(57)【要約】【課題】癌における多剤耐性に関与している新規遺伝子及びその蛋白質の検索・提供し、それら遺伝子及びその蛋白質の機能の解明し、該遺伝子の検査方法及び該蛋白質に対する抗体を提供し、上記の遺伝子及び抗体を用いて、癌の検査診断方法を提供する。【解決手段】ヒト又は動物の細胞の核に存在し、転写因子機能及び／又はレチノブラストーマ−１遺伝子（ＲＢ１遺伝子）或いはその遺伝子産物の発現を誘導しうる機能を有する新規蛋白質（ＲＢ１ＣＣ１）又はポリペプチド、及びその遺伝子を見出した。そのアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列を決定し、新規遺伝子とハイブリダイズするプライマーにより、遺伝子の増幅、検出を行い、新規遺伝子の発現、変異等を検査し、癌細胞の増殖との関連を見出し癌の検査を行ない、新規蛋白質に対する抗体を調製し、抗体による新規蛋白質の検出により、新規蛋白質と癌細胞の増殖との関連を見出し癌の検査を行なった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は動物の細胞の核に存在し、転写因子機能及び／又はレチノブラストーマ遺伝子（ＲＢ１遺伝子）或いはその遺伝子産物の発現を誘導しうる機能を有する蛋白質又はポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のヒト蛋白質が下記の群より選ばれるポリペプチド又は蛋白質；（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド又は蛋白質、（２）前記のポリペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（３）前記のポリペプチド又は蛋白質と少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド又は蛋白質、（４）および前記（１）から（３）のポリペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリペプチド又は蛋白質。
【請求項３】
請求項１記載の動物蛋白質がマウス由来の蛋白質であり、下記の群より選ばれるポリペプチド又は蛋白質；（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド又は蛋白質、（２）前記のポリペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（３）前記のポリペプチド又は蛋白質と少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド又は蛋白質、（４）および前記（１）から（３）のポリペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリペプチド又は蛋白質。
【請求項４】
請求項１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質をコードする核酸またはその相補鎖。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする核酸。
【請求項６】
配列表の配列番号３〜４に記載の核酸またはその相補鎖の塩基配列のうち少なくとも１５個の連続した塩基配列で示される核酸であって、該核酸の転写によって発現されるポリペプチドが請求項１〜３記載のポリペプチドである核酸。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項９】
請求項８の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１０】
請求項４〜６に記載の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする配列表の配列番号５〜１３２に記載の核酸プライマー。
【請求項１１】
請求項１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質を免疫学的に認識する抗体。
【請求項１２】
請求項１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質の転写因子活性及び／又はＲＢ１遺伝子の発現を誘導しうる機能を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法であって、請求項１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質、請求項１１に記載の抗体のうち、少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項４もしくは６に記載の核酸と相互作用して該核酸の発現を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法であって、請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の形質転換体、請求項１０に記載の核酸プライマーのうち少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法でスクリーニングされる化合物。
【請求項１５】
請求項１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質の転写因子活性及び／又はＲＢ１遺伝子の発現を誘導しうる機能を阻害もしくは増強する化合物。
【請求項１６】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸と相互作用して該核酸の発現を阻害もしくは増強する化合物。
【請求項１７】
請求項１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質、請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸、請求項７に記載のベクター、請求項８に記載の形質転換体、請求項１０に記載の核酸プライマー、請求項１１に記載の抗体、または請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の化合物のうち、少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする、抗がん剤の治療に抵抗性である多剤耐性の治療に用いる医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質の発現または活性に関連した疾病の検査診断方法であって、試料中の（ａ）該ポリペプチド又は蛋白質をコードしている核酸、および／または（ｂ）該ポリペプチド又は蛋白質をマーカーとして分析することを含む検査診断方法。
【請求項１９】
癌細胞の検査方法又は癌の診断方法である請求項１８の検査診断方法。
【請求項２０】
請求項１１に記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質の全部又は一部の発現、増加、減少、欠損等を検査する請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１０に記載の核酸プライマーの少なくとも何れかの１つを用いて請求項１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を増幅させる工程を経て、請求項１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の全部又は一部の発現、変異、欠損又は挿入等を検査する請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２２】
癌抑制遺伝子レチノブラストーマ遺伝子（ＲＢ１遺伝子）或いはその遺伝子産物（ＲＢ１蛋白質）の全部又は一部の発現、増加、減少、変異、欠損又は挿入等を検査することを組み合わせることを特徴とする請求項１８〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
多剤耐性遺伝子、（ＭＤＲ１遺伝子）の或いはその遺伝子産物（ＭＤＲ１蛋白質：Ｐ−糖蛋白質）の全部又は一部の発現、増加、減少、変異、欠損又は挿入等を検査することを組み合わせることを特徴とする請求項１８〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞増殖マーカー、Ｋｉ−６７蛋白質、の全部又は一部の発現、増加、減少等を検査することを組み合わせることを特徴とする請求項１８〜２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法を用いる癌細胞の薬剤感受性を検査する方法。
【請求項２６】
