(57)【要約】【課題】茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）を抽出して得られるカテキンの新たな用途を提供する。【解決手段】本発明は、カテキン又はカテキン混合物を有効成分として含有する骨形成促進剤並びに骨形成促進飲食物を提供する。骨芽細胞死を抑制し、骨芽細胞の増殖・分化或いは成熟を助長（強化）することによって骨細胞による骨形成を促進することができる。カテキン又はカテキン混合物とは、（−）ＥＣ、（−）ＥＧＣ、（−）ＥＣｇ、（−）ＥＧＣｇ、（−）Ｃ、（−）ＧＣ、（−）Ｃｇ及び（−）ＧＣｇのいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物であり、中でも（−）ＥＣｇを有効成分とするのが好ましい。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテキンを有効成分として含有する骨形成促進剤。
【請求項２】
カテキン混合物を有効成分として含有する骨形成促進剤。
【請求項３】
上記のカテキン又はカテキン混合物とは、（−）エピカテキン（ＥＣ）、（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、（−）エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、（−）カテキン（Ｃ）、（−）ガロカテキン（ＧＣ）、（−）カテキンガレート（Ｃｇ）及び（−）ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）のいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物である請求項１又は２に記載の骨形成促進剤。
【請求項４】
（−）エピカテキンガレート（ＥＣｇ）を有効成分とする骨形成促進剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の骨形成促進剤の有効成分を有効成分として含有する骨形成促進飲食物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）を抽出して得られるカテキンの新たな用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
茶から抽出されるポリフェノール、中でもカテキンには既に様々な薬理作用が見出され、各種用途に使われている。
【０００３】
例えば、特許文献１は、カテキンを有効成分とする体内アルコール及びその代謝物の低下促進剤を開示している。
【０００４】
また、特許文献２は、茶カテキンを有効成分とする解毒剤、すなわち過剰飲酒等により体内の酢酸或いはアセトン濃度が過剰に上昇して酸性血症となり、吐き気、めまいなどの不快な症状が生じた際に摂取すれば体内における酢酸及びアセトンの代謝を促進させることができ、これらの体内濃度を有効に低下させて前記諸症状を短時間で消失させる解毒剤を開示しており、
特許文献３は、茶カテキンに活性酸素発生抑制効果があることを見出し、活性酸素発生抑制剤及び活性酸素起因疾患予防剤すなわち歯周病や肺炎、老化、癌などの活性酸素起因疾患を予防する予防剤として利用することを提案している。
【０００５】
特許文献４は、茶カテキンを主成分とするヒトパピローマウイルス由来の尖圭コンジローマ治療剤を開示し、特許文献５は、抗ガン剤に茶カテキン類及び／またはテアフラビン類を添加すると抗ガン剤の効力増強効果を得られる旨を開示し、
特許文献６は、茶カテキンを有効成分とするガストリン分泌抑制剤及び胃酸分泌抑制剤を提案し、摂取することにより胃体部におけるガストリンの分泌及び胃酸の過剰分泌を抑制し、ひいては胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、胃癌等の消化器疾患の予防を図ることができる旨を開示している。
【０００６】
特許文献７は、カテキンを含有する主要カテキン組成物が肝傷害保護効果（肝機能改善効果）を発揮する旨を開示し、特許文献８は緑茶由来のポリフェノール類を有効成分としたアポトーシス誘導性抗白血病細胞剤を開示している。
【０００７】
また、特許文献９は、茶から得られるポリフェノール抽出物が、骨破壊を促進する因子であるＰＴＨｒｐ（副甲状腺ホルモン関連蛋白質）またはその活性フラグメント誘発する培養新生仔マウス頭蓋冠からのカルシウム及び無機リン酸の遊離抑制作用を示すことを見出し、かかる知見に基づいて、茶から得られるポリフェノール抽出物を有効成分とする、骨粗鬆症などの吸収性骨疾患（例えば骨粗鬆症）の予防及び治療剤を開示している。
【０００８】
【特許文献１】
特開平０６−２６３６４８号公報
【特許文献２】
特開平０９−５９１５４号公報
【特許文献３】
特開平１０−１７５８５８号公報
【特許文献４】
特開平１０−１４７５２５号公報
【特許文献５】
特開平１０−３６２６０号公報
【特許文献６】
特開平１１−１９３２３９号公報
【特許文献７】
特開２０００−６０４２７号公報
【特許文献８】
特開２００１−２２６２７６号公報
【特許文献９】
特開平６−１８３９８５号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、茶から抽出して得られるカテキンについては既に様々な研究がなされ、各種薬理作用が見出されているが、本発明者は、従来開示されていない新たな薬理作用を見出すことに成功し、かかる知見に基づいて本発明を想到するに至ったものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）などに含まれるカテキンに、骨芽細胞死を抑制し、骨芽細胞の増殖・分化・成熟を助長（強化）する骨組織再生促進作用を見出し、かかる知見に基づいて本発明を想到したものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、カテキン又はカテキン混合物を有効成分として含有する骨形成促進剤（骨芽細胞死抑制剤、又は骨芽細胞の増殖・分化或いは成熟を助長する薬剤とも言える。）及び骨形成促進飲食物を提案する。
【００１２】
