(57)【要約】【課題】痒み症状を伴う皮膚疾患治療剤をスクリーニングする方法、及び該疾患治療剤を提供する。【解決手段】以下の工程（１）及び（２）：（１）被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程、（２）（１）の結果に基づいて、ＰＡＲ２阻害活性を有する被験物質を皮膚疾患治療剤の有効成分として選別する工程、を含む、痒み症状を伴う皮膚疾患治療剤のスクリーニング方法、及びＰＡＲ２阻害活性を有する化合物を有効成分として含有する、痒みを伴う皮膚疾患治療剤。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）及び（２）：
（１）被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程、
（２）（１）の結果に基づいて、ＰＡＲ２阻害活性を有する被験物質を皮膚疾患治療剤の有効成分として選別する工程、
を含む、皮膚疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
（１）の工程が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）被験物質とＰＡＲ２を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）（ａ）におけるＰＡＲ２の発現量を測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の値を、被験物質を接触させない対照におけるＰＡＲ２の発現量と比較する工程、
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程
を含むことを特徴とする、請求項１記載の皮膚疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
（１）の工程が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）被験物質と、ＰＡＲ２及びＰＡＲ２活性化因子を含む細胞、または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（ｂ）（ａ）におけるＰＡＲ２由来の機能を測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の値を、被験物質を接触させない対照におけるＰＡＲ２由来の機能と比較する工程、
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程、
を含むことを特徴とする、請求項１記載の皮膚疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
皮膚疾患が、痒みを伴う疾患であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
皮膚疾患治療剤が、痒み症状を改善することを特徴とする治療剤である、請求項１〜４のいずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物を有効成分として含有する、皮膚疾患治療剤。
【請求項７】
ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物が、一般式（１）：
【化１】
2004170323.tif 000028
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素原子、又はアルキル基（該アルキル基は、水酸基、アルコキシ基、ニトリル基、置換もしくは無置換のアリール基、または置換もしくは無置換のヘテロアリール基で置換されていてもよい。）を表すか、あるいは、Ｒ１とＲ２は隣接する窒素原子とともに結合して、アルキル基、置換もしくは無置換のアリールカルボニル基、アルキルカルボニル基、アルコキシカルボニル基、置換もしくは無置換のアリール基、または置換もしくは無置換のアリールアルキル基で置換されていてもよい１〜２個の窒素原子、０〜１個の酸素原子、および０〜１個の硫黄原子を含むヘテロシクロアルカンを形成しており、
Ｒ３は、水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、または置換もしくは無置換のアリール基を表し、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、メチレンジオキシ基、またはハロアルキル基を表す。）
で表される化合物、又はその薬学上許容される塩である、請求項６記載の治療剤。
【請求項８】
皮膚疾患が、痒みを伴う疾患であることを特徴とする、請求項６又は７記載の治療剤。
【請求項９】
皮膚疾患治療剤が、痒み症状を改善することを特徴とする治療剤である、請求項６〜８のいずれか記載の治療剤。
【請求項１０】
ＰＡＲ２またはＰＡＲ２活性化因子を有効成分として含有する、痒み症状を改善する薬剤を評価するための動物モデルにおける痒み惹起用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚疾患治療剤のスクリーニング方法、詳しくは、痒みを抑制する皮膚疾患治療剤及びそのスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテアーゼ受容体ＰＡＲ  （ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）  はＧタンパク共役７回膜貫通型受容体の一種であり、現在までに４つのＰＡＲ；ＰＡＲ１，  ＰＡＲ２，  ＰＡＲ３，  ＰＡＲ４  がクローニングされている。
ＰＡＲ２はトリプシン、トリプターゼ、または、血液凝固第ＶＩＩａ因子もしくは第Ｘａ因子によって、Ｎ末端の部分ペプチドが切断され、新しいＮ末端が生成することによって活性化される。例えば、ヒトＰＡＲ２の場合、Ｎ末端３６残基が切断されて、新たにＳＬＩＧＫＶの配列ではじまるＮ末端を有するポリペプチドとなって活性化される。また、活性化されて生成するＮ末端のペプチドの配列に基づく、５〜６個のアミノ酸から成る合成ペプチド（アゴニストペプチド）によっても、活性化されることが知られている（非特許文献１および非特許文献２）。該アゴニストペプチドとしては、ＳＬＩＧＫＶの配列及びＳＬＩＧＲＬの配列で表される部分ペプチドやその改変ペプチドｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍｏｙｌ−ＬＩＧＲＬＯ等が挙げられる（非特許文献３）。
【０００３】
ＰＡＲ２は、消化液の分泌、神経性炎症、疼痛、アレルギー反応（非特許文献４及び非特許文献５）などの種々の生理活性に関与している。
一方、痒みは皮膚固有の感覚である痒みをひきおこす生理活性物質としては、疾患により異なるが、例えば、ヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエンＢ４、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、トリプシン（非特許文献６）等が報告されている。痒みを知覚するメカニズムについては不明な点も多いが、痒み刺激に対してヒスタミン等の生理活性物質が肥満細胞等から分泌され、知覚神経の一種であるＣ繊維を通して脳へと伝達されると考えられている。
上記に関連して、ＰＡＲ２は、Ｃ線維（非特許文献７）及び肥満細胞に発現していること、並びに、ＰＡＲ２の作用により脱顆粒が生じること（非特許文献８）等が報告されているが、ＰＡＲ２と皮膚の痒み症状との関係は不明であった。
【非特許文献１】
Ｄｅｒｙ，  Ｏら、「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」１９９８  第２７４巻，  ｐ．Ｃ１４２９−５２
【非特許文献２】
Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，  Ｓ．Ｒ．ら、「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ」２００１  第５３巻，ｐ  ２４５−２８２
【非特許文献３】
Ａｌ−Ａｎｉ，  Ｂ．ら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」１９９９  第２９０巻，  ｐ７５３−７６０
【非特許文献４】
Ｓｕｎ，  Ｇ．ら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」２００１  第１６７巻，  ｐ１０１４−１０２１
【非特許文献５】
Ｍｉｉｋｅ，  Ｓ．ら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」２００１  第１６７巻，  ｐ６６１５−６６２２
【非特許文献６】
Ｈａｇｅｒｍａｒｋ，  Ｏ．ら、  「Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ」１９９５  第１４巻，ｐ２７１−２７６
【非特許文献７】
Ｓｔｅｉｎｈｏｆｆ，  Ｍ．ら、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」２０００  第６巻，  ｐ１５１−１５８
【非特許文献８】
Ｇｒａｎｔ，  Ｒ．Ｓ．ら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」２００２  第３０２巻，  ｐ４６６−４７４
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規な作用機序に基づく、痒み症状を改善する皮膚疾患治療剤、およびそのスクリーニング方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ＰＡＲ２アゴニストペプチドが、マウスにおいて痒み症状を誘発することを見出した。本発明は以上の知見に基づき、完成するに至ったものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］  以下の工程（１）及び（２）：
（１）被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程、
（２）（１）の結果に基づいて、ＰＡＲ２阻害活性を有する被験物質を皮膚疾患治療剤の有効成分として選別する工程、
を含む、皮膚疾患治療剤のスクリーニング方法、
［２］  （１）の工程が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）被験物質とＰＡＲ２を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）（ａ）におけるＰＡＲ２の発現量を測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の値を、被験物質を接触させない対照におけるＰＡＲ２の発現量と比較する工程、
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程
を含むことを特徴とする、［１］記載の皮膚疾患治療剤のスクリーニング方法、
［３］  （１）の工程が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）被験物質と、ＰＡＲ２及びＰＡＲ２活性化因子を含む細胞、または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（ｂ）（ａ）におけるＰＡＲ２由来の機能を測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の値を、被験物質を接触させない対照におけるＰＡＲ２由来の機能と比較する工程、
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程、
を含むことを特徴とする、［１］記載の皮膚疾患治療剤のスクリーニング方法、
［４］  （ｄ）の工程が、以下の工程：
（ｄ−１）被験物質のＰＡＲ２阻害活性と、式：
【化２】
2004170323.tif 000002
で表される化合物のＰＡＲ２阻害活性を比較する工程、
