(57)【要約】【課題】新規生物発光アッセイおよびそれに有用な細菌株を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は細胞が代謝的に活性である程度を評価する新規アッセイに関する。同時に突然変異誘発性アッセイ、より具体的には問題の作用物質が遺伝毒であるかを決定する方法も提供される。アッセイの実施態様は、試験作用物質の存在がそれら微生物又は細胞のＤＮＡの中に突然変異、例えば復帰型又は前進型突然変異を起こす場合に光を生じる様に遺伝的に変更された細菌又は哺乳動物を使用する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が代謝的に活性であるその程度を評価するアッセイにあって、前記アッセイが；構成的プロモーターの制御下に発現可能な異種ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体を含む細胞より発せられる光の量を測定すること；前記細胞の環境を変化させること；及び前記変化の前に前記細胞より発せられた光の量と前記変化の後で前記細胞より発せられた光の量とを比較することをを含み；前記細胞が代謝的に活性である場合には光産生に十分な量のＦＭＮＨ2を産生することを前提とし、前記変化の後に発せられた前記光の前記量が増加することが前記細胞が前記変化後により代謝的に活性であることを示し、前記変化後に発せられた前記光の前記の量が減少することが前記細胞が前記変化後に代謝的により活性でなくなったことを意味するアッセイ。
【請求項２】
前記ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体がキセノルハブダス・ルミネッセンス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）より単離されたものである、請求項１記載のアッセイ。
【請求項３】
前記細胞が培地中にあり、そして前記変化が前記培地への試験作用物質の添加を含むものである、請求項１記載のアッセイ。
【請求項４】
前記培地が更に前記試験作用物質に関する外来性の代謝活性化システムを含んでいる、請求項３記載のアッセイ。
【請求項５】
前記細胞がサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）  ＴＡ１５３５ｌｕｘ（ｐＢＲＴＮｌｕｘ１を含む）（ＵＣ２５４４７）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）  ＴＡ１００ｌｕｘ（ｐＢＲＴＮｌｕｘ２を含む）（ＵＣ２５４４８）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）  ＴＡ９８ｌｕｘ（ｐＴＮｌｕｘ２を含む）（ＵＣ２５４４９）より成るグループから選択され、前記培地が実質的にヒスチジンを含まず、前記外来性代謝活性化システムがＳ−９標本であり、そして前記試験物質の前記添加後の前記上昇が前記試験作用物質が前記細胞のヒスチジン遺伝子の突然変異を復帰させたことを意味する、請求項４記載のアッセイ。
【請求項６】
前記細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＷＰ２ｌｕｘ（ｐＢＲＴＮｌｕｘ１を含む）（ＵＣ２５４５２）であり、前記培地が実質的にトリプトファンを含まず、前記外来性代謝活性化システムがＳ−９標本であり、そして前記試験物質の前記添加後の前記上昇が前記試験作用物質が前記細胞のトリプトファン遺伝子の突然変異を復帰させたことを意味する、請求項４記載のアッセイ。
【請求項７】
前記細胞がサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）  ＴＡ２２２０ｌｕｘ（ｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭ１を含む）（ＵＣ２５４５０）又はサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）  ＴＡ２２１１ｌｕｘ（ｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭｍｕｃ６３１を含む）（ＵＣ２５４５１）であり、前記培地がアンピシリンを含み、前記外来性代謝活性化システムがＳ−９標本であり、そして前記試験物質の前記添加後の前記上昇が前記試験作用物質が前記細胞のβ−ラクタマーゼ遺伝子の突然変異を復帰させたことを意味する、請求項４記載のアッセイ。
【請求項８】
発現可能な異質ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体及び実質的に復帰性である点突然変異を含む細胞。
【請求項９】
生物発光復帰突然変異性アッセイにあって、前記アッセイが：生物発光復帰突然変異性アッセイにあり、該アッセイが；細菌にあって、該細胞が非変異型の場合にはその機能が細胞が選択培地中で代謝的に活性であること関し重要であるポリペプチドをコードしている遺伝子内に発現可能な異質ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体（又はオペロン）及び復帰可能な点突然変異を含んでいる細胞と試験作用物質及び外来性代謝活性化システムとを接触さること；前記細胞から発せられる光の量を測定すること；及び前記試験作用物質及び前記外来性代謝活性化システムに曝された前記細胞より発せられた前記光の前記量と前記試験作用物質が無い状態で外来性代謝活性化システムに接触した実質的に同一である細胞とを比較することを含み；前記細胞が代謝的に活性である場合には前記細胞が光産生反応に十分な量のＦＭＮＨ2を産生する場合に於いて、発光量が前記試験作用物質及び前記外来性代謝活性化システムと接触させられた細胞に検出され、前記試験作用物質が無い状態で前記外来性代謝活性化システムに接触させられた前記細胞には実質発光量が検出されないことが試験作用物質が突然変異誘発物質であることを意味するアッセイ。
【請求項１０】
化合物に突然変異誘発性を付与する化合物の構造及び化学的特徴を決定する方法にあって、前記方法が；実質的に同一の細菌細胞に化合物ライブラリーの各化合物のある量と前記化合物を活性化するのに実質的に十分な量の外来性代謝活性化システムとを接触させることにあって、該細胞が非変異型の場合にはその機能が細胞が選択培地中で代謝的に活性であることに関し重要であるポリペプチドをコードしている遺伝子内に発現可能な異質ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体（又はオペロン）及び復帰可能な点突然変異を含んでいる細胞であるもの；前記細胞から発せられる光の量を測定すること；及び前記化合物ライブラリーの前記化合物の前記量及び前記外来性代謝活性化システムに曝された前記各細胞より発せられた前記光の前記量と、前記化合物ライブラリーの前記化合物が無い状態で外来性代謝活性化システムに接触した実質的に同一である細胞とを比較することを含み；発光量が前記化合物ライブラリーの前記化合物の前記の量び前記外来性代謝活性化システムと接触させられた細胞に検出され、前記化合物ライブラリーの前記化合物が無い状態で前記外来性代謝活性化システムに接触させられた前記細胞には実質発光量が検出されないことが前記化合物ライブラリーの前記化合物が突然変異誘発物質であることを意味し；そして共通特性を特定するために発光した前記ライブラリーの前記各化合物の化学的及び構造的特性を比較することを含む；前記細胞が代謝的に活性である場合には前記細胞が光産生反応に十分な量のＦＭＮＨ2を産生することを前提とした方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規生物発光アッセイ、及びそれに有用な細菌株に関する。より具体的には、これらアッセイにより代謝的に活発な細胞と代謝的に非活発な細胞とを区別することができる。具体的好適実施態様では、これらアッセイにより特定試験作用物質が遺伝毒であるか、又は突然変異誘発物質であるか確認することができる。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の研究開発の基礎は、特定の目的を持った作用物質が突然変異誘発性、又は遺伝毒性の危険をしめすか否かを早期に発見することである。一般にはある作用物質、例えば化合物の突然変異誘発能は大まかにはその発癌能に比例すると考えられている。
【０００３】
突然変異誘発物質は、化学的発癌剤の様な作用物質であり、突然変異率を増加する。突然変異は一般には生物体のＤＮＡ配列中の変化、例えば遺伝子又は点突然変異、１次性のＤＮＡ損傷及び修復、又は染色体異常とし考えられている。
【０００４】
突然変異誘発物質又は遺伝毒の検出に一般的に使用されている試験（突然変異誘発性試験）には、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）突然変異誘発性試験（エームス試験（Ａｍｅｓ  Ｔｅｓｔ）、Ａｍｅｓら，１９７３ａ、１９７３ｂ及び１９７５参照；またＡｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．，１９７１も参照）、及びより最近のサルモネラ又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ラクタム突然変異誘発性試験（β−ｌａｃ試験、Ｌｅｅ、Ｃ−Ｃ，ら１９９４、及びＨｏｕｒ、Ｔ−Ｃ．，ら、１９９５）が含まれる。これら試験は共に、ＤＮＡ損傷作用物質の特定細菌遺伝子内に逆突然変異を生じせしめる能力に基づいている。サルモネラ突然変異誘発性試験は、それぞれがｈｉｓ（ヒスチジン生合成）オペロン内に異なるタイプ、例えばフレームシフト又は塩基対置換といった突然変異を含むサルモネラ菌株を使用する。ラクタム突然変異誘発性試験に使用されるサルモネラ菌株又は大腸菌株は、それ自体がβ−ラクタマーゼの発現を排除する突然変異を有するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいる。β−ラクタマーゼ遺伝子は、ペニシリン及びセファロスポリンのβ−ラクタム環内にあるアミド結合を加水分解し抗菌活性を欠く誘導体にし、その結果これら細菌をβ−ラクタム系抗菌剤に耐性にする蛋白質をコードしている。
【０００５】
サルモネラ／哺乳動物マイクロゾーム突然変異誘発アッセイとしても知られるこのサルモネラ試験システムは、発癌性が疑われる物質のスクリーニング、天然材料からの発癌物質の単離、及び発癌物質の活性形状の特定を可能にする。最も広く使用され研究されている突然変異誘導アッセイであるエームス試験（例えばＭａｒｏｎ、Ｄ．Ｍ．とＡｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．，１９８３；Ｄｕｎｋｅｌ、Ｖ．Ｃ．ら、１９８５；及びＺｅｉｇｅｒ，Ｅ．，１９８５；及びＫｉｅｒ、Ｌ．Ｅ．ら、１９８６参照）は現在も細菌の突然変異誘発に推奨されるアッセイである。
【０００６】
サルモネラ／哺乳動物マイクロゾーム突然変異誘発アッセイの変形はその後もＡｍｅｓ及びその他より報告されている（例えばＹａｈａｇｉ、Ｔら、１９７５；Ｐｒｉｖａｌ、Ｍ．Ｊ．とＭｉｔｃｈｅｌｌ、Ｖ．Ｄ．１９８２；Ｈａｗｏｒｔｈ，Ｓら、１９８３；Ｋａｄｏ、Ｎ．Ｙ、ら、１９８３；及びＲｅｉｄ、Ｔ．Ｍら、１９８４；及び毒物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（２０００）、３章．遺伝毒物学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）：突然変異誘導及び付加物形成（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｄｄｕｃｔ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、３章序、ユニット３．１   突然変異誘導性に関するサルモネラ（エームス）試験、代替プロトコール（Ｔｈｅ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ａｍｅｓ）Ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ、Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）  １：前インキュベーション操作を伴うプレートアッセイ（Ｐｌａｔｅ  Ａｓｓａｙ  Ｗｉｔｈ  Ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）；代替プロトコール（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）  ２：揮発性液体に適したデシケーターアッセイ（Ｄｅｓｉｃｃａｔｏｒ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｖｏｌｉｔｅ  Ｌｉｑｕｉｄｓ）；代替プロトコール（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）３：気体に適したデシケーターアッセイ（Ｄｅｓｉｃｃａｔｏｒ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｇａｓｅｓ）；代替プロトコール（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）４：還元型代謝アッセイ（Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ａｓｓａｙ）；代替プロトコール（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）５：改良型微量懸濁アッセイ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（Ｋａｄｏ）Ｍｉｃｒｏｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）参照）。
【０００７】
これら改良の幾つかは一般に試験薬の必要量を少なくすること、及び処理能力を高めること、即ちエームス試験（細菌試験株を外来性代謝活性系存在下に漸増する試験作用物質に曝される標準的なプレート取り込み法）の用手法作業を少なくすることに焦点が当てられてきた（例えばＷａｌｅｈ、Ｎ．Ｓら、１９８２；及び毒物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）、３章、遺伝毒物学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）：突然変異誘導及び付加物形成（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｄｄｕｃｔ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、３章序、ユニット３．１   突然変異誘導性に関するサルモネラ（エームス）試験）、補助プロトコール（Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）１；投与量選択に関する毒性試験（Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｄｏｓｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）参照）。
