(57)【要約】      （修正有）【課題】  抗原提示細胞による抗原提示を増強あるいは阻害するための方法を提供する。【解決手段】  抗原提示細胞による抗原提示を増強あるいは阻害するための方法であって、抗原提示細胞をＩｉの精製されたペプチドと接触させることを含む方法であって、該ペプチドは、カテプシンＢならびにカテプシンＢおよびＤの混合物からなる群から選択されたエンドプロテアーゼによるＩｉの加水分解によって得られる特定のアミノ酸配列を有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞による抗原提示を増強するための方法であって、抗原提示細胞をＩｉの精製されたペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項２】
Ｉｉのペプチドを、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンＢならびにカテプシンＢおよびＤの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるＩｉの消化によって製造することができる、請求項１の方法。
【請求項３】
ＩｉペプチドがYRMKLPKPPKPVSKMRである、請求項１の方法。
【請求項４】
抗原提示細胞による抗原提示を阻害するための方法であって、抗原提示細胞をＩｉの精製されたペプチドと接触させることを含む方法であり、当該ペプチドが、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンＢならびにカテプシンＢおよびＤの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるＩｉの消化によって製造することができる方法。
【請求項５】
抗原提示細胞による抗原提示を阻害するための方法であって、抗原提示細胞をENLRHLKNTMETLDWKV を含むＩｉのペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項６】
抗原提示細胞による抗原提示を増強するIiの精製されたペプチドであって、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンＢならびにカテプシンＢおよびＤの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるＩｉの消化によって製造することができるペプチド。
【請求項７】
抗原提示細胞による抗原提示を阻害するIiの精製されたペプチドであって、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンＢならびにカテプシンＢおよびＤの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるＩｉの消化によって製造することができるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原提示細胞による抗原提示を増強するための方法であって、抗原提示細胞をＩｉの精製されたペプチドと接触させることを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の細胞中において、外来または自己抗原からのペプチドは、ＭＨＣ分子に対して細胞内で結合した後に細胞表面にもたらされ、そこで該ペプチドおよび提示ＭＨＣ分子はＴリンパ球上の受容体によって複合体として一緒に認識される。概して、ＭＨＣ Ｉ型分子は、内因的に合成された抗原を提示し且つＭＨＣ ＩＩ型分子は外因性抗原を提示する。細胞内感染生物のペプチドフラグメントは小胞体中に移されて、合成直後のＭＨＣクラスＩ分子に対して結合する。細胞内に取り込まれた細胞外抗原のペプチドフラグメントは、ゴルジ後プロセシング区分においてタンパク質分解によって生成され、そこにおいて該フラグメントはＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するようになる。大部分の細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子によってペプチドフラグメントをプロセシングし且つ提示することができるし、そして特殊化されたクラスの抗原提示細胞もまたＭＨＣクラスＩＩ経路によって外因性抗原を提示する。例えば、マクロファージは抗原を取込み且つそれをヘルパーまたはキラー細胞に成熟するＴ細胞に対して提示し、そして処女（virgin）Ｂ細胞は抗原をそれらの表面免疫グロブリンに結合した後、細胞内に取込み、消化し、そしてその抗原のフラグメントをそれらのＭＨＣクラスＩＩ分子によってヘルパーＴ細胞に対して提示する。それらのヘルパーＴ細胞はリンホカインを放出し、そしてＢ細胞を刺激して増殖させ且つ免疫グロブリン生産性プラズマ細胞「工場」に成熟させる直接的な細胞内分子シグナルを与える。ＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原提示は、多数の防御免疫応答の開始並びに自己免疫応答の起点に極めて重要である。
【０００３】
ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖複合体の抗原負荷の重要な調節因子はＩiタンパク質である。このタンパク質は、合成時にＭＨＣクラスＩＩα,β鎖を結合し、そしてゴルジ後区分において消失し、そこにおいてそれは、外来抗原からペプチドフラグメントを生じさせる同様のプロテアーゼによって消化されたと考えられる。
【０００４】
抗原プロセシング区分においてＩiが消化されるまでのＭＨＣクラスＩＩα,β鎖上のペプチド結合部位のブロッキングは、おそらく、自己抗原提示を制限している。即ち、ＭＨＣクラスＩＩ分子は内因的に合成されたウイルス決定因子を提示することができるので、その結合状況は、（１）ゴルジ後抗原結合区分中へその区分の膜を越えた細胞質からのこのような決定因子の輸送、あるいは（２）前記ペプチドの小胞体中への輸送およびＩiの「早めの」放出によるＭＨＣクラスＩＩ分子に対する「未成熟」結合若しくはゴルジ後抗原結合区分へのおそらくは保護された複合体での該ペプチドの流動を反映していると考えられる。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖からのＩiの放出の間に開裂される部位を同定するための方法に関する。これは、例えば、ＩiをコードしているＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ構築物を提供することによって達成することができる。次に、突然変異体Ｉiの局所二次構造を変更すると予想される方法で、部位特異的突然変異誘発を行なうことによって遺伝子を修飾して、Ｉi中の予め決定されたエンドプロテアーゼの推定上の開裂認識部位かその付近にあるアミノ酸残基の同一性を変更する。次に、突然変異体ＩiＭＨＣクラスＩＩα鎖およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖を含む三量体複合体を、細胞中の対応するＤＮＡ配列の同時発現によって生成する。
【０００６】
次に、三量体複合体をインビトロでエンドプロテアーゼによって消化する。エンドプロテアーゼによる消化によって生じたペプチドフラグメントの大きさを慣用的な技法によって決定し、そして（ｅ）で決定されたフラグメントの大きさと、エンドプロテアーゼによる野生型Ｉiの消化によって生じたフラグメントの大きさとを比較して、既存の開裂部位での開裂が変更されたかどうかを決定する。
【０００７】
この方法で決定された開裂部位はＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖からの野生型Ｉiの放出の間に開裂される部位を意味する。
このような方法およびこのような方法によって同定される突然変異体は、免疫変調（immunomodulatory）活性について更に試験される小有機化合物などの化合物のクラスを同定するのに有用である。このような方法での最初の工程は、Ｉi開裂経路の中間体に対して選択的に結合する小有機化合物を同定することである。次に、この方法で同定された化合物を抗原提示細胞と接触させ、そして抗原提示の変化を測定する。
【０００８】
発明の詳細な説明
免疫調節タンパク質Ｉiは、合成時のＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖を結合し、おそらく、タンパク質抗原が消化されてＭＨＣクラスＩＩ分子に対して結合するペプチドになる同じ細胞内区分において、細胞内プロテアーゼカテプシン（cathepsins）ＢおよびＤ（レイズ（Reyes），Ｖ．Ｅ．他、１９９１年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：３８７７〜３８８０）を含むプロテアーゼによってα,β鎖から開裂され且つ放出されることが実証されている（トーマス(Thomas)，Ｌ．Ｊ．他、１９８８年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：２６７０〜２６７４）。
【０００９】
外来ペプチドは、カテプシンＢによるＩiの開裂および放出の間にそれらが存在する場合、一層効率よくＭＨＣクラスＩＩ分子に対して結合することが分かっている。このようなペプチドの結合は、カテプシンＤ単独による消化の間に存在する場合は促進されないが、少量のカテプシンＤは、カテプシンＢによって触媒されたペプチドの結合レベルを更に増加させる。これらの知見は、ＭＨＣクラスＩＩα,β−Ｉiフラグメント中間体中への外来ペプチドの同時挿入を伴うＩiの段階的開裂および放出の仮説を導く。この仮説の妥当性を、本明細書中において、推定上の開裂部位での突然変異体の設計、生成および試験によって実証する。
【００１０】
