(57)【要約】【課題】本発明は、大腸菌・赤痢菌検出用のプライマー対等、目的とする１または２以上の特定種類の微生物の検出が可能なプライマー対またはプライマー対を作成する方法を提供する。【解決手段】単一のかつ適当な種類数のＤＮＡ断片が増幅される増幅確率のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片のうち、特定の種類の微生物には共通して見られ、その他の種類の微生物では見られないＤＮＡ断片を選択する第一の工程と、前記第一の工程で選択した断片の一部または全部を配列決定する第二の工程と、前記第二の工程で決定された配列から新規なプライマー対を設計する第三の工程によって、種特異的プライマーまたはプライマー対を作成する。【選択図】      図１
2004283064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌・赤痢菌検出用のプライマー対であって、Ｂ６９プライマー（配列番号３８）により大腸菌・赤痢菌のＤＮＡより増幅されるべき配列番号４４のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対。
【請求項２】
大腸菌・赤痢菌検出用のプライマー対であって、配列番号１から６（プライマー５Ｆ、プライマー１６Ｆ、プライマー２０Ｆ、プライマー３０Ｆ、プライマー１６Ｒ、プライマー５Ｒ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対。
【請求項３】
ＥＨＥＣ検出用のプライマー対であって、Ｂ４７プライマー（配列番号３９）によりＥＨＥＣのＤＮＡより増幅されるべき配列番号４５のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対。
【請求項４】
ＥＨＥＣ検出用のプライマー対であって、配列番号７から１４（プライマー３６Ｒ、プライマー３７Ｒ、プライマー３８Ｒ、プライマー３９Ｒ、プライマー３７Ｆ、プライマー３６Ｆ、プライマー３８Ｆ、プライマー３９Ｆ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対。
【請求項５】
赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）のプライマー対であって、Ｇ２２プライマー（配列番号４０）により赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）のＤＮＡより増幅されるべき配列番号４６のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基（又はその相補配列）とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対。
【請求項６】
赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）検出用のプライマー対であって、配列番号１５から１９（プライマー４１Ｆ、プライマー４１Ｒ、プライマー４２Ｆ、プライマー４２Ｒ、プライマー４３Ｆ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対。
【請求項７】
赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）検出用のプライマー対であって、Ｂ７２プライマー（配列番号４１）により赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）のＤＮＡより増幅されるべき配列番号４７および配列番号４８のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対。
【請求項８】
赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）検出用のプライマー対であって、配列番号２０から２５（プライマー４７Ｆ、プライマー４７Ｒ、プライマー４８Ｆ、プライマー４８Ｒ、プライマー４９Ｆ、プライマー４９Ｒ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対。
【請求項９】
赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）検出用のプライマー対であって、Ｆ６９プライマー（配列番号４２）により赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）のＤＮＡより増幅されるべき配列番号４９および配列番号５０のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対。
【請求項１０】
赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）検出用のプライマー対であって、配列番号２６から３１（プライマー５２Ｆ、プライマー５２Ｒ、プライマー５３Ｆ、プライマー５３Ｒ、プライマー５４Ｆ、プライマー５４Ｒ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対。
【請求項１１】
赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）と大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６）検出用のプライマー対であって、Ｅ８３プライマー（配列番号４３）により、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６）のＤＮＡより増幅されるべき配列番号５１のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対。
【請求項１２】
赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）と大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６）検出用のプライマー対であって、配列番号３２から３７（プライマー４４Ｆ、プライマー４４Ｒ、プライマー４５Ｆ、プライマー４５Ｒ、プライマー４６Ｆ、プライマー４６Ｒ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対。
【請求項１３】
１または２以上の特定種類の微生物を検出するためのプラーマー対の作成方法であって、単一のかつ適当な種類数のＤＮＡ断片が増幅される増幅確率のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片のうち、特定の種類の微生物には共通して見られ、その他の種類の微生物では見られないＤＮＡ断片を選択する第一の工程と、前記第一の工程で選択した断片の一部または全部を配列決定する第二の工程と、前記第二の工程で決定された配列から新規なプライマー対を設計する第三の工程を含むことを特徴とする種特異的プライマーまたはプライマー対作成方法。
【請求項１４】
前記第二の工程の配列決定方法は、単一のかつ適当な種類数のＤＮＡ断片が増幅される増幅確率のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片のプライマーの結合サイトが一つになるよう加工する工程と、前記ＰＣＲ用プライマーとして用いた単一のプライマーをシーケンス反応のプライマーとしておこなうダイレクト・シーケンス法により配列を決定する工程を含むことを特徴とする請求項１３に記載の種特異的プライマーまたはプライマー対作成方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ断片のプライマーの結合サイトが一つになるよう加工する工程は、制限酵素での切断を含むことを特徴とする請求項１４に記載の種特異的プライマーまたはプライマー対作成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はプライマー対及び種特異的プライマーまたはプライマー対作成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然界には膨大な種類数の微生物が存在するが、ＤＮＡ解析が進んでいる種は一部分にすぎない。その一方で、食中毒や伝染病の調査や環境調査等のため、効率的に特定の微生物または微生物群を検出する技術及び、これを可能とするＤＮＡ増幅および解析技術に対する高いニーズがある。ＤＮＡを増幅する代表的な技術としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ；ポリメラーゼ連鎖反応）法を利用した技術と、組換えＤＮＡ技術を用いたＤＮＡクローニングとが上げられる。
【０００３】
ＰＣＲ法は、増幅しようとするＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）の両端の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用い、熱変性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返すことにより、鋳型ＤＮＡとほぼ同じＤＮＡ断片を増幅することを可能にするものである。このＰＣＲ法を用いると、微量にしか存在しないＤＮＡ断片を指数関数的に増幅することができる。
【０００４】
感染症診断等では、特定の微生物種に特異的なプライマーを作成しその病原体の検出系を作成することが行なわれる。しかしながら、このＰＣＲ法を用いるためには、プライマーとなるオリゴヌクレオチドが必要であるため、一部が既に配列決定されているＤＮＡの解析にしか使用できないという問題点がある。
【０００５】
さらに、同属または同種の微生物間であっても染色体の類似度が高い場合が多い等の理由から、目的とする種類の微生物または微生物群のみを任意にかつ簡便に検出することは従来困難であった。
【０００６】
また、ＰＣＲ法の応用技術として、任意の単一のプライマーを作用させ、ＤＮＡの１部のみ増幅させるＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）法又はＡＰ−ＰＣＲ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｐｒｉｍｅｄ−ＰＣＲ）法がある。
【０００７】
これらの方法では、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニーリング温度を下げ、さらに反応液中のマグネシウムイオン濃度を上げることにより、プライマーの結合時の配列特異性を下げる。すると、プライマーはミスマッチを伴って微生物の染色体ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ断片が複製される。単一のプライマーで塩基配列の情報なしに一種類のＤＮＡから同時に多数の種類のＤＮＡ断片を増幅することができる。本
方法の詳細な説明については、
【非特許文献１】等を参考にすることができる。
【０００８】
ＲＡＰＤ法又はＡＰ−ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により分離することによりＤＮＡフィンガープリントが得られる。このＤＮＡフィンガープリントを分析することによる解析が一般的に行われている。
【０００９】
また、配列決定の糸口となる情報が不足しているＤＮＡ断片を増幅・解析しようとする場合には、ＤＮＡクローニングが一つの有効な方法として考えられる。ＤＮＡクローニングによるＤＮＡの増幅では、ＰＣＲ法とは違い、ＤＮＡの配列の一部が解析されている必要はない。ＤＮＡクローニングは、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＤＮＡ断片をプラスミド等のクローニングベクターに組み込み組換えＤＮＡ分子を作成し、得られた組換えＤＮＡ分子を形質転換等の方法で大腸菌等の宿主細胞に導入し、クロラムフェニコール等の存在下でコピー数を増幅させたり、宿主細胞を増殖させたり等の手段で組換えＤＮＡ分子のコピー数を増大させ、レプリカ平板法等を用いてコロニーを選別し、さらに培養後、プラスミド等を抽出し、クローニングベクターのプライマーアニ−リングサイトを利用したサンガー法等を用いて、ＤＮＡ断片の配列を解析するというものである。しかし、クローニングには時間や手間が多くかかるという問題点がある。
【００１０】
また、組換えＤＮＡ実験では自然界に存在しなかった新しい遺伝子の組合せをもつ細胞が作られることとなり、その研究に当たっては、慎重に対応する必要がある。わが国では、「組換えＤＮＡ実験指針」が策定されており、組換えＤＮＡ研究を対象とした安全確保等のための指針が示されている。特に病原性を持つ微生物やウィルスの組換え体に関しては、「組換えＤＮＡ実験指針」に沿って、実験や製品化で取り扱う組換え体の種類に応じ、高度な物理的封じ込めが可能な実験施設を持つことや、実験の届け出が必要なことが規定されており、これらの手続きを踏むことなしにＤＮＡクローニングを行うことはできない。
【００１１】
しかし、ＲＡＰＤ法で得たＤＮＡ断片や、超音波や制限酵素でランダムに切断したＤＮＡ断片を増幅しようとした場合には、増幅されるＤＮＡ断片に病原性因子が含まれているかどうかをあらかじめ判断することはできない。
【００１２】
このため、個々に法律的な問題を考慮することなく簡便にＤＮＡ配列を解析するためには、ＤＮＡクローニングの段階を介在しないことが好ましい。
【００１３】
また、配列決定の方法としては、Ｍ１３ベクターをもちいたクローニングのような一本鎖のＤＮＡを得ることが容易な場合を除き、取り扱いが容易な２本鎖のままＤＮＡ配列を解析できるダイレクト・シーケンス法が簡便であると考えられる。ダイレクト・シーケンス法は、ＰＣＲ増幅を応用してシーケンス反応の鋳型を調製するものである。
【００１４】
ＤＮＡ断片が両端に異なったプライマーをもっている場合には、通常の配列決定方法で配列をすることが可能である。しかし、図２下段の左に示すように、ＲＡＰＤ法で得られたＤＮＡ断片は両端に同じプライマー結合部位を持っているため、ＲＡＰＤ法で用いたプライマーと同じ配列のシーケンス用プライマーによって、ダイレクト・シーケンス法で配列を解析しようとした場合には、２本鎖の双方向から相補鎖が合成されていくこととなり、解析が困難である。
