(57)【要約】      （修正有）【課題】ホスホランバン不活性剤を同定またはデザインする。【解決手段】三次元構造決定のための充分高い解像度のＮＭＲデータから、ホスホランバン（ＰＬＢ）の細胞質ゾルドメインおよびその活性部位の三次元構造を決定する。適当なコンピュータアルゴリズムを有するコンピュータシステムで解析されるように、コンピュータ可読媒体で提供する。三次元構造データを用いることに基づいてホスホランバン不活性化剤のデザインを可能にする論理的ドラッグデザインを構築する。ホスホランバン不活性化剤は、うっ血性心疾患のような、Ｃａ−ＡＴＰａｓｅのＣａ−ポンプ活性が減じられる可能性のある疾患を治療するのに有用である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホランバン不活性化剤を同定またはデザインする方法であって、
（ｉ）ホスホランバンの細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造を定義する原子座標を提供し、
（ｉｉ）三次元構造を採用して三次元構造の結合部位と相互作用することができるか、または三次元構造の結合部位と良好な立体的および静電気的相補性を有する候補分子を選択し、そして
（ｉｉｉ）潜在的ホスホランバン不活性化剤としての選択された候補分子を同定し、ついで潜在的ホスホランバン不活性化剤を合成し、そしてホスホランバン不活性化剤として機能する能力について試験することからなる方法。
【請求項２】
さらに前記潜在的ホスホランバン不活性化剤を合成し、そして合成された潜在的ホスホランバン不活性化剤をホスホランバン存在下におけるＣａＡＴＰａｓｅの活性化について試験することからなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分が、ホスホランバン不活性化剤の結合を許容するコンホメーションにある請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記原子座標がコンピュータ化されたモデリングシステムにおいて提供される請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記原子座標が表ＩＩＩの原子座標である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記結合部位がＳ１結合部位、Ｓ２結合部位、Ｓ３結合部位およびＳ４結合部位からなる群より選択される請求項１記載の方法。
【請求項７】
ホスホランバン不活性化剤を同定する方法であって、
（ｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部位の三次元構造を定義する第一のコンピュータ可読データセットを提供し、
（ｉｉ）第一のコンピュータ可読データセットを候補分子の構造を定義する第二のコンピュータ可読データセットと組み合わせ、
（ｉｉｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位と相互作用する候補分子の能力を評価し、ここで、該結合部位はホスホランバン細胞質ゾルドメインのＳ１結合部位、Ｓ２結合部位、Ｓ３結合部位およびＳ４結合部位からなる群から選択され、
（ｉｖ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位と好適に相互作用する候補分子を選択し、そして
（ｖ）該候補分子を潜在的ホスホランバン不活性化剤として同定し、ついで潜在的ホスホランバン不活性化剤を合成し、そしてホスホランバン不活性化剤として機能する能力について試験することからなる方法。
【請求項８】
さらに潜在的ホスホランバン不活性化剤を合成し、そして合成された潜在的ホスホランバン不活性化剤をホスホランバンの存在下にＣａＡＴＰａｓｅの活性化について試験することからなる請求項７記載の方法。
【請求項９】
段階（ｉｉ）がホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の結合部位と会合する候補分子の能力を評価するための指示でもってプログラムされたコンピュータを採用することからなる請求項７記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｉｉｉ）が、
（ｉｉｉａ）候補分子とホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の結合部位とのあいだで適合操作を遂行し、そして
（ｉｉｉｂ）適合操作の結果を解析することにより、候補分子とホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の結合部位とのあいだのつながりを定量化することからなる請求項７記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｉｉｉ）が、
（ｉｉｉａ′）第一のコンピュータ可読データセットと第二のコンピュータ可読データセットとの組み合わせによりコード化されているタンパク質構造をグラフィック形式で表示し、そして
（ｉｉｉｂ′）グラフィック形式で表示されたタンパク質構造を視覚的に検査することにより、候補分子が有する、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の結合部位と相互作用する能力を評価することからなる請求項７記載の方法。
【請求項１２】
ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部位に結合し得る化合物を化学構造のデータベースから選択する方法であって、
（ｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造を定義する原子座標を提供し、
（ｉｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位における１つ以上の官能基の相互作用の適合性を評価し、
（ｉｉｉ）化学構造のデータベースから、おのおのの化合物がホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位との好ましい相互作用を有する前工程で評価された１つ以上の官能基を有する１つ以上の化合物の第一セットを選択し、そして
（ｉｖ）第一の化合物セットから、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造の少なくとも３つの結合部位との相互作用の最適な適合性を有する構造の第二の化合物を選択することからなる方法。
【請求項１３】
ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の前記結合部位が、ホスホランバン細胞質ゾルドメインのＳ１結合部位、Ｓ２結合部位、Ｓ３結合部位およびＳ４結合部位からなる群より選択される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記原子座標がコンピュータ化されたモデリングシステムで提供される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ホスホランバン不活性化剤をデザインする方法であって、（ｉ）コンピュータ化されたモデリングシステムで、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造を定義する原子座標を提供し、そして
（ｉｉ）該原子座標を使用してホスホランバン不活性化剤候補分子をデサインすることからなる方法。
【請求項１６】
さらに、
（ｉ）ホスホランバン不活性化剤候補分子を合成し、そして
（ｉｉ）ホスホランバン不活性化剤候補分子またはそれから誘導される類縁体をホスホランバンの存在下にＣａＡＴＰａｓｅの活性化について試験することからなる方法。
【請求項１７】
ホスホランバン不活性化剤候補分子がコンピュータ支援分子デザイン技術を用いてデザインされる請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造が、ホスホランバン不活性化剤と複合体を形成したホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造からなる請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
ホスホランバン不活性化剤候補分子をデザインするために使用されるコンピュータ支援技術が新規なデザイン技術である請求項１７記載の方法
【請求項２０】
ホスホランバン不活性化剤候補分子をデザインするために使用されるコンピュータ支援技術が、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分と立体的および静電気的相補性を有する分子のコンピュータベースの選択からなる請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
ホスホランバン不活性化剤候補分子をデザインするために使用されるコンピュータ支援技術が、リード分子のコンピュータ支援最適化である請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
段階（ｉｉ）が、
（ｉｉａ）ホスホランバン不活性化剤候補分子の結合のための領域として機能する、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の表面における標的領域を選択し、
（ｉｉｂ）該標的領域と会合することができる１つ以上の分子または断片を選択し、
（ｉｉｃ）コンピュータソフトウェアプログラムを用い、標的領域に分子または断片の三次元構造を適合させ、そして
（ｉｉｄ）コンピュータソフトウェアプログラムから得られる結果を使用して標的領域と好ましい立体的または静電気的相互作用を有する分子またはその断片を同定することからなる請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
さらに、
（ｉｉｅ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の標的領域と好ましい立体的および静電気的相互作用を有する分子またはその断片を合成し、そして
（ｉｉｆ）該分子またはその断片を、ホスホランバンを不活性化する能力について試験することからなる請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ホスホランバン不活性化剤ペプチドｃＰ２２６がホスホランバン不活性化剤をデザインするために使用される請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
ホスホランバン不活性化剤ペプチドｃＰ２２６が標的領域を定義するために使用される請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
さらに、
（ｉｉｅ′）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の標的領域と好ましい立体的または静電気的相互作用を有する１つ以上の小さい分子またはその断片を一緒に架橋して単一のより大きな分子を作製し、
（ｉｉｆ′）該単一のより大きな分子を、ホスホランバンを不活性化する能力について試験することからなる請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
段階（ｉｉ）が、
（ｉｉａａ）対話型分子グラフィックスシステムを使用して、分子足場をホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の標的領域に適合させ、そして
（ｉｉｂｂ）官能基またはその断片を分子足場に加えて、標的領域と好ましい立体的または静電気的相互作用を有する、単一のより大きな分子を作製することからなる請求項１５記載の方法。
【請求項２８】
さらに、
（ｉｉｃｃ）単一のより大きな分子を合成し、そして
（ｉｉｄｄ）該単一のより大きな分子を、ホスホランバンを不活性化する能力について試験することからなる請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の構造の原子座標を、ホスホランバン不活性化剤のホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分への結合を許容するコンホメーションで保存しているコンピュータ可読媒体。
【請求項３０】
前記分子座標が表ＩＩＩの原子座標である請求項２９のコンピュータ可読媒体。
【請求項３１】
構造：
【化１】
2004226176.tif 000065
（式中、ＸはＴｙｒまたはＡｌａである）
を有する環状ペプチド。
【請求項３２】
ＸがＴｙｒである請求項３１記載のペプチド。
【請求項３３】
環状ペプチドが水性溶液と接触している請求項３１記載のペプチド。
【請求項３４】
ホスホランバン不活性化剤として使用するための請求項３１記載のペプチド。
【請求項３５】
ホスホランバン不活性化剤を同定する方法であって、
（ｉ）環状ペプチド
【化２】
2004226176.tif 000066
（式中、ＸはＴｙｒまたはＡｌａである）
の三次元構造を得、そして
（ｉｉ）該三次元構造を、ホスホランバン不活性化剤をデザインするためのモデルとして用いることからなる方法。
【請求項３６】
段階（ｉｉ）が、
（ｉｉａ）ホスホランバンに結合した前記環状ペプチドの複合体の三次元モデルを作成する段階、および
（ｉｉｂ）該モデルから誘導される距離測定と静電気的性質を用いて１つ以上のホスホランバン不活性化剤を同定する段階からなる請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
段階（ｉｉ）が、１つ以上の分子モデリング技術を実行することからなる請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
ホスホランバン不活性化剤が結合し得る標的領域として機能し得るホスホランバンの表面上の領域を同定する方法であって、
（ｉ）環状ペプチド
【化３】
2004226176.tif 000067
（式中、ＸはＴｙｒまたはＡｌａである）
の三次元構造を得る段階、および
（ｉｉ）１つ以上の分子モデリング技術を用いて前記標的領域として機能し得るホスホランバンの表面上の前記領域を定義する段階からなる方法。
【請求項３９】
段階（ｉｉ）が、前記環状ペプチドと相互作用し、また前記ホスホランバン不活性化剤と相互作用し得る前記領域において、ホスホランバンの１つ以上のアミノ側鎖を決定する段階からなる請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
請求項１、７、１２、１５または３５のいずれかにしたがったホスホランバン不活性化剤の同定、デザインまたは選択方法であって、同定され、デザインされまたは選択されたホスホランバン不活性化剤が、以下：
（ａ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ｔｙｒ−６、Ａｒｇ−９および／またはＡｒｇ−１３からなるＳ１結合部位と会合し得る第一電気陰性部分；
（ｂ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ａｒｇ−１４からなるＳ２結合部位と会合し得る第二電気陰性部分；
（ｃ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ｍｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７および／またはＬｅｕ−２８からなるＳ３結合部位と会合し得る第一疎水性部分；および
（ｄ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ｐｈｅ−３２および／またはＰｈｅ−３５からなるＳ４結合部位と会合し得る第二疎水性部分
のいずれか３つからなる方法。
【請求項４１】
同定、デザインまたは選択されたホスホランバン不活性化剤が、以下：
（ａ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインの、Ｔｙｒ−６の−ＯＨ基との水素結合、Ａｒｇ−９のグアニジニウム基との塩橋および／またはＡｒｇ−１３のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第一電気陰性部分；
（ｂ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＡｒｇ−１４のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第二電気陰性部分；
（ｃ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＭｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７および／またはＬｅｕ−２８によって作り出される疎水性ポケットと会合することができる第一疎水性部分；および
（ｄ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＰｈｅ−３２および／またはＰｈｅ−３５により作り出される疎水性ポケットと会合することができる第二疎水性部分
のいずれか３つからなる請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
同定、デザインまたは選択されたホスホランバン不活性化剤が、以下：
（ａ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインの、Ｔｙｒ−６の−ＯＨ基との水素結合、Ａｒｇ−９のグアニジニウム基との塩橋および／またはＡｒｇ−１３のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第一電気陰性部分；
（ｂ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＡｒｇ−１４のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第二電気陰性部分；および
（ｃ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＭｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７および／またはＬｅｕ−２８によって作り出される疎水性ポケットと会合することができる第一疎水性部分
からなる請求項４０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は三次元構造決定に関して充分高い解像度のＮＭＲデータを用いてホスホランバン（ＰＬＢ）の三次元構造を決定することに関する。本発明はまた、適切なコンピュータアルゴリズムを有するコンピュータシステムで解析されるような、コンピュータ可読媒体で提供される三次元構造データを使用することに基づいてホスホランバンを不活性化する化合物のデザインを可能にする論理的ドラッグデザインのための方法に関する。本発明はまた、ホスホランバンの特定の残基との相互作用を許容する、構造的、物理化学的、空間的な特性を有するホスホランバン不活性化化合物に関する。本相互作用はＣａ２＋−ＡＴＰａｓｅに対するホスホランバンの阻害効果を阻止するものであり、それにより、該作用を有する化合物は、うっ血性心疾患のような、Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅのＣａポンプ活性が減じられる可能性のある疾病を治療するのに有効なものとなる。
【０００２】
【従来の技術】
ホスホランバン（ＰＬＢ）は、心臓の遅筋および平滑筋に存在する低分子量タンパク質（５２アミノ酸）であって、ｃＡＭＰ依存性ホスホキナーゼおよびＣａ２＋／カルモジュリン依存性ホスホキナーゼの両者によりリン酸化され得る。さまざまな種から得たホスホランバンのアミノ酸配列を図１に示す。ホスホランバンのリン酸化／脱リン酸化は、筋細胞における筋小胞体／小胞体のＣａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ＿２）を調節することが示されてきた。ホスホランバンは、リン酸化されていない形態で、ＳＥＲＣＡ＿２の細胞質ドメインにおける大きなループの特定領域に結合し、Ｃａ２＋に対するＳＥＲＣＡ＿２の親和性を低下させることによりＳＥＲＣＡ＿２ポンプを阻害する（一方、リン酸化された形態のものはＳＥＲＣＡ＿２を阻害しない）ことが示されてきた。
【０００３】
ホスホランバンとＣａ２＋−ＡＴＰａｓｅとの機能的な結合にとって必須な領域は、ホスホランバンの細胞質ドメインにあり、一方、膜貫通領域は筋形質膜にＰＬＢを固定するということが提案されてきた。
【０００４】
最近十年間に、架橋実験の手段により、またはＳＥＲＣＡ＿２と点突然変異したＰＬＢとの再構築により、あるいは、最終的に、円偏光二色性、レーザー光分散光度測定法−ＦＴＩＲスペクトル分光法およびＮＭＲ分光法により直接的な構造情報を取得することにより、ＰＬＢの二次構造を少なくとも部分的に解明する努力がなされてきた。分子モデリングが、ＰＬＢ五量体における膜貫通領域の四次構造に対する仮説を立てるのに用いられてきた。得られた構造情報は最近概説されている（Ａｒｋｉｎ，Ｉ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．，  ２６，  １５７−１７９）。
【０００５】
ＰＬＢは、ｉ）両親媒性のオリゴぺプチドであり、ｉｉ）３個のシステインを含んでおり、ｉｉｉ）インビトロでも五量化する傾向があるので、その構造を研究するためのよい条件、とくに非特異的な凝集を抑制する適当な溶媒系を見出すことは簡単ではない。したがって、現在まで、ＮＭＲ研究は短いＰＬＢ断片に対して、または有機溶媒中で実施されてきた。いずれの場合も、ＰＬＢの細胞質ゾルのドメインに対する四次構造の証拠は見出されていない。
【０００６】
ＣａＡＴＰａｓｅの阻害は、筋細胞のカルシウムレベルが高い心疾患において原因的な役割を果たし得る。ホスホランバンがＳＲ  ＣａＡＴＰａｓｅを阻害するように、この阻害はそのような疾患において害をおよぼし得る。たとえば、ホスホランバン−Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ相互作用を妨げることにより、心臓ＳＲ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅに対するホスホランバンの阻害効果を軽減することができる化合物は、前記のような心疾患の治療に潜在的に有効であろう。ホスホランバンによるＣａＡＴＰａｓｅの阻害を防止することができる化合物についての例は、文献ではほとんどみられない。このような化合物としては、抗ホスホランバン抗体、いくつかの大きなポリアニオン性のオリゴペプチドおよびタンニン類があげられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明では、ホスホランバンはよく特徴づけられたコンホメーションを想定でき、そのコンホメーションではホスホランバンは、定義されたコンホメーションでホスホランバンの特定残基との相互作用を許容する共通の構造的、物理化学的、空間的特性を有する広範な低分子化合物と結合し得ることが見出された。この相互作用はホスホランバンを不活性化し、ＣａＡＴＰａｓｅに対する阻害効果を妨げる。ホスホランバン不活性化化合物は、ＳＲ  ＣａＡＴＰａｓｅの活性化が有益である心疾患の治療に潜在的に有用である。本明細書では、ホスホランバン不活性化化合物をホスホランバン不活性化剤と称する。
【０００８】
本発明は、本発明者らがなした、ホスホランバンの全細胞質ゾルドメインとそのリガンド結合部位の三次元構造の完全な解明に基づくものである。
【０００９】
ある側面では、本発明は、適切なコンピュータアルゴリズムを有するコンピュータシステムで解析されるような、コンピュータ可読媒体で提供される三次元構造データを使用することに基づいてホスホランバン不活性化剤のデザインを可能にする論理的ドラッグデザインのための方法に関する。本発明の方法によってデザインされ同定された化合物は、心臓のＳＲ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅに対するホスホランバンの阻害効果を軽減することができ、したがって、このような化合物は、ホスホランバンタンパク質への直接的な結合によりホスホランバン不活性化剤として作用する。このような化合物は、該化合物とホスホランバンのリガンド結合部位の特定残基との相互作用を許容する共通の構造的、物理化学的、空間的特性を有する。
【００１０】
別の側面では、本発明はコンピュータ可読媒体で提供されるホスホランバン細胞質ゾルドメインの三次元構造を提供する。
【００１１】
本発明のさらなる別の側面は、本発明に関する下記の詳細な説明および実施例から当業者にとって明らかである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
ホスホランバン（１〜３６）の構造
本発明は、本発明者らがなした、ホスホランバン（ＰＬＢ）の全細胞質ゾルドメインとリガンド結合部位の三次元構造の完全な解明に基づくものである。ＮＭＲデータが三次元構造決定にとって充分高い解像度を有するＮＭＲ分光法の方法を用いてホスホランバンの細胞質ゾルドメインの構造を決定することが可能である。本方法は、３０％トリフルオロエタノールを含む水溶液中でＮＭＲ分析するために、ホスホランバンの１〜３６ａ．ａ．断片を提供することからなり、該断片は細胞質ゾルドメインと膜貫通ドメインの６個のアミノ酸とからなる。そして三次元構造は、距離幾何学とそれにつづく模擬アニーリングによりＮＭＲデータから決定され得る。本方法は実施例１に詳細に記載されている。
【００１３】
ホスホランバン（１〜３６）断片は、ヘリックス−ターン−ヘリックス  モチーフのコンホメーション特性をとることが見出された。ターンの残基はＩｌｅ１８、Ｇｌｕ１９、Ｍｅｔ２０およびＰｒｏ２１であり、それらは２個のリン酸化部位Ｓｅｒ１６およびＴｈｒ１７に隣接している。プロリンはトランス型コンホメーションである。両ヘリックスは一方側に優先的に荷電した極性残基を有し、他方側は親油性である。Ｎ−末端ヘリックスの親水性側は、常に、両親媒性アームピットとして記載され得るポケットを定義するＣ−末端ヘリックスの親油性側に面している。これは、ＳＥＲＣＡ＿２と相互作用するために、ＰＬＢが延長状態（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）（すなわち、２個のヘリックスの軸はほとんど並行であるはずである）を取るが、折れ曲がりコンホメーションでは、これらの荷電はＡＴＰａｓｅに晒されてはおらず、結局、リン酸脂質二分子層の表面荷電に晒されているということを意味している。したがって、可動中心ヒンジドメイン周辺の２つのへリックスのゆるやかな相対的位置取りは、ＰＬＢの機能的特徴である。このフレキシビリティーは、有機溶媒中で、ＰＬＢが延長構造を取り得る理由を説明しているかもしれない。
【００１４】
その構造はまた、Ｎ−末端ヘリックスの親水性部位とＣ−末端の親油性部位とのあいだのポケット（両親媒性アームピットと定義される）が、折れ曲がりコンホメーションを安定化することによりＰＬＢを不活性化する目的を持ってデザインされた低分子量の両親媒性薬物分子の理想的な標的であることを表わしている。このような分子は心臓のＳＲ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅに対するホスホランバンの阻害効果を軽減し、それゆえ、ＰＬＢの活性部位に直接結合することによりＰＬＢ不活化剤として作用するであろう。
【００１５】
ｃＰ２２６の構造
ＰＬＢと相互作用する化合物を見出すために、一連のペプチドをスクリーニングした。式（ｐＩ）の環状ペプチドは、ＰＬＢと結合し、ＳＥＲＣＡ＿２とＰＬＢの両者を含むリポソーム中へのカルシウムの取り込みを活性化できることが見出された。式（ｐＩ）の環状ペプチドはリン酸化されていないＰＬＢに結合し、ＳＥＲＣＡ＿２に対するＰＬＢによりなされる阻害を防止してＰＬＢ不活性化剤として作用すると結論づけられた。したがって、式（ｐＩ）の環状ペプチドは、論理的ドラッグデザインのためのリード化合物として、またＰＬＢの不活性化が望まれる疾患の治療に有用である。環状ジペプチド（ｐＩ）は構造：
【００１６】
【化４】
