(57)【要約】【課題】  経口投与後効率的に抗体を産生せしめ感染防御効果が得られる経口ワクチンを提供する。【解決手段】  抗原と脂質からなる複合体であって、脂質としてマンノースを結合している糖脂質を含んでいる経口投与用ワクチン。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と脂質を含有するリポソームであって、抗原としてインフルエンザウイルス不活化抗原、インフルエンザウイルスHA抗原およびB型肝炎ウイルス抗原のうちの少なくとも１つを含有し、脂質としてマンノースを結合している糖脂質を含有することを特徴とする経口投与用ワクチン。
【請求項２】
抗原と脂質を含有するリポソームであって、抗原としてインフルエンザウイルス不活化抗原、インフルエンザウイルスHA抗原またはB型肝炎ウイルス抗原のうちの少なくとも１つを含有し、脂質としてマンノースを結合している糖脂質を含有し、IgG抗体価およびIgA抗体価を上昇させることを特徴とする経口投与用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口投与後効率的に抗体を産生せしめる経口ワクチンに関する。本発明の経口ワクチンは、生体に経口投与後、保持した抗原に対する抗体を効率的に産生せしめ、感染防御効果が得られるものである。
【背景技術】
【０００２】
現行のワクチンのほとんどは皮下に接種する注射剤であるが、少頻度で起こる副作用や投与時の疼痛が臨床上問題となっている。これを改良するための様々な投与方法の検討がなされてはいるが、経口ワクチンは安全性と投与方法の便利さから、その早期開発が最も望まれている剤形である。
【０００３】
経口ワクチンの検討は、従来より緩衝剤、腸溶コーティング錠剤、マイクロパーティクル、ナノパーティクル、アジュバント物質などを用いて行われてきたが、未だ成功には至っていない(非特許文献１、非特許文献２)。また、これら総説においては、オーソドックスな膜組成のリポソームを用いた経口ワクチンへの応用例も紹介されてはいるが、多少の抗体価の上昇は認められたものの、実用化にはほど遠いことが記されている。
【０００４】
いずれにしても、従来技術においては、経口投与後、抗体を効率的に産生せしめる手段はなかったといえる。
【０００５】
ホスファチジルセリンで膜を修飾したリポソームを静脈注射した例は知られており（非特許文献３）、また、マンノース誘導体またはマンナン誘導体で膜を修飾したリポソームが肝臓や肺に集積性があるとの報告がある(非特許文献４、非特許文献５) 。
【０００６】
【非特許文献１】International Journal of Pharmaceutics,75, 1(1991)
【非特許文献２】Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics,16,309 (1991)
【非特許文献３】Cancer Research, 40,4460 (1980)
【非特許文献４】Biochimica et Biophysica Acta 632,562 (1980)
【非特許文献５】病態生理 6, 771 (1985)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、生体に経口投与後、保持した微生物抗原もしくは弱毒化微生物等の抗原に対する抗体を効率的に産生することができる経口ワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗原と脂質の複合体である経口投与用ワクチンに関するが、この複合体は、脂質としてマンノースを結合している糖脂質を含んでいることにより経口投与によっても抗体価を上げることができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の経口ワクチンは、生体に経口投与後、保持した抗原に対する抗体を効率的に産生せしめるものである。したがって、従来経口では吸収されず、その抗体産生が不可能であった微生物抗原もしくは弱毒化微生物の経口ワクチンを可能ならしめたのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
複合体は、抗原である蛋白質や糖蛋白質と脂質とが疎水結合および／または水素結合により不規則に配列した集合体である場合と脂質膜構造体である場合とに分けることができる。
