(57)【要約】【課題】厄介な順化工程は不要で、それでいて定植成功率は約９０％と非常に高く、これによりジネンジョの大量生産が可能となる極めて画期的なジネンジョの製造方法を提供するものである。【解決手段】ジネンジョの組織を培養してマイクロチューバ１付きの培養体２を形成し、この培養体２からマイクロチューバ１を分離した後、この分離したマイクロチューバ１を土壌で栽培することによりジネンジョを製造するものである。【選択図】　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジネンジョの組織を培養してマイクロチューバ付きの培養体を形成し、この培養体からマイクロチューバを分離した後、この分離したマイクロチューバを土壌で栽培することによりジネンジョを製造することを特徴とするジネンジョの製造方法。
【請求項２】
請求項１記載のジネンジョの製造方法において、マイクロチューバ付きの培養体からマイクロチューバを分離した後、低温処理し、この低温処理したマイクロチューバを土壌で栽培することによりジネンジョを製造することを特徴とするジネンジョの製造方法。
【請求項３】
請求項１，２いずれか１項に記載のジネンジョの製造方法において、マイクロチューバを分離した後、該マイクロチューバを冷蔵保存し、その後、該冷蔵保存したマイクロチューバを培養して新たにマイクロチューバを形成し、この新たに形成したマイクロチューバからジネンジョを製造することを特徴とするジネンジョの製造方法。
【請求項４】
ジネンジョの組織を培養してマイクロチューバ付きの培養体を形成し、このマイクロチューバ付きの培養体を土壌で栽培して該マイクロチューバからジネンジョを製造することを特徴とするジネンジョの製造方法。
【請求項５】
請求項４記載のジネンジョの製造方法において、マイクロチューバ付きの培養体を低温処理し、この低温処理したマイクロチューバ付きの培養体を土壌で栽培して該マイクロチューバからジネンジョを製造することを特徴とするジネンジョの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載のジネンジョの製造方法において、マイクロチューバを形成する為のジネンジョの組織として、ヤマノイモモザイクウイルスに感染していないジネンジョの組織を採用したことを特徴とするジネンジョの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ジネンジョの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ジネンジョ（ヤマノイモ科、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　ｊａｐｏｎｉｃａ　Ｔｈｕｎｂ．）は、中山間地域において、ムカゴや切り芋によって増殖することが知られている。
【０００３】
ところで、ジネンジョの人工栽培は困難である。これは、ジネンジョがヤマノイモモザイクウイルス（ＪＹＭＶ：葉にモザイク症状を起こして生育を抑制させてしまうウイルス）に感染し易く、単にムカゴや切り芋を培土で栽培するだけでは、前記ヤマノイモモザイクウイルスの感染によって収量が非常に低下してしまう為である。
【０００４】
この現状に鑑み、本発明者らは、新潟県農業総合研究所研究報告、第２号、６９〜７０、２０００年において、ヤマノイモモザイクウイルスに感染していないウイルスフリーのジネンジョの苗を大量に増殖する方法（以下、ウイルスフリーの苗の製造方法という。）を提案している。
【０００５】
しかし、このウイルスフリーの苗の製造方法で得られた苗をそのまま土壌で栽培しようとしても、その成功率は非常に低い。これは、ウイルスフリーの苗を製造する環境が、無菌状態で且つ温度管理された非常に手厚い保護環境であるのに対し、一般的な土壌は苗の生育に厳しい環境であるからである。即ち、この急激な環境の変化に苗が耐えられないことが、前記成功率の低下の原因である。
【０００６】
よって、従来は、苗を土壌に順化させる工程を行っているが、この順化は、例えば２５℃の温室を用意し、減菌した専用培土をビニールポットに入れ、この専用培土に苗を植え込み、更に、適度に遮光したり灌水したりしなければならない等、非常に厄介である。
【０００７】
更に、順化工程を行っても、普通の土壌に定植した後に枯死してしまうものが多く、ジネンジョの定植の成功率は約１０％に止まっている。
【０００８】
本発明は、上記問題点を解決するもので、厄介な順化工程は不要で、それでいて定植成功率は約９０％と非常に高く、これによりジネンジョの大量生産が可能となる極めて画期的なジネンジョの製造方法を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。
【００１０】
ジネンジョの組織を培養してマイクロチューバ１付きの培養体２を形成し、この培養体２からマイクロチューバ１を分離した後、この分離したマイクロチューバ１を土壌で栽培することによりジネンジョを製造することを特徴とするジネンジョの製造方法に係るものである。
【００１１】
