(57)【要約】　　　（修正有）【課題】検体中の食中毒菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓの特異的で簡便かつ迅速な検出法。【解決手段】Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ特異的ゲノムＤＮＡから得られたＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ）分析用のオリゴヌクレオチドプライマー。【選択図】　図３
2004057202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓゲノムＤＮＡを鋳型に配列番号６のＰＣＲプライマーを用いたＲＡＰＤ増幅を行い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓにのみ出現する増幅産物から単離された、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出マーカーとして有用なＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ特異的ゲノムＤＮＡ断片。
【請求項２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓがＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　ＪＣＭ　２１５２またはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　Ｎｏ．　５５である、請求項１記載のゲノムＤＮＡ断片。
【請求項３】
配列番号１のヌクレオチド配列を有する、請求項２記載のゲノムＤＮＡ断片。
【請求項４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓゲノムＤＮＡを鋳型に配列番号９および１０のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲを行い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓにのみ出現する増幅産物から単離された、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出マーカーとして有用なＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ特異的ゲノムＤＮＡ断片。
【請求項５】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓがＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　ＪＣＭ　２１５２またはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　Ｎｏ．　５５である、請求項４記載のゲノムＤＮＡ断片。
【請求項６】
配列番号２のヌクレオチド配列を有する、請求項５記載のゲノムＤＮＡ断片。
【請求項７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出用の１０塩基からなるＲＡＰＤプライマーを作製するための、配列番号１のヌクレオチド配列の使用。
【請求項８】
ＲＡＰＤプライマーが配列番号６のヌクレオチド配列を有する請求項７記載の使用。
【請求項９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出用の１０〜２５塩基からなるＰＣＲプライマーセットを作製するための、配列番号２のヌクレオチド配列の使用。
【請求項１０】
ＰＣＲプライマーセットが配列番号９および１０のヌクレオチド配列を有する請求項９記載の使用。
【請求項１１】
配列番号１のヌクレオチド配列から得られる１０塩基からなるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出用ＲＡＰＤプライマー。
【請求項１２】
配列番号６のヌクレオチド配列を有する、請求項１１記載のＲＡＰＤプライマー。
【請求項１３】
配列番号２のヌクレオチド配列から得られる２０〜２５塩基からなるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出用ＰＣＲプライマーセット。
【請求項１４】
配列番号９および１０のヌクレオチド配列を有する、請求項１３記載のＰＣＲプライマーセット。
【請求項１５】
請求項１１または１２のＲＡＰＤプライマーを用いたＲＡＰＤ法による検体中のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出方法
【請求項１６】
請求項１３または１４のＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ法による検体中のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出方法
【請求項１７】
請求項１１または１２のＲＡＰＤプライマーを有するＢａｃｉｌｌｕｓ
ｃｅｒｅｕｓ検出キット。
【請求項１８】
請求項１３または１４のＰＣＲプライマーセットを有するＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食中毒菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ特有のゲノムＤＮＡ領域を標的とした特異的で簡便かつ迅速なＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓの検出に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓは、人や動物の生活環境を含む自然界に広く分布しており、人や動物の日和見感染症、人の食中毒、食品の腐敗・変敗の原因菌である。本菌による食中毒の発生は細菌性食中毒の中では多い方ではないが、毎年発生している。動物に対しては、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓの自然感染によるウシの乳房炎や流産例なども報告されている。このため本菌は、原料乳や液卵などからも検出されることがあり、低温性のＢ．　ｃｅｒｅｕｓも存在するため、乳および卵製品の安全性確保において問題となっている。
