(57)【要約】【課題】ジンクフィンガータンパク質をコードするホヤ由来の新規遺伝子群、およびそのタンパク質に対する抗体などを提供する。【解決手段】本発明に係る新規のジンクフィンガータンパク質は、カタユウレイボヤから単離されたタンパク質であり、ＤＮＡに結合し、転写調節に関わる重要なタンパク質であると考えられる。このホヤ由来の新規のジンクフィンガータンパク質は、ホヤにおける発生遺伝子の時間的・空間的発現制御機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、発生遺伝子の時間的・空間的制御機構に関わる種々の病気の病態解析やその治療薬の開発、治療改善に有効利用できる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）２以上２４０以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるジンクフィンガータンパク質。
（ｂ）２以上２４０以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるジンクフィンガータンパク質。
【請求項２】
ホヤ由来である請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
１以上２３９以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列のオープンリーディングフレーム領域を有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【請求項５】
２以上２４０以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるジンクフィンガータンパク質。
【請求項６】
２以上２４０以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるジンクフィンガータンパク質。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項８】
請求項１から３のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項９】
請求項５又は６に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ジンクフィンガータンパク質をコードするホヤ由来の新規遺伝子群、およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、生物の発生についての研究が急速に進んでおり、このような発生の研究では種々の生物材料が使用されている。発生の研究は主として遺伝子を解析することにより行われるが、とりわけ、ヒトを含む脊椎動物、さらにはホヤ等の脊索動物の発生段階において特異的に発現する遺伝子の発現制御機構を解析することは、単に発生のメカニズムの解明のみならず、細胞の増殖・分化・再生のメカニズムの解明にも資するものである。さらに、このような解析により得られた知見は、医学上及び産業上への応用も期待されており、具体的には、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患の原因究明、さらにはその診断法や治療法の開発に貢献すること等が期待されている。
【０００３】
一方、遺伝子の発現を制御するタンパク質として、ジンクフィンガー（Ｚｎフィンガー：Ｚｎ　ｆｉｎｇｅｒ）モチーフをもつタンパク質が知られている。Ｚｎフィンガーは、タンパク質中の構造ドメインの１つであり、転写調節タンパク質など、ＤＮＡ結合タンパク質に存在することが知られている。Ｚｎフィンガーは、アフリカツメガエルの遺伝子の転写調節タンパク質（ＴＦＩＩＩＡ）において最初に発見され、ＤＮＡ結合モチーフとして提唱された。
【０００４】
上述のように、生物の発生についての研究対象となっている生物の１つにホヤが挙げられる。ホヤは、世界中の海に広く分布しており、岩やブイに付着して生活する生物である。ホヤの成体は、入水口及び出水口という２つの開口部を有しており、この開口部を通過する海水から栄養物を濾過摂食する。ホヤはすべて雌雄同体であり、ホヤの受精卵は、比較的短時間に胞胚、嚢胚、神経胚、尾芽胚を経て、オタマジャクシ型幼生へと変態する。ホヤの幼生は、しばらく遊泳したのち変態して成体となる。ホヤの形態形成パターンは、予定神経細胞が巻きあがって神経管を形成するなど、脊椎動物の発生様式とよく似ている。
【０００５】
ホヤは尾索動物群に属し、ナメクジウオを含む頭索動物、カエルやヒトを含む脊椎動物とともに脊索動物門を構成する。尾索動物は尾に脊索を持ち、頭索動物は脊索が頭部の先端まで延びており、脊椎動物は発生に伴って脊索が椎骨に置き換わる。これらの３つの動物群には、脊索、脊索の中空の神経管、咽頭の裂け目である鰓裂など、いくつかの共通した形質がある。脊索動物は、今から約５億年以上昔に、上述した脊索動物に特有の性質を獲得することによって、新口動物から進化してきたものと考えられている。新口動物とは、脊索動物、半索動物、及び棘皮動物を含む動物群である。半索動物の例としてはギボシムシが、棘皮動物の例としては、ウニ、ヒトデなどが挙げられる。
【０００６】
ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制（ボディプラン）は、両生類のオタマジャクシ幼生のミニチュア版ともいうべきものであり、脊椎動物の体制の最も単純な型（原型）を表している。そのため、脊椎動物の体制を研究する上で、ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制を調べることは、極めて重要な意味をもつ。また、ホヤの受精卵がどのように分裂して、胚を構成する各割球がどのような位置を占めて、最終的に何個のどのような細胞を生みだすのかというホヤの細胞系譜は、ほぼ完全に調べられている。
【０００７】
ホヤのオタマジャクシ型幼生を構成する細胞の数は少なく、２６５０個に満たない。しかしながら、ホヤのオタマジャクシ型幼生の頭部の背側には、耳に相当する平衡器と眼に相当する眼点とを含む中枢神経系が存在する。この中枢神経系を構成する細胞数は約３５０個であり、そのうち神経細胞は約８０個と見積もられている。上記中枢神経系の腹側には消化器系をつくりだす約５００個の細胞からなる内胚葉、首の部分には約９００個の細胞からなる間充織が存在する。間充織は、主として成体の中胚葉を形成する。
【０００８】
ホヤのオタマジャクシ型幼生の尾部の中央には、４０個の細胞からなる脊索、その両側には単核で横紋をもった筋肉が、背側にはグリア細胞からなる神経索、腹側には内胚葉索が存在し、幼生全体は１層の表皮によって覆われている。上記脊索は、上記内胚葉の誘導作用を受けて形成され、脊索動物の個体発生において重要な役割を果たす。形成された脊索は、その背側の外胚葉に働きかけて神経系形成を誘導するばかりでなく、脊索の両側における筋肉のパターン形成、及び消化器系の形成にも重要な働きをする。
【０００９】
本発明者は以前、カタユウレイボヤの尾芽胚における遺伝子発現プロファイルを報告している（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２８，２８９３−２９０４（２００１））。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、脊椎動物などを用いて発生段階に発現する遺伝子（発生遺伝子）の解析が急速に進められているが、脊椎動物において、発生遺伝子の機能の解析と、発生遺伝子の発現制御の解析とを行なうには、次の問題点がある。
【００１１】
脊椎動物は、進化にともなって、ゲノムレベルで２回の遺伝子重複が起こったと考えられており、この遺伝子重複が遺伝子機能のリダンダンシー（冗長性）を引き起こし、脊椎動物の遺伝子機能の解析を難しくしている。最近の研究では、脊索動物の共通の祖先から脊椎動物への進化のルートをたどった動物は、その進化の間に遺伝子の全体的な重複が２回おこったことが明らかになっている。
【００１２】
上記のように進化の間に遺伝子の全体的な重複が２回起こり、無脊椎動物の遺伝子数を約１万５千と仮定した場合、ヒトを含む脊椎動物の遺伝子数は、６万程度存在することになる。一般的に、Ａという親遺伝子が重複してＡ＋Ａ’になった場合、Ａはもともとの機能を保持し、Ａ’にはＡと異なった新しい機能が付加されると考えられている。
