(57)【要約】【課題】  生理活性物質を含む材料の滅菌に関わる問題を解決し、生理活性物質と材料を別々に滅菌した後で、無菌的に混合することにより容易に滅菌された、有用物質や病因物質等を回収可能な生理活性物質を含む材料を提供する。【解決手段】  アニオン性表面をもつ材料に、生理活性物質とカチオン性物質との複合体が固定された生理活性物質を含む材料、または、生理活性物質とカチオン性物質の複合体を水溶液状態にし、アニオン性表面をもつ材料に接触し固定させることを特徴とする生理活性物質を含む材料の製造方法、または、生理活性物質とカチオン性物質の複合体を水溶液状態で無菌ろ過滅菌し、ろ過滅菌した生理活性物質とカチオン性物質の複合体の水溶液を別に滅菌されたアニオン性表面をもつ材料に無菌的に接触し固定させることを特徴とする生理活性物質を含む材料の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アニオン性表面をもつ材料に、生理活性物質とカチオン性物質との複合体が固定された生理活性物質を含む材料。
【請求項２】
カチオン性物質がアミノ基を有することを特徴とする請求項１記載の生理活性物質を含む材料。
【請求項３】
カチオン性物質がポリエチレンイミンまたはジエチルアミノエチルデキストランであることを特徴とする請求項１記載の生理活性物質を含む材料。
【請求項４】
生理活性物質が蛋白質および／またはペプチドであることを特徴とする請求項１記載の生理活性物質を含む材料。
【請求項５】
蛋白質および／またはペプチドが、抗体、レセプター、サイトカイン、分化因子、増殖因子および接着因子からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項４記載の生理活性物質を含む材料。
【請求項６】
外部刺激により生理活性物質が脱離することを特徴とする請求項１に記載の生理活性物質を含む材料。
【請求項７】
外部刺激が還元剤による還元反応であることを特徴とする請求項６記載の生理活性物質を含む材料。
【請求項８】
生理活性物質とカチオン性物質との複合体がジスルフィド結合を介して結合していることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の生理活性物質を含む材料。
【請求項９】
血液浄化用途に用いられることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の生理活性物質を含む材料。
【請求項１０】
細胞分離用途に用いられることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の生理活性物質を含む材料。
【請求項１１】
細胞培養用途に用いられることを特徴とする請求項１〜８のいずれかにに記載の生理活性物質を含む材料。
【請求項１２】
組織形成用途に用いられることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の生理活性物質を含む材料。
【請求項１３】
生理活性物質とカチオン性物質の複合体を水溶液状態にし、アニオン性表面をもつ材料に接触し固定させることを特徴とする生理活性物質を含む材料の製造方法。
【請求項１４】
生理活性物質とカチオン性物質の複合体を水溶液状態で無菌ろ過滅菌し、ろ過滅菌した生理活性物質とカチオン性物質の複合体の水溶液を別に滅菌されたアニオン性表面をもつ材料に無菌的に接触し固定させることを特徴とする生理活性物質を含む材料の製造方法。
【請求項１５】
アニオン性表面をもつ材料が放射線で滅菌されることを特徴とする請求項１４記載の生理活性物質を含む材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、滅菌の難しい生理活性物質を含む材料において、滅菌された生理活性物質を含む材料およびその製造方法に関するものであり、生理活性物質とカチオン性物質の複合体とアニオン性表面をもつ材料を別々に滅菌した後で、無菌的に混合することにより、容易に滅菌された生理活性物質を含む材料を提供できる。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性物質を含む材料が血液浄化用途、細胞分離用途、細胞培養用途、組織形成用途などの医療材料として利用されてきた。生理活性物質を含む材料の担体素材としては、セルロース、セルロース誘導体、アガロース、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリスルホン系ポリマー、キチン、キトサン、ポリウレタンなどの高分子化合物が用いられてきた。これら担体の形状としては、ビーズ、繊維、中空糸膜、平膜、ゲル、カットファイバーなどが用いられている。
【０００３】
しかし、これら担体素材になんらかの物質を固定する際は、臭化シアンで活性基を表面に導入したり、スクシンイミド基、α−クロロアセトアミドメチル基などの活性基を表面に導入したり、担体官能基と物質の官能基を結合させてやるためにカルボジイミドなどを利用したりして、物質を共有結合などにより固定してやる必要があった（例えば、非特許文献１参照）。例えば、生理活性物質として、抗体を不織布担体に化学的に固定した材料を用い、抗体と相互作用するある特定の細胞を除去する技術が検討されている（例えば、特許文献１参照）。これらの手法は研究用途などでは頻繁に用いられているが、医療用途などの製造に用いる場合は、製造コストがかかってしまう問題があった。さらに医療用途の場合は製品を滅菌しなければならないが、抗体などの生理活性物質は、放射線や熱による滅菌により失活してしまうため、抗体などの生理活性物質を固定したような医療用具を製造する場合は製造プロセスをすべて無菌状態にして製造するなどされており、莫大な製造コストを必要としている。
【０００４】
材料に含まれる生理活性物質が滅菌可能な合成物質のようなリガンドであれば、そのリガンドの含まれる材料の製造コストは安く、滅菌は容易であるが、血液中から種々の物質を除去したり、培養材料に利用したりする場合には特異性に欠け、血液浄化用途の場合には有用物質も同時に除去されてしまう可能性がある。
【０００５】
細胞分離、培養用途の場合は、ポリスチレンなどのディッシュに生理活性物質をコーティングすることにより、細胞分離や培養が行われているが、コーティングできる量は非常に少なく、細胞分離や培養における生理活性物質の効果は低い。
【０００６】
一方、静電的相互作用を利用して生理活性物質を固定した医療材料としては、例えば、カチオン性材料にアニオン性の生理活性物質であるヘパリンを固定した抗血栓性材料（例えば特許文献２参照）などがあるが、固定した生理活性物質と血液中の物質との相互作用を利用して該物質を回収するといった方法はなされていない。
【非特許文献１】ポール・Ｔ・シャープ（P.T.Sharpe），「生化学実験法１３−細胞分離法−」，第１版，東京化学同人，１９９１年，ｐ．１５１〜１９０ｐ
【特許文献１】国際公開第９７／０２７８７８号パンフレット
