(57)【要約】【課題】植物の培養細胞によって植物系天然ゴムを生産する方法を提供する。【解決手段】植物生長ホルモンおよび炭素源を含む植物組織培養用培地中で培養、育成した杜仲植物体の根組織よりゴムを得る。好ましい植物組織培養用培地は、ＭＳ培地、ＬＳ培地、ガンボーグＢ５培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｓｃｈ培地またはこれらを微改変した培地である。好ましい炭素源は、シュークロース、グルコース、フルクトース、キシロース、キシルロース等の糖類である。好ましい植物生長ホルモンは、オーキシン類およびサイトカイン類の少なくとも一方である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物生長ホルモンおよび炭素源を含む植物組織培養用培地中で培養、育成した杜仲植物体の根組織よりゴムを得ることを特徴とする植物培養によるゴムの生産方法。
【請求項２】
植物組織培養用培地がＭＳ培地、ＬＳ培地、ガンボーグＢ５培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｓｃｈ培地またはこれらを微改変した培地であることを特徴とする請求項１に記載の植物培養によるゴムの生産方法。
【請求項３】
炭素源がシュークロース、グルコース、フルクトース、キシロース、キシルロース等の糖類であることを特徴とする請求項１または２に記載の植物培養によるゴムの生産方法。
【請求項４】
植物生長ホルモンがオーキシン類およびサイトカイン類の少なくとも一方であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の植物培養によるゴムの生産方法。
【請求項５】
オーキシン類がインドール酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドールプロピオン酸、２，４−Ｄもしくは２，４，５−Ｔまたはこれらの２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項４記載の植物培養によるゴムの生産方法。
【請求項６】
サイトカイン類がゼアチン、カイネチネンもしくはベンジルアミノプリンまたはこれらの２種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項４記載の植物培養によるゴムの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、植物培養細胞によるゴムの生産方法に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
現代工業社会においてゴム製品は至るところに使用されており、ゴム製品なくして社会が成り立たないといっても過言ではない。ゴムはそのように重要な素材であるが、２０００年のゴム素材の日本での消費実績は、天然ゴムで約７５０千トン、代表的な合成ゴムのＳＢＲで約１，１４０千トンである。言うまでもなくＳＢＲは石油由来のものであり、鉱物資源の使用、地球環境保全（炭酸ガスの排出）の観点からはＳＢＲの消費を減少、節減することが望ましい。したがって、ＳＢＲの消費分を天然ゴムで代替すればよいが、天然ゴムは南方地域にその資源的偏りがあり、必ずしも代替がスムーズに行われない。
【０００３】
天然ゴムはゴムの木から採取される樹液を原料とするシス型のイソプレンゴムであるが、その他のゴム資源としては温暖域においても生育可能な杜仲も天然ゴムを産生することが知られている。石油系合成ゴムの発明以前には杜仲からもゴム物質が採取され、海底電線の被覆材、ゴルフボールの被覆材、また、歯科材料などに広く利用されていた。ところが、合成ゴムが安価に合成されるようになったため、これらはほとんど合成ゴムにとって替わられた。
【０００４】
そこで、植物系天然ゴムの生産を復活させることは、地球環境規模においてもきわめて意義あることである。植物系天然ゴムの生産には、言うまでもなく植物を育成することが必要である。これは、先に述べたように植生に地域性があり、特にシス型イソプレンゴム（所謂、天然ゴム）は、南米、東南アジアといったごく限られた地域でしか生産されないからである。したがって、世界中のどこでも植物系天然ゴムの生産が達成されれば、これはゴム生産産業に計り知れない利益をもたらすものである。そして、その技術は地球環境保全の観点から人類にとっても重要な意味を持ってくる。
【０００５】
本発明は、このような実状に鑑み、植物の木としての生育を経由せずに、その植物の培養細胞によって、直接植物系のゴムを提供することを企図したものである。したがって、本発明方法によれば、特殊な地域での植物の栽培、広大な育成面積を必要とせず、工場内でのゴム生産が可能である。
【０００６】
【従来の技術】