【００１１】
本発明の脂質膜構造体は広い意味で解釈すべきであり、脂質を有し脂質が膜を形成している場合または油成分と水成分が境界として膜を形成している場合があり、両親媒性脂質の極性基が界面の水相側に向かって配列した膜構造を有する粒子ということもでき、具体的にはリポソーム、エマルジョンあるいは水溶性ミセルが例示される。本発明は、この複合体が脂質としてマンノースを結合している糖脂質および／またはホスファチジルセリンである燐脂質を含んでいることにより、上記課題を解決できるとの知見に基づいてなされたのである。
【００１２】
本発明のワクチンは、場合によっては更にアジュバント物質が添加されていてもよい。
【００１３】
ワクチンに使用する抗原はこの分野の研究者が良く理解しているものであるが、例えば微生物の抗原もしくは弱毒化微生物としては、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエンザウイルスＣ型、ロタウイルス、サイトメガロウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型・２型、ＡＴＬ（成人型Ｔ細胞白血病）ウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、突発性発疹ウイルス（ＨＨＶ−６）、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプス（おたふくかぜ）ウイルス、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルスなどのウイルス類、虫歯連鎖球菌、コレラ菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌、百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌などの菌類、クラミジアなどのリケッチア類、マラリア病原虫などの原虫類等の微生物の蛋白質抗原、もしくはこれら微生物そのものの病原性を弱めた弱毒化微生物等を挙げることができる。なお、微生物の蛋白質抗原としては、インフルエンザウイルスの場合には、ヘマグルチニン（ＨＡ）やノイラミニダーゼ（ＮＡ）の単品もしくは混合物を、本発明の経口ワクチンに保持させるものとして例示することができる。
【００１４】
これらの抗原は、微生物から加工、精製する等の方法で得ることができるが、合成によって得ることもでき、さらに遺伝子工学的に製造することもできる。
【００１５】
また、本発明の経口ワクチンが保持しうる抗原は、脂質膜構造体の種類によっても異なる。例えば、リポソームが保持しうるものとしては特に制限がなく、水溶性あるいは脂溶性の微生物抗原もしくは弱毒化微生物等を挙げることができる。またエマルジョンの場合には脂溶性の抗原を、ミセルの場合には水難溶性の抗原を保持可能なものとして挙げることができる。
【００１６】
本発明にかかわるホスファチジルセリンとしては、大豆、卵黄等の天然物に由来するホスファチジルセリン、これらを水素添加した水素添加ホスファチジルセリン、または、大豆、卵黄等の天然物に由来するホスファチジルコリンから半合成により得られるホスファチジルセリン、これらを水素添加した水素添加ホスファチジルセリン、さらに半合成もしくは全合成のジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン等が挙げられるが、好ましくは水素添加ホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリンおよびジステアロイルホスファチジルセリンである。
【００１７】
本発明にかかわるマンノースを結合している糖脂質としては、マンノース残基を有するホスファチジルエタノールアミンの誘導体（Biocheimica et Biophysica Acta, 632 562 (1980)) やコレステロールの誘導体 (Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,4430 (1980)) 、ジマンノシルジグリセリド (Biochemical and Biophysical Research Communications, 110,140 (1983))、マンノビオース脂肪酸エステル及びアミド（特開平 1-104088 号）、ホスファチジルマンノース等、多糖であるマンナンに脂肪酸やコレステロールが部分的に置換された誘導体（病態生理、6,771 (1985)）等を挙げることができる。さらに具体的な化合物としては、4-0-(6-O- エイコサノイル- β-D- マンノピラノシル)-D-マンノピラノースおよびN-(2-N'-コレステリルカルボキシメチル）カルバミルメチルマンナンを挙げることができる。
