(57)【要約】【課題】最適なハイブリダイゼーション効率を示すように核酸の固定化量の制御を容易に行うことができる手段を提供すること。【解決手段】基板表面に核酸スポッティング溶液をスポットして核酸スポットを形成する核酸マイクロアレイの作製方法。前記核酸スポッティング溶液は、少なくとも基板表面に固定化することができる反応基をスペーサー基を介して有する核酸と、核酸を有さず基板表面に固定化することができる反応基とスペーサー基を有する化合物を含む。前記核酸分子数と、前記化合物の分子数の比率が１：１〜１：１０００の範囲である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に核酸スポッティング溶液をスポットして核酸スポットを形成する核酸マイクロアレイの作製方法において、
前記核酸スポッティング溶液は、少なくとも基板表面に固定化することができる反応基をスペーサー基を介して有する核酸と、核酸を有さず基板表面に固定化することができる反応基とスペーサー基を有する化合物を含むことを特徴とする作製方法。
【請求項２】
基板表面に固定化される核酸量を制御することを特徴とする請求項１に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
【請求項３】
前記核酸及び化合物が有する反応基が、硫黄原子を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
【請求項４】
前記核酸及び化合物が有する反応基が、チオール基又はジスルフィド基であることを特徴とする請求項３に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
【請求項５】
前記核酸及び化合物が有するスペーサー基がアルキル鎖である請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
【請求項６】
前記アルキル鎖は、炭素数３以上の直鎖状アルキル鎖である請求項５に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
【請求項７】
前記核酸が有するアルキル鎖の炭素数が、前記核酸を有さない化合物が有するアルキル鎖の炭素数と同じであるか、又はそれより多い請求項５又は６に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
【請求項８】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡである請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
【請求項９】
前記基板が、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金基板、銀基板、銅基板、プラチナ基板、Ｆｅ基板、ＧａＡｓ基板、又はＩｎＰ基板である請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
【請求項１０】
前記基板が、ガラス基板又はプラスチック基板であり、該基板表面にマレイミド基を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
【請求項１１】
基板表面に固定化することができる反応基をスペーサー基を介して有する核酸及び核酸を有さず基板表面に固定化することができる反応基とスペーサー基を有する化合物を含む核酸スポッティング溶液であって、前記核酸分子数と、前記化合物の分子数の比率が１：１〜１：１０００の範囲である核酸スポッティング溶液。
【請求項１２】
前記反応基をスペーサー基を介して有する核酸と、前記核酸を有さず反応基とスペーサー基を有する化合物の含有量が１〜５００μＭの範囲である請求項１１に記載の核酸スポッティング溶液。
【請求項１３】
界面活性剤を更に含む請求項１１又は１２に記載の核酸スポッティング溶液。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸マイクロアレイの作製方法であって、
フォトリソグラフィ技術及びエッチング技術を用いて、核酸スポッティング溶液受容固相部を設ける工程、
基板表面上の前記核酸スポッティング溶液受容固相部以外の部分に撥水処理を施す工程、及び
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の核酸スポッティング溶液をスポットすることにより、前記核酸スポッティング溶液受容固相部に、少なくとも反応基を介して核酸を固定化する工程
