(57)【要約】【課題】  ＰＤＥ１１Ａ活性を調節すること。【解決手段】  本発明は、機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および遺伝子修飾された動物細胞を提供する。本発明によって更に提供されるのは、精子形成を調節するＰＤＥ１１Ａを調節する物質のスクリーニング方法、精子形成を調節する哺乳動物を治療する方法、およびＰＤＥ１１Ａを発現する細胞においてｃＡＭＰおよびｃＧＭＰシグナル伝達を調節する方法である。【選択図】  図１
2004283180.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある物質をＰＤＥ１１Ａポリペプチドと接触させ、そしてＰＤＥ１１Ａ活性を測定することを含み、ここにおいて、該物質の不存在下における該活性と該物質の存在下における該活性との差が、該物質が精子形成を調節しうることを示す、精子形成を調節する物質を識別する方法。
【請求項２】
前記物質が、ＰＤＥ１１Ａ活性を阻害し、精子形成を減少させる場合に用いるために識別される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ある物質をＰＤＥ１１Ａポリペプチドを発現する細胞と接触させ、そしてＰＤＥ１１Ａ活性またはＰＤＥ１１Ａ発現を測定することを含み、ここにおいて、該物質の不存在下における該活性または発現と該物質の存在下における該活性または発現との差が、該物質が精子形成を調節しうることを示す、精子形成を調節する物質を識別する方法。
【請求項４】
ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質を含む、哺乳動物における精子形成を調節するための医薬組成物。
【請求項５】
前記物質がＰＤＥ１１Ａ活性を低下させ且つ精子形成を減少させる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記物質がＵＫ−３３６，０１７（ＩＣ−３５１）、ＵＫ−２２７，７８６（Ｅ４０２１）またはＵＫ−２３５，１８７である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質を含む、哺乳動物の精巣、前立腺、下垂体、膀胱尿路上皮および／または膀胱神経線維、ニューロン、骨格筋、心筋細胞、血管平滑筋、および／または血管内皮細胞においてｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達を調節するための医薬組成物。
【請求項８】
前記物質がＵＫ−３３６，０１７（ＩＣ−３５１）、ＵＫ−２２７，７８６（Ｅ４０２１）またはＵＫ−２３５，１８７である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質を含む、高血圧症、心不全、アテローム性動脈硬化症、過プロラクチン血症、成長ホルモン不全、失禁、または骨格筋代謝または収縮性に関連した障害を治療するための医薬組成物。
【請求項１０】
前記物質がＵＫ−３３６，０１７（ＩＣ−３５１）、ＵＫ−２２７，７８６（Ｅ４０２１）またはＵＫ−２３５，１８７である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
哺乳動物における調節された精子形成を示すバイオマーカーとしての、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックス（Chromobox）Ｍ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ（CryptdinＩ）、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン（Nidogen）、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上の使用。
【請求項１２】
哺乳動物の精巣、前立腺、下垂体、膀胱尿路上皮および／または膀胱神経線維、ニューロン、骨格筋、心筋細胞、血管平滑筋、および／または血管内皮細胞における調節されたｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達を示すバイオマーカーとしての、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上の使用。
【請求項１３】
コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上のモジュレーターを含む、哺乳動物における精子形成を調節するための医薬組成物。
【請求項１４】
コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上のモジュレーターを含む、哺乳動物の精巣、前立腺、下垂体、膀胱尿路上皮および／または膀胱神経線維、ニューロン、骨格筋、心筋細胞、血管平滑筋、および／または血管内皮細胞においてｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達を調節するための医薬組成物。
【請求項１５】
前記モジュレーターがコルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上の阻害物質またはアンタゴニストである、請求項１３または請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記阻害物質またはアンタゴニストがコルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上をコードする任意の一つまたは複数の遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイム、または該遺伝子の転写および／または翻訳をダウンレギュレートする化合物である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記モジュレーターがコルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上の刺激物質、活性化物質またはアゴニストである、請求項１３または請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記刺激物質または活性化物質がコルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上をコードする任意の一つまたは複数の遺伝子の転写および／または翻訳の刺激物質または活性化物質である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および遺伝子修飾された動物細胞に関する。本発明は、更に、ＰＤＥ１１Ａを調節する物質のスクリーニング方法、およびＰＤＥ１１Ａを発現する細胞でのｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達を調節する方法を特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、第二メッセンジャーｃＡＭＰ（サイクリックアデノシン３’５’−一リン酸）およびｃＧＭＰ（サイクリックグアノシン３’５’−一リン酸）のようなサイクリックヌクレオチドの加水分解を触媒する。したがって、ＰＤＥは、広範囲のシグナル伝達経路において中心的な調節の役割を果たしている（Beavo, Physiol.Rev. 75:725-48,1995）。例えば、ＰＤＥは、視覚（McLaughlin et al., Nat.Genet. 4:130-34,1993）、嗅覚（Yan et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9677-81,1995）、血小板凝集（Dickinson et al., Biochem.J. 323:371-77,1997）、アルドステロン合成（MacFarland et al., J.Biol.Chem. 266:136-42,1991）、インスリン分泌（Zhao et al., J.Clin.Invest. 102:869-73,1998）、Ｔ細胞活性化（Li et al., Science 283:848-51,1999）および平滑筋弛緩（Boolell et al., Int.J.Impot.Res. 8:47-52,1996; Ballard et al., J.Urol. 159:2164-71,1998）に関与する過程を媒介する。
【０００３】
ＰＤＥは、１１種類の主要なファミリーに細分される酵素のスーパーファミリーを形成している（Beavo, Physiol.Rev. 75:725-48,1995; Beavo et al., Mol.Pharmacol. 46:399-05,1994; Soderling et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8991-96,1998; Fisher et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 246:570-77,1998; Hayashi et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 250:751-56,1998; Soderling et al., J.Biol.Chem. 273:15553-58,1998; Fisher et al., J.Biol.Chem. 273:15559-64,1998; Soderling et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:7071-76,1999;および Fawcett et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3702-07,2000）。
【０００４】
それぞれのＰＤＥファミリーは、独特の酵素的特性および薬理学的プロフィールによって機能的に区別される。更に、それぞれのファミリーは、明瞭な組織、細胞および細胞下の発現パターンを示す（Beavo et al., Mol.Pharmacol. 46:399-405,1994; Soderling et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8991-96,1998; Fisher et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 246:570-77,1998; Hayashi et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 250:751-56,1998; Soderling et al., J.Biol.Chem. 273:15553-58,1998; Fisher et al., J.Biol.Chem. 273:15559-64,1998; Soderling et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:7071-76,1999; Fawcett et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3702-07,2000; Boolell et al., Int.J.Impot.Res. 8:47-52,1996; Ballard et al., J.Urol. 159:2164-71,1998; Houslay, Semin.Cell Dev.Biol. 9:161-67,1998; および Torphy et al., Pulm.Pharmacol.Ther. 12:131-35,1999）。したがって、ＰＤＥ酵素の一つのファミリーまたはサブファミリーの活性を選択的に調節する化合物を投与することにより、細胞または組織に特異的な方式でｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰシグナル伝達経路を調節することが可能である。
【０００５】
ＰＤＥ１１は、ＰＤＥの最も最近記載されたファミリーの一つであり、ＰＤＥ１１Ａは、これまでに識別されたこのファミリーの唯一のメンバーである（Fawcett et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3702-07,2000, 以下、“Fawcett, 2000”, Yuasa et al., J.Biol.Chem. 275:31469-79,2000, 以下、“Yuasa, 2000”）。ＰＤＥ１１Ａは、例えば、精巣、骨格筋、腎、肝、種々の腺組織（例えば、下垂体、唾液腺、副腎、乳腺および甲状腺）、膵臓、脊髄および気管において発現されることが知られているが（Fawcett, 2000）、ＰＤＥ１１Ａ機能についてはほとんど知られていない。本発明は、これらＰＤＥ１１Ａ機能に関連する疾患および状態を治療する場合に用いるための、ＰＤＥ１１Ａ機能を研究する生物学的手段、およびＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質を識別する方法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の一つの態様は、ＰＤＥ１１Ａノックアウトマウスの提供であり、これは、特に、精子形成に関与する遺伝子を研究するための、および野生型マウスと比較した場合に、精子形成に関与する成分を詳しく分析するすばらしい機会を与える。この種類の分析の一つの方法は、ミクロアレー技術（microarray technologiy）である。ＤＮＡミクロアレー技術を用いると、大規模な遺伝子発現を経時的に監視することが可能になる。多数の、例えば、Affymetrix（ＣＡ，ＵＳＡ）によって製造されたような特別に設計されたオリゴヌクレオチドプローブの予め組み立てられたアレーは、何千もの遺伝子のハイブリダイゼーションに基づく同時分析を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する遺伝子修飾された動物細胞および遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物、更には、ＰＤＥ１１Ａを発現する細胞および組織でのＰＤＥ１１Ａ機能を識別する検定、これらＰＤＥ１１Ａ機能を調節する物質を識別する方法、およびＰＤＥ１１Ａ機能を調節することによって哺乳動物の疾患または状態を治療するまたは予防する方法を特徴とする。例えば、ＰＤＥ１１Ａ活性のモジュレーターを哺乳動物に投与して、精子形成を調節する。
【０００８】
本発明の一つの側面は、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物であって、その修飾が、機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を生じる非ヒト哺乳動物を特徴とする。好ましくは、その哺乳動物は、その修飾についてヘテロ接合性である。より好ましくは、その哺乳動物は、その修飾についてホモ接合性である。他の好ましい態様において、その哺乳動物は齧歯類動物、より好ましくは、マウスである。
【０００９】
第二の側面において、本発明は、遺伝子修飾された動物細胞であって、その修飾が、機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含む動物細胞を提供する。好ましくは、その動物細胞は、その修飾についてヘテロ接合性である。より好ましくは、その細胞は、その修飾についてホモ接合性である。他の好ましい態様において、その細胞は胚性幹（ＥＳ）細胞である、および／または細胞はヒトまたはマウスである。
【００１０】
本発明の第三の側面は、精子形成を調節する物質を識別する方法であって、ある物質をＰＤＥ１１Ａポリペプチドと接触させ、そしてＰＤＥ１１Ａ活性を測定することを含み、ここにおいて、その物質の不存在下における活性とその物質の存在下における活性との差が、その物質が精子形成を調節しうることを示している方法を特徴とする。好ましくは、その方法は、精子形成を減少させる場合に用いるための、ＰＤＥ１１Ａ活性を阻害する物質を識別する。
【００１１】
関連する第四の側面において、本発明は、更に、精子形成を調節する物質を識別する方法であって、ある物質を、ＰＤＥ１１Ａポリペプチドを発現する細胞と接触させ、そしてＰＤＥ１１Ａ活性またはＰＤＥ１１Ａ発現を測定することを含み、ここにおいて、その物質の不存在下における活性または発現とその物質の存在下における活性または発現との差が、その物質が精子形成を調節しうることを示している方法を提供する。
【００１２】
第五の側面は、哺乳動物において精子形成を調節する方法であって、ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、投与される物質は、ＰＤＥ１１Ａ活性を低下させ且つ精子形成を減少させる。
【００１３】
第六の側面において特徴とされるのは、哺乳動物の精巣、前立腺、下垂体、膀胱尿路上皮および／または膀胱神経線維、ニューロン、骨格筋、心筋細胞、血管平滑筋、および／または血管内皮細胞においてｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達を調節する方法であって、ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質を投与することを含む方法である。好ましい態様において、ＰＤＥ１１Ａに選択的な物質は、ＵＫ−３３６，０１７（ＩＣ−３５１）、ＵＫ−２２７，７８６（Ｅ４０２１）またはＵＫ−２３５，１８７である。
【００１４】
本発明は、更に、第七の側面において、高血圧症、心不全、アテローム性動脈硬化症、過プロラクチン血症、成長ホルモン不全、失禁、または骨格筋代謝または収縮性に関連した障害を治療する方法であって、ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質を投与することを含む方法を特徴とする。好ましくは、その物質は、ＰＤＥ１１Ａに選択的である。より好ましくは、その物質は、ＵＫ−３３６，０１７（ＩＣ−３５１）、ＵＫ−２２７，７８６（Ｅ４０２１）またはＵＫ−２３５，１８７である。
【００１５】
第八の側面において、本発明は、哺乳動物における調節された精子形成を示すバイオマーカーを提供するが、これらバイオマーカーは、哺乳動物における精子形成を監視するのに、更には、減少した精子形成を特徴とする疾患または障害を監視するのに用いることができる。これらバイオマーカーは、精子形成の臨床的評価において有用であり、適当な治療的介入の選択の助けとするのに用いることができる。本発明のバイオマーカーは、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックス（Chromobox）Ｍ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ（CryptdinＩ）、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン（Nidogen）、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質から成る群より選択される。
【００１６】
関連の第九の側面において、本発明は、哺乳動物の精巣、前立腺、下垂体、膀胱尿路上皮および／または膀胱神経線維、ニューロン、骨格筋、心筋細胞、血管平滑筋、および／または血管内皮細胞における調節されたｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達を示すバイオマーカーを提供する。
【００１７】
本発明の第十の側面において、哺乳動物において精子形成を調節する方法であって、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上のモジュレーターを投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
