(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子組換え法による多量生産に適したニワトリ由来モノクローナル抗体を提供する。【解決手段】以下の（ａ）、又は（ｂ）からなる核酸、すなわち、（ａ）特定の塩基配列からなる核酸。（ｂ）前記特定の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、当該塩基配列と８０％の相同性を有することを特徴とする。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、又は（ｂ）からなる核酸。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−３９８で示される塩基配列からなる核酸。
（ｂ）前記塩基配列番号１−３９８の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項２】
以下の（ａ）、又は（ｂ）からなる核酸。
（ａ）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−３９８で示される塩基配列からなる核酸。
（ｂ）前記塩基配列番号１−３９８の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項３】
以下の（ａ）、又は（ｂ）からなる核酸。
（ａ）配列表の配列番号３に示す、塩基配列番号１−３５０で示される塩基配列からなる核酸。
（ｂ）前記塩基配列番号１−３５０の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項４】
以下の（ａ）、又は（ｂ）からなる核酸。
（ａ）配列表の配列番号４に示す、塩基配列番号１−３５０で示される塩基配列からなる核酸。
（ｂ）前記塩基配列番号１−３５０の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項５】
請求項１記載の配列からなる重鎖と、請求項３記載の配列からなる軽鎖とを含むニワトリ由来モノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項２記載の配列からなる重鎖と、請求項４記載の配列からなる軽鎖とを含むニワトリ由来モノクローナル抗体。
【請求項７】
以下の（ａ）、又は（ｂ）からなるペプチド断片。
（ａ）配列表の配列番号５に示す、アミノ酸配列番号１−１３２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片。
（ｂ）当該配列番号５に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片。
【請求項８】
以下の（ａ）、又は（ｂ）からなるペプチド断片。
（ａ）配列表の配列番号６に示す、アミノ酸配列番号１−１３２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片。
（ｂ）当該配列番号６に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片。
【請求項９】
以下の（ａ）、又は（ｂ）からなるペプチド断片。
（ａ）配列表の配列番号７に示す、アミノ酸配列番号１−１１６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片。
（ｂ）当該配列番号７に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片。
【請求項１０】
以下の（ａ）、又は（ｂ）からなるペプチド断片。
（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−１１６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片。
（ｂ）当該配列番号８に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片。
【請求項１１】
請求項７記載の配列からなる重鎖と、請求項９記載の配列からなる軽鎖とを含むニワトリ由来モノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項８記載の配列からなる重鎖と、請求項１０記載の配列からなる軽鎖とを含むニワトリ由来モノクローナル抗体。
【請求項１３】
少なくとも２種以上の哺乳動物タンパク質間で５０％以上の相同性を有するが、対応する鳥類タンパク質では５０％以下の相同性を有する領域を抗原決定基とする請求項５、６、１１、又は１２のいずれか１項に記載のニワトリ由来モノクローナル抗体。
【請求項１４】
前記抗原決定基が、タンパク質分解酵素及び／又はペプチターゼによって分解されない領域である請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
前記タンパク質が、プリオンである請求項１３又は１４項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗原決定基が、Ｘ１ＨＸ２ＱＷＮＫ（但し、Ｘ１は、Ｔ又はＳを示し、Ｘ２は、Ｓ又はＮを示す。）を有することを特徴とする請求項１３〜１５項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）、ニワトリｓｃＦｖ領域を有する請求項１３〜１６項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、さらに精製用タグを有する請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】
精製用タグが、ＦＬＡＧタグ、及び／又はヒスチジンタグである請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
請求項５、６、１１、１２、１３〜１９項のいずれか１項に記載の抗体を用いて検出するプリオンタンパク質の検出方法。
【請求項２１】
プリオンタンパク質が、正常型又は異常型である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
プリオンタンパク質の検出を、ウエスタンブッロティング法、ＥＬＩＳＡ法、フィルトレーションブロット法からなる群から選択される少なくとも１種によって行なう請求項８又は９項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗体及び当該抗体を用いたプリオンタンパク質の検出方法に関し、特に、ニワトリ由来モノクローナル抗体及び当該抗体を用いたプリオンタンパク質の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
モノクローナル抗体は、抗原の特定部分だけを認識する単一抗体であり、この技術は遺伝子組み換えと並んでバイオテクノロジー分野での基幹技術であり、これを利用した診断薬、治療薬は急速に普及発展している。モノクローナル抗体については、マウス、ラット型など広く活用されているが、ニワトリ型については、発明者がすでに提案した例がある程度である。このニワトリ型の大きな利点は、マウス等の哺乳動物では作成困難な抗体が作成可能であるということである。
【０００３】
ニワトリは系統発生学的に哺乳動物より下等であるが、哺乳動物と同様に極めて精緻な免疫能力を持つ動物であることから、これまでに有用なニワトリ抗体が数多く作成されてきた。このような鳥類抗体は、ヒトをはじめとする哺乳動物間で高度保存された生体成分を認識できる抗体が哺乳動物を用いて作成できない場合に、特に有益である。なぜなら、鳥類と哺乳類との間の対応するアミノ酸配列の相同性は、哺乳類相互間と比較してかなり低く、このため哺乳類由来の抗体では、認識できない抗原であっても、鳥類では認識できるという特異性があるからである。
【０００４】
こうしたことから、ニワトリ抗体を大量調製するひとつの手段として、産卵鶏を特定の抗原で免疫し、その後、卵に移行した抗体を精製して卵黄抗体（ポリクローナル抗体）として利用する方法が開発されているが、この方法によりモノクローナル抗体を製造することはできない。
【０００５】
一方、マウスモノクローナル抗体は、極めて広範な基礎・応用領域に活用されているが、マウス型、ラット型以外のモノクローナル抗体については、応用にまで至っている成功例は少ない。マウス型、ラット型以外のモノクローナル抗体での応用の一例としては、本発明者らが開発した細胞融合法によるニワトリ型モノクローナル抗体がすでに報告されている。上述したとおり、ニワトリの大きな利点は、マウスあるいはラットを用いて作成困難な抗体がニワトリ抗体として得られやすいことであり、モノクローナル抗体としても作成可能なことである。本発明者らによる細胞融合技術を用いたニワトリ型モノクローナル抗体の成功例としては、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）を認識するニワトリ型モノクローナル抗体や哺乳動物に高度保存されたプリオンタンパク（ＰｒＰ）を認識するニワトリ型モノクローナル抗体などである。ＮｅｕＧｃは、ヒトのがんマーカーとなる抗原で、ヒトを除くほとんどの哺乳動物に存在しているため、マウス、ラットやウサギなど一般に広く免疫動物として用いる動物では抗体を作ることができない。また、ＰｒＰは、その異常型が狂牛病やヒトＣＪＤの病原体となることで知られているが、ＰｒＰは哺乳動物間でアミノ酸配列の相同性は８０％以上であり、哺乳動物由来の抗体では、認識困難なタンパク質である。
したがって、哺乳動物以外、例えば、ニワトリなどの鳥類由来の抗体が考えられるが、哺乳動物とニワトリの間ではその相同性がわずか３０％台であるため、これまでに作成された哺乳動物ＰｒＰを認識するニワトリモノクローナル抗体作成の成功例はわずかである。本発明者らは、すでにＮｅｕＧｃや哺乳動物ＰｒＰを認識できるニワトリ型ｍＡｂの作成に成功し、それらをヒトがんの診断や狂牛病・ヒトＣＪＤの研究に活用することができていた。
【０００６】
近年になり、遺伝子工学技術を活用して組み換え抗体（リコンビナント抗体）をファージ表面に発現させる技術が開発された。このファージディスプレイ抗体技術は１９９１年に英国ＭＲＣ研究所のＷｉｎｔｅｒらによって開発されたシステムで（Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４９，  ２９３−２９９  （１９９１））、非免疫ヒト末梢血リンパ球から抗体遺伝子を単離し、人工的にＶＨ、ＶＬ遺伝子をシャッフリングさせ多様化したｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）抗体をファージ融合タンパクとして発現させ、特異抗体を得た（Ｍａｒｋｓ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２，  ５８１−５９７  （１９９１））。この技術は、免疫を回避でき、さらに細胞融合法に変わるヒト化抗体作製技術として高く評価された。現在では高度免疫したマウス脾細胞を利用して実用的抗体が数多く作製され、抗ＰｒＰ抗体も同様に作製されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，  Ｒ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９９，  ７２７９−７２８２  （１９９６））。
【０００７】
また、ニワトリを利用した例としては、以下に示す国内外の２つのグループからの報告が挙げられる。Ｄａｖｉｅｓらは、非免疫状態のファブリキウス嚢由来抗体遺伝子と、発現ベクターｆｄ−ｔｅｔ−ＤＯＧ  １から３種の特異抗体を樹立し、哺乳動物以外でも同様にこの技術の適応が可能であり、しかも免疫を回避して作出できることを証明した（Ｄａｖｉｓ，  Ｅ．  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １８６，１２５−１３５  （１９９５））。
一方、山中らは、マウスアルブミン免疫脾細胞由来の抗体Ｖ領域遺伝子と、独自に開発した発現ベクターｐＰＤＳを利用して十分な反応性を示す特異的ファージディスプレイ抗体の構築を報告し、実用化抗体の作製には、免疫脾細胞由来抗体遺伝子ライブラリーの利用を強調した（Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｈ．  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５７，  １１５６−１１６２  （１９９６））。ここで使用したｐＰＤＳは、マウス抗体発現用ベクターとして開発されたもの（Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｈ．  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７，  １２１８−１２２７  ８１９９５））で、ＳＴＲＡＴＡ  ＧＥＮＥ社から市販されているクローニング用ファージミドベクターのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩをベースとしている。
【０００８】
に発現ベクターｐＰＤＳの構成を示す。ｐＰＤＳは、そのラクトースオペロン（Ｌａｃ）プロモーターを利用し組み込んだｓｃＦｖ抗体ｃＤＮＡの発現を誘導するようになっている。プロモーターの下流には、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）およびＭ１３  ｇｅｎｅＩＩＩのリーダー配列（ｇ３ｌ）を人工的に繋ぎ込み、ＥａｇＩとＢｓｓＨＩＩとからなるクローニングサイトで組み込まれた抗体遺伝子が大腸菌のペリプラズムを経て再構成ファージ体として発現できるよう設計されている。更にその下流にはＦａｂ抗体の発現に備えてマウスＣλ鎖遺伝子を繋ぎ、ｃｐ３の構造部位へとつながり終止コドンとなっている。このＣλ鎖は、融合タンパクの発現がうまく行われているかどうかを検証する上でも非常に有効なタグとなる。また、このｐＰＤＳベクターは、可溶型ｓｃＦｖもしくはＦａｂ抗体の発現にも対応できるように、Ｃλ鎖とｇｅｎｅＩＩＩの間にはＴＡＧ（アンバー配列）ストップコドンを挿入しており、通常はｓｕｐＥの大腸菌株を用いることによりファージディスプレイ抗体として発現されるが、ノンサプレッサー株で培養すれば、培地中に可溶型抗体が分泌されるようになる。
【（非）特許文献１】
Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４９，  ２９３−２９９  （１９９１））
【（非）特許文献２】
Ｍａｒｋｓ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２，  ５８１−５９７  （１９９１）
【（非）特許文献３】
Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，  Ｒ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９９，  ７２７９−７２８２  （１９９６）
【（非）特許文献４】
Ｄａｖｉｓ，  Ｅ．  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １８６，１２５−１３５  （１９９５）
【（非）特許文献５】
Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｈ．  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５７，  １１５６−１１６２  （１９９６）
【（非）特許文献６】
Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｈ．  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７，  １２１８−１２２７  ８１９９５）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、本発明者らが先に開発したニワトリ型モノクローナル抗体の最大の欠点は、その抗体を産生するハイブリドーマ（融合細胞）の抗体産生能力が低いことであった。このように、ニワトリ型モノクローナル抗体は、他の哺乳動物では作成が困難であるモノクローナル抗体を作成することができるが、その抗体産生細胞（ハイブリドーマ）の抗体産生能力がマウスやラットより低いことが大きな欠点であり、実用化にあたっての大きな障害となっていた。
【００１０】
また、上述のＤａｖｉｅｓらの方法によれば、作出された抗体の反応性は極めて低く、また発現ベクターの構造からファージディスプレイ抗体しかできないという欠点があった。
【００１１】
また、上述の山中らによる方法によれば、可溶型抗体においてはニワトリ抗体遺伝子由来であっても、検出にはマウスＣλ鎖に対する抗体を用いなければならず、サンドイッチＥＬＩＳＡ等におけるマウス抗体併用の場合、ニワトリ抗体の正確な測定が不可能であった。本発明者らは、山中博士よりｐＰＤＳの恵与を受け、抗体産生ニワトリハイブリドーマからファージディスプレイ抗体の作出に活用しようとしていることからも、この問題は解決すべき事項であった。
【００１２】
そこで、本発明は、遺伝子組換え法による多量生産に適したニワトリ由来モノクローナル抗体を提供するものである。また、本発明は、特定タンパク質を極めて特異的に認識し得るニワトリ由来モノクローナル抗体及び当該抗体を用いた特定タンパク質の検出方法を提供するものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の問題点を解決し、有用な抗体を提供するために、種々の抗体構築を鋭意研究した結果、本発明の抗体及び当該抗体を用いたプリオンタンパク質の検出方法を完成するに至った。
【００１４】
本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）  ：
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−３９８で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−３９８の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）  ：
（ａ）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−３９８で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−３９８の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号３に示す、塩基配列番号１−３５０で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−３５０の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号４に示す、塩基配列番号１−３５０で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−３５０の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体は、請求項１記載の配列からなる重鎖と、請求項３記載の配列からなる軽鎖とを含むことを特徴とする。
【００１９】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体は、請求項２記載の配列からなる重鎖と、請求項４記載の配列からなる軽鎖とを含むことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明のペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号５に示す、アミノ酸配列番号１−１３２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号５に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明のペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号６に示す、アミノ酸配列番号１−１１６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号６に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、とからなることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明のペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号７に示す、アミノ酸配列番号１−１１６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号７に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、とからなることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明のペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−１１６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号８に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体は、請求項７記載の配列からなる重鎖と、請求項９記載の配列からなる軽鎖とを含むことを特徴とする。
