(57)【要約】【課題】生体に対して無侵襲でｍＲＮＡを画像化可能にすると共に、生体内での放射線被曝に対する懸念を一層軽減させて核酸を検出するために適切な標識化核酸を提供する。【解決手段】標的核酸と相補的なポリヌクレオチド核酸又はペプチド核酸で構成された単鎖の核酸断片と、この核酸断片に相補的であり鉄含有基を有するセンス鎖とで、二重鎖を形成させ、この二重鎖の端部に１１Ｃを導入する。その後、熱による変性を行ってから、磁石を用いてセンス鎖を反応容器に吸着させて、単鎖の１１Ｃ標識化核酸を精製する。【選択図】　　　　図１
2004123542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド核酸又はペプチド核酸で構成された単鎖の核酸断片を、放射性同位元素によって標識化して標識化核酸を製造する標識化核酸の製造方法において、
前記核酸断片のアミノ基を１１Ｃの導入部位とし、
前記核酸断片と１１Ｃ化合物を接触させ、該導入部位に１１Ｃを導入する
ことを含む標識化核酸の製造方法。
【請求項２】
前記核酸断片にハイブリダイズ可能な他の核酸断片と前記核酸断片とで末端にアミノ基を有する二重鎖を形成させ、前記１１Ｃ化合物と該二重鎖とを接触させて二重鎖末端のアミノ基に１１Ｃを導入し、前記二重鎖を分離して、単鎖の１１Ｃ標識化核酸を精製することを特徴とする請求項１記載の標識化核酸の製造方法。
【請求項３】
前記他の核酸断片が鉄含有基を含むものであり、前記二重鎖の分離・精製を、磁力を作用させて行うことを特徴とする請求項２記載の標識化核酸の製造方法。
【請求項４】
前記１１Ｃが、１１Ｃケテン化合物由来である請求項１記載の標識化核酸の製造方法。
【請求項５】
前記鉄含有基が、三酸化鉄二由来である請求項３記載の標識化核酸の製造方法。
【請求項６】
標的核酸とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド核酸又はペプチド核酸で構成された単鎖の核酸断片を、放射性同位元素を用いて標識化して、標識化核酸を製造する標識化核酸合成装置であって、
１１Ｃ化合物を収容する１１Ｃ化合物収容部と、
前記１１Ｃ化合物収容部に連結すると共に、末端にアミノ基を有する前記核酸断片及び、該核酸断片にハイブリダイズ可能であると共に鉄含有基を含む他の核酸断片により形成された二重鎖に、前記１１Ｃ化合物収容器から投入された１１Ｃ化合物を接触させて１１Ｃ標識化二重核酸鎖が合成される反応部と、
前記反応部で合成された１１Ｃ標識化二重核酸鎖を、単鎖の１１Ｃ標識化核酸及び、鉄分子含有基を含む単鎖の核酸断片に分離させ、磁力を用いて１１Ｃ標識化核酸を精製する分離・精製手段と、
を備えたことを特徴とする標識化核酸合成装置。
【請求項７】
前記分離・精製手段が、
前記反応部に対して磁力を作用させる磁力付与手段と、
前記反応部を所定の温度に加温する加温手段と、
前記反応部及び前記分離・精製手段の相対的位置関係を、反応部に磁力を作用させる第１の位置、反応部を加温する第２の位置並びに、該第１及び第２の位置以外の第３の位置に調整する調整する位置変更手段と、
を含むことを特徴とする請求項６記載の標識化核酸合成装置。
【請求項８】
前記位置変更手段が、前記磁力付与手段及び前記加温手段の位置を移動する第１の移動手段と、前記反応器の位置を移動する第２の移動手段とを含むことを特徴とする請求項７記載の標識化核酸合成装置。
【請求項９】
標的核酸とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド核酸又はペプチド核酸で構成されると共に、放射性同位元素を用いて標識化された単鎖の標識化核酸を用いて、標的核酸を画像化する核酸画像化方法において、
１１Ｃが導入された１１Ｃ標識化核酸を、標的核酸にハイブリダイズさせた後に、前記１１Ｃ標識化核酸に由来する放射線を感知し、前記感知された放射線に基づいて標的核酸を画像化する
を含む核酸画像化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識化核酸の製造方法、標識化核酸合成装置及び核酸画像化方法に関し、特に、標的核酸とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド核酸又はペプチド核酸で構成された単鎖の核酸断片を、放射性同位元素によって標識化して標識化核酸を製造する標識化核酸の製造方法、このような標識化核酸を合成する合成装置及び、このような標識化核酸を用いた核酸画像化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、特定の組織における遺伝子の発現を解析するにあたり、ｍＲＮＡの有無を画像化する方法が開発されており、この方法のひとつとしてｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法が挙げられる。これは、薄い組織切片に対して、局所的な遺伝子ｍＲＮＡの発現部位を蛍光又はラジオアイソトープで標識化したオリゴデオキシ核酸（ＯＤＮ）により画像化するものである。
【０００３】
また、陽電子［ポジトロン］放射断層撮影法（ＰＥＴ）や単光子放射型（コンピューター）断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）での解析を実施するために、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１８Ｆ等のラジオアイソトープ（ＲＩ）で標識したＯＤＮを用いたｉｎ　ｖｉｖｏハイブリダイゼーション法も提案されている。この方法によれば、無侵襲でｍＲＮＡの画像化を行うことができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述のような組織切片を使用するｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、生体から組織を採取する必要があり、生きた状態でしかも無侵襲でｍＲＮＡの発現を画像化することができない。
