(57)【要約】【課題】本発明は、クロレラ培養によりヒアルロン酸及びキチンの両多糖類を同時に且つ効率よく安価に製造する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、宿主クロレラ細胞にヒアルロン酸及びキチンの両多糖類を生産させるクロロウイルスに関する。また、本発明は、上記クロロウィルスを宿主クロレラ細胞に感染させることを特徴とする、ヒアルロン酸及びキチンの製造方法に関する。本発明の方法によれば、極めて短時間（２〜４時間）に高純度のヒアルロン酸繊維、キチン繊維を生産できる。得られたヒアルロン酸繊維、キチン繊維は、どちらも電子顕微鏡測定により長さが０．５〜１．０ミクロンにも達しており重合度が非常に高い。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主クロレラ細胞にヒアルロン酸及びキチンの両多糖類を生産させるクロロウイルス。
【請求項２】
ＤＮＡフィンガープリント法により、ウイルスＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、その断片をアガロースゲル電気泳動で分離したときに、キチン合成酵素の遺伝子（ｃｈｓ）に相当する３．０ｋｂのシグナルと、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ｈａｓ）に相当する３．５ｋｂｐと０．４ｋｂｐのシグナルの両方を有するクロロウィルスである、請求項１に記載のクロロウィルス。
【請求項３】
クロロウイルスＣＶＩＫ１である請求項１又は２に記載のクロロウィルス。
【請求項４】
クロロウイルスＣＶＨＡ１である請求項１又は２に記載のクロロウィルス。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のクロロウィルスを宿主クロレラ細胞に感染させることを特徴とする、ヒアルロン酸及びキチンの製造方法。
【請求項６】
クロレラ培養液にクロロウイルスをｍｏｉ１〜１０程度（細胞あたりのウイルス数）で感染させる請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
クロロウイルスＣＶＩＫ１を用いる請求項５又は６に記載の製造方法。
【請求項８】
クロロウイルスＣＶＨＡ１を用いる請求項５又は６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロレラ培養によるヒアルロン酸及びキチンの同時製造方法と、これに用いられる新規なクロロウィルス（クロレラウィルス）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、その多糖類特性のため、人工皮膚、関節潤滑液、眼科治療剤、化粧品、再生医療などの用途で市場は伸びており（国内：約５Ｔ／年）、更なる用途開発も行われている。
ヒアルロン酸の製造方法としては、ニワトリ鶏冠などから抽出して生産する方法、微生物培養によって生産する方法などが知られている。しかし、前者は原料確保の不安定性、生産工程の複雑さ、コストなどの問題がある。また、近年は微生物（乳酸菌等）培養による生産が多くなっていると言われているが、生産コストなどで問題が残っているのも事実である。
更に、クロレラがヒアルロン酸を生産すると言う報告も見られるが、実用化には至っていない（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。
キチンは、人工皮膚、手術縫合糸、生分解性プラスチック原料、繊維、機能性食品、キチン分解物としてグルコサミンの調味剤、化粧品素材、変形性関節炎剤等の用途が知られているが、エビ・カニの甲殻を化学的に処理し抽出して生産される（国内：約２０００ｔ／年：キチン・キトサン含む）。しかし、原料確保の不安定性、生産工程の複雑さ、コストなどに問題点がある。
また本発明者らはクロロウイルスであるＣＶＫ２がキチンシンターゼ遺伝子（ｃｈｓ）を有していることを先に見出し、更に、生成されたキチンを回収しその物性を解析した（非特許文献３参照。）。
現在行われているいずれの多糖類の製造方法も、原料を天然資源の廃棄物に求める限りは、原料確保の不安定性などによる数量並びに品質のバラツキに問題が残る。特に、化粧品、医療用材料として使用される場合には品質上の問題が大きい。また、微生物（乳酸菌等）培養によるヒアルロン酸製造方法の研究開発も盛んに行われているが、更なる技術開発が望まれている。