請求項１８〜２５に記載の方法に用いる検査診断試薬およびキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、癌抑制遺伝子（レチノブラストーマ遺伝子：ＲＢ１遺伝子）の発現を誘導しうる新規な蛋白質およびポリペプチド（以下新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１）に関するものである。さらに詳しくは、新規蛋白質のアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸（以下ＲＢ１ＣＣ１遺伝子）、該核酸を含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を使ったペプチドまたはポリペプチドの製造方法、該ペプチドまたはポリペプチドに対する抗体、これらを利用した化合物のスクリーニング方法、該スクリーニングされた化合物、該ポリペプチド若しくは該核酸に作用する活性阻害化合物または活性賦活化合物、これらに関係する医薬組成物、及びこれらに関係する疾病の検査診断方法並びに試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗がん剤の治療に抵抗性である多剤耐性（ＭＤＲ）は癌治療を困難にさせている。ＭＤＲの成因は明確ではないが、いくつかの癌ではＭＤＲ関連遺伝子（ＭＤＲ１遺伝子）産物であるＰ−糖蛋白質が関与していると言われている。一方、他の癌ではＰ−糖蛋白質の発現が癌の発生や転移と逆に相関することも知られている。これらのＰ−糖蛋白質の異なる効果は異なる遺伝子産物の抑制を受けているか或いは異なった相互作用をしていると考えられる。ＭＤＲに関連する遺伝子の検索はこれらの現象を解明する上で必須である。
【０００３】
【解決しようとする課題】本発明が解決しようとする課題は、上記のように抗がん剤に対する多剤耐性に関与する遺伝子およびその遺伝子産物を見いだすことである。より具体的には、本発明の課題は癌抑制遺伝子（レチノブラストーマ遺伝子：ＲＢ１遺伝子）の発現を誘導しうる新規な蛋白質およびポリペプチド（新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１）を提供することである。また本発明の別の課題は、新規蛋白質のアミノ酸配列の全部または一部をコードする核酸（以下ＲＢ１ＣＣ１遺伝子）を提供し、遺伝子工学手法による、蛋白質又はポリペプチド（新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１）の製造法を提供することである。さらに本発明の別の課題は、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１由来のポリペプチドに対する抗体を提供することである。その他の本発明の課題は、上記のものを利用して新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１の有する作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤のスクリーニングをおこなうことであり、スクリーニングされた化合物を提供することであり、またこれらを利用した抗がん剤の治療に抵抗性である多剤耐性（ＭＤＲ）の治療に用いる医薬組成物を提供することである。また別の本発明が解決しようとする課題は、本発明中で明らかになった、癌抑制遺伝子（レチノブラストーマ遺伝子：ＲＢ１遺伝子）の発現を誘導しうる新規の蛋白質およびポリペプチド（ＲＢ１ＣＣ１蛋白質）又は該蛋白質のアミノ酸配列の全部または一部をコードする核酸（以下ＲＢ１ＣＣ１遺伝子）、これを検査することによって癌細胞又は癌の診断方法を提供することである。さらに、該蛋白質のアミノ酸配列の全部または一部をコードする核酸を増幅しうる核酸プライマーを提供し、該プライマーを用いた核酸の増幅産物を検査することによる癌細胞又は癌の診断方法を提供することである。そして、該蛋白質又はポリペプチド（ＲＢ１ＣＣ１蛋白質）と反応しうる抗体を提供することであり、またその抗体を用いた免疫学的な検査方法を提供する。又本発明の課題は該検査方法に用いられる該プライマー又は該抗体を用いた検査試薬又はキットを提供することでもある。
【０００４】
【解決する手段】課題解決のため、本発明者らは、Ｕ−２　ＯＳ骨肉腫細胞とＭＤＲ変異誘導細胞の間で別々に発現されている遺伝子を検索しその塩基配列および該新規蛋白質のｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を決定した。また動物においても同様な蛋白質が存在することを証明するためマウスの新規蛋白質のアミノ酸配列および該新規蛋白質のｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を決定した。さらには、これらの蛋白質を認識する抗体を調製し、遺伝子の発現、変異、欠損等の検査に加えて免疫学的な検討を行い、ある種の癌細胞において本遺伝子の発現及び蛋白質の発現が抑制されていることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は以下の構成よりなる。
１、ヒト又は動物の細胞の核に存在し、転写因子機能及び／又はレチノブラストーマ遺伝子（ＲＢ１遺伝子）或いはその遺伝子産物の発現を誘導しうる機能を有する蛋白質又はポリペプチド。
２、上記１記載のヒト蛋白質が下記の群より選ばれるポリペプチド又は蛋白質；（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド又は蛋白質、（２）前記のポリペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（３）前記のポリペプチド又は蛋白質と少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド又は蛋白質、（４）および前記（１）から（３）のポリペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリペプチド又は蛋白質。
３、上記１記載の動物蛋白質がマウス由来の蛋白質であり、下記の群より選ばれるポリペプチド又は蛋白質；（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド又は蛋白質、（２）前記のポリペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（３）前記のポリペプチド又は蛋白質と少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド又は蛋白質、（４）および前記（１）から（３）のポリペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリペプチド又は蛋白質。
４、上記１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質をコードする核酸またはその相補鎖。
５、上記３に記載の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする核酸。
６、　配列表の配列番号３〜４に記載の核酸またはその相補鎖の塩基配列のうち少なくとも１５個の連続した塩基配列で示される核酸であって、該核酸の転写によって発現されるポリペプチドが上記１〜３記載のポリペプチドである核酸。
７、上記４〜６のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
８、上記７の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
９、上記８の形質転換体を培養する工程を含む、上記１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質の製造方法。
１０、上記４〜６に記載の核酸またはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする配列表の配列番号５〜１３２に記載の核酸プライマー。
１１、上記１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質を免疫学的に認識する抗体。
１２、上記１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質の転写因子活性及び／又はＲＢ１遺伝子の発現を誘導しうる機能を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法であって、上記１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質、上記１１に記載の抗体のうち、少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
１３、上記４もしくは６に記載の核酸と相互作用して該核酸の発現を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法であって、上記４〜６のいずれか１項に記載の核酸、上記７に記載のベクター、上記８に記載の形質転換体、上記１０に記載の核酸プライマーのうち少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
１４、上記１２又は１３に記載のスクリーニング方法でスクリーニングされる化合物。
１５、上記１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質の転写因子活性及び／又はＲＢ１遺伝子の発現を誘導しうる機能を阻害もしくは増強する化合物。
１６、上記４〜６のいずれか１項に記載の核酸と相互作用して該核酸の発現を阻害もしくは増強する化合物。
１７、上記１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質、上記４〜６のいずれか１項に記載の核酸、上記７に記載のベクター、上記８に記載の形質転換体、上記１０に記載の核酸プライマー、上記１１に記載の抗体、または上記１４〜１６のいずれか１項に記載の化合物のうち、少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする、抗がん剤の治療に抵抗性である多剤耐性の治療に用いる医薬組成物。