を含むことを特徴とする核酸マイクロアレイの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸マイクロアレイの作製方法及び核酸スポッティング溶液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸マイクロアレイ作製において、チオール化核酸を用いることにより、基板表面にチオール基を介して核酸を結合することができることが知られている（非特許文献１及び２参照）。しかし、基板表面にチオール化核酸含有溶液をドットとしてスタンプしてマイクロアレイを作製する際、スタンプ開始時に一定濃度に調製したチオール化核酸溶液を用意しても、多数のドットを作成していくスタンプ操作中に溶液中の溶媒（例えば水）の蒸発により、チオール化核酸の濃度が経時的に変化する。そのため、各ドットに同一量の核酸をスタンプして、一定密度で核酸が固定化されたドットを形成することは事実上不可能であった。即ち、核酸固定化量をドット間でバラツキのないように制御することができないという問題があった。また、溶液中の核酸濃度が高くなり過ぎると、ドット中の核酸密度が高くなり過ぎて、プローブ核酸の間のスペースが少なくなり、ターゲット核酸がプローブ核酸に近づきにくくなり、ハイブリダイゼーション効率が低下するという問題もあった。
【０００３】
【非特許文献１】
トンヤ（Ｔｏｎｙａ）  Ｍ．  ヘルネ（Ｈｅｒｎｅ）及びミカエル（Ｍｉｃｈａｅｌ）  Ｊ．  タルロブ（Ｔａｒｌｏｖ）著、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ，  Ｓｏｃ．  （米国）、アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９９７年、１１９、ｐ．８９１６−８９２０
【非特許文献２】
ジェニファー（Ｊｅｎｎｉｆｅｒ）  Ｍ．  ブロックマン（Ｂｒｏｃｋｍａｎ），  アンソニー（Ａｎｔｈｏｎｙ）  Ｇ．  フルートス（Ｆｒｕｔｏｓ）及びロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）  Ｍ．  コーン（Ｃｏｒｎ）、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ，  Ｓｏｃ．  （米国）、アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９９９年、１２１、ｐ．８０４４−８０５１
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、最適なハイブリダイゼーション効率を示すように核酸の固定化量の制御を容易に行うことができる手段を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記本発明の目的を達成するための手段は以下の通りである。
（１）  基板表面に核酸スポッティング溶液をスポットして核酸スポットを形成する核酸マイクロアレイの作製方法において、
前記核酸スポッティング溶液は、少なくとも基板表面に固定化することができる反応基をスペーサー基を介して有する核酸と、核酸を有さず基板表面に固定化することができる反応基とスペーサー基を有する化合物を含むことを特徴とする作製方法。
（２）  基板表面に固定化される核酸量を制御することを特徴とする（１）に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
（３）  前記核酸及び化合物が有する反応基が、硫黄原子を有することを特徴とする（１）又は（２）に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
（４）  前記核酸及び化合物が有する反応基が、チオール基又はジスルフィド基であることを特徴とする（３）に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
（５）  前記核酸及び化合物が有するスペーサー基がアルキル鎖である（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
（６）  前記アルキル鎖は、炭素数３以上の直鎖状アルキル鎖である（５）に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
（７）  前記核酸が有するアルキル鎖の炭素数が、前記核酸を有さない化合物が有するアルキル鎖の炭素数と同じであるか、又はそれより多い（５）又は（６）に記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
