(57)【要約】【課題】Ｈ２３抗原を持つ大腸菌の検出、定量などに利用できる抗体等を提供する。【解決手段】大腸菌のＨ２３抗原と結合できる抗体であって、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列がそれぞれＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　、Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ、Ｇｌｙ　ＴｒｐＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｉｌｅであり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれＡｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ、Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ、Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　である抗体。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌のＨ２３抗原と結合できる抗体であって、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号９、配列番号１０、配列番号１１記載のアミノ酸配列で表されるか、又はこれらと実質的に同一のアミノ酸配列で表され、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４記載のアミノ酸配列で表されるか、又はこれらと実質的に同一のアミノ酸配列で表される抗体。
【請求項２】
重鎖の可変領域に配列番号６記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域に配列番号８記載のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項３】
大腸菌のＨ２３抗原と結合できるＦａｂ型抗体であって、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号９、配列番号１０、配列番号１１記載のアミノ酸配列で表されるか、又はこれらと実質的に同一のアミノ酸配列で表され、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４記載のアミノ酸配列で表されるか、又はこれらと実質的に同一のアミノ酸配列で表されるＦａｂ型抗体。
【請求項４】
重鎖の可変領域に配列番号６記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域に配列番号８記載のアミノ酸配列を含む請求項３記載のＦａｂ型抗体。
【請求項５】
配列番号６記載のアミノ酸配列、又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列で表されるポリペプチド。
【請求項６】
配列番号８記載のアミノ酸配列、又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列で表されるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、大腸菌のＨ２３抗原に対して分子認識能を有し、結合性を有するアミノ酸配列を含む抗体、Ｆａｂ型抗体、ポリペプチド等の認識分子に関する。この抗体等は、Ｈ２３抗原を持つ大腸菌の検出及び定量に有用である。また、本発明により、Ｈ２３抗原に対する抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸配列が明らかになったことにより、既知のＤＮＡやアミノ酸配列のデーターベースを検索することにより、大腸菌Ｈ２３抗原を認識するペプチド、ポリペプチド、抗体、蛋白質等が推定でき、大腸菌認識分子を創出するための重要な糸口となり得る。
【０００２】
【従来の技術】
大腸菌は、菌体抗原（Ｏ群：０１〜０１７３）及びべん毛抗原（Ｈ型：Ｈ１〜Ｈ５６）の組み合わせによって血清学型（血清型）が決められている。その判定には、それぞれの抗原を免疫して得た抗血清を用いて、測定対象となる大腸菌が抗血清で凝集するかどうかで判定していた。
【０００３】
抗原特異的抗血清の作製のためには、抗原の動物への免疫、その動物の飼育、動物からの血清の回収、血清の精製、及び類似凝集物の吸収といった非常に煩雑な工程が存在する。また、一度作製した抗血清を使用してしまうと、再度同じプロセスを経て抗血清を作り直さなければならず、しかもその作り直した抗血清が前回の抗血清と全く同じ物である保証はない。
【０００４】
また、細菌の表層抗原であるＨ抗原を特異的に認識する抗体を、従来からよく知られている技術で作製することも考えられる。精製したＨ抗原をマウスに免疫し、数ヶ月後に、マウス血清内に抗原に対して結合能を有した抗体の産生量が高まっていることを確認した後、脾臓を取り出し、マウスミエローマー細胞と融合させ、ハイブリドーマーを作製する。その後、Ｈ抗原を認識する抗体を産生している融合細胞をクローニングする。次に、その細胞を培養するか、マウス腹腔内に移植することで、同一な性能を持ったＨ抗原を認識する抗体を作製することができる。しかしながら、非常に多岐にわたる細菌の表層抗原に対して、上記方法により抗体を作製するためには、多くの労力、時間がかかり好ましくない。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｈｅ　Ｙ，　Ｋｅｅｎ　ＪＥ，　Ｗｅｓｔｅｒｍａｎ　ＲＢ，　Ｌｉｔｔｌｅｄｉｋｅ　ＥＴ，　Ｋｗａｎｇ　Ｊ．　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈ７　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１９９６　Ｓｅｐ；６２（９）：３３２５−３２．
【０００６】
【非特許文献２】