【０００８】
エームスの標準寒天プレート取り込み法から派生した改訂版プロトコール（前インキュベーションアッセイ）が記載されている（Ｍａｒｏｎ、Ｄ．Ｍ．及びＡｍｅｓ、Ｂ．Ｎ．，１９８３）。その他変形、ＭｕｔａｓｃｒｅｅｎR は濁度測定法と動態原理をエームス試験と同一の生物学的システムに基づく細菌突然変異誘導性試験に組み合わせている（Ｆａｌｃｋら、１９８５）。
【０００９】
別の細菌突然変異誘導性試験の自動化法であるスパイラルサルモネラアッセイは用量−反応性データを得るための連続希釈及び複数のプレートに関する必要性を排除すると報告されている（例えばＤｅＦｌｏｒａ、Ｓ．，１９８１；Ｃｏｕｒｓｅ、Ｎ．Ｌ．＆Ｋｉｎｇ、Ｊ．Ｗ．，１９８２；Ｈｏｕｋ、Ｖ．Ｓ．ら、１９８９、及び１９９１参照）。
【００１０】
その他方法は、まだ例えばＫａｔｏ、ｈ．，１９９５に記載の自動液体前インキュベーション曝露プロトコールの様な個体寒天接種法を使用している。
エームス試験の小規模版であるミニスクリーン（Ｍｉｎｉｓｃｒｅｅｎ）は、エームス試験で必要とされる試験作用物質２ｇに対しより少量の試験作用物質（２０ｍｇ）を使用すると報告されており、様々なタイプの試験作用物質に関するブランケット又は前スクリーニングとして使用される（Ｂｒｏｏｋｓ、Ｔ．Ｍ．，１９９５；Ｂｕｒｋｅ、Ｄ．Ａ．ら、１９９６も参照）。
【００１１】
更にエームス試験ＩＩTM試験（Ｘｅｎｏｍｅｔｒｉｘ）は、試験株ＴＡ７０００シリーズを使用した選択培地への曝露細胞の平板培養の自動化を可能にする、揺動アッセイの改良法として報告されている（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｈ．Ｌら、１９７６；Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ、Ｄ．Ｇ．＆Ｄｅｌｏｗ，Ｇ．Ｆ．，１９７９；及びＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｍ．Ｆ．＆Ｎｅｓｔｍａｎｎ、Ｅ．Ｒ．，１９９０）。
【００１２】
この様な改良型プロトコール技術は、比較的持続的に改良されてきたにもかかわらず、例えば上記の如く細菌突然変異誘導性については未だにエームス試験が推奨されている；即ち当業者は例えば試験作用物質の必要量、結果を得るまでに必要な時間、復帰突然変異の用手法測定、高処理アッセイへの規模拡大し易さの欠如等といったアッセイの改訂に関する必要性が未だ存在することを認識するだろう。  同様に当業者は、同様の限界がアンピシリン−感受性からアンピシリン−耐性への復帰突然変異を測定する既存のβ−ラクタム試験（例えばＢｏｓｗｏｒｔｈ、Ｄ．ら、１９８７；Ｆｏｓｔｅｒ、Ｐ．Ｌ．ら、１９８７；Ｄｅｌａｉｒｅ、Ｍ．ら、１９９１；Ｌｅｅ、Ｃ−Ｃ．，ら、１９９４；及びＨｏｕｒ、Ｔ−Ｃ．，ら、１９９８参照）だけでなくトリプトファン遺伝子内の点突然変異を前提とした既存の突然変異誘導性アッセイにも存在していること（例えば大腸菌ＷＰ２を使用した場合については、例えばＭｃＣａｌｌａ、Ｄ．Ｒ．とＶｏｕｔｓｉｎｏｓ、Ｄ．，１９７４参照）を理解するだろう。
【００１３】
本発明は、一部において改良型の復帰突然変異誘導試験を提供する。アッセイは専らエームス試験で利用された特性が良く解析されているＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株を使用するが、これら株は構成的プロモーターの制御下に発現性の異種由来ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体を含むプラスミドを獲得することを目的として、ここに記した如くに更に改良されている。これによりこれら微生物は、以下更に詳細記すように代謝活性になった場合に測定可能な光を発する様になる。
【００１４】
細菌性生物発光及びｌｕｘオペロン、ならびにその応用については当分野で良く知られている（例えばＭｅｉｇｈｅｎ、Ｅ．Ａ．，１９８８；Ｆｒａｃｋｍａｎ、Ｓ．ら，１９９０；Ｊａｓｓｉｍ、Ｓ．Ａ．Ａ．ら、１９９０；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｇ．Ｓ．Ａ．Ｂ、１９９０；Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｇ．Ｓ．Ａ．Ｂ．＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．，１９９２；Ｍｅｉｇｈｅｎ、Ｅ．Ａ．，１９９３；Ｈｉｌｌ，Ｐ．Ｊ．，ら、１９９３；Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ、Ｉ．ら．，１９９４；Ｈｉｌｌ、Ｐ．Ｊ．＆Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｇ．Ｓ．Ａ．Ｂ、１９９４；Ｍａｒｉｎｃｓ、Ｆ．＆Ｗｈｉｔｅ、Ｄ．Ｗ．Ｒ．，１９９４；Ｃｈａｔｅｒｊｅｅ、Ｊ．＆Ｍｅｉｇｈｅｎ、Ｅ．Ａ．，１９９５；及びＶｏｉｓｅｙ、Ｃ．Ｒ．＆Ｍａｒｉｎｃｓ、Ｆ．，１９９８参照）。
【００１５】
ｌｕｘ構造オペロンのｌｕｘＡ及びｌｕｘＢ遺伝子はそれぞれ細菌ルシフェラーゼの非同一型α及びβサブユニットをコードし、レポーター遺伝子として広く利用されている（例えばＳｔｅｗａｒｔ、Ｇ．Ｓ．Ａ．Ｂ及びＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．，１９９２；及びＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ、Ｊ．＆Ｍｅｉｇｈｅｎ、Ｅ．Ａ．，１９９５参照）。生じたヘテロダイマーはＦＭＮＨ2及び長鎖脂肪アルデヒドの酸化を触媒し、その結果光りを放射する。代謝的に活性な細菌細胞はＦＭＮＨ2を産ずる。
【００１６】
ｌｕｘオペロンのｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ及びｌｕｘＥ遺伝子は脂肪酸還元酵素複合体をコードしており、そのうちのｌｕｘＣは還元酵素ポリペプチドをコードし、ｌｕｘＤはトランスフェラーゼポリペプチドをコードし、そしてｌｕｘＥは合成酵素ポリペプチドをコードしている。脂肪酸還元酵素複合体は、ルシフェラーゼに必要なアルデヒド基質を産ずる。ルシフェラーゼによる基質の切断が内因性ＡＴＰを必要とし、生物発光を生ずる。
【００１７】
細菌生物発光反応はＦＭＮＨ2及びＯ2も必要とする。上記の如く、代謝的に活性な細菌細胞はＦＭＮＨ2を産ずる。新規試験株の代謝的に活性な細胞は、試験作用物質に曝された後には非突然変異表現形に復帰し、従って選択培地、例えば場合によってヒスチジンを含まない培地、トリプトファンを含まない培地、アンピシリンを含む培地中にて増殖できる細胞であり、その結果増殖により（又は代謝活性により）変異の自然復帰により生ずるものに比べより大きな発光が放射され、そして前記自然復帰の程度は例えば例えば賦形剤（例えば溶媒）を含むアッセイにサンプルと細胞のみを加えたもの、及び／又は賦形剤と外来性の代謝活性化システムを加えたものにより測定することができる。
【００１８】
選択された新規細菌株に応じて、ｎｇ／μｇ程度の量の試験作用物質が使用されるだろう。更に、発光復帰コロニーの生物発光の読みとりは本質的に迅速であり、ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）を発現させる構成的プロモーターにより、復帰コロニーは可能な限り長期にわたりその代謝活性を維持し、例えばＦＭＮＨ2を産生する。即ち本発明は、エネルギーを産生する細胞の能力に関するセンサーとして生物発光を利用するアッセイを提供する。従って本アッセイは、本記載に基づき望まれる形に、測定値として代謝活性を利用するアッセイに適合させることができる。
【００１９】
更に、本発明のアッセイでの使用に適した細胞は、各種ルシフェラーゼを含む哺乳動物であろう（例えばＢｒｏｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．，ら、１９９４参照）。最も一般的な細胞は米国産ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のｌｕｃ遺伝子である。このシステムでは、ルシフェリンはｌｕｃ遺伝子にコードされたルシフェラーゼによる切断の基質として作用する。従って内因性基質、例えばルシフェリンが好適手段により、哺乳動物細胞を利用する本発明のアッセイに供給される。更に、生物発光はエネルギー源としてＡＴＰを、そして当業者が理解する様に環境中に大量に存在する酸素を必要とする。
【００２０】
本発明により提供されるエームス試験の改良、及びその変更は更に必要とされる試験作用物質の量及びプロトコールに関する困難さを減らし、実質的に迅速な読みとりを可能にし、それにより特定の試験作用物質が点突然変異の復帰をもたらすか否か、即ち変異誘導剤であるか否かを決定することができる。この様なアッセイは、高処理スクリーニングに関するアッセイ能力について求められてきた自動化及びスケールアップを容易にする。この様な規模拡大性は、前臨床研究の極初期にて推定医薬品産物の高処理スクリーニング（突然変異誘導性又は遺伝毒性に関する）を可能にすることで、医薬品産業に大きな利便性をもたらす。遺伝毒性が初期に判明することは医薬製品候補に伴う消耗を減らし、従って意志決定の効率を上げることができる。更に本発明により提供されるアッセイは、化合物に遺伝毒性を付与する化合物の特性、例えば特定の置換基を決定することにも利用でき、それにより非突然変異性化合物の設計を支援することもできる。
【００２１】
ここに引用される全ての資料は、前述のものも含めその全てがここに参照され、取り込まれる。
【００２２】
本発明は、第１の側面に於いては、細胞の代謝的に活性の程度を評価するための新規アッセイにあって；構成的プロモーター制御下に発現可能な異種由来ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体を含む細胞により放出される光を測定すること；前記細胞の環境を変えること；及び前記変更前に前記細胞より放射された光の量と前記変化後に前記細胞より放射された光の量とを比較することを含み；前記細胞が代謝的に活性である場合に光産生反応に十分な量のＦＭＮＨ2を前記細胞が生じることを前提に前記変化後に放出された前記光の量が増加することが前記細胞が前記変化後により代謝的に活性であることを意味し；そして前記変化後に放射された光の量が減少することが前記変化後に細胞が代謝活性的に低いことを意味するアッセイを提供する。
【００２３】
第１側面の好適実施態様では、ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体（又はオペロン）はＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓより単離される。
第１側面の別の好適実施態様では、細胞は培地中にあり、そして前記変化が前記培地への試験作用物質の添加を含む。
【００２４】
第１側面の別の好適実施態様では、細胞は培地中にあり、前記変化が前記培地への試験作用物質の添加を含み、そして前記培地は更に前記試験作用物質に関する外来性代謝活性システムを含む。
【００２５】
第１側面の別の好適実施態様では、細胞は培地中にあり、前記変化が前記培地への試験作用物質の添加を含み、前記培地は更に前記試験作用物質に関する外来性代謝活性システムを含み、そして前記細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ１５３５ｌｕｘ（ＵＣ２５４４７）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ１００ｌｕｘ（ＵＣ２５４４８）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ９８ｌｕｘ（ＵＣ２５４４９）を含むグループから選択され、前記培地は実質的にヒスチジンを含まず、前記外来性代謝活性システムがＳ−９標本であり、そして前記試験体の前記添加後の前記増加が前記試験作用物質が前記細胞のヒスチジン遺伝子突然変異を復帰させることを意味する。
【００２６】
第１側面の別の好適実施態様では、細胞は培地中にあり、前記変化が前記培地への試験作用物質の添加を含み、前記培地は更に前記試験作用物質に関する外来性代謝活性システムを含み、そして前記細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＷＰ２ｌｕｘ（ＵＣ２５４５２）であり、前記培地が実質トリプトファンを含まず、前記外来性代謝活性システムがＳ−９標本であり、そして前記試験体の前記添加後の前記増加が前記試験作用物質が前記細胞のヒスチジン遺伝子突然変異を復帰させることを意味する。
【００２７】
第１側面の別の好適実施態様では、細胞は培地中にあり、前記変化が前記培地への試験作用物質の添加を含み、前記培地は更に前記試験作用物質に関する外来性代謝活性システムを含み、そして前記細胞がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ２２２０ｌｕｘ（ＵＣ２５４５０）又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ２２１１ｌｕｘ（ＵＣ２５４５１）であり、前記培地はアンピシリンを含み、前記外来性代謝活性システムがＳ−９標本であり、そして前記試験体の前記添加後の前記増加が前記試験作用物質が前記細胞のβ−ラクタマーゼ遺伝子突然変異を復帰させることを意味する。
【００２８】
前記第１側面の別の好適実施態様では、細胞は培地中にあり、そして前記培地は１より多い試験作用物質を含む。
前記第１側面の別の好適実施態様では、細胞は培地中にあり、前記試験作用物質が前記培地に加えられ、前記試験作用物質が突然変異誘発剤であり、そして前記発光の前記増加後に別の試験作用物質が加えられ、第２試験作用物質が突然変異表現形を復帰させる復帰突然変異を生じるか否かが決定される。
【００２９】
本発明は、第２側面に於いて発現性異種由来ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体及び実質的に復帰性である点突然変異を含む細胞を提供する。
前記第２側面の好適実施態様では、前記点突然変異はヒスチジン遺伝子内にある。
【００３０】
