(57)【要約】【課題】リグニン誘導体の一種であるリグノフェノール系誘導体を用いた細胞保護剤を提供すること。【解決手段】（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、からなる群から選択される１種あるいは２種以上のリグニン誘導体を含有する、哺乳動物の細胞保護剤とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞の保護剤であって、
（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、
からなる群から選択される１種あるいは２種以上のリグニン誘導体を含有する、保護剤。
【請求項２】
前記フェノール化合物は、１価のフェノール化合物である、請求項１記載の保護剤。
【請求項３】
前記カルボキシアルキル基におけるアルキル基はメチル基である、請求項１又は２記載の保護剤。
【請求項４】
前記リグニン含有材料は、木本類植物及び草本類植物から選択される１種あるいは２種以上のリグノセルロース系材料である、請求項１〜３のいずれかに記載の保護剤。
【請求項５】
非生理的細胞死抑制剤であって、
（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、
からなる群から選択される１種あるいは２種以上のリグニン誘導体を含有する、非生理的細胞死抑制剤。
【請求項６】
非生理的細胞死抑制剤であって、
１価のフェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体を含有する、抑制剤。
【請求項７】
前記１価のフェノール化合物は、クレゾールである、請求項６記載の抑制剤。
【請求項８】
前記カルボキシアルキル基は、カルボキシメチル基である、請求項６は７に記載の抑制剤。
【請求項９】
前記リグニン含有材料はタケである、請求項６〜８のいずれかに記載の抑制剤。
【請求項１０】
非生理的細胞死抑制剤であって、
１価のフェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体を含有する、抑制剤。
【請求項１１】
前記フェノール化合物は、クレゾールである、請求項１０記載の抑制剤。
【請求項１２】
神経細胞の非生理的細胞死を抑制する、請求項５〜１１のいずれかに記載の抑制剤。
【請求項１３】
請求項５〜１１のいずれかに記載のリグニン誘導体を含有する栄養補助剤。
【請求項１４】
非生理的細胞死の異常亢進が関連する疾患の予防及び／又は治療する方法であって、
（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、
からなる群から選択される１種あるいは２種以上のリグニン誘導体の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リグニンにフェノール化合物を導入して得られるリグニン誘導体の利用に関し、特に、非生理的細胞死の抑制作用、細胞保護作用を発揮するリグニン誘導体の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リグニンは、ｐ−ヒドロキシシンナミルアルコールのランダムなラジカルカップリングにより構築された不規則な天然高分子である。その基本構成単位は、芳香族及び脂肪族両者の反応性を有し、さらに高分子構築後もその側鎖α位（ベンジル位）には、水酸基、カルボニル、アルキルエーテル、アリールエーテル、二重結合等様々な活性位が存在している。すなわち、天然リグニンは、多様な反応性を示す重合しきっていない不安定ポリマーである。
【０００３】
ここに、天然リグニン由来のリグニン誘導体としては、クラフトリグニン、蒸煮爆砕リグニン、酢酸リグニンなど多種類のリグニン誘導体がある他、リグノセルロース系材料にフェノール化合物を添加し溶媒和させた後、酸を添加することにより得られるポリフェノール系化合物である、リグニンのフェノール誘導体化合物（以下、リグノフェノール系誘導体ともいう。）が知られている（特許文献１、２）。
かかるリグノフェノール系誘導体は、リグニンの基本ユニットであるフェニルプロパンユニットの側鎖α位にフェノール化合物がグラフトされて構成されている。かかるグラフティングにより、リグニンが低分子化されると同時に一定の構造規則性が付与し、さらに、天然リグニンの有する反応性が制御される。
【０００４】
一方、他のポリフェノール化合物であるカテキンなどにおいては、各種の生理活性が見出されている。かかる生理活性としては、一般的な抗酸化作用やフリーラジカル消去作用を始めとして神経保護作用が知られている（非特許文献１、２）。
【０００５】
【特許文献１】
特開平７−２０６６０１号公報
【特許文献２】
特開平８−１４３５８７号公報
【非特許文献１】
Ｍａｔｓｕｏｋａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２７４（２），  ６０２−８
【非特許文献２】
Ｃｈｏｉ，  Ｙ．  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ７０（５），  ６０３−１４
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、天然リグニンから誘導されるポリフェノール系化合物を哺乳類の細胞保護剤として提供することである。また、本発明の別の課題は、非生理的細胞死抑制剤を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、リグニン含有材料から特定の分離抽出操作及び誘導体化により得られるリグニン誘導体が、抗酸化活性、非生理的細胞死抑制活性及び細胞保護活性を有し、非生理的細胞死抑制剤及び細胞保護剤として有用であることを見出した。
本発明は上記の知見を基にして完成されたものであり、以下の手段が提供される。
【０００８】
（１）  哺乳動物細胞の保護剤であって、
（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、
からなる群から選択される１種あるいは２種以上のリグニン誘導体を含有する、保護剤。
（２）前記フェノール化合物は、１価のフェノール化合物である、（１）記載の保護剤。
（３）前記カルボキシアルキル基におけるアルキル基はメチル基である、請求項１又は２記載の保護剤。
