(57)【要約】【課題】遊離Ｄ−アスパラギン酸に対して高い特異性を有するＤ−アスパラギン酸酸化酵素をコードする遺伝子を提供する。【解決手段】遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、酵母クリプトコッカス・ヒュミコラス（ＵＪ１株）の該遺伝子をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；または前記塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；からなる遺伝子を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１１記載の塩基配列からなるＤＮＡ；または
前記塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
からなる遺伝子。
【請求項２】
遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１１記載の塩基配列からなるＤＮＡ；または
前記塩基配列からなるＤＮＡにおいて１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
からなる遺伝子。
【請求項３】
遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１２記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；または
前記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質；をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の遺伝子であって、前記遺伝子が、酵母クリプトコッカス・ヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＵＪ１株に由来することを特徴とする遺伝子。
【請求項５】
遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質の組換え蛋白質であって、
配列番号１２記載のアミノ酸配列からなる組換え蛋白質、または
該配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する組換え蛋白質。
【請求項６】
請求項１〜４の何れか１項に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターによって形質転換した形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体であって、前記形質転換体が真核生物である形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体であって、前記真核生物が酵母である形質転換体。
【請求項１０】
請求項７記載の形質転換体であって、前記形質転換体が原核生物である形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換体であって、前記原核生物が細菌である形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換体であって、前記細菌が大腸菌である形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素の遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミノ酸は不斉炭素原子を有していることから、グリシンを除くアミノ酸にはＤ型およびＬ型の２つの鏡像異性体が存在する。生体に存在するアミノ酸は、Ｌ型が大多数であるが、Ｄ型も少数ながら存在している。その存在状態としては、蛋白質中のアミノ酸として存在する場合、また遊離した単独の状態の双方で存在していることが確認されている。Ｄ型のアミノ酸は、ヒトを含む様々な種において存在が確認されており、且つＤ型アミノ酸を基質として特異的に反応する酵素なども存在することなどから重要な生体機能を担っていることが推測されている。
【０００３】
Ｄ−アスパラギン酸は、このようなＤ型アミノ酸の一種であり、生体内に遊離した状態でも存在している（以後、このような生体内で遊離した状態で存在しているＤ−アスパラギン酸を遊離Ｄ−アスパラギン酸と呼称する）。このＤ型アミノ酸も、様々な生理活性を有することが明らかとなってきている。生物試料中の遊離Ｄ−アスパラギン酸を解析する場合、そのＬ型異性体と区別して検出する手段が必要である。しかしながら、Ｄ型とＬ型とは構造上酷似しているため、それらを区別して検出する方法は限られている。これらの方法には、各種キラルカラムクロマトグラフィーなどを使用してＤ型アミノ酸を分離した後に検出する方法が知られている。また、遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的に作用する酵素を遊離Ｄ−アスパラギン酸に反応させて、対応する代謝産物に変換して、その代謝産物を検出することによって間接的に検出する酵素反応に基づく方法などが知られている。
【０００４】
特異的な酵素反応に基づく方法には、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素（Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）を用いる方法がある。この酵素は、ＦＡＤを補酵素とし、遊離Ｄ−アスパラギン酸および遊離Ｄ−グルタミン酸などの酸性Ｄ−アミノ酸の酸化的脱アミノ反応を触媒する酵素である。この酵素は、これらのアミノ酸に作用して、オキサロ酢酸およびα−ケトグルタル酸などのα−ケト酸、過酸化水素、アンモニウムイオンを生じる。この酵素は、多くの真核生物に存在し、高等動物では腎臓、肝臓、及び脳などに発現している。
【０００５】
これまでウシ腎臓のＤ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子、ヒトの脳のＤ−アスパラギン酸酸化遺伝子が既にクローニングされており、その配列情報は公知である。従って、これら公知の遺伝子は、当業者が容易にクローニングし、適切な宿主に導入して発現させることが可能である。しかし、これら公知の遺伝子は、上述のとおりＤ−アスパラギン酸およびＤ−グルタミン酸の遊離型の双方を基質とするので、Ｄ−アスパラギン酸のみを特異的に検出することはできないという問題点を有する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以下に記載される発明を提供することを課題とするものである。即ち、遊離Ｄ−アスパラギン酸を特異的に認識する酵素をコードする遺伝子を提供する。また、該遺伝子を組込んだ発現ベクターを提供する。更に、該ベクターを導入した形質転換体を提供する。なお更に、該遺伝子による組換えタンパク質を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下に手段によって本発明の課題を解決するものである。即ち、
遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１１記載の塩基配列からなるＤＮＡ；または
前記塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
からなる遺伝子を提供する。
【０００８】
また、遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１１記載の塩基配列からなるＤＮＡ；または
前記塩基配列からなるＤＮＡにおいて１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
からなる遺伝子を提供する。
【０００９】
更に、遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１２記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；または
前記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質；をコードする遺伝子を提供する。
【００１０】
更に、遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質の組換え蛋白質であって、
配列番号１２記載のアミノ酸配列からなる組換え蛋白質、または
該配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する組換え蛋白質を提供する。
更に、前記遺伝子を含むベクター、前記ベクターによって形質転換した形質転換体、および前記遺伝子による組換えタンパク質を提供する。
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、これまで構造が明らかとされていなかった酵母クリプトコッカス・ヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＵＪ１株由来の遊離Ｄ−アスパラギン酸特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素をコードする遺伝子をクローニングした。そして、前記遺伝子が座位するゲノムＤＮＡの構造、前記遺伝子のｃＤＮＡにおける構造などの詳細を明らかにした。
【００１２】
以下に本発明の遺伝子と、公知の遺伝子との関係を説明する。
【００１３】
＜公知の遺伝子との比較＞
公知の遺伝子の産物（酵素）は、上述のとおり遊離Ｄ−アスパラギン酸のみならず遊離Ｄ−グルタミン酸に対しても反応するという問題点があった。それ故、公知の遺伝子の産物を利用する遊離Ｄ−アスパラギン酸を特異的に検出するための従来技術は、直接的に遊離Ｄ−アスパラギン酸を検出することはできず、煩雑な操作を必要とする間接的なものであった。
【００１４】
発明者は、上記問題点を克服すべく優れた特性を有するＤ−アスパラギン酸酸化酵素を具備する生物種をスクリーニングした結果、酵母クリプトコッカス・ヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）のＵＪ１株を土壌中から分離した。そして、ＵＪ１株が具備するＤ−アスパラギン酸酸化酵素が、Ｄ−アスパラギン酸に特異的に作用することを見出した。そして更に研究を重ねた結果、前記酵素を発現させ、発現した酵素を精製する方法を確立した。
【００１５】
しかしながら、前記株は生育環境中にＤ−アスパラギン酸が存在する場合のみ前記酵素を発現するため、培地中にＤ−アスパラギン酸を添加して、菌体内で前記酵素の転写発現を条件的に誘導する必要があった。Ｄ−アスパラギン酸は、高価であり培地中に大量に添加した場合にはコストがかかる。また、発現した酵素は更に各種の精製工程をへて精製される必要がある。一般的に、蛋白質の精製には時間がかかり、且つ熟練を要するものであり、更に本酵素の生産コストを増大させている。
【００１６】
これらのコスト面に関する課題は、本酵素をコードする遺伝子をクローニングすることによって解決すると思われる。即ち、適切な異種のプロモータの制御下にクローニングした本酵素の遺伝子を組み込むことによって、Ｄ−アスパラギン酸を必要としない発現系を作成することができる。更に本酵素の組換えタンパク質に精製用のタグを付与するなどの改変を施すことによって、精製の工程を減らし、且つ精製を容易にすることができる。しかしながら、本酵素の遺伝子は公知の遺伝子配列情報を基にした従来の技術によっては容易にクローニングすることができなかった。この理由としては、本酵素の遺伝子は発明者によって土壌中から分離された特殊な分離株であるクリプトコッカス・ヒュミコラスのＵＪ１株がコードする遺伝子であることに起因すると思われる。
【００１７】
即ち、（ａ）酵母類は、哺乳動物との系統類縁関係が低いこと、（ｂ）ＵＪ１株は、遺伝情報がよく知られたパン酵母などとは異なる特殊な分離株であること、（ｃ）系統類縁関係が高い生物種から本酵素活性を有する酵素の遺伝子がクローニングされていないこと、（ｄ）本酵素は、哺乳動物の酵素とは酵素活性の諸特性が顕著に相違していること、などから哺乳類の遺伝子とは配列の相同性が低いことが容易に予想され、恐らくこの相同性の低さ故に、配列の相同性に依拠する従来技術では容易にクローニングできなかったものと推測される。
【００１８】
本発明によってクローニングされた遺伝子と、既に公表されている公知の遺伝子とのｃＤＮＡの配列の相同性解析をＣｌｕｓｔａｌ  Ｘ  １．８１コンピュータープログラム〔Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｔ．  Ｊ．，  Ｐｌｅｗｎｉａｋ，  Ｆ．，  Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ，  Ｆ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．  Ｇ．：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２４，  ｐ．４８７６  （１９９７）〕を用いて行ったところ相同性は実際に低い値であった。例えば、本発明の遺伝子と、ウシ腎臓のＤ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子〔ＧｅｎＢａｎＫ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｘ９５３１０；  Ｓｉｍｏｎｉｃ，Ｔ．，  Ｄｕｇａ，  Ｓ．，  Ｎｅｇｒｉ，  Ａ．，  Ｔｅｄｅｓｃｈｉ，  Ｇ．，  Ｍａｌｃｏｖａｔｉ，  Ｍ．，  Ｔｅｎｃｈｉｎｉ，  Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｒｏｎｃｈｉ，  Ｓ．：  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３２２，  Ｐ．７２９  （１９９７）〕  との相同性は約４３％である。また、同様に本発明の遺伝子と、ヒト脳のＤ−アスパラギン酸酸化遺伝子〔ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｄ８９８５８；  Ｓｅｔｏｙａｍａ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｍｉｕｒａ，  Ｒ．：Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２１，  ｐ．７９８  （１９９７）〕との相同性も約４３％程度である。
