(57)【要約】【課題】バックグラウンドのノイズを低減し、放出量と放出組織とを対応させて測定できる神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システムを提供する。【解決手段】組織外に放出された伝達物質アミノ酸を特異的に定量して二次元的に測定する神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システムにおいて、個々のアミノ酸と特異的に反応してニコチンアミドジヌクレオチドまたはニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の還元を行う酵素を用い、組織外に放出された特定の伝達物質アミノ酸を定量する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織外に放出された伝達物質アミノ酸を特異的に定量して二次元的に測定する神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システムにおいて、
個々のアミノ酸と特異的に反応してニコチンアミドジヌクレオチドまたはニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の還元を行う酵素を用い、組織外に放出された特定の伝達物質アミノ酸を定量することを特徴とする神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システム。
【請求項２】
請求項１記載の神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システムにおいて、前記還元されたニコチンアミドジヌクレオチドまたはニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の発する特定波長の蛍光をＣＣＤカメラで撮影して画像処理することにより、伝達物質アミノ酸の二次元的な放出量を得ることを特徴とする神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経組織からの放出アミノ酸、中でも情報伝達に関わる小分子として重要なグルタミン酸とγアミノ酪酸の量を、二次元画像として検出する新しい方法に関するものである。この方法は、組織からの放出アミノ酸量を短時間に、かつ放出細胞を特定しながら測定することができるため、再生組織における組織の状態の判定や病理検査などに有用である。
【０００２】
【従来の技術】
神経組織は特定の分子を細胞外へ放出して情報伝達しており、この放出される分子を神経伝達物質と呼ぶ。その中でもグルタミン酸とγアミノ酪酸の２種のアミノ酸は、小分子でありながら多くの神経から放出され、神経組織の成熟・機能・病変に深く関わる重要な分子である。
【０００３】
従来、これらのアミノ酸量の測定は、組織周辺の溶液を採取して蛍光性の担体を付加し、高速液体クロマトグラフィで定量する方法がほとんどだった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した従来のアミノ酸量の測定方法では、組織周辺溶液を用いるため、どの細胞種が放出したアミノ酸かを知ることができない。また、採取時にアミノ酸を放出していない組織の周辺の溶液も混入するため正確な濃度を測定することが難しい。しかも、小分子を測定するため極めて感度の鋭敏な担体を付加する必要があり、一回の測定が大変高価なものになっている。
【０００５】
また、二次元的にグルタミン酸放出量を測定する試みが、非神経性の単一細胞でなされてきたが、この方法では、神経細胞からの放出量を測定することはできない。神経組織からのグルタミン酸の放出量を測定するためには、バックグラウンドのノイズを低減し、グルタミン酸放出量と放出組織とを対応させて測定できる条件を設定し、適切なチャンバーを構成したシステムを考える必要がある。
【０００６】
本発明は、上記状況に鑑みて、バックグラウンドのノイズを低減し、放出量と放出組織とを対応させて測定できる神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システムを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕組織外に放出された伝達物質アミノ酸を特異的に定量して二次元的に測定する神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システムにおいて、個々のアミノ酸と特異的に反応してニコチンアミドジヌクレオチドまたはニコチンアミドジヌクレオチドリン酸の還元を行う酵素を用い、組織外に放出された特定の伝達物質アミノ酸を定量することを特徴とする。
【０００８】
〔２〕上記〔１〕記載の神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システムにおいて、前記還元されたニコチンアミドジヌクレオチドまたはニコチンアミドジヌクレオチドリン酸が発する特定波長の蛍光をＣＣＤカメラで撮影して画像処理することにより、伝達物質アミノ酸の二次元的な放出量を得ることを特徴とする。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１０】
図１は本発明の第１実施例を示す神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システムの模式図であり、図１（ａ）はその全体構成図、図１（ｂ）はそのチャンバーの斜視図であり、ここでは、生体外で測定する場合に用いるシステムを示している。
【００１１】