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体は、請求項８記載の配列からなる重鎖と、請求項１０記載の配列からなる軽鎖とを含むことを特徴とする。
【００２５】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体は、少なくとも２種以上の哺乳動物タンパク質間で５０％以上の相同性を有するが、対応する鳥類タンパク質では５０％以下の相同性を有する領域を抗原決定基とすることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体の好ましい実施態様において、前記抗原決定基が、タンパク質分解酵素及び／又はペプチターゼによって分解されない領域であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体の好ましい実施態様において、前記タンパク質が、プリオンであることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体の好ましい実施態様において、前記抗原決定基が、Ｘ１ＨＸ２ＱＷＮＫ（但し、Ｘ１は、Ｔ又はＳを示し、Ｘ２は、Ｓ又はＮを示す。）を有することを特徴とする。
【００２９】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体の好ましい実施態様において、前記抗体が、ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）、ニワトリｓｃＦｖ領域を有することを特徴とする。
【００３０】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体の好ましい実施態様において、前記抗体が、さらに精製用タグを有することを特徴とする。
【００３１】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体の好ましい実施態様において、精製用タグが、ＦＬＡＧタグ、及び／又はヒスチジンタグであることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明のプリオンタンパク質の検出方法は、請求項１〜７項記載の抗体を用いて検出することを特徴とする。
【００３３】
また、本発明のプリオンタンパク質の検出方法の好ましい実施態様において、プリオンタンパク質が、正常型又は異常型であることを特徴とする。
【００３４】
また、本発明のプリオンタンパク質の検出方法の好ましい実施態様において、プリオンタンパク質の検出を、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フィルトレーションブロット法からなる群から選択される少なくとも１種によって行なうことを特徴とする。
【００３５】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の核酸について説明する。本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−３９８で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−３９８の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなる。本発明の核酸には、前記塩基配列番号１−３９８の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されていているものであっても、例えば、当該核酸を得るためのプローブとして用いることができるからである。
【００３６】
また、本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−３９８で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−３９８の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなることを特徴とする。本発明の核酸には、配列表の配列番号２に示す、前記塩基配列番号１−３９８の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されていているものであっても、例えば、当該核酸を得るためのプローブとして用いることができるからである。
【００３７】
また、本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号３に示す、塩基配列番号１−３５０で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−３５０の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなる。本発明の核酸には、配列表の配列番号３に示す、前記塩基配列番号１−３５０の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されていているものであっても、例えば、当該核酸を得るためのプローブとして用いることができるからである。
【００３８】
また、本発明の核酸は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号４に示す、塩基配列番号１−３５０で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−３５０の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸、からなる。本発明の核酸には、配列表の配列番号４に示す、前記塩基配列番号１−３５０の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは、９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸をも包含する。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されていているものであっても、例えば、当該核酸を得るためのプローブとして用いることができるからである。
【００３９】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体は、請求項１記載の配列からなる重鎖と、請求項３記載の配列からなる軽鎖とを含む。請求項１記載の配列からなる重鎖と、請求項３記載の配列からなる軽鎖とからなる抗体によれば、後述するように、動物由来の抗体では識別しにくいプリオンタンパク質を特異的に認識し得るという有利な効果を奏する。
【００４０】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体は、請求項２記載の配列からなる重鎖と、請求項４記載の配列からなる軽鎖とを含む。請求項２記載の配列からなる重鎖と、請求項４記載の配列からなる軽鎖とからなる抗体によれば、後述するように、動物由来の抗体では識別しにくいプリオンタンパク質を特異的に認識しうるという有利な効果を奏する。
【００４１】
また、本発明のペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号５に示す、アミノ酸配列番号１−１３２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号５に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。好ましい態様において、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と９０％、より好ましくは、９０％、さらに好ましくは、９５％の相同性を有する。これらも上記本発明のペプチドを検出するための、プローブとして有効に用いることができるからである。
【００４２】
また、本発明のペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号６に示す、アミノ酸配列番号１−１３２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号６に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、とからなる。好ましい態様において、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と９０％、より好ましくは、９０％、さらに好ましくは、９５％の相同性を有する。これらも上記本発明のペプチドを検出するための、プローブとして有効に用いることができるからである。
【００４３】
また、本発明のペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号７に示す、アミノ酸配列番号１−１１６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号７に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、とからなる。好ましい態様において、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と９０％、より好ましくは、９０％、さらに好ましくは、９５％の相同性を有する。これらも上記本発明のペプチドを検出するための、プローブとして有効に用いることができるからである。
【００４４】
また、本発明のペプチド断片は、以下の（ａ）、又は（ｂ）：
（ａ）配列表の配列番号８に示す、アミノ酸配列番号１−１１６で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号８に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％の相同性を有するペプチド断片、からなる。好ましい態様において、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と９０％、より好ましくは、９０％、さらに好ましくは、９５％の相同性を有する。これらも上記本発明のペプチドを検出するための、プローブとして有効に用いることができるからである。
【００４５】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体は、請求項７記載の配列からなる重鎖と、請求項９記載の配列からなる軽鎖とを含む。請求項７記載の配列からなる重鎖と、請求項９記載の配列からなる軽鎖とからなる抗体によれば、後述するように、動物由来の抗体では識別しにくいプリオンタンパク質を特異的に認識しうるという有利な効果を奏する。
【００４６】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体は、請求項８記載の配列からなる重鎖と、請求項１０記載の配列からなる軽鎖とを含む。請求項８記載の配列からなる重鎖と、請求項１１記載の配列からなる軽鎖とからなる抗体によれば、後述するように、動物由来の抗体では識別しにくいプリオンタンパク質を特異的に認識しうるという有利な効果を奏する。
【００４７】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体は、少なくとも２種以上の哺乳動物タンパク質間で５０％以上の相同性を有するが、対応する鳥類タンパク質では５０％以下の相同性を有する領域を抗原決定基とする。２種以上の哺乳動物は、特に限定されず、たとえば、ヒト、マウス、ウマ、ヒツジ、ウシなどを挙げることができる。鳥類としては、例えば、ニワトリが含まれる。
【００４８】
少なくとも２種以上の哺乳動物タンパク質間で５０％以上の相同性を有することとしたのは、５０％未満の相同性を有していれば、従来からあるマウス由来抗体を用いても容易にモノクローナル抗体を得ることができるからである。２種以上のタンパク質間での相同性が高くなればなるほど、従来のマウス等由来の抗体では、抗原を認識することが困難となる傾向がある。
【００４９】
一方、対応する鳥類タンパク質では５０％以下の相同性を有するとしたのは、かかる相同性の違いがあれば、抗体が十分抗原を認識できるからである。
【００５０】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体の好ましい実施態様において、前記抗原決定基が、タンパク質分解酵素及び／又はペプチターゼによって分解されない領域である。これは、抗原決定基の存在する領域が、タンパク分解酵素などで分解されると、例えば、タンパク質分解酵素によって分解されても活性を有する抗原を抗体が認識できなくなるからである。タンパク質として、プリオンタンパク質を例示すれば、このような領域は、Ｃ末端側のＢ領域（Ａ領域とＢ領域とは、プロテアーゼＫ切断点近傍で、それぞれ分断される領域である。Ａ領域とＢ領域との境界（プロテアーゼＫ切断点）は、具体的にマウスを例にとれば、プリオンタンパク質の配列８２〜９７の間である）であり、この部分は、タンパク質分解酵素抵抗部位である。
【００５１】
本発明の好ましい実施態様において、少なくとも２種以上の哺乳動物タンパク質間で５０％以上の相同性を有するが、対応する鳥類タンパク質では５０％以下の相同性を有するタンパク質として、例えば、プリオンを挙げることができる。プリオンタンパク質は、その異常型が狂牛病やヒトＣＪＤの病原体となることで知られている。プリオンタンパク質は、哺乳動物間でアミノ酸配列の相同性は８０％以上である一方、哺乳動物とニワトリの間ではその相同性がわずか３０％台である。したがって、プリオンタンパク質は、従来のマウスなど哺乳動物由来のモノクローナル抗体では、認識困難なタンパク質の１つである。
【００５２】
タンパク質がプリオンである場合には、好ましくは、抗原決定基が、Ｘ１ＨＸ２ＱＷＮＫ（但し、Ｘ１は、Ｔ又はＳを示し、Ｘ２は、Ｓ又はＮを示す。）を有する。当該Ｘ１ＨＸ２ＱＷＮＫの領域を有するモノクローナル抗体によれば、哺乳類由来のプリオンタンパク質を的確に認識することが可能である。
【００５３】
また、本発明のニワトリ由来モノクローナル抗体の好ましい実施態様において、前記抗体が、ニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）、ニワトリｓｃＦｖ領域を有する。ニワトリＣλ鎖は、ニワトリ由来モノクローナル抗体のＬ鎖定常領域に該当し、ニワトリｓｃＦｖは、ニワトリＶＨ鎖及びＶＬ鎖をリンカーでつないだものである。
【００５４】
本発明では、抗体が、さらに精製用タグを有してもよい。たとえば、精製用タグとしては、ＦＬＡＧタグ、及び／又はヒスチジンタグを挙げることができる。
【００５５】
ここで、本発明のモノクローナル抗体の作成方法について説明する。すなわち、抗ニワトリＩｇ抗体で検出できるよう、ｐＰＤＳ内のマウスＣλ鎖をニワトリＣλ鎖（Ｌ鎖定常領域）に置換した新規な発現ベクターの構築を試みた。さらに精製を簡便化する目的から、精製用タグ（ＦＬＡＧ）を導入した純ニワトリ型リコンビナント抗体発現用ベクターの構築をおこなった。
【００５６】
にニワトリリコンビナント抗体発現用ベクター（ｐＣＰＤＳ）の構築の概要を一例として示す。
【００５７】
ニワトリＣλ鎖遺伝子のクローニング、Ｃλ＋ＦＬＡＧの作成
まず、ニワトリＣλ鎖遺伝子をクローニングする。正常ニワトリ脾細胞から合成したｃＤＮＡをもとにＰＣＲでニワトリＣλ鎖を増幅させれば、Ｃλ鎖遺伝子と思われる約３４０  ｂｐのバンドを得ることができる。このバンドを制限酵素処理後ライゲーションし、形質転換を行い、その後ランダムにクローンをアルカリＳＤＳ法でプラスミド調製を行い、インサートの有無を確認することができる。
塩基配列決定を行い、１１４残基のアミノ酸をコードする既報のＣλ鎖と完全一致するクローンを、ベクター再構築用コンストラクト調製のためのテンプレートとすることができる。
【００５８】
塩基配列を決定したクローニング済のニワトリＣλ鎖遺伝子をもとに、再構築コンストラクトに使用するニワトリＣλ鎖遺伝子をＰＣＲ法を用いて調製すれば、約３６０  ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖にＦＬＡＧ配列の付加したと思われるバンドが検出されるので、このバンドを精製し、ｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子とのオーバーラップＰＣＲ用テンプレートとすることができる。
【００５９】
ｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子の増幅（このｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子が、ファージディスプレイ法で利用可能なファージを生産する遺伝子である。）
一方、ｐＰＤＳからのｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子の増幅は、ＰＣＲ法を用いて行えば、約６００  ｂｐの位置にｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子と思われるバンドを検出することができる。このバンドを精製し、ＦＬＡＧ配列の付加したニワトリＣλ遺伝子とのオーバーラップＰＣＲ用テンプレートとする。
【００６０】
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子のオーバーラップＰＣＲは、ニワトリＣλ鎖遺伝子３’側そしてｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子の５’側に付加されたＦＬＡＧ配列を介して行えば、約９５０  ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子が連結したと思われるバンドが検出される。このバンドを精製し制限酵素処理を行い、ＥａｇＩとＥｃｏＲＩで処理されたｐＰＤＳにライゲーション、大腸菌へ形質転換し本発明の抗体を得ることができる。
【００６１】
また、本発明のプリオンタンパク質の検出方法は、上述の抗体を用いて検出することを特徴とする。上述の抗体によれば、好ましくは、正常型又は異常型のプリオンタンパク質を検出することが可能である。
【００６２】
プリオンタンパク質の検出は、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フィルトレーションブロット法からなる群から選択される少なくとも１種によって行なうことができる。
【００６３】
【実施例】以下に実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６４】
実施例１
まず、プリオンタンパク質を用いて、抗原の調製を行なった。
１．  抗原調製（合成ペプチド、リコンビナントタンパク）
１−１．  ペプチド合成
本研究で使用したプリオン（以下では、ＰｒＰと略する。）合成ペプチド（ヒトＰｒＰ  ２５−４９残基；Ｈ２５、マウス５３−６８、６９−８４、８５−１００、９４−１０９、１０９−１２７、１２４−１４４、１４１−１５９、１５６−１７５、１７２−１８１、１８２−１９０、１８７−２０４、２０５−２２４、２２０−２４２；Ｍ５３−６８、Ｍ６９−８４、Ｍ８５−１００、Ｍ９４−１０９、Ｍ１０９−１２７、Ｍ１２４−１４４、Ｍ１４１−１５９、Ｍ１５６−１７５、Ｍ１７２−１８１、Ｍ１８２−１９０、Ｍ１８７−２０４、Ｍ２０５−２２４、Ｍ２２０−２４２）（図３３）は、ペプチド合成機（ＰＳＳＭ−８  Ｓｈｉｍａｚｕ）を用いてＦｍｏｃ法により合成した。合成したペプチドは、ＤＷもしくはＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）加ＤＷで完全溶解させた。ヒツジＰｒＰペプチドＳＨ１（９３−１１５残基）およびウシＰｒＰペプチドＢ１０６（１０６−１２１残基）の合成は業者委託した。
【００６５】
１−２．  リコンビナントＰｒＰの調製
