(57)【要約】【課題】通常の蛍光ビーズはレーザで励起し、蛍光を読み取るため、光の洩れこみがおこり、ノイズの影響が無視できなかった。【解決手段】表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズを流路に導き、該流路において該機能性ビーズに電圧を印加することにより該ナノ粒子特有の波長の光を発光させ、該発光から該機能性ビーズを識別するビーズ読み取り方法、および読み取り装置。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在することを特徴とする機能性ビーズ。
【請求項２】
前記ビーズが、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ポリプロピレン、メンブレン、磁性体から選ばれたビーズであることを特徴とする請求項１に記載の機能性ビーズ。
【請求項３】
前記コート層が、金属アルコシドを脱水縮合反応させたものであることを特徴とする請求項１または２に記載の機能性ビーズ。
【請求項４】
前記ビーズがプラスチックであり、前記コート層がビニル化合物を重合させたものであることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の機能性ビーズ。
【請求項５】
前記ナノ粒子が、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子または金属化合物ナノ粒子の１種以上であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の機能性ビーズ。
【請求項６】
表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズを流路に導き、該流路において該機能性ビーズに電圧を印加することにより該ナノ粒子特有の波長の光を発光させ、該発光から該機能性ビーズを識別するビーズ読み取り方法。
【請求項７】
表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズを通過させる流路、該流路の途中に設けられた１対の電極、該電極に電圧を印加する電源、該電極から電圧を印加された該機能性ビーズからの発光を捉える受光素子を有するビーズ読み取り装置。
【請求項８】
表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズを流路に導き、該流路において該機能性ビーズに電磁波を照射することにより該ナノ粒子特有の波長の光を発光させ、該発光から該機能性ビーズを識別するビーズ読み取り方法。
【請求項９】
表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズを通過させる流路、該流路の途中に設けられた電磁波源、該電磁波源に照射された該機能性ビーズからの発光を捉える受光素子を有するビーズ読み取り装置。
【請求項１０】
前記機能性ビーズを磁力により流路を通過させるための磁石ベルトを有する請求項７または９に記載のビーズ読み取り装置。
【請求項１１】
表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズの表面に生体高分子が固定されたことを特徴とする機能性ビーズ。
【請求項１２】
請求項１１に記載の機能性ビーズの存在下に、前記生体高分子と他の生体高分子を特異的に反応させ、前記特異的反応を前記機能性ビーズを識別することを特徴とする機能性ビーズ読み取り方法。
【請求項１３】
前記特異的反応が、ハイブリダイゼーション反応、核酸増幅反応または抗原抗体反応であることを特徴とする請求項１２に記載の機能性ビーズ読み取り方法。
【請求項１４】
請求項７、９または１０に記載のビーズ読み取り装置を有することを特徴とするフローサイトメータ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は容易に識別され種々の機能を有するビーズ、該ビーズを識別する読み取り方法および読み取り装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ビーズを核酸検出に用いることが知られている。また、下記特許文献１には、蛍光マイクロビーズを免疫測定に用いることが開示されている。生体高分子間の特異的な反応のサイトとなったマイクロオーダーサイズのビーズは、有機溶媒中で染色し、蛍光顕微鏡やフローサイトメータでビーズの読み取りや識別を行っていた。しかしながら、ビーズの識別化は容易ではなく、特に数十種から数万種の多数のビーズを正確かつ容易に識別することは困難であった。また、励起にレーザ等の光源を利用し、蛍光を読み取る場合は、光の漏れこみが発生し、バックグランドは０にはならず、正確な読み取りが行えないという問題があった。
