(57)【要約】【課題】  細胞死の抑制方法、細胞死抑制剤、及びその細胞死抑制剤を含む細胞死に起因する疾患の治療薬剤を提供する。【解決手段】  本発明の細胞死の抑制方法は、細胞膜上にアニオンチャネルを人工的に形成するアニオンチャネル形成ペプチドを乳酸アシドーシス下の細胞に投与することを特徴とするものであり、本発明の細胞死抑制剤は、このアニオンチャネル形成ペプチドを含むことを特徴とするものである。このアニオンチャネル形成ペプチドの一例として、ヘリコバクターピロリ菌由来のＶａｃＡタンパク質、あるいは、グリシンレセプタチャネル変異体ペプチドを挙げることができる。本発明の細胞死抑制方法及び細胞死抑制剤は、細胞膨張を伴うネクローシス性細胞死に特に有効に作用するものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アニオンチャネル形成ペプチドを乳酸アシドーシス下の細胞に投与することを特徴とする細胞死の抑制方法。
【請求項２】
上記細胞死は、ネクローシス性の細胞死であることを特徴とする請求項１に記載の細胞死の抑制方法。
【請求項３】
上記細胞死は、細胞膜不透過性蛍光色素ヨウ化プロピジウムによる核染色性を指標として判断されることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞死の抑制方法。
【請求項４】
上記細胞死は、ミトコンドリア脱水素酵素の活性の顕著な低下を伴うことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞死の抑制方法。
【請求項５】
上記アニオンチャネル形成ペプチドは、ヘリコバクターピロリ菌由来のＶａｃＡタンパク質であることを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の細胞死の抑制方法。
【請求項６】
上記アニオンチャネル形成ペプチドは、グリシンレセプタチャネル変異体ペプチドであることを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の細胞死の抑制方法。
【請求項７】
アニオンチャネル形成ペプチドを含むことを特徴とする細胞死抑制剤。
【請求項８】
ネクローシス性の細胞死を抑制することを特徴とする請求項７に記載の細胞死抑制剤。
【請求項９】
上記ネクローシス性の細胞死の抑制は、細胞膜不透過性蛍光色素ヨウ化プロピジウムによる核染色性の喪失により評価されることを特徴とする請求項７または８に記載の細胞死抑制剤。
【請求項１０】
上記ネクローシス性の細胞死の抑制は、ミトコンドリア脱水素酵素活性の低下を防御することにより評価されることを特徴とする請求項７または８に記載の細胞死抑制剤。
【請求項１１】
上記アニオンチャネル形成ペプチドは、ヘリコバクターピロリ菌由来のＶａｃＡタンパク質であることを特徴とする請求項７から１０の何れか１項に記載の細胞死抑制剤。
【請求項１２】
上記アニオンチャネル形成ペプチドは、グリシンレセプタチャネル変異体ペプチドであることを特徴とする請求項７から１０の何れか１項に記載の細胞死抑制剤。
【請求項１３】
請求項７から１２の何れか１項に記載の細胞死抑制剤を含み、細胞死に起因する疾患の治療に使用される治療薬剤。
【請求項１４】
グリア細胞死に起因する疾患の治療に使用されることを特徴とする請求項１３に記載の治療薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液供給の障害によって起こる虚血などの病的現象によって発生する細胞死、特に、乳酸アシドーシス下における細胞膨張を伴うネクローシス性の細胞死を抑制する方法、このような細胞死を抑制する細胞死抑制剤、及びこのような細胞死に起因する疾患の治療薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脳血管障害などの病態において、脳内が虚血に陥ると、しばしば乳酸の蓄積を伴ったアシドーシスに陥ることが知られている。この状態を乳酸アシドーシスと呼ぶ。乳酸アシドーシスに陥ったグリア細胞や神経細胞は、虚血環境の改善がない限り、やがては虚血性細胞死に陥ることが知られている。これまでに、このような細胞死を抑制するために多くの薬剤が開発・研究されてきた。
【０００３】
乳酸アシドーシス下では、これらの細胞の容積は持続的に膨張することが知られている。このような細胞の膨張を伴って細胞死に至るものは、ネクローシス性細胞死と呼ばれている。本願発明者等は、乳酸アシドーシス下において細胞容積の持続的な膨張は、（少なくとも神経細胞やグリア細胞においては）容積調節性アニオンチャネルが抑制されているためであることを明らかにしている。これまでに、上記容積調節性アニオンチャネルは、特に低浸透圧（低張）刺激時などにおける細胞膨張後に見られる調節性容積減少（ＲＶＤ）において、必要不可欠なチャネルであることが知られている。このため、乳酸アシドーシス下において、その機能が抑制されている容積調節性アニオンチャネルの機能に代替し得る物質を投与することにより、この持続的な細胞膨張を抑制できる可能性があると考えられている。
【０００４】
ところで、細胞死には、上述の細胞の膨張を伴うネクローシス性細胞死以外に、細胞の収縮を伴うアポトーシス性細胞死がある。このアポトーシス性細胞死を抑制するには、アニオンチャネルブロッカーを使用してアニオンチャネルの働きを抑制するという方法が有効であるということが、本願発明者等の研究グループをはじめとしていくつかのグループによって報告されている。特許文献１は、その一例であり、細胞死に起因する疾患の治療にも有用な手段となる可能性があることが報告されている。
【特許文献１】特開２００２−３４０２（公開日：平成１４年１月９日）
【非特許文献１】Cover TL, Blaser MJ, 「Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori」, J. Biol. Chem., 267, 10570-10575, 1992年
【非特許文献２】Wallace DP, Tomich JM, Iwamoto T, Henderson K, Grantham JJ, Sullivan LP, 「A synthetic peptide derived from glycine-gated Cl- channel induces transepithelial Cl- and fluid secretion」, Am. J. Physiol., 272, C1672-C1679, 1997年
【非特許文献３】Mitchell KE, Iwamoto T, Tomich J, Freeman LC, 「A synthetic peptide based on a glycine-gated chloride channel induces a novel choloride conductance in isolated epithelial cells」, Biochim. Biophys. Acta., 1466, 47-60, 2000年