本発明は、カテプシンＢ開裂の二残基モチーフ（疎水性−陽イオン性）およびカテプシンＤ開裂の二残基モチーフ（疎水性−疎水性）を基準とするＩi中の開裂部位の同定に依存する。それらの開裂部位のサブセットはＩiの一次アミノ酸配列の領域でクラスターを形成して、局所二次構造を有するように見え、従って、複合体の構造および機能を制御するように見える。ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖の一般的な構造は、細胞膜を介してそれらのＣ末端に挿入される２種類のタンパク質から成る。α,β鎖の二つの外部Ｎ末端部分はそれぞれ、αヘリックスが位置するβプリーツ（β-pleated）シートを支持する球状ドメインで、細胞表面付近に巻かれている。二つの鎖はほぼ鏡像であり、そしてβプリーツシートの一端で、該シートが二つのαヘリックスを逆平行様式で支持するような様式で一緒になる（ブラウン（Brown），Ｊ．Ｈ．他、１９８８年，Ｎａｔｕｒｅ３３２：８４５〜８５０）。抗原ペプチドは、逆平行ヘリックス間に（抗原結合部位に）結合し、そして複合体全体（具体的には、外来ペプチド上および隣接するαヘリックス上の一定の残基）がＴリンパ球上の受容体によって認識される。Ｉiは、逆平行αヘリックス間に結合することによってＭＨＣクラスＩＩα,β鎖に対するペプチド負荷を開裂および放出まで阻止しうる。或いはまた、Ｉiは、ペプチドを受容する抗原結合部位の能力を間接的に（アロステリックに）調節する別の様式でＭＨＣクラスＩＩα,β鎖と相互作用するのかもしれない。
【００１１】
合成時にＭＨＣクラスＩＩα,β鎖に対して結合される不変鎖Ｉiは、ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖複合体の、小胞体中のそれらの合成部位から、細胞内に取込まれ且つ消化された外来抗原に該複合体が遭遇するゴルジ後区分への、細胞内輸送を支配すると考えられる（グアグリアルジ（Guagliardi），Ｌ．Ｅ．他、１９９０年，Ｎａｔｕｒｅ，３４３：１３３〜１３９）。ＭＨＣクラスＩＩα,β複合体上のＩi鎖の存在は、ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖の抗原結合部位における抗原ペプチドの結合を阻止すると考えられる（テイトン（Teyton），Ｌ．他、１９９０年，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：３９〜４４；ロシェ（Roche），Ｐ．他、１９９０年，Ｎａｔｕｒｅ，３４５：６１５〜６１９）。それらの報告において、クラスＩＩα,β鎖からのＩiの完全な除去は、外来ペプチドの結合前に生じると提唱されている。外来ペプチド結合が、タンパク質分解されたＩiのフラグメントの除去と協調した結果として生じ、しかもそれによって触媒されることさえあるということを実証することは、本発明の開示に特有のものである。
【００１２】
カテプシンＢおよびＤは両方とも、抗原タンパク質を免疫原性フラグメントに消化し且つＭＨＣクラスＩＩα,β鎖からＩiを放出させることができる。カテプシンＢおよびカテプシンＤは、抗原ペプチドフラグメントを生じる（タカハシ（Takahashi），Ｈ．他、１９８９年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：２２２１〜２２２６；ロシェ（Roche），Ｐ．他、１９９０年，Ｎａｔｕｒｅ，３４５：６１５〜６１９；ロドリゲツ（Rodriguez），Ｇ．Ｍ．他、１９９２年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９：２８９４〜２８９８）。カテプシンは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するペプチド負荷が起こると考えられる細胞内区分において見出される（グアグリアルジ（Guagliardi），Ｌ．Ｅ．他、１９９０年，Ｎａｔｕｒｅ，３４３：１３３〜１３９）。チオールプロテアーゼカテプシンＢおよびアスパルチルプロテアーゼカテプシンＤは、Ｉiのｐ２１および他の更に小さいフラグメントを生じる（ロシェ（Roche），Ｐ．Ａ．他、１９９１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３１５０〜３１５４；レイズ（Reyes），Ｖ．Ｅ．他ら、１９９１年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：３８７７〜３８８０）。カテプシンＢ阻害剤ロイペプチン（leupeptin）は、Ｉiのｐ２１およびｐ１４フラグメントまでの最終タンパク質分解を制限し（ブルム（Blum），Ｊ．Ｓ．他、１９８８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：３９７５〜３９７９；グエン（Nguyen），Ｑ．Ｖ．他、１９８９年，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：１５３〜１６３）、且つインビトロでの抗原負荷を阻止する（プリ（Puri），Ｊ．他、１９８８年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１：３３１３〜３３１９）。カテプシンＢはロイペプチンによって阻害されたがカテプシンＤは阻害されなかったので（ボンド（Bond），Ｊ．Ｓ．、１９８９年、商業的に入手可能なプロテアーゼ。Ｒ．Ｊ．ベイノン（Beynon）他によって監修されたＰｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ；Ａ ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，２３２頁，ＩＲＬプレス，ニューヨーク）、Ｉiの細胞内開裂は、カテプシンＤに続いてカテプシンＢの逐次的作用を必要とすると考えられる。精製されたα,β，Ｉi三量体のカテプシンＢ消化は、ペプチド結合部位を生じた（ロシェ（Roche），Ｐ．Ａ．他、１９９１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３１５０〜３１５４）。
【００１３】
ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖とまだ結合した、またはそれらから放出されたＩiフラグメントの独特のパターンは、カテプシンＢまたはＤによるタンパク質分解放出後にみられた（レイズ（Reyes），Ｖ．Ｒ．他、１９９１年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：３８７７〜３８８０）。カテプシンＢは、Ｉiのｐ２１およびｐ６フラグメントを生じた。Ｉi中の包含された［35Ｓ］システインも唯一のシステインもＣ28位にあるので、それらはＮ末端であったし、ｐ２１はＭ1−Ｋ138であると考えられた。ｐ６フラグメントはＭ1−Ｒ61であり得る。過渡的ｐ２４フラグメントはＭ1−Ｋ154 でありうる。ｐ２１およびｐ１０ Ｉiフラグメントは、代謝的放射性標識後のロイペプチン処理された細胞中で大きく増加されて、それらのフラグメントを更に分解する内因性カテプシンＢのロイペプチンによる部分阻害のために強調されると考えられる（ルーデンスキー（Rudensky），Ａ．Ｙ．他、１９９１年，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：６２２〜６２７；チッツ（Chicz），Ｒ．Ｍ．他、１９９２年，Ｎａｔｕｒｅ，３５８：７６４〜７６８）。
【００１４】
カテプシンＤは、Ｉiを、個々の分子中の開裂部位の見掛け上の混合物を伴うことなく二つの別々のパターンに開裂させた。更に、相対的に基本的な可変性シアル酸誘導体のＮ末端ｐ２５のＮ末端性状は、それがＩi中の唯一のシステインであるＣ28を含んでいたために、識別された。［35Ｓ］システインを含むこのｐ２５ｂ型は、Ｍ1 −Ｗ168 およびＭ1 −Ｌ173 から誘導することができた。
【００１５】
本発明は、ゴルジ後ＭＨＣクラスＩＩ抗原−Ｉi交換区分におけるＩi放出の間の抗原負荷の過程が、ＩiおよびＭＨＣクラスＩＩα,β鎖を含む三量体複合体からのＩiの逐次的または段階的開裂を伴うという知見に基づく。これらの結果は、ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖に対するペプチド結合が、抗原プロセシング細胞中に存在するエンドプロテアーゼによるＩiの開裂および放出と協調した過程であることを実証する。ペプチドは、Ｉiフラグメントの放出のある段階で抗原結合部位に挿入される。本発明は、推定上の開裂部位でのＩi突然変異体の使用によってＩiの開裂および放出の段階を決定する方法を構成する。Ｉi開裂／放出−ペプチド負荷機序における中間体をこのように組み立てる、タンパク質分解処理後に選択されたＩi突然変異体は、ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖による抗原の負荷および提示に影響を及ぼす小さな有機分子のスクリーニングに用いることができる。更に、Ｉiのフラグメントの相同体は、ペプチド負荷過程、またはおそらくは免疫応答の他の段階を調節することができる。
【００１６】
従って、一つの態様において、本発明は、ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖からのＩiの放出の間に開裂される部位を同定するための方法に関する。この方法は、ＩiをコードしているＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ構築物の使用を包含する（例えば、ストルビン（Strubin）他、ＥＭＢＯ Ｊ．３：８６９〜８７２（１９８４）を参照されたい）。部位特異的突然変異誘発を組換えＤＮＡ構築物上で慣用的な技法を用いて行なって、突然変異体Ｉi中の開裂部位特異性を変更すると予想される方法で、予め決定されたエンドプロテアーゼの推定上の開裂認識部位かまたは付近にあるアミノ酸残基の同一性を変更する。テトラプロリル陽イオン性偽ヘリックスまたはねじれ（kink）および両親媒性αヘリックスそれぞれに似ている二つの局所セグメントの周囲にクラスター形成した疎水性で且つ正電荷の隣接したアミノ酸残基の高度に反復されたパターンは、それらの部位がカテプシンＢによって開裂されていることを示唆した。Ｌｅｕ97Ｌｅｕ ＭｅｔおよびＬｅｕ173 Ｌｅｕ Ｐｈｅでの３個の隣接した疎水性残基の方向は、カテプシンＤの既知の開裂部位特異性と一致する。開裂部位特異性を変更することが予想されるアミノ酸置換は、概して、野生型分子中に存在する残基のそれとは異なるＲ基官能性の基準で選択される。このような特定の開裂部位を変更することが予想される最も多く選択されるアミノ酸置換は、野生型分子中に存在するアミノ酸をアラニンで置き換えることである。
【００１７】
ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖からのＩiの放出の間に開裂される部位を同定するための方法における次の工程は、突然変異体Ｉi並びにＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖を含む三量体複合体を形成することである。これは、上記の突然変異体Ｉi遺伝子とＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖との同時発現によって最も好都合に達成される。この同時発現は、慣用法を用いて、好ましくはＣＯＳ細胞などの培養された哺乳動物細胞中で達成される。ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖をコードしているＤＮＡは、ロックビル、ＭＤのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手することができる。三量体複合体の成分をコードしている三つの遺伝子を、発現（好ましくは、インビボでもインビトロでも）のために必要であることが知られている調節配列と選択可能なマーカーとを含むＤＮＡ発現構築物中に配置させる。培養細胞の使用は、本開示の文脈中においてはインビトロ使用であると考えられる。次に、構築物を用いて、培養中の哺乳動物細胞をトランスフェクトさせる。トランスフェクション後の適当な時間、細胞を増殖させ、そして代謝的に放射性標識する（例えば、［35Ｓ］メチオニンを用いて）。次に、ミクロソーム膜を慣用法によって放射性標識細胞から調製した後、非イオン性界面活性剤中で可溶化させる。この段階で、組立てられた三量体複合体の存在を、免疫生化学的方法によって（例えば、免疫沈降によって）確証することができる。この確証に有用である三量体複合体の成分と反応性のある抗体は、ＡＴＣＣからおよび商業的源から入手可能である。
【００１８】
次に、界面活性剤で可溶化されたミクロソーム膜調製試料の成分として存在する組立てられた三量体複合体を、抗原提示細胞中に存在する細胞内プロテアーゼであると考えられるエンドプロテアーゼによって消化する。好ましいエンドプロテアーゼとしては、カテプシンＢおよびＤがある。このような酵素は商業的に入手可能であり且つ適当なインキュベーション条件を記載しているプロトコルと一緒に供給されている。消化時間および酵素濃度は、中間体フラグメントから検出される最小のペプチドまでの内部タンパク質分解消化産物のスペクトルを示すように変更することができる。消化産物の大きさは、例えば、ＳＤＳ−ゲル電気泳動によって（例えば、ポリアクリルアミド電気泳動用媒質中で）決定される。バンドパターンを消化時間と相関させることにより、それぞれのプロテアーゼによるＩi分子の開裂の連続パターンを推論することが可能である。
【００１９】
次に、この方法で決定されたペプチドフラグメントの大きさを、エンドプロテアーゼによる野生型Ｉiの消化によって生じたフラグメントの大きさと比較して、既存の開裂部位での開裂が変更されたかどうかを決定する。この比較によって決定される開裂部位は、ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖からの野生型Ｉiの放出の間に開裂される部位を表す。
【００２０】
以下の実施例に記載されるように、いくつかの突然変異体Ｉi分子を前記の方法で同定した。本明細書中で用いられる命名は、一文字アミノ酸略号を用いる。
この方法で同定された突然変異体をそれぞれ、文字「Ｍ」（突然変異体として）の後に、突然変異体に存在する特定の突然変異を明記する括弧付きの情報によって示す。例えば、Ｍ［Ｒ19→Ａ；Ｒ20→Ａ］は、１９位のアルギニンがアラニンで置き換えられ且つ２０位のアルギニンがアラニンで置き換えられている突然変異体Ｉiを示す。野生型のものとは異なるエンドプロテアーゼ消化パターンを示す具体的に同定された他の突然変異体は、Ｍ［Ｒ78→Ａ；Ｋ80→Ａ；Ｋ83→Ａ；Ｋ86→Ｔ］；Ｍ［Ｋ137→Ａ；Ｋ143→Ａ］；Ｍ［Ｒ151→Ａ；Ｋ154→Ａ］；およびＭ［Ｌ174→Ｖ；Ｆ175→Ａ］である。
【００２１】
本発明のもう一つの態様は、Ｉi開裂経路の中間体に対して選択的に結合する小さな有機化合物を同定するための方法に関する。このような中間体は、例えば、開裂／放出における速度制限段階、すなわちペプチド負荷過程を模擬しうる。
【００２２】
本明細書中で用いられる小さな有機化合物は、化学合成によって誘導されるまたは生物学的源からの抽出物として得られる、好ましくは、３，０００未満の分子量、そして最も好ましくは１，０００未満の分子量の有機化合物である。構造的特徴に関して系統化されたこのような小さな有機化合物のライブリーをこのようなスクリーニング目的のために維持し且つ慣例的に用いる。
【００２３】
このような小さな有機化合物を同定するための好ましい方法は、例えば、Ｔ細胞提示ペプチドまたはその相同体を用いる阻害結合検定を開発することである。
Ｔ細胞提示ペプチドとは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の前後関係においてＴ細胞ハイブリドーマによって認識された独特のエピトープを含むことが実証されているペプチドである。これらは、例えば、プロテアーゼ消化および単離によって、または化学合成によって生じさせることができる。本明細書中で用いられる、Ｔ細胞提示ペプチドの相同体とは、アミノ酸置換を有するペプチド、このようなペプチドのフラグメント、またはＴ細胞提示ペプチドのセグメントに対して構造的相同性を有すると考えられる小さな有機化合物として定義される。このような阻害検定は、インビトロで以下の成分、すなわち、（１）エンドプロテアーゼ消化パターンが野生型のものとは異なる突然変異体Ｉiと、ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖とを含むエンドプロテアーゼで消化された第一の三量体複合体、（２）Ｔ細胞提示ペプチド結合の阻害について試験される小さな有機分子および（３）Ｔ細胞提示ペプチドを組合わせることによって実施される。このような検定において、Ｔ細胞提示ペプチドのエンドプロテアーゼで消化された三量体複合体に対する結合が小さな有機化合物の存在下で阻止される場合、小さな有機化合物は段階的開裂過程の中間体に結合していると結論を下すことができる。ＥＬＩＳＡ検定などの指示検定は、指示化合物の結合を阻害する化合物を同定するのに用いることができる。このような検定は、Ｔ細胞提示ペプチド（またはその相同体）に対する結合親和性について試験される精製分子を固体支持体に対して結合することによって行なわれる。次に、溶液中に存在するＴ細胞提示ペプチド（またはその相同体）を、結合に適当な条件下において固体支持体に結合された分子と一緒にインキュベートする。このような結合は、Ｔ細胞提示ペプチドまたはその相同体に対して結合した指示薬の認識によって確認される。
【００２４】
上記で論及された結合の選択性は、野生型Ｉi、ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖を含む第二の三量体複合体；並びにＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖を含む二量体に対する小有機化合物の結合に関して定義される。野生型Ｉi、ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖を含む第二の三量体複合体；並びにＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖を含む二量体に対する結合親和性よりも少なくとも約３倍高い、エンドプロテアーゼで消化された第一の三量体複合体に対する結合親和性を示す化合物は、本方法の選択性必要条件を満たす。結合親和性決定は、種々の周知の技法（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて行なうことができる。
【００２５】
結合親和性決定は、以下の複合体、すなわち、（１）プロテアーゼで消化された第一の三量体複合体、第二の三量体複合体（野生型Ｉiを含む）、並びにＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖についてそれぞれ別々に行なわれる。必要な選択性を実証する野生型Ｉi含有複合体を同定する。次に、このような突然変異体を同様の阻害結合検定において用いる。更に具体的には、ＥＬＩＳＡ阻害結合検定の場合、突然変異体複合体を固体支持体に固定した後、選択された小さな有機分子と一緒にインキュベーションする。小さな有機分子の濃度は経験的に決定されるであろう。このスクリーニング工程の目的は、突然変異体Ｉi含有複合体に対して結合することによってＴ細胞提示ペプチド（またはその相同体）の突然変異体Ｉi含有複合体に対する結合を阻害する小有機分子を同定することである。
【００２６】
上記の結合阻害検定において同定された小有機化合物を免疫変調活性について検査することができる。この目的に用いることができる種々の検定（インビボでもインビトロでも）は当該技術分野において知られている。このような検定の一つの例は、応答Ｔリンパ球に対する抗原提示細胞による免疫原ペプチドの提示の変調の分析を含む。更に具体的には、免疫変調活性について検査される小さな有機化合物を、既知のＴ細胞免疫原ペプチド、その制限性抗原提示細胞、および抗原提示細胞の前後関係において免疫原ペプチドに対して特異的に応答するＴ細胞を含む細胞培養物と接触させる。阻害化合物が不存在の場合、論及された成分の組合わせはＴ細胞刺激を引き起こす。Ｔ細胞刺激は、例えば、Ｔ細胞からのインターロイキン放出の測定によって検出することができる。しかしながら、小さな有機化合物が免疫変調作用を有する場合、阻害剤を伴わない基底レベルのＴ細胞刺激は検出可能的に変更される。本明細書中で用いられる、検出可能的に変更されるとは、小さな有機分子を含まない対照試料でのＴ細胞活性化レベルに相対する、小有機化合物含有混合物で測定されたＴ細胞活性化レベルの１より大の標準偏差の変化を意味する。
【００２７】
もう一つの態様において、本発明は、免疫変調ペプチドの同定に関する。ＭＨＣクラスＩＩ分子からのＩi放出は、ＭＨＣクラスＩＩ複合体の抗原結合部位中への免疫原ペプチドの挿入を伴う段階的過程として起こるという仮説が与えられると、Ｉiのペプチドは中間体複合体中の選択された位置に結合し、それによって抗原提示の過程を変調すると提唱することは道理にかなっている。この仮説を試験するために、Ｉiペプチドおよびそれらの相同体を上記の種類の抗原提示検定と関連させて免疫変調活性を決定する。
