(57)【要約】  【目的】  電極に使用するためにセルロースアセテートをペースト状に配合する方法を提供する。  【構成】  セルロースアセテートを蒸気圧の小さい溶媒と混合して粘度の大きいペーストを形成する工程を含む。【選択図】          図１６
2004340949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学電極用のセルロースアセテートペーストを形成する方法であって、
セルロースアセテートを蒸気圧の小さい溶媒と混合して粘度の大きいペーストを形成する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
(a)   セルロースアセテート、および
(b)   蒸気圧の小さい溶媒
からなるセルロースアセテートペースト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学センサ、より詳しくは、グルコースセンサおよびラクテートセンサ等の酵素を触媒とした電気化学センサに関するものである。本発明はまた基体を有する酵素の触媒活性に応答する、導電手製基体中に酵素を含む酵素電極を組み入れた新たなパッケージについて記載する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のグルコースとラクテートの濃度は、恒常性を維持する上で非常に重要である。例えば、グルコースの濃度が正常範囲より小さい場合には、意識が失せたり、血圧が低下することがあり、ときには、死に至るかもしれない。グルコースの濃度が正常範囲より大きいか、または高血糖症の場合には、脂肪酸およびコレステロールを合成し、糖尿病性昏睡となることがある。したがって、インシュリン療法により血中グルコース濃度を制御している糖尿病患者にとって、血液中のグルコースの濃度を測定することが必要となっている。
【０００３】
臨床環境においては、電気化学センサを用いて血液試料を測定することにより、正確で比較的迅速にグルコースおよび／またはラクテートの濃度を求めることができる。従来は、多くの丈夫な部品からなる大型のセンサ、または多くの状況でより便利な小型のプレーナ型センサが製造されている。本発明において「プレーナ」は、例えば、よく知られている厚膜または薄膜技術を用いて、比較的薄い材料の層からなる実質的平面プレーナ構造物を製造する既知の方法を意味している。例えば、特許文献１（リュー等）および特許文献２（パパダキス等）を参照のこと。この両方を参照文献として引用する。
【０００４】
臨床環境においては、化学血液分析の最中に、比較的少量（マイクロリットル）の試験試料から得られるデータを最大にすることが目的である。センサと接触する血液試料を保持するセンサ試料室を製造することは、例えば、少量の試料から異なる分析物を検出するように構成された一連の連続センサを用いて、試験試料について多くの測定を同時に行なえるといった点で望ましい。しかしながら、試料室は小さく作られているので、センサ構成部材自体から放出される不純物、特に試料室を規定する特定の構成部材および／またはセンサ自体のある反応生成物のような、試料中の不純物の濃度も大きくなる。そのような不純物が生じる結果、センサの寿命が短くなってしまうかもしれない。
【０００５】
グルコースまたはラクテート電極センサには大別して２種類のものがある。１つは、測定可能な応答を得るために、グルコースまたはラクテートを直接酸化させる電気触媒装置である。もう１つは、グルコースまたはラクテートを電気活性生成物に転化する酵素を用いて、その電気活性生成物を電気化学的に分析する酵素電極である。
【０００６】
グルコースセンサに関して、酵素電極等の後者の種類の電極センサは、グルコースオキシダーゼのような酵素の存在下でグルコースを転化して、その結果、下記の反応に従って過酸化水素等の反応生成物が形成される。
【０００７】
［オキシダーゼ］
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ−−−−−−−＞Ｃ６Ｈ１２Ｏ７＋Ｈ２Ｏ２
Ｈ２Ｏ２  −−−−−−−＞Ｏ２＋２Ｈ＋＋２ｅ−
これらの反応において、グルコースは酸素と反応してグルコノラクトンおよび過酸化水素を生成する。そこで、適切な電極を用いて、電気信号として過酸化水素の生成を測定することができる。この信号は、過酸化物からの電子が電極に移送された後に生成され、適切な条件下で、酵素を触媒とする電流がグルコースの濃度に比例する。酵素電極等のラクテート電極センサも同様に、ラクテートオキシダーゼのような酵素の存在下でラクテートを転化する。
【０００８】
グルコースおよびラクテートを測定する様々な装置が記載されているが、それらのうちのほとんどには、再現性、応答速度、試験試料の容積、効果的な用途の数、および検出範囲に関して制限がある。現存するいくつかの商業的方法は、上述のように概説した過酸化水素の測定を利用している。
【０００９】
グルコースセンサに関して、既知の酵素電極において、血液からのグルコースおよび酸素、並びに、アスコルビン酸および尿酸のようなある干渉物質は、センサの一次膜を通過して拡散する。グルコース、酸素および干渉物質は、二次膜に達するので、グルコースオキシダーゼのような酵素がグルコースの過酸化水素およびグルコノラクトンへの転化を触媒する。過酸化水素は一次膜を逆に通過して拡散するか、もしくは二次膜を通過して拡散し電極まで到達するかもしれない。電極では、過酸化水素が反応して酸素と電子を生成し、グルコースの濃度に比例した電流を生成できる。電極の膜アッセンブリは、いくつかの機能を果たす。その機能としては、グルコースを選択的に通過させること、一次膜を通過するグルコースと酸素の間の反応を触媒する酵素を一次膜と二次膜との間に配置すること、および過酸化水素だけを二次膜を通過させて電極に到達させることがある。
【００１０】
特許文献３（ジョーンズ等）には単一層の電極膜が記載されている。この文献は、３つの主要構成部材、すなわち、金属電極、直接陰極に固定化された酵素の反応層、および単一層膜からなる電気化学センサに関するものである。特許文献３に開示されている膜は、グルコース透過性、および全血適合性を有するので、これにより、従来のセンサに一般的な二次膜が必要ない。この膜は、不完全硬化形態として施される重合性ケイ素含有化合物の分散物であって、実質的に分散相には不溶性であり、硬化中に分散物から除去可能な液体キャリアを有する分散物から形成する。膜は、グルコース透過性が大きい連続層、フイルムまたは膜として硬化する。
【００１１】
しかしながら、特許文献３に開示されている単一膜層は、アスコルビン酸および尿酸のような陰イオン干渉物質のみがその層を通過するのを妨げることが分かった。アセタミノフェン（acetaminophen ）のような中性物質は膜を通過して拡散でき、センサの感度および精度に影響を及ぼす。
【００１２】
上述したように、酵素電極はグルコースを過酸化水素に転化し、この過酸化水素が反応してグルコースの濃度に比例する電流を生成する。他の分析物を測定するために適合させた酵素電極もまた従来技術に記載されている。樹脂により結合した炭素またはグラファイト粒子の多孔性層からなる、またはそれを含む導電性支持部材を有する酵素電極が、ベネット等の特許文献４に開示されている。炭素またはグラファイト粒子は、微粉砕白金族元素と密接に混合されて、酵素が吸着されるかまたは固定化される、実質的に均一な多孔性の基体層を形成する。好ましい基体材料は、結合剤として合成樹脂、好ましくは、ポリテトラフルオロエチレンを用いて、炭素紙基体に結合された白金化炭素粉末粒子からなる、樹脂結合され、白金化された炭素紙電極である。これらの電極材料は、コロイド状の大きさの白金、パラジウム、または他の白金族元素の粒子を炭素またはグラファイトの微粉砕粒子に蒸着させて、白金化またはパラジウム化炭素もしくはグラファイト粒子をフルオロカーボン、好ましくは、ポリテトラフルオロエチレンと混合して、この混合物を炭素紙のような導電性支持体、またはフィラメント炭素繊維ウェブに施すことにより製造する。
【００１３】
上述した酵素電極には、しばしば成形した圧縮粉を焼成して結合剤を融解することを必要とする条件下でグラファイトまたは炭素のベースを前成形する必要がある。前述したように、結合剤は、融点が高い疎水性の合成樹脂である。このような高温のために、グルコースオキシダーゼまたはラクテートオキシダーゼのような酵素が破壊されてしまう。
【００１４】
高温結合剤を用いずに樹脂結合した白金化もしくはパラジウム化された炭素またはグラファイト粒子の多孔層上に固定化もしくは吸着された酵素または酵素の混合物を使用した酵素電極が特許文献５（ミューレン等）に開示されている。ミューレンのこの特許には、高温結合剤は、使用せずに済ますか、またはゼラチン（室温で活性化でき、高温での焼結を必要としない結合剤）のような、低温の、好ましくは、水溶性または水分散性の結合剤により置き換えられることが開示されている。
【特許文献１】米国特許第4,571,292号明細書
【特許文献２】米国特許第4,536,274号明細書
【特許文献３】欧州特許第207 370号明細書
【特許文献４】米国特許第4,970,145号明細書
【特許文献５】米国特許第5,160,418号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述した改良にもかかわらず、グルコースまたはラクテートおよび酸素透過性膜、および酵素電極からなる正確で多目的のグルコースまたはラクテートのセンサが望まれている。さらに、少量の血液試料について、そして長期間に亘るサンプリングに、または臨床環境の用途に使用できる電気化学センサパッケージが望まれている。メインテナンス、すなわち、膜の再生、電極の洗浄等を必要としないこの種類の電気化学センサもまた望ましい。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、一般的に、金属化炭素をベースとする酵素電極およびその上に設けられたケイ素を含有するグルコースおよび／またはラクテート浸透性の保護膜を含む改良電気化学センサ、およびその製造方法を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、長いサンプリング期間に亘り効率を維持するためにセンサに干渉補正電極を設けた電気化学センサを提供することにある。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、容積が小さい試料室を備えた改良センサパッケージであって、一連の連続センサとともに用いられるセンサパッケージを提供することにある。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、金属接点を覆う金属化炭素活性層を用い、血液等の試料を迅速に試験できる外側膜を有することにより、グルコースおよび／またはラクテートの濃度を測定する改良プレーナ電極を提供することにある。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、押流しが不十分、すなわち、試料が残留することなく液体を流動させる速度調節部材（velocity compensator）、または試料室中の速度を変更することを含む小容量の試料室を有し、これにより試料室を速く充填したり空にしたりし、試料の処理量を増加させたプレーナセンサを提供することにある。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、小さな弾性電気リード線を、迅速かつ効率的に予め設定した位置決めを行いつつ高精度で電気センサの複数の接点に付着させる手段および方法を提供することにある。
【００２２】
本発明の目的は、センサを前処理してそのセンサの貯蔵寿命またはウェットアップ（wet-up）を延長する方法を提供することにある。
【００２３】
本発明の目的は、寿命の長い多目的のグルコースおよびラクテートのセンサを提供することにある。
【００２４】
本発明の目的は、電極に使用するために酵素をペースト状に配合する方法を提供することにある。
【００２５】
本発明の目的は、電極に使用するためにセルロースアセテートをペースト状に配合する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
したがって、本発明は、非導電性基体、作用電極、および該作用電極を覆い、グルコースと酸素またはラクテートと酸素を通して電極まで到達させる半透膜を含む固体プレーナ電気化学センサを提供する。作用電極には、前記基体の一部に接着した導電性物質がある。導電性物質の第１の部分は、絶縁コーティングにより覆われ、導電性物質の第２の部分は活性層により覆われている。活性層には、活性層中に分布している白金化炭素粉末粒子により担持されたグルコースオキシダーゼまたはラクテートオキシダーゼのような触媒的に活性を有する量の酵素が含まれる。
【００２７】
センサにはさらに、非導電性基体の第２の部分に接着した第２の導電性物質を有する対電極を備えていてもよい。この第２の導電性物質の一部は、絶縁コーティングにより覆われ、第２の導電性物質の少なくとも一部は被覆されないままとなっている。
【００２８】
本発明のある実施態様においては、非導電性基体はガラス結合剤と混合したアルミナから作られ、導電性物質は銀、金、または白金いずれかの厚膜ペーストである。誘電コーティングは、セラミック、ガラス、高分子、またはこれらの組合せいずれかから作られる。半透膜は、セルロースアセテート、ポリウレタン、シリコーン、およびナフィオン（登録商標）（デラウエア州、ウィルミントンのデュポン社から市販されている）のような従来より業界で知られている他の物質から成形できる。好ましい膜は、液体キャリア中のシリコーン化合物分散相の不完全硬化形態で施された重合性ケイ素含有化合物の分散体である。半透膜は、少なくとも約10.0重量パーセントのコロイド状シリカとしてシリコーン化合物を含む。好ましい半透膜は、少なくとも約14.0重量パーセントのコロイド状シリカを含む。
【００２９】
本発明の別の実施態様においては、電気化学センサはさらに、非導電性基体の第３の部分に接着した第３の導電性銀物質を含む参照電極を備えていてもよい。  第３の導電性物質の第１の部分は絶縁コーティングにより覆われ、第３の導電性材料の第２の部分はこの絶縁コーティングには覆われないままとなっている。この第３の導電性物質は一般的に、銀／塩化銀厚膜ペーストを含む。この導電性物質の第２の部分はセルロースアセテートにより覆われている。
【００３０】
本発明のさらなる別の実施態様においては、電気化学センサはさらに、非導電性基体の第４の部分に接着した第４の導電性物質を含む干渉補正電極を備えていてもよい。この導電性物質の第１の部分は絶縁コーティングにより覆われ、該導電性物質の第２の部分は不活性層により覆われている。この不活性層には、白金化炭素粉末粒子に固定化された不活性タンパク質が含まれており、この白金化炭素粉末粒子は不活性層中に実質的に均一に分布している。
【００３１】
本発明の別の実施態様において、沸点が高く、水溶性を有し、親水性の乾燥防止剤（anti-drying agent ）により半透膜を前処理する。
【００３２】
本発明の別の実施態様において、電気化学センサパッケージを提供する。このパッケージには、外周部のある窪みおよび該窪みに連結した少なくとも１つの通路を有するハウジングが含まれる。ガスケットが窪みの外周部および前述したような固体プレーナ電気化学センサと接触し、それらの間にシールを形成している。ハウジングと電気化学センサが試料室を規定している。
【００３３】
本発明のセンサパッケージのさらに別の実施態様において、このパッケージにはさらに接触リード線フレームがある。リード線フレームには、第１の末端でフレームに、反対の末端でセンサの窪みに固定されたリード線がある。接触リード線フレームはさらに、センサの表面に接触パッドによりリード線を配列させる安定化棒（stabilizer bar）を含んでいてもよい。センサ接触パッドと位置合せすべきリード線フレームの上面部分を覆ってリード線を巻きつけているので、安定化棒を受け入れるパッケージに溝を設けてもよい。本発明のパッケージに接触リード線フレームの窪み内にセンサを支持するパッド等を設けてもよい。
【００３４】