【００１５】
この課題を解決するため、ＲＡＰＤ法で用いたプライマーにＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかを付加した４種類のプライマーでシーケンスが可能かどうかを順次試し、全てのプライマーでシーケンス不可能な場合には、４種類のプライマーそれぞれにさらにＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかを付加した１６種類のプライマーで順次試す、という具合に２本鎖の双方向から相補鎖が合成されない配列になるまでプライマーにヌクレオチドを付加していく方法が考案されている。本方法の詳細については
【非特許文献２】に記載されている。しかし、当該方法では、鋳型ＤＮＡの配列によっては膨大な数のプライマーを試さなければならないことになり、シーケンス反応に使用するプライマーの選択にかかる労力が大きいという問題がある。また、しばしばＲＡＰＤ法で得られたバンドは異なる配列で同じ長さのＤＮＡ断片を含んでいるため、上記の方法では配列を決定することが困難となる場合がある。
【００１６】
一方、出願人は、
【特許文献１】において、ＲＡＰＤ法を改良した発明を出願している。
【特許文献１】は、要約すれば、増幅確率を低く調整したプライマーを単一のプライマーとして用いることにより、解析可能な種類のＤＮＡ断片を増幅させ、電気泳動を行った後、電気泳動像を解析することにより微生物を識別する方法である。図４は、増幅確立とフィンガープリントとして現れるバンドの数との関係を示している。また
【特許文献１】には、当該方法で得られたバンドの発光強度及び位置等のパターンは識別対象の微生物の種類ごとに特有であることが示唆されている。バンドまたはバンドパターンが生物の種類に特有であることは、即、ＤＮＡ配列自体が生物の種類に特有である事を意味するものではないが、他の生物種では見られない断片に、特定の生物種を識別するのに有用な塩基配列が含まれている可能性がある。しかし、このような断片も、両端に同じプライマー結合部位を持っているため、簡便なダイレクト・シーケンスを行う事は困難であった。同様の理由で、ＤＮＡフィンガープリント中の特定のバンドのみを、ミスマッチなく試料中等から直接増幅させたい場合にも、ＰＣＲ法のプライマーを設定するための配列情報を得る事が困難であるという問題があった。
【００１７】
尚、シーケンス反応には、ＰＣＲ増幅を使用する方法のほか、一本鎖に調製した上でのジデオキシ法等の温度変化を繰り返す工程を含まない方法も含まれる。
【００１８】
【特許文献１】
特願平１１−６９６９４
【００１９】
【非特許文献１】
ＤＮＡ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １，１３９−１４８（１９９４）  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＡＰＤ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  Ｒｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｇｅｄ  Ｓｉｔｅｓ（ＳＴＳｓ）  ａｎｄ  ＡＴＡ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒｓ
【００２０】
【非特許文献２】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｃｈ，１９９９，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１９  Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＲＡＰＤ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ３’−ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、大腸菌・赤痢菌検出用のプライマー対、ＥＨＥＣ検出用のプライマー対、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）検出用のプライマー対、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）検出用のプライマー対、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）検出用のプライマー対、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）と大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６）検出用のプライマー対を提供する。
【００２２】
また、目的とする１または２以上の特定種類の微生物の検出が可能なプライマー対を作成する方法を提供する。
【００２３】
増幅された解析可能な種類数のＤＮＡ断片の発光強度及び位置等のパターンの解析を基に、生物種ごとに特有である断片および他の生物種では見られない断片を作成・選別し、当該断片の配列を解析し、当該断片の配列情報からプライマー対を再設計することにより、特定の生物種を簡便に検出できるプライマーまたはプライマー対を作成可能にする方法を提供する。
【００２４】
また、検出を行ないたい生物種の塩基配列の解析が進んでいない、病原性因子を含んでいる可能性がある等ＤＮＡクローニングに適さない、などの事情がある場合でもこれらの事情を障害とすることなく、簡便に特定の生物種を検出できるプライマーまたはプライマー対を作成可能にする方法を提供する。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
請求項１は、大腸菌・赤痢菌検出用のプライマー対であって、Ｂ６９プライマー（配列番号３８）により大腸菌・赤痢菌のＤＮＡより増幅されるべき配列番号４４のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対である。
【００２６】
請求項２は、大腸菌・赤痢菌検出用のプライマー対であって、配列番号１から６（プライマー５Ｆ、プライマー１６Ｆ、プライマー２０Ｆ、プライマー３０Ｆ、プライマー１６Ｒ、プライマー５Ｒ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対である。
【００２７】
請求項３は、ＥＨＥＣ検出用のプライマー対であって、Ｂ４７プライマー（配列番号３９）によりＥＨＥＣのＤＮＡより増幅されるべき配列番号４５のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対である。
【００２８】
請求項４は、ＥＨＥＣ検出用のプライマー対であって、配列番号７から１４（プライマー３６Ｒ、プライマー３７Ｒ、プライマー３８Ｒ、プライマー３９Ｒ、プライマー３７Ｆ、プライマー３６Ｆ、プライマー３８Ｆ、プライマー３９Ｆ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対である。
【００２９】
請求項５は、赤痢菌赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）のプライマー対であって、Ｇ２２プライマー（配列番号４０）により赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）のＤＮＡより増幅されるべき配列番号４６のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基（又はその相補配列）とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対である。
【００３０】
請求項６は、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）検出用のプライマー対であって、配列番号１５から１９（プライマー４１Ｆ、プライマー４１Ｒ、プライマー４２Ｆ、プライマー４２Ｒ、プライマー４３Ｆ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対である。
【００３１】
請求項７は、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）検出用のプライマー対であって、Ｂ７２プライマー（配列番号４１）により赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）のＤＮＡより増幅されるべき配列番号４７および配列番号４８のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対である。
【００３２】
請求項８は、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）検出用のプライマー対であって、配列番号２０から２５（プライマー４７Ｆ、プライマー４７Ｒ、プライマー４８Ｆ、プライマー４８Ｒ、プライマー４９Ｆ、プライマー４９Ｒ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対である。
【００３３】
請求項９は、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）検出用のプライマー対であって、Ｆ６９プライマー（配列番号４２）により赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）のＤＮＡより増幅されるべき配列番号４９および配列番号５０のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対である。
【００３４】
請求項１０は、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）検出用のプライマー対であって、配列番号２６から３１（プライマー５２Ｆ、プライマー５２Ｒ、プライマー５３Ｆ、プライマー５３Ｒ、プライマー５４Ｆ、プライマー５４Ｒ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対である。
【００３５】
請求項１１は、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）と大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６）検出用のプライマー対であって、Ｅ８３プライマー（配列番号４３）により、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６）のＤＮＡより増幅されるべき配列番号５１のヌクレオチドから選択された約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする第一のプライマーと、前記実質的に連続した塩基と一定塩基数以上の間隔を置いて相補鎖上にある約６〜５０個の実質的に連続した塩基又はその相補配列とＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズし、前記第一のプライマーとＴｍ値が近縁な第二のプライマーからなるプライマー対である。
【００３６】
請求項１２は、赤痢菌（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）と大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６）検出用のプライマー対であって、配列番号３２から３７（プライマー４４Ｆ、プライマー４４Ｒ、プライマー４５Ｆ、プライマー４５Ｒ、プライマー４６Ｆ、プライマー４６Ｒ）から選ばれる２つの塩基配列または塩基配列に相補的な配列を有するプライマー対である。
【００３７】
請求項１３は、１または２以上の特定種類の微生物を検出するためのプラーマー対の作成方法であって、単一のかつ適当な種類数のＤＮＡ断片が増幅される増幅確率のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片のうち、特定の種類の微生物には共通して見られ、その他の種類の微生物では見られないＤＮＡ断片を選択する第一の工程と、前記第一の工程で選択した断片の一部または全部を配列決定する第二の工程と、前記第二の工程で決定された配列から新規なプライマー対を設計する第三の工程を含むことを特徴とする種特異的プライマーまたはプライマー対作成方法である。
【００３８】
請求項１４は、前記第二の工程の配列決定方法は、単一のかつ適当な種類数のＤＮＡ断片が増幅される増幅確率のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片のプライマーの結合サイトが一つになるよう加工する工程と、前記ＰＣＲ用プライマーとして用いた単一のプライマーをシーケンス反応のプライマーとしておこなうダイレクト・シーケンス法により配列を決定する工程を含むことを特徴とする請求項１３に記載の種特異的プライマーまたはプライマー対作成方法である。
請求項１５は、前記ＤＮＡ断片のプライマーの結合サイトが一つになるよう加工する工程は、制限酵素での切断を含むことを特徴とする請求項１４に記載のプライマーまたはプライマー対作成方法である。
【００３９】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態につき、実証を通じて説明する。
以下、ＲＡＰＤ法により増幅されたＤＮＡ断片をＲＡＰＤ断片と呼ぶ。ＲＡＰＤ断片作成のための任意のプライマーとして、表１に示すプライマーを用いた。
【００４０】
【表１】
2004283064.tif 000003
特願２００１−３８６７３０号に記載されているように、これらの増幅確率の低いプライマーを用いることにより、出現するバンドの数を減らし、目的とする細菌に特徴的なＲＡＰＤ断片を簡便に見つけることができる（図３１参照）。当該増幅確立の低いプライマーを用いたＲＡＰＤ法を以下ＳＳＣ−ＰＣＲと呼ぶ。