Ｊ．Ａｌｕｎ　Ｗ．　Ｍｏｒｇａｎ，　Ｃｒａｉｇ　Ｗｉｎｓｔａｎｌｅｙ，　Ｒｏｇｅｒ　Ｗ．　Ｐｉｃｋｕｐ，　Ｊｏｎ　Ｒ．　Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ｒａｐｉｄ　ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　Ｌａｋｅ　ｗａｔｅｒ　ｂｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｌａｇｅｌｌａ　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１９９１　Ｆｅｂ；５７（２）：５０３−５０９
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、大腸菌のＨ抗原を認識する抗体を得るためには、多大な労力を要する。もし、Ｈ抗原認識抗体の可変領域のアミノ酸配列を解明することができれば、その配列情報を基に人工的にＨ抗原認識分子の合成が可能になる。本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、Ｈ抗原を認識する抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を明らかにすることを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ヒトＦａｂ型抗体をファージ表面に提示させたファージディスプレイライブラリーから、大腸菌Ｈ２３抗原結合性を有するＦａｂ型抗体を単離し、その可変領域のアミノ酸配列を決定することに成功し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、大腸菌のＨ２３抗原と結合できる抗体であって、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号９、配列番号１０、配列番号１１記載のアミノ酸配列で表されるか、又はこれらと実質的に同一のアミノ酸配列で表され、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４記載のアミノ酸配列で表されるか、又はこれらと実質的に同一のアミノ酸配列で表される抗体である。
【００１０】
また、本発明は、大腸菌のＨ２３抗原と結合できるＦａｂ型抗体であって、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号９、配列番号１０、配列番号１１記載のアミノ酸配列で表されるか、又はこれらと実質的に同一のアミノ酸配列で表され、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４記載のアミノ酸配列で表されるか、又はこれらと実質的に同一のアミノ酸配列で表されるＦａｂ型抗体である。
【００１１】
更に、本発明は、配列番号６記載のアミノ酸配列、又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列で表されるポリペプチドである。
【００１２】
更に、本発明は、配列番号８記載のアミノ酸配列、又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列で表されるポリペプチドである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の抗体及びＦａｂ型抗体は、大腸菌のＨ２３抗原と結合できる抗体及びＦａｂ型抗体であって、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号９、配列番号１０、配列番号１１記載のアミノ酸配列で表されるか、又はこれらと実質的に同一のアミノ酸配列で表され、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４記載のアミノ酸配列で表されるか、又はこれらと実質的に同一のアミノ酸配列で表されるものである。
【００１５】
ここで、実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号９〜１４記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列であって、大腸菌のＨ２３抗原と結合できるＣＤＲを表すアミノ酸配列をいう。アミノ酸の置換、欠失若しくは付加の程度及びそれらの位置などは、改変されたアミノ酸配列が、配列番号９〜１４記載のアミノ酸配列と同様に、大腸菌のＨ２３抗原に対して結合性を有するＣＤＲを表すものであれば特に制限されない。アミノ酸配列の改変は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などに生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明の抗体及びＦａｂ型抗体は、このような改変、変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有するすべての改変抗体及びＦａｂ型抗体を包含する。
【００１６】
本発明の抗体及びＦａｂ型抗体の一例として、重鎖の可変領域に配列番号６記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖の可変領域に配列番号８記載のアミノ酸配列を含む抗体及びＦａｂ型抗体を例示できる。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、上記本発明の抗体及びＦａｂ型抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域の一部を構成するものであって、配列番号６若しくは８記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列で表されるものである。
【００１８】
