(57)【要約】【解決手段】繊維質吸水性シートに少なくとも水可溶性ゲル化剤、菌体栄養成分、ｐＨ指示薬及びリジンデカルボキシラーゼ基質を担持してなる簡易乾燥培地を用いるサルモネラの検出法であって、被検試料液を当該培地の一部にのみ浸透する量接種し、次いで水又は水溶液を当該培地全体に浸透する量接種した後培養することを特徴とするサルモネラの検出法。【効果】本発明によれば、食品等の多くの夾雑菌が共存する検体から、サルモネラを簡便かつ短時間で正確に検出できる。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維質吸水性シートに少なくとも水可溶性ゲル化剤、菌体栄養成分、ｐＨ指示薬及びリジンデカルボキシラーゼ基質を担持してなる簡易乾燥培地を用いるサルモネラの検出法であって、被検試料液を当該培地の一部にのみ浸透する量接種し、次いで水又は水溶液を当該培地全体に浸透する量接種した後培養することを特徴とするサルモネラの検出法。
【請求項２】
被検試料液が、被検体懸濁液又は被検体前培養液である請求項１記載のサルモネラの検出法。
【請求項３】
リジンデカルボキシラーゼ基質が、リジン、リジン含有オリゴペプチド又はそれらの塩である請求項１又は２記載のサルモネラの検出法。
【請求項４】
簡易乾燥培地が、さらに乳糖及び白糖を担持するものである請求項１〜３のいずれか１項記載のサルモネラの検出法。
【請求項５】
簡易乾燥培地が、さらに水に可溶な接着剤を担持するものである請求項１〜４のいずれか１項記載のサルモネラの検出法。
【請求項６】
繊維質吸水性シートに少なくとも水可溶性ゲル化剤、菌体栄養成分、ｐＨ指示薬及びリジンデカルボキシラーゼ基質を担持してなるサルモネラ検出用簡易乾燥培地。
【請求項７】
リジンデカルボキシラーゼ基質が、リジン、リジン含有オリゴペプチド又はそれらの塩である請求項６記載の簡易乾燥培地。
【請求項８】
さらに乳糖及び白糖を担持するものである請求項６又は７記載の簡易乾燥培地。
【請求項９】
さらに水に可溶な接着剤を担持するものである請求項６〜８のいずれか１項記載の簡易乾燥培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品等種々の検体中のサルモネラを、特殊な熟練や技術を必要とせず、短時間にかつ簡便に検出できる方法及びその方法に用いる培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から行なわれているサルモネラの検出方法は、検体を前増菌培養培地（ＥＥＭブイヨン又は緩衝ペプトン水ＢＰＷ）で３５℃、２０〜２４時間培養後、この前増菌培養液の一部を選択増菌培地（ハーナテトラチオネート培地、ラパポート・バシリアディス培地等）に接種し、４２℃で２０〜２４時間培養する。次いでこの選択増菌培養液の一部をサルモネラ選択分離培地であるＭＬＣＢ寒天培地、ＤＨＬ寒天培地、ＸＬＤ寒天培地、Ｒａｍｂａｃｈ寒天培地、ＳＳ寒天培地等の平板培地に塗抹し、３５℃で１８〜２４時間培養し、サルモネラと疑われる集落をＴＳＩ寒天培地、ＬＩＭ寒天培地等により確認する。さらに必要に応じて免疫学的試験で血清型判定やＤＮＡプローブ法も行なう等煩雑で手間と時間のかかる方法である。そのため、検体中のサルモネラの存在は、前増菌培養、選択増菌培養、選択分離培地での塗抹を経た３日目以降にスクリーニングされることとなる。そのため、迅速又は簡易にサルモネラを検出する試みとして、（１）前増菌培養液に半流動選択培地を充填した容器の貫通口を接触させ、目的菌の運動性を利用することにより検出する方法（特開２００１−１３６９９８）、（２）半流動選択培地に１白金耳（又は０．１ｍＬ）接種し、運動性により目的菌を検出する方法（Ｈｅｒｍａｎ　Ｇｏｏｓｓｅｎｓ他．　１９８４．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１９（６）、ＤＩＡＳＡＬＭ）、（３）サルモネラ検出用シート状培地（特開２００１−３２１１９６）等が報告されている。しかし、（１）は前増菌培養液に容器を入れるだけの簡易な操作で目的菌の検出が可能であるが、生培地のため保存性に問題がある、容器の貫通口より菌を釣菌しなければならないため目的菌の分離操作が困難である。（２）は半流動の生培地であるために保存性に問題があり、また検体を接種した後流れやすいので取り扱いに注意を要する。