドシンターゼとしての機能を有しないものとなるので、紅麹菌におけるシトリニン合成能が破壊されることが考えられる。
ここで、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊された変異遺伝子としては、ポリケタイドシンターゼとしての機能が破壊されているのであれば特に限定されるものではないが、例えば、ポリケタイドシンターゼとしての機能するのに必須である、ケトシンターゼドメイン、アシルトランスフェラーゼドメイン、アシルキャリアータンパク質ドメインの少なくとも１つのドメインの機能が破壊されたものが挙げられる。破壊の態様としては特に限定されるものではないが、アミノ酸置換、欠失、挿入などにより活性を消失するような態様、ドメイン自体が欠失するような態様などが挙げられる。
ここでのそれぞれのドメインは、各ドメインの活性に必須の部分として既に述べたような活性中心を有する。よって、好ましくは、破壊の態様としては、ケトシンターゼ活性中心、アシルトランスフェラーゼ活性中心、アシルキャリアータンパク質活性中心の少なくとも１つの活性中心が破壊されたものが挙げられる。
【００１８】
上記、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡの１態様として、本発明のポリケタイドシンターゼ遺伝子において、１以上の塩基の置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも１つを行うことにより得られる、ケトシンターゼ活性中心およびアシルキャリアータンパク質活性中心が欠失したＤＮＡが挙げられる。かかるＤＮＡは、紅麹菌ゲノムＤＮＡのポリケタイドシンターゼ遺伝子と相同組換えを起こすことにより、ケトシンターゼ活性中心が欠失したタンパク質と、アシルキャリアータンパク質活性中心が欠失したタンパク質とが生産されることとなり、これらそれぞれが不完全な機能しか有しないためにポリケタイドの生合成が行われないものと推定される。上記活性中心の欠失の態様は特に限定されるものではないが、例えば、活性中心のみが欠失する態様でも良いし、活性中心を含むドメインが欠失するような態様でも良い。このような観点から、本発明のＤＮＡとしては、好ましくは、配列番号１の塩基配列における塩基番号３４０５〜６８３０の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられ、また他の態様としては、配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の一部分からなるＤＮＡであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡが挙げられる。より好ましくは、本発明のＤＮＡとしては、配列番号１の塩基配列における塩基番号３４３２〜５５５４の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられ、また他の態様としては、配列表の配列番号１における塩基番号３４３２〜５５５４の一部分からなるＤＮＡであって、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡが挙げられる。
さらなる本発明のＤＮＡとして、配列表の配列番号１における塩基番号３４０５〜６８３０の一部分であって、紅麹菌ゲノム中のポリケタイドシンターゼ遺伝子と相同組換えを起こし得るＤＮＡが挙げられ、好ましくは、配列表の配列番号１における塩基番号３４３２〜５５５４の一部分であって、紅麹菌ゲノム中のポリケタイドシンターゼ遺伝子と相同組換えを起こし得るＤＮＡが挙げられる。
【００１９】
本発明の紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡとして、上述のようなＤＮＡが挙げられるが、当該ＤＮＡにおいて１以上、好ましくは１もしくは複数のヌクレオチドの置換、欠失、付加、挿入のうちの少なくとも１つを有するＤＮＡであっても、紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子と相同組換えを起こし、ポリケタイドシンターゼ遺伝子を破壊し得ることを、当業者は理解するであろう。よって、そのようなＤＮＡも本発明の範囲に包含される。このようなヌクレオチドの置換、欠失、付加または挿入法としては、例えば、特定部位指定突然変異誘発法（サイトディレクティッドミュータジェネシス）あるいは遺伝子相同組換え法（ホモロガスリコンビネーション）や、制限酵素による切断並びにリガーゼによる結合を組み合わせるなどして行うことができる。また、合成ＤＮＡ断片をプライマーとしたプライマー伸長法（プライマーエクステンション）やポリメラーゼ連鎖増幅法（ポリメラーゼチェーンリアクション）を上記方法に適宜組み合わせて実施することもできる。これらの方法は、例えばサムブルック等編［モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社，１９８８、エールリッヒ，ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス，１９８９等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができる。
【００２０】
さらに本発明の紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡは、上述のＤＮＡを含むＤＮＡ、本発明のＤＮＡに相補的なＤＮＡ、本発明のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも包含する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、ポリケタイドシンターゼ遺伝子において記載された条件に準ずる。例えば、配列番号１の塩基番号３４０５〜６８３０からなるＤＮＡまたは配列番号１の塩基番号８６１８〜９１０７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
本発明のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても、組換えベクターとして紅麹菌に導入された場合に、当該ＤＮＡは紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子と相同組換えを起こし、紅麹菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子を破壊し得ることを、当業者は理解するであろう。
【００２１】
本発明の他の態様は、本発明の紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡを含む組換えベクターである。当該組換えベクターは、当業者に公知の、任意の方法で構築することが可能である。また、組換えベクターを作成するためのベクターとしては、任意の、公知のベクターを使用可能であり、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。好ましくは、ベクターとしては、紅麹菌に導入が可能なベクターである。上記ベクターには、ベクターが導入された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、アルギニン、ウラシルのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、オーレオバシジン、オリゴマイシン、ベノミル、ピリチアミンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
好ましくは、本発明の組換えベクターに使用されるベクターとしては、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）に、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｔｒｐＣ遺伝子のプロモーター、ターミネーターを繋げた遺伝子をマーカーに持つベクターｐＣＳＮ４３、ｐＣＳＮ４４（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから入手可能）等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００２２】
本発明の他の態様は、前記組換えベクターが導入された紅麹菌である。前記組換えベクターが導入された紅麹菌においては、シトリニン合成能が破壊され、紅麹菌のシトリニン合成能破壊株を得ることができる。前記組換えベクター中の、本発明の紅麹菌のシトリニン合成能を破壊可能なＤＮＡが紅麹菌ゲノム中のポリケタイドシンターゼ遺伝子とが相同組換えを起こすことにより、ポリケタイドシンターゼ遺伝子が破壊された紅麹菌のシトリニン合成能破壊株を得ることができる。
組換えベクターの紅麹菌への導入は、たとえばカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの一般的な方法で実施でき、特に限定されるものではない。好ましくは、組換えベクターの紅麹菌への導入は、プロトプラスト法である。
【００２３】
本発明の他の態様は、配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子である。当該配列番号４の塩基配列は、配列表の配列番号１の塩基番号９７３１〜１１４７９の塩基配列に対応する。（なお、順序は逆であり、配列番号１の１１４７９が配列番号４の１に対応する。）すなわち、配列番号１の記載から明らかであるが、配列番号４の塩基配列を有する遺伝子は、紅麹菌染色体上でｐｋｓＣＴ遺伝子とクラスターを形成して存在しているが、当該配列番号４の塩基配列を有する遺伝子はｐｋｓＣＴ遺伝子とは反対向きに存在している。