【００１９】
更に、本発明の遺伝子と、他の酵母の中性アミノ酸を基質とするＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子との相同性も低いものである（ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の双方の相同性とも低い）。例えば、ｃＤＮＡ配列に関して、本発明の遺伝子と、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）  〔ＧｅｎＢａｎＫ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：  ＣＡＢ４０１７４〕のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子との相同性は約４４％程度、更にロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）〔ＧｅｎＢａｎＫ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：  Ｕ６００６６；  Ｐｏｌｌｅｇｉｏｎｉ，  Ｌ．，  Ｍｏｌｌａ，  Ｇ．，  Ｃａｍｐａｎｅｒ，  Ｓ．，  Ｍａｒｔｅｇａｎｉ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｐｉｌｏｎｅ，  Ｍ．  Ｓ．：  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５８，  ｐ．  １１５  （１９９７）〕のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子との相同性は約４８％程度である。
【００２０】
以上のように本発明の遺伝子は公知の遺伝子配列とは相同性が低いため、公知の配列情報をもとに従来技術を利用しても容易にクローニングできたものではない。従って、本発明は当該技術分野の当業者によって容易に達成できたものではないことは明らかである。
以下に本発明の遺伝子について更に詳細に説明する。
【００２１】
＜本発明の遺伝子＞
本発明の遺伝子は、一般的な適用において、前記ＵＪ１株のＤ−アスパラギン酸酸化酵素をコードするポリヌクレオチド、および該酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドの形態で使用される。より具体的には、前記Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。また、前記Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。また、配列番号１２に示すアミノ酸配列は、配列番号１１に示す塩基配列を翻訳したアミノ酸配列である。アミノ酸をコードするコドンは単一ではなく、縮重により複数のコドンが対応することは周知の事実である。従って、配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドには、配列番号１１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドのみならず、異なるコドンに基づく塩基配列からなるポリヌクレオチドも含まれる。従って、前記Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素をコードするポリヌクレオチドには、複数のポリヌクレオチドが含まれ得る。
【００２２】
前記ホモログは、例えば、遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質の酵素活性を有し、且つ以下の（ａ）〜（ｃ）に定義するポリヌクレオチドのうち少なくとも１つに適合するポリヌクレオチドがコードする酵素蛋白質である。
（ａ）配列番号１１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１１に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【００２３】
上記（ａ）の「ストリンジェントな条件」は、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（例えば、０．５％ＳＤＳ、１００  μｇ／ｍｌ  変性サケ精子核酸、５０％  （ｖ／ｖ）ホルムアミドなどを少なくとも含む）中、４２℃で１２時間加熱することで達成される条件である。このような条件下において、公知のハイブリダイゼーション法に従って実施できるが、例えば、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて５５℃で４時間加熱することによりハイブリダイゼーションすることもできる。
【００２４】
上記（ｂ）および（ｃ）のポリヌクレオチドは、当業者であれば、配列番号１１記載の塩基配列からなるＤＮＡに、部位特異的変異導入法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １０，  ｐ．６４８７  （１９８２），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １００，  ｐ．４４８  （１９８３），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ３ｒｄ  Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）〕などに記載の方法を用いて、置換、欠失、挿入および付加変異を導入することにより得ることが可能である。
【００２５】
更に、前記ホモログは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上のホモロジーを有するタンパク質であってもよい。タンパク質のホモロジー検索は、例えばＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  ＪＡＰＡＮ）を対象に、ＦＡＳＴＡ  プログラムやＢＬＡＳＴ  プログラムなどを用いて行うことができる。
【００２６】
また、遺伝子を規定するものは、その遺伝子が具備する特異的な塩基配列情報であることも周知の事実である。従って、本発明において「遺伝子」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの特定のポリヌクレオチドに限定して解釈されない。従って、本発明において「遺伝子」は、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡの何れのポリヌクレオチドであってもよく、１本鎖もしくは２本鎖の何れの状態であってもよく、および各種の標識、タグ、ヌクレオチド誘導体などの人為的な物質を含むポリヌクレオチドなどであってもよい。
以下、特に他に説明しない限り、本発明の遺伝子をコードする様々なポリヌクレオチドを、総括的に「本発明のポリヌクレオチド」と呼称する。当業者であれば、以下の記載中において「本発明のポリヌクレオチド」がどのような形態をとりうるものであるかを判断できる。
【００２７】
［本発明のポリヌクレオチドの単離］
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。
《ライブラリーの作成》
Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素の産生能を有する酵母のゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、配列番号８もしくは配列番号１１に示す塩基配列から適切に選択された塩基配列を含むＤＮＡをプローブとしてスクリーニングすることにより、本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。配列番号８および配列番号１１に示す塩基配列は、酵母クリプトコッカス・ヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）  ＵＪ１株に由来するものなので、この菌株から調製したライブラリーを用いて本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。前記ＵＪ１株は、理化学研究所の生物基盤研究部  微生物系統保存施設にＪＣＭ  アクセッション番号  ［９５７５］で寄託されており、この施設から入手することが可能である。また近縁の酵母や、あるいは他種の酵母に由来するライブラリーを利用することによって、前記ホモログを単離することもできる。
【００２８】
酵母のゲノムライブラリーは、公知の方法によって得ることができる。例えば、まず酵母の培養物を集めて、酵母を物理的に、あるいは酵素的に破壊する。具体的には、たとえば菌体の凍結等により細胞壁を破壊することができる。更に核分画を集めて、フェノール／クロロホルム等で核酸を抽出し、制限酵素等でランダムに切断する。ランダムに切断されたゲノムの断片を、適切なクローニングベクターに挿入すればゲノムライブラリーを得ることができる。
【００２９】
一方、ｃＤＮＡライブラリーは、以下のようにして得ることができる。例えば、凍結菌体から、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、プロトコルに従ってｍＲＮＡを抽出し、それを精製する。得られたｍＲＮＡを鋳型として、Ｇｕｂｌｅｒ  および  Ｈｏｆｆｍａｎらの方法〔Ｇｅｎｅ，  ２５，  ｐ．２６３  （１９８３）〕などに基づいて、ｃＤＮＡライブラリーを合成する。すなわちＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーと、逆転写酵素とを用いて各ｍＲＮＡから、それぞれに対応するｃＤＮＡが合成される。これを適切なプラスミドやファージベクターに挿入することにより、ｃＤＮＡライブラリーを作出することができる。
【００３０】
《ハイブリダイゼーションによるクローニング》
これらのライブラリーに対して、好ましくは先に述べたようなストリンジェントな条件下でプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズに関して陽性の反応を呈したクローン（ポジティブクローン）を集めて、そのクローンが具備する塩基配列を確認することにより、本発明のポリヌクレオチドを具備していることが確認される。
【００３１】
前記クローンから単離されたポリヌクレオチドが、タンパク質翻訳領域の全長を含まない場合には、下記のように全長を含む本発明のポリヌクレオチドを取得できる。即ち、得られた全長を含まない配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適切な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＰＣＲ）を行うことにより〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １２０，  ｐ．６２１  （１９８８）〕、また、ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄ、「ＰＣＲ実験マニュアル」ｐ２５−３３，ＨＢＪ出版局）などにより取得することができる。
【００３２】
《ＰＣＲクローニング》
さらに、配列番号８または配列番号１１に示す塩基配列に基づいて設定されたプライマーを用い、ＰＣＲ法を利用して本発明のポリヌクレオチドを得ることもできる。すなわち、先に述べたゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を行い、目的とする長さの断片を回収する。これを適切なクローニングベクターに挿入してクローニングすることにより、本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。プライマーとして縮重プライマーを用いることによって、配列番号８や配列番号１１のみならず、これらの塩基配列と相同性の高いホモログをクローニングすることもできる。与えられた塩基配列に基づいて、その配列を有するポリヌクレオチドを増幅することができるプライマー、並びにその配列に相同性のあるホモログをコードするポリヌクレオチドを増幅することができる縮重プライマーを設計することは、当業者が日常的に行っていることである。なお本発明のポリヌクレオチドは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡとして取得する以外にも、例えば、化学合成によって得ることもできる。
【００３３】
＜本発明のベクターおよび形質転換体＞
このようにして単離されたＤ−アスパラギン酸酸化酵素をコードする本発明のポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素の発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養し、適切に発現誘導し、そして精製することにより、本発明の組換えタンパク質を得ることができる。