骨は身体の骨格としての役割だけではなく、カルシウムなどのミネラルの貯蔵庫となり、ホルモン等による調整により身体を正常に保つ役割をしている。
骨は、一度出来上がればそのままという組織ではなく、体内の他の組織同様常に新陳代謝を繰り返している。すなわち、骨では絶えず骨を溶かす破骨細胞と骨を作る骨芽細胞とが密接に連係して骨破壊（骨吸収）と骨形成とを繰り返しており（リモデリング）、成人では骨骨格の３〜５％が活発にリモデリングしているといわれている。
このような骨組織リモデリングにおいて、破骨細胞が吸収した骨質と等量の骨質を形成すると、骨芽細胞は活動を停止して自ら分泌した骨質内に埋もれたのち、骨細胞となって増殖能力を失うことが知られているが、本発明では、カテキン及びカテキン混合物には、このような骨芽細胞の活動停止（すなわち細胞死）を抑制し、骨細胞による骨形成を促進させる得ることを見出した（下記試験）。これにより、カテキン又はカテキン混合物は、骨芽細胞死を抑制し、骨芽細胞の増殖・分化或いは成熟を助長（強化）することによって骨細胞による骨形成を促進することができ、例えば骨折後の回復過程を促進したり、骨粗鬆症をはじめとする代謝性骨疾患の症状を軽減したりする効果を期待することができる。
【００１３】
なお、骨形成を促進する要素としては、従来、女性ホルモン（エストロゲン）やビタミンＤなどが知られていた。また、最近になって、牛乳や母乳等にごく微量含まれているミルク・ベーシック・プロテイン（ＭＢＰ）が、骨芽細胞と破骨細胞の両方に働きかけ、骨の新陳代謝をスムーズにすることが分かってきたが、カテキンが骨芽細胞に作用し、骨形成促進に寄与し得る旨の報告は存在しなかった。
【００１４】
本発明において「特定のカテキン（例えば（−）エピカテキン（ＥＣ）或いは（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）、或いはこれらの混合物など、限定されたカテキン）を有効成分とする」とは、骨細胞による骨形成の促進作用が阻害しなければ、その他の成分、例えば当該特定のカテキン以外のカテキンなどの成分を含んでいてもよいという意を包含するものである。
また、ＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ、ＥＧＣｇ、Ｃ、ＧＣ、Ｃｇ及びＧＣｇそれぞれのカテキンの重合体、並びに、当該それぞれのカテキンと他のカテキンとの共重合体、或いはそれらの二種類以上の組合わせからなる混合物は、「カテキン又はカテキン混合物」「ＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ、ＥＧＣｇ、Ｃ、ＧＣ、Ｃｇ及びＧＣｇのいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物」の均等物であると考えることができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の骨形成促進剤及び骨形成促進飲食物は、カテキン又はカテキン混合物を適宜濃度で配合することによって製造することができる。但し、カテキン又はカテキン混合物の薬理活性を阻害しない範囲でその他の成分を配合したり、その他の処理を施すことは適宜可能である。
【００１６】
上記のカテキンとしては、（−）エピカテキン（ＥＣ）、（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）エピカテキンガレート（ＥＣｇ）及び（−）エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、これらのエピマーである（−）カテキン（Ｃ）、（−）ガロカテキン（ＧＣ）、（−）カテキンガレート（Ｃｇ）及び（−）ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）の８種類のカテキンのいずれかを用いることができる。
また、上記のカテキン混合物としては、上記８種類のカテキンのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物を用いることができる。
中でも特に、（−）エピカテキンガレート（ＥＣｇ）の骨形成促進作用は優れているため、ＥＣｇを有効成分として含有するものが好ましい。
なお、上記各カテキンの重合体、上記カテキンから選ばれたいずれか二種類以上の組合わせからなる共重合体、それらの化合物或いは重合体或いは共重合体も同様の効果を有するものと期待することができる。
【００１７】
上記カテキンの中でＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ及びＥＧＣｇは、天然物、特に茶葉中に多く含有されているから、従来公知の方法或いは今後公知となる方法によって抽出及び精製などによって得ることができる。
【００１８】
他方、これらのエピマーであるＣ、ＧＣ、Ｃｇ及び  ＧＣｇは、茶葉を含めて天然植物中にはほとんど存在しないが、ＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ及びＥＧＣｇのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物を加熱処理することにより熱異性化（エピマー化）させて得ることができる。例えば、精製したＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣｇ及びＥＧＣｇのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物、例えば茶の抽出液や浸出液などを、好ましくはｐＨ５〜６に調整した上で、８０℃以上の加熱処理することによりカテキンの熱異性化を促してＣ、ＧＣ、Ｃｇ及び  ＧＣｇの含有濃度を高め、このような加熱処理後物からＣ、ＧＣ、Ｃｇ及び  ＧＣｇのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物を分離・精製して得ることができる。