１８、上記１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質の発現または活性に関連した疾病の検査診断方法であって、試料中の（ａ）該ポリペプチド又は蛋白質をコードしている核酸、および／または（ｂ）該ポリペプチド又は蛋白質をマーカーとして分析することを含む検査診断方法。
１９、癌細胞の検査方法又は癌の診断方法である上記１８の検査診断方法。
２０、上記１１に記載の抗体を用いることを特徴とする、上記１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質の全部又は一部の発現、増加、減少、欠損等を検査する上記１８又は１９に記載の方法。
２１、上記１０に記載の核酸プライマーの少なくとも何れかの１つを用いて上記１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子を増幅させる工程を経て、上記１〜３に記載のポリペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の全部又は一部の発現、変異、欠損又は挿入等を検査する上記１８又は１９に記載の方法。
２２、癌抑制遺伝子レチノブラストーマ遺伝子（ＲＢ１遺伝子）或いはその遺伝子産物（ＲＢ１蛋白質）の全部又は一部の発現、増加、減少、変異、欠損又は挿入等を検査することを組み合わせることを特徴とする上記１８〜２１に記載の方法。
２３、多剤耐性遺伝子、（ＭＤＲ１遺伝子）の或いはその遺伝子産物（ＭＤＲ１蛋白質：Ｐ−糖蛋白質）の全部又は一部の発現、増加、減少、変異、欠損又は挿入等を検査することを組み合わせることを特徴とする上記１８〜２２に記載の方法。
２４、細胞増殖マーカー、Ｋｉ−６７蛋白質、の全部又は一部の発現、増加、減少等を検査することを組み合わせることを特徴とする上記１８〜２３に記載の方法
２５、上記２３記載の方法を用いる癌細胞の薬剤感受性を検査する方法。
２６、上記１８〜２５に記載の方法に用いる検査診断試薬およびキット。
【０００６】
【発明の実施の形態】（新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１）本発明において提供される新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１をコードする核酸は、Ｕ−２　ＯＳ骨肉腫細胞とＭＤＲ変異誘導細胞の間で別々に発現されている遺伝子を検索し、配列表・配列番号５〜３７に記載の核酸プライマーを用いて、Ｕ−２　ＯＳ　ｍＲＮＡを鋳型として増幅し、その塩基配列および該新規蛋白質のｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を決定し、新規なアミノ酸配列を有する物質として、そのｃＤＮＡが取得されたものである。本発明の新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１のｃＤＮＡは、６．６−ｋｂの長さを持ち、４７８２ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、分子量１８０ｋＤａの１５９４個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしていた。
【０００７】
ヒト新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１はコンセンサス核局在シグナル配列部位（リジン−プロリン−アルギニン−リジン配列：ＫＰＲＫ）、ロイシンジッパーモチーフ配列部位及びコイルーコイル構造を有していた。ヒト新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１はＤＮＡ結合転写機能を持つことが示唆された。
【０００８】
（マウス新規蛋白質Ｒｂ１ｃｃ１）マウス筋肉のｍＲＮＡを鋳型にして配列表の配列番号５３〜８３に記載の核酸プライマーを用いて増幅・解析した。得られたマウス新規蛋白質Ｒｂ１ｃｃ１をコードするｃＤＮＡは６５１８ｂｐの鎖長であり、１５８８アミノ酸をコードしている４７６４ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を持っていた。マウス新規蛋白質Ｒｂ１ｃｃ１の遺伝子はヒト新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１遺伝子と８９％の相同性を持っていた。マウス新規蛋白質Ｒｂ１ｃｃ１もヒトと同様コンセンサス核局在シグナル配列部位（リジン−プロリン−アルギニン−リジン配列：ＫＰＲＫ）、ロイシンジッパーモチーフ配列部位及びコイルーコイル構造を有していた。マウス新規蛋白質Ｒｂ１ｃｃ１もＤＮＡ結合転写機能を持つことが示唆された。
【０００９】
（新規蛋白質及び遺伝子の機能）ＭＤＲにおける本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子の役割を調べるために、親細胞Ｕ−２　ＯＳ細胞、ＭＤＲに変異した細胞（Ｕ−２　ＯＳ／ＤＸ５８０）とＭＤＲ１遺伝子を導入したＵ−２　ＯＳ細胞（Ｕ−２／ＤＯＸＯ３５）に対してドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）処理をした場合のＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現を比較したところ、親細胞Ｕ−２ＯＳ細胞と遺伝子導入コントロール細胞（Ｕ−２／Ｎｅｏ８）において、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）はＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現を低下させ、細胞死を誘導した。対照的に、ＭＤＲに変異した細胞においてはドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）処理はＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現レベル、細胞生存期間又は細胞増殖に抑制効果を示さず、ＭＤＲ１遺伝子を有する細胞ではＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現を増加させた。これらの細胞ではＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現とＲＢ１遺伝子の発現が相関し、両遺伝子の発現はこれらの細胞の増殖を持続させた。
【００１０】
本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＲＢ１遺伝子の発現の関係を調べるために、Ｕ−２　ＯＳヒト骨肉種細胞の５種のＭＤＲへの変異株と２４種のヒト腫瘍細胞（１０種の骨肉種、４種の肺癌、７種の乳癌、３種の血液癌）での両遺伝子の発現を調べたところ、全ての細胞でＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現はＲＢ１遺伝子の発現と強く相関した。非腫瘍組織のノーザンブロット解析においてもＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＲＢ１遺伝子の発現は同様な相関を示した。
【００１１】
さらに、Ｋ５６２細胞とジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞において本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子の外来性発現はＲＢ１遺伝子発現を増加させた。ＭＤＲ１遺伝子の発現はこれらの細胞では検出できなかった。ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の誘導はＲＢ１遺伝子のプロモーターの転写活性も刺激した。ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の導入はＲＢ１遺伝子のプロモーターの刺激活性を通じてＲＢ１遺伝子の発現を上昇させた。
【００１２】
新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１のアミノ酸配列、その核局在性及びその発現パターンから、本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子は分子中間体を通って直接或いは間接的に、ＲＢ１遺伝子発現を増強させる転写因子である可能性がある。ヒト及びマウス由来ＲＢ１遺伝子のプロモーター配列の解析からＳｐ１やＡＴＦのような構成転写因子が存在する可能性は示されているが、ＲＢ１遺伝子発現を直接制御する転写因子は知られていない。約８０％のヒトの癌においてはＲＢ１遺伝子経路に存在する分子がその発癌機構に関連しており、ＲＢ１遺伝子の制御不能が多くの人の癌に重要な役割をしている。
【００１３】
本発明のヒト及びマウスのＲＢ１ＣＣ１遺伝子は表１に示すようにヒトでは７４ｋｂ、マウスでは５７ｋｂ以上の長さを有している２４のエキソンと２３個のイントロンから構成されている。そしてエキソン３の部位に翻訳開始箇所がある。マウスにおけるこの遺伝子構造は、配列表・配列番号８４？１３２に記載のプライマーを用いて明らかにした。この遺伝子の染色体上の局在部位を調べたところ、ヒトでは第８染色体上の８ｑ１１．２に、マウスでは第１染色体の１Ａ２−４に存在していることがわかった。
【表１】
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【００１４】