（ｄ−２）前記化合物と同等以上のＰＡＲ２阻害活性を示す被験物質を、皮膚疾患治療剤候補化合物として選択する工程、
を含むことを特徴とする、［３］記載のスクリーニング方法。
［５］  （１）の工程が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）被験物質と、ＰＡＲ２、及びＰＡＲ２リガンドを含む水溶液、細胞、または該細胞から調製した細胞膜画分とを接触させる工程、
（ｂ）（ａ）におけるＰＡＲ２に結合したＰＡＲ２リガンド量を測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の値を、被験物質を接触させない対照における、ＰＡＲ２に結合したＰＡＲ２アゴニスト量と比較する工程、
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程、
を含むことを特徴とする、［１］記載の皮膚疾患治療剤のスクリーニング方法、
［６］  皮膚疾患が、痒みを伴う疾患であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか記載のスクリーニング方法、
［７］  皮膚疾患治療剤が、痒み症状を改善することを特徴とする治療剤である、［１］〜［６］のいずれか記載のスクリーニング方法、
【０００７】
［８］  ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物を有効成分として含有する、皮膚疾患治療剤、
［９］  ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物が、一般式（１）：
【化３】
2004170323.tif 000003
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素原子、又はアルキル基（該アルキル基は、水酸基、アルコキシ基、ニトリル基、置換もしくは無置換のアリール基、または置換もしくは無置換のヘテロアリール基で置換されていてもよい。）を表すか、あるいは、Ｒ１とＲ２は隣接する窒素原子とともに結合して、アルキル基、置換もしくは無置換のアリールカルボニル基、アルキルカルボニル基、アルコキシカルボニル基、置換もしくは無置換のアリール基、または置換もしくは無置換のアリールアルキル基で置換されていてもよい１〜２個の窒素原子、０〜１個の酸素原子、および０〜１個の硫黄原子を含むヘテロシクロアルカンを形成しており、
Ｒ３は、水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、または置換もしくは無置換のアリール基を表し、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、メチレンジオキシ基、またはハロアルキル基を表す。）
で表される化合物、又はその薬学上許容される塩である、［８］記載の治療剤、
［１０］  Ｒ３がハロアルキル基で表されることを特徴とする、［９］記載の治療剤、
［１１］  ハロアルキル基がトリフルオロメチル基であることを特徴とする、［９］記載の治療剤、
［１２］  Ｒ１とＲ２が隣接する炭素原子とともに結合して、アルキル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルコキシカルボニル基、フェニル基、またはベンジル基で置換されていてもよい、ピペリジン、パーヒドロアゼピン、モルホリン、チオモルホリン、またはピペラジンを形成していることを特徴とする、［８］〜［１０］のいずれか記載の治療剤、
［１３］  Ｒ１とＲ２が隣接する炭素原子とともに結合して、アルキル基、または、アルコキシカルボニル基で置換されていてもよい、ピペリジン、またはパーヒドロアゼピンを形成していることを特徴とする、［１１］記載の治療剤、
［１４］  一般式（２）：
【化４】
2004170323.tif 000004
［式中、Ｒ１は、以下の群：
【化５】
2004170323.tif 000005
または、
【化６】
2004170323.tif 000006
（式中、Ｒ６は水素原子、アリールカルボニル基、またはアルキルカルボニル基を表し、Ｒ７は、水素原子、またはアルキル基をあらわし、Ｒ８およびＲ９は、水素原子、アルキル基、またはアルコキシカルボニル基を表し、Ｒ１０はアルキル基を表し、Ｒ１１は水酸基、アルコキシ基、ニトリル基、置換もしくは無置換のアリール基、または置換もしくは無置換のヘテロアリール基で置換されていてもよいアルキル基を表す。）
から選択される基を表し、Ｒ３’は、水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、またはフェニル基を表し、
Ｒ４’およびＲ５’は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、またはハロアルキル基を表す。］
で表される化合物、またはその薬学上許容される塩を有効成分として含有する皮膚疾患治療剤、
【０００８】
［１５］  皮膚疾患が、痒みを伴う疾患であることを特徴とする、［８］〜［１４］のいずれか記載の治療剤、
［１６］  皮膚疾患治療剤が、痒み症状を改善することを特徴とする治療剤である、［８］〜［１４］のいずれか記載の治療剤、
［１７］  ＰＡＲ２又はＰＡＲ２活性化因子を有効成分として含有する、痒み症状を改善する薬剤を評価するための動物モデルにおける痒み惹起用試薬、
に関するものである。
【０００９】
【本発明の実施の形態】
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １３８：  ９  （１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１０】
本明細書において、「ＰＡＲ２」とは、Ｇタンパク共役７回膜貫通型受容体に属するトリプシンやトリプターゼ等のプロテアーゼによって活性化される受容体（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）蛋白質を表し、そのアミノ酸配列は、ヒトについては、Ｂｏｈｍ，  Ｓ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｌ  Ｊ．，  ３１４，  １００９−１６，  １９９６  （Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．  Ｎｏ．Ｕ３４０３８）  に記載されており、他の動物種のホモログについては、マウス：  Ｎｙｓｔｅｄｔ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７０，  ５９５０−５５，  １９９５（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．  Ｎｏ．  Ｚ４８０４３）、及びラット：Ｓａｉｆｅｄｄｉｎｅ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  １１８，  ５２１−３０，  １９９６（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．  Ｎｏ．  Ｕ６１３７３）についてそれぞれ公知である。
【００１１】
本明細書において「ＰＡＲ２」には、上記のアミノ酸配列を有するものだけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などが包含される。ここで上記以外の動物種のホモログは、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。
【００１２】
本明細書において、「ＰＡＲ２遺伝子」とは、前記ＰＡＲ２をコードする遺伝子を表し、その塩基配列は、ヒトについてはＢｏｈｍ，  Ｓ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｌ  Ｊ．，  ３１４，  １００９−１６，  １９９６  （Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．  Ｎｏ．  Ｕ３４０３８）に記載されており、他の動物種のホモログについては、マウス：Ｎｙｓｔｅｄｔ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７０，  ５９５０−５５，１９９５（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．  Ｎｏ．  Ｚ４８０４３）、ラット：Ｓａｉｆｅｄｄｉｎｅ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  １１８，  ５２１−３０，  １９９６（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃ．  Ｎｏ．  Ｕ６１３７３）等についてそれぞれ公知である。
また、本明細書において「ＰＡＲ２遺伝子」には、上記の塩基配列を有するものだけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体等が包含される。
ここで上記以外の動物種のホモログは、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変された塩基配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
【００１３】
「生物学的機能が同等である」とは、具体的には、既知のＰＡＲ２アゴニストとの結合活性を保持しているか、又は以下に述べるＰＡＲ２の機能を保持してことを表す。
【００１４】
本明細書において、「ＰＡＲ２活性化因子」とは、▲１▼ＰＡＲ２のＮ末端の部分ペプチドを加水分解させることによってＰＡＲ２を活性化する酵素蛋白質、及び▲２▼▲１▼の酵素蛋白質非存在下にＰＡＲ２を活性化することができるアゴニスト化合物を表し、ＰＡＲ２活性化とは▲１▼▲２▼により生ずる作用を共に含む概念である。
すなわち、ＰＡＲ２の天然における活性化機構は、ＰＡＲ２活性化因子によりＮ末端のペプチド（ヒトＰＡＲ２の場合Ｎ末端３６残基に相当する。）が加水分解されて新たに生成するＮ末端部分ペプチド（以下、活性型Ｎ末端部分ペプチドと称する場合がある。）が、リガンドとしてＰＡＲ２に結合し、これによりＰＡＲ２由来の生理活性が生じるものであり、具体的な前記▲１▼のＰＡＲ２活性化因子（酵素蛋白質）としては、トリプシン、トリプタ−ゼ、血液凝固第Ｘａ因子、又は血液凝固第ＶＩＩａ因子等を例示することができる。
一方、前記▲２▼のＰＡＲ活性化因子（アゴニスト）としては、活性化されたＰＡＲ２のＮ末端部分ペプチド配列に基づくペプチド化合物及びその誘導体が挙げられる。具体的には、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号：１）及びＳＬＩＧＲＬ（配列番号：２）で表される部分ペプチドやその改変ペプチドｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍｏｙｌ−ＬＩＧＲＬＯ（配列番号：３）等が挙げられる。また、膜結合型セリンプロテアーゼ  １（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５，  ２６３３３−２６３４２  （２０００））、及び膜結合型セリンプロテアーゼ  ３  （Ｗａｌｌｒａｐｐ，  Ｃ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６０，  ２６０２−２６０６  （２０００））等もアゴニストとして例示することができる。
【００１５】
本明細書において、「ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物」とは、ＰＡＲ２の機能を阻害する方向へ作用する化合物であれば何ら限定されるものではなく、ＰＡＲ２の発現量を減少させる活性を有する化合物、ＰＡＲ２アンタゴニスト活性を有する化合物、ＰＡＲ２の機能を抑制する化合物等を含む概念である。
ここで「ＰＡＲ２の発現量を減少させる」とは、ＰＡＲ２をコードするｍＲＮＡの発現量を減少させること、またはＰＡＲ２の蛋白質量を減少させることを表す。