【００３４】
［形質転換の対象］
本発明において形質転換の対象となる生物は、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、結果としてＤ−アスパラギン酸酸化酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限されない。当業者であれば、適切な生物とベクターの組み合わせを選択することができる。
例えば、利用可能な微生物としては、以下のような微生物を使用することができる。即ち、
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌、
また、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、
更に、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、
なお更に、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などである。
【００３５】
［ベクターの作出］
形質転換体の作製方法および宿主に適合した組み換えベクターの構築方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている方法に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。例えば、微生物中で本発明の遺伝子を発現させるためには、まずその微生物中において安定に存在し得るプラスミドベクターやファージベクター中に本発明のポリヌクレオチドを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、好ましくはターミネーターを３’−側下流に、それぞれ組み込めばよい。
【００３６】
プロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関しては「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．，  ４３，  ｐ．７５  （１９９０）、Ｙｅａｓｔ，  ８，  ｐ．４２３  （１９９２）などに詳細に記述されている。
【００３７】
《好適なベクターの構成》
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−の例を以下に記載する。
エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）においては、以下のものを使用することができる。即ち、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドなどを利用でき、プロモーターとしてｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが利用でき、および、ターミネーターとして、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを利用することができる。
【００３８】
バチルス属においては、以下のものを使用することができる。即ち、ベクターとしてｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーターおよびターミネーターとして、ａｐｒ（アルカリプロテアーゼ）、ｎｐｒ（中性プロテアーゼ）、ａｍｙ（α−アミラーゼ）のプロモーターおよびターミネーターなどを利用できる。
【００３９】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０などが利用可能である。プロモーターおよびターミネーターとして、リパーゼ（特開平５−２８４９７３）遺伝子の由来のプロモーターおよびターミネーターなどが利用できる。
【００４０】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、以下のものを使用することができる。即ち、ｐＡＪ４３〔Ｇｅｎｅ，  ３９，  ｐ．２８１  （１９８５）〕などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターおよびターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーターおよびターミネーターが、この属においても同様に利用可能である。
【００４１】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＢ１０１〔Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １９６，  ｐ．１７５  （１９８４）〕などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００４２】
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属においては、以下のものを使用することができる。即ち、ｐＨＶ１３０１（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  ２６，  ｐ．２３９  （１９８５）〕、ｐＧＫ１（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５０，  ｐ．９４  （１９８５）〕などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００４３】
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属においては、以下のものを使用することができる。即ち、ストレプトコッカス属用に開発されたｐＡＭβ１（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １３７，  ｐ．６１４  （１９７９）〕などが利用可能であり、プロモーターとしては、大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００４４】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）から単離されたプラスミドベクターが使用可能である〔Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １３８，  ｐ．１００３  （１９９２）〕。
【００４５】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属においては、ＨｏｐｗｏｏｄらのＧｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （１９８５）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）においては、ｐＩＪ４８６〔Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２０３，  ｐ．４６８  （１９８６）〕、  ｐＫＣ１０６４〔Ｇｅｎｅ，  １０３，  ｐ．９７  （１９９１）〕、  ｐＵＷＬ−ＫＳ  〔Ｇｅｎｅ，  １６５，  ｐ．１４９  （１９９５）〕が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）においても、同様のプラスミドを使用することができる〔Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｌ．，  １１，  ｐ．４６  （１９９７）〕。
【００４６】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが利用可能である。また、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（ＥＰ  ５３７４５６など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ＡＤＨ（アルコール脱水素酵素）、  ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、  ＰＨＯ（酸性フォスファターゼ）、  ＧＡＬ（β−ガラクトシダーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、  ＥＮＯ（エノラーゼ）などに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４７】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）においては、以下のものを使用することができる。即ち、サッカロマイセス・セレビジアエ由来２μｍ系プラスミド、  ｐＫＤ１系プラスミド〔Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １４５，  ｐ．３８２  （１９８１）〕、キラー活性に関与するｐＧＫｌ１由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子ＫＡＲＳ系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（ＥＰ  ５３７４５６など）などが利用可能である。また、ＡＤＨ、ＰＧＫ遺伝子などに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４８】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、以下のものを使用することができる。即ち、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＲＳ  （自律複製に関与する遺伝子）及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である〔Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ６，  ｐ．８０  （１９８６）〕。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＤＨプロモーターなどが利用できる〔ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６，  ｐ．７２９  （１９８７）〕。特に、ｐＡＵＲ２２４は宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００４９】
チゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）においては、以下のものを使用することができる。即ち、チゴサッカロマイセス・ロウキシ  （Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）由来のｐＳＢ３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３，  ｐ．４２６７  （１９８５）〕などに由来するプラスミドベクターが利用可能である。また、サッカロマイセス・セレビジアエ由来ＰＨＯ５プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来ＧＡＰ−Ｚｒ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）のプロモーター〔Ａｇｒｉ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５４，  ｐ．２５２１  （１９９０）〕などが利用可能である。
【００５０】
ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属においては、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ハンゼヌラ・ポリモルファ由来自律複製に関与する遺伝子（ＨＡＲＳ１、ＨＡＲＳ２）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である〔Ｙｅａｓｔ，  ７，  ｐ．４３１  （１９９１）〕。また、メタノールなどで誘導されるＡＯＸ（アルコールオキシダーゼ）、ＦＤＨ（ギ酸脱水素酵素）のプロモーターなどが利用可能である。
【００５１】
ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属においては、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子（ＰＡＲＳ１、ＰＡＲＳ２）などを利用した宿主ベクター系が開発されており〔Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５，  ｐ．３３７６  （１９８５）〕、高濃度培養とメタノールで誘導可能なＡＯＸなど強いプロモーターが利用できる〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １５，  ｐ．３８５９  （１９８７）〕。
【００５２】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ウチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ〔Ａｇｒｉ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５１，  ｐ．１５８７  （１９８７）〕、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平０８−１７３１７０）。
