(57)【要約】【課題】  二重結合を有する脂質、並びに脂肪酸又はそれらの誘導体の製造に有用なデサチュラーゼ、及びそれをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターによって形質転換された微生物を提供する。【解決手段】  以下の（a）又は（b）のDNAからなるデサチュラーゼ遺伝子：（a）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、（b）（a）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）又は（b）のDNAからなるデサチュラーゼ遺伝子：
（a）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（b）（a）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
以下の（a）又は（b）のDNAからなるデサチュラーゼ遺伝子：
（a）配列番号３又は４で示される塩基配列からなるDNA、
（b）（a）のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項３】
以下の（a）又は（b）のタンパク質：
（a）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）（a）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１又は２記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５及び６記載の形質転換体を培養することを特徴とするデサチュラーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デサチュラーゼ遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
不飽和脂肪酸又はその誘導体は、香料、薬剤、塗料、界面活性剤、化粧品等として、或いはこれらの合成原料として広く使用されている。最近では、不飽和化した脂質、及び脂肪酸が様々な生理作用を有することが明らかとなりつつあり、医薬品のみならず、食品にまで登場している。特に不飽和脂肪酸の中でもシス−６−ヘキサデセン酸は、ヒト皮膚最外層のバリアーを構成する皮脂の主要成分であり、シス−６−ヘキサデセン酸を含む皮脂由来の脂肪酸誘導体が、抗菌活性を有することも報告されており（特許文献１参照）、有用性が高い素材と言える。
【０００３】
斯かるシス−６−ヘキサデセン酸又はその誘導体は、化学合成、ヤハズカズラやオオハンゴソウ等の植物からの抽出、或いは微生物を利用する方法により製造できることが知られており、このうち微生物を利用する製造方法は、他の方法と比較して安価且つ簡便に生産が可能であるという利点があり、特にロドコッカス（Rhodococcus）属細菌を用いた方法（特許文献２、特許文献３参照）は、不飽和脂肪酸又はその誘導体が菌体外に生産されることから好ましい方法である。
しかしながら、微生物を培養することにより不飽和脂肪酸を得る方法では、目的とする不飽和脂肪酸を大量に生産することは容易ではない。
【０００４】
一方、上記微生物が産生し、不飽和脂肪酸合成に関与する酵素と考えられるデサチュラーゼ（例えばΔ６−デサチュラーゼ等）をコードする遺伝子を取得できれば、当該酵素の大量生産や微生物における当該酵素の発現量や活性、当該酵素によって変換される不飽和脂肪酸の生産量、並びに遺伝子の改変による生成不飽和脂肪酸の種類を変化させることが可能であると考えられる。
【０００５】
デサチュラーゼは、酵素の存在様式として２つのタイプに大別される。１つは可溶性のデサチュラーゼであり、もう１つは膜結合性のデサチュラーゼである。
可溶性のデサチュラーゼは植物に存在しており、酵素の単離・精製もベニバナの種子（非特許文献１参照）やアボカドの中果皮（非特許文献２参照）等から行われている。また、可溶性のデサチュラーゼに関しては、酵素の結晶構造が明らかとなっているものも存在（非特許文献３参照）し、研究として進展を見せている。
【０００６】
一方、現在までに知られている膜結合性のデサチュラーゼは、特に鉄に配位すると考えられ、ヒスチジンに富んだ領域であるヒスチジンボックス（例えば、HXXXH、HXXXXH、HXXHH、HXXXHH等）を有しており、精製過程で失活し易く、精製が困難である。従って、酵素を単離、精製し、N又はC端配列の解析をし、プライマーを設定して、遺伝子断片を取得し、ハイブリダイゼーション又はインバースPCRを行って完全長遺伝子を取得するという従来の遺伝子取得法を用いることができない。これまでにヒスチジンボックスを有するΔ６−デサチュラーゼについては、細菌から単離されたという報告はなく、更にロドコッカス属細菌について云えば、デサチュラーゼ遺伝子が単離されたという報告すらない。
【特許文献１】特表２００１−５０２３３７号公報
【特許文献２】特公平２−６５１６号公報
【特許文献３】特公平４−１２７１８号公報
【非特許文献１】Thomas A. McKeon and Paul K. Stumpf., J. Biol. Chem., 257, 12141-12147(1982)
【非特許文献２】John Shanklin and Chris Somerville, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2510-2514(1991)
