(57)【要約】　　　（修正有）【課題】脂肪組織、特に、例えば、腹腔内脂肪組織における糖取り込み抑制能力を有する物質を探索するために必須となる、脂肪細胞における細胞内取り込み糖量の分析方法を提供する。【解決手段】細胞内取り込み糖量の分析方法であって、（１）脂肪細胞に、（ａ）糖取り込み促進蛋白質のアミノ酸配列、（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列等のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞内糖取り込み促進蛋白質及び被験物質を接触させる第一工程、及び（２）前記第一工程後に、前記脂肪細胞に含まれる取り込み糖量を測定する第二工程を有することを特徴とする分析方法等に関する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内取り込み糖量の分析方法であって、
（１）脂肪細胞に、下記のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞内糖取り込み促進蛋白質及び被験物質を接触させる第一工程、及び
（２）前記第一工程後に、前記脂肪細胞に含まれる取り込み糖量を測定する第二工程を有することを特徴とする分析方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
【請求項２】
第一工程が、脂肪細胞に本蛋白質を接触させた後、当該処理済みの脂肪細胞に被験物質を接触させる工程であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
第一工程が、脂肪細胞に本蛋白質を接触させると同時に又は前に、前記脂肪細胞に被験物質を接触させる工程であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項４】
第二工程における取り込み糖量の測定が、２−デオキシ−Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］グルコース量を指標とする測定であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項５】
第一工程で使用される脂肪細胞が腹腔内脂肪細胞であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項６】
第一工程で使用される脂肪細胞が成熟脂肪細胞であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項７】
第一工程が、脂肪細胞に本蛋白質をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換脂肪細胞に、被験物質を接触させる工程であることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項８】
脂肪細胞に、本蛋白質をコードする遺伝子が導入されてなることを特徴とする形質転換脂肪細胞。
【請求項９】
請求項１記載の分析方法により測定された、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における取り込み糖量を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の糖取り込み抑制能力を評価することを特徴とする糖取り込み抑制能力の検定方法。
【請求項１０】
請求項５記載の分析方法により測定された、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における取り込み糖量を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の糖取り込み抑制能力を評価することを特徴とする糖取り込み抑制能力の検定方法。
【請求項１１】
異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が糖取り込み抑制能力を有さない物質であることを特徴とする請求項９記載の検定方法。
【請求項１２】
異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が糖取り込み抑制能力を有さない物質であることを特徴とする請求項１０記載の検定方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の検定方法により評価された糖取り込み抑制能力に基づき糖取り込み抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とする糖取り込み抑制物質の探索方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の検定方法により評価された糖取り込み抑制能力に基づき糖取り込み抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とする糖取り込み抑制物質の探索方法。
【請求項１５】
請求項１３記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする糖取り込み抑制剤。
【請求項１６】
請求項１４記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする糖取り込み抑制剤。
【請求項１７】
選抜された物質が抗体であることを特徴とする請求項１５記載の糖取り込み抑制剤。
【請求項１８】
下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつ糖取り込み促進活性を有する蛋白質を有効成分とすることを特徴とする糖取り込み促進剤。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
【請求項１９】
脂肪細胞における糖取り込みを促進させるための、配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレトチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、からなる蛋白質の使用。
【請求項２０】
脂肪細胞における糖取り込みを促進させるための、配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレトチドで示される塩基配列を有するＤＮＡの使用。
【請求項２１】
脂肪細胞に対して有効量の、配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレトチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、からなる蛋白質を施用することを特徴とする糖取り込み促進方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脂肪細胞における細胞内取り込み糖量の分析方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物等の身体における代表的な脂肪組織としては、例えば、（１）腹側部、大腿部、臀部もしくは胸部等の皮下脂肪組織、（２）腎臓もしくは副睾丸等に接する脂肪組織、腸間膜脂肪組織、又は、大網脂肪組織等の腹腔内脂肪組織、（３）肝臓に含まれる脂肪組織、あるいは（４）胸腔内脂肪組織、等が知られている。このような脂肪組織、特に、例えば、腹腔内脂肪組織（中でも腸間膜脂肪組織及び大網脂肪組織等の門脈に流入する血管の周囲に存在する腹腔内脂肪組織）における細胞内糖取り込みは、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化などの代謝性疾患等の疾患の発症と密接に関連している。即ち、脂肪組織、特に、例えば、腹腔内脂肪組織への糖取り込みを抑えることにより、脂肪組織への糖取り込みの増大に密接に関連する前記疾患の治療または予防が可能となる。
これまでに、糖取り込み抑制能力を有する物質を見い出すためのいくつかの方法が知られているが、いずれの方法も脂肪組織、特に、例えば、腹腔内脂肪組織への糖取り込みを抑制する能力の評価には必ずしも充分なものではなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このために、脂肪組織、特に、例えば、腹腔内脂肪組織における糖取り込み抑制能力を有する物質を探索するために必須となる、脂肪細胞における細胞内取り込み糖量の効果的な分析方法の開発が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる細胞内糖取り込み促進蛋白質の存在を見い出し、当該蛋白質を利用することにより、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は、
１．細胞内取り込み糖量の分析方法であって、
（１）脂肪細胞に、下記のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞内糖取り込み促進蛋白質（以下、本蛋白質と記すこともある。）及び被験物質を接触させる第一工程、及び
（２）前記第一工程後に、前記脂肪細胞に含まれる取り込み糖量を測定する第二工程を有することを特徴とする分析方法（以下、本発明分析方法と記すこともある。）
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列；
２．第一工程が、脂肪細胞に本蛋白質を接触させた後、当該処理済みの脂肪細胞に被験物質を接触させる工程であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
３．第一工程が、脂肪細胞に本蛋白質を接触させると同時に又は前に、前記脂肪細胞に被験物質を接触させる工程であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
４．第二工程における取り込み糖量の測定が、２−デオキシ−Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］グルコース量を指標とする測定であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
５．第一工程で使用される脂肪細胞が腹腔内脂肪細胞であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
６．第一工程で使用される脂肪細胞が成熟脂肪細胞であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
７．第一工程が、脂肪細胞に本蛋白質をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換脂肪細胞に、被験物質を接触させる工程であることを特徴とする前項１記載の分析方法；
８．脂肪細胞に、本蛋白質をコードする遺伝子が導入されてなることを特徴とする形質転換脂肪細胞（以下、本発明形質転換脂肪細胞と記すこともある。）；
９．前項１記載の分析方法により測定された、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における取り込み糖量を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の糖取り込み抑制能力を評価することを特徴とする糖取り込み抑制能力の検定方法（以下、本発明検定方法と記すこともある。）；
１０．前項５記載の分析方法により測定された、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における取り込み糖量を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の糖取り込み抑制能力を評価することを特徴とする糖取り込み抑制能力の検定方法；