【非特許文献４】第７８回日本生理学会大会予稿集、２５４頁、１ＰＡ７６、（発行日：２００１年３月１日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、これまでにアポトーシス性細胞死の抑制方法・抑制剤の研究・開発は盛んに行われてきた一方で、ネクローシス性細胞死の抑制方法・抑制剤についての報告例は確認されていない。即ち、乳酸アシドーシス下において、容積調節性アニオンチャネルの機能に代替し得る物質を投与し、アニオンのみを透過させる人工的アニオンチャネルを形成することをメカニズムとするネクローシス性細胞死の抑制剤が実用化されている例はない。
【０００６】
その原因の一つとして、カチオン選択性、または、カチオン・アニオン双方を透過させるイオノフォア（人工的にイオンチャネルやイオントランスポータを形成させる物質）は、グラミシジンやナイスタチンなど、従来からよく知られていたにもかかわらず、アニオン選択性のイオノフォア（アニオンイオノフォア）は、ごくわずかしか知られていないことが挙げられる。しかし近年、ヘリコバクターピロリ菌（Helicobacter pylori）由来のＶａｃＡタンパク質（非特許文献１参照）、グリシンレセプタチャネル変異体ペプチドなどが（非特許文献２及び非特許文献３参照）上記アニオンイオノフォアとしての機能を有するということが明らかにされている。
【０００７】
そこで、本発明は、上記アニオンイオノフォアを用いて人工的アニオンチャネルを形成することをメカニズムとする細胞死の抑制方法、細胞死抑制剤、及びその細胞死抑制剤を含む細胞死に起因する疾患の治療薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者等は、虚血中の乳酸アシドーシスにおいてしばしば見られるグリア細胞膨張とそれに続くネクローシス性細胞死とが、容積調節性アニオンチャネルの機能不全によるものであること、及び、ヘリコバクターピロリ菌由来のＶａｃＡタンパク質が人工的にアニオンチャネルを形成するという性質に着目し、上記ＶａｃＡタンパク質を乳酸アシドーシス下の細胞に投与することによって、その細胞死が抑制されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
即ち、本発明に係る細胞死の抑制方法は、アニオンチャネル形成ペプチドを乳酸アシドーシス下の細胞に投与することを特徴とするものである。また、本発明に係る細胞死抑制剤は、アニオンチャネル形成ペプチドを含むことを特徴とするものである。
【００１０】
細胞膜上に存在するイオンチャネルは、細胞膜を貫通するタンパク質で、細胞膜を越えて特定のイオンを通す重要な経路であり、細胞内外の物質のやり取りや情報の受け渡しに重要な役割を果たしている。アニオンチャネルは、このイオンチャネルの一種であり、アニオンのみを選択的に透過させるイオンチャネルである。したがって、上記「アニオンチャネル形成ペプチド」とは、上述のようなアニオンチャネルを人工的に形成する外来性のペプチドを意味する。また、上記ペプチドには、オリゴペプチドからポリペプチドに至るまで、種々のアミノ酸残基数からなるものが含まれる。それゆえ、上記ペプチドにはタンパク質も含まれるものとする。
【００１１】
一般に細胞は、低張刺激負荷などによってその容積を強制的に膨張させられた場合、その後しばらくすると、元の容積に回復する現象を示す。この現象は、調節性容積減少（ＲＶＤ）と呼ばれている。しかし、脳梗塞を発症した場合に起こる脳虚血時にしばしば見られる乳酸アシドーシス条件下では、脳神経細胞及びグリア細胞（神経膠細胞）の容積が膨張したまま元の容積に回復せず、やがて細胞死に陥ることが知られている。即ち、乳酸アシドーシス時には容積感受性アニオンチャネルが阻害されていることによって、ＲＶＤが起きないために細胞死が起こる。
【００１２】
本発明の細胞死の抑制法及び細胞死抑制剤では、上記アニオンチャネル形成ペプチドの作用によって、細胞膜上に人工的にアニオンチャネルを形成させて、ＲＶＤを引き起こし、持続的な細胞膨張を抑制させることができる。そして、後述の実施例にも示すように、細胞死を抑制し、細胞の生存率を改善させることができる。このように、上記細胞死の抑制方法及び細胞死抑制剤は、細胞死の中でも特に、乳酸アシドーシス下における細胞膨張を伴うネクローシス性の細胞死を抑制する効果を奏するものである。
【００１３】
なお、上記ＶａｃＡを投与することによって、乳酸アシドーシスによって膨張したグリア細胞にアニオンチャネルを形成すること、及び、上記アニオンチャネルの形成によって、膨張したグリア細胞にＲＶＤが生じることについては、本願発明者等によって上記非特許文献４において既に公表されている。
【００１４】
しかしながら、上記非特許文献４にはアニオンチャネルの形成およびそれに伴うＲＶＤによって、ネクローシス性の細胞死が有意に減少し、細胞死の抑制という疾患の予防及び治療的意義については記載されていない。即ち、後述の実施例に記載されている、アニオンチャネル形成ペプチド（ＶａｃＡタンパク質、グリシンレセプタチャネル変異体ペプチド）の投与によって、細胞死が有意に減少し、細胞の生存率が改善するという事実は、本出願によって初めて明らかにされるものである。
【００１５】
上記アニオンチャネル形成ペプチドとして具体的には、ヘリコバクターピロリ菌（Helicobacter pylori）由来のＶａｃＡタンパク質、グリシンレセプタチャネル変異体ペプチドを挙げることができる。これらは、実施例にも示すように、乳酸アシドーシス条件下において、実際に細胞の持続的膨張を抑制させることが確認されている。
【００１６】
本発明の細胞死の抑制方法において、上記細胞死は、細胞膜不透過性蛍光色素ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による核染色性を指標として判断されるものであってもよい。また、本発明の細胞死抑制剤において、上記ネクローシス性の細胞死の抑制は、細胞膜不透過性蛍光色素ヨウ化プロピジウムによる核染色性の喪失により評価されるものであってもよい。これはつまり、本発明においては、細胞死の判断を、細胞膜不透過性蛍光色素ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による核染色性を指標として行うこともできるということを意味する。上記の細胞死の判断方法については、後述の実施例において説明する。
【００１７】
またさらに、本発明の細胞死の抑制方法において、上記細胞死は、ミトコンドリア脱水素酵素の活性の顕著な低下を伴うものであってもよい。また、本発明の細胞死抑制剤において、上記ネクローシス性の細胞死の抑制は、ミトコンドリア脱水素酵素活性の低下を防御することにより評価されてもよい。これはつまり、本発明においては、細胞死の判断を、ミトコンドリア脱水素酸素活性を指標として行うこともできるということを意味する。この細胞死の判断方法についても、後述の実施例において説明する。