関連の第十一の側面において、本発明は、哺乳動物の精巣、前立腺、下垂体、膀胱尿路上皮および／または膀胱神経線維、ニューロン、骨格筋、心筋細胞、血管平滑筋、および／または血管内皮細胞においてｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達を調節する方法であって、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上のモジュレーターを投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、本発明の第十および第十一の側面のモジュレーターは、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上の阻害物質またはアンタゴニストである。より好ましくは、その阻害物質またはアンタゴニストは、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上をコードする任意の一つまたは複数の遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイム、またはその遺伝子の転写および／または翻訳をダウンレギュレートする化合物である。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、男性避妊薬が望まれる場合（すなわち、精子形成を減少させるために）、その薬剤は、いずれか一つまたはそれ以上のコルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェンまたはＨＲ６Ａの阻害物質またはアンタゴニストを含むであろう。このような薬剤は、本質的には、いずれか一つまたはそれ以上のコルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェンまたはＨＲ６Ａの精巣中の存在を減少させる作用を有するであろう。
【００２１】
本発明のもう一つの好ましい態様において、男性用稔性薬（male pro-fertility agent）が望まれる場合（すなわち、精子形成を増加させるまたは正常化させるために）、その薬剤は、いずれか一つまたはそれ以上のプロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質の阻害物質またはアンタゴニストを含むであろう。このような薬剤は、本質的には、いずれか一つまたはそれ以上のプロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質の精巣中の存在を減少させる作用を有するであろう。
【００２２】
或いは、本発明の第十および十一の側面のモジュレーターは、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上の刺激物質、活性化物質またはアゴニストである。好ましくは、その刺激物質または活性化物質は、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上をコードする任意の一つまたは複数の遺伝子の転写および／または翻訳の刺激物質または活性化物質である。
【００２３】
本発明の好ましい態様において、男性避妊薬が望まれる場合（すなわち、精子形成を減少させるために）、その薬剤は、いずれか一つまたはそれ以上のプロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質の刺激物質、活性化物質またはアゴニストを含むであろう。このような薬剤は、本質的には、いずれか一つまたはそれ以上のプロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質の精巣中の存在を増加させる作用を有するであろう。
【００２４】
本発明のもう一つの好ましい態様において、男性用稔性薬が望まれる場合（すなわち、精子形成を増加させるまたは正常化させるために）、その薬剤は、いずれか一つまたはそれ以上のコルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェンまたはＨＲ６Ａの刺激物質、活性化物質またはアゴニストを含むであろう。このような薬剤は、本質的には、いずれか一つまたはそれ以上のコルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェンまたはＨＲ６Ａの精巣中の存在を増加させるまたは正常化させる作用を有するであろう。
【００２５】
本発明の第十二の側面により、哺乳動物での精子形成を調節するための薬剤の製造における、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上のモジュレーターの使用を提供する。
【００２６】
本発明の第十三の側面により、哺乳動物の精巣、前立腺、下垂体、膀胱尿路上皮および／または膀胱神経線維、ニューロン、骨格筋、心筋細胞、血管平滑筋、および／または血管内皮細胞でのｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達を調節するための薬剤の製造における、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上のモジュレーターの使用を提供する。
【００２７】
好ましくは、本発明の第十二および第十三の側面のモジュレーターは、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上の阻害物質またはアンタゴニストである。より好ましくは、その阻害物質またはアンタゴニストは、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上をコードする任意の一つまたは複数の遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイム、またはその遺伝子の転写および／または翻訳をダウンレギュレートする化合物である。
【００２８】
或いは、本発明の第十二および第十三の側面のモジュレーターは、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上の刺激物質、活性化物質またはアゴニストである。より好ましくは、その刺激物質または活性化物質は、コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上をコードする任意の一つまたは複数の遺伝子の転写および／または翻訳の刺激物質または活性化物質である。
【００２９】
コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上の阻害物質またはアンタゴニストが、標的の活性を低下させる化合物、標的に特異的な抗体、更には、生産される標的の量を減少させる作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムまたは転写阻害物質でありうるということは理解されるであろう。コルチコステロイド結合性グロブリン、セントリン３、ＸＲＣＣ１、クロモボックスＭ３３、ＧＡＢＡ−Ａ（γ３サブユニット）、プロホルモンコンベルターゼ５、ライディヒインスリン様ペプチド、カルパイン３、Ｙ−Ｂｏｘ３、クロモグラニンＢ、クリプトジンＩ、ＰＰ２Ｂ、グルタミン酸システインリガーゼ、ニドジェン、ＨＲ６Ａ、プロタミン１、ｓｐ３２、ｍＣＤＣ４６、アデニル酸キナーゼ２、ＡＫＡＰ１２１またはＫｒｏｘ−２４結合タンパク質のいずれか一つまたはそれ以上の刺激物質、活性化物質またはアゴニストが、標的自体の活性を増加させる化合物、更には、標的の発現を増加させる化合物を含みうるということも理解されるであろうが、標的の増加した活性を得るもう一つの方法は、標的それ自体をタンパク質としてかまたは、遺伝子治療として適当なベクター中のそのコーディング領域として供給することである。
【００３０】
本発明の第十四の側面により、精子形成の調節のための薬剤の製造における、ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質の使用を提供する。好ましくは、その物質はＰＤＥ１１Ａ活性を低下させ、その調節は精子形成の減少である。
【００３１】
本発明の第十五の側面により、哺乳動物の精巣、前立腺、下垂体、膀胱尿路上皮および／または膀胱神経線維、ニューロン、骨格筋、心筋細胞、血管平滑筋、および／または血管内皮細胞でのｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達の調節のための薬剤の製造における、ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質の使用を提供する。
【００３２】
本発明の第十六の側面により、高血圧症、心不全、アテローム性動脈硬化症、過プロラクチン血症、成長ホルモン不全、失禁、または骨格筋代謝または収縮性に関連した障害の治療のための薬剤の製造における、ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質の使用を提供する。
【００３３】
好ましくは、本発明の第十四、第十五および第十六の側面の物質は、ＵＫ−３３６，０１７（ＩＣ−３５１）、ＵＫ−２２７，７８６（Ｅ４０２１）またはＵＫ−２３５，１８７である。
【００３４】
本発明は、ＰＤＥ１１Ａ活性の調節が、特に、精子形成の減少をもたらすＰＤＥ１１Ａ活性の低下かまたは、特に、精子形成の増加または正常化をもたらすＰＤＥ１１Ａ活性の増加でありうるということを提供していることは理解されるであろう。精子形成を減少させる本発明の物質は、男性避妊薬として分類されうる。精子形成を増加させるまたは正常化させる本発明の物質は、男性用稔性薬として分類されうる。
【００３５】
当業者は、本明細書および請求の範囲において本発明を記載するのに用いられる用語を充分に理解するであろう。それにもかかわらず、本明細書中に特に断らない限り、次の用語は下記に記載の通りである。
【００３６】
“コーディング配列”または“コーディング領域”とは、配列が発現される場合に遺伝子産物を生じるのに必要な配列情報を有する核酸分子を意味する。
“アンチセンスオリゴヌクレオチド”とは、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよいしまたは修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい、典型的には、約１０〜５０ヌクレオチド長さの低分子核酸分子を意味し、それは、それぞれの転写物にハイブリッド形成し、それによって、例えば、それぞれの転写物の翻訳を阻止することによりまたは急速分解を促進することにより、タンパク質へのその翻訳を減少させるように設計されている。
【００３７】
“リボザイム”とは、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡでありうる核酸分子を意味し、これは、それぞれの転写物にハイブリッド形成して且つ切断するように設計されている。
【００３８】
本明細書中で用いられる“抗体”という用語には、組換えまたはタンパク質分解手段によって生じていようがいまいが、多クローン性および単クローン性抗体、単鎖のキメラおよびヒト化抗体、更には、抗体フラグメントが含まれる。その用語は、任意の抗体由来発現ライブラリー、例えば、単鎖ＦｖまたはＦａｂフラグメント発現ライブラリーの生産物を含むことも意味する。
【００３９】
“バイオマーカー／マーカー”とは、状態、障害、疾患、またはある過程、例えば、精子形成の進行または疾患の進行の状況を示す任意の分子、例えば、遺伝子の転写物または翻訳産物を意味する。
【００４０】
“遺伝子修飾”されている非ヒト哺乳動物または動物細胞は、遺伝子操作によって非ヒト哺乳動物または動物細胞中に、または先祖(progenitor)非ヒト哺乳動物または動物細胞中に導入される修飾についてヘテロ接合性またはホモ接合性である。修飾を導入するのに利用可能な遺伝子操作の標準法には、相同的組換え、ウイルスベクター遺伝子トラッピング、照射、化学的突然変異誘発、および単独または触媒リボザイムとの組合せでのアンチセンスＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列のトランスジェニック発現が含まれる。遺伝子修飾に好ましい方法は、“外来核酸配列”を遺伝子座に挿入することによって、例えば、相同的組換えまたはウイルスベクター遺伝子トラッピングによって内因性遺伝子を修飾するものである。“外来核酸配列”は、遺伝子中に天然に存在しない外因性配列である。外来ＤＮＡのこの挿入は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子のいずれの領域内でも、例えば、エンハンサー、プロモーター、調節領域、非コーディング領域、コーディング領域、イントロンまたはエクソン中に起こりうる。遺伝子操作の最も好ましい方法は、相同的組換えであり、この場合、外来核酸配列は、単独でかまたは内因性遺伝子配列の一部分の欠失との組合せで、ターゲット方式で挿入される。
【００４１】
“機能的に破壊”されているＰＤＥ１１Ａ遺伝子とは、破壊された遺伝子によってコードされるＰＤＥ１１Ａポリペプチドの細胞性活性が、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の野生型を通常なら発現する細胞中で低下するように遺伝子修飾されているＰＤＥ１１Ａ遺伝子を意味する。遺伝子修飾が、細胞中のＰＤＥ１１Ａ遺伝子の野生型コピーを全て除去する（例えば、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物または動物細胞が、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊にホモ接合性である、または最初に存在するＰＤＥ１１Ａ遺伝子の唯一の野生型コピーがここで破壊される）場合、その遺伝子修飾は、野生型ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を発現する適当な対照細胞と比較して、ＰＤＥ１１Ａポリペプチド活性の低下を引き起こす。ＰＤＥ１１Ａポリペプチド活性のこの低下は、減少したＰＤＥ１１Ａ遺伝子発現によって生じるか（すなわち、ＰＤＥ１１Ａ  ｍＲＮＡレベルは有効に低下し、低下したレベルのＰＤＥ１１Ａポリペプチドを生じる）、および／または破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子が、野生型ＰＤＥ１１Ａポリペプチドと比較して、低下した機能または安定性を有する突然変異ポリペプチドをコードしているために生じる。好ましくは、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物または動物細胞におけるＰＤＥ１１Ａポリペプチドの活性は、野生型レベルの５０％またはそれ未満まで、より好ましくは、２５％またはそれ未満まで、そしてなお一層好ましくは、野生型レベルの１０％またはそれ未満まで低下する。最も好ましくは、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊は、検出可能なＰＤＥ１１Ａ活性を生じない。
【００４２】
機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する“遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物”とは、例えば、所望の遺伝子修飾を有する胚盤胞または胚を生じさせた後、その胚盤胞または胚を、子宮内発生のために養母に着床させることによって最初に生じる非ヒト哺乳動物を意味する。遺伝子修飾された胚盤胞または胚は、マウスの場合、遺伝子修飾された胚性幹（ＥＳ）細胞をマウス胚盤胞中に植え込むことによってまたはＥＳ細胞を四倍体胚と一緒に集合させることによって作ることができる。或いは、いろいろな種の遺伝子修飾された胚は、核移植によって得ることができる。核移植の場合、ドナー細胞は、体細胞または多能性幹細胞であり、それを遺伝子操作して、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊する所望の遺伝子修飾を含有させる。次に、この細胞の核を、除核されている受精したまたは単為発生した卵母細胞中に移植し、胚を再構成させ、発生させて胚盤胞にする。次に、上の方法のどちらかによって生じる遺伝子修飾された胚盤胞を、当業者に周知の標準法にしたがって養母に着床させる。“遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物”には、上記の方法によって生じた哺乳動物の全子孫が含まれるが、但し、その子孫は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊する遺伝子修飾の少なくとも一つのコピーを受け継いでいるという条件付である。遺伝子修飾された哺乳動物の体細胞および生殖系細胞は全て、その修飾を含有するということが好ましい。破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有するように遺伝子修飾されている好ましい非ヒト動物には、マウスおよびラットのような齧歯類動物、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタおよび白イタチが含まれる。
【００４３】
機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する“遺伝子修飾された動物細胞”とは、機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有するように遺伝子修飾されることによって生じるヒト細胞を含めた動物細胞、更には、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を受け継いだ娘細胞を意味する。これら細胞は、当該技術分野において知られているいずれかの標準法によって培養物中で遺伝子修飾されていてよい。培養物中で細胞を遺伝子修飾することに代わるものとして、非ヒト哺乳動物細胞は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊を含有する遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物から単離してもよい。本発明の動物細胞は、初代の細胞または組織標本、更には、培養に適応した、腫瘍性の、または形質転換された細胞系から入手しうる。これら細胞および細胞系は、例えば、内皮細胞、上皮細胞、島細胞、ニューロンおよび他の神経組織由来細胞、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要な腺または器官の細胞（例えば、精巣、肝、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓および皮膚）、筋細胞（骨格筋、平滑筋および心筋からの細胞を含めた）、外分泌または内分泌細胞、線維芽細胞、および胚性および他の全能性または多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞、ＥＳ様細胞および胚性生殖系（ＥＧ）細胞、および先祖細胞および組織由来幹細胞のような他の幹細胞）に由来する。好ましい遺伝子修飾された細胞は、ＥＳ細胞、より好ましくは、マウスまたはラットのＥＳ細胞、そして最も好ましくは、ヒトＥＳ細胞である。
【００４４】
“ＥＳ細胞”または“ＥＳ様細胞”とは、無制限の自己再生、更には、３種類全部の胚性胚葉を代表する細胞種類への分化が可能である胚、始原生殖細胞または奇形癌に由来する多能性幹細胞を意味する。
【００４５】
“ＰＤＥ１１Ａ遺伝子”とは、Fawcett, 2000（ヒトＰＤＥ１１Ａ１，GenBank 受託番号ＡＪ２５１５０９）、ＷＯ００／４０７３３号（ヒトＰＤＥ１１Ａ１およびＰＤＥ１１Ａ２）または Yuasa, 2000（ヒトＰＤＥ１１Ａ３およびＰＤＥ１１Ａ４，GenBank 受託番号ＡＢ０３６７０４およびＡＢ０３８０４１）に開示されたポリペプチドをコードしている核酸配列、更には、任意のヒト対立遺伝子変異体、およびＰＤＥ１１Ａ活性を有する同族体をコードしている任意の哺乳動物配列およびそれらの対立遺伝子変異体を意味する。“ＰＤＥ１１ポリペプチド”とは、Fawcett, 2000 または Yuasa, 2000に開示されたホスホジエステラーゼ、更には、任意のヒト対立遺伝子変異体によってコードされる任意のポリペプチドおよびＰＤＥ１１Ａ活性を有する任意の哺乳動物同族体を意味する。本明細書中で用いられる“同族体”という用語は、異なった種における対照タンパク質（例えば、ヒトおよびマウスＰＤＥ１１ポリペプチド）に進化論的に関係し且つそれとの実質的な構造および機能類似性を共有するタンパク質を意味する。
【００４６】
“ＰＤＥ１１Ａポリペプチド活性”または“ＰＤＥ１１Ａポリペプチド様活性”または“ＰＤＥ１１Ａ活性”とは、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子によってコードされるポリペプチドによるｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの加水分解を意味する。細胞におけるこのような活性は、ＰＤＥ１１Ａ発現レベルで（例えば、細胞内に有効に存在するポリペプチドの量を変化させることによって）またはそれぞれのＰＤＥ１１Ａポリペプチド分子の特定の機能特性を変更することによって（例えば、突然変異ポリペプチドに関する加水分解のＫmを変化させることによって）調節することができる。
【００４７】
“調節する”とは、増加または（完全な除去を含めた）減少を意味する。
