(57)【要約】【課題】コラーゲン成分またはゼラチン成分をプロテアーゼにより分解して得られる機能的なペプチド組成物であって、より安価に供給可能なペプチド組成物、その製造方法およびそのペプチド組成物を用いた機能性食品、化粧品、医薬部外品、医薬品その他のペプチド添加物質を提供する。【解決手段】コラーゲン成分またはゼラチン成分をシステインプロテアーゼにより分解してペプチド組成物を得る。コラーゲン成分またはゼラチン成分をシステインプロテアーゼならびに、ペプシン、トリプシンおよびコラゲナーゼのうちの１種または２種以上の組み合わせにより分解してペプチド組成物を得てもよい。ペプチド組成物は、トリペプチドおよびジペプチドの少なくとも一方を５重量％以上含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン成分またはゼラチン成分をシステインプロテアーゼにより分解して得られるペプチド組成物。
【請求項２】
コラーゲン成分またはゼラチン成分をシステインプロテアーゼならびに、ペプシン、トリプシンおよびコラゲナーゼのうちの１種または２種以上の組み合わせにより分解して得られるペプチド組成物。
【請求項３】
トリペプチドおよびジペプチドの少なくとも一方を含むことを特徴とする請求項１または２記載のペプチド組成物。
【請求項４】
前記システインプロテアーゼはキモパパイン、パパイン、ブロメラインおよびフィシンのうちの１種または２種以上の組み合わせから成ることを特徴とする請求項１，２または３記載のペプチド組成物。
【請求項５】
前記システインプロテアーゼはパパイヤ果汁抽出物から成ることを特徴とする請求項１，２または３記載のペプチド組成物。
【請求項６】
コラーゲン成分またはゼラチン成分をシステインプロテアーゼにより分解してペプチド組成物を得ることを特徴とするペプチド組成物の製造方法。
【請求項７】
コラーゲン成分またはゼラチン成分をシステインプロテアーゼならびに、ペプシン、トリプシンおよびコラゲナーゼのうちの１種または２種以上の組み合わせにより分解してペプチド組成物を得ることを特徴とするペプチド組成物の製造方法。
【請求項８】
請求項１，２，３，４，５または６記載のペプチド組成物を０．０５重量％以上含むことを特徴とするペプチド添加物質。
【請求項９】
機能性食品であることを特徴とする請求項８記載のペプチド添加物質。
【請求項１０】
化粧品であることを特徴とする請求項８記載のペプチド添加物質。
【請求項１１】
医薬部外品または医薬品であることを特徴とする請求項８記載のペプチド添加物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コラーゲン成分またはゼラチン成分をプロテアーゼにより分解して得られるペプチド組成物、その製造方法およびそのペプチド組成物を用いた機能性食品、化粧品、医薬部外品、医薬品その他のペプチド添加物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
旧来から、コラーゲンやコラーゲンを加熱変性させたゼラチン、およびそれらの加水分解物は化粧品及び食品向けの原材料、更に医薬品向けの生体機能性材料として幅広く利用されてきた。コラーゲンは皮膚、血管、内臓および骨組織などいたるところに存在し、体を構成するタンパク質の約３０％を占めている。皮膚では真皮の７０％がコラーゲンからできており、個々の筋肉を包む筋膜もコラーゲンで構成されている。さらに細胞本体の外側を取り囲み、細胞集団を支える足場となっている細胞マトリックスの主要成分がやはりコラーゲンであることが知られている。
【０００３】
そして、近年、コラーゲンタンパクおよびその分解物の経口摂取の薬理効果について多くの研究がなされるようになった。これまでに、主な効果として、骨粗鬆症の予防・改善に結びつく骨芽細胞増殖促進作用、骨強化作用（特許文献１，２参照）、加齢に伴う生体組織の機能の低下を改善させる、生体組織の新陳代謝促進作用（特許文献３，４参照）、皮膚代謝促進作用、皮膚賦活作用（特許文献５，６参照）など、数多くの効果が明らかとなっている。
【０００４】