「ＰＡＲ２のアンタゴニスト活性」とは、Ｎ末端が切断されて活性化されたＰＡＲ２の活性型Ｎ末端部分ペプチドとＰＡＲ２の結合や、アゴニストとＰＡＲ２の結合を阻害する活性を言う。
また、「ＰＡＲ２の機能」としては、細胞内カルシウムの濃度上昇や細胞内イノシトール３リン酸の産生増加等のＧＰＣＲに特有の機能、プロテインキナーゼＣもしくはＭＡＰ  キナーゼによる細胞内タンパク質のリン酸化増加、又は細胞からのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）放出促進、又は、哺乳動物における唾液分泌促進等の機能が挙げられる。
【００１６】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
本発明の第１の態様は、以下の工程（１）被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程、及び（２）（１）の結果に基づいて、ＰＡＲ２阻害活性を有する被験物質を皮膚疾患治療剤の有効成分として選別する工程を含む、皮膚疾患治療剤のスクリーニング方法である。
上記（１）において、ＰＡＲ２阻害活性を評価する方法としては、Ｉ．ＰＡＲ２の発現量を測定する方法、ＩＩ．ＰＡＲ２の機能を測定する方法、ＩＩＩ．ＰＡＲ２結合阻害活性を測定する方法等が挙げられる。以下それぞれについて、具体的に述べる。
【００１７】
Ｉ．ＰＡＲ２の発現量を測定する方法
ＰＡＲ２の発現量に基づき、ＰＡＲ阻害活性を評価する方法は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程：
（ａ）被験物質とＰＡＲ２を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）（ａ）におけるＰＡＲ２の発現量を測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の値を、被験物質を接触させない対照におけるＰＡＲ２の発現量と比較する工程、
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程
を含む。
【００１８】
ここで、ＰＡＲ２を発現可能な細胞としては、内在性および外来性を問わず、ＰＡＲ２を発現する培養細胞全般を挙げることができる。培養細胞においてこれら本発明遺伝子が発現しているか否かは、公知のノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法にてこれらの遺伝子発現を検出することにより、容易に確認することができる。
当該スクリーニングに用いられる細胞の具体例としては、例えば以下の（１）〜（３）：
（１）  ＰＡＲ２を発現している哺乳動物由来細胞
（２）上記ＰＡＲ２活性化因子で処理した細胞
（３）ＰＡＲ２をコードする遺伝子を導入した細胞、
等を挙げることができる。
ここで、前記（１）の細胞としては、膵臓組織由来細胞、ケラチノサイト由来細胞、肥満細胞、血管内皮細胞、Ｔリンパ球、血小板、骨芽細胞、肝細胞、又は各種の株化された細胞が挙げられる。具体的には、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ヒト膵臓癌由来細胞株）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓由来細胞株）、Ａ５４９（ヒト肺ガン由来細胞株）、ＨＦＬ１（ヒト胎児肺由来細胞株）、ＳＷ９８２（ヒト滑膜様細胞株）、又はＳＷ１３５３（ヒト軟骨様細胞株）を例示することができる。
前記（２）において、ＰＡＲ２活性化因子としては、前記と同じものが挙げられる。処理する細胞としては、前記（１）に記載された細胞が挙げられる。
【００１９】
前記（３）の遺伝子を導入した細胞としては、前記（１）及び（２）に挙げた細胞の他、通常遺伝子導入に用いられる宿主細胞、すなわちＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＳＴ２等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、ＢＨＫ、ＣＨＯ等のハムスター由来細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１、Ｖｅｒｏ等のサル由来細胞、ＨｅＬａ、２９３等のヒト由来細胞、およびＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ等の昆虫由来細胞などが例示される。
【００２０】
さらに、本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞には、細胞の集合体である組織なども含まれる。
また本発明スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つ本発明遺伝子を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
【００２１】
ＰＡＲ２の発現量を測定する方法としては、試料として工程（ａ）の細胞から調製されるＲＮＡを用いるノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、もしくはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析法、又は、試料として工程（ａ）の細胞から調製される蛋白質を用いるウェスタンブロッティング法などの公知の方法が挙げられる。測定試料は、通常細胞を破砕、希釈、又は遠心分離する等の必要な処理を行い、ＲＮＡもしくは蛋白質を含む画分として調製する。
【００２２】
ノーザンブロット法を利用する場合は、ＰＡＲ２遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドをプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中のＰＡＲ２の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、前記プローブを放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐなど：ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、これを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした、工程（ａ）の細胞由来ＲＮＡとハイブリダイズさせた後、形成されたプローブ（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を、疾患マーカーの標識物（ＲＩ若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、該プロトコールに従ってプローブＤＮＡを標識し、前記ＲＮＡとハイブリダイズさせた後、前記プローブの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００２３】
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、本発明の上記プローブと同様の塩基配列をプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中のＰＡＲ２の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、工程（ａ）の細胞由来ＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的のＰＡＲ２の遺伝子の領域が増幅できるように、前記プライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めＲＩや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識されたプライマーとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント２１００バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社製）で該プロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社製）で反応させて、該反応物を検出することもできる。
ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、上記ノーザンハイブリダイゼーション法でプローブとして用いたＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）を樹脂上のチップに結合させたものを用意し、これに工程（ａ）の細胞由来ＲＮＡから常法によって調製されたｃＲＮＡをハイブリダイズさせて、形成されたＤＮＡとｃＲＮＡとの二本鎖を、前記プライマーから調製される標識プライマーと結合させて検出する方法を挙げることができる。
【００２４】
また、ＰＡＲ２を認識する抗体を用いて、ウエスタンブロット法などの公知方法で、ＰＡＲ２を検出、定量する方法を挙げることができる。
ウエスタンブロット法は、一次抗体を試料と反応後、二次抗体として１２５Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）などの酵素等で標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
【００２５】
ここで前記抗体は、ポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、その製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１．１２〜１１．１３（２０００））。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＰＡＲ２を用いて、あるいは常法に従ってこれら本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＰＡＲ２、またはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４〜１１．１１）。
【００２６】
抗体の作製に免疫抗原として使用されるＰＡＲ２は、前記公知文献に記載された配列情報に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８３），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ＤＭ．  Ｇｌｏｖｅｒ，  ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ  （１９８５））などに準じて行うことができる。
【００２７】
上記のように測定した被験物質存在下におけるＰＡＲ２発現量（工程（ｂ）の測定値）を、被験物質を接触させない対照におけるＰＡＲ２の発現量と比較することによって、被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価することができる。
具体的には、被験物質を添加した上記（１）〜（３）のいずれかの細胞におけるＰＡＲ２の発現レベルが、被験物質を添加しない細胞（対照）のそのレベルに比して低くなることをもって、行うことができる。また、ＰＡＲ２の発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質としてＰＡＲ２活性化因子を用いることによって誘導される発現が被験物質の存在によって制御されること、すなわち発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることを指標として、当該被験物質をＰＡＲ２阻害活性を有する化合物として評価することができる。
【００２８】
上記のように評価した被験物質のＰＡＲ２阻害活性を指標として、皮膚疾患治療剤の候補物質を選別することができる。例えば、被験物質存在下におけるＰＡＲ２の発現量が、被験物質を接触させない対照細胞における発現量と比較して、１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上減少する被験物質を候補物質として選別することができる。