上記増幅確率の低い任意のプライマーおよびＲＡＰＤ断片の配列から作成したプライマーは、表２に示す大腸菌・赤痢菌４８株のテンプレート、または、表３に示す９６種細菌のテンプレート（表２と共通の大腸菌１株と赤痢菌１株を含む）に対して作用させることにより検証した。
【００４１】
【表２】
2004283064.tif 000004
【００４２】
【表３】
2004283064.tif 000005
尚、ＳＳＣ−ＰＣＲのプライマーであれ、特異的なプライマーであれ、プライマーとして機能するためには、プライマーがＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズする必要がある。本実施例では、アニ−リング温度として４５℃または５５℃を用いているため、当該温度でもアニ−リングできる程度の相同性があれば、ミスマッチや欠失があってもプライマーの機能を発揮できる可能性がある。また、作成したプライマーと細菌ＤＮＡとの相同性がより低く、４５℃または５５℃でハイブリダイズしない場合でも、ＰＣＲ法の温度条件等を工夫することによって、ＤＮＡの複製が可能となる状態でハイブリタイズさせることが可能になる場合もある。
【００４３】
これまでの実験から、出願人は、プライマーとして機能するためには、３’側末端の６塩基にはミスマッチがない状態でかつプライマーを通じてのミスマッチが３塩基以内の状態でハイブリタイズすることがより好ましいと想定しているが、ＤＮＡの複製が可能となる状態の意義は、上記条件または本実施例の条件に制限されるものではない。
【００４４】
また、プライマーは単一のものであれ、ｆｏｒｗａｒｄ側とｒｅｖｅｒｓｅ側で異なるものであれ、対として２本鎖の双方にアニ−ルして増幅を行なうと考えられる。このため、一方のプライマーの結合領域と、相補鎖上にあるもう一方のプライマー結合領域が重なっていないこと、即ち、結合領域間に、一定塩基数以上の間隔が必要と考えられる。これまでの実験から、出願人は、当該間隔は１００ｂｐ以上であることが好ましいと想定して、本実施例のプライマーの選択や作成を行なっているが、５０ｂｐ程度のＰＣＲ産物（仮に２０塩基づつのプライマー対で増幅を行なったとすれば、間隔は１０ｂｐ程度となる）が増幅された例もあり、一定塩基数以上の間隔の意義は、上記条件または本実施例の条件に制限されるものではない。
【００４５】
〔実施例１〕
本実施例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３０１）のゲノムから表１中のＢ６９プライマー（配列番号３８）を任意のプライマーとして得られたＲＡＰＤ断片の塩基配列決定と、当該配列から設定したプライマーについて示す。尚、大腸菌ＩＦＯ  ３３０１は、全ゲノム塩基配列が報告されている大腸菌Ｋ１２株と由来が同じであるため、塩基配列データベースの検索で正しく配列決定できたか否かを確認できる（Ｂｌａｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１４５３−１４７４，  １９９７）ことから、実証のモデルとした。
【００４６】
特願２００１−３８６７３０号に記載されているように、１２塩基からなる単一のプライマー  Ｂ６９（配列番号３８）（塩基配列：５’−ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＡＧＴ  ＴＧＣ−３’）を表２のテンプレートに用いると、大腸菌・赤痢菌の内、一株（図１Ａ、および、表２の１９番、大腸菌ＧＩＦＵ１３２５１）を除いて、種々の株で共通したサイズ（約１，８００ｂｐ）のＲＡＰＤ断片が増幅される（図１Ａの矢印参照）。一方、図１Ｂに示されるように、表３の他の細菌では同じサイズのＲＡＰＤ断片は見られない（図１Ｂの３０と７６は、大腸菌と赤痢菌である）。本実施例ではこの約１，８００ｂｐのＲＡＰＤ断片を対象として、配列決定とプライマーの作成を行なう。まず、本ＲＡＰＤ断片を得るまでの過程を以下に示す。
〔ＤＮＡ抽出〕
大腸菌ＩＦＯ  ３３０１をＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ：商標）、または、普通寒天培地（栄研：商標）に塗抹接種後、３７℃恒温下で１２−２４時間培養した。寒天培地上に生育したコロニーを観察して単一細菌であることを確認後、白金耳を用いて１．５  ｍｌ容量のチューブに採取した。菌体に１  ｍｌのＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（１．５  Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．１  Ｍ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ，  ｐＨ  ８．０）を加え、ボルテックス・ミキサーで懸濁し、洗浄した。次いで小型遠心器にて１５，０００回転で約３０秒間遠心し、沈殿菌体に０．４  ｍｌのＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液と０．０４  ｍｌの２０％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液とを加え、ボルテックス・ミキサーで懸濁後、６０℃で１０分以上放置して溶菌させた。濁り具合で溶菌を確認し、０．４  ｍｌのフェノール混合液（ｐｈｅｎｏｌ：ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｉｓｏａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ＝２５：２４：１の混合液）を加え、水層とフェノール層とが混ざって白濁するまで攪拌した。直ちに１５，０００回転で１０−３０分間遠心し、もう一度水層とフェノール層とを分離させた。ここで、水層にＤＮＡを含む水溶性成分が、フェノール層と水層の界面にタンパク質成分及び菌体残渣などが、そして脂溶性成分がフェノール層に分画される。水層のみを注意深く、別のチューブに移し取り、等量のエタノール（９９．５％）を加え、ゆっくりと転倒混和し、ＤＮＡを塩として沈殿させた。次いで１５，０００回転で１０−３０分間遠心し、沈渣に０．４  ｍｌの洗浄用バッファー（０．２５  Ｍ  ＮａＣｌ，  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．０）を加えて約３０秒間ミキサーで攪拌し、沈渣を洗浄した。洗浄用バッファーに溶解したＤＮＡを回収するため、もう一度、等量のエタノールを加え、転倒混和し、１５，０００回転で約１０分間遠心した。沈渣に７０％  エタノールを加えて軽く転倒して洗浄した後、１５，０００回転で約５−１０分間遠心し、上清を捨て沈渣を乾燥させた。乾燥後、０．０５−０．４  ｍｌのＴＥ  バッファー（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ  ８．０）を加え、沈渣を溶解させ、ＤＮＡ抽出液とした。
〔テンプレート溶液の調整〕
実験条件を統一するため、ＤＮＡ抽出液の濃度を測定し、その結果から希釈率を決定し、ＴＥ  バッファーまたは純水で希釈してテンプレート溶液を調整した。
【００４７】
ＤＮＡの濃度測定は、電気泳動法、または、吸光度測定法のいずれかを用いた。
【００４８】
電気泳動法では、アガロースゲルを用いた。０．５×ＴＢＥ  バッファー（４５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ８．０）に１％  アガロースを加熱溶解し、コームをセットしたゲル作成用プレートに注ぎ、室温で冷却してゲルを作成した。ＤＮＡ抽出液は、あらかじめＴＥ  バッファーで１０−１００倍に希釈し、それぞれ１０  μｌに１−２  μｌのＢＰＢ溶液（０．１  ％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，  ３０  ％  ｇｌｙｃｅｒｏｌをＴＥ  バッファーに溶解）を入れ、サンプル溶液とした。また、あらかじめ濃度調整されているＤＮＡ溶液（λＤＮＡ，ニッポン・ジーン：商標）にＢＰＢ溶液と０．５×ＴＢＥ  バッファーを加えて、ＤＮＡ濃度が３０  μｇ／ｍｌ、１０  μｇ／ｍｌ、３  μｇ／ｍｌ、１  μｇ／ｍｌ、０．３  μｇ／ｍｌとなる５段階の校正用ＤＮＡ溶液を作成した。電気泳動槽にゲルをセットし、サンプル溶液は全量を、校正溶液は１０  μｌをそれぞれ独立のレーンに入れた。８．３  Ｖ／ｃｍで約３０分間の電気泳動後、泳動槽からゲルを取り出し、１  μｇ／ｍｌのＥｔｈｙｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ溶液（１０  ｍｇ／ｍｌ  Ｅｔｈｙｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅを０．５×ＴＢＥで１／１００００希釈した溶液）に３０分間浸漬した。Ｅｔｈｙｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ溶液からゲルを取り出し、トランス・イルミネーターにセットし、３０２  ｎｍの励起光を照射しながらフィルター（ＹＡ３及びＬ４１，  ケンコー：商標）を通して蛍光を写真撮影した。画像をコンピュータに取り込み、画像処理ソフト（ＧｅｌＰｒｉｎｔ  ＡＱ、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．：商標）を用いて、電気泳動で形成されたＤＮＡのバンドの蛍光強度を計測した。校正用ＤＮＡの蛍光強度を基に抽出液のＤＮＡ濃度を計算した。
【００４９】
一方、ＤＮＡは２６０  ｎｍの波長に吸収ピークを持ち、二本鎖ＤＮＡ濃度が５０  μｇ／ｍｌのとき２６０  ｎｍの吸光度（ＯＤ２６０）が１．０になることが知られている。しかし、通常、ＤＮＡ抽出液には、ＲＮＡ、タンパク質などのＤＮＡ以外の不純物が含まれる。これらは吸収ピークがＤＮＡの吸収ピークに近いので（例えばＲＮＡはＤＮＡとほぼ同じ、タンパク質は２８０  ｎｍ）、不純物もいっしょに測定される。タンパク質混入が少ないＤＮＡでは、２６０  ｎｍと２８０  ｎｍの吸光度の比、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０が１．８以上になることが知られており、この比率からＤＮＡ精製度を推定できる。そこで、吸光度でＤＮＡ濃度を測定する場合は、測定前にＲＮＡ分解酵素処理とタンパク質分解酵素処理を行った。ＤＮＡ抽出液に５  Ｍ  ＮａＣｌと１０  ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ溶液とを１／２０量ずつ加え、３７  ℃で１時間処理後、２０  ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液と２０  ％  ＳＤＳ溶液とを１／２０量ずつ加え、６０  ℃で３０分間処理した。処理液にフェノール混合液を等量加え、白濁するまで攪拌した後、１５，０００回転で１５−３０分間遠心した。水層を別のチューブに移し取り、等量のエタノールを加えて転倒混和して１５，０００回転で１０−３０分間遠心後、沈渣を７０  ％エタノールで洗浄した。１５，０００回転で５−１０分間遠心し、上清を捨て、沈渣を乾燥させた後、ＴＥ  バッファーに溶解した。このＤＮＡ溶液を純水で１０−１００倍に希釈し、ＯＤ２６０およびＯＤ２８０を分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３０００ｐｒｏ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：商標）で測定し、精製度を確認するとともにＤＮＡ濃度を計算した。
【００５０】
〔ＳＳＣ−ＰＣＲ〕
ＳＳＣ−ＰＣＲは、抽出したＤＮＡから作成したテンプレート溶液と、表１中の１２塩基からなる単一のプライマー  Ｂ６９（配列番号２）（５’−ＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣ−３’，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｌｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ：商標）を用いて行った。試薬にはＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（宝酒造：商標）を、サーマル・サイクラーにはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：商標）を用いた。反応液の混合量、及び、サーマル・サイクラー設定条件とを表４に示す。
【００５１】
【表４】
2004283064.tif 000006
上記条件で反応後、反応液に等量の１０×  Ｌｏａｄｉｎｇ  バッファー（１  ％  ＳＤＳ，  ５０  ％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ０．０５  ％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，  宝酒造：商標）を１／１０容量加えて混合後、４０  μｌずつを１  ％  アガロース  ゲルの各レーンに入れた。また、対象となる断片のサイズを測定するため、５倍希釈したサイズ・マーカー（Ｓｍａｒｔ  Ｌａｄｄｅｒ，  ニッポン・ジーン：商標）１０μｌをゲルの両端のレーンに入れた。電気泳動を８．３  Ｖ／ｃｍで３０分間行った後、ゲルをＥｔｈｙｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ溶液に３０分間浸し、トランス・イルミネーターで励起光を照射しながら、フィルターを通して蛍光を写真撮影した。
【００５２】
図１は、電気泳動後のパターンである。両端のレーンは、サイズ・マーカーで、それぞれのバンドのサイズを数字で示した。矢印が本実施例で対象とした約１，８００ｂｐ  のＲＡＰＤ断片である。尚２重矢印は細菌１９でバンドが現れた位置を示す。
〔配列決定〕
次に、当該ＲＡＰＤ断片の配列を決定する。
【００５３】