当該配列番号４の塩基配列を有する遺伝子は、塩基番号３１６〜３７７および１４６２〜１５１１にイントロンを含んでおり、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。よって、本発明の好ましい態様は、配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子であって、イントロン（塩基番号３１６〜３７７および１４６２〜１５１１）を含まない遺伝子である。
当該配列番号４の塩基配列を有する遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを日本ＤＮＡデータバンク提供のＦＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴによる相同性検索により解析した結果見出されたものであり、当該配列番号４の塩基配列を有する遺伝子産物は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓにおいてアゾール系抗真菌剤に対する耐性に関与している多剤排出トランスポーター（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｅｆｆｌｕｘ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）（ＦＬＵ１）のアミノ酸配列３４％の相同性を有していた。このことから、配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子がコードするタンパク質は、ＦＬＵ１がコードするタンパク質と類似の機能、すなわち、アゾール系抗真菌剤に対する耐性に関与する多剤排出トランスポーターの機能を有することが推察される。
【００２４】
多剤排出トランスポーターであるＦＬＵ１がコードするタンパク質は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓにおいてフルコナゾールをはじめとするアゾール系抗真菌剤を菌体外に排出する機能を有しており、これによりアゾール系抗真菌剤に対して耐性を生じさせていると考えられている。また、ＦＬＵ１が破壊されたＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓは、ミコフェノール酸に超感受性であり、このことからＦＬＵ１がコードするタンパク質はミコフェノール酸を基質とし、これを特異的に菌体外に排出することが示唆されている（Ｃａｌａｂｒｅｓｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）、１４６、２７４３−２７５４）。
ここで、ミコフェノール酸は、縮合２環式構造を有しており、その一方の環がフェノール性水酸基を有するベンゼン環であり、他方の環が酸素原子を有する複素環である化合物である。一方、紅麹菌が生産するシトリニンも縮合２環式構造をゆうしており、その一方の環がフェノール性水酸基を有するベンゼン環であり、他方の環が酸素原子を有する複素環である点で、ミコフェノール酸とその化学構造が類似している。
【００２５】
すなわち、配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子がコードするタンパク質とＦＬＵ１がコードするタンパク質とのアミノ酸配列の相同性、およびＦＬＵ１がコードするタンパク質が特異的に菌体外に排出するミコフェノール酸とシトリニンとの構造上の類似性を鑑みると、配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子がコードするタンパク質はシトリニンの菌体外排出に関与していることが推察される。また、一般に、真菌類においては、２次代謝産物の生産に関連する遺伝子群は、染色体上でクラスターを形成していることが多く、ここで、配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子は、シトリニンの生合成に関与するポリケタイドシンターゼとクラスターを形成しているという点からも、配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子は紅麹菌におけるシトリニンの菌体外排出に関与している可能性が考えられる。なお、紅麹菌の菌体内で産生されたシトリニンが菌体外に排出されることは、例えば（文献“Kinetic analysis of red pigment and citrinin production by Monascus ruber as a function of organic acid accumulation” Hassan Hajjaj, P. Blanc, E. Groussac, J. L. Uribelarrea, G. Goma, and P. Loubiere, Enzyme and Microbial Technology, vol.27, 2000, pp619-625.）に開示されているように公知である。
よって、配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子（以下、多剤排出トランスポーター遺伝子とも称する）がコードするタンパク質は、好ましくは、多剤排出トランスポーター活性を有しており、より好ましくは、シトリニンを菌体外に排出するシトリニン排出活性を有する。なお、本明細書において、紅麹菌において生産されたシトリニンが、菌体内から菌体外へ排出される場合に、シトリニン排出活性が認められたとする。
【００２６】
配列表の配列番号４の塩基配列を有する遺伝子がコードするタンパク質は、紅麹菌におけるシトリニンの菌体外排出に関与しているものと考えられるので、当該遺伝子を破壊することにより、菌体外に排出されるシトリニン量が低減された紅麹菌を作成することが可能となる。
また、当該遺伝子がコードするタンパク質は、シトリニンだけでなく、アゾール系抗真菌剤を菌体外に排出することが考えられるので、当該遺伝子をシトリニンまたはアゾール系抗真菌剤の耐性遺伝子である形質転換マーカーとして使用することが可能となる。また、当該遺伝子を改変することにより、多様なアゾール系化合物または他の物質に対する耐性マーカーとして使用することも可能である。
さらに、当該遺伝子がコードするタンパク質は、シトリニンまたはアゾール系抗真菌剤を菌体外に排出すると考えられるので、当該タンパク質で輸送されない化合物をスクリーニングすること、または当該タンパク質の機能を阻害する物質をスクリーニングすることによる抗真菌剤の開発に使用することが可能である。
【００２７】
本発明における紅麹菌の多剤排出トランスポーター遺伝子は、配列表の配列番号４の塩基配列（イントロン：塩基番号３１６〜３７７および１４６２〜１５１１）で、配列表の配列番号３に示される５２１アミノ酸からなるタンパク質をコードする。
また、本発明の多剤排出トランスポーター遺伝子は、その配列中に任意のイントロン（配列番号４における塩基番号３１６〜３７７および１４６２〜１５１１と同じであっても良いし、異なっていても良い）を含んでいても良いし、イントロンを含んでいなくても良い。
また、配列表の配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする多剤排出トランスポーター遺伝子も本発明の範囲内のものである。かかる遺伝子は、任意の公知の方法で、適宜、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、挿入等を行うことにより得ることができる。
さらに、配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする多剤排出トランスポーター遺伝子；配列表の配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする多剤排出トランスポーター遺伝子；並びに配列表の配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であって配列表の配列番号１に示した塩基配列で表わされる多剤排出トランスポーター遺伝子のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ多剤排出トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする多剤排出トランスポーター遺伝子も本発明の範囲内のものである。
【００２８】
本明細書中で使用する用語「ストリンジェントな条件」とは、特異的な配列にはハイブリダイズするが、非特異的な配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件の設定は当業者に周知であるが、例えば、上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１の塩基番号  １０３４２〜１０９７９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００２９】
本発明の多剤排出トランスポーター遺伝子を含む、配列番号１の塩基配列の塩基番号８７８６〜１２６９７の部分を有するＤＮＡは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６１３の下、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されているプラスミドｐＳＩ３（受託日：平成１５年１２月１８日）から、常法通り単離することができる。よって、本発明の多剤排出トランスポーター遺伝子は、当該ＤＮＡより常法通り単離することが可能である。