さらに、本発明者らは鋭意研究を重ね、コラーゲン成分あるいはゼラチン成分をコラゲナーゼ酵素を用いて特異的に分解して得られる、アミノ酸配列が  Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙのコラーゲントリペプチドは、従来のコラーゲン、ゼラチン、あるいはその加水分解物よりも速やかに効率よく消化吸収され、コラーゲン産生促進、骨強化、生体組織の新陳代謝促進、皮膚賦活、創傷治癒促進などに重要な役割を果たすことを見出した（特許文献７参照）。
【０００５】
【特許文献１】
特開平９−２５５５８８号公報
【特許文献２】
特開平１１−１２１９２号公報
【特許文献３】
特開平７−２７８０１２号公報
【特許文献４】
特開平９−６７２６２号公報
【特許文献５】
特開平９−６７２６２号公報、
【特許文献６】
特開２０００−２０１６４９号公報
【特許文献７】
特開２００２−２５５８４７号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のコラゲナーゼ酵素を用いた特異的分解による製造では、コスト上の問題があり、機能性食品をはじめとした食品向けの素材として大量供給するのは困難という課題があった。
【０００７】
本発明は、このような課題を解決するためになされたもので、コラーゲン成分またはゼラチン成分をプロテアーゼにより分解して得られる機能的なペプチド組成物であって、より安価に供給可能なペプチド組成物、その製造方法およびそのペプチド組成物を用いた機能性食品、化粧品、医薬部外品、医薬品その他のペプチド添加物質を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、コラーゲン成分あるいはゼラチン成分をキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシンなどのシステインプロテアーゼを用いて分解して得られるペプチド組成物が従来のコラーゲン、ゼラチンあるいはその加水分解物よりも速やかに効率よく消化吸収されることを見出した。そのシステインプロテアーゼにより分解して得られるペプチド組成物は、トリペプチド、ジペプチドまたはその両方を含む。そのペプチド組成物は、コラゲナーゼ酵素を用いてコラーゲン成分またはゼラチン成分を特異的に分解して得られる  Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙのアミノ酸配列のコラーゲントリペプチドほどには消化吸収が速やかではないが、市販のシステインプロテアーゼを用いて安価に製造可能である。
【０００９】
本発明に係るペプチド組成物は、コラーゲン成分またはゼラチン成分をシステインプロテアーゼにより分解して得られるペプチド組成物である。本発明に係るペプチド組成物は、コラーゲン成分またはゼラチン成分をシステインプロテアーゼならびに、ペプシン、トリプシンおよびコラゲナーゼのうちの１種または２種以上の組み合わせにより分解して得られるペプチド組成物であってもよい。
本発明に係るペプチド組成物は、トリペプチドおよびジペプチドの少なくとも一方を含むことが好ましく、特に、５重量％以上含むことが好ましい。
【００１０】
本発明に係るペプチド組成物の製造方法は、コラーゲン成分またはゼラチン成分をシステインプロテアーゼにより分解してペプチド組成物を得ることを特徴とする。本発明に係るペプチド組成物の製造方法は、コラーゲン成分またはゼラチン成分をシステインプロテアーゼならびに、ペプシン、トリプシンおよびコラゲナーゼのうちの１種または２種以上の組み合わせにより分解してペプチド組成物を得る方法であってもよい。本発明に係るペプチド組成物の製造方法により、本発明に係るペプチド組成物を製造することができる。
【００１１】
本発明に係るペプチド組成物およびその製造方法において、前記システインプロテアーゼはキモパパイン、パパイン、ブロメラインおよびフィシンのうちの１種または２種以上の組み合わせから成ることが好ましい。システインプロテアーゼとしては、カテプシンＢ，Ｌ，Ｓ，Ｋその他のシステインプロテアーゼを用いてもよい。前記システインプロテアーゼはパパイヤ果汁抽出物から成ってもよい。
【００１２】
本発明に係るペプチド添加物質は、本発明に係るペプチド組成物を０．０５重量％以上含むことを特徴とする。本発明に係るペプチド添加物質は、機能性食品、化粧品、医薬部外品および医薬品のいずれであってもよい。機能性食品としては、飲料、固形食品のいずれであってもよい。医薬品としては、外用剤、内服剤のいずれであってもよい。