本研究で使用した６×ヒスチジン融合−リコンビナントマウスＰｒＰ２３−２３１（Ｍｏ２３−２３１；アミノ酸残基２３−２３１）は、マウスＰｒＰ発現ベクター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．，  ６３，  ９６７−９７０  （２００１））を使用した。マルトース結合タンパク融合−リコンビナントヒトＰｒＰ２３−２３１（Ｈｕ２３−２３１；アミノ酸残基２３−２３１）および６×ヒスチジン融合−リコンビナントヒトＰｒＰ１２２−２３０（Ｈｕ１２２−２３０；アミノ酸残基１２２−２３０）は、東北大院  北本博士より分与されたものを使用した。ヒトＰｒＰ１２２−２３０に相当するマウス、ヒツジおよびウシＰｒＰ（マウス：Ｍｏ１２１−２３１；アミノ酸残基１２１−２３１、ヒツジ：Ｓｈ１２５−２３４；アミノ酸残基１２５−２３４、ウシ：Ｂｏ１３３−２４１；アミノ酸残基１３３−２４１）は、発現タンパク質のＣ末端にヒスチジン標識されるｐＥＴ２２ｂ  （＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて調製した。抗体エピトープ解析に使用したリコンビナントマウスおよびハムスターＰｒＰ（Ｍｏ２３−８７、Ｍｏ２３−１６７、Ｍｏ２３−２１４、Ｍｏ８９−２３１、Ｍｏ１５５−２３１、Ｈａ２３−２３１、Ｈａ  Ｃ１７９Ａ、Ｈａ  Ｃ２１４Ａ）は、帯広畜産大学  堀内博士より恵与いただいた。
【００６６】
１−２−１．  リコンビナントマウス、ヒツジおよびウシＰｒＰ（プロテアーゼＫ耐性領域）発現ベクターの調製
ヒトＰｒＰ１２２−２３０（プロテアーゼＫ耐性領域）に相当するマウス、ヒツジおよびウシＰｒＰ遺伝子は、分与いただいたＤＮＡ（マウス、ヒツジ、ウシ）をテンプレートにｐＥＴ２２ｂ  （＋）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩサイトに挿入できるように設計したプライマーとＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用して増幅した。増幅した遺伝子断片は２０  ＵのＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。同一酵素で処理したｐＥＴ２２ｂ  （＋）と増幅遺伝子断片は、モル比で１：３になるように混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）でライゲーション反応を行いＰｒＰ発現ベクターとした。発現ベクターはＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、挿入遺伝子の有無をＰＣＲで確認した。
【００６７】
１−２−２．  タンパク発現
挿入遺伝子の確認された大腸菌は、１００  μｇ／ｍｌアンピシリン加ＬＢ培地  ２  ｍｌで３７℃  終夜培養した。培養液の一部は１００  μｇ／ｍｌアンピシリン加ＬＢ培地１リットルに移し、培養液のＯＤ６００の値が１．０になるまで３７℃で培養した。培養液のＯＤ値を確認後、終濃度が１  ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２２℃で６時間の培養後に１０，０００×ｇ  ４℃  ２０分間の遠心でその菌体を回収した。なお、マウスＰｒＰ２３−２３１の発現は、同濃度のＩＰＴＧ添加後、３７℃で１２時間の培養後に菌体を回収した。
【００６８】
１−２−３．  発現タンパク精製１（Ｍｏ１２１−２３１、Ｓｈ１２５−２３４、Ｂｏ１３３−２４１）
リコンビナントＰｒＰの精製は、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。回収した大腸菌は、４０  ｍｌのリン酸バッファー（２０  ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５  Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．４）に再懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ  ２５０Ｄ（ＢＲＡＮＳＯＮ）で超音波破砕した。破砕した菌体は、１０，０００×ｇ  ４℃  １０分間遠心しその上清を精製に用いた。カラムバッファーで平衡化したニッケルキレートカラム  ２  ｍｌに遠心回収した上清を添加し、４℃  ６０分間の転倒混和後、オープンカラムＰＤ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填し上清を除去後、カラムの２０倍容量のカラムバッファー（２０  ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５  Ｍ  ＮａＣｌ  １０  ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｐＨ  ７．４）で洗浄した。溶出は、０．１、０．２、０．３、０．４および０．５  Ｍイミダゾール加カラムバッファーの順にカラムの２倍容量で行った。主要な溶出フラクションは、そのままＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でゲル濾過クロマトグラフィー（流速；０．５  ｍｌ／ｍｉｎ、バッファー；２０  ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５  Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．４）し、単一ピークを精製品として使用した。
【００６９】
１−２−４．  発現タンパク精製２（Ｍｏ２３−２３１）
回収した大腸菌は、４０  ｍｌの６  Ｍグアニジン塩酸塩加カラムバッファー（６  Ｍ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、２０  ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ  ７．８）に再懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ  ２５０Ｄで超音波破砕した。破砕した菌体は１０，０００×ｇ  ４℃  １０分間遠心しその上清を精製に用いた。６  Ｍグアニジン塩酸塩加カラムバッファーで平衡化したニッケルキレートカラム５  ｍｌに遠心回収した上清を添加し、４℃  ６０分間の転倒混和後、オープンカラムＰＤ−１０に充填し上清を除去後、カラムの５倍容量の６  Ｍグアニジン塩酸塩加カラムバッファー（ｐＨ  ７．８）、５倍量の６  Ｍグアニジン塩酸塩加カラムバッファー（ｐＨ  ６．０）、２倍量の６  Ｍグアニジン塩酸塩加カラムバッファー（ｐＨ  ５．４）で順次洗浄した。溶出は、ｐＨ  ５．４とｐＨ  ４．０の６  Ｍグアニジン塩酸塩加カラムバッファーを９：１から１：９まで比率を変えて混合したもの５  ｍｌで行い、主要な溶出フラクションを精製品として使用した。
【００７０】
２．  免疫
本実施例では、Ｍｏ２３−２３１およびＭｏ１２１−２３０を抗原として用いた。１００  μｇ／０．５  ｍｌの抗原に等量のコンプリートフロイントアジュバンド（和光純薬）でエマルジョン化させた後、４週齢のＨ−Ｂ１５ニワトリ腹腔内に免疫した。初回免疫後約３週間目に同量の抗原をインコンプリートフロイントアジュバンド（和光純薬）で追加免疫した。
【００７１】
３．  特異抗体産生ハイブリドーマからのファージディスプレイ
本実験では、抗ＰｒＰニワトリモノクローナル抗体（ＨＵＣ２−１３）産生ハイブリドーマの抗体Ｖ領域重鎖（ＶＨ）遺伝子と抗体Ｖ領域軽鎖（ＶＬ）遺伝子を−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３−で構成されるフレキシブルなオリゴペプチドリンカーで繋いだｓｃＦｖ型抗体を作製した。
【００７２】
３−１．  抗体Ｖ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅
３−１−１．  ＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成
ＨＵＣ２−１３のＲＮＡは、ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）を用い、２．０×１０７  ｃｅｌｌｓから添付のプロトコールに従い単離した。調製したＲＮＡは、ジエチルピロカーボネート処理蒸留水（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ、ＤＥＰＣ−ＤＷ）２０  μｌに再溶解した。
１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成は、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマー法を用いて行った。１  μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液に５００  μｇ／ｍｌ  Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ１５プライマー（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を１  μｌ加え、蒸留水（ＤＷ）で１２  μｌに調製した。この混合液を７０℃で１０分間インキュベートし、氷冷後、５×逆転写バッファー（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を４  μｌ、０．１  Ｍ  ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ＤＴＴ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を２．０  μｌ、５  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を２  μｌ加え、４２℃で２分間インキュベートした。その後、２００  Ｕ／μｌ逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を０．５  μｌ加え、４２℃で５０分間、続いて７０℃で１５分間インキュベートした。合成したｃＤＮＡは−２０℃で保存した。
【００７３】
３−１−２．  ＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子ならびにリンカー遺伝子の増幅と精製
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子の増幅には、３−１−１で合成したｃＤＮＡを、リンカー遺伝子の増幅にはリンカー供給用に構築されたプラスミドｐＬＩＮＫをテンプレートとし、表１に示したそれぞれ１ペアのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｃｌｏｎｅｄ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いた。表１中、ＣＨＢは、重鎖可変領域用センスプライマーを示し、ＣＨＳＦは、重鎖用アンチセンスプライマーを示し、ＣＬＳＢは、軽鎖用センスプライマーを示し、ＣＬＦは、軽鎖用アンチセンスプライマーを示し、ＣＲＢは、ｓｃＦｖ断片の再増幅用センスプライマーを示し、ＣＲＦは、再増幅用アンチセンスプライマーを示し、ｐＬＩＮＫ１は、リンカーの増幅用センスプライマーを示し、ｐＬＩＮＫ２は、リンカー用アンチセンスプライマーを示し、Ｍ１３−Ｒは、ｓｃＦｖの配列用センスプライマ−を示し、ＳＬＰ−１は、ｓｃＦｖの配列用アンチセンスプライマーを示す。アンダーラインは、ＥａｇＩ又はＢｓｓＨＩＩ用挿入制限部位を示す。
【００７４】
【表１】
2004283111.tif 000002
なお、その条件は表２に示した。表２は、免疫グロブリン及びリンカ−遺伝子の増幅を示す。
【００７５】
【表２】
2004283111.tif 000003
また、陽性対照として、Ｙａｍａｎａｋａらが作製した抗マウスアルブミンモノクローナル抗体３Ｃ８（ニワトリリコンビナント抗体）（Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｈ．  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５７，  １１５６−１１６２  （１９９６））を供試した。ＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子のＰＣＲ反応溶液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、１０  ｍｇ／ｍｌ  グリコーゲン  ２  μｌを加えたエタノール沈殿によって濃縮した後、１．５％アガロースゲル（和光純薬）を用いて電気泳動した。得られたバンドは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで添付プロトコールに従い精製し、ＤＷ  ２０  μｌで溶出させた。リンカー遺伝子のＰＣＲ反応溶液は、ＶＨ、ＶＬ抗体遺伝子の精製と同様に行った。ただし、電気泳動には３．０％アガロースゲルを用いた。
【００７６】
ｓｃＦｖ抗体遺伝子合成増幅のためのアッセンブリー反応ならびに再増幅反応は、精製したＶＨ、ＶＬ、およびリンカーをそれぞれモル比１：１：１で混合したＰＣＲによって行った。ｓｃＦｖ抗体遺伝子のＰＣＲ反応溶液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、１０  ｍｇ／ｍｌ  グリコーゲン  ２  μｌ加えたエタノール沈殿によって濃縮した後、１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動した。得られたバンドは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで添付プロトコールに従い精製し、ＤＷ  ２０  μｌで溶出させた。
【００７７】
３−４．  制限酵素処理と脱リン酸化処理
精製したｓｃＦｖ遺伝子断片２  μｇとベクターｐＰＤＳ  １０  μｇは、ＤＮＡ  １  μｇに対して４  ＵのＥａｇＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，  Ｉｎｃ．）を添加し、３７℃で終夜処理した。ＥａｇＩ処理後、同様の比率で反応液にＢｓｓＨＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，  Ｉｎｃ．）を添加し、５０℃で６時間処理した。ＢｓｓＨＩＩ処理後、６８℃、２０分間の酵素失活処理をし、反応液をＤＷで３００  μｌにメスアップした上でフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、１０  ｍｇ／ｍｌ  グリコーゲン  ２  μｌを加えたエタノール沈殿をし、ＤＷ  ３０μｌに再溶解した。
【００７８】
ベクターは、分子内ライゲーションを防ぐため大腸菌由来アルカリフォスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＢＡＰ）（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて脱リン酸化処理した。ベクター３０  μｌに５×ＢＡＰバッファー１０  μｌ、ＢＡＰ（０．４  Ｕ／μｌ）３  μｌ、ＤＷ  ７  μｌを加え、３７℃  ３時間の処理を行った。処理後の反応液は、ＤＷで３００  μｌにメスアップした上でフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、１０  ｍｇ／ｍｌ  グリコーゲン  ２  μｌ加えたエタノール沈殿をし、ＤＷ  ３０  μｌに再溶解した。
【００７９】
３−５．  ベクターへのライゲーション
ライゲーションは、精製したｓｃＦｖ遺伝子断片２０  ｎｇとベクターｐＰＤＳ  １００  ｎｇをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いて行った。なお、その方法は添付のマニュアルに従った。
【００８０】
３−６．  形質転換（塩化ルビジウム法）
形質転換は、−８５℃で保存されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテントセル溶液１００  μｌにライゲーション溶液を１０  μｌ加え、常法に従い行った。形質転換体は１００  μｇ／ｍｌアンピシリン加２×ＹＴプレートにプレーティングし、３７℃で終夜培養した。
【００８１】
３−７．  挿入ＤＮＡ断片の確認
挿入ＤＮＡであるｓｃＦｖ遺伝子の確認は、ｐＰＤＳベクター由来の配列であり挿入部位を完全に増幅できるように設計したＬａｃ  Ｚ上流配列のＭ１３−Ｒ、およびマウスＣκ鎖内配列のＳＬＰ−１の１ペアプライマーを用い、コロニーをテンプレートとしたＰＣＲ（表８）で行った。
【００８２】
３−８．  ファージディスプレイ抗体の調製
形質転換後、挿入ＤＮＡ断片の確認されたコロニーは、５０  μｇ／ｍｌアンピシリン加２×ＹＴ培地  ２  ｍｌで３０℃、ゆっくりとした終夜振盪培養をした。翌日、培養液  ０．８  ｍｌに、１００  μｇ／ｍｌアンピシリン加ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地  ０．２  ｍｌ、および２  Ｍ  グルコース  ３７  μｌを添加した。５０  ｍｌチューブで３７℃、３時間振盪培養した後、７．５×１０９  ｐｆｕのヘルパーファージ（ＶＣＳ−Ｍ１３、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を加え穏やかに振盪しながら３０分間培養しファージを感染させた。さらに３０分間強めに振盪培養した後、室温で８００×ｇ  １０分間遠心し上清を除去した。沈殿物は、１  ｍｌの１００  μｇ／ｍｌ  アンピシリン、５０  μｇ／ｍｌカナマイシン加ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地で再懸濁した後、同培地９  ｍｌを加えて激しく振盪しながら終夜培養した。翌日冷却後、８００×ｇ  １０分間の遠心で菌体を除き、０．４５  μｍポアフィルター（関東化学）で上清を濾過し、その濾液をファージディスプレイ抗体浮遊液とした。なお、抗体は４℃もしくは−２０℃で保存した。
【００８３】
３−９．  発現ベクター（ｐＰＤＳ）の調製
ロート製薬（株）山中八郎博士より分与を受けたファージディスプレイ用発現ベクター（ｐＰＤＳ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅへ塩化ルビジウム法による形質転換を行い、５０  μｇ／ｍｌアンピシリン加２×ＹＴプレートにプレーティング後、３７℃の終夜培養をした。得られたコロニーは選択採取し、５０  μｇ／ｍｌアンピシリン加２×ＹＴ培地で大量振盪培養した。培養した大腸菌からのベクター精製は、塩化セシウム密度勾配平衡遠心法により行った。
【００８４】
その後、ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクターｐＣＰＤＳおよびＨｉｓ−ｐＣＰＤＳを設計した。手順を以下に説明する。
【００８５】
発現ベクター（ｐＣＰＤＳの調製）
ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクターｐＣＰＤＳの設計
ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクターｐＣＰＤＳの設計は、上述したｐＰＤＳベクターをベースに行った。ｐＰＤＳに既に挿入されているマウスＣκ鎖遺伝子をニワトリＣλ鎖遺伝子に置換し、その際ＶＬとＣλ連結の配列がｇｅｒｍｌｉｎｅのアミノ酸配列に近似し、使用遺伝子が切断されないようなクローニング用制限酵素部位を選択した（表３）。表３は、制限酵素及びそれらの部位用の候補を示す。＊は、交換可能なことを示し、イタリックは、交換が推奨されないものを示す。１）は、ｐＰＤＳ用のプライマーであり、２）は、ｐＣＰＤＳ及びＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ用のプライマーを示す。
【００８６】
【表３】
2004283111.tif 000004
また、インサートのない状態（Ｍｏｃｋ）でもニワトリＣλ鎖の発現でベクター検定できるようＥａｇＩ以降のスペーサー配列も新たに設計し直した。ニワトリＣλ鎖の下流には精製用タグであるＦＬＡＧ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、さらにＦＬＡＧ配列とｇｅｎｅＩＩＩの間には可溶型抗体として発現できるようＴＡＧ（ａｍｂｅｒ）ストップコドンを挿入した。ＥａｇＩ部位からｇｅｎｅＩＩＩまで作製したコンストラクトは、ＥａｇＩとＥｃｏＲＩ処理したｐＰＤＳにライゲーション（Ｌｉｇａｔｉｏｎ）し、ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクターとした（図２）。