【００１８】
上記の各細胞死の判断方法を用いることによって、本発明の細胞死の抑制方法および細胞死抑制剤を利用した場合の細胞死抑制効果を、容易に判定することができる。
【００１９】
本発明に係る細胞死の抑制方法及び細胞死抑制剤は、虚血中の乳酸アシドーシス下において見られる細胞膨張およびそれに続く細胞死（特に、ネクローシス性細胞死）を抑制することができる。虚血性細胞死は、種々の虚血性疾患に伴って発生するものであり、これを阻止することによって、脳機能不全や心機能不全さらには死亡を防止することができると考えられる。即ち、上記細胞死の抑制方法及び細胞死抑制剤は、細胞死に起因する種々の疾患の予防及び治療に有効に利用することができる。従って、本発明には、上記細胞死抑制剤を含み、細胞死に起因する疾患の治療に使用される治療薬剤も含まれる。
【００２０】
さらに、上記細胞抑制剤は、種々の細胞の中でも特にグリア細胞の細胞死を効果的に抑制することができるため、上記細胞死抑制剤を含む本発明の治療薬剤は、グリア細胞死に起因する疾患の治療に使用されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
以上のように、本発明の細胞死の抑制方法は、アニオンチャネル形成ペプチドを乳酸アシドーシス下のグリア細胞に投与することを特徴とするものである。また、本発明の細胞死抑制剤は、アニオンチャネル形成ペプチドを含むことを特徴とするものである。
【００２２】
これらは、虚血中の乳酸アシドーシス下において見られる細胞膨張およびそれに続く細胞死（特に、ネクローシス性細胞死）を抑制することができる。そのため、細胞死に起因する種々の疾患の予防及び治療に有効に利用することができる。また、本発明の細胞死の抑制方法及び細胞死抑制剤は、従来の虚血性障害を抑制させる薬剤とは全く異なる新しいメカニズムによって細胞死を抑制するものであるため、利用価値が高いと言える。
【００２３】
本発明の治療薬剤は、上記の細胞死抑制剤を含み、細胞死に起因する種々の疾患の治療に使用されるものである。この治療薬剤は、脳のみならず心臓などにおいても、種々の疾患に伴う虚血性細胞死及び臓器障害を抑制する薬剤として用いられ、生命の予後の改善や虚血性諸疾患の改善に大きく寄与するものと考えられ、有用性が高いと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００２５】
本発明に係る細胞死の抑制方法は、アニオンチャネル形成ペプチドを乳酸アシドーシス下のグリア細胞に投与することを特徴とするものであり、また、本発明に係る細胞死抑制剤は、アニオンチャネル形成ペプチドを含んでなるものである。
【００２６】
ここで、上記アニオンチャネル形成ペプチドとしては、例えば、ヘリコバクターピロリ菌由来のＶａｃＡタンパク質、グリシンレセプタチャネルの変異体ペプチド、コレラ菌溶血性毒素などを挙げることができる。
【００２７】
上記ＶａｃＡタンパク質は、動物の胃内に生息するヘリコバクターピロリ菌（Helicobacter pylori）毒素から単離されたものであり、人工脂質二重層膜上など、異所的にアニオンチャネルを形成することが知られている（非特許文献１参照）。このＶａｃＡタンパク質は、上記非特許文献１に記載の方法に基づいて単離することができる。なお、このＶａｃＡタンパク質には、非特許文献１に記載された一次構造のもののみでなく、アニオンチャネルを形成するという機能が損なわれない程度に、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたタンパク質も含まれる。即ち、上記ＶａｃＡタンパク質の変異タンパク質も上記アニオンチャネル形成ペプチドに含まれるものとする。
【００２８】
また、グリシンレセプタチャネル変異体ペプチドは、上記非特許文献２及び非特許文献３に記載されているように、グリシンレセプターαサブユニットのポア形成部位に相当する第２膜貫通領域（Ｍ２）の２３個のアミノ酸からなるポリペプチドにおいて、そのカルボキシ末端に４個のリジンを加えて水溶性を高めたポリペプチドである。このグリシンレセプタチャネル変異体ペプチドは、上皮細胞モノレイヤーのＣｌ−分泌を高めることや、上皮細胞のＣｌ−コンダクタンスを高めることが報告されている。上記グリシンレセプタチャネル変異体ペプチドの作製および取得は、非特許文献２及び非特許文献３に記載の方法に基づいて実施することができる。
【００２９】
上記コレラ菌溶血性毒素の性質及び取得方法については、以下の参考文献１、２に記載されている。
参考文献１：Zitzer A, Palmer M, Weller U, Wassenaar T, Biermann C, Tranum-Jensen J, Bhakdi S, 「Mode of primary binding to target membranes and pore formation induced by Vibrio cholerae cytolysin (hemolysin)」, Eur. J. Biochem., 247, 209-216, 1997年
参考文献２：Moschioni M, Tombola F, de Bernard M, Coelho A, Zitzer A, Zoratti M, Montecucco C, 「The Vibrio cholerae hemolysin anion channel is required for cell vacuolation and death」, Cell. Microbiol., 4 (7), 397-409, 2002年
本発明の細胞死抑制剤は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サルなど）に対し、細胞死に起因する疾患（特に、ネクローシスの促進が関わる疾患であることが好ましい）の予防または治療薬剤として用いることができる。上記疾患としては、例えば、心筋梗塞、脳虚血などの虚血性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患、うっ血性心不全などが挙げられる。後述の実施例に示されるように、ＶａｃＡタンパク質などのアニオンチャネル形成ペプチドを含む上記細胞死抑制剤は、虚血後の乳酸アシドーシス下のグリア細胞膨張を抑制することから、上記疾患の中でも特に、虚血性疾患の予防および治療に使用されることが好ましい。また、本発明の細胞死抑制剤は、上記疾患が１種の場合にも、複数の疾患が併発した場合にも適用することができる。
【００３０】
本発明の細胞死抑制剤は、上記「アニオンチャネル形成ペプチド」のみを含み、それを直接投与して使用することもできるが、通常、上記アニオンチャネル形成ペプチドに加えて、薬理学的に許容される担体がさらに含まれていてもよい。このような細胞死抑制剤の製造は、従来公知の製造方法によって行うことができる。
