(57)【要約】　　　（修正有）【課題】植物細胞の活性を低下させる薬剤を用いずに目的遺伝子導入組織を選抜することができ、しかも、その選抜効率が改善された、遺伝子組換え植物の効率的作成方法と、この方法に用いるベクターを提供する。【解決手段】目的遺伝子、及び、選抜マーカー遺伝子としてオーキシン前駆体からオーキシンを合成する酵素の遺伝子を含む、植物への遺伝子導入用ベクターを植物細胞に導入し、このベクターにより遺伝子導入された植物細胞を、上記オーキシン前駆体及び／又はその類縁物質の存在下で培養して再分化組織を生成させ、この再分化組織を選抜して植物個体を再生する。例えば、オーキシン前駆体からオーキシンを合成する酵素の遺伝子としてｉａａＨ（ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）遺伝子、オーキシン前駆体等としてインドールアセトアミド又はナフタレン酢酸アミドを使用することができる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え植物を作成する方法であって、次の過程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）からなることを特徴とする方法。
（Ａ）目的遺伝子、及び、選抜マーカー遺伝子としてオーキシン前駆体からオーキシンを合成する酵素の遺伝子を含む、植物への遺伝子導入用ベクターを植物細胞に導入する過程
（Ｂ）　このベクターにより遺伝子導入された植物細胞を、上記オーキシン前駆体及び／又はその類縁物質の存在下で培養して再分化組織を生成させ、この再分化組織を検出して選抜する過程
（Ｃ）　前記（Ｂ）で選抜した再分化組織を培養して植物個体を再生する過程
【請求項２】
オーキシン前駆体及び／又はその類縁物質として、インドールアセトアミド及び／又はナフタレン酢酸アミド、オーキシン前駆体からオーキシンを合成する遺伝子として、ｉａａＨ（ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）遺伝子である遺伝子導入用ベクターを用いて行う、請求項１に記載の遺伝子組換え植物の作成方法。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子導入用ベクターの選抜マーカー遺伝子として、オーキシン前駆体からオーキシンを合成する遺伝子と共に、サイトカイニン合成遺伝子を更に含むものを用いて行う、請求項１又は２に記載の遺伝子組換え植物の作成方法。
【請求項４】
サイトカイニン合成遺伝子がｉｐｔ（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子である、請求項３に記載の遺伝子組換え植物の作成方法。
【請求項５】
目的遺伝子、選抜マーカー遺伝子としてｉａａＨ（ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）遺伝子及びｉｐｔ（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子を含み、かつ、ｉａａＭ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子を含まない、植物への遺伝子導入用ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、遺伝子工学的手法を用いて効率的に遺伝子組換え植物を作成する方法、及び、その方法に用いるベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
目的遺伝子を対象植物に導入し、遺伝子組換え植物を作成するには、（１）目的遺伝子の植物細胞への導入、（２）目的遺伝子が導入された細胞のみからなる植物組織（目的遺伝子導入組織）の選抜、（３）選抜された植物組織からの植物体の再生、の３段階を必ず経ることになる。このうち目的遺伝子導入組織の選抜にあたっては、一般に、細胞培養の段階で、目的遺伝子の発現のみを指標としてかかる組織を選抜することは容易ではないため、目的遺伝子は、その発現が容易に検出できる選抜マーカー遺伝子と共に植物細胞に導入され、目的遺伝子導入組織は、この選抜マーカー遺伝子の発現の有無によって選抜される。このような選抜マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性を付与するカナマイシン抵抗性遺伝子（ＮＰＴＩＩ：ネオマイシンリン酸化酵素遺伝子）やハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ＨＰＴ：ハイグロマイシンリン酸化酵素遺伝子）、農薬耐性を付与するスルフォニルウレア系抵抗性遺伝子（ＡＬＳ：アセトラクテート合成酵素遺伝子）等、薬剤耐性に関与する遺伝子が実用的に多く用いられている。
【０００３】
薬剤耐性に関与する遺伝子を選抜マーカー遺伝子として用いた場合には、これらの薬剤を含む培地で、遺伝子導入処理後の細胞を培養して選抜マーカー遺伝子の発現の有無、つまりはかかる薬剤に対する耐性を評価し、これを指標として選抜を行うこととなる。これらの薬剤は、もともと植物細胞に対し毒性を有しているため、選抜マーカー遺伝子（ひいては目的遺伝子）が導入されていない植物細胞は、かかる培地で培養を行うことにより枯死するからである。しかし、この場合において耐性がある、即ちかかる薬剤の存在下で植物細胞が増殖するといっても、これは程度の問題であり、このような薬剤の存在下での培養が、植物細胞にとって好ましからぬ影響を与えることは避け難く、現実に、植物細胞の活性低下に伴う目的遺伝子導入組織の増殖率や再分化率の低下等が問題となっている。