また、本発明の他の態様は、上記多剤排出トランスポーター遺伝子によってコードされるタンパク質であり、すなわち、紅麹菌における多剤排出トランスポーターとして機能するタンパク質であり、特に、シトリニン排出活性を有するタンパク質である。当該組換えタンパク質の調製は、任意の公知の方法によって行うことができ、特に限定されるものではない。
【００３０】
本発明の他の態様は、本発明の多剤排出トランスポーター遺伝子を含む組換えベクターである。当該組換えベクターは、当業者に公知の、任意の方法で構築することが可能である。また、組換えベクターを作成するためのベクターとしては、任意の、公知のベクターを使用可能であり、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。好ましくは、ベクターとしては、紅麹菌に導入が可能なベクターである。上記ベクターには、ベクターが導入された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、アルギニン、ウラシルのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、オーレオバシジン、オリゴマイシン、ベノミル、ピリチアミンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
好ましくは、本発明の組換えベクターに使用されるベクターとしては、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）に、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のｔｒｐＣ遺伝子のプロモーター、ターミネーターを繋げた遺伝子をマーカーに持つベクターｐＣＳＮ４３、ｐＣＳＮ４４（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから入手可能）等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００３１】
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。なお、実施例中の学術用語、略号等は特に断らない限り当該技術分野で一般的に使用されているものに従った。また、各種操作は、サムブルック等編［モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９、今本文男等編［組換え遺伝子の細胞への導入と発現］蛋白質核酸酵素臨時増刊２８（１４）１９８３、岡田善男監修［細胞工学的技術総集編］実験医学臨時増刊７（１３）１９８９等を参考として実施した。
【実施例】
【００３２】
実施例１
紅麹菌菌体中のシトリニンの定量
１００ｍｌヘンネベルク（Ｈｅｎｎｅｂｅｒｇ）液体培地（グルコース  ５．０％；ペプトン  ０．７５％；ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４  ０．２％；ＫＮＯ３  ０．０５％；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．０１％；ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  ０．２％）入りの５００ｍｌ容のバッフルフラスコにヘンネベルクアガープレート（上記ヘンネベルク液体培地にさらに２％の寒天を含む）で培養しておいた、紅麹菌の高シトリニン生産株であるＹＡＷ１株、または紅麹菌の低シトリニン生産株であるＨＵ３９１株の菌糸片をアガーごと（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ角）植菌し、２８℃、１２０ｓｐｍで培養し、経時的に菌体をそれぞれブフナー漏斗で回収し、乾燥機（１００℃）で乾燥させた菌体を液体窒素と共に、乳鉢で菌体をすりつぶして粉状乾燥菌体とした。特に示されない限りは、後述の実施例における紅麹菌の培養条件は実施例１に準じて行われた。
【００３３】
シトリニンの抽出は以下の手順で行った。１．２５ｇの粉状乾燥菌体に７０％ｅｔｈａｎｏｌを５０ｍｌ加えてｐＨ８．０にあわせ、室温で３時間激しく撹拌して抽出を行った。途中１時間おきにｐＨ８．０に調整した。抽出液をＮＯ．２  フィルターペーパーでろ過を行った後、カートリッジフィルター（０．２０μｍ）でろ過を行い、これをＨＰＬＣ測定用サンプルとした。ＨＰＬＣは、ポンプ：Ｊａｓｃｏ社ＴＲＩ  ＲＯＴＡＲ−Ｖ、蛍光検出器：Ｊａｓｃｏ社ＦＰ−２１０、ペンレコーダー：ＨＩＴＡＣＨＩ社５６１、カラム：ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．Ｉｎｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ−２を使用して行った。移動相としては、アセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸＝１００：１００：０．１溶液を使用し、流速は１ｍｌ／分であった。和光純薬工業社製のシトリニンを、メタノール：水＝７：３溶液に溶解したものをシトリニン標品として、０．１〜５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度に調整し、これを上記条件でＨＰＬＣ分析して、得られたチャートの高さを指標として検量線を作成した。サンプルは、上記検量線の濃度範囲内となるように適宜希釈して、検量線からサンプル中のシトリニンを定量した。
培養２日目頃からシトリニンの生産が認められ、培養７日目では、高シトリニン生産株であるＹＡＷ１株の、乾燥菌体重量あたりのシトリニンの含有量は約１２００ｐｐｍであり、低シトリニン生産株であるＨＵ３９１株の、乾燥菌体重量あたりのシトリニンの含有量は約３０ｐｐｍであった。また、培養１０日目では、高シトリニン生産株であるＹＡＷ１株の、乾燥菌体重量あたりのシトリニンの含有量は約１５００ｐｐｍであり、低シトリニン生産株であるＨＵ３９１株の、乾燥菌体重量あたりのシトリニンの含有量は約１０ｐｐｍであり、いずれにおいても、シトリニンの生産が認められた。
【００３４】
実施例２
ＲＴ−ＰＣＲによるポリケタイドシンターゼ遺伝子のスクリーニング
（１）紅麹菌菌糸体からのトータルＲＮＡの抽出
１００ｍｌヘンネベルク液体培地入りの５００ｍｌ容のバッフルフラスコにヘンネベルクアガープレートで培養しておいた高シトリニン生産株であるＹＡＷ１株または低シトリニン生産株であるＨＵ３９１株の菌糸片をａｇａｒごと（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ角）植菌し、培養７日目の菌体をそれぞれブフナー漏斗とろ紙によりろ過して集菌した。約５０ｍｇの菌体を液体窒素で凍結させ、乳鉢で粉状になるまですりつぶして凍結紛状菌体を得た。ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、該凍結紛状菌体からＲＮＡを抽出し、トータルＲＮＡを得た。抽出条件は、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔに添付されるマニュアルに記載の条件に従った。得られたトータルＲＮＡは２０μｌのＤＥＰＣ処理水に懸濁された。
【００３５】
（２）トータルＲＮＡのＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅフリー）処理
高シトリニン生産株であるＹＡＷ１株および低シトリニン生産株であるＨＵ３９１株のトータルＲＮＡは、それぞれ以下の組成で、３７℃．３０分間反応を行うことによりＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅフリー）処理された。
組成：トータルＲＮＡ  ２４．５μｌ；１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２．５μｌ；２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２０μｌ；ＲＮａｓｅインヒビター  １μｌ；およびＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅフリー）２μｌ（合計５０μｌ）。
反応終了後、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔでクリーンアップを行った。クリーンアップの条件は添付のマニュアルに記載の条件に従った。
【００３６】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ処理
ＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅフリー）処理後の、シトリニン高生産株であるＹＡＷ１株のトータルＲＮＡを鋳型に、以下の組成で、ＴＡＫＡＲＡ社のｍＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１．１を使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ処理条件は、５０℃で１５分処理を１回行った後、８５℃３０秒、４０℃１分、７２℃１分の処理を３０サイクル行い、次いで、７２℃７分の処理を１回行った。処理後に得られた反応液を２％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  Ｌ０３：タカラバイオ株式会社）で電気泳動を行った。プライマーとしては、各種糸状菌のポリケタイドシンターゼ遺伝子のコンセンサス配列を参考にして作成された下記のプライマーの組み合わせを使用した場合に増幅産物が確認された。
