(57)【要約】【課題】基板のバックグラウンド蛍光量が低く、かつ、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑えることにより、検出精度の高いマイクロアレイを提供すること。【解決手段】表面にアルデヒド基が導入されたマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法であって、該基板の表面の一部に生理活性物質を固定化後、アルデヒド基のアルデヒド基以外の官能基へ変換する処理工程を含むことにより基板のバックグラウンドの蛍光発生量をより低減するマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法であり、アルデヒド基の変換の機構は、金属水素化物との反応による還元反応、およびまたは、アルコールの付加反応であることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にアルデヒド基が導入されたマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法であって、該基板の表面の一部に生理活性物質を固定化後、アルデヒド基のアルデヒド基以外の官能基へ変換する処理工程を含むことにより基板のバックグラウンドの蛍光発生量をより低減することを特徴とするマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法。
【請求項２】
プラスチック基板が飽和環状ポリオレフィンからなる請求項１記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法。
【請求項３】
アルデヒド基が基板表面へ導入されたアミノ基を介して
多官能性アルデヒドが共有結合することにより導入されている請求項１又は２記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法。
【請求項４】
アミノ基がアミノアルキルシラン由来である請求項３記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法。
【請求項５】
多官能性アルデヒドがグルタルアルデヒドである請求項３又は４記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法。
【請求項６】
生理活性物質が核酸、オリゴペプチド、タンパク質、糖鎖、又は糖タンパク質のいずれかである請求項１〜５記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法。
【請求項７】
アルデヒド基のアルデヒド基以外の官能基へ変換する処理工程が、金属水素化物を介したアルデヒド基の還元反応、およびまたは、アルデヒドとアルコールの付加反応によるアセタール生成反応を含む請求項１〜６いずれか記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法。
【請求項８】
０．００１重量％以上の金属水素化物、およびまたは、５体積％以上のアルコールを含む溶液へ接触させる工程を含む請求項７記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法。
【請求項９】
金属水素化物が水素化ホウ素ナトリウムであり、アルコールがエタノールである請求項８記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法。
【請求項１０】
０．１〜０．５重量％の水素化ホウ素ナトリウム、およびまたは、１０〜５０体積％のエタノールを含む溶液への接触工程を含む請求項９記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シグナルを蛍光量として検出するマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応後の蛍光シグナル検出において、マイクロアレイ基板に由来する蛍光（バックグラウンド）が高いと、Ｓ／Ｎ比の低下により検出精度が低下する。ゆえに、マイクロアレイ基板の材料には低蛍光性のものを使用することが多い。また、基板表面には核酸を効率良く固定化するための化学的修飾が施されることが通常であり、アルデヒド基やアミノ基を導入したものが多用されている。これらの官能基に由来する蛍光を低減することは、マイクロアレイを用いたアッセイの精度向上の観点から重要となってくる。マイクロアレイ用基板はガラスもしくはプラスチック製であることが多いが、通常これらの材料表面は化学的に不活性であることから、核酸を固定化するためには表面修飾を施す必要がある。表面修飾としては、アルデヒド基、アミノ基などの活性な官能基を導入する場合が多い。特にアルデヒド基を導入した基板では、固定化する核酸分子にアミノ基を予め導入しておくことにより、共有結合形成による強固な固定化が可能であることから、特に塩基数が数十個以下のオリゴＤＮＡ固定化用基板として広く用いられている。（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３）
ガラスやプラスチックなどの表面修飾の手法として、シランカップリング剤による表面コーティングがある。この方法では、比較的簡便な工程で表面に官能基を導入することが可能であることから多用されている。例えばシランカップリング剤としてアミノアルキルシランを用いた場合、浸漬処理工程と加熱処理工程のみで表面にアミノ基を導入することが可能である。さらに、上記の方法で導入されたアミノ基に多官能性のアルデヒドを作用させることにより、基板表面にアルデヒド基を導入することができる。しかしながら、アルデヒド基を導入した場合、基板のバックグラウンド蛍光量が大幅に増大し、シグナルの検出精度が低くなってしまうため、バックグラウンド蛍光量を低減するための有効な解決手段が求められていた。
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−１７６９９１号公報