【００２９】
またＰＡＲ２の発現レベルの検出及び定量は、これを制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することによっても実施できる。従って、ＰＡＲ２の発現制御物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含されるものであり、この意味において、ＰＡＲ２の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子を用いたスクリーニングも本発明の範疇である。
【００３０】
なお、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましい。具体的には、上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子が例示できる。
また、ここで前記本発明遺伝子の発現制御領域は、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１ｋｂ、好ましくは約２ｋｂを用いることができる。
【００３１】
本発明遺伝子の発現制御領域は、例えば（ｉ）５’−ＲＡＣＥ法（例えば、５’ｆｕｌｌ  Ｒａｃｅ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）等を用いて実施される）、オリゴキャップ法、Ｓ１プライマーマッピング等の通常の方法により、５’末端を決定するステップ；（ｉｉ）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ  Ｋｉｔ（クローンテック社製）等を用いて５’−上流領域を取得し、得られた上流領域について、プロモーター活性を測定するステップ；を含む手法等により同定することができる。また融合遺伝子の作成、およびマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
【００３２】
ＩＩ．ＰＡＲ２の機能を測定する方法
ＰＡＲ２の機能に基づき、ＰＡＲ阻害活性を評価する方法は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程：
（ａ）被験物質と、ＰＡＲ２及びＰＡＲ２活性化因子を含む細胞、または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（ｂ）（ａ）におけるＰＡＲ２由来の機能を測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の値を、被験物質を接触させない対照におけるＰＡＲ２由来の機能と比較する工程、
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程、
を含む。
【００３３】
ここで、ＰＡＲ２の公知の機能に基づく如何なる機能測定方法をも利用することができる。すなわち、ＰＡＲ２の公知の機能・活性測定系に被験物質を添加し、当該ＰＡＲ２の公知の機能を抑制する被験物質を、ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物として評価することができる。
【００３４】
本発明のスクリーニングは、ＰＡＲ２を含む細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させることにより行うことができる。
【００３５】
また、本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞としては、内在性及び外来性を問わず、ＰＡＲ２を発現し得る細胞を挙げることができる。該細胞としては、具体的には、前記Ｉにおいて（１）〜（３）に記載した細胞などを用いることができる。
また本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞画分とは、上記細胞に由来する各種の画分を意味し、これには、例えば細胞膜画分などが含まれる。
【００３６】
前記スクリーニングにおいて用いられるＰＡＲ２は、公知のタンパク質であり、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換細胞の培養、および必要に応じて培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８３），  ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，  ＤＭ．  Ｇｌｏｖｅｒ，  ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ  （１９８５））などに準じて行うことができる。
【００３７】
ＰＡＲ２の機能を測定する方法としては、具体的には、細胞内カルシウム濃度の上昇活性、アラキドン酸遊離（Ｋｏｎｇ，  Ｗ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４，  ８８８４−８８８９  （１９９７）；  ＭｃＨｏｗａｔ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｕｒｏｌｏｇｙ，  １６５，  ２０６３−２０６７（２００１））、細胞内イノシトール３リン酸の産生促進、細胞膜電位変動、ｃ−ｆｏｓ活性化（Ｈｏｏｇｅｒｗｅｒｆ，  Ｗ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２１，  ９０３６−９０４２  （２００１）；  Ｃｏｅｌｈｏ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  １２２，  １０３５−１０４７  （２００２））、又はプロテインキナーゼＣもしくはＭＡＰキナーゼによる細胞内蛋白質のリン酸化促進活性等のＧＰＣＲ特有の機能を測定する方法、または細胞からのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）放出促進活性、哺乳動物における唾液分泌促進活性等が挙げられる。
該生理活性は、公知の方法、または市販の測定用キットを用いて測定することができる。すなわち、ＰＡＲ２を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。新鮮な培地、あるいは細胞毒性を示さない適当なバッファーに交換し、被験化合物、および／またはリガンド等を添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出、あるいは上清液を回収して生成した産物をそれぞれ該当する方法に従って定量する。生理活性の指標とする物質（例えばアラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって測定不能な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を併用することもできる。具体的な測定方法を以下に例示する。
【００３８】
▲１▼Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（ＦＬＩＰＲ）法
細胞内カルシウム濃度上昇活性の測定方法としては、ヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３細胞、ヒト肺ガン由来細胞株Ａ５４９、またはヒト胎児肺由来細胞株ＨＦＬ１等のＰＡＲ２を発現し得る培養細胞株に、Ｆｌｕｏ−３  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）等のカルシウム結合性蛍光プローブ、及びｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（色素を細胞内に保持するために、ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｕｍｐの阻害剤として用いる。）を含む培地で培養し、ＰＡＲ２アゴニスト（ＮＨ２−ＳＬＩＧＲＬ−ＣＯＮＨ２等の合成ペプチド）もしくはトリプシン等のＰＡＲ２活性化因子を添加して、更に一定時間（例えば３０分〜２時間）培養した後、ＰＡＲ２を活性化することによって変動する細胞内カルシウム濃度を、蛍光シグナルの変化としてＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）にて検出する。検出は、４８８ｎｍのアルゴンレーザーで細胞を励起し、カルシウムイオンが結合したＦｌｕｏ−３の蛍光を５００−５６０ｎｍの波長でとらえることによって行う。例えば、リガンド添加直後から６０秒後までの蛍光強度から、添加前の値をバックグラウンドとして差し引いた値を活性とすることができる。被験物質を添加する場合はＰＡＲ２活性化因子を添加する前に添加することが好ましい。被験物質のＰＡＲ２機能阻害活性は、被験物質存在下におけるカルシウムイオン量が、被験物質非存在下におけるカルシウムイオン量に比して減少するか否かを指標にして評価することができる。
尚、上記において、ＰＡＲ２の発現ベクターと、Ｇｑ蛋白、もしくはＧｑｓ５蛋白（Ｇｑｓ５とは、Ｃ末端に、Ｇｓ蛋白のＣ末端アミノ酸５残基を置換したＧｑ蛋白を意味する。）、もしくはＧｑｉ５蛋白（Ｇｑｉ５とは、Ｃ末端に、Ｇｉ蛋白のＣ末端アミノ酸５残基を置換したＧｑ蛋白を意味する。）の発現ベクターを作製し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞等に遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いて共導入し、形質転換細胞を調製して用いることもできる。
【００３９】
▲２▼イノシトール３リン酸の産生量を測定する方法
ヒト膵臓癌由来細胞株  ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞等の培養細胞株に、ＰＡＲ２アゴニスト（ＮＨ２−ＳＬＩＧＲＬ−ＣＯＮＨ２等の合成ペプチド）もしくはトリプシン等のＰＡＲ２活性化因子を添加して、ＰＡＲ２を活性化する。一定時間後にトリクロロ酢酸等の酸を加えて反応を停止させた後、細胞を回収し、ジエチルエーテル等の有機溶媒を含む水溶液等を用いて細胞内のイノシトール３リン酸を抽出し、イノシトール３リン酸の量を定量することができる。
定量方法としては、［３Ｈ］アッセイシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＴＲＫ１０００；ＩＰ３抗体及び［３Ｈ］ＩＰ３を用いて生体内ＩＰ３量を測定するシステム）で定量する方法が挙げられる。
【００４０】
▲３▼プロテインキナーゼＣ活性化測定方法
ヒト膵臓癌由来細胞株、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞等の培養細胞株に、［３２Ｐ］ＡＴＰ存在下で、ＰＡＲ２アゴニスト（Ｈ−ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２等の合成ペプチド）もしくはトリプシン等のＰＡＲ２活性化因子を添加して、ＰＡＲ２を活性化する。一定時間後に０℃に冷却することによって反応を停止させた後、細胞をホモゲナイズし、バッファー（例えば、０．２５ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ、２０ｍＭ  ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＥ、１０ｕｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ溶液）を加えて超音波処理後に遠心分離を行い、上清▲１▼と沈渣を共に回収する。沈渣を更にバッファー（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有バッファー）中でホモゲナイズし、遠心分離を行って上清▲２▼を回収する。前記上清▲１▼及び▲２▼をＤＥＡＥイオン交換カラムなどを用いてＰＫＣ画分を分離精製し、ＰＫＣの基質である［３２Ｐ］ＡＴＰ由来の［３２Ｐ］リン酸量を測定することにより、ＰＫＣの量を定量することができる。
