(57)【要約】【課題】本発明は、高い集積度で、鎖長に制限のないＤＮＡプローブが固定化されたＤＮＡチップを、簡単な工程で安価に提供することを目的としている。【解決手段】本発明に係るＤＮＡチップの製造方法は、放射線の作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物を含有する感放射線組成物を基板上に塗布し、感放射線組成物膜を形成する工程（工程１）、該感放射線組成物膜表面に、所定のパターンマスクを介して放射線を照射し、複数の領域に反応性官能基を現出させる工程（工程２）、および該反応性官能基にＤＮＡプローブを固定化する工程（工程３）からなることを特徴としている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線の作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物を含有する感放射線組成物を基板上に塗布し、感放射線組成物膜を形成する工程（工程１）、
該感放射線組成物膜表面に、所定のパターンマスクを介して放射線を照射し、複数の領域に反応性官能基を現出させる工程（工程２）、および
該反応性官能基にＤＮＡプローブを固定化する工程（工程３）
からなることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項２】
前記感放射線組成物膜が疎水性であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項３】
前記反応性官能基が、酸性官能基であることを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項４】
前記工程３において、現出した前記酸性官能基をスクシンイミド化し、該スクシンイミド化した酸性官能基にＤＮＡプローブを反応させて該ＤＮＡプローブを固定化することを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項５】
前記放射線の作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物が、ｏ−ナフトキノンジアジドであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項６】
前記感放射線組成物が、ｏ−ナフトキノンジアジドとバインダーとからなることを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項７】
前記感放射線組成物が、光酸発生剤と、酸により酸性官能基を現出させうる化合物とを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡチップの製造方法。
【請求項８】
酸またはアルカリの作用に由来して反応性官能基を現出させうる疎水性化合物を含有する疎水性組成物を基板上に塗布し、疎水性組成物膜を形成する工程（工程１’）、
該疎水性組成物膜表面に、所定のパターンマスクを介し、酸またはアルカリを接触させて、複数の領域に反応性官能基を現出させる工程（工程２’）、および
該反応性官能にＤＮＡプローブを固定化する工程（工程３’）
からなることを特徴とするＤＮＡチップの製造方法。
【請求項９】
基板上に塗着された、感放射線組成物膜からなる領域と、ＤＮＡプローブが固定された複数の領域とからなり、前記感放射線組成物膜からなる領域は疎水性であることを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項１０】
前記感放射線組成物膜が、ｏ−ナフトキノンジアジドとバインダーとからなることを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡチップ。
【請求項１１】
前記感放射線組成物膜が、光酸発生剤と、酸により酸性官能基を現出させうる化合物とを含むことを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡチップおよびＤＮＡチップの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年のゲノム塩基配列の情報解析の進展に伴い、生体における多数の遺伝子発現情報やゲノムの変異・多型性の検出を、大規模に一度に行うための手段が求められるようになっている。このような状況を背景に、従来の遺伝子発現解析手法であるＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ法、ｃＤＮＡｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ、ＳＡＧＥなどに代わり、ＤＮＡマイクロアレイあるいはＤＮＡチップ法が開発されつつある。
【０００３】
ＤＮＡチップ法は、表面を特殊加工したスライドガラスなどの固相基板上に、多数の異なるＤＮＡプローブを固定し、このＤＮＡプローブに、標識したターゲットＤＮＡ等をハイブリダイズさせ、それぞれの標識からのシグナルを検出することにより、遺伝子発現情報などを得る方法である。
【０００４】
ＤＮＡチップ法を用いることにより、発生分化の過程の遺伝子発現変動の広範な解析、病態に伴って発現変動する遺伝子群の同定、シグナル伝達系や転写制御に関与する新しい遺伝子の発見などが可能となりつつある。また遺伝子多型についても多数のＳＮＰを１つのＤＮＡチップで解析ができるようになりつつある。
【０００５】
ＤＮＡチップの製造方法としては、大別して２つの方法がある。１つは、リソグラフィー技術を用いて固相担体表面で直接ＤＮＡを合成してゆく方法（特許文献１、２（「合成型ＤＮＡチップ法」という。））、もう一つは、あらかじめ調製したｃＤＮＡをポリ−Ｌ−リジン等でコーティングした表面に固定化する方法（「貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイ法」という。）である。
【０００６】
このうち、合成型ＤＮＡチップ法は、フォトリソグラフィー技術を用いることにより、高い集積度を達成することが可能であり、網羅的な発現解析を実現できる可能性がある。しかしながら、この方法では、基板上に合成するＤＮＡの鎖長を長くできず、現時点では、２５ｍｅｒ以上のオリゴマーでは、信頼性が低下する可能性があるという問題があった。さらに、該合成型ＤＮＡチップは再利用ができないという課題もあった。
【０００７】
一方、貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイ法は、既に調製されたｃＤＮＡをスポッターにより基板上に整列固定させる方法であるため、固定化できる鎖長に制限はなく、また作製が容易である。しかし、アレイヤーを用いてＤＮＡ溶液を基板上に供給するため、通常、数百μｍのスポット間隔が必要となり、高密度のスポット集積を行うには限界があった。また、ＤＮＡプローブの基板への固定は静電気的な結合力を利用するものであるため、測定時に行われる基板洗浄等の工程で、基板からＤＮＡプローブが剥がれてしまう可能性があるという問題もあった。
【０００８】
さらに、これらの方法の場合、基板上のＤＮＡプローブ以外の部分に、ＤＮＡとの相互作用の強い官能基が全面に存在すると、ターゲットＤＮＡがＤＮＡチップ全面に非特異的に付着しやすいため、ノイズが高くなるという問題もあった。このため未反応の官能基を塞ぐためのブロッキング工程が必要となることがあった。
【特許文献１】特表２０００−５０８５４２号公報
【特許文献２】特表２０００−５１１５６０号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高い集積度で、鎖長に制限のないＤＮＡプローブが強固に固定化されたＤＮＡチップを、簡単な工程で安価に提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、反応性官能基を現出させうる化合物を含有する感放射線組成物膜を基板上に形成させ、次いで、この感放射線組成物膜表面に、所望のパターンマスクを介して放射線を照射し、複数の領域に反応性官能基を現出させ、さらに該反応性官能にＤＮＡプローブを固定化することにより、高い集積度で、鎖長に制限のないＤＮＡプローブが強固に固定化されたＤＮＡチップを、簡単な工程で安価に提供できることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１１】