組成：Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  ３８μｌ；ＡＭＶ  Ｒｔａｓｅ  １μｌ；ＡＭＶ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｔａｑ  １μｌ；ＫＳ１ＦＲＴ（ｆｏｗａｒｄ）１μｌ；ＬＣ５ＲＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ）１μｌ；および鋳型ＲＮＡ  ３μｌ（合計４５μｌ）。
Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘの組成：２×ｍＲＮＡバッファー  ２５μｌ；ＭｇＣｌ２  １０μｌ；ｄＮＴＰ／アナログ  ５μｌ；ＲＮａｓｅインヒビター  １μｌ；ＤＨ２Ｏ  ４μｌ（合計４５μｌ）。
プライマー
ＫＳ１ＦＲＴ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＣＣ−３’
ＬＣ５ＲＲＴ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＴＧＴＣＡＴＴＡＧＧ−３’
【００３７】
実施例３
ノザンハイブリダイゼーションによる遺伝子断片の転写解析
上述のＲＴ−ＰＣＲ増幅産物が、シトリニン高生産株であるＹＡＷ１株およびシトリニン低生産株であるＨＵ３９１株において転写されているのか、およびこの増幅産物を含む遺伝子の転写に差があるのかを調べるために、ノザンハイブリダイゼーションによる転写解析を行った。
【００３８】
（１）ホルムアルデヒド変性ゲルによるトータルＲＮＡの電気泳動
蒸留水７４ｍｌに、アガロース１．２ｇ、１０×電気泳動用緩衝液（ＭＯＰＳバッファー）１０ｍｌを加え、ゲルを溶解した後、１６ｍｌのホルムアルデヒドを加え混合し、サブマリン型電気泳動ゲルを作成した。泳動バッファーは１×ＭＯＰＳバッファーを用いた。上述の方法で調製された、ＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅフリー）処理後のトータルＲＮＡ溶液６μｌ、１０×ＭＯＰＳ  ２．５μｌ、ホルムアルデヒド４μｌ、ホルムアミド１２．５μｌを混合し、６５℃、５分加熱後、氷中で急冷し、泳動用色素液を２．５μｌ加え、５０Ｖで約２時間泳動を行った。この際分子量マーカーを同時に泳動した。分子量マーカーの部分は切り取り、エチジウムブロマイド溶液で染色し移動距離を測定した。
【００３９】
（２）トランスファー
トランスファーは、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ブロッティングメンブレン（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社）の使用説明書に記載の方法に従った。電気泳動で分離したＲＮＡをトランスファーによりナイロンメンブレンに移した。トランスファーバッファーは２０×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ：３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）を用い、１２時間以上行った。ブロットしたメンブレンを蒸留水で洗浄した後、３ＭＭ（Ｗｈａｔｍａｎ社）ろ紙にはさんで乾燥させ、ラップに包んでＵＶを５分間照射しＲＮＡを固定化した。
【００４０】
（３）ＤＮＡプローブの作成
プローブとしてＫＳ１ＦＲＴおよびＬＣ５ＲＲＴを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を鋳型として、ランダムプライマーラベリングキット（タカラバイオ株式会社）を用いてＤＮＡプローブを作成した。エッペンドルフチューブに約１μｇの鋳型ＤＮＡ断片とランダムプライマー２μｌを入れ、滅菌水で１４μｌにメスアップして反応液を調整し、これを９５℃、３分間加熱後、氷中で急冷した。以降の操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行い、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社）でラベルされたＤＮＡプローブを調製した。
【００４１】
（４）ノザンハイブリダイゼーション
上述の方法でＲＮＡが固定化されたメンブレンおよびＤＮＡプローブを用いてノザンハイブリダイゼーション処理を行った。まず、メンブレンをＲａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社）に充分浸し、６５℃、３０分間、プレハイブリダイゼーションを行った後、調製したＤＮＡプローブを加えてさらに６５℃、２時間振とうを行いハイブリダイゼーションを行った。反応終了後、バッファーを捨て、洗浄液（０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ）２００ｍｌで、６５℃、１０分間洗浄を行った。この操作をもう一度繰り返し、メンブレンから洗浄液を良く除いた後ラップフィルムに包み、シグナルをＸ線フィルムに−８０℃、１時間感光させて現像を行った。
ノザンハイブリダイゼーションの結果を図１に示す。図１のレーン１はシトリニン低生産株であるＨＵ３９１株、レーン２はシトリニン高生産株であるＹＡＷ１株である。シトリニン低生産株であるＨＵ３９１株、シトリニン高生産株であるＹＡＷ１株のいずれにおいても、８ｋｂ付近にバンドが検出されたが、シトリニン低生産株であるＨＵ３９１株よりもシトリニン高生産株であるＹＡＷ１株の方が強いシグナルを示した。ここで、トータルＲＮＡを回収した時点で、いずれの菌株においてもシトリニンが生産されていること、シトリニン低生産株であるＨＵ３９１株よりもシトリニン高生産株であるＹＡＷ１株の方が菌体内シトリニンの量が多いことを考慮すると、ＫＳ１ＦＲＴおよびＬＣ５ＲＲＴを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片はシトリニン生合成に関連する遺伝子の断片である可能性が示唆された。
【００４２】
実施例４
ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物周辺領域のクローニング
実施例２で得られたＫＳ１ＦＲＴおよびＬＣ５ＲＲＴを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を含む遺伝子をクローニングするために、該増幅されたＤＮＡ断片の周辺領域のクローニングを行った。
【００４３】
（１）シトリニン低生産株ＨＵ３９１株のゲノムＤＮＡの抽出
１００ｍｌヘンネベルク液体培地入りの５００ｍｌ容のバッフルフラスコにヘンネベルクアガープレートで培養しておいた高シトリニン生産株であるＹＡＷ１株または低シトリニン生産株であるＨＵ３９１株の菌糸片をアガーごと（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ角）植菌し、培養７日目の菌体をそれぞれブフナー漏斗とろ紙によりろ過して集菌した。約１０００ｍｇの菌体を液体窒素で凍結させ、乳鉢で粉状になるまですりつぶして凍結紛状菌体を得た。該凍結紛状菌体から、Ｚｏｌａｎ  ＭＥ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８６  Ｊａｎ；６（１）：１９５−２００の方法でゲノムＤＮＡの抽出を行った。最終的に、ＨＵ３９１株の菌体１ｇから、約６００μｇのゲノムＤＮＡが得られ、これをＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で０．５μｇ／μｌ溶液とした。
【００４４】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物のゲノミックサザンハイブリダイゼーション解析
クローニングに適切な長さにゲノムＤＮＡを切断すべく、各種制限酵素を用いて以下の通り、ゲノムＤＮＡの切断処理を行った。ゲノムＤＮＡ（０．５μｇ／μｌ）３０μｌ、制限酵素１０μｌ、制限酵素バッファー１０μｌ、ＲＮａｓｅ（２ｍｇ／ｍｌ）２μｌおよび滅菌蒸留水５０μｌ（トータル１００μｌ）をチューブに取り、３７℃、オーバーナイトでゲノムＤＮＡの制限酵素処理を行った。制限酵素は、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩまたはＸｈｏＩを使用した。
切断処理後、エタノール沈殿して最終１２μｌに懸濁し、ｍｕｐｉｄ用ＥＭ−１０ゲルを用いて電気泳動を約５０分間行った。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し撮影を行った後、ナイロンメンブレンにトランスファーを行った。トランスファーの方法は前述の、実施例３（２）に記載された通りである。トランスファー後、メンブレンを２×ＳＳＣで５分間洗浄し、ＵＶ固定を５分間行った。サザンハイブリダイゼーション解析用プローブは、前述の実施例３（３）で調製されたものを使用し、ハイブリダイゼーションは、前述の実施例３（４）に記載された方法で行った。
【００４５】