この図において、１はガラス容器、２は開放系チャンバー、３はサンプル（個々のアミノ酸）、４は個々のアミノ酸３と特異的に反応してＮＡＤ（ニコチンアミドジヌクレオチド）またはＮＡＤＰ（ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸）の還元を行う酵素（例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼＧＤＨ）、５はＵＶ光源、６は１次フィルター及びレンズ、７は励起ＵＶ光、８は反射ミラー、９は２次フィルター、１０は冷却ＣＣＤカメラ（光検出器）、１１はマイクロピペット、１２はチャンバー２の上面に設けられる穴である。つまり、倒立培養顕微鏡（５〜９）と冷却ＣＣＤカメラ１０を用いて測定するように構成している。例えば、パテで接着剤を塗布し、容器１に厚さ１．０ｃｍ、容量２７０μｌのチャンバー２を接着する。サンプルを供給した後、酵素とＮＡＤをマイクロピペット１１でチャンバー２の穴１２に供給する。なお、開放系チャンバー２の材料としては、例えば、テフロン（登録商標）を用いることができる。
【００１２】
このように、神経組織からの放出アミノ酸の二次元検出において、生体外で測定する場合は、開放系チャンバー２を用い、倒立培養顕微鏡（５〜９）と冷却ＣＣＤカメラ１０を用いて測定する。
【００１３】
このように、個々のアミノ酸３と特異的に反応してＮＡＤまたはＮＡＤＰの還元を行う酵素４を用い、組織外に放出された特定の伝達物質アミノ酸を定量する。還元されたＮＡＤまたはＮＡＤＰは、特定波長の蛍光を発するため、これを冷却ＣＣＤカメラ１０で撮影して画像処理することにより、伝達物質アミノ酸の二次元的な放出量を知ることができる。
【００１４】
図２は本発明の第２実施例を示す神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システムの模式図であり、図２（ａ）はその正面図、図２（ｂ）はその側面図である。ここでは、脳内で測定する場合のシステムを示している。
【００１５】
この図において、２１は微小キュベット（酵素溜め）、２２は電磁弁、２３は反応チャンバー（閉鎖系チャンバー）、２４は半透膜、２５は光ファイバー（シリカガラス製：３４０ｎｍ励起光）、２６は４００ｎｍバンドパスフィルタ、２７は薄膜画像素子（人工網膜ＬＳＩ）、２８は薄膜画像素子２７の出力である。
【００１６】
この図に示すように、反応チャンバー２３表面には分子量１００以下に透過性を持つ半透膜２４を設け、サンプルとしての伝達物質アミノ酸を脳内で直接反応チャンバー２３内に浸透させる。励起光はシリカガラス製光ファイバー２５で導入し、画像撮影は人工網膜ＬＳＩなどの薄膜画像素子２７を用いて行う。また、定量の酵素を添加するため電磁弁２２を備えた微小キュベット２１を備える。
【００１７】
測定は以下の手順で行う。
【００１８】
（１）まず、反応チャンバー２３中にＮＡＤまたはＮＡＤＰと緩衝液を封入する。
【００１９】
（２）次に、分子量１００以下の分子に透過性を持つ半透膜２４を通して反応チャンバー２３内に伝達物質アミノ酸の浸透を受ける（３０秒）。
【００２０】
（３）次に、薄膜画像素子（人工網膜ＬＳＩ）２７で反応前の画像を撮影する（Ｆ０）。
【００２１】
（４）次に、微小キュベット２１から酵素を反応チャンバー２３内に定量注入し反応させる（１０秒）。
【００２２】
（５）光ファイバー２５から励起光３４０ｎｍで還元されたＮＡＤまたはＮＡＤＰを励起し、薄膜画像素子（人工網膜ＬＳＩ）２７で反応後の画像を撮影する（Ｆ１）。
【００２３】
（６）平均蛍光変化率ｄＦ／Ｆ０（ｄＦ＝Ｆ１−Ｆ０）がアミノ酸濃度に比例するので、これを用いて放出アミノ酸量を算出する。
【００２４】
本発明によれば、上記したように、
▲１▼  生体外測定の時は開放系チャンバー、脳内測定の場合は閉鎖系チャンバーを用いるなど適切なチャンバーを備え、試料の非破壊検査法による測定システムを提供した。
【００２５】
▲２▼  測定サンプル・細胞の量を限定せず、一定時間での組織表面からの放出量を測定面の面積を超えない範囲で任意の測定面積を設定できるウインドウ観測をするシステムを提供する。つまり、ウインドウの面積を越えない範囲でどのような試料でも測定することができる。
【００２６】
▲３▼  測定チャンバーは反応酵素が短時間で十分行き渡る小ささであり、かつ、酵素の添加により環境が大きく変化しない大きさとする（例えば、容量約３００μｌのチャンバーが適切である）。
【００２７】
▲４▼  酵素の失活による副反応を防ぐために、短時間測定とする。本発明では酵素反応開始後１０秒での測定が可能である。
【００２８】
図３は小脳培養組織から放出されたグルタミン酸を本発明の第２実施例の方法により測定した結果を示す図であり、図３の上段、つまり図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）が脳組織の顕微鏡画像、図３の下段、つまり図３（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）がその組織からのグルタミン酸放出を輝点で表した画像であり、図３の上段と下段、つまり図３（ａ）と（ｅ）、図３（ｂ）と（ｆ）、図３（ｃ）と（ｇ）、図３（ｄ）と（ｈ）は同じ組織を写したものであり、ディジタルＣＣＤカメラで撮影している。
【００２９】
すなわち、図３（ａ）と（ｅ）は、脳の成熟が始まった時期の脳組織で、組織全体ではなく、組織の特定の場所（顆粒細胞という神経細胞のある場所）に、グルタミン酸の放出が見られることを示している。
【００３０】
図３（ｂ）と（ｆ）は、脳の成熟が落ち着いてきた時期の脳組織で、同じく組織の特定の場所からのグルタミン酸の放出が見られる。図３（ｅ）及び（ｆ）の暗い部分にも脳組織は存在しているが、グルタミン酸の放出がないので光っていない。
【００３１】
