(57)【要約】      （修正有）【課題】２型糖尿病の発症の指標となるマーカーを提供する。【解決手段】下記（ａ）または（ｂ）のマーカーであり、ＨＮＦ−４α遺伝子のエキソン４における３１位の塩基のＣからＴへの変異の有無によって、２型糖尿病および動脈硬化の発症の可能性を判断する。（ａ）ヒト肝細胞核内因子（ＨＮＦ）−４α遺伝子のエキソン４において３１位のＣがＴに変異した、特定の塩基配列からなるＨＮＦ−４α遺伝子断片（ｂ）前記（ａ）の遺伝子断片を含むＨＮＦ−４α遺伝子。【選択図】  図１
2004283086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２型糖尿病の発症の可能性を判断するためのマーカーであって、下記（ａ）または（ｂ）のマーカー。
（ａ）ヒト肝細胞核内因子（ＨＮＦ）−４α遺伝子のエキソン４において３１位のＣがＴに変異した、配列番号１の塩基配列からなるＨＮＦ−４α遺伝子断片
（ｂ）前記（ａ）の遺伝子断片を含むＨＮＦ−４α遺伝子
【請求項２】
請求項１記載のマーカーを検出するためのプローブであって、下記（ｃ）〜（ｅ）からなる群から選択された少なくとも一つのプローブ。
（ｃ）請求項１記載の前記（ａ）のＨＮＦ−４α遺伝子断片に相補的であり、かつ、前記配列番号１の塩基配列における３１位のＴに相補的な塩基Ａを含むポリヌクレオチド
（ｄ）請求項１記載の前記（ｂ）のＨＮＦ−４α遺伝子に相補的であり、かつ、前記配列番号１の塩基配列における３１位のＴに相補的な塩基Ａを含むポリヌクレオチド
（ｅ）前記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
【請求項３】
ポリヌクレオチドの塩基数が、５〜５０の範囲である請求項２記載のプローブ。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが、ポリデオキシヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドである請求項２または３記載のプローブ。
【請求項５】
２型糖尿病の発症可能性を判断するためのＤＮＡチップであって、基板上に請求項２〜４のいずれか一項に記載のプローブが固定化されたＤＮＡチップ。
【請求項６】
請求項１記載のマーカーの検出に使用するプライマーであって、下記（ｅ）および（ｆ）の少なくとも一方のプライマー。
（ｅ）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項７】
動脈硬化の発症の可能性を判断するためのマーカーであって、下記（ａ）または（ｂ）からなるマーカー。
（ａ）ヒト肝細胞核内因子（ＨＮＦ）−４α遺伝子のエキソン４において３１位のＣがＴに変異した、配列番号１の塩基配列からなるＨＮＦ−４α遺伝子断片
（ｂ）前記（ａ）の遺伝子断片を含むＨＮＦ−４α遺伝子
【請求項８】
請求項７記載のマーカーを検出するためのプローブであって、下記（ｃ）〜（ｅ）からなる群から選択された少なくとも一つのプローブ。
（ｃ）請求項７記載の前記（ａ）のＨＮＦ−４α遺伝子断片に相補的であり、かつ、前記配列番号１の塩基配列における３１位のＴに相補的な塩基Ａを含むポリヌクレオチド
（ｄ）請求項７記載の前記（ｂ）のＨＮＦ−４α遺伝子に相補的であり、かつ、前記配列番号１の塩基配列における３１位のＴに相補的な塩基Ａを含むポリヌクレオチド
（ｅ）前記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
【請求項９】
ポリヌクレオチドの塩基数が、５〜５０の範囲である請求項８記載のプローブ。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが、ポリデオキシヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドである請求項８または９記載のプローブ。
【請求項１１】
動脈硬化の発症可能性を判断するためのＤＮＡチップであって、基板上に請求項８〜１０のいずれか一項に記載のプローブが固定化されたＤＮＡチップ。
【請求項１２】
請求項７記載のマーカーの検出に使用するプライマーであって、下記（ｅ）および（ｆ）の少なくとも一方のプライマー。
（ｅ）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、２型糖尿病および動脈硬化の発症の指標となるマーカー、前記マーカーを検出するためのプローブおよびプライマー、ならびにＤＮＡチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、大きく２つのタイプ、すなわち１型糖尿病と２型糖尿病とに分類され、中でも２型糖尿病は、その発症に遺伝的な素因が関与していることが知られている。そして、２型糖尿病に関しては、単一遺伝子異常による糖尿病の原因として、例えば、インスリン遺伝子や核内受容体型の肝細胞核内因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＮＦ）−４α遺伝子が同定されている。
【０００３】
ＨＮＦ−４αは、肝臓、ランゲルハンス島、腎臓、小腸等において発現するステロイドホルモン受容体のスーパーファミリーの一種であり（非特許文献１）、いくつかの機能ドメイン、すなわち、Ｎ末端転写活性領域（ＡＦ−１）、ＤＮＡ結合ドメイン（Ａ−ｂｏｘ  ｒｅｇｉｏｎ）、ダイマー形成ドメイン・リガンド結合ドメイン・転写活性ドメイン（ＡＦ−２）複合体から形成されている。このＨＦＮ−４αは、ホモダイマーを形成してＤＮＡに結合することによって、ターゲット遺伝子の転写を活性化しており、例えば、糖代謝や脂質代謝に関連する分子の転写制御に関与していることが知られている。そして、このＨＮＦ−４αの遺伝子異常が、比較的若年（通常２５歳以下）で発症し、常染色体の優性遺伝により特定される単一遺伝子（ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｆｏｒｍ）の２型糖尿病である、若年発症型糖尿病  ｍｕｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ（ＭＯＤＹ；ＭＯＤＹ１）の遺伝的素因であることが明らかとされているのである（非特許文献２）。
【０００４】
しかしながら、このようなＨＮＦ−４α遺伝子やインスリン遺伝子は、その遺伝子単独の異常によって、直接的に糖尿病の原因となりうる遺伝子であるが、このような遺伝子異常が明らかに直接的な発症原因となる糖尿病は全体の数％と推定されている。このため、一つの遺伝子異常が原因となるＭＯＤＹ１のような２型糖尿病ではなく、例えば、遺伝因子や環境因子の両方が原因となる多因子疾患と考えられる通常の２型糖尿病（ｌａｔｅ−ｏｎｓｅｔ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）についてのリスクファクターの解析が求められている。
【０００５】
そこで、近年、２型糖尿病の発症と関連する遺伝因子として、ＰＰＡＲγ遺伝子のＰ１２Ａ変異ＳＮＰ（非特許文献３）やカルパイン１０遺伝子のＳＮＰ（非特許文献４）等が報告されている。しかしながら、前者については、２型糖尿病のリスクファクターとして２型糖尿病との相関を示すが、診断における有効性の点で疑問が残り、後者については、患者が日本人の場合に２型糖尿病との関連性が弱いという問題がある。他方、動脈硬化に関しても、同様に、その発症に関与するリスクファクターの解析が求められている。
