(57)【要約】【課題】測定対象と受容体反応の速度を促進し、早期に測定が完了するようにし、また検出対象の存在が確認できる濃度の最小下限値の低減を図る測定方法を提案する。【解決手段】本発明は、測定対象とそれに対し特異的に結合する受容体との反応を試薬カートリッジによって行う固相チップ方式のｐＨ変化誘因体測定方法に関するものである。試薬カートリッジ１０において、検体希釈液が収納された検体希釈液収納部４に、測定対象に対し特異的に結合する受容体が表面に固定化された固相部３ａを有する固相チップ３が、その固相部３ａが検体希釈液に浸漬されるように固定した状態とし、さらに試薬カートリッジ１０を、少なくとも固相部３ａの軸方向に振騰させる。固相部３ａの先端付近の内面は先細り状にテーパがかけられているものを用いるとよい。この方法により反応速度が速められ、同一の検出下限濃度を達成するための反応時間を短縮することができる。【選択図】  図５
2004226307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬カートリッジにおいて、検体希釈液が収納された検体希釈液収納部に、測定対象に対し特異的に結合する受容体が表面に固定化された固相部を有する固相チップが、その固相部が前記検体希釈液に浸漬されるように固定した状態とし、
前記試薬カートリッジを、少なくとも前記固相部の軸方向に振騰させることを特徴とする試薬カートリッジによる固相チップ方式ｐＨ変化誘因体測定方法。
【請求項２】
前記固相部の先端付近の内面が先細り状にテーパがかけられている前記試薬カートリッジを用いた請求項１に記載の固相チップ方式ｐＨ変化誘因体測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、測定対象とそれに対し特異的に結合する受容体との反応を試薬カートリッジによって行う固相チップ方式のｐＨ変化誘因体測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
医学、生化学等の生物関連分野において、生体活性に関する微量な物質の測定として、細径管の内壁に測定対象物質に対する受容体を固定化した細径管固相を用いた測定装置がある（例えば、特許文献１、特許文献２）。また本出願人は、そのような測定装置に用いる試薬カートリッジを提案している（特許文献３）。このような測定装置では従来、測定対象物質を細径管固相に吸着される際、細径管固相を単に検体溶液中に浸漬して静置していた。例えば、特許文献３に提案した試薬カートリッジにおいては、細径管固相チップを収納する固相チップ収容部と検体を溶解させる検体希釈液収容部が一体化されている。この試薬カートリッジを使用する場合、操作者はまず検体希釈液収容部に検体を溶解させ、次に固相チップを固相チップ収容部から取り出して、これを検体を溶解した検体希釈液収容部に挿入し、密栓状態で所定時間、静置させる。そうすると、毛細管現象によって、検体溶液は細径管内に吸引され、測定対象物質がリガンド−受容体反応によって細径管内壁に吸着される。その後、この固相チップを測定装置にかけ、吸着された測定対象物質を測定する。
【０００３】
【特許文献１】
特許第２５９１６４１号    （全般）
【特許文献２】
特許第２６３４３７４号    （全般）
【特許文献３】
特開平１１−１７４０５６号（全般）
【０００４】
しかしながら、固相チップを、検体を溶解した検体希釈液収容部に挿入し静置させていたので、リガンド−受容体反応の速度が遅く、測定に時間がかかっていた。また、検出対象の存在が確認できる濃度の最小下限値をできるだけ下げる要求もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような問題を解決するためになされたものであって、その目的は、リガンド−受容体反応の速度を促進し、早期に測定が完了するようにし、また検出対象の存在が確認できる濃度の最小下限値の低減を図る測定方法を提案することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために、本発明に係る試薬カートリッジによる固相チップ方式ｐＨ変化誘因体測定方法は、
試薬カートリッジにおいて、検体希釈液が収納された検体希釈液収納部に、測定対象に対し特異的に結合する受容体が表面に固定化された固相部を有する固相チップが、その固相部が前記検体希釈液に浸漬されるように固定した状態とし、前記試薬カートリッジを、少なくとも前記固相部の軸方向に振騰させることを特徴とする。