【０００３】
一方、半導体ナノ粒子や金属ナノ粒子等のナノオーダーの粒子が有機系色素に変わる標識手段として注目されている。本発明において、ナノ粒子とは一般に量子ドット、又はナノドットと呼ばれる１０ｎｍ以下の粒径を有する粒子であれば良い。好ましくは１〜５ｎｍのサイズであるが、ナノ粒子を形成する材料の種類は、金、銀、パラジウム、銅等の金属、元素半導体（Ｓｉ，Ｇｅ等）や化合物半導体（ＧａＡｓ，ＣｄＳ等）の半導体、酸化チタン、酸化錫等の金属酸化物やカルコゲナイド等が知られている。
【０００４】
半導体ナノ粒子を例にすると、粒径が１０ｎｍ以下の半導体ナノ粒子は、バルク半導体結晶と分子との遷移領域に位置することから、いずれとも異なった物理化学特性を示す。このような領域では、量子サイズ効果の発現により、粒径の減少に伴って半導体ナノ粒子のエネルギーギャップが増大する。さらにこれに付随して、バルク半導体で見られたエネルギーバンドの縮退が解け軌道が離散化し、伝導帯下端が負側に、価電子帯上端が正側にシフトする。
【０００５】
半導体ナノ粒子の製造方法は、ＣｄおよびＸ（ＸはＳ，Ｓｅ，Ｔｅ）の前駆体を等モル量溶解することで簡単に調製することができる。これらは、ＣｄＳｅ，ＺｎＳ，ＺｎＳｅ，ＨｇＳ，ＨｇＳｅ，ＰｂＳ，ＰｂＳｅなどにおける製造についても同様である。しかし、前記方法により得られた半導体ナノ粒子は、広い粒径分布を示すため、半導体ナノ粒子の特性を十分に利用することができない。このため、調製直後の広い粒径分布を有する半導体ナノ粒子から、化学的手法を用いて粒径分離を精密に行い、特定の粒子サイズの半導体ナノ粒子のみを分離・抽出することで単分散化することが試みられている。これまでに、ナノ粒子の有する表面電荷が粒径によって変化することを利用した電気泳動分離法、粒径による保持時間の差を利用した排除クロマトグラフィー、粒子サイズの違いによる有機溶媒中への分散性の差を利用したサイズ選択沈殿法があり、これらの手法とはまったく異なる方法として、半導体ナノ粒子溶液への単色光照射により粒径制御を行うサイズ選択光エッチング法などが報告されている。以上のような方法により得られた半導体ナノ粒子は、比較的波長幅の狭いピークを持つスペクトルを示す。
【特許文献１】
特開平６−３００７６３号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
マイクロオーダーのビーズを介在させた生物的に特異な反応は今後その重要性を増すものであり、その有用性のためにも容易にビーズを識別化する技術の開発が求められる。特に数十種から数万種の多数のビーズを正確かつ容易に識別することができれば、ビーズの有用性は倍増する。また、励起にレーザ等の光源を利用し、蛍光を読み取る場合には、光の漏れこみが発生し、バックグランドを０として、正確な読み取りを行うことが出来なかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は鋭意研究した結果、ビーズの表面に特定のコート層を設けた機能性ビーズを用いることで上記課題を解決した。
即ち、第１の本発明は、表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在することを特徴とする機能性ビーズである。
【０００８】
本発明で言うビーズとは、ガラス、プラスチック、セラミックス、磁性体製等の直径１００ミクロン以下、例えば数ミクロン程度の微小粒子であり、マイクロスフィアとも呼ばれているものである。本発明では、ビーズは限定されず、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ポリプロピレン、メンブレン、磁性体から選ばれたビーズが好ましく例示される。
【０００９】
