(57)【要約】【課題】植物における活性窒素ストレスの抑制手段を提供すること。【解決手段】ペルオキシレドキシンの発現を増大させる、植物における活性窒素ストレスの抑制方法；植物細胞に、ペルオキシレドキシンをコードする核酸を導入し、形質転換植物細胞を得るステップ、得られた形質転換植物細胞から植物体を再生するステップ、及び得られた植物体を、導入された核酸に由来するペルオキシレドキシンの発現に適した条件下に生育させるステップを含む、活性窒素ストレス抑制能を有するトランスジェニック植物の製造方法；及び該製造方法により得られるトランスジェニック植物又はその種子。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシレドキシンの発現を増大させることを特徴とする、植物における活性窒素ストレスの抑制方法。
【請求項２】
該ペルオキシレドキシンが、植物由来の２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンである、請求項１記載の抑制方法。
【請求項３】
該２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンが、
（ｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｉｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失、付加若しくは挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチド、及び
（ｉｉｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチド、
からなる群より選ばれた１種のポリペプチドである、請求項１又は２記載の抑制方法。
【請求項４】
（ａ）植物細胞に、ペルオキシレドキシンをコードする核酸を導入し、形質転換植物細胞を得るステップ、
（ｂ）前記（ａ）で得られた形質転換植物細胞から植物体を再生するステップ、及び
（ｃ）前記（ｂ）で得られた植物体を、導入された核酸に由来するペルオキシレドキシンの発現に適した条件下に生育させるステップ、
を含む、活性窒素ストレス抑制能を有するトランスジェニック植物の製造方法。
【請求項５】
該ペルオキシレドキシンが、植物由来の２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンである、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
該ペルオキシレドキシンをコードする核酸が、誘導可能なプロモーターの制御下に配置された核酸である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
該ペルオキシレドキシンをコードする核酸が、
（Ｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ＩＩ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ＩＩＩ）  前記（Ｉ）の核酸の塩基配列と少なくとも２０％の配列同一性を有し、かつコードされるポリペプチドが、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチドである核酸、及び
（ＩＶ）  前記（Ｉ）の核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸であり、かつコードされるポリペプチドが、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチドである核酸、
からなる群より選ばれた１種の核酸である、請求項５又は６記載の製造方法。
【請求項８】
請求項４〜７いずれか１項に記載の製造方法により得られるトランスジェニック植物又はその種子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物における活性窒素ストレスの抑制方法、活性窒素ストレス抑制能を有する植物及びその製造方法、並びに植物の生育環境における活性窒素ストレス抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物において、一酸化窒素、そのレドックス活性型であるＳ−ニトロソグルタチオン（ＧＳＮＯ）などの活性窒素分子種は、活性酸素分子種、ヘム酵素群、タンパク質を含めた生体チオール分子種などの標的分子と速やかに反応し、免疫、細胞シグナル伝達、種々のホメオスタチック制御プロセスなど、生理学的現象及び病理学的現象の両方において、種々の役割を果たすことが知られている。
【０００３】
また、植物においては、一酸化窒素は、病原菌への防御応答の活性化シグナル分子として働き、おそらく、その他の生理プロセスや発生プロセスをも調節していると考えられている（非特許文献１）。
【０００４】
例えば、前記一酸化窒素及びその機能的に同等な誘導体の生物活性は、代謝酵素、イオンチャネル、シグナル伝達分子、転写因子などの標的分子の触媒機能及び調節機能を担うチオール基及び遷移金属中心の酸化還元修飾に関与することが報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
しかしながら、一酸化窒素及びその機能的に同等な誘導体は、ＤＮＡを変異させ、タンパク質を酸化、ニトロ化し、脂質酸化を開始させ、細胞傷害等を引き起こす場合がある（非特許文献３及び非特許文献４）。
【０００６】
植物には，硝酸から亜硝酸を経て一酸化窒素を生成する経路がある（非特許文献５）。植物における前記活性窒素分子種によるストレス（活性窒素ストレス）の例としては、植物への過剰な亜硝酸塩の存在は、生育阻害や葉の白化現象を引き起こすなどが挙げられるが、該活性窒素ストレスに対する応答機構は、不明な点が多いのが現状である。
【０００７】
【非特許文献１】
ウェンデーン（Ｗｅｎｄｅｈｅｎｎｅ），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ
Ｓｃｉ．，６，１７７−１８３（２００１）
【非特許文献２】
ステイムラー（Ｓｔａｍｌｅｒ）ら，Ｃｅｌｌ，１０６，６７５−６８３頁，２００１
【非特許文献３】
コッペノル（Ｋｏｐｐｅｎｏｌ）ら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，５，８３４−８４２，１９９２
【非特許文献４】
ナザン（Ｎａｔｈａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、８８４１−８８４８、２０００
【非特許文献５】
ロケル（Ｒｏｃｋｅｌ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．、５３、１０３−１１０、２００２
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記従来の技術に鑑みてなされたものであり、本発明は、植物における活性窒素ストレスを抑制すること、活性窒素ストレスの要因となる一酸化窒素・パーオキシナイトライト等の活性窒素種や、活性窒素源である硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーションのための手段を提供すること等を可能にする、植物における活性窒素ストレスの抑制方法を提供することを目的とする。また、本発明は、活性窒素ストレス抑制能を発揮し、活性窒素ストレスの要因となる一酸化窒素・パーオキシナイトライト等の活性窒素種や、活性窒素源である硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーションに有用なトランスジェニック植物又はその種子を提供することを目的とする。さらに、本発明は、活性窒素ストレス抑制能を発揮し、活性窒素ストレスの要因となる一酸化窒素・パーオキシナイトライト等の活性窒素種や、活性窒素源である硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーションに有用なトランスジェニック植物又はその種子を供給することができる、活性窒素ストレス抑制能を有する植物の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、活性窒素ストレスの要因となる一酸化窒素・パーオキシナイトライト等の活性窒素種や、活性窒素源である硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーション等に有用な、植物の生育環境における活性窒素ストレス抑制剤を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、
