(57)【要約】【課題】機能性成分、すなわちアミノ酸、ペプチド類を製造現場等でも容易に検出・定量できる、簡便・迅速・安価かつ高精度な定量分析方法を得る。【解決手段】アミノ酸を含有する組成物中のアミノ酸を検出、定量する方法であって、チオールアルキルを含まない誘導体化試薬と組成物中のアミノ酸とを反応させ、得られた紫外吸収体の紫外線吸収強度を測定するもの。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸を含有する組成物中のアミノ酸を検出、定量する方法であって、
チオールアルキルを含まない誘導体化試薬と組成物中のアミノ酸とを反応させ、得られた紫外吸収体の紫外線吸収強度を測定することを特徴とするアミノ酸の分析方法。
【請求項２】
紫外線吸収強度を測定する前の前工程として、紫外吸収体を液体クロマトグラフィーにて分離する工程を具備することを特徴とする請求項１記載のアミノ酸の分析方法。
【請求項３】
誘導体化試薬に用いる反応試薬が、ｏ−フタルアルデヒドであることを特徴とする請求項１又は２記載のアミノ酸の分析方法。
【請求項４】
誘導体化試薬を５０％以上のアルコール溶液として用いることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のアミノ酸の分析方法。
【請求項５】
アミノ酸がγ−アミノ酪酸であることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のアミノ酸の分析方法。
【請求項６】
更に、前工程として、組成物中の高分子物質を除去する工程を具備することを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載のアミノ酸の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ酸を含む食品等から標的とするアミノ酸を定量する方法に関し、特に機能性を高めるために調整された食品（特定保健用食品）の有効成分の含有量を簡便・迅速・正確に測定する定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アミノ酸はタンパク合成に必要な成分であり、重要な栄養素であるため、古くからその研究が進められており、最近では様々な生理効果も見出されている。また、アミノ酸が数個結合したペプチド類についても同様に研究が進められており、これらの機能性として、例えば、ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）、ラクトトリペプチドの血圧降下作用やグロビン蛋白分解物（オリゴペプチド）の食後中性脂肪上昇抑制、分岐鎖アミノ酸の疲労回復力の向上作用、グルタミン及びアルギニンの免疫力の向上作用等が報告されている。
【０００３】
近年、生活習慣病の予防や食生活の質的向上を目的とした機能性食品が数多く開発され、特定保健用食品や保健機能食品等として市販されており、上記アミノ酸、ペプチドには、このような食品類の有効成分（機能性成分）となっているものもある。
【０００４】
機能性を有する成分を食品、医薬品等として上市する際には、その有効量を設定し製品中の含有量を保証する必要がある。このため、効果の検証や含有量の調査、あるいは、製品中における含有量の保証（確認）を行うための定量分析方法を確立することが望まれている。
【０００５】
一般に食品中のアミノ酸の定量方法としては、蛍光誘導体化を組み合わせたＨＰＬＣ法が使用されている。代表的な分析法であるｏ−フタルアルデヒド（以下、ＯＰＡという）を用いた　ＨＰＬＣ法では、高感度に定量が可能である反面、自動分析を行うためには反応装置等、専用の装置が必要であり、また誘導体化物が不安定であることから、定量精度に問題が生じたりしている。
【０００６】
また、誘導体化（反応）試薬として使用するチオールアルキル試薬が独特の臭気を持つことから、実験環境にしばしば影響を与えている。