【００１３】
しかしながら、脊椎動物の進化時におこった発生遺伝子の重複は、ＡがＡ＋Ａ’＋Ａ’’＋Ａ’’’となっても、４つの遺伝子の機能は基本的に同じであるが、微妙にその空間的・時間的発現パターンを変えている。これによって、原型的な脊索動物には認められないような量的にも質的にも異なった器官及び組織をつくり出し、巧妙な遺伝子の相互作用によって機能を増し、現存する非常に複雑な体制を、脊椎動物は得たと考えられている。
【００１４】
上述のように、遺伝子重複による遺伝子機能のリダンダンシー（冗長性）が存在しているため、脊椎動物の遺伝子機能の解析は難しいという問題点がある。
【００１５】
最近の研究では、ハエ、線虫、カエル、哺乳類などの様々な動物の体づくりが、基本的には同じ遺伝子や分子を使ってなされているということが明らかになっている。また、脊索動物であるホヤの遺伝子は、前述のように、脊椎動物における遺伝子の重複がなく、遺伝子重複前の脊索動物の基本型を保っており、ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制は、脊索動物の体制の最も単純な型（原型）を表している。
【００１６】
したがって、脊索動物であるホヤは、ヒトを含む脊椎動物全般の発生メカニズムの解明に非常に適したモデル動物であり、ホヤにおいて発生段階に発現する遺伝子、とりわけその多くが転写因子として遺伝子の発現を制御するジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子は、発生の研究を進める上において有用であるのみならず、遺伝子治療や再生医療等の医療分野、さらには環境分野・食品分野などへの応用も期待されるものである。
【００１７】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ジンクフィンガータンパク質をコードするホヤ由来の新規遺伝子群、およびその利用方法を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記のように、ホヤの遺伝子には脊椎動物における遺伝子の重複がないこと、ホヤの発生遺伝子は遺伝子重複前の脊索動物の基本型を保っていること、及び、ホヤの発生遺伝子は脊索動物のボディプランの最も単純な型（原型）の形成に関与していることに着目した。
【００１９】
そこで、本発明者は、ホヤの発生遺伝子の時間的・空間的発現制御機構を解析することによって、脊椎動物の複雑な発生遺伝子の時間的・空間的発現制御機構の解明に重要な貢献をもたらすものと考えた。さらに、ホヤの発生遺伝子の時間的・空間的発現制御機構を解析するには、ホヤのＺｎフィンガーの機能を明らかにすることが重要であると考えた。
【００２０】
本発明者は、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）の受精卵・卵割期胚・尾芽胚・幼生・幼若体・精巣で発現する遺伝子のｍＲＮＡに対して、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ：発現配列タグ）解析を行った。その解析で得られた塩基配列情報をもとに相同性検索を行い、Ｚｎフィンガータンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの断片的塩基配列情報を得た。このｍＲＮＡの断片的な情報から、本発明者は、１２０個のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の全塩基配列を決定して、本発明を完成させるに至った。
【００２１】
本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする。
（ａ）２以上２４０以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるジンクフィンガータンパク質。
（ｂ）２以上２４０以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるジンクフィンガータンパク質。
【００２２】
なお、「２以上２４０以下の偶数の配列番号」とは、具体的に言うと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、及び２４０のことである。
【００２３】
上記「遺伝子」とは、ＤＮＡを含むものとする。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる。
【００２４】
上記「遺伝子」とは、ＲＮＡを含むものとする。なお、「遺伝子」がＲＮＡを意味するときは、塩基配列の「Ｔ（チミン）」を「Ｕ（ウラシル）」と読み替えて解釈するものとする。
【００２５】
本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２６】
本発明の遺伝子は、１以上２３９以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を有する。
【００２７】
なお、「１以上２３９以下の奇数の配列番号」とは、具体的に言うと、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、及び２３９のことである。
【００２８】
本発明の遺伝子は、１以上２３９以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有するものであってもよい。
【００２９】
ここで、「１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列」とは、公知のＤＮＡ組換え技術、変異導入方法により欠失、置換、挿入、及び／又は付加できる程度の数の塩基が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を意味する。
【００３０】
本発明の遺伝子は、ホヤ由来の遺伝子である。なお、ここで言うホヤとは、ホヤ類に属する動物を指す。ここで言うホヤとしては、例えば、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｓａｖｉｇｎｙｉ）、マボヤ（Ｈａｌｏｃｙｎｔｈｉａ
ｒｏｒｅｔｚｉ）などが挙げられる。
【００３１】
本発明のタンパク質は、２以上２４０以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるＺｎフィンガータンパク質である。
【００３２】
本発明に係るタンパク質は、細胞などから単離精製された状態であってもよいし、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよい。また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨＡやＭｙｃ、ｆｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００３３】
本発明に係るタンパク質は、２以上２４０以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるＺｎフィンガータンパク質であってもよい。
【００３４】
ここで、「１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法などの公知の変異タンパク質作製法により欠失、置換、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたことを意味する。
【００３５】
このように、上記タンパク質は、換言すれば、２以上２４０以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなる本発明に係る上記タンパク質、すなわちＺｎフィンガータンパク質の変異タンパク質である。ここにいう「変異」は、主として、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３６】
上記変異タンパク質の性質は特に限定されるものではなく、例えば、上記Ｚｎフィンガータンパク質と同様のＤＮＡ結合能を持つものであってもよいし、結合領域に変異を生じさせることにより結合能を増強したもの、結合能が弱まったもの、あるいは結合能が失われたものであってもよい。
【００３７】