【０００６】
【非特許文献１】
スラデック  エフエム、  ゾング  ダブリューエム、  ダーネル  ジェイイー  ジュニア  （  Ｓｌａｄｅｋ  ＦＭ，  Ｚｈｏｎｇ  ＷＭ，  Ｌａｉ  Ｅ，  Ｄａｒｎｅｌｌ  ＪＥ  Ｊｒ．）  ステロイドホルモンレセプタースーパーファミリーの新規要素である肝臓過多転写因子ＨＮＦ−４α（Ｌｉｖｅｒ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＨＮＦ−４  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．）  “Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ”  （１９９０）  ４巻  ｐ．２３５３−２３６５
【非特許文献２】
ヤマガタ  ケー、  フルタ  エイチ、  オダ  エヌら（Ｙａｍａｇａｔａ  Ｋ，  Ｆｕｒｕｔａ  Ｈ，  Ｏｄａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．）若年発症型糖尿病における肝細胞核内因子−４α遺伝子の変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−４ａ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｍａｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ  （ＭＯＤＹ１））  “Ｎａｔｕｒｅ”  （１９９６）  ３８４巻  ｐ．４５８−４６０
【非特許文献３】
ヒロユキ  モリ、ヒロシ  イケガミ、ヨシヒコ  コワグチら（Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｍｏｒｉ，  Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｉｋｅｇａｍｉ，  Ｙｏｓｈｉｈｉｋｏ  Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）  一般的個体群における糖尿病発症の抵抗性に関与するＰＰＡＲ−γのＰｒｏ１２→Ａｌａ置換（Ｔｈｅ  Ｐｒｏ１２→Ａｌａ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＰＡＲ−γ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．）  ”Ｄｉａｂｅｔｅｓ”  ２００１年４月  ５０巻  ｐ．８９１−８９４
【非特許文献４】
ユキオ  ホリカワら（Ｙｕｋｉｏ  Ｈｏｒｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）  ２型糖尿病と関連するｃａｌｐａｉｎ−１０  をコードする遺伝子における遺伝的変異（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃａｌｐａｉｎ−１０  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．）  “Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”  （２０００）  ２６巻  ｐ．１６３−１７５
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の第１の目的は、２型糖尿病の発症の可能性を判断するための新たなマーカーの提供であって、本発明の第２の目的は、動脈硬化の発症可能性を判断するための新たなマーカーの提供である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の第１のマーカーは、２型糖尿病の発症の可能性を判断するためのマーカーであって、下記（ａ）または（ｂ）のマーカーである。
（ａ）ヒト肝細胞核内因子（ＨＮＦ）−４α遺伝子のエキソン４において３１位のＣがＴに変異した、配列番号１（ｃｃｇｔｃｃａｇａａ  ｔｇａｇｃｇｇｇａｃ  ｃｇｇａｔｃａｇｃａ  ｔｔｃｇａａｇｇｔｃ  ａａｇｃｔａｔｇａｇ  ｇａｃａｇｃａｇｃｃ  ｔｇｃｃｃｔｃｃａｔ  ｃａａｔｇｃｇｃｔｃ  ｃｔｇｃａｇｇｃｇｇ  ａｇｇｔｃｃｔｇｔｃ  ｃｃｇａｃａｇ）の塩基配列からなるＨＮＦ−４α遺伝子断片
（ｂ）前記（ａ）の遺伝子断片を含むＨＮＦ−４α遺伝子
【０００９】
本発明者らは、２型糖尿病のリスクファクターとなり得るＳＮＰについて鋭意研究を行った結果、以下の知見を得て本発明に到達した。すなわち、ＨＮＦ−４α遺伝子は、前述のように、遺伝子異常が生じた場合、それが直接の原因となってＭＯＤＹ１を発症することが知られているが、前記遺伝子異常がなく、かつ、エキソン４の３１位のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変異したＳＮＰを有する場合には、高い確率で２型糖尿病を発症することを見出したのである。具体的には、合計７７７例の日本人（患者４２３、正常対照３５４）について遺伝子解析を行った結果、前記ＳＮＰは、健常者の０．８％にしか認められなかったのに対して、２型糖尿病患者では３．５％に存在し、ｐ＝０．０１５、オッズ比４．３と非常に優れた有意差を示し、前記ＳＮＰと２型糖尿病との間に非常に強い関連性が確認されたのである。このため、本発明の第１のマーカーにおける変異が、２型糖尿病感受性のリスクファクターであることは明らかであるといえる。また、従来のＳＮＰは、それ単独では信頼性が低いため、例えば、複数のＳＮＰの組み合わせから２型糖尿病の罹患性を判断する必要があったが、本発明の第１のマーカーによれば、前述のように単独で高い有意差を示すため、従来のＳＮＰよりも格段に信頼性に優れ、有効性が高いといえる。前述のようにＨＮＦ−４α遺伝子変異がＭＯＤＹ１の原因になる等、従来からＨＮＦ−４α遺伝子が糖尿病に関与すること、および、エキソン４の３１位のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変異したＳＮＰの存在自体は知られていたが、前記ＳＮＰが２型糖尿病発症の指標となり得ることは、本発明者らが初めて見出した事実である。なお、このＳＮＰが、一般の個体群においても検出され、前述のＤＮＡ結合領域（Ａ−ｂｏｘ  ｒｅｇｉｏｎ）におけるミスセンス変異であること、前記Ａ−ｂｏｘ  ｒｅｇｉｏｎ  が、ＨＮＦ−４αのホモダイマー化およびＤＮＡとの結合における高親和性の点で重要であることは知られているが、この一塩基変異のみではＭＯＤＹ１の原因にならないこともすでに確認されている（前記非特許文献４）。したがって、２型糖尿病との関係が全く予想されていなかった前記ＳＮＰが２型糖尿病に関連することを、本発明者らが初めて立証したことにより、本発明の第１のマーカーを検出、すなわち、エキソン４の３１位の変異（ｃ→ｔ）の有無を確認することによって、２型糖尿病の発症の可能性を有効に判断することが可能となったのである。このため、本発明の第１のマーカーは、臨床医療の分野において非常に有効な指標と言える。