【００１３】
本発明に係るペプチド組成物は、外用または内服により、コラーゲン産生促進、骨芽細胞あるいは線維芽細胞の増殖促進、骨強化、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・改善、皮膚賦活、新陳代謝促進、慢性関節リウマチや変形関節症の改善などの効果を発揮する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態のペプチド組成物は、コラーゲン成分あるいはゼラチン成分をキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシンなどのシステインプロテアーゼを用いて分解して得られるペプチド組成物であって、トリペプチド、ジペプチドあるいはその両方を５％以上含有するものである。
【００１５】
そのペプチド組成物は、コラゲナーゼ酵素を用いて特異的に分解して得られるＧｌｙ−Ｘ−Ｙのアミノ酸配列のコラーゲントリペプチドには及ばないものの、従来のコラーゲンやゼラチン、およびその加水分解物と同等ないしはそれ以上に速やかに、且つ効率よく消化吸収される。
【００１６】
本発明の実施の形態の機能性食品は、前記ペプチド組成物を０．０５重量％以上含むことを特徴とする。その機能性食品は、健康食品であっても、栄養機能食品や特定保健用食品などの保健機能食品であっても良い。本発明の実施の形態の機能性食品は、コラーゲン産生促進、骨芽細胞あるいは線維芽細胞の増殖促進、骨強化、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・改善、皮膚賦活、新陳代謝促進、慢性関節リウマチや変形関節症の改善などの機能性を有する。
【００１７】
本発明の実施の形態の医薬品または医薬部外品は、前記ペプチド組成物を０．０５重量％以上含むことを特徴とする。その医薬品または医薬部外品は、コラーゲン産生促進、骨芽細胞あるいは線維芽細胞の増殖促進、骨強化、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・改善、皮膚賦活、新陳代謝促進、慢性関節リウマチや変形関節症の改善などの機能性を有する。
【００１８】
本発明の実施の形態のペプチド組成物の出発原料は、コラーゲンまたはゼラチンである。そのコラーゲンまたはゼラチンには、牛、豚、鳥、鯨などの骨、軟骨、皮、腱、または鮭、鮫などの魚皮を原料として調製されたものを用いることができ、そのタイプは問わない。
【００１９】
コラーゲン成分またはゼラチン成分の酵素分解に用いるシステインプロテアーゼには、キモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシンなどの１種または２種以上を用いることができる。それによる酵素分解では、コラーゲン中のアミノ酸の約３分の１を占めるグリシンのカルボキシル基側を切断し、Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙといったアミノ酸配列のトリペプチドを含むペプチド組成物を生成する。
【００２０】
システインプロテアーゼの中でも、特にキモパパインが効果的に作用する。システインプロテアーゼとともに、バチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの細菌、ストレプトマイセス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ）などの放線菌、乳酸菌、酵母あるいは真菌などに由来の酵素、またはコラゲナーゼ、ペプシン、トリプシンなどのプロテアーゼを単独もしくは複数種組み合わせて用いることができる。
【００２１】
酵素分解に用いるプロテアーゼは、遊離の形で使用しても良いし、物理吸着法あるいは化学結合法によって各種の担体に結合させた固定化酵素として使用しても良い。また、プロテアーゼによる酵素分解の方法には（ａ）バッチ法、（ｂ）カラム法あるいは（ｃ）これらを組み合わせた方法などがあり、これら（ａ）〜（ｃ）の方法による製造ラインと、使用するプロテアーゼの形態との組み合わせはいろいろな方式を採用する事が可能である。
【００２２】