前記コート層としては、チタンアルコキシド、ケイ素アルコキシド等の金属アルコシドを脱水縮合反応させたものが好ましく例示される。また、前記ビーズがプラスチックである場合には、前記コート層がビニル化合物を重合させたものであることができる。
【００１０】
本発明で言うナノ粒子とは、一般に量子ドット、又はナノドットと呼ばれる１０ｎｍ以下の粒径を有する粒子であれば良い。好ましくは１〜５ｎｍのサイズであるが、ナノ粒子を形成する材料の種類や目的とする機能によっても異なるため一概に限定されない。また、ナノ粒子を構成する材料は特に限定するものではない。例えば、金属としては、金、銀、パラジウム、銅等、半導体としては、元素半導体（Ｓｉ，Ｇｅ等）や化合物半導体（ＧａＡｓ，ＣｄＳ等）等、金属化合物としては、酸化チタン、酸化錫等の金属酸化物やカルコゲナイドなど公知のものが挙げられる。
【００１１】
特に、半導体ナノ粒子は材料、粒径によって特有の蛍光を発光するので好ましい。具体的には、ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＯ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＴｉＯ２、ＷＯ３、ＰｂＳ、又はＰｂＳｅ等が好ましく例示される。
これらナノ粒子は１種類を用いることもできるが、２種以上用いることによって多数の機能性ビーズを識別することが可能となるので好ましい。
【００１２】
本発明の機能性ビーズは、例えばガラスビーズに金属アルコシドをコーティングする際に機能性粒子である半導体ナノ粒子等のナノ粒子を同時に添加し、その後に加熱することで金属アルコシドの脱水縮合反応を起こし、ガラスビーズ表面上にナノ粒子が存在するコート層を有する機能性ガラスビーズを製造することが出来る。
【００１３】
本発明において、多数の機能性ビーズを識別する原理を具体例を示して説明する。まず、２種類の蛍光波長の異なる半導体ナノ微粒子（４．２ｎｍの粒径と５．５ｎｍの粒径）を用意し、ポリスチレンビーズ（０．１μ〜１００μｍの範囲内で特に１μｍ〜１０μｍの粒径が望ましい）に結合する。この際のビーズの材料及び結合方法は特に問わない。ここでは、２種類の蛍光試薬として半導体ナノ微粒子の混合比を変えて溶媒に溶解した状態で、ポリスチレンビーズに染色する。
【００１４】
図１は、半導体ナノ微粒子の混合割合と、発光される蛍光強度との関係を示す図である。粒径が４．２ｎｍの半導体ナノ微粒子と粒径が５．５ｎｍの半導体ナノ微粒子とを混合する。その混合割合を（１０：１）から（１０：７）までに変えて、それぞれポリスチレンビーズＡ〜Ｇを染色する。ビーズＡ（４．２ｎｍ半導体ナノ微粒子：５．５ｎｍ半導体ナノ微粒子＝１０：１）とビーズＢ（１０：２）についてフローサイトメータで測定した結果を示す。４．２ｎｍ半導体ナノ微粒子に相当する５７０ｎｍの波長における光強度ピークはＡ、Ｂの両者ほとんど同じであるが、５．５ｎｍ半導体ナノ微粒子に相当する６２５ｎｍの波長の光強度ピークは、ビーズＡに対してビーズＢは５７０ｎｍの光強度ピークに対する相対強度がほぼ２倍となっている。このように５７０ｎｍの光強度ピークに対する６２５ｎｍの光強度ピークの相対強度をシグナルとして、どのビーズであるかの識別を行うことができる。
【００１５】
本発明の機能性ビーズにおいて、表面コート層はほぼ透明であるので、表面コート層中にナノ粒子は埋没していても良く、コート層表面からナノ粒子が部分的に表出して存在しても良い。
【００１６】
第２に、本発明は、表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズを流路に導き、該流路において該機能性ビーズに電圧を印加することにより該ナノ粒子特有の波長の光を発光させ、該発光から該機能性ビーズを識別するビーズ読み取り方法である。これは、上記第１の本発明の機能性ビーズが電圧を印加することにより該ナノ粒子特有の波長の光を発光する物性を利用するものである。
【００１７】
第３に、本発明は、表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズを通過させる流路、該流路の途中に設けられた１対の電極、該電極に電圧を印加する電源、該電極から電圧を印加された該機能性ビーズからの発光を捉える受光素子を有するビーズ読み取り装置である。
【００１８】