【０００３】
本菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の中でも大型で、類縁菌としてＢ．　ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　があるが、特にＢ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓとは形態学的にも生化学的性状にも同一なため、細菌の分類に広く利用されている１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列分析では両菌を区別できない。このため一般的なＢ．　ｃｅｒｅｕｓの検出法としては、ポリミキシンＢを用いて他の細菌の増殖を抑制し、卵黄反応（卵黄に対するレシチナーゼの作用）を指標として集落の判定を行う培養法（例えば、非特許文献１参照）があるが、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓにも卵黄反応陽性株は多数存在する。
【０００４】
Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓの迅速検出法としては、増菌培養後、ＤＮＡジャイレース遺伝子のＢ．　ｃｅｒｅｕｓ特異的な領域のＰＣＲによる増幅検出法（例えば、非特許文献２参照）、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ遺伝子増幅による検出法（例えば、非特許文献３参照）などがこれまでに報告されているが、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓでも検出できない菌株が存在したり、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株が検出されるなど、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓのみを確実に検出できる迅速法は無い。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｄｏｎｏｖａｎ，　Ｋ．　：　Ｊ．　Ａｐｐｌ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　２１：　１００−１０３，　１９５８
【非特許文献２】
Ｙａｍａｄａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　６５：　１４８３−１４９０，　１９９９
【非特許文献３】
Ｄａｍｇａａｒｄ，　Ｐ．　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎｄ　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１９（３）：　４３６−４４１，　１９９６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、食中毒菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ特有のゲノムＤＮＡ領域を同定することにより、該領域の塩基配列から該領域を標的とした、特異的で簡便かつ迅速なＰＣＲによるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓの検出に有用なプライマーセットを提供することを課題とする。
また本発明は、該プライマーセットを用いた検体中の食中毒菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓの特異的で簡便かつ迅速な検出方法を提供することを課題とする。
さらにまた本発明は、該プライマーセットを有する食中毒菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓの特異的で簡便かつ迅速な検出キットを提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
１０残基からなるランダムプライマーを用いて代表数のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌種の各菌株のゲノムＤＮＡを鋳型にＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ：ＤＮＡ多型）分析を実施する。各菌株のＰＣＲ増幅産物（ＲＡＰＤマーカー）のバンドパターンを比較し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓのみに存在するバンドあるいは他と異なるバンドを選択する。この（これらの）バンド中にはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓに特異的な塩基配列を含む可能性がある。そこで該増幅産物からＤＮＡ断片を単離し、その塩基配列を常法により決定する。
【０００８】