【００４１】
▲４▼ＰＧＥ２量の測定
ヒト滑膜様細胞株ＳＷ９８２細胞を被験物質存在下に、炭酸ガス培養装置内で一定時間培養した後、アゴニストペプチドを添加し、更に一定時間（例えば２４時間）培養する。培養上清中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の量を、プロスタグランジンＥ２  ＥＩＡ  （Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ５１４０１０）  を用いて測定することができる。候補物質の選択は、被験物質の存在下におけるＰＧＥ２の量が、被験物質非存在下におけるＰＧＥ２に比して減少するか否かを指標にして行うことができる。
【００４２】
上記のように測定した被験物質存在下におけるＰＡＲ２の機能（工程（ｂ）の測定値）を、被験物質を接触させない対照におけるＰＡＲ２の機能と比較することによって、被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価することができる。
具体的には、被験物質を添加した上記（１）〜（３）のいずれかの細胞におけるＰＡＲ２の機能レベルが、被験物質を添加しない細胞（対照）のそのレベルに比して低くなることをもって、行うことができる。
【００４３】
上記のように評価した被験物質のＰＡＲ２阻害活性を指標として、皮膚疾患治療剤の候補物質を選別することができる。例えば、被験物質存在下におけるＰＡＲ２の機能レベルが、被験物質を接触させない対照細胞における機能レベルと比較して、１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上低下する被験物質を候補物質として選別することができる。
【００４４】
ＩＩＩ．  ＰＡＲ２結合阻害活性を測定する方法
ＰＡＲ２は受容体であるので、受容体結合阻害活性に基づき、ＰＡＲ２阻害活性を評価する方法は、以下の工程（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）被験物質と、ＰＡＲ２、及びＰＡＲ２リガンドを含む水溶液、細胞、または該細胞から調製した細胞膜画分とを接触させる工程、
（ｂ）（ａ）におけるＰＡＲ２に結合したＰＡＲ２アゴニスト量を測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の値を、被験物質を接触させない対照における、ＰＡＲ２に結合したＰＡＲ２アゴニスト量と比較する工程、
（ｄ）（ｃ）の結果に基づいて、被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価する工程、
を含む。
ここで、ＰＡＲ２のリガンド（受容体結合物質）としては、ＰＡＲ２アゴニスト、ＰＡＲ２アンタゴニスト、及びそれらを標識化した標識リガンドが挙げられる。また、公知アゴニスト化合物の誘導体をペプチド合成等により調製したものを用いることもできる。
【００４５】
具体的には、被験物質存在下におけるＰＡＲ２に対するリガンド（アゴニスト化合物等）の結合量を測定し、当該結合量を被験物質非存在下でのＰＡＲ２に対するリガンド（アゴニスト化合物等）の結合量（対照結合量）と比較する。
【００４６】
この場合、前記ＰＡＲ２とリガンドとの結合阻害は、▲１▼受容体に結合することによって、リガンドのＰＡＲ２への結合を阻害する態様のものであってもよいし、▲２▼リガンドに結合することによって、リガンドのＰＡＲ２への結合を阻害する態様のものであってもよい。但し、とりわけ▲１▼の態様の場合は、ＰＡＲ２に結合してもリガンドと同じ作用を発揮しない被験物質を選択することが必要である。
このため、上記のスクリーニング方法で選別された被験物質は更に、選択された被験物質の中から、更にリガンドと同じ作用を有する被験物質、又はリガンドの作用を拮抗する被験物質を選択する工程に供することが好ましい。具体的には、上記ＩＩ．に記載された方法を挙げることができる。
【００４７】
ここで、ＰＡＲ２は、精製物（単離物）又はその水溶液であっても良いし、当該ＰＡＲ２を含有する細胞またはその細胞画分の形態であっても良い。  ここでＰＡＲ２を含む水溶液としては、例えばＰＡＲ２を含む水溶液の他、これらのタンパク質を含む細胞溶解液、細胞破砕液、核抽出液あるいは細胞の培養上清などを例示することができる。
本発明スクリーニングで用いるＰＡＲ２を含有する細胞は、当該受容体を天然に発現している細胞を用いても良いし、またＰＡＲ２をコードする遺伝子を細胞に導入して作製した形質転換細胞を用いても良い。
【００４８】
前記形質転換細胞は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）等の基本書に従い、当業者にとって公知の方法で調製することができる。例えば、前記受容体のｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−１９９（１９９１））、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ３．１誘導体（インビトロジェン社）などの公知の発現ベクターに挿入する。その後、適当な宿主に導入し、培養することにより、導入した受容体のＤＮＡに対応するタンパク質を発現させた形質転換細胞を作製することができる。宿主としては、一般的に広く普及している、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＣＯＳ細胞などを用いることができるが、これに限定されることなく、酵母、細菌、昆虫細胞などを用いることもできる。
【００４９】
ＰＡＲ２のｃＤＮＡを有する発現ベクターの宿主細胞への導入方法としては、公知の発現ベクターの宿主細胞への導入方法であれば、どのような方法でもよく、例えばリン酸カルシウム法（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ５２，  ４５６−４６７（１９７３））、ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ社製）を用いる方法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を用いる方法などが挙げられる。
前記ＰＡＲ２を天然に発現する細胞、および前記ＰＡＲ２を発現する形質転換細胞は、そのままスクリーニングに用いることができるが、細胞膜をスクリーニングに用いる場合は、例えば以下のようにして細胞膜画分を得ることができる。すなわちまず細胞に低張バッファーを添加し、細胞を低張破壊した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより細胞膜画分の沈殿物を得る。そしてこの沈殿物をバッファーに懸濁することにより、ＰＡＲ２を含有する細胞膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分は、抗体を結合させたカラム等により常法で精製することもできる。
【００５０】
リガンドとしては、アゴニスト化合物をそのままで用いても良いし、任意の標識物質で標識された標識化アゴニスト化合物を用いることもできる。ここで標識物質としては、放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）、蛍光物質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社Ａｌｅｘａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔｓ等）、化学発光物質（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ等）などを例示することができる。
【００５１】
受容体結合阻害活性の測定は、具体的には、以下の方法が例示される。すなわち、受容体（ＰＡＲ２）を含有する水溶液（通常緩衝液が用いられる）、前記細胞若しくは細胞膜画分に、１０−３〜１０−１０Ｍの適当な濃度に調製した被験化合物溶液（通常溶媒には水もしくは緩衝液が用いられるが、溶解度に応じてエタノールやＤＭＳＯを添加することもできる）を加えた後、リガンドを加え、一定時間（通常、１０分〜２時間）反応させる。その後遠心分離等により上清を分離してリガンド量を計測する。あるいは、形質転換細胞もしくは細胞膜画分を含む沈殿物を界面活性剤、塩基を含む溶液に溶解した後溶液に含まれるリガンド量を計測することもできる。ここでリガンドが放射性同位元素で標識された標識化アゴニスト化合物であれば、放射活性を測定すればよい。また、リガンド量は、ＨＰＬＣなどで試料を精製して計測してもよい。例えば、標識化されていないリガンドを用いる場合は、ＨＰＬＣを用いてリガンドを含む画分を分離してＵＶ（例えば２２０ｎｍや２５４ｎｍ）で検出することもできる。
【００５２】
上記の数値を、被験化合物の代わりに溶媒をブランクとして用いて実施した場合の値（対照結合量）と比較することにより、被験化合物が、受容体と標識リガンドの結合を阻害するか否かを評価することができる。すなわち候補物質のスクリーニングは、被験物質存在下での結合量が、被験物質非存在下での結合量に比して、減少するか否かを指標にして行うことができる。
具体的な阻害率（％）については、以下の式：
｛１−（被験物質を添加した場合にＰＡＲ２と結合した標識アゴニストリガンド量）／（被験物質非添加時におけるＰＡＲ２と結合した標識アゴニストリガンド量）｝Ｘ１００
で算出することによって求めることができる。
【００５３】
上記のように測定した被験物質の阻害率に基づき、被験物質のＰＡＲ２阻害活性を評価することができる。例えば、阻害率が、１０％以上、好ましくは３０％以上、特に好ましくは５０％以上である被験物質を候補物質として選別することができる。
【００５４】
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質（候補物質）は、制限されないが、核酸（本発明遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料（被験試料）を上記細胞および／または組織と接触させることにより行われる。かかる被験試料としては、被験物質を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００５５】
本発明の第２の態様は、ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物を有効成分として含有する、皮膚疾患治療剤に関する。ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物、又はその薬学上許容される塩は、皮膚の痒み症状を抑える効果を有し、皮膚疾患治療剤、詳しくは痒み症状を伴う皮膚疾患治療剤として有効である。
ここで、ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物は、上記スクリーニング方法で述べたＰＡＲ２の発現や機能を抑制する化合物であれば、特に限定は無く、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物、蛋白質、核酸、糖化合物等が挙げられる。好ましくは、分子量２００〜２０００、更に好ましくは分子量３００〜１０００の化合物であり、例えば、実施例１８に記載された方法において、１０μｇ／ｍｌにおいて３０％以上のＰＡＲ２阻害活性を示す化合物である。
【００５６】
ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物として、具体的には、前記式（１）で表される化合物又はその薬学上許容される塩が挙げられる。
式（１）において、アルキル基とは炭素数１〜１０のアルキル基を表し、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基を、更に好ましくは炭素数１〜４のアルキル基を表す。具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、１−メチルエチル基、またはブチル基等が挙げられる。