2004226176.tif 000002
【００１７】
（Ｘは、好ましくはＴｙｒまたはＡｌａである）
を有する。
【００１８】
ＸがＴｙｒである式（ｐＩ）の環状ペプチドは、ｃＰ２２６と命名された。ＰＬＢのリガンド結合部位を決定するために、ｃＰ２２６の三次構造をＮＭＲ分光法により解析した。使用した方法は実施例２に詳細に記述している。ｃＰ２２６の三次元構造は、ベンド−コイル−ベンド  モチーフを示している。Ｔｒｙ−３、Ｌｅｕ−５、Ｔｒｐ−７およびＬｅｕ−８の親油性側鎖は、環状ペプチドの一方側にクラスターをなしている。環状ペプチドｃＰ２２６の三次元座標は、本明細書に添付した表Ｉに提示されている。
【００１９】
複合体ｃＰ２２６・ＰＬＢ（１〜３６）の構造
ＰＬＢ（１〜３６）とそのリガンドであるｃＰ２２６の解析した三次構造を基礎にして、分子モデリングにより複合体ｃＰ２２６・ＰＬＢ（１〜３６）のモデルを調製することが可能であった。その三次元モデルはＰＬＢ（１〜３６）とそのリガンドとの相互作用を記述しており、その相互作用はＰＬＢの細胞質ゾルドメインへのリガンドの結合において重要である。
【００２０】
ＰＬＢ（１〜３６）とｃＰ２２６とのＮＭＲで解析された構造を、複合体の構築に対するテンプレートとして用いた。ｃＰ２２６は、分子グラフィック法の助けにより相互作用的に結合され  （ｄｏｃｋｅｄ）、２個のペプチド間の起こり得る相互作用により導かれた。ｃＰ２２６の構造は、そのペプチドが一方の側面に２個の負荷電の側鎖（Ｇｌｕ−４およびＧｌｕ−６）を有し、他方の側面が疎水性である（Ｔｒｐ−７、Ｌｅｕ−８およびＰｒｏ−９）ことを示している（図２）。ＰＬＢ（１〜３６）において、Ｃ−末端ヘリックスの主に疎水性の表面（たとえば、Ｌｅｕ−２８、Ｌｅｕ−３１、Ｐｈｅ−３２、Ｐｈｅ−３５）により相対している３個の正に荷電した側鎖（Ａｒｇ−９、Ａｒｇ−１３、Ａｒｇ−１４）のクラスターがある（図３）。ｃＰ２２６は、Ｇｌｕ−４およびＧｌｕ−６がＡｒｇ−９、Ａｒｇ−１３およびＡｒｇ−１４と接触するようにし、同時にＴｒｐ−７，Ｌｅｕ−８およびＰｒｏ−９がＰＢＬ  Ｃ−末端ヘリックスの疎水性表面近くになるように、ＰＬＢ（１〜３６）上に手動で結合させた（ｄｏｃｋｅｄ）。これは複合体のエネルギー精密化の出発点を与えた。
【００２１】
得られた複合体のエネルギーは、一般的な荷電力場（ｇｖｆｆ９３）を用いるインサイトＩＩにより最小化した。大まかな最少化は、最急勾配法ついで共役勾配法およびニュートン法により行なった。
【００２２】
エネルギー最少化複合体ｃＰ２２６・ＰＬＢ（１〜３６）の構造を図４に示す。複合体の最終の全エネルギーは１１３ｋｃａｌ／ｍｏｌ（非結合分散エネルギー  −１５７４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、クーロンエネルギー  −６９０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であった。
【００２３】
ｃＰ２２６のＰＬＢに対する結合様式の模式図を、図５に示す。該結合は、Ｇｌｕ−４、Ｇｌｕ−６、Ｔｒｐ−７およびＰｒｏ−９をそれぞれ結合する４個の結合部位（Ｓ１〜Ｓ４）により記述し得る（表ＩＩ、図６）。Ｇｌｕ−４はＴｙｒ−６、Ａｒｇ−９およびＡｒｇ−１３（Ｓ１）と静電的／Ｈ−結合相互作用を有し、Ｇｌｕ−６はＡｒｇ−１４（Ｓ２）と結合し、Ｔｒｐ−７は、おもにＭｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７およびＬｅｕ−２８によって形成される疎水性ポケット（Ｓ３）の中に埋まり、Ｐｒｏ−９はおもにＰｈｅ−３２およびＰｈｅ−３５により形成される疎水性の間隙（Ｓ４）に結合する。さらに、Ｌｅｕ−５はＡｒｇ−１３の側鎖の疎水性部分によって裏打ちされており、Ｔｒｙ−７のインドールのＮＨはＡｒｇ−１３のカルボニルとＨ−結合を形成し得る。正に荷電したＮ−末端アミノ基（ＮＨ３＋）は、疎水性結合部位Ｓ４の近くにある。
【００２４】
【表１】
2004226176.tif 000003
【００２５】
したがって、用語「結合部位Ｓ１」は、アミノ酸残基Ｔｙｒ−６、Ａｒｇ−９および／またはＡｒｇ−１３、とくにＴｙｒ−６の−ＯＨ基、Ａｒｇ−９のグアニジニウム基および／またはＡｒｇ−１３のグアニジニウム基により囲まれた空間として定義される。
【００２６】
用語「結合部位Ｓ２」は、アミノ酸残基Ａｒｇ−１４、とくにＡｒｇ−１４のグアニジニウム基により囲まれた空間として定義される。
【００２７】
用語「結合部位Ｓ３」は、アミノ酸残基Ｍｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７および／またはＬｅｕ−２８、とくにそれらの側鎖により囲まれた空間として定義される。
【００２８】
用語「結合部位Ｓ４」は、アミノ酸残基Ｐｈｅ−３２および／またはＰｈｅ−３５、とくにそれらのフェニル基により囲まれた空間として定義される。
【００２９】
環状ペプチドｃＰ２２６の結合を許容するコンホメーションでのホスホランバン（１〜３６）の三次元原子座標は、本明細書に添付される表ＩＩＩに開示されている。ホスホランバン（１〜３６）と環状ペプチドｃＰ２２６とのあいだの複合体の三次元原子座標は、本明細書に添付される表ＩＶに記載されている。図８は本発明の方法によってデザインされた１つの化合物をＰＬＢ構造上に重ね合わせた説明図である。
【００３０】
論理的ドラッグデザイン
構造決定方法もＰＬＢリガンドの論理的ドラッグデザインのために本発明により提供される。このようなドラッグデザインは、ＰＬＢの決定された結合部位または他の構造的もしくは機能的なドメインと相互作用すると期待される種々の分子の構造を計算するコンピューターモデリングプログラムを用いる。ついで、これらの分子を製造し、本発明の方法にしたがってＰＬＢを不活性化する活性に対してスクリーニングする。
【００３１】
本発明は、今まで知られていないＰＬＢ細胞質ゾルドメインのリガンド結合部位を表わしており、原子のはっきりした三次元配列からなる。ＰＬＢ不活性化剤のＰＬＢ細胞質ゾルドメインへの結合を許容するコンホメーションにおけるＰＬＢ（１〜３６）の原子座標が表ＩＩＩに開示されている。この構造は、高い活性をもつＰＬＢ不活性化剤の構造ベースのデザインを始めて可能にする。本明細書に提供されているＰＬＢ細胞質ゾルドメインの構造は、コンピュータ化された評価システムの使用により、既知化合物のスクリーニングやＰＬＢ細胞質ゾルドメインのリガンド結合部位に結合する新規分子のデザインを可能にする。たとえば、コンピュータ−モデリングシステムが利用される。そのシステムにおいては、表ＩＩＩで提供されているような、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインとそのリガンド結合部位の原子座標が入力データとして使用され得る。したがって、本方法においては、コンピュータ可読媒体が表ＩＩＩの座標を表わしているデータで記号化されていてもよい。
【００３２】
したがって、本発明はホスホランバン不活性化剤を同定またはデザインするための方法を提供するものであって、該方法は：
（ｉ）ホスホランバンの細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造を定義する原子座標を提供し、
（ｉｉ）三次元構造を採用して三次元構造の結合部位と相互作用することができるか、または三次元構造の結合部位と良好な立体的および静電気的相補性を有する候補分子を選択し、そして
（ｉｉｉ）潜在的ホスホランバン不活性化剤としての選択された候補分子を同定し、ついで潜在的ホスホランバン不活性化剤を合成し、そしてホスホランバン不活性化剤として機能する能力について試験することからなる。
【００３３】
他の側面では、本発明はホスホランバン不活性化剤を同定する方法を提供するものであって、該方法は：
（ｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部位の三次元構造を定義する第一のコンピュータ可読データセットを提供し、
（ｉｉ）第一のコンピュータ可読データセットを候補分子の構造を定義する第二のコンピュータ可読データセットと組み合わせ、
（ｉｉｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位と相互作用する候補分子の能力を評価し、ここで、該結合部位はホスホランバン細胞質ゾルドメインのＳ１結合部位、Ｓ２結合部位、Ｓ３結合部位およびＳ４結合部位からなる群から選択され、
（ｉｖ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位と好適に相互作用する候補分子を選択し、そして
（ｖ）該候補分子を潜在的ホスホランバン不活性化剤として同定し、ついで潜在的ホスホランバン不活性化剤を合成し、そしてホスホランバン不活性化剤として機能する能力について試験することからなる。
【００３４】
他の側面において、本発明は、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分に結合することができる化合物を化学構造のデータベースから選択する方法を提供するものであって、該方法は：
（ｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造を定義する原子座標を提供し、
（ｉｉ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位における１つ以上の官能基の相互作用の適合性を評価し、
（ｉｉｉ）化学構造のデータベースから、おのおのの化合物がホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の少なくとも３つの結合部位との好ましい相互作用を有する前工程で評価された１つ以上の官能基を有する１つ以上の化合物の第一セットを選択し、そして
（ｉｖ）第一の化合物セットから、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造の少なくとも３つの結合部位との相互作用の最適な適合性を有する構造の第二の化合物を選択することからなる。
【００３５】
好ましくは、原子座標は、当該分野でよく知られているいずれかのコンピュータ化されたモデリングシステムで提供される。
【００３６】
一般に、本発明はまた、ホスホランバン不活性化剤をデザインする方法を提供するものであって、該方法は：
（ｉ）コンピュータ化されたモデリングシステムで、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の三次元構造を定義する原子座標を提供し、そして
（ｉｉ）該原子座標を使用してホスホランバン不活性化剤候補分子をデサインすることからなる。
【００３７】
また、本方法は標準のコンピュータ支援分子デザイン技術を用いて好適に実行される。本デザイン工程は好適には、
（ｉｉａ）ホスホランバン不活性化剤候補分子の結合のための領域として機能する、ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の表面における標的領域を選択し、
（ｉｉｂ）該標的領域と会合することができる１つ以上の分子または断片を選択し、
（ｉｉｃ）コンピュータソフトウェアプログラムを用い、標的領域に分子または断片の三次元構造を適合させ、そして
（ｉｉｄ）コンピュータソフトウェアプログラムから得られる結果を使用して標的領域と好ましい立体的または静電気的相互作用を有する分子またはその断片を同定することからなる。
【００３８】
本方法はさらに、
（ｉｉｅ）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分と好ましい立体的および静電気的相互作用を有する分子またはその断片を合成する段階、および
（ｉｉｆ）該分子またはその断片を、ホスホランバンを不活性化する能力について試験する段階からなる。
【００３９】
また、前記デザイン工程は、
（ｉｉｅ′）ホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の標的領域と好ましい立体的または静電気的相互作用を有する１つ以上の小さい分子またはその断片を一緒に架橋して単一のより大きな分子を作製する工程、および（ｉｉｆ′）該単一のより大きな分子を、ホスホランバンを不活性化する能力について試験する工程からなっていてもよい。
【００４０】
そのデザイン工程は、あるいは、
（ｉｉａａ）対話型分子グラフィックスシステムを使用して、分子足場をホスホランバン細胞質ゾルドメインまたはそのリガンド結合部分の標的領域に適合させる工程、および
（ｉｉｂｂ）官能基またはその断片を分子足場に加えて、標的領域と好ましい立体的または静電気的相互作用を有する、単一のより大きな分子を作製する工程からなっていてもよい。
【００４１】
前記方法で用いられる三次元構造はホスホランバン不活性化剤と複合体を形成したホスホランバン細胞質ゾルドメインの三次元構造であり、とくに結合部位Ｓ１〜Ｓ４および／またはその近傍における三次元構造であるのが好ましい。
【００４２】
前記方法はすべて、さらに潜在的ホスホランバン不活性化剤を合成し、そして合成した潜在的ホスホランバン不活性化剤を、実施例３に詳細に記載されているように、またはその変形でホスホランバンの存在下にＣａＡＴＰａｓｅの活性化について試験することからなっていてもよい。
【００４３】
本発明はまた、ＰＬＢ不活性化剤のＰＬＢ細胞質ゾルドメインへの結合を許容するコンホメーションにおけるＰＬＢ細胞質ゾルドメインまたはその部分の構造の原子座標を保存したコンピュータ可読媒体を提供する。
【００４４】
本明細書において使用されているように、「コンピュータ可読媒体」はコンピュータにより直接読まれまたアクセスされ得るいかなる媒体も意味する。このような媒体としては、限定されるものではないが、たとえば、フロッピィーディスク、ハードディスク保存媒体、磁性テープのような磁性保存媒体；光学ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭのような光学保存媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電子保存媒体；磁性／光学保存媒体のようなこれらカテゴリーの混成物などがあげられる。熟練技術者であれば、ＰＬＢの構造の原子座標を保存したコンピュータ可読媒体からなる製品を作るのに、現在知られているコンピュータ可読媒体をどのように使用し得るのか容易に評価できる。データ保存構造の選択は、一般に、保存される情報にアクセスするのに選択される手段に基づいている。コンピュータ可読媒体に本発明の原子座標データを保存するために、種々のデータ処理プログラムおよびフォーマットが使用され得る。
【００４５】
ＰＬＢの構造の原子座標データを保存したコンピュータ可読媒体を提供することにより、熟練技術者であればＰＬＢ細胞質ゾルドメインまたはその一部分の構造の原子座標データに日常的にアクセスできる。コンピュータ可読媒体に与えられているこのデータに熟練技術者がアクセスし、そして構造決定および／または論理的ドラッグデザインのためにそれを分析することを許容するコンピュータアルゴリズムは、公におよび市場で入手できる。たとえば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ，  Ｍａｒｙ  Ａｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ  Ｐｕｂｌ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９５）を参照。
【００４６】
表ＩＩＩで表わされるＰＬＢ（１〜３６）の構造的原子座標は、三次元形状のようなディスプレイのために、またはそれらが規定する構造座標のコンピュータ支援操作などの他の用途のために、コンピュータ可読保存媒体上に、コンピュータ可読形式で保存され得る。たとえば、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインまたはその部分の三次元構造を定義するデータは、コンピュータ可読保存媒体に保存され、また典型的には、該保存媒体からデータを読むことができ、かつこのようなデータから表示を作り出すための指示でプログラムされたコンピュータを使用して、タンパク質構造のグラフィック的な三次元表示としてディスプレイされ得る。したがって、本発明は、追加的な任意のデータおよびそのようなデータを操作するための指示と共に、本発明のＰＬＢタンパク質の構造座標、たとえば表ＩＩＩで表わされるような座標を表わしているデータを含んでいるメモリーを有する、コンピュータのような機械をも包含する。このようなデータは論理的ドラッグデザインのような種々の目的に使用され得る。本発明は、表ＩＩＩの座標、ならびに内部座標を維持する、すなわち内在的な内部関連を維持するそれらの変形（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）またはローテーション（ｒｏｔａｔｉｏｎ）なども包含する。当業者であれば、座標が、たとえば、動的シミュレーション、最小化などのような分子メカニズム計算を含む他のトランスフォーメーションを受けてもよいことを理解するであろう。
【００４７】
たとえば、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインまたはその部分の三次元構造を定義する第一のコンピュータ可読データセットは、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインタンパク質に会合する候補分子の能力、および／またはそのような会合の位置および／または方向性を評価するための指示と共にプログラムされたコンピュータを使用して、候補分子の構造を定義する第二のコンピュータ可読データセットと組み合わされる。
【００４８】
データによりコード化されたタンパク質構造は、候補分子との構造会合の視覚的検分のみならず、構造の視覚的検分を許容するグラフィック的なフォーマットで表示され得る。また、より定量的な計算法を使用し得る。たとえば、候補分子のＰＬＢ細胞質ゾルドメインとの会合能力を評価するための本発明の１つの方法は、ｉ）候補分子とＰＬＢの結合部位とのあいだの適合操作を実行する計算手段を採用する段階、およびｉｉ）適合操作の結果を分析して候補分子とＰＬＢの結合部位とのあいだの会合を定量する段階からなる。
【００４９】
本発明の１つの方法は、化学構造のデータベースからＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合することができる化合物を選択するために提供される。本方法はＰＬＢ細胞質ゾルドメインまたはその部分の三次元構造を定義する構造座標から始まる。その三次元構造の結合部位は１つ以上の官能基との相互作用の適合性に関して特徴づけられる。化学構造のデータベースはついで、先の特徴づけに基づいて、ＰＬＢとの好ましい相互作用のために配置されている官能基を含む候補化合物を求めて調査される。このようにして、三次元構造との好ましい相互作用のポイントに最も適合する構造を有する化合物が同定される。
【００５０】
三次元構造を見るための、または原子座標を操作ためのコンピュータプログラムは入手可能であり、当業者によく知られている。
【００５１】
ホスホランバン不活性化化合物
本発明は、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインの４つの結合部位Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４の少なくとも３つと会合し得る化合物を提供する。このような化合物はホスホランバン不活性化能を有することがわかる。とくに、本発明は、以下のうち少なくともいずれか３つからなるホスホランバン不活性化化合物を提供する。
（ａ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ｔｒｙ−６、Ａｒｇ−９および／またはＡｒｇ−１３からなるＳ１結合部位と会合し得る第一電気陰性部分、
（ｂ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ａｒｇ−１４からなるＳ２結合部位と会合し得る第二電気陰性部分、
（ｃ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ｍｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７および／またはＬｅｕ−２８からなるＳ３結合部位と会合し得る第一疎水性部分、および
（ｄ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、Ｐｈｅ−３２および／またはＰｈｅ−３５からなるＳ４結合部位と会合し得る第二疎水性部分。
【００５２】
とくに、本発明は、以下のうち少なくともいずれか３つからなるホスホランバン不活性化化合物を提供する。
（ａ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインの、Ｔｙｒ−６の−ＯＨ基との水素結合、Ａｒｇ−９のグアニジニウム基との塩橋および／またはＡｒｇ−１３のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第一電気陰性部分、
（ｂ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＡｒｇ−１４のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第二電気陰性部分、
（ｃ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＭｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７および／またはＬｅｕ−２８によって作り出される疎水性ポケットと会合することができる第一疎水性部分、および
（ｄ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＰｈｅ−３２および／またはＰｈｅ−３５により作り出される疎水性ポケットと会合することができる第二疎水性部分。
【００５３】
とくに、本発明は、
（ａ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインの、Ｔｒｙ−６の−ＯＨ基との水素結合、Ａｒｇ−９のグアニジニウム基との塩橋および／またはＡｒｇ−１３のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第一電気陰性部分；
（ｂ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＡｒｇ−１４のグアニジニウム基との塩橋を形成することのできる第二電気陰性部分；および
（ｃ）不活性化剤がＰＬＢ細胞質ゾルドメインに結合する際、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインのＭｅｔ−２０、Ｌｙｓ−２７および／またはＬｅｕ−２８によって作り出される疎水性ポケットと会合することができる第一疎水性部分
からなるホスホランバン不活性化剤を提供する。
【００５４】
したがって、前記で定義されたような４つの同時相互作用（ａ）〜（ｄ）のうち、少なくとも３つは、ＰＬＢ細胞質ゾルドメインと会合でき、そしてＰＬＢ不活性化剤として作用することができる化合物にとって必要であると思われる。
【００５５】
活性部位に関連する幾何次元およびファーマコフォアー（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）
活性部位Ｓ１〜Ｓ４のいずれかのあいだの距離は、本明細書で提示されている原子座標から測定できる。同様に、所定の結合部分からそれが会合している活性部位までの距離は、これらの原子座標から演繹できる。
【００５６】
少なくとも３つの会合型が生じる。
【００５７】
塩橋は、リガンドの荷電した基がタンパク質の反対に荷電した基によって引き寄せられるときに形成される。逆に荷電した原子間の最適距離は約２．８Åであるが、逆に荷電した基の重心間の距離は、問題とする基の大きさにしたがって変化し得る。
【００５８】
水素結合は、水素原子が電気陰性の原子（水素原子供与体）に結合し、また他の電気陰性原子（水素結合受容体）により引き寄せられるときに形成される。水素結合における２つの電気陰性原子間の距離は、約２．５Åと約３．３Åのあいだである。
【００５９】
疎水性相互作用は、２つの疎水性基がファンデルワールス力で相互に引き寄せられるときに形成される。２つの疎水性基の重心間の距離は、問題とする基の大きさにしたがって変化し得る。
【００６０】
原子座標からの距離測定は、結合部分とその活性部位とのあいだの相互作用に対してつぎの距離幅を示している。疎水性相互作用に対する距離は、疎水性部分の重心からＰＬＢ−タンパク質の骨格原子（カルボニル酸素、アミド窒素、α炭素）までと下記に定義されており、その理由は骨格原子は空間において静置しているからである。
【００６１】
１．第一電気陰性部分
塩橋を形成することによりＰＬＢのＳ１結合部位と会合している第一電気陰性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ａ）第一電気陰性部分（陰性に荷電している基）の重心からＡｒｇ−９のＣＺ原子までの距離は、約２．３Åと約６．３Åとのあいだである。
ｂ）第一電気陰性部分（陰性に荷電している基）の重心からＡｒｇ−１３のＣＺ原子までの距離は、約１．６Åと約５．６Åとのあいだである。
【００６２】
水素結合を形成することによりＰＬＢのＳ１結合部位と会合している第一電気陰性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ｃ）第一電気陰性部分の電気陰性原子（水素結合受容体）からＴｙｒ−６のＯＨ原子までの距離は、約２．５Åと約３．３Åとのあいだである。
ｄ）第一電気陰性部分の電気陰性原子（水素結合受容体）からＡｒｇ−９のグアニジニウム窒素のいずれかまでの距離は、約２．５Åと約３．３Åとのあいだである。
ｅ）  第一電気陰性部分の電気陰性原子（水素結合受容体）からＡｒｇ−１３のグアニジニウム窒素のいずれかまでの距離は、約２．５Åと約３．３Åとのあいだである。
【００６３】
２．第二電気陰性部分
塩橋を形成することによりＰＬＢのＳ２結合部位と会合している第二電気陰性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ａ）第二電気陰性部分（陰性に荷電している基）の重心からＡｒｇ−１４のＣＺ原子までの距離は、約１．５Åと約５．５Åとのあいだである。
【００６４】
水素結合を形成することによりＰＬＢのＳ２結合部位と会合している第二電気陰性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ｂ）第二電気陰性部分の電気陰性原子（水素結合受容体）からＡｒｇ−１４のグアニジニウム窒素のいずれかまでの距離は、約２．５Åと約３．３Åとのあいだである。
【００６５】
３．第一疎水性部分
ＰＬＢのＳ３結合部位と会合している第一疎水性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ａ）Ｓ３結合部位における第一疎水性部分の重心からＭｅｔ−２０のアミド窒素までの距離は、約６．０Åと約１２．０Åとのあいだである。
ｂ）Ｓ３結合部位における第一疎水性部分の重心からＬｙｓ−２７のカルボニル酸素までの距離は、約４．４Åと約１０．４Åとのあいだである。
ｃ）Ｓ３結合部位における第一疎水性部分の重心からＬｅｕ−２８のα炭素までの距離は、約２．９Åと約８．９Åとのあいだである。
【００６６】
４．第二疎水性部分
ＰＬＢのＳ４結合部位と会合している第二疎水性部分は、好ましくは、つぎのようになるように会合する：
ａ）Ｓ４結合部位における第二疎水性部分の重心からＰｈｅ−３２のカルボニル酸素までの距離は、約３．６Åと約９．６Åとのあいだである。
ｂ）Ｓ４結合部位における第二疎水性部分の重心からＰｈｅ−３５のアミド窒素までの距離は、約５．６Åと約１１．６Åとのあいだである。
【００６７】
本明細書で開示されている原子座標から作成されるファーマコフォア、すなわち、１つのクラスのＰＬＢ−不活性化剤の三次元定義は、図１３に示されている。それぞれの球は、それぞれの結合部分の重心が複合体中に位置すべき空間を表わし、球の中心は最適位置である。結合部分間の最適距離も与えられている。
【００６８】
