(57)【要約】【課題】クラゲの体積を減少させるためのコラゲナーゼ、そのコラゲナーゼを含むクラゲ分解剤、及びクラゲ分解酵素を分泌する細菌のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】クラゲ抽出物である培地で増殖する細菌を選択する工程を含むスクリーニング方法を用いて海底泥から単離したビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ．）ＨＩＨ−１株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１７８９７）又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）細菌Ｊ２６Ｗ株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３）を、ミズクラゲ熱水抽出物を含む培地上で、室温で振とう培養して、増殖させた。この海洋細菌は増殖時にコラゲナーゼを培地中に分泌する。この培地に硫酸アンモニウム溶液を加えタンパク質を沈殿させ、遠心分離により得たタンパク質画分を透析し、ゲル濾過により精製し、精製コラゲナーゼを得た。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビブリオ属　（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ．）細菌ＨＩＨ−１株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１７８９７）由来であり、クラゲのコラーゲンの繊維を切断することができるコラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）。
【請求項２】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）細菌Ｊ２６Ｗ株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３）由来であり、クラゲのコラーゲンの繊維を切断することができるコラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）。
【請求項３】
ビブリオ属　（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ．）細菌ＨＩＨ−１株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１７８９７）又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）細菌Ｊ２６Ｗ株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３）を培養した培地。
【請求項４】
請求項３に記載の培地に硫酸アンモニウム溶液を加えタンパク質を沈殿させ、遠心分離により得たタンパク質画分を透析し、ゲル濾過により精製することによって得られうるコラゲナーゼ。
【請求項５】
請求項１、２または４のいずれかに記載のコラゲナーゼを含むクラゲ分解剤。
【請求項６】
請求項３に記載の培地を含むクラゲ分解剤。
【請求項７】
ビブリオ属　（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ．）細菌ＨＩＨ−１株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１７８９７）又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）細菌Ｊ２６Ｗ株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３）を含むクラゲ分解剤。
【請求項８】
クラゲの分解酵素を有する細菌のスクリーニング方法であって、
クラゲ抽出物である培地で増殖する細菌を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項９】
クラゲの分解酵素を有する細菌のスクリーニング方法であって、
細菌をクラゲ抽出物である培養液で増殖させた後、その培養液を前記クラゲ抽出物と寒天からなる寒天培地上に塗布し、クリア・ゾーンを形成したコロニーを単離することにより、クラゲの分解酵素を有する細菌を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クラゲの体積を減少させる（以下、減容化という。）ためのコラゲナーゼ、そのコラゲナーゼを含むクラゲ分解剤、及びクラゲ分解酵素を分泌する細菌のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
夏季になると日本近海には大量のクラゲが発生する。臨海地域に立地し、冷却水として大量の海水を必要とする発電所等のプラント施設においては、発生したクラゲが潮流にのって押し寄せ、冷却水の取水口から取り込まれると、フィルタの目詰まり等多くの弊害をもたらす。そのため、発電所等では回転式除塵機等を使用してクラゲを捕獲・回収している。このように陸揚げされたクラゲは、そのまま陸地に埋め立て処分されるか、自然乾燥されるか、あるいは、機械的、化学的又は生物学的に処理されている。