【００２８】
この種類の検定を用いて、免疫変調活性を有するＩiのペプチドを同定した。
抗原提示のエンハンサーおよび阻害剤の両方を同定した。例えば、抗原提示を促すペプチドとしては、［Ｔｙｒ−Ｉi（７８〜９２），（ＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ）］があり；そして抗原提示を阻害するペプチドは、［Ｉi（１４８〜１６４），（ＥＮＬＲＨＬＫＮＴＭＥＴＬＤＷＫＶ）］および［ＬＹＥＬＱＴＫＬＱＴＬＫ］である。セッテ（Sette）ら（（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１８０１〜１８０４）が、Ｔ細胞提示ペプチドの結合に対する阻害作用を有するＩiのペプチドを報告したことは注目される。しかしながら、抗原提示を促すＩiペプチドの開示がこれまでに文献で報告されたことはなかった。ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖の結合を保持するが、抗原提示の促進に関係した機能を妨げるアミノ酸残基の系統的置換によって抗原提示を阻害する［Ｔｙｒ−Ｉi（７８〜９２），（ＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ）］の相同体を当業者が得ることはできると考えられる。
【００２９】
本発明の開示は、自己免疫疾患の治療と密接に関係している。Ｔ細胞に対するＭＨＣクラスＩＩα,β鎖に媒介された抗原提示を阻害する治療薬の開発は、例えば、クラスＩＩα,β鎖の構造変化が抗原ペプチドを抗原結合部位中に閉込める引続の工程まで進行を阻止するこれらの突然変異体Ｉi分子によって与えられたこのような過渡期複合体相同体の使用によって大いに促進される。
【００３０】
ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖がＩiの相対的または絶対的欠失によって誘導される一定の細胞による内因性自己抗原決定因子のＭＨＣクラスＩＩに媒介された提示。抗原のＭＨＣクラスＩＩに媒介された提示のための大部分のモデルは、ゴルジ後／エンドソーム区分においてクラスＩＩα,β鎖に対して結合されるようになる外因性抗原を取込み且つ消化することを含むが、抗原提示細胞によって内因的に合成された抗原もまた提示される。ＭＨＣクラスＩ分子に対して結合するために小胞体中に輸送されるそれらの抗原のフラグメントは、通常、クラスＩＩ分子の輸送およびプロセシングの間にＩi分子が抗原結合部位中への挿入を妨げるので、ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖に対して結合しない。膵臓β細胞などの一定の細胞では、一定の病理学的条件下において、ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖をＩiの絶対的または相対的欠失によって誘導することができる。次に、他の場合にクラスＩ ＭＨＣ分子に対して結合するように予定された内因性ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖にも結合されるようになり、引続きＴ細胞に対して提示されることによって自己免疫応答を誘導すると考えられる。
【００３１】
このような異常な病理学的条件下におけるこの内因性抗原の提示は、Ｉiの機能を突然変異体Ｉi遺伝子から生じたタンパク質と、またはこのような構造を用いるスクリーニングによって同定されたか若しくはこのような構造から設計されたペプチドフラグメント若しくは化合物と置き換えることによって阻害されることがある。例えば、この条件は、完全に開裂されていないが、クラスＩＩ ＭＨＣα,β鎖に対して結合した状態のままである、例えば、Ｍ［Ｒ78→Ａ；Ｋ80→Ａ；Ｋ83→Ａ；Ｋ86→Ｔ］、しかもペプチドの負荷または負荷されたペプチドのＴ細胞に対する細胞表面での提示を妨げる（または阻害する）Ｉi突然変異体の発現によってこのような細胞中で補正することができる。理論によって拘束されることはないが、野生型ＩiまたはＭＨＣα,β鎖に対する保持特性について選択されるＩi突然変異体を、抗原の結合が正常な生理学的条件下で起こると考えられるゴルジ後／エンドソーム区分以外でのそれらの輸送およびプロセシングの間のＭＨＣクラスＩＩα,β鎖に対するペプチドの結合を阻止するために、自己抗原を提示するように提案された細胞中で発現させる。膵臓β細胞の場合、野生型Ｉiまたは選択されたＩi突然変異体の遺伝子を、その構築物を生成するための確立された分子生物学的技法を用いてインスリンのプロモーターの制御下で発現させる。インスリンプロモーター−Ｉi遺伝子構築物を、トランスジェニック法または均等な方法によって挿入する。自己抗原のＭＨＣクラスＩＩ提示を阻害するこの方法の改良に最適な条件をノノベース（ｎｏｎｏｂｅｓｅ）糖尿病マウスモデルで確立した後、真性糖尿病および他の自己免疫疾患の治療のためにヒト被験者に用いる。
【実施例】
【００３２】
実施例１：カテプシンＢによるＩi放出の間のペプチド結合
ペプチド結合の効率を、可溶化されたＭＨＣクラスＩＩα,β，Ｉi複合体からのカテプシンＢで媒介されたＩiの放出の間に試験した。種々の濃度のカテプシンＢ、ｐＨ５．０［Ａ：酵素なし（ペプチドのみ）；ＢカテプシンＢ（０．１Ｕ／ｍｌ）；Ｃ：カテプシンＢ（０．５Ｕ／ｍｌ）；Ｄ：カテプシンＢ（２．５Ｕ／ｍｌ）］による室温または３７℃で５分間、１５分間、３０分間または６０分間の消化を、結合されたところで引き続き架橋された、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアジドベンゾイル（ＨＳＡＢ）標識され、125Ｉ−放射性標識されたインフルエンザウイルスＭＡ（１８〜２９）ペプチド存在下で行なった。このＨＬＡ−ＤＲ１で制限されたＴ細胞提示ペプチドを、ＤＲ−１陽性ジェストム（Ｊｅｓｔｈｏｍ）細胞系によって試験した。放射性ヨウ素化ペプチド（１００ｎＭ）を、種々の時間Ｉiを開裂したカテプシンＢによってジェストム細胞から可溶化されたミクロソーム膜タンパク質に対して加えた。それぞれのインキュベーション後、２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド酸および１ｍＭヨードアセトアミドを含む１０ｍＭトリス、ｐＨ９．０を用いる１：１希釈によって酵素を失活させた。次いで、ペプチドを、アジド基の紫外線活性化の後にα,β鎖に架橋させた。架橋ペプチドを、ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖に対して架橋したペプチドの量の漸進的増加による消化の５分目に検出した。比較しうる時点および温度で、約１０倍程度のペプチドが、酵素を伴わないペプチド単独によるよりもカテプシンＢ ０．０５Ｕ／ｍｌによって結合した。ペプチド結合は、酵素の量、インキュベーション時間およびインキュベーション温度に比例して増加した。
【００３３】
実施例２：カテプシンＢの失活後のペプチドの添加
ペプチド結合は、カテプシンＢ処理なしでは検出されなかったが、ペプチドがＩiタンパク質分解中に存在した場合、はるかに多量のペプチドが結合された。
【００３４】
ＭＨＣクラスＩＩα,β，Ｉi三量体に対するペプチドの結合を、カテプシンＢによってＩiを放出したＭＨＣクラスＩＩα,β二量体に対する結合と比較した。ＭＨＣクラスＩＩα,β，Ｉi三量体を含む界面活性剤で可溶化されたミクロソーム膜を、カテプシンＢ（０、０．１、０．５、２．５Ｕ／ｍｌ）と一緒に125Ｉ−標識ＨＳＡＢ−ＭＡ（１８〜２９）ペプチド（１００ｎＭ）存在下においてｐＨ５．０、室温で３０分間インキュベートした。そのインキュベーション後、ペプチドをそれが結合されたところで光活性化によって架橋し、そして試料を抗クラスＩＩ ｍＡｂによって免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、そして乾燥ゲルにオートラジオグラフィーを行なった。或いは、可溶化されたミクロソーム膜との３０分間のインキュベーション後、２ｍＭフェニルメチルスルホン、１０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミドおよび１ｍＭヨードアセトアミドを含む１０ｍＭトリス、ｐＨ９．５を用いる１：１希釈によって酵素を失活させた。
【００３５】
125Ｉ−標識ＨＳＡＢ−ＭＡ（１８〜２９）を更に３０分間加え、ペプチド架橋のために光活性化させた。抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体によるこれらの試料の免疫沈降物を上記のように処理した。ペプチドは、カテプシンＢ ０．５Ｕ／ｍｌまたは２．５Ｕ／ｍｌによる消化からのオートラジオグラフのデンシトメトリーによって判定したところ、後で加えられた場合よりも、カテプシンＢ消化中に存在する場合に約３倍効率よくＭＨＣクラスＩＩα,β鎖に対して結合した。ペプチドは、カテプシンＢによって処理されなかったＭＨＣクラスＩＩα,β，Ｉi複合体に対して結合しなかった。
【００３６】
実施例３：カテプシンＤによるＩi放出の間のペプチド結合
ペプチド結合は、カテプシンＤによるＩi開裂の間には促進されなかった。ＭＨＣクラスＩＩα,β，Ｉi三量体を含む界面活性剤で可溶化されたミクロソーム膜を、種々の量のカテプシンＤと一緒に125Ｉ−標識ＨＳＡＢ−ＭＡ（１８〜２９）ペプチド（１００ｎＭ）存在下において３０分間インキュベートし、架橋させ、そして上記のように処理した。Ｉiを開裂したがそのフラグメントのＭＨＣクラスＩＩα,β鎖からの完全な解離を速やかにもたらさなかったカテプシンＤの広範囲の濃度下において（レイズ（Reyes），Ｖ．Ｅ．他、１９９１年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：３８７７〜３８８０）、放射性ヨウ素化ＭＡ（１８〜２９）ペプチドの促進された結合はみられなかった。
【００３７】
ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖に対するペプチド結合が、カテプシンＢ（カテプシンＤではなく）処理の間にペプチドの存在によって促進されたという知見は、これらのフラグメントの開裂および放出が、抗原ペプチドによるＭＨＣクラスＩＩ分子の付加と協調した過程を構成しているという結論を導く。