【００１０】
また、本発明の第２のマーカーは、動脈硬化の発症の可能性を判断するためのマーカーであって、下記（ａ）または（ｂ）のマーカーである。
（ａ）ヒト肝細胞核内因子（ＨＮＦ）−４α遺伝子のエキソン４において３１位のＣがＴに変異した、配列番号１の塩基配列からなるＨＮＦ−４α遺伝子断片
（ｂ）前記（ａ）の遺伝子断片を含むＨＮＦ−４α遺伝子
【００１１】
本発明者らは、前記２型糖尿病に関与する本発明の第１のマーカーについてさらに研究を進めた結果、前記ＳＮＰを有する患者は、前記ＳＮＰを有さない患者に比べて血漿  ＨＤＬ−コレステロールレベルが低いことを見出し、本発明の第２のマーカーに到達した。具体的には前記ＳＮＰを有する患者についてＨＤＬコレステロールを測定した結果、前記ＳＮＰを有さない患者に比べて有意に低値（ｐ＝０．００６）を示したことから、前記マーカーが動脈硬化発症のリスクファクターを兼ねることを見出したのである。このため、本発明の第２のマーカーを検出、すなわち、エキソン４の３１位の変異（Ｃ→Ｔ）の有無を確認することによって、動脈硬化発症の可能性を有効に判断することが可能になり、これは、臨床医療の分野において非常に有効な新たな指標と言える。なお、前記ＳＮＰと動脈硬化との関連性は、前記２型糖尿病との関連性と同様に、本発明者ら初めて証明したものである。
として有用である。
【００１２】
なお、本発明の第１および第２のマーカーは、前記配列番号１の塩基配列に示すように、ＨＮＦ−４α遺伝子のエキソン４の３１位がａｃｔからａｔｔに変異しているため、ＨＮＦ−４αタンパク質が発現した際には、１３０番目のアミノ酸がＴｈｒからＩｌｅとなるアミノ酸置換を伴うこととなる。したがって、本発明において、以下、エキソン４の３１位がＣからＴに変異したＳＮＰを有するＨＮＡ−４α遺伝子は「Ｔ１３０Ｉ変異のＨＮＦ−４α遺伝子」、前記ＳＮＰを有するエキソン４は、「Ｔ１３０Ｉ変異のエキソン４」とも言う。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のマーカーは、前述のように２型糖尿病または動脈硬化の発症の可能性を判断するためのマーカーであって、それぞれ前記（ａ）または（ｂ）のマーカーである。
【００１４】
なお、ＨＮＦ−４αをコードする遺伝子のゲノムＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（  ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ  ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｇｅｎｂａｎｋ／”）のデータベースに開示されている（ＡＨ００５０９９、Ｕ７２９５９、Ｕ７２９６０）。
【００１５】
本発明のマーカーを用いて２型糖尿病または動脈硬化の発症可能性の判断する方法としては、以下に示す方法があげられる。例えば、対象物であるＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させ、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、本発明のマーカーの存在（すなわち、Ｔ１３０Ｉ変異のＳＮＰの存在）を確認する方法、前記ＰＣＲ産物と後述する本発明のプローブをハイブリダイズさせて、前記マーカーの存在を確認する方法等があげられる。また、ＨＮＦ−４α遺伝子のエキソン４の３１位が変異（ｃ→ｔ）すると、その変異を含む配列が制限酵素Ｂｓｍ  Ｉ等の切断部位となることから、前記ＰＣＲ産物をＢｓｍ  Ｉ処理して、制限酵素断片長多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＲＦＬＰ）によって前記ＳＮＰの存在を確認することもできる。なお、前記制限酵素の種類は、特に制限されず、ＳＮＰを含む配列を認識するものであれば、Ｂｓｍ  Ｉには制限されない。このような方法によって、前記ＳＮＰの存在、つまり本発明のマーカーが確認された場合、２型糖尿病および動脈硬化の罹患性が高いと判断することができる。なお、前記ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、ＲＦＬＰの条件は特に制限されず、従来公知の方法および条件に基づいて適宜決定できる。また、本発明のマーカーの確認方法は、これらの方法には制限されない。
【００１６】
２型糖尿病および動脈硬化に関連する前記マーカーの検出に使用する本発明のプライマーとしては、例えば、ＨＮＦ−４α遺伝子のエキソン４の３１位の塩基を含む部分断片を増幅できるプライマーであれば特に制限されない。前記３１位の塩基を含む前記部分断片の長さも、特に制限されないが、例えば、前記ＲＦＬＰ法等を適用する場合、例えば、１００〜５００ｂｐ程度のものが取り扱い易いことから、このような長さとなるように、プライマーを設定することが好ましい。このプライマーのバリエーションは、当業者であれば、例えば、ＨＮＦ−４α遺伝子の塩基配列、エキソン４の塩基配列、配列番号１の塩基配列に基づいて適宜設計可能である。また、プライマーの長さは、従来公知のプライマーと同様に設定でき、特に制限されないが、通常、１５〜３０ｍｅｒである。
【００１７】
本発明のプライマーの具体例としては、例えば、（ｅ）配列番号２（ｃｃａｃｃｃｃｃｔａｃｔｃｃａｔｃｃｃｔｇｔ）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、（ｆ）配列番号３（ｃｃｃｔｃｃｃｇｔｃａｇｃｔｇｃｔｃｃａ）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。前者のオリゴヌクレオチドはＨＮＰ−４α遺伝子におけるエキソン４のフォワードプライマー、後者のオリゴヌクレオチドは、エキソン４のリバースプライマーとなり、これらのプライマーを用いたＰＣＲによって、エキソン４およびｆｌａｎｋｉｎｇ  ｉｎｔｒｏｎが増幅され、増幅物として配列番号４の塩基配列であるＤＮＡ（２７１ｂｐ）が得られる。
【００１８】
２型糖尿病または動脈硬化の発症の可能性を判断するにあたって、本発明のマーカーを検出するための本発明のプローブは、ＨＮＦ−４α遺伝子におけるエキソン４の３１位の塩基を含む部分断片と相補的なポリヌクレオチドであって、本発明のマーカーに特異的に結合できる長さであれば特に制限されない。したがって、当業者であれば、配列番号１の塩基配列や、ＨＮＦ−４α遺伝子の塩基配列、エキソン４の塩基配列に基づいて、本発明のプローブを設計可能である。また、本発明のマーカーの相補鎖に対するプローブであってもよい。具体的には、例えば、以下の（ｃ）〜（ｅ）のプローブがあげられる。
（ｃ）前記（ａ）のＨＮＦ−４α遺伝子断片に相補的であり、かつ、前記配列番号１の塩基配列における３１位のＴに相補的な塩基Ａを含むポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ｂ）のＨＮＦ−４α遺伝子に相補的であり、かつ、前記配列番号１の塩基配列における３１位のＴに相補的な塩基Ａを含むポリヌクレオチド
（ｅ）前記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
