(57)【要約】      （修正有）【課題】ａｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子の提供。【解決手段】ａｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、ストレプトミセス・アベルミティリスの発酵培養物において生成されるクラス２：１アベルメクチンの比又は量を変化させるのに用いることができる。また、ベクター、宿主細胞、及び生成されるクラス２：１アベルメクチンの比又は量が変化するようにａｖｅＣ遺伝子が突然変異又は不活性化されたストレプトミセス・アベルミティリスの突然変異株を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかの塩基配列からなる単離ポリヌクレオチド分子。
（ａ）配列表の配列番号３の塩基配列からなるストレプトミセス・ヒグロスコピカスの完全ａｖｅＣオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列
（ｂ）（ａ）の塩基配列と高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ（ａ）の塩基配列がコードするａｖｅＣ遺伝子産物と同じ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（ｃ）（ａ）の塩基配列がコードするａｖｅＣ遺伝子産物のポリペプチドをコードする塩基配列
（ｄ）（ａ）の塩基配列がコードするａｖｅＣ遺伝子産物のポリペプチドにおいて、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたポリペプチドをコードする塩基配列であって、（ａ）の塩基配列がコードするａｖｅＣ遺伝子産物と同じ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子であって、プライマー又はプローブとして機能するオリゴヌクレオチド分子。
（ａ）配列表の配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）に対して相補的である請求項２に記載のオリゴヌクレオチド分子。
（ａ）配列表の配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列表の配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチド分子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターであって、調節要素をコードするヌクレオチド配列を更に含み、そして、前記の調節要素をコードするヌクレオチド配列と、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列とが、影響を及ぼす関係にある組換えベクター。
【請求項６】
選択マーカーをコードする塩基配列を更に含む、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項８】
ストレプトミセス・ヒグロスコピカスである、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかのポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）（ａ）のポリペプチドにおいて、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ａ）のａｖｅＣ遺伝子産物と同じ活性を有するポリペプチド
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列と高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列をコードするポリペプチドであって、かつ（ａ）のａｖｅＣ遺伝子産物と同じ活性を有するポリペプチド
【請求項１０】
組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の生成を促す条件下で培養し、その細胞培養物からＡｖｅＣ遺伝子産物を回収することを含む、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の製造方法であって、組換え発現ベクターが請求項５に記載の組換えベクターであることを特徴とする製造方法。
【請求項１１】
ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前記細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を減少させる遺伝子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する）により生成されたアベルメクチンの組成物であって、
前記アベルメクチンが、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリスの同じ株の細胞により生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と比較して、減少したクラス２：１比で生成される、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の属する技術分野
本発明は、組成物及びアベルメクチンの製造方法（主に、動物の健康の分野）に関する。より詳しくは、本発明は、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子、組成物、及び前記ポリヌクレオチド分子のスクリーニング方法に関する。なお、前記ＡｖｅＣ遺伝子産物は、ストレプトミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）培養物の発酵によって生成されるクラス２：１アベルメクチンの比を調整するのに用いることができる。更に、本発明は、ベクター、形質転換宿主細胞、そして、生成されるクラス２：１アベルメクチンの比を調整するようにａｖｅＣ遺伝子を突然変異させたストレプトミセス・アベルミティリスの新規突然変異株に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
２．１．アベルメクチン
ストレプトミセス種は、多様な種々の二次代謝物を生成する。前記二次代謝物には、有効な駆虫（ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ）及び殺虫（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ）活性を有する８種の関連する１６員大環状ラクトンの一群を含むアベルメクチンが含まれる。８種の異なる（但し、密接に関連する）化合物は、Ａ１ａ、Ａ１ｂ、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ１ａ、Ｂ１ｂ、Ｂ２ａ、及びＢ２ｂと称する。「ａ」が付く一連の化合物は、Ｃ２５位における置換基が（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル基である天然アベルメクチンを意味し、「ｂ」が付く一連の化合物は、Ｃ２５位における置換基がイソプロピル基である化合物を意味する。「Ａ」及び「Ｂ」の呼称は、Ｃ５位の置換基が、それぞれ、メトキシ基及びヒドロキシ基であるアベルメクチンを意味する。数字の「１」は、Ｃ２２，２３位に二重結合を有するアベルメクチンを意味し、数字の「２」は、Ｃ２２位に水素原子を有し、Ｃ２３位にヒドロキシ基を有するアベルメクチンを意味する。前記の関連するアベルメクチンの中で、Ｂ１タイプのアベルメクチンが、最も有効な殺寄生生物（ａｎｔｉｐａｒａｓｉｔｉｃ）及び殺虫（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ）活性を有することが認められているので、最も商業的に望ましいアベルメクチンである。
【０００３】
アベルメクチン及びストレプトミセス・アベルミティリス株の好気性発酵によるそれらの製造が、米国特許第４３１０５１９号及び第４４２９０４２号各明細書に記載されている。天然アベルメクチンの生合成は、イソ酪酸及びＳ−（＋）−２−メチル酪酸のＣｏＡチオエステル類似体から内因的に開始されると考えられている。
【０００４】
無作為な突然変異誘発による菌株の向上と、外因的に供給される脂肪酸の使用との両方を組み合わせることによって、アベルメクチン類似体の効果的な製造が行なわれてきた。分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼが欠損しているストレプトミセス・アベルミティリスの突然変異体（ｂｋｄ欠損突然変異体）は、脂肪酸補充下で発酵した場合には、アベルメクチンのみを生成することができる。分枝鎖デヒドロゲナーゼ活性が欠けている突然変異体（例えば、ストレプトミセス・アベルミティリス，ＡＴＣＣ５３５６７）のスクリーニング及び単離方法が、欧州特許（ＥＰ）第２７６１０３号明細書に記載されている。外因的に供給される脂肪酸の存在下で前記突然変異体を発酵させると、使用した脂肪酸に相当する４種類のアベルメクチンのみが生成される。従って、ストレプトミセス・アベルミティリス（ＡＴＣＣ５３５６７）をＳ−（＋）−２−メチル酪酸補充下で発酵させると、天然アベルメクチンＡ１ａ、Ａ２ａ、Ｂ１ａ、及びＢ２ａが生成される。また、イソ酪酸補充下で発酵させると、天然アベルメクチンＡ１ｂ、Ａ２ｂ、Ｂ１ｂ、及びＢ２ｂが生成される。更に、シクロペンタンカルボン酸補充下で発酵させると、４種の新規シクロペンチルアベルメクチンＡ１、Ａ２、Ｂ１、及びＢ２が生成される。
【０００５】
もし、別の脂肪酸を補充した場合には、新規なアベルメクチンが生成される。８００に亘る潜在的前駆体をスクリーニングすることによって、６０を超える別の新規アベルメクチンが同定されている（Ｄｕｔｔｏｎら，１９９１，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４４：３５７−３６５；及びＢａｎｋｓら，１９９４，Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．１４７：１６−２６）。更に、５−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性のないストレプトミセス・アベルミティリスの突然変異体は、本質的に、Ｂ類似アベルメクチンのみを生成する。結果的に、分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ及び５−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの両方を欠いているストレプトミセス・アベルミティリス突然変異体は、発酵の補充に使用した脂肪酸に相当するＢアベルメクチンのみを生成する。従って、前記の二重突然変異体にＳ−（＋）−２−メチル酪酸を補充すると、天然アベルメクチンＢ１ａ及びＢ２ａのみが生成されるが、イソ酪酸又はシクロペンタンカルボン酸を補充する場合には、それぞれ、天然アベルメクチンＢ１ｂ及びＢ２ｂ、あるいは、新規のシクロペンチルＢ１及びＢ２アベルメクチンが生成される。前記二重突然変異体にシクロヘキサンカルボン酸を補充することは、商業的に重要な新規アベルメクチンであるシクロヘキシルアベルメクチンＢ１（ドラメクチン：ｄｏｒａｍｅｃｔｉｎ）を生成するのに好ましい方法である。このような二重突然変異体［例えば、ストレプトミセス・アベルミティリス（ＡＴＣＣ５３６９２）］の単離及び特徴が、欧州特許第２７６１０３号明細書に記載されている。
【０００６】
２．２．アベルメクチン生合成に関連する遺伝子
多くの場合において、二次代謝物の生成に関連する遺伝子及び特定の抗生物質をコードする遺伝子が、染色体上で共に集まって発見されている。その例としては、例えば、ストレプトミセスにおけるポリケチドシンターゼ遺伝子クラスター（ＰＫＳ）（Ｈｏｐｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３７−６６を参照）を挙げることができる。従って、生合成経路における遺伝子をクローニングするための一つの戦略は、薬剤耐性遺伝子を単離し、次に、その特定の抗生物質の生合成に関する別の遺伝子に関して、染色体の隣接領域を試験することであった。重要な代謝物の生合成に関連する遺伝子のクローニングに関する別の戦略は、突然変異体の相補性であった。例えば、特定の代謝物を生成することのできる生物由来のＤＮＡライブラリーの一部を、生成しない突然変異体中に導入し、前記代謝物の生成に関して形質転換体スクリーニングする。更に、別のストレプトミセス種由来のプローブを用いてライブラリーをハイブリダイゼーションすることが、生合成経路における遺伝子の同定及びクローニングに用いられている。
【０００７】
アベルメクチンの生合成に関連する遺伝子（ａｖｅ遺伝子）は、別のストレプトミセスの二次代謝物（例えば、ＰＫＳ）の生合成に必要な遺伝子のように、染色体上においてクラスターとして発見される。アベルメクチンの生合成が妨害されているストレプトミセス・アベルミティリス突然変異体を補完するためのベクターを用いて、多くのａｖｅ遺伝子が、首尾よくクローニングされている。前記遺伝子のクローニングは、米国特許第５２５２４７４号明細書中に記載されている。更に、Ｉｋｅｄａら，１９９５，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４８：５３２−５３４には、Ｃ２２，２３脱水工程に関連する染色体領域（ａｖｅＣ）が、ストレプトミセス・アベルミティリスの４．８２ＫｂのＢａｍＨＩフラグメント内にあることを突き止めたこと、そして、単独成分Ｂ２ａプロデューサーの生成を引き起こすａｖｅＣ遺伝子における突然変異が記載されている。有効な駆虫性化合物であるイベルメクチンは、アベルメクチンＢ２ａから化学的に生成することができるので、アベルメクチンＢ２ａの単独成分プロデューサーは、イベルメクチンの商業生産に特に有用であると考えられる。
アベルメクチン生成の複雑さを最小化するａｖｅＣ遺伝子内の突然変異（例えば、アベルメクチンのＢ２：Ｂ１比を減少させる突然変異）を同定することは、商業的に重要なアベルメクチンの製造及び精製を単純化するであろう。
【発明の開示】
【０００８】
３．発明の概要
本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスの完全ａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体部分を含む、単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記単離ポリヌクレオチド分子が、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体において、生体内でａｖｅＣ−ＯＲＦの下流に位置する次の完全ＯＲＦを欠失する、前記単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明による単離ポリヌクレオチド分子は、好ましくは、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と同じであるか、あるいは、図１（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体部分のヌクレオチド配列と同じであるヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
更に、本発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列に対して、あるいは、図１（配列表の配列番号１）に示すａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体部分のヌクレオチド配列に対して、相同なヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子を提供する。
更に、本発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、あるいは、図１（配列表の配列番号２）のアミノ酸配列又はその実体部分に対して、相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１０】
更に、本発明は、ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様では、前記単離ポリヌクレオチド分子が、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来のＡｖｅＣ相同遺伝子産物（但し、前記相同遺伝子産物は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列又はその実体部分を含む）をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい態様では、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列表の配列番号３のヌクレオチド配列又はその実体部分を含む。
【００１１】
更に、本発明は、配列表の配列番号３のストレプトミセス・ヒグロスコピカスのヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子を提供する。更に、本発明は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するストレプトミセス・ヒグロスコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産物に相同なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子を提供する。
更に、本発明は、図１（配列表の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対して、あるいは、図１（配列表の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対してハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドを提供する。
【００１２】
更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦ又はａｖｅＣ相同ＯＲＦを含むポリヌクレオチド分子を含む、組換えクローニングベクター及び発現ベクターを提供する。前記ベクターは、本発明のポリヌクレオチドをクローニング又は発現するのに有用である。非限定的な態様では、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ遺伝子の完全ＯＲＦを含むプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）を提供する。更に、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子又は組換えベクターを含む形質転換宿主細胞、及びそれらに由来する新規株又は細胞系を提供する。
【００１３】
更に、本発明は、実質的に精製又は単離された、組換え発現ａｖｅＣ遺伝子産物若しくはＡｖｅＣ相同遺伝子産物、又はそれらの実体部分、及びそれらの相同体を提供する。更に、本発明は、組換え発現ベクター［但し、前記組換え発現ベクターは、ＡｖｅＣ遺伝子産物又はＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含み、前記ポリヌクレオチド分子と、宿主細胞中におけるポリヌクレオチド分子の発現を制御する調節要素１又はそれ以上とが、影響を及ぼす関係にある］で形質転換した宿主細胞を、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物又はＡｖｅＣ相同遺伝子産物の生成を促す条件下で培養し、その細胞培養物からＡｖｅＣ遺伝子産物又はＡｖｅＣ相同遺伝子産物を回収することを含む、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の製造方法を提供する。
【００１４】
更に、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が不活化されており、しかも、突然変異１又はそれ以上を更に含むヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子が発現されるストレプトミセス・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株の細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株の細胞によって生成されるアベルメクチンと比較して、異なる比又は量のアベルメクチンを生成するような前記突然変異ヌクレオチド配列を更に含むこと以外は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と、あるいは、図１（配列表の配列番号１）に記載のストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦのヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明によれば、前記ポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株と比較して、アベルメクチンの生成において検知可能な変化を示すストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を生成することに用いることができる。好ましい態様では、前記ポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株と比較して、クラス２：１比が減少した状態でアベルメクチンを生成するストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を生成するのに有用である。更に好ましい態様では、前記ポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株と比較して、増加したレベルでアベルメクチンを生成するストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を生成するのに有用である。更に好ましい態様では、前記ポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＣ遺伝子が不活性化されているストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を生成するのに有用である。
【００１５】
更に、本発明は、アベルメクチンの生成比及び／又は量を変化させることのできるストレプトミセス・アベルミティリスのＡｖｅＣ−ＯＲＦの突然変異を同定する方法を提供する。好ましい態様では、本発明は、（ａ）天然のａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されており、しかも、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子が導入されて発現しているストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を決定し；（ｂ）図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌクレオチド配列、あるいは、それに相同なヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現すること以外は、工程（ａ）と同じストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を決定し；そして、（ｃ）工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比とを比較し；工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比とが異なる場合に、アベルメクチンのクラス２：１比を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦの突然変異を同定することを含む、生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦの突然変異を同定する方法を提供する。
【００１６】
更に、好ましい態様では、本発明は、（ａ）天然のａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されており、しかも、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むか、あるいは、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド分子が導入されて発現しているストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量を決定し；（ｂ）図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌクレオチド配列、あるいは、それに相同なヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現すること以外は、工程（ａ）と同じストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量を決定し；そして、（ｃ）工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンの量と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンの量とを比較し；工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンの量と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンの量とが異なる場合に、アベルメクチンの量を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦ又は遺伝子構築物の突然変異を同定することを含む、生成されるアベルメクチンの量を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦ又はａｖｅＣ−ＯＲＦを含む遺伝子構築物の突然変異を同定する方法を提供する。好ましい態様では、生成されるアベルメクチンの量は、突然変異によって増加する。
【００１７】
更に、本発明は、アベルメクチン生成が変化したストレプトミセス・アベルミティリスの新規株の製造に有用な組換えベクターを提供する。例えば、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体のＡｖｅＣ遺伝子の部位を標的として、本発明の突然変異ヌクレオチド配列を含む任意のポリヌクレオチド分子を、相同組換えによって、ａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその一部に挿入又は置換するのに使用することのできるベクターを提供する。しかしながら、本発明によれば、本発明と共に提供される本発明の突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体中のａｖｅＣ遺伝子以外の部分に挿入する場合や、あるいは、ストレプトミセス・アベルミティリス細胞中でエピソーム的に維持される場合には、アベルメクチン生合成を調整する機能を果たすこともできる。従って、本発明は、本発明の突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターも提供する。前記ベクターは、ポリヌクレオチド分子を、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体のａｖｅＣ遺伝子以外の位置に挿入するか、あるいは、エピソーム的に維持するのに用いることができる。好ましい態様では、本発明は、突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子をストレプトミセス・アベルミティリス染色体中に挿入することにより、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比が低いアベルメクチンを生成する細胞の新規株を製造するのに用いることができる遺伝子置換ベクターを提供する。