【００３８】
実施例４：ペプチド結合に対する競合
ＨＬＡ−ＤＲ１+ジェストム（Jesthom）ヒトＢリンパ芽球細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子に対する［125Ｉ］ＭＡ（１８〜２９）結合特異性を、ＭＡ（１８〜２９）ペプチド、ＨＬＡ−ＤＲ１制限インフルエンザＨＡ（３０６〜３１８）、ＨＬＡ−ＤＰ制限デング熱ウイルスＮＳ３（２５１〜２６５）およびＨＬＡ−Ｂ３７制限インフルエンザウイルスＮＰ（３３６〜３５６）との競合によって検査した。これらのペプチドおよび125Ｉ標識ＨＳＡＢ−ＭＡ（１８〜２９）ペプチド（１００ｎＭ）を、ＭＨＣクラスＩＩα,β，Ｉi三量体を含む界面活性剤で可溶化されたミクロソーム膜と一緒にカテプシンＢ ０．５Ｕ／ｍｌの存在下で３０分間インキュベートし、架橋のために光活性化し、そして抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体との免疫沈降物を上記のように処理した。結合に対する競合は、ＨＬＡ−ＤＲ１制限ペプチド、すなわちヒトＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ１分子を結合後のＴリンパ球によって認識されることが他で示されたペプチドによってのみ見られた。すなわち、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する［125Ｉ］ＨＳＡＢ−ＭＡ（１８〜２９）（１０-7Ｍ）の結合は、冷ＨＳＡＢ結合ＭＡ（１８〜２９）およびインフルエンザウイルスＨＡ（３０６〜３１８）と競合したが、インフルエンザウイルスＮＰ（３３６〜３５６）およびデング熱ウイルスＮＳ３（２５１〜２６５）とは競合しなかった。
【００３９】
実施例５：カテプシンＤの添加によるカテプシンＢに媒介されたペプチド結合の一層の促進
Ｉiを開裂するのが見られたカテプシンＤの最低量は０．１Ｕ／ｍｌであった。［35Ｓ］メチオニン標識ジェストム細胞から可溶化されたミクロソーム膜タンパク質を、カテプシンＤ（濃度０、０．０１、０．０５、０．１、０．５、２．５、１０．０Ｕ／ｍｌ）によってｐＨ５．０で室温において３０分間処理した。  インキュベーションの最後に酵素を失活させ、そして抗クラスＩＩ ｍＡｂ，ＩＶＡ１２または抗Ｉi ｍＡｂ，ＶＩＣ−Ｙ１によって免疫沈降物を生成させた。免疫沈降した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオクラフィーによって分析した。第二の実験において、Ｉiを開裂するのが見られたカテプシンＤの最低量（０．１Ｕ／ｍｌ）を、種々の濃度のカテプシンＢ（０．０２〜０．５Ｕ／ｍｌ）存在下のペプチド結合検定に加えた場合、ペプチド結合の正味量は、オートラジオグラフのデンシトメトリーによって判定したところ、カテプシンＤ不含で見られるよりも約３倍増加した。この実験に対して、ヨウ素化ＨＳＡＢ−ＭＡ（１８〜２９）ペプチドおよび放射性標識されていないミクロソーム膜を、カテプシンＤ ０．１Ｕ／ｍｌと一緒にまたは不含で、種々の量のカテプシンＢ（０．０２、０．１または０．５Ｕ／ｍｌ）存在下で１０分間または３０分間インキュベートした。引き続きの光活性化および抗クラスＩＩ ｍＡｂによる免疫沈降の後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオクラフィーに付した。
【００４０】
実施例６：カテプシンＢおよびＤの見掛けの二次構造要素および開裂モチーフのためのＩiの一次配列の分析によるＩi開裂部位の同定
ＭＨＣクラスＩＩα,β鎖抗原結合部位の外来ペプチド負荷は、Ｉiの開裂および放出と同時の過程であったという仮説を試験するために、Ｉiの配列中の推定上の開裂部位を、カテプシンＤおよびカテプシンＢによるＩiの段階的開裂および放出について提唱した。カテプシンＢおよびカテプシンＤは、それぞれの酵素に特有の一連のＩiフラグメントと一緒にＭＨＣクラスＩＩα,β鎖からＩiを開裂したので（レィズ（Reyes），Ｖ．Ｅ．他、１９９１年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：３８７７〜３８８０）、Ｉiはそれぞれの酵素に特異的な開裂部位を有する。疎水性−陽イオン性部位でのカテプシンＢ開裂および疎水性−疎水性部位でのカテプシンＤ開裂を提唱することができる（表１）。
【００４１】
【表１】
2004161777.tif 000002
【００４２】
表Ｉ中、カテプシンＢ部位を配列上方の記号＼で示し、カテプシンＤ部位を配列下方の記号／で示す。どの場合にも、開裂は指定残基のカルボキシル側で生じると推測される。トランスメンブラン領域Gly31-Gln57、ヘキサ-カチオニックテトラプロリルキンクLeu77-Met93及びαヘリックスPhe146-Val164を下線を付けて示している。
【００４３】
開裂はまた、トランスメンブランヘリックスA32-L55と、潜在的カテプシンＢ開裂部位LR78、MK80、PK83、PK86、VSK90、MR92を伴うテトラプロリルパリンドローム(L81-M93)と、第２のテトラプロリル領域P96-P111と、潜在的カテプシンＢ開裂部位LK137、LK143、LR151、LK154、WK163、VK165を伴う両親媒性ヘリックスF146-V164と、潜在的カテプシンＤ開裂部位LLF175を伴うＣ-末端テールとを含むIi局部構造(表Ｉ)によっても制限されるであろう。これらの推定上の開裂部位の機能を特定するために、以下のIi遺伝子突然変異体を作成した：〔R78→A；K80→A；K83→A；K86→T〕、〔K137→A；K143→A〕、〔R151→A；K154→A〕及び〔L174→V；F175→A〕。突然変異体Ii及び野生型HLA-DRα及びβ遺伝子をトランスフェクトしたCOS1細胞中のタンパク質産物のカテプシンＢ及びカテプシンＤによる開裂パターンは、IiがカテプシンＤ及びカテプシンＢによって段階的に開裂されることを示した。まずLLF175の処でカテプシンＤによる開裂が生じるならば、次にLK137及びLK143の処でカテプシンＢによる開裂が生じて推定ヘリックスPhe146-Leu164を放出し、次いで抗原結合部位にペプチドを挿入し得ると推測し得る。
【００４４】
このヘリックスは、ヘリックスの内部及び周囲の6つのLRまたはLK位置でカテプシンＢ消化によって速やかに破壊されるであろう。密集したテトラプロリルパリンドロームL81-M93中で6つのLKまたはLR部位の1つまたはそれ以上の処で最終的な開裂が生じると、α,β鎖との結合を維持した小さいIiフラグメントが産生される。MA(18-29)は、LK137及びLK143でのカテプシンＢ開裂またはテトラプロリルパリンドロームLK137-M93でのカテプシンＢ開裂の段階でMHCクラスIIα,β鎖に結合するのかもしれない。これら及び近縁のIi突然変異体に関する更に機能的な研究は、MHCクラスII抗原結合部位へのペプチド挿入メカニズムを解明し、対立遺伝子非特異的（allele-non-specific）免疫抑制剤の選択アッセイを可能にするであろう。
【００４５】
１つの推定カテプシンＤ部位に対応するIi遺伝子中に突然変異を構築し、推定カテプシンＢ部位の3つのクラスターを構築した。また、細胞質二塩基性部位R19R20にも突然変異を作成した。突然変異体の設計には4つの戦略理論を使用した。
【００４６】
(1)推定開裂部位は実験的なカテプシンＢまたはカテプシンＤ消化後に見出されたフラグメントを与える筈である。例えば、カテプシンＢは、IiのＮ-末端の21kDaのフラグメントを産生させるので(Reyes,V.E．et al.，1991，J．Immunol.，146:3877-3880)、K137またはK143の処で開裂するとこのフラグメントが産生され得る。(2)プロテアーゼ特異的開裂モチーフを同定した。カテプシンＢは異常な頻度のクラスター化LK及びLR残基を攻撃すると推測され、カテプシンＤはC-末端残基がVal、GlyまたはAlaであるときを除外して、対を成す疎水性残基を好むと報告されている(Bond，J.S.，1989，Commercially available proteases.：Proteolytic Enzymes: A Practical Approach，R.J.Beynon et al.編、pp.232，IRL Press，New York)。(3)p21及び天然に産するIi消化産物、例えばL97-G119の双方がMHCクラスIIα,β鎖に結合したという事実(Chicz，R.M．et al.，1992，Nature，358:764-768)からは、p21及びp25を産生する開裂部位がこの領域に対してC-末端側であると示唆される。(4)推定カテプシンＢ開裂部位のクラスターを有する局部的Ii構造を推測すると（表Ｉ）、カテプシンＢ及びカテプシンＤによるIiの段階的開裂及び放出のモデルに到達する。
【００４７】
実施例７：HLA-DRα,β鎖含有または非含有の野生型及び突然変異体Ii鎖のCOS1細胞中での発現
表IIのオリゴヌクレオチドによって構築した突然変異体Ii遺伝子を、HLA-DR1 α及びβ遺伝子と共に、ヒトHLA-DR1 α,β遺伝子(RSV-5(neo)-DRα 120及びRSV.5(gpt)-DRβ 008)をクローニングしラウス肉腫ウイルス(RSV)ロングターミナルリピート(LTR)配列(Long et al.，1991)によってドライブされたRSV.5(neo)プラスミドに組込んだ後で、C0S1細胞にトランスフェクトした。Ii突然変異体を作成するためにIi遺伝子(451-p33-143)(Sekaly et al.，1986)を使用した。突然変異体及び野生型のIi遺伝子をRSV.5(ヒグロマイシン)ベクターにクローニングした。遺伝子及びクローニングベクターはすべてNIHのEric Long博士から寄贈された。RSV.5(neo)DR1α 120をNde1で消化してプラスミドを直鎖化し、RSV.5(gpt)DR1β 008をNde1及びBg1IIで消化してDR1β遺伝子を放出させることによってHLA-DR1 α及びβ遺伝子を１つのプラスミド中に再構築した。直鎖化したRSV.5(neo)DR1α 120プラスミドを仔ウシ腸ホスファターゼによって処理し、精製したDR1β遺伝子フラグメントに結合させた。産物をT4 DNAポリメラーゼによって処理して不整合末端を埋め戻し、再結合させた。
【００４８】