ＫＳ１ＦＲＴおよびＬＣ５ＲＲＴを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片をプローブとした、シトリニン低生産株ＨＵ３９１株のゲノミックサザンハイブリダイゼーションの結果は図２に示される（図２中、レーン１：ＢａｍＨＩ、レーン２：ＥｃｏＲＩ、レーン３：ＨｉｎｄＩＩＩ、レーン４：ＰｓｔＩ、レーン５：ＳａｃＩ、レーン６：ＳａｌＩ、レーン７：ＸｂａＩ、レーン８：ＸｈｏＩである）。図２に示される通り、シトリニン低生産株ＨＵ３９１株のゲノムＤＮＡには、ＫＳ１ＦＲＴおよびＬＣ５ＲＲＴを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片にハイブリダイズする部分が存在することが明らかとなった。また、各種制限酵素を用いることにより、該ハイブリダイズする部分を含む種々の長さのＤＮＡ断片が検出できた。ＢａｍＨＩでゲノムＤＮＡを処理した場合に約４ｋｂ付近にシグナルを検出でき、このＢａｍＨＩ断片をクローニングすることとした。
【００４６】
（３）ゲノミッククローンのクローニング用ＢａｍＨＩ断片の調製
実施例４の（１）で得られたＨＵ３９１株のゲノムＤＮＡ（０．５μｇ／μｌ）１８μｌ、ＢａｍＨＩ（株式会社ニッポンジーン）２０μｌ、Ｂバッファー（株式会社ニッポンジーン）２０μｌおよび滅菌蒸留水１４２μｌ（トータル２００μｌ）をチューブに取り、３７℃、オーバーナイトでゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ処理を行った。この処理をチューブ５本分行った。
各チューブについてエタノール沈殿後、約１２μｌの滅菌蒸留水に懸濁し、電気泳動を行った。エチジウムブロマイドで染色後撮影を行い、約４ｋｂ付近のゲルをカッターナイフで切り出した。泳動の乱れを予想して、予想されるゲルの位置からさらに上とさらに下の部分も切り出した。それぞれ切り出したゲルについてウルトラフリーＤＡ（日本ミリポア）を用いてゲル中のＤＮＡを回収した。この溶液をさらにエタノール沈殿し、乾燥後８μｌの滅菌蒸留水に懸濁した。この内３μｌを電気泳動し、メンブレンにトランスファーしてサザンハイブリダイゼーション解析を行うことにより、ゲルから抽出したＤＮＡ中に目的の断片が含まれているのかどうかを確認した。サザンハイブリダイゼーション解析用プローブとして、前述の実施例３（３）で調製されたものを使用し、ハイブリダイゼーションは、前述の実施例３（４）に記載された方法で行った。解析の結果、切り出したゲル３片の中で最もシグナルが強く、かつコントロールのシグナルと同等以上の強さがあるＤＮＡ溶液をプラスミドベクターｐＵＣ１９とのライゲーション反応に用いることとした。
【００４７】
（４）プラスミドベクターｐＵＣ１９の調製およびライゲーション
クローニングに使用するプラスミドベクターｐＵＣ１９は、ＢａｍＨＩ、ＣＩＡＰ処理を行ったものを電気泳動し、バンドをゲルから切り出してＤＮＡ抽出したものを使用した。ｐＵＣ１９（１．４μｇ／μｌ）４μｌ、Ｋ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社）４μｌ、ＢａｍＨＩ（タカラバイオ株式会社）４μｌ、および蒸留水３８μｌの組成（合計５０μｌ）で、３７℃、２時間反応を行った。反応後エタノール沈殿を行い、ＤＮＡペレットを乾燥して乾燥ＤＮＡを得た。当該乾燥ＤＮＡに、１０×ＣＩＰ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社）１０μｌ、ＣＩＰ（タカラバイオ株式会社）２μｌ、および蒸留水８８μｌを加え（合計１００μｌ）、５０℃で、３０分間反応を行った。反応後、フェノール抽出を２回行い、さらにクロロホルム抽出を１回行った。抽出液をエタノール沈殿し、ＤＮＡペレットを乾燥後、１５μｌの蒸留水に溶解し、プラスミドベクターｐＵＣ１９液を調製した。
実施例４（３）で得られたＢａｍＨＩ断片を含むＤＮＡ溶液３．５μｌ、上記実施例４（４）で調製されたプラスミドベクターｐＵＣ１９液５μｌおよびライゲーションキットＩ液（タカラバイオ株式会社）８．５μｌをチューブに入れ（合計１７μｌ）、１６℃で３０分間処理して、ＢａｍＨＩ断片含有プラスミドベクターｐＵＣ１９を得た。
【００４８】
（５）ＢａｍＨＩ断片を含む形質転換体の作成
実施例４（４）で得られたＢａｍＨＩ断片含有プラスミドベクターｐＵＣ１９を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１０  ＧＯＬＤ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の形質転換処理を行った。形質転換処理は、添付されたマニュアルに記載の条件に従って行った。形質転換後、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ入りのＬＢａｍｐプレートにスプレッドして、３７℃、オーバーナイト培養した。出現した白色コロニーをコロニーシートを貼り付けたプレートにそれぞれ植菌し、さらに３７℃、オーバーナイト培養した。
【００４９】
（６）形質転換体のコロニーハイブリダイゼーション
出現したコロニーの面をナイロンメンブレンに貼り付けて、約１分後に剥がし、菌体面を上にして、１％ＳＤＳ溶液を染み込ませたろ紙を該菌体面に５分間のせ、このろ紙を剥がした後、次いで、変性用バッファー（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｍ  ＮａＯＨ）を染み込ませたろ紙を該菌体面に５分間のせ、このろ紙を剥がした後、次いで、中和用バッファー（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ７．４））を染み込ませたろ紙を該菌体面に５分間のせ、このろ紙を剥がした後、次いで、２×ＳＳＣを染み込ませたろ紙を該菌体面にのせ５分後に剥がした。続いて、２×ＳＳＣ中で該ナイロンメンブレン上に残留している菌体をすすぎ落とし、風乾後、ＵＶ固定を５分間行った。さらに、２×ＳＳＣ中で菌体をすすぎ落とした。このナイロンメンブレンに対して、実施例３（３）で調製されたプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション処理を行った。ハイブリダイゼーションは、実施例３（４）に準じて行った。
約５０００コロニーについて、コロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行ったところ、１０のクローンがポジティブシグナルを示した。
【００５０】
（７）コロニーダイレクトＰＣＲ
ポジティブシグナルを呈した１０のクローンについて、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、増幅断片が含まれているか否かの確認を行った。コロニーダイレクトＰＣＲは、ＰＣＲ  Ｔｉｐｓ（秀潤社）の方法に従って行った。すなわち、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商標：タカラバイオ株式会社製）（５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、プライマー溶液（ＫＳ１ＦＲＴ：１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、プライマー溶液（ＬＣ５ＲＲＴ：１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑバッファー（タカラバイオ株式会社製、添付のものを使用、マグネシウムを含む。）５μｌ、ｄＮＴＰミクスチャー（タカラバイオ株式会社製、各２．５ｍＭ）５μｌおよび滅菌蒸留水３７．５μｌ（トータル５０μｌ）を含む溶液にコロニーから採取した大腸菌を少量懸濁した。前記溶液を９４℃で５分間１回処理した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、続いて７２℃で３０秒の一連のサイクルを３０サイクル行い、次いで７２℃で７分間処理した。この処理で得られた反応液を１０μｌ電気泳動し、増幅の有無を確認した。予想される約４００ｂｐにバンドが観察されることにより、増幅されていたものと認められた。
コロニーダイレクトＰＣＲを行った結果、１０のクローンのうちの１つのクローンで遺伝子断片の増幅が認められ、このクローンが目的クローンと推察された。
【００５１】
（８）塩基配列の決定
実施例４（７）で得られた、遺伝子断片の増幅が認められた１つのクローンについて、ｐｋｓ遺伝子の探索・同定を主眼として塩基配列の決定・配列の解析を行った。塩基配列の決定には、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ７−ｄｅａｚａ  ｄＧＴＰ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）を用い、付属のマニュアル通りにサンプルを調製した。なお使用したプライマーは、Ｍ１３−４０  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）、Ｍ１３  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）。シークエンスゲル電気泳動装置はＡＬＦｒｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）を用い、ゲルはＬｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｇｅｌ（ＦＭＣ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を付属マニュアル通りに作製した。