【００１８】
これら膜成分としての燐脂質（ホスファチジルセリン）および糖脂質は、単品もしくは混合物として、ホスファチジルコリン類（レシチン）、スフィンゴミエリン等の他の膜成分を主体とした脂質膜構造体に添加すれば良いが、これらのみで脂質膜構造体を形成しても良い。
【００１９】
即ち、ホスファチジルセリン類はこれ単独でもリポソームやエマルジョンを形成することは可能であるし、マンノースを結合している糖脂質（マンノビオース脂肪酸エステルやアミド）はこれ単独でエマルジョンやミセルを形成することが可能である。したがって、本発明においては、本脂質膜構造体に膜成分として用いられるホスファチジルセリン、マンノースを結合している糖脂質の添加比率は上限においては何ら限定されるものではない。下限については、全脂質膜成分に対しモル分率で１％以上とするのがよく、 5〜50％添加することが望ましい。
【００２０】
他の膜成分としては、ホスファチジルコリン類（レシチン）、例えば、ホスファチジルコリン、大豆や卵黄等の天然物由来のホスファチジルコリンに水素添加した水素添加ホスファチジルコリン、半合成もしくは全合成ジミリストイルホスファチジルコリン、半合成もしくは全合成ジパルミトイルホスファチジルコリンおよび半合成もしくは全合成ジステアロイルホスファチジルコリン等や、スフィンゴミエリン等の脂質を挙げることができる。
【００２１】
また、他の脂質として荷電脂質を加えてリポソームの物理的安定化を図ることもできる。荷電脂質の例としては、ジアルキルホスフェート、ジアシルホスファチジン酸、ステアリルアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミンまたはイオン性界面活性化剤（酸性または塩基性）を示すことができる。
【００２２】
さらに、リポソームの物理的および生物学的安定を図るためにコレステロール等のステロール類を加えることもある。
【００２３】
本発明において、場合によっては更にアジュバント物質を添加することもできる。アジュバント物質としては、例えば、結核菌の細胞壁にあるアジュバント物質の最少有効物質である(N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-イソグルタミン（ムラミルジペプチド、ＭＤＰ）並びにその誘導体、例えば、6-O-(2-テトラデシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-イソグルタミン（Ｂ30−ＭＤＰ）、6-O-(2-テトラデシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-グルタムアミド（Ｂ30−ＭＤＰアミド体）、N2-[(N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-イソグルタミニール]-N6-ステアロイル-L-リジン（ＭＤＰ−Lys[L18]）等を挙げることができる。水溶性であるムラミルジペプチドの場合には、脂質膜構造体としてはリポソームが適用でき、リポソームの内水相に保持させれば良い。このムラミルジペプチドの添加量は何ら限定されるものではなく、水性溶媒への飽和溶解度まで添加可能である。また脂溶性であるムラミルジペプチド誘導体の場合には、脂質膜構造体としてはリポソーム、エマルジョン、ミセルが適用できる。全脂質膜成分に対する添加比率は何ら限定されるものではないが、モル分率で0.1 ％以上とするのがよく、 1〜30％添加することが好ましい。
【００２４】
