(57)【要約】【課題】ＤＮＡマーカーを用いた抵抗性検定を利用可能にして、ジャガイモシストセンチュウに対する抵抗性をＤＮＡレベルで、しかも短時間に検定でき、且つＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を確認できるようにすることにある。【解決手段】バレイショのＤＮＡを、“５’−ＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴ−３’”の２０塩基の合成プライマーと、“５’−ＣＧＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴ−３’”の３５塩基の合成プライマーと、“５’−ＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＡＴＧＧＧＧ−３’”の１６塩基の合成プライマーと、を用いてＰＣＲにより、目的ＤＮＡを増幅させて、増幅の有無で検定し、且つＰＣＲを確認する。【選択図】　　　　図３
2004057025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バレイショのＤＮＡを用いてジャガイモシストセンチュウのパソタイプＲｏ１に対して抵抗性を示す抵抗性遺伝子に特異的なＤＮＡの有無の検出を通じて検定する方法であって、バレイショのＤＮＡを、
“５’−ＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴ−３’”の２０塩基の合成プライマーと、
“５’−ＣＧＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴ−３’”の３５塩基の合成プライマーと、
“５’−ＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＡＴＧＧＧＧ−３’”の１６塩基の合成プライマーと、
を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、目的ＤＮＡを増幅させて、増幅の有無で検定し、且つＰＣＲを確認することを特徴とするＤＮＡマーカーを用いたジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定法。
【請求項２】
バレイショのＤＮＡを用いてジャガイモシストセンチュウのパソタイプＲｏ１に対して抵抗性を示す抵抗性遺伝子に特異的なＤＮＡの有無の検出を通じて検定する方法であって、バレイショのＤＮＡを、
“５’−ＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴ−３’”の２０塩基の合成プライマーと、
“５’−ＣＧＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴ−３’”の３５塩基の合成プライマーと、
“５’−ＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＡＴＧＧＧＧ−３’”の１６塩基の合成プライマーと、
を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、目的ＤＮＡを増幅させて、増幅の有無で検定し、且つＰＣＲを確認する方法において、上記ＰＣＲにおけるアニーリング反応温度条件を、
９４℃９分を１サイクル
９４℃３０秒→６６．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６４．５℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６３．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６１．５℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６０．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６２．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を３５サイクル
７２℃８分を１サイクル
としたことを特徴とするＤＮＡマーカーを用いたジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、バレイショ畑の重要線虫であるジャガイモシストセンチュウに抵抗性を持つ品種育成を効率的に進めるため、交配によって得た雑種後代の抵抗性の有無を判別する検定法であって、特に、ジャガイモシストセンチュウ抵抗性遺伝子（Ｈ１）と密接に連鎖するＣＰ１１３遺伝子の一部の増幅を通じて、ジャガイモシストセンチュウ抵抗性又は感受性個体を識別するＤＮＡマーカーを用いたジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ジャガイモシストセンチュウの根部寄生により、栽培されているバレイショは養分吸収が阻害され、下葉が黄化してしおれ、生産力や品質が低下する。ジャガイモシストセンチュウは、土中ではシストと呼ばれる卵の集合体を形成し長期の生存が可能なため、汚染圃場での撲滅は困難となっている。このため、抵抗性品種の育成が望まれている。