【００３１】
上記薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として一般に使用可能な各種有機または無機担体物質を用いることができる。これらは、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤として、あるいは、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また、上記細胞死抑制剤における「アニオンチャネル形成ペプチド」としてのＶａｃＡタンパク質の含量は０．２〜７．５μｇ／ｍｌであることが好ましく、２．５〜７．５μｇ／ｍｌであることがより好ましい。なお、上記ＶａｃＡタンパク質は、使用直前に酸性溶液（ｐＨ２）によって活性化させておくことが必須である。
【００３２】
本発明の細胞死抑制剤の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口剤のほか、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤などの非経口剤が挙げられる。これらは毒性も低く、それぞれ経口的あるいは非経口的に投与できる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。但し、本発明はこの実施例の記載に限定されるものではない。本実施例では、本発明に係る細胞抑制剤に含まれるアニオンチャネル形成ペプチドの一例である、ＶａｃＡタンパク質及びグリシンレセプタチャネル変異体ペプチドが、乳酸アシドーシス下での細胞膨張を抑制できることを確認した。以下には、その確認実験の方法、結果などを示す。
【００３４】
（１）実験方法
［細胞培養法］
ラットのアストログリア細胞系統のＣ６グリオーマ細胞系列（参考文献：Benda  et  al.、「Differentiated rat glial strain in tissue culture」、Science  161、370-371、1968）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American  Type  Culture  Collection）から取得され、ダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）を用いて、３７℃、５％のＣＯ２を含む加湿エア内でペトリ皿あるいは培養用フラスコ中で単層培養された。上記培地には、２５ｍＭの炭酸水素イオン、１０％のウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンＧ、及び、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加された。０．０５％トリプシンと０．０２％ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いたトリプシン処理によって、単層培養細胞がはがし取られた。細胞は、８００ｒｐｍで１分間遠心分離され。上清は除去された。トリプシン活性を抑制するために、細胞はウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ内に懸濁され、２回目の遠心分離が行われた後、上清が除去された。続いて、上記の細胞は、以下の電解質を含み、血清を含まない溶液に懸濁された。
【００３５】
電解質：１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３
この細胞懸濁液は、実験に使用されるまで、９５％空気と５％のＣＯ２の気泡によって飽和されることによって、３７℃、ｐＨ７．４で保存された。
【００３６】
［細胞容積測定法］
細胞容積は、流動細胞数測定器（フローサイトメータ：EPICS  Elite  ESP、Coulter  Co.、Miami、FL）を使用するコールターの原理に基づいて評価された。細胞の生存率についても、ヨウ化プロピジウム遮断テストによって細胞数測定に基づいて評価された。１０ｍｌの細胞懸濁液は、１０ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含む２μｌのＰＢＳを添加した後、３７℃で１分間インキュベートされた。細胞の平均容積は、２×１０４個の細胞を含む３５０μｌの細胞懸濁液を、上記流動細胞測定器に所定の時間内に注入することによって測定された。基準の細胞容積は、コントロール溶液（ｐＨ７．４）で２０分間インキュベートされる前と後との測定値の平均として得られた。ｐＨ６．２のアシドーシスの効果、及び、ｐＨ６．２の乳酸アシドーシスあるいはｐＨ７．４の乳酸の効果は、その後、以下に示すように、塩酸、乳酸、あるいは、乳酸とトリスとをそれぞれ添加することによって観察された。細胞は、コントロール（ｐＨ７．４）、酸性（ｐＨ６．２）溶液、あるいは、乳酸を含むｐＨ６．２の乳酸アシドーシス溶液（これらは全て等張性である）でプレインキュベートされた後、３０％の体積の脱イオン蒸留水で上記等張性の溶液を希釈することによって、低張刺激負荷の効果についても観察された。
【００３７】
細胞容積測定のために用いられたコントロール溶液の組成は、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  glucose、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．４、in  ９５％空気／５％ＣＯ２）であった。乳酸アシドーシスの効果を調べるために、培地のｐＨが、等張性の乳酸溶液を滴下することによって６．２に滴定され、乳酸の最終濃度が２５ｍＭに調製された。アシドーシスの効果を調べるために、培地のｐＨが、塩酸を用いてｐＨ６．２に滴定された。乳酸単独の効果を調べるために、２５ｍＭ乳酸を含む培地のｐＨが、７．５ｍＭの適当量のトリスを加えることによってｐＨ７．４に調整された。凝固点降下浸透圧計（Vogel  GmbH、Giessen、Germany）によって測定された重量モル浸透圧濃度は、コントロール溶液、乳酸含有酸溶液、乳酸含有トリス緩衝溶液、それぞれに対して３００、３０６、３１２ｍ osmol／kg-H20であった。
【００３８】
［電気生理学法］