【０００４】
かかる問題を解決すべく、本願出願人は、先に特開平９−１５４５８０において、新規な植物への遺伝子導入用ベクター、及び、このベクターを用いて行う植物への遺伝子導入方法を提案した。このベクター及び方法を用いて植物への遺伝子導入を行えば、植物細胞の活性を低下させる薬剤を用いずに、遺伝子導入処理後の植物組織の形態変化のみを指標として、目的遺伝子導入組織を選抜することが可能となる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記した特開平９−１５４５８０に開示のベクター及び方法では、選抜マーカー遺伝子として植物ホルモン合成遺伝子等の形態異常誘導遺伝子を用いており、目的遺伝子導入組織は、遺伝子導入処理を行った組織から再分化する不定芽や不定根として得ることができる。しかし、こうして得られる不定芽や不定根の中には、目的遺伝子が導入されていないもの（以下、エスケープとも呼ぶ。）もかなり多く存在していた。これは、目的遺伝子と共に形態異常誘導遺伝子を導入した細胞中で産生される植物ホルモン等が、その周囲の細胞にも移行して影響を与え、その影響を受けた非遺伝子導入細胞からも形態異常を示す組織が分化・増殖してくるためであると考えられる。一般に遺伝子導入が難しいとされる植物においては、そもそも不定芽等の再分化率が悪い上に、このエスケープの存在のため目的遺伝子導入組織の選抜効率が非常に悪く、その向上が特に望まれていた。
【０００６】
本願発明は、かかる問題を解決すべくなされたものであり、植物細胞の活性を低下させる薬剤を用いずに目的遺伝子導入組織を選抜することができ、しかも、その選抜効率が改善された、遺伝子組換え植物の効率的作成方法と、この方法に用いるベクターを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは鋭意研究の結果、目的遺伝子が導入された細胞内で合成されるオーキシン量を人為的に調節することにより、上記目的が達成されることを見出し、本願発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本願発明は、遺伝子組換え植物を作成する方法であって、次の過程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）をからなる方法を提供する。
【０００９】
（Ａ）目的遺伝子、及び、選抜マーカー遺伝子としてオーキシン前駆体からオーキシンを合成する酵素の遺伝子（以下、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子という。）を含む、植物への遺伝子導入用ベクターを植物細胞に導入する過程
（Ｂ）　このベクターにより遺伝子導入された植物細胞を、上記オーキシン前駆体及び／又はその類縁物質の存在下で培養して再分化組織を生成させ、この再分化組織を検出して選抜する過程
（Ｃ）　前記（Ｂ）で選抜した再分化組織を培養して植物個体を再生する過程
【００１０】
また、本願発明は、目的遺伝子、選抜マーカー遺伝子としてｉａａＨ（ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）遺伝子及びｉｐｔ（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子を含み、かつ、ｉａａＭ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子を含まない、植物への遺伝子導入用ベクターをも提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本願請求項１〜４に記載の方法（以下、本願発明の方法という。）は、選抜マーカー遺伝子として、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子を用いる。オーキシンとは植物ホルモンの１種であり、細胞の伸長生長と分裂を促進することが知られている。例えば、植物病原菌であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、以下、単にＡ．ツメファシエンスという。）では、トリプトファンが酵素トリプトファンモノオキシゲナーゼ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）により酸化されて、オーキシン前駆体であるインドールアセトアミド（ＩＡＭ）となり、次いで、このＩＡＭが酵素インドールアセトアミドヒドロラーゼ（ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔａｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）により加水分解されて、天然オーキシンであるインドール酢酸（ＩＡＡ）となる。このとき、トリプトファンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子はｉａａＭ遺伝子、インドールアセトアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子はｉａａＨ遺伝子である（Ｄ．　Ｉｎｚｅ、Ｍ．　Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ、１９４：２６５、１９８４）。ｉａａＨ遺伝子が単独で存在していても、オーキシンが合成されることはない（Ｈａｒｒｙ　Ｋｌｅｅ、Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．、１９９１、４２：５２９−５１）。オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子として、このｉａａＨ遺伝子は解析も相当に進んでおり、当業者が容易に取得可能であることから、本願発明に用いる遺伝子として好ましい。
