(57)【要約】【課題】凍結組織標本のみならずパラフィン組織標本を用いた免疫組織化学法等で使用できる、ミクログリアのみに反応するミクログリア特異抗体を提供すること。【解決手段】ＧＬＵＴ−５またはそのフラグメントを抗原とすることにより得られ、ミクログリアと特異的に結合するミクログリア特異抗体およびこれを有効成分として含有する組織染色剤。【選択図】　図２
2004123613.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＵＴ−５またはそのフラグメントを抗原とすることにより得られ、ミクログリアと特異的に結合するミクログリア特異抗体。
【請求項２】
単球由来マクロファージと実質的に反応しない請求項第１項記載のミクログリア特異抗体。
【請求項３】
ＧＬＵＴ−５のフラグメントが、ＧＬＵＴ−５のＣ末端の少なくとも１０個のアミノ酸配列を含むフラグメントである請求項第１項または第２項記載のミクログリア特異抗体。
【請求項４】
ＧＬＵＴ−５のフラグメントが、次のペプチド配列
ＳＥＶＹＰＥＫＥＥＬＫＥＬＰＰＶＴＳＥＱ
である請求項第１項ないし第３項の何れかの項記載のミクログリア特異抗体。
【請求項５】
請求項第１項ないし第４項の何れかの項記載のミクログリア特異抗体を有効成分として含有する組織染色剤。
【請求項６】
脳組織を染色するものである請求項第５項の組織染色剤。
【請求項７】
パラフィン組織標本に対し優れた染色性を示すものである請求項第５項または第６項記載の組織染色剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ミクログリアと特異的に結合する抗体に関し、更に詳細には、単球由来マクロファージと反応せず、免疫染色による形態観察で、ミクログリアが静止型か活性型かまでをも容易に区別することが可能なミクログリア特異抗体およびこれを利用する組織染色剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミクログリアは、中枢神経系組織実質内に存在する細胞の一つで、近年の研究でアルツハイマー病、クロイツフェルド・ヤコブ病、脳腫瘍、エイズ脳症を含む、あらゆるヒト脳疾患の発症と病態進行に重要な役割を演ずる可能性が指摘されている。
【０００３】
ヒト脳疾患の診断と研究を主目的とする神経病理学の分野では、ホルマリン固定パラフィン包埋された脳組織を検索材料とするが、一般的な組織染色でミクログリアを選択的に可視化することは困難であるため、免疫組織化学的にミクログリアを同定する特異的マーカーが重要となる。
【０００４】
ところで、ミクログリアは活性型、静止型でその形態が異なり、活性型ミクログリアの存在は脳のその部分に細胞の変性や炎症等の障害が生じていることを意味する。このため、病理学的研究において、ミクログリアの形態を知ることの重要性は古くから示唆されていた。初めてミクログリアが染色されたのは１９１９年、凍結組織標本を用いた渡銀法によってである。その後レクチンの１種であるＲＣＡ−１をビオチン化し、西洋ワサビペロキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」という）−アビジンと反応させることでミクログリアが染色されることが報告された（　Ｈ．　Ｍａｎｎｏｊｉ　ら；非特許文献１参照　）。また、ＭＨＣクラスＩＩ細胞に特異的な糖タンパクでありマクロファージのマーカーであるＨＬＡ−ＤＲの抗体が活性型ミクログリアの免疫染色に有用であること（　Ｐａｔｒｉｃ　Ｌ．　ＭｃＧｅｅｒ　ら；　非特許文献２参照、Ｐ．Ｌ．ＭｃＧｅｅｒ　ら；　非特許文献３参照）や、Ｂ−リンパ球特異抗体やＣＤ６８の抗体がミクログリアの染色に使えること（　Ｄｅｎｎｉｓ．　Ｗ．　Ｄｉｃｋｓｏｎ　ら；　非特許文献４参照）が報告されてきた。これらのレクチンや特異抗体を用いた新たな染色法はいずれも凍結組織標本を用いた場合では良好な染色性を示すが、パラフィン組織標本では染色性が低下するという問題があった。
【０００５】
また、これらの抗体やレクチンはミクログリアの一部のみと反応したり、また、ミクログリア以外に血管周囲細胞、髄膜や脈絡叢のマクロファージとも反応するマーカーであり、ミクログリアに対する反応性および特異性は高いものではなかった。さらに、従来のミクログリアマーカーは、本来が血液単球や血液単球由来マクロファージのマーカーであり、ヒト脳病巣での内因性（脳ミクログリア由来）マクロファージと血液単球由来マクロファージを染め分けて関与の違いを比較検討することは困難であった。
【０００６】
ミクログリアのみに反応する抗体を見出すことができれば、免疫組織化学法により、正常状態あるいは病的状態の脳におけるミクログリアの全貌を把握し、病理診断や病態を解明することが可能となるが、このような抗体が提供されていないのが現状であった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ　７１：　３４１−
３４３
【非特許文献２】
Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　７９：　１９５−
２００
【非特許文献３】
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　３８：　１２８５−１２９１
【非特許文献４】
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，
３５：　１３５−１４７５
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、凍結組織標本のみならずパラフィン組織標本を用いた免疫組織化学法等で使用できる、ミクログリアのみに反応するミクログリア特異抗体の提供をその課題とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行っていたところ、最近グルコーストランスポーター（Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，　以下「ＧＬＵＴ」と略す）のひとつであるＧＬＵＴ−５がヒトの脳においてミクログリアのマーカーになるとの報告があることを知った。そして、このＧＬＵＴ−５のＣ末端に対する抗体は、ミクログリアにを選択的に染色し、単球と単球由来マクロファージとは反応しないことを見い出した。既にミクログリアマーカーとして報告されている他の抗体による染色と比較しても、形態観察において優れており、形態観察で静止型か活性型が容易に区別することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、ＧＬＵＴ−５またはそのフラグメントを抗原とすることにより得られ、ミクログリアと特異的に結合するミクログリア特異抗体を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、上記抗体を有効成分として含有する組織染色剤を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の態様】
本発明においてミクログリア特異抗体とは、ミクログリアに対し特異的に結合する抗体を意味する。このようなミクログリア特異抗体は、ＧＬＵＴ−５またはそのフラグメント、特に、ＧＬＵＴ−５のＣ末端の少なくとも１０個のアミノ酸配列を含むＧＬＵＴ−５フラグメントを抗原とし、常法に従って動物を免疫することにより得られる。
【００１３】
抗原として使用されるＧＬＵＴ−５は、１３種類あるグルコース・トランスポーターのひとつであり、ヒトでは小腸、精巣、脳で発現していることが分かっている。このＧＬＵＴ−５の配列は、米国ＮＣＢＩデータベース上で蛋白質として、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ａ３６６２９に開示されているが、このうち、Ｃ端からの少なくとも１０個、好ましくは２０個程度のアミノ酸配列がミクログリア特異抗体を得るために使用される。
【００１４】
具体的にミクログリア特異抗体を得るには、例えば次のようにすればよい。すなわち、Ｃ端から少なくとも１０個のアミノ酸配列を含むフラグメント（以下、「Ｃ端ペプチド」という）あるいは、これと生体高分子化合物と結合させた結合物が抗原として用いられる。
【００１５】
上記のＣ端ペプチドと結合させる生体高分子化合物の例としては、サイログロブリン、スカシ貝のヘモシアニン、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン等が挙げられ、このうちサイログリブリンが好ましい。
【００１６】
上記Ｃ端プペチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．　Ｆ．　Ｅｒ．ｌａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　：Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２３４　１０９０−１０９４（１９５４））または活性化エステル法（Ａ．　Ｅ．　ＫＡＲＵ　ｅｔ　ａｌ．　：Ｊ．　Ａｇｒｉｃ．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．　４２　３０１−３０９（１９９４）等の公知の方法によって行うことができる。
【００１７】
上記の方法によるＣ端ペプチドと生体高分子化合物との反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製することにより、Ｃ端ペプチドと生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物」ということがある）を得ることができる。
【００１８】
次に、上のようにして得られたＣ端ペプチドあるいは結合物を抗原とし、これを用いて抗体を作製するが、これにあたっては、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法を適宜利用することができる。
