(57)【要約】      （修正有）【課題】アナモックス細菌の検出に利用することができ、アナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする新規かつ有用な核酸断片、プライマー、アナモックス細菌検出用プローブ、高精度のアナモックス細菌の検出方法、および高効率なアンモニア性窒素含有排液の処理方法を得る。【解決手段】アナモックス細菌に特有な塩基配列、これらと９０％以上のホモロジーを有する塩基配列、または相補的な塩基配列を有する核酸断片、あるいは少なくとも１０個の連続する塩基配列が、アナモックス細菌に特有な塩基配列と同じ塩基配列である核酸断片、またはこれらと相補的な塩基配列を有する核酸断片、プローブ、をプライマーとし、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、合成された核酸断片を検出するアナモックス細菌の検出方法、検出結果に基づいて処理を行うアンモニア性窒素含有排液の処理方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１８〜２０ヌクレオチドからなる核酸断片であって、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列、またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片。
【請求項２】
アナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１０〜５０のヌクレオチドからなる核酸断片であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列である核酸断片、またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片。
【請求項３】
アナモックス細菌検出用である請求項１または２記載の核酸断片。
【請求項４】
請求項１または２記載の核酸断片からなるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）用プライマー。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載の核酸断片を標識物質で標識したアナモックス細菌検出用標識プローブ。
【請求項６】
請求項１ないし３のいずれかに記載の核酸断片をプライマーとし、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、合成された核酸断片を検出するアナモックス細菌の検出方法。
【請求項７】
請求項５記載のアナモックス細菌検出用標識プローブとしてハイブリダイゼーションを行い、標識を指標にしてアナモックス細菌の検出を行う請求項６記載の方法。
【請求項８】
合成されたＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、Ｔ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）解析を行うことによって、アナモックス細菌の種類を解析する請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに共通な塩基配列を有する核酸断片またはこれと相補的な核酸断片を一方のプライマーに、請求項１ないし３のいずれかに記載の核酸断片を他方のプライマーにしてＰＣＲを行う請求項６ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
アンモニア性窒素含有排液を、アナモックス細菌を含む汚泥を用いて処理する方法において、処理方法を立ち上げる汚泥、または立ち上げ後の汚泥について、請求項６ないし９のいずれかに記載の方法でアナモックス細菌の検出を行い、検出結果に基づいて処理を行うアンモニア性窒素含有排液の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする核酸断片、アナモックス細菌検出用核酸断片、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）用プライマー、アナモックス細菌検出用プローブ、これらの核酸断片またはプローブを用いたアナモックス細菌の検出方法、およびアンモニア性窒素含有排液の処理方法に関するものである．
【０００２】
【従来の技術】
従来のアンモニア性窒素含有排液の処理方法では、硝化工程でアンモニア性窒素をアンモニア酸化細菌によって亜硝酸性窒素に酸化し、この亜硝酸性窒素を亜硝酸酸化細菌によって硝酸性窒素に酸化し、次に脱窒工程でこれらの亜硝酸性窒素および硝酸性窒素を従属栄養性細菌である脱窒菌により、有機物を電子供与体として利用しながら窒素ガスにまで分解していた。この方法では、メタノールなどの有機物の添加が必要であり、処理コストが高いとされている。
【０００３】
このような従来の生物学的窒素除去に代わる方法として、アナモックス細菌を利用した脱窒方法が提案されている。このアナモックス細菌は独立栄養性脱窒微生物であって、アンモニア性窒素と亜硝酸性窒素を直接窒素ガスに変換させる微生物であり、アンモニア性窒素を電子供与体、亜硝酸性窒素を電子受容体として、アンモニア性窒素と亜硝酸性窒素とを反応させて脱窒する。独立栄養性脱窒微生物を利用する脱窒方法ではメタノールなどの有機物の添加は不要であるため、従属栄養性脱窒微生物の場合に比べてコストを低減できる。
