(57)【要約】【課題】チロシナーゼ活性阻害作用を有するうえに、従来のチロシナーゼ活性阻害剤の欠点を克服し、更にフラボノイドの持つ種々の機能をも有するチロシナーゼ活性阻害剤を提供する。【解決手段】フラボノイド−アルデヒド重縮合体を有効成分として含有することを特徴とし、前記フラボノイドがカテキン等のフェノール性水酸基を３つ以上含み、アルデヒドがアセトアルデヒドなどであり、全体の分子量が５００から１００，０００の範囲で、経時安定性及び水中耐酸化性に優れるるチロシナーゼ活性阻害剤である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボノイド−アルデヒド重縮合体を有効成分として含有することを特徴とするチロシナーゼ活性阻害剤。
【請求項２】
前記フラボノイドがフェノール性水酸基を３つ以上含む請求項１に記載のチロシナーゼ活性阻害剤。
【請求項３】
前記重縮合体が下記一般式（１）で表される請求項１に記載のチロシナーゼ活性阻害剤。
【化１】
2004244335.tif 000006
（式中、ｎは２以上の整数、Ｒはアルデヒドからホルミル基を除いた残基を示す。）
【請求項４】
前記Ｒがメチル基、カルボキシル基、アセチル基及びヒドロキシフェニル基のうちから選ばれる１種以上である請求項３に記載のチロシナーゼ活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フラボノイドとアルデヒド類の重縮合体からなることを特徴とするチロシナーゼ活性阻害剤に関する。この阻害剤は、化粧品及び食品の分野で好適に利用される。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献１】特開平６−６５０８５
【特許文献２】特開平６−４０８８３
従来より、チロシンやドーパなどの酸化を触媒するチロシナーゼの活性を阻害する化合物は、メラニン生成抑制作用を有することを利用して化粧品における美白剤として、また、食品の黒変防止剤として使用されている。このようなチロシナーゼ活性阻害剤として、アスコロビン酸類、グルタチオン、コウジ酸、アルブチン等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記従来のチロシナーゼ活性阻害剤は、経時安定性が低い、細胞毒性が強い、水分存在下の酸化により阻害能力が低下する等の欠点があった。
そのため、本発明の課題は、チロシナーゼ活性阻害作用を有するうえに、従来のチロシナーゼ活性阻害剤の欠点を克服し、更にフラボノイドの持つ種々の機能をも有するチロシナーゼ活性阻害剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
その課題を解決するために、本発明のチロシナーゼ活性阻害剤は、
フラボノイド−アルデヒド重縮合体を有効成分として含有することを特徴とする。
従来より、緑茶ポリフェノールの主成分であるカテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート等のフラボノイド類に抗酸化性や殺菌作用があることが知られている。さらに抗ガン作用、抗炎症作用、紫外線吸収作用、毛細血管の強化、血圧上昇抑制、血圧降下作用、記憶力向上、肝機能向上、脂肪吸収抑制、ストレス抑制、女性ホルモンバランス調整、抗腫瘍作用、突然変異抑制、血中コレステロール抑制、整腸作用等の効果も知られており、食品、化粧品素材や生医学分野への応用が期待されている。
【０００５】
一方、カテキン類にはチロシナーゼ活性阻害はなく、むしろ、チロシンの酸化を促進する作用があり、チロシナーゼ活性阻害作用は見られない。
これに対して、フラボノイドとアルデヒドを重縮合させて高分子化したものは、一転してチロシナーゼ活性阻害作用を発揮する。特に前記フラボノイドがフェノール性水酸基を３つ以上含むものであるとき、その作用が顕著である。そして、重縮合反応によりアルデヒドのホルミル基は除かれるが、フラボノイドの骨格及び官能基は全て残っていることから、フラボノイドの上記各作用もそのまま維持される。