他方、安定した誘導体化を得る方法としては、ＡＱＣ（６−ａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｌｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｃａｒｂａｍａｔｅ）やＤＮＣ（５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−　ａｍｉｎｏｎａｐｈｔａｌｅｎｅ−１−Ｓｕｌｆｏｎｙｌ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｄａｎｓｙｌ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）或いはＤＢＣ（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−　ａｍｉｎｏａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ−４’−ｓｕｌｆｏｎｙｌ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｄａｂｓｙｌ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）などの試薬を利用した方法が使用されているが、反応試薬が高価であったり、反応時の温度が高温なため、別途反応槽を設置する必要があるなどの問題があった。また、高感度であるがゆえに、試料を高倍率で希釈しなければならず、操作が煩雑であった。
【０００７】
上記、製品中における機能性成分含量の確認試験等は、通常、製造現場において行われるため、これら問題点の改善された簡便な定量方法を確立することが望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、機能性成分、すなわちアミノ酸、ペプチド類を製造現場等でも容易に検出・定量できる、簡便・迅速・安価かつ高精度な定量分析方法を得ることを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載された発明に係るアミノ酸の分析方法は、アミノ酸を含有する組成物中のアミノ酸を検出、定量する方法であって、
チオールアルキルを含まない誘導体化試薬と組成物中のアミノ酸とを反応させ、得られた紫外吸収体の紫外線吸収強度を測定するものである。
【００１０】
請求項２に記載された発明に係るアミノ酸の分析方法は、請求項１に記載の紫外線吸収強度を測定する前の前工程として、紫外吸収体を液体クロマトグラフィーにて分離する工程を具備するものである。
【００１１】
請求項３に記載された発明に係るアミノ酸の分析方法は、請求項１又は２に記載の誘導体化試薬に用いる反応試薬が、ｏ−フタルアルデヒドであるものである。
【００１２】
請求項４に記載された発明に係るアミノ酸の分析方法は、請求項１〜３の何れかに記載の誘導体化試薬を５０％以上のアルコール溶液として用いるものである。
【００１３】
請求項５に記載された発明に係るアミノ酸の分析方法は、請求項１〜４の何れかに記載のアミノ酸がγ−アミノ酪酸であるものである。
【００１４】
請求項６に記載された発明に係るアミノ酸の分析方法は、請求項１〜５の何れかに記載の前工程として、組成物中の高分子物質を除去する工程を具備するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明においては、アミノ酸を含有する組成物中のアミノ酸に紫外吸収を有する反応物を得るための誘導体化試薬を反応させることにより得られ、構造中にチオールアルキルを含まない誘導体が、充分な安定を有していること、そしてこの誘導体の紫外線吸収強度を測定することで、簡便、迅速かつ高精度にアミノ酸またはペプチドを定量できる。
【００１６】
即ち、本発明は、アミノ酸を含有する組成物中のアミノ酸を検出、定量する方法であって、誘導体化試薬と組成物中のアミノ酸とを反応させ、得られた紫外吸収体の紫外線吸収強度を測定するものである。
【００１７】
また、本発明は、誘導体化試薬に用いる反応試薬として、ｏ−フタルアルデヒドであることを特徴とする上記のアミノ酸の検出・定量方法を提供するものである。
【００１８】
また、意外にも、前記反応時において、誘導体化試薬を５０重量％以上のアルコール溶液として用いることにより、検出感度が顕著に増加することを見出した。即ち、本発明は、誘導体化試薬を５０重量％以上のアルコール溶液として用いることを特徴とする上記のアミノ酸の検出・定量方法を提供するものである。
【００１９】
更にまた、本発明は、アミノ酸がγ−アミノ酪酸であることを特徴とする上記のアミノ酸の検出・定量方法をも提供するものである。
【００２０】
また、本発明は、紫外線吸収強度を測定する前の前工程として、紫外吸収体を液体クロマトグラフィーにて分離する工程を具備することを特徴とする上記のアミノ酸の検出・定量方法を提供するものである。
【００２１】