【００５３】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されている。これらの種において、プラスミドや染色体ＤＮＡに異種遺伝子をインテグレーションすることが可能である。また、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である〔Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７，  ｐ．２８３  （１９８９）〕。
【００５４】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７，  ｐ．５９６  （１９８９  ）〕。
【００５５】
更に、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、こららの宿主・ベクター系を利用して本発明の遺伝子を発現させることもできる。特に蚕を用いた昆虫〔Ｎａｔｕｒｅ，  ３１５，  ｐ．５９２  （１９８５）〕、および菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物を利用して大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、これらの系を好適に利用できる。
【００５６】
［形質転換方法］
本明細書に記載のとおりに作出されたベクターおよび形質転換する対象である宿主生物に応じて適切な方法によって形質転換すればよい。例えば、電気穿孔法は、各種の生物種において汎用される方法であり、適切な条件は適用する対象毎に公知の条件を使用すればよい。また、アルカリカチオン法、スフェロプラスト法、パーティクルガン法、リポフェクション法やリン酸カルシウム法などの宿主に応じた適切な方法によって形質転換することができる。
【００５７】
［形質転換体の調製］
本発明の形質転換体は、その宿主生物に適した公知の方法で生育、栽培、および培養される。例えば、宿主生物が微生物である場合について以下に培養条件を説明する。
《宿主微生物の培地》
培地としては、炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であり、液体培地または固体培地を使用することができる。具体的には、
炭素源として、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類、麦、とうもろこしなどの天然炭水化物、グリセロール、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパラフィンなどの炭化水素類、グリシン、グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸類等の一般的な炭素源より使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
【００５８】
また、窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素などの無機窒素化合物より使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
【００５９】
更に、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。
【００６０】
また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。培養は前記培地成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、該菌株が増殖し、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素を産生できる条件であれば特に制限はない。通常は、培養開始時のｐＨを４から１０、好ましくは６から８に調節し、１５から５０℃、好ましくは２５から３５℃の温度条件下で培養することが望ましい。
【００６１】
［遺伝子の発現誘導］
本発明の形質転換体を、その形質転換体に適した公知の方法で処理して導入した遺伝子を発現誘導させる。先に酵母クリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株によるＤ−アスパラギン酸酸化酵素の生産にはＤ−アスパラギン酸を唯一の窒素源として用いなければならないことは既に述べた。これに対して、異種のプロモータの制御下に本発明の遺伝子を組み込んだ遺伝子組み換え体を用いた場合には、この遺伝子の発現にＤ−アスパラギン酸を必要としない。
【００６２】
例えば、宿主生物が微生物である場合について以下に発現誘導条件を説明する。
即ち、十分に菌体が増殖した後に、または増殖過程の途中に、形質転換体内に導入された外来遺伝子の発現を誘導する条件を与える。例えば、ｌａｃプロモーターに対しては、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を与えることにより、その下流に連結されている外来遺伝子の発現が誘導される。温度感受性プロモーターであれば、発現に必要な温度条件で培養を行う。
培養時間は、十分量のＤ−アスパラギン酸酸化酵素活性を有する菌体が得られれば特に制限はなく、通常は１日から１４日、このましくは１日から３日培養する。
【００６３】
［酵素タンパク質の精製］
形質転換体内で生産蓄積された本発明の組換えタンパク質であるＤ−アスパラギン酸酸化酵素タンパク質は、周知のタンパク質の精製方法に従って精製すればよい。
【００６４】
《抽出操作》
例えば、次のような方法によって、前記酵素タンパク質を抽出することができる。即ち、
本発明の遺伝子を発現誘導した形質転換体の細胞を、宿主生物に適切な方法で分離する。次に、その細胞をろ過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液、生理食塩水等で洗浄する。次に、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理手段、またはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理のような生化学的処理、または界面活性剤との接触処理などの化学的処理を、単独もしくは組み合わせて行うことにより細胞を破砕し、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素タンパク質を適切な緩衝液中に抽出して粗精製物を作出することができる。
【００６５】
また、本発明の組換えタンパク質が、形質転換した細胞の外へ排出される場合には、その培養液を前記粗精製物と同様に以下の操作により精製すればよい。更に、本発明の組換えタンパク質が、公知のインビトロ・トランスレーション法により無細胞系において発現される場合にも、翻訳処理が終了した反応液を前記粗精製物と同様に以下の操作により精製すればよい。更に、前記粗精製物などの本発明の組換えタンパク質を含有する溶液は、目的によってはそのまま使用してもよい。
【００６６】
《精製操作》
前記粗精製物は、以下に説明する方法を単独もしくは組み合わせて使用することによって精製できる。前記方法としては、例えば塩析、有機溶媒などによる分別沈殿；また、塩析クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーを、オープンカラム、中圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行うクロマトグラフィー；更に、等電点電気泳動、ｎａｔｉｖｅ電気泳動などの電気泳動法；などが存在する。
【００６７】
より具体的には、例えば、以下に説明する方法によって本発明の組換えタンパク質を精製することができる。即ち、
本発明の遺伝子を発現誘導させた形質転換体の細胞を、ろ過もしくは遠心分離によって集める。この細胞を、緩衝液に懸濁し、次に超音波破砕機を用いて破砕処理してＤ−アスパラギン酸酸化酵素タンパク質を含有する抽出液を得る。その後、硫安を用いた塩析処理、Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ疎水クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過クロマトグラフィーを２回行い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単一のバンドに精製することができる。
【００６８】
＜酵素タンパク質の特性＞
配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素は、下記の（ａ）から（ｈ）の理化学的性質を有する。
【００６９】
（ａ）作  用：  遊離Ｄ−アスパラギン酸に作用して、オキサロ酢酸、過酸化水素、アンモニウムイオンを生じる。
（ｂ）補酵素：  本酵素活性に補酵素としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を要求する。ＦＡＤの解離定数（Ｋｄ）は８．２×１０−１２  Ｍ程度である。
（ｃ）分子量：  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子質量が約４０  ｋＤａである。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  Ｈｉ−Ｌｏａｄ  １．６／６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した分子質量が１６０〜１７０  ｋＤａ付近を示す。また、ＦＡＤを含まないアポ体は上記ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子質量が約４０  ｋＤａである。
【００７０】
（ｄ）基質特異性：  Ｄ−アスパラギン酸に対して最も高い活性を有する。Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）にも作用を示す。Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アスパラギンに対してはわずかにしか活性を示さない。一方、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、およびＤ−アルギニンには全く活性を示さない。
（ｅ）温度安定性：  ｐＨ７．５で１０分間熱処理した場合、４５℃までは比較的安定であり、５０℃以上では失活する。
（ｆ）至適温度：  ｐＨ７．５で反応させる場合、温度３３℃から３７℃において作用が至適である。
【００７１】
（ｇ）安定化剤：  ０．５  ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン存在下において、その活性が安定に保持されるが、１０％（ｖ／ｖ）グリセリン溶液中では安定に保持されない。
（ｈ）阻害剤  ：  マロン酸が最も強く阻害し、次いでＤ−リンゴ酸が強く阻害する。また、ｍｅｓｏ−酒石酸、マレイン酸はわずかに阻害する。なおＤＬ−酒石酸、フマル酸、シュウ酸、コハク酸、グルタル酸、クエン酸、ｎ−酪酸、安息香酸、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ではほとんど阻害されない。
【００７２】
本発明によるＤ−アスパラギン酸酸化酵素の基質特異性は、次のようにして確認することができる。例えば、５０  μｌの酵素液と２０  ｍＭの基質（各種Ｄ−もしくはＬ−アミノ酸）を含む５０  ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ  ７．５）緩衝液（全量１．０  ｍｌ）中で、３７℃、１０分間で反応させる。この反応によって生成する様々なα−ケト酸の量を２，  ４−ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）と反応させ、生じたヒドラゾンの光吸収を分光光度計で（４４５  ｎｍ）で測定することにより、各基質に対する酵素活性を比較することができる。
【００７３】
酵素活性の比較のためには、Ｄ−もしくはＬ−アミノ酸を基質とし、３７℃において１分間に１  μｍｏｌのα−ケト酸を生成する酵素量を１単位（ユニットもしくはＵ）として、酵素間、あるいは基質間の反応性を比較することができる。このような解析結果によれば、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素は、以下のような基質特異性を有する。
【００７４】
遊離Ｄ−アスパラギン酸に対する活性を１００％とした場合、ＮＭＤＡに対しては９．４％、  Ｄ−アスパラギンに対しては０．７％、  Ｄ−グルタミン酸に対しては０．４％の活性を示す。一方、Ｌ−アスパラギン酸、  Ｌ−グルタミン酸、  Ｄ−アラニン、  Ｄ−グルタミン、  Ｄ−バリン、  Ｄ−ロイシン、  Ｄ−フェニルアラニン、  Ｄ−プロリン、  Ｄ−セリン、  Ｄ−スレオニン、およびＤ−アルギニンには全く活性を示さない。本発明において全く活性を示さないとは、上記反応条件で検出し得るα−ケト酸が生成されないことを意味する。
【００７５】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００７６】
また、以下の実施例において市販の試薬あるいはキットを用いている場合は、それらに添付の指示書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）や添付の試薬などを使用している。また、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。
【００７７】
［実施例１］