前記重縮合体は、典型的には下記一般式（１）で表される。
【０００６】
【化２】
2004244335.tif 000003
（式中、ｎは２以上の整数、Ｒはアルデヒドからホルミル基を除いた残基を示す。）
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のチロシナーゼ活性阻害剤を製造する際の重縮合反応で使用するフラボノイドは、特に制限されるものではないが、フェノール性水酸基を３つ以上含むものが好ましい。具体例としては、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、クエルセチン、ヘスペリジン、ルチン等が挙げられる。これらは単独あるいは混合物として使用される。
本発明で使用するアルデヒドは、フラボノイドと反応するものであれば、特に制限されるものではない。具体例としては、ホルマリン、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、カプロンアルデヒド、ピルビンアルデヒド、グリオキシル酸、ベンズアルデヒド、２−メトキシベンズアルデヒド、サリチルアルデヒド、４−ヒドロキシベンズアルデヒド、３−シアノベンズアルデヒド、ｐ−ジフェニルアルデヒド、クロトンアルデヒド等が挙げられる。これらは単独あるいは混合物として使用され、フラボノイド１ｇに対して、０．１〜１０００グラムの範囲で用いることが好ましい。
【０００８】
フラボノイドとアルデヒドの重縮合反応においては、反応を効率よく進めるために酸触媒を加えても良い。用いる酸触媒は特に制限はなく、公知のものが使用できる。具体例として酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、硫酸、硝酸、トリフルオロボレート、パラトルエンスルホン酸、メタンスルホン酸等が挙げられ、フラボノイド１ｇに対して、０．０１ｍｇ〜１００ｇの範囲で用いることが好ましい。フラボノイドとアルデヒドの重縮合反応に用いる溶媒としては、フラボノイドとアルデヒドと触媒が共に溶解するものが好ましい。具体例としてメタノール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ニトロメタン、ニトロベンゼン、ピリジン、１，４−ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、蒸留水、脱イオン水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液を用いる場合はｐＨが２〜１２の範囲が望ましい。緩衝液の種類としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等が望ましいが、これらに限定されるものではない。これらは単独あるいは混合物として使用され、任意の量を用いることができる。
重合温度は、反応が効率良く進行する温度が望ましい。好ましくは−２０〜１００℃の範囲であり、より好ましくは０〜６０℃の範囲である。
上記重合反応によって得られる重縮合体の数平均分子量は５００から１００，０００の範囲である。
【０００９】
【実施例】
以下に、本発明を試験例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
−実施例１−
１００ミリリットルナスフラスコに、０．３７グラム（１．３ｍｍｏｌ）のカテキンを取り、０．５ミリリットルの酢酸、３ミリリットルのエタノール及び２２ミリリットルの蒸留水の混合液に溶解させた。カテキンの溶解後、２．０４ミリリットルの９０％アセトアルデヒド溶液（３２．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下で留去し、残査を真空乾燥することにより、収率９３％で重縮合体（以下、ポリマーＡ）を得た。ポリマーＡの分子量は水酸基を常法によりアセチル化した後に、クロロホルムを溶離液に用いてＧＰＣにより測定した。