図１４において、実施例１２の化合物がどのようにしてファーマコフォアに適しているかが証明されている。Ｓ２〜Ｓ４に相補的であるこれらの結合部分の位置はかなりよく、一方Ｓ１に相補的な結合部分の位置は最適性に劣ると思われ得る。各結合部分の重心の、ＰＬＢ−タンパク質の選択された骨格原子までの距離が以下に与えられている。
2004226176.tif 000004
【００６９】
これらの値は、前記で与えられた距離幅の定義と比較され得る。さらに、Ｓ２〜Ｓ４に対する結合部分は、定義された範囲内にあるのに対して、Ｓ１に対する結合部分は、定義された範囲の境界付近にある。
【００７０】
本発明によりデザインされたホスホランバン不活性化剤の例は、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【００７１】
【化５】
2004226176.tif 000005
【００７２】
（式中、Ｒ１は水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロゲンアルキル、アルコキシ、ＣＯＲ１０、ＣＯＮＲ１０Ｒ１１、ＯＲ１０、Ｓ（Ｏ）ｍＲ１０、ＮＲ１０ＣＯＲ１１またはＮＲ１０Ｒ１１、ここでＲ１０は水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロゲンアルキル、アルコキシまたはヒドロキシ、そしてＲ１１は水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシまたはアシル、またはＸがＮＲ１１の場合、Ｒ１はカルボキシアルキル、
Ｒ６は水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、
Ｒ２およびＲ７は水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルケニル、ＣＯＲ１０、ＣＯＮＲ１０Ｒ１１、ハロゲン、トリフルオロメチル、ニトロまたはシアノ、ここでＲ１０およびＲ１１は前記と同じ、
Ｒ３は水素、アルキル、アリールまたはアリールアルキル、Ａは、アルキルまたは置換アルキルを意味し、ｍは０〜２、およびｎは１〜３、ＹはＯ、ＮＲ１１またはＳ、ここでＲ１１は前記と同じ、ＸはＯ、ＮＲ１１またはＳ、ここでＲ１１は前記と同じ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８およびＲ９は独立して以下の基：
【００７３】
【化６】
2004226176.tif 000006
【００７４】
の１つ、またはＸがＮＲ１１の場合、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８およびＲ９は独立して、ＨＯＯＣ−、Ｒ１２ＯＯＣ−、Ｈ２ＮＣＯ−またはＨＯＨＮＣＯ−、ここでＲ１２はアルキル、アリールアルキルまたはアリール、そしてここで、それ自身またはほかの基の一部として定義される各アリール残基は置換されていてもよい）で表される化合物、およびその薬学的に許容し得る塩およびエステルを包含するが、それらに限定されるものではない。
【００７５】
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、それらをＰＬＢ細胞質ドメインのリガンド結合部位に結合させ得る構造的特徴を共有し、それにより心臓のＳＲ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅに対するＰＬＢの阻害作用を軽減する。
【００７６】
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、以下のスキーム１にしたがって、１，３−ジヒドロキシ置換へテロ芳香族化合物から、適当なアルキル化剤、たとえばクロロアセトニトリルまたはブロモ酢酸エステルによってジヒドロキシ化合物のアルキル化によって製造され得る。スキーム１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ＸおよびＹは前記と同じであり、Ｒ′は、ヒドロキシル基の保護基、たとえばメチル、ベンジルまたはテトラヒドロピラニルである。
【００７７】
【化７】
2004226176.tif 000007
【００７８】
前記シアノ化合物（ＩＶ）は、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １９９６，  ３９，  ５２２８−５２３５に記載された方法を用いて、１，２，４−オキサジアゾールおよび１，２，４−チアジアゾール誘導体を製造するために使用される。
【００７９】
合成はスキーム２に示す。スキーム２においてＲ１、Ｒ２、Ｒ３、ＸおよびＹは前記とおなじである。
【００８０】
【化８】
2004226176.tif 000008
【００８１】
置換基Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８およびＲ９のような他のヘテロ環は、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，  １９９４，  ４，  ４５−５０に記載されたように製造される。
【００８２】
ジヒドロキシ芳香族化合物（ＩＩＩ）は文献の方法の使用により製造される。クマリン（ＸＩＶ）、（ＸＶＩ）および（ＸＸ）は、スキーム３および４に表わすクネーフェナーゲル（Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ）縮合またはフォン  ペヒマン（ｖｏｎ  Ｐｅｃｈｍａｎｎ）反応の使用により製造される。スキーム３および４において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記と同じ、Ｚはアルキル、アリール、アリールアルキルまたはアルケニル、そしてＲ′はヒドロキシル基の保護基、たとえばメチル、ベンジルまたはテトラヒドロピラニルである。
【００８３】
【化９】
2004226176.tif 000009
【００８４】
【化１０】
2004226176.tif 000010
【００８５】
キノリノンは、スキーム５に記載されたクノール（Ｋｎｏｒｒ）反応によって製造される。スキーム５において、Ｒ１、Ｒ１１およびＲ３は前記と同じ、Ｘはハロゲンである。
【００８６】
【化１１】
2004226176.tif 000011
【００８７】
環状化合物（ＩＩ）は、スキーム６にしたがって製造され得る化合物（ＸＸＸＩ）から相応して製造され得る。スキーム６において、Ｒ２およびＲ６は前記と同じ、Ｒ′はヒドロキシル基の保護基、たとえばメチル、ベンジルまたはテトラヒドロピラニルである。
【００８８】
【化１２】
2004226176.tif 000012
【００８９】
環状キノリノン化合物（ＩＩ）はスキーム５を用いて（ＸＸＶＩ）から相応して製造され得る。
【００９０】
これら化合物の塩およびエステルは、適当な場合、既知の方法によって製造され得る。生理学的に許容し得る塩は活性医薬として有用であるが、アルカリ金属またはアルカリ土類金属との塩が好ましい。生理学的に許容し得るエステルもまた、活性医薬として有用である。その例としては、脂肪族アルコールまたは芳香族アルコールとのエステルがあげられる。
【００９１】
本明細書において、それ自身またはそのほかの基の一部として使用される用語「アルキル」は、炭素数１８まで、好ましくは炭素数１から８、最も好ましくは炭素数１から４の直鎖および分岐鎖の双方の基を包含する。本明細書において、それ自身またはそのほかの基の一部として使用される用語「低級アルキル」は、炭素数１から７、好ましくは炭素数１から４、最も好ましくは炭素数１または２の直鎖および分岐鎖の双方の基を包含する。アルキル基および低級アルキル基それぞれの具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、デシルおよびドデシル、ならびにそれらのさまざまな分岐鎖異性体があげられる。
【００９２】
本明細書において、それ自身またはそのほかの基の一部として使用される用語「アシル」は、アルキルカルボニル基またはアルケニルカルボニル基をいい、アルキル基およびアルケニル基は前記で定義されている。
【００９３】
本明細書において、それ自身またはそのほかの基の一部として使用される用語「アリール」は、環部分に６から１０の炭素原子を含む単環式または二環式の基をいう。アリール基の具体例としては、フェニル、ナフチルなどがあげられる。「アロイル」は、対応する方法で酸素原子に結合したアリール基を意味する。
【００９４】
本明細書において、それ自身またはそのほかの基の一部として使用される用語「アルコキシ」は、酸素原子に結合した前記と同じアルキル基を包含する。「アリールオキシ」は、対応する方法で酸素に結合したアリール基を意味する。
【００９５】
本明細書において、さまざまな基と関連して使用される用語「置換」は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素またはトリフルオロメチル基などのハロゲン置換基、アミノ、アルキル、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、ハロゲンアリール、シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、ヒドロキシ、アルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ニトロ、シアノ、チオールまたはアルキルチオ置換基をいう。
【００９６】
「置換」基は、前記置換基の１から３、好ましくは１または２、最も好ましくは１を含んでもよい。
【００９７】
本発明にしたがってデザインされた化合物は、患者の年齢、体重、状態、投与経路および使用されるホスホランバン不活性化剤によって、通常、１日当たり約０．１から５００ｍｇの範囲にある、治療に効果的な量で患者に投与され得る。本発明にしたがってデザインされた化合物は、当該分野に既知の原理を使用して投薬形態に製剤化され得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、座剤、エマルジョン、懸濁液または溶液の形態で、そのまま、または適当な薬学的賦形剤と組み合わせて患者に与えられ得る。組成物の好適な成分の選択は、通常の当業者にとって決まりきったことである。好適な担体、溶液、ゲル化剤、分散化剤、抗酸化剤、着色料、甘味料、湿潤化合物および通常この技術分野で使用されるほかの成分も使用され得ることは明らかである。活性成分を含有する組成物は、経腸的または非経腸的に投与され得るが、経口ルートが最も好ましい方法である。組成物中の活性化合物の含有量は、全組成物の重量に対して、約０．５から１００％、好ましくは約０．５から約２０％である。
【００９８】
以下の実施例は、単に本発明のさまざまな側面の説明として記載されたものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００９９】
【実施例】
実施例１  ホスホランバンの細胞質ゾルドメインの構造
ホスホランバン（１〜３６）の合成、精製および特徴づけ
アミノ酸配列ＭＥＫＶＱＹＬＴＲＳＡＩＲＲＡＳＴＩＥＭＰＱＱＡＲＱＫＬＱＮＬＦＩＮＦＣを有する、ホスホランバンペプチドの細胞質ゾル部分は、フルオレニルメトキシカルボニル法を用いて自動ペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ）で合成した。合成は、疎水性Ｃ−末端から開始した。合成中に使用した側鎖の保護基は、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＣｙｓに対してはトリチル（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕに対してはｔｅｒｔ−ブトキシ（ＯｔＢｕ）、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒに対してはｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）、Ｌｙｓに対してはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）そしてＡｒｇに対しては２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）であった。
【０１００】
事前に充填した樹脂の量は１００μｍｏｌであり、合成の各工程でのアミノ酸の量は１ｍｍｏｌであった。これは、事前に充填した樹脂の量と比較して１０倍過剰量であった。
【０１０１】
樹脂支持体（通常、Ｗａｎｇ樹脂が事前に充填される）からのペプチドの切断は、５％ＴＦＡ、０．２％β−メルカプトエタノール、０．２％チオアニソールおよび０．２％ジメチルスルフィドを含有する塩化メチレン中で行なわれた。ペプチドの側鎖の脱保護は、エタンジチオール：チオアニソール：水：トリフルオロ酢酸＝２５０μｌ：５００μｌ：５００μｌ：１０ｍｌの混合物中で、１．５時間、室温で行なわれた。そののち、ペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルで３回洗浄し、凍結乾燥した。
【０１０２】
合成した粗ホスホランバン（１〜３６）ペプチドを、分析用逆相（ＲＰ）カラム（Ｃ８、２０μｍ、直径４．６ｍｍ×３０ｍｍ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  ＴＭカラム）を用いて高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。０．１％ＴＦＡにおけるアセトニトリル（３０分で０〜１００％）のリニアグラジエントを溶出に使用した。
【０１０３】
再精製ペプチドを、Ｃ１８  Ｋｒｏｍａｓｉｌ、５μｍ（１．０×２５ｃｍ）カラムを用いてＨＰＬＣ  ＲＰ−クロマトグラフィーによりさらに精製した。ペプチドは、０．１％ＴＦＡにおけるアセトニトリル、０．０７５％ＴＦＡ（１０分で３〜３０％、１２０分で３０〜５０％）の段階的グラジエントを用いて溶出した。精製ホスホランバン（１〜３６）ペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ついでクーマシーブリリアントブルー染色により特徴付けた。ウエスタンブロット分析を市販のモノクローナル抗ＰＬＢ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して行なった。ペプチドを含む精製ＲＰ−クロマトグラフィーのピークを、３３７ｎｍ窒素レーザーを使用してＢＩＦＬＥＸ（登録商標）質量分析計を用いて反射型（ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｅ）で質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によりさらに分析した。試料を、質量分析用のシナピン酸マトリックスの液滴と共に、３０％  アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡを含む溶液中に適用した。精製タンパク質の総量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄにしたがい、さらに標準物質としてβ−ラクトグロブリンを用いたＲＰ−クロマトグラフィーに基づき見積もった。精製ペプチドを凍結乾燥し、乾燥粉末の重量を三次元構造解析の前に測定した。
【０１０４】
ホスホランバン（１〜３６）のＮＭＲスペクトルの獲得
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＲＸ４００およびＶａｒｉａｎＵＮＩＴＹ６００ＮＭＲ分析計において、それぞれ４００．１３ＭＨｚおよび５９９．８６ＭＨｚで得た。ジスルフィドの形成を防止するため６ｍＭ  ｄ１０−ＤＴＴを含有するＨ２Ｏ：Ｄ２Ｏ：ｄ３−ＴＦＥ（６３：７：３０）の混合溶媒におけるＰＬＢの３６−ａ．ａ．フラグメントの３ｍＭ溶液に対して１Ｄおよび２ＤＮＭＲスペクトルを得た。ｐＨを、マイクロリットル量のＮａＯＤで３．００±０．０２に調整した（重水素同位体効果のため不正確）。ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ（３０〜９０ｍｓ）およびＮＯＥＳＹ（４０〜４００ｍｓ）スペクトルを、２、７、１７および２７℃で、スペクトル幅８．５ｐｐｍを用いたＳｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩ法により記録した。２Ｄデータは加重され、２ｋ×１ｋの実点の行列にフーリエ変換された。残留溶媒系を飽和させた（２．０ｓ）トランスミッターは逆重畳によって換算した。スペクトルは残留溶媒シグナル（２７℃で４．７５ｐｐｍ、−１０ｐｐｂ／℃）を基準とした。一連の１Ｄスペクトルを種々の温度（２から４７℃に変動）で取得した。
【０１０５】
ホスホランバン（１〜３６）のＮＭＲスペクトルの帰属
スピン系の帰属および連続帰属は、１２、１７および２７℃で得られたＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹスペクトルを使用して、Ｗｅｕｔｈｒｉｃｈ，  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  ”ＮＭＲ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ”  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮｅｗＹｏｒｋにしたがって誘導した。アミドプロトンの化学シフトの温度依存性の相違は、共鳴の重なりを解くのに足るものであった。非変性メチレンに対する立体特異的帰属は、ＣＯＳＹスペクトルから測定される結合定数ＪＨαＨβと、残基内ＮＯＥ交差ピーク強度とから演繹された。
【０１０６】
ホスホランバン（１〜３６）構造の発生および精密化
一連のＮＯＥＳＹスペクトルを１７℃にて５種類の混合時間（５０、８０、１２０、１６０および２００ｍｓ）で得た。積算した交差ピーク強度（Ｉ）をＮＯＥＳＹ累積分析（ＮＯＥＳＹ−ｂｕｉｌｔ−ｕｐ−ａｎａｌｙｓｉｓ）において使用した。距離制限（ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）を、初期条件Ｉ（τｍ＝０）＝０を用いて、一連のＮＯＥから積算された交差ピークの体積に適合させた二次多項曲線の初期勾配から引き出した。内部メチレンＮＯＥおよび連続ＮＯＥが校正に役立った。最初に、第一の構造群の発生のために、距離を、短い（１．８〜２．５Å）、中程度（１．８〜３．５Å）または長い（３．０〜６．０Å）のように分類した。部分的（＞２０％）重なり、不充分なシグナル−ノイズ比または妨害により距離が累積曲線から算出できない場合は、距離を５．０Å未満としたのみであった。各仮の原子に対して１．０Åずつ上限を拡大した。制限データに、１２℃で得られた１５０ｍｓＮＯＥスペクトルからの強、中および弱ＮＯＥに基づく距離制限を加えた。
【０１０７】
結合定数（Ｊ）をＪ−倍加法（ＭｃＩｎｔｙｒｅ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  ９６，  ４２５−４３１）により、ＣＯＳＹ交差ピークの微細構造から算定した。中間Ｊによって特徴付けられた二面φおよびχは拘束しなかったが、小および大ＪＮＨαおよびＪＨαＨβは、カープラス（Ｋａｒｐｌｕｓ）関数および残基内ＮＯＥに基づいてねじれ型配座（±３０度）に関連づけた（Ｋａｒｐｌｕｓ，  Ｍ．  （１９６３）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８５，  ２８７０）。Ｈ−Ｈ距離制限および二面角制限を計算し、データをソフトウェアＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に取り込み、構造を発生させ、評価し、精密化した。模擬ＮＯＥＳＹスペクトルを逆算した。タンパク質の座標ファイルを、ソフトウェアＰＲＯＭＯＴＩＦ  ｖ２．０（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，  Ｇ．  （１９９５），  ｖ２．０  Ｅｄ．，  １２８．４０．４６．１１における匿名ｆｔｐより入手）により分析した。
【０１０８】
構造を距離幾何学（ＤＧＩＩ）により発生させ、ついで模擬アニーリングを行なった（力場ＡＭＢＥＲ）（Ｈａｖｅｌ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９７９）  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  １８，  ７３）。一組の構造が算定された。制限違反の最も少ない構造を用いて、ＮＯＥマトリックスを逆算した。α−へリックスの典型的なＮＯＥによって特徴付けられたセグメントの後の残基のＨα化学シフトが、−０．２ｐｐｍよりも大きい相当するランダムコイルの値から逸脱した場合は、対応する二面Ψも制限された（±６０度）。そののち、新しい一組の構造が算出された。この新しい構造群から、０．２Åを超過しない構造のみを承認した。
【０１０９】
帰属結果
記載した実験条件下で完全なスピン系帰属および連続帰属を得た。帰属を、１７℃で、５４％  Ｈ２Ｏ／６％  Ｄ２Ｏ／３０％  ｄ３−ＴＦＥ、ｐＨ３．０５におけるＰＬＢ（１〜３６）のＨ−化学シフトを示す表Ｖ（本願に添付）にあげる。表Ｖにおいて、ねじれ型配座は、アンチ−配座においてはＣβＨの化学シフトに下線を引くことにより示し、ＣαＨに対するゴーシュ型配座（−６０度）においては点線により示した。
【０１１０】
図７は、１７℃で、５４％  Ｈ２Ｏ／６％  Ｄ２Ｏ／３０％  ｄ３−ＴＦＥ、ｐＨ３．０５におけるＰＬＢ（１〜３６）に対する、観測された連続および中位ＮＯＥ連結性の概略であり、帰属は、１２０、１６０および２００ｍｓ混合時間で得られたＮＯＥＳＹスペクトルからなされた。連続ＮＯＥは斜線ブロックで示した。中位ＮＯＥは、適切な残基を結ぶ矢印で表わした。中空円は、７Ｈｚより小さい３ＪＮＨαＣＨ結合定数を意味する。αＣＨの二次シフト（Δδ）は、各残基に対する観測された化学シフトとランダムコイル化学シフトとの差として定義される。Ｗｉｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９２），  ３１，  １６４７−１６５１によれば、負（高磁場（ｕｐｆｉｅｌｄ））のΔδ値はα−へリックス二次構造と関連付けられ、正（低磁場（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ））のΔδ値はβ−構造と関連付けられる。
【０１１１】
全部で７２３のＮＯＥを帰属した。３４個の可能な内部ＮＨ−ＣαＨ相関はすべて、フィンガープリント領域において観測された。対応するＮＯＥのほとんどは、かなり強力で、ＮＨｉ＋１−ＣαＨｉＮＯＥ（図７）に匹敵する。多くの連続ＮＨｉ−ＮＨｉ＋１およびＮＨｉ−ＮＨｉ＋２ＮＯＥが存在した。巨大なＣαＨｉ−ＮＨｉ＋３およびいくつかのＣαＨｉ−ＮＨｉ＋４ＮＯＥは、ＮＯＥＳＹスペクトルのフィンガープリント領域に集中した。さらに、多数のＣαＨｉ−ＣβＨｉ＋３交差ピークがあった。ｉ＞ｉ＋４より長い相互作用に由来するＮＯＥがＭｅｔ２０のプロトンに対してのみ観測された。
【０１１２】
ＮＨとＣαＨとのあいだのＪ−カップリングは、ほとんどの残基に関して小さかった。ＣＯＳＹ交差ピークの共鳴の重なり、または強度の弱さのために、すべての残基に対して正確な値を測定することは不可能であったが、カップリングは、Ｎ末端およびＣ末端の残基、およびＰＬＢ（１〜３６）の中心の残基を除いて、７〜８Ｈｚを下回っていた。
【０１１３】
ＰＬＢ（１〜３６）の中心領域は、へリックス特性を示さなかった。すなわち、残基Ｇｌｕ１９、Ｍｅｔ２０およびＰｒｏ２１のδＣαＨ値は、それらのランダムコイル値よりも顕著に小さいものではなかった。Ｇｌｕ１９およびＭｅｔ２０は、へリックス構造の典型的なＮＯＥが主に欠けており、Ｇｌｕ１９のＣαＨとＭｅｔ２０のＮＨとのあいだ、およびＭｅｔ２０のＣαＨとＰｒｏ２１のＣδＨｓとのあいだにはっきりとした強い連続ＮＯＥがあった。さらに、混み合ったフィンガープリント領域において部分的に覆い隠されたときでさえ、Ｉｌｅ１８のＣαＨとＧｌｕ１９のＮＨとのあいだのＮＯＥは強いものであった。これらはすべて、ＰＬＢ（１〜３６）の中央領域が伸びたコンホメーションをとることを意味する。伸びたセグメントは、伸びているにもかかわらず、短い。Ｔｈｒ１７およびＧｌｎ２２は、αへリックス残基のＮＯＥおよび結合定数特性を示し、Ｇｌｕ１９およびＭｅｔ２０の側鎖プロトンから、Ｎ末端およびＣ末端へリックスの隣接した残基のプロトンへのＮＯＥが存在する。我々は、Ｎ末端およびＣ末端αへリックスがＩｌｅ１８、Ｇｌｕ１９、Ｍｅｔ２０およびＰｒｏ２１でのターンによって分離されていると推論する。プロリンは、トランス型コンホメーションで存在する。Ｎ末端およびＣ末端へリックスの軸が平行になるような堅いターンは不可能である。Ｎ末端へリックスとＣ末端へリックスとのあいだに、不明瞭なＮＯＥが存在する。
【０１１４】
ＰＬＢ（１〜３６）の構造
ＰＬＢ（１〜３６）の構造は、共有構造だけによってより正確に定義されたものを除いた５９９の距離制限および５０の二面制限から決定される。これらの重複ＮＯＥ誘導制限は、共有的に強要された距離制限に合致しており、これは、距離の校正が妥当なものであるということを示唆した。平均して、残基あたり１６．６の有意なＮＯＥ誘導制限が存在した。Ｎ末端へリックスの残基Ｌｙｓ３〜Ｉｌｅ１８は、平均して、Ｃ末端へリックスにおける残基Ｇｌｎ２２〜Ｃｙｓ３６よりも残基あたりの制限が少ない。これは、Ｎ末端へリックスにおけるよりもＣ末端へリックスにおいて、残基あたりの非変性シフトを有するプロトンが平均して多く存在するという事実（表Ｖ）に、少なくとも部分的に起因するものである。ターンを制限する残基Ｉｌｅ１８〜Ｐｒｏ２１に関しては、Ｎ末端へリックスにおける残基と同じほどの残基あたりの制限が存在した。
【０１１５】
構造発生により、すべてへリックス−ターン−へリックスモチーフを示す構造群が得られた。根二乗平均偏差を、０．２Åを超える距離違反や二面違反をもたない２０の構造群から計算した。図９は、ＮＯＥデータから得られたＰＬＢ（１〜３６）の構造の質が示され、残基あたりのＲＭＳＤおよび残基あたりの制限の数を示す。
【０１１６】
あいまいな遠位ＮＯＥがＮ末端へリックスとＣ末端へリックスとのあいだに見られたので、構造群は、Ｎ末端およびＣ末端へリックスの遠く離れた部分において原子座標の分散を表示した。へリックスの相互の方向は、ターンにおける短距離の距離制限によってのみ拘束された。したがって、残基あたりのＲＭＳＤは、ｉ）Ｎ末端へリックスとターン（ａ．ａ．１〜２１）について、およびｉｉ）Ｃ末端へリックスとターン（１８〜３６）について、別々に算定された。ＲＭＳＤは、予想どおり、残基あたりの制限数とおおまかな逆相関を示した。平均して、Ｎ末端へリックスの原子を、１．３Å（骨格のみ）および２．３Å（全原子）の精度に、Ｃ末端へリックスでは０．８Å（骨格のみ）および１．９Å（全原子）の精度に定めた。Ｇｌｕ１９のＣαからＰｒｏ２１のＣαまでのセグメントが伸ばされ、Ｍｅｔ２０の側鎖がＣ末端へリックスにほぼ平行に突出し、そしてＧｌｕ１９の側鎖がほとんど反対方向に向いている構造に対して、最小数の距離違反（０．２Å未満）が観測された。これらの構造において、ペプチド結合Ｉｌｅ１８〜Ｇｌｕ１９の面は、伸びたセグメントの面に対してほぼ直角である。
【０１１７】
ターンの構造的可動性のため、構造群は、Ｎ末端およびＣ末端へリックスの相対位置における分散を示す。分散は、それでもなお制限される。群のさまざまな構造をＣ末端へリックスの残基のＣα上に重ね合わせる場合、Ｎ末端の軸が、約９０度の開口と約８０度の相対角を有する円錐内に分散される。一方が膜貫通であり他方が両親媒性である２つの連続したへリックスに対する同様の相互の方向は、小さな膜結合タンパク質またはペプチドに対して見出されているかまたは仮定されている（Ｓｔｏｐａｒ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３５  （４８），  ５４６７−５４７３）。
【０１１８】
ある構造においては、Ａｒｇ９、Ａｒｇ１３およびＡｒｇ１４の側鎖εＮＨは、その化学シフトがＴとほぼ無関係であり、Ｓｅｒ１０、Ｓｅｒ１６およびＴｈｒ１７の隣接した側鎖の酸素と水素結合を形成する。Ａｒｇ２５に関しては、大きいΔδＮＨ（Ｔ）を有し、明らかな水素結合のドナー候補が存在しなかった。グルタミンおよびアスパラギンの側鎖ＮＨ２はへリックス軸に平行な水素結合ネットワークを形成し得た。