本発明のワクチンは、経口投与によって抗体価をあげ感染を防御することに特徴を有するが、用量としては成人一人一回当りインフルエンザワクチンで50μg 乃至 5mg、通常は 200μ乃至  2mg である。これを一回投与するか、または一週間間隔で２回投与するか、二週間間隔で２回投与するか、三週間間隔で２回投与するか、もしくは一か月間隔で２回投与するように応用することもできる。さらに、同様な間隔で３回投与、４回投与、５回投与、６回投与することもある。通常は単回投与または一か月間隔での２〜４回投与である。また、Ｂ型肝炎ワクチンの場合には用量としては成人一人一回当たり20μg 乃至5mg、通常は50μg 乃至2mg である。用法としては注射用ワクチンと同様に考えることができる。これ以外の抗原に対するワクチンに関しても、注射用のワクチンの同量から20倍量で、用法もこれらに準じて適宜投与すれば良い。もちろん、投与される個人の免疫応答性や年令等に応じて適宜増減する場合があってもよい。
【００２５】
本発明で使用するホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロール等は生体成分であることから毒性は低いと考えられる。Y.M.Rustumらが卵黄由来のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロールで調製したリポソームの急性毒性を試験しているが、50% 致死毒性は5.5g/kg 以上である(Cancer Research 39,1390〜1395 (1979) 参照）。
【００２６】
次に本発明のワクチンの製造法を説明する。
ａ）リポソーム型ワクチンの製造法
微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、ホスファチジルセリン類（レシチン）、スフィンゴミエリン等の膜成分物質と、ホスファチジルセリン及び／またはマンノースを結合している糖脂質と、場合によっては更にアジュバント物質とを用いて、公知の方法（例えば、Annual Review of Biophysics and Bioengeneering, 9, 467 (1980))に従いリポソームの水分散液を調製する。かかるリポソームには安定化剤としてコレステロール等のステロール類、ジアルキルホスフェート、ジアシルホスファチジン酸、ステアリルアミン等の荷電脂質及びα−トコフェロール等の酸化防止剤を含ませても良い。
ｂ）エマルジョン型ワクチンの製造法
微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、レシチン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween) 等の両親媒性物質と、大豆油等の油脂と、ホスファチジルセリンおよび／またはマンノースを結合している糖脂質と、場合によっては更にアジュバント物質とを用い、公知のエマルジョン調製方法に従ってエマルジョンを調製する。
ｃ）ミセル型ワクチンの製造法
微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween) 、脂肪酸ナトリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等のミセル形成界面活性物質（ミセル形成臨界濃度以上の濃度で水性溶媒に加える）と、ホスファチジルセリンおよび／またはマンノースを結合している糖脂質と、場合によっては更にアジュバント物質とを用い、公知のミセル調製方法に従ってミセルの水分散液を調製する。
【実施例】
【００２７】
本発明を、微生物の蛋白質抗原のモデルとして牛血清アルブミン（ＢＳＡ）並びにインフルエンザウイルス抗原およびＢ型肝炎ウイルス抗原を用いて実施例及び試験例により説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
なお、実施例において、脂質膜構造体に封入されることなく、脂質膜構造体と遊離して抗原蛋白の存在する場合あるいは別な形の複合体が存在することもあるが、必要に応じてこれを超遠心分離法、ゲル濾過法等の操作により除去して用いても、除去せずに用いてもかまわない。
牛血清アルブミン(BSA) を保持したリポソーム型経口ワクチン
ａ）ＢＳＡ封入リポソームの調製