前記第２側面の別の好適実施態様では、前記点突然変異はヒスチジン遺伝子内にあり、前記細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ１５３５ｌｕｘ（ＵＣ２５４４７）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ１００ｌｕｘ（ＵＣ２５４４８）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ９８ｌｕｘ（ＵＣ２５４４９）を含むグループから選択される。
【００３１】
前記第２側面の別の好適実施態様では、前記点突然変異はトリプトファン遺伝子内にある。
前記第２側面の別の好適実施態様では、前記点突然変異はトリプトファン遺伝子内にあり、そして前記細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＷＰ２ｌｕｘ（ＵＣ２５４５２）である。
【００３２】
前記第２側面の別の好適実施態様では、前記点突然変異はβ−ラクタマーゼ遺伝子である。
前記第２側面の別の好適実施態様では、前記点突然変異はβ−ラクタマーゼ遺伝子であり、前記β−ラクタマーゼ活性部位はセリンコドン内にある。
【００３３】
前記第２側面の別の好適実施態様では、前記点突然変異はβ−ラクタマーゼ遺伝子であり、前記β−ラクタマーゼの活性部位はセリンコドン内にあり、そして前記細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ２２２０ｌｕｘ（ＵＣ２５４５０）又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ２２１１ｌｕｘ（ＵＣ２５４５１）である。
【００３４】
従って、本発明は生物発光復帰変異誘導性アッセイにあって；細菌細胞をある量の試験作用物質及びある量の外来性代謝活性システムと接触させることにあって、前記細胞が発現性異種由来ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体（又はオペロン）及び非突然変異型では選択培地中にて細胞が代謝的に活性であるために重要な機能を持つポリペプチドをコードしている遺伝子内の復帰型点突然変異を含んでいるもの；前記細胞から発する光の量を測定すること；及び前記細胞が代謝的に活性である場合には細胞が光産生反応にとって十分な量のＦＭＮＨ2を産生する場合において、前記試験作用物質及び前記外来性代謝活性システムに曝露した前記細胞より発せられる前記光の前記量と前記試験作用物質が無い状態で外来性代謝活性システムとを比較することを含むものであり；発光量が前記試験作用物質及び前記外来性代謝活性システムと接触した前記細胞内に検出され、そして前記試験作用物質なしに前記外来性代謝性活性化システムに曝された前記細胞には実質的な発光量が検出されないことが、前記試験作用物質が変異誘導剤であることを意味するアッセイを提供する。
【００３５】
いずれの好適材料も本発明の実施態様において試験作用物質として利用することができる。好ましい試験作用物質には、小分子、ペプチド、既知又は推定突然変異誘発剤及び発癌剤、抗体、アンチセンスＲＮＡ、代謝仮性の既知阻害剤等が含まれる。特に好ましい試験作用物質には、小分子及び既知突然変異誘発剤及び発癌剤が含まれる。
【００３６】
本発明はまた、第３側面において以下を含む代謝的に活性な細胞の範囲を評価するための新規アッセイにアッセイにあって：ある量のルシフェリン存在下に、構成的プロモーターの制御下に発現可能な外来性ｌｕｃ遺伝子を含む細胞から発せされた光の量を測定すること；前記細胞の環境を変化させること；及び前記変更前に前記細胞より放射された光の量と前記変化後に前記細胞より放射された光の量とを比較すること；前記細胞が代謝的に活性である場合には前記細胞が光産生反応に十分な量のＡＴＰを産生することを前提として、前記変化後に放出された前記光の量が増加することが前記細胞が前記変化後により代謝的に活性であることを意味し；そして前記変化後に放射された光の量が減少することが前記変化後に細胞が代謝活性的に低いことを意味するアッセイを提供する。
【００３７】
第３側面の好適実施態様では、細胞は培地中にあり、そして前記変化が前記培地への試験作用物質の添加を含む。
第３側面の別の好適実施態様では、細胞は培地中にあり、前記変化が前記培地への試験作用物質の添加を含む、そして前記培地は前記試験作用物質に関する外因性代謝活性化システムを更に含む。
【００３８】
第３側面の別の好適実施態様では、細胞は培地中にあり、前記変化は前記培地への試験作用物質の添加を含み、前記培地は前記試験作用物質に関する外来性代謝活性システムを含み、そして前記細胞は更に非変異型遺伝子が選択培地中にある前記細胞の機能発現にとって重要な成分を提供する遺伝子内の復帰型点突然変異も含んでいる。
【００３９】
第３側面の別の好適実施態様では細胞は培地中にあり、前記変化は前記培地への試験作用物質の添加を含み、前記培地は前記試験作用物質に関する外来性代謝活性システムを含み、そして前記細胞は更に非変異型遺伝子が選択培地中にある前記細胞の機能発現にとって重要な成分を提供する遺伝子内の復帰型点突然変異も含んでおり、前記培地が前記非突然変異型遺伝子より提供される前記重要成分を含まず、前記外来性代謝活性化システムがＳ−９標本であり、そして前記試験帯の前記添加後の前記上昇が前記試験作用物質が前記細胞の前記遺伝子内の点突然変異を復帰させたことを意味する。
【００４０】
第３側面の別の好適実施態様では、前記細胞はさらに遺伝子内に復帰型点突然変異にあって、前記遺伝子の非突然型が選択培地中での前記細胞の機能にとって重要なポリペプチドをコードしている変異も含む。
【００４１】
本発明は第４の側面にて、前記化合物に突然変異性を付与する化合物の特性（例えば化学及び／又は構造）を決定する方法にあって；実質的に同一な細菌細胞と化合物ライブラリーの各化合物の一定量及び前記化合物を活性化するのに実質十分な量の外来性代謝活性化システムとを接触させることにあって、前記各細胞が非変異型の場合にはその機能が選択培地内で細胞が代謝的に活性であることに関し重要であるポリペプチドをコードしている遺伝子の中に、発現可能な異種由来ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体（又はオペロン）及び復帰型点突然変異を含んでいるもの；前記細胞それぞれから発する光の量を測定すること；及び前記化合物ライブラリーの前記化合物の前記量及び前記外来性代謝活性化システムに曝された前記各細胞より発せられた前記光の量と、前記化合物ライブラリーの前記量が存在しない状態で外来性代謝活性システムに接触した実質的に同一な細胞より発生された前記光の量を比較することにあって；前記の発光量が前記化合物ライブラリーの前記化合物の前記量と前記外来性代謝活性化システムと接触した前記細胞、に検出され、そして前記ライブラリーの化合物の前記の量がない状態で前記外来性代謝活性化システムと接触した前記細胞には発光量が実質検出されず、これが前記化合物ライブラリーの前記化合物が変異誘導剤であることを意味する比較；及び前記細胞が前記細胞が代謝的に活性な場合に光り産生反応にとって十分な量のＦＭＮＨ2を生ずることと前提として、発光を引き起こした前記ライブラリーの各前記化合物の化学的及び構造的特性を比較することで共通特性を特定することを含む、方法を提供する。
【００４２】
本発明は第５の側面にて、前記化合物に突然変異性を付与する化合物の特性（例えば化学及び／又は構造）を決定する方法にあって；実質的に同一な哺乳動物細胞と化合物ライブラリーの各化合物の一定量及び前記化合物を活性化するのに実質十分な量の外来性代謝活性化システムとを接触させることにあって、前記各細胞が非変異型の場合には、その機能が前記ポリペプチドの基質存在する場合に於いて選択培地内で細胞が代謝的に活性であることに関し重要であるポリペプチドをコードしている遺伝子の中に、発現可能な異種由来ｌｕｃ遺伝子及び復帰型点突然変異を含んでいるものであり；前記細胞それぞれから発する光の量を測定すること；及び前記化合物ライブラリーの前記化合物の前記量及び前記外来性代謝活性化システムに曝された前記各細胞より発せられた前記光の量と、前記化合物ライブラリーの前記量が存在しない状態で外来性代謝活性システムに接触した実質的に同一な細胞より発生された前記光の量を比較することにあって；前記の発光量が前記化合物ライブラリーの前記化合物の前記量と前記外来性代謝活性化システムと接触した前記細胞、に検出され、そして前記ライブラリーの化合物の前記の量がない状態で前記外来性代謝活性化システムと接触した前記細胞には発光量が実質検出されず、これが前記化合物ライブラリーの前記化合物が変異誘導剤であることを意味する比較；及び前記細胞が前記細胞が代謝的に活性な場合に光り産生反応にとって十分な量のＡＴＰを生ずることと前提として、発光を引き起こした前記ライブラリーの各前記化合物の化学的及び構造的特性を比較することで共通特性を特定することを含む、方法を提供する。
【００４３】
試験作用物質はまた１より多い作用物質を含む標本であっても良く、従って本発明のアッセイは標本の非突然変異誘導性又は低突然変異誘導性成分から突然変異誘導性試験作用物質を単離するのにも利用できる。更に、様々な方法を使い作用物質を活性化し各種代謝体を作り出すことで、突然変異誘導性代謝物を同定できる。
【００４４】
好ましい外来性活性化システムにはＳ−９肝臓マイクロゾーム標本、Ｓ−９標本より実質的に精製されたミクロゾーム酵素、又は組換え体肝臓ミクロゾーム酵素の組み合わせが含まれる。特に好ましい実施態様では、Ｓ−９標本はヒト又はラット肝臓からの標本に由来する。
【００４５】
特記ない限り本明細書及び添付クレームを通じ使用される用語は、一般には当業者により理解される通常の意味を有している（例えばＴｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｌａｃｋｉｅ，Ｊ．ＭとＤｏｗ  Ｊ．Ａ．Ｔ．，１９９９年Ａａｃｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）より発刊；及びＩｎｓｔａｎｔ  Ｎｏｔｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．Ｃ．ら、１９９８年ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄより発刊を参照）。ここに使用される限りにおいて以下の用語は次の一般的な意味を持つ：
生物発光は、光が生きている生命体によって作られ、例えば細菌ルシフェラーゼ又はホタルルシフェラーゼにより触媒される反応より生じる現象である；
カセットとは、その中に挿入体を入れることができる既存構造体であり、一般には特定のベクター、例えば隣接するＤＮＡ配列の発現に必要とされる全てのものを含むベクターを表すのに使用される；
コドンは転移ＲＮＡ上にある安置コドンにより認識されるＤＮＡのコーディング単位（３塩基組）であり、蛋白質合成中にポリペプチドに取り込まれるアミノ酸を規定する；
フレームシフト突然変異はＤＮＡ配列中にあるオープンリーディングフレーム内への挿入又は欠失である；
グラム陰性細菌はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの様な、内毒素（リポポリサッカライド）を含む該膜が結合した薄いペプチドグリカン細胞壁を持つ細菌である；
グラム陽性細菌とは、ペプチドグリカンと複合体形成するテイコ酸及びリポテイコ酸を含む厚い細胞壁を持つ細菌である；
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）とは、蛋白質に翻訳可能なＤＮＡ配列の可能な読みとり方である；
オペロンとは１単位としてコントロールされポリシストロン性のｍＲＮＡ（１片）を生ずる、共通プロモーターを持つ細菌遺伝子のグループであり、 少なくとも２個の構造遺伝子とこれら構造遺伝子の転写を制御する制御要素から成る；
プラスミド（エピゾーム）とは、前核生物及び真核生物の両方に見いだされる小型の自立的に複製される直鎖型又は環状の細胞質ＤＮＡであり、自己複製できある生物から別の生物にトランスファーすることができ、一般にクローニングベクター（遺伝子のベクター）として使用される；
点突然変異とは、単一塩基対を別の塩基対に置換する突然変異である；
プロモーター（構成的）とは ＤＮＡからＲＮＡへの転写が開始される前にＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡの領域である；
制限酵素（エンドヌクレアーゼ）とは、特異的部位にてＤＮＡを切断することができる細菌性の酵素の１分類である；
制限部位とは、制限酵素により切断することができるＤＮＡ中の部位である；  トランスポゾン（転移可能エレメント）は染色体内の不特定の部位にて複製し、そのコピーを挿入することができる小型の、移動性のＤＮＡ配列である；
転換とは、特定部位でのアデニン（Ａ）のグアニン（Ｇ）への転換突然変異の様な、プリンがピリミジンに置換される、又はその逆の突然変異である；
ベクターとは、ある生物から別の生物にＤＮＡ配列を移すことに利用できるプラスミドである。
【００４６】
特記ない限り、本明細書及び添付クレームと通して％はパーセントであり；２Ａは２−アントラミンであり；ＡＧＥはアガロースゲル電気泳動であり；ＡＴＣＣは米国標準株コレクションであり；℃は摂氏温度であり；ｃｍ2は平方センチメートルであり；ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドであり；ＤＮＡはデオキシリボ核酸であり；ＥＤＴＡはエチルジアミンテトラ酢酸であり；ＦＭＮＨ2は還元型フラビン１ヌクレオチドであり；ｋｂはキロベースであり；ＫＣＮはシアン化カリウムであり；ＫＶはキロボルトであり；ｍｇはミリグラムであり；ｍＬはミリリットルであり；ｍＭはミリモル（濃度）であり；ＭＮＮＧはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジンであり；ｍＲＮＡはメッセンジャーリボ核酸であり；Ｖはボルトであり；ＮａＮはアジ化ナトリウムであり；ｎｇはナノグラムであり；ｎｍはナノメートルであり；ＯＤは、ＯＤ600が６００ｎｍに於ける光学密度を示す様な光学密度であり；ＰＢＳがドルベッコのリン酸バッファー食塩水であり；ｒｌｕは相対発光単位であり；ｒｐｍは分あたりの回転数であり；ｓｅｃは秒であり；ＳＯＣ（Ｓｕｐｅｒ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ）培地は２％バクトトリプトン、０．５％酵母抽出物、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4であり；ＴＡＥバッファーは４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、２ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ×２Ｈ2Ｏであり；μｇはマイクログラムであり；μＬはマイクロリットルであり；μｓｅｃはマイクロ秒であり；ＵＶは紫外線であり；μＷはマイクロワットであり；ＶＢＢＨ培地は４ｍｇ／ｍＬグルコース、２０μＬ／ｍＬ  ＶＢ濃縮液（５０×）、７．５μｇ／ｍＬビオチン及び５μｇ／ｍＬヒスチジンであり；そしてフォーゲル−ボナー塩濃縮液は１％ＭｇＳＯ4×４Ｈ2Ｏ、１０％クエン酸モノヒドレート、５０％Ｋ2ＨＰＯ4及び１７．５％Ｎａ2ＮＨ2ＰＯ4×４Ｈ2Ｏである。