本発明の組換え発現ベクターは、上記に記載の遺伝子を含んでいる。このベクターを用いると、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、形質転換体を得ることができる。さらに、そのベクターに含まれる遺伝子がコードする遺伝子を対象細胞（宿主細胞）内で発現させることにより、目的とするＺｎフィンガータンパク質を生産することができる。
【００３８】
本発明に係る形質転換体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（ホヤ、海洋生物、魚類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、ホヤは現在、実験動物・モデル動物として広く用いられており、本発明に係る遺伝子やタンパク質を用いた発生や再生等の研究に利用できるだけでなく、本発明に係る遺伝子やタンパク質のヒトホモログの関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などにも有用である。
【００３９】
本発明の遺伝子検出器具は、上記に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いている。
【００４０】
上記遺伝子検出器具は、Ｚｎフィンガータンパク質（特にホヤ由来のＺｎフィンガータンパク質）をコードする遺伝子の発現パターンのモニタリングを行なうことができる。本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子を基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。
【００４１】
本発明の抗体は、上記に記載のＺｎフィンガータンパク質に対する抗体である。上述のように、Ｚｎフィンガータンパク質は、遺伝子の発現制御に関与しているため、発生遺伝子の発現制御の研究に本発明の抗体を利用することができる。
【００４２】
なお、本発明に係るタンパク質に対する抗体の生産方法は、特に限定されるものではない。例えば、本発明に係るタンパク質に対する抗体は、本発明に係るタンパク質それ自体、又はそのタンパク質の部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法により、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。尚、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４４】
（１）ホヤについて
本実施の形態においては、ホヤの１種であるカタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）を用いた。カタユウレイボヤは、ホヤの中でも世界で広く研究されている種である。カタユウレイボヤのゲノムサイズは約１６０Ｍｂ（Ｍｂ＝１００万塩基）であり、カタユウレイボヤの遺伝子数は約１５，５００と見積もられている。これは、ショウジョウバエのゲノムサイズ及び遺伝子数にほぼ匹敵する。さらに、カタユウレイボヤの発生遺伝子の時間的・空間的発現を調節する配列（基本的プロモーター及びエンハンサー）のほとんどは、転写開始点の上流約１ｋｂ以内、場合によっては約２００塩基対以内におさまっている。したがって、カタユウレイボヤのゲノムは、多くの遺伝子が比較的コンパクトにつまった型のゲノムであることが予想される。
【００４５】
（２）ジンクフィンガー（Ｚｎフィンガー）について
次に、ジンクフィンガー（ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ）について説明する。ジンクフィンガーは、亜鉛（Ｚｎ）を補助因子として要求する構造ドメインである。ジンクフィンガーは、転写調節タンパク質など、ＤＮＡ結合タンパク質に存在する結合のための構造単位の１つである。
【００４６】
ジンクフィンガーは、アフリカツメガエルが持つ、５ＳＲＮＡの遺伝子の転写調節タンパク質ＴＦＩＩＩＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＩＩＡ）において最初に発見され、ＤＮＡ結合モチーフとして提唱されてきた。それ以来、ジンクフィンガーは、転写因子をはじめ、多くのタンパク質中に見出されている構造ドメインである。上記のように、Ｚｎフィンガーの多くは、ＤＮＡ結合に関与することが知られているが、タンパク質間の相互作用に関与するものも知られている。
【００４７】
Ｚｎフィンガーは、亜鉛結合部位の構造から、いくつかのタイプ（型）に分類できる。代表的な型としては、システイン残基２個とヒスチジン残基２個とからなる亜鉛結合部位をもつもの（Ｃ２Ｈ２型のＺｎフィンガー）と、システイン残基４個〜５個からなる亜鉛結合部位をもつもの（Ｃ４型のＺｎフィンガー）とがある。なお、「Ｃ」はシステインを、「Ｈ」はヒスチジンを示している。
【００４８】
Ｃ２Ｈ２型のＺｎフィンガーは、真核生物の転写因子（Ｓｐ１，　ＴＦＩＩＩＡ，　Ｚｉｆ２６８）によくみられる。Ｃ２Ｈ２型のＺｎフィンガーは３０残基からなり、多くの場合、「Ｃ−Ｘ２−４−Ｃ−Ｘ１２−Ｈ−Ｘ３−５−Ｈ」という基本構造をもち、この基本構造の繰り返しがみられる。
【００４９】
Ｃ４型のＺｎフィンガーは、核内レセプター因子群で多く見つかっており、独立した７０残基程度のＤＮＡ結合性ドメインをもち、「Ｃ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１３−Ｃ−Ｘ２−Ｃ」という基本構造をもっている。また、Ｚｎフィンガーの変型で、ＲＩＮＧフィンガーと呼ばれる一群のタンパク質（ＰＭＬ−１）もある。
【００５０】
ホヤにおいても、Ｚｎフィンガーは、転写調節又はタンパク質間の相互作用に関与する重要なタンパク質である。そのため、ホヤ由来のＺｎフィンガーの機能を個々に明らかにすることは、ホヤにおける発生遺伝子の時間的・空間的発現制御機構の解明に重要な貢献をもたらすとともに、脊椎動物における発生遺伝子の発現制御の解明にも重要な貢献をもたらす可能性が高い。
【００５１】
（３）タンパク質及び遺伝子について
次に、本実施の形態におけるタンパク質及び遺伝子について説明する。本実施の形態におけるタンパク質は、２以上２４０以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるジンクフィンガータンパク質である。
【００５２】
本実施の形態における遺伝子は、上記タンパク質をコードする遺伝子である。また、本実施の形態における遺伝子は、１以上２３９以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を有している。
【００５３】
上記オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域は、配列表の数字見出し＜２２２＞、および下記の表１〜表４の「翻訳領域」の項目に示している。例えば、配列番号１に示される塩基配列は、３２〜１４７４番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するが、この場合、配列表の数字見出し＜２２２＞の項においては「＜２２２＞　（３２）．．（１４７４）」のように示され、下記の表１〜表４の「翻訳領域」の項においては「３２〜１４７４」のように示される。
【００５４】
本発明者は、カタユウレイボヤの発生における遺伝子の発現プロファイルを解析する目的で、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）の受精卵・卵割期胚・尾芽胚・幼生・幼若体・精巣で発現する遺伝子のｍＲＮＡに対して、３’側７６，９２０及び５’側７６，２５０のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ：発現配列タグ）解析を行った。上記ＥＳＴ解析によって得られた塩基配列情報をもとに相同性検索（ＢＬＡＳＴ検索）を行い、約１５０のＺｎフィンガータンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの断片的塩基配列情報を得た。この中から１２０のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の全塩基配列を決定した。上記Ｚｎフィンガータンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列を、１以上２３９以下の奇数の配列番号に示す。また、上記Ｚｎフィンガータンパク質のアミノ酸配列を、２以上２４０以下の偶数の配列番号に示す。