【０００５】
その一方で、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１８Ｆ等のラジオアイソトープ（ＲＩ）を使用するＰＥＴやＳＰＥＣＴのようなｉｎ　ｖｉｖｏハイブリダイゼーション法では、これらのＲＩの血中或いは組織中からのクリアランスが悪いという問題点があり、このため、測定部位での非特異的な放射能による影響が多く、明瞭な画像が得られ難い。また、１１１Ｉｎについては、半減期が２．８３日と長いため、体内で分解されて生成された１１１Ｉｎによる被験者の被爆量に注意を要し、１８Ｆについても、１８Ｆ標識化ＤＮＡから脱離した１８Ｆが骨に集積するため骨での被爆が懸念される。さらに半減期が長いと、廃液であっても放射能が放出されているため処理に注意を要し、取り扱い上の負担が大きい。
【０００６】
従って、本発明は、生体に対して無侵襲でＲＮＡを画像化可能にすると共に、生体内での放射線被曝に対する懸念を一層軽減させて核酸を検出するために適切であり、標的遺伝子の検出を感度よく行うことができる標識化核酸の製造方法及びその合成装置並びに画像化方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の標識化核酸の製造方法は、標的核酸とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド核酸又はペプチド核酸で構成された単鎖の核酸断片を、放射性同位元素によって標識化して標識化核酸を製造する標識化核酸の製造方法において、前記核酸断片のアミノ基を１１Ｃの導入部位とし、前記核酸断片と１１Ｃ化合物を接触させ、該導入部位に１１Ｃを導入することを含むことを特徴としている。
【０００８】
この方法によれば、標識化核酸の標識として、１１Ｃが用いられる。この１１Ｃは、生体の構成要素の中で最も多く存在する１２Ｃの放射性同位体であり、その半減期は２０分と短いことが知られている。このため、このような１１Ｃを標識とする標識化核酸は、検体中の標的核酸にハイブリダイズして検出可能とした後、短時間で半減し、検体に対する被爆量を少なくすることができる。特に、検体として生体に適用した場合に、１１Ｃ標識化核酸は生体によって分解されて炭酸ガスとして呼気により放出されるため、検出時の負担を大幅に軽くすることができる。また、ハイブリダイズ可能な標識化核酸を使用することによって、感度よく標的核酸を検出することができる。従って、標的核酸の検出を、検体に対する被爆量を少なくすると共に感度よく検出可能な標識化核酸を提供することができる。特に、ＰＥＴなどに用いた場合には標的核酸の所在を検体に対する負担を小さくして無侵襲で検出できる。また、検体に対してだけでなく、作業を行う製造者や取扱者に対しても同様に被爆量を軽減することができ、さらに廃液等の処理の負担を軽くすることができる。
【０００９】
本発明の他の標識化核酸の製造方法は、上記製造方法において、前記核酸断片にハイブリダイズ可能な他の核酸断片と前記核酸断片とで末端にアミノ基を有する二重鎖を形成させ、前記１１Ｃ化合物と該二重鎖とを接触させて二重鎖末端のアミノ基に１１Ｃを導入し、前記二重鎖を分離して、単鎖の１１Ｃ標識化核酸を精製することを特徴としている。
【００１０】
この方法によれば、ハイブリダイズ可能な核酸断片の特徴を利用して二重鎖を形成させることにより、末端（導入部位）以外のアミノ基に１１Ｃが導入することを防止する。これにより、１１Ｃの導入を効率よく行うことができる。また、その後に二重鎖を分離することによって、単鎖の１１Ｃ標識化核酸を効率よく精製することができる。従って、１１Ｃ標識化核酸を効率よく製造することができる。
【００１１】
更に本発明の他の標識化核酸の製造方法は、上記製造方法において、前記他の核酸断片が鉄含有基を含むものであり、前記二重鎖の分離・精製を、磁力を作用させて行うことを特徴としている。
この方法によれば、他の核酸断片に鉄含有基が存在するので、１１Ｃ標識化核酸と他の核酸断片とを磁力によって容易に分離することができる。
【００１２】
ここで前記１１Ｃが、１１Ｃケテン化合物由来であることが好ましい。
また、前記鉄含有基が、三酸化鉄二由来であることが好ましい。
【００１３】
本発明の標識化核酸合成装置は、標的核酸とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド核酸又はペプチド核酸で構成された単鎖の核酸断片を、放射性同位元素を用いて標識化して、標識化核酸を製造する標識化核酸合成装置であって、１１Ｃ化合物を収容する１１Ｃ化合物収容部と、前記１１Ｃ化合物収容部に連結すると共に、末端にアミノ基を有する前記核酸断片及び、該核酸断片にハイブリダイズ可能であると共に鉄含有基を含む他の核酸断片により形成された二重鎖に、前記１１Ｃ化合物収容器から投入された１１Ｃ化合物を接触させて１１Ｃ標識化二重核酸鎖が合成される反応部と、前記反応部で合成された１１Ｃ標識化二重核酸鎖を、単鎖の１１Ｃ標識化核酸及び、鉄分子含有基を含む単鎖の核酸断片に分離させ、磁力を用いて１１Ｃ標識化核酸を精製する分離・精製手段と、を備えたことを特徴としている。
【００１４】