図３（ｃ）と（ｇ）は、脳の成熟を起こさない条件下での脳組織では、グルタミン酸の放出が見られないことを示している。この組織は図３（ａ）と（ｅ）の脳組織と同時期の脳であるが、成熟を起こさないようにされている。
【００３２】
図３（ｄ）と（ｈ）は、そのような脳組織でも時間を経るとグルタミン酸の放出が現れることを示している。
【００３３】
最下段に示されているＡｖｅ．ｏｆ  ｄＦ／Ｆ０は、光っている場所の平均蛍光変化率を出したものであり、Ａｖｅはａｖｅｒａｇｅの略、ｄＦは蛍光変化量、Ｆｏは蛍光初期値を示しており、この蛍光測定法では、ｄＦ／Ｆ０が化学物質（グルタミン酸）の濃度に比例して変化している。ここでは、その平均蛍光変化率は、図３（ｅ）では１０５．０、図３（ｆ）では１４６．９、図３（ｇ）では４６．１、図３（ｈ）では１１９．１を示している。
【００３４】
その値をあらかじめ測定したキャリブレーション（較正）と照らして放出グルタミン酸の濃度に換算した値が、図３（ｅ）では４５０μＭ、図３（ｆ）では７４０μＭ、図３（ｇ）では２３０μＭ、図３（ｈ）では６００μＭを示している。単位は濃度単位のモル、ｍｏｌ／ｌのＭで示している。
【００３５】
このように、ここでは、顆粒細胞上に特異的にグルタミン酸の放出を確認することができた。
【００３６】
このとき用いた反応と酵素は以下のようである。
【００３７】
グルタミン酸＋ニコチンアミドジヌクレオチド→
αケトグルタル酸＋還元型ニコチンアミドジヌクレオチド
酵素；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
さらに、小脳組織から放出されたγアミノ酪酸を、本発明の方法により測定したところ、プルキンエ細胞付近に特異的に１０５．０μＭ〔１００μＭ程度〕のγアミノ酪酸の放出量を確認した。このとき用いた反応と酵素は以下のようである。
【００３８】
γアミノ酪酸＋ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸→
コハク酸＋還元型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸
酵素；γアミノ酪酸分解酵素
反応基質の拡散と酵素の濃度から、測定に用いるチャンバーの溶液体積は３００μｌとした。
【００３９】
上記したように、本発明によれば、
（Ａ）個々のアミノ酸と特異的に反応してＮＡＤまたはＮＡＤＰの還元を行う酵素を用い、組織外に放出された特定の伝達物質アミノ酸を定量する。
【００４０】
（Ｂ）還元されたＮＡＤまたはＮＡＤＰが発する特定波長の蛍光を、ＣＣＤカメラで撮影して画像処理することにより、伝達物質アミノ酸の二次元的な放出量とその放出組織を知ることができる。
【００４１】
このように、本発明は、神経組織からの放出アミノ酸、中でも情報伝達に関わる小分子として重要なグルタミン酸とγアミノ酪酸の量を、二次元画像として検出する新しい方法に関するものであり、この方法は組織からの放出アミノ酸量を短時間に、放出細胞を特定しながら測定することができるため、再生組織における組織の状態の判定や病理検査などに有用である。
【００４２】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【００４３】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
【００４４】
脳組織からの放出される伝達物質アミノ酸は、情報伝達だけでなく、脳の発達状態や病変の強力な指標である。従来の方法では、伝達物質放出量の空間分布を知ることが不可能だったが、本発明により、組織中の特定の細胞からの伝達物質放出量、及びその空間分布を測定することが可能になる。
【００４５】
これにより、以下のようなことが可能になる。
【００４６】
（１）病変の考えられる脳組織からのグルタミン酸およびγアミノ酪酸放出量を測定して神経回路性の病変か否かを判定する。
【００４７】
（２）再生工学的に調整された脳組織の機能検査を行う。
【００４８】
（３）酵素反応のセンサー化によって患者の脳内のグルタミン酸放出量を測定することで、外傷や脳梗塞を発症した患者の脳内での神経細胞死を予測して抑制する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１実施例を示す神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システムの模式図である。
【図２】本発明の第２実施例を示す神経組織からの放出アミノ酸二次元検出システムの模式図である。
【図３】小脳培養組織から放出されたグルタミン酸を、本発明の第２実施例の方法により測定した結果を示す図である。
【符号の説明】
１    ガラス容器
２    開放系チャンバー
３    サンプル（個々のアミノ酸）
４    個々のアミノ酸３と特異的に反応してＮＡＤまたはＮＡＤＰの還元を行う酵素
５    ＵＶ光源
６    １次フィルター及びレンズ
７    励起ＵＶ光
８    反射ミラー
９    ２次フィルター
１０    冷却ＣＣＤカメラ（光検出器）
１１    マイクロピペット
１２    穴
２１    微小キュベット（酵素溜め）
２２    電磁弁
２３    反応チャンバー（閉鎖系チャンバー）
２４    半透膜
２５    光ファイバー（シリカガラス製：３４０ｎｍ励起光）
２６    ４００ｎｍバンドパスフィルタ
２７    薄膜画像素子（人工網膜ＬＳＩ）
２８    薄膜画像素子（人工網膜ＬＳＩ）の出力
【図１】
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【図２】
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【図３】
2004321016.tif 000005