〔１〕  ペルオキシレドキシンの発現を増大させることを特徴とする、植物における活性窒素ストレスの抑制方法、
〔２〕  該ペルオキシレドキシンが、植物由来の２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンである、前記〔１〕記載の抑制方法、
〔３〕  該２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンが、
（ｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｉｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失、付加若しくは挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチド、及び
（ｉｉｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチド、
からなる群より選ばれた１種のポリペプチドである、前記〔１〕又は〔２〕記載の抑制方法、
〔４〕  （ａ）植物細胞に、ペルオキシレドキシンをコードする核酸を導入し、形質転換植物細胞を得るステップ、
（ｂ）前記（ａ）で得られた形質転換植物細胞から植物体を再生するステップ、及び
（ｃ）前記（ｂ）で得られた植物体を、導入された核酸に由来するペルオキシレドキシンの発現に適した条件下に生育させるステップ、
を含む、活性窒素ストレス抑制能を有するトランスジェニック植物の製造方法、
〔５〕  該Ｃｙｓペルオキシレドキシンが、植物由来の２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンである、前記〔４〕記載の製造方法、
〔６〕  該ペルオキシレドキシンをコードする核酸が、誘導可能なプロモーターの制御下に配置された核酸である、前記〔５〕記載の製造方法、
〔７〕  該ペルオキシレドキシンをコードする核酸が、
（Ｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ＩＩ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ＩＩＩ）  前記（Ｉ）の核酸の塩基配列と少なくとも２０％の配列同一性を有し、かつコードされるポリペプチドが、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチドである核酸、及び
（ＩＶ）  前記（Ｉ）の核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸であり、かつコードされるポリペプチドが、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチドである核酸、
からなる群より選ばれた１種の核酸である、前記〔５〕又は〔６〕記載の製造方法、並びに
〔８〕  前記〔４〕〜〔７〕いずれか１項に記載の製造方法により得られるトランスジェニック植物又はその種子、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本明細書において、「活性窒素ストレス」とは、土壌の硝酸体窒素や大気中の窒素酸化物に由来する活性窒素種、例えば、一酸化窒素、パーオキシナイトライト、プロトン型亜硝酸塩等により生じるニトロソ化及び酸化障害の結果としてもたらされる活性窒素誘導細胞傷害等ストレスをいう。
【００１１】
本発明は、予想外にも、植物、例えば、シロイヌナズナのクロロプラスト  ペルオキシレドキシンにより、パーオキシナイトライトが消去され、活性窒素ストレスによる酸化傷害を減少させるという本発明者らの知見に基づものであり、かかる知見により、植物における活性窒素ストレスの抑制手段、土壌のレメディエーション手段等が提供される。
【００１２】
本発明の植物における活性窒素ストレスの抑制方法は、ペルオキシレドキシンの発現を増大させることに１つの大きな特徴がある。本発明の抑制方法においては、植物内におけるペルオキシレドキシンの発現を増大させるため、活性窒素ストレスによる酸化傷害を低減させることができるという優れた効果を発揮する。
【００１３】
本発明の抑制方法に用いられるペルオキシレドキシンとしては、パーオキシナイトライトを捕捉して、消去する活性（パーオキシナイトライト消去能）を呈するものであればよい。前記ペルオキシレドキシンとしては、具体的には、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシン、１−Ｃｙｓペルオキシレドキシン等が挙げられる。植物における活性を十分に発揮させる観点から、植物由来２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンが好ましく、具体的には、シロイヌナズナ由来２−Ｃｙｓペルオキシレドキシン、イネ由来２−Ｃｙｓペルオキシレドキシン、オオムギ由来２−Ｃｙｓペルオキシレドキシン、ホウレンソウ由来２−Ｃｙｓペルオキシレドキシン等が挙げられる。
【００１４】
前記２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンとしては、より具体的には、（ｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。なお、前記（ｉ）のポリペプチドは、シロイヌナズナクロロプラストの２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンであり、本発明者らにより、パーオキシナイトライト消去能を有することが見出されたものである。
【００１５】
前記配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する２ＣＰＲＸは，２６６アミノ酸残基からなる前駆体タンパク質として生産され、葉緑体に輸送される。その後、アミノ末端側の６８残基からなると推定される輸送シグナル配列が切断され、成熟型タンパク質を生じる。
【００１６】
また、本発明の抑制方法に用いられる２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンは、パーオキシナイトライト消去能を有するものであれば、配列番号：１に示されるアミノ酸配列により限定されるものではなく、（ｉｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失、付加若しくは挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチド、又は
（ｉｉｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチド、
であってもよい。
【００１７】
前記（ｉｉ）のポリペプチドは、天然に存在するバリアントであってもよく、人為的に変異（置換、欠失、付加若しくは挿入）を導入して得られた変異体であってもよい。前記人為的な変異の導入は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸に対し、慣用の部位特異的変異導入方法〔例えば、ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，９４４１−９４５６，１９８４）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８−４９２，１９８５）等〕により変異を導入することにより行なわれうる。
【００１８】
前記変異としては、例えば、配列番号：１に示されるアミノ酸配列中の少なくとも１残基のアミノ酸の保存的置換；配列番号：１のアミノ酸番号：１１０〜１２２、１４０〜１５５、及び２４０〜２４５を除く領域におけるアミノ酸の置換、欠失、付加若しくは挿入；配列番号：１のアミノ酸番号：１１０〜１２２、１４０〜１５５、及び２４０〜２４５を除く領域の少なくとも１つのおけるアミノ酸の保存的置換等が挙げられる。ただし、配列番号：１のアミノ酸番号：１１９
及び２４１のシステイン残基の置換は除かれる。
【００１９】
本明細書において、「保存的置換」は、生理的に同等な物理化学的性質を与えるアミノ酸との置換をいう。前記「生理的に同等な物理化学的性質を与えるアミノ酸」としては、ポリペプチドの有する生理活性を維持し、かつ生体において、立体構造における形状の特徴、疎水性、電荷、ｐＫ等に関して同等の物理化学的性質を示しうるアミノ酸が挙げられる。より具体的には、下記グループ１〜６：