＜遺伝子クローニング＞
本実施例は、酵母クリプトコッカス・ヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＵＪ１株からの本発明の遺伝子のクローニングについて記載する。
《ゲノムＤＮＡの調製》
酵母クリプトコッカス  ヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＵＪ１株を、２５  ｍｌの試験管に入った５  ｍｌ  ＹＭ液体培地〔０．３％  酵母エキス（ナカライテスク）、０．３％  麦芽エキス（ナカライテスク）、０．５％  ミクニペプトン（ミクニ化学産業）、１％  グルコース（ナカライテスク）、ｐＨ７．０〕に稙菌し、３０℃、２４時間、１４０  ｒｐｍで振盪培養し、これを前培養液とした。５００  ｍｌの坂口フラスコに入った２００  ｍｌのＹＭ液体培地に前培養液を１  ｍｌ稙菌し、３０℃で１６時間、１４０  ｒｐｍで振盪培養した。菌体を遠心分離（５，５００×ｇ、２０分間、４℃）により集菌し、氷冷生理食塩水で洗浄を行った。洗浄後の菌体５  ｇをＳＰ緩衝液（１  Ｍソルビトール、４０  ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で洗浄し、ＳＰ緩衝液１０  ｍｌに懸濁した。
【００７８】
この細胞懸濁液にＬＹＳＩＮＧ  ＥＮＺＹＭＥＳ  Ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ（Ｓｉｇｍａ）１００  ｍｇと２−メルカプトエタノール（ナカライテスク）１０μｌを加えた後、３０℃で１時間保温した。１時間後、ＬＹＳＩＮＧ  ＥＮＺＹＭＥＳ  Ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ（Ｓｉｇｍａ）をさらに５０  ｍｇ添加し、さらに３０℃で１時間保温した。この処理によってスフェロプラスト化した菌体を遠心分離（３，０００×ｇ、２０分間、４℃）により集菌し、ＳＥＰ緩衝液（１．０  Ｍ  ソルビトール、０．５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５  ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２）で２回洗浄した。洗浄後の菌体を、ＴＥ緩衝液１６  ｍｌに懸濁したのち、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を８  ｍｌ添加し、６０℃で３０分間保温した。
【００７９】
保温後、この溶液に、２０  ｍｌのフェノール／クロロホルム混合液と２  ｍｌの５  Ｍ  酢酸カリウム溶液とを加え撹拌したのち、氷上で３０分間静置した。次に、この溶液を遠心分離（５，５００×ｇ、２０分間、４℃）し、上清を回収したのち、その上清に２倍量のエタノールを加えＤＮＡを沈殿させた。次に、この溶液を遠心分離（５，５００×ｇ、２０分間、４℃）し、沈殿したＤＮＡを回収した。このＤＮＡ  をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＴＥ緩衝液と称す）２０  ｍｌに溶解した。その溶解液にＲＮａｓｅＡ溶液（１０  ｍｇ／ｍｌ）（ナカライテスク）を５  μｌ加え、３７℃で１時間保温した後、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液（１０  ｍｇ／ｍｌ）（ナカライテスク）を１００  μｌ添加し、３７℃で１時間保温した。その後、この溶液に２０％ポリエチレングリコール６０００（ナカライテスク）／２．５  Ｍ  ＮａＣｌ溶液１２  ｍｌを添加し、一晩４℃で静置したのち、遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分間、４℃）によりＤＮＡを沈殿させた。そして、この沈殿したＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解し、フェノール／クロロホルム処理を２〜３回行ったのち、遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分間、４℃）により上清を回収した。この回収した上清中のＤＮＡをエタノール沈殿により回収し、ＴＥ緩衝液に溶解させて使用時まで４℃で保存した。
【００８０】
《ゲノムＤＮＡライブラリーの作成》
上記の「ゲノムＤＮＡの調製」において調製した染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（ＴａＫａＲａ）で部分消化し、９〜２３  ｋｂｐの染色体ＤＮＡ断片をショ糖密度勾配遠心法により精製・単離した。この単離したＤＮＡ断片の脱リン酸化処理をＣａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅアルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行ったのち、λＤＡＳＨＩＩ／ＢａｍＨＩ  ベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に、ＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて組込んだ。パッケージングはＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｐｌｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。
【００８１】
《ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成》
クリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株を、７０  ｍｌ試験管に入った１０  ｍｌ  ＹＰＤ液体培地〔１％酵母エキス（ナカライテスク）、２％カゼインペプトン（ナカライテスク）、２％グルコース（ナカライテスク）〕に稙菌し、３０℃、２９時間、１６０  ｒｐｍで振盪培養した。この培養した菌体を遠心分離（１０，０００×ｇ、１分間、４℃）により集菌したのち、氷冷滅菌水で２度洗浄し、５００  ｍｌの坂口フラスコに入った１００  ｍｌのＹＣＢＤ液体培地〔１％  Ｄ−アスパラギン酸（田辺製薬）、１．１７％  ｙｅａｓｔ  ｃａｒｂｏｎ  ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ）、ｐＨ７．０〕にＯＤ６００が０．０５になるよう稙菌し、３０℃、１１．５時間、１６０  ｒｐｍで振盪培養した。この培養した菌体を遠心分離（５，０００×ｇ、５分間、４℃）により集菌し、氷冷水で洗浄を行った。
【００８２】
調製した菌体からの全ＲＮＡの抽出は、Ｂｒａｗｎらの方法〔Ｂｒｏｗｎ，  Ａ．  Ｊ．  Ｐ．：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ５３，  ｐ．２６９  （１９９６）〕に従い行った。全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて単離した。Ｇｕｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎらの方法〔Ｇｅｎｅ，  ２５，  ｐ．２６３  （１９８３）〕に基づいたｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （ＴａＫａＲａ）を用いて、上記で調製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として２本鎖ＤＮＡを合成し、ＴａＫａＲａ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いてｃＤＮＡを増幅した。
【００８３】
《遺伝子の一部をコードするＤＮＡ断片の取得》
クリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株から精製したＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）と内部アミノ酸配列（配列番号２）をもとに２種の縮重プライマー（日清紡）を合成した。これらの縮重プライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号３（ＮＤＤＯｐ１）および配列番号４（ＮＡＤＤＯｐ１）に示す。上記「ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成」で調製したｃＤＮＡを鋳型として使用し、ＰＣＲにより本酵素をコードする部分遺伝子断片を得た。ＰＣＲの条件は以下の通りである。即ち、ＮＤＤＯｐ１プライマーを５０  ｐｍｏｌ、ＮＡＤＤＯｐ１プライマーを５０  ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  （ＴａＫａＲａ）を２０  ｎｍｏｌ、ｃＤＮＡ溶液２  μｌ、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を２．５  Ｕ、１０×ＥＸＴａｑ  バッファー（ＴａＫａＲａ）を１０  μｌを含む１００  μｌの反応液を用いて、変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、３０秒）、伸長（７２℃、１分）からなるサイクルを３５サイクル、ＰＴＣ−１００  Ｐｒｏｇｒａｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅｒｃｈ）を用いて繰り返すことによりＰＣＲを行った。この反応後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出された。
【００８４】
《ＰＣＲ産物の塩基配列解析》
上記「遺伝子の一部をコードするＤＮＡ断片の取得」において得られたＤＮＡ断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。次に回収したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、目的とするＤＮＡ断片を含むバンド部分を切り出し、ゲル中のＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。次に精製したＤＮＡ断片をＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いてｐＴ７ＢｌｕｅＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。そして、このＤＮＡ断片の塩基配列を解析するために前記ｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターから前記ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ）とＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ）で切り出し、上述した方法でアガロースゲルより抽出・精製し、ＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイト間にクローニングし、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’に導入した。
【００８５】
塩基配列解析は、ＶＣＳＭ１３  ヘルパーファージ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ３ｒｄ  Ｅｄｔ．  （２００１）〕に従って調製した一本鎖ＤＮＡを用いて行った。調製した一本鎖ＤＮＡ  ０．６５  μｇを鋳型とし、配列番号５に示した塩基配列を含むＣｙ５標識化Ｔ７プロモータープライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）をプライマーとした、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたジデオキシチェーンターミネイター法により反応させた。この反応による生成物をＤＮＡシーケンサーＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて解析し、塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号６に示す。
【００８６】
決定したＤＮＡ塩基配列をコンピュータ解析したところ、５’末端および３’末端に使用したプライマー配列に一致する配列がみられ、プライマー特異的に増幅されたＤＮＡであることが確認できた。更に、前記塩基配列と、前記塩基配列から推定される推定アミノ酸配列（配列番号７）とをＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  ＪＡＰＡＮ）を対象に、ＢＬＡＳＴ  プログラムを用いて相同検索した。その結果、塩基配列に対しては有意な相同性を示す配列はなかったが、前記推定アミノ酸配列に対しては相同性を示す配列が存在した。即ち、前記推定アミノ酸配列は、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）およびロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）のＤ−アミノ酸酸化酵素と約２８％の相同性を示した。ＤＮＡ塩基配列及び推定アミノ酸配列のコンピュータ解析はＧＥＮＥＴＩＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４（ソフトウェア開発）を用いて行った。
【００８７】
《ゲノムＤＮＡライブラリーからの遺伝子全長の単離》