また、請求項１記載のジネンジョの製造方法において、マイクロチューバ１付きの培養体２からマイクロチューバ１を分離した後、低温処理し、この低温処理したマイクロチューバ１を土壌で栽培することによりジネンジョを製造することを特徴とするジネンジョの製造方法に係るものである。
【００１２】
また、請求項１，２いずれか１項に記載のジネンジョの製造方法において、マイクロチューバ１を分離した後、該マイクロチューバ１を冷蔵保存し、その後、該冷蔵保存したマイクロチューバ１を培養して新たにマイクロチューバ１を形成し、この新たに形成したマイクロチューバ１からジネンジョを製造することを特徴とするジネンジョの製造方法に係るものである。
【００１３】
また、ジネンジョの組織を培養してマイクロチューバ１付きの培養体２を形成し、このマイクロチューバ１付きの培養体２を土壌で栽培して該マイクロチューバ１からジネンジョを製造することを特徴とするジネンジョの製造方法に係るものである。
【００１４】
また、請求項４記載のジネンジョの製造方法において、マイクロチューバ１付きの培養体２を低温処理し、この低温処理したマイクロチューバ１付きの培養体２を土壌で栽培して該マイクロチューバ１からジネンジョを製造することを特徴とするジネンジョの製造方法に係るものである。
【００１５】
また、請求項１〜５いずれか１項に記載のジネンジョの製造方法において、マイクロチューバ１を形成する為のジネンジョの組織として、ヤマノイモモザイクウイルスに感染していないジネンジョの組織を採用したことを特徴とするジネンジョの製造方法に係るものである。
【００１６】
【発明の作用及び効果】
本発明は繰り返し実験した結果得られた作用効果を請求項としてまとめたもので、ジネンジョの組織を培養してマイクロチューバ１付きの培養体２を形成し、この培養体２からマイクロチューバ１を分離した後、土壌で栽培すると、厄介な順化工程を行わなくても、マイクロチューバ１の約９０％がジネンジョとして成長することが確認された。
【００１７】
マイクロチューバ１を培養体２から分離しない場合も同様であった。
【００１８】
本発明は上述のようにするから、ジネンジョの大量生産が可能となる極めて画期的なジネンジョの製造方法となる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
図面は本発明の一実施例を図示したものであり、以下に説明する。
【００２０】
先ず、前述のウイルスフリーの苗の製造方法により、ウイルスフリーのジネンジョの苗を製造する。
【００２１】
このウイルスフリーのジネンジョの苗を、分割（ツルを節毎に切断する等）、発根、伸長することにより大量増殖する。
【００２２】
この大量増殖したウイルスフリーのジネンジョの苗を組織培養し、マイクロチューバ１付きの培養体２を形成する。
【００２３】
このマイクロチューバ１は、組織培養により培養体２の一部に形成される塊茎のことである（図２参照）。また、マイクロチューバ１は、イモやムカゴの様なもので、ジネンジョの場合、茎が肥大した組織であるといわれている。
【００２４】
また、組織培養は、温度，光，栄養，ホルモン等の条件を人為的にコントロールして行う。この組織培養は、例えば、前記ウイルスフリーのジネンジョの苗をショ糖６０ｇ／ｌを含むＭＳ培地に移植し、２５℃で培養を続けることにより行う。
【００２５】
続いて、形成されたマイクロチューバ１を培養体２から分離し、土壌に植えて栽培する。
【００２６】
また、土壌に植える前、マイクロチューバ１を低温処理することにより休眠打破を行い、その後に土壌に植えて栽培した方が良い。
【００２７】
形成されたマイクロチューバ１は、休眠状態（成長が一時的に停止した状態）にあり、このまま分離して土壌に植えても直ぐには成長しない。前述のように、低温処理（例えば、２カ月以上５℃に保持）すると、前記休眠状態が打破され、土壌に植えた後に短期間で成長を開始する。
【００２８】
このマイクロチューバ１を土壌に植えて得たジネンジョの苗を取り出し、別途畑等に植えてジネンジョを製造する。
【００２９】
以上の工程によれば、マイクロチューバ１の約９０％が土壌でジネンジョとして成長することが確認された。
【００３０】
また、一旦、マイクロチューバ１を形成したら、このマイクロチューバ１を組織培養することにより、再度マイクロチューバ１を形成する（この再度のマイクロチューバ１の形成により、多量のマイクロチューバ１を形成することができる。）というサイクルを繰り返すことにより、ウイルスフリーのジネンジョの苗を製造する工程を省いてマイクロチューバ１を大量生産する。
【００３１】
また、前記分離したマイクロチューバ１は、低温（例えば５℃）で保存することができ、更に、この低温状態を解除することでいつでも成長を再開することができる。従って、前記分離したマイクロチューバ１は低温で保存しておき、前記マイクロチューバ１の組織培養を実施する必要が生じた場合に、前記低温状態を解除する方法を採用する。
【００３２】
この低温で保存していたマイクロチューバ１も、約９０％が土壌でジネンジョとして成長することが確認された。
【００３３】
本実施例は上述のようにするから、順化工程を行わず、ウイルスに感染していない成長し易いジネンジョの苗を形成してジネンジョの大量生産を達成できる実用性に秀れたジネンジョの製造方法となる。
【００３４】