【特許文献２】特開昭６３−４３１０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明では、上記の問題を考慮して、生理活性物質を含む材料の滅菌に関わる問題を解決し、生理活性物質と材料を別々に滅菌した後で、無菌的に混合することにより容易に滅菌された、有用物質や病因物質等を回収可能な生理活性物質を含む材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は主として以下の構成を有する。すなわち、「アニオン性表面をもつ材料に、生理活性物質とカチオン性物質との複合体が固定された生理活性物質を含む材料。」、「生理活性物質とカチオン性物質の複合体を水溶液状態にし、アニオン性表面をもつ材料に接触し固定させることを特徴とする生理活性物質を含む材料の製造方法。」、「生理活性物質とカチオン性物質の複合体を水溶液状態で無菌ろ過滅菌し、ろ過滅菌した生理活性物質とカチオン性物質の複合体の水溶液を別に滅菌されたアニオン性表面をもつ材料に無菌的に接触し固定させることを特徴とする生理活性物質を含む材料の製造方法。」である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、生理活性物質を含む材料の滅菌に関わる問題を解決し、生理活性物質とカチオン性物質の複合体とアニオン性表面をもつ材料を別々に滅菌した後で、無菌的に混合することにより、容易に滅菌された生理活性物質を含む材料を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、アニオン性表面をもつ材料に、生理活性物質とカチオン性物質との複合体が固定された材料である。
【００１１】
本発明で用いられるアニオン性表面をもつ材料の素材は、アニオン性表面を有するものまたは表面にアニオン性を付与できるものであれば特に限定されないが、具体的にはセルロース、セルロースアセテート、セルローストリアセテート、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリアリレート、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリスルホン系ポリマー、ゼラチン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、コラーゲン、アガロースなどの高分子化合物、ステンレス、チタン、白金などの金属、ハイドロキシアパタイト、トルカルシウムホスフェートなどが挙げられる。なかでも、加工性等の点から、高分子化合物が好ましい。
【００１２】
材料の形状としては平膜状、粒子状、中空糸状、繊維状、スポンジ状、カットファイバーなど何でもよいが、血液浄化用途、細胞培養用途の場合は、閉鎖系で圧力損失を伴わず、細胞を傷つけず循環できる利点から中空糸膜が望ましく、三次元的な立体空間を利用し、細胞を捕捉できる利点からは繊維状が望ましい。また、中空糸膜の場合、表面積を確保する点からこれらは多孔質であることがのぞましい。中空糸膜を多孔質として用いる場合は、透析やろ過機能を付与することができ、血液浄化用途のみならず、バイオリアクターなどの細胞培養用途としても用いることができる。多孔質材料の場合は、製造条件を制御することにより孔の制御も可能である。繊維状の場合、繊維くずの流出などを防ぐという点で長繊維からなることが望ましい。また、繊維は織布でもよいし、不織布でもよいが、細胞の通過する空間を保持させるという観点から不織布が望ましい。不織布を用いる場合は、細胞が通過できる空間を保持されていれば、どのような繊維径、密度でもよいが、繊維系については０．１μｍ以上１００μｍ以下であることが望ましく、密度は０．００５〜０．５０ｇ／ｃｍ3であることが望ましい。
【００１３】
これらの材料にアニオン性を付与するために用いられる物質としては、硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ＤＮＡ、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、アクリル酸、ビニル硫酸、パラスチレンスルホン酸ナトリウム、末端アミノ基の封鎖されたポリアミドなど、アニオン性の官能基をもつ低分子、高分子物質が用いられる。
【００１４】
これらの材料にアニオン性を付与する方法としては、化学反応、グラフト反応、放射線架橋、共重合、ブレンド、イオン注入、真空蒸着、コーティングなど材料表面にアニオン性を付与できる方法であれば何でも良い。
【００１５】
例えば、セルロースにアミノ基を導入し、カルボジイミドでヘパリンを固定させてやることにより、アニオン性表面を導入できる。ポリスルホンとポリビニルピロリドンからなる材料の場合は、デキストラン硫酸の水溶液中で放射線を照射することにより、材料表面にアニオン性を付与できる。また、ポリスチレンからなる材料の場合は、濃硫酸で処理してやることにより、表面に硫酸基を導入でき、表面にアニオン性官能基を導入できる。また、ポリメチルメタクリレートを通常のラジカル重合によって得る際、カルボキシル基や、スルホン酸基などのアニオン性基を含有するビニルモノマーと共重合したものを、材料に成形することにより、材料表面にアニオン性を付与できる。また、アニオン性ポリマーをポリメチルメタクリレートのようなポリマーとブレンドして成形することによっても材料表面にアニオン性を付与することができる。ナイロンやポリエステルにアクリル酸をグラフトすることによっても得ることができる。ナイロンのようなポリアミドの重合時に末端アミノ基を酢酸などで封鎖して重合したものはカルボキシル基を有しており、その高分子を用いて成形することによってアニオン性表面をもつ材料を得ることができる。金属の負イオン注入によっても得ることができる。
【００１６】
材料に生理活性物質を固定し、生理活性物質を脱離させるようにするには材料は親水性であることが望ましい。親水化の方法としては、血漿やアルブミンなどで親水化処理したり、ポリエチレングリコールやポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどをブレンドまたはコーティングしたりする方法が挙げられる。
【００１７】
本発明の生理活性物質を含む材料は、アニオン性表面をもつ材料にカチオン性物質と複合した生理活性物質を含む水溶液を添加することにより、容易に生理活性物質を材料に固定することができる。これはアニオン性表面とカチオン性物質の静電的相互作用により固定されるためである。
【００１８】
活性基を導入した材料に生理活性物質を導入する場合、通常、１ｍｇ／ｍｌ以上の高濃度の生理活性物質の溶液濃度を必要とするが、本発明における生理活性物質の固定化方法であれば、０．１ｍｇ／ｍｌであっても、材料に固定することが可能である。
【００１９】
本発明に用いられるカチオン性物質はカチオン性ポリマーが好ましい。ここでいうカチオン性ポリマーの分子量は、特に限定されない。カチオン性ポリマーは窒素原子を含有するポリマー、すなわち１級、２級、３級アミノ基、４級アンモニウム塩のいずれか１種以上を有するアミノ基含有ポリマー、イミノ基含有ポリマー、アミド基含有ポリマーなどが好ましく用いられる。これらのポリマーを構成する原料成分の共重合体またはノニオン、アニオン性化合物との共重合体なども好ましく使用される。ここで、該カチオン性ポリマーは直鎖状、分岐状、環状のいずれであってもよい。また、分子量は好ましくは６００以上１０００万以下、より好ましくは１０００以上１０万以下である。