ＲＡＰＤ法で使用したＢ６９プライマーの結合部分は、増幅されたＲＡＰＤ断片にも含まれており、シーケンス反応のためのプライマーとしてもアニ−リングすることができる。但し、ＲＡＰＤ法では、一つのＤＮＡ断片に対し単一のプライマーを使用して増幅を行うため、増幅されたＤＮＡ断片は各々の鎖の５’末端側に同一のプライマーをもつことになる。このため、ＲＡＰＤ法で増幅したＤＮＡ断片にたいし、ＲＡＰＤ法で使用したプライマーを用いてシーケンス反応を行わせた場合には、２本鎖のそれぞれの５’末端から、ジデオキシＡＴＰで終止した新たなＤＮＡ鎖が合成されてゆくこととなり、このままでは、配列を決定することが困難である（図３３参照）。
【００５４】
かかる不都合は、ＲＡＰＤ断片を、選択したプライマーの結合サイトが一つになるよう加工することにより解決される（図３２参照）。本実施例では、加工の手段として、制限酵素による切断を用いた。尚、プライマーの結合サイトが一つになるよう加工する方法は、制限酵素による切断以外の方法を使用することも可能である。例えば選択したプライマーの結合サイトが一つになるよう加工する手段として、制限酵素ではなく、ＤＮＡを一本鎖にする方法がある。ＤＮＡ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １，  ２７１−２７７（１９９４）  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｔａｇｇｅｄ  Ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  Ｒｉｃｅ  ｂｙ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍに示すように、２本鎖のＤＮＡ断片は、尿素等を用いて溶液をアルカリにし、温度を調節して電気泳動を行うことにより、ゲル上で一本鎖に分離することができる。一本鎖に分離したＤＮＡをゲルから切り出し、ＲＡＰＤ法で用いたプライマーをシーケンス反応用のプライマーとして使用して配列決定を行う等の方法を用いた場合でも、プライマーの結合部位は一つとなり、配列決定を行うことができる。
〔制限酵素のスクリーニング〕
対象のＤＮＡ断片を分割し、配列決定に用いるため、ＤＮＡ断片を２分割する制限酵素をスクリーニングした。
【００５５】
まず、ゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン：商標）を用いて、メーカー推奨の方法でＤＮＡ抽出を行った。以下に方法を簡単に記す。トランス・イルミネーター上でバンドを確認しながら、手術用メスを用いてバンドを含むゲルの小片を切り出した。１レーン分の小片をそれぞれ１．５  ｍｌチューブに入れ、バッファー  ＱＧを６００  μｌ加えた。チューブを５０  ℃で保温し、アガロースを溶解させた。溶解確認後、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ２００  μｌを加えて混合し、溶液約７５０  μｌをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎチューブに移し取り、１分間遠心分離した。これによりｃｏｌｕｍｎにＤＮＡが吸着し、アガロースを除去できる。以上の操作を繰り返し、１０レーン分のＤＮＡを一つのｃｏｌｕｍｎに吸着させた。新鮮なバッファー  ＱＧを加えて１分間遠心して洗浄した後、空のまま遠心を１分間行い、水分を飛ばした。新しいチューブに上記ｃｏｌｕｍｎを移し、５０  μｌの純水を加えて１分以上放置し、ｃｏｌｕｍｎに吸着したＤＮＡを再溶解させた後、遠心して精製ＤＮＡ溶液を得た。
【００５６】
次いで、制限酵素のスクリーニングを行った。反応条件を以下に示す。表５はスクリーニングに用いた制限酵素（宝酒造：商標）と反応用バッファー（宝酒造：商標）について示す。尚、バッファー部分の「Ｍ」「Ｌ」「Ｈ」はメーカー指定のバッファーのタイプを示す。認識部位の「ｍ」はａ  またはｃを、「ｋ」はｇ  またはｔを示す。
【００５７】
【表５】スクリーニングに用いた制限酵素と反応溶液
2004283064.tif 000007
表５、の反応液を３７℃に保温し、３時間酵素処理を行った。反応液に１／１０量の１０×Ｌｏａｄｉｎｇ  バッファーを加えた後、１０  μｌを１  ％のアガロースゲルに入れた。また、１０  μｌのサイズ・マーカー（Ｓｍａｒｔ  Ｌａｄｄｅｒ，  ニッポン・ジーン：商標）を両端のレーンに入れて電気泳動（８．３Ｖ／ｃｍ，  ３０分間）を行った。電気泳動後、Ｅｔｈｙｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ溶液に浸し、トランス・イルミネーターを用いて写真撮影を行った。
【００５８】
図３４に制限酵素で処理の結果の一部を示す。図３４Ａに示すように、制限酵素の種類によって、ＲＡＰＤ断片が切断されたり（Ａｌｕ  Ｉ，  Ｂｇｌ  ＩＩ，  ＥｃｏＲ  Ｉ，  ＨａｅＩＩＩ，  Ｐｖｕ  ＩＩ）、されなかったり（Ａｃｃ  Ｉ，  Ｓａｌ  Ｉ）すること、そして切断された場合も制限酵素によって断片の長さや、本数が異なることが分かる。Ｂｇｌ  ＩＩおよびＥｃｏＲ  Ｉでは、対象のバンドより短い２本のバンドが見られる。それぞれで、二本のバンドのサイズを合計するとどちらもほぼ１，８００  ｂｐになることから、この２つの制限酵素は対象の断片を２分割すると推定できる。しかし、Ｂｇｌ  ＩＩ、ＥｃｏＲ  Ｉでは、どちらも１８００ｂｐにバンドが残っているのに対して、ＡｌｕＩ、ｈａｅ  ＩＩＩ、Ｐｖｕ  ＩＩではバンドが消えている。さらにＰｖｕ  ＩＩでは４本のバンドが見られ、一番大きいバンドと一番小さいバンドの組、２番目と３番目のバンドの組で、それぞれサイズの合計が約１，８００ｂｐになっている。これらの結果から、対象としたバンドには、２種類の異なる塩基配列を持つＤＮＡ断片が含まれており、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲ  Ｉは、このうちのいずれか１本の断片のみを２分し、Ｐｖｕ  ＩＩは両方の断片をそれぞれ２分すると推定できる。即ち、塩基配列をしようとするバンドに複数のＤＮＡ断片が含まれている場合に制限酵素で分解することでそれぞれを分離することが可能といえる。ＲＡＰＤ法では一般的に多数のＤＮＡ断片が生成されてしまうので、制限酵素のスクリーニングの段階でこれらを分離できる本方法は、最初のプライマーに塩基を追加して塩基配列を行う方法に比べて有利な点と言える。
【００５９】
本実施例では、制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩで２つに切断されたＤＮＡ断片を対象として、それぞれの切断された断片の塩基配列の決定を行うことにした。以下に塩基配列の決定について記す。
〔ｒａｎｄｏｍ  プライマーを用いた塩基配列決定〕
塩基配列決定用のサーマル・サイクリングを行うためのテンプレートは、制限酵素のスクリーニング時のゲルから切断された断片を抽出して用いることができる。しかし、本実施例ではスクリーニング時には少量の断片しか用いていなかった。そこで、十分なテンプレート量を確保するため、本実施例ではあらためてＲＡＰＤ断片に制限酵素処理を行い、塩基配列決定用のテンプレートを作成した（図３４Ｂ参照）。以下に示す割合で制限酵素ＢｇｌＩＩを用いた反応液を調整し、３７℃で一晩、処理反応を行った。
【００６０】
【表６】
2004283064.tif 000008
制限酵素処理後、電気泳動を行い制限酵素で切断された２本のＤＮＡ断片（以下、長いものをＬ−ｆｒａｇｍｅｎｔ、短いものをＳ−ｆｒａｇｍｅｎｔと呼ぶ。  図３３にＬ、Ｓと表示。）をそれぞれ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン：商標）を用いてゲルから抽出した。
【００６１】
抽出したＤＮＡ断片のそれぞれについて、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：商標）を用いて以下の条件で塩基配列決定用のサーマル・サイクリングを行った。
【００６２】
【表７】
2004283064.tif 000009
サーマル・サイクリング後、塩基配列決定用の電気泳動を行うため、以下の精製処理を行った。反応液２０μｌに３Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ溶液（ｐＨ５．０）２μｌとエタノール  ５０μｌとを加え、−８０℃で３０分間静置した後、４℃、１５，０００回転で３０分間遠心して上清を除去した。３００μｌの７０％  エタノールを加え、沈殿を洗浄した。１０分間風乾後、１５μｌのＴｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：商標）を加え、沈殿を溶解し、９５℃で２分間熱変性した後、氷上に２分間静置して電気泳動用サンプル溶液とした。電気泳動と塩基配列の決定は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：商標）により、ＰＯＰ−６  ｐｏｌｙｍｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：商標）を用いてメーカー推奨の方法で行った。
【００６３】
Ｌ−ｆｒａｇｍｅｎｔからエレクトロフェログラムの波形データを得、塩基配列を決定した。波形データは、Ａで終了している１本鎖ＤＮＡ、Ｇで終了している１本鎖ＤＮＡ、Ｃで終了している１本鎖ＤＮＡ、Ｔで終了している１本鎖ＤＮＡのシグナルを異なる波長で測定するものである。それぞれの波形のピークの順番からＤＮＡ塩基配列を決定できる。本実施例で用いた装置は、全長で約６００ｂｐまでのＤＮＡ断片の塩基配列を決定できる仕様である。但し、最初の約２５塩基までと約４７５塩基以降はシグナルがばらついているため、正確な塩基配列特定はできなかった。以下には、問題なく塩基配列決定できた４４７ｂｐ（配列番号４４の一部）を示した。
【００６４】
2004283064.tif 000010
次に、Ｓ−ｆｒａｇｍｅｎｔからエレクトロフェログラムの波形データを得、塩基配列を決定した。この場合は、約２０塩基から約５３５塩基までの５１６塩基を正確に読めたと判断した。Ｌ−およびＳ−ｆｒａｇｍｅｎｔのプライマー結合部位は、お互いに相補鎖上に存在し、どちらも５’側から３’側に向かって塩基配列決定されていくので、Ｓ−ｆｒａｇｍｅｎｔから得られた塩基配列は、Ｌ−ｆｒａｇｍｅｎｔから決定された塩基配列に対して、相補的で、かつ、方向が逆向きになる。以下に決定された配列（塩基配列２−１）、および、この配列をＬ−ｆｒａｇｍｅｎｔと同じＤＮＡ鎖上に直した配列（相補的にして、逆向きにした配列）を示す（配列番号４４の一部）。
【００６５】
2004283064.tif 000011
上記した塩基配列でアンダーラインを引いた部分の塩基は正しく読めていなかったり、誤って読まれたものである。これらは、ＰＣＲの反応である確率で必ず起こるミスであったり、あるいは反応生成物の量がばらつき電気泳動時のシグナルが弱かったりして起こる。こうした問題は、エレクトロフェログラムをチェックすること、塩基配列決定実験を繰り返し行い、再現性を確認すること、データベースなどでチェックすることなどで修正できる。上記の塩基配列は、一度の試行の結果を示したものであるが、エレクトロフェログラムのチェック、及び、複数回の塩基配列決定実験の結果から、誤りであることを確認したものである。  尚、当該修正では全配列を決定することが出来ない場合でも、後述の〔実施例７〕にの方法によれば全配列を決定することが可能である。
【００６６】
これらの修正により、配列番号４４に示す配列を決定した。この配列に基いて、以下のプライマーを設定した（図２参照）。尚、プライマー名につく「Ｆ」はｆｏｒｗａｒｄ側として設計・合成されたことを示し、「Ｒ」はｒｅｖｅｒｓｅ側のプライマーとして設計・合成されたことを示す。
2004283064.tif 000012
これらのプライマーは、対となるプライマーのＴｍ値が近い、プライマー自体でパリンドロームが形成されにくい、対となるプライマーの相補性が低い、対となるプライマーが結合する位置同士が近すぎない、等の条件を考慮し選択した。これらの条件を満たせば、他の部分でもプライマーまたはプライマーの結合部分とすることができる。
図３は５Ｆ−５Ｒのプライマー対を用いて、表２、表３の細菌をテンプレートにしてＰＣＲを行なった結果である。本実施例では、ＲＡＰＤ断片の配列の中で新たにプライマー  ５Ｆ（配列番号１）（５’−ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＴＣ−３’）と５Ｒ（配列番号２）（５’−ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＣＡ−３’）とをｆｏｒｗａｒｄ側、およびｒｅｖｅｒｓｅ側のプライマーとして設計・合成し、表８の条件でのＰＣＲ増幅と電気泳動を行い、増幅されるかどうかを確認した。
【００６７】
【表８】
2004283064.tif 000013
実際にＰＣＲ増幅を行った産物を電気泳動すると、図３Ａ矢印に示されるように、大腸菌・赤痢菌のテンプレートでは、約１，７００ｂｐの位置（矢印部）にバンドが見られた。一方、表３の細菌を用いたテンプレートＢの結果から分かるように、同じサイズのバンドは、大腸菌・赤痢菌以外では見られない。尚、塩基配列データからは、プライマー  ５Ｆ（配列番号１）と５Ｒ（配列番号２）で増幅される断片の長さは１，６８９ｂｐと計算できる。但し、大腸菌ＧＩＦＵ１３２５１（図３Ａの１９番）では、ＳＳＣ−ＰＣＲの結果（図１Ａ）と同様に異なるサイズのバンド（図３Ａの２重矢印、約２９００ｂｐ）が得られた。
同様の方法で、１６Ｆ−５Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図４に示す。矢印部のサイズは約１３００ｂｐ、２重矢印部のサイズは２５００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは１３４０ｂｐである。この場合も、大腸菌ＧＩＦＵ１３２５１（図４Ａの１９番）のみ、異なるサイズのバンドが見られた。
