(57)【要約】【課題】化学構造が類似した複数の構造類似物質を含む混合物をキャピラリー電気泳動法で分離するにあたり、構造類似物質相互の分離度を予測する方法を提供する。【解決手段】化学構造が類似した複数の構造類似物質を含む混合物の分離をキャピラリー電気泳動法で行うにあたり、構造類似物質相互の分離度を予測する方法であって、下記の工程：（Ａ）該構造類似物質のうちの少なくとも１つの物質についてキャピラリー電気泳動における実効移動度μｅを求め、この物質の実効移動度μｅとｐＫａとから下記の式（Ｉ）：ｋ＝μｅ×（ｍ／ｚ）（式中、ｚはイオン電荷を示し、ｍは分子量を示す）により分離挙動定数ｋを算出する工程：及び（Ｂ）上記工程（Ａ）で求めた分離挙動定数ｋと上記の式（Ｉ）を用いて、他の構造類似物質について、ｐＫａ及び分子量から実効移動度を算出する工程を含む方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学構造が類似した複数の構造類似物質を含む混合物の分離をキャピラリー電気泳動法で行うにあたり、構造類似物質相互の分離度を予測する方法であって、下記の工程：
（Ａ）該構造類似物質のうちの少なくとも１つの物質についてキャピラリー電気泳動における実効移動度μｅを求め、この物質の実効移動度μｅとｐＫａとから下記の式（Ｉ）：ｋ＝μｅ×（ｍ／ｚ）（式中、ｚはイオン電荷を示し、ｍは分子量を示す）により分離挙動定数ｋを算出する工程：及び
（Ｂ）上記工程（Ａ）で求めた分離挙動定数ｋと上記の式（Ｉ）を用いて、他の構造類似物質について、ｐＫａ及び分子量から実効移動度を算出する工程
を含む方法。
【請求項２】
さらに以下の工程：
（Ｃ）構造類似物質相互の分離度を算出する工程
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該構造類似物質のうちの少なくとも１つの物質についてキャピラリー電気泳動における実効移動度の実測値μｅを用いて工程（Ａ）を行う請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該構造類似物質のうちの少なくとも１つの物質についてキャピラリー電気泳動における実効移動度の実測値μｅを求め、該実測値μｅから算出された実効移動度の理論値μｅを用いて工程（Ａ）を行う請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
該構造類似物質がカルボキシル基及び／又はアミノ基を有する化合物である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該構造類似物質のｐＫａの個数と同数又はそれ以上の数での異なるｐＨにおける実効移動度の実測値μｅを求め、該実測値μｅから算出されたそれぞれのｐＨにおける実効移動度の理論値μｅを用いて工程（Ａ）を行う請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学構造が類似した複数の構造類似物質を含む混合物をキャピラリー電気泳動法で分離するにあたり、構造類似物質相互の分離度を予測する方法に関する。
【０００２】
有機化合物を化学合成的手法で製造した場合の反応液や植物からの植物成分の抽出物には、化学構造が類似した構造類似物質が多数含まれていることがあり、それぞれの物質を効率的に分離する必要がある。しかしながら、化学構造が類似した構造類似物質は物理化学的な性状や挙動に差がないことが多く、一般的には分離が極めて困難であるという問題がある。特に、医薬品の有効成分には厳密な製品規格が適用されており、製品中に混入する微量の不純物を正確に定量して規格管理を行うことが求められているが、有効成分の化学合成において生じた微量の構造類似物質が製品に混入してくる場合があり、その分離及び定量が困難である。
【０００３】