【０００３】
陸揚げされたクラゲ処理には、以下のような問題点がある：
（１）死んだクラゲは魚が腐ったような臭気を発生して悪臭源となる。
（２）クラゲはその体に占める水分が９５〜９８％であるため焼却処理が可能であるとしてもエネルギー消費量が高く、しかもゼリー状で流動性に乏しいため、そのままでは通常の廃水処理工程での処理も困難である。
（３）埋め立て処分する場合にも用地の確保が難しい。
【０００４】
かかる問題を解決すべく、特開平１１−１７９３２７号公報は、陸揚げされたクラゲを嫌気性条件下で、嫌気性細菌により生物学的及び機械的に処理し、その後廃水処理する簡易な処理方法・装置について記載している。また、特開平１１−２４４８３３号公報は、陸揚げされたクラゲを加圧下で加熱し、その後瞬時に脱圧して膨化処理してクラゲ水を得、このクラゲ水に次亜塩素酸ナトリウムを添加して、廃水処理する方法について記載している。しかしながら、特開平１１−１７９３２７号公報に記載の発明においては、そのクラゲ分解処理が嫌気性菌の自然発生又は下水処理後の活性汚泥に含まれる嫌気性細菌の添加によるので、嫌気性環境を作り出さなければならず、また、その分解処理には、３日間と長期間を要するので、迅速かつ効率のよい処理とは言い難い。特開平１１−２４４８３３号公報に記載の発明においては、加熱蒸気の供給設備、加圧槽、次亜塩素酸ナトリウム添加設備等の装置が必要であり、それらの装置群の建設・維持費は高い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、陸揚げクラゲの処理に関する上記の諸問題を解決すべく、クラゲの体積を減少させるためのコラゲナーゼ、そのコラゲナーゼを含むクラゲ分解剤、及びクラゲ分解酵素を分泌する細菌のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明の第一の態様においては、ビブリオ属　（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ．）細菌ＨＩＨ−１株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１７８９７）由来であり、クラゲのコラーゲンの繊維を切断することができるコラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）細菌Ｊ２６Ｗ株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３）由来であり、クラゲのコラーゲンの繊維を切断することができるコラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を提供する。前記細菌は、１９９９年６月１４日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された海洋細菌ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ．）（ＨＩＨ−１株）（受託番号ＦＥＲＭＰ−１７８９７）又は２００１年４月２５日に独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託された海洋細菌バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（Ｊ２６Ｗ株）（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３）である。
本発明の第二の態様においては、ビブリオ属　（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ．）細菌ＨＩＨ−１株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１７８９７）又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）細菌Ｊ２６Ｗ株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３）を培養した培地、またはこの培地に硫酸アンモニウム溶液を加えタンパク質を沈殿させ、遠心分離により得たタンパク質画分を透析し、ゲル濾過により精製することによって得られうるコラゲナーゼを提供する。