同様の方法で、１６Ｆ−１６Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図５に示す。矢印部のサイズは約９００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは８９３ｂｐである。この場合には、リバース側のプライマーに５Ｒを用いた前２つの結果と異なり、大腸菌ＧＩＦＵ１３２５１（図５Ａの１９番）でも、他の大腸菌と同じサイズのバンドが見られた。このことは、大腸菌ＧＩＦＵ１３２５１では、５Ｒのプライマーサイトと１６Ｒのプライマーサイトの間に約１２００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されている可能性を示している。
同様の方法で、２０Ｆ−１６Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図６に示す。矢印部のサイズは約５００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは５０８ｂｐである。
同様の方法で、５Ｆ−１６Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図７に示す。矢印部のサイズは約１２００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは１２３６ｂｐである。テンプレートには表３の９６種を用いた。
同様の方法で、２０Ｆ−５Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図８に示す。矢印部のサイズは約１０００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは９６１ｂｐである。テンプレートには表３の９６種を用いた。
同様の方法で、３０Ｆ−５Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図９に示す。矢印部のサイズは約７００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは６６５ｂｐである。テンプレートには表３の９６種を用いた。
同様の方法で、３０Ｆ−１６Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図１０に示す。矢印部のサイズは約２００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは２１２ｂｐである。テンプレートには表３の９６種を用いた。
いずれの場合にも大腸菌・赤痢菌の株については、予想されるサイズのバンドが出現し、その他の細菌については同じサイズのバンドは出現しない。即ち、大腸菌・赤痢菌のＤＮＡから増幅する特徴的なＲＡＰＤ断片の配列（配列番号４４）から設定したプライマーのいずれを用いた場合にも、大腸菌・赤痢菌を検出することができる事がわかる。
〔実施例２〕
本実施例では、病原性大腸菌を検出するプライマーの作成について示す。表１に示す、１２塩基からなる単一のプライマー  Ｂ４７  （配列番号３９）（塩基配列：５’−  ＧＣＣＧＣＣＡＧＡＧＧＡ  −３’）を表２のテンプレートに用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行なうと、Ｏ１５７とよばれるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＧＴＣ  １０６１と、他の２種の株で共通したサイズ（約１，２００ｂｐ）のＲＡＰＤ断片が増幅される（図１１の２０〜２３レーン参照）。一方、他の細菌では同じサイズのＲＡＰＤ断片は見られない（図１１矢印の領域参照）。今回、約１，２００ｂｐのＲＡＰＤ断片が増幅された表２の２０、２１、２２の細菌は、いずれもＶＴＥＣとよばれる病原性大腸菌である。本実施例では当該約１，２００ｂｐのＲＡＰＤ断片を対象として、配列決定とプライマーの作成を行なう。
実施例１と同様の方法でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＧＴＣ  １０６１よりＤＮＡ抽出液を作成した。ＳＳＣ−ＰＣＲは、抽出したＤＮＡから作成したテンプレート溶液と、表１中の１２塩基からなる単一のプライマー  Ｂ４７  （配列番号３９）（塩基配列：５’−  ＧＣＣＧＣＣＡＧＡＧＧＡ  −３’）をもちいた。サーマル・サイクリング条件を表９に示す。反応液は実施例１と同様の組成を用いた。
【００６８】
【表９】
2004283064.tif 000014
次に上記で得た約１２００ｂｐのＲＡＰＤ断片の配列を、実施例１と同様の方法で決定する。シーケンス反応のためのプライマーとして、ＳＳＣ−ＰＣＲ時のプライマーと同様、Ｂ４７  （配列番号３９）（塩基配列：５’−  ＧＣＣＧＣＣＡＧＡＧＧＡ  −３’）をもちいた。
また、Ｂ４７プライマーの結合サイトが一つになるよう加工するための制限酵素を選択するため、表５の制限酵素と反応液を用いて、３７℃、３時間の酵素処理を行なった。当該ＲＡＰＤ断片は、Ｐｓｔ  Ｉを用いた場合とＳｍａ  Ｉを用いた場合のともに、良好に２分割されたので、ＰｓｔＩで切断した断片を配列決定を行なった後、Ｓｍａ  Ｉで切断した断片でも配列決定を行い、決定された配列の確認・補足を行なった。
この結果、制限酵素Ｓｍａ  Ｉ、および、Ｐｓｔ  Ｉの切断断片のＬｏｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔから下記配列の３３から６２８までに示す５９５ｂｐを決定し、Ｓｈｏｒｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔから下記配列の７０３から１１６９までに示す４６７  ｂｐを決定した。両側のＢ４７のプライマーサイトを含む残りの１６２ｂｐ（下線の部分）については、ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．  ＡＢ０１１５４９より推定した。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＧＴＣ  １０６１から  Ｂ４７プライマーにより増幅されるＲＡＰＤ断片は下記の配列（配列番号４５）を持つ１２２４  ｂｐと予測され、この断片は、Ｅ．  ｃｏｌｉ  のプラスミドｐＯ１５７上にあると考えられる。
2004283064.tif 000015
この配列に基いて、以下のプライマーを設定した（図１２参照）。尚、プライマー名につく「Ｆ」はｆｏｒｗａｒｄ側として設計・合成されたことを示し、「Ｒ」はｒｅｖｅｒｓｅ側のプライマーとして設計・合成されたことを示す。
【００６９】
2004283064.tif 000016
これらのプライマーは、対となるプライマーのＴｍ値が近い、プライマー自体でパリンドロームが形成されにくい、対となるプライマーの相補性が低い、対となるプライマーが結合する位置同士が近すぎない、等の条件を考慮し選択した。これらの条件を満たせば、他の部分でもプライマーまたはプライマーの結合部分とすることができる。
図１３は３６Ｆ−３６Ｒのプライマー対を用いて、表２、表３の細菌をテンプレートにし、ＰＣＲ増幅と電気泳動を行い、増幅されるかどうかを確認した。尚、配列から計算した予想されるサイズは９６９ｂｐである。表２の細菌をテンプレートとした結果を図１３Ａに、表３の細菌をテンプレートとした結果を図１３Ｂに示す。図１３Ａでは表２の２０、２１、２２の細菌のレーンにのみ約１０００ｂｐのバンドが見られる。即ちＶＴＥＣのみが検出されている。その他の細菌、および表３に示される細菌のレーンには約１０００ｂｐのバンドは現れない。
同様の方法で、３７Ｆ−３７Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図１４に示す。矢印部のサイズは約１０００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは９３７ｂｐである。
同様の方法で、３８Ｆ−３８Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図１５Ａに示す。矢印部のサイズは約９００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは９１９ｂｐである。テンプレートには表２の４８種を用いた。
同様の方法で、３９Ｆ−３９Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図１５Ｂに示す。矢印部のサイズは約８５０ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは８３４ｂｐである。テンプレートには表２の４８種を用いた。
上記の結果、いずれの場合にもＶＴＥＣの株については、予想されるサイズのバンドが出現し、その他の細菌については同じサイズのバンドは出現しない。即ち、ＶＴＥＣのＤＮＡより増幅する特徴的なＲＡＰＤ断片の配列（配列番号４５）から設定したプライマーのいずれを用いた場合にもＶＴＥＣを検出することができる事がわかる。
〔実施例３〕
本実施例では、赤痢菌Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＧＴＣ  ７８０を検出するプライマーの作成について示す。
表１に示す、１２塩基からなる単一のプライマーＧ２２（配列番号４０）（塩基配列：５’−ＡＧＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡ  −３’）を表２のテンプレートに用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行なうと、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＧＴＣ  ７８０のレーンの約１０５０ｂｐ特徴的なＲＡＰＤ断片が現れる（図１６の４６レーン参照）。一方、他の細菌では同じサイズのＲＡＰＤ断片は見られない（図１６の矢印の領域参照）。本実施例では当該約１０５０  ｂｐのＲＡＰＤ断片を対象として、配列決定とプライマーの作成を行なう。
実施例１と同様の方法でＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＧＴＣ  ７８０よりＤＮＡ抽出液を作成した。ＳＳＣ−ＰＣＲは、抽出したＤＮＡから作成したテンプレート溶液と、表１中の１２塩基からなる単一のプライマーＧ２２（配列番号４０）（塩基配列：５’−ＡＧＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡ  −３’）をもちいた。尚、ＳＳＣ−ＰＣＲ条件、制限酵素処理条件、配列決定用反応条件、新たに作成した特異的プライマーのＰＣＲ条件等は、実施例２と同様である。
次に上記で得た約１０５０  ｂｐ  のＲＡＰＤ断片の配列を、実施例１と同様の方法で決定する。シーケンス反応のためのプライマーとして、ＳＳＣ−ＰＣＲ時のプライマーと同様、Ｇ２２（配列番号４０）（塩基配列：５’−ＡＧＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡ  −３’）をもちいた。Ｇ２２プライマーの結合サイトが一つになるよう加工するための制限酵素は、表５の制限酵素と反応液を用いて、３７℃、３時間の酵素処理を行なった結果から、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩを選択した。
制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩによる切断断片のＬｏｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔから、下記配列の５４から６５０までに示す５９７  ｂｐを決定し、Ｓｈｏｒｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔから下記配列の６６３から１０７３までに示す４１１  ｂｐを決定した。Ｇ２２のプライマーサイトを含む残りの９３  ｂｐ（下線の部分）については、ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．  ＡＥ０１５０８３  ＡＥ００５６７４より推定した。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉＧＴＣ  ７８０からＧ２２プライマーにより増幅されるＲＡＰＤ断片は下記の配列（配列番号４６）を持つ１１０１ｂｐと予測され、この断片は、Ｓ．  ｆｌｅｘｎｅｒｉの染色体ＤＮＡ上にあると考えられる。
2004283064.tif 000017
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この配列に基いて、以下のプライマーを設定した（図１７参照）。尚、プライマー名につく「Ｆ」はｆｏｒｗａｒｄ側として設計・合成されたことを示し、「Ｒ」はｒｅｖｅｒｓｅ側のプライマーとして設計・合成されたことを示す。
2004283064.tif 000019
これらのプライマーは、対となるプライマーのＴｍ値が近い、プライマー自体でパリンドロームが形成されにくい、対となるプライマーの相補性が低い、対となるプライマーが結合する位置同士が近すぎない、等の条件を考慮し選択した。これらの条件を満たせば、他の部分でもプライマーまたはプライマーの結合部分とすることができる。
図１８は４１Ｆ−４１Ｒのプライマー対を用いて、表２、表３の細菌をテンプレートにし、ＰＣＲ増幅と電気泳動を行い、増幅されるかどうかを確認した。尚、配列から計算した予想されるサイズは７２６ｂｐである。表２の細菌をテンプレートとした結果を図１８Ａに、表３の細菌をテンプレートとした結果を図１８Ｂに示す。図１８Ａでは表２の４６の細菌のレーンにのみ、図１８Ｂでは表２の７６の細菌のレーンにのみ約７００ｂｐのバンドが見られる。即ちＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＧＴＣ  ７８０のみが検出されている。その他の細菌のレーンには約７００ｂｐのバンドは現れない（図１８Ａ矢印領域参照）。
