(57)【要約】【課題】本発明は、ヒアルロン酸又は／及びキチンを効果的に分離・精製する方法、就中、クロロウィルスを宿主クロレラ細胞に感染させることによりクロレラ細胞上に生産されたヒアルロン酸又は／及びキチンを、容易に且つ効果的に分離・精製する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、クロロウィルスを宿主クロレラ細胞に感染させることによりクロレラ細胞上に生産されたヒアルロン酸又は／及びキチンを、分離・精製する方法であって、ヒアルロン酸繊維又は／及びキチン繊維を細胞表面に蓄積したクロレラ細胞に、機械的な振動を加えることによりヒアルロン酸繊維又は／及びキチン繊維を細胞から遊離させ、回収することを特徴とする、該ヒアルロン酸又は／及びキチンの分離・精製方法に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロウィルスを宿主クロレラ細胞に感染させることによりクロレラ細胞上に生産されたヒアルロン酸又は／及びキチンを、分離・精製する方法であって、ヒアルロン酸繊維又は／及びキチン繊維を細胞表面に蓄積したクロレラ細胞に、機械的な振動を加えることによりヒアルロン酸繊維又は／及びキチン繊維を細胞から遊離させ、回収することを特徴とする、該ヒアルロン酸又は／及びキチンの分離・精製方法。
【請求項２】
ボルテックス処理により機械的な振動を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
超音波処理により機械的な振動を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
クロレラ細胞上に生産されたヒアルロン酸を分離・精製する請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
クロロウィルスがヒアルロン酸のみを生産するクロロウィルスである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
クロロウィルスが、ＣＶＨＩ１、ＣＶＫＡ１、ＣＶＢＲ４、ＣＶＡ１、ＣＶＮＩ１、ＣＶＮＡ１、ＣＶＴＳ１、ＣＶＳＥ１又はＣＶＯ１である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
クロロウィルスがヒアルロン酸とキチンの両者を生産するクロロウィルスである請求項４に記載の方法。
【請求項８】
クロロウィルスが、ＣＶＩＫ１又はＣＶＨＡ１である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
クロレラ細胞上に生産されたキチンを分離・精製する請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
クロロウィルスがキチンのみを生産するクロロウィルスである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
クロロウィルスが、ＣＶＫ２、ＣＶＮＡ２又はＣＶＫＵ２である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
クロロウィルスがヒアルロン酸とキチンの両者を生産するクロロウィルスである請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
クロロウィルスが、ＣＶＩＫ１又はＣＶＨＡ１である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
クロレラ細胞上に生産されたヒアルロン酸及びキチンの両者をそれぞれ分離・精製する請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
クロロウィルスがヒアルロン酸とキチンの両者を生産するクロロウィルスである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
クロロウィルスが、ＣＶＩＫ１又はＣＶＨＡ１である請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒアルロン酸又は／及びキチンの分離・精製方法に関する。
より詳しくは、クロロウィルスを宿主クロレラ細胞に感染させることによりクロレラ細胞上に生産されたヒアルロン酸又は／及びキチンの、分離・精製方法に関する。ヒアルロン酸もキチンも共に医療用材料、化粧品等の分野において、種々の用途に用いられおり、更なる用途開発も行われている。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、その多糖類特性のため、人工皮膚、関節潤滑液、眼科治療剤、化粧品、再生医療などの用途で市場は伸びており（国内：約５Ｔ／年）、更なる用途開発も行われている。
ヒアルロン酸の製造方法としては、ニワトリ鶏冠などから抽出して生産する方法、微生物培養によって生産する方法などが知られている。しかし、前者は原料確保の不安定性、生産工程の複雑さ、コストなどの問題がある。また、近年は微生物（乳酸菌等）培養による生産が多くなっていると言われているが、生産コストなどで問題が残っているのも事実である。
