(57)【要約】【課題】  新規なカバノアナタケの生理活性成分の抽出方法、生理活性成分組成物、機能性食品および抗酸化活性の増強方法を提供すること。【解決手段】  本発明のカバノアナタケの生理活性成分の抽出方法は、カバノアナタケにアミラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼから選ばれる少なくとも１種の糖質分解酵素を加えて酵素処理を行った後、酵素処理物に対して抽出操作を行うことを特徴とする。本発明の生理活性成分組成物は、カバノアナタケにアミラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼから選ばれる少なくとも１種の糖質分解酵素を加えて酵素処理を行った後、酵素処理物に対して抽出操作を行うことによって調製されてなることを特徴とする。本発明の機能性食品は、この生理活性成分組成物を加工してなることを特徴とする。本発明の抗酸化活性の増強方法は、カバノアナタケに糖質分解酵素を加えて酵素処理を行うことを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カバノアナタケの生理活性成分の抽出方法であって、カバノアナタケにアミラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼから選ばれる少なくとも１種の糖質分解酵素を加えて酵素処理を行った後、酵素処理物に対して抽出操作を行うことを特徴とする抽出方法。
【請求項２】
カバノアナタケの子実体、菌糸体、菌核、これらの混合物、これらの培養残物から選ばれる少なくとも１つを用いることを特徴とする請求項１記載の抽出方法。
【請求項３】
粉砕した菌核を用いることを特徴とする請求項２記載の抽出方法。
【請求項４】
酵素処理物に抽出溶媒としてアルコールを加えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の抽出方法。
【請求項５】
アルコール抽出液と抽出残渣を分離し、抽出残渣に熱水を加えて抽出操作を行い、熱水抽出液とアルコール抽出液を混合することを特徴とする請求項４記載の抽出方法。
【請求項６】
カバノアナタケにアミラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼから選ばれる少なくとも１種の糖質分解酵素を加えて酵素処理を行った後、酵素処理物に対して抽出操作を行うことによって調製されてなることを特徴とするカバノアナタケの生理活性成分組成物。
【請求項７】
請求項６記載のカバノアナタケの生理活性成分組成物を加工してなることを特徴とする機能性食品。
【請求項８】
カバノアナタケに糖質分解酵素を加えて酵素処理を行うことを特徴とするカバノアナタケの抗酸化活性の増強方法。
【請求項９】
糖質分解酵素がアミラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項８記載の増強方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なカバノアナタケの生理活性成分の抽出方法、生理活性成分組成物、機能性食品および抗酸化活性の増強方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カバノアナタケ（Fuscoporia obliqua）は、耐寒性のきのこで、中部ヨーロッパ、シベリア、中国、日本の北部地方等の寒冷地に広く分布している。シラカバやダケカンバ等のカバノキ類に多く寄生し、それらの樹木の樹液を養分にして生育し、その黒く硬い菌核はチャーガと呼ばれ、ロシアでは古くからお茶代わりに飲用されている。カバノアナタケは、抗腫瘍作用や血糖降下作用等の生理活性を有することが知られており、例えば、下記の特許文献１には、カバノアナタケの生理活性成分の抽出方法として、カバノアナタケにプロテアーゼおよび／またはセルラーゼを加えて酵素処理を行った後、酵素処理物に対して抽出操作を行う抽出方法が提案されているが、新規なカバノアナタケの生理活性成分の抽出方法を探求することは、カバノアナタケの優れた生理活性を広く世に知らしめ、多くの人々が健康を手にするために意義深いものである。