１１．異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が糖取り込み抑制能力を有さない物質であることを特徴とする前項９記載の検定方法；
１２．異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が糖取り込み抑制能力を有さない物質であることを特徴とする前項１０記載の検定方法；
１３．前項１１記載の検定方法により評価された糖取り込み抑制能力に基づき糖取り込み抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とする糖取り込み抑制物質の探索方法（以下、本発明探索方法と記すこともある。）；
１４．前項１２記載の検定方法により評価された糖取り込み抑制能力に基づき糖取り込み抑制能力を有する物質を選抜することを特徴とする糖取り込み抑制物質の探索方法；
１５．前項１３記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする糖取り込み抑制剤（以下、本発明糖取り込み抑制剤と記すこともある。）；
１６．前項１４記載の探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とすることを特徴とする糖取り込み抑制剤；
１７．選抜された物質が抗体であることを特徴とする前項１４記載の糖取り込み抑制剤；
１８．下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつ糖取り込み促進活性を有する蛋白質を有効成分とすることを特徴とする糖取り込み促進剤
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列；
１９．脂肪細胞における糖取り込みを促進させるための、配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレトチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、からなる蛋白質の使用；
２０．脂肪細胞における糖取り込みを促進させるための、配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレトチドで示される塩基配列を有するＤＮＡの使用；
２１．脂肪細胞に対して有効量の、配列番号１で示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレトチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、からなる蛋白質を施用することを特徴とする糖取り込み促進方法；
等を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明分析方法において用いられる「下記のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞内糖取り込み促進蛋白質」（本蛋白質）とは、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、（ｅ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｆ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、（ｇ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、（ｈ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつ、例えば、脂肪組織、特に、腹腔内脂肪組織由来の細胞における細胞内糖取り込み促進活性を有する蛋白質である。
【０００８】
ここで、前記（ｂ）にある「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」や前記（ｅ）及び（ｇ）にある「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）にある「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、糖取り込み促進活性を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
【０００９】
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ　ＮＴＩを用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４）を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはＶｅｃｔｏｒ　ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
【００１０】
前記（ｈ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１．５ＭＮａＣｌ、０．１５Ｍ　クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎ．　Ｙ．　（１９８９），　６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×ＳＳＣで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００１１】
本蛋白質は、細胞膜外へ分泌される蛋白質であることが好ましい。このような分泌性蛋白質は、特に後述するような、例えば、脂肪細胞に本蛋白質をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換脂肪細胞を利用する場合における本発明に適している。
【００１２】
本蛋白質の調製方法について以下に説明する。
まず、本蛋白質をコードする遺伝子（以下、本遺伝子と記すこともある。）、例えば、（Ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、（ＩＩ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列（即ち、配列番号１で示されるアミノ酸配列における第２７番目から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列）、（ＩＩＩ）前記（ＩＩ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、（ＩＶ）配列番号４で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列、（Ｖ）配列番号４で示される塩基配列等の塩基配列を有する遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法）に準じて取得する。次いで、得られた本遺伝子を用いることにより、通常の遺伝子工学的方法に準じて本蛋白質を製造・取得する。このようにして本蛋白質を調製することができる。
【００１３】
例えば、本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することで得られる培養物から本蛋白質を取得すればよい。上記プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本蛋白質をコードする遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。例えば、大腸菌での発現に使用される発現ベクターは、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクターであって、これらはファルマシア社、宝酒造等から市販されている。当該発現ベクターに本蛋白質をコードする遺伝子を導入するために用いられる制限酵素も宝酒造等から市販されている。さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本蛋白質をコードする遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ　Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ　２０，　ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，　ｐ２０２，　講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
【００１４】
哺乳動物細胞での発現に使用されるベクターは、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Ｒａｕｓ　ＳａｒｃｏｍａＶｉｒｕｓプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター、ａＰ２遺伝子プロモーター等のプロモーターを含む発現ベクターであって、これらは、東洋紡社、宝酒造社等から市販されている。
【００１５】
宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、本蛋白質の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
前記のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法により前記宿主細胞に導入することができる。
【００１６】
形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
【００１７】
本蛋白質の取得は、一般の蛋白質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離等で集め、該形質転換体を破砕または溶解せしめ、必要であれば蛋白質の可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、若しくは組み合わせることにより精製すればよい。精製された蛋白質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。また、例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離などで除去し、培養上清から本蛋白質を前記と同様にして精製してもよい。
【００１８】
本発明分析方法は、（１）脂肪細胞に、本蛋白質及び被験物質を接触させる第一工程、及び（２）前記第一工程後に、前記脂肪細胞に含まれる取り込み糖量を測定する第二工程を有する。
本発明分析方法の感度を高めるためには、例えば、第一工程におけるインシュリンの作用をできるだけ排除することがよい。第一工程においてインシュリンが存在すれば、当該分析方法は影響を受けることになり、その結果、分析上でのバックグランドが高くなる。これでは分析感度が低くなり、ひどい場合には分析困難になる。従って、第一工程では、脂肪細胞にインシュリンを実質的に接触させないことが好ましく、脂肪細胞に本蛋白質及び被験物質を接触させる系内におけるインシュリンの存在量をできるだけゼロに近づけること（実質的に非存在）がよい。　本発明分析方法において用いられる脂肪細胞は、動物の脂肪組織（特に、例えば、腹腔内脂肪組織）由来の脂肪細胞（特に、例えば、腹腔内脂肪細胞）である。当該脂肪細胞には、脂肪組織から分離された脂肪細胞や、同一の機能・形態を持つ集団を形成している脂肪細胞等も含まれる。前記動物としては、例えば哺乳動物等を挙げることができ、さらに具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ハムスターなどを挙げることができる。
【００１９】