全細胞電流記録法（パッチクランプ法）による観察は、室温（２３〜２５℃）で実施され、参考文献（Kubo M., Okada Y.,「Volume-regulatory Cl- channel currents in cultured human epithelial cells」、J. Physiol.  456、351-371、1992）に記載の方法に基づいて、ワイドチップ電極（〜２ＭΩ）を使用して記録された。直列抵抗（＜５ＭΩ）は、電圧誤差を最小化するために、６０−７０％に補正された。電流変化の時間経過が、０ｍＶから±４０ｍＶの保持電位から交流のステップパルス（持続時間１ｓ）を１５秒ごとに加えることによってモニタリングされた。全細胞の容積感受性電流の電圧依存性をモニターするために、ステップパルス（持続時間２ｓ）が−６０ｍＶ（持続時間２ｓ）の前電位から加えられ、膨張誘導電流が定常状態活性化に達した後に、−６０ｍＶから＋１００ｍＶの電位が２０ｍＶ毎に試験された。ＶａｃＡ誘導電流をモニターするために、ステップパルス（持続時間３００ｍｓ）が−８０ｍＶ（持続時間３００ｍｓ）の前電位から加えられ、−８０から＋８０ｍＶの電位が２０ｍＶ毎に試験された。ステップパルス印加後２．５ｍｓの瞬間電流が記録された。容積感受性電流あるいはＶａｃＡ誘導電流の電流−電圧曲線（Ｉ−Ｖ曲線）をモニターするために、ランプパルスが−４０ｍＶから＋６０ｍＶの範囲内で０．５ｓ間加えられた。電流は、ＥＰＣ−９増幅器（ＨＥＫＡ、Lambrecht、Germany）を用いて記録された。電流信号は、１ｋＨｚで濾波され、４ｋＨｚでデジタル化された。パルス＋パルスフィットソフトウエア（version8.11；ＨＥＫＡ）が指令パルス制御、データ収集、及び解析に使用された。
【００３９】
ほぼすべての細胞のパッチクランプ実験のために、次の溶液（電解槽）およびピペット溶液が使用された。
【００４０】
等張性（３２０ｍ osmol／kg-H2O）電解槽溶液：１１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、９０ｍＭマンニトール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨでｐＨ７．４に滴定されたもの）を含む。
【００４１】
細胞膨張は、マンニトールが４０ｍＭに減らされた低張性（２７０ｍ osmol／kg-H20）の溶液で誘導された。ピペット（細胞間）溶液（２９０ｍ osmol／kg-H2O）は、１１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２ｍＭ  Ｎａ２ＡＴＰ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、６０ｍＭマンニトール、及び１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨでｐＨ７．２に滴定されたもの）を含む。実験に応じて、１０ｍＭ  1,2-ビス（2-アミノフェノキシ）エタン-Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）が、１ｍＭ  ＥＧＴＡの代わりにピペット溶液に加えられた。容積感受性Ｃｌ−チャネルあるいはＶａｃＡ誘導チャネルのアニオン透過性を調べるために、等張性電解槽溶液中で、塩素が等モル濃度のヨウ素、臭素、アスパラギン酸、あるいは、メタンスルホン酸と置き換えられた。ＶａｃＡチャネルの透過性についても、次の溶液を使用して調べられた。
【００４２】
等張性（３１５ｍ osmol／kg-H2O）電解槽溶液：１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭマンニトール、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（トリスでｐＨ７．４に滴定されたもの）を含む。
ピペット（細胞間）溶液（３００ｍ osomol／kg-H2O）：３０ｍＭ  ＮａＣｌ、８０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７０ｍＭマンニトール、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  Ｎａ２ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含む。
【００４３】
アスパラギン酸で１１５ｍＭの細胞外Ｃｌ−を置換することによって、相対アニオン透過性が調べられた。相対カチオン透過性は、７５ｍＭ  Ｎａ＋及び７０ｍＭ  Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）で１４５ｍＭの細胞外Ｎａ＋を置換することによって調べられた。
【００４４】
（２）結果及び考察
［乳酸アシドーシス下におけるグリア細胞の容積変化］
図１には、ｐＨ７．４のコントロール条件下（○）、乳酸アシドーシス下（■）、アシドーシス下（▲）、乳酸投与下（◆）、それぞれの場合のグリア細胞の細胞容積変化を、相対細胞容積で経時的（単位：分）に記録したグラフを示す。
【００４５】
コントロール条件下では、Ｃ６グリア細胞の平均細胞容積は、８０２．４±３９．４μｍ３であり、図１の○で示すように、１時間変化することはなかった。乳酸を添加せずに培地のｐＨを６．２に下げたもの（即ち、アシドーシス下）は、細胞容積にわずかな変化が認められた（図中、▲で示す）。対照的に、２５ｍＭの乳酸の投与によって培地のｐＨが６．２に下げられた場合（即ち、乳酸アシドーシス下）には、細胞容積に顕著な増加が認められた（図中、■で示す）。その平均細胞容積は、投与後２分で基準となる細胞容積のレベルの１．０６±０．０２倍に増加した。そして、緩やかに膨張し続けた後、４５分から６０分以内に頭打ちの状態に達した（６０分後には１．１１±０．０２倍になった）。しかしながら、培地のｐＨが７．４に維持された場合（図中、◆で示す）には、乳酸単独では顕著な膨張は誘導されなかった。これらの結果から、グリア細胞膨張は、酸性化のみ、あるいは、乳酸のみでは何れも誘導されず、乳酸アシドーシスによって誘導されることがわかった。
【００４６】
[乳酸アシドーシス下におけるＲＶＤの阻害]
図２には、ｐＨ７．４のコントロール条件の状態（○）、乳酸のみを投与した場合（◆）、アシドーシス下の場合（△）、乳酸アシドーシス下の場合（■）、それぞれのＣ６グリア細胞の細胞容積の変化を記録したグラフを示す。
【００４７】
低張刺激負荷（７０％オスモル濃度）が行われると、グリア細胞は一時的に膨張し、引き続いてコントロール状態下に回復することが確認された（図２の○で示す）。ＲＶＤが乳酸アシドーシスによって影響されるか否かを調べるために、細胞は乳酸を含む酸性（ｐＨ６．２）等張性溶液でプレインキュベートされ、その後、乳酸アシドーシスを維持しながら低張性溶液に浸された。この場合は、図２に■で示すように、乳酸アシドーシス条件下であり、ＲＶＤは起こらなかった。しかしながら、ｐＨ７．４で乳酸を加えた場合には、ＲＶＤはほぼ通常どおり引き起こされた（図２中、◆で示す）。乳酸が欠如した場合には、酸性条件（ｐＨ６．２、図中△で示す）下でＲＶＤは一部のみ阻害された。
【００４８】