表IIのオリゴデオキシヌクレオチドを用いてHo et al．(1989)のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって部位特異的突然変異を誘発した。Taqポリメラーゼを製造業者(Perkin Elmer Cetus，Norwalk CT)の指示通りに用いてPCRを実施した。PCRの間に、3'方向に重合させるために、Sall部位のRSV.5ベクター配列に対応する１つのオリゴデオキシヌクレオチド(オリゴＡ)を合成し、5'方向に重合させるために、終止コドン(Strubin et al.，1984)に対して3'側のヌクレオチド26からヌクレオチド43までのIi遺伝子の3'非翻訳領域の配列に対応する第2のDNAオリゴデオキシヌクレオチド(オリゴＢ)を合成した。これらの2つのオリゴデオキシヌクレオチドの夫々に、クローニングの目的でSall及びBamH1部位を作成した。突然変異が作成される配列の予定の場所(表１)に従って他のオリゴデオキシヌクレオチドを合成した。50mMのKCl、10mMのTris-NaCl,pH8.3、4mMのMgCl2、100μMの各dNTP、200ngの各オリゴヌクレオチド及び2.5ユニットのTaqポリメラーゼを含有する50μl容量中でPCR反応を実施した。これらのサンプルに50μlのミネラルオイルを重層した。変性(94℃、2分間)と、アニーリング(Ho et al.に従って算定された温度、2分間)と、伸長(72℃、2分間)とから成る1サイクルとなるようにプログラムしたDNAサーマルサイクラー(Perkin Elmer Cetus)を用い、PCR反応を実施した。94℃で1分間に設定する以外は最初のサイクルと同じ条件下で更に30サイクルの増幅を継続した。突然変異誘発は、プラスミド鋳型からのDNAフラグメントの増幅、及び、精製したDNAフラグメントを低融点ゲル中で接合するオーバーラップ伸長から成る2段階で実施した。第2ラウンドのPCR産物をSall及びBamH1によって消化し、ヒグロマイシン耐性遺伝子(Long et al.，1991)を含みSall及びBamH1で消化したRSV.5ベクターにライゲーションさせた。分子生物学的技術はすべてSambrook et al.(1989)に従って実施し、突然変異をDNA配列決定によって確認した。
【００４９】
【表２】
2004161777.tif 000003
【００５０】
COS1細胞はUniversity of Massachusetts Medical Center(Worcester，MA)のDr．P．Newbergerから得た。10cmの組織培養皿(Falcon，Lincoln Parker)中の2％のウシ胎児血清及び8％の仔ウシ血清(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan,Utah)を補充したRPMI-1640培地中の細胞を、5％CO2雰囲気中で37℃に維持した。VIC-Y1またはE1抗体による免疫沈降によって試験するとCOS1細胞はIiを発現していなかった。VIC-Y1はすべてのIi分子を認識するが、E1はIiの高マンノース形態だけを認識する。Ｎ-末端Ii決定基に対するVIC-Y1 mAb(Quaranta et al.，1984)は、An Der Grub，G.m.b.H(Kaumberg，Austria)のDr．Walter Knapp の寄贈である。
【００５１】
E1抗ヒトIi(183-193)血清を予め調製した(Thomas et al.，1988)。ヒトMHCクラスII分子に対するIVA12 mAbはATCCのハイブリドーマHB145から腹水として産生した。
Xu及びStavnezer(1992)のエレクトロポレーションによって遺伝子トランスフェクションを実施した。COS1細胞を24時間増殖させ、トリプシン-EDTA(GIBCO，BRL)によって放出させ、加温した無血清RPMI-1640培地によって2回洗浄し、無血清RPMI-1640培地に6×106細胞／mlで再浮遊させた。PG200 Progenitor IIエレクトロポレーター(Hoefer Scientific Instruments，San Francisco，CA)によって容量1mlあたり250V/1200μFでトランスフェクションを行った。6×106細胞あたり24μgの量で各プラスミドを使用した。トランスフェクション後、細胞を完全RPMI-1640培地中で3×106細胞／8ml／皿の濃度で再度培養した。エレクトロポレーションによってDNAがCOS1細胞に効率的に導入された。免疫蛍光染色によって定量するとトランスフェクションの45時間後に40〜65％のCOS1細胞が細胞表面にHLA-DR1分子を発現していた。
【００５２】
トランスフェクションの45時間後、〔35S〕メチオニン(Sambrook et al.，1989)で細胞を3時間標識した。培地を傾瀉し、皿を、10mlの加温したメチオニン非含有無血清RPMI-1640培地で２回洗浄し、2％のFCSと8％のBCS(双方とも透析したもの)とを含有する1.5mlの加温したメチオニン非含有RPMI-1640培地を添加した。皿を5％CO2中で37℃で20分間インキュベートした。各皿に0.15mCiの〔35S〕メチオニン(NEN，MA)を添加し、次いでほぼ20分毎に皿を揺動させながら3時間インキュベートした。3時間後、皿を冷PBSで2回洗浄し、次いで1mlの溶菌バッファ(10mMのTris-HCl,pH7.4及び0.5％のTriton-X100)を添加した。皿を氷上に20分間維持し、細胞を皿から掻き取って、チューブに移した。1分間撹拌後、溶菌液を微量遠心機に入れて4℃で10分間遠心した。上清を第2のチューブに収集し、ホルマリン処理したStaphylococcus aureus Cowen A株(Chemicon，E1 Sequndo，CA)で清澄化し、免疫沈降処理した。100μlのプロテインA−セファロース(Sigma)を1μlのIVA12 mAb、1μlのVIC-Y1 mAbまたは25μlのE1抗血清と共にインキュベートすることによって免疫吸着剤を調製した。免疫吸着剤をバッファー(50mMのTris-HCl,pH7.4、150mMのNaCl、5mMのEDTA、0.05％のTriton-X100及び0.02％のNaN3)で5回洗浄し、SDSサンプルバッファーによって溶出させた。サンプルをSDS-PAGE及びオートラジオグラフィー(Reyes et al.，1991)によって分析した。
【００５３】
HLA-DRα,β遺伝子非含有の突然変異体及び野生型のIi鎖に対する遺伝子でトランスフェクションした45時間後に、COS1細胞を〔35S〕メチオニンによって3時間標識し、E1抗-Ii(183-193)血清によって免疫沈降物を形成し、エンドグリコシダーゼHによって消化した。サンプルをSDS-PAGE及びオートラジオグラフィーによって検査した。5つのIi突然変異体タンパク質は野生型Iiと同様に強力に発現された。Ii鎖は、エンドグリコシダーゼH処理に感受性であったので、高マンノース多糖鎖を含有していた。これらの鎖は、炭水化物側鎖のそれ以上のプロセシングなしに、粗面小胞体中に封鎖されていると推定された。何故なら、IiがクラスIIα,β鎖に結合していないときは、Iiはシアル化されることなくエンドグリコシダーゼH感受性によって粗面小胞体中に封鎖され得ることは、Marks et al.(1990，J．Cell Biol.，111:839-855)によって証明されていたからである。VIC-Y1 mAbは突然変異体〔R19R20〕を認識しなかったが、他の突然変異及び野生型のIi鎖を認識したので(データ示さず)、突然変異はVIC-Y1決定基を変化させ、従って、IiのN-末端にVIC-Y1の見掛け上の認識部位を更に形成すると推測される(Quaranta,V．et al.，1984，J.Immunol.，132:1900-1905)。
【００５４】
実施例８：突然変異体及び野生型IiのカテプシンＢ消化
Reyes et al.(1991，J．Immunol，146:3877-3880)に従ってカテプシンＢ消化を実施した。150μl中に約5×105細胞からの細胞溶解物を、0.1Mのクエン酸ナトリウム(pH2.5)によってpH5.0に調整した。1mMのDTT及び1mMのEDTAの存在下のカテプシンＢで溶解液を室温で１時間または別の指定時間処理した。酵素消化またはコントロール消化後、2mMのPMSF、10mMのNEM及び1mMのヨードアセトアミドを含有する10mMのTris(pH9.5)によってサンプルをpH7.4に調整し、MHCクラスIIα,β鎖にまだ結合しているIiフラグメントを分析するために、IVA12抗-MHCクラスIIα,β鎖により免疫沈降物を調製した。MHCクラスIIα,β鎖に結合し及びそれから放出したIiフラグメントを分析するために、30μl容量中で上記と同じ条件下で免疫沈降物を消化し、3×SDSサンプルバッファーを用い100℃に加熱して反応を終結させた(1×SDSサンプルバッファーは、62.5mMのTris-HCl,pH6.8、10％(w/v)のグリセロール、5％の2-メルカプトエタノール及び2.3％のSDSを含有していた)。サンプルを電気泳動ゲルに直接添加した。MHCクラスIIα,β及びIiのトリプルトランスフェクタントを抗MHCクラスII mAb IVA-12で免疫沈降させると、野生型及び突然変異体のすべてのIi鎖がクラスIIα,β鎖と結合し、ほぼ等しい量の三量体的複合体を形成した。しかしながら、これらの複合体をカテプシンＢで消化すると、Ii開裂の異なるパターンが判明した（表III）。〔R151K154〕以外の全部の突然変異体においては野生型IiのカテプシンＢ消化によって生じるフラグメントのいくつかがレベル低下または欠損を示した。野生型Iiの消化によって観察されたIiの主要な野生型形態はp21、p14、p10及びp6であった。野生型Ii消化パターンと対照的に、突然変異体〔L174F175〕は微量のp21を有しており、突然変異体〔R78K80K83K86〕はp14、p10及びp6を産生しなかった。また、突然変異体〔R19R20〕及び〔K137K143〕は、野生型p21バンドの約1/10の弱いp21バンドを有していた(5ユニットのカテプシンＢと突然変異体〔R19R20〕及び〔K137K143〕とのパターンと、0.5ユニットのカテプシンＢと野生型Iiとのパターンとの比較)。
【００５５】
【表３】
2004161777.tif 000004
【００５６】