【０１１９】
ＰＬＢのリン酸化に関して、我々はリン酸化部位Ｓｅｒ１６が容易に利用でき、溶媒にさらされていることが重要であることを見出した。Ｎ末端へリックス上のＴｈｒ１７は、Ｃ末端へリックスに面しており、Ｓｅｒ１６より溶媒に曝されていないように思われる。αへリックスのピッチのため、Ａｒｇ１３およびＡｒｇ１４も、へリックスの同じ側面上のＳｅｒ１６およびＴｈｒ１７に関して位相で６０度遅れる配向性で曝されている。ホスホキナーゼの基質（たとえば、トポロニンＩ）において、セリンまたはトレオニン残基の近傍に正電荷残基の存在がしばしば見られる。
【０１２０】
我々は、Ｎ末端へリックスの一面が、主に極性または親水性であるということを見出した。同じことがＣ末端へリックスについても当てはまり、その極性残基は、親油性側鎖によって占められる他の面から離れて一面に局在化される。ヘリックスの相対的な配向性のため、Ｎ末端へリックスの親水性面は、常にＣ末端へリックスの親油性面に面しているということが注目され得る。これは、両親媒性のアームピットと言われているポケットを定義する。このポケットにおいて、Ｎ末端上の極性残基と、Ｃ末端上の親油性残基との相対位置は、選択された側鎖の座標を平均化することにより計算された２つの重心を用いることによって都合よく定義され得る。Ｎ末端に関連した重心を構築するためにＡｒｇ１３、Ａｒｇ９およびＴｙｒ６の側鎖の座標が使用され、Ｃ末端に関連した重心を構築するためにＰｈｅ３２およびＰｈｅ３５の側鎖の座標が使用された。これら２つの重心のあいだの距離は、群のすべての構造に対して計算され、１８．５±４．５Åであった。ＰＬＢ（１〜３６）の洗練された構造を図３に示す。
【０１２１】
実施例２  環状ペプチドｃＰ２２６の構造
ペプチドの合成、環化および精製
アミノ酸配列ＣＹＷＥＬＥＷＬＰＣＡを有する線状ペプチドを、フルオレニルメトキシカルボニル法を用いて自動ペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ）で合成した。合成は、カルボキシ末端から開始した。合成中に使用した側鎖の保護基は、Ｃｙｓに対してはトリチル（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕに対してはｔｅｒｔ−ブトキシ（ＯｔＢｕ）そしてＴｙｒに対してはｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）であった。
【０１２２】
事前に充填した樹脂の量は１００μｍｏｌであり、合成の各工程でのアミノ酸の量は１ｍｍｏｌであった。
【０１２３】
樹脂支持体（通常、Ｗａｎｇ樹脂が事前に充填される）からのペプチドの切断、ならびに側鎖の脱保護は、エタンジチオール：チオアニソール：水：トリフルオロ酢酸＝２５０μｌ：５００μｌ：５００μｌ：１０ｍｌの混合物中で、１．５時間、室温で行なった。そののち、ペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテルで３回洗浄し、凍結乾燥した。
【０１２４】
ペプチド合成に使用したアミノ酸および事前充填樹脂はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製で、エタンジチオール（ＥＤＴ）およびチオアニソールはＦｌｕｋａ製であった。
【０１２５】
精製したペプチドを０．５ｍｇ／ｍｌで、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＣＯ３に溶解することにより、環状ペプチドｃＰ２２６を線状ＣＹＷＥＬＥＷＬＰＣＡペプチドから再構成した。そして、その溶液を室温で１〜２日放置することによって、分子内ジスルフィド架橋を形成するための２つのシステイン残基のＳＨ基の酸化を行なった。反応を、時間の関数として変化する線状および環状ペプチドのピークからＨＰＬＣクロマトグラフィーで追跡した。
【０１２６】
線状および環状ｃＰ２２６の両ペプチドを、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｃ８、Ａｑｕｑｐｏｒｅ  オクチル、３０μｍ、１０×１００ｍｍ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により、０．１％ＴＦＡから１００％アセトニトリルへの３０分リニアグラジエントを用いて精製し分離した。得られたペプチドを質量分析により特徴付けた。
【０１２７】
ｃＰ２２６のＮＭＲスペクトル
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＲＸ４００およびＶａｒｉａｎＵＮＩＴＹ６００ＮＭＲ分光計において、それぞれ４００．１３ＭＨｚおよび５９９．８６ＭＨｚで得た。環状ペプチドの１ｍＭ水溶液に対して１Ｄおよび２ＤＮＭＲスペクトルを得た。ｐＨを、マイクロリットル量のＮａＯＤで６．５０±０．０２に調整した（重水素同位体効果のため不正確）。ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ（３０〜９０ｍｓ）およびＮＯＥＳＹ（２００〜４００ｍｓ）スペクトルを、５、１０、１５および２７℃で、スペクトル幅８．５ｐｐｍを用いたＳｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩ法により記録した。２Ｄデータは加重され、２ｋ×１ｋの実点の行列にフーリエ変換された。残留溶媒系を飽和させた（２．０ｓ）トランスミッターは逆重畳によって換算した。スペクトルは残留溶媒シグナル（２７℃で４．７５ｐｐｍ、−１０ｐｐｂ／℃）を基準とした。
【０１２８】
ｃＰ２２６のＮＭＲスペクトルの帰属
スピン系の帰属および連続帰属は、５、１０および２７℃で得られたＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹスペクトルを使用して、実施例１と同様にＷｅｕｔｈｒｉｃｈにしたがって誘導した。アミドプロトンの化学シフトの温度依存性の相違は、共鳴の重なりを解くのに足るものであった。非変性メチレンに対する立体特異的帰属は、ＣＯＳＹスペクトルから測定される結合定数ＪＨαＨβと、残基内ＮＯＥ交差ピーク強度とから演繹された。
【０１２９】
ｃＰ２２６構造の発生および精密化
一連のＮＯＥＳＹスペクトルを１０℃にて種々の混合時間（２００、３００、４００ｍｓ）で得た。積算した交差ピーク強度（Ｉ）をＮＯＥＳＹ累積分析において使用した。距離制限を、初期条件Ｉ（τｍ＝０）＝０を用いて、一連のＮＯＥから積算された交差ピークの体積に適合させた二次多項曲線の初期勾配から引き出した。内部メチレンＮＯＥおよび連続ＮＯＥが校正に役立った。最初に、第一の構造群の発生のために、距離を、短い（１．８〜２．５Å）、中程度（１．８〜３．５Å）または長い（３．０〜６．０Å）のように分類した。部分的（＞２０％）重なり、不充分なシグナル−ノイズ比または妨害により距離が累積曲線から算出できない場合は、距離を５．０Å未満としたのみであった。各仮の原子に対して１．０Åずつ上限を拡大した。制限データに、１０℃で得られた３００ｍｓＮＯＥスペクトルからの強、中および弱ＮＯＥに基づく距離制限を加えた。
【０１３０】
結合定数（Ｊ）をＪ−倍加法により、ＣＯＳＹ交差ピークの微細構造から算定した。中間Ｊによって特徴付けられた二面φおよびχは拘束しなかったが、小および大ＪＮＨαおよびＪＨαＨβは、カープラス関数および残基内ＮＯＥに基づいてねじれ型配座（±３０度）に関連づけた。Ｈ−Ｈ距離制限および二面角制限を計算した。最終的には、データをソフトウェアＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に取り込み、構造を発生させ、評価し、精密化した。模擬ＮＯＥＳＹスペクトルを逆算した。タンパク質の座標ファイルを、ソフトウェアＰＲＯＭＯＴＩＦ  ｖ２．０により分析した。
【０１３１】
構造を距離幾何学（ＤＧＩＩ）により発生させ、ついで模擬アニーリングを行なった（力場ＡＭＢＥＲ）。３０個で一組の構造が算定された。制限違反の最も少ない構造を用いて、ＮＯＥマトリックスを逆算した。逆算したＮＯＥスペクトルと実験的ＮＯＥ巣ペクトルとの比較に基づき、はっきりとより多くのＮＯＥを同定し、対応する距離制限を課すことが可能となった。その後、新しい３０個で１組の構造が算出された。この新しい群から、０．３Åよりも大きい、せいぜい１の違反を有する１２の構造が選択され、さらに検討された。よく分離された交差ピークに対応する距離制限を、制限違反（＞０．２Å、＞０度）をもたない構造に基づく反復緩和マトリックス法（ＩＲＭＡ）により精密化した。τｃの不確定性を考慮に入れるため、ＩＲＭＡによって得られた正確な距離の１０％以上に上限を維持した。ついで、精密化された制限セットを模擬アニーリングによって座標を精密化するために使用した。
【０１３２】
得られた最終的な１２個の構造群を、グラフィックソフトウェアＭＯＬＭＯＬ（Ｋｏｒａｄｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  １４，  ５１−５５）により視覚化した。
【０１３３】
帰属結果
記載した実験条件下で完全なスピン系帰属および連続帰属を得た。充分な磁化伝達（ｔｒａｎｓｆｅｔ）を誘導し交差ピークを視覚化するために、低温（＜１０℃）でのＮＯＥＳＹ実験、および比較的長い混合時間（＞３００ｍｓ）でのＮＯＥＳＹ実験を行なう必要があった。帰属を表ＶＩにあげる。
【０１３４】
ｃＰ２２６スペクトルは、８．５ｐｐｍを超える化学シフト分散を示した。ＣαＨシフトは３．９〜４．７ｐｐｍにおよび、ＮＨシフトの大部分は７．８〜８．５ｐｐｍのあいだに拘束されたが、Ｔｙｒ２およびＬｅｕ８については、ＮＨ共鳴は上場側にそれぞれ６．９ｐｐｍおよび７．３ｐｐｍにシフトした。非常に高い場（＞０ｐｐｍ）にはメチル基のシグナルはなかった。
【０１３５】
図１０は、１０℃で、９０％  Ｈ２Ｏ／１０％  Ｄ２Ｏ、ｐＨ６．５０におけるｃＰ２２６に対する、観測された連続および中位ＮＯＥ連結性の概略である。帰属は、３００および４００ｍｓ混合時間で得られたＮＯＥＳＹスペクトルからなされた。連続ＮＯＥは斜線ブロックで示した。中位ＮＯＥは、適切な残基を結ぶ矢印で表わした。中空円は、８Ｈｚより大きい３ＪＮＨαＣＨ結合定数を意味する。αＣＨの二次シフト（Δδ）は、各残基に対する観測された化学シフトとランダムコイル化学シフトとの差として定義される。Ｗｉｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９２），  ３１，  １６４７−１６５１によれば、負（高磁場（ｕｐｆｉｅｌｄ））および正（低磁場（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ））のΔδ値は、二次構造に関連付けられる。
【０１３６】
全部で１２０のＮＯＥを帰属した。９個の可能な内部ＮＨ−ＣαＨ相関は、フィンガープリント領域においてすべては観測されなかった。対応するＮＯＥのほとんどは、かなり弱かった。４つの連続ＮＨｉ−ＮＨｉ＋１および１つのＮＨｉ−ＮＨｉ＋２ＮＯＥのみが存在した。いくつかのＮＨｉ＋ｎ−ＣβＨｉがＮＯＥスペクトル中に見られ、連続帰属を容易化した。各残基に対する観測された化学シフトとランダムコイル化学シフトとの差として定義されるαＣＨの二次シフト（Δδ）は、折れ曲がり構造の証拠を与えた（図１０）。ｉ＞ｉ＋４より長い（環を横切る）相互作用から誘導されるＮＯＥが、Ｔｒｐ３およびＬｅｕ８の側鎖のプロトンならびにＴｙｒ２およびＣｙｓ１０のプロトンに対して観測された。
【０１３７】
ＮＨとＣαＨとのあいだのＪ−カップリング（ＣＯＳＹ交差ピークから計算される）は、ほとんどの残基に対して大きかった。すべての残基に対するカップリングは、８Ｈｚを上回っており、これは、φ角が大部分は１２０±３０°の値を有するということを示唆した。プロリンは、トランス型コンホメーションで存在した。
【０１３８】
ｃＰ２２６の構造
ｃＰ２２６の構造は、共有構造だけによってより正確に定義されたものを除いた１１０の距離制限および８の二面制限から決定される。これらの重複ＮＯＥ誘導制限は、共有的に強要された距離制限に合致しており、これは、距離の校正が妥当なものであるということを示唆した。平均して、残基あたり１０の有意なＮＯＥ誘導制限が存在した。ペプチドの中央部分の残基（Ｔｒｐ３からＬｅｕ８）は平均よりも残基あたりの制限が多い。これは、その領域の残基あたりの非変性シフトを有するプロトンが平均的に多く存在するという事実に、少なくとも部分的に起因するものである。
【０１３９】
構造発生により、すべてベンド−コイル−ベンド  モチーフを示す構造群が得られた（ＭＯＬＭＯＬ）。根二乗平均偏差を、０．３Åを超える距離違反や二面違反をもたない１２の構造群から計算した。小さい距離制限違反は、主に、側鎖、たとえばチロシンの側鎖のあいだに生じる。これは、非同時ＮＯＥを誘発し得るこれらの部分の極端な動きやすさの結果であり得る。残基あたりのＲＭＳＤを計算したところ、予想どおり、残基当たりの制限の数とおおよその逆相関を表わした。平均して、原子は０．９６Å（骨格のみ）および２．０２Å（全原子）の精度に定められ、Ｔｒｐ３からＴｒｐ７までのプロトンに対してのみ計算した場合は、０．７２Å（骨格のみ）および１．８７Å（全原子）の精度に定められた（表ＶＩＩ）。
【０１４０】
Ｔｒｐ３、Ｌｅｕ５、Ｔｒｐ７およびＬｅｕ８の親油性側鎖が、環式ペプチドの一方側に集中し、骨格の極性カルボニルおよびアミン基の大部分がもう一方の側に残った。
【０１４１】
このレポートに示すｃＰ２２６の構造を、前述のＰＬＢ（１〜３６）の構造上に合体させた。２つの構造の比較により、ｃＰ２２６上の２つのグルタミン酸残基が、ＰＬＢ（１〜３６）上のＡｒｇ９およびＡｒｇ１３との連結により結合に関与し、ｃＰ２２６の親油性クラスターがＰＬＢ（１〜３６）のＣ末端ヘリックスの親油性外側部分に曝されるという仮説が確認される。
【０１４２】
図１１は、ＮＭＲデータから推論されるｃＰ２２６の１２個の構造からなる群を示す。骨格、Ｔｒｐ３およびＴｒｐ７側鎖の重原子、Ｇｌｕ４およびＧｌｕ６側鎖の重原子、Ｇｌｕ４およびＧｌｕ６のβ炭素が示される。２つのグルタミン酸残基のベータ炭素間の距離（図１１）は高度に保存されていた（８．３±０．９Å）。この情報は、ｃＰ２２６上のＧｌｕ４およびＧｌｕ６の位置を２つのアセテート残基が模倣する小さな分子の設計に有用であり得る。同様に、２つのグルタミン酸残基からの親油性クラスターの距離も薬物設計工程において有用となる。
【０１４３】
実施例３  活性アッセイ
実験１  心臓および速骨筋から調製されたＳＲベジクル中へのカルシウム取り込みに対する効果
ホスホランバンに対する所定化合物の抑制効果を、心臓組織から調製されたＳＲベジクル中へのカルシウムの取り込み、および速骨筋（腰筋）から調製されたＳＲベジクル中へのカルシウムの取り込みに対する、その化合物の効果を測定することにより示した。両方の種類のＳＲベジクルは、Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅを含むが、速骨筋由来ベジクルはホスホランバンを含まない（Ｈｏｈ  ＪＦＹ，  ”Ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，  ４：  ８０１−８０８，  １９９２）。速骨筋から調製されたＳＲベジクルではなく、心臓組織から調製されたＳＲ小胞中に取り込まれるカルシウムが増大するということは、その化合物が、ＳＲ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅに対するホスホランバンの抑制効果を軽減し、したがってホスホランバン不活性化剤として作用することを示している。ホスホランバンは、心臓ＳＲ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅに対するその抑制効果をとおして哺乳動物の心臓における弛緩速度と収縮速度との両方を抑制するので、これらの効果を低減する化合物は、心臓疾患の治療において役立つ可能性がある。
【０１４４】
方法
モルモット（１０〜１２）を断頭した。それらの心臓または腰筋を切除し、氷冷０．９％ＮａＣｌ中で洗浄し、２０ｍＭ  トリス−マレイン酸塩、０．３Ｍスクロースを含む緩衝液（ｐＨ７．０）中で切断して断片とした。そののち、組織片を、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を用いて、さらにはポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）を用いて均質化した（１０ストローク）。ホモジネートを、４℃にて１０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を集め、ペレットを５ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ  トリス−マレイン酸塩、０．３Ｍスクロース、ｐＨ７．０）中に再懸濁させ、４℃にて１０００ｇで１０分間再び遠心分離した。得られた上清を、最初に集めておいた上清と合わせ、もう一度、４℃にて１００００ｇで２０分間遠心分離した。最終上清をろ過して、マグネチックスターラーとともに瓶に入れた。ＫＣｌを最終的濃度０．６Ｍ（４℃で）まで、ろ過した上清に添加した。得られた溶液を、４℃にて１０００００ｇで６０分間遠心分離した。ペレットを２０ｍＭ  トリス−マレイン酸塩、０．３Ｍスクロースを含む緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌ中に懸濁させ、４℃にて１０００００ｇで６０分間遠心分離した。得られたペレットを、２０ｍＭ  トリス−マレイン酸塩、０．３Ｍスクロース、０．１Ｍ  ＫＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌ中に懸濁させ、使用まで−８０℃で貯蔵した。別途調製した小胞調製品を標準化するためにタンパク質濃度も測定した。
【０１４５】
カルシウム取り込みアッセイにおいて、ＳＲ  Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅがベジクル外空間からＳＲベジクル中にＣａ２＋を移動させた場合に、蛍光指示薬ｆｌｕｏ−３を用いてベジクル外Ｃａ２＋濃度の減少を検出した。
【０１４６】
前記で得られたＳＲベジクル（５０μｇ  タンパク質／ｍｌ）を、４０ｍＭイミダゾール、９５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＮａＮ３、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭシュウ酸カリウム、２μｌルテニウムレッド、５μＭ  ｆｌｕｏ−３を含むアッセイ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、試験化合物と共にまたは試験化合物を用いないで、３７℃で５分間予備インキュベーションした。遊離カルシウムを、ＣａＣｌ２で０．１μＭまたは０．０４μＭに調整した。ＡＴＰ（５ｍＭ）を添加することにより反応を開始した。最終的反応体積は１．５ｍｌであった。反応混合物の蛍光を、それぞれ５１０ｎｍおよび５３０ｎｍの励起および発光波長を用いることにより３分間測定した。
【０１４７】
結果
図１２Ａおよび１２Ｂは、心臓（Ａ）および速骨筋（Ｂ）のＳＲベジクル中へのＣａ２＋取り込み速度に対する、実施例１ｃの化合物（５０および１００μＭ）の効果を示す。本発明の化合物が、心臓ＳＲベジクル中へのカルシウム取り込みを加速したが、速骨筋から調製されたＳＲベジクル中へのカルシウム取り込みは変化させなかったことがわかる。
【０１４８】
表ＶＩＩＩは、心臓（Ａ）および速骨筋（Ｂ）のＳＲベジクル中へのＣａ２＋取り込み速度に対する、本発明の種々の化合物の効果を示す。それぞれ０．１μＭおよび０．０４μＭの遊離カルシウム濃度で実験を行なった。
【０１４９】
【表２】
2004226176.tif 000013
【０１５０】
実験２  左心室圧誘導への効果
方法
雌雄の３００〜４００ｇのモルモットをこの研究に用いた。頭蓋の殴打によりモルモットを殺し断頭したのち、心臓を素早く切除した。ついで、心臓を冷酸素化灌流緩衝液中で濯いだ。カニューレを大動脈中に挿入し、結紮糸で固定した。ランゲンドルフ装置のサーモスタット制御湿潤チャンバー中に心臓を置くとすぐに、逆行灌流が始まった。サーモスタット制御された球状人工肺（ｏｘｙｇｅｎａｔｏｒ）でカルボゲン（Ｏ２９５％およびＣＯ２５％）で平衡化された改変タイロード溶液（３７℃）を灌流緩衝液として用いた。タイロード溶液の組成（ｍＭ）は、ＮａＣｌ  １３５；ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ  １；ＫＣｌ  ５；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ  ２；ＮａＨＣＯ２  １５；Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ  １；グルコース１０で、ｐＨ７．３〜７．４であった。一定圧力条件（５０ｍｍＨｇ）下で実験を行なった。短時間（１０分）の予備安定化後、ラテックスバルーン（サイズ４）を、左肺静脈および左心房をとおして左心室に注意深く入れた。ラテックスバルーンを、圧力変換器に連結されたステンレススチールカニューレに取り付けた。ラテックスバルーン、カニューレおよび圧力変換器のチャンバーを、気泡を避けつつエチレングリコール／水（１：１）混合物で満たした。圧力変換器をとおして等体積左心室圧を記録した。実験の最初に、バルーンの体積を、約５ｍｍＨｇの拡張期圧を得るように調節した。実験の開始前に、心臓を、灌流緩衝液中のビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）で３０〜５０分間さらに安定化させた。
【０１５１】
１５分間のベースライン記録後、種々の濃度の試験化合物を１５分の間隔で灌流緩衝液に添加した。０．３〜３０μＭの濃度範囲を試験した。実験をとおして、ビヒクル濃度（０．１％ＤＭＳＯ）を一定に維持した。
【０１５２】
結果
本発明の種々の化合物の左心室収縮期圧に対するＥＣ５０値および最大効果（ベースラインからの変化％）を表ＩＸに示す。
【０１５３】
【表３】
2004226176.tif 000014
【０１５４】
実施例４
ＰＬＢ不活性化剤の製造を以下の実施例により説明するが、限定するものではない。
【０１５５】
実施例（１）  ３−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ）  ３−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール二水和物（２０ｇ）および２−ベンジルアセト酢酸エチル（２７．５ｍｌ）のエタノール（３２０ｍｌ）溶液を、０℃にて無水ＨＣｌで５時間処理し、溶液をこの温度で一晩維持した。黄色の溶液を濃縮し、水で粉砕し、固形分をろ過し、水洗し、乾燥した。得られた水和物をトルエンから３回蒸発乾燥し、石油エーテル（沸点４０〜６０℃）で粉砕し、ろ過した。収量３３．４ｇ（９６％）。融点２５８〜２６０℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  ２．５２５  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ３．８８７  （ｓ，  ２  Ｈ，  ＣＨ２Ｐｈ），  ６．１７１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．２７４  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．１６７−７．２７９  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ），  １０．２  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ），  １０．４７  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ）．
【０１５６】
ｂ）  ３−ベンジル−５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
クロロアセトニトリル（６．８６ｇ）、炭酸カリウム（２３．９ｇ）および実施例（１）ａの生成物１２．２ｇを、窒素雰囲気下、１００℃にてＤＭＦ１２０ｍｌ中で２時間攪拌した。反応混合物を冷却し、氷水中に注いだ。固形物をろ過し、水洗した。収量１３．８ｇ（８８％）。融点１４７〜１５４℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  ２．５２５  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ３．９６９  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２Ｐｈ），  ５．３０７  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ５．３１４  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ６．８１４  （ｄ，  １  Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．９４０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ７．１８−７．２９２  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ）．
【０１５７】
ｃ）  ３−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
実施例（１）ｂの生成物（１ｇ）、アジ化ナトリウム（０．４２ｇ）および塩化アンモニウム（０．３４ｇ）を、窒素雰囲気下、１００℃にてＤＭＦ（５ｍｌ）中で５時間攪拌した。反応混合物を冷却し、ついで氷水中に注いだ。溶液のｐＨを１０〜１１に調整し、ついで溶液を酢酸エチルで１回抽出するかセライト（ＣＥＬＩＴＥ）をとおしてろ過した。溶液を塩酸でｐＨ２まで酸性化し、５℃に維持し、ろ過した。収量０．９６ｇ（８１％）。融点２２９〜２３３℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  ２．４６８  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ３．９３７  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２Ｐｈ），  ５．５９６  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ５．６０２  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ６．８３２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．８５１  （ｄ，１Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．１７１−７．２８３  （ｍ，  ５Ｈ  Ｐｈ）．
【０１５８】
実施例（２）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−７−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オンの製造
ａ）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ジヒドロキシ−７−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