【非特許文献３】Ylva Lindqvist, Weijun Huang, Gunter Schneider and John Shanklin, EMBO J., 15, 4081-4092(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、特にシス−６−ヘキサデセン酸又はその誘導体の製造に有用なデサチュラーゼ及びそれをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターによって形質転換された微生物、並びに該形質転換微生物を培養することにより得られるデサチュラーゼの製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、現在までに報告されたデサチュラーゼ遺伝子の配列を網羅的に解析することにより、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌の染色体DNAから、デサチュラーゼをコードする遺伝子のクローニングに成功し、斯かる遺伝子を含有する発現ベクターで微生物を形質転換して得られた形質転換体を培養すれば、デサチュラーゼを効率よく製造でき、且つ二重結合が導入された脂肪酸、特にΔ６位にシス二重結合が導入された脂肪酸を大量に製造できることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の（a）又は（b）のDNAからなるデサチュラーゼ遺伝子：
（a）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（b）（a）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、以下の（a）又は（b）のDNAからなるデサチュラーゼ遺伝子：
（a）配列番号３又は４の塩基配列で示されるDNA、
（b）（a）の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA、を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、以下の（a）又は（b）のタンパク質：
（a）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（b）（a）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質、を提供するものである。
【００１２】
更に本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、並びに該形質転換体を培養することを特徴とするデサチュラーゼの製造法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のデサチュラーゼ遺伝子は、Δ６−デサチュラーゼに代表されるデサチュラーゼの大量生産や、微生物におけるデサチュラーゼの発現量や活性を変化させる技術に利用可能であり、且つ特にシス６位に二重結合を有する脂質、並びに脂肪酸又はそれらの誘導体の製造、中でもシス−６−ヘキサデセン酸又はその誘導体の製造に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のデサチュラーゼとは、脂肪酸又はその誘導体に二重結合を導入する酵素を意味し、具体的にはΔ４、Δ５、Δ６、Δ９、Δ１２、Δ１５、Δ１７等が挙げられるが、中でもΔ６位（カルボキシル末端から６番目の炭素と７番目の炭素間）にシス二重結合を導入するΔ６−デサチュラーゼが好ましい。
ここで、脂肪酸としては例えば炭素数１〜２２、好ましくは１４〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられ、その誘導体としては当該脂肪酸のアルキル（炭素数１〜１０、好ましくは２〜４）若しくはアリールエステル、第１級若しくは２級アンモニウム塩又はアルカリ金属塩が挙げられ、このうち、n−ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、n−テトラデカン酸（ミリスチン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）これら脂肪酸のメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソブチル、tert−ブチル等の各エステル、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等が好ましい。
本発明のデサチュラーゼは、n−ヘキサデカン酸又はその誘導体からシス−６−ヘキサデセン酸又はその誘導体を得るための酵素として特に有用である。
【００１５】
本発明のデサチュラーゼ遺伝子は、（a）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、又は（b）（a）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAである。
【００１６】
ここで、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてデサチュラーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