膜組成比がジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)：水素添加ホスファチジルセリン (H-PS)：コレステロール (Chol) ＝1:1:2（モル比）からなる脂質160mg に、クロロホルム：メタノール＝9:1 混液を20ml加えて溶解し、ロータリーエバポレーターを用いて37℃で加温しながら溶媒を留去した。更に真空下で２時間乾燥し、リピドフィルムを調製した。これに生理食塩液に溶解したそれぞれの濃度のＢＳＡ（表１参照）を 4ml加え、ボルテックスミキサーで50℃、10分間の撹拌を行い、多重層リポソーム (MLV 、multilamellar vesicle) を調製した。引きつづき、遠心分離(35,000 ×ｇ、 4℃、20分）を行い、上清を除去し、沈澱物に生理食塩液4ml を加えて再懸濁した。この遠心分離操作を３回繰り返し、遊離のＢＳＡを除去した。このように調製したリポソーム懸濁液を0.1 μｍのポリカーボネート製メンブランフィルターを用いて３リットルの生理食塩液に対して１２時間透析を行い、粒子径が0.1 μｍ以下のリポソームを除去して、最終的に表１右に示すＢＳＡ封入リポソーム型経口ワクチンとした。
【００２８】
【表１】
2004161781.tif 000002
【００２９】
最終リポソーム懸濁液：DSPC/H-PS/Chol＝54.4/51.2/54.4 (mg)
マウス１匹あたり１回 0.5ml投与するので、脂質投与量は10μmol、ＢＳＡ投与量は50μg（実施例１）〜400 μg （実施例４）となる。
ｂ）免疫試験
調製したＢＳＡ封入リポソーム懸濁液もしくは対照例としてのＢＳＡ単独水溶液（ＢＳＡ投与量をリポソーム群と一致させた）を表２に示すスケジュールに従い、胃ゾンデを用いてＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、７週齢）に１回あたり0.1ml ずつ経口投与した（１群６匹）。血中及び唾液中の抗体価を測定するために、血液は眼窩採血により採取し、唾液は、マウスに12mg/ml のペントバルビタールを0.1ml腹腔内投与して麻酔し、0.2mg/mlピロカルピンを腹腔内投与した後、パスツールピペットを口内に挿入し採取した。
【００３０】
【表２】
2004161781.tif 000003
【００３１】
ｃ）抗体価測定
血清中のＩｇＧ、ＩｇＡ及び唾液中のＩｇＡ抗体価は下に示すＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
［ＥＬＩＳＡ法］
炭酸緩衝液(pH 9.4)に溶解した 100μg/mlのＢＳＡをマイクロプレートの各ウエルに50μl ずつ加え、４℃で一夜放置し抗原であるＢＳＡをマイクロプレートに固定した後、0.05％のTween 20を含むリン酸緩衝液(PBST) 100μl/wellで３回洗浄し余分なＢＳＡを除去する。次に、３％スキムミルクでブロッキングを行い、ＰＢＳＴで３回洗浄し余分なスキムミルクを除去した後、マウスから採取した血清をＰＢＳＴで倍倍希釈したものを50μl/wellずつ加え、25℃で２時間インキュベーションする。ＰＢＳＴ 100μl/wellで３回洗浄して血清を除去し、500ng/mlの濃度の抗マウス抗体ＩｇＧ、あるいはＩｇＡコンジュゲート・ホースラデイッシュ・パーオキシダーゼ50μl を各ウエルに加え、２５℃で２時間インキュベーションする。ＰＢＳＴ  100 μl/well  で３回洗浄し、余分な抗マウス抗体を
除去し、0.015 ％過酸化水素を含む2,2'-アジノ−ビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）(500ng/ml)を50μl/well加え、37℃で20分間インキュベーション後、マイクロプレートリーダーで405nm における吸光度を測定する。抗体価(antibody titer)は、吸光度が血清では0.2、唾液では0.1 を越える最大の希釈倍率を 2nとし、ｌｏｇ22n で表す。
ｄ）試験結果
表２に示すスケジュールで試験した時の血清中ＩｇＧ、ＩｇＡ抗体価並びに唾液中のＩｇＡ抗体価を表３−１〜４及び表４−１〜３に示す。
試験例１の５日間連続投与の場合（表３−１〜４）、対照例のＢＳＡ水溶液経口投与群では血清中ＩｇＧ抗体価は若干の上昇傾向が認められたものの、実施例の経口ワクチン投与群の方が明らかにその抗体価の上昇は大きかった。また血清中ＩｇＡ抗体価については、ＢＳＡ水溶液群では投与量を増加させても全くその変化が認められなかったが、経口ワクチン投与群では確実な抗体価の上昇を認めることができた。
【００３２】
【表３】
2004161781.tif 000004
【００３３】
【表４】
2004161781.tif 000005
【００３４】
【表５】
2004161781.tif 000006
【００３５】
【表６】
2004161781.tif 000007