一方、クロレラを利用した各多糖類の生産はいずれもまだ実用化されるまでには至っていない。
【０００３】
【非特許文献１】
ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ  Ｐ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，１８９９−１９９３（１９９７）
【非特許文献２】
Ｇｒａｖｅｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５７，１５−２３（１９９９）
【非特許文献３】
田中允ら：平成１３年度日本工学会大会講演要旨集２３６（２００  １）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、クロレラ培養によりヒアルロン酸及びキチンの両多糖類を同時に且つ効率よく安価に製造する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、宿主クロレラ細胞にヒアルロン酸及びキチンの両多糖類を生産させるクロロウイルスに関する。
【０００６】
また、本発明は、上記クロロウィルスを宿主クロレラ細胞に感染させることを特徴とする、ヒアルロン酸及びキチンの製造方法に関する。
【０００７】
本発明者は、自然界より３００種類のクロロウイルスをスクリーニングすることが出来た。これらのクロロウイルスの中には、ヒアルロン酸生産ウイルスとして、ＣＶＨＩ１、ＣＶＫＡ１、ＣＶＢＲ４、ＣＶＡ１、ＣＶＮＩ１、ＣＶＮＡ１、ＣＶＴＳ１、ＣＶＳＥ１、ＣＶＯ１があり、また、キチン生産ウイルスとして、ＣＶＫ２、ＣＶＮＡ２、ＣＶＫＵ２が認められた。
また、感染過程のごく初期から（６０〜９０分）クロレラ細胞表面にヒアルロン酸繊維及びキチン繊維を同時に蓄積する興味ある２種類のクロロウイルス（ＣＶＩＫ１及びＣＶＨＡ１）を分離した。
培養し増殖過程にあるクロレラにこの２種類のクロロウイルス（ＣＶＩＫ１又はＣＶＨＡ１）を感染させたところ、感染後１〜１．５時間後にクロレラ細胞表面にヒアルロン酸繊維及びキチン繊維が蓄積し始め、数時間後の溶菌時までその量は増大した。対培養液（１Ｌ）当たりアルロン酸は１００ｍｇ、キチンは１００ｍｇであった。
発酵法での物質生産は、常温・常圧で行えると言う特徴はあるものの、仕込み濃度が低く装置が大きくなる欠点を有する。本発明では、ヒアルロン酸並びにキチンと共にクロレラまでも同時に生産できる特徴がある。従って、本発明の方法は、今後各物質の安価な製造方法として有望な方法であると言うことが出来る。
【０００８】
【発明の実施の形態】
クロロウィルス（クロレラウィルス）は、分類学上はＰｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科  Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ属に属するウィルスである。
クロロウィルスは自然界に広く分布し、日本においても各地の自然淡水中から検出されている（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９１，５７，３４３３−３４３７；Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９３，５７，７３３−７３９等）。
これまでに明らかにされた各種クロロウィルスに共通する特徴は、以下のように要約される。
（１）藻類クロレラを宿主とする。
（２）直径１４０〜１９０の巨大な正二十面体粒子であり（ショ糖密度勾配沈降係数２３００ｓ）、主としてタンパク質（６４％）、ＤＮＡ（２５％）、及び脂質（１０％）から成る。
（３）ウィルス粒子は５０種以上の構成タンパク質から成り、その内主要タンパク質Ｖｐ５４（Ｖｐ５２）が約４０％を占める。
（４）ウィルスゲノムは巨大な（３００〜３８０ｋｂｐ）線状ｄｓＤＮＡであり、特殊なヘアピン末端構造を有する。
（５）ウィルスゲノムには７００個以上の遺伝子読み取り枠（ＯＲＦ）があり、その多くが感染サイクル中に発現している。
（６）感染様式はバクテリオファージと類似し、プラークを形成する。
（７）ウイルス粒子は宿主細胞質で増殖する。
【０００９】