本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子の変異を検出するために、３５例の原発性乳癌から調製したｃＤＮＡを用いてＲＢ１ＣＣ１遺伝子を解析したところ、７例の癌で９種類の変異を確認した。９種類全ての変異はエキソン３−２４での抜け落ちの存在であり、断片化した新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１はコンセンサス核局在シグナル配列部位、ロイシンジッパーモチーフ配列部位及びコイルーコイル構造が失われており、基本的な新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１の機能がないものであった。
【００１５】
２例の原発乳癌（ＭＭＫ３と６）では両方の対立遺伝子において複数のヘテロ接合体の抜け落ちがあり、抜け落ちを持つＲＢ１ＣＣ１遺伝子からは明らかに断片化された新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１が得られることが予測される。ＭＭＫ６ではエキソン３−２４（ヌクレオチド、５３４−５３２２）とエキソン９−２３（ヌクレオチド、１７５７−５１８７）での抜け落ちがあり、コドン４と４１１でそれぞれフレームシフトをしていた。ＭＭＫ３においては、エキソン３−２４（ヌクレオチド、５３５−５３２４）とエキソン５―１１（ヌクレオチド、８４９−２１０９）での抜け落ちがあり、前者ではコドン４での終止が起こり、後者ではコドン１０９でのフレームシフトを引き起こし１２２アミノ酸の断片蛋白が得られる結果になっていた。癌試料のゲノムＤＮＡのＰＣＲではそれぞれの抜け落ち変異に対応する変則な生成物が検出されたのに対して、胚細胞ＤＮＡでは変異が認められないことから、これらの変異は体細胞で見出されるものである。これらの癌では新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１が検出されず、そしてＲＢ１蛋白質がＭＭＫ６では欠如しており、ＭＭＫ３では優位に減少していた。両方とも染色体のＲＢ１ローカスでのヘテロ接合性の消失はなかった。一方、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の変異がない癌試料（ＭＭＫ１２と２９）では新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１とＲＢ１蛋白質の両方が存在していた。このことはＲＢ１ＣＣ１遺伝子の不活性化変異はＲＢ１遺伝子の発現を不十分にし、ＲＢ１遺伝子経路の制御不能を促進し、そして癌発生を引き起こすことが示唆される。
【００１６】
５例の他の乳癌（ＭＭＫ１、１５、３１、３８及び４０）においても、機能を持たない断片蛋白質を生成するＲＢ１ＣＣ１遺伝子内での抜け落ちを検出した。これらの変異は全てヘテロ接合体であったが、ＲＢ１ＣＣ１ローカスでのヘテロ接合性の消失も存在しており、すべてのケースでＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現もないことより、両方の対立遺伝子で機能消失が起きていることが示唆された。これらの癌においてＲＢ１蛋白質の発現がＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＲＢ１遺伝子の変異がないケース（ＭＭＫ１２と２９）に比較して明らかに減少していた。これらの５例（ＭＭＫ１、１５、３１、３８及び４０）ではＲＢ１ローカスでのヘテロ接合性の消失は認められなかった。
【００１７】
本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子のホモ接合不活性化は乳癌の発生に関連している。調べた原発乳癌の約２０％において、明らかに機能を持たない断片の新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１を生成するＲＢ１ＣＣ１遺伝子の抜け落ち変異が認められた。これらの癌の２例はＲＢ１ＣＣ１遺伝子内部での複数のヘテロ接合の抜け落ちであり、残りはＲＢ１ＣＣ１遺伝子のヘテロ接合性の消失であった。７例全てで新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１は検出できないが、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の変異のない癌では蛋白質が発現されていた。ＲＢ１蛋白質はＲＢ１ローカスでのヘテロ接合の消失がないにも拘わらず、７例全てで存在しないか又は有意に減少していた。
新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１はＲＢ１遺伝子の発現を増加させる方向に制御しており、乳癌においてＲＢ１ＣＣ１遺伝子は腫瘍抑制因子として働いている。そして、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の異常・不活化は、ＲＢ１遺伝子の発現低下をもたらし、癌の発生・進行を引き起こす．
【００１８】
上述のようにＲＢ１ＣＣ１遺伝子および蛋白質の発現がＲＢ１遺伝子の発現と相関していることから、本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子および蛋白質検査をＲＢ１遺伝子の発現又は蛋白質の発現と組み合わせて検査することによってより有用な癌細胞又は癌の診断方法が提供される。
【００１９】
さらに多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）又は蛋白質と組み合わせる検査によって、薬剤の癌又は癌細胞に対する効果を調べることができ、抗癌剤の選択、効果の予測に有用な検査方法又は診断方法が提供される。
【００２０】
（ポリペプチド又は蛋白質）本発明の新規蛋白質は、配列表の配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド又は蛋白質である。さらに本発明のポリペプチド又は蛋白質は、この配列表の配列番号１又は２に示すポリペプチドの部分配列を有するポリペプチドから選択される。その選択されるポリペプチドは、配列表の配列番号１又は２に示すポリペプチドと、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％をこえる相同性を有する。この相同性をもつポリペプチドの選択は、例えばＲＢ１遺伝子又はＲＢ１蛋白質の発現を指標にして行うことができる。
【００２１】
アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、推定される核酸の塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等を使用することができる。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド又は蛋白質の部分配列を有するポリペプチドから選択されるアミノ酸配列を試薬・標準物質・免疫原として利用できる。その最小単位としては、少なくとも約５個以上、好ましくは少なくとも約８〜１０個以上、さらに好ましくは少なくとも約１１〜１５個以上のアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、免疫学的にスクリーニングしうるポリペプチドを本発明の対象とする。
【００２３】
さらに、このように特定されたポリペプチドをもとにして、ＲＢ１遺伝子又はＲＢ１蛋白質の発現を指標とすることにより、１ないし数個のアミノ酸の欠失・置換・付加などの変異あるいは誘発変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも提供することができる。欠失・置換・付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９：６６６，１９８３）を利用することが出来る。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基などを修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、それら自体で、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１の機能を制御するための医薬組成物に使用できる。また、本発明のポリペプチド又は蛋白質は、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１の機能を制御しうる化合物、例えば、阻害剤、拮抗剤、賦活剤等を得るためのスクリーニングや、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１に対する抗体の取得に用いることができる。さらに、本発明のポリペプチド又は蛋白質は、試薬・標準品としても使用可能である。
【００２５】
（核酸）本発明の核酸およびその相補鎖は、配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号３又は４に記載の核酸および該核酸に対する相補鎖、これらの核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする核酸、およびこれらの核酸のうち少なくとも１５個の連続した塩基配列を有しかつコードするペプチドが新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１に対する抗体と結合能を有する核酸を意味する。核酸としてＤＮＡを代表例にとると、「ＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、自体公知の方法で例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９　本の名前ですよね？出版社、出版年度がいるのでは？）に記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、６ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で　６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。