解析の結果、当該クローンの遺伝子断片は、配列番号１の塩基番号１６８４〜９５２０よりなるＯＲＦの一部（１６８４〜３９０５）を含んでいることが明らかとなった。この領域に加えて、ＯＲＦの上流約１２００塩基に存在するＸｂａＩサイトまでの領域、およびそのさらに上流約５００塩基の遺伝子配列を決定し、最終的に配列番号１の塩基配列における塩基番号１〜３９０５の塩基配列を決定した。当該配列を有するＤＮＡ断片含有プラスミドｐＳＩ１は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９３の下、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。当該クローンの塩基配列をＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮを使用して解析したところ、この配列を決定した領域はは遺伝子の上流領域約１．７ｋｂをカバーするものであったので、続いてこの下流領域のクローニングを行った。また、ＢＬＡＳＴを用いてホモロジー検索を行ったところ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅと最も高い相同性を示した。
【００５２】
実施例５
実施例４でクローニングされた遺伝子断片は目的遺伝子の上流約１．７ｋｂをカバーするもので、その下流領域をクローニングすべく以下の実験を行った。
（１）ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ処理されたゲノムＤＮＡを用いたクローニング
実施例４（１）で得られたシトリニン低生産株ＨＵ３９１株のゲノムＤＮＡを２種類の制限酵素の組み合わせで処理したＤＮＡ断片について、実施例４（２）と同じ方法でサザンハイブリダイゼーション解析を行ったところ、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを併用して処理した場合に、約７ｋｂ付近にシグナルを検出できたので、このＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片をクローニングすることとした。クローニングは、制限酵素としてＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを使用したこと、約７ｋｂ付近のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片を抽出したことを除き、実施例４（１）〜（８）の方法に準じて行った。
形質転換体約２０００コロニーについて、コロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行ったところ、１つのクローンがポジティブシグナルを示し、このポジティブシグナルを呈した１つのクローンについて、コロニーダイレクトＰＣＲを行ったところ、１つのクローンで遺伝子断片の増幅が認められ、このクローンが目的クローンと推察された。
【００５３】
（２）塩基配列の決定
前記処理（１）により得られたクローンについて、実施例４（８）の方法に準じて塩基配列の決定を行った。当該クローンの遺伝子断片は、配列番号１の塩基配列における塩基番号２２７８〜９１３４の塩基配列を有していた。当該配列を有するＤＮＡ断片含有プラスミド  ｐＳＩ２は、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９４の下、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
解析の結果、実施例５で得られた遺伝子断片は、実施例４で得られた遺伝子断片と一部重複していることが確認できた。実施例４および５から明らかとなった目的遺伝子断片は、配列番号１の塩基番号１〜９１３４を有していた。当該ＤＮＡは、ポリケタイドシンターゼ遺伝子の一部分と推定された。
また、実施例４および５の結果から、目的遺伝子のＯＲＦの推定を行ったところ、実施例４および５でクローニングされたＤＮＡ断片はＯＲＦの下流領域をカバーできていないことが明らかとなった。
【００５４】
実施例６
実施例５でクローニングされた遺伝子断片の下流領域をクローニングすべく以下の実験を行った。
（１）ＫｐｎＩ処理されたゲノムＤＮＡを用いたクローニング
実施例４（１）で得られたシトリニン低生産株ＨＵ３９１株のゲノムＤＮＡをＫｐｎＩで処理したＤＮＡ断片について、実施例４（２）と同じ方法でサザンハイブリダイゼーション解析を行ったところ、約４．２ｋｂ付近にシグナルを検出できたので、このＫｐｎＩ断片をクローニングすることとした。クローニングは、制限酵素としてＫｐｎＩを使用したこと、約４．２ｋｂ付近のＫｐｎＩ断片を抽出したこと、およびプローブとしてＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片の３’領域の配列に基づいてデザインされた
Ｆ：５’−ＡＴＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧ−３’
Ｒ：５’−ＡＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣ−３’
の二つのプライマーを用いたＰＣＲにより増幅された配列番号１の塩基番号８９１８−９４０７からなる断片を使用したこと、コロニーＰＣＲの際に上記二つのプライマーを用いたことを除き、実施例４（１）〜（８）の方法に準じて行った。
形質転換体約１１００コロニーについて、コロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行ったところ、９つのクローンがポジティブシグナルを示し、このポジティブシグナルを呈した１つのクローンについて、コロニーダイレクトＰＣＲを行ったところ、１つのクローンで遺伝子断片の増幅が認められ、このクローンが目的クローンと推察された。
【００５５】
（２）塩基配列の決定
前記処理（１）により得られたクローンについて、実施例４（８）の方法に準じて塩基配列の決定を行った。当該クローンの遺伝子断片は、配列番号１の塩基配列における塩基番号８７８６〜１２６９７の塩基配列を有していた。当該配列を有するＤＮＡ断片含有プラスミド  ｐＳＩ３は、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６１３の下、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
解析の結果、実施例６で得られた遺伝子断片は、実施例５で得られた遺伝子断片と一部重複していることが確認できた。実施例４、５および６から明らかとなった目的遺伝子断片は、配列番号１の塩基配列を有していた。配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡは、ポリケタイドシンターゼ遺伝子を含むものと推定された。この配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを解析した結果、該ＤＮＡがコードするであろうと推定されるタンパク質（ポリケタイドシンターゼ）は、塩基番号  １６８４〜９５２０のＯＲＦを有し（塩基番号２２６５〜２３４８のイントロンを含む）、当該遺伝子中にケトシンターゼ活性中心（ＫＳ）（塩基番号３４０２〜３４０４）、アシルトランスフェラーゼ活性中心（ＡＴ）（塩基番号４７３７〜４７３９）、およびアシルキャリアータンパク質活性中心（ＡＣＰ）（塩基番号６８３１〜６８３３）を有しているものと推定された。ＯＲＦの前後には、ＴＡＴＡボックス（配列番号１の塩基番号１６７６〜１６８０）、ポリアデニル化シグナル（配列番号１の塩基番号９５７０〜９５７４）がそれぞれ存在しているものと推定された。当該ＤＮＡがコードするポリケタイドシンターゼのアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示される。図３には、実施例４〜６でクローニングされたＤＮＡフラグメント（３本のラインで示される）およびポリケタイドシンターゼ遺伝子のＯＲＦ（ＯＲＦ中、ＫＳはケトシンターゼドメイン、ＡＴはアシルトランスフェラーゼドメイン、ＡＣＰはアシルキャリアータンパク質ドメイン）が示される。なお、図３中、ＡおよびＢのラインはコロニーハイブリダイゼーションにおいて使用されたプローブの位置を示し、黒色矢印はポリケタイドシンターゼ遺伝子ＯＲＦを示す。また、図３中、斜線矢印はｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｅｆｆｌｕｘ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒと推定されるＯＲＦ（配列番号４の塩基配列により示され、当該塩基配列は、配列番号１の塩基番号９７３１〜１１４７９に対応する。また、当該ＯＲＦがコードするアミノ酸配列は配列表の配列番号３に示される。
【００５６】
実施例７
紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株におけるポリケタイドシンターゼ遺伝子破壊株の構築
（１）ｐＣＳＮ４４を用いた紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株の形質転換系の確立
ベクターとしてｐＣＳＮ４４を用いて、紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株の形質転換が可能であることの確認を行った。
使用されたｐＣＳＮ４４は、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）にアスペルギルス  ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来ｔｒｐＣ遺伝子のプロモーター、ターミネーターをつなげた遺伝子をマーカーとして有するベクターであり、ファンガルジェネティックストックセンター（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ：ＦＧＳＣ）から入手した。ｐＣＳＮ４４は、滅菌水中、１．４μｇ／μｌの濃度に調製されたものを使用した。