この処理工程により上記「ゲノムＤＮＡライブラリーの作成」において作成したクリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株のゲノムＤＮＡライブラリーから、本発明の遺伝子の全長をコードする領域が座位するゲノムＤＮＡを有するクローンを取得する。
【００８８】
上記「ＰＣＲ産物の塩基配列解析」において取得されたＤＮＡ断片をベクターより切り出し、上記「ＰＣＲ産物の塩基配列解析」に記した方法でアガロースゲルより抽出・精製した。この抽出・精製したＤＮＡ断片を、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてアルカリホスファターゼで標識化し、ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。
【００８９】
ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた２００００個のプラークのスクリーニングにより、４個の陽性クローンを単離した。そのクローン中の１個の陽性プラークを純化し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ（Ｐ２）に感染させてファージを増やした後に、ファージ粒子を精製し、ファージＤＮＡを得た。調製したファージＤＮＡから、全長Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子を有すると推測されたＳａｌＩ（ＴａＫａＲａ）消化により生じる約１．８  ｋｂｐのＤＮＡ断片をファージＤＮＡから切り出し、上述のようにアガロースゲルを用いて精製した。この精製したＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ  （＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクターのＳａｌＩサイトにサブクローニングした。
【００９０】
このベクターにより形質転換し、クローン化した大腸菌から、プラスミドＤＮＡを常法〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．  Ｗ．：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ３ｒｄ  Ｅｄｔ．  （２００１）〕に従って調製した。調製したプラスミドＤＮＡは、ＴａＫａＲａ  Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて様々な欠失体を作成した。上記「ＰＣＲ産物の塩基配列解析」で使用した方法と同様な方法を用いて、両鎖について全塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号８に示す。この塩基配列のＧＥＮＥＴＩＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４（ソフトウェア開発）を用いたコンピューター解析により、クローニングしたＤＮＡに５’および３’非翻訳領域を含むＤ−アスパラギン酸酸化酵素の全長をコードする遺伝子が含まれていることが確認できた。また、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子中にイントロンの存在が示唆された。
【００９１】
《遺伝子の全長をコードするｃＤＮＡの単離》
上記「ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成」に記載した方法と同様な方法を用いてクリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株から全ＲＮＡを調製した。この全ＲＮＡ  ２４μｇを鋳型とし、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。そして、クローニングした本遺伝子が座位する領域のゲノムＤＮＡの塩基配列情報をもとに、ＯＲＦの５’上流および３’下流とそれぞれハイブリダイズする２種類のプライマーＤＤＯ５ｐ１（配列番号９）およびＤＤＯ３ｐ１（配列番号１０）を設計した。これらのプライマーと、調製したｃＤＮＡとを用いたＰＣＲによりＤ−アスパラギン酸酸化酵素の全長をコードするｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲの条件は、以下の通りである。即ち、ＤＤＯ５ｐ１プライマーを１５  ｐｍｏｌ、ＤＤＯ３ｐ１プライマーを１５  ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）を１５  ｎｍｏｌ、ｃＤＮＡ溶液２  μｌ、Ｐｌｕｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１．２５  Ｕ、１０×Ｐｆｘ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５  μｌ、１０×ＰＣＲｘ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５  μｌ、  ＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０  ｎｍｏｌ含む５０  μｌの反応液を用いて、変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５８℃、３０秒）、伸長（６８℃、１分）からなるサイクルを３５サイクル、ＰＴＣ−１００  Ｐｒｏｇｒａｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅｒｃｈ）を用いて繰り返すことによりＰＣＲ行った。
【００９２】
ＰＣＲ反応後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。ＰＣＲ反応により得られた前記ｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収し、ＳａｌＩ（ＴａＫａＲａ）で切断した後、アガロースゲル電気泳動を行った。そして、目的とするバンド部分を切り出し、ゲル中に存在するｃＤＮＡをＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した後、ＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳａｌＩサイトにクローニングした。この構築したプラスミドをｐＫＳＣＤ２と名付けた。そして、クローニングしたｃＤＮＡの全長塩基配列を解析するために上記「ゲノムＤＮＡライブラリーからの遺伝子全長の単離」中に記した同様な方法で様々な欠失体を作成し、上記「ＰＣＲ産物の塩基配列解析」中に記した同様な方法で一本鎖ＤＮＡを調製した後、その全塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１１に示す。
【００９３】
塩基配列解析の結果、クローニングしたｃＤＮＡの配列中には、本遺伝子のゲノムＤＮＡ配列と一致する配列が確認でき、開始コドンおよび終始コドンも確認できた。また、ゲノムＤＮＡ配列中にみられたイントロンは確認されなかった。また、このｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。このアミノ酸配列中には、クリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株から精製したＤ−アスパラギン酸酸化酵素のＮ末端配列（配列番号１）と内部アミノ酸配列（配列番号２）が確認でき、Ｄ−アミノ酸酸化酵素間で保存性の高いアミノ酸残基も確認できた。これらの結果から、クローニングしたｃＤＮＡがクリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株のＤ−アスパラギン酸酸化酵素の全長をコードするｃＤＮＡであることが確認できた。これらの解析はＧＥＮＥＴＩＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４（ソフトウェア開発社）を用いて行った。
【００９４】
［実施例２］
＜ベクターおよび形質転換体の作成＞
本実施例は、本発明の遺伝子を組み込んだベクター、該ベクターを導入した形質転換体について記載する。
《大腸菌における遺伝子発現ベクターの構築》
実施例１の「遺伝子の全長をコードするｃＤＮＡの単離」で得られた遺伝子を大腸菌で発現させるため、まず「遺伝子の全長をコードするｃＤＮＡの単離」で構築したｐＫＳＣＤ２を鋳型として、ＯＲＦの５’末端部分にハイブリダイズするプライマーＣＤ１ｐ（配列番号１３）と３’末端部分にハイブリダイズするプライマーＣＤ２ｐ（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行い、全長遺伝子を増幅した。ＰＣＲの条件は、以下の通りである。即ち、ＣＤ１ｐプライマーを１５  ｐｍｏｌ、ＣＤ２ｐプライマーを１５  ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）を１５  ｎｍｏｌ、ｐＫＳＣＤ２を２０  ｎｇ、Ｐｌｕｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１．２５  Ｕ、１０×Ｐｆｘ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５  μｌ、１０×ＰＣＲｘ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５  μｌ、ＭｇＳＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０  ｎｍｏｌ含む５０  μｌの反応液を用いて、変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５８℃、３０秒）、伸長（６８℃、１分）からなるサイクルを３０サイクル、ＰＴＣ−１００  Ｐｒｏｇｒａｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅｒｃｈ）を用いて繰り返すことによりＰＣＲを行った。
【００９５】
ＰＣＲ反応後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、目的のＤＮＡバンドが確認できた。得られたＤＮＡ断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収し、ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）とＢａｍＨＩ（ＴａＫａＲａ）で切断した後、アガロースゲル電気泳動を行った。そして、ゲル中の目的とするバンド部分を切り出し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した後、ＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて大腸菌発現用プラスミドであるｐＥＴ１１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイト間にクローニングした。この発現プラスミドをｐＥＣＤ５と名付けた。次に、以下の処理を行って、このｐＥＣＤ５にクローニングされたＤ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子にＰＣＲ反応中に変異が生じていないことを確認する。
【００９６】
まず、ｐＥＣＤ５のＤ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子をＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ）とＢａｍＨＩ（ＴａＫａＲａ）で切り出し、アガロースゲル電気泳動を行った。そして、ゲル中の目的のバンドを切り出し、このバンド中に存在するＤＮＡをＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した後、ＴａＫａＲａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）のＸｂａＩとＢａｍＨＩサイト間にクローニングした。上記「ＰＣＲ産物の塩基配列解析」に記した方法と同様な方法を用いて、このＤＮＡの塩基配列を解析した。解析の結果、ｐＥＣＤ５のＤ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子上に変異がないことが確認された。
【００９７】
《形質転換体を用いた遺伝子発現》