この方法により、測定対象とそれに対し特異的に結合する受容体との反応の速度が速められることになる。
【０００７】
さらに、前記固相部の先端付近の内面が先細り状にテーパがかけられている前記試薬カートリッジを用いることにより、試薬カートリッジが少なくとも前記固相部の軸方向に振騰されることから、より反応速度が速められることになる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態の試薬カートリッジの全体の外観を図２に示し、その縦断面図を図１に示す。これらの図に示すように試薬カートリッジの本体１は、固相チップ収納部２と、検体希釈液収納部４が一体化されて成るものである。固相チップ収納部２は固相チップ３が収納され、検体希釈液収納部４には検体希釈液５が収納されている。検体希釈液収納部４の開口部４ａは、シール６により覆われ、検体希釈液収納部４は密閉されている。シール６は固相チップ３の一端にも接着されている。
【０００９】
以下各部について詳細な説明を行う。検体希釈液収納部４と固相チップ収納部２とは並行に配置され、樹脂によって一体成型されている。樹脂としては、検体希釈液５の散逸防止のために、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラプロロエチレン等の水蒸気の透過性の低いものが好ましい。
【００１０】
固相チップ３の外観を図３に示す。この図に示すように、固相チップ３は、固相部３ａと、操作者が手で持つ部分である固相チップホルダー部３ｂとから成る。さらに固相部３ａは、径大部と細径管部とから成り、細径管部は図１に示したように細径管となっている。固相部３ａの径大部には半径方向に貫通孔３ｃが設けられており、その径大部の内部には貫通孔３ｃと細径管部の内部を連通する通路が設けられている。固相部３ａは、吸湿等によってその活性が経時的に劣化する恐れがあるので、気密に保存することが必要である。そのために、固相部３ａは固相チップ収納部２に収納されている。そして、固相チップホルダー部３ｂに設けられているテーパー部３ｄとこれに密着する形状とされた固相チップ収納部２の開口部周辺とが密着することによって固相チップ収納部２は気密に保たれている。
また、固相部３ａの先端付近は内面が先細り状にテーパがかけられている。
【００１１】
検体希釈液５は、血液、血清、リンパ液、胃液、胃粘液、尿等の検体を希釈すると共に、後述の抗原抗体反応に好適なｐＨを確保する機能を有する。そのために検体希釈液としては通常、リン酸塩緩衝液、トリス緩衝液等のｐＨ緩衝液が用いられる。シール６は検体希釈液収納部４の上面の開口部４ａ周辺と、固相チップ３の固相チップホルダー部３ｂの基端に接着され、検体希釈液収納部４の開口部４ａを密閉すると共に、固相チップ３が未使用であることを保証している。ここでシール６の素材としては、水蒸気の散逸の少ないアルミラミネートのシートが用いられる。検体希釈液収納部４の開口部４ａの周辺も固相チップホルダー部３ｂのテーパー部３ｄに密着する形状となっている。
【００１２】
つぎに、本発明の試薬カートリッジにおいて最も重要な部品である固相チップ３をさらに詳細に説明する。固相チップ３は、上述のように固相部３ａと固相チップホルダー部３ｂとから構成されている。固相部３ａには抗体が固定化されている。ここで抗体は、測定対象と特異的に結合し得る抗体であり、この抗体は固相部３ａの少なくとも細径管部の内壁に固定化されている。この固定化は物理吸着法により行う。そのためには固相部３ａの素材として、ポリスチレン、ポリプロピレン等の疎水性の樹脂を用いることが好ましい。固相部３ａと固相チップホルダー部３ｂは別々に成型し、あとで連結しても良いし、一体成型でも良い。多数製造する場合、前者は、固相部３ａだけをまとめて抗体の固定化を行うことができるので効率よく固定化を行うことができる。
【００１３】
固相部３ａへ抗体を物理吸着させるには、抗体をｐＨ７付近のＰＢＳ（リン酸塩／生理食塩水緩衝液）に溶解して１乃至１００μｇ／ｍｌの濃度とし、これに固相部３ａを浸漬して１乃至２４時間静置する。さらにその後いわゆるブロッキングを行う。ブロッキングは、上記の抗体溶液から取り出し、さらに液切りした固相部３ａをブロッキング溶液に１時間乃至３日間程度浸漬することによって行う。ブロッキング溶液としては、０．２乃至２％の牛血清アルブミンのＰＢＳ（ｐＨ７付近）溶液を用いる。ブロッキング後の固相部３ａは、液切り、真空乾燥を行った後、試薬カートリッジの固相部３ａとして組み込む迄の間、密封下で４℃乃至室温で保存しておく。
