(57)【要約】【課題】胃癌腹膜播種又は腹腔内遊離癌細胞の検出のため、特異性の高い新規マーカーを同定する。【解決手段】被験者から生体試料を採取するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方の存在を被検者の生体試料から検出するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方が存在する場合には、胃癌由来の転移癌細胞が前記試料中に含まれている可能性が高いと判断するステップとを含む方法により、胃癌由来の転移癌細胞を検出する。これらを胃癌由来の転移癌細胞のマーカーとして使用することによって、胃癌患者の腹膜転移の有無を迅速かつ確実に検出することができ、腹腔内癌化学療法を適用すべきかの決定のための有力な材料が提供される。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から生体試料を採取するステップと、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方の存在を被検者の生体試料から検出するステップと、
アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方が存在する場合には、胃癌由来の転移癌細胞が前記試料中に含まれている可能性が高いと判断するステップと
を含む胃癌由来の転移癌細胞の検出方法。
【請求項２】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの存在を、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡの存在により確認することを特徴とする請求項１の転移癌細胞の検出方法。
【請求項３】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの存在を抗体により検出することを特徴とする請求項１に記載の転移癌細胞の検出方法。
【請求項４】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー対又はプローブを含んでなる胃癌由来の転移癌細胞の診断キット。
【請求項５】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼを検出するための抗体を含んでなる胃癌由来の転移癌細胞の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、胃癌由来の転移癌細胞の検出方法の検出方法、より詳細には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼをマーカーとした、胃癌の腹膜播種又は腹腔内遊離癌細胞のような胃癌由来の転移癌細胞の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
胃癌は、日本と東南アジアでは消化管で最も多くみられる悪性腫瘍であり、癌死亡率では、胃癌が世界で第２位を占めている（Ｐａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）。胃癌の予後は、診断技術や胃癌の治療法の発達により改善しているが、進行癌の治癒的切除の後に起こる再発の主原因は腹膜播種である。胃漿膜にまで浸潤した胃癌の予後は、５年生存率が３５％と低い（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９）。胃癌細胞のこのような悪性の特性のうちで、腹膜への転移は特に複雑な現象であり、多くのステップと多くの遺伝子が関与している。胃癌の腹膜播種には、接着分子、アポトーシス関連遺伝子および他の遺伝子が深く関与しているという報告があるが（Ｔａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  ２０００；  Ｙａｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）、胃癌の転移のメカニズムの解明には、さらなる研究が必要である。癌の転移能に関係すると考えられている遺伝子発現の変化により、原発性腫瘍細胞の基底層からの脱出とアポトーシスへの耐性が高まることがわかっているが、そのメカニズムの詳細は未だ不明である。
【０００３】
胃癌の腹膜播種のメカニズムを研究するために、Ｐａｒｋらは、原発病巣からＳＮＵ−１、ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６およびＳＮＵ−７１９、腹水から他の癌細胞株を樹立した（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  １９９４）。ＳＮＵ細胞系は特に集中的に研究されている。例えば、ＳＮＵ−１６ではｃＭＥＴが増幅され、ＳＮＵ−１、ＳＮＵ−５およびＳＮＵ−１６ではＴＧＦ−β２型受容体、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９およびｃ−ｅｒｂＢ２の過剰発現が観察され、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞ではＫ−ｓａｍが増幅され（Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）、ＧＴ３ＴＫＢではＥカドヘリンの発現が減少する（Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）ことが確認されている。しかし、転移性胃癌細胞における遺伝子の共通した変化は、まだ明らかにされていない。
癌転移には、複数の遺伝子が協同して関与することが知られているにもかかわらず、単一の遺伝子又は少数の遺伝子と転移との関連についてのみしか報告されていない。また、癌原発巣の転移能の相違は、発現された遺伝子の組み合わせが異なることに起因するものと考えられている。そのため、転移の程度および転移先の点で異なる転移能を有する胃癌細胞の遺伝子発現の解析は、胃癌腹膜播種のメカニズムの解明に重要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
胃癌の予後を改善するために、発明者らは、マイトマイシンＣ吸着微粒子活性炭（ＭＭＣ−ＣＨ）腹腔内投与による漿膜浸潤陽性胃癌の再発予防を開発している。しかし、ＭＭＣ−ＣＨなどの腹腔内癌化学療法には、血小板減少、イレウス等の副作用があるため、胃癌細胞の腹腔内への転移可能性を確認し、腹腔内癌化学療法を適用すべきかどうか迅速に決定する必要がある。
消化器系の癌の診断には、一般的にＣＥＡ（癌胎児性抗原）がマーカーとして使用され、これを指標にした迅速定量ＲＴ−ＰＣＲを腹腔内遊離癌細胞の検出に使用することが国内では愛知癌センター等から提案されている。しかし、このマーカーは、上皮性の正常細胞や中皮細胞で弱く発現しているため、擬陽性と判断されるケースが多く、腹腔内の癌細胞の検出には難点がある。
そこで、本発明は、胃癌の腹膜播種又は腹腔内遊離癌細胞のような胃癌由来の転移癌細胞の検出のため、特異性の高い新規マーカーを同定することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
胃癌が腹腔転移性であるかどうかを迅速に判断するための特異性の高いマーカーを見つけるために、発明者らは、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、胃癌腹膜播種由来の細胞株であるＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６、ＳＮＵ−７１９、ＫＡＴＯ−ＩＩＩおよびＧＴ３ＴＫＢ細胞における約２１０００個の遺伝子の発現プロフィールを解析した。対照として、胃癌原発巣由来細胞株であるＳＮＵ−１を用いた。胃癌の腹膜播種に由来する細胞では特異的に高い発現を示すが、胃癌原発巣由来細胞では発現しないか極めて発現が弱い遺伝子を約２０種同定した。
【０００６】
さらに、遺伝子の発現の変化とノザンブロッティング又はＲＴ−ＰＣＲの解析とを組み合わせることにより、胃癌腹膜播種に由来する細胞に特異的な上記２０種の遺伝子が、腹腔内の微小癌細胞の存在診断と術中迅速診断への応用が可能かどうかを検討した。その結果、ＣＥＡと同程度、あるいはそれ以上の感度および特異性を有する遺伝子を同定した。
発明者らは、胃癌原発巣細胞には発現しないが、胃癌腹膜播種に由来する細胞で特異的に発現する遺伝子として、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ；ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）およびドーパデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ；ｄｏｐａ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）を同定し、これらの遺伝子が、胃癌由来の転移癌細胞の検出マーカーとして使用できることを見出した。
したがって、本発明は、被験者から生体試料を採取するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方の存在を被検者の生体試料から検出するステップと、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの少なくとも一方が存在する場合には、胃癌由来の転移癌細胞が前記試料中に含まれている可能性が高いと判断するステップとを含む胃癌由来の転移癌細胞の検出方法を提供する。
ここで、「アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼが存在する」とは、少なくともこれらの酵素をコードしている遺伝子がｍＲＮＡに転写されていることを意味し、もちろんこれらがタンパク質に翻訳されている場合も含むものとする。