ＰＤＥ１１Ａ活性を調節するのに“選択的”である物質とは、主にＰＤＥ１１Ａに作用するが、同じ物質濃度で別のＰＤＥにほとんど作用しない物質を意味する。例えば、ある物質がＰＤＥ１１Ａを阻害するのに選択的である場合、ＰＤＥ１１Ａに関するその物質のＩＣ５０は、ＰＤＥ１〜１０の群からの１種類またはそれ以上のＰＤＥに関するＩＣ５０と比較して、濃度が少なくとも２０倍、より好ましくは、少なくとも３０倍、なお一層好ましくは、少なくとも５０倍、そしてなお一層好ましくは、少なくと１００倍低い。好ましくは、その物質は、ＰＤＥ７〜１０と比較して、なお一層好ましくは、ＰＤＥ１〜１０の全て、特に、ＰＤＥ３〜６と比較して、ＰＤＥ１１Ａに選択的である。
【００４８】
本発明の他の特徴および利点は、次の詳細な記述および請求の範囲から明らかであろう。本発明を具体的な態様に関して記載するが、実行しうる他の変更および修正も本発明の一部分であり、請求の範囲の範囲内でもあるということは理解されるであろう。本出願は、当該技術の範囲内の既知のまたは慣例の実施に収まる本発明の開示からの逸脱を含めた、概して、本発明の原理にしたがう、および過度の実験を伴うことなく確かめることができる本発明の同等物、変更、使用または適応の全てを包含することを意味する。核酸およびポリペプチドの製造および使用に関する追加の指標は、分子生物学、タンパク質科学および免疫学の標準的な教本で見出される（例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing,Inc., New York, NY, 1986; Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985; Molecular Cloning, Sambrook et al., Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., John Wiley and Sons; Current Protocols in Human Genetics, Eds. Dracopoli et al., John Wiley and Sons; Current Protocols in Protein Science, Eds. John E.Coligan et al., John Wiley and Sons; および Current Protocols in Immunology, Eds. John E.Coligan et al., John Wiley and Sons を参照されたい）。本明細書中に挙げられた公報は全て、本明細書中にそのまま援用される。
【００４９】
発明の詳細な記述
本発明は、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する遺伝子修飾された動物細胞および遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物、更には、通常はＰＤＥ１１Ａを発現する細胞および組織でのＰＤＥ１１Ａ機能を識別する検定を特徴とする。
【００５０】
ＰＤＥ１１Ａ破壊にホモ接合性（ＰＤＥ１１Ａ−／−）の遺伝子修飾されたマウスの研究に基づいて、本発明者は、ＰＤＥ１１Ａが、精子形成を刺激する場合にある役割を果たしていることを発見している。したがって、本発明は、ＰＤＥ１１Ａ活性を増加させるまたは低下させるそれぞれの物質を投与することにより、哺乳動物における精子形成に衝撃を与えるまたは影響を及ぼす、例えば、刺激するまたは阻害する方法も提供する。
【００５１】
１．遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞
本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および遺伝子修飾されたヒト細胞を含めた動物細胞は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊する修飾についてヘテロ接合性またはホモ接合性である。それら動物細胞は、培養物中の細胞を遺伝子操作することによって誘導することができるし、または非ヒト哺乳動物細胞の場合、それら細胞は、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物から単離することができる。
【００５２】
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座は、化学的突然変異誘発（Rinchik, Trends in Genetics 7:15-21,1991, Russell, Environmental & Molecular Mutagenesis 23 (Suppl. 24) 23-29,1994）、照射（Russell,上記）、単独かまたは触媒ＲＮＡリボザイム配列との組合せでのＰＤＥ１１Ａ遺伝子アンチセンスＲＮＡのトランスジェニック発現（Luyckx et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 96:12174-79,1999; Sokol et al., Transgenic Research 5:363-71,1996; Efrat et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2051-55,1994; Larsson et al., Nucleic Acids Research 22:2242-48,1994）、および下に更に論じられるような、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座中への外来核酸配列の挿入によるＰＤＥ１１Ａ遺伝子の破壊を含めた、当該技術分野において知られている遺伝子修飾のいくつかの技法の一つによって機能的に破壊される。好ましくは、外来配列は、相同的組換えによってまたはウイルスベクターの挿入によって挿入される。最も好ましくは、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊の方法は相同的組換えであり、内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子配列の一部分の欠失を含む。
【００５３】
外来配列の組込みは、次の機序、すなわち、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子転写または翻訳過程を妨げることによる（例えば、プロモーター認識を妨げることによる、または転写終結部位または翻訳停止コドンをＰＤＥ１１Ａ遺伝子中に導入することによる）；またはＰＤＥ１１Ａ遺伝子コーディング配列を、それがもはや、正常な機能を有するＰＤＥ１１Ａポリペプチドをコードしないように歪めることによる（例えば、外来コーディング配列を、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子コーディング配列中に挿入することによる、フレームシフト突然変異または１個若しくは複数のアミノ酸の置換を導入することによる、または二重交差の場合、機能的ＰＤＥ１１Ａタンパク質の発現に必要なＰＤＥ１１遺伝子コーディング配列の一部分を欠失することによる）の一つまたはそれ以上によってＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊する。
【００５４】
細胞のゲノム中のＰＤＥ１１Ａ遺伝子座中に外来配列を挿入するには、外来ＤＮＡ配列を、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、レトロウイルス感染、マイクロインジェクション、バイオリスティクス（biolistics）、リポソームトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションまたはトランスファーインフェクションのような当該技術分野において周知のいずれか適当な方法によって導入する（例えば、Neumann et al., EMBO J. 1:841-845,1982; Potter et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7161-65,1984; Chu et al., Nucleic Acids Res. 15:1311-26,1987; Thomas and Capecchi, Cell 51:503-12,1987; Baum et al., Biotechniques 17:1058-62,1994; Biewenga et al., J.Neuroscience Methods 71:67-75,1997; Zhang et al., Biotechniques 15:868-72,1993; Ray and Gage, Biotechniques 13:598-603,1992; Lo, Mol.Cell.Biol. 3:1803-14,1983; Nickoloff et al., Mol.Biotech. 10:93-101,1998; Linney et al., Dev.Biol.(Orlando) 213:207-16,1999; Zimmer and Gruss, Nature 338:150-153,1989;および Robertson et al., Nature 323:445-48,1986 を参照されたい）。外来ＤＮＡを細胞中に導入する好ましい方法はエレクトロポレーションである。
【００５５】
Ａ．相同的組換え
相同的組換えの方法は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する細胞中に、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子ターゲッティングベクターを導入することによって、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を破壊の標的とする。ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を破壊の標的とするそのベクターの能力は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子に相同であるベクター中のヌクレオチド配列を用いることに由来する。この相同領域は、そのベクターと、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の内因性配列との間のハイブリダイゼーションを容易にする。ハイブリダイゼーションにより、ターゲッティングベクターとゲノム配列との間の交差の可能性は大きく増加する。この交差は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座中へのベクター配列の組込みおよびＰＤＥ１１Ａ遺伝子の機能的破壊を引き起こす。
【００５６】
当業者が理解するように、ターゲッティングに用いられるベクターの構築に関する一般的な原理は、Bradley et al.（Biotechnol. 10:534,1992）に概説されている。二つの異なった代表的な種類のベクター、すなわち、挿入ベクターまたは置換ベクターが、相同的組換えによってＤＮＡを挿入するのに用いることができる。挿入ベクターは、二本鎖切断部分を持ったＰＤＥ１１Ａ遺伝子相同部分を含有する環状ＤＮＡである。相同領域と内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子とのハイブリダイゼーション後、二本鎖切断部分での一回の交差は、交差部位における内因性遺伝子中へのベクター配列全体の挿入をもたらす。
【００５７】
相同的組換えに用いるのにより好ましいベクターは、置換ベクターであり、これは、環状よりもむしろ同一直線上的である。ＰＤＥ１１Ａ遺伝子中への置換ベクター組込みは、二重交差、すなわち、ターゲッティングベクターとＰＤＥ１１Ａ遺伝子との間の二つのハイブリダイゼーション部位にわたる交差を必要とする。この二重交差は、二つの交差部位間に挟まれるベクター配列のＰＤＥ１１Ａ遺伝子中への組込み、および二つの交差部位間にわたる該当する元の内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子配列の欠失を引き起こす（例えば、Thomas and Capecchi et al., Cell 51:503-12,1987; Mansour et al., Nature 336:348-52,1988; Mansour et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:7688-7692,1990;および Manusour, GATA 7:219-227,1990を参照されたい）。
【００５８】
ターゲッティングベクター中の相同領域は、概して、少なくとも１００ヌクレオチド長さである。最も好ましくは、相同領域は少なくとも１〜５キロベース（Ｋｂ）長さである。相同領域に必要な最小限の長さまたは最小限の近親度は示されていない。しかしながら、当業者は、相同的組換えのターゲッティング効率が、概して、ターゲッティングベクターとＰＤＥ１１Ａ遺伝子座との間の長さおよび近親度に対応するということを理解するであろう。置換ベクターが用いられ、そして内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の一部分が相同的組換えの際に欠失する場合、更に考慮すべきは、内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の欠失部分の大きさである。内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子のこの部分が１Ｋｂ長さより大きい場合、組換え効率を増加させるのに、１Ｋｂより長い相同領域を含むターゲッティングカセットが推奨される。相同的組換えに有効な配列の選択および使用に関する更に別の指標は、参考文献に記載されている（例えば、Deng amd Capecchi, Mol.Cell.Biol. 12:3365-3371,1992; Bollag et al., Annu.Rev.Genet. 23:199-225,1989;および Waldman ana Liskay, Mol.Cell.Biol. 8:5350-5357,1988を参照されたい）。  広範囲のクローニングベクターを、本発明のＰＤＥ１１Ａ遺伝子ターゲッティングベクターの構築においてベクター主鎖として用いることができるが、これらには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ関連プラスミド（例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋１１）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ファージスクリプト、ｐｈｉＸ１７４、ｐＢＫ Phagemid、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ｚ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５  ＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ＰＢＰＶ、ＰＭＳＧ、およびｐＳＶＬ、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２２基剤ベクター、ｐＢＭ９、ｐＢＲ３２５、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、ｐＨＣ７９、ファージ Charon ２８、ｐＫＢ１１、ｐＫＳＶ−１０、ｐＫ１９関連プラスミド、ｐＵＣプラスミド、およびｐＧＥＭ系列のプラスミドが含まれる。これらベクターは、いろいろな市販元から入手可能である（例えば、Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, ＩＮ；Qiagen, Valencia, ＣＡ；Stratagene, La Jolla, ＣＡ；Promega, Madison, ＷＩ；および New England Biolabs, Beverly,ＭＡ）。しかしながら、任意の他のベクター、例えば、プラスミド、ウイルスまたはその一部分は、それらが所望の宿主中において複製可能であり且つ生存可能である限りにおいて、増殖に用いることができる。ベクターは、ゲノムが修飾される宿主においてそれを複製可能にさせる配列も含んでいてよい。このようなベクターの使用は、組換えが起こりうる際の相互作用の時間を拡大して、ターゲッティングの効率を増加させることができる（Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Unit 9.16, Fig.9.16.1を参照されたい）。
【００５９】
本発明のターゲッティングベクターを増殖させるのに用いられる具体的な宿主は、臨界的ではない。例としては、大腸菌（E.coli）Ｋ１２  ＲＲ１（Bolivar et al., Gene 2:95,1977）、E.coliＫ１２  ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ３３６９４号）、E.coliＭＭ２１（ＡＴＣＣ３３６７８０号）、E.coliＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９号）、E.coli菌株ＤＨ５αおよび E.coli ＳＴＢＬ２が含まれる。或いは、Ｃ．セレビシエ（cerevisiae）または枯草菌（B.subtilis）のような宿主を用いることができる。上述の宿主は、商業的に入手可能である（例えば、Stratagene, La Jolla, ＣＡ；および Life Technologies, Rockville,ＭＤ）。
【００６０】
ターゲッティングベクターを生じるために、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子ターゲッティング構築物を、上記ベクター主鎖に加える。本発明のＰＤＥ１１Ａ遺伝子ターゲッティング構築物は、少なくとも一つのＰＤＥ１１Ａ遺伝子相同領域を有する。ＰＤＥ１１Ａ遺伝子相同領域を作るには、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子関連配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを製造するためのベースとして用いる。これらプライマーを用いて、ハイフィデリティＰＣＲ増幅によってＰＤＥ１１Ａ配列の所望の領域を増幅させる（Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:4967,1991; Eckert and Kunkel 1:17,1991; および米国特許第４，６８３，２０２号）。ゲノム配列は、ゲノムクローンライブラリーからまたはゲノムＤＮＡ調製物から、好ましくは、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊の標的とされる動物種から得られる。ＰＤＥ１１Ａ遺伝子関連配列は、例えば、Fawcett, 2000（ヒトＰＤＥ１１Ａ１，GenBank 受託番号ＡＪ２５１５０９）、ＷＯ００／４０７３３号（ヒトＰＤＥ１１Ａ１およびＰＤＥ１１Ａ２）または Yuasa, 2000（ヒトＰＤＥ１１Ａ３およびＰＤＥ１１Ａ４，GenBank 受託番号ＡＢ０３６７０４およびＡＢ０３８０４１）に報告されている。
【００６１】
好ましくは、本発明のターゲッティング構築物には、正のマーカータンパク質をコードしている外因性ヌクレオチド配列も含まれる。ベクター組込み後の正のマーカーの安定な発現は、細胞生存状態を犠牲にすることなく、細胞に識別可能な特性を与える。したがって、置換ベクターの場合、マーカー遺伝子は、二重交差後にそれがＰＤＥ１１Ａ遺伝子中に組み込まれるように、二つの隣接する相同領域の間に位置する。
【００６２】
正のマーカータンパク質は、選択可能なタンパク質であるのが好適であり、このようなタンパク質の細胞中での安定な発現は、選択可能な表現型特性を与える、すなわち、その特性は、通常は致死的である条件下でも細胞の生存を促す。したがって、選択可能な条件を課すことにより、生存可能性に基づいてベクター配列をうまく組み込んでいない他の細胞からの正の選択可能マーカーを安定して発現する細胞を単離することができる。正の選択可能マーカータンパク質（およびそれらの選択物質）の例には、Ｎｅｏ（Ｇ４１８またはカナマイシン）、Ｈｙｇ（ハイグロマイシン）、ＨｉｓＤ（ヒスチジノール）、Ｇｐｔ（キサンチン）、Ｂｌｅ（ブレオマイシン）およびＨｐｒｔ（ヒポキサンチン）が含まれる（例えば、Capecchi and Thomas,米国特許第５，４６４，７６４号および Capecchi, Science 244:1288-92,1989 を参照されたい）。選択可能マーカーに代わるものとして用いることもできる他の正のマーカーには、β−ガラクトシダーゼ、ホタルのルシフェラーゼまたはグリーン蛍光タンパク質のようなリポータータンパク質が含まれる（例えば、Current Protocols in Cytometry, Unit 9.5, および Current Protocols in Molecular Biology, Unit 9.6, John Wiley & Sons, New York, NY, 2000を参照されたい）。