従来、構造類似物質の分離には高速液体クロマトグラフィーが利用されているが、最近ではキャビラリー電気泳動法（ＣＥ）も利用されるようになった。しかしながら、いずれの方法においても、多数の構造類似物質を含む試料からそれぞれの物質を完全に、かつ一度の分離操作で一斉に分離するためには、試行錯誤を繰り返して最適な分離用パラメーターを選択せねばならず、その条件設定に多大な労力と時間がかかることが問題であった。特に、キャピラリー電気泳動法については適用例が少なく、公知の分離用パラメーターを参照することもできないため、多数の構造類似物質を含む試料からそれぞれの物質を一斉に完全分離するための条件設定は困難を極める作業であった。例えば、様々なβブロッカーにおける光学活性体のそれぞれを分離するための最適条件に関する検討がＪ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ，  ８５５，  ｐｐ．６８１−６９３，  １９９９に記載されているが、この条件設定の方法は種々の化合物に対して一般的に応用できるものではなく、極めて限定された適用範囲しかない。
【０００４】
本発明者は、先に、化学構造が類似した複数の構造類似物質を含む混合物をキャピラリー電気泳動法を用いて分離するにあたり、一度の分離操作でそれぞれの物質を完全に分離するための分離用パラメーターを簡便に設定する方法を提供した（特開２００２−１６２３８４号公報）。この方法によれば、一度の分離操作でそれぞれの物質を完全に分離するための条件設定が簡便に行える。もっとも、この方法は各物質相互の分離度を予測できるものではなく、各物質の分離挙動をあらかじめ予測できる方法の開発が望まれていた。
【特許文献１】特開２００２−１６２３８４号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、化学構造が類似した複数の構造類似物質を含む混合物をキャピラリー電気泳動法を用いて分離するにあたり、構造類似物質相互の分離挙動を予測する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、複数の構造類似物質を含む試料を用いてそれらの物質の熱力学的解離定数（ｐＫａ）を測定した後、それらの構造類似物質のうちの１つの物質についてキャピラリー電気泳動における実効移動度μｅを求め、この物質の実効移動度μｅとｐＫａとから分離挙動定数ｋを算出し、得られたｋと他の構造類縁物質のｐＫａ及び分子量から、各構造類縁物質の移動度と分離度Ｒｓを精度よく予測できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、化学構造が類似した複数の構造類似物質を含む混合物の分離をキャピラリー電気泳動法で行うにあたり、構造類似物質相互の分離度を予測する方法であって、下記の工程：
（Ａ）該構造類似物質のうちの少なくとも１つの物質についてキャピラリー電気泳動における実効移動度μｅを求め、この物質の実効移動度μｅとｐＫａとから下記の式（Ｉ）：ｋ＝μｅ×（ｍ／ｚ）（式中、ｚはイオン電荷を示し、ｍは分子量を示す）により分離挙動定数ｋを算出する工程：及び
（Ｂ）上記工程（Ａ）で求めた分離挙動定数ｋと上記の式（Ｉ）を用いて、他の構造類似物質について、ｐＫａ及び分子量から実効移動度を算出する工程
を含む方法を提供するものである。
本発明の好ましい態様では、さらに工程（Ｃ）構造類似物質相互の分離度を算出する工程を含む。
【０００８】
本発明のさらに好ましい態様によれあｂ、該構造類似物質のうちの少なくとも１つの物質についてキャピラリー電気泳動における実効移動度の実測値μｅを用いて工程（Ａ）を行う上記の方法；該構造類似物質のうちの少なくとも１つの物質についてキャピラリー電気泳動における実効移動度の実測値μｅを求め、該実測値μｅから算出された実効移動度の理論値μｅを用いて工程（Ａ）を行う上記の方法；該構造類似物質がカルボキシル基及び／又はアミノ基を有する化合物である上記の方法；及び該構造類似物質のｐＫａの個数と同数又はそれ以上の数での異なるｐＨにおける実効移動度の実測値μｅを求め、該実測値μｅから算出されたそれぞれのｐＨにおける実効移動度の理論値μｅを用いて工程（Ａ）を行う上記の方法が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本明細書において用いられる用語の定義は以下のとおりである。