この標識化核酸合成装置によれば、分離・精製手段と位置変更手段とを備えているので、反応部において、二重鎖末端のアミノ基に１１Ｃが導入されて標識化核酸の合成が行われた後に、二重鎖を、熱によって、１１Ｃ標識化核酸と鉄含有基を有する他の核酸断片とに分離し、磁力を用いて、１１Ｃ標識化核酸のみを精製することができる。これにより、１１Ｃ標識化核酸の合成及び精製を連続的に且つ簡便に行うことができる。
【００１５】
本発明の標識化核酸合成装置は、上記装置において、前記分離・精製手段が、前記反応部に対して磁力を作用させる磁力付与手段と、前記反応部を所定の温度に加温する加温手段と、前記反応部及び前記分離・精製手段の相対的位置関係を、反応部に磁力を作用させる第１の位置、反応部を加温する第２の位置並びに、該第１及び第２の位置以外の第３の位置に調整する位置変更手段と、を含むことを特徴としている。
この装置によれば、二重鎖をほどく加温手段と、ほどいた二重鎖を磁力によって精製する磁力付与手段を備え、位置変更手段によって、このような磁力付与手段及び加温手段と反応部との相対位置を変更することによって、容易に分離・精製を行うことができる。
【００１６】
ここで、前記位置変更手段が、前記磁力付与手段及び前記加温手段の位置を移動する第１の移動手段と、前記反応器の位置を移動する第２の移動手段とを含むものであってよい。
【００１７】
本発明の核酸画像化方法は、標的核酸とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド核酸又はペプチド核酸で構成されると共に、放射性同位元素を用いて標識化された標識化核酸を用いて、標的核酸を画像化する核酸画像化方法において、１１Ｃが導入された１１Ｃ標識化核酸を、標的核酸にハイブリダイズさせた後に、前記１１Ｃ標識化核酸に由来する放射線を感知し、前記感知された放射線に基づいて標的核酸を画像化することを特徴としている。
【００１８】
この方法によれば、標的核酸に、１１Ｃ標識化核酸をハイブリダイズさせ、この１１Ｃに基づいて標的核酸を画像化する。これにより、検体に対して少ない被爆量で且つ感度よく標的核酸を検出することができる。特に、ＰＥＴなどに適用した場合では、無侵襲で感度よく検体内の標的核酸を画像化することができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
［第１の実施形態］
以下に本発明の実施形態を、添付図面を参照しながら説明する。なお、図中、同一符号は同一又は対応する部分を示すものとする。
【００２０】
図１には、本発明にかかる１１Ｃオリゴヌクレオチド自動合成装置（以下、自動合成装置）１０が示されている。自動合成装置１０には、１１Ｃオリゴヌクレオチドの合成の場となる反応容器１２が備えられている。
【００２１】
反応容器１２は、洗浄用のジクロロメタン容器１４、蒸留水容器１６、１１Ｃ標識エチルケテン生成装置１８に、それぞれ電磁弁（Ｖ）６、電磁弁Ｖ５及び電磁弁Ｖ１を介して連通している。ジクロロメタン容器１４と蒸留水容器１６には、それぞれ、ジクロロメタン及び蒸留水の液量を感知する液量計（以下、それぞれＬＳ−１、ＬＳ−２）１４Ａ、１６Ａが備えられている。この反応容器１２は、ヘリウムガスライン２０、排気ライン２２及びベンチレーション２４にも、それぞれ電磁弁Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４を介して連通している。
【００２２】
また自動合成装置１０には、廃液バイアル２６及び捕集バイアル２８が備えられている。捕集バイアル２８は、電磁弁Ｖ９を介して反応容器１２に連通している。一方、廃液バイアル２６は、電磁弁Ｖ７を介して反応容器１２に連通していると共に、電磁弁Ｖ８を介して排気ラインに連通している。捕集バイアル２８内には、図示しない滅菌フィルタが配置されており、反応容器１２内の内容物が電磁弁Ｖ９を通って捕集バイアル２８に回収される際、滅菌フィルタを通過するようになっている。
【００２３】
反応容器１２には、昇降機構３０が連結されている。この昇降機構３０は、エアシリンダ（ＡＳ−２）３０Ａを備えており、エアシリンダ３０Ａがオンのときには図１下方へ、オフのときには図１上方へ、反応容器１２を移動可能となっている。なお、昇降機構３０は、反応容器１２を上下に移動可能であればエアシリンダ以外のもので構成されていてもよい。
また、反応容器１２の近傍には、反応容器１２内の放射線量を感知するＲＩモニタ３２が配置されている。
【００２４】
反応容器１２の図１下方には、マグネット３４及び湯漕３６が配置されている。マグネット３４及び湯漕３６は、載置台３８上に載置されており、載置台３８は、移動機構４０に連結されている。この移動機構４０は、エアシリンダ（ＡＳ−１）４０Ａ及びロッド４０Ｂを備えており、反応容器１２に対向する位置（図１では反応容器１２の下方）に、エアシリンダ４０Ａがオンのときにはマグネット３４を配置し、オフのときには湯漕３６を配置するように、ロッド４０Ｂを介して載置台３８を図１左右方向に水平移動可能となっている。なお、移動機構４０は、載置台３８を移動可能であれば、エアシリンダ以外のもので構成されていてもよい。
【００２５】
マグネット３４及び湯漕３６の図１下方であって、反応容器１２に対向する位置には、位置決めセンサ４２が配置されている。位置決めセンサ４２の載置台３８と対向する面には、検出部４２Ａが設けられている。載置台３８の裏面には、マグネット３４及び湯漕３６に対応する位置にそれぞれ被検出部３８Ａが設けられている。これにより、位置決めセンサ４２が、載置台３８の被検出部３４Ａを検出することによって、マグネット３４及び湯漕３６が反応容器１２に対向する位置に配置したか否かを判断できるようになっている。
【００２６】