この際、カテキンを熱異性化（エピマー化）させるための加熱処理としては、カテキンを含有する溶液（カテキン溶液）を少なくとも８０℃以上に加熱処理する必要がある。例えば、１００℃×１５分加熱、１１５℃×２０分加熱、１２０℃×３〜３０分加熱、１２３℃×１０分加熱、１３１℃×３０秒加熱、１３３℃×４５秒のいずれにおいてもカテキンの熱異性化が認められている。
カテキン溶液をｐＨ５〜６に調製した上で加熱処理するのが好ましいとするのは、ｐＨ４．５以下ではカテキンはほとんど熱異性化しないことが報告されているためである（末松伸一ら、：日食工誌、３９，１７８（１９９２））。
【００１９】
なお、カテキンの分離・精製方法は、従来公知の方法或いは今後公知となる方法によって行えばよい。例えば、茶の抽出液を、例えば水−アセトニトリル−リン酸の混合液を移動相とした逆相ＨＰＬＣにかけ、アセトニトリル濃度でグラジエントをかけることによってそれぞれ分離できることが知られている。
【００２０】
本発明の「カテキン混合物」として、カテキン濃度２０重量％以上、好ましくは２５％以上、中でも特に３０％以上の茶抽出物を用いることが可能である。
茶抽出物は、茶を水、温水または熱水、好ましくは４０℃〜１００℃の温熱水、中でも９０〜１００℃の熱水、或いは人体に無害なエタノール水溶液またはエタノールなどの有機溶媒で抽出して得ることができ、好ましくは、この茶抽出物を溶媒抽出法、樹脂吸着法、限外濾過・逆浸透濾過等の濾過などの精製手段によってカテキンの含有量を高める方向に精製して得ることができる。抽出の際、カテキン含有量を高めるべく塩酸等を添加した酸性条件下で抽出を行ってもよい。
また、市販の茶抽出物を用いることがもできる。例えば、テアフラン３５及び３０Ａ（商品名；伊藤園社製）のいずれも、緑茶を熱水抽出処理し、この抽出物を乾燥させてカテキン濃度を約３０％とした緑茶抽出物（組成（重量％）：ＥＧＣ７．６２、ＥＧＣｇ１３．７０、ＥＣ２．１３、ＥＣｇ２．６１、ＧＣ２．６１、ＧＣｇ０．４９、（＋）Ｃ０．４３、Ｃｇ０．２８）であり、テアフラン９０Ｓ（商品名；伊藤園社製）は、緑茶を熱水抽出処理して得た抽出物を、水と低・高濃度アルコールを使って吸着カラムにて分離し乾燥させ、茶ポリフェノール濃度を約８５〜９９．５％とした緑茶抽出物（組成の一例（重量％）：ＥＧＣｇ５０．１８、ＥＣ０．５７、ＥＣｇ１７．１１、ＧＣｇ３．９６、Ｃｇ０．９１）である。
【００２１】
本発明の骨形成促進剤において、カテキン又はカテキン混合物は、それぞれ単独で本発明の有効成分として配合することも可能であるが、既に或いは将来的に骨形成促進効果が認められた物質（例えば女性ホルモン（エストロゲン）やビタミンＤ、ＭＢＰなど）と混合し、これらの有効成分と併用することも可能である。
なお、単独で本発明の有効成分として配合する場合、例えばカテキン又はカテキン混合物を、精製水や生理食塩水などに溶解して骨形成促進剤（例えば経口投与剤、腹腔内投与剤等）とすることも可能である。
【００２２】
本発明の骨形成促進剤は、経口投与剤または非経口投与剤（筋肉注射、静脈注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など）とすることができ、それぞれの投与に適した配合及び剤型とするのが好ましい。
剤型について言えば、例えば経口投与剤用としては液剤、錠剤、散剤、顆粒、糖衣錠、カプセル、懸濁液、乳剤、丸剤などの形態に調製することができ、非経口投与剤用としては注射剤、アンプル剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などの形態に調製することができる。
配合（製剤）について言えば、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。また、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどの無毒性の添加剤を配合することも可能である。
【００２３】
また、本発明の骨形成促進剤は、医薬品のほか、医薬部外品、薬理効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品、食品添加剤、その他ヒト以外の動物に対する薬剤や餌、餌用添加剤などとして提供することが可能である。
例えば、医薬部外品として調製し、これを瓶ドリンク飲料等の飲用形態、或いはタブレット、カプセル、顆粒等の形態とすることにより、より一層摂取し易くすることができる。
【００２４】
本発明の骨形成促進飲食物（本発明では、骨形成促進効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品を総称して「骨形成促進飲食物」という。）は、例えば、カテキン又はカテキン混合物、或いはこの混合物を含むカテキン溶液（例えばカテキン抽出液や浸出液）などを他の飲食品材料、例えば炭酸、賦形剤（造粒剤含む）、希釈剤、或いは更に甘味剤、フレーバー、小麦粉、でんぷん、糖、油脂類等の各種タンパク質、糖質原料やビタミン、ミネラルなどの飲食品材料群から選ばれた一種或いは二種以上と混合したり、或いは、現在公知の飲食品、例えばスポーツ飲料、果実飲料、乳飲料、茶飲料、野菜ジュース、乳性飲料、アルコール飲料、ゼリー、ゼリー飲料、炭酸飲料、チューインガム、チョコレート、キャンディ、ビスケット、スナック、パン、乳製品、魚肉練り製品、畜肉製品、冷菓、乾燥食品、サプリメントなどに添加して製造することができる。
【００２５】
本発明における有効成分の含有量は、使用方法によっても異なるが、医薬品であれば、カテキン或いはこれらの混合物を、乾燥重量換算で０．００１〜１重量％、特に０．０１〜０．５重量％配合するのが好ましく、
飲食品であれば、カテキン或いはこれらの混合物を０．００１〜１重量％、特に０．０１〜０．５重量％配合するのが好ましい。特に飲料の形態とする場合、通常飲用されるお茶の１．４倍〜８倍の濃度に調製するのが好ましい。
なお、摂取量としては、カテキン或いはこれらの混合物を乾燥重量換算で大人一日に１０〜５０００ｍｇ、好ましくは１００〜１５００ｍｇ程度摂取するのが好ましい。
【００２６】
（試験）