（８）  前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡである（１）〜（７）のいずれかに記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
（９）  前記基板が、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金基板、銀基板、銅基板、プラチナ基板、Ｆｅ基板、ＧａＡｓ基板、又はＩｎＰ基板である（１）〜（８）のいずれかに記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
（１０）  前記基板が、ガラス基板又はプラスチック基板であり、該基板表面にマレイミド基を有する（１）〜（８）のいずれかに記載の核酸マイクロアレイの作製方法。
（１１）  基板表面に固定化することができる反応基をスペーサー基を介して有する核酸及び核酸を有さず基板表面に固定化することができる反応基とスペーサー基を有する化合物を含む核酸スポッティング溶液であって、前記核酸分子数と、前記化合物の分子数の比率が１：１〜１：１０００の範囲である核酸スポッティング溶液。
（１２）  前記反応基をスペーサー基を介して有する核酸と、前記核酸を有さず反応基とスペーサー基を有する化合物の含有量が１〜５００μＭの範囲である（１１）に記載の核酸スポッティング溶液。
（１３）  界面活性剤を更に含む（１１）又は（１２）に記載の核酸スポッティング溶液。
（１４）  （１）〜（１０）のいずれかに記載の核酸マイクロアレイの作製方法であって、
フォトリソグラフィ技術及びエッチング技術を用いて、核酸スポッティング溶液受容固相部を設ける工程、
基板表面上の前記核酸スポッティング溶液受容固相部以外の部分に撥水処理を施す工程、及び
（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の核酸スポッティング溶液をスポットすることにより、前記核酸スポッティング溶液受容固相部に、少なくとも反応基を介して核酸を固定化する工程
を含むことを特徴とする核酸マイクロアレイの作製方法。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明について更に詳細に説明する。
［核酸マイクロアレイの作製方法］
本発明の核酸マイクロアレイの作製方法では、基板表面に核酸スポッティング溶液をスポットしてスポットを形成する。前記核酸スポッティング溶液は、少なくとも基板表面に固定化することができる反応基をスペーサー基を介して有する核酸と、核酸を有さず反応基とスペーサー基を有する化合物を含むことを特徴とする。ここで、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡであることができる。
【０００７】
核酸スポッティング溶液をスタンプしてマイクロアレイを作製する場合、スタンプ中に水分等の溶媒の蒸発により溶液が経時的に濃縮されると、ドットによって核酸の固定化量が変化し、かつ濃縮の程度によっては、過剰量の核酸がアレイ上に固定化される場合もあるため、定量性に乏しいデータしか得られない場合や、ハイブリダイゼーション効率が低下する場合があるという問題があった。そこで、本発明では、例えば、核酸スポッティング溶液に、基板表面に固定化することができる反応基をスペーサー基を介して有する核酸（以下、「スペーサー基含有核酸」ともいう）とともに、核酸を有さず反応基とスペーサー基を有する化合物（以下、「核酸未含有化合物」ともいう）を含有させ、基板上に設けた核酸スポッティング溶液受容固相部に、この溶液をスポットする。これにより、核酸スポッティング溶液受容固相部には、図１に示すように、スペーサー基含有核酸とともに、核酸未含有化合物も固定化される。即ち、このように前記核酸と前記化合物を含む溶液を核酸スポッティング溶液として用いれば、溶媒の蒸発によりこの溶液が濃縮されたとしても、基板上の核酸スポッティング溶液受容固相部には、核酸がスペーサー基を介して固定化されることに加えて、核酸を有さないスペーサー基を有する化合物も固定化される。即ち、本発明の核酸マイクロアレイは、核酸の周囲に核酸を有さないスペーサー基を有する化合物も固定化される。そのため、スペーサー基含有核酸と核酸未含有化合物の混合比を調整することで、核酸（プローブ）を核酸（プローブ）の間のスペースを確保することができ、核酸の固定化密度が過密になることを回避することができる。本発明の核酸マイクロアレイ基板には、例えば核酸スポッティング溶液中の核酸と化合物との混合比を調整することにより、基板表面に固定化される核酸量を制御して、所望の密集度で核酸を固定化することができるため、良好なハイブリダイゼーションを実現することができる。