【特許文献２】特開２００２−１８１８１７号公報
【特許文献３】特表２００２−５３２６９９号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、バックグラウンド蛍光量が低減されており、シグナル蛍光の検出精度の高いマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）  表面にアルデヒド基が導入されたマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法であって、該基板の表面の一部に生理活性物質を固定化後、アルデヒド基のアルデヒド基以外の官能基へ変換する処理工程を含むことにより基板のバックグラウンドの蛍光発生量をより低減するマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法、
（２）プラスチック基板が飽和環状ポリオレフィンからなる（１）記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法、
（３）アルデヒド基が基板表面へ導入されたアミノ基を介して多官能性アルデヒドが共有結合することにより導入されている（１）又は（２）記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法、
（４）アミノ基がアミノアルキルシラン由来である（３）記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法、
（５）多官能性アルデヒドがグルタルアルデヒドである（３）又は（４）記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法、
（６）生理活性物質が核酸、オリゴペプチド、タンパク質、糖鎖、又は糖タンパク質のいずれかである（１）〜（５）記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法、
（７）アルデヒド基のアルデヒド基以外の官能基へ変換する処理工程が、金属水素化物を介したアルデヒド基の還元反応、およびまたは、アルデヒドとアルコールの付加反応によるアセタール生成反応を含む（１）〜（６）いずれか記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法、
（８）０．００１重量％以上の金属水素化物、およびまたは、５体積％以上のアルコールを含む溶液へ接触させる工程を含む（７）記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法、
（９）金属水素化物が水素化ホウ素ナトリウムであり、アルコールがエタノールである（８）記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法、
（１０）０．１〜０．５重量％の水素化ホウ素ナトリウム、およびまたは、１０〜５０体積％のエタノールを含む溶液への接触工程を含む（９）記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の使用方法、
である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に使用するマイクロアレイは、表面にアルデヒド基が導入された基板上に生理活性物質が固定化された後に、残存するアルデヒド基が他の官能基に変換されていることを特徴とする。アルデヒド基の他の官能基への変換は、基板のバックグラウンド蛍光量を低減するとともに、検出対象物質の基板表面への非特異的な吸着を抑える効果を有する。
アルデヒド基の変換の機構は、酸化反応、還元反応、付加反応、縮合反応など一般的な反応を用いることができるが、還元反応、付加反応を利用することが好ましい。アルデヒド基の還元反応には、金属水素化物を作用させることが有効である。アルデヒドにアルコールを付加することにより、アルデヒドと比べて反応性の低いアセタールに変換することができる。
【０００７】
本発明のマイクロアレイの作製工程は、基板作製工程、基板表面修飾工程、核酸固定化工程、官能基変換工程を含む。
（基板の素材）
マイクロアレイ用基板の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、表面処理の容易性、量産性の観点から、熱可塑性樹脂が好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましい。、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。
【０００８】
（基板の表面修飾）
基板表面へのアルデヒド基の導入方法として好適に用いられるのは、アミノ基導入の後に多官能性アルデヒドを反応させる方法である。アミノ基の導入手段としては、アミノ基含有シランカップリング剤による処理、窒素雰囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティングなどが挙げられるが、処理の簡便性、均一性の観点から、アミノ基含有シランカップリング剤による処理が好ましい。多官能性アルデヒドとしてはグルタルアルデヒドが好ましい。一般的にアルデヒド基導入工程後の基板は、未修飾の基板、および、アミノ基導入工程後の基板と比較してバックグラウンド蛍光量が高くなる。
【０００９】
（核酸の固定化）
固定化する核酸は、アルデヒド基との反応性を高めるため、予めアミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基の導入位置は核酸の分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが好ましい。固定化は通常、核酸を溶解した溶液を基板上に点着した後、適宜処理を施すことにより行う。
【００１０】
（アルデヒド基の変換）