【００１４】
次にこのように構成された試薬カートリッジを用いてｐＨ変化誘因体を測定する手順について説明する。操作者はまずシール６を検体希釈液収納部４の上面および固相チップホルダー部３ｂの基端から剥離させ、検体を検体希釈液収納部４の中に注入し、検体希釈液５とよく混合する。
【００１５】
次に固相チップ３を固相チップ収納部２から取り出し、図４に示すように検体希釈液収納部４の中に挿入する。このとき固相チップ３のテーパー部３ｄが、検体希釈液収納部４の開口部４ａに密着して嵌合する状態となる。この挿入時から、希釈された検体が毛細管現象によって固相チップ３の固相部３ａの内部に自然吸引され、固相部３ａの表面の抗体と測定対象との間の抗原抗体反応が進行する。本試薬カートリッジをこの状態で振騰させ、抗原抗体反応を所定時間行わせる。この間、テーパー部３ｄによって検体希釈液収納部４の気密性が保たれるので、振騰による検体の散逸を防ぐことができる。次に抗原抗体反応終了後の固相チップ３を固相チップ方式ｐＨ変化誘因体測定装置の測定セルに挿入して、検体濃度の測定を行う。
【００１６】
図４に示すように固相チップ３が検体希釈液収納部４の中に挿入された状態の本試薬カートリッジを振騰させる装置を図５において説明する。図５（ａ）はこの振騰装置の側面断面図であり、図５（ｂ）はこの振騰装置の正面図である。
図５（ａ）に示すように、防振ケース２１には、回転モーター２２が内蔵されており、偏心ローター２３を回転させるようになっている。偏心ローター２３には、支軸部２４が設けられている。一方、固相チップ３が検体希釈液収納部４の中に挿入された状態の本試薬カートリッジ１０を立てて固定するためのカートリッジ固定台２５には、固定台支持部２６が一体に形成され、回転軸受け２７を介して、支軸部２４を軸受けできるようになっている。なお、固定台支持部２６が支軸部２４を回転軸受け２７で軸受けできるように、防振ケース２１には開口部２８が設けられている。試薬カートリッジ１０を振騰中に試薬カートリッジ１０がカートリッジ固定台２５から離脱しないように、カートリッジ固定台２５の上下にはゴム製ストッパー２９ａ、２９ｂが設けられている。また、試薬カートリッジ１０がカートリッジ固定台２５にしっかり当接されるようにゴム製クッション３０が敷かれている。
また、図５（ｂ）に示すように、カートリッジ固定台２５には試薬カートリッジ１０が３つ立てて配列されており、試薬カートリッジ１０同士の間にはクッション３１が設けられている。
【００１７】
図５に示した状態で、回転モーター２２を駆動させると、偏心ローター２３が支軸部２４とともに回転する。それにともなって、回転軸受け２７を介して支軸部２４を軸受けしている固定台支持部２６も回転させ、カートリッジ固定台２５も回転させられる。このとき、固定台支持部２６は回転軸受け２７により支軸部２４を軸受けし、試薬カートリッジ１０とカートリッジ固定台２５から成る物体の重心は支軸部２４より下方にあるので、固相チップ３が上側に本体１が下側になっていることが維持されて試薬カートリッジ１０が振騰されることになる。したがって、固相チップ３の軸の上下方向に振騰されることになる。
【００１８】
固相部３ａの先端付近はその内面が先細り状にテーパがかけられているので、振騰装置により試薬カートリッジ１０が振騰されると、検体希釈液５が固相部３ａ内壁に十分攪拌されてゆきわたることになる。なお、固相部３ａ内の検体希釈液５の一部は貫通孔３ｃから検体希釈液収容部４に流れ出て循環することになる。
【００１９】
図６に特開平１０−３３２６３４  号公報に記載の方式のｐＨ変化誘因体測定装置を示す。この装置による測定を説明すると、まず図６に示しているように、測定セル１１に固相チップ３を挿入する。次にこの状態で基質溶液を入口１２から送液し、固相部３ａ内部の洗浄を行う。このとき基質溶液は矢印で示すように固相チップ３の固相部３ａの内部を通り、貫通孔３ｃを経由して基質溶液オーバーフロー部１３に至り、廃液口１４から排出される。所定時間基質溶液で洗浄した後、その送液を停止する。このため固相部３ａ内部の基質溶液が、そこに吸着されたｐＨ変化誘因体の作用によって分解され、ｐＨが変化する。その後、固相チップ３内の基質溶液を測定用ｐＨ電極１５のある場所まで逆流させてそのｐＨを測定する。一方、未反応の基質溶液のｐＨは参照用ｐＨ電極１６によって測定する。両者の差ΔｐＨをｐＨ変化誘因体の濃度の指標とする。