【０００８】
上記スペーサー基は、アルキル鎖であることができる。前記アルキル鎖としては、炭素数３以上の直鎖状アルキル鎖を用いることが好ましい。炭素数は、３〜３０であることがより好ましく、６〜１８であることが更に好ましい。炭素数が３以上であれば、ＳＡＭ（自己組織化膜）が形成されるため好ましい。また、アルキル鎖が直鎖状であれば、ＳＡＭ形成が容易である。また、マイクロアレイ基板が金属からなる場合は、アルキル鎖が長いほど、金属表面の酸化を防ぐことができる。
【０００９】
また、スペーサー基として、エチレングリコール鎖などの酸素原子を含むものを用いることができる。スペーサー基が酸素原子を含むことにより、核酸スポットの親水性を高めることができる。
【００１０】
本発明の核酸マイクロアレイの作製方法において、スペーサー基がアルキル鎖である場合、高いハイブリダイゼーション効率が得られるという観点から、スペーサー基含有核酸が有するアルキル鎖の炭素数は、核酸未含有化合物が有するアルキル鎖の炭素数と同じであるか、それより多いことが好ましい。特に、スペーサー基含有核酸が有するアルキル鎖の炭素数が、核酸未含有化合物が有するアルキル鎖の炭素数より多ければ、核酸の塩基がターゲットに対してすべて提示され、ハイブリダイゼーションの特異性を高めることができるので好ましい。但し、核酸未含有化合物が有するアルキル鎖の炭素数の方が多い場合は、すべての核酸の塩基がターゲットに提示されないため、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００１１】
本発明の核酸マイクロアレイ基板は、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金基板、銀基板、銅基板、プラチナ基板、Ｆｅ基板、ＧａＡｓ基板、ＩｎＰ基板であることができる。
【００１２】
特に、マイクロアレイ基板表面が硫黄原子を有する反応基と結合し得る物質、例えば金からなる場合には、硫黄原子を有する反応基、特に、チオール基又はジスルフィド基との反応により、核酸を基板上に固定化することができる。従って、マイクロアレイ基板表面が硫黄原子を有する反応基と結合し得る物質からなる場合は、上記反応基が硫黄原子を有する場合、特に、チオール基又はジスルフィド基である場合、核酸を、硫黄原子を介して基板表面に固定化することができる。
【００１３】
また、核酸マイクロアレイ基板がガラス基板又はプラスチック基板である場合は、基板表面にマレイミド基を有することが好ましい。ガラス基板又はプラスチック基板がその表面にマレイミド基を有することにより、硫黄原子を有する反応基とマレイミド基との特異的結合により、核酸を、硫黄原子を介して基板表面に固定化することができる。
【００１４】
本発明において、反応基を有するスペーサー基の具体例としては、１８−アミノ−１−オクタデカンチオール、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール、８−アミノ−１−オクタンチオール、６−アミノ−１−ヘキサンチオール、１０−カルボキシ−１−デカンチオール、７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、５−カルボキシ−１−ペンタンチオール、１０−カルボキシデシルジスルフィド、４−４’−ジチオジブチリックアシッド（ｄｉｔｈｉｏｄｉｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）を挙げることができる。
【００１５】
本発明の核酸マイクロアレイの作製方法において、上記の硫黄を介する結合のほかに基板上に核酸を固定化する方法としては、遷移金属からなる基板に、Ｓｅを含有する反応基を結合させる方法を挙げることができる。
【００１６】
［核酸スポッティング溶液］
本発明の核酸スポッティング溶液は、基板表面に固定化することができる反応基をスペーサー基を介して有する核酸及び核酸を有さず基板表面に固定化することができる反応基とスペーサー基を有する化合物を含む核酸スポッティング溶液であって、前記核酸分子数と、前記化合物の分子数の比率が１：１〜１：１０００の範囲であることを特徴とする。好ましくは、１：２〜１：５０であり、更に好ましくは１：５〜１：２０である。この比率が１：１０００を超えると、ターゲット検出に必要なプローブを確保することができず、１：１未満では、核酸の固定化密度が高すぎてハイブリダイゼーション効率が低下する。