【００４７】
ＡＴＣＣは米国、２０１１０−２２０９、バージニア州、マナサス、１０８０１ヴルヴァード大学にある。ベーリンガーマンハイム（ベーリンガー）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈａｉｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））はドイツ、マンハイムにある。ＤＩＦＣＯＴＭ（ｗ／ＢＤ  バイオサイエンス）は米国、メリーランド州、スパークにある。エピセントレテクノロジー社（エピセントレ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ））は米国ウイスコンシン州、マジソンにある。ライフテクノロジー社は米国、メリーランド州、ロックビルにある。モレキュラーデバイス社は米国、カリフォルニア州、サニーベールにある。モレキュラートキシコロジー社は、米国、ノースキャロライナ州、ブームにある。ＱＩＡＧＥＮ社は米国、カリフォルニア州、バレンシアにある。ロシュモレキュラーバイオケミカル社（ロシュ）は米国、インディアナ州、インディアナポリスにある。シグマ社は米国、ミズーリ州、セントルイスにある。シグマ−ジノシス社は米国、ミズーリ州、セントルイスにある。ストラタジーン社は米国、カリフォルニア州、ラジョラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）にある。キセノメトリックス社（Ｘｅｎｏｍｅｔｒｉｘ）は米国、コロラド州、ボルダーにある。
【発明の詳細な説明】
【００４８】
エームスアッセイＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｉｍｕｒｉｕｍのヒスチジン突然変異体のセットを使用する。これら突然変異体はそれぞれヒスチジン遺伝子の一つに特有の可逆的点突然変異を有しており、これが突然変異体をヒスチジン産生できない様にしている。突然変異体は、試験作用物質を活性化できる哺乳動物（一般にはラット又はヒト）の肝臓ホモジェネート（Ｓ−９分画、肝臓マクロゾーム酵素）存在下に試験物質（推定突然変異誘導剤）に曝され、ヒスチジン要求突然変異のセット内に試験作用物質により誘導された復帰体コロニー（ヒスチジンが合成できる）の数が決定される（エームスは試験した化合物の結果が２日間でスコア化できることを開示している）。コントロール値は；（ａ）試験作用物質を含むがＳ−９混合体は含まないプレート上にある復帰体コロニーの数、及び（ｂ）Ｓ−９混合体は含むが試験作用物質は含まないコロニー上の復帰体コロニーの数として決定される。続いて試験体及びコントロールの値が比較される。
【００４９】
標準的なＡＭＥＳ試験（毒物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）、３章、遺伝毒物学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）：突然変異誘導及び付加物形成（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｄｄｕｃｔ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、３章序、ユニット３．１   突然変異誘導性に関するサルモネラ（エームス）試験）では、６ヒスチジン（ｈｉｓ）突然変異株のセットが開発され（ＴＡ７００１（ｈｉｓＧ１７７５）、ＴＡ７００２（ｈｉｓＣ９１３８）、ＴＡ７００３（ｈｉｓＧ９０７４）、ＴＡ７００４（ｈｉｓＧ９１３３）、ＴＡ７００５（ｈｉｓＧ９１３０） 及びＴＡ７００６（ｈｉｓＣ９０７０））、特定突然変異誘導剤の変異誘導スペクトル、即ち特異的な塩基対の置換によるこれら株の復帰について決定された（例えばＧｅｅ，Ｐ．，ら、１９９４参照）。６株はそれぞれ以下の突然変異の１つを欠失した；Ｔ；Ａ→Ｃ：Ｇ、Ｔ：Ａ→Ａ：Ｔ、Ｔ：Ａ→Ｇ：Ｃ、Ｃ：Ｇ→Ｔ：Ａ、Ｃ；Ｇ→Ａ：Ｔ又はＣ：Ｇ→Ｇ：Ｃ、そしてそれ自体は自然復帰頻度と同程度に低いものであった（例えば毒物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）、３章、遺伝毒物学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）：突然変異誘導及び付加物形成（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｄｄｕｃｔ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、３章序、ユニット３．１   突然変異誘導性に関するサルモネラ（エームス）試験、補助プロトコール４：株の遺伝分析（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ）を参照）。これら細胞を突然変異誘導剤で処理すると、非復帰細胞（ｈｉｓ-）とは異なり内因性にヒスチジンを生ずることができる復帰体（ｈｉｓ+）の数が増加した。復帰体はｈｉｓ-細胞の背景の上で増殖する細胞のコロニーとして検出される。
【００５０】
本発明により与えられるエームスアッセイの生物発光改良法は、遺伝的に変更され好ましくはＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ、Ｔ．Ｃ．ら、１９９０；Ｓｚｉｔｔｎｅｒ、ＲとＭｅｉｇｈｅｎ、１９９０；及びＸｉ，Ｌ．ら、１９９１参照）由来のｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）オペロンを発現するエームスサルモネラ試験株を利用する。
【００５１】
Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来ｌｕｘＣＤＡＢＥオペロン（ＡＴＣＣ番号２９９９９、Ｇ．Ｍ．Ｔｈｏｍａｓの貢献による）はルシフェラーゼ（Ａ及びＢ）及び脂肪酸還元酵素（Ｃ、Ｄ及びＥ）をコードしている（Ｆｒａｃｋｍａｎ、Ｓ．ら、１９９０）。脂肪酸還元酵素は内因性基質を生じ、これがルシフェラーゼにより分解される。反応は内因性のＦＭＮＨ２の形のエネルギー供給を必要とし、可視的な測定可能な生物発光を生じる（Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｇ．Ｓ及びＷｉｌｌｉａｍｓ、Ｐ，１９９２）。本発明のアッセイの利点は、３７℃にて安定であることであり、これにより３７という生理学的温度で実験を行うことが可能になる。更に、脂肪酸還元酵素が存在することで外来基質による生物発光反応の補充の必要がない閉鎖システムを提供おする。当業者は、本記載に基づき、好適微生物より単離された他の好適ルシフェラーゼもまた本発明に利用できること、例えば本発明がＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来のｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）の使用に限定されないことを容易に理解するだろう（Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｇ．Ｓ．及びＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．，１９９２）。
【００５２】
当業者が本記述より知る如く、好適方法を利用し本発明のｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットを調整することができる。本発明の好適実施態様では、カナマイシントランスポゾンＥＺ：ＴＮ＜ＫＡＮ−２＞（エピセントレ）がｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットのベースに使用される、この場合カナマイシン耐性（カナマイシンホスホトランスフェラーゼ）遺伝子の発現は構成的プロモーターにより制御されており、ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）の発現は、カナマイシンホスホトランスフェラーゼプロモーターからの読み過ごしにより行われる。ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）の読み過ごし発現が報告されている（例えばＷｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋら、１９９８参照）。各種好適構成的プロモーターを使いｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）の発現を制御することができる。本発明の好適カセットの利点は、比較的小型であり、ＤＮＡの平滑端断片としてＰｖｕＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより切り出すことができることである。これにより比較的容易にｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットを様々な好適プラスミド内に挿入することができる。更に、カナマイシン耐性遺伝子の存在はアンピシリン耐性表現形を持った株内での形質転換細胞の選別に有用である。
【００５３】
発光試験株はプラスミッド上にあるｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットを使用し作られる。あるいは、ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットは細菌染色体内に挿入できる。例えば、ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットを含むトランスポゾンを酵素トランスポーザス（エピセントレ）と共に使用しトランスゾームを形成し、染色体内に挿入することができる。あるいはその他のトランスポゾン作製に関する好適手段も本発明に使用できる（ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ．Ｖ．，ら、１９９３、及び１９９０）。当業者は本記述に基づき、ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）オペロンの挿入がＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｏｓ ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、（２０００）、第１章、大腸菌、プラスミド及びバクテリオファージ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｌａｓｍｉｄｓ、ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ） に記載の様なファージベクターを使用し成し遂げられることに気付くだろう。
【００５４】
当業者は、本記述に基づき本発生での使用に適した細菌へのｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）の 導入が、各種好適技術により達成されること、及び細菌試験株の構築を成功させるための重要条件が代謝的に活性である細胞においてのみ安定な生物発光を達成することであることに気付くだろう（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１章、ユニット１．８  プラウｓみどＤＮＡの細胞内への導入（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｃｅｌｌｓ）。
【００５５】
好適細胞は、発明の高処理能力変異誘導性アッセイの開発に利用することができる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの元のエームス株（Ａｍｅｓ、Ｂ．Ｍ．，１９７３）は本発明により提供される生物発光細菌復帰型突然変異体アッセイの好適実施態様の開発に使用された。この様な株は、例えばそれらが元のエームス試験と実質的に相関することを示すデータを示すことから選別された（Ｖｏｌｌｍａｒ、Ｊ．及びＥｄｌｅｒ、Ｌ．，１９９０）。大腸菌ＷＰ２の様なその他の株（ＭｃＣａｌｌａ、Ｄ．Ｒ．ら、１９７５）も本発明のアッセイに使用できる。
【００５６】
当業者は、本記述に基づき細菌復帰突然変異体アッセイに好適であるいずれの細菌試験株も本発明のアッセイに使用できることを認識するだろう。例えば好適実施態様では、β−ラクタマーゼ復帰系が用いられる。更に本発明のアッセイのエンドポイントは活性な代謝の維持を誘導する事象になれ、従って点突然変異の復帰に限定されない。
【００５７】
しかし発明により提供されるシステムが最終的に発光を利用できるいずれの生物、例えば酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）も本発明のアッセイに利用できる。    例えばｌｕｘＡ及びｌｕｘＢを融合し、酵母内で機能するルシフェラーゼを形成することができる（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓａｎｄ，Ｓ．Ｔら、１９９２）。当業者は本記載に照らし、本発明により利便性の改良を与える様に変更可能である既知アッセイが多数あることを認識するだろう（例えばＳｈｃｉｅｓｔｌ、Ｒ．Ｈ．，１９８９により記載された欠失組換えアッセイ）。本発明のアッセイはまた哺乳動物細胞も使用でき、そして当業者は本発明よりこれら細胞をどの様に作製し利用するか理解するだろう。
【００５８】
当業者は本発明の記述より何れの好適アッセイ形式も本発明のアッセイに利用できることを知るだろう。好適実施態様では、現在利用可能な道具を使い高処理を達成できる利点からマルチウエル型プレートが使用される。本発明のアッセイは非液系（例えばトップ軟寒天中に播かれた細胞をボトム寒天）又は液系（例えば液体培地）のいずれでも実施できる。好適実施態様では、アッセイはトップ軟寒天中に播かれた試験細胞を有するボトム寒天を使用する。液体培地系を使用する場合には、培地の混合、攪拌、及び／又は循環を最適化し、復帰変異体の増殖を障害し、データを誤らせることがある選択的検出現象（Ｓｕｒｅｔｔｅ、Ｍ．Ｇ及びＢａｓｓｌｅｒ、Ｂ．Ｌ．，１９９８）を誘導することがある望ましくない細胞の沈降を除かねばならない。別の実施態様では寒天の代わりに培地中に増粘剤、例えばカルボキシメチルセルロースを使用する。更に別の好適実施態様では、細菌試験株のバイオフィルムが使用される。
【００５９】