その結果、数平均分子量が３７００、分子量分布が１．８であった。また、ポリマーの構造解析をＮＭＲを用いて行ったところ、カテキンの６位と８位で結合したカテキン−アセトアルデヒド重縮合体であることを確認した。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ｐｐｍ）  １．１−１．９  （ｂｒ，  ＣＨ３），  ２．３−３．２  （ｂｒ，  Ｈ−４），  ２．８−３．２  （ｂｒ，Ｈ−３），  ４．０−４．６  （ｂｒ，  Ｈ−２，  ＣＨ），  ６．５−７．２  （ｍＨ−２’，  Ｈ−５’，  Ｈ−６’）１３Ｃ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ｐｐｍ）  １８−２２  （ｍ，  ＣＨ３），  ２６−３１  （ｍ，  Ｃ−４），  ４１  （ｓ，  ＣＨ），  ６９−７１（ｍ，  Ｃ−３），  ８５−８７  （ｍ，  Ｃ−２），  １０５−１０７  （ｍ，  Ｃ−４ａ），  １１１−１１３，  １１７−１１８  （ｍ，  Ｃ−６，  Ｃ−８），  １１８−１１９  （ｍ，  Ｃ−２’，  Ｃ−５’），  １２１−１２３  （ｍ，  Ｃ−６’），  １３１−１３４  （ｍ，  Ｃ−１’），  １４７−１４８  （ｍ，  Ｃ−３’，  Ｃ−４’），  １５２−１５７  （ｍ，  Ｃ−５，  Ｃ−７，  Ｃ８ａ）
【００１０】
−実施例２−
実施例１におけるアセトアルデヒド溶液に代えてグリオキシル酸（３２．５ｍｍｏｌ）を用いたことと、酢酸を用いなかったこと以外は、実施例１と同一条件で原料モノマーを配合し、反応させることにより重縮合体（以下、ポリマーＢ）を合成した。ポリマーＢの収率、数平均分子量、分子量分布の結果を実施例１の結果と併せて表１に示す。
【００１１】
−実施例３−
実施例１におけるアセトアルデヒド溶液に代えてピルビンアルデヒド（３２．５ｍｍｏｌ）を用いたことと、０．５ミリリットルの酢酸を加えることに代えて１Ｍの塩酸を用いて混合液をｐＨ＝２に調整したこと以外は、実施例１と同一条件で原料モノマーを配合し、反応させることにより重縮合体（以下、ポリマーＣ）を合成した。ポリマーＣの収率、数平均分子量、分子量分布の結果を実施例１の結果と併せて表１に示す。
【００１２】
−実施例４−
実施例１におけるアセトアルデヒド溶液に代えてサリチルアルデヒド（３２．５ｍｍｏｌ）を用いたことと、０．５ミリリットルの酢酸を加えることに代えて１Ｍの塩酸を用いて混合液をｐＨ＝２に調整したこと以外は、実施例１と同一条件で原料モノマーを配合し、反応させることにより重縮合体（以下、ポリマーＤ）を合成した。ポリマーＤの収率、数平均分子量、分子量分布の結果を実施例１の結果と併せて表１に示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
［試験例１］（モノフェノラーゼ作用の阻害能力の評価）
チロシナーゼの触媒作用としてチロシンをＤＯＰＡへ酸化するモノフェノラーゼ作用とＤＯＰＡを酸化するジフェノラーゼ作用が知られている。本例ではモノフェノラーゼ作用の阻害能力を評価するため、チロシナーゼによるＬ−チロシンの酸化における４７５ｎｍの吸光度の経時変化を測定した。測定は、Ｌ−チロシン（２ｍＭ）、チロシナーゼ（１００ユニット、マッシュルーム由来、ＳＩＧＭＡ製）、及び阻害剤（ポリマーＡ〜Ｄ）をｐＨ＝６．８の０．１Ｍリン酸緩衝液と蒸留水との混合液（５：４重量比）に溶解させ、２５℃で行った。
阻害剤におけるポリマー濃度の阻害能力への影響を調べた結果を図１に示す。尚、ポリマー濃度はカテキンユニット当たりで示したものである。これより阻害剤を加えない対照系と比較して、チロシンの酸化を阻害していることがわかる。また、ポリマー濃度が高いほどチロシンの酸化が抑制された。図２にポリマーＡ〜Ｄ及びカテキンのモノフェノラーゼ阻害能力を示す（ポリマー濃度４０μＭ）。これより、カテキンでは吸光度の増加が対照系より高く、チロシンの酸化を促進していることがわかる。一方、ポリマーＡ〜Ｄではモノフェノラーゼ阻害が見られ、用いるアルデヒド種により阻害能力が異なり、アセトアルデヒドを用いて合成したポリマーＡが最も阻害能力に優れていることがわかった。
