(57)【要約】【課題】本発明は、紅藻類のデンプンの構造を解析し、その合成酵素を単離・同定することを目的としている。紅藻類のデンプンは、他の生物とは異なる特異な構造をしており、それ自体が新規なデンプンとして食品用や産業用デンプンとして有用なばかりでなく、その合成酵素は新規の構造を有するデンプンを製造するための酵素して有用である。【解決手段】本発明は、紅藻類の１種であるチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）由来のイソアミラーゼに関する。また、本発明は、当該イソアミラーゼをコードする遺伝子、それを含有してなるベクター、及びそれを含有してなる形質転換体に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
紅藻類の１種であるチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）由来のイソアミラーゼ。
【請求項２】
イソアミラーゼが、その一部に配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のイソアミラーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のイソアミラーゼをコードする遺伝子。
【請求項４】
遺伝子がＤＮＡである請求項３に記載の遺伝子。
【請求項５】
遺伝子が、その一部に配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する請求項４に記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれかに記載の遺伝子の、連続した少なくとも１０塩基の塩基を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
塩基が、少なくとも１５塩基以上である請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項３〜５のいずれかに記載の遺伝子を含有してなるベクター。
【請求項９】
ベクターが発現ベクターである請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項３〜５のいずれかに記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、紅藻類の１種であるチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）由来のイソアミラーゼ、それをコードする遺伝子、並びに当該遺伝子を含有してなるベクター及び形質転換体に関する。また、本発明は藻類の１種であるチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）由来のイソアミラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の部分配列からなるオリゴヌクレオチドに関する。
本発明のイソアミラーゼは、紅藻類に特異的なデンプンを合成する酵素の１種であり、当該酵素活性を利用することにより新規な構造を有する食糧用や産業用のデンプンの開発を行うことが可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
デンプンは穀物の主成分として食品や飼料として使用されるだけでなく、デキストリン、オリゴ糖、異性化糖などに加工されて加工食品などにも利用され、また、糊や添加剤などとして工業製品やその原材料としても利用されている。デンプンと一言でいっても、稲のデンプン、じゃがいものデンプン、小麦のデンプン、とうもろこしのデンプンなど、その由来によりデンプンの形、味、糊化したときの物性などが微妙に異なり、我々はその用途に応じて各種の植物由来のデンプンを使い分けてきている。このようなデンプンの性質の違いはデンプンの化学構造による違いから来ていると説明されてきているが、デンプンは一般にアミロースとアミロペクチンからできているものであり、その化学構造の相違は主として枝分かれ構造を有するアミロペクチンに由来するところが大きいとされている。
デンプン（Ｓｔａｒｃｈ）は高等植物の貯蔵器官に蓄積するα‐ポリグルカンである。デンプンは、２種類のグルコース・ホモポリマーであるアミロペクチン（Ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）とアミロース（Ａｍｙｌｏｓｅ）からなる。アミロースは、グルコース・ユニットがα−１，４グルコシド結合で繋がっており、少量のα‐１，６グルコシド結合の枝を含む線状のらせん状の分子である。一方、アミロペクチンは、グルコース・ユニットがα‐１，４グルコシド結合で伸び、その主鎖からα‐１，６グルコシド結合で枝が延びた構造をとっている。この枝分かれがかたまりを構成して”クラスター”構造と呼ばれる特徴的な構造を形成している。
動物やバクテリアの貯蔵物質であるグリコーゲン（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ）もアミロペクチンと同じくグルコース・ホモポリマーで構成されているが、クラスター構造は持っておらず、”ｔｒｅｅ  ｌｉｋｅ”や”ｂｕｓｈ  ｌｉｋｅ”と呼ばれるランダムな構造を持っている。グリコーゲンは、全く不規則な枝分かれ構造からなるものである。グリコーゲンはアミロペクチンに比べて分子も小さく、枝も短く、その多くは水溶性の物質である。これに対してアミロペクチンは、枝も長く、かつグルコースが高密度で充填されており、一般に水不溶性の物質である。
【０００３】
デンプンの合成の概要は、次の酵素、（１）デンプン合成酵素（Ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＳＳ））、（２）デンプン分枝酵素（Ｓｔａｒｃｈ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＳＢＥ））、（３）デンプン枝切り酵素（Ｓｔａｒｃｈ  ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＤＢＥ））の反応で合成される。ＳＳは、アミロペクチンの非還元末端にＡＤＰグルコースをα‐１，４グルコシド結合で繋ぎ、鎖を伸ばす役割をする。ＳＳがアミロペクチンの鎖を伸ばすのに対し、ＳＢＥは、アミロペクチンのα‐１，６グルコシド結合を形成する酵素であり、枝分かれ構造の枝分かれ部分を形成させる酵素である。従来、デンプン枝切り酵素（ＤＢＥ）はクラスターの形成に必要ない酵素であると考えられていた。しかし、この分解酵素が欠損した植物ではアミロペクチンのクラスターを形成することができないことが明らかにされ、ＤＢＥがクラスター構造の形成に不可欠であることを示すことが報告されている（非特許文献１〜３参照）。
【０００４】
このようにデンプンの成分であるアミロペクチンを生合成するにはＤＢＥの１種であるイソアミラーゼなどの存在が不可欠であるから、デンプンを合成する高等植物は各植物に応じたイソアミラーゼを持っている。デンプンを産生しない生物、例えば動物などは、イソアミラーゼを持っていないが、生物の中にはデンプンを産生しないにもかかわらず、イソアミラーゼをもっているものも存在している。このような生物におけるイソアミラーゼの存在理由については現在のところ明らかではなく、今後の研究が期待されている。現在までに、ラン藻のイソアミラーゼ（ＩＳＡ）遺伝子が単離されてきている（特許文献１参照）が、他の原始的な生物についてのイソアミラーゼの単離はみられない。
【０００５】
紅藻は、紅藻の祖先である真核細胞にラン藻が共生することによって生まれた光合成生物であり、最も古い真核生物の一つであるといわれている。紅藻の葉緑体は緑色植物に由来するものであるが、遺伝子的には緑色植物との類縁性が全くみられない。これは、緑色植物とは遺伝子的に類縁性の無い宿主が、緑色植物を取り込み、共生した結果と考えられている。紅藻は、生物の進化論的にも、また生物の分類学的にも極めて多くの興味を持たれている生物である。
紅藻類には海産性のものや淡水性のものがあり、微細藻類から大型藻類まで非常に多様性に富んでいることが知られている。紅藻類は、分類学的には真核植物類（Ｅｕｋａｒｙｏｐｈｙｔａ）の紅色植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）の紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する生物であり、現在約６００属５０００種が知られており、その内の約２００種くらいが淡水性のものとして知られている。
【０００６】