本発明の２種のクロロウィルスは、何れもヒアルロナンシンターゼ遺伝子（ヒアルロン酸合成酵素遺伝子；ｈａｓ）及びキチンシンターゼ遺伝子（キチン合成酵素遺伝子；ｃｈｓ）の両方を有し、感染過程の初期（感染後１〜１．５時間後）から中期（感染後３〜４時間後）にかけて宿主細胞表面にヒアルロン酸繊維及びキチン繊維を生産する。
これらウイルスを識別する最も有効な方法は「ＤＮＡフィンガープリント法」である。即ち、ウイルスＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、その断片をアガロースゲル電気泳動法で分離してパターンを見る。
図１に示すように、各ウイルスは切断パターンに特徴があり、一見して識別できる。サイズマーカとの対比において、ＣＶＩＫ１、ＣＶＨＡ１特有のパターンが確認できる。このパターンが完全に一致するウイルスは他にはない。
図１において、各レーンはレーン１からレーン１６まで順に、ＣＶＫ２，ＣＶＨＡ１，ＣＶＨＩ１，ＣＶＫＡ１，ＣＶＢＲ４，ＣＶＡ１，ＣＶＮＩ１，ＣＶＮＡ１，ＣＶＩＫ１，ＣＶＴＳ１，ＣＶＳＥ１，ＣＶＯ１，ＣＶＮＡ２，ＣＶＫＵ２，ＰＢＣＶ−１，ＣＶＫ２に対応する。サイズはｋｂｐ（キロ塩基対数）で示してある。
更に、このパターンの中で、特に重要なキチン合成酵素の遺伝子（ｃｈｓ）に相当するものは、図２に示すように３．０ｋｂのシグナルである。
即ち、ウイルスＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、ｃｈｓ遺伝子をプローブとしてサザン解析を行うと、ｃｈｓ遺伝子を有する場合には３．０ｋｂｐの位置にシグナルが出現する。
なお、図２における各レーンは図１と同じである。
またヒアルロン酸合成遺伝子（ｈａｓ）に相当するものは、図３に示すように３．５ｋｂｐと０．４ｋｂｐのシグナルである。
即ち、ウイルスＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、ｈａｓ遺伝子をプローブとしてサザン解析を行うと、ｈａｓ遺伝子を有する場合には３．５ｋｂｐと０．４ｋｂｐの位置にシグナルが出現する。
図３における各レーンも図１と同じである。
これらを全部（即ち、３．０ｋｂｐのシグナル、３．５ｋｂｐのシグナル及び０．４ｋｂｐのシグナル）有するものは、これまでに発見されたクロロウィルスの中では、ＣＶＩＫ１とＣＶＨＡ１のみである。
【００１０】
本発明の２種のクロロウィルスは、他のクロロウィルスと同様、Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ属に属するウィルスであるが、どちらも新種のウィルスと判断されるので、本発明者はこれらをそれぞれＣＶＩＫ１及びＣＶＨＡ１と命名した。
【００１１】
本発明のクロロウイルスのスクリーニング方法は、プラークアッセイ法により行えばよい。
即ち、例えば、ＭＢＢＭ寒天培地（硝酸ナトリウム０．０２５％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、リン酸１カリウム０．０１７５％、リン酸２カリウム０．００７５％、食塩０．００２５％、ペプトン０．１％、ショ糖０．５％、寒天１．５％、ｐＨ６．５）に培養クロレラ細胞（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４Ａ、Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｅｃｈｏｉｄｅｓ２１１−６等）１０７ｃｅｌｌｓと試料水（１００μｌ），０．７５％ＭＢＢＭ軟寒天培地の混合液を重層し。光照射下（白色光３０００〜５０００ルックス）、２５℃で２〜４日間培養し、形成されたプラークからウイルスを回収する。ウイルスはプラークを爪楊枝でつつき培養クロレラ細胞液に接種し、６〜８時間後溶菌液を遠心分離（１５，０００Ｇ）した後沈殿として回収できる。ウイルスＤＮＡを用いたサザン法によって（キチン合成酵素遺伝子ｃｈｓ、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子ｈａｓをプローブとする）、キチン生産型、ヒアルロン酸生産型を識別できるので、これらの中から両多糖類を生産するものをスクリーニングすれば本発明に係るＣＶＩＫ１、ＣＶＨＡ１等が得られる。
【００１２】