【００５５】
【表１】
2004057126.tif 000002
【００５６】
【表２】
2004057126.tif 000003
【００５７】
【表３】
2004057126.tif 000004
【００５８】
【表４】
2004057126.tif 000005
【００５９】
次に、表に記載の事項について説明する。表１〜表１１において、「配列ＩＤ」の項目には、１２０個のＺｎフィンガータンパク質に振られた番号を記している。
【００６０】
表１〜表４について以下に説明する。「配列番号」の項目は、左側の列に当該Ｚｎフィンガータンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列と該ｃＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列とが併記されている配列の配列番号、右側の列に当該Ｚｎフィンガータンパク質のアミノ酸配列の配列番号を記している。すなわち、「配列番号」の項目の右側の列に記載の配列番号に示されるアミノ酸配列は、「配列番号」の項目の左側の列に記載の配列番号に示されるｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列とが併記された配列におけるアミノ酸配列のみを単独で示した配列である。
【００６１】
「ｃＤＮＡの長さ」の項目には、当該Ｚｎフィンガータンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列の総塩基数を記載している。「アミノ酸残基の数」の項目には、当該Ｚｎフィンガータンパク質のアミノ酸残基数を記載している。
【００６２】
「翻訳領域」の項目においては、アミノ酸翻訳開始位置（翻訳領域の項目における左側の数字）と、アミノ酸翻訳停止位置（翻訳領域の項目における右側の数字）とを示している。上記アミノ酸翻訳停止位置は、終止コドンを含まないものとする。すなわち、「翻訳領域」の項目は、当該Ｚｎフィンガータンパク質をコードする全長ｃＤＮＡ配列上におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を示している。
【００６３】
なお、「翻訳領域」の項目における右側の数値に「［　　］」を付しているものは、ＯＲＦの３’側がストップコドンで終わっていない可能性があると判定されたものである。「翻訳領域」の項目における左側の数値に「［　　］」を付しているものは、ＯＲＦの５’側にストップコドンがないなどの状況から、まだ実際には５’側が存在する可能性があると判定されたものである。
【００６４】
「Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ」の項目は、各Ｚｎフィンガータンパク質の種類を示している。「繰り返し数」の項目は、各Ｚｎフィンガータンパク質におけるＺｎフィンガー構造の繰り返し数を記載している。
【００６５】
本発明のＺｎフィンガータンパク質は、Ｚｎフィンガー部分の構造の違いにより、表１から表４の「Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ」の項目に示すように分類される。本発明のＺｎフィンガータンパク質は、Ｃ２Ｈ２型、ＤＨＨＣ型、ＲＩＮＧ型、ＰＨＤ型、ＣＣＣＨ型、ＣＣＨＣ型、Ｃ４型、Ｃ４ＣＨＨＣ型に分類される。
【００６６】
複数の型のＺｎフィンガー構造を有するＺｎフィンガータンパク質は、「／」で区切って各Ｚｎフィンガー構造の型を記載している。例えば、Ｃ２Ｈ２型及びＣＣＨＣ型のＺｎフィンガー構造を有するＺｎフィンガータンパク質は「Ｃ２Ｈ２／ＣＣＨＣ」のように記載している。
【００６７】
「ＲＩＮＧ／Ｃ２Ｈ２（Ｂ　ｂｏｘ）」、「Ｃ４（Ｔｉｍ１０　ＤＤＰ）」、「Ｃ４（ＡＮ１　ｌｉｋｅ）」、「Ｃ４ＣＨＨＣ（ＭＹＮＤ）」に示される「（）」は、「ＲＩＮＧ／Ｃ２Ｈ２」、「Ｃ４」、「Ｃ４ＣＨＨＣ」をさらに細かく分類したものである。
【００６８】
複数の型のＺｎフィンガー構造を有するＺｎフィンガータンパク質は、「繰り返し数」の項目においては、「／」で区切り、各Ｚｎフィンガー構造の繰り返し数を記載している。例えば、５個のＣ２Ｈ２型のＺｎフィンガー構造及び１個のＣＣＨＣ型のＺｎフィンガー構造を有するＺｎフィンガータンパク質の場合、「Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ」の項目には「Ｃ２Ｈ２／ＣＣＨＣ」のように記載し、「繰り返し数」の項目には「５／１」のように記載している。
【００６９】
なお、表１〜表４の「Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ」の項目において、例えば「［Ｃ２Ｈ２］」のように「［　　］」を付しているものは、すべてのＯＲＦ領域が含まれていない可能性があると判定されたものである。「［　　］」を付しているものは、他の生物との相同性検索の結果、及び５’側にストップコドンがないなどの状況から、まだ実際には５’側が存在する可能性があると判定されたものである。
【００７０】
Ｃ２Ｈ２型のＺｎフィンガードメインは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方に結合する機能を有する。また、Ｃ２Ｈ２型のＺｎフィンガードメインは、タンパク質間の相互作用に関与することが示唆されている。
【００７１】
ＤＨＨＣ型のＺｎフィンガードメインは、タンパク質間の相互作用又はタンパク質−ＤＮＡ間の相互作用に関与しているものと予測されている。
【００７２】
ＲＩＮＧ型のＺｎフィンガードメインは、タンパク質間の相互作用に関与しているものと示唆されおり、ユビキチン−タンパク質リガーゼＥ３（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｉｇａｓｅ　Ｅ３）活性を有するものや、ユビキチン共役タンパク質Ｅ２（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅｓ　Ｅ２）との結合を示すものが報告されている。
【００７３】
ＰＨＤ型のＺｎフィンガードメインは、クロマチンを媒介した転写調節に関与すことが示唆される核タンパクであるＣ４ＨＣ３型のＺｎフィンガー様ドメインであり、ＤＮＡ結合能を有するものと予測されている。
【００７４】
ＣＣＣＨ型のＺｎフィンガードメインは、核酸に結合するものと考えられており、様々なｍＲＮＡの３’非翻訳領域に相互作用するとの報告もある。
【００７５】
Ｃ４型のＺｎフィンガードメインは、ＤＮＡに結合する機能を有しており、Ｃ４型のＺｎフィンガータンパク質は、転写因子として機能するものと予測されている。
【００７６】
【表５】
2004057126.tif 000006
【００７７】
【表６】
2004057126.tif 000007
【００７８】
【表７】
2004057126.tif 000008
【００７９】
次に、表５〜表７について説明する。表５〜表７の項目は、「配列ＩＤ」の項目と、「発現プロファイル」の項目との大きく２つがある。「発現プロファイル」の項目には、「ＥＧ」、「ＣＬ」、「ＴＢ」、「ＬＶ」「ＡＤ」、「ｓｕｂｔｏｔａｌ」、「ＴＳ」、及び「ｔｏｔａｌ」の項目がある。「配列ＩＤ」の項目は、上記と同様、１２０個のＺｎフィンガータンパク質に振られた番号を示している。「発現プロファイル」の項目は、各発生段階及び精巣におけるＺｎフィンガータンパク質の発現頻度を示している。
【００８０】
「発現プロファイル」の「ＥＧ」、「ＣＬ」、「ＴＢ」、「ＬＶ」、「ＡＤ」は、それぞれ、受精卵（ＥＧ）、卵割期胚（ＣＬ）、尾芽胚（ＴＢ）、幼生（ＬＶ）、幼若体（ＡＤ）の各発生段階におけるＺｎフィンガータンパク質の発現頻度を示している。すなわち、各遺伝子の配列と同じ配列をもつｃＤＮＡクローンが、各発生ステージ（段階）由来のｃＤＮＡライブラリに何個存在するかという数を示したものである。
【００８１】