【特許文献１】特開２００２−２６２８２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明は、新規なカバノアナタケの生理活性成分の抽出方法、生理活性成分組成物、機能性食品および抗酸化活性の増強方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の点に鑑みてなされた本発明のカバノアナタケの生理活性成分の抽出方法は、請求項１記載の通り、カバノアナタケの生理活性成分の抽出方法であって、カバノアナタケにアミラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼから選ばれる少なくとも１種の糖質分解酵素を加えて酵素処理を行った後、酵素処理物に対して抽出操作を行うことを特徴とする。
また、請求項２記載の抽出方法は、請求項１記載の抽出方法において、カバノアナタケの子実体、菌糸体、菌核、これらの混合物、これらの培養残物から選ばれる少なくとも１つを用いることを特徴とする。
また、請求項３記載の抽出方法は、請求項２記載の抽出方法において、粉砕した菌核を用いることを特徴とする。
また、請求項４記載の抽出方法は、請求項１乃至３のいずれかに記載の抽出方法において、酵素処理物に抽出溶媒としてアルコールを加えることを特徴とする。
また、請求項５記載の抽出方法は、請求項４記載の抽出方法において、アルコール抽出液と抽出残渣を分離し、抽出残渣に熱水を加えて抽出操作を行い、熱水抽出液とアルコール抽出液を混合することを特徴とする。
また、本発明のカバノアナタケの生理活性成分組成物は、請求項６記載の通り、カバノアナタケにアミラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼから選ばれる少なくとも１種の糖質分解酵素を加えて酵素処理を行った後、酵素処理物に対して抽出操作を行うことによって調製されてなることを特徴とする。
また、本発明の機能性食品は、請求項７記載の通り、請求項６記載のカバノアナタケの生理活性成分組成物を加工してなることを特徴とする。
また、本発明のカバノアナタケの抗酸化活性の増強方法は、請求項８記載の通り、カバノアナタケに糖質分解酵素を加えて酵素処理を行うことを特徴とする。
また、請求項９記載の増強方法は、請求項８記載の増強方法において、糖質分解酵素がアミラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、新規なカバノアナタケの生理活性成分の抽出方法、生理活性成分組成物、機能性食品および抗酸化活性の増強方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明のカバノアナタケの生理活性成分の抽出方法における抽出対象としては、例えば、カバノアナタケの子実体や菌糸体や菌核が挙げられる。これらは天然物であっても栽培物または培養物であってもよい。子実体や菌糸体や菌核は混合状態のものを抽出対象としてもよく、また、これらの培養残物を抽出対象としてもよい。好ましい抽出対象は菌核であり、生理活性成分の抽出効率を高めるためには菌核は粉砕して用いることが好ましい。菌核を粉砕する方法は特に限定されず、通常の粉砕装置を用いて粒径が数十μｍ〜数千μｍになるように粉砕してもよいし、同体気流摩擦装置（トルネードミル）を用いて粒径が数μｍ〜数十μｍになるように微粉砕してもよい。
【０００７】
カバノアナタケの酵素処理に用いる糖質分解酵素は、アミラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼから選ばれる少なくとも１種である。これらは単独で用いてもよいし、混合して用いてもよい。アミラーゼはデンプンを加水分解する作用を有するものであればよい。グルカナーゼはグルカンを加水分解する作用を有するものであればよい。マンナナーゼはマンナンを加水分解する作用を有するものであればよい。酵素の使用量は、標準的には、カバノアナタケ重量（乾燥重量）に対して０．５重量％〜５重量％である。酵素処理は、蒸留水中のカバノアナタケに酵素を加え、個々の酵素が最も活発に作用するｐＨ条件と温度条件にて３０分〜４時間ゆるやかに攪拌することで行えばよい。酵素処理は、反応系内を加熱して酵素を失活させることで終了させる。
【０００８】