【００１８】
更に、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、しかも、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリスの同じ株の細胞と比較して、比及び／又は量が異なるアベルメクチンを生成する細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法を提供する。好ましい態様では、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、しかも、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリスの同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比が異なるアベルメクチンを生成する細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子（但し、前記遺伝子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異した対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を変化させる遺伝子産物をコードする）を担持するベクターによって形質転換し、そして、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する株の細胞により生成されるクラス２：１比と比較して、クラス２：１比が異なるアベルメクチンを生成する形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方法を提供する。好ましい態様では、前記の新規株の細胞中において、生成されるアベルメクチンのクラス２：１割合が、減少する。
【００１９】
より好ましい態様では、本発明は、異なる量のアベルメクチンを生成する細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物（但し、その発現の結果、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、変化する）を担持するベクターによって形質転換し、そして、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する株の細胞により生成されるアベルメクチンの量と比較して、異なる量のアベルメクチンを生成する形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方法を提供する。好ましい態様では、前記の新規株の細胞中において、生成されるアベルメクチンの量が、増加する。
【００２０】
更に、好ましい態様では、本発明は、細胞が、不活性化されたａｖｅＣ対立遺伝子を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、ａｖｅＣ対立遺伝子を不活性化させるベクターで形質転換し、そして、ａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化された形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方法を提供する。
【００２１】
更に、本発明は、本発明の突然変異したヌクレオチド配列を含む任意のポリヌクレオチド分子又はベクターで形質転換された細胞を含む、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を提供する。好ましい態様では、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子の代わりに、あるいは、それに加えて、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する細胞を含む、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株（ここで、前記新規株の細胞は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比が異なるアベルメクチンを生成する）を提供する。より好ましい態様では、新規株の細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比が減少したアベルメクチンを生成する。前記新規株は、商業的に望ましいアベルメクチン（例えば、ドラメクチン）の大規模生産に有用である。
【００２２】
更に、好ましい態様では、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子の代わりに、あるいは、それに加えて、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物を発現する細胞［但し、前記遺伝子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞により生成されるアベルメクチンの量と比較して、異なる量のアベルメクチンの生成（細胞による）を引き起こす］を含む、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を提供する。好ましい態様では、前記新規細胞は、増加した量のアベルメクチンを生成する。
より好ましい態様では、本発明は、ａｖｅＣ遺伝子が不活性化されている細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を提供する。前記の株は、野生型株とは異なるアベルメクチン（前記株により生成される）のスペクトルと、アベルメクチン生成に影響を与えるａｖｅＣ遺伝子の標的突然変異誘発又はランダム突然変異誘発のいずれかを決定する本明細書に記載の相補性スクリーニングアッセイとの両方に有用である。
【００２３】
更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前記細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を変化させる遺伝子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する）を、その細胞によるアベルメクチンの生成を許容又は誘発する条件下で、培養培地中で培養し、そして、培養物からアベルメクチンを回収することを含む、アベルメクチンの製造方法を提供する。好ましい態様では、前記突然変異を発現する細胞によって生成されたアベルメクチンのクラス２：１比が、減少する。この製造方法は、商業的に価値のあるアベルメクチン（例えば、ドラメクチン）の生成における効率の増加を提供する。
【００２４】
更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前記細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物を発現することなく野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチン生成量の変化を引き起こす突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発現する）を、その細胞によるアベルメクチンの生成を許容又は誘発する条件下で、培養培地中で培養し、そして、培養物からアベルメクチンを回収することを含む、アベルメクチンの製造方法を提供する。好ましい態様では、前記の突然変異又は遺伝子構築物を発現する細胞によって生成されるアベルメクチンの量が、増加する。
【００２５】
更に、本発明は、本発明の突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株によって生成されるアベルメクチン（ここで、前記アベルメクチンは、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリスの同じ株の細胞により生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と比較して、減少したクラス２：１比で生成される）の新規組成物を提供する。前記の新規アベルメクチン組成物は、発酵培養液中で生成されたものとして存在するか、あるいは、それらから回収されたものであることができるか、そして、それらから部分的に又は実質的に精製したものであることができる。
【００２６】
４．図面の簡単な説明
図１．ストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦを含むＤＮＡ配列（配列表の配列番号１）及び推定されるアミノ酸配列（配列表の配列番号２）。
図２．ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ遺伝子の完全ＯＲＦを含むプラスミドベクターｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）。
図３．ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦ中に挿入された、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ
ｅｒｙｔｈｒａｅａ）のｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０５）。
図４．ストレプトミセス・アベルミティリス由来のアベルメクチンポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターのＢａｍＨＩ制限地図、及び同定された５種の重複コスミドクローン（すなわち、ｐＳＥ６５、ｐＳＥ６６、ｐＳＥ６７、ｐＳＥ６８、ｐＳＥ６９）。ｐＳＥ１１８とｐＳＥ１１９との関係も示す。
図５．ストレプトミセス・アベルミティリス株により生成された発酵生成物のＨＰＬＣ分析。ピークの定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較により実施した。シクロヘキシルＢ２の保持時間は、７．４〜７．７分間；シクロヘキシルＢ１の保持時間は、１１．９〜１２．３分間。図５Ａ．不活性ａｖｅＣ−ＯＲＦを有するストレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。図５Ｂ．ｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）で形質転換されたストレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。図５Ｃ．ｐＳＥ１８７で形質転換されたストレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。図５Ｄ．ｐＳＥ１８８で形質転換されたストレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。
図６．ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦでコードされる推定アミノ酸配列（ＳＥＣ  ＩＤ  ＮＯ：２）と、ストレプトミセス・グリセオクロモゲネス（ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のａｖｅＣ相同部分的ＯＲＦでコードされる推定アミノ酸配列（配列表の配列番号５）と、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来のａｖｅＣ相同ＯＲＦでコードされる推定アミノ酸配列（配列表の配列番号４）との比較。太字（ｂｏｌｄ）のバリン残基が、タンパク質の推定上のスタート部位である。保存されている残基を、３種の全ての配列で相同であれば大文字で示し、３種の配列の内、２つが相同であれば小文字で示す。アミノ酸配列は、約５０％の配列一致を含む。
図７．ストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦ中のＢｓａＡＩ／ＫｐｎＩ部位に挿入された、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスａｖｅＣ相同遺伝子由来の５６４ｂｐのＢｓａＡＩ／ＫｐｎＩフラグメントを含むハイブリッドプラスミド構築物。
【００２７】
５．発明の詳細な説明
本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス由来のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の同定及び特徴付け、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物を、アベルメクチン生成におけるそれらの効果に関してスクリーニングするのに用いることのできるストレプトミセス・アベルミティリスの新規株の構成、そして、或る突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物がストレプトミセス・アベルミティリスにより生成されるＢ１：Ｂ２アベルメクチンの比を減少することができるという発見に関する。例えば、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と同じヌクレオチド配列か、あるいは、図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に関して、そして、それから誘導される突然変異したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に関して、後出のセクションに本発明を記載している。しかしながら、本発明に記載の前記原理は、別のポリヌクレオチド分子、例えば、別のストレプトミセス種［例えば、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）及びストレプトミセス・グリセオクロモゲネス（ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）など］由来のＡｖｅＣ相同遺伝子にも同様に適用することができる。
【００２８】
５．１．ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド分子
本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスの完全ａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体部分を含む単離ポリヌクレオチド分子であって、前記単離ポリヌクレオチド分子が、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体において、生体内でａｖｅＣ−ＯＲＦの下流に位置する次の完全ＯＲＦを欠失する、前記単離ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２９】
本発明の前記の単離ポリヌクレオチド分子は、好ましくは、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と同じであるか、あるいは、図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦ又はその実体部分のヌクレオチド配列と同じであるヌクレオチド配列を含む。本明細書において、ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子の「実体部分」とは、図１（配列表の配列番号１）に示す完全ａｖｅＣ−ＯＲＦ配列の少なくとも約７０％を含み、しかも、機能的に等価なＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする単離ポリヌクレオチド分子を意味する。これに関連して、「機能的に等価な」ＡｖｅＣ遺伝子産物は、ストレプトミセス・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株（この株では、天然のａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されている）中で発現した場合に、野生型（ストレプトミセス・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株に天然の機能的ａｖｅＣ対立遺伝子）のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株によって生成されるアベルメクチンと実質的に同じ比及び量の生成を引き起こす遺伝子産物として規定される。
【００３０】
ａｖｅＣ−ＯＲＦのヌクレオチド配列に加えて、本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、更に、ストレプトミセス・アベルミティリスの生体内でａｖｅＣ遺伝子に天然に隣接しているヌクレオチド配列［例えば、図１（配列表の配列番号１）に示す隣接ヌクレオチド配列］を含むことができる。
【００３１】
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド分子」、「ポリヌクレオチド配列」、「コード配列」、「オープンリーディングフレーム」、及び「ＯＲＦ」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかであることができるＤＮＡ及びＲＮＡ分子を意味することを意図しており、そして、それらは、適当な調節要素の制御下に置かれた場合に、適当な宿主細胞発現系において、ＡｖｅＣ遺伝子産物に、あるいは、以下に示すように、ＡｖｅＣ相同遺伝子産物に、あるいは、ＡｖｅＣ遺伝子産物又はＡｖｅＣ相同遺伝子産物と相同なポリペプチドに、転写及び翻訳（ＤＮＡ）又は翻訳（ＲＮＡ）されることができる。コード配列には、原核配列、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、及び化学的に合成されたＤＮＡ及びＲＮＡ配列が含まれることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
図１（配列表の配列番号１）に示すヌクレオチド配列は、ｂｐ位置４２、１７４、１７７、及び１８０に、４個の異なるＧＴＧコドンを含む。後出のセクション９に記載されているように、ａｖｅＣ−ＯＲＦ（図１；配列表の配列番号１）の５’領域に複合的な欠失を構築することにより、それらのコドンのどれがａｖｅＣ−ＯＲＦ中でタンパク質発現に関するスタート部位として機能することができるかを規定した。ｂｐ４２における第１のＧＴＧ位置の欠失は、ＡｖｅＣ活性を消失しなかった。ｂｐ位置１７４、１７７、及び１８０における全てのＧＴＧコドンと一緒の更なる欠失は、ＡｖｅＣ活性を無くし、このことは、この領域がタンパク質の発現に必要であることを示している。従って、本発明は、図１（配列表の配列番号１）に示すｂｐ１７４、１７７、又は１８０ｂｐに位置する任意のＧＴＧ部位において翻訳を開始する種々の長さのａｖｅＣ−ＯＲＦ、及びそれぞれに対する相当するポリペプチドを含む。
【００３３】
更に、本発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列に対して、あるいは、図１（配列表の配列番号１）に示すａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体部分のヌクレオチド配列に対して、相同なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を提供する。用語「相同」とは、ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と相同なポリヌクレオチド分子に関して使用される場合には、以下のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味する：
（ａ）プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と同じＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするか、あるいは、図１（配列表の配列番号１）に示すＡｖｅＣ−ＯＲＦのヌクレオチド配列と同じＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするが、遺伝子コードの縮重によるヌクレオチド配列に対するサイレント変化１又はそれ以上を含むヌクレオチド配列；又は
（ｂ）プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列によってコードされるアミノ酸配列をコードするか、あるいは、図１（配列表の配列番号２）に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体に対して、適度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズ［すなわち、０．５Ｍ−ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中で、６５℃で、フィルター結合ＤＮＡへハイブリダイゼーションし、そして、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で４２℃で洗浄する］［Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．），１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ２．１０．３を参照のこと］し、しかも、先に規定した機能的等価ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列。
好ましい態様では、相同ポリヌクレオチド分子は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の相補体に対して、あるいは、図１（配列表の配列番号１）に示すヌクレオチド配列又はその実体部分の相補体に対して、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ［すなわち、０．５Ｍ−ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中で、６５℃で、フィルター結合ＤＮＡへハイブリダイゼーションし、そして、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃で洗浄する］（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９，前出）し、しかも、先に規定した機能的等価ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする。
【００３４】
ＡｖｅＣ遺伝子産物及びその潜在的機能的等価物の活性は、後出の実施例に記載のように、発酵生成物をＨＰＬＣ分析することによって決定することができる。ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物の機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子には、天然に現われるか設計されたかどうかに関わらず、ストレプトミセス・アベルミティリスの別の株に存在する天然に現われるＡｖｅＣ遺伝子、ストレプトミセスの別の種に存在するＡｖｅＣ相同遺伝子、及び突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子が含まれる。
【００３５】
更に、本発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、あるいは、図１（配列表の配列番号２）のアミノ酸配列又はその実体部分に対して、相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、図１（配列表の配列番号２）のアミノ酸配列の「実体部分」とは、図１（配列表の配列番号２）に示すアミノ酸配列の少なくとも約７０％を含み、しかも、先に規定した機能的等価ＡｖｅＣ遺伝子産物を構成するポリペプチドを意味する。
【００３６】
本明細書において、ストレプトミセス・アベルミティリス由来のＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を意味する場合の用語「相同」は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列によりコードされるか、あるいは、図１（配列表の配列番号２）のアミノ酸配列を有するが、その中のアミノ酸残基１又はそれ以上が、別のアミノ酸残基で保存的に（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ）置換されている（前記の保存的置換の結果、先に規定した機能的等価遺伝子産物が生じる）ポリペプチドを意味する。保存的アミノ酸置換は、当業者に周知である。前記の置換を実施するためのルールとしては、「Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，１９７８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｖｏｌ，５，Ｓｕｐ．３」などに記載のものを挙げることができる。より具体的には、保存的なアミノ酸置換は、側鎖の酸度、極性、又は嵩高さの関連するアミノ酸ファミリー内で一般的に起こるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般的に、４種に分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）荷電されていない極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。また、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、芳香族アミノ酸としてまとめて分類される。いずれかの特定の基内における１又はそれ以上の置換［例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの置換、あるいは、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、あるいは、セリンによるトレオニンの置換、あるいは、構造的に関連するアミノ酸残基（例えば、類似する酸度、極性、嵩高さ、又はそれらのいくつかの組合せにおける類似性を有するアミノ酸残基）による任意の別のアミノ酸残基の置換］が、一般的に、ポリペプチドの機能において些細な効果を有するであろう。
【００３７】