また、紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株のハイグロマイシン感受性を調べたところ、ＭＩＣ２００μｇ／ｍｌであった。
【００５７】
形質転換は以下の方法で行った。３％のＮ−アセチルグルコサミンを含むヘンネベルク液体培地１００ｍｌ入りの５００ｍｌ容のバッフルフラスコに、ヘンネベルクアガープレートで培養しておいたＩＦＯ３０８７３株の菌糸片をアガーごと（１ｃｍ×１ｃｍ角）植菌し、培養３６時間目の菌体を滅菌したＧ１ガラスフィルター（ＴＯＰ社製）でろ過して集菌し、菌体を滅菌水、スクロース−ＭＥＳバッファー（０．６Ｍスクロース、２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０）の順で洗浄した。洗浄された菌体をポリプロピレンチューブ（５０ｍｌ：ファルコン社製）に移し、菌体量を測定した。菌体１５０ｍｇあたり、ヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ：２０ｍｇ／ｍｌ）、ウスキザイム（Ｕｓｕｋｉｚｙｍｅ：２０ｍｇ／ｍｌ）を各濃度となる様に菌体懸濁液に直接添加し、約２時間、３０℃、８０ｓｐｍで振とうし、菌体をプロトプラスト化した。得られたプロトプラスト処理液をガラスウールフィルターでろ過し、ろ液を１６００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、プロトプラストを沈殿させた。上清を捨て、沈殿したプロトプラストをスクロース−ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）に懸濁させた後に、１６００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、プロトプラストを沈殿させた。上清を捨て、沈殿したプロトプラストを、形質転換用溶液Ｉ（０．６Ｍ  スクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２からなる）に懸濁させた後に、１６００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、プロトプラストを沈殿させた。上清を捨て、沈殿したプロトプラストを、２×１０８個プロトプラスト／ｍｌとなるように、形質転換用溶液Ｉで懸濁し、さらに、０．２容量の形質転換用溶液Ｉを加え、穏やかに懸濁してプロトプラスト含有液を調製した。このプロトプラスト含有液０．２ｍｌをチューブに取り、ベクターｐＣＳＮ４４（１．４ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ添加し、氷上で静置した。２０分静置後、１ｍｌの形質転換用溶液ＩＩを加え、穏やかに懸濁し、室温で１０分間静置した。次いで、８．５ｍｌの形質転換用溶液Ｉを加え、穏やかに懸濁した後、これを遠心してプロトプラストを沈殿させ、上清をなるべく除いて、プロトプラストを０．２ｍｌの形質転換用溶液Ｉに懸濁した。このプロトプラスト懸濁液を、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含む、ヘンネベルク再生軟寒天培地（バクトアガーを０．５％にした以外はヘンネベルク再生寒天培地と同じ）０．５ｍｌに懸濁し、これを２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むヘンネベルク再生寒天培地（組成：グルコース  ５．０％、ペプトン  ０．７５％、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４  ０．２％、ＫＮＯ３  ０．０５％、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．０１％、ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  ０．２％、バクトアガー  ２％、ＭＥＳ  １０ｍＭ、スクロース  ０．６Ｍ；ＫＯＨでｐＨ６．０に調整）上に重層することにより、プロトプラストを播種した。
これを２８℃で培養したところ、５日目にポジティブコロニーが５〜１０個生育しているのが確認できた。
【００５８】
（２）ＰＣＲ法によるポジティブコロニーの確認
上述の方法により得られた紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株の形質転換体と思われるポジティブコロニーのうち２つをピックアップして、ベクターが紅麹菌ゲノム内に組み込まれているかどうかの確認を行った。まず、簡易的にポジティブコロニーについて、選択圧をかけた液体培地（ヘンネベルク培地、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含む）で培養を行った。ポジティブコロニーのゲノムＤＮＡを抽出した。紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株を用いたこと、培地として、上記選択圧をかけた液体培地を使用したことを除き、培養条件、ゲノムＤＮＡの抽出は、実施例４（１）の方法に従って行われた。形質転換株から得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｐＣＳＮ４４に含まれるハイグロマイシンＢ耐性遺伝子のＯＲＦの部分をコードする、下記のプライマー（ｈｐｈＦおよびｈｐｈＲ）を用いてＰＣＲを行った。
使用したプライマー
ｈｐｈＦ：５’−ＡＡＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＴＣＴＣＣ−３’
ｈｐｈＲ：５’−ＡＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＧ−３’
ＰＣＲは、９４℃３０秒後、３０サイクルの９４℃３０秒、５１℃１分、７２℃３０秒の反応後、７２℃７分間の処理の条件で行った。また、負のコントロールとして、形質転換処理を行っていない紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株をヘンネベルク培地で実施例４（１）の方法に従って培養し、ゲノムＤＮＡの抽出を行い、これを鋳型としてＰＣＲを行った。また、正のコントロールとしてｐＣＳＮ４４を鋳型としてＰＣＲを行った。これらについて、ＰＣＲにより得られた増幅物を回収し、電気泳動して、予想される５００ｂｐに増幅産物を確認することにより、増幅物のシグナルの確認を行った。
【００５９】
２つの形質転換体では、いずれもｐＣＳＮ４４と同じく、約５００ｂｐの部分にシグナルが認められた。これに対して、紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株では、この部分にシグナルは認められなかった。この結果から、紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株をｐＣＳＮ４４を用いて上記方法で得られるポジティブコロニーにおいては、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子がゲノム内に組み込まれていることが確認された。すなわち、上記方法により、紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株をｐＣＳＮ４４を用いて形質転換できることが明らかとなった。
なお、上記培養条件で培養した場合、菌体回収時点において、２つの形質転換体のいずれについてもＩＦＯ３０８７３株と同程度の赤色色素が生産されていることが目視により確認できた。
【００６０】
（３）ポリケタイドシンターゼ遺伝子破壊用ベクターｐＣＴ１の構築
実施例４〜６の結果から明らかとなった配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡに含まれるポリケタイドシンターゼ遺伝子における、ケトシンターゼドメイン（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼドメイン（ＡＴ）、およびアシルキャリアータンパク質ドメイン（ＡＣＴ）、並びに制限酵素切断部位の配置は図３のＡに示される通りであった。よって、相同組換えによる遺伝子破壊が可能なベクターを構築すべく、ポリケタイドシンターゼ遺伝子においてケトシンターゼドメインおよびアシルキャリアータンパク質ドメインが欠失したＳｐｈＩ／ＫｐｎＩフラグメントを作成し、ｐＣＳＮ４４ベクターに導入することにより、ポリケタイドシンターゼ遺伝子破壊用ベクターｐＣＴ１を作成した。
ＳｐｈＩ／ＫｐｎＩフラグメントの調製方法、平滑末端処理方法、ｐＣＳＮ４４の調製（ＥｃｏＲＩ処理）方法、ライゲーション方法は以下の通りである。
【００６１】
ｐＳＩ１のＳｐｈＩ／ＫｐｎＩフラグメントの調製は、つぎの通りに行われた。
ｐＳＩ１（１．４μｇ／μｌ）１５μｌ、ＳｐｈＩ（タカラバイオ株式会社）６μｌ、ＫｐｎＩ（タカラバイオ株式会社）６μｌ、１０×Ｋ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社）６μｌ、および蒸留水８７μｌの組成（合計１００μｌ）で、３７℃、２時間反応を行った。反応後エタノール沈殿を行い、ＤＮＡペレットを乾燥させ乾燥ＤＮＡを得た。