（４）前記リグニン含有材料は、木本類植物及び草本類植物から選択される１種あるいは２種以上のリグノセルロース系材料である、（１）〜（３）のいずれかに記載の保護剤。
（５）  非生理的細胞死抑制剤であって、
（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、
からなる群から選択される１種あるいは２種以上のリグニン誘導体を含有する、非生理的細胞死抑制剤。
（６）  非生理的細胞死抑制剤であって、
１価のフェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体を含有する、抑制剤。
（７）前記１価のフェノール化合物は、クレゾールである、（６）記載の抑制剤。
（８）前記カルボキシアルキル基は、カルボキシメチル基である、（６）又は（７）に記載の抑制剤。
（９）前記リグニン含有材料はタケである、（６）〜（８）のいずれかに記載の抑制剤。
（１０）非生理的細胞死抑制剤であって、
１価のフェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体を含有する、抑制剤。
（１１）前記１価のフェノール化合物は、クレゾールである、（１０）記載の抑制剤。
（１２）神経細胞の非生理的細胞死を抑制する、（５）〜（１１）のいずれかに記載の抑制剤。
（１３）（５）〜（１１）のいずれかに記載のリグニン誘導体を含有する栄養補助剤。
（１４）非生理的細胞死の異常亢進が関連する疾患の予防及び／又は治療する方法であって、
（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体、
からなる群から選択される１種あるいは２種以上の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法。
【０００９】
これらの細胞保護剤及び非生理的細胞死抑制剤は、哺乳類細胞に適用することにより、細胞保護活性及び非生理的細胞死抑制活性を発現し、好ましくないアポトーシスなどの非生理的細胞死を抑制して細胞を保護し、哺乳類細胞の好ましい生育あるいは増殖状態を維持することができる。したがって、例えば、各種添加剤、薬剤として有用である他、経口あるいは腸管経由等の栄養補助剤としても有用である。さらに、の異常亢進が関連する疾患の予防及び／又は治療方法並びにこれらの予防及び／又は治療に有用な医薬を提供することができる。より具体的には、アルツハイマー病やパーキンソン氏病などの神経疾患の予防及び／又は治療のための方法及び医薬として有用である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の細胞保護剤、非生理的細胞死抑制剤及び栄養補助剤は、リグニン含有材料から所定の手法により分離して得られるリグノフェノール系誘導体を含有している。これらのリグノフェノール系誘導体としては、以下の（ａ）〜（ｃ）を挙げることができる。
（ａ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性のリグニン二次誘導体、
（ｂ）（ａ）記載のリグニン一次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化されたリグニン二次誘導体及び
（ｃ）フェノール化合物により溶媒和されたリグニン含有材料に酸を添加し混合して得られるリグニンの一次誘導体をアルカリ処理して得られる水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して炭素数１〜５の低級アルキル基を備えるカルボキシアルキル基によりカルボキシアルキル化して得られるリグニン三次誘導体
これらのリグニン誘導体が由来するリグニン含有材料は入手が容易で再生可能な天然資源であり、この資源を由来材料とすることにより、有効性と安全性のバランスが取れた細胞保護剤及び非生理的細胞死抑制剤を提供することができる。また、基本骨格を合成手法でなく、大量かつ再生可能に存在する植物資源から得るために、これらの剤の製造にかかる原料コスト及び工程コストを含む製造コストを低減することができる。
また、リグニン含有材料からリグノフェノール系誘導体は、構造制御や修飾が容易であり、薬物送達性や有効性を確保するような構造を探索し、リード化合物群として有用である。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１１】
（リグニン一次誘導体）
本発明において用いるリグニン一次誘導体は、リグニン含有材料をフェノール化合物で溶媒和後、酸を添加し混合して得られるリグニンのフェノール化合物であるリグニン誘導体である。この反応過程によりリグニンのアリールプロパンユニットのベンジル位（側鎖Ｃ１位、以下、単にＣ１位という。）にフェノール化合物がグラフト（導入）されたリグニン誘導体を得ることができる。フェノール化合物は、そのフェノール性水酸基に対してオルト位あるいはパラ位にて前記Ｃ１位の炭素原子に結合する。この結果、１，１−ビス（アリール）プロパンユニットがリグニン中に形成される。この反応において、フェノール化合物は、前記Ｃ１位に対して選択的に導入されるため、出発原料であるリグニン含有材料におけるＣ１位における様々な結合を開放し、リグニンマトリックスの多様性を低減し、また、低分子量化することができる。さらに、この結果、従来のリグニンにはなかった各種溶媒への溶解性、熱流動性、熱可塑性など各種の特性を発現することが既に知られている。
なお、ここで、フェノール化合物で溶媒和するとは、液体のフェノール化合物にリグニン含有材料を浸漬する等して溶媒和する他、液体あるいは固体のフェノール化合物を当該フェノール化合物が溶解する溶媒に溶解させたものをリグニン含有材料に適用後、溶媒を留去することでリグニン含有材料にフェノール化合物を収着することによっても達成することができる。
【００１２】
濃酸による炭水化物の膨潤に基づく組織構造の破壊と、フェノール化合物によるリグニンの溶媒和とを組み合わせてリグニンの不活性化を抑制しつつ、リグノセルロース系材料を炭水化物とリグノフェノール誘導体とに分離する方法（特開平２−２３３７０１号）が知られている。
また、これらの他、リグノフェノール誘導体に関するより一般的な記載及びその製造プロセスについては、国際公開ＷＯ９９／１４２２３号公報、特開２００１−６４４９４号公報、特開２００１−２６１８３９号公報、特開２００１−１３１２０１号公報、特開２００１−３４２３５３号公報、特開２００２−１０５２４０号公報において記載されている（これらの特許文献に記載の内容は、全て引用により本明細書中に取り込まれるものとする）。