このように、通常の細胞においては、一時的な細胞膨張の後に発生するＲＶＤが、乳酸アシドーシス下では起こらず、細胞が持続的に膨張し続けることが示された。この結果から、乳酸アシドーシス下では、最終的にネクローシス性細胞死に至ることが示唆される。
【００４９】
また、データは示さないが、この細胞容積の持続的な膨張は、容積調節性のＣｌ−チャネルの機能が抑制されていることに起因することが本実験において確認された。
【００５０】
［ＶａｃＡの投与によるグリア細胞膜上でのアニオンチャネルの形成］
続いて、ＶａｃＡタンパク質を投与した場合に、グリア細胞膜上にアニオンチャネルが人工的に形成されることを確認した結果を示す。なお、ＶａｃＡは、上記非特許文献１に記載の方法によって、ヘリコバクターピロリ菌60190から精製され、酸性（ｐＨ２）のリン酸緩衝液によって、３７℃で１０分間、活性化前処理が施されたものが使用された。
【００５１】
上記ＶａｃＡを２．５μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で５０分間Ｃ６グリア細胞をインキュベートした場合、光学顕微鏡で観察すると、細胞の形態変化は誘導されなかった。これは、細胞からのヨウ化プロピジウムの排除（即ち、非染色性）によって判断されるように、培地にはアンモニウムのような補足的な弱い塩基が添加されていないので、細胞の生存率に影響を与えないことが原因であると推定できる。しかし、結果として電流は大きく活性化される。上記電流は、時間依存性の活性化や不活性化のキネティクスを発揮することなく（図３（ａ）参照）、わずかな外向き整流性のみを示す（図３（ｄ）中、○で示す）。乳酸アシドーシス（ｐＨ６．２）条件下で記録されるＶａｃＡ誘導電流に対する電流（図３（ｂ）参照）とＩ−Ｖ相関（図３（ｄ）中、●で示す）とは、コントロール条件下で記録された電流に対するそれ（図３（ｄ）中、○で示す）と見分けることができない。ＶａｃＡ誘導電流は、ピペット溶液中の１０ｍＭのＢＡＰＴＡの含有物によって影響を受けない（データ示さず）。ＮＰＰＢ（１００μＭ）の細胞外添加は、ＶａｃＡによって仲介される電流を強く阻害する（図３（ｃ）参照、図３（ｄ）中□で示す）。
【００５２】
このように、ＶａｃＡをグリア細胞に投与すると、乳酸アシドーシス下においてもチャネルを形成し、そのチャネルを流れる電流がパッチクランプ法（全細胞法）によって確認された。また、図３（ｃ）、（ｄ）に示されるように、この電流は、Ｃｌ−チャネルブロッカとして知られるＮＰＰＢによって抑制されることからも、アニオンチャネルによるものであることがわかる。
【００５３】
続いて、Ｃ６グリア細胞において、全細胞法によって観察されたＶａｃＡによる誘導電流がアニオン選択性を示す（即ち、アニオン透過性チャネルであることを示す）ことを確認した実験の結果を以下に示す。図４（ａ）は、ランプ波を加えることによって測定された電流−電圧相関を示すグラフであり、細胞外Ｃｌ−濃度が異なる場合（５ｍＭ、３０ｍＭ、１１０ｍＭの各場合）のそれぞれの結果を示す。図４（ｂ）は、逆転電位と、細胞外Ｃｌ−濃度の対数との相関を示すグラフである。図４（ｃ）は、Ｃｌ−をＩ−、Ｂｒ−、methansulfonate−にそれぞれ置換した場合に、電流−電圧曲線に与える影響を示すグラフである。図４（ｄ）は、カチオン及びアニオンを置換した場合に、電流−電圧曲線に与える影響を示すグラフである。
【００５４】
アスパラギン酸との置換による［Ｃｌ−］０の減少は、ＶａｃＡによって仲介される電流の逆転電位の右側へのシフトを誘導する（図４（ａ）、（ｂ）参照）。このことは、ＶａｃＡによって仲介される電流がアニオン電流であることを示している。細胞外Ｃｌ−の他のアニオン種（Ｉ−、Ｂｒ−、methansulfonate−）との置換における逆転電位のシフトも観察される（図４（ｃ）参照）。これらの結果は、以下の表１にまとめられるように、ＰＩ＞ＰＢｒ＞ＰＣｌ＞Ｐmethansulfonate＞Ｐaspartateというアニオン透過性の順番を示す。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
また、７０ｍＭ細胞外Ｎａ＋の等モル濃度のＮＭＤＧとの置換において、逆転電位におけるわずかなシフトのみが観察されるように、ＶａｃＡによって仲介されるチャネルは、ごくわずかなカチオン透過性（ＰＮａ／ＰＣｌ＝０．１８±０．０６）を有することが分かった（図４（ｄ）参照）。
【００５７】
以上のように、本実験では、図３及び図４に示すように、ヘリコバクターピロリ菌のＶａｃＡタンパク質の投与によって、Ｃ６グリア細胞の細胞膜のアニオンコンダクタンスが増加されることが見出された。また、このＶａｃＡによる表１に示すようなチャネル透過性は、平面的な脂質二重層膜においてＶａｃＡによって誘導されるチャネルにおけるチャネル透過性と類似している。さらに、本実験では、ＶａｃＡによるアニオン電流は、乳酸アシドーシスに関係なく誘導され（図３参照）、細胞内Ｃａ２＋には依存しないということが確認された。この結果から、ＶａｃＡによって誘導されるチャネルは、細胞質Ｃａ２＋の依存性の欠如に関して、多くの細胞種において見られるＣａ２＋活性化Ｃｌ−チャネルとも別のものであることが示唆される。
【００５８】
これらの事実をまとめると、ＶａｃＡはＣ６グリア細胞の形質膜における外向き整流性・容積感受性アニオンチャネルとは異なり、乳酸アシドーシス下でも機能的に活性を持つアニオンチャネルを形成することができるということが言える。
【００５９】
［乳酸アシドーシスによる細胞膨張のＶａｃＡ事前投与による回復］
次に、Ｃ６グリア細胞における乳酸アシドーシスによる細胞膨張に対して、ＶａｃＡあるいはグラミシジン（カチオンイオノフォアを示す）を投与した場合の細胞容積変化を調べた実験結果について、図５のグラフを用いて以下に説明する。図５には、ＶａｃＡあるいはグラミシジンを投与した場合の、時間（分）の経過における相対細胞容積の変化を示す。なお、細胞容積の基本レベルは、正常状態（乳酸アシドーシスが起きていない状態）においてＶａｃＡを投与した場合のものとし、図５中では◇で示す
乳酸アシドーシスによる細胞膨張は、乳酸アシドーシス下でＶａｃＡなどの投与なしのもの（図５中■で示す）と比較して、ＶａｃＡが投与されたＣ６グリア細胞（図５中▼で示す）において顕著に減少する。ＶａｃＡが投与された細胞は、乳酸アシドーシスに反応して一時的にのみ膨張し、約１５分後に基本レベルの約１．０５±０．０２倍のピークに達した。しがしながら、その後、乳酸アシドーシスが維持されたにもかかわらず、細胞容積は徐々に減少し、４５から６０分以内で基本レベルにほぼ近いレベル（６０分後には約０．９９±０．０２倍）にまで達した。ＶａｃＡを投与した細胞では、乳酸アシドーシスに誘導される一時的な細胞膨張の後の容積調節が、１００μＭのＮＰＰＢによって阻害される（図５中、▲参照）。対照的に、Ｃ６グリア細胞が０．５μＭのグラミシジンで前処理された場合、乳酸アシドーシスによる持続的な細胞膨張が抑制されなかった（図５中、●参照）。
【００６０】