【００２０】
アミノ基含有ポリマーの例としては、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ジアルキルアミノアルキルデキストラン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、キトサン、ポリオルニチン、ポリリジン、アジリジン（エチレンイミン）化合物を有するポリマー、およびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらを構成するモノマー単位からなる共重合体などが挙げられる。
【００２１】
ポリエチレンイミンには、分子量６００以上１０００万以下の直鎖状、分岐状のものが好ましく用いられる。より好ましくは分子量１０００以上１０万以下のものが用いられる。
【００２２】
また、ポリエチレンイミン誘導体としては、ポリエチレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化など、所望の割合で誘導体化したものが挙げられる。
【００２３】
カチオン性ポリマーの中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさなどから、分岐状のポリエチレンイミンやジエチルアミノエチルデキストランが特に好適に用いられる。
【００２４】
本発明で使用する生理活性物質は、ａ）細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつものや、ｂ）抗血栓性を有するもの、ｃ）細胞を活性化するもの、ｄ）アポトーシスを誘導するもの、ｅ）増殖、分化因子、ｆ）サイトカイン、ｇ）接着因子などがあげられる。これらは単独、または複数組み合わせて用いられる。
ａ）細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつもの
細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつものの場合、特異性の点から抗体およびレセプターを好ましく用いることができる。用いる抗体としては、例えば、抗ＣＤ１ａ抗体、抗ＣＤ１ｂ抗体、抗ＣＤ１ｃ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤｗ１２抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１６ａ抗体、抗ＣＤ１６ｂ抗体、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４２ａ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ５０抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ５７抗体、抗ＣＤ５８抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、抗ＣＤ６２Ｐ抗体、抗ＣＤ６６抗体、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ９５抗体、抗ＣＤ１０２抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ＣＤ１０９抗体、抗ＣＤｗ１１９抗体、抗ＣＤ１２０ａ抗体、抗ＣＤ１２０ｂ抗体、抗ＣＤ１２１ａ抗体、抗ＣＤｗ１２１ｂ抗体、抗ＣＤ１２２抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＤ１２６抗体、抗ＣＤｗ１２８ａ抗体、抗ＣＤ１３０抗体、抗ＣＤｗ１３１抗体、抗ＣＤ１３２抗体、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１３８抗体、ＣＤ１５２抗体、抗ＣＤ１５４抗体、抗ＣＤ１９９抗体、抗免疫グロブリン抗体、抗低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）抗体、抗酸化ＬＤＬ抗体、抗β２ミクログロブリン抗体、抗ＡＧＥ抗体、抗ＣＣＲ１抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ５抗体、抗ＣＣＲ７抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、抗ＣＸＣＲ１抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。また、レセプターとしては例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ５等のサイトカインレセプターやＦｃγ、Ｆｃε等のイムノグロブリンレセプター、ＲＡＧＥ、ＬＤＬレセプター等のスカベンジャ−レセプター等、Ｔ細胞レセプターや主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体やレセプターは単独で固定しても良いし、複数の抗体やレセプターを組み合わせても良い。抗体は、アフィニティーの高さからモノクローナル抗体が好ましい。
【００２５】
これら抗体やレセプターは目的によって種々選定することができ、血液中の有用物質や病因物質を特異的に除去、回収する場合は細胞、無機物、タンパク質、ＤＮＡ、脂質、糖、ウィルスなどがターゲットとして挙げられる。例えば、本発明における細胞分離用途として、抗ＣＤ２抗体を用いればＴ細胞およびＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ３抗体を用いればＴ細胞をを分離でき、抗ＣＤ４抗体を用いればヘルパーＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ８抗体を用いればサイトトキシックＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ１１ａを用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ１１ｂを用いれば単球を分離でき、抗ＣＤ１４抗体を用いれば単球やマクロファージを分離でき、抗ＣＤ１５抗体を用いれば顆粒球やミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ１６細胞を用いれば好中球あるいは休止期ＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ１９抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２２抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２７抗体を用いればナイーブＢ細胞やメモリーＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ３０抗体を用いれば活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞を分離でき、抗ＣＤ３３細胞を用いれば単球、顆粒球およびミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ３４抗体を用いれば造血幹細胞を分離でき、抗ＣＤ４５抗体を用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ５６抗体を用いればＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ６１抗体を用いれば巨核球及びその前駆細胞を分離でき、抗ＣＤ６６抗体を用いれば顆粒球を分離でき、抗ＣＤ６９抗体を用いれば活性化Ｔ細胞や活性化Ｂ細胞やＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ７１抗体を用いれば赤芽球や活性化されたリンパ芽球を分離でき、抗ＣＤ１０５抗体を用いれば内皮細胞、抗ＣＤ１３３抗体を用いれば神経幹細胞を分離できる。