更に、本発明は、ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、「ＡｖｅＣ相同遺伝子産物」は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列によりコードされるアミノ酸配列、あるいは、図１（配列表の配列番号２）に示すアミノ酸配列を含むストレプトミセス・アベルミティリスのＡｖｅＣ遺伝子産物に対して、少なくとも約５０％のアミノ酸配列同一性を有する遺伝子産物として規定される。限定されない態様では、ＡｖｅＣ相同遺伝子産物が、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（欧州出願０２９８４２３に記載；寄託ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０１）由来であり、配列表の配列番号４のアミノ酸配列又はその実体部分を含む。配列表の配列番号４のアミノ酸配列の「実体部分」は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の少なくとも約７０％を含み、機能的等価ＡｖｅＣ相同体生成物を構成するポリペプチドを意味する。「機能的等価」ＡｖｅＣ相同遺伝子産物は、天然ａｖｅＣ相同対立遺伝子が不活性化されているストレプトミセス・ヒグロスコピカス株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０１中で発現した場合に、野生型（ストレプトミセス・ヒグロスコピカス株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０１に天然の機能的ａｖｅＣ相同対立遺伝子）のみを代わりに発現するストレプトミセス・ヒグロスコピカス株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０１によって生成されるミルベマイシンと実質的に同じ比及び量の生成を引き起こす遺伝子産物として規定される。限定されない態様では、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列表の配列番号３のヌクレオチド配列又はその実体部分を含む。これに関連して、配列表の配列番号３のヌクレオチド配列を含む単離ヌクレオチド分子の「実体部分」は、配列表の配列番号３のヌクレオチド配列の少なくとも７０％を含み、直前に規定した機能的等価ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする単離ポリヌクレオチド分子を意味する。
【００３８】
更に、本発明は、配列表の配列番号３のストレプトミセス・ヒグロスコピカスのヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド分子を提供する。用語「相同」は、配列表の配列番号３のストレプトミセス・ヒグロスコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする配列に相同なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を意味することに用いる場合には、以下のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味する：
（ａ）配列表の配列番号３のヌクレオチド配列又はその実体部分と同じ遺伝子産物をコードするが、遺伝子コードの縮重によるヌクレオチド配列に対するサイレント変化１又はそれ以上を含むヌクレオチド配列；又は
（ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の相補体に対して、適度なストリンジェントな条件下でハイブリダイズ［すなわち、０．５Ｍ−ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中で、６５℃で、フィルター結合ＤＮＡへハイブリダイゼーションし、そして、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で４２℃で洗浄する］（前出のＡｕｓｕｂｅｌら参照）し、しかも、先に規定した機能的等価ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列。
好ましい態様では、相同ポリヌクレオチド分子が、配列表の配列番号３のＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列又はその実体部分の相補体に対して、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ［すなわち、０．５Ｍ−ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中で、６５℃で、フィルター結合ＤＮＡへハイブリダイゼーションし、そして、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃で洗浄する］（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９，前出）し、しかも、先に規定した機能的等価ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする。
【００３９】
更に、本発明は、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産物と相同なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス由来の配列表の配列番号４のＡｖｅＣ相同遺伝子産物と相同なポリペプチドを意味する場合の用語「相同」は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するが、その中のアミノ酸残基１又はそれ以上が、別のアミノ酸残基で保存的に置換されている（前記の保存的置換の結果、先に規定した機能的等価相同遺伝子産物が生じる）ポリペプチドを意味する。
【００４０】
更に、本発明は、図１（配列表の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対して、あるいは、図１（配列表の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供する。前記オリゴヌクレオチドは、長さが、少なくとも約１０ヌクレオチド、好ましくは長さ約１５〜約３０ヌクレオチドであり、そして、高ストリンジェントな条件下で前記ポリヌクレオチド分子の１つとハイブリダイズ（すなわち、６×ＳＳＣ／０．５％ピロリン酸ナトリウム中で、〜１４塩基オリゴに対して〜３７℃で、〜１７塩基オリゴに対して〜４８℃で、〜２０塩基オリゴに対して〜５５℃で、そして、〜２３塩基オリゴに対して〜６０℃で洗浄する）する。好ましい態様では、前記オリゴヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチド分子の一つの一部と相補的である。これらのオリゴヌクレオチドは、種々の目的、例えば、遺伝子調節に有用なアンチセンス分子を、あるいは、ａｖｅＣ−又はａｖｅＣ相同体をコードするポリヌクレオチド分子の増幅におけるプライマーを、コード又は作用させる目的に有用である。
【００４１】
更なるａｖｅＣ相同遺伝子は、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子又はオリゴヌクレオチドを、公知の技術と関連させて使用することによって、ストレプトミセスの別の種又は株中で同定することができる。例えば、図１（配列表の配列番号１）のストレプトミセス・アベルミティリスのヌクレオチド配列の一部、又は配列表の配列番号３のストレプトミセス・ヒグロスコピカスのヌクレオチド配列の一部を含むオリゴヌクレオチド分子を、検出可能に標識化し、そして、興味ある生物由来のＤＮＡから構成されるゲノムライブラリーをスクリーニングすることに使用することができる。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、参考生物（本実施例では、ストレプトミセス・アベルミティリス又はストレプトミセス・ヒグロスコピカス）と興味ある生物との関係に基づいて選択する。種々のストリンジェンシー条件に対する要求は、当業者に周知であり、前記条件は、ライブラリー及び標識配列を提供する特定の生物に従って、予想可能に変化する。前記オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも約１５ヌクレオチドであることが好ましく、例えば、後出の実施例に記載のものを挙げることができる。相同遺伝子の増幅は、これらの及び別のオリゴヌクレオチドを使用し、標準的技術［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）］を適用することによって実施することができるが、当業界で公知の他の増幅技術（例えば、リガーゼ鎖反応）も用いることができる。
【００４２】
ａｖｅＣ相同ヌクレオチド配列を含むと確認されたクローンを、機能的ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする能力に関して試験することができる。この目的のために、前記クローンを、配列分析して、適当なリーディングフレーム、並びに開始及び終止信号を確認する。あるいは、又は更に、クローン化したＤＮＡ配列を適当な発現ベクター（すなわち、挿入したタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクター）中に挿入することができる。多様な宿主／ベクター系のいずれも、以下のとおりに用いることができ、以下に限定するものではないが、細菌に関する系、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、又はコスミド発現ベクターが含まれる。次に、潜在的なａｖｅＣ相同体をコードする配列を含む前記ベクターで形質転換された適当な宿主細胞を、例えば、後出のセクション７に記載のとおりに、発酵生成物をＨＰＬＣ分析する方法を用いて、ＡｖｅＣ−タイプ活性に関して分析することができる。
【００４３】
本明細書で開示するポリヌクレオチド分子の生成及び操作は、当業者の技術の範囲内であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｉｎｎｉｓら（ｅｄｓ），１９９５，ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；及びＥｒｌｉｃｈ（ｅｄ），１９９２，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（これらのすべては引用により、本明細書中に組込まれる）に記載の組換え技術に従って実施することができる。ＡｖｅＣ遺伝子産物又はＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドクローンは、当業者に公知の任意の方法（例えば、これに限定されないが、後出のセクション７に記載の方法）を用いて同定することができる。ゲノムＤＮＡライブラリーは、例えば、バクテリオファージライブラリーに関しては、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６：１８０及びプラスミドライブラリーに関しては、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ，１９７５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：３９６１−３９６５に記載の技術を用いて、ａｖｅＣ及びａｖｅＣ相同体をコードする配列に関してスクリーニングすることができる。ａｖｅＣ−ＯＲＦを含むことが知られているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子［例えば、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）又はプラスミドｐＳＥ１１９（後出のセクション７に記載）に存在する］は、それらのスクリーニング実験においてプローブとして使用することができる。あるいは、精製されたＡｖｅＣ相同遺伝子産物のアミノ酸配列の一部又は全体から推定されるヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドプローブを合成することができる。
【００４４】
５．２．組換え系
５．２．１．クローニング及び発現ベクター
更に、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子（例えば、ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦ又は任意のａｖｅＣ相同体ＯＲＦを含む）のクローニング又は発現に有用な、組換えクローニングベクター及び発現ベクターを供給する。非限定的な態様では、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ遺伝子の完全ＯＲＦを含むプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ
２０９６０４）を提供する。
ストレプトミセス・アベルミティリス由来のａｖｅＣ−ＯＲＦ、又はストレプトミセス・アベルミティリス由来のａｖｅＣ−ＯＲＦ若しくはその一部を含むポリヌクレオチド分子、又はストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物に関する以下の全ての記載は、特に断わらない限り、ａｖｅＣ相同体及びＡｖｅＣ相同遺伝子産物も意味する。
【００４５】
多様な種々のベクター、例えば、ファージ、高コピー数のプラスミド、低コピー数のプラスミド、及びＥ．ｃｏｌｉ−ストレプトミセスシャトルベクターなどが、ストレプトミセスにおける特定の使用のために開発されて来ており、そして、それらのいずれもが本発明の実施に使用することができる。また、多くの薬物耐性遺伝子がストレプトミセスからクローン化されており、それらの遺伝子のいくつかが選択マーカーとしてベクター中に組込まれている。ストレプトミセス中で使用するための現行のベクターの例が、他の場所（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，１９８０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１６９−１９０）に存在する。
【００４６】
本発明の組換えベクター（特に発現ベクター）は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチド分子のためのコード配列が、ポリペプチドを生成するためのコード配列の転写及び翻訳のために必要な調節要素１個以上と有効に関連して存在するよう構成される。本明細書において、用語「調節要素」には、以下に限定することなく、誘発性及び非誘発性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、並び他の要素をコードするヌクレオチド配列が含まれる。なお、前記の他の要素とは、ポリヌクレオチドをコードする配列の発現を誘導及び／又は調節するのに使用される当業者に公知の別の要素である。また、本明細書において、前記のコード配列は、調節要素１以上と「有効に関連」しており、ここで、前記調節要素は、前記コード配列の転写又はそのｍＲＮＡの翻訳、あるいはその両方を、有効に調節及び許容する。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチド分子を含むように設計することができる典型的なプラスミドベクターとしては、多くの別のものの中で、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びシャトルベクターｐＷＨＭ３（Ｖａｒａら，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７１：５８７２−５８８１）を挙げることができる。
【００４８】
適当な調節要素と有効に関連する特定のコード配列を含む組換えベクターの構築方法は、当業者に周知であり、それらを本発明の実施に用いることができる。これらの方法としては、例えば、イン・ビトロ組換え技術、合成技術、及びイン・ビボ遺伝的組換えを挙げることができる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９（前出）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９（前出）；及びＥｒｌｉｃｈ，１９９２（前出）に記載の技術を参照されたい。
【００４９】
これらのベクターの調節要素は、強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）及び特異性において変化させることができる。用いる宿主／ベクター系によって、多くの適当な転写及び翻訳要素の全てを使用することができる。細菌に関する転写調節領域又はプロモーターの非限定的な例としては、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、λレフト及びライトプロモーター、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターを挙げることができ、ストレプトミセスに関してより具体的には、プロモーターｅｒｍＥ、ｍｅｌＣ、及びｔｉｐＡなどを挙げることができる。後出のセクション１１に記載の特定の態様では、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ
ｅｒｙｔｈｒａｅａ）由来の強力な構成的ｅｒｍＥプロモーターに隣接してクローン化したＡｖｅＣ−ＯＲＦを含む発現ベクターを生成した。前記ベクターをストレプトミセス・アベルミティリス中に形質転換し、続いて発酵生成物をＨＰＬＣ分析したところ、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子を発現する同じ株によって生成されるアベルメクチンと比較して、生成されたアベルメクチンの量が増えていることが明らかになった。
【００５０】
融合タンパク質発現ベクターを、ＡｖｅＣ遺伝子産物−融合タンパク質を発現するために使用することができる。精製された融合タンパク質は、ＡｖｅＣ遺伝子産物に対する抗血清を生じせしめるために、ＡｖｅＣ遺伝子産物の生化学特性を研究するために、種々の生化学活性を有するＡｖｅＣ融合タンパク質を構築するために、あるいは、発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物の同定又は精製を助けるために、使用することができる。可能な融合タンパク質発現ベクターとしては、以下に限定されるものでなく、β−ガラクトシダーゼ及びｔｒｐＥ融合体、マルトース結合タンパク質融合体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合体、及びポリヒスチジン融合体（キャリヤー領域）をコードする配列が組込まれているベクターを含む。別の態様では、ＡｖｅＣ遺伝子産物又はその一部を、ストレプトミセスの別の種又は株［例えば、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス又はストレプトミセス・グリセオクロモゲネス（ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）］由来のＡｖｅＣ相同遺伝子産物又はその一部と融合させることができる。特に好ましい態様が、後出のセクション１２に記載されており、図７に記載されている。キメラプラスミドは、ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ−ＯＲＦの相同な５６４ｂｐ領域に換えて、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスａｖｅＣ相同ＯＲＦの５６４ｂｐ領域を含むように構築した。前記ハイブリッドベクターは、ストレプトミセス・アベルミティリス細胞に形質転換し、そして、それらの効果（例えば、生成されるアベルメクチンのクラス２：１比における効果）に関して試験することができる。
【００５１】
ＡｖｅＣ融合タンパク質は、精製のために有用な領域を含むように構築することができる。例えば、ＡｖｅＣ−マルトース−結合タンパク質融合体を、アミロース樹脂を用いて精製することができ；ＡｖｅＣ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオン−アガロースビーズを用いて精製することができ；そして、ＡｖｅＣ−ポリヒスチジン融合体を、２価のニッケル樹脂を用いて精製することができる。あるいは、担体タンパク質又はペプチドに対する抗体を、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製に使用することができる。例えば、モノクローナル抗体の標的エピトープをコードするヌクレオチド配列を、調節要素と有効に関連する発現ベクター中に構築し、そして発現されるエピトープがＡｖｅＣポリペプチドに融合するように位置決定することができる。例えば、親水性マーカーペプチドであるＦＬＡＧTMエピトープタグ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）をコードするヌクレオチド配列は、標準技術により、相当する位置（例えば、ＡｖｅＣポリペプチドのカルボキシル末端）で発現ベクター中に挿入することができる。次に、発現したＡｖｅＣポリペプチド−ＦＬＡＧTMエピトープ融合生成物を検出し、そして市販の抗−ＦＬＡＧTM抗体を用いてアフィニティー精製することができる。
【００５２】
また、ＡｖｅＣ融合タンパク質をコードする発現ベクターは、特定のプロテアーゼ切断部位をコードするポリリンカー配列を含むよう構築することができ、その結果、発現したＡｖｅＣポリペプチドは、特定のプロテアーゼによる処理により担持領域又は融合パートナーから開放されることができる。例えば、融合タンパク質ベクターは、特には、トロンビン又はＸａ因子切断部位をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。
ａｖｅＣ−ＯＲＦの上流に（ａｖｅＣ−ＯＲＦとリーディングフレームとなるように）存在するシグナル配列は、公知の方法により、発現される遺伝子産物の転送（トラフィキング）及び分泌を指図するために、発現ベクター中に構築することができる。シグナル配列の非制限的な例としては、特には、α−因子、免疫グロブリン、外層膜タンパク質、ペニシリナーゼ、及びＴ−細胞受容体由来のものを挙げることができる。
【００５３】
本発明のクローニング又は発現ベクターにより形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を助けるために、ベクターを、更にレポーター遺伝子産物又は他の選択マーカーのためのコード配列を含むように構築することができる。そのようなコード配列は、前記の調節要素をコードする配列と有効に関連して存在することが好ましい。本発明において有用なレポーター遺伝子は、当業界において周知であり、例えば、特には、緑色螢光タンパク質、ルシフェラーゼ、ｘｙｌＥ、及びチロシナーゼをコードするものを挙げることができる。選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、当業界において周知であり、抗生物質又は抗−代謝物に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードするか、あるいは、栄養要求性必要条件を供給するものが含まれる。前記配列の例には、特には、エリスロマイシン、チオストレプトン、又はカナマイシンに対する耐性をコードするものが含まれる。
【００５４】
５．２．２．宿主細胞の形質転換
更に、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子又は組換えベクターを含む形質転換された宿主細胞、及びそれらから誘導される新規株又は細胞系を供給する。本発明の実施において有用な宿主細胞は、好ましくは、ストレプトミセス細胞であるが、但し、他の原核細胞又は真核細胞も使用することができる。典型的には、前記の形質転換された宿主細胞としては、以下に限定されずに、特には、微生物、例えば、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、若しくはコスミドＤＮＡベクターにより形質転換された細菌、又は組換えベクターで形質転換された酵母が含まれる。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチド分子は、ストレプトミセス細胞において機能するよう意図されるが、しかしまた、例えば、クローニング又は発現目的のために、他の細菌又は真核細胞中に形質転換されることができる。典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉの株、例えば、ＤＨ５α株［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ（受託番号３１３４３）又は市場（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手することができる］を使用することができる。好ましい真核宿主細胞としては、酵母細胞を挙げることができるが、哺乳類細胞又は昆虫細胞も効果的に使用することができる。
【００５６】
本発明の組換え発現ベクターは、好ましくは、実質的に均質の細胞培養物の宿主細胞１個以上を形質転換又はトランスフェクトする。発現ベクターは、一般的に、公知技術（例えば、プロトプラスト形質転換、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、組換えウィルスとの接触によるトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、トランスダクション、接合、又はマイクロプロジェクティル衝撃）に従って、宿主細胞中に導入する。形質転換体の選択は、標準的手順、例えば、選択マーカー（例えば、前記のように、組換えベクターと関連する耐抗生物質性）を発現する細胞に関する選択により実施することができる。
【００５７】
発現ベクターが宿主細胞中に導入されているならば、宿主細胞染色体における又はエピソームにおける、ａｖｅＣコード配列の組込み及び維持を、標準的技術、例えば、サザンハイブリダイゼーション分析、制限酵素分析、ＰＣＲ分析［逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含む］により、あるいは、予測される遺伝子産物を検出する免疫学的アッセイにより確かめることができる。組換えａｖｅＣコード配列を含む及び／又は発現する宿主細胞は、少なくとも４種の当業界で周知の一般的アプローチのいずれかによって同定することができる：（ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡ、又はＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション；（ii）「マーカー」遺伝子機能の存在の検出；（iii) 宿主細胞におけるａｖｅＣ−特異的ｍＲＮＡ転写体の発現により測定されるような転写のレベルの評価；及び（iv）例えば、イムノアッセイにより、又はＡｖｅＣ生物学的活性（例えば、例えばストレプトミセス・アベルミティリス宿主細胞におけるＡｖｅＣ活性を啓示する、アベルメクチン生産の特異的な割合及び量）の存在によって測定される成熟ポリペプチド生成物の存在の検出。
【００５８】
５．２．３．組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の発現及び特徴付け