（３）は培養液の希釈操作が必要であり、選択分離培地の代わりに用いられるため迅速性に問題がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、より短時間かつ簡便にサルモネラを検出する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、簡易乾燥培地によるサルモネラの検出について種々検討した結果、水可溶性ゲル化剤と菌体栄養成分に加えてｐＨ指示薬とリジンデカルボキシラーゼ基質を担持させた乾燥培地を用い、まず被検試料を少量接種して培地の一部にのみ担持させ、次いで水を培地全体に浸透するように接種し、その後に培養すれば、サルモネラは運動性があるため培地中の一部に担持されたサルモネラが培地中を運動し、特に被検試料接種部分以外の部分において、サルモネラにより分泌されたリジンデカルボキシラーゼの作用による酵素反応及び発色反応が生起し、肉眼観察により、簡便かつ短時間でサルモネラが検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、繊維質吸水性シートに少なくとも水可溶性ゲル化剤、菌体栄養成分、ｐＨ指示薬及びリジンデカルボキシラーゼ基質を担持してなる簡易乾燥培地を用いるサルモネラの検出法であって、被検試料液を当該培地の一部にのみ浸透する量接種し、次いで水又は水溶液を当該培地全体に浸透する量接種した後培養することを特徴とするサルモネラの検出法を提供するものである。
【０００６】
また、本発明は、繊維質吸水性シートに少なくとも水可溶性ゲル化剤、菌体栄養成分、ｐＨ指示薬及びリジンデカルボキシラーゼ基質を担持してなるサルモネラ検出用簡易乾燥培地を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の検出対象であるサルモネラには、主に運動性を有しリジン脱炭酸反応を有する食中毒等の原因となる菌、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ等が含まれる。
【０００８】
本発明に用いる簡易乾燥培地は、繊維質吸水性シートに少なくとも水可溶性ゲル化剤、菌体栄養成分、ｐＨ指示薬及びリジンデカルボキシラーゼ基質を担持する乾燥培地である。この培地には、さらに水に可溶な接着剤が担持されているのが好ましい。
【０００９】
これらの簡易培地の具体例としては、例えば次の（１）〜（６）の簡易培地が挙げられる。
（１）防水性基体の上面部に、接着剤層、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培地（特開昭５７−５０２２００号公報）。
（２）防水性基体の上面部に、空気透過性膜、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培地（特開平３−１５３７９号公報）。
（３）濾紙等に菌体栄養成分を含浸させ、その表面をカバーシートで覆ってなる検出紙（特開平２−６５７９８号公報）。
（４）防水性平板の表面に冷水可溶性ゲル化剤と微生物培養基、繊維質吸水性シートを順次積層した培地（特開平６−１８１７４１号公報）。
（５）（ａ）水及びアルコールに可溶な接着剤、（ｂ）水に可溶でアルコールに不溶なゲル化剤、及び（ｃ）菌体栄養成分を含有する培地組成物を、該ゲル化剤より大きいメッシュを有する繊維状吸水性シートに担持させた簡易培地（特開平９−１９２８２号公報）。
（６）（ａ）水及びアルコールに可溶な接着剤０．０１〜０．４重量％、（ｂ）水に可溶でアルコールに不溶なゲル化剤、及び（ｃ）菌体栄養成分を含有するアルコール懸濁液を、防水性平板上に載置された該ゲル化剤の粒径より大きいメッシュを有する繊維質吸水性シートに含浸させ、これをアルコールの急速な蒸発を抑制しつつ乾燥して、吸水性シートを防水性平板に固着させてなる簡易培地（特開２０００−３２５０７２公報）。
これらの簡易乾燥培地のうち、（５）及び（６）が好ましく、（６）が特に好ましい。
【００１０】
ゲル化剤としては、水に可溶であればよいが、水に可溶でアルコールに不溶であるのが特に好ましく、例えばキサンタンガム、ローカストビーンガム、グアーガム、カラギーナン等の天然ゲル化剤、ヒドロキシエチルセルロース等の合成ゲル化物質が挙げられるが、なかでもキサンタンガムが特に好ましい。かかるゲル化剤は、平均粒径５００μｍ以下、特に０．５〜５０μｍの粉体を使用するのが好ましい。
【００１１】
培地組成物に必要に応じて用いられる接着剤としては、水に可溶であるのが好ましく、水及びアルコールに可溶なものが特に好ましく、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキサイド等が挙げられるが、なかでもヒドロキシプロピルセルロースが特に好ましい。
【００１２】