「発現プロファイル」の「ＴＳ」の項目は、精巣（ＴＳ）におけるＺｎフィンガータンパク質の発現頻度を記載している。「発現プロファイル」の「ｓｕｂｔｏｔａｌ」の項目は、受精卵（ＥＧ）、卵割期胚（ＣＬ）、尾芽胚（ＴＢ）、幼生（ＬＶ）、及び幼若体（ＡＤ）の時期における発現頻度の合計を示している。「発現プロファイル」の「ｔｏｔａｌ」の項目は、受精卵（ＥＧ）、卵割期胚（ＣＬ）、尾芽胚（ＴＢ）、幼生（ＬＶ）、幼若体（ＡＤ）、及び精巣（ＴＳ）における発現頻度の合計を示している。発現頻度は、ＥＳＴ解析により決定した。
【００８２】
抽出されたＲＮＡからバイアスをかけずに（その中に多く含まれているｍＲＮＡは多いまま、少ないｍＲＮＡは少ないまま）ｃＤＮＡライブラリを作製しており、又各発生段階ほぼ同数のクローンのＥＳＴ解析を行なっているため、上記「発現プロファイル」のデータは、各発現時期にそれぞれの遺伝子がどの程度発現しているかを表わす指標となる。
【００８３】
なお、配列ＩＤが１５番・１６番の遺伝子、配列ＩＤが２６番・２７番の遺伝子、配列ＩＤが４０番・４１番の遺伝子、配列ＩＤが９１番・９２番の遺伝子、配列ＩＤが１００番・１０１番の遺伝子、配列ＩＤが１０９番・１１０番の遺伝子、配列ＩＤが１１７番・１１８番の遺伝子、及び配列ＩＤが１１９番・１２０番の遺伝子は、それぞれ選択的スプライシング型（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｆｏｒｍ）の関係であることが示唆される遺伝子である。
【００８４】
上記選択的スプライシング型の関係が示唆される遺伝子については、選択的スプライシング型の関係にある遺伝子の発現頻度の合計をそれぞれ配列ＩＤ１５番、２６番、４０番、９１番、１００番、１０９番、１１７番、及び１１９番の「発現プロファイル」の項目に示した。
【００８５】
上記発現プロファイルに示す、受精卵（ＥＧ）の時期においては、発生のスタートとして、将来の胚の軸形成及びパターン形成にかかわる母性遺伝子ｍＲＮＡが蓄積していると考えられる。表中において、受精卵（ＥＧ）の時期にのみ発現している遺伝子としては、配列ＩＤが７番、９番、２０番、２２番、３９番、４３番、４５番、６０番、及び１０５番のものが挙げられる。それら遺伝子およびタンパク質は、発生のスタートとして将来の胚の軸形成及びパターン形成にかかわる遺伝子の転写調節に関与している可能性がある。
【００８６】
卵割期胚（ＣＬ）の時期においては、内胚葉、筋肉細胞などの細胞型の自律的分化にかかわる遺伝子が働いていると考えられる。さらに、卵割期胚（ＣＬ）の時期においては、脊索や神経などその分化に必要とされる細胞間相互に関連した分子が働いていると考えられる。表中において、卵割期胚（ＣＬ）の時期にのみ発現している遺伝子としては、配列ＩＤが４４番、４８番、５９番、８２番、８３番、８７番、及び９７番のものが挙げられる。それら遺伝子およびタンパク質は、内胚葉、筋肉細胞などの細胞型の自律的分化にかかわる遺伝子の転写調節に関与している可能性がある。
【００８７】
尾芽胚（ＴＢ）の時期においては、ホヤ幼生を構成する組織や器官の分化が始まるときであり、それぞれの組織形成にかかわる遺伝子が働いていると考えられる。表中において、尾芽胚（ＴＢ）の時期にのみ発現している遺伝子としては、配列ＩＤが２９番、３８番、及び１０７番のものが挙げられる。それら遺伝子およびタンパク質は、ホヤ幼生を構成する組織や器官の分化及び組織形成にかかわる遺伝子の転写調節に関与している可能性がある。
【００８８】
幼生（ＬＶ）の時期においては、ある意味では完全に分化し独特な機能をもった細胞の集まりからなるといえる。特に、神経系などの機能にかかわっている遺伝子の発現が期待される。表中において、幼生（ＬＶ）の時期にのみ発現している遺伝子としては、配列ＩＤが５３番のものが挙げられる。その遺伝子およびタンパク質は、神経系などの機能にかかわる遺伝子の転写調節に関与している可能性がある。
【００８９】
幼若体（ＡＤ）の時期においては、既に多くの成体器官の形成が進んでおり、幼生とは異なった遺伝子の発現が期待される。表中において、幼若体（ＡＤ）の時期にのみ発現している遺伝子としては、配列ＩＤが２５番のものが挙げられる。その遺伝子およびタンパク質は、幼生とは異なった発現を示す遺伝子の転写調節に関与している可能性がある。
【００９０】
【表８】
2004057126.tif 000009
【００９１】
【表９】
2004057126.tif 000010
【００９２】
【表１０】
2004057126.tif 000011
【００９３】
【表１１】
2004057126.tif 000012
【００９４】
次に、表８〜表１１について説明する。「配列ＩＤ」の項目は、上記と同様、１２０個のＺｎフィンガータンパク質に振られた番号を示している。「相同性検索の結果（ＢＬＡＳＴＸ）」の項目には、ＢＬＡＳＴ（ブラスト）検索の結果を記載している。上記相同性検索の結果を示す「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ」の項目には、データベース・アクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ）を示している。相同性検索の結果を示す「Ｄａｔａｂａｓｅ　ｅｎｔｒｙ　ｎａｍｅ」の項目には、データベースに登録されている名称を示している。「Ｏｒｇａｎｉｓｍ」の項目には生物名を、「ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ」の項目には確率（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）を示している。本実施の形態のタンパク質において、ＢＬＡＳＴ検索により結果が得られているものは、その検索結果と同様の機能を有する可能性が高い。
【００９５】
なお、「Ｄａｔａｂａｓｅ　ｅｎｔｒｙ　ｎａｍｅ」の項目において、「ｎｏｔ　ｅｎｏｕｇｈ　ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ」と記載されているものは、ＢＬＡＳＴ検索の結果、他の生物のＥＳＴクローンと相同性を示したものである。すなわち、ＥＳＴクローンであるため、その生物に存在することは確かであるが、機能や発現パターンが研究されていない（ｎｏｔ　ｅｎｏｕｇｈ　ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ）ものである。
【００９６】
なお、本実施の形態におけるタンパク質は、２以上２４０以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するジンクフィンガータンパク質であってもよい。
【００９７】
また、本実施の形態における遺伝子は、１以上２３９以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有する遺伝子であってもよい。
【００９８】
（４）遺伝子の取得方法
次に、本実施の形態における遺伝子の取得方法について説明する。本実施の形態における遺伝子の取得方法としては、例えば、上記の配列情報などに基づいて上記遺伝子を含むＤＮＡを単離して、クローニングする方法が挙げられる。具体的に言えば、まず、上記Ｚｎフィンガータンパク質をコードするＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製する。そして、ＤＮＡライブラリ、例えば、ホヤのＤＮＡライブラリ、ホヤのゲノムＤＮＡライブラリ、ホヤのｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすればよい。
【００９９】
上記プローブとしては、Ｚｎフィンガータンパク質をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡなど）の塩基配列、又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行なえばよい。
【０１００】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡを取得できたかを容易に確認することができる。
【０１０１】