しかし、紅藻のデンプン合成および代謝系については情報が少なく、紅藻の炭水化物の代謝の研究については１９６０年代頃から行われてきている。当時は主に大型藻Ｄｉｌｓｅａ  ｅｄｕｌｉｓの紅藻デンプンについて、またＦｒｅｄｒｉｃｋら（１９７１）が原始紅藻であるＣｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍのグルコーストランスフェラーゼ（Ｇｌｕｃｏｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のアイソザイムについて研究を行っていた（非特許文献４参照）。このころ紅藻のデンプンについてはヨウ素デンプン反応の呈色、粘性そして平均鎖長などから紅藻に特有な紅藻デンプン（ｆｌｏｒｉｄｅａｎ  Ｓｔａｒｃｈ）を持ち、構造的にはアミロースをもたず、アミロペクチンだけの構成物であるといわれていた。しかし、１９８０年代になると紅藻Ｇｌａｕｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｖａｃｕｏｌａｔａ  のデンプンにアミロペクチンとアミロースの存在が示唆された（非特許文献５参照）。それ以来、紅藻デンプンはデンプン粒にアミロースを持っていると考えられる原始紅藻亜綱（Ｐｒｏｔｏｆｌｏｒｉｄｅｏｐｈｙｃｉｄａｅ）のデンプンと紅藻デンプンを含む真正紅藻亜綱（Ｆｌｏｒｉｄｅｏｐｈｙｃｉｄａｅ）のデンプンの２種類にわけられるようになった。しかし、原始紅藻のＣｙａｎｉｄｉｏｓｉｚｏｎ  ｍｅｒｏｌａｅやＣ．ｃａｌｄａｒｉｕｍではフィトグリコーゲン様のデンプン構造をしているとの報告もあり、紅藻類のデンプン構造の明確な解明はされておらず、デンプンの合成機構の解明や、新規なアミロペクチン構造を有するデンプンの開発のために、紅藻類のデンプン構造の解明やその酵素系の解明が求められている。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００２−２６２８７７号
【非特許文献１】
Ｍ．Ｇ．Ｊａｍｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  （１９９５）  ７，  ４１７−４２９
【非特許文献２】
Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰｌａｎｔＪ．，  （１９９７）  １２（１），  １４３−１５３
【非特許文献３】
Ａ．Ｋｕｂｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．，  （１９９９）  １２１，  ３９９−４０９
【非特許文献４】
Ｆｒｅｄｒｉｃｋ，  Ｊ．  Ｆ．，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  （１９７１）  １０，  ３９５−３９８
【非特許文献５】
ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，  Ｄ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．，  （１９８１）  ８８，  ６７−７１
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、紅藻類のデンプンの構造を解析し、その合成酵素を単離・同定することを目的としている。紅藻類のデンプンは、他の生物とは異なる特異な構造をしており、それ自体が新規なデンプンとして食品用や産業用デンプンとして有用なばかりでなく、その合成酵素は新規の構造を有するデンプンを製造するための酵素して有用である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、紅藻類のデンプンの構造解析から、紅藻類が有する新規なイソアミラーゼ遺伝子の単離に成功してイソアミラーゼを同定し、本発明に至った。
【００１０】
本発明は、紅藻類の１種であるチノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）由来のイソアミラーゼに関する。また、本発明は、当該イソアミラーゼをコードする遺伝子、それを含有してなるベクター、及びそれを含有してなる形質転換体に関する。
更に、本発明は、当該遺伝子の塩基配列の部分配列、より詳細には少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドに関する。
【００１１】
本発明者らは、生物材料として、原始紅藻亜綱（Ｐｒｏｔｏｆｌｏｒｉｄｅｏｐｈｙｃｉｄａｅ）に属するポルフィリディウム・プルプレウムＲ−１（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ  Ｒ−１）、ガルディエリア・サルフラリアＭ−８（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  Ｍ−８）、シアニディウム・カルダリウムＮ−５５１（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ  Ｎ−５５１）、及びポルフィラ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ（スサビノリ））、並びに真正紅藻亜綱（Ｆｌｏｒｉｄｅｏｐｈｙｃｉｄａｅ）に属するゲリディウム（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ（テングサ））の５種の紅藻類を用いて、そのデンプンの構造を解析し、その中のポルフィリディウム・プルプレウムＲ−１（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ  Ｒ−１）から新規なイソアミラーゼを単離することに成功した。
【００１２】
本発明者らは、これらの生物を数日間培養し、細胞を遠心分離した後、細胞を破砕し、得られた細胞破砕液を遠心分離して、それぞれの細胞からデンプンを単離した。
これらの紅藻類の各デンプンの鎖長を分析し、高等植物であるイネ（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）のデンプンの鎖長分布と比較した。
ポルフィリディウム・プルプレウムＲ−１（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ  Ｒ−１）、ガルディエリア・サルフラリアＭ−８（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  Ｍ−８）、シアニディウム・カルダリウムＮ−５５１（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ  Ｎ−５５１）、及びゲリディウム（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ（テングサ））、並びにイネ（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）についてデンプンの鎖長分析を行った結果を、それぞれ図１〜図５に示す。図１〜図５の鎖長分布の図における横軸は鎖長（グルコースの数（ＤＰ））を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計の量に対する比率（％）を示す。図１はポルフィリディウム・プルプレウムＲ−１（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ  Ｒ−１）のデンプンであり、図２はガルディエリア・サルフラリアＭ−８（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  Ｍ−８）のデンプンであり、図３はシアニディウム・カルダリウムＮ−５５１（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ  Ｎ−５５１）のデンプンであり、図４はゲリディウム（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ（テングサ））のデンプンであり、図５はイネ（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）のデンプンである。
【００１３】
この結果、同じ原始紅藻亜綱であるにもかかわらずガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）、シアニディウム・カルダリウム（Ｃ．  ｃａｌｄａｒｉｕｍ）とポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）との間には鎖長分布に違いが見られた。このうちガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）とシアニディウム・カルダリウム（Ｃ．  ｃａｌｄａｒｉｕｍ）は、ＤＰ１０以下の短い鎖長の枝が多くラン藻類の鎖長分布に近いと考えられた。しかし、ＤＰ８付近に突出したピークが見られ、オリゴ糖などの不純物が混じっている可能性もある。一方、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）の鎖長分布は真正紅藻亜綱のＧｅｌｉｄｉｕｍに似ており、ともにイネに比べ短鎖が多くＤＰ１０−１５の鎖長のピークが低く、クラスター構造を形成するために必要と考えられているＤＰ４５のピークがイネよりも低かった。
【００１４】
