(57)【要約】【課題】バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢をフラスコ培養や固体（平板）培養でも安定的に製造可能な方法、及び該方法を利用した有効な培地成分のスクリーニング方法、更に該胞子嚢を工業レベルの高い生産性で製造する方法を提供する。【解決手段】０．１〜１質量％の遊離型メチオニンを含む培地で培養するバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法、及び、０．１〜１質量％の遊離型メチオニンを含む培地を基本培地とするバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造に有効な培地成分のスクリーニング方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ポピリエに属する菌を培地で培養し胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を製造する方法であって、前記培地が遊離型メチオニンを０．１〜１質量％含むことを特徴とするバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項２】
前記培地が、ペプトン、酵母エキス及び吸着剤を含む請求項１記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項３】
前記培地が、グルタミン酸及びその塩、並びにプロリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を含む請求項２に記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項４】
前記培地が、（１）ラクトアルブミン分解物、（２）トレハロース、（３）ピルビン酸及びその塩、（４）マグネシウム、マンガン、カルシウム及びこれらを含む化合物、からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む請求項２または３に記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項５】
バチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造に有効な培地成分をスクリーニングする方法であって、請求項１〜４のいずれかに記載の培地を基本培地とすることを特徴とするバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造に有効な培地成分のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記基本培地が、加水分解率１０％〜２０％のラクトアルブミン分解物を０．１〜１質量％含む請求項５記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造に有効な培地成分のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バチルス・ポピリエに属する菌を培地で培養することにより、コガネムシ科昆虫の幼虫防除に有用なバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢（以下、単に胞子嚢と言うことがある）を製造する方法、及び該胞子嚢の製造に有効な培地成分をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（コガネムシ幼虫による被害とバチルス・ポピリエに属する菌の防除剤としての利用）
コガネムシ科昆虫の幼虫は、芝や農園芸作物や樹木等の広範囲な植物の根を食餌し、多大な被害を与えることが知られている。これらコガネムシ科昆虫の幼虫は地中に棲息するため、地上から散布する化学農薬では防除効果が得にくく、また幼虫の棲息場所も特定しにくい。このため広範囲に多量の農薬を散布して地中に農薬を浸透させる必要があり、自然環境や人体に対する悪影響が懸念されるため、より有効な防除方法が切望されていた。
バチルス・ポピリエに属する菌はコガネムシ科昆虫の幼虫に経口的に感染して乳化病を発病させ最終的にこれらを死に至らしめることが知られている。このため化学農薬が効きにくいコガネムシ科昆虫の防除に該菌の胞子嚢を利用しようとする試みが古くから行われてきた。
【０００３】
（バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢の難生産性）
バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を生産する方法としては例えば、寄生宿主であるコガネムシ科昆虫の幼虫を利用した方法が従来から知られていた。即ち、胞子嚢を含む腐葉土中で幼虫を飼育して経口的に摂取させる、あるいは直接虫体に胞子嚢を注射するなどして幼虫体内で増殖させ、その後虫体を切開するなり擂り潰すなりして得た体液から胞子嚢を回収する方法である。しかし、この方法ではコガネムシ科昆虫の幼虫を大量に飼育することが必要であり、装置、人員、コストなどの観点から事実上工業生産は難しかった。そこで工業生産に適する、コガネムシ科昆虫の幼虫を必要としない人工培養方法に関する多くの研究がなされてきた。
【０００４】
ところで、バチルス・ポピリエに属する菌は図１の生活環で示すように、まず休眠状態の胞子嚢が発芽して活動状態の栄養細胞へと変化する。次に、これが分裂サイクルを繰り返すことでその数を増やしていき、増殖する。最終的に栄養細胞は再び胞子嚢へと変化し、休眠状態に戻る。このとき、栄養細胞のうち胞子嚢形成のサイクルに移行するものの割合が高ければ高いほど、それだけ多くの胞子嚢を生産できたことになる。よって、胞子嚢の高生産を達成するためには、十分な栄養細胞の増殖と高い胞子嚢化率を両立させることが必要である。しかし実際には、他の微生物に用いられるような培地でバチルス・ポピリエに属する菌の培養を試みても栄養細胞を増殖させることすら困難で、例え栄養細胞を増殖し得たとしてもすぐに急激な死滅を起こし、胞子嚢形成に到達させることは極めて困難であった。