抗免疫グロブリン抗体を用いればＢ細胞を分離できる。
ｂ）抗血栓性を有するもの
生理活性物質において、抗血栓性を有するものとしては、ヘパリン、トロンモボジュリン、ヒルジンなどがあげられる。これらを材料に固定したものは、例えば、本発明における血液浄化用途として、人工腎臓や血液吸着材などに、組織形成用途における人工血管などに利用できる。
ｃ）細胞を活性化するもの
細胞を活性化するものとして、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−１２、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、やＴ細胞レセプター、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスIおよびクラスIIやそれらに抗原ペプチドを複合したもの等が挙げられる。例えば、本発明における細胞培養用途として、材料に抗ＣＤ３抗体や抗ＣＤ２８抗体を固定したものを用いてリンパ球を培養すれば、培養によりリンパ球が活性化され、培養されたリンパ球をがん免疫療法に用いることができる。
ｄ）アポトーシスを誘導する生理活性物質
アポトーシスを誘導する生理活性物質としてはＦａｓリガンドやＣＤ４０リガンドなどある。
ｅ）増殖、分化因子
増殖、分化因子としては、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、FGF-2、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、オステオネクチン、アンジオポイエチン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、腫瘍壊死因子-α、腫瘍壊死因子-β、ノッチリガンド（Delta1,Delta2,Delta3,Delta4,Jagged1,Jagged2,DNER,Deltex）などが挙げられる。また、上記タンパク質の組み換え体および機能的に活性をもつ断片を含むタンパク質またはその誘導体、またはその断片、または同じ作用をもつ上記タンパクの遺伝子をもちいることもできる。生理活性物質として増殖因子を含有した材料は、例えば、本発明における組織形成用途として、人工皮膚、塞栓物質、人工血管、人工神経、人工骨、人工気管、人工軟骨、人工粘膜、人工食道、肝再生足場、膵再生足場、心筋再生足場、腎臓再生足場、角膜再生足場、毛髪再生足場などに利用される。また、本発明における細胞培養用途として、神経分化用、ＥＳ細胞培養用、造血幹細胞培養用、神経幹細胞培養用、免疫細胞培養用、間葉系幹細胞培養用、多能性幹細胞培養用、血管内皮細胞培養用、繊維芽細胞培養用、心筋細胞培養用、膵β細胞培養用、肝細胞培養用などに利用される。
ｆ）サイトカイン
サイトカインとして、インターロイキン-1α、インターロイキン-1β、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-6  、インターロイキン-6レセプター、インターロイキン-7、インターロイキン-8、インターロイキン-10、インターロイキン-11、インターロイキン-12、インターロイキン-13、インターロイキン-14、インターロイキン-15、インターロイキン-16、インターロイキン-17、インターロイキン-18、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、単球遊走因子（ＭＣＰ−１）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）などが挙げられる。
【００２６】
がん細胞を認識するものとして、マンノース−６−リン酸などが挙げられ、例えば、本発明における細胞分離用途として、癌患者の血中に存在するガン細胞を除去し、転移を抑制するための血液浄化カラムに用いることができる。
ｇ）接着因子
接着因子として、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、カテニンやカドヘリン等のカドヘリンファミリー、Ｉ−ＣＡＭなどのＩｇスーパーファミリー、セレクチンファミリー、シアロムチンファミリーやこれらの活性部位を含む組み換え体などがあげられる。
【００２７】
用いる生理活性物質は市販の生理活性物質や医薬品を用いても良いし、抗体の場合には、ハイブリドーマから作製してもよい。
【００２８】
本発明における複合体とは、物質が複合したものをいい、本発明における複合とは、共有結合、イオン結合（静電相互作用）、疎水性相互作用による結合などのことをいう。カチオン性物質と生理活性物質を複合するには、アミノ基をもったカチオン性物質、特にアミノ基をもったカチオン性ポリマーを利用するのが望ましい。
【００２９】
生理活性物質とカチオン性物質を複合するには、カチオン性物質と生理活性物質を容易に解離しないような結合形式で複合してもよいし、外部刺激で解離できるようなスペーサーを介して結合することにより複合してもよい。外部刺激で解離できるようなスペーサーを介して結合した場合、生理活性物質を材料に固定した際、生理活性物質または生理活性物質と結合した物質、細胞などを外部刺激により回収することができる。
【００３０】
複合するには、生理活性物質中にある官能基、例えば、蛋白質の場合はアミノ基などを利用すればよい。アミノ基であれば、スクシンイミド基を導入したカチオン性物質を用いて複合することができる。また、カルボキシル基を有するカチオン性物質であれば、カルボジイミドなどの縮合剤を用いて複合することができる。
【００３１】