骨組織リモデリングは、破骨細胞と骨芽細胞により行われることは周知の事実であるが、破骨細胞が吸収した骨質と等量の骨質を形成すると、骨芽細胞は活動を停止して、自ら分泌した骨質内に埋もれたのち、骨細胞となって増殖能力を失うと理解される。したがって、骨芽細胞の生存決定要因の追究は、骨粗鬆症をはじめとする代謝性骨疾患の発症原因解明研究のみならず、治療方法開発研究のうえでも、極めて大きな病態生理学的意義を持つと推察される。したがって、本研究では初代培養骨芽細胞を用いて、培養メディウム交換により引き起こされる細胞死について多面的解析を行った。
【００２７】
＜方法＞
（試薬調整）
テアフラン９０Ｓ（組成（重量％）：ＥＧＣｇ４３．１４、ＥＣ０．８２、ＥＣｇ１６．３０、ＧＣｇ４．１６、Ｃｇ１．４４、カテキンＴＯＴＡＬ総量６５．８６）及びテアニン（ｔｈｅａｎｉｎｅ）をＰＢＳ中に懸濁し、それぞれ１００ｍｇ／ｍＬ及び１Ｍのｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを作成した。
また、（−）−エピカテキン（ＥＣ）、（−）−エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、（−）−エピガロテキテキン（ＥＧＣ）及び（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）をＤＭＳＯ中に懸濁し、それぞれ１００ｍＭのｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（貯蔵液）を作成した。
【００２８】
（骨芽細胞培養法）
１）Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット（１−２日齢）を７０％ｅｔｈａｎｏｌで消毒後に屠殺した。
２）頭蓋骨皮膚を剥離後、頭蓋骨をＰＢＳ中へ摘出した（ただし、後頭骨部分は除去）。
３）付着した血球や髄膜を除去し、ＰＢＳで洗浄した。
４）頭蓋骨を酵素溶液（０．１％  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎ  ＰＢＳ）１０ｍＬ中で３７℃、５分間攪拌後、細胞浮遊画分を吸引除去した。
５）新しい酵素溶液１０ｍＬを添加し３７℃、１０分間攪拌後、細胞浮遊画分を１０％ＦＢＳ−αＭＥＭ中へ回収した。
６）５）の作業をさらに３回繰り返し、それぞれの細胞浮遊画分を回収した。
７）回収した画分を細胞ろ過用フィルターでろ過した。
８）ろ液を２５０ｇ、５分間遠心後、沈渣を１０％ＦＢＳ−αＭＥＭで懸濁した。
９）１×１０４  ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で各プレートに播種した。
１０）翌日、メディウムを５０ｍｇ／ｍＬ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ及び５ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅを含む１０％ＦＢＳ−αＭＥＭへ交換し、この日を培養０日目（開始日）とした。以後１日おきにメディウムを交換した。
【００２９】
頭蓋骨由来骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１についても、１０％ＦＢＳ−αＭＥＭを用いて同様に培養した。
【００３０】
（細胞生存活性測定法）
細胞生存活性の測定手順を図１に示す。
１）細胞は、各培養日数経過まで、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ中で培養した。
２）各培養日数経過後に、細胞培養メディウムを、被検化合物を含む１０％ＦＢＳ−αＭＥＭに交換した。
３）メディウム交換１２時間後に、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８  （ＤＯＪＩＮＤＯ）を添加後、４５０ｎｍの吸光度を測定した（参照波長６５０ｎｍ）。
【００３１】
（細胞死測定法）
１）細胞をＰＢＳで２回洗浄後、１０ｍｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２  及び  ５ｍｇ／ｍＬ          ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅを添加し、室温で１５分間反応させた。
２）励起主波長４０５ｎｍまたは５４６ｎｍのダイクロイックミラーを用いて、オリンパス倒立型顕微鏡で蛍光の観察をした。
【００３２】
（ＤＮＡ結合能測定法）
細胞核抽出液
１）細胞をＰＢＳで２回洗浄後、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ  ７．９）［１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  各種  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  （ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ及びｓｏｄｉｕｍ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、及び１  ｍｇ／ｍＬ  各種  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ［（ｐ−ａｍｉｄｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ  及び  ａｎｔｉｐａｉｎ］］中で懸濁した。
２）１０％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０を最終濃度０．６％になるように添加し、攪拌後２０，０００ｇ、５分間遠心分離した。
３）沈渣を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）［４００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ  上記各種  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、及び１  ｍｇ／ｍＬ  上記各種  ｐｒｏｔｅａｓｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ］を用いて懸濁した。