これらの結果から、乳酸アシドーシスによる持続的な細胞膨張は、アニオンチャネルを形成するＶａｃＡの事前投与によって抑制され、細胞は元の容積に回復するが、カチオンチャネルを形成するグラミシジンの投与によっては抑制されず、細胞は膨張し続けることが確認された。また、容積感受性Ｃｌ−チャネルの機能を抑制するチャネルブロッカであるＮＰＰＢを投与した場合には、ＶａｃＡの投与によって形成されたアニオンチャネルの働きが抑制され、細胞容積の減少は起こらないことも確認された。
【００６１】
以上のように、本実験では、ＶａｃＡによって誘導されるアニオン透過性の発現が、持続的な乳酸アシドーシス下でＣ６グリア細胞に容積調節の能力を与えるということを実証した（図５参照）。この結果は、乳酸アシドーシスによって誘導される外向き整流性・容積感受性アニオンチャネルの損傷は、乳酸アシドーシス下でのＲＶＤの機能障害の原因となるということを示すものである。
【００６２】
[グリシンレセプタチャネル変異体ペプチドの投与によるＲＶＤの誘導]
次に、もう一つのアニオンチャネル形成ペプチドであるグリシンレセプタチャネル変異体ペプチドを、乳酸アシドーシス下のＣ６グリア細胞に投与した場合の細胞容積変化を調べた結果について、図６を用いて説明する。
【００６３】
図６のグラフでは、コントロール状態（ｐＨ７．４の正常状態）の細胞容積変化を○で示し、ｐＨ７．４（正常状態）においてグリシンレセプタチャネル変異体ペプチドを投与した場合の細胞容積変化を●で示し、乳酸アシドーシス下においてグリシンレセプタチャネル変異体ペプチドを投与した場合の細胞容積変化を▲で示している。図６に示すように、グリシンレセプタチャネル変異体ペプチドをＣ６グリア細胞に投与することによって、乳酸アシドーシス下において、細胞の持続的な膨張は抑制され、むしろ細胞容積が減少することが明らかとなった。
【００６４】
［細胞膨張下でのＲＶＤの誘導による細胞死の減少］
続いて、乳酸アシドーシス下にある細胞に、アニオンチャネル形成ペプチドの一つであるＶａｃＡを投与することによって、実際に細胞死が抑制されるか否かについて確認を行った。本実施例では、以下の２つの方法によって細胞死の測定を行った。
【００６５】
（ａ）細胞膜不透過性蛍光色素ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による核染色性を指標とした細胞死の測定
まず、乳酸アシドーシス１時間後までのＣ６グリア細胞ネクローシス性細胞死へのＶａｃＡ投与効果を、細胞膜不透過性蛍光色素ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による核染色性を指標に調べた。その結果を、図７を用いて説明する。
【００６６】
図７は、Ｃ６グリア細胞における乳酸アシドーシス下で、ＶａｃＡの投与の有無による細胞のコントロール細胞（ｐＨ７．４の正常状態に置かれたもの）に対する生存率（％）（ＰＩ核染色性を示すネクローシス性死細胞の割合）をフローサイトメトリにより検討した結果を示すグラフである。図７においては、乳酸アシドーシス下の細胞（ＶａｃＡ投与なし）の生存率を▲で示し、アシドーシス下の細胞の生存率を▼で示し、正常状態の細胞にＶａｃＡを投与した場合の細胞の生存率（コントロール）を◇で示し、乳酸アシドーシス下の細胞にＶａｃＡを投与した場合の細胞の生存率を△で示している。図７に示すように、乳酸アシドーシス下においては、ＶａｃＡを投与しない場合（▲）に比べて、ＶａｃＡを投与した場合（△）に、細胞の生存率が改善することが示された。つまり、乳酸アシドーシス下でも、ＶａｃＡを事前投与（５０分）しておくと（△の場合）、生存率が改善される傾向が見られることが確認された。
【００６７】
また、例数を増やして同様の実験を行った結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
2004189730.tif 000003
【００６９】
表２に示すように、ＶａｃＡを投与しない場合、乳酸アシドーシス１時間後の生存率は９３％であるのに対し、ＶａｃＡ投与下では９６％と有意に改善した。そして、この９６％という生存率は、乳酸添加なしのアシドーシス条件での生存率９５％と有意差を示さなくなった。
【００７０】
以上の結果から、乳酸アシドーシス下にある細胞は、ＶａｃＡなどのアニオンチャネル形成ペプチドの投与によってＲＶＤが誘導され、持続的な細胞膨張を抑制することができることが確認された。さらにその結果、細胞死を抑制し、細胞の生存率を向上させることができるということが確認された。この結果は、上記アニオンチャネル形成ペプチドを用いた本発明の細胞死の抑制方法、及び、上記アニオンチャネル形成ペプチドが含まれる本発明の細胞死抑制剤の有効性を実証するものであると言える。
【００７１】
（ｂ）ミトコンドリア脱水素酵素活性を指標にした細胞死の測定
次に、外来性アニオンチャネルＶａｃＡの事前導入による乳酸アシドーシス（１時間処理）による細胞死に対する抑制効果が、ミトコンドリア脱水素酵素活性を指標にして細胞死を測定しても再現されるかどうかを調べた。その結果を図８に示す。
【００７２】
図８は、Ｃ６グリア細胞を乳酸アシドーシス条件で１時間処理した後の細胞の生存率を示すグラフである。このグラフにおいて、Ａ：コントロール（ｐＨ７．４）、Ｂ：乳酸アシドーシス条件下（ｐＨ６．２）、Ｃ：乳酸アシドーシス条件下（溶剤添加、ｐＨ６．２）、Ｄ：ＶａｃＡ（０．８μｇ／ｍｌ）を投与した場合の乳酸アシドーシス条件下（ｐＨ６．２）、Ｅ：ＶａｃＡ（２．５μｇ／ｍｌ）を投与した場合の乳酸アシドーシス条件下（ｐＨ６．２）、Ｆ：ＶａｃＡ（７．５μｇ／ｍｌ）を投与した場合の乳酸アシドーシス条件下（ｐＨ６．２）、である。
【００７３】
図８に示すように、ＭＴＴアッセイ法によって測定したＣ６細胞の脱水素酵素活性（すなわち、細胞の生存率）は、乳酸アシドーシス１時間処理後には約７０％まで低下したが（図８Ｂ、Ｃ参照）、ＶａｃＡの事前投与により酵素活性（生存率）の低下は、約８０％にとどまり（図８Ｅ、Ｆ参照）、有意に細胞死の抑制効果を示すことが示された。
【００７４】
また、乳酸アシドーシス条件下でさらに時間を置いたときのグリア細胞死に対してもＶａｃＡが抑制効果を示すかどうかを調べた。その結果を図９に示す。
【００７５】
図９は、Ｃ６グリア細胞を乳酸アシドーシス条件で２時間処理した後の細胞の生存率を示すグラフである。このグラフにおいて、Ａ：コントロール（ｐＨ７．４）、Ｂ：乳酸アシドーシス条件下（ｐＨ６．２）、Ｃ：乳酸アシドーシス条件下（溶剤添加、ｐＨ６．２）、Ｄ：ＶａｃＡ（０．８μｇ／ｍｌ）を投与した場合の乳酸アシドーシス条件下（ｐＨ６．２）、Ｅ：ＶａｃＡ（２．５μｇ／ｍｌ）を投与した場合の乳酸アシドーシス条件下（ｐＨ６．２）、Ｆ：ＶａｃＡ（７．５μｇ／ｍｌ）を投与した場合の乳酸アシドーシス条件下（ｐＨ６．２）、である。
【００７６】