本発明において、検出、定量の対象となるアミノ酸は特に限定されないが、グリシン、アラニン、ロイシン、ＧＡＢＡ、α−アミノ酪酸、５−アミノ吉草酸等、一級アミノ酸を対象とした場合に、検出感度が高いため好ましく、特にＧＡＢＡを対象とすることが好ましい。また、ペプチドとしては、アミノ酸数が２〜１０個結合したものを対象として用いることができ、例えばラクトトリペプチド、グロビン蛋白分解物等が挙げられる。
【００２２】
アミノ酸又はペプチド（以下両者をあわせてアミノ酸等ともいう）を含有する組成物も特に限定されず、牛乳、豆乳、発酵乳、果汁飲料、清涼飲料水、ゼリー、菓子等の飲食品や、医薬品、化粧品等いずれも好適に使用し得る。中でも、発酵乳、果汁飲料、清涼飲料水等の多くの成分（糖質、タンパク質、食物繊維等）が混在する中から対象とするアミノ酸あるいはペプチドを検出する際に、本発明の定量方法を用いれば、迅速且つ簡便に検出、定量を行えるため好ましく、特に発酵乳の工程管理等、迅速な分析が要求される場合の定量に用いることが好ましい。
【００２３】
組成物としては、簡便かつ正確な定量のためには、対象とするアミノ酸等を１００ｎｇ／ｍＬ以上、特に１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ含むものを用いることが好ましい。１００ｎｇ／ｍＬ未満では、再現性の高い定量が困難であり、１００μｇ／ｍＬ以上では、検出、定量の前処理として行う希釈が煩雑なためである。
【００２４】
本発明においては、まず、アミノ酸等を含む組成物をイオン交換水（または蒸留水）により希釈する。この時、再現性の高い定量を保つため、アミノ酸等の濃度は１〜１００μｇ／ｍＬとなるように希釈するのが望ましい。また、組成物が、発酵乳等固形物や不溶物を含むものである場合や、タンパク質等の高分子成分が存在する場合には、遠心分離（例えば４℃、１２０００Ｇ、２０分）、限外濾過等の手段により、これらを予め除去しておくことが好ましい。これらの成分の残存は、後工程である高速液体クロマトグラフィーにおいて使用するカラムに残留し、カラム劣化の問題を起こすためである。なお、限外濾過膜としては、分画分子量１０，０００以上の高分子物質を除去するものを用いることが、効率性の点から好ましい。得られた希釈液は、０．４５μｍ程度のフィルターで濾過し、調製液とする。
【００２５】
次いで、得られた調製液を少量とり、これに誘導体化試薬を加え、攪拌、振とう等により混合し、反応させ、紫外誘導体を得る。ここで、誘導体化試薬とは、紫外吸収を有し、アミノ酸またはペプチドのアミノ基と結合能を有する物質（反応試薬）を溶媒に溶解したものである。反応試薬がｏ−フタルアルデヒドである場合、誘導体化試薬中にチオールアルキルを添加すると、チオールアルキルが結合した蛍光誘導体が生成するが、同生成物は安定性が低く、蛍光強度のみならず紫外強度が経時的に低下してしまうため、チオールアルキルを本発明の誘導体化試薬として用いることはできないのである。例えば、チオールアルキルの一種である２−メルカプトエタノールは、アミノ酸等を分析する際の蛍光誘導体生成時に用いられているが、これを用いて得られる反応生成物は、イソインドール環の１位の炭素に結合したチオールアルキルが不安定であり、室温下でチオールアルキルの脱離が容易に生じ、構造的に不安定となってしまう。
【００２６】
誘導体化試薬の調製に用いる溶媒としては、メタノール、エタノール等のアルコール類やアセトン等があげられ、反応効率の点から水性溶媒を用いることが好ましく、特にアルコール類を用いることが好ましく、メタノールが最も好ましい。また、誘導体化試薬に用いる反応試薬としては、ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ　）が好ましい。
【００２７】
また、アルコールを用いる場合、その濃度は５０％以上とすることが、反応効率や検出感度から好ましく、特に５０％〜８０％、更に７５％〜８０％が好ましい。反応試薬および誘導体の溶解性はアルコール濃度に比例すること、内標比は２０〜８０％の間で一定であることから、　ＯＰＡ反応試薬のアルコール濃度が高いほど、誘導体化反応の反応性は高くなり、また、９５％のアルコール濃度では加えている５０ｍＭほう酸緩衝液の一部が沈殿し、反応時のｐＨ変化による反応性の低下が起こり、ピーク面積値が低下するためである。
【００２８】