【００６３】
上記の正の選択スキームは、任意の染色体位置へのベクター配列のランダムな非相同的組込みがおこった細胞と、標的相同的組換えによってＰＤＥ１１Ａ遺伝子座にベクターを組み込んだ細胞とを区別しない。したがって、相同的組換えに置換ベクターを用いた場合、負の選択可能マーカータンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むことも好適である。負の選択可能マーカーの発現は、ある物質に暴露された場合、そのマーカーを発現する細胞に生存可能性を失わせる（すなわち、そのマーカータンパク質は、一定の選択条件下で細胞に致死的になる）。負の選択可能マーカー（およびそれらの致死物質）の例には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ガンシクロビアまたは１，２−デオキシ−２−フルオロ−α−ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨードウラシル）、Ｈｐｒｔ（６−チオグアニンまたは６−チオキサンチン）、およびジフテリア毒素、リシン毒素およびシトシンデアミナーゼ（５−フルオロシトシン）が含まれる。
【００６４】
負の選択可能マーカーをコードしているヌクレオチド配列は、置換ベクターの二つの相同領域の外側に位置する。この位置決定によると、細胞は、ランダムな非相同的組換えによって組込みが起こる場合、負の選択可能マーカーを単に組込み且つ安定して発現するであろうが、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子とターゲッティング構築物中の二つの相同領域との間の相同的組換えは、負の選択可能マーカーをコードしている配列を組込みから除外する。したがって、負の条件を課すことにより、ランダムな非相同的組換えによってターゲッティングベクターを組み込んだ細胞は、生存可能性を失う。
【００６５】
正および負の選択可能マーカーの組合せは、一連の正および負の選択段階が、相同的組換えによるベクター組込みが行われ、したがって、潜在的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を有する細胞だけを一層効率よく選択するように設計されうるので、本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞を製造するのに好ましい選択スキームである。正負選択スキーム、選択可能マーカーおよびターゲッティング構築物の更に別の例は、例えば、米国特許第５，４６４，７６４号、ＷＯ９４／０６９０８号、および Valancius and Smithies, Mol.Cell.Biol. 11:1402,1991に記載されている。
【００６６】
マーカータンパク質がベクター組込み時に安定して発現されるためには、ターゲッティングベクターを、マーカーコーディング配列がベクター組込み時に内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子プロモーターに機能的に結合するように設計することができる。次に、マーカーの発現を、通常はＰＤＥ１１Ａ遺伝子を発現する細胞中においてＰＤＥ１１Ａ遺伝子プロモーターによって作動させる。或いは、ベクターのターゲッティング構築物中のそれぞれのマーカーは、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子プロモーターとは無関係の発現を作動するそれ自体のプロモーターを含有してよい。この後者のスキームは、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を典型的に発現しない細胞中でマーカーを発現させる利点を有する（Smith and Berg, Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 49:171,1984; Sedivy and Sharp, Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 86:227:1989; Thomas and Capecchi, Cell 51:503,1987）。
【００６７】
マーカー遺伝子発現を作動させるのに用いることができる外因性プロモーターには、細胞特異的または時期特異的プロモーター、構成性プロモーター、および誘導性または調節性プロモーターが含まれる。これらプロモーターの非制限例には、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＭＣ−１ｎｅｏ、メタロチオネインプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、トリβグロビンプロモーター、ヒストンプロモーター（例えば、マウスヒストンＨ３−６１４）、βアクチンプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ、筋アクチンプロモーター、およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターが含まれる（概して、Sambrook et al., Molecular Cloning, Vols.I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989,および Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 2000; Stratagene, La Jolla, CAを参照されたい）。
【００６８】
細胞が、標的ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座にベクター配列を組み込んだかどうか確認するために、所望のベクター組込みに特異的であるプライマーまたはゲノムプローブを、ＰＣＲまたはサザンブロット分析と組み合わせて用いて、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座中の所望のベクター組込みの存在を確認することができる（Erlich et al., Science 252:1643-51,1991, Zimmer and Gruss, Nature 338:150,1989; Mouellic et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 87:4712,1990; および Shesely et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 88:4294,1991）。
【００６９】
Ｂ．遺伝子トラッピング
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊するために、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座中に外来核酸配列を挿入するのに利用可能なもう一つの方法は、遺伝子トラッピングである。この方法は、エクソンをｍＲＮＡ中にスプライシングして、遺伝子トラップベクターコーディング配列をランダム形式で遺伝子中に挿入する、全ての哺乳動物細胞中に存在する細胞機構を利用する。いったん挿入されると、遺伝子トラップベクターは、トラッピングされたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊しうる突然変異を生じる。相同的組換えとは対照的に、この突然変異誘発システムは、主としてランダム突然変異を生じる。したがって、機能的に破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する遺伝子修飾された細胞を得るためには、この特定の突然変異を含有する細胞を、いろいろな遺伝子中にランダム突然変異を含有する細胞のプールから識別し且つ選択する必要がある。
【００７０】
遺伝子トラッピング用のシステムおよびベクターは、ネズミ細胞および他の細胞種類を遺伝子修飾する場合に用いるために記載されている（例えば、Allen et al., Nature 333:852-55,1988; Bellen et al., Genes Dev. 3:1288-1300,1989; Bier et al., Genes Dev. 3:1273-1287,1989; Bonnerot et al., J.Virol. 66:4982-91,1992; Brenner et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:5517-21,1989; Chang et al., Virology 193:737-47,1993; Friedrich and Soriano, Methods Enzymol. 225:681-701, 1993; Friedrich and Soriano, Genes Dev. 5:1513-23,1991; Goff, Methods Enzymol. 152:469-81,1987; Gossler et al., Science 244:463-65,1989; Hope, Develop. 113:399-408,1991; Kerr et al., Cold Spring Harb Symp.Quant.Biol. 2:767-776,1989; Reddy et al., J.Virol. 65:1507-1515,1991; Reddy et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89:6721-25,1992; Skarnes et al., Genes Dev. 6:903-918,1992; von Melchner and Ruley, J.Virol. 63:3227-3233,1989; および Yoshida et al., Transgen.Res. 4:277-87,1995を参照されたい）。
【００７１】
プロモータートラップ（５’トラップ）ベクターは、５’〜３’の順に、スプライス受容配列、次にエクソンを含有し、これは、典型的に、翻訳開始コドンおよび読み取り枠および／または内部リボソームエントリー部位を特徴とする。概して、これらプロモータートラップベクターは、プロモーターも機能的に結合したスプライス供与配列も含有しない。その結果、宿主細胞の細胞ゲノム中への組込み後、そのプロモータートラップベクター配列は、上流の遺伝子の正常なスプライシングを妨げ、末端エクソンとして作用する。ベクターコーディング配列の発現は、破壊された遺伝子のイントロン中へ適切な読み枠でベクターが組込まれるかに依存する。このような場合、細胞スプライシング機構は、ベクターコーディング配列の上流のトラッピングされた遺伝子からエクソンをスプライシングする（Zambrowicz et al.,ＷＯ９９／５０４２６号）。
【００７２】
上記のプロモータートラップベクターと同様の作用を生じる別の方法は、プロモータートラップベクターのスプライス受容体と、翻訳開始コドンまたはポリアデニル化配列との間の領域中に存在するまたは遺伝子操作される一組の重ね合わせ（a nested set）停止コドンを組込むベクターである。コーディング配列は、独立したリボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を含有するように遺伝子操作して、そのコーディング配列が、宿主細胞ゲノム中の組込み部位とはほとんど無関係の方式で発現されるようにすることもできる。必然的ではないが、典型的には、ＩＲＥＳは、一組の重ね合わせ停止コドンと一緒に用いる。
【００７３】
遺伝子トラッピングスキームのもう一つの種類は、３’遺伝子トラップベクターを利用する。この種類のベクターは、隣接するコーディング配列の発現を媒介するプロモーター領域、コーディング配列、およびコーディング配列エクソンの３’末端を規定するスプライス供与配列を、機能的組合せで含有する。宿主細胞ゲノム中への組込み後、ベクタープロモーターによって発現される転写物は、組み込まれた遺伝子トラップベクター配列の下流に位置するトラッピングされた遺伝子からスプライス受容配列へスプライシングされる。したがって、ベクターの組込みは、３’遺伝子トラップカセットのコーディング配列、および末端エクソンおよびそのポリアデニル化シグナルを含めたいずれか下流の細胞エクソンを含む融合転写物の発現を引き起こす。このようなベクターが遺伝子中に組み込まれた場合、細胞スプライシング機構は、トラッピングされた遺伝子の３’エクソンの上流のベクターコーディング配列をスプライシングする。このようなベクターの一つの利点は、３’遺伝子トラップベクターの発現が、遺伝子トラップカセット内のプロモーターによって作動され、通常は宿主細胞中で発現される遺伝子中への組込みを必要としないことである（Zambrowicz et al.,ＷＯ９９／５０４２６号）。３’遺伝子トラップベクター中に包含されてよい転写プロモーターおよびエンハンサーの例には、ターゲッティングベクターに関して上に論及されたものが含まれる。
【００７４】
プロモーターまたは３’遺伝子トラップベクターの構造的成分として用いられるウイルスベクター主鎖は、標的細胞のゲノム中に挿入されうる広範囲のベクターより選択されうる。適当な主鎖ベクターには、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、仮性狂犬病ウイルス、αヘルペスウイルスベクター等が含まれるが、これらに制限されるわけではない。ウイルスベクター、特に、非複製性細胞を修飾するのに適したウイルスベクターの充分な概説、およびこのようなベクターを外因性ポリヌクレオチド配列の発現と一緒に用いる方法は、Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications, Eds. Caplitt and Loewy, Academic Press, San Diego, 1995に見出されうる。
【００７５】
好ましくは、レトロウイルスベクターを、遺伝子トラッピングに用いる。これらベクターは、米国特許第５，４４９，６１４号に記載されたものなどのレトロウイルスパッケージング細胞系と一緒に用いることができる。非ネズミ哺乳動物細胞を遺伝子修飾の標的細胞として用いる場合、両種性または汎親和性パッケージング細胞系を用いて、適当なベクターをパッケージングすることができる（Ory et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 93:11400-11406,1996）。ここに記載されている３’遺伝子トラップベクターを生じるのに適応されうる典型的なレトロウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，５２１，０７６号に記載されている。
【００７６】
遺伝子トラッピングベクターは、相同的組換えに用いられるターゲッティングベクターに関して上に論及された正のマーカー遺伝子の一つまたはそれ以上を含有してよい。ターゲッティングベクター中でのそれらの使用と同様に、これら正のマーカーは、細胞ゲノム中にベクターを組み込んだ細胞を識別し且つ選択するために、遺伝子トラッピングベクター中で用いられる。そのマーカー遺伝子は、ＩＲＥＳを含有するように遺伝子操作して、標的細胞ゲノム中のベクターが組み込まれた位置とはほとんど無関係に、そのマーカーが発現されるようにすることができる。
【００７７】
遺伝子トラップベクターが、感染した宿主細胞のゲノム中にかなりランダムに組み込まれるとしても、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を有する遺伝子修飾された細胞は、ランダムなベクター組込みを受けた細胞集団から識別されなければならない。好ましくは、細胞集団における遺伝子修飾は、その集団が、細胞のゲノム中で見出されるほとんど全ての遺伝子での突然変異を示すように充分にランダムで且つ頻繁に起こり、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含む細胞を集団から識別することを可能にする（Zambrowicz et al.,ＷＯ９９／５０４２６号；Sands et al., ＷＯ９８／１４６１４号を参照されたい）。
【００７８】
破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する個々の突然変異細胞系は、突然変異細胞の集団において、例えば、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子配列中の突然変異を識別する逆転写およびＰＣＲを用いて識別される。この過程は、クローンをプールすることによって能率的にすることができる。例えば、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する個々のクローンを見つけるには、ＲＴ−ＰＣＲを、遺伝子トラップベクターに固定された一つのプライマーおよびＰＤＥ１１Ａ遺伝子配列に位置するもう一方のプライマーを用いて行う。正のＲＴ−ＰＣＲ結果は、ベクター配列が、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子転写物中にコードされていることを示し、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子は、遺伝子トラップ組込みによって破壊されていることが示される（例えば、Sands et al., ＷＯ９８／１４６１４号を参照されたい）。
【００７９】
Ｃ．時間的、空間的および誘導性のＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊
本発明のいくつかの態様において、内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の機能的破壊は、特定の発生段階または細胞周期段階で（時間的破壊）または特定の細胞種類で（空間的破壊）起こる。他の態様において、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊は、いくつかの条件が存在する場合に誘導可能である。Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステムのような組換え酵素切断システムは、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を、特定の発生段階で、特定の組織または細胞種類で、または特定の環境条件下で活性化するまたは失活させるのに用いることができる。概して、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ技術を利用する方法は、Torres and Kuhn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997 に記載のように行われる。Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステムについて記載されたのと同様の方法は、ＦＬＰ−ＦＲＴシステムを利用して行うこともできる。ＦＬＰ−ＦＲＴシステム、および相同的組換えまたはウイルス挿入によって条件付で遺伝子を破壊する組換え酵素切断システムの使用に関する追加の指標は、例えば、米国特許第５，６２６，１５９号、同第５，５２７，６９５号、同第５，４３４，０６６号、ＷＯ９８／２９５３３号、Orban et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6861-65,1992; O'Gorman et al., Science 251:1351-55,1991; Sauer et al., Nucleic Acids Research 17:147-61,1989; Barinaga, Science 265:26-28,1994; および Akagi et al., Nucleic Acids Res. 25:1766-73,1997 に与えられている。二つ以上の組換え酵素システムを用いて、非ヒト哺乳動物または動物細胞を遺伝子修飾することができる。
【００８０】
Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステムのような組換え酵素システムを用いて、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を時間的、空間的または誘導性様式で破壊する相同的組換えを用いた場合、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子コーディング領域の一部分は、ｌｏｘＰ部位に隣接するＰＤＥ１１Ａ遺伝子コーディング領域を含むターゲッティング構築物によって置き換えられる。この遺伝子修飾を有する非ヒト哺乳動物および動物細胞は、機能的ｌｏｘＰ隣接ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する。ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊の時間的、空間的または誘導性の側面は、所望の空間的に調節された、時間的に調節されたまたは誘導性のプロモーターそれぞれの制御下において非ヒト哺乳動物または動物細胞で発現される追加の導入遺伝子であるＣｒｅ組換え酵素導入遺伝子の発現パターンによる。Ｃｒｅ組換え酵素は、ｌｏｘＰ部位を組換えの標的とする。したがって、Ｃｒｅ発現が活性化された場合、ＬｏｘＰ部位は組換えを受けて、挟まれているＰＤＥ１１Ａ遺伝子コーディング配列を切断し、結果として、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の機能的破壊を引き起こす（Rajewski et al., J.Clin.Invest. 98:600-03,1996; St.-Onge et al., Nucleic Acids Res. 24:3875-77,1996; Agah et al., J.Clin.Invest. 100: 169-79,1997; Brocard et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:14559-63,1997; Feil et al., Proc Natl.Acad.Sci.USA 93:10887-90,1996; および Kuehn et al., Science 269:1427-29,1995）。
【００８１】
Ｃｒｅ組換え酵素導入遺伝子およびｌｏｘＰ隣接ＰＤＥ１１Ａ遺伝子両方を含有する細胞は、標準的なトランスジェニック技術によって、または遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物の場合、一方の親がｌｏｘＰ隣接ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有し且つもう一方がＣｒｅ組換え酵素導入遺伝子を、所望のプロモーターの制御下で含有する遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物を、交雑することによって生じることができる。ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を時間的、空間的または条件付で破壊するのに有用な組換え酵素システムおよび具体的なプロモーターに関する追加の指標は、例えば、Sauer, Meth.Enz. 225:890-900,1993, Gu et al., Science 265:103-06,1994, Araki et al., J.Biochem. 122:977-82,1997, Dymecki, Proc.Natl.Acad.Sci. 93:6191-96,1996,および Meyers et al., Nature Genetics 18:136-41,1998に見出される。
【００８２】
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の誘導性破壊は、テトラサイクリン応答性バイナリーシステム（Gossen and Bujard, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-51,1992）を用いることによって行うこともできる。このシステムでは、細胞を遺伝子修飾して、内因性ＰＤＥ１１Ａ遺伝子調節要素およびテトラサイクリン制御性リプレッサー（ＴｅｔＲ）発現性の導入遺伝子中にＴｅｔプロモーターを導入することを行う。このような細胞の場合、テトラサイクリンの投与は、ＴｅｔＲを活性化し、これが順次、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子発現を阻害し、したがって、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊する（St.-Onge et al., Nucleic Acids Res. 24:3875-77,1996,米国特許第５，９２２，９２７号）。
【００８３】
ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の時間的、空間的および誘導性破壊のための上記のシステムは、例えば、ＷＯ９８／２９５３３号に記載のように、遺伝子修飾の方法として遺伝子トラッピングを用いた場合に用いることもできる。
【００８４】
Ｄ．遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および動物細胞の発生
遺伝子修飾についての上記の方法を用いて、動物に由来する体細胞または幹細胞のほとんど全ての種類においてＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊することができる。本発明の遺伝子修飾された動物細胞には、ヒト細胞を含めた哺乳動物細胞および鳥類細胞が含まれるが、これらに制限されるわけではない。これら細胞は、培養に適応した、腫瘍発生性のまたは形質転換された細胞系のようないずれかの動物細胞系を遺伝子修飾することから誘導しうるし、またはそれらは、所望のＰＤＥ１１Ａ遺伝子修飾を有する遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物から単離しうる。
【００８５】
それら細胞は、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子についてヘテロ接合性であってよいしまたはホモ接合性であってよい。ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊についてホモ接合性である細胞（ＰＤＥ１１Ａ−／−）を得るには、両方の対立遺伝子の直接的逐次ターゲッティングを行うことができる。この方法は、正の選択可能マーカーを循環使用することによって容易にすることができる。このスキームによれば、正の選択可能マーカーをコードしているヌクレオチド配列は、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステムを用いた一つの対立遺伝子の破壊後に除去される。したがって、その同じベクターを、次の回のターゲッティングで用いて、次のＰＤＥ１１Ａ遺伝子対立遺伝子を破壊することができる（Abuin and Bradley, Mol.Cell.Biol. 16:1851-56,1996; Sedivy et al., T.I.G. 15:88-90,1999; Cruz et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 88:7170-74,1991; Mortensen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 88:7036-40,1991; te Riele et al., Nature (London) 348:649-651,1990）。
【００８６】
ＰＤＥ−／−であるＥＳ細胞を得るための別の戦術は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊についてヘテロ接合性である細胞（ＰＤＥ１１Ａ＋／−）の集団からの細胞の均一化（homogenotization）である。その方法では、選択可能な薬物耐性マーカーを発現するＰＤＥ１１Ａ＋／−標的クローンが、極めて高い薬物濃度に対して選択されるスキームを用いるが、この選択は、薬物耐性マーカーをコードしている配列の二つのコピーを発現し、したがって、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊についてホモ接合性である細胞に好都合である（Mortensen et al., Mol.Cell.Biol. 12:2391-95,1992）。更に、遺伝子修飾された動物細胞は、下で更に考察されるように、生殖系細胞においてＰＤＥ１１Ａ＋／−である非ヒト哺乳動物を交配することによって生じる遺伝子修飾されたＰＤＥ１１Ａ−／−非ヒト哺乳動物から得ることができる。
【００８７】
所望の細胞または細胞系の遺伝子修飾後、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子座は、標準的なＰＣＲによるＰＣＲ分析または当該技術分野において知られているサザンブロッティング法により、修飾部位として確認されうる（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；および Erlich et al., Science 252:1643,1991 を参照されたい）。ＰＤＥ１１Ａ遺伝子メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルおよび／またはＰＤＥ１１Ａポリペプチドレベルが、通常はＰＤＥ１１Ａ遺伝子を発現する細胞中で低下する場合、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の機能的破壊について更なる確認を行うことができる。ＰＤＥ１１Ａ遺伝子ｍＲＮＡレベルの測定値は、逆転写酵素に媒介されるポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット分析または in situハイブリダイゼーションを用いることによって得ることができる。細胞によって産生されるＰＤＥ１１Ａポリペプチドレベルの定量化は、例えば、当該技術分野において知られている標準的なイムノアッセイによって行うことができる。このようなイムノアッセイには、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、“サンドイッチ”型イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散検定、in situ イムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体の標識を用いる）、ウェスタンブロット、二次元ゲル分析、沈降反応、免疫蛍光検定、プロテインＡ検定および免疫電気泳動検定のような技法を用いた競合的および非競合的検定システムが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００８８】
好ましい遺伝子修飾された動物細胞は、ＥＳ細胞およびＥＳ様細胞である。これら細胞は、マウス（Evans et al., Nature 129:154-156,1981; Martin, Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 78:7634-7638,1981）、ブタおよびヒツジ（Notanianni et al., J.Reprod.Fert.Suppl., 43:255-260,1991; Campbell et al., Nature 380:64-68,1996）、およびヒトを含めた霊長類（Thomson et al., 米国特許第５，８４３，７８０号，Thomson et al., Science 282:1145-1147,1995; および Thomson et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844-7848,1995）のようないろいろな種の着床前の胚および胚盤胞に由来する。
【００８９】
これらの種類の細胞は、多能性である。すなわち、適当な条件下において、それらは、全部で３種類の胚性胚葉、すなわち、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する広範囲の細胞種類に分化する。培養条件により、ＥＳ細胞の試料は、幹細胞として無制限に培養されて、一つの試料内で広範囲の異なった細胞種類に分化させうるし、またはマクロファージ様細胞、神経細胞、心筋細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、角化細胞、および好酸球、マスト細胞、赤血球前駆細胞または巨核球などの造血細胞のような特定の細胞種類に分化するように誘導されうる。誘導される分化は、例えば、Keller et al., Curr.Opin.Cell Biol. 7:862-69,1995, Li et al., Curr.Biol. 8:971,1998, Klug et al., J.Clin.Invest. 98:216-24,1996, Lieschke et al., Exp.Hematol. 23:328-34,1995, Yamane et al., Blood 90:3516-23,1997,および Hirashima et al., Blood 93:1253-63,1999に更に記載されるように、培養条件に特定の成長因子または基質成分を含むことによって達せられる。
【００９０】
遺伝子修飾に用いられる具体的な胚性幹細胞系は、臨界的ではないが、代表的なネズミＥＳ細胞系には、ＡＢ−１（McMahon and Bradley, Cell 62:1073-85,1990）、Ｅ１４（Hooper et al., Nature 326:292-95,1987）、Ｄ３（Doetschman et al., J.Embryol.Exp.Morph. 87:27-45,1985）、ＣＣＥ（Robertson et al., Nature 323:445-48,1986）、ＲＷ４（Genome Systems, St.Louis, MO）およびＤＢＡ／１ｌａｃＪ（Roach et al., Exp.Cell Res. 221:520-25,1995）が含まれる。遺伝子修飾されたネズミＥＳ細胞は、公表された手順にしたがって、遺伝子修飾されたマウスを生じるのに用いることができる（Robertson, 1987, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Ed. E.J.Robertson, Oxford: IRL Press, pp.71-112,1987; Zjilstra et al., Nature 342:435-438,1989; および Schwartzberg et al., Science 246:799-803,1989）。
【００９１】
ＥＳ細胞が、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の所望の機能的破壊を含有することを確認後、これらＥＳ細胞を、当該技術分野において知られている方法にしたがって、キメラマウスの発生に適した胚盤胞宿主に注入する（Capecchi, Trends Genet. 5:70,1989）。本発明において用いられる具体的なマウス胚盤胞は、臨界的ではない。このような胚盤胞の例には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Ｃ５７ＢＬ／６アルビノマウス、スイス異系交配マウス、ＣＦＬＰマウスおよびＭＦＩマウスに由来するものが含まれる。或いは、ＥＳ細胞は、集合ウェル中の四倍体胚の間に挟まれていてよい（Nagy et al., Proc.natl.Acad.Sci.USA 90:8424-8428,1993）。
【００９２】
次に、遺伝子修飾されたＥＳ細胞を含有する胚盤胞または胚を、偽妊娠雌マウスに着床させ、子宮内で発生させる（Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;および Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J.Robertson,ed., IRL Press, Washington, D.C., 1987）。養母の産んだ子は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊についてキメラである子を識別するためにスクリーニングされうる。概して、このような子は、遺伝子修飾されたドナーＥＳ細胞に由来する若干の細胞、更には、元の胚盤胞からの他の細胞を含有する。このような状況において、ドナーＥＳ細胞に由来する細胞を胚盤胞の他の細胞と区別するのに毛色選択戦術を用いている場合、最初に、モザイク毛色について子をスクリーニングすることができる。或いは、子の尾組織からのＤＮＡを用いて、遺伝子修飾された細胞を含有するマウスを識別することができる。
【００９３】
生殖系細胞中にＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊を含有するキメラマウスの交配は、生殖系細胞および体細胞の全てにＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊を有する子孫を生じる。次に、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊についてヘテロ接合性であるマウスを交雑させて、ホモ接合体を生じることができる（例えば、米国特許第５，５５７，０３２号および米国特許第５，５３２，１５８号を参照されたい）。
【００９４】
遺伝子修飾を細胞から動物全体へと伝える上記のＥＳ細胞技術に代わるものは、核移植を用いることである。この方法は、マウス以外の他の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物、例えば、ヒツジ（McCreath et al., Nature 29:1066-69,2000; Campbell et al., Nature 389:64-66,1996;および Schnieke et al., Science 278:2130-33,1997）および子牛（Cibelli et al., Science 280:1256-58,1998）を作るのに用いることができる。簡単にいうと、体細胞（例えば、線維芽細胞）または多能性幹細胞（例えば、ＥＳ様細胞）を核ドナーとして選択し、そしてＰＤＥ１１Ａ遺伝子の機能的破壊を含有するように遺伝子修飾する。ＤＮＡベクターを体細胞中に挿入してＰＤＥ１１Ａ遺伝子を突然変異させる場合、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子中へのベクター組込みが、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子プロモーターの制御下でマーカーを発現させるように、プロモーター不含マーカーをベクター中で用いることが好適である（Sedivy and Dutriaux, T.I.G. 15:88-90,1999; McCreath et al., Nature 29:1066-69,2000）。次に、適当なＰＤＥ１１Ａ遺伝子破壊を有するドナー細胞からの核を、除核されている受精したまたは単為発生した卵母細胞中に移植する（Campbell et al., Nature 380:64,1996; Wilmut et al., Nature 385:810,1997）。胚を再構成させ、培養して発生させて桑実胚／胚盤胞期にし、出産予定期間の子宮内発育のために養母に移植する。
【００９５】
本発明は、遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および遺伝子修飾された動物細胞の子孫も包含する。その子孫は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を機能的に破壊する遺伝子修飾についてヘテロ接合性またはホモ接合性であるが、それらは、ここに記載の遺伝子修飾に加えて他の遺伝子座で後の世代に起こりうる突然変異または環境上の影響ゆえに、親の非ヒト哺乳動物および動物細胞と遺伝的に一致しないことがありうる。
【００９６】
Ｅ．“ヒト化”非ヒト哺乳動物および動物細胞
破壊された内因性ＰＤｅ１１Ａ遺伝子を含有する本発明の遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物および非ヒト動物細胞は、ヒトＰＤＥ１１Ａ配列（本明細書中において“ヒト化”と称される）を発現するように更に修飾することができる。ヒトＰＤＥ１１Ａ配列は、例えば、Fawcett, 2000、Phillips et al.,ＷＯ００／４０７３３号および GenBank受託番号ＡＪ２５１５０９に開示されている。
【００９７】
細胞をヒト化する好ましい方法では、相同的組換えによって内因性ＰＤＥ１１Ａの代わりにヒトＰＤＥ１１Ａ配列を置き換えることを行う。ターゲッティングベクターは、５’および３’相同アームおよび正／負選択スキームに関して、ノックアウトベクターとして伝統的に用いられているものと同様である。しかしながら、それらベクターは、組換えの際に、内因性配列の代わりにヒトＰＤＥ１１Ａコーディング配列を挿入する配列、または内因性配列が内因性野生型配列の代わりにヒトＰＤＥ１１Ａをコードするようにその配列を修飾する塩基対変化、コドン置換またはエクソン置換に影響を与える配列も含む。相同的組換えがいったん確認されたら、いずれか挿入された選択に基づく配列（例えば、ｎｅｏ）を、ＣｒｅまたはＦｌｐに媒介される部位特異的組換えを用いることによって切除することが可能である（Dymecki, Proc.Natl.Acad.Sci. 93:6191-96,1996）。