ａｖｅＣコード配列が適当な宿主細胞中に安定して導入されているならば、形質転換された細胞宿主がクローン的に増殖され、そしてその得られる細胞は、ａｖｅＣ遺伝子産物の最大生成の助けとなる条件下で増殖させることができる。前記条件は、典型的には、細胞の高密度への増殖が含まれる。発現ベクターが誘発性プロモーターを含む場合、適当な誘発条件、例えば、温度シフト、栄養物の消耗、余計な誘発物質［例えば、炭水化物の類似体、例えばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）］の添加、又は過剰代謝副生成物の蓄積などが、発現を誘発する必要がある場合に使用される。
【００５９】
発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が宿主細胞内に保持される場合、細胞を、収穫及び溶解し、そしてその溶解物から、タンパク質分解を最少にするための当業界で公知の抽出条件（例えば、４℃で、又はプロテアーゼ阻害剤の存在下で、あるいはその両方）において、生成物を単離及び精製する。発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が宿主細胞から分泌される場合、消耗された栄養培地を単純に収集し、そしてそれから生成物を単離することができる。
【００６０】
発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物は、所望により、標準的方法、例えば、以下に限定するものでないが、以下の方法（すなわち、硫酸アンモニウム沈殿、サイズ分別、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離、及びアフィニティークロマトグラフィー）の任意の組み合わせを用いて、細胞溶解物又は培養培地から単離又は実質的に精製することができる。発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が生物学的活性を示す場合、適切なアッセイを用いることによって、調製物の上昇する純度を、精製手順の各工程で観視することができる。発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が生物学的活性を示すか示さないにかかわらず、例えば、サイズにより、あるいは、さもなければＡｖｅＣに対して特異的な抗体との反応性に基づいて、あるいは、融合タグの存在により検出することができる。
【００６１】
従って、本発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列によってコードされるアミノ酸配列を、あるいは、図１（配列表の配列番号２）のアミノ酸配列又はその実体部分を含む組み換え発現したストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物、及びその相同体を提供する。
更に、本発明は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列又はその実体部分を含む組み換え発現したストレプトミセス・ヒグロスコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産物及びその相同体を提供する。
【００６２】
更に、本発明は、組換え発現ベクター［前記ベクターは、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含み、前記ポリヌクレオチド分子は、宿主細胞中における前記ポリヌクレオチド分子の発現を制御する調節要素１種以上と有効な関係がある］で形質転換した宿主細胞を、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の生成を促す条件下で培養し、そしてその細胞培養物からＡｖｅＣ遺伝子産物を回収することを含む、ＡｖｅＣ遺伝子産物の製造方法を提供する。
【００６３】
前記の組み替え発現ストレプトミセス・アベルミティリスＡＶＥｃ遺伝子産物は、種々の目的（例えば、ＡｖｅＣ遺伝子生成機能を変化させ、それにより、アベルメクチン生合成を調整する化合物をスクリーニングする目的、及びＡｖｅＣ遺伝子産物に対する抗体を生じさせる目的）に有用である。
【００６４】
充分な純度のＡｖｅＣ遺伝子産物が得られれば、それを、標準的方法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列分析、アベルメクチン生合成経路における適当な生成物の生成における生物学的活性など）によって特徴付けることができる。例えば、ＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸配列を、標準的ペプチド配列決定技術を用いて決定することができる。更に、ＡｖｅＣ遺伝子産物の疎水性及び親水性領域を同定するために、ＡｖｅＣ遺伝子産物を、親水性分析（例えば、Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４を参照されたい）、又は類似ソフトウェアアルゴリズムを用いて特徴付けることができる。特定の二次構造を想定するＡｖｅＣ遺伝子産物の領域を同定するために、構造分析を実施することができる。ＡｖｅＣ遺伝子産物とその基質との間の相互作用の部位をマッピング及び研究するために、生物物理学的方法、例えばＸ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１１：７−１３）、コンピューターモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｚｏｌｌｅｒ（ｅｄｓ），１９８６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用することができる。それらの研究から得られる情報は、より所望するアベルメクチン生成特徴を有するストレプトミセス・アベルミティリスの新菌株の開発を助けるために、ＡｖｅＣのＯＲＦにおける突然変異のための新規部位を選択するために使用することができる。
【００６５】
５．３．ＡｖｅＣ突然変異体の構成及び使用
本発明は、突然変異１又はそれ以上を更に含む（そのため、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されており、しかも、突然変異したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子が発現しているストレプトミセス・アベルミティリス株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリス株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞によって生成されるものと異なる割合及び量でアベルメクチンを生成する）こと以外は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスのＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と、あるいは、図１（配列表の配列番号１）に示すストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦのヌクレオチド配列と同じであるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。
【００６６】
本発明によれば、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株と比較して、アベルメクチン生成における検出可能な変化を示すＳ．アベルメクチンの新規株を製造するために、前記ポリヌクレオチド分子を用いることができる。好ましい態様では、前記ポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株と比較して、減少したクラス２：１比でアベルメクチンを生成するＳ．アベルメクチンの新規株を製造することに有用である。更に好ましい態様では、前記ポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株と比較して、増加したレベルでアベルメクチンを生成するＳ．アベルメクチンの新規株を製造することに有用である。更に好ましい態様では、前記ポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＣ遺伝子が不活性化されているストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を製造することに有用である。
【００６７】
ａｖｅＣコード配列に対する突然変異には、ＡｖｅＣ遺伝子産物にアミノ酸の欠失、付加、又は置換を起こさせるか、あるいは、ＡｖｅＣ遺伝子産物のトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を引き起こし（又はそれらの任意の組み合わせ）、しかも、所望の結果が得られる任意の突然変異が含まれる。例えば、本発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列、又は図１（配列表の配列番号１）に示すストレプトミセス・アベルミティリスのＡｖｅＣ−ＯＲＦのヌクレオチド配列を含むが、更に、ＡｖｅＣ遺伝子産物中の選択した位置において或るアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換されることをコードする突然変異１又はそれ以上を含む、ポリヌクレオチド分子を提供する。後に例示するいくつかの非限定的な態様では、前記置換を、５５、１３８、１３９、又は２３０のアミノ酸位置、又はそれらのいくつかの組み合わせにおいて実施することができる。
【００６８】
ａｖｅＣコード配列に対する突然変異は、種々公知の方法によって（例えば、エラー傾向ＰＣＲ又はカセット突然変異誘発を用いることによって）、実施することができる。例えば、オリゴヌクレオチド演出（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発を、明らかにされた方法（例えば、制限部位又は終始コドン１以上をＡｖｅＣ−ＯＲＦ配列中の特定の領域に導入する方法）で、ａｖｅＣ−ＯＲＦ配列を変化させることに用いることができる。例えば、米国特許５６０５７９３に記載の方法（ランダムフラグメンテーション、突然変異誘発の繰り返しサイクル、及びヌクレオチドシャッフリングを含む）も、ａｖｅＣ突然変異をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの大きなライブラリーを形成することに用いることができる。
【００６９】
標的突然変異は、有用であることができ、特に、ＡｖｅＣ遺伝子産物における保存されたアミノ酸残基１以上を変化させるためにそれらを役立たせる場合に有用である。例えば、図６に示すように、ＡｖｅＣ遺伝子産物の推定アミノ酸配列と、ストレプトミセス・アベルミティリス（配列表の配列番号２）、ストレプトミセス・グリセオクロモゲネス（配列表の配列番号５）、及びストレプトミセス・ヒグロスコピカス（配列表の配列番号４）由来のＡｖｅＣ相同遺伝子産物との比較は、それらの種の間のアミノ酸残基の重要な保存の位置を明らかにする。これらの保存されたアミノ酸残基１個以上において変化をもたらす標的突然変異誘発は、アベルメクチン生成において所望の変化を示す新規変異株を製造することに特に有効であることができる。
【００７０】
また、ランダム突然変異誘発も、有用であることができ、そして紫外線若しくはＸ線、又は化学的突然変異誘発物質（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、亜硝酸、又は窒素マスタード）にストレプトミセス・アベルミティリスの細胞をさらすことによって実施することができる。例えば、突然変異誘発技術の参考用に、Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８９（前出）を参照されたい。
【００７１】
突然変異したポリヌクレオチド分子が生成したならば、それらをスクリーニングして、それらがストレプトミセス・アベルミティリスにおけるアベルメクチン生合成を調整できるか否かを決定する。好ましい態様では、突然変異したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を、ａｖｅＣ遺伝子が不活性化することによりａｖｅＣ陰性（ａｖｅＣ’）背景（ａｖｅＣ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を示すストレプトミセス・アベルミティリス株における補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）によって試験する。非限定的な方法では、突然変異したポリヌクレオチド分子を、調節要素１種以上と有効に関連する発現プラスミド（このプラスミドは、形質転換した細胞を選択可能な薬剤耐性遺伝子１種以上も含むことが好ましい）中にスプライスさせる。次に、このベクターを、公知技術を用いてａｖｅＣ宿主細胞中に形質転換させ、そして形質転換した細胞を、適当な発酵培地中で、アベルメクチン生成を許容又は誘発する条件下で、選択及び培養する。次に、発酵生成物を、ＨＰＬＣによって分析して、突然変異したポリヌクレオチド分子が宿主細胞を補完する能力を決定する。アベルメクチンのＢ２：Ｂ１比を減少させることのできる突然変異したポリヌクレオチド分子を担持するいくつかのベクター（例えば、ｐＳＥ１８８、ｐＳＥ１９９、及びｐＳＥ２３１）を、後出のセクション８．３に例示する。
【００７２】
本発明は、生成されるアベルメクチンの比及び／又は量を変えることのできるストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦにおける突然変異の同定方法を提供する。好ましい態様では、本発明は、（ａ）天然のａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されており、しかも、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子が導入されて発現しているストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を決定し；（ｂ）図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌクレオチド配列、あるいは、それに相同なヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現すること以外は、工程（ａ）と同じストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を決定し；そして、（ｃ）工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比とを比較し；工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比とが異なる場合に、アベルメクチンのクラス２：１比を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦの突然変異を同定することを含む、生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦの突然変異を同定する方法を提供する。好ましい態様では、突然変異によってアベルメクチンのクラス２：１比が減少する。
【００７３】
更に好ましい態様では、本発明は、（ａ）天然のａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されており、しかも、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むか、あるいは、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド分子が導入されて発現しているストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量を決定し；（ｂ）図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌクレオチド配列、あるいは、それに相同なヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現すること以外は、工程（ａ）と同じストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量を決定し；そして、（ｃ）工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンの量と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンの量とを比較し；工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンの量と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンの量とが異なる場合に、アベルメクチンの量を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦ又は遺伝子構築物の突然変異を同定することを含む、生成されるアベルメクチンの量を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦ又はａｖｅＣ−ＯＲＦを含む遺伝子構築物の突然変異を同定する方法を提供する。
【００７４】
突然変異を同定するための前記の全ての方法は、発酵培養培地（好ましくは、シクロヘキサンカルボン酸を補充した発酵培養培地）を用いることによって実施するが、別の適当な脂肪酸前駆体（例えば、表１に挙げた脂肪酸前駆体）も用いることができる。
【００７５】
所望の方向のアベルメクチン生成を調整する突然変異されたポリヌクレオチド分子が同定されているならば、そのヌクレオチド配列における突然変異の位置を決定することができる。例えば、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を、ＰＣＲによって単離し、そして公知の方法を用いてＤＮＡ配列分析を行うことができる。突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子のＤＮＡ配列と、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のＤＮＡ配列とを比較することによって、アベルメクチン生成における変化に関する突然変異反応性を決定することができる。具体的であるが非限定的な本発明の態様では、５５（Ｓ５５Ｆ）、１３８（Ｓ１３８Ｔ）、１３９（Ａ１３９Ｔ）、若しくは２３０（Ｇ２３０Ｇ）の任意の残基における単独のアミノ酸の置換、又は１３８（Ｓ１３８Ｔ）及び１３９（Ａ１３９Ｔ）位置における二重置換のいずれかを含むストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物は、ＡｖｅＣ遺伝子産物の機能における変化を生じた。例えば、生成されるクラス２：１アベルメクチンの比が変わった（後出のセクション８を参照されたい）。従って、５５、１３８、１３９、又は２３０のアミノ酸残基１以上又はそれらの任意の組み合わせにおけるアミノ酸置換を含む突然変異したストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子は、本発明に含まれる。
【００７６】
更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株（その細胞は、アベルメクチン生成を変化させる結果となる突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子を含む）を製造するための組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の突然変異ヌクレオチド配列を含む全てのポリヌクレオチド分子を、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体のＡｖｅＣ遺伝子の部位に向かわせることにより、相同組換えによるａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその一部を挿入又は置換するのに使用することのできる組み換えベクターを提供する。しかしながら、本発明によれば、これと共に提供された本発明の突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体中のａｖｅＣ遺伝子以外の部位に挿入された場合、あるいは、ストレプトミセス・アベルミティリス細胞中でエピソーム的に維持された場合に、アベルメクチン生合成を調整するように機能することもできる。従って、本発明は、本発明の突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターも提供する。前記ベクターは、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体中のａｖｅＣ遺伝子以外の部位にポリヌクレオチド分子を挿入するために、あるいは、エピソーム的に維持するために用いることができる。
【００７７】
好ましい態様では、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスの株の細胞中に突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を挿入して、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株（その細胞は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、異なるクラス２：１比でアベルメクチンを生成する）を生成するのに用いることができる遺伝子置換ベクターを提供する。好ましい態様では、前記細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比が減少する。前記遺伝子置換ベクターは、これと共に提供される発現ベクター、例えばｐＳＥ１８８、ｐＳＥ１９９、及びｐＳＥ２３１（これらの発現ベクターは、後出のセクション８．３中に例示されている）中に存在する突然変異したポリヌクレオチド分子を用いて構築することができる。
【００７８】
更に好ましい態様では、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、異なる量のアベルメクチンを生成する新規株を生成するために、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞中に突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を挿入するのに用いることのできるベクターを提供する。好ましい態様では、前記細胞によって生成されるアベルメクチンの量が増加する。具体的であるが非限定的な態様では、前記ベクターは、更に、当業者に公知の強力なプロモーター、例えば、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）由来の強力な構成的ｅｒｍＥプロモーター（これは、ａｖｅＣ−ＯＲＦの上流に位置し、そしてａｖｅＣ−ＯＲＦと有効に関連している）を含む。前記ベクターは、プラスミドｐＳＥ１８９（後出の実施例１１に記載）であることができるか、あるいは、プラスミドｐＳＥ１８９の突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を用いて構築することができる。
【００７９】
更に好ましい態様では、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスの野生型株におけるａｖｅＣ遺伝子を不活性化することに有用な遺伝子置換ベクターを提供する。非限定的な態様では、前記遺伝子置換ベクターを、プラスミドｐＳＥ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）［これは、後出のセクション８．１で例示されている（図３）］中に存在する突然変異したポリヌクレオチド分子を用いて構築することができる。更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体において、生体内でＡｖｅＣ遺伝子に天然に隣接するヌクレオチド配列［例えば、図１（配列表の配列番号１）に示す隣接ヌクレオチド配列］からなるか、あるいは、それを含むポリヌクレオチド分子を含む遺伝子置換ベクターを提供する。このベクターは、ストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦを欠失させることに用いることができる。
【００８０】
更に、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、しかも、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリスの同じ株と比較して異なる比及び／又は量でアベルメクチンを生成する細胞を含む、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株の製造方法を提供する。好ましい態様では、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、しかも、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリスの同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比が異なるアベルメクチンを生成する細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子（但し、前記遺伝子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を変化させる遺伝子産物をコードする）を担持するベクターによって形質転換し、そして、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する株の細胞により生成されるクラス２：１比と比較して、クラス２：１比が異なるアベルメクチンを生成する形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方法を提供する。好ましい態様では、アベルメクチンの変化したクラス２：１比が、減少する。
【００８１】
更に好ましい態様では、本発明は、異なる量のアベルメクチンを生成する細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって、
ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物（但し、その発現の結果、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、変化する）を担持するベクターによって形質転換し、そして、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する株の細胞により生成されるアベルメクチンの量と比較して、異なる量のアベルメクチンを生成する形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方法を提供する。好ましい態様では、形質転換細胞において生成されるアベルメクチンの量が、増加する。
【００８２】