【００１２】
なお、選抜マーカー遺伝子としては、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子と共に、他の植物ホルモン合成遺伝子、例えば、上記ｉａａＭ遺伝子や、側芽の生長と細胞の分裂を促進する植物ホルモンである、サイトカイニンの合成遺伝子を用いることができる。特にサイトカイニン合成遺伝子を用いた場合には、本願発明の方法により目的遺伝子を導入した植物細胞からの再分化組織の生成が、これを培養する培地中のオーキシン前駆体及び／又はその類縁物質の濃度を調節するのみでコントロールすることができるようになる。サイトカイニン合成遺伝子して最も代表的な遺伝子はｉｐｔ遺伝子（Ａ．　Ｃ．　Ｓｍｉｇｏｃｋｉ、Ｌ．　ｄ．　Ｏｗｅｎｓ、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、８５：５１３１、１９８８）である。この遺伝子も解析が相当に進み、当業者は容易にこれを取得することができるので、本願発明に用いる遺伝子として好ましい。
【００１３】
本願発明の方法は、これらの植物ホルモン遺伝子からなる選抜マーカー遺伝子を、目的遺伝子と共に、植物への遺伝子導入用ベクターとして公知のものに組込んで、植物細胞に導入する。植物細胞へのベクターの導入は、植物に感染するウイルスや細菌を介して間接的に、あるいは、物理的・化学的手法によって直接的に行うことができる（Ｉ．　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｐｌａｎｔ　ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．、４２：２０５、１９９１）。
【００１４】
植物に感染するウイルスや細菌を介してベクターの導入を行う場合は、例えば、カリフラワーモザイクウィルス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、ブロムモザイクウイルス等のウイルスや、Ａ．ツメファシエンス、アグロバクテリウム・リゾジェネス等の細菌が使用できる。また、物理的・化学的手法によってベクターの導入を行う手法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティックベネトレーション法等を挙げることができる。
【００１５】
遺伝子導入処理を行った植物細胞は、オーキシン前駆体及び／又はその類縁物質の存在下で培養して不定芽等の再分化組織を生成させる。ここでオーキシン前駆体又はその類縁物質とは、選抜マーカー遺伝子として導入した、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子が発現することで、オーキシン又はオーキシンと同様な生理活性を持つ物質（以下、まとめてオーキシン様物質ともいう。）に変換される物質である。例えば、上記ｉａａＨ遺伝子が発現するとインドールアセトアミドヒドロラーゼが合成されるが、この酵素は、その本来の其質であるＩＡＭの他に、ナフタレン酢酸アミド（ＮＡＭ）もＩＡＭと同様に加水分解し、合成オーキシンであるナフタレン酢酸（ＮＡＡ）に変換する。従って、本願発明において、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子としてｉａａＨ遺伝子を用いた場合には、オーキシン前駆体の類縁物質としてこのＮＡＭも、オーキシン前駆体であるＩＡＭと同様に用いることができる。
【００１６】
なお、不定芽等の再分化組織の生成は、主として、サイトカイニンとオーキシンによってコントロールされることが知られている。即ち、サイトカイニン／オーキシン比が高い場合には芽の分化が誘導され、サイトカイニン／オーキシン比が低い場合には根の分化が誘導される（Ｊｏｈｎ　Ｄ．　ＨａＭｉｌｌ、Ａｕｓｔ．　Ｊ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０：４０５、１９９３）。
【００１７】
一方、本願発明において目的遺伝子が導入された細胞には、選抜マーカー遺伝子としてオーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子も導入されている。従って、オーキシン前駆体及び／又はその類縁物質とサイトカイニンとをそれぞれ適当量添加した培地で遺伝子導入処理後の植物細胞を培養することにより、目的遺伝子が導入された不定芽等の再分化組織を生成させることができる。オーキシン前駆体等は、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子の働きにより、その添加量に応じ、目的遺伝子が導入された植物細胞内でオーキシン様物質に変換されるため、これらオーキシン前駆体等とサイトカイニンとをそれぞれ適当量添加した培地で培養すれば、目的遺伝子が導入された細胞においては、結局、オーキシンとサイトカイニンが適当量供給され、不定芽等の再分化に適正なサイトカイニン／オーキシン比となるからである。一方、目的遺伝子が導入されていない細胞は、このとき、目的遺伝子が導入された細胞とは異なった挙動をとる。この細胞は、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子が導入されていないため、オーキシン前駆体等をオーキシンとして利用する能力が極めて低く、培地中に添加されたオーキシン前駆体等とサイトカイニンのうち、主にサイトカイニンしか利用できないからである。