同様の方法で、４２Ｆ−４２Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図１９に示す。矢印部のサイズは約８００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは８１４ｂｐである。
同様の方法で、４３Ｆ−４３Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図２０Ａに示す。矢印部のサイズは約７５０ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは７５６ｂｐである。
上記の結果、いずれの場合にもＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＧＴＣ  ７８０の株については、予想されるサイズのバンドが出現し、その他の細菌については同じサイズのバンドは出現しない。即ち、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＧＴＣ  ７８０のＤＮＡより増幅する特徴的なＲＡＰＤ断片の配列（配列番号４６）から設定したプライマーのいずれを用いた場合にもＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＧＴＣ  ７８０を検出することができる事がわかる。
〔実施例４〕
本実施例では、赤痢菌Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ＧＴＣ  ７８６を検出するプライマーの作成について示す。
表１に示す、１２塩基からなる単一のプライマーＢ７２  （配列番号４１）（塩基配列：５’−  ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ  −３’）を表２のテンプレートに用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行なうと、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ＧＴＣ  ７８６のレーンに約２５００ｂｐ特徴的なＲＡＰＤ断片が現れる（図２１の４８レーン参照）。一方、他の細菌では同じサイズのＲＡＰＤ断片は見られない（図２１矢印の領域参照）。本実施例では当該約２５００ｂｐのＲＡＰＤ断片を対象として、配列決定とプライマーの作成を行なう。
実施例１と同様の方法でＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ＧＴＣ  ７８６よりＤＮＡ抽出液を作成した。ＳＳＣ−ＰＣＲは、抽出したＤＮＡから作成したテンプレート溶液と、表１中の１２塩基からなる単一のプライマーＢ７２  （配列番号４１）（塩基配列：５’−  ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ  −３’）をもちいた。尚、ＳＳＣ−ＰＣＲ条件、制限酵素処理条件、配列決定用反応条件、新たに作成した特異的プライマーのＰＣＲ条件等は、実施例２と同様である。。
次に上記で得た約２５００ｂｐ  のＲＡＰＤ断片の配列を、実施例１と同様の方法で決定する。シーケンス反応のためのプライマーとして、ＳＳＣ−ＰＣＲ時のプライマーと同様、１２塩基からなる単一のプライマーＢ７２  （配列番号４１）（塩基配列：５’−  ＴＡＡＣＡＡＣＣＧＡＧＣ  −３’）をもちいた。Ｂ７２プライマーの結合サイトが一つになるよう加工するための制限酵素は、表５の制限酵素と反応液を用いて、３７℃、３時間の酵素処理を行なった結果から、ＰｖｕＩＩを選択した。
制限酵素ＰｖｕＩＩによる切断断片のＬｏｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔから、下記の５３６  ｂｐの配列を決定した。
2004283064.tif 000020
制限酵素Ｐｖｕ  ＩＩのＳｈｏｒｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔから下記の５４６  ｂｐを決定した。
2004283064.tif 000021
ＦＡＳＴＡ検索では、部分的に相同性の高い領域はみられたが、ほぼ全ての領域と相同性の高い領域はみられず、残りの約１４００  ｂｐについては未決定の状態で、以下のプライマーの設計を行なった（図２２参照）。尚、プライマー名につく「Ｆ」はｆｏｒｗａｒｄ側として設計・合成されたことを示し、「Ｒ」はｒｅｖｅｒｓｅ側のプライマーとして設計・合成されたことを示す。
2004283064.tif 000022
これらのプライマーは、対となるプライマーのＴｍ値が近い、プライマー自体でパリンドロームが形成されにくい、対となるプライマーの相補性が低い、対となるプライマーが結合する位置同士が近すぎない、等の条件を考慮し選択した。これらの条件を満たせば、他の部分でもプライマーまたはプライマーの結合部分とすることができる。
図２３は４７Ｆ−４７Ｒのプライマー対を用いて、表２、表３の細菌をテンプレートにし、ＰＣＲ増幅と電気泳動を行い、増幅されるかどうかを確認した。尚、配列から計算した予想されるサイズは２４９ｂｐである。表２の細菌をテンプレートとした結果を図２３Ａに、表３の細菌をテンプレートとした結果を図２３Ｂに示す。図２３Ａでは表２の４８の細菌のレーンにのみ、図２３Ｂではいずれのレーンにも約２５０ｂｐのバンドは見られない。
即ちＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ＧＴＣ  ７８６のみが検出されている。その他の細菌のレーンには約２５０ｂｐのバンドは現れない（図２３矢印領域参照）。
同様の方法で、４８Ｆ−４８Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図２４Ａに示す。テンプレートには表２の４８種を用いた。矢印部のサイズは約２００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは２１２ｂｐである。
同様の方法で、４９Ｆ−４９Ｒのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった結果を図２４Ｂに示す。テンプレートには表２の４８種を用いた。矢印部のサイズは約２２００ｂｐである。当該サイズは、ＲＡＰＤ断片の全体（約２５００ｂｐ）のサイズと、プライマーを設定した位置（図２２参照）とから予測されるサイズである。上記の結果、いずれの場合にもＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ＧＴＣ  ７８６の株については、予想されるサイズのバンドが出現し、その他の細菌については同じサイズのバンドは出現しない。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ＧＴＣ  ７８６のＤＮＡより増幅する特徴的なＲＡＰＤ断片の配列（配列番号４７および配列番号４８）から設定したプライマーのいずれを用いた場合にもＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ＧＴＣ  ７８６を検出することができる事がわかる。
〔実施例５〕
本実施例では、赤痢菌Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ  ＧＴＣ  ７７９を検出するプライマーの作成について示す。
表１に示す、１２塩基からなる単一のプライマーＦ６９  （配列番号４２）（塩基配列：５’−  ＡＴＣＧＡＣＧＧＡＧＡＡ  −３’）を表２のテンプレートに用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行なうと、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ  ＧＴＣ  ７７９のレーンに約２４００ｂｐの特徴的なＲＡＰＤ断片が現れる（図２５の４５レーン参照）。一方、他の細菌では同じサイズのＲＡＰＤ断片は見られない（図２１矢印の領域参照）。本実施例では当該約２４００ｂｐのＲＡＰＤ断片を対象として、配列決定とプライマーの作成を行なう。
実施例１と同様の方法でＳｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ  ＧＴＣ  ７７９よりＤＮＡ抽出液を作成した。ＳＳＣ−ＰＣＲは、抽出したＤＮＡから作成したテンプレート溶液と、表１中の１２塩基からなる単一のプライマーＦ６９  （配列番号４２）（塩基配列：５’−  ＡＴＣＧＡＣＧＧＡＧＡＡ  −３’）をもちいた。尚、ＳＳＣ−ＰＣＲ条件、制限酵素処理条件、配列決定用反応条件、新たに作成した特異的プライマーのＰＣＲ条件等は、実施例２と同様である。。
次に上記で得た約２４００ｂｐ  のＲＡＰＤ断片の配列を、実施例１と同様の方法で決定する。シーケンス反応のためのプライマーとして、ＳＳＣ−ＰＣＲ時のプライマーと同様、１２塩基からなる単一のプライマーＦ６９  （配列番号４２）（塩基配列：５’−  ＡＴＣＧＡＣＧＧＡＧＡＡ  −３’）をもちいた。Ｆ６９プライマーの結合サイトが一つになるよう加工するための制限酵素は、表５の制限酵素と反応液を用いて、３７℃、３時間の酵素処理を行なった結果から、制限酵素Ｈｐａ  Ｉを選択した。
制限酵素Ｈｐａ  Ｉによる切断断片のＬｏｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔから、下記の６１６  ｂｐの配列を決定した。
2004283064.tif 000023
制限酵素Ｈｐａ  ＩのＳｈｏｒｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔから下記の６５０  ｂｐを決定した。
2004283064.tif 000024
ＦＡＳＴＡ検索では、部分的に相同性の高い領域はみられたが、ほぼ全ての領域と相同性の高い領域はみられず、残りの約１１５０  ｂｐについては未決定の状態で、以下のプライマーの設計を行なった（図２６参照）。尚、プライマー名につく「Ｆ」はｆｏｒｗａｒｄ側として設計・合成されたことを示し、「Ｒ」はｒｅｖｅｒｓｅ側のプライマーとして設計・合成されたことを示す。
2004283064.tif 000025
これらのプライマーは、対となるプライマーのＴｍ値が近い、プライマー自体でパリンドロームが形成されにくい、対となるプライマーの相補性が低い、対となるプライマーが結合する位置同士が近すぎない、等の条件を考慮し選択した。これらの条件を満たせば、他の部分でもプライマーまたはプライマーの結合部分とすることができる。
図２７Ａは５２Ｆ−５２Ｒのプライマー対を用いて、ＰＣＲ増幅と電気泳動を行い、増幅されるかどうかを確認した。テンプレートには表２の４８種を用いた。矢印部のサイズは約２１００ｂｐである。当該サイズは、ＲＡＰＤ断片の全体（約２４００ｂｐ）のサイズと、プライマーを設定した位置（図２６参照）とから予測されるサイズである。レーン４５にのみ当該予想されるサイズのバンドが見られ、その他の細菌のレーンには当該サイズのバンドは見られない（図２７Ａ矢印領域参照）。即ちＳｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ  ＧＴＣ  ７７９のみが検出されている。
図２７Ｂは５３Ｆ−５３Ｒのプライマー対を用いて、ＰＣＲ増幅と電気泳動を行い、増幅されるかどうかを確認した。テンプレートには表２の４８種を用いた。矢印部のサイズは約２０００ｂｐである。当該サイズは、ＲＡＰＤ断片の全体（約２４００ｂｐ）のサイズと、プライマーを設定した位置（図２６参照）とから予測されるサイズである。レーン４５にのみ当該予想されるサイズのバンドが見られ、その他の細菌のレーンには当該サイズのバンドは見られない（図２７Ｂ矢印領域参照）。即ちＳｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ  ＧＴＣ  ７７９のみが検出されている。
図２７Ｃは５４Ｆ−５４Ｒのプライマー対を用いて、ＰＣＲ増幅と電気泳動を行い、増幅されるかどうかを確認した。テンプレートには表２の４８種を用いた。矢印部のサイズは約２０００ｂｐである。当該サイズは、ＲＡＰＤ断片の全体（約２４００ｂｐ）のサイズと、プライマーを設定した位置（図２６参照）とから予測されるサイズである。レーン４５にのみ当該予想されるサイズのバンドが見られ、その他の細菌のレーンには当該サイズのバンドは見られない（図２７Ｃ矢印領域参照）。即ちＳｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ  ＧＴＣ  ７７９のみが検出されている。
【００７０】
上記の結果、いずれの場合にもＳｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ  ＧＴＣ  ７７９の株については、予想されるサイズのバンドが出現し、その他の細菌については同じサイズのバンドは出現しない。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ  ＧＴＣ  ７７９のＤＮＡより増幅する特徴的なＲＡＰＤ断片の配列（配列番号４９および配列番号５０）から設定したプライマーのいずれを用いた場合にもＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ＧＴＣ  ７８６を検出することができる事がわかる。
〔実施例６〕
本実施例では、赤痢菌Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ＧＴＣ  ７８１と大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６を検出するプライマーの作成について示す。
【００７１】
表１に示す、１２塩基からなる単一のプライマーＥ８３  （配列番号４３）（塩基配列：５’−ＣＴＧＣＧＴＴＴＴＣＡＣ−  ３’）を表２のテンプレートに用いてＳＳＣ−ＰＣＲを行なうと、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ＧＴＣ  ７８１とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６のレーンに約８００ｂｐの特徴的なＲＡＰＤ断片が現れる（図２８の２４レーン・４７レーン参照）。一方、他の細菌では同じサイズのＲＡＰＤ断片は見られない（図２８矢印の領域参照）。本実施例では当該約８００ｂｐのＲＡＰＤ断片を対象として、配列決定とプライマーの作成を行なう。