次に、紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）、ガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）、緑藻Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ＣＣ１２５、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｋｅｓｌｅｒｉ  １１ｈ、及び高等植物イネ（Ｆｕｊｉｈｉｋａｒｉ）についてデンプンのゲル濾過クロマトグラフィを行った。紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）、緑藻Ｃ．  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃ．ｋｅｓｓｌｅｒｉについてはパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）法で得られたデンプンを用い、紅藻ガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）についてはパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）法ではデンプンが得られなかったため、ＤＭＳＯ抽出法で得られたデンプンを用いた。
紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）の各画分のヨウ素デンプン反応による呈色反応の結果を図６に図面に代わる写真で示す。フラクション１１−１３では紫色の呈色を示し、フラクション１９−２５では青色の呈色を示した。図７に紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のゲル濾過クロマトグラフィの結果を示す。図７の（ａ）（上段）はヨウ素デンプン反応における５９５ｎｍの吸光度による測定であり、（ｂ）（下段）はフェノール硫酸法による還元糖の定量による測定である。いずれもサンプルは２０ｍｇで、流速０．１４ｍＬ／分で、カラムはセファクリルＳ−１００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００）を使用した。図７の（ａ）及び（ｂ）の横軸はフラクション番号を示し、（ａ）の縦軸は各フラクションの５９５ｎｍの吸光度を示し、（ｂ）の縦軸は各フラクションの４９０ｎｍの吸光度を示している。
この図からわかるように５９５ｎｍの吸光度の測定から２つのピークが得られたが、それぞれのピークフラクション（フラクション１２及びフラクション２２）におけるλｍａｘは５４０ｎｍ及び６３９ｎｍであった（図７（ａ）参照）。高等植物などのλｍａｘと比較すると５４０ｎｍのピークはアミロペクチン、６３９ｎｍのピークはアミロースであると考えられる。また、フェノール硫酸法での呈色による４９０ｎｍの吸光度を測定した（図７（ｂ）参照）。５９５ｎｍのグラフとフェノール硫酸法のグラフはアミロースがアミロペクチンより２０倍ほど染色されやすいことを考えるとほぼ一致している。フェノール硫酸法の結果をもとにアミロペクチンとアミロースの還元糖量を比べてみるとアミロペクチンがかなり多いことがわかった。
【００１５】
紅藻ガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）ではヨウ素デンプン反応による呈色が見られなかった。これはガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）でのデンプンがヨウ素では染色されにくい構造をとっているか、あるいはヨウ素による染色ができるほど十分な量がなかったためではないかと考えられる。ヨウ素デンプン反応による呈色が見られなかったため還元糖量が少ないのではないかと考え、フェノール硫酸法では通常の条件とは異なり各フラクションを５０μｌ、０．５Ｍ  ＨＣｌを１０μｌにして反応を行わせた。その結果、単一のピークが得られた。結果を図８に示す。図８は紅藻ガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）のフェノール硫酸法による還元糖の定量による測定を示し、サンプルは２５ｍｇで、流速０．１６ｍＬ／分で、カラムはセファクリルＳ−１００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００）を使用した。図８の横軸はフラクション番号を示し、縦軸は各フラクションの４９０ｎｍの吸光度を示している。
このことから、アミロペクチンとアミロースを含むポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のデンプンと異なり、ガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．  ｓｕｐＨｕｒａｒｉａ）のデンプンは単一の構成体から成り立っていることが考えられる。
【００１６】
同様に、緑藻Ｃ．  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉとＣ．  ｋｅｓｓｌｅｒｉのデンプン、並びにイネのデンプンについてゲル濾過クロマトグラフィを行った。
図９に緑藻Ｃ．  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのゲル濾過クロマトグラフィの結果を示す。図１０に緑藻Ｃ．  ｋｅｓｓｌｅｒｉのゲル濾過クロマトグラフィの結果を示す。図１１にイネ（Ｆｕｊｉｈｉｋａｒｉ）のゲル濾過クロマトグラフィの結果を示す。
図９〜１１の各々の、（ａ）（上段）はヨウ素デンプン反応における５９５ｎｍの吸光度による測定であり、（ｂ）（下段）はフェノール硫酸法による還元糖の定量による測定である。いずれもサンプルは２０ｍｇで、流速０．１４ｍＬ／分で、カラムはセファクリルＳ−１００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００）を使用した。図９〜１１の各々の、（ａ）及び（ｂ）の横軸はフラクション番号を示し、（ａ）の縦軸は各フラクションの５９５ｎｍの吸光度を示し、（ｂ）の縦軸は各フラクションの４９０ｎｍの吸光度を示している。
【００１７】
緑藻Ｃ．  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉとＣ．  ｋｅｓｓｌｅｒｉのデンプンは、イネのデンプンと同様、アミロペクチンとアミロースをもっていた（図９（ａ）及び図１０（ａ）参照）。これら緑藻のフェノール硫酸法の結果を、紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のものと比べると、若干だが緑藻類のほうがアミロース含量が多かった（Ｃ．  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ２２．４％、Ｃ．  ｋｅｓｓｌｅｒｉ  １３．０％、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）  ６．４％）（図９（ｂ）及び図１０（ｂ）参照）。イネでは、紅藻や緑藻と比べるとヨウ素デンプン反応、フェノール硫酸法、ともにアミロースのピークが高く、含量が多いことがわかる（アミロース含量２９．４％）（図１１の（ａ）及び（ｂ）参照）。
また、ヨウ素デンプン反応から得られたピーク付近のλｍａｘを測り、平均して標準誤差を出して表にしたものを表１に示す。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
次に、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）とイネ（Ｆｕｊｉｈｉｋａｒｉ）のゲル濾過クロマトグラフィで得られたフラクションのアミロペクチンとアミロースの画分の鎖長分布を解析した。両者の鎖長分布を図１２に示す。図１２の（ａ）（上段）はアミロペクチン画分の比較であり、（ｂ）（下段）はアミロース画分の比較である。図１２の灰色の棒はイネ（Ｆｕｊｉｈｉｋａｒｉ）を示し、黒色の棒は紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）を示す。図１２（ａ）及び（ｂ）の横軸は鎖長（グルコースの数（ＤＰ））を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計の量に対する比率（％）を示す。
ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）ではアミロペクチン画分と比較するとアミロース画分の方が短差の量が若干多いものの、両画分は非常によく似た鎖長分布を示した。アミロース画分へのアミロペクチンの混在によってアミロースだけの鎖長分布が得られなかったためと思われる。この点について、Ｆｕｊｉｈｉｋａｒｉでも同様のことがいえた。
また、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のアミロペクチンはＦｕｊｉｈｉｋａｒｉに比べＤＰ８以下の短鎖が多いが、ＤＰ１０−２５付近までの分布は少なかった。また、ＤＰ４５付近にも違いが見られ、Ｆｕｊｉｈｉｋａｒｉではなだらかなピークが見られるのに対し、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）ではそのピークは見られなかった。