フロログルシノール（０．７ｇ）および２−エトキシカルボニル−３−フェニルシクロヘキサノン（１．５ｇ）のエタノール溶液を、実施例（１）ａに記載のように無水ＨＣｌで処理した。生成物を、まず、エタノール−水（１：１）から再結晶し、ついでエーテルで粉砕した。収量０．６１ｇ。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  １．３８−１．５２  （ｍ，  １Ｈ），  １．５７−１．６６  （ｍ，  １Ｈ），  １．６９−１．７８  （ｍ，  １Ｈ），  １．８６−１．９６（ｍ，  １Ｈ），  ２．９−３．０２  （ｍ，  １Ｈ），  ３．３−３．４  （ｍ，  １Ｈ），  ４．０５０  （ｂ，  １Ｈ），  ６．１５７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．２９７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．０７６−７．２６５  （ｍ，  ５Ｈ），  １０．１５３  （ｓ，  １Ｈ），  １０．４５６  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１５９】
ｂ）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス（シアノメトキシ）−７−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
実施例（２）ａの生成物（０．５ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のクロロアセトニトリル（０．２５ｇ）および炭酸カリウム（１．１２ｇ）で処理した。収量０．６ｇ。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  １．３８−１．５８  （ｍ，  １Ｈ），  １．６−１．７  （ｍ，  １Ｈ），  １．７−１．７６  （ｍ，  １Ｈ），  １．８９−１．９９  （ｍ，  １Ｈ），  ２．９−３．０３  （ｍ，  １Ｈ），  ３．２−３．２８  （ｍ  １Ｈ），  ４．１１１（ｂ，  １Ｈ），  ５．３１４  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．３４９  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．８４０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．９２５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ７．１０８−７．２７４  （ｍ，  ５Ｈ）．
【０１６０】
ｃ）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−７−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
実施例（２）ｂの生成物（０．６ｇ）を、実施例（１）ｃに記載のように、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（０．２ｇ）および塩化アンモニウム（０．１７ｇ）で処理した。生成物を、ＤＭＦ、エタノールおよび水の混合物（約１：２：３）から再結晶した。収量０．４１ｇ。融点１５３〜１５４℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  １．３８−１．５  （ｍ，  １Ｈ），  １．５−１．６  （ｍ，  １Ｈ），  １．６９−１．７６  （ｍ，  １Ｈ），  １．８７−１．９６  （ｍ，  １Ｈ），  ２．９−３．０５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．２−３．３  （ｍ，  １Ｈ），  ４．０９４  （ｂ，  １Ｈ），  ５．６０２  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．６４３  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．８３２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．８５１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３．Ｈｚ），  ７．０８９−７．２１２  （ｍ，  ５Ｈ）．
【０１６１】
実施例（３）  ３−ベンジル−５，７−ビス［（２，５−ジヒドロ−５−オキソ−４Ｈ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）−メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ）  ３−ベンジル−５，７−ビス［（ヒドロキシアミジノ）メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
トリエチルアミン（１．９４ｍｌ）を、ヒドロキシルアミン塩酸塩（０．９７ｇ）のＤＭＳＯ（２ｍｌ）懸濁液に添加し、得られた混合物を室温で３０分間攪拌した。結晶をろ過し、ＴＨＦで洗浄した。濾液を濃縮し、実施例（１）ｂの生成物（０．５ｇ）を添加した。この溶液を７５℃で一晩維持した。反応混合物を氷水で処理し、ｐＨを１１に調整し、固形物をろ過し、水洗し、乾燥した。収量０．５ｇ。融点１５５〜１６０℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  ２．５６  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ３．９３８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４６６  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４８６  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５６５  （ｓ，  Ｈ，  ＮＨ２），  ５．７０９  （ｓ，  ２Ｈ，  ＮＨ２），  ６．６５８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．６９２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．１６８−７．２８４  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ），  ９．３４６  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ），  ９．３６２  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ）．
【０１６２】
ｂ）  ３−ベンジル−５，７−ビス［（エトキシカルボニルオキシアミジノ）メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
クロロギ酸エチル（０．４５ｍｌ）を、実施例（３）ａの生成物（１ｇ）およびピリジン（０．３８ｍｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）溶液に０℃にて添加した。反応混合物をこの温度でさらに３０分間維持し、ついで氷水を添加した。固形分をろ過し、水洗した。収量１．６３ｇ。融点８７〜９２℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  １．２１５−１．２５６  （ｍ，  ６Ｈ），  ２．５５３  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．９４７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１４０−４．１９８  （ｍ，  ４Ｈ），  ４．５６６  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．５９９  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．６８８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．７１８  （ｄ，  １Ｈ，Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．７９２  （ｂ，  ２Ｈ，  ＮＨ２），  ６．８１８  （ｂ，  ２Ｈ，  ＮＨ２），  ７．１７１−７．２８５  （ｍ，  ５Ｈ）．
【０１６３】
ｃ）  ３−ベンジル−５，７−ビス［（２，５−ジヒドロ−５−オキソ−４Ｈ−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）−メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
ＤＭＦ（５ｍｌ）中の前実施例の生成物（１．５ｇ）およびＤＢＵ（０．８ｍｌ）を室温で一晩攪拌した。反応混合物を氷水で処理し、酸性化した。固形物をろ過し、水洗した。得られた固体塊を０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液に混入し、活性炭で処理し、最後に酸性化した。収量０．６４ｇ。融点１３０〜１３６℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  ２．５２４  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．９５４  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．１８７  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．２１５  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．７４８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．８３４  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．１５８−７．２８９  （ｍ，  ５Ｈ），  １２．８  （ｂ，  ２Ｈ）．
【０１６４】
実施例（４）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−１，３−ジヒドロキシ−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オンの製造
【０１６５】
ａ）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ジヒドロキシ−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
フロログルシノール（１ｇ）および２−オキソシクロヘキサンカルボン酸エチル（１．３２ｇ）を７５％硫酸（１０ｍｌ）中で一晩攪拌し、混合物を氷水中に注ぎ、ろ過した。収量１．５５ｇ。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  １．６５  （ｂ，  ４Ｈ），  ２．３４５  （ｂ，  ２Ｈ），  ３．０３７  （ｂ，  ２Ｈ），  ６．１３８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．２４５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  １０．０６９  （ｂ，  １Ｈ，  ＯＨ），  １０．３２２  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ）．
【０１６６】
ｂ）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−ビス（シアノメトキシ）−１，３−ジヒドロキシ−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
前実施例の生成物（０．５ｇ）、クロロアセトニトリル（０．３４ｇ）および炭酸カリウム（１．５ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（５ｍｌ）中で反応させた。収量０．４４ｇ。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  １．６８  （ｂ，  ４Ｈ），  ２．４１  （ｂ，  ２Ｈ），  ３．００  （ｂ，  ２Ｈ），  ５．２９７  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．３０９  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．７９７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．８９９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ）．
【０１６７】
ｃ）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−１，３−ジヒドロキシ−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
前実施例の生成物（０．４ｇ）を、実施例（１）ｃに記載のように、ＤＭＦ（２．５ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（０．１８ｇ）および塩化アンモニウム（０．１４ｇ）で処理した。生成物を、エタノール−ＤＭＦ（１：１）から再結晶した。収量０．１７ｇ。融点２８３〜２８６℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  １．６２６  （ｂ，  ４Ｈ），  ２．３９３  （ｂ，  ２Ｈ），  ２．９７１  （ｂ，  ２Ｈ），  ５．５８３  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５９９  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．８１１  （ｓ，  ２Ｈ）．
【０１６８】
実施例（５）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−フェニル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ）  ５，７−ジヒドロキシ−４−フェニル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（２．００ｇ）およびベンゾイル酢酸エチル（３．０５ｇ）のエタノール（３０ｍｌ）溶液を、実施例（１）ａに記載のように、無水ＨＣｌで処理した。生成物を、エタノール−水（１：１）から再結晶した。収量３．０ｇ（７５％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ５．７３９  （ｓ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ），  ６．１５５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．２６３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ７．３０５−７．３８１  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ），  １０．０８４  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ），  １０．３６８  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ）．
【０１６９】
ｂ）  ５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−フェニル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（１．００ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のクロロアセトニトリル（０．６２ｇ）および炭酸カリウム（２．７２ｇ）で処理した。反応混合物を氷水中に注ぎ、混合物を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。生成物をイソプロパノールから再結晶した。収量０．４１ｇ（３１％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ４．８４５  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ５．３４４  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ６．０８６  （ｓ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ），  ６．７７０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．０４０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．３２０−７．４４３  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ）．
【０１７０】
ｃ）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−フェニル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．４０ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（０．１６ｇ）および塩化アンモニウム（０．１４ｇ）で、１００℃にて２時間処理した。生成物を実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．４０ｇ（７９％）。融点２２２〜２２４℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ５．１４８  （ｓ，  ２Ｈ，ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ５．６４９  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ５．９６８  （ｓ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ），  ６．８１１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．９６２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．９９４−７．１８５  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ）．
【０１７１】
実施例（６）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−８−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オンの製造
ａ）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ジヒドロキシ−８−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
フロログルシノール（１．５６ｇ）および２−オキソ−５−フェニルシクロヘキサンカルボン酸エチル（２．５２ｇ）のエタノール（２５ｍｌ）溶液を、実施例（１）ａに記載のように無水ＨＣｌで処理した。沈殿をろ過し、水およびＥｔＯＨで洗浄した。収量１．０ｇ（３２％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  １．７２−１．８２  （ｍ，  １Ｈ），  ２．０１  （ｂ，  １Ｈ），  ２．３１７−２．３８７  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７０７−２．７６３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．８３０  （ｂ，  １Ｈ），  ３．０４１  （ｂ，  １Ｈ），  ３．３５  および  ３．４０  （ｂ，  １Ｈ），  ６．１７４  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．２７７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ７．２００−７．３５０  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ），  １０．１３１  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ），  １０．４０１  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ）．
【０１７２】
ｂ）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス（シアノメトキシ）−８−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
前実施例の生成物（１．０ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のクロロアセトニトリル（０．５７ｇ）および炭酸カリウム（１．０ｇ）で処理した。ＤＭＦを蒸発させ、残渣をＥｔＯＡｃに溶解した。酢酸エチルを１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。生成物をアセトン−イソプロパノール（１：３）から再結晶した。収量０．５０ｇ（４０％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  １．７５−１．８８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．０５  （ｂ，  １Ｈ），  ２．３８−２．４８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７７−２．８５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．９０  （ｂ，  １Ｈ），  ３．０７  （ｂ，  １Ｈ），  ３．２２  および  ３．２８  （ｂ，  １Ｈ），  ５．３１６  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ５．３３１  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ６．８２９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．９３９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ７．２１０−７．３８０  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ）．
【０１７３】
ｃ）  ７，８，９，１０−テトラヒドロ−１，３−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−８−フェニル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−６−オン
前実施例の生成物（０．３０ｇ）をＤＭＦ（２ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（０．１０ｇ）および塩化アンモニウム（０．０９ｇ）で、１００℃にて３．５時間処理した。生成物を実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．３０ｇ（８２％）。融点２３５〜２４５℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  １．７０−１．８０  （ｍ，  １Ｈ），  １．９６  （ｂ，  １Ｈ），  ２．３８−２．４４６  （ｍ，  １Ｈ），  ２．８３６  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０５２  （ｂ，  １Ｈ），  ３．２５２  および  ３．３０１  （ｂ，  １Ｈ），  ５．６０４  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ５．６３２  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ６．８２７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．８５８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ７．２０９−７．３５１  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ）．
【０１７４】
実施例（７）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ）  ５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（０．８７ｇ）および２−（２−フェニルエチル）アセト酢酸エチル（１．６２ｇ）のエタノール（３０ｍｌ）溶液を、実施例（１）ａに記載のように無水ＨＣｌで処理した。収量１．７７ｇ（８７％）。融点２４８〜２５２℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．４１３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ２．６５２−２．７８２  （ｍ，４Ｈ，  ＣＨ２ＣＨ２），  ６．１５１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．２５６  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．１８３−７．３０４  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ），  １０．１３７  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ），  １０．３６９  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ）．
【０１７５】
ｂ）  ５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．９０ｇ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中のクロロアセトニトリル（０．４８ｇ）および炭酸カリウム（２．１ｇ）で、１００℃にて０．５時間処理した。生成物を実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量１．００ｇ（８８％）。融点１７９〜１８３℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．３８４  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ２．６９９−２．７５４  （ｍ，  ２Ｈ，  ＣＨ２ＣＨ２），  ２．８０５−２．８４１  （ｍ，  ２Ｈ，  ＣＨ２ＣＨ２），  ５．３０２（ｓ，  ４Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ６，７９０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．９０９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ７．１９０−７．３０７  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ）．