通常、これら溶媒は２０％以下の濃度で使用されているが、本発明の方法においては、意外にも溶媒濃度が高濃度の領域で良い効果が得られ、特に、誘導体化試薬（　ＯＰＡ反応試薬）の溶媒としてメタノールを用い、その濃度を７５％〜８０％とした場合に特に優れていた。より具体的には、８０％メタノールで反応試薬を溶解後、５０ｍＭホウ酸緩衝液：ｐＨ１０．５を加えた誘導体化試薬とした場合に良好な反応効率、検出感度を得ることができた。
【００２９】
誘導体化試薬のｐＨは、反応効率の点から反応時のｐＨを　９．５〜１０．５とすることが望ましく、更に、ｐＨ１０．０が最も好ましい。緩衝液の種類としては、ｐＨ９〜１１の範囲で緩衝作用を有するものであれば特に限定されず、ホウ酸緩衝液や炭酸緩衝液等が使用可能である。緩衝液濃度は広範な食品に対応するため５０ｍＭ程度が望ましいが、反応時の調製液のｐＨが１０．０程度であれば、緩衝液濃度は特にこの濃度に固定されるものではない。
【００３０】
調製液と反応試薬の混合比は特に限定されないが、反応効率を良くするためには、調整液５〜１に対し、反応試薬１の割合で反応するのが望ましく、特に１：１が好ましい。
【００３１】
また、誘導体化反応時の反応試薬濃度は、対象とするアミノ酸に対し、１０〜５０００倍程度高濃度が望ましく、特に１００　〜１０００倍程度とすることが反応効率の点から好ましい。反応試薬の濃度が高くなるにつれて、後工程である紫外線吸収測定時のピーク面積は増加するが、濃度が高すぎると試薬が溶解し難く、沈殿物が生じてしまうためである。
【００３２】
また、定量精度を向上させるには内部標準物質を使用することが最も望ましく、被験試料に含有せず、分析対象物質に構造が類似した物質を用いるのが望ましい。ＧＡＢＡ分析においては、５−アミノ吉草酸やα−アミノ酪酸等が最適である。
【００３３】
試薬誘導体化の反応時間は、ピーク面積値及び内標比が一定値を示し、安定する１０分〜３０分とすることが好ましく、特に簡便性や再現性を考慮すると反応時間は１５分〜２０分が好ましい。反応温度は、室温程度でよいが、室温が安定しない場合は反応効率に差が生じることから、２０℃〜５０℃、特に３０℃〜５０℃の範囲で加温することが最も好ましい。
【００３４】
さらに、反応再現性の点から調製液に誘導体化試薬を加えた時の振とうは重要である。最低でも２０秒以上、ボルテックスミキサー等を用いて激しく攪拌することが望ましく、３０秒以上攪拌することが最も望ましい。
【００３５】
本発明においては、次いで、反応後の組成物中から、試薬とアミノ酸等の反応生成物（紫外誘導体）の紫外吸収強度を測定し、アミノ酸、ペプチドの定量を行う。紫外吸収の測定は、紫外吸収体を分離する前工程を経てから行うことが好ましく、例えば紫線吸収検出器を使用した高速液体クロマトグラフ装置で分析し、同様の方法にて紫外誘導体化した標準品の検量線からこれを定量すればよい。液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の条件は特に制限されず通常用いられているものを使用できる。
【００３６】
分離に使用する分析カラムは、他の成分の妨害を防ぎ、分離条件設定の容易さ等の理由からオクタデシルシリカゲル等の充填剤を用いた逆送系充填カラムの使用が好ましく、中でも充填剤としてオクタデシルシリカカラム（ＯＤＳカラム）を用いることが最も好ましい。使用するカラムは、特に実施例で示したＯＤＳカラムに限定されるものではなく、例えば充填剤の粒子径や細孔径などは一般的な粒子径３〜５μｍ、細孔径１００〜１２０Å以外の充填剤も使用することができ、分析対象物や希望する分析時間に合わせて、種々の選択が可能である。
【００３７】
また、移動相としては、アセトニトリルと０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を使用でき、その比率が３０：７０〜１０：９０の場合、最も良好な分離を示すため望ましい。その他移動相としてはアセトニトリルの代わりとしてメタノールが、緩衝液としてはギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等が使用できる。
【００３８】
また、検出方法は紫外吸収検出器により検出が可能であるが、得られた紫外誘導体化物は２５６ｎｍおよび３２５ｎｍ付近に極大吸収を持つことから、これらの波長を用いて検出するのが好ましく、なかでも　３２５ｎｍ付近の波長を用いることが、他の妨害成分の影響を避ける上でも最も好ましい。これらの条件、方法を用いることにより、精度の高い分析が可能となる。
【００３９】
【実施例】
以下の実施例をもって、本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