【０００５】
（従来の胞子嚢製造技術）
それでも、選抜された菌株を用いたり、培地成分を工夫したりすることで胞子嚢生産を可能とする技術が一部開発されている。
例えば、バチルス・ポピリエに属する菌のうち、ＮＲＲＬ  Ｂ−２３０９ＳやＮＲＲＬ  Ｂ−２３０９Ｍといった選抜株を用いて人工培養により胞子嚢が得られたとする報告が知られている。しかし、その生産性は低かった。また、前者においては経口投与でのコガネムシ科昆虫の幼虫に対する防除効果の記述がなく、不明である。後者に至っては、経口投与での効果は全くないことが明らかにされている（例えば非特許文献１参照）。これに対し、培地にグルタミン酸などを含ませることにより胞子嚢が培地１ｍｌ当たり５×１０７〜１×１０９個得られ、且つそれが防除効果を有するという技術も開示されている（例えば特許文献１参照）。しかし、工業レベルでの胞子嚢製造という観点では必ずしも満足できる生産性ではなかった。
【０００６】
（従来の培地成分スクリーニング技術）
工業レベルでの胞子嚢製造を可能にするには、バチルス・ポピリエに属する菌の培養方法、特に培地組成の検討、即ち、有効な培地成分のスクリーニングが不可欠である。培地成分のスクリーニング方法としては例えば、ある特定の組成を持つ基本培地を用意して、そこに検討する種々の培地成分を種々の濃度で添加し、これらにバチルス・ポピリエに属する菌を接種して培養した後、基本培地に対する胞子嚢生産性の向上で評価する方法がある。スクリーニングの対象は、必ずしも単一培地成分の添加だけとは限らず、複数成分の組み合わせ、更にはそれぞれの濃度の組み合わせなども考えられ、試験点数は膨大となる。そのため、スクリーニングはフラスコ培養あるいは固体（平板）培養で行うことが望ましい。なぜなら、発酵槽を用いた培養は胞子嚢高生産に有利で評価をしやすい反面、大がかりな装置であり、スクリーニング手法としては非効率的だからである。ところが、従来公知の培地を用いたバチルス・ポピリエに属する菌のフラスコ培養あるいは固体（平板）培養では、比較的高い胞子嚢生産性が得られることがあるものの再現性は必ずしも高くなく、試験の度に値が大きく変動してしまうという問題があった。このような理由から、バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢生産に有効な培地成分のスクリーニング用基本培地として従来公知の培地は適しておらず、好適なスクリーニング方法はこれまで存在しなかった。そこで、安定的な（再現性よい）胞子嚢生産が可能で、かつ好ましくは検出・評価しやすくするため比較的生産性の高い培地及びそれを利用したスクリーニング方法が切望されていた。
【０００７】
（従来の培地における遊離型メチオニン含有量）
従来、胞子嚢生産性の安定化を図る方策として培地に０．１〜１質量％の遊離型メチオニンを添加した例はなかった。但し、遊離型メチオニンは培地成分としてしばしば用いられるペプトン、酵母エキスやラクトアルブミン分解物などにも少量含まれていることから、意図せずとも結果的に培地に含まれていることがあった。しかし、そのような場合にも含有量は非常に低く、０．１質量％よりも遙かに低かった。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００２−３５５０３０号公報
【非特許文献１】
イー  エス  シャーペ、グラント  セイント  ジュリアン、クラレンス  クロウェル（Ｅ．  Ｓ．  Ｓｈａｒｐｅ，  Ｇｒａｎｔ  Ｓｔ．  Ｊｕｌｉａｎ，  ａｎｄ  Ｃｌａｒｅｎｃｅ  Ｃｒｏｗｅｌｌ），「アプライド  マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，１９７０年，第１９巻，Ｐ．６８１−６８８
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、胞子とパラスポラルボディとを含み、コガネムシ科昆虫の幼虫に対して優れた防除効果を示すバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢をフラスコ培養や固体（平板）培養でも安定的に製造可能な方法、及び該方法を利用した有効な培地成分のスクリーニング方法、更には該胞子嚢を工業レベルの高い生産性で製造する方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、０．１〜１質量％の遊離型メチオニンを含有した培地を用いてバチルス・ポピリエに属する菌を培養することにより、胞子嚢の安定的生産がフラスコ培養や固体（平板）培養でも可能となりスクリーニング用基本培地として使用できること、及び前記培地で培養することにより胞子嚢が安定高生産されることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、バチルス・ポピリエに属する菌を培地で培養し、胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を製造する方法であって、０．１〜１質量％の遊離型メチオニンを含む培地で培養することを特徴とするバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法を提供する。
【００１２】