また、本発明者らは、反応性官能基を現出させうる化合物を含有する疎水性組成物膜を基板上に形成させ、次いで、この疎水性組成物膜表面に、所望のパターンマスクを介して、酸またはアルカリの作用によって複数の領域に反応性官能基を現出させ、該反応性官能にＤＮＡプローブを固定化することにより、非特異的吸着を抑制することが可能な、鎖長に制限のないＤＮＡプローブが強固に固定化されたＤＮＡチップを、ブロッキング工程を要することなく、簡単な工程で安価に提供できることを見出した。
【００１２】
すなわち本発明の概要は以下の通りである。
本発明に係るＤＮＡチップの製造方法は、放射線の作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物を含有する感放射線組成物を基板上に塗布し、感放射線組成物膜を形成する工程（工程１）、
該感放射線組成物膜表面に、所定のパターンマスクを介して放射線を照射し、複数の領域に反応性官能基を現出させる工程（工程２）、および
該反応性官能基にＤＮＡプローブを固定化する工程（工程３）
からなることを特徴としている。
【００１３】
前記感放射線組成物膜は疎水性であることが好ましい。
【００１４】
前記反応性官能基は、酸性官能基であることが好ましい。
【００１５】
前記工程３において、現出した前記酸性官能基をスクシンイミド化し、該スクシンイミド化した酸性官能基にＤＮＡプローブを反応させて該ＤＮＡプローブを固定化することができる。
【００１６】
前記放射線の作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物は、ｏ−ナフトキノンジアジドであることが好ましい。
【００１７】
前記感放射線組成物は、ｏ−ナフトキノンジアジドとバインダーとからなることが好ましい。
【００１８】
前記感放射線組成物は、光酸発生剤と、酸により酸性官能基を現出させうる化合物とを含むものであってもよい。
【００１９】
本発明に係る他のＤＮＡチップの製造方法は、酸またはアルカリの作用に由来して反応性官能基を現出させうる疎水性化合物を含有する疎水性組成物を基板上に塗布し、疎水性組成物膜を形成する工程（工程１’）、
該疎水性組成物膜表面に、所定のパターンマスクを介し、酸またはアルカリを接触させて、複数の領域に反応性官能基を現出させる工程（工程２’）、および
該反応性官能にＤＮＡプローブを固定化する工程（工程３’）
からなることを特徴としている。
【００２０】
本発明に係るＤＮＡチップは、基板上に塗着された、感放射線組成物膜からなる領域と、ＤＮＡプローブが固定された複数の領域とからなり、前記感放射線組成物膜からなる領域は疎水性であることを特徴としている。
【００２１】
前記感放射線組成物膜は、ｏ−ナフトキノンジアジドとバインダーとからなることが好ましい。
【００２２】
前記感放射線組成物膜は、光酸発生剤と、酸により酸性官能基を現出させうる化合物とを含むものであってもよい。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明に係るＤＮＡチップの製造方法は、以下の工程１〜工程３からなる。
放射線の作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物を含有する感放射線組成物を基板上に塗布し、感放射線組成物膜を形成する工程（工程１）、
該感放射線組成物膜表面に、所定のパターンマスクを介して放射線を照射し、複数の領域に反応性官能基を現出させる工程（工程２）、および
該反応性官能基にＤＮＡプローブを固定化する工程（工程３）。（第１のＤＮＡチップの製造方法）
【００２４】
該方法は、放射線照射によりＤＮＡプローブを固定するための領域を形成するもので、集積度が高く、固定するＤＮＡプローブの鎖長にも制限がない。
【００２５】
本発明の第２のＤＮＡチップの製造方法は、以下の工程１’〜３’からなる。
工程１’：酸またはアルカリの作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物を含有する疎水性組成物を基板上に塗布し、疎水性組成物膜を形成する工程、
工程２’：該疎水性組成物膜表面に、所定のパターンマスクを介し、酸またはアルカリを接触させて、複数の領域に反応性官能基を現出させる工程、および
工程３’：該反応性官能にＤＮＡプローブを固定化する工程。（第２のＤＮＡチップの製造方法）
【００２６】
該ＤＮＡチップの製造方法では、基板上に形成される組成物膜が疎水性であるため、ＤＮＡチップに対する非特異的なＤＮＡ吸着を著しく抑制することができる。
【００２７】
＜第１のＤＮＡチップの製造方法で用いる感放射線組成物＞
本発明で用いられる感放射線組成物は、放射線の作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物を含み、さらに必要に応じバインダーを含んでいてもよい。
放射線の作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物
【００２８】
本発明において、反応性官能基とは、化学反応により共有結合による化学構造等の変化を可能としうる基を意味する。
【００２９】
前記放射線の作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物としては、たとえば、
（１）放射線の照射により、自己の分子内構造が変化して、反応性官能基を現出させる化合物（化合物Ａ）、
（２）酸により酸性官能基を現出させる化合物（化合物Ｂ）と光酸発生剤との混合物、
が挙げられる。
【００３０】
（１）放射線の照射により自己の分子内構造が変化して反応性官能基を現出させる化合物（化合物Ａ）
化合物Ａにおいて、反応性官能基としては、たとえば、酸性官能基が挙げられる。なお、本明細書中、酸性官能基とは、酸性を示す官能基を意味する。該酸性官能基は、アミノ基と共有結合できることが好ましい。
【００３１】
このような酸性官能基としては、たとえば、カルボキシル基、スルホニル基などが挙げられる。これらのうちでは、カルボキシル基が好ましい。
【００３２】
このような化合物Ａのうち、カルボキシル基を現出させる化合物としては、たとえば、ｏ−ナフトキノンジアジド、ｏ−ニトロベンジルカルボン酸エステル、ジアゾジメドンなどが挙げられ、スルホニル基を現出させる化合物としては、たとえば、ｐ−ニトロベンジル−９，１０−ジアルコキシアントラセン−２−スルホネートの重合体、ｏ−ニトロベンジル−ｐ−ビニルベンゼンスルホネートの重合体、ｐ−ニトロベンジル−ｐ−ビニルベンゼンスルホネートの重合体、これらとスチレンなど他のモノマーとの共重合体などが挙げられる。
【００３３】
なお、ｏ−ナフトキノンジアジドは、ｏ−ナフトキノンジアジドスルホン酸エステル化合物の総称である。通常多価フェノールまたはアミノ基含有化合物のｏ−ナフトキノンジアジドスルホニルクロライドによるエステル化、アニリド化反応により、各種のｏ−ナフトキノンジアジドを合成することができる。ｏ−ナフトキノンジアジドは、放射線照射により窒素を放出し、カルベン、ケテンを経てＷｏｌｆｆ転移を行い３−インデンカルボン酸となってカルボキシル基を現出する。
【００３４】
このような化合物Ａのうちでは、ｏ−ナフトキノンジアジドを好ましく用いることができる。
【００３５】
さらにｏ−ナフトキノンジアジドのうちでは、
２，３，４−トリオキシベンゾフェノン−３，４−ビス（ナフトキノン−１，２−ジアジド−５−スルホン酸）エステル、
２，３，４−トリオキシベンゾフェノン−２，３，４−トリス（ナフトキノン−１，２−ジアジド−５−スルホン酸）エステル、
２，３，４，４’−テトラオキシベンゾフェノン−２，３，４，４’−テトラキス（ナフトキノン−１，２−ジアジド−５−スルホン酸）エステル、
ｐ−（ナフトキノン−１，２−ジアジド−５−スルホニルオキシ）トルエン、３，４，５−トリス（ナフトキノン−１，２−ジアジド−５−スルホニルオキシ）安息香酸メチルなどが挙げられる。
これらは、１種単独で、または複数を組み合わせて用いることができる。
【００３６】
このような化合物Ａは、疎水性の高いものが好ましい。疎水性が高いと、ＤＮＡチップにおいて、非特異的なＤＮＡの吸着の抑制に寄与する。
【００３７】
なお、本発明において疎水性とは、水との間の相互作用が非常に小さく、水との親和性が小さい性質を意味する。
【００３８】
（２）酸により酸性官能基を現出させる化合物（化合物Ｂ）と光酸発生剤との混合物