ここで、実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号６若しくは８記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列であって、大腸菌のＨ２３抗原と結合できるポリペプチドを表すアミノ酸配列をいう。アミノ酸の置換、欠失若しくは付加の程度及びそれらの位置などは、改変されたアミノ酸配列が、配列番号６若しくは８記載のアミノ酸配列と同様に、大腸菌のＨ２３抗原に対して結合性を有するポリペプチドを表すものであれば特に制限されない。アミノ酸配列の改変は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などに生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明のポリペプチドは、このような改変、変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有するすべてのポリペプチドを包含する。
【００１９】
本発明の抗体、Ｆａｂ型抗体、及びポリペプチドは、分子ライブラリーのスクリーニング法、好ましくは、ファージディスプレイライブラリー法により選択取得することができる。ファージディスプレイライブラリー法は、Ｍ１３ファージに代表される繊維状ファージの表面蛋白質に、Ｆａｂ型抗体等を融合させることで、それぞれのファージ表面に、ランダムな相補性決定部位（ＣＤＲ）からなるＦａｂ型抗体等が提示されたライブラリーを作製し、抗原と特異的に結合するペプチド等を提示するファージを単離し、次いで、単離されたファージのＤＮＡを解析し、提示アミノ酸配列を取得する方法である（Ｓｍｉｔｈ　Ｇ．Ｐ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２８８：　１３１５−１３１７　（１９８５）；Ｈ．Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　１５：　６２−７０　（１９９７））。
【００２０】
本発明の抗体、Ｆａｂ型抗体、及びポリペプチドは以下の（１）から（４）の工程によって選択取得することができる。
（１）の工程
この工程では、任意のＦａｂ型抗体をその表面に提示するファージからなるファージライブラリーを調製する。提示されるＦａｂ型抗体の種の由来は特に限定されるものではなく、ヒト、マウス、ラットなどのＦａｂ型抗体を用いることができる。Ｆａｂ型抗体をファージ表面に提示するには、そのＦａｂ型抗体がファージ表面蛋白質と融合蛋白となるように、そのＦａｂ型抗体をコードするＤＮＡをファージＤＮＡに導入すればよい。ファージとしては、ファージディスプレイライブラリー法に通常使用されるものであればよく、Ｍ１３ファージなどが例示できる。
（２）の工程
この工程では、抗原を固相に固定し、ブロッキング剤で処理し、ファージライブラリーのファージ粒子と接触させた後、洗浄する。本発明では、大腸菌Ｈ抗原を固相に固定する。大腸菌Ｈ抗原は天然から精製されたＨ抗原や遺伝子工学的に組み換えたリコンビナントＨ抗原を使用することができる。ブロッキング剤としては牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などが用いられるが、本発明においては、低分子の蛋白質消化物を用いる。本発明において使用可能なブロッキング剤としては、スキムミルク、ブロックエースなどを例示することができる。固相となる不溶性担体としては、マイクロタイタープレート、イムノチューブ、ビーズ、セルロースフィルターなどが例示することができる。固相に固定化された大腸菌Ｈ抗原は、ファージライブラリー粒子と接触・反応させることにより、大腸菌Ｈ抗原と特異的に結合するファージと結合するが、同時に不溶性担体又は大腸菌Ｈ抗原と非特異的に結合するファージも結合する。そこで、この大腸菌Ｈ抗原を界面活性剤を含む緩衝液で洗浄することにより、このような非特異的に結合したファージを除去する。
（３）の工程
この工程では、ファージを固相から解離させた後、増殖させる。一般のファージディスプレイライブラリー法では、ファージの解離はｐＨを変化させることにより行うが、本発明においては、大腸菌Ｈ抗原を含む溶液を用いてファージを大腸菌抗原から解離させる。この操作により、解離されたファージに含まれる大腸菌Ｈ抗原結合性ファージの割合を高めることができる。溶出液中の大腸菌Ｈ抗原濃度は１〜１００μｇ／ｍｌとするのが好ましいが、これに限定されるわけではない。溶出液はリン酸緩衝液などを溶媒とし、ブロッキング剤等を含むものが好ましい。ファージの増殖は、大腸菌等に感染させることにより行うことができる。大腸菌等にファージを感染させる方法は、従来から良く知られている種々のファージに関する手法によりファージの種類に応じて適宜行えばよい。
（４）の工程
この工程では、増殖させたファージの中から大腸菌Ｈ抗原と特異的に結合するＦａｂ型抗体を提示するファージを選択する。上記（１）から（３）の工程を１ラウンドとして、同様なラウンドを数サイクル程度連続して行い、数ラウンド後に得られたファージの溶出液から、ファージをクローニングし、その中から、大腸菌Ｈ抗原に特異的に結合するファージを選択する。ファージを選択する方法は特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ法によって選択するのが好ましい。
【００２１】
以上の工程により得られた大腸菌Ｈ抗原と特異的に結合しうるＦａｂ型抗体を提示したファージからＤＮＡを抽出しその配列を決定することにより、ファージが提示したＦａｂ型抗体、すなわち大腸菌Ｈ抗原と特異的に結合するＦａｂ型抗体のアミノ酸配列を同定することができる。この遺伝子情報に基づき、通常の遺伝子組み換え技術を応用し、大腸菌Ｈ抗原と特異的に結合する抗体、Ｆａｂ型抗体及びポリヌクレオチドを容易に調製することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
〔実施例１〕　大腸菌Ｈ抗原に特異的に結合するファージのアフィニティーセレクション