本発明の別の実施態様においては、センサパッケージには試料室内に速度調節部材または隆起が含まれる。速度調節部材はハウジングの成形部分であっても差支えなく、好ましくはセンサと向き合っている。
【００３５】
固体プレーナ電気化学センサを形成する方法には、非導電性材料から作られた適切な基体材料を選択し、この基体材料を所望の形状と大きさに形成することを含む。次いで導電性材料を基体の一部に配置する。次に、導電性材料の一部を絶縁コーティングにより覆い、電極区域を規定するために導電性材料の一部を被覆しないままにしておく。活性層中に実質的に均一に分布している白金化炭素粉末粒子に固定化されたグルコースオキシダーゼまたはラクテートオキシダーゼのような、触媒的に活性な量の酵素からなる活性層を含む電極区域に作用電極を形成する。最後に、半透膜が作用電極を覆い、グルコースと酸素またはラクテートと酸素を通過させて電極に到達させる。
【００３６】
本発明の好ましい固体プレーナ電気化学センサを、アルミナおよびガラス結合剤からなるセラミック材料のような非導電性材料から作られた、適切な大きさで適切な形状の基体を選択することにより形成する。基体の第１の末端から第２の末端まで延びるように、４つの導電性片を基体の上面に配置する。基体の第１の末端において、導電性片は電気的接続用の接触パッドを規定し、基体の反対の末端では、導電性片が試験試料に露出される電極区域を規定する。導電性片は、銀、金、および／または白金のいずれかの導電性金属ペーストを用いた薄膜または厚膜のシルクスクリーニング技術を利用して蒸着させてもよい。絶縁コーティングも同様に、導電性片の一部の上面に蒸着させ、一方で導電性片の一部を被覆しないままにして、参照電極、対電極、作用電極、干渉補正電極、および接触パッドを規定する。露出電極領域に銀／塩化銀の層を蒸着させることにより参照電極を形成する。次いで、セルロースアセテート層を銀／塩化銀参照電極を覆うように設けて、参照電位を変動させる不純物から塩化銀を保護する。
【００３７】
作用電極は、同様にスクリーン印刷技術を利用して、白金化炭素粉末粒子に固定化された触媒的に活性な量の酵素からなる活性層を導電性片に蒸着することにより形成する。干渉補正電極も作用電極と同様な方法で形成する。しかしながら、干渉補正電極には、白金炭素粒子に固定化された触媒的に活性な量の酵素の代わりに不活性タンパク質からなる不活性層がある。干渉補正電極は、好ましくは電極を覆ってスピンキャストされた半透膜を通って拡散するかもしれない電気化学的に活性な中性物質を調節する機能を果たす。
【００３８】
本発明が行なう改良点において、生体外のグルコースおよび／またはラクテートの測定に使用するプレーナ電極は、絶縁ベース層、導電性層、その上の活性層、およびグルコースおよび／またはラクテート浸透性の外側保護膜を有している。本発明の改良点は、試験すべきグルコースまたはラクテートが活性層にさらされるときに、それらの量と比例する量の過酸化水素を活性層が形成させることができるように、グルコースまたはラクテートのうちの一方と反応する酵素、および白金化炭素粉末粒子部分を有する活性層と、グルコースまたはラクテートの移送を可能してグルコースまたはラクテートの迅速で正確な測定を可能にする添加剤を含むシリコーン化合物である外側保護膜とを備えることである。
【００３９】
本発明の別の改良点において、メインテナンスを必要とせずに効果的に使用できる寿命の長い多目的電気化学センサを提供する。
【００４０】
本発明の別の改良点として、試料室中に位置する複数の電極を有するプレーナセンサであって、その試料室は、流路、出口および入口を有し、それら各々が試料室の一部の断面積よりも小さな断面積を有するプレーナセンサにおいて、速度調節部材を設ける。この速度調節部材は、不純物が集積するのを防ぐことを目的として流路中の試料室の断面積を減少させるために、また、試料室中を流体が通過する際に流体速度を実質的に安定させるために、入口と出口の間の流路中に設けた構造障害物である。速度調節部材は好ましくは、試料室と一体であり、電極上を通過する流体を干渉せずに電極の方に延びる。
【００４１】
本発明の別の改良点として、ハウジング内に搭載された電気化学センサであって、互いに近接した複数の電気接点および該接点と連結した軸方向に延びた複数のリード線を有する電気化学センサにおいて、リード線が安定化棒により間隔をおいている。この安定化棒はリード線に付着しており、電気的接触が行なえるようにリード線を確実に位置づけている。リード線は弾性を有し、好ましくはリード線フレームのベースに組み込まれる安定化棒により接点に押し付けられている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明の他の特徴は、図面を参照することにより、以下の詳しい記載により明らかとなる。それらの図面は、説明を目的として作成したものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００４３】
ここで図面を参照する。いくつかの図面を通じて同一の部品を示す場合には、同じ参照番号を用いている。本発明の好ましい一実施態様による集成電気化学センサパッケージ10を図１に示す。パッケージ10は、ハンドル部12、本体14、接触部16、および流体または液体通路18を含む、一般的にＪ型の物体を有する。
【００４４】
センサパッケージ10の内部部材を図２の分解図に示す。パッケージ10には、内部に窪み22が形成されたＪ型ハウジング20がある。試料室54（図５）の一部を形成している窪み22には、外側境界面24および少なくとも１つの通路18がある。ハウジング20には、実質的に平らな上側部分120 、側壁122,124 、前面穴126 、およびセンサパッケージのハンドル部12と接触している背面壁128 がある。ハウジング20にはさらに、パッケージ10を組み立てたときにリード線フレーム32と接触する突起物132 および凹んだ内側の縁がある。ガスケット26を設けて、ハウジング境界面24とセンサ28とを接触させ、それらの間にシールを形成する。ガスケット26は実質的に矩形の形状をしており、実質的に楕円形の穴134 、および該楕円形の穴134 の長さに沿って延びる２つの突出面136,138 を備えている。ガスケットの突出面136,138 により、ガスケット26はハウジングの窪み境界面24の周りに適合し、窪み22がセンサ28に露出される。センサパッド30を用意して、センサ28を支持する。センサパッド30には、パッケージ10を組み立てたときにセンサ28を支持する、背面側142 に一連の横突出部140 がある。最後に、接触リード線フレーム32を用意して、電流を測定して換算し、分析物の濃度、すなわち、グルコースまたはラクテートの濃度を測定できる装置（図示せず）にセンサ28を電気的に接続する。接触リード線フレーム32には、第１の末端部38でベース36に固定された４本のリード線、および第２の末端部42でセンサ窪み40がある。接触リード線フレーム32には、それぞれに関して所定の位置にリード線34を保持し、これらのリード線34をセンサ28に整合させる安定化棒44を設けることもできる。この安定化棒44を受け入れる追加の窪み46を設けることもできる。チバコーニングダイアグノスティクス社から市販されている電極Ｏリング48等を設けて、隣接するセンサパッケージの間のシール、または流体導管（図示せず）を維持することができる。この場合、各々異なるセンサを用いれば、同一の流体試料から異なる分析物を同時に検出できる。
【００４５】
ここで図３および４を参照する。これらの図は、図２の線３に沿った接触リード線フレーム32の断面側面図であり、リード線の一部が曲がった様子と延びている様子を示している。上述したように、装置とセンサ28上の接点（以下に記載する）との間に界面系を設けるために、末端部38でベース36に固定された複数のリード線34を備えた接触リード線フレーム32を設ける。リード線34は一般的に銅のような、導電性が大きい可鍛性金属から作成する。好ましくは、リード線34は、メッキ材料のコストのほうが安いために、モリブデンメッキ、銀メッキ、金メッキ、または白金メッキ等の導電性が大きい可鍛性材料から作成する。最も好ましくは、導電性が大きいために、フォトエッチングした金メッキのリード線34を使用する。リード線34を接触リード線フレーム32の一方の末端部38に組み入れて成形する。リード線フレーム32は、センサパッケージのハウジング20と相溶性があり、そこに固定できるいかなる材料からも成形できる。一般的に、リード線フレーム32は、ガラス、セラミック、ステンレススチールのような硬質の耐久性材料、またはアクリル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等のプラスチック材料から作られる。強度が大きいこと、耐久性があること、コストが比較的安いこと、および加工が容易であることの理由により、好ましくは、ロームアンドハース社（ペンシルベニア州、フィラデルフィア）から得られるＶ８２５アクリルのようなアクリルプラスチック材料を用いてリード線フレーム32を成形する。
【００４６】
センサパッケージ10を組み立てる最中に、センサ28を窪み40内に配置し、リード線34を、センサと接触するまでリード線フレーム32の付近に曲げる。リード線34は、センサの接点に一定の圧力を加える丸まったスプリングチップ50によりセンサと接触している。安定化棒44を、リード線がフレームの付近に曲げられた後に窪み46内に固定する。この安定化棒44はリード線34をセンサの接点に整合させるものである。
【００４７】
好ましくは、安定化棒を使用する場合には、この安定化棒は窪み46内の適所に固められた溶剤である。装置接触表面52は、リード線をフレームの縁に沿って曲げたときに形成される（図３に示す）。この装置接触表面52は、センサパッケージ10が組み立てられた後に露出される。一度リード線をセンサに接触させたら、ハウジング20をリード線フレーム32の上に配置する。そして、ハウジングおよびリード線を、スナップ嵌め、超音波溶接、接着剤結合、または当業者に知られている他の方法により、互いに固定する。
【００４８】
次に図５から１２を参照する。センサパッケージ10の試料室54の拡大図を示す。上述したように、試料室54は、ハウジング20、窪み22の周りの外側境界面24、ガスケット26、およびセンサ28により規定される。入口56および出口58を有する少なくとも１つの通路18を設けて、血液のような流体試料を試料室54に出入りさせる。図示した実施態様においては、入口56および出口58はハウジング20を通っているが、これらの穴は、流体試料が試料室54に達することができる通路であればどのような方法により形成してもよい。例えば、穴、またはチャンネルをガスケット26内かまたはセンサパッケージ10の他の部分に形成することもできる。
【００４９】
本発明のセンサパッケージ10の試料室54には、速度調節部材60（バンプ）もある。この速度調節部材60は、試料室の内部容積を減少させ、入口56および出口58の断面積に近い断面積を作り出す。図６は、速度調節部材60がある場合とない場合の、試料室54の流路に沿った断面積をグラフにより示している。グラフに示したように、速度調節部材を有する場合の試料室の断面積は、入口と出口の断面積に近いものである。速度調節部材またはバンプは、流体の流れを導く構造物として機能する。従来の試料配送システムには、前回の試料物質が残留したり、試料室内に存在するかまたは試料流体の前端にとらえられている気泡が補捉されたりといった問題があり、従来の試料配送系によくあるこのような問題に対処している。一般的に、試料が試料室54に入っていく際、その流速は、試料室がその試料で満たされるまで急速に低下していく。その後試料の速度は最初の水準まで上昇するが、試料室の壁付近では溶液が停滞している。試料室は測定と測定との間に洗浄されるが、試料室内の停滞区域では気泡および流体が捕捉されてしまう。これらの気泡や残留流体は、試料測定の精度に影響を与える。したがって、本発明に使用する速度調節部材60は、試料室内の流速を安定させ、気泡や流体が集まり得る停滞区域を減少させるかなくす。ここで図９および１０を参照する。試料室を通過する流体の流速は、速度調節部材が存在するために実質的に均一である。さらに、速度調節部材60により、入口56および出口58の断面が比較的小さいながら、大きな検出区域を使用することができる。図７は、速度調節部材60がある場合とない場合の試料室の流路に沿った流路断面積に対する検出区域の比率をグラフに示している。試料室54の断面積が速度調節部材60が適所に存在するために減少しているので（図６参照）、流路断面積に対する検出区域の比率は増加している。本発明のこの特徴は、流体試料がパッケージ10を通過する際に、この流体試料をより能率的にセンサ28に接触させている。さらに、速度調節部材60をセンサ28と向かい合うように位置させることにより、試料はセンサ28に向かう一方で、気泡は実質的に減少する。
【００５０】
図８は、図５の線６に沿った、試料室54の断面図である。速度調節部材60がハウジング20の成形部材として示されている。丸い形状を有するものとして速度調節部材が示されているが、停滞区域がなく滑らかで傾斜した様々な形状のものを使用することができる。さらに、ハウジングの成形部材として速度調節部材60を示しているが、試料室54に加えた別の部材であってもよい。
【００５１】
試料室54の中と外に導く入口56および出口58の部分が示されている。これらの試料の通路は一般的に、約0.02インチから約0.04インチまでの間の直径を有し、好ましくは、直径は約0.03インチである。速度調節部材60を備えた試料室54は、約0.06インチまでの少なくとも試料通路の大きさの試料直径を有する。図１２は、図５の線８に沿った、通路18を横切るセンサパッケージ10の側面図である。この図は、速度調節部材60、試料室54、および通路18の相対的な大きさを示している。
【００５２】
ハウジング20、および速度調節部材60、並びに入口56および出口58は、分析最中に試料室54中を通過する試料に対して不活性であるいかなる材料から作ることができる。例えば、ガラス、セラミック、ステンレススチールのような材料、または、アクリル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルのようなプラスチック材料等を使用することができる。
【００５３】
強度が大きく、耐久性を有し、比較的コストが安いために、好ましくは、ロームアンドハース社から得られるＶ８２５アクリルのような無色透明なアクリルプラスチック材料を使用してこれらの部材を成形する。
【００５４】
図８および１１に示したガスケット26は、窪み境界面24とセンサ28との間にしっかりと保持されたときに、流体が実質的に通過できないように試料室54の周りにシールを形成する材料から成形する。
【００５５】
一般的に、応力を加えられたときに、変形したり流動せず、ジュロメータ硬度が小さく、わずかに吸湿性であり得る耐久性のある有機高分子からガスケット２６を配合する。好ましくは、ガスケット26の製造に使用する材料は、ショアＡスケールで10から100 までの範囲の硬度、より好ましくはショアＡスケールで約40から約70までの硬度、最も好ましくはショアＡスケールで約45から約55の硬度を有する。
【００５６】
ガスケット26は一般的に有機高分子であるので、センサ28に浸入するかもしれない可塑剤のような移動性の抽出物質を多量には含まないように製造する。さらに、上述したような他のセンサ部材の場合のように、ガスケット26の配合に選択する材料においては、試料室54内の試料中に移行して、電気化学測定に影響を与えたり、および／またはセンサ部材を破壊したりし得るいかなる物質も含まないことが重要である。ガスケット26の配合に使用する材料は好ましくは、移動性の遷移金属および主系列の金属、特に、鉄、コバルト、ニッケル、鉛、銅のような電池に使用する金属、抽出物、および好ましい電極材料にとって有害な硫化物のような物質を実質的に含まないように選択する。
【００５７】
ガスケット26は一般的に架橋の度合いが大きいエラストマー系化合物から形成する。上述したような純度および物理的必要条件の全てを満たすものであれば、いかなるエラストマー系材料を用いてもよい。最も好ましくは、ショアＡスケールで約50の硬度を有する、ＤＳＭから得られるサーリンク（登録商標）２４５０エラストマー系材料を使用してガスケット26を成形する。
【００５８】