アルデヒドデヒドロゲナーゼ若しくはドーパデカルボキシラーゼ、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼとドーパデカルボキシラーゼの両方を腹膜播種のような胃癌由来の転移癌の検出マーカーとして使用することにより、高い検出感度で被検者の腹水、術中腹腔洗浄細胞等のような生体試料から胃癌の腹膜播種細胞を検出することが可能である。
【０００７】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの発現をそれらのｍＲＮＡの存在により確認することができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡの存在の有無は、プライマー又はプローブを用いて確認できる。アルデヒドデヒドロゲナーゼのｍＲＮＡの存在を確認するためのプライマーとしては、配列番号１および２に記載のプライマー対を例示することができ、ドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡの存在を確認するためのプライマーとしては、配列番号３および４に記載のプライマー対を例示することができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼのｍＲＮＡの存在を確認するためのプローブとしては、配列番号５に記載のプローブを例示することができ、ドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡの存在を確認するためのプローブとしては、配列番号６に記載のプローブを例示することができる。
【０００８】
別の方法として、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの存在を抗体を用いて検出することができる。
さらには、本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡの存在を検出するためのプライマー、例えば、配列番号１および２、又は配列番号３および４に記載の配列を有する一対のプライマーを提供する。本発明は、また、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブ、例えば、配列番号５又は６に記載の配列を有するプローブを提供する。またさらに、本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼを検出するための抗体を提供する。
【０００９】
これらのプライマー、プローブ若しくは抗体、又はそれらを含んでなる診断キットを用いてアルデヒドデヒドロゲナーゼ若しくはドーパデカルボキシラーゼ、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼの両方をそのｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで検出することにより、被験者、特に胃癌患者の腹膜転移の有無を迅速かつ確実に検出することができ、腹腔内癌化学療法を適用すべきかの決定のための有力な材料が提供される。
【００１０】
被検者の生体試料としては、腹腔内に由来するものであれば特に限定されるものではなく、具体的には、被験者の腹膜のような腹腔の組織、腹水、術中腹腔洗浄中に含まれる細胞、腹腔内洗浄液（腹腔内洗浄に供された後に回収した洗浄液）等を例示できる。特に、腹水、術中腹腔洗浄細胞、腹腔内洗浄液が取得容易であるため好ましい。なお、本明細書では、原発性胃癌細胞に由来した腹腔内に転移した癌細胞を総称して、「転移癌細胞」と呼ぶ。転移癌細胞には、例えば、腹腔内遊離癌細胞、胃癌腹水癌細胞、及び腹膜播種などが含まれる。被験者は、患者、特に、癌患者、好ましくは胃癌の腹膜転移が疑われる患者をいう。
【発明の実施の形態】
【００１１】
アルデヒドデヒドロゲナーゼは、細胞内外のアルデヒドからの細胞の防御機構に関連するタンパク質であるとして知られており、正常肝細胞や肝細胞癌での発現が報告されている（Ｃａｎｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｄｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｃａｎｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。また、ドーパデカルボキシラーゼは、別名芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼとも呼ばれ、腎臓、肝臓、脳など各組織に分布し、生理活性アミンの生合成系、例えば神経伝達物質のドーパミンやセロトニンの合成に関連している。ドーパデカルボキシラーゼは、神経芽細胞腫や肺小細胞癌において高い発現が報告されている（Ｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼは、胃癌を除く他の癌での報告が散見されているが、胃癌での発現は報告されていない。また、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼについて、胃癌を含め、癌のマーカーに使用できるという報告はない。
【００１２】
腹膜播種細胞又は胃癌腹水癌細胞を検出するために、本発明では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ若しくはドーパデカルボキシラーゼ、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼとドーパデカルボキシラーゼをマーカーとして用いるが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの検出は、ｍＲＮＡのレベルでもタンパク質のレベルでも行なうことができる。
【００１３】
ｍＲＮＡレベルの検出では、ノザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法又はそれらの組み合わせなどの各種の方法を用いることができるが、これらの方法に特に限定されることなく任意の方法によりｍＲＮＡを定量的、定性的に測定することができる。例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼのｍＲＮＡをノザンブロットにより検出するためのプローブとしては、５’ＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＴＡＡＣＡＣＡＡＴ３’（配列番号５）が、ドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡをノザンブロットにより検出するためのプローブとしては、５’−ＡＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＡＧＧＧＣＴＴＡＴＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣＣＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＧＧＡＴＧＴＡＴＧＧＡＧＴＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＴＡＴＡＴＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＧＴＣＣＡ−３’（配列番号６）がそれぞれ挙げられる。
ｍＲＮＡの検出には、適当なプローブを用いて行なうことができる。ここで、本発明のプローブは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡ配列の一部と実質的に相補的な配列を有すればよく、プローブ配列の長さおよびｍＲＮＡのどの部位と実質的に相補的であるかなどは特に限定されない。ここで、実質的に相補的とは、プローブがアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡと特異的にハイブリッドできる程度に相補的であればよいことを意味する。さらに、これらのプローブは、５’側又は３’側、又はその両方に、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡ配列と相補的ではない配列を含んでもｍＲＮＡ配列と特異的にハイブリッドできる限り、本発明のプローブに含まれるものとする。例えば、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることができる。また、検出しやすいように５’末端を標識したものを用いることもでき、そのような標識としては、たとえば、ビオチン、蛍光、又は３２Ｐなどが例示できる。
【００１４】
本発明のプライマーは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのうち、上流および下流の配列の一部と実質的に相補的なプライマー対であればよく、プライマー配列の長さおよびｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのどの部位と実質的に相補的であるかなどは特に限定されない。ここで、実質的に相補的とは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリッドできる程度に相補的であればよいことを意味する。たとえば、これらのプライマーは、５’側又は３’側、又はその両方に、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリッドできる限り、本発明のプライマーに含まれるものとする。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、これらのｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。