これらのアミノ酸の欠失、置換、付加の程度は、もとのアミノ酸配列との相同性が５５％以上のものであれば許容しうる範囲内であり、従って、本発明の遺伝子は、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と６５％以上、好ましくは７５％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを包含するものである。斯かるDNAとしては、例えばその構造的特徴および遺伝子発現パターンの共通性、並びにその生物学的活性の類似性より、一つの遺伝子ファミリーに属すると認識される一連の関連遺伝子が挙げられる。
【００１７】
尚、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Mutan-super-Express Km キット(TaKaRa)]等を用いて変異を導入すればよい。
【００１８】
また、相同性の検索は、例えばGENETYX-WIN（ソフトウェア開発）のサーチホモロジープログラムやマキシマムマッチング法並びweb上にてBasic Local Alignment Search Tool（BLAST）及びSequence Similarity Search（FASTA）を用いて行うことができる。
【００１９】
本発明のデサチュラーゼ遺伝子は、更に、（a）配列番号３又は４の塩基配列で示されるDNA、（b）（a）の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子が好ましい。
【００２０】
すなわち、本発明の遺伝子には、配列番号３又は４の塩基配列で示されるDNAにおいて、変異剤処理、ランダム変異、特定部位突然変異、欠損あるいは挿入などによって部分的に塩基配列が変化したものであっても、これらのDNA変異体が配列番号３又は４の塩基配列で示されるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを包含するものである。
【００２１】
このようなDNA変異体としては、自然に生じる変換体の他、変異剤またはPCRを利用したランダム変異、特定部位変異誘発、エンドヌクレアーゼ若しくは制限酵素などによるDNA断片の変異、欠失、連結等の人為的手段によって構築される変換体であってもよい。斯かるDNA変異体の変異の程度は、配列番号３又は４の塩基配列で示されるDNAにおける塩基配列と６３％以上の相同性を有するものであればほぼ許容しうる範囲内であり、従って、本発明の遺伝子は、配列番号３又は４で示される塩基配列と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを包含するものである。
【００２２】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M  塩化ナトリウム、０．０１５M  クエン酸ナトリウム、pH７．０）０．５％  SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２３】
本発明のタンパク質は、上記のデサチュラーゼ遺伝子がコードするものであり、具体的には、（a）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（b）（a）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つデサチュラーゼ活性を有するタンパク質である。
【００２４】
ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）  KSM−T６４５株のデサチュラーゼ遺伝子は、配列番号３及び配列番号４で示される塩基配列からなる２種類のDNA（遺伝子１及び遺伝子２）がタンデムに存在しており、いずれも構造遺伝子内部に鉄に配位すると考えられるヒスチジンボックスを３箇所有するという特徴を有する。
【００２５】
そして、遺伝子１は開始コドンから終始コドンまでが１２６０bpであり、これによりコードされるタンパク質１（配列番号１）は４２０アミノ酸より構成され、分子量４７９８５であると推定される。また、遺伝子２は開始コドンから終始コドンまでが１２３９bpであり、これによりコードされるタンパク質２（配列番号２）は、４１３アミノ酸より構成され、分子量４６９５１であると推定される。
【００２６】
本発明遺伝子を大腸菌内で発現させた場合、本発明遺伝子由来のタンパク質により、特にカルボキシル末端から数えて６番目の炭素と７番目の炭素間に二重結合を導入した炭素数１６個の不飽和脂肪酸であるシス−６−ヘキサデセン酸或いはシス−６−ヘキサデセン酸より構成される脂質を著量蓄積する。このことから、本発明遺伝子によって作られるタンパク質は、現在までに知られているヒスチジンボックスを有し、且つ不飽和脂肪酸を更に不飽和化する酵素とは相違する新規な酵素、すなわちヒスチジンボックスを有し、且つ飽和脂肪酸を不飽和化する酵素であると考えられる。
尚、FASTAによる相同性検索の結果から、遺伝子１はマイコバクテリウム（Mycobacterium）のリノレイル−Δ６−デサチュラーゼ（probable）の遺伝子と塩基配列において約５４％の相同性を示し、遺伝子２は同じくマイコバクテリウム（Mycobacterium）のリノレイル−Δ６−デサチュラーゼ（probable）と約６５％の相同性を示すものである。