更に、クロレラがヒアルロン酸を生産すると言う報告も見られるが、実用化には至っていない（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。
キチンは、人工皮膚、手術縫合糸、生分解性プラスチック原料、繊維、機能性食品、キチン分解物としてグルコサミンの調味剤、化粧品素材、変形性関節炎剤等の用途が知られているが、エビ・カニの甲殻を化学的に処理し抽出して生産される（国内：約２０００ｔ／年：キチン・キトサン含む）。しかし、原料確保の不安定性、生産工程の複雑さ、コストなどに問題点がある。
また本発明者らはクロロウイルスであるＣＶＫ２がキチンシンセターゼ遺伝子（ｃｈｓ）を有していることを先に見出し、更に、生成されたキチンを回収しその物性を解析した（非特許文献３参照。）。
現在行われているいずれの多糖類の製造方法も、原料を天然資源の廃棄物に求める限りは、原料確保の不安定性などによる数量並びに品質のバラツキに問題が残る。特に、化粧品、医療用材料として使用される場合には品質上の問題が大きい。また、微生物（乳酸菌等）培養によるヒアルロン酸製造方法の研究開発も盛んに行われているが、更なる技術開発が望まれている。
これら多糖類の製造方法においては、何れの場合も水溶媒からの分離／回収が必要であり、ｐＨを変化させるとか、有機溶媒を加えるとか、加水分解処理をするなど面倒な操作が必要な場合が多い。
【０００３】
【非特許文献１】
ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ  Ｐ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，１８９９−１９９３（１９９７）
【非特許文献２】
Ｇｒａｖｅｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５７，１５−２３（１９９９）
【非特許文献３】
田中允ら：平成１３年度日本工学会大会講演要旨集２３６（２００  １）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き現状に鑑みなされたもので、ヒアルロン酸又は／及びキチンを効果的に分離・精製する方法、就中、クロロウィルスを宿主クロレラ細胞に感染させることによりクロレラ細胞上に生産されたヒアルロン酸又は／及びキチンを、容易に且つ効果的に分離・精製する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、クロロウィルスを宿主クロレラ細胞に感染させることによりクロレラ細胞上に生産されたヒアルロン酸又は／及びキチンを、分離・精製する方法であって、ヒアルロン酸繊維又は／及びキチン繊維を細胞表面に蓄積したクロレラ細胞に、機械的な振動を加えることによりヒアルロン酸繊維又は／及びキチン繊維を細胞から遊離させ、回収することを特徴とする、該ヒアルロン酸又は／及びキチンの分離・精製方法に関する。
【０００６】
即ち、本発明は、培養したクロレラ細胞に自然界より単離したクロロウイルス（ヒアルロン酸生成型、キチン生産型、両多糖質生産型）を感染させ、短時間（２〜３時間）にこれら多糖質を細胞表面に生成蓄積させた後、機械的な振動により細胞から遊離させて迅速に回収する方法を提供するものである。
培養したクロレラ細胞にクロロウイルスを感染させると、ウイルスＤＮＡにコードされたヒアルロン酸合成酵素、キチン合成酵素が感染後短時間のうちに宿主クロレラ細胞内で発現し、細胞表面で多糖質の合成反応を行う結果、ヒアルロン酸やキチンが繊維構造を成して細胞外部に析出してくる。この繊維構造は長さが０．５〜１．０ミクロンにもなる重合度が極めて高いものである。本発明者は、この状態の細胞に機械的な振動を加えることによって繊維構造体を細胞から遊離させることが出来る事を見出し、本発明を完成するに到った。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、宿主クロレラ細胞に感染させるクロロウィルス（クロレラウィルス）は、分類学上はＰｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科  Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ属に属するウィルスである。
クロロウィルスは自然界に広く分布し、日本においても各地の自然淡水中から検出されている（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９１，５７，３４３３−３４３７；Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９３，５７，７３３−７３９等）。
これまでに明らかにされたクロロウィルスの特徴は、以下のように要約される。
（１）藻類クロレラを宿主とする。