【００９８】
ヒトＰＤＥ配列は、内因性翻訳開始部位の直ぐ下流に位置していることが好適である。この位置は、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の内因性の時間的および空間的発現パターンを保存する。ヒト配列は、ゲノムＰＤＥ１１Ａ配列全体、または適当なプロセシングのために３’末端に結合したポリＡ尾部を含む完全長さヒトｃＤＮＡ配列を含むことができる（Shiao et al., Transgenic Res. 8:295-302,1999）。細胞および非ヒト哺乳動物を遺伝子修飾して、内因性遺伝子の発現をそのヒト相対物と置き換えるこれらの方法に関する追加の指標は、例えば、Sullivan et al., J.Biol.Chem. 272:17972-80,1997, Reaume et al., J.Biol.Chem. 271:23380-88,1996, および Scott et al.,米国特許第５，７７７，１９４号に見出される。
【００９９】
このような“ヒト化”生物を生じるもう一つの方法は、最初に、ＰＤＥ１１Ａ−／−胚の生成、そして次に、ヒト配列をコードしている導入遺伝子のＰＤＥ１１Ａ−／−胚への導入を行う多段法である。
【０１００】
Ｆ．実施例−ＰＤＥ１１Ａ＋／−およびＰＤＥ１１Ａ−／−マウスの発生
遺伝子修飾されたマウスＥＳ細胞（ＰＤＥ１１Ａ＋／−）を、図１に示されるスキームを用いて生じさせた（DeltaGen, Menlo Park, CA）。ヒトＰＤＥ１１Ａ遺伝子の部分ｃＤＮＡ配列（図２Ａ；配列番号：１および２）を用いて、下記のオリゴヌクレオチド鎖７７４４および７７４５を設計した。
【０１０１】
オリゴヌクレオチド７７４４−
５’ＴＴＴＣＴＧＴＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧ３’（配列番号：３）
オリゴヌクレオチド７７４５−
５’ＡＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴ３’（配列番号：４）
上のプライマーを用いたマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲに基づく増幅は、図２Ｂに示されるマウスＰＤＥ１１Ａ配列（配列番号：５および６）を示す生成物を生じた。このゲノム配列に基づいて、図１に示されるような、配列番号：７および８の二つの相同アーム（それぞれ１０ヌクレオチド長さ）およびそれらアーム間に挿入されたＬａｃＺ−Ｎｅｏ配列を含有するターゲッティング構築物を生じた。そのターゲッティング構築物を含有するＤＮＡを、エレクトロポレーションによってＥＳ細胞中に挿入した。ＥＳ  Ｒ１細胞（Deng et al., Dev.Biol. 185:42-54,1997; Udy et al., Exp.Cell Res. 231:296-301,1997）中のネズミＰＤＥ１１Ａ遺伝子中へのこの構築物の組込みの結果として、配列番号：５および６のヌクレオチド２７〜４２がＬａｃＺ−Ｎｅｏ遺伝子で置換された。ネオマイシン耐性のＥＳ細胞を、サザンブロットによって分析して、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子の破壊を確認した。次に、これら標的ＥＳ細胞を、胚盤胞中に細胞を注入し、それら胚盤胞を偽妊娠雌マウスに着床させることによってキメラマウスの発生のために用いた（Cappecchi et al., Trends Genet. 5:70,1989, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; および Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J.Robertson,ed., IRL Press, Washington, D.C., 1987）。次に、キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６（Jackson Laboratories, Bar Harbor ME）マウスと交配して、Ｆ１  ＰＤＥ＋／−ヘテロ接合体を生じ、これを順次に交配して、Ｆ２  ＰＤＥ−／−ホモ接合性マウスを生じた。ヘテロ接合体およびホモ接合体中のＰＤＥ１１Ａ遺伝子の機能的破壊は、ＰＣＲおよびサザンブロット分析によって確認した。
【０１０２】
２．ＰＤＥ１１Ａ機能の特性決定および治療的妥当性
ＰＤＥ１１Ａ活性または発現を調節する摂動を、細胞、組織または哺乳動物において、ＰＤＥ１１Ａ調節が生理学的に適切な作用または表現型を生じるかどうか確認するために誘発させることができる。このような摂動を誘導する一つの手段は、概して、非ヒト哺乳動物または動物細胞を遺伝子修飾して、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子を破壊することである。或いは、ＰＤＥ１１Ａ活性または発現を調節する物質を投与して、細胞または組織標本、または哺乳動物へのその作用を確認することができる。
【０１０３】
Ａ．組織発現
ＰＤＥ１１Ａ機能に関してどの細胞、組織または表現型を研究するか決定する指標は、マウスおよびヒトのような種におけるＰＤＥ１１Ａ発現パターンで見出される。ヒトＰＤＥ１１Ａ発現に関して、以前に Fawcett, 2000に記載されたもの（例えば、精巣、骨格筋、腎、肝、種々の腺組織（例えば、下垂体、唾液腺、副腎、乳腺および甲状腺）、膵臓、脊髄および気管）に加えて、本発明者は、ここで、ＰＤＥ１１Ａを発現する更に別の組織を開示し、以前に開示された組織における発現を更に特性決定する。
【０１０４】
ＰＤＥ１１Ａ発現パターンを、５μｍの幅に切断されたホルマリン固定されパラフィンで包埋された正常ヒト組織（Peterborough Hospital Cellular Pathology Services, Peterborough,ＵＫ）および７μＭに切断されたパラホルムアルデヒド固定されパラフィンで包埋された正常マウス精巣試料（カタログ番号６９５８４−３，Novagen, Madison, ＷＩ）において決定した。固定された切片を、キシレン（５分）、無水アルコール（５分）、そして次に、工業用変性アルコール（５分）中で洗浄することによって脱ロウした。その後、それらスライドを流水中で５分間洗浄後、次の方法の内の一つによって抗原検索のために処理した。（１）トリプシンを用いて３７℃で１５分間処理（カタログ番号Ｔ７１６８，Sigma Chemicals, St.Louis,ＭＯ, 錠剤１個／ｍｌ水）後、流水中で更に洗浄；または（２）標的検索用溶液（カタログ番号Ｓ１７００，ＤＡＫＯ Corp., Carpinteria,ＣＡ）を用い、製造者の指示によるスチーマー法を用いて処理後、トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）（カタログ番号Ｔ６６６４，Sigma Chemicals, St.Louis,ＭＯ, サシェ１個／Ｌ水）中で数回洗浄。試料を新鮮なＴＢＳ中に浸漬し、下記のような二つの別の免疫組織化学キットの一つの成分を用いて処理した。
【０１０５】
試料を、一次ウサギ抗ＰＤＥ１１Ａ抗体（ＴＢＳ／５％脱脂乳中で１：５００または１：１０００希釈、６０分間）と一緒にインキュベートした。一次抗体を、ＳＡＩＦＤＲＮＲＫＤＥＬＰＲＬ（配列番号：９）（Cambridge Research Biochemicals, Cleaveland,ＵＫ）のヒトＰＤＥ１１Ａ（GenBank 受託番号ＡＪ２５１５０９）触媒ドメインペプチド配列に対して生じさせた。抗体検出システムには、（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）への抗ウサギ二次抗体結合体および３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色素原溶液（カタログ番号Ｋ４０１０，ＤＡＫＯ EnVisionTM＋System, ＤＡＫＯ Corp.）；かまたは（２）アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）（カタログ番号ＡＫ５００１，ＡＢＣ−ＡＰキット，Vector Laboratories, Burlingame,ＣＡ）に結合した抗ウサギ二次抗体およびＡＰ基質キット（カタログ番号ＳＫ−５１００，Vector（登録商標）Red, Vector Laboratories）が含まれた。免疫組織化学的手順は、製造者の指示にしたがって行われた。色素原とのインキュベーション後、ヘモトキシリン（カタログ番号Ｈ３４０１，Vector Laboratories）を用いて組織を対比染色した。次に、試料を水中で洗浄し、そして酸性洗浄液（２％ｖ／ｖ氷酢酸）中に１０回（１０Ｘ）、次に水中に１０Ｘ、Scott の水道水（カタログ番号６７６９００２，Shandon Scientific, Runcorn,ＵＫ）中に２０Ｘ浸漬し、水中で３分間洗浄し、脱水し、ＤＰＸ（カタログ番号３６０２９４Ｈ，ＢＤＨ Laboratory Supplies, Poole,ＵＫ）中でスライドに載せ、カバーガラスを用いて封止した。
【０１０６】
強いＰＤＥ１１Ａ抗体染色は、次の細胞種類および構造で示された。全心室中の心筋細胞；心内膜内側の内皮細胞；小静脈、静脈、小動脈および動脈の（特に、より小さい直径の血管の）心臓（心外膜および内心筋）および全身血管系の内側平滑筋細胞である血管内皮細胞；シュワン細胞および神経周囲細胞（しばしば、特定の組織、例えば、膀胱、精巣および心臓に関連する神経および血管染色）；精巣、精原細胞の核、更には、精母細胞および精子細胞、間質ライディヒ細胞、および精細管の基底膜の下にある細胞（線維芽細胞）、および血管平滑筋；結腸および直腸腺内のアミン前駆体吸収および脱炭酸（ＡＰＵＤ）腸内分泌細胞；黒質中のような脳全体のニューロン（中程度〜強い染色）、扁桃（amygdyla）、基底核、最後野、および下垂体前葉の（特に、外側区域周辺の）好酸球（成長ホルモン産生細胞およびラクトトロープ）；肺の肺胞マクロファージ；膵臓の島細胞；脾臓の赤色脾髄中の希少細胞；多数の脂肪細胞；リンパ系組織；および癌性前立腺、過形成前立腺および悪性黒色腫の皮膚からの試料。
【０１０７】
ＰＤＥ１１Ａについて中程度〜弱い染色を示した更に別の細胞種類および組織には、次が含まれた。膀胱尿路上皮、特に、基底層〜移行上皮層（細胞質中、特に、細胞の核内）；外分泌腺実質中の細胞；表皮の基底層および有棘層中の角化細胞；毛包の皮質、外毛根鞘およびコラーゲン性毛根鞘；外分泌腺；時々、小脳のプルキンエ細胞；脳幹神経節および線条中の細胞である上衣細胞；アウエルバッハ神経叢およびマイスナー神経叢中の神経節細胞；滑膜細胞；肝細胞；平滑筋；胸膜中皮；膣粘膜中の扁平上皮細胞；乳房中の小葉および管状上皮細胞；脾臓赤色脾髄中の血管および洞様毛細血管の管壁細胞；皮脂腺；腎臓の曲尿細管および集合管；アテローム性動脈硬化症における血管内膜平滑筋組織球を含めた組織球；およびマスト細胞、形質細胞、リンパ球および顆粒球。
【０１０８】
骨格筋における発現についての更なる解明は、数種類の試料における運動終板の強い染色と共に、変化しうる染色を示した。染色は、前脛骨筋細胞、長指心筋、腓腹筋、ヒラメ筋および外側広筋において弱〜強であった。
【０１０９】
ＰＤＥ１１Ａのネズミ組織発現パターンは、精巣の場合、精細管の生殖上皮（精原細胞、精母細胞、精子細胞、ライディヒ細胞および血管平滑筋）において弱い発現を示した。この発現は、特に、精母細胞において支配的である。
【０１１０】
Ｂ．ＰＤＥ１１Ａアゴニストおよびアンタゴニストの識別
ＰＤＥ１１Ａアゴニストおよびアンタゴニストを識別する一つの種類のスクリーニングを、in vitroで、組織から単離される天然の酵素を用いて、またはトランスフェクションされた宿主細胞、例えば、Ｓｆ９昆虫細胞（Fawcett, 2000）、酵母細胞（Loughney et al.,米国特許第５，９３２，４６５号）またはＣＯＳ−７細胞（Yuasa, 2000）において発現される組換え酵素を用いて行う。好ましくは、ＰＤＥ１１Ａ酵素はヒト酵素である。ＰＤＥ１１Ａアゴニストおよびアンタゴニストとして識別される物質は、ＰＤＥ１１ファミリーのいずれか他のメンバーに同様の作用を生じると考えられる。
【０１１１】
ＰＤＥ１１Ａ活性を、例えば、適当な基質［3Ｈ］ｃＡＭＰまたは［3Ｈ］ｃＧＭＰの加水分解速度として測定する。基質加水分解を増加させるまたは減少させる物質は、ＰＤＥ１１Ａ選択性アゴニスト（すなわち、エンハンサー）またはアンタゴニスト（すなわち、阻害物質）としてそれぞれ識別される。この活性は、例えば、シンチレーション近接検定（ＳＰＡ）に基づく方法（Fawcett, 2000; Phillips et al., ＷＯ００／４０７３３号および Thompson et al., Biochem. 18:5228,1979（製品コードＴＲＫＱ７０９０／７１００，Amersham Int'l Ltd., Buckinghamshire, ＵＫを用いて修飾される））によって測定される。簡単にいうと、ＰＤＥ１１Ａ酵素を含有する試料を、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ基質（Sigma Chemical）と接触させ、その一部分（例えば、１／４〜１／２）を、3Ｈ（Amersham）標識する。反応は、例えば、微量滴定プレート（例えば、Microfluor（登録商標）プレート，Dynex Technologies, Chantilly,ＶＡ）中で行い、過剰の未標識環状ヌクレオチドを含有するケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（Amersham）の添加によって停止する。ビーズを暗所で沈降させた後、微量滴定プレートリーダー（例えば、TopCount（登録商標），Packard, Meriden, ＣＴ，ＵＳＡ）によってプレートを読み取る。
【０１１２】
ＰＤＥ活性は、32Ｐ−ｃＡＭＰまたは32Ｐ−ｃＧＭＰから放出される32Ｐ−リン酸塩の検出によって（例えば、Loughney et al., J.Biol.Chem. 271:796-806,1996, および Loughney,米国特許第５，９３２，４６５号に記載のように）、またはＰＤＥ基質ｃＧＭＰまたはｃＡＭＰと、それらの加水分解生成物とを区別する抗体を用いて（例えば、FlashPlateTM技術，ＮＥＮ（登録商標）Life Sciences Products, Boston, ＭＡを用いて）検定することもできる。
【０１１３】
ＰＤＥ１１Ａ触媒活性を検定することに代わるものとして、物質が、ＰＤＥ１１Ａ触媒活性を、例えば、翻訳後修飾（例えば、リン酸化）、アロステリックリガンド結合の調節（例えば、ＧＡＦドメインによる（Fawcett, 2000））、またはＰＤＥ１１Ａ自体に触媒かまたはアロステリック調節部位で結合することによって、直接的に調節する場合、それら物質をＰＤＥ１１Ａアゴニストまたはアンタゴニストとして識別することができる。これらの機序によってＰＤＥ１１Ａ触媒活性を増加させる物質は、可能性のあるアゴニストとして識別され、逆に、これらの機序によってＰＤＥ１１Ａ触媒活性を減少させる物質は、可能性のあるＰＤＥ１１Ａアンタゴニストである。ＰＤＥ１１Ａリン酸化およびアロステリックリガンド結合を決定する方法は、参考文献（例えば、McAllister-Lucas et al., J.Biol.Chem. 270:30671-79,1995 および Corbin et al., Eur.J.Biochem. 267:2760-67,2000 を参照されたい）に記載されている。
【０１１４】
スクリーニングされる物質の例には、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、炭水化物、脂質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模擬体、低分子および他の化合物が含まれるが、これらに制限されるわけではない。物質は、試験用にまたはライブラリーの一部分として個々に選択することができる。これらライブラリーは、当該技術分野において知られている組合せライブラリー法での多数のアプローチのいずれかを用いて得られ、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；デコンヴォルーション（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー法；“一ビーズ一化合物”ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法が含まれる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４種類のアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子ライブラリーに応用できる（例えば、Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145; 米国特許第５，７３８，９９６号；および米国特許第５，８０７，６８３号）。
【０１１５】
分子ライブラリーの合成法の例は、当該技術分野において、例えば、DeWitt et al., 1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909, Erb et al., 1994, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422, Zuckermann et al., 1994, J.Med.Chem. 37:2678, Cho et al., 1993, Science 261:1303, Carrell et al., 1994, Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33:2059, Carell et al., 1994, Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33:2061,および Gallop et al., 1994, J.Med.Chem. 37:1233 に見出されうる。
【０１１６】
個々の物質または物質のライブラリーは、溶液中で（例えば、Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421）、またはビーズ（Lam, 1991, Nature 354:82-84）、チップ（Fodor, 1993, Nature 364:555-556）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号；および第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869）またはファージ（Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382;および Felici, 1991, J.Mol.Biol. 222:301-310）上で提示することができる。
【０１１７】
ＰＤＥ１１Ａ酵素速度論（例えば、ＶｍａｘおよびＫｍ）への試験物質の作用は、in vitroで、例えば、一定濃度のＰＤＥ１１Ａ酵素、一定範囲の基質濃度（例えば、０．１０〜１０μＭ）および例えば、５〜６０分間の一定の時間経過を用いて加水分解を測定することによって決定される。Ｖｍａｘを増加させるまたはＫｍを減少させる物質は、アゴニストとして識別される。ＰＤＥ１１Ａ活性を阻害する物質は、Ｖｍａｘを減少させ、またはＫｍを増加させ、そして好ましくは、ナノモル範囲のＩＣ５０値を有する。このようなＩＣ５０決定には、いろいろな阻害物質濃度および低基質濃度（例えば、０．１〜１．０μＭ）の存在下において一定量の精製された組換え体または天然のＰＤＥ１１Ａを検定することを行う。阻害物質に暴露される試料の値は、非阻害対照（１００％）の活性％に変換され、５０％阻害が起こる濃度（ＩＣ５０）を見つけるために、阻害物質濃度に対してプロットされる。
【０１１８】
好ましくは、スクリーニングは、ＰＤＥ１１Ａ酵素に選択的であるＰＤＥ１１Ａアゴニストおよびアンタゴニストを識別する。例えば、好ましいアゴニストまたはアンタゴニストは、ＰＤＥ１〜１０の群からの一つまたはそれ以上のＰＤＥと比較して、少なくとも２０倍、より好ましくは、少なくとも３０倍、なお一層好ましくは、少なくとも５０倍、そして最も好ましくは、少なくとも１００倍までＰＤＥ１１Ａに選択的である。好ましいアゴニストおよびアンタゴニストは、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５および／またはＰＤＥ６の一つまたはそれ以上と比較して、ＰＤＥ１１Ａに選択的である。