この塩基配列に基づき、データベース上の他の細菌遺伝子の既知配列と相同性の低い部分を検索して１つあるいは２つ以上の２０〜２５塩基からなるプライマー対を合成する。次に各プライマー対で代表数のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌種の各菌株のゲノムＤＮＡを鋳型に通常のＰＣＲを行う。電気泳動で増幅断片長を比較し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓのみを増幅するプライマー対（プライマーセットともいう）を選択する。このプライマーセットで増幅されるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓのゲノムＤＮＡ領域はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ以外のＢ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含むＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌種には存在せず特異的であるといえる。
【０００９】
すなわち、この（これらの）２０〜２５塩基からなるプライマーセットを用いた通常のＰＣＲにより、検体中のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓを特異的かつ簡便・迅速に検出することができる。さらに該プライマーセットを有する食中毒菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓの特異的で簡便かつ迅速な検出キットを提供することができる。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓゲノムＤＮＡを鋳型に配列番号６のＰＣＲプライマーを用いたＲＡＰＤ増幅を行い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓにのみ出現する増幅産物から単離された、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出マーカーとして有用なＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ特異的ゲノムＤＮＡ断片、
（２）　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓがＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　ＪＣＭ　２１５２またはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　Ｎｏ．　５５である、前記（１）記載のゲノムＤＮＡ断片、
（３）　配列番号１のヌクレオチド配列を有する、前記（２）記載のゲノムＤＮＡ断片、
（４）　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓゲノムＤＮＡを鋳型に配列番号９および１０のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲを行い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓにのみ出現する増幅産物から単離された、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出マーカーとして有用なＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ特異的ゲノムＤＮＡ断片、
（５）　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓがＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　ＪＣＭ　２１５２またはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓＮｏ．　５５である、（４）記載のゲノムＤＮＡ断片、
（６）　配列番号２のヌクレオチド配列を有する、前記（５）記載のゲノムＤＮＡ断片、
（７）　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出用の１０塩基からなるＲＡＰＤプライマーを作製するための、配列番号１のヌクレオチド配列の使用、
（８）　ＲＡＰＤプライマーが配列番号６のヌクレオチド配列を有する前記（７）記載の使用、
（９）　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出用の１０〜２５塩基からなるＰＣＲプライマーセットを作製するための、配列番号２のヌクレオチド配列の使用、
（１０）　ＰＣＲプライマーセットが配列番号９および１０のヌクレオチド配列を有する前記（９）記載の使用、
（１１）　配列番号１のヌクレオチド配列から得られる１０塩基からなるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出用ＲＡＰＤプライマー、
（１２）　配列番号６のヌクレオチド配列を有する、前記（１１）記載のＲＡＰＤプライマー、
（１３）　配列番号２のヌクレオチド配列から得られる２０〜２５塩基からなるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出用ＰＣＲプライマーセット、
（１４）　配列番号９および１０のヌクレオチド配列を有する、前記（１３）記載のＰＣＲプライマーセット、
（１５）　前記（１１）または（１２）記載のＲＡＰＤプライマーを用いたＲＡＰＤ法による検体中のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出方法
（１６）　前記（１３）または（１４）記載のＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ法による検体中のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出方法、
（１７）　前記（１１）または（１２）記載のＲＡＰＤプライマーを有するＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出キット、