【００１９】
本発明のプローブを用いれば、前述のようなハイブリダイゼーション法等によって本発明のマーカーを検出することによって、診断対象物におけるＨＮＦ−４α遺伝子エキソン４における３１位の塩基がシトシン（ｃ）であるかチミン（ｔ）であるかを決定できるため、２型糖尿病および動脈硬化の発症可能性を診断することができる。
【００２０】
本発明のプローブにおいて、前記ポリヌクレオチドの種類は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチドからなるポリデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび修飾リボヌクレオチドの少なくとも一方からなるポリリボヌクレオチド、または、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方からなるキメラポリヌクレオチドがあげられる。また、前記ポリヌクレオチドの長さは、前述のように特に制限されないが、塩基数が、例えば、５〜５０の範囲であり、好ましくは１０〜３０、より好ましくは１５〜３０である。また、本発明のプローブとハイブリダイズさせる対象物としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡのいずれであってもよく、この対象物の種類と、前記ポリヌクレオチドの種類の組み合わせは、通常公知の組み合わせがあげられる。
【００２１】
また、本発明のプローブは、ＤＮＡチップに利用することもできる。本発明のＤＮＡチップは、基板上に本発明のプローブが固定化されたことを特徴とし、前記本発明のプローブを使用すること以外は、従来公知のＤＮＡチップと同様の構成であり、従来公知の方法に基づき使用できる。このようなＤＮＡチップを用いれば、前記プローブを、調製したｍＲＮＡ等の試料とハイブリダイズさせ、ハイブリッド形成の強度を検出することによって、本発明の第１のマーカーおよび第２のマーカーを検出できる。したがって、このＤＮＡチップによって本発明の第１および第２のマーカーを検出することによって、２型糖尿病または動脈硬化の発症の可能性を容易かつ迅速に診断できるのである。
【００２２】
【実施例】
（実施例１）
以下に示す本発明の実施例において、統計学上の有意性として、アレル頻度をカイ二乗検定（ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔ）およびＦｉｓｈｅｒｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔによりテストした。全ての臨床データは、ｍｅａｎ±ＳＤとして表した。また、異なる遺伝型グループ間における変数の比較は、ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ  およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｔｅｓｔの少なくとも一方によって行った。統計分析は、公知のソフトウェア「ＳｔａｔＶｉｅｗ  ５．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ＳＡＳ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）」を用いて行った。なお、特に示さない限りは、ｐ値が０．０５より小さい場合、有意であるとみなした。
【００２３】
１．ＨＮＦ−４α遺伝子におけるＴ１３０Ｉ変異のスクリーニング
（患者）
日本人の２型糖尿病患者４２３例（男性２５３、女性１７０；年齢  ６３．９  ±  ８．９才；  ＢＭＩ  ２３．０  ±  ３．２  ｋｇ／ｍ２、  ＨｂＡ１ｃ  ７．６  ±  １．６  ％、  ｍｅａｎ  ±ＳＤ）、日本人の非糖尿病患者（コントロール）３５４例（男性１５８、女性１９６；年齢  ６３．８  ±  １８．９  才；  ＢＭＩ  ２２．４  ±  ２．８  ｋｇ／ｍ２、ＨｂＡ１ｃ  ４．９  ±  ０．４％）についてスクリーニングを行った。２型糖尿病はＷＨＯ基準に基づき診断し、全ての２型糖尿病患者は、３５歳以降に２型糖尿病であるとして診断された患者とした。また、１型糖尿病および他の糖尿病（例えば、ＭＯＤＹ）の患者は除外した。
【００２４】
（方法）
常法に従って抽出した患者のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＨＮＦ−４α遺伝子におけるエキソン４およびｆｌａｎｋｉｎｇ  ｉｎｔｒｏｎを、特異的なフォワードプライマー（配列番号２：  ５’−ＣＣＡＣＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＣＣＴＧＴ−３’）およびリバースプライマー（配列番号３：  ５’−ＣＣＣＴＣＣＣＧＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡ−３’）を用いてＰＣＲによって増幅させた（前記非特許文献４参照）。Ｔ１３０Ｉ変異部位はＢｓｍＩ  ｓｉｔｅに生じるため、得られた増幅産物を制限酵素Ｂｓｍ  Ｉ処理し、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により検出した。その結果、配列番号４（ｃｃａｃｃｃｃｃｔａ  ｃｔｃｃａｔｃｃｃｔ  ｇｔｔｃｔｃｃｃｔｃ  ｃｔｃａｃｃｔｃｔｃ  ｔｇｔｇｃｃｔｃｃｔ  ｃａｃａｇｃｃｇｔｃ  ｃａｇａａｔｇａｇｃ  ｇｇｇａｃｃｇｇａｔ  ｃａｇｃａｔｔｃｇａ  ａｇｇｔｃａａｇｃｔ  ａｔｇａｇｇａｃａｇ  ｃａｇｃｃｔｇｃｃｃ  ｔｃｃａｔｃａａｔｇ  ｃｇｃｔｃｃｔｇｃａ  ｇｇｃｇｇａｇｇｔｃ  ｃｔｇｔｃｃｃｇａｃ  ａｇｇｔａｃｃｇｇｇ  ｇｔｇａｔｃｃｔｇｃ  ｃａｃｃｃａｃｃｃａ  ｇｇｇａｔｃｃｃｃｃ  ａｃａｃｔａｃａｇａ  ｇｇａｇｃｔｃａｃｃ  ｔｃｃｔｃｃａｃｃｔ  ｃｃａｔｔｃｔｃｃｃ  ｃａｇｃｃａｇｇｃｃ  ｃｔｇｇａｇｃａｇｃ  ｔｇａｃｇｇｇａｇｇ  ｇ）の塩基配列からなるＴ３０Ｉ変異の増幅物においては８１ｂｐと１９０ｂｐの断片が、未変異（Ｔ１３０Ｔ）の増幅物においては２７１ｂｐの断片が確認された。
【００２５】
（結果）
前記ＳＮＰ解析を行った結果、Ｔ１３０Ｉ変異は、２型糖尿病４２３例のうち１５例（３．５％）、非糖尿病患者３５４例のうち３例（０．８％）で確認された。この結果は、非糖尿病患者に比べて、２型糖尿病患者における変異頻度が有意に異なっており、非常に頻度が高いことを示している  （ｐ＝０．０１５，  オッズ比  ４．３，  ９５％ＣＩ  １．２４−１４．９８）。また、従前の文献（Ｓａｋｕｒａｉ  Ｋ，  Ｓｅｋｉ  Ｎ，  Ｆｕｊｉｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−４ａ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ：  ａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒｏｎ  １ｂ．  Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  ３２：  ３１６−３２２）に、同じ変異の頻度が、日本人の２型糖尿病患者およびコントロール患者においてそれぞれ２．０％  （２／１００）および０％（０／１００）であることが開示されていることから、これらの２つの結果を総合すると、２型糖尿病の変異頻度  １７／５２３  （３．３％）、コントロールの変異頻度  ３／４５４  （０．７％）、ｐ＝０．００５３、オッズ比  ５．０５、  ９５％ＣＩ  １．４７−１７．３５という結果となる。このことから、Ｔ１３０Ｉ変異と２型糖尿病との関連性が強いことが十分に裏付けられたと言える。なお、前記文献において、変異頻度の有意差は認められておらず、また、前記ＳＮＰと２型糖尿病との関連性についても立証されておらず、前記ＳＮＰと２型糖尿病との関連性は本発明者らが、初めて見出し立証したことは明らかである。