精製大腸菌Ｈ２３抗原（特開２０００−２７９１７６号公報）をリン酸緩衝液ＰＢＳ（和光純薬社製）に１０μｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解させ、この溶液を市販のイムノチューブ（ヌンク社製）に２．０ｍｌずつ加え、一晩放置しＨ２３抗原を固相に固定化した。翌日、チューブの溶液を除去した後、１０％ブロックエース（大日本製薬社製）を２．０ｍｌずつ加え、室温で２時間放置し、イムノチューブをブロッキングした。次に、１．０Ｅ＋１２個相当のヒトＦａｂ型抗体提示ファージ粒子を含むＰＢＳ、２．０ｍｌを加え２時間放置した。ヒトＦａｂ型抗体提示ファージライブラリーは藤田保健衛生大学から供与されたものを使用した（Ｙｏｓｈｉｔａｋａ，　Ｉｂａ　ｅｔ　ａｌ，（１９９７）　ＧＥＮＥ，　１９４：３５−４６）。所定時間経過後、溶液を除去し、１ラウンド目は０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄し、２ラウンド目以降は２０回洗浄することにより結合しなかったファージを除去した。次に、２．０ｍｌの溶出液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と１０％ブロックエースを含むＰＢＳに終濃度５０μｇ／ｍｌのＨ抗原を加えたもの）を加え、大腸菌Ｈ抗原に特異的に吸着したファージを遊離させた。この溶液２．０ｍｌを２×ＴＹ培地（０．５％ＮａＣｌ、１％イーストイクストラクト、１．６％トリペプトン）２０ｍｌで培養（３７℃）した対数増殖期の大腸菌ＤＨ１２株（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）に加え、１．０時間培養し、溶出液中のファージを大腸菌に感染させた。この大腸菌溶液を８０ｍｌの２×ＴＹに加え、さらに、グルコースとアンピシリンの終濃度がそれぞれ１％及び２００μｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃でファージ感染大腸菌が対数増殖期となるまで培養した。次に、対数増殖期を確認した培養液２０ｍｌを２×ＴＹＧＡ培地２０ｍｌ（１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＴＹ培地）に加え、さらに対数増殖期まで３７℃で培養し、６０μｌのヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製）を加え１．０時間培養した。次いで、培養液を遠心分離操作（５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）により菌体と上清に分け、菌体を２×ＴＹＧＡ培地に懸濁し、４００ｍｌの２×ＴＹＫＡ培地（終濃度１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、７５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＴＹ培地）で１８時間、３７℃で培養した。この培養液を定法に従い、ポリエチレングリコールで濃縮・精製し、次のラウンドのスクリーニング用ファージディスプレイライブラリーとした。これらの操作を１ラウンドとして、これを５ラウンド繰り返し大腸菌Ｈ抗原結合性ファージを選択的に濃縮した。結合性ファージの濃縮度については添加したファージタイターと溶出されたファージタイターの比をラウンド事に比較することで判断することができる。この選択的濃縮の結果を図１に示す。
図１に示した通り、ラウンドを重ねるにつて大腸菌Ｈ抗原に結合するファージが選択的に濃縮されたことがわかる。
【００２４】
〔実施例２〕　ファージタイターの算出方法
ファージタイターは次のようにして算出した。先ず、大腸菌ＤＨ１２Ｓ株を２×ＴＹ培地に接種し、３７℃で対数増殖期まで培養し、ラウンドチューブ（ベクトンディッキンソン社製）に１．０ｍｌ分注した。これに、２×ＴＹ培地で連続的に希釈したファージ溶液１０μｌを添加し、再び３７℃、１時間培養しファージを大腸菌ＤＨ１２Ｓに感染させた。続いて、ファージ感染大腸菌溶液を１００μｌサンプリングし、２×ＴＹＧＡアガープレートにスプレッドし３０℃で培養した。１８時間培養後、プレートの大腸菌ＤＨ１２Ｓコロニーをカウントすることによりファージタイターを算出した。
以降の実施例記載のファージタイターも同様にして算出した。
【００２５】
〔実施例３〕　大腸菌Ｈ抗原結合性ファージの単離
大腸菌Ｈ２３抗原に対して、５回目のセレクションが終了したファージを大腸菌ＤＨ１２に感染させ、２×ＴＹＧＡプレートにまいて３０℃で培養した。１８時間培養後、大腸菌ＤＨ１２Ｓコロニーから任意の４８クローンを選び、それぞれを、０．５ｍｌの２×ＴＹＧＡ培地を添加した２４穴プレートの各ウェルに接種し、激しく振とうしながら３７℃で培養した。培養開始から４時間後、１０倍希釈のヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を１０μｌ添加し、引き続き３７℃で培養を行い、１時間後、遠心分離操作（６０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行い培養上清を得た。この各クローン毎の培養上清を４５０μｌの２×ＴＹＡＫ培地を添加した２４穴プレートにそれぞれ加えて１８時間３７℃で培養した。培養後、遠心分離操作（６０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）により培養上清を得てファージクローン溶液とした。調製されたファージクローンから、大腸菌Ｈ２３抗原に結合するＦａｂ型抗体を提示したファージを次のように選別した。まず、Ｈ２３抗原をＰＢＳに１０μｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解させ、この溶液を市販の９６穴マイクロタイタープレートの左半分に０．１ｍｌずつ加え、右半分には対照としてＰＢＳのみを０．１ｍｌずつ加え、一晩放置した。翌日、ウェルの溶液を除去した後、ＰＢＳで３回洗浄し、全てのウェルに２％スキムミルクを含むＰＢＳを０．２ｍｌずつ加え、３７℃で２時間放置し、マイクロタイタープレートをブロッキングした。その後０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、クローニングされたファージ溶液０．１ｍｌをＨ２３抗原固定化ウェルと対照ウェルに加えた。３７℃で１．５時間反応後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。その後ＨＲＰ標識の抗Ｍ１３抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）を適宜希釈し添加した。３７℃で１．５時間反応後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ＨＲＰ用の発色試薬ＡＢＴＳ（フナコシ社製）を０．１ｍｌずつプレートに添加し反応させ、吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。両ウェルの吸光度の差（Ｈ２３抗原固定化ウェルの吸光度−対照ウェルの吸光度）を図２に示す。