【００２７】
本発明遺伝子のクローニングは、例えばロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）KSM−B−３M株（FERM  BP１５３１）や、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）KSM−T６４５株（FERM  P−１８１８２）等のロドコッカス（Rhodococcus）属細菌、好ましくは、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）KSM−T６４５株の染色体DNAから以下のようにして行うことができる。
【００２８】
すなわち、上記の菌体から、例えばマーマーの方法[Marmur, J., J. Mol. Biol., 3, 208(1961)]や斉藤と三浦の方法[Saito, H. and Miura, K., Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]により染色体DNAを得られるが、他の類似の方法を用いることもできる。得られた染色体DNAを各種制限酵素を用いて完全消化して各種のDNA断片を調製し、適当なプローブを用いてデサチュラーゼをコードするDNAを含むDNA断片をサザン・ハイブリダイゼーション等により検索し、デサチュラーゼをコードするDNAを含むと考えられるDNA断片を決定すればよい。
【００２９】
ここで用いるプローブとしては、本発明遺伝子の塩基配列に関する情報を基にして化学合成されたDNA断片等を用いることができ、また後記実施例で示すように、現在までに知られている数種のΔ6−デサチュラーゼ（Mortierella、Borago、Caenorhabditis等）のアライメントから、比較的相同性の高い領域であるヒスチジンボックス周辺の配列を基に設定されたセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて増幅されたPCR産物をスクリーニング用プローブとして用いることができる。斯かるプローブの塩基配列は、配列番号３又は４における対応する部分塩基配列であって、１００個〜７００個の連続した塩基配列を有するものを含んでいるのが好ましい。
【００３０】
本発明遺伝子の取得に際しては、PCR法［Mullis, K. B. and Faloona, F. A., Methods Enzymol., 155, 335(1987)；Saiki, R. K. et al., Science, 239, 487(1988)］によるDNA増幅法が好適に利用できる。斯かるPCR法の採用に際して使用されるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、常法に従って合成することができる。尚、増幅させたDNA断片の単離精製は、例えばゲル電気泳動法等により行うことができる。
【００３１】
増幅されたDNA断片は、例えばDNAリガーゼによってベクターへ結合させる方法等によりクローニングすることができ、In vitro cloningキット（TaKaRa社）等の市販のクローニングキットを用いてクローニングしてもよい。クローニングされたDNA断片の塩基配列の確認は、蛍光プライマーを用いるジデオキシ法により行うことができ、簡便には、市販のシークエンスキット等を用いてその塩基配列を決定すればよい。
【００３２】
以上に述べた本発明遺伝子を適当なベクターに導入して発現用の組換えベクターを構築し、このベクターで微生物を形質転換し、得られる形質転換体を培養することにより、その培養物からデサチュラーゼ又はデサチュラーゼ活性を有するタンパク質を製造することができる。ここで用いられる適当なベクターとしては、宿主菌中で複製可能であり、組み込んだ当該遺伝子を安定に保持できるものであれば、いかなるものも使用することができる。例えば、pET（Novagen社）、pGEX（Amersham Biosciences社）、pCAL（Toyobo社）、pBAD（Invitrogen社）、pPRO(Clontech社），pQE(Qiagen社)、pMAL（Biolabs社）などの大腸菌での発現用プラスミドが挙げられる。これら以外にも、バチルス（Bacillus）属などの原核細胞、あるいは酵母、動物細胞などの真核細胞中での発現用に用いられる通常の発現用ベクターを用いることができる。
【００３３】
ベクターを制限酵素で切断し、上記の染色体DNA断片と結合させ、組換えプラスミドDNA分子を作成するが、結合の方法としては、例えばDNAリガーゼによって結合させる方法等が挙げられる。このように調製されたデサチュラーゼ若しくはその活性を有するタンパク質をコードするDNAが導入された組換えベクターとしては、例えばpET−Rdes１、pET−Rdes２等が挙げられる。これらの組換えベクター又は宿主に適するように改変したベクターで原核細胞、真核細胞などの微生物を塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法、コンピテントセル法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等の通常の方法で形質転換し、得られる形質転換体を培養することによりデサチュラーゼ又はその活性を有するタンパク質を得ることができる。且つ、発現されたデサチュラーゼ又はデサチュラーゼ活性を有するタンパク質により不飽和結合を有する脂肪酸並びにその誘導体が合成できる。