【０００４】
アナモックス細菌はＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに属す細菌であって、増幅速度が極めて遅く、コロニーを形成しないため、検出は困難である。このためアナモックス細菌を利用しようとする場合、種汚泥として利用する汚泥に本細菌が含まれているか否かを検査することは困難である．またアナモックス細菌を接種してアナモックスプロセスを立ち上げる場合、あるいは立ち上げ後に、アナモックス細菌が順調に生育しているか否かをモニタリングすることは困難である。
【０００５】
従来のＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ検出方法として、技術文献１には、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法が提案され、プローブ、プライマーとして利用できる核酸断片も報告されている。しかしＦＩＳＨ法では、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ全体の検出を目的としているため、アナモックス細菌のみの検出はできない。またＦＩＳＨ法では増幅は行わず、顕微鏡下での検出法のため、検出感度は低く、検出対象のアナモックス細菌の存在割合が数％以上ないと検出できず、また数種類存在するアナモックス細菌を的確に分類する方法がないなどの問題点がある。
【０００６】
【技術文献１】
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８），１４４，３２５７−３２６６、特に３２５９頁。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アナモックス細菌の検出に利用することができる核酸断片であって、アナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする新規かつ有用な核酸断片、アナモックス細菌検出用核酸断片、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）用プライマー、アナモックス細菌検出用プローブ、これらの核酸断片またはプローブを用いた高精度のアナモックス細菌の検出方法、およびその検出結果を用いる高効率なアンモニア性窒素含有排液の処理方法を提案することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は次の核酸断片、アナモックス細菌検出用核酸断片、ＰＣＲ用プライマー、プローブ、アナモックス細菌の検出方法、およびアンモニア性窒素含有排液の処理方法である。
（１）  アナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１８〜２０ヌクレオチドからなる核酸断片であって、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列、またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片。
（２）  アナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１０〜５０のヌクレオチドからなる核酸断片であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列である核酸断片、またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片。
（３）  アナモックス細菌検出用である上記（１）または（２）記載の核酸断片。
（４）  上記（１）または（２）記載の核酸断片からなるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）用プライマー。
（５）  上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の核酸断片を標識物質で標識したアナモックス細菌検出用標識プローブ。
（６）  上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の核酸断片をプライマーとし、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、合成された核酸断片を検出するアナモックス細菌の検出方法。
（７）  上記（５）記載のアナモックス細菌検出用標識プローブとしてハイブリダイゼーションを行い、標識を指標にしてアナモックス細菌の検出を行う上記（６）記載の方法。
（８）  合成されたＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、Ｔ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）解析を行うことによって、アナモックス細菌の種類を解析する上記（６）または（７）記載の方法。