【００２６】
本発明の核酸は、配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号３又は４の核酸の情報から選択される相同鎖および相補鎖を意味し、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する少なくとも約１５〜２０個以上の配列からなる核酸配列及び該相補鎖を意味する。この有用な核酸配列の決定は、公知の蛋白質発現系、例えば無細胞蛋白質発現系を利用して簡易に発現蛋白質の確認を行い、その生理活性新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１に対する抗体との結合性を指標にして選別することにより行うことができる。無細胞蛋白質発現系としては、例えば胚芽、家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる（Ｎａｔｕｒｅ、１７９、１６０〜１６１、１９５７）。
【００２７】
これらの核酸は、いずれも本発明の新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１および本発明のポリペプチド又は蛋白質の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、これらをコードする遺伝子等の核酸、またはｍＲＮＡ検出のためのプローブもしくはプライマーとして、あるいは遺伝子発現を制御するためのアンチセンスオリゴマーとして使用することができる。さらに、本発明の核酸は、核酸に関する試薬・標準品としても利用できる。
【００２８】
（形質転換体）上記のような無細胞蛋白質発現系以外にも、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によって、本発明からなる新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドを提供可能である。
【００２９】
形質転換は、自体公知の手段を応用することができ、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換を行う。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法があげられるが、簡便には核外遺伝子を用いた自律複製系を利用する。ベクターは、宿主の種類により選択され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。構成要素は宿主が原核細胞か真核細胞かによって選択し、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等を自体公知の方法によって組合せて使用する。
【００３０】
形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養することにより、本発明のポリペプチドの製造に用いることができる。培養は、発現産生される新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドの生理活性、特にＲＢ１遺伝子誘導活性又はＤＮＡ結合性転写因子活性を指標にして行ってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチによって行う。
【００３１】
（新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物の回収）培地からの新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドの回収は、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１に対する抗体との結合性を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を組合せるか、溶解度差にもとづく硫安、アルコール等の分画手段によっても精製回収できる。
【００３２】
（抗体）抗体は、本発明の新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドの抗原決定基を選別し、作成する。抗原決定基は、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸で構成される。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号１又は２と相同である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位であればよく、露出部位が不連続部位であれば、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であることも有効である。抗体は、免疫学的に新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドを認識する限り特に限定されない。この認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定する。
【００３３】
抗体を産生するためには、本発明の新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドを、アジュバントの存在または非存在下で、単独または担体に結合して、動物に対して体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行う。担体は、自身が宿主に対して有害作用をおこさなければ特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫する動物としては、マウス、ラット、兎、やぎ、馬等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得する。
【００３４】
モノクローナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞を回収し、自体公知の永久増殖性細胞への形質転換手段を導入することによって行われる。
【００３５】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、直接本発明からなる新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１と結合し、その活性を制御可能であり、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１とＲＢ１遺伝子又は蛋白質の発現の制御を容易に行うことができる。そのため、ＲＢ１遺伝子産物と新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１が関連する疾患の治療・予防のために有用である。
【００３６】
（スクリーニング）かくして調製された新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチド、これらをコードする核酸およびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、並びに新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数手段を組合せることによって、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドとの結合性、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１の機能、または新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１の発現に対する阻害剤もしくは賦活剤のスクリーニングに有効な手段を提供する。すなわち、本発明のポリペプチド、本発明の抗体の少なくともいずれか１つを用いることで、本発明のポリペプチド又は蛋白質とＲＢ１遺伝子又は蛋白質の発現を阻害もしくは増強する化合物を得るためのスクリーニング方法が、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の形質転換体、本発明の抗体の少なくともいずれか１つを用いることで本発明の核酸と相互作用し該核酸の発現を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法が、本発明のポリペプチド又は蛋白質、本発明の抗体の少なくともいずれか１つを用いることで本発明のポリペプチド又は蛋白質のＲＢ１遺伝子又は蛋白質の発現制御機能を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法が提供可能である。例えば、ポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質発現系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用した抗体認識物質の選別等が、自体公知の医薬品スクリーニングシステムにおいて利用可能である。