図２に示されるように、自動合成装置１０には、制御部４４が備えられている。制御部４４は、各電磁弁Ｖ、ＲＩモニタ３２、液量計（ＬＳ−１）１６Ａ及び液量計（ＬＳ−２）１８Ａに接続されており、各電磁弁Ｖの開閉を制御すると共に、蒸留水及びジクロロメタンの液量をモニターし、反応容器１２に充填される１１Ｃの量を検出する。また、制御部４４は、位置決めセンサ４２、エアシリンダ（ＡＳ−２）３０Ａ及びエアシリンダ（ＡＳ−１）４０Ａに接続しており、エアシリンダ（ＡＳ−２）３０Ａ及びエアシリンダ（ＡＳ−１）４０Ａの駆動のオンオフを、位置決めセンサ４２からの情報に基づいて指示している。さらに制御部４４には図示しないタイマー機構が備えられており、時間に基づいて各手段の駆動を制御可能になっている。
【００２７】
このように、自動合成装置１０では、電磁弁Ｖ３、Ｖ５が開弁すると、反応容器１２に蒸留水が充填され、電磁弁Ｖ３、Ｖ６が開弁すると、反応容器１２にジクロロメタンが充填され、電磁弁Ｖ１、Ｖ３が開弁すると、１１Ｃエチルケテンが反応容器１２に投入される。一方、電磁弁Ｖ２、Ｖ９が開弁すると、ヘリウムガス圧によって反応容器１２内の溶液が捕集バイアル２８に移動し、電磁弁Ｖ４、Ｖ７、Ｖ８が開弁すると、反応容器１２内の溶液が廃液バイアル２６に移動する。
【００２８】
また、本自動合成装置１０では、反応容器１２での１１Ｃ標識化核酸の合成と分離・精製とが、反応容器１２の位置を変更することによって、連続的に実施可能となる。
反応容器１２の位置は、１１Ｃ標識化核酸の合成が行われると共に、磁力又は熱の作用を受けない位置（以下、退避位置とする）と、反応容器１２に対して磁力又は熱を作用させて合成された生成物の分離・精製を行う位置（以下、作用位置とする）と、に変更される。退避位置は、反応容器１２が、昇降機構３０によって、マグネット３４又は湯漕３６と最も離反した位置（図１では上位）であり、退避位置は、反応容器１２が、昇降機構３０によって、マグネット３４又は湯漕３６と最も接近した位置（図１では下位）である。一方、マグネット３４及び湯漕３６は、反応容器１２に対して磁力又は熱を作用可能とするために、交互に、反応容器１２に対向した位置（以下、作用位置）に配置される。
【００２９】
このため、磁力を付与する場合には、反応容器１２が作用位置に配置されると共に、マグネット３４が作用位置に配置されるので、反応容器１２とマグネット３４とが接触して磁力が作用する。一方、加温する場合には、反応容器１２が作用位置に配置されると共に、湯漕３６が作用位置に配置されるので、反応容器１２が湯漕３６内の湯に浸漬して加温される。
【００３０】
次に、本発明の自動合成方法について説明する。
本発明では、標的とする遺伝子ｍＲＮＡを検出するために、このｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なオリゴデオキシ核酸（ＯＤＮ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ）で構成された核酸断片に１１Ｃ化合物を接触する。これにより作製された単鎖の標識化核酸は、１１Ｃによって標識化されており、標的遺伝子ｍＲＮＡとハイブリダイズすることにより、標的遺伝子を感知可能にする。すなわち、１１Ｃ標識化核酸は、標的とする遺伝子ｍＲＮＡの発現部位でその相補的塩基配列の部位と水素結合により二重鎖構造を形成して、その部位に留まり、１１Ｃがポジトロンを放出し、その際、その消滅ガンマ線を放出する。このガンマ線をＰＥＴ等で計測することにより、標的とする遺伝子ｍＲＮＡの発現部位及び量的な解析を可能にする。１１Ｃは半減期がＦ又はＩと比較して短く、感度もよいため、放射線に暴露する時間を短くすることができ、身体に対する少ない負担で標的遺伝子の発現を効率よく検出することができる。
【００３１】
ここで使用される１１Ｃ化合物には、核酸の処理及び核酸に対する反応性及び１１Ｃ化合物の安定性などから、１１Ｃエチルケテンを使用する。１１Ｃ原子は、核酸断片のどこに存在させてもよいが、配列の保存や標的遺伝子ｍＲＮＡとの反応性の観点から、末端に導入することが好ましい。なお、同様の効果を奏する化合物であればエチルケテン以外の他のアルキルケテンでもよく、また、１１Ｃ標識ヨウ化メチルでも良い。
【００３２】
本発明の核酸断片は、標的遺伝子ｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な単鎖のポリヌクレオチド核酸又はペプチド核酸である。ここで標的遺伝子ｍＲＮＡとしては配列が判明している如何なるものであってもよい。この核酸断片の標的遺伝子ｍＲＮＡに対する相同性は、標的遺伝子ｍＲＮＡとハイブリダイズできる程度であればよいが、標的遺伝子ｍＲＮＡの種類や、検出の感度に基づいて、１００％相同性又はそれに近い相同性、少なくとも８０％を超える相同性の範囲から選択することができる。１００％又はそれに近い相同性のものは、感度よく検出する場合に適している。本発明の核酸断片に必要な相同性は、この分野の当業者によって容易に且つ的確に把握可能である。図２では、グリオーマに特異的な遺伝子ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の配列に対して完全に相補的なアンチセンス配列が示されている。
【００３３】
また本発明での核酸断片は、アミノ基を有するものであればよいが、標識の容易性や標的核酸との反応性の関連から、末端に一級アミノ基を有するものが好ましい。ＯＤＮの場合には末端に一級アミノ基を結合すればよく、ＰＮＡの場合には末端の一級アミノ基をそのまま使用することができる。末端に一級アミノ基を有すればＯＤＮであってもＰＮＡであってもよく、標的核酸の検出に用いられる通常の長さのものであれば、いずれでもよい。以下、ＯＤＮを例に説明する。