図８および１１に示すように、ガスケット26を形成するのに使用した材料と同一の材料からセンサパッド30を形成することができる。パッド30は、応力を加えたときに変形したり流動せず、ジュロメーター硬度が小さい、耐久性有機高分子から形成する。好ましくは、パッド30を形成するのに使用する材料は、ショアＡスケールで40から60までの硬度を有する。最も好ましくは、シリコーンゴムまたはサーリンク２４５０のような材料を使用してパッド30を形成する。
【００５９】
本発明によると、いかなる大きさの試料室54を製造することもできる。ある状況においては、大きな試料室を製造することが有利かもしれない。しかしながら、上述したように、血液の電気化学分析の分野においては、非常の少量の血液について、できるだけ多くの分析物の分析を行なうことが通常望ましい。したがって、本発明の好ましい実施態様によると、できるだけ小さい試料室54を有するセンサ28を製造することが望ましい。本発明の新たな材料および方法を用いることにより、約10.0μｌ（マイクロリットル）未満の容量、好ましくは約3.0 μｌから約5.0 μｌの容量の試料室を有するセンサを、少なくとも30日間の期間に亘り、または、少なくとも1,000 の血液試料の測定について、効果的に使用できるかもしれない。
【００６０】
ここで図１３から１６までと図２５、および表Ｉを参照する。それらは、本発明の好ましい一実施態様によるプレーナ電気化学センサ28を示している。図１３はまた、試料室54、入口56および出口58の透視輪郭も示している。これらの特徴を示して、試験すべき試料の流路に対する、以下に記載する電極86,88,90および92の相対位置を説明している。センサ28には、実質的に平らな基体62、該基体62に付着した導電性金属片64,66,68および70、ならびに導電性金属片64,66,68および70の一部を覆う一方で、それらのある部分を覆わずにいるように基体62に付着した絶縁層72がある。
【００６１】
基体62は、セラミック、ガラス、耐火物、高分子またはそれらの組合せのような実質的に電気絶縁性を有する物質により形成される。このような絶縁基体を機械的支持またはベースとして形成することは、当業者にとっては珍しいことではない。好ましい実施態様においては、基体は、約96％のアルミナおよび約４％のガラス結合剤からなる。好ましい組成を構成する適切な材料は、クアーズセラミック社（コロラド州、グランドジャンクション）から得られる。本発明の好ましい実施態様においては、単一の基体がセンサ28の基礎を形成するが、複数の基体を用いることもできる。この場合、各々が別々のセンサ部材を支持する、および／または他の基体により支持されたセンサ部材の支持を補助する。
【００６２】
好ましい実施態様において、第１の末端74から第２の末端76に延びるように、導電性金属片64,66,66および70を基体の上面に付着させる。第１の末端74においては、一般的に、それぞれ接触パッド78,80,82および84を規定するのに十分な幅となるように、導電性金属片を付着させる。第２の末端76においては、以下に記載するように、電極を規定してもよいいくぶん狭い露出領域となるように導電性金属片を付着させる。
【００６３】
既知の薄膜技術または厚膜技術を用いて、導電性金属片64,66,68および70を付着させてもよい。一般的に、金属を含む化合物を一般的な厚膜スクリーニングを用いて基体62に塗布し、次いで、塗布した化合物および基体を焼成して、活性金属を焼結し、この活性金属を基体に互いに接着させる。電気活性金属は、例えば、銀、白金または金のような、測定すべきどの物質も酸化または還元しないような電位範囲で、酸化または還元されない導電性金属からなるものであってもよい。さらに、導電性金属片64,66,68および70を製造するのに選択される材料は好ましくは、一般的に、ワイヤボンディング、ハンダ付け、または溶接のために市販されている規格材料に一般的に存在する電池用の金属（水中で電気化学的に活性である）のような不純物を含まないように選択する。ヨーロッパ特許第A-9481090.2 または1993年 9月 4日に出願された米国特許出願08/045,847号を参照のこと。
【００６４】
本発明に使用するのに適した多くの厚膜ペーストが市販されている。そのような例としては、メテック社（ペンシルベニア州、エルバーソン）から得られる製品番号３５７１ＵＦ／Ａｇの銀ペースト、メテック社の製品番号２５３９／Ａｇ／ＡｇＣｌの塩化銀ペースト、メテック社の製品番号ＰＣ１０２３１／Ａｕ、およびメテック社の製品番号PC10208/Ptの白金ペーストが挙げられる。
【００６５】
特に、その一部が作用電極90を規定する導電性金属片66に関して好ましい物質は、非常に純度の高い白金厚膜ペーストである。導電性金属片68は好ましくは、電極領域上に付着した銀／塩化銀の層を有することにより参照電極86を形成する、基体62の上面に付着した銀の層からなる。セルロースアセテートの層を塩化銀の層の上面に付着させる。導電性金属片64,66,および70は、好ましい実施態様において、白金厚膜ペーストからなる。
【００６６】
銀参照電極を使用することは、本発明の請求の範囲に含まれることである。電圧の設定に関して、本発明に記載されている内容は、銀参照電極を銀／塩化銀参照電極に置き換えることにより、当業者が容易に変更を行なえる。
【００６７】
基体62の第２の末端76において、導電性金属片64,66,68および70の一部を覆う一方で、それぞれが、参照電極86、対電極88、作用電極90、および干渉補正電極92、並びに、接触パッド78,80,82および84を規定するように上記導電性金属片の一部を覆わないでおくように、絶縁層72を付着させる。絶縁層72の製造に選択する物質は、望ましくは、上述したように、測定すべき物質または分析物の電位範囲で酸化または還元されるかもしれない不純物を含まず、電気絶縁性を有し、非多孔性のものであり、電位的に電荷を運び、センサに用いる電解質の活性に支障をきたす移動性イオンを含まないように選択する。さらに、絶縁層72は、基体62並びに導電性金属片64,66,68および70にしっかりと接着するように、また、電極86,88,90および92を電気的にアドレス可能とする一方で、電気絶縁部分をこの絶縁層により効果的に覆うように選択する。セラミック、ガラス、耐火性材料、高分子材料、またはこれらの組合せのような材料が絶縁材料としてよく知られており、本発明の絶縁物質としての使用に適している。好ましい材料は、デュポン社（デラウェア州、ウィルミントン）の電子部から製品番号9615として得られるセラミック材料である。
【００６８】
導電性金属片64,66,68および70の製造に好ましく選択される材料に関して、接触パッド78,80,82および84を規定し、結合パッドを電極を規定する領域に接続する導電性金属片の領域において、材料の選択はそれほど重要ではないことに注意されたい。例えば、接触パッドおよびこの接触パッドを電極に接続する導電性金属片の領域は、基体62と接着し、絶縁層72の電気絶縁機能には支障のない導電性物質から製造してもよい。ある実施態様によると、接触パッドおよびこの接触パッドを電極に接続する導電性金属片の領域を金ペーストから製造する。
【００６９】
上述した材料の選択要素に加え、絶縁物質の選択に関して述べたように、センサの製造においては、隣接層との間の接着が良好となる、言い換えれば、離層が最小限となるように、基体、導電性金属片、および絶縁層を製造する材料を選択することが好ましい。ヨーロッパ特許第A-94810190.2号または1993年 9月 4日に出願された米国特許出願第08/045,847号を参照のこと。もし接着が良好ではない場合には、ある実施態様においては厚膜蒸着工程に使用したスクリーンにより規定されている、参照電極86、対電極88、作用電極90および干渉補正電極92がうまく規定されず、電気化学的に不都合なことが生じてしまう。
【００７０】
図１３の線10に沿った、作用電極90の断面図を図１５に示す。上述したように、導電性金属片66が基体62上に付着し、絶縁層72が導電性金属片66の一部を覆い、作用電極区域を規定するように一部を被覆しないままにする。導電性金属片64,66,68および70の付着と同様な技術を用いて、白金化炭素粉末粒子に固定化された、触媒的活性量の酵素からなる活性層96を導電性金属片66上に付着させる。酵素に与えられる熱による損傷を制限するために、一般的に、低温の厚膜スクリーン印刷を用いて、活性ペーストを導電性金属片66に塗布する。表Ｉを参照のこと。
【００７１】
上述したように、活性層96は、樹脂結合炭素またはグラファイト粒子の多孔性層からなるか、それを含む導電性支持部材に固定化された酵素からなる。粒子は微粉砕した白金族金属と互いによく混合されるか、または活性層を形成すべく結合させる前に個々の粒子の表面に前記微粉砕した白金族金属を付着もしくは吸着させて、酵素が吸着するかまたは固定化される、白金族金属を吸着した樹脂結合炭素またはグラファイト粒子の実質的に不均質な層からなる多孔性の基体層を形成する。樹脂により結合した白金化炭素粒子の多孔性層に固定化または吸着された酵素が、ミューレンの米国特許第5,160,418 号およびベネット等の米国特許第4,970,145 号に開示されており、これらをここに引用する。その代わりに、樹脂結合剤の一部または全てを使用してもしなくても、必要に応じて、微粉砕した炭素またはグラファイトに予め吸着したかまたはそれらと混合した微粉砕白金族金属を導電性基体の表面または導電性金属片66に最初に付着させることにより活性層96を形成してもよい。
【００７２】
白金、パラジウム、イリジウム、またはロジウム等の、微粉砕した元素形態の白金族金属を、酸化白金または酸化パラジウムのような各々の金属に対応する酸化物により置き換えてもよい。したがって、白金化物質と称するものはすべて、上述したような白金族金属、および／または別の条件を必要としない限りは対応する酸化物含有物質を含むものとしてとらえる。
【００７３】
酵素の固定化を容易にするものであれば、いかなる適切な炭素またはグラファイト粒子を使用して活性層を形成してもよい。これを達成するために、表面に、カルボキシレート、アミノ含有基および硫黄含有基のような官能基を高密度で有する炭素粉末を使用すべきであり、それに対して、よりガラス質でガラス状の炭素を使用すると、わずかしか酵素を結合できない。一般的に、炭素またはグラファイト粉末の粒径は、約3.0 ｎｍから約50.0ｎｍ、好ましくは約5.0 ｎｍから約30.0ｎｍの範囲にある。
【００７４】
白金は、例えば、蒸着、電着、またはコロイド状懸濁液からの単なる吸着といったいかなる都合のよい方法により炭素粒子に付着させて、炭素の重量に対して、約0.1 重量％から約20.0重量％までの範囲で白金族金属を充填してもよい。好ましくは、白金族金属の充填量は約5.0 重量％から約15.0重量％までの範囲である。しかしながら、これらの制限は限界というよりも実際的である。白金族金属の充填量が約1.0 重量％未満である場合、出力信号が、実際的な条件において、非常に感度の高い装置により測定する場合を除いては小さすぎて測定できないレベルまで低下してしまい、約20.0重量％を越える場合には、応答または感度を高めるという点に関する利点がほとんどなく、白金族金属の充填が不経済となる。好ましい技術においては、例えば、ペトロー等の米国特許第4,044,193 号および同第4,166,143 号に教示されている方法により、塩化白金酸、またはより好ましくは、白金またはパラジウムと被酸化性のリガンドとの複合体のような白金化合物の炭素粉末の存在下での酸化分解により炭素粉末を白金化し、それにより、炭素粒子の表面に直接コロイドの大きさの白金またはパラジウムを付着させる。上記特許をここに引用する。好ましくは、白金族金属または酸化物粒子は、約1.0 ｎｍから約20.0ｎｍまでの範囲の粒径を有し、最も好ましくは、このコロイドの大きさは、約1.0 ｎｍから約4.0 ｎｍまでの範囲である。
【００７５】
本発明により使用する好ましい活性層の基体は、イーテック社（マサチューセッツ州、フラミンガム）からプラチナムオンカーボンブラックの名称で実際に市販されている材料である。Ｈ２Ｏ２を用いて白金亜硫酸(II)複合体（complex platinum sulfite acid (II)）を酸化分解することにより、公称粒径が約30.0ｎｍの炭素粉末に約1.5 ｎｍから約2.5 ｎｍまでの範囲の粒径を有するコロイド状白金を付着させることにより調製した白金化炭素粉末粒子にグルコースオキシダーゼ、またラクテートオキシダーゼのような酵素を固定化できる。
【００７６】
本発明において、ｐＨが約7.5 であるリン酸塩緩衝液中で白金活性炭を処理する。白金活性炭を上記緩衝液に加えて、白金化炭素粉末粒子の形成の際に生じた硫酸を中和する。白金活性炭および緩衝液混合物にウシ血清アルブミンのような共タンパク質（co-protain）を加えて、活性炭に吸着させる。当業者に知られていることであるが、ウシ血清アルブミンを加えて、グルコースオキシダーゼのような酵素の安定化を助ける。メテック社から製品番号８１０１ＲＳで市販されている樹脂溶液のような結合剤をウシ血清アルブミンと白金活性炭との混合物に加える。上述したような結合剤物質は、活性層の成分を互いに保持するように作用する。活性層96を導電性金属片66上にスクリーン印刷する場合には、この混合物に界面活性剤を加えて印刷の流動特性を改善してもよい。界面活性剤を加えるさらなる利点としては、使用中にセンサの湿潤剤として機能することが挙げられる。疎水性結合剤からなる活性層96は、完全に乾燥した後では水で湿潤させることが困難になってしまう。界面活性剤を使用すると、湿潤させることが容易になる。使用する界面活性剤物質は、水溶性であり、12−16の範囲のＨＬＢを示す、当業者に知られているいかなる液体の界面活性剤であってもよい。この点に関して、使用する一般的な界面活性剤物質は、アルキルフェノキシポリエトキシエタノールのようなアルキルアリールポリエーテルアルコールで差支えない。そのような物質の一例としては、ユニオンカーバイドケミカルスアミドプラスチックス社（コネチカット州、ダンバリー）から登録商標トリトンとして市販されているものが挙げられる。本発明に使用するのに好ましい物質は、トリトンＸ−100 界面活性剤（ＨＬＢが13.5）である。これらの成分を微粉砕した後、樹脂シンナーを加えることにより、印刷を目的として活性層96の粘度を調節してもよい。一般的に、石油溶媒をベースとする樹脂シンナーを用いて、ペーストの粘度を約10,000センチポアズから約100,000 センチポアズまでの範囲に調節する。この目的に使用する樹脂シンナーは、メテック社から製品番号８１０１シンナーとして市販されている。グルコースオキシダーゼまたはラクテートオキシダーゼのような酵素を上記混合物に加えて、導電性金属片66上に最終的なペーストをスクリーン印刷する。同様に他の酵素を混合物に加えて、他の分析物用の活性層を調製してもよい。
【００７７】
活性層を最後に、言い換えれば、保護膜を付着させる前に付着させて、センサを形成する際の他の工程からの酵素への熱衝撃を最小限にすることが好ましい。表Ｉおよび図３２を参照のこと。
【００７８】
作用電極90と同様な方法で干渉補正電気92を形成する。しかしながら、干渉補正電極92には、作用電極を形成するのに用いたものと同一の成分と方法を用いて作成した不活性層（図示せず）があるが、ウシ血清アルブミンのような不活性または非反応性タンパク質を、ウシ血清アルブミン−白金活性炭、樹脂、界面活性剤、およびシンナーからなる混合物に加える。上述したように、干渉補正電極は、中性物質であるアセトアミノフェン（acetaminophen ）のような干渉物質が、電極86,88,99および92の上面にある半透膜層94（以下に記載する）を通過して拡散するのを調節する。
【００７９】
ここで図１６を参照する。図１３の線11による参照電極86の断面図を示す。上述したように、好ましくは銀の層からなる導電性金属片68を基体上に付着させることにより、参照電極86を形成する。導電性金属片68の一部を覆うが、電極区域と接触パッドを規定するためにある部分は覆わないままにしておく絶縁層72を付着させる。当業者に知られているスクリーン印刷技術により、銀／塩化銀の層102 を導電性金属片68上に付着させる。メテック社の製品番号２３５９の電極インキのような銀／塩化銀の参照電極用インキを開発して、銀／塩化銀対を用いて標準参照電極を作成する。