更に好ましい態様では、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリスの株の細胞を、ａｖｅＣ対立遺伝子を不活性化するベクターで形質転換し、そしてａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されている形質転換細胞を選択することを含む、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株（その細胞は、不活性化したａｖｅＣ対立遺伝子を含む）の製造方法を提供する。好ましいが非限定的な態様では、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異によって、あるいは、異種遺伝子配列によるａｖｅＣ対立遺伝子の一部の置換によって不活性化されたａｖｅＣ対立遺伝子を担持する遺伝子置換ベクターで形質転換し、そして形質転換細胞（その細胞の天然ａｖｅＣ対立遺伝子は、不活性化ａｖｅＣ対立遺伝子で置換されている）を選択する。ａｖｅＣ対立遺伝子の不活性化は、発酵生成物のＨＰＬＣ分析（後出）によって決定することができる。後出のセクション８．１に記載の具体的であるが非限定的な態様では、ａｖｅＣ−ＯＲＦ中に、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）由来のｅｒｍＥ遺伝子を挿入することによって、ａｖｅＣ対立遺伝子を不活性化する。
【００８３】
更に、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子又はベクターのいずれかで形質転換された細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を提供する。好ましい態様では、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子の代わりに、又は野生型ａｖｅＣ対立遺伝子に加えて、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリスの新規株（ここで、前記新規株の細胞は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と比較して、異なるクラス２：１比でアベルメクチンを生成する）を提供する。好ましい態様では、前記の新規細胞によって生成される異なったクラス２：１比が、減少する。前記の新規株は、商業的に望ましいアベルメクチン（例えば、ドラメクチン）の大規模生産に有用である。
【００８４】
本明細書に記載のスクリーニングアッセイの第１の目的は、ストレプトミセス・アベルミティリス細胞中で発現することによって、生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を変化させる（特には、減少させる）ａｖｅＣ遺伝子の突然変異した対立遺伝子を同定することにある。好ましい態様では、生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を減少させる突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現している本発明のストレプトミセス・アベルミティリスの新規株の細胞によって生成されるＢ２：Ｂ１アベルメクチンの比は、１．６：１未満〜約０：１の間であり；より好ましい態様では、前記割合は、約１：１〜約０：１の間であり；そして最も好ましい態様では、前記割合は、約０．８４：１〜約０：１である。後出の具体的な態様では、本発明の新規細胞は、１．６：１未満の比で、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する。別の後出の具体的な態様では、本発明の新規細胞は、約０．９４：１の比で、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する。更に別の後出の具体的な態様では、本発明の新規細胞は、約０．８８：１の割合で、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する。更に別の後出の具体的な態様では、本発明の新規細胞は、約０．８４：１の割合で、シクロヘキシル２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する。
【００８５】
更に好ましい態様では、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子に代えて、あるいは、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子に加えて、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物（これにより、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、異なる量で、前記の新規株の細胞がアベルメクチンを生成する）を発現する細胞を含む、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規菌株を提供する。好ましい態様では、前記の新規株は、アベルメクチンを増加した量で生成する。非限定的な態様では、前記の遺伝子構築物は、更に、強力なプロモーター（例えば、ａｖｅＣ−ＯＲＦの上流に位置し、そしてａｖｅＣ−ＯＲＦと有効に関連している、サッカロポリスポラ・エリスラエア由来の強力な構成的ｅｒｍＥプロモーター）を含む。
【００８６】
更に好ましい態様では、本発明は、ａｖｅＣ遺伝子が不活性化されている細胞を含有する、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を提供する。前記株は、野生型株とは異なるアベルメクチン（前記株により生成される）のスペクトルと、アベルメクチン生成に影響を与えるａｖｅＣ遺伝子の標的突然変異誘発又はランダム突然変異誘発のいずれかを決定する本明細書に記載の相補性スクリーニングアッセイとの両方に有用である。後出の具体的態様では、ストレプトミセス・アベルミティリス宿主細胞を、不活性化ａｖｅＣ遺伝子を含有するように遺伝子的に設計した。例えば、ａｖｅＣコード領域中にｅｒｍＥ耐性遺伝子を挿入することによってストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ遺伝子が不活性化するように構築した遺伝子置換プラスミドｐＳＥ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）（図３）を用いて、株ＳＥ１８０−１１（後出の実施例に記載）を生成した。
【００８７】
更に、本発明は、本発明の任意の前記ポリヌクレオチド分子でコードされ、組換え発現し、突然変異した、ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物、及びその製造方法を提供する。
【００８８】
更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前記細胞は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を変化させる遺伝子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する）を、その細胞によるアベルメクチンの生成を許容又は誘発する条件下で、培養培地中で培養し、そして、培養物からアベルメクチンを回収することを含む、アベルメクチンの製造方法を提供する。好ましい態様では、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する細胞により培養物中で生成されるアベルメクチンのクラス２：１比が、減少する。この製造方法は、商業的に価値のあるアベルメクチン（例えば、ドラメクチン）の生成における効率の増加を提供する。
【００８９】
更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前記細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物を発現することなく野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチン生成量の変化を引き起こす突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発現する）を、その細胞によるアベルメクチンの生成を許容又は誘発する条件下で、培養培地中で培養し、そして、培養物からアベルメクチンを回収することを含む、アベルメクチンの製造方法を提供する。好ましい態様では、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発現する細胞により培養物中で生成されるアベルメクチンの量が、増加する。
【００９０】
更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス株（但し、前記株は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を減少させる遺伝子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する）により生成されたアベルメクチンの新規組成物であって、前記新規組成物中の前記アベルメクチンが、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリスの同じ株の細胞により生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と比較して、減少したクラス２：１比で生成される、前記組成物を提供する。前記新規アベルメクチン組成物は、消耗された発酵培養液中で生成されたものとして存在することができるか、あるいは、それらから収集することができる。前記新規アベルメクチン組成物は、公知の生化学的精製技法（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、サイズ分別、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなど）によって、培養液から部分的に又は実質的に精製することができる。
【００９１】
５．４．アベルメクチンの使用
アベルメクチンは、駆虫剤（ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ）、外部殺虫剤（ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃｉｄｅ）、殺虫剤（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ）、及びダニ駆虫剤（ａｃａｒｉｃｉｄｅ）としての特別な利用性を有する高活性の抗寄生生物剤である。そして本発明の方法によって生成されるアベルメクチン化合物は、それらの目的のすべてに有用である。例えば、本発明によって生成されるアベルメクチンは、ヒトにおける種々の疾患又は状態を治療するために（特に、前記の疾患又は状態が、当業界で公知の寄生生物感染により引き起こされる場合に）有用である。例えば、Ｉｋｅｄａ及びＯｍｕｒａ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７（７）：２５９１−２６０９を参照されたい。より具体的には、本発明に従って調製されるアベルメクチン化合物は、ヒト、家畜、ブタ、ヒツジ、家禽、ウマ、又はウシに感染することができる内部寄生生物（例えば、寄生性線虫）により引き起こされる種々の疾患及び状態の治療において効果的である。
【００９２】
より具体的には、本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物は、ヒトに感染する線虫及び種々の動物種に感染する線虫に効果的である。前記線虫としては、胃腸寄生生物［例えば、アンシロストマ（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）、ネカトール（Ｎｅｃａｔｏｒ）、アスカリス（Ａｓｃａｒｉｓ）、ストロンギロイデス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）、トリキネラ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、カピラリア（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）、トリクリス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、エンテロビウス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）、ジロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）］、及び血液又は他の組織若しくは器官に見出される寄生生物［例えば、フィラリア属の虫（ｆｉｌａｒｉａｌ  ｗｏｒｍ）、並びにストロンギロイデス及びトリキネラの抽出腸状態］を含む。
【００９３】
また、本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物は、外部寄生生物感染［例えば、特には、マダニ、ダニ、シラミ、ノミ、ハエ（ｂｌｏｗｆｌｙ）、刺傷昆虫、あるいは、牛及び馬に影響することができる移動性双翅類幼虫により引き起こされる、哺乳類及び鳥類の節足動物侵入］の治療においても有用である。
【００９４】
また、本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物は、屋内害虫（例えば、特には、ゴキブリ、蛾、カーペットビートル、及びイエバエ）、並びに保存穀物及び農作物を害する昆虫［例えば、クモダニ（ｓｐｉｄｅｒ  ｍｉｔｅ）、アリマキ、イモムシ、及び直翅類（例えば、特にはバッタ）］に対する殺虫剤としても有用である。
【００９５】
本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物により処理されることのできる動物には、ヒツジ、ウシ、ウマ、シカ、ヤギ、ブタ、鳥（家禽を含む）、並びに犬及びネコが含まれる。
【００９６】
本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物は、意図された特定の使用、治療される宿主動物の個々の種、及び関連する寄生生物又は昆虫に適切な製剤中で投与される。殺寄生生物剤（ｐａｒａｓｉｔｉｃｉｄｅ）としての使用のためには、本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物を、カプセル、ボーラス、錠剤、又は液体飲剤の形で経口投与することもできるし、あるいは、ポア−オン（ｐｏｕｒ−ｏｎ）として、注射により、又は移植物として投与することもできる。前記製剤は、標準的獣医学的手法に従って、通常の方法で調製される。従って、活性成分と微細に分割された適当な希釈剤又は担体とを混合し、更に、崩壊剤及び／又は結合剤（例えば、スターチ、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウムなど）を含むことによって、前記カプセル、ボーラス、又は錠剤を調製することができる。飲用製剤は、分散又は湿潤剤などと共に、活性成分を水溶液中に分散させることによって調製することができる。注射用製剤は、溶液を血液と等張にするための他の物質（例えば、充分な塩及び／又はグルコース）を含むことができる無菌溶液の形態で調製することができる。
【００９７】
前記製剤は、患者、又は処理される宿主動物の種類、感染の重篤度及びタイプ、並びに宿主の体重によって、活性化合物の重量に関して変化するであろう。一般的に、経口投与のためには、１〜５日間に対する単独投与量又は分割投与量として、患者又は動物体重１ｋｇ当たり約０．００１〜１０ｍｇの活性化合物の用量が満足のいくものであろう。しかしながら、臨床学的症状に基づいて、例えば医者又は獣医が決定するような、より高いか又はより低い投与量範囲が示される場合が存在する。
【００９８】
あるいは、本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物を、動物飼料と組み合わせて投与することができ、そしてこの目的のために、通常の動物用飼料と共に混合するための、濃縮された飼料添加物又はプレミックスを調製することができる。
【００９９】
殺虫剤としての使用、及び農業用害虫の処理用に、本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物を、標準的農業手法に従って、噴霧、微粉末、及びエマルジョンなどとして適用することができる。
【実施例】
【０１００】
６．実施例：ストレプトミセス・アベルミチリスの発酵及びＢ２：Ｂ１アベルメクチン分析
分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性及び５−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性の両方を欠いている菌株は、発酵培地に脂肪酸が補充されていない場合に、アベルメクチンを生産しない。本実施例は、かかる突然変異体において生合成が種々の脂肪酸の存在下で開始される場合に、広範囲のＢ２：Ｂ１比のアベルメクチンを得ることができることを証明するものである。
【０１０１】
６．１．材料及び方法
ストレプトミセス・アベルミチリスＡＴＣＣ５３６９２を、スターチ（Ｓｔａｒｃｈ）［ナデックス（Ｎａｄｅｘ），レイン・ナショナル（Ｌａｉｎｇ  Ｎａｔｉｏｎａｌ）］２０ｇ；ファーマメディア（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）［トレーダーズ・プロテイン（Ｔｒａｄｅｒ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ），テネシー州メンフィス］１５ｇ；アルダミンｐＨ（Ａｒｄａｍｉｎｅ  ｐＨ）［イースト・プロダクツ社（Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．）］５ｇ；炭酸カルシウム１ｇからなる種培地中に調製した完全ブロスとして−７０℃で保存した。最終容量は、生水（ｔａｐ  ｗａｔｅｒ）で１リットルに調整し、ｐＨは７．２に調整し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１０２】
前記調製物の解凍した懸濁液２ｍＬを、同じ培地５０ｍＬを含むフラスコに接種するのに用いた。１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで２８℃のインキュベーションを４８時間行った後、ブロス２ｍＬを、スターチ８０ｇ；炭酸カルシウム７ｇ；ファーマメディア５ｇ；リン酸水素二カリウム１ｇ；硫酸マグネシウム１ｇ；グルタミン酸０．６ｇ；硫酸第一鉄七水化物０．０１ｇ；硫酸亜鉛０．００１ｇ；硫酸第一マンガン０．００１ｇからなる生産培地５０ｍＬを含むフラスコに接種するのに用いた。最終容量は、生水で１リットルに調整し、ｐＨは７．２に調整し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１０３】
種々のカルボン酸基質（表１を参照）をメタノールに溶かし、最終濃度が０．２ｇ／Ｌとなるように接種の２４時間後に発酵ブロスに添加した。この発酵ブロスを２８℃で１４日間インキュベートした後、ブロスを遠心処理（２，５００ｒｐｍで２分間）し、上澄み液を捨てた。この菌糸体ペレットをアセトン（１５ｍＬ）、次いでジクロロメタン（３０ｍＬ）で抽出し、有機相を分離、濾過し、次いで蒸発乾固した。この残渣をメタノール（１ｍＬ）中に取り、スキャンニング・ダイオード−アレー検出器セットを備えたヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）１０９０Ａ液体クロマトグラフを用いたＨＰＬＣにより２４０ｎｍで分析した。使用したカラムは、４０℃で保持したベックマン・ウルトラスフフィアー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ）Ｃ−１８、５μｍ、４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムであった。前記メタノール溶液２５μＬをカラムに注入した。溶出は、８０：２０〜９５：５のメタノール−水のリニアーグラジエントを４０分間にわたり０．８５／ｍＬ  ｍｉｎで実施した。２つの標準濃度のシクロヘキシルＢ１を用いて検出器応答をキャリブレーションし、Ｂ２及びＢ１アベルメクチンに対する曲線下の面積を測定した。
【０１０４】
６．２．結果
Ｂ２及びＢ１アベルメクチンについて観察されたＨＰＬＣのリテンションタイム、及び２：１の比を表１に示す。
【０１０５】
2004283174.tif 000002
【０１０６】
表１に示したデータは、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチンの生産量の比が非常に広範囲であることを証明するものであり、このことは、供給した脂肪酸側鎖スターターユニットの性質に応じてクラス２の化合物からクラス１の化合物への脱水転換（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｖｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）の結果にかなりの差が生じることを示している。このことは、ＡｖｅＣタンパク質に対する変性（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）から生じるＢ２：Ｂ１の比の変化が特定の基質に特異的であることができることを示している。従って、特定の基質を用いて得られるＢ２：Ｂ１比に変化を示す突然変異体のスクリーニングは、当該基質の存在下に実施されることが必要である。下記の引き続きの実施例では、スクリーニング基質としてシクロヘキサンカルボン酸を用いている。しかしながら、この基質は単に可能性を例示するために用いるに過ぎず、本発明の適用性を限定しようとするものではない。
【０１０７】
７．実施例：ａｖｅＣ遺伝子の単離
本実施例は、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするストレプトミセス・アベルミチリス染色体の領域の単離及び特徴付けを述べるものである。以下に示すように、ａｖｅＣ遺伝子は、生産されるシクロヘキシル−Ｂ２対シクロヘキシル−Ｂ１（Ｂ２：Ｂ１）アベルメクチンの比を変えることができるものとして同定された。
【０１０８】
７．１．材料及び方法
７．１．１．ＤＮＡ単離のためのストレプトミセスの増殖
ストレプトミセスの増殖を行うため、以下の方法に従った。ストレプトミセス・アベルミチリスＡＴＣＣ３１２７２の単一コロニー（単一コロニー単離物＃２）を、ディフコ・イースト・エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）５ｇ；ディフコ・バクト−ペプトン（Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ）５ｇ；デキストロース２．５ｇ；ＭＯＰＳ５ｇ；ディフコ・バクト・アガー（Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ）１５ｇを含む１／２強度のＹＰＤ−６上で単離した。最終容量は、ｄＨ2Ｏで１リットルに調整し、ｐＨは７．０に調整し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１０９】
前記培地で増殖した菌糸体を、２５ｍｍｘ１５０ｍｍの試験管中のＴＳＢ培地［１リットルのｄＨ2Ｏ中、ディフコ・トリプティック・ソイ・ブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）３０ｇ、１２１℃で２５分間オートクレーブ処理］１０ｍＬに接種し、振とう（３００ｒｐｍ）しながら２８℃で４８〜７２時間保持した。
【０１１０】
７．１．２．ストレプトミセスからの染色体ＤＮＡ単離
前記のように増殖させた菌糸体のアリコート（０．２５ｍＬ又は０．５ｍＬ）を１．５ｍＬの微小遠沈管に入れ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心処理により細胞を濃縮した。この上澄みを捨て、細胞を、２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含むＴＳＥバッファー［１．５Ｍショ糖２０ｍＬ，１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２．５ｍＬ，１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２．５ｍＬ，及びｄＨ2Ｏ７５ｍＬ］０．２５ｍＬ中に再懸濁させた。このサンプルを振とうしながら３７℃で２０分間インキュベートし、オートゲン（ＡｕｔｏＧｅｎ）５４０TM自動核酸単離装置［インテグレイティド・セパレーション・システム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ），マサッチューセッツ州ネイティック（Ｎａｔｉｃｋ）］にかけ、そしてサイクル（Ｃｙｃｌｅ）１５９（装置ソフトウェアー）を製造業者の取扱説明書に従って用いてゲノムＤＮＡを分離した。
【０１１１】
これに代えて、菌糸体５ｍＬを１７ｍｍｘ１００ｍｍの試験管に入れ、細胞を３，０００ｒｐｍで５分間の遠心処理によって濃縮し、その上澄みを除去した。細胞をＴＳＥバッファー１ｍＬ中に再懸濁させ、３，０００ｒｐｍで５分間の遠心処理によって濃縮し、その上澄みを除去した。細胞を、２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含むＴＳＥバッファー１ｍＬ中に再懸濁させ、振とうしながら３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。インキュベーション後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．５ｍＬを添加し、溶解（ｌｙｓｉｓ）が完了するまで細胞を３７℃でインキュベートした。そのライセートを６５℃で１０分間インキュベートし、室温まで冷却し、１．５ｍＬ容のエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管２本に分けて入れ、フェノール／クロロホルム［０．５Ｍトリス（ｐＨ８．０）で予め平衡化した５０％フェノール；５０％クロロホルム］０．５ｍＬで１回（１ｘ）抽出した。その水性相を取り出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で２〜５回（２〜５ｘ）抽出した。１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を添加することによりＤＮＡを沈殿させ、この混合物を氷上で１０分間インキュベートし、この混合物を５℃で１５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心処理を行い、その上澄みを清潔な試験管に取り出し、そこに１容量のイソプロパノールを添加した。次いで、その上澄みとイソプロパノールとの混合物を、氷上で２０分間インキュベートし、５℃で１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心処理を行い、その上澄みを除去し、そしてＤＮＡペレットを７０％エタノールで１回（１ｘ）洗浄した。ペレットを乾燥させた後、ＤＮＡをＴＥバッファー［１０ｍＭトリス，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］中に再懸濁させた。
【０１１２】
７．１．３．ストレプトミセスからのプラスミドＤＮＡ単離