【００１９】
すなわち、上記のＣ端ペプチドあるいは結合物を使用して、本発明のポリクローナル抗体を作製するには、これらで動物を免疫し、当該動物から抗体を採取すれば良い。
【００２０】
例えば、Ｃ端ペプチド−サイログロブリン結合物をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤と混合したものを、免疫原として哺乳動物を免疫する。
【００２１】
免疫される動物としては当該分野で常用されたものをいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ等を挙げることができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は１回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回行うことができる。
【００２２】
次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取し、そこから抗血清を分離する。この抗血清を、更に、例えば抗原カラムを用いてアフィニティ−精製し、ポリクローナル抗体としてミクログリア特異抗体を得ることができる。
【００２３】
一方、常法に従い、前記結合物で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによってモノクローナル抗体としてミクログリア特異抗体を得ることもできる。
【００２４】
かくして得られるミクログリア特異抗体は、免疫組織化学や、ウエスタンブロッティングに使用することができ、例えば、霊長類由来の病理組織標本において、静止型および活性型ミクログリアやミクログリア由来マクロファージを免疫染色により簡便に、かつ特異的に同定するために使用することができる。
【００２５】
例えば、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、エタノール等を用いる固定法により固定された組織標本のパラフィン切片において、ミクログリア特異抗体を用いる染色は、特に制約はなく、公知の手段により実施される（改訂版　酵素抗体法　編集　渡辺慶一、中根一穂　学際企画株式会社出版等参照）。
【００２６】
より具体的には、パラフィン切片は、脱パラフィン操作後、組織上に存在するＧＬＵＴ−５をミクログリア特異抗体（一次抗体）により捕捉し、ＧＬＵＴ−５／一次抗体複合体を生成させる。更に、洗浄後、この一次抗体を免疫に供した動物に対するＩｇ抗体にビオチンを標識した二次抗体を加え、ＧＬＵＴ−５／一次抗体複合体と結合させ、ＧＬＵＴ−５／一次抗体複合体／ビオチン標識二次抗体を生成させる。ついで、ビオチンと共有結合できるストレプトアビジン・ＨＲＰ結合体を反応させ、最後に当該複合体の標識量を発色剤により発色させる。この発色が認められる場合にＧＬＵＴ−５陽性を決定することができる。
【００２７】
また、上記染色は、前処理としてマイクロウエーブやオートクレーブなどで熱処理を行うことにより、その染色性が著しく向上する。この熱処理は、容器に低濃度酸性緩衝液（一般的には５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）を入れて切片を浸し、マイクロウエーブ（出力５００−６００Ｗの家庭用電子レンジ）で９０−１００℃に、またはオートクレーブで１１０−１２０℃に加熱する。この温度を１０分程度保った後、冷却して使用する。
【００２８】
本発明のミクログリア特異抗体は、静止型、活性型ミクログリアの両方を染色し、形態観察で静止型か活性型が容易に区別することが可能であった。そして、染色の感度はビオチン化ＲＣＡ−１やその他の既にミクログリアマーカーとして報告されている他の抗体による染色と比較しても、優れていた。
【００２９】
これらのことから、本発明のミクログリア特異抗体を用いる組織染色は、ヒト脳等の病理組織標本の染色法のスタンダードと成りえるものといえる。
【００３０】
【作用】
本発明のミクログリア特異抗体を用いるパラフィン包埋組織切片の免疫染色で、核が細長く、不規則な形の、細胞体から鹿の角のような突起が直角的に分岐した細胞が染色され、形態学的な特徴から染色された細胞はミクログリアであると判断された。更に、既にミクログリアマーカーであると報告されているＲＣＡ−１やＫＰ−１、Ｋｉ−Ｍ１ｐの染色と連続切片を用いて比較すると、同じ細胞が染色されており、このことからも、ミクログリア特異抗体によって染色された細胞はミクログリアであることが証明された。
【００３１】
また、ＲＣＡ−１やＫＰ−１、Ｋｉ−Ｍ１ｐは静止型、活性型ミクログリアマーカーであると報告されているが、ミクログリア特異抗体の染色像と連続切片を用いて比較すると、同じ細胞が染色されており、ミクログリア特異抗体が静止型、活性型の両方の染色に使用できることが確認できた。また、染色された細胞を形態学的に観察するとミクログリア特異抗体による染色像のほうが胞体やミクログリアの突起のすみずみまではっきり染色されており、クリアであった。また、ＲＣＡ−１と比較すると、ミクログリア特異抗体によりＲＣＡ−１染色よりも多数のミクログリアが染色されており、ＲＣＡ−１よりも感度が良いことが確認できた。