【００８０】
参照電極の安定性測定により、数日間に亘り、センサを全血に露出した際に参照電極（86）の電位が移動することが分かった。問題の根源は、血液タンパク質を浸透させる膜（94）の排除特性（rejection properties）が徐々に減少することにあると断定した。この血液タンパク質は参照電極を塞いでしまう。タンパク質に対するバリア特性、および十分な水と電解質を移送する能力のために、参照電極のシールドとしてセルロースアセテートを選択して、印刷した銀／塩化銀の表面に安定した電位を維持した。
【００８１】
参照電極上に均一なセルロースアセテートの層を調製する際には、適切な溶媒と硬化工程を選択することが重要である。完了すべき印刷工程に関して、十分なスクリーン寿命を達成するためには、溶媒の蒸気圧が低く（沸点が高く）なければならない。またこの溶媒は印刷スクリーンに対して相溶性を有さなければならない。言い換えれば、印刷中にスクリーンのエマルジョンを分解してはならない。調製したペーストの粘度は40,000センチポアズから350,000 センチポアズまでの範囲と比較的大きくなければならない。このことは、高分子溶液の固体％がかなり大きく、したがって、溶媒が高分子にとって非常に好ましいものでなければならないことを指示している。適切な溶媒には、いわゆる、「スーパー溶媒」があり、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホアミド、および１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）のような極性非プロトン性溶媒がこの級の溶媒の例として挙げられる。最後の限定は、配合技術者およびスクリーンの印刷者にとって容易に取り扱えるように、溶媒には、発癌性物質、突然変異誘発物質、または奇形形成物質を含ませてはならないことである。好ましい溶媒はＤＭＩである。
【００８２】
セルロースアセテートの濃度を100 ｍｌのＤＭＩ中に15ｇから35ｇまでの範囲にして調製した溶液が、印刷用途に通用することが分かった。好ましい濃度として、100 ｍｌのＤＭＩ中に20ｇのセルロースアセテートを含有するものを選択した。高分子を迅速に溶解するために、溶媒を60℃から100 ℃までの範囲の温度まで加熱する。好ましい温度は95℃である。急速に撹拌して（マグネティックスターラ）加熱した溶媒（予め温度設定した水槽中）に高分子を加える。次いでスパチュラにより機械的に混合し、その後、高分子が完全に溶解するまで連続的に撹拌する。高分子と溶媒との混合物（ペースト）を水槽から取り出して、室温まで冷まし、ラベルを付けて印刷に必要とされるまで取っておく。
【００８３】
ペーストは一般的に調製した当日に印刷に使用され、調製後も数か月にわたり使用することができるが、ペーストの棚寿命とともに層の性能も段々と悪くなる。ペーストを二重（２pass）印刷として塗布し、その後、10分から１時間までの期間に亘りレベリングさせる。このペーストを10分間に亘り55℃の箱型オーブン中で硬化させ、このオーブンの温度を10分間に亘り100 ℃まで上昇させ、この温度で10分以上に亘り硬化させ続ける。セルロースアセテート膜の性能にとっては、この印刷方法と硬化サイクルが重要である。硬化温度が低すぎる場合には、十分には溶媒を除去することができず、硬化時間が長すぎたり、または硬化温度が高すぎたりする場合には、特に抗乾燥剤でセンサを後処理した後に基体から容易に離層する脆い膜が形成されてしまう。より多く重ね塗り印刷を行なうと膜がより厚くなってしまい、このことによってもまた離層しやすくなってしまう。溶媒を完全に除去すると水和工程を妨げるので、完全には溶媒を除去しないことが重要である。
【００８４】
セルロースアセテート層100 を銀／塩化銀層102 の上に塗布して、参照電位を移行させる、血液試料中に存在する不純物から塩化銀を保護する。スポッティング（spotting）技術またはスクリーン印刷技術によりセルロースアセテート層100 を塗布しても差支えない。スポッティング技術を用いる場合、アシムテック社（カリフォルニア州、カールスバッド）から得られ、当業者に知られているアシメテックＸＹＺ表を使用する。スクリーン印刷付着技術を用いる場合には、２−（２−エトキシエトキシ）エチレンアセテートのような沸点の高い溶媒から得られる粘度の大きい溶液を使用する。
【００８５】
最後に、上述したように、各々の電極86,88,90および92をグルコースおよび酸素透過膜94で覆う。セルロースアセテート、ポリウレタン、シリコーン化合物、およびデュポン社（デラウェア州、ウィルミントン）から得られるナフィオン  （登録商標）材料のような当業者に知られている他の膜材料から膜94を形成しても差支えない。好ましい膜94は、液体キャリア中にシリコーン化合物が分散して相を形成した不完全硬化形態として施される重合性ケイ素含有化合物の分散体である。このキャリアは分散相中には実質的に溶解せず、硬化の最中に分散体から除去できる。グルコースおよび酸素の透過性が大きい連続層、フイルムまたは膜として分散体が乾燥して硬化し、電気化学グルコースセンサにおいて単一膜として機能する。単一層の半透膜がジョーンズのヨーロッパ特許第207,370 B1号に開示されており、この特許をここに引用する。オリゴマー、プレポリマー、または不完全硬化ポリマーとして連続相中にケイ素含有化合物を分散させてもよい。
【００８６】
ジョンソン等の米国特許第4,221,688 号およびエリアスの米国特許第4,427,811 号に開示されているように、例えば乳化剤を含ませることにより連続相中に分散させた後、水−連続相シリコーンエマルジョンまたは分散体から水を蒸発させることにより、連続相の除去最中に、重合性ケイ素含有化合物を既知の方法により硬化させても差支えない。上記特許をここに引用する。さらに、ケイ素含有化合物の分散体に適切な硬化触媒を含ませるか、または熱硬化しても差支えない。このため、重合性ケイ素含有化合物の分散体を不完全硬化分散体の形態にある層として施し、キャリアまたは連続相の少なくとも一部を最終的な硬化の最中に分散体から除去する。エマルジョンは、シリコーンラテックス粒子およびシリカの分散体からなるものであっても差支えない。水を蒸発させる際に、シリコーンラテックス粒子はシリカにより架橋される。得られる膜の形態は、シリカまたケイ酸塩の連続体により結合したポリジオルガノ架橋粒子である。これは、分析物、すなわち、グルコースおよびラクテート等を移送するシリカ相である。
【００８７】
本発明のある実施態様によると、重合性ケイ素含有化合物はオルガノシロキサン、特に、各々のジオルガノシロキサン100 ユニットに対して最大で約１ユニットまでの少量のモノオルガノシロキサンを含んでいてもよい、実質的に線状のジオルガノシロキサンの繰り返しユニットからなるジオルガノシロキサンである。ここで高分子鎖は、各々の末端においてシリコーン結合ヒドロキシル基で終わっている。
【００８８】
本発明の別の重要な実施態様によると、酸素およびグルコース透過性膜を形成する重合性ケイ素含有化合物を、連続水相および陰イオン安定化した分散シリコーン相からなる水性シリコーンエマルジョンとして電極に施す。ここでシリコーン相は、水溶性ケイ酸塩および末端がヒドロキシル基で終わった（ヒドロキシルブロックト）ポリジオルガノシロキサンのグラフトコポリマーである。サームの米国特許第4,244,849 号に開示されているように、ｐＨの範囲が約8.5 から約12.0までである、このようなシリコーンエマルジョンは、長期間に亘り安定しており、周囲条件下で水を除去する際に硬化したゴム弾性を有する連続層が形成される。これらのシリコーン化合物は、末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサンとアルカリ金属ケイ酸塩との相互作用により、例えば、8.5 から12.0までのｐＨ範囲の水性エマルジョン中で陰イオン的に安定したグラフトポリマーを形成することにより得られる。しかしながら、安定性が重要ではない場合には、ｐＨは重要ではない。成分を均一に分散させてすぐに、エマルジョンを層状に施して、膜を製造しても差支えない。
【００８９】
「末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサン（hyclroxyl endblocked pdydiorganosiloxane）」は、モノオルガノシロキサンユニットの不純物を少量しか含まない、実質的に線状高分子であるジオルガノシロキサンの繰り返しユニットを意味する。したがって、末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサンは、１分子当たり実質的に２つのケイ素結合ヒドロキシル基を有する。エマルジョンから水を除去した後に得られた生成物にゴム弾性の特性を付与するためには、ポリシロキサンは少なくとも5,000 の平均分子量（Ｍｗ）を有するべきである。硬化によりポリマーが連続フイルムまたは層を形成する場合には、約5,000 未満から約90までの平均分子量を有するポリシロキサンも有用である。平均分子量が増加するにつれ、引張強さおよび破断点伸びが改善され、平均分子量が50,000より大きい場合には、比較的大きな引張強さと破断点伸びが達成される。しかしながら、本発明の好ましい実施態様においては、硬化した高分子が電極に直接結合し、使用中には厳しい機械的応力が加えられないので、役立つべき高分子には引張強さが大きいことは必要ではない。最大平均分子量は、水のような液体キャリアまたは連続相中に乳化できるかまたは他の方法で分散できる範囲のものである。不完全硬化分散ポリシロキサンにとって約1,000,000 までの平均分子量が本発明のセンサに使用するのに実際的である。硬化の際には、膜の分子量には上限がない。重合性分散シロキサンの好ましい平均分子量は、1,000 から700,000 までの範囲である。
【００９０】
末端がヒドロキシル基で終わった有用なポリジオルガノシロキサンが有する有機ラジカルは、例えば、ラジカル当たり７未満の炭素原子を含有する一価炭化水素ラジカルまたはラジカル当たり７未満の炭素原子を含有する２−（ペルフルオロアルキル）エチルラジカルであっても差支えない。一価炭化水素ラジカルの例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ペンチル、ヘキシル、ビニル、シクロヘキシルおよびフェニルが挙げられ、２−（ペルフルオロアルキル）エチルラジカルの例としては、３，３，３−トリフルオロプロピルおよび２−（ペルフルオロブチルメチル）が挙げられる。末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサンは好ましくは、少なくとも50パーセントがメチルである有機ラジカルである。好ましいポリジオルガノシロキサンは、末端がヒドロキシル基で終わったポリジメチルシロキサンである。
【００９１】
本発明の重要な一実施態様によると、陰イオン安定化した水性エマルジョンとして末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサンを用いる。この実施態様においては、「陰イオン安定化」は、ポリジオルガノシロキサンが陰イオン界面活性剤によりエマルジョンとして安定化していることを意味する。末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサンの最も好ましい陰イオン安定化した水性エマルジョンは、フィンドレイ等の米国特許第3,294,725 号により記載された陰イオンエマルジョン重合方法により調製されたものである。この特許をここに引用する。末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサンの別の調製方法がハイデ等の米国特許第2,891,920 号に記載されており、この特許をここに引用する。
【００９２】
本発明に使用する、長期に亘り安定しているエマルジョンを調製するために、アルカリ金属ケイ酸塩またはコロイド状シリカを乳化したシリコーン組成物中に含ませなければならない。本発明の酸素および低分子量分析物透過性膜を形成するエマルジョンに使用するのに好ましいアルカリ金属ケイ酸塩は水溶性ケイ酸塩である。水溶液としてアルカリ金属ケイ酸塩を使用することが好ましい。ケイ酸リチウム、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウム、ケイ酸ルビジウムおよびケイ酸セシウムのようなどのアルカリ金属のケイ酸塩水溶液も用いることができる。
【００９３】
コロイド状シリカが業界に知られ、市販されており、強度と貯蔵安定度を増加させるためにコロイド状シリカを分散体中に含むことができる。ヒュームドシリカおよび沈殿コロイド状シリカを含むどのコロイド状シリカも使用することができるが、水性媒質中のシリカが好ましい。ナトリウムイオン、アンモニアまたはアルミニウムイオンにより安定化したコロイド状シリカのような水性媒質中のコロイド状シリカは、通常安定化形態で得られる。ｐＨを例えば8.5 から12.0までの範囲内にするために他の成分を加える必要がなくｐＨの必要条件を満たすことができるので、エマルジョンを形成するためには、ナトリウムイオンにより安定化した水性コロイド状シリカが特に有用である。ここで「コロイド状シリカ」は、約0.0001から約0.1 マイクロメータまでの粒径を有するシリカを意味する。好ましくは、コロイド状シリカの粒径は、約0.03から約0.08マイクロメータまでの範囲にあり、最も好ましくは、シリカの粒径は約0.06マイクロメータである。
【００９４】
コロイド状シリカを乾燥粉末の形態でまたは水性分散体として陰イオン安定化ヒドロキシル化ポリジオルガノシロキサンに加えることができる。好ましくは、コロイド状シリカをナトリウムイオン安定化水性分散体の形態で加える。それらの多くが市販されている。これら市販のコロイド状シリカは通常、コロイド状シリカを約10.0から約30.0重量％含有し、ｐＨが約8.5 から約10.5までである水性分散体で得られる。
【００９５】
ケイ酸ナトリウムまたはケイ酸カリウムの水溶液がよく知られており、市販されている。この水溶液は一般的に、非晶質シリカの離散粒子を多量には含まず、通常水ガラスと称されている。アルカリ金属ケイ酸塩の水溶液中のアルカリ金属酸化物に対するシリカの重量比率は重要ではなく、ケイ酸ナトリウムの場合には、約1.5 から約3.5 までの範囲、ケイ酸カリウムの場合には、約2.1 から約2.5 までの範囲で変化しても差支えない。ケイ酸塩溶液を添加するとエマルジョンのｐＨが約8.5 から約12.0までの範囲内に入り、そのためにエマルジョンのｐＨを調節するために追加の成分を含有させる必要がなくなるので、本発明に使用するエマルジョンを調製するには、アルカリ金属ケイ酸塩の水溶液が特に好ましい。もちろん、アルカリ金属水酸化物水溶液中でケイ素エステルを加水分解することにより調製したもののような、他のアルカリ金属ケイ酸塩水溶液を本発明に使用しても差支えない。
【００９６】
本発明の一実施態様によると、アルカリ金属ケイ酸塩および重合性ケイ素含有化合物をエマルジョン中で組み合わせて分散粒子としてグラフトコポリマーを形成することにより、重合性ケイ素含有化合物を分散させる。シリコーンエマルジョンを調製する好ましい方法は、１種類以上の末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサンの陰イオン安定化水性エマルジョンにアルカリ金属ケイ酸塩を加え、エマルジョンのｐＨを約8.5 から約12.0までの範囲内に調節し、所定の期間に亘りこのエマルジョンを熟成させて周囲条件下で水を除去する際にゴム弾性生成物を形成することである。この方法において、溶解したケイ酸塩および分散された末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサンを含有するエマルジョンのｐＨは、エマルジョンの形成にとっては重要である。ｐＨを8.5 から12.0までの範囲に維持すると、アルカリ金属ケイ酸塩を溶解させたままにでき、キャリア（例えば、水）を除去する間に溶解したケイ酸塩と分散したシロキサンとの間で十分なグラフト共重合が生じ、膜を形成するために層として付着させたときにケイ素含有化合物の重合化あるいはそのさらなる重合化が達成できるエマルジョンを製造することができる。ｐＨが上述した範囲よりも小さい場合には、アルカリ金属ケイ酸塩からケイ酸が形成されてしまう。ケイ酸は不安定で、縮合により急速に重合する。このケイ酸はエマルジョンをゲル化することができる。ケイ酸の形成は約10.0から約12.0までの範囲のｐＨではほぼ完全に抑圧され、溶解したアルカリ金属ケイ酸塩と分散シロキサンとの間の反応がこのｐＨ範囲内ではより急速に生じるので、アルカリ金属ケイ酸塩を含有するエマルジョンにとってはこの範囲が好ましい。