【００１５】
アルデヒドデヒドロゲナーゼの検出のためのプライマーの例として、配列番号１および２の配列を有するプライマー対、ドーパデカルボキシラーゼの検出のためのプライマーの例として、配列番号３および４の配列を有するプライマー対が挙げられる。
アルデヒドデヒドロゲナーゼの検出のためのプローブの例として、配列番号５の配列を有するプローブ、ドーパデカルボキシラーゼの検出のためのプローブの例として、配列番号６の配列を有するプローブが挙げられる。
【００１６】
タンパク質レベルの検出では、抗体を用いて検出することができ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼに対するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、又はそれらの抗原結合性の断片などを用いることができるが、特異性が高い点から、モノクローナル抗体がより好ましい。
上記各種の抗体は、当業者に公知の方法に基づいて作成できる。例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼ、又はそれらの一部のポリペプチドを抗原として用い、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ等の動物に対して通常行われる免疫操作を実施してポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作成する。通常は、モノクローナル抗体の作成には、ミエローマと脾臓細胞とを融合してハイブリドーマを作成するハイブリドーマ法又はその各種の変法を用いることができる。
【００１７】
検出を容易にするために、抗体を標識することが好ましい。例えば、蛍光標識（ＦＩＴＣなど）、フッ素−クロム標識、酵素標識（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、フィコエリトリンなど）、放射標識（３２Ｐ、１２５Ｉなど）、ビオチン標識、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、金コロイド標識などによる標識が挙げられる。
タンパク質の検出では、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、ＥＬＩＳＡ、ＩＤＡＴ法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、オクタロニー解析、免疫電気泳動、又はそれらの組み合わせなどの各種の方法を用いることができるが、これらの方法に特に限定されることなく任意の方法によりタンパク質を定量的、定性的に測定することができる。
なお、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの存在を酵素活性の測定等により、検出することも可能である。
アルデヒドデヒドロゲナーゼまたはドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質の検出の検出は、当業者に公知の方法により行なうことができる（例えば「新遺伝子工学ハンドブック」改定第３版、松村正實、山本雅編集、１９９９年９月１０日、羊土社を参照）。
【００１８】
被験者の腹腔内播種の有無の判断には、被験者の生体試料中から、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質を検出する。必要に応じて、ｍＲＮＡとタンパク質の両方のレベルを測定することによって腹膜転移が起こっているかどうかを判断するための材料としてもよい。
検出用キットは、プローブ、プライマー又は抗体のほか、採用する検出方法に応じて任意の試薬、緩衝液、容器等を含んでもよい。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ用には、逆転写酵素、緩衝液、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼなどを含む。
【実施例】
以下に実施例をあげて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらにより本発明を制限することを意図するものではない。
実施例１：腹水から得られた胃癌細胞系のｃＤＮＡのマイクロアレイによる遺伝子発現解析
高密度ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、胃癌の腹膜播種に由来する細胞株および胃癌原発巣由来細胞株において２１１６８個の遺伝子の発現を解析し、遺伝子発現プロフィールを比較した。
【００１９】
胃癌細胞株ＳＮＵ−１、ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６、ＳＮＵ−７１９はＰａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．により樹立された。ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、およびＧＴ３ＴＫＢは理研細胞バンク（筑波、日本）より購入した。これらの細胞のうち、ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６、ＳＮＵ−７１９、ＫＡＴＯ−ＩＩＩおよびＧＴ３ＴＫＢは、胃癌腹膜播種由来の細胞株であり、ＳＮＵ−１は胃癌原発巣由来細胞株である。ＧＴ３ＴＫＢは、一定の湿度に保ち、高グルコースＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）中で、３７℃で５％のＣＯ２下で維持した。ＤＭＥＭには、１０％牛胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えた。８０〜９０％の集密に達した後、冷ＰＢＳで洗浄し、迅速にホモジナイズした。各細胞系から抽出したｍＲＮＡは、使用説明書に従い、ＦＡＳＴ  ｔｒａｃｋキットＶｅｒ．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により精製した。
【００２０】
プローブの作成は次のように行なった。各細胞株から精製したｍＲＮＡのうち１μｇを、ランダムプライム逆転写の間、Ｃｙ３を組み込むことにより標識した。各胃癌細胞株から得たｃＤＮＡは、Ｃｙ５で標識し、全組織について発現レファレンスとして使用した。正常胃粘膜の３０サンプルのｍＲＮＡを、対照として使用した。標識は、４００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）；０．１ｍＭのＣｙ３−ｄＵＴＰ（又はＣｙ５−ｄＵＴＰ）；０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ各々、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、６μｌの５×ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄバッファーおよび６μｇのランダムプライマーを含む全体積３０μｌ中において、４２℃で１時間行った。不要なヌクレオチドを除くために、標識したｃＤＮＡを、５００μｌの結合バッファー（０．０３％ゼラチンおよび２ｎｇ／μｌのｔＲＮＡを含む、５Ｍのグアニジンチオシアネート／１０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．０／０．１ｍＭのＥＤＴＡ）および５０μｌのシリカマトリクスバッファー（１０％マトリクス／３．５Ｍグアニジン塩酸塩／２０％グリセロール／０．１ｍＭのＥＤＴＡ／２００ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８〜５．０）と混合し、ＧＦＸカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通して、Ｓｏｌｖｅｌｌの遠心分離機（ＲＣ−３Ｂ  ｐｌｕｓ；  Ｈ６０００Ａ／ＨＢＢ６  ローター）を用いて１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。流出物を廃棄し、カラムを５００μｌの洗浄バッファーで洗浄した。吸着したプローブを最終容量１７μｌの蒸留水に溶出した。この標識プローブを、３μｌのブロッキング溶液（１０μｇ／μｌのオリゴ（ｄＡ）、３μｌの２０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡ、１μｌの２０μｇ／μｌマウスＣｏｔ１ＤＮＡ、５．１μｌの２０×ＳＳＣおよび０．９μｌの１０％ＳＤＳ）と混合した（Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。
【００２１】
アレイハイブリダイゼーションおよびデータ解析は、次のように行なった。標的を含む理研ｃＤＮＡを、３つのマルチブロックからなる完全アレイ（各マルチブロックは１０μｌのハイブリダイゼーション溶液を要する）の最終容量３０μｌ中でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの前に、プローブアリコートを９５℃で１分間加熱し、その後室温に戻した。カバースリップを６５℃でＨｙｂｄｉｃａｓｅｔｔｅ（ＡｒｒａｙＩｔ．ｃｏｍから入手）においてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、スライドを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中でカバースリップが外れるまで洗浄し、その後１×ＳＳＣ中に移し、２分間穏やかに攪拌し、０．１×ＳＳＣで２分間洗浄した。洗浄後、スライドをＳｏｒｖａｌｌ遠心分離機（ＲＣ−３Ｂ  ｐｌｕｓ：  Ｈ６０００Ａ／ＨＢＢ６ローター）により８００ｒｐｍで遠心した。これらのスライドを、ＳｃａｎＡｒｒａｙ５０００共焦点レーザースキャナーによりスキャンし、得られた画像をＩＭＡＧＥＮＥ  （ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ：  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ）を用いて解析した。