【０１１９】
例えば、別のＰＤＥと比較されるＰＤＥ１１Ａに関するアンタゴニストの選択倍率は、他のＰＤＥについてのＩＣ５０値を、ＰＤＥ１１ＡのＩＣ５０で割ることによって決定される。選択倍率比較には、ＰＤＥ１１Ａ値を、従来報告された他のＰＤＥの値と比較すること、または他のＰＤＥ酵素を同時に試験することを行ってよい。
【０１２０】
in vitroスクリーニングに代わるものとして、化合物は、細胞に基づく、組織に基づく、または動物全体に基づく検定において、ＰＤＥ１１Ａを内因的に発現する試料を用いてまたは遺伝子操作の結果として、ＰＤＥ１１Ａ調節作用についてスクリーニングすることができる。
【０１２１】
その物質の存在下または不存在下でこのような試料を比較することに加えて、このような検定のための追加の負の対照は、適当につり合う遺伝子修飾されたＰＤＥ１１Ａ−／−細胞若しくは組織標品または非ヒト哺乳動物についてその物質を試験することである。このような試料を用いて、ＰＤＥ１１Ａ＋／＋試料において認められる何らかの作用が、ＰＤＥ１１Ａによって媒介されるか否かを確認することができる。
【０１２２】
実施例：ＰＤＥ１１Ａアンタゴニストの識別
ＰＤＥ５を阻害することが知られている物質を、例えば、Fawcett, 2000 および Phillips et al., ＷＯ００／４０７３３号に記載の方法によって調べて、それらがＰＤＥ１１Ａ活性も調節するかどうか確認した。ＰＤＥ１１Ａを阻害する物質のＩＣ５０値を、ＰＤＥ５〜１０を阻害する場合のＩＣ５０値と比較した。ＰＤＥ５は、ヒト海綿体から単離され、ＰＤＥ６は、ウシ網膜から単離され、そして組換え体ヒトＰＤＥ７〜１１は、Ｓｆ９細胞中でのバキュロウイルス発現によって製造された（Fawcett, 2000 および Ballard et al., J.Urol. 159:2164-71,1998）。
【０１２３】
試験された物質には、次が含まれた。
シルデナフィル（sildenafil）；
ＵＫ−３３６，０１７（ＩＣ３５１；（６Ｒ，１２ａＲ）−６−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２，３，６，７，１２，１２ａ−ヘキサヒドロ−２−メチルピラジノ［１’，２’：１，６］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，４−ジオン；ＣＡＳ番号：１７１４８８−０１−０；ＷＯ９５１９９７８号も参照されたい）、
ＵＫ−２２７，７８６（Ｅ４０２１；１−［４−［（１，３−ベンゾジオキソール−５−イルメチル）アミノ］−６−クロロ−２−キナゾリニル］−４−ピペリジンカルボン酸一塩酸塩；ＣＡＳ番号：１５０４５２−２１−４；ＷＯ９３０７１２４号も参照されたい）；および
ＵＫ−２３５，１８７（６−クロロ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−Ｎ−（フェニルメチル）−４−キナゾリンアミン二塩酸塩；ＣＡＳ番号：１５７８６３−３１−５；ＥＰ５７９４９６号も参照されたい）。
【０１２４】
化合物をＤＭＳＯ（４ｍＭ）中に溶解させた後、緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，５ｍＭ  ＭｇＣｌ2六水和物，２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））中において２５℃で４０μＭまで希釈した（成分は全て、Sigam Chemicals, St.Louis,ＭＯから入手可能である）。次に、この４０μＭ溶液を段階希釈して、少なくとも５段階を越えて半対数希釈を作成した。それぞれの範囲点の試料（２５μｌ）を、微量滴定プレート（Microfluor（登録商標）プレート，Dynex Technologies, Chantilly,ＶＡ）中に二重に入れた。次に、ＰＤＥ酵素を含有する試料を、それぞれのウェルに加えた。精製された組換え体または天然の酵素を、緩衝液Ｂ中で１：５００に希釈し、この希釈２５μｌを各ウェルに加えた。（この酵素量は、時間および濃度について確実に直線反応にするのに充分であった。）次に、酵素および化合物試料を、室温で１５分間予めインキュベートした。
【０１２５】
基質を、各プレートに５０μｌ試料中で加えた。基質は、ＰＤＥ１１Ａ試験用の６９ｎＭの最終ｃＧＭＰ濃度について（試験された他のＰＤＥに関する基質濃度は、１／３Ｋｍに等しいかまたはそれ未満であるように調整された）、緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，５ｍＭ  ＭｇＣｌ2六水和物）中に９０ｎＭ未標識ｃＧＭＰ（Sigma Chemicals）、４８ｎＭ  3Ｈ−ＧＭＰ（カタログ番号ＲＰＮＱ０１５０，Amersham International Ltd.）から成った。確実に充分に混合するように設定されたプレート振とう機上において室温で５０分間インキュベーション後、過剰の（３ｍＭ）未標識ｃＧＭＰを含有するケイ酸イットリウムＳＰＡビーズ（Amersham）の添加によって反応を止めた。次に、プレートを１５分間振とうして、より確実に混合した後、ビーズを３０分間沈降させた。プレートは、微量滴定プレートリーダー（TopCount（登録商標）プレートリーダー，TopCountプロトコール５０，Packard, Meriden, ＣＴ）によって読み取った。
【０１２６】
ＰＤＥ１１Ａを阻害する物質のＩＣ５０値を、ＰＤＥ５〜１０を阻害する場合の値と比較した。下の表１に示されるように、ＰＤＥ５阻害物質ＵＫ−３３６，０１７（ＩＣ３５１）、ＵＫ−２２７，７８６（Ｅ４０２１）およびＵＫ−２３５，１８７は、ＰＤＥ７〜１０と比較した場合、ＰＤＥ１１Ａを阻害する選択性を示した（ＩＣ−３５１は、ＰＤＥ６との比較でもＰＤＥ１１Ａに選択的であった）。対照的に、ＰＤＥ５阻害物質シルデナフィルは、ＰＤＥ５〜１０のいずれと比較した場合も、ＰＤＥ１１Ａに選択的ではなかった。
【０１２７】
【表１】
2004283180.tif 000003
【０１２８】
結果は全て、少なくとも３個の測定値の幾何平均である。
Ｃ．ＰＤＥ１１Ａ−／−およびＰＤＥ１１Ａ＋／−マウスの表現型特性決定
ＰＤＥ１１Ａポリペプチド活性を低下させた本発明の遺伝子修飾されたＰＤＥ１１Ａ−／−およびＰＤＥ１１Ａ＋／−非ヒト哺乳動物および動物細胞は、例えば、精子形成、ＮＯに媒介される膀胱弛緩および血管拡張に関するような、何らかの異常な表現型の出現に基づく新規なＰＤＥ１１Ａに媒介される生物学的機能を識別するのに用いることができる。低下したＰＤＥ１１Ａ活性に関連する何らかの異常な表現型は、ＰＤＥ１１Ａに関連した疾患または状態を治療するためのＰＤＥ１１Ａ標的療法を識別するおよび開発する基準を決定する。
【０１２９】
実施例−ＰＤＥ１１Ａ−／−マウスは、精子形成を減少させる。
ＰＤＥ遺伝子破壊についてホモ接合性のマウスを、野生型マウスと比較して、６〜８週令で何らかの異常な表現型を識別した。データは、身体検査、検死、組織学、臨床化学、血液化学、体重、器官重量、および骨髄の細胞学的評価から集めた。これら比較のために、６匹のＰＤＥ−／−マウス（雄３匹および雌３匹）および４匹のＰＤＥ１１Ａ＋／＋野生型マウス（雄２匹および雌２匹）を研究した。
【０１３０】
組織学的研究は、雄ＰＤＥ１１Ａ−／−マウスの精巣での変化を明らかにした。これら変化には、低下した精子形成、精子形成性上皮細胞の増加した脱落、精子形成性上皮の薄化、平均精細管直径の減少、細管内側上皮細胞の変性、および残余体の増加した脱落が含まれた。これらＰＤＥ１１Ａ  ＫＯマウスは、減少した精巣上体精子、増加した多核精子前駆体、および増加した細胞断片およびタンパク質破片の出現も示した。調べられた他の組織は、組織学的に正常であった。これら他の組織には、精嚢、唾液腺、胸腺、下垂体、甲状腺、大動脈、心臓、肝臓、胆嚢、食道、盲腸、結腸、直腸、骨、関節組織、脊髄、骨髄、気管、咽頭、骨格筋、坐骨神経、舌、乳腺、卵巣、子宮、子宮頸、眼組織およびハーダー腺が含まれた。ＰＤＥ１１Ａ−／−マウスと対照マウスとの間で、血液化学分析、器官重量または体重に関して一貫したまたは有意の差を示したものはなかった。
【０１３１】
ＰＤＥ１１Ａ−／−雄マウスで認められた異常な表現型は、ＰＤＥ１１Ａが、通常は精子形成に関与することを示している。したがって、雄哺乳動物においてＰＤＥ１１Ａ活性を阻害することまたは増大させることは、それぞれ、精子形成を減少させるまたは増加させる。精子形成におけるＰＤＥ１１Ａの役割は、野生型マウスの精細管の生殖上皮、特に、精母細胞におけるＰＤＥ１１Ａ発現によって更に確かめられる。
【０１３２】
Ｄ．ＰＤＥ１１Ａ−／−およびＰＤＥ１１Ａ＋／−マウスの遺伝子型特性決定  ＰＤＥ１１Ａポリペプチド活性を低下させた本発明の遺伝子修飾されたＰＤＥ１１Ａ−／−およびＰＤＥ１１Ａ＋／−非ヒト哺乳動物および動物細胞は、例えば、精子形成、ＮＯに媒介される膀胱弛緩および血管拡張に関するような、若干の遺伝子のアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションに基づく新規なＰＤＥ１１Ａに媒介される生物学的機能を識別するのに用いることができる。低下したＰＤＥ１１Ａ活性に関連する何らかの異常な遺伝子発現は、ＰＤＥ１１Ａに関連した疾患または状態を治療するためのＰＤＥ１１Ａ標的療法を識別するおよび開発する基準を決定する。
【０１３３】
実施例−ＰＤＥ１１Ａ−／−マウスは、野生型マウスと比較して異常な遺伝子発現を示す。
ＲＮＡ抽出
液体窒素中で凍結された組織（ＰＤＥ１１Ａ−／−ノックアウト（ＫＯ）マウスおよび野生型（ＷＴ）マウスの精巣から）を、ジスメンブレーター（dismembrator）（B.Braun Biotech International）を用いて粉末にし、緩衝液ＲＬＴ（Qiagen, Germany）中で溶解させた。その溶液を、Qiashredder（Qiagen）を用いて均一化し、ＲＮｅａｓｙカラム（Qiagen）を用いて、製造者の指示にしたがってＲＮＡを抽出した。
【０１３４】
アフィメトリックス（affymetrix）遺伝子発現分析
二本鎖ｃＤＮＡを、１０μｇの全ＲＮＡから、Ｔ７−ポリＴプライマーと一緒に Superscript Choice キット（Invitrogen（Life Technologies）Limited, Scotland,ＵＫ）を用いて生じさせた。約１μｇのｃＤＮＡを用いて、Bioarray High Yield RNA Transcript Labeling Kit（Enzo, ＵＳＡ）を用いた in vitro 転写によってビオチニル化ｃＲＮＡを生じさせた。１０μｇのフラグメントのｃＲＮＡを、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  Ｎａ+、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％トゥイーン２０、０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５０ｐＭ対照オリゴヌクレオチドを加えた０．５ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、および真核性ハイブリダイゼーション対照中において、Murine Genome Ｕ７４Ａアレイ（ＭＧＵ７４Ａアレイ−カタログ番号：９００３２１または９００３２２；Affymetrix, ＣＡ，ＵＳＡ）に、４５℃で１６時間ハイブリッド形成させた。アレイは、Affymetrixプロトコールを用いて、非緊縮緩衝液（６Ｘ  ＳＳＰＥ，０．０１％トゥイーン２０，０．００５％消泡剤）中において２５℃でおよび緊縮洗浄緩衝液（１００ｍＭ  ＭＥＳ，０．１Ｍ  Ｎａ+，０．０１％トゥイーン）中において５０℃で洗浄し、そして抗体増幅工程を含めて、ストレプトアビジンフィコエリトリン（１０μｇ／ｍｌ）を用いて染色した。アレイを、レーザー共焦点スキャナーを用いて走査して、蛍光強度を生じさせた。そのデータは、Microarray Analysis Suite バージョン４．０（Affymetrix）を用いて処理した。非機能性として Affymetrix によって識別された約２，６００プローブセットが、その分析からマスクされた。データは、３００の標的強度に合わせて決められた。
【０１３５】
ｎ＝４データセットのデータ分析
引き続き、データを、Spotfire Array Explorer ３．０ソフトウェア（例えば、米国特許第６，０１４，６６１号を参照されたい）を用いて分析した。最初に、遺伝子を、“ＷＴで高い／ＫＯで低い”（すなわち、ＰＤＥ１１除去によってダウンレギュレーションされた）または“ＷＴで低い／ＫＯで高い”（すなわち、ＰＤＥ１１除去によってアップレギュレーションされた）発現プロフィールに基づいて選択した。次に、そのように選択された１０００種類の遺伝子を、発現レベルおよび倍率変化（ＷＴとＫＯとの間で少なくとも２倍）の基準で選別したが、これにより、遺伝子の大部分が除去された。次に、発現された配列標識（ＥＳＴ）クラスター（現在、機能が知られていない）も除去した。これによって、ダウンレギュレーションかまたはアップレギュレーションされた既知の機能を有する１０８の遺伝子が残った。次に、これら遺伝子をそれぞれ、特に、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰに媒介されるシグナル伝達である精巣機能の関与について、Medline において検査した。ＫＯマウスにおける７２のダウンレギュレーションされた遺伝子の内、１５種類は、多少認められる精巣への関連を有する。３５のアップレギュレーションされた遺伝子の内、６種類は、多少認められる精巣への関連を有する。
【０１３６】
ＰＤＥ１１  ＫＯ精巣におけるダウンレギュレーションされた遺伝子のデータ分析の要旨
・ＷＴで高い／ＫＯで低い発現プロフィールへの類似性を示す５００の遺伝子を識別した。
【０１３７】
・これらの内、１９９遺伝子は、ＷＴかまたはＫＯにおいて、結果を有意義にする有意のレベルで発現されなかったので、無視された。
・残りの３０１の遺伝子の内、１７０遺伝子は、ＷＴとＫＯとの間に２倍より少ない差の発現を示した。統計学的には、これら遺伝子の全てが、少なくともＰ＝０．０５の有意性までかなり示差的に発現されたが、この分析の目的に関して、それらは除外された。
【０１３８】
・残りの１３１遺伝子の内、５９遺伝子は、マウスＥＳＴクラスターに由来していて、現在のところ識別可能な機能を有していない。
・残りの７２遺伝子の内、４３遺伝子は、参考文献の研究に基づく、特に精巣機能において識別しうる役割を有していなかった。
【０１３９】
・残りの２９遺伝子の内、１２遺伝子は、他の理由で除外された。
・更に２種類の遺伝子は、生体内異物代謝に関与することが認められた。
・ここで１５の遺伝子（下を参照されたい）が残り、それらは、精巣機能へのいろいろな関連を有し、ＰＤＥ１１  ＫＯ精巣において有意にダウンレギュレーションされる。
【０１４０】
ＰＤＥ１１  ＫＯ精巣におけるアップレギュレーションされた遺伝子のデータ分析の要旨
・ＷＴで低い／ＫＯで高い発現プロフィールへの類似性を示す５００の遺伝子を識別した。
【０１４１】
・これらの内、２６９遺伝子は、ＷＴかまたはＫＯにおいて、結果を有意義にする有意のレベルで発現されなかったので、無視された。
・残りの２３１の遺伝子の内、１６１遺伝子は、ＷＴとＫＯとの間に２倍より少ない差の発現を示した。統計学的には、これら遺伝子の全てが、少なくともＰ＝０．０５の有意性までかなり示差的に発現されたが、この分析の目的に関して、それらは除外された。
【０１４２】
・残りの７０遺伝子の内、３５遺伝子は、マウスＥＳＴクラスターに由来していて、ここで識別可能な機能を有していない。
・残りの３５遺伝子の内、２８遺伝子は、参考文献の研究に基づく、特に精巣機能において識別しうる役割を有していなかった。
【０１４３】
・１遺伝子は、生体内異物代謝に関与することが認められた。
・ここで６遺伝子（下を参照されたい）が残り、これらは、精巣機能へのいろいろな関連を有し、ＰＤＥ１１  ＫＯ精巣において有意にアップレギュレーションされる。
【０１４４】
遺伝子発現
ミクロアレイデータは、野生型動物（ｎ＝４）と比較されるＰＤＥ１１ノックアウトマウス（ｎ＝４）の精巣においてダウンレギュレーションされた１５種類の遺伝子（図４を参照されたい）および野生型動物（ｎ＝４）と比較されるＰＤＥ１１ノックアウトマウス（ｎ＝４）の精巣においてアップレギュレーションされた６種類の遺伝子（図５を参照されたい）を示した。
【０１４５】
１５種類のダウンレギュレーションされた遺伝子：
１．コルチコステロイド結合性グロブリンは、ステロイド類（例えば、テストステロン）の輸送に関与することが知られ、それはスペルピン（Sperpins）に関係している。主な発現は肝においてであるが、精巣でも発現される（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5153）。この遺伝子のダウンレギュレーションは、ライディヒ細胞によって分泌されるテストステロンの輸送に影響を与えるであろう。それは、精子細胞生存能力または二次性徴への下流作用を有することがありうる。
【０１４６】
２．セントリン３は、動原体形成および細胞周期進行に関与する必須タンパク質である。セントリンのダウンレギュレーションは、有糸分裂回転に影響を与え、したがって、産生される精子細胞の数を減少させることがありうる。
【０１４７】
３．ＸＲＣＣ１は、ＤＮＡ鎖破壊修復、相同的組換えおよび姉妹染色分体交換に関与する。発現は、マウスの場合、経時変化しないことが知られている。したがって、ＸＲＣＣ１のダウンレギュレーションは、有糸分裂中にＤＮＡの不正確な修復を引き起こすことがありうる（Brain Res. 869:105）。
【０１４８】
４．クロモボックスＭ３３は、転写因子であり、Polycombに関係している。このタンパク質のダウンレギュレーションは、ＫＯマウスで見られる性転換表現型によく似ていることがありうる。
【０１４９】
５．ＧＡＢＡ−Ａ，γ３サブユニットは、ＧＡＢＡ−Ａ受容体の重要な構造成分である。ＧＡＢＡは、アクロソーム反応に必要であることが知られている。このサブユニットのダウンレギュレーションは、アクロソーム反応を阻害しうるＧＡＢＡ−Ａ受容体によって効果のないシグナリングを引き起こすことがありうる。
【０１５０】
６．プロホルモンコンベルターゼ５は、ＭＩＳを活性化すると考えられる。このプロテアーゼのダウンレギュレーションは、不適切なミュラー管退行に関連する発育異常を引き起こすことがありうる。
【０１５１】
７．ライディヒインスリン様ペプチドは、導帯発生に関与するリラキシン様因子である。この遺伝子のダウンレギュレーションは、Ｌｅｙ−Ｌ  ＫＯマウスの側面、例えば、精巣のクリプトコルディスム（cryptochordism）によく似ていることがありうる。
【０１５２】
８．カルパイン３は、アクロソーム反応に関与する。他のカルパインは、ダウンレギュレーションされない。カルパイン３のダウンレギュレーションは、アクロソーム反応に影響を与えることがありうる。
【０１５３】
９．Ｙ−Ｂｏｘ３は、転写に関与する。他のＹ−Ｂｏｘタンパク質は、ダウンレギュレーションされない。それは、精巣における重要な転写因子であると考えられるので、ダウンレギュレーションは、精巣生理機能への多種多様な作用を有することがありうる。
【０１５４】
１０．クロモグラニンＢは、内分泌組織からの分泌に関与する。このタンパク質のダウンレギュレーションは、ライディヒ細胞の分泌経路を破壊し、それによって間質微小環境の変化を引き起こすことがありうる。
【０１５５】
１１．クリプトジンＩは、感染性細菌に対する防御に重要である。クリプトジンは、精巣における細菌防御に関与することが示されている。したがって、減少したクリプトジン発現は、精巣を感染に感受性にすることがありうる。
【０１５６】
１２．ＰＰ２Ｂは、精子形成の鍵である、カルモジュリンに媒介されるカルシウムシグナリング経路に関与することが知られているホスファターゼである。このタンパク質のダウンレギュレーションは、カルシウムシグナリングへの妨害を生じ、有効な精子形成に影響を与えることがありうる。
【０１５７】
１３．グルタミン酸システインリガーゼは、γグルタミルサイクルに関与する。このサイクルは、精子形成に不可欠であることが知られているので、ダウンレギュレーションは、この過程を阻害することがありうる。
【０１５８】
１４．ニドジェンは、細管周囲細胞の細胞外基質への接着に関与する。この遺伝子のダウンレギュレーションは、細管周囲細胞における不安定性、および不適切な精子遊離および遊走を引き起こすことがありうる。
【０１５９】
１５．ＨＲ６Ａは、ユビキチン結合に関与する。このタンパク質のダウンレギュレーションは、ＫＯマウスに見られる表現型と一致する影響を受けた精子形成によく似ていることがありうる。
【０１６０】
６種類のアップレギュレーションされた遺伝子：
１．プロタミン１は、精巣に特異的であるヒストン様タンパク質である。プロタミン１調節の変化は、精子細胞核の不正確な縮合を引き起こすことが知られている。
【０１６１】