【００９７】
ケイ酸塩の共重合により調製したシリコーンエマルジョンを、溶解したケイ酸塩と分散したシロキサンとの間で相互作用させるのに十分な時間に亘り約8.5 から約12.0までのｐＨ範囲で熟成させて、周囲条件下で水を除去する際にゴム弾性生成物を形成する。有機スズ塩をポリジオルガノシロキサンの重量に対して約0.1 から約2.0 重量部の範囲の量で用いる場合、熟成期間が効果的に短縮される。エマルジョン中で有用であると期待されている有機スズ塩の例としては、モノオルガノスズ塩、ジオルガノスズ塩およびトリオルガノスズ塩が挙げられる。使用するスズ塩の陰イオンは重要ではなく、有機物でも無機物であっても差支えないが、カルボンキシレートのような有機陰イオンが一般的に好ましい。使用できる有機スズ塩の例としては、オクチルスズトリアセテート、ジオクチルスズジオクトエート、ジデシルスズジアセテート、ジブチルスズジアセテート、ジブチルスズジブロミド、ジオクチルスズジラウレートおよびトリオクチルスズアセテートが挙げられる。好ましいジオルガノスズジカルボキシレートはジオクチルスズジラウレートである。
【００９８】
アルカリ金属ケイ酸塩および末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサンの相対量は、広い範囲に亘り変化しても差支えない。シロキサン100 重量部に対して約0.3 から約30重量部までの範囲のケイ酸塩を使用する場合、好ましいゴム弾性特性が得られる。
【００９９】
本発明の一実施態様において、分散体にアルキルスズ塩を加えて、キャリアの脱蔵、または他の方法による除去を行なう最中に最終的なエマルジョンの硬化に対して触媒作用を促して硬化膜を形成する。好ましい塩は、ジブチルスズジアセテート、ジブチルスズジラウレート、およびジオクチルスズジラウレートのようなジアルキルスズジカルボキシレートであり、最も好ましいスズ塩はジブチルスズジラウレートである。ポリジオルガノシロキサンのような重合性ケイ素含有化合物100 重量部に対して約0.1 から約2.0 重量部までの範囲のアルキルスズ塩を生成するのに十分な量で、触媒のエマルジョンを使用する。触媒を多量に試用することができるが、そのことによる利点はない。
【０１００】
重合性ケイ素含有化合物の分散体には、各成分を広範囲の濃度で含有させても差支えない。好ましい濃度は、所望の膜厚による。例えば、キャリアまたは連続相が蒸発するときに、割れを生じない薄いゴム弾性膜（20ミクロン）を得るためには、合計量が、水のようなキャリア100 重量部に対して約67.0から約160.0 重量部までの範囲のとなる、ケイ酸塩とポリジオルガノシロキサンの組合せからなる分散体を使用することが最も好ましい。好ましい膜厚は、約10.0から約100.0 ミクロンまでの範囲にあり、特に好ましくは約20.0ミクロンである。
【０１０１】
乳化剤を組成物に含ませて分散体を形成する場合には、乳化剤の量はエマルジョンの約2.0 重量パーセント未満であっても差支えない。末端がヒドロキシル基で終るポリジオルガノシロキサンを調製するエマルジョン重合法に使用する中和スルホン酸から乳化剤を生成しても差支えない。
【０１０２】
陰イオン界面活性剤は好ましくは、末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサンを形成する乳化重合に使用する界面活性スルホン酸の塩である。スルホン酸のアルカリ金属塩が好ましく、中でもそのナトリウム塩が好ましい。スルホン酸を、脂肪族置換したベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、およびジフェニルエーテルスルホン酸、脂肪族スルホン酸、およびシリルアルキルスルホン酸により例示することができる。他の陰イオン乳化剤を用いても差支えない。そのような例としては、アルカリ金属スルホリシノーリエート、脂肪酸のスルホン化グリセリルエステル、スルホン化一価アルコールエステルの塩、オレイルメチルタウリドのナトリウム塩のようなアミノスルホン酸のアミド、アルファ−ナフタレンモノスルホン酸ナトリウムのようなスルホン化芳香族炭化水素のアルカリ塩、ナフタレンスルホン酸とホルムアルデヒドとの縮合生成物、並びにアンモニウムラウリルスルフェート、トリエタノールアミンラウリルスルフェートおよびナトリウムラウリルエーテルスルフェートのようなスルフェートが挙げられる。
【０１０３】
非イオン性乳化剤をエマルジョン中に含ませても差支えない（陰イオン乳化剤に加えて）。そのような非イオン性乳化剤の例としては、サポニン、テトラエチレンオキシドのドデシルエーテルのような脂肪酸とエチレンオキシドとの縮合生成物、エチレンオキシドとソルビタントリオリエートとの縮合生成物、エチレンオキシドとイソドデシルフェノールとの縮合生成物のような、側鎖を有するフェノール化合物とエチレンオキシドとの縮合生成物、および重合性エチレンイミンのようなイミン誘導体が挙げられる。
【０１０４】
本発明の酸素およびグルコース透過性膜を形成するのに使用する重合性ケイ素含有化合物分散体に追加の成分を含ませて、分散物、または分散物から得られる硬化重合膜の特性を改良してもよい。例えば、増粘剤を加えて、分散体の粘度を改良するか、または分散体にチキソトロピーを付与してもよい。分散体に消泡剤を加えて、分散体から層を形成する際に、調製、被覆または硬化中の発泡を減少させてもよい。
【０１０５】
分散体に充填剤を加えて、膜を強化したり、増量したり、または着色してもよい。有用な充填剤の例としては、コロイド状シリカ、カーボンブラック、粘土、アルミナ、炭酸カルシウム、石英、酸化亜鉛、マイカ、二酸化チタンおよび業界で知られている他の物質が挙げられる。これらの充填剤は、微粉砕されているべきであり、このような充填剤の水性分散体を使用することが有利かもしれない。
【０１０６】
この充填剤は好ましくは約10.0マイクロメータ未満の平均粒径を有している。シリコーンエマルジョンを最終硬化のために塗布して本発明の酸素およびグルコース透過性膜を形成するときに、水、または他の非溶媒キャリアを蒸発させるか、または別の方法で除去して、硬化した酸素およびグルコース透過性膜を形成させる。キャリアの蒸発は、分散体フイルム厚および適用方法に依存して、数時間から約１日以内に通常完了する。本発明の膜の別の重要な特性は、極性基体と非
極性基体の両方に対して優れた接着特性を有することである。
【０１０７】
本発明に使用する酸素および分析物透過性膜のさらに重要な利点の１つは、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、またはラクテートオキシダーゼのような適切な酵素触媒により活性化される電極にこれらの膜を結合できることである。本発明の一実施態様によると、グルコースと酸素との反応に対して触媒作用を促すことのできる化合物を陰極または活性層96内に含ませており、本発明のグルコース透過性膜94で、参照電極86、対電極88、作用電極90（活性層96を含む）、および干渉補正電極92を被覆している。
【０１０８】
ここに記載した膜物質は全血98に対して良好な相容性を有し、酸素の透過に対する選択性が高く、そのため、全血からでさえ、十分に過剰な理論量の酸素が膜94を透過する。
【０１０９】
膜94に好ましい材料は、少なくとも約10.0重量パーセントのシリカを含有する陰イオン安定化した、水性の、末端がヒドロキシル基で終わったポリジメチルシロキサンエラストマーである。最も好ましくは、このエラストマーは約14.0重量パーセントのコロイド状シリカを含み、ダウコーニング（ミシガン州、ミッドランド）からＦＣ−６１コーティングとして市販されている。この材料は、粘度が小さく、充填剤が添加された不透明なエマルジョンである。一般的に、この材料において、ｐＨが約11.0であり、粘度が約40,000センチポアズである。
【０１１０】
本発明の別の実施態様において、センサ28の乾燥貯蔵中に、膜94を湿らせること（wetup ）が段々と難しくなることが分かった。キャスティング後の膜94中に最初に存在する残留水および他の溶媒が貯蔵中に蒸発し、シリコーン凝集物を融合させてしまうと考えられている。このように膜構造物が凝集すると、センサのグルコースに対する感度が減少し、応答時間が長くなってしまう可能性がある。
【０１１１】
例えば、界面活性剤またはポリエチレングリコールのような、沸点が高く、水溶性である、親水性高分子液体乾燥防止剤による処理または増湿により、膜が完全に乾くのを防ぐことにより、乾燥貯蔵中に膜が老化するのを防ぐようにセンサ28を後処理することができる。好ましくは、ユニオンカーバイドケミカルスアンドプラスチックス社（コネチカット州、ダンバリー）から得られるトリトン（登録商標）Ｘ−１００界面活性剤、ターギトール（登録商標）１５界面活性剤、ＩＣＩサーファクタンツ社（デラウェア州、ウィルミントン）から得られるツイーン（登録商標）２０エトキシル化ソルビタンエステル界面活性剤および分子量が約200 から約600 までの範囲にあるポリエチレングリコールのような、分子量が少なくとも約300 である非イオン性界面活性剤をセンサ28の後処理として施して、最初の始動の際に、センサのドリフトを最小限にしつつ、出力、および応答時間を改良する。後処理に好ましい材料は、分子量が約400 であるポリエチレングリコールである。
【０１１２】
ここで再度図１３および１４を参照する。異なる用途において様々なセンサの形状が有利となり得ることを注記する一方で、本発明の好ましい実施態様により製造したセンサ28の好ましい形状を示す。この図は、本発明を制限するものではない。
【０１１３】
基体62を様々な形状と寸法で製造しても差支えない。本発明の好ましい実施態様の１つによると、基体62は、長さが約0.4 インチから約0.5 インチまで、好ましくは約0.45インチであり、幅が約0.15インチから約0.25インチまで、好ましくは約0.18インチであり、厚さが約0.02インチから約0.05インチまで、好ましくは約0.025 インチである。導電性金属片64,66,68および70各々を、厚さが約10.0ミクロンから約20.0ミクロンまで、好ましくは約15.0ミクロンとなるように付着させる。導電性金属片64,66,68および70の各々はセンサの末端76で、幅が約0.01インチから約0.03インチまで、好ましくは約0.01インチである。接触パッド78,80,82および84はセンサの末端74で、幅が約0.025 インチから約0.05インチまで、好ましくは約0.03インチである。
【０１１４】
絶縁層72を、厚さが約10.0ミクロンから約50.0ミクロンまで、好ましくは約20.0ミクロンとなるように付着させる。焼成または硬化後に厚さの値が分かる。
【０１１５】
導電性金属片の一部を露出させて、参照電極86、対電極88、作用電極90、および干渉補正電極92を規定する。参照電極86、および対電極88の露出表面積は、それぞれ約0.00015 平方インチ、および約0.00022 平方インチである。作用電極90、および干渉補正電極92の各々の露出表面積は、約0.00038 平方インチである。これらの露出した表面積は、付着したときの電極の厚さまたは層の多孔度により
規定される電極の縁による表面積を考慮していない。このような縁の寸法は、電極の全体の面積と比較して小さい。したがって、露出した表面積の規格値はいくぶん近似値である。
【０１１６】
参照電極86の銀／塩化銀層102 上にセルロースアセテート層100 を塗布する。この銀／塩化銀層102 は、導電性金属片68の露出部分上に付着させたものである。このセルロースアセテート層100 は、参照電位を移行させてしまう不純物から銀塩化銀を保護する。
【０１１７】
導電性金属片66および70の露出部分上に活性層および不活性層を塗布して、それぞれ作用電極90および干渉補正電極92を形成する。保護膜94を、合計の厚さが約5.0 ミクロンから約50.0ミクロンまで、好ましくは約10.0ミクロンから約20.0ミクロンまでとなるように、好ましくはスピンキャストにより付着させる。保護膜94を好ましくは層の形態で塗布して、必要とされる透過性特性を有する全体的に薄い厚さのものを形成することができる。
【実施例】
【０１１８】
以下、図面に示す実施例を参照して本発明を詳細に説明する。なお、以下の実施例は、本発明を限定するものではなく、説明を意図したものである。
【０１１９】
（実施例Ｉ）
図１３、１４および３２並びに表Ｉを参照する。実質的に本発明の実施態様による構成部材および設計による固体プレーナグルコースセンサ28のある適切な構成を以下の要素の組合せにより提供する。
【０１２０】
基体62および導電性金属片64,66,68および70を有するプレーナグルコースセンサ28の部分的アセンブリを本発明の方法にしたがってこの基体62上に製造した。この基体62は、絶縁性を有し、厚さが0.025 インチで、大きさが0.18インチ×0.45インチであり、約96％のアルミナおよび約４％のガラス結合剤からなる。このガラス結合剤は、クアーズセラミック社（コロラド州、グランドジャンクション）から得られるものである。スクリーン印刷技術を用いて、メテック社（ペンシルベニア州、エルバーソン）から製品番号ＰＣ１０２３１として得られる金導電性ペーストの10.0ミクロン厚のエマルジョンにより、導電性金属片64,66,68および70の一部、並びに接触パッド78,80,82および84をこの基体62上に付着させた。
【０１２１】
325 のメッシュパターンを有するステンレススチール製のスクリーンを用いて、金ペーストを基体62上にスクリーン印刷した。導電性金属片64,66 および70は第２の末端76に向って連続しており、これら導電性金属片を白金上部に接続した。これらの導電性金属片は、メテック社から製品番号ＰＣ１０２０８として得られる純度の大きい白金導体ペーストの10.0ミクロン厚のエマルジョンを基体上にスクリーン印刷することにより製造したものである。上述したものと同様のスクリーンを用いて、白金導体組成物を付着させた。メテック社から製品番号３５７１ＵＦとして得られる銀導体ペーストの10.0ミクロン厚のエマルジョンを基体上に塗布することにより、導電性金属片68を同様に第２の末端76のほうに向かせた。ステンレススチール製のワイヤから作成した325 メッシュスクリーンを用いて、銀導体ペーストをスクリーン印刷した。メテック社から製品番号２５３９して得られる銀／塩化銀参照電極インクの10.0ミクロン厚のエマルジョンを第２の末端76で導電性金属片68の一部の上を、少なくともできるだけ大きく導電性金属片68の区域を覆うように、好ましくは、参照電極86を規定する絶縁層72により露出するべき導電性金属片68の区域より大きい区域を覆うように、続いてスクリーン印刷した。最後に、アルドリッヒケミカル社（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から製品番号１８０９５−５として得られるセルロースアセテート層100 を銀／塩化銀参照電極86の上にスクリーン印刷した。この層は、参照電位を移行させ得る不純物から塩化銀を保護するために参照電極の上に塗布してある。
【０１２２】
この実施例において、無機ペーストを焼成する際には、ファストファイヤ社  （マサチューセッツ州、ビレリカ）から得られる３つのゾーン乾燥機を有するＢＴＵ７ゾーン炉を用いた。製造者の勧告に従い、ピーク条件まで上昇させて焼成を行なった。金導体ペーストを10分間に亘り850 ℃で焼成し、白金導体ペーストを13分間に亘り750 ℃で焼成し、銀導体ペーストを10分間に亘り750 ℃で焼成した。
【０１２３】
導電性金属片64,66,68および70を末端76で0.01インチ幅となるように基体62上に付着させた。接触パッド78,80,82および84を末端74で0.03インチ幅で0.8 インチ長さとなるように基体62上に付着させた。