【００８７】
＜ニワトリＣλ鎖遺伝子の単離＞
ニワトリＣλ鎖遺伝子クローニング用プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）の設計と合成
ニワトリＣλ鎖遺伝子クローニング用プライマーは、既報のＣλ鎖塩基配列をもとにＯＬＩＧＯ  ４．０５  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて設計し、北海道システムサイエンスに委託して合成した（表４）。表４は、発現ベクターの構築用に使用されたプライマーを示す。プライマー１は、Ｃλ領域用のセンスプライマーを示し、プライマー２は、ニワトリＣλ領域用のアンチセンスプライマーを示し、プライマー３は、遺伝子ＩＩＩ用のセンスプライマーを示し、プライマー４は、遺伝子ＩＩＩ、ｐＣＰＤＳ、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳ構築物用のアンチセンスプライマーを示す。プライマー５は、ニワトリＣλ、ｐＣＰＤＳ及びＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ構築物の再増幅用センスプライマーを示し、プライマー６は、ニワトリ再増幅用アンチセンスプライマーを示し、プライマー７は、ニワトリＣλ再増幅用アンチセンスプライマーを示す。プライマー８は、遺伝子ＩＩＩ用センスプライマーを示す。プライマー１〜８は、図のそれらに対応する。
【００８８】
【表４】
2004283111.tif 000005
ニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅とクローニング
ニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅は、正常ニワトリ脾臓細胞からＲＴ−ＰＣＲ法（表５）で行った。ＰＣＲ反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ  ２０  μｌに再溶解した。その溶液に１６  Ｕ／μｌのＢａｍＨＩと２０  Ｕ／μｌのＨｉｎｄＩＩＩをそれぞれ１  μｌずつ添加し、３７℃  ２時間の制限酵素処理、エタノール沈殿濃縮をした。濃縮後のサンプルは、ＤＷ  １０  μｌに再溶解し、１．５％  アガロースゲルを用いて電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製し、ＤＷ  １０  μｌに再溶解した。濃度測定後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ  （−）とモル比がベクター：インサート＝１：３になるように混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈで１６℃  ３時間ライゲーションした。ライゲーション終了後、その反応液５  μｌをＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテントセルに形質転換し、４０  μｌをアンピシリン加２×ＹＴプレートにプレーティングした。翌日、得られたコロニーを単離しアンピシリン加２×ＹＴ培地で少量培養し、アルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドを調製後、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、インサート有無の確認をした。
【００８９】
ニワトリＣλ鎖の塩基配列決定
塩基配列の決定は、ＡＢＩ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。なお、サイクルシーケンスには、Ｔ３およびＴ７プライマーを使用した。
【００９０】
＜連結反応用ニワトリＣλ鎖遺伝子の調製＞
ニワトリＣλ鎖遺伝子増幅用プライマーの設計と合成
再構築ベクターのコンストラクトとなるニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅用プライマーは、ｓｃＦｖ抗体遺伝子クローニングサイトになるようＥａｇＩ、ＢｓｓＨＩＩを組み込み、さらに空ベクターでも発現できるようフレームシフトに留意したセンスプライマーと、ＦＬＡＧ−アンバー−ｇｅｎｅＩＩＩ  ５’末端配列を付加してｐＰＤＳから単離したｇｅｎｅＩＩＩと連結できるようにしたアンチセンスプライマーを設計し、その合成は北海道システムサイエンスに委託した（表４）。
【００９１】
ニワトリＣλ鎖遺伝子の増幅
塩基配列決定後、データバンクと照会し完全一致したクローンは、塩化セシウム密度勾配平衡遠心法で大量調製した。調製したサンプルをテンプレートとし、オーバーラップＰＣＲ用ニワトリＣλ鎖遺伝子を調製した（表５）。
【００９２】
【表５】
2004283111.tif 000006
ＰＣＲ反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ  １０  μｌに再溶解した。この反応液を１．５％アガロースゲルで電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製、ＤＷ  １０  μｌに再溶解し、ＶＣＳ−Ｍ１３由来ｇｅｎｅＩＩＩとのオーバーラップＰＣＲ用サンプルとした。
【００９３】
＜連結反応用ＶＣＳ−Ｍ１３由来ｇｅｎｅＩＩＩの調製＞
ｇｅｎｅＩＩＩ増幅用プライマーの設計と合成
ｐＰＤＳからのｇｅｎｅＩＩＩ増幅には、ニワトリＣλ鎖とＦＬＡＧ−アンバー配列を介して連結できるようなセンスプライマーとｇｅｎｅＩＩＩの終止コドン直後にＥｃｏＲＩを導入したアンチセンスプライマーを設計し、その合成は北海道システムサイエンスに委託した（表４）。
【００９４】
ｇｅｎｅＩＩＩの増幅
ＶＣＳ−Ｍ１３由来ｇｅｎｅＩＩＩの調製は、ｐＰＤＳベクターからＰＣＲ法で行った（表５）。  ＰＣＲ反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ  １０  μｌに再溶解した。この反応液を１．５％  アガロースゲルで電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製、ＤＷ  １０  μｌに再溶解し、ニワトリＣλ鎖とのオーバーラップＰＣＲ用サンプルとした。
【００９５】
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅＩＩＩとの連結反応
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅＩＩＩとの連結は、モル比１：１で混合したテンプレートをもとにアッセンブリー反応、再増幅反応で行った（表６）。
【００９６】
【表６】
2004283111.tif 000007
ＰＣＲ反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ  １０  μｌに再溶解した。この反応液を１．５％  アガロースゲルで電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製、ＤＷ  １０  μｌに再溶解した。
【００９７】
ｐＰＤＳベクターからのマウスＣκ鎖、ｇｅｎｅＩＩＩの除去とニワトリＣλ鎖−ｇｅｎｅＩＩＩの挿入
ｐＰＤＳベクターはニワトリＣλ鎖−ｇｅｎｅＩＩＩを挿入するため、１０  Ｕ／μｌのＥａｇＩと１０  Ｕ／μｌのＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、さらに、分子内ライゲーションを防ぐため脱リン酸化処理を行った。脱リン酸化処理後の反応液は、１．０％アガロースゲルを用いて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製後、ＤＷ  １０  μｌに再溶解し、再構築用サンプルとした。また、ニワトリＣλ鎖−ｇｅｎｅＩＩＩも同様に制限酵素処理、精製して１０  μｌの再構築用サンプルを準備した。調製した再構築用サンプルは濃度測定後、ベクター：インサートのモル比が１：３になるように混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈで１６℃  ３時間ライゲーションし、その反応液５  μｌをコンピテントセル５０μｌに形質転換した。形質転換した大腸菌はアンピシリン加２×ＹＴプレートに４０  μｌプレーティングし、終夜３７℃で培養した。
【００９８】
挿入遺伝子の確認
挿入遺伝子は、コロニーをテンプレートにニワトリＣλ鎖のＰＣＲ法による増幅で確認した（表７）。
【００９９】
【表７】
2004283111.tif 000008
発現ベクター（Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳの調製）
ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクターＨｉｓ−ｐＣＰＤＳの設計は、ｐＣＰＤＳベクターをベースに行った。ＦＬＡＧ配列の下流にヒスチジンの六回繰り返し配列が入るように、ニワトリＣλ鎖増幅用アンチセンスプライマーとｇｅｎｅＩＩＩ増幅用センスプライマーを設計し、ｐＣＰＤＳ作製と同じ方法で構築した。
【０１００】
再構成ファージ体発現の確認
再構成ファージ体発現の確認は、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で行った。抗ニワトリλ鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と抗マウスκ鎖抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を０．５  μｇ／ｗｅｌｌで４℃  終夜固相化し、ブロッキング後、挿入遺伝子の確認できたコロニーをもとに上述した方法に準じて調製したｓｃＦｖ抗体発現なしの再構成ファージ体を５０  μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃  １時間反応させた。反応後、３，５００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗Ｍ１３抗体を３７℃  １時間反応させｏ−フェニレンジアミンを基質として発色させた。１０分間の反応後、４９２  ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダー  ＭＰＲ−Ａ４ｉで測定した。
【０１０１】
ＨＵＣ２−１３  ｓｃＦｖ抗体の再構築ベクターを用いた発現
上述のようにｐＰＤＳベクターを用いて構築したＨＵＣ２−１３のファージディスプレイ抗体ＨＵＣ２ｐ３からｓｃＦｖ抗体遺伝子を再構築ベクター用に設計したプライマーを用い、増幅させた（表４）。反応液は、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出後、エタノール沈殿濃縮し、ＤＷ  ２０  μｌに再溶解した。
大量調製後のｐＣＰＤＳ、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳならびにＨＵＣ２−１３由来ｓｃＦｖ抗体遺伝子は、１０  Ｕ／μｌのＥａｇＩと１０  Ｕ／μｌのＢｓｓＨＩＩで制限酵素処理した。さらに、ベクターは分子内ライゲーションを防ぐため脱リン酸化処理を行った。処理後の反応液は、１．０％アガロースゲルを用いて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製後、ＤＷ  １０  μｌに再溶解し、再構築用サンプルとした。調製した再構築用サンプルは濃度測定後、ベクター：インサートのモル比が１：３になるように混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈで１６℃  ３時間ライゲーションし、その反応液５  μｌをコンピテントセル５０  μｌに形質転換した。形質転換した大腸菌はアンピシリン加２×ＹＴプレートに４０  μｌプレーティングし、終夜３７℃で培養した。インサートのチェックは、ｓｃＦｖ抗体遺伝子増幅用のプライマーを用い、コロニーをテンプレートとするＰＣＲで行った。
【０１０２】
インサートの確認できたコロニーは、上述した方法に準じてファージディスプレイ抗体を調製した。
【０１０３】
可溶型抗体の調製
可溶型抗体は、アンバー配列ノンサプレッサー株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＳＯＬＲ株（ＳＯＬＲ株、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にファージディスプレイ抗体を感染させることにより作成した。ＳＯＬＲ株は２５  μｇ／ｍｌカナマイシン加２×ＹＴ培地２  ｍｌで終夜培養し、その培養液２００  μｌにファージディスプレイ抗体５  μｌを加えて３７℃で１時間感染させた。この培養液を２×ＹＴ培地で希釈し、１００  μｇ／ｍｌアンピシリン加２×ＹＴプレートにプレーティングし、３７℃で終夜培養した。得られたコロニーをテンプレートとしたＰＣＲでｓｃＦｖ抗体遺伝子断片が確認されたものを５０  μｇ／ｍｌアンピシリン加ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地２  ｍｌで培養した。その培養液５００  μｌにＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地４．５  ｍｌを加え、さらにアンピシリン、カナマイシンをそれぞれ終濃度１００  μｇ／ｍｌ、５０  μｇ／ｍｌとなるように加え３７℃、２時間振盪培養した。その後、終濃度が１  ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、さらに４時間振盪培養した。培養液は氷冷後、室温で８００×ｇ  １０分間遠心し、その上清を回収した。上清はさらに０．４５  μｍポアフィルターで濾過滅菌し、その濾液を可溶型抗体液として調製した。なお、抗体は４℃もしくは−２０℃で保存した。
【０１０４】
ＦＬＡＧタグの発現確認
ＦＬＡＧタグの発現は抗ＦＬＡＧ抗体を利用したウエスタンブロッティングで行った。１５％アクリルアミドゲルでファージディスプレイ抗体および可溶型抗体液５  μｌ／ｌａｎｅで泳動後、Ｉｍｍｕｎ−ＢｌｏｔＴＭ  ＰＶＤＦ膜に２００  ｍＡ、２時間でウェットブロッティングした。ブロッティング後の転写膜は、ブロッキング溶液で２時間以上のブロッキングを行った。ブロッキング終了後、ビオチン標識抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ）またはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスκ鎖抗体を一次抗体として９０分間反応させた。反応終了後、洗浄溶液で１０分間振盪させながら３回洗浄した後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰにて検出した。なお、ビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体による検出系は、一次抗体反応後にＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）による反応を行った後に、ＮＢＴ／ＢＣＩＰで検出した。
【０１０５】
ＥＬＩＳＡ
培養上清中のニワトリ型ファージディスプレイ抗体ならびに可溶型抗体の反応性、および精製可溶型抗体の反応性は、Ｈ２５ペプチド（２．５  μｇ／ｍｌ）を抗原としたＥＬＩＳＡで解析した。培養上清内リコンビナント抗体は希釈せずに一次抗体として使用し、二次抗体には、３，０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗ニワトリＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）抗体を用いた。
【０１０６】
脳由来ＰｒＰへの反応性（ウエスタンブロッティング）
リコンビナント抗体の脳由来ＰｒＰへの反応性検討には、ＢＡＬＢ／ｃ近郊系マウス脳を用いた。１０％脳ホモジネート５０  μｇを１３．５％アクリルアミドゲルで泳動し、展開したタンパクは、ＰＶＤＦ膜に転写した。ブロッキング終了後、可溶型抗体（培養上清）５００  μｌ／ｌａｎｅを一次抗体として９０分間  室温で反応させた。反応終了後、洗浄液で１０分間振盪させながら３回洗浄し、３，０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗ニワトリＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）抗体を二次抗体として６０分間  室温で反応させた。反応終了後、洗浄液で１０分間振盪させながら３回洗浄した後、ＥＣＬを用いてフィルム感光させた。フィルムへの感光時間は３分で行った。
【０１０７】
リコンビナント抗体の精製
それぞれの発現ベクターに挿入した可溶型ｓｃＦｖ抗体ＨＵＣ２−１３の精製は、１リットルのアンピシリン加ＬＢ培地（終濃度  １  ｍＭ  ＩＰＴＧを含む）で３７℃の終夜培養液から行った。氷冷した培養液は、１０，０００  ｒｐｍ  ２０分間の遠心で上清だけを回収し、６０％硫安塩析を行った。沈澱物は、５  ｍｌのＰＢＳで溶解後、同一のＰＢＳで透析を行いそれぞれのアフィニティー精製に供試した。
【０１０８】
抗ＦＬＡＧアフィニティー精製
ｐＣＰＤＳ由来可溶型抗体は、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ）を用いて精製した。ＰＢＳで洗浄した１  ｍｌのカラム担体へ透析したサンプルを混合後、室温１時間で転倒混和による結合を行った。未吸着フラクションを回収後、カラム２０倍容量のＰＢＳで洗浄し、０．１  Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ  ３．５）を溶出バッファーとした溶出を行った。カラム等量の溶出バッファーでカラム担体を撹拌し５分間の静置後、フラクションを回収した。回収用チューブには予め１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）を加えておき、即座に中和できるよう準備した。最終的に５フラクションを回収した。
【０１０９】
メタルキレートアフィニティー精製（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ−Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；  ＩＭＡＣ）
Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳ由来可溶型抗体は、ニッケルイオンをキレートしたＩＭＡＣで精製した。ＤＷで洗浄した１  ｍｌのＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に０．１  Ｍ  ＮｉＳＯ４を２  ｍｌ添加し、室温  ２０分間の静置でニッケルイオンと担体の結合を行った。結合反応後、５  ｍｌのＤＷで再度洗浄し、透析したサンプルを加え、室温１時間で転倒混和による結合を行った。未吸着フラクションを回収後、カラム２０倍容量の１０  ｍＭイミダゾール−ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で洗浄し、０．１〜０．５  Ｍイミダゾール−ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）を溶出バッファーとして溶出した。カラム等量の溶出バッファーでカラム担体を撹拌し、５分間静置した後フラクションを回収した。
【０１１０】
ゲル濾過クロマトグラフィー
それぞれのアフィニティー精製から回収した可溶型抗体は、ＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ＨＲ（Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でゲル濾過クロマトグラフィー（流速：０．５  ｍｌ／ｍｉｎ、バッファー：ＰＢＳ）した。精製抗体は、ＤＣ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で濃度測定後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いＣＢＢ染色で精製度の確認を行った。また、精製抗体の反応性は、Ｈ２５を抗原とし１００  μｇ／ｍｌから２倍段階希釈したものを一次抗体としたＥＬＩＳＡで検討した。
【０１１１】
４．  免疫脾臓細胞からのファージディスプレイ
４−１．  抗体Ｖ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる増幅