【００３２】
ミクログリア特異抗体による染色は、パラホルムアルデヒド固定やエタノール固定、ホルマリン固定のどの固定法でも可能であった。固定期間は１週間以内であれば問題なく、パラフィン切片で染色できた。また静止型、活性型ミクログリアの両方を染色でき、染色像がきれいなので形態的観察により静止型ミクログリアか活性型ミクログリアかが容易に見分けがついた。すなわち、細く、長く、たくさんの突起を分岐した静止型ミクログリアと比較して、太く、短い突起の活性型ミクログリアを見分けることができたのである。
【００３３】
また、このミクログリア特異抗体を用いて脳以外の組織を染色し、この抗体のミクログリア選択性を確認した。肺の肺胞マクロファージ、肝のクッパー細胞、骨髄や消化管のマクロファージ、血液単球、皮膚や関節組織の組織球などはマクロファージマーカーであるＫＰ１、ＫｉＭ１Ｐ、ＲＣＡ−１、ＨＬＡ−Ｄなどに陽性であるが、このミクログリア特異抗体には陰性であり、本抗体が血液単球や単球由来のマクロファージや組織球と反応しないことが確認された。
【００３４】
【実施例】
以下実施例および試験例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制約されるものではない。
【００３５】
実　施　例　１
（１）ミクログリア特異抗体の調製：
次の配列１で示されるＧＬＵＴ−５のＣ端の２０アミノ酸のＮ端側にキャリア蛋白導入のために必要なシステインを加えた計２１アミノ酸の部分合成ペプチド（以下、「合成ペプチド」という）を作製した。このペプチドのＮ端側のシステインにキャリア蛋白としてＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）サクシンイミド（ＥＭＣＳ）を結合させたサイログロブリンをマレイミド法に従って導入した。このサイクログロブリン結合合成ペプチドを完全アジュバントと良く混和し、ウサギ（日本白色腫；２．５〜３Ｋｇ）に１００μｇ投与した。一週間後、２回目の免疫として、サイクログロブリン結合合成ペプチドを不完全アジュバントと良く混和したものを１００μｇ投与した。以後各週の間隔で追加免疫を計６回行い、最終的にウサギから抗血清を採取した。
【００３６】
配列１：　ＳＥＶＹＰＥＫＥＥＬＫＥＬＰＰＶＴＳＥＱ
【００３７】
一方、活性化チオールセファロースに合成ペプチドのチオール基をジスルフィド結合させたものを充填したポリプレップカラム（商品名、アクチベーッティド４、バイオラッド社）を用意した。このカラムを用いて、上記抗血清のアフィニティ精製を行い、精製ＩｇＧとしてミクログリア特異抗体を得た。
【００３８】
（２）ウエスタンブロッティングによる特異性の確認：
次に、得られたポリクローナル抗体がＧＬＵＴ−５を認識することを確認するために、脳抽出物を電気泳動し、ウエスタンブロッティングを行った。
【００３９】
用いたヒト脳サンプルは５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）中でホモジェナイズし、その不溶性画分を、ＳＤＳを１０％含む０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）で可溶化した。
【００４０】
自家調整した１０％のポリアクリルアミド　ゲル上でレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法で電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）を行った。電気泳動された蛋白は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）へ電気的に転写した。メンブレンは３％スキムミルクと１％ＢＳＡを添加した１０ｍＭ　リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングし、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０添加ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したミクログリア特異抗体と一晩反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０添加ＰＢＳ溶液で洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ−ｃｈａｉｎ：ＩＢＬ社製）を２０００倍に希釈して２次抗体として反応させ、洗浄後ＥＣＬ溶液（アマシャム社製）で発光させた。
【００４１】