【０１２４】
デュポンエレクトロニクス社（デラウェア州、ウィルミントン）から製品番号９６１５として得られる絶縁層72を、センサ28の大部分を覆うように15.0ミクロン厚のエマルジョンとしてスクリーン印刷した。この絶縁層72は、末端76から接触パッド78,80,82および84まで延びている。スクリーン印刷の工程には、ステンレススチール製の325 メッシュスクリーンを用いた。この絶縁層を10分間に亘り750 ℃で焼成した。上述したように、導電性金属片64,66,68および70の一部を絶縁層72では覆わずに、電極区域を露出させた。
【０１２５】
銀／塩化銀を30分間に亘り75℃で塗布した。
【０１２６】
セルロースアセテートを10分間に亘り55℃に保持し、10分間で100 ℃まで上昇させ、10分間に亘り100 ℃に保持して塗布した（30分間の硬化時間）。
【０１２７】
厚膜スクリーン印刷技術を用いて、イーテック社（マサチューセッツ州、フラミンガム）から得られる白金化炭素粉末粒子に固定化された、バイオザイムラボラトリーズインターナショナル社（カリフォルニア州、サンディエゴ）から得られるグルコースオキシダーゼを触媒的に活性を有する量だけ有する活性層96を導電性金属片66上に付着させ、作用電極90を形成した。同様に厚膜スクリーン印刷技術を用いて、イーテック社から得られる白金化炭素粉末粒子に固定化された、マイルス社（イリノイ州、カンカキー）からペンタックス（登録商標）ウシアルブミンとして販売されているウシ血清アルブミンのような不活性タンパク質を有する不活性層を導電性金属片70上に付着させて、干渉補正電極92を形成した。活性層および不活性層の製造については、実施例IIにおいて詳細に記載する。
【０１２８】
導電性金属片、絶縁層、および電極を基体62上に付着させ、電極が「分流」するのを防ぐように接触箇所を遮蔽した後、センサの電極区域上に保護膜94をスピンキャストした。スピンキャスティング技術を用いて、ダウコーニング（ミシガン州、ミッドランド）からファブリックコーティング（ＦＣ）−６１として市販されているコロイド状シリカを約14重量パーセント含む、陰イオン安定化した水性の、末端がヒドロキシル基で終わったポリジオルガノシロキサンエラストマーをセンサ28に塗布した。ＩＶＥＫラボラトリーポンプおよびインテグレイテッドテクノロジーズＰ−６０００スピンコーターを用いてセンサ上に保護膜94を多層状に塗布した。ウェファーをエラストマーの膜材料に完全に浸すことにより最初の層を塗布した。次いで、インテグレイテッドテクノロジーズＰ−６０００スピンコーターを7,000 ｒｐｍの回転速度と、90秒の回転時間で始動させた。回転を完了した後、最初の層を15分間に亘り乾燥した。次いでセンサ28を7,000 ｒｐｍで再度回転させて、膜材料の第２の層を塗布した。第２の層を塗布するのに使用したスピンフラッド技術を用いて、さらに２つの層を塗布した。各層をキャスティングする間隔として15分をとった。４つの層全てをキャスティングした後、無塵の環境において室温で保護膜94を一晩硬化させた。保護膜94の多層の合計厚は、硬化後には、約20.0ミクロンであった。
【０１２９】
（実施例II）
作用電極90に使用するために活性層96を調製した（実施例Ｉ参照）。グルコースセンサ用の活性層96は主に、イーテック社から得られる白金化炭素粉末粒子に固定化された、バイオザイムラボラトリーズ社から得られるグルコースオキシダーゼを触媒的に活性である量含み、これらの粒子は層中に実質的に均一に分布している。
【０１３０】
Ｈ２Ｏ２を用いて錯体白金スルフィット酸(II)（comlex platinum sulfite acid(II)）を酸化分解することにより、炭素粉末（公称粒径約30ｎｍ）の表面にコロイド状白金（約1.5 から2.5 ｎｍまでの粒径）を付着させることにより調製した、カボット社（マサチューセッツ州、ボストン）からバルカン（登録商標）ＸＣ−７２カーボンブラックとして得られる白金化炭素粉末粒子、約3.15グラムをリン酸塩緩衝液中で処理して、その中に含まれる残留硫酸を中和した。このリン酸塩緩衝液は、ロームアンドハース社（ペンシルベニア社、フィラデルフィア）からキャソン（登録商標）ＣＧ殺菌剤として市販されている殺菌剤を含んでいる。11.499グラムの二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、2.898 グラムの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、および1.0 グラムのキャソンＣＧ殺菌剤を1.0 リットルの蒸留水に添加することにより緩衝液を調製した。ｐＨメータおよび電極を用いて緩衝液配合物を試験して、ｐＨが7.5 となることが分かった。3.15グラムの白金化活性炭に約100 ｍｌのリン酸塩緩衝液を加え、７日間に亘り混合した。白金化活性炭を沈殿させ、使用した緩衝液60ｍｌを上澄みとして流出させ、新たな緩衝液100 ｍｌを加えることにより、最初の３日間の混合後に、緩衝液を取り換えた。７日間の混合後に混合物を減圧
濾過し、100 ｍｌの緩衝液を使用して減圧濾過を行ないながら中和した炭素を洗浄した。緩衝液の大部分を炭素を通して引いた後に約15から20秒間に亘り減圧状態を維持して、炭素をやや乾燥させて、材料の取扱い適性を改良した。
【０１３１】
白金化活性炭（ＰＡＣ）を625 ｍｇのペンテックス（登録商標）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と混合した。625 ｍｇのＢＳＡを、ＰＡＣおよび40ｍｌの緩衝液を含有するフラスコに最初に加えた。ＢＳＡおよびＰＡＣを研究室の回転器によりやさしく混合し、30分間放置してＢＳＡを溶解させた。この混合物を室温で約18時間に亘り3.5 の速度設定で再度やさしく混合した。ＢＳＡ−ＰＡＣの混合物を減圧濾過して、減圧濾過したまま100 ｍｌの緩衝液で洗浄した。再度、大部分の緩衝液をＢＳＡ−ＰＡＣを通して引いた後に約20秒間に亘り減圧状態を保持して、ＢＳＡ−ＰＡＣを約60から70パーセントの湿分まで乾燥させた。スクリーン印刷用の活性層および不活性層のインクに将来使用するために、ＢＳＡ−ＰＡＣを冷蔵した。
【０１３２】
メテック社から製品番号８１０１ＲＳとして得られる結合剤樹脂5.0 グラムを2.0 グラムのＢＳＡ−ＰＡＣ（上述のように調製した）に加えることにより、活性層インクを配合した。この混合物に、活性層の印刷流動助剤および湿潤剤として0.25グラムのトリトン（登録商標）Ｘ−１００界面活性剤を加えた。次いで、塗料業界で標準的な三本ロール練り機を用いて混合物を練磨した。最初の練磨を完了して印刷目的のためにペーストの粘度を調節した後、メテック社から製品番号８１０１ＲＳシンナーとして得られるアルベッソＴシンナー1.0 ｍｌを混合物に加えた。そしてこの混合物に２度目の練磨を行なった。最後に、バイオザイムラボラトリーズ社から得られるグルコースオキシダーゼ0.4 グラムを混合物に加えて練磨を行なった。活性ペーストを導電性金属片66上にスクリーン印刷して作用電極90を形成した。
【０１３３】
（実施例III ）
干渉補正電極92を形成するのに使用する不活性層インクを実施例IIに記載した方法を用いて配合した。しかしながら、不活性層は、グルコースオキシダーゼのような酵素を触媒的に活性を有する量だけ含まない。5.0 グラムの結合剤樹脂を、2.0 グラムのＢＳＡ−ＰＡＣ（実施例IIにおいて調製した）、0.25グラムのトリトン（登録商標）Ｘ−１００界面活性剤および1.0 ｍｌのアルベッソＴ（８１０１ＲＳ）シンナーとともに練磨を行なうことにより不活性層インクを調製した。この混合物にさらに0.4 グラムのペンテックス（登録商標）ＢＳＡを加えて練磨した。次いで、不活性層のペーストを導電金属片70の電極部分上にスクリーン印刷して干渉補正電極92を形成した。
【０１３４】
（実施例IV）
ここで再度図１から１２を参照する。実質的に本発明の一実施態様による構成部材および設計を含むセンサパッケージの適切な構成の１つを、以下の要素の組合せにより示す。
【０１３５】
センサパッケージ10をロームアンドハース社から得られるＶ８２５アクリルプラスチックから成形した。このセンサパッケージ10には、幅が約0.5 インチであり、本体14の長さが約1.535 インチであり、厚さが約0.37インチである、後ろ側が空洞となったＪ型ボディがある。装置中へまたは装置からセンサパッケージ10を挿入または取り出すのを補助する、ハンドル12またはゲート部分が本体から突出している。パッケージ10には、中に実質的に楕円形の窪み22が形成されたハウジング20がある。この窪みは、長さが約0.1 インチであり、幅が約0.065 インチである。この窪みには、外側の境界面24および入口56と出口58からなる通路18がある。この通路は縦方向に窪み22に入って出る。通路18は実質的に丸い横断面を有し、その直径は約0.03インチである。図５−１２に示すように、速度調節部材またはバンプ60が窪み22に設けられている。速度調節部材60は窪み22の幅方向に延び、長さが約0.065 インチであり、幅が約0.04インチである。言い換えれば、この速度調節部材60は、半径が約0.02インチの通路18内にあるバンプ状の突出物である。速度調整部材は試料室の内部容積を減少させ、入口56と出口58の直径に近い横断面区域を形成した。ガスケット26を設けて、ハウジングの窪みの境界面24およびセンサ28（実施例Ｉにおいて作成した）と接触してそれらの間にシールを形成させた。ガスケット26は、ショアＡスケールにおいて約50の硬度を有するサーリンクＴ２４５０エラストマーから作成した。ガスケット26は、一片が約0.17インチの正方形である。ガスケット26には、長さが約0.1 インチであり、幅が約0.064 インチである実質的に楕円形の穴が開いている。
【０１３６】
ガスケット26は、厚さがその中心の空洞部分では約0.014 インチであり、ガスケットの穴の長さ方向に沿った２つの外側の端では約0.05インチである。これらの厚いほうの表面により、ガスケットがハウジングの窪み境界部の周りに適合し、一方ではまたセンサ電極区域に対して開いているべき窪み22がセンサ試料室となる。
【０１３７】
実施例Ｉに記載したように、固体プレーナ電気化学センサを、厚さ0.025 インチ、長さ0.45インチ、そして幅0.18インチのセラミック基体上に形成した。ショアＡスケールで約40から60までの範囲の硬度を有するシリコーンゴム材料から作られたベースパッド30上にセンサ28を配置する。このパッドは、長さが約0.5 インチであり、幅が約0.227 インチである。このベースパッド30は、合計の厚さが約0.058 インチであり、その裏側には一連の横突起物がある。これらの横突起物は、約0.1 インチ間隔で位置し、ベースパッドの裏面から約0.015 インチの高さを有している。このベースパッド30にはまた、その反対側に、センサ28を収容する矩形の中心空洞がある。この空洞は、長さが約0.45インチであり、幅が約0.185 インチである。
【０１３８】
最後に、接触リード線フレーム32を設けて、電流を測定して転化して、試料中のグルコース（またはラクテート）の濃度を求めることのできる装置にセンサ28を接続する。図３および４に示すように、リード線フレーム32には、４本のリード線34がある。これらのリード線34は各々、ベース側の末端では幅が約0.041 インチであり、リード線接触部50での幅が約0.026 インチである。これらリード線34は、長さが約１インチであり、厚さが約0.01インチである。リード線34は、約40から80マイクロインチまでの範囲の厚さにニッケルメッキされ、約20から50マイクロインチまでの範囲の厚さにミクロ電子級の金メッキ材料により金メッキされた、ＢｅＣｕ合金材料から製造したものである。
【０１３９】
Ｖ８２５アクリルプラスチックから成形したリード線フレーム32には、第１の末端部38にはベース36に固定されたリード線、および第２の末端部42にはセンサ用窪み40がある。センサ用窪み40は、ベースパッド30およびセンサ28を収容するために、深さが約0.042 インチであり、長さが約0.5 インチであり、幅が約0.225 インチである。リード線フレーム32には、深さが約0.06インチであり、長さが約0.296 インチであり、幅が約0.085 インチである第２の矩形窪み46がある。第２の窪み46は、安定化棒44を収容するためのものであり、リード線34をセンサ接触パッドに位置合わせする（前述）。安定化棒44は、矩形の固体片であり、ロームアンドハース社から得られるＶ８２５アクリルプラスチック材料から成形したものである。安定化棒44は、長さが約0.29インチであり、幅と高さが約0.075 インチである。
【０１４０】
ベースパッド30およびセンサ28をセンサ用窪み40に配置した後、リード線34がセンサ28に接触し、安定化棒44が窪み46内に固定されるまで、リード線34をフレーム32の縁に沿って曲げた。リード線フレームは、長さが約1.147 インチであり、幅が約0.395 インチである。ガスケット26、センサ28、ベースパッド30および接触リード線フレーム32を含む構成部材を組み立てた後、接触リード線フレームの外側外周の周りに超音波溶接を行なうことにより、ハウジングとリード線フレームを互いに固定した。センサパッケージ10を組み立てた後に、４つの電気接触表面52を露出させる。接触表面は、リード線フレームの第１の末端38から約0.064 インチ延びた３つの分割部により間隔が離されており、長さが約0.1 インチであり、幅が約0.033 インチである。装置接触表面52は、装置と電気接触するために約0.1 インチの長さが露出されている。
【０１４１】
（実施例Ｖ）
実質的に実施例Ｉ−IVにしたがって構成したプレーナグルコースセンサを全血により評価し、ｍｇ／ｄｌで表したグルコースの濃度とナノアンペア（ｎＡ）で表したセンサの測定電流との関係を図１７のグラフにプロットした。図１７のグラフに示したように、このセンサの重要な特徴の１つは、グルコースの濃度がセンサにより測定された電流と線形の関係を示すことである。グルコースおよび酸素の両方が透過するセンサ膜94により、グルコースに対して化学量論的に過剰な酸素が、全血から膜に浸透し、その結果として、グラフの左端から右端まで線形の関係が得られると考えられている。
【０１４２】
全血中のラクテートに対する応答を測定するために、同様のセンサを評価した。使用したセンサは、グルコースオキシダーゼの代わりにラクテートオキシダーゼを使用したことを除いて、実施例Ｉ−IVで構成したものと実質的に同じであっ
た。ｍモル／ｌで表したラクテートの濃度とナノアンペア（ｎＡ）で表したセンサにより測定された電流との関係を図１８のグラフに示した。図１８のグラフに示したように、このセンサの重要な特徴の１つは、ラクテートの濃度がセンサにより測定された電流と線形の関係を示すことである。ここで再度、ラクテートおよび酸素の両方が透過するセンサ膜により、ラクテートに対して化学量論的に過剰な酸素が、全血から膜に浸透して、その結果として、グラフの左端の約1.00ｍモル／ｌから右端の約20.0ｍモル／ｌまで線形の関係が得られると考えられている。
【０１４３】
（実施例VI）
干渉補正電極92の効果を求めるために、この干渉補正電極を使用する場合としない場合の、グルコースの濃度に対するグルコースセンサの応答を記録して、図１９のグラフに示した。電極92を設けて、中性物質であるアセトアミノフェンのような、センサの半透膜94を通って拡散し得る干渉物質のために調節した。
【０１４４】
この実施例において、1.0 ｍモル／ｌの干渉物質（アセトアミノフェン）を一連の血液試料に加えた。これらの血液試料は、500.0 ｍｇ／ｄｌまでのグルコース濃度の範囲にわたるものであった。前述したように、補正電極を用いた場合と用いなかった場合の測定値を図１９に示す。補正電極を用いない場合には、補正電極を用いた場合の測定値よりもプラス方向に約65.0ｇｍ／ｄｌのずれが生じた。換言すると、干渉補正電極を用いない場合には、前記グルコース濃度の範囲に亘り平均で＋65.0ｍｇ／ｄｌの誤差が生じる。この誤差では、約82.0ｍｇ／ｄｌの正常な血中グルコース含有量を正常な範囲外の含有量（補正しない場合には、147.0 ｍｇ／ｄｌ）として読み取ってしまうことになる。
【０１４５】