光酸発生剤とは、放射線の照射を受けて、酸（Ｈ＋）を発生させる化合物である。このような光酸発生剤としては、アンモニウム塩、ジアゾニウム塩、ヨードニウム塩、スルホニウム塩、ホスホニウム塩、セレノニウム塩、アルソニウム塩、メタロセン錯体などが挙げられる。（たとえば、梅原明：Ｊ．  Ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  Ｖｏｌ．２，  ｐ．２８３〜ｐ．２８５（１９８９）  図４）
【００３９】
これらのうちでは、ヨードニウム塩、スルホニウム塩が好ましく、ジアリールヨードニウム塩、トリアリールスルホニウム塩がより好ましい。
これらの光酸発生剤は、１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。さらに、放射線の波長により、分光増感する必要があり、この場合、増感色素を加えることができる。
【００４０】
このような増感色素としては、たとえば、ミヒラーズケトン、４，４’−ビス（ジエチルアミノ）ベンゾフェノンなどのアミノベンゾフェノン誘導体、シアニン、メロシアニン誘導体、クマリン誘導体、カルコン誘導体、キサンテン誘導体、チオキサンテン誘導体、アズレニウム誘導体、スクアリリウム誘導体、ボルフィリン誘導体などを挙げることができる。
【００４１】
酸により酸性官能基を現出させる化合物（化合物Ｂ）は、酸の存在下加熱することにより官能基の一部が加水分解を起こし、酸性官能基を現出させる化合物が挙げられ、本発明では、光酸発生剤に由来する酸存在下の加熱により、化合物Ｂが酸性官能基を現出させる。
前記酸性官能基としては、前記化合物Ａと同様の、カルボキシル基などが挙げられる。
【００４２】
前記化合物Ｂとしては、たとえば、第３アルコールのカルボン酸エステル基、トリフェニルメチルエステル基、ベンズヒドリルエステル基などを有する高分子化合物、およびこれらの誘導体が挙げられる。
【００４３】
カルボン酸エステル基を有する高分子化合物としては、たとえば、
（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルの重合体、
（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピルの重合体、
（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピルの重合体
等の（メタ）アクリル酸アルキルの重合体、これらのモノマーと、他のビニルモノマーまたは各種（メタ）アクリル酸エステルモノマーとの共重合体などが挙げられる。
【００４４】
このような他のビニルモノマー、（メタ）アクリル酸エステルは、疎水性の化合物であることが好ましい。
【００４５】
他のビニルモノマーとしては、スチレン、酢酸ビニル、クロロプレン、塩化ビニル、エチレン、ビニルカルバゾールなどが挙げられ、このうちではスチレンが好ましい。
【００４６】
また、（メタ）アクリル酸エステルとしては、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ベンジル、（メタ）アクリル酸フェニルなどが挙げられる。
【００４７】
より具体的には、これらのうちでは、
ポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）
が好ましい。
【００４８】
これら
ポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）
を用いると、ＤＮＡチップにおいて、非特異的なＤＮＡの吸着をより抑制することができる。また、非特異的なＤＮＡ吸着の抑制によって、ＳＮＰｓの検出も可能とすることができるとともに、ターゲットＤＮＡの使用濃度を低減させても、非特異的な吸着を抑制できる。
【００４９】
これらのカルボン酸エステル基を有する高分子化合物の重量は特に限定されないが、たとえば、重量平均分子量が好ましくは１，０００〜１，０００，０００、さらに好ましくは１，０００〜２００，０００の範囲にあることが望ましい。
【００５０】
このような光酸発生剤の使用量は、化合物Ｂに対して、３〜２０質量％の量であることが好ましい。
【００５１】
バインダーおよび感放射線組成物
本発明で用いられる前記感放射線組成物は、必要に応じバインダーを含んでもよい。バインダーとしては、特に限定はなく、感放射線組成物膜が基板上で一定の厚さを有する膜として形状が維持されるものであればよい。
【００５２】
また、前記放射線の作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物自体が、基板上で一定の厚さを有する膜としての形状を維持できる場合バインダーを併用する必要はないが、必要に応じ添加してもよい。
【００５３】
たとえば、前記化合物Ａを用いる場合、通常、バインダーを併存させる。一方、前記化合物Ｂが高分子化合物であり、該化合物Ｂ自体がバインダーとして、前記疎水性組成物膜の形成に寄与する場合、通常、他のバインダーを添加しなくてもよいが、必要に応じ添加することができる。
【００５４】
このようなバインダーとしては、たとえば、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリクロロプレン、ポリ塩化ビニル、エチレン／酢酸ビニル共重合体、ポリビニルカルバゾールなどの熱可塑性樹脂、フェノールノボラック樹脂、クレゾールノボラック樹脂などのノボラック樹脂などが挙げられる。
【００５５】
これらのバインダーのうちでは、疎水性の樹脂を用いることがより好ましい。
前記のバインダーのうち疎水性の樹脂としては、たとえば、ポリメタクリル酸メチル、ポリスチレンなどが挙げられる。
【００５６】
疎水性の樹脂を用いることにより、ＤＮＡチップにおいて、非特異的なＤＮＡの吸着をより抑制することができる。
【００５７】
本発明で用いる感放射線組成物がこのようなバインダーを含む場合、たとえば、バインダーと反応性官能基を現出させうる化合物との使用割合｛バインダー：反応性官能基を現出させうる化合物（質量割合）｝は、好ましくは０．５：１〜３：１、さらに好ましくは１：１〜２．５：１の範囲にあることが望ましい。
【００５８】
使用割合が上記範囲にあると、ＤＮＡチップにした場合の集積度を高めることができるとともに、所望の位置へのＤＮＡプローブの固定を確実に行うことができる。
【００５９】
本発明で用いる前記感放射線組成物は、必要に応じて、帯電防止剤、保存安定剤、消泡剤、顔料、染料などを含んでもよい。
【００６０】
このような前記感放射線組成物は、上記のような各成分を均一に混合することにより容易に調製することができる。
【００６１】
また前記感放射線組成物は、通常適当な溶媒に溶解して溶液状態で用いられる。溶媒としては、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、２−ブタノン、シクロヘキサノン、酢酸エチル、２−メトキシエタノール、２−エトキシエタノール、２−ブトキシエタノール、２−メトキシエチルアセテート、２−エトキシエチルアセテート、２−ブトキシエチルアセテート、２−アセトキシ−１−メトキシプロパン、２−（２−エトキシエトキシ）エタノール、２−（２−ブトキシエトキシ）エタノール、２−（２−エトキシエトキシ）エチルアセテート、２−（２−ブトキシエトキシ）エチルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテルを好ましく用いることができる。
【００６２】
これらのうちでは、２−アセトキシ−１−メトキシプロパン、ジエチレングリコールジメチルエーテルを好ましく用いることができる。
これらの溶媒は、１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６３】
＜第２のＤＮＡチップの製造における疎水性組成物＞
前記第２のＤＮＡチップの製造方法においては、疎水性組成物として、酸またはアルカリの作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物を含有する疎水性組成物を用いる。このため、該疎水性組成物により得られる組成物膜は疎水性である。
【００６４】
このような、疎水性組成物膜を与える化合物としては、酸またはアルカリの作用に由来して酸性官能基を現出させ、疎水性の組成物膜を与えうる化合物（本明細書において「疎水性化合物」ということがある。）が挙げられる。
【００６５】
このような疎水性化合物としては、たとえば、カルボン酸エステル基を有する高分子化合物、およびこれらの誘導体が挙げられる。
【００６６】