括弧内の文字は突然変異の発生場所を示す。例えば、M〔R19→A;R20→A〕中では、19位及び20位のアルギニンがアラニンによって置換されていた。本明細書では表現を簡潔にするために、置換残基を省略し、例えば〔R19→A;R20→A〕を略号〔R19R20〕で示す。＋/-は、突然変異体Iiに由来のバンドが野生型Iiに由来の対応するバンドよりも弱いことを示す。CBまたはCDによる消化から得られた同等の大きさのフラグメントは同一の部位で開裂されたことを意味しない。
【００５７】
野生型Ii及び突然変異体〔R78K80K83K86〕の消化パターンは、p14、p10及びp6がp21の分解産物であることを示した。これらの小さいIiフラグメント間の互いの関係を明らかにするために、MHCクラスIIα,β鎖の複合体を野生型または突然変異Ii鎖と共に、30ユニット/mlという比較的高い用量を包含する一連の濃度のカテプシンＢによって消化した。カテプシンＢのこの用量で、α,β鎖に対するIVA-12 mAbを用いた免疫沈降でも依然としてMHCクラスIIα,β鎖に結合していた耐性p6を除いて、Ii及びIiの中間体フラグメント全部が開裂した。この結果と、高用量カテプシンＢで生じたp6バンドの組込み密度が低用量のカテプシンＢ消化で見られたp14、p10及びp6のバンドの和とほぼ等しいという知見とは、p6がp14及びp10の分解産物であることを示す。
【００５８】
これまでは、カテプシンＢとカテプシンＤとが、α,β鎖を明らかに損傷することなくMHCクラスII分子からIiを開裂し放出すると報告されていた(Reyes，V.E.et al.，1991，J．Immunol.，146:3877-3880)。しかしながら、いくつかのIi突然変異体がクラスIIβ鎖を1〜2キロダルトンの減損から保護するという知見を考え合わせると、野生型Iiの除去がおそらくはK12の処のβ鎖の開裂に関連することは明らかである。
【００５９】
実施例９：野生型及び突然変異体IiのカテプシンＤ消化パターン
Reyes et al.(1991)の手順に従ってCD消化を行った。150μl中の約5×105細胞に由来の細胞溶解物を0.1Mのクエン酸ナトリウム(pH2.5)によってpH5.0に調整した。1mMのEDTAの存在下で溶解物をカテプシンＤ(Sigma)によって室温で１時間または別の指定時間処理した。酵素消化またはコントロール消化後、2mMのPMSF、10mMのNEM及び1mMのヨードアセトアミドを含有する10mMのTris(pH9.5)によってサンプルをpH7.4に調整し、MHCクラスIIα,β鎖にまだ結合したIiフラグメントを分析するために免疫沈降物を調製した。MHCクラスIIα,β鎖に結合し且つそれから放出したIiフラグメントを分析するために、30μl容量中で上記と同じ条件下で免疫沈降物を消化し、3×SDSサンプルバッファーを用いて100℃に加熱することによって反応を終結させた(1×SDSサンプルバッファーは、62.5mMのTris-HCl,pH6.8、10%(w/v)のグリセロール、5％の2-メルカプトエタノール及び2.3％のSDSを含有していた)。サンプルを電気泳動ゲルに直接添加した。
【００６０】
トランスフェクトした三量体をカテプシンＤ消化すると、突然変異体〔L174F175〕以外の全部の突然変異体及び野生型Iiからp21が産生された（表III）。従ってL173L147F175はカテプシンＤ開裂部位であると考えられる。実際に突然変異体〔L174F175〕中ではp14、p10及びp6の産生量が増加しており、これは、L173L174F175部位が変化すると、他のカテプシンＤ開裂部位が優勢になり、これらの小さいフラグメントがp21に由来すると考えられることを示す。カテプシンＤ消化のIiフラグメント化パターンは概して、カテプシンＢ消化の対応するパターンと類似しており、その理由は、カテプシンＤ部位がカテプシンＢ部位の近傍に存在することにあると推測される。しかしながら、いくつかの違いが見出された。(1)カテプシンＤ消化ではIiプラグメントの早期放出は生じなかった。突然変異体〔R78K80K83K86〕及び〔K13K143〕はカテプシンＤ消化にある程度耐性であり、カテプシンＢについて観察された結果に比べてp21のレベルが低く、インタクトなIiが増加していた。(2)これらの後者の２つの突然変異体の場合、カテプシンＤ消化のときにp21バンドがはっきりと形成されたが、カテプシンＢ消化の場合にはp21バンドよりスメア（smear）であった。
【００６１】
実施例10：いくつかのIi突然変異体からのカテプシンＢ生成p21 Iiフラグメントの放出の増加
突然変異体〔R19R20〕、〔K137K143〕及び〔L174F175〕からのカテプシンＢ誘導p21がHLA-DR1α,β鎖から産生されたか、分解されたか、または解離されたかを試験するために、クラスIIα,β三量体をIVA-12 mAbでの免疫沈降によって単離し、次いでこれらをカテプシンＢによって消化し、全部の産物をSDS-PAGEによって分析した。免疫沈降物を30μl容量中で実施例８と同じ条件下で消化し、3×SDSのサンプルバッファーを用い100℃に加熱することによって反応を終結させた(1×SDSサンプルバッファーは、62.5mMのTris-HCl,pH6.8、10％(w/v)のグリセロール、5％の2-メルカプトエタノール及び2.3％のSDSを含有していた)。サンプルを電気泳動ゲルに直接添加した。
【００６２】
カテプシンＢは野生型Iiに対する場合と同様に強力に突然変異体〔R19R20〕及び〔K137K143〕からp21を産生した。これは、p21がこれらの2つの突然変異体から産生されたがDR1 α,β鎖から速やかに解離されたことを示す。突然変異体〔K137K143〕中では、カテプシンＢ開裂はR151もしくはK154に生じるかまたはK137もしくはK143に生じてp21を産生するであろう。しかしながら、K137K143の処またはその近傍の天然型コンホメーションは、α,β鎖に保持されているp21をカテプシンＢ開裂によって産生するための最適の部位である。カテプシンＢがK137K143で最初に開裂しないとき、IiはMHCクラスIIα,β鎖から解離する。R19R20の突然変異の場合も、カテプシンＢ消化後にp21の早期の遊離が生じる。突然変異体〔L174F175〕の場合、p21の代わりにp18及びp16が産生され、これは、L174F175部位での突然変異がここでのカテプシンＢ開裂を阻止するだけでなく、K137K143でのカテプシンＢ開裂も阻止することを示唆する。p18及びp16は、産生された後にMHCクラスIIα,β鎖から遊離された。この実験の低分子量バンドのパターンは、高用量のカテプシンＢによる消化パターンと同様であり、p14またはp10がほとんどまたは全く存在せずp6だけが存在した。これらの免疫沈降においてはおそらく、他の溶解タンパク質による競合阻害が少なく、従って、高用量カテプシンＢ消化物と同等のパターンが生じたものである。
【００６３】
実施例11：Ii(148-164)及びPH-1.0ペプチドによる抗原提示の阻害及びIi(78-92)ペプチドによる抗原提示の増進
Ｔ細胞に提示されたエピトープが両親媒性ヘリックスとしてコイルを形成し得ることがDeLisi及びBerzofskyによって証明されたので(DeLisi,C．et al.，1985，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:7048-7052)、このようなモチーフのメカニズムに基づくこのようなエピトープの選択理論が試験されてきた(Margalit,H．et al.，1987，J．Immunol.，138:2213-2229; Rothbard,J.B．et al.，1988，EMBO J.，7:93-100; Stille,C.J．et al.，1987，Mol．Immunol.，24:1021-1027; Reyes,V.E．et al.，1988，Mol．Immunol.，25:867-871)。Ii(146-164)中のかかる「完全な」両親媒性ヘリックスは、このヘリックスが代理の抗原であり、MHCクラスIII分子のペプチド結合部位をブロックし得るという仮説を導いた(Elliott,W.L．et al.，1987，J．Immunol.，138:2949-2952; Stille,C.J．et al.，1987，Mol．Immunol.，24:1021-1027)。細い長手方向の疎水性ヘリックスストリップを有するという点でIi(146-164)に構造的に類似した合成ペプチドPH-1.0を設計した。また、長手方向ヘリックスストリップ内部のロイシンからトレオニンへの系統的な置換が脂質ミセルに対するペプチドの螺旋状コイル形成に与える効果を試験するために、PH-1.0の一連の類縁体を設計した(Lu,S．et al.，1991，J．Biol．Chem.，266:10054-10057）。
【００６４】
抗原提示に対するPH-1.0の効果を機能的アッセイで試験した。PH-1.0は、特異的にEk制限されたTPc9.1ネズミＴ細胞ハイブリドーマ細胞に対するハトのシトクロムC(81-104)ペプチドの提示をブロックした（表IV）。競合阻害アッセイを以下のごとく行った。96ウエルのプレートで、5×104のパラホルムアルデヒド固定CH27 Bリンパ腫細胞(抗原提示細胞)を5×104のTPc9.1ハイブリドーマＴ細胞(2200ラド照射)と共に、6μM(81-104)の抗原性ペプチドと種々の濃度のPH-1.0ペプチドとの存在下で24時間インキュベートした。各条件で三重の重複試験を実施した。インキュベーション後、24時間培養中に分泌されたIL-2/IL-4を測定することによってＴ細胞ハイブリドーマの応答を判定した。培養上清を収集し、IL-2/IL-4依存性細胞系HT-2の増殖を支持する能力を、〔3H〕チミジンの取込みによって測定して、培養上清のIL-2/IL-4含量について試験した。阻害％を、式：100−〔(T＋APC＋ペプチド＋PH-1.0のCPM／T＋APC＋ペプチドのCPM)×100〕によって算出した。
【００６５】
【表４】
2004161777.tif 000005
【００６６】