補正電極を用いたグルコースセンサの応答の、理想的な補正値に対する相関関係は優れたものであった。
【０１４６】
（実施例VII ）
本発明の電気化学センサの寿命を測定するために、実質的に実施例Ｉ−IVにしたがって構成したグルコースセンサを、長期間に亘り多数の試料に対して用いた。このセンサを69日間に亘り試験した。この期間中に、2,250 の試料を評価した。グルコースの濃度が180 ｍｇ／ｄｌである水溶液に対してｎＡで示した電流を
69日間に亘り測定した。図２０に示すように、本発明のグルコースセンサは、69日間に亘り、および／または少なくとも2,250 の試料について、10ｎＡより大きい応答を示した。
【０１４７】
（実施例VIII）
貯蔵期間を終了した後の最初の性能について、界面活性剤による後処理の効果を測定するために、センサを試験して、約83.0ｍｇ／ｄｌから約470.0 ｍｇ／ｄｌまでの範囲のグルコース濃度とナノアンペア（ｎＡ）で示したセンサにより測定した電流との間の関係を図２３および２４に示した。第１のセンサをトリトン（登録商標）Ｘ−１００（前出）により後処理し、一方第２のセンサは後処理しなかった。ここでの評価を行なう前に、センサを室温で１週間に亘り貯蔵した。処理しなかったセンサにおいては、グルコースの濃度に対する応答が小さくて非線形であった（図２４に示した拡大グラフからより明確に分かるように、処理しなかったセンサの応答は、約200.0 ｍｇ／ｄｌのグルコース濃度を越えるとドリフトしてしまう）。これは、貯蔵中に膜が乾ききってしまうことによりウェットアップ（wetup ）が遅くなった結果である。一方、処理したセンサにおいては、たった１時間のウェットアップ後に線形で完全なウェットアップ応答が達成された。
【０１４８】
センサの初期性能について界面活性剤によりセンサを後処理した効果を測定するために、様々な界面活性剤を評価した。グルコースの濃度が約180.0 ｍｇ／ｄｌの水性試料について、５つのグルコースセンサを試験した。第１のセンサには後処理を施さず、残りのセンサには、トリトン（登録商標）Ｘ−１００界面活性剤、ユニオンカーバイドケミカルアンドプラスチック社（コネチカット州、ダンベリー）から得られるターギシール（登録商標）１５界面活性剤、ツイーン（登録商標）２０エトキシル化ソルビタンエステル界面活性剤および分子量が約300 のポリエチレングリコールにより別々に処理を施した。センサについて試験を行ない、後処理とナノアンペア（ｎＡ）で示したセンサの測定した電流との間の関係を図２２に示した。処理しなかったセンサでは応答が小さいことから分かるように、後処理をしていない場合には、グルコースセンサをウェットアップすることが困難になる。これは、貯蔵中に膜が乾ききった結果である。ここに用いた界面活性剤のような抗乾燥剤によりセンサを処理することにより、センサの電流出力を２倍以上にすることができる。
【０１４９】
（実施例IX）
センサの応答の線形性に対する膜厚の影響を測定するために、２層の薄い膜  （約10ミクロン）、２層の厚い膜（約22.0ミクロン）、および４層の膜（約22.0ミクロンを別々に評価した。センサを試験して、ｍｇ／ｄｌで示した水溶液中のグルコースの濃度とナノアンペア（ｎＡ）で示したセンサにより測定した電流との間の関係を図２５にプロットした。ダウコーニング（ミシガン州、ミッドランド）からＦＣ−６１コーティングとして市販されているコロイド状シリカを約14.0重量パーセント含有する陰イオン安定化した水性の、末端がヒドロキシル基で終わったポリジメチルシロキサンエラストマーから多層膜の全てを調製した。図２５から分かるように、多層の膜によりセンサの性能は改良され、このことは、グラフに示された線形応答により立証される。４層の膜と同じ厚さ（約22.0ミクロン）の厚い２層の膜は、出力が大きいが、グルコースの濃度に対する応答は線形ではなかった。４層の膜では、膜の欠点がなくなったために性能が改良されている。２層の膜は、酸素に対して過剰のグルコースが膜を通過してしまい、出力が大きいこと、並びに応答が線形ではないことの原因となる欠点がある。
【０１５０】
ＦＣ−６１コーティング材料からなる２層（約11.0ミクロン）と４層（約18.0ミクロン）のスピンキャスト膜を比較して、同様の評価を行なった。センサを試験して、約69.0ｍｇ／ｄｌから約487.0 ｍｇ／ｄｌまでの範囲にわたるグルコースの濃度と、ナノアンペア（ｎＡ）で示したセンサにより測定した電流との間の関係を図２６にプロットした。ここで、２層のスピンキャスト膜には、酸素に対して過剰のグルコースが膜を透過して、このために出力が大きくなり、応答が線形ではなくなるという欠点がある。
【０１５１】
２層（約10.0ミクロン）のスピンキャスト膜をスクリーン印刷膜（約65.0ミクロン）と比較して、効果的な膜厚を求めた。上記膜は、市販されているＦＣ−６１コーティング材料（前出）からなるものであった。センサを試験し、約500.0 ｍｇ／ｄｌまでの範囲のグルコースの濃度と、ナノアンペア（ｎＡ）で示したセンサにより測定した電流との間の関係を図２７および２８にプロットした。グルコースの濃度に対して応答が線形ではなく、出力が小さいことにより立証されるように、厚いスクリーン印刷膜では、ウェットアップが遅かった。厚さが65.0ミクロンの膜では厚すぎて、グルコースに対して有用な応答が得られないことが分かった。図２８のグラフにおいては、スクリーン印刷膜は応答が線形からプラス方向にずれが生じていることに注意されたい。さらに、厚いスクリーン印刷膜では、応答時間が約60秒よりも長くかかってしまった。２層のスピンキャスト膜では、出力が大きく、応答が線形ではなかった（上述したように）。
【０１５２】
（実施例Ｘ）
白金化活性炭（ＰＡＣ）材料に界面活性剤を含ませることの貯蔵に対する性能への効果を求めるために、室温で１日貯蔵した後と21日貯蔵した後のＰＡＣ中に界面活性剤を含ませない場合について、グルコースセンサの応答を評価した。センサを試験して、約500.0 ｍｇ／ｄｌまでの範囲のグルコースの濃度と、ナノアンペア（ｎＡ）で示したセンサにより測定した電流との間の関係を図２９にプロットした。図２９から分かるように、トリトン（登録商標）Ｘ−１００のような界面活性剤をＰＡＣ材料に加えなかった場合には、時間が経過するにつれてセンサの出力が低下する。図２１は、最適化した多層膜についてであるが、図２９と同様な効果を示している。
【０１５３】
図３０は、ＰＡＣ材料にトリトンＸ−１００界面活性剤を含ませたグルコースセンサについて、約500.0 ｍｇ／ｄｌまでの範囲のグルコースの濃度と、ナノアンペア（ｎＡ）で示したセンサにより測定した電流との間の関係を示したグラフである。ＰＡＣからなる活性層と不活性層に界面活性剤を加えると、老化したセンサのウェットアップに役立つ。ＰＡＣ材料に界面活性剤を加えることにより、新しいセンサと古いセンサの性能を等しくすることができる。
【０１５４】
（実施例ＸＩ）
界面活性剤を膜94に加えることによるセンサの性能に対する影響を調べるために、グルコースセンサを試験し、約500.0 ｍｇ／ｄｌまでの範囲のグルコースの濃度と、ナノアンペア（ｎＡ）で示したセンサにより測定した電流との関係を図３１にプロットした。市販されているＦＣ−６１コーティング材料（前出）から実質的になるセンサ膜94をそれぞれのセンサに施した。一方のセンサには、ステパン社（イリノイ州、ノースフィールド）から得られる界面活性剤である、マコン（登録商標）１０界面活性剤を含ませた。両方の膜とも、厚さが約11.0ミクロン厚である、２層のスピンキャスト膜である。膜に界面活性剤を添加することにより、グルコースの濃度に対する応答を大きくし、ウェットアップを改良することができる。
【０１５５】
説明のために本発明の特定の実施態様を詳細に記載したけれども、本発明の精神および範囲から逸脱せずに様々な変更を行なってもよい。設計について検討して、センサおよび／またはセンサパッケージの形状を変更して、ある用途の効率を最適化し、製造とその使用に関連するコストを最小限にしてもよい。したがって、本発明は請求の範囲による以外には限定されるべきではない。
【表１】
2004340949.tif 000003
【０１５６】
以下に、他の参考例を記載する。
【０１５７】
（参考例１）  非導電性基体、
前記非導電性基体の第１の部分に接着した第１の導電性材料からなり、該第１の導電性材料の一部が絶縁コーティングにより覆われ、前記第１の導電性材料の一部が白金化炭素粉末粒子により担持された触媒的に活性を有する量の酵素を含む活性層により覆われ、前記白金化炭素粉末粒子が前記活性層全体に分布している作用電極、
前記非導電性基体の第２の部分に接着した第２の導電性材料からなり、該第２の導電性材料の一部が絶縁コーティングにより覆われ、前記第２の導電性材料の少なくとも一部が前記絶縁コーティングにより覆われずにいる対電極、
前記非導電性基体の第３の部分に接着した第３の導電性材料からなり、該第３の導電性材料の一部が絶縁コーティングにより覆われ、前記第３の導電性材料の少なくとも一部が前記絶縁コーティングにより覆われずにいる参照電極、および
前記作用電極を覆う半透膜
からなる多目的に使用できる固体電気化学センサ。
【０１５８】
（参考例２）  前記非導電性基体が、平面的であり、セラミック、ガラス、耐火物、およびそれらの組合せからなる群より選択される材料からなることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１５９】
（参考例３）  前記非導電性基体が、ガラス結合剤と混合されたアルミナ複合体からなることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１６０】
（参考例４）  前記第１の導電性材料が、銀、金、および白金からなる群より選択される金属からなる厚膜ペーストより作成されることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１６１】
（参考例５）  前記第１の導電性材料が、高純度の厚膜白金ペーストから作成されることを特徴とする参考例４記載のセンサ。
【０１６２】
（参考例６）  前記第２の導電性材料が、銀、金、および白金からなる群より選択される金属からなる厚膜ペーストより作成されることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１６３】
（参考例７）  前記絶縁コーティングが、セラミック、ガラス、高分子、およびそれらの組合せからなる群より選択される材料からなることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１６４】
（参考例８）  前記導電性材料の前記絶縁コーティングにより覆われた部分が、厚膜シルクスクリーン技術により形成されたものであることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１６５】
（参考例９）  前記半透膜は、低分子量の分析物を透過させ、シリコーンとシリカとの混合物からなることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１６６】
（参考例１０）  前記半透膜が、約10.0重量パーセントのシリカを含有する陰イオン安定化した水性の、末端がヒドロキシル基で終わったポリジメチルシロキサンエラストマーからなることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１６７】
（参考例１１）  前記半透膜が、約14.0重量パーセントのシリカを含有する陰イオン安定化した水性の、末端がヒドロキシル基で終わったポリジメチルシロキサンエラストマーからなることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１６８】
（参考例１２）  前記第３の導電性材料の上に銀／塩化銀の厚膜ペーストを印刷することを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１６９】
（参考例１３）  前記第３の導電性材料の上にセルロースアセテートを付着させることを特徴とする参考例１２記載のセンサ。
【０１７０】
（参考例１４）  前記非導電性基体の第１の部分に接着した第４の導電性材料からなる干渉補正電極を含み、前記導電性材料の一部が前記絶縁コーティングにより覆われ、前記導電性材料の第２の部分が、白金化炭素粉末粒子に固定化された不活性タンパク質からなる不活性層により覆われ、前記白金化炭素粉末粒子が前記不活性層全体に実質的に均一に分布していることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１７１】
（参考例１５）  前記センサがグルコースセンサであり、前記酵素がグルコースオキシダーゼであることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１７２】
（参考例１６）  前記センサがラクテートセンサであり、前記酵素がラクテートオキシダーゼであることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１７３】
（参考例１７）  前記センサを、1,000 回または30日の短いほうの期間に亘り効果的に機能するように適合させることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１７４】
（参考例１８）  前記センサを、2,000 回または60日の短いほうの期間に亘り効果的に機能するように適合させることを特徴とする参考例１記載のセンサ。
【０１７５】
（参考例１９）  非導電性基体、
前記非導電性基体の第１の部分に接着した第１の導電性材料からなり、該第１の導電性材料の一部が絶縁コーティングにより覆われ、前記第１の導電性材料の一部が白金化炭素粉末粒子に固定化された触媒的に活性を有する量のグルコースオキシダーゼを含む活性層により覆われ、前記白金化炭素粉末粒子が前記活性層全体に実質的に均一に分布している作用電極、
前記非導電性基体の第２の部分に接着した第２の導電性材料からなり、該第２の導電性材料の一部が絶縁コーティングにより覆われ、前記第２の導電性材料の少なくとも一部が前記絶縁コーティングにより覆われずにいる対電極、
前記非導電性基体の第３の部分に接着した第３の導電性材料からなり、該第３の導電性材料の一部が絶縁コーティングにより覆われ、前記第３の導電性材料の少なくとも一部が前記絶縁コーティングにより覆われずにいる参照電極、および
前記電極を覆うグルコースおよび酸素透過性膜
からなる多目的に使用できる固体グルコースセンサ。
【０１７６】
（参考例２０）  前記グルコースおよび酸素透過性膜が約14.0重量パーセントのシリカを含有する陰イオン安定化した水性の、末端がヒドロキシル基で終わったポリジメチルシロキサンエラストマーからなることを特徴とする参考例１９記載のセンサ。
【０１７７】
（参考例２１）  前記第３の導電性材料が銀／塩化銀厚膜ペーストからなることを特徴とする参考例１８記載のセンサ。
【０１７８】
（参考例２２）  前記非導電性基体の一部に接着した導電性材料からなる干渉補正電極を含み、前記導電性材料の一部が前記絶縁コーティングにより覆われ、前記導電性材料の一部が、白金化炭素粉末粒子に固定化された不活性タンパク質からなる不活性層により覆われ、前記白金化炭素粉末粒子が前記不活性層全体に実質的に均一に分布していることを特徴とする参考例１８記載のセンサ。
【０１７９】
（参考例２３）  中に窪みが形成されたハウジング、ここで前記窪みには境界面があり、該窪みに少なくとも１つの通路が連絡しており、
前記窪みの下にある固体平板電気化学センサ、および
前記窪みの境界面および前記固体平面電気化学センサに接触してこれらの間にシールを形成するガスケット
からなり、
前記ハウジング、前記ガスケット、および前記センサが試料室を形成することを特徴とするセンサパッケージ。
【０１８０】
（参考例２４）  第１の末端に複数のリード線が取り付けられ、第２の末端に前記センサを支持する窪みが形成された接触リード線フレームアセンブリを含むことを特徴とする参考例２３記載のセンサパッケージ。
【０１８１】
（参考例２５）  前記接触リード線フレームアセンブリに、前記複数のリード線に取り付けられた安定化棒を備え付けて、所定の位置に各々のリード線を保持して、該リード線を前記センサの表面にある接触パッドに位置合わせすることを特徴とする参考例２３記載のセンサパッケージ。