４）懸濁液を氷水中で３０分間静置後、２０，０００ｇ、５分間遠心分離し、その上清を細胞核抽出液とした。
【００３３】
（ゲルシフト法）
１）細胞核抽出液を、［α−３２Ｐ］ｄｅｏｘｙ−ＡＴＰで放射ラベルしたＡＰ１  （５’−ＣＴＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣ−３’）プローブ、またはＮＦ−ｋＢ（５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’）プローブと、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）［１  ｍｇ  ｐｏｌｙ  （ｄＩ−ｄＣ）、１６０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５ｍＭ  上記各種  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、及び１ｍｇ／ｍＬ  上記各種  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ］中で２５℃、３０分間反応させた。
２）反応終了後、６％ポリアクリルアミドゲルを用いて泳動用緩衝液（ｐＨ８．５）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．３８Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で、８０Ｖ定電圧、２℃、１．５時間泳動分離した。ゲルを乾燥したのち、オートラジオグラフィー法によりゲル中の放射能を検出した。
【００３４】
＜結果＞
培養液交換に関しては、培養開始後３日目までの初代培養骨芽細胞では、培養メディウムをαＭＥＭからＤＭＥＭに交換すると、その１２時間後には骨芽細胞の生存率は著明に減少した（図２〜図４）。これに対して、５日間以上αＭＥＭ中で培養した細胞では、培養液をＤＭＥＭに交換しても１２時間後の細胞生存率は著変を示さなかった（図５）。培養０日目の細胞では、培養メディウム交換後２時間目には既に５０％以上の細胞死が誘発され、交換後４時間目には殆ど全ての細胞が死滅した（図２）。これに対して、培養１日目の細胞では、メディウム交換２時間後でも６０％以上の細胞の生存が確認されたが、交換後８時間目には殆どの細胞が死滅した（図３）。培養３日目の細胞では、メディウム交換後６時間目までは著明な細胞死は観察されなかったが、交換後１２時間目には著しい細胞死が誘発された（図４）。したがって、αＭＥＭメディウム中での培養初期にのみ、メディウム交換による骨芽細胞死が誘発されることは明白である。
【００３５】
ＤＮＡ結合能に関しては、３日間培養した細胞について、培養メディウム交換直後に細胞を回収して、遺伝子転写制御因子のＤＮＡ結合能を測定した。その結果、交換後６０分目ではＡＰ１  ＤＮＡ結合に著変は見られなかったが、１２０分後にはＡＰ１結合は２倍以上増強された。しかしながら、交換後２４０分経過時には有意なＡＰ１結合上昇は観察されなかった。これに対して、ＮＦ−ｋＢのＤＮＡ結合能は、メディウム交換後１２０分経過時に１０倍以上の上昇が認められただけでなく、２４０分経過後にも５倍の上昇が見られた。したがって、培養メディウム交換はＡＰ１の一過性発現のみならず、ＮＦ−ｋＢの持続的発現を招来すると推察される。
【００３６】
細胞死に関しては、３日間培養細胞について、メディウム交換後１２時間目に細胞を染色して、蛍光顕微鏡で観察すると、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した場合は、細胞核凝集を示す細胞が認められた。同様に、細胞をｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅで染色すると、高い染色性を示す細胞が複数観察された。したがって、培養メディウム交換に伴う細胞死には、アポトーシスとネクローシスの両方が関与すると推察される。
【００３７】
株化細胞に関しては、初代培養骨芽細胞だけでなく、頭蓋骨由来株化細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１についても同様の検討を行ったところ、初代培養細胞の場合と同様に、１日間培養した株化細胞においても、培養メディウム交換により著明な細胞死が誘発された。
したがって、初代培養骨芽細胞だけでなく株化骨芽細胞でも、未成熟な発達段階では培養メディウムをα−ＭＥＭからＤＭＥＭに交換すると、著明な細胞死が出現することは明らかである。
【００３８】
生存因子に関しては、骨芽細胞の生存に必須な物質を、αＭＥＭとＤＭＥＭ間の組成相違を基に検討した。３日間培養細胞について、交換メディウムＤＭＥＭ中にピルビン酸やシステインを添加すると、メディウム交換後１２時間目でも著明な細胞死が出現しないことが判明した。したがって、ピルビン酸やシステインは骨芽細胞の生存に必須な内在性物質であると類推される。
【００３９】
次いで、骨芽細胞生存に必要な外因性物質を探索するために、多価フェノール群（カテキンやテアニンなど）の効果について検索を進めた。
【００４０】
まず、緑茶成分カテキンの混合物であるテアフラン９０Ｓについて同様の解析を行ったが、培養０日目及び培養１日目の細胞の場合は、交換メディウムＤＭＥＭ中にテアフランを添加しても、メディウム交換に伴う骨芽細胞死は著明な影響を受けなかった（図１８、図１９）。これに対して、３日間培養細胞の場合は１００μｇ／ｍＬテアフラン９０Ｓ添加の場合に著明な防御効果が観察されたが、より高濃度でもテアフランには細胞死防御作用は見られなかった（図２０）。一方、培養７日目の細胞ではメディウム交換に伴う細胞死は元来誘発されなかったが、高濃度のテアフラン９０Ｓを添加したαＭＥＭにメディウムを交換すると、１２時間後には殆どの骨芽細胞が死滅することが明らかとなった（図２１）。これらの結果は、位相差顕微鏡による観察でも確認された（図２２〜図２７）。