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、上記スクリーニングによる方法以外にも、例えば、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）などの増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記Ｚｎフィンガータンパク質のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中から、それぞれプライマーを調製する。次に、これらプライマーを用いて、ホヤのＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなど）を鋳型にしてＰＣＲを行なう。このＰＣＲにより、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域が増幅されて、本発明の遺伝子を含むＤＮＡを大量に取得することができる。
【０１０２】
上記Ｚｎフィンガータンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有する遺伝子（変異遺伝子）は、例えば、次の方法によってＤＮＡを改変して作製することができる。その方法とは、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入する方法、部位特異的突然変異誘発法など、公知の変異導入方法である。
【０１０３】
なお、上記遺伝子を取得する方法は、上記方法に限定されるものではない。
【０１０４】
（５）タンパク質の取得方法
次に、本実施の形態におけるタンパク質の取得方法について説明する。本実施の形態におけるタンパク質の取得方法としては、例えば、上記遺伝子を微生物、動物細胞などに組み入れて、遺伝子がコードするタンパク質を得る方法などが挙げられる。
【０１０５】
上記方法を具体的に言うと、まず、上記の方法で取得したｃＤＮＡを、周知の方法により、大腸菌、酵母などの微生物、又は動物細胞などに組み入れる。なお、ここで使用するｃＤＮＡは、上記Ｚｎフィンガータンパク質、又はその相同分子などをコードするｃＤＮＡなどである。次に、そのタンパク質をコードするｃＤＮＡを発現させて、タンパク質を生産する。さらに、生産したタンパク質を精製することによって、本実施の形態のタンパク質を取得することができる。
【０１０６】
なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の組換え領域に宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター、及び、宿主には様々なものがある。そのため、それら発現ベクター及び宿主は、目的に応じて選択すればよい。また、生産したタンパク質は、用いた宿主と、タンパク質の性質とに応じて、適切な条件下で精製及び取得すればよい。
【０１０７】
上記Ｚｎフィンガータンパク質のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する変異タンパク質を作製する方法としては、次のような方法がある。例えば、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入して変異タンパク質を作製する方法、部位特異的突然変異誘発法、市販のキットを用いた方法、文献「細胞工学別冊　新細胞工学実験プロトコール　秀潤社　２４１−２４８　（１９９３）」に記載の方法などである。なお、部位特異的突然変異誘発法の詳細は、文献「ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ　１５２，２７１−２７５（１９９５）他」に記載されている。上記市販のキットを用いた方法で用いるキットとしては、例えば、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などが挙げられる。
【０１０８】
上記のように作製された変異タンパク質が、野生型と同様の活性・機能を有する例は既に多数知られている。さらに、そのタンパク質の活性又は機能に異常が発生するように変異を導入して、変異タンパク質を作製することも既に多く行われている。例えば、結合領域である上記Ｚｎフィンガータンパク質のＺｎフィンガー領域に変異を生じさせることによって、上記Ｚｎフィンガータンパク質の変異タンパク質を作製することができる。このような変異タンパク質は、野生型のＺｎフィンガータンパク質と比べて、ＤＮＡとの結合能について、結合能が増強された変異タンパク質、又は、結合能が弱まった変異タンパク質である可能性が高い。さらに、上記変異タンパク質は、ＤＮＡとの結合能が失われた変異タンパク質である可能性もある。
【０１０９】
なお、本実施の形態のタンパク質を取得する方法は、上記の方法だけに限定されるものではない。
【０１１０】
（６）遺伝子検出器具
次に、本実施の形態における遺伝子検出器具について説明する。本実施の形態の遺伝子検出器具は、例えば、上記に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いたものである。
【０１１１】
本実施の形態における遺伝子検出器具としては、例えば、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチド（プローブ）を固定化して作るＤＮＡチップが挙げられる。なお、ここで言う「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味する。しかし、ここで言う「ＤＮＡチップ」とは、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
【０１１２】
上記基盤上に固定化するオリゴヌクレオチドは、１以上２３９以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるＤＮＡ配列であって、そのＤＮＡ配列にあるコード領域内の７ヌクレオチド以上の連続したＤＮＡ配列、又はその連続したＤＮＡ配列の相補配列からなることがより好ましい。
【０１１３】
プローブとして用いる配列は、調製したｃＤＮＡのそれぞれについて、個々を識別することが可能な特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができる。プローブとして用いる配列は、例えばＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７６：１２６８，　１９９７；　Ｃｅｌｌ　８８：２４３，　１９９７；　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：４８４，　１９９５；　Ｎａｔｕｒｅ　３８９：３００，　１９９７；　米国特許第５，６９５，９３７　号）により決定することができる。
【０１１４】
なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
【０１１５】
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置してＺｎフィンガータンパク質をコードする遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なるＺｎフィンガータンパク質をコードする遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
【０１１６】
（７）形質転換体
次に、本実施の形態における組換え発現ベクター及び形質転換体について説明する。本実施の形態における組換え発現ベクターは、上記に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクターである。また、本実施の形態の形質転換体は、上記に記載の遺伝子の少なくとも１つを含有する組換えベクターを含むものである。
【０１１７】
なお、本実施の形態における組換え発現ベクターは、上記遺伝子を得て、公知の方法により取得することができる。
【０１１８】
本実施の形態における形質転換体は、上記遺伝子の取得方法を用いて、下記のように生産することができる。つまり、単離した上記遺伝子を、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入して、当該遺伝子を発現する形質転換体を生産すればよい。上記の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）としては、例えば、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＮＡ直接導入法、適切なベクター系を用いた導入法などが挙げられる。なお、これら遺伝子工学的手法は、対象細胞（宿主細胞）の種類に応じて最適なものを選択すればよい。