「構造類似物質」とは、例えば、主要な化学構造が共通しており側鎖や置換基の一部又は全部が異なる物質、あるいは主要な化学構造が類似しており同一又は類似の側鎖や置換基を有する物質などを意味しており、好ましくは上記の特徴を有する有機物質を意味する。本発明の方法において適用対象となる構造類似物質は、少なくともイオン化できる物質である必要があり、両極性の物質であってもよい。また、分離の対象となる混合物に含まれる構造類似物質は、それぞれ異なるｐＫａ値を有していることが望ましい。ラセミ体中の２以上のエナンチオマーや２以上のジアステレオマー混合物中の各ジアステレオマーも構造類似物質の例である。物質の種類はイオン化できるものであれば特に限定されず、医薬の有効成分である化合物又はその塩のほか、アミノ酸、染料、農薬、界面活性剤、ペプチド化合物、タンパク質、糖類、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが包含される。本発明の方法では、カルボキシル基とアミノ基を有する両性化合物を好ましい対象として分離予測することができる。
【００１０】
それぞれの物質の種類に応じて、当業者には構造類似物質の範囲は明確であり、「構造類似物質」の用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならない。構造類似物質は実質的に同一又は類似の物理化学的性質を有していることが多く、高速液体クロマトグラフィー法やキャピラリー電気泳動法による分離においても近接した挙動を示すことが一般的である。本発明の方法を適用すべき好適な構造類似物質は、高速液体クロマトグラフィー法やキャピラリー電気泳動法などを用いた通常の一斉分離操作において、特定の分離条件の設定を行わない場合には完全な分離が不可能であるか、又は著しく分離が困難である程度に類似の物理化学的性質を有している。なお、本発明の方法において、構造類似物質はその化学構造が既知又は未知のいずれであっても差し支えないが、少なくとも分子量は既知である必要がある。
【００１１】
「キャピラリー電気泳動法」とは、緩衝液が充填されている内径（ｉｄ）  ２５−７５μｍ程度のフューズドシリカキャピラリー内で電気泳動を行なう方法であり、高電圧を印加しつつジュール熱がおよぼす悪影響を減少させることができるので、短い分析時間及び高い分離効率と分解能が得られる方法である。キャピラリー電気泳動には種々の分離メカニズムや選択性を持つ多くの分離モードが提案されているが、本発明の方法においてはいかなるものを用いてもよい。また、キャピラリー電気泳動においては、電圧の印加手段や検出手段などのシステムの構成、自動化手段の採用などにより多様な組み合わせが可能であり、それらのいずれを本発明の方法に用いてもよい。
キャピラリー電気泳動における「実効移動度μｅ」には、実効移動度の実測値μｅ及び実効移動度の理論値μｅの両者が含まれる。
【００１２】
本発明の方法は、化学構造が類似した複数の構造類似物質を含む混合物をキャピラリー電気泳動法を用いて分離するにあたり、構造類似物質相互の分離度を予測する方法であって、下記の工程：
（Ａ）該構造類似物質のうちの少なくとも１つの物質についてキャピラリー電気泳動における実効移動度μｅを求め、この物質の実効移動度μｅとｐＫａとから下記の式（Ｉ）：ｋ＝μｅ×（ｍ／ｚ）（式中、ｚはイオン電荷を示し、ｍは分子量を示す）により分離挙動定数ｋを算出する工程：及び
（Ｂ）上記工程（Ａ）で求めた分離挙動定数ｋと上記の式（Ｉ）を用いて、他の構造類似物質について、ｐＫａ及び分子量から実効移動度を算出する工程
を含み、好ましくは、さらに
（Ｃ）構造類似物質相互の分離度を算出する工程
を含むことを特徴としている。
【００１３】