１）試験溶液の調製
ＧＡＢＡ標準品をイオン交換水または蒸留水でＧＡＢＡ濃度が２０〜５０μｇ／ｍＬとなるよう希釈し、試験溶液を調製した。
【００４１】
２）ＯＰＡ誘導体化試薬の調製
ＯＰＡ１０ｍｇを秤量し、メタノール８００μＬに溶解後、２００μＬの　５０ｍＭほう酸緩衝液（四ほう酸ナトリウム１．９１ｇを１００ｍＬ容メスフラスコにとり、少量の水で溶解後、水で１００ｍＬに定容し、１Ｎ　ＮａＯＨを使用してｐＨを１０．５に調整）を加え、良く混和する。この反応試薬は用時調製する。
【００４２】
３）紫外誘導体の調製
ＧＡＢＡを２０〜５０μｇ／ｍＬ含有する試験溶液５０μＬにＯＰＡ誘導体化試薬５０μＬを加え、直ちに３０秒以上、ボルテックスミキサーを使用して混和した。その後、３５℃で１５ｍｉｎ反応し、これをＨＰＬＣ分析試料とした。
【００４３】
４）試験条件
以下の試験においては、次の試験条件を基本条件として採用した。なお、内部標準としては、５−アミノ吉草酸（５−ＡＶＡ：５−ａｍｉｎｏ　ｖａｌｅｒｉｃ　ａｃｉｄ）を用いた。
【００４４】
・ＨＰＬＣ分析条件
使用カラム　　：μ−Ｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８−１００Å（ウォーターズ　内径３．９ｍｍ，長さ１５０ｍｍ）
ガードカラム　：ＬｉｃｒｏＣＡＲＴ　Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒｅ　１００　ＲＰ−１８（メルク　内径４ｍｍ，長さ４ｍｍ）
移　動　相　　：アセトニトリル：０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ３．０）＝３０：７０
検　出　器　　：紫外吸収検出器　検出波長＝３２５ｎｍ
カラム温度　　：３０℃
流　　　速　　：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注　入　量　　：１０μＬ
【００４５】
・検量線作成
ＯＰＡ　紫外誘導体化したＧＡＢＡ標準試料（５．０，１０．０，２０．０，５０．０，１００μｇ／ｍＬ）をＨＰＬＣ分析し、クロマトグラムからピーク面積値またはピーク高さを縦軸にとり、横軸に各標準試料の濃度をとって検量線を作成する。
【００４６】
・定性の原理：
ＯＰＡ　紫外誘導体化した試験試料およびＧＡＢＡ標準試料（２０．０μｇ／ｍＬ）を、上記で示した高速液体クロマトグラフィーで同一条件により分析する。標準品との保持時間（リテンションタイム）の比較によりＧＡＢＡを同定する。
【００４７】
・定量の原理：
ＯＰＡ　紫外誘導体化したＧＡＢＡ標準試料を定性試験と同一の分析条件により分析する。標準試料のピーク面積値またはピーク高さから算出した内標比を縦軸に、標準試料濃度を横軸に検量線を作成し、試験試料中のＧＡＢＡ量を定量する。
【００４８】
５）ＯＰＡ誘導体化試薬の検討
・ＯＰＡ試薬のアルコール濃度の検討
ＯＰＡ反応試薬のアルコール濃度がＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡのピーク面積値に与える影響について検討した。ＯＰＡ　を各１０ｍｇ秤量し、メタノール２００、４００、６００、８００、９５０μＬにて溶解後、全量が１ｍＬとなるように５０ｍＭホウ酸緩衝液を加え、良く混和し、ＯＰＡ反応試薬とした（メタノール濃度は２０，４０，６０，８０，９５％となる）。これらのＯＰＡ反応試薬を使用して、ＧＡＢＡ標準溶液を誘導体化し、ＧＡＢＡ、５−ＡＶＡのピーク面積値及び内標比の変化について検討した。図１はＯＰＡ反応試薬のメタノール濃度とＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡのピーク面積の関係を示す線図である。
【００４９】
図に示す通り、ＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡのピーク面積ともＯＰＡ反応試薬のメタノール濃度が高くなるにつれて増加し、メタノール濃度が８０％の時にピーク面積値は最大となった。反応試薬及び誘導体の溶解性はメタノール濃度に比例すること、内標比は２０〜８０％の間で一定であることから、ＯＰＡ反応試薬のメタノール濃度が高いほど、誘導体化反応の反応性は高いものと考えられた。９５％のメタノール濃度においてピーク面積値が低下した原因は、この濃度ではＯＰＡ試薬中に加えた５０ｍＭホウ酸緩衝液の一部が沈殿し、反応時のｐＨが変化したことから（ｐＨ９以下）反応性が低下したためであった。したがって、ＯＰＡ反応試薬のメタノール濃度は８０％程度が良好と考えられた。