【００２２】
データの正確さを高めるために、２回の別々の反応において同じＲＮＡテンプレートを標識した、２回の実験を行った。データは、ゼロ以外であれば中央観測値（ｍｅｄｉａｎ  ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｖａｌｕｅ）を差し引き（ログスペース）することによりレファレンス標準と標準化した。再現可能なデータポイントのみを使用した。信頼度の低いデータを除外するために、ソフトウエア解析の結果、胃癌腹膜播種由来の細胞株と胃癌原発巣由来細胞株の両細胞系に発現しないと判断された遺伝子を除いた。
【００２３】
発現した１１６８０〜１５１５１個の遺伝子のなかで、４４個の遺伝子が、対照であるＳＮＵ−１の発現の２倍の発現を示し、３０個が他の細胞系の発現の半分以上の発現を示した。これらの結果を確認するために、ノザンブロット解析を行い、ｃＤＮＡアレイに関して２倍以上の発現を示した全ての遺伝子を解析した。
ノザンブロットは、以前発明者らが報告した方法（Ｓａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  １９９６）により行った。簡単に説明すると、全細胞ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム法により調整した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの選択は、オリゴｄＴカラムにより行い、１％アガロース／２．２Ｍのホルムアルデヒドゲルにおいて分画した。プローブには、３２Ｐでランダムプライムにより標識したものを用いた。選択した各々の遺伝子とβアクチンを、プローブとハイブリダイズさせた。各ブロットをＢＡＳ２０００イメージアナライザーによりシグナル解析し、対照であるＳＮＵ−１と比較して過剰発現している度合いを計算した。
【００２４】
ノザンブロット解析による発現レベルにおける２倍以上の変化が有意であると考えると、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析との整合性は５５％（７４個のうちの４１個）であるが、２７％（７４個のうちの２０個）は有意な変化を示さず、１８％（７４個のうちの１３個）はｃＤＮＡマイクロアレイとは整合しない結果となった。マイクロアレイおよびノザンブロット解析により解析された遺伝子を、表１と２にまとめた。
【００２５】
【表１】
2004321102.tif 000002
【００２６】
【表２】
2004321102.tif 000003
【００２７】
実施例２：８個の胃癌細胞系における選択された遺伝子の発現
他の胃癌細胞系について腹膜播種能はこれまでの報告にいくつかまとめられているので、実施例１で調べた６個の細胞株に加えて他の２つの胃癌細胞株ＭＫＮ７とＮＵＧＣ−３を用いて、ＳＮＵ−１と他の胃癌細胞系との間で発現に差を生じる遺伝子が胃癌細胞株の腹膜播種能に相関関係があるかどうかをノザンブロット解析により調べた。ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６およびＳＮＵ−７１９の４種の細胞株が、高い播種能を有することを知られているため、ヌードマウスを用いた腹膜播種モデルとしてこれらの細胞株を使用した。ＭＫＮ７は理研細胞バンク（筑波、日本）より購入した。ＮＵＧＣ−３細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（大阪、日本）から購入した。ＭＫＮ７およびＮＵＧＣ−３を１０％牛胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）中で維持した。他の胃癌細胞系は、実施例１に記載のとおり培養した。ＭＫＮ７およびＮＵＧＣ−３は、動物実験により接種後４週間後でも腹膜転移を生じないことを確認した。ヌードマウスにおけるＧＴ３ＴＫＢの播種能については、報告がない。
【００２８】
ノザンブロット解析は、実施例１に記載のとおりに行なった。典型的なデータを図１と図２にまとめた。図１および図２は、８種の胃癌細胞における異なる発現を示す遺伝子のノザンブロット解析である。図１は、原発巣と比べて、胃癌腹膜播種由来の細胞において発現量が増加した遺伝子を示す。図２は、原発巣と比べて、胃癌腹膜播種由来の細胞において発現量が減少した遺伝子を示す。
これらの結果から、細胞は、次の３つのグループに分類できることが明らかになった。（ａ）腹膜播種についての高いポテンシャルを有する細胞株ＳＮＵ−５、ＳＮＵ−１６、ＳＮＵ−７１９、ＫＡＴＯ−ＩＩＩおよびＧＴ３ＫＴＢ、（ｂ）播種についてのポテンシャルがない腫瘍由来細胞系であるＳＮＵ−１、（ｃ）播種について低いポテンシャルしか有さないか、ポテンシャルがないＭＫＮ７およびＮＵＧＣ−３。
【００２９】
多くの遺伝子、例えばＣＤ４４およびケラチンファミリー遺伝子が腹膜播種由来の胃癌細胞に強く発現された。アルデヒドデヒドロゲナーゼやＩＰ３Ｒのような遺伝子は、播種について高いポテンシャルがある細胞のみにおいて高レベルで発現するが、播種について低いポテンシャルを有する細胞では、低レベルの発現を示すか、ほとんど発現されなかった。これらの遺伝子における発現量の変化は、胃癌腹膜播種について特異的であると考えられる。ｐ２７のよう発現量が減少した遺伝子の多くは、他の全ての胃癌細胞系で抑制されたが、ＩＬ４Ｓｔａｔのようないくつかの遺伝子は、腹膜播種の胃癌細胞において集中的に発現量が減少した。
【００３０】
実施例３：臨床検体におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼのＲＴ−ＰＣＲ
実施例１および実施例２の結果から、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼは、原発性胃癌細胞では発現されないか又は極めて発現量が低いが、胃癌腹膜播種由来の細胞では発現量が増加するため、これらの発現を調べることによって、腹腔内の微小癌細胞の存在診断に使用できると考えられた。これらの遺伝子の発現を腹腔内微小癌細胞の存在診断に適用できるかどうかを確かめるため、京都府立医大消化器外科における胃癌手術症例のうち、胃癌癌性腹膜炎患者１２例、非癌患者２１例をそれぞれポジティブコントロール、ネガティブコントロールとし、実際に腹膜転移しているかどうか不明である漿膜浸潤陽性胃癌患者１８例において、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼの発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。
【００３１】
胃癌癌性腹膜炎患者から穿刺吸引した癌性腹水、非癌患者および漿膜浸潤陽性胃癌患者の術中腹腔洗浄水中に含まれる細胞を遠心により集め、ＡＧＰＣ変法によってＲＮＡを抽出後、アルデヒドデヒドロゲナーゼには、配列番号７のセンスプライマー５’−ＡＴＴＧＴＧＴＴＡＧＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号７）および配列番号８のアンチセンスプライマー５’−ＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡ−３’（配列番号８）を、ドーパデカルボキシラーゼには、配列番号９のセンスプライマー５’−ＡＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＡ−３’（配列番号９）および配列番号１０のアンチセンスプライマー５’−ＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＴＧＣＧＧＡＴＡＴＡＡＧ−３’（配列番号１０）をそれぞれ用いて、ｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型として、Ｇｅｎｅ  ａｍｐ５７００を使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、アルデヒドデヒドロゲナーゼには配列番号１のセンスプライマー５’−ＡＴＴＧＴＧＴＴＡＧＣＴＧＡＴＧ  ＣＣＧＡＣＴＴ−３’および配列番号２のアンチセンスプライマー５’−ＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＡ−３’を、ドーパデカルボキシラーゼには配列番号３のセンスプライマー５’−ＡＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＣＡＤＤＣ−ＡＳ１２１７および配列番号４のアンチセンスプライマー５’−ＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＴＧＣＧＧＡＴＡＴＡＡＧ−３’をそれぞれ用いた。
アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびドーパデカルボキシラーゼのＲＴ−ＰＣＲの結果は、以下のとおりである。
【００３２】
【表３】
2004321102.tif 000004
【００３３】
表中、特異性は、胃癌癌性腹膜炎患者１２例のうちのアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼが検出された例数を示し、感度は、非癌患者２１例のうちのアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼが検出されなかった例数を示す。漿膜浸潤陽性胃癌患者については、１８例のうち、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼが検出された例数である。