【０１７６】
ｃ）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．４０ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中のアジ化ナトリウム（０．１５ｇ）および塩化アンモニウム（０．１２ｇ）で、１００℃にて２．５時間処理した。生成物を実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．３８５ｇ（７８％）。融点２４８〜２５０℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．３６８  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ２．６６８−２．７０７  （ｍ，  ２Ｈ，  ＣＨ２ＣＨ２），  ２．７８３−２．８２２  （ｍ，  ２Ｈ，  ＣＨ２ＣＨ２），  ５．５９３  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ５．６０４  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ６．８１９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．８３４  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２，３  Ｈｚ），  ７．１６１−７．２９１  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ）．
【０１７７】
実施例（８）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−メトキシ］−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ）  ２−ベンジル−３−オキソブタン酸３，５−ジメトキシアニリド
３，５−ジメトキシアニリン（５ｇ）を、窒素雰囲気下に予備加熱（１６０℃）された２−ベンジルアセト酢酸エチル（１５ｍｌ）に少しずつ添加し、その温度で６０分間維持した。冷却された溶液をヘプタン−エチルエーテルで希釈しろ過した。収量５．２ｇ（４９％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．１８３  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．０６９  （ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７．２  Ｈｚ），  ３．９２３  （ｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．２  Ｈｚ），  ６．６１６  （ｄｄ．  １Ｈ，  Ｊ＝２．３Ｈｚ），  ６．７６５  （ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ７．１３−７．３  （ｍ，  ５Ｈ），  １０．１２３  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１７８】
ｂ）  ３−ベンジル−５，７−ジメトキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１．２ｇ）を、予備加熱（８５℃）されたメタンスルホン酸（３．５ｍｌ）に添加し、その温度で１５分間維持した。溶液を冷却し、ついで氷水で処理した。生成物をろ過し、重炭酸ナトリウムおよび水で洗浄した。収量１．０８ｇ（９５％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ）：  ２．４８６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．７８５  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．８０８  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．９８５  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．３１５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．４７２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．１−７．３  （ｍ，  ５  Ｈ），  １１．５２  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１７９】
ｃ）  ３−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１ｇ）を窒素雰囲気下にピリジン塩酸塩（５ｇ）中で２０分間還流した。反応混合物を水で処理し、生成物をろ過した。収量０．９ｇ（１００％）。融点３０７〜３１２℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ）：  ２．５０３  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．９４２  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．１０２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．１８７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ７．１−７．２５  （ｍ，  ５Ｈ），  ９．７２５  （ｓ，  １Ｈ），  ９．９８４  （ｓ，  １Ｈ），  １１．２８５  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１８０】
ｄ）  １，３−ジベンジル−５，７−ジメトキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
実施例（８）ｂの生成物（１ｇ）、カリウムｔ−ブトキシド（０．６２ｇ）および臭化ベンジル（０．６８ｍｌ）を、ＤＭＳＯ（１０ｍｌ）中で６０℃にて４時間攪拌した。反応混合物を水で処理し、トルエンで抽出し蒸発させた。生成物をエチルエーテルで粉砕し、ろ過した。収量０．５ｇ（３９％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ）：  ２．５３７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．７０８  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．８２６  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．１２４  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５６  （ｂ，２Ｈ），  ６．４１３−６．４３４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．１５４−７．３３２  （ｍ，  １０Ｈ）．
【０１８１】
ｅ）  １，３−ジベンジル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（２ｇ）を、実施例（８）ｃに記載のように、ピリジン塩酸塩（１０ｇ）で処理した。生成物を酢酸エチルで抽出し、蒸発させた。収量１．４ｇ（７５％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ）：  ２．５７０  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．０７６  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．４５０  （ｂ，  ２Ｈ），  ６．１３５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．２  Ｈｚ），  ６．１９９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．２  Ｈｚ），  ７．１２８−７．３３３  （ｍ，１０Ｈ），  ９．８３  （ｂ，  １Ｈ），  １０．１６６  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１８２】
ｆ）  ５，７−ビス（シアノメトキシ）−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１．４ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（２０ｍｌ）中のクロロアセトニトリル（０．７６ｇ）およびＫ２ＣＯ３（２．５ｇ）で処理した。収量１．５ｇ（８９％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ）：  ２．５５５  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．１４６  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．２１４  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．２７５  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５７８  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．７３５  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．１３−７．３３  （ｍ，  １０Ｈ）．
【０１８３】
ｇ）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１．３ｇ）を、実施例（１）ｃに記載のように、アジ化ナトリウム（０．４１ｇ）および塩化アンモニウム（０．３４ｇ）で処理した。収量０．６９ｇ（４５％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ）：  ２．４７１  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．１１３  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．４７７  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５５  （ｂ，  ２Ｈ），  ５．５７４  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．６７０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ６．７７５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ７．１３−７．３２  （ｍ，  １０Ｈ）．
【０１８４】
実施例（９）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−ベンジル−１，４−ジメチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ）  ３−ベンジル−５，７−ジメトキシ−１，４−ジメチル−２（１Ｈ）−キノリノン
実施例（８）ｂの生成物（０．５ｇ）、ｔ−ＢｕＯＫ（０．２ｇ）およびヨウ化メチル（０．４ｍｌ）をＤＭＳＯ（５ｍｌ）中で３５℃にて２日間攪拌した。反応混合物を水で処理し、トルエンで抽出した。生成物を、溶離液としてトルエン−酢酸エチル−酢酸（８：２：１）を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量０．２４ｇ（４６％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ）：  ２．５１  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．６３２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８４６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．８９６  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．０４７  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．４６８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．５５８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ７．１−７．２６  （ｍ，  ５Ｈ）．
【０１８５】
ｂ）  ３−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−１，４−ジメチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．２ｇ）を、実施例（８）ｃに記載のように、ピリジン塩酸塩（２ｇ）で処理し、生成物を酢酸エチルで抽出した。収量０．１６ｇ（８９％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ）：  ２．５６７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５１５  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．００５  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．２４４  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．２６８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ７．０８−７．２５  （ｍ，  ５Ｈ），  ９．８７９  （ｓ，  １Ｈ），  １０．１１３  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１８６】
ｃ）  ５，７−ビス（シアノメトキシ）−３−ベンジル−１，４−ジメチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．１５ｇ）、クロロアセトニトリル（０．０８ｇ）およびＫ２ＣＯ３（０．２８ｇ）を、実施例（１）ｂに記載のように、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で反応させた。収量０．１６ｇ（８４％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ）：  ２．５２４  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．６５８  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．０７９  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．２９２  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．３７９  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．７６６  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．８５５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ７．１３−７．２４  （ｍ  ５Ｈ）．
【０１８７】
ｄ）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−ベンジル−１，４−ジメチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．１５ｇ）を、実施例（１）ｃに記載のように、ＤＭＦ（２ｍｌ）中のＮａＮ３（５７ｍｇ）およびＮＨ４Ｃｌ（４７ｍｇ）で処理した。収量０．１１５ｇ。融点２５０〜２５３℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ）：  ２．４５１  （ｓ，  ３Ｈ），３．６４９  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．０４２  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．７９２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．２  Ｈｚ），  ６．８３３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝Ｈｚ），  ７．１−７．２５  （ｍ，  ５Ｈ）．
【０１８８】
実施例（１０）  ３−ベンジル−５，７−ビス［（２−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンおよびその３種類の異性体の製造
ヨウ化メチル０．０７ｍｌを、実施例（１）ｃの生成物０．２ｇおよびＫ２ＣＯ３０．３１ｇのＤＭＦ２ｍｌ溶液に添加し、混合物を室温で４時間攪拌した。反応混合物を氷水中に注ぎ、ろ過した。収量：４種類の位置異性体の混合物として０．２ｇ。融点７１〜７６℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００ＭＨｚ）：  ２．４７  （ｓ，  ＣＨ３），  ２．４８  （ｓ，  ＣＨ３），  ３．９３  （ｓ，  ＣＨ２Ｐｈ），  ４．１１  （ｓ，  ＮＣＨ３），  ４．１２  （ｓ，  ＮＣＨ３），  ４．１５  （ｓ，  ＮＣＨ３），  ４．３８  （ｓ，  ＮＣＨ３），  ４．４０  （ｓ，  ＮＣＨ３），  ５．５１  （ｓ，  ＯＣＨ２），  ５．５２  （ｓ，  ＯＣＨ２），  ５．６２  （ｓ，  ＯＣＨ２），  ５．６７  （ｓ，  ＯＣＨ２），  ６．８４−６．９１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．１６−７．２８  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ）．
【０１８９】
実施例（１１）  ３−ベンジル−５，７−ビス［１−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン、立体異性体の混合物の製造
ａ）  ３−ベンジル−５，７−ビス［（１−シアノ）エトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
実施例（１）ａの生成物（１ｇ）、２−クロロプロピオニトリル（０．７ｇ）および炭酸カリウム（２ｇ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）中で、窒素雰囲気下、１１０℃で６０分間加熱した。混合物を水で処理し、ろ過し、１Ｎ  ＮａＯＨおよび水で洗浄した。収量１．２ｇ。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００ＭＨｚ）：  １．７４−１．７８  （ｔ＋ｔ，  ６  Ｈ，ＣＨ−ＣＨ３），  ２．５３  （ｓ，  ３  Ｈ），  ３．９７  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５８−５．６６  （ｍ，  ２Ｈ，  ＣＨ−ＣＨ３），  ６．８７  （ｍ，  １Ｈ），  ６．９９  （ｄ，  １Ｈ），  ７．１８−７．３１  （ｍ，  ５Ｈ）．
【０１９０】
ｂ）  ３−ベンジル−５，７−ビス［１−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エトキシ］−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン、立体異性体の混合物
前実施例の生成物（０．５ｇ）、アジ化ナトリウム（０．１８ｇ）および塩化アンモニウム（０．１５ｇ）を、ＤＭＦ（７ｍｌ）中で、１００℃にて９０分間加熱した。生成物を水で処理し、酢酸エチルで抽出し、蒸発させた。収量０．５７ｇ。融点９１〜１０４℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００ＭＨｚ）：  １．６９−１．７７  （ｍ，  ６  Ｈ，  ＣＨ−ＣＨ３），  ２．５４  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．９４  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．１０−６．１７  （（ｍ，  ２Ｈ，  ＣＨ−ＣＨ３），  ６．６５  （ｄｄ，  １Ｈ），  ６．７４  （ｄｄ，  １Ｈ），  ７．１３−７．３０  （ｍ，  ５Ｈ）．
【０１９１】
実施例（１２）  ５，７−ビス（カルボキシメトキシ）−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
【０１９２】
実施例（８）ｆの生成物（０．２ｇ）を、濃塩酸（３ｍｌ）および酢酸（２ｍｌ）からなる溶液中で１時間還流した。生成物を２５℃でろ過した。収量０．１４ｇ。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  Ｍｈｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ２．６３  （ｓ，  ＣＨ３），  ４．１４  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２Ｐｈ），  ４．６６  （ｓ，  ２  Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＯＯＨ），  ４．７９  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＯＯＨ），  ５．５３  （ｓ，  ２Ｈ，  ＮＣＨ２Ｐｈ），  ６．４１（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．２  Ｈｚ），  ６．４５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．２  Ｈｚ），  ７．１３−７．３４  （ｍ，  １０Ｈ，  Ｐｈ）．
【０１９３】
実施例（１３）  ３−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−１−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ）  １−ベンジル−５，７−ジメトキシ−３−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
実施例（８）ｂの生成物（２ｇ）、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（０．８７ｇ）および４−フルオロベンジルクロライド（１．１２ｇ）を、実施例（８）ｄに記載のように、ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）中で６０℃にて３時間加熱した。収量１．２８  ｇ。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  Ｍｈｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ２．５３  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．７３  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．８３  （ｓ，  ３Ｈ），  ５．５５  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．４３  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．１２−７．２  （ｍ，  ５Ｈ），  ７．２６−７．２８  （ｍ，  ４Ｈ）．
【０１９４】
ｂ）  ３−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−１−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１．２５ｇ）を、ピリジン塩酸塩（１２．５ｇ）中で、約２２５℃にて９分間加熱した。収量１ｇ。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  Ｍｈｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ２．５６  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．０７  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．４  （ｂ，  ２Ｈ），  ６．１３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ６．２０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ７．１２−７．２８  （ｍ，  ９Ｈ），  ９．８８  （ｓ，  １Ｈ），  １０．２２  （ｓ，  １Ｈ）．
【０１９５】
ｃ）  ３−ベンジル−５，７−ビス（シアノメトキシ）−１−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１ｇ）、ＣｌＣＨ２ＣＮ（０．４３ｇ）およびＫ２ＣＯ３（１．４２ｇ）を、ＤＭＦ（８ｍｌ）中で１２０℃にて１時間加熱した。収量０．９４ｇ。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  Ｍｈｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ２．５５  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．１４  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．２５  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．２８  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５７  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．７４  （ｓ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ７．１−７．３  （ｍ，  ９Ｈ）．
【０１９６】