【００２０】
以上のことから、紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のデンプンはイネのものと比べると短鎖が多く、クラスター構造を形成するために必要と考えられているＤＰ４５付近の長鎖のピークが低く、長鎖のものが少ないことがわかる。ラン藻類は、主にＤＰ１０以下の短鎖が非常に多く、クラスター構造を形成するために必要だと思われるＤＰ４５付近にピークをもた無いことが知られているが、緑藻類は短鎖の分布にわずかな違いがあるが、高等植物のイネと類似した鎖長分布を示し、ＤＰ４５付近のピークも見られることからクラスター構造を形成していることが示された。イネと緑藻類では、短鎖にはわずかの違いがみられるが、ＤＰ４５付近の長鎖のピークは共通して観察されているため、緑藻のほうが紅藻よりも高等植物に近いデンプン構造を形成していると考えられる。ラン藻類はフィトグリコーゲンを合成するため、鎖長分析ではＤＰ３−８付近までの短鎖が非常に多く、ＤＰ３０以降の長鎖が無いものが多い。
したがって、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）はラン藻類と比べると短鎖は少ないがＤＰ３０以降に長鎖が見られるということになる。これらのことから、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のデンプンはラン藻類とイネの中間型であると考えられる。構造的にはイネのアミロペクチンのクラスター構造ほどしっかりした構造は形成できてはいないが、ラン藻類のフィトグリコーゲンほど乱雑に分枝してはいないと考えられる。一方、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）とは異なる鎖長分布を示した紅藻シアニディウム・カルダリウム（Ｃ．ｃａｌｄａｒｉｕｍ）とガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）は非常に短鎖が多く、ラン藻類に近い鎖長分布であると考えられる。
大型藻であるＧｅｌｉｄｉｕｍ（テングサ）ではＤＰ１０−１５付近の側鎖が少ないが、それ以外はポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）の場合の鎖長分析と非常に似ていることからＧｅｌｉｄｉｕｍのデンプンはシアニディウム・カルダリウム（Ｃ．ｃａｌｄａｒｉｕｍ）やガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）のものよりもポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のものと似たような構造を含んでいると考えられる。
【００２１】
このように、紅藻類でもアミロースをもつものともたないものの存在が明らかになった。特にガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）ではフェノール硫酸法では還元糖の存在が確認されたのにもかかわらず、ヨウ素デンプン反応での呈色は得られなかった。また、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のデンプンのゲル濾過クロマトグラフィの溶出位置を比べると、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）では４０ｍｌ付近から溶出されているのに対し、ガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）では８０ｍｌ付近から溶出されていた。これらのことからガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）のポリグリカンは一つの構成体からなっており、ヨウ素デンプン反応では染色されにくく、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のアミロペクチン画分よりも小さい分子量をもつことがわかる。その構成体は不完全なアミロペクチン構造かフィトグリコーゲン様の構造であると考えられ、鎖長分析の結果も加えるとフィトグリコーゲン様の構造をしていると考えられる。
また、紅藻類、緑藻類ともにイネに比べると圧倒的にアミロースが少ないことがわかった。
【００２２】
高等植物ではイソアミラーゼ（ＩＳＡ）がデンプンのクラスター構造の形成に必須であると考えている。そこで、デンプンのクラスター構造の存在が確認された紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）においてＩＳＡの存在を検討した。
ヨウ素デンプン反応を利用した活性染色（Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ）により、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のＩＳＡの活性を試験した結果を図１３に図面に代わる写真で示す。図１３レーン１及び２は、マーカーとしてのイネの登熟種子抽出液であり、レーン３は紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）の細胞をガラスビーズで破砕した破砕液であり、レーン４はその１８，０００×ｇでの遠心分離の上澄液である。図１３の左側にはプルラナーゼ（ＰＵＬ）の位置を示し、右側にはイソアミラーゼ（ＩＳＡ）の位置を示している。
この結果、紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）においてもＩＳＡの存在を確認することができた（図１３のレーン３及び４参照）。このことから、緑色植物のようにポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）でもＩＳＡがアミロペクチンの合成か分解に関与していることが考えられる。
なお、この活性染色では、ゲル中のアミロペクチンは、ＩＳＡでα−１，６グリコシド結合を切断され分枝が少なくなるとヨウ素に染まりやすくなり青色を呈するが、アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）で切断されるとグルコースやマルトースそしてオリゴサッカライドのような糖に分解されるためヨウ素によって染色されなくなる。したがって、図１３で色が白く抜けて見えるバンドがいくつか観察されているがこれはアミラーゼであると考えられる。
【００２３】
紅藻はＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅをグルコースドナーとすることや、アミロースを合成するものとしないものとが存在することなど、独特のデンプン代謝系を持っていると考えられる。そこで、デンプン合成関連酵素の中から、前記の実験により確認することができたＩＳＡのｃＤＮＡをまずクローニングしてその塩基配列を決定し、ラン藻、緑藻及び高等植物と比較し、遺伝子レベルでどのような違いがあるかを検討することにした。
【００２４】
ＩＳＡには、ＩＳＡ遺伝子に共通に見られる領域（保存領域）が存在していることが知られている。これを図１４に示す。ここに例示しているのはトウモロコシ（ｍａｉｚｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ）、イネ（ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ）、ラン藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）の２種である。いずれも図１４に示した、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶの４つの領域において保存領域がある。
そこで、ＩＳＡ遺伝子に共通に見られる領域（保存領域）のアミノ酸配列をもとに作製したプライマーを用いて、紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のｃＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを行った。プライマーの種々な組み合わせでＰＣＲを行ったところ、Ｆ１とＲ１のプライマーでＰＣＲを行ったのち、そのＰＣＲ産物をテンプレートとしてＦ１とＲ２のプライマー（図１４の下段に示す。）でネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを行った場合に、予想される大きさのＰＣＲ産物が得られた。得られたＰＣＲ断片をシークエンスした。得られた塩基配列から予想されるアミノ酸配列は他の生物のＩＳＡのものと相同性を示したため、この部分の塩基配列（ＢｏｘＩ、ＩＩの間の配列）をもとに６８ｍｅｒのプローブを作製した。
【００２５】