本発明の方法を行うにあたっては、あらかじめ、各構造類似物質のｐＫａを求めておくことが望ましい。ｐＫａの測定方法は特に限定されないが、例えば電位差滴定法やキャピラリー電気泳動法を用いると簡便かつ正確にｐＫａの測定を行うことができる。キャピラリー電気泳動法を用いた化合物のｐＫａ測定の具体的手法は、例えばＪ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕ．  Ｓｃｉ．，  ８３，  ｐｐ．１５００−１５０７，  １９９４；  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ，  ８３９，  ｐｐ．１８３−１９２，  １９９９などに記載されている。これらの文献に記載された方法をそのまま利用してもよいが、適宜の修飾ないし改変を加えてｐＫａの測定を行ってもよい。必要に応じて、それぞれの構造類似物質のｐＫａの情報に基づいて、キャピラリー電気泳動を行うための好適な泳動溶液ｐＨの範囲を定めておいてもよいが、そのような方法は特開２００２−１６２３８４号公報に具体的に記載されており、この特許文献の開示のすべてを参照として本明細書の開示に含める。
【００１４】
物質のｐＫａが未知の場合には、まず一つの化合物についてｐＫａを求める必要がある。例えば、多価イオンにおける熱力学的乖離定数Ｋａは酸性度定数Ｋａ’を用いて下記の式から算出することができる。ここで｛Ｘ｝＝ｆｘ・［Ｘ］（｛Ｘ｝はＸの活量、［Ｘ］はＸの濃度、ｆｘはＸの活量定数）と定義する。
【数１】
2004264069.tif 000002
【００１５】
デバイ−ヒュッケル則より、希薄溶液中（イオン強度Ｉ≦０．１、２５℃）の活量係数ｆｘは次式で表される。
【数２】
2004264069.tif 000003
【００１６】
上記式のｎはイオン価数、ｄはÅ単位で表されるイオンの大きさを表すパラメーターであり、通常１〜１１Åの範囲とされているため、ここではｄ＝５と仮定し（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ．，  ６５２，  ３０１，  １９９３）、次式を得ることができる。この式に従って、実効移動度から算出したｐＫａ’を用いてｐＫａを求めることができる。
【数３】
2004264069.tif 000004
【００１７】
ｐＫａ’を算出するための実効移動度μｅは、キャピラリー電気泳動において、見かけの移動度μａと電気浸透流移動度μｏおよび溶質とアセトン（電気浸透流マーカー）のそれぞれの移動時間ｔａとｔｏ、キャピラリー全長ＬＣ、キャピラリー有効長ＬＤ、印加電圧Ｖを用い、下記の式で表される。
μｅ＝μａ−μｏ＝（ＬＣ×ＬＤ）／Ｖ×（１／ｔａ−１／ｔｏ）
【００１８】
一方、溶質の実効移動度μｅは、あるイオン種の実効移動度ｍｎ−ｉ＋１と酸性度定数Ｋｊ’を用い、以下の式で表すこともできる（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ．  Ａ．，  ７４５，  １１７，  １９９６）。ただし、０≦ｉ≦ｎ、１≦ｊ≦ｎ、μ１≦μｅ≦μｎ＋１、Ｋ１’≦Ｋｊ’≦Ｋｎ’とする。
【数４】
2004264069.tif 000005
【００１９】
この式は全ての多価化合物に対して適用可能である。ここで、Ｉが一定のときＫｊ’は定数となりμｅはｐＨ依存性を示す。すなわち、一定イオン強度下でμｅとｐＨとの関係を測定することでＫｊ’を算出することができ、ある特定のｐＨで測定した実効移動度の実測値μｅを用いて、種々のｐＨにおける実効移動度の理論値μｅとｐＫａ’を算出できることになり、さらに、そのｐＫａ’を用いてｐＫａを算出できることになる。
【００２０】
例えば、カルボキシル基とアミノ基を有する両性化合物については、３種のイオン種Ｈ２Ａ＋、ＨＡ、Ａ−が存在しており、解離する水素イオンを２つ持つので、ｎ＝２を代入して以下の式を得ることができる。
μｅ＝（μｅ３｛Ｈ｝２＋μｅ２Ｋ１’｛Ｈ｝＋μｅ１Ｋ１’Ｋ２’）／（｛Ｈ｝２＋Ｋ１’｛Ｈ｝＋Ｋ１’Ｋ２’）
【００２１】
イオン種ＨＡは、見かけ上電荷を持たない完全に等価である両性イオンが存在し、電気浸透流マーカーと同時に移動して、両性イオンの移動度はμｅ２＝０と推定できる。これにより、下記の式が得られる。