【００２６】
２．Ｔ１３０Ｉ変異を有する糖尿病患者の臨床特徴
下記表１に、１３０番目にＩｌｅコドンを有する（Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α変異を有する）糖尿病患者と、Ｔｈｒコドンを有する（Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α変異を有さない）糖尿病患者の臨床特徴を示す。下記表１において、「Ｔｈｒ／Ｔｈｒ」はＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α変異を有さない糖尿病患者「Ｔｈｒ／Ｉｌｅ」はＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α変異を有する糖尿病患者、「ｎ」は患者数、「Ｍ／Ｆ」は患者の「男性数／女性数」、「ａｇｅ」は患者の年齢、「ａｇｅ  ａｔ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ」は糖尿病と診断された年齢をそれぞれ示す。なお、表中において、ＢＭＩ等の各検査項目の測定値は「Ｍｅａｎｓ±ＳＤ」で表し、ｐ＞０．０５の場合は、有意差は無いと判断した（ＮＳ）。
【００２７】
【表１】
2004283086.tif 000003
【００２８】
前記表１に示すように、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α変異の糖尿病患者が糖尿病と診断された平均年齢は４７．１±８．８歳（ｐ＝１．０×１０−６）であり、表中「＃」に示す他のＨＮＦ−４α変異の糖尿病患者（ＭＯＤＹ１患者）の平均年齢２８．２±１５．２歳（ｎ＝４０、ｐ＝１．０×１０−６）よりも、非常に高いことがわかった。この結果から、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α変異の患者は、若年発症型糖尿病（例えば、ＭＯＤＹ）ではなく、通常の２型糖尿病を発症する確率が高いと言える。
【００２９】
Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α変異の糖尿病患者と、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α変異を有さない糖尿病患者の間では、発症年齢、ＢＭＩ（ボディマス指数）、最大ＢＭＩ、空腹時血糖（ＦＰＧ）、ＨｂＡ１ｃ、インシュリン耐性のｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  （ＨＯＭＡ−ＩＲ）、全コレステロールおよびトリグリセリドのレベルに関して大きな有意差は無かった。しかしながら、血漿  ＨＤＬ−コレステロールレベルは、Ｔ１３０Ｉ変異糖尿病患者の方がより低い値を示した（ｐ＝０．００６）。この結果は測定レベルの違いは、有意差と判断できるため、Ｔ１３０Ｉ変異のＨＮＦ−４α遺伝子は、動脈硬化の発症可能性の判断における指標（マーカー）であることが確認された。
【００３０】
また、有意なデータが得られたＴ１３０Ｉ遺伝子型の糖尿病患者（４例）において、グルカゴンで刺激したＣ−ペプチド応答に、０．９  ｎｇ／ｍｌ、１．３  ｎｇ／ｍｌ、４．０  ｎｇ／ｍｌ、４．７  ｎｇ／ｍｌという変動が見られた（正常  ＞２．０ｎｇ／ｍｌ）。また、患者（６例）の尿中Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ｕＣＰＲ）濃度は、それぞれ１４．７μｇ／２４ｈ、４７．８μｇ／２４ｈ、６７．２μｇ／２４ｈ、９３．７μｇ／２４ｈ、１０１μｇ／２４ｈおよび１４９μｇ／２４ｈ（ｎｏｒｍａｌ：  ５０〜１２０μｇ／２４ｈ）であった。これらの結果は、インシュリン分泌が、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α変異を持つ患者間において変動していることを示唆している。これは、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α変異の糖尿病患者は、インシュリン分泌の特性欠陥を誘導するＭＯＤＹ１変異とは対照的であるといえる（前記非特許文献４）。
【００３１】
３．トランスアクティベーション活性の確認
（プラスミド）
Ｔ１３０Ｉ変異ＨＮＦ−４α遺伝子を、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を用いてｈｕｍａｎ  ＨＮＦ−４α２  ｃＤＮＡ  から調製し、ｐｃＤＮＡ３．１  発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）によりクローニングした。なお、その構造は、ＤＮＡシークエンスにより確認した。異種ＴＫプロモーターとエンハンサーであるＨＮＦ−４α結合配列とのレポーター構築物（ｐＨＮＦ４−ｔｋ−Ｌｕｃ）、ＨＮＦ−１αレポーター、およびＰＫＬレポーター構築物は、文献（Ｙａｎｇ  Ｑ，  Ｙａｍａｇａｔａ  Ｋ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｒ１２７Ｗ−ＨＮＦ−４ａ  ｉｓ  ａ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ａ  ｒａｒｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ｃａｕｓｅｓ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ＭＯＤＹ１．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４３：  ５２０−５２４）に従った。
【００３２】
（細胞培養）
