(57)【要約】【課題】ジンセノサイドＲｂ１と同様の挙動を示す、所謂ジンセノサイドＲｂ１様物質をスクリーニングする方法と、それによって得られる有用物質（若しくは有用組成物）であるジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の提供。【解決手段】糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖との結合を測定、推定又は解析することからなる、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により得られたユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）などのジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、並びに、当該ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を含んでなる、創傷治療用等の医薬組成物、細胞を冷凍若しくは凍結することにより傷害させるための添加剤組成物、及び、精子、卵子、非生殖細胞、非腫瘍細胞の凍結（冷凍）保存用組成物、並びに、アストロサイト、皮膚ケラチノサイトなどの非腫瘍細胞に対する凍結保存用組成物。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖との結合を測定、推定又は解析することからなる、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物のスクリーニング方法。
【請求項２】
糖脂質及び／又は糖蛋白が細胞膜表面の糖脂質及び／又は糖蛋白である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖との結合が、水素結合若しくは水素結合による糖鎖の架橋である請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ジンセノサイドＲｂ１様物質が糖鎖を有するものである請求項１〜３の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
糖鎖がグルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、シアル酸、キシロース、マンノース、タロース、フラクトース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、リボース、アラビノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラムノース、２−デオキシグルコース、オリゴ糖又は希少糖である請求項１〜４の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
細胞が皮膚ケラチノサイト、皮膚組織の細胞、ＨＥＫ２９３細胞、神経細胞又はアストロサイトである請求項２〜５の何れかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れかに記載のスクリーニング方法により得られるジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物。
【請求項８】
ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物が、ジヒドロキシクロメン、トリヒドロキシクロメン又はテトラヒドロキシクロメンを基本骨格として有する配糖体化合物若しくはそれらの塩、又はそれらを含んでなる組成物である、請求項７に記載のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物。
【請求項９】
ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物が、下記一般式［１］
【化１】
2004077456.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、少なくとも一つが糖鎖で、残りは水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、アラルキル基（アルキル部分はＣ１−１０）、アリール基、Ｃ１−１０アシル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ１−１０アシル基を表し、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、アラルキル基（アルキル部分はＣ１−１０）、Ｃ１−１０アシル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−１０アシル基、Ｃ１−１０アルケニル基又は水酸基を表す。）で示される配糖体化合物若しくはそれらの塩、又はそれらを含んでなる組成物である請求項７に記載のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物。
【請求項１０】
配糖体化合物が下式で示される、３，５，７−トリヒドロキシクロメン−４−オン−３−Ｏ−Ｌ−ラムノシド（ユークリフィン）である請求項９に記載のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物。
【化２】
2004077456.tif 000008
【請求項１１】
請求項７〜１０の何れかに記載のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物及び担体を含んでなる、脳神経疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、神経外傷の予防、処置又は治療用医薬組成物、静脈内投与用医薬組成物、細胞のアポトーシス若しくはアポトーシス様細胞死をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、病理組織学的変化をきたす器質的疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、創傷（熱傷）の予防、処置又は治療用医薬組成物、血流障害をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、皮膚外用剤組成物、化粧品組成物、皮膚・粘膜疾患の予防、処置又は治療のための局所投与用医薬組成物、発毛育毛用組成物、フィジカルピーリング剤組成物、ケミカルピーリング剤組成物、粘膜外用剤組成物、動物成長調整用組成物、植物成長調整用組成物、肥料組成物、飼料組成物、細胞又は組織の冷凍又は凍結のための添加剤組成物、細胞又は組織を冷凍保存又は凍結保存するための添加剤組成物、腫瘍細胞又は不死化細胞を冷凍又は凍結することにより傷害させるための添加剤組成物、若しくは悪性腫瘍の予防、転移抑制、処置又は治療のための医薬組成物。
【請求項１２】
請求項７〜１０の何れかに記載のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を含んでなる、腫瘍細胞又は不死化細胞を冷凍若しくは凍結することにより傷害させるための添加剤組成物。
【請求項１３】
請求項７〜１０の何れかに記載のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を含んでなる、精子、卵子、非生殖細胞、非腫瘍細胞の凍結（冷凍）保存用組成物。
【請求項１４】
請求項７〜１０の何れかに記載のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を含んでなる、アストロサイト、皮膚ケラチノサイトなどの非腫瘍細胞に対する凍結保存用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、各種疾患の予防、処置又は治療用に使用し得る医薬品又は医薬組成物として、また、化粧品や動植物成長調整用薬剤、細胞又は組織の冷凍又は凍結のための添加剤、細胞又は組織を冷凍保存又は凍結保存するための添加剤等の組成物として極めて有用なジンセノサイドＲｂ１と同様の挙動を示す物質、即ち、ジンセノサイドＲｂ１様物質のスクリーニング方法に関する。また、本発明は、当該スクリーニング方法により得られるジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の新規用途、効果、効能及び使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内特には真核細胞（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ）内で産生されたタンパク質にはしばしば糖鎖が結合し、その結果細胞膜に多種多様な糖蛋白（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）が局在することになる。これらの糖蛋白に結合した糖鎖は、当該蛋白の安定性や三次構造に影響を与えるのみならず、細菌感染、ウイルス感染、細胞接着（例えば炎症、癌の転移、細胞分化、発生における細胞接着）などにも関与すると言われているが、その詳細な作用メカニズムは明らかにされていない（例えば、非特許文献１参照）。なお、細胞膜上の糖蛋白は、イオンチャネル、受容体又は接着因子としても機能することが知られているが、その機能が不明なものも多々ある。また、細胞膜には糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）も存在するがその糖鎖の役割も不明である。
糖蛋白（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）又は糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）を構成する糖鎖としては、例えば、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、シアル酸（ｓｉａｌｉｃ　ａｃｉｄｓ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）などが代表的なものとして挙げられるが、勿論これ以外のものも多数ある（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００３】
これまで、糖蛋白及び／又は糖脂質を構成する糖鎖の生理作用に関する多くの研究が実施されてきたにもかかわらず、これらの糖鎖の配列や三次構造の多様性に阻まれて、細胞膜（特には真核細胞）表面に存在する１つ又は複数の糖蛋白又は糖脂質の糖鎖に結合して糖鎖を架橋することにより、当該細胞に好ましい効果を発揮する有用物質又は有用組成物（特には非ペプチド性化合物）は本発明者の知る限り開発されていない。なお、本発明で言う有用物質或いは有用組成物とは、例えば脳神経疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、神経外傷の予防、処置又は治療用医薬組成物、静脈内投与用医薬組成物、細胞のアポトーシス若しくはアポトーシス様細胞死をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、病理組織学的変化をきたす器質的疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、創傷の予防、処置又は治療用医薬組成物、血流障害をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、皮膚外用剤組成物、化粧品組成物、皮膚・粘膜疾患の予防、処置又は治療のための局所投与用医薬組成物、発毛育毛用組成物、ケミカルピーリング剤組成物、フィジカルピーリング剤組成物、粘膜外用剤組成物、動物成長調整用組成物、植物成長調整用組成物、肥料組成物、飼料組成物、細胞又は組織の冷凍又は凍結のための添加剤組成物、細胞又は組織を冷凍保存又は凍結保存するための添加剤組成物、腫瘍細胞又は不死化細胞を冷凍又は凍結することにより傷害させるための添加剤組成物（即ち凍結腫瘍細胞傷害用組成物）、悪性腫瘍の予防、処置又は治療のための医薬組成物、等のことである。前記した疾患、病態、組成物の具体例については、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０等に記載されている。なお、本発明においては器質的疾患の中に肥満は含まないものとする。
【０００４】
さて、下記構造式
【０００５】
【化３】
2004077456.tif 000002
【０００６】
で示されるジンセノサイドＲｂ１又はその塩は、患部組織における細胞外液濃度が１０ｎｇ／ｍｌ以下又は１ｎｇ／ｍｌ以下のときに、細胞に対して好ましい効果を発揮し、脳神経疾患の予防、処置又は治療のための静脈内投与用医薬組成物、神経外傷の予防、処置又は治療用医薬組成物、細胞のアポトーシス若しくはアポトーシス様細胞死をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、病理組織学的変化をきたす器質的疾患の予防、処置又は治療のための局所投与用若しくは外用投与用医薬組成物、創傷の予防、処置又は治療用医薬組成物、化粧品組成物、発毛育毛用組成物、ケミカルピーリング剤組成物、動物成長調整用組成物、植物成長調整用組成物、肥料組成物、飼料組成物として利用されることが既に見出されている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４参照。）。しかし、ジンセノサイドＲｂ１と選択的に結合する標的分子又は標的蛋白が細胞膜に存在するかどうかも明らかにされていない。また、ジンセノサイドＲｂ１の標的分子が存在するとしても、ジンセノサイドＲｂ１の化学構造のうちどの部分が、細胞の未知の標的分子に結合するのかはまったく明らかにされていない。更に、ジンセノサイドＲｂ１の標的分子が存在すると仮定しても、それが細胞膜に局在するのか細胞質内に局在するのか、核に局在するのかも不明である。そこで、本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ１の標的分子がもし局在するのなら、それを同定することによりジンセノサイドＲｂ１と同様の挙動を示す新規有用物質、即ち、ジンセノサイドＲｂ１様物質をスクリーニングする方法が確立できるものと考えてこれまで鋭意研究を継続してきた。
【０００７】
一方、本発明者らはジンセノサイドＲｂ１及び下記構造式
【０００８】
【化４】
2004077456.tif 000003
【０００９】
で示されるジヒドロジンセノサイドＲｂ１がヒト皮膚ケラチノサイトなどの非腫瘍細胞に対しては、当該細胞を冷凍保存又は凍結保存するための添加剤組成物として利用され、ＨＥＫ２９３細胞などの腫瘍細胞又は不死化細胞に対しては、同細胞を冷凍若しくは凍結することにより傷害させるための添加剤組成物となることを見出し先に特許出願している（特許文献５及び特許文献８）。更に、本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ１をヒト皮膚ケラチノサイトを含む凍結細胞保存液に添加した後に、ヒト皮膚ケラチノサイトを凍結解凍すると、ジンセノサイドＲｂ１を添加しない場合に比べて明らかにヒト皮膚ケラチノサイトの細胞膜全周が均一に保護されることを本発明に係る研究の途上、電子顕微鏡下で見出した。これらの実験結果より、（１）ジンセノサイドＲｂ１及びその化学的誘導体（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１）は、細胞膜全周にわたって存在する分子（群）又は構成要素に結合するか若しくは作用すること、及び（２）ジンセノサイドＲｂ１及びその化学的誘導体（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１）が作用するか若しくは結合する分子（群）又は細胞膜構成要素の局在、性状又は種類が非腫瘍細胞と腫瘍細胞（不死化細胞）で異なるため、相反する作用（即ち凍結保存作用と凍結傷害作用）が見られること、が推測された。本発明者らはこのような分子（群）又は細胞膜構成要素として、細胞膜に存在する糖蛋白（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）及び糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）の糖鎖に着目した。
【００１０】
そこで、本発明者らの糖鎖への着目が正しいかどうかを明らかにするため、細胞膜に存在する糖蛋白と糖脂質の糖鎖をノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）により切断した神経細胞に対して、ジンセノサイドＲｂ１が抗アポトーシス作用又はアポトーシス様細胞死抑止作用を示すかどうかを本発明者らはしらべた。コントロールとしては、ノイラミニダーゼ処置をしていない神経細胞を用いた。その結果、ノイラミニダーゼ処置により、コントロールとは異なり、ジンセノサイドＲｂ１の抗アポトーシス効果又はアポトーシス様細胞死抑止効果は消失した。以上のことよりジンセノサイドＲｂ１及びその化学的誘導体（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１）は、細胞膜上に存在する糖蛋白（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）及び／又は糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）の糖鎖に結合（おそらくは水素結合）することにより、細胞膜上の糖鎖を架橋し、細胞に対して好ましい効果を発揮することが明らかとなった。
【００１１】
即ち、ジンセノサイドＲｂ１及びその化学的誘導体（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１）は、細胞膜上の特定の受容体蛋白若しくは標的分子に結合するのではなく、おそらく細胞膜上の複数の糖蛋白及び／又は糖脂質の糖鎖に同化合物の糖鎖を介して水素結合することにより、細胞膜上の糖鎖を架橋し、細胞に対して好ましい効果を示すと言える。本発明者らの知る限り、このような作用機構を示す化合物は見当たらない。従って、今後細胞膜表面に存在する糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖との結合を測定又は解析することにより、ジンセノサイドＲｂ１と同様の挙動を示す有用物質若しくは有用組成物、即ち、ジンセノサイドＲｂ１様物質をスクリーニングすることができると考えられる。
【００１２】
【特許文献１】
国際公開第００／３７４８１号公報
【特許文献２】
国際公開第００／４８６０８号公報
【特許文献３】
国際公開第０１／１５７１７号公報
【特許文献４】
国際公開第０１／９２２８９号公報
【特許文献５】
特願２００１−３７４５０９号明細書
【特許文献６】
特願２００１−３６５２８２号明細書
【特許文献７】
特願２００１−０４４８１８号明細書
【特許文献８】
ＰＣＴ／ＪＰ０１／１１２７５号明細書
【特許文献９】
ＰＣＴ／ＪＰ０２／００３６８号明細書
【特許文献１０】
ＰＣＴ／ＪＰ０２／００３６９号明細書
【特許文献１１】
特願２００１−０５２９２５号明細書
【非特許文献１】
エンドウ（Ｅｎｄｏ，Ｔ．）著「バイオヒミカ　エト　バイオ　フィジカアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）」エルセビア出版、１９９９年、１４７３巻、Ｐ．２３７−２４６
【非特許文献２】
ブロックハウゼン（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，　Ｉ．）著「バイオヒミカ　エトバイオ　フィジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）」１９９９年、１４７３巻、Ｐ．６７−９５
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き状況を踏まえ、ジンセノサイドＲｂ１と同様の挙動を示す有用物質若しくは有用組成物、即ち、ジンセノサイドＲｂ１様物質をスクリーニングする方法と、それによって得られる有用物質（若しくは有用組成物）であるジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖との結合を測定、推定又は解析することからなる、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物のスクリーニング方法に関する。
【００１５】
また、本発明は、上記スクリーニング方法により得られるジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物に関する。
【００１６】
更に、本発明は、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物がジヒドロキシクロメン、トリヒドロキシクロメン又はテトラヒドロキシクロメンを基本骨格として有する配糖体化合物若しくはそれらの塩、又はそれらを含んでなる組成物である、上記ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物に関する。
【００１７】
更にまた、本発明は、上記ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物及び担体を含んでなる、脳神経疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、神経外傷の予防、処置又は治療用医薬組成物、静脈内投与用医薬組成物、細胞のアポトーシス若しくはアポトーシス様細胞死をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、病理組織学的変化をきたす器質的疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、創傷（熱傷）の予防、処置又は治療用医薬組成物、血流障害をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、皮膚外用剤組成物、化粧品組成物、皮膚・粘膜疾患の予防、処置又は治療のための局所投与用医薬組成物、発毛育毛用組成物、フィジカルピーリング剤組成物、ケミカルピーリング剤組成物、粘膜外用剤組成物、動物成長調整用組成物、植物成長調整用組成物、肥料組成物、飼料組成物、細胞又は組織の冷凍又は凍結のための添加剤組成物、細胞又は組織を冷凍保存又は凍結保存するための添加剤組成物、腫瘍細胞又は不死化細胞を冷凍又は凍結することにより傷害させるための添加剤組成物、若しくは悪性腫瘍の予防、処置又は治療のための医薬組成物に関する。
【００１８】
また、本発明は、上記ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を含んでなる、腫瘍細胞又は不死化細胞を冷凍若しくは凍結することにより傷害させるための添加剤組成物、及び、精子、卵子、非生殖細胞、非腫瘍細胞の凍結（冷凍）保存用組成物、並びに、アストロサイト、皮膚ケラチノサイトなどの非腫瘍細胞に対する凍結保存用組成物に関する。
【００１９】