ここで「脂肪組織」とは、（１）腹側部、大腿部、臀部もしくは胸部等の皮下脂肪組織、（２）腎臓もしくは副睾丸等に接する脂肪組織、腸間膜脂肪組織、又は、大網脂肪組織等の腹腔内脂肪組織、（３）肝臓に含まれる脂肪組織、あるいは（４）胸腔内脂肪組織、等を意味する。さらに「腹腔内脂肪組織」とは、腹腔内の腹直筋、外・内腹斜筋、腹横筋、腰方形筋、大腰筋および錐体の内側に存在する脂肪組織を意味し、腎臓もしくは副睾丸等に接する脂肪組織、腸間膜脂肪組織、大網脂肪組織、等を挙げることができる。本発明分析方法において用いられる脂肪細胞は、いかなる分化過程にある脂肪細胞であってもよく、例えば、前駆脂肪細胞、成熟脂肪細胞等を挙げることができる。好ましくは、成熟脂肪細胞が挙げられる。ここで前駆脂肪細胞とは、脂肪細胞としての素地を獲得した幹細胞が、脂肪細胞に分化することが決定づけられた細胞を指し、その形態としては細胞内に脂肪をまだ含有していない状態である。該前駆脂肪細胞は、組織から分離された後の細胞の倍加回数が４回以下であるとさらに好ましい。成熟脂肪細胞とは、前記の前駆脂肪細胞が細胞内に脂肪を蓄積できるように分化した細胞を指し、その形態としては細胞内に脂肪を蓄積した状態である（実験医学，　１４，　２２０９−２２１４，　１９９６）。
【００２０】
脂肪細胞は、基本的には下記と同様な方法に準じて調製することができる。ここでは、腹腔内脂肪組織から脂肪細胞を調製する場合を一例にして詳細に説明するが、他の脂肪組織の場合においても基本的には同様である。
まず、動物から腹腔内脂肪組織を摘出する。摘出された腹腔内脂肪組織は、細断した後、これを、例えばコラゲナーゼなどの組織分解性酵素で消化して細胞懸濁液を得る。得られた細胞懸濁液をＳｈｉｌｌａｂｅｅｒ　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｂｅｓｉｔｙ　２０，　Ｓ７７−Ｓ８３などに記載される方法に準じて、例えば遠心分離などにより分画し沈殿を回収することにより、前駆脂肪細胞に富む画分を調製する。また、得られた前駆脂肪細胞に分化誘導処理を施し、脂肪を蓄積させることによって、成熟脂肪細胞に富む画分を調製することもできる。分化誘導処理としては、例えば、インシュリン、デキサメサゾン、３−イソブチル−１−メチル−キサンチン、プロスタグランジンＪ２活性を有する物質などの分化誘導物質を一種以上添加した培地にて前駆脂肪細胞を培養する方法を挙げることができる。具体的には、Ｗｕ　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．　９，　２３５０−２３６３等に記載の方法に準じて行えばよい。ここで、プロスタグランジンＪ２活性を有する物質とは、前駆脂肪細胞に接触させた場合に、該前駆脂肪細胞を成熟脂肪細胞に分化させる能力がプロスタグランジンＪ２と同程度である物質を意味し、例えば、プロスタグランジンＪ２、１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２等を挙げることができる。分化誘導物質の培地への添加濃度は、分化誘導物質に応じて適宜選択すればよいが、例えば、インシュリンの場合には、約０．１μＭ〜約１０μＭ、デキサメサゾンの場合には、約０．１μＭ〜約２μＭ、３−イソブチル−１−メチル−キサンチンの場合には、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、プロスタグランジンＪ２の場合には、通常約５μＭ〜約２５μＭ、１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２の場合には、通常約１μＭ〜約１０μＭで良い。分化誘導処理を施す前駆脂肪細胞は、予めコンフレントになるように培養しておくとよい。分化誘導処理として行われる培養は通常の方法（例えば、バイオ実験イラストレイテッド▲６▼すくすく育て細胞培養，１９９６年、秀潤社刊等に記載されている方法）に準じて行うことができ、具体的には、例えば、３７℃、５％ＣＯ２下で培養する方法を好ましい態様として挙げることができる。
【００２１】
本発明分析方法の第一工程は、脂肪細胞に本蛋白質を接触させた後、当該処理済みの脂肪細胞に被験物質を接触させる方法でもよいし、また脂肪細胞に本蛋白質を接触させると同時に又は前に、前記脂肪細胞に被験物質を接触させる方法でもよい。即ち、脂肪細胞に、本蛋白質及び被験物質を接触させる順序は、どちらが先であってもよく、また同時であってもよい。
【００２２】
脂肪細胞と接触させる本蛋白質の濃度としては、通常約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌであればよく、約１ｎｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌが好ましい。脂肪細胞と本蛋白質とを接触させる時間は、通常５分間〜３０分間程度である。脂肪細胞と接触させる被験物質の濃度としては、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、１μＭ〜５０μＭが好ましい。脂肪細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常５分間〜３０分間程度であり、好ましくは１０分間〜２０分間程度である。
さらにまた本発明分析方法の第一工程は、例えば、脂肪細胞に本蛋白質をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換脂肪細胞に、被験物質を接触させる方法でもよい。
【００２３】
当該工程において、本発明形質転換脂肪細胞と接触させる被験物質の濃度は、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、１μＭ〜５０μＭが好ましい。脂肪細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常５分間〜３０分間程度であり、好ましくは１０分間〜２０分間程度が挙げられる。
【００２４】
前記本発明形質転換脂肪細胞は、以下のようにして調製することができる。
本遺伝子を、通常の遺伝子工学的手法を用いて、本遺伝子を導入する脂肪細胞において使用可能なベクターに、発現可能な形でプロモーターと接続されるように挿入することにより、プラスミドを作製する。ここで用いられるプロモーターは、本遺伝子が導入される脂肪細胞で機能可能なものであればよく、該細胞が動物細胞である場合には、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Ｒａｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａ　Ｖｉｒｕｓプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター、ａＰ２遺伝子プロモーター等が挙げられる。尚、このようなプロモーターをマルチクローニング部位の上流に含む市販のベクターを利用してもよい。
次いで、前記プラスミドを脂肪細胞へ導入する。脂肪細胞への導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気導入法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル形成法等を挙げることができる。リン酸カルシウム法としてはＧｒｉｍｍ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９３，　１０９２３−１０９２７等に記載される方法、電気導入法及びＤＥＡＥデキストラン法としてはＴｉｎｇ，　Ａ．　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　１５，　６１８９−６１９６等に記載される方法、ミセル形成法としてはＨａｗｋｉｎｓ，　Ｃ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９３，　１３７８６−１３７９０等に記載される方法を挙げることができる。ミセル形成法を用いる場合には、リポフェクトアミン（ギブコ製）やフュージーン（ベーリンガー製）等の市販の試薬を利用するとよい。
前記プラスミドの導入処理を施した脂肪細胞を、例えば、当該ベクターに予め含まれる選抜マーカー遺伝子を利用し、当該選択マーカー遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、本発明形質転換脂肪細胞を選抜することができる。さらに選抜を続けて、本遺伝子が染色体に導入されてなる安定形質転換体となった本発明形質転換脂肪細胞を取得してもよい。導入された本遺伝子が脂肪細胞中に存在する染色体上に組込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いるＰＣＲや、本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるサザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、ゲノムＤＮＡ中の本遺伝子の存在を検出・確認すればよい。
【００２５】
本発明分析方法において、脂肪細胞に含まれる取り込み糖量を測定する方法としては、脂肪細胞中の取り込み糖量を測定する方法であればどのような方法であってもよいが、例えば、脂肪細胞内に取り込まれた放射標識グルコースを定量する方法等を挙げることができる。脂肪細胞内に取り込まれた放射標識グルコースを定量する方法の具体的な例としては、（１）前述の脂肪細胞の調製に関する記載に準じた方法で調製された、脂肪組織から遊離させた成熟脂肪細胞を用いて細胞中に取り込まれた放射標識グルコースの量をオイルフローテーション法で測定する方法、（２）前述の脂肪細胞の調製に関する記載のように調製された前駆脂肪細胞を分化誘導し、脂肪を蓄積させた細胞（即ち、成熟脂肪細胞）を用いて、当該細胞中に取り込まれた放射標識グルコースの量を測定する方法等が挙げられる。遊離の成熟脂肪細胞を用いてオイルフローテーション法で測定する方法（前者）としては、例えば、Ｅｚａｋｉ，　Ｏ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６４，　１６１１８−１６１２２等に記載される方法を用いることができる。脂肪を蓄積させた細胞を用いて、当該細胞中に取り込まれた放射標識グルコースの量を測定する方法（後者）としては、例えば、医学の歩み，　１８４（６），　５０３−５０６，　１９９８等に記載される方法を用いることができる。
【００２６】
前記のようにして本発明分析方法により測定された、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における取り込み糖量を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の糖取り込み抑制能力を評価する。このようにして被験物質が有する糖取り込み抑制能力の検定（本発明検定方法）を行うことができる。
本発明検定方法において、前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が糖取り込み抑制能力を有さない物質（例えば、溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等であってもよい。）とすることで、他方の被験物質が有する糖取り込み抑制能力を評価してもよいし、また前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が有する糖取り込み抑制能力を基準としながら他方の被験物質が有する糖取り込み抑制能力を評価してもよい。
もちろん、本蛋白質と被験物質との両者を接触させた後の脂肪細胞に含まれる取り込み糖量（以下、測定値１と記す。）を、本蛋白質を接触させ、かつ被験物質を接触させなかった後の脂肪細胞に含まれる取り込み糖量（以下、測定値２と記す。）と比較することによって、当該被験物質の糖取り込み抑制能力を評価してもよい。この場合、糖取り込み抑制能力を、前記測定値を用いて、下記の式に従って糖取り込み抑制率として求めるとよい。