また、本発明の別の態様において、上記いずれかのコラゲナーゼ、上記培地、またはビブリオ属　（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ．）細菌ＨＩＨ−１株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１７８９７）又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）細菌Ｊ２６Ｗ株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３）、を含むクラゲ分解剤を提供する。前記コラゲナーゼ又は前記細菌は、前記クラゲが大量発生した海域に適用することができるが、好ましくは、前記のクラゲが大量発生した海域を周りの海域と隔離することが望ましい。あるいは、前記コラゲナーゼ又は前記細菌は、陸揚げされた前記クラゲに適用する。さらに、本発明の別の態様において、クラゲの分解酵素を有する細菌のスクリーニング方法であって、クラゲ抽出物である培地で増殖する細菌を選択する工程を含むスクリーニング方法を提供する。特に、クラゲの分解酵素を有する細菌のスクリーニング方法であって、細菌をクラゲ抽出物である培養液で増殖させた後、その培養液を前記クラゲ抽出物と寒天からなる寒天培地上に塗布し、クリア・ゾーンを形成したコロニーを単離することにより、クラゲの分解酵素を有する細菌を選択する工程を含むスクリーニング方法であることが好ましい。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本明細書中、クラゲの減容化とは、コラゲナーゼを又はクラゲ分解酵素分泌細菌を適用することにより、上記クラゲの体を構成するコラーゲン繊維を破壊して、上記体に含有される水を除去し、もってクラゲの体積を減少させることをいう。したがって、減容率は、コラゲナーゼ又はクラゲ分解酵素分泌細菌適用後のクラゲの残渣湿重量を適用前のクラゲの重量で除して１００を乗じた値である。ここで、クラゲ重量は容器・反応液を含めた重量の増加分として、そして分解後残渣重量は、反応液をろ過し、残った固形分の重量を乾燥させない状態で測定した。
【０００８】
クラゲは、その体を構成するタンパク質（コラーゲン）が繊維状構造をとり、その網目に水を閉じ込めてゼリー状となっている。この網目構造を構成するコラーゲン繊維をコラゲナーゼ、好ましくは、海洋性Ｖｉｂｒｉｏ　属細菌又はＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌が分泌するコラゲナーゼによって切断し、上記の閉じ込められた水を溶出させて（解放して）、クラゲを減容化する。クラゲの減溶化に伴って、クラゲと溶出水の混合物は流動化する。図１にクラゲ分解のイメージを示す。
【０００９】
陸揚げされたクラゲを処理する場合には、コラゲナーゼを分泌する細菌を培養した容器を用意し、これに減容化すべきクラゲを投入する。投入されたクラゲは、培地中に分泌されたコラゲナーゼにより減容化される。かかるクラゲの投入は、繰り返し行われることができる。減容化後の処理水を、環境上の理由からそのままクラゲ捕獲海域に戻せない場合には、その処理水をさらに廃水処理にかけてＣＯＤやＢＯＤを低下させた後に、上記海域に戻すことができる。一方、コラゲナーゼ又はクラゲ分解酵素分泌細菌をクラゲ発生海域にそのまま適用する場合には、９５〜９８％の体内保持水分が除去された減容化クラゲだけを、従来技術のクラゲ処理を行うか又はそのまま埋め立て処分等をすることができる。
【００１０】
重要なことは、クラゲ減容化方法は、厳密なる嫌気条件下でなくても実施することができるということであり、そしてこれが、クラゲの減容化を迅速かつ効率の高いものにする。
【００１１】
【実施例】
実施例１：ビブリオ属細菌の単離及び同定
海洋細菌ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ．）（ＨＩＨ−１株）（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１７８９７）を、広島県呉市阿賀海岸から採取し、以下の方法で単離・同定した。
【００１２】
約１ｇの上記海洋土壌を、選択培地（ミズクラゲ熱水抽出物（ミズクラゲを１２１℃で１５分間熱処理して得られた上清））１０ｍｌに植菌し、そして２５℃で１４日間集積培養した。その後、この培養液０．１ｍｌを、選択寒天培地（ミズクラゲ熱水抽出物、１．５％寒天）上に塗布し、そして２５℃で３日間培養した。培養により上記培地上にクリア・ゾーンを形成したコロニーを、釣菌操作を繰り返すことにより、単一分離した。
【００１３】
以上のようにして、コラーゲンに対して高い分解活性を有する分解菌を選別し、その中で最優秀の菌株について遺伝子レベルでの解析を行い、新種として単離・同定した。
【００１４】
上記菌株のＤＮＡをＨｉｇｈ　ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて抽出し、ＰＣＲ法により１６Ｓ　ｒＤＮＡを増幅させた。シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列を読み取り、ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）にデータを送信し、分子系統学的解析に基づく同定を行った。
【００１５】