以上の方法によって行われた酵素処理で得られた酵素処理物に対する抽出操作は、例えば、エタノールなどのアルコールを抽出溶媒として用いて行えばよい。具体的には、酵素処理物にアルコールを加えて還流抽出を行うことで生理活性成分を含むアルコール抽出液を得る。生理活性成分の抽出効率を高めるために、アルコールを用いた抽出操作により生成した抽出残渣に熱水を加えて還流抽出などの抽出操作を行い、生理活性成分を含む熱水抽出液を得てもよい。
【０００９】
以上の方法によって得られたカバノアナタケの生理活性成分を含む抽出液は、例えば、抽出溶媒を除去することで生理活性成分組成物に調製されて実用に供せられる。この生理活性成分組成物は、後述する実施例において明らかなように、優れた生理活性を有している。
【００１０】
カバノアナタケの生理活性成分組成物は、所定の方法で加工することで、粉末形態や錠剤形態などの機能性食品とすることができる。この際、必要に応じて所定の食品添加剤を添加してもよいことはいうまでもない。
【実施例】
【００１１】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定して解釈されるものではない。
【００１２】
実施例１：本発明のカバノアナタケの生理活性成分組成物の調製
チャーガ（ウクライナ産）の殺菌粉末（ハンマーミルを用いて粒径を約２０μｍ〜約２００μｍとしたもの）２５ｇを蒸留水２００ｍＬに懸濁し、糖質分解酵素０．４ｇを加え、所定の条件にて２時間ゆるやかに攪拌することで酵素処理を行った（用いた糖質分解酵素と酵素処理条件は表１の通り）。反応系内を加熱して酵素を失活させた後、エタノール６０ｍＬを加え、３０℃にて１６時間還流抽出し、カバノアナタケの生理活性成分を含むエタノール抽出液を上清として回収した。さらに、抽出残渣に蒸留水２００ｍＬを加え、８０℃にて２時間還流抽出し、カバノアナタケの生理活性成分を含む熱水抽出液を上清として回収した。得られたエタノール抽出液と熱水抽出液を混合してスプレードライすることで、粉末状のカバノアナタケの生理活性成分組成物を約７．５ｇ得た。
【００１３】
参考例１：
糖質分解酵素としてセルラーゼとヘミセルラーゼを用い、実施例１と同様にしてカバノアナタケの生理活性成分組成物を得た（酵素処理条件は表１の通り）。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
試験例１：実施例１で調製したカバノアナタケの生理活性成分組成物の抗酸化活性（ＳＯＤ様活性）の測定
Ａ．方法（Ｎｉｔｒｉｔｅ法）
１．試薬
（ａ）基質
ヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）１３．６ｍｇと、ヒドロキシルアミン−Ｏ−スルフォン酸１００ｍｇを、１００ｍＭのＫＨ2ＰＯ4・ほう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２：以下、単に緩衝液と略称する）１００ｍＬに溶解したものを用いた。
（ｂ）酵素液
キサンチンオキシダーゼ（Ｘａｎｔｈｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ：和光純薬工業株式会社）１０μＬと、ＥＤＴＡ・２Ｎａ３７２ｍｇを緩衝液１００ｍＬに溶解した溶液０．５ｍＬと、緩衝液９．５ｍＬを混合したものを用いた。
（ｃ）発色液
スルファニル酸２２５ｍｇと、Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン・２ＨＣｌ５ｍＬと、酢酸１２５ｍＬを混合し、蒸留水で全量を５００ｍＬにしたものを用いた。
【００１６】
２．サンプル液
実施例１で調製したカバノアナタケの生理活性成分組成物（検体）１５０ｍｇを蒸留水３ｍＬに懸濁し、ボルテックスミキサーにて３０秒間混和した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、上清を回収した。回収した上清を孔径０．４５μｍのフィルターにて濾過し、濾液をサンプル原液とした。このサンプル原液より希釈系列を調製し、サンプル液とした。
【００１７】
３．測定方法