いずれの好適な代謝活性システムも、望まれ場合には本発明のアッセイにて試験作用物質の活性化に使用できる。好ましい代謝活性化システムには、例えばＳ−９が含まれる。本調製体の使用に適した試料及び条件は当分野周知である（毒物学に於ける最新プロトコール法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｏｓ ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、ユニット３．１、突然変異誘導性に関するサルモネラ（エームス）試験、補助プロトコール（ＴｈｅＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ａｍｅｓ）Ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ、Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｐｒｔｏｃｏｌ）５：代謝活性化システム（Ｓ−９）の調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓ−９）；Ａｍｅｓ，Ｂ．Ｎら、１９７５；及びＭａｒｏｎ、Ｄ．Ｍ．とＡｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．，１９８３）。更に、当業者は、典型的なＳ−９標本が含み、その試験試薬を活性化することに役割を果たす１酵素、又はその組合せがそれが望ましい場合には、本発明のアッセイに使用することができることを知るだろう。
【００６０】
当業者は本記述に基づき、所望する結果を得るにはどの様に好適試薬とアッセイ条件を選択するか理解するだろう（例えば毒物学に於ける最新プロトコール法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｏｓ ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）３章、遺伝毒物学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）：突然変異誘導及び付加物形成（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｄｄｕｃｔ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、３章序、ユニット３．１   突然変異誘導性に関するサルモネラ（エームス）試験、試薬と溶液（Ｅｒｒｏｉ  Ｚｅｉｇｅｒ機構、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ａｎｄ  Ｋｒｉｓｔｉｅｎ  Ｍｏｒｔｅｌｍａｎｓ、ＳＲＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及び表（表３．１．１  一般的に使用されるサルモネラ試験株とその遺伝子型（Ｃｏｍｍｏｎｌｙ  Ｕｓｅｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｅｓｔｅｒ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ）、表３．１．２推奨される陽性コントロール化学物質及び試験（各種既知試験株に適した）（Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔ（ｆｏｒ）  ｖａｒｉｏｕｓ  ｋｎｏｗｎ  ｔｅｓｔｅｒ  ｓｔｒａｉｎｓ）、表３．１．３サルモネラ試験株に適した自然発生コントロールの価値（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｅｓｔｅｒ  Ｓｔｒａｉｎｓ）、及び表３．１．４エームス試験に関するトラブルシューティングガイド（Ｔｒｏｕｂｌｅｓｈｏｏｔｉｎｇ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｍｅｓ  Ｔｅｓｔ）参照）。
【００６１】
生物発光細胞を検出することに適したいずれかの好適手段が本発明のアッセイに使用できる。例えば好適実施態様では、光子量子測定−電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ（Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用い生物発光性微小コロニーが検出される（Ｓｉｌｃｏｃｋ、Ｄ．Ｊ．ら、１９９２）。あるいは、通常の３５ｍｍフィルム又はＸ−線フィルムの長時間露光により大まかなコロニー形成パターンが記録される。
【００６２】
発明の一側面では、発明の細菌細胞（ＴＡ１５３５（ｈｉｓＧ４６）、ＴＡ１００（ｈｉｓ（Ｇ４６）、又はＴＡ９８（ｈｉｓＤ３０５２）、Ａｍｅｓ、Ｂ．Ｎ．ら、１９７５参照）（構成的プロモーター制御下に異質性ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）を含む）を突然変異誘導剤にて処理すると、ＨＩＳ＋細胞（復帰突然変異体）の数が増加する。ｈｉｓ遺伝子はヒスチジンの生合成にとって必須であることから、復帰突然変異体であるｈｉｓ+細胞は内因性にヒスチジンを産生でき、ｈｉｓ-細胞の背景の上に増殖する細胞のコロニーとして検出される。本発明の生物発光アッセイのこの実施態様では、培地中にはヒスチジンを欠いていることからｈｉｓ-細胞中の代謝活性は停止し、その結果生物発光を生じるのに十分なレベルのＦＭＮＨ2を産生できなくなる。これに対し、ｈｉｓ＋復帰突然変異体細胞は代謝活性を維持でき、ヒスチジンが無い場合でも生物発光を生ずることができる。
【００６３】
本発明の別の側面では、発明の大腸菌株ＷＰ２細胞（トリプトファン遺伝子内に点突然変異を持つ、Ｇｒｅｅｎ、Ｍ．Ｈ．Ｌ．及びＭｕｒｉｅｌ、Ｗ．Ｊ．，１９７６；Ｗｉｌｃｏｘ、Ｐ．ら、１９９０；およびＤｕｎｋｅｌ、Ｖ．Ｃ．ら、Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｕｔａｇｅｎ、６（補遺、２）：１−２５（１９８４） ）（構成的プロモーターの制御下に異質性ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体を含む）を突然変異誘導剤で処理すると、ｔｒｐ＋細胞（復帰突然変異体）の数が増加する。 ｔｒｐ遺伝子はトリプトファンの生合成にとって必須であることから、復帰突然変異体であるｔｒｐ+細胞は内因性にトリプトファンを産生でき、ｔｒｐ-細胞の背景上に増殖する細胞のコロニーとして検出される。本発明の生物発光アッセイのこの実施態様では、培地中にはトリプトファンを欠いていることからｔｒｐ-細胞中の代謝活性は停止し、その結果生物発光を生じるのに十分なレベルのＦＭＮＨ2を産生できなくなる。これに対し、ｔｒｐ+復帰突然変異体細胞は代謝活性を維持でき、トリプトファンが無い場合でも生物発光を生ずることができる。
【００６４】
本発明の更に別の側面では発明のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ試験株（例えばＴＡ１５３５）（構成的プロモーター制御下に異質性ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体を含む）（例えばｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭ又はｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭｍｕｃ６３１、場合により共にカナマイシンをコードする遺伝子を有し、それぞれβ−ラクタマーゼ遺伝子内に点突然変異を有している（アンピシリン感受性表現形を付与する））を突然変異誘導剤で処理するとアンピシリン耐性細胞（復帰突然変異体）の数が増加する。アンピシリン耐性はアンピシリン含有培地内での生存に重要であることから、復帰突然変異体細胞はこの様な培地中でも代謝的に活性であり、その結果アンピシリン感受性細胞を背景にして増殖する細胞のコロニーとして検出される。本発明の生物発光アッセイのこの実施態様では、適切に機能するβ−ラクタマーゼを消失した場合、培地中のアンピシリンの存在がこれらアンピシリン感受性細胞の代謝活性を停止させ、その結果生物発光を生じるのに十分なレベルのＦＭＮＨ2を産生できなくなる。これに対し復帰突然変異体細胞は代謝活性を維持でき、アンピシリン存在時でも生物発光を生ずることができる。
【００６５】
ここに開示された以下の各微生物の凍結乾燥サンプルはブダペスト条約の条項に従い、２０００年１２月７日にファイザー社（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｉｎｃ）よりＡＴＣＣに寄託された。
【００６６】
寄託番号ＰＴＡ−２７６０が与えられたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ１５３５ｌｕｘ（ｐＢＲＴＮｌｕｘ１を含む）（ＵＣ２５４４７、ＳＡ１５３５ｐＢＲＴＮｌｕｘ１）；
寄託番号ＰＴＡ−２７６１が与えられたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ１００ｌｕｘ（ｐＢＲＴＮｌｕｘ２を含む）（ＵＣ２５４４８、ＳＡ１５３５ｐＢＲＴＮｌｕｘ２）；
寄託番号ＰＴＡ−２７６２が与えられたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ９８ｌｕｘ（ｐＴＮｌｕｘ２を含む）（ＵＣ２５４４９、ＳＡ９８ｐＴＮｌｕｘ２）；
寄託番号ＰＴＡ−２７６３が与えられたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ２２２０ｌｕｘ（ｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭ１を含む）（ＵＣ２５４５０、ＳＡ１５３５ｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭ１）；
寄託番号ＰＴＡ−２７６４が与えられたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ２２１１ｌｕｘ（ｐＢＲＴＮｌｕｘ１ＡＭｍｕｃ６３１を含む）（ＵＣ２５４５１、ＳＡ１５３５ｐＢＲＴＮｌｕｘ１ＡＭｍｕｃ６３１）；
寄託番号ＰＴＡ−２７６５が与えられたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＷＰ２ｌｕｘ（ｐＢＲＴＮｌｕｘ１を含む）（ＵＣ２５４２、ＷＰｐＢＲＴＮｌｕｘ１）。
【００６７】
寄託された微生物培養体を公的利用に関する全ての制限は、本発明の明細書の特許の交付により自動的に取り除かれる。
これら新規細菌株は、例えばそれらが適当な野生型遺伝子に自然復帰する好適頻度を有すること、ある場合には変異誘導源、例えば発癌物質に曝された後に発行される生物発光の量が、変異誘導物質が存在しないか又は変異誘導物質が存在していても外来性の代謝活性システム（例えばラット又はヒト肝臓マイクロゾームより調整されたＳ−９混合体）が存在しない場合に微生物が産生する発光量に比べ大きく、そしてある場合にはこのエームス試験の生物発光改良法の結果（特定試験作用物質の突然変異誘導性）が元のエームス試験又はその改良法を使用した場合の結果と本質的に相関することから、主題の工程に使用される。
【００６８】
当業者は、本記載を基に下表１に掲載されたものを含む本発明での使用に好適なプラスミドが通常の技術により寄託微生物より単離できることを認識するだろう。従って、必要に応じ当業者は試験株として異なる微生物を使用することができ、この微生物を適当な寄託微生物より単離された所望プラスミドを使い形質転換することができる。更に当業者は本記載に基づき、所望寄託微生物よりｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）遺伝子複合体を取り出し、それを本発明の特定の突然変異誘導性アッセイに合わせ選択された好適ベクター又はプラスミドに連結する方法も理解するだろう。
【００６９】
従って、本発明は細菌性ｌｕｘオペロン及び例えばβ−ラクタム系抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子の様な選択マーカー（形質転換細菌細胞の集団を選択するための）を有するプラスミドを提供する。
【００７０】
いずれかの好適方法を用いｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットを調整することができる。当業者は、本記載に基づき通常の技術を使用して標的細菌細胞の最終的形質転換のために発現カセットを調整し、そしてカセットを好適プラスミドに連結する方法を理解するだろう。好適方法は以下に提供される実施例中に示される。
【００７１】
本記載より当業者が理解できる様に、エームス試験、又は既報のエームス試験改良法と比較した場合に、必要とされる試薬量が少ないこと、生物発光が高感度であることから非復帰突然変異体の背景に対し復帰突然変異体コロニーを測定する労力が少ないこと、結果を得るまでに必要な時間が短いこと、及び高処理形式に容易に拡大でき一方で、この様なエームス試験を利用し集められたデータと実質的に相関し、従ってこれらデータが合理的に比較し得るという観点に於いて、本発明の工程は容易に実施でき、そして実質的なコストの削減を得ることができるものである。多くのデータがエームステストにより集められていることから、当業者は遺伝毒性の判定の観点に於いて直接比較可能である好適な改良を望んでるだろう。
【００７２】
本発明は特定の作用物質が突然変異誘導物質（復帰変異を起こす（又は場合によっては本記載より当業者により理解される様に前進変異を起こす））であるか、又は遺伝毒性的であるか決定するための新規アッセイを提供する。これらアッセイはエームス試験で使用される標準細菌株、例えばヒスチジン遺伝子内に点突然変異を持つＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株を好ましく使用できる；しかしこれら細菌細胞はここでは遺伝的に変更され生物発光を生じるか、又は特定条件の下に光りを発する。エームス試験形式にてこれら新規細菌株を使用することで、より少ない量（ｎｇ／ｕｇ対ｇ）試験作用物質（又は推定突然変異誘導物質）の使用が可能になるだけでなく、復帰突然変異体コロニーの数をコロニーの数を労苦の多い用手法的に測定することなく比較的迅速に読みとることができる。上記の改良型エーム試験とは異なり、本アッセイ又は試験は例えば細菌の増殖曲線からの推定値に基づく、又は希釈接種法による復帰突然変異体の検出を必要としない。
【００７３】
以下に記す詳細実施例は、試験作用物質、例えば医薬品候補の突然変異誘導性を、発明のアッセイを利用し確かめられることを示している。下表１は発明の阿世で使用される新規細菌試験株の調整に使用されたプラスミド標本のなかで用いられたプラスミドの一覧表である。
【００７４】
【表１】
2004283177.tif 000002