また本発明は、バチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造に有効な培地成分をスクリーニングする方法であって、０．１〜１質量％の遊離型メチオニンを含む培地を基本培地とすることを特徴とするバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造に有効な培地成分のスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（使用するバチルス・ポピリエに属する菌）
本発明で用いるバチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に属する菌の細菌学的性質は、非特許文献２によれば、長さが１．３〜５．２μｍ、幅が０．５〜０．８μｍのグラム陰性桿菌で、生育温度が２０〜３５℃であり、図２に示す模式図の如く胞子嚢の中に胞子とパラスポラルボディとを有する。しかし、バチルス・ポピリエはパエニバチルス・ポピリエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に再分類されるべきとのパターソンらの学説（非特許文献３）が提示されており、現段階ではその分類扱いが明確になっていないため、本発明においてはバチルス・ポピリエに属する菌とはパエニバチルス・ポピリエに属する菌をも包含するものとする。
【００１４】
（非特許文献２）：アール  イー  ブヒャナン、エヌ  イー  ギボンズ（Ｒ．  Ｅ．  Ｂｕｃｈａｎａｎ，  Ｎ．  Ｅ．  Ｇｉｂｂｏｎｓ），「バージェイズ  マニュアル  オブ  デターミネイティブ  バクテリオロジー（ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＶＥ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ）」，１９７４年，第８版
【００１５】
（非特許文献３）：バーティル  パターソン、カレン  イー  リップレ、アランエー  ユーステン、ファーガス  ジー  プリースト（Ｂｅｒｔｉｌ  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，  Ｋａｒｅｎ  Ｅ．  Ｒｉｐｐｅｒｅ，  Ａｌｌａｎ  Ａ．  Ｙｏｕｓｔｅｎ，  Ｆｅｒｇｕｓ  Ｇ．  Ｐｒｉｅｓｔ），「インターナショナル  ジャーナル  オブ  システマティック  バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，１９９９年，第４９巻，Ｐ．５３１−５４０
【００１６】
本発明で使用されるバチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に属する菌株としては、バチルス・ポピリエ・セマダラ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  Ｓｅｍａｄａｒａ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０６８）、バチルス・ポピリエ・マメ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  ｖａｒ．  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  Ｍａｍｅ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０６９）、バチルス・ポピリエ・ヒメ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  ｖａｒ．  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  Ｈｉｍｅ、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６６０）、バチルス・ポピリエ・サクラ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  ｖａｒ．  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  Ｓａｋｕｒａ、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６６２）、バチルス・ポピリエ・デュトキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  Ｄｕｔｋｙ、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４７０６）、バチルス・ポピリエ・メロロンサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａｅ）等が挙げられる。
【００１７】
尚、バチルス・ポピリエ・セマダラは、平成１０年５月２１日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８１８で寄託され、平成１４年５月２１日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０６８が付与されている。また、バチルス・ポピリエ・マメは、平成１１年１１月２５日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６６１で寄託され、平成１４年６月１０日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０６９が付与されている。
【００１８】
（遊離型メチオニン）