カルボン酸エステル基を有する高分子化合物としては、たとえば、（メタ）アクリル酸アルキルの重合体、これらのモノマーと、他のビニルモノマーまたは各種（メタ）アクリル酸エステルモノマーとの共重合体などが挙げられる。
【００６７】
他のビニルモノマーとしては、スチレン、酢酸ビニル、クロロプレン、塩化ビニル、エチレン、ビニルカルバゾール、（メタ）アクリル酸などが挙げられ、このうちではスチレンが好ましい。
【００６８】
また、（メタ）アクリル酸エステルとしては、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ベンジル、（メタ）アクリル酸フェニルなどが挙げられる。
【００６９】
このような他のビニルモノマー、（メタ）アクリル酸エステルは、疎水性の化合物であることが好ましい。
【００７０】
前記カルボン酸エステル基を有する高分子化合物のうちでは、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル、（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル、（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピルなどの（メタ）アクリル酸アルキルの重合体、（メタ）アクリル酸メトキシエチルなどの（メタ）アクリル酸アルキルオキシアルキルの重合体；これらのモノマーと、他のビニルモノマーまたは各種（メタ）アクリル酸エステルモノマーとの共重合体を好ましく用いることができる。
【００７１】
より具体的には、これらのうちでは、
ポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）、
ポリ（メタ）アクリル酸メトキシエチル
が好ましい。
【００７２】
これらポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸メチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−フェニル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）、
ポリ（（メタ）アクリル酸２−シクロプロピル−２−プロピル−コ−（メタ）アクリル酸エチル）、
ポリ（メタ）アクリル酸メトキシエチル
を用いると、ＤＮＡチップにおいて、非特異的なＤＮＡの吸着をより抑制することができる。また、非特異的なＤＮＡ吸着の抑制によって、ＳＮＰｓの検出も可能とすることができるとともに、ターゲットＤＮＡの使用濃度を低減させても、非特異的な吸着を抑制できる。
【００７３】
第２のＤＮＡチップの製造方法においては、このような疎水性化合物を用いることにより、得られる組成物膜の表面が疎水性となるので、ＤＮＡチップにおいて、非特異的なＤＮＡの吸着をより抑制することができる。また、非特異的なＤＮＡ吸着の抑制によって、ＳＮＰｓの検出も可能とすることができるとともに、ターゲットＤＮＡの使用濃度を低減させても、非特異的な吸着を抑制できる。
【００７４】
バインダーおよび疎水性組成物
第２のＤＮＡチップの製造方法において、前記疎水性組成物は、前記化合物Ｂ（疎水性化合物）が高分子化合物であり、該化合物Ｂ自体がバインダーとして、前記疎水性組成物膜の形成に寄与する場合、他のバインダーを含有しなくてもよいが、必要に応じ含有することができる。
【００７５】
バインダーとしては、特に限定はなく疎水性組成物膜が基板上で一定の厚さを有する膜として形状が維持されればよい。
【００７６】
このようなバインダーとしては、各種メタクリル酸エステル、スチレンの単独重合体、あるいは共重合体、フェノールノボラック樹脂、クレゾールノボラック樹脂などのノボラック樹脂などが挙げられる。
【００７７】
これらのバインダーのうちでは、疎水性の樹脂を用いることがより好ましい。前記のバインダーのうち疎水性の樹脂としては、たとえば、ポリメタクリル酸メチル、ポリスチレンなどが挙げられる。
【００７８】
疎水性の樹脂を用いることにより、ＤＮＡチップにおいて、非特異的なＤＮＡの吸着をより抑制することができる。
本発明で用いる疎水性組成物がこのようなバインダーを含む場合、たとえば、バインダーと前記疎水性化合物との使用割合｛バインダー：疎水性化合物（質量割合）｝が、好ましくは０．５：１〜３：１、さらに好ましくは１：１〜２．５：１の範囲にあることが望ましい。
使用割合が上記範囲にあると、疎水性を向上させることができる。
【００７９】
前記疎水性組成物は、必要に応じて、帯電防止剤、保存安定剤、消泡剤、顔料、染料などを含んでもよい。
【００８０】
このような疎水性組成物は、上記のような各成分を均一に混合することにより容易に調製することができる。
【００８１】
このような前記疎水性組成物は、通常適当な溶媒に溶解して溶液状態で用いられる。溶媒としては、トルエン、キシレン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、２−ブタノン、シクロヘキサノン、酢酸エチル、２−メトキシエタノール、２−エトキシエタノール、２−ブトキシエタノール、２−メトキシエチルアセテート、２−エトキシエチルアセテート、２−ブトキシエチルアセテート、２−アセトキシ−１−メトキシプロパン、２−（２−エトキシエトキシ）エタノール、２−（２−ブトキシエトキシ）エタノール、２−（２−エトキシエトキシ）エチルアセテート、２−（２−ブトキシエトキシ）エチルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテルを好ましく用いることができる。
【００８２】
これらのうちでは、２−アセトキシ−１−メトキシプロパン、ジエチレングリコールジメチルエーテルを好ましく用いることができる。
これらの溶媒は、１種単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００８３】
＜基板＞
本発明の第１および第２のＤＮＡチップで用いられる基板は、特に限定されないが、たとえば、ソーダガラス、硼珪酸ガラス、石英ガラス、多孔質ガラス、窒化ホウ素、窒化珪素、炭化珪素、シリコン、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどを用いることができる。これらのうちでは、ソーダガラス、硼珪酸ガラス、石英ガラスを好ましく用いることができる。
【００８４】
基板の形状には特に制限はなく、例えば、薄板、フィルムまたはシートのような平板状のものであってもよい。また、立方体、棒状、紐状、球状のものであってもよい。板状の場合、基板の厚さは特に限定されず、ＤＮＡチップの大きさなどにより適宜選択することができる。
【００８５】
＜ＤＮＡプローブ＞
本発明で用いるＤＮＡプローブは、たとえば、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ＲＮＡ断片などが挙げられる。
【００８６】
これらのＤＮＡプローブは、データベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法により増幅して調製することができる。また、ＰＣＲ法により増幅しないものも用いることができる。
【００８７】
また、別途合成したオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドを用いることもできる。
【００８８】
ＤＮＡプローブは、それぞれ保存することができ、必要に応じて、必要な組み合わせで、基板上に固定化することができる。
【００８９】
このようなＤＮＡプローブは、末端がアミン化（−ＮＨ２）されていることが好ましい。
【００９０】
ＤＮＡ末端のアミン化は、常法（たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ  ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．４９  Ａｕｇｕｓｔ  １９９８）により行うことができる。
【００９１】
本発明に係るＤＮＡチップの製造方法では、ＤＮＡプローブの鎖長に制限はないが、たとえば、２５ｍｅｒ以上の鎖長とすることができる。
【００９２】
＜第１のＤＮＡチップの製造方法＞
本発明に係る、第１のＤＮＡチップの製造方法は、リソグラフィ技術を用い、感放射線組成物膜に反応性官能基を現出させることによりＤＮＡプローブを固定させる領域を形成させ、次いで別途調製したＤＮＡプローブを該反応性官能基に固定する方法である。
【００９３】