ｄ）  ３−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−１−（４−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．５ｇ）、アジ化ナトリウム（０．１４ｇ）および塩化アンモニウム（０．１２ｇ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中で１２０℃にて９０分間加熱した。生成物をアセトニトリルで粉砕した。収量０．２８ｇ。融点１２６〜１３２℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  Ｍｈｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ２．４８  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．１１  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５１  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５５  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５８  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．６７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ６．７８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ）．
【０１９７】
実施例（１４）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（４−クロロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ）  ３−（４−クロロベンジル）−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（１．５７ｇ）および２−（４−クロロベンジル）アセト酢酸エチル（３．１８ｇ）のエタノール（２５ｍｌ）溶液を、０℃にて無水ＨＣｌで１．５時間処理し、溶液をこの温度に一晩維持した。溶媒を蒸発させ、沈殿を水で粉砕した。収量３．８７ｇ（９８％）。融点２７０〜２７８℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．５２  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ３．８７  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  ６．１７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．２８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．１８−７．３４  （ｍ，  ４Ｈ，  Ｐｈ），  １０．２１  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ），  １０．４８  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ）．
【０１９８】
ｂ）  ５，７−ビス（シアノメトキシ）−３−（４−クロロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（１．００ｇ）、クロロアセトニトリル（０．５０ｇ）および炭酸カリウム（２．１８ｇ）を、ＤＭＦ（５ｍｌ）中で１００℃にて３０分間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．９０ｇ（７２％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．５２  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ３．９５  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  ５．３０８  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ５．３１２  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ６．８１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．９４  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ７．２２−７．３３  （ｍ，  ４Ｈ，  Ｐｈ）．
【０１９９】
ｃ）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（４−クロロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．４０ｇ）、アジ化ナトリウム（０．１４ｇ）および塩化アンモニウム（０．１１ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて２時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．４０ｇ（８２％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．４６  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ３．９２  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  ５．６０２  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ５．６０９  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ６．８３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．８５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ７．２０−７．３３  （ｍ，  ４Ｈ，  Ｐｈ）．
【０２００】
実施例（１５）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（４−ニトロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ）  ５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−３−（４−ニトロベンジル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（０．４８ｇ）および２−（４−ニトロベンジル）アセト酢酸エチル（１．００ｇ）のエタノール（１５０ｍｌ）溶液を、０℃にて無水ＨＣｌで７．５時間処理し、溶液をこの温度に一晩維持した。溶媒を蒸発させ、沈殿を水で粉砕した。収量０．６３ｇ（５１％）。融点２８０〜２８５℃。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．５３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ４．０３  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  ６．１９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．２９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．４０−７．５１  および  ８．１１−８．１７  （ｍ，  ４Ｈ  Ｐｈ），  １０．２５  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ），  １０．５２  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ）．
【０２０１】
ｂ）  ５，７−ビス（シアノメトキシ）−３−（４−ニトロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．５７ｇ）、クロロアセトニトリル（０．２７ｇ）および炭酸カリウム（１．２０ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて５０分間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．４７ｇ（６７％）。融点１７８〜１８５℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．５３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ４．１１  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  ５．３１９  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ５．３２３  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），６．８３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．９６  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．４８−７．５３  および  ８．１２−８．１６  （ｍ，  ４Ｈ，  Ｐｈ）．
【０２０２】
ｃ）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（４−ニトロベンジル）−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．３８ｇ）、アジ化ナトリウム（０．１２ｇ）および塩化アンモニウム（０．１１ｇ）を、ＤＭＦ（３ｍｌ）中で１００℃にて２時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．２５ｇ（５４％）。融点２４０〜２４４℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．４７  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ４．０８  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  ５．６１１  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ５．６２３  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），６．８５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．８７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ７．４６−７．５０  および  ８．１２−８．１６  （ｍ，  ４Ｈ，  Ｐｈ）．
【０２０３】
実施例（１６）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−シクロペンチル−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造ａ）  ３−シクロペンチル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（２．００ｇ）および２−シクロペンチルアセト酢酸エチル（３．１４ｇ）のエタノール（４０ｍｌ）溶液を、０℃にて無水ＨＣｌで２．５時間処理し、溶液をこの温度に一晩維持した。溶媒を蒸発させ、沈殿をトルエン−ＥｔＯＡｃ−ＡｃＯＨ（８：１：１）で溶離するフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量１．２２ｇ（２９％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：１．５０−１．８８  （ｍ，  ８Ｈ，  −（ＣＨ２）４−），  ２．５７  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ３．２５  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ），  ６．１１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．２５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  １０．２５  （ｂ，  ２Ｈ，  ＯＨ）．
【０２０４】
ｂ）  ５，７−ビス（シアノメトキシ）−３−シクロペンチル−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．５０ｇ）、クロロアセトニトリル（０．３１ｇ）および炭酸カリウム（０．６１ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で８０℃にて４０分間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．５６ｇ（８６％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  １．５５−１．９０  （ｍ，  ８Ｈ，  −（ＣＨ２）４−），  ２．５６（ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ３．３７  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ），  ５．２９  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ５．３１  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ６．７５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．８８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ）．
【０２０５】
ｃ）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−シクロペンチル−４−メチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．３０ｇ）、アジ化ナトリウム（０．１３ｇ）および塩化アンモニウム（０．１１ｇ）を、ＤＭＦ（１ｍｌ）中で１００℃にて１．５時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．３０ｇ（８０％）。融点２４８〜２５２℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  １．５３−１．８９（ｍ，  ８Ｈ，  −（ＣＨ２）４−），  ２．５１（ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ３．３４  （ｍ，  １Ｈ，  ＣＨ），  ５．５９  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ５．６１  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ６．８０  （ｓ，  ２Ｈ）．
【０２０６】
実施例（１７）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−３−（１−ナフチルメチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オンの製造
ａ）  ５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−３−（１−ナフチルメチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
フロログルシノール（０．４７ｇ）および２−（１−ナフチルメチル）アセト酢酸エチル（１．００ｇ）のエタノール（２０ｍｌ）溶液を、０℃にて無水ＨＣｌで３時間処理し、溶液をこの温度に一晩維持した。溶媒を蒸発させ、沈殿を水で粉砕し、イソプロパノール−水（１：１）から再結晶した。収量０．９６ｇ（７８％）。融点２７５〜２８０℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．４５  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ４．３２  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  ６．２３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．３２  （ｄ，  １  Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．９７−８．２５  （ｍ，  ７Ｈ，  Ｎａｐｈ），  １０．２６  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ），  １０．５３  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ）．
【０２０７】
ｂ）  ５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−メチル−３−（１−ナフチルメチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．８０ｇ）、クロロアセトニトリル（０．３６ｇ）および炭酸カリウム（０．６６ｇ）を、ＤＭＦ（４ｍｌ）中で１００℃にて１時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．３０ｇ（３０％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．４５  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ４．４０  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  ５．３４  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ５．３６  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ６．８６  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ７．０１０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ７．０１６−８．２７  （ｍ，  ７Ｈ，  Ｎａｐｈ）．
【０２０８】
ｃ）  ５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−３−（１−ナフチルメチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン
前実施例の生成物（０．２５ｇ）、アジ化ナトリウム（０．０８０ｇ）および塩化アンモニウム（０．０７２ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて２．５時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．１１ｇ（３６％）。融点１６４〜１７４℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．４０  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ４．３７  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  ５．６３  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ５．６５  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ６．８７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．９２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．５  Ｈｚ），  ６．９８−８．２６  （ｍ，  ７Ｈ，Ｎａｐｈ）．
【０２０９】
実施例（１８）  １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−メトキシ］−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ）  ５，７−ジメトキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
アセト酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．５８ｇ）を１２０℃に加熱し、キシレン（４ｍｌ）に溶解した３，５−ジメトキシアニリン（１．５３ｇ）を添加した。混合物を１２０〜１３０℃で２０分間加熱し、ついで室温まで冷却した。メタンスルホン酸（２ｍｌ）を添加し、混合物を周囲温度で１０分間攪拌した。水（４０ｍｌ）を添加し、沈殿をろ過し乾燥した。収量１．３１ｇ（６０％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．５０  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ３．７９  （ｓ，  ３Ｈ，  ＯＣＨ３），  ３．８３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＯＣＨ３），  ６．０３  （ｓ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ），  ６．３１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．４５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  １１．４  （ｂ，  １Ｈ，  ＮＨ）．
【０２１０】
ｂ）  １−ベンジル−５，７−ジメトキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（１．２０ｇ）をＤＭＳＯ（１５ｍｌ）中に懸濁しｔ−ＢｕＯＫ（０．６８ｇ）および臭化ベンジル（１．０３ｇ）を添加した。反応混合物を周囲温度で一晩攪拌した。水を添加し、生成物をＥｔＯＡｃ中に抽出した。ＥｔＯＡｃを乾燥し、蒸発乾燥させた。生成物をトルエンから再結晶した。収量０．８０ｇ（４７％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．５５  （ｄ，  ３Ｈ，  Ｊ＝１．１  Ｈｚ，  ＣＨ３），  ３．７１  （ｓ，  ３Ｈ，  ＯＣＨ３），  ３．８４  （ｓ，  ３Ｈ，  ＯＣＨ３），  ５．４８  （ｂ，  ２Ｈ，  ＮＣＨ２），  ６．２９  （ｄ，１Ｈ，  Ｊ＝１．１  Ｈｚ，  ＣＨ＝Ｃ），  ６．４  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．１８−７．３３  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ）．
【０２１１】
ｃ）  １−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．６９ｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（１４ｍｌ）中に溶解し、反応混合物を−２０℃に冷却した。ＣＨ２Ｃｌ２中のＢＢｒ３（２．４ｇ）（１Ｍ溶液）を添加し、混合物を一晩で周囲温度まで暖めた。沈殿をろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、ＥｔＯＡｃ中に溶解した。ＥｔＯＡｃを希ＨＣｌで洗浄し、乾燥し、蒸発乾燥した。収量０．３４ｇ（５４％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．５６  （ｄ，  ３Ｈ，  Ｊ＝１．０  Ｈｚ，  ＣＨ３），  ５．３３  （ｂ，  ２Ｈ，  ＮＣＨ２），  ６．１１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ６．１３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝１．０  Ｈｚ，  ＣＨ＝Ｃ），  ６．１７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ７．１２−７．３４  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ），  ９．９０  （ｂ，  １Ｈ，  ＯＨ），  １０．２２  （ｓ，  １Ｈ，  ＯＨ）．
【０２１２】
ｄ）  １−ベンジル−５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．３４ｇ）、クロロアセトニトリル（０．１３ｇ）および炭酸カリウム（０．３４ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて１．５時間加熱した。水を添加し、沈殿をろ過し乾燥した。生成物をイソプロパノールから再結晶した。収量０．２０ｇ（４６％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．５７  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ５．２２  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ５．３０  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２ＣＮ），  ５．５０  （ｂ，  ２Ｈ，  ＮＣＨ２），  ６．４２  （ｓ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ），  ６．７０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ６．７３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ７．２１−７．３２  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ）．
【０２１３】
ｅ）  １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．２０ｇ）、アジ化ナトリウム（０．０７２ｇ）および塩化アンモニウム（０．０６０ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて３時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．２１ｇ（８５％）。融点２４６〜２４９℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．５０  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ５．４８  （ｂ，  ４Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ，  ＮＣＨ２），  ５．６０  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２Ｔｅｔ），  ６．３４  （ｓ，  １Ｈ，  ＣＨ＝Ｃ），  ６．６４  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝１．９  Ｈｚ），  ６．７７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝１．９  Ｈｚ），  ７．１８−７．３２  （ｍ，  ５Ｈ，  Ｐｈ）．
【０２１４】