（８）抗体
次に、本実施の形態における抗体について説明する。本実施の形態における抗体は、本発明のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【０１１９】
上記抗体は、Ｚｎフィンガータンパク質の検出に極めて有効である。また、Ｚｎフィンガータンパク質は遺伝子の発現制御に関与しているため、発生遺伝子の発現制御の研究においても、上記抗体を利用することができる。
【０１２０】
本実施の形態における抗体は、例えば、次のようにして生産することができる。まず、本実施の形態におけるタンパク質を、上記に示した方法により取得する。次に、そのタンパク質自体、又はそのタンパク質の部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法により、抗体を得ることができる。なお、ここで言う従来公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎らの「単クローン抗体　ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」）に記載の方法が挙げられる。
【０１２１】
（９）有用性
上記のように、本発明に係るタンパク質は、本発明者によって初めて明らかにされた、ホヤの発生段階に発現する新規のジンクフィンガータンパク質である。したがって、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は以下の有用性を有する。
【０１２２】
前述のように、ハエ、線虫、カエル、哺乳類など、様々な動物の体づくりは、基本的には同じ遺伝子及び分子を使ってなされていることが明らかになっている。また、脊索動物であるホヤの遺伝子は、前述のように、脊椎動物における遺伝子の重複がなく、遺伝子重複前の脊索動物の基本型を保っており、ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制は、脊索動物のボディプランの最も単純な型（原型）を表している。
【０１２３】
したがって、脊索動物であるホヤの発生段階に発現する遺伝子の発現制御機構の解析により得られた知見は、単にホヤにおける発生のメカニズムの解明のみならず、ヒトを含む脊椎動物の発生のメカニズムの解明に資するものである。さらに、このような解析により得られた知見は、細胞の増殖・分化・再生のメカニズムの解明にも資するものである。また、このような解析により得られた知見は、医学上及び産業上へ有効利用できるものであり、具体的には、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患の原因究明、さらにはその診断法や治療法の開発などに有効利用できるものである。
【０１２４】
前述のように、ジンクフィンガータンパク質は、遺伝子の発現制御に関与しているので、例えば、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患においては、その疾患の原因となる遺伝子の発現を調節する等の治療法及び治療薬の開発に利用できる。例えば、発生段階において、ある遺伝子の発現が微量なために起こる疾患では、その疾患の原因となる遺伝子の発現を促進するジンクフィンガータンパク質を過剰発現させる等の治療法及び治療薬の開発に、本発明に係る遺伝子を利用することができる。
【０１２５】
発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患においては、その疾患の原因となる遺伝子に結合して、その遺伝子の転写を調節するジンクフィンガータンパク質に変異が生じている可能性も考えられる。本発明に係る遺伝子検出器具、及び本発明に係る抗体は、上記のようにジンクフィンガータンパク質に生じた変異が関わる遺伝子疾患の診断及び診断薬に利用できる。
【０１２６】
例えば、ウィルムス腫瘍、多指症、先天性ミエリン形成不全症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｈｙｐｏｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ）などの疾患は、Ｃ２Ｈ２型のＺｎフィンガータンパク質をコードする遺伝子に生じたミスセンス突然変異が原因とされている。
【０１２７】
男性ホルモン不能症候群、男性乳癌、くる病（Ｒｉｃｋｅｔｓ）、球脊髄性筋萎縮症、前立腺癌、遅発性の網膜色素変性症、男性における副腎皮質不全などの疾患は、Ｃ４型のＺｎフィンガータンパク質をコードする遺伝子に生じたミスセンス突然変異が原因とされている。
【０１２８】
本発明に係る遺伝子、とりわけＣ２Ｈ２型、Ｃ４型のＺｎフィンガータンパク質をコードする遺伝子は、上記のようなジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子に生じた変異が関わる遺伝子疾患の治療法及び治療薬の開発、並びに診断及び診断薬に利用することができる。
【０１２９】
ＲＩＮＧ型のＺｎフィンガードメインは、前述のように、ユビキチン−タンパク質リガーゼＥ３活性を有するものや、ユビキチン共役タンパク質Ｅ２との結合を示すものが報告されている。ユビキチンは、細胞内で不要になったタンパク質を分解するための目印となるタンパク質であり、原核生物から哺乳類までのほぼ全ての細胞に存在し、アルツハイマー病患者の脳内においても発見されている。また、パーキンソン病の原因遺伝子からつくられるタンパク質は、ユビキチンに類似した構造をもつ。
【０１３０】
本発明に係る遺伝子、とりわけＲＩＮＧ型のＺｎフィンガータンパク質をコードする遺伝子は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの疾患の治療法及び治療薬の開発、並びに診断及び診断薬の開発に利用できる可能性がある。
【０１３１】
本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、細胞の増殖・分化・再生のメカニズムを研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、種々の病気の病態解析やその治療薬の開発、治療改善に有効利用できる。例えば、再生医療分野においては、ジンクフィンガータンパク質をベクター等を用いて人為的に細胞内発現させることにより、幹細胞の分化の誘導及び分化した細胞の増殖を促すなどの治療法の開発に本発明に係る遺伝子、タンパク質等を利用することができる。
【０１３２】
本発明に係る遺伝子は、環境測定、特に海水などの水質調査に利用できる。例えば、発生段階の生物への影響を調べたい物質を加えて、人為的に調整した海水環境下で発生段階のホヤを飼育し、そのホヤにおける発生遺伝子の発現を本発明に係る遺伝子検出器具を用いて測定する。この場合、調査したい地域の海水を採取して、その採取した海水を用いて発生段階のホヤを飼育してもよい。
【０１３３】
上記のような環境測定により、種々の環境因子に対してそれぞれ感受性を示す遺伝子を特定することができる。例えば、ある地域の海水を用いて飼育したホヤのみが特別な遺伝子発現パターンを示した場合、その海水をさらに詳しく分析することにより、生物の発生に影響を与える環境因子を特定することができる。このような環境測定は、環境浄化や養殖など産業上広く利用できるものである。
【０１３４】
さらに、本発明の遺伝子は、ホヤの形質転換体の作製に利用できる。例えば、食用のホヤの改良に、本発明の遺伝子を利用できる。食用としてのホヤには、例えば、マボヤ（Ｈａｌｏｃｙｎｔｈｉａ　ｒｏｒｅｔｚｉ）が挙げられる。
【０１３５】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１３６】
Ｚｎフィンガータンパク質と、その遺伝子の配列（全長ｃＤＮＡ）とを、次の方法により決定した。
【０１３７】
（１）使用したホヤ
ホヤは、京都大学の舞鶴Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｔａｔｉｏｎ及び東北大学のＥｄｕｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂｉｏ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓで培養したカタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）を使用した。このホヤの成体を一定の光のもとで保持することにより、卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅ）の成熟を促した。