糖取り込み抑制率（％）＝｛（測定値２−測定値１）／測定値２｝×１００
また本発明検定方法において、（ｉ）脂肪細胞として脂肪組織から分離された脂肪細胞を用いる場合の本発明検定方法と（ｉｉ）脂肪細胞として同一の機能・形態を持つ集団を形成している脂肪細胞を用いる場合の本発明検定方法との両者を実施することにより高度な検定を行なうことも可能である。
【００２７】
さらに下記のような確認試験を補足・追加的に行なうことで、被験物質の糖取り込み抑制能力における、インシュリン依存型糖取り込み抑制能力との関連性を確認することもできる。ここでは、腹腔内脂肪組織から調製された脂肪細胞を用いた場合を一例にして詳細に説明するが、他の脂肪組織から調製された脂肪細胞の場合においても下記の方法に準じて確認試験を行なうことができる。具体的には、例えば、まず腹腔内脂肪組織から調製された細胞懸濁液をウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。）（ＧＩＢＣＯ製）、アスコルビン酸（和光純薬工業（株）製）、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）及びアンフォテリシン（ＧＩＢＣＯ社製）をそれぞれ終濃度１０％、２００μＭ、１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ及び２５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ／Ｌ　Ｄ−グルコース及び５８４ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン含有。ＧＩＢＣＯ製）（以下、ＦＢＳ含有培地と記す。）で適宜希釈し、１．４×１０５細胞／ｍｌとし、２４穴プレート（接着細胞培養用。岩城硝子製）に１ウエルあたり５００μｌずつ分注する。５％ＣＯ２存在下、３７℃にて１日間培養した後、２４穴プレートの各ウェルから培地を除き、５μＭ　１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（Ｃａｙｍａｎ製）及び１００ｎｇ／ｍｌ　インシュリンを含むＦＢＳ含有培地５００μｌを各ウェルに添加して５％ＣＯ２存在下、３７℃で２日間培養する。培養上清を除去し、５μＭ　１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（Ｃａｙｍａｎ製）及び１００ｎｇ／ｍｌ　インシュリンを含むＦＢＳ含有培地を添加して２日間培養する操作をさらに２回繰り返し、細胞内に脂肪を蓄積させる。次いで、２４穴プレートの各ウエルから培地を除き、ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）およびアンフォテリシン（ＧＩＢＣＯ社製）をそれぞれ終濃度０．５％、１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび２５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した低濃度グルコースダルベッコ改変イーグル培地（１ｇ／Ｌ　Ｄ−グルコースおよび５８４ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン含有。ＧＩＢＣＯ製）（以下、スタベーション培地と記す。）５００μｌを添加し、１６〜１８時間培養する。２４穴プレートの各ウエルから培地を除き、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（シグマ社製）を１０ｍＭとなるように添加した低濃度グルコースダルベッコ改変イーグル培地５００μｌを添加し、３時間培養する。各ウエルから培地を除き、８．２ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ　ＫＣｌ、０．２ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、１．１５ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．４６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｇ／Ｌ　ＣａＣｌ２を含む緩衝液（ｐＨ７．４。以下、ＤＢ緩衝液と記す。）５００μｌを添加し、通常の方法により細胞を洗浄する。各ウエルから緩衝液を除き、０．１％　ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す。）（シグマ社製）を含むＤＢ緩衝液（以下、ＤＢ−ＢＳＡ緩衝液と記す。）５００μｌを添加し、通常の方法により細胞を洗浄し、緩衝液を除いて新たなＤＢ−ＢＳＡ緩衝液５００μｌを添加し、供試細胞を得る。得られた供試細胞を含むウエルに３００μＭ　被験物質、及���１０％ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す、和光純薬工業（株）製）を含むリン酸緩衝液５μｌを添加して、３７℃で２０分間保温する。続いて、１００ｎｇ／ｍｌとなるようにインシュリンを添加し、３７℃で１０分間保温する。さらに１μＣｉ／ｍｌ　２−デオキシ−Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］グルコース（アマシャム社製）及び０．１ｍＭ　２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含むＤＢ−ＢＳＡ緩衝液（以下、ラベル液と記す。）０．２５ｍｌを添加し、３７℃で１０分間保温する。予め氷冷しておいた１００μＭ　フロレチン（シグマ社製）を含むＤＢ−ＢＳＡ緩衝液（以下、停止液と記す。）１ｍｌを添加し、反応を停止する。２４穴プレートのウエルから反応液を完全に除き、停止液５００μｌを添加し、通常の方法により細胞を洗浄する操作を２回繰り返す。０．１Ｎ　ＮａＯＨ　１５０μｌを添加し、細胞をウエルから完全に回収して、予め液体シンチレーター（パッカード社製）５ｍｌを注入したバイアルびんに添加する。液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で総放射能量を測定する（以下、測定値３と記す。）。本被験物質の代わりに１０％　ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液５μｌを添加する以外は同様の操作を行い、総放射能量を測定する（以下、測定値４と記す。）。これらの測定値から、下記の式に従って、本被験物質の糖取込み抑制率を算出する。
糖取り込み抑制率（％）＝｛（測定値４−測定値３）／測定値４｝×１００
上記確認試験において、実質的にゼロと判断される糖取り込み抑制率が得られる場合には、当該結果と先の本発明検定方法での結果（例えば、糖取り込み抑制能力が有りとの結果）とを組み合わせることにより、当該被験物質は非インシュリン依存型糖取り込みを抑制すると判断することができる。逆に、上記確認試験において、統計学的に有意な値であると判断される糖取り込み抑制率が得られる場合には、当該結果と先の本発明検定方法での結果（例えば、糖取り込み抑制能力が有りとの結果）とを組み合わせることにより、当該被験物質はインシュリン依存型糖取り込みと非インシュリン依存型糖取り込みとの両者を抑制すると判断することができる。
【００２８】
糖取り込み抑制物質を探索するには、本発明検定方法により評価された糖取り込み抑制能力に基づき糖取り込み抑制能力を有する物質を選抜すればよい（本発明探索方法）。
例えば、被験物質の糖取り込み抑制能力を表わす糖取り込み抑制率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、３０％以上を示す物質、より好ましくは５０％以上を示す物質を、糖取り込み抑制能力を有する物質として選抜する。尚、当該物質は、糖取り込み抑制能力を有する限り、低分子化合物、蛋白質又はペプチド等のいかなる物質であってもよい。
【００２９】
本発明探索方法によって選抜された物質は糖取り込み抑制能力を有しており、糖取り込み抑制剤の有効成分として使用してもよい。
以下に、本蛋白質の糖取り込み促進活性を抑制（消失も含む）する能力を有する抗体を選抜する場合（即ち、糖取り込み抑制物質が抗体である場合）における本発明探索方法の具体例を述べる。
【００３０】
まず、本蛋白質の抗体を調製する。
（１）抗原の調製
前記の方法で調製される本蛋白質を抗原として用いることができるが、例えば、本蛋白質のアミノ酸配列のうち特有な部分アミノ酸配列を含む抗原性ペプチドを高分子量化する方法、または該抗原性ペプチドを直接的またはスペーサーを介して間接的に高分子量担体分子に結合した複合体を得る方法等により抗原を作製することもできる。これらの方法は、それ自身では低分子量で抗原性が低い、すなわち不完全抗原である抗原性ペプチドを、高分子量化することで完全抗原化する方法である。
抗原性ペプチドの選抜方法は、例えば、抗ペプチド抗体実験プロトコール（大海忍、辻村邦夫、稲垣昌樹著、秀潤社刊、１９９４年発行）に記載される蛋白質中のエピトープ予測法を用いて行うことができる。通常、１０〜２０個のアミノ酸からなるペプチドを抗原性ペプチドとして選抜する。選抜された抗原性ペプチドは、抗ペプチド抗体実験プロトコール（大海忍、辻村邦夫、稲垣昌樹著、秀潤社刊、１９９４年発行）に記載された通常の合成及び精製方法に準じて調製すればよく、さらに必要に応じて高速液体クロマトグラフィー等の通常の方法により純度の高いものにすることができる。
抗原性ペプチドを高分子量化する方法としては、例えば、Ｔａｍらの考案したＭＡＰ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｅｐｔｉｄｅ）法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８５，　ｐ５４０９）を挙げることができる。
抗原性ペプチドを直接的にまたはスペーサーを介して間接的に高分子量担体分子に結合した複合体を得る方法において使用される高分子量担体分子は、抗原性ペプチド及びこれらにスペーサーが結合した化合物（以下、両者をまとめて不完全抗原と記す。）との結合反応に利用可能な反応基を有し、かつ該不完全抗原に結合されることにより免疫原性を獲得し得るか、または既に存在する免疫原性を高められ得る巨大分子化合物であればよい。
【００３１】
（２）哺乳動物の免疫感作化工程および抗体取得
（１）に記載される方法により調製した抗原を用いて、例えば、Ｊ．　Ａｓｓｏｃ．　Ｏｆｆ．　Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．　７０，　１０２５−１０２７等に記載されるＮｅｗｓｏｍｅ　Ｗ．　Ｈ．らによる通常の免疫感作の方法に従い、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ等の哺乳動物を免疫する。抗原は、１回または複数回投与すればよい。
抗原は、例えば、約７ないし約３０日、特に約１２ないし約１６日間隔で、３または４回の投与等が好ましい。投与量は１回につき、例えば、抗原約０．０５ｍｇから２ｍｇ程度を目安とする。投与方法は、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を選択することができる。好ましくは静脈内、腹膜腔内もしくは皮下投与を挙げることができ、特に好ましくは皮下注射と腹膜腔内注射との組合せが挙げられる。