２．ｓｐ３２は、プロアクロシン結合性因子である。それは、受精効率に有害でありうるプロアクロシンの活性化を促進する。
３．ｍＣＤＣ４６は、ＤＮＡ複製に不可欠であるＤＮＡ複製許可容因子である。アップレギュレーションは、精巣における有害な変化に反映されることがありうる。
【０１６２】
４．アデニル酸キナーゼ２は、ヌクレオチド調節に重要である。アップレギュレーションは、上昇したｃＡＭＰレベルへの応答でありうる。
５．ＡＫＡＰ１２１は、キナーゼアンカータンパク質である。それは、ｃＡＭＰおよびホルモン類によって調節されることが知られている。アップレギュレーションは、精巣微環境の有害な変化へと反映されることがありうる。
【０１６３】
６．Ｋｒｏｘ−２４結合タンパク質は、ＥＧＲを活性化するジンクフィンガー転写因子と結合する。増加した発現は、ノックアウトマウスの不妊の原因となりうる。
Ｅ．ＰＤＥ１１Ａアゴニストおよびアンタゴニストを用いたＰＤＥ１１Ａ機能の識別
ＰＤＥ１１Ａのモジュレーターとして識別される化合物、より好ましくは、選択的ＰＤＥ１１Ａモジュレーターとして識別される化合物は、ＰＤＥ１１Ａを発現する細胞または組織標本に、または動物全体に投与されて、化合物投与に応答して起こる変化に基づくＰＤＥ１１Ａ機能を識別することができる。
【０１６４】
例えば、膀胱尿路上皮におけるＰＤＥ１１Ａ発現があれば、それは、膀胱のおよび膀胱神経線維興奮性の一酸化窒素（ＮＯ）に媒介される阻害の調節物質としての候補である。このＮＯに媒介される作用は、例えば、Ozawa et al., J.Urol. 162:2211,1999, Pandita et al., J.Urol. 545-550,2000,および Burnett et al., Nat.Med. 3:571-74,1997 に記載されている。膀胱収縮性におけるＰＤＥ１１Ａの役割を特性決定するために、ＰＤＥ１１Ａアンタゴニストの作用は、オキシヘモグロビンに誘発される（Pandita,上記）またはシクロホスファミドに誘発される（Ozawa,上記）膀胱機能亢進のモデルで研究することができる。実験動物（例えば、ラット）に、オキシヘモグロビン（膀胱内，Sigma Chemical）またはシクロホスファミド（腹腔内）を、例えば、ＤＭＳＯ中に溶解し且つ適当な緩衝液で希釈したＰＤＥ１１Ａアンタゴニストと組み合わせて投与する。そのＰＤＥ１１Ａアンタゴニストは、適当な経路によって（例えば、膀胱内、腹腔内または静脈内）投与される。
【０１６５】
ＰＤＥ１１Ａは、ＰＤＥ１１Ａアンタゴニストが、そのアンタゴニストを投与されない対照動物と比較して、膀胱を神経支配する球心性ニューロンにおけるニューロン刺激の減少、膀胱収縮頻度の減少、排尿圧の低下、および／または基礎圧力低下を引き起こす場合、試験動物における膀胱のおよび膀胱神経線維興奮性のＮＯに媒介される阻害を調節する場合にある役割を果たしていると識別される。膀胱機能の測定は、参考文献（例えば、Pandita（上記）および Ozawa（上記））に記載の標準法にしたがって行われる。認められる作用が、ＰＤＥ１１Ａを阻害することによって媒介されたことを確認するための追加の対照として、破壊されたＰＤＥ１１Ａ遺伝子を含有する適当につり合う遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物（好ましくは、ＰＤＥ１１Ａ−／−）を調べることができる。
【０１６６】
ＰＤＥ１１Ａ活性または発現を調節する物質の作用を調べる場合、ヒト細胞系または一次ヒト組織標本に由来するものなどの、ヒトＰＤＥ１１Ａを発現する組織または細胞試料を用いることは好適である。或いは、このような組織または細胞試料は、ＰＤＥ１１Ａヒト化非ヒト哺乳動物または動物細胞から得ることができる。同様に、ＰＤＥ１１Ａ機能研究に好ましい一つの試験動物は、遺伝子修飾されたＰＤＥ１１ヒト化哺乳動物である。
【０１６７】
Ｆ．治療的用途
ＰＤＥ１１Ａ活性を調節すると識別される物質は、治療目的に用いることができる。好ましくは、その物質は、少なくとも一つの他のＰＤＥに関して、ＰＤＥ１１Ａに選択的であり（例えば、ＵＫ−３３６，０１７（ＩＣ−３５１）、ＵＫ−２２７，７８６（Ｅ４０２１）およびＵＫ−２３５，１８７は、ＰＤＥ７〜１０と比較して、ＰＤＥ１１Ａに選択的である）、より好ましくは、その物質は、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ５および／またはＰＤＥ６の少なくとも一つに対して、ＰＤＥ１１Ａに選択的である（例えば、ＵＫ−３３６，０１７（ＩＣ−３５１）は、ＰＤＥ６と比較してＰＤＥ１１Ａに選択的である）。
【０１６８】
典型的な治療的用途は、次の通りである。男性避妊薬として（ＰＤＥ１１Ａ活性を低下させることおよび精子形成を減少させることによる）かまたは男性受精能を増加させるのに（ＰＤＥ１１Ａ活性を刺激するおよび精子形成を刺激することによる）用いるために精子形成を調節する、または骨格筋代謝または収縮性を調節する物質を投与すること；過興奮性または過活性膀胱、心不全、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、過プロラクチン血症、または増加した成長ホルモン分泌の結果として進む状態または障害の治療のためにＰＤＥ１１Ａ活性を低下させる物質を投与すること。ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質は、いずれか適当な経路によって投与することができる。例えば、投与は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼科用、脳室内、嚢内、脊髄内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアゾル、坐剤によるまたは経口投与であってよい。
【０１６９】
ＰＤＥ１１Ａは、心筋細胞、心臓血管の内皮細胞内層および内側平滑筋細胞において発現される。心筋細胞におけるｃＡＭＰレベルの調節は、増加したｃＡＭＰレベルによる正の変力応答をもたらすＰＤＥ３の阻害（例えば、アムリノンおよびミルリノンを用いて）によって例示されるように（Fischer et al., Drugs 44:928-45,1992）、イオン電流の下流調節によって心臓収縮性に明らかな作用を有すると、充分に証明される。サイクリックＧＭＰは、心臓収縮性の調節に関与すると示されてもいる。例えば、ラット筋細胞の場合、一酸化窒素（ＮＯ）ドナーに応答したｃＧＭＰの中程度の増加は、ｃＡＭＰ依存性経路による増加した収縮応答に関連したが、大きなｃＧＭＰ増加は、収縮応答を減少させた（Kojda et al., Circ.Res. 78:91-101,1996）。更に、サイトカイン（誘導一酸化窒素合成酵素による）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（Joe et al., J.Mol.Cell.Cardiol. 30:303-15,1998; Brusq et al., Br.J.Pharmacol. 128:206-12,1999）への暴露による、または薬理学的操作（Weiss et al., Can.J.Physiol.Pharmacol. 77:422-31,1999）によるｃＧＭＰの上昇は、弛緩を促進するかまたは心臓収縮性を減少させると報告されてもいる。したがって、ＰＤＥ１１Ａのモジュレーターは、心筋細胞収縮性を正かまたは負に調節する場合にある役割を果たしうる。
【０１７０】
心筋細胞におけるそれらの役割に加えて、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰは、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）機能において重要な調節の役割を有すると、充分に証明されてもいる。例えば、ＮＯ−ｃＧＭＰシグナリング経路によるｃＧＭＰの上昇は、血管弛緩を媒介しうる（Ignarro et al., J.Cardiovasc.Pharmacol. 34:879-86,1999）。同様に、例えば、βアゴニスト刺激後に上昇したｃＡＭＰは、最終的には細胞内Ｃａ++レベルの低下を引き起こすいろいろな細胞内機序によってＶＳＭＣを媒介しうる（Wilson and Warren, Br.J.Pharmacol. 110:633-38,1993）。サイクリックＡＭＰおよびｃＧＭＰは、ＶＳＭＣ増殖に影響を与えると報告されてもいる（Indolfi et al., Nat.Med. 3:775-79,1997, Kariya et al., Atherosclerosis 80:143-47,1989; Fukumoto et al., Circ.Res. 85:985-91,1999; Koyama et al., J.Cell.Physiol. 186:1-10,2001）。したがって、ＰＤＥ１１Ａ活性を調節することによるｃＧＭＰかまたはｃＡＭＰの調節は、血管正常状態（したがって、血圧）、更には、ＶＳＭＣ増殖に影響を与えることがありうる。
【０１７１】
ＰＤＥ１１Ａは、一定範囲の筋種類の筋細胞においてであるがいろいろな程度に且ついろいろな細胞比率で（すなわち、モザイクパターンで）発現される。代謝および力発生（すなわち、興奮収縮連関）のような一定範囲の骨格筋機能は、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰ両方によって調節されると報告されている。例えば、グルコース吸収、解糖、ミトコンドリア酸素消費およびクレアチンキナーゼ活性は、ＮＯ−ｃＧＭＰ経路によってＮＯ感受性であると報告されている。ｃＧＭＰの増加は、‘燃料’酸化の増加を引き起こす（Young & Leighton, FEBS Lett. 424:79-83,1998; Stamler and Meissner, Physiol.Rev. 81:209-37,2001）。ＮＯは、骨格筋収縮を調節することもでき、興奮収縮連関を変化させることによって力生産を阻害することがありうる（Reid, Acta.Physiol.Scand. 162:401-09,1998）。逆に、ｃＡＭＰは、興奮収縮連関に重要であり、したがって、力発生に重要であることが示されている（Grossman et al., J.Card.Fail. 2:(4 Suppl.):S105-11,1996; Bishop et al., Ann.N.Y.Acad.Sci. 853:209-219,1998）。したがって、ＰＤＥ１１Ａ阻害によるｃＧＭＰかまたはｃＡＭＰの調節は、例えば、筋肉代謝（燃料消費）および／または収縮性（力発生）に影響を与えることがありうるし、したがって、このような調節は、筋肉の疲労および性能にある役割を果たすことがありうる。
【０１７２】
ＰＤＥ１１Ａは、精巣の精細管内の生殖上皮の多数の細胞、すなわち、精原細胞、精母細胞および精子細胞、更には、間質（ライディヒ）細胞において発現される。６〜８週令の雄ＰＤＥ１１Ａ−／−マウスで認められる減少した精子形成に加えて、いくつかの他の形跡輪郭は、ＰＤＥ１１Ａが、ｃＡＭＰを調節することによって精子形成においてある重要な役割を果たすということを示している。例えば、ｃＡＭＰシグナリング経路の成分、すなわち、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）（Lonnerberg et al., Biol.Reprod. 46:1057-68,1992）、ＰＫＡ固定化タンパク質ＡＫＡＰ８４（Lin et al., J.Biol.Chem. 270:27804-11,1995）およびｃＡＭＰ応答要素モジュレーターＣＲＥＭ（Nantel et al., Nature 380:159-62,1996）は、生殖細胞において発現されることが知られている。最後のＣＲＥＭは、ｃＡＭＰに誘導される遺伝子転写のダウンレギュレーターとして作用する転写因子であり（Foulkes et al., Cell 64:739-49,1996）、パキテン期精母細胞において高レベルで開始して発現される。遺伝子ノックアウトによってＣＲＥＭに効果のないマウスは、成熟した精子を生じるが、おそらくはｃＡＭＰに誘導される遺伝子転写の阻害の除去によって、不妊である（Nantel et al.,上記）。結果として、精母細胞におけるＰＤＥ１１Ａ阻害によるｃＡＭＰレベルの増大は、例えば、ＣＲＥＭによるｃＡＭＰに誘導される遺伝子転写のダウンレギュレーションに優先し、精子形成の抑制をもたらすことがありうる。
【０１７３】
精子形成に加えて、ｃＡＭＰは、成熟精子での運動性の維持において重要なメッセンジャーであるとも報告されている（Chaudhry et al., Cell Motil.Cytoskeleton 32:65-79,1995）。更に、それは、精子において受精能獲得をもたらすシグナリングおよびアクロソーム反応を引き出す場合に重要な役割も有し（Duncan & Fraser, J.Reprod.Fertil. 97:287-99,1993; Aitken et al., J.Cell Sci. 111:645-656,1998; Adeoya-Osiguwa & Fraser, Mol.Reprod.Dev. 57:384-92,2000）、後者反応は、精子活性化および受精能に重要である。結果として、ＰＤＥ１１Ａ阻害による精母細胞、精子細胞および精子におけるｃＡＭＰレベルの摂動は、例えば、精子形成を抑制することがありうるが、射精時の精子運動性および／または精子活性化を促進しうる。
【０１７４】
間質（ライディヒ）細胞は、テストステロンを生じ、これは、精子形成、男性生殖系の副腺、例えば、性嚢の発生および維持、および二次男性性徴に必要である。ライディヒ細胞におけるテストステロン生合成は、主に、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ依存性経路の活性化による下垂体性腺刺激ホルモン黄体形成ホルモン（ＬＨ）によって調節される（Cooke, Mol.Cell.Endocrinol. 151:25-35,1999）。テストステロン生合成の調節には、いくつかの他のパラ分泌および自己分泌因子、例えば、インスリン様成長因子Ｉ（Rouiller-Fabre et al., Endocrinology 139:2926-34,1998）およびＴＮＦα（Xiong & Hales, Endocrinology 132:2438-44,1990）が関与することもありうるし、ｃＡＭＰによる作用もありうる。更に、ｃＧＭＰは、ライディヒ細胞におけるテストステロン分泌の調節に関与すると報告されている。例えば、ＮＯは、培養されたラットライディヒ細胞におけるテストステロン産生を二相で調節するが、低用量ＮＯドナーは、ｃＧＭＰレベルおよびテストステロン分泌を増加させる（Valenti et al., Int.J.Androl. 22:336-41,1999）。したがって、ライディヒ細胞におけるＰＤＥ１１Ａを調節することによるｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰの調節は、テストステロン産生、精子形成および／または精巣発育に正かまたは負の影響を与えることがありうる。
【０１７５】
ＰＤＥ１１Ａは、下垂体前葉の好酸球、すなわち、成長ホルモン産生細胞およびラクトトロープにおいて発現される。好酸球中のＰＤＥ１１Ａの存在は、ラクトトロープおよび成長ホルモン産生細胞からそれぞれ分泌されるプロラクチンおよび／または成長ホルモンの分泌を調節する場合に、ＰＤＥ１１Ａがある役割を果たすということを示している。例えば、ＮＯは、ｃＧＭＰの上昇によってプロラクチン分泌を阻害することが示されている（Duvilanski et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:170-74,1995）。したがって、ＰＤＥ１１Ａ阻害によって生じるラクトトロープにおけるｃＧＭＰレベルの上昇は、例えば、過プロラクチン血症に関連する障害を治療するためにプロラクチンの分泌を減少させるのに有用でありうる。プロラクチンは、乳汁分泌におけるその充分に確立された役割に加えて、いろいろな範囲の活性を有するが、それらには、黄体機能への作用、ステロイド合成、免疫調節、成長、精巣発育および精子形成が含まれる（Bole-Feysot et al., Ecdocr.Rev. 19:225-68,1998）。プロラクチン受容体に効果のないマウスは、不妊、正常な乳房発育欠如および低下した母性行動（雌）、受精能遅滞（雄）、減少した骨形成および体重の僅かな減少を示す（Kelly et al., Front.Neuroendocrinol. 22:140-45,2001）。これら作用は、減少したまたは除去されたプロラクチン分泌に応答して現れることがありうる。したがって、ＰＤＥ１１Ａアゴニストは、下垂体前葉ラクトトロープにおけるｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのレベルを減少させ且つプロラクチン分泌を増加させるのに用いることができる。
【０１７６】
成長ホルモン産生細胞における成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）刺激に応答したサイクリックＡＭＰ上昇は、分泌顆粒から成長ホルモン（ＧＨ）を放出させるので、下垂体前葉成長ホルモン産生細胞におけるＰＤＥ１１Ａ阻害は、例えば、この放出を促すことがありうる。ＧＨ放出のこの増大は、例えば、骨成長および維持に（Murray & Shalet, Expert Opin.Pharmacother. 1:975-90,2000）および老化に関連する虚弱、骨粗鬆症、病的肥満、心不全、大熱傷、およびいろいろな急性および慢性の異化状態の治療に重要でありうる。
【０１７７】
ＰＤＥ１１Ａ活性を調節する物質を含む治療用製剤を投与する場合、それら製剤は、液状の水剤または懸濁剤の形、錠剤またはカプセル剤の形、または散剤、点鼻剤またはエアゾル剤の形であってよい。製剤を製造する当該技術分野において周知の方法は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（ed. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, ＰＡ，18thed., 1990）に見出される。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１は、ネズミＰＤＥ１１Ａ配列を用いた相同的組換えを行って、ヒトｃＤＮＡ配列のヌクレオチド５６０〜５７５に該当する遺伝子配列（ＡＴＧ開始部位は５７位で始まる）を削除して、それをＬａｃＺＮｅｏ配列に置換した、例示的なＰＤＥ１１Ａ遺伝子ターゲッティングまたはノックアウト（ＫＯ）構築物の略図を示す。遺伝子の欠失部分は、ＰＤＥ１１Ａの触媒ドメインをコードしている配列を含む。ＬａｃＺ／Ｎｅｏ配列に隣接する相同アームの配列は、配列番号：７および配列番号：８と称される。ＳＳは、遺伝子内のイントロンスプライス部位を意味する。ｐＡは、ポリアデニル化シグナルを意味する。
【図２】図２Ａは、ＰＣＲ増幅によって該当するネズミ遺伝子配列を入手する場合に用いるためのＰＣＲプライマー（配列番号：３および４）を生じるのに用いられる例示的なヒトＰＤＥ１１Ａ配列（配列番号：１および２）を示す。  図２Ｂは、図２Ａに示されるプライマーを用いて生じたネズミＰＤＥ１１Ａ遺伝子ＰＣＲ産物を示す。これら配列は、図１に示されるＰＤＥ１１Ａターゲッティング構築物の相同アームを設計するのに用いることができるネズミＰＤＥ１１Ａ配列の例である。
【図３】図３は、ＰＤＥ１１ノックアウト（ＫＯ）マウスの精巣中でのＰＤＥ１１ｍＲＮＡの減少を示す、臭化エチジウム染色されたアガロースゲルを示す。４匹の野生型（ＷＴ；＝ＷＴ１、ＷＴ２、ＷＴ３およびＷＴ４）および４匹のＰＤＥ１１ノックアウトマウス（ＫＯ；＝ＫＯ１、ＫＯ２、ＫＯ３およびＫＯ４）から抽出された５μｇの精巣全ＲＮＡに、逆転写後、ＰＣＲを施した。ＰＤＥ１１特異的プライマー（挿入部位にわたって設計される）を用いると、４匹の野生型試料は、インタクトなＰＤＥ１１転写物の存在を示す。この転写物は、ＰＤＥ１１ノックアウト試料中では検出されない。βアクチン対照は、等量のｃＤＮＡを示す。
【図４】図４は、野生型（ＷＴ）動物（ｎ＝４）との比較において、ＰＤＥ１１ノックアウト（ＫＯ）マウス（ｎ＝４）の精巣における発現のダウンレギュレーションを示す１５種類の遺伝子を示す柱状グラフを示す。柱状グラフのバーは平均値であり、誤差バーは、＋／−標準偏差である。
【図５】図５は、野生型（ＷＴ）動物（ｎ＝４）との比較において、ＰＤＥ１１ノックアウト（ＫＯ）マウス（ｎ＝４）の精巣における発現のアップレギュレーションを示す６種類の遺伝子を示す柱状グラフを示す。柱状グラフのバーは平均値であり、誤差バーは、＋／−標準偏差である。
【図１】
2004283180.tif 000004
【図２】
2004283180.tif 000005
【図３】
2004283180.tif 000006
【図４】
2004283180.tif 000007
【図５】
2004283180.tif 000008
【配列表】
2004283180000001.app