本発明の方法は、ヒト皮膚ケラチノサイト、ＨＥＫ２９３細胞、神経細胞、アストロサイトなどの細胞を公知の凍結細胞保存液（例えば、特許文献５，特許文献８参照）内でスクリーニング対象物質を添加後若しくは非添加後に凍結融解し、同細胞の生存率、生着率又は微細構造をしらべることにより、細胞膜表面に存在する糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖とスクリーニング対象物質との結合を測定、推定又は解析するものである。より詳細には、本発明の方法は細胞の凍結融解実験により、細胞膜表面に存在する糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖とスクリーニング対象物質との水素結合若しくは水素結合による糖鎖の架橋を測定又は解析することからなるものである。前記した細胞の凍結融解実験により、スクリーニング対象物質が細胞の生存率、生着率又は微細構造を改善若しくは悪化せしめた場合にも、当該スクリーニング対象物質をジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物と本発明では呼ぶこととする。また、スクリーニング対象物質を後述する実施例で示すごとく、熱傷や創傷病変に外用投与して効果が得られたときにも、同物質をジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物と呼ぶことが出来る。もちろん、スクリーニング対象物質の作用を特許文献１〜１０に記載の方法の何れかを用いて解析した結果、陽性所見が得られれば、当該スクリーニング対象物質をジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物と呼ぶことが出来る。また、スクリーニング対象物質として単に細胞膜上の糖蛋白又は糖脂質の糖鎖と結合することが推定される化合物、たとえば糖鎖若しくは水酸基を有する化合物を選ぶことも出来る。
なお、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物としては、例えば脳神経疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、神経外傷の予防、処置又は治療用医薬組成物、静脈内投与用医薬組成物、細胞のアポトーシス若しくはアポトーシス様細胞死をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、病理組織学的変化をきたす器質的疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、創傷の予防、処置又は治療用医薬組成物、血流障害をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、皮膚外用剤組成物、化粧品組成物、皮膚・粘膜疾患の予防・処置又は治療のための局所投与用医薬組成物、発毛育毛用組成物、ケミカルピーリング剤組成物、粘膜外用剤組成物、フィジカルピーリング剤組成物、動物成長調整用組成物、植物成長調整用組成物、肥料組成物、飼料組成物、細胞又は組織の冷凍又は凍結のための添加剤組成物、細胞又は組織を冷凍保存又は凍結保存するための添加剤組成物、腫瘍細胞又は不死化細胞を冷凍又は凍結することにより傷害させるための添加剤組成物、悪性腫瘍の予防、処置又は治療のための医薬組成物、等が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。前記した疾患、病態、組成物の具体例については、上記特許文献１〜１０に記載されている。
【００２０】
また、前述の細胞の凍結融解実験において、あらかじめ細胞膜上に存在する糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖（例えばシアル酸等）をノイラミニダーゼなどの糖鎖切断酵素で除去した後にスクリーニング対象物質の効果をしらべてもよい。例えば、ノイラミニダーゼ処理により、スクリーニング対象物質の効果が変化すれば、同物質が細胞膜上に存在する糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖に結合すると言える。このような場合も当該スクリーニング対象物質を、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物と呼ぶ。
【００２１】
更に、後述の実施例の項で示すごとく、細胞の凍結融解実験の他に、神経細胞などの細胞にあらかじめノイラミニダーゼ処理を施した場合とそうでない場合とで、スクリーニング対象物質の効果（例えば抗アポトーシス作用、細胞保護作用等）を比較することにより、細胞膜上に存在する糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖とスクリーニング対象物質との結合（特には水素結合）を解析してもよい。またガングリオシドなどの糖脂質及び／又は糖蛋白とスクリーニング対象物質を培養細胞に投与した場合と、スクリーニング対象物質のみを投与した場合とで、同物質の抗アポトーシス作用、細胞保護作用、凍結細胞保護作用、凍結細胞傷害作用等を比較することにより、ジンセノサイドＲｂ１様物質をスクリーニングしてもよい。更に糖鎖（たとえばシアル酸）とある物質又は細胞膜の結合を阻害する化合物を培養細胞に投与した上で、スクリーニング対象物質の効果を判定することにより、ジンセノサイドＲｂ１様物質をスクリーニングしてもよい。もちろん、前記のような細胞を用いた実験ではなく、任意の若しくは公知の糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖とスクリーニング対象物質との結合（特には水素結合）をｉｎ　ｖｉｔｒｏの系で化学的に測定又は解析するか若しくは化学的に推定することにより、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をスクリーニングしてもよい。例えば、ＢｉＡ−Ｃｏｒｅシステムを用いて糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖とスクリーニング対象物質との結合を解析することなどが挙げられる。前記した方法により陽性所見を示したスクリーニング対象物質も、本発明ではジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物と呼ばれる。
【００２２】
本発明は、前記した方法の何れか１つ又は２つ以上を用いて得られる（選び出される）ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、若しくは前記した実験結果より創製されるジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えば、３，５，７−トリヒドロキシクロメン−４−オン−３−Ｏ−Ｌ−ラムノシド［慣用名：ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）］及び／又はその化学的誘導体などの、糖鎖を有するジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物にも関する。さて、後述する参考例等に示すごとく、ジンセノサイドＲｂ１又はその化学的誘導体（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１）が細胞膜上に存在する糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖と結合することにより優れた凍結非腫瘍細胞保存作用、凍結腫瘍細胞傷害作用、抗アポトーシス作用等を発揮することが判明した。
従って、本発明者らはこの実験結果に基づいて、ジンセノサイドＲｂ１又はその化学的誘導体（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１）の糖鎖部分に着目して、ジンセノサイドＲｂ１又はその化学的誘導体（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１）以外のジンセノサイドＲｂ１様有用物質（特に配糖体化合物）を選出、創製した。その際に、ジンセノサイドＲｂ１の糖鎖根本の水酸基間が１０オングストロームであることに配慮し、基本骨格部分として４から１２オングストローム程度のものを選択した。但し、この基本骨格のサイズはあくまでも目安であり、実際には糖鎖が結合するための水酸基を有する化合物であれば、特に基本骨格のサイズ又は化学構造には制限がない。
【００２３】
図１〜図６に基本骨格の例を示す。図１には直鎖状の基本骨格のうち８〜１２オングストロームのサイズのもののみ記載されている。図１〜図６に示すごとく、基本骨格として、長さ４〜１２オングストロームの直鎖構造を有するものに加えて、２，１１−ビス−ヒドロキシメチル−１８−クラウン−６、フラボノイドの６位及び４’位水酸化物及びイソフラバン類の５位及び４’位水酸化物、フラバン骨格、フラビリウム骨格、イソフラバン骨格、ゴナン骨格、エストラン骨格、アンドロスタン骨格、プレグナン骨格、コラン骨格、コレスタン骨格、カルダノリド骨格、ブファノリド骨格、スピロスタン骨格、フロスタン骨格、エルゴスタン骨格、サンペスタン骨格、（２４Ｒ）−エルゴスタン骨格、スチグマスタン骨格、ポリフェラスタン骨格、（２４Ｓ）−スチグマスタン骨格、ゴルゴスタン骨格、ダマラン骨格、ガンマセラン骨格、ラノスタン骨格、ルパン骨格、３，５，７−トリヒドロキシクロメン−４−オン骨格、３，５，７−トリヒドロキシクロメン−２−オン骨格、３，７−ジヒドロキシクロメン−４−オン骨格、３，７−ジヒドロキシクロメン−２−オン骨格、３，７，８−トリヒドロキシクロメン−２−オン骨格、３，７，８−トリヒドロキシクロメン−４−オン骨格、３，６，７−トリヒドロキシクロメン−４−オン骨格、３，６，７−トリヒドロキシクロメン−２−オン骨格、３，５，　６，７−テトラヒドロキシクロメン−４−オン骨格、３，５，６，７−テトラヒドロキシクロメン−２−オン骨格、３，　６，７，８−テトラヒドロキシクロメン−４−オン骨格、３，６，７，８−テトラヒドロキシクロメン−２−オン骨格、１，５−ナフタレンジオール骨格、１，６−ナフタレンジオール骨格、２，６−ナフタレンジオール骨格、２，７−ナフタレンジオール骨格、２，６−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレン骨格、２，７−ビス（ヒドロキシメチル）ナフタレン骨格、４，４’−ビフェノール　４，４’−ビス（ヒドロキシメチル）ビフェニル骨格、ビスフェノールＡ骨格、ビスフェノール誘導体骨格、４，４’−アゾベンゼンジオール骨格、４，４’−ビス（ヒドロキシメチル）アゾベンゼン骨格、３，３’−ビス（ヒドロキシメチル）アゾベンゼン骨格等が挙げられる。その他、図には示していないが、５，８−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ、２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｐｈｅｎｏｎｅ、４，４’−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ、２，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，５−ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ、２，７−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｏｃｔａ−３，５−ｄｉｙｎｅ−２，７−ｄｉｏｌ、３，６−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ｏｃｔｙｎ−３，６−ｄｉｏｌ、Ｅｌｌａｇｉｃ　ａｃｉｄ　ｄｉｈｙｄｒａｔｅ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ　ａｃｉｄ、Ｇｌｙｏｘａｌ　ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｌ）、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ、４，４’−（Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ）ｄｉｐｈｅｎｏｌ、Ｈｙｄｒｉｎｄａｎｔｉｎ　ｄｉｈｙｄｒａｔｅ、Ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ、Ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｓａｌｔ、２−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ、３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ、４−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ、ＤＬ−４−Ｈｙｄｒｏｘｙｍａｎｄｅｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、４，４’−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅｂｉｓ（２，６−ｄｉｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ）、４，４’−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅｄｉｐｈｅｎｏｌ、Ｋｏｊｉｃ　ａｃｉｄ、２−Ｍｅｔｈｏｘｙｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ、Ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ　Ｇｒｅｅｎ、Ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ　Ｐｕｒｐｌｅ、Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ、Ｂｒｏｍｏｔｈｙｍｏｌ　Ｂｌｕｅ、Ｂｒｏｍｏｘｙｌｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ、Ｃａｌｃｅｉｎ、Ｃａｌｃｏｎｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ、Ｃａｌｍａｇｉｔｅ、Ｌ−Ａｄｒｅｎａｌｉｎｅ、１，３−Ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｍｅｔｈａｎｏｌ、１，４−Ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｍｅｔｈａｎｏｌ、３，９−Ｂｉｓ（１，１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２，４，８，１０−ｔｅｔｒａｏｘａｓｐｉｒｏ［５，５］ｕｎｄｅｃａｎｅ、１，４−Ｂｉｓ（１−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｉｏｈｅｘｙｌ）−１，３−ｂｕｔａｄｉｙｎｅ、１，４−Ｂｉｓ（１−ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌ）−１，３−ｂｕｔａｄｉｙｎｅ、１，３−Ｂｉｓ（１，１，１，３，３，３−ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ、４，４’−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）ｂｉｐｈｅｎｙｌ、４，４−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｐｈｅｎｙｌ　ｅｔｈｅｒ、Ｂｉｓ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｐｈｏｎｅ、４，４−Ｂｉｓ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｖａｌｅｒｉｃ　ａｃｉｄ、Ｎ，Ｎ’−Ｂｉｓ（ｓａｌｉｃｙｌｉｄｅｎｅ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、Ｎ，Ｎ’−Ｂｉｓ（ｓａｌｉｃｙｌｉｄｅｎｅ）−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ、Ｃａｔｅｃｈｏｌ　Ｖｉｏｌｅｔ、Ｃｈｉｏｒａｎｉｌｉｃ　ａｃｉｄ、Ｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ、Ｃｏｎｉｆｅｒｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ、ｏ−Ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ、ｏ−Ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅ、ｏ−Ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅ，　ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ、ｍ−ＣｒｅｓｏｌＰｕｒｐｌｅ、ｏ−Ｃｒｅｓｏｌ　Ｒｅｄ、Ｄｅｘｙｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ、Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、３，５−Ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ　ａｉｃｏｈｏｌ、２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、２，６−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ、１，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ、１，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ、１，８−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ、２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｉｄｅｈｙｄｅ、２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ、４，４’−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ、２，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ、２，２’−Ｄｉｈｄｒｏｘｙｂｉｐｈｅｎｙｌ、４，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｉｐｈｅｎｙｌ、２，２−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ、４，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ、４’，７−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ、４’，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ、１，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ、１，６−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ、２，７−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ、３，５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ、２，２’−Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓ（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）、Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ　ａｃｉｄ、Ｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ、（Ｒ）−（−）−２−Ｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｌ、（±）−２−Ｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｌ、Ｍｅｔｈｙｌ　２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ、９−Ｍｅｔｈｙｌ−２，３，７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｆｌｕｏｒｏｎｅ　ｓｕｌｐｈａｔｅ、２−Ｎｉｔｒｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉｏｌ、Ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ　ａｃｉｄ、Ｐａｍｏｉｃ　ａｃｉｄ、Ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ、１Ｈ’１Ｈ’１２Ｈ，１２Ｈ−Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ−１，１２−ｄｏｄｅｃａｎｅｄｉｏｌ、Ｐｈｅｎｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ、Ｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄ、Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ、２，６−Ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｍｅｔｈａｎｏｌ、Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ、Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ　Ｒｅｄ、９−Ｐｈｅｎｙｌ−２，３，７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｆｌｕｏｒｏｎｅ、Ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ、Ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｄｅ、Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ　Ｒｅｄ、（＋）−Ｒｕｔｉｎ　ｔｒｉｈｙｄｒａｔｅ、Ｓａｌｉｃｙｌａｌｄｅｈｙｄｅ　ａｚｉｎｅ、Ｓａｌｉｃｙｌｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ　ａｃｉｄ、Ｓａｌｉｃｙｌｌｄｅｎｅ　ｓａｌｉｃｙｌｈｙｄｒａｚｉｄｅ、Ｔｅｔｒａｂｒｏｍｏｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ、Ｔｅｔｒａｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ、２，２’，４，４’−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ、Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−ｐ−ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ　ｄｉｈｙｄｒａｔｅ、３，３’５，５’−Ｔｅｔｒａｉｏｄｏｐｈｅｎｏｌｓｕｌｐｈｏｎｅｐｈｔｈａｌｅｉｎ、４，４’−Ｔｈｉｏｄｉｐｈｅｎｏｌ、Ｔｈｙｍｏｌ　Ｂｌｕｅ、Ｔｈｙｍｏｌ　Ｂｌｕｅ，　ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ、Ｔｈｙｍｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ、Ｔｈｙｍｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ　ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｈｙｄｒａｔｅ、Ｔｈｙｍｏｌｐｈｔｈａｌｅｘｏｎｅ、１，８，９−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ、２，４，５−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ、Ｘａｎｔｈｕｒｅｎｉｃ　ａｃｉｄ、１，２，４−Ｔｒｉｈｙ���ｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ、ｐ−Ｘｙｌｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ（以上ランカスター社のカタログ参照）なども基本骨格の候補として挙げられる。なお、前記基本骨格における１箇所以上の炭素間の単結合を酸化し二重結合にしたものを、基本骨格としてもよい。更に基本骨格の炭素原子の１つ又は２つ以上を酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、イオウ（Ｓ）等と置換してもよい。また、公知の天然の配糖体化合物より加水分解等により糖鎖を切断したものも本発明の基本骨格に含まれる。但し、本発明の基本骨格は前記のものに限定されるわけではない。