交雑育種において、育成個体のジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定は、汚染圃場へ直接栽培し植物の根への寄生の有無によって判別する方法が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ジャガイモシストセンチュウ抵抗性品種育成を行う場合、交配組合せで得られた多くの個体を特定の現地汚染圃場で栽培し、抵抗性の有無を調査しているため多くの労力と時間を要している。また、汚染圃場での検定は気候条件等にも影響されやすく、人や車による他の地域への汚染の拡大を防ぐ必要がある。
【０００４】
この発明は、上記のような課題に鑑み、その課題を解決すべく創案されたものであって、その目的とするところは、ＤＮＡマーカーを用いた抵抗性検定を利用可能にして、ジャガイモシストセンチュウに対する抵抗性をＤＮＡレベルで、しかも短時間に検定でき、且つＰＣＲを確認できるようにすることにより、抵抗性品種育成を効率的に行うことのできるＤＮＡマーカーを用いたジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
以上の目的を達成するために、請求項１の発明は、バレイショのＤＮＡを用いてジャガイモシストセンチュウのパソタイプＲｏ１に対して抵抗性を示す抵抗性遺伝子に特異的なＤＮＡの有無の検出を通じて検定する方法であって、バレイショのＤＮＡを、
“５’−ＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴ−３’”の２０塩基の合成プライマーと、
“５’−ＣＧＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴ−３’”の３５塩基の合成プライマーと、
“５’−ＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＡＴＧＧＧＧ−３’”の１６塩基の合成プライマーと、
を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、目的ＤＮＡを増幅させて、増幅の有無で検定し、且つＰＣＲを確認する手段よりなるものである。
【０００６】
また、請求項２の発明は、バレイショのＤＮＡを用いてジャガイモシストセンチュウのパソタイプＲｏ１に対して抵抗性を示す抵抗性遺伝子に特異的なＤＮＡの有無の検出を通じて検定する方法であって、バレイショのＤＮＡを、
“５’−ＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴ−３’”の２０塩基の合成プライマーと、
“５’−ＣＧＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴ−３’”の３５塩基の合成プライマーと、
“５’−ＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＡＴＧＧＧＧ−３’”の１６塩基の合成プライマーと、
を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、目的ＤＮＡを増幅させて、増幅の有無で検定し、且つＰＣＲを確認する方法において、上記ＰＣＲにおけるアニーリング反応温度条件を、
９４℃９分を１サイクル
９４℃３０秒→６６．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６４．５℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６３．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６１．５℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６０．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６２．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を３５サイクル
７２℃８分を１サイクル
とした手段よりなるものである。
【０００７】
ところで、ジャガイモに寄生するジャガイモシストセンチュウは、数種のパソタイプに分類されており、これらのうち、日本国内で発生が確認されているのは、ジャガイモシストセンチュウのパソタイプＲｏ１のみである。
一方、ジャガイモシストセンチュウ抵抗性遺伝子（Ｈ１）は、ジャガイモシストセンチュウのパソタイプがＲｏ１，Ｒｏ４の２種に対してのみ抵抗性を示すが、日本で発生しているジャガイモシストセンチュウはパソタイプがＲｏ１のみであり、非常に有効な抵抗性遺伝子である。