【００３４】
１１Ｃ標識化ＯＤＮの製造では、上記ＯＤＮと１１Ｃ化合物との接触の前に、上記ＯＤＮとハイブリダイズ可能な保護断片（センス鎖）と上記ＯＤＮとで二重鎖を形成することが好ましい。
すなわち、図３に示されるように、本発明では、ＯＤＮにハイブリダイズ可能な配列（以下、センス鎖）を合成し、このセンス鎖と二重鎖を形成させると、この二重鎖の形成によって、ＯＤＮ上の他のアミノ基が保護され、末端の導入部位のみが１１Ｃ化合物と接触可能となる。これにより、簡便に導入部位以外のアミノ基を保護することができると共に、導入部位に１１Ｃ原子を確実に導入することができる。
【００３５】
ここで用いられる保護断片（センス鎖）は、１１Ｃを二重鎖に導入した後にセンス鎖と１１Ｃ標識化ＯＤＮとを容易に分離するため、鉄含有基を有するものである。これにより磁力を作用させることによって容易にセンス鎖と１１Ｃ標識化ＯＤＮとを分離・精製可能となる。
【００３６】
センス鎖に含まれる鉄含有基は、鉄原子をセンス鎖に含ませるものであれば、いずれの化合物に由来するものであってもよく、例えば、三酸化鉄二（Ｆｅ２Ｏ３）、を挙げることができるが、入手容易性の観点から、三酸化鉄二であることが好ましい。また鉄含有基は、センス鎖中に少なくとも１カ所、好ましくは末端に存在すればよいが、分離・精製を確実に行う場合には、それよりも多くてもよい。
【００３７】
またセンス鎖は、ＯＤＮとハイブリダイズして、１１Ｃを確実に末端に導入することができれば如何なる長さのものであってもよいが、好ましくは、ＯＤＮと同じ長さのものであり、１００％の相同性とする。このようなセンス鎖の長さ及び相同性については、この分野での通常の条件に従う。
【００３８】
次に、図４を参照して、１１Ｃ標識化ＯＤＮのためのＯＤＮ前処理について以下に説明する。
図４においてステップＳ１００において、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を決定し、この配列に基づいてＯＤＮが合成される。なお、ＯＤＮの合成は、通常行われる合成方法により行ってもよいが、商業的又は他の方法によって入手可能なものであれば、そのまま使用することができる。ＯＤＮの合成が行われると、ステップＳ１０２において、ＯＤＮの高脂溶性化処理を行う。１１Ｃ標識前駆体であるケテンは水と非常に反応しやすく、反応条件下に水分があると標識効率が低下する。このため、このＯＤＮの高脂溶性化処理は、標識効率を下げないために用いられる有機溶媒に対して、ＯＤＮの溶解性を高めるために行われる。ここではＯＤＮの３’末端にコレステロールを結合させる。
【００３９】
次いで、ステップＳ１０４において、ヘキシルアミン化を行う。このヘキシルアミン化は、ＯＤＮに対して１１Ｃ標識を導入するためにＯＤＮ末端に一級アミノ基を導入する工程である。このようなヘキシルアミンへの変換には、この反応を実施することができるものであればいずれの方法も採用することができるが、一例として、縮合反応を挙げることができる。なお、ＰＮＡの場合には、この工程を省略できる。
【００４０】
ヘキシルアミン化が終了すると、ステップＳ１０６において、ヘキシルアミン化ＯＤＮの配列に対して相補的な配列を有するセンス鎖を作製する。この相補的センス鎖は、ＯＤＮと二重鎖を形成することにより、末端以外に存在する他のアミノ基を１１Ｃエチルケテンから保護するためのものである。センス鎖の作製は、通常の核酸合成方法を用いて容易に行うことができる。
【００４１】
センス鎖の合成が完了すると、ステップＳ１０８において、ステップＳ１０６で作製されたセンス鎖に連結基を介して鉄化合物を付加する。ここでは、センス鎖の５’末端に、スペーサとして１０ベースのチミン残基を結合し、ビオチン−ストレプトアビジンを介して三酸化二鉄を結合する。これらの結合処理は、この目的で実施される通常の方法によって実施することができる。また連結基の種類や長さは、センス鎖に含有される鉄含有基の種類や、センス鎖の長さ及び性質に基づいて決定されるが、この選択は当業者の通常の知識の範囲内で容易に行うことができる。
【００４２】
鉄化合物の付加が完了すると、ステップＳ１１０において、鉄含有基を有するセンス鎖とヘキシルアミン化ＯＤＮとを接触させて二重鎖を形成させる（図３下、参照）。このとき、センス鎖とヘキシルアミン化ＯＤＮとを接触を、０．５ｍＬのリン酸バッファ中１：２のモル比で接触させ、室温で２０分間インキュベートする。これにより、一端にヘキシルアミンを有し、他端に三酸化二鉄が結合された二重鎖が形成される。このようにして得られた二重鎖は、センス鎖側に鉄含有基が存在するので、磁力を作用させて容易に精製できる。
【００４３】
次に、１１Ｃ標識化ＯＤＮの合成処理について説明する。
１１Ｃ標識化ＯＤＮの合成方法は、上記のヘキシルアミン化ＯＤＮ及びセンス鎖で形成された二重鎖を原料として、自動合成装置１０を用いて合成する。以下、このダブルストランド法について図５を参照して説明する。
【００４４】
二重鎖を形成しているヘキシルアミン化ＯＤＮを含む原料（例えば、０．５ｍｇ）に、１ｍｇのジメチルアミノピリジン及び２ｍＬのジクロロメタンを加えて充分に攪拌し、原料液を準備する。自動合成装置１０では、すべての電磁弁Ｖの閉弁が確認されると、ステップＳ２００において、マグネット３４が作用位置に配置されているか否かが判断される。エアシリンダ４０Ａがオンになってマグネット３４が移動し、位置決めセンサ４２によって確認されると判断は否定されて、ステップＳ２０２に移行する。
【００４５】
