(57)【要約】      （修正有）【課題】生体におけるＭＡＩＬ遺伝子の機能を解明すること及びそのための手段を提供すること。【解決手段】ＭＡＩＬ遺伝子欠損マウス、特に、生後４週目から眼周囲に異常がみられることを特徴とする該欠損マウス、及び生後６週目にアトピー性皮膚炎様のアレルギー性疾患がみられることを特徴とする該欠損マウス。胎生期、特に、胎齢１１．５日〜１３．５日の間に死亡することを特徴とする、ＭＡＩＬ等のＩκＢタンパク質ファミリー遺伝子欠損マウス。これらの遺伝子欠損マウスを用いることを特徴とする、ＮＦ−κＢ情報伝達系に作用する物質の検索方法。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＩＬ遺伝子欠損マウス。
【請求項２】
ヘテロ欠損である、請求項１記載のＭＡＩＬ遺伝子欠損マウス。
【請求項３】
ホモ欠損である、請求項１記載のＭＡＩＬ遺伝子欠損マウス。
【請求項４】
生後４週目から眼周囲に異常がみられることを特徴とする、請求項３記載の欠損マウス。
【請求項５】
生後６週目にアトピー性皮膚炎様のアレルギー性疾患がみられることを特徴とする、請求項３又は４記載の欠損マウス。
【請求項６】
胎生期に死亡することを特徴とする、ＩκＢタンパク質ファミリー遺伝子欠損マウス。
【請求項７】
胎齢１１．５日〜１３．５日の間に死亡することを特徴とする、請求項６記載のＩκＢタンパク質ファミリー遺伝子欠損マウス。
【請求項８】
肝臓における異常が原因で胎生期に死亡することを特徴とする、請求項７記載のＩκＢタンパク質ファミリー遺伝子欠損マウス。
【請求項９】
ＩκＢタンパク質ファミリーがＭＡＩＬであることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の欠損マウス。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＭＡＩＬ遺伝子欠損マウスを用いることを特徴とする、ＮＦ−κＢ情報伝達系に作用する物質の検索方法。
【請求項１１】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のＩκＢタンパク質ファミリー遺伝子欠損マウスを用いることを特徴とする、ＮＦ−κＢ情報伝達系に作用する物質の検索方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＭＡＩＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ  ａｎｋｙｒｉｎ−ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）遺伝子欠損マウス、及び、胎生期に死亡することを特徴とする、ＩκＢタンパク質ファミリー遺伝子欠損マウス、並びに、これらの遺伝子欠損マウスを用いることを特徴とする、ＮＦ−κＢ情報伝達系に作用する物質の検索方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者ら岩手大学と北海道大学のグループは、国内外を通じて初めて  ＭＡＩＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ  ａｎｋｙｒｉｎ−ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を報告した  。ＭＡＩＬは、グラム陰性細菌の細胞壁成分であるＬＰＳ（内毒素、エンドトキシン）をマウスに投与すると遺伝子発現が誘導されるタンパク質である。アンキリンリピート（ａｎｋｙｒｉｎ‐ｒｅｐｅａｔ）というアミノ酸構造上の特徴から、ＩκＢタンパク質ファミリーの新規分子であると考えられる（非特許文献１）。その後、国内で理化学研究所の  Ｈａｒｕｔａ  らと九州大学の  ＹａｍａｚａｋｉらがＭＡＩＬと同じ分子を独立に発見した（非特許文献２及び非特許文献３）。更に、ＭＡＩＬ遺伝子のエクソン−イントロン構造、染色体上の位置、プロモーター等の構造に関して報告されている（非特許文献４）。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４８５  ｐ．５３−５６  （２０００）
【非特許文献２】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２７６５７（２００１），
【非特許文献３】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，１２４８５（２００１）
【非特許文献４】
Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５３：６４９−６５５  （２００１）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ＮＦ‐κＢは様々な遺伝子の転写を制御することで、細菌感染症やアレルギーの重要な病態である炎症反応の誘導に関与する。ＭＡＩＬは、核内で活性化したＮＦ−κＢを制御することによって、炎症・免疫応答の強弱をコントロールしている、と予想されるが、ＭＡＩＬがＮＦ−κＢとどのように相互作用するのか、炎症にどのように関与しているのか、そして個体レベルでどのような役割を果たしているのかは、未だ不明である。
【０００５】
従って、本発明の主な目的は、生体におけるＭＡＩＬ遺伝子の機能を解明すること及びそのための手段を提供すること等である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明者は、ＭＡＩＬ遺伝子欠損マウスを作製することに成功し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、ＭＡＩＬ遺伝子欠損（ノックアウト）マウスに係る。ＭＡＩＬ遺伝子欠損の種類によって、ヘテロ欠損（ＭＡＩＬ＋／‐）マウス及びホモ欠損（ＭＡＩＬ‐／‐）マウスがある。このうち、誕生したホモ欠損（ＭＡＩＬ‐／‐）マウスには、本明細書の実施例に示されるように、生後４週目から眼周囲に異常がみられ、更に、生後６週目にアトピー性皮膚炎様のアレルギー性疾患が認められる。