ニワトリ免疫脾臓細胞（１．０×１０９  ｃｅｌｌｓ）からのＲＮＡ抽出からｓｃＦｖ抗体遺伝子の増幅と精製までは、上記した方法に準じて行った。
【０１１２】
４−２．  発現ベクター（ｐＰＤＳ）の調製
ｐＰＤＳの調製は、上記した方法に準じて行った。
【０１１３】
４−３．  制限酵素処理とＢＡＰ処理
制限酵素処理とＢＡＰ処理は、上記した方法に準じて行った。
【０１１４】
４−４．  ベクターへのライゲーション
ライゲーションは、精製したｓｃＦｖ遺伝子断片２００  ｎｇとベクターｐＰＤＳ  １  μｇをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。また、反応液は、Ｋｏｂｏｒｉらの方法（Ｋｏｂｏｒｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  ６３，  ２７８２  （１９９３））に従いフェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿による濃縮精製後、ＤＷ  ５０  μｌに再溶解しエレクトロポレーションサンプルとした。
【０１１５】
４−５．  エレクトロポレーション
エレクトロポレーションは、エレクトロポレーション用に作製されたＥｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）８０  μｌにエレクトロポレーションサンプル  １０  μｌを加え、３０秒程度冷却後、０．１  ｃｍ幅のエレクトロポレーション用キュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に移し、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて１８  ＫＶ／ｃｍ、  ５  ｍｓｅｃの条件で行った。
【０１１６】
４−６．  ファージディスプレイ抗体の調製
エレクトロポレーション後の大腸菌は、ＳＯＣ培地にプールし、３７℃  １時間培養した。培養後、培養液の一部はライブラリーサイズ測定のためにサンプリングチューブに回収し、残りには７．５×１０９  ｐｆｕのヘルパーファージ（ＶＣＳ−Ｍ１３）、５０  ｍｇ／ｍｌアンピシリン  １０  μｌ、１２．５  ｍｇ／ｍｌテトラサイクリン  １０  μｌを加え、感染操作を１時間行った。感染後、８００×ｇ  １０分間遠心して上清を除き、１００  μｇ／ｍｌアンピシリン、５０  μｇ／ｍｌカナマイシン、２５  μｇ／ｍｌテトラサイクリン加ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地  １００  ｍｌで終夜培養した。翌日冷却後、８００×ｇ  １０分間の遠心で菌体を除き、０．４５  μｍポアフィルターで上清を濾過し、その濾液をファージディスプレイ抗体ライブラリー（ライブラリーＡ、Ｍｏ２３−２３１免疫；ライブラリーＢ、Ｍｏ１２１−２３１免疫）とした。
【０１１７】
４−７．  パニング選抜による特異抗体選抜
２．５  μｇ／ｍｌ濃度のＭｏ２３−２３１および  Ｍｏ１２１−２３１を９６ウェルプレートに５０  μｌ／ｗｅｌｌ（０．１２５  μｇ／ｗｅｌｌ）ずつ加え、４℃、終夜固相化しこれを抗原コートプレートとした。抗原コートプレート１６ウェルに２５％  ＢｌｏｃｋＡｃｅ  ４００  μｌ／ｗｅｌｌ加え３７℃  １時間ブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）で３回洗浄した。洗浄後、免疫原に対し、ファージディスプレイ抗体浮遊液（０．１−１．０×１０１２  ＣＦＵ／ｍｌ）  １．６  ｍｌ、ＢｌｏｃｋＡｃｅ  ７０４  μｌ、５  Ｍ  ＮａＣｌ  ９６  μｌで混合したものを１５０  μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃  ２時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で１５回洗浄した。なお、洗浄回数はパニングごとに５回ずつ増やした。洗浄後のウェルには、溶出液（０．１  Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｐＨ  ２．２、  １  ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）５０  μｌ／ｗｅｌｌを添加し、１５分間  室温の反応後、２  Ｍ  トリス３  μｌ／ｗｅｌｌで中和した。中和後、反応液を回収しＯＤ６００＝０．５〜１．０に培養したＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ２  ｍｌに３７℃  １時間感染させた。感染後の溶液の一部は力価測定のために、１００μｇ／ｍｌアンピシリン加２×ＹＴプレートにプレーティングし、溶出ファージ力価を測定した。さらにＰＣＲによるインサートチェック後、そのインサート率を溶出ファージ力価に積し陽性溶出ファージ力価を求めた。残りの感染溶液には５０  μｇ／ｍｌアンピシリン加ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地  ４００  μｌと２  Ｍ  グルコース３７  μｌ加え、３７℃  ２時間の培養後、７．５×１０９  ｐｆｕのヘルパーファージを１時間感染させた。感染後、８００×ｇ  １０分間遠心して上清を除き、１００  μｇ／ｍｌアンピシリン、５０  μｇ／ｍｌカナマイシン、２５  μｇ／ｍｌテトラサイクリン加ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地  １０  ｍｌで終夜培養した。翌日冷却後、８００×ｇ  １０分間の遠心で菌体を除き、０．４５  μｍポアフィルターで上清を濾過し、その濾液を一次パニング済ファージディスプレイ抗体浮遊液とし、次回のパニングサンプルとした。
【０１１８】
４−８．  ファージディスプレイ抗体のモノクローナル化
３回目のパニング終了後、溶出ファージ力価測定用にプレーティングしたプレートからライブラリーごとに６０クローンずつランダムにピックアップし、挿入ｓｃＦｖ抗体遺伝子の有無をＰＣＲで確認後、特異抗体産生ハイブリドーマからのファージディスプレイ抗体調製に示した方法に従い調製した。
【０１１９】
５．  ファージディスプレイ抗体の塩基配列決定
塩基配列の決定は、ダイデオキシ法をもとにＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて添付マニュアルに従った。なお、サイクルシーケンスには、挿入ＤＮＡ断片の確認用プライマー（Ｍ１３−ＲおよびＳＬＰ−１）を使用した。塩基配列の解析は３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、機器の設定および塩基配列の解析方法は機器付属のマニュアルに従った。得られた塩基配列はＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０を用いて分析した。
【０１２０】
６．  ＥＬＩＳＡ
調製したファージディスプレイ抗体ならびに可溶型抗体の免疫原および異種動物のそれに相当する領域のＰｒＰに対する反応性試験は、ＥＬＩＳＡ法により行った。２．５μｇ／ｍｌ濃度の抗原を９６ウェルプレートに５０  μｌ／ｗｅｌｌ（０．１２５  μｇ／ｗｅｌｌ）ずつ添加し、４℃、終夜固相化しこれを抗原プレートとした。抗原プレートはＢｌｏｃｋＡｃｅをＰＢＳで２５％に希釈したものを４００  μｌ／ｗｅｌｌ加え３７℃  １時間ブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）で３回洗浄した。一次抗体反応は、リコンビナント抗体を５０  μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃、２時間静置して行った。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）で５回洗浄後、二次抗体反応として１０％  ＢｌｏｃｋＡｃｅで１，０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識抗マウスκ鎖抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）もしくは１，０００倍希釈したＡＰ標識抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を５０  μｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃  １時間静置した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．０５％）で５回洗浄後、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて１５分間の発色を行い、４０５  ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダーＭＰＲ−Ａ４ｉ（東ソー）で測定した。
【０１２１】
７．  正常型及び異常型ＰｒＰの検出
７−１．  脳由来正常型ＰｒＰ（ＰｒＰＣ）の調製
正常マウス、ヒツジおよびウシの脳を摘出し、脳湿重量１  ｇに対しリシスバッファー（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ  ７．５）、１００  ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、  ０．５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）１０  ｍｌの割合でホモジナイズした。脳溶解液は、１０，０００×ｇ  ４℃で１０分間遠心後、上清を回収し、この溶液を１０％ホモジネートサンプルとして以後の実験に使用した。タンパク濃度はＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて測定した。
【０１２２】
７−２．  感染細胞および脳由来異常型ＰｒＰ（ＰｒＰＳｃ）の調製
ＰｒＰＳｃ（プロテアーゼＫ処理、ＰＫ  （＋＋））サンプルの調製は、以下の手順で行った。１０  ｃｍ培養用ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｅｃｋｉｎｓｏｎ）でコンフルエントになったＮ２ａ／２２Ｌを冷ＰＢＳで細胞が剥がれない程度に２回の洗浄後、１  ｍｌのリシスバッファーを添加し氷上で溶解させた。細胞溶解液は１０，０００×ｇ  ４℃で１０分間遠心し、その上清をＤＣ−ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔで濃度測定後、プロテアーゼＫ未処理（ＰＫ  （−））サンプルとして回収した。１  ｍｇ／ｍｌに調製したＰＫ  （−）サンプルに２０  μｇ／ｍｌになるようにプロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ）を添加し、３７℃  ６０分間のインキュベーション後、１  ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ  （Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で反応停止させた。この反応液を１００，０００×ｇ  ２５℃で６０分間超遠心後、上清を完全に除去し３０  μｌの１×ＳＤＳサンプルバッファーを添加した。５５℃  ３０分間のインキュベーションでペレットを完全に溶解させた後、１００℃  １０分間の煮沸処理を行い、以後の実験に供試した。スクレイピー（Ｏｂｉｈｉｒｏ株）感染マウス脳由来ＰＫ  （＋）サンプルは、動物衛生研究所  横山博士より供与いただいた。
【０１２３】
７−３．  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは上述した方法に準じて行った。
【０１２４】
７−４．  検出
転写後のＰＶＤＦ膜は、ブロッキングバッファー（８％  ＳｋｉｍＭｉｌｋ、  ０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、  ２．５  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｉｎ  ＰＢＳ）で終夜  室温でブロッキングした。ブロッキング終了後、リコンビナント抗体５００  μｌ／ｌａｎｅを一次抗体として９０分間  室温で反応させた。反応後、洗浄バッファー（１％  ＳｋｉｍＭｉｌｋ、  ０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、  ２．５  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｉｎ  ＰＢＳ）で１０分間振盪させながら３回洗浄し、洗浄バッファーで３，０００倍希釈したペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識ヤギ抗マウスκ鎖抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはＨＲＰＯ標識ヤギ抗ニワトリＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を二次抗体として６０分間  室温で反応させた。反応終了後、洗浄バッファーで１０分間振盪させながら３回洗浄した後、化学発光基質のＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて検出した。
【０１２５】
８．  エピトープマッピング
エピトープマッピングは、プリオンタンパクの合成ペプチド（マウス５３−６８、６９−８４、８５−１００、９４−１０９、１０９−１２７、１２４−１４４、１４１−１５９、１５６−１７５、１７２−１８１、１８２−１９０、１８７−２０４、２０５−２２４、２２０−２４２残基；Ｍ５３−６８、Ｍ６９−８４、Ｍ８５−１００、Ｍ９４−１０９、Ｍ１０９−１２７、Ｍ１２４−１４４、Ｍ１４１−１５９、Ｍ１５６−１７５、Ｍ１７２−１８１、Ｍ１８２−１９０、Ｍ１８７−２０４、Ｍ２０５−２２４、Ｍ２２０−２４２、ヒツジ９３−１１５、ウシ１０６−１２１）、ディレーションミュータント（Ｍｏ２３−８７、Ｍｏ２３−１６７、Ｍｏ２３−２１４、Ｍｏ８９−２３１、Ｍｏ１５５−２３１）およびジスルフィド結合しないようにシステイン残基をアラニン残基に置換した（Ｈａ  Ｃ１７９Ａ、Ｈａ  Ｃ２１４Ａ）を抗原とするＥＬＩＳＡで行った。ＥＬＩＳＡは、上記した方法に準じて行った。
【０１２６】
結果は以下の通りであった。
Ｍｏ１２１−２３１、Ｓｈ１２５−２３４、Ｂｏ１３３−２４１の調製
ヒトＰｒＰ１２２−２３１に相当するマウス、ヒツジおよびウシＰｒＰの調製は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）を用いて行った。それぞれのコンストラクトをＰＣＲで増幅したところ、予想された約３５０  ｂｐの位置に単一バンドとして検出された（データ示さず）。シーケンスの結果、これらのクローンには変異・挿入等の変化は確認されなかった。塩基配列の確認された組み換え大腸菌の発現誘導を行った結果、培養温度が２２℃の時に予想された約１４〜１５  ＫＤの融合タンパク発現が可溶性画分として認められたが、３０℃以上ではいずれも不溶性画分に認められた。この可溶性画分中の発現タンパクは、ニッケルキレートカラムおよびゲル濾過クロマトグラフィーで回収したところ、それぞれ１．９、１．１３、４．２  ｍｇ／ｌ  ｃｕｌｔｕｒｅであり、単一バンドとして精製できた（図３）。
【０１２７】
＜ＨＵＣ２−１３リコンビナント抗体の作製＞
ＨＵＣ２−１３由来ｓｃＦｖ型抗体の構築
合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いたＰＣＲ法によるＶＨおよびＶＬの増幅を行った結果、ＶＨ遺伝子と思われるバンド（約３８０  ｂｐ）とＶＬ遺伝子と思われるバンド（約３３０  ｂｐ）が確認された。次に、精製したＶＨ・ＶＬ遺伝子とリンカーとのアッセンブリーおよび再増幅反応を行ったところ、陽性対照３Ｃ８より若干高分子量の位置にｓｃＦｖ遺伝子と思われるバンド（約７６０  ｂｐ）が確認された（図１２Ａ）。このバンドを精製した後、制限酵素処理して、これをファージディスプレイ抗体作製のためのｓｃＦｖ遺伝子断片とした。
【０１２８】
得られたｓｃＦｖ遺伝子断片を発現ベクターｐＰＤＳにライゲーションした後、コンピテントセルＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換した。ついで、その培養液をプレーティングし、得られたコロニーから１０コロニーをランダムに単離し、ＰＣＲでｓｃＦｖ遺伝子断片の有無を確認した。その結果、１０クローン中４クローン（クローン＃：１、３、５、および６）でインサートが確認され（図１２Ｂ）、これをもとにファージディスプレイ抗体を調製し、これら４種のファージディスプレイ抗体をそれぞれＨＵＣ２ｐ１、ＨＵＣ２ｐ３、ＨＵＣ２ｐ５およびＨＵＣ２ｐ６と命名した。
【０１２９】
リコンビナント抗体の特異性
４クローンから調製したファージディスプレイ抗体（ＨＵＣ２ｐ１、ＨＵＣ２ｐ３、ＨＵＣ２ｐ５およびＨＵＣ２ｐ６）の特異性とその力価測定のためにＥＬＩＳＡを実施した。免疫原であるＨ２５ペプチドを抗原とした場合、ＨＵＣ２ｐ３とＨＵＣ２ｐ５のＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４０５）が、それぞれ１．４７、１．５７５であったのに対し、ＨＵＣ２ｐ１とＨＵＣ２ｐ６は、平均０．４であった。また、陰性対照用抗原であるＤＮＰ２０−ＫＬＨやＤＮＰ２０−ＢＳＡには、いずれも０．２以下の低値であった（図１３）。
【０１３０】
ＨＵＣ２ｐ３およびＨＵＣ２ｐ５からそれぞれ調製した可溶型抗体（ＨＵＣ２ｓ３およびＨＵＣ２ｓ５）とこれらに対応するファージディスプレイ抗体（ＨＵＣ２ｐ３およびＨＵＣ２ｐ５）は、Ｈ２５ペプチドを抗原、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスκ鎖抗体を二次抗体としたＥＬＩＳＡでその抗体力価を測定した。その結果、培養上清と菌体破壊抽出物ともＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４０５）１．０を越える高力価を示したが、ファージディスプレイ抗体は可溶型に比べると低力価でありＥＬＩＳＡ値はいずれも約０．５であった。一方、対照抗体として用いた３Ｃ８は、ファージディスプレイ抗体および可溶型抗体のいずれにおいてもＥＬＩＳＡ値は０．１以下であった。（図１４）
【０１３１】
ＨＵＣ２−１３抗体の塩基配列の解析
上述の実験で調製したリコンビナント抗体４クローンは、ＥＬＩＳＡで陽性反応を示したものと示さないものがあった。この違いが遺伝子の差違によるものか、ｓｃＦｖ抗体の構造的な問題かを明らかにする目的で、リコンビナント抗体４クローン、ＨＵＣ２−１３ハイブリドーマ、ならびに細胞融合の親株であるＭｕＨ１細胞株について抗体Ｖ領域遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を決定した。
【０１３２】
リコンビナント抗体４クローンのＶＨ遺伝子解析の結果、ＥＬＩＳＡ陽性クローン（ＨＵＣ２ｐ３およびＨＵＣ２ｐ５）と陰性クローン（ＨＵＣ２ｐ１およびＨＵＣ２ｐ６）で分類できる２種のＶＨ遺伝子が検出された。これらの配列はＨＵＣ２−１３産生ハイブリドーマでも認められ、陽性クローンの持つ配列の方がＤセグメントで１８塩基長い３８７  ｂｐで構成されるものであった。また、ＭｕＨ１では、陰性クローンの持つ３６９  ｂｐの配列が認められた（図１５）。陽性・陰性クローンＶＨのアミノ酸配列は生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）と比較してそれぞれ７４％、７７％の相同性であった（図１５）。一方、ＶＬ遺伝子を解析した結果、リコンビナント抗体４クローンおよびＨＵＣ２−１３産生ハイブリドーマから共通のＶＬ遺伝子が検出された。このＶＬ遺伝子はｇｅｒｍｌｉｎｅと比較して、ＣＤＲ１領域に３塩基の欠失、ＣＤＲ３に高頻度の変異がみられ３１２  ｂｐで構成されるものであった。また、ＭｕＨ１のＶＬ遺伝子は、これらのＶＬ遺伝子とは異なり、ＣＤＲ１が１８塩基長かった（図１６）。ＶＬ遺伝子は偽遺伝子全ての配列が解析済であり遺伝子変換を推測することが可能であることから、ＨＵＣ２−１３のＶＬ遺伝子の多様化機構を解析した。その結果、少なくとも４回の遺伝子変換と３回の突然変異の可能性が示唆された（図１７）。また、ＨＵＣ２−１３由来ＶＬのアミノ酸配列はｇｅｒｍｌｉｎｅと比較して７８％の相同性であった。一方、ＭｕＨ１由来ＶＬのアミノ酸配列はｇｅｒｍｌｉｎｅと７５％の相同性を有していた（図１６）。