ステップＳ２０２では、反応容器１２が取り付け位置（退避位置）にあることが確認された後、反応容器１２、ジクロロメタン、注射用蒸留水、捕集バイアル２８及び廃液バイアル２６をセットアップする。また、図示しない湯漕３６の温度計から湯漕３６内の温度が制御部４４に入力され、図示しない加熱装置を制御して８０℃に設定する。
【００４６】
すべてのセットアップが完了すると、ステップＳ２０４において、１１Ｃ標識エチルケテン生成装置１８から反応容器１２へ１１Ｃエチルケテン化合物の投入が開始される。反応容器１２では、１１Ｃエチルケテンが、ＯＤＮのヘキシルアミンと反応して、二重鎖ＯＤＮの末端に１１Ｃが取り込まれる。
【００４７】
１１Ｃエチルケテンの投入が開始されると、ステップＳ２０６において、反応容器１２内の放射能の増加率が監視され、単位時間あたりの放射能の増加が認められなくなったか否かが判断される。放射能の増加率はＲＩモニタ３２により行われ、増加が認められなくなると、判断は肯定されてステップＳ２０８に移行し、１１Ｃエチルケテンの投入を完了する。
【００４８】
１１Ｃエチルケテンの投入が完了すると、ステップＳ２１０において、反応容器１２が作用位置に到達したか否かが判断される。エアシリンダ３０Ａがオンとなって反応容器１２が移動し、作用位置に到達すると判断は肯定されて、ステップＳ２１２に移行する。
【００４９】
ステップＳ２１２では、溶媒除去及び洗浄が実施される。このとき、反応容器１２とマグネット３４とが共に作用位置に配置されているので、ＯＤＮ末端の三酸化二鉄によって１１Ｃ標識化ＯＤＮが反応容器１２に吸着する。このため、反応容器１２内の溶媒が廃液バイアル２６に移動しても、１１Ｃ標識化ＯＤＮを反応容器１２内に維持することができる。なお、反応容器１２が作用位置に到達してから所定時間後（例えば１分後）に、廃液バイアル２６へ溶媒を移送し、次いでジクロロメタンによる洗浄を実施する。洗浄後のジクロロメタンは、廃液バイアル２６へ移送される。
【００５０】
溶媒除去及び洗浄が完了すると、ステップＳ２１４において、反応容器１２が退避位置に到達したか否かが判断される。エアシリンダ３０Ａがオフとなって反応容器１２が移動し、退避位置に到達すると判断は肯定されて、ステップＳ２１６に移行する。
【００５１】
ステップＳ２１６では、反応容器１２に蒸留水が所定時間、例えば５秒間投入される。なお、この退避位置では、反応容器１２には磁力が作用していないので、１１Ｃ標識化ＯＤＮは、反応容器１２から離れて、投入された蒸留水に懸濁する。
【００５２】
所定時間が経過して蒸留水の投入が完了すると、ステップＳ２１８において、湯漕３６が作用位置に配置されたか否かが判断される。エアシリンダ４０Ａがオフとなって、湯漕３６が移動し、作用位置に到達すると判断が肯定されて、ステップＳ２２０に移行する。
【００５３】
ステップＳ２２０では、反応容器１２が作用位置に到達したか否かが判断され、判断が肯定されるまで、エアシリンダ３０Ａがオンとなって反応容器１２の移動が継続される。このとき、反応容器１２の下方の作用位置には、８０℃の湯が充填された湯漕３６が配置されているので、反応容器１２が下方に移動すると、反応容器１２が湯漕３６中の８０℃の湯に浸かり、熱が加えられる。
【００５４】
反応容器１２が作用位置に到達して、判断が肯定されると、ステップＳ２２２において、８０℃の熱による変性処理が実施される。ここで図示しないタイマーが、反応容器１２が作用位置に到達した時点から所定時間、例えば１０分間を計測する。この間、１１Ｃ標識化ＯＤＮと三酸化二鉄結合センス鎖との二重鎖が熱により分離し、１１Ｃ標識化ＯＤＮは、単鎖となって反応容器１２内に浮遊する。
【００５５】
所定時間が経過して変性処理が完了すると、ステップＳ２２４において、反応容器１２が退避位置に到達したか否かが判断される。エアシリンダ３０Ａがオフとなって反応容器１２が上方へ移動すると、反応容器１２は湯漕３６から取り出され、退避位置に到達すると判断は肯定されてステップＳ２２６に移行する。
【００５６】
ステップＳ２２６では、マグネット３４が作用位置に到達したか否かが判断される。エアシリンダ４０Ａがオンとなってマグネット３４が移動し、位置決めセンサ４２がマグネット３４を検出すると、判断は肯定されてステップＳ２２８に移行する。
【００５７】
ステップＳ２２８では、反応容器１２が作用位置に到達したか否かが判断され、エアシリンダ３０Ａがオフとなって反応容器１２が移動して、作用位置に到達すると判断が肯定されてステップＳ２３０に移行する。
【００５８】
ステップＳ２３０では、１１Ｃ標識化ＯＤＮの採取が実施される。作用位置にはマグネット３４が配置しているので、反応容器１２に対して磁力が作用する。磁力が作用すると、三酸化二鉄結合センス鎖のみが磁力によって反応容器１２に吸着し、単鎖の１１Ｃ標識化ＯＤＮは反応容器１２中に浮遊する。１１Ｃ標識化ＯＤＮの精製は、所定時間、例えば１分間実施される。このとき、電磁弁Ｖ３が閉じられていることを確認した後に、所定時間、例えば３分間、電磁弁Ｖ９及びＶ２を開弁すると、反応容器１２にヘリウムが供給されて容器内の水溶液が、滅菌フィルタを通じて捕集バイアル２８に移送され、単鎖の１１Ｃ標識化ＯＤＮを含む１１Ｃ標識化ＯＤＮ水溶液を得ることができる。
【００５９】
これにより、１１Ｃ標識化ＯＤＮを効率よく連続的に合成することができ、安定して供給することができる。
また、得られた１１Ｃ標識化ＯＤＮは、半減期が短く被検体に対する負担を大幅に軽減することができる。従って、このようにして得られた１１Ｃ標識化ＯＤＮを使用すれば、生体内での放射線被曝に対する懸念を一層軽減させ、生体に対して無侵襲で標的ｍＲＮＡを感度よく画像化することができる。更に、使用後においても放射線量が早期に著しく低くなるので、廃液等の取り扱いの負担も同時に軽減することができる。