また、菌体栄養成分としては、サルモネラの生育に適したものが選択される。例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス等の栄養成分、糖類、及びサルモネラ以外の菌を抑制するための選択剤や抗生剤を含有する培地成分が用いられる。糖類としては、被検試料中に混在している可能性の高い大腸菌群が特に資化する乳糖及び白糖を用いるのが、サルモネラに対する選択性を向上させるうえで好ましい。選択剤としては、マラカイトグリーンや塩化マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩、胆汁酸塩類等が好ましい。さらに抗生剤としてはプロテウス属菌に有効なノボビオシンの添加が有効である。
【００１３】
ｐＨ指示薬としては、サルモネラから分泌されたリジンデカルボキシラーゼによりその基質であるリジン類が脱炭酸されることによるｐＨ変化（アルカリ化）を探知できる指示薬であればよく、例えばブロムクレゾールパープル、ブロムチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッド、リトマス等が挙げられる。
【００１４】
また、リジンデカルボキシラーゼ基質としては、リジン、リジン含有オリゴペプチド及びそれらの塩が挙げられる。リジン含有オリゴペプチドとしては、リジンデカルボキシラーゼにより脱炭酸され得るカルボキシル基を有し、かつ脱炭酸により生成した物質がアルカリ性を示すものであればよく、リジン残基を有するジペプチド、トリペプチドが挙げられる。これらの塩としては、塩酸塩等が挙げられる。これらのうち、リジン塩酸塩が特に好ましい。
【００１５】
また、本発明の培地には、サルモネラが硫化水素を産生する菌である性質を利用した検出用成分、例えばチオ硫酸塩及び第二鉄塩を含有させることができる。チオ硫酸塩としては、チオ硫酸ナトリウムが挙げられる。第二鉄塩としては、多塩基有機酸の第二鉄塩、例えばクエン酸鉄アンモニウム等が挙げられる。これらの成分が含まれていると、サルモネラが生成した硫化水素は、クエン酸鉄アンモニウムと反応して黒色の硫化鉄を形成し、培地が黒色となる。
【００１６】
さらに、本発明の培地には、色の観察を容易にするために、前記ｐＨ指示薬以外の適当な発色剤、例えばトリフェニルテトラゾリウムクロライド、３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド等の色素；５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドや５−ブロモ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド等の酵素基質を含有することができる。
【００１７】
本発明培地におけるゲル化剤の量は、サルモネラの運動性を阻害しない程度のゲル化を生起させる量であるのが好ましく、通常の簡易培地よりは少ないのが好ましい。具体的には、被検試料液及び水又は水溶液接種後の培地が半流動性培地状態となる量に調整するのが好ましい。
【００１８】
培地調製時の培地組成物を懸濁するための媒体としてはアルコールが好ましく、例えばエタノール、２−プロパノール等が特に好ましい。
【００１９】
上記培地組成物を担持させる繊維質吸水性シートは、接種された被検液が毛細管現象により容易に拡散し、かつ培地組成物中のゲル化剤をその網目構造中に担持できるものであるのが好ましい。繊維質吸水性シートはゲル化剤の粒径よりも大きいメッシュを有し、かつ厚さも当該粒径より厚いことが好ましく、例えば、網目の大きさが１５〜１００メッシュ、特に２０〜５０メッシュで、厚さが１０〜１０００μｍ、特に５０〜６００μｍのものが好ましい。
【００２０】
このような繊維質吸水性シートとしては、レーヨン不織布に代表される合成繊維不織布、コットン不織布に代表される天然繊維不織布等が挙げられる。これらのシートの形状は特に制限されず、正方形、長方形、円形等の何れであってもよい。またその大きさも特に制限されないが、長径１〜１５ｃｍのものが好ましい。
【００２１】
上記繊維質吸水性シートを固着させる防水性平板としては、プラスチック、ガラス等の防水性の材質のものであれば何れでもかまわないが、外部からの観察のため透明のものが好ましい。
【００２２】
本発明のサルモネラ検出法においては、まず被検試料液を前記培地の一部にのみ浸透する量接種する。被検試料液を培地全体に浸透する量接種してしまうと、サルモネラの運動性による選択性が得られず、正確な検出ができない。培地の一部のみとは、被検試料液が浸透しない部分が残存していればよいが、培地表面積の１／２以上が浸透しないで残存しているのが、サルモネラ検出のために好ましい。具体的な、被検試料液の接種量は、培地全体に浸透する量の１／１００〜１／２で充分である。また、接種部位は、サルモネラの運動性を良好に検出するためには、培地の中央部よりも端部寄りの部位が好ましい。
【００２３】
被検試料液としては、食品の水懸濁液、又は前培養液が挙げられる。本発明においては、必要に応じて前培養液（前増菌培養液）を用いればよい。ここで前培養としては、食品検体等の検査試料を前増菌培地（ＥＥＭブイヨン、緩衝ペプトン水ＢＰＷ等）に１０倍量となる量混和して３５℃で２０〜２４時間培養を行なう方法が挙げられる。