本発明者は、この株をビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ．）（ＨＩＨ−１株）と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に１９９９年６月１４日に寄託申請した。この株は、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１７８９７として受託された。
【００１６】
実施例２：上記ビブリオ属細菌分泌酵素含有培地を用いたクラゲ処理
図２に本実施例のクラゲ処理手順を示す。海底泥から採取した海洋細菌Ｖｉｂｒｉｏｓｐ．（ＨＩＨ−１株）ＦＥＲＭ　Ｐ−１７８９７を、ミズクラゲ熱水抽出物を含む培地上で、室温で振とう培養して、増殖させた。この海洋細菌は増殖時にコラゲナーゼを培地中に分泌する。分泌されたコラゲナーゼを含む培地３０ｍｌを１５０ｍｌの海水に添加した。これに、ミズクラゲ（学名Ａｕｒｅｌｉａ　ａｕｒｉｔａ）個体（直径約５ｃｍ；体重３５ｇ）を入れて、２５℃で静置した。ほぼ１日後、クラゲの体を構成するコラーゲンの繊維が切断されて、閉じ込められていた水が溶出し、減容化がなされた。減容化率は、約９０％以上であった。本実施例により減容化されたクラゲ溶出物を含む海水のＣＯＤは２００ｍｇ／１と高かったので、環境上の理由により海洋と隔離した状態で処理したクラゲ溶出物をそのまま放流することはできなかった。そこでクラゲ溶出物を含む海水のＣＯＤ除去のために空気吹き込み処理を行い、海水中のＣＯＤを放流可能な数値１５ｍｇ／１以下まで減少させた。
【００１７】
実施例３：凍結乾燥させた上記ビブリオ属細菌分泌酵素含有培地を用いたクラゲ処理
図３に本実施例のクラゲ処理手順を示す。前記の分泌されたコラゲナーゼを含む培地３０ｍｌを液体窒素で凍結させた後、真空ポンプを用いて水分を除去した。この凍結乾燥物をビニール袋に入れて密封し、室温、遮光状態で１年間保存した。これを３０ｍｌの水で溶解させた後、１５０ｍｌの海水に添加し、ミズクラゲ個体（直径約５ｃｍ；体重３５ｇ）を入れて、２５℃で静置した。ほぼ１日後、クラゲの体を構成するコラーゲンの繊維が切断されて、閉じ込められていた水が溶出し、減容化がなされた。減容化率は、約９０％以上であった。
【００１８】
実施例４：精製酵素を用いたクラゲ処理
図４に精製酵素を用いたクラゲ処理手順を示す。実施例２における分泌されたコラゲナーゼを含む培地に、硫酸アンモニウム溶液を加えタンパク質を沈殿させ、遠心分離によりタンパク質画分を得た。このタンパク質画分をセロハンチューブに入れ、海水で透析して硫酸アンモニウムを除去した。このタンパク質画分からゲル濾過によりコラゲナーゼ活性を持つ酵素を精製した。
上記精製酵素溶液１ｍｌを３Ｌの海水中に添加して、ミズクラゲ個体（直径約５ｃｍ；体重３５ｇ）を入れて、２５℃で静置した。ほぼ１日後、クラゲの体を構成するコラーゲンの繊維が切断されて、閉じ込められていた水が溶出し、減容化がなされた。減容化率は、約９０％以上であった。
【００１９】
実施例５：上記ビブリオ属細菌自体を用いたクラゲ処理
図５に海洋細菌自体を用いたクラゲ処理手順を示す。海底泥から取得した海洋細菌Ｖｉｂｒｉｏ　ｓｐ．　（ＨＩＨ−１株）ＦＥＲＭ　Ｐ−１７８９７を、クラゲ熱水抽出物を含む培地で増殖させた後、遠心分離により上記細菌を、５ｇ回収した。１５０ｍｌの海水中のミズクラゲ個体（直径約５ｃｍ；体重３５ｇ）に上記回収細菌１ｇを散布し、静置した。ほぼ１日後、クラゲの体を構成するコラーゲンの繊維が切断されて、閉じ込められていた水が溶出し、減容化がなされた。減容化率は、約９０％以上であった。
【００２０】
実施例６：バチルス属細菌の単離及び同定
海洋細菌バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）　（Ｊ２６Ｗ株）　（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３）を、広島県安芸津町の海岸から採取し、以下の方法で単離・同定した。
【００２１】
約１ｇの上記海洋土壌を、選択培地ミズクラゲ熱水抽出物（ミズクラゲを１２１℃で１５分間熱処理して得られた上清））１０ｍｌに植菌し、そして２５℃で１４日間集積培養した。その後、この培養液０．１ｍｌを、選択寒天培地（ミズクラゲ熱水抽出物、１．５％寒天）上に塗布し、そして２５℃で３日間培養した。培養により上記培地上にクリア・ゾーンを形成したコロニーを、釣菌操作を繰り返すことにより、単一分離した。
【００２２】
以上のようにして、コラーゲンに対して高い分解活性を有する分解菌を選別し、その中で最優秀の菌株について遺伝子レベルでの解析を行い、新種として単離・同定した。
【００２３】
上記菌株のＤＮＡをＨｉｇｈ　ｐｕｒｅ　ＰＣＲ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて抽出し、ＰＣＲ法により１６Ｓ　ｒＤＮＡを増幅させた。シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列を読み取り、ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）にデータを送信し、分子系統学的解析に基づく同定を行った。
【００２４】