μｅ＝（μｅ３｛Ｈ｝２＋μｅ１Ｋ１’Ｋ２’）／（｛Ｈ｝２＋Ｋ１’｛Ｈ｝＋Ｋ１’Ｋ２’）
【００２２】
また、本発明の方法で用いられるイオン電荷ｚは、下記のようにして求めることができる。ＣＺＥモードの電気泳動では、物質の実効移動度μｅは、イオン電荷ｚ、イオン半径ｒ、溶液粘度ηを用い、下記の理論式が成り立つ。
μｅ＝（１／６πη）×ｚ／ｒ
すなわち、実効移動度はイオン電荷に比例し、イオン半径に反比例する。このとき、イオン電荷ｚはｐＨ（すなわちｐＫａ’）依存性であり、カルボキシル基とアミノ基を有する両性化合物では、見かけ上電荷を持たない完全に等価である状態を境に符号が逆転するため下記式として導くことができる。
ｚ＝（｛Ｈ｝２−Ｋ１’Ｋ２’）／（｛Ｈ｝２＋Ｋ１’｛Ｈ｝＋Ｋ１’Ｋ２’）
【００２３】
このようにして、構造類似物質の一つについて実効移動度の実測値μｅを求めることによりｐＫａを求めることができ、イオン電荷ｚが算出できる。これらを式（Ｉ）：ｋ＝μｅ×（ｍ／ｚ）（式中、ｚはイオン電荷を示し、ｍは分子量を示す）に代入することにより分離挙動定数ｋを算出することができる。通常、この分離挙動定数ｋは広い範囲のｐＨでほぼ一定である。例えば、両性化合物についての分離挙動定数ｋは両イオンが解離状態で存在する中性付近で変動することもあるが、酸性領域又は塩基性領域で分離挙動定数がほぼ一定の値として得られる場合には、この値を以下の工程に用いればよい。
【００２４】
工程（Ａ）では、構造類似物質のうちの少なくとも１つの物質についてキャピラリー電気泳動における実効移動度μｅを求める必要があるが、対象とする物質は混合物に含まれる構造類似物質のうちの２以上の物質でもよい。もっとも、通常は１つの代表的物質を選択して実効移動度μｅを求めれば十分である。実効移動度μｅとしては実測から求めた実効移動度μｅ（本明細書において「実効移動度の実測値μｅ」と呼ぶ）を用いてもよいが、理論的に求めた実効移動度μｅ（本明細書において「実効移動度の理論値μｅ」と呼ぶ場合がある）を用いてもよい。実効移動度を求める物質のｐＫａが既知である場合には、実効移動度の実測値μｅと実効移動度の実測値μｅとの一致度を確認しておいてもよい。より精度を高めるためには、実効移動度の理論値μｅを式（Ｉ）にあてはめるのがよい。１つのｐＨにおいて実効移動度を求めてもよいが、２以上のｐＨにおける実効移動度を求め、実効移動度とｐＨとの関係を測定することも好ましい。また、２以上の異なるｐＨにおいて実効移動度の実測値μｅを求め、この実測値を基にして２以上の異なるｐＨにおける実効移動度の理論値μｅを算出することもできる。この場合、実効移動度の実測値μｅを求めた２以上のｐＨと同じｐＨにおける実効移動度の理論値μｅのほか、それらのｐＨとは異なるｐＨにおける実効移動度の理論値μｅを算出することもできる。特に、構造類似物質が両性化合物である場合には、２以上のｐＨで実効移動度の実測値μｅを求め、その値を基にして多数のｐＨにおける実効移動度の理論値μｅを算出することが好ましい。
【００２５】
工程（Ｂ）では、この分離挙動定数ｋと上記の式（Ｉ）を用いて、他の構造類似物質について、既知のｐＫａ及び分子量から実効移動度μｅを算出することができる。さらに、各構造類縁物質の分離度Ｒｓは下記の式により計算できる（式中、物質１の見かけの移動度をμａ１とし、物質２の見かけの移動度をμａ２とする）。
【数５】
Ｒｓ＝｛（μａ２−μａ１）／（μａ２＋μａ１）｝×１００
【００２６】
上記の分離挙動定数ｋを用いることにより、構造類縁物質のそれぞれについて実効移動度と分離度の予測が可能である。このようにして実効移動度が求められた各物質について、エレクトロフェログラム上でのピークの分離度を計算することもできる。このようにして求めた分離度は、日本薬局方１４改正、２００１、一般試験法「ＨＰＬＣ法」に記載された方法に準じて算出した分離度と良い相関性を有する。
【００２７】