【００１７】
上記溶液におけるスペーサー基含有核酸と核酸未含有化合物の合計含有量は、１〜５００μＭであることが好ましく、１０〜３００μＭであることがより好ましい。両者の合計含有量が１μＭ以上であれば、プローブ固定量を確保することができ、５００μＭ以下であれば、アレイヤーによるスタンプを容易に行うことができる。
【００１８】
上記溶液は、スペーサー基含有核酸及び核酸未含有化合物を、適当な溶媒で希釈することによって調製することができる。溶媒としては、例えば、超純水、クエン酸緩衝液、燐酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの水系緩衝液やエタノールを用いることができる。また、市販品としては、ｍｉｃｒｏ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｓｏｌｎ．（テレケム社製）を挙げることができる。
【００１９】
上記溶液には、界面活性剤を更に含有させることが好ましい。上記溶液に界面活性剤を含有させることにより、核酸スポットが核酸スポッティング溶液受容固相部外へ広がることを防止し、良好な形状のスポットを得ることができるため、データ解析における定量性及び再現性を向上させることができる。界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ等を用いることができ、その濃度は、例えば、０．０１〜１％とすることが適当である。
【００２０】
本発明の核酸マイクロアレイ基板は、
フォトリソグラフィ技術及びエッチング技術を用いて、核酸スポッティング溶液受容固相部を設ける工程、
基板表面上の前記核酸スポッティング溶液受容固相部以外の部分に撥水処理を施す工程、及び
上記核酸スポッティング溶液をスポットすることにより、前記核酸スポッティング溶液受容固相部に、少なくとも反応基を介して核酸を固定化する工程
によって作製することができる。
【００２１】
上記の核酸スポッティング溶液受容固相部を設ける工程は、例えば、以下の方法によって行うことができる。表面研磨したスライドガラスの片側の表面に、真空蒸着装置を用いて、例えば、クロム、チタン、ニッケル等を蒸着することにより、接着層を設ける。接着層の厚さは、例えば、１０〜１０００Åにすることができる。この接着層の上に、例えば、金を１０〜５０００Åの厚さに蒸着し、蒸着層を形成する。次いで、この上に、ポジ型レジストを、スピンコーターで塗布した後、露光装置によって、フォトマスクを通して紫外光を照射する。フォトマスクは、基板上に所望の核酸スポッティング溶液受容固相部を形成すべく、所定の大きさの径を有する円パターンが形成されたものであり、その径は、例えば１０〜４００μｍとすることができ、その間隔は、例えば１０〜４００μｍとすることができる。
【００２２】
紫外光照射後、現像を行い、レジストのパターンを形成する。次いで、露出している蒸着層表面のエッチングを行う。例えば、蒸着物質として金を用いた場合、エッチャントとしては、ヨウ化カリウム及びヨウ素を含有する水溶液（例えば、ヨウ化カリウム：ヨウ素：水＝６：１：８０）を用いることができる。次いで、洗浄を行った後、さらに露出した接着層のエッチング及び洗浄を行う。ここで、例えば接着層がクロムからなる場合、エッチャントとしては、１０％硝酸二セリウムアンモニウム（ＩＶ）を用いることができる。
【００２３】
次いで、基板表面のレジストを完全に除去する。以上の工程により、蒸着物質がパターン化した、核酸スポッティング溶液受容固相部を、基板表面上に形成することができる。なお、本発明は、上記態様には限定されず、基板としては、上述の基板を用いることもできる。また、使用するレジストも、ポジ型レジストに限られず、ネガ型レジストを用いることもできる。また、蒸着物質としては、硫黄原子を有する反応基と結合し得るものであれば、金以外のものも用いることもできる
【００２４】
次いで、基板表面上に核酸スポッティング溶液受容固相部以外の部分に撥水処理を施す。撥水剤としては、シリコンコーティング剤、シラン剤等を用いることができる。撥水剤含有溶液に上記基板を浸漬した後、洗浄、乾燥させることにより、核酸スポッティング溶液受容固相部以外の部分に撥水処理を施すことができる。例えば、ガラス基板上に金がパターン化された基板の場合は、基板上のガラス表面が露出した部分にのみ撥水処理が施されることになる。
【００２５】