（１８）　前記（１３）または（１４）記載のＰＣＲプライマーセットを有するＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ検出キット、
からなる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
ＰＣＲによる、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓに特異的かつ簡便・迅速な検出方法の確立のためには、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓゲノムに特異的なＤＮＡ配列を有する領域の同定が必須である。Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　特異的ＤＮＡ領域の同定には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ゲノムＤＮＡのＲＡＰＤ分析は有力な手段である。ＲＡＰＤ分析は、単一種類のプライマーを用いてＰＣＲ　を行い、アガロース電気泳動、あるいは低分子領域の分離解像能が高いポリアクリスアミド電気泳動により検出される複数のＰＣＲ産物のバンドパターンにより、生物を短時間に同定・識別する方法である。ＲＡＰＤ　は、同一種の細菌の同定・型別には非常に有効であり、Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｓｐｐ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐｐ、Ｅ，　ｃｏｌｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｓｐｐやＢ．　ｃｅｒｅｕｓ　などの食品衛生細菌の型別に用いられている（宮本敬久：　Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｆｏｏｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１７（４）：　２１７−２２４，　２０００）。
【００１２】
数種のランダムプライマー（例えば、表１の６種のプライマー）を作製し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　属細菌ゲノムＤＮＡのＲＡＰＤ分析を行う。プライマーは基本的には、１０塩基からなるランダムな配列をコンピュータから出力した配列を用いる。再現性よくＲＡＰＤ分析を行うにはＲＡＰＤを同定標識（ＳＴＳ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇｇｅｄ　Ｓｉｔｅｓ）化して作り直す必要がある。
【００１３】
Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ゲノム　ＤＮＡ　を鋳型とした場合何も増幅されないが、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓのゲノムを鋳型とした場合、明瞭にＲＡＰＤ産物が増幅されるプライマー、および他の菌株とは異なるバンドパターンを示すプライマー、この場合は、表１のＮｏ．　４のプライマー；配列番号６を選択する。
【００１４】
具体的には、表１の６種類のプライマー（配列番号３〜８）を用いて、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　属細菌標準株および分離株のＢ．　ｂｒｅｖｉｓ　ＩＦＯ　３３３１、Ｂ．　ｐｏｌｙｍｙｘａ　ＪＣＭ２５０７、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　ＪＣＭ　２１５２、Ｂ．　ｐｕｍｉｌｕｓ　ＪＣＭ　２５０８、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　Ｎｏ．　５５、Ｂ．　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＩＦＯ　１２５５０、Ｂ．　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　ＪＣＭ　２５０４　、Ｂ．　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ＪＣＭ　２５０２、Ｂ．　ｃｏａｇｕｌａｎｓ　ＩＦＯ　１２５８３、Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＪＣＭ　１４６５、Ｂ．　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｓ　ＪＣＭ　２５０５、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　Ｂ、Ｂ．　ｍａｃｅｒａｎｓ　ＪＣＭ　２５００、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｓｏｔｔｏ、およびＢ．　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　ＪＣＭ　２５０６からＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ法）から調製したゲノムＤＮＡについてＲＡＰＤ分析を行う。通常のＲＡＰＤ分析は、１種類のプライマーで行われることが多いが、２種類のプライマーを混合して反応を行ってもよい。
【００１５】
ＲＡＰＤ分析における反応液の組成は例えば表２に、反応条件は例えば表３に示される。ＲＡＰＤ分析の場合、１０塩基の短いプライマーを結合させるために、アニーリング温度は３５℃付近まで下げた特異性の低いＰＣＲを行うため、実際には塩基配列が不完全な一致でも増幅される場合がある。その場合は４０℃と高く設定することができる。
【００１６】