このジャガイモシストセンチュウ抵抗性遺伝子（Ｈ１）は、直接には検出不可であるが、ジャガイモ第５染色体に位置するｃＤＮＡクローンＣＰ１１３と強く連鎖することが知られている。つまり、ジャガイモシストセンチュウ抵抗性遺伝子（Ｈ１）の近傍には、ＣＰ１１３遺伝子領域が位置する。
【０００８】
ジャガイモシストセンチュウ抵抗性四倍体品種（染色体数：４８本）由来の二倍性半数体（染色体数：２４本）を作出し、ジャガイモシストセンチュウの接種により抵抗性及び感受性個体を育成した。これらの抵抗性及び感受性二倍性半数体個体より、ジャガイモシストセンチュウ抵抗性遺伝子の近傍に位置するＣＰｌ１３遺伝子領域（図１）をそれぞれ単離し、ＤＮＡの塩基配列を分析した結果、両者で塩基配列の一部が異なることが判明した。即ち
抵抗性個体のＣＰ１１３遺伝子領域の塩基配列はアンチセンス側で（・・ＧＧＧＧ・・）、
感受性個体のＣＰ１１３遺伝子領域の塩基配列はアンチセンス側で（・・ＧＧＧＡ・・）、
である（図２）。その配列を基に抵抗性個体にのみＤＮＡ断片を増幅し、且つＰＣＲを確認するプライマーを設計、合成した。
合成したプライマー（ＣＰ１１３ＳＰ−Ｓ１：５’−ＣＡＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴ−３’、ＣＰ１１３ＳＰ−Ａ１：５’−ＣＧＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＧＡＡＡＴ−３’、Ｈ１ＳＰ−Ａ１：５’−ＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＡＴＧＧＧＧ−３’）を用いて以下のようなＰＣＲの条件を設定した後電気泳動を行った結果、ＤＮＡマーカーによって抵抗性有無の判別を可能にした（図３）。
さらに、新しいＰＣＲ機器に合わせたＰＣＲのアニーリング温度条件を設定し、温度条件にあったＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを選定した。
開発したジャガイモシストセンチュウ検定用ＤＮＡマーカーは、新しいＰＣＲ機器（商品名：Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　９７００、ＰＥアプライドバイオシステムズ社）を用いて、ＰＣＲのアニーリング温度条件（６６℃から２サイクル毎に１．５℃ずつ下げて行き、６０℃２サイクル終了後、６２℃で３５サイクル反応させる）を設定し、温度条件にあったＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＥｘｐａｎｄＴＭ　ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ、ロシュ・ダイアグノスティックス社）を選定した。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、この発明をより具体的に説明する。
〔バイレショＤＮＡ簡易抽出〕
（１）０．０５ｇ組織を１．５ｍｌチューブに入れ、ペッスルですりつぶす。
（２）０．１７５ｍｌの２％ＣＡＴＢと０．１７５ｍｌ８Ｍ　ＬｉＣｌを加えて、優しく撹拌する。
（３）６５℃、５分間インキュベート（時々撹拌する）。
（４）０．３５ｍｌクロロホルム／イソアミルアルコールを加えて、優しく撹拌する。
（５）１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
（６）上澄みを新しい１．５ｍｌチューブに移す。
（７）（４）〜（６）を後１回繰り返す。
（８）０．７〜１倍容の冷イソプロパノールを加えて、優しく撹拌する。
（９）白いＤＮＡの糸が見えたら、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
（１０）１ｍｌの７０％冷エタノールを加えて、すぐに吸い出す。
（１１）１ｍｌの冷エタノールを加えて、すぐに吸い出す。
（１２）蓋を開けたまま、キムタオルの上に逆さまにして５〜１０分間置き、エタノールをとばす。
（１３）５０μｌのＴＥ　Ｂｕｆｆｅｒ（１０μｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅＡ入り）を加え、５５℃で溶解する。
【００１０】
〔ＤＮＡ濃度測定〕
（１）Ｌｏｗ　Ｒａｎｇｅ（Ａ）またはＨｉｇｈ　Ｒａｎｇｅ（Ｂ）＊）２ｍｌをキュベットに入れ、「ＺＥＲＯ」を押し、０点調整を行う。
（２）ＤＮＡ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２５０μｇ／ｍｌ）を１μｌ加え、「ＣＡＬＩＢ」を押し、「ｌ」「２」「５」と入力後、「ＥＮＴＥＲ」を押す。
（３）Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ終了後、キュベットの液を捨て、新しいＬｏｗ　Ｒａｎｇｅ（Ａ）を２ｍｌを入れ、「ＺＥＲＯ」を押し０点調整後、ＤＮＡサンプルの２μｌを加え濃度を測定する。
ここで、
2004057025.tif 000003