本発明者は、この株をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）（Ｊ２６Ｗ株）と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに２００１年４月２５日に寄託申請した。この株は、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３として受託された。
【００２５】
実施例７：上記バチルス属細菌分泌酵素含有培地を用いたクラゲ処理
図６に本実施例のクラゲ処理手順を示す。海底泥から採取した海洋細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．（Ｊ２６Ｗ株）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３を、ミズクラゲ熱水抽出物を含む培地上で、室温で振とう培養して、増殖させた。この海洋細菌は増殖時にコラゲナーゼを培地中に分泌する。分泌されたコラゲナーゼを含む培地３０ｍｌを１５０ｍｌの海水に添加した。これに、ミズクラゲ（学名Ａｕｒｅｌｉａ　ａｕｒｉｔａ）個体（直径約５ｃｍ；体重３５ｇ）を入れて、２５℃で静置した。ほぼ１日後、クラゲの体を構成するコラーゲンの繊維が切断されて、閉じ込められていた水が溶出し、減容化がなされた。減容化率は、約９０％以上であった。このミズクラゲが分解した海水に新たに同様にミズクラゲ個体（直径約５ｃｍ；体重３５ｇ）を入れて、２５℃で静置した結果、更にほぼ１日後、同様にクラゲの体を構成するコラーゲンの繊維が切断されて、閉じ込められていた水が溶出し、減容化がなされた。この操作によるクラゲの減容化は少なくとも６回の繰り返しが可能であった。
【００２６】
実施例８：凍結乾燥させた上記バチルス属細菌分泌酵素含有培地を用いたクラゲ処理
本実施例における凍結乾燥させたバチルス属細菌分泌酵素含有培地を用いたクラゲ処理手順は、実施例３において用いたクラゲ処理手順（図３）と同様のものであった。実施例７における分泌されたコラゲナーゼを含む培地３０ｍｌを液体窒素で凍結させた後、真空ポンプを用いて水分を除去した。この凍結乾燥物をビニール袋に入れて密封し、室温、遮光状態で１年間保存した。これを３０ｍｌの水で溶解させた後、１５０ｍｌの海水に添加し、ミズクラゲ個体（直径約５ｃｍ；体重３５ｇ）を入れて、２５℃で静置した。ほぼ１日後、クラゲの体を構成するコラーゲンの繊維が切断されて、閉じ込められていた水が溶出し、減容化がなされた。減容化率は、約９０％以上であった。
【００２７】
実施例９：精製酵素を用いたクラゲ処理
本実施例における精製酵素を用いたクラゲ処理手順は、実施例４において用いたクラゲ処理手順（図４）と同様のものであった。実施例７における分泌されたコラゲナーゼを含む培地に、硫酸アンモニウム溶液を加えタンパク質を沈殿させ、遠心分離によりタンパク質画分を得た。このタンパク質画分をセロハンチューブに入れ、海水で透析して硫酸アンモニウムを除去した。このタンパク質画分からゲル濾過によりコラゲナーゼ活性を持つ酵素を精製した。
上記精製酵素溶液５０μｌを１５０ｍｌの海水中に添加して、ミズクラゲ個体（直径約５ｃｍ；体重３５ｇ）を入れて、２５℃で静置した。ほぼ１日後、クラゲの体を構成するコラーゲンの繊維が切断されて、閉じ込められていた水が溶出し、減容化がなされた。減容化率は、約９０％以上であった。
【００２８】
実施例１０：上記バチルス属細菌自体を用いたクラゲ処理
本実施例における海洋細菌自体を用いたクラゲ処理手順は、実施例５において用いたクラゲ処理手順（図５）と同様のものであった。海底泥から取得した海洋細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．（Ｊ２６Ｗ株）ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３１３を、クラゲ熱水抽出物を含む培地で増殖させた後、遠心分離により上記細菌を、５ｇ回収した。１５０ｍｌの海水中のミズクラゲ個体（直径約５ｃｍ；体重３５ｇ）に上記回収細菌１ｇを散布し、静置した。ほぼ１日後、クラゲの体を構成するコラーゲンの繊維が切断されて、閉じ込められていた水が溶出し、減容化がなされた。減容化率は、約９０％以上であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】クラゲ分解のイメージ図。
【図２】海洋細菌分泌酵素含有培地を用いたクラゲ処理。
【図３】凍結乾燥させた海洋細菌分泌酵素含有培地を用いたクラゲ処理。
【図４】精製酵素を用いたクラゲ処理。
【図５】海洋細菌自体を用いたクラゲ処理。
【図６】バチルス属細菌分泌酵素含有培地を用いたクラゲ処理（繰り返し処理を含む）。
【図１】
2004057209.tif 000002
【図２】
2004057209.tif 000003
【図３】
2004057209.tif 000004
【図４】
2004057209.tif 000005
【図５】
2004057209.tif 000006
【図６】
2004057209.tif 000007