ＲＡＰＤ産物はアガロースゲル分離し、ゲルのバンドをエチジウムブロマイドで検出し（例えば、図１）、バンドパターンの比較を行う。Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓにのみ特異的に出現しかつＢ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓには出現しないバンドを選択する（例えば図１のＢ．　ｃｅｒｅｕｓ　ＪＣＭ　２１５２およびＢ．　ｃｅｒｅｕｓ　Ｎｏ．　５５）。これらのバンドをゲルから抽出し、ＤＮＡ断片を単離する。このＤＮＡ断片をプラスミドベクターに連結、形質転換しクローン化し、常法により塩基配列を決定する（図２、配列番号１）。この３２０９ｂｐ　からなる塩基配列はＢ．　ｃｅｒｅｕｓ　ゲノムＤＮＡに特異的な塩基配列を含むと考えられる。
【００１７】
そこで、この塩基配列に基づいて、データベース上の他の細菌遺伝子の既知配列と相同性の低いＤＮＡ領域を検索する。このＤＮＡ領域を標的としたＰＣＲ　プライマーのデザインは、市販のプライマー検索システム（例えばＴａＫａＲａのＯＬＩＧＯ）を利用することができる。しかし最終的には、プライマーの良し悪しは、結果（感度と特異性）で判断する。プライマーの鎖長は１５〜３０　ｍｅｒ、望ましくは２０〜２５　ｍｅｒである。あまり短いと、ミスアニールの確率が高くなり、長すぎると鋳型とうまくアニールしない。
【００１８】
種々の組み合わせ（例えば２６通りの組み合わせ）でＰＣＲを行い、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓを特異的に検出しかつＢ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを検出しないプライマーセットを選択する。このようなプライマーセットとして、非限定的に、配列番号９の２０塩基からなるオリゴヌクレオチド（フォーワードプライマー：ＢＣＦ）および配列番号１０の２０塩基からなるオリゴヌクレオチド（リバースプライマー：ＢＣＲ）があげられる。
【００１９】
このプライマーセットを用いて、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　属細菌標準株および分離株のＢ．　ｂｒｅｖｉｓ　ＩＦＯ　３３３１、Ｂ．　ｐｏｌｙｍｙｘａ　ＪＣＭ　２５０７、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　ＪＣＭ　２１５２、Ｂ．　ｐｕｍｉｌｕｓ　ＪＣＭ　２５０８、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　Ｎｏ．　５５、Ｂ．　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＩＦＯ　１２５５０、Ｂ．　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　ＪＣＭ　２５０４　、Ｂ．　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ＪＣＭ　２５０２、Ｂ．　ｃｏａｇｕｌａｎｓ　ＩＦＯ　１２５８３、Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＪＣＭ　１４６５、Ｂ．　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｓ　ＪＣＭ　２５０５、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　Ｂ、Ｂ．　ｍａｃｅｒａｎｓ　ＪＣＭ　２５００、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｓｏｔｔｏ、およびＢ．　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　ＪＣＭ　２５０６からＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ法）から調製したゲノムＤＮＡについて、ＰＣＲを行う。
【００２０】
ＰＣＲ条件は、通常の、変性：９３〜９５℃３０　秒〜１分、アニーリング：５３〜５５　℃　１　分、伸長：７２　℃１．５〜　２　分を２５〜３０　サイクル繰り返す条件からスタートして至適条件を決定する。例えば、上記プライマーセットを用い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ゲノムを鋳型にＰＣＲを行う場合、ＰＣＲ反応は、熱変性：９５℃で１分、アニーリング：５３℃で１　分、伸長：７２　℃で１．５　分を１サイクルとし、３０　サイクル行う。
【００２１】
微量かつ／または含量の少ない標的ＤＮＡを増幅させるときには工夫が必要である。反応開始時点での非特異的プライミングを避ける手段として、Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ　法（例えば、ＴａｇＢｅａｄ　Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｂｅａｄ、Ｐｒｏｍｅｇａ　社　）を用いることができる。
ＰＣＲ産物の検出は、通常、１２　％アガロース電気泳動後に、蛍光色素により染色して行うが、迅速化のためには、５’−ヌクレアーゼ法によるリアルタイムＰＣＲ（Ｙｏｌａｎｄａ，　Ｓ．　Ｌ．，　Ｃｈｒｉｓｔｏｓ，　Ｊ．　Ｐ．：　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　９：　４３−４８，　１９９８）やキャピラリーＰＣＲ　（Ｃａｒｌｉ，　Ｋ．　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．：　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
７３：　１５３７−１５４３，　２００１）が有効と考えられる。
【００２２】