実施例（１９）  １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ）  ５，７−ジメトキシ−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
キシレン（１ｍｌ）中の２−（２−フルオロベンジル）アセト酢酸エチル（２．５ｇ）を１５０℃に加熱し、キシレン（４ｍｌ）中の３，５−ジメトキシアニリン（１．４６ｇ）を３０分間で少しずつ添加した。反応混合物を１６０℃で３時間加熱し、ついで室温まで冷却した。メタンスルホン酸（１．７ｍｌ）を添加し、混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。水を添加し、沈殿をろ過し、乾燥した。生成物を温エタノールで粉砕した。収量０．６４ｇ（２１％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．４５  （ｓ，  ３Ｈ），  ３，７９  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．８２  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．９７  （ｓ，  ２Ｈ），６．３３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．４８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．４  Ｈｚ），  ６．９０−７．２５  （ｍ，  ４Ｈ），  １１．６１  （ｓ，  １Ｈ）．
【０２１５】
ｂ）  １−ベンジル−５，７−ジメトキシ−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．６２ｇ）をＤＭＳＯ（１２ｍｌ）中のｔ−ＢｕＯＫ（０．２３ｇ）および臭化ベンジル（０．３６ｇ）で６０℃にて２．５時間処理した。生成物を、実施例（１８）ｂに記載のように単離した。収量０．３９ｇ（４９％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．５１  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．７２  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．８４  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．１１  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５５  （ｂ，  ２Ｈ），  ６．４３３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ６．４４３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ６．９７−７．３３  （ｍ，  ９Ｈ）．
【０２１６】
ｃ）  １−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．３４ｇ）を、実施例（１８）ｃに記載のように、ＣＨ２Ｃｌ２（７ｍｌ）中のＢＢｒ３（８．４８ｇ）で処理した。収量０．３０ｇ（８２％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．５５  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．０６  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．４０  （ｂ，  ２Ｈ），  ６．１３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ６．２２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ６．９７−７．３３  （ｍ，  ９Ｈ），  １０．３  （ｂ，  ２Ｈ）．
【０２１７】
ｄ）  １−ベンジル−５，７−ビス（シアノメトキシ）−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．２１ｇ）、クロロアセトニトリル（０．０８６ｇ）および炭酸カリウム（０．３７ｇ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１００℃にて２時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．１８ｇ（７１％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．５３  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．１３  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．２３  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．２９  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５７  （ｂ，  ２Ｈ），  ６．７４６  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．７５６  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２，３  Ｈｚ），  ７．００−７．３２  （ｍ，  ９Ｈ）．
【０２１８】
ｅ）  １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−３−（２−フルオロベンジル）−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．１７ｇ）、アジ化ナトリウム（０．０５１ｇ）および塩化アンモニウム（０．０４２ｇ）を、ＤＭＦ中で１００℃にて３時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．１７ｇ（８５％）。融点１３５〜１４０℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．４６  （ｓ，  ３Ｈ），  ４．１０  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．４８  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５１（ｂ，  ２Ｈ），  ５，５９  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．６８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．２  Ｈｚ），  ６．７９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．２  Ｈｚ），  ６．９９−７．３２  （ｍ，  ９Ｈ）．
【０２１９】
実施例（２０）  １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−メトキシ］−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
ａ）  ５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノン
キシレン（５ｍｌ）中の２−（２−フェニルエチル）アセト酢酸エチル（２．７０ｇ）を、実施例（１９）ａに記載のように、１５０℃にて３，５−ジメトキシアニリン（１．６０ｇ）で処理した。メタンスルホン酸（４．０ｍｌ）を室温で添加し、混合物を８０℃で１時間加熱した。生成物を、実施例（１９）ａに記載のように単離した。収量１．３８ｇ（４１％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：２．４５  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．６４−２．６８  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．８２−２．８６  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７８  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．８１  （ｓ，  ３Ｈ），  ６．３０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ６．４５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．３  Ｈｚ），  ７．１８−７．３０  （ｍ，  ５Ｈ），  １１．４５  （ｓ，  １Ｈ）．
【０２２０】
ｂ）  １−ベンジル−５，７−ジメトキシ−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．６１ｇ）、ｔ−ＢｕＯＫ（０．２４ｇ）および臭化ベンジル（０．３６ｇ）を、ＤＭＳＯ（１２ｍｌ）中で６０℃にて２時間加熱した。生成物を、実施例（１８）ｂに記載のように単離した。収量０．３１ｇ（４０％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．５１  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．７３−２．７７  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．９６−３．００  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７０  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．８３  （ｓ，  ３Ｈ），  ５．５５  （ｂ，  ２Ｈ），  ６．４０  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．１７−７．３３  （ｍ，  １０Ｈ）．
【０２２１】
ｃ）  １−ベンジル−５，７−ジヒドロキシ−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．３１ｇ）を、実施例（１８）ｃに記載のように、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）中のＢＢｒ３（０．７５ｇ）で処理した。収量０．２６ｇ（８９％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ３００  ＭＨｚ）：  ２．５６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．６９−２．７５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．９０−２．９５  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．３９  （ｂ，  ２Ｈ），  ６．０８  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．０  Ｈｚ），  ６．１９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．０  Ｈｚ），  ７．１１−７．３３  （ｍ，  １０Ｈ），  １０．２  （ｂ，２Ｈ）．
【０２２２】
ｄ）  １−ベンジル−５，７−ビス（シアノメトキシ）−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例からの生成物（０．２２ｇ）、クロロアセトニトリル（０．０９１ｇ）および炭酸カリウム（０．３９ｇ）を、１００℃にて２時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｂに記載のように単離した。収量０．２０ｇ（７６％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．５０  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．７３−２．７７  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．９８−３．０２  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．２１  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．２９  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５６  （ｂ，  ２Ｈ），  ６．７０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ６．７２  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．１  Ｈｚ），  ７．１８−７．３３  （ｍ，  １０Ｈ）．
【０２２３】
ｅ）  １−ベンジル−５，７−ビス［（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）メトキシ］−４−メチル−３−（２−フェニルエチル）−２（１Ｈ）−キノリノン
前実施例の生成物（０．１９ｇ）、アジ化ナトリウム（０．０５７ｇ）および塩化アンモニウム（０．０４７ｇ）を、ＤＭＦ中で１００℃にて３時間加熱した。生成物を、実施例（１）ｃに記載のように単離した。収量０．１８ｇ（７８％）。融点２１５〜２１８℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６，  ４００  ＭＨｚ）：  ２．４６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．７０−２．７４  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．９５−２．９９  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．４７  （ｓ，  ２Ｈ），  ５．５４  （ｂ，  ２Ｈ），  ５．５７  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．６４  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．０  Ｈｚ），  ６．７７  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．０  Ｈｚ），  ７．１６−７．３３  （ｍ，  １０Ｈ）．
【０２２４】
実施例（２１）  ５，７−ビス（アミノカルボニルメトキシ）−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
５，７−ジヒドロキシ−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン（０．５ｇ）、炭酸カリウム（０．９ｇ）および２−クロロアセトアミド（０．２５ｇ）をＤＭＦ（６．５ｍｌ）中に含む混合物を、１００℃にて２時間反応させた。反応混合物を氷水で処理し、ろ過した。生成物を、熱エタノールで粉砕した。収量０．３２ｇ。融点２５２〜２５３℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ２．６３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ４．１３  （ｓ，  ２Ｈ，  ＰｈＣＨ２），  ４．３７  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２），  ４．５５  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２），  ５．５４  （ｓ，  ２Ｈ，  ＮＣＨ２Ｐｈ），  ６．４０  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２  Ｈｚ，  ＡｒＨ），  ６．５３  （ｄ，  １Ｈ，Ｊ＝２  Ｈｚ，  ＡｒＨ），  ７．１３−７．３３  （ｍ，  １０Ｈ，  Ｐｈ），  ７．４４  （ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝６５  Ｈｚ，  ＣＯＮＨ２），  ７．４７  （ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝６８  Ｈｚ，  ＣＯＮＨ２）．
【０２２５】
実施例（２２）  ５，７−ビス（エトキシカルボニルメトキシ）−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
５，７−ジヒドロキシ−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン（１ｇ）、２−ブロモ酢酸エチル（０．６３ｍｌ）および炭酸カリウム（１．４９ｇ）をＤＭＦ（５ｍｌ）中に含む混合物を、窒素雰囲気下に１１０℃にて３時間加熱し、氷水中に注ぎ、ろ過した。得られた固体物質を、エーテルで粉砕し、再びろ過した。収量１．０３ｇ。融点１１３〜１１６℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  １．１５  （ｔ，  ３Ｈ，  ＣＨ３ＣＨ２，  Ｊ＝７．１  Ｈｚ），  １．２０  （ｔ，  ３Ｈ，  ＣＨ３ＣＨ２，  Ｊ＝７．１  Ｈｚ），  ２．６３  （ｓ，  ３Ｈ，  ＣＨ３），  ４．０３  （ｑ，  ２Ｈ，  ＣＨ２ＣＨ３，  Ｊ＝７．１  Ｈｚ），  ４．１３  （ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２Ｐｈ），  ４．１７  （ｑ，  ２Ｈ，  ＣＨ２ＣＨ３，  Ｊ＝７．１  Ｈｚ），  ４．７８  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２），  ４．９０  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２），  ６．４１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．２  Ｈｚ），  ６．４４  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝２．２  Ｈｚ），  ７．１３−７．３３  （ｍ，  １０Ｈ，  Ｐｈ）．
【０２２６】
実施例（２３）  ５，７−ビス（ヒドロキシアミノカルボニルメトキシ）−１，３−ジベンジル−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリノンの製造
前実施例の生成物（０．３ｇ）、ヒドロキシルアミン塩酸塩（０．３２ｇ）および５Ｎ  ＮａＯＨ（１．０５ｍｌ）を、エタノール（８ｍｌ）中で５０℃にて６時間反応させた。反応混合物を水で処理し、塩基性（ｐＨ１０）にし、ろ過した。ろ液をｐＨ２まで酸性化し、ろ過した。収量０．２ｇ。融点１２１〜１２７℃。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ヒドロキサム酸の互変異性型がＯＣＨ２シグナルに見られた。２．６３  （ｓ，３Ｈ，  ＣＨ３），  ４．１３  （Ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２Ｐｈ），  ４．４１  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２），４．５４  （ｓ，  ２Ｈ，  ＯＣＨ２），  ４．６４  （ｓ，  ２Ｈ，  ＨＯＮ＝Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２Ｏ），  ４．６５  （ｓ，  ２Ｈ，  ＨＯＮ＝Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２Ｏ），  ４．７７  （ｓ，  ２Ｈ，  ＨＯＮ＝Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２Ｏ），  ４．７８  （ｓ，  ２Ｈ，  ＨＯＮ＝Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２Ｏ），  ５．５４  （ｓ，  ２Ｈ，  ＮＣＨ２Ｐｈ），  ６．３８−６．５４  （ｍ，  ２Ｈ，  ＡｒＨ），  ７．１４−７．３４  （ｍ，  １０Ｈ，  Ｐｈ），  ９．０５  （ｂ，  ２Ｈ，  ＮＯＨ），  １０．８４  （ｓ，  １Ｈ，  ＨＯＮＨＣＯ），  １０．８８  （ｓ，  １Ｈ，  ＨＯＮＨＣＯ）．
【０２２７】
実施例５  ＰＬＢ不活性化剤の設計
ホスホランバンに対して決定された三次元構造を、該タンパク質に結合する化合物を選択するためのターゲットとして用いることができる。ホスホランバンへの優れた親和性を得るために、リガンドは、ターゲットと立体的かつ静電的相補性を有すべきである。とくに、優れた静電的相互作用および／または水素結合相互作用が部位Ｓ１およびＳ２と形成されるべきであり、また優れた疎水的相互作用が部位Ｓ３およびＳ４と形成されるべきである。そのような目的に利用できる任意の種々のコンピュータプログラムおよびデータベースを用いて、これらの要求を満たす化合物を設計することができる。構造に基づく研究方法としては、デノボ設計、コンピュータに基づくターゲットに相補的なリガンドの選択、および優勢な分子のコンピュータ支援最適化があげられる。ＰＬＢ結合性化合物の検出は、以下の工程を用いて進めることができる。
【０２２８】
１．タンパク質のターゲット領域を選択する。効果的なホスホランバン不活性化剤ペプチドｃＰ２２６の結合モデルを用いて、ホスホランバン不活性化剤用のターゲットとして機能し得るホスホランバンの表面上の領域を定めることができる。とくに、これにより、設計すべき化合物と相互作用することができるホスホランバンの側鎖が決定される。
【０２２９】
２．結合部位に相補的な小さい分子を、たとえば、Ｌｕｄｉ、ＤＯＣＫまたはＬｅａｐＦｒｏｇのような入手可能なソフトウェアを用いることによりターゲットに結合させることができる。この結合に、小さな分子または分子フラグメントの三次元構造のコンピューターデータベースを用いることができる。このような研究方法により、ターゲット領域の種々の部分と優れた相互作用を有する分子またはフラグメントが与えられる。
【０２３０】
３．ターゲット領域に結合する種々の小さい分子またはフラグメントを結合し、または新しい側鎖および／または官能基をそれらに組み込み、単一のより大きな分子を得ることができる。得られる新規化合物は、より小さい分子よりも、ターゲットへの親和性が優れている可能性が高い。
【０２３１】
４．対話型分子グラフィックシステムを用いることにより、タンパク質の結合部位の近くの適当な足場または結合部を選択することができる。次に、足場に新しいフラグメントおよび官能基を加えて、新しい基が、ターゲットの表面と優れた相互作用を呈するようにさせることができる。
【０２３２】
５．環状ペプチドｃＰ２２６は、ホスホランバンのリガンド結合部位に結合する化合物の一例である。ｃＰ２２６の構造を、ホスホランバンに親和性を有する新規化合物を設計するためのモデルとして用いることができる。ペプチド模倣体、より一般的にはペプチドの模倣体（ｍｉｍｉｃｓ）を設計するための充分に洗練された任意の方法を用いて、そのような化合物を設計することができる。
【０２３３】
先に概説した方法により、限定された数の化合物を選択することができる。当業者は、コンピュータシステムに格納されたホスホランバンの三次元構造を用いることにより、そのような化合物を同定することができる。ついで実施例３に概説したアッセイと同様のアッセイにて、その化合物を合成し、ホスホランバンを不活性化する能力を試験することができる。
【０２３４】
【表４】
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【０２３５】
【表５】
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【０２３６】
【表６】
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【０２３７】
【表７】
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【０２３８】
【表８】
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【０２３９】
【表９】
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【０２４０】
略語
ＰＬＢ、ホスホランバン；ＰＬＢ［ａ．ａ．１−３６］、ヒトホスホランバンの３６ａ．ａ．Ｎ末端フラグメント；ＳＲ、筋小胞体；ＳＥＲＣＡ、筋／細胞質内小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ；ＳＥＲＣＡ ２、筋／細胞質内小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅの心臓アイソフォーム；ＣＤ、円偏光２色性；ＣＯＳＹ、相関分光法；ＴＯＣＳＹ、全相関分光法；ＮＯＥＳＹ、核オーバーハウゼル・エンハンスメント分光法；ｄ３−ＴＦＥ、過重水素化トリフルオロエタノール；ｄ１０−ＤＴＴ、過重水素化ジチオスレイトール
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、さまざまな種（ヒト、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、ニワトリ）由来のホスホランバンのアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、環状ペプチドｃＰ２２６のＮＭＲ構造の例図である。
【図３】図３は、ＰＬＢ（１〜３６）のＮＭＲ構造の例図である。
【図４】図４は、ＰＬＢ（１〜３６）と環状ペプチドｃＰ２２６との複合体のモデル構造の例図である。
【図５】図５は、二元複合体のモデルにおけるｃＰ２２６のＰＬＢ（１〜３６）との主たる相互作用の例図である。静電気的結合、Ｈ−結合または疎水性相互作用に必要な能力を有する重原子間距離を示す。
【図６】図６は、Ｓ１〜Ｓ４として示される４つの相互作用部位に分けられた、リガンドに対する結合部位を形成するＰＬＢアミノ酸側鎖を示す例図である。
【図７】図７は、ＰＬＢ（１〜３６）に関して観測された連続ＮＯＥおよび中位ＮＯＥの連続性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）の要約である。
【図８】図８は、ＰＬＢ構造上への実施例１ｃの化合物の重ね合わせの例図である。
【図９】図９は、ＮＯＥデータにより得られたＰＬＢ（１〜３６）の構造の質を示す。残基当たりのＲＭＳＤおよび残基当たりの制限（ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ）数を示す。
【図１０】図１０は、ｃＰ２２６に関して観測された連続ＮＯＥおよび中位ＮＯＥの連続性の要約である。
【図１１】図１１は、ＮＭＲデータから演繹されるｃＰ２２６の１２個の構造からなる群の例図である。
【図１２】図１２のＡおよびＢは、心臓（Ａ）および速骨格筋（Ｂ）のＳＲベジクル中へのＣａ２＋取り込み率に対する実施例１ｃ（５０および１００μＭ）の化合物の効果を示す。
【図１３】図１３は、ＰＬＢ不活性化剤の三次元ファーマコフォア（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）を説明する。
【図１４】図１４は、ＰＬＢ不活性化剤のファーマコフォアにおける実施例１２の化合物の適合を証明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【外国語明細書】
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