一方、比較のため、同じメンブレンを上記のようにブロッキングした後、ミクログリア特異抗体を、あらかじめ抗原とした合成ペプチドと反応させ、抗体活性を吸収した抗原吸収ミクログリア特異抗体に代える以外は同様にして発光させた。
【００４２】
このウエスタンブロッティングの結果を図１に示す。上記実施例により作成されたミクログリア特異抗体は５０ＫＤａ付近に濃いバンドを確認し（図１左レーン）、このバンドは抗原吸収ミクログリア特異抗体では消えていたことから（図１右レーン）、この抗体が特異的にＧＬＵＴ−５を認識することが確認できた。
【００４３】
実　施　例　２
免疫組織染色試験（１）：
実施例１で得たミクログリア特異抗体を用いて免疫組織染色試験を行った。試料としては、アルツハイマー型痴呆７例、脳梗塞２例、全脳放射線照射２例、その他の神経変性疾患１０例を含む、３０代から８０代の２８例の脳の切片を用いた。これらの切片は、ホルマリン、４％パラホルムアルデヒドあるいはエタノールで、１日〜数日間（１週間）固定したパラフィン包埋切片である。なお、比較としては、ＲＣＡ−１を用いた。
【００４４】
パラフィン切片をキシレン濃度系列溶液とアルコール濃度系列溶液により、脱パラフィン・親水化した後、免疫染色を行った。具体的な各工程は以下の通りである。３％過酸化水素溶液にて組織上を覆い、内因性パーオキシダーゼのブロッキング操作を行った。次いで、ＰＢＳにて良く洗浄後、５％正常ヤギ血清で組織上を覆い、非特異反応部位のブロッキング操作を行った。次にＰＢＳで良く洗浄した後、上記ポリクローナル抗体をＰＢＳにて２μｇ／ｍＬに希釈した抗体で組織上を覆い、４℃で一夜反応させた（一次反応）。ＰＢＳで良く洗浄した後、調整済みのビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体にて組織上を覆い、室温で２時間反応させた。ＰＢＳで良く洗浄した後、調整済みのＨＲＰ標識ストレプトアビジンにて組織上を覆い、室温で１時間反応させた。最後に充分にＰＢＳで洗浄した後、調整したジアミノベンチジン（ＤＡＢ）溶液を組織上に覆い１０分間反応させた。核の対比染色としてヘマトキシリン溶液中に数秒浸し、良く水洗した。この後、脱水・透徹・封入操作を行い、顕微鏡下で検鏡観察した。
【００４５】
この結果、ミクログリア特異抗体による染色ではミクログリアと思われる細胞（核が細長く、不規則な形の、細胞体から鹿の角のような突起が直角的に分岐した細胞）がよく染色され、その形態から活性型、静止型を区別することが可能であった。この結果を図２に示した。（図２左は静止型ミクログリア、図２右は活性型ミクログリアを示す）。これを静止型ミクログリアマーカーであるＲＣＡ−１と比較すると、ミクログリア特異抗体による免疫染色のほうが、ミクログリアの形態をクリアに捉えていた。また、ＲＣＡ−１で検出できないミクログリアがミクログリア特異抗体では染色されており、ミクログリア特異抗体による免疫染色のほうが感度が良いことが示唆された。
【００４６】
また、免疫染色における前処理としてのマイクロウェーブ熱処理の効果について検討したところ、強度５００Ｗのマイクロウェーブで９６℃の加熱処理を１０分間行った場合に、加熱処理を行わない場合（図３右）と比較して、染色性が著しく向上した。（図３左）
【００４７】
一方、各疾患におけるミクログリア特異抗体とＲＣＡ−１による染色性の比較では、共に脳病変をもたないコントロールと比較してアルツハイマー型痴呆、脳梗塞の症例では特に活性型ミクログリアが濃く、強く染色された。特にアルツハイマー型痴呆では老人斑の周囲に活性型ミクログリアが多く集まっていることが確認できる症例もあった。また、ＲＣＡ−１では小脳のミクログリアはほとんど確認できないが、ミクログリア特異抗体では小脳のミクログリアも強く染色された。このことからミクログリア特異抗体がＲＣＡ−１と比較して感度が良いことが示唆された。
【００４８】
また、放射線治療をうけた例では、病巣部はすべての細胞が壊死しており、ミクログリア特異抗体によってもこの部分は染色されていないが、病巣部周囲には病巣部を取り囲むように突起の短い細胞が濃く染色され、活性型ミクログリアが存在しているのがはっきりと確認できた。ＲＣＡ−１による染色でもこれは確認できた。
【００４９】
以上のことから、▲１▼ミクログリア特異抗体による免疫染色では静止型、活性型両方のミクログリアを染色で、ＲＣＡ−１と比較して感度が良いこと、▲２▼その染色像は、ミクログリアの胞体や突起のすみずみまでとらえ、形態観察に優れており、また、形態観察で、静止型、活性型のどちらかを区別するのが容易であること、▲３▼ホルマリン固定、パラフィン組織標本で染色可能であり、汎用性があることが明らかになった。
【００５０】
実　施　例　３
免疫染色試験（２）：
実施例２と同様な方法により、現在までにミクログリアマーカーとして報告されているいくつかの抗体との染色性の比較を行った。すなわち、実施例１で得たミクログリア特異抗体、Ｋｉ−Ｍ１ｐ（ＣＤ１１ｃ、汎マクロファージ）抗体、ＫＰ１（ＣＤ６８）抗体、ＣＲ３．４３（β　ｃｈａｉｎ　ｏｆ　ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ）抗体及びビオチン化レクチンＲＣＡ−１を用いてアルツハイマー脳３例、脳梗塞例１例について染色性を比較した。