【００１３】
このプロセスによりリグノセルロース系材料からリグノフェノール誘導体を得るシステムにおける構造変換プロセスの一例を図１に示す。
この構造変換プロセスは、リグノセルロース系材料を予めフェノール化合物で溶媒和しておいた上で、当該リグノセルロース系材料を酸と接触させることにより、リグニンのアリールプロパンユニットのリグニンの複合状態を緩和させ、同時に、天然リグニンのアリールプロパンユニットのＣ１位（ベンジル位）に選択的に前記フェノール誘導体をグラフティングさせ、リグノフェノール誘導体を生成させ、同時にセルロースとリグノフェノール誘導体とに分離できる。
【００１４】
リグノフェノール誘導体は、それ自体、リグノセルロース系材料などのリグニン含有材料から反応、分離して得られるリグニン由来のポリマーの混合物である。このため、得られるポリマーにおける導入フェノール誘導体の量や分子量は、原料となるリグニン含有材料のリグニン構造および反応条件により変動する。
【００１５】
（リグニン含有材料）
本発明におけるリグニン含有材料には、天然リグニンを含有するリグノセルロース系材料を含む。リグノセルロース系材料は、木質化した材料、主として木材である各種材料、例えば、木粉、チップの他、廃材、端材、古紙などの木本類植物資源に付随する農産廃棄物や工業廃棄物を挙げることができる。また用いる木本類の種類としては、スギ、ヒノキなどの針葉樹、ブナなどの広葉樹等、任意の種類のものを使用することができる。さらに、ケナフ、ジュート、イネ、タケなどの各種草本類植物、それに関連するイネワラ、モミガラなどの農産廃棄物や工業廃棄物なども使用できる。
本発明に用いる誘導体においては、木本類植物や草本類植物のいずれのリグノセルロース系材料も使用できるが、とくに、草本類植物に由来するリグノセルロース系材料を用いることが好ましい。さらに好ましくはタケである。
【００１６】
（フェノール化合物）
フェノール化合物としては、１価のフェノール化合物、２価のフェノール化合物、または３価のフェノール化合物などを用いることができる。本発明においては、好ましくは１価のフェノール化合物を用いることができる。
１価のフェノール化合物の具体例としては、１以上の置換基を有していてもよいフェノール、１以上の置換基を有していてもよいナフトール、１以上の置換基を有していてもよいアントロール、１以上の置換基を有していてもよいアントロキノンオールなどが挙げられる。
２価のフェノール化合物の具体例としては、１以上の置換基を有していてもよいカテコール、１以上の置換基を有していてもよいレゾルシノール、１以上の置換基を有していてもよいヒドロキノンなどが挙げられる。
３価のフェノール化合物の具体例としては、１以上の置換基を有していてもよいピロガロールなどが挙げられる。
本発明の一次誘導体にあっては、１価のフェノール化合物から選択される１種あるいは２種以上を用いることが好ましいが、２価のフェノール化合物及び３価のフェノール化合物のうち、１種あるいは２種以上を用いることもできる。
【００１７】
なお、１価から３価のフェノール化合物が有していてもよい置換基の種類は特に限定されず、任意の置換基を有していてもよいが、好ましくは、電子吸引性の基（ハロゲン原子など）以外の基であり、例えば、炭素数が１〜４、好ましくは炭素数が１〜３の低級アルキル基含有置換基である。低級アルキル基含有置換基としては、例えば、低級アルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基など）、低級アルコキシ基（メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基など）である。また、アリール基（フェニル基など）の芳香族系の置換基を有していてもよい。また、水酸基含有置換基であってもよい。
【００１８】
本発明においては、好ましくはｐ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、２，６−ジメチルフェノール、２，４−ジメチルフェノール、２−メトキシフェノール（Ｇｕａｉａｃｏｌ）、２，６−ジメトキシフェノール等を用いることができ、より好ましくは、ｐ−クレゾール、フェノール、ｐ−エチルフェノールである。また、２価のフェノール化合物としては、レゾルシノール、カテコール、ホモカテコール、ハイドロキノン、１，３−ナフタレンジオール等を用いることが好ましく、より好ましくは、レゾルシノール、カテコールである。また、３価のフェノール化合物としては、好ましくは、ピロガロール、フロログルシノール、２−ヒドロキシ−ナフトキノン等を用いることができ、より好ましくは、ピロガロール、フロログルシノールである。
【００１９】
これらのフェノール化合物は、そのフェノール性水酸基に対してオルト位あるいはパラ位の炭素原子がリグニンのアリールプロパンユニットのＣ１位の炭素に結合することにより、１，１−ビス（アリール）プロパンユニットが形成されることになる。したがって、少なくとも１つの導入サイトを確保するには、オルト位及びパラ位のうち、少なくともひとつの位置に置換基を有していないことが好ましい。
フェノール化合物のフェノール性水酸基のオルト位炭素原子が前記Ｃ１位に結合して形成されたユニットをオルト位結合ユニットといい、フェノール化合物のフェノール性水酸基のパラ位炭素原子が前記Ｃ１位に結合して形成されたユニットをパラ位結合ユニットという。図２に、オルト位結合ユニット及びパラ位結合ユニットの一例として、フェノール化合物として、ｐ−クレゾール及び２，６−ジメチルクレゾールを用いた各ユニットを示す。
【００２０】
以上のことから、本発明では、一次誘導体について、無置換フェノール誘導体の他、少なくとも一つの無置換のオルト位あるいはパラ位を有する各種置換形態のフェノール誘導体の１種あるいは２種以上を適宜選択して用いることができる。
【００２１】
オルト位結合ユニットとパラ位結合ユニットとは、例えば、後述するアルカリ処理工程において異なる機能を発現する。オルト位結合ユニットは、緩和なアルカリ処理により導入されたフェノール化合物におけるフェノール性水酸基を消失させるとともにアリールクマラン構造を当該ユニットにおいて生成し、強いアルカリ処理によりアリール基移動に伴って分子形態を変動させる。いずれにおいても、オルト位結合ユニットは、アルカリ処理による効率的なリグノフェノール誘導体の低分子化に寄与する。