グループ１  グリシン、アラニン；
グループ２  バリン、イソロイシン、ロイシン；
グループ３  アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；
グループ４  セリン、スレオニン；
グループ５  リジン、アルギニン；
グループ６  フェニルアラニン、チロシン；
のいずれかのグループに属するアミノ酸と、同じグループに属する他のアミノ酸との置換が挙げられる。
【００２０】
前記パーオキシナイトライト消去能は、ブライク（Ｂｒｙｋ）ら〔Ｎａｔｕｒｅ  ４０７，２１１−２１５，２０００〕に記載の技術により、パーオキシナイトライト−感受性プローブであるジヒドロローダミン１２３を用いて評価されうる。具体的には、測定対象のポリペプチドを、５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．０）と、２０μＭ  ジヒドロローダミン１２３と２０μＭ  ジエチレントリアミン五酢酸とを含有した溶液中、２５℃でインキュベートする。パーオキシナイトライトを添加し、ついで、１分間強く攪拌させて、ジヒドロローダミン１２３のローダミンへの酸化を開始させる。また、使用に先立ち、パーオキシナイトライトの濃度を、０．１Ｍ  ＮａＯＨ中３０２ｎｍ（ε３０２＝１，６７０Ｍ−１ｃｍ−１）での吸光度から決定しておく。ローダミン１２３の形成を、５００ｎｍで、分光光度法によりモニターする。なお、パーオキシナイトライトの存在下では、ジヒドロローダミン１２３は、高蛍光ローダミン１２３に酸化される。
【００２１】
また、本発明に用いることができる２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンの機能は、過酸化水素還元ペルオキシダーゼ活性の発現によっても評価されうる。前記過酸化水素還元ペルオキシダーゼ活性は、Ｈ２Ｏ２あるいはｔｅｒｔ−ブチルハイドロペルオキシド（ｔ−ＢｕＯＯＨ）を基質とし、組換タンパク質の再生のための酵母由来のＴｒｘ／ＮＡＤＰＨ：Ｔｒｘオキシドレダクターゼ（ＴＲ）共役系とを用いた山本（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら〔ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４４７，  ２６９−２７３，１９９９〕の方法の改変法により評価されうる。具体的には、２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ  ７．０）と、２００μＭ  ＮＡＤＰＨと、６μＭＴＲ〔カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製〕と０．６−６μＭ  組換タンパク質とを含有した溶液を、２５℃でプレインキュベートする。その後、基質（７０μＭ  ｔ−ＢｕＯＯＨ又は１００μＭ  Ｈ２Ｏ２）を添加し、ついで、８μＭ  Ｔｒｘ〔カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）〕を添加することにより反応を開始させる。ＮＡＤＰＨ（ε３４０＝６，３１０Ｍ−１ｃｍ−１）の酸化による３４０ｎｍにおける吸光度の減少を、２５℃で連続的に記録し、モニターすることにより、活性を測定する。なお、活性は、１ｍｇのタンパク質あたり、１分間に酸化される  ＮＡＤＰＨ（ｎｍｏｌ）であらわされる。
【００２２】
なお、測定対象のポリペプチドが、本発明に用いることができる２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンであることの評価は、該測定対象のポリペプチドをコードする核酸を保持するベクターをサッカロマイセス・セルビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ｔｓａ１Δ−ｔｓａ２Δ二重変異体に導入し、得られた形質転換酵母細胞を、１ｍＭ  亜硝酸ナトリウムを含む培地（ｐＨ５．２）で培養し、該形質転換酵母が、ｔｓａ１Δ−ｔｓａ２Δ二重変異体又は該核酸を保持しないベクターが導入されたｔｓａ１Δ−ｔｓａ２Δ二重変異体に比べ、生育が良好であることを指標として評価することもできる。
【００２３】
前記（ｉｉ）のポリペプチドは、前記したように、変異を導入し、得られた変異体の中から、前記した評価により、前記パーオキシナイトライト消去能、さらには、前記ペルオキシダーゼ活性、さらには、亜硝酸ナトリウム存在下における良好な生育を呈するものを選別することにより、容易に得ることができる。
【００２４】
また、前記（ｉｉｉ）のポリペプチドは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもののなかから、前記パーオキシナイトライト消去能、さらには、前記ペルオキシダーゼ活性、さらには、亜硝酸ナトリウム存在下における良好な生育を呈するものを選別することにより、容易に得ることができる。
【００２５】
なお、前記配列同一性は、少なくとも２０％、好ましくは、３０％以上、より好ましくは、４０％以上、さらに好ましくは、５０％以上、よりさらに好ましくは、６０％以上、より一層好ましくは、７０％以上であればよい。
【００２６】
前記配列同一性は、２つの分子における比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を配列同一性の算出に適したアルゴリズムに基づき比較することにより決定されうる。ここで、比較対象の配列は、２つの配列の最適なアラインメントのための参考配列（例えば、コンセンサス配列等）と比べて、付加又は欠失（例えば、ギャップ等）を有していてもよい。なお、本明細書において、配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム〔期待値１０、ワードサイズ３、ギャップコスト（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１）〕を用いることにより算出された値であり、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において、一般に利用可能なＢＬＡＳＴ等を用いて算出されうる。したがって、他のアルゴリズムに基づく手法、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）らの局所ホモロジーアルゴリズム〔Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ．，２，４８２，１９８１〕、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）らのホモロジーアラインメントアルゴリズム〔Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，４８，４４３，１９７０］、パールソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）らの相同性検索法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８５，２４４４，１９８８〕で算出した場合と数値が異なる場合があってもよい。
【００２７】
２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンの発現の増大は、該２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンに対する発現誘導剤の使用、該２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンに対する発現に適した条件下での生育、酸化ストレスを誘引する環境要因（例えば、強光条件）、活性酸素の適用（例えば、過酸化水素の添加）等により行なわれうる。
【００２８】
なお、前記発現誘導剤は、例えば、前記ペルオキシレドキシンが導入された細胞、例えば、酵母（例えば、前記ｔｓａ１Δ−ｔｓａ２Δ二重変異体等）、植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞等に前記２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンをコードする核酸を導入して得られた細胞を、該発現誘導物質の存在下に培養し、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンの発現の増大、亜硝酸ナトリウム存在下における生育の改善などを指標として、容易に選別し、得ることもできる。