漿膜浸潤陽性胃癌患者は、その後の再発を確認されていないが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼが検出された患者は、腹腔内に転移した可能性が極めて高いと推測される。
【００３４】
実施例４：アルデヒドデヒドロゲナーゼの感度検定
中皮細胞培養株又は健常者の抹消血リンパ球と胃癌細胞株ＳＮＵ−５を混合してＲＴ−ＰＣＲによりアルデヒドデヒドロゲナーゼの感度検定を行なった。また、正常細胞と胃癌細胞株ＳＮＵ−５を混合してＣＥＡの感度検定を行い比較した。アルデヒドデヒドロゲナーゼの感度検定に用いたプライマーおよびＲＴ−ＰＣＲの条件は実施例３とほぼ同じである。アルデヒドデヒドロゲナーゼの感度検定では、正常リンパ球１×１０４〜５個中１個の癌細胞を検出でき、中皮細胞培養株１×１０４〜５個中１個の癌細胞を検出できた。ＣＥＡを用いた場合、検出感度は、正常細胞１×１０４〜５個の癌細胞を検出可能であるが、ＣＥＡは中皮細胞では弱く発現しているため、中皮細胞中での検出感度はかなり低下する。したがって、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＣＥＡに比べて高感度であるといえる。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ若しくはドーパデカルボキシラーゼ、又はその両者を、腹腔内の微小癌細胞の存在診断と術中迅速診断への応用が可能な、腹腔内遊離癌細胞の検出用のマーカーに用いることができる。アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼは、従来から検出用マーカーとして用いられているＣＥＡと比べて、上皮性の正常細胞や中皮細胞で発現しないため、その発現を検出することにより、高い特異性および感度で腹腔内遊離癌を検出できる。アルデヒドデヒドロゲナーゼ又はドーパデカルボキシラーゼの発現の有無を調べることにより、被験者の腹腔内播種の有無を高い精度で検出して、その後の腹腔内癌化学療法を行なうかどうかの指針の一つとして用いることができる。
【配列表】
2004321102.tif 000005
2004321102.tif 000006
2004321102.tif 000007
2004321102.tif 000008
2004321102.tif 000009
【００３６】
この出願に関連する先行技術文献情報としては次のものがある。
【非特許文献１】
Ｂａｌｌｉｆ  ＢＡ，  Ｍｉｎｃｅｋ  ＮＶ，  Ｂａｒｒａｔｔ  ＪＴ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＭＬ  ａｎｄ  Ｓｉｍｍｏｎｓ  ＤＬ．  （１９９６）  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，  ９３：５５４４−９．
【非特許文献２】
Ｂｒｏａｄ  ＬＭ，  Ｂｒａｕｎ  ＦＪ，  Ｌｉｅｖｒｅｍｏｎｔ  ＪＰ，  Ｂｉｒｄ  ＧＳ，  Ｋｕｒｏｓａｋｉ  Ｔ  ａｎｄ  Ｐｕｔｎｅｙ  ＪＷ  Ｊｒ．  （２００１）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ  １，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｖｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｅｎｔｒｙ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１５９４５−５２．
【非特許文献３】
Ｃａｎｕｔｏ  ＲＡ，  Ｆｅｒｒｏ  Ｍ，  Ｓａｌｖｏ  ＲＡ，  Ｂａｓｓｉ  ＡＭ，  Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ  Ａ，  Ｍａｇｇｉｏｒａ  Ｍ，  Ｍａｒｔｉｎａｓｓｏ  Ｇ，  Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｒ  ａｎｄ  Ｍｕｚｉｏ  Ｇ．  （２００１）  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｌａｓｓ  ２  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ３５７：８１１−８．
【非特許文献４】
Ｃｈｉｓｈｏｌｍ  ＣＡ，  Ｖａｖｅｌｉｄｉｓ  Ｆ，  Ｌｏｖｅｌｌ  ＭＡ，  Ｓｗｅｅｔｍａｎ  Ｌ，  Ｒｏｅ  ＣＲ，  Ｒｏｅ  ＤＳ，  Ｆｒｅｒｍａｎ  ＦＥ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ  ＷＧ．  （２００１）  Ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｙｓｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ．  Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ．，  ２１：８５６−９．
【非特許文献５】
Ｃｈｕ  ＰＧ，  Ｌｙｄａ  ＭＨ，  Ｗｅｉｓｓ  ＬＭ．  （２００１）  Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  １４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ：  ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ４３５  ｃａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｖａｌｕｅ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｆｒｏｍ  ｏｔｈｅｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｍｏｕｒｓ．  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ；  ３９：９−１６
【非特許文献６】
Ｄａｖｉｅｓ  ＥＬ，  Ｇｅｅ  ＪＭ，  Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ＲＡ，  Ｊｉａｎｇ  ＷＧ，  Ｓｈａｒｍａ  ＡＫ，  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＲＩ  ａｎｄ  Ｍａｎｓｅｌ  ＲＥ．  （１９９９）  Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｓｍｏｐｌａｋｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  ３５，  ９０２−７．
【非特許文献７】
Ｄｅｉｃｈｍａｎｎ  Ｍ，  Ｂｅｎｎｅｒ  Ａ，  Ｂｏｃｋ  Ｍ，  Ｊａｃｋｅｌ  Ａ，  Ｕｈｌ  Ｋ，  Ｗａｌｄｍａｎｎ  Ｖ  ａｎｄ  Ｎａｈｅｒ  Ｈ．  （１９９９）  Ｓ１００−Ｂｅｔａ，  ｍｅｌａｎｏｍａ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ａｎｄ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｇｅ  ＩＶ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，  １７：１８９１−６．
【非特許文献８】
Ｅｉｓｅｎ  Ｍ  Ｂ  ，  Ｓｐｅｌｌｍａｎ  Ｐ  Ｔ，  Ｂｒｏｗｎ  Ｐ０  ａｎｄ  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  Ｄ  （１９９８）  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｉ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５，１４８６３−１４８６８．
【非特許文献９】
Ｅｌ−Ｒｉｆａｉ  Ｗ，  Ｆｒｉｅｒｓｏｎ  ＨＦ  Ｊｒ，  Ｈａｒｐｅｒ  ＩＣ，  Ｐｏｗｅｌｌ  ＳＭ，  ａｎｄ  Ｋｎｕｕｔｉｌａ  Ｓ．  （２００１）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ｃＤＮＡ  ａｒｒａｙ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  ９２：８３２−８．
【非特許文献１０】
Ｇａｌｂｉａｔｉ  Ｆ，  Ｒａｚａｎｉ  Ｂ  ａｎｄ  Ｌｉｓａｎｔｉ  ＭＰ．  （２００１）  Ｃａｖｅｏｌａｅ  ａｎｄ  ｃａｖｃｏｌｉｎ−３  ｉｎ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ；  ７：４３５−４１．
【非特許文献１１】
Ｇｈｉｇｎａ  Ｃ，  Ｍｏｒｏｎｉ  Ｍ，  Ｐｏｒｔａ  Ｃ，  Ｒｉｖａ  Ｓ  ａｎｄ  Ｂｉａｍｏｎｔｉ  Ｇ．  （１９９８）  Ａｌｔｅｒｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ＳＲ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ５８：５８１８−２４．
【非特許文献１２】
Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｊ，  Ｈａｂｅｒ  Ｍ，  Ｂｏｒｄｏｗ  ＳＢ，  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＧＭ  ａｎｄ  Ｎｏｒｒｉｓ  ＭＤ．  （１９９９）  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｆｒｏｍ  ｏｔｈｅｒ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｓｍａｌｌ  ｒｏｕｎｄ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，  １５５：１７−２１．
【非特許文献１３】
Ｈａｓｈｉｄａ  Ｈ，  Ｔａｋａｂａｙａｓｈｉ  Ａ，  Ｔｏｋｕｈａｒａ  Ｔ，  Ｔａｋｉ  Ｔ，  Ｋｏｎｄｏ  Ｋ，  Ｋｏｈｎｏ  Ｎ，  Ｙａｍａｏｋａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｍｉｙａｋｅ  Ｍ．  （２００２）  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ：  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭＲＰ−１／ＣＤ９  ａｎｄ  ＫＡＩ１／ＣＤ８２．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  ９７：５１８−２５．
【非特許文献１４】
Ｈｅｎｒｙ  ＭＤ，  Ｃｏｈｅｎ  ＭＢ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＫＰ．  （２００１）  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ，  ３２：７９１−５．
【非特許文献１５】
Ｈｉｐｐｏ  Ｙ，  Ｙａｓｈｉｒｏ  Ｍ，  Ｉｓｈｉｉ  Ｍ，  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｈ，  Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  ５，  Ｈｉｒａｋａｗａ  Ｋ，  Ｋｏｄａｍａ  Ｔ  ａｎｄ  Ａｂｕｒａｔａｎｉ  Ｈ．  （２００１）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｓｃｉｒｒｈｏｕｓ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｐｅｒｉｔｏｎｅｕｍ  ｏｒ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ６１：８８９−９５．
【非特許文献１６】
Ｈｏｎｇ  ＴＭ，  Ｙａｎｇ  ＰＣ，  Ｐｅｃｋ  Ｋ，  Ｃｈｅｎ  ＪＪ，  Ｙａｎｇ  ＳＣ，  Ｃｈｅｎ  ＹＣ  ａｎｄ  Ｗｕ  ＣＷ．  （２０００）  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ＰＴＥＮ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，  ２３：３５５−６３．
【非特許文献１７】
Ｈｓｉｅｈ  ＨＦ，  Ｙｕ  ＪＣ，  Ｈｏ  ＬＩ，  Ｃｈｉｕ  ＳＣ  ａｎｄ  Ｈａｍ  ＨＪ．  （１９９９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ，  ５２：２５−８．
【非特許文献１８】
Ｉｓｈｉｉ  Ｙ，  Ｏｃｈｉａｉ  Ａ，  Ｙａｍａｄａ  Ｔ，  Ａｋｉｍｏｔｏ  ５，  Ｙａｎａｇｉｈａｒａ  Ｋ，  Ｋｉｔａｊｉｍａ  Ｍ  ａｎｄ  Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ  Ｓ．  （２０００）  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ６ｂｅｔａ４  ａｓ  ａ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｎｄ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  １８，  ４９７−５０６．
【非特許文献１９】
Ｋａｏｔａ  Ｋ，  Ｍｉｋｉ  Ｒ  ，  Ｂｏｎｏ  Ｈ  ，  Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｋ  ，  Ｏｋａｚａｋｉ  Ｙ  ａｎｄ  Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ  Ｙ  （２００１）  Ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  （ＰＲＩＭ）：  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，１８３−１８８
【非特許文献２０】
Ｋａｔｏｈ  Ｍ，  Ｈａｔｔｏｒｉ  Ｙ，  Ｓａｓａｋｉ  Ｈ，  Ｔａｎａｋａ  Ｍ，  Ｓｕｇａｎｏ  Ｋ，  Ｙａｚａｋｉ  Ｙ，  Ｓｕｇｉｍｕｒａ  Ｔ  ａｎｄ  Ｔｅｒａｄａ  Ｍ  （１９９２）  Ｋ−ｓａｍ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８９：２９６０−４．
【非特許文献２１】
Ｋｕｒｉｈａｒａ  ＬＪ，  Ｓｅｍｅｎｏｖａ  Ｂ，  Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ，  Ｉｎｇｒａｍ  ＲＳ，  Ｇｕａｎ  ＸＪ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ  ＳＭ．  （２００２）  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉｓｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １４  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １３ｑ２２．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７９：１５４−６１．
【非特許文献２２】
Ｌａｇａｎａ  Ａ，  Ｖａｄｎａｉｓ  Ｉ，  Ｌｅ  ＰＵ，  Ｎｇｕｙｅｎ  ＴＮ，  Ｌａｐｒａｄｅ  Ｒ，  Ｎａｂｉ  ＩＲ  ａｎｄ  Ｎｏｅｌ  Ｊ．  （２０００）  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｓｅｕｄｏｐｏｄｉａ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｎａ（＋）／Ｈ（＋）  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ＮＨＥ１．  Ｉ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１３  （Ｐｔ  ２０）：３６４９−６２．
【非特許文献２３】
Ｌｅｅ  Ｂ  ａｎｄ  Ｌａｙｃｈｏｃｋ  ＳＧ．  （２００１）  Ｉｎｏｓｉｔｏｌ  １，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃａｒｂａｃｈｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ６１．，  ３２７−３６．
【非特許文献２４】
Ｍａｒｔｅｎｓ  Ｊ，  Ｂａａｒｓ  Ｊ，  Ｓｍｅｄｔｓ  Ｆ，  Ｈｏｌｔｅｒｈｅｕｓ  Ｍ，  Ｋｏｋ  ＭＪ，  Ｖｏｏｉｊｓ  Ｐ  ａｎｄ  Ｒａｍａｅｋｅｒｓ  Ｆ．  （１９９９）  Ｃａｎ  ｋｅｒａｔｉｎ  ８  ａｎｄ  １７  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｂｅ  ｏｆ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃｙｔｏｌｏｇｙ？  Ａ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ８７：８７−９２．
【非特許文献２５】
Ｍａｒｕｓｈｉｇｅ  Ｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｕｓｈｉｇｅ  Ｋ．  （１９９５）  Ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ２Ａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＴＧＦ  ｂｅｔａ  １−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １５：２６７−７２．
【非特許文献２６】
ＭｃＬｅａｎ  ＬＡ，  Ｒｏｓｃｏｅ  Ｊ，  Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＮＫ，  Ｇｏｒｉｎ  ＦＡ  ａｎｄ  Ｃａｌａ  ＰＭ．  （２０００）  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｐＨ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＮＨＥ１  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ；２７８：Ｃ６７６−８８．
【非特許文献２７】