【００２４】
前記の基本骨格に存在する１つ又は２つ以上の水酸基若しくはアミノ基に、以下にリストアップした糖鎖が、１つ又は２つ以上グリコシド結合したものが、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物に含まれる。もちろん、これらの糖鎖には、ピラノース（Ｐｙｒａｎｏｓｅ）やフラノース（Ｆｒａｎｏｓｅ）即ち、安定な環状構造を呈したものも含まれる。次に、具体的な糖鎖の例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
糖鎖部分（Ｄ−，　Ｌ−）
グルコース　　　Ｇｌｃ　　　グロース　　　　Ｇｕｌ　　　リボース　　　　Ｒｉｂ
マンノース　　　Ｍａｎ　　　イドース　　　　Ｉｄｏ　　　アラビノース　　Ａｒｂ
ガラクトース　　Ｇａｌ　　　アロース　　　　Ａｌｌ
タロース　　　　Ｔａｌ　　　アルトロース　　Ａｌｔ
フラクトース　　Ｆｒｃ　　　キシロース　　　Ｘｙｌ
及び、これらのデオキシ体、酸素官能基を炭素（Ｃ）窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）テルル（Ｔｅ）を用いて置換したもの。
以下にその例を示す。
アミノヘキソースおよびその誘導体
Ｎ−アセチルガラクトサミン　ＧａｌＮａｃ
Ｎ−アセチルグルコサミン　　ＧｌｃＮａｃ
デオキシヘキソース
フコース
ラムノース
２−デオキシグルコース
シアル酸
Ｎ−アセチルノイラミン酸　　　　ＮｅｕＡｃ
Ｎ−グルコリルノイラミン酸　　　Ｎｅｕ５Ｇｃ
デアミノノイラミン酸　　　　　　ＫＤＮ
【００２５】
なお先に示したヘキソース若しくはヘキソースの１−３，１−６結合したオリゴ糖を糖鎖部位とするが、それ以外の希少型オリゴ糖や単糖の例として以下のようなものがある。
オリゴ糖
Ｋｏｊｉｂｉｏｓｅ　　　　コージビオース　　　　　Ｇｌｃ（α１−２）Ｇｌｃ
Ｎｉｇｅｒｏｓｅ　　　　ニゲロース　　　　　　　Ｇｌｃ（α１−３）Ｇｌｃ
Ｍａｌｔｏｓｅ　　　　　マルトース　　　　　　　Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ
Ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ　　　イソマルトース　　　　　Ｇｌｃ（α１−６）Ｇｌｃ
Ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ　　　　ソホロース　　　　　　　Ｇｌｃ（β１−２）Ｇｌｃ
Ｌａｍｉｎａｒｉｂｉｏｓｅ　　ラミナリビオース　　　　Ｇｌｃ（β１−３）Ｇｌｃ
Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ　　　セロピオース　　　　　　Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ
Ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ　　　ゲンチオビオース　　　　Ｇｌｃ（β１−６）Ｇｌｃ
Ｌａｃｔｏｓｅ　　　　　ラクトース　　　　　　　Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ
Ｓｕｃｒｏｓｅ　　　　　スクロース
Ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ　　　サッカロース　　　　　　　Ｆｒｕｆ（β２−１α）Ｇｌｃ
Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ　　　　メリビオース　　　　　　　Ｇａｌ（α１−６）Ｇｌｃ
Ｒｕｔｉｎｏｓｅ　　　　ルチノース　　　　　　　Ｌｒｈａ（α１−６）Ｇｌｃ
Ｐｒｉｍｅｖｅｒｏｓｅ　　　プリメベロース　　　　　　Ｘｙｌ　（β１−６）Ｇｌｃ
Ｔｕｒａｎｏｓｅ　　　　ツラノース　　　　　　　Ｇｌｃ（α１−３）Ｆｒｕｆ
Ｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ　　　マルトトリオース　　　　Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ
Ｉｓｏｍａｌｔｏｔｒｉｏｓｅ　イソマルトトリオース　　Ｇｌｃ（α１−６）Ｇｌｃ（α１−６）Ｇｌｃ
Ｐａｎｏｓｅ　　　　　パノース　　　　　　　　Ｇｌｃ（α１−６）Ｇｌｃ（α１−４）Ｇｌｃ
Ｉｓｏｐａｎｏｓｅ　　　　イソパノース　　　　　　Ｇｌｃ（α１−４）［Ｇｌｃ（α１−６）］Ｇｌｃ
Ｃｅｌｌｏｔｒｉｏｓｅ　　　セロトリオース　　　　　Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−４）Ｇｌｃ
Ｍａｎｎｉｎｏｔｒｉｏｓｅ　　マンニノトリオース　　　Ｇａｌ（α１−６）Ｇａｌ（α１−６）Ｇｌｃ
Ｓｏｌａｔｒｉｏｓｅ　　　ソラトリオース　　　　　Ｌｒｈａ　（α１−２）［Ｇｌｃ（β１−３）］Ｇａｌ
ペントース　２，３，４，５−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｅｎｔａｎａｌ
Ｒｉｂｏｓｅ　リボース　ｒｉｂｏ−ｐｅｎｔｏｓｅ　ｒｉｂｏ−ペントース
Ａｒａｂｉｎｏｓｅ　アラビノース　ａｒａｂｉｎｏ−ｐｅｎｔｏｓｅ　ａｒａｂｉｎｏ−ペントース
Ｘｙｌｏｓｅ　キシロース　ｘｙｌｏ−ｐｅｎｔｏｓｅ　　ｘｙｌｏ−ペントース
Ｌｙｘｏｓｅ　リキソース　ｌｙｘｏ−ｐｅｎｔｏｓｅ　　ｌｙｘｏ−ペントース
ヘキソース　２，３，４，５，６−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎａｌ
Ａｌｌｏｓｅ　アロース　ａｌｌｏ−ｈｅｘｏｓｅ　　ａｌｌｏ−ヘキソース
Ａｌｔｒｏｓｅ　アルトロース　ａｌｔｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ　　ａｌｔｒｏ−ヘキソース
Ｇｌｕｃｏｓｅ　グルコース　ｇｌｕｃｏ−ｈｅｘｏｓｅ　　ｇｌｕｃｏ−ヘキソース
Ｍａｎｎｏｓｅ　マンノース　ｍａｎｎｏ−ｈｅｘｏｓｅ　　ｍａｎｎｏ−ヘキソース
Ｇｕｌｏｓｅ　グロース　ｇｕｌｏ−ｈｅｘｏｓｅ　　ｇｕｌｏ−ヘキソース
Ｉｄｏｓｅ　イドース　ｉｄｏ−ｈｅｘｏｓｅ　　ｉｄｏ−ヘキソース
Ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ガラクトース　ｇａｌａｃｔｏ−ｈｅｘｏｓｅ　ｇａｌａｃｔｏ−ヘキソース
Ｔａｌｏｓｅ　タロース　ｔａｌｏ−ｈｅｘｏｓｅ　ｔａｌｏ−ヘキソース
テトルロース　１，３，４−Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎ−２−ｏｎｅ
Ｅｒｙｔｈｒｕｌｏｓｅ　エリトルロース　ｇｌｙｃｅｒｏ−ｔｅｔｒｕｌｏｓｅ　　ｇｌｙｃｅｒｏ−テトルロース
２−ペンツロース　１，３，４，５−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｅｎｔａｎ−２−ｏｎｅ
Ｒｉｂｕｌｏｓｅ　リブロース　ｅｒｙｔｈｒｏ−ｐｅｎｔ−２−ｕｌｏｓｅ　ｅｒｙｔｈｒｏ−ペント−２−ウロース
Ｘｙｌｕｏｓｅ　キシルロース　ｔｈｒｅｏ−ｐｅｎｔ−２−ｕｌｏｓｅ　　ｔｈｒｅｏ−ペント−２−ウロース
２−ヘキスロース　１，３，４，５，６−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎ−２−ｏｎｅ
Ｐｓｉｃｏｓｅ　プシコース　ｒｉｂｏ−ｈｅｘ−２−ｕｌｏｓｅ　　ｒｉｂｏ−ヘキソ−２−ウロース
Ｆｒｕｃｔｏｓｅ　フルクトース　ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘ−２−ｕｌｏｓｅ　ａｒａｂｉｎｏ−ヘキソ−２−ウロース
Ｓｏｒｂｏｓｅ　ソルボース　ｘｙｌｏ−ｈｅｘ−２−ｕｌｏｓｅ　　ｘｙｌｏ−ヘキソ−２−ウロース
Ｔａｇａｔｏｓｅ　タガトース　ｌｙｘｏ−ｈｅｘ−２−ｕｌｏｓｅ　　ｌｙｘｏ−ヘキソ−２−ウロース
２−ヘプツロース　１，３，４，５，６，７−Ｈｅｘａｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔａｎ−２−ｏｎｅ
Ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅ　セドヘプツロース　Ｄ−ａｌｔｒｏ−ｈｅｐｔ−２−ｕｌｏｓｅ　　Ｄ−ａｌｔｒｏ−ヘプト−２−ウロース
【００２６】
デオキシ糖
Ｑｕｉｎｏｖｏｓｅ　キノボース　６−ｄｅｏｘｇｌｕｃｏｓｅ　６−デオキシグルコース
Ｒｈａｍｎｏｓｅ　ラムノース　６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ　６−デオキシマンノース
Ｆｕｃｏｓｅ　フコース　６−ｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ　６−デオキシガラクトース
Ｄｉｇｉｔｏｘｏｓｅ　ジギトキソース　２，６−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｒｉｂｏ−ｈｅｘｏｓｅ　２，６−ジデオキシ−Ｄ−ｒｉｂｏヘキソース
Ａｂｅｑｕｏｓｅ　アベクオース　３，６−ｄｉｄｅｏｓｙ−Ｄ−ｘｙｌｏ−ｈｅｘｏｓｅ　３，６−ジデオキシ−Ｄ−ｘｙｌｏ−ヘキソース
Ｔｙｖｅｌｏｓｅ　チベロース　３，６−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｏｓｅ　３，６−ジデオキシ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ヘキソース
２−Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ　デオキシリボース　２−ｄｅｏｘｙ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｐｅｎｔｏｓｅ　２−デオキシ−　ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントース
２−Ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ　２−デオキシグルコース　２−ｄｅｏｘｙ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｏｓｅ　２−デオキシ−ａｒａｂｉｎｏ−ヘキソース
アミノ糖
Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ　グルコサミン　２−ａｍｉｎｏ−２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ
２−アミノ−２−デオキシグルコース
Ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ　マンノサミン　２−ａｍｉｎｏ−２−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ
２−アミノ−２−デオキシマンノース
Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ　ガラクトサミン　２−ａｍｉｎｏ−２−ｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ
２−アミノ−２−デオキシガラクトース
Ｆｕｃｏｓａｍｉｎｅ　フコサミン　２−ａｍｉｎｏ−２，６−ｄｉｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ
２−アミノ−２，６−ジデオキシガラクトース
Ｑｕｉｎｏｖｏｓａｍｉｎｅ　キノボサミン　２−ａｍｉｎｏ−２，６−ｄｉｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ
２−アミノ−２，６−ジデオキシグルコース
Ｒｈａｍｎｏｓａｍｉｎｅ　ラムノサミン　２−ａｍｉｎｏ−２，６−ｄｉｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ
２−アミノ−２，６−ジデオキシマンノース
Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ　ａｃｉｄ　ノイラミン酸　５−ａｍｉｎｏ−３，５−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−ｎｏｒ−２−ｕｌｏｓｏｎｉｃ　ａｃｉｄ
５−アミノ−３，５−ジデオキシ−Ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏ−ノル−２−ウロソン酸
Ｍｕｒａｍｉｃ　ａｃｉｄ　ムラミン酸　２−ａｍｉｎｏ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ
２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−Ｄ−グルコース
Ｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ　ノジリマイシン　５−ａｍｉｎｏ−５−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ
５−アミノ−５−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース
分岐糖
Ａｐｉｏｓｅ　アピオース　３−Ｃ−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ｇｌｙｃｅｒｏ−ｔｅｔｒｏｓｅ
３−Ｃ−（ヒドロキシメチル）−ｇｌｙｃｅｒｏ−テトロース
Ｓｔｒｅｐｔｏｓｅ　ストレプトース　５−ｄｅｏｘｙ−３−Ｃ−ｆｏｒｍｙｌ−Ｄ−ｌｙｘｏｓｅ
５−デオキシ−３−Ｃ−ホルミル−Ｄ−リキソース
Ｅｖａｌｏｓｅ　エバロース　６−ｄｅｏｘｙ−３−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ
６−デオキシ−３−Ｃ−メチル−Ｄ−マンノース
Ｈａｍａｍｅｌｏｓｅ　ハマメロース　２−Ｃ−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ
２−Ｃ−（ヒドロキシメチル）−Ｄ−リボース
【００２７】
更に、糖鎖部分として上記のものに加えて、ケトース、アルドース、ポリオール、Ｄ−アロース、Ｄ−プシコースなどの希少糖も含まれる。また、サイコサポニン類（サイコサポニンａ，ｂ１，ｂ２，ｂ３，ｂ４，ｃ、ｄ、ｆ）、大豆サポニン類（大豆サポニンＩ，ＩＩ，ＩＩＩ，Ａ１，Ａ２）、アジアティコサイド、マデカソサイド又はキンセノサイドなどの天然の配糖体化合物も本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物に含まれる。なお、前記した配糖体化合物の中でも糖鎖が１つのみ酸素原子に結合している化合物の場合、当該糖鎖が単独で細胞膜上の糖蛋白又は糖脂質の糖鎖と結合するか、若しくはそれに加えて当該糖鎖以外の位置に存在する水酸基が細胞膜上の糖蛋白又は糖脂質の糖鎖と結合すると考えられる。また、糖鎖を１つのみ有する配糖体化合物が２量体若しくは多量体を形成した上で、細胞膜上の糖蛋白又は糖脂質の糖鎖と結合してもよい。
但し、前記した配糖体化合物のうち公知の用途を有するものは当該用途に限定して本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物からは除く。たとえば、ダマラン骨格に糖鎖が結合した化合物のうちジンセノサイド類の公知の用途、効果、効能、使用方法については本発明から除く。言い換えれば、本発明は、新規又は公知の配糖体化合物又はその塩、及び、要すれば担体からなる有用組成物の新規用途、効果、効能又は使用方法に関するものである。より詳細には、本発明は前記したスクリーニング方法により得られる。新規ジンセノサイドＲｂ１様物質（化合物）の用途、効果、効能又は使用方法、若しくは公知のジンセノサイドＲｂ１様物質（たとえば配糖体化合物）の新規用途、効果、効能又は使用方法に関するものである。
【００２８】
また、一般的なグリコシル化反応の例としては、下式で示すごとくベンジル基、イソプロピリデン基、アシル基等で水酸基を保護し、アノメリック位水酸基をハロゲン、アシル基、又はスルホニル基等に変換された糖誘導体と、触媒存在下（主に銀トリフルオラートや塩化ハフニウムなどのルイス酸）又は無触媒で水酸基を有する基本骨格と反応させたのちに、脱保護を行うことが挙げられる。反応中にアノメリック位水酸基を活性化する試薬を用いる場合は、アノメリック位は水酸基のままでよい。下式の●は基本骨格を示す。なお、図１−図６に示した基本骨格は公知の方法により合成可能か、若しくは天然物より分離した配糖体化合物より作製可能である。
【化５】
2004077456.tif 000004
【００２９】
本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物［例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体等］としては、当該ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物若しくはその代謝産物又はそれらの塩を低濃度で含有してなるものが好ましい。また、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物は、特許文献１並びに特許文献２において開示されたジンセノサイドＲｂ１と同様に静脈内投与、皮膚外用投与又は粘膜外用投与などの非経口投与形態のものが好ましい。より詳細には、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物は、当該ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物若しくはその代謝産物又はそれらの塩を低濃度で含有してなる非経口投与製剤として利用することが好ましい。
また、本発明は、前記したジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物若しくはその代謝産物又はそれらの塩を好ましくは低濃度で含有してなる脳神経疾患若しくは細胞死を伴う疾患の予防、処置又は治療用の非経口投与製剤、好ましくはジンセノサイドＲｂ１の場合と同様の静脈内投与用製剤、皮膚外用製剤、皮膚外用剤、粘膜外用製剤、粘膜外用剤に関する。
これらの本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を医薬組成物として利用するときは、静脈内投与用製剤、皮膚外用製剤、粘膜外用製剤に添加することが好ましいが病変部局所外用剤、病変部局所注射剤、経口投与製剤、点鼻薬、点眼薬、眼軟膏、点耳薬、坐薬（膣坐薬を含む）、皮下注射薬、皮内注射薬、筋肉注射薬、吸入薬、舌下薬、経皮吸収薬等、任意の又は公知の投与経路若しくは剤形を選択してもよい。
また、本発明は特許文献１並びに特許文献２において開示されたジンセノサイドＲｂ１と同様に、前記の静脈内投与用製剤又は病変部局所外用製剤などからなる脳・神経疾患の長期にわたる治療、予防、若しくは処置剤、又は脳細胞若しくは神経細胞保護剤に関する。
また、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の化学構造の一部を修飾してプロドラッグを作製したのちに、任意の又は公知の投与経路を選択することも可能である。
【００３０】
本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体は遊離のものを使用することもできるが、それを適当な塩と使用することもできる。また、それらの水和物のような溶媒和物として使用することもできる。
本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の濃度は、特許文献７に記載のジンセノサイド類誘導体と同様に低濃度が好ましく、より具体的には患部組織における、細胞外液濃度が１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは１００ｆｇ／ｍｌ以下となる濃度である。本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を、特許文献４及び特許文献９に記載のジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１と同様に静脈内投与用製剤、皮膚外用製剤若しくは粘膜外用製剤の組成物として使用する場合にも、患者の患部組織における細胞外液濃度が前記の濃度になるように製剤を調整することが好ましい。本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物は、患部組織の細胞外液濃度が０．０００１〜１００ｆｇ／ｍｌ程度でも充分な効果が得られる。
【００３１】
本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物若しくはその塩及び静脈内投与用担体を含んでなる静脈内投与用製剤は、特許文献４及び特許文献９に記載のジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１と同様に血管内、好ましくは静脈に直接投与できるものであればよい。本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体は、生理食塩水、蒸留水、リン酸緩衝液、ブドウ糖液、リポソーム、脂肪乳剤等、生物学的若しくは薬学的に許容される公知の担体に溶解したのちに、単回静脈内注入用製剤若しくは静脈内持続投与用製剤として使用できる。また、点滴用組成物などの静脈内投与製剤に添加して使用できる剤型であってもよい。また、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の化学構造の一部を修飾してプロドラッグを作成し、任意の又は公知の投与経路、投与方法を選択することができる。例えば、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の水酸基をエステル化してプロドラッグを作成し、血液脳関門を通過せしめたのち、内因性エステラーゼで加水分解して脳内へのジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の移行量を増やすことも可能となる。
【００３２】