【００２９】
本発明者らの知見によれば、活性窒素ストレス抑制能を有するトランスジェニック植物又はその種子及びその製造方法も提供されうる。かかるトランスジェニック植物又はその種子及びその製造方法も本発明に含まれる。
【００３０】
本発明のトランスジェニック植物の製造方法は、（ａ）植物細胞に、ペルオキシレドキシンをコードする核酸を導入し、形質転換植物細胞を得るステップ、
（ｂ）前記（ａ）で得られた形質転換植物細胞から植物体を再生するステップ、及び
（ｃ）前記（ｂ）で得られた植物体を、導入された核酸に由来するペルオキシレドキシンの発現に適した条件下に生育させるステップ、
を含む方法である。
【００３１】
前記ペルオキシレドキシンは、前記と同様である。
【００３２】
前記ステップ（ａ）において、植物細胞への核酸の導入は、生物的導入法、直接的導入法等により行なわれうる。
【００３３】
前記生物的導入法としては、例えば、慣用のアグロバクテリウムを用いる方法等が挙げられる。かかるアグロバクテリウムを用いる方法においては、Ｔｉプラスミド等の慣用のベクターを介して前記核酸が導入されうる。
【００３４】
なお、前記核酸は、誘導可能なプロモーターの制御下に配置された核酸であってもよい。
【００３５】
前記ベクターは、マーカーとなる遺伝子、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等、前記２ＣＰＲＸの発現制御可能なプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、イネアクチン遺伝子プロモーター、トウモロコシユビキチン遺伝子プロモーター等、前記２ＣＰＲＸの発現を調節しうるエレメント、例えば、アグロバクテリウムのノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター等を含有していてもよい。
【００３６】
前記直接的導入法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガンを用いたボンバードメント法等が挙げられる。かかる直接的導入法においては、前記核酸又は該核酸を含有した発現可能な構築物が用いられうる。また、前記直接的導入法においては、前記核酸又は該核酸を含有した発現可能な構築物を、植物のプロトプラスト、ディスク状の葉切片（リーフディスク）等に導入する。
【００３７】
前記ペルオキシレドキシンをコードする核酸としては、
（Ｉ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ＩＩ）  配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ＩＩＩ）  前記（Ｉ）の核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸であり、かつコードされるポリペプチドが、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチドである核酸、
（ＩＶ）  前記（Ｉ）の核酸の塩基配列と少なくとも２０％の配列同一性を有し、かつコードされるポリペプチドが、パーオキシナイトライト消去能を有するポリペプチドである核酸、
が挙げられる。
【００３８】
ここで、前記「ストリンジェントな条件」としては、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス刊、１９８９〕等に記載の条件が挙げられる。具体的には、例えば、
▲１▼  ６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ    ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％  ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ  変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％  ホルムアミド（含有しなくてもよい）を含む溶液中、プローブとともに４２℃（ホルムアミドを含まない場合は、６５℃）で一晩保温するステップ、
▲２▼  非特異的にハイブリダイズしたプローブを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、より厳しくは、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、より厳しくは、３０℃下、さらに厳しくは、２５℃下、よりさらに厳しくは、１０℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、より厳しくは、３７℃以上、さらに厳しくは、４２℃以上、よりさらに厳しくは、５０℃以上、より一層厳しくは、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なうことにより、例えば、前記（Ｉ）の核酸の塩基配列と少なくとも約２０％、好ましくは、３０％以上、より好ましくは、４０％以上、さらに好ましくは、５０％以上、よりさらに好ましくは、６０％以上、より一層好ましくは、７０％以上の配列同一性を有する核酸を得ることができる。なお、Ｔｍは、例えば、下記式：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチド中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる。
【００３９】
植物細胞としては、プロトプラスト等が挙げられる。
【００４０】
植物細胞の由来は、特に限定されるものではなく、例えば、シロイヌナズナ、イネ、タバコ等が挙げられる。
【００４１】
核酸が導入された形質転換細胞の選別は、例えば、マーカー遺伝子を用いた場合には、該マーカー遺伝子の発現を指標とすることもでき、さらには、遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、導入遺伝子の特異的増幅を指標として行なわれうる。
【００４２】
前記ステップ（ｂ）において、形質転換植物細胞からの植物体の再生は、例えば、プロトプラストの場合、該プロトプラストを栄養培地で５〜１０日程度培養して、細胞壁を合成させ、ついで、液体培地中で、激しく攪拌させながら、培養し、カルスを得、得られたカルスをオーキシンおよびサイトカイニンの存在下に培養することにより行なわれうる。なお、カルスからの植物体の再生は、
（１）低濃度のオーキシンと高濃度のサイトカイニンを最初に用いた場合には、枝に該当する部分が再生され、ついで、高濃度のオーキシンの存在下に生育させること、
（２）高濃度のオーキシンと低濃度のサイトカイニンを最初に用いた場合には、枝に該当する部分が再生され、ついで、高濃度のサイトカイニンの存在下に生育させること、
により植物体を得ることができる。
【００４３】
前記ステップ（ｃ）においては、ペルオキシレドキシンの発現に適した条件は、例えば、導入した核酸が誘導可能なプロモーターの制御下に配置されている場合、該プロモーターの誘導条件を適用すればよい。
【００４４】
前記製造方法により得られたトランスジェニック植物又はその種子は、例えば、種々の強度の亜硝酸ストレス下での培養、化学窒素肥料（硝酸塩又はアンモニウム塩）  過剰施肥下での生育の評価をバイオマス増加量（根や茎葉の生長量）・クロロフィル含有量（ともに個体レベル）や光合成活性（細胞レベル）を指標とすること、二酸化窒素などの窒素酸化物を含む大気中での生育等により評価されうる。
【００４５】
また、本発明者らの知見により、植物の生育環境における活性窒素ストレス抑制剤も提供されうる。
【００４６】
前記活性窒素ストレス抑制剤は、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンを保持した支持体を含有することに１つの大きな特徴がある。本発明の活性窒素ストレス抑制剤は、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンの機能が利用されているため、パーオキシナイトライトを消去することができ、それにより、植物における活性窒素ストレスを抑制すること、活性窒素ストレスの要因となる一酸化窒素・パーオキシナイトライト等の活性窒素種や，活性窒素源である硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーション等を行なうことができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の活性窒素ストレス抑制剤は、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンを保持した支持体を用いられているため、より安定に、長期にわたり、効率よく、パーオキシナイトライト消去能を発現させることができるという優れた効果を発揮する。