核酸を固定化した状態では、基板上には固定化反応に寄与しなかったアルデヒド基が残存しており、そのままハイブリダイゼーション反応を行うと、非特異的な吸着・結合が生じ、Ｓ／Ｎ比の低下につながる。そのため、基板表面を何らかの方法で不活性化する必要があり、大別して２つの方法がある。すなわち、ハイブリダイゼーション反応に無関係の物質をアルデヒド基に結合・吸着させる方法（いわゆるブロッキング）、および、アルデヒド基を他の不活性な官能基に変換する方法である。前者の方法では、ブロッキング剤自体が蛍光を発する可能性があることから、バックグラウンド蛍光量の低減化の観点からは後者が好ましい。
【００１１】
以下、アルデヒド基の変換について記述する。
アルデヒド基を他の官能基に変換する手段として、金属水素化物によるアルデヒド基の還元反応を利用することができる。金属水素化物がアルデヒドに作用するとアルミニウムアルコキシドが生成し、さらに加水分解されてアルコールが生成する（Ｈ．ハート著「基礎有機化学」、培風館、１９９６年、ｐ．２４７）。金属水素化物としては、水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウムなど一般的なものを用いることができ、好ましくは水素化ホウ素ナトリウムである。金属水素化物を水性媒体中に分散・溶解した溶液中に基板を浸漬することにより、基板表面のアルデヒド基を還元することができる。水性媒体は純水、緩衝塩溶液などを用いることができ、アルコールなどの有機溶媒を含んでも良い。アルコールはアルデヒドに作用し、ヘミアセタールを経由してアセタールを生成する（同上、ｐ．２４２）ため、上記の金属水素化物による還元反応と相加的に作用し、アルデヒド基の変換効率を高めることができる。また、アルコール添加の副次的効果として、金属水素化物を水性媒体に分散・溶解するさいに、水素の発生による発泡をある程度抑えることができ、均一な処理を行うことができる。
【００１２】
溶液中の金属水素化物の濃度は、好ましくは０．００１重量パーセント以上、より好ましくは０．１〜０．５重量パーセントであり、０．１〜０．３重量パーセントが最も好ましい。アルコールとしては一価あるいは多価アルコールを用いることができるが、エタノールが最も好ましい。溶液中のアルコール濃度は、好ましくは５〜５０体積パーセント、より好ましくは１０〜５０体積パーセントであり、１０〜３０体積パーセントが最も好ましい。
【００１３】
以上の方法によって作製したマイクロアレイは、アルデヒド基の他の不活性な官能基への変換により、アルデヒド基導入工程で上昇したバックグラウンド蛍光量が低減されており、さらに、アルデヒド基変換効果によりハイブリダイゼーション反応時の非特異的吸着を抑制されているため、ハイブリダイゼーション反応後のシグナルを高精度で検出することが可能である。
【００１４】
【実施例】
（実施例１）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（７６×２６×１ｍｍ）に加工した。表面に親水化処理を施したのち、アミノ基含有アルキルシランの２％水溶液中に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した。これを１％グルタルアルデヒド水溶液中に浸漬することにより、表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
１８０ｍｌのリン酸緩衝溶液中に０．６ｇの水素化ホウ素ナトリウムと５０ｍｌのエタノールを溶解させた溶液を作製した。上記の基板を５分間浸漬した後、純水で洗浄、風乾することにより、基板表面のアルデヒド基の変換を行った。その後、基板のバックグラウンド蛍光量測定を行った。
【００１５】
（参考例１）
市販の顕微鏡用スライドガラスを十分に洗浄した後、アミノ基含有アルキルシランの２％水溶液に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した。これを１％グルタルアルデヒド水溶液中に浸漬することにより、表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
実施例１と同様の方法でアルデヒド基の変換を行った後、バックグラウンド蛍光量を測定した。
【００１６】
（参考例２）
市販のアルデヒド基導入マイクロアレイ用基板（ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製  Ｓｉｌｙｌａｔｅｄ  Ｓｌｉｄｅ，  ＣＳＳ−２５）を準備した。
実施例１と同様の方法でアルデヒド基の変換を行った後、バックグラウンド蛍光量測定を行った。
【００１７】
（比較例１）
実施例１で作製した基板を、アルデヒド基変換操作を行わないまま、バックグラウンド蛍光量を測定した。
【００１８】
（参考比較例１）
実施例２で作製した基板を、アルデヒド基変換操作を行わないまま、バックグラウンド蛍光量を測定した。
【００１９】
（参考比較例２）
実施例３の基板を、アルデヒド基の変換を行わないまま、バックグラウンド蛍光量を測定した。
【００２０】
実施例および比較例におけるバックグラウンド蛍光量の測定には、Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＣｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度７０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
いずれの実施例においても、比較例と比べてバックグラウンド蛍光量の減少が認められ、アルデヒド基の変換がバックグラウンド蛍光量の低減に有効であることが示された。
【００２１】
【表１】
2004170351.tif 000002
【００２２】
【発明の効果】
本発明により、生理活性物質の固定化のために導入したアルデヒド基を他の官能基に変換することにより、１）基板のバックグラウンド蛍光量を低減し、２）検出対象物質の基板へ非特異的な吸着、結合を抑制したマイクロアレイの作製が可能となり、高い検出精度を有するマイクロアレイの提供が可能となった。