マウスの初代肝細胞（Ｍｏｕｓｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）を、文献（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ  Ｉ，  Ｍａｔｓｕｄａ  Ｍ，  Ｈａｍｍｅｒ  ＲＥ，  Ｂａｓｈｍａｋｏｖ  Ｙ，  Ｂｒｏｗｎ  ＭＳ，  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＪＬ  （２０００）  Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ＩＲＳ−２  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ＳＲＥＢＰ−１ｃ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｍｉｘｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ａｎｄ  ｏｂ／ｏｂ  ｍｉｃｅ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：  ７７−８６）に従って、コラゲナーゼ潅流法（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）により調製し、６−ｗｅｌｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅに３×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で平板培養した。そして、ＨｅＬａ細胞、ＭＩＮ６細胞、ＨｅｐＧ２細胞および初代肝細胞に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ  ＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔを用いて、前述の発現ベクターおよびレポーターを、内部コントロールとなるｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）１０ｎｇと共に感染させた。
【００３３】
（ルシフェラーゼアッセイ）
トランスアクティベーション活性は、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  および  Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０１  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを用いて、細胞に前記発現ベクターを感染させてから４８時間後に測定した（Ｙａｍａｇａｔａ  Ｋ，  Ｙａｎｇ  Ｑ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｐ２９１ｆｓｉｎｓＣ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−１ａ  ｉｓ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：  １２３１−１２３５）。
【００３４】
（ウエスタンブロット分析および電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ウエスタンブロット分析は、前記Ｙａｍａｇａｔａらの文献（１９９８）に報告されている抗−ＨＮＦ−４α抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）を用いて行った。野生型ＨＮＦ−４αタンパク質およびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αタンパク質は、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて合成した。そして、  ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳されたタンパク質を、ＨＮＦ−１α遺伝子のＨＮＦ−４α結合部位（５’−ＧＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＴＣＣＣＴＴＣＧＣ−３’）を含む  ３２Ｐ−ラベルオリゴヌクレオチドのプローブと共に、２０μＬの反応混合液においてインキュベーションし、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成した（Ｙａｎｇ  Ｑ，  Ｙａｍａｇａｔａ  Ｋ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−１ａ，  ａ  ｄｉａｂｅｔｅｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６６：  １９６−２０２）。また、競合結合分析（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）においては、５０倍の非ラベル化プローブ（前記ラベル化プローブと同じ配列）をｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとして使用した。前記インキュベーション後のタンパク質（ＤＮＡ−タンパク質複合体）を、０．５×ＴＢＥ  緩衝液を用いた５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフィーによってＥＭＳＡ分析を行った。また、ポリクローナル抗−ＨＮＦ−４α抗血清（α４４５）を、移動度分析（ｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）に使用した（前記非特許文献１参照）。さらに、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αの相対的な結合親和性を確認するために、非平衡状態となるように、非ラベル化ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒの量を増加して（１０、２５および５０倍）添加し、５分間インキュベートした（前記Ｙａｎｇ  Ｑらの文献（１９９９）参照）。
【００３５】
まず、Ｈｅｌａ細胞に、野生型（ＷＴ）−ＨＮＦ−４αの発現ベクターおよびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αの発現ベクターをそれぞれ感染させ、ＷＴ−ＨＮＦ−４αとＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αの発現を確認した。この結果を図１Ａに示す。図１Ａは、前記各発現ベクター（８μｇ）をＨｅｌａ細胞に感染させ、４８時間後に行ったウエスタンブロットの結果を示す写真であり、レーン１はＷＴ−ＨＮＦ−４α、レーン２はＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α、レーン３はコントロール（発現ベクター無し）の結果を示す。図示のように、ＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αの発現レベルは、ほぼ同様であった。このことから、Ｔ１３０ＩのＳＮＰの有無によっては、ＨＮＦ−４αの発現自体には影響が無いと言える。
【００３６】