【００４７】
前記活性窒素ストレス抑制剤は、より安定に、長期にわたり、効率よく、パーオキシナイトライト消去能を発現させる観点から、好ましくは、酸化されたＣｙｓ残基を還元しうる系（システイン還元系）をさらに保持していることが望ましい。なお、かかるシステイン還元系は、好ましくは、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンによるパーオキシナイトライト消去能を発現させるに適した量となるように保持されていることが望ましい。
【００４８】
前記２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンを保持した支持体としては、前記２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンが導入された微生物（例えば、酵母、細菌等に前記２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンをコードする核酸を導入して得られた微生物）、前記２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンが固定化された担体（例えば、慣用の固定化酵素に用いられる担体等）等が挙げられる。
【００４９】
なお、前記微生物は、好ましくは、土壌微生物、特に植物の生育を妨げない土壌微生物であることが望ましい。
【００５０】
また、本発明の活性窒素ストレス抑制剤は、適宜、支持体の維持、２−Ｃｙｓペルオキシレドキシンの機能の維持・発現に適した助剤を含有していてもよい。
【００５１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５２】
また、以下の実施例において、一般的な遺伝子操作等は、特に明記しない限り、モレキュラークローニング  ア  ラボラトリーマニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９〕に記載の方法に準じた。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を、ＬＢ培地〔組成：１％（ｗ／ｖ）  トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）  酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）〕中、３７℃で培養した。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡの操作には、大腸菌ＤＨ５α株を用い、かかる操作の際には、ＴＡ−クローニングベクターは、ｐＴ７Ｂｌｕｅ〔ノバージェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕を用いた。サッカロマイセス・セルビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、特に明記しない限り、ＹＰＤ培地［１％（ｗ／ｖ）  酵母エキス，２％（ｗ／ｖ）バクトペプトン，２％（ｗ／ｖ）  グルコース］中、ｐＨ５．８で３０℃で培養した。
【００５３】
実施例１
クロロプラスト局在型２ＣＰＲＸであるオオムギＢＡＳ１〔バイエル（Ｂａｉｅｒ）ら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１１，６５１，１９９６〕に対するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）における推定成熟型ホモログをコードするｃＤＮＡ（５９７ｂｐ長）をクローン化するため、シロイヌナズナ  エコタイプ  コロンビアの緑色栄養生長組織について構築されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、Ｅｘ  ＴａｑＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼ〔タカラバイオ社製〕を用い、ＰＣＲを行なった。
【００５４】
なお、シロイヌナズナにおける成熟型２ＣＰＲＸタンパク質のＮ末端アミノ酸配列の情報がないため、スピナシア  オレナシア（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）由来の成熟型クロロプラスト２ＣＰＲＸのＮ末端配列に対するホモロジーに基づき、前駆体の輸送ペプチドの切断部位を割り当てた。用いたプライマーは、ＮｄｅＩ制限酵素部位（下線）を有するセンスプライマー（５’−ｃａｔａｔｇｇｃｃｇａｔｇａｔｃｔｔｃｃａｃｔｇｇｔｔ−３’；配列番号：２）とＢａｍＨＩ制限酵素部位（下線）を有するアンチセンスプライマー（５’−ｇｇａｔｃｃｃｔａａａｔａｇｃｔｇａｇａａｇｔａｃｔｃ−３’；配列番号：３）である。かかるプライマー対を用いることにより、得られる産物においては、輸送ペプチドを構成すると考えられる前駆体Ａｔｃ２ＣＰＲＸのＮ末端６８アミノ酸に対応する領域が除去され、これに代わりメチオニン１残基に対応するコドンが創出される。
【００５５】
ＰＣＲの反応条件は、前処理９４℃／５分のあと，９４℃／１分（変性），５６℃／１分（アニーリング），７２℃／１分（鎖伸長）のサイクルを３０回繰り返したものである。
【００５６】
ついで、得られた増幅断片をｐＴ７Ｂｌｕｅに連結し、クローニングプロセスで変異が導入されていないことを確認するためにシークエンスした。ついで、前記ｃＤＮＡをＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ断片として、Ｔ７プロモーターによる制御が可能な発現ベクターｐＥＴ１６ｂに連結し、ｐＥＴ−ＡｔＰＲＸを得た。
【００５７】
得られたｐＥＴ−ＡｔＰＲＸを用い。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を形質転換し、６０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールと８０μｇ／ｍｌ  アンピシリンとを含有したＬＢ培地で培養した。得られた形質転換体について、６０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールと８０μｇ／ｍｌ  アンピシリンとを含有したＬＢ培地中３７℃で培養し、培地の濁度が０．５に達した時点で、該培地に、０．４ｍＭ  イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時間培養して、Ｎ末端６ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ融合タンパク質として、推定成熟タンパク質（以下、Ａｔｃ２ＣＰＲＸと表示する）の発現を誘導した。
【００５８】
ついで、得られた培養物のＨｉｓタグ組換タンパク質含有可溶性画分について、Ｎｉ２＋−アフィニティーカラム〔商品名：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；ノバージェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕で、キットにより提供されたマニュアルの説明に従い精製した。精製タンパク質を脱塩し、限外ろ過〔商品名：ＮａｎｏｓｅｐＴＭ  １０Ｋ；ポールジェルマンラボラトリー（Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）社製〕で濃縮した。
【００５９】
得られたタンパク質を、１２％（ｗ／ｖ）  変性ポリアクリルアミドゲルでのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、クマシーブルーで染色した。タンパク質濃度は、ＢＳＡを標準として用いて、ブラッドフォード法〔Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ；ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕で決定した。
【００６０】