（９）  Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに共通な塩基配列を有する核酸断片またはこれと相補的な核酸断片を一方のプライマーに、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の核酸断片を他方のプライマーにしてＰＣＲを行う上記（６）ないし（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）  アンモニア性窒素含有排液を、アナモックス細菌を含む汚泥を用いて処理する方法において、処理方法を立ち上げる汚泥、または立ち上げ後の汚泥について、上記（６）ないし（９）のいずれかに記載の方法でアナモックス細菌の検出を行い、検出結果に基づいて処理を行うアンモニア性窒素含有排液の処理方法。
【０００９】
アナモックス細菌は、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに属する独立栄養型の嫌気性アンモニア酸化微生物（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ−Ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏ−Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）であって、アンモニア性窒素を電子供与体、亜硝酸性窒素を電子受容体として、アンモニア性窒素と亜硝酸性窒素とを反応させて直接窒素ガスに変換させて脱窒する微生物である。
【００１０】
前述の技術文献１にも記載されているように、一般的なＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓは従属栄養型の好気性グラム陰性細菌とされているが、上記のようにアナモックス細菌はＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに属するものであるにもかかわらず、独立栄養型の嫌気性アンモニア酸化微生物であって、両者は異なる菌学的性質を有するため、一般的なＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓについての従来の検出方法に関する技術をアナモックス細菌に適用することはできない。核酸の塩基配列についてみても、アナモックス細菌は一般のＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓと共通の部分と、非共通の特異な部分を有し、一般的なＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓの核酸を用いる検出方法に関する技術も適用できない。
【００１１】
技術文献１におけるＦＩＳＨ法では、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓの１６ＳｒＤＮＡの４６−６３ベースに位置する核酸断片（ＰＬＡ４６Ｆと記す）と相補の配列番号６の塩基配列を有する核酸断片ＰＬＡ４６をプローブとしてハイブリダイゼーションを行ってＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓの１６ＳｒＲＮＡを検出しているが、この場合は前述のとおり、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ全体の１６ＳｒＲＮＡが検出され、ＰＣＲによる増幅を行わず、顕微鏡下での検出法のため、その検出感度は低い。
【００１２】
核酸の検出感度を高くするためには、核酸の増幅を行うことが考えられる。核酸の増幅については、１対の核酸断片をプライマーとし、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、１対のプライマー間の核酸断片を合成、増幅する方法が知られている。しかしこの場合、試料中には雑多な核酸が含まれているため、プライマーとする１対の核酸断片、またはプローブとして検出する核酸断片の選択を誤ると、目的とする核酸断片を合成、増幅し、または検出することができない。
【００１３】
すなわち核酸の塩基配列には、一般の細菌に共通なものと、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに共通または特有なものと、アナモックス細菌に共通または特有なものと、さらにアナモックス細菌に含まれる菌種に共通または特有なものとが含まれるため、任意の核酸断片をプライマーとしてＰＣＲを行っても、アナモックス細菌の核酸断片のみを合成、増幅し、または検出することができない。従ってアナモックス細菌の核酸の塩基配列が知られていても、ＰＣＲによりアナモックス細菌の核酸のみを合成、増幅し、または検出することは容易ではない。
【００１４】
アナモックス細菌については、配列番号７の塩基配列を有するＡタイプ、配列番号８の塩基配列を有するＢタイプ、配列番号９の塩基配列を有するＣタイプの３種の１６Ｓｒ核酸の塩基配列が、タイプＡ：ＡＪ１３１８１９、タイプＢ：ＡＪ２５０８８２、タイプＣ：ＡＢ０５７４５３のアクセッションナンバーで、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されている。配列番号７〜９では技術文献１の４６番目の塩基（ベース）を１番目の塩基（ベース）として、その下流の塩基を表示している。
【００１５】