【００５０】
・ＯＰＡ試薬濃度の検討
ＯＰＡ試薬濃度が２，５，１０，２５，５０ｍｇ／ｍＬとなるように調製したＯＰＡ反応試薬を使用して、ＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡを誘導体化し、ＧＡＢＡ、５−ＡＶＡのピーク面積値及び内標比の変化について検討した。図２はＯＰＡ反応試薬中のＯＰＡ試薬濃度とＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡのピーク面積の関係を示す線図である。
【００５１】
図に示す通り、ＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡのピーク面積ともＯＰＡ反応試薬のＯＰＡ試薬濃度が高くなるにつれてピーク面積は増加した。しかし、ＧＡＢＡでは１０ｍｇ／ｍＬ以上、５−ＡＶＡでは２５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度において、大きなピーク面積の増加は認められなかった。また、ＯＰＡ濃度が２５ｍｇ／ｍＬ以上ではＯＰＡが溶解し難いことから、ＯＰＡ試薬濃度は１０ｍｇ／ｍＬ程度が良好と考えられた。
【００５２】
・ＯＰＡ紫外誘導体化の反応時間の検討
ＯＰＡ反応試薬調製法（メタノール濃度及びＯＰＡ試薬濃度）が決定したことから、反応時間について検討した。反応時間を２、５、１０、１５、２０、３０ｍｉｎとして、ＧＡＢＡ標準溶液を誘導体化し、これまでと同様にＧＡＢＡ、５−ＡＶＡのピーク面積値及び内標比の変化について検討した。図３はＯＰＡ紫外誘導体化の反応時間とＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡのピーク面積の関係を示す線図である。
【００５３】
図に示す通り、ＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡのピーク面積値とも、反応時間に比例してピーク面積は増加したが、１０ｍｉｎを越える反応時間ではピーク面積はほぼ一定となり、１０ｍｉｎで誘導体化反応は終了しているものと考えられた。内標比も反応時間１０ｍｉｎ以降では、非常に安定した値を示していた。また、３０ｍｉｎの反応においても、面積値や内標比に変化は認められないことから、得られた誘導体の分解等は生じないものと考えられた。したがって、ＯＰＡ誘導体化の反応時間は、ピーク面積値及び内標比が一定値を示し安定した１５ｍｉｎ程度が良好と考えられた。
【００５４】
６）ＨＰＬＣ分析条件の検討
得られた紫外誘導体を用いてＨＰＬＣの分析条件（移動相）について検討した。
ＨＰＬＣ移動相であるアセトニトリルと０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）を、▲１▼３０：７０、▲２▼３２：６８、▲３▼３５：６５、▲４▼４０：６０の混合比に調整し、分析した。図４はＨＰＬＣ移動相を変更した際のＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡ紫外誘導体の溶出時間を示すＨＰＬＣクロマトグラムであり、図中▲１▼はアセトニトリル：０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）＝３０：７０、▲２▼＝３２：６８、▲３▼＝３５：６５、▲４▼＝４０：６０を示す。
【００５５】
図に示す通り、ＨＰＬＣ移動相▲１▼（３０：７０の混合比）におけるＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡは、ＧＡＢＡ＝１６．３分、５−ＡＶＡ＝２２．９分で溶出された。ＨＰＬＣ移動相▲４▼（４０：６０の混合比）との間では、溶出時間に３倍程度の差が認められたが、いずれの移動相においても、ＧＡＢＡや５−ＡＶＡのピーク形状の対称性は良好であり、また新たなピークも検出されなかった。移動相▲１▼を用いた場合においても、分析時間は２５分で終了することから、いずれのＨＰＬＣ移動相を用いても分析が可能であると考えられた。
【００５６】
６）食品（発酵乳）中のＧＡＢＡ量を測定するためのＨＰＬＣ分析条件の検討