実施例１と同様の方法でＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ＧＴＣ  ７８１よりＤＮＡ抽出液を作成した。ＳＳＣ−ＰＣＲは、抽出したＤＮＡから作成したテンプレート溶液と、表１中の１２塩基からなる単一のプライマー  Ｅ８３  （配列番号４３）（塩基配列：５’−ＣＴＧＣＧＴＴＴＴＣＡＣ−  ３’）をもちいた。尚、ＳＳＣ−ＰＣＲ条件、制限酵素処理条件、配列決定用反応条件、新たに作成した特異的プライマーのＰＣＲ条件等は、実施例２と同様である。
次に上記で得た約８００ｂｐ  のＲＡＰＤ断片の配列を、実施例１と同様の方法で決定する。シーケンス反応のためのプライマーとして、ＳＳＣ−ＰＣＲ時のプライマーと同様、１２塩基からなる単一のプライマーＥ８３  （配列番号４３）（塩基配列：５’−ＣＴＧＣＧＴＴＴＴＣＡＣ−  ３’）をもちいた。Ｅ８３プライマーの結合サイトが一つになるよう加工するための制限酵素は、表５の制限酵素と反応液を用いて、３７℃、３時間の酵素処理を行なった結果から、制限酵素ＢｇｌＩを選択した。
制限酵素ＢｇｌＩによる切断断片のＬｏｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔから、
下記配列の３１から４８４までに示す４５４ｂｐを決定し、Ｓｈｏｒｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔから下記配列の５００から７２７までに示す２２８ｂｐを決定した。Ｌｏｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ側のＥ８３のプライマーサイトを含む一部の配列、および、Ｌｏｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔとＳｈｏｒｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔとの間の配列（合計４５  ｂｐ）（下線の部分）については、ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．  Ｘ０５９５６より推定した。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ＧＴＣ  ７８１からＥ８３プライマーにより増幅されるＲＡＰＤ断片は下記の配列（配列番号５１）を持つ７２７  ｂｐ  ｂｐと予測され、この断片は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ＧＴＣ  ７８１の染色体ＤＮＡ上にあると考えられる。Ｓｈｏｒｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔ側の末端部の数十ｂｐについては、未決定である。
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この配列に基いて、以下のプライマーを設定した（図２９参照）。尚、プライマー名につく「Ｆ」はｆｏｒｗａｒｄ側として設計・合成されたことを示し、「Ｒ」はｒｅｖｅｒｓｅ側のプライマーとして設計・合成されたことを示す。
【００７２】
2004283064.tif 000027
これらのプライマーは、対となるプライマーのＴｍ値が近い、プライマー自体でパリンドロームが形成されにくい、対となるプライマーの相補性が低い、対となるプライマーが結合する位置同士が近すぎない、等の条件を考慮し選択した。これらの条件を満たせば、他の部分でもプライマーまたはプライマーの結合部分とすることができる。
図３０Ａは４４Ｆ−４４Ｒのプライマー対を用いて、ＰＣＲ増幅と電気泳動を行い、増幅されるかどうかを確認した。テンプレートには表２の４８種を用いた。矢印部のサイズは約５００ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは５１０ｂｐである。レーン４７およびレーン２４にのみ当該予想されるサイズのバンドが見られ、その他の細菌のレーンには当該サイズのバンドは見られない（図３０Ａ矢印領域参照）。即ち、赤痢菌Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ＧＴＣ  ７８１と大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６のみが検出されている。
図３０Ｂは４５Ｆ−４５Ｒのプライマー対を用いて、ＰＣＲ増幅と電気泳動を行い、増幅されるかどうかを確認した。テンプレートには表２の４８種を用いた。矢印部のサイズは約４５０ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは４３３ｂｐである。レーン４７およびレーン２４にのみ当該予想されるサイズのバンドが見られ、その他の細菌のレーンには当該サイズのバンドは見られない（図３０Ｂ矢印領域参照）。即ち、赤痢菌Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ＧＴＣ  ７８１と大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６のみが検出されている。
図３０Ｃは４６Ｆ−４６Ｒのプライマー対を用いて、ＰＣＲ増幅と電気泳動を行い、増幅されるかどうかを確認した。テンプレートには表２の４８種を用いた。矢印部のサイズは約４５０ｂｐ、配列から計算した予想されるサイズは４６８ｂｐである。レーン４７およびレーン２４にのみ当該予想されるサイズのバンドが見られ、その他の細菌のレーンには当該サイズのバンドは見られない（図３０Ｃ矢印領域参照）。即ち、赤痢菌Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ＧＴＣ  ７８１と大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６のみが検出されている。
【００７３】
上記の結果、いずれの場合にも赤痢菌Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ＧＴＣ  ７８１と大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６の株については、予想されるサイズのバンドが出現し、その他の細菌については同じサイズのバンドは出現しない。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ＧＴＣ  ７８１とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６のＤＮＡより増幅する特徴的なＲＡＰＤ断片の配列（配列番号５１）から設定したプライマーのいずれを用いた場合にもＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ＧＴＣ  ７８１とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯを検出することができる事がわかる。〔実施例１〕から〔実施例６〕に示される通り、任意のプライマーによって、目的とする１または２以上の特定の種類の細菌ＤＮＡから特徴的に増幅されるＲＡＰＤ断片を選択し、当該ＲＡＰＤ断片の配列からプライマーを作成することにより、極めて高い確率で、目的とした１または２以上の特定種類の微生物を検出可能なプライマーを作成することが可能である。
〔実施例７〕配列決定ウォーキング
上記のようにＲＡＰＤ断片の塩基配列決定の目的が、特異的なプライマー、あるいは、プローブを作成することであれば、必ずしも切断されたＤＮＡ断片各々の配列が必要なわけではない。
しかし、他の種や、株と塩基配列を比較したい場合など、断片全体の塩基配列を知りたい場合には、Ｌ−およびＳ−ｆｒａｇｍｅｎｔの最初の塩基配列を元にしてプライマーを再度、設定・合成し、それを用いて残りの塩基配列決定（いわゆるウォーキングによる塩基配列決定）することにより、配列を決定することができる。〔実施例１〕で用いた、Ｂ６９プライマー（配列番号３８）を任意のプライマーとして得られたＲＡＰＤ断片を用いて実証する。
プライマーの設計は、市販のソフトウェアＯｌｉｇｏ  ｖｅｒ．  ５．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．：商標）を用いて単一プライマー内での二本鎖形成を避け、適当な融解温度（通常、５０−７０℃）になるような２０塩基程度の配列を探索した。また、設計したプライマーを塩基配列決定用の反応だけでなく、ＤＮＡ断片の増幅に用いる場合には、ｆｏｒｗａｒｄ側とｒｅｖｅｒｓｅ側に相当する２つのプライマー同士がテンプレートに結合する前に結合しないような考慮も必要である。
【００７４】
最初にＬ−ｆｒａｇｍｅｎｔの塩基配列からプライマー  １６Ｆ（配列番号３）（５’−ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＴＴ−３’）を、そして、Ｓ−ｆｒａｇｍｅｎｔの塩基配列からプライマー  １６Ｒ（配列番号４）（５’−ＴＧＣ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  Ｇ−３’）を設計した。設計したプライマーを合成し（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｌｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ：商標）、以下に示す条件でサーマル・サイクリング、電気泳動および塩基配列決定を行った。
【００７５】
【表１０】
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塩基配列の決定の結果を示す。
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プライマー  １６Ｒ（配列番号４）を用いて決定できた配列は、末端が切れており、しかも、その末端は制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩの認識・切断部位に相当すると推定できたので、Ｓ−ｆｒａｇｍｅｎｔについては、その５’側の数十塩基を除き、ほぼ全領域が配列決定できた。しかし、Ｌ−ｆｒａｇｍｅｎｔについては、制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩの認識・切断部位で終末していないので全体の塩基配列ができていないと考え、さらにプライマー  １６Ｆ（配列番号３）を用いて得られた塩基配列から、新しくプライマー  ２０Ｆ（配列番号５）（５’−ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＣＧＡ  ＧＡ−３’）を設計し、プライマー  １６Ｆ（配列番号３）の場合と同じ条件で塩基配列決定を行った。この結果を以下に示す。決定した配列の最後は、制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩの認識・切断部位に相当しているので、Ｌ−ｆｒａｇｍｅｎｔの５’側の数十塩基を除き、ほぼ全領域が配列決定できたと推定できる。
【００７６】
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これまでの塩基配列の決定により、対象としたＲＡＰＤ断片のほぼ全域の塩基配列の決定ができたことが分かる（図２参照）。本実施例では、断片の両端の合計数十塩基分（最初のプライマー結合部位の近傍にあたる）の塩基配列決定を示していないが、塩基配列が分かった部分を用いて断片の外側に向かうプライマーを両側で設定して塩基配列決定を行うことで、未決定部分の塩基配列の決定ができる。
【００７７】
例えば、プライマー  １６Ｆ（配列番号３）と相補的で逆向きのプライマー（５’−ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＴＡＡ  ＧＧＴ  ＧＧ−３’）、および、プライマー  １６Ｒ（配列番号４）に相補的で逆向きのプライマー（５’−ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＴＧＣ  Ａ−３’）を用いて塩基配列を決定できる。
〔実施例８〕塩基配列の由来の確認
特定の種に特異的なプライマーを作成する工程で、他の細菌などのＤＮＡがなんらかの原因で混入し、その塩基配列を読み取ってしまっているという可能性を払拭するため、決定した塩基配列が本当に対象としたＤＮＡに含まれているかどうかを確認することが有益な場合がある。この確認には、少なくとも、データベースの検索による方法と新規にプライマーを設計しＰＣＲ増幅できるかどうかを確認する方法の２通りが考えられる。
【００７８】
本実施例で対象とした大腸菌ＩＦＯ  ３３０１株の場合は、由来を同じくする株の全ゲノム塩基配列が既に決定されているので、データベースを利用する方法が適用できる。本実施例では、公開されているデータベース（ＤＤＢＪ）とその検索エンジン（ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ）を用いて検索した。その結果、Ｌ−およびＳ−ｆｒａｇｍｅｎｔのいずれも大腸菌Ｋ１２株のゲノム塩基配列上に一致する配列を認め、電気泳動から推測された塩基数だけ離れて連続していた（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．  ＡＥ０００４９３）。また、遺伝子解析情報より、対象としたＲＡＰＤ断片は、遺伝子「ｙｔｆＬ」および「ｍｓｒＡ」にまたがっており、それぞれの一部とこの２つの遺伝子の間の領域（遺伝子ではない領域）を含んだ断片であることが分かった。これは、本実施例で決定された塩基配列が大腸菌から正しく読み取られたことを示している。こうしてデータベースの検索で配列の正しさを確認することができるのは、これまでに塩基配列が決定された生物を対象とした場合だけであり、全ての生物の場合に利用できるわけではない。