配列番号７〜９の１〜１８ベース（技術文献１の４６−６３ベースに相当）に位置する核酸の塩基配列は、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに共通であって、アナモックス細菌の各タイプにも共通であり、前記ＰＬＡ４６Ｆと一致する。しかし他の塩基配列は一致しないものがあり、Ａタイプ、Ｂタイプ、Ｃタイプ間でも差がある。またアナモックス細菌は比較的最近知られた菌であり、未知の菌も多い。従って、塩基配列のどの位置の核酸断片をプライマーまたはプローブとしてＰＣＲを行うかの選択は困難である。
【００１６】
本発明では、ＰＣＲによりアナモックス細菌の核酸を増幅または検出する場合、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに属するアナモックス細菌を網羅して、アナモックス細菌の漏れを防ぐため、一方のプライマー例えばアッパープライマーとして、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに共通の塩基配列の核酸断片またはこれと相補的な核酸断片、例えば前記ＰＬＡ４６Ｆを選択する。そしてアナモックス細菌以外の菌を排除するため、他方のプライマー例えばローワープライマーとして、アナモックス細菌に特有な塩基配列の核酸断片またはこれと相補的な核酸断片を選択する。
【００１７】
他方のプライマーとして選択するアナモックス細菌に特有な塩基配列の核酸断片としては、他の菌の塩基配列に類似の配列がないことが要求されるが、この類似の配列の位置は限定されず、他の菌のいかなる位置に類似の配列があっても、プライマーとして使用できない。このほかこのプライマーとしては、他方のプライマーであるＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに共通の塩基配列の核酸断片またはこれと相補的な核酸断片、あるいは他の菌と反応しないもの、例えばこれらと相補の関係にないものであることが要求される。
【００１８】
実際のＰＣＲでは、一方のプライマーとしてＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに共通の塩基配列の核酸断片、例えば前記ＰＬＡ４６Ｆを用いる場合は、他方のプライマーとしてアナモックス細菌に特有な塩基配列の核酸断片と相補的な核酸断片を用い、一方のプライマーとしてＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに共通の塩基配列の核酸断片と相補的な核酸断片、例えば前記ＰＬＡ４６を用いる場合は、他方のプライマーとしてアナモックス細菌に特有な塩基配列の核酸断片を用いる。これにより５’末端側から３’末端側へ核酸が伸長する。
【００１９】
上記のプライマーを用いてＰＣＲを行うと、上記一方および他方のプライマー間の塩基配列の核酸断片が増幅され、高濃度で得られる。このような核酸断片を検出するためには、検出のための標識をつけたプローブを用いるのが好ましい。標識をつけたプローブとしては、核酸断片を放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質等の標識物質を結合させて標識した核酸断片を用いることができる。このようなプローブは試料中の核酸にハイブリダイズすることにより、試料中の核酸または増幅された核酸が検出される。
【００２０】
このようなプローブは上記のプライマーと兼用することができる。単にプローブとして用いる核酸断片は、標識物質を５’末端または３’末端のどちらに付けてもよいが、プライマーと兼用する核酸断片は、標識物質を５’末端に付け、３’末端は遊離の状態にしておくことにより、３’末端側への核酸の伸長を許容することができる。プローブ専用として用いる核酸断片の５’末端に標識物質を付けた場合は、３’末端を燐酸等でブロックしてＰＣＲを行うことにより、３’末端側への核酸の伸長を阻止することができる。３’末端をブロックしてプローブ専用として用いる核酸断片は、１本鎖の核酸にハイブリダイズして検出されるが、ＰＣＲの進行によりプライマーから核酸が伸長するのに伴ってはじき飛ばされ、サイクルの進行により１本鎖になった核酸に再度ハイブリダイズして検出される。プライマー専用として用いる核酸断片は、標識を付けないで用いることができる。
【００２１】
上記の核酸断片は、プライマーとして用いるのに適しているものと、プローブとして用いるのに適しているものとがある。これらの核酸断片をプライマーまたはプローブとして使い分ける場合、これらを組み合わせて使用することができる。この場合、いずれの核酸断片もアナモックス細菌に特有な塩基配列の核酸断片を用いるが、プライマーとして用いる核酸断片は、アナモックス細菌に特有な核酸断片の選択的増幅に適したものを用い、プローブとして用いる核酸断片は、アナモックス細菌に特有な核酸断片に選択的にハイブリダイズして、検出精度を高くするものが好ましい。
【００２２】
本発明の核酸断片は、上記のようなプライマーまたはプローブとして用いられる核酸断片であって、アナモックス細菌に特有な配列番号１〜４のいずれかの塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列、またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片、あるいは少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列である核酸断片、またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片（以下、これらを含めて「核酸断片等」という場合がある）である。例えば、配列番号１の塩基配列の任意の位置から始まる連続した１０個以上の塩基配列と同じ塩基配列を有する核酸断片であり、この配列番号１の塩基配列と同じ塩基配列の上流および／または下流には塩基が結合していてもよい。