更に下表２は本発明に記載と同様に調整され、本発明のアッセイでの使用に適したる生物発光性細菌試験株の一覧である。株にはヒスチジン遺伝子内に点突然変異を持つもの、及びβ−ラクタマーゼ遺伝子内（活性部位のセリンに関するコドンの中）に点突然変異を有するものが含まれる。
【００７５】
【表２】
2004283177.tif 000003
【実施例】
【００７６】
本発明を以下実施例により描写する。発明の前記及び以下の記載、及び各種実施態様は発明を制限するものではなく、むしろその例示である。従って発明はこれら実施例の詳細な既述に限定されるものではないと理解される。
実施例１
生物発光突然変異誘発性アッセイ
１．１．  ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットの構築
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍとしてＡＴＣＣ番号２９６２９（ＴＡ１５３５）、Ｐ．Ａ．Ｐａｔｔｅｅにより寄託されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（Ｓｍｉｔｈ）Ｗｅｌｄｉｎ血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の様な（非発光性）グラム陰性細菌に安定な発光を行わせるために、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（Ｐｈｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（ＴｈｏｍａｓとＰｏｉｎａｒ  １９７９）、ＢｏｅｍａｒｅらによりＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｉｌｕｍｉｅｓｃｅｎｓ、ＡＴＣＣ番号２９９９９として寄託され、Ｇ．Ｍ．Ｔｈｏｍａｓより寄贈された）由来のｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）オペロンをカナマイシントランスポゾンＥＺ：：ＴＮ＜ＫＡＮ−２＞（エピセントレ）上に配置された強力なプロモーターの制御下に置かれた。トランスポゾンは直鎖型のＰｖｕｌｌ部位に接続されたＤＮＡ断片として購入した。ベクターＰｕｃ１９（ＮＥＢ）をＰｖｕｌｌ（ＮＥＢ）で消化した。５μｇＤＮＡ及び１００単位のＰｖｕｌｌをメーカー供給のバッファー中に含む反応混合液２０μｌを３７度で１時間インキュベーションした。Ｐｖｕｌｌ消化はアガロースゲル電気泳動により分離される２断片を生じた（分子生物学の最新プロトコール、ユニット２Ａ  アガロースゲル電気泳動（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ２Ａ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））。要約するとサンプルを０．８％アガロースゲルに乗せ、ＴＡＥバッファー中、５０Ｖ、１時間電気泳動した。バンドはエチジウムブロマイドを用い（５ｎｇ／ｍＬ、３０分間）染色され、２５００μｗ／ｃｍ3のトランスイルミネーター上にて視覚化された。２．２ｋｂの断片を含む寒天片を切り出した。寒天ゲルよりＱＩＡｕｉｃｋキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いＤＮＡを精製した。５’リン酸基を除くためには、単離したＤＮＡを１８μｌのバッファー２（ＮＥＢ）に溶解し、２μｌのウシ小腸アルカリフォスファターゼ（ＮＥＢ）と３７℃にて２時間インキュベーションした。ＤＮＡはＱＩＡｑｕｉｋ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い精製され、１０μｌの滅菌水に懸濁された。単離された２．２ｋｂのＰｕｃ１９のＰｖｕｌｌ連結断片は複製起源と選択マーカーとしてのβ−ラクタマーゼを含んでいた。カナマイシントランスポゾンＥＺ：：ＴＮ＜ＫＡＮ−１＞をＰｕｃ１９のＰｖｕＩＩ連結断片に結合した。結合反応はＲａｐｉｄＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行われた。ライゲーション混合体を用いた大腸菌細胞の形質転換（ＵｌｔｒａＭＡｘTMＤＨ５α−ＦＴTMコンペテント細胞、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、メーカー推奨の方法に従い行われた。これによりアンピシリン及びカナマイシンに対し耐性であるｐＴＮＫａｎを有する細胞のコロニーが作られた。
【００７７】
カナマイシン耐性オペロンプロモーターからのｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）オペロン
の読み過ごしコントロールを得るために、ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）配列をカナマイシン耐性遺伝子の下流に配置した。適当なクローニング部位が無いことから、Ｐｂｓ４１７よりＥｃｏＲＩ断片として単離されたｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）をまずクローニングベクターＰｂｋｃｍｖ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内のＥｃｏＲＩ部位に連結した。簡単に述べると、５μｇのＰｓｂ４１７又はＰｂｋｃｍｖ及び１００単位のＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）を含む反応混合液（全容積２０μｌ）を３７℃で２時間、メーカー供給バッファー存在下にインキュベーションした。消化サンプルはＡＧＥ（分子生物学の最新プロトコール、ユニット２Ａ  アガロースゲル電気泳動（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ２Ａ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））を用い分析された。Ｐｓｂ４１７のＥｃｏＲＩ消化により、ベクターとして約２．８ｋｂの大きさを持つものと、プロモーターを持たないｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）として５．７ｋｂの２断片を得た。Ｐｂｋｍｃｖの場合には、ＥｃｏＲＩはＡＧＥにより分離された約４．５ｋｂのＤＮＡ断片を生じた。サンプルは０．８％アガロースゲルに乗せられ、ＴＡＥバッファー中、５０Ｖにて１時間電気泳動された。バンドは２５００μｗ／ｃｍ3のトランスイルミネーター上にて視覚化され、Ｐｓｂ４１７の５．７ｋｂの断片及び直鎖型の４．５ｋｂのＰｂｋｃｍｖを含む寒天片を切り出した。ＤＮＡをＱＩＡｕｉｃｋキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い寒天より精製した。プロモーターを持たないｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）カセットより５’リン酸基を除くために、単離したＤＮＡを１８μｌのバッファー２（ＮＥＢ）に溶解し、２μｌのウシ小腸アルカリフォスファターゼ（ＮＥＢ）と３７℃にて２時間インキュベーションした。脱リン酸化されたｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）カセットはＱＩＡｑｕｉｋキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い精製され、１０μｌの滅菌水に懸濁された。続く連結反応でＰｂｋｃｍｖ及びｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）カセットをまとめｐｌｕｘと命名したプラスミドを作った。接続反応はＲａｐｉｄＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行われた。連結混合液を用いた大腸菌細胞の形質転換（ＵｌｔｒａＭＡｘTMＤＨ５α−ＦＴTMコンペテント細胞）はメーカー推奨の方法に従い行われた。その結果、カナマイシンに耐性であるｐｌｕｘを有する生物発光性細胞のコロニーを得た。
【００７８】
Ｐｂｋｃｍｖ上のｌａｃプロモーターに対するｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）の方向は、制限酵素マッピングにより決定された（分子生物学の最新プロトコール３章、ＤＮＡ及びＲＮＡの酵素処理、ＩＩ節制限酵素マッピング（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈａｐｔｒ３．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ、ＳｅｃｔｉｏｎＩＩ  Ｒｅｓｔｒｃｉｔｉｏｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ）。無作為に取り上げたコロニーから単離したプラスミドをＣｌａｌ（ＮＥＢ）で消化した。反応条件は全容積２０μｌ中に２μｇのＤＮＡ，１００ｕの制限酵素及び適当な緩衝液であった。サンプルはＡＧＥ（０．８％アガロースゲル、ＴＡＥバッファー、５０Ｖ）を用い解析された。ｐＴＮＫａｎへの挿入のために、５’ＢａｍＨｉ及び３’Ｐｓｔ１が接続されたｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）カセットが選択された。ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）は５μｇのＤＮＡ，１００単位のＢａｍＨ１、１００単位のＰｓｔ１及びバッファー２（ＮＥＢ）を含む反応混合液中にて、ＢａｍＨ１及びＰｓｔ１で消化された。消化反応によりベクターＰｂｋ−ＣＭＶを含む５．４ｋｂ及びプロモーターを持たない５．７ｋｂのｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）カセットの２断片を得た。ＰＴＮＫａｎは５μｇのＤＮＡ，１００単位のＢａｍＨ１、１００単位のＰｓｔ１及びバッファー２を含む反応混合液中でＢａｍＨ１及びＰｓｔ１により直鎖化された。サンプルはＡＧＥ（分子生物学の最新プロトコール、ユニット２Ａ  アガロースゲル電気泳動（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ２Ａ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））により分析された。ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）断片と直鎖化されたｐＴＮＫａｎはＱＩＡｕｉｃｋキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いゲルより精製された。続いてＢａｍｎＨ１−Ｐｓｔ１接続ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）断片はＢａｍｎＨ１−Ｐｓｔ１消化されたｐＴＮＫａｎに連結された。連結反応はＲａｐｉｄＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行われた。連結混合液を用いた大腸菌細胞の形質転換（ＵｌｔｒａＭＡｘTMＤＨ５α−ＦＴTMコンペテント細胞）はメーカー推奨の方法に従い行われた。その結果、アンピシリン及びカナマイシンに耐性であるｐＴＮｌｕｘを有する生物発光性細胞のコロニーを得た。最終プラスミドはｐＴＮｌｕｘ（図１）と命名された。ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットはカナマイシンホスフォトランスフェラーを含み、ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）はｐＴＮｌｕｘからＰｖｕｌｌ断片として容易に切り出すことができる。
【００７９】
１．２  ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットを持つ低及び中コピープラスミッドの構築
ｐＴＮｌｕｘプラスミドはＰｕｃ１９ベクターに基づいており、細胞質内にて高コピー数（１０００−３０００コピー／細胞）複製する。生物発光出力に及ぼすプラスミドのコピー数の影響を決定するために、我々は複数の複製起源を持つ別のプラスミドを構築した。
【００８０】
中コピー数プラスミド（１００−３００コピー／細胞）はベクターｐＢＲ３２２（ＮＥＢ）を基に構築された。ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットをｐＴＮｌｕｘより、５μｇのＤＮＡ，１００単位のＰｖｕＩＩ及びバッファー２（ＮＥＢ）を含む反応混合液中にてＰｖｕＩＩ（ＮＥＢ）によって切り出した。反応は３７℃にて、１時間インキュベーションされた。ベクターｐＢＲ３２２はＥｃｏＲＶにより直線化された。反応液は５μｇのＤＮＡ，１００単位のＥｃｏＲＶ、メーカーより供給されたバッファー２を含んだ。反応液は３７℃にて１時間インキュベーションされた。消化反応の産物はＡＧＥ（分子生物学の最新プロトコール、ユニット２Ａ  アガロースゲル電気泳動（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ２Ａ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））により分析された。ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）断片及び直鎖化ｐＢＲ３２２のＤＮＡバンドは寒天ゲルよりＱＩＡｕｉｃｋキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い単離された。ベクターが再環状化することを防ぐために、直鎖状ベクターＤＮＡをバッファー２存在下（ＮＥＢ）、全反応容積２０μｌ中２μｌのウシ小腸アルカリホスファターゼと３７℃、２時間インキュベーションすることで５’リン酸基を除いた。脱リン酸化されたｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットはＱＩＡｑｕｉｃｋキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い精製され、１０μｌの滅菌水に懸濁された。続いてｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットはｐＢＲ３２２に連結された。連結反応はＲａｐｉｄＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行われた。連結混合液を用いた大腸菌細胞の形質転換（ＵｌｔｒａＭＡｘTMＤＨ５α−ＦＴTMコンペテント細胞、ライフテクノロジー）はメーカー推奨の方法に従い行われた。その結果、アンピシリン及びカナマイシンの細胞毒性に対し耐性である生物発光性細胞のコロニーを得た。最終プラスミドはｐＢＲＴＮｌｕｘ（図１）と命名された。