本発明で使用する培地は遊離型のメチオニンを含ませること以外特に限定はなく、微生物を培養する公知の培地を使用することができる。遊離型メチオニンの培地中濃度は０．１〜１質量％となるよう調整することが好ましい。通常用いられる培地成分、例えばペプトン、酵母エキスやラクトアルブミン分解物により該遊離型メチオニンが供給されることがあるが、その濃度は０．０３質量％前後と低く、不十分であるため、別途０．０７〜０．９７質量％添加することでこれを補うことが好ましい。
【００１９】
（ペプトン、酵母エキス）
本発明で使用する培地はペプトンや酵母エキスを含有することが好ましい。
ペプトンとしては、通常の微生物培養に用いられるものであれば特に限定されないが、「ポリペプトンＳ」（日本製薬社製）や「ポリペプトンＹ」（日本製薬社製）、「細菌用ペプトン」（ＯＸＯＩＤ社製）や「ソイペプトン」（ＯＸＯＩＤ社製）、「トリプトン」（Ｄｉｆｃｏ社製）などが挙げられ、これらのうち胞子嚢形成促進効果が高いことからポリペプトンＳ、ポリペプトンＹが好ましい。培地への添加濃度は０．００１〜５質量％とすることが好ましく、０．１〜１質量％とすることが特に好ましい。
【００２０】
酵母エキスとしては、例えば、ＯＸＯＩＤ社製あるいはＤｉｆｃｏ社製の「酵母エキス」などが挙げられる。培地への添加濃度は０．００１〜５質量％とすることが好ましく、０．１〜１質量％とすることが特に好ましい。
【００２１】
（吸着剤）
本発明で使用する培地は、バチルス・ポピリエに属する菌の生育を阻害する物質の除去を目的とした吸着剤を含んでいてもよい。該吸着剤としては活性炭、吸着樹脂、アロフォサイト又はモレキュラーシーブ等が挙げられる。培養における胞子嚢生産性がより高いことから、活性炭及び吸着樹脂が好ましい。
本発明で使用する活性炭の形状は、粉末状、粒状又はシート状等、いずれであってもよいが、単位質量当たりの分解又は吸着能が最も高い粉末状の活性炭を使用するのが好ましい。
【００２２】
吸着樹脂は、吸着能を有する多孔質重合体を意味し、例えば粒子状に成型された架橋性多孔質重合体で、粒子内部にまで達する細孔構造により水溶液中の生育阻害物質を効率よく吸着しうる合成樹脂である。具体的には、三菱化学社製の芳香族系合成樹脂吸着剤「ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２０」、「ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２１」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ８２５」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ８５０」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ７０」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ７００」、置換芳香族系合成樹脂吸着剤「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７」、アクリル系合成樹脂吸着剤「ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２ＭＧ」などを挙げることができる。
【００２３】
本発明で使用する培地中の吸着剤の含有率は、培地の０．０５〜５質量％が好ましい。０．０５質量％以上であれば菌の生育阻害物質の吸着、除去効果を十分発揮し、５％以下であれば菌の増殖に必要な栄養源の吸着も少ないため、該範囲内で菌の高い増殖促進効果を示す。
【００２４】
（プロリン、グルタミン酸）
本発明で使用する培地はプロリンを含有することが好ましい。プロリンの培地中の含有率は、菌の増殖を促進し、かつ胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の単位体積当たりの生産数を高くできることから培地の０．１〜０．７質量％が好ましく、より好ましくは０．２〜０．６質量％である。該含有率が０．１質量％未満である場合、及び０．７質量％を超える場合、菌の増殖促進効果が低下するだけでなく培地単位体積当たりの胞子嚢の生産数も低下する。
【００２５】
本発明で使用する培地はグルタミン酸及びその塩を含有していても良い。グルタミン酸及びその塩としては、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、グルタミン酸アンモニウム、グルタミン酸塩酸塩等が挙げられる。これらの培地中の濃度は０．２〜４．０質量％であり、より優れた菌の増殖及び胞子嚢化率を呈する点で０．４〜１．０質量％が好ましい。
【００２６】
（ラクトアルブミン分解物）
本発明で使用するラクトアルブミン分解物としては特に限定されないが、例えば「ラクトアルブミン水解物」（和光純薬社製）、「オルプラスＷ１」（オルガノ社製）、「オルプラスＷ３」（オルガノ社製）、「オルプラスＷ５」（オルガノ社製）などが挙げられる。但し、加水分解率が１０％以下のラクトアルブミン分解物ではバチルス・ポピリエに属する菌の増殖への効果は小さく、また、加水分解率が２０％以上のものを用いるとフラスコ培養や固体（平板）培養においては胞子嚢化率が低くなり生産性が低下する。よって、フラスコ培養や固体（平板）培養での培地成分スクリーニングにおける基本培地には、これらにおいても比較的高い胞子嚢生産性が得られる加水分解率１０〜２０％のラクトアルブミン分解物を用いることで生産性検討をしやすくすることが好ましい。加水分解率が１０〜２０％のものとしては「オルプラスＷ３」（オルガノ社製）、「オルプラスＷ５」（オルガノ社製）などが例示される。一方、発酵槽での培養においては胞子嚢形成促進効果が高いことから「ラクトアルブミン水解物」（和光純薬社製）が好ましい。これらの培地への添加濃度は０．００１〜５質量％とすることが好ましく、０．１〜１．５質量％とすることが特に好ましい。
【００２７】
（トレハロース、ピルビン酸）