そして、上記の哺乳動物を０．５ないし４ケ月間処置せずに放置した後、該哺乳動物の血液を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇したら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば１００μｇないし１ｍｇの抗原の投与量で１回ないし５回の投与が行われる。最後の投与の１ないし２ケ月間後に免疫感作した哺乳動物から通常の方法により血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いることによる沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離、精製することにより、ポリクローナル抗血清を調製する。このようにして本蛋白質の抗体を得ることができる。
また、上記の免疫感作した哺乳動物から免疫適格Ｂ細胞を単離し、該免疫適格Ｂ細胞を、連続的に細胞分裂し得る腫瘍細胞と融合し、生成する融合細胞を単離する。所望の抗体を産生する融合細胞を選択し、クローン化し、該融合細胞からモノクローナル抗体を調製することにより、本蛋白質の抗体を得ることも可能である。以下にこのような抗体の取得方法について詳述する。
モノクローナル抗体を産生する融合細胞の作製は通常の方法、例えば、ハイブリドーマテクニックス（コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）又は細胞組織化学（山下ら，日本組織細胞化学学会編，１９８６）等に記載される方法により行うことができる。免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物を用いることができる。通常マウスが最も汎用され、Ｂａｌｂ／ｃマウス、その他の系（ｓｔｒａｉｎ）のマウスを用いることができる。この際、十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるように、免疫計画および抗原の濃度を選べばよい。例えばマウス１匹に０．０５ｍｇから２ｍｇの抗原を２週間間隔で腹腔に３回免疫する。必要に応じてさらに０．０５ｍｇから２ｍｇを静脈に投与してもよい。最終免疫の数日後に細胞融合のための脾臓を摘出する。
前記のように免疫した哺乳動物の個体から脾臓を無菌的に摘出し、当該組織から細胞懸濁液状態の脾臓細胞を調製する。該脾臓細胞（抗体産生細胞）を適当な骨髄腫細胞と、適当な融合促進剤の存在下で細胞融合させる。骨髄腫細胞としては免疫動物と同種の哺乳動物に由来するものが望ましいが、ラット、ハムスター等の脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融合させることもできる。好ましい融合の比率は約２０：１〜約２：１の範囲である。約１０８個の脾臓細胞について０．５ｍｌ〜１．５ｍｌの融合促進剤の使用が適当である。好ましい融合促進剤としては、例えば平均分子量１０００〜４０００ポリエチレングリコールを使用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤、例えばセンダイウイルス（別名ＨＶＪ）を用いることもできる。また、融合促進剤を使用せずに電気ショックを用いる方法により細胞融合を行ってもよい。
融合細胞は、未融合の脾臓細胞、未融合の骨髄腫細胞および融合細胞の混合物を、未融合の骨髄腫細胞が生育できない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１時間）培養することにより選択する。培地は薬剤抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）かつ未融合の骨髄腫細胞が生育できない選択培地（例えばＨＡＴ培地）が使用される。該選択培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。また、未融合の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間（例えば１週間）後に死滅する。これに対して、融合細胞は親骨髄腫細胞の腫瘍性と、親脾臓細胞の性質を併せ持つため、選択培地中で生育できる。
得られた融合細胞についてスクリーニングを行い、本蛋白質と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する融合細胞を選択する。スクリーニング方法としては、得られた抗体の特異性について、多くの検体を簡単、迅速に、感度よく検出できる方法であればよく、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、酵素標識抗体測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、マイクロウエスタンブロッティング等が挙げられる。酵素標識抗体測定法としては、さらに具体的には、ストレプトアビジンとビオチンを利用した方法、二抗体サンドイッチ法等が挙げられる。
選択された融合細胞を適当な方法（例えば限界希釈法）でクローン化した後、モノクローナル抗体を得る。融合細胞を一定期間、適当な培地で培養することにより、その培養上清からモノクローナル抗体を得ることができる。また、融合細胞を免疫動物の腹腔内に注射し、一定時間後の当該免疫動物の血液および腹水からモノクローナル抗体を得ることもできる。
【００３２】
次に抗体クラスの決定・確認を行う。抗体クラスは、通常の方法、例えばアイソタイピングキット（アマシャムファルマシア製）を用いて添付のプロトコールに基づき決定・確認することができる。さらに、抗体クラスに適した方法で、抗体を精製する。モノクローナル抗体はもともと特異性、抗体価ともに高いので、融合細胞を無血清培地で培養し、培養上清を濃縮、硫酸アンモニウムによる塩析行うことによって免疫グロブリン画分を調製すれば簡便に純度の高い抗体を得ることができる。抗体クラスがＩｇＭの場合には、ゲル濾過により夾雑する非特異的ＩｇＧを除くことができる。また、市販のＨｉＴｒａｐ　ＩｇＭカラム（アマシャムファルマシア製）を用いて、添付のプロトコールに基づき精製してもよい。一方、ＩｇＧクラスの抗体の場合には、プロテインＡ又はプロテインＧ（アマシャムファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製が可能である。他の方法としては、抗原結合担体によるアフィニティークロマトグラフィーや種々の担体（例えば陰イオン交換体、陽イオン交換体、ハイドロキシアパタイト、シリカ）を用いた高速液体クロマトグラフィーを挙げることができる。
【００３３】
上記のようにして調製された抗体等を被験物質とした本発明分析方法により、脂肪細胞に含まれる取り込み糖量を測定する。ここで、抗体等の被験物質としては異なる２種以上の物質を各々独立して用いて本発明分析方法を実施するとよい。
【００３４】
本発明分析方法により測定された、抗体等の被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における、脂肪細胞に含まれる取り込み糖量を比較することにより得られる差異に基づき前記被験物質の糖取り込み抑制能力を評価する。このようにして抗体等の被験物質が有する糖取り込み抑制能力の検定（本発明検定方法）を行うことができる。
この場合、前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質が糖取り込み抑制能力を有さない物質（例えば、溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等であってもよい。）とすることで、他方の被験物質（即ち、上記のようにして調製された抗体）が有する糖取り込み抑制能力を評価してもよいし、また前記異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質（即ち、上記のようにして調製された抗体のうちの一つの抗体）が有する糖取り込み抑制能力を基準としながら他方の被験物質（即ち、前者以外の抗体）が有する糖取り込み抑制能力を評価してもよい。
もちろん、本蛋白質と被験物質（即ち、上記のようにして調製された抗体）との両者を接触させた後の脂肪細胞に含まれる取り込み糖量（以下、測定値５と記す。）を、本蛋白質を接触させ、かつ被験物質を接触させなかった（例えば、溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等が本発明でいう被験物質となる場合に相当する。）後の脂肪細胞に含まれる取り込み糖量（以下、測定値６と記す。）と比較することによって、該被験物質の糖取り込み抑制能力を評価してもよい。この場合、糖取り込み抑制能力を、前記測定値を用いて、下記の式に従って糖取り込み抑制率として求めるとよい。
糖取り込み抑制率（％）＝｛（測定値６−測定値５）／測定値６｝×１００
糖取り込み抑制抗体（いわゆる中和抗体）を探索するには、本発明検定方法により評価された糖取り込み抑制能力に基づき糖取り込み抑制能力を有する抗体を選抜すればよい。
例えば、被験物質である抗体の糖取り込み抑制能力を表わす糖取り込み抑制率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的に好ましくは、例えば、３０％以上を示す物質、より好ましくは５０％以上を示す物質を、糖取り込み抑制能力を有する抗体（いわゆる中和抗体）として選抜することができる。
【００３５】
本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする糖取り込み抑制剤（以下、本糖取り込み抑制剤と記す。）は、その有効量を経口的または非経口的にヒト等の哺乳動物に対し投与することができる。例えば、経口的に投与する場合には、本糖取り込み抑制剤は錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の通常の形態で使用することができる。また、非経口的に投与する場合には、本糖取り込み抑制剤を溶液、乳剤、懸濁液等の通常の液剤の形態で使用することができる。前記形態の本糖取り込み抑制剤を非経口的に投与する方法としては、例えば注射する方法、坐剤の形で直腸に投与する方法等を挙げることができる。
【００３６】
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本糖取り込み抑制剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよく、注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００３７】
本糖取り込み抑制剤の適用可能な疾患としては、例えば、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化などの代謝性疾患等の疾患等をあげることができる。この場合、本糖取り込み抑制剤が腹腔内脂肪組織における糖取り込み抑制能力に優れていることが好都合である。
【００３８】
本発明において、腹腔内脂肪組織への糖取り込みに特に注目する場合には、腹腔内脂肪細胞における細胞内取り込み糖量の分析方法を基本とした発明を実施すればよい。この場合には、［１ａ］　細胞内取り込み糖量の分析方法であって、（１）腹腔内脂肪細胞に、本蛋白質及び被験物質を接触させる第一工程、及び（２）前記第一工程後に、前記腹腔内脂肪細胞に含まれる取り込み糖量を測定する第二工程を有する分析方法や、［１ｂ］（１）腹腔内脂肪細胞に本蛋白質をコードする遺伝子が導入されてなる形質転換腹腔内脂肪細胞に、被験物質を接触させる第一工程、及び（２）前記第一工程後に、前記形質転換腹腔内脂肪細胞に含まれる取り込み糖量を測定する第二工程を有する分析方法等の分析方法が適しており、同様に、［２］　当該分析方法により測定された、被験物質として異なる２種以上の物質を各々独立して用いた区における取り込み糖量を比較することにより得られる差異に基づき前記物質の糖取り込み抑制能力を評価する腹腔内脂肪細胞における糖取り込み抑制能力の検定方法、［３］　当該検定方法により評価された腹腔内脂肪細胞における糖取り込み抑制能力に基づき腹腔内脂肪細胞における糖取り込み抑制能力を有する物質を選抜する腹腔内脂肪細胞における糖取り込み抑制物質の探索方法、［４］　当該探索方法により選抜された物質またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする腹腔内脂肪細胞における糖取り込み抑制剤等が好都合である。