以上により得られた核酸マイクロアレイ基板上に、例えば、反応基としてチオール基を有する核酸及び化合物を用いる場合、本発明の核酸スポッティング溶液をスポットし、次いで、チオール基を基板上に蒸着された物質と反応させることにより、核酸スポッティング溶液受容固相部に、少なくとも反応基を介して核酸を固定化することができる。蒸着物質とチオール基との反応は、例えば、上記溶液をスポットした基板を、モイスチャーチャンバー内で一昼夜放置することにより行うことができる。蒸着物質が金の場合、上記反応後、この基板を１ｍＭ  ヒドロキシアルカンチオール水溶液に浸漬し、洗浄、乾燥させることにより、チオール基のアレイ上への結合が完了し、少なくとも反応基を介して核酸が固定化された核酸マイクロアレイを得ることができる。
【００２６】
更に、本発明によれば、単色標識による定量的なマイクロアレイを作製することができる。従来の方法では、アレイ上に固定化される核酸量がばらついているので、二組織由来の２つのターゲットを別の色素で標識し、その２つのターゲットをまぜて同時にハイブリダイゼーションを行い、相対的にターゲット量を評価していた。それに対して、本発明の方法によれば、核酸マイクロアレイ上のすべてのスポットに一定量の核酸を固定化することができる。従って、本発明によって作製されたマイクロアレイを用いれば、単色標識したターゲット量を、絶対量として検出することができる。
【００２７】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１
金リソグラフィック基板の作製
１）表面研磨したスライドガラスの片側の表面に、真空蒸着装置により、クロムを２５０Åで蒸着し、接着層を形成した後、金をその上に２５００Åで蒸着した。
２）金蒸着スライドグラス上にポジ型レジストをスピンコーターで塗布した。露光装置により、フォトマスクを通して紫外光を照射した。フォトマスクは、直径１００μｍの円のパターンが形成されている。照射後、現像を行い、レジストのパターンを形成した。
３）露出している金表面を、エッチャント（ヨウ化カリウム：ヨウ素：水＝６：１：８０）によりエッチングした。超純水で洗浄した後、さらに露出したクロムをエッチャント（１０％硝酸二セリウムアンモニウム（ＩＶ））によりエッチングを行い、超純水で洗浄した。
４）アセトンにつけ、レジストを溶解後、超純水で洗浄し、さらに残っているレジストを完全に除去するために、ピラニア溶液（硫酸：過酸化水素＝１：１）に１０分間つけ、超純水で洗浄した。以上により、金がパターン化した基板が作製された。
５）シリコンコーティング剤（主成分ジメチルポリシロキサン、ＩＷＡＫＩ，  ＳＩＬ−ＣＯＡＴ５）を７０℃の超純水に２．５％になるように加え、よく撹拌した。
６）金がパターン化した基板を上記の２．５％シリコンコーティング水溶液に１０秒浸し、すぐに超純水でよくすすいだ。１１０℃のオーブンで、３０分間乾燥させた。
【００２８】
実施例２
チオール化ＤＮＡと結合した有機チオール化合物の基板への固定化
蛍光修飾されたチオール化オリゴＤＮＡ（ＳＨ−（ＣＨ２）６−ｇｇｃｔａｃａｇｃａａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｃａｔｇ（３０ｍｅｒ））と６−メルカプト−１−ヘキサンチオールを混合し、ＤＮＡスポット用溶液を作製した。最終的に固定化されたプローブＤＮＡの濃度、該濃度のプローブＤＮＡを固定化するためのチオール化ＤＮＡとヒドロキシアルカンチオールの混合比及びチオール化ＤＮＡとヒドロキシアルカンチオールの合計含有量を、表１に示す。溶媒としては、ｍｉｃｒｏ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｓｏｌｎ．（テレケム社）を用いた。上記溶液には、界面活性剤として、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を添加した。この溶液を、本出願人らが開発したＤＮＡアレイヤーにより、正確に金がパターン化されている固相化部位にスタンプした。スタンプ後、モイスチャーチャンバー内で一昼夜放置し（６×ＳＳＣ（４５０ｍＭ塩化ナトリウム、４５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、１６時間）、金−チオール反応を行った。反応後、１ｍＭヒドロキシアルカンチオール水溶液に１時間浸漬し、超純水で洗浄し乾燥させて金への有機チオール化合物の結合を完了させた。
【００２９】
【表１】
2004170367.tif 000002
【００３０】
実施例３
Ｇｅｎｅ  Ｓｃｏｐｅ  ＩＩ（Ｇｅｎｅ  Ｆｏｃｕｓ社製）を用いて、実施例２で得られたＤＮＡマイクロアレイのスタンプ直後のＦＩＴＣ画像を得た。結果を図２に示す。
【００３１】
実施例４