低コピー数プラスミド（２−６コピー／細胞）はベクターＰｆｎ４６７（ＡＴＣＣ番号８６９６２、Ｐ．Ｓｎａｋａｒ寄贈）を基に構築された。ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットをｐＴＮｌｕｘより、５μｇのＤＮＡ，１００単位のＰｖｕＩＩ及びバッファー２（ＮＥＢ）を含む反応混合液中にてＰｖｕＩＩ（ＮＥＢ）によって切り出した。反応は３７℃にて、１時間インキュベーションされた。ベクターＰｆｎ４６７はＳｍａｌ（ＮＥＢ）により直線化された。反応液は５μｇのＤＮＡ，１００単位のＳｍａｌ、メーカーより供給されたバッファー２を含んだ。反応液は３７℃にて１時間インキュベーションされた。両消化反応物はアガロースゲル電気泳動（分子生物学の最新プロトコール、ユニット２Ａ  アガロースゲル電気泳動（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ２Ａ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））により分析された。ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）断片及び直鎖化Ｐｆｎ４６７のＤＮＡバンドは寒天ゲルよりＱＩＡｕｉｃｋキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い単離された。ベクターが再環状化することを防ぐために、直鎖化されたＰｆｎ４６７ＤＮＡをバッファー２存在下（ＮＥＢ）に、全反応容積２０μｌ中２μｌのウシ小腸アルカリホスファターゼと３７℃、２時間インキュベーションし５’リン酸基を除いた。脱リン酸化されたＰｆｎ４６７分子はＱＩＡｑｕｉｃｋキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い精製され、１０μｌの滅菌水に懸濁された。続いてｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットをｐＢＲ３２２に連結した。連結反応はＲａｐｉｄＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行われた。連結混合液を用いた大腸菌細胞の形質転換（ＵｌｔｒａＭＡｘTMＤＨ５α−ＦＴTMコンペテント細胞、ライフテクノロジー）はメーカー推奨の方法に従い行われた。形質転換の結果、アンピシリン及びカナマイシンの細胞毒性に対し耐性である生物発光性細胞のコロニーを得た。最終プラスミドはｐＦＮＴＮｌｕｘと命名された。
【００８１】
１．３  生物発光性細菌試験株の構築
エレクトロコンペテントな細胞の調製にはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株ＴＡ９８、ＴＡ１００及びＴＡ１５３５及び大腸菌株ＷＰ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）を用いた。ＮＢ培地１リットルに１００μｌの凍結保存液（ＯＤ＝０．５、１０％ＤＭＳＯ添加ＬＢ培地（ライフテクノロジー） ）を接種した。培養体を３７℃にて、細胞密度がＯＤ600＝０．５−０．８になるまで増殖させた。洗浄を繰り返して塩を除いた。細胞を沈殿し（４℃にて４０００ｒｐｍ）、１０００ｍＬの氷冷滅菌水に懸濁した。得られた細胞懸濁液を再度沈殿し、５００ｍＬの氷冷水に懸濁した。さらに遠心分離した後、細胞を氷冷した１０％グリセロール水溶液１０ｍＬに再懸濁した。１０％グリセロール中の細胞を再度沈殿し、１ｍＬの氷冷１０％グリセロールに再懸濁した。エレクトロコンペテント細胞の一部４０μｌを液体窒素で瞬間凍結し、−８０℃に保存した。
【００８２】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及び大腸菌株の形質転換はＢＴＸエレクトロポレーターを使い実施した。エレクトロコンペテント細胞の凍結保存体を氷上にてゆっくり溶解した。細胞懸濁液８０μｌと５μｌのＤＮＡ液（１０μｇ）をエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍ電極ギャップ）に入れた。エレクトロポレーションの条件は、磁界強度２．５ｋＶ／ｃｍで９９秒パルス３回であった。エレクトロポレーション混合液を１ｍＬのＳＯＣ培地（ライフテクノロジー）に懸濁し、３７℃にて１時間インキュベーションした。細胞懸濁液をカナマイシン又はアンピシリンが添加された寒天盤上に接種し、形質転換細胞を選別した。各株からは得た少なくとも４つの独立した発光性コロニーを詳しく調べ、突然変異誘発性に関するそれらの能力を評価した。これらの株は高処理型突然変異誘発性アッセイの開発に使用された（表２）。
【００８３】
１．４  生物発光表現形の特徴付け
１．４．１  細菌培養の増殖期における生物発光出力
ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットを持つプラスミドで形質転換されたサルモネラ又は大腸菌株を、３７℃、２０ｍＬのＬＢ培地中にて２５時間まで増殖させた。培養はＬＢプレート（ライフテクノロジー）上に一晩増殖させた細胞を使い行った。液体培養の細胞密度をＯＤ６００＝０．１に調製し、生物発光の初期レベルを記録した。１００μｌの培養体サンプルを１１時間目まで１時間間隔で集めた。追加サンプルを培養開始後２５時間目に集めた。分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）及び光量子測定ＣＣＤカメラ（Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使って、各時点の光学密度及び生物発光を測定した。生物発光は細胞密度に伴い増加し、定常期入口にて最高値に達した後急激に減少した（図２）。一般に、定常期の細菌細胞はその代謝活性を制限しており、突然に死滅するか胞子を形成する。生物発光反応は内因性の還元型フラビンモノヌクレオチドであるＦＭＮＨ2の形のエネルギーを必要とする（Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｇ．Ｓ．及びＷｉｌｌｉａｍｓ、Ｐ．，１９９２）。従って、定常期での発光の低下は代謝活性の停止の結果として説明することができる。プラスミドｐＴＮｌｕｘ、ｐＢＲＴＮｌｕｘ又はｐＦＮＴＮｌｕｘを持つ全ての株は同様の結果を示した。これに対し元のプラスミドＰｓｂ４１７で形質転換されたサルモネラ細胞は増殖依存的な生物発光出力の低下を示し、増殖がｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現の制御に依存していることを示唆した。これらの結果は、ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）のカナマイシントランスポゾンによる発現を利用するｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットが細菌細胞の代謝活性のモニターに好適であることを示す証拠を提出している。
【００８４】
１．４．２  生物発光は細胞内のエネルギー供給源に依存している
ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）による生物発光は、還元型フラビンモノヌクレオチドであるＦＭＮＨ2の形のエネルギーの安定供給に依存している（例えばＳｔｅｗａｒｔ、Ｇ．Ｓ．及びＷｉｌｌｉａｍｓ、Ｐ．，１９９２参照）。嫌気性生物に於けるインビボでのＦＭＮＨ2産生はＮＡＤＨ及びＦＭＮ還元酵素共役を介した電子伝達鎖に共役しており、呼吸鎖の中断は生物発光の即時的消失をもたらす。一般にシアン化合物は呼吸鎖の最後の結合部であるチトクロームｃ酸化酵素のＦｅ２＋と相互作用することで電子伝達系を中断し、その結果エネルギー産生を停止させる。シアン化カリウムはエネルギー供給への生物工程の依存度を研究するのに広く用いられている（例えばＳｋｕｌａｃｈｅｖ、Ｖ．Ｐ．，１９８９参照）。
【００８５】
ｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）による生物発光に及ぼすエネルギー供給の役割を調べるために、我々はプラスミドｐＴＮｌｕｘを持つサルモネラ試験株をシアン化カリウムで処理した（図３）。我々の実験では、ｐＢＲＴＮｌｕｘで形質転換されたサルモネラ株ＴＡ１５３５は液体ＬＢ培地中にて、細胞密度ＯＤ600＝０．６まで増殖した。培養体の一部１００μｌを各種濃度のシアン化カリウム（シグマ）で処理し、直ぐに光量子測定ＣＣＤカメラ（Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ、ベーリンガー）を用い発光を測定した。生物発光は用量依存的に減少した。この実験は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに於けるｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）生物発光のエネルギー供給への依存性を明瞭に示している。
【００８６】
１．４．３  発明の生物発光型”エームス”アッセイの実施態様を使用する突然変異誘発性の検出
標準のエームスアッセイでは、ＨＩＳ遺伝子の一つに点突然変異を持つ細胞（ＴＡ１５３５、ＴＡ１００、ＴＡ９８）（ｈｉｓ-細胞）を突然変異誘発剤で処理するとＨＩＳ＋細胞（復帰突然変異体）の数が増加する。
【００８７】
ＨＩＳ遺伝子はヒスチジンの生合成にとって必須であることから、復帰突然変異体であるＨＩＳ+細胞は内因性にヒスチジンを産生でき、ｈｉｓ-細胞の背景の上に増殖する細胞のコロニーとして検出される。生物発光アッセイでは、培地中にヒスチジンを欠いていることからｈｉｓ-細胞中の代謝活性は停止し、その結果生物発光を生じるのに十分なレベルのＦＭＮＨ2を産生できなくなる。これに対し、ＨＩＳ+復帰突然変異体細胞は代謝活性を維持でき、ヒスチジンが無い場合でも生物発光を生ずることができる。エームスアッセイの生物発光改良法はマルチウエル培養プレート中に実施された。アッセイではｈｉｓ−細胞は、細胞が２−３回の分裂できるだけの微量のヒスチジンを含んだ軟寒天が重層された試験化合物により処理された（毒物学の最新プロトコール、ユニット３．１  変異誘発性に関するサルモネラ（エームス）試験、基本プロトコール：標準プレート取り込み試験）。生物発光性ＨＩＳ+細胞の微小コロニーは光量子測定ＣＣＤカメラ（Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ、ベーリンガー）を使い、３０−４０時間後に目視確認された。
【００８８】
凍結した一部細胞を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した３５ｍＬのＬＢ培地に接種した。培養体を３０℃で１５−１８時間（一晩）振盪しながら（２５０ｒｐｍ）増殖させた。一晩たった培養体を新たにカナマイシンを添加されたＬＢ培地で３：１に希釈し、細胞密度がＯＤ600＝０．５−０．６になるまで３７℃で増殖した（約１−２時間）。次に細胞を２回ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ライフテクノロジー）で洗浄した。最終細胞密度をＯＤ600＝０．５に調整し細胞懸濁液を氷上に維持した。滅菌したトップ寒天液（７．２５ｍＬ）を次の成分を用い調製した；ＶＢ濃縮液（５０×）０．２ｍＬ；ビオチン（１７０μｇ／ｍＬ）０．４４ｍＬ；ヒスチジン（６．７ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬ；カナマイシン（４０μｇ／ｍＬ）０．０１ｍＬ；グルコース（２．６％）２．５９ｍＬ；細胞（ＯＤ600＝０．５）２．５ｍＬ）。トップ寒天は使用前に調製され、５０℃に維持された。サルモネラ細胞は高温に曝されるとその生命力を低下することから、未使用のトップ寒天は１０分後に廃棄された。アッセイは事前に調整された最少寒天２４−又は４８−ウエルプレートの中で行われた。各ウエルは１又は０．２５ｍＬの最少寒天をそれぞれ含んだ。最少寒天は１５ｇのＢａｃｔｏａｇａｒ（ＤＩＦＣＯ）、４ｇのグルコース及び２０ｍＬの５０×ヴォーゲル−塩濃縮液（１％ＭｇＳＯ4×ｈ2Ｏ、１０％クエン酸、１水和物、５０％Ｋ2ＨＰＯ4、１７．５％Ｎａ2ＮＨ2ＰＯ4×４Ｈ2Ｏ）を用い、総容積１０００ｍＬの蒸留水中に調製された。滅菌寒天は各ウエル中に適当な容積分注する前に５０℃まで冷却された。アッセイは１７．５μｌのＰＢＳ又は代謝を活性化する場合には１７．５μｌのＳ）懸濁液を最少寒天の表面上にピペッティングすることで開始された。次に１０μｌの化合物液が加えられ、細胞を含むトップ寒天が混合体上に重層された。全ての成分が適当に分布する様に、プレートはボルテックサーにより９００ｒｐｍで振盪された。プレートは３７℃にて、４８時間インキュベーションされた。復帰突然変異体の発光性の微小コロニーは光量子測定ＣＣＤカメラ（Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ、ベーリンガー）を用いて視覚化された。未処置ウエルに対し処置ウエルの発光微小コロニーの数は増加し、試験した化合物が突然変異誘発性であることが示された（表３）。
実施例３
生物発光突然変異誘発性アッセイの高処理型実施態様
少量の化合物条件（３０μｇ／アッセイ）による高処理を実現するために、本発明の生物発光性”エームス”アッセイの前インキュベーション型改良法を開発した。凍結した一部細胞を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した３５ｍＬのＬＢ培地に接種した。培養体を３０℃で１５−１８時間（一晩）振盪しながら（２５０ｒｐｍ）増殖させた。一晩たった培養体を新たにカナマイシンを添加されたＬＢ培地で３：１に希釈し、細胞密度がＯＤ600＝０．５−０．６になるまで３７℃で増殖した（約１−２時間）。次に細胞を２回ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ライフテクノロジー）で洗浄した。最後に細胞をＶＢＢＨ培地（グルコース、４ｍｇ／ｍＬ；ＶＢ濃縮液（５０）×）、２０μｌ／ｍＬ；ビオチン７．５μｇ／ｍＬ；ヒスチジン５μｇ／ｍＬ）中に懸濁した。最終細胞密度をＯＤ600＝０．６５に調整し細胞懸濁液を氷上に維持した。滅菌したトップ寒天液（７．２５ｍＬ）を次の成分を用い調製した；ＶＢ濃縮液（５０×）０．２ｍＬ；ビオチン（１７０μｇ／ｍＬ）０．４４ｍＬ；カナマイシン（４０μｇ／ｍＬ）０．０１ｍＬ；グルコース（２．６％）１．５９ｍＬ；ＰＢＳ２．５ｍＬ；寒天（２．４％）２．５９ｍＬ）。トップ寒天は使用前に調製され、５０℃に維持された。アッセイは事前に調整された最少寒天４８−ウエルプレートの中で行われた。各ウエルは０．２５ｍＬの最少寒天を含んだ。最少寒天は１５ｇのＢａｃｔｏａｇａｒ（ＤＩＦＣＯ）、４ｇのグルコース及び２０ｍＬの５０×ヴォーゲル−塩濃縮液（１％ＭｇＳＯ4×ｈ2Ｏ、１０％クエン酸、１水和物、５０％Ｋ2ＨＰＯ4、１７．５％Ｎａ2ＮＨ2ＰＯ4×４Ｈ2Ｏ）を用い、総容積１０００ｍＬの蒸留水中に調製された。滅菌寒天は各ウエル中に適当な容積分注する前に、水槽ないにて５０℃まで冷却された。