図１のパネルａに、ニッケル−アフィニティークロマトグラフィーを用いた、細菌細胞の可溶性画分からの組換Ａｔｃ２ＣＰＲＸの精製を示す。図１のパネルａ，レーン４に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での精製融合タンパク質の見かけの分子量（２７  ｋＤａ）は、Ｈｉｓタグとリンカー配列とを含む組換タンパク質の推定分子量（２３ｋＤａ）よりも大きかった。同様な所見が、他の生物由来の２ＣＰＲＸについて報告されており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度の遅延は、おそらく、種々の供給源由来の２ＣＰＲＸの共通の性質であろうと思われる。
【００６１】
２ＣＰＲＸファミリーの典型的な性質は、２つのサブユニットの触媒システイン残基間のジスルフィドで結合した二量体の形成能である。そこで、Ａｔｃ２ＣＰＲＸがこの性質を維持しているかどうかを調べるため、５ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は５ｍＭ  Ｈ２Ｏ２で単独で処理し、Ａｔｃ２ＣＰＲＸを、ゲルろ過により精製して還元剤及び酸化剤を除去し、変性／非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。なお、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥには、還元剤を含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを用いた。
【００６２】
その結果、図１のパネルｂのレーン３に示されるように、Ａｔｃ２ＣＰＲＸは、酸化による二量体化で５０−ｋＤａタンパク質を形成するが、レーン１に示されるように、還元後、単量体として存在した。これらの結果は、Ａｔｃ２ＣＰＲＸが、２ＣＰＲＸに共通の報告された構造的性質を保持した形で、細菌内で生産されたことを示す。
【００６３】
実施例２
Ａｔｃ２ＣＰＲＸが大腸菌内で活性を保持した形で生産されているかどうかを決定するため、以下のように、インビトロで過酸化水素還元ペルオキシダーゼ活性を測定した。
【００６４】
Ｈ２Ｏ２あるいはｔｅｒｔ−ブチルハイドロペルオキシド（ｔ−ＢｕＯＯＨ）を基質とし、組換タンパク質の再生のための酵母由来のＴｒｘ／ＮＡＤＰＨ：Ｔｒｘオキシドレダクターゼ（ＴＲ）共役系とを用いた山本（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら〔ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４４７，  ２６９−２７３，１９９９〕の方法の改変法により、組換Ａｔｃ２ＣＰＲＸのペルオキシダーゼ活性を測定した。
【００６５】
２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．０）と、２００μＭ  ＮＡＤＰＨと、６μＭ  ＴＲ〔カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製〕と０．６−６μＭ組換タンパク質とを含有した溶液を、２５℃でプレインキュベートした。その後基質（７０μＭ  ｔ−ＢｕＯＯＨ又は１００μＭ  Ｈ２Ｏ２）を添加し、ついで、８μＭ  Ｔｒｘ〔カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）〕を添加することにより反応を開始させた。
【００６６】
活性は、ＮＡＤＰＨ（ε３４０＝６，３１０Ｍ−１ｃｍ−１）の酸化による３４０ｎｍにおける吸光度の減少を、２５℃で連続的に記録し、モニターすることにより測定した。活性は、１ｍｇのタンパク質あたり、１分間に酸化される  ＮＡＤＰＨ（ｎｍｏｌ）であらわされる。
【００６７】
その結果、図２のパネルａに示されるように、精製Ａｔｃ２ＣＰＲＸは、酵素的に活性であり、基質（Ｈ２Ｏ２又はｔ−ＢｕＯＯＨ）及びＴｒｘ／ＴＲ系の両方の存在に完全に依存してＮＡＤＰＨの酸化を触媒した。Ｈ２Ｏ２及びｔ−ＢｕＯＯＨに対する比活性は、それぞれ２６３±５及び２０２±７ｎｍｏｌ  酸化ＮＡＤＰＨ分−１ｍｇ−１タンパク質（各値について、ｎ＝３）であった。ＮＡＤＰＨの酸化は、基質、Ｔｒｘ又はそれら両方の非存在下では、ほとんど起こらないので無視できる。
【００６８】
したがって、Ｈｉｓタグ融合タンパク質として生産されたＡｔｃ２ＣＰＲＸは、インビトロで触媒機能を発揮し、酵母Ｔｒｘ／ＴＲ系により、過酸化水素基質を還元すると思われる。
【００６９】
実施例３
Ｔｒｘ−依存性ペルオキシダーゼ活性を確認するため、以下のように、パーオキシナイトライト−感受性プローブであるジヒドロローダミン１２３を用いて、Ａｔｃ２ＣＰＲＸについて、インビトロでのパーオキシナイトライト消去能を調べた。
【００７０】
ブライク（Ｂｒｙｋ）ら〔Ｎａｔｕｒｅ  ４０７，２１１−２１５，２０００〕に記載の技術を用いて、パーオキシナイトライト消去活性を評価した。
【００７１】
種々の濃度の還元型又は酸化型の組換Ａｔｃ２ＣＰＲＸを、５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．０）と、２０μＭ  ジヒドロローダミン１２３〔モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社製〕と２０μＭ  ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）とを含有した溶液中、２５℃でインキュベートした。パーオキシナイトライト（８μＭ；Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を添加し、ついで、１分間強く攪拌させて、ジヒドロローダミン１２３のローダミンへの酸化を開始させた。
【００７２】
使用に先立ち、パーオキシナイトライトの濃度を、０．１Ｍ  ＮａＯＨ中３０２ｎｍ（ε３０２＝１，６７０Ｍ−１ｃｍ−１）での吸光度から決定した。ローダミン１２３の形成を、５００ｎｍで、分光光度法によりモニターした。なお、パーオキシナイトライトの存在下では、ジヒドロローダミン１２３は、高蛍光ローダミン１２３に酸化される。
【００７３】
Ａｔｃ２ＣＰＲＸの２つの標品：（１）ＤＴＴ処理で得られた還元タンパク質及び（２）Ｈ２Ｏ２処理による酸化型を、アッセイに用いた。還元型の組換Ａｔｃ２ＣＰＲＸは、５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．０）及び１０ｍＭ  ＤＴＴ中２５℃で１０分間インキュベートし、ついで、クロマトグラフィーカラム〔Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ（登録商標）  ６；バイオラッド  ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）〕でのゲルろ過で、ＤＴＴを除去することにより調製した。また、前記において、Ｈ２Ｏ２（１０ｍＭ）をＤＴＴに置換し、酸化型Ａｔｃ２ＣＰＲＸを得た。対照として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を同様に還元又は酸化させ、アッセイに用いた。
【００７４】
その結果、図２のパネルｂに示されるように、還元型Ａｔｃ２ＣＰＲＸは、パーオキシナイトライト−誘導酸化からジヒドロローダミンを保護し、濃度依存的にローダミンの形成を抑制した。また、ＢＳＡは、アッセイに先立って還元された場合、パーオキシナイトライトに対し多少保護を提供しうるが、保護の程度は、還元Ａｔｃ２ＣＰＲＸに比べて非常に低かった。対照的に、酸化型では、Ａｔｃ２ＣＰＲＸ及びＢＳＡの両方とも、ジヒドロローダミンの酸化をほとんど妨げなかった。これらの結果により、Ａｔｃ２ＣＰＲＸは、インビトロで、有効なパーオキシナイトライトスカベンジャーとして作用し、この能力は、おそらく、サブユニットの二量体化に反応しうる触媒システイン残基の酸化還元状態に依存することが示唆される。
【００７５】
実施例４
サッカロマイセス・セルビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ｔｓａ１Δ−ｔｓａ２Δ二重変異体は、活性酸素ストレス及び活性窒素ストレスに対して過敏性であり、細胞質に局在する２ＣＰＲＸをコードするＴＳＡ１及びＴＳＡ２の２つのほぼ同じ構造を持つ遺伝子の標的変異により、酸化ストレス及び活性窒素ストレスの両方に対するその耐性を大幅に損なう。
【００７６】