試験管にサンプル液０．１ｍＬと蒸留水０．５ｍＬと基質０．２ｍＬを入れ、３７℃の温浴で５分間加熱した。その後、酵素液０．２ｍＬを加え、３７℃の温浴でさらに３０分間加熱した後、発色液２ｍＬを加え、室温で２時間放置してから５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして蒸留水を用い、各サンプル液の希釈倍率における発色阻害率（％）を｛(コントロール吸光度−サンプル液吸光度)／コントロール吸光度｝×１００から求めた。
発色阻害率が５０％であるサンプルの希釈倍率を求めて、その値を１ユニット（１  Ｎｉｔｒｉｔｅ  ｕｎｉｔ）とした。これに希釈倍率をかけてサンプル原液のユニット数を求めた。サンプル原液は検体５０ｍｇ／ｍＬで調製してあるので、サンプル原液のユニット数を２０倍して検体１ｇあたりのユニット数を求め、これをＳＯＤ様活性値とした。すなわち、例えば、原液を２倍希釈してなるサンプル液の阻害率が５０％であった場合、サンプル原液のユニット数は１（ユニット）×２（希釈率）＝２ユニットとなり、サンプル原液は検体５０ｍｇ／ｍＬで調製してあるので、サンプル原液のユニット数を２０倍して検体１ｇあたりのユニット数を求めると４０ユニットとなり、これをＳＯＤ様活性値とした。
【００１８】
Ｂ．結果
実施例１で調製した生理活性成分組成物の１ｇあたりのＳＯＤ様活性値を、チャーガの殺菌粉末と、実施例１において糖質分解酵素を加えないこと以外は実施例１と同じ操作を行って調製した組成物（酵素コントロール）と、参考例１で調製した生理活性成分組成物の１ｇあたりのＳＯＤ様活性値とともに図１に示す。図１から明らかなように、カバノアナタケに糖質分解酵素を加えて酵素処理を行うことで、カバノアナタケのＳＯＤ様活性を増強できることがわかった。また、アミラーゼ処理組成物とグルカナーゼ処理組成物は、セルラーゼ処理組成物とヘミセルラーゼ処理組成物よりもＳＯＤ様活性に優れることがわかった。
【００１９】
試験例２：実施例１で調製したカバノアナタケの生理活性成分組成物のメラニン含有量の測定
１．試薬
・  ２％水酸化ナトリウム水溶液
・  濃塩酸
・  メラニン（シグマ社）
・  ０．２５％過マンガン酸カリウム水溶液
・  ５％シュウ酸水溶液
【００２０】
２．測定方法
実施例１で調製したカバノアナタケの生理活性成分組成物（検体）１５０ｍｇを蒸留水３ｍＬに懸濁し、ボルテックスミキサーにて３０秒間混和した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、上清を回収した。回収した上清を濃塩酸にてｐＨ２に調製し酸性化した。これを３０００ｒｐｍで１５分間遠沈し、得られた沈殿物を２％水酸化ナトリウム水溶液３ｍＬに溶解してサンプル液とした。このサンプル液の４９０ｎｍの吸光度を測定することで、抗酸化能の主要有効成分と目されるメラニンの含有量を測定した。
【００２１】
３．測定結果
実施例１で調製した生理活性成分組成物から調製したサンプル液１ｍＬあたりのメラニン含有量を、チャーガの殺菌粉末と、実施例１において糖質分解酵素を加えないこと以外は実施例１と同じ操作を行って調製した組成物（酵素コントロール）と、参考例１で調製した生理活性成分組成物から調製したサンプル液１ｍＬあたりのメラニン含有量とともに図２に示す。図２から明らかなように、カバノアナタケに糖質分解酵素を加えて酵素処理を行うことで、サンプル液１ｍＬあたりのメラニン含有量を増量できることがわかった。また、アミラーゼ処理組成物とグルカナーゼ処理組成物は、セルラーゼ処理組成物とヘミセルラーゼ処理組成物よりもメラニン含有量が多いことがわかった。なお、メラニンの存在の確認は、上記の上清を用いて過マンガン酸カリウム−シュウ酸法により行った。具体的には、上清２ｍＬに０．２５％過マンガン酸カリウム水溶液３８ｍＬを加え、常温にて４時間放置した後、濃塩酸にてｐＨ２に調製し、これを３０００ｒｐｍで１５分間遠沈し、得られた沈殿物に５％シュウ酸水溶液３０ｍＬを加え、それを１０分放置した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、得られた沈殿物が漂白されていることで確認した。
【００２２】
試験例３：実施例１で調製したマンナナーゼ処理組成物の免疫賦活作用を有するインターロイキン１２（ＩＬ−１２）産生促進活性の測定
１．試薬
・  ＩＬ−１２アッセイキット（和光純薬工業株式会社）
・  Ｈａｎｋ’ｓ液（ペニシリン、ストレプトマイシン含有）