図９に示すように乳酸アシドーシス２時間処理でも同様に、Ｃ６細胞の脱水素酵素活性は約７５％まで低下したが（図９Ｂ、Ｃ参照）、ＶａｃＡを事前投与することにより酵素活性の低下は約９５％にとどまり（図９Ｅ、Ｆ参照）、有意にグリア細胞死の抑制効果を示すことが示された。
【００７７】
なお、ＶａｃＡ効果に濃度依存性が認められるかどうかを検討するために、異なる３種の濃度のＶａｃＡで事前処理を行い、その効果を調べた。その結果、図８のＤ〜Ｆ、および、図９のＤ〜Ｆに示すように、乳酸アシドーシス１時間処理、２時間処理いずれにおいてもＶａｃＡは濃度依存的にその抑制効果を示した。つまり、ＶａｃＡの濃度が高い方が細胞死抑制効果が高いことが示された。具体的には、ＶａｃＡの濃度は、２．５μｇ／ｍｌ以上が好ましい。
【００７８】
これらの結果は、ＶａｃＡによるアニオンチャネルの導入によって、乳酸アシドーシス下での細胞膨張からのＲＶＤ達成が可能となり、これによってグリア細胞の乳酸アシドーシス下でのネクローシス死も救済されることを示している。
【００７９】
（３）結論
乳酸アシドーシス下では、グリア細胞の膨張は、ＭＣＴ（モノカルボン酸輸送体）を介してプロトン及び乳酸が取り込まれることによって誘発され、容積調節を行うことなく膨張し続けると考えられる。この容積調節の欠損は、容積感受性Ｃｌ−チャネル活性の損傷が原因となって起こる。乳酸アシドーシスによって誘導される膨張の後に起こる容積調節は、カチオン透過体であるグラミシジンによって形成されるカチオンチャネルではなく、アニオン透過体であるＶａｃＡによって形成される外因性アニオンチャネルの誘導によって可能となる。
【００８０】
脳虚血によって起こる乳酸アシドーシスは、細胞障害性の脳浮腫の主要な要因である。グリア細胞は、細胞障害性の脳浮腫に最も関連の深い細胞である。それゆえ、乳酸アシドーシスによって誘導されるグリア細胞膨張を抑制し、細胞容積を減少させること（即ち、ＲＶＤを発生させること）は、脳虚血による脳浮腫の予防法および治療法の開発のために非常に有効であると言える。
【００８１】
本実験では、容積感受性アニオンチャネル阻害が、グリア細胞における乳酸アシドーシスに誘導される持続的な容積膨張に寄与すること、及び、グリア細胞へのＶａｃＡ投与によるアニオンコンダクタンスの誘導が、乳酸アシドーシスによって誘導される一時的な細胞膨張の後に容積調節の能力を回復させることを実証した。
【００８２】
以上のように、乳酸アシドーシス下に置かれたグリア細胞にアニオンイオノフォアであるＶａｃＡタンパク質あるいはグリシンレセプタチャネル変異体ペプチドを投与することによって、その細胞死を抑制できることが明らかになった。この細胞死抑制メカニズムは、持続的細胞膨張から細胞容積を回復することによって達成されたものと考えられる。このメカニズムは、全く新しい発見であり、これまでに開発されてきたあらゆる虚血性疾患の治療薬及び治療方法とも異なるものである。また、乳酸アシドーシス下には、グリア細胞のみならず、神経細胞も同様のメカニズムで持続的細胞膨張が起こっていることが明らかになっており、神経変性疾患の原因となる神経細胞死の抑制にも、本発明の細胞死の抑制方法を適用できる可能性が高いと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によれば、虚血後の乳酸アシドーシス下において見られる細胞膨張およびそれに続く細胞死（特に、ネクローシス性細胞死）を抑制することができる。そのため、細胞死に起因する種々の疾患の予防及び治療に有効に利用することができる。本発明の細胞死の抑制方法および細胞死抑制剤は、従来の虚血性障害を抑制させる薬剤とは全く異なる新しいメカニズムによって細胞死を抑制するものであるため、利用価値が高いと言える。
【００８４】
本発明の治療薬剤は、脳のみならず心臓などにおいても、種々の疾患に伴う虚血性細胞死及び臓器障害を抑制する薬剤として用いられ、生命の予後の改善や虚血性諸疾患の改善に大きく寄与するものと考えられるため、医療分野において高い利用可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】Ｃ６グリア細胞に対して、乳酸アシドーシス、アシドーシス、及び、乳酸を投与した場合に細胞容積に与える影響を調べた結果を示すグラフである。
【図２】Ｃ６グリア細胞において、乳酸アシドーシス、アシドーシスを生じさせた場合、及び、乳酸を投与した場合の、ＲＶＤに対する影響を調べた結果を示すグラフである。
【図３】ＶａｃＡを投与してプレインキュベートされたＣ６グリア細胞において、全細胞電流記録法によって記録された電流を示すものである。（ａ）から（ｃ）は、−８０〜＋８０ｍＶのステップパルスを加えた場合の、電流の反応を記録した結果を示すグラフである。なお、（ａ）は、ｐＨ７．４（コントロール条件）で、ＶａｃＡを投与した場合、（ｂ）は、乳酸アシドーシス下でＶａｃＡを投与した場合、（ｃ）は、ｐＨ７．４でＶａｃＡ及びＮＰＰＢを投与した場合である。（ｄ）は、コントロール（○）、乳酸アシドーシス（●）、ＮＰＰＢを含む場合（□）、それぞれにおける瞬間電流の電流−電圧相関を示すグラフである。
【図４】Ｃ６グリア細胞において、全細胞電流記録法によって観察されたＶａｃＡ誘導電流のアニオン選択性を示すものである。（ａ）は、ランプ波を加えることによって測定された電流−電圧相関を示すグラフであり、細胞外Ｃｌ−濃度が異なる場合のそれぞれの結果を示す。（ｂ）は、逆転電位と、細胞外Ｃｌ−濃度の対数との相関を示すグラフである。（ｃ）は、アニオンを置換した場合に、電流−電圧曲線に与える影響を示すグラフである。（ｄ）は、カチオン及びアニオンを置換した場合に、電流−電圧曲線に与える影響を示すグラフである。
【図５】Ｃ６グリア細胞における乳酸アシドーシスによる細胞膨張に対して、ＶａｃＡあるいはグラミシジンを投与した場合の細胞容積変化を調べた結果を示すグラフである。
【図６】Ｃ６グリア細胞における乳酸アシドーシスによる細胞膨張に対して、グリシンレセプタチャネル変異体ペプチドを投与した場合の細胞容積変化を調べた結果を示すグラフである。なお、このグラフにおいては、相対細胞容積を％で示す。
【図７】Ｃ６グリア細胞における乳酸アシドーシス条件下で、ＶａｃＡの投与の有無による細胞の生存率を調べた結果を示すグラフである。
【図８】ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標として、乳酸アシドーシス条件（１時間処理）下のＣ６グリア細胞の生存率を調べた結果を示すグラフである。
【図９】ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標として、乳酸アシドーシス条件（２時間処理）下のＣ６グリア細胞の生存率を調べた結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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