Ｍｉｋｉ  Ｒ，  Ｋａｄｏｔａ  Ｋ，  Ｂｏｎｏ  Ｈ，  Ｍｉｚｕｎｏ  Ｙ，  Ｔｏｍａｒｕ  Ｙ，  Ｃａｒｎｉｎｃｉ  Ｐ，  Ｉｔｏｈ  Ｍ，  Ｓｈｉｂａｔａ  Ｋ，  Ｋａｗａｉ  Ｊ，  Ｋｏｎｎｏ  Ｈ，  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｓ，  Ｓａｔｏ  Ｋ，  Ｔｏｋｕｓｕｍｉ  Ｙ，  Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｎ，  Ｉｓｈｉｉ  Ｙ，  Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ，  Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ  Ｉ，  Ｇｏｔｏ  Ｈ，  Ｎｉｔａｎｄａ  Ｈ，  Ｓａｔｏｍｉ  Ｓ，  Ｙｏｓｈｉｋｉ  Ａ，  Ｋｕｓａｋａｂｅ  Ｍ，  ＤｅＲｉｓｉ  ＪＬ，  Ｅｉｓｅｎ  ＭＢ，  Ｉｙｅｒ  ＶＲ，  Ｂｒｏｗｎ  Ｐ０，  Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｍ，  Ｓｈｉｍａｄａ  Ｈ，  Ｏｋａｚａｋｉ  Ｙ  ａｎｄ  Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ  Ｙ．  （２０００）  Ｄｅｌｉｎｅａｔｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＲＩＫＥＮ  ｓｅｔ  ｏｆ  １８，８１６  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｃＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；  ９８：２１９９−２０４．
【非特許文献２８】
Ｍｉｌａｄ  Ｍ，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ｗ，  Ｄｉｅｈｌ  Ｅ，  Ａｌｔｍａｎｎ  Ｍ，  Ｎｏｒｄｅｅｎ  Ｓ，  Ｅｄｗａｒｄｓ  ＤＰ  ａｎｄ  Ｔｏｆｔ  ＤＯ  （１９９５）  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ＦＫ５０６  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ．  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ９：８３８−４７．
【非特許文献２９】
Ｍｏｏｎ  ＢＫ，  Ｌｅｅ  ＹＪ，  Ｂａｔｔｌｅ  Ｐ，  Ｊｅｓｓｕｐ  ＪＭ，  Ｒａｚ  Ａ  ａｎｄ  Ｋｉｍ  ＨＲ．  （２００１）  Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−３  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，  １５９：１０５５−６０．
【非特許文献３０】
Ｍｕｒａｔａ  Ｔ，  Ｎｏｇｕｃｈｉ  ＰＤ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉ  ＲＫ．  （１９９６）  ＩＬ−１３  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＪＡＫ２  Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ：  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＩＬ−４  ａｎｄ  ＩＬ−１３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １５６：２９７２−８．
【非特許文献３１】
Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ，  Ｍｉｔａｍｕｒａ  Ｔ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｔ  ａｎｄ  Ｍｅｋａｄａ  （２０００）  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＣＤ９  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＥＧＦ）−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：１８２８４−９０．
【非特許文献３２】
Ｎｏｒｔｈ  ＷＧ  ａｎｄ  Ｄｕ  Ｊ．  （１９９８）  Ｋｅｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９：１７４３−７．
【非特許文献３３】
Ｏｚａｗａ  Ｙ，  Ｔｏｗａｔａｒｉ  Ｍ，  Ｔｓｕｚｕｋｉ  Ｓ，  Ｈａｙａｋａｗａ  Ｆ，  Ｍａｅｄａ  Ｔ，  Ｍｉｙａｔａ  Ｙ，  Ｔａｎｉｍｏｔｏ  Ｍ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ  Ｈ．  （２００１）  Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ３  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＧＡＴＡ−２．  Ｂｌｏｏｄ，  ９８：２１１６−２３．
【非特許文献３４】
Ｐａｒｋ  ＪＧ，  Ｆｒｕｃｈｔ  Ｈ，  ＬａＲｏｃｃａ  ＲＶ，  Ｂｌｉｓｓ  ＤＰ  Ｊｒ，  Ｋｕｒｉｔａ  Ｙ，  Ｃｈｅｎ  ＴＲ，  Ｈｅｎｓｌｅｅ  ＪＧ，  Ｔｒｅｐｅｌ  ＪＢ，  Ｊｅｎｓｅｎ  ＲＴ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＢＥ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ５０：２７７３−８０．
【非特許文献３５】
Ｐａｒｋ  Ｋ，  Ｋｉｍ  ＳＪ，  Ｂａｎｇ  ＹＪ，  Ｐａｒｋ  ＪＧ，  Ｋｉｍ  ＮＫ，  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＡＢ  ａｎｄ  Ｓｐｏｒｎ  ＭＢ．  （１９９４）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  （ＴＧＦ−ｂｅｔａ）  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ：  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ．  Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ９１：８７７２−６．
【非特許文献３６】
Ｐａｒｋｉｎ，Ｄ．Ｍ．，  Ｐｉｓａｎｉ，Ｐ  ａｎｄ  Ｆｅｒｌａｙ，Ｊ．  （１９９９）．  Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ２５  ｍａｊｏｒ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  １９９０．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８０，  ８２７−８４１．
【非特許文献３７】
Ｐｏｒｔｅｒ  ＰＬ，  Ｍａｌｏｎｅ  ＫＥ，  Ｈｅａｇｅｒｔｙ  ＰＪ，  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＧＭ，  Ｇａｔｔｉ  ＬＡ，  Ｆｉｒｐｏ  ＥＪ，  Ｄａｌｉｎｇ  ＪＲ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＪＭ．  （１９９７）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｐ２７Ｋｉｐ１  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ，  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，  ３：２２２−５．
【非特許文献３８】
Ｐｕｔｉｌｉｎａ  Ｔ，  Ｊａｗｏｒｓｋｉ  Ｃ，  Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ  Ｓ，  ＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｂ，  Ｋａｄｉｒｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ  Ｐ．  （１９９８）  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ＬＩＭ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２５２，４３３−９．
【非特許文献３９】
Ｒａｚａｎｉ  Ｂ，  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  Ａ  ａｎｄ  Ｌｉｓａｎｔｉ  ＭＰ．  （２０００）  Ｃａｖｅｏｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １１３：２１０３−９．
【非特許文献４０】
Ｒｏｃｋ  ＲＳ，  Ｒｉｃｅ  ＳＥ，  ＷｅｌｌｓＡＬ，  Ｐｕｒｃｅｌｌ  ＴＪ，  Ｓｐｕｄｉｃｈ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｓｗｅｅｎｅｙ  ＨＬ．  （２００１）  Ｍｙｏｓｉｎ  ＶＩ  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ  ｍｏｔｐｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｓｔｅｐ  ｓｉｚｅ．  Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９８，  １３６５５−９．