本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体は、特許文献１、特許文献２、特許文献３及び特許文献９において記載されたジンセノサイドＲｂ１並びにジヒドロジンセノサイドＲｂ１と同様に、静脈内投与で脳梗塞病巣体積を顕著に縮小させると考えられるので、急性期・慢性期の脳梗塞（脳血栓・脳塞栓）のみならず脳出血・クモ膜下出血の急性期や慢性期あるいは一過性脳虚血発作に対しても、神経保護剤として利用することができるとされる。即ち本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物（含担体）は脳卒中が疑われる患者に対して救急車の中でも点滴静注が可能な医薬組成物と考えられる。また、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を血栓溶解療法を実施する前の脳梗塞患者に投与することにより患者の予後が改善する。もちろん、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物は、特許文献９に記載のジヒドロジンセノサイドＲｂ１と同様に血流障害をきたす疾患・病態の予防、処置又は治療に有用とされる。
【００３３】
本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体は、特許文献１、特許文献２、特許文献３及び特許文献９に記載されたジンセノサイドＲｂ１やジヒドロジンセノサイドＲｂ１と同様に、虚血巣周辺部（ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｐｅｎｕｍｂｒａ）におけるアポトーシス様神経細胞死を抑止し、加えてグリア細胞、血管内皮細胞を始めとするあらゆる細胞のアポトーシス若しくはアポトーシス様細胞死を抑止すると考えられる。即ち、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物は、ジンセノサイドＲｂ１やジヒドロジンセノサイドＲｂ１とほぼ同様の薬理作用を有すると言える。より具体的には、特許文献１、特許文献２、特許文献４、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、若しくは特許文献１１において本発明者ら（阪中、田中、橋本、宇野、倉本）が見出したジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１若しくはその代謝産物の効果・効能・用途・作用はすべて本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物若しくはその代謝産物又はそれらの塩が兼ね備えているものと考えられる。更に具体的には、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物若しくはその代謝産物又はそれらの塩が、細胞のアポトーシス又はアポトーシス様細胞死をきたす疾患の予防、処置、若しくは治療のための医薬組成物、脳・神経疾患の予防、処置若しくは治療のための医薬組成物、静脈内投与用医薬組成物、神経外傷（頭部外傷・脊髄損傷を含む）の予防、処置若しくは治療のための医薬組成物、病理組織学的変化をきたす器質的疾患の予防、処置又は治療のための医薬組成物、創傷の予防、処置又は治療のための医薬組成物、血流障害をきたす疾患の予防、処置又は治療のための医薬組成物、皮膚・粘膜疾患の予防、処置又は治療のための局所投与用医薬組成物、化粧品組成物、発毛育毛用組成物、ケミカルピーリング剤組成物、皮膚外用剤組成物、フィジカルピーリング剤組成物、粘膜外用剤組成物、動物成長調整用組成物、植物成長調整用組成物、肥料組成物、飼料組成物、細胞又は組織の冷凍又は凍結のための添加剤組成物、細胞又は組織を冷凍保存又は凍結保存するための添加剤組成物、腫瘍細胞又は不死化細胞を冷凍又は凍結することにより傷害させるための添加剤組成物、若しくは悪性腫瘍（悪性新生物）の予防、処置又は治療のための医薬組成物として利用されると考えられる。本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を皮膚外用製剤、皮膚外用剤、粘膜外用製剤、粘膜外用剤、化粧品、発毛育毛剤、フィジカルピーリング剤、ケミカルピーリング剤、成長調整剤、肥料、飼料、細胞又は組織の凍結のための添加剤の組成物として使用するときの濃度は、組成物全体の１−５重量％以下、好ましくは０．１−０．０１重量％以下又は未満、より好ましくは０．００１重量％以下又は未満、更に好ましくは０．００００１重量％以下又は未満、１０−１５重量％以上である。
【００３４】
本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体を医薬組成物として利用するときの全身投与量は、特許文献９に記載のジンセノサイド類誘導体と同様に体重６０ｋｇの患者１日当たり０．００１ｍｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、更に好ましくは１０ｍｇ以上である。しかし血液脳関門の破綻の程度が軽微な脳神経疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ポリグルタミン病を始めとする神経変性疾患、脱髄疾患、神経外傷、一過性脳虚血発作、脊髄損傷、頭部外傷）に本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を投与するときは、前述の投与量と同量若しくはそれより５〜１０倍程度用量を増やすことが必要になると考えられる。また、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を脳神経疾患以外の疾病又は病態の予防・治療・処置に使用する時は、前述の投与量と同等若しくはその１／１０から１／１０００００程度の投与量を選択することが好ましい。本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を医薬組成物として利用するときの全身投与量の上限は１日当たり３０ｇ以下、好ましくは１０ｇ以下、より好ましくは１ｇ以下、更に好ましくは０．１ｇ以下である。本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を医薬組成物として利用するときの全身投与量の下限は、特許文献９に記載のジンセノサイド類誘導体と同様に１日当たり１ｆｇと考えられる。本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を医薬組成物として、例えば皮膚外用製剤や粘膜外用製剤に添加して病変部局所に投与する時は、投与量の上限が１日当たり１００ｍｇ、下限が０．１ｆｇ程度と考えられる。しかし、実際には特許文献９に記載のジンセノサイド類誘導体と同様に患部組織の細胞外液濃度（０．０００１ｆｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）を目安にしながら、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の投与量を適宜調整することが好ましい。
【００３５】
本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体又はその塩を医薬組成物として利用して全身投与する方法としては、血管内投与特に静脈内投与が好ましく、前記した投与量を断続的又は連続的に投与することができる。本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物は、通常の方法により製剤化することができる。例えば、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物は、凍結乾燥結晶を生理食塩水、蒸留水、リン酸緩衝液、ブドウ糖液等の生物学的に又は製薬上許容される公知の担体に溶解することにより静脈内投与用製剤又は静脈内投与用医薬組成物とすることができる。脂肪乳剤、リポソーム製剤としても使用可能である。静脈内投与するときの製剤中の医薬組成物の濃度としてはあまり高濃度でない限り任意の濃度に調整することができ、例えば０．０００１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｍｌ程度にして投与することができる。
【００３６】
次に細胞膜表面に存在する糖脂質又は糖蛋白の糖鎖との結合を測定、推定又は解析することからなる、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をスクリーニングする本発明の方法、並びに本発明の方法により選出されるジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体について、具体例に基づいて詳細に説明する。より具体的には、細胞膜表面に存在する糖脂質又は糖蛋白の糖鎖との水素結合を測定、推定又は解析することからなる、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、特には糖鎖を有するジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をスクリーニングする方法について説明する。このため、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１を用いた、ヒト皮膚ケラチノサイトやＨＥＫ２９３細胞の凍結融解実験についてまず記述し、その後ノイラミニダーゼにより糖鎖を切断された培養神経細胞に対するジンセノサイドＲｂ１の効果をしらべた実験について述べることとする。その際に、本発明の前記したジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の凍結非腫瘍細胞保存効果、凍結腫瘍細胞傷害効果についても言及する。更に、これらの実験結果より、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１が細胞膜表面に存在する糖脂質又は糖蛋白の糖鎖と水素結合することにより糖鎖を架橋し、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献８、特許文献９、特許文献１０及び特許文献１１に記載されたごとく多彩な効果、効能、用途、作用を示すことを明らかにする。最後に、これらの新規な知見を踏まえて、細胞膜表面に存在する糖脂質又は糖蛋白の糖鎖との結合を測定、推定又は解析することからなる、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をスクリーニングする方法に言及すると共に、同方法により創製又は選出されるユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）の熱傷治療効果について実験結果を提示することにより、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物について再度記述することとする。
【００３７】
そこで、本発明者らは、まずフリーの若しくは浮遊している培養皮膚ケラチノサイトの凍結融解実験を実施した。
【００３８】
−１５０℃で保存している４継代目のヒト由来ケラチノサイトを融解若しくは解凍した上で播種し、３７℃で２４時間培養後、生着細胞数をカウントした。なお、生着細胞とは培養皮膚シートを形成する生存細胞を意味する。同細胞（即ちヒト由来ケラチノサイト）を凍結細胞保存液（７０％ＤＭＥＭ、１０％ＤＭＳＯ、２０％ＦＣＳ）とともに５０万個／ｍｌの密度でクリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）に分注し、ジンセノサイドＲｂ１を０，１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ（各群ｎ＝３）の濃度で添加した。その後、同細胞を−８０℃の条件下で２４時間凍結後、−１５０℃で更に４８時間保存した。再度同細胞を融解若しくは解凍した上で播種し、３７℃で２４時間培養後、生着細胞数をコールターカウンター（ｃｏｕｌｔｅｒ　ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて計測した。なお、ケラチノサイトの培養方法並びに凍結手技は愛媛大学医学部皮膚科学講座にて通常実施している公知のものである（組織培養の技術第三版、日本組織培養学会編、編集代表、丹羽　章、朝倉書店、ｐｐ１５１−１５５、１９９６）。
結果を図７に示す。
【００３９】
図７の横軸はジンセノサイドＲｂ１の濃度を、縦軸は凍結解凍後の生着細胞数を示す。図７の左端のカラムに示すごとく、ジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておかなければ培養皮膚ケラチノサイトの生着細胞数は１回の凍結解凍操作により５０万個／ｍｌから約４１．５万個／ｍｌに減少した。しかし、図７の左から２番目、３番目、４番目のカラムに示すごとく、ジンセノサイドＲｂ１を１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作による生着細胞数の減少が有意に抑止された。特に１０ｐｇ／ｍｌの濃度でジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと１回の凍結解凍操作後でも、培養皮膚ケラチノサイトの生着細胞数はほとんど減少せず、およそ４９．５万個／ｍｌの皮膚ケラチノサイトが生着した。このことは、凍結解凍を４回くり返しても、至適濃度のジンセノサイドＲｂ１を培養液又は凍結細胞保存液（例えばセルバンカー）に添加しておけば、生着細胞数の減少がほとんど起こらず約４８万個／ｍｌの生着細胞が維持できることを物語っている。一方、ジンセノサイドＲｂ１を培養液又は凍結細胞保存液に添加しておかなければ凍結解凍若しくは凍結融解という操作を４回くり返しただけで、生着細胞が約２３万個／ｍｌに減少することになる。即ち、ジンセノサイドＲｂ１は本発明において、思いもかけず、極めて優れた凍結ケラチノサイト保存用組成物となることが見出されたことになる。また、ジンセノサイドＲｂ１は１０ｎｇ／ｍｌという高濃度では抗アポトーシス作用を示さないことが、特許文献１及び特許文献２において開示されているが、このように高濃度のジンセノサイドＲｂ１でも凍結細胞保存用組成物としては使用可能であることを本発明は明らかにしている。即ち、ジンセノサイドＲｂ１は抗アポトーシス作用とは異なるメカニズムで凍結細胞保存効果を発揮すると言える。＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊はＰ＜０．００１を示す。統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｓｃｈｅｆｆｅのｐｏｓｔ　ｈｏｃ　ｔｅｓｔによる。
【００４０】
図７の生着細胞数をもとに、皮膚ケラチノサイトの生着率を計算した結果を図８に示す。図８の横軸はジンセノサイドＲｂ１の濃度を、縦軸は凍結解凍後の生着率を示す。生着率は生着細胞数／５０万×１００（％）という計算式により算出した。図８の左端のカラムに示すごとく、ジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておかなければ培養皮膚ケラチノサイトの生着率は１回の凍結解凍操作により８２．５％程度に減少した。しかし、図８の左から２番目、３番目、４番目のカラムに示すごとく、ジンセノサイドＲｂ１をそれぞれ１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作による生着率が平均９０％以上となり有意に改善した。特に１０ｐｇ／ｍｌの濃度でジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作後でも、培養皮膚ケラチノサイトの生着率は平均９９％という高値を示した。このことは、凍結解凍を４回くり返しても、至適濃度のジンセノサイドＲｂ１を培養液又は凍結細胞保存液（例えばセルバンカー）に添加しておけば、生着率の低下がほとんど起こらず、およそ９６％程度の生着率を維持できることを物語っている。一方、ジンセノサイドＲｂ１を培養液又は凍結細胞保存液に添加しておかなければ凍結解凍若しくは凍結融解という操作を４回くり返しただけで、生着率が４６．２％程度に減少することになる。＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊はＰ＜０．００１を示す。統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｓｃｈｅｆｆｅのｐｏｓｔ　ｈｏｃ　ｔｅｓｔによる。
【００４１】
以上のことより、ジンセノサイドＲｂ１又はその塩は、皮膚ケラチノサイトを始めとする細胞の細胞外液濃度が１ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以下又は１０ｎｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは０．００００１ｆｇ／ｍｌ〜１０ｐｇ／ｍｌのときに、凍結非生殖細胞又は凍結非腫瘍細胞の保存用組成物として利用されると言える。
【００４２】
次に本発明者らはジンセノサイドＲｂ１の凍結細胞保存効果を電子顕微鏡でしらべた。−１５０℃で保存している４継代目のヒト由来ケラチノサイトを融解若しくは解凍した上で播種し、３７℃で２４時間培養後、生着細胞数をカウントした。同細胞（即ちヒト由来ケラチノサイト）を凍結細胞保存液（７０％ＤＭＥＭ，１０％ＤＭＳＯ，２０％ＦＣＳ）とともに５０万個／ｍｌの密度でｃｒｙｏｔｕｂｅ（クリオチューブ）に分注し、ジンセノサイドＲｂ１を０又は１０ｐｇ／ｍｌの濃度で添加した。その後、同細胞を−８０℃の条件下で２４時間凍結後、−１５０℃で更に４８時間保存した。再度同細胞を融解若しくは解凍した直後に、パラホルムアルデヒド−グルタルアルデヒド含有リン酸緩衝液で同細胞を固定し、エポンに包埋した。エポン包埋されたヒト皮膚ケラチノサイトの超薄切片を作製し、電子顕微鏡で観察した。結果を図９に示す。
【００４３】
図９の左側（Ａ）はジンセノサイドＲｂ１未処置細胞であり、図９の右側（Ｂ）はジンセノサイドＲｂ１（１０ｐｇ／ｍｌ）処置細胞である。ジンセノサイドＲｂ１を添加しなかった場合、凍結融解操作により多くのヒト皮膚ケラチノサイトが死滅し、生存しているヒト皮膚ケラチノサイトも図９の左側に示すごとく細胞膜が部分的に膨化していた。おそらく、このように部分的に膨化した皮膚ケラチノサイトの細胞膜も近い将来に破裂し、皮膚ケラチノサイトを死に至らしむると考えられる。一方、ジンセノサイドＲｂ１（１０ｐｇ／ｍｌ）添加後に凍結融解されたヒト皮膚ケラチノサイトでは、図９の右側に示すごとく、細胞膜の部分的な膨化はあまり見られず、多くの細胞が円型若しくは球型の安定した形状を維持して生存していた。
【００４４】
これらの電子顕微鏡所見より、ジンセノサイドＲｂ１はヒト皮膚ケラチノサイトの細胞膜に局在する特定の標的分子に作用するというよりも、むしろ細胞膜上に幅広くほぼ均一に分布する分子群又は構成要素に作用するものと考えられた。
【００４５】
次に本発明者は、特許文献９に記載のジンセノサイド類誘導体の１つであるジヒドロジンセノサイドＲｂ１が凍結細胞保存に有用かどうか調べた。このため、皮膚ケラチノサイトを用いた実験を以下のごとく実施した。
【００４６】
−１５０℃で保存している４継代目のヒト由来皮膚ケラチノサイトを融解若しくは解凍した上で播種し、３７℃で２４時間培養後、生着細胞数をカウントした。同細胞（即ちヒト由来ケラチノサイト）を５０万個／ｍｌの密度でｃｒｙｏｔｕｂｅに分注し、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を０，１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ（各群ｎ＝３）の濃度で凍結細胞保存液（７０％ＤＭＥＭ，１０％ＤＭＳＯ，２０％ＦＣＳ）に添加した。その後、同細胞を−８０℃の条件下で２４時間凍結後、−１５０℃で更に４８時間保存した。再度同細胞を融解若しくは解凍した上で播種し、３７℃で２４時間培養後、生着細胞数をｃｏｕｌｔｅｒ　ｃｏｕｎｔｅｒを用いて計測した。なお、ヒト皮膚ケラチノサイトの培養方法は愛媛大学医学部皮膚科学講座にて通常実施している公知のものである（組織培養の技術第三版、日本組織培養学会編、編集代表、丹羽　章、朝倉書店、ｐｐ１５１−１５５、１９９６）。
結果を図１０に示す。
【００４７】
図１０の横軸はジヒドロジンセノサイドＲｂ１の濃度を、縦軸は凍結解凍後の生着細胞数を示す。図１０の左端のカラムに示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておかなければ培養皮膚ケラチノサイトの生着細胞数は１回の凍結解凍操作により５０万個／ｍｌから約４２．４万個／ｍｌに減少した。しかし、図１０の左から２番目、３番目、４番目のカラムに示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作による生着細胞数の減少が明らかに抑止された。特に、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でジヒドロジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと１回の凍結解凍操作後でも、培養皮膚ケラチノサイトの生着細胞数はほとんど減少せず、およそ４９万個／ｍｌの皮膚ケラチノサイトが生着した。おそらく、ｎ＝３と例数が少ないため１０ｎｇ／ｍｌの濃度でのみ有意差が認められているが、例数を増加せしめることによりすべての濃度で有意差が検出されるものと思われる。＊はＰ＜０．０５を示す。統計解析法は、ＡＮＯＶＡ＋Ｓｃｈｅｆｆｅのｐｏｓｔ　ｈｏｃ　ｔｅｓｔによる。
【００４８】
図１０の生着細胞数をもとに、皮膚ケラチノサイトの生着率を計算した結果を図１１に示す。図１１の横軸はジヒドロジンセノサイドＲｂ１の濃度を、縦軸は凍結解凍後の生着率を示す。生着率は生着細胞数／５０万×１００（％）という計算式により算出した。図１１の左端のカラムに示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておかなければ培養皮膚ケラチノサイトの生着率は１回の凍結解凍操作により８５％程度に減少した。しかし、図１１の左から２番目、３番目、４番目のカラムに示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１をそれぞれ１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作による生着率が８９％以上に改善した。特に、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でジヒドロジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作後でも、培養皮膚ケラチノサイトの生着率は９８％という高値を示した。おそらく、ｎ＝３と例数が少ないため１０ｎｇ／ｍｌの濃度でのみ有意差が認められているが、例数を増加せしめることによりすべての濃度で有意差が検出されるものと思われる。＊はＰ＜０．０５を示す。
【００４９】
以上のことより、特許文献８及び特許文献９に記載されたジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体は、皮膚ケラチノサイトを始めとする非生殖細胞又は非腫瘍細胞若しくは精子・卵子の細胞外液濃度が１ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０００ｎｇ／ｍｌ以下又は１００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは０．００００１ｆｇ／ｍｌ〜１０ｐｇ／ｍｌのときに、凍結精子、凍結卵子、凍結非生殖細胞又は非腫瘍細胞保存用組成物として利用されることが判明した。おそらく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体も、ジンセノサイドＲｂ１と同様に細胞膜上に幅広くほぼ均一に分布する分子群又は構成要素に作用するものと考えられた。