食品におけるＨＰＬＣ分析条件の適用性を検証するため、ＧＡＢＡを含有するモデル発酵乳を調製し、同様に紫外誘導体化し、ＨＰＬＣの分析条件について検討した。なお、モデル発酵乳としては、加熱殺菌した３０％脱脂粉乳溶液にＬ．カゼイＹＩＴ９０２９を接種し、３０℃で３日間培養後、蒸留水で２倍に希釈したものを用いた。希釈時には、最終濃度が１６ｍｇ／１００ｍＬとなるようにＧＡＢＡを添加した。図５は、ＨＰＬＣ移動相を変更した際のモデル発酵乳中のＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡの溶出時間を示すＨＰＬＣクロマトグラムであり、図４と同様に図中▲１▼はアセトニトリル：０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）＝３０：７０、▲２▼＝３２：６８、▲３▼＝３５：６５、▲４▼＝４０：６０を示す。
【００５７】
図５に示す通り、ＨＰＬＣ移動相▲４▼（３５：６５の混合比）のクロマトグラムにおいて、ＧＡＢＡピークの近傍に未知ピークが認められた。さらに検討した結果、この未知ピークは移動相▲１▼（３０：７０の混合比）を用いることにより、ベースライン分離することが可能であった。
【００５８】
７）ＯＰＡ紫外誘導体の安定性の検討
ＯＰＡ紫外誘導体の安定性について、１０℃で保存し、経時的にＨＰＬＣ分析を行い、ＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡのピーク面積値の変化から、その安定性を評価した。表１は、１０℃での保存時間（ｍｉｎ）におけるＧＡＢＡ、５−ＡＶＡのピーク面積値及び内標比を示す。また、図６は保存時間に対するＧＡＢＡ、５−ＡＶＡのピーク面積値及び内標比の変化を示す線図である。
【００５９】
【表１】
2004045174.tif 000002
【００６０】
図６及び表１に示す通り、　ＯＰＡ紫外誘導体後、２４時間、１０℃で保存した結果、ＧＡＢＡ標準溶液および試験溶液とも２４時間の保存中にＧＡＢＡおよび　５−ＡＶＡのピーク面積値、内標比に大きな変化は認められず、　ＯＰＡ紫外誘導体は安定であった。ＧＡＢＡ標準溶液における反応直後から保存２４時間までのＧＡＢＡのピーク面積値の変動はｃｖ％＝２．２２、５−ＡＶＡの変動はｃｖ％＝１．９８であり、また内標比の変動はｃｖ％＝１．０５と非常に良好な結果が得られた。
【００６１】
８）定量範囲の検討
定量範囲について、ＧＡＢＡ標準溶液をＯＰＡ紫外誘導体とし、検討した。定量範囲については検量線の直線性から評価した。図７はＧＡＢＡ標準溶液（μｇ／ｍＬ）と内標比との相関を示す線図である。図７に示す通り、ＧＡＢＡ検量線の相関係数は５．０〜１００．０μｇ／ｍＬの間でＲ＝０．９９９以上であり、検量線に直線性が認められ、定量範囲は５．０〜１００．０μｇ／ｍＬとした。
【００６２】
９）定量精度の検討
ＧＡＢＡ定量値の精度について、分析定量茅野へ以降制度から評価した。先に調整したＧＡＢＡ含有モデル発酵乳の思料採取を３回行い、各５回ＯＰＡ誘導体化後、ＨＰＬＣにより分析し、得られたＧＡＢＡ定量値の標準偏差（ＳＤ）及びバラツキ（ｃｖ％）を算出した。結果を次の表２に示す。
【００６３】
【表２】
2004045174.tif 000003
【００６４】
表２に示す通り、得られたＧＡＢＡ定量値は１５．６５〜１６．０５ｍｇ／１００ｍＬの範囲であり、そのバラツキは１５．８３±０．１２（０．７９）であった（ｍｅａｎ±ＳＤ（ｃｖ％））。ＳＤ及びｃｖ％は良好な結果を示し、誘導体反応及びＨＰＬＣ分析の再現性に問題はないものと考えられた。
【００６５】
またこのモデル発酵乳にＧＡＢＡ標準溶液（１５ｍｇ／１００ｍＬ）を添加し、添加回収率を算出した。得られた添加回収率は１０２．２％であり、良好な添加回収率であった。以上の結果から、ＯＰＡ紫外誘導体化法により得られた分析値の妥当性が認められた。したがって、食品中のＧＡＢＡ定量分析法として、ＯＰＡ紫外誘導体化法が適用可能であった。
【００６６】
実施例２
食品への応用として、「γ−アミノ酪酸を含有する発酵乳」３ロットの分析を行った。発酵乳であるが、加熱滅菌した３０％脱脂粉乳溶液にＬ．カゼイＹＩＴ９０２９とＬ．ラクチスＹＩＴ２０２７の両菌株を１：１の比率で接種し、３０℃で３日間培養後、蒸留水で２倍に希釈し、調製した。発酵乳１０ｇを５０ｍＬ容メスフラスコにとり、内部標準溶液（５−ＡＶＡ）を添加した後、水で５０ｍＬに定容し、良く混和した。この希釈水溶液から遠心上清（２００００Ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）を調製し、水系メンブランフィルター（孔径０．４５ｍｍ）でろ過し、試験溶液とした。この試験溶液５０μＬにＯＰＡ反応試薬５０μＬを加え、直ちに３０秒以上、激しく混和し、３５℃で１５ｍｉｎ反応後、これを試験試料とした。