【０１８２】
（参考例２６）  前記接触リード線フレームアセンブリは、前記複数のリード線が前記センサパッケージ内に適切に位置するときに前記安定化棒を収容する前記ハウジング内に窪みがあることを特徴とする参考例２４記載のセンサパッケージ。
【０１８３】
（参考例２７）  前記窪み内に前記センサを支持するセンサパッドを含むことを特徴とする参考例２３記載のセンサパッケージ。
【０１８４】
（参考例２８）  前記試料室に速度調節部材を含むことを特徴とする参考例２３記載のセンサパッケージ。
【０１８５】
（参考例２９）  前記速度調節部材は、前記センサと向かい合う前記ハウジングの成形部分であることを特徴とする参考例２８記載のセンサパッケージ。
【０１８６】
（参考例３０）  前記試料室は、容積が約3.0 マイクロリットルから約5.0 マイクロリットルまでの範囲にあることを特徴とする参考例２５記載のセンサパッケージ。
【０１８７】
（参考例３１）  多目的に使用できる固体電気化学センサを形成する方法であって、
非導電性基体を選択し、
該非導電性基体上の第１の部分に導電性材料を付着させ、
該導電性材料上の一部に活性層を付着させて作用電極を形成し、ここで該活性層が白金化炭素粉末粒子に固定化された触媒的に活性を有する量の酵素を含み、前記白金化炭素粉末粒子が前記活性層全体に実質的に均一に分布しており、
前記非導電性基体上の第２の部分に第２の導電性材料を付着させて対電極を形成し、
前記非導電性基体上の第３の部分に第３の導電性材料を付着させて参照電極を形成し、  前記電極上に半透膜を付着させる
各工程からなることを特徴とする方法。
【０１８８】
（参考例３２）  前記半透膜は、低分子量の分析物を透過させ、シリコーンとシリカとの混合物からなることを特徴とする参考例３１記載の方法。
【０１８９】
（参考例３３）  前記半透膜が、約14.0重量パーセントのシリカを含有する陰イオン安定化した水性の、末端がヒドロキシル基で終わったポリジメチルシロキサンエラストマーからなることを特徴とする参考例３１記載の方法。
【０１９０】
（参考例３４）  前記非導電性基体上の一部に第４の導電性材料を付着させ、
該第４の導電性材料上の一部に絶縁材料を付着させ、
前記第４の導電性材料上の他の一部分に不活性層を付着させて干渉補正電極を形成させる
各工程を含み、ここで前記不活性層が白金炭素粉末粒子に固定化した不活性タンパク質を含み、前記白金炭素粉末粒子が前記不活性層全体に実質的に均一に分布していることを特徴とする参考例３１記載の方法。
【０１９１】
（参考例３５）  生体外でグルコースまたはラクテートを測定するのに使用する、絶縁基礎層、導電性層、上面活性層および酸素とグルコースまたはラクテートを透過させる外面保護層を有する平面電極であって、
前記活性層が、グルコースまたはラクテートの１つに対して反応性がある酵素と白金化炭素粉末粒子とからなり、それによって、グルコースまたはラクテートの１つが前記活性層にさらされるときに、前記活性層が前記グルコースまたはラクテート１つの量に比例した量のＨ２Ｏ２を形成させることができ、
前記外面保護層が前記酸素およびグルコースまたはラクテートの１つを移送させられるように含ませた添加剤を有するシリコーン化合物からなり、それによって、前記電極を用いて、グルコースまたはラクテートの濃度の１つを迅速かつ正確に測定できることを特徴とする電極。
【０１９２】
（参考例３６）  前記シリコーン化合物が末端がヒドロキシル基で終わったポリジメチルシロキサンエラストマーからなることを特徴とする参考例３５記載の電極。
【０１９３】
（参考例３７）  前記外面保護膜が複数の薄い層からなることを特徴とする参考例３５記載の電極。
【０１９４】
（参考例３８）  前記外面保護膜が４つの層からなり、厚さの合計が約65.0ミクロン未満であることを特徴とする参考例３７記載の電極。
【０１９５】
（参考例３９）  前記外面保護膜の添加剤に、少なくとも約10.0重量パーセントのシリカを含有させることを特徴とする参考例３５記載の電極。
【０１９６】
（参考例４０）  前記外面保護膜が、約14.0重量パーセントのシリカを含む、陰イオン安定化した水性の、末端がヒドロキシル基で終わったポリジメチルシロキサンエラストマーからなることを特徴とする参考例３５記載の電極。
【０１９７】
（参考例４１）  前記外面保護膜を抗乾燥物質により後処理して前記電極の貯蔵寿命またはウェットアップを延ばすことを特徴とする参考例３５記載の電極。
【０１９８】
（参考例４２）  前記抗乾燥物質は、沸点が高く、水溶性を有する親水性高分子液体抗乾燥剤であることを特徴とする参考例４１記載の電極。
【０１９９】
（参考例４３）  前記抗乾燥物質が、約200 から約600 までの分子量を有するポリエチレングリコールであることを特徴とする参考例４１記載の電極。
【０２００】
（参考例４４）  試験すべき流体が通過する試料室中に位置した複数の電極を有するセンサであって、前記試料室が流路を有し、試料用入口と出口の各々が前記試料室の一部の断面積よりも小さな断面積を有するセンサにおいて、
速度調節部材が前記入口と出口との間の流路内に設けられた構造バリアからなり、この速度調節部材により前記試料室の前記流路に当る部分の断面積を減少させて、試験すべき流体が前記試料室を通過するときにこの流体の速度を実質的に安定化することを特徴とするセンサ。
【０２０１】
（参考例４５）  前記電極の上を流れる流体の流動を干渉することなく該電極に向かって延びるように前記速度調節部材を位置させることを特徴とする参考例４４記載のセンサ。
【０２０２】
（参考例４６）  前記試料室が成形したプラスチック製の試料室であり、前記速度調節部材が前記流路を部分的に干渉するように位置した前記試料室の一体形延長部であることを特徴とする参考例４４記載のセンサ。
【０２０３】
（参考例４７）  ハウジング内に搭載され、互いに近接した複数の電気的接点、および該接点に接続された軸方向に延びる複数のリード線を有するセンサにおいて、
前記リード線は該リード線に取り付けられた安定化棒により互いに離間されており、それによって前記リード線が、前記電気的接点に接触する適切な位置に確実に位置されることを特徴とするセンサ。
【０２０４】
（参考例４８）  前記リード線が弾性を有し、前記安定化棒によって前記リード線が前記電気的接点と接触させられることを特徴とする参考例４７記載のセンサ。
【０２０５】
（参考例４９）  前記リード線を電気的試験システムに接続するための接触区域を与えるリード線フレームベースに前記リード線が取り付けられていることを特徴とする参考例４８記載のセンサ。
【０２０６】
（参考例５０）  前記リード線フレームベースが複数の電極を搭載すると共に、前記ハウジングの一部を構成し、前記リード線が前記電気的接点に付けられたスプリングチップを含むことを特徴とする参考例５０記載のセンサ。
【０２０７】
（参考例５１）  試験試料と接触する半透膜を含むセンサであって、前記半透膜を、高沸点で、水溶性かつ親水性の高分子の液体抗乾燥剤で処理して、前記センサの貯蔵寿命またはウェットアップが延ばされていることを特徴とするセンサ。
【０２０８】
（参考例５２）  前記抗乾燥剤が、界面活性剤またはポリエチレングリコールからなる群より選択される物質からなることを特徴とする参考例５１記載のセンサ。
【０２０９】
（参考例５３）  半透膜を含む電気化学センサの貯蔵寿命またはウェットアップを延長する方法であって、前記半透膜を、高沸点で、水溶性かつ親水性の高分子の液体抗乾燥剤で処理する工程を含むことを特徴とする方法。
【０２１０】
（参考例５４）  非導電性基体、
該非導電性基体の一部に接着した導電性材料を含む干渉電極であって、前記導電性材料の一部が絶縁コーティングにより覆われ、前記導電性材料の他の一部が白金化炭素粉末粒子に固定化された不活性タンパク質からなる不活性層により覆われ、前記白金化炭素粉末粒子が前記不活性層全体に実質的に均一に分布している干渉電極、そして
前記干渉電極を覆う半透膜
からなる電気化学センサ。
【０２１１】
（参考例５５）  (a)   白金化炭素粉末粒子を中性緩衝液と混合し、
(b)   上記工程(a) で得た緩衝化した白金化炭素粉末粒子をタンパク質と混合してタンパク質−白金化活性炭組成物を形成し、
(c)   上記工程(b) で得た前記タンパク質−白金化活性炭組成物を結合剤樹脂と混合し、
(d)   上記工程(c) で得た混合物を混練し、
(e)   上記工程(d) で得た混練生成物に酵素または不活性タンパク質のいずれかを加えて混合してペーストを形成する
各工程からなる電気化学電極用のペーストを形成する方法。
【０２１２】
（参考例５６）  (a)   白金化炭素粒子、
(b)   タンパク質、
(c)   樹脂結合剤、および
(d)   酵素または不活性タンパク質のいずれか一方
からなる電気化学電極用のペースト。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】本発明の一実施態様である電気化学センサパッケージの斜視図
【図２】図１に示したセンサパッケージの構成部材の分解図
【図３】図２の線３に沿った、リード線がやや開いた接触リード線フレームの断面側面図
【図４】リード線が開いた図３に示した接触リード線フレームの断面側面図
【図５】図２に示したセンサパッケージの試料室の部分拡大図
【図６】速度調節部材（バンプ）を有する場合と有さない場合の、試料室の流路に沿った位置に対する図５に示した試料室の断面積を示すグラフ
【図７】速度調節部材（バンプ）を有する場合と有さない場合の、試料室の流路に沿った位置に対する図５に示した試料室の断面積流路に対する測定区域の比率を示すグラフ
【図８】図５の線６に沿った、試料室の断面側面図
【図９】速度調節部材を有する場合の流路の速度を示す、線６に沿った試料室の断面側面図
【図１０】速度調節部材を有さない場合の流路の速度を示す、線６に沿った試料室の断面側面図
【図１１】図８の線７に沿った、試料室の断面側面図
【図１２】図５の線８に沿った、試料室の断面側面図
【図１３】図１に示したセンサパッケージに使用したセンサの拡大平面図
【図１４】図１に示したセンサパッケージに使用した別のセンサの拡大平面図
【図１５】図１３の線10に沿った、センサに使用した作用電極の断面側面図
【図１６】図１３の線11に沿った、センサに使用した参照電極の断面側面図
【図１７】本発明の一実施態様による全血試料中のグルコース濃度に対するグルコースセンサの応答を示したグラフ
【図１８】本発明の一実施態様による全血試料中のラクテート濃度に対するラクテートセンサの応答を示したグラフ
【図１９】補正電極を有する場合と有さない場合でグルコースの濃度を測定したときの、本発明の一実施態様による干渉補正電極の効果を示すグラフ
【図２０】長期に亘り多数の試料を測定した場合のグルコースセンサの出力を示すグラフ
【図２１】界面活性剤の後処理を行なった場合と行なわなかった場合の、グルコースの濃度に対するグルコースセンサの応答を示すグラフ
【図２２】様々な界面活性剤により後処理を行なった、グルコース濃度に対するグルコースセンサの応答を示すグラフ
【図２３】界面活性剤による後処理を行なった場合と行なわなかった場合の、室温で１週間貯蔵した後のグルコース濃度に対するグルコースセンサの応答を示すグラフ
【図２４】界面活性剤により後処理を行なった場合と行なわなかった場合の、室温で１週間貯蔵した後のグルコース濃度に対するグルコースセンサの応答を示すグラフ
【図２５】グルコースの濃度に対するグルコースセンサの応答、および応答の線形に関する膜厚の影響を示すグラフ
【図２６】グルコースの濃度に対するグルコースセンサの応答、および応答の線形に関して２層と４層のスピンキャスト膜の比較を示すグラフ
【図２７】グルコースの濃度に対するグルコースセンサの応答、および応答の線形に関して２層のスピンキャスト膜とスクリーン印刷膜との比較を示すグラフ
【図２８】グルコースの濃度に対するグルコースセンサの応答、および応答の線形に関して２層のスピンキャスト膜とスクリーン印刷膜との比較を示すグラフ
【図２９】グルコースの濃度に対するグルコースセンサの応答、およびセンサ電極の活性層および不活性層の白金化活性炭に界面活性剤を加えない場合の応答に関する長期間に亘る貯蔵の影響を示すグラフ
【図３０】グルコースの濃度に対するグルコースセンサの応答、およびセンサ電極の活性層および不活性層の白金化活性炭に界面活性剤を加える場合の応答に関する長期間に亘る貯蔵の影響を示すグラフ
【図３１】グルコースの濃度に対するグルコースセンサの応答、およびセンサ電極を覆う膜材料に界面活性剤を加える効果を示すグラフ
【図３２】グルコースセンサを形成する層を示す概略図
【符号の説明】
【０２１４】
10    センサパッケージ
12    ハンドル部
14    本体
16    接触部
18    流体通路
20    ハウジング
22    窪み
24    境界面
26    ガスケット
28    センサ
30    センサパッド
32    接触リード線フレーム
34    リード線
36    ベース
42    センサ窪み
44    安定化棒
48    Ｏリング
50    スプリングチップ
54    試料室
56    入口
58    出口
60    速度調節部材
62    基体
64、66、68、70    導電性金属片
72    絶縁層
78、80、82、84    接触パッド
86、88、90、92    電極
94    活性層または保護膜
100     セルロースアセテート層
102     銀／塩化銀層
122 、124     側壁
126     前面穴
132     突起物
134     楕円形の穴
136 、138     突出面
【図１】
2004340949.tif 000004
【図２】
2004340949.tif 000005
【図３】
2004340949.tif 000006
【図４】
2004340949.tif 000007
【図５】
2004340949.tif 000008
【図６】
2004340949.tif 000009
【図７】
2004340949.tif 000010
【図８】
2004340949.tif 000011
【図９】
2004340949.tif 000012
【図１０】
2004340949.tif 000013
【図１１】
2004340949.tif 000014
【図１２】
2004340949.tif 000015
【図１３】
2004340949.tif 000016
【図１４】
2004340949.tif 000017
【図１５】
2004340949.tif 000018
【図１６】
2004340949.tif 000019
【図１７】
2004340949.tif 000020
【図１８】
2004340949.tif 000021
【図１９】
2004340949.tif 000022
【図２０】
2004340949.tif 000023
【図２１】
2004340949.tif 000024
【図２２】
2004340949.tif 000025
【図２３】
2004340949.tif 000026
【図２４】
2004340949.tif 000027
【図２５】
2004340949.tif 000028
【図２６】
2004340949.tif 000029
【図２７】
2004340949.tif 000030
【図２８】
2004340949.tif 000031
【図２９】
2004340949.tif 000032
【図３０】
2004340949.tif 000033
【図３１】
2004340949.tif 000034
【図３２】
2004340949.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月23日(2004.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】手続補正書
【補正対象項目名】手続補正２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】手続補正書
【補正対象項目名】手続補正３
【補正方法】削除
【補正の内容】