【００３４】
組換え微生物が保持する組換えDNA分子は通常のプラスミド調製法あるいはファージDNA調製法を用いて抽出でき、更に各種制限酵素による切断パターンを電気泳動等によって解析することにより、組換えDNA分子がベクターDNA分子とデサチュラーゼ遺伝子を含むDNA断片が結合したものであることを確認できる。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明する。
実施例１  ゲノムDNAからのクローニング
（１）ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）KSM-T６４５株のゲノムDNA抽出
ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.） KSM-T６４５株（P−１８１８２）をLB培地（Tryptone Peptone １％、Yeast Extract０．５％、NaCl１％）を用いて、約２３時間、３０℃、２１０rpmにて対数増殖期後期まで培養した。遠心分離（１２０００rpm、１０分間）により菌体を回収し、Genとるくん（TaKaRa社）にてゲノムDNAを得た。得られたゲノムDNAに対して、RNase処理、フェノール・クロロホルム処理による除タンパク操作を行った後、エタノール・酢酸ナトリウムにてDNAを沈殿させ、７０％エタノールによる洗浄、遠心式エバポレーターにて風乾後、TE緩衝液（pH８）（１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）＋１mM  EDTA）に溶解してゲノムDNA標品を得た。
【００３６】
（２）PCR（ポリメラーゼチェインリアクション）
現在までに知られている数種のΔ6−デサチュラーゼ（Mortierella、Borago、Caenorhabditis等）のアライメントから、比較的相同性の高い領域として知られているヒスチジンボックス周辺の配列を基にセンスプライマーとアンチセンスプライマーを作製し、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）KSM-T６４５株のゲノムDNAを鋳型としてディジェネレイティッドプライマー及びネスティドプライマーを利用したPCRを行った。PCRにはPCR master（Roche社）を使用した。作製した合成オリゴヌクレオチドプライマーは次の通りであった。
【００３７】
センスプライマー：
（１）YTGGTGGAAGGRYAABCAYAA（２１mer；配列番号５）
（２）CAYAAYNMDCAYCAY（１５mer；配列番号６）
アンチセンスプライマー：
（１）RGGGAAVARRTGGTG（１５mer、配列番号７）
（２）GTGGTGCTCRATCTGGWARTT（２１mer、配列番号８）
ここで、Y、R、B、N、M、D、V、WはそれぞれY；C／T、R；A／G、B；C／G／T、N；A／C／G／T、M；A／C、D；A／G／T、V；A／C／G、W；A／Tからなる混合塩基を示す。
【００３８】
PCR実施条件；
ゲノムDNA（５０ng／μL）  ５μL、センスプライマー（５０pmol／μL）  ０．５μL、アンチセンスプライマー（５０pmol／μL）  ０．５μL 、PCR Master mix  ２５μL、滅菌水１９μL  総容量５０μL
［９４℃−１分、５５℃−２分、７２℃−３分：３０サイクル］
【００３９】
（３）増幅断片のクローニング
増幅されたPCR産物をpT7Blue-T vector（Novagen社）にクローニングし、E.coli JM１０９ Competent Cells（TaKaRa社）に形質転換後、IPTG（イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド）及びX−Gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−D−ガラクトシド）を含有する寒天培地にてBlue−WhiteカラーセレクションによるPCR産物の導入された形質転換体の選抜及びコロニーPCRによる挿入断片の確認を行った。コロニーPCRにはPCR masterを使用した。
【００４０】
（４）塩基配列の決定
取得された形質転換株をAmpicillin（５０μg／mL）含有LB培地２mLを用いて３７℃、１６０rpmにて一昼夜培養した。培養液からPlasmid Isolation kit（Roche社）により、プラスミドを得た。取得したプラスミドを利用して挿入断片の塩基配列を決定したところ、１つは５６５bpのDNA断片であり、その推定されるアミノ酸配列がFASTAによる相同性検索の結果、マイコバクテリウム（Mycobacterium）のリノレイル−Δ６−デサチュラーゼ（probable）と約５０％、もう１つは５５９ｂｐのＤＮＡ断片であり、その推定されるアミノ酸配列が同様にマイコバクテリウム（Mycobacterium）のリノレイル−Δ６−デサチュラーゼ（probable）と約６３％のそれぞれ相同性を示した。
【００４１】
（５）インバースPCRによる完全長Δ６−デサチュラーゼ遺伝子の取得  
ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.） KSM-T６４５株のゲノムDNAを制限酵素BamHＩ、PstＩ、SphＩにてそれぞれ処理し、DNA Ligation kit ver.１（TaKaRa社）を利用して１６℃にて一昼夜自己閉環反応を行った。得られた環状DNAを鋳型として、取得されたDNA断片の配列情報より構築したネスティドプライマーを利用してインバースPCRを行った。インバースPCRにはTaKaRa LA Taq（TaKaRa社）又はTaKaRa Ex Taq（TaKaRa社）を使用した。増幅されたＤＮＡ断片は、直接塩基配列決定に供するか、一端pT７Blue-T vectorにクローニングした後に塩基配列決定に供した。
【００４２】
（６）ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.） KSM-T６４５株のΔ６−デサチュラーゼ遺伝子の解析  
ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）KSM-T６４５株のΔ６−デサチュラーゼ遺伝子は、遺伝子１（配列番号３）及び遺伝子２（配列番号４）の２種類がタンデムに存在していた。遺伝子１は予想される開始コドンから終始コドンまでが１２６０bpであり、これによりコードされるタンパク質１（配列番号１）は４２０アミノ酸より構成され、分子量４７９８５であると推定された。また、遺伝子２は予想される開始コドンから終始コドンまでが１２３９bpであり、これによりコードされるタンパク質２（配列番号２）は、４１３アミノ酸より構成され、分子量４６９５１であると推定された。遺伝子１はＦFASTAによる相同性検索の結果、マイコバクテリウム（Mycobacterium）のリノレイル−Δ６−デサチュラーゼ（probable）の遺伝子と塩基配列において約５４％の相同性を示し、遺伝子２は同じくマイコバクテリウム（Mycobacterium）のリノレイル−Δ６−デサチュラーゼ（probable）と約６５％の相同性を示した。
【００４３】
実施例２  大腸菌でのΔ６−デサチュラーゼの発現
（１）発現ベクターの構築
ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.） KSM-T６４５株のゲノムDNAを鋳型とし、配列１及び配列２の領域を下記の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCRを行った。PCRにはPyrobest DNA Polymerase（TaKaRa社）を使用した。
【００４４】
センスプライマー：
（１）ATTATCTAGAATAAGGAGATATACCGTGGCCATCACCGATATCAAAGAGTT（５１mer、配列番号９）
（２）ATTATCTAGAATAAGGAGATATACCATGGCCATCACCGATATCAAAGAGTT（５１mer、配列番号１０）
アンチセンスプライマー：
（１）ATTACTCGAGTTATCACTTCCGGCGCTTCGGCAT（３４mer、配列番号１１）
センスプライマー：
（１）ATTACCATGGCGATTGCAGATGTCAAGGAA（３０mer、配列番号１２）
アンチセンスプライマー：
（１）ATTTGCTCAGCGCAGGCCGAGGAGGCT（２７mer、配列番号１３）
（２）ATTAGCTCAGCTTACGTGCGATGGCGCTCTTGA（３３mer、配列番号１４）
【００４５】
PCR実施条件；
ゲノムDNA（５０ng／μL）  １μL、センスプライマー（１００pmol／μL）  ０．５μL、アンチセンスプライマー（１００pmol／μL）  ０．５μL 、１０X Pyrobest Buffer II  １０μL、dNTP Mixture（２．５mM each）  ８μL、Pyrobest DNA Polymerase（５units／μL）  ０．５μL、滅菌水７９．５μL  総容量１００μL
［９５℃−１分、６４℃−１分、７２℃−２分：３５サイクル］
【００４６】
得られた増幅DNA断片を遺伝子１に関してはXhoＩ及びXbaＩにて、遺伝子２に関してはNcoＩ及びBpu１１０２Ｉにてそれぞれ処理した。pET System pET-１５b Vector（Novagen社）の遺伝子1に関してはXhoＩ及びXbaＩサイト、遺伝子２に関してはNcoＩ及びBpu１１０２Ｉサイトにそれぞれ挿入し、発現プラスミドを構築した。この発現プラスミドをそれぞれpET−Rdes１、pET−Rdes２と命名した（図１参照）。構築した発現プラスミドをT７  RNAポリメラーゼを含まない大腸菌であるE.coli HB１０１ Competent Cells（TaKaRa社）に形質転換した。コロニーPCRにより目的とする遺伝子断片を有する形質転換体を取得した後、形質転換体より目的タンパク質を発現させる為の発現プラスミドを調製した。
【００４７】
（２）形質転換体の作製
発現プラスミドをT７  RNAポリメラーゼ発現系を有するE.coli BL２１（DE３）（Novagen社）に形質転換し、Ampicillin５０（μg／mL）を含有するLB寒天培地にて目的とする発現プラスミドを有する形質転換体を取得した。
【００４８】
（３）タンパク質の発現