【００１８】
さらに、本願発明の選抜マーカー遺伝子として、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子と共にサイトカイニン合成遺伝子を用いた場合には、前記したように、遺伝子導入処理後の植物細胞を、オーキシン前駆体及び／又はその類縁物質の濃度を適当に設定した培地で培養するだけで、目的遺伝子が導入された不定芽等を再分化させることができる。このとき目的遺伝子が導入された細胞内では、オーキシン前駆体等はその添加量に応じてオーキシン様物質に変換され、また、サイトカイニン合成遺伝子により、サイトカイニンを培地に添加しなくともサイトカイニンが活発に合成されるので、オーキシン前駆体等を適当量添加した培地で培養すれば、目的遺伝子が導入された細胞において、サイトカイニン／オーキシン比は不定芽等の再分化に適正なものとなるからである。一方、目的遺伝子が導入されていない細胞は目的遺伝子が導入された細胞とはかなり異なった挙動をとる。かかる細胞では、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子もサイトカイニン合成遺伝子も導入されていないため、こうした植物ホルモンが殆ど生産されないからである。
【００１９】
以上より明らかなように、本願発明の方法によれば、再分化組織の生成にあたり、培地中に添加するオーキシン前駆体及び／又はその類縁物質やサイトカイニンの量をコントロールすることで、目的遺伝子が導入された不定芽等を優先的に再分化させ、エスケープの確率を減少させることができる。これは特に、選抜マーカー遺伝子として、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子と共にサイトカイニン合成遺伝子を用いた場合に、より大きな効果が得られる。
【００２０】
実際に培地中に添加すべきオーキシン前駆体等やサイトカイニンの具体的な量は、これら植物ホルモンの種類と、本願発明の方法により遺伝子組換え体を作成しようとする植物の種類に応じて、適宜決定することができる。この量を決定するには、例えば、本願発明において使用する選抜マーカー遺伝子と、ＧＵＳ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子等のレポーター遺伝子とを含むベクターを用いて、遺伝子組換え体を作成しようとする植物に遺伝子導入処理を行う。遺伝子導入処理後の組織は、培地中のオーキシン前駆体等やサイトカイニンの種類と量を何段階かに変化させて培養し、不定芽等を再分化させてレポーター遺伝子の発現を調査する。この場合においてレポーター遺伝子を発現している不定芽等の再分化率が最も高くなるような条件が、目的遺伝子が導入された植物細胞の再分化組織生成に最も適した条件であるので、本願発明の方法により、目的遺伝子をその植物に導入して遺伝子組換え体を作成する際には、オーキシン前駆体等やサイトカイニンの種類と量に関してこの条件を採用すればよい。
【００２１】
なお、上記再分化組織生成のための培地には、オーキシン前駆体等やサイトカイニン以外の、植物細胞の増殖と分化に必要な他の成分及び／又は植物細胞の増殖と分化には必要がない他の成分を、本願発明の目的を損ねない範囲で添加することができる。このような培地としては、例えば、ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ、１５：４７３−４９７、１９６２）、ＷＰＭ（Ｌｏｙｄ　ａｎｄ　ＭｃＣｏｗｎ　Ｐｒｏｐ．　Ｉｎｔ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｐ．　Ｓｏｃ．、３０：４２１−４２７、１９８０）等のよく知られた基本培地そのものに、又は遺伝子組換え体を作成しようとする植物に適するようこれらの基本培地に若干の改変を加えたものに、オーキシン前駆体等やサイトカイニンを添加し、炭素原として１〜３ｗ／ｖ％のシュークロース、固形剤として０．５〜１．０ｗ／ｖ％の寒天又は０．１〜０．４ｗ／ｖ％のジェランガムを添加した固形培地を用いることができる。
【００２２】
本願発明の方法は、以上のようにして得られた不定芽等の再分化組織を検出して選抜し、植物個体を再生することにより、目的遺伝子が導入された遺伝子組換え植物を作成する。ここで選抜される組織は、不定芽等の再分化組織であることから、特殊な試薬や器具を用いることなく肉眼で検出し、選抜することができる。さらに、選抜マーカー遺伝子として導入したオーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子と、再分化組織生成に用いる培地中に添加したオーキシン前駆体及び／又はその類縁物質との協働作用によって、このようにして選抜された再分化組織に目的遺伝子が導入されている確率は、従来と比べ高くなっている。従って、目的遺伝子導入組織の選抜効率が良く、こうして得られた再分化組織を定法に従って植物個体に再生することで、目的遺伝子が導入された遺伝子組換え植物を効率的に作成することができる。
【００２３】