ＰＣＲ反応後のＤＮＡ検出を短縮するために、予めアガロースゲルにエチジウムブロマイドを加えておけば、染色に要する時間が省ける。また、泳動バッファーとしてＴＡＥに変えてＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ　を使えば、ＤＮＡバンドの幅がシャープになり、泳動時間を１５　分程度に短縮可能である。ＤＮＡバンドの検出にエチジウムブロマイド染色とともにサイバーグリーン染色が用いると感度が２０倍ほど高くなる（長島浩二／川上　誠：　食品工業：　４１−５０，　２００１−７．３０）。この文献の方法を本発明に試みることもできる。
【００２３】
上記配列番号９および１０のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用い、上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌種ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行うと、図３に示すようにＢ．　ｃｅｒｅｕｓ　ＪＣＭ　２１５２、およびＢ．　ｃｅｒｅｕｓ　Ｎｏ．　５５に特異的なＰＣＲ増幅産物が検出されるが、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ＢおよびＢ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｓｏｔｔｏを含むＢａｃｉｌｌｕｓ属菌種には全くＰＣＲ増幅産物は検出されない。
【００２４】
これらの増幅産物からＤＮＡ断片を単離しその塩基配列を決定する。該ＤＮＡ断片は配列番号２の１１５３ｂｐからなる塩基配列を有する。このＤＮＡ断片の塩基配列はＢ．　ｃｅｒｅｕｓ　のゲノムにのみ含まれ、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓゲノムには含まれない。したがって、該ＤＮＡ断片の塩基配列はＢ．　ｃｅｒｅｕｓに特有のものであり、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓのＰＣＲによる検出マーカーとして有用である。
【００２５】
本発明によりＢ．　ｃｅｒｅｕｓに特有の１１５３ｂｐからなる塩基配列が同定された。そこで当業者はこの塩基配列に基づきパソコンソフト（例えば、Ｇｅｎｅ　Ｗｏｒｋｓ）などを用いてさらに増幅しやすい部位を解析することができる。そしてさまざまな組み合わせのＰＣＲプライマーをデザインし、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、最適なＰＣＲプライマーセットを選択することができる。したがってこのようにして得られた新たなＰＣＲプライマーセットも本発明に包含される。また、本発明において検出マーカーに隣接する２０〜２５ｂｐからなるオリゴヌクレオチドも、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓの検出に用いるプライマーセットとして有用である。
【００２６】
本発明の検出マーカーは、いったん同定されると、いくつかの分析方法（例えば、ＲＦＬＰ：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）のどれによってでもＢ．ｃｅｒｅｕｓを検出するために用いることができる。さらに、マーカーの配列の部分あるいはすべてに基づいて核酸プローブをデザインすることができる。したがって、標準的なハイブリダイゼーションとレポーター法を用いて、マーカー配列の存在を検出するために用いることができる。マーカーの、とくにそのプライマー領域を含む、約３０塩基対あるいはそれ以上の領域を、核酸プローブのハイブリダイゼーション部位として用いることができる。
本発明の配列番号９および１０のプライマーセットを用い、ＰＣＲを行うことにより、検体（例えば、乳および卵製品）中のＢ．　ｃｅｒｅｕｓ　を特異的かつ簡便・迅速に検出することが可能である。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］Ｂａｃｉｌｌｕｓ　属細菌ゲノムＤＮＡ　のＲＡＰＤ　分析
１−１．供試菌株
使用したＢａｃｉｌｌｕｓ　属細菌菌株は、Ｂ．　ｂｒｅｖｉｓ　ＩＦＯ　３３３１、Ｂ．　ｐｏｌｙｍｙｘａ　ＪＣＭ　２５０７、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　ＪＣＭ　２１５２、Ｂ．　ｐｕｍｉｌｕｓ　ＪＣＭ　２５０８、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　Ｎｏ．　５５、Ｂ．　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＩＦＯ　１２５５０、Ｂ．　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　ＪＣＭ　２５０４　、Ｂ．　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ＪＣＭ　２５０２、Ｂ．　ｃｏａｇｕｌａｎｓ　ＩＦＯ　１２５８３、Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＪＣＭ　１４６５、Ｂ．　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｓ　ＪＣＭ　２５０５、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　Ｂ、Ｂ．　ｍａｃｅｒａｎｓ　ＪＣＭ　２５００、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｓｏｔｔｏおよびＢ．　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　ＪＣＭ　２５０６の１５株である。
１−２．ゲノムの調製