発現プラスミドｐＥＣＤ５をＩｎｏｕｅらの方法〔Ｉｎｏｕｅ，  Ｈ．，  Ｎｏｊｉｍａ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，  Ｈ．：  Ｇｅｎｅ，９６，ｐ．２３  （１９９０）〕に従って発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入し、形質転換体を得た。先ず得られた大腸菌形質転換体を、２５  ｍｌ試験管中のアンピシリン（１００  μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地〔１％  トリプトン（ナカライテスク）、０．５％  酵母エキス（ナカライテスク）、１％  塩化ナトリウム（ナカライテスク）〕５  ｍｌに稙菌し、３０℃で一晩１６７  ｒｐｍで振盪培養し、これを前培養とした。５００  ｍｌの三角フラスコに１００  ｍｌの上記培地を入れて前培養した菌液を５００  μｌ稙菌し、ＯＤ６００が約０．５となるまで、３０℃、２００  ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００が約０．５に到達した時に、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ナカライテスク、以下、ＩＰＴＧと称す）を終濃度１  ｍＭになるように添加し、さらに６時間、３０℃、２００  ｒｐｍで培養を行った。培養終了後、遠心分離（５，０００×ｇ、１０分、４℃）により集菌し、氷冷した１  ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０  ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で菌体を洗浄後、同緩衝液１０  ｍｌに懸濁した。そして、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ  ＵＤ−２０１（ＴＯＭＹ）を用いて氷上で超音波破砕処理（Ｏｕｔｐｕｔ  ５、  Ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ  ５０％、３０秒を１５回）により菌体を破砕した後、遠心分離（２０，０００×ｇ、３０分、４℃）し上清を回収した。この上清を無細胞抽出液として以下の実験に使用した。一方、陰性コントロールとして以下の大腸菌、即ち、ＩＰＴＧを添加しないで培養したｐＥＣＤ５を導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子を有しないｐＥＴ１１ｂを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、及びＩＰＴＧを添加して培養した前記ｐＥＴ１１ｂを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）  から同様な方法で調製した無細胞抽出液を陰性コントロール無細胞抽出液とした。
【００９８】
《発現産物のウエスタンブロット解析》
上記「形質転換体を用いた遺伝子発現」において得られた無細胞抽出液（タンパク質１０  μｇを含む）、およびクリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株から精製したＤ−アスパラギン酸酸化酵素タンパク質０．２  μｇに対して、２×ＳＤＳ  ローディングバッファー〔０．２５  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、１０％  ２−メルカプトエタノール、０．０１％  ブロモフェノール・ブルー〕を等量加えて、沸騰水浴にて５分間加熱し、両試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを作成した。次にＬａｅｍｍｌｉの方法〔Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．  Ｋ．：  Ｎａｔｕｒｅ，  ２２７，  ｐ．６８０  （１９７０）〕に従い、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて、還元条件下で前記サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００９９】
電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルからタンパク質を転写緩衝液（２５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、  １９２ｍＭ  グリシン、  ２０％  メタノール）中でゲルメンブレン転写装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、  ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ  ＳＤ  ＳＥＭＩ−ＤＲＹ  ＴＡＮＳＦＥＲ  ＣＥＬＬ）を用いて９０分、１００  ｍＡの条件でＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。
【０１００】
転写後のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ〔２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００  ＮａＣｌ〕中、室温で１０分間振とうして２回洗浄した後、ブロッキング緩衝液〔３％ゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むＴＢＳ〕に浸して、室温で１時間振盪した。そして、ＰＶＤＦ膜を０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むＴＢＳ（以下、ＴＴＢＳと称す）で１０分間、二回洗浄した後、クリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株から精製したＤ−アスパラギン酸酸化酵素を用いて作成したウサギ抗Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素抗血清を１％ゼラチンを含むＴＴＢＳで３０００倍希釈した溶液に浸して、室温で１時間穏やかに振とうした。次いで、前記ＰＶＤＦ膜を取り出し、ＴＴＢＳで１０分間、３回洗浄した。その後、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をＴＴＢＳ（１％ゼラチンを含有する）で３０００倍に希釈した溶液に前記ＰＶＤＦ膜を浸して、室温で１時間振とうした。処理したＰＶＤＦ膜を取り出し、ＴＴＢＳで１０分間、２回洗浄した後、ＴＢＳで１０分間、２回洗浄した。洗浄後のＰＶＤＦ膜を発色による検出試薬（Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ  Ｋｉｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に浸し、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素に対する抗体が結合するタンパク質の検出を行った。
その結果、前記両試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルの双方において、特異的なバンドが分子質量約４０  ｋＤａに検出された。一方、上記「形質転換体を用いた遺伝子発現」に記載の陰性コントロール無細胞抽出液から調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルの全てにおいて、特異的なバンドは確認できなかった。
【０１０１】
［実施例３］
＜酵素活性の解析＞
本実施例は、本発明の遺伝子によりコードされる酵素蛋白質の酵素活性について記載する。
実施例２の「形質転換体を用いた遺伝子発現」に記載した無細胞抽出液のＤ−アスパラギン酸酸化酵素活性をＹａｍａｄａらの方法〔Ｙａｍａｄａ，  Ｒ．，  Ｕｊｉｉｅ，  Ｈ．，  Ｋｅｒａ，  Ｙ．，  Ｎａｋａｓｅ，  Ｔ．，  Ｋｉｔａｇａｗａ，  Ｋ．，  Ｉｍａｓａｋａ，  Ｔ．，  Ａｒｉｍｏｔｏ，  Ｋ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，  Ｙ．：  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １２９４，  ｐ．１５３  （１９９６）〕により測定した。その結果、無細胞抽出液に比活性  ８２．８  ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ蛋白質のＤ−アスパギン酸酸化酵素酵素活性が確認できた。一方、陰性コントロールである前記陰性コントロール無細胞抽出液のＤ−アスパラギン酸酸化酵素活性を同様に測定したところ、以下の数値が得られた。即ち、それぞれＩＰＴＧを添加しないで培養したｐＥＣＤ５を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の無細胞抽出液では０．０５３１  ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ  蛋白質、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子を有しないｐＥＴ１１ｂを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）では０．０２２４  ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ蛋白質、及びＩＰＴＧを添加して培養したｐＥＴ１１ｂを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）では０．０６２３  ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ蛋白質であり、有意な活性は確認できなかった。なお、無細胞抽出液中のタンパク質濃度測定はウシ血清アルブミン（ナカライテスク）を標準物質として用いＬｏｗｒｙらの方法〔Ｌｏｗｒｙ，  Ｏ．  Ｈ．，  Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，  Ｎ．  Ｊ．，  Ｆａｒｒ，  Ａ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｒａｎｄａｌｌ，  Ｒ．  Ｊ．：  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９３，  ｐ．２６５  （１９５１）〕に従って行った。
【０１０２】
［実施例４］
＜酵素の諸特性の解析＞
本実施例は、本発明の遺伝子によりコードされる酵素蛋白質の特性について記載する。
前記酵素蛋白質の諸特性について、他の生物に由来する酵素と比較して解析した結果を以下に記載する。特に、熱安定性やタンパク質濃度などの酵素活性への影響。更に、基質特異性および阻害剤の影響について速度論的解析を行なった。他の生物に由来する酵素としては、ウシ腎臓とタコ肝膵臓のＤ−アスパラギン酸酸化酵素、部分精製されたブタ腎臓のＤ−アスパラギン酸酸化酵素、および酵母キャンディダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｎｄｉｎｉｉ）  ２２０１株から精製されたＤ−グルタミン酸酸化酵素を使用した。
【０１０３】
【表１】
2004321075.tif 000002
【０１０４】
ブタ腎臓のＤ−アスパラギン酸酸化酵素を１９５倍に部分精製した。これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、５３および５７ｋＤａの２つの主要なタンパク質と、数種の他のタンパク質とからなるものであった。
キャンディダ・ボイジニ２２０１株のＤ−グルタミン酸酸化酵素を精製した。これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、４５ｋＤａのタンパク質からなるものであった。未変性（ｎａｔｉｖｅ）の酵素の分子量は、ゲル濾過によって４３ｋＤａであると推定された。
【０１０５】
《材料》
Ｄ−アスパラギン酸は田辺製薬から寄贈されたものを使用した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、その他の試薬はナカライテスクより購入した試薬を使用した。
【０１０６】
《方法》
Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素活性は、特に示さない限り２０ｍＭ  Ｄ−アスパラギン酸を含む５０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、反応温度３７℃、反応時間１０分間で測定した。また、失活を防ぐため酵素希釈の際には、最終濃度が０．５ｇ／ｍＬ  ＢＳＡとなるように希釈した。
至適ｐＨと最適温度
至適ｐＨの検討は、５０ｍＭ  ピロリン酸カリウムバッファーを用いてｐＨ６．０〜１０．０の範囲で各ｐＨにおける酵素活性を測定した。最適温度の検討は、２０〜６０℃の範囲で各温度における酵素活性を測定した。
【０１０７】
熱安定性
本酵素の熱安定性の検討は、酵素（５８μｇ／ｍＬ、７６．１μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ）を２０〜６０℃の範囲で１０分間インキュベーションした後の残存酵素活性を測定した。また、酵素をさらに安定化するため、ＢＳＡを２５もしくは５００μｇ／ｍＬ添加したときの熱安定性についても検討した。
【０１０８】
活性測定条件の検討
酵素の希釈方法の検討は、希釈液として０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡまたは１０％（ｖ／ｖ）グリセリンを含んだ５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）を用いて酵素を希釈・氷冷し、経過時間ごとに酵素活性を測定した。また、２５〜４０℃の範囲における酵素反応直線性はそれぞれの温度でインキュベーションし、経過時間ごとに活性測定を行なった。酵素活性と吸光度の相関関係は、酵素（１１．１μｍｏｌ／ｍｉｍ／ｍＬ）の希釈倍率をそれぞれ変えて活性測定を行なうことにより示した。
【０１０９】
基質特異性
本酵素の基質として、酸性アミノ酸であるＤ−型およびＬ−型のアスパラギン酸およびグルタミン酸、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）、それ以外のＤ−アミノ酸のうちアラニン、  アスパラギン、  グルタミン、  バリン、  ロイシン、  フェニルアラニン、  プロリン、  セリン、  チロシン、  アルギニンを用いたときの酵素活性を測定した。基質濃度はすべて２０ｍＭで、緩衝液のｐＨは７．５とした。