例えば、植物個体への再生は、得られた再分化組織が不定芽である場合には、この不定芽をそのまま、又はある程度増殖させてから切出し、発根培地に挿し付けて発根させることにより行うことができる。このとき、培養温度は１５〜３０℃、光強度は５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ未満が好ましい。発根培地としては、上記の基本培地又はこれを希釈したものに、植物ホルモンとしてＮＡＡやインドール酪酸等のオーキシン類１種類以上を組合せ、更に炭素源としてシュークロース５〜３０ｇ／ｌを添加した液体培地又は寒天等にて固化させた固体培地を用いることができる。
【００２４】
また、本願請求項５に記載のベクター（以下、本願発明のベクターという。）は植物への遺伝子導入用ベクターであって、植物染色体への遺伝子導入部位に、目的遺伝子、選抜マーカー遺伝子としてｉａａＨ遺伝子及びｉｐｔ遺伝子を含み、かつ、ｉａａＭ遺伝子を含まないことを特徴とする。本願発明の方法は、かかる構成のベクターを用いて行うことにより、その目的をより高いレベルで達成することが可能となる。
【００２５】
本願発明の方法に用いるベクター及び上記本願発明のベクターには、本願発明の目的を損ねない範囲で、ここまでに述べた遺伝子以外の他の遺伝子や因子（特定の機能を有するＤＮＡ配列）を含んでいていも構わない。例えば、特開平９−１５４５８０にて本願出願人が提案しているように、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子やサイトカイニン合成遺伝子を脱離能を有するＤＮＡ因子と組み合わせて用いれば、再分化組織の選抜後、選抜マーカー遺伝子として用いたこれらの遺伝子を除去することができるので、選抜マーカー遺伝子の影響が全く排除された遺伝子組換え植物を得ることが可能となる。かかる脱離能を有するＤＮＡ因子は、トランスポゾンや部位特異的組換え系等より得ることができる。
【００２６】
本願発明の方法及びベクターを適用することができる植物の種類に特に制限はない。しかし、木本植物等、遺伝子組換え体の作成が困難であるとされている植物に適用することにより、本願発明の方法及びベクターは特に大きな効果を発揮することができる。
【００２７】
また、本発明の方法及びベクターにより植物に導入する目的遺伝子も種類を問わない。農業的に優れた形質を付与できる遺伝子、農業的に優れた形質を付与するとは限らないが、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子等、その目的に応じて種々選択することができる。
【００２８】
【作用】
植物の組織培養において、培養組織から植物個体を再生するまでの過程には、植物ホルモンであるオーキシンとサイトカイニンがその各段階において深く関わっている。これは、不定芽等の再分化組織の生成についても例外ではない。前記したように、不定芽等の生成はサイトカイニン／オーキシン比によってコントロールされ、細胞内のサイトカイニン／オーキシン比が適正な値となって始めて、その細胞は不定芽等を生成する。
【００２９】
従って、選抜マーカー遺伝子を単にサイトカイニン合成遺伝子及び／又はオーキシン合成遺伝子として、植物細胞に目的遺伝子を導入しても、目的遺伝子が導入された再分化組織が得られる確率は低い。この場合は目的遺伝子が導入された細胞において、これら選抜マーカー遺伝子の働きによってサイトカイニンとオーキシンが活発に生産されることとなるが、その生産量は人為的にコントロールすることができないので、これらの植物ホルモン遺伝子が導入された細胞、つまりは目的遺伝子が導入された細胞中のサイトカイニン／オーキシン比は必ずしも適正な値にならない。そのため、これらの細胞が、目的遺伝子が導入されていない細胞に対して優先的に再分化するとは限らないからである。
【００３０】
そこで、本願発明においては、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子を選抜マーカー遺伝子として用い、これとオーキシン前駆体等との協働作用により、目的遺伝子が導入された細胞内で合成されるオーキシン量を人為的に調節する。即ち、目的遺伝子と共に、選抜マーカー遺伝子としてオーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子を用いて植物組織に遺伝子導入処理を行い、この植物組織をオーキシン前駆体及び／又はその類縁物質を添加した培地で培養する。すると、目的遺伝子が導入された細胞においては、培地中のオーキシン前駆体等の濃度に応じてオーキシンが生産されるので、培地へのオーキシン前駆体等の添加量を調節することで、細胞内のオーキシン量も調節できることとなる。このとき、もう一方の植物ホルモンであるサイトカイニンは、オーキシン前駆体等と共に培地中に添加するか、オーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子と共にサイトカイニン合成遺伝子を細胞中に導入することで、目的遺伝子が導入された細胞内に一定量が供給されるようにすれば、結局、細胞内のサイトカイニン／オーキシン比も調節されることとなる。
【００３１】