以上の結果から、混合物であるテアフラン９０Ｓ中には、未熟骨芽細胞において観察されるメディウム交換に伴う細胞死を防御する物質だけでなく、骨芽細胞死を誘導する物質が含まれることは明らかである。そこで次に、テアフラン９０Ｓ中の各含有成分それぞれについて、メディウム交換誘発性細胞死に対する影響を検索した。
【００４１】
エピカテキン（ＥＣ）に関しては、培養０日目から３日目までの細胞では、０．３から３００μＭまでのエピカテキン添加ＤＭＥＭにメディウムを交換しても、メディウム交換に伴う細胞死には著明な変化は認められなかった（図２８〜図３０）。また、７日間培養細胞でも各濃度のエピカテキンは、細胞生存率に著変を与えなかった（図３１）。
以上の結果から、エピカテキンは骨芽細胞の成熟度に拘わらず、メディウム交換に伴う細胞死を防御する活性や、或いは細胞死を誘導する活性を持たないと推察される。
【００４２】
エピカテキンガレート（ＥＣｇ）に関しては、培養０日目細胞の場合は、０．４から４００μＭまでのエピカテキンガレートを添加しても、メディウム交換に伴う細胞死は影響されなかったが（図３２）、培養１日目及び３日目の細胞の場合は、メディウム交換による細胞死は４０から４００μＭのエピカテキンガレート添加により阻止された。しかしながら、７日間培養した骨芽細胞では、高濃度（４００μＭ）のエピカテキンガレートを添加したＤＭＥＭにメディウム交換すると、１２時間後には軽度ではあるが有意な細胞死が招来された。
以上の結果から、エピカテキンガレートは超未熟な骨芽細胞におけるメディウム交換誘発性細胞死は防御できないが、未熟骨芽細胞における細胞死に対しては、強い防御作用を発揮することが判明した。しかしながら、成熟発達段階にある骨芽細胞では、極めて高濃度のエピカテキンガレートは弱い細胞毒性を示す可能性が考えられる。
【００４３】
エピガロカテキン（ＥＧＣ）に関しても、エピカテキンの場合と同様に、培養０日目から３日目までの細胞では、１から１，０００μＭまでの濃度を添加しても、メディウム交換に伴う細胞死に対する著明な影響を与えなかったが、エピカテキンの場合とは異なり、７日間培養細胞では高濃度のエピガロカテキン添加により、１２時間後に殆どの骨芽細胞が死滅した。
以上の結果から、エピガロカテキンは未熟骨芽細胞におけるメディウム交換性細胞死を防御する活性を示さないのに対して、成熟発達段階にある骨芽細胞では極めて高濃度で強い細胞毒性を発揮する可能性が示唆される。
【００４４】
エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）の場合は、培養０日目の細胞ではメディウム交換による細胞死に対する影響は認められなかったが、１日間培養及び３日間培養の細胞では、１００μＭでは有意な保護作用を示したのに対して、１，０００μＭでは有意な保護効果は見られなかった。一方、７日間培養細胞では、１，０００μＭエピガロカテキンガレート添加により、１２時間後には著しい細胞死が誘発された。
以上の結果から、エピガロカテキンガレートは超未熟骨芽細胞におけるメディウム交換誘発性細胞死は防御できないが、未熟骨芽細胞における細胞死に対しては、二相性の防御効果を発揮することが判明した。すわなち、１００μＭでは強い防御効果を示すのに対して、１０００μＭではメディウム交換に伴う細胞死に対する保護作用は全く観察されなかった。この原因の一つには、成熟発達段階の骨芽細胞で見られたように、高濃度エピガロカテキンガレート自身の細胞毒性を挙げることができる。
【００４５】
他の緑茶成分であるテアニンについてもカテキンと同様の検索を行ったが、何れの条件でも、テアニン１０μＭから１０ｍＭは、初代骨芽細胞の生存率に著明な影響を与えなかった。
したがって、カテキンとは異なり、テアニンにはメディウム交換に伴う骨芽細胞死に対する防御活性はないものと類推される。
【００４６】
＜考察＞
緑茶成分カテキンの中でも、エピカテキンガレートは骨芽細胞の増殖、分化、あるいは成熟過程に対する影響を通じて、骨細胞による骨形成を促進させて、骨組織リモデリングに貢献する可能性が考えられる。この効果は、単に骨折後の回復過程促進だけでなく、骨粗鬆症をはじめとする代謝性骨疾患の症状軽減に臨床医学的意義を持つと類推される。
【図面の簡単な説明】
【図１】培養した骨芽細胞の生存活性の測定手順を示す図である。
【図２】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養０日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の生存率を経時的に示したグラフである。
【図３】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養１日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の生存率を経時的に示したグラフである。
【図４】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の生存率を経時的に示したグラフである。
【図５】細胞培養メディウムを培養０日目から培養２１日目までのαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図６】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による６０分後のＡＰ１  ＤＮＡ結合能の観察結果である。
【図７】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による１２０分後のＡＰ１  ＤＮＡ結合能の観察結果である。
【図８】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による２４０分後のＡＰ１  ＤＮＡ結合能の観察結果である。
【図９】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による６０〜２４０分後のＡＰ１  ＤＮＡ結合能の測定結果を示したグラフである。