【００１５】
［試験例２］（ジフェノラーゼ作用の阻害能力の評価）
本例ではジフェノラーゼ作用の阻害能力を評価するため、チロシナーゼによるＤＯＰＡの酸化における４７５ｎｍの吸光度変化を測定した。測定は、チロシナーゼ（１００ユニット、マッシュルーム由来、ＳＩＧＭＡ製）と阻害剤（ポリマーＡ〜Ｄ：１００μＭ）をｐＨ＝６．８の０．１Ｍリン酸緩衝液と蒸留水との混合液（５：４重量比）に溶解させ、２５℃で１０分間インキュベートし、その後にＬ−ＤＯＰＡ（１ｍＭ）を加えて更に１０分間インキュベートさせて行った。阻害率（％）は以下の式から計算した。尚、対照実験は、阻害剤を混合液に添加しない以外は上記と同一条件とした。また、比較のために上記阻害剤に代えてルチン（１００μＭ）又はアルブチン（１００μＭ）を上記混合液に溶解させた以外は上記と同一条件で測定した。
【００１６】
【数１】
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Ｐ：対照実験における吸光度
Ｑ：熱処理により活性を無くしたチロシナーゼを用いた場合の吸光度
Ｒ：阻害剤を加えた場合の吸光度
【００１７】
評価結果を図３に示す。これより、重縮合体ではジフェノラーゼ阻害能力が認められるとともに、用いるアルデヒド種により阻害能力が異なり、アセトアルデヒドを用いて合成したポリマーＡが最も阻害能力に優れていることがわかった。一方、カテキンではＤＯＰＡの酸化を促進しており、比較のために評価したルチン、アルブチンといった低分子のフェノール類はジフェノラーゼ活性が見られたもののカテキン−アルデヒド重縮合体より阻害能力が低いことがわかった。
【００１８】
［試験例３］（経時安定性）
ポリマーＡを空気下、室温で半年以上放置後にＮＭＲを測定したところ、合成直後と全く同一であり、着色も見られなかった。試験例１と同様にモノフェノラーゼ活性に対する阻害を評価したところ、合成直後（図２における２０分後のポリマーＡ）と比べて２０分後の吸光度の増加率が３％以下であった。また、試験例２と同様にジフェノラーゼ活性に対する阻害を評価したところ、阻害率の低下は５％以下であった。
［試験例４］（細胞毒性）
２００μＭのポリマーＡ溶液を牛大動脈由来の血管内皮細胞に播種し、３７℃でインキュベートした。２４時間後のサンプルの顕微鏡観察を行ったところ、ほぼ全ての細胞が生存していたことから、血管内皮細胞に対するポリマーＡの低い細胞毒性が確認された。
［試験例５］（水中での耐酸化性）
ポリマーＡを室温、蒸留水中で攪拌し、ろ過により回収した。回収物のＮＭＲを測定したところ、合成直後と全く同一であり、着色も見られなかった。試験例１と同様にモノフェノラーゼ活性に対する阻害を評価したところ、合成直後（図２における２０分後のポリマーＡ）と比べて２０分後の吸光度の増加率が１％以下であった。また、試験例２と同様にジフェノラーゼ活性に対する阻害を評価したところ、阻害率の低下は３％以下であった。
【００１９】
【発明の効果】
本発明によると、フラボノイドをアルデヒド類との重縮合することにより、チロシナーゼ活性阻害作用を有するポリマーを提供することができる。これらのフラボノイド重合物はこの酵素阻害作用以外にもフラボノイドに起因する種々の機能を有しており、香粧品用及び食品用素材として有望である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１のポリマー濃度とモノフェノラーゼ活性阻害作用との関係を示すグラフである。
【図２】実施例１〜４のポリマーのモノフェノラーゼ活性阻害作用を示すグラフである。
【図３】実施例１〜４のポリマーのジフェノラーゼ活性阻害作用を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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