【００３６】
試験例２の１週間ごと５回投与の場合（表４−１〜３）の結果は以下の通りであった。即ち、対照例のＢＳＡ水溶液経口投与群では、血清中ＩｇＧ抗体価は試験例１と同様の若干の上昇傾向しか認められず、投与方法に基づく差も特に認められなかった。これに対して、実施例のリポソーム経口投与群では、試験例２の投与スケジュールの方が更にその抗体価が上昇する傾向が認められ、対照のＢＳＡ水溶液群と比較して明らかに抗体価が高かった。また血清中ＩｇＡ抗体価については、ＢＳＡ水溶液群では、試験例１と同様、投与量を増加させても全くその変化が認められなかったが、リポソーム投与群では確実な抗体価の上昇を認めることができた。唾液中ＩｇＡ抗体価についても、ＢＳＡ水溶液投与群に比べ、明らかにリポソーム投与群の方が高い価が得られた。
【００３７】
【表７】
2004161781.tif 000008
【００３８】
【表８】
2004161781.tif 000009
【００３９】
【表９】
2004161781.tif 000010
【００４０】
以上から、モデル抗原として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて製造された本発明のワクチンは、経口投与することにより、生体に対して効率的に抗体を産生せしめることが明らかとなった。
【００４１】
ａ）インフルエンザＨＡ抗原封入リポソーム型経口ワクチンの調製
膜組成比がジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)：水素添加ホスファチジルセリン(H-PS)：コレステロール(Chol)＝1:1:2（モル比）からなる脂質160mg に、クロロホルム：メタノール＝9:1混液を20ml加えて溶解し、ロータリーエバポレーターを用いて37℃で加温しながら溶媒を留去する。更に真空下で２時間乾燥し、リピドフィルムを調製する。これにリン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ、pH 7.4）に分散したそれぞれの濃度のインフルエンザＨＡ抗原（表５参照）を4ml 加え、ボルテックスミキサーで10分間の撹拌を行い、多重層リポソーム(MLV、multilamellar vesicle) を調製する。最終的には、これらをＰＢＳにより3.5 倍希釈して、表５右に示すインフルエンザＨＡ抗原封入リポソーム型経口ワクチンとする。
【００４２】
【表１０】
2004161781.tif 000011
【００４３】
最終リポソーム懸濁液：DSPC/H-PS/Chol＝54.4/51.2/54.4 (mg) 
マウス１匹あたり１回0.5ml 投与するので、脂質投与量は10μmol 、ＨＡ抗原投与量は10μg（実施例５）〜80μg （実施例８）となる。
ｂ）免疫試験
調製したインフルエンザＨＡ抗原入リポソーム懸濁液もしくは対照例としてのＨＡ抗原単独のＰＢＳ液（ＨＡ抗原投与量をリポソーム群と一致させる）を表６に示すスケジュールに従い、胃ゾンデ用いてＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、７週齢に１回あたり0.5ml ずつ経口投与する（１群６匹）。血中及び唾液中の抗体価を測定するために、血液は眼窩採血により採取し、唾液は、マウスに12mg/lのペントバルビタールを0.1ml 腹腔内投与して麻酔し、0.2mg/mlピロカルピンを腹腔内投与した後、パスツールピペットを口内に挿入し採取する。
【００４４】
【表１１】
2004161781.tif 000012
【００４５】
試験例３のＨＡ抗原投与量：10、20、40、80 μg/１回／マウス
ｃ）抗体価測定
血清中のＩｇＧ、ＩｇＡ及び分泌型のＩｇＡ抗体価の測定は、ＢＳＡ封入リポソーム型ワクチンの場合と同様に行い、ＨＡ抗原封入リポソームの抗体価の上昇が優れていることが認められる。
【００４６】
ａ）インフルエンザウイルス抗原またはＢ型肝炎ウイルス抗原封入リポソーム型経口ワクチンの調製
ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)19.3mg、コレステロール(Chol)19.3mgおよび水素添加大豆ホスファチジルセリン(HSPS) 18.2mg にクロロホルム：メタノール混液(9:1  体積比) を50ml加えて溶解し、ロータリーエバポレーターを用いて50℃に加温しながら溶媒を留去した。次いで真空下で２時間乾燥しリピドフィルムを調製した。これにリン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）に懸濁した抗原（表７参照）を 2ml加え、ボルテックスミキサーで50℃、10分間撹拌した。これを50℃に加温しつつ、孔径0.6 μのポリカーボネート製メンブランフィルターで２回加温濾過し、多重層リポソームを調製した。
【００４７】
【表１２】
2004161781.tif 000013
【００４８】
得られたリポソーム型経口ワクチンの粒子径を準弾性光散乱法（ダイナミック光散乱計DLS-700、大塚電子株式会社製）により測定した。結果を表８に示す。抗原蛋白の不在下
で調製したリポソームを対照例とした。
【００４９】
【表１３】
2004161781.tif 000014
【００５０】
これらの経口ワクチンの形態をネガティブ染色法により染色し、透過型電子顕微鏡観察を行った。実施例と対照例ともリポソームとしての形態をしていることを確認した。
【００５１】
ホスファチジルセリンとして、水素添加卵黄ホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリンもしくは牛脳由来のホスファチジルセリンを用いた経口ワクチンも同様に調製できる。
（実施例１２）
【００５２】
4-0-(6-O-エイコサノイル- β-D- マンノピラノシル)-D-マンノピラノース 6.4mg、 ジステアロイルホスファチジルコリン 32.0mg、コレステロール 19.3mg、ジセチルホスフェート 5.5mgを、抗原としてA/PR/8(H1N1)由来のインフルエンザウイルス不活化抗原(2mg/ml)を2ml 用いて実施例９と同様にして多重層リポソームを調製した。
（実施例１３）
【００５３】
膜成分にマンナン誘導体を含有する経口ワクチンの調製
ジステアロイルホスファチジルコリン32.0mg、コレステロール19.3mgおよびジセチルリン酸5.5mg を、抗原としてA/PR/8(H1N1)由来のインフルエンザウイルス不活化抗原(2mg/ml)を2ml 用いて実施例９と同様にして多重層リポソームを調製した。
【００５４】
ＰＢＳ10mlにN-(2-N'-コレステリルカルボキシアミノメチル）カルボキシメチルマンナン 10.0mg を溶解し、これを上記のリポソーム懸濁液に加え、液温を20℃に保ちながら２時間攪拌し、膜成分にマンナン誘導体を含有するリポソーム型経口ワクチンを得た。
【００５５】
実施例１２および１３で得た経口ワクチンの粒子径を前記と同様にして測定した。重量平均粒子径±標準偏差(nm)は実施例１２が443.7 ±208 (nm)実施例１３が450.7 ±211 (nm)であった。また、透過型電子顕微鏡観察を同様に行ってリポソームとしての形態を取っていることを確認した。
【００５６】
マンノース誘導体として、マンノース残基を有するホスファチジルエタノールアミンの誘導体、マンノース残基を有するコレステロールの誘導体、ジマンノシルジグリセリド、ホスファチジルマンノースを用いる経口ワクチンも同様に調製できる。
（実施例１４）
【００５７】
膜成分にマンノース誘導体またはマンナン誘導体およびホスファチジルセリンを含有する経口ワクチンの調製
水素添加大豆ホスファチジルセリン20.0mg、ジステアロイルホスファチジルコリン20.0mgおよびコレステロール19.3mgを用いて実施例９と同様にして多重層リポソームを製した。
【００５８】
N-(2-N'-コレステリルカルボキシメチル）カルバミルメチルマンナン10.0mgをＰＢＳ 10 mlに溶解し、これを上記のリポソーム懸濁液中に添加し、液温を20℃に保ちながら、２時間撹拌し経口ワクチンを得た。
【００５９】
得た経口ワクチンの重量平均粒子径±標準偏差は476.9 ±206 (nm)であった。また、透過型電子顕微鏡観察によりリポソームとしての形態を取っていることを確認した。
（実施例１５）
【００６０】
ａ）アジュバント物質を添加した経口ワクチンの調製
(6-O-(2-テトラデシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-グルタミン 10mg 、水素添加大豆ホスファチジルセリン20.0mg、ジステアロイルホスファチジルコリン20.0mgおよびコレステロール19.3mgを実施例９と同様に処理し多重層リポソームを調製した。重量平均粒子径±標準偏差は461.2 ±210 (nm)であった。また、透過型電子顕微鏡観察によりリポソームとしての形態を取っていることを確認した。