一方、パラ位結合ユニットは、アルカリ処理によりアリールクマラン構造やその後の分子形態変動を生じず、当該ユニット部位における低分子化には寄与しない。
【００２２】
なお、オルト位結合ユニットを有するリグノフェノール誘導体を得るには、少なくとも一つのオルト位（好ましくは全てのオルト位）に置換基を有していないフェノール化合物を用いる。また、少なくとも一つのオルト位（２位あるいは６位）が置換基を有さず、パラ位（４位）に置換基を有するフェノール化合物（典型的には、２，４位置換１価フェノール誘導体）が好ましい。最も好ましくは、全てのオルト位が置換基を有さず、パラ位に置換基を有するフェノール化合物（典型的には、４位置換１価フェノール化合物）である。したがって、４位置換フェノール化合物及び２，４位置換フェノール化合物を１種あるいは２種以上組み合わせて用いることができる。
【００２３】
パラ位結合ユニットを有するリグノフェノール誘導体を得るには、パラ位に置換基を有していないフェノール化合物（典型的には、２位（あるいは６位）置換１価フェノール化合物）が好ましく、より好ましくは、同時に、オルト位（好ましくは、全てのオルト位）に置換基を有するフェノール化合物（典型的には２，６位置換１価フェノール化合物）を用いる。すなわち、２位（あるいは６位）置換フェノール化合物及び２、６位置換フェノールのうち１種あるいは２種以上を組み合わせて用いることが好ましい。
【００２４】
（酸）
リグニン含有材料と接触させる酸としては、特に限定しないで、リグノフェノール誘導体を生成しうる範囲で各種無機酸や有機酸を使用することができる。したがって、硫酸、リン酸、塩酸などの無機酸の他、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ギ酸などを使用することができる。リグニン含有材料としてリグノセルロース系材料を使用する場合には、セルロースを膨潤させる作用を有していることが好ましい。例えば、６５重量％以上の硫酸（好ましくは、７２重量％の硫酸）、８５重量％以上のリン酸、３８重量％以上の塩酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ギ酸などを挙げることができる。好ましい酸は、６５重量％以上の硫酸（好ましくは、７２重量％の硫酸）、８５重量％以上（好ましくは９５重量％以上）のリン酸、トリフルオロ酢酸又はギ酸である。
【００２５】
リグニン含有材料中のリグニンを、リグノフェノール誘導体に変換し、分離する方法としては各種方法が採用できる。
一次誘導体を得る反応工程としては、例えば、リグニン含有材料に、液体状のフェノール化合物（上記で説明したもの、例えば、ｐ−クレゾール）を浸透させ、リグニンをフェノール誘導体により溶媒和させ、次に、リグノセルロース系材料に酸（上記で説明したもの、例えば、７２％硫酸）を添加し混合して、セルロース成分を溶解する（以下、一段法ともいう。）。この方法によると、リグニンが低分子化され、同時にその基本構成単位のＣ１位にフェノール化合物が導入されたリグノフェノール誘導体がフェノール化合物相に生成される。このフェノール化合物相から、リグノフェノール誘導体が抽出される。リグノフェノール誘導体は、リグニン中のベンジルアリールエーテル結合が開裂して低分子化されたリグニンの低分子化体の集合体として得られる。
また、他の反応工程としては、リグニン含有材料に、固体状あるいは液体状のフェノール化合物を溶解した溶媒（例えば、エタノールあるいはアセトン）を浸透させた後、溶媒を留去（フェノール誘導体の収着）した場合も、先の方法と同様、リグノフェノール誘導体が生成される（以下、二段法ともいう）。
【００２６】
後段でカルボキシメチル化及び／又はアルカリ処理により、リグニン一次誘導体に水溶性を付与する。したがって、一次誘導体としては、有機溶媒区分のリグニン一次誘導体を分離抽出することが有効である。
有機溶媒区分のリグニン一次誘導体を分離回収するには、一段法にあっては、液体のフェノール化合物相を、大過剰のエチルエーテルに加えて得た沈殿物を集めて、アセトンに溶解する。アセトン不溶部を遠心分離により除去し、アセトン可溶部を濃縮する。このアセトン可溶部を、大過剰のエチルエーテルに滴下し、沈殿区分を集める。この沈殿区分から溶媒留去し、リグニン一次誘導体を得る。なお、粗一次誘導体は、フェノール化合物相やアセトン可溶区分を単に減圧蒸留により除去することによって得ることができる。
【００２７】
また、二段法にあっては、生成したリグノフェノール誘導体は、液体フェノール化合物にて抽出分離することができる。あるいは、全反応液を過剰の水中に投入し、不溶区分を遠心分離にて集め、脱酸後、乾燥する。この乾燥物にアセトンあるいはアルコールを加えてリグノフェノール誘導体を抽出する。さらに、この可溶区分を１段法における場合と同様に、過剰のエチルエーテル等に滴下して、リグノフェノール誘導体を不溶区分として得ることもできる。
以上、一次誘導体の調製方法の具体例を説明したが、これらに限定されるわけではなく、これらに適宜改良を加えた方法で調製することもできる。
【００２８】
次に、一次誘導体をさらに化工して得られる二次及び三次誘導体について説明する。
アルカリ処理による水溶性化
アルカリ処理は、リグニン一次誘導体をアルカリと接触させることにより行う。好ましくは加熱する。アルカリ処理においては、オルト位結合ユニットにおいて、導入されたフェノール化合物のフェノキシドイオンによるＣ２位炭素の攻撃が生じる。すなわち、一旦この反応が生じれば、Ｃ２アリールエーテル結合が開裂する。
例えば、緩和なアルカリ処理では、一次誘導体が第一のユニットを有する場合、当該導入フェノール誘導体の当該フェノール性水酸基が開裂し、生じたフェノキシドイオンが、Ｃ２アリールエーテル結合を構成するＣ２位を分子内求核反応的にアタックして、当該エーテル結合を開裂させて低分子化することができる。Ｃ２アリールエーテル結合の開裂により、リグニンの母核にフェノール性水酸基が生成されることになり、当該分子内求核反応により、導入フェノール核が、それが導入されたフェニルプロパン単位とクマラン骨格を形成した構造（アリールクマラン単位）が発現される。
これらの結果、フェノール誘導体側にあったフェノール性水酸基が、リグニン母核側に移動されたことになる。
このため、オルト位結合ユニットを有するリグノフェノール誘導体においては、このユニットの存在部位において（１）Ｃ２アリールエーテル結の開裂による低分子化、（２）アリールクマラン構造の発現、（３）Ｃ２アリールエーテル結合で結合されていたリグニン母核側におけるフェノール性水酸基が発現する。