また、低温処理によってマイクロチューバ１の休眠打破を行っているから、土壌に植えたマイクロチューバ１が短期間でジネンジョとして成長することになり、生産性は良好となる。
【００３５】
また、マイクロチューバ１からマイクロチューバ１を形成することにより、やや複雑なウイルスフリー化工程を可及的に省略することができ、これにより多量のウイルスフリーのマイクロチューバ１を大量に形成して該マイクロチューバ１から大量のジネンジョを製造することができる。
【００３６】
また、マイクロチューバ１を低温で保存することにより、いつでもジネンジョの生産を開始することができ、この点においても生産性は良好となる。
【００３７】
尚、マイクロチューバ１付きの培養体２をそのまま土壌で栽培しても同様である。
【００３８】
以下、本実施例の作用効果を確認した実験例について説明する。
【００３９】
実験例１：ジネンジョのマイクロチューバ生産とマイクロチューバからの苗の再生
１．茎頂培養による苗の生産
ムカゴをバーミキュライトに植えつけ、温室内（２５℃）で３〜４週間栽培した。ムカゴから伸長したツルを節毎に切断し、７０％エタノールに数秒間浸漬した後、１％次亜塩素酸ナトリウムに５分間浸漬することによって表面殺菌し、滅菌水で３回洗浄した。実体顕微鏡を用いてツルの先端及び腋芽の茎頂を０．２〜０．５ｍｍの大きさで摘出し、培地に置床した。３０ｇ／ｌ　ショ糖、０．１ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、０．１ｍｇ／ｌ　ＢＡ、２ｇ／ｌ　ゲランガムを含み、多量要素を１／２にしたＭＳ培地へ置床し、２５℃、１６時間照明で３〜４ヶ月間培養した。
【００４０】
２．ＲＴ−ＰＣＲ法によるウイルス検定
培養により生長した苗から、１ｃｍ角の葉切片３〜５枚を切り出し、ＳＤＳフェノール法によりＲＮＡを抽出した。ＲＴ反応及びＰＣＲ反応は、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ　（ＡＭＶ）（Ｔａｋａｒａ）を用い、５’−ＡＴＧＧＴ（ＴＧ）ＴＧＧＴＧ（ＴＣ）ＡＴ（ＴＡ）ＧＡ（ＡＧ）ＡＡ（ＴＣ）ＧＧ−３’およびを５’−ＧＣ（ＴＣ）ＴＴＣＡＴ（ＴＣ）ＴＧ（ＡＧ）（ＴＡ）（ＴＧ）ＧＴＧ（ＴＧ）ＧＣ（ＴＣ）ＴＣ−３’をプライマーとして、Ｔａｋａｒａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＭＰにより、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の条件で３０サイクル行った。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ染色することにより、ウイルス感染の有無を検定した。
【００４１】
３．節培養による苗の増殖
ウイルス感染していないことが確認された苗は、ツルを節毎に切断して３０ｇ／ｌ　ショ糖、０．００２ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、０．０２ｍｇ／ｌ　ＢＡを含むＭＳ培地へ置床し、２５℃、１６時間照明で培養した。苗の増殖は、約３０日毎に、ツルを節毎に切断し継代することによって行った。
【００４２】
４．マイクロチューバの生産
増殖した苗を、マイクロチューバ形成培地（６０ｇ／ｌ　ショ糖、０．００２ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、０．０２ｍｇ／ｌ　ＢＡを含むＭＳ培地）へ移植し、２５℃、１６時間照明で約２〜６ヶ月間培養した結果マイクロチューバ１付きの培養体２を形成した（図２参照）。
【００４３】
５．低温処理によるマイクロチューバの休眠打破
培養体２からマイクロチューバ１を分離し、このマイクロチューバ１を、２ヶ月以上、５℃で低温処理することにより休眠打破した。５月頃、休眠打破したマイクロチューバ１を、培養瓶から取り出し、水で洗浄後、ビニルポットに定植し栽培することにより、苗が再生した。
【００４４】
また、苗の再生成功率は約９０％であった。
【００４５】
実験例２：マイクロチューバによる原種保存
１．マイクロチューバの保存
実験例１−４で生産したマイクロチューバ１を、無菌状態のまま５℃、暗黒で２年間保存した。
【００４６】
２．保存したマイクロチューバからの苗生産
マイクロチューバ１を取り出し、３０ｇ／ｌ　ショ糖、０．００２ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、０．０２ｍｇ／ｌ　ＢＡを含むＭＳ培地へ移植し、２５℃、１６時間照明で培養することにより、約１ヶ月で苗が再生した。
【００４７】
また、苗の再生成功率は約９０％であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施例の説明図である。
【図２】実験例のマイクロチューバ１付き培養体２の説明図である。
【符号の説明】
１　マイクロチューバ
２　培養体
【図１】
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【図２】
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