・  １０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液（ＲＰＭＩ１６４０（和光純薬工業株式会社）溶液と牛胎児血清（ＦＣＳ）とを容量比９：１で混合したもの）
・  リポポリサッカライド（ＬＰＳ：和光純薬工業株式会社）溶液（１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液を用いて１００ｎｇ／ｍＬに調製したもの）
【００２３】
２．サンプル液
実施例１で調製したマンナナーゼ処理組成物（検体）２００ｍｇを乳鉢で粉砕した後、Ｈａｎｋ’ｓ液１．８ｍＬに溶解した。これを１５ｍＬチューブに移し、室温にて１時間静置した。その後、１０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、上清０．５ｍＬを回収した。回収した０．５ｍＬを原液とし、Ｈａｎｋ’ｓ液４ｍＬを加えサンプル液とした。
【００２４】
３．測定方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（♀６週齢、ｎ＝８）を１週間予備飼育した７週齢の実験マウスの腹腔内に、調製した各サンプル液をそれぞれ０．５ｍＬ投与した。サンプル液の投与から１８時間後に腹腔内細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液にて洗浄し、溶血バッファーにて赤血球を除去した後、細胞数を算定し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液を用いて１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、２４穴カルチャープレートにて培養した。その際に、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを１０μＬ加えた場合と加えなかった場合との２通りで培養した。ＬＰＳ添加から１８時間後に培養上清を回収し、ＩＬ−１２アッセイキットを用い、その製品プロトコールに準じてＩＬ−１２産生量を測定した。
【００２５】
４．測定結果
ＬＰＳを加えて培養した場合における、実施例１で調製したマンナナーゼ処理組成物のＩＬ−１２産生量を、チャーガの殺菌粉末と、実施例１において糖質分解酵素を加えないこと以外は実施例１と同じ操作を行って調製した組成物（酵素コントロール）とともに図３に示す。図３から明らかなように、カバノアナタケは、ＩＬ−１２産生促進活性を有しており、マンナナーゼ処理組成物においてもＩＬ−１２産生促進活性が認められた。なお、ＬＰＳを加えないで培養した場合におけるＩＬ−１２産生促進活性は認められなかった。
【００２６】
（試験例のまとめ）
以上の試験例から、酵素処理に用いる糖質分解酵素の種類によって、得られる生理活性成分組成物の特性は異なることがわかった。マンナナーゼ処理組成物は、アミラーゼ処理組成物とグルカナーゼ処理組成物よりも抗酸化活性は低いものの、優れたＩＬ−１２産生促進活性を有することは注目に値するものであった。従って、各々の酵素を用いて調製されたカバノアナタケの生理活性成分組成物は、単独で機能性食品に加工してもよいが、混合して機能性食品に加工することで、各々の組成物が有する特性を兼ね備えた機能性食品（例えば優れた抗酸化活性とＩＬ−１２産生促進活性を兼ね備えた機能性食品）とすることができることがわかった。
【００２７】
製造例１：錠剤品の製造
実施例１で調製したアミラーゼ処理組成物を打錠機にて打錠し、機能性食品としての錠剤品を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、新規なカバノアナタケの生理活性成分の抽出方法、生理活性成分組成物、機能性食品および抗酸化活性の増強方法を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】試験例１における抗酸化活性を示すグラフ。
【図２】試験例２におけるメラニン含有量を示すグラフ。
【図３】試験例３におけるＩＬ−１２産生促進活性を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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