【非特許文献４１】
Ｓａｋａｋｕｒａ  Ｃ，  Ｙｍａｇｕｃｈｉ−Ｉｗａｉ  Ｙ，  Ｓａｔａｋｅ  Ｍ，  Ｂａｅ  ＳＣ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ａ，  Ｏｇａｗａ  Ｅ，  Ｈａｇｉｗａｒａ  Ａ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ａ，  Ｍａｋｉｎｏ  Ｋ，  ＮａｋａｇａｗａＡ  Ｔ，  Ｋａｍａｄａ  Ｎ  ａｎｄ  Ｉｔｏ  Ｙ  （１９９４）  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔ（８；２１）  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＰＥＢＰ２  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＡＭＬ１／ＭＴＧ８（ＥＴＯ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１１７２３−１１７２７．
【非特許文献４２】
Ｓａｋａｋｕｒａ  Ｃ，  Ｓｗｅｅｎｅｙ  ＥＡ，  Ｓｈｉｒａｈａｍａ  Ｔ，  Ｉｇａｒａｓｈｉ  Ｙ，  Ｈａｋｏｍｏｒｉ  Ｓ，  Ｎａｋａｔａｎｉ  Ｈ，  Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  Ｈ，  Ｉｍａｎｉｓｈｉ  Ｔ，  ＯｈｇａｋｉＨ  Ｍ，  Ｏｈｙａｍａ  Ｔ，  Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｊ  ａｎｄ  Ｈａｇｉｗａｒａ  Ａ，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｔ，  Ｓａｗａｉ  Ｋ  ａｎｄ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ  （１９９６）  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｘ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ＭＣＦ−７  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ；  ６７：１０１−１０５．
【非特許文献４３】
Ｔａｈａｒａ  Ｅ  （２０００）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ  Ｖｅｒｈ  Ｄｔｓｃｈ  Ｇｅｓ  Ｐａｔｏｌ，  ８４，  ４３−９．
【非特許文献４４】
Ｔａｈａｒａ  Ｅ，  Ｓｅｍｂａ  Ｓ  ａｎｄ  Ｔａｈａｒａ  Ｈ  （１９９６）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：３０７−１５．
【非特許文献４５】
Ｔａｍｕｒａ  Ｇ，  Ｓａｋａｔａ  Ｋ，  Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ  ５，  Ｍａｅｓａｗａ  Ｃ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ，  Ｉｗａｙａ  Ｔ，  Ｔｅｒａｓｈｉｍａ  Ｍ，  Ｓａｉｔｏ  Ｋ  ａｎｄ  Ｓａｔｏｄａｔｅ  Ｒ．  （１９９６）  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．；８７：１１５３−９．
【非特許文献４６】
Ｔｅｒａｂｅ  Ｍ，  Ｍａｔｓｕｉ  ５，  Ｎｏｂｅｎ−Ｔｒａｕｔｈ  Ｎ，  Ｃｈｅｎ  Ｈ，  Ｗａｔｓｏｎ  Ｃ，  Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ＤＤ，  Ｃａｒｂｏｎｅ  ＤＰ，  Ｐａｕｌ  ＷＥ  ａｎｄ  Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ＪＡ．  （２０００）  ＮＫＴ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｂｙ  ＩＬ−１３  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＩＬ−４Ｒ−ＳＴＡＴ６  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １：５１５−２０．
【非特許文献４７】
Ｔｅｒａｔａｎｉ  Ｔ，  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ，  Ｋｕｗａｈａｒａ  Ｆ，  Ｋｕｍａｇａｉ  Ｈ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｓ，  Ａｏｋｉ  Ｕ，  Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ａ，  Ａｒａｉ  Ｋ  ａｎｄ  Ｎｏｚａｗａ．  （２００２）  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｌＯ０Ａｌ  ａｎｄ  Ｓ１００Ａ１Ｏ  ｇｅｎｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  １７５  ；７１−７７．
【非特許文献４８】
Ｗａｎｇ  ＹＪ，  Ｏｂａ  ＳＭ，  Ｙｏｓｈｉｉ  ５，  Ｓｏｎｇ  ＪＰ，  Ｗａｎｇ  Ｙ，  Ｋａｎａｍｏｒｉ  Ｍ，  Ｏｔａ  Ｓ，  Ｔａｎａｋａ  Ｍ  ａｎｄ  Ｓｕｇｉｍｕｒａ  Ｈ．  （２００１）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−ｐｉｘ，  ａｎｄ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｐｏｌｙ  （Ｔ）  ｔｒａｃｔ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，  １６４：６９−７５．
【非特許文献４９】
Ｘｉａｎｇｍｉｎｇ  Ｃ，  Ｎａｔｓｕｇｏｅ  Ｓ，  Ｔａｋａｏ  Ｓ，  Ｈｏｋｉｔａ  Ｓ，  Ｔａｎａｂｅ  Ｇ，  Ｂａｂａ  Ｍ，  Ｋｕｒｏｓｈｉｍａ  Ｋ  ａｎｄ  Ａｉｋｏｕ  Ｔ．  （２０００）  Ｔｈｅ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐ２７  ｗｉｔｈ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ８９：１２１４−９．
【非特許文献５０】
Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｈ，  Ｏｓｈｉｍａ  Ａ，  Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ｒ，  Ｅｎｄｏｈ  Ｓ  ａｎｄ  Ｕｂｕｋａｔａ  Ｔ．  Ａ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ．  １９８９；６３：６１３−７．
【非特許文献５１】
Ｙａｗａｔａ  Ａ，  Ａｄａｃｈｉ  Ｍ，  Ｏｋｕｄａ  Ｈ，  Ｎａｉｓｈｉｒｏ  Ｙ，  Ｔａｋａｍｕｒａ  Ｔ，  Ｈａｒｅｙａｍａ  Ｍ，  Ｔａｋａｙａｍａ  Ｓ，  Ｒｅｅｄ  ＪＣ．  ａｎｄ  Ｉｍａｉ  Ｋ．  （１９９８）  Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｌ６，  ２６８１−２６８６．
【非特許文献５２】
Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｍ，  Ｈｏｍｍａ  Ｋ，  Ｓａｉｔｏ  Ｊ，  Ｉｎｏｕｅ  Ａ，  Ｉｋｅｂｅ  Ｒ  ａｎｄ  Ｉｋｅｂｅ  Ｍ．  （２００１）  Ｄｕａｌ  ｒｅｇｕｌｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｙｏｓｉｎ  ＶＩ  ｍｏｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７６，  ３９６−７．
【非特許文献５３】
Ｙｕ  ＬＲ，  Ｚｅｎｇ  Ｒ，  Ｓｈａｏ  ＸＸ，  Ｗａｎｇ  Ｎ，  Ｘｕ  ＹＨ  ａｎｄ  Ｘｉａ  ＱＣ．  （２０００）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｉｏｎ  ｔｒａｐ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２１：３０５８−６８．
【非特許文献５４】
Ｚｈｕ  Ｗ，  Ｚｈａｎｇ  ＪＳ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  ＣＹ．  （２００１）  Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＬＮＣａＰ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ２２：１３９９−４０３．  ２１
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、原発巣と比べて、胃癌腹膜播種由来の細胞において発現量が増加した遺伝子についてのノザンブロット解析の結果を示す。
【図２】図２は、原発巣と比べて、胃癌腹膜播種由来の細胞において発現量が減少した遺伝子についてのノザンブロット解析の結果を示す。
【図１】
2004321102.tif 000010
【図２】
2004321102.tif 000011