【００２９】
当該アルカリ処理は、具体的には、リグノフェノール誘導体をアルカリ溶液に溶解し、一定時間反応させ、必要であれば、加熱することにより行う。この処理に用いることのできるアルカリ溶液は、リグノフェノール誘導体中の導入フェノール誘導体のフェノール性水酸基を解離させることができるものであればよく、特に、アルカリの種類及び濃度、溶媒の種類等は限定されない。アルカリ下において前記フェノール性水酸基の解離が生じれば、隣接基関与効果により、クマラン構造が形成されるからである。例えば、ｐ−クレゾールを導入したリグノフェノール誘導体では、水酸化ナトリウム溶液を用いることができる。例えば、アルカリ溶液のアルカリ濃度範囲は０．５〜２Ｎとし、処理時間は１〜５時間程度とすることができる。また、アルカリ溶液中のリグノフェノール誘導体は、加熱されることにより、容易にクマラン構造を発現する。加熱に際しての、温度、圧力等の条件は、特に限定することなく設定することができる。例えば、アルカリ溶液を１００℃以上（例えば、１４０℃程度）に加熱することによりリグノフェノール誘導体の低分子化を達成することができる。さらに、アルカリ溶液を加圧下においてその沸点以上に加熱して一次誘導体の低分子化を行ってもよい。
【００３０】
なお、同じアルカリ溶液で同濃度においては、加熱温度が１２０℃〜１４０℃の範囲では、加熱温度が高い程、Ｃ２−アリールエーテル結合の開裂による低分子化が促進されることがわかっている。また、該温度範囲で、加熱温度が高い程、リグニン母体由来の芳香核由来のフェノール性水酸基が増加し、導入されたフェノール誘導体由来のフェノール性水酸基が減少することがわかっている。したがって、低分子化の程度及びフェノール性水酸基部位のＣ１位導入フェノール誘導体側からリグニン母体のフェノール核への変換の程度を、反応温度により調整することができる。すなわち、低分子化が促進され、あるいは、より多くのフェノール性水酸基部位がＣ１位導入フェノール誘導体側からリグニン母体へ変換されたアリールクマラン体を得るには８０〜１４０℃程度の反応温度が好ましい。
【００３１】
Ｃ１フェノール核の隣接基関与によるＣ２−アリールエーテルの開裂は、上述したようにアリールクマラン構造の形成を伴うが、リグノフェノール誘導体の架橋体の低分子化は、必ずしもアリールクラマンが効率よく生成する条件下（１４０℃付近）で行う必要はなく、より高い温度（例えば１７０℃付近）で行うこともできる。この場合、一旦生成したクラマン環は開裂し、導入フェノール誘導体側にフェノール性水酸基が再生される結果、１４０℃処理物とは特性の異なるよりフェノール活性が高い素材を誘導することができる。本発明のリグニン誘導体としては、１５０℃以上１８０℃以下、好ましくは、１６０℃以上１８０℃以下、さらに好ましくは、約１７０℃でのアルカリ処理を採用することができる。
【００３２】
以上のことから、アルカリ処理における加熱温度は、特に限定されないが好ましくは８０℃以上２００℃以下である。８０℃を大きく下回ると、反応が十分に進行せず、２００℃を大きく越えると好ましくない副反応が派生しやすくなるからである。
【００３３】
クラマン構造の形成とそれに伴う低分子化のための処理の好ましい一例としては、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液をアルカリ溶液として用い、１４０℃で加熱時間６０分という条件を挙げることができる。また、０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液をアルカリ溶液として用い、１７０℃で加熱時間６０分という条件を挙げることができる。
【００３４】
アルカリ処理して水溶性のリグニン二次誘導体を得る方法としては、アルカリ処理反応液を中和後、その水溶性区分を遠心分離等により分離採取し、これを透析等により脱塩し、凍結乾燥等する方法を採用することができる。脱塩後の液をそのまま水溶性リグニン二次誘導体含有組成物として用いることもできる。なお、アルカリ処理反応液中和後の水不溶性区分は、水不溶性リグニン二次誘導体として後述するカルボキシアルキル化三次誘導体の前駆体となる。
水溶性リグニン二次誘導体は、重量平均分子量は７００以上１００００以下とすることが好ましく、より好ましくは、７００以上６０００以下である。
また、水不溶性のリグニン二次誘導体の重量平均分子量は７００以上１００００以下、好ましくは７００以上６０００以下である。
【００３５】
カルボキシアルキル化による二次誘導体化及び三次誘導体化
一次誘導体及び、水溶性及び／又は水不溶性のリグニン二次誘導体に対して、カルボキシアルキル基を導入することによりカルボキシアルキル化二次誘導体及び三次誘導体を得ることができる。カルボキシルアルキル基におけるアルキル基は、炭素数１〜５の直鎖あるいは分枝アルキル基であることが好ましく、より好ましくは、炭素数１〜３の直鎖アルキル基である。たとえば、メチル基、エチル基、プロピル基を用いることができる。
カルボキシルアルキル基は、リグニン誘導体中のアルコール性あるいはフェノール性水酸基に導入される。カルボキシアルキル化は、一般に、アルカリ存在下に、モノハロゲノアルキルカルボン酸と反応させることにより達成することができる。リグニン誘導体のカルボキシアルキル化法は従来公知の各種方法を採用することができる。
例えば、リグニン一次誘導体を、この誘導体を分散できるイソプロパノールなどの有機溶媒で分散し、その後、アルカリ水溶液を加え、必要に応じてさらにイソプロパノールなどの有機溶媒を加えて得られた不均一混合溶液をモノクロロ酢酸などのモノハロゲノ酢酸（カルボキシアルキル化剤）を添加し、攪拌等しながら反応させることができる。また、リグニン誘導体を予めアルカリ溶液に浸漬した後、この浸漬物を有機溶媒に分散して、その後反応させることもできる。
なお、アルカリとしては、一般に用いられるアルカリ試薬でよいが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属化合物のような強アルカリが好適に用いられる。また、リグニン誘導体等を分散する有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化物、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類等が挙げられ、これらは単独であるいは２種以上混合して使用される。これらの中でも、アルコール類、ケトン類、エーテル類等の極性有機溶媒の１種又は２種以上の組合せが良く、さらに好ましくは、イソプロパノール、アセトン、１，４−ジオキサンが用いられる。