式（１）において、アルコキシ基とは炭素数１〜１０のアルコキシ基を表し、好ましくは炭素数１〜６のアルコキシ基を、更に好ましくは炭素数１〜４のアルコキシ基を表す。具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、１−メチルエトキシ基、またはブトキシ基等が挙げられる。
式（１）において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を表し、好ましくは、フッ素原子または塩素原子を表す。
本明細書において、ハロアルキル基とは、同一または異なる、１〜３個のハロゲン原子を含む炭素数１〜２のハロアルキル基を表し、具体的には、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、１，１，１−トリフルオロエチル基、または２，２−ジフルオロエチル基等が挙げられる。好ましくは、トリフルオロメチル基が挙げられる。
式（１）において、ヘテロシクロアルカンとしては、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、チオモルホリンオキシド、チオモルホリンジオキシド、パーヒドロアゼピン、または、パーヒドロジアゼピン等が挙げられる。好ましくは、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、または、パーヒドロアゼピンが挙げられる。
前記ヘテロシクロアルカンが置換されている場合の置換基としては、アルキル基、置換もしくは無置換のアリールカルボニル基、アルキルカルボニル基、アルコキシカルボニル基、置換もしくは無置換のアリール基、または置換もしくは無置換のアリールアルキル基が挙げられる。
好ましくは、炭素原子上で置換されている場合の置換基としては、炭素数１〜４のアルキル基、または炭素数２〜４のアルコキシカルボニル基が挙げられる。
また、前記ヘテロシクロアルカンが窒素原子上で置換されている場合の置換基としては、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数２〜４のアルコキシカルボニル基、炭素数１〜４のアルキルカルボニル基、置換もしくは無置換のアリールカルボニル基、置換もしくは無置換のアリール基、または置換もしくは無置換のアリールアルキル基が挙げられる。
前記置換もしくは無置換のアリールカルボニル基，置換もしくは無置換のアリール基、または置換もしくは無置換のアリールアルキル基におけるアリールとしては、フェニル、１−ナフチル、または２−ナフチルが挙げられ、特に好ましくはフェニルが挙げられる。
また、前記置換アリールカルボニル基、置換アリール基、または置換アリールアルキル基における置換基としては、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、またはメチレンジオキシ基等が挙げられる。
【００５７】
一般式（１）で表される化合物において、Ｒ１およびＲ２は好ましくは、隣接する炭素原子とともに結合して、アルキル基、アリールカルボニル基、アルキルカルボニル基、またはアルコキシカルボニル基で置換されていてもよい１〜２個の窒素原子、０〜１個の酸素原子、および０〜１個の硫黄原子を含むヘテロシクロアルカンを形成しており、該へテロシクロアルカンは、好ましくは、ピペリジン、ピペラジン、またはパーヒドロアゼピンである。
あるいは、一般式（１）で表される化合物において、Ｒ１が炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ２が、水酸基、アルコキシ基、ニトリル基、置換もしくは無置換のアリール基、または置換もしくは無置換のヘテロアリール基で置換されていてもよいアルキル基を表すのもまた、好ましい態様の一つである。前記アリール基としてはフェニル基が挙げられる。また、前記へテロアリール基としては、ピリジル基が挙げられる。Ｒ２におけるアルキル基の置換基が置換アリール基もしくは置換ヘテロアリール基を表す場合の、アリール基もしくはヘテロアリール基の置換基としては、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のハロアルキル基、または炭素数１〜４のアルコキシ基が挙げられる。
一般式（１）で表される化合物において、Ｒ３におけるアリール基としては、フェニル基が挙げられ、該アリール基が置換されている場合の置換基としては、ハロゲン原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜２のハロアルキル基、または炭素数１〜４のアルコキシ基が挙げられる。Ｒ３は好ましくは炭素数１〜３のアルキル基、フェニル基、または炭素数１〜２のハロアルキル基を表す。特に好ましい例として、トリフルオロメチル基が挙げられる。
一般式（１）で表される化合物において、Ｒ４およびＲ５は、好ましくは、同一または異なって、水素原子、または、ハロゲン原子を表す。
【００５８】
一般式（２）において、Ｒ６は、好ましくは、水素原子、炭素数２〜４のアルキルカルボニル基、またはベンゾイル基を表す。
一般式（２）において、Ｒ７は、好ましくは、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基を表し、更に好ましくは、水素原子、メチル基、を表す。
一般式（２）において、Ｒ８は、好ましくは、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、または炭素数２〜４のアルコキシカルボニル基を表し、更に好ましくは、水素原子、メチル基、メトキシカルボニル基、またはエトキシカルボニル基を表す。ここでＲ８がアルコキシカルボニル基を表す場合、Ｒ７は好ましくは水素原子を表す。
一般式（２）において、Ｒ９は、好ましくは、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、または炭素数２〜４のアルコキシカルボニル基を表し、更に好ましくは、水素原子、メトキシカルボニル基、またはエトキシカルボニル基を表す。
一般式（２）において、Ｒ１０は、好ましくは、メチル基もしくはエチル基を表し、Ｒ１１は、好ましくは水酸基、もしくはピリジル基で置換されていてもよいエチル基、もしくはプロピル基を表す。
【００５９】
式（１）で表される化合物は、その多くが公知であり、市販品として得ることができる。また、以下の方法で製造することもできる。
製造法：
【化７】
2004170323.tif 000007
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は前記と同義である。］
式（１−２）のヒドラゾンは、公知化合物である式（１−１）の化合物とヒドラジン１水和物を、酸性条件下、０〜１００℃で反応させることで製造できる。溶媒としては、メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒、クロロホルム、ジクロロメタンなどのハロゲン系溶媒、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシト゛、アセトン、アセトニトリル、ジオキサンやテトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒、水またはこれらの混合溶媒等が用いられる。メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒がより好ましい。酸としては、酢酸、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸などを用いることができる。この反応では、クロロホルム中、酸として硫酸を用いる等の方法により、式（１−２）の化合物を単離することなく、式（１−３）の化合物を製造することができる。
式（１−２）の化合物を、メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒中、塩基を加えて加熱することにより、式（１−３）の化合物を得ることができる。塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、もしくは炭酸水素ナトリウムなどの無機塩基や、トリエチルアミン、もしくはピリジンなどの有機塩基が用いられる。好ましくは、炭酸カリウム、または炭酸ナトリウムを用いることができる。
式（１−５）の化合物は、式（１−３）の化合物と式（１−４）で表される１，３−ジケトンを、塩基もしくは酸の存在、または非存在下に、室温から１００℃で反応させることにより製造できる。溶媒としては、メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒、クロロホルム、ジクロロメタンなどのハロゲン系溶媒、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシト゛、アセトン、アセトニトリル、ジオキサンやテトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒、水、またはこれらの混合溶媒等が用いられる。このうち、メタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒がより好ましい。酸としては、酢酸、塩酸、または、塩化亜鉛などのルイス酸などを用いることができる。塩基として、ピロリジン、またはピペリジンなどの有機塩基を用いることができる。
式（１−４）の化合物は、公知化合物を用いるか、あるいは本明細書実施例に記載された方法で製造することができる。また、式（１−５）の化合物は、式（１−２）の化合物から、式（１−３）の化合物を単離することなく製造することもできる。
式（１−６）の化合物は、式（１−５）の化合物を加水分解してカルボン酸とした後、公知の方法に従い市販のアミン化合物と縮合させることにより製造できる。縮合方法としては、本明細書記載の水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＩ）を用いる方法、混合酸無水物法、または、酸ハライドを用いる方法等が挙げられる。該縮合方法については「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｌａｒｏｃｋ，  Ｒ．Ｃ．，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  １９８９）」等に記載されている。
【００６０】
一般式（１）で表される化合物の特に好ましいものとして、以下の式５１〜６４の化合物が例示される。
【化８】
2004170323.tif 000008
【００６１】
薬学上許容される塩としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等の無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩等の有機塩基塩等が挙げられ、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性あるいは酸性アミノ酸といったアミノ酸塩が挙げられる。また、本発明のＰＡＲ阻害活性を有する化合物は、水和物、又はエタノール和物等の溶媒和物であってもよい。
【００６２】
一般式（１）で表される化合物、またはその薬学上許容される塩は、皮膚疾患治療剤、詳しくは、痒み症状を伴う皮膚疾患治療剤として有効である。
【００６３】
痒み症状を伴う皮膚疾患としては、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、乾癬、湿疹、蕁麻疹、乾皮症、虫刺され、しもやけ、あせも、疥癬等が挙げられる。好ましくは、乾癬、アトピー性皮膚炎が挙げられる
【００６４】
以下、本発明のＰＡＲ２阻害活性を有する化合物を有効成分として含有する、上記疾患の治療剤を医薬品として用いる場合の投与量および投与形態などにつき記述する。