つぎに、ＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αのトランスアクティベーション活性をルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによって算出した。これらの結果を図２のＢ、Ｃおよび図３のＤに示す。これらの図は、ｐＨＮＦ４−ｔｋ−Ｌｕｃ  １００ｎｇ  およびｐＲＬ−ＴＫ  １０ｎｇ  と共に、前述の発現ベクター５００ｎｇを各細胞に感染させ、４８時間後の各細胞におけるＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ４αのトランスアクティベーション活性を示すグラフである。なお、図２ＢはＨｅｌａ細胞、図２Ｃはマウスインスリノーマセルライン  ＭＩＮ６細胞、図３Ｄはヒトヘパトーマセルライン  ＨｅｐＧ２細胞についての結果である。各図において、縦軸は内部標準で補正したトランスアクティベーション活性を示し、「ｖｅｃｔｏｒ」とは、ＨＮＦ−４α遺伝子を含まないベクターを感染させた結果である（以下同様）。図２Ｂおよび２Ｃに示すように、Ｈｅｌａ細胞とＭＩＮ６細胞において、Ｗｔ−ＨＮＦ−４αとＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αとの間には、トランスアクティベーション活性に有意差は見られなかった（Ｎ．Ｓ．）。しかしながら、図３Ｄに示すように、同じ量の発現ベクターをヒトヘパトーマセルライン  ＨｅｐＧ２細胞に感染した場合には、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αの転写活性は、ＷＴ−ＨＮＦ−４αと比較して、４６．２％までに減少した（ｐ＜０．００１）。
【００３７】
そこで、発現ベクターの用量を増加させ、ＨｅｐＧ２細胞におけるＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αのトランスアクティベーション活性を確認した。この結果を図４Ｅに示す。同図は、前記発現ベクターの用量を増加し（５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ）、ｐＨＮＦ−４−ｔｋ−Ｌｕｃと共にＨｅｐＧ２細胞に感染させた、４８時間後におけるＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αのトランスアクティベーション活性の結果を示すグラフである。同図において、それぞれの結果は、６回の試験の「ｍｅａｎ±ＳＤ」値を示す。ＭＩＮ６細胞の場合、前記発現ベクターの用量を変化させても、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αはＷＴ−ＨＮＦ−４αと同様のトランスアクティベーションに達したが（データ表示せず）、図示のように、ＨｅｐＧ２においては、発現ベクターの量を変化させても、全ての用量において、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αのトランスアクティベーション活性の減少が見られた。
【００３８】
使用したＨｅｐＧ２細胞は、ＨＮＦ−４α遺伝子においてＤ６９Ａ変異を有している（Ｌａｕｓｅｎ  Ｊ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｈ，  Ｌｅｍｍ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＨＮＦ４ａ  ｇｅｎｅ  ｉｍｐａｉｒ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ａ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｄｅｇｒｅｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：  ４３０−４３７）。そこで、このＤ６９Ａ変異が、ＨｅｐＧ２細胞における、前述のようなＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αのトランスアクティベーション減少の原因となるか否かを、マウスの初代培養肝細胞を用いて、前記ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにより確認した。具体的には、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度のマウス初代肝細胞に、各レポーター遺伝子（ｐＨＮＦ−４−ｔｋ−Ｌｕｃ、ＨＮＦ−１αプロモーターまたはＰＫＬプロモーター）１００ｎｇと共に前記発現ベクター０．５μｇを感染させ、４８時間後の初代肝細胞におけるＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ４αのトランスアクティベーション活性を測定した。この結果を図５Ｆ〜Ｈに示す。各図は、初代肝細胞におけるトランスアクティベーション活性を示すグラフであり、図５Ｆはレポーター遺伝子としてｐＨＮＦ−４−ｔｋ−Ｌｕｃ、図５Ｇはレポーター遺伝子としてＨＮＦ−１αプロモーター、図５Ｈはレポーター遺伝子としてＰＫＬプロモーターを使用した結果を示すグラフである。各図において、それぞれの結果は、６回の試験の「ｍｅａｎ±ＳＤ」値を示す。図５Ｆ（レポーター遺伝子：ｐＨＮＦ−４−ｔｋ−Ｌｕｃ）に示すように、初代肝細胞においてもＴＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αのトランスアクティベーションの減少が見られた（ＷＴ−ＨＮＦ−４αの活性の２７．９％、ｐ＝９．７×１０−５）。また、ＨＮＦ−１αおよびＬ型ピルベートキナーゼ（ＰＫＬ）は、ＨＮＦ−４αにとってのターゲット遺伝子であり（Ｙａｍａｇａｔａ  Ｋ，  Ｏｄａ  Ｎ，  Ｋａｉｓａｋｉ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−１ａ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｍａｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ  （ＭＯＤＹ３）．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：  ４５５−４５８）、図５Ｇおよび図５Ｈに示すように、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αによって、ＨＮＦ−１α遺伝子のトランスアクティベーション活性はＷＴの７８．２％（ｐ＝０．０２４）に、ＰＫＬ遺伝子のトランスアクティベーション活性はＷＴの７７．１％（ｐ＝０．００２）に減少した。これらの結果は、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αが、Ｈｅｌａ細胞やマウスのＭＩＮ６細胞ではなく、肝細胞の環境において機能欠損の変異（ａ  ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）として作用していることを強く示唆するといえる。
【００３９】