菌糸体のアリコート（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬ容の微小遠沈管に入れ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心処理により細胞を濃縮した。この上澄みを捨て、細胞を、１０．３％ショ糖１．０ｍＬ中に再懸濁させ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心処理により濃縮し、その上澄みを捨てた。次いで、細胞を、２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含むＴＳＥバッファー中に再懸濁させ、振とうしながら３７℃で２０分間インキュベートし、オートゲン５４０TM自動核酸単離装置にかけた。サイクル１０６（装置ソフトウェアー）を製造業者の取扱説明書に従って用いてプラスミドＤＮＡを分離した。
【０１１３】
これに代えて、菌糸体１．５ｍＬを１．５ｍＬ容の微小遠沈管に入れ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心処理により細胞を濃縮した。この上澄みを捨て、細胞を、１０．３％ショ糖１．０ｍＬ中に再懸濁させ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心処理により濃縮し、その上澄みを捨てた。細胞を、２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含むＴＳＥバッファー０．５ｍＬ中に再懸濁させ、３７℃で１５〜３０分間インキュベートした。インキュベーション後、アルカリ性ＳＤＳ（０．３Ｎ−ＮａＯＨ，２％ＳＤＳ）０．２５ｍＬを添加し、細胞を、５５℃で１５〜３０分間、あるいは、溶液が透明になるまでインキュベートした。酢酸ナトリウム（０．１ｍＬ，３Ｍ，ｐＨ４．８）をこのＤＮＡ溶液に添加し、次いで、氷上で１０分間インキュベートした。このＤＮＡサンプルを、５℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心処理を行った。その上澄みを清潔な試験管に取り出し、そこにフェノール：クロロホルム（５０％フェノール：５０％クロロホルム）０．２ｍＬを添加し、穏やかに混合した。このＤＮＡ溶液を、５℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、その上層を清潔なエッペンドルフ管に取り出した。イソプロパノール（０．７５ｍＬ）を添加し、この溶液を穏やかに混合し、次いで室温で２０分間インキュベートした。このＤＮＡ溶液を、５℃で１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心処理し、その上澄みを除去し、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、ＴＥバッファー中に再懸濁させた。
【０１１４】
７．１．４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプラスミドＤＮＡ単離
形質転換した単一の大腸菌コロニーを、ルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地［ｄＨ2Ｏ１リットル中、バクト−トリプトン（Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）１０ｇ、バクト−イースト・エキストラクト（Ｂａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）５ｇ、及びＮａＣｌ１０ｇ（ｐＨ７．０），１２１℃で２５分間オートクレーブ処理，及び１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充］５ｍＬに接種した。この培養物を一晩インキュベートし、１ｍＬアリコートを１．５ｍＬ容の微小遠沈管に入れた。この培養サンプルを、オートゲン５４０TM自動核酸単離装置にかけ、サイクル３（装置ソフトウェアー）を製造業者の取扱説明書に従って用いてプラスミドＤＮＡを単離した。
【０１１５】
７．１．５．ストレプトミセス・アベルミチリスのプロトプラストの調製及び形質転換
ストレプトミセス・アベルミチリスの単一のコロニーを、１／２強度のＹＰＤ−６上で単離した。その菌糸体を、２５ｍｍｘ１５０ｍｍ試験管中のＴＳＢ培地１０ｍＬに接種し、次いで、振とう（３００ｒｐｍ）しながら２８℃で４８時間インキュベートした。菌糸体１ｍＬをＹＥＭＥ培地５０ｍＬに接種した。ＹＥＭＥ培地は、１リットル当たり、ディフコ・イースト・エキストラクト３ｇ；ディフコ・バクト−ペプトン５ｇ；ディフコ・モルト・エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ
Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）３ｇ；シュークロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）３００ｇを含んでいる。１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した後、次の成分を添加した：２．５Ｍ−ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（別途、１２１℃で２５分間オートクレーブ処理済み）２ｍＬ；及びグリシン（２０％）（濾過滅菌済み）２５ｍＬ。
【０１１６】
菌糸体を３０℃で４８〜７２時間増殖させ、３，０００ｒｐｍで２０分間の遠心処理により５０ｍＬ容の遠沈管［ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）］に集めた。上澄みを捨て、菌糸体をＰバッファー中に再懸濁させた。Ｐバッファーは、ショ糖２０５ｇ；Ｋ2ＳＯ4０．２５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ２．０２ｇ；Ｈ2Ｏ６００ｍＬ；Ｋ2ＰＯ4（０．５％）１０ｍＬ；微量元素溶液２０ｍＬ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（３．６８％）１００ｍＬ；及びＭＥＳバッファー（１．０Ｍ，ｐＨ６．５）１０ｍＬを含んでいる（微量元素溶液は１リットル当たり、ＺｎＣｌ2４０ｍｇ；ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ２００ｍｇ；ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ１０ｍｇ；ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ１０ｍｇ；Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ１０ｍｇ；（ＮＨ4）６Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ１０ｍｇを含んでいる）。ｐＨは６．５に調整し、最終容量は１リットルに調整し、そして培地は０．４５ミクロンフィルターで熱濾過した。
【０１１７】
菌糸体を３，０００ｒｐｍで２０分間でペレット化し、上澄みを捨て、菌糸体を２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含むＰバッファー２０ｍＬ中に再懸濁させた。この菌糸体を、振とうしながら３５℃で１５分間インキュベートし、プロトプラスト形成の程度を顕微鏡で測定して調べた。プロトプラスト形成が完了した時、プロトプラストを８，０００ｒｐｍで１０分間の遠心処理に付した。上澄みを除去し、プロトプラストをＰバッファー１０ｍＬ中に再懸濁させた。プロトプラストを、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、上澄みを除去し、プロトプラストをＰバッファー２ｍＬ中に再懸濁させ、そして約１ｘ１０9個のプロトプラストを、２．０ｍＬ容の極低温用バイアル瓶［ナルジェン（Ｎａｌｇｅｎｅ）］に分配した。
【０１１８】
１ｘ１０9個のプロトプラストを含むバイアル瓶を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、上澄みを除去し、プロトプラストをＰバッファー０．１ｍＬ中に再懸濁させた。２〜５μｇの形質転換ＤＮＡをプロトプラストに添加し、その後直ちにワーキングＴバッファー０．５ｍＬを添加した。Ｔバッファーベースは、ＰＥＧ−１０００［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］２５ｇ；ショ糖２．５ｇ；Ｈ2Ｏ８３ｍＬを含んでいる。ｐＨは１Ｎ−ＮａＯＨ（濾過滅菌済み）を用いて８．８に調整し、そしてＴバッファーベースを濾過滅菌して４℃で保存した。使用当日に調製したワーキングＴバッファーは、Ｔバッファーベース８．３ｍＬ；Ｋ2ＰＯ4（４ｍＭ）１．０ｍＬ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（５Ｍ）０．２ｍＬ；及びＴＥＳ（１Ｍ、ｐＨ８）０．５ｍＬであった。ワーキングＴバッファーの各成分は個々に濾過滅菌した。
【０１１９】
プロトプラストにＴバッファーを添加して２０秒以内に、Ｐバッファー１．０ｍＬも添加し、そしてプロトプラストを８，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理した。上澄みを捨て、プロトプラストをＰバッファー０．１ｍＬ中に再懸濁させた。次いで、プロトプラストをＲＭ１４培地で平板培養（ｐｌａｔｅ）した。このＲＭ１４培地は、ショ糖２０５ｇ；Ｋ2ＳＯ4０．２５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ１０．１２ｇ；グルコース１０ｇ；ディフコ・キャスアミノ・アシッズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｃａｓａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）０．１ｇ；ディフコ・イースト・エキストラクト５ｇ；ディフコ・オートミール・アガー（Ｄｉｆｃｏ  Ｏａｔｍｅａｌ  Ａｇａｒ）３ｇ；ディフコ・バクト・アガー（Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ）２２ｇ；ｄＨ2Ｏ８００ｍＬを含んでいる。この溶液を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理後、以下の滅菌ストックを添加した：Ｋ2ＰＯ4（０．５％）１０ｍＬ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（５Ｍ）５ｍＬ；Ｌ−プロリン（２０％）１５ｍＬ；ＭＥＳバッファー（１．０Ｍ，ｐＨ６．５）１０ｍＬ；微量元素溶液（前記に同じ）２ｍＬ；シクロヘキシミド・ストック（２５ｍｇ／ｍＬ）４０ｍＬ；及び１Ｎ−ＮａＯＨ２ｍＬ。ＲＭ１４培地２５ｍＬをプレ−ト当たりに分取し、プレートを使用前２４時間乾燥させた。
【０１２０】
プロトプラストを湿度９５％、３０℃で２０〜２４時間インキュベートした。チオストレプトン耐性の形質転換体を選択するため、１２５μｇ／ｍＬのチオストレプトンを含むオーバーレイバッファー１ｍＬをＲＭ１４再生プレート上に均一になるように広げた。オーバーレイバッファーは、１００ｍＬ当たり、ショ糖１０．３ｇ；微量元素溶液（前記に同じ）０．２ｍＬ；及びＭＥＳ（１Ｍ，ｐＨ６．５）１ｍＬを含んでいる。このプロトプラストを、チオストレプトン耐性（Ｔｈｉｏr）コロニーが見えてくるまで、湿度９５％、３０℃で７〜１４日間インキュベートした。
【０１２１】
７．１．６．ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）プロトプラストの形質転換
ストレプトミセス・リビダンスＴＫ６４［ジョン・インズ・インスティチュート（Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ノーリッジ（Ｎｏｒｗｉｃｈ）、英国（Ｕ．Ｋ）により供給］を、ある場合に形質転換に用いた。ストレプトミセス・リビダンスの増殖、プロトプラスト形成、及び形質転換のための方法及び構成は、Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９８５年，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ノーリッジ，英国に記載されており、その本に記載のように実施した。前記セクション７．１．３に記載のように、プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リビダンス形質転換体から分離した。
【０１２２】
７．１．７．ストレプトミセス・アベルミチリス菌株の発酵分析
１／２強度のＹＰＤ−６で４〜７日間増殖させたストレプトミセス・アベルミチリスの菌糸体を、プレフォーム培地８ｍＬ及び２個の５ｍｍガラスビーズを含む１ｘ６インチの試験管に接種した。プレフォーム培地は、可溶性デンプン［弱く煮た（ｔｈｉｎ  ｂｏｉｌｅｄ）デンプン又はコソ（ＫＯＳＯ）；ジャパン・コーン・スターチ社（Ｊａｐａｎ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔａｒｃｈ  Ｃｏ．），名古屋］２０ｇ／Ｌ；ファーマメディア１５ｇ／Ｌ；アルダミン（Ａｒｄａｍｉｎｅ）ｐＨ５ｇ／Ｌ［シャンプラン・インド．（Ｃｈａｍｐｌａｉｎ  Ｉｎｄ．）、クリフトン（Ｃｌｉｆｔｏｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）］；ＣａＣＯ3２ｇ／Ｌ；培地中の最終濃度５０ｐｐｍの２−（＋／−）−メチル酪酸、６０ｐｐｍのイソ酪酸、及び２０ｐｐｍのイソ吉草酸を含有する２ｘｂｃｆａ（「ｂｃｆａ」とは、分枝鎖の脂肪酸をいう）を含んでいる。ｐＨを７．２に調整し、培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１２３】
試験管を１７゜の角度にして２１５ｒｐｍにおいて２９℃で３日間振とうした。この種培養液の２ｍＬアリコートを、生産培地２５ｍＬを含む３００ｍＬ容のアーレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコに接種した。この生産培地は、デンプン［弱く煮たデンプンまたはコソ］１６０ｇ／Ｌ；ニュトリソイ（Ｎｕｔｒｉｓｏｙ）［アーチャー・ダニエルズ・ミッドランド（Ａｒｃｈａｒ  Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｍｉｄｌａｎｄ）、デカーチャー（Ｄｅｃａｔｕｒ）、イリノイ州（ＩＬ）］１０ｇ／Ｌ；アルダミンｐＨ１０ｇ／Ｌ；Ｋ2ＨＰＯ4２ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ4・４Ｈ2Ｏ２ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．０２ｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ2０．００２ｇ／Ｌ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．００２ｇ／Ｌ；ＣａＣＯ3１４ｇ／Ｌ；２ｘｂｃｆａ（前記に同じ）；及びシクロヘキサンカルボン酸（ＣＨＣ）（ｐＨ７．０の２０％溶液として調製済み）８００ｐｐｍを含んでいる。ｐＨを６．９に調整し、培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１２４】
接種後、フラスコを２００ｒｐｍで振とうしながら２９℃で１２日間インキュベートした。インキュベーション後、サンプル２ｍＬをフラスコから取り出し、メタノール８ｍＬで希釈し、混合し、この混合物を１，２５０ｘｇで１０分間遠心処理して破片をペレット化した。次いで、この上澄みを、ベックマン・ウルトラスフィアＯＤＳカラム（２５ｃｍｘ直径４．６ｍｍ）を用いて、流速０．７５ｍＬ／ｍｉｎ及び２４０ｎｍ吸収による検出でＨＰＬＣによって分析した。移動相は、８６／８．９／５．１のメタノール／水／アセトニトリルであった。
【０１２５】
７．１．８．ストレプトミセス・アベルミチリスＰＫＳ遺伝子の単離
ストレプトミセス・アベルミチリス（ＡＴＣＣ３１２７２，ＳＣ−２）染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーを調製し、サッカロポリスポラ・エリスレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子のフラグメントから調製したケトシンターゼ（ＫＳ）プローブとハイブリッドした。コスミドライブラリーの調製の詳細な記述は、前記のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等，１９８９年に見いだすことができる。ストレプトミセス染色体ＤＮＡライブラリーの調製の詳細な記述は、前記のホップウッド等，１９８５年に示されている。ケトシンターゼ−ハイブリッド形成領域を含むコスミドクローンは、［ドクター・ピー．リードレイ（Ｄｒ．Ｐ．Ｌｅａｄｌａｙ），ケンブリッジ，英国から親切に供給された］ｐＥＸ２６由来の２．７ＫｂのＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７IIIフラグメントへのハイブリダイゼーションによって同定した。約５ｎｇのｐＥＸ２６は、ＮｄｅＩ及びＥｃｏ４７IIIを用いて消化した。この反応混合物を、０．８％シープラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）ＧＴＧアガロースゲル［ＦＭＣバイオプロダクツ（ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ），ロックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ），メイン州（ＭＥ）］にかけた。電気泳動の後、ゲルから２．７ＫｂのＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７IIIフラグメントを切り出し、ファースト・プロトコル（Ｆａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いたエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からのＧＥＬアーゼ（ＧＥＬａｓｅTM）を用いてＤＮＡをゲルから回収した。この２．７ＫｂのＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７IIIフラグメントに、ＢＲＬニック・トランスレーション・システム（Ｎｉｃｋ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）［ＢＲＬライフ・テクノロジーズ社（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．），ゲテルスバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ），メリーランド州（ＭＤ）］を用い製造業者の取扱説明書に従って、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ［デオキシシチジン５’−トリホスフェート，テトラ（トリエチルアンモニウム）塩，［α−32Ｐ］−］［ＮＥＮ−デュポン（ＮＥＮ−Ｄｕｐｏｎｔ），ボストン，マサチューセッツ州］でラベル付与した。典型的な反応は、０．０５ｍＬ容量で実施した。ストップバッファー５μＬ添加後、Ｇ−２５セファデックス・クイック・スピン（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｑｕｉｃｋ  ＳｐｉｎTM）カラム［ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］を用い製造業者の取扱説明書に従って、取り込まれなかったヌクレオチドからラベル付きのＤＮＡを分離した。
【０１２６】
約１，８００個のコスミドクローンを、コロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。サッカロポリスポラ・エリスレアＫＳプローブに強くハイブリダイズする１０個のクローンを同定した。コスミドＤＮＡを含有する大腸菌コロニーをＬＢ液体培地で増殖させ、そしてオートゲン５４０TM自動核酸単離装置で、サイクル３（装置ソフトウェアー）を製造業者の取扱説明書に従って用いて、各培養物からコスミドＤＮＡを単離した。制限エンドヌクレアーゼマッピング及びサザンブロットハイブリダイゼーション分析によって、５個のクローンが部分的に重なり合う染色体領域を含んでいることが示された。５個のコスミド（すなわち、ｐＳＥ６５、ｐＳＥ６６、ｐＳＥ６７、ｐＳＥ６８、ｐＳＥ６９）のストレプトミセス・アベルミチリスのゲノムＢａｍＨＩ制限地図を、部分的に重なり合うコスミド及びハイブリダイゼーションの分析によって作成した（図４）。
【０１２７】
７．１．９．アベルメクチンＢ２：Ｂ１比を調節するＤＮＡの同定及びａｖｅＣ−ＯＲＦの同定
以下の方法を用いて、ｐＳＥ６６コスミドクローンから得られたサブクローン化フラグメントを、ＡｖｅＣ突然変異体におけるアベルメクチンのＢ２：Ｂ１比を調節する能力について試験した。ｐＳＥ６６（５μｇ）をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化した。反応混合物を０．８％シープラーク（ＳｅａｐｌａｑｕｅTM）ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣバイオプロダクツ）にかけ、電気泳動の後、ゲルから２．９ＫｂのＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを切り出し、ファースト・プロトコルを用いたＧＥＬアーゼ（ＧＥＬａｓｅTM）（エピセンター・テクノロジーズ）を用いてＤＮＡをゲルから回収した。約５μｇのシャトルベクターｐＷＨＭ３［バラ（Ｖａｒａ）等，１９８９年，ジェイ．バクテリオル．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１７１：５８７２−５８８１］を、ＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化した。約０．５μｇの２．９Ｋｂインサート及び０．５μｇの消化されたｐＷＨＭ３を一緒にして混合し、１単位のリガーゼ［ニューイングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．），ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ），マサチューセッツ州］と、総容量２０μＬにして、製造業者の取扱説明書に従い、１５℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、５μＬの連結混合物は７０℃で１０分間インキュベートし、室温まで冷却し、製造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞（ＢＲＬ）を形質転換するのに用いた。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から分離し、制限分析によって２．９ＫｂのＳａｃＩ／ＢａｍＨＩインサートの存在を確認した。このプラスミドは、ｐＳＥ１１９として表示した。
【０１２８】
ストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８（ファイザー自社菌株）のプロトプラストを調製し、前記セクション７．１．５に記載のｐＳＥ１１９を用いて形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８は、シクロヘキサンカルボン酸を補充した場合にアベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ１型に比べ有意に多量のアベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ２型を生産する（約３０：１のＢ２：Ｂ１）突然変異体である。ストレプトミセス・アベルミチリスのプロトプラストを形質転換するために用いたｐＳＥ１１９は、大腸菌株ＧＭ２１６３［ドクター・ビー．ジェイ．バックマン（Ｄｒ．Ｂ．Ｊ．Ｂａｃｈｍａｎｎ），キュレーター（Ｃｕｒａｔｏｒ），イー．コリ・ジェネティック・ストック・センター（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ），エール大学］、大腸菌株ＤＭ１（ＢＲＬ）、又はストレプトミセス・リビダンス菌株ＴＫ６４から分離したものである。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１１９を含有するストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８の形質転換体は、約３．７：１の変化比のアベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ２：シクロヘキシル−Ｂ１を生産した（表２）。
【０１２９】
ｐＳＥ１１９は、ＡｖｅＣ突然変異体におけるアベルメクチンＢ２：Ｂ１の比を調節できるということが確かめられた後、インサートＤＮＡの配列を決定した。約１０μｇのｐＳＥ１１９を、プラスミドＤＮＡ単離キット［キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ），バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ），カリフォルニア州（ＣＡ）］を製造業者の取扱説明書に従って用いて分離し、ＡＢＩ３７３Ａ自動ＤＮＡシークェンサー（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）［パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ），フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ），カリフォルニア州］を用いて配列を決定した。配列データは、ジェネティック・コンピューター・グループ・プログラムス（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）［ＧＣＧ，マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ），ウィスコンシン州（ＷＩ）］を用いてアセンブルし編集した。ＤＮＡ配列及びａｖｅＣ−ＯＲＦは、図１（配列表の配列番号１）に示す。
【０１３０】
ｐＳＥ１１８と表示する新規なプラスミドは、以下のように構築した。約５μｇのｐＳＥ６６をＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩを用いて消化した。この反応混合物を０．８％シープラークＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣバイオプロダクツ）にかけ、２．８ＫｂのＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを電気泳動の後にゲルから切り出し、ファースト・プロトコルを用いたＧＥＬアーゼ（ＧＥＬａｓｅTM）（エピセンター・テクノロジーズ）を用いてＤＮＡをゲルから回収した。約５μｇのシャトルベクターｐＷＨＭ３を、ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化した。約０．５μｇの２．８Ｋｂインサート及び０．５μｇの消化されたｐＷＨＭ３を一緒にして混合し、１単位のリガーゼ（ニューイングランド・バイオラブス社）と、総容量２０μＬにして、製造業者の取扱説明書に従い、１５℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、５μＬの連結混合物は７０℃で１０分間インキュベートし、室温まで冷却し、製造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換するのに用いた。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、制限分析によって２．８ＫｂのＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩインサートの存在を確認した。このプラスミドは、ｐＳＥ１１８として表示した。ｐＳＥ１１８及びｐＳＥ１１９中のインサートＤＮＡは、約８３８個のヌクレオチドによって部分的に重なっている（図４）。