【００３９】
【実施例】
以下に本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４０】
実施例１　（本遺伝子の単離：配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子の単離）
ヒト腹腔内脂肪組織からグアニジンチオシアネート／セシウムクロライド法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，　Ｊ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１８，　５２９４，　１９７９）により調製された全ＲＮＡ１．０μｇを鋳型にして、これとｃＤＮＡ合成キット（宝酒造社製）に添付のオリゴｄＴプライマーとを混合した後、１ｍＭ　ｄＮＴＰの存在下でＭＭＴＶ逆転写酵素（宝酒造製）５０ユニットを添加し、室温で１０分間、次いで４２℃、１５分間、さらに９９℃、５分間保温することによって、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
続いて当該１本鎖ｃＤＮＡ２．０μｇを鋳型に用いて、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの各２０ｐｍｏｌをプライマーとして、２００μＭ　ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２存在下でＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー製）１ユニットを添加し、９４℃、１分間、さらに７２℃、２分間の保温を１サイクルとしてこれを５５サイクル行う条件下でＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し（泳動バッファー；トリス−硼酸緩衝液（ナカライテスク製））、約１．５ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから切り出し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．著：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ」、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）に記載される方法により、プラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒造製）のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした。クローニングされたＤＮＡの塩基配列を、Ｔａｑ　Ｄｙｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＫｉｔおよびＴａｑ　Ｄｙｅ　Ｄｅｏｘｙ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製）を用いてアプライドバイオシステムズ製の３７３Ａ型のＤＮＡシークエンサーにより決定した。当該ＤＮＡは配列番号４で示される塩基配列からなり、当該塩基配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードしていた。
このようにして配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子を単離した。
【００４１】
実施例２　（配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の発現プラスミドの調製）
配列番号１で示されるアミノ酸配列における第１番目のアミノ酸から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を産生させるための発現プラスミドは、実施例１において増幅・単離されたＤＮＡを、通常の遺伝子工学的方法によって公知の発現ベクター（ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６：Ｔａｋｅｂｅ，　Ｙ．，　Ｓｅｉｋｉ，　Ｍ．，Ｆｕｊｉｓａｗａ，　Ｊ．，　Ｈｏｙ，　Ｐ．，　Ｙｏｋｏｔａ，　Ｋ．，　Ａｒａｉ，　Ｋ．，　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｍ．，　ａｎｄ　Ａｒａｉ，　Ｎ．，Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　Ｊａｎ．　１９８８，　ｐ４６６−４７２）に組み込みことにより調製された。このようにして調製された発現プラスミドで、フュージーン試薬（ベーリンガー製）を用いて、試薬に添付のプロトコールに記載の方法と同様な方法によりサル由来のＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ製）を形質転換した。
【００４２】
実施例３　（本蛋白質の調製：配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質標品の調製）
配列番号１で示されるアミノ酸配列における第１番目のアミノ酸から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、実施例２で形質転換されたサル由来のＣＯＳ１細胞を、通常の動物細胞培養法に従って培養することにより培地中に当該蛋白質を分泌させ、さらに分泌された蛋白質を通常の蛋白質分離法に従って培地中から回収・精製することにより蛋白質標品として得た。当該蛋白質標品について、そのＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量を測定したところ、５２ｋＤであった。
【００４３】
実施例４　（脂肪細胞の調製）
（１）脂肪組織の摘出
１４週齢の雄性のＩＣＲマウス（日本エスエルシー）１０匹を屠殺・開腹し、副睾丸周囲に付着した脂肪組織（以下、本脂肪組織と記すこともある。）を摘出した。摘出された本脂肪組織を、リン酸緩衝液（０．２０ｇ／Ｌ　ＫＣｌ、０．２０ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、８．００ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、２．１６ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１００ユニット／ｍｌペニシリン（ＧＩＢＣＯ製）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）、２５０ｎｇ／ｍｌアンフォテリシン（ＧＩＢＣＯ製））約３０ｍｌに浸し、室温で洗浄した。
【００４４】
（２）脂肪組織からの脂肪細胞の調製と培養
洗浄後の本脂肪組織について次に示す処理を行った。
即ち、まず本脂肪組識を、コラゲナーゼ（タイプＩＩまたはＶＩＩＩ。シグマ社製）、ペニシリン（ＧＩＢＣＯ製）、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）及びアンフォテリシン（ＧＩＢＣＯ製）をそれぞれ終濃度１ｍｇ／ｍｌ、１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ及び２５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ／Ｌ　Ｄ−グルコースおよび５８４ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン含有。ＧＩＢＣＯ製）約３０ｍｌ中でハサミを用いて約５ｍｍ角に細断した。次いで、これを３７℃で６０分間振とう（約１７０ｒｐｍ）し、ナイロンメッシュ（８０Ｓ［目の大きさが２５０μｍ］。三紳工業製）で濾過し、濾液を回収した。当該濾液を室温で１８００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、液層をデカンテーションにより静かに除去し、沈査を得た。得られた沈査を、ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。）（ＧＩＢＣＯ製）、アスコルビン酸（和光純薬工業（株）製）、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）およびアンフォテリシン（ＧＩＢＣＯ社製）をそれぞれ終濃度１０％、２００μＭ、１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび２５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ／Ｌ　Ｄ−グルコースおよび５８４ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン含有。ＧＩＢＣＯ製）（以下、ＦＢＳ含有培地と記す。）３０ｍｌに懸濁し、当該懸濁液をナイロンメッシュ（４２０Ｓ［目の大きさが２５μｍ］。三紳工業製）で濾過した。濾液を回収し、室温で１８００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、液層をデカンテーションにより静かに除去し、沈査を再度ＦＢＳ含有培地３０ｍｌに懸濁した。当該懸濁液について、遠心分離、液層除去、ＦＢＳ含有培地に懸濁するという操作を更に２回、前記と同様に行い、懸濁液を調製した。当該懸濁液を細胞培養用フラスコ（接着細胞用Ｔ１５０。岩城硝子製）に注入し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養開始２〜３時間後に培地を除き、フラスコの器壁を１５ｍｌの前記リン酸緩衝液で洗浄した。洗液を除き、当該洗浄操作を再度行った後、リン酸緩衝液を除き、３０ｍｌのＦＢＳ含有培地をフラスコに添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培養開始１日後に培地を除き、１５ｍｌのリン酸緩衝液でフラスコの器壁を１回洗浄した後、当該フラスコにトリプシン−エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（以下、ＥＤＴＡ・４Ｎａと記す。）溶液（０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭ　ＥＤＴＡ・４Ｎａを含む。ＧＩＢＣＯ製）１〜２ｍｌを細胞が浸るように添加し、３７℃で５分放置した。これに、ＦＢＳ含有培地をトリプシン−ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液の約１０倍量添加し、細胞懸濁液を得た。
【００４５】
実施例５　（本蛋白質の糖取込み促進活性に関する試験）
（１）供試細胞の調製