Ii(148-163)及びIi(78-92)ペプチドは、特異的なEK制限されたネズミＴ細胞ハイブリドーマTPc9.1の、ハトシトクロムC(81-104)ペプチドに対する応答を増進した(表Ｖ)。アッセイを以下のごとく行った。96ウエルのプレートで、5×104のパラホルムアルデヒド固定CH27 Bリンパ腫細胞(抗原提示細胞)を5×104のTPc9.1Ｔハイブリドーマ細胞(2200ラド照射)と共に、ペプチド非含有、50μMのIiペプチド単独、6μMのハトのシトクロムC(81-104)ペプチド単独、及び、50μMのIiペプチドと6μMのハトのシトクロムC(81-104)ペプチドとの双方、の夫々の存在下で24時間インキュベートした。各条件で六重の重複試験を実施した。インキュベーション後、24時間培養中に分泌されたIL-2/IL-4を測定することによって、Ｔ細胞ハイブリドーマの応答を測定した。培養上清を収集し、IL-2/IL-4依存性細胞系HT-2の増殖を支持する能力を、〔3H〕チミジンの取込みによって測定して、培養上清のIL-2/IL-4含量について試験した。表Ｖに示した値はHT-2指示アッセイで取込まれたCPM×10-3である。
【００６７】
【表５】
2004161777.tif 000006
【００６８】
Ii(148-164)及びIi(78-92)によってハトのシトクロムCペプチド(81-104)に生じた応答の増進を、添加Iiペプチドの濃度の関数としてアッセイした(表ＶＩ)。表中の数値は、パラホルムアルデヒド固定CH27 Bリンパ腫細胞(APC)によって提示されたペプチドに対してTPc9.1ネズミＴ細胞ハイブリドーマ(Ｔ)が示すハトのシトクロムC(81-104)ペプチド特異的Ek制限応答の増進％を示す。培養上清を収集し、IL-2/IL-4依存性細胞系HT-2の増殖を支持する能力を、〔3H〕チミジンの取込みによって測定して、IL-2/IL-4含量について試験した。増進％を式：〔(T＋APC＋ペプチド＋IiペプチドのCPM／T＋APC＋ペプチドのCPM)×100〕−100によって算出した。
【００６９】
【表６】
2004161777.tif 000007
【００７０】
均等物
当業者は、本文中に具体的に記載した本発明の実施態様に対する多数の均等物を定型化した実験方法以外の手段を要せずに認識し確認することができよう。このような均等物は後記の請求の範囲に包含されることが意図されるものである。
【００７１】
【表７】
2004161777.tif 000008
【００７２】
【表８】
2004161777.tif 000009
【００７３】
【表９】
2004161777.tif 000010
【００７４】
【表１０】
2004161777.tif 000011
【００７５】
【表１１】
2004161777.tif 000012
【００７６】
【表１２】
2004161777.tif 000013
【００７７】
【表１３】
2004161777.tif 000014
【表１４】
2004161777.tif 000015
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年1月16日(2004.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞による抗原提示を増強するための方法であって、抗原提示細胞を精製されたＩｉのペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項２】
Ｉｉのペプチドを、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンＢならびにカテプシンＢおよびＤの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるＩｉの消化によって製造することができる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＩｉのペプチドがYRMKLPKPPKPVSKMRである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
抗原提示細胞による抗原提示を阻害するための方法であって、抗原提示細胞を精製されたＩｉのペプチドと接触させることを含む方法であり、当該ペプチドが、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンＢならびにカテプシンＢおよびＤの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるＩｉの消化によって製造することができる方法。
【請求項５】
抗原提示細胞による抗原提示を増強するための方法であって、抗原提示細胞をENLRHLKNTMETLDWKV を含むＩｉのペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項６】
抗原提示細胞による抗原提示を増強する精製されたIiのペプチドであって、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンＢならびにカテプシンＢおよびＤの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるＩｉの消化によって製造することができるペプチド。
【請求項７】
抗原提示細胞による抗原提示を阻害する精製されたIiのペプチドであって、もう一つのエンドプロテアーゼとは独立のカテプシンＢならびにカテプシンＢおよびＤの混合物からなる群から選択されるエンドプロテアーゼによるＩｉの消化によって製造することができるペプチド。
【請求項８】
ＩｉのペプチドがPH-1.0ペプチドである、請求項４記載の方法。
【請求項９】
ＩｉのペプチドがENLRHLKNTMETLDWKV である、請求項６記載のペプチド。
【請求項１０】
ＩｉペプチドがYRMKLPKPPKPVSKMRである、請求項６記載のペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
この種類の検定を用いて、免疫変調活性を有するＩiのペプチドを同定した。
抗原提示のエンハンサーおよび阻害剤の両方を同定した。例えば、抗原提示を促すペプチドとしては、［Ｔｙｒ−Ｉi（７８〜９２），（ＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ）］および［Ｉi（１４８〜１６４），（ＥＮＬＲＨＬＫＮＴＭＥＴＬＤＷＫＶ）］があり；そして抗原提示を阻害するペプチドは、［ＬＹＥＬＱＴＫＬＱＴＬＫ］がある。セッテ（Sette）ら（（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１８０１〜１８０４）が、Ｔ細胞提示ペプチドの結合に対する阻害作用を有するＩiのペプチドを報告したことは注目される。しかしながら、抗原提示を促すＩiペプチドの開示がこれまでに文献で報告されたことはなかった。ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖の結合を保持するが、抗原提示の促進に関係した機能を妨げるアミノ酸残基の系統的置換によって抗原提示を阻害する［Ｔｙｒ−Ｉi（７８〜９２），（ＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ）］の相同体を当業者が得ることはできると考えられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
実施例11：PH-1.0ペプチドによる抗原提示の阻害及びIi(148-164)及びIi(78-92)ペプチドによる抗原提示の増進
Ｔ細胞に提示されたエピトープが両親媒性ヘリックスとしてコイルを形成し得ることがDeLisi及びBerzofskyによって証明されたので(DeLisi,C．et al.，1985，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:7048-7052)、このようなモチーフのメカニズムに基づくこのようなエピトープの選択理論が試験されてきた(Margalit,H．et al.，1987，J．Immunol.，138:2213-2229; Rothbard,J.B．et al.，1988，EMBO J.，7:93-100; Stille,C.J．et al.，1987，Mol．Immunol.，24:1021-1027; Reyes,V.E．et al.，1988，Mol．Immunol.，25:867-871)。Ii(146-164)中のかかる「完全な」両親媒性ヘリックスは、このヘリックスが代理の抗原であり、MHCクラスIII分子のペプチド結合部位をブロックし得るという仮説を導いた(Elliott,W.L．et al.，1987，J．Immunol.，138:2949-2952; Stille,C.J．et al.，1987，Mol．Immunol.，24:1021-1027)。細い長手方向の疎水性ヘリックスストリップを有するという点でIi(146-164)に構造的に類似した合成ペプチドPH-1.0を設計した。また、長手方向ヘリックスストリップ内部のロイシンからトレオニンへの系統的な置換が脂質ミセルに対するペプチドの螺旋状コイル形成に与える効果を試験するために、PH-1.0の一連の類縁体を設計した(Lu,S．et al.，1991，J．Biol．Chem.，266:10054-10057）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
Ii(148-164)及びIi(78-92)ペプチドは、特異的なEK制限されたネズミＴ細胞ハイブリドーマTPc9.1の、ハトシトクロムC(81-104)ペプチドに対する応答を増進した(表Ｖ)。アッセイを以下のごとく行った。96ウエルのプレートで、5×104のパラホルムアルデヒド固定CH27 Bリンパ腫細胞(抗原提示細胞)を5×104のTPc9.1Ｔハイブリドーマ細胞(2200ラド照射)と共に、ペプチド非含有、50μMのIiペプチド単独、6μMのハトのシトクロムC(81-104)ペプチド単独、及び、50μMのIiペプチドと6μMのハトのシトクロムC(81-104)ペプチドとの双方、の夫々の存在下で24時間インキュベートした。各条件で六重の重複試験を実施した。インキュベーション後、24時間培養中に分泌されたIL-2/IL-4を測定することによって、Ｔ細胞ハイブリドーマの応答を測定した。培養上清を収集し、IL-2/IL-4依存性細胞系HT-2の増殖を支持する能力を、〔3H〕チミジンの取込みによって測定して、培養上清のIL-2/IL-4含量について試験した。表Ｖに示した値はHT-2指示アッセイで取込まれたCPM×10-3である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
【表５】
2004161777.tif 000021