本発明の化合物又はその薬学上許容される塩は、経口または非経口投与、好ましくは経口投与することができ、薬剤としてそれぞれ経口または非経口投与に適した種々の剤型で、ヒトおよびヒト以外の動物に使用される。例えば、経口的に投与する場合、通常用いられる投与形態、例えば錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液などで投与することができる。非経口的に投与する場合、溶液、乳剤、懸濁液などの液剤を注射剤として投与すること、坐剤の型で直腸投与すること、軟膏、ローション剤、クリーム剤等の塗布剤の型で経皮投与すること、スプレー剤、エアゾル剤等を噴霧剤の型で吸入により投与すること、点滴液（点眼薬など）として投与すること等ができる。このような投与剤型は、通常の担体、賦型剤、結合剤、安定化剤などの助剤と有効成分を配合することにより一般的方法に従って製造することができる。注射剤型で用いる場合は、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤などを添加することもできる。投与量、投与回数は、対象とする疾患、患者の症状、年齢、体重等、および投与形態などによって異なるが、経口投与する場合、有効成分は通常は成人に対し１日あたり約１〜１０００ｍｇの範囲、好ましくは、約１０〜５００ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与することができる。注射剤として投与する場合、有効成分は約０．１〜約５００ｍｇの範囲、好ましくは約３〜約１００ｍｇの範囲を１回または数回に分けて投与することができる。
【００６５】
【実施例】
以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はもとよりこれに限定されるものではない。
実施例１
（２Ｅ）−３−シアノ−２−ヒドラゾノプロパン酸エチル
【化９】
2004170323.tif 000009
エチルシアノピルベートナトリウムエノラート（ｅｔｈｙｌ  ｃｙａｎｏｐｙｒｕｖａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ−ｅｎｏｌａｔｅ）（７．８ｇ）を酢酸（４０ｍｌ）とエタノール（４０ｍｌ）に溶かし、０℃でヒドラジン１水和物を加えた。３０分後室温にし、一晩攪拌した。反応液を濃縮後、水、クロロホルムを加え、分液、抽出した。有機層を乾燥、濃縮し、目的物（５．０ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ：  １．３４−１．４１（ｍ，  ３Ｈ），  ３．４６（ｓ），  ３．６３（ｓ），  ４．２６−４．３８（ｍ，  ２Ｈ），  ６．５２（ｂｒｓ），  ８．５０（ｂｒ）
【００６６】
実施例２
エチル  ５−フェニル−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボキシレート
【化１０】
2004170323.tif 000010
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  ：  １．３７（ｔ，  ３Ｈ，  Ｊ＝７．１Ｈｚ），  ４．４２（ｑ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７．１Ｈｚ），  ７．４４（ｓ，  １Ｈ），  ７．５７−７．６５（ｍ，  ３Ｈ），  ８．３１−８．３８（ｍ，  ３Ｈ）
【００６７】
実施例３
５−フェニル−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸カリウム
【化１１】
2004170323.tif 000011
実施例２の化合物（４．６ｇ）、エタノール（５０ｍｌ）、１Ｎ水酸化カリウム水溶液（１５ｍｌ）を混ぜ、加熱還流した。３０分後、室温に冷却した。生じた結晶をろ過、乾燥し、目的物（４．２ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  ：  ６．８７（ｓ，  １Ｈ），  ７．５３−７．５９（ｍ，  ３Ｈ），  ８．０２（ｓ，  １Ｈ），  ８．２４−８．３１（ｍ，  ２Ｈ）
【００６８】
実施例４
５−フェニル−２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン
【化１２】
2004170323.tif 000012
実施例３で得た化合物（３．０ｇ）をＤＭＦに溶かし、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２．３５ｇ）、ピペリジン（０．９５ｍｌ）、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１．８４ｇ）を加え、室温で一晩攪拌した。反応液に、水、酢酸エチルを加え、分液、抽出した。有機層を、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和重曹水、水、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。残渣をジイソプロピルエーテルで洗浄、ろ過、乾燥し、目的物（２．８ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ：  １．６２−１．７８（ｍ，  ６Ｈ），  ３．７５−３．８３（ｍ，  ４Ｈ），  ７．１７（ｓ，  １Ｈ），  ７．５４−７．５９（ｍ，  ３Ｈ），  ７．６８（ｓ，  １Ｈ），  ８．０９−８．１６（ｍ，  ２Ｈ）
【００６９】
実施例５
２−［（２−メチルピペリジン−１−イル）カルボニル］−５−フェニル−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン
【化１３】
2004170323.tif 000013
実施例３で得た化合物と２−メチルピペリジンから、実施例４と同様の方法により目的物（１．８ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ：  １．３０−１．４０（ｍ，  ３Ｈ），  １．４９−１．９０（ｍ，  ６Ｈ），  ２．９０−３．３０（ｍ，  １Ｈ），  ４．２０−４．７４（ｍ，  １Ｈ），  ４．５５−５．１４（ｍ，  １Ｈ），  ７．１５（ｓ，  １Ｈ），  ７．５４−７．５９（ｍ，  ３Ｈ），  ７．６７（ｓ，  １Ｈ），  ８．０９−８．１５（ｍ，  ２Ｈ）
【００７０】
実施例６
２−（アゼパン−１−イルカルボニル）−５−フェニル−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン
【化１４】
2004170323.tif 000014
実施例３で得た化合物とヘキサメチレンイミンから、実施例４と同様の方法により目的物（１．７ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ：    １．６０−１．７３（ｍ，  ４Ｈ），  １．８１−１．９３（ｍ，  ４Ｈ），  ３．７３−３．８５（ｍ，  ４Ｈ），  ７．２３（ｓ，  １Ｈ），  ７．５４−７．５９（ｍ，  ３Ｈ），  ７．６８（ｓ，  １Ｈ），  ８．０９−８．１５（ｍ，  ２Ｈ）
【００７１】
実施例７
２−［（４−ベンゾイルピペラジン−１−イル）カルボニル］−５−フェニル−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン
【化１５】
2004170323.tif 000015
実施例３で得た化合物と１−ベンゾイルピペラジン塩酸塩から、実施例４と同様の方法により目的物（１．６ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ：  ３．５０−４．２５（ｍ，  ８Ｈ），  ７．２８（ｓ，  １Ｈ），  ７．５５−７．６０（ｍ，  ３Ｈ），  ７．７２（ｂｒｓ，  １Ｈ），  ８．１０−８．１５（ｍ，  ２Ｈ）
【００７２】
実施例８
エチル  １−｛［５−フェニル−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］カルボニル｝ピペリジン−２−カルボキシレート
【化１６】
2004170323.tif 000016
実施例３で得た化合物とピペコリン酸エチル塩酸塩から、実施例４と同様の方法により目的物（０．１ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ：    １．２６−１．３５（ｍ，  ３Ｈ），  １．４０−１．９０（ｍ，  ５Ｈ），  ２．２８−２．４３（ｍ，  １Ｈ），  ３．００−３．４０（ｍ，  １Ｈ），  ４．２０−４．３２（ｍ，  ２Ｈ），  ４．４５−４．８０（ｍ，  １Ｈ），  ５．４５−５．６０（ｍ，  １Ｈ），  ７．２１−７．２８（ｍ，  １Ｈ），  ７．５３−７．６０（ｍ，  ３Ｈ），  ７．６７−７．７１（ｍ，  １Ｈ），  ８．１０−８．０６（ｍ，  ２Ｈ）
【００７３】
実施例９
エチル  １−｛［５−フェニル−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］カルボニル｝ピペリジン−４−カルボキシレート
【化１７】
2004170323.tif 000017
実施例３で得た化合物とイソニペコチン酸エチルから、実施例４と同様の方法により目的物（０．２ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ：    １．２８（ｔ，  ３Ｈ，  Ｊ＝７．１Ｈｚ），  １．８０−２．１２（ｍ，  ４Ｈ），  ２．６４（ｍ，  １Ｈ），  ３．１３（ｍ，  １Ｈ），  ３．３７（ｍ，  １Ｈ），  ４．１８（ｑ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．１Ｈｚ），  ４．４６−４．６２（ｍ，  ２Ｈ），  ７．２１（ｓ，  １Ｈ），  ７．５４−７．６０（ｍ，  ３Ｈ），  ７．６９（ｓ，  １Ｈ），  ８．１０−８．１６（ｍ，  ２Ｈ）
実施例１０
１−（４−クロロフェニル）−４，４，４−トリフルオロブタン−１，３−ジオン
【化１８】
2004170323.tif 000018
４−クロロアセトフェノン（４．６ｍｌ）をテトラヒドロフラン（５０ｍｌ）に溶かし、０℃に冷却後、水素化ナトリウム（１．５５ｇ；  ６０％）を加えた。１５分後室温にし、３０分攪拌した。反応液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸エチルを加えた。２時間後、室温にあげ、さらに１．５時間攪拌した。１Ｎ塩酸を反応液に加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水洗、乾燥、濃縮し、目的物（１０．６ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  ：    ７．０２（ｓ，  １Ｈ），  ７．６６（ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝８．７Ｈｚ），  ８．１４（ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝８．７Ｈｚ）
【００７４】
実施例１１
エチル  ５−（４−クロロフェニル）−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボキシレート
【化１９】
2004170323.tif 000019
実施例１で得た化合物と実施例１０で得た化合物を用いて、実施例２と同様の方法で目的物（４．３ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δｐｐｍ  ：    １．４７（ｔ，  ３Ｈ，  Ｊ＝７．１Ｈｚ），  ４．５１（ｑ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７．１Ｈｚ），  ７．３８（ｓ，  １Ｈ），  ７．５２−７．５７（ｍ，  ２Ｈ），  ７．７１（ｓ，  １Ｈ），  ８．０７−８．１２（ｍ，  ２Ｈ）
【００７５】
実施例１２
５−（４−クロロフェニル）−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボン酸カリウム
【化２０】