実施例２で得られたＤＮＡマイクロアレイに蛍光修飾させたターゲットＤＮＡ：Ｃｙ３−ｃａｔｇｔａｇｇｃｃａｔｇａｇｇｔｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｔｔをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後のＣｙ３画像を図３に示す。ハイブリダイゼーション溶液としては、１０μＭ  Ｃｙ３標識相補ｏｌｉｇｏ、１５μＭ  ｄＡ  １０ｍｅｒ、１ｍｇ／ｍｌ  ｙｅａｓｔ  ｔＲＮＡ、３．４×ＳＳＣ、４．４％ブロッキング溶液を用いた。この溶液をアレイ上に２０μｌのせ、カバーガラス（２２×２２ｍｍ）を被せた。飽和ＮａＣｌ湿潤チャンバーに入れて密閉し、４５℃で１時間反応させ、ハイブリダイゼーションを行った。その後、１×ＳＳＰＥで洗浄した後、スキャナーにてＣｙ３画像を得た。
図２及び図３より、本発明の方法によれば、スタンプ中の溶液中の溶媒の蒸発による濃縮の影響を受けずに、一定量のプローブＤＮＡを固定化することができることがわかる。
【００３２】
実施例５
界面活性剤の影響
蛍光修飾させたプローブＤＮＡ：ＳＨ−（ＣＨ２）３−ａａｃａｇｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｃｔｃａｔｇを用いて、実施例２と同様の方法で１０μＭのプローブＤＮＡを固定化したスポット、界面活性剤をＳＤＳに変えた場合のスポット、及び界面活性剤を添加しなかった場合のスポットのＣｙ３画像（スタンプ直後）を得た。結果を図４に示す。図４より、界面活性剤を添加しなかった場合は、核酸スポッティング溶液受容固相部外へスポット溶液が広がり、良好なスポット形状が得られないことがわかる。また、界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いた場合に、特に良好なスポット形状が得られたことがわかる。
【００３３】
実施例６  プローブ濃度とハイブリダイゼーション強度との関係
チオール化ＤＮＡ（３０ｍｅｒオリゴＤＮＡ）と、６−メルカプト−１−ヘキサノ−ル（ＭＣＨ）を１：４の混合比で混合し、全チオール濃度を３０μＭ〜９０μＭまで変化させ、実施例１で作製した金リソグラフィック基板に本出願人らが開発したアレイヤーによりスポットした。また、スタンプ溶液の組成として、上記の物質以外に１×ｍｉｃｒｏｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｓｏｌｎ．（テレケム社）と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む。スタンプ後、モイスチャーチャンバー内で一昼夜放置し（６×ＳＳＣ、１６時間）、金−チオール反応を行った。反応後、７０℃ｈｅａｔ  ｂｌｏｃｋで乾燥させ、超純水で洗浄する。１０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｃｙ３標識ターゲットｏｌｉｇｏ（３０ｍｅｒ）と４５℃で１時間ハイブリダイゼーション反応を、飽和ＮａＣｌ  湿潤チャンバー内で行い、１×ＳＳＰＥで洗浄後マイクロアレイ蛍光スキャナー（Ｇｅｎｅ  Ｓｃｏｐｅ  ＩＩ；Ｇｅｎｅ  Ｆｏｃｕｓ社製）によりハイブリダイゼーション蛍光強度を測定し混合比による固定量の制御を評価した。結果を図５に示す。
この結果から、７０μＭ（ＳＨ−ＤＮＡ／ＭＣＨ＝１４μＭ／５６μＭ）以上の全チオール濃度でスタンプすると、ハイブリダイゼーション強度が一定になることより、混合比が一定であれば濃度変化が起きても固定量制御が可能であることがわかる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、所望の量のプローブ核酸を固定化した核酸マイクロアレイを得ることができる。従って、本発明により、最適なハイブリダイゼーション効率となる量の核酸を固定化し、良好なハイブリダイゼーションを行うことができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸マイクロアレイ基板上での核酸固定化の概略である。
【図２】実施例３で得られたＦＩＴＣ画像である。
【図３】実施例４で得られたハイブリダイゼーション後のＣｙ３画像である。
【図４】実施例５で得られたＣｙ３画像である。
【図５】実施例６で得られたプローブ濃度とハイブリダイゼーション強度との関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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