より具体的に、本発明の実施の形態のペプチド組成物の製造方法の一例を挙げれば、以下の実施例で示すように、ゼラチンあるいはコラーゲンを出発原料とし、反応ｐＨは、ｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ７付近に調整し、酵素分解にはキモパパイン、パパイン、ブロメライン、フィシンなどのシステインプロテアーゼをゼラチンあるいはコラーゲンに対し、例えば１／１００００〜１／１０の重量比で用いることができる。この際、複数のシステインプロテアーゼを混合して用いると、より効果的にトリペプチド断片を生成することができる。また、酵素分解の際の分解温度は４０〜５０℃が好ましく、分解時間は使用する酵素の活性などに応じて数時間〜数日間で適宜設定できる。
【００２３】
また、システインプロテアーゼによる分解の後、バチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の酸性プロテアーゼ、ストレプトマイセス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来のコラゲナーゼなどを用いてさらに分解度合いを進行させることが出来る。
【００２４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものではない。また、本発明に係るペプチド組成物を機能性食品、化粧品、医薬部外品、医薬品に配合する方法は、既に公知となっている操作方法に準じて実施することができる。
【００２５】
【実施例１】
高純度ゼラチン（宮城化学工業社製）５０  ｇ  に精製水を加えて膨潤させた後、加温しながら溶解させ、ｐＨをｐＨ７に調整して、２０％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液を調製した。この基質溶液を４５±１℃に保温しながら、キモパパイン  ０．２５  ｇ  およびフィシン  ０．２５  ｇを添加し、攪拌しながら１７時間反応させた。その後、８５℃で３０分間加熱して酵素活性を失活させ、０．４５  μｍ  のフィルターで濾過を行った。この濾液をスプレードライ（噴霧乾燥器）で粉末化し、ペプチド組成物を製造した。この粉末中に含まれるトリペプチド含量は、スーパーデックスペプチド（ファルマシア社製）を用いたゲルろ過法、あるいは  ＯＤＳ  カラム（ワイエムシー社製）を用いた逆相クロマト法によって検定した。
【００２６】
【実施例２】
＜体内動態試験＞
実施例１により製造したペプチド組成物を放射性同位元素：トリチウム（３Ｈ）で標識したもの（以下、３Ｈ−ペプチド）と、比較対照としてコラゲナーゼを用いた特異的分解により得られるコラーゲン・トリペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）のトリチウム標識体（以下、３Ｈ−コラーゲン・トリペプチド）と、３Ｈ−プロリンとを準備した。これらをそれぞれラットに経口投与し、血漿中放射能濃度の測定により、被験物質のラット体内における吸収について検討した。
【００２７】
血漿中放射能濃度の測定の結果、３Ｈ−ペプチドを経口投与から  ５分後において、既に血漿中放射能濃度は  １．２μｇ  ｅｑ．／ｍＬ  を示し、その後、経時的に上昇し、最大濃度：４２．１μｇ  ｅｑ．／ｍＬ  に達した。次いで、徐々に放射能濃度が低下する様子が観察された。この試験結果から、実施例１により製造したペプチド組成物は、対照として用いた３Ｈ−コラーゲン・トリペプチドにはわずかに及ばないものの、アミノ酸：３Ｈ−プロリンと同等以上の吸収速度であることが確認された。
【００２８】
【実施例３】
＜骨芽細胞のコラーゲン合成促進作用＞
（１）実施例１によるペプチド組成物、（２）従来のコラーゲンペプチドおよび（３）熱変性コラーゲン（ゼラチン）の３種類について、コラーゲン合成促進作用を調べた。
【００２９】
すなわち、骨芽細胞を５％牛胎児血清を含む  Ｅａｇｌｅ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養して試験用培養細胞とした。そして、牛胎児血清を含まないＥａｇｌｅ−ＭＥＭ培地に交換し、上記の（１）〜（３）の３種類の成分をそれぞれ最終濃度２０μｇ／ｍ１となるよう培地に添加して、３７℃で３日間培養した後、ヒドロキシプロリンを定量することにより、合成されたコラーゲン量を求めた。なお、ヒドロキシプロリンの定量は、培養細胞の破砕液を６Ｎ塩酸で加水分解し、Ｗｏｅｓｓｅｎｅｒ  の方法に従って測定した（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを用いた）。