【００２３】
すなわち本発明の核酸断片は、アナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１８〜２０ヌクレオチドからなる核酸断片であって、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列、またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片、あるいはアナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１０〜５０のヌクレオチドからなる核酸断片であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号１〜４のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列である核酸断片、またはこれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片等である。
【００２４】
配列番号１の核酸断片は、アナモックス細菌に特有の塩基配列であって、前記Ａタイプ、Ｂタイプ、Ｃタイプの各タイプに共通の塩基配列であり、配列番号７の６５８−６７５ベース、配列番号８および９の６５６−６７３ベースに位置する核酸の塩基配列に相当する。配列番号２の核酸断片は、アナモックス細菌に特有の塩基配列であって、前記Ａタイプ、Ｂタイプ、Ｃタイプの各タイプに共通の塩基配列であり、配列番号７の３５３−３７２ベース、配列番号８および９の３４９−３６８ベースに位置する核酸の塩基配列に相当する。配列番号３の核酸断片は、アナモックス細菌に特有の塩基配列であって、前記Ｂタイプ、Ｃタイプの各タイプに共通の塩基配列であり、配列番号８および９の３７０−３８９ベースに位置する核酸の塩基配列に相当する。配列番号４の核酸断片は、アナモックス細菌のＡタイプに特有の塩基配列であって、配列番号７の３７４−３９２ベースに位置する核酸の塩基配列に相当する。これらの塩基配列は、アナモックス細菌の核酸から切り取り、あるいは公知の方法により化学的に合成することができる。
【００２５】
上記配列番号１〜４の核酸断片等は、アナモックス細菌の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に特異的な部分を利用してデザインしているので、アナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡ（配列番号１〜４に相補なもののみ）またはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする。配列番号１〜４の核酸断片等はいずれも、上記のプライマーとして用いることも、プローブとして用いることも、あるいはプローブとプライマーを兼用することもできるが、配列番号１の核酸断片等はプライマーとして用い、配列番号２〜４の核酸断片等はプローブとして用いるのに適している。配列番号３および配列番号４の核酸断片等は、相互に代替的に使用してもよく、また両者を混合して使用してもよい。
【００２６】
本発明のアナモックス細菌の検出方法は、前記本発明の核酸断片を用いてＰＣＲを行い、アナモックス細菌のＲＮＡあるいはＤＮＡを増幅させて検出する方法である。すなわち、前記本発明の核酸断片をプライマーとし、アナモックス細菌の有無を検出したい試料から調製した核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、予想される大きさの核酸断片、すなわち１対のプライマー間のアナモックス細菌の塩基配列に相当する核酸断片が合成されれば試料中にアナモックス細菌の存在および量を判断できる。
【００２７】
ＰＣＲは公知の方法で行うことができ、また市販されているＰＣＲ用キットを用いて行うこともできる。ＰＣＲは通常Ｕｐｐｅｒ  ＰｒｉｍｅｒおよびＬｏｗｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒの２種類のプライマーを使用するが、いずれか一方または両方のプライマーとして本発明の核酸断片を用いることができる。プライマーとして種類の異なる複数の核酸断片を用いて複数回検出を行うことにより、検出精度をより高くすることができる。
【００２８】
配列番号１〜４の核酸断片等は、アナモックス細菌の特異的な部分であるため、これらを一対のプライマーの両方に用い、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、アナモックス細菌の特異的な核酸断片を増幅できるが、選択的増幅の精度を上げるためには、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに共通な塩基配列を有する核酸断片またはこれと相補的な核酸断片、例えば前記ＰＬＡ４６Ｆを一方のプライマーに、配列番号１〜４の核酸断片等を他方のプライマーにしてＰＣＲを行うことができる。特に他方のプライマーとして、配列番号１の核酸断片等を用いてＰＣＲを行うことにより、アナモックス細菌を逃さず、かつ他の細菌を混入させないで増幅を行うことができるので好ましい。