本発明に係るヒアルロン酸及びキチンの製造方法は、上記クロロウィルス（ＣＶＩＫ１又はＣＶＨＡ１）を宿主クロレラ細胞に感染させることにより達成されるが、クロレラウィルスの使用量としては、通常、１Ｌのクロレラ培養液（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にクロロウィルス（ＣＶＩＫ１又はＣＶＨＡ１）をｍｏｉ１〜１０程度（細胞あたりのウイルス数）で感染させる。
そして、通常、感染後２〜４時間で細胞を遠心分離により回収する。この菌体から多糖類を分離精製すれば、目的とする繊維状のヒアルロン酸及び繊維状のキチンが得られる。
得られたヒアルロン酸繊維、キチン繊維は、電子顕微鏡測定によりその長さを測定すると０．５〜１．０ミクロンにも達しており重合度が非常に高いことが判る。
【００１３】
クロロウィルスを感染させる宿主クロレラ細胞としては、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４ＡやＣ．ｐｒｏｔｏｔｅｃｈｏｉｄｅｓ  ２１１−６等のクロレラ株が用いられる。
クロレラの培養に用いられる培地としては、例えば、ＭＢＢＭ培地（硝酸ナトリウム０．０２５％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、リン酸１カリウム０．０１７５％、リン酸２カリウム０．００７５％、食塩０．００２５％、ペプトン０．１％、ｐＨ６．５）やＭＡＭ培地（硝酸アンモニウム０．０２５％、硝酸カリウム０．０１％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、塩化ナトリウム０．００２５％、β−グリセロリン酸ナトリウム０．１％、バクトペプトン０．１％、酵母エキス０．０５％、カザミノ酸０．１％、マルトエキス０．０５％）等が用いられる。
クロレラの培養は、通常、光照射下（白色光３０００〜５０００ルックス）、２５℃で対数増殖期後期（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）まで培養する。増殖速度（倍加時間）は約６時間程度である。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例及び参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例、参考例により何ら限定されるものではない。
【００１５】
実施例１  クロロウイルスのスクリーニング
スクリーニング方法は、プラークアッセイ法によって行った。
ＭＢＢＭ寒天培地（硝酸ナトリウム０．０２５％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、リン酸１カリウム０．０１７５％、リン酸２カリウム０．００７５％、食塩０．００２５％、ペプトン０．１％、ショ糖０．５％、寒天１．５％、ｐＨ６．５）に培養クロレラ細胞（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４Ａ）１０７ｃｅｌｌｓと試料水（１００μｌ）及び０．７５％ＭＢＢＭ軟寒天培地の混合液を重層した。光照射下（白色光３０００〜５０００ルックスｓ）、２５℃で４日間培養し、形成されたプラークからウイルスを回収した。ウイルスはプラークを爪楊枝でつつき培養クロレラ細胞液に接種し、８時間後、溶菌液を遠心分離（１５，０００Ｇ）した後、沈殿として回収した。ウイルスＤＮＡを用いたサザン法（キチン合成酵素遺伝子ｃｈｓ、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子ｈａｓをプローブとする）によってキチン生産型、ヒアルロン酸生産型を識別した。
〈結果〉
分離されたクロロウイルスは３００株であったが、その内に、ヒアルロン酸のみを生産するものとして、ＣＶＨＩ１，ＣＶＫＡ１，ＣＶＢＲ４，ＣＶＡ１，ＣＶＮＩ１，ＣＶＮＡ１，ＣＶＴＳ１，ＣＶＳＥ１，ＣＶＯ１等が（６０％）、また、キチンのみを生産するものとして、ＣＶＫ２，ＣＶＮＡ２，ＣＶＫＵ２等（２７％）があり、更に、両多糖類を生産ものとしてＣＶＩＫ１，ＣＶＨＡ１等（１３％）がスクリーニングされた。
【００１６】
参考例１  クロレラの培養