生理活性物質とカチオン性物質を外部刺激で解離可能なスペーサーを介して複合する場合に用いられうる外部刺激としては光、熱、ｐＨ、塩濃度、化学反応などがあるが、生理活性物質の安定性などから化学反応により化学結合を切断して生理活性物質が解離できるスペーサーを用いることが好ましく、化学的な結合が切断される反応として、加水分解反応、酸化反応、還元反応、酵素反応などがあげられる。材料がセルロースである場合には、生理活性物質を固定して、セルラーゼを用いて、材料そのものを酵素処理したり、生理活性物質をＤＮＡを介して結合し、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）で酵素処理したり、生理活性物質そのものをパパイン等で消化することができるが、取り扱い性、コスト、水中での安定性や細胞の生存率維持の必要性から還元反応が好ましい。特に、ジスルフィド結合を還元剤による還元反応により切断させる反応は、タンパク質のリフォールディングなど生体内で良く行われる反応であり、生理活性物質を解離する反応として好適である。また、ここで使用する還元剤としてジチオスレイトール、メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオンなどがあげられる。
【００３２】
カチオン性物質にジスルフィド結合を介して生理活性物質を複合する方法としては、メルカプト基同士の酸化反応やあるいは下記のようなジスルフィド交換反応を利用してジスルフィド結合を形成させる方法をとる。ジスルフィド交換反応を利用する方法としては、ピリジルジスルフィド基とメルカプト基の交換反応を用いるのが反応性の点から好ましく、ピリジルジスルフィド基やメルカプト基を生理活性物質およびカチオン性物質に導入して結合させる。この際、通常架橋剤を利用する。カチオン性物質にピリジルジスルフィド基を導入した場合は、生理活性物質にピリジルジスルフィド基を導入して還元し、メルカプト基を導入したものや生理活性物質が抗体である場合は、抗体をペプシンで消化し、抗体の可変部位のみに精製した後、生成するメルカプト基を用いて結合することができる。生理活性物質にピリジルジスルフィド基を導入して、還元する場合、生理活性物質が抗体である場合は、抗体自体の還元による失活を防ぐためには酢酸緩衝液中などで還元することにより抗体自身の還元を抑えることができる。カチオン性物質にメルカプト基を導入した場合は、生理活性物質にピリジルジスルフィド基を導入したものと反応させればよい。
【００３３】
生理活性物質やカチオン性物質にメルカプト基やピリジルジスルフィド基を導入する場合に、スクシンイミド基を有する架橋剤を利用する場合は、生理活性物質中にアミノ基があればよく、カチオン性物質の場合はアミノ基をもったものがよい。
【００３４】
上記のようなジスルフィド結合を介した複合に利用できるような架橋剤としては、カチオン性物質同士あるいは生理活性物質同士の結合を防ぐため二種類の違った官能基と反応する活性基をもつ架橋剤を使用することが好ましく、活性基として、アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミド基、イミドエステル基、ニトロアリールハライド基、イミダゾリルカルバミン酸基、メルカプト基と反応するマレイミド基、ピリジルジスルフィド基、チオフタルイミド基、活性化ハロゲン基、光化学反応により架橋するフェニルアジド基、ジアゾカルベン基、などを持つような架橋剤を利用することができる。なかでも、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基を持つような架橋剤を利用することにより、アミノ基を有するカチオン性物質や抗体などのアミノ基を有する生理活性物質にピリジルジスルフィド基を導入できる。また、このピリジルジスルフィド基を還元剤により還元することによりメルカプト基に変換できる。このような架橋剤として、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートや水溶性のスルフォスクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートなどが挙げられる。水に不溶性の架橋剤を用いる場合は、ジメチルスルホキシドやメタノールなどの可溶性の有機溶媒に溶解後、水系の反応液に添加することにより利用できる。
【００３５】
メルカプト基を導入する場合は、２−イミノチオランを利用すれば、一段階でメルカプト基を導入できる。
【００３６】
生理活性物質へのピリジルジスルフィド基の導入率は生理活性物質１モルあたり１モル以上であることが必要であるが、導入率を上げるためにピリジルジスルフィド化剤の仕込量を上げると失活したり、凝集したりするおそれがある。望ましくは仕込量はリガンド１モルあたり５０モル以下が望ましい。
【００３７】
本発明における血液浄化用途とは、腎不全患者の治療に用いられる人工透析、腎不全、高脂血症、敗血漿など血中に病因物質が混入した患者における血液吸着療法などのことをいう。細胞分離用途では、患者血中から病因物質となる細胞を分離したり、患者および健常者の血液や組織から治療に必要な細胞を分離したりする。細胞培養用途では、患者および健常者の血液や組織から採取した細胞を培養して、それを治療や分析、タンパク生産に用いたりする。組織形成用途では、材料を埋め込んで、血管などの組織を体内で形成させたり、体外で培養して組織を形成してから埋め込んだりして用いられる。
【００３８】
生理活性物質を含む材料を医療用として提供する場合は、滅菌されている必要がある。本発明の場合、生理活性物質とカチオン性物質の複合体とアニオン性表面をもつ材料は別々に滅菌され、その後、無菌的に混合することにより製造される。
【００３９】
生理活性物質とカチオン性物質の複合体は医薬品と同様、無菌ろ過により滅菌される。滅菌された生理活性物質とカチオン性物質の複合体は水溶液の状態でもよいし、滅菌後、凍結乾燥されたものでもよい。凍結乾燥されたものであれば、材料と混合する前に滅菌済みの生理食塩水などで溶解してから用いられる。
【００４０】
アニオン性表面をもつ材料の滅菌を行う場合は、蒸気滅菌、放射線滅菌、エチレンオキサイド滅菌などが医療用の材料の滅菌においては好適に用いられる。
【００４１】
本発明の材料を利用すれば、上記で示したようなターゲットとなる有用物質や病因物質を生理活性物質により捕捉でき、さらに、外部刺激により生理活性物質を材料から脱離させることにより、捕捉した有用物質や病因物質を回収する事が可能である。また、ターゲット物質を捕捉あるいは回収する際に使用する溶媒として、様々なｐＨ値のリン酸、酢酸、クエン酸などの緩衝液をもちいることができ、さらに緩衝液の中にウシ血清アルブミンや抗体などのタンパク質あるいはカチオン性、アニオン性などのポリマーなどを含有していても良い。
【００４２】
細胞を回収する際は全血と作用させてもよいし、血漿分画や単核球分画などにした後、作用させてもよい。
【００４３】
以上のような方法で、回収した有用物質、病因物質を分析に用いることが可能である。また、細胞の場合はそれを培養し、分析や治療などに利用できる。例えば、生理活性物質として抗ＣＤ４抗体を使用し、この生理活性物質を固定した本発明の材料に血液を通してＣＤ４陽性のＴ細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤で生理活性物質を脱離することにより、捕捉した細胞を大量に回収し、この細胞に様々な刺激を加えて活性化させ体内に戻すことにより、癌、アレルギー、感染症、臓器移植、あるいは自己免疫疾患の治療やワクチンとしてもちいることができる。
【００４４】