本願発明は、このようにして、目的遺伝子導入細胞中のサイトカイニン／オーキシン比が不定芽等の再分化に最適となるよう調節することにより、この細胞からの再分化組織の生成を促進して、遺伝子導入処理後の植物組織から、目的遺伝子が導入された不定芽等を優先的に再分化させ、エスケープの確率を減少させる。この効果は特に、選抜マーカー遺伝子としてオーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子と共にサイトカイニン合成遺伝子を用いた場合に大きいと考えられる。この場合においては、選抜マーカー遺伝子としてオーキシン前駆体−オーキシン合成遺伝子のみを使用した場合と比べ、目的遺伝子が導入された細胞とこれが導入されていない細胞との間で、植物ホルモンに関する細胞内の生理的環境の差が大きい。このため、適当量のオーキシン前駆体等を培地に添加して培養した場合、目的遺伝子導入細胞がより優越的な不定芽分可能を示すと推測されるからである。
【００３２】
【実施例】
以下に、本願発明を実施例に基づいて説明する。
【００３３】
［実施例１］
目的遺伝子のモデルとしてＧＵＳ遺伝子、選抜マーカー遺伝子としてｉｐｔ遺伝子とｉａａＨ遺伝子を有するプラスミドｐＩＡＨ６をベクターとして、本願発明の方法により、ユーカリ・グロビュラス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｌｏｂｕｌｕｓ、以下、Ｅ．グロビュラスという。）への遺伝子導入を行い、遺伝子組換え体を作成した。
【００３４】
ｐＩＡＨ６の構造のうち、植物染色体に組込まれることとなる領域（Ｔ−ＤＮＡ領域）を図１に示す。図中、丸で囲んだＰ、Ｔは、それぞれｉｐｔ遺伝子及びｉａａＨ遺伝子自身のプロモーター及びポリアデニル化シグナルを示し、ＮＯＳ−Ｐはノパリンシンセターゼ遺伝子のプロモーター、Ｔはノパリンシンセターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナル、３５Ｓ−Ｐはカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーターをを示す。また、図の両端の黒い鏃型は、Ｔ−ＤＮＡ領域を画するＲＢサイトとＬＢサイトを表している。このプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域以外の部分は、市販の植物への遺伝子導入用ベクターｐＢＩ１２１（東洋紡績（株）製）の対応する部分と同様の構造をしている。
【００３５】
なお、このプラスミドｐＩＡＨ６は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に導入し、この大腸菌をＥ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９　（ｐＩＡＨ６）として国内寄託に付している（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１６８８２）。
【００３６】
Ｉ．アグロバクテリウムへのプラスミドｐＩＡＨ６の導入
Ａ．ツメファシエンスＥＨＡ１０５株を、１０ｍｌのＹＥＢ液体培地（ビーフエキス５ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ペプトン１ｇ／ｌ、シュークロース５ｇ／ｌ、２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、２２℃でのｐＨ７．２（以下、特に示さない場合、２２℃でのｐＨとする。））に接種し、ＯＤ６３０が０．４から０．６の範囲に至るまで、２８℃で培養した。この培養液を、６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌した後、菌体を２０ｍｌの１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌し、次いでこの菌体を２００μｌのＹＥＢ液体培地に懸濁して、これをプラスミド導入用菌液とした。
【００３７】
アグロバクテリウム菌体へのプラスミドｐＩＡＨ６の導入は、このようにして調整されたプラスミド導入用菌液５０μｌと上記ｐＩＡＨ６　３μｌを０．５ｍｌチューブ（アシスト社製）内で混合し、これをエレクトロポレーション法（ジーンパルサーＩＩシステム（ＢＩＯＲＡＤ社製））に供することにより行った。エレクトロポレーション後は、この混合液に２００μｌのＹＥＢ液体培地を加えて２５℃で１時間振とうして培養し、得られた菌体を５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＹＥＢ寒天培地（寒天１．５ｗ／ｖ％、他の組成は上記に同じ。）に播種して２８℃で２日間培養を続け、Ａ．ツメファシエンスの菌コロニーを形成させた。このコロニーの菌体からアルカリ法でプラスミドを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、及びＥｃｏＲＩにより切断してアガロースゲル電気泳動にて分析することにより、Ａ．ツメファシエンスＥＨＡ１０５株へのｐＩＡＨ６の導入を確認した。
【００３８】
ＩＩ．ユーカリへのｐＩＡＨ６の導入
チリ産Ｅ．グロビュラスの種子を、７０％エタノールに約１分間浸漬し、さらに、２％次亜塩素酸ソーダ水溶液に約４時間撹拌しつつ浸漬して殺菌した後、無菌水でよく洗浄して、ゼアチン０．５ｍｇ／ｌを添加したＭＳ寒天培地に播種し、発芽促進のため４℃の冷蔵庫で２日間保存してから、２５℃、光強度約１０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で培養し、これを発芽させた。発芽用培地に種子を播種してから１〜２週間後、発芽苗の頂芽、子葉及び根を切取って胚軸を採取し、更にこの胚軸を約５ｍｍに切断して遺伝子導入用試料とし、以下の実験に供した。
【００３９】