【０１３３】
リコンビナント抗体の機能学的解析
調製したリコンビナント抗体が、合成ペプチドだけでなく脳由来プリオンタンパクにも反応することを検討するため、１０％マウス脳ホモジネートをサンプルとして、リコンビナント抗体（ＨＵＣ２ｐ３およびＨＵＣ２ｓ３）を一次抗体に用いてＰｒＰの検出を試みた。その結果、ファージディスプレイ抗体および可溶型抗体は、ともにＨＵＣ２−１３と同様にＰｒＰの糖鎖結合パターンによる３タイプのバンドが確認できた（図１８）。しかし、ＨＵＣ２−１３のようにバックグラウンドの低い検出はできなかった。
【０１３４】
可溶型抗体の生化学的解析
１０％マウス脳ホモジネートをサンプルとするウエスタンブロッティングでは、ＨＵＣ２−１３と比較してＨＵＣ２ｐ３、ＨＵＣ２ｓ３ともバックグラウンドが高かった。これらのリコンビナント抗体は大腸菌培養上清からの調製物であり、リコンビナント抗体以外に様々な不純物が含まれている。バックグラウンドがこの不純物によるものかを確認するため、ウエスタンブロッティングによって可溶型抗体の検出を試みた。ＣＢＢ染色では、はっきりと識別できるような可溶型抗体のバンドは検出できなかったが、ウエスタンブロッティングでは見かけ上の分子量  約４０  ＫＤ付近に明瞭な一本のバンドとして検出された（図１９）。可溶型抗体の正確な分子量は、構成アミノ酸から３９．３７  ＫＤであると算出され、ウエスタンブロッティング結果とほぼ一致した。
【０１３５】
ニワトリＣλ鎖遺伝子のクローニングとシーケンス
正常ニワトリ脾臓細胞から合成したｃＤＮＡをもとにＰＣＲでニワトリＣλ鎖遺伝子を増幅させたところ、約３４０  ｂｐの予想された断片を得た（図４）。この断片をクローニング・塩基配列決定を行ったところ、１１４残基のアミノ酸をコードする既報のＣλ鎖と完全一致した（図５）。このクローンはベクター再構築用コンストラクト調製のためのテンプレートとした。
【０１３６】
＜ｐＣＰＤＳの構築＞
ニワトリＣλ鎖の調製
塩基配列を決定したクローニング済のニワトリＣλ鎖遺伝子をもとに、再構築コンストラクトに使用するニワトリＣλ鎖遺伝子を調製した。その結果、副生成物も多々みられたが、約３６０  ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖にＦＬＡＧ配列が付加したと思われる断片が検出された（図４）。この断片は精製し、ｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子とのオーバーラップＰＣＲ用テンプレートとした。
【０１３７】
ｐＰＤＳからのｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子増幅
ｐＰＤＳからのｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子の増幅は、ＰＣＲ法を用いて行った。その結果、約６００  ｂｐの位置にｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子と思われる断片が検出された（図４）。この断片は精製し、ＦＬＡＧ配列の付加したニワトリＣλ遺伝子とのオーバーラップＰＣＲ用テンプレートとした。
【０１３８】
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子のオーバーラップ
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子のオーバーラップＰＣＲは、ニワトリＣλ鎖遺伝子３’側そしてｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子５’側に付加されたＦＬＡＧ配列を介して行った。その結果、約９５０  ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子が連結したと思われる断片が検出された（図４）。この断片は精製と制限酵素処理を行い、ＥａｇＩとＥｃｏＲＩで処理されたｐＰＤＳにライゲーション、大腸菌へ形質転換した。得られたベクターは、ｐＣＰＤＳと命名し、ｓｃＦｖ遺伝子を含まない状態で再構成ファージ体の調製を行い発現タンパクの検討を行った。
【０１３９】
＜Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳの構築＞
ニワトリＣλ鎖の調製
ｐＣＰＤＳをもとに、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳコンストラクトに使用するニワトリＣλ鎖遺伝子を調製した。その結果、約３８０  ｂｐの位置にニワトリＣλ鎖にＦＬＡＧ−６×ヒスチジン配列が付加したと思われる断片が検出された（図４）。この断片は精製し、ｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子とのオーバーラップＰＣＲ用テンプレートとした。
【０１４０】
ｐＣＰＤＳからのｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子増幅
ｐＣＰＤＳからのｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子の増幅は、ＰＣＲ法を用いて行った。その結果、約６００  ｂｐの位置にｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子と思われる断片が検出された（図４）。この断片は精製し、ＦＬＡＧ−６×ヒスチジン配列の付加したニワトリＣλ遺伝子とのオーバーラップＰＣＲ用テンプレートとした。
【０１４１】
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子のオーバーラップ
ニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子のオーバーラップＰＣＲは、ニワトリＣλ鎖遺伝子３’側そしてｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子５’側に付加された６×ヒスチジン配列を介して行った。その結果、約１  Ｋｂｐの位置にニワトリＣλ鎖とｇｅｎｅＩＩＩ遺伝子が連結したと思われる断片が検出された（図４）。この断片は精製と制限酵素処理を行い、ＥａｇＩとＥｃｏＲＩで処理されたｐＣＰＤＳにライゲーション、大腸菌へ形質転換した。得られたベクターは、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳと命名し、ｓｃＦｖ遺伝子を含まない状態で再構成ファージ体の調製を行い発現タンパクの検討を行った。
【０１４２】
＜構築ベクターの発現確認＞
ニワトリＣλ鎖の発現
ｐＣＰＤＳおよびＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ由来の再構成ファージ体は、抗マウスκ鎖ならびに抗ニワトリλ鎖抗体をキャプチャー抗体とし、ペルオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体を検出用抗体とするサンドイッチＥＬＩＳＡでニワトリＣλ鎖および再構成ファージ体の発現確認をした。なお、陽性対照としてｐＰＤＳから発現させた再構成ファージ体を用いた。その結果、ｐＣＰＤＳおよびＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ由来再構成ファージは、抗ニワトリλ鎖抗体をキャプチャー抗体としたときにのみ反応性が得られた。一方、ｐＰＤＳ由来再構成ファージは抗マウスκ鎖抗体にのみ反応性が確認された（図６）。
【０１４３】
ＦＬＡＧ配列の発現
ＦＬＡＧ発現は、ｐＣＰＤＳ、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳおよびｐＰＤＳ由来ファージ抗体ならびに可溶型抗体をサンプルとしたウエスタンブロッティングで確認した。その結果、抗ＦＬＡＧ抗体で検出した場合には、ｐＣＰＤＳおよびＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ由来の抗体がアミノ酸から推定される分子量である約４０  ＫＤの位置にシングル断片として検出され、陰性対照であるｐＰＤＳ由来抗体は全く検出されなかった。一方、抗マウスκ鎖抗体には、予想通りｐＰＤＳ由来抗体だけが反応性を示した（図７）。
【０１４４】
＜新規ベクター発現リコンビナント抗体の反応性＞
ＥＬＩＳＡ
新規発現ベクターｐＣＰＤＳ、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳを用い、ＨＵＣ２−１３のファージ抗体および可溶型抗体を調製した。調製したリコンビナント抗体は、ＨＵＣ２−１３、ｐＰＤＳ発現リコンビナント抗体と併せてＨ２５ペプチドに対する反応性の確認を試みた。その結果、ＨＵＣ２−１３と同様にファージ・可溶型抗体ともに抗ニワトリＩｇＧ抗体を二次抗体とした場合のみ反応した。ｐＰＤＳ由来抗体も、抗ニワトリＩｇＧ抗体を二次抗体としたときに反応したが、その反応性はその他の抗体の約２０％だった。抗マウスκ鎖抗体を二次抗体にした場合、ｐＰＤＳ由来抗体のみ反応性が得られた（図８）。
【０１４５】
ウエスタンブロッティング
脳由来ＰｒＰへの反応性は、正常マウス脳をサンプルとするウエスタンブロッティングで確認した。その結果、ｐＣＰＤＳおよびＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ由来抗体は、ＨＵＣ２−１３と同様にＰｒＰ特有の３本の断片に対し強い反応性を示した。ｐＰＤＳ由来抗体は、全体的に反応性が弱いがＰｒＰを認識していた（図９）。
【０１４６】
リコンビナント抗体の精製
ｐＣＰＤＳ、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳ由来可溶型ＨＵＣ２は、それぞれＦＬＡＧもしくはヒスチジンタグを利用したアフィニティー精製後、最終的にゲル濾過クロマトグラフィー精製まで行った。抗ＦＬＡＧアフィニティー精製をした場合、二回目の溶出フラクションにＣＢＢ染色レベルでほぼ単一断片として回収できた。一方、ニッケルキレートカラム精製した場合、洗浄操作直後の０．５  Ｍイミダゾール溶出では、目的タンパク以外の溶出もみられ、精製抗体としての回収は不可能だった。そこで、０．１  Ｍから０．５  Ｍまで段階的にイミダゾール濃度を変えて特異抗体の溶出を試みた。その結果、０．１、０．２  Ｍイミダゾールフラクションでは目的タンパク以外に多数の非特異的結合タンパクの溶出が確認された。０．３〜０．５  Ｍイミダゾールフラクションは主に目的タンパクが溶出されたが、わずかな非特異的タンパクも確認された。両サンプルは、ゲル濾過精製で単一の断片としてＣＢＢ染色され、その分子量はＦＬＡＧタグの検出時に示された位置と一致した（図１０）。なお精製品は、培養上清１ｌ当りそれぞれ１．７４３、１．１９７  ｍｇだった。
【０１４７】
２種の精製抗体は、Ｈ２５ペプチドを抗原とした抗体力価測定に供試した。その結果、両アフィニティー精製抗体とも５０  μｇ／ｍｌ濃度で最大反応値（抗ＦＬＡＧ、０．８２９；ＩＭＡＣ、１．１７２）を示したが、約１．４倍の差が生じた。４９２  ｎｍの吸光度が０．５のときで比較すると、抗ＦＬＡＧ精製では２０  μｇ／ｍｌ必要なのに対し、ＩＭＡＣでは２  μｇ／ｍｌと１０倍の力価差がみられた。いずれの精製抗体も０．１  μｇ／ｍｌ以下では反応性が確認されなかった（図１１）。なお、ＨＵＣ２−１３培養上清原液の反応値は０．７５５で精製リコンビナント抗体の最大反応値より下回った。
【０１４８】
ここで使用した発現ベクターｐＰＤＳは、当初マウスリコンビナント抗体を作製する目的から構築されたベクターであり、プライマーの改変によってニワトリリコンビナント抗体として作製可能となった。そのため検出用タグとしてマウスＣκ鎖が発現し、マウス抗体をキャプチャー抗体としたサンドイッチＥＬＩＳＡやマウスを実験動物として用いる場合、検出における交差反応性等のバックグラウンドが懸念された。そこで本章の実験では、バックグラウンドをなくし、本来の活性を維持したまま抗体精製ができるようにする目的から、純粋なニワトリリコンビナント抗体発現ベクターの構築を行った。構築時の留意点として、▲１▼ファージディスプレイできる、▲２▼機能的な可溶型ｓｃＦｖ抗体が発現できる、▲３▼将来的にＦａｂ抗体も作製できるようなベクターにする、▲４▼本来の抗体活性を維持したまま簡便に精製できる、の４点を挙げた。これらを考慮し、マウスＣκ鎖の代わりにニワトリＣλ鎖、精製用タグとして低分子量であり発現タンパクの立体構造形成を阻害しないようなＦＬＡＧ配列（８アミノ酸）（Ｂｒｉｚｚａｒｄ，  Ｂ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １６，  ７３０  （１９９４））および６×ヒスチジン（６アミノ酸）（Ｖｌａｄｋａ，  Ｇ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｖｉｋｔｏｒ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ４９，  ３３５−３６０  （２００１））を選択した。
【０１４９】
新規ベクターの作製はｐＰＤＳベクターをベースとし、適当な制限酵素部位を利用してコンストラクトの入替えという形でできるようにした。ｐＰＤＳは、ｓｃＦｖ抗体クローニングサイト以降ｇｅｎｅＩＩＩ終止コドンの直後のＥｃｏＲＩまで、位置的にも適当な制限酵素部位がないためＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩ間、もしくはＢｓｓＨＩＩ−ＥｃｏＲＩ間でコンストラクトを置換せざるを得なかった。ニワトリＣλ鎖とｓｃＦｖ抗体遺伝子の連結部位は、自然なＶＬ−Ｃλアミノ酸配列に近似するよう注意しながら、高切断効率であり、かつベクターやｓｃＦｖ抗体遺伝子を切断しない制限酵素とその設置部位を選定した（表３）。その結果、再びＢｓｓＨＩＩとなったが、ＢｓｓＨＩＩ−ＥｃｏＲＩ間でコンストラクトの置換を行うと、空ベクター発現時にフレームシフトが生じ正確にタンパク発現されないことから、ベクターの有効性を確認できないことが明らかとなった。そこで、新たなＥａｇＩ−ＢｓｓＨＩＩ間のスペーサーをつけ加えたＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩ間コンストラクトを導入することにした。
【０１５０】
ニワトリＣλ鎖は正常ニワトリ脾臓細胞から、ｇｅｎｅＩＩＩはｐＰＤＳからそれぞれ遺伝子を準備した。ＦＬＡＧ−アンバー配列はプライマーの一部に導入し、Ｃλ鎖増幅時に連結させることとしたが、煩雑な脾臓細胞由来ｃＤＮＡ群からＣλ鎖増幅時にこの５４塩基もあるプライマーを用いるのは危険であると判断し、いったんクローニングしたＣλ鎖をテンプレートとしてＦＬＡＧ−アンバー連結ＰＣＲを行うことにした。
【０１５１】
ＥａｇＩ−ＢｓｓＨＩＩのｓｃＦｖ抗体遺伝子クローニングサイト−ニワトリＣλ鎖−ＦＬＡＧ−アンバー配列（ＴＡＧ）−ｇｅｎｅＩＩＩまでの再構築用コンストラクトは全て、校正活性のあるＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法で作製し、ＥａｇＩとＥｃｏＲＩで処理したｐＰＤＳにライゲーションしてｐＣＰＤＳを得た。一方、ヒスチジンタグの付加されたベクターは、ｐＣＰＤＳ作製と同じ要領で行い、ＥａｇＩ−ＢｓｓＨＩＩのｓｃＦｖ抗体遺伝子クローニングサイト−ニワトリＣλ鎖−ＦＬＡＧ−６×ヒスチジン−アンバー配列（ＴＡＧ）−ｇｅｎｅＩＩＩで構成されるコンストラクトをＥａｇＩとＥｃｏＲＩで処理したｐＣＰＤＳにライゲーションしてＨｉｓ−ｐＣＰＤＳを得た。これら２種のベクター由来抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティングによるニワトリＣλ鎖、ＦＬＡＧの発現が確認され十分使用できることが明らかになった。コンストラクトのシーケンス結果からも構築時における変異や欠失は全く認められなかった。
【０１５２】
新規ベクターは、ｐＰＤＳでのファージディスプレイに使用したＨＵＣ２−１３抗体遺伝子を用いて機能的発現およびその精製法確立に供試した。発現の確認として抗ニワトリＩｇＧ抗体を二次抗体としたＥＬＩＳＡを行ったところ、ｐＣＰＤＳおよびＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ由来リコンビナント抗体は、インタクトなＨＵＣ２−１３の反応性までには達しなかったものの、それに匹敵する反応性を示した。ｐＰＤＳ由来抗体も前者のベクター由来抗体の約２０％の反応性が確認されており（図８）、構成タンパクから判断してｓｃＦｖ部分への二次抗体認識が反映された値と推測される。つまり、残り８０％の認識差は二次抗体のニワトリＣλ鎖認識に起因しており、Ｃλ鎖が検出感度の向上に重要な役割を果たしていることが示された。続いて、マウス脳ホモジネートをサンプルとするウエスタンブロッティングを行ったところ、ｐＣＰＤＳおよびＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ由来抗体は、ネイティブな抗体同様にプリオンタンパクの３バンドすべてを強く検出し、ｐＰＤＳ由来抗体と比較しても二次抗体によるバックグラウンドが低く（図９）純ニワトリ型リコンビナント抗体の有効性を証明できた。
【０１５３】
リコンビナント抗体の精製は、抗ＦＬＡＧアフィニティーもしくはニッケルキレートアフィニティー（ＩＭＡＣ）精製とゲル濾過クロマトグラフィーの組み合わせで行った。ここで使用したＦＬＡＧタグによる精製法は、Ｂｒｉｚｚａｒｄらによって考案された方法で、人工合成配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）に対する抗体を利用することで発現タンパクを極めて特異的に精製する方法である（Ｂｒｉｚｚａｒｄ，  Ｂ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １６，  ７３０  （１９９４））。ＦＬＡＧは人工的配列であることから、精製タグ以外にレポーターアッセイ用タグとしても利用されている。また、ＩＭＡＣ精製は６つの連続したヒスチジンがニッケル分子へ配位結合することを利用した簡便精製法で、タンパクフォールディングや活性に影響を与えないという点で汎用されている（Ｖｌａｄｋａ，  Ｇ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｖｉｋｔｏｒ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ４９，  ３３５−３６０  （２００１））。ｐＣＰＤＳ由来抗体を抗ＦＬＡＧ精製したところ、溶出フラクションに単一断片として抗体精製が可能であった。この精製度は、ゲル濾過クロマトグラフィー精製でもシングルピークとして得られていることから、ワンステップ精製が可能と思われた。一方、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳ由来抗体のＩＭＡＣ精製では、実施した全ての条件において抗ＦＬＡＧ精製グレードのものは得られず、目的外タンパクの混在が確認された。ＩＭＡＣ精製は、これまでも非特異的吸着の問題が報告されており、ヒスチジンを構成アミノ酸配列内に持つタンパクが低アフィニティーながらも結合していることが原因とされている。そこで、ニッケル以外に銅イオンやコバルトイオンのキレートカラムによる精製や洗浄液中に低濃度のＥＤＴＡ添加、０．１〜０．５  Ｍ塩化ナトリウム添加などして行うといった精製法の改良が様々なグループで試みられている（Ｖｌａｄｋａ，  Ｇ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｖｉｋｔｏｒ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ４９，  ３３５−３６０  （２００１））。今後、効率よく目的タンパクだけを精製するためにも、このような精製法を試す必要があると思われる。
【０１５４】
精製抗体は、ＥＬＩＳＡによる抗体力価測定に供試した。その結果、抗ＦＬＡＧ精製した抗体はＩＭＡＣ精製した抗体と比較して約１／１０の力価低下が認められた（図１１）。Ｓｈｉｍｉｚｕらは、ウシ血清アルブミン特異的卵黄抗体（ＩｇＹ）とウサギ抗体との生化学的比較解析を行い、ＩｇＹはｐＨ  ４．０以下、１１．０以上で急激な抗原結合活性の低下を報告している（Ｓｈｉｍｕｚｕ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５６，  ２７０  （１９９２））ことから、抗ＦＬＡＧ精製抗体の力価低下は、ニワトリ抗体特有のｐＨ感受性である可能性が最も考えられた。もしくはｓｃＦｖ抗体内リンカー配列の低ｐＨによるフレキシビリティー低下、重鎖定常領域が存在しないことによる重鎖立体構造の崩壊といったｓｃＦｖ抗体の構造的問題によって生じたものと考えられる。これらの結果から、現時点でのリコンビナント抗体精製は、中性ｐＨを維持しながら行えるＩＭＡＣ精製とゲル濾過クロマトグラフィーの２段階精製が最善である。本実験ではできなかったが、抗ＦＬＡＧ精製にもＦＬＡＧペプチドを用いた競合的溶出法を採用することで中性ｐＨを維持できる。この方法でうまく精製できれば、理想的な抗体活性を維持したままのワンステップ精製が可能になるだろう。