このプローブを用いて、約５×１０５クローンについてスクリーニングしたところ、１次スクリーニングで５個のポジティブクローンが得られ、さらに２次スクリーニングを行ったところ５種類全てについてポジティブクローンが得られた。５個のポジティブクローンのうち、インビボエクサイション（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ）がうまくいったのは２種類で、また、インビボエクサイション（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ）のときの希釈が異なるものを加えると４個であった。プレートから２個ずつとり、計８個をシークエンスにかけた。シークエンスの結果、８クローンのうち同様の配列が得られたものを除き、異なる配列のクローンが３クローン得られた。
得られた３クローンのうち、クローン２はホモロジー検索からシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＤｅｇＰタンパク質（ＡＹ０３９５８５−１）と相同性が高かったので、解析を終わらせた。
クローン１とクローン３は上述のＰＣＲ産物の配列に一致する配列を含んでいた。
これらのクローンから解読できた塩基配列を配列表の配列番号１に示し、また、その遺伝子がコードしていると予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。図１５にアミノ酸の１文字表記によるアミノ酸配列を示す。
【００２６】
クローン１とクローン３の塩基配列の相同性は９９．４％であり、これらのクローンの塩基配列から予想されるアミノ酸配列は他の生物のＩＳＡのものと高い相同性を示した。図１６及び図１７に各種の生物のＩＳＡと本発明のＩＳＡのアミノ酸配列の比較を示す。図１６及び図１７は、上から本発明の紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）の解読できた部分のアミノ酸配列を示し、その下の段はイネのＩＳＡ（Ｒｉｃｅ−ＩＳＡ）を示し、その下の段はラン藻ｇｌｇＸのＩＳＡ（Ｓｃｙｓｔｉｓ−ｇｌｇＸ）を示し、その下の段はラン藻ｇｌｇＸＸのＩＳＡ（Ｓｃｙｓｔｉｓ−ｇｌｇＸＸ）を示し、その下の段はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａのＩＳＡ（Ｐ．ａｍｙｌｏ−ＩＳＡ）を示す。図１７は図１６の続きである。
また、クローン１の配列に他の生物のＩＳＡの配列を加えて作製した系統樹を図１８に示した。図１８の各枝の上の数字はブーツストラップを示す。
【００２７】
本発明は、紅藻の原始紅藻亜綱のチノリモ目（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉａｌｅｓ）のチノリモ属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、より詳細にはプルプレウム種（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）に由来するイソアミラーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。本発明は紅藻のイソアミラーゼの存在を確認し、当該酵素をコードする遺伝子をクローニングしたものであり、その塩基配列については全部の解析が完了していないが、本明細書に記載した方法により目的の紅藻の遺伝子を入手でき、常法によりその塩基配列を解読することができる。
本発明のイソアミラーゼは、前記した例ではプルプレウム種（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のＲ−１に由来したものが示されているが、これに限定されるものではない。
本発明のイソアミラーゼは、前記してきたように、紅藻に特有なデンプンである、ラン藻類とイネの中間型のような、構造的にはイネのアミロペクチンのクラスター構造ほどしっかりした構造は形成できてはいないが、ラン藻類のフィトグリコーゲンほど乱雑に分枝してはいない構造を有するデンプンを製造に有用なものと考えられる。一般に、クラスター構造がしっかりしていないデンプンは、しっかりしているデンプンに比べて水溶性になり、また糊化温度などの特性も特異的なものとなり、全く新規なデンプンを製造するために重要な酵素であると考えられる。
本発明のイソアミラーゼは、一部のアミノ酸配列が想定されているが（配列番号２参照）、このアミノ酸配列を有するものに限定されるものではなく、紅藻類、好ましくはチノリモ目（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉａｌｅｓ）、より好ましくはチノリモ属（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）、さらに好ましくはプルプレウム種（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）に由来するものであり、前記した紅藻類に特有なデンプンを形成できる活性を有するものであればよい。
【００２８】
本発明のイソアミラーゼは、前記した方法により製造することができるが、この方法に限定されるものではなく、本発明により提供される塩基配列を利用してＰＣＲ法などの公知の手法を組み合わせることにより各種の方法で製造することができる。
また、本発明の遺伝子のクローニング方法も前記した手法に限定されるものではなく、公知の各種のクローニング手法を利用することができる。
さらに、本発明のイソアミラーゼの遺伝子は必要により、その上流及び／又は下流側に各種の塩基配列を有する遺伝子を接続して使用することができるが、いずれの場合であっても本発明の遺伝子を含有している限りにおいては本発明の技術的範囲に属するものである。本発明のイソアミラーゼ遺伝子の上流側に接続できる遺伝子の例としては各種の生物から誘導されるプロモーターが挙げられる。プロモーターとしては紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のもを使用することもできるが、他の生物のものを組み合わせることもできる。
【００２９】
本発明は、前記した本発明のイソアミラーゼ遺伝子を含有しているベクターを包含している。ベクターとしては、前記の例でしめしてきたようなクローニングベクターでもよく、またプロモーターを結合させた発現ベクターであってもよい。べくたーとしては各種のプラスミドを選定することができる。
また、本発明は、前記してきた本発明の遺伝子を導入した形質転換体を提供する。本発明の遺伝子が導入される宿主細胞としては、特に制限はないがデンプンを生産できる細胞が好ましい。宿主細胞が既にイソアミラーゼの遺伝子を有している場合にはこれをノックアウトしておいてもよいし、そのままの状態で本発明の遺伝子を導入してもよい。このようにして本発明の遺伝子が導入され、発現した細胞は、本発明のイソアミラーゼの活性によりデンプンの枝切りが行われ、紅藻のデンプンに近い構造をしたデンプンの産生が行われるものと考えられる。
【００３０】
本発明は、また、本発明のイソアミラーゼ遺伝子の部分配列からなるオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおけるプライマーや、クローニングのプローブや、本発明の遺伝子の存在を検出するためのプローブなどとして有用である。本発明のオリゴヌクレオチドの長さに特に制限はないが、好ましくは１０〜１５０塩基、１５〜１５０塩基、２０〜１５０塩基、１５〜５０塩基などの長さのものを適宜使用することができる。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
生物材料の、ポルフィリディウム・プルプレウムＲ−１（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ  Ｒ−１）（チノリモ）、ガルディエリア・サルフラリアＭ−８（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  Ｍ−８）、及びシアニディウム・カルダリウムＮ−５５１（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ  Ｎ−５５１）の３種は東京大学分子細胞学研究所のＩＡＭカルチャーコレクションより入手した。スサビノリ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｓｐ．）は神戸大学内海城機能教育研究センターより入手した。テングサ（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）は愛媛の浜から採取したものである。
ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）はＭＫＭ培地で２０℃、２％ＣＯ２のバブリングで、ガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）はアレン（Ａｌｌｅｎ）培地で３３℃、空気のバブリングで、シアニディウム・カルダリウム（Ｃ．ｃａｌｄａｒｉｕｍ）はＡ１５Ｌ培地で３３℃、空気のバブリングの条件で培養した。
【００３２】
実施例１  （デンプンの抽出）
（１）小型生物からの抽出