そこで、活性窒素ストレス耐性及び酸化ストレス耐性におけるＡｔｃ２ＣＰＲＸの機能的関連性を調べるため、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）  クロロプラスト２ＣＰＲＸにより、酵母における活性酸素ストレスに対する過敏感応答性を相補するかどうかを調べた。機能相補は、ワン（Ｗｏｎｇ）ら〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，５３８５−Ｔ３９４，２００２〕に記載の方法に準じて、細胞質ゾルの２ＣＰＲＸのｎｕｌｌ変異体である酵母変異体ｔｓａ１Δ−ｔｓａ２Δを用いて行なった。親株であるＢＹ４７４１を野生型コントロールとして用いた。相補試験には、発現ベクターは、オウレオバシジン−Ａ耐性を与える選択マーカー遺伝子を保持するｐＡＵＲ１２３〔タカラバイオ社製〕用いた。
【００７７】
Ａｔｃ２ＣＰＲＸについてＰＣＲで得られたｃＤＮＡを保持したｐＴ７Ｂｌｕｅを、ＮｄｅＩで消化し、平滑末端化し、ついで、ＳａｃＩで切断した。切り離されたｃＤＮＡを、ついで、ｐＡＵＲ１２３のＳｍａＩ制限部位とＳａｃＩ制限部位との間に挿入した。ｐＡｔＰＲＸと名づけられたこのプラスミドは、サッカロマイセス・セルビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＤＨ１プロモーターの制御下、前記ｃＤＮＡの発現を可能にする。ギエッツ（Ｇｉｅｔｚ）ら〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０，１４２５，１９９２〕に従い、酵母変異体ｔｓａ１Δ−ｔｓａ２Δのコンピテントセルを調製し、ｐＡｔＰＲＸを用いて形質転換した。なお、挿入断片を含まないベクター（空ベクター）で形質転換した前記変異体細胞を、コントロールとして用いた。
【００７８】
過敏感表現型の遺伝子相補は、以下のように行なった。野生型及び変異体の形質転換株をそれぞれ一晩培養した（ＯＤ６００＝０．５）。ついで、培養後の野生型及び変異体の形質転換株それぞれを、新しいＹＰＤ培地でＯＤ６００＝０．０３まで希釈させ、培養を再開させた。活性酸素耐性の評価のために、希釈細胞を、０．３ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を入れたＹＰＤで培養した。弱酸性条件（ｐＨ５．２）で、１ｍＭ  ＮａＮＯ２を含むＹＰＤで細胞を生育させることにより活性窒素ストレスを与えた。参照として、亜硝酸毒性を抑制するために、同じＹＰＤ／ＮａＮＯ２培地中、ｐＨ６．６で実験を行なった。細胞生育を。３時間毎ＯＤ６００で記録した。ＯＤ６００  が０．４を超えた場合、培養物の画分を適当に希釈し、精度をチェックするために、ＯＤを再記録した。
【００７９】
酵母でのＡｔｃ２ＣＰＲＸの異種発現を確認するため、組換タンパク質に対するウサギ抗体を用いてイムノブロット解析を行なった。
【００８０】
ウサギポリクローナル抗体を、Ｎｉ２＋−アフィニティークロマトグラフィーを用い、ついで、ゲルろ過（商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＨＲ  ｇｅｌ；アマシャム・ファルマシア  バイオテック社製）を行ない、４Ｍ  尿素の存在下変性条件下で精製された組換Ａｔｃ２ＣＰＲＸに対して生じさせた。
【００８１】
イムノブロット解析のために、酵母由来の１０μｇの可溶性タンパク質を１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。分離後、ゲル上のタンパク質をポリビニリデンフルオリド膜（商品名：ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭ−Ｐ；ミリポア社製）に転写した。膜をＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ含有でブロックした。免疫したウサギの血液血清（ＰＢＳで１：５０００希釈）とビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体とをそれぞれ、一次抗体及び二次抗体として用いた。４−クロロ−１−ナフトールをインディゴ生成基質として用いて、アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体とインキュベーションして、抗原−抗体複合体を視覚化させた。なお、前記抗体については、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）抽出物中の植物クロロプラスト２ＣＰＲＸと同様のサイズである２６ｋＤａタンパク質の検出能により信頼できることを確認した。
【００８２】
その結果、図３のパネルａのレーン３に示されるように、ｐＡｔＰＲＸにより形質転換された細胞（ＡＴＰＲＸと表示）は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に存在する２６ｋＤａタンパク質と共移動する免疫反応性タンパク質を生じた。一方、図３のパネルａのレーン２及び４のそれぞれに示されるように、そのようなシグナルは、野生型株（ＷＴ）又は空ベクターにより形質転換された変異体（ベクターコントロール）では検出されなかった。
【００８３】
したがって、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）  ｃＤＮＡで形質転換された変異体は、Ａｔｃ２ＣＰＲＸを生産することがわかった。
【００８４】
ついで、遺伝子導入により生産されたＡｔｃ２ＣＰＲＸが、ｔｓａ１Δ−ｔｓａ２Δ変異体の活性酸素ストレスに対する過敏感反応を相補しうるかどうかを調べた。その結果を図３のパネルｂ〜ｄに示す。
【００８５】
図３のパネルｂに示されるように、ＷＴの生育は、０．３ｍＭ  Ｈ２Ｏ２の存在下にほとんど影響を受けなかったが、ベクターコントロールは、同じ条件下で、大幅に遅い生育表現型を示した。Ａｔｃ２ＣＰＲＸ  ｃＤＮＡの発現は、図３のパネルｂに示されるように、ＡＴＰＲＸの生育により示されるように、変異体の生育を、十分ではないが、回復した。図３のパネルｃに示されるように、非ストレス条件下、これらの３つの株は、ＡＴＰＲＸに、軽い生育遅延が観察されたが、ほんのわずかに違っただけであった。図３のパネルｄに示されるように、非ストレス条件下に対するストレス条件下での９時間培養における各株の生育は、それぞれ、ＷＴで９０％、ＡＴＰＲＸで７０％及びベクターコントロールで１９％であった。
【００８６】
これらの結果により、Ａｔｃ２ＣＰＲＸが、インビボで機能し、酸化ストレスから酵母細胞を保護すること及び表現型相補が、実際に、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）タンパク質によるものであることが示された。
【００８７】
実施例５
亜硝酸塩は、プロトン化型のみが、ＮＯ及びその反応性誘導体を生じるため、中性でなく弱酸性で細胞傷害効果を発揮することが知られている活性窒素ストレス因子である。
【００８８】
そこで、亜硝酸塩のｐＨ−依存性毒性を利用して、酵母株について、５．２又は６．６のどちらかのｐＨで、１ｍＭ  亜硝酸ナトリウムを含む培地で培養することにより、活性窒素ストレスに対する耐性を調べた。結果を図４のパネル（ａ）〜（ｃ）に示す。
【００８９】
その結果、図４のパネル（ａ）に示されるように、ｐＨ５．２で亜硝酸ナトリウムの存在下、ベクターコントロールの生育は、実質的に阻害され、亜硝酸毒性が、細胞に傷害を与えることを示した。対照的に、ＡＴＰＲＸは、ベクターコントロールよりも顕著によく生育し、実際、生育は、ストレス条件下で野生型とＡＴＰＲＸとの間で差異がつかなかった。また、図４のパネル（ｂ）に示されるように、ｐＨ５．２で亜硝酸の非存在下、前記のような生育異常は、ベクターコントロールでは検出されなかった。
【００９０】
一方、ｐＨ６．６で培養した場合、亜硝酸毒性は、亜硝酸塩の存在〔図４のパネル（ｃ）〕又は非存在にもかかわらず、同様に生育する３株全てで、明らかに抑制された。かかるコントロール実験により、亜硝酸毒性は、より低いｐＨ条件に特異的であることが示唆された。
【００９１】
図４のパネル（ｄ）に示されるように、生育を９時間で比べた場合、ベクターコントロールの亜硝酸ストレスをうけた生育は、非ストレス条件下の生育の６０％にすぎなかったが、ＷＴ及びＡＴＰＲＸの両方は、実際に、ストレス処理により影響を受けなかった。
【００９２】
これらの結果により、Ａｔｃ２ＣＰＲＸが、インビボで活性窒素媒介ストレスの悪影響を緩和したことを示し、ＡＴＰＲＸにおいて観察された耐性が、インビボでパーオキシナイトライトなどの活性窒素ストレスを除去するＡｔｃ２ＣＰＲＸの能力に起因するであろうことが示唆される。
【００９３】