【００２９】
配列番号１〜４の核酸断片等をプローブとして用いる場合は、放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質等の標識物質で標識をつけた核酸断片を用いることができる。このような標識物質としては従来から使用されている標識物質が使用でき、具体的なものとしては３２Ｐ等の放射性元素；ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＬＣＲｅｄ６４０、ローダミン等の蛍光物質；ジコキシゲニン等のハプテン；アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素；ビオチン等の生化学物質；などがあげられる。これらの標識物質は、公知の方法で核酸断片に導入することができる。
【００３０】
このような核酸断片等をプローブとして用いる場合、ＰＣＲを行う際にプライマーおよびＰＣＲ原料とともにプローブを仕込んでＰＣＲを行うことにより、ＰＣＲの進行に従って増幅したアナモックス細菌の核酸断片の検出を行うことができる。またＰＣＲの途中で、または終了後に、増幅したアナモックス細菌の核酸断片にプローブを添加し、ハイブリダイズさせて検出を行うこともできる。
【００３１】
ハイブリダイゼーションしたプローブの検出は、標識物質の種類に応じて公知の方法により行うことができる。例えば、放射性元素で標識した場合は公知の方法で放射能を測定することにより検出できる。また蛍光物質で標識した場合は公知の方法により光量を測定することにより検出できる。また酵素で標識した場合は公知の方法で酵素活性を測定することにより検出できる。また抗原または抗体で標識した場合は、標識した抗原または抗体と特異的に反応する抗体または抗原を用いて抗原抗体反応させ、反応生成物を公知の方法により測定することにより検出できる。
【００３２】
合成されたＰＣＲ産物は、制限酵素で切断し、Ｔ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）解析を行うことによって、アナモックス細菌の種類を解析することができる。この場合、タイプＡ、Ｂ、Ｃ等の各種のアナモックス細菌において、それぞれ異なる位置に存在する切断部位を切断できる制限酵素で切断することによって、例えば末端に付けた標識部位からの長さの異なる切断片を形成し、それぞれの長さまたはその組み合わせを検出することにより、アナモックス細菌の種類を解析することができる。標識を付けたプローブをプライマーとしてＰＣＲを行うと、末端に標識部位を付けた切断片が形成されるので、長さの異なる切断片に分離して容易に検出することができる。
【００３３】
本発明のアンモニア性窒素含有排液の処理方法は、アンモニア性窒素含有排液をアナモックス細菌を含む汚泥を用いて処理する際、処理方法の立ち上げに使用する汚泥、または立ち上げ後の汚泥について、上記の方法でアナモックス細菌の検出を行い、検出結果に基づいて処理を行う。例えば処理方法の立ち上げの際、立ち上げに使用する汚泥として、上記の方法でアナモックス細菌を検出した汚泥を接種して処理方法を立ち上げると、効率よく処理方法を立ち上げることができる。また立ち上げ後の汚泥について、上記の方法でアナモックス細菌の検出を行い、アナモックス細菌が適正な生育をするように、検出結果に基づいて処理条件を制御することにより、効率よく処理を行うことができる。
【００３４】
上記のように、本発明の検出方法では、近縁であるＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓを検出せず、アナモックス細菌のみを検出できるプライマーにより、従来よりも精度よくアナモックス細菌を検出することができる。そしてＰＣＲ合成された部分のＤＮＡはアナモックス細菌の間でも差がある部分であり、アナモックス細菌の種類を特定することができる。この場合、働いているアナモックス細菌の種類を特定し、処理性能との関連づけを行い、管理することが可能となる。
【００３５】
本発明のアンモニア性窒素含有排液の処理方法では、廃水、生物膜、汚泥などに含まれるアナモックス細菌を検出し、それらを種にプロセスの立ち上げをスムーズに行うことができる。この場合、窒素処理に適した細菌の検出が可能となり、細菌が検出されなければ他の場所から細菌を導入するなど、プロセス管理に利用できる。従来はアナモックス細菌の種類を特定できなかったが、本発明では特定可能である。また従来はどの汚泥を種にアナモックスプロセスを立ち上げて良いか分からなかったが、本発明によりそれが可能になる。
【００３６】
また立ち上げ後は、アナモックス反応が処理装置内で起こっていることを、モニタリングする必要があるが、本方法の適用によりそれが可能となる。この場合、プロセスの状態が良好で、アナモックス細菌が活性の高い状況で維持されているか否かをモニタリングすることができる。従来はアナモックスプロセスの高感度管理ができなかったが、本発明により可能になる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の核酸断片は、アナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする新規かつ有用な核酸断片である。