クロレラ株（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４Ａ）をＭＢＢＭ培地（硝酸ナトリウム０．０２５％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、リン酸１カリウム０．０１７５％、リン酸２カリウム０．００７５％、食塩０．００２５％、ペプトン０．１％、ｐＨ６．５）で光照射下（白色光３０００〜５０００ルックス）、２５℃で対数増殖期後期（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）まで培養した。増殖速度（倍加時間）は約６時間であった。
【００１７】
実施例２  ＣＶＩＫ１感染による多糖類の生産
参考例１で得られた１Ｌのクロレラ培養液（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にクロロウイルス（ＣＶＩＫ１）をｍｏｉ１〜１０程度（細胞あたりのウイルス数）で感染させ、感染後３時間で細胞を遠心分離により回収した。
〈結果〉
この菌体より多糖類を分離精製したところ対培養液あたりヒアルロン酸及びキチンはそれぞれ１００ｍｇ／Ｌであった。キチンは細胞遊離不溶性多糖質でキチナーゼによって分解される画分として回収し定量した。ヒアルロン酸は不溶性多糖を除いた後、酢酸ナトリウム０．５％及びエチルアルコール３倍量（Ｖ／Ｖ）を加えて沈殿した画分をイオン交換クロマトグラフィー法で精製後定量した。
なお、別法として、感染３時間後、細胞を遠心分離により回収し、トミー精工ＭＴ−３６０ボルテックスミキサー（ｍｉｘｉｎｇ  ｓｐｅｅｄ  １０）で室温にて５分間処理した後、低速遠心分離（１，０００×Ｇ）により沈殿させると、上清表面に白い浮遊物としてキチンが回収出来た（回収量は１００ｍｇ／Ｌであった。）。キチンを回収後、試料液を高速遠心分離（１０，０００×Ｇ）して沈殿物を除去し、上清に酢酸ナトリウム０．５％及びエチルアルコール３倍量（Ｖ／Ｖ）を添加してヒアルロン酸を析出させ、遠心分離（１０，０００×Ｇ）により沈殿としてこれを回収した。エチルアルコールによる析出を２回繰り返すことによって高純度のヒアルロン酸を得ることが出来た（１００ｍｇ／Ｌ）。
また、上記ボルテックスミキサー処理の代りに超音波処理を行った場合もボルテックスミキサー処理の場合と全く同様な結果が得られた。
【００１８】
実施例３  ＣＶＨＡ１感染による多糖類の生産
参考例１と同様にして得られた１Ｌのクロレラ培養液（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にクロロウイルス（ＣＶＨＡ１）をｍｏｉ１〜１０程度（細胞あたりのウイルス数）で感染させ、感染後３時間で細胞を遠心分離により回収した。〈結果〉
この菌体より、実施例２の方法に準じて多糖類を分離精製したところ対培養液あたりヒアルロン酸及びキチンがそれぞれ１００ｍｇ／Ｌ得られた。
【００１９】
【発明の効果】
クロロウィルスを用いる本発明の方法によれば、
（１）極めて短時間（２〜４時間）に高純度のヒアルロン酸繊維、キチン繊維を生産できる。
（２）得られたヒアルロン酸繊維、キチン繊維は、どちらも電子顕微鏡測定により長さが０．５〜１．０ミクロンにも達しており重合度が非常に高い。
（３）培養したクロレラ自身も利用できる可能性が高い。
等の効果を奏する。
また、クロレラ培養には長い歴史があり特に日本においては、健康・安全のイメージが強いので、クロレラからの生産物として一般に受け入れられ易いと言う利点もある。
更にまた、大気温暖化ガス吸収プロセス等とカップリングさせれば更に高付加価値物質生産系として効果が大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、各種クロレラウイルスのＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡフィンガープリント法による比較を示す。
【図２】図２は、各種クロロウイルスについてキチン合成酵素遺伝子（ｃｈｓ）のパターン解析を行った結果を示す。
【図３】図３は、各種クロロウイルスについてヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ｈａｓ）のパターン解析を行った結果を示す。
【図１】
2004283095.tif 000002
【図２】
2004283095.tif 000003
【図３】
2004283095.tif 000004