（２）直径１４０〜１９０の巨大な正二十面体粒子であり（ショ糖密度勾配沈降係数２３００ｓ）、主としてタンパク質（６４％）、ＤＮＡ（２５％）、及び脂質（１０％）から成る。
（３）ウィルス粒子は５０種以上の構成タンパク質から成り、その内主要タンパク質Ｖｐ５４（Ｖｐ５２）が約４０％を占める。
（４）ウィルスゲノムは巨大な（３００〜３８０ｋｂｐ）線状ｄｓＤＮＡであり、特殊なヘアピン末端構造を有する。
（５）ウィルスゲノムには７００個以上の遺伝子読み取り枠（ＯＲＦ）があり、その多くが感染サイクル中に発現している。
（６）感染様式はバクテリオファージと類似し、プラークを形成する。
（７）ウイルス粒子は宿主細胞質で増殖する。
【０００８】
本発明において、宿主クロレラ細胞に感染させるクロロウィルスの具体例としては、例えば、ヒアルロン酸生産ウィルスである、ＣＶＨＩ１、ＣＶＫＡ１、ＣＶＢＲ４、ＣＶＡ１、ＣＶＮＩ１、ＣＶＮＡ１、ＣＶＴＳ１、ＣＶＳＥ１、ＣＶＯ１、キチン生産ウィルスである、ＣＶＫ２、ＣＶＮＡ２、ＣＶＫＵ２、ヒアルロン酸及びキチンの両者を産生する、ＣＶＩＫ１、ＣＶＨＡ１等が挙げられる。
【０００９】
ウイルスの調製法は、例えば下記のようにして行えばよい。
即ち、クロレラ株（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４ＡやＣ．ｐｒｏｔｏｔｅｃｈｏｉｄｅｓ  ２１１−６等）を宿主とした寒天平板培地プラークアッセイ法により単離したウイルス各種をクロレラ培養細胞（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に接種する。数時間後の溶菌液を遠心分離（１５，０００Ｇ）し、沈殿したウイルス粒子を適当量のＭＢＢＭ培地に懸濁し、０．４５μｍ孔径のメンブランフィルターで濾過する。ウイルス粒子はクロレラ培養液１Ｌ（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）当り２×１０１３ＰＦＵ程度得られる。
【００１０】
クロロウィルスを感染させるクロレラ細胞としては、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４ＡやＣ．ｐｒｏｔｏｔｅｃｈｏｉｄｅｓ  ２１１−６等のクロレラ株が用いられる。
クロレラの培養に用いられる培地としては、例えば、ＭＢＢＭ培地（硝酸ナトリウム０．０２５％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、リン酸１カリウム０．０１７５％、リン酸２カリウム０．００７５％、食塩０．００２５％、ペプトン０．１％、ｐＨ６．５）やＭＡＭ培地（硝酸アンモニウム０．０２５％、硝酸カリウム０．０１％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、塩化ナトリウム０．００２５％、β−グリセロリン酸ナトリウム０．１％、バクトペプトン０．１％、酵母エキス０．０５％、カザミノ酸０．１％、マルトエキス０．０５％）等が用いられる。
クロレラの培養は、通常、光照射下（白色光３０００〜５０００ルックス）、２５℃で対数増殖期後期（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）まで培養する。増殖速度（倍加時間）は約６時間程度である。
【００１１】
クロレラ細胞上にヒアルロン酸又は／及びキチンを生産させる方法は、上記何れかのクロロウィルス（例えば、ＣＶＫ２、ＣＶＩＫ１、ＣＶＨＡ１等）を宿主クロレラ細胞に感染させることにより達成されるが、クロレラウィルスの使用量としては、通常、１Ｌのクロレラ培養液（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にクロロウィルス（ＣＶＩＫ１又はＣＶＨＡ１）をｍｏｉ１〜１０程度（細胞あたりのウイルス数）で感染させる。
そして、通常、感染後２〜４時間で細胞を遠心分離により回収する。この菌体から多糖類を分離精製すれば、目的とする繊維状のヒアルロン酸又は／及び繊維状のキチンが得られる。
【００１２】
本発明の分離・精製方法は、上記遠心分離により得られた菌体に機械的な振動を与えることによりヒアルロン酸又は／及びキチンを細胞から遊離させてこれを迅速に回収すると言うものである。
【００１３】
遊離したヒアルロン酸やキチンはそれぞれ物性が異なるため、本発明の方法によればヒアルロン酸及びキチンを同時生産した場合も一連の簡単な操作によって同時回収が出来る。
キチン回収のためには、ウイルス感染細胞（感染後２時間）に機械的な振動を与えることによってキチンを遊離させ、該細胞を、例えば低速遠心分離（例えば１，０００×Ｇ）等により沈殿させれば、キチンを浮遊物として回収することが出来る。更に、遠心分離（例えば、３，０００×Ｇ〜１０，０００×Ｇ）によって細胞並びに不溶性物質を沈殿除去した後、可溶性画分に、例えば、酢酸ナトリウム０．５％及びエチルアルコール３倍量（Ｖ／Ｖ）を添加してヒアルロン酸を析出させ、沈殿として回収することが出来る。
得られたヒアルロン酸の沈殿は、必要に応じてエチルアルコール等により１乃至数回再沈殿させることによりより高純度のヒアルロン酸とすることが出来る。