【０１５５】
ここでのｐＣＰＤＳおよびＨｉｓ−ｐＣＰＤＳベクター構築は、完全なニワトリ型リコンビナント抗体として発現させ、さらに精製抗体として利用することを可能にした。現段階では、ｐＣＰＤＳよりＨｉｓ−ｐＣＰＤＳの方が有効なベクターと思われるが、上述したようなＦＬＡＧタグによる精製の改良により、用途に応じてベクター選択でき、有用ニワトリ抗体の半永久的供給の一手法として貢献できることが期待される。
【０１５６】
＜ＰｒＰ特異的リコンビナント抗体の樹立＞
ファージ抗体ライブラリーの構築
細胞融合後の残った免疫脾臓細胞から合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＶＨ、ＶＬの増幅を行った結果、ＶＨ遺伝子と思われるバンド（約３８０  ｂｐ）と４００  ｂｐ以上の位置に明瞭なバンドが検出された。ＶＬ遺伝子も同様にＶＬ遺伝子と思われるバンド（約３３０  ｂｐ）以外に３８０  ｂｐ以上の位置に明瞭なバンドが確認された。精製したＶＨ、ＶＬ遺伝子とリンカーとのアッセンブリーおよび再増幅反応を行った結果、ｓｃＦｖ遺伝子と思われるバンド（約７６０  ｂｐ）が確認された。得られたｓｃＦｖ遺伝子断片をもとに２．７１×１０７  ＣＦＵ／μｇ  ｖｅｃｔｏｒ（ライブラリーＡ）、１．０×１０７  ＣＦＵ／μｇ  ｖｅｃｔｏｒ（ライブラリーＢ）のライブラリーを得た。
【０１５７】
パニング選抜
抗体ライブラリーＡ、Ｂは、それぞれＭｏ２３−２３１、Ｍｏ１２１−２３１を抗原とした三次パニングまでを行い、特異抗体の選抜を行った。パニングにおける陽性溶出ファージ力価は、一次から二次パニング間で６．５７、５．０２倍の増加、二次から三次パニング間で２６．２１、１２０．０６倍の増加がそれぞれ確認された。インサート率もライブラリーＡでは５０、８０、１００％とパニング選抜を繰り返すごとに増加していた（表８）。
【表８】
2004283111.tif 000009
【０１５８】
パニング過程におけるファージディスプレイ抗体の反応性は、それぞれの免疫原を抗原としたＥＬＩＳＡで測定した。上記で示したライブラリーとも一次パニング後までＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４０５）は０．１以下であったが、二次パニング以降は上昇し、ライブラリーＡは三次パニング後の反応性の約９０％にまで反応性の増加がみられた。一方、ライブラリーＢはパニング回数に比例した直線的反応性の増加が確認された（図２０）。
【０１５９】
モノクローナルファージディスプレイ抗体の作製とその特異性
二次および三次パニング後、各ライブラリーからインサートの確認された６０コロニーからモノクローナルファージディスプレイ抗体を作製し、抗体遺伝子配列をもとにした分類を行った。その結果、ライブラリーＡから単離された抗体は４種類（図２０）であり、重鎖は、Ｄセグメントが１８塩基（６残基）で構成される２パターン（３７７  ｂｐおよび３８３  ｂｐ）と３３塩基（１１残基）で構成される２パターン（３９８  ｂｐ）の計４パターン（図２２、２３）、軽鎖は、ＣＤＲ１がｇｅｒｍｌｉｎｅと比較して１５塩基（５残基）長い１パターン（３４１  ｂｐ）とＣＤＲ３が３塩基（１残基）長い２パターン（３３５  ｂｐ）の計３パターンだった（図２２、図２３）。一方、ライブラリーＢから単離された抗体は２９種類であり（図２１）、重鎖は、Ｄセグメントが１８塩基（６残基）で構成される１５パターン（３８３  ｂｐ）と３３塩基（１１残基）で構成される５パターン（３９８  ｂｐ）の計２０パターン（図２４、図２）、軽鎖は、ＣＤＲ１がｇｅｒｍｌｉｎｅと比較して６塩基（２残基）長い１パターン（３３２  ｂｐ）、１５塩基（５残基）長い１９パターン（３３８  ｂｐ、１パターン；３４１  ｂｐ、７パターン；３４４  ｂｐ、１１パターン）、ＣＤＲ３が３塩基（１残基）短い１パターン（３２６  ｂｐ）、ｇｅｒｍｌｉｎｅと同一長の１パターン（３２９  ｂｐ）の計２２パターンだった（図１６、図２７）。これらのクローンの変異はいずれも特定の場所で起こっており、ライブラリーＢから得られたクローンはその特定場所での特定塩基置換が多く認められた。また、ライブラリーＢから得られたクローンのうち、重鎖の２クローンで終止コドン（ＴＡＧ）の含まれているものが確認された。重鎖および軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列のみを比較した場合、ライブラリーＢでは、３カ所のＣＤＲ配列が全て一致し、フレームワーク領域だけが異なるクローンもあった。
【０１６０】
ライブラリーＡからの４クローン（ｐｈＡｂ１−４、ｐｈＡｂ２−１、ｐｈＡｂ３−７、ｐｈＡｂ３−１５）と、ライブラリーＢからの２９クローン（ｐｈＡｂ４−１〜２９）は、免疫原および他動物種の相同領域を抗原とするＥＬＩＳＡで反応性を確認した。ライブラリーＡからの４クローンはいずれもマウスおよびヒトＰｒＰ全領域の抗原には高い反応性を示したが、ＭｏＰｒＰ１２１−２３１の領域には反応性を示さなかった（図２８）。ライブラリーＢからの２９クローンは、いずれもＭｏ１２１−２３１およびその領域に相当する３種（ヒト、ヒツジ、ウシ）ＰｒＰに反応性を示し、その傾向はヒトおよびマウスＰｒＰへの反応性がヒツジおよびウシＰｒＰへの反応性より高いというものだった。ストップコドンの確認されたクローンは、可溶型抗体での反応性は認められなかった（データ示さず）。図２８には、２９クローンのうちＭｏ１２１−２３１への反応性が高い３クローンを示し、以後の実験もこの３クローンを中心に行った。
【０１６１】
＜ウエスタンブロッティング＞
ＰｒＰＣへの反応性
細胞融合から得られた２種の抗体（ＨＵＮＮ１、ＨＵＮＮ２）と２つのファージディスプレイライブラリーから得られた７種のファージ抗体（ｐｈＡｂ１−４、ｐｈＡｂ２−１、ｐｈＡｂ３−７、ｐｈＡｂ３−１５、ｐｈＡｂ４−３、ｐｈＡｂ４−１２、ｐｈＡｂ４−１９）を用いてＰｒＰＣへの反応性を検討した。
【０１６２】
ＨＵＮＮ１およびＨＵＮＮ２は、糖鎖結合の違いによる３タイプの全長型ＰｒＰＣを主に認識し、約６０  ＫＤの二量体ＰｒＰには、わずかながらに反応性を示していた。ＨＵＮＮ１は、マウスおよびウシＰｒＰに強く反応し、ヒツジＰｒＰには微弱な反応だった。ＨＵＮＮ２の反応性は、ＨＵＮＮ１の反応性に類似していたが、ヒツジＰｒＰへの反応性は、ＨＵＮＮ１よりさらに微弱だった（図２９）。なお、これら両抗体は陰性対照であるＰｒｎ−ｐ０／０マウス脳ホモジネートには反応性を示さなかった（データ示さず）。
【０１６３】
ファージ抗体ｐｈＡｂ１−４およびｐｈＡｂ２−１のマウスＰｒＰへの反応性は、ＥＬＩＳＡでの高い反応性に反して非常に弱かった。ヒツジおよびウシＰｒＰへの反応性は認められたが、その反応性はｐｈＡｂ１−４の方がｐｈＡｂ２−１より強く、ｐｈＡｂ１−４では二糖鎖型、一糖鎖型および無糖鎖型ＰｒＰ全てを認識できたが、ｐｈＡｂ２−１は二糖鎖型ＰｒＰのみ明瞭に認識された。ｐｈＡｂ３−７およびｐｈＡｂ３−１５は、マウス、ヒツジおよびウシＰｒＰ全てに反応性がみられ、動物間における反応性の差は、ＨＵＮＮ１と類似していた（図３０Ａ）。ｐｈＡｂ４−３、ｐｈＡｂ４−１２およびｐｈＡｂ４−１９は、マウス、ヒツジおよびウシＰｒＰに同一感度で反応性を示したが、いずれの抗体も二糖鎖型ＰｒＰを認識しなかった。またこれらの抗体は、約１６．５および２５  ＫＤの修飾型ＰｒＰを認識していた（図３０Ｂ）。ライブラリーＢから樹立した残りの２６種の抗体はいずれもｐｈＡｂ４−３、ｐｈＡｂ４−１２およびｐｈＡｂ４−１９と同一反応パターンだった（データ示さず）。
【０１６４】
ＰｒＰＳｃへの反応性
樹立した抗体が、ＰＫ抵抗性ＰｒＰ領域を認識できるか感染マウス脳および感染細胞株由来のＰＫ処理したＰｒＰＳｃをサンプルとして検討した（図３１）。ＨＵＮＮ１、  ＨＵＮＮ２、  ｐｈＡｂ３−７およびｐｈＡｂ３−１５はＰｒＰＳｃの糖鎖付加の違いによって生じる３本のバンド検出が可能であり、特にＨＵＮＮ１およびＨＵＮＮ２は、ＰＫ未処理サンプルよりＰＫ処理サンプルに強く反応性を示しているようであった。ＨＵＮＮ１およびＨＵＮＮ２は、感染マウスおよび感染細胞由来ＰｒＰＳｃの３本のバンドを差がなく検出したが、ｐｈＡｂ３−７およびｐｈＡｂ３−１５は、感染細胞由来の二糖鎖型ＰｒＰへの認識が一糖鎖型・無糖鎖型ＰｒＰに比べわずかではあるが弱かった。ｐｈＡｂ４−３およびｐｈＡｂ４−１９は、一糖鎖型および無糖鎖型ＰｒＰは検出できたが二糖鎖型ＰｒＰは全く検出されなかった。ｐｈＡｂ４−１２は、感染マウス由来ＰｒＰは３種類とも検出できたが、感染細胞由来ＰｒＰでは二糖鎖型を認識することができなかった。ｐｈＡｂ１−４およびｐｈＡｂ２−１は、ＰＫ処理ＰｒＰＳｃを全く検出できなかった。
【０１６５】
エピトープマッピング
樹立した抗体は、マウスＰｒＰ配列をもとに作製した１３種類の合成ペプチド、５種類のディレーションミュータント、２種類のジスルフィド結合欠損ハムスターＰｒＰおよび免疫原を抗原としたＥＬＩＳＡでエピトープマッピングした。その結果、ＨＵＮＮ１およびＨＵＮＮ２はＭ８５−１００に最も強く反応し、Ｍ９４−１０９にわずかな反応性がみられた。ｐｈＡｂ３−７は、Ｍ８５−１００とＭ９４−１０９に同程度で強く反応した。ｐｈＡｂ３−１５は、Ｍ９４−１０９、Ｍ８５−１００の順で強く反応し、Ｍ１２４−１４４にもわずかな反応性を示した。また、ｐｈＡｂ３−７およびｐｈＡｂ３−１５の両抗体は、ヒツジＰｒＰペプチド（ＳＨ１）およびウシＰｒＰペプチド（Ｂ１０６）とも反応したことから、これら両抗体はほ乳類ＰｒＰに共通して存在するＱＷＮＫのテトラペプチドを認識エピトープとしているものと思われる。その他の抗体は、免疫原には反応したが合成ペプチドには全く反応性を示さなかった。ｐｈＡｂ１−４およびｐｈＡｂ２−１は、Ｍｏ２３−８７および２３−１６７に最も強く反応し、Ｃ末側に延長するにつれて反応性の低下がみられた。ｐｈＡｂ４−３、ｐｈＡｂ４−１２およびｐｈＡｂ４−１９は、Ｍｏ２３−２３１に最も強く反応し、Ｃ末側が２１４、１６７、８７残基目までと短くなるにつれて反応性の減少が認められ、特に２１４残基目までＣ末を削除すると著しく減少した。Ｎ末側は、８９残基目まで削除しても反応性に変化はみられなかったが、１５５残基目まで削除するとＭｏ２３−２３１および８９−２３１の反応性と比較して約５０％に低下した。またｐｈＡｂ４−３およびｐｈＡｂ４−１９は、ハムスターＰｒＰのＣ１７９ＡやＣ２１４Ａに対して急激な反応性消失が確認され、ｐｈＡｂ４−１２はわずかながら反応性が認められた（表９）。表９は、ＭｏＰｒＰｓに対するパニング後に溶出したファージを示す。０．１−１．０×１０１２ＣＦＵ／ｍｌのファージディスプレイＡｂｓをピックアップした。
【表９】
2004283111.tif 000010
【０１６６】
以上まとめると、本発明にかかる抗体の作成を行ない、これらの抗体を用いて、種々の抗原との抗原抗体反応の有無を確認した。図３２に、ヒト、マウス、ヒツジ、ウシ由来のプリオンタンパク質の塩基配列、及び対応するニワトリの塩基配列を示す。図中、Ｍ８５−１００、Ｍ９４−１０９、ＳＨ１及びＢ１０６は、上述したような合成法によって合成したペプチドであり、これらの合成ペプチドと、本発明によるニワトリ由来抗体が抗原抗体反応を引き起こすことから、本抗体（ｐｈＡｂ３−７およびｐｈＡｂ３−１５）は、プリオンタンパク質のＴＨ−ＱＷＮＫを主要な認識領域としていることが判明した。
【０１６７】
このように本抗体によれば、哺乳動物間では認識し得ないか、又は認識することが困難な抗原であっても的確に認識し得るという有利な効果を奏する。
【０１６８】
ｐｈＡｂ３−７およびｐｈＡｂ３−１５は、ｐＰＤＳだけでなくｐＣＰＤＳやＨｉｓ−ｐＣＰＤＳを発現ベクターに用いても、図３２に示すＭ８５−１００、Ｍ９４−１０９、ＳＨ１及びＢ１０６を認識でき、有用な抗体であることが判明した。さらに、ヒスチジンタグを用いる場合には、ＦＬＡＧタグを用いる場合よりも、安価で容易に抗体を精製することができるという利点を有する。
【０１６９】
【発明の効果】
本発明は、純粋な鳥類型リコンビナント抗体、好ましくはニワトリ型リコンビナント抗体を提供する。ニワトリ型モノクローナル抗体は、哺乳動物では作成できないモノクローナル抗体を作成することができ、ヒトのがんマーカーとなる抗原であるＮ−グリコリルノイラミン酸、プリオン病に関連するプリオンタンパクなどを認識するなどの例をはじめ、多くの生体高分子への応用が可能であり、種々の検査・診断薬などへの展開が期待される。したがって、がん、プリオン病などの種々の診断薬、治療薬への応用が期待される。
【０１７０】
本発明では、実質上純粋なニワトリ型抗体を、遺伝子組換え法で多量に作ることができる。即ち、本発明は、新規なプラスミドベクターとプライマーを用いてニワトリ型モノクローナル抗体を効率よく多量に産生することを可能にしたものである。
【０１７１】
また、鳥類の抗体遺伝子は、３’末端及び５’末端の塩基配列が比較的固定化されており、本発明が提供するプライマーを用いて抗体の種類に関係なく当該遺伝子を増幅することが可能であり、本発明は各種の抗原に対するモノクローナル抗体を遺伝子組換え手段により簡便に作成できるという有利な効果を有する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、公知の発現ベクターｐＰＤＳの構成を示す。
【図２】図２は、ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクター（ｐＣＰＤＳ）の構築の概要を示す。
【図３】図３は、精製したリコンビナントＰｒＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ｍｏは、マウスＰｒＰ１２１−２３１を示し、Ｓｈは、ヒツジＰｒＰ１２５−２３４を示し、Ｂｏは、ウシＰｒＰ１３３−２４１を示す。左の数は、ｋＤａで見かけの分子量を示す。
【図４】図４は、ベクター構築段階におけるＰＣＲによる各フラグメントの増幅を示す。段階Ａ−Ｇは、図（ベクター構築の概要図）におけるそれぞれのステップに対応する。矢印は、目的バンド、Ｍ１−３、ＤＮＡ分子量マーカーを示す。
【図５】図５は、ベクター構築用のニワトリＣλ領域（Ｃｈｉｃｈｅｎ  Ｃλ  ｒｅｇｉｏｎ）の核酸及びアミノ酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上部に示す。生殖系列配列の核酸は、ダッシュで示される。＊は、ストップコドンを示す。制限部位をアンダーラインで示す。
【図６】図６は、構築したベクターのニワトリＣλ発現試験を示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。それぞれ、抗マウスκ抗体（黒のバー）、及び抗ニワトリλ抗体（白のバー）を使用して検出されたｐＣＰＤＳのＥＬＩＳＡ値、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳ及びｐＰＤＳファージを示す。
【図７】図７は、ｐＣＰＤＳ、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳ、及びｐＰＤＳ発現ベクター（ファージ（ｐｈａｇｅ），可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ））から構築したリコンビナントニワトリｍＡｂのウエスタンブロット分析を示す。ｍＡｂは、１５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜へブロットした。全ての抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、アルカリフォスファターゼラベルした抗マウスκ抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  κ）（Ａ）又はビオチンラベル抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）、及びＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）で検出した（Ｂ）。左の数は、ｋＤａで見かけの分子量を表す。
【図８】図８は、リコンビナントｍＡｂのＨ２５ペプチドへの結合特異性を示す。抗マウスκ鎖抗体を使用したｍＡｂのＥＬＩＳＡ値は、黒のバーで示し、抗ニワトリλ鎖抗体を使用したものは、白のバーで示す。
【図９】図９は、リコンビナントｍＡｂを使用したマウス脳ＰｒＰｃのウエスタンブロット分析を示す。レーン１は、ＨＵＣ２−１３ハイブリドーマ培養からの上清で検出した。レーン２、３及び４は、それぞれ、ｐＣＰＤＳ、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳ及びｐＰＤＳベクターによって発現された抗体で検出した。左の数は、ｋＤａで見かけの分子量を表す。
【図１０】図１０は、ｐＣＰＤＳ（Ａ）及びＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ（Ｂ）ベクターからのリコンビナントｍＡｂの精製を示す。矢印は、目的のバンドを示し、Ｍは、タンパク質マーカー、レーン１及び３は、未精製バクテリア上清、レーン２及び４は、それぞれ、２ステップ法を使用して精製されたｐＣＰＤＳ及びＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ由来のＨＵＣ２−１３  ｓｃＦｖ  ｍＡｂである。左の数は、ｋＤａで見かけの分子量を示す。
【図１１】図１１は、精製したｓｃＦｖ抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。２倍段階希釈のｓｃＦｖ  ｍＡｂをＨ２５ペプチドで反応させた。
【図１２】図１２は、ＨＵＣ２−１３抗体遺伝子のＰＣＲ増幅を示す。（Ａ）それらのＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖにおけるＨＵＣ２−１３及び３Ｃ８のＰＣＲプロフィールの比較である。レーン１は、ｐＵＣ１１８  ＨｉｎｆＩ消化、レーン２は、ＨＵＣ２−１３のＶＨ、レーン３は３Ｃ８のＶＨ、レーン４は、ＨＵＣ２−１３のＶＬ、レーン５は、３Ｃ８のＶＬ、レーン６は、ＨＵＣ２−１３のｓｃＦｖ、レーン７は、３Ｃ８のｓｃＦｖ、レーン８は、φｘ１７４ＨａｅＩＩＩ消化、である。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで分離した。両方の側の数は、ｂｐにおける見かけの長さを示す。（Ｂ）ＰＣＲを用いたｓｃＦｖ遺伝子の挿入チェック。クローン数は、１から１０で示す。増幅したｓｃＦｖは、約１  Ｋｂｐのところに移動する。
【図１３】図１３は、４つのニワトリファージディスプレイｍＡｂの結合特異性を示す。黒のバーは、Ｈ２５ペプチドを示す。白のバーは、ＤＮＰ２０−ＫＬＨ抗原を示す。ストライプのバーは、ＤＮＰ２０−ＢＳＡ抗原を示す。挿入なしのもの（ｐＰＤＳ）及び３Ｃ８  ｍＡｂは、陰性対照例として使用した。この実験において、陽性対照例としてのＨＵＣ２−１３ハイブリド−マ培養由来の上清に対するＯＤ値（ＯＤ４０５）は、１．８５４±０．０６４であった。
【図１４】培養液、及び上清からの２つのニワトリファージディスプレイ及び可溶型ｍＡｂのＨ２５ペプチドへの結合特異性を示す。黒のバーは、ＨＵＣ２ｐ３（ファージＡｂ）及びＨＵＣ２ｓ３（可溶性Ａｂ）を示す。白のバーは、ＨＵＣ２ｐ５（ファージＡｂ）及びＨＵＣ２ｓ５（可溶性Ａｂ）を示す。ストライプのバーは、ファージディスプレイ又は可溶型の３Ｃ８を示す。
【図１５】図１５は、ＨＵＣ２−１３由来ｍＡｂのＶＨ鎖の核酸及びアミノ酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列配列を上に示す。生殖配列と同一なものをダッシュで示す。相当する残基がないものをコロンで示す。ＰＣＲプライマーアニールへのＣＤＲ及び配列を、アンダーラインで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｎ（核酸）又はＸ（アミノ酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図１６】図１６は、ＨＵＣ２−１３由来ｍＡｂのＶＬ鎖の核酸及びアミノ酸配列を示す。生殖配列と同一なものをダッシュで示す。相当する残基がないものをコロンで示す。ＰＣＲプライマーアニールへのＣＤＲ及び配列を、アンダーラインで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｎ（核酸）又はＸ（アミノ酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図１７】図１７は、ＨＵＣ２−１３軽鎖の多様性を示す。