【００３７】
（化合物、医薬組成物）上記のスクリーニング方法で得られた化合物は、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドのＲＢ１遺伝子又は蛋白質の発現制御機能を調節する阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物として利用可能である。また、遺伝子レベルでの新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドの発現に対する阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物としても利用可能である。上記の阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物としては、蛋白質、ポリペプチド、抗原性を有さないポリペプチド、低分子化合物等が挙げられ、好ましくは低分子化合物である。
【００３８】
かくして選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、骨肉腫、白血病、更に、乳腺、前立腺、肺、及び大腸由来の腫瘍等の治療に用いる医薬組成物として調製可能である。また、本発明からなる新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチド、これらをコードする核酸およびその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター並びに、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それら自体が、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１とＲＢ１遺伝子産物との相互作用に対する阻害・拮抗・賦活等の機能を有する、乳癌、前立腺癌等の治療に用いる医薬手段として使用できる。ここで、乳癌、前立腺癌等とは、良性腫瘍ならびに悪性腫瘍を含み、なお、製剤化にあたっては、自体公知のポリペプチド、蛋白質、核酸、抗体等、各対象に応じた製剤化手段を導入すればよい。
【００３９】
本発明からなる新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチド、これらをコードする核酸およびその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター並びに、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１およびその由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、本発明のポリペプチドの発現またはその活性が関連する疾患、例えば、本発明の新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１の発現またはＲＢ１遺伝子又はその産物との相互作用に関連した疾患等の検査診断方法として使用することができる。特に、乳癌、前立腺癌等の診断マーカーおよび／または試薬等の検査診断方法として有用である。診断は、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１をコードしている核酸配列との相互作用・反応性を利用して、相応する核酸配列の存在量を決定すること、および／または新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１について生体内分布を決定すること、および／または新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１の試料中での存在量を決定することによって行う。詳しくは、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１を診断マーカーとして検定する。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応系、酵素反応系、ＰＣＲ反応系等を利用すればよい。さらに、検査診断の方法に用いる試薬キットなども含まれる。
【００４０】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【００４１】
【実施例１】（ヒトＲＢ１ＣＣ１のｃＤＮＡ）ＭＤＲに関連する遺伝子を同定するために、Ｕ−２　ＯＳ骨肉腫細胞とＭＤＲ変異誘導細胞の間で別々に発現されている遺伝子を検索し新規ヒト遺伝子を同定した。配列表の配列番号５と２６のプライマー対（ＣＣ１−Ｓ１及びＣＣ１−ＡＳ１）及び配列番号６と２５のプライマー対（ＣＣ１−Ｓ２及びＣＣ１―ＡＳ２）を用いてクローニングし、更に配列番号７〜２４のプライマーを使ってその核酸配列を決定した。また、市販のｃＤＮＡ末端配列迅速増幅キット（ＲＡＣＥキット、ロッシュ社製）を用い、配列番号２７〜３７のプライマーを使って、５´末端及び３´末端ｃＤＮＡの配列を同定した。ＤＮＡとそのコードされるアミノ酸配列はＤＮＡｓｉｓ　ｖｅｒ．３．２　シークエンスアナライザー（日立ソフトウエア製）とＰＳＯＲＴ　ＩＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｋ．ｒｉｍ．ｏｒ．ｊｐ／〜ａｉｓｏａｉ／ｍｏｌｂｉｏ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いて解析した。その結果、そのｃＤＮＡは、６．６−ｋｂの長さを持ち、４７８２ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、１８０ｋＤａの分子量で１５９４個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしていた。
【００４２】
【実施例２】（マウスＲｂ１ｃｃ１のｃＤＮＡ）マウス筋肉のｍＲＮＡを鋳型にＲＴ？ＰＣＲ法を用いて増幅させ、配列表の配列番号５３と７３のプライマー対（ＭＣＣ１−Ｓ１及びＭＣＣ１−ＡＳ１）及び配列番号５４と７２のプライマー対（ＭＣＣ１−Ｓ２及びＭＣＣ１−ＡＳ２）を使ってクローニングした。そして更に配列表・配列番号５５〜７１のプライマーを使ってその核酸配列を決定した。また、配列表の配列番号７４〜７７のプライマー（ＭＣＣ−ＡＳＲ１、ＭＣＣ−ＡＳＲ２、ＭＣＣ−ＡＳＲ３及びＩＮＴＲＯＮ１ＡＳＲ）を５´末端ＲＡＣＥ用プライマー、配列番号７８〜８３のプライマー（ＭＣＣ−ＳＲ１、ＭＣＣ−ＳＲ２、ＭＣＣ３−Ｓ３、ＭＣＣ３−Ｓ４、ＭＣＣ３−ＡＳ２及びＭＣＣ３−ＡＳ３）を３´末端ＲＡＣＥ用プライマーとしてｃＤＮＡの迅速増幅を行った以外は実施例１と同様に操作してマウス新規蛋白質Ｒｂ１ｃｃ１のｃＤＮＡを同定した。マウス新規蛋白質Ｒｂ１ｃｃ１をコードするｃＤＮＡは６５１８ｂｐの鎖長であり、１５８８アミノ酸をコードしている４７６４ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を持っている。マウス新規蛋白質Ｒｂ１ｃｃ１の遺伝子はヒト新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１遺伝子と、核酸レベルにて８６％、蛋白レベルにて８９％の相同性を持っていた（配列番号１〜４参照）。
【００４３】
【実施例３】（本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＭＤＲ１遺伝子の分析）親細胞Ｕ−２　ＯＳ細胞と数種のＭＤＲ変異細胞におけるＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＭＤＲ１遺伝子の発現レベルをノーザンブロットで解析した。ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の解析用プローブはＲＢ１ＣＣ１遺伝子配列のヌクレオチド番号４１９０〜４６５４の間にハイブリダイズするものを用い、ＭＤＲ１遺伝子にはＭＤＲ１遺伝子のヌクレオチド番号８３４〜１１１９にハイブリザイズするプローブを用いた。プローブはデオキシシトシン３リン酸のα位のリンを放射性同元素に置換したα−３２Ｐ―ｄＣＴＰでラベルして用いた。グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）をｍＲＮＡ発現の指標として用いた。その結果両遺伝子の発現レベルは逆相関した（図１）。
【００４４】
【実施例４】（抗体の調製とウエスタンブロット解析）本発明の新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１のアミノ酸配列６４２−６５８（ＲＢ１ＣＣ−６４２）、７４４−７５７（ＲＢ１ＣＣ−７４４）及び１１０４−１１１８（ＲＢ１ＣＣ−１１０４）の３種類の合成ポリペプチドを調製し、それぞれのポリペプチドのアミノ末端にシステイン残基を導入したものを、ウサギに通常の方法で免疫し抗体を得た。Ｕ−２　ＯＳ細胞の核成分と細胞質成分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、調製した抗体を用いてウエスタンブロットによる解析を行った。その結果、分子量１８０ｋＤａのＲＢ１ＣＣ１蛋白質が核に存在していることが示された（図２）。