１Ｌ培養液から総計４時間の工程で約１００ｍｇのキチン純産物或いは約１００ｍｇのヒアルロン酸純産物が得られる。両者生産ウイルスを使用した場合には、キチンとヒアルロン酸がそれぞれ等量ずつ得られる。
従って、例えば、クロロウィルスとしてＣＶＩＫ１又はＣＶＨＡ１を用い、上記スケールで一日６サイクル生産すれば６００ｍｇ／日／Ｌのヒアルロン酸とキチンを生産することが出来る。
【００１４】
本発明における機械的な振動としては、例えば、ボルテックス処理や超音波処理等による振動等が挙げられる。
ボルテックス処理の場合は、ボルテックスミキサー（例えば、トミー精工  ＭＴ−３６０等）により適当な速度（例えば、ｍｉｘｉｎｇ  ｓｐｅｅｄ  １０）で室温で数分〜１０分間程度（通常４〜６分間程度）処理する。
また、超音波処理の場合は、例えば、トミー精工  ＵＤ  ２０１  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ等の超音波発生器を用いて、適当な設定条件、例えばｏｕｔ  ｐｕｔ３、ｄｕｔｙ５０％等で数十秒〜数分間程度（通常３０秒〜４０秒間程度）処理すればよい。
【００１５】
【実施例】
以下、参考例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら参考例、実施例により何ら限定されるものではない。
【００１６】
参考例１  クロレラの培養
クロレラ株（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４Ａ）をＭＢＢＭ培地（硝酸ナトリウム０．０２５％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、リン酸１カリウム０．０１７５％、リン酸２カリウム０．００７５％、食塩０．００２５％、ペプトン０．１％、ｐＨ６．５）で光照射下（白色光３０００〜５０００ルックス）、２５℃で対数増殖期後期（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）まで培養した。増殖速度（倍加時間）は約６時間であった。
【００１７】
実施例１  キチン繊維の生産及び分離／回収
１Ｌのクロレラ培養液（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にクロロウイルス（ＣＶＩＫ１）をｍｏｉ１〜１０程度（細胞あたりのウイルス数）で感染させた。感染後２〜３時間で細胞を遠心分離により回収し、トミー精工  ＭＴ−３６０ボルテックスミキサー（ｍｉｘｉｎｇ  ｓｐｅｅｄ  １０）で室温で５分間処理した。  機械的振動処理した細胞を低速遠心分離（１，０００×Ｇ）により沈殿させると、上清表面に白い浮遊物としてキチンが回収出来た。得られたキチンは各種キチナーゼ（例えばキチナーゼＲＳ：生化学工業（株））によって分解され、また酸加水分解によってＧｌｃＮＡｃに完全分解した。回収量は１００ｍｇ／Ｌであった。全工程はウイルス感染開始から３時間以内で終了した。
【００１８】
実施例２  ヒアルロン酸繊維の生産及び分離／回収
１Ｌのクロレラ培養液（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にクロロウイルス（ＣＶＨＡ１）をｍｏｉ１〜１０程度（細胞あたりのウイルス数）で感染させた。感染後３〜４時間で細胞を遠心分離により回収し、トミー精工  ＵＤ  ２０１  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃを用いて、ｏｕｔ  ｐｕｔ３、ｄｕｔｙ５０％で３０秒間超音波処理を行った。次いで、上記実施例１に従ってキチンを回収後、試料液を高速遠心分離した（１０，０００×Ｇ）。沈殿物を除去後、上清に酢酸ナトリウム０．５％及びエチルアルコール３倍量（Ｖ／Ｖ）を添加してヒアルロン酸を析出させ、遠心分離（１０，０００×Ｇ）により沈殿として回収した。エチルアルコールによる析出を２回繰り返すことによって高純度のヒアルロン酸を得ることが出来た（１００ｍｇ／Ｌ）。全工程はキチン回収を含めて４時間以内に終了した。
【００１９】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、極めて短時間（ウイルス感染から４時間以内）にクロレラ細胞から高純度のヒアルロン酸及びキチンを同時生産・回収できる。
例えば、クロロウィルスとしてＣＶＩＫ１又はＣＶＨＡ１を用い、１Ｌ培養液×１で、一日に６回感染・回収操作をすれば、ヒアルロン酸及びキチンをそれぞれ６００ｍｇ／Ｌ、同時生産、回収することが出来る。また、クロレラ自身も利用できる可能性が高い。
クロレラ培養には長い歴史があり特に日本においては、健康・安全のイメージが強い。当プロセスで得られるヒアルロン酸やキチンはクロレラの生産物として一般に受け入れられ易い。多くの研究がなされているクロレラ培養系を用いた大気温暖化ガス吸収プロセス等とカップリングさせれば、さらに高付加価値物質生産系として効果が大きい。