数日間培養したポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）等の細胞を１，７００×ｇ、４℃、１０分間で遠心した。メタノールを加えガラスビーズで１０分間ボルテックスにかけ、細胞を破砕した。１，７００×ｇ、４℃、１０分間で遠心後、沈殿に対し再度メタノールを加え、色素がぬけるまで上記の操作を繰り返した。遠心した沈殿にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、９０℃で１２０分間煮沸した。煮沸後、５０ｍｌのチューブに移し、１，７００×ｇ、４℃、１０分間で遠心し、上清を１Ｌのメディウムビンにいれ、沈殿にもう一度ＤＭＳＯを加え、９０℃で１２０分間煮沸した。煮沸後、もう一度上記の遠心操作を行い、得られた上清を１Ｌのメディウムビンに入れエタノールを８００ｍｌ程加えて、−２０℃で一晩おき、デンプンを析出させた。
【００３３】
（２）大型藻類からの抽出
Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｓｐなどの大型藻を乳鉢に入れ、液体窒素で凍らせ乳棒ですりつぶした。ある程度すりつぶした後メタノールを加え撹拝し−２０℃で一晩おいた。次の日２，０００×ｇで１０分間遠心し沈殿を乳鉢にいれ前日と同様の操作を行い細胞をできるだけ破砕した。細胞破砕液を２，０００×ｇで１０分間遠心してメタノ−ルを取り除き、ＤＭＳＯを加えた。後の操作は微細藻類のデンプン抽出と同様に行った。
【００３４】
実施例２  （キャピラリー電気泳動による分析）
デンプンのα−１，６グリコシド結合をイソアミラーゼで完全分解して得たさまざまな長さのα−１，４グルカンの集合体を得た。酵素処理で得られたα−１，４グルカンすべての還元末端に蛍光物質であるＡＴＰＳ（１−ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−３，６，８−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）を付加し、それらを電気泳動して、４８８ｎｍのレーザー誘導蛍光ディテクターで高感度検出して、定量した。
結果を、図１〜図４にそれぞれ示す。比較としてイネのデンプンの鎖長分布を図５に示す。
【００３５】
実施例３  （デンプンのゲル濾過クロマトグラフィによる構造解析）
（１）サンプルの調製
微細藻類のデンプンは、エタノールを１ｍｌ加え懸濁し、１０，０００×ｇ、４℃、１０分で遠心し上清を除き、アスピレーターで乾燥させた。
イネ（Ｆｕｊｉｈｉｋａｒｉ）のデンプンは、胚乳を乳鉢に入れ乳棒ですりつぶしてエタノールを加え懸濁し、１８，０００×ｇで５分間遠心した。沈澱をアスピレーターで乾燥させデンプンを得た。
デンプン２０ｍｇに１．６ｍｌの蒸留水を加えて懸濁し、０．４ｍｌの５Ｎ  ＮａＯＨを加えて混合した。４７℃の湯浴に３０分間放置し、デンプンを糊化させた。２．０ｍｌの蒸留水を加えて混合し、２，０００×ｇで５分間、室温で遠心分離し、上清３．０ｍｌを別の試験管に移しゲル濾過サンプルとした。
（２）ゲル濾過クロマトグラフィ
ゲル濾過クロマトグラフィによる構造解析はナカムラらの方法（Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，  （１９９７）  ，  １２（１），  １４３−１５３）に準じて行った。フラクションコレクタ一（ＡＴＴＯ）に分取用試験管（６ｍｌ）を６０本セットした。流速は約０．１４ｍｌ／分で、試験管１本あたり約４ｍｌずつ分画分取した。
得られたポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のゲル濾過クロマトグラフィの各画分のヨウ素デンプン反応による呈色反応の結果を図６に示す。
また、図７〜図１１にそれぞれのゲル濾過クロマトグラフィの結果を示す。
【００３６】
実施例４  （ゲル濾過における各画分の鎖長分析）
ゲル濾過クロマトグラフィによって得られたフラクションのうち、λｍａｘの測定よりアミロぺクチンとアミロースと推定されるフラクションをそれぞれメディウムビンに集めエタノールを加え、−２０℃で一晩おいて、デンプンを析出させた。遠心によりデンプンを回収し、それぞれを前記したキャピラリー電気泳動法により鎖長の分析を行った。
結果を、図１２に示す。
【００３７】
実施例５  （デンプン合成・分解関連酵素の活性染色（Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ））
デンプン合成・分解関連酵素活性を調べるために、ネイティブのゲルを用いて電気泳動をし、活性染色を行った。
アクリルアミドゲルを次のようにして調製した。
ポテトアミロぺクチン（２４ｍｇ）をビーカーに測り取り３．３ｍｌの蒸留水を加えて混合しラップをかぶせてスターラーで回しながら６０℃で透明になるまで溶かした。３０％アクリルアミド、０．８％  ビス−アクリルアミドと１．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８）、０．２％  ＴＥＭＥＤをそれぞれ１．６５ｍｌ、アミロペクチン溶液３．３ｍｌを混合し１０％  ＡＭＰＳ（過硫酸アンモニウム）を３０μｌ加え、ゲル板に流し込んだ。ブタノールを重層し、約３０分放置した。３０分後ブタノ−ルを取り除き蒸留水でゲル上部を洗浄した。３０％アクリルアミド、０．８％ビス−アクリルアミド、１．０Ｍトリス−ＨＣｌ  （ｐＨ  ６．８）、０．２％  ＴＥＭＥＤをそれぞれ０．３ｍｌ、蒸留水を１．８ｍｌ加え混合しＡＰＳを１６μｌ加えゲル板に流し込み、１０または１２レーンのコームをさし、２０分放置した。
イネ（登熟）の籾と胚を取り除き、エッペンドルフチューブに入れて、胚乳の重量を測定した。胚乳に胚乳重量の３−４倍量の細胞破砕用バッファー（Ｇｒｉｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下、Ｇｓと略す）（５０ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２．５％グリセロール、５００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）加え、プラスチックペッスルですりつぶした。１８，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を別のチューブに入れれた。この上清とサンプルバッファーが２：１になるように混合し、泳動マーカーとした。
サンプルの細胞は、１，７００×ｇ、１０分で細胞を集めた。集めた細胞を細胞破砕用バッファー（Ｇｓ）で懸濁した。ガラスビーズの入った試験管に懸濁した細胞液を入れ、１０分間ボルテックスをかけ細胞を破壊し、１８，０００×ｇ、５分遠心し上清を泳動サンプルとした。
【００３８】
前記で調製したマーカー及びサンプルを用いて、先に調製したアクリルアミドゲルで電気泳動した。
泳動後、ゲルをゲル板からはずし反応液の入った容器に入れ、５分間、３０℃で振盪した。同じ操作を２回繰り返した後、ゲルを反応液に浸し、１２０分間、３０℃でインキュベートした。反応液を捨て、ヨウ素溶液を入れ、１５分ほど振盪してゲルを染色した。染色後イルミネーターで観察を行った。
結果を図１３に示す。
【００３９】
実施例６  ポルフィリディウム・プルプレウムＲ−１（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ  Ｒ−１）の
イソアミラーゼ（ＩＳＡ）ｃＤＮＡクローンの単離
（１）  ＩＳＡプローブの作製
ＩＳＡ遺伝子に共通に見られる領域（保存領域）（図１４参照）のアミノ酸配列をもとに作製したプライマー（フォーワードプライマー，Ｆ１、及びＦ２；リバースプライマー，Ｒ１、及びＲ２）を用いて、ポルフィリディウム・プルプレウムＲ−１（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のｃＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片をシークエンスした。得られた塩基配列から予想されるアミノ酸配列は他の生物のＩＳＡのものと相同性を示したため、この部分の塩基配列（ＢｏｘＩ、ＩＩの間の配列）をもとに６８ｍｅｒのプローブを作製した。
【００４０】
（２）  １次スクリーニング
ＬＢ培地で終夜培養した大腸菌（ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ｑＬＩ−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’  ｓｔｒａｉｎ）の濃度（ＯＤ６００）を測定し、１，５００×ｇ、１０分間遠心し、沈澱を大腸菌の濃度がＯＤ６００＝０．５になるよう１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４で懸濁した。この大腸菌懸濁液１．５ｍｌにファージ液８μｌ（１０，０００クローン）を加え、３７℃で１５分間インキュベートした。
インキュベート後ファージに感染させた大腸菌６００μｌをソフトアガーに加え、３７℃のインキュベーターで保温しておいたプレート（１５０ｍＭ）培地に素早く広げた。１５分間室温で静置しソフトを固まらせた。固まったプレート培地を逆さにして３７℃のインキュベーターで６〜８時間程静置し、その後４℃で保存した。
メンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をプレート培地の上に気泡が入らないように静かにのせ、１分間静置した。墨汁をつけた注射針で３箇所突き刺しマークをつけた。ピンセットでメンブレンを剥がした。この操作をプレート１枚につきメンブレン２枚ずつ行った。メンブレンのプレート培地と接していた面を上にして変性溶液を浸み込ませたろ紙の上に７分間静置した。静置後、メンブレンを乾いたろ紙の上に置き、中和液を浸み込ませたろ紙の上に３分間静置した。この操作を２回繰り返した。メンブレンを２×ＳＳＣバッファーに浸し、１分間程度洗浄した。メンブレンを乾いたろ紙の上に置き乾燥させ、８０℃で２時間加熱した。
前記で調製したプローブ（放射性元素で標識）を用いて、プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーションとハイプリダイゼーションにはラピッド−ハイブバッファー（Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いた。４２℃で温めておいたＲａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒにメンブレンを浸し４２℃、３０分間振盪しプレハイブリダイゼーションを行わせた。
Ｘ線フィルムを現像して、ポジティブプラークの有無を調べた。
【００４１】
（３）  ２次スクリーニング
得られたポジティブプラークをプレートから切り出し、５００μｌのＳＭバッファー（１Ｌ中、ＮａＣｌ  ５．８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２．０ｇ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）  ５０．０ｍｌ、２％ｇｅｌａｔｉｎ  ５．０ｍｌ）が入ったエッペンドルフチューブに入れクロロホルムを一滴加えた。ボルテックス後４℃で保存した。
１次スクリーニングと同様にＬＢ培地で大腸菌を培養し、１，５００×ｇ、１０分の条件で遠心し、沈澱にＯＤ６００＝０．５になるように１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を加え懸濁した。ＯＤ６００＝０．５の宿主細胞２００μｌに対して、ファージ原液をＳＭバッファーで１／１００、１／１，０００あるいは１／１０，０００に希釈したものを１μｌずつ加え、３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベート後ファージに感染させた大腸菌を３ｍｌのトップに加え、ＮＺＹプレート（９０ｍＭ）に広げた。室温で１０分間トップを固まらせ、プレートを逆さにして３７℃で一晩保温しプラークを得た。１次スクリーニングと同様に１枚のプレートにつき２枚ずつハイブリダイゼーション用メンブレンを作製した。
この後の実験操作は現像まで１次スクリーニングと同様の方法で行った。
【００４２】
（４）  インビボエクサイション（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ）
ポジティブプラークをプレートから切り出し、５００μｌのＳＭバッファーが入ったエッベンドルフチューブに入れクロロホルムを一滴加えた。ボルテックス後４℃で保存した。ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株とＳＯＬＲ株を、ＬＢ培地に０．２％マルトースと１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を加えた培地で、それぞれ３０℃で終夜培養を行った。１，０００×ｇ、１０分間遠心しＯＤ６００＝１０になるように１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を加え懸濁した。ＸＬ１−ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株（ＯＤ６００＝１．０）２００μｌ、ファージストック２５０μｌ及びＥＸ  Ａｓｓｉｓｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ  １μｌ  をチューブに入れ、３７℃で１５分間インキュベートした。３ｍｌのＬＢ培地を加え２〜３時間、３７℃で振盪培養を行った。培養後、６５〜７０℃で２０分間加熱μｌ，０００×ｇで１５分間遠心した。その上清をデカンテーションで新しいチューブに移した。ストックとする場合は４℃で保存した。プレーティングを行う場合は、ＳＯＬＲ  ｃｅｌｌｓ（ＯＤ６００＝１．０）２００μｌにファージの上清を１００μｌもしくは１０μｌ加え、３７℃で１５分間インキュベートした。それぞれの細胞混合物２００μｌをＬＢ−アムピシリンアガープレートにまき３７℃で終夜培養を行った。
【００４３】
（４）  プラスミドの抽出
前記の（３）で得られたコロニーを楊枝でつつき２×ＹＴ培地とアンピシリンの入った培地に植え、３７℃で終夜培養を行った。３，０００×ｇ、１分間遠心し、上澄みを捨てた。溶液Ｉ（５０ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０））を２００μｌ加えピペッティングで混ぜ、溶液ＩＩ（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ）を３００μｌ加えチューブを倒置して混ぜ、氷上で５分間静置した。溶液ＩＩＩ（３Ｍ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ  ４．８））を３００μｌ加えチューブを倒置して混ぜ氷上に５分間静置し、３，０００×ｇ、室温、１０分間遠心して上澄みを新しいチューブに移した。上澄みに１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａを２μｌ加え３７℃で２０分間静置した。クロロホルムを４００μｌ加え手で転がすように３０秒境拝した後、１分間遠心し、水層（上層）を新しいチューブに移した。この操作を２回行った。水層に６００μｌの２−プロパノールを加えて１８，０００×ｇ、室温で１０分間遠心し、上清を捨て沈澱に７０％エタノール５００μｌを加えた。もう一度同様に遠心を行い上清を捨て沈澱をアスピレーターで１０分ほど乾燥させた。乾燥後、滅菌水３３．６μｌ、５Ｍ  ＮａＣｌ  ６．４μｌ、１３％  ＰＥＧ６０００  ４０μｌを加えてよく撹拌し氷上に２０分間静置した。これを１８，０００×ｇ、４℃、１５分間遠心し上清を注意深く捨て、沈澱に７０％エタノールを５００μｌ加えて洗浄しアスピレーターで乾燥させた。得られたＤＮＡに１０μｌの滅菌水を加えて溶解させ、Ａ２６０、Ａ２８０を測定してＤＮＡ濃度を計算し、−２０℃で保存した。
【００４４】
（５）  ｃＤＮＡクローンの長さを調べるためのＰＣＲ
ｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡ部分（インサート）の長さを調べるためにそれぞれのクローンをテンプレートとしてＰＣＲを行った。
【００４５】
実施例７  ＩＳＡ遺伝子の塩基配列の決定
テンプレートＤＮＡ（０．２５−０．５μｇ）に対して、Ｍ１３プライマーＦ、あるいはＲ（１  ｐｍｏｌ／μｌ）を３．２μｌ、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ｐｒｅｍｉｘを４μｌ、希釈バッファー４μｌ、蒸留水を全体で２０μｌになるように加え、以下の条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物に３Ｍ酢酸ナトリウムを２μｌ、９５％  エタノールを５０μｌ加え、室温で１５分間放置した。放置後、１８，０００×ｇ、２０分間遠心し、上清を残さないように注意深く吸い取り、沈殿に７０％エタノールを８００μｌ加え軽く撹拌した。１８，０００×ｇ、５分間遠心し上清を取り除き、アスピレーターで乾燥させた。ＨｉＤｉホルムアミドを２０μｌ加え、懸濁し、９５℃で２分間加熱した後氷冷し、シークエンサーにかけた。
得られた塩基配列を配列番号１に示す。得られた塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。予想されるアミノ酸配列の一部を図１５に示す。
【００４６】
【発明の効果】
本発明は、新規なイソアミラーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。本発明のイソアミラーゼは紅藻類に由来するものであり、紅藻類はイネなどの高等植物が製造するデンプンとラン藻類が製造するフィトグリコーゲンとの中間的な構造を有するものであるから、本発明のイソアミラーゼと高等植物のデンプン合成酵素とを組み合わせることにより、新規なクラスター構造を有するデンプン類を製造できることになり、食糧用や産業用の新たな有用なデンプンを提供できる可能性がある。
【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ポルフィリディウム・プルプレウムＲ−１（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ  Ｒ−１）のデンプンの鎖長分布を示す。図１の横軸は鎖長（グルコースの数（ＤＰ））を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計の量に対する比率（％）を示す。