マウスＮＩＨ３Ｔ３−３細胞の核成分と細胞質成分を同様に電気泳動後、ＲＢ１ＣＣ−６４２抗体を用いてウエスタンブロット解析した。同時に抗スタスミンウサギ抗体を用いてスタスミンの検出も行った。その結果、Ｒｂ１ｃｃ１蛋白質は核に局在し、スタスミンは細胞質に存在していることが示された。さらに同細胞を各抗体による免疫細胞染色を行い比較したところ、ＲＢ１ＣＣ−６４２抗体では核が染色され、一方抗スタスミンウサギ抗体では細胞質が染色された（図３）。
以上の結果、本発明の新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１は哺乳動物細胞の核に存在することが示された。
【００４５】
【実施例５】（本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現に対する抗癌剤の効果）親細胞（Ｕ−２　ＯＳ）、ＭＤＲに変異した細胞（Ｕ−２　ＯＳ／ＤＸ５８０）とＭＤＲ１遺伝子を導入したＵ−２　ＯＳ細胞（Ｕ−２／ＤＯＸＯ３５）に対してドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）処理をした４種の細胞について、抗癌剤の影響を調べた。抗癌剤ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、４５０ｎｇ／ｍＬの存在下での細胞増殖の影響を調べた。その結果、図４に示すように親細胞Ｕ−２　ＯＳ細胞と遺伝子導入コントロール細胞（Ｕ−２／Ｎｅｏ８）では抗癌剤によって細胞増殖が抑えられるのに対して、ＭＤＲに変異した細胞（Ｕ−２　ＯＳ／ＤＸ５８０）とＭＤＲ１遺伝子を導入したＵ−２　ＯＳ細胞（Ｕ−２／ＤＯＸＯ３５）の場合には抗癌剤の効果はなく細胞増殖が１２０時間以上続いた（図４）。
【００４６】
上記の実験で得られた各経時的に得られた細胞のｍＲＮＡ発現レベルの解析を行った。本発明の新規遺伝子ＲＢ１ＣＣ１遺伝子、ＲＢ１遺伝子及びＭＤＲ１遺伝子を、ＲＢ１遺伝子の発現レベルをヒトＲＢ１　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列３３６−６７５の部位にハイブリダイズするプローブを用いて検出した以外は実施例３と同様にそれぞれ解析した。その結果を図５に示した。抗癌剤の効果が認められた親細胞Ｕ−２　ＯＳ細胞と遺伝子導入コントロール細胞（Ｕ−２／Ｎｅｏ８）では、経時的にＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現が低下していた。対照的に、ＭＤＲに変異した細胞（Ｕ−２　ＯＳ／ＤＸ５８０）とＭＤＲ１遺伝子を導入したＵ−２　ＯＳ細胞（Ｕ−２／ＤＯＸＯ３５）細胞においてはドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）処理によってＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現レベルは抑制されず、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現が増加した。これらの細胞ではＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現とＲＢ１遺伝子の発現が相関していた（図５）。
【００４７】
【実施例６】（本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＲＢ１遺伝子の発現）種々の癌細胞におけるＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＲＢ１遺伝子の発現を半定量ＲＴ−ＰＣＲ法によって調べた。用いた細胞株は、ＳＡＲＧ、ＩＯＲ／ＯＳ９、１０、１４、１５、１８、ＭＯＳ、（これらは進行したヒト骨肉種の手術試料から得た）、Ｓａｏｓ−２，　ＨＯＳ，　ＭＣＦ−７，　Ｔ−４７Ｄ，　ＢＴ−２０，ＳＫ−ＢＲ３、ＺＲ７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｄａｕｄｉ、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２（これらはアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクションより購入）、ＮＺＫ−Ｋ１（これは４６才女性の乳癌組織より樹立した）、ＬＫ２、ＱＧ５６，ＥＢＣ１及びＳＢＣ２（これらは愛知ガンセンターの成田達彦博士より分与された）である。各細胞株より２μｇのＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを２２−３０サイクルかけて増幅した。ＲＢ１遺伝子用のプライマーは公知のプライマーを合成して用いた（Ｓａｕｅｒｂｒｅｙら、１９９６年）。ＲＢ１ＣＣ１増幅用プライマー対は配列表・配列番号１９及び２０（ＣＣ１−ＳとＣＣ１−ＡＳ）の組み合わせを用いた。コントロールとしてβ２ミクログロブリンを用いた。これら全ての細胞でＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現はＲＢ１遺伝子の発現と強く相関した。正常リンパ球１例と６例の癌細胞Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ７、ＮＺＫ−Ｋ１、Ｄａｕｄｉ、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔの結果を図６に示した（図６）。
【００４８】
【実施例７】（臓器での本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＲＢ１遺伝子の発現）ヒトの脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、リンパ球の各非腫瘍組織中に発現しているＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＲＢ１遺伝子を市販のＭＴＮ　Ｂｌｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてノーザンブロット解析によって行った。その結果を図７に示した。心臓および骨格筋では両遺伝子は強く発現しており、大腸、小腸、肺及びリンパ球では発現は弱かった。しかし、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＲＢ１遺伝子の発現は相関していた。一方マウスの心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、筋肉、腎臓、睾丸の各組織中に発現しているＲｂ１ｃｃ１遺伝子をノーザンブロット解析した。その結果を図８に示した。心臓では６．２−ｋｂと６．８−ｋｂの転写産物が強く発現しており、腎臓、肝臓および筋肉で若干の発現が認められた。睾丸では６．２−ｋｂの発現が主であり、肺及び脾臓では発現は弱かった（図７、図８）。
【００４９】
【実施例８】（本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子導入によるＲＢ１遺伝子の発現）実施例６で示した細胞の中でＲＢ１ＣＣ１遺伝子及びＲＢ１遺伝子の両方が弱い発現レベルであったＪｕｒｋａｔ及びＫ５６２細胞にＲＢ１ＣＣ１遺伝子を外から導入して、ＲＢ１遺伝子の発現レベルの変化を調べた。ＲＢ１ＣＣ１分子の完全なコード領域を含む４．９−ｋｂをｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ　ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込み、クローニングしてＲＢ１ＣＣ１発現ベクター（ｐＣＲ−ＲＢ１ＣＣ）を調製した。調製した発現ベクターをＫ５６２及びＪｕｒｋａｔ細胞に組み込みＲＢ１ＣＣ１形質転換細胞を調製した。対照としてｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ　ベクターにｌａｃ　Ｚ遺伝子を組み込んだものを調製した。親細胞と形質転換細胞（ＲＢ１ＣＣ１遺伝子導入細胞）のそれぞれのＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＲＢ１遺伝子の発現レベルを実施例６と同様に操作して調べた。その結果を図９に示した。未転換の細胞及びｌａｃ　Ｚ遺伝子を組み込んだ細胞ではＲＢ１ＣＣ１遺伝子及びＲＢ１遺伝子ともに発現は弱いが、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子を組み込んだ細胞ではＲＢ１ＣＣ１遺伝子はもとよりＲＢ１遺伝子も強く発現されていることが判り、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の導入（外来性発現）によりＲＢ１遺伝子の発現も誘導されることが示された（図９）。
【００５０】