細菌ゲノムＤＮＡは、それぞれの最適温度　（３７℃および４９℃）で一晩培養した菌株から調製した。ゲノムＤＮＡは、　ＣＴＡＢ　法（Ｍｕｒｒａｙ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　８：　４３２１−４３２５，　１９８０）で抽出した。
１−３．ＲＡＰＤ分析
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　属標準株について表１に示す６種のプライマーを用いてＲＡＰＤ分析を行った。６種のプライマーの塩基配列を表１に、そして反応液組成を表２に示した。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
【表２】
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【００３０】
ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＭＰ（ＴａＫａＲａ社）を用いて表３の反応条件で３０サイクルのＰＣＲを行った。ＲＡＰＤ増幅産物は１．５％　アガロースゲル電気泳動を行って検出した。
【００３１】
【表３】
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【００３２】
結果および考察
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　属細菌標準株および分離株から調製したゲノムＤＮＡについて、表１に示す６種のプライマーでＲＡＰＤ分析を行った。このうちのプライマー４についての結果を図１に示す。プライマー４では、菌種に特異的なバンドパターンが検出され、特にＢ．　ｃｅｒｅｕｓ　２　株では特異的に約３．０　ｋｂのＲＡＰＤ産物が増幅した。
【００３３】
［実施例２］Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　特異的ＤＮＡ　領域の特定
本ＲＡＰＤ産物中にはＢ．　ｃｅｒｅｕｓ　に特異的な塩基配列を含む可能性があるため、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ　ＪＣＭ　２１５２由来ＲＡＰＤ産物の塩基配列を決定した。結果を図２（配列番号１）に示す。塩基配列解析の結果、この配列中にはグルコネートパーミアーゼ遺伝子と思われる配列が含まれていた。データベース上の他の細菌遺伝子の既知配列と相同性の低い部分を検索してプライマーを合成し、２６通りの組み合わせでＰＣＲを行った。この結果、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　のみを特異的に検出できる１組のプライマーセットが見出された。このプライマーの塩基配列はフォーワードプライマー（ＢＣＦ）：５’−ＡＡＴＴＡＧＧＣＧＴＧＣＡＡＡＣＣＣＴＣＧ−３’（配列番号９）、リバースプライマー（ＢＣＲ）：５’−ＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＡ−３’（配列番号１０）である。ＰＣＲ反応は、熱変性：９５℃、１ｍｉｎ、アニーリング：５３℃、１ｍｉｎ、伸長反応：７２℃、　１．５　ｍｉｎを１サイクルとし、３０サイクル行った。
種々のＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ゲノムＤＮＡと作製したＢＣプライマーセットを用いてＰＣＲを行った結果を図３に示す。ＰＣＲ反応液組成を表４に、反応条件を表５に示す。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＭＰ　［　ＴａＫａＲａ　社　］を用いて下記の反応条件で３０サイクルのＰＣＲを行った。
【００３６】
【表５】
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【００３７】
１．５％　アガロース〔ナカライテスク（株）〕ゲルを　ＴＡＥ［４０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ　８．０］緩衝液を用いて調製した。ＰＣＲ　後の反応液　１０　μｌ　と　１／１０　容量のローディング緩衝液［３０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，　５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．２５　％　Ｂｒｏｍｏ　ｐｈｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ，　０．２５　％　Ｘｙｌｅｎｅ　Ｃｙａｎｏｌ　ＦＦ、ｐＨ　７．０］を混合した後、アガロースゲルの試料溝にチャージし、ＴＡＥ　緩衝液中で　１００　Ｖ　で泳動を行った。泳動終了後、アガロースゲルを　１０　μｇ／ｍｌ　のエチジウムブロマイド溶液に浸して染色し、紫外線照射装置　ＴＦＰ−３５Ｍ（１８０Ｗ−３１２　ｎｍ　ｔｕｂｅ）〔ＶＩＬＢＥＲ　ＬＯＵＲＭＡＴ　社〕によりバンドを検出した。
【００３８】
さらに、配列番号９および１０のプライマーセットを用いて、乳製品から分離されたＢ．　ｃｅｒｅｕｓ　５１株、セレウス菌標準株（ＪＣＭ２１５２）および、嘔吐型食中毒原因株１株の検出を行った（図４）。また、これらの菌株の生化学的性状を調べた（表６）。デンプン分解性は常法にしたがって調べた。エンテロトキシンは、デンカ生研製セレウス菌エンテロトキシン検出用キット「ＣＲＥＴ−ＲＰＬＡ生研」を用いて調べた。嘔吐毒（細胞の空胞化）試験の結果、空胞化因子産生陽性だったのは１株（デンプン分解陰性、ＰＣＲ陽性）のみだった。
【００３９】
【表６】
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【００４０】