図２にビーズが搬送される際に発光を行うメカニズムを示す。図２（ａ）において、ビーズ２およびビーズ３は流路１を矢印の方向に流れて来る。流路の途中に１対の電極４が設けられている。電極４には電圧発生装置５より所定の電圧が印加されている。ここで、ビーズ２の粒径よりも電極間の位置を小さくすることにより、ビーズの表面に電極が確実に接触するように設定する。流路の幅や電極間の幅は使用するビーズの粒径に依存するが、おおむね流路の幅はビーズの粒径の３倍以上、電極間の幅は３分の２以下が好ましい。電極４は板状で薄く、ビーズの搬送経路側に可動するように斜めに設置するのが好ましい。図２（ｂ）において、両電極４に先頭のビーズ２が接触した際にビーズ２の表面に電気が流れ、ビーズ表面の半導体ナノ粒子が発光する。図２（ｃ）において、先頭のビーズが電極を通過した後、次のビーズ３が電極４に接触し、同様にビーズ表面の半導体ナノ粒子が発光する。
【００１９】
発光したビーズは図３に示すＲＧＢのカラーフィルターを備えたフォトダイオード６で光の色を判別するとともに、各色の強度を数値化することができる。これら数値は画像処理装置７で処理される。フォトダイオード６は色センサーとして機能することでビーズの色を識別することを可能とすることが出来る。また、完全な暗闇で、交流、直流問わずに電圧を印加し、ビーズの発光を行うことでバックグランドを０にすることができる。
【００２０】
第４に、本発明は、表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズを流路に導き、該流路において該機能性ビーズに電磁波を照射することにより該ナノ粒子特有の波長の光を発光させ、該発光から該機能性ビーズを識別するビーズ読み取り方法である。これは、上記第１の本発明の機能性ビーズに電磁波を照射することにより該ナノ粒子特有の波長の光を発光する物性を利用するものである。例えば、各種半導体ナノ粒子には紫外線レーザを照射することにより特有の波長の蛍光が見られることが知られている。この他、白色発光ダイオードやハロゲンランプ等の光を照射して、ナノ粒子からの反射光を読み取っても良い。
【００２１】
第５に、本発明は、表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズを通過させる流路、該流路の途中に設けられた電磁波源、該電磁波源に照射された該機能性ビーズからの発光を捉える受光素子を有するビーズ読み取り装置である。
【００２２】
図４にビーズ表面のナノ粒子の蛍光強度を読み取るための装置概要を示す。流路１を矢印方向に流れるビーズ２に白色ＬＥＤ８より白色光を照射して、ビーズ表面に存在する半導体ナノ粒子を励起し、半導体ナノ粒子からの蛍光を光ファイバー９でフォトダイオード６に導く。図３と同じくＲＧＢのカラーフィルターを備えたフォトダイオード６で光の色を判別するとともに、各色の蛍光強度を数値化することができる。これら数値は画像処理装置７で処理される。フォトダイオード（色センサー）は、蛍光を測定するために周囲の色に曝されない部分に設置する。また、この装置はビーズの蛍光だけでなく、反射光や錯乱光も感知するために、流路の測定部分をビーズが通過したかどうかを確認すると同時に、ビーズの粒径も反映するために、ビーズの粒径を測定することも可能となる。
【００２３】
磁性体のビーズ１０を用いた場合には、図５に示すように、上記の各ビーズ読み取り装置の流路１に沿って機能性ビーズを磁力により流路を通過させるための磁石ベルト１１を有することもできる。機能性ビーズをフローさせる手段に磁力を用いることにより、微小なビーズでもスムースにフローさせることができる。
【００２４】
第６に、本発明は、表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズの表面に生体高分子が固定されたことを特徴とする機能性ビーズである。ここで、生体高分子とは、タンパク質、ポリアミノ酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成高分子等の１種以上である。このような生体高分子が固定されたことを特徴とする機能性ビーズはイオン性高分子同定用高分子チップ、ＤＮＡチップ等のバイオチップとして用いられる。特に、機能性ビーズの表面に固定された第１のＤＮＡに、第２のＤＮＡを相補的に結合させて二重鎖ＤＮＡを有するプローブとしたＤＮＡチップが好ましく例示される。
【００２５】