更に本発明は、胎生期、特に、胎齢１１．５日〜１３．５日の間に死亡することを特徴とする、ＩκＢタンパク質ファミリー遺伝子欠損マウスに係る。このような死亡の原因として、肝臓における異常が認められた。ＩκＢタンパク質ファミリーは転写因子ＮＦ‐κＢの制御因子であって、  ＭＡＩＬの他に、ＩκＢ‐α、ＩκＢ‐β、ＩκＢ‐ε、及びＢｃｌ‐３の存在が知られている。
【０００８】
又、本発明は、このような遺伝子欠損マウスを用いることを特徴とする、ＮＦ−κＢ情報伝達系に作用する物質の検索方法にも係るものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のＭＡＩＬ遺伝子欠損（ノックアウト）マウスである、ヘテロ欠損（ＭＡＩＬ＋／‐）マウス及びホモ欠損（ＭＡＩＬ‐／‐）マウスは、当業者に公知の方法に従って作製することが可能である。本発明の遺伝子欠損マウス作製に使用するマウスの種類・系統に特に制限はなく、当業者に公知の任意のマウスを使用することが出来る。このようなマウスの例として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスや１２９マウスを挙げることができる。
【００１０】
ヘテロ欠損（ＭＡＩＬ＋／‐）マウスは、ＥＳ細胞を用いて、例えば、Ｈｏｇａｎ，  Ｂ．，  Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｒ．，  Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｌａｃｙ，  Ｅ．  （１９９４）  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅ，  ａｎｄ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  ｉｎ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｎａｌ．  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  ｐｐ２５３−２９０．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．、又は、相沢慎一  （１９９５）  ジーンターゲティング  ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製、実験医学別冊、羊土社、東京、に記載の方法に準じて作製することができる。
【００１１】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。又、以下の実施例中で具体的な手段・方法が特に記載されていない場合には、該実施例は当業界で標準的なものに準じて実施されたものである。
【００１２】
【実施例１】
ＭＡＩＬ遺伝子ホモ欠損マウス（ＭＡＩＬ−／−）の作製
（１）キメラマウスの作製
以下の手順により、ＭＡＩＬ遺伝子が欠損した細胞を有するキメラマウスを作製さした。
ＥＳ細胞においてＭＡＩＬ遺伝子を欠損させるために、まず、ターゲティングベクターを作製した。マウスＭＡＩＬ遺伝子の構造は本発明者等が非特許文献４に報告したが、この遺伝子のエキソン４からイントロン８までを除去し、かわりにネオマイシン耐性遺伝子を導入するコンストラクトを選択した。すなわち、エキソン４の５’側３ｋｂｐ、ＰＧＫ−ｎｅｏ遺伝子、イントロン８の３’側３．５ｋｂｐを連結させて挿入したプラスミドベクターを作製した。
次に当業者に公知の方法に従い、エレクトロポレーションでターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入した。ＥＳ細胞は、Ｇ４１８選択（ネオマイシン選択）した後、サザンブロットで解析したところ、２クローンで相同組み換えを確認した。
相同組み換えの認められた陽性クローン（ＥＳ細胞）を胚盤胞に導入して仮親に移植することによりキメラマウスを作製した。
（２）ヘテロ欠損（ＭＡＩＬ＋／‐）マウスの作製
こうして得られたキメラマウスの交配によってＦ１マウスを作製した。Ｆ１マウスの遺伝型をＰＣＲで解析したところ生殖系列への変異の導入（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ化）が確認され、ヘテロ欠損マウス（ＭＡＩＬ＋／‐マウス）が作製された。
（３）更に、ＭＡＩＬ＋／−マウスどうしを交配させて、ＭＡＩＬ遺伝子ホモ欠損マウスの作製を試みた。計２０２匹の子マウスが誕生した。うち、ＭＡＩＬ‐／−は５個体だった（表１）。ＭＡＩＬ＋／＋とＭＡＩＬ＋／‐は、それぞれ６９匹と１２８匹で、ほぼメンデル律に従っていた。尚、マウスの遺伝型の解析は、尻尾からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲで行った（図１）。
【００１３】
以下のプライマーを用いてゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを実施すると、野生型遺伝子では５２０  ｂｐのＤＮＡが、変異型では４３０  ｂｐのＤＮＡが、それぞれ増幅された。ＰＣＲの反応は、９４度３０秒間、５５度３０秒間、７２度１分間を３０回繰り返すことにより実施した。得られたＤＮＡ産物は、ＴＡＥ緩衝液で作製した２％アガロースゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色することにより検出した。
Ｐｒｉｍｅｒ  １
５’−ＴＴＴＣＴＴＴＣＧＣＣＴＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣ−３’
野生型遺伝子に特異的
Ｐｒｉｍｅｒ  ２