ここで領域とは、放射線照射により、感放射線組成物膜上に反応性官能基が現出した範囲を指し、パターンマスクを介して放射線が照射された部分の形状を有する。
【００９４】
具体的には、放射線の作用に由来して反応性官能基を現出させうる化合物を含有する感放射線組成物を基板上に塗布し、感放射線組成物膜を形成する工程（工程１）、
該感放射線組成物膜表面に、所望のパターンマスクを介して放射線を照射し、複数の領域に反応性官能基を現出させる工程（工程２）、および
該反応性官能基にＤＮＡプローブを固定化する工程（工程３）
からなる。
【００９５】
工程１においては、前記基板上に前記感放射線組成物を塗布する。基板表面への感放射線組成物の塗布方法は特に限定されず、たとえば、スプレー法、ロールコート法、回転塗布法などの各種の方法を採用することができる。
【００９６】
塗布した後、加熱などの方法により、溶媒を除去することで、感放射線組成物膜を形成することができる。加熱条件は各成分の種類、配合割合などによっても異なるが、通常、７０〜１２０℃である。加熱時間は、ホットプレートによる場合、通常１〜１０分、オーブンによる場合、通常５〜３０分程度である。
【００９７】
感放射線組成物膜の厚さは、好ましくは０．５〜２μｍの範囲にあることが望ましい。
【００９８】
工程２においては、形成された感放射線組成物膜に、所定パターンを有するパターンマスクを介して放射線を照射する（パターン露光）。
【００９９】
ＤＮＡチップ用の露光マスクとしては、ＤＮＡチップのパターンにより異なり、また、パターン露光により領域を形成しうるものであれば特に限定されないが、たとえば、１μｍ程度の幅のパターンを形成できる材質のものが好ましい。
【０１００】
放射線としては、たとえば、低圧水銀灯、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、メタルハライドランプ、キセノン灯、ｇ線ステッパー、ｉ線ステッパーなどの紫外線、電子線、各種レーザー光線などが挙げられる。露光量は、使用する光源や組成物の膜厚などによって適宜選択されるが、たとえば、超高圧水銀灯からの紫外線の場合、膜厚０．５〜１０μｍでは１００〜５０００Ｊ／ｍ２程度であることが好ましい。
【０１０１】
このようなパターン露光により、複数の領域に前記反応性官能基を現出させることができる。このため、集積度の高いＤＮＡチップを製造することができる。
【０１０２】
さらに工程３においては、該反応性官能基に、ＤＮＡプローブを固定化する。
【０１０３】
ＤＮＡプローブの固定化は、たとえば、所定のＤＮＡプローブを水性媒体に溶解または分散した水溶液を、マイクロピペット、注射針などで基板上の所定の領域に滴下する方法などを採用することができる。
【０１０４】
ＤＮＡプローブと反応性官能基とは、たとえば、反応性官能基が酸性官能基であって、ＤＮＡプローブの末端がアミン化されている場合、アミド結合により共有結合が形成されるため、強固な結合となる。このため、基板からのＤＮＡプローブの脱離が抑制され、ＤＮＡチップの信頼性を向上させることができる。
【０１０５】
ＤＮＡプローブの固定化においては、前記反応性官能基が酸性官能基の場合、該酸性官能基がスクシンイミド化されていることが好ましい。スクシンイミド化は、たとえば、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）とヒドロキシスクシンイミド（Ｔｅｎｇｂｌａｄ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，．，１９９，２９７（１９８１）  ）  （Ｆｕｎａｂａｓｈｉ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２６，４１４（１９８２））又は、２−エトキシカルボニル１，２−ジヒドロキノン（ＥＥＤＱ）（Ｓｃｃｏｍａｎｉ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５６，１２４０５（１９８１））を水溶液中で混合し、該混合液とカルボキシル基などの酸性官能基とを接触させて行うことができる。
【０１０６】
このように酸性官能基をスクシンイミド化することにより、該酸性官能基が活性化されて、末端がアミン化されたＤＮＡプローブとの反応性が向上し、ＤＮＡプローブの固定化を確実に行うことができる。
本発明では、このように別途調製したＤＮＡプローブを固定化するため、ＤＮＡプローブの鎖長を所望の長さに設定することができる。
【０１０７】
＜第２のＤＮＡチップの製造方法＞
本発明に係る、第２のＤＮＡチップの製造方法は、疎水性組成物膜に、ＤＮＡプローブを固定させうる領域を形成させ、次いで別途調製したＤＮＡプローブを固定する方法である。
【０１０８】
具体的には、酸またはアルカリの作用に由来して反応性官能基を現出させうる疎水性化合物を含有する疎水性組成物を基板上に塗布し、疎水性組成物膜を形成する工程（工程１’）、
該疎水性組成物膜表面に、所望のパターンマスクを介して酸またはアルカリを接触させ、複数の領域に反応性官能基を現出させる工程（工程２）、および
該反応性官能基にＤＮＡプローブを固定化する工程（工程３）
からなる。
【０１０９】
工程１’は、前記工程１と同様に行うことができる。
工程１’を経て得られる疎水性組成物膜の厚さは、好ましくは０．５〜２μｍの範囲にあることが望ましい。
【０１１０】
工程２’においては、形成された疎水性組成物膜に、所定パターンを有するパターンマスクを介して酸またはアルカリを接触させる。
ＤＮＡチップ用のマスクとしては、ＤＮＡチップのパターンにより異なり特に限定されないが、たとえば、少なくとも１００μｍ程度の幅のパターンを形成できるものが好ましい。
【０１１１】
酸としては、塩酸水溶液、硝酸水溶液、硫酸水溶液などが挙げられ、アルカリとしては水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液などが挙げられる。
【０１１２】
工程３’は、前記工程３と同様に行うことができ、該工程３’において、ＤＮＡプローブの固定化、酸性官能基のスクシンイミド化などを経てＤＮＡチップを得ることができる。第２のＤＮＡチップの製造方法においても、別途調製したＤＮＡプローブを固定化するため、ＤＮＡプローブの鎖長を所望の長さに設定することができる。
【０１１３】
＜ＤＮＡチップ＞
本発明のＤＮＡチップは、基板上に塗着された、感放射線組成物膜からなる領域と、ＤＮＡプローブが固定された複数の領域とからなる。また、本発明のＤＮＡチップの感放射線組成物膜からなる領域は疎水性である。
【０１１４】
感放射線組成物膜が疎水性であるので、非特異的なターゲットＤＮＡの吸着を抑制することができる。
【０１１５】
本発明において感放射線組成物膜または疎水性組成物膜が疎水性であるとは、ターゲットＤＮＡの非特異的な吸着が実質的に抑止される程度の疎水性を意味する。
【０１１６】
本発明で用いるＤＮＡチップの含まれる感放射線組成物膜は、前記バインダーを含む場合、バインダーと反応性官能基を現出させる化合物との含有割合（バインダー：反応性官能基を現出させる化合物（質量割合））が、好ましくは０．５：１〜３：１、さらに好ましくは１：１〜２．５：１の範囲にあることが望ましい。
【０１１７】
含有割合が上記範囲にあると、ＤＮＡチップにした場合の露光領域の集積度を高めることができるとともに、所望の位置へのＤＮＡプローブの固定を確実に行うことができる。
【０１１８】
また、本発明のＤＮＡチップ上の各露光領域中のＤＮＡプローブの集積度には特に制限はなく、ＤＮＡプローブの用途に応じ適宜集積度を変化させることができる。たとえば、露光領域の最小線幅、スペースをともに５μｍとすると、１，０００，０００ｓｐｏｔｓ／ｃｍ２程度を固定することができる。
【０１１９】
本発明のＤＮＡチップは、ＤＮＡプローブが反応性官能基と共有結合して固定化されているため、基板上で滲みや、遊離することが少ない。さらに、本発明のＤＮＡチップは、低濃度での検出が可能である。
【０１２０】
このようなＤＮＡチップは、固定化されたＤＮＡプローブと相補性を有する、標識されたＤＮＡ断片あるいはＲＮＡ断片などのターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に用いることができる。
【０１２１】
【実施例】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【０１２２】
【実施例１】