【００５０】
従って、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１からなる凍結非生殖細胞又は非腫瘍細胞保存用組成物は、１ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０００ｎｇ／ｍｌ以下又は１００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは０．００００１ｆｇ／ｍｌ〜１０ｐｇ／ｍｌの細胞外液濃度で非生殖細胞又は非腫瘍細胞の凍結保存用培養液（例えばセルバンカー等）に添加後、同細胞を冷凍保存又は凍結保存すれば、将来解凍若しくは融解しても生着率を１００％近くまで維持することを可能ならしむる。
もちろん、後述するユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体を含む本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物もジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１と同様に精子、卵子、非生殖細胞、非腫瘍細胞の凍結（冷凍）保存用組成物として利用できると言える。本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質、例えば後述するユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体を含んでなる細胞冷凍保存用組成物は、前述の濃度の範囲内であれば任意の若しくは公知の細胞培養メディウム（例えばＤＭＥＭ、ＭＣＤＢ１５３およびその改変培地、ＣＭＦ、セルバンカー、ＤＭＥ、ＣＳ−４ＺＯ−７００、ＳＦ−４ＺＯ−７００、ＭＥＭ等）に添加することができる。また、任意の若しくは公知の細胞培養メディウムにその他の公知の組成物又は化合物（ＦＣＳ、ウマ血清、ブタ血清、ＤＭＳＯ、ビタミン類、サイトカイン類、成長因子類、抗アポトーシス因子、細胞保護剤、アミノ酸、セリン、グリシン、イソカルバサイクリン群、プロサポシン関連ペプチド群、抗酸化剤、単糖類、多糖類、抗生物質、抗菌剤、アルブミン、ＨＥＰＥＳ、ＢＨＥ（ウシ視床下部エキス）、インスリン、ステロイド、胎盤エキス、トランスフェリン、ｓｏｄｉｕｍ　ｓｅｌｅｎｉｔｅ、ＢＳＡ等）のうち何れか１つ又は２つ以上を、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質を含んでなる非生殖細胞又は非腫瘍細胞冷凍保存用組成物と共に添加してもよい。　また、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体を含んでなる非生殖細胞又は非腫瘍細胞冷凍保存用組成物は、単独で同細胞の冷凍保存剤又は冷凍添加剤として使用してもよい。更に、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質を含んでなる非生殖細胞若しくは非腫瘍細胞の冷凍保存用組成物又は凍結保存用組成物は、蒸留水、リン酸緩衝液、クエン酸ナトリウム溶液、生理食塩水、ブドウ糖液、培養液等の公知の基液又は担体に溶解後、単独で冷凍保存剤組成物又は冷凍添加剤組成物として使用してもよいし、凍結細胞保存用基液（例えばセルバンカー）に添加してもよい。その際に、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体を含んでなる添加剤組成物又は凍結細胞保存用組成物の最終細胞外液濃度が、前記した範囲内に維持されるように添加する量を調整することが必要である。本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質を含んでなる精子、卵子、非生殖細胞又は非腫瘍細胞の冷凍保存用組成物は、皮膚ケラチノサイトはもとより、あらゆる生体組織由来の細胞、例えば幹細胞（神経幹細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞を含む）、胚細胞、受精卵、臍帯血中の造血幹細胞、植物細胞、赤血球、白血球、血小板、ＴＧ動物由来細胞、移植組織又は移植臓器作成・構成用細胞、ＫＯ動物由来細胞、遺伝子導入細胞等の長期にわたる冷凍保存に極めて有用であり、前記細胞を冷凍保存後に解凍しても生着率又は生存率を１００％近くまで維持することを可能ならしむる。また、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体を含んでなる細胞冷凍保存用組成物は、移植用組織や臓器（角膜、培養皮膚、肝、腎、心、血管等）の凍結保存のみならず、食品（肉、野菜、果実、魚貝類、穀類等）の冷凍保存にも有用である。より詳細には、本発明の有用物質、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体からなる細胞冷凍保存用組成物を蒸留水、海水、生理食塩水、リン酸緩衝液、エタノール、脱イオン水、ブドウ糖液又は培養液等に溶解したのちに、食品に同溶解液を塗布、噴霧するか食品を同溶解液中につけた上で食品を冷凍保存することができる。このようにすれば、例えば遠洋漁業で採取されたマグロなども鮮度を維持したままで、消費者に届けることが可能となる。更に輸血用の血球成分（例えば赤血球、白血球、血小板）を凍結保存する際にも、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体を含んでなる細胞冷凍保存用組成物又は細胞凍結保存用組成物（細胞を凍結保存するための組成物）を公知の凍害保護液又は血球成分保存液（ＭＡＰ液、ＣＰＤ液等）に添加しておけば、解凍時に血球成分の破壊を最小限にくい止めることができる。
【００５１】
次に本発明者らは、ジンセノサイドＲｂ１などの天然のジンセノサイド類又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体が、分裂増殖能の高い腫瘍細胞又は不死化細胞に対しては思いもかけず凍結傷害作用を発揮することを見出したので、以下にその実験結果について説明する。このため、分裂増殖能の高い腫瘍細胞又は不死化細胞の例として、ＨＥＫ２９３細胞を選んで実験を実施した。
【００５２】
培養増殖させたＨＥＫ２９３細胞を凍結細胞保存液（ｃｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ）とともに２００万個／ｍｌの密度でｃｒｙｏｔｕｂｅ（クリオチューブ）に分注した。その際に、ジンセノサイドＲｂ１を０，１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ（各群ｎ＝４）の濃度で添加し、同細胞を−８０℃の条件下で７２時間凍結した。その後同細胞を解凍又は融解したうえで播種し、３７℃で４８時間培養後、生存細胞数を数えた。結果を図１２に示す。図１２の縦軸は生存率を示しており、ジンセノサイドＲｂ１を添加しなかった場合の生存細胞数の平均値を１００％として表示している。横軸は、ジンセノサイドＲｂ１の濃度を示している。なお、ＨＥＫ２９３細胞の培養メディウムとして１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭを用いた。
【００５３】
図１２に示すごとく、ジンセノサイドＲｂ１を１０ｐｇ／ｍｌ又は１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加したときに、添加しなかった場合と比べて、凍結融解後のＨＥＫ２９３細胞の生存率が有意に低下した。また、１０ｆｇ／ｍｌのジンセノサイドＲｂ１がＨＥＫ２９３細胞の生存率を低下せしめる効果は軽微であったが、例数を増やすことにより、この濃度でも有意な生存率抑止効果が得られるものと期待される。データは平均±標準偏差で表示されており、統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎによる。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【００５４】
次に、本発明者らはジヒドロジンセノサイドＲｂ１を用いて、同様の実験を実施した。培養増殖させたＨＥＫ２９３細胞を凍結細胞保存液（ｃｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ）とともに２００万個／ｍｌの密度でｃｒｙｏｔｕｂｅ（クリオチューブ）に分注した。その際に、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を０，１ｆｇ／ｍｌ，１ｐｇ／ｍｌ，１ｎｇ／ｍｌ（各群ｎ＝４）の濃度で添加し、同細胞を−８０℃の条件下で７２時間凍結した。その後、同細胞を解凍・融解したうえで播種し、３７℃で、４８時間培養後、生存細胞数を数えた。結果を図１３に示す。図１３の縦軸は生存率を示しており、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を添加しなかった場合の生存細胞数の平均値を１００％として表示している。横軸は、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１の濃度を示している。
【００５５】
図１３に示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を１ｆｇ／ｍｌ又は１ｐｇ／ｍｌの濃度で添加したときに、添加しなかった場合と比べて、凍結融解後のＨＥＫ２９３細胞の生存率が有意に低下した。データは、平均値±標準偏差で表示されており、統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎによる。＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【００５６】
以上の結果により、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類は、ＨＥＫ２９３細胞などの分裂増殖能が高い腫瘍細胞又は不死化細胞に対しては、皮膚ケラチノサイトなどの非腫瘍細胞に対する作用とは逆に、傷害作用を及ぼすことが明らかとなった。従って、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えば後述するユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体も分裂増殖能が高い腫瘍細胞又は不死化細胞に対しては傷害作用を及ぼすと考えられる。なお、本発明ではジンセノサイドＲｂ１などの天然のジンセノサイド類とジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体をあわせてジンセノサイド類と呼ぶこととする。
【００５７】
次に本発明者らは、非腫瘍細胞に同様の凍結融解操作を施しても、ジンセノサイド類を添加しておけば細胞の生存率が低下しないことを確認することとした。このため、非腫瘍細胞の例としてグリア細胞の一種であるアストロサイトを選び、ジンセノサイド類の例としてジヒドロジンセノサイドＲｂ１を選んで、以下の実験を実施した。なお、アストロサイトは本発明者ら（阪中、田中）の既発表論文（Ｆｕｊｉｔａ，Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｌｉａ，　１８，　２６９−２８１，　１９９６；　Ｔａｎａｋａ，Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｌｉａ，　２０，　２３−３７，　１９９７；　Ｔａｎａｋａ，Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｌｉａ，　２４，　１９８−２１５，　１９９８）に記載された方法に準じて新生仔ラット脳より分離した。
【００５８】
アストロサイトを１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地にて２週間培養後、凍結細胞保存液（ｃｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ）とともに１００万個／ｍｌの密度でｃｒｙｏｔｕｂｅ（クリオチューブ）に分注した。その際に、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を０，１ｆｇ／ｍｌ，１ｐｇ／ｍｌ，１ｎｇ／ｍｌ（各群ｎ＝４）の濃度で添加し、同細胞を−８０℃の条件下で４８時間凍結した。その後、同細胞を解凍・融解したうえで播種し、３７℃で４８時間培養後、生存細胞数を数えた。結果を図１４に示す。図１４の縦軸は生存率を示しており、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を添加しなかった場合の生存細胞数の平均値を１００％として表示している。横軸は、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１の濃度を示している。
【００５９】
図１４に示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を１ｆｇ／ｍｌの濃度で添加したときに、アストロサイト即ち非腫瘍細胞の生存率が有意に増加した。ｎ＝４と例数が少ないため１ｐｇ／ｍｌ及び１ｎｇ／ｍｌの濃度では有意な効果が得られていないが、おそらく例数を増加すれば、これらの濃度でも有意な生存率増加作用を示すものと期待される。データは平均値±標準偏差で表示されており、統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎによる。＊はＰ＜０．０５を示す。
【００６０】
以上のことより、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体は、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類と同様に、アストロサイトや皮膚ケラチノサイトなどの非腫瘍細胞に対しては凍結保存用組成物となり、逆に、ＨＥＫ２９３細胞などの分裂増殖能が高い腫瘍細胞又は不死化細胞に対しては凍結傷害用組成物又は凍結傷害用医薬組成物となることが判明した。
【００６１】
即ち増殖能の高い腫瘍細胞（癌細胞、悪性新生物由来の細胞、肉腫細胞を含む）に対しては、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体はジンセノサイドＲｂ１やジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類と同様に、アストロサイト又は皮膚ケラチノサイトなどの非腫瘍細胞に対する場合とは逆に、著しい細胞傷害作用を示すと言える。従って、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体を医薬組成物として利用して静脈内投与しながら、生体内で腫瘍組織を凍結融解せしめることにより、生体の正常細胞を保存若しくは保護しながら腫瘍組織（癌、肉腫を含む）のみを破壊することが可能となる。もちろん、単に本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を静脈内投与又は全身投与するだけでも正常細胞を保護しながら、増殖能の高い悪性腫瘍細胞（癌細胞、肉腫細胞を含む）を傷害せしめるか、若しくは悪性腫瘍細胞の転移を抑制することができる。また、腫瘍組織をマイクロウェーブ、エタノール、放射線、抗癌剤で傷害しながら、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を投与してもよい。即ち、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体は悪性腫瘍（癌、悪性新生物、白血病、肉腫を含む）の予防、治療、処置、又は転移抑制のための医薬組成物若しくは悪性腫瘍細胞の凍結傷害用組成物として利用できると言える。
【００６２】
さて、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１が非腫瘍細胞と腫瘍細胞（不死化細胞）に対して相反する作用を示すということ、並びにジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１が細胞膜上に幅広くほぼ均一に分布する分子群又は構成要素に作用すること、から本発明者らは非腫瘍細胞と腫瘍細胞の細胞膜の相異に注目した。中でも、非腫瘍細胞と腫瘍細胞とでは、細胞膜上の糖脂質と糖蛋白の糖鎖に相異があり、その糖鎖の相異が非腫瘍細胞と腫瘍細胞の接着機能にも影響を与えていると考えられている。そこで、本発明者らはジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１が、特にその糖鎖の部分が、細胞膜上の糖蛋白又は糖脂質の糖鎖に結合（おそらくは水素結合）することにより、細胞に対して多彩な作用を及ぼすと推測した。本発明者らは、この推測を実証するため培養神経細胞を用いて以下の実験を行った。
【００６３】
胎生１７日のラット大脳皮質由来の神経細胞をポリエルリジンコートを施した２４ウェルプレートにまき、１０％牛胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で培養した。培養第２日目に、培養液を１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ブドウ糖（４．５ｍｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ソディウムセレナイト（５ｎＭ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，１ｍｇ／ｍｌ）を含む無血清ＤＭＥＭに変えた。培養第４日目に、神経細胞をノイラミニダーゼ（５００ｍＵ）及び／又はジンセノサイドＲｂ１で２４時間インキュベートした。なお、ノイラミニダーゼは細胞膜上の糖脂質又は糖蛋白の糖鎖を切断する酵素の１つである。その後、培養神経細胞を一酸化窒素供与体であるニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ，　２００μＭ）に１０分間暴露した後に、培養液を新しいものと入れ替え、更に１２〜１６時間神経細胞を培養した。その後、各ウェルの神経細胞を３％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）を含むレムリーのサンプル溶液（Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ）で可溶化し、可溶化サンプルを電気泳動した。泳動タンパクをニトロセルロース膜にトランスファーしたのちに、ＭＡＰ２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２、マイクロチュブル関連タンパク２）に対するモノクローナル抗体（スタンバージャー社）を用いてイムノブロットを実施した。二次抗体として、アルカリフォスファターゼ標識抗マウス抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。なお、ＭＡＰ２のバンドの強度を神経細胞生存の指標とした。結果を図１５に示す。
【００６４】
図１５の左端のレーンは、ＳＮＰ、ジンセノサイドＲｂ１及びノイラミニダーゼのうちいずれの処理も施していないコントロールの神経細胞であり、明らかなＭＡＰ２のバンドを示している。左から２番目のレーンはＳＮＰ処理のみを施した神経細胞であり、ＳＮＰにより神経細胞のアポトーシス又はアポトーシス様神経細胞死が惹起された結果、ＭＡＰ２のバンドが著しく減弱している。左から３番目のレーンは、ＳＮＰにより誘導される神経細胞のアポトーシス又はアポトーシス様神経細胞死が、ジンセノサイドＲｂ１により抑止されることを示している。左から４番目又は５番目のレーンは、ジンセノサイドＲｂ１又はノイラミニダーゼ（糖鎖切断酵素の一種）処置により、神経細胞の生存が不変であるかむしろ促進されることを示している。一方、右端のレーンでは、左から３番目のレーンにおいて確認されたジンセノサイドＲｂ１の抗アポトーシス作用がノイラミニダーゼ処理により、著しく減弱した。即ち、ノイラミニダーゼ処理により神経細胞膜上の糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖が切断された結果、ジンセノサイドＲｂ１のアポトーシス抑止作用又はアポトーシス様細胞死抑止作用が消失したのである。
【００６５】
以上の培養神経細胞を用いた実験結果並びに前記した凍結細胞を用いた実験結果より、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１は図１６及び図１７の模式図に示したごとく、その糖鎖部分又は水酸基部分を介して、細胞膜上の糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖と結合（おそらく水素結合）することにより細胞に作用し、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献８、特許文献９、特許文献１０及び特許文献１１に記載された多彩な効果、効能、用途、使用方法、を示すと言える。
より詳細には、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体を含む本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物は、細胞膜上の一つ又は複数の糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖に結合し、細胞膜上の糖鎖を架橋することにより細胞に好ましい効果をもたらす。即ち、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１が細胞に作用するためには、それらと特異的に結合する受容体分子（若しくは標的分子）は必ずしも必要とされないということになる。
なお、図１６及び図１７には記載されていないが、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１の基本骨格（たとえばダマラン骨格）及び／又はその側鎖（カーボンチェーン）が細胞膜の脂質二重層に入り込んだ状態で、同化合物の糖鎖と細胞膜上の糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖とが水素結合することもあり得る。更に、図１６及び図１７には細胞膜上の糖蛋白の例として、イオンチャネル、接着因子、受容体等が記載されている。
【００６６】
従って、細胞膜上の糖脂質又は糖蛋白の糖鎖（例えばガラクトース、Ｎ−アセチルグルコーサミン、フコース、シアル酸、グルコース、キシロース、マンノース等）と化学的に結合する化合物、特には水素結合する配糖体化合物又は水酸基を有する化合物をスクリーニング又は創製することにより、新規にジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１と同様の効果、効能、用途を示す化合物を見出すことができる。このような化合物を本明細書では、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物として呼んでいる。具体的にジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をスクリーニング又は見出す方法としては、本明細書に記載のごとく、細胞の凍結融解実験及び／又はノイラミニダーゼ処理細胞の培養実験においてジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の候補物質（即ちスクリーニング対象物質）の効果を検証してもよいし、より簡便には例えばビアコアシステムのチップ上に糖蛋白、糖脂質及び／又は糖鎖を固定した上で、スクリーニング対象物質との結合を解析してもよい。もちろん、ビアコアシステムのチップ上にスクリーニング対象物質を固定して、糖鎖との結合を解析しても良い。また、単純にジンセノサイドＲｂ１の基本骨格部分を修飾するか、若しくはジンセノサイドＲｂ１の基本骨格に類似する骨格を作成したのちに、同骨格に任意の糖鎖又は水酸基を結合させて、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の候補物質若しくはスクリーニング対象物質を作製してもよい。このような方法により選出又は創製される修飾基本骨格の一部については図１〜図６で説明した。また、基本骨格に結合する糖鎖についても既述することにより、後述するユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含む本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の具体例を示した。