本発明で使用するトレハロースは、優れた菌の増殖促進効果が得られることから、培地に対して０．００１〜５質量％添加することが好ましい。
また、ピルビン酸及びその塩としては、ピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム等が挙げられる。菌の増殖促進及び胞子嚢生産数を高めるためには培地へのピルビン酸及びその塩の添加濃度を０．００１〜０．５質量％とすることが好ましく、０．０１〜０．３質量％とすることがより好ましい。
【００２８】
（マグネシウム、マンガン、カルシウム）
本発明で使用する培地は、マグネシウム、マンガン、カルシウムを含んでいることが好ましい。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成を強く促進することから、培地中の前記金属の含有濃度をマグネシウムが５０〜１００ｐｐｍ、マンガンが１０〜４０ｐｐｍ、カルシウムが５０〜１００ｐｐｍとなるよう調整することが好ましい。通常用いられる培地成分、例えばペプトン、酵母エキスやラクトアルブミン分解物によりこれらが供給されることがあるが、その濃度は低く不十分であるため、別途金属化合物を添加することでこれを補う必要がある。
【００２９】
マグネシウムを供給するための化合物としては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、乳酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、リン酸マグネシウム及びこれらの水和物などが例示される。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成促進効果が優れていることから、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム及びこれらの水和物、水酸化マグネシウムが好ましく、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムがより好ましい。培地への添加濃度は培地組成によって異なるが、前述の濃度範囲に対応するため、０．５〜４．１１ｍＭとすることが好ましい。
【００３０】
マンガンを供給するための化合物としては、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、シュウ酸マンガン、硝酸マンガン、リン酸マンガン及びこれらの水和物などが例示される。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成促進効果が優れていることから、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン及びこれらの水和物が好ましく、硫酸マンガン、塩化マンガンがより好ましい。培地への添加濃度は培地組成によって異なるが、前述の濃度範囲に対応するため、０．１〜０．７３ｍＭとすることが好ましい。
【００３１】
カルシウムを供給するための化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、クエン酸カルシウム、硝酸カルシウム及びこれらの水和物などが例示される。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成促進効果が優れていることから、塩化カルシウム、酢酸カルシウム及びこれらの水和物、炭酸カルシウム、水酸化カルシウムが好ましく、塩化カルシウムがより好ましい。培地への添加濃度は培地組成によって異なるが、前述の濃度範囲に対応するため、０．１〜１．０５ｍＭとすることが好ましい。
【００３２】
以上のことから、本発明で使用する培地に、ペプトン、酵母エキス及び吸着剤を含有することが好ましい。また、グルタミン酸及びその塩、並びにプロリンからなる群から選ばれる少なくとも一種を含有すること、及び（１）ラクトアルブミン分解物、（２）トレハロース、（３）ピルビン酸及びその塩、（４）マグネシウム、マンガン、カルシウム及びこれらを含む化合物、からなる群から選ばれる少なくとも一種が含まれることが好ましい。
【００３３】
（液体培地、固体培地）
本発明の製造方法に用いる培地は、液体培地であっても固体（平板）培地であっても良いが、胞子嚢生産性や操作性の観点から液体培地が好ましい。固体培地の場合には、培地組成に寒天などの多糖類を加えればよい。その添加濃度は０．５〜５質量％であり、優れた菌の増殖を呈することから１〜３質量％が好ましい。液体培地による培養は、フラスコまたは発酵槽を用いた回分培養、連続培養、半回分培養又は流加培養など、いずれの方式で行っても良い。
【００３４】
（培養条件）
本発明で使用するバチルス・ポピリエに属する菌の増殖に適した培養温度は２５〜３２℃である。また、培地のｐＨは６．５〜９．０が好ましく、フラスコ（液体）培養及び固体培養の場合には７．５〜８．５がより好ましく、発酵槽を用いた培養の場合には７．０〜８．０がより好ましい。更に好ましくは、発酵槽での培養中、培地のｐＨを常に７．０〜８．０に制御する。ｐＨの調整には各種の緩衝液や塩酸又は硫酸など通常用いられる酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニアなど、通常用いられるアルカリを使用することができる。通気量は０．１〜２ｖｖｍ（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ／ｍｉｎｕｔｅ）に調整することが好ましく、優れた菌の増殖及び胞子嚢生産性が得られることから０．５〜１．５ｖｖｍとすることがより好ましい。これら最も好ましい条件で培養を行うためには、液体培養、特に発酵槽を用いた液体培養が適している。
【００３５】