ｏ−ナフトキノンジアジド型フォトレジスト（ＡＺ−Ｐ１３５０（商品名）、クラリアントジャパン株式会社製）を感放射線組成物として使用した。
【０１２３】
該感放射線組成物を、洗浄した７６ｍｍ×２４．５ｍｍ、厚さ０．７ｍｍのスライドガラス（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ７０５９）基板上にスピン塗布した。
次いで、塗布されたガラス基板を、オーブンにて８０℃で１０分間加熱し、溶媒を除去した。
得られた感放射線組成物膜の膜厚は０．９μｍであった。
【０１２４】
次に、該感放射線組成物膜に、テストパターンを有するフォトマスクを密着して重ね、露光機（ＯＲＣ  ＨＭＷ−５３２Ｄ（商品名）、超高圧水銀灯１ＭＬ−３０００使用、株式会社オーク製作所製）により、８００Ｊ／ｍ２にて露光した。
【０１２５】
次いで、０℃の水溶液（１．５ｇ／Ｌ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（和光純薬）  、２．５ｇ／Ｌ  水溶性カルボジイミド（和光純薬）  ）にチップを２時間浸漬し、露光部のインデンカルボン酸をスクシンイミド化した。蒸留水によりチップを洗浄した後、スピンドライヤーｍｉｎｉ（Ｔｏｍｙ  Ｃｏ．Ｊａｐａｎ）でチップを２分間遠心乾燥した。
【０１２６】
さらに、末端がアミン化されたＤＮＡプローブ（Ｈ２Ｎ−ＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴ（配列は５’→３’）（プローブＡ））（シグマジェノシスジャパン株式会社）が、３．２ｐｍｏｌ／μＬの濃度で含まれる水溶液３０μＬを基板上に滴下し、上からカバーガラスをかぶせ、２時間静置した。その後、６５℃で２×ＳＳＣに５分間、０．２×ＳＳＣに２５分間浸漬して過剰量のプローブＤＮＡを除去した。スライドガラスを蒸留水で５回リンスし、スピンドライヤーによって、２分間遠心して乾燥して、ＤＮＡチップを得た。
【０１２７】
Ｃｙ５標識した下記のターゲットＤＮＡ（１）（シグマジェノシスジャパン株式会社製）を含む下記の溶液を、９５℃で３分間熱変性させた後、ＤＮＡチップに滴下し、２２ｍｍ×２２ｍｍのカバーガラスをかぶせ、チップ上に３０μＬ滴下し、スライドガラスをかぶせ、５６℃で２時間ハイブリダイゼーションを行った。
【０１２８】
2004264084.tif 000002
【０１２９】
ＤＮＡマイクロアレイ用スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００ＸＬ（商品名）、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．）で、Ｃｙ５（励起波長６６３ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ）で蛍光像観察を行った。
【０１３０】
蛍光像観察の結果、約１μｍレベルの幅の極めて微細な露光部においても、蛍光部にのみ位置選択的にＤＮＡが固定化できていることが確認された。
【０１３１】
また、蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、Ｓ／Ｎ＝４．４３であった。Ｓ／Ｎ比を表１に示す。
【０１３２】
【実施例２】
実施例１において、感放射線組成物として、ｏ−ナフトキノンジアジド型フォトレジスト（ＡＺ−Ｐ１３５０（商品名）、クラリアントジャパン株式会社製）を用いる代わりに、ポリメタクリル酸メチル（１８，２２３−０、アルドリッチ社製、Ｍｗ＝〜１２０，０００）２．５質量部を、２−アセトキシ−１−メトキシプロパン（関東化学）２２．５質量部に溶解した後、２，３，４−トリオキシベンゾフェノン−２，３，４−トリス（ナフトキノン−１，２−ジアジド−５−スルホン酸）エステル（ＮＴ−２００，東洋合成工業株式会社製）１質量部を溶解させ感光液を調製したものを組成物として用い、露光量を８００Ｊ／ｍ２とする代わりに１２００Ｊ／ｍ２とした以外は、実施例１と同様にして、プローブＡが固定化されたＤＮＡチップを作成し、実施例１と同様にして、ターゲットＤＮＡ（１）をハイブリダイゼーションした。
【０１３３】
実施例１と同様にして蛍光像観察をしたところ、蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、Ｓ／Ｎ＝４．５０であった。Ｓ／Ｎ比を表１に示す。
【０１３４】
【実施例３】
実施例２において、ＤＮＡプローブ（Ｈ２Ｎ−ＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴ）（プローブＡ）を用いる代わりに、Ｈ２Ｎ−ＡＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＧＧＧＧＴ（配列５’→３’：一塩基変異）（プローブＢ）を用いた以外は、実施例２と同様にして、プローブＢが固定化されたＤＮＡチップを作成し、実施例２と同様にして、ターゲットＤＮＡ（１）をハイブリダイゼーションした。
【０１３５】
実施例１と同様にして蛍光像観察をしたところ、蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、Ｓ／Ｎ＝３．２５であった。Ｓ／Ｎ比を表１に示す。
【０１３６】
【実施例４】
ポリ（メチルメタクリレート−エチルアクリレート）（１８，２２４−９（商品番号）、アルドリッチ社製、Ｍｗ＝１０１，０００）を、クロロホルム（和光純薬）に溶解し、０．１ｇ／Ｌの濃度の溶液を調製した。
【０１３７】
得られたスライドガラスを概溶液にそれぞれ２時間浸漬した後、１１０℃で２時間加熱乾燥した。Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．）により、１Ｍの水酸化ナトリウムを１スポット当たり、３ｎＬスポッティングした後、１１０℃で２時間加熱し、加水分解した。
【０１３８】
次いで、０℃の水溶液（１．５ｇ／Ｌ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（和光純薬）  、２．５ｇ／Ｌ  水溶性カルボジイミド（和光純薬）  ）に２時間浸漬し、露光部のインデンカルボン酸をスクシンイミド化した。蒸留水によりチップを洗浄した後、スピンドライヤーｍｉｎｉ（Ｔｏｍｙ  Ｃｏ．Ｊａｐａｎ）でチップを２分間遠心乾燥した。
【０１３９】
水酸化ナトリウム水溶液をスポットしたのと同じ位置に、実施例１と同様の末端がアミン化されたＤＮＡプローブ（Ｈ２Ｎ−ＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴ（配列５’→３’）（プローブＡ））を含有する溶液（濃度３．２ｐｍｏｌ／μＬ）をスポットし、ＤＮＡプローブを固定化した。
【０１４０】
得られたＤＮＡプローブが固定化されたチップを、実施例１と同様に、ターゲットＤＮＡ（１）を含む溶液に浸漬し、５６℃で２時間ハイブリダイゼーションを行った。
【０１４１】
実施例１と同様にして、蛍光像観察を行った。
蛍光像観察の結果、水酸化ナトリウム水溶液をスポットした部分にのみ位置選択的にＤＮＡが固定化できていることが確認された。
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、Ｓ／Ｎ＝４７．８であった。
【０１４２】
【実施例５】
実施例４において、ポリ（メチルメタクリレート−エチルアクリレート）を用いる代わりに、ポリ（ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート−エチルアクリレート−メタアクリル酸）（４４，４７９−０（商品番号）、アルドリッチ社製）を用いた以外は、実施例４と同様にして、ＤＮＡチップを調製し、ターゲットＤＮＡ（１）とハイブリダイゼーションした。
【０１４３】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較結果を表１に示す。
【０１４４】
【実施例６】
ジオキサン中、窒素気流下にて、ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート（３２，７１８−２  アルリッチ社製）とエチルアクリレート（Ｅ９７０−６  アルドリッチ社製）とを、ＡＩＢＮ（和光純薬）を開始剤として、６０℃で１４時間重合させ、ポリ（ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート−エチルアクリレート）（Ｍｗ＝８５，０００）を得た。なお、分子量の測定は、ＧＰＣ（ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により行った。