【００３６】
モノハロゲノアルキルカルボン酸は、次の一般式〔Ｉ〕で表わされるものが好ましく用いられる。
ＸＲＣＯＯＨ  〔Ｉ〕
（上式中、Ｘ及びＲはそれぞれ以下のものを表わす。
Ｘ：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲン原子、Ｒ：炭素数１〜５の直鎖及び分枝を有するアルキル基。）
上記化合物中、特にＸがＣｌ又はＢｒ原子で、炭素数が１〜３の直鎖アルキル基を有するものが好ましい。
【００３７】
上記モノハロゲノアルキルカルボン酸の使用量は、リグニンの水酸基量以上あれば良く、水酸基あたり、約１〜３モルであることが好ましい。モノハロゲノアルキルカルボン酸の添加方法としては、固体のまま及び／又はこの有機溶媒の溶液として、一括あるいは連続滴下で添加すれば良い。好ましいのは、有機溶媒の溶液として０．５〜３時間かけた連続滴下の方法であり、特に１〜２時間で連続滴下することが好ましい。また、モノハロゲノアルキルカルボン酸の添加終了後、その温度で０．５〜５時間（より好ましくは１〜４時間）反応を続けることが好適である。なお、モノハロゲノアルキルカルボン酸による反応にあたり、反応液を４０℃〜６０℃程度の範囲で加熱することが好ましい。
【００３８】
カルボキシアルキル化二次及び三次誘導体は、固形生成物の他一部溶解した状態とで得られる。固形生成物は、反応終了後、ろ過等により固形の生成物を分離採取し、この固形生成物を水に溶解させ、希鉱酸、例えば希塩酸、希硫酸等の酸で中性に中和した後、電気透析で脱塩し、凍結乾燥等して得ることができる。また、溶解生成物は、上記ろ液中の有機溶媒を留去し、溶解物を乾固させ、この乾固物を中和前の固形生成物に添加することにより、両者を回収することができる。
本発明においては、１価のフェノール化合物の一次誘導体をカルボキシアルキル化した二次誘導体が好ましい形態であり、より好ましくは、１価のフェノール化合物がクレゾールであり、さらに好ましくは、カルボキシメチル化された形態である。
また、１価のフェノール化合物の一次誘導体をアルカリ処理しえて得られた水溶性及び／又は水不溶性の二次誘導体のカルボキシメチル化した三次誘導体も好ましい形態であり、さらに、当該水溶性の二次誘導体をカルボキシメチル化したものが好ましく、より好ましくは、１価のフェノール化合物がクレゾールである形態であり、カルボキシメチル化された形態である。
【００３９】
（細胞保護剤及び非生理的細胞死抑制剤としてのリグニン誘導体）
以上説明した本発明におけるリグニン誘導体、すなわち、上記した二次誘導体及び三次誘導体は、本発明者らの研究によれば、ヒトを含む哺乳動物細胞に対して好ましい細胞保護活性及び／又は非生理的細胞死抑制活性を有していることが認められている。
細胞保護活性及び非生理的細胞死抑制活性は、各種細胞死誘導物質、特に、酸化ストレスとなる過酸化水素、一酸化窒素などを用いて各種哺乳類細胞に細胞死を誘導し、本リグニン誘導体の細胞死抑制活性を測定することにより確認することができる。
細胞死誘導物質としては、各種存在するが、各種の活性ラジカル種を生成する物質の他、細胞死を誘導する各種プロテアゾーム活性阻害剤やなどの物質を用いることができる。細胞死誘導のメカニズムを限定しないが、例えば、過酸化水素水や、過酸化窒素を放出するＳＩＮ−１（３−（４−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｓｙｄｎｏｎｉｍｉｎｅ，  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅなどのオキサイドラジカル発生剤、ＰＫ１１１９５（１−（２−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−（１−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）３−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ））などによるミトコンドリアの機能阻害剤、ＰＳＩ（Ｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（Ｏｂｕ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈ（ａｌｄｅｈｙｄｅ））などのプロテアゾーム活性阻害剤を用いることができる。
このような物質により誘導される細胞死抑制活性を見出すことができる場合には、非生理的細胞死抑制活性及び細胞保護活性を確認することができる。したがって、当該細胞死抑制活性を確認することにより同時に細胞保護剤及び非生理的細胞死抑制剤として機能させることができる。
なお、本発明のリグニン誘導体は有効な非生理的細胞死抑制活性及び細胞保護活性を有していることから、これらの化合物をリード化合物として、非生理的細胞死抑制活性及び細胞保護活性を指標としてさらに有用な化合物を探索し、得ることができる。
【００４０】
細胞としては、ヒトを含む哺乳類細胞とすることが好ましいが、特に、神経系の細胞とすることが好ましい。また、脳細胞とすることも好ましい。かかる細胞としては、例えば、ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞などの神経芽細胞種などを用いることができる。
【００４１】
リグニン誘導体が非生理的細胞死抑制活性及び細胞保護活性を有することにより、これらのリグニン誘導体を非生理的細胞死抑制剤及び細胞保護剤などの試薬として使用することができる。例えば、各種培養細胞系へ直接投与することにより、不適切に誘導されるアポトーシスに対して細胞を保護することができる。これらの試薬の形態は特に限定されないが、例えば、粉末などの固形剤、又は有機溶剤若しくは含水有機溶剤に溶解した液体剤などを挙げることができる。通常、上記の化合物を試薬として用いて非生理的細胞死抑制作用及び細胞保護作用を発揮させるための効果的な使用濃度は、１０〜５０μＭであるが、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なり当業者が適宜選択可能である。また、動物に投与する場合、血中濃度１０〜１００μＭであることがこのましい。また、必要により上記範囲外の量を用いることができる。
【００４２】