培地に接種する菌体としてはバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を用いる。接種する菌体の接種量は少なすぎると、単位培地当たりの生産量を増やすことが難しく、逆に接種量を多くしても生産量が接種量に比例して上がらず、生産量は飽和してしまう。このため、接種量としては培地１ｍｌ当たり１×１０２〜１×１０８個が好ましく、１×１０３〜１×１０７個の胞子嚢の接種が特に好ましい。
培養時間は培養方法、培養温度、培養ｐＨ又は接種菌体量によって異なるが、通常、回分液体培養の場合で５〜１０日である。
【００３６】
（胞子嚢の生産性と回収）
液体培養終了後に培養物から胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を回収する方法は、培養液から遠心分離や濾過等の一般的な分離方法で該胞子嚢を含む菌体を分離し回収すればよい。この際、必要に応じて水や緩衝液を使った洗浄操作を加えてもよい。固体（平板）培養の場合は、培地表面に生えた菌体に水などをかけて懸濁させ、後の操作は液体培養の場合と同様に行えばよい。
【００３７】
本発明の製造方法によれば、フラスコ培養や固体（平板）培養においても安定的に胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を製造することができ、これを基本培地とした培地成分のスクリーニングが可能となる。また本発明の製造方法によれば、胞子嚢の数を、菌数に対し３０〜６０％の割合で製造することができ、かつ該胞子嚢の数を培養液１ｍｌ当たり１．２×１０９個〜２．５×１０９個（１２億個〜２５億個）の割合で製造することができる。
【００３８】
（防除対象コガネムシ幼虫）
本発明の製造方法により得られた胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢はコガネムシ科昆虫の幼虫に殺虫活性又は生育抑制等の防除効果を示し、コガネムシ科昆虫の防除剤として有用である。
防除対象のコガネムシ科昆虫としては、ドウガネブイブイ（Ａｎｏｍａｌａ  ｃｕｐｒｅａ）、セマダラコガネ（Ｂｌｉｔｏｐｅｒｔｈａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ウスチャコガネ（Ｐｈｙｌｌｏｐｅｒｔｈａ  ｄｉｖｅｒｓａ）、チャイロコガネ（Ａｄｏｒｅｔｕｓ  ｔｅｎｕｉｍａｃｕｌａｔｕｓ）、ヒメコガネ（Ａｎｏｍａｌａ  ｒｕｆｏｃｕｐｒｅａ）、チビサクラコガネ（Ａｎｏｍａｌａ  ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄｔｉ）等の幼虫が挙げられる。
【００３９】
（バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢製剤及びその使用方法）
本発明の製造方法により製造した胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢は、それらを懸濁した液のままコガネムシ科昆虫の防除剤として用いても良く、または乾燥して粉末にして散布しても良い。また乾燥した粉末を水あるいは緩衝液との懸濁液とし、土壌に散布しても良い。しかし、通常は該胞子嚢を農薬に用いられる慣用の添加剤と共に通常の微生物農薬の製造方法で製剤化してコガネムシ科昆虫の防除剤として施用することが好ましい。また本発明の製造方法により得られる胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を他の微生物製剤に混合して使用することも可能である。前記防除剤中に含まれる胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の含有率は、コガネムシ科昆虫に防除効果を示す範囲であれば特に限定されるものではないが、例えば、施用に際して水和剤、乳剤では防除剤１リットル当たり胞子嚢が１×１０９〜１×１０１３個程度となるよう調製することが好ましく、粉剤、粒剤では防除剤１ｇ当たり１×１０８〜１×１０１２個程度となるよう調製することが好ましい。
【００４０】
防除剤の施用方法としては、剤型や対象作物等によって適宜選択され、例えば、地上液剤散布、地上固形散布、空中液剤散布、空中固形散布、施設内施用、土壌混和施用又は土壌潅注施用等の方法を挙げることができる。また、他の薬剤、すなわち殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、除草剤、殺菌剤、植物生長調節剤、肥料又は土壌改良資材（泥炭、腐植酸資材又はポリビニルアルコール系資材等）等と混合して施用、あるいは混合せずに交互施用または同時施用することもできる。前記防除剤の施用量は、コガネムシ科昆虫の種類、適用植物の種類及び剤型等によって異なるため一概には規定できないが、例えば、地上散布する場合、本発明の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の施用量が１アール当たり１０１０〜１０１５個、好ましくは１アール当たり１０１１〜１０１４個程度となるようにすればよい。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【００４２】
（参考例１）
（各培地成分に含まれる遊離型メチオニンの測定）
バチルス・ポピリエに属する菌の培養にしばしば用いられる培地成分に含まれる遊離型メチオニンの含有量を、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）を用いたポストカラム法により測定した。
標準試料としてはアミノ酸混合標準液Ｈ型（和光純薬社製、各アミノ酸２．５ｍｍｏｌ／ｌを含む）を使用した。測定した試料は、「ポリペプトンＳ」（日本製薬社製）、「ポリペプトンＹ」（日本製薬社製）、「トリプトン」（Ｄｉｆｃｏ社製）、酵母エキス（ＯＸＯＩＤ社製）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、ラクトアルブミン水解物（和光純薬社製）であった。分析には日立製作所製のアミノ酸自動分析装置「ＬａＣｈｒｏｍ」を使用した。