【００３８】
本発明の核酸断片およびアナモックス細菌の検出方法によれば、アナモックス細菌の少ない試料から、アナモックス細菌特有の核酸断片を増幅させることができ、高精度でアナモックス細菌の検出を行うことができる。
【００３９】
本発明の核酸断片、プライマー、プローブ、およびアナモックス細菌の検出方法によれば、プライマー、プローブをアナモックス細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズさせることができ、高感度でアナモックス細菌の検出を行うことができる。
【００４０】
本発明のアンモニア性窒素含有排液の処理方法によれば、高精度のアナモックス細菌の検出結果に基づき、高効率なアンモニア性窒素含有排液の処理を行うことができる。
【００４１】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施例について説明する。
【００４２】
実施例１（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒによる検出）：
アナモックスプロセスを立ち上げるための５種類の汚泥を採取し、その汚泥の中に含有されているアナモックス細菌の濃度測定を行った。
【００４３】
（ＤＮＡ抽出法）；
汚泥サンプル０．５ｍＬを２ｍＬ容のチューブに入れた。８０００ｘｇにて４℃で１５分間遠心分離し、上澄みを捨てた。さらにそのチューブにＺｉｒｃｏｎｉａ／Ｓｉｌｉｃａ  Ｂｅａｄｓ（直径０．１ｍｍ）１ｍＬおよびＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，１００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］，１００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ［ｐＨ８．０］，１．５Ｍ  ＮａＣｌ）１ｍＬを加え、細胞破砕機Ｂｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒで２分間処理した。次に凍結融解を３回繰り返した後、１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃にて３０分間保温した。この液に、２５０μＬの１０％ＳＤＳ溶液を加え、６５℃で２時間保温、再び上記のＢｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒ処理を行った。その後８０００ｘｇにて室温で１０分間遠心分離し、上清を採取した。上清はクロロホルム抽出し、等量のイソプロパノールを添加後、室温で６０分間静置、８０００ｘｇにて室温で２０分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿は７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、５０μＬのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，１ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）に溶解し、スピンカラムにて精製を行った。
【００４４】
この抽出ＤＮＡを利用して下記の通りＰＣＲ反応を行い、アナモックス細菌の増幅を調査した。
（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲによる１６Ｓ  ｒＤＮＡの定量）；
前述のように抽出したＤＮＡ溶液をＴＥにて１０倍希釈した後、１μＬをテンプレートとし、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲをロッシュ・ダイアグノスティック株式会社製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）を利用して行った。その際、アッパープライマーとしては配列番号６のＰｌａ４６Ｆを、ローワープライマーとしては配列番号１のＫＷＩ−ＡＭＸＲと相補的な核酸断片を利用した。また、ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号２のＫＷＩ−ＡＭＸ１の３’末端をＦＩＴＣにて標識したもの、ならびに配列番号３のＫＷＩ−ＡＭＸ２および配列番号４のＫＷＩ−ＡＭＸ３の３’末端をリン酸化し、５’末端をＬＣＲｅｄ６４０にて標識したものを、（ＫＷＩ−ＡＭＸ２）：（ＫＷＩ−ＡＭＸ３）＝１：１、（ＫＷＩ−ＡＭＸ１）：（ＫＷＩ−ＡＭＸ２＋ＫＷＩ−ＡＭＸ３）＝１：１（いずれもモル比）に混ぜて利用した。ＰＣＲ反応にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓキット（商標）を利用した。
【００４５】
ＰＣＲで使用した核酸断片断片の塩基配列を表１に示す。またＰＣＲの運転条件を表２〜５に示す。ＰＣＲは、変性→定量→融解→冷却の順序で運転した。
結果を図１に示す。図１より、取得した５種類の汚泥の内、２種類の汚泥にアナモックス細菌が存在しており、これらの汚泥はアナモックスプロセスの立ち上げに利用できることが明らかである。
【００４６】
【表１】