得られたポリ（ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート−エチルアクリレート）を、クロロホルム（和光純薬）に溶解し、０．１ｇ／Ｌの濃度の溶液を調製した。
【０１４５】
洗浄したスライドガラスを該溶液にそれぞれ２時間浸漬した後、１１０℃で２時間加熱した。Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．）により、１Ｍの水酸化ナトリウムを１スポット当たり、３ｎＬスポッティングした後、１１０℃で２時間加熱し、加水分解した。
【０１４６】
次いで、０℃の水溶液（１．５ｇ／Ｌ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（和光純薬）  、２．５ｇ／Ｌ  水溶性カルボジイミド（和光純薬）  ）に２時間浸漬し、露光部のインデンカルボン酸をスクシンイミド化した。蒸留水によりチップを洗浄した後、スピンドライヤーｍｉｎｉ（Ｔｏｍｙ  Ｃｏ．Ｊａｐａｎ）でチップを２分間遠心乾燥した。
【０１４７】
次に、以下の２種類のプローブＡ，Ｂを含有する２種類の溶液（濃度はともに３．２ｐｍｏｌ／μＬ）を、水酸化ナトリウム水溶液をスポットしたのと同じ位置であって、それぞれ異なる位置にスポットした。
プローブＡ：Ｈ２Ｎ−ＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴ（配列５’→３’）
プローブＢ：Ｈ２Ｎ−ＡＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＧＧＧＧＴ（配列５’→３’）（一塩基変異）（１７ｍｅｒ）
【０１４８】
得られたＤＮＡプローブが固定化されたチップを、実施例１で用いたのと同様の下記ターゲットＤＮＡ（１）を含む溶液（ターゲットＤＮＡ濃度０．１６ｐｍｏｌ／μＬ）に浸漬し、５６℃で２時間ハイブリダイゼーションを行った。
【０１４９】
2004264084.tif 000003
【０１５０】
ＤＮＡマイクロアレイ用スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００ＸＬ（商品名）、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．）で、Ｃｙ５（励起波長６６３ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ）で蛍光像観察を行った。
【０１５１】
蛍光像観察の結果、水酸化ナトリウム水溶液をスポットした部分にのみ位置選択的にＤＮＡが固定化できていることが確認された。
【０１５２】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝２４．２、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝１０．６であった。結果を表２に示す。
【０１５３】
【実施例７】
実施例６において、ターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液を用いる代わりに、ターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．０１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液（Ｄ．Ｗ．を増加して調製した。）を用いた以外は、実施例６と同様にして、ハイブリダイゼーションを行った。
【０１５４】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝１８．０、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝８．５６であった。結果を表２に示す。
【０１５５】
【実施例８】
実施例６において、ターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液を用いる代わりに、ターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．００１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液（Ｄ．Ｗ．を増加して調製した。）を用いた以外は、実施例６と同様にして、ハイブリダイゼーションを行った。
【０１５６】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝９．４７、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝２．７３であった。結果を表２に示す。
【０１５７】
【実施例９】
実施例６において、ターゲットＤＮＡ（１）：Ｃｙ５−ＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴの溶液の代わりに、ターゲットＤＮＡ（２）：Ｃｙ５−ＣＧＣＴＣＴＴＴＣＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＣ  （配列５’→３’）（２２ｍｅｒ）を含む溶液（ターゲットＤＮＡ（２）濃度０．１６ｐｍｏｌ／μＬ。ターゲットＤＮＡ以外は、実施例６と同様の成分の溶液）を用いた以外は、実施例６と同様にしてハイブリダイゼーションを行った。
【０１５８】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝１．００、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝１．００であった。結果を表２に示す。
【０１５９】
【実施例１０】
実施例６において、ポリ（ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート−コ−エチルアクリレート）を用いる代わりに、ポリ（メトキシエチルアクリレート）（Ｍｗ＝７０，０００）を用いた以外は、実施例６と同様のターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液を用いて、実施例６と同様にしてハイブリダイゼーションを行った。
用いたポリ（メトキシエチルアクリレート）（Ｍｗ＝７０，０００）は、ジオキサン中、窒素気流下にて、２−メトキシエチルアクリレート（４１，５３３−２  アルドリッチ社）を、ＡＩＢＮ（和光純薬）を開始剤として、６０℃で１４時間重合させて製造した。分子量の測定は、ＧＰＣ（ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により行った。
【０１６０】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝２７．０、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝３．７０であった。結果を表３に示す。
【０１６１】
【実施例１１】
実施例１０において、ターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液を用いる代わりに、ターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．０１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液（Ｄ．Ｗ．を増加して調製した。）を用いた以外は、実施例１０と同様にして、ハイブリダイゼーションを行った。
【０１６２】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝１７．７、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝１．８９であった。結果を表３に示す。
【０１６３】
【実施例１２】
実施例１０において、ターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液を用いる代わりに、ターゲットＤＮＡ濃度（１）が０．００１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液（Ｄ．Ｗ．を増加して調製した。）を用いた以外は、実施例１０と同様にして、ハイブリダイゼーションを行った。