【００６１】
アジュバント物質として、(6-O-(2-テトラデシルヘキサデカノイル)-N-アセチルムラモイル)-L-アラニル-D-グルタムアミドおよびN2-[N-アセチルムラモイル]-L-アラニル-D-イソグルタミニール]-N6-ステアロイル-L-リジンを用いて同様に経口ワクチンを調製できる。
ｂ）免疫試験
実施例９で得たインフルエンザウイルス不活化抗原(inactivated whole virus particles、0.05%ホルマリンで固定）入りリポソーム懸濁液を表９に示すスケジュールに従い、マウス用胃ゾンデを用いてBALB/cCr Slcマウス（雌、７週齢）に１回あたり0.2ml ずつ経口投与した（１群５匹）。免疫投与開始３週後（21または22日）に各群のマウスから血清および腸管洗浄液を採取し、それらの投与した抗原に特異的なＩｇＧおよびＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【００６２】
血清および腸管洗浄液の調製は以下の手順、手法を用いた。
エーテル麻酔下、マウスの腋下静脈を切断し採血した。得た血液は3000rpm で10分間遠心して血清分離し、抗体測定に供した。採血後、同一マウスを開腹し、腸を摘出し、回腸と盲腸の結合部で腸を切断した。胃、十二指腸結合部から25針付き注射筒(10ml 用) でサンプリング液(ELISAmate: ＫＰＬ社のDiluent/Bloking Solution) 5ml をゆっくり注入し、回腸末端部から出てくる腸管洗浄液をシャーレに受けた。その洗浄液を2000rpm で10分間遠心後、上清を抗体測定に供した。各サンプルは測定時まで-20 ℃に保存した。
【００６３】
【表１４】
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【００６４】
ｃ）抗体価測定
血清中および腸管洗浄液の、投与した抗原に特異的なＩｇＧおよびＩｇＡ抗体価測定は、ＫＰＬ社 (Kirlegaard & Perry Lab.Inc.)のＥＬＩＳＡ測定用キット(ELISAmate) を用い、そのプロトコールに記載してある方法に準じておこなった。
【００６５】
その結果、血清中に抗原に特異的なＩg Ａ、Ｉg Ｇの産生が、腸管洗浄液中にＩg Ａの産生が認められた。
［ＥＬＩＳＡ法］
コーティング緩衝液に溶解した2.5 μg/mlの抗原を96穴マイクロプレートの各ウエルに50μlずつ加え、室温で１時間静置し、抗原をマイクロプレートに固定する。各ウエルの液を捨て、ペーパータオル上でプレートを良くはたいて完全に液を除去した後、ブロッキング液100 μl ずつを各ウエルに加え、室温で５分間静置する。ウエルの液を除去後、マウスから調製した、血清および腸管洗浄液の２倍段階希釈液各50μl ずつを各ウエルに加え、室温で１時間静置する。ウエルの液を除去後、洗浄液 200〜300 μl で４回洗浄を繰り返す。ウエルの液を除去後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体あるいはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＡ（α）抗体の200 倍希釈液、50μl ずつを各ウエルに加え、室温で１時間静置する。ウエルの液を除去し、 200〜300 μl の洗浄液で４回洗
浄後、洗浄液でウエルを満たし、室温でさらに５分間静置する。ウエルの液を除去後、ペルオキシダーゼ基質溶液50μl ずつを各ウエルに加え、室温で20分静置後、ペルオキシダーゼ反応停止液50μl ずつを各ウエルに加えて反応を停止し、プレートミキサーで撹拌する。各ウエルの405nm における吸光度をELISA READER (Multiskan PLUS: Titertek社)で測定する。抗体価は、同時に測定する標準サンプル（抗体価が既知のサンプル） の各希釈での吸光度を式１に示すlogit-log 変換式でＹを求め、縦軸にlogit Y を横軸に抗体価の対数値をプロットし、標準直線を引き、その標準直線を基に、各サンプルの抗体価を算出する。
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