発現プラスミドを保持した形質転換体を、Ampicillin５０（μg／mL）を含有するLB培地２mL、３７℃、１６０rpmにて一昼夜培養した。培養液５００μLをAmpicillin５０（μg/／mL）を含有するLB培地４．５mLに添加し、更に３７℃にて１時間培養を行った。終濃度１mMとなるように１００mM  IPTGを５０μL添加した後、同条件にて発現タンパク質の誘導の為に３時間培養を継続した。遠心分離（１２０００rpm、１０分間）にて菌体を回収し、５００μLのソニケーション用緩衝液（pH８）（５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）+ ５０mM NaCl +１ｍM  EDTA+１mM DTT）に懸濁した。得られた懸濁液を氷冷下にてソニケーションした後、遠心分離（１２０００rpm、１０分間）により無細胞抽出液を得た。その一部をSDS−PAGEに供し、IPTG未誘導時の無細胞抽出液のタンパク質と比較した。その結果、未誘導時に比較して誘導時において、遺伝子１を配列番号９及び１１によって調製した場合は分子量約４５０００、配列番号１０及び１１によって調製した場合にも分子量約４５０００、遺伝子２を配列番号１２及び１３によって調製した場合は分子量約４５０００、配列番号１２及び１４によって調製した場合は分子量約４３０００のタンパク質が顕著に増加していた（図２、図３参照）。
【００４９】
実施例３  形質転換体の脂肪酸組成の比較
（１）BL２１（DE３）形質転換体の大量調製（１）
配列番号９及び１１、配列番号１２及び１３にて構築した発現プラスミドを有する形質転換体の培養は、以下の様に行った。
Ampicillin５０（μg／mL）を含有するLB培地１００mLを添加した５００mL容坂口フラスコにて、BL２１（DE３）形質転換体を一昼夜、３７℃、１６０rpmにて培養した。培養液３０mLをAmpicillin５０（μg／mL）を含有するLB培地２７０mLを添加した２L容三角フラスコに植菌し、１時間、３７℃、２１０rpmにて培養した。終濃度１mMとなるように１００mM  IPTGを添加した後、同条件にて発現タンパク質の発現の為に４〜７時間培養を継続した。遠心分離（１２０００rpm、１０分間）にて菌体を回収した後、滅菌生理食塩水にて２回菌体を洗浄し、遠心分離（１２０００rpm、１０分間）にて洗浄菌体を回収した。
【００５０】
（２）BL２１（DE３）形質転換体の大量調製（２）
配列番号１０及び１１、配列番号１２及び１３、配列番号１２及び１４にて構築した発現プラスミドを有する形質転換体の培養は、以下の様に行った。
Ampicillin５０（μg／mL）を含有するLB培地３００mLを添加した２L容三角フラスコにて、BL２１（DE３）形質転換体を１５時間、３０℃、２１０rpmにて培養した。終濃度１mMとなるように１００mM  IPTGを添加した後、同条件にて発現タンパク質の発現の為に３．５〜４．５時間培養を継続した。遠心分離（１２０００rpm、１０分間）にて菌体を回収した後、滅菌生理食塩水にて２回菌体を洗浄し、遠心分離（１２０００rpm、１０分間）にて洗浄菌体を回収した。
【００５１】
（３）アルカリ加水分解
３口フラスコを使用し、１gの湿菌体に対して、２５％（v/v）メタノールに１５％（w/v）となるように水酸化カリウムを溶解した溶液を２０mL添加した。窒素ガスにて内部の空気を４回置換した後、７０℃にて４〜６．５時間反応を行った。反応後、６N硫酸を徐々に添加してpHを約２に調整した。
【００５２】
（４）溶媒抽出
pH２に調整した反応液に対して２倍量のヘキサンを添加し抽出した。この操作を４回繰り返した。ヘキサン抽出画分を遠心エバポレーターにて濃縮し、メチル化後、ガスクロマトグラフィー及びガスクロマトグラフィー／マススペクトルにて分析を行った。
【００５３】
（５）脂肪酸組成の比較
遺伝子１がコードするタンパク質を発現させたBL２１（DE３）及び遺伝子２がコードするタンパク質を発現させたBL２１（DE３）の両形質転換体から抽出した脂肪酸の組成をベクターだけを形質転換したBL２１（DE３）から調製した脂肪酸の組成と比較した。その結果、ベクターだけを形質転換したBL２１（DE３）（実施例３（２）にて調製）では、痕跡程度認められるシス−６−ヘキサデセン酸が配列番号９及び１１にて調製した遺伝子１を発現させた場合（実施例３（１）にて調製）では約１．９倍に、配列番号１０及び１１にて調製した遺伝子１を発現させた場合（実施例３（２）にて調製）では約６倍に、又配列番号１２及び１３にて調製した遺伝子２を発現させた場合（実施例３（１）にて大量調製）では約３．６倍に、配列番号１２及び１３にて調製した遺伝子２を発現させた場合（実施例３（２）にて調製）では約２．３倍に、配列番号１２及び１４にて調製した遺伝子２を発現させた場合（実施例３（２）にて調製）では約５１倍に顕著に増加していた（表１）。
【００５４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は発現プラスミドの構築図である。
【図２】図２は、配列番号９及び１１、配列番号１０及び１１によって構築したpET-Rdes１をE.coli  BL２１（DE３)に導入した際のIPTGによる未誘導時及び誘導時におけるタンパク質の発現状態の相違を示す図である。
【図３】図３は、配列番号１２及び１３、配列番号１２及び１４によって構築したpET-Rdes２をE.coli  BL２１（DE３)に導入した際のIPTGによる未誘導時及び誘導時におけるタンパク質の発現状態の相違を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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