【０１３８】
ホヤの卵子及び精子（精巣）は、生殖輸管から外科的に採取した。必要に応じて、受精後、１．３％チオグリコール酸ナトリウム（Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）と、０．０６５％アクチナーゼＥ（Ｋａｋｅｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）とを含んだ海水に卵子を浸すことによって、受精卵からコリオンを除いた。洗浄後、寒天で覆われたシャーレ内で、５０μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンを含んでいるミリポア−フィルタでろ過された海水（ＭＦＳＷ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ　ｓｅａｗａｔｅｒ）とともに、室温（１８℃〜２０℃）下に受精卵を保持した。そのような環境に受精卵を保つことによって、ホヤの卵割期胚、尾芽胚、幼生、及び幼若体を得た。
【０１３９】
（２）ｃＤＮＡライブラリの作製
まず、上記カタユウレイボヤを用いて、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、ホヤの受精卵（受精直後）、卵割期胚、尾芽胚、幼生、幼若体、及び精巣から抽出した。また、酸グアニジウムチオシアネイト−フェノール−クロロホルム法（ＡＧＰＣ法）（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１６２，　１５６−１５９（１９８７））により、上記ＲＮＡを抽出した。
【０１４０】
上記ＡＧＰＣ法で抽出したＲＮＡを精製して、ｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を得た。なお、オリゴテクスビーズ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた２回の精製により、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを得た。
【０１４１】
上記精製されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、ＥｃｏＲＩ部位を５’末端に有し、ＸｈｏＩ部位を３’末端に有する２本鎖のｃＤＮＡに変換した。なお、その変換には、ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。
【０１４２】
次に、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで処理されたベクター（ｐＢＳＩＩ−ＳＫ（−））に、上記ｃＤＮＡを結合させた。そして、上記ｃＤＮＡが結合したベクターを、エレクトロポレーションにより、ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に導入して、ｃＤＮＡライブラリを得た。
【０１４３】
上記ライブラリは、Ｇｅｎｅｔｉｘ　Ｑ−Ｐｉｘロボットを使って３８４ウェルプレートに整列した。なお、上記ライブラリは、得られたＲＮＡの由来（受精卵、卵割期胚、尾芽胚、幼生、幼若体、及び精巣の由来）が分かるように作製されている。
【０１４４】
（３）塩基配列のシークエンス
塩基配列のシークエンスは、下記の方法で行った。まず、３８４ウェルプレートからクローンを取り出し、ｃＤＮＡ挿入断片をＰＣＲにより増幅した。その増幅は、アガロース電気泳動法を用いて、良好な増幅であることを確認した。
【０１４５】
上記ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を精製した後、オートシークエンサーを用いて、そのＰＣＲ産物の塩基配列を従来の手法で決定した。なお、オートシークエンサーは、Ａｃａｄｅｍｉａ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊａｐａｎのオートシークエンサー（ＡＢＩ３７００）を用いた。さらに、そのオートシークエンサーとともに、塩基配列の決定には、ビッグダイターミネータ（ｔｈｅ　ｂｉｇ−ｄｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）も用いた。なお、シークエンスにおいて、３’配列用のプライマーに固着オリゴｄＴプライマー（５’−（Ｔ）１７−Ｖ−３’）を、５’配列用のプライマーにＢＳ７４０（５’−ＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧ−３’）を用いた。
【０１４６】
（４）クラスタリング及び相同性検索
３’末端配列タグを用いてクローンの重複を調べ、クローンをクラスタに分類した。上記クラスタの分類には、ＦＡＳＴＡプログラムを用いた。それぞれのクラスタは、同一の遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンを含んでいる。
【０１４７】
次に、３’側７６，９２０のＥＳＴ及び５’側７６，２５０のＥＳＴの塩基配列について、相同性検索を行った。なお、相同性検索には、データベースとして、遺伝子データベース（ＤＤＢＪ　ＤＮＡデータベース）と、タンパク質データベース（ＤＡＤ）とを用いた。相同性検索には、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ）を用いた。
【０１４８】
（５）ｃＤＮＡ全長の決定
上記相同性検索の結果（ＢＬＡＳＴＸの結果）から、ジンクフィンガータンパク質に関する約１５０個のｍＲＮＡ断片を得た。この約１５０個のｍＲＮＡ断片は、ジンクフィンガータンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡである。
【０１４９】
上記約１５０のｍＲＮＡ断片の全塩基配列を決定したところ、これらは１２０個のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）に相当することがわかった。なお、決定したｃＤＮＡの全塩基配列（全長ｃＤＮＡ配列）は、本発明に係る上記Ｚｎフィンガータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域の塩基配列のほか、５’末端側と３’末端側とにそれぞれ非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むものである。
【０１５０】
（６）モチーフ検索
次に、上記全長ｃＤＮＡ配列の情報、上記ＯＲＦの情報などを用いて、アミノ酸配列を決定した。さらに、決定したアミノ酸配列を用いて、モチーフ検索を行った。そのモチーフ検索により、上記表１〜４の「Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ」の項目に示される各Ｚｎフィンガータンパク質の種類、及び表１〜４の「繰り返し数」の項目に示されるＺｎフィンガー構造の繰り返し数を決定した。
【０１５１】
なお、モチーフ検索には、主としてＧｅｎｏｍｅＮｅｔのモチーフ検索を用い、ＣｕｔＯＦＦの値はデフォルトのままとして、ライブラリは、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰｒｏＤｏｍ、ＰＲＩＮＴＳ、Ｐｆａｍを用いた。
【０１５２】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、発生遺伝子の時間的・空間的発現制御機構の解析に、特にホヤにおける発生遺伝子の時間的・空間的発現制御機構の解析に極めて有用であるという効果を奏する。さらに、本発明は、上記解析を通じて、医学上及び産業上への応用も期待されており、具体的には、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患の原因究明、さらにはその診断法や治療法の開発に有用であるという効果を奏する。
【０１５３】
【配列表】
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