【０１６４】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝１１．８、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝１であった。結果を表３に示す。
【０１６５】
【実施例１３】
実施例１０において、ターゲットＤＮＡ（１）：Ｃｙ５−ＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴの溶液の代わりに、ターゲットＤＮＡ（２）：Ｃｙ５−ＣＧＣＴＣＴＴＴＣＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＣ  （配列５’→３’）を含む溶液（ターゲットＤＮＡ（２）濃度０．１６ｐｍｏｌ／μＬ。ターゲットＤＮＡ以外は、実施例１０と同様の成分の溶液）を用いた以外は、実施例１０と同様にしてハイブリダイゼーションを行った。
【０１６６】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝１．００、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝１．００であった。結果を表３に示す。
【０１６７】
【比較例１】
ポリＬリジン（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ）コートマイクロアレイの作製はＳｔａｎｆｏｒｄ法（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）に準拠して行った。
【０１６８】
ガラス製チャンバー内で、ＮａＯＨ（和光純薬）  １４ｇをエタノール／水混合溶媒（８０ｍＬ／６０ｍＬ）に加え、完全に透明になるまでスターラーで撹拌しながら溶解させてスライドガラス洗浄用溶液を調製した。スライドガラスをラックに入れ、溶液中で２時間振とうした。その後、スライドガラスを別のラックに移し入れて、蒸留水中で５〜６回上下させ、リンスした。リンスを４回繰り返した後、スライドガラスをスピンドライヤーによって、２分間遠乾燥した。
【０１６９】
プラスチック製チャンバー中で、Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ＳＩＧＭＡ社）１４ｍＬ、
（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）（ＰＨ７．４）１４ｍＬ、蒸留水１１２ｍＬを混合し、Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ溶液を調製した。リンスの終了したスライドガラスを、ラックごとＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ溶液中に入れ、１時間振とうを行った。その後、スライドガラスを別のラックに移し入れて、蒸留水中で５〜６回上下させ、リンスした。リンスを５回繰り返した後、スライドガラスをスピンドライヤーによって、２分間遠心乾燥した。その後、オーブンで８０℃、４時間の加熱乾燥を行った。
【０１７０】
２種類のプローブＤＮＡ（プローブＡ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）、プローブＢ（１００ｐｍｏｌ／μＬ））：
プローブＡ：Ｈ２Ｎ−ＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴ（配列５’→３’）
プローブＢ：Ｈ２Ｎ−ＡＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＧＧＧＧＴ（配列５’→３’）
それぞれ１．６μＬを、蒸留水４８．４μＬに溶解させ、プローブＡの溶液（３．２  ｐｍｏｌ／μＬ）  ５０μＬ、プローブＢの溶液（３．２  ｐｍｏｌ／μＬ）  ５０μＬをそれぞれ調製した。
【０１７１】
Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．）用いて、基板上にそれぞれを、整列スポットした。３ｎＬ／１ｓｐｏｔで、４行×１２列の計６０ｓｐｏｔｓのマイクロアレイを作製した。スライドガラスの表裏を区別するため、裏面右下にダイヤモンドペンにて印をつけた。
【０１７２】
ビーカーに注いだ蒸留水を９０℃に加熱し、スライドガラスの表面を、水蒸気に当て、リハイドレーションを行った。スライドガラスを裏返して、表面を上にして、８０℃に加熱したヒートブロック上で水分を蒸発させた。ＵＶクロスリンカーで６０ｍＪのＵＶをあてクロスリンクした。ブロッキング溶液は、水酸化ナトリウムでｐＨ８に調整した１Ｍホウ酸溶液１５ｍＬに、無水コハク酸３．３ｇを３３５ｍＬの１−メチル−２−ピロリドンに溶解させて作製した溶液と混合した。
【０１７３】
チップをブロッキング溶液に、２０分間浸した後、蒸留水で静置した。スライドガラスを蒸留水で５回リンスし、スピンドライヤーによって、２分間遠心して乾燥して、プローブＡおよびプローブＢが固定されたＰＬＬコートマイクロアレイを得た。
【０１７４】
得られたプローブＡおよびＢが固定化されたＰＬＬコートマイクロアレイを、実施例１と同様のターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液を用いて、５６℃で２時間ハイブリダイゼーションを行った。
【０１７５】
実施例１と同様にして蛍光像観察を行った。
【０１７６】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝２．６６、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝２．７６であった。結果を表４に示す。
【０１７７】
【比較例２】
比較例１において、ターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液を用いる代わりに、ターゲットＤＮＡ濃度（１）が０．０１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液（Ｄ．Ｗ．を増加して調製した。）を用いた以外は、比較例１と同様にして、ハイブリダイゼーションを行った。
【０１７８】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝１．００、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝１．００であった。結果を表４に示す。
【０１７９】
【比較例３】
比較例１において、ターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液を用いる代わりに、ターゲットＤＮＡ（１）濃度が０．００１６ｐｍｏｌ／μＬの溶液（Ｄ．Ｗ．を増加して調製した。）を用いた以外は、比較例１と同様にして、ハイブリダイゼーションを行った。
【０１８０】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝１．００、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝１．００であった。結果を表４に示す。
【０１８１】
【比較例４】
比較例１において、ターゲットＤＮＡ（１）：Ｃｙ５−ＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴの溶液の代わりに、ターゲットＤＮＡ（２）：Ｃｙ５−ＣＧＣＴＣＴＴＴＣＧＴＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＣ  （配列５’→３’）を含む溶液（ターゲットＤＮＡ（２）濃度０．１６ｐｍｏｌ／μＬ。ターゲットＤＮＡ以外は、比較例１と同様の成分の溶液）を用いた以外は、比較例１と同様にしてハイブリダイゼーションを行った。
【０１８２】
蛍光部（Ｓ：シグナル）と非蛍光部（Ｎ：ノイズ）との間の蛍光強度を比較したところ、プローブＡについては、Ｓ／Ｎ＝１．００、プローブＢについては、Ｓ／Ｎ＝１．００であった。結果を表４に示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０１８３】
【発明の効果】
本発明に係るＤＮＡチップの製造方法によれば、高い集積度で、鎖長に制限のないＤＮＡプローブが強固に固定化されたＤＮＡチップを、簡単な工程で安価に提供できる。