標準試料及び各測定試料より得られたピークエリアから換算して、各測定試料中に含まれるメチオニンの含有率を算出し表１に示した。
【００４３】
【表１】
（表１）
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【００４４】
上記分析値から、バチルス・ポピリエに属する菌の培養に好適な培地組成（例えば、０．７５質量％ポリペプトンＳ、０．７５質量％酵母エキス（ＯＸＯＩＤ）、１．０質量％ラクトアルブミン水解物、０．５質量％トレハロース、０．６４質量％グルタミン酸ナトリウム、０．５質量％Ｌ−プロリン、０．０５質量％ピルビン酸ナトリウム、０．０５質量％硫酸マグネシウム七水和物、０．０５質量％硫酸マンガン五水和物、０．０１質量％、０．３質量％活性炭素粉末）に含まれるメチオニンの量を算出すると０．０３質量％程度であり、本発明の下限値０．１質量％よりも遙かに低いことが判明した。
【００４５】
（比較例１）
（メチオニン未添加／フラスコ培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ）
３００ｍｌ三角フラスコに下記培地（ａ）１００ｍｌを入れ、通気性の栓をして１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理にて殺菌した。
バチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢約５×１０８個を１ｍｌの蒸留水に懸濁してプラスチックチューブに入れ、ヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。この胞子嚢液２０μｌを前記培地に接種し、３０℃、１００ｒｐｍにて７日間振盪培養した。培養終了後、顕微鏡観察により胞子嚢数を計測した。同様の試験を２０回行い、胞子嚢数の平均値及び標準偏差を求めた。結果を実施例１と併せて図３に示す。メチオニンを添加していない培地でフラスコ培養した場合、得られる胞子嚢数のばらつきが大きかった（平均値４．８３×１０８個／ｍｌ、標準偏差２．８４×１０８個／ｍｌ）。
【００４６】
培地（ａ）：０．７５質量％ポリペプトンＳ（日本製薬社製）、０．７５質量％酵母エキス（ＯＸＯＩＤ社製）、０．５質量％オルプラスＷ３（オルガノ社製）（加水分解率；１０％〜２０％）、０．５質量％トレハロース（和光純薬社製特級）、０．６４質量％グルタミン酸ナトリウム（和光純薬社製特級）、０．２質量％Ｌ−プロリン（和光純薬社製特級）、０．０５質量％硫酸マグネシウム七水和物（和光純薬社製特級）、０．０５質量％硫酸マンガン五水和物（和光純薬社製特級）、０．０１質量％塩化カルシウム二水和物（和光純薬社製特級）、０．３質量％活性炭素粉末（関東化学社製）／水酸化カリウムにてｐＨを８．２に調整。溶媒には蒸留水を使用。
【００４７】
（実施例１）
（メチオニン添加／フラスコ培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ）
前記培地（ａ）に０．２質量％Ｌ−メチオニン（和光純薬社製特級）を加えた培地（ｂ）を調製し、比較例１と同様の操作を行った。
結果を比較例１と併せて図３に示す。メチオニンを添加した培地でフラスコ培養した場合、得られる胞子嚢数のばらつきが小さく（平均値７．０４×１０８個／ｍｌ、標準偏差０．７３×１０８個／ｍｌ）、安定した胞子嚢生産が可能となることが判明した。
比較例１と実施例１との比較より、フラスコ培養により得られる胞子嚢数の標準偏差は、メチオニンを添加した培地の方が、無添加の培地の約１／３であることわかる。このことから本発明の培地は新たな培地成分のスクリーニングにあたっては、約３倍の検知能力があることが分かる。
【００４８】
（実施例２）
（メチオニン添加／フラスコ培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ）
３００ｍｌ三角フラスコに下記培地（ｃ）１００ｍｌを入れ、通気性の栓をして１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理にて殺菌した。
バチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢約５×１０８個を１ｍｌの蒸留水に懸濁してプラスチックチューブに入れ、ヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。この胞子嚢液２０μｌを前記培地に接種し、３０℃、１００ｒｐｍにて７日間振盪培養した。培養終了後、顕微鏡観察により胞子嚢数を計測した。結果を実施例１の培地（ｂ）で得られた胞子嚢数平均値と共に表２に示す。
【００４９】
【表２】
（表２）
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【００５０】
培地（ｃ）：０．７５質量％ポリペプトンＳ、０．７５質量％酵母エキス、０．５質量％ラクトアルブミン水解物（和光純薬社製）（加水分解率３６％）、０．５質量％トレハロース、０．６４質量％グルタミン酸ナトリウム、０．２質量％Ｌ−プロリン、０．２質量％Ｌ−メチオニン、０．０５質量％硫酸マグネシウム七水和物、０．０５質量％硫酸マンガン五水和物、０．０１質量％塩化カルシウム二水和物、０．３質量％活性炭素粉末／水酸化カリウムにてｐＨを８．２に調整。溶媒には蒸留水を使用。
【００５１】
フラスコ培養においては、ラクトアルブミン分解物として加水分解率が１０％〜２０％であるオルプラスＷ３を用いた培地（ｂ）の方が、高い胞子嚢生産性が得られた。