【００２４】
次に水又は水溶液を前記培地全体に浸透する量接種する。ここで、水としては精製水が好ましく、また水溶液としては、ｐＨ変化による発色に影響を与えない成分を含む水溶液が好ましい。培地全体に浸透する量は、培地の大きさ、空隙率などにより決定することができる。また、接種部位は、被検試料液接種部位と同じ部位でもよいが、被検試料液接種部位と異なる部位がサルモネラの分離性の点で好ましい。例えば、被検試料液を中央部より下方部に接種した場合には、水又は水溶液はその反対側に接種するのが好ましい。
【００２５】
次いで培養に付し、培地の色を観察すれば、サルモネラが正確に検出できる。培養は４１〜４３℃で、２０〜２４時間、静置、さらには倒置して好気的に行なうのが好ましい。
【００２６】
このように簡易培地の一部に被検試料液を接種すると、被検試料中の微生物がメッシュ間に担持される。その後、多量の水を接種すると培地全体が膨潤ゲル化する。担持された微生物のうち、運動性のあるサルモネラは、ゲル化した培地中を運動し、被検試料接種部位とは異なる部位へと移動する。当該部位でサルモネラにより分泌されたリジンデカルボキシラーゼによりその基質の脱炭酸がおこり、その部位の液性がアルカリ側に変化するためｐＨ指示薬により色の変化が生じる。かくして、サルモネラが簡便かつ短時間で検出できる。
【００２７】
このように被検試料接種部位から離れた部位では、サルモネラのみが増殖しているので、サルモネラのみを釣菌することができ、釣菌したサルモネラを常法により分離培養試験、血清学的、生化学的鑑別試験に付すことができる。
【００２８】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２９】
実施例１
（１）簡易培地の作製
ペプトン２１ｇ、酵母エキス１ｇ、乳糖１０ｇ、白糖１０ｇ、ｐＨ指示薬（ニュートラルレッド）０．０３ｇ、マラカイトグリーン０．０３６ｇ、塩化マグネシウム１３．５８ｇ、クエン酸ナトリウム１ｇ、クエン酸鉄アンモニウム１ｇ、チオ硫酸ナトリウム２ｇ、発色酵素基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド）０．３ｇ、Ｌ−リジン塩酸塩５ｇ、ノボビオシン０．０２ｇ、キサンタンガム１５ｇをヒドロキシプロピルセルロース１ｇ含有するエタノール溶液１０００ｍＬに加え、懸濁液とした。このエタノール懸濁液を１ｍＬずつ繊維質吸水性シート（５０φｍｍ）を収納した容器（５０φｍｍ）に分注し乾燥した後、ふたをして簡易培地を作製した。本培地を乾燥剤と共にアルミ包材に密封包装した後、表面線量１０〜２０ｋＧｙのγ線照射を行なって滅菌した。
（２）被検試料
鶏むねひき肉
（３）簡易培地への接種
鶏むねひき肉２５ｇをＥＥＭブイヨン２２５ｍＬで前増菌培養を３５℃で２４時間行なった後、（１）の培地に接種した。その方法は、以下に示す５種類とした。試料接種量は１ｍＬ、０．１ｍＬ、０．０５ｍＬ、０．０２５ｍＬ、０．０１ｍＬ、０．００５ｍＬの６段階、滅菌水は１ｍＬ注加した。
（Ａ）中心部に試料を接種→滅菌精製水を接種箇所を避けてゆっくり注加。
（Ｂ）端部に試料を接種→滅菌精製水を反対側より注加。
（Ｃ）中心部に試料を接種→同一箇所から滅菌精製水を注加。
（Ｄ）滅菌精製水１ｍＬ注加→中心部に試料を接種。
（Ｅ）原液から８倍まで１０倍段階希釈したものを１ｍＬ接種。
（４）観察接種後４２℃で１８時間培養し、簡易培地を観察した。
（５）確認
簡易培地から一白金耳釣菌し、ＭＬＣＢ（ニッスイ）、Ｒａｍｂａｃｈ　Ａｇａｒ（Ｍｅｒｃｋ）で画線培養した。
（６）結果
結果を表１及び２に示す。
【００３０】
【表１】
2004057054.tif 000002
【００３１】
表１のように、接種方法（Ａ）〜（Ｅ）のいずれにおいても培地の黄変が認められ、サルモネラの存在は確認できた。しかしながら、（Ｄ）法では滅菌水注加後菌が流れやすい傾向が認められた。
【００３２】
【表２】
2004057054.tif 000003
【００３３】
表２より、サルモネラが比較的他の夾雑菌を排除した、純培養に近い状態で分離されたのは、試料接種後と滅菌水を注加した（Ａ）〜（Ｃ）の方法、特に（Ａ）と（Ｂ）の方法が良好であった。サルモネラが運動性により移動した接種部から離れたところを釣菌した場合、分離性が極めて良好であった。ただし、試料の接種量が多い場合（１ｍＬ）は、試料の希釈操作を行なわなければ分離不可能であった。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、食品等の多くの夾雑菌が共存する検体から、サルモネラを簡便かつ短時間で正確に検出できる。