上記ＩでプラスミドｐＩＡＨ６を導入したＡ．ツメファシエンスＥＨＡ１０５株をＹＥＢ液体培地で一夜培養後、ＥＧ基本培地でＯＤ６３０＝０．５に希釈し、この菌液に上記のようにして調整した胚軸の切片を浸漬した。次いでこの切片を、余分な菌液を除去した上で、ＥＧ基本培地にゼアチン１．０ｍｇ／ｌ、ＮＡＡ０．０５ｍｇ／ｌ、アセトシリンゴン４０ｍｇ／ｌを添加した寒天培地（寒天８．５ｇ／ｌ）で３日間、２５℃、暗所にてアグロバクテリウム菌と共存培養することにより、これにｐＩＡＨ６導入アグロバクテリウムを感染させた。なお、ＥＧ基本培地としては、アンモニア態窒素と硝酸態窒素の濃度比を１：３とした改変ＭＳ培地（ＮＨ４　５ｍＭ、ＮＯ３　１５ｍＭ）にシュークロース２０ｇ／ｌを添加して用いた。
【００４０】
感染培養後の切片は、ティカルシリン５００ｍｇ／ｌ、及び、オーキシン前駆体の類縁物質であるＮＡＭ１μＭ又は１０μＭを添加したＥＧ基本寒天培地（寒天８．５ｇ／ｌ）に置床して、２５℃、光強度３０〜４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で、２週間ごとに植え継ぎながら同培地で培養を続けた。置床した切片のうち、早いものはアグロバクテリウムの感染後２ヶ月頃から不定芽を再分化させた。
【００４１】
アグロバクテリウムの感染から３ヶ月後、目的遺伝子のモデルとして用いたＧＵＳ遺伝子の発現を見るために、再分化してきた不定芽について、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法に準拠し、ＧＵＳ染色試験を行い、染色される不定芽の数（目的遺伝子が発現している不定芽の数）を調べることで、目的遺伝子が導入された不定芽がどの程度得られているかを判定した。結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2004057066.tif 000002
【００４３】
表１から明らかなように、不定芽の再分化率、選抜効率（再分化した不定芽に目的遺伝子が導入されている確率）、不定芽への遺伝子導入率（目的遺伝子が導入された不定芽が得られる率）を遺伝子導入用試料である切片基準で算出した場合、ＮＡＭ濃度１μＭの場合がそれぞれ３５．０％、３８．１％、１３．３％、ＮＡＭ濃度１０μＭの場合がそれぞれ４．２％、５０．０％、２．１％であった。
【００４４】
［比較例１］
ティカルシリン５００ｍｇ／ｌ、及び、オーキシンであるＮＡＡを０μＭ、１μＭ又は１０μＭ添加したＥＧ基本寒天培地（寒天８．５ｇ／ｌ）にてアグロバクテリウム感染後の胚軸切片を培養した他は、実施例１と同様にしてＥ．グロビュラスへの遺伝子導入実験を行った。結果を表２に示す。
【００４５】
【表２】
2004057066.tif 000003
【００４６】
表２から明らかなように、この場合はいずれも選抜効率が低く、最も良い値を示したＮＡＡ１μＭ添加の場合でも、切片基準で２２．２％にしかならなかった。
【００４７】
［比較例２］
選抜マーカー遺伝子としてｉｐｔ遺伝子しか有していないプラスミドｐＩＰＴ１０をベクターとして、実施例１又は比較例１と同様にＥ．グロビュラスへの遺伝子導入実験を行った。なお、このベクターも目的遺伝子のモデルとして、ＧＵＳ遺伝子を有している。
【００４８】
このとき用いたｐＩＰＴ１０のＴ−ＤＮＡ領域の構造を図２に、遺伝子導入実験の結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
2004057066.tif 000004
【００５０】
表３から明らかなように、この場合も選抜効率が低く、最も良い値を示したＮＡＡ１μＭ添加の場合でも、切片基準で１１．１％にしかならなかった。
【００５１】
［実施例２］
実施例１で使用したプラスミドｐＩＡＨ６をベクターとして、本願発明の方法により、交雑ヤマナラシ（ポプルス・シーボルディ×ポプルス・グランディタータ：Ｐｏｐｕｌｕｓ　Ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ×Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｇｒａｎｄｉｄｅｎｔａｔａ）への遺伝子導入を行い、遺伝子組換え体を作成した。
【００５２】
交雑ヤマナラシＹ６３株（秋田十條化成（株）内実験林より採取）の無菌苗の茎を、節を含まないように長さ５ｍｍに切断し、これを更に縦に二つ割にしたものに、ｐＩＡＨ６を導入したＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社より購入）を感染させることにより、この交雑ヤマナラシＹ６３株にｐＩＡＨ６を導入した。即ち、実施例１と同様にしてｐＩＡＨ６を導入したＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株をＹＥＢ液体培地で一夜培養後、Ｙ基本培地でＯＤ６３０＝０．５に希釈し、この菌液に上記のようにして調整した茎切片を浸漬した。次いでこの切片を、余分な菌液を除去した上で、Ｙ基本培地にアセトシリンゴン４０ｍｇ／ｌを添加した寒天培地（寒天８ｇ／ｌ）で３日間、２５℃、暗所にてアグロバクテリウム菌と共存培養することにより、これにｐＩＡＨ６導入アグロバクテリウムを感染させた。なお、Ｙ基本培地としては、改変ＭＳ培地（ＮＨ４　１０ｍＭ、ＮＯ３　３０ｍＭ）にシュークロース２０ｇ／ｌを添加して用いた。
【００５３】