【００２６】
〔実施例４〕　Ｈ抗原結合性ファージが提示しているＦａｂ型抗体のアミノ酸配列の決定
実施例３において吸光度差が０．１以上の２０個のファージを選び、定法に従い、これらのファージが感染している大腸菌からファージミドＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ファージが提示しているＦａｂ型抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を決定した。塩基配列は、重鎖については配列表配列番号１のプライマー（５’−ＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＴ−３’）と配列番号２のプライマー（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）、軽鎖については配列表配列番号３のプライマー（５’−ＣＡＣＣＣＴＣＡＧＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣ−３’）と配列番号４のプライマー（５’−ＡＴＴＡＡＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＣＣＣＧＧ−３’）を使用し、チェーンターミネーター法に基づくＢｉｇ　ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ　アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。大腸菌Ｈ抗原結合性ファージが提示したＦａｂ型抗体の重鎖及び軽鎖のＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列を配列表配列番号５、６及び７、８に示す。また、配列番号６及び配列番号８記載のアミノ酸配列中に含まれるＰｅｌＢシグナル配列及びＣＤＲ　１−３の位置を図３及び図４にそれぞれ示す。更に、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列をぞれぞれ配列番号９、１０、１１に、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列をぞれぞれ配列番号１２、１３、１４に示す。なお、２０個の結合性ファージの中には、同一のアミノ酸配列を有するファージ、または、ファージが提示するＦａｂ型抗体領域のＤＡＮ配列に欠損が確認されたものが単離されていた。
【００２７】
〔実施例５〕　結合性Ｆａｂ型抗体を提示したファージの大腸菌Ｈ抗原に対する反応性
精製大腸菌Ｈ２３抗原を１００μｇ／ｍｌから連続的に希釈し、それぞれの濃度のＨ抗原１００μｌを９６穴マイクロタイタープレートのウェルに添加し、プレートに固定した（４℃、１８時間）。次に、２％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキング後（３７℃、２時間）、各ウェルを０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。ここに、ファージのタイターを算出して、ファージ粒子濃度を１．０Ｅ＋１２個／ｍｌに調製したファージ溶液１００μｌを添加、反応させた（３７℃、１．５時間）。評価対象のファージは、実施例３、４の結果から大腸菌Ｈ抗原に結合活性を示し、Ｆａｂ型抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を決定することができたファージを選択した。反応終了後、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ標識の抗Ｍ１３抗体を適宜希釈して１００μｌ添加し反応させた（３７℃、１．５時間）。次いで、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ用の発色試薬ＡＢＴＳを添加し反応させ、吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。この結果を図５に示す。図５に示した通り、供試したヒトＦａｂ型抗体提示ファージは大腸菌Ｈ抗原に濃度依存的に強い結合活性を示した。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の抗体、Ｆａｂ型抗体及びポリヌクレオチドは、Ｈ２３抗原を持つ大腸菌の検出、定量などに有用である。
【００２９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】アフィニティーセレクションによる選択的な濃縮効果を示す図である。
【図２】単離したファージの大腸菌Ｈ抗原に対する反応性を示す図である。
【図３】ＰｅｌＢシグナル配列、ＣＤＲ１−３の重鎖可変領域上の位置を示す図である。
【図４】ＰｅｌＢシグナル配列、ＣＤＲ１−３の軽鎖可変領域上の位置を示す図である。
【図５】Ｆａｂ型抗体を提示したファージの固定化Ｈ抗原に対する反応性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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