つぎに、ＨＮＦ−４αのＡ−ｂｏｘ  ｒｅｇｉｏｎは前述のようにＤＮＡ結合に重要であると考えられているため、さらにＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αのＤＮＡ結合活性を調べた。まず、ＷＴ−ＨＮＦ−４αタンパク質およびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αタンパク質を、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（１μｇ）から前記ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳し、これをＥＭＳＡに供した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写されたタンパク質の発現レベルは、ウェスタンブロット分析によって確認した（データ表示せず）。なお、ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒとしては、前述のように過剰（５０倍）の非ラベル化オリゴヌクレオチドを使用した。
【００４０】
これらの結果を図６Ａに示す。同図は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させたＷＴ−ＨＮＦ−４αとＤＮＡ、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αとＤＮＡのＥＭＳＡ結果を示す写真である。同図において、レーン１はＷＴ−ＨＮＦ−４α、レーン２はＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ、レーン３はＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α、レーン３はＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４α、レーン４がＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αおよびｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ、レーン５がコントロール（ベクター無し）、レーン６がコントロール（ベクター無し＋ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）、レーン７がＷＴ−ＨＮＦ−４および抗−ＨＮＦ−４α抗体、レーン８がＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αおよび抗−ＨＮＦ−４α抗体の結果であり、矢印はＨＮＦ−４α／ＤＮＡ複合体の位置を示す。同図に示すように、レーン１および３において矢印の位置にバンドが確認できたことから、ＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αは、前記オリゴヌクレオチドと特異的に結合したことがわかる。また、レーン７および８では、レーン１および２に比べて、バンドのｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔが確認されたことから、ＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αがさらに抗−ＨＮＦ−４α抗体とも結合したことがわかる。
【００４１】
また、添加する非ラベル化ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒの量を増加して（１０、２５、５０モル）、非平衡状態においてＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αと前記ラベル化オリゴヌクレオチドとを結合させ、ＥＭＳＡを行った。この結果を図６Ｂに示す。図示のように、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αのＤＮＡ結合は、前記図６Ａの平衡状態においても、図６Ｂに示す非平衡状態においても同様の結果を示した。この結果から、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αのアミノ酸変化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡとの結合に影響がないことがわかった。
【００４２】
【発明の効果】
以上のように、本発明の第１のマーカーによれば、優れた信頼性で２型糖尿病の発症可能性を判断し、本発明の第２のマーカーによれば、動脈硬化の発症の可能性を判断することができる。このため、例えば、臨床分野における２型糖尿病および動脈硬化の診断や治療に非常に有用であるといえる。
【００４３】
【配列表】
2004283086.tif 000004
2004283086.tif 000005
2004283086.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａは、ＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１５０Ｉ−ＨＮＦ−４αの発現ベクターをＨｅｌａ細胞に感染させた後のウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図２】ＢおよびＣは、ＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１５０Ｉ−ＨＮＦ−４αの発現ベクターを細胞に感染させた後のＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ４αのトランスアクティベーション活性を示すグラフであり、ＢはＨｅｌａ細胞、Ｃはマウスインスリノーマセルライン  ＭＩＮ６細胞についての結果である。
【図３】Ｄは、ＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１５０Ｉ−ＨＮＦ−４αの発現ベクターを細胞に感染させた後のＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ４αのトランスアクティベーション活性を示すグラフであり、ヒトヘパトーマセルライン  ＨｅｐＧ２細胞についての結果である
【図４】ＨｅｐＧ２細胞におけるＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αのトランスアクティベーション活性を示すグラフである。
【図５】マウス初代肝細胞にレポーター遺伝子と共にＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１５０Ｉ−ＨＮＦ−４αの発現ベクターを感染させた後のＷＴ−ＨＮＦ−４αおよびＴ１３０Ｉ−ＨＮＦ４αのトランスアクティベーション活性を示すグラフであり、ＦはｐＨＮＦ−４−ｔｋ−Ｌｕｃ、ＧはＨＮＦ−１αプロモーター、ＨはＰＫＬプロモーターをレポーター遺伝子として使用した結果である。
【図６】ＡおよびＢは、ＷＴ−ＨＮＦ−４αとＤＮＡ、Ｔ１３０Ｉ−ＨＮＦ−４αとＤＮＡのＥＭＳＡ結果を示す写真であって、Ａは平衡状態、Ｂは非平衡の結果を示す。
【図１】
2004283086.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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