【００６７】
以上のごとく、本発明は標的分子を設定した上で同分子に特異的に作用する化合物をスクリーニングするという従来の方法とは異なり、細胞膜上に存在する多種類の糖蛋白及び／又は糖脂質の糖鎖との非特異的な結合（おそらく水素結合）を化学的に解析、推定又は測定することからなるジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をスクリーニング／創製する方法を提供するものである。より詳細には、本発明は、前記したスクリーニング／創製方法により得られる、新規ジンセノサイドＲｂ１様物質（組成物）の用途、効果、効能又は使用方法、若しくは公知のジンセノサイドＲｂ１様物質（たとえば公知の配糖体化合物）の新規用途、効果、効能又は使用方法を提供するものである。
【００６８】
さて、先に述べたごとく本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質すなわち配糖体化合物には、天然の配糖体化合物も含まれる。そこで本発明者らは、天然の配糖体化合物の中でもこれまで薬理作用があまり解明されていない化合物を選んで、その新規用途、効果、効能又は使用方法をしらべた。
【００６９】
このため、たとえば下記構造式
【化６】
2004077456.tif 000005
で示される配糖体化合物３，５，７−トリヒドロキシクロメン−４−オン−３−Ｏ−Ｌ−ラムノシド［慣用名：ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）］を選び、同化合物がジンセノサイドＲｂ１と同様に優れた創傷（特には熱傷）治療効果を示すかどうかをしらべた。なお、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）はこれまで、ノルアドレナリン存在下で脂肪分解を促進することが培養実験結果として報告されている（Ｊ，　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，　６１，　１００６−１０１１，　１９９８）。本発明で用いたユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）は前掲の論文で用いたものと同じである。
【００７０】
また、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）は下記の一般式
【化７】
2004077456.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、少なくとも一つが糖鎖で、残りは水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、アラルキル基（アルキル部分はＣ１−１０）、アリール基、Ｃ１−１０アシル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ１−１０アシル基を表し、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃは、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、アラルキル基（アルキル部分はＣ１−１０）、Ｃ１−１０アシル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−１０アシル基、Ｃ１−１０アルケニル基又は水酸基を表す。）で示される配糖体化合物の１つであり、その基本骨格は図５に記載された３，５，７−トリヒドロキシクロメン−４−オンである。
【００７１】
まず、本発明者らはユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を眼科用白色ワセリン（プロペト）に添加することにより、０．００５重量％及び０．０５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペト（皮膚外用製剤）を作製した。
体重２５ｇ程度のＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部に麻酔下で一定サイズの熱傷病変（皮膚全層欠損病変）を作ったのちに、同動物の熱傷部にプロペトのみ、０．００５重量％又は０．０５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトを１日当たり０．１ｇの量で連続単回１７日間外用投与した。なお、２〜３日おきに熱傷部の創傷面積を測定した。結果を図１８に示す。図１８は、熱傷面積の時間経過を示すグラフである。図１８の白丸印は、プロペトのみを外用投与したコントロール例であり、黒丸印は０．００５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトを外用投与した例であり、白四角印は０．０５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトを外用投与した例である。
【００７２】
図１８に示すごとく、熱傷後プロペトのみを外用投与した例では、熱傷後６日目に至るまで創傷面積が著しく拡大し、その後少しずつ創傷（熱傷）面積が縮小し始めるものの、熱傷後、１３日目においてもなお創傷（熱傷）面積は、熱傷直後の創傷面積と近似していた。通常の鋭利なメスによる切開創や開放創では、このように顕著な創傷面積の拡大はみられないので、本熱傷モデルは公知の鋭利なメスによる切開創や開放創モデルよりも重篤なものであると言える。一方、０．００５重量％又は０．０５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトを外用投与すると、有意に熱傷による創傷面積の拡大が抑止され、熱傷の治癒及び／又は皮膚組織の再生・再構築が促進された。このことはユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有してなる皮膚外用製剤が優れた熱傷治療薬となることを示している。
【００７３】
次に熱傷後１７日目にマウスを麻酔により安楽死せしめ、熱傷部を写真撮影した。結果を図１９に示す。図１９の左側の写真が熱傷後プロペトのみを外用投与した例であり（０％と表示）、図１９の真中の写真が０．００５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩を含有するプロペトを外用投与した例であり、図１９の右側の写真が０．０５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩を含有するプロペトを外用投与した例である。図１９に示すごとく、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含んでなる皮膚外用製剤を皮膚の熱傷部に外用投与することにより、明らかに皮膚組織の再生及び／又は再構築が促進され、更に熱傷部の発毛、育毛、上皮化又は表皮化も促進された。その結果、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトの皮膚外用投与により熱傷部の創傷治癒も顕著に促進された。
【００７４】
このように、熱傷によってひとたび欠損した皮膚組織がユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含んでなる薬剤の皮膚外用投与により速やかに且つ正常に近い状態にまで再生及び／又は再構築し、熱傷が治癒するという本実験結果は、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩及び薬学上許容される担体からなる医薬組成物を含んでなる薬剤が皮膚欠損部周辺の表皮細胞、表皮角化細胞、上皮細胞、角質細胞、メルケル細胞、ランゲルハンス細胞、メラノサイト、幹細胞、皮脂腺の細胞、汗腺の細胞、平滑筋細胞、筋細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、間葉系細胞、血管内皮細胞、立毛筋の細胞、又は血管平滑筋細胞の分裂、増殖、移動、分化、並びに表皮細胞の毛包、汗腺、皮脂腺細胞への分化を促進することをも明らかにしている。しかも前述の皮膚細胞、各種細胞、末梢神経、血管がユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含んでなる薬剤の外用投与により有機的に系統立てて再生及び／又は再構築した結果、正常皮膚組織に近い状態にまで皮膚の熱傷病変が速やかに回復するということが発明されたことになる。すなわち、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩及び担体を含有してなる医薬組成物の皮膚外用投与により、皮膚欠損部に新たに再生した表皮細胞、線維芽細胞、血管又は末梢神経が正常の皮膚組織に類似した態様で配列し、表皮、真皮、真皮の乳頭、皮下組織、結合組織、汗腺、脂腺、毛乳頭、毛包、立毛筋、血管、末梢神経、細胞外基質、膠原線維、弾性線維、又は細網線維なども正常皮膚組織に近い状態にまで再生・再構築されると言える。従ってユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）が単独で皮膚組織の再生・再構築若しくは熱傷治癒をかくもあざやかに成しとげるということは、皮膚組織の創傷治癒若しくは再生・再構築にかかわるサイトカイン類（ＥＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦ−β１、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＩＧＦ、ＫＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＦＧＦ−２、Ｕ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ等）の産生や血球成分・血漿成分の機能などもユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）により調節されていることを物語っている。即ち、Ｓｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｊ．とＣｌａｒｋ，Ｒ．Ａ．Ｆの総説（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．，　３４１，　７３８−７４６，　１９９９）に記述されたごとく、創傷治癒若しくは組織再生・再構築にかかわる複雑な生命現象を、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有してなる薬剤の皮膚外用投与が単独ですべて成しとげたといえる。なお、皮膚組織の再生・再構築の概略については、特許文献４に記述されている。従って、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩及び薬学上許容される担体を含有してなる医薬組成物は、皮膚組織の再生及び／又は再構築の促進作用を介して、皮膚の病理組織学的変化をきたす器質的疾患の予防、処置又は治療に有用と考えられる。
【００７５】
また、一般に口腔粘膜や鼻粘膜などの粘膜も皮膚組織と類似した組織又は細胞から構成されているので、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）の外用投与が皮膚組織の再生及び／又は再構築を促進せしめるという本実験結果は、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩及び担体からなる医薬組成物を含有してなる薬剤の粘膜外用投与が粘膜の再生及び／又は再構築をも促進することを物語っている。より詳細には、粘膜の熱傷などの病理組織学的変化をきたす器質的疾患に対して、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含んで成る薬剤の外用投与は、粘膜の上皮細胞、幹細胞、間葉系細胞、線維芽細胞、唾液腺の細胞、筋上皮細胞、平滑筋細胞、粘液腺の細胞、漿液腺の細胞、混合腺の細胞、筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、膠原線維、弾性線維、細網線維又は細胞外基質の再生及び／又は再構築を促進すると考えられる。その結果、粘膜の上皮、粘膜固有層、筋組織、粘膜下層、粘膜筋板、唾液腺、混合腺、粘液腺、漿液腺、血管若しくは末梢神経がユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）の外用投与により再生及び／又は再構築し、粘膜熱傷などの病理組織学的変化をきたす器質的疾患が治療される。
【００７６】
ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）の適応が期待される粘膜の病理組織学的変化をきたす疾患や病態としては、う蝕、歯髄炎、辺縁性歯周組織炎、口内炎、舌炎、再発性アフタ、口腔内アフタ、口臭、口腔異常感症、歯性感染症、口腔粘膜咬傷、舌の咬傷、口腔粘膜熱傷、舌の熱傷、口腔粘膜損傷、歯肉炎、歯槽膿漏、カタール性口内炎、壊疽性口内炎、ワンサン口内炎、アフタ性口内炎、急性疱疹性歯肉口内炎、ヘルパンギーナ、帯状疱疹、口腔粘膜びらん、口腔粘膜潰瘍、褥瘡性潰瘍、放射線性口内炎、天疱瘡、口腔カンジダ症、扁平苔癖、Ｒｉｇａ−Ｆｅｄｅ癖、平滑舌、赤平舌、角膜びらん、角膜潰瘍、ドライアイ、シェーグレン症候群、消化管粘膜びらん、消化性潰瘍、角膜びらん、角膜潰瘍、アレルギー性鼻炎、花粉症、春季カタル、痔疾、気管支喘息、膣粘膜びらん、消化管粘膜熱傷、消化管粘膜創傷等が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【００７７】
なお、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩及び担体からなる医薬組成物を含んでなる薬剤の適応が期待される皮膚の病理組織学的変化をきたす器質的疾患又は病態としては、例えば以下のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。即ち、創傷、熱傷、放射線障害、凍傷、紫外線障害、電撃症、外傷、皮膚潰瘍、褥創、接触性皮膚炎、水疱性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾皮症、糖尿病性皮膚潰瘍、自家感作性皮膚炎、紅皮症、剥脱性皮膚炎、表皮水疱症、光線過敏症、慢性色素性紫斑（シャンバーグ病）、ストロフルス、虫刺され、痒疹、多形滲出性紅斑、環状紅斑、結節性紅斑、天疱瘡、類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、掌蹠膿疱症、乾癬、扁平苔癬、魚鱗癬、毛孔性苔癬、黄色腫症、皮膚アミロイドーシス、単純疱疹、ウイルス性いぼ、伝染性軟属腫、膿皮症、皮膚結核、皮膚非定型抗酸菌症、白癬、皮膚・口腔カンジダ症、疥癬、毛虱症、梅毒、ケロイド、肥厚性瘢痕、血管腫、リンパ管腫、母斑、尋常性白斑、雀卵斑、肝斑、黒皮症、汗疱、あせも、にきび、酒査皮（しゅさ）、酒査皮（しゅさ）様皮膚炎、口腔粘膜損傷、口内炎、口囲皮膚炎、皮膚の老化症状、脱毛症、爪囲炎、嵌入爪等である。
また、熱傷モデルマウスを用いた前記実験において、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含んでなる薬剤の外用投与により明らかな発毛が観察されたので、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩と適当なその基剤（担体）を含んでなる組成物は、発毛・育毛用組成物としても利用できると言える。従って、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）は発毛・育毛剤に添加することにより、円形脱毛症、男性型脱毛症、び慢性脱毛症の予防、処置又は治療にも有用とされる。なお、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩及び担体を含有してなる本発明の薬剤に他の任意の医薬組成物（たとえば、ブドウ糖、抗生物質、ビタミンＡ、レチノイン酸、ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体、ビタミンＤ、ビタミンＤ誘導体、はちみつ、ビタミン類、抗ウイルス剤、免疫抑制用組成物、ステロイド、薬用人蔘成分、抗アレルギー剤、天然物成分等）を添加してもよい。ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩を含有してなる本発明の薬剤の基剤又は薬学上許容される担体としては、軟こう基剤、パップ剤、芳香水剤、リニメント剤、配合剤、クリーム基剤、水溶性基剤、噴霧・吸入用基剤等公知のものが何れも挙げられる。
【００７８】
前述のごとく、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩及び薬学上許容される担体からなる医薬組成物を含有してなる薬剤の皮膚外用塗布が、皮膚の表皮組織、真皮の結合組織、真皮の乳頭、皮下組織、血管、立毛筋、皮脂腺、汗腺、毛乳頭、毛包等の再生及び／又は再構築を促進するという事実は、当然のことながらユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有してなる薬剤の皮膚外用塗布が、表皮細胞、表皮角化細胞、メルケル細胞、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、角質細胞、真皮並びに皮下組織の線維芽細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、皮脂腺の細胞、脂肪細胞、汗腺の細胞、毛包の細胞、立毛筋の細胞、間葉系細胞、皮膚の幹細胞等の再生及び／又は再構築をも促すことを明らかにしている。即ち、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）は皮膚組織を構成するあらゆる細胞やその分泌成分の再生及び／又は再構築を促進すると考えられる。一方、皮膚の疾患又は老化による症状（皮膚の萎縮、易感染性、たるみ、ふけ、脱毛、かゆみ、かさつき、白髪、亀裂、皮脂欠乏、角質細胞剥離、角層剥離、ひびわれ、あかぎれ、しみ、しわ、そばかす、色素沈着、日焼け、再生不良、乾燥等）は、皮膚組織を構成する前記細胞が、皮膚疾患、紫外線障害若しくは生体の老化に伴い徐々に死滅若しくは機能不全に陥り、もとの健常な状態に再生できなくなるために、生じるものと考えられる。たとえば、皮膚疾患、加齢若しくは老化に伴う皮膚のかさつき、乾燥、脱毛、角質細胞剥離、角層剥離、ひびわれ、あかぎれ、皮脂欠乏、かゆみなどは皮膚の汗腺、毛包、並びに脂腺の細胞が、機能障害に陥るか死滅したままで再生しないために、生じると考えられる。また、日焼け、色素沈着、しみ、そばかす等は、日光や紫外線に照射された皮膚の細胞が死に至っても、元通りに細胞が再生しなくなるために起こると考えられる。更に皮膚疾患若しくは老化に伴う、皮膚のしわ、たるみ、萎縮などは、真皮や皮下組織の線維芽細胞若しくは間葉系細胞が、疾患又は老化により機能不全に陥るか数が減少したために、真皮や皮下組織で充分な膠原線維、弾性線維、細網線維又は細胞外基質を保持できなくなった結果、生じると言える。一方、メラノサイトやランゲルハンス細胞の機能障害により白髪や易感染性が生じると考えられる。
【００７９】
本発明に係るユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩は、皮膚組織を構成するすべての細胞やその分泌成分の再生及び／又は再構築を促進することができるので、化粧品組成物又は発毛・育毛用組成物などの皮膚外用剤組成物として利用すれば、皮膚の疾患若しくは老化に伴う皮膚の構成細胞の減少（細胞死）、機能障害に帰因する諸症状（皮膚の萎縮、易感染性、たるみ、ふけ、脱毛、かゆみ、かさつき、白髪、亀裂、皮脂欠乏、角質細胞剥離、角層剥離、ひびわれ、あかぎれ、しみ、しわ、そばかす、色素沈着、日焼け、再生不良、乾燥等）を予防、処置、軽減若しくは改善することができる。
同様に、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩及び担体を含んでなる粘膜外用剤（或いは粘膜外用剤組成物）の粘膜外用投与は、粘膜組織の再生及び／又は再構築促進作用を介して、粘膜の疾患又は老化による症状（粘膜の萎縮、剥離、上皮剥離、再生不良、かゆみ、乾燥又はひびわれ等）を予防、処置又は改善すると考えられる。従って、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩をあらゆる化粧品、発毛育毛剤や健康薬（化粧水（スキンローション）、乳液（ミルクローション）、美容液、マッサージ剤、パック剤、乳剤、ファンデーション、ハンドクリーム、ゲル、ローション、エマルジョン、パウダー、ヘアーダイ、ヘアーマニキュア、コールドクリーム、アイシャドウ、クレンジングクリーム、洗顔フォーム、ナイトクリーム、美白クリーム、トローチ、のどあめ、おしろい、口紅、入浴剤、化粧石けん、健康飲料水、アイソトニックウォーター、水割用氷、シャーベット、アイスクリーム、アルコール飲料、洗眼薬、洗眼液、洗顔液、うがい薬、シャンプー、リンス、歯みがき粉、ｔｏｏｔｈ　ｐａｓｔｅ、リップクリーム、下地クリーム（メイクアップベース）、ＵＶリキッドファンデーション、パウダーファンデーション等に添加すれば、皮膚や粘膜の疾患又は老化による症状（萎縮、易感染性、たるみ、かゆみ、かさつき、再生不良、上皮剥離、粘膜剥離、皮脂欠乏、角質細胞剥離、角層剥離、ひびわれ、あかぎれ、しみ、しわ、そばかす、白髪、ふけ、脱毛、色素沈着、日焼け、乾燥等）に対して優れた効果を発揮する。たとえば、皮膚の疾患又は老化により皮膚の脂（即ち皮脂）が欠乏するだけでも、皮膚のかさつき、ひびわれ、あかぎれ、乾燥、かゆみ、角質細胞剥離等が生じるが、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩をあらゆる化粧品に混入して使用することにより、皮脂腺の再生及び／又は再構築が促進され前記の皮膚疾患又は老化による症状を予防、処置、改善若しくは軽減すると考えられる。もちろん、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩のかわりに、それらを含む天然物エキスを皮膚外用剤組成物として利用してもよい。
【００８０】
また、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩を含有してなる任意の化粧品は、表皮細胞（角質細胞）若しくは表皮角化細胞の再生を促進するので、角質細胞間脂質や天然保湿因子の産生や分泌も促進することにより、皮膚の乾燥やかさつきを抑止し、皮膚に自然な潤いをもたらす。
更に、例えば、ミネラルウォーターなどにユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩を添加することにより、アルコール飲料や高温刺激物による口腔粘膜や消化管粘膜（特に食道粘膜）の障害を改善、予防、処置することができる。ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩と適当な担体（基剤）を含んでなる組成物はケミカルピーリング剤組成物又はフィジカルピーリング剤組成物として、ケミカルピーリングの全過程（前、中又は後）で使用される試薬類又は投与剤（すなわちケミカルピーリング剤又はフィジカルピーリング剤）のうち１種類若しくは２種類以上に混入して使用することができる。特に皮膚のピーリング後のスキンケアのために、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩を含有してなるケミカルピーリング剤（組成物）又はフィジカルピーリング剤（組成物）が有用である。もちろん、原因若しくは疾患が特定できずに皮膚又は粘膜に上記症状が出現したときにも、当該症状の予防、処置、改善のためにユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩を含有してなる皮膚外用剤（組成物）を使用できる。
【００８１】
なお、本発明に係わるユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩を含んでなる薬剤（医薬製剤）、皮膚外用剤（化粧品類、発毛・育毛剤、フィジカルピーリング剤、ケミカルピーリング剤等）又は粘膜外用剤の基剤又は担体としては、パップ剤、リニメント剤、軟こう基剤、配合剤、クリーム基剤、水溶性基剤、ローション剤、噴霧・吸入用基剤、油脂類、ロウ類、ゲル状基剤、炭化水素類、脂肪酸類、低級アルコール類、高級アルコール類、多価アルコール類、エステル類、界面活性剤、水溶性高分子化合物等公知のものが挙げられる。もちろん、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩を含有してなる上記の薬剤、皮膚外用剤等には、これらの基剤、担体等に加えて他の有効成分、例えば血行促進用組成物、局所刺激用組成物、毛包賦活用組成物、抗男性ホルモン、抗脂漏用組成物、角質溶解用組成物、抗生物質、生薬エキス、ビタミン類、オキシアカンチン、セリン、グリシン、アミノ酸、薬用人蔘エキス、ヒアルロン酸、パントテン酸、セファランチン等が必要に応じて公知の濃度で１乃至２以上含まれても良い。更に、本発明の前記皮膚外用剤には、その他の細胞賦活剤、抗炎症剤、活性酸素消去剤、美白剤、保湿剤、紫外線吸収剤、防腐防黴剤、エモリエント剤、天然物エキス、レチノイン酸等が必要に応じてそれぞれ至適濃度で１乃至２以上含まれていても良い。
【００８２】
ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩は、特許文献１〜４、及び特許文献８〜１０に記載されたジンセノサイドＲｂ１の効果・効能・用途をすべて兼ね備えていると考えられる。更に、前記した一般式で示されるユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）の化学的誘導体並びに図５に示したジヒドロキシクロメン、トリヒドロキシクロメン又はテトラヒドロキシクロメンを基本骨格として有する配糖体化合物とそれらの化学的誘導体もジンセノサイドＲｂ１又はユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）と同様の効果・効能・用途を示すと言える。なお、図５に示したジヒドロキシクロメン，トリヒドロキシクロメン及びテトラヒドロキシクロメンを基本骨格として有する配糖体化学物の化学的誘導体もユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）の化学的誘導体の作製方法に準じて、合成できる。
また、公知のｂｅｒｇｅｎｉｎやａｓｔｉｌｂｉｎ（異性体を含む）及びそれらの化学的誘導体も、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）と同様の効果・効能・用途を示すと考えられる。
なお、図２０にジヒドロキシクロメン、トリヒドロキシクロメン又はテトラヒドロキシクロメンを基本骨格として有する配糖体化合物とその化学的誘導体の例を一般式で示す。
なお、各式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、少なくとも一つが糖鎖で、残りは水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、アラルキル基（アルキル部分はＣ１−１０）、アリール基、Ｃ１−１０アシル基、又はハロゲン原子で置換されたＣ１−１０アシル基を表し、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄは、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−１０アルキル基、アラルキル基（アルキル部分はＣ１−１０）、Ｃ１−１０アシル基、ハロゲン原子で置換されたＣ１−１０アシル基、Ｃ１−１０アルケニル基又は水酸基を表す。
【００８３】
ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその化学的誘導体若しくはそれらの塩を含有してなる皮膚・粘膜疾患の予防・処置又は治療用の医薬組成物、皮膚外用剤組成物、粘膜外用剤組成物、化粧品組成物、発毛・育毛用組成物、ケミカルピーリング剤組成物又はフィジカルピーリング剤組成物は、その含有量が組成物全体、薬剤全体又は外用剤全体の１−５重量％乃至それ以下、好ましくは、０．１−０．００１重量％乃至それ以下、より好ましくは０．００１重量％以下又は未満、更に好ましくは０．００００１重量％以下である。本発明の組成物の濃度の下限は組成物全体の１０−１５重量％程度と考えられる。
従って、以上のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩及び担体からなる医薬組成物を含んでなる皮膚外用製剤の熱傷治療効果を示す実験結果は、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質のスクリーニング方法が有効に利用され得ることを証明している。
【００８４】
【実施例】
以下、参考例、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら参考例、実施例により何ら限定されるものではない。
【００８５】
参考例１（ジンセノサイドＲｂ１によるフリーの凍結皮膚ケラチノサイト保存作用）
−１５０℃で保存している４継代目のヒト由来皮膚ケラチノサイトを融解若しくは解凍した上で播種し、３７℃で２４時間培養後、生着細胞数をカウントした。同細胞（即ちヒト由来皮膚ケラチノサイト）を凍結細胞保存液（７０％ＤＭＥＭ、１０％ＤＭＳＯ、２０％ＦＣＳ）とともに５０万個／ｍｌの密度でクリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）に分注し、ジンセノサイドＲｂ１を０，１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ（各群ｎ＝３）の濃度で添加した。その後、同細胞を−８０℃の条件下で２４時間凍結後、−１５０℃で更に４８時間保存した。再度同細胞を融解若しくは解凍した上で播種し、３７℃で２４時間培養後、生着細胞数をｃｏｕｌｔｅｒ　ｃｏｕｎｔｅｒを用いて計測した。
結果を図７に示す。
【００８６】
図７の横軸はジンセノサイドＲｂ１の濃度を、縦軸は凍結解凍後の生着細胞数を示す。図７の左端のカラムに示すごとく、ジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておかなければ培養皮膚ケラチノサイトの生着細胞数は１回の凍結解凍操作により５０万個／ｍｌから約４１．５万個／ｍｌに減少した。しかし、図７の左から２番目、３番目、４番目のカラムに示すごとく、ジンセノサイドＲｂ１を１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作による生着細胞数の減少が有意に抑止された。特に１０ｐｇ／ｍｌの濃度でジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと１回の凍結解凍操作後でも、培養皮膚ケラチノサイトの生着細胞数はほとんど減少せず、およそ４９．５万個／ｍｌの皮膚ケラチノサイトが生着した。このことは、凍結解凍を４回くり返しても、至適濃度のジンセノサイドＲｂ１を培養液又は凍結細胞保存液（例えばセルバンカー）に添加しておけば、生着細胞数の減少がほとんど起こらず約４８万個／ｍｌの生着細胞が維持できることを物語っている。一方、ジンセノサイドＲｂ１を培養液又は凍結細胞保存液に添加しておかなければ凍結解凍若しくは凍結融解という操作を４回くり返しただけで、生着細胞が約２３万個／ｍｌに減少することになる。即ち、ジンセノサイドＲｂ１は本発明において、思いもかけず、極めて優れた凍結ケラチノサイト保存用組成物となることが見出されたことになる。また、ジンセノサイドＲｂ１は１０ｎｇ／ｍｌという高濃度では抗アポトーシス作用を示さないことが、特許文献２及び特許文献１において開示されているが、このように高濃度のジンセノサイドＲｂ１でも凍結細胞保存用組成物としては使用可能であることを本発明は明らかにしている。即ち、ジンセノサイドＲｂ１は抗アポトーシス作用とは異なるメカニズムで凍結細胞保存効果を発揮すると言える。＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊はＰ＜０．００１を示す。統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｓｃｈｅｆｆｅのｐｏｓｔ　ｈｏｃ　ｔｅｓｔによる。
【００８７】
図７の生着細胞数をもとに、皮膚ケラチノサイトの生着率を計算した結果を図８に示す。図８の横軸はジンセノサイドＲｂ１の濃度を、縦軸は凍結解凍後の生着率を示す。生着率は生着細胞数／５０万×１００（％）という計算式により算出した。図８の左端のカラムに示すごとく、ジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておかなければ培養皮膚ケラチノサイトの生着率は１回の凍結解凍操作により８２．５％程度に減少した。しかし、図８の左から２番目、３番目、４番目のカラムに示すごとく、ジンセノサイドＲｂ１をそれぞれ１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作による生着率が平均９０％以上となり有意に改善した。特に１０ｐｇ／ｍｌの濃度でジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作後でも、培養皮膚ケラチノサイトの生着率は平均９９％という高値を示した。このことは、凍結解凍を４回くり返しても、至適濃度のジンセノサイドＲｂ１を培養液又は凍結細胞保存液（例えばセルバンカー）に添加しておけば、生着率の低下がほとんど起こらず、およそ９６％程度の生着率を維持できることを物語っている。一方、ジンセノサイドＲｂ１を培養液又は凍結細胞保存液に添加しておかなければ凍結解凍若しくは凍結融解という操作を４回くり返しただけで、生着率が４６．２％程度に減少することになる。＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊はＰ＜０．００１を示す。統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｓｃｈｅｆｆｅのｐｏｓｔ　ｈｏｃ　ｔｅｓｔによる。
【００８８】
以上のことより、ジンセノサイドＲｂ１は、皮膚ケラチノサイトを始めとする細胞の細胞外液濃度が１ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以下又は１０ｎｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは０．００００１ｆｇ／ｍｌ〜１０ｐｇ／ｍｌのときに、凍結非生殖細胞又は凍結非腫瘍細胞の保存用組成物として利用されると言える。
【００８９】
参考例２（凍結融解された皮膚ケラチノサイトの電子顕微鏡像）
−１５０℃で保存している４継代目のヒト由来皮膚ケラチノサイトを融解若しくは解凍した上で播種し、３７℃で２４時間培養後、生着細胞数をカウントした。同細胞（即ちヒト由来ケラチノサイト）を凍結細胞保存液（７０％ＤＭＥＭ，１０％ＤＭＳＯ，２０％ＦＣＳ）とともに５０万個／ｍｌの密度でｃｒｙｏｔｕｂｅ（クリオチューブ）に分注し、ジンセノサイドＲｂ１を０又は１０ｐｇ／ｍｌの濃度で添加した。その後、同細胞を−８０℃の条件下で２４時間凍結後、−１５０℃で更に４８時間保存した。再度同細胞を融解若しくは解凍した直後に、パラホルムアルデヒド−グルタルアルデヒド含有リン酸緩衝液で同細胞を固定し、エポンに包埋した。エポン包埋されたヒト皮膚ケラチノサイトの超薄切片を作製し、電子顕微鏡で観察した。結果を図９に示す。
【００９０】
図９の左側（Ａ）はジンセノサイドＲｂ１未処置細胞であり、図９の右側（Ｂ）はジンセノサイドＲｂ１（１０ｐｇ／ｍｌ）処置細胞である。ジンセノサイドＲｂ１を添加しなかった場合、凍結融解操作により多くのヒト皮膚ケラチノサイトが死滅し、生存しているヒト皮膚ケラチノサイトも図９の左側に示すごとく細胞膜が部分的に膨化していた。おそらく、このように部分的に膨化した皮膚ケラチノサイトの細胞膜も近い将来に破裂し、皮膚ケラチノサイトを死に至らしむると考えられる。一方、ジンセノサイドＲｂ１（１０ｐｇ／ｍｌ）添加後に凍結融解されたヒト皮膚ケラチノサイトでは、図９の右側に示すごとく、細胞膜の部分的な膨化はあまり見られず、多くの細胞が円型又は球型の安定した形状を維持して生存していた。
【００９１】
これらの電子顕微鏡所見より、ジンセノサイドＲｂ１はヒト皮膚ケラチノサイトの細胞膜に局在する特定の標的分子に作用するというよりも、むしろ細胞上に幅広くほぼ均一に分布する分子群又は構成要素に作用するものと考えられた。なお、当該参考例２の実験結果は、本明細書において始めて開示される実験結果である。
【００９２】
参考例３（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１によるフリーの凍結皮膚ケラチノサイト保存作用）
−１５０℃で保存している４継代目のヒト由来皮膚ケラチノサイトを融解若しくは解凍した上で播種し、３７℃で２４時間培養後、生着細胞数をカウントした。同細胞（即ちヒト由来皮膚ケラチノサイト）を５０万個／ｍｌの密度でｃｒｙｏｔｕｂｅに分注し、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を０，１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ（各群ｎ＝３）の濃度で凍結細胞保存液（７０％ＤＭＥＭ，１０％ＤＭＳＯ，２０％ＦＣＳ）に添加した。その後、同細胞を−８０℃の条件下で２４時間凍結後、−１５０℃で更に４８時間保存した。再度同細胞を融解若しくは解凍した上で播種し、３７℃で２４時間培養後、生着細胞数をｃｏｕｌｔｅｒ　ｃｏｕｎｔｅｒを用いて計測した。結果を図１０に示す。
【００９３】
図１０の横軸はジヒドロジンセノサイドＲｂ１の濃度を、縦軸は凍結解凍後の生着細胞数を示す。図１０の左端のカラムに示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておかなければ培養皮膚ケラチノサイトの生着細胞数は１回の凍結解凍操作により５０万個／ｍｌから約４２．４万個／ｍｌに減少した。しかし、図１０の左から２番目、３番目、４番目のカラムに示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作による生着細胞数の減少が明らかに抑止された。特に、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でジヒドロジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと１回の凍結解凍操作後でも、培養皮膚ケラチノサイトの生着細胞数はほとんど減少せず、およそ４９万個／ｍｌの皮膚ケラチノサイトが生着した。おそらく、ｎ＝３と例数が少ないため１０ｎｇ／ｍｌの濃度でのみ有意差が認められているが、例数を増加せしめることによりすべての濃度で有意差が検出されるものと思われる。＊はＰ＜０．０５を示す。統計解析法は、ＡＮＯＶＡ＋Ｓｃｈｅｆｆｅのｐｏｓｔ　ｈｏｃ　ｔｅｓｔによる。
【００９４】
図１０の生着細胞数をもとに、皮膚ケラチノサイトの生着率を計算した結果を図１１に示す。図１１の横軸はジヒドロジンセノサイドＲｂ１の濃度を、縦軸は凍結解凍後の生着率を示す。生着率は生着細胞数／５０万×１００（％）という計算式により算出した。図１１の左端のカラムに示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておかなければ培養皮膚ケラチノサイトの生着率は１回の凍結解凍操作により８５％程度に減少した。しかし、図１１の左から２番目、３番目、４番目のカラムに示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１をそれぞれ１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作による生着率が８９％以上に改善した。特に、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でジヒドロジンセノサイドＲｂ１を培養液（凍結細胞保存液）に添加しておくと、１回の凍結解凍操作後でも、培養皮膚ケラチノサイトの生着率は９８％という高値を示した。おそらく、ｎ＝３と例数が少ないため１０ｎｇ／ｍｌの濃度でのみ有意差が認められているが、例数を増加せしめることによりすべての濃度で有意差が検出されるものと思われる。＊はＰ＜０．０５を示す。
【００９５】
以上のことより、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体は、皮膚ケラチノサイトを始めとする非生殖細胞又は非腫瘍細胞若しくは精子・卵子の細胞外液濃度が１ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０００ｎｇ／ｍｌ以下又は１００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは０．００００１ｆｇ／ｍｌ〜１０ｐｇ／ｍｌのときに、凍結精子、凍結卵子、凍結非生殖細胞又は非腫瘍細胞保存用組成物として利用されることが判明した。おそらく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類誘導体も、ジンセノサイドＲｂ１と同様に細胞膜上に幅広くほぼ均一に分布する分子群又は構成要素に作用するものと考えられる。
【００９６】
従って、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１からなる凍結非生殖細胞又は非腫瘍細胞保存用組成物は、１ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０００ｎｇ／ｍｌ以下又は１００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは０．００００１ｆｇ／ｍｌ〜１０ｐｇ／ｍｌの細胞外液濃度で培養非生殖細胞又は非腫瘍細胞の凍結保存用培養液（例えばセルバンカー等）に添加後、同細胞を冷凍保存又は凍結保存すれば、将来解凍若しくは融解しても生着率を１００％近くまで維持することを可能ならしむる。
【００９７】
よって、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び又はその化学的誘導体もジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１と同様に精子、卵子、非生殖細胞又は非腫瘍細胞の凍結（冷凍）保存用組成物として利用できると言える。
【００９８】
参考例４（ジンセノサイドＲｂ１の凍結ＨＥＫ２９３細胞傷害作用）
培養増殖させたＨＥＫ２９３細胞を凍結細胞保存液（ｃｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ）とともに２００万個／ｍｌの密度でｃｒｙｏｔｕｂｅ（クリオチューブ）に分注した。その際に、ジンセノサイドＲｂ１を０，１０ｆｇ／ｍｌ，１０ｐｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ（各群ｎ＝４）の濃度で添加し、同細胞を−８０℃の条件下で７２時間凍結した。その後同細胞を解凍又は融解したうえで播種し、３７℃で４８時間培養後、生存細胞数を数えた。結果を図１２に示す。図１２の縦軸は生存率を示しており、ジンセノサイドＲｂ１を添加しなかった場合の生存細胞数の平均値を１００％として表示している。横軸は、ジンセノサイドＲｂ１の濃度を示している。なお、ＨＥＫ２９３細胞の培養メディウムとして１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭを用いた。
【００９９】
図１２に示すごとく、ジンセノサイドＲｂ１を１０ｐｇ／ｍｌ又は１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加したときに、添加しなかった場合と比べて、凍結融解後のＨＥＫ２９３細胞の生存率が有意に低下した。また、１０ｆｇ／ｍｌのジンセノサイドＲｂ１がＨＥＫ２９３細胞の生存率を低下せしめる効果は軽微であったが、例数を増やすことにより、この濃度でも有意な生存率抑止効果が得られるものと期待される。データは平均±標準偏差で表示されており、統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎによる。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【０１００】
参考例５（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１の凍結ＨＥＫ２９３細胞傷害作用）
培養増殖させたＨＥＫ２９３細胞を凍結細胞保存液（ｃｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ）とともに２００万個／ｍｌの密度でｃｒｙｏｔｕｂｅ（クリオチューブ）に分注した。その際に、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を０，１ｆｇ／ｍｌ，１ｐｇ／ｍｌ，１ｎｇ／ｍｌ（各群ｎ＝４）の濃度で添加し、同細胞を−８０℃の条件下で７２時間凍結した。その後、同細胞を解凍又は融解したうえで播種し、３７℃で、４８時間培養後、生存細胞数を数えた。結果を図１３に示す。図１３の縦軸は生存率を示しており、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を添加しなかった場合の生存細胞数の平均値を１００％として表示している。横軸は、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１の濃度を示している。
【０１０１】
図１３に示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を１ｆｇ／ｍｌ又は１ｐｇ／ｍｌの濃度で添加したときに、添加しなかった場合と比べて、凍結融解後のＨＥＫ２９３細胞の生存率が有意に低下した。データは、平均値±標準偏差で表示されており、統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎによる。＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【０１０２】
参考例４及び５の結果より、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類は、ＨＥＫ２９３細胞などの分裂増殖能が高い腫瘍細胞又は不死化細胞に対しては、皮膚ケラチノサイトなどの非腫瘍細胞に対する作用とは逆に、傷害作用を及ぼすことが明らかとなった。