【図２】図２は、ガルディエリア・サルフラリアＭ−８（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ  Ｍ−８）のデンプンの鎖長分布を示す。図２の横軸は鎖長（グルコースの数（ＤＰ））を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計の量に対する比率（％）を示す。
【図３】図３は、シアニディウム・カルダリウムＮ−５５１（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ  Ｎ−５５１）のデンプンの鎖長分布を示す。図３の横軸は鎖長（グルコースの数（ＤＰ））を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計の量に対する比率（％）を示す。
【図４】図４は、ゲリディウム（Ｇｅｌｉｄｉｕｍ（テングサ））のデンプンの鎖長分布を示す。図４の横軸は鎖長（グルコースの数（ＤＰ））を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計の量に対する比率（％）を示す。
【図５】図５は、イネ（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）のデンプンの鎖長分布を示す。図５の横軸は鎖長（グルコースの数（ＤＰ））を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計の量に対する比率（％）を示す。
【図６】図６は、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のゲル濾過クロマトグラフィの各画分のヨウ素デンプン反応による呈色反応の結果を示す図面に代わるカラー写真である。
【図７】図７は、紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のゲル濾過クロマトグラフィの結果を示す。図７の（ａ）（上段）はヨウ素デンプン反応における５９５ｎｍの吸光度による測定であり、（ｂ）（下段）はフェノール硫酸法による還元糖の定量による測定である。いずれもサンプルは２０ｍｇで、流速０．１４ｍＬ／分で、カラムはセファクリルＳ−１００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００）を使用した。図７の（ａ）及び（ｂ）の横軸はフラクション番号を示し、（ａ）の縦軸は各フラクションの５９５ｎｍの吸光度を示し、（ｂ）の縦軸は各フラクションの４９０ｎｍの吸光度を示している。
【図８】図８は、紅藻ガルディエリア・サルフラリア（Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ）のフェノール硫酸法による還元糖の定量による測定を示し、サンプルは２５ｍｇで、流速０．１６ｍＬ／分で、カラムはセファクリルＳ−１００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００）を使用した。図８の横軸はフラクション番号を示し、縦軸は各フラクションの４９０ｎｍの吸光度を示している。
【図９】図９は、緑藻Ｃ．  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのゲル濾過クロマトグラフィの結果を示す。図９の、（ａ）（上段）はヨウ素デンプン反応における５９５ｎｍの吸光度による測定であり、（ｂ）（下段）はフェノール硫酸法による還元糖の定量による測定である。いずれもサンプルは２０ｍｇで、流速０．１４ｍＬ／分で、カラムはセファクリルＳ−１００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００）を使用した。図９の、（ａ）及び（ｂ）の横軸はフラクション番号を示し、（ａ）の縦軸は各フラクションの５９５ｎｍの吸光度を示し、（ｂ）の縦軸は各フラクションの４９０ｎｍの吸光度を示している。
【図１０】図１０は、緑藻Ｃ．  ｋｅｓｓｌｅｒｉのゲル濾過クロマトグラフィの結果を示す。図１０の、（ａ）（上段）はヨウ素デンプン反応における５９５ｎｍの吸光度による測定であり、（ｂ）（下段）はフェノール硫酸法による還元糖の定量による測定である。いずれもサンプルは２０ｍｇで、流速０．１４ｍＬ／分で、カラムはセファクリルＳ−１００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００）を使用した。図１０の、（ａ）及び（ｂ）の横軸はフラクション番号を示し、（ａ）の縦軸は各フラクションの５９５ｎｍの吸光度を示し、（ｂ）の縦軸は各フラクションの４９０ｎｍの吸光度を示している。
【図１１】図１１は、イネ（Ｆｕｊｉｈｉｋａｒｉ）のゲル濾過クロマトグラフィの結果を示す。図１１の、（ａ）（上段）はヨウ素デンプン反応における５９５ｎｍの吸光度による測定であり、（ｂ）（下段）はフェノール硫酸法による還元糖の定量による測定である。いずれもサンプルは２０ｍｇで、流速０．１４ｍＬ／分で、カラムはセファクリルＳ−１００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００）を使用した。図１１の各々の、（ａ）及び（ｂ）の横軸はフラクション番号を示し、（ａ）の縦軸は各フラクションの５９５ｎｍの吸光度を示し、（ｂ）の縦軸は各フラクションの４９０ｎｍの吸光度を示している。
【図１２】図１２は、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）とイネ（Ｆｕｊｉｈｉｋａｒｉ）のゲル濾過クロマトグラフィで得られたフラクションのアミロペクチンとアミロースの画分の鎖長分布を解析した結果を示す。図１２の（ａ）（上段）はアミロペクチン画分の比較であり、（ｂ）（下段）はアミロース画分の比較である。図１２の灰色の棒はイネ（Ｆｕｊｉｈｉｋａｒｉ）を示し、黒色の棒は紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）を示す。図１２（ａ）及び（ｂ）の横軸は鎖長（グルコースの数（ＤＰ））を示し、縦軸は各鎖長の量の全鎖長の合計の量に対する比率（％）を示す。
【図１３】図１３は、ヨウ素デンプン反応を利用した活性染色（Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ）により、ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）のＩＳＡの活性を試験した結果を示す図面に代わる写真である。図１３レーン１及び２は、マーカーとしてのイネの登熟種子抽出液であり、レーン３は紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）の細胞をガラスビーズで破砕した破砕液であり、レーン４はその１８，０００×ｇでの遠心分離の上澄液である。図１３の左側にはプルラナーゼ（ＰＵＬ）の位置を示し、右側にはイソアミラーゼ（ＩＳＡ）の位置を示している。
【図１４】図１４は、ＩＳＡ遺伝子に共通に見られる領域（保存領域）を示す。図１４中に例示しているのはトウモロコシ（ｍａｉｚｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ）、イネ（ｒｉｃｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ）、ラン藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）の２種である。図１４の下段は、本発明の紅藻のＩＳＡのためのＰＣＲのプライマーを示している。
【図１５】図１５は、本発明のイソアミラーゼ（ＩＳＡ）の予想されるアミノ酸配列の一部を、アミノ酸の１文字表記により示したものである。
【図１６】図１６は、各種の生物のＩＳＡと本発明のＩＳＡのアミノ酸配列の比較を示す。図１６の上から本発明の紅藻ポルフィリディウム・プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）の解読できた部分のアミノ酸配列を示し、その下の段はイネのＩＳＡ（Ｒｉｃｅ−ＩＳＡ）を示し、その下の段はラン藻ｇｌｇＸのＩＳＡ（Ｓｃｙｓｔｉｓ−ｇｌｇＸ）を示し、その下の段はラン藻ｇｌｇＸＸのＩＳＡ（Ｓｃｙｓｔｉｓ−ｇｌｇＸＸ）を示し、その下の段はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａのＩＳＡ（Ｐ．ａｍｙｌｏ−ＩＳＡ）を示す。
【図１７】図１７、各種の生物のＩＳＡと本発明のＩＳＡのアミノ酸配列の比較を示す図１６の続きである。
【図１８】図１８は、本発明の方法で得られたクローン１からのＩＳＡの配列に他の生物のＩＳＡの配列を加えて作製した系統樹を示す。図１８の各枝の上の数字はブーツストラップを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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