2004283032.tif 000002
【００４７】
【表２】
2004283032.tif 000003
【００４８】
【表３】
2004283032.tif 000004
【００４９】
【表４】
2004283032.tif 000005
【００５０】
【表５】
2004283032.tif 000006
【００５１】
比較例１：
アナモックス細菌に特有でタイプＡ、Ｂ、Ｃに共通であると推定された配列番号７の４２０−４３７、配列番号８および９の４１７−４３４ベースに位置する核酸である表１の配列番号５の核酸断片ＫＷＩ−ＡＭＸ０と相補な核酸断片を、実施例１の配列番号１のＫＷＩ−ＡＭＸＲと相補な核酸断片に代えてＰＣＲを行った実験では、アナモックス細菌以外のＰｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに属す細菌のＤＮＡが増幅され、アナモックス細菌のＤＮＡ増幅はできなかった。配列番号１のＫＷＩ−ＡＭＸＲの下流に位置する他の２個の核酸断片と相補な核酸断片を用いた他の実験の結果も同様であった。
【００５２】
実施例２（Ｔ−ＲＦＬＰによるアナモックス細菌の分類・検出）：
実施例１で選択したＣ汚泥を用いて、アンモニア性窒素含有排液の処理方法を立ち上げ、３０日目、１２０日目、１５０日目の汚泥について、以下のＴ−ＲＦＬＰによるアナモックス細菌の分類・検出を行った。
【００５３】
（ＰＣＲ）；
まず実施例１と同様にして抽出したＤＮＡをテンプレートに、次のＰＣＲ反応条件によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｐｒｅ−ｈｅａｔｉｎｇ；９４℃，２分に続き、第１段階；９４℃，２０秒、第２段階；５５℃，３０秒、第３段階；７２℃，１分を３０サイクル繰り返し、Ｐｏｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；７２℃，７分を行った。この際、プライマーはＰｌａ４６の５’末端を４，７，２’，４’，５’，７’−ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＨＥＸ）で標識したもの、および配列番号１のＫＷＩ−ＡＭＸＲと相補な核酸断片の５’末端を６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（６−ＦＡＭ）で標識したものを使用した。
【００５４】
（Ｔ−ＲＦＬＰ）；
ＰＣＲ増幅産物はアガロース電気泳動にかけ、目的である１６ＳｒＤＮＡ（約１．５ｋｂ）断片を含む部分を切り出し精製した。その後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、少量の滅菌蒸留水に溶解させ、適量を制限酵素ＴｓｐＥＩで、ＡＡＴＴ部位を切断した。タイプＡは約１２０ベース、タイプＢは約１９０ベース、タイプＣは約５５０ベースの位置に第一の切断部位（最も５’末端側）がある。ここで、切断した１６ＳｒＤＮＡはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製、商標）によりＧｅｎｅ  Ｓｃａｎモードで解析し、Ｔ−ＲＦＬＰ（０〜５５０ｂａｓｅｓの範囲）のＥｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍを得た。Ｔ−ＲＦＬＰのＥｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍは１６ＳｒＤＮＡの５’末端および３’末端に関して得られたが、ここでは５’末端のＨＥＸによる解析結果のみを利用した。また、内部標準にはＧｅｎｅＳｃａｎ５００  ＲＯＸ  （ＲＯＸ：６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｏｄａｍｉｎｅ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製、商標）を利用した。
【００５５】
Ｔ−ＲＦＬＰの結果を図２に示す。ピーク位置は、理論値より少し小さめになる。運転開始後３０日目では、１９０ベース、および５５０ベースの近傍にピークが観察され、タイプＢおよびタイプＣのアナモックス細菌が優占であることが分かった。しかしながら、１２０日目以降はタイプＣの細菌が優先的に生育していることがわかる。
【００５６】
別のアンモニア性窒素含有排液の処理方法の実験では、同様に、最終的にはタイプＣのアナモックス細菌が優占化した後、処理が安定化することが分かっており、解析対象の装置は、順調に稼働していることが分かる。もし、タイプＡの細菌が優占化する場合は、アナモックスグラニュールが崩れやすくなることがまれにあり、アンモニア濃度等運転条件の見直しが必要となるなど、解析結果による制御が可能であることがわかる。
【配列表】
2004283032.tif 000007
2004283032.tif 000008
2004283032.tif 000009
2004283032.tif 000010
2004283032.tif 000011
2004283032.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】実施例２の結果を示すグラフである。
【図１】
2004283032.tif 000013
【図２】
2004283032.tif 000014