本明細書の実施例には、上記の工程に従って一群の構造類似物質の代表物質について分離挙動定数を求める方法、及びその定数を用いて他の物質について実効移動度と分離度を算出する方法が具体的かつ詳細に説明されているので、当業者は本実施例の説明を参照しつつ、必要に応じて適宜の修飾や改変を加えながら、分離挙動定数を求めて各物質についての実効移動度の算出を行うことが可能である。
【００２８】
本発明の方法は、構造類似物質を含む混合物の分離に先立って、分離条件を効率的に定めるために用いることができる。該混合物に含まれる構造類似物質の量については、すべての構造類似物質の含有量がほぼ等量であるか、あるいは特定の１又は２以上の構造類似物質の含有量が特に多いか又は少ない場合にも本発明の方法を適用できる。構造類似物質を含む混合物としては、例えば、有機合成のプロセスで得られた反応混合物、医薬品や農薬の最終製品、天然物抽出物、コンビナトリアルケミストリーを適用した反応混合物、光学活性体混合物、ラセミ体などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００２９】
医薬品に含まれる有効成分以外の不純物の測定のためには、錠剤やカプセル剤から抽出した混合物を用いることができる。エナンチオマーの分離のためにはシクロデキストリンやクラウンエーテルなどの光学活性な添加剤を用いると良好な分離を達成できる場合があり、エナンチオマーやジアステレオマーの分離のために適宜の添加剤を適宜選択して用いることが可能である。また、本発明の方法における工程（Ａ）及び（Ｂ）、又は工程（Ａ）ないし（Ｃ）を自動化した装置を用いることにより、キャピラリー電気泳動を用いた構造類似物質の一斉分離のための好適な分離条件を迅速かつ簡便に設定することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
（Ａ）方法
試料溶液はキノロン系抗菌剤  ５  ｍｇ  に、３％のアセトンを添加した水または  １  ｍｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液に加えて溶かし、不溶物はメンブランフィルター  （０．２μｍ）でろ過して使用した。なお、アセトンを電気浸透流マーカーとして用いた。キャピラリー電気泳動溶液は、りん酸、酢酸、ホウ酸にアルカリを添加し、緩衝液間での影響を可能な限り無くし、緩衝能を大きくするために、イオン強度  ０．０５  となるように調製した。泳動溶液の  ｐＨ  はＣＥ測定前に測定した。ＣＥ測定には、内面未処理フューズドシリカキャピラリー内径  ５０μｍ、全長  ３３  ｃｍ（有効長  ２４．５  ｃｍ）  または全長  ４８．５  ｃｍ（有効長  ４０  ｃｍ）  を用い、キャピラリー温度は  ２５℃に設定した。印加電場は  ０．２〜０．３  ｋＶ／ｃｍ、検出は  ２５４または  ２９５  ｎｍを用いた。試料の注入は、試料溶液を  ５０  ｍｂａｒで２秒間注入し、続いて泳動溶液を５０  ｍｂａｒで２秒間注入する加圧法により実施した。キャピラリーは、分析開始前に水酸化ナトリウム試液  （０．１  ｍｏｌ／Ｌ）  を３分間加圧  （１  ｂａｒ）  導入した後、泳動溶液を３分間加圧  （１  ｂａｒ）  導入し、安定化させた。
【００３１】
各  ｐＨにおける実効移動度の実測値は、試料とアセトンの移動度から下記式より算出した。
μｅ＝μａ−μｏ＝（ＬＣ×ＬＤ）／Ｖ×（１／ｔａ−１／ｔｏ）
また、これらの値を下記式に代入し、マイクロソフトＥｘｃｅｌ  （Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，  Ｒｅｄｍｏｎｔ，  ＷＡ，  ＵＳＡ）  のソルバー機能を用いて準ニュートン法に基づく非線形最少二乗法を行い、実効移動度のμｅ（理論値）及び  ｐＫａ’を算出した。
【数６】
2004264069.tif 000006
【００３２】
さらに、化合物の  ｐＫａ  は  Ｉ＝０．０５  として下記式より算出した。
【数７】
2004264069.tif 000007
【００３３】