第７に、本発明は、上記第６の本発明の機能性ビーズの存在下に、前記生体高分子と他の生体高分子を特異的に反応させ、前記特異的反応を前記機能性ビーズを識別することを特徴とする機能性ビーズ読み取り方法である。ここで、特異的反応としては、ハイブリダイゼーション反応、核酸増幅反応または抗原抗体反応等が好ましく例示される。
【００２６】
上記の他に、本発明の機能性ビーズを用いて、特異的反応を行うことができる。例えば、コート層材料として金属アルコシドを使用し、ゾルゲル法にて対象とする生体分子のインプリンティングをビーズ表面上で行い、ビーズ表面上で目的分子をトラップすることを可能とすることが出来る。
【００２７】
第８に、本発明は、上記の各ビーズ読み取り装置を有することを特徴とするフローサイトメータである。上記の各ビーズ読み取り装置をフローサイトメータとして組み込むことにより、装置を大型化することなく高い識別性を得ることができる。
【００２８】
【実施例】
ビーズの表面に金属アルコシドでコートする際に、発光物質として半導体ナノ粒子を添加する。ＲＧＢの光の３原色として、Ｒ（赤）にＣｄＳｅ（波長７００ｎｍ）、Ｇ（緑）にＧａＰ（波長５５０ｎｍ）、Ｂ（青）にＣｄＳ（波長４９０ｎｍ）を使用する。目的とする色に応じて、それぞれの半導体粒子を添加する量を調整することで様々な色のビーズの製造を行う。
【００２９】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０００，  Ｖｏｌ．  ２８，  Ｎｏ  ２，  ｅ５によると３．１μｍ  ＣＰＧ  ｂｅａｄｓ：  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｏｌｅ  Ｇｌａｓｓ  （ＣＰＧ  Ｉｎｃ．）  を使用してガラスビーズ上にＤＮＡプライマーを貼り付けて、ガラスビーズ上でＰＣＲを行っている。しかし、通常のガラスビーズだと、ビーズ上に異なるプライマーを結合したとしてもビーズでは区別がつかないため、区別するために何らかの方法でビーズを識別する必要性があった。
【００３０】
そこで、本実施例では、ガラスビーズ表面を金属アルコシドであるＴｉ（ＯＣ２Ｈ５）４と水（Ｈ２Ｏ）を加えて加水分解を行い、反応性モノマーである（Ｃ２Ｈ５Ｏ）３ＴｉＯＨを生成し、ガラス表面をコートする。この際に機能性の粒子として半導体粒子ＣｄＳを混入する。半導体ナノ粒子であるＣｄＳのバンドギャップは２．５３ｅＶで
Ｅ＝ｈν＝ｈｃ／λ＝１２３９．８／λ
（ここで、ｈ（プランク定数）＝６．６２６×１０−３４［ジュール・秒］、Ｃは光の速度、νは振動数、λは波長）より、ＣｄＳ半導体は励起すると４９０ｎｍ（青色）で発光する。
【００３１】
ＣｄＳ半導体を混ぜ込む量を調整することで、発光強度を調節することが可能である。また、他の種類の半導体粒子をまぜることで発光する色を変えることも可能である。
これら電気発光でビーズの識別が可能になるため、例えば、塩基配列の異なるＤＮＡを発光色の異なる機能性ビーズに貼り付けることで識別が可能になる。
【００３２】
【発明の効果】
本発明により、ビーズの識別を容易にするとともに、読み取り感度を向上させることが出来る。また、共焦点レーザ顕微鏡やフローサイトメータといったレーザを搭載した装置は値段も高価で、装置も大きい。本発明の電圧を印加することによる発光では、読み取り感度を向上すると同時にレーザを搭載する必要がないため、安価でコンパクトな装置を提供可能とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】半導体ナノ微粒子の混合割合と、発光される蛍光強度との関係を示す図。
【図２】流路の中をビーズが流れる際に端子部分とビーズの接触を説明する図。
【図３】受光素子を用いてビーズの発光を読み取る装置の模式図。
【図４】ビーズの蛍光を読み取る装置の模式図。
【図５】流路の中を磁力を利用してビーズが流れることを説明する図。
【符号の説明】
１：流路、２：機能性ビーズ、３：機能性ビーズ、４：電極、５：電圧発生装置、６：フォトダイオード、７：画像処理装置、８：白色ＬＥＤ、９：光ファイバー、１０：磁性体ビーズ、１１：磁石ベルト。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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