【実施例９】（本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子のＲＢ１遺伝子プロモーター転写活性）ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の導入がＲＢ１遺伝子のプロモーター領域の転写活性を増強制御していることを調べた。約２−ｋｂのＲＢ１プロモーター領域の遺伝子をプライマー対、５´−ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＡＡＴ　ＴＣＣ　ＴＣＣ　ＴＧＣ　ＡＣＣ　Ａ−３´（Ｂｇｌ．ＲｂＰｒｏ−Ｓ）と５´−ＣＣＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＧＣ　ＣＡＧ　ＣＧＡ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ−３´（Ｈｉｎｄ．ＲｂＰｒｏ−ＡＳ）で増幅させ、ＰｉｃａＧｅｎｅ　Ｂａｓｉｃ　ベクター２（東洋インク製）に組み込んだ。そして、ＲＢ１プロモーターが蛍ルシフェラーゼの発現を支配しているｐＧＶ−ＲｂＰｒｏベクターを調製した。調製したｐＧＶ−ＲｂＰｒｏベクターはさらに、内部コントロールとしてシーパンジールシフェラーゼ遺伝子をコードするｐＲＬ−ＳＶ４０で重転換させて、Ｋ５６２細胞にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ　ＰＬＵＳ試薬（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて組み込んだ。４８時間後に東洋インク社製の２重ルシフェラーゼ分析システムを用いて分析したところ、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子を導入したＫ５６２細胞ではコントロールのｌａｃ　Ｚを組み込んだＫ５６２細胞に比べて強いルシフェラーゼ活性を示し、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子の導入がＲＢ１遺伝子プロモーターの転写活性を強めることが判った（図１０）。
【００５１】
【実施例１０】（原発性乳癌におけるＲＢ１ＣＣ１遺伝子のローカス（Ｄ８Ｓ５６７）でのヘテロ接合性の消失）癌組織のＤＮＡ試料及び同一患者のゲノムＤＮＡをＰＣＲにより増幅した試料を尿素変性８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。電気泳動後、銀染色により得られた結果を図１１に示した。何れの患者でもゲノムＤＮＡでは２本のバンドが認められ、ヘテロ接合性が保持されているのに対して、５例の癌組織のＤＮＡで１本のバンドしか検出されず、ヘテロ接合性の消失を認めた（図１１）。
【００５２】
【実施例１１】（乳癌における本発明のＲＢ１ＣＣ１遺伝子の変異解析）
実施例１で用いた配列番号６及び２５のプライマー対（ＣＣ１−Ｓ２とＣＣ１−ＡＳ２）によりＥＬＯＮＧＡＳＥシステム（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて増幅したｃＤＮＡ試料を、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３１０型遺伝子解析装置、および配列表・配列番号７〜２４のプライマーを用いて、遺伝子配列を解析することによりＲＢ１ＣＣ１遺伝子の変異を同定した。その結果３５例の乳癌中７例の変異例を確認し、９種類の変異型を確認した。更にこれを配列番号３８〜５２のプライマーを使って再確認した。その結果を表２に示した。
【表２】
2004057003.tif 000003
【００５３】
【実施例１２】
実施例１１で解析した試料のうちＲＢ１ＣＣ１遺伝子に変異の求められたＭＭＫ６と認められなかったＭＭＫ２９についてＰＣＲ産物を分析した結果とそれに対応する遺伝子配列解析結果を図１２に示した。その結果、変異のないＭＭＫ２９では４．９−ｋｂの遺伝子が発現されているのに対して変異のあるＭＭＫ６では４．９−ｋｂの発現は認められず断片遺伝子（１４５６ｂｐと９８ｂｐ）の発現が認められた（図１２）。
【００５４】
【実施例１３】（ウエスタンブロットによる解析）
実施例１１で解析した試料のうちＲＢ１ＣＣ１遺伝子に変異を認めた３種の癌（ＭＭＫ６、ＭＭＫ４０，ＭＭＫ３８）及び変異を認めなかった２例（ＭＭＫ１２、ＭＭＫ２９）について、新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１とＲＢ１蛋白質の発現をウエスタンブロットで確認した。抽出蛋白質を５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブランに転写し、実施例４で調製した抗ヒトＲＢ１ＣＣ１抗血清（α−ＲＢ１ＣＣ−６４２）を反応させた。ＲＢ１蛋白質は抗ＲＢ１モノクローナル抗体（Ｇ３−２４５；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を反応させた。反応後、検出はＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）で行った。その結果を図１３に示した。変異のないＭＭＫ１２とＭＭＫ２９においては１８０ｋＤａの分子量を持つ新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１と１１０〜１１６ｋＤａのＲＢ１蛋白質の両蛋白質が発現しているのに対して、変異のある３例では何れも両蛋白質の発現は認められなかった（図１３）。
【００５５】
【実施例１４】（免疫組織染色）実施例１１で解析した試料のうちＲＢ１ＣＣ１遺伝子に変異を認めた２種の癌（ＭＭＫ３、ＭＭＫ６）及び変異を認めなかった１例（ＭＭＫ１２）の免疫組織染色を行った。反応させる抗体は実施例１３と同じ抗体を用い、それぞれの癌試料から得たパラフィン固定ブロックより調製した組織切片に抗体を反応させた。図１４に示したように新規蛋白質ＲＢ１ＣＣ１とＲＢ１蛋白質の発現レベルは相関しており、ＲＢ１ＣＣ１遺伝子に変異を認めた２種の癌（ＭＭＫ３、ＭＭＫ６）では変異を認めなかった１例（ＭＭＫ１２）よりも明らかにその発現レベルは低下していることが確認された（図１４）。
【００５６】
【実施例１５】
実施例１４と同様に操作し、５４例の原発性乳癌組織を免疫組織染色により検査したところ、１５％にあたる８例でＲＢ１ＣＣ１蛋白質が検出されなかった。そして、これら全てでＲＢ１蛋白質の発現が欠如しているか或いは有意に低下していた。
一方、ＲＢ１ＣＣ１蛋白質を発現している４６例では、４５例においてＲＢ１蛋白質が同時に発現していた。このＲＢ１蛋白質の発現を免疫組織染色の染色指標（１０００個以上の細胞のうち染色される細胞の数の割合を％で表したもの）でＲＢ１ＣＣ１陽性群と陰性群で比較すると、ＲＢ１ＣＣ１陽性群が７８．６±１３．９％に対して陰性群は１３．６±１２．１％とＲＢ１ＣＣ１の発現と正の相関を示していた（図１５ａ）。一方、Ｋｉ−６７の免疫組織染色をマウスモノクローナル抗体（ＮＣＬ−Ｋｉ−６７−ＭＭＩ、ノボカストラ社製）を用いて行ったところ、その染色指標はＲＢ１ＣＣ１陽性群で２０．３±１２．８％に対して、陰性群では６５．０±１２．２％と明らかにＲＢ１ＣＣ１の発現と逆相関が認められた（図１５ｂ）。
これらのことから、ＲＢ１ＣＣ１蛋白質の発現が抑制されている癌では、細胞増殖のマーカーであるＫｉ−６７が多量に発現されており、癌細胞の増殖が盛んであることを示している。このようにＲＢ１ＣＣ１蛋白質とＫｉ−６７の両者を組み合わせて検査することにより、癌の診断に有用であることが判った。
【００５７】
【発明の効果】本発明の新規遺伝子（ＲＢ１ＣＣ１遺伝子）及びその蛋白質（ＲＢ１ＣＣ１）を検査することにより、癌細胞の増殖及び癌の診断に有用な情報を提供できる。
【００５８】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＲＢ１ＣＣ１遺伝子とＭＤＲ１遺伝子の発現の関連を調べたノーザンブロットの写真である。
【図２】ヒトＲＢ１ＣＣ１蛋白質が核に存在していることを示すウエスタンブロットと細胞の免疫染色の写真である。
【図３】マウスＲｂ１ｃｃ１蛋白質が核に存在していることを示すウエスタンブロットと細胞の免疫染色の写真である。
【図４】抗癌剤ドキソルビシン処理による細胞増殖の効果を調べた図である。
【図５】抗癌剤ドキソルビシン処理による細胞増殖とＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現とＲＢ１遺伝子の発現の関連を調べたノーザンブロットの写真である。
【図６】各種癌細胞におけるＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現とＲＢ１遺伝子の発現の関連を調べたＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図７】ヒト各種臓器におけるＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現とＲＢ１遺伝子の発現の関連を調べたノーザンブロットの写真である。
【図８】マウス各種臓器におけるＲＢ１ＣＣ１遺伝子の発現とＲＢ１遺伝子の発現の関連を調べたノーザンブロットの写真である。
【図９】ＲＢ１ＣＣ１遺伝子導入によるＲＢ１遺伝子発現効果を調べたＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図１０】ＲＢ１遺伝子プロモーター領域の転写活性に及ぼすＲＢ１ＣＣ１遺伝子誘導の効果を調べた結果の図である。
【図１１】各種の原発性乳癌におけるＲＢ１ＣＣ１遺伝子ローカスのヘテロ接合性の消失の検査結果の写真である。
【図１２】原発性乳癌におけるＲＢ１ＣＣ１遺伝子の変異を調べたＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動の写真と遺伝子配列解析結果の図である。
【図１３】原発性乳癌におけるＲＢ１ＣＣ１蛋白質とＲＢ１蛋白質の発現を調べたウエスタンブロットの写真である。
【図１４】原発性乳癌におけるＲＢ１ＣＣ１蛋白質とＲＢ１蛋白質の発現を調べた免疫組織染色の写真である。
【図１５】染色指標のＲＢ１ＣＣ１と、Ｋｉ−６７及びＲＢ１との相関を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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