【００６０】
［第２の実施形態］
次に、本発明の第２の実施形態について、説明する。
第２の実施形態では、１１Ｃ標識化ＯＤＮを、二重鎖を用いないシングルストランド法によって合成するものである。なお、第１の実施形態で使用した自動合成装置１０をそのまま適用することができる。
【００６１】
シングルストランド法では、ヘキシルアミンの反応性に基づいて、核酸鎖の末端のアミノ基以外のアミノ基を保護することなく、１１Ｃ標識化核酸を合成する方法である（図７参照）。すなわち、ダブルストランド法と同様に、標的遺伝子ｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸断片の末端一級アミノ基に、直接１１Ｃケテン（エチルケテン）を反応させる。１１Ｃケテンは、一級アミンとの反応性が高く、特に、ヘキシルアミンが他の一級アミンよりも立体障害等で優位に１１Ｃケテンと反応するため、保護工程を特別設ける必要がない。
【００６２】
自動合成装置１０を用いてシングルストランド法により１１Ｃ標識化核酸を合成する場合には、ＯＤＮの場合にはヘキシルアミン化した後、ＰＮＡの場合には直接、反応容器１２に単鎖の状態で投入し、１１Ｃケテン化合物と接触させて、１１Ｃ標識化核酸を合成する。その後、１１Ｃ標識化核酸はすでに単鎖の状態であるので、マグネット３４及び湯漕３６を用いた分離・精製を行うことなく、捕集バイアル２８に回収する。
【００６３】
この方法によれば、二重鎖を形成させる必要がなく、合成工程を簡略化することができるため、短時間で１１Ｃ標識化核酸を合成することができる。
これにより、前記同様に、半減期が短く被検体に対する負担が大幅に軽減された１１Ｃ標識化ＯＤＮを、簡便に且つ連続して合成することができる。
従って、このようにして得られた１１Ｃ標識化ＯＤＮを使用すれば、前記同様に、生体内での放射線被曝に対する懸念を一層軽減させ、生体に対して無侵襲で標的ｍＲＮＡを感度よく画像化することができる。
【００６４】
本発明の実施の形態の自動合成装置１０では、反応容器１２とマグネット３４又は湯漕３６との相対位置の変更を、昇降機構３０及び移動機構４０の２つに移動手段によって行ったが、これに限定されない。例えば１つの移動手段によって行ってもよい。この場合には、反応容器１２を固定して、マグネット３４又は湯漕３６のみを移動する方法と、マグネット３４及び湯漕３６を固定して反応容器１２のみを移動する方法とが挙げられる。このように反応容器１２とマグネット３４又は湯漕３６の相対位置変更手段の数及び種類を変更することによって、装置全体の構成を状況に応じて適宜変更することができる。
【００６５】
また本発明の実施の形態の自動合成装置１０では、マグネット３４及び湯漕３６を用いて、１１Ｃ標識化核酸の分離・精製を行ったが、これに限定されない。磁力付与手段として反応容器１２内の内容物に対して磁力を付与することができれば、マグネット３４は永久磁石であっても電磁石であってもよい。また加温手段として反応容器１２内の内容物を加温できれば、電熱器等であってもよい。
【００６６】
本発明の標識化核酸は、１１Ｃに由来する放射線に基づいて画像化することができる用途に利用するものであるが、このような用途であれば、如何なるものにも適用することができる。例えば、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）の他に、通常のオートラジオグラムにおいても同様に用いることができる。また同様に、本発明の核酸画像化方法においても、１１Ｃ標識化核酸のガンマ線を感知し、これに基づいて画像化するものであれば、如何なる画像化手段であっても適用することができる。
【００６７】
本発明の標識化核酸を用いた画像化方法では、生体内における遺伝子レベルの異常を、被験者に対する少ない負担で把握することができる。例えばガン特有の遺伝子発現をＰＥＴで画像定量化することにより、そのガン特有の性質や活性度などの情報を得ることができる。また、この情報を元に遺伝子治療の計画や治療効果判定などを行うことができ、これらの治療において重要な役割を果たすと共に、今後の遺伝子治療の研究開発に大きく貢献することができる。
【００６８】
【実施例】
以下に、本発明の実施例について説明する。
［実施例１］
神経膠筋原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）のｍＲＮＡを標的ｍＲＮＡとし、この標的ｍＲＮＡに対して相補的な１１Ｃ標識化ＯＤＮ（以下、１１Ｃ標識化アンチセンスという）を作製した。１１Ｃ標識化アンチセンスは、本発明のダブルストランド法に従って合成した。対照物として、この１１Ｃ標識化アンチセンスに相補的な１１Ｃ標識化ＯＤＮ（以下、１１Ｃ標識化センスという）と、２０％ミスマッチの１１Ｃ標識化ＯＤＮ（以下、１１Ｃ標識化２０％ミスマッチアンチセンスという）も、同様にして作製した。
これを簡単に説明すれば、ＧＦＡＰ−ｍＲＮＡのアンチセンスであるヘキシルアミン化ＯＤＮと、Ｆｅ２Ｏ３結合センス鎖を１：２のモル比で接触させた。２０分間のインキュベート後に二重鎖を得て、これと１１Ｃエチルケテンとを反応させた後、８０℃変性及びマグネット３４による精製を経て、この二重鎖から単鎖の１１Ｃ標識化ＯＤＮを得た。収率は約１０〜１５％であった。
【００６９】
得られた１１Ｃ標識化ＯＤＮを、Ｃ６グリオーマを脳へ移植したラットの尾静脈から投与して、６０分後に脳を取り出した。この脳を６０μｍの凍結切片を作製して、オートラジオグラムを得た。結果を図６に示す。図６において、左欄はオートラジオグラム（ＡＲＧ）の像を示し、中央はヘマトキシリン染色（ＨＥ）像、右欄は抗ＧＦＡＰ抗体によるＧＦＡＰの免疫組織化学染色像を示している。