従って、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体も分裂増殖能が高い腫瘍細胞又は不死化細胞に対しては傷害作用を及ぼすと考えられる。
【０１０３】
参考例６（ジヒドロジンセノサイドＲｂ１の凍結アストロサイト保存効果又は保護作用）
アストロサイトを１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地にて２週間培養後、凍結細胞保存液（ｃｅｌｌ　ｂａｎｋｅｒ）とともに１００万個／ｍｌの密度でｃｒｙｏｔｕｂｅ（クリオチューブ）に分注した。その際に、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を０，１ｆｇ／ｍｌ，１ｐｇ／ｍｌ，１ｎｇ／ｍｌ（各群ｎ＝４）の濃度で添加し、同細胞を−８０℃の条件下で４８時間凍結した。その後、同細胞を解凍・融解したうえで播種し、３７℃で４８時間培養後、生存細胞数を数えた。結果を図１４に示す。図１４の縦軸は生存率を示しており、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を添加しなかった場合の生存細胞数の平均値を１００％として表示している。横軸は、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１の濃度を示している。
【０１０４】
図１４に示すごとく、ジヒドロジンセノサイドＲｂ１を１ｆｇ／ｍｌの濃度で添加したときに、アストロサイト即ち非腫瘍細胞の生存率が有意に増加した。ｎ＝４と例数が少ないため１ｐｇ／ｍｌ及び１ｎｇ／ｍｌの濃度では有意な効果が得られていないが、おそらく例数を増加すれば、これらの濃度でも有意な生存率増加作用を示すものと期待される。データは平均値±標準偏差で表示されており、統計解析法はＡＮＯＶＡ＋Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎによる。＊はＰ＜０．０５を示す。
【０１０５】
以上のことより、後述するユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体を含む本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物はジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイド類と同様に、アストロサイトや皮膚ケラチノサイトなどの非腫瘍細胞に対しては凍結保存用組成物となり、逆に、ＨＥＫ２９３細胞などの分裂増殖能が高い腫瘍細胞又は不死化細胞に対しては凍結傷害用組成物又は凍結傷害用医薬組成物となることが判明した。
【０１０６】
実施例１（ジンセノサイドＲｂ１の作用機構解析実験）
胎生１７日のラット大脳皮質由来の神経細胞をポリエルリジンコートを施した２４ウェルプレートにまき、１０％牛胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ　（ＤＭＥＭ）中で培養した。培養第２日目に、培養液を１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ブドウ糖（４．５ｍｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ソディウムセレナイト（５ｎＭ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，　１ｍｇ／ｍｌ）を含む無血清ＤＭＥＭに変えた。培養第４日目に、神経細胞をノイラミニダーゼ（５００ｍＵ）及び／又はジンセノサイドＲｂ１とともに２４時間インキュベートした。なお、ノイラミニダーゼは細胞膜上の糖脂質又は糖蛋白の糖鎖を切断する酵素の１つである。その後、培養神経細胞を一酸化窒素供与体であるニトロプルシッドナトリウム（ＳＮＰ，　２００μＭ）に１０分間暴露した後に、培養液を新しいものと入れ替え、更に１２〜１６時間神経細胞を培養した。その後、各ウェルの神経細胞を３％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）を含むレムリーのサンプル溶液（Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ）で可溶化し、可溶化サンプルを電気泳動した。泳動タンパクをニトロセルロース膜にトランスファーしたのちに、ＭＡＰ２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２、マイクロチュブル関連タンパク２）に対するモノクローナル抗体（スタンバージャー社）を用いてイムノブロットを実施した。二次抗体として、アルカリフォスファターゼ標識抗マウス抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。なお、ＭＡＰ２のバンドの強度を神経細胞生存の指標とした。結果を図１５に示す。
【０１０７】
図１５の左端のレーンは、ＳＮＰ、ジンセノサイドＲｂ１及びノイラミニダーゼのうちいずれの処理も施していないコントロールの神経細胞であり、明らかなＭＡＰ２のバンドを示している。左から２番目のレーンはＳＮＰ処理のみを施した神経細胞であり、ＳＮＰにより神経細胞のアポトーシス又はアポトーシス様神経細胞死が惹起された結果、ＭＡＰ２のバンドが著しく減弱している。左から３番目のレーンは、ＳＮＰにより誘導される神経細胞のアポトーシス又はアポトーシス様神経細胞死が、ジンセノサイドＲｂ１により抑止されることを示している。左から４番目又は５番目のレーンは、ジンセノサイドＲｂ１又はノイラミニダーゼ（糖鎖切断酵素の一種）処置により、神経細胞の生存が不変であるかむしろ促進されることを示している。一方、右端のレーンでは、左から３番目のレーンにおいて確認されたジンセノサイドＲｂ１の抗アポトーシス作用がノイラミニダーゼ処理により、著しく減弱した。即ち、ノイラミニダーゼ処理により神経細胞膜上の糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖が切断された結果、ジンセノサイドＲｂ１のアポトーシス抑止作用又はアポトーシス様細胞死抑止作用が消失したのである。
【０１０８】
以上の培養神経細胞を用いた実験結果並びに前記した凍結細胞を用いた実験結果より、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１は図１６及び図１７の模式図に示したごとく、その糖鎖部分又は水酸基部分を介して、細胞膜上の糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖と結合（おそらく水素結合）して細胞膜上の糖鎖を架橋することにより細胞に作用し、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１に記載されたごとく多彩な効果、効能、用途、使用方法を示すと言える。即ち、ジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１が細胞に作用するためには、それらと特異的に結合する受容体分子（若しくは標的分子）は必ずしも必要とされないということになる。
【０１０９】
従って、細胞膜上の糖脂質又は糖蛋白の糖鎖（例えばガラクトース、Ｎ−アセチルグルコーサミン、フコース、シアル酸、グルコース、キシロース、マンノース等）と化学的に結合する化合物、特には水素結合する配糖体化合物又は水酸基を有する化合物をスクリーニング又は創製することにより、新規にジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロジンセノサイドＲｂ１と同様の効果、効能、用途、使用方法を示す化合物を見出すことができる。このような化合物を本明細書では、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物として呼んでいる。具体的にジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をスクリーニング又は創製する方法としては、本明細書に記載のごとく、細胞の凍結融解実験及び／又はノイラミニダーゼ処理細胞の培養実験においてジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の候補物質（即ちスクリーニング対象物質）の効果を検証してもよいし、より簡便には例えばビアコアシステムのチップ上に糖蛋白、糖脂質及び／又は糖鎖を固定した上で、スクリーニング対象物質との結合を解析してもよい。もちろん、ビアコアシステムのチップ上にスクリーニング対象物質を固定した上で、糖蛋白、糖脂質及び／又は糖鎖との結合を解析してもよい。また、単純にジンセノサイドＲｂ１の基本骨格部分を修飾したのちに、修飾骨格に任意の糖鎖又は水酸基を結合させて、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物を作製してもよい。このような方法により創製される修飾基本骨格の一部については図１−図６で説明した。また、基本骨格に結合する糖鎖の具体例についても既述した。
【０１１０】
以上のごとく、本発明は標的分子を設定した上で同分子に特異的に作用する化合物をスクリーニングするという従来の方法とは異なり、細胞膜上に存在する多種類の糖蛋白及び／又は糖脂質の糖鎖との非特異的な結合（おそらく水素結合）を化学的に解析、推定又は測定することにより細胞に対して好ましい効果を発揮するジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をスクリーニング／創製する方法を提供するものである。
【０１１１】
実施例２（本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物による造血幹細胞凍結保存）
臍帯血若しくは骨髄移植ドナーから公知の方法により造血幹細胞を採取又は分離し、レシピエントに移植する手技は再生不良性貧血や白血病の治療に欠くことができない。将来の使用に備えて安全かつ確実に造血幹細胞を凍結保存若しくは冷凍保存するために、公知の凍結細胞保存液に本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の何れかを、１ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以下又は１０ｎｇ／ｍｌ以下、更に好ましくは０．００００１ｆｇ／ｍｌ〜１０ｐｇ／ｍｌの濃度で添加することができる。もちろん、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物は、公知の方法により分離同定された神経幹細胞、ＥＳ細胞、皮膚幹細胞の凍結保存のために使用して、将来の移植手術に備えることもできる。更に前記の幹細胞を研究用試料として用いてもよい。また、臍帯血そのものを凍結保存するために、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の何れかを前記濃度で用いることもできる。
【０１１２】
実施例３［本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の１つであるユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）の熱傷治療効果］
ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）がジンセノサイドＲｂ１と同様に創傷治療効果を示すかどうかしらべた。このため、創傷の中でも傷害が重篤なマウス熱傷モデルを用いて実験を実施した。まず、本発明者らはユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を眼科用白色ワセリン（プロペト）に添加することにより、０．００５重量％又は０．０５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペト（皮膚外用製剤）を作製した。
体重２５ｇ程度のＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部に麻酔下で一定サイズの熱傷病変（皮膚全層欠損病変）を作ったのちに、同動物の熱傷部にプロペトのみ、０．００５重量％又は０．０５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトを１日当たり０．１ｇの量で連続単回１７日間外用投与した。なお、２〜３日おきに熱傷部の創傷面積を測定した。結果を図１８に示す。図１８は、熱傷面積の時間経過を示すグラフである。図１８の白丸印は、プロペトのみを外用投与したコントロール例であり、黒丸印は０．００５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトを外用投与した例であり、白四角印は０．０５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトを外用投与した例である。各値は、各群のマウス５匹の平均値±標準誤差で表示した。
＊は、Ｐ＜０．０５で、コントロール群との間の有意差を示す。
【０１１３】
図１８に示すごとく、熱傷後プロペトのみを外用投与した例では、熱傷後６日目に至るまで創傷（熱傷）面積が著しく拡大し、その後少しずつ創傷（熱傷）面積が縮小し始めるものの、熱傷後、１３日目においてもなお創傷（熱傷）面積は、熱傷直後の創傷面積と近似していた。通常の鋭利なメスによる切開創や開放創では、このように顕著な創傷面積の拡大はみられないので、本熱傷モデルは公知の鋭利なメスによる切開創や開放創モデルよりも重篤なものであると言える。一方、０．００５重量％又は０．０５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトを外用投与すると、有意に熱傷による創傷面積の拡大が抑止され、熱傷の治癒及び／又は皮膚組織の再生・再構築が促進された。このことはユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩及び担体（又は基剤）からなる医薬組成物を含有してなる皮膚外用製剤又は皮膚外用製剤組成物が優れた熱傷治療薬となることを示している。
【０１１４】
次に熱傷後１７日目にマウスを麻酔により安楽死せしめ、熱傷部を写真撮影した。結果を図１９に示す。図１９の左側の写真が熱傷後プロペトのみを外用投与した例であり（０％と表示）、図１９の真中の写真が０．００５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトを外用投与した例であり、図１９の右側の写真が０．０５重量％のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトを外用投与した例である。図１９に示すごとく、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含んでなる皮膚外用製剤を皮膚の熱傷部に外用投与することにより、明らかに皮膚組織の再生及び／又は再構築が促進され、更に熱傷部の発毛、育毛、上皮化又は表皮化も促進された。その結果、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有するプロペトの皮膚外用投与により熱傷部の創傷治癒も顕著に促進された。
【０１１５】
実施例４（ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩を含有してなる化粧品類による紫外線障害又は日焼けの予防、処置、改善）
好ましくは０．１重量％以下又は未満のユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩若しくはそれらを含む天然物エキスを公知のゲル状基剤、液状基剤又は水溶性基剤に添加して、ゲル又はローションを調製した。
得られたゲル又はローションは紫外線障害又は日焼けによる皮膚の炎症、かゆみ、発赤、水疱形成又は角層剥離の予防、処置又は改善に顕著な効果を示した。
なお、ゲル又はローションを作製する際に、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩若しくはそれらを含む天然物エキスのほかに、その他の公知の抗炎症剤、活性酸素消去剤、美白剤、保湿剤、紫外線吸収剤、エモリエント剤、薬用人蔘エキス、天然物エキス、ヒアルロン酸、セファランチン（ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎｅ）、オキシアカンチン（Ｏｘｙａｃａｎｔｈｉｎ）、パントテン酸、ビタミンＡ、アスコルビン酸、レチノイン酸、プロリン、セリン、グリシン、リジン、ビタミンＡ　パルミテート、又はそれらの化学的誘導体のうち１つ以上を通常の濃度で添加しても同様の効果が得られる。但し、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）又はその塩若しくはそれらを含む天然物エキスと薬用人蔘エキスとを共に化粧品組成物などの皮膚外用剤組成物として使用するときは、皮膚外用剤（化粧品類、発毛育毛剤、ケミカルピーリン剤、フィジカルピーリング剤）における薬用人蔘エキスの濃度を１０−２０重量％以上、０．００１重量％未満、好ましくは０．００００１重量％未満とすることが望ましい。
【０１１６】
【発明の効果】
本発明は、糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖との結合若しくは細胞膜表面に存在する糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖との結合を測定、推定又は解析することからなる、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をスクリーニングする方法を提供する。より詳細には、本発明は、細胞の凍結融解実験及び／又はノイラミニダーゼ処理実験により、細胞膜表面に存在する糖脂質及び／又は糖蛋白の糖鎖との水素結合を測定又は解析することからなる、ジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えば、糖鎖を有するジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をスクリーニングする方法を提供する。また、本発明は、前記した方法により得られるか、若しくは前記方法・実験結果を基に創製されるジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をも提供する。
本発明の方法により得られるか創製されるジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物、例えばユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）及び／又はその化学的誘導体は、例えば脳神経疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、神経外傷の予防、処置又は治療用医薬組成物、静脈内投与用医薬組成物、細胞のアポトーシス若しくはアポトーシス様細胞死をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、病理組織学的変化をきたす器質的疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、創傷の予防、処置又は治療用医薬組成物、血流障害をきたす疾患の予防、処置又は治療用医薬組成物、化粧品組成物、皮膚・粘膜疾患の予防、処置又は治療のための局所投与用医薬組成物、発毛育毛用組成物、ケミカルピーリングのための組成物、動物成長調整用組成物、植物成長調整用組成物、肥料組成物、飼料組成物、細胞又は組織の冷凍又は凍結のための添加剤組成物、細胞又は組織を冷凍保存又は凍結保存するための添加剤組成物、腫瘍細胞又は不死化細胞を冷凍又は凍結することにより傷害させるための添加剤組成物、悪性腫瘍の予防、転移抑制、処置又は治療のための医薬組成物として有用であるが、これらの効果、効能、用途に限定されるわけではない。
以上のごとく、本発明は標的分子を設定した上で同分子に特異的に作用する化合物をスクリーニングするという従来の方法とは異なり、細胞膜上に存在する多種類の糖蛋白及び／又は糖脂質の糖鎖との非特異的な結合（おそらく水素結合）を化学的に解析、推定又は測定することによりジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物をスクリーニング若しくは創製する方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の基本骨格例を示す図である。
【図２】図２は、図１の続きで図１と同様、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の基本骨格例を示す図である。
【図３】図３は、図２の続きで図２と同様、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の基本骨格例を示す図である。
【図４】図４は、図３の続きで図３と同様、本発明のジンセノサイドＲｂ１　様物質又は組成物の基本骨格例を示す図である。
【図５】図５は、図４の続きで図４と同様、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の基本骨格例を示す図である。
【図６】図６は、図５の続きで図５と同様、本発明のジンセノサイドＲｂ１様物質又は組成物の基本骨格例を示す図である。
【図７】図７は、フリーの凍結皮膚ケラチノサイトの生着細胞数に対するジンセノサイドＲｂ１の効果を示すグラフである。
【図８】図８はフリーの凍結皮膚ケラチノサイトの生着率に対するジンセノサイドＲｂ１の効果を示すグラフである。
【図９】図９は、凍結融解後の皮膚ケラチノサイトの電子顕微鏡像を示す、図面に代わる写真である。左側（Ａ）がジンセノサイドＲｂ１未処置例であり、右側（Ｂ）がジンセノサイドＲｂ１処置例である。
【図１０】図１０は、フリーの凍結皮膚ケラチノサイトの生着細胞数に対するジヒドロジンセノサイドＲｂ１の効果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、フリーの凍結皮膚ケラチノサイトの生着率に対するジヒドロジンセノサイドＲｂ１の効果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、凍結ＨＥＫ２９３細胞に対するジンセノサイドＲｂ１の傷害作用を示すグラフである。
【図１３】図１３は、凍結ＨＥＫ２９３細胞に対するジヒドロジンセノサイドＲｂ１の傷害作用を示すグラフである。
【図１４】図１４は、凍結アストロサイトに対するジヒドロジンセノサイドＲｂ１の保存効果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ジンセノサイドＲｂ１の抗アポトーシス作用に対するノイラミニダーゼの効果を示す、図面に代わるＭＡＰ２イムノブロットの写真である。
【図１６】図１６は、ジンセノサイドＲｂ１と細胞表面上の糖鎖との相互作用を示す模式図である。
【図１７】図１７は、ジンセノサイドＲｂ１の細胞表面糖鎖への結合を示す模式図である。
【図１８】図１８は、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有してなる皮膚外用製剤（薬剤）の投与による熱傷病変面積の経時変化を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）を含有してなる皮膚外用製剤（薬剤）による、熱傷治療後の病変部外観像を示す、図面に代わる写真である。
【図２０】図２０は、ユークリフィン（ｅｕｃｒｙｐｈｉｎ）の化学的誘導体の例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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