また、例えば、生理活性物質として抗ＣＤ３４抗体を使用し、この生理活性物質を固定した本発明の材料に末梢血や臍帯血を通して、造血幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤で生理活性物質を脱離することにより、造血幹細胞を大量に回収し、回収した造血幹細胞を培養して輸血医療に用いたり、様々な組織幹細胞に分化させることにより、肝疾患や神経疾患、血管傷害などの細胞療法に用いることができる。
【００４５】
また、例えば、生理活性物質として抗ＣＤ１３３抗体を使用し、この生理活性物質を固定した本発明の材料に末梢血や臍帯血を通して、神経幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤で生理活性物質を脱離することにより、神経幹細胞を大量に回収し、回収した神経幹細胞を培養して神経幹細胞移植に用いたり、様々な神経細胞に分化させることにより、パーキンソン病やアルツハイマー病など神経疾患、脳梗塞により壊死した神経細胞の修復などの細胞療法に用いることができる。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４７】
＜実施例１＞
１．メルカプト基を持つポリエチレンイミン誘導体の作製
１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にポリエチレンイミン（数平均分子量１００００、和光純薬製）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この溶液３ｍｌに、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアース社製、以下ＳＰＤＰ）を２０ｍＭになるように溶解したジメチルスルホキシド溶液を０．５ｍｌ添加し、室温で３０時間撹拌した。反応させた溶液をＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。
【００４８】
合成したＳＰＤＰ化ポリエチレンイミンを２５ｍＭのジチオスレイトール（ピアース社製、以下ＤＴＴ）を含むリン酸緩衝液中で還元反応を行った後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製することにより、メルカプト基を有するポリエチレンイミン誘導体（以下、ＨＳ−ＰＥＩ）を合成した。還元反応について、反応により生成するピリジン−２−チオンの吸収（３４３ｎｍ）を測定することにより、メルカプト基の導入量を測定したところ、ポリエチレンイミン１分子当たり５モルのメルカプト基が導入されていることが分かった。
２．ヒト免疫グロブリンＧのＳＰＤＰ化
ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５ｍｇ／ｍｌに溶解した精製ヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製）にＳＰＤＰを２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液をヒト免疫グロブリンＧ１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。ヒト免疫グロブリンＧ１モルあたりのＳＰＤＰ導入量は４．２モルであった。
３．ジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンの合成
１．で得られたＨＳ−ＰＥＩを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液と２．で得られたＳＰＤＰ化ヒト免疫グロブリンＧを１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：０．５となるように混合し、室温で１４時間反応させ、ヒト免疫グロブリンＧをポリエチレンイミンにジスルフィド結合を介して複合した。複合化は反応液を高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ、測定条件は、カラム：東ソーＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ、溶出液：０．５Ｍ酢酸バッファー、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。さらに、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体の溶液にＤＴＴを２５ｍＭとなるように添加して複合体を還元後再びＨＰＬＣ測定すると、もとのヒト免疫グロブリンＧとポリエチレンイミンのピークになることが確認され、複合体が還元により分離できることがわかった。得られたジスルフィド結合を介して複合されたポリエチレンイミン化ヒト免疫グロブリンＧは無菌ろ過滅菌により滅菌した。
【００４９】
＜実施例２＞
１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にポリエチレンイミン（数平均分子量１００００、和光純薬製）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。この溶液３ｍｌに、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ピアース社製）を２０ｍＭになるように溶解したジメチルスルホキシド溶液を０．５ｍｌ添加し、室温で３０時間撹拌した。反応させた溶液をＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。
【００５０】
上記で得られたマレイミド化ポリエチレンイミンを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液とヒト免疫グロブリンＧを１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１となるように混合し、室温で１４時間反応させ混合し、ヒト免疫グロブリンＧをポリエチレンイミンと複合した。複合化は反応液をＨＰＬＣを用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。得られたポリエチレンイミン化ヒト免疫グロブリンＧは無菌ろ過滅菌により滅菌した。
【００５１】
＜実施例３＞
１．ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９重量部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２重量部、水１重量部に加え、９０℃、１４時間加熱溶解した。この溶液を０．１ｍｍスペーサー付きのガラス板に塗布し、ドクターブレードにて溶液を引き延ばしたものを水中にいれて、凝固させ、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンドからなる平膜状の材料を作製した。
【００５２】