2004170323.tif 000020
実施例１１で得た化合物から、実施例３と同様の方法で目的物（３．５ｇ）を得た。
【００７６】
実施例１３
５−（４−クロロフェニル）−２−（ピペリジン−１−イルカルボニル）−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン
【化２１】
2004170323.tif 000021
実施例１２で得た化合物とピペリジンから、実施例４と同様の方法により目的物（０．１ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ：    １．６１−１．７７（ｍ，  ６Ｈ），  ３．７６−３．８３（ｍ，  ２Ｈ），  ７．１８（ｓ，  １Ｈ），  ７．５１−７．５６（ｍ，  ２Ｈ），  ７．６３（ｓ，  １Ｈ），  ８．０６−８．１１（ｍ，  ２Ｈ）
【００７７】
実施例１４
５−（４−クロロフェニル）−２−［（２−メチルピペリジン−１−イル）カルボニル］−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン
【化２２】
2004170323.tif 000022
実施例１２で得た化合物と２−メチルピペリジンから、実施例４と同様の方法により目的物（０．１ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ：    １．３１−１．４０（ｍ，  ３Ｈ），  １．５０−１．９０（ｍ，  ６Ｈ），  ２．９０−３．３０（ｍ，  １Ｈ），  ４．２０−４．７３（ｍ，  １Ｈ），  ４．５３−５．１５（ｍ，  １Ｈ），  ７．１４（ｓ，  １Ｈ），  ７．５１−７．５６（ｍ，  ２Ｈ），  ７．６３（ｓ，  １Ｈ），  ８．０６−８．１１（ｍ，  ２Ｈ）
【００７８】
実施例１５
２−（アゼパン−１−イルカルボニル）−５−（４−クロロフェニル）−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン
【化２３】
2004170323.tif 000023
実施例１２で得た化合物とヘキサメチレンイミンから、実施例４と同様の方法により目的物（０．１ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δｐｐｍ  ：    １．６０−１．７１（ｍ，  ４Ｈ），  １．８０−１．９２（ｍ，  ４Ｈ），  ３．７３−３．８４（ｍ，  ４Ｈ），  ７．２３（ｓ，  １Ｈ），  ７．５１−７．５６（ｍ，  ２Ｈ），  ７．６３（ｓ，  １Ｈ），  ８．０６−８．１１（ｍ，  ２Ｈ）
【００７９】
実施例１６
エチル  １−｛［５−（４−クロロフェニル）−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］カルボニル｝ピペリジン−２−カルボキシレート
【化２４】
2004170323.tif 000024
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δｐｐｍ  ：    １．２６−１．３５（ｍ，  ３Ｈ），  １．３６−１．９０（ｍ，  ５Ｈ），  ２．２７−２．４２（ｍ，  １Ｈ），  ３．００−３．４０（ｍ，  １Ｈ），  ４．２０−４．３３（ｍ，  ２Ｈ），  ４．５０−４．８０（ｍ，  １Ｈ），  ５．５０−５．５８（ｍ，  １Ｈ），  ７．２２−７．２６（ｍ，  １Ｈ），  ７．５０−７．５６（ｍ，  ２Ｈ），  ７．６２−７．６６（ｍ，  １Ｈ），  ８．０６−８．１２（ｍ，  ２Ｈ）
実施例１７
５−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ−メチル−７−（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−カルボキシアミド
【化２５】
2004170323.tif 000025
実施例１２で得た化合物と２−（メチルアミノ）エタノールから、実施例４と同様の方法により目的物（１．８ｇ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ：  ３．０５−３．２４（ｍ，  １Ｈ），  ３．２４−３．４７（ｍ，  ３Ｈ），  ３．７８−４．００（ｍ，  ４Ｈ），  ７．２７−７．３３（ｍ，  １Ｈ），  ７．５１−７．５８（ｍ，  ２Ｈ），  ７．６５−７．７０（ｍ，  １Ｈ），  ８．０６−８．１２（ｍ，  ２Ｈ）  。
【００８０】
実施例１８：  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  （ＦＬＩＰＲ）  を用いた細胞内カルシウム濃度測定
［材料と方法］
牛胎児血清１０％（１０％ＦＢＳ）添加ＤＭＥＭ培養液（インビトロジェン社）を用いて培養したヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３細胞を  ２．５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、ポリＤリジンでコートした９６穴黒色プレート（透明底）（ファルコン社）に８０μｌ／ｗｅｌｌ播いて、炭酸ガス培養装置で一晩培養した。Ｈａｎｋｓ−２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  緩衝液（ｐＨ７．４）で調製したＦＬＩＰＲ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を細胞に８０μｌ／ｗｅｌｌ添加して、１時間炭酸ガス培養装置にて培養した。Ｈａｎｋｓ−２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で、ＰＡＲ２活性化因子として０．０００５％に調製したｔｒｙｐｓｉｎ  （ＳＩＧＭＡ社  Ｔ８６４２）を、９６穴Ｖ底ポリプロピレンプレート（ヌンク社）に添加して試薬プレートとした。ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で測定する直前に、Ｈａｎｋｓ−２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で調製した被験物質を、細胞に４０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、プレートシェーカーで攪拌した。被験物質を添加した細胞プレートと試薬プレートをＦＬＩＰＲにセットし、細胞内カルシウム濃度の変化をＣＣＤカメラにて検出した。測定は室温で７０秒間行い、試薬プレートから細胞プレートへの試薬の添加（５０μｌ／ｗｅｌｌ）は、ＦＬＩＰＲ本体内蔵の９６ｗｅｌｌ自動分注機で行った。
被験物質の細胞内カルシウム上昇抑制率は、以下の式：
（被験物質存在下における細胞内カルシウム濃度の変化−Ｔｒｙｐｓｉｎ非存在下における細胞内カルシウム濃度の変化）／（被験物質非存在下における細胞内カルシウム濃度の変化−被験物質及びＴｒｙｐｓｉｎ非存在下における細胞内カルシウム濃度の変化）
で求めることができる。
［結果］被験物質の細胞内カルシウム上昇抑制率（％）を、表１に示した。
【表１】
2004170323.tif 000026
上記のように、化合物のＦＬＩＰＲによるアッセイで細胞内カルシウム濃度上昇抑制活性を測定することにより、ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物として選別できる。
【００８１】
実施例１９：  ＰＧＥ２量の測定を利用したＰＡＲ２阻害活性の評価
ＳＷ９８２細胞を２．５ｘ１０５細胞／ｍｌになるように各培地で希釈し、９６穴プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌの細胞を播きこんだ。炭酸ガス培養装置内で一晩前培養した後、培地を除去し、５μｇ／ｍｌ  化合物入り培地を  ８０μｌ  ／ｗｅｌｌ添加した（コントロール群、コントロールペプチド群、アゴニストペプチド単独群、ＩＬ−１β群には０．１％ＤＭＳＯ含有培地を添加した）。化合物を入れたウェルには  ５００ｕＭ  アゴニストペプチド入り培地を  ２０μｌ  ／ｗｅｌｌ  添加した（終濃度は  ４μｇ／ｍｌ  化合物・１００ｕＭ  アゴニストペプチト）。コントロール群のウェルには各培地を２０ｕｌ  ／ｗｅｌｌ、コントロールペプチド群のウェルには５００μＭ  コントロールペプチド入り培地を  ２０μｌ  ／ｗｅｌｌ  （終濃度１００μＭ）、アゴニストペプチド単独群のウェルには５００ｕＭ  アゴニストペプチド入り培地を  ２０μｌ  ／ｗｅｌｌ  （終濃度１００μＭ）、ＩＬ−１β群のウェルには５０ｎｇ／ｍｌＩＬ−１β入り培地を  ２０μｌ  ／ｗｅｌｌ  （終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）の割合で添加した。２４時間後  （Ｎ＝３）  に各上清を回収し−８０℃で測定時まで保管した。各上清中のＰＧＥ２量の測定は、プロスタグランジンＥ２  ＥＩＡ  （Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ５１４０１０）  を用いて行った。コントロールペプチドのＰＧＥ２量の値を  阻害率１００％の値、アゴニストペプチドのＰＧＥ２量を阻害率０％の値として、実施例の化合物のＰＧＥ２産生阻害率を計算した。すなわち、被験物質のＰＡＲ２阻害率は以下の式：
（被験物質におけるアゴニスト存在下でのＰＧＥ２量−被験物質におけるコントロールペプチド存在下でのＰＧＥ２量）／（対照におけるアゴニスト存在下でのＰＧＥ２量−対照におけるコントロールペプチド存在下でのＰＧＥ２量）
で求めた。実施例の化合物のＰＧＥ２産生抑制率を表２に示した。
【表２】
2004170323.tif 000027
上記のように、化合物のＰＧＥ２産生抑制活性を測定することにより、ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物として選別できる。
【００８２】
実施例２０：ＰＡＲ２の痒み惹起活性
７週齢の雄ＩＣＲマウスの肩背部皮内にアゴニストペプチドまたはコントロールペプチドを５０ｐｍｏｌ／２０ｕｌ投与した。投与後１０分間、後肢で投与部付近を引っかく行動を計測した（後肢が地面から離れて、再度戻るまでを１回と計測した）。結果を表３に示した。この結果から、アゴニストペプチド（配列番号：２）を投与した群は、コントロールペプチド（配列番号：４）を投与した群と比較して、著しく投与部位付近を引っかく回数が多いことがわかった。
更に、実施例１７の化合物（２００ｍｇ／ｋｇ）を経口で投与した後、投与化合物の血中濃度を考慮して３０分後にアゴニストペプチドを投与した。上記と同様にアゴニストペプチド投与後１０分間、後肢で投与部付近を引っかく行動を計測した。結果を表４に示した。この結果から、実施例１の化合物により、アゴニストペプチドにより惹起された引っかき行動が抑制されることがわかった。
【表３】
投与液                          引っかき回数
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生理食塩水（ペプチド溶解溶媒）    ２回
ＳＬＩＧＲＬ（アゴニストペプチド）      ２５回
ＬＳＩＧＲＬ（コントロールペプチド）    ７回
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【表４】
投与液                          引っかき回数
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実施例１７の化合物＋ＳＬＩＧＲＬ      １２回
ＳＬＩＧＲＬ                        ２４回
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【００８３】
【発明の効果】
本発明により、痒みを伴う皮膚疾患治療剤をスクリーニングする方法を提供することが可能になった。また、ＰＡＲ２阻害活性を有する化合物を有効成分として含有する痒みを伴う皮膚疾患治療剤を提供することが可能になった。