試験に供した化合物ＡないしＣの構造を以下に示す。化合物Ｄは化合物Ａと同じ分子式を有することから、化合物Ａの異性体であることが確認されているが、その構造は不明である。また、化合物Ｅは化合物Ａの製造工程において反応副生成物として検出された化合物であり、化合物Ａと同様の母核構造を有することが予想されるが、その構造は未知である。
【化１】
2004264069.tif 000008
【００３４】
【表１】
2004264069.tif 000009
【００３５】
（Ｂ）結果及び考察
化合物Ａにつき各ｐＨにおける実効移動度μｅを測定し、μｅ（理論値）及び  ｐＫａ’を算出した（図１）。その結果、化合物Ａのカルボン酸とアミンのｐＫａは  ５．５と９．０であった。得られたｐＫａから各ｐＨにおけるイオン電荷ｚと分離挙動定数ｋを算出した（表２）。この結果より、両性イオンが共存するｐＨ６〜９の領域ではμｅとｚが０付近であり分離挙動定数ｋにはばらつきが認められたが、その他の領域ではほぼ一定  （ｋ＝７００±３０）  であった。
【００３６】
【表２】
2004264069.tif 000010
【００３７】
つぎに、構造類縁物質としてそれぞれｐＫａが既知の化合物ＢからＥを用い、ｋ＝７００としたときの実効移動度μｅと各構造類縁物質相互の分離度Ｒｓを予測した。結果を表３に示す。
【００３８】
【表３】
2004264069.tif 000011
【００３９】
各構造類縁物質における予測した実効移動度−ｐＨ曲線（図２）から、ｐＨ６と９付近で相互分離の可能性が示唆された。また、表３に示した分離度予測よりＥＯＦを含む６化合物のピークの組み合わせ１５通りから、ｐＨ９．０３のときに分離度の絶対値の最小値が１．０であり、ｐＨ９付近で良好な分離の可能性があることが示された。以上より、化合物Ａを含む構造類縁物質５種類を含む混合試料溶液を調製し、ｐＨ９での分離を検討した。その結果、５種類全ての化合物の分離が４分以内で達成された（図３）。
【００４０】
続いて、これらの構造類縁物質の各ｐＨにおける実効移動度を実際に測定し、分離度の予測値と実測値における相関性を検討した。その結果、良好な直線関係（相関係数０．９９）が認められた（図４）。この結果から、さらにこれらの構造類縁物質についてμｅ（実測値）からμｅ（理論値）及びｐＫａ’を算出し、各類縁における分離挙動定数ｋを算出した（表４）。
【００４１】
【表４】
2004264069.tif 000012
【００４２】
その結果、ｋは６８０±７０の範囲であることが認められ、ほぼ化合物Ａについての値と同等であった。以上から、構造類縁物質では式（Ｉ）：ｋ＝μｅ×（ｍ／ｚ）（式中、ｚはイオン電荷を示し、ｍは分子量を示す）の関係が成立し、構造類似物質のうちの１つの物質について算出した分離挙動定数ｋを用いてｐＫａ既知の他の類縁物質の実効移動度と分離度の予測が可能であることが確認できた。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、化学構造が類似した複数の構造類似物質を含む混合物をキャピラリー電気泳動法を用いて分離するにあたり、構造類似物質相互の分離挙動を簡便かつ確実に予測することができ、試行錯誤に頼らずに効率的な分離を行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】化合物Ａについて各ｐＨにおける実効移動度μｅを測定し、μｅ（理論値）及び  ｐＫａ’を算出した結果を示した図である。
【図２】構造類縁物質である化合物Ａ〜化合物Ｅについての実効移動度の予測値とｐＨとの関係を示した図である。
【図３】構造類縁物質である化合物Ａ〜化合物Ｅを含む混合試料溶液（ｐＨ９）のエレクトロフェログラムを示した図である。
【図４】構造類縁物質である化合物Ａ〜化合物Ｅについて分離度の予測値と実測値との相関を示した図である。
【図１】
2004264069.tif 000013
【図２】
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【図３】
2004264069.tif 000015
【図４】
2004264069.tif 000016