当該乾燥ＤＮＡに、１０×Ｔ４  ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ、０．１％ＢＳＡ  １０μｌ、ｄＮＴＰ  １０μｌ、蒸留水６９μｌおよびＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）１μｌを添加し、３７℃、５分間反応を行った。反応後、フェノール／クロロホルム抽出を２度行った。抽出液のエタノール沈殿を行い、この反応液をアガロースゲル電気泳動し、臭化エチジウムで染色後、約２ｋｂのバンドをゲルごとカッターナイフで切り出し、ＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  ＶＥＲ．２（タカラバイオ株式会社）を用いてゲルからＤＮＡを抽出した。抽出方法は添付のマニュアルに従った。最終的に２０μｌのＤＮＡ抽出液（ｐＳＩ１のＳｐｈＩ／ＫｐｎＩ処理フラグメント抽出液）とした。
【００６２】
ｐＣＳＮ４４は、以下の通り酵素処理を行った。
ｐＣＳＮ４４（１．４μｇ／μｌ）１５μｌ、Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社）１２μｌ、ＥｃｏＲＶ（タカラバイオ株式会社）６μｌ、および蒸留水８７μｌの組成で、３７℃、２時間反応を行った。反応後エタノール沈殿を行い、ＤＮＡペレットを乾燥させ、乾燥ＤＮＡを得た。
当該乾燥ＤＮＡに、１０×ＣＩＰ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社）１２μｌ、ＣＩＰ（タカラバイオ株式会社）２μｌおよび蒸留水９６μｌを添加し、５０℃で、３０分間反応を行った。反応後フェノール抽出を２回行い、さらにクロロホルム抽出を１回行った。抽出液をエタノール沈殿し、ＤＮＡペレットを乾燥後、１５μｌの蒸留水に溶解した（ｐＣＳＮ４４のＥｃｏＲＶ処理液）。
【００６３】
上述のように調製された、ｐＳＩ１のＳｐｈＩ／ＫｐｎＩ処理フラグメント抽出液と、ｐＣＳＮ４４のＥｃｏＲＶ処理液を用いてライゲーション反応を行った。ライゲーション反応は、ｐＳＩ１のＳｐｈＩ／ＫｐｎＩ処理フラグメント抽出液  ５μｌ、ｐＣＳＮ４４のＥｃｏＲＶ処理液  １μｌ、およびＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ株式会社）Ｉ液  ６μｌの組成で、１６℃、２０分間、反応が行われた。
【００６４】
この反応液でＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１０  ＧＯＬＤ（商標）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を形質転換した。形質転換は、ＸＬ−１０  ＧＯＬＤ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓを用い、方法は添付のマニュアルに従った。
生育してきた白コロニーを３ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ培地に植菌し、３７℃で１６時間振とう培養を行った。この培養液から、Ｆｌｅｘｉ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社）を用いてプラスミドを抽出した。方法は添付のマニュアルに従った。
上記方法により、配列番号１の塩基配列において、３７３２〜５８５４の部分を有するＤＮＡを含むｐＣＳＮ４４ベクター、すなわち、ｐＣＴ１ベクターを構築した。ｐＣＴ１ベクターの構造は図４のＡに示される。
【００６５】
（４）ｐＣＴ１を用いた紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株の形質転換
使用されたベクターｐＣＴ１であることを除き、実施例７（１）の方法に従って紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株の形質転換処理が行われた。該処理により、１つのポジティブコロニーを取得することができた。
【００６６】
（５）ｐＣＴ１による形質転換株についてのＰＣＲ法によるポジティブコロニーの確認
上記（４）で得られたポジティブコロニーについて、実施例７（２）の方法に従ってポジティブコロニーの確認を行った。ただし、使用したプラーマーは以下の通りである。
使用されたプライマー
ＫＳ１ＦＲＴ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＣＣ−３’
ｈｐｈＲ：５’−ＡＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＣＡＴＣＧＡＧ−３’
確認の結果、（４）で得られたポジティブコロニーについては、上記プライマーの組み合わせで約３．０ｋｂあたりに増幅産物が確認できた。
【００６７】
（６）紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株のｐＣＴ１による形質転換体におけるシトリニン生合成能の分析
実施例７（４）で得られた紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株のｐＣＴ１による形質転換体、およびＩＦＯ３０８７３株について、実施例１に記載された方法に従って７日間培養を行って、それぞれのシトリニン生産量をＨＰＬＣにより分析を行った。ＨＰＬＣでは、検出されたピークにより定量する手法を採用しているが、このピークがシトリニン以外の物質に起因する場合も考えられるので、同じサンプルについて、別の定量方法である抗体検出法でもさらに分析を行った。抗体検出法には、リダスクリーン  ファースト  シトリニン（ＲＩＤＡＳＣＲＥＥＮ  ＦＡＳＴ  Ｃｉｔｒｉｎｉｎ：ｒ−ｐｈａｒｍ社製）が使用された。抗体検出法における測定は、当該キットに添付のマニュアルに従って行われた。
【００６８】
抗体検出法によると、紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株では、３．５×１０３ｐｐｍであったのに対し、実施例７（４）で得られた紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株のｐＣＴ１による形質転換体では、検出限界（検出限界：１５ｐｐｂ）以下であった。
菌体が回収された時点において、紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株および実施例７（４）で得られた紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株のｐＣＴ１による形質転換体のいずれにおいても、目視により、菌体中に赤色色素の生産されていることが認められた。
いずれの測定方法を用いた場合でも、紅麹菌ＩＦＯ３０８７３株のｐＣＴ１による形質転換体では、野生株であるＩＦＯ３０８７３株の数千分の１程度のシトリニン生産能しか有していないことが明らかとなった。このことから、配列番号１の塩基配列における塩基番号３４３２〜５５５４の部分を有するＤＮＡ、すなわち、ポリケタイドシンターゼ遺伝子においてケトシンターゼドメインおよびアシルキャリアータンパク質ドメインが欠失した変異遺伝子を含むベクターｐＣＴ１は、紅麹菌のシトリニン合成能を破壊できることが明らかとなった。
【００６９】
また、プローブとしてＫＳ−ＬＣ５  ＰＣＲ産物を用いて、ＳａｌＩで分解されたゲノムに対してサザンブロット分析を行った。サザンブロットは実施例４（２）の方法に準じて行った。結果は図４のＢに示され、図４Ｂのレーン１は野生株であり、レーン２はｐＣＴ１による形質転換体である。図４Ｂの結果から、野生株においてはゲノムのＳａｌＩ分解物において、１６ｋｂにバンドが認められたが、ｐＣＴ１による形質転換体では１６ｋｂのバンドは消失し、１２．５ｋｂ付近にバンドが認められた。ポリケタイドシンターゼ遺伝子の制限酵素切断部位を考慮すると、ｐＣＴ１による形質転換体により、図４Ａで示されるような、紅麹菌ゲノムのポリケタイドシンターゼ遺伝子の破壊が生じていることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、シトリニン低生産株ＨＵ３９１株トータルＲＮＡを鋳型とし、ＫＳ１ＦＲＴおよびＬＣ５ＲＲＴをプローブとしてノザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す図である。
【図２】図２は、ＫＳ１ＦＲＴおよびＬＣ５ＲＲＴを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片をプローブとした、シトリニン低生産株ＨＵ３９１株のゲノミックサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図３】図３は、配列番号１に示されるＤＮＡ配列におけるポリケタイドシンターゼ遺伝子および制限酵素切断部位を示す図である。
【図４】図４は、ポリケタイドシンターゼ遺伝子破壊用ベクターｐＣＴ１の構造、および紅麹菌ゲノムへの相同組換えによる遺伝子破壊の作用メカニズム（図４Ａ）、並びにｐＣＴ１による紅麹菌の形質転換により、ゲノムＤＮＡのＳａｌＩ分解物が変化したことを示す（レーン１：野生株、レーン２：形質転換体）、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションの結果（図４Ｂ）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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