【００６７】
また、標準溶液についても同様の操作でＯＰＡ紫外誘導体化した。得られたＯＰＡ紫外誘導体をＨＰＬＣ分析し、検量線法により分析試料中のＧＡＢＡ量を定量した。「γ−アミノ酪酸を含有する発酵乳」３ロットを定量した結果、得られた定量値は１５．９〜１６．０ｍｇ／１００ｍＬと非常に良好な結果が得られた（表３）。
【００６８】
組成物への応用として、「γ−アミノ酪酸を含有する発酵乳」３ロットの分析を行った。発酵乳１０ｇを５０ｍＬ容メスフラスコにとり、内部標準溶液（５−アミノ吉草酸：１ｍｇ／ｍＬ調製液）を１ｍＬ添加した後、水で５０ｍＬに定容し、良く混和した。この「γ−アミノ酪酸を含有する発酵乳」希釈水溶液から遠心上清（２００００Ｇ、４℃、２０ｍｉｎ）を調製し、水系メンブランフィルター（孔径０．４５ｍｍ）でろ過し、試験溶液とした。この試験溶液５０μＬにＯＰＡ反応試薬５０μＬを加え、直ちに３０秒以上、激しく混和し、３５℃で１５ｍｉｎ反応後、これを試験試料とした。
【００６９】
また、標準溶液についても同様の操作でＯＰＡ紫外誘導体化した。得られたＯＰＡ紫外誘導体をＨＰＬＣ分析し、検量線法により分析試料中のＧＡＢＡ量を定量した。結果を次の表３に示す。表３に示す通り、「γ−アミノ酪酸を含有する発酵乳」３ロットを定量した結果、得られた定量値は１５．９〜１６．０ｍｇ／１００ｍＬと非常に良好な結果が得られた。
【００７０】
【表３】
2004045174.tif 000004
【００７１】
以上のように、本発明によれば、特殊な装置およびチオールアルキル化剤を使用せずに食品中のアミノ酸類あるいはペプチド類を簡便な操作で迅速に精度良く、定量分析することができる。
【００７２】
【発明の効果】
本発明は以上説明した通り、機能性成分、すなわちアミノ酸、ペプチド類を製造現場等でも容易に検出・定量できる、簡便・迅速・安価かつ高精度な定量分析方法を得るという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＯＰＡ反応試薬のメタノール濃度とＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡのピーク面積と内標比の関係を示す線図である。
【図２】ＯＰＡ反応試薬中のＯＰＡ試薬濃度とＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡのピーク面積と内標比の関係を示す線図である。
【図３】ＰＡ紫外誘導体化の反応時間とＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡのピーク面積と内標比の関係を示す線図である。
【図４】ＨＰＬＣ移動相を変更した際のＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡ紫外誘導体の溶出時間を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】ＨＰＬＣ移動相を変更した際のモデル発酵乳中のＧＡＢＡ及び５−ＡＶＡの溶出時間を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】ＯＰＡ紫外誘導体化後の保存時間に対するＧＡＢＡと５−ＡＶＡのピーク面積値及び内標比の関係を示す線図である。
【図７】ＧＡＢＡ標準溶液の濃度（μｇ／ｍＬ）と内標比との相関を示す線図である。
【図１】
2004045174.tif 000005
【図２】
2004045174.tif 000006
【図３】
2004045174.tif 000007
【図４】
2004045174.tif 000008
【図５】
2004045174.tif 000009
【図６】
2004045174.tif 000010
【図７】
2004045174.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成14年7月17日(2002.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
９）定量精度の検討
ＧＡＢＡ定量値の精度について、分析定量値の併行精度から評価した。先に調整したＧＡＢＡ含有モデル発酵乳の試料採取を３回行い、各５回ＯＰＡ誘導体化後、ＨＰＬＣにより分析し、得られたＧＡＢＡ定量値の標準偏差（ＳＤ）及びバラツキ（ｃｖ％）を算出した。結果を次の表２に示す。