【００２０】
次に振騰速度・振騰時間が反応速度に及ぼす影響について述べる。
表１は、Ｈｐウレアーゼ濃度を０．１ミリ単位／ｍＬ、振騰の振幅を４ｍｍ、振騰時間を１５分、検体溶液を７０μＬと固定し、振騰速度を３００〜２８００ｒｐｍまで変化させたときのｐＨ変化であるΔｐＨを測定した実験結果である。２回分の平均値を算出している。
なおここで、１ミリ単位は、２６℃で１分間に１μｍｏｌ  の尿素を分解するウレアーゼの量と定義する。
表１からわかるように、振騰速度である回転数が大きいほどΔｐＨが大きくなることから、振騰速度が早いほど反応速度が速いことがわかる。
【表１】
2004226307.tif 000003
【００２１】
表２は、振騰速度を２８００ｒｐｍとして振騰時間を５分、１０分、１５分としたとき、および振騰させずに１５分間静置させたものの、Ｈｐウレアーゼ濃度（ｍＵ／ｍＬ）に対するΔｐＨのデータの結果である。データは２回分の平均である。
【表２】
2004226307.tif 000004
【００２２】
図７は、表２の結果をグラフにまとめたものである。これより、同じＨｐウレアーゼ濃度であれば静置よりも振騰させた方がΔｐＨは大きいこと、さらには振騰時間が長いほどΔｐＨが大きいことが示されている。
【００２３】
以上の説明において、例えば測定対象をヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼとすれば、固相部３ａに固定化される抗体とは、ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼに対するモノクロナール抗体である。しかし、本発明はこれに限定されず、固相部３ａに固定化される受容体は測定対象と特異的に結合し、測定対象は基質溶液のｐＨを変化させるものであれば良い。
【００２４】
【発明の効果】
以上詳記したように、本試薬カートリッジの固相チップ３が検体希釈液収納部４の中に挿入された状態で振騰装置により振騰させるようにしたため、測定対象と受容体との結合反応速度を速めることができる。そのことにより同一の検出下限濃度を達成するための反応時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態の試薬カートリッジの縦断面図。
【図２】本発明の実施の形態の試薬カートリッジの外観を示す斜視図。
【図３】本発明の実施の形態の試薬カートリッジにおける固相チップ３の外観を示す斜視図。
【図４】本発明の実施の形態の試薬カートリッジの使用状態を示す図。
【図５】本発明の試薬カートリッジを振騰装置に取り付けた状態を示す図であり、図５（ａ）は側面断面図、図５（ｂ）は正面図。
【図６】本発明の実施の形態の試薬カートリッジにおける固相チップ３を用いて行ったｐＨ誘因体測定を説明するための図。
【図７】Ｈｐウレアーゼ濃度・振騰の有無・振騰時間がΔｐＨに与える影響をグラフにした図。
【符号の説明】
１    本体
２    固相チップ収納部
３    固相チップ
３ａ  固相部
３ｂ  固相チップホルダー部
３ｃ  貫通孔
４    検体希釈液収納部
５    検体希釈液
６    シール
１０    試薬カートリッジ
１１    測定セル
１２    入口
１３    オーバーフロー部
１４    廃液口
１５    ｐＨ電極
１６    参照用ｐＨ電極
２１    防振ケース
２２    回転モーター
２３    偏心ローター
２４    支軸部
２５    カートリッジ固定台
２６    固定台支持部
２７    回転軸受け
２８    開口部
２９ａ、２９ｂ  ゴム製ストッパー
３０    ゴムクッション
３１    クッション
【図１】
2004226307.tif 000005
【図２】
2004226307.tif 000006
【図３】
2004226307.tif 000007
【図４】
2004226307.tif 000008
【図５】
2004226307.tif 000009
【図６】
2004226307.tif 000010
【図７】
2004226307.tif 000011