【００５１】
本発明のミクログリア特異抗体による染色では、活性型、静止型ともに、ミクログリアの胞体や突起の細部まではっきりと染色された。これに対し、Ｋｉ−Ｍ１ｐ抗体及びＫＰ１抗体は染色はされているものの、細かい形態までわかるものはまれであった。また、ＣＲ３．４３抗体は老人斑らしき場所が濃く染色され、この部分に活性型ミクログリアが存在することが確認できた。ＲＣＡ−１は内皮細胞らしきものが染色されていたが、ミクログリアに関しての染色性は弱かった。脳梗塞巣では、血液脳関門が破壊された梗塞巣中心部に出現する血液単球由来と考えられるマクロファージがほとんど染色されなかった。ところが、梗塞・正常組織境界部に出現したマクロファージ様ミクログリアは強く染色され、部位による脳マクロファージ様細胞の由来の違いを示すことができた。一方、ＫＰ１、ＫｉＭ１Ｐ、ＲＣＡ−１などのマクロファージマーカーは、両者を同等に染色し、脳マクロファージ様細胞の由来を示すのに役立たなかった。
【００５２】
実　施　例　４
反応性試験：
本発明のミクログリア特異抗体の、各生体組織に対する反応性を、免疫組織化学的方法により調べた。比較としては、現在までにミクログリアマーカーとして報告されているＫＰ１、Ｋｉ−Ｍ１Ｐ、ＲＣＡ−１およびＣＲ３．４３（ＨＬＡ−Ｄ）を用いた。この結果を表１に示す。
【００５３】
表に示すように、本発明のミクログリア特異抗体は、血液単球を染色しない。
また、脳外各臓器・組織に分布する血液単球由来と考えられているマクロファージや組織球とはほとんど反応しない。脾臓の赤脾髄のみが例外的に散在性の弱い反応を示したのみである。
【００５４】
【表１】
2004123613.tif 000003
【００５５】
以上の結果をまとめると、本発明のミクログリア特異抗体は、▲１▼脳ではミクログリア由来のマクロファージ様細胞を染色するが、血液単球由来のマクロファージを染色しない。▲２▼血液単球を染色しない。▲３▼血液単球由来のマクロファージと組織球とはほとんど反応しない。との結果から、本抗体のミクログリア選択性が明示された。
【００５６】
【発明の効果】
本発明のミクログリア特異抗体は、霊長類由来の病気組織標本において、ミクログリアとミクログリア由来マクロファージを同定するために使用できる。
【００５７】
すなわち、本発明のミクログリア特異抗体は、基本的なヘマトキシリン・エオジン染色では検出できないミクログリアを、免疫染色によって明確に染め分けることが可能となる。そしてこの抗体は正常脳に存在する静止型と病的状態で出現する活性型ミクログリアの両者と反応し、さらにミクログリアの核周囲細胞質から細胞突起末端までの全体を染色することができる。さらに、従来のミクログリアマーカーで免疫染色を行うと、ミクログリアとともに血管周囲細胞も染色されたが、本発明のミクログリア特異抗体では血管周囲細胞とは反応せず、ミクログリアのみを選択的に染めることができる。
【００５８】
したがって、本発明のミクログリア特異抗体による免疫染色は、疾患脳でのミクログリアの変化を非常に正確に判定でき、定量的な解析も容易となる。
【００５９】
また、本発明のミクログリア特異抗体は、脳外のマクロファージ（肝クッパー細胞、肺胞内マクロファージ、ｔｉｎｇｉｂｌｅ　ｂｏｄｙ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅなど）とはほとんど反応しないので、梗塞巣など脳血液関門の破壊された脳病巣に出現する単球由来のマクロファージと、ミクログリア由来のマクロファージ様ミクログリアの２種類を明確に染め分けることが可能となる。さらに、脳腫瘍の腫瘍細胞由来の検討にも有用と考えられる。
【００６０】
更に、本発明のミクログリア特異抗体を用いる免疫染色は、通常のパラフィン切片を試料として、静止型・活性型ミクログリアの形態観察を行うことができるので、有用性が高いものである。
【００６１】
【配列表】
2004123613.tif 000004
2004123613.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のミクログリア特異抗体の特異性を確認するウエスタンブロッティングの結果を示す図面（写真）
【図２】本発明のミクログリア特異抗体により組織中のミクログリアを染色した結果を示す図面（写真）
【図３】マイクロウェーブ熱処理による、ミクログリア特異抗体の染色性の向上を示す図面（写真）
以　　上
【図１】
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【図２】
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【図３】
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