実施例４で本脂肪組織から得られた細胞懸濁液をＦＢＳ含有培地で適宜希釈し、１．４×１０５細胞／ｍｌとし、２４穴プレート（接着細胞培養用。岩城硝子製）に１ウエルあたり５００μｌずつ分注した。５％ＣＯ２存在下、３７℃にて１日間培養した後、２４穴プレートの各ウェルから培地を除き、５μＭ　１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（Ｃａｙｍａｎ製）および１００ｎｇ／ｍｌ　本蛋白質標品を含むＦＢＳ含有培地５００μｌを各ウエルに添加して５％ＣＯ２存在下、３７℃で２日間培養した。培養上清を除去し、５μＭ　１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（Ｃａｙｍａｎ製）および１００ｎｇ／ｍｌ　本蛋白質標品を含むＦＢＳ含有培地を添加して２日間培養する操作をさらに２回繰り返し、細胞内に脂肪を蓄積させた。次いで、２４穴プレートの各ウエルから培地を除き、ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）及びアンフォテリシン（ＧＩＢＣＯ社製）をそれぞれ終濃度０．５％、１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび２５０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した低濃度グルコースダルベッコ改変イーグル培地（１ｇ／Ｌ　Ｄ−グルコースおよび５８４ｍｇ／Ｌ　Ｌ−グルタミン含有。ＧＩＢＣＯ製）（以下、スタベーション培地と記す。）５００μｌを添加し、１６〜１８時間培養した。２４穴プレートの各ウエルから培地を除き、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（シグマ社製）を１０ｍＭとなるように添加した低濃度グルコースダルベッコ改変イーグル培地５００μｌを添加し、３時間培養した。各ウエルから培地を除き、８．２ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ　ＫＣｌ、０．２ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、１．１５ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．４６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｇ／Ｌ　ＣａＣｌ２を含む緩衝液（ｐＨ７．４。以下、ＤＢ緩衝液と記す。）５００μｌを添加し、通常の方法により細胞を洗浄した。各ウエルから緩衝液を除き、０．１％　ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと記す。）（シグマ社製）を含むＤＢ緩衝液（以下、ＤＢ−ＢＳＡ緩衝液と記す。）５００μｌを添加し、通常の方法により細胞を洗浄し、緩衝液を除いて新たなＤＢ−ＢＳＡ緩衝液５００μｌを添加した。一方、インシュリン分化区については、本蛋白質標品の代わりに１００ｎｇ／ｍｌのインシュリンを添加することにより細胞内に脂肪を蓄積させること以外は同様の操作を行い、供試細胞を得た。
【００４６】
（２）糖取込み活性の測定
実施例５（１）で得られた供試細胞を含むウエルに６００ｎｇ／ｍｌとなるように本蛋白質標品を添加し、３７℃で１０分間保温した。さらに１μＣｉ／ｍｌ２−デオキシ−Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］グルコース（アマシャム社製）、０．１ｍＭ　２−デオキシ−Ｄ−グルコース、を含むＤＢ−ＢＳＡ緩衝液（以下、ラベル液と記す。）０．２５ｍｌを添加し、３７℃で１０分間保温した。予め氷冷しておいた１００μＭ　フロレチン（シグマ社製）を含むＤＢ−ＢＳＡ緩衝液（以下、停止液と記す。）１ｍｌを添加し、反応を停止した。２４穴プレートのウエルから反応液を完全に除き、停止液５００μｌを添加し、通常の方法により細胞を洗浄する操作を２回繰り返した。０．１Ｎ　ＮａＯＨ　１５０μｌを添加し、細胞をウエルから完全に回収して、予め液体シンチレーター（パッカード社製）５ｍｌを注入したバイアルびんに添加した。液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で総放射能量を測定した（以下、測定値７と記す。）。実施例５（１）で得られた供試細胞を含むウエルに本蛋白質標品の代わりにＤＢ−ＢＳＡ緩衝液を添加する以外は同様の操作を行い、総放射能量を測定した（以下、測定値８と記す。）これらの測定値から、下記の式に従って、本蛋白質の糖取込み促進率を算出した。
糖取込み促進率（％）＝（測定値７／測定値８）×１００
本蛋白質による糖取込み促進率は１６７％であった。
また、実施例５（１）でインシュリン分化区として得られた供試細胞を用いて、本蛋白質標品の代わりにインシュリン６００ｎｇ／ｍｌを添加すること以外は上記に記載される方法と同様な方法に準じてインシュリンによる糖取込み促進率を算出した結果、１７８％であった。本蛋白質が、インシュリンの生理作用として広く公知である脂肪細胞における糖取込み作用を示すことが確認された。
【００４７】
実施例６　（本発明検定方法：被験物質の糖取込み抑制能力の検定）
実施例５（１）で得られた供試細胞を含むウエルに３００μＭ　被験物質（Ｎ−（４−ピリジルメチル）−４−（ｔｅｒｔ−ブチル）フェニルスルフォンアミド：下記の化学構造式を有する。以下、本被験物質と記す。）
【化１】
2004057137.tif 000002
及び１０％　ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す、和光純薬工業（株）製）を含むリン酸緩衝液５μｌを添加して、３７℃で２０分間保温した。続いて、１００ｎｇ／ｍｌとなるように本蛋白質標品を添加し、３７℃で１０分間保温した。さらにラベル液０．２５ｍｌを添加し、３７℃で１０分間保温した。予め氷冷しておいた停止液１ｍｌを添加し、反応を停止した。２４穴プレートのウエルから反応液を完全に除き、停止液５００μｌを添加し、通常の方法により細胞を洗浄する操作を２回繰り返した。０．１Ｎ　ＮａＯＨ　１５０μｌを添加し、細胞をウエルから完全に回収して、予め液体シンチレーター（パッカード社製）５ｍｌを注入したバイアルびんに添加した。液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で総放射能量を測定した（以下、測定値９と記す。）。本被験物質の代わりに１０％　ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液５μｌを添加する以外は同様の操作を行い、総放射能量を測定した（以下、測定値１０と記す。）。これらの測定値から、下記の式に従って、本被験物質の糖取込み抑制率を算出した。
糖取込み抑制率（％）＝｛（測定値１０−測定値９）／測定値１０｝×１００
その結果、本蛋白質標品１０分処理下での本被験物質による糖取込み抑制率は５４％であった。
また、本蛋白質標品の代わりにＤＢ−ＢＳＡ緩衝液を添加すること以外は前記と同様な方法に準じて、本蛋白質無処理下での本被験物質による糖取込み抑制率を算出した結果、２３％であり、前記本蛋白質処理下での被験物質による糖取込み抑制率より低かった。本被験物質の糖取込み抑制能力検定における、本蛋白質添加の効果が確認された。
【００４８】
実施例７　（モノクローナル抗体の調製）
（７−１）マウスの免疫感作
実施例３で得られた本蛋白質標品によりマウスを免疫する。マウスは７週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（チャールズリバー（株））を５匹使用する。１週間の予備飼育の後、マウス一匹あたり１００μｇの本蛋白質標品を完全フロイントアジュバント（ディフコ製）１００μｌと混合して腹腔内投与する。さらに２週間後に前記と同量の本蛋白質標品を不完全フロイントアジュバント（ディフコ製）１００μｌと混合して同様に、腹腔内投与する。さらに２週間後、および４週間後に前記と同量の本蛋白質標品／不完全フロイントアジュバント混合物を腹腔内投与する。
【００４９】
（７−２）細胞融合
前記（７−１）に記載される操作により抗体価の上昇したマウスから脾臓細胞を調製する。得られた脾臓細胞（１０８細胞／ｍｌ）１ｍｌとマウス骨髄腫細胞Ｐ３／Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（２×１０７細胞／ｍｌ）１ｍｌを２４穴プレートのウエル内で混合し、通常の方法（例えば、大河内ら，実験医学，５，１３１５−１３１９等に記載の方法）に従って、細胞融合装置（ＳＳＨ−２、島津製作所製）にて電気的に融合させる。得られた融合細胞をＦＢＳ、メルカプトエタノール、ピルビン酸をそれぞれ１０％、５０μＭ、１ｍＭ含むＨＡＴ培地（ＧＩＢＣＯ製）に懸濁し、９６穴プレート（ヌンク製）に１ウエルあたり１００μｌずつ分注する。
該細胞懸濁液が分注された９６穴プレートを５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養する。２日後に各ウエルから培地を除き、前記ＨＡＴ培地１００μｌを添加する操作を繰り返しながら約１０日間培養する。
【００５０】
（７−３）融合細胞の選択とクローニング
前記の操作により増殖可能な融合細胞を選抜する。該融合細胞の培養上清を用いて、ＥＬＩＳＡ法により本蛋白質の抗体が産生されていることを確認する。
まず、本蛋白質標品を１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、２．７ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４および１．８ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）を含有する溶液（以下、ＰＢＳ溶液と記す。）で、２μｇ／ｍｌとなるように希釈し、コーティング液を調製する。当該コーティング液をポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートに、１ウエルあたり５０μｌずつ分注した後、４℃で一晩保温する。コーティング液を除去した後、各ウエルに３００μｌのＰＢＳ溶液を添加し、ウエル内部を洗浄する。次にＰＢＳ溶液を除去した各ウエルにブロッキング溶液（ブロックエース、大日本製薬製）を１ウエルあたり２００μｌ添加した後、室温で２時間保温してブロッキングを行う。
ブロッキング液を除去後、各ウエルに０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ溶液（以下、洗浄液と記す。）３００μｌ添加し、ウエル内部を洗浄する。洗浄液を除去した後、前記融合細胞の培養上清を１ウエルあたり５０μｌ添加し、室温で１時間保温する。該抗原抗体反応液を除去した後、１ウエルあたり３００μｌの洗浄液を添加し、ウエル内部を洗浄する。次いで、ペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社製）を１ウエルあたり５０μｌ添加し、室温で１時間保温する。抗マウスＩｇＧ溶液を除去し、１ウエルあたり３００μｌの洗浄液を添加し、ウエル内部を洗浄する。ウエル内の洗浄液を除去し、新たな洗浄液を添加し、洗浄する操作をさらに２回繰り返す。最後に洗浄液を除去した後、オルトフェネレンジアミン／過酸化水素水溶液（オルトフェネレンジアミン１０ｍｇ／２５ｍｌ、３０％過酸化水素水２μｌ／２５ｍｌ）を１ウエルあたり１００μｌ添加し、マイクロタイタープレートをアルミホイルで被覆し、室温で２０分間保温する。保温後、２Ｎ　硫酸を１ウエルあたり５０μｌ添加し、ペルオキシダーゼ反応を停止する。各ウエルの発色を分光光度計を用いて、４９０ｎｍ及び５９５ｎｍの吸光度を測定し、両者の差を算出する（以下、Δ４９０−５９５ｎｍと記す。）。
融合細胞の培養上清を種々の倍率で希釈した溶液を用いて上記のＥＬＩＳＡ法を行い、同一希釈率で大きいΔ４９０−５９５ｎｍを示す融合細胞を選抜する。これにより本蛋白質に対して高い親和性を示す融合細胞クローンを得る。さらに、選抜した融合細胞クローンについて、培養上清を種々の倍率で希釈した溶液を用いて上記のＥＬＩＳＡ法を行い、高い希釈率でも大きいΔ４９０−５９５ｎｍを示すクローンを力価が高いとして選抜する。
上記のようにして得られた融合細胞クローンに対して限界希釈法（例えば、黒木ら，実験医学「細胞工学ハンドブック」，羊土社刊等に記載されている方法）によるクローニングを行う。
【００５１】
（７−４）抗体の精製