感染培養後の切片は、ティカルシリン５００ｍｇ／ｌ、及び、オーキシン前駆体の類縁物質であるＮＡＭ１μＭ、５μＭ又は３０μＭを添加したＹ基本寒天培地（寒天８ｇ／ｌ）に置床して、２５℃、光強度３０〜４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で培養を行った。２ヶ月後、再分化してきた不定芽を選抜して分離し、この不定芽について同条件で培養を続けて更に２ヶ月後（ＮＡＭ存在下での培養を開始してから４ヶ月後）、培養されている組織の形態を観察することで、選抜された不定芽に目的遺伝子が導入されているか否かを判定した。このとき、選抜された不定芽に目的遺伝子が導入されていれば、これと共に導入されている選抜マーカー遺伝子（ｉｐｔ遺伝子）の働きにより、培養されている組織は多芽状を示すが、目的遺伝子が導入されていなければ、つまり選抜された不定芽がエスケープであれば培養組織が多芽状を示すことはない。エスケープにはｉｐｔ遺伝子が導入されておらず、これは単に、隣接して存在していた目的遺伝子導入細胞の影響を受けて不定芽を再分化したに過ぎないからである。
結果を表４に示す。
【００５４】
【表４】
2004057066.tif 000005
【００５５】
表４から明らかなように、ＮＡＭ濃度１μＭ及び５μＭのとき、目的遺伝子が導入された不定芽が得られ、その選抜効率は切片基準で算出した場合、ＮＡＭ濃度１μＭの場合が５０．０％、ＮＡＭ濃度５μＭの場合が４０．０％であった。なお、表中には示していないが、このとき、ＮＡＭ濃度１μＭで再分化した不定芽の総数は６７個であり、うち６個に目的遺伝子が導入されていた。また、ＮＡＭ濃度５μＭでは総数３４個の不定芽が再分化し、やはり５個に目的遺伝子が導入されていた。
【００５６】
［比較例３］
ティカルシリン５００ｍｇ／ｌのみを添加したＹ基本寒天培地（寒天８ｇ／ｌ）にてアグロバクテリウム感染後の茎切片を培養した他は、実施例２と同様にして交雑ヤマナラシへの遺伝子導入実験を行った。結果を表４に示す。
【００５７】
表４より明らかなように、この場合には不定芽は再分化せず、目的遺伝子が導入された再分化個体も得られなかった。
【００５８】
［実施例３］
チリ産Ｅ．グロビュラスの高発根性クローンの定芽を、実施例２のＹ基本培地にゼアチン０．５ｍｇ／ｌを添加した培地を用いて無菌的に増殖させ、伸長してきた茎を５ｍｍに切断して遺伝子導入用試料とし、実施例１と同様にしてプラスミドｐＩＡＨ６導入アグロバクテリウムを感染させた。
【００５９】
感染培養後の切片は、ティカルシリン５００ｍｇ／ｌ、及び、オーキシン前駆体の類縁物質であるＮＡＭ１μＭを添加したＥＧ基本寒天培地（寒天８．５ｇ／ｌ）に置床して、２５℃、光強度３０〜４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓの全明条件下で、２週間ごとに植え継ぎながら同培地で培養を続けた。
【００６０】
アグロバクテリウムの感染から４ヶ月後、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法に準拠してＧＵＳ染色試験を行い、再分化してきた不定芽について、目的遺伝子が導入された不定芽がどの程度得られているかを判定した。
【００６１】
その結果、茎切片４０片のうち、５切片から不定芽が分化し、このうち３切片由来の芽に目的遺伝子が導入されていることが確認された。即ち、遺伝子導入用試料である切片基準で、不定芽再分化率、選抜効率、不定芽への遺伝子導入率はそれぞれ１２．５％、６０．０％、７．５％であった。遺伝子が導入された不定芽が、遺伝子導入処理を行った試料に対して７．５％の確率で得られたというこの事実は、Ｅ．グロビュラスのクローン苗を遺伝子導入材料とする場合において、驚くべきことである。
【００６２】
［比較例４］
プラスミドｐＩＰＴ１０をベクターとして、実施例３と同様にＥ．グロビュラスの高発根性クローンへの遺伝子導入実験を行った。しかし、この場合には不定芽は再分化せず、目的遺伝子が導入された再分化個体も得られなかった。
【００６３】
【発明の効果】
本願発明によれば、目的遺伝子が導入された植物細胞内のサイトカイニン／オーキシン比を人為的にコントロールすることができる。従って、目的遺伝子導入細胞のサイトカイニン／オーキシン比を、不定芽等の再分化組織の生成に最も適するように調節してこの細胞の再分化を促進させ、この細胞から不定芽等を優先的に再分化させることができる。
【００６４】
これにより本願発明は、いわゆるエスケープの確率を減少させて目的遺伝子導入組織の選抜効率を向上させ、遺伝子組換え体の取得率を向上させる。これは特に、遺伝子組換え体の作成が困難であるとされている植物に適用した場合に効果が大きい。従って、本願発明によれば遺伝子組換え植物を効率的に作成することができる。
【００６５】
また、本願発明において、選抜マーカー遺伝子を脱離能を有するＤＮＡ因子と組み合わせて用いることにより、ここで用いた選抜マーカー遺伝子の影響が全く排除された遺伝子組換え植物も作成することが可能となる。
【００６６】
すなわち、本願発明によれば、遺伝子組換え体の作成が困難な植物であっても効率的に遺伝子組換え体を作成することができ、しかも、選抜マーカー遺伝子の影響が全く排除され、目的遺伝子のみが導入された遺伝子組換植物を作成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＩＡＨ６ベクターのうち、植物染色体に組込まれることとなるＴ−ＤＮＡ領域の構造を示す概念図である。
【図２】ｐＩＰＴ１０ベクターのうち、植物染色体に組込まれることとなるＴ−ＤＮＡ領域の構造を示す概念図である。
【図１】
2004057066.tif 000006
【図２】
2004057066.tif 000007