また、本リグニン誘導体は、非生理的細胞死の異常亢進が関与する疾患の予防及び／又は治療のための医薬として有用である。正常のアポトーシス制御機構が逸脱して細胞死が亢進している疾患として、例えば、関節リウマチ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎等のウイルス感染に伴う肝炎、劇症肝炎、糖尿病、心筋梗塞、潰瘍性大腸炎、慢性腎炎、脱毛症、アルツハイマー病およびパーキンソン氏病などの神経変性疾患、虚血性脳障害、後天性免疫不全症候群、拡張性心筋症などを例示することができる。
【００４３】
本発明の医薬は、使用目的にあわせて投与方法、剤型、又は投与量を適宜決定することが可能である。本発明の医薬の投与形態は、経口投与でも非経口投与でもよい。本発明の医薬の形態は特に限定されないが、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤を挙げることができる。これらの製剤は、賦形剤、結合剤等の製薬上許容される添加剤を用いて既知の方法で医薬組成物として調製することができる。本発明の化合物を有効成分として含む医薬の投与量は、患者の年齢、体重、感受性、症状の程度などにより異なるが、通常、効果的な量は成人１日あたり２５０ｍｇ〜２．５ｇ程度であり、１日一回又は数回にわけて投与することも可能である。また、必要により上記範囲外の量を用いることができる。
【００４４】
さらに、本剤は、経口あるいは腸管経由の栄養補助材（食品）としても有用である。食品の形態は、従来公知の各種形態を採ることができる。また、食品添加物としても用いることができる。栄養補助食品として摂取する場合、好ましい摂取量としては、１日あたり２５０ｍｇ〜２．５ｇ程度であり、必要により上記範囲外の量を用いることができる。また、本剤は化粧品としても有用である。化粧品の形態としては、従来公知の各種形態を採ることができる。化粧品として使用する場合、一日塗布量が２５０ｍｇ〜２．５ｇ程度であることが好ましい。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００４６】
（実施例１）
カルボキシメチル化二次誘導体（試料１〜３）の調製
モミガラ、タケ（葉を除いた茎部）及びブナ脱脂粉末試料を用い、それぞれに含まれるリグニン基本単位（フェニルプロパン単位、Ｃ９）あたり、ｐ−クレゾール３モルをアセトンに溶解させた。そのアセトン溶液に各試料を一昼夜浸漬させた後、アセトンを完全に留去、風乾することにより、それぞれのフェノール化合物を試料に収着させた。
モミガラ及びタケでは、上記収着試料に６８ｗｔ％硫酸（４ｍｌ／ｇ脱脂試料）を加えて３０℃、１時間、攪拌した。攪拌後、有機相に可溶（水に不溶）なリグノフェノール及び過剰な未反応フェノール化合物を抽出するため、フェノール：ベンゼン（７：３，ｖ／ｖ）混液（２ｍｌ／ｇ脱脂試料）を加え、再度、１５分間攪拌し、遠心分離（３０℃、３５００ｒｐｍ、１０分）により２相に分離した。フェノール：ベンゼン相を大過剰のジエチルエーテルに滴下し、さらに、再度分離された硫酸相に少量のフェノール：ベンゼン混液を加え攪拌、遠心分離し、フェノール：ベンゼン相をジエチルエーテルに滴下した。フェノール：ベンゼン混液に可溶なリグノフェノール及び未反応フェノール化合物が硫酸相から抽出されなくなるまで同じ操作を数回繰り返した。フェノール：ベンゼン相をジエチルエーテルに滴下し生じた沈殿物を遠心分離によって回収後、これをアセトンに溶解させ、不溶解区分を遠心分離によって除去した。このアセトン抽出溶液をエバポレーターで濃縮後、大過剰のジエチルエーテルに滴下し、その不溶解沈殿物を遠心分離にて回収、さらに沈殿物を少量のジエチルエーテルにて遠心分離により洗浄し、五酸化リン上で減圧乾燥後、リグノフェノール一次誘導体として、それぞれリグノクレゾール−ＲＨ、リグノクレゾール−Ｂを得た。
ブナでは、上記収着試料に７２％硫酸（４ｍｌ／ｇ  脱脂木粉）を加え、１時間攪拌しながら３０℃で反応させた後、反応系を大過剰の水に投入し、硫酸濃度を１０％程度まで希釈した。その時、生じた不溶解沈殿物を遠心分離にて分離し、硫酸と未反応のクレゾールを取除くまで完全に洗浄し、五酸化リン上で減圧乾燥させた。これにアセトンを加え、一昼夜攪拌後、不溶物を遠心分離にて取除き、エバポレーターで濃縮後、大過剰のジエチルエーテルに滴下し、その不溶解沈殿物を遠心分離、洗浄し、リグノフェノール一次誘導体として、ブナ由来のリグノクレゾールを得た。
これら各リグノクレゾール１ｇを容器に取り、予めイソプロピルアルコール４ｇで分散させ、４０％水酸化ナトリウム水溶液６．２５ｇを加え、十分に静置した。これにイソプロピルアルコール１２ｇを加え、この不均一混合溶液を攪拌下、５０℃に維持し、モノクロロ酢酸（リグノクレゾール中の水酸基あたり、モミガラ、タケには約１．３ｍｏｌ、ブナには約１．６ｍｏｌ）をイソプロピルアルコール４ｇに溶解させた溶液を１時間かけて添加し、その後さらに、５０℃で２時間攪拌した。反応終了後、反応系は水酸化ナトリウムを含むリグニン二次誘導体の沈殿物と一部溶解した二次誘導体とを含むアルコール溶液に分離され、この沈殿物とアルコール溶液とをろ別し、アルコール溶液をエバポレータにて留去し、溶解物を乾固させた。次に、沈殿物を水に溶解し、これに少量の水で溶解させた乾固物を加え、１Ｎ塩酸にて中和した。このとき生じた沈殿物を遠心分離にて分離洗浄し、取り除き、上澄み液及び洗浄液を回収し、透析にて脱塩、凍結乾燥し、カルボキシメチル化二次誘導体として、それぞれリグノクレゾール−ＣＭ−ＲＨ、−ＣＭ−Ｂ、−ＣＭ（試料１〜３）を得た。
【００４７】
（実施例２）
アルカリ処理して得られる水溶性の二次誘導体及び三次誘導体（試料４，５）の調製
実施例１で調製したリグノクレゾール（ブナ）２０ｇを採り、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液４００ｍｌに完全溶解させ、これをオートクレーブに投入し、１７０℃（０．６８ＭＰａ）にて１時間処理した。反応終了後、冷却し、１Ｎ塩酸にて中和した。上澄み液を遠心分離にて回収、透析して脱塩後、凍結乾燥して、アルカリ処理二次誘導体で水溶化物であるリグノクレゾール−１７０（試料４）を得た。