【図１８】図１７は、完全なリコンビナントＨＵＣ２−１３を使用したマウスＰｒＰＣのウエスタンブロット像を示す。レーン１は、ＨＵＣ２−１３ハイブリドーマ培養由来の上清で検出した。レーン２は、ファージディスプレイｍＡｂ  ＨＵＣ２ｐ３で検出した。レーン３は、可溶性ｍＡｂ  ＨＵＣ２ｓ３で検出した。
【図１９】図１９は、可溶型ｍＡｂ（ＨＵＣ２ｓ３）のウエスタンブロッティングを示す。可溶型ＨＵＣ２ｓ３は、１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。レーン１は、ＣＢＢで染色した。レーン２は、アルカリフォスファターゼラベル抗マウスκ抗体で染色した。左の数は、ｋＤａで見かけの分子量を示す。
【図２０】図２０は、パニング後のファージディスプレイ抗体のＥＬＩＳＡ反応性を示す。ライブラリーＡ及びＢからのファージディスプレイ抗体（４×１０１０  ＣＦＵ／ｍｌ）を、それぞれ、ＭｏＰｒＰ２３−２３１及びＭｏＰｒＰ１２１−２３１を抗原に使用することによって調べた。データは、平均±標準偏差、個体数＝３ウェル／テストを示す。
【図２１】図２１は、ＰｒＰに対するニワトリモノクローナルｓｃＦｖのＶＨ−ＶＬを示す。重鎖の黒のバーは、配列内部にストップコドンを含む遺伝子を示す。
【図２２】図２２は、ライブラリーＡ由来ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ鎖の核酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｎ（核酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図２３】図２３は、ライブラリーＡ由来ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ鎖のアミノ酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｘ（アミノ酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図２４】図２４は、ライブラリーＢ由来ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ鎖の核酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｎ（核酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図２５】図２５は、ライブラリーＢ由来ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ鎖のアミノ酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｘ（アミノ酸）で示す（定まった配列でない部分）。＊は、ストップコドンを示す。
【図２６】図２６は、ライブラリーＢ由来ｍＡｂのＶＬ鎖の核酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。
【図２７】図２７は、ライブラリーＢ由来ｍＡｂのＶＬ鎖のアミノ酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｘ（アミノ酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図２８】図２８は、ニワトリファージディスプレイｍＡｂの交差反応性を示す。（Ａ）黒のバーは、ＭｏＰｒＰ２３−２３１を示し、白のバーは、ＨｕＰｒＰ２３−２３１を示し、網目模様のバーは、ＭｏＰｒＰ１２１−２３１、及びストライプのバーは、ＨｕＰｒＰ１２１−２３１を示す。（Ｂ）黒のバーは、ＭｏＰｒＰ１２１−２３１を示し、白のバーは、ＨｕＰｒＰ１２２−２３０を示し、網目模様のバーは、ＳｈＰｒＰ１２５−２３４を示し、ストライプのバーは、ＢｏＰｒＰ１３３−２４１を示す。
【図２９】図２９は、細胞融合由来のｍＡｂを使用した哺乳類ＰｒＰＣのウエスタンブロット分析を示す。健全なマウス（Ｍ）、ヒツジ（Ｓ）、ウシ（Ｂ）脳の非ＰＫ−消化１０％脳乳剤をｍＡｂ  ＨＵＮＮ１及びＨＵＮＮ２を使用してウエスタンブロットによって分析した。ＨＵＣ２−１３は、ＰｒＰの検出用の陽性対照例として使用した。Ｈ、Ｉ及びＵは、二糖鎖型、一糖鎖型、及び無糖鎖型完全長ＰｒＰを、それぞれ示す。右の数は、ＫＤａで見かけの分子量を示す。＊ＨＵＣ２−１３  ｍＡｂは、以前に説明した。
【図３０】図３０は、ファージディスプレイ抗体ライブラリー由来のｍＡｂを使用した哺乳類ＰｒＰＣのウエスタンブロット分析を示す。健全なマウス（Ｍ）、ヒツジ（Ｓ）、ウシ（Ｂ）脳の非ＰＫ−消化１０％脳乳剤をライブラリーＡ［Ａ］及びライブラリーＢ［Ｂ］由来のｍＡｂを使用してウエスタンブロットによって分析した。Ｈ、Ｉ及びＵは、二糖鎖型、一糖鎖型、及び無糖鎖型完全長ＰｒＰを、それぞれ示す。右の数は、ｋＤａでの明確な分子量を示す。＊は、修飾型ＰｒＰｓを示す。右の数は、ｋＤａで見かけの分子量を示す。
【図３１】図３１は、ニワトリｍＡｂを使用した哺乳類ＰｒＰ  ｓｃのウエスタンブロット分析を示す。スクレピー感染マウス脳から調整したＰｒＰｓｃ（Ｂｒ）及びＮ２ａ／２２Ｌ細胞株を、細胞融合及びファージディスプレイ抗体ライブラリーから誘導したニワトリｍＡｂを使用してＷＢによって分析した。右の数は、明確な分子量を示す。
【図３２】図３２は、本発明の一実施態様におけるプリオン合成ペプチドを示す。Ｍ８５−１００、Ｍ９４−１０９、ＳＨ１（９３−１１５）、Ｂ１０６（１０６−１２１）は、それぞれ、マウス（Ｍ），ヒツジ（ＳＨ）、ウシ（Ｂ）のプリオンタンパクの合成ペプチドでそのアミノ酸配列を示している。
【図３３】図３３は、マウスＰｒＰの合成ペプチド領域を示す。上述のバーマウスＰｒＰ配列は、合成ペプチドの領域を示す。Ｎは、Ｎグリコシル化部位を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月26日(2003.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、公知の発現ベクターｐＰＤＳの構成を示す。
【図２】図２は、ニワトリリコンビナント抗体発現用ベクター（ｐＣＰＤＳ）の構築の概要を示す。
【図３】図３は、精製したリコンビナントＰｒＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ｍｏは、マウスＰｒＰ１２１−２３１を示し、Ｓｈは、ヒツジＰｒＰ１２５−２３４を示し、Ｂｏは、ウシＰｒＰ１３３−２４１を示す。左の数は、ｋＤａで見かけの分子量を示す。
【図４】図４は、ベクター構築段階におけるＰＣＲによる各フラグメントの増幅を示す。段階Ａ−Ｇは、図（ベクター構築の概要図）におけるそれぞれのステップに対応する。矢印は、目的バンド、Ｍ１−３、ＤＮＡ分子量マーカーを示す。
【図５】図５は、ベクター構築用のニワトリＣλ領域（Ｃｈｉｃｈｅｎ  Ｃλ  ｒｅｇｉｏｎ）の核酸及びアミノ酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上部に示す。生殖系列配列の核酸は、ダッシュで示される。＊は、ストップコドンを示す。制限部位をアンダーラインで示す。
【図６】図６は、構築したベクターのニワトリＣλ発現試験を示す（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。それぞれ、抗マウスκ抗体（黒のバー）、及び抗ニワトリλ抗体（白のバー）を使用して検出されたｐＣＰＤＳのＥＬＩＳＡ値、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳ及びｐＰＤＳファージを示す。
【図７】図７は、ｐＣＰＤＳ、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳ、及びｐＰＤＳ発現ベクター（ファージ（ｐｈａｇｅ）
，可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ））から構築したリコンビナントニワトリｍＡｂのウエスタンブロット分析を示す。ｍＡｂは、１５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜へブロットした。全ての抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、アルカリフォスファターゼラベルした抗マウスκ抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  κ）（Ａ）又はビオチンラベル抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）、及びＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）で検出した（Ｂ）。左の数は、ｋＤａで見かけの分子量を表す。
【図８】図８は、リコンビナントｍＡｂのＨ２５ペプチドへの結合特異性を示す。抗マウスκ鎖抗体を使用したｍＡｂのＥＬＩＳＡ値は、黒のバーで示し、抗ニワトリλ鎖抗体を使用したものは、白のバーで示す。
【図９】図９は、リコンビナントｍＡｂを使用したマウス脳ＰｒＰｃのウエスタンブロット分析を示す。レーン１は、ＨＵＣ２−１３ハイブリドーマ培養からの上清で検出した。レーン２、３及び４は、それぞれ、ｐＣＰＤＳ、Ｈｉｓ−ｐＣＰＤＳ及びｐＰＤＳベクターによって発現された抗体で検出した。左の数は、ｋＤａで見かけの分子量を表す。
【図１０】図１０は、ｐＣＰＤＳ（Ａ）及びＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ（Ｂ）ベクターからのリコンビナントｍＡｂの精製を示す。矢印は、目的のバンドを示し、Ｍは、タンパク質マーカー、レーン１及び３は、未精製バクテリア上清、レーン２及び４は、それぞれ、２ステップ法を使用して精製されたｐＣＰＤＳ及びＨｉｓ−ｐＣＰＤＳ由来のＨＵＣ２−１３  ｓｃＦｖ  ｍＡｂである。左の数は、ｋＤａで見かけの分子量を示す。
【図１１】図１１は、精製したｓｃＦｖ抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。２倍段階希釈のｓｃＦｖ  ｍＡｂをＨ２５ペプチドで反応させた。
【図１２】図１２は、ＨＵＣ２−１３抗体遺伝子のＰＣＲ増幅を示す。（Ａ）それらのＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖにおけるＨＵＣ２−１３及び３Ｃ８のＰＣＲプロフィールの比較である。レーン１は、ｐＵＣ１１８  ＨｉｎｆＩ消化、レーン２は、ＨＵＣ２−１３のＶＨ、レーン３は３Ｃ８のＶＨ、レーン４は、ＨＵＣ２−１３のＶＬ、レーン５は、３Ｃ８のＶＬ、レーン６は、ＨＵＣ２−１３のｓｃＦｖ、レーン７は、３Ｃ８のｓｃＦｖ、レーン８は、Φｘ１７４ＨａｅＩＩＩ消化、である。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで分離した。両方の側の数は、ｂｐにおける見かけの長さを示す。（Ｂ）ＰＣＲを用いたｓｃＦｖ遺伝子の挿入チェック。クローン数は、１から１０で示す。増幅したｓｃＦｖは、約１  Ｋｂｐのところに移動する。
【図１３】図１３は、４つのニワトリファージディスプレイｍＡｂの結合特異性を示す。黒のバーは、Ｈ２５ペプチドを示す。白のバーは、ＤＮＰ２０−ＫＬＨ抗原を示す。ストライプのバーは、ＤＮＰ２０−ＢＳＡ抗原を示す。挿入なしのもの（ｐＰＤＳ）及び３Ｃ８  ｍＡｂは、陰性対照例として使用した。この実験において、陽性対照例としてのＨＵＣ２−１３ハイブリド−マ培養由来の上清に対するＯＤ値（ＯＤ４０５）は、１．８５４±０．０６４であった。
【図１４】培養液、及び上清からの２つのニワトリファージディスプレイ及び可溶型ｍＡｂのＨ２５ペプチドへの結合特異性を示す。黒のバーは、ＨＵＣ２ｐ３（ファージＡｂ）及びＨＵＣ２ｓ３（可溶性Ａｂ）を示す。白のバーは、ＨＵＣ２ｐ５（ファージＡｂ）及びＨＵＣ２ｓ５（可溶性Ａｂ）を示す。ストライプのバーは、ファージディスプレイ又は可溶型の３Ｃ８を示す。
【図１５】図１５は、ＨＵＣ２−１３由来ｍＡｂのＶＨ鎖の核酸及びアミノ酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列配列を上に示す。生殖配列と同一なものをダッシュで示す。相当する残基がないものをコロンで示す。ＰＣＲプライマーアニールへのＣＤＲ及び配列を、アンダーラインで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｎ（核酸）又はＸ（アミノ酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図１６】図１６は、ＨＵＣ２−１３由来ｍＡｂのＶＬ鎖の核酸及びアミノ酸配列を示す。生殖配列と同一なものをダッシュで示す。相当する残基がないものをコロンで示す。ＰＣＲプライマーアニールへのＣＤＲ及び配列を、アンダーラインで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｎ（核酸）又はＸ（アミノ酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図１７】図１７は、ＨＵＣ２−１３軽鎖の多様性を示す。
【図１８】図１８は、完全なリコンビナントＨＵＣ２−１３を使用したマウスＰｒＰＣのウエスタンブロット像を示す。レーン１は、ＨＵＣ２−１３ハイブリドーマ培養由来の上清で検出した。レーン２は、ファージディスプレイｍＡｂ  ＨＵＣ２ｐ３で検出した。レーン３は、可溶性ｍＡｂ  ＨＵＣ２ｓ３で検出した。
【図１９】図１９は、可溶型ｍＡｂ（ＨＵＣ２ｓ３）のウエスタンブロッティングを示す。可溶型ＨＵＣ２ｓ３は、１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。レーン１は、ＣＢＢで染色した。レーン２は、アルカリフォスファターゼラベル抗マウスκ抗体で染色した。左の数は、ｋＤａで見かけの分子量を示す。
【図２０】図２０は、パニング後のファージディスプレイ抗体のＥＬＩＳＡ反応性を示す。ライブラリーＡ及びＢからのファージディスプレイ抗体（４×１０１０  ＣＦＵ／ｍｌ）を、それぞれ、ＭｏＰｒＰ２３−２３１及びＭｏＰｒＰ１２１−２３１を抗原に使用することによって調べた。データは、平均±標準偏差、個体数＝３ウェル／テストを示す。
【図２１】図２１は、ＰｒＰに対するニワトリモノクローナルｓｃＦｖのＶＨ−ＶＬを示す。重鎖の黒のバーは、配列内部にストップコドンを含む遺伝子を示す。
【図２２】図２２は、ライブラリーＡ由来ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ鎖の核酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｎ（核酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図２３】図２３は、ライブラリーＡ由来ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ鎖のアミノ酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｘ（アミノ酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ライブラリーＢ由来ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ鎖の核酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｎ（核酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ライブラリーＢ由来ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ鎖の核酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｎ（核酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、ライブラリーＢ由来ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ鎖の核酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｎ（核酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図２５】図２５は、ライブラリーＢ由来ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ鎖のアミノ酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｘ（アミノ酸）で示す（定まった配列でない部分）。＊は、ストップコドンを示す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ライブラリーＢ由来ｍＡｂのＶＬ鎖の核酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ライブラリーＢ由来ｍＡｂのＶＬ鎖の核酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。
【図２７】図２７は、ライブラリーＢ由来ｍＡｂのＶＬ鎖のアミノ酸配列を示す。ＣＢ近交系ニワトリの生殖系列は、上に示す。生殖系列配列へ同一なものは、ダッシュで示す。対応する残基がないものは、コロンで示す。生殖系列重鎖におけるＤ断片で満たすべき配列を、Ｘ（アミノ酸）で示す（定まった配列でない部分）。
【図２８】図２８は、ニワトリファージディスプレイｍＡｂの交差反応性を示す。（Ａ）黒のバーは、ＭｏＰｒＰ２３−２３１を示し、白のバーは、ＨｕＰｒＰ２３−２３１を示し、網目模様のバーは、ＭｏＰｒＰ１２１−２３１、及びストライプのバーは、ＨｕＰｒＰ１２１−２３１を示す。（Ｂ）黒のバーは、ＭｏＰｒＰ１２１−２３１を示し、白のバーは、ＨｕＰｒＰ１２２−２３０を示し、網目模様のバーは、ＳｈＰｒＰ１２５−２３４を示し、ストライプのバーは、ＢｏＰｒＰ１３３−２４１を示す。
【図２９】図２９は、細胞融合由来のｍＡｂを使用した哺乳類ＰｒＰＣのウエスタンブロット分析を示す。健全なマウス（Ｍ）、ヒツジ（Ｓ）、ウシ（Ｂ）脳の非ＰＫ−消化１０％脳乳剤をｍＡｂ  ＨＵＮＮ１及びＨＵＮＮ２を使用してウエスタンブロットによって分析した。ＨＵＣ２−１３は、ＰｒＰの検出用の陽性対照例として使用した。Ｈ、Ｉ及びＵは、二糖鎖型、一糖鎖型、及び無糖鎖型完全長ＰｒＰを、それぞれ示す。右の数は、ＫＤａで見かけの分子量を示す。＊ＨＵＣ２−１３  ｍＡｂは、以前に説明した。
【図３０】図３０は、ファージディスプレイ抗体ライブラリー由来のｍＡｂを使用した哺乳類ＰｒＰＣのウエスタンブロット分析を示す。健全なマウス（Ｍ）、ヒツジ（Ｓ）、ウシ（Ｂ）脳の非ＰＫ−消化１０％脳乳剤をライブラリーＡ［Ａ］及びライブラリーＢ［Ｂ］由来のｍＡｂを使用してウエスタンブロットによって分析した。Ｈ、Ｉ及びＵは、二糖鎖型、一糖鎖型、及び無糖鎖型完全長ＰｒＰを、それぞれ示す。右の数は、ｋＤａでの明確な分子量を示す。＊は、修飾型ＰｒＰｓを示す。右の数は、ｋＤａで見かけの分子量を示す。
【図３１】図３１は、ニワトリｍＡｂを使用した哺乳類ＰｒＰ  ｓｃのウエスタンブロット分析を示す。スクレピー感染マウス脳から調整したＰｒＰｓｃ（Ｂｒ）及びＮ２ａ／２２Ｌ細胞株を、細胞融合及びファージディスプレイ抗体ライブラリーから誘導したニワトリｍＡｂを使用してＷＢによって分析した。右の数は、明確な分子量を示す。
【図３２】図３２は、本発明の一実施態様におけるプリオン合成ペプチドを示す。Ｍ８５−１００、Ｍ９４−１０９、ＳＨ１（９３−１１５）、Ｂ１０６（１０６−１２１）は、それぞれ、マウス（Ｍ），ヒツジ（ＳＨ）、ウシ（Ｂ）のプリオンタンパクの合成ペプチドでそのアミノ酸配列を示している。
【図３３】図３３は、マウスＰｒＰの合成ペプチド領域を示す。上述のバーマウスＰｒＰ配列は、合成ペプチドの領域を示す。Ｎは、Ｎグリコシル化部位を示す。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月23日(2004.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
また、鳥類の抗体遺伝子は、3’末端及び5’末端の塩基配列が比較的固定化されており、本発明が提供するプライマーを用いて抗体の種類に関係なく当該遺伝子を増幅することが可能であり、本発明は各種の抗原に対するモノクローナル抗体を遺伝子組換え手段により簡便に作成できるという有利な効果を有する。
【配列表】
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