【図１０】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による６０分後のＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合能の観察結果である。
【図１１】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による１２０分後のＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合能の観察結果である。
【図１２】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による２４０分後のＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合能の観察結果である。
【図１３】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による６０〜２４０分後のＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合能の測定結果を示したグラフである。
【図１４】細胞培養メディウムをＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）の１２時間後に骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色したものの蛍光顕微鏡写真である。
【図１５】細胞培養メディウムをＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）の１２時間後に骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）をｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅで染色したものの蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はＤＭＥＭに交換した日（培養１日目）における頭蓋骨由来初代培養骨芽細胞及び株化骨芽細胞の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図１７】細胞培養メディウムを培養３日目にＤＭＥＭに交換する際に各種物質を添加した場合における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図１８】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はテアフラン９０Ｓを０〜１０００μｇ／ｍＬ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養０日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図１９】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はテアフラン９０Ｓを０〜１０００μｇ／ｍＬ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養１日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図２０】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はテアフラン９０Ｓを０〜１０００μｇ／ｍＬ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図２１】細胞培養メディウムをテアフラン９０Ｓを０〜１０００μｇ／ｍＬ添加したαＭＥＭに交換した日（培養７日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図２２】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま３日間培養した骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来、コントロール）の１２時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図２３】細胞培養メディウムをテアフラン９０Ｓを添加しないＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図２４】細胞培養メディウムをテアフラン９０Ｓを１００μｇ／ｍＬ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図２５】細胞培養メディウムをテアフラン９０Ｓを１０００μｇ／ｍＬ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図２６】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま７日間培養した骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来、コントロール）の１２時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図２７】細胞培養メディウムをテアフラン９０Ｓを１０００μｇ／ｍＬ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養７日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図２８】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピカテキンを０〜３００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養０日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図２９】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピカテキンを０〜３００