【００３０】
その結果を図１に示す。（１）実施例１によるペプチド組成物を添加して培養すると、（２）従来のコラーゲンペプチドおよび（３）熱変性コラーゲン（ゼラチン）の２種類に比較し、ハイドロキシプロリン量が効果的に増加しており、骨芽細胞のコラーゲン合成が促進されていることか判った。
【００３１】
【配合例１】
（栄養飲料）
実施例１によるペプチド組成物  ２００ｍｇ、ビタミンＣ  １００ｍｇ、乳酸カルシウム  ５０ｍｇ、果糖ブドウ糖液糖  １２ｇ、クエン酸  １ｇ、香料  ０．５ｇに精製水を添加して  １００ｍｌとし、混合し、常法により、飲料を作成した。これにより、皮膚賦活効果に優れた栄養飲料が得られた。
【００３２】
【実施例４】
＜皮膚賦活効果の確認＞
（１）配合例１に示したペプチド組成物を用いて調製した飲料、（２）（１）のペプチド組成物に代えて、熱変性コラーゲン（ゼラチン）を用いて調製した飲料、（３）（１）のペプチド組成物に代えて、市販のコラーゲンペプチド（ゼラチン加水分解物）を用いて調製した飲料、（４）（１）のペプチド組成物を除いて調製した飲料（プラセボ）の４種を被験試料として用意した。年齢２５〜６２才の健常人６６名の被験者を４群に分け、（１）〜（４）の各飲料を各群の被験者に３０日間（１００ｍｌ／日）摂取させた後、肌の状態の変化について調査した。調査項目は、ａ．被験者の前腕の皮膚の角層水分含量およびＴＥＷＬ（皮膚不感蒸散水分量）（試験開始前と終了後の比較）、ｂ．肌のハリ、ｃ．しわ  の３項目とし、ａ．については、皮表角層水分量測定装置（ＩＢＳ社製、ＳＫＩＣＯＮ−２００）および水分蒸発量測定装置（ＣＯＲＴＥＸ社製、ＤｅｒｍａＬａｂ）を用いて測定を行い、ｂ．ｃ．については、以下の評価基準に基づき、アンケート調査（被験者の感想）を実施した。
【００３３】
［評価基準］
Ａ．改善された
Ｂ．やや改善された
Ｃ．変化なし（改善効果が認められない）
Ｄ．やや悪化した
Ｅ．悪化した
【００３４】
ａ．被験者の前腕の角層水分量の変化を調査した結果、（４）（プラセボ）および（２）の飲料を摂取した被験者の皮膚の角層水分量については、試験前後で有意差が認められなかったが、（１）（３）の飲料を摂取した被験者の皮膚の角層水分量は、試験終了後、試験前と比較し有意な上昇が認められ、また、（３）よりも（１）の飲料を摂取した被験者の皮膚の角層水分量の方が、より上昇する傾向が確認された。さらに、（１）では、有意なＴＥＷＬ抑制効果も確認された。その結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
2004244369.tif 000003
【００３６】
ｂ．肌のハリ、ｃ．しわ  に対するアンケート調査の結果、プラセボ群（（４））や比較対照群（（２）（３））よりも、本発明によるところの機能性素材を含む（１）の飲料を摂取した被験者の方が肌のハリや、しわの改善を実感したことが明らかとなった。その結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、コラーゲン成分またはゼラチン成分をプロテアーゼにより分解して得られる機能的なペプチド組成物であって、より安価に供給可能なペプチド組成物、その製造方法およびそのペプチド組成物を用いたペプチド添加物質を提供することができる。本発明に係るペプチド組成物は、体内に速やかに効率よく消化吸収される。本発明に係るペプチド組成物およびそのペプチド組成物を用いたペプチド添加物質は、コラーゲン産生促進作用、骨芽細胞増殖促進作用、骨強化作用および皮膚賦活作用を有し、有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】（１）実施例１によるペプチド組成物、（２）従来のコラーゲンペプチドおよび（３）熱変性コラーゲン（ゼラチン）の３種類による骨芽細胞のコラーゲン合成促進作用を示すグラフである。
【図１】
2004244369.tif 000005