【０１１０】
基質に対するＫｍ、Ｖｍａｘ値
本酵素の基質として、Ｄ−アスパラギン酸、  Ｄ−グルタミン酸、  ＮＭＤＡを用いたときの基質濃度の影響を測定し、ミカエリス定数（Ｋｍ）および最大速度（Ｖｍａｘ）の値を求めた。このときの基質濃度は、Ｄ−アスパラギン酸が０．１〜２０ｍＭ、  Ｄ−グルタミン酸が４〜５０ｍＭ、  ＮＭＤＡが１〜２０ｍＭとなるようにしてそれぞれ測定を行なった。
【０１１１】
阻害剤の影響
本酵素の阻害剤として、ジカルボン酸であるシュウ酸、  マロン酸、  コハク酸、  グルタル酸、  Ｄ−リンゴ酸、  ｍｅｓｏ−酒石酸、  ＤＬ−酒石酸、  フマル酸、  マレイン酸；  モノカルボン酸である安息香酸、  ｎ−酪酸；  トリカルボン酸であるクエン酸；  金属キレート剤であるＥＤＴＡを添加したときの阻害効果を測定した。阻害剤濃度はすべて２０ｍＭとした。
【０１１２】
阻害剤に対するＫｉ値
本酵素の阻害剤として、  マロン酸、  Ｄ−リンゴ酸、  ｍｅｓｏ−酒石酸を用いたときの基質濃度の影響をそれぞれの阻害剤の濃度に対して測定した。このときの基質濃度はＤ−アスパラギン酸  ０．０７〜２０ｍＭとした。また、阻害剤濃度はそれぞれについて０〜２０ｍＭとなるようにしてそれぞれ測定を行なった。
【０１１３】
《結果と考察》
至適ｐＨと最適温度
本酵素活性に及ぼすｐＨの影響について検討した（図１）。本酵素の至適ｐＨは７．５であり、高い活性を示す領域はｐＨ７〜８と狭い範囲（ｐＨ８．５では最大活性の約６０％）であることが明らかとなった。この結果は、これまでに報告されている脊椎動物やタコに由来する本酵素において認められた結果、即ち、酸性Ｄ−アミノ酸を基質とした場合にみられる生理的ｐＨよりかなり高いｐＨで高い活性を示す傾向にあるとの結果とは異なっていた。例えば、ブタ腎では至適ｐＨは８．５であり、最大活性の約９０％以上を示す領域は７．５〜９．５とかなり広範囲にわたっている。一方、キャンディダ・ボイジニ２２０１株のＤ−グルタミン酸酸化酵素では至適ｐＨが７．０であり、高い活性を示す領域もかなり狭い（ｐＨ８．５では最大活性の約３０％）。
【０１１４】
次に、本酵素活性に及ぼす温度の影響について検討した（図２）。本酵素の最適温度は３３〜３７℃であり、高い活性を示す領域は狭い範囲であった。ブタ腎における最適温度４７．５℃（３５〜５０℃の広い範囲で高い活性）と比較するとかなり低い。一方、キャンディダ・ボイジニ２２０１株の酵素の結果は、本酵素の結果と類似しており、最適温度は３７℃であった。
以上のように本発明の酵素は、至適ｐＨ、至適温度とも動物の酵素とは異なる性質を呈したが、同じ酵母の一種であるキャンディダ・ボイジニ２２０１株のＤ−グルタミン酸酸化酵素とは類似した性質を呈した。
【０１１５】
熱安定性
本酵素の熱安定性について検討した（図３）。本酵素は３０℃までほぼ安定であったが、それ以上の温度ではやや不安定となり、４５℃を超えると急激に不安定となることが明らかとなった。また、ＢＳＡを添加することにより安定化を試みたが、ほとんど効果はなかった。このことから、４５℃以上で酵素タンパクが変性するために失活している可能性が示唆される。一方、ブタ腎のＤ−アスパラギン酸酸化酵素は熱に対して比較的安定（タンパク質濃度約０．５ｍｇ／ｍｌ、  １０分間のインキュベーションにより６０℃で約６０％の残存活性）であり、本酵素のそれとは大きく異なっていた。
【０１１６】
活性測定条件の検討
本酵素は熱や低タンパク質濃度により不安定となることが示唆されたので、これらを踏まえて活性測定条件を確立することを試みた。
本酵素活性測定を行なう場合、酵素活性が高いときには希釈してから測定を行なっていたが、精製酵素を希釈するとただちに失活することが明らかとなった。そこで、酵素の希釈方法について検討を行なった（図４）。本酵素はリン酸緩衝液やグリセリン溶液で希釈すると速やかに失活し、また、リン酸緩衝液を用いると希釈直後から活性が失われていることが明らかとなった。一方、ＢＳＡ溶液で希釈すると約２０分間酵素の失活はみられなかった。この結果から、酵素を希釈する際にはＢＳＡ溶液などを用いたほうが好ましいと考えられる。
【０１１７】
本酵素は熱安定性に乏しいので、活性測定の問に酵素が失活していることが示唆される。そこで、酵素活性測定の温度と時間を検討することにした（図５）。本酵素は最適温度である３４〜３７℃で活性測定を行なった場合、約１５分間ほぼ直線性が認められるが、それ以上の時間では直線からはずれてくることがわかる。また、それより高い４０℃では直線性は認められなかった。一方、最適温度より低い２５℃と３０℃では長時間直線性を保っているが、３０分間以内では最適温度よりも低い吸光度を示した。これらの結果から、本酵素活性測定は最適温度で１０分間反応させるのが良いと考えられる。
【０１１８】
さらに、同じ酵素量で基質をより多く消費させるには、低い温度で長時間反応させる方が効率的であると思われる。酵素活性測定の際、反応溶液中に高濃度の酵素を添加すると、期待される活性値よりも低く算出されることが明らかとなった。そこで、活性測定中の酵素量と吸光度にどの程度相関があるのか検討した（図６）。吸光度が０．６、  酵素活性が２００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ（反応溶液１ｍｌ中では１００ｎｍｏｌのＤ−アスパラギン酸の酸化に対応）まではほぼ直線性が認められるが、それ以上だと直線から少しずつはずれていくことがわかった。以上の結果より、活性測定の条件は酵素２００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ以下、３７℃、１０分間で行ない、酵素希釈には０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを用いることにする。
【０１１９】
基質特異性
本酵素の各アミノ酸に対する基質特異性について検討した（表２）。ここでは、Ｄ−アスパラギン酸に対する酵素活性を１００％として、その他を相対活性で示した。本酵素はＤ−アスパラギン酸に対してもっとも活性が高く、次いでＮＭＤＡに対して９．４％、同じ酸性Ｄ−アミノ酸であるＤ−グルタミン酸に対しては０．４％と低い値であった。この結果から、本酵素はＤ−アスパラギン酸を良い基質とし、他のアミノ酸に対してあまり作用しないことが明らかとなった。
【０１２０】
【表２】
2004321075.tif 000003
【０１２１】
基質を２０ｍＭの濃度で使用した。
【０１２２】
基質に対するＫｍ、Ｖｍａｘ値
本酵素と基質（Ｄ−アスパラギン酸、  Ｄ−グルタミン酸、  ＮＭＤＡ）との親和性について速度論的解析を行なった。各基質についてＫｍおよびＶｍａｘ値を解析した（表３）。ＫｍおよびＶｍａｘ値は、Ｄ−アスパラギン酸に対してそれぞれ３．６５ｍＭ、  ８１．３μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ、  Ｄ−グルタミン酸に対してそれぞれ１５２  ｍＭ、  ３．０４μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、  ＮＭＤＡに対してそれぞれ２８．０ｍＭ、  １５．８μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇであった。酵素効率を示す（ｋｃａｔ／Ｋｍ）で比較すると、Ｄ−アスパラギン酸に対して圧倒的に高く、Ｄ−グルタミン酸に対する値の約１０００倍、  ＮＭＤＡに対する値の約４０倍であった。他の動物と比較する（表４）と、ウシやブタではＮＭＤＡがＤ−アスパラギン酸よりも適した基質（それぞれ約４７倍、約３．６倍）である。一方、タコではＤ−アスパラギン酸とほぼ同程度の割合でＤ−グルタミン酸にも作用する。従って、本酵素は基質特異性の点で他の生物由来の酵素とは大きく異なることが明らかとなった。
【０１２３】
【表３】
2004321075.tif 000004
【０１２４】
使用した基質濃度は、Ｄ−アスパラギン酸が０．１〜２０ｍＭ、  Ｄ−グルタミン酸が４〜５０ｍＭ、  ＮＭＤＡが１〜２０ｍＭ。ｋｃａｔは単量体サブユニット（４０ｋＤａ）の分子量に基ずいて計算した。
【０１２５】
【表４】
2004321075.tif 000005
【０１２６】
ウシおよびタコ；  速度論的パラメータを、２５℃で５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、  ０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、  ０．２５ｍＭの固定酸素濃度下において測定した。
ブタ；  速度論的パラメータを、３７℃で２５μｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）において測定した。
【０１２７】
さらに、Ｄ−アスパラギン酸に対しては基質を低濃度にして検討を行なった。ラインウィーバー・バークプロット（データ示さず）は、基質が低濃度でも直線性を示し、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式に従うことが明らかとなった。しかし、今までに報告されているウシやブタ、タコのＤ−アスパラギン酸酸化酵素ではＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式に従わないことが知られている。この傾向も既知の酵素ではみられない特徴である。
【０１２８】
阻害剤の影響
本酵素の阻害剤の影響について検討を行なった（表５）。本酵素に対してマロン酸が最も強く阻害し、次いでＤ−リンゴ酸が強く阻害した。しかし、ウシやタコ、当研究室で研究されたニワトリ、  ハト、  両生類、  ニジマスのＤ−アスパラギン酸酸化酵素、  酵母キャンディダ・ボイジニ２２０１株のＤ−グルタミン酸酸化酵素などで強い阻害が確認されているｍｅｓｏ−酒石酸はあまり阻害効果がなかった。この傾向も既知の酵素ではみられない特徴である。また、Ｄ−アミノ酸酸化酵素に対する阻害剤である安息香酸も阻害効果はみられなかった。
【０１２９】
【表５】
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【０１３０】
【発明の効果】
Ｄ−アスパラギン酸を特異的に認識する酵素をコードする新規遺伝子が提供される。また、該遺伝子を組込んだ発現ベクターが提供される。更に、該ベクターを導入した形質転換体が提供される。なお更に、該遺伝子による組換えタンパク質が提供される。
【０１３１】
また、これらの発明は、Ｄ−アスパラギン酸を特異的に且つ低コストで検出する手段に使用でき、更にケト酸の生産、アスパラギン酸のラセミ体の光学分割などに応用することができる。
【０１３２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素における、ｐＨ条件と活性との相関関係を示す図である。
酵素活性をｐＨ６〜１０の範囲（５０ｍＭ  ピロリン酸緩衝液中）で測定した。データをｐＨ７．５での最大活性のパーセントとして示す。
【図２】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素における、温度条件と活性との相関関係を示す図である。
酵素活性を図に示す温度で１０分間インキュベーションした後に測定した。データを３７℃での最大活性のパーセントとして示す。
【図３】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素における、温度条件と酵素の安定性との相関関係を示す図である。
酵素溶液（５８μｇ／ｍｌ）を２０〜６０℃の範囲で１０分間インキュイベーションし、その後通常の活性測定を行った。相対活性は２０℃における酵素活性を１００％として示した。
【図４】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素のＢＳＡもしくはグリセロールの存在下における安定性を示す図である。
酵素溶液（５８μｇ／ｍｌ、９５．１ユニット／ｍｇ）を以下に示す試薬を含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で３０倍希釈した。使用した試薬は、ＢＳＡが０．５ｍｇ／ｍｌ、グリセロールが１０％（ｖ／ｖ）。これらを氷中で保温し、各時間ごとに酵素活性を測定した。相対活性はＢＳＡを添加した際の０ｍｉｎを１００％とした。
【図５】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素の様々な温度条件での反応のタイムコースを示す図である。
酵素溶液（５８μｇ／ｍｌ、９８．６ユニット／ｍｇ）を０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを用いて８０倍希釈した。酵素溶液は反応溶液１ｍｌに対し、５０μｌを添加した。吸光度０．６は、１ｍｌの反応溶液中の約１００ｎｍｏｌのＤ−アスパラギン酸の酸化に対応する。
【図６】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素の活性と吸光度変化（反応物の蓄積）との相関関係を示す図である。
酵素溶液（８２μｇ／ｍｌ、１３７．０ユニット／ｍｇ）を０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを用いてそれぞれ希釈した。酵素溶液は反応溶液１ｍｌに対し、５０μｌを添加した。吸光度０．６は、１ｍｌの反応溶液中の約１００ｎｍｏｌのＤ−アスパラギン酸の酸化に対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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