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養１日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図３０】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピカテキンを０〜３００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図３１】細胞培養メディウムをエピカテキンを０〜３００μＭ添加したαＭＥＭに交換した日（培養７日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図３２】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピカテキンガレートを０〜４００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養０日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図３３】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピカテキンガレートを０〜４００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養１日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図３４】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピカテキンガレートを０〜４００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図３５】細胞培養メディウムをエピカテキンガレートを０〜４００μＭ添加したαＭＥＭに交換した日（培養７日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図３６】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピガロカテキンを０〜１０００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養０日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図３７】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピガロカテキンを０〜１０００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養１日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図３８】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピガロカテキンを０〜１０００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図３９】細胞培養メディウムをエピガロカテキンを０〜１０００μＭ添加したαＭＥＭに交換した日（培養７日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図４０】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピガロカテキンガレートを０〜１０００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養０日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図４１】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピガロカテキンガレートを０〜１０００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養１日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図４２】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はエピガロカテキンガレートを０〜１０００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図４３】細胞培養メディウムをエピガロカテキンガレートを０〜１０００μＭ添加したαＭＥＭに交換した日（培養７日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図４４】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はテアニンを０〜１００００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養０日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図４５】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はテアニンを０〜１００００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養１日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図４６】細胞培養メディウムをαＭＥＭのまま又はテアニンを０〜１００００μＭ添加したＤＭＥＭに交換した日（培養３日目）における骨芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ系新生仔ラット由来）の１２時間後の生存率を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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