活性窒素ストレスに対するＡｔｃ２ＣＰＲＸの保護機能のさらなる証拠を得るため、細胞内オキシダントの存在下で高蛍光ＤＣＦに酸化される膜透過性化合物であるオキシダント感受性プローブである２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセイン  ジアセテート（Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡ）〔モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社製〕を用いて、インビボにおける該Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡの蛍光２’，７’−ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）への活性窒素ストレス誘導酸化を妨げる酵母株の能力を調べた。
【００９４】
定常状態の細胞内オキシダントレベルを、蛍光測定により評価した。
【００９５】
ＹＰＤ培地中３０℃で対数増殖期中期まで増殖させた場合、酵母細胞（ＯＤ６００＝０．４−０．６）を、ＮＯ−放出剤であるジエチルアミン／ＮＯ複合体ＤＥＡＮＯ〔シグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製〕を終濃度０．５ｍＭで処理し、活性窒素ストレスを与えた。さらに１時間培養後、細胞を回収し、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させた。Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡ（終濃度１０μＭ）を細胞懸濁液に添加し、３０℃で６０分間、さらにインキュベートして、Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡのインビボ酸化を行なった。細胞をペレット化し、洗浄し、ＰＢＳ中ガラスビーズで溶菌させた。等分量の細胞溶解物（タンパク質３００μｇ相当量）を、４８８ｎｍ及び５２５ｎｍの励起及び発光波長で蛍光光度計（商品名：ＲＦ−５０００；島津製作所社製）により蛍光強度を解析した。既知濃度で調製されたＤＣＦ〔ポリサイエンシーズ（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕をキャリブレーションに用いた。細胞内オキシダントレベルは、タンパク質１ｍｇあたりに形成されたＤＣＦ（ｐｍｏｌ）として表す。
【００９６】
その結果、図５に示されるように、ＮＯ放出剤の処理の際、ＤＣＦ蛍光が、ベクターコントロールで有意（２倍）に増加したが、ＷＴ及びＡＴＰＲＸの両方ではほとんど変化しなかったことがわかる。したがって、０．５ｍＭ  ＤＥＡＮＯ存在下で、ＷＴ及びＡＴＰＲＸの両方が、細胞内オキシダントレベルを維持しうるが、ベクターコントロールは、ＮＯ−媒介酸化を抑制できないことがわかる。これらの結果は、酵母変異体におけるＡｔｃ２ＣＰＲＸの異種発現が、インビボでの活性窒素ストレス媒介酸化傷害を著しく減少させ、さらに、活性窒素ストレスに対する耐性におけるＡｔｃ２ＣＰＲＸの機能を支持したことを示唆する。
【００９７】
配列表フリーテキスト
配列番号：２は、Ａｔｃ２ＣＰＲＸ遺伝子の増幅用プライマーの配列である。
【００９８】
配列番号：３は、Ａｔｃ２ＣＰＲＸ遺伝子の増幅用プライマーの配列である。
【００９９】
【発明の効果】
本発明の植物における活性窒素ストレスの抑制方法によれば、植物における活性窒素ストレスを抑制し、活性窒素ストレスの要因となる一酸化窒素・パーオキシナイトライト等の活性窒素種や、活性窒素源である硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーションを可能にするという優れた効果を奏する。また、本発明のトランスジェニック植物又はその種子によれば、活性窒素ストレス抑制能を発揮し、活性窒素ストレスの要因となる一酸化窒素・パーオキシナイトライト等の活性窒素種や、活性窒素源である硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーションに用いることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の活性窒素ストレス抑制能を有する植物の製造方法によれば、活性窒素ストレス抑制能を発揮し、活性窒素ストレスの要因となる一酸化窒素・パーオキシナイトライト等の活性窒素種や、活性窒素源である硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーションに有用なトランスジェニック植物又はその種子を製造することができ、安定して供給することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の植物の生育環境における活性窒素ストレス抑制剤によれば、より安定に、長期にわたり、効率よく、パーオキシナイトライト消去能を発現させることができ、それにより、植物における活性窒素ストレスを抑制し、活性窒素ストレスの要因となる一酸化窒素・パーオキシナイトライト等の活性窒素種や、活性窒素源である硝酸態窒素により汚染された土壌のレメディエーション等を行なうことができ、るという優れた効果を奏する。
【０１００】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、組換Ａｔｃ２ＣＰＲＸの解析の結果を示す。図中、パネル（ａ）は、大腸菌で過剰発現された組換Ａｔｃ２ＣＰＲＸの精製度を調べた結果である。分子サイズ（ｋＤａ）を左に示す。レーン１は、分子サイズ標準マーカー、レーン２は、空ベクターで形質転換されたＩＰＴＧ誘導細胞のライゼート（１０μｇ相当量）、レーン３は、ｐＥＴ−ＡｔＰＲＸで形質転換されたＩＰＴＧ誘導細胞のライゼート（１０μｇ相当量）、レーン４は、精製後の組換Ａｔｃ２ＣＰＲＸタンパク質（５μｇ相当量）である。パネル（ｂ）は、５ｍＭ  ＤＴＴ（レーン１）又は５ｍＭ  Ｈ２Ｏ２（レーン３）で前処理した精製Ａｔｃ２ＣＰＲＸ（３μｇ相当量）について、ゲル濾過後に非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ゲル）を行なった結果を示す。分子サイズ（ｋＤａ）を左に示す。
【図２】図２は、組換Ａｔｃ２ＣＰＲＸのインビトロでの活性を調べた結果を示す。パネル（ａ）は、ＮＡＤＰＨを還元剤として用いて、間接的にペルオキシダーゼ活性を測定した結果を示す。パネル（ｂ）は、パーオキシナイトライトスカベンジャー活性を、ジヒドロローダミン１２３からローダミンへのパーオキシナイトライト媒介酸化に対する組換Ａｔｃ２ＣＰＲＸの阻害能として評価した結果を示す。図中、白丸は、酸化型Ａｔｃ２ＣＰＲＸ、白四角は、酸化型ＢＳＡ、黒丸は、還元型Ａｔｃ２ＣＰＲＸ、黒四角は、還元型ＢＳＡを示す。データは、３回の実験の平均±ＳＤで示す。
【図３】図３は、Ａｔｃ２ＣＰＲＸによるｔｓａ１Δｔｓａ２Δ変異体の酸化ストレス過敏感反応性の相補を調べた結果を示す。パネル（ａ）は、酵母各株由来の可溶性タンパク質のイムノブロットの結果を示す。レーン１は、アラビドプシスの可溶性タンパク質（２μｇ相当量）、レーン２は、野生型酵母、レーン３は、ＡＴＰＲＸ、レーン４は、対照を示す。パネル（ｂ）は、０．３ｍＭ  過酸化水素存在下に細胞を培養した結果を示し、パネル（ｃ）は、過酸化水素非存在下に細胞を培養した結果を示す。パネル（ｂ）及びパネル（ｃ）において、白丸は、ＷＴ、白三角は、ベクター対照、白四角は、ＡＴＰＲＸを示す。データは、３回の実験の平均±ＳＤで示す。パネル（ｄ）は、パネル（ｂ）及びパネル（ｃ）における９時間培養時のデータをもとにした細胞生長の相対値である。
【図４】図４は、Ａｔｃ２ＣＰＲＸによるｔｓａ１Δｔｓａ２Δ変異株における活性窒素ストレス過敏感反応の相補を調べた結果を示す。パネル（ａ）は、１ｍＭ  亜硝酸ナトリウム（ｐＨ５．２）存在下、パネル（ｂ）は、亜硝酸ナトリウム非存在下（ｐＨ５．２）、パネル（ｃ）は、１ｍＭ  亜硝酸ナトリウム（ｐＨ６．６）存在下に、細胞を培養した結果を示す。パネル（ａ）〜（ｃ）において、白丸は、ＷＴ、白三角は、ベクター対照、白四角は、ＡＴＰＲＸを示す。データは、３回の実験の平均±ＳＤで示す。パネル（ｄ）は、パネル（ａ）及びパネル（ｂ）における９時間培養時のデータをもとにした細胞生長の相対値である。
【図５】図５は、Ａｔｃ２ＣＰＲＸを発現するｔｓａ１Δｔｓａ２Δ変異株における活性窒素ストレス媒介細胞内酸化の抑制を調べた結果を示す。データは、３回の実験の平均±ＳＤで示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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