【０１３１】
ストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８のプロトプラストを前記のｐＳＥ１１８で形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１１８を含有するストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８の形質転換体は、菌株１１００−ＳＣ３８と比較して、アベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ２：アベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ１の比における変化がなかった（表２）。
【０１３２】
７．１．１０．ストレプトミセス・アベルミチリス染色体ＤＮＡ由来のａｖｅＣ遺伝子のＰＣＲ増幅
ａｖｅＣ−ＯＲＦを含有する〜１．２Ｋｂのフラグメントを、先に得られたａｖｅＣヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅することにより、ストレプトミセス・アベルミチリス染色体ＤＮＡから分離した。ＰＣＲプライマーは、ジェノシス・バイオテクノロジーズ社（Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．），テキサス（Ｔｅｘａｓ）から供給を受けた。右向き（ｒｉｇｈｔｗａｒｄ）のプライマーは、５’−ＴＣＡＣＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡＣＡＣ−３’（配列表の配列番号６）であり、左向き（ｌｅｆｔｗａｒｄ）のプライマーは、５’−ＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡＧ−３’（配列表の配列番号７）であった。ＰＣＲ反応は、製造業者により供給されたバッファー中ディープ・ベント（Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔTM）ポリメラーゼ（ニューイングランド・バイオラブス社）を用い、３００μＭのｄＮＴＰ、１０％グリセロール、２００ビコモルの各プライマー、０．１μｇの鋳型、及び２．５単位の酵素の存在下に、最終容量１００μで、パーキン−エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）サーマルサイクラーを用いて実施した。最初のサイクルの熱履歴は、９５℃で５分間（変性工程）、６０℃で２分間（アニーリング工程）、及び７２℃で２分間（伸長工程）であった。引き続きの２４サイクルは、変性工程を４５秒間に短縮し及びアニーリング工程を１分間に短縮した以外は、同様の熱履歴であった。
【０１３３】
このＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル中で電気泳動させ、〜１．２Ｋｂの単一のＤＮＡバンドを検出した。このＤＮＡをゲルから精製し、製造業者の取扱説明書に従い、２５ｎｇの線状化された（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）ブラントのｐＣＲ−ブラント（Ｂｌｕｎｔ）ベクター［インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］と、１：１０のベクター対インサートのモル比で連結した。この連結混合物を用いて、製造業者の取扱説明書に従い、ワン・ショット（Ｏｎｅ  ＳｈｏｔTM）コンピテント（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌細胞（インビトロジェン）を形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、〜１．２Ｋｂのインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１７９と表示した。
【０１３４】
ｐＳＥ１７９由来のインサートＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化して単離し、電気泳動によって分離し、ゲルから精製し、そして同様にＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化しておいたシャトルベクターｐＷＨＭ３と、全ＤＮＡ濃度１μｇにおいて、１：５のベクター対インサートのモル比で連結した。この連結混合物を用いて、製造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、〜１．２Ｋｂのインサートの存在を制限分析によって確認した。ｐＳＥ１８６（図２，ＡＴＣＣ２０９６０４）と表示したこのプラスミドを、大腸菌ＤＭ１中に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離した。
【０１３５】
７．２．結果
ｐＳＥ１１９由来の２．９ＫｂのＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントは、ストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８中に形質転換された場合、有意にＢ２：Ｂ１アベルメクチン生産の比を変化させることが確認された。ストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８は、通常、約３０：１のＢ２：Ｂ１比を有しているが、２．９ＫｂのＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを含むベクターで形質転換された場合、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチンの比が約３．７：１まで減少した。形質転換体培養物の発酵後分析により、形質転換ＤＮＡの存在が確認された。
【０１３６】
２．９ＫｂのｐＳＥ１１９フラグメントの配列を決定し、〜０．９ＫｂのＯＲＦを同定した（図１）（配列表の配列番号１）。これは、予め他で突然変異処理を受け、Ｂ２生産物のみを生産するＰｓｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントを包含している［イケダ（Ｉｋｅｄａ）等，１９９５年，前記］。このＯＲＦ又はその対応する推定ポリペプチドの、既知のデータベース（ＧｅｎＥＭＢＬ，ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）に照らした比較では、既知のＤＮＡ又はタンパク質配列との強い相同性はいずれも示されなかった。
【０１３７】
表２は、種々のプラスミドにより形質転換されたストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８の発酵分析を示す。
【０１３８】
2004283174.tif 000003
【０１３９】
８．実施例：ストレプトミセス・アベルミチリスＡｖｅＣ突然変異体の構築
本実施例では、前記の組成及び方法を用いた数種の異なるストレプトミセス・アベルミチリスＡｖｅＣ突然変異体の構築を述べる。ストレプトミセスの遺伝子に突然変異を導入するための技法の一般的な記載は、キーサー（Ｋｉｅｓｅｒ）及びホップウッド，１９９１年，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，２０４：４３０−４５８にある。一層詳細な記載は、アンザイ（Ａｎｚａｉ）ら，１９８８年，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，ＸＬＩ（２）：２２６−２３３及びストゥツマン−エングウォール（Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ）ら，１９９２年，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４（１）：１４４−１５４により提供される。これらの参考文献は、その全体を参考のため本明細書に引用する。
【０１４０】
８．１．ストレプトミセス・アベルミチリスａｖｅＣ遺伝子の不活性化
不活性化されたａｖｅＣ遺伝子を含有するＡｖｅＣ突然変異体を、以下に記載のように、いくつかの方法を用いて構築した。
【０１４１】
最初の方法では、ｐＳＥ１１９（前記セクション７．１．９に記載のプラスミド）中のａｖｅＣ遺伝子に内在する６４０ｂｐのＳｐｈＩ／ＰｓｔＩフラグメントをサッカロポリスポラ・エリスレア由来の（エリスロマイシン耐性に対する）ｅｒｍＥ遺伝子と置き換えた。ｅｒｍＥ遺伝子は、ＢｇｌII及びＥｃｏＲＩによる制限酵素消化、それに続く電気泳動によってｐＩＪ４０２６［ジョン・インズ・インスティチュート，ノーリッジ，英国により供給された；ビブ（Ｂｉｂｂ）等，１９８５年，Ｇｅｎｅ，４１：３５７−３６８も参照］から単離し、そしてゲルから精製した。〜１．７Ｋｂのフラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化しておいたｐＧＥＭ７Ｚｆ［プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）］中に連結し、この連結混合物を、製造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、〜１．７Ｋｂのインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２７と表示した。
【０１４２】
ｐＳＥ１１８（前記セクション７．１．９に記載）をＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化し、その消化産物を電気泳動して、〜２．８ＫｂのＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩインサートをゲルから精製した。ｐＳＥ１１９をＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、その消化産物を電気泳動して、〜１．５ＫｂのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩインサートをゲルから精製した。シャトルベクターｐＷＨＭ３をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。ｐＳＥ２７をＰｓｔＩ及びＳｐｈＩで消化し、その消化物を電気泳動して、〜１．７ＫｂのＰｓｔＩ／ＳｐｈＩインサートをゲルから精製した。４つのフラグメント（すなわち、〜２．８Ｋｂ、〜１．５Ｋｂ、〜７．２Ｋｂ、〜１．７Ｋｂ）すべてを、４通りの連結法により、一緒に連結した。この連結混合物を、製造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１８０（図３；ＡＴＣＣ２０９６０５）と表示した。
【０１４３】
ｐＳＥ１８０をストレプトミセス・リビダンス菌株ＴＫ６４中に形質転換し、形質転換したコロニーをチオストレプトン及びエリスロマイシンに対する耐性により同定した。ｐＳＥ１８０をストレプトミセス・リビダンスから単離し、ストレプトミセス・アベルミチリスのプロトプラストを形質転換するのに用いた。４つのチオストレプトン耐性のストレプトミセス・アベルミチリス形質転換体を同定し、それらのプロトプラストを調製し、ＲＭ１４培地上で非選択的条件下に平板培養した。プロトプラストが再生した後、不活性化されたａｖｅＣ遺伝子の染色体組込み及び自由レプリコンの欠損を示す、エリスロマイシン耐性の存在及びチオストレプトン耐性の不在について、単一のコロニーをスクリーニングした。１つのＥｒｍrＴｈｉｏs形質転換体を同定し、菌株ＳＥ１８０−１１と表示した。染色体ＤＮＡの全体を、菌株ＳＥ１８０−１１から単離し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、又はＳｐｈＩを用いて消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動することによって分離し、ナイロン製の膜に移し、ｅｒｍＥプローブにハイブリダイズさせた。これらの分析により、ｅｒｍＥ耐性遺伝子の染色体組込み、及び６４０ｂｐのＰｓｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントの付随的欠失が二重の交差事象により引き起こされたことが示された。菌株ＳＥ１８０−１１の発酵生産物のＨＰＬＣ分析は、通常の（ｎｏｒｍａｌ）アベルメクチンがもはや生産されないということを示した（図５Ａ）。
【０１４４】
ａｖｅＣ遺伝子を不活性化する第二の方法では、ストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１の染色体から、ａｖｅＣ遺伝子中に６４０ｂｐのＰｓｔＩ／ＳｐｈＩ欠失を残して、１．７ＫｂのｅｒｍＥ遺伝子を取り出した。遺伝子置き換えプラスミドを以下のように構築した。すなわち、ｐＳＥ１８０をＸｂａＩで部分的に消化し、〜１１．４Ｋｂのフラグメントをゲルから精製した。この〜１１．４Ｋｂのバンドは、１．７ＫｂのｅｒｍＥ耐性遺伝子を欠いている。次いで、このＤＮＡを連結し、大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このｐＳＥ１８４と表示したプラスミドを大腸菌ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離した。このプラスミドを用いて、ストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。プロトプラストは、菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体から調製し、ＲＭ１４培地上で単一のコロニーとして平板培養した。プロトプラストを再生した後、不活性化されたａｖｅＣ遺伝子の染色体組込み及びｅｒｍＥ遺伝子を含有する自由レプリコンの欠損を示す、エリスロマイシン耐性及びチオストレプトン耐性の両方の不在について、単一のコロニーをスクリーニングした。１つのＥｒｍsＴｈｉｏs形質転換体を同定し、ＳＥ１８４−１−１３と表示した。ＳＥ１８４−１−１３の発酵分析によって、通常のアベルメクチンが生産されないこと及びＳＥ１８４−１−１３がＳＥ１８０−１１と同じ発酵の特徴を有していることが示された。
【０１４５】
ａｖｅＣ遺伝子を不活性化する第三の方法では、ＰＣＲを用いてｎｔ位４７１のＣの後ろに２個のＧを付加してＢｓｐＥ１部位を作ることにより、染色体ａｖｅＣ遺伝子中にフレームシフトを導入した。作られたＢｓｐＥ１部位の存在は、遺伝子置き換え事象を検出するのに有効であった。ＰＣＲプライマーは、フレームシフト突然変異をａｖｅＣ遺伝子中に導入するように設計し、これは、ジェノシス・バイオテクノロジーズ社により供給された。右向きのプライマーは、５’−ＧＧＴＴＣＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＣＧ−３’（配列表の配列番号８）であり、左向きのプライマーは、５’−ＡＡＣＴＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＣＣＣＴＴＣ−３’（配列表の配列番号９）であった。ＰＣＲ条件は、前記セクション７．１．１０に記載の通りであった。その６６６ｂｐＰＣＲ産物をＳｐｈＩで消化し、それぞれ２７８ｂｐ及び３８８ｂｐの２つのフラグメントを得た。３８８ｂｐのフラグメントをゲルから精製した。
【０１４６】
遺伝子置き換えプラスミドを以下のように構築した。すなわち、シャトルベクターｐＷＨＭ３をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ｐＳＥ１１９をＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩを用いて消化し、その消化産物を電気泳動し、〜８４０ｂｐのフラグメントをゲルから精製した。ｐＳＥ１１９をＥｃｏＲＩ及びＸｍｎＩで消化し、その消化産物を電気泳動によって分離し、〜１．７Ｋｂのフラグメントをゲルから精製した。４つのフラグメント（すなわち、〜７．２Ｋｂ、〜８４０ｂｐ、〜１．７Ｋｂ、及び３８８ｂｐ）すべてを、４通りの連結法で一緒に連結した。この連結混合物を、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を制限分析及びＤＮＡ配列分析によって確認した。このｐＳＥ１８５と表示したプラスミドを大腸菌ＤＭ１中に形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離した。このプラスミドを用いてストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８のプロトプラストを形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１８５は、ストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８中に形質転換された場合、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチンの比を有意に変えなかった（表２）。
【０１４７】
ｐＳＥ１８５を用いてストレプトミセス・アベルミチリスのプロトプラストを形質転換し、染色体ａｖｅＣ遺伝子にフレームシフト突然変異を引き起こした。チオストレプトン耐性の形質転換体からプロトスラストを調製し、ＲＭ１４上で単一のコロニーとして平板培養した。プロトプラストを再生した後、チオストレプトン耐性の不在について、単一のコロニーをスクリーニングした。チオストレプトン感受性コロニーから染色体ＤＮＡを単離し、染色体中に組込まれたフレームシフト突然変異の存在についてＰＣＲによりスクリーニングした。このＰＣＲプライマーは、ａｖｅＣヌクレオチド配列に基づいて設計し、ジェノシス・バイオテクノロジーズ社（テキサス）により供給された。右向きのＰＣＲプライマーは、５’−ＧＣＡＡＧＧＡＴＡＣＧＧＧＧＡＣＴＡＣ−３’（配列表の配列番号１０）であり、左向きのプライマーは、５’−ＧＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＡＣ−３’（配列表の配列番号１１）であり、ＰＣＲ条件は前記セクション７．１．１０に記載の通りであった。得られたＰＣＲ産物は５４３ｂｐであり、ＢｓｐＥ１で消化した場合、不活性化されたａｖｅＣ遺伝子の染色体組込み及び自由レプリコンの欠損を示す、３６８ｂｐ、９６ｂｐ、及び７９ｂｐの３つのフラグメントが観察された。
【０１４８】
ａｖｅＣ遺伝子中にフレームシフト突然変異を含有するストレプトミセス・アベルミチリス突然変異体の発酵分析は、通常のアベルメクチンがもはや生産されないこと、及びこれらの突然変異体が菌株ＳＥ１８０−１１及びＳＥ１８４−１−１３と同じ発酵ＨＰＬＣの特徴を有していることを示した。１つのＴｈｉｏs突然変異体を同定し、菌株ＳＥ１８５−５ａと表示した。
【０１４９】
更に、ｎｔ位５２０をＧからＡに変え、この結果、位１１６でトリプトファン（Ｗ）をコードするコドンを終止コドンに変える、ａｖｅＣ遺伝子における突然変異を行った。この突然変異を持ったストレプトミセス・アベルミチリス菌株は、通常のアベルメクチンを生産せず、そして菌株ＳＥ１８０−１１、ＳＥ１８４−１−１３、及びＳＥ１８５−５ａと同じ発酵の特徴を有していた。
【０１５０】
さらに、（ｉ）位２５６でアミノ酸をグリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変える、ｎｔ位９７０でのＧからＡへの変更、及び（ii）位２７５でアミノ酸をチロシン（Ｙ）からヒスチジン（Ｈ）に変える、ｎｔ位９９６でのＴからＣへの変更の両方を行うａｖｅＣ遺伝子における突然変異を行った。これらの突然変異（Ｇ２５６Ｄ／Ｙ２７５Ｈ）を持ったストレプトミセス・アベルミチリス菌株は、通常のアベルメクチンを生産せず、そして菌株ＳＥ１８０−１１、ＳＥ１８４−１−１３、及びＳＥ１８５−５ａと同じ発酵の特徴を有していた。
【０１５１】
ストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ不活性化突然変異体菌株ＳＥ１８０−１１、ＳＥ１８４−１−１３、ＳＥ１８５−５ａ、及び本明細書で記載した他の菌株は、ａｖｅＣ遺伝子中の他の突然変異の影響を評価するためのスクリーニングツールを提供する。ａｖｅＣ遺伝子の野生型のコピーを含んでいるｐＳＥ１８６を、大腸菌ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離した。このｐＳＥ１８６ＤＮＡを用いてストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、ＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。機能的なａｖｅＣ遺伝子［イン・トランス（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）］の存在により、菌株ＳＥ１８０−１１は通常のアベルメクチン生産を回復することができた（図５Ｂ）。
【０１５２】
８．２．クラスＢ２：Ｂ１の比を変えるａｖｅＣ遺伝子における突然変異の分析
前記のように、不活性なａｖｅＣ遺伝子を含有するストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１は、機能的なａｖｅＣ遺伝子（ｐＳＥ１８６）を含有するプラスミドを用いて形質転換することにより補完した。菌株ＳＥ１８０−１１も、下記のように、ａｖｅＣ遺伝子における他の突然変異を特徴付けるために宿主菌株として用いた。
【０１５３】
染色体ＤＮＡを菌株１１００−ＳＣ３８から単離し、ａｖｅＣ遺伝子のＰＣＲ増幅のための鋳型として用いた。１．２ＫｂのＯＲＦを、ａｖｅＣヌクレオチド配列を基礎として設計したプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって単離した。右向きのプライマーは、配列表の配列番号６であり、左向きのプライマーは、配列表の配列番号７であった（前記セクション７．１．１０参照）。ＰＣＲ及びサブクローニング条件は、セクション７．１．１０に記載の通りであった。１．２ＫｂのＯＲＦのＤＮＡ配列分析は、ｎｔ位３３７をＣからＴに変えるａｖｅＣ遺伝子における突然変異であって、位５５のアミノ酸をセリン（Ｓ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変える突然変異を示している。Ｓ５５Ｆ突然変異を含有するａｖｅＣ遺伝子をｐＷＨＭ３中にサブクローニングしてｐＳＥ１８７と表示したプラスミドを形成し、これを用いてストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、ＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。アミノ酸残基５５（Ｓ５５Ｆ）における変化をコードするａｖｅＣ遺伝子の存在により、菌株ＳＥ１８０−１１は通常のアベルメクチン生産を回復することができた（図５Ｃ）。しかしながら、そのシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の比は、約１．６：１のＢ２：Ｂ１の比を有する、ｐＳＥ１８６を用いて形質転換した菌株ＳＥ１８０−１１と比較して、約２６：１であり（表３）、このことは、単一の突然変異（Ｓ５５Ｆ）がシクロヘキシル−Ｂ１に対して生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量を調節していることを示している。
【０１５４】
ｎｔ位８６２をＧからＡに変える、ａｖｅＣ遺伝子における別の突然変異であって、位２３０のアミノ酸をグリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変える突然変異を同定した。この突然変異（Ｇ２３０Ｄ）を有するストレプトミセス・アベルミチリス菌株は、約３０：１のＢ２：Ｂ１比でアベルメクチンを生産する。
【０１５５】
８．３．Ｂ２：Ｂ１比を低下させる突然変異
シクロヘキシル−Ｂ１に対して生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量を低下させる数種の突然変異を、以下のように構築した。
【０１５６】
ｎｔ位５８８をＧからＡに変える、ａｖｅＣ遺伝子における突然変異であって、位１３９のアミノ酸をアラニン（Ａ）からスレオニン（Ｔ）に変える突然変異を同定した。このＡ１３９Ｔ突然変異を含有するａｖｅＣ遺伝子をｐＷＨＭ３中にサブクローニングしてｐＳＥ１８８と表示したプラスミドを形成し、これを用いてストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、ＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。アミノ酸残基１３９（Ａ１３９Ｔ）における変化をコードする、突然変異ａｖｅＣ遺伝子の存在により、菌株ＳＥ１８０−１１はアベルメクチン生産を回復することができた（図５Ｄ）。しかしながら、そのＢ２：Ｂ１の比は、約０．９４：１であり、このことは、この突然変異がシクロヘキシル−Ｂ１に対して生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量を低下させることを示している。この結果は予期できないものであった。なぜならば、刊行物に記載されている結果、並びに前記の突然変異の結果は、ａｖｅＣ遺伝子の不活性化またはアベルメクチンのＢ１型に対するＢ２型の生産の増加を示していたに過ぎないからである。
【０１５７】
Ａ１３９Ｔ突然変異は、Ｂ２：Ｂ１の比をより有利なＢ１方向に変えたので、アミノ酸位１３８でセリンの代わりにスレオニンをコードする突然変異が構築された。このように、ｐＳＥ１８６をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩで消化されているｐＧＥＭ３Ｚｆ（プロメガ）中にクローニングした。このｐＳＥ１８６ａと表示したプラスミドをＡｐａＩ及びＫｐｎＩで消化し、そのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで分離し、そして〜３．８Ｋｂ及び〜０．４Ｋｂの２つのフラグメントをゲルから精製した。ｐＳＥ１８６由来の〜１．２ＫｂのインサートＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いて、ｎｔ位５８５に単一の塩基変化を導入した。このＰＣＲプライマーは、ｎｔ位５８５に突然変異を導入するように設計し、ジェノシス・バイオテクノロジーズ社（テキサス）により供給を受けた。右向きのＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＧＡＣＧ−３’（配列表の配列番号１２）であり、左向きのＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＡＣＡ−３’（配列表の配列番号１３）であった。ＰＣＲ反応は、アドバンテージＧＣゲノムＰＣＲキット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ  ｋｉｔ）［クローンテック・ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），パロ・アルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ），カリフォルニア州］を用いて、製造業者によって供給されたバッファー中、２００μＭのｄＮＴＰｓ、２００ピコモルの各プライマー、５０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１．０ＭのＧＣ−メルト（ＧＣ−Ｍｅｌｔ）及び１ユニットのクレンタック・ポリメラーゼ・ミックス（ＫｌｅｎＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ）の存在下に最終容量５０μＬで実施した。最初のサイクルの熱履歴は、９４℃で１分間であり、それに続いて９４℃で３０秒間及び６８℃で２分間の２５サイクル、そして６８℃で３分間の１サイクルであった。２９５ｂｐのＰＣＲ産物をＡｐａＩ及びＫｐｎＩを用いて消化して２５４ｂｐフラグメントを放出させ、これを電気泳動により分離しそしてゲルから精製した。３個のフラグメント（〜３．８Ｋｂ、〜０．４Ｋｂ及び２５４ｂｐ）すべてを３通りの連結法で一緒に連結した。この連結混合物を、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１９８と表示した。