上記の方法で選抜した融合細胞クローンを、ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、メルカプトエタノール、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）をそれぞれ終濃度１０％、１ｍＭ、５×１０−５Ｍ、１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌとなるように添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ製）（以下、血清培地と記す。）に５×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌになるように懸濁して、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養する。２〜３日ごとに培地を除去し、新たな血清培地を添加する操作を繰り返しながら、細胞濃度が５×１０６〜１×１０７細胞／ｍｌ程度まで増殖させた後、培養液を１，５００ｒｐｍ、３分間、４℃で遠心分離して沈査を回収する。回収した沈査をペニシリン、ストレプトマイシンをそれぞれ終濃度１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌとなるように添加したＣＤハイブリドーマ（ＧＩＢＣＯ製）（以下、無血清培地と記す。）に、５×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌになるように懸濁して、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養する。培地を除去し、新たな血清培地を添加し、培養する操作を２〜３日ごとに繰り返しながら、融合細胞濃度が５×１０６〜１×１０７細胞／ｍｌ程度まで増殖させた後、培養液を１，５００ｒｐｍ、３分間、４℃で遠心して上清を回収する。回収された上清（融合細胞上清）を０．２２μｍのフィルターで濾過して濾液を得る。
該濾液を用いてアイソタイピングキット（アマシャムファルマシア製）により添付のプロトコールに従って、当該濾液中に含まれる抗体の抗体クラスを確認する。
前記濾液から、モノクローナル抗体トラップキット（アマシャムファルマシア製）を用いてＩｇＧを精製する。具体的には、蒸留水５ｍｌとキットに添付の結合バッファー５ｍｌで予め洗浄、平衡化したＨｉＴｒａｐ　ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ベッド体積１ｍｌ）に、結合バッファーで２倍に希釈した前記濾液を供する。さらに結合バッファー７ｍｌでカラムを洗浄した後、溶出バッファー６ｍｌをカラムに供する。あらかじめキットの中和液７５μｌが入ったチューブに溶出液を１ｍｌずつ分取する。各チューブの溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定し（以下、測定値１１と記す。）、ＩｇＧのモル吸光係数＝１．３５から下記の式に従ってＩｇＧの回収量を算出する。
ＩｇＧ回収量（ｍｇ）＝測定値１１／１．３５×１
また、前記濾液から、ＨｉＴｒａｐ　ＩｇＭ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎカラム（アマシャムファルマシア製）を用いて、添付のプロトコールに従ってＩｇＭを精製する。ＩｇＧの場合と同様にして、ＩｇＭの回収率を算出する。
【００５２】
実施例８　（本発明探索方法）
実施例７に記載された方法で得られたモノクローナル抗体（被験物質）の糖取り込み抑制能力を測定する。
実施例４と同様にして本脂肪組織から得られる細胞懸濁液の希釈液（１．４×１０５細胞／ｍｌ）を２４穴プレート（接着細胞培養用。岩城硝子製）に１ウエルあたり５００μｌずつ分注し、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて１日間培養する。２４穴プレートの各ウエルから培地を除き、５μＭ　１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（Ｃａｙｍａｎ製）および１００ｎｇ／ｍｌ　本蛋白質標品を含むＦＢＳ含有培地５００μｌを各ウエルに添加して５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養する操作を繰り返しながら５〜６日間培養し、細胞内に脂肪を蓄積させる。脂肪を蓄積した細胞に実施例５と同様の操作を施し供試細胞を得る。前記供試細胞を含むウエルにモノクローナル抗体を終濃度０．０１〜１ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、１０〜２０分間保温する。続いて、１００ｎｇ／ｍｌとなるように本蛋白質標品を添加し、３７℃で１０分間保温する。さらにラベル液０．２５ｍｌを添加して、実施例６と同様の操作により総放射能量を測定する（以下、測定値１２と記す。）。一方、モノクローナル抗体無添加区については、モノクローナル抗体を添加しないこと以外は同様の操作を行い、総放射能量量を測定する（以下、測定値１３と記す。）。これらの測定値から下記の式に従って、モノクローナル抗体（被験物質）による糖取り込み抑制率を算出する。
糖取り込み抑制率（％）＝｛（測定値１３−測定値１２）／測定値１３｝×１００
その結果、上記糖取り込み抑制率が、３０％以上を示す場合、当該モノクローナル抗体は糖取り込み抑制能力を有する物質として選抜される。
【００５３】
実施例９　（本発明形質転換脂肪細胞の調製）
（１）プラスミドの調製
配列番号５と配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡ各１０ｐｍｏｌをプライマーとして、マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック製）から、配列番号７で示される塩基配列を含むＤＮＡを増幅する。即ち、ＥｘＴａｑポリメラーゼ２．５ユニット（宝酒造製）を用いて、９４℃で２分間、５８℃で２分間、７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを１サイクル、次に９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１分間の保温を１サイクルとしてこれを５５サイクル、最後に７２℃で５分間保温の条件でＰＣＲ反応を行う。増幅されたＤＮＡをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、得られた約１．５ｋｂの断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）（東洋紡製）のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅＳＫ／ｍ０８５（図１）を得る。ｐＢｌｕｅＳＫ／ｍ０８５のＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ部位に、プラスミドｐＥＥ６（Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄ．　Ｒｅｓ．，　１７，　７１１０）をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化して得られる約０．５ｋｂの断片を挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅＳＫ／ｍ０８５／ｐｏｌｙＡ（図２）を得る。次に、ｐＢｌｕｅＳＫ／ｍ０８５／ｐｏｌｙＡから、配列番号７で示される塩基配列を含むＤＮＡおよびＳＶ４０ＥポリＡを含むＢａｍＨＩ断片（約１．７ｋｂｐ）を取得し、末端平滑化反応を施す。得られる約１．７ｋｂの断片を、マウスａＰ２プロモーター領域（約５．４ｋｂ）を有するプラスミド（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，　Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｍｔ，　１２，　３１８２）のＳｍａＩサイトに挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅＳＫ／ｍａＰ２ｐｒｏ／ｍ０８５／ｐｏｌｙＡ（図３）を得る。得られるプラスミドｐＢｌｕｅＳＫ／ｍａＰ２ｐｒｏ／ｍ０８５／ｐｏｌｙＡにより、本脂肪組織から分離された脂肪細胞を形質転換する。
実施例４（２）で得られた細胞懸濁液（１〜２×１０５細胞／ｍｌ）を９６穴プレートに１ウエルあたり１００μｌずつ分注し、５％ＣＯ２存在下、３７℃にてあらかじめ培養しておく。一方、フュージーン試薬（ベーリンガー製）約１４μｌとＯＰＴＩ−ＭＥＭ　Ｉ培地（ＧＩＢＣＯ製）約６００μｌとを混合する。室温で５分間保温後、これにプラスミドｐＢｌｕｅＳＫ／ｍａＰ２ｐｒｏ／ｍ０８５／ｐｏｌｙＡ約６μｇを含む溶液を約６０μｌ添加し、さらに室温で１５分間保温し、プラスミド混液とする。当該プラスミド混液を、前記の細胞懸濁液に１ウエルあたり約７μｌずつ添加し、１５時間から１８時間培養し、本発明形質転換脂肪細胞を得る。
【００５４】
実施例１０　（本発明形質転換脂肪細胞を用いた、細胞内取り込み糖量の分析方法及びその利用）
実施例９で得られた本発明形質転換脂肪細胞を含む各ウエルから培地を除き、ＦＢＳ含有培地を１ウエルあたり１００μｌずつ分注し、５％ＣＯ２存在下、３７℃にて１〜２日間培養する。９６穴プレートの各ウエルから培地を除き、５μＭ　１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（Ｃａｙｍａｎ製）を含むＦＢＳ含有培地１００μｌを各ウエルに添加して５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養する操作を繰り返しながら５〜６日間培養し、細胞内に脂肪を蓄積させる。脂肪を蓄積した細胞に実施例５と同様の操作を施し供試細胞を得る。
前記供試細胞を含むウエルに被験物質およびＤＭＳＯを終濃度がそれぞれ３μＭ、０．１％となるように添加し、１０分間〜２０分間保温する。さらにラベル液０．２５ｍｌを添加して、実施例６と同様の操作により総放射能量を測定する（以下、測定値１４と記す。）。一方、被験物質無添加区については、被験物質を添加しないこと以外は同様の操作を行い、総放射能量量を測定する（以下、測定値１５と記す。）。これらの測定値から下記の式に従って、被験物質による糖取り込み抑制率を算出する。
糖取り込み抑制率（％）＝｛（測定値１５−測定値１４）／測定値１５｝×１００
その結果、上記糖取り込み抑制率が、３０％以上を示す場合、当該被験物質は糖取り込み抑制能力を有する物質として選抜される。
【００５５】
【発明の効果】
本発明により、脂肪細胞における細胞内取り込み糖量の分析方法等が提供可能となった。
【００５６】
［配列表フリーテキスト］
配列番号２
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００５７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドｐＢｌｕｅＳＫ／ｍ０８５の構造を示す。図中、斜線部分は、挿入された配列番号７で示される塩基配列を含むＤＮＡ（約１．５ｋｂ）を示す。
【図２】図２は、プラスミドｐＢｌｕｅＳＫ／ｍ０８５／ｐｏｌｙＡの構造を示す。図中、斜線部分は、挿入された配列番号７で示される塩基配列を含むＤＮＡ（約１．５ｋｂ）を示す。
【図３】図３は、プラスミドｐＢｌｕｅＳＫ／ｍａＰ２ｐｒｏ／ｍ０８５／ｐｏｌｙＡの構造を示す。図中、斜線部分は挿入された配列番号７で示される塩基配列を含むＤＮＡを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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