２．上記、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド材料を十分水洗した後、１ｗｔ％のデキストラン硫酸（分子量５０万、和光純薬製）水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射して、表面に硫酸基をもつ平膜を作製した（滅菌を兼ねる）。
【００５３】
３．２．で作製したアニオン性平膜１ｃｍ2を実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体がアニオン性平膜に固定されていることが確認された。また、この膜を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により７．７μｇ／ｃｍ2のヒト免疫グロブリンＧがアニオン性平膜から脱離された。
【００５４】
＜実施例４＞
実施例３の２．で作製したアニオン性平膜１ｃｍ2を実施例２で合成したヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体がアニオン性平膜に固定されていることが確認された。
【００５５】
＜比較例１＞
実施例３の１．で得られた表面にポリビニルピロリドン層を有するポリスルホン製平膜に、実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させたが、ヒト免疫グロブリンＧは平膜に固定されなかった。
【００５６】
＜比較例２＞
実施例３の２．で作製したアニオン性平膜にヒト免疫グロブリンＧを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させたが、ヒト免疫グロブリンＧは平膜に固定されなかった。
【００５７】
＜実施例５＞
表面に硫酸基をもつ東レ製繊維状イオン交換体“アイオネックス”０．１ｇを２５ｋＧｙのγ線で滅菌した後、ヒト血漿またはヒトアルブミンで親水化した後、実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液に室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が繊維に固定されていることが確認された。また、この繊維を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により１０μｇ／０．１ｇ繊維のヒト免疫グロブリンＧが繊維から脱離された。
【００５８】
＜実施例６＞
２５ｋＧｙでγ線滅菌された表面に硫酸基を有するＰＭＭＡ中空糸膜からなる東レ製“フィルトライザー”人工腎臓（ＢＧ）を解体して中空糸膜を取り出し、中空糸膜を３６本束ね、中空糸膜中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、ミニモジュールを作製した。該ミニモジュールの直径は約７ｍｍ、長さは約１０ｃｍである。作製したミニモジュールの中空糸内部に実施例１で合成したジスルフィド基を介してヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌを室温で２時間灌流した。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が中空糸内部に固定されていることが確認された。得られたヒト免疫グロブリンＧ固定化中空糸膜は、分子量６０００のポリエチレングリコールで親水化処理した。この中空糸内部を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で灌流して中空糸内表面を還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により１０μｇのヒト免疫グロブリンＧがミニモジュールから脱離された。
【００５９】
＜実施例７＞
ヘパリン固定化セルロースビーズ（アマシャム製）０．１ｇをγ線で滅菌した後、実施例２で合成したヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が０．３ｍｇ固定されたヘパリンビーズを作製できた。
【００６０】
＜実施例８＞
硫酸化セルロファインビーズ（チッソ製）０．１ｇをγ線で滅菌した後、実施例１で合成したヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が０．３ｍｇ固定された硫酸化セルロファインビーズを作製できた。このビーズを２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液に浸漬してビーズ表面を還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により１００μｇヒト免疫グロブリンＧがビーズから脱離された。
【００６１】
＜実施例９＞
酢酸でアミノ基末端の封鎖された６，６−ナイロンからなるナイロン長繊維不織布０．１ｇをオートクレーブで滅菌した後、実施例１で合成したヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が０．２ｍｇ固定されたナイロン繊維を作製できた。このナイロン繊維を２５ｍＭのメルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液に浸漬して繊維表面を還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により５０μｇヒト免疫グロブリンＧが繊維から脱離された。
【００６２】
＜実施例１０＞
酢酸でアミノ基末端の封鎖された６，６−ナイロンにポリビニルピロリドンが５重量％ブレンドされた親水化ナイロン長繊維不織布０．１ｇをγ線で滅菌した後、実施例１で合成したヒト免疫グロブリンＧを複合したポリエチレンイミンを０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれるヒト免疫グロブリンＧの吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ヒト免疫グロブリンＧ−ポリエチレンイミン複合体が０．１５ｍｇ固定されたナイロン繊維を作製できた。このナイロン繊維を２５ｍＭのメルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液に浸漬して繊維表面を還元し、脱離されたヒト免疫グロブリン量をＨＰＬＣおよび吸光度で測定したところ、還元処理により７０μｇヒト免疫グロブリンＧが繊維から脱離された。
【００６３】
＜実施例１１＞
１．ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５ｍｇ／ｍｌに溶解したＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体、ヤンセンファーマ社製）にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアス社製、ＳＰＤＰ）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して１０倍モル量添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。ＯＫＴ３が１モルに対してＳＰＤＰ導入量は３．８モルであった。