【００８９】
試験物質への細胞の曝露は９６ウエルＶ底マイクロタイタープレート中に、４時間、３７℃にて試験濃度の溶液１２．５μｌ中に実施された。溶液は９μｌの細胞懸濁液（ＯＤ600＝０．６５）、２．２μｌのＰＢＳ又はＳ９、１．２５μｌの試験物質を含んだ。インキュベーション後、２５μｌのトップ寒天を各ウエル内に加え、直ぐに最少寒天を含む４８ウエルプレート上に播いた。全ての成分が適当に分布する様に、プレートはボルテックサーにより９００ｒｐｍで振盪された。プレートは３７℃にて、４８時間インキュベーションされた。復帰突然変異体の発光性の微小コロニーは光量子測定ＣＣＤカメラ（Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ、ベーリンガー）を用いて視覚化された。未処置ウエルに対し処置ウエルの発光微小コロニーの数は増加し、試験した化合物が突然変異誘発性であることが示された（表４及び５）。
実施例４
生物発光β−ラクタマーゼ実施態様
β−ラクタマーゼ内の点突然変異は、復帰突然変異体誘発性アッセイの遺伝的基質として利用できることが示されている（例えばＬｅｅ，Ｃ−Ｃら、１９９４参照）。このシステムでは、β−ラクタマーゼの活性部位（位置２０２）に於けるＡからＧへの転換変異がセリンコドンをグリシンに変型する。この変異はアンピシリン感受性表現形を生ずる。ＧからＡへの転換突然変異は野生型β−ラクタマーゼを復活させるため、アンピシリンを添加された寒天プレート上で復帰突然変異体が選別される。β−ｌａｃアッセイは複数のモデル突然変異誘発剤を検出できることが示されている。
【００９０】
２．１  β−ラクタマーゼ細菌突然変異誘発システムの構築
β−ｌａｃアッセイの生物発光版はｐＢＲＴＮｌｕｘプラスミドに基づいている。このプラスミドはβ−ラクタマーゼ及びｌｕｘ（ＣＤＡＢＥ）発現カセットを含む。部位特異的突然変異誘発はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭシステム（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用い行った。２種類の位置２０２の転換突然変異ＡからＧを含む相補的オリゴヌクレオチド（ＡｔｏＧｕｐ：ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＣＴＧ；ＡｔｏＧｄｏｗｎ：ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＡＣＧ）を特別に合成した（シグマ−ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ））。鋳型（１０ｎｇのｐＢＲＴＮｌｕｘ）、１２５ｎｇの各プライマー、Ｄｎｔｐ混合体、及び２．５単位のＰｆｕＴｕｒｂＤＮＡポリメラーゼを用い、転換突然変異を含む環状の切れ目入りＤＮＡ産物を合成した。合成は９０℃、３０秒間の短時間の変性段階の後１２温度サイクルで実施された。各サイクルは９５℃３０秒間、５５℃１分間、及び６８℃１５分間より構成された。鋳型ＤＮＡはＤｐｎＩ制限酵素により３７℃、１７時間消化し、取り除かれた。精製された切れ目入り産物はＸＬ−１−Ｂｌｕｅスーパーコンペテントな細胞（ストラタジーン）に形質導入され、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む寒天プレートに播かれた。生物発光カナマイシン耐性コロニーを拾い集め、それらのアンピシリンに対する感受性をアンピシリン添加ＬＢプレート（１００μｇ／ｍＬ）に接種して評価した。カナマイシン耐性及びアンピシリン感受性を付与するプラスミドはｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭと命名された（図６）。このプラスミドはサルモネラ株ＴＡ１５３５内に形質導入され、最終株ＳＡｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭを与えた。この株の突然変異誘発性を検出する能力は、モデル化合物ＭＮＮＧを用い確認された。
実施例５
β−ラクタマーゼ細菌性突然変異誘発システムの好適実施態様
３．１  改良型β−ラクタマーゼシステムの構築
プラスミドＰｋｍ１０１上にあるｍｕｃＡＢオペロンを元のエームスサルモネラ株ＴＡ１５３５及びＴＡ１５３８に導入すると、アッセイの感受性が大きく増加した（例えばＭｃＣａｎｎ、Ｊら、１９７５参照）。新規株ＴＡ１００及びＴＡ９８はそれぞれ突然変異誘発性試験に使用される最も重要な株になりつつある。しかし生物発光性β−ｌａｃ試験株ＳＡｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭはｍｕｃＡＢ-株ＴＡ１５３５に基づいている。従って、我々はｍｕｃＡＢオペロンを含む改良型β−ｌａｃシステムを構築した。プラスミドＰｋｍ１０１上にβ−ラクタマーゼが存在すると元の株であるＴＡ１００及びＴＡ９８の使用を妨げることから、我々はＰｋｍ１０１よりｍｕｃＡＢ発現カセットを単離し、それをｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭに挿入することとした。ｍｕｃＡＢはＴＡ１００サルモネラ株中に存在するＰｋｍ１０１プラスミドよりＰＣＲを利用し単離された。２種類のプライマー（ＭＵＣ２６ｌｏｗ  ＧＣＴ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＡＣＡ  ＡＡ及びＭＵＣ２６ｕｐ  ＴＣＣ  ＣＣＧＧ  ＧＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  Ｔ）を用いｍｕｃＡＢ配列をその内因性プロモーターと共に含む２．６ｋｂの断片を増幅した。続くサブクローニング段階を単純化するため、ＭＵＣ２６ｕｐプライマーはＳｍａＩ切断部位を含む様に工夫されている。増幅反応はＳａｆｅＦａｉｌ  ＰＣＲ増幅キット（エピセントレ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ））を用い行われた。得られた２．６ｋｂの産物はアガロースゲル電気泳動を用い精製された（（分子生物学の最新プロトコール、ユニット２Ａ  アガロースゲル電気泳動（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ２Ａ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ））。要約するとサンプルを０．８％アガロースゲルに乗せ、ＴＡＥバッファー中、５０Ｖ、１時間電気泳動した。ゲルはエチジウムブロマイドを用い（５ｎｇ／ｍＬ、３０分間）染色され、２５００μｗ／ｃｍ3のトランスイルミネーター上にて視覚化された。２．６ｋｂの増幅産物を含む寒天片を切り出した。寒天ゲルよりＱＩＡｕｉｃｋキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いＤＮＡを精製した。ｍｕｃＡＢ発現カセットをＳｍａＩ断片として得るため、ＰＣＲ産物はＳｍａＩ（ＮＥＢ）で処理された。反応より２種類の断片が生じた：ｍｕｃＡＢを含む１．９ｋｂ及び３’端側でｍｕｃＡＢに隣接している配列を表す０．７ｋｂの。１．９ｋｂ断片はアガロースゲル電気泳動で精製され、Ｐｕｃ１９のＳｍａＩ部位に、ＲａｐｉｄＤＮＡライゲーションキット（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて連結された。大腸菌細胞の形質転換（ＵｌｔｒａＭＡｘTMＤＨ５α−ＦＴTMコンペテント細胞、ライフテクノロジー）はｍｕｃＡＢ発現カセットの共有元として使用されたｐＵＣｍｕｃと命名されたプラスミドを持つアンピシリン耐性コロニーを生じた。最終段階はｍｕｃＡＢのｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭへの挿入を含んだ。ｍｕｃＡＢ発現カセットはｐＵＣｍｕｃよりＳｍａＩ断片として単離され、ｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭのＰｕｖｕＩＩ部位に連結された。最終のプラスミドはｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭｍｕｃ６３１と命名された（図）６）。
【００９１】
生物発光ｍｕｃＡＢ+β−ｌａｃ試験体株はサルモネラ株ＴＡ１５３５をｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭｍｕｃ６３１で形質転換して作製された。新規株はＳＡ１５３５ｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭｍｕｃ６３１と命名された。ｍｕｃＡＢはサルモネラ細胞をＵＶによる殺滅より保護することから（例えばＷａｌｋｅｒ、Ｇ．Ｃ．，１９７７参照）、ＵＶ細胞毒性を用いてクローン化されたｍｕｃＡＢ発現カセットの機能性を確認することができる。本実験ではｐＢＲＴＮＵｌｕｘＡＭｍｕｃ６３１のＵＶ細胞毒性は、ｍｕｃＡＢ+株であるＴＡ１００及びｍｕｃＡＢ-株のＴＡ１５３５並びにＳＡＢＲＴＮｌｕｘＡＭと比較された（図７）。予想通り我々の新規株ＳＡ１５３５ｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭｍｕｃ６３１及びｍｕｃＡＢ+ＴＡ１００は殆ど同等にＵＶによる殺明に対し耐性であったあ。これに対し、親のｍｕｃＡＢ-株であるＴＡ１５３５及びＳＡＢＲＴＮｌｕｘＡＭはＵＶの作用に対し有意により感受性であった。当業者はこのデータがｍｕｃＡＢ発現カセットの適切な機能性を示していることを理解するだろう。
【００９２】
２．２  生物発光β−ｌａｃアッセイを用いた突然変異誘発物質の検出
生物発光β−ｌａｃアッセイは、プラスミドｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭ又はｐＢＲＴＮｌｕｘＡＭ６３１上に供給された遺伝的に変更されたβ−ラクタマーゼを利用する。このアッセイでは、ＧからＡへの復帰突然変異による野生型β−ラクタマーゼへの回復を突然変異誘発性の指標に利用している。生物発光は復帰突然変異体の検出に適した簡便な手段である。更に各細胞が復帰突然変異に適した複数の標的（プラスミドの複数コピー）を持つこととアンピシリン選別によって完全ＬＢ培地（ライフテクノロジー）を使用することを可能にしている。即ち、アッセイは約＜３０μｇの試験物質を使い実施可能であり、例えば約１７−２４時間で好適な結果を提供することができる。
【００９３】
凍結した一部細胞（５００μｌ：細胞濃度〜Ｄ＝０．５、１０％ＤＭＳＯを添加した培地ＬＢを凍結）を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した３５ｍＬのＬＢ培地に接種した。培養体を３０℃で１５−１８時間（一晩）２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。一晩たった培養体を新たにカナマイシンを添加されたＬＢ培地で３：１に希釈し、細胞密度がＯＤ600＝０．５−０．６になるまで３７℃で増殖した（約１−２時間）。次に細胞を新鮮なＮＢ培地で洗浄し、最終細胞密度をＯＤ600＝０．６５に調整した。細胞を２．２μｌのＰＢＳ又はＳ９懸濁液、９μｌの細胞懸濁液及び１．２５μｌの試験化合物又はＤＭＳＯを含む液体倍知勇にてＵＶに曝露した。混合液はＶ字底型の９６ウエルプレート中に、３７℃で４時間インキュベーションされたあ。１．０％のＢａｃｔｏａｇａｒ、０．５％ＮａＣｌ）を含むトップ寒天混合体を調製し、５０℃に維持された。２５μｌのトップ寒天を処理培地に加え、各ウエルが３００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び４０μｇ／ｍＬのカナマイシンが添加されたＬＢ寒天１５０μｌを含んでいる９６ウエルプレート上に接種された。プレートは３７℃にて１６−１８時間インキュベーションされた。復帰突然変異体の発光性微小コロニーは光量子測定ＣＣＤカメラ（Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ、ベーリンガー）を用いて視覚化された。未処置ウエルに対し処置ウエルの発光微小コロニーの数は増加し、試験した化合物が突然変異誘発性であることが示された（表８）。
【００９４】
本発明のアッセイを利用することで化学的突然変異誘発性を検出することができるが、これは例えば放射線（Ｘ線）、磁場等を含む環境遺伝毒性の評価にも利用できる。
文献
【００９５】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
発明及びそのその他の対象並びに更なる特徴をより良く理解するためには、以下に添付する図面と結びつけながら下記各種好適実施態様に関する詳細な説明を参照する；
【図１】図１は本発明の好適実施態様の概略図である。本図は本発明のアッセイでの使用に適した細菌試験株の開発に用いられるプラスミドを描写している。
【図２】図２は本発明の好適実施態様の概略図である。本図は細菌培養の増殖期の生物発光レベルを表しており、生物発光は時間及び細胞密度の両方に対しプロットされている。
【図３】図３は本発明の好適実施態様の概略図である。本図は生物発光に及ぼすＫＣＮの影響を描写している。
【図４】図４は本発明の好適実施態様の概略図である。本図は既知突然変異誘導剤であるＭＮＮＧの一定量により処理した後の、生物発光復帰体の検出を描写している。
【図５】図５は本発明の好適実施態様の概略図である。本図は２種類の既知突然変異誘導剤、即ちＭＮＮＧ及びＮａＮの一定量を、発明の細菌細胞に独立に曝することに基づく、生物発光復帰体の検出を描写している。同時に、右端のフレームには一定量のＳ−９に実質同時暴露した場合、あるいはしない場合の２Ａに暴露された復帰体の生物発光も描かれている。
【図６】図６は本発明の好適実施態様の概略図である。本図は本発明の生物発光β−ラクタマーゼアッセイに適した細菌試験株の開発に用いられるプラスミドを描写している。
【図７】図７は本発明の好適実施態様の概略図である。本図はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＵＶ感受性に及ぼすｍｕｃＡＢ発現の影響を描いている。
【図８】図８は本発明の好適実施態様の概略図である。本図は本発明の生物発光β−ラクタマーゼアッセイを用いたＭＮＮＧの突然変異誘導活性の検出を描いている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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