【０１５８】
ｐＳＥ１９８をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩで消化されているｐＷＨＭ３中にクローニングし、そして大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を制限分析及びＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、そして正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このｐＳＥ１９９と表示したプラスミドを用いて、ストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。アミノ酸残基１３８（Ｓ１３８Ｔ）における変化をコードする、突然変異ａｖｅＣ遺伝子の存在により、菌株ＳＥ１８０−１１は通常のアベルメクチン生産を回復することができた。しかしながら、そのＢ２：Ｂ１の比は、約０．８８：１であり、このことは、この突然変異がシクロヘキシル−Ｂ１に対して生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量を低下させることを示している（表３）。このＢ２：Ｂ１の比は、前記の、ｐＳＥ１８８を用いた菌株ＳＥ１８０−１１の形質転換により形成されたＡ１３９Ｔ突然変異について観察された０．９４：１の比より低くさえある。
【０１５９】
アミノ酸位１３８及び１３９の両方にスレオニンを導入するように、別の突然変異を構築した。ｐＳＥ１８６由来の〜１．２ＫｂのインサートＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いた。ＰＣＲプライマーは、ｎｔ位５８５及び５８８に突然変異を導入するように設計し、ジェノシス・バイオテクノロジーズ社（テキサス）により供給を受けた。右向きのＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＣ−３’（配列表の配列番号１４）であり、左向きのＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＴＴＣＡＣＣ−３’（配列表の配列番号１５）であった。ＰＣＲ反応は、本セクションにおいて直前に記載した条件を用いて実施した。４４９ｂｐのＰＣＲ産物をＡｐａＩ及びＫｐｎＩを用いて消化して２５４ｂｐのフラグメントを放出させ、これを電気泳動により分離しそしてゲルから精製した。ｐＳＥ１８６ａをＡｐａＩ及びＫｐｎＩを用いて消化し、そのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで分離し、そして〜３．８Ｋｂ及び〜０．４Ｋｂの２つのフラグメントをゲルから精製した。３つのフラグメント（〜３．８Ｋｂ、〜０．４Ｋｂ及び２５４ｂｐ）すべてを３通りの連結法で一緒に連結し、この連結混合物をコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２３０と表示した。
【０１６０】
ｐＳＥ２３０をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩで消化されているｐＷＨＭ３中にクローニングし、そして大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を制限分析及びＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、そして正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２３１と表示し、このプラスミドを用いて、ストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵によって分析した。Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔをコードする、二重に突然変異されたａｖｅＣ遺伝子の存在により、菌株ＳＥ１８０−１１は通常のアベルメクチン生産を回復することができた。しかしながら、そのＢ２：Ｂ１の比は、約０．８４：１であり、このことは、この突然変異が、前記のｐＳＥ１８８またはｐＳＥ１９９を用いた菌株ＳＥ１８０−１１の形質転換によりもたらされた低下よりさらに、シクロヘキシル−Ｂ１に対して生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量を低下させることを示している（表３）。
【０１６１】
2004283174.tif 000004
【０１６２】
これらの結果は、クラス２のアベルメクチンに対してより商業的に望ましいクラス１の生産を増加させる結果をもたらす、ａｖｅＣ遺伝子における特異的な突然変異を示す最初のものである。
【０１６３】
９．実施例：５’欠失突然変異体の構築
前記セクション５．１において説明したように、図１に示したストレプトミセス・アベルミチリスのヌクレオチド配列（配列表の配列番号１）は、潜在的な開始位置であるｂｐ位４２、１７４、１７７及び１８０において４つの異なるＧＴＧコドンを含んでいる。本セクションは、ａｖｅＣ−ＯＲＦ（図１；配列表の配列番号１）の５’領域の複数の欠失の構成を説明し、これらのコドンのうちどれがタンパク質発現のためのａｖｅＣ−ＯＲＦにおける開始位置として機能することができたかを規定するのに資するものである。
【０１６４】
５’末端において種々に欠失したａｖｅＣ遺伝子のフラグメントを、ＰＣＲ増幅によりストレプトミセス・アベルミチリスの染色体ＤＮＡから単離した。ＰＣＲプライマーは、ａｖｅＣのＤＮＡ配列に基づいて設計し、これは、ジェノシス・バイオテクノロジーズ社により供給を受けた。右向きのプライマーは、５'−ＡＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＧＣＣＧＣＴＣ−３'（配列表の配列番号１６）（Ｄ１Ｆ１）；５'−ＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＡＡＣＧＡＡＣ−３'（配列表の配列番号１７）（Ｄ１Ｆ２）；５'−ＣＣＡＡＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡＧＴＡＧ−３'（配列表の配列番号１８）（Ｄ１Ｆ３）；及び５'−ＴＧＣＡＧＧＣＧＴＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣ―３'（配列表の配列番号１９）（Ｄ２Ｆ２）；であった。左向きのプライマーは、５'−ＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡ−３'（配列表の配列番号２０）；５'−ＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡＧＧＡ−３'（配列表の配列番号２１）；及び５'−ＡＧＧＡＧＴＧＴＧＧＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡ―３'（配配列表の配列番号２２）であった。このＰＣＲ反応は前記セクション８．３に記載の通りに実施した。
【０１６５】
このＰＣＲ産物を１％アガロースゲル中での電気泳動により分離し、〜１．０Ｋｂまたは〜１．１Ｋｂの単一のＤＮＡバンドを検出した。このＰＣＲ産物をゲルから精製し、２５ｎｇの線状化されたｐＣＲ２．１ベクター（インビトロジェン）と１：１０モルのベクター対インサートの比で、製造業者の取扱説明書に従って連結した。この連結混合物を用いて、製造業者の取扱説明書に従い、ワン・ショット（Ｏｎｅ  ＳｈｏｔTM）コンピテント（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌細胞（インビトロジェン）を形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、インサートの存在を制限分析及びＤＮＡ配列分析によって確認した。これらのプラスミドをｐＳＥ１９０（プライマーＤ１Ｆ１を用いて得られた）、ｐＳＥ１９１（プライマーＤ１Ｆ２を用いて得られた）、ｐＳＥ１９２（プライマーＤ１Ｆ３を用いて得られた）、及びｐＳＥ１９３（プライマーＤ２Ｆ２を用いて得られた）と表示した。
【０１６６】
これらのインサートＤＮＡをそれぞれＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化し、電気泳動により分離し、ゲルから精製し、そして別々に、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化されているシャトルベクターｐＷＨＭ３と、１：５のベクター対インサートのモル比で総ＤＮＡ濃度１μｇにして連結した。この連結混合物を用いてコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から分離し、インサートの存在を制限分析によって確認した。これらのプラスミドは、ｐＳＥ１９４（Ｄ１Ｆ１）、ｐＳＥ１９５（Ｄ１Ｆ２）、ｐＳＥ１９６（Ｄ１Ｆ３）及びｐＳＥ１９７（Ｄ２Ｆ２）と表示し、それぞれを別々に大腸菌菌株ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このＤＮＡを用いてストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析し、どのＧＴＧ部位がａｖｅＣ発現に必要であるかを特定した。この結果は、それぞれ位４２においてＧＴＧ部位を欠いているが位１７４、位１７７及び位１８０においてはすべてが３つのＧＴＧ部位を含んでいるｐＳＥ１９４、ｐＳＥ１９５及びｐＳＥ１９６は、それぞれがＳＥ１８０−１１中に形質転換された場合に通常のアベルメクチン生産を回復することができたので、位４２のＧＴＧコドンを、ａｖｅＣ発現に影響を与えることなしに除去することができるということを示している。通常のアベルメクチン生産は、菌株ＳＥ１８０−１１を、４つのＧＴＧ部位のすべてを欠いているｐＳＥ１９７で形質転換した場合には、回復がなかった（表４）。
【０１６７】
2004283174.tif 000005
【０１６８】
１０．実施例：ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）及びストレプトミセス・グリセオクロモゲネス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のａｖｅＣ相同体のクローニング
本発明は、他のアベルメクチンまたはミルベマイシン（ｍｉｌｂｅｍｙｃｉｎ）を生産するストレプトミセスの種由来のａｖｅＣ相同遺伝子を同定しそしてクローニングすることを可能にするものである。例えば、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９０１）のコスミドライブラリーを、前記ストレプトミセス・アベルミチリス由来の１．２ＫｂのａｖｅＣプローブとハイブリダイズさせた。強くハイブリダイズしたいくつかのコスミドクローンを同定した。染色体ＤＮＡをこれらのコスミドから分離し、ａｖｅＣプローブとハイブリッドした４．９ＫｂのＫｐｎＩフラグメントを同定した。このＤＮＡの配列を決定し、ストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ−ＯＲＦと有意な相同性を持つＯＲＦ（配列表の配列番号３）を同定した。ストレプトミセス・ヒグロスコピカスのａｖｅＣ相同ＯＲＦから推定されたアミノ酸配列（配列表の配列番号４）を図６に示す。
【０１６９】
更に、ストレプトミセス・グリセオクロモゲネスのゲノムＤＮＡのコスミドライブラリーを、前記したストレプトミセス・アベルミチリス由来の１．２ＫｂのａｖｅＣプローブとハイブリダイズした。強くハイブリダイズしたいくつかのコスミドクローンを同定した。染色体ＤＮＡをこれらのコスミドから分離し、ａｖｅＣプローブとハイブリダイズした５．４ＫｂのＰｓｔＩフラグメントを同定した。このＤＮＡの配列を決定し、ストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ−ＯＲＦと有意な相同性を持つａｖｅＣ相同体の部分的ＯＲＦを同定した。推定された部分的アミノ酸配列（配列表の配列番号５）を図６に示す。
【０１７０】
ストレプトミセス・ヒグロスコピカス及びストレプトミセス・グリセオクロモゲネス由来のａｖｅＣ相同体のＤＮＡ及びアミノ酸配列分析は、これらの領域が、両方とも互いに対して及びストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ−ＯＲＦ及びＡｖｅＣ遺伝子産物に対して有意な相同性（アミノ酸レベルで〜５０％の配列一致）を共有していることを示している（図６）。
【０１７１】
１１．実施例：ｅｒｍＥプロモーターの後にａｖｅＣ遺伝子を用いたプラスミドの構築
ｐＳＥ１８６由来の１．２ＫｂのａｖｅＣ−ＯＲＦを、ｐＷＨＭ３のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位中にＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてインサートされた３００ｂｐのｅｒｍＥプロモーターを有するシャトルベクターｐＷＨＭ３であるｐＳＥ３４中にサブクローニングした［ウォード（Ｗａｒｄ）ら，１９８６年，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０３：４６８−４７８参照］。ｐＳＥ１８６をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、その消化産物を電気泳動により分離し、そして１．２Ｋｂフラグメントをアガロースゲルから分離し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化されているｐＳＥ３４と連結した。この連結混合物を、製造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、１．２Ｋｂのインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドは、ｐＳＥ１８９と表示し、大腸菌ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離した。ストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８のプロトプラストをｐＳＥ１８９を用いて形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。
【０１７２】
ｐＳＥ１８９を含有するストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８の形質転換体は、生産されるアベルメクチン・シクロヘキシル−Ｂ２：アベルメクチン・シクロヘキシル−Ｂ１の比（約３：１）において菌株１１００−ＳＣ３８（約３４：１）と比較して変化が生じ、アベルメクチンの総生産量が、ｐＳＥ１１９を用いて形質転換された菌株１１００−ＳＣ３８と比べ約２．４倍増加した（表５）。
【０１７３】
ｐＳＥ１８９を、同様に、野生型のストレプトミセス・アベルミチリス菌株のプロトプラスト中に形質転換した。チオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１８９を用いて形質転換された野生型のストレプトミセス・アベルミチリスにより生産されたアベルメクチン総量は、ｐＳＥ１１９を用いて形質転換された野生型のストレプトミセス・アベルミチリスに比べて約２．２倍増加した（表５）。
【０１７４】
2004283174.tif 000006
【０１７５】
１２．実施例：ストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ−ＯＲＦ及びストレプトミセス・ヒグロスコピカスのａｖｅＣ相同体の両方に由来する配列を含んでいるキメラプラスミド
ストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ−ＯＲＦの５６４ｂｐ相同性部分をストレプトミセス・ヒグロスコピカスのａｖｅＣ相同体の５６４ｂｐ部分に置き換えて含んでいる、ｐＳＥ３５０と表示したハイブリッドプラスミド（図７）を、以下のように構築した。ｐＳＥ３５０は、両方の配列中に保存されているＢｓａＡＩ制限部位（ａｖｅＣ位２２５）、及びストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ遺伝子中に存在するＫｐｎＩ制限部位（ａｖｅＣ位８１０）を用いて構築した。ＫｐｎＩ部位は、前記セクション７．１．１０に記載のＰＣＲ条件を用い、右向きのプライマー５’−ＣＴＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＴＣＧ−３’（配列表の配列番号２３）及び左向きのプライマー５’−ＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＣ−３’（配列表の配列番号２４）（ジェノシス・バイオテクノロジーズ社により供給された）を用いたＰＣＲによって、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスのＤＮＡ中に導入した。このＰＣＲ産物をＢｓａＡＩ及びＫｐｎＩで消化し、そのフラグメントを１％アガロースゲル中の電気泳動により分離し、そして５６４ｂｐのＢｓａＡＩ／ＫｐｎＩフラグメントをゲルから分離した。ｐＳＥ１７９（前記セクション７．１．１０に記載）をＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、そのフラグメントを１％アガロースゲル中の電気泳動により分離し、そして〜４．５Ｋｂのフラグメントをゲルから分離した。ｐＳＥ１７９をＨｉｎｄIII及びＢｓａＡＩで消化し、そのフラグメントを１％アガロースゲル中の電気泳動により分離し、そして〜０．２ＫｂのＢｓａＡＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントをゲルから分離した。ストレプトミセス・ヒグロスコピカス由来の〜４．５ＫｂのＨｉｎｄIII／ＫｐｎＩフラグメント、〜０．２ＫｂのＢｓａＡＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント及び５６４ｂｐのＢｓａＡＩ／ＫｐｎＩフラグメントを３通りの連結法で一緒に連結し、この連結混合物をコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在をＫｐｎＩ及びＡｖａＩを用いた制限分析によって確認した。このプラスミドをＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化して、１．２Ｋｂのインサートを放出させ、次いでこのインサートを、ＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化しておいたｐＷＨＭ３と連結した。この連結混合物をコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在をＨｉｎｄIII及びＡｖａＩを用いた制限分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から分離し、正しいインサートの存在を制限分析及びＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ３５０と表示し、これを用いてストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。その結果は、ストレプトミセス・アベルミチリス／ストレプトミセス・ヒグロスコピカスのハイブリッドプラスミドを含有する形質転換体は平均で約１０９：１のＢ２：Ｂ１比を有していることを示している。
【０１７６】
2004283174.tif 000007
【０１７７】
生物学的材料の寄託
下記の生物学的材料を、米国、２０８５２、メリーランド州、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、パークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ）１２３０１在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に、１９９８年１月２９日に寄託し、下記の受託番号を付与された。
プラスミド                受託番号
プラスミドｐＳＥ１８０      ２０９６０５
プラスミドｐＳＥ１８６      ２０９６０４
【０１７８】
前記したすべての特許、特許出願及び刊行物は、その全体を参考までに本明細書に引用するものである。
本発明は、本明細書に記した特定の態様により発明の範囲を限定することを意図するものではなく、これらの態様は本発明の個々の観点の単独の説明を意図して設けたものであり、機能的に等価な方法及び要素は本発明の範囲内にある。実際、本明細書に示し記載した態様の他に、本発明の種々の態様があることは、本明細書の記載内容及び添付の図面から当業者には明白なことであろう。かかる態様が、請求の範囲内に包含されることは意図するところである。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】ストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦを含むＤＮＡ配列（配列表の配列番号１）及び推定されるアミノ酸配列（配列表の配列番号２）。
【図２】ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ遺伝子の完全ＯＲＦを含むプラスミドベクターｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）。
【図３】ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦ中に挿入された、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）のｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０５）。
【図４】ストレプトミセス・アベルミティリス由来のアベルメクチンポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターのＢａｍＨＩ制限地図、及び同定された５種の重複コスミドクローン（すなわち、ｐＳＥ６５、ｐＳＥ６６、ｐＳＥ６７、ｐＳＥ６８、ｐＳＥ６９）。ｐＳＥ１１８とｐＳＥ１１９との関係も示す。
【図５Ａ】ストレプトミセス・アベルミティリス株により生成された発酵生成物のＨＰＬＣ分析。ピークの定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較により実施した。シクロヘキシルＢ２の保持時間は、７．４〜７．７分間；シクロヘキシルＢ１の保持時間は、１１．９〜１２．３分間。不活性ａｖｅＣ−ＯＲＦを有するストレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。
【図５Ｂ】ストレプトミセス・アベルミティリス株により生成された発酵生成物のＨＰＬＣ分析。ピークの定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較により実施した。シクロヘキシルＢ２の保持時間は、７．４〜７．７分間；シクロヘキシルＢ１の保持時間は、１１．９〜１２．３分間。ｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）で形質転換されたストレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。
【図５Ｃ】ストレプトミセス・アベルミティリス株により生成された発酵生成物のＨＰＬＣ分析。ピークの定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較により実施した。シクロヘキシルＢ２の保持時間は、７．４〜７．７分間；シクロヘキシルＢ１の保持時間は、１１．９〜１２．３分間。ｐＳＥ１８７で形質転換されたストレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。
【図５Ｄ】ストレプトミセス・アベルミティリス株により生成された発酵生成物のＨＰＬＣ分析。ピークの定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較により実施した。シクロヘキシルＢ２の保持時間は、７．４〜７．７分間；シクロヘキシルＢ１の保持時間は、１１．９〜１２．３分間。ｐＳＥ１８８で形質転換されたストレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。
【図６】ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦでコードされる推定アミノ酸配列（ＳＥＣ  ＩＤ  ＮＯ：２）と、ストレプトミセス・グリセオクロモゲネス（ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のａｖｅＣ相同部分的ＯＲＦでコードされる推定アミノ酸配列（配列表の配列番号５）と、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来のａｖｅＣ相同ＯＲＦでコードされる推定アミノ酸配列（配列表の配列番号４）との比較。太字（ｂｏｌｄ）のバリン残基が、タンパク質の推定上のスタート部位である。保存されている残基を、３種の全ての配列で相同であれば大文字で示し、３種の配列の内、２つが相同であれば小文字で示す。アミノ酸配列は、約５０％の配列一致を含む。
【図７】ストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦ中のＢｓａＡｌ／Ｋｐｎｌ部位に挿入された、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスａｖｅＣ相同遺伝子由来の５６４ｂｐのＢｓａＡｌ／Ｋｐｎｌフラグメントを含むハイブリッドプラスミド構築物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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