一方、ＩＮ塩酸中和し遠心分離後の沈殿物であるアルカリ処理水不溶物を回収し、凍結乾燥した。このアルカリ処理水不溶物１ｇを容器に取り、予めイソプロピルアルコール４ｇで分散させ、４０％水酸化ナトリウム水溶液６．２５ｇを加え、十分に静置した。これにイソプロピルアルコール１２ｇを加え、この不均一混合溶液を攪拌下、５０℃に維持し、モノクロロ酢酸（リグノクレゾール中の水酸基あたり、モミガラ、タケには約１．３ｍｏｌ、ブナには約１．６ｍｏｌ）をイソプロピルアルコール４ｇに溶解させた溶液を１時間かけて添加し、その後さらに、５０℃で２時間攪拌した。反応終了後、反応系は水酸化ナトリウムを含むリグニン二次誘導体の沈殿物と一部溶解した二次誘導体とを含むアルコール溶液に分離され、この沈殿物とアルコール溶液とをろ別し、アルコール溶液をエバポレータにて留去し、溶解物を乾固させた。次に、沈殿物を水に溶解し、これに少量の水で溶解させた乾固物を加え、１Ｎ塩酸にて中和した。このとき生じた沈殿物を遠心分離にて分離洗浄し、取り除き、上澄み液及び洗浄液を回収し、透析にて脱塩、凍結乾燥し、カルボキシメチル化三次誘導体であるリグノクレゾール−ＣＭ−１７０（試料５）を得た。
【００４８】
（実施例３）
１．過酸化水素誘導アポトーシスの阻止活性の測定
実施例１及び２で得た試料１〜５について、以下の条件で抗アポトーシス活性を測定した。
細胞としては、神経芽細胞種株であるドーパミン作動性ヒトＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を用いた。ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞は、９５％ａｉｒ−５％ＣＯ２下で、Ｃｏｓｍｅｄｉｕｍ−００１組織培養培地（Ｃｏｍｏｂｉｏ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）で培養し、５％の仔牛血清（Ｎａｋａｓｈｉｂｅｔｓｕ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｋａｓｅｉ，  Ｔｏｙｋｏ，  Ｊａｐａｎ））に懸濁した。５〜１５×１０４細胞／ｍｌとなるように調製した培地（５％仔牛血清）を調製し、これらの各液２ｍｌに対し、一連の希釈系列の試料１〜５を添加し、培地におけるＨ２Ｏ２濃度７５〜２００μＭとして培地を暴露処理し、一晩培養した後、ヘキスト３３３４２染色（核染色）を行い、細胞を顕微鏡観察して、４００個の細胞中のアポトーシスを生じている細胞を計数した。核が分断されている細胞及び核が小さく濃染されている細胞をアポトーシスを生じている細胞として計数した。これらの結果から、アポトーシス抑制活性を４段階（−；活性なし、＋；ブロック率２５％以下、＋＋；同２５％超５０％以下、＋＋＋；５０％超１００％以下）に分けて判断した結果を図３に示す。
図３に示すように、用いた試料はいずれも抗アポトーシス活性を有し、この結果から、これらの試料は、アポトーシスに対して細胞を保護する作用を有していることも明らかであった。なかでもカルボキシメチル化されたタケ由来のリグノクレゾールである試料２が最も高い抗アポトーシス活性を示した（＋＋＋）であった。またかかる抗アポトーシス活性を示した反応系中の試料濃度は、２０〜３０μＭであった。
【００４９】
２．過酸化水素及びＳＩＮ−１誘導アポトーシスの阻止活性の測定
さらに、試料２について、アポトーシス誘導剤として過酸化水素と過酸化窒素発生剤であるＳＩＮ−１を用い、公知の抗酸化剤であるエピガロカテキンガレート（ＥＣＧ）を対照として比較実験を行った。結果を図４に示す。なお、反応系における過酸化水素の暴露濃度は１００μＭとし、ＳＩＮ−１の暴露濃度は５００μＭとし、試料２及びＥＣＧの濃度を２０μＭ及び３０μＭとなるようにし、培養時間を１５時間とした以外は、上記と同様に試験した。加えて、同時期の細胞を採取し、フェノール／クロロホルムで抽出後エタノール沈殿させることによりＤＮＡを回収し、ＲＮａｓｅを添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、これをアガロースゲル電気泳動しアポトーシスに特徴的なＤＮＡラダー形成を観察した。
【００５０】
図４（図４中、試料２をＬｉｇとして示す。）に示すように、試料２は、ＥＣＧに比べて高い抗アポトーシス活性を示した。また、その抗アポトーシス活性は、濃度応答性を示していた。また、ＤＮＡのラダー形成の観察においてもこの結果が支持された。この結果から、試料２は、アポトーシスに対して細胞を保護する作用を有していることが明らかであった。
【００５１】
（実施例４）
ＰＫ１１１９５及びＰＳＩ（Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）誘導アポトーシスの阻止活性の測定実施例１で調製した試料２について、さらに、ＰＫ１１１９５（イソキノリンタイプＰＢＲリガンド）とＰＳＩをアポトーシス誘導剤として用いて、抗アポトーシス活性を測定した。反応系における試料濃度を３０μＭ、ＰＫ１１１９濃度を５０μＭ及び７５μＭとし、ＰＳＩ濃度を１μＭ及び２μＭとしてこれらを添加（ただし、ＰＫ１１１９５添加の場合は無血清培地にて測定）し、培養時間を１５時間とした以外、実施例３の１．に記載の条件と同様の条件で試験した。なお、ＰＳＩ誘導アポトーシスについては、併せて反応系において過酸化水素を１００μＭの濃度で暴露した。結果を図５に示す。
【００５２】
図５に示すように、試料２の抗アポトーシス活性は明らかであり、かつ顕著であった。特に、ＰＫ１１１９５に誘導されたアポトーシスに対して高い抗アポトーシス活性を示し、この結果から、試料２は、アポトーシスに対して細胞を保護する作用を有していることも明らかであった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明によれば、リグニン誘導体の一種であるリグノフェノール系誘導体を用いる細胞保護剤等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】天然リグニンからのフェノール化合物を利用したリグノフェノール誘導体への構造変換の一例を示す図である。
【図２】オルト位結合ユニットとパラ位結合ユニットとを示す図である。
【図３】実施例３における抗アポトーシス活性測定結果を示す図である。
【図４】実施例３における抗アポトーシス活性測定結果を示すグラフ図である。
【図５】実施例４における抗アポトーシス活性測定結果を示すグラフ図である。
【図１】
2004244367.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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