【００１１】
2004057025.tif 000004
ここで、Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはロシュ・ダイアグノスティックス社のＥｘｐａｎｄＴＭ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを使用。１０×Ｂｕｆｆｅｒ、ＭｇＣｌ２はキット添付のもの。
（ＰＣＲ条件）
９４℃９分を１サイクル
９４℃３０秒→６６．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６４．５℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６３．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６１．５℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６０．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を２サイクル
９４℃３０秒→６２．０℃３０秒（アニーリング温度）→７２℃６０秒を３５サイクル
７２℃８分を１サイクル
ＰＣＲ条件は、アニーリング温度条件を６６℃から２サイクル毎に６０℃まで１．５℃ずつ下げて行き、６０℃２サイクル終了後、６２℃で３５サイクル反応させることが特徴である。
【００１２】
〔電気泳動〕
（１）アガロース０．８ｇを耐熱ビンに入れ、１×ＴＡＥ　ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ氷酢酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）４０ｍｌを加えて電子レンジで加熱し撹拌しながら完全に溶かす。
（２）溶液の温度が約４０℃に冷えたら、１０ｍｇ／ｍｌエチレンブロマイド（臭化エチジウム）を２．５μｌ加えてゲルトレイに注ぎ、コームを差し込む。ゲルが固まったら泳動槽にセットする。
（３）Ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（０．２５％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ、０．２５％ｘｙｌｅｎｅ　ｃｙａｎｏｌ　ＦＦ、ｌｍＭ　ＥＤＴＡ、３０％グリセロール）１μｌ取り、ＰＣＲさせたチューブに直接加えて混合し、そこから９μ１取る。
（４）９μｌのサンプルを泳動槽にセットしたアガロースゲルの注入穴に静かに注入する。
（５）１００Ｖで電気泳動、２０分間泳動し、ゲルをトランスイルミネーターにのせ、紫外線を照射してカメラで撮影する。
【００１３】
【実施例】
総合農林試験場愛野馬鈴薯支場育種栽培科で供試検定したジャガイモシストセンチュウ圃場抵抗性を有する３５品種・系統を用いてジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定用ＤＮＡマーカーにより検定した結果、３４品種・系統は抵抗性を示すＤＮＡマーカーを検出した。一方、圃場感受性の１１品種・系統はそのすべてが抵抗性を示すＤＮＡマーカーが検出されず、ＤＮＡマーカーを用いた四倍体品種・系統の抵抗性検定法は圃場抵抗性検定結果とほとんど一致した（表１）。交雑育種におけるジャガイモシストセンチュウ抵抗性系統の選抜に、ＤＮＡマーカーを用いた選抜技術の有効性が確認された。
【００１４】
【表１】
2004057025.tif 000005
【００１５】
【発明の効果】
以上の記載より明らかなように、この発明に係るＤＮＡマーカーを用いたジャガイモシストセンチュウ抵抗性検定法によれば、栽培されている四倍体間の交配組合せで得られた雑種後代個体のジャガイモシストセンチュウ抵抗性有無の判別が、ＤＮＡマーカーを用いて可能となった。現地汚染圃場での検定に比較して非常に短い期間で済み労力の省力化となり、多くの個体を幼苗検定することによって早期世代での抵抗性選抜が可能となり、育種効率を高めることができる。また、ＤＮＡマーカーによる抵抗性検定は現地汚染圃場検定で心配される他の地域へのジャガイモシストセンチュウ伝搬の危険性がない等、極めて新規的有益なる効果を奏するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ジャガイモシストセンチュウ抵抗性遺伝子（Ｈ１）が存在する第５番染色体とＣＰ１１３遺伝子領域を示す図である。
【図２】ジャガイモシストセンチュウ抵抗性・感受性二倍性半数体個体間におけるＣＰｌ１３遺伝子領域の塩基配列の比較を示す図である。
【図３】プライマー（ＣＰｌ１３ＳＰ−Ｓ１、ＣＰｌ１３ＳＰ−Ａ１、Ｈ１ＳＰ−Ａ１）を用いたＰＣＲによる抵抗性・感受性個体のＤＮＡマーカーによる識別を示す図である。
【図１】
2004057025.tif 000006
【図２】
2004057025.tif 000007
【図３】
2004057025.tif 000008