セレウス菌による食中毒の病型は下痢型と嘔吐型に類別されている。前者は下痢型菌が大量に増殖した食品の摂取により感染する。潜伏期間は８〜１６時間で、下痢および腹痛が主な症状である。後者はチャーハンやピラフ、オムライスといった米飯類によるものが大半で、摂取後３０分〜５時間、平均３時間程度の潜伏期をおいて発症する。主な症状は嘔吐である。わが国では嘔吐型が圧倒的に多く、デンプンを主体とした食品で発生している。また、菌側の特徴として、嘔吐型症例由来株がデンプン分解陰性株が多く、下痢型には陽性株が多い。
【００４１】
嘔吐毒（セレウリド）は４個のアミノ酸または酸化アミノ酸の環状構造の疎水性の高いペプチドで、１２１℃、６０分加熱、またはｐＨ　２および１１でも失活せず、消化酵素に対しても安定であり、抗原性を欠く物質である。一方、エンテロトキシンはｐＨ（３以下、１１以上で失活）や熱（５６℃５分で失活）、消化酵素に対して不安定である。
【００４２】
結果と考察
嘔吐毒（細胞の空胞化）試験の結果、空胞化因子産生陽性だったのは嘔吐毒型食中毒原因株１株のみであった。他のセレウス菌５２株はすべて陰性であった。したがって、嘔吐毒産生の可能性のあるセレウス菌を含むデンプン分解性陰性株が特異的に検出可能である。さらにセレウス菌において妨害となる類縁菌Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは全く検出されなかった。
【００４３】
［実施例３］Ｂａｃｉｌｌｕｓ　属以外に属する細菌ゲノムＤＮＡ　のＲＡＰＤ　分析
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　属以外に属する細菌ゲノムＤＮＡを実施例１と同様に調製し、配列番号９および１０のプライマーセットを用いて実施例２と同様に分析した。結果を図５に示す。その結果、セレウス菌で検出された１１５０ｂｐ付近のバンドは見られず、当該プライマーを用いることによりセレウス菌を特異的に検出できることが示された。
【００４４】
【発明の効果】
本発明により、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　ゲノムに特異的なＤＮＡ領域およびその塩基配列が同定された。その結果、該塩基配列に基づいて、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓ　を特異的で簡便かつ迅速に検出するためのＰＣＲプライマーセットをデザインすることが可能となった。該ＰＣＲプライマーセットを用い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った結果、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓのみを特異的に検出しかつＢ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを検出しないことが確認された。
すなわち、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓは、Ｂ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓとは形態学的にも生化学的性状にも同一なため、細菌の分類に広く利用されている１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列分析では両菌を区別できないが、本発明のＢ．　ｃｅｒｅｕｓ特異的ＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲにより、Ｂ．　ｃｅｒｅｕｓとＢ．　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの識別を迅速かつ簡便に行うことが可能となった。
本発明のＢ．　ｃｅｒｅｕｓ特異的ＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲを行うことにより、検体、例えば穀類およびその加工品（焼き飯類、米飯類、麺類）、複合調理食品（弁当類、調理パン）、魚介類およびその加工品、菓子類、野菜サラダ、肉料理、魚料理、土鍋料理、あるいはスバゲティや米飯の調理・加工食品のようなデンプン食品、チーズや粉乳を加えたバニラ・スライス等におけるＢ．　ｃｅｒｅｕｓ汚染を簡便かつ迅速に検出することが可能となった。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プライマー４による、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　属細菌のＲＡＰＤパターンを示す。
【図２】Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　特異的ＲＡＰＤ増幅産物の塩基配列を示す。網掛けの部分は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　のみを特異的に検出できるプライマー部分をを示す。
【図３】各種Ｂａｃｉｌｌｕｓ　属細菌ゲノムから、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　検出用プライマーセットにより増幅されたＰＣＲ　産物の電気泳動パターンを示す。
【図４】乳製品から分離されたＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ（５１株）、セレウス菌標準株（ＪＣＭ２１５２）および、嘔吐型食中毒原因株１株の生化学的性状と配列番号９および１０のプライマーセットにより増幅されたＰＣＲ　産物の電気泳動パターンを示す。
【図５】セレウス菌標準株（ＪＣＭ２１５２）および、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属以外に属する微生物の配列番号９および１０のプライマーセットにより増幅されたＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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