【００７９】
決定した塩基配列が対象としたＤＮＡ由来であるかどうかを確認する手段としてより一般的で簡便な方法としては、ＰＣＲを用いる方法である。まず、決定した塩基配列を元にして、その塩基配列に特異的なプライマーのセットを設計・合成する。そして、そのプライマーのセットを用いて対象のＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲを行い、予想されたサイズの断片が増幅されるかどうかを電気泳動で確認することによって明らかにすることができる。
〔実施例９〕配列特異的なプライマーを利用した大腸菌の検出
新規に設計したプライマーを用いて、糞便サンプルからの大腸菌の検出を行った結果について示す。
【００８０】
健康成人１４人から糞便を採取し、０．５ｇの糞便サンプルからＤＮＡを直接抽出した。抽出は、Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  ＳＰＩＮ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ：商標）を用いて、メーカー推奨の方法で行った。以下に簡単に手順を記す。まず、０．５ｇの糞便サンプルに２０ｍｌの５  ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を加え、攪拌して洗浄後、８，０００回転で１０分間遠心分離し、上清を捨てた。この操作を３回行った後、沈渣に９８７μｌのＳｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  バッファー、及び、１２２μｌのＭＴ  バッファーを加え、メーカー指定のチューブに移した。チューブをＦａｓｔＰｒｅｐ装置にセットし、３０秒間処理した。１５，０００回転で３０秒間遠心した後、上清を新しいチューブに移した。２５０μｌのＰＰＳ溶液を加えて、混合した。さらに１５，０００回転で５分間遠心して上清を新しい１５ｍｌチューブに移して１ｍｌのＢｉｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを加えた。２分間混合後、３分間静置してＤＮＡをＭａｔｒｉｘに吸着させた。０．５ｍｌの上清を捨てて残りを再度混合した後、ＳＰＩＮ  Ｆｉｌｔｅｒに移し、１５，０００回転で１分間遠心した。０．５ｍｌのＳＥＷＳ−Ｍを加え、１分間遠心後、溶液を捨て、さらに２分間遠心して溶液を飛ばした。Ｆｉｌｔｅｒを新しいチューブに入れ、５分間風乾させた後、５００μｌのＤＥＳを加え、静かに攪拌して吸着したＤＮＡを溶出させた。１分間遠心分離して溶液をチューブに採取してＤＮＡ抽出液とした。ＤＮＡ抽出液のＤＮＡ濃度を測定して、テンプレート溶液を作成し、ＲＡＰＤ断片の両端に近い部分に設計したプライマー  ５Ｆ（配列番号１）と５Ｒ（配列番号２）を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った。
【００８１】
【表１１】
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図３５に、１４例の糞便ＤＮＡサンプルを用いた結果を示す。サンプルによって、生成物の量（バンドの濃さ）はかなり差があるものの、全ての場合で約１，７００  ｂｐの断片の増幅を確認した。この結果は、糞便中に存在した大腸菌のＤＮＡが抽出され、そのＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲ産物が増幅されたと考えられる。即ち、本件発明により設計されたプライマーは、人工的に調整されたテンプレート以外であっても目的とする細菌を検出できることが分かる。
【００８２】
【００８３】
【発明の効果】
本発明は、大腸菌と赤痢菌に属するもの、ＥＨＥＣ、ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ、ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＦＯ  ３３６６、の１または２以上の種類の微生物を検出することを可能にする。
【００８４】
また、目的とする１または２以上の特定種類の微生物の検出が可能なプライマー対を作成することを可能にする。
また、病原性因子を含んでいる可能性がある等ＤＮＡクローニングに適さない、生物種の塩基配列の解析が進んでいない、などの事情があってもこれらの事情を障害とすることなく、簡便に特定の生物種を検出できるプライマーまたはプライマー対を作成可能にする。
【００８５】
【００８６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】各種細菌にＢ６９プライマーを作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約１８００ｂｐ、２重矢印部のサイズは約３０００ｂｐを示す。Ａは、全てのレーンに約１８００ｂｐまたは約３０００ｂｐのバンドが、Ｂは、３０，  ７６のレーンに約１８００ｂｐのバンドがみられる。
【図２】実施例１のＲＡＰＤ断片の塩基配列決定と、当該配列から設定したプライマーを示したもの。
【図３】各種細菌に５Ｆ−５Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約１７００ｂｐ、２重矢印部のサイズは約２９００ｂｐを示す。Ａは、全てのレーンに約１７００ｂｐまたは約２９００ｂｐのバンドが、Ｂは、３０，  ７６のレーンに約１７００ｂｐのバンドがみられる。
【図４】各種細菌に１６Ｆ−５Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約１３００ｂｐ、２重矢印部のサイズは約２５００ｂｐを示す。Ａは、全てのレーンに約１３００ｂｐまたは約２５００ｂｐのバンドが、Ｂは、３０，  ７６のレーンに約１３００ｂｐのバンドがみられる。
【図５】各種細菌に１６Ｆ−１６Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約９００ｂｐを示す。Ａは、全てのレーンに、Ｂは、３０，  ７６のレーンに約９００ｂｐのバンドがみられる。
【図６】各種細菌に２０Ｆ−１６Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約５００ｂｐを示す。Ａは、全てのレーンに、Ｂは、３０，  ７６のレーンに約５００ｂｐのバンドがみられる。
【図７】各種細菌に５Ｆ−１６Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約１２００ｂｐを示す。３０，  ７６のレーンに約１２００ｂｐのバンドがみられる。
【図８】各種細菌に２０Ｆ−５Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約１０００ｂｐを示す。３０，  ７６のレーンに約１０００ｂｐのバンドがみられる。
【図９】各種細菌に３０Ｆ−５Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約７００ｂｐを示す。３０，  ７６のレーンに約７００ｂｐバンドがみられる。
【図１０】各種細菌に３０Ｆ−１６Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約２００ｂｐを示す。３０，  ７６のレーンに約２００ｂｐのバンドがみられる。
【図１１】各種細菌にＢ４７プライマーを作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約１２００ｂｐを示す。２０〜２２のレーンに約１２００ｂｐのバンドがみられる。
【図１２】実施例２のＲＡＰＤ断片の塩基配列決定と、当該配列から設定したプライマーを示したもの。
【図１３】各種細菌に３６Ｆ−３６Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約１０００ｂｐを示す。Ａの２０〜２２のレーンにのみ約１０００ｂｐバンドがみられる。
【図１４】各種細菌に３７Ｆ−３７Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約１０００ｂｐを示す。Ａの２０〜２２のレーンにのみ約１０００ｂｐバンドがみられる。
【図１５】各種細菌にＡに３８Ｆ−３８Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約９００ｂｐを示す。Ａでは２０〜２２のレーンにのみ約９００ｂｐバンドがみられる。Ｂに３９Ｆ−３９Ｒ  のプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約８５０ｂｐを示す。２０〜２２のレーンにのみ約８５０ｂｐのバンドがみられる。
【図１６】各種細菌にＧ２２プライマーを作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約１０５０ｂｐを示す。４６のレーンに約１０５０ｂｐのバンドがみられる。
【図１７】実施例３のＲＡＰＤ断片の塩基配列決定と、当該配列から設定したプライマーを示したもの。
【図１８】各種細菌に４１Ｆ−４１Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約７００ｂｐを示す。Ａは４６のレーンに、Ｂは７６のレーンに約７００ｂｐのバンドがみられる。
【図１９】各種細菌に４２Ｆ−４２Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約８００ｂｐを示す。Ａは４６のレーンに、Ｂは７６のレーンに約８００ｂｐのバンドがみられる。
【図２０】各種細菌に４３Ｆ−４３Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約７５０ｂｐを示す。Ａは４６のレーンに、Ｂは７６のレーンに約７５０ｂｐのバンドがみられる。
【図２１】各種細菌にＢ７２プライマーを作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約２５００ｂｐを示す。４８のレーンに約２５００ｂｐのバンドがみられる。
【図２２】実施例４のＲＡＰＤ断片の塩基配列決定と、当該配列から設定したプライマーを示したもの。
【図２３】各種細菌に４７Ｆ−４７Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約２５０ｂｐを示す。Ａの４８のレーンにのみ約２５０ｂｐのバンドがみられる。
【図２４】Ａに、各種細菌に４８Ｆ−４８Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約２００ｂｐを示す。４８のレーンにのみ約２００ｂｐのバンドがみられる。Ｂに各種細菌に４９Ｆ−４９Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約２２００ｂｐを示す。４８のレーンにのみ約２２００ｂｐのバンドがみられる。
【図２５】各種細菌にＦ６９プライマーを作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約２４００ｂｐを示す。４５のレーンに約２４００ｂｐのバンドがみられる。
【図２６】実施例５のＲＡＰＤ断片の塩基配列決定と、当該配列から設定したプライマーを示したもの。
【図２７】Ａに、各種細菌に５２Ｆ−５２Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約２１００ｂｐを示す。４５のレーンにのみ約２１００ｂｐのバンドがみられる。Ｂに各種細菌に５３Ｆ−５３Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約２０００ｂｐを示す。４５のレーンにのみ約２０００ｂｐのバンドがみられる。Ｃに各種細菌に５４Ｆ−５４Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約２０００ｂｐを示す。４５のレーンにのみ約２０００ｂｐのバンドがみられる。
【図２８】各種細菌にＥ８３プライマーを作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約８００ｂｐを示す。２４と４７のレーンにのみ約２４００ｂｐのバンドがみられる。
【図２９】実施例６のＲＡＰＤ断片の塩基配列決定と、当該配列から設定したプライマーを示したもの。
【図３０】Ａに、各種細菌に４４Ｆ−４４Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約５００ｂｐを示す。２４と４７のレーンにのみ約５００ｂｐのバンドがみられる。Ｂに各種細菌に４５Ｆ−４５Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約４５０ｂｐを示す。２４と４７のレーンにのみ約２０００ｂｐのバンドがみられる。Ｃに各種細菌に４６Ｆ−４６Ｒのプライマー対を作用させた結果を示す。矢印部のサイズは約４５０ｂｐを示す。２４と４７レーンにのみ約２０００ｂｐのバンドがみられる。
【図３１】増幅確率の異なるプライマーを用いることにより増幅されるＤＮＡ断片が減少することを示す図である。
【図３２】ＤＮＡ断片の配列決定の工程図である。
【図３３】ＲＡＰＤ法で増幅された断片が、ＲＡＰＤ法で用いたプライマーを使用しての配列決定が困難であることを示す図である。
【図３４】ＲＡＰＤ断片をレーン上に記載の制限酵素で切断した後の電気泳動像である。
【図３５】配列番号１および配列番号２のプライマー対を用いて１４例の糞便ＤＮＡサンプルからＲＡＰＤ断片を増幅した図である。
【符号の説明】
１０はマイクロタイタプレート
１０ａは、マイクロタイタプレートの各ウェル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2004283064.tif 000079
【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月12日(2004.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
【配列表】
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