【００６４】
実施例１の１．で得られたＨＳ−ＰＥＩを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液と得られたＳＰＤＰ化ＯＫＴ３を１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１となるように混合し、室温で１４時間反応させ混合し、ＯＫＴ３をポリエチレンイミンにジスルフィド結合を介して複合した。複合化は反応液をＨＰＬＣを用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。得られたＯＫＴ３とポリエチレンイミンの複合体水溶液は無菌ろ過滅菌した。
２．実施例３の２．で作製したアニオン性平膜１ｃｍ2をジスルフィド基を介して複合したＯＫＴ３−ポリエチレンイミン複合体０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれる複合体の吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、ＯＫＴ３−ポリエチレンイミン複合体がアニオン性平膜に固定されていることが確認された。
【００６５】
こうして得られたＯＫＴ３−ポリエチレンイミン複合体固定化平膜１ｃｍ2に健常者血液から得た単核球からなる細胞懸濁液を５×１０5個添加して２０分後、洗浄した材料に５ｍＭのメルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して、ジスルフィド結合を還元することによりＯＫＴ３に結合したＣＤ３陽性細胞を脱離させた。フローサイトメトリーにより求められる細胞懸濁液中のＣＤ３陽性細胞の比率は６０％から８０％になり、ＣＤ３陽性細胞を分離することができた。
【００６６】
＜実施例１２＞
１．ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に２ｍｇ／ｍｌに溶解した抗ヒト免疫グロブリン抗体（ＩＣＮファーマシューティカル社製）にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアス社製、ＳＰＤＰ）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して３６倍モル量添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。抗ヒト免疫グロブリン抗体が１モルに対してＳＰＤＰ導入量は５．０モルであった。
【００６７】
実施例１の１．で得られたＨＳ−ＰＥＩを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液と得られたＳＰＤＰ化抗ヒト免疫グロブリン抗体を０．７ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１となるように混合し、室温で１４時間反応させ混合し、抗ヒト免疫グロブリン抗体をポリエチレンイミンにジスルフィド結合を介して複合した。複合化は反応液をＨＰＬＣを用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。得られた抗ヒト免疫グロブリン抗体とポリエチレンイミンの複合体水溶液は無菌ろ過滅菌した。
２．繊維径１０μｍの長繊維からなる末端アミノ基封鎖６，６−ナイロン長繊維不織布０．１ｇにジスルフィド基を介して複合した抗ヒト免疫グロブリン抗体−ポリエチレンイミン複合体０．２ｍｇ／ｍｌを含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれる複合体の吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、抗ヒト免疫グロブリン抗体−ポリエチレンイミン複合体がナイロン不織布に固定されていることが確認された。
【００６８】
こうして得られた抗ヒト免疫グロブリン抗体−ポリエチレンイミン複合体固定化ナイロン繊維０．１ｇに健常者血液から得た単核球からなる細胞懸濁液を５×１０5個添加して２０分後、洗浄した材料に２５ｍＭのメルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して、ジスルフィド結合を還元することにより抗ヒト免疫グロブリン抗体に結合したＢ細胞を脱離させた。フローサイトメトリーにより求められる細胞懸濁液中のＢ細胞（ＣＤ１９陽性細胞）の比率は１１％から８０％になり、Ｂ細胞を分離することができた。
【００６９】
＜実施例１３＞
１．ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１ｍｇ／ｍｌに溶解した抗ＣＤ４抗体（ベクトンディキンソン社製）にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアス社製、ＳＰＤＰ）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して１０倍モル量添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。抗ＣＤ４抗体が１モルに対してＳＰＤＰ導入量は３．０モルであった。
【００７０】
実施例１の１．で得られたＨＳ−ＰＥＩを２．１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液と得られたＳＰＤＰ化抗ＣＤ４抗体を０．５ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液をモル比で１：１となるように混合し、室温で１４時間反応させ混合し、抗ＣＤ４抗体をポリエチレンイミンにジスルフィド結合を介して複合した。複合化は反応液をＨＰＬＣを用いて分析し、高分子量側にシフトすることにより確認した。得られた抗ＣＤ４抗体とポリエチレンイミンの複合体水溶液は無菌ろ過滅菌した。
２．表面に硫酸基をもつ東レ製繊維状イオン交換体“アイオネックス”０．１ｇを２５ｋＧｙのγ線で滅菌した後、ヒトアルブミンで親水化処理した材料にジスルフィド基を介して複合した抗ＣＤ４抗体−ポリエチレンイミン複合体０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌに室温で２時間浸漬させた。２時間後のリン酸緩衝液に含まれる複合体の吸光度（２８０ｎｍ）を測定したところ、吸光度が減少し、抗ＣＤ４抗体−ポリエチレンイミン複合体が“アイオネックス”に固定されていることが確認された。
【００７１】
こうして得られた抗ＣＤ４抗体−ポリエチレンイミン複合体固定化“アイオネックス”０．１ｇに健常者血液から得た単核球からなる細胞懸濁液を５×１０5個添加して２０分後、洗浄した材料に２５ｍＭのメルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加して、ジスルフィド結合を還元することにより抗ＣＤ４抗体に結合したＣＤ４陽性細胞を脱離させた。フローサイトメトリーにより求められる細胞懸濁液中のＣＤ４陽性細胞の比率は３０％から８０％になり、ＣＤ４陽性細胞を分離することができた。