【００７０】
図６に示されるように、１１Ｃ標識化アンチセンスが、ＧＦＡＰ−ｍＲＮＡと特異的に二重鎖構造を形成して腫瘍部位に集積していることがわかる。これに対して１１Ｃ標識化センス及び１１Ｃ標識化２０％ミスマッチでは、共に腫瘍部位への放射能の集積が認められない。１１Ｃ標識化センスでは、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズできないためであり、１１Ｃ標識化２０％ミスマッチでは、標的ｍＲＮＡに対する特異性を失うためと考えられる。
【００７１】
従って、本発明による１１Ｃ標識化アンチセンスは、標的ｍＲＮＡと高度に特異的にハイブリダイズすることができ、標的ｍＲＮＡの所在を感度よく画像化することができる。
これにより、本発明の１１Ｃ標識化アンチセンスを、ＰＥＴなどの画像表示装置に用いることによって、非侵襲性で感度よく標的ｍＲＮＡの発現を検出することができる。
【００７２】
［実施例２］
テロメラーゼに関連したｍＲＮＡを標的ｍＲＮＡとして、シングルストランド法によって、テロメラーゼｍＲＮＡを標的ｍＲＮＡとする１１Ｃ標的化ＰＮＡアンチセンス（親和性が異なる２種類、ＰＮＡ（ＸＩＩ）、（ＶＩ）、図７上段）と、テロメラーゼ逆転者酵素ｍＲＮＡを標的ｍＲＮＡとする１１Ｃ標的化ＯＤＮ（図７中段）を、シングルストランド法とした以外は実施例１と同様にして作製した。なお、収率は約１５％であった。各核酸の作製は、シングルストランド法に基づいており、各ＰＮＡ及びＯＤＮに対して直接１１Ｃ標識を結合させるので、ダブルストランド法よりも簡便な工程とすることができる（図７下段）。なお対照物として、実施例１と同様に、センス及び２０％ミスマッチも作製した。
【００７３】
シングルストランド法によって合成されたＰＮＡについて、１１Ｃ標識化の前後で質量分析を行った。結果を図８に示す。質量分析した結果、ＰＮＡの質量は、ＰＮＡの終端のアミンがアシル化した分子量だけ増加していた。これ結果から、シングルストランド法がダブルストランド法と同様に１１Ｃ標識化を行うことができることが明らかとなった。
【００７４】
この合成方法により得られた１１Ｃ標識化ＰＮＡアンチセンス及び１１Ｃ標識化ＯＤＮアンチセンスを、ヒト胃ガン由来細胞（Ａ−５４９）を移植したヌードマウス（図９）又はヒトグリオブラストーマ由来細胞（Ｕ−２５１）を移植したヌードマウス（図１０）にそれぞれ投与した。このようなヌードマウスでは、腫瘍細胞によって高いテロメラーゼ活性を示すことが知られている。投与後４０分に、それぞれの脳を取り出した後、６０μｍの凍結切片を作製し、オートラジオグラムを得た。結果を図９及び１０に示す。
【００７５】
これらの結果はいずれも、１１Ｃ標識化アンチセンスは、１１Ｃ標識化センスと比較して約２０％取り込みが高く、配列特異性が高いことを示している。
【００７６】
従って、本発明による１１Ｃ標識化アンチセンスは、標的ｍＲＮＡと高度に特異的にハイブリダイズすることができ、標的ｍＲＮＡの所在を感度よく画像化することができる。これにより、本発明の１１Ｃ標識化アンチセンスを、ＰＥＴなどの画像表示装置に用いることによって、非侵襲性で感度よく標的ｍＲＮＡの発現を検出することができる。
【００７７】
【発明の効果】
本発明によれば、生体に対して無侵襲でｍＲＮＡを画像化可能にすると共に、生体内での放射線被曝に対する懸念を一層軽減させて核酸を検出するために適切な標識化核酸の製造方法及びその合成装置並びに画像化方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態にかかる自動合成装置の構成図である。
【図２】本発明の実施形態にかかる自動合成装置のシステム構成図である。
【図３】本発明の実施形態にかかるＯＤＮ前処理を説明する概念図である。
【図４】本発明の実施形態にかかるＯＤＮ前処理を説明するフローチャートである。
【図５】本発明の実施形態にかかるダブルストランド法を説明するフローチャートである。
【図６】本発明の実施例にかかる１１Ｃ標的化ＯＤＮによるラット脳のオートラジオグラムである。
【図７】本発明の実施例にかかるシングルストランド法による１１Ｃ標的化ＰＮＡの図である。
【図８】本発明の実施例にかかる１１Ｃ標的化ＰＮＡの質量分析の結果を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例にかかる１１Ｃ標的化ＰＮＡを用いたマウス脳のオートラジオグラムである。
【図１０】本発明の実施例にかかる１１Ｃ標的化ＯＤＮを用いたマウス脳のオートラジオグラムである。
【符号の説明】
１０　　１１Ｃオリゴヌクレオチド自動合成装置（標識化核酸合成装置）
１２　　反応容器（反応部）
１８　　１１Ｃ標識エチルケテン生成装置（１１Ｃ化合物収容部）
３０　　昇降機構（位置変更手段）
３４　　マグネット（磁力付与手段）
３６　　湯漕（加温手段）
４０　　移動機構（位置変更手段）
【図１】
2004123542.tif 000003
【図２】
2004123542.tif 000004
【図３】
2004123542.tif 000005
【図４】
2004123542.tif 000006
【図５】
2004123542.tif 000007
【図６】
2004123542.tif 000008
【図７】
2004123542.tif 000009
【図８】
2004123542.tif 000010
【図９】
2004123542.tif 000011
【図１０】
2004123542.tif 000012