５’−ＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＣ−３’
野生型と変異型の遺伝子に共通
Ｐｒｉｍｅｒ  ３
５’−ＣＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＧＴＣＣＴＧＣ−３’
変異型遺伝子に特異的
【００１４】
【実施例２】
ＭＡＩＬ‐／‐マウスの表現型解析
ＭＡＩＬ−／−マウスは、生後３週目までは外見上正常であるが、４週目頃から眼の周囲が白くなり、常に眼険を閉じている状態になった（図２）。さらに、６週目には眼周囲の炎症（目脂など）や被毛粗剛が認められ、以後、眼周囲から顔面、さらに下顎、腹部へと脱毛（アトピー性皮膚炎様のアレルギー性疾患）が拡大していった。
【００１５】
【実施例３】
胎子の遺伝子型の解析
ＭＡＩＬ＋／‐マウスどうしを交配させて妊娠したマウスの１０．５、１１．５、１２．０、１２．５、１３．５日胎齢の胎子の遺伝子型を調べた。胎齢１１．５、１２．５日で死亡胎子、倭小胎子にＭＡＩＬ−／‐が認められた。１３．５日胎齢ではＭＡＩＬ‐／−は死亡していた（表１）。これらの結果から、死亡する胎齢は１１．５日から１３．５日齢であることが示唆された。
【００１６】
【表１】
2004321112.tif 000003
【００１７】
【実施例４】
胎子の組織学的解析
マウス胎仔を摘出し、胎膜からゲノムＤＮＡを抽出して胎仔の遺伝型を判別した。遺伝型の判別は実施例１に記載したものと同様のＰＣＲ法により行った。胎齢１１．５日および１２．５日のＭＡＩＬ＋／＋およびＭＡＩＬ‐／−マウス胎子のＨＥ染色標本を作製し、顕微鏡下で観察した。１２．５日では−／‐の肝臓に異常が見られた。一方、１１．５日では肝臓に＋／＋、‐／‐間で大きな差は認められなかった。肝臓の異常が胚死の原因であることが示唆された。
尚、ＨＥ組織標本は次の通りに作製した。すなわち、胎仔組織をザンボニ固定液で固定した後、エタノールとキシレンで脱水処理し、パラフィンに包埋してからミクロトームを用いて厚さ５  ｍｍの切片を作製した。これをヘマトキシリンおよびエオジンで染色して光学顕微鏡で観察した。
【００１８】
【実施例５】
胎子におけるＭＡＩＬｍＲＮＡの発現
胚・胎子の成長にＭＡＩＬが関与している可能性を考え、胎子でのＭＡＩＬの発現を解析した。野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の妊娠マウスから取り出した胎子（９．５日、１２．５日、１５．５  日）からＲＮＡを抽出し、ＭＡＩＬｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲによって調べた（図３）。胎子期にＭＡＩＬが発現していることが明らかになった。
尚、ＰＣＲは胎仔から抽出したＲＮＡを鋳型として逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、以下のプライマーを用いて実施した。ＭＡＩＬ  ｍＲＮＡの存在は、５２０  ｂｐのＤＮＡが増幅されることで確認された。ＰＣＲの反応は、９４度３０秒間、５５度３０秒間、７２度１分間を３０回繰り返すことにより実施した。得られたＤＮＡ産物は、ＴＡＥ緩衝液で作製した２％アガロースゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色することにより検出した。
Ｐｒｉｍｅｒ  １
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＧＧ−３’
Ｐｒｉｍｅｒ  ２
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＧＴＴＧＣ−３’
【００１９】
【発明の効果】
以上の結果から、ＭＡＩＬは胎子の発生、成長にとって重要な役割をしていることが予想された。これまでに知られているＩκＢタンパク質ファミリーのノックアウトマウスで胎生期に死亡するものは報告されておらず、また、ＮＦ‐κＢファミリーであるＲｅＩＡノックアウトマウスやＩκＢキナーゼβノックアウトマウスの死亡時期よりも早期に死亡する（表２）ことから、ＭＡＩＬは未知の機能、役割を有している可能性が高い。尚、表２は、審良静男著、「サイトカイン情報伝達研究の新しい展開」、実験医学（羊土社）、１８巻、第３号（２月号）、３２０〜３２４頁（２０００）からの引用である。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
本発明のＭＡＩＬ遺伝子欠損マウスは、このようなＭＡＩＬの生体内、例えば、ＮＦ−κＢ情報伝達系における機能・役割、発生と炎症に関わる生理活性、等を解明する為の実験動物として有用である。
更に、本発明のＭＡＩＬ遺伝子欠損マウスは、ＮＦ−κＢ情報伝達系に作用する物質の検索、並びに、炎症関連疾患及びアレルギー等に対する治療薬の開発等に利用することが出来る。
【００２２】
【配列表】
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2004321112.tif 000006
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＭＡＩＬ遺伝子の欠損部分及び各プライマーの位置を示す図、並びにＰＣＲで得られたマウスの遺伝型の解析結果を示す電気泳動の写真である。
【図２】図２は、ＭＡＩＬ＋／＋マウス及びＭＡＩＬ−／−マウスの４週目における様子を示す写真である。
【図３】図３は、ＲＴ−ＰＣＲで得られた野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の胎子におけるＭＡＩＬｍＲＮＡの発現を示す電気泳動の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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