【００５２】
（実施例３）
（メチオニン添加／発酵槽培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ、マメ、ヒメ、サクラ／活性炭）
下記培地（ｄ）を１Ｌ作成した。これを、ｐＨ電極を備えた発酵槽（丸菱バイオエンジ社製）に移し、１２１℃、６０分間のオートクレーブ処理にて殺菌した。バチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢約１×１０９個を１ｍｌの蒸留水に懸濁してプラスチックチューブに入れ、ヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。この胞子嚢液を全量発酵槽に接種し、撹拌１５０ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、３０℃、ｐＨ７．６制御の条件で７日間培養した。
バチルス・ポピリエ・マメ、バチルス・ポピリエ・ヒメ、バチルス・ポピリエ・サクラについても同様の操作を行った。
各菌株における胞子嚢生産性を表３に示す。いずれも１．２×１０９個／ｍｌ以上の胞子嚢、及び３０％以上の胞子嚢化率が得られ、高い生産性が認められた。
【００５３】
培地（ｄ）：０．２質量％Ｌ−メチオニン、０．７５質量％ポリペプトンＳ、０．７５質量％酵母エキス、１．０質量％ラクトアルブミン水解物（和光純薬社製）、０．５質量％トレハロース、０．６４質量％グルタミン酸ナトリウム、０．５質量％Ｌ−プロリン、０．０５質量％ピルビン酸ナトリウム（和光純薬社製特級）、０．０５質量％硫酸マグネシウム七水和物、０．０５質量％硫酸マンガン五水和物、０．０１質量％塩化カルシウム二水和物、０．３質量％活性炭素粉末、０．１質量％消泡剤（日本油脂社製「ディスホームＣＡ−１２３」）／水酸化カリウムにてｐＨを７．６に調整。
【００５４】
【表３】
（表３）
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【００５５】
（実施例４）
（メチオニン添加／発酵槽培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ／吸着樹脂）
実施例３の培地（ｄ）の活性炭素粉末の代わりに０．５質量％の吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ８２５（三菱化学社製）を用いた培地（ｄ’）を１Ｌ作成した。これを、ｐＨ電極を備えた発酵槽（丸菱バイオエンジ社製）に移し、１２１℃、６０分間のオートクレーブ処理にて殺菌した。
バチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢約１×１０９個を１ｍｌの蒸留水に懸濁してプラスチックチューブに入れ、ヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。該胞子嚢液を全量培地（ｄ’）の発酵槽に接種し、撹拌１５０ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、３０℃、ｐＨ７．６制御の条件で７日間培養した。
培地（ｄ’）における胞子嚢生産性を表４に示す。２．１×１０９個／ｍｌの胞子嚢、及び４８％以上の胞子嚢化率が得られ、高い生産性が認められた。
【００５６】
【表４】
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（表４）
【００５７】
（試験例１）
（殺虫活性試験）
本発明の製造方法により得られた胞子嚢によるコガネムシ科昆虫の幼虫の防除効果試験を行った。
実施例３の培地（ｄ）を用いた培養で取得したバチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢を蒸留水に２×１０８個／ｍｌとなるよう懸濁させた。腐葉土を約１５ｇずつ入れた直径６ｃｍのプラスチックカップ２０個に胞子嚢懸濁液を１ｍｌずつ散布し、よく混和した。各カップにドウガネブイブイ２令幼虫を１頭ずつ入れ、２５℃のインキュベーター内で３０日間飼育し、幼虫の死亡率を計測した。
同様の操作をバチルス・ポピリエ・マメ、バチルス・ポピリエ・ヒメ、バチルス・ポピリエ・サクラについても行った。また、対照試験区では胞子嚢懸濁液の代わりに水を用いた。
表５に示した結果から明らかなように、本発明の方法により製造された胞子嚢はいずれの菌株においてもコガネムシ科昆虫の幼虫に対し優れた防除効果を有することが確認された。
【００５８】
【表５】
（表５）
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【００５９】
【発明の効果】
本発明により、胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢をフラスコ培養や固体（平板）培養でも安定的に製造可能な方法、及び該方法を利用した有効な培地成分のスクリーニング方法を提供できる。また、該胞子嚢を工業レベルの高い生産性で製造する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】バチルス・ポピリエに属する菌の生活環を示した図である。
【図２】胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の模式図である。
【図３】フラスコ培養における胞子嚢生産性（平均値±標準偏差）を示した図である。
【符号の説明】
１  胞子嚢
２  パラスポラルボディ
３  胞子
４  栄養細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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