通常、植物系天然ゴムを得るには、植物を栽培し、その植物体内でゴム物質を生合成させ、それを採取している。しかし、植物体は必ずしも完全な木まで成長させずともカルスなどの植物培養体においても固有の成分（二次代謝物質）を生合成できることは知られている。
【０００７】
しかし、一般的にはカルス等の植物培養組織は植物体と比べて二次代謝物質の生産能力に劣り、従来、植物培養組織においてゴム物質を生合成（二次代謝）させることに関する報告はない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物の培養細胞によって植物系天然ゴムを生産する方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、植物培養組織体において、ゴム物質を生合成させタンク培養によってゴム物質を生産する方法を提供するものである。
【００１０】
すなわち本発明は、植物生長ホルモンおよび炭素源を含む植物組織培養用培地中で培養、育成した杜仲植物体の根組織よりゴムを得ることを特徴とする植物培養によるゴムの生産方法である。
【００１１】
好ましい植物組織培養用培地は、ＭＳ培地、ＬＳ培地、ガンボーグＢ５培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｓｃｈ培地またはこれらを微改変した培地である。
【００１２】
好ましい炭素源は、シュークロース、グルコース、フルクトース、キシロース、キシルロース等の糖類である。
【００１３】
好ましい植物生長ホルモンは、オーキシン類およびサイトカイン類の少なくとも一方である。
【００１４】
好ましいオーキシン類は、インドール酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドールプロピオン酸、２，４−Ｄもしくは２，４，５−Ｔまたはこれらの２種以上の組み合わせである。
【００１５】
好ましいサイトカイン類は、ゼアチン、カイネチネンもしくはベンジルアミノプリンまたはこれらの２種以上の組み合わせである。
【００１６】
好ましい実施形態では、杜仲幼植物体の根をＭＳ培地にα−ナフタレン酢酸を加えた培地中にて振とう培養する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
つぎに、この発明を具体的に説明するために、この発明の実施例およびこれとの比較を示すための比較例をいくつか挙げる。
【００１８】
実施例１
愛媛県生名島の杜仲雌株より採集した種子を２重量％の蔗糖を含むゲルライト培地（ゲルライト濃度０．２４重量％）に無菌的に播種した。播種後４０〜６０日経過した幼植物体から根を２〜３ｃｍに切断し、根の切断片を採取した。採取した根切断片を、培地を５０ｍｌずつ分注したコニカルビーカーに３本ずつ入れ、無菌的に振とう培養を行った。
【００１９】
培養には、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａ１．，  １９６２）に、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）およびα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）（以上オーキシン：植物性ホルモン）と６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を種々の濃度で加え、それぞれに蔗糖（濃度２重量％）を加えた培地を用いた。
【００２０】
温度を２５℃に一定に保ち、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）５０μ  ｍｏ１（／ｍ２・ｓ）、明期１６時間／日の照明下で振とう培養し、振とう回数は１００〜１１０回／ｍｉｎとした。
【００２１】
根の培養に適したホルモン濃度を決定するために、まず、表１から分かるようにＮＡＡとＢＡＰを種々の濃度で組み合わせた。この結果、ＢＡＰの濃度が高くなると根が膨張する傾向にあった。そして、ＮＡＡが０．１μＭ、１μＭで、ＢＡＰが０μＭ、０．１μＭ、１μＭである組み合わせの培地（Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．１０、Ｎｏ．１１）では根の伸長が見られた。そこで、これらの培地で伸長した根の本数および長さの合計を調べたところ、Ｎｏ．３（ＮＡＡ：１μＭ、ＢＡＰ：０μＭ）の培地で最も大きな値が得られた。その次に大きな値が得られたのはＮｏ．７（ＮＡＡ：１μＭ、ＢＡＰ：１μＭ）の培地であるが、この培地では培養後４週間目にカルスが形成される傾向があった。
【００２２】
根の伸長の状況は次の通りである。根は培養開始後１０日から２週間目で伸長し始め、Ｎｏ．２（ＮＡＡ：０．１μＭ、ＢＡＰ：０μＭ）の培地では培養後４週間目に、Ｎｏ．３（ＮＡＡ：１μＭ、ＢＡＰ：０μＭ）の培地では培養後６週間目に、それぞれ著しい根の伸張が見られた。また、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．１０、Ｎｏ．１１の培地でも根の伸長が見られたが、これらの培地では培養後４週間目にカルスが形成されたり根が膨脹する傾向があり、培養の初期段階において効率のよい根の伸張が見られるのはＮｏ．２とＮｏ．３であった。
【００２３】
培養開始後４週間目におけるＮｏ．２（ＮＡＡ：０．１μＭ，ＢＡＰ：０μＭ）の培地の伸長した根の重量は、０．０５〜０．１５ｇ増加した。
【００２４】
以上の結果から、根の振とう培養ではＢＡＰを加えると根が膨張し、根を効率よく伸長させることが出来ないこと、および、低濃度のＮＡＡのみであればカルスを形成しないことが分かる。したがって、根の増殖の初期段階にはオーキシンＮＡＡが最も有効で有り、その濃度は０．１μＭ〜１μＭ（試験Ｎｏ．２とＮｏ．３）が最も有効である。
【００２５】
比較例１
実施例１で見たように、根の培養にはＢＡＰは必ずしも必要ではなく、オーキシンのみでもよいと考えられたため、他のオーキシンを用いて根の生育状況を試験した。その結果、２，４−Ｄ（表２、試験Ｎｏ．１７〜２２）、ＩＢＡ（表３、試験Ｎｏ．２３〜２２）、ＩＡＡ（表４、試験Ｎｏ．２７〜３０）では、全ての試験培地で著しい根の伸長が見られたものは無かった。
【００２６】
【表１】
2004283089.tif 000002
【００２７】
【表２】
2004283089.tif 000003
【００２８】
【表３】
2004283089.tif 000004
【００２９】
【表４】
2004283089.tif 000005
【００３０】
実施例２
増殖した根の培養細胞を凍結破砕し、トルエンソックスレー抽出により破砕細胞からゴム成分の抽出を行った。
【００３１】
得られたトルエンソックスレー抽出物をＮＭＲ分析に供し、ゴム成分の存在の有無を調べた。その結果、図２に示すようにトランスポリイソプレンに由来するシグナルが認められ、ゴムの存在が確認された。
【００３２】
また、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、ゴムの分子量分布を調べた。その結果、図３に示すように、数平均分子量１１０００、重量平均分子量７６０００、多分散度６．９の分子量分布を有するゴムが生産したことが確認された。
【００３３】
比較例２
実施例１で述べた試験Ｎｏ．４の条件で得られた杜仲のカルスについて、同様にトルエンソックスレー抽出によりゴムの抽出を試みＮＭＲ分析を行った。しかし、図２で認められるようなゴムに由来するシグナルは観測されず、ゴムの存在は磯認できなかった。
【００３４】
比較例３
培養に、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａ１．，  １９６２）に、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）または２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）と６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を種々の濃度で加え、それぞれに蔗糖（濃度２重量％）を加えた培地（表５，表６）を用いた以外、実施例１と同様の操作を行った。
【００３５】
培養の結果、元の茎に根の形成等の変化は全く見られなかった。
【００３６】
【表５】
2004283089.tif 000006
【００３７】
【表６】
2004283089.tif 000007
【００３８】
【００３９】
【発明の効果】
この発明によれば、従来難しいとされてきた組織培養系でのゴム生産が初めて可能になった。これにより、タンク培養によるゴム生産が可能である。さらに、遺伝子改変が容易な本培養細胞において、高いゴム生産能を有する形質転換体を作成し、効率的で安定したゴム生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】培養開始後６週間目の杜仲根培養物を示す写真である。
【図２】杜仲根培養物トルエンソックスレー抽出物１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。杜仲ゴム（トランスポリイソプレン）由来のシグナルを矢印で示す。
【図３】杜仲根培養物トルエンソックスレー抽出物ＳＥＣ分析結果を示すグラフである。
【図１】
2004283089.tif 000008
【図２】
2004283089.tif 000009
【図３】
2004283089.tif 000010