(57)【要約】【課題】広範囲の木本植物に遺伝子を導入することが可能な遺伝子の導入方法、該遺伝子導入方法を用いた形質転換植物の作出方法、及び該方法によって作出された形質転換植物、を提供することにある。【解決手段】腋芽の直近に遺伝子導入のための切り口を設けた培養用シュートからなる外植体を用いて遺伝子の導入処理を行い、更に、該処理を行った培養用シュートを培養して多芽体を形成させ、該遺伝子が導入された芽を選抜することによって、木本植物への遺伝子の導入を行う。本発明の方法は、個体再分化を経由しないので、バラ科果樹のような個体再分化の難しい植物についても適用することができ、広い範囲の木本植物について形質転換植物の作出が可能となる。また、本発明の方法は個体再分化を経由しないので、短期間で組換えシュートが得られ、葉片を用いた場合等に比較して高効率で遺伝子を導入することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腋芽の直近に遺伝子導入のための切り口を設けた培養シュートの茎からなる外植体を用いて遺伝子の導入を行う処理、及び該処理を行った培養用シュートを培養して多芽体を形成させ遺伝子が導入された芽を選抜する処理を行うことを特徴とする木本植物への遺伝子導入法。
【請求項２】
外植体が、腋芽の直近０．５ｍｍ以内に遺伝子導入のための切り口を設けた茎からなることを特徴とする請求項１記載の木本植物への遺伝子導入法。
【請求項３】
腋芽を含んだ外植体が、２〜３ｍｍであることを特徴とする請求項１又は２記載の木本植物への遺伝子導入法。
【請求項４】
外植体を用いた遺伝子の導入を、アグロバクテリウム法による感染処理により行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の木本植物への遺伝子導入法。
【請求項５】
外植体のアグロバクテリウム法による感染処理を、アグロバクテリウム菌を分散させた感染液への浸漬で行うことを特徴とする請求項４記載の木本植物への遺伝子導入法。
【請求項６】
外植体のアグロバクテリウム法による感染処理を、アグロバクテリウム菌を分散させた感染液への浸漬後、暗黒条件下、共存培養により行うことを特徴とする請求項５記載の木本植物への遺伝子導入法。
【請求項７】
遺伝子が導入された芽の選抜を、抗生物質耐性遺伝子の導入により行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の木本植物への遺伝子導入法。
【請求項８】
遺伝子が導入された芽の選抜を、抗生物質含有培地を用いて選抜培養することにより行うことを特徴とする請求項７記載の木本植物への遺伝子導入法。
【請求項９】
遺伝子が導入された芽の選抜を、多芽体を形成させる条件の培地で選抜培養することにより行うことを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の木本植物への遺伝子導入法。
【請求項１０】
木本植物が、バラ科果樹であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の木本植物への遺伝子導入法。
【請求項１１】
バラ科果樹が、セイヨウナシ、ニホンナシ、リンゴ又はオウトウであることを特徴とする請求項１０記載の木本植物への遺伝子導入法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか記載の遺伝子導入法により遺伝子が導入された外植体に、発根処理を行うことを特徴とする遺伝子導入木本植物の作出法。
【請求項１３】
請求項１２記載の遺伝子導入木本植物の作出法により作出されたことを特徴とする遺伝子導入木本植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、木本植物に遺伝子を導入する方法、特に、バラ科果樹のような木本植物に効率的に遺伝子を導入する方法、該方法を用いて木本植物の形質転換植物を作出する方法、及び、該方法により作出された遺伝子導入木本植物（形質転換植物）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物においては、１９８３年にタバコを用いた実験で形質転換に成功して以来（Ｎａｔｕｒｅ  ３０３，  ２０９−２１３，  １９８３）、植物に遺伝子を導入して形質転換して新しい植物を作出する多くの研究がなされ、数多くの植物種で成功した例が報告されている。
落葉果樹のような木本植物においては、元来その育種は主に交雑育種により行われていたが、この種の植物は遺伝的にヘテロで、しかも実生から開花・結実に至るまで数年から数十年を要することから、草本植物に比べてその遺伝解析に長期の期間を要していた。このため、木本植物を短期間で効率的に育種を展開することが困難で、新品種の育成に十数年から、数十年を必要としていた。そこで、落葉果樹のような木本植物においても、草本植物のように遺伝子導入による形質転換技術を用いれば、短期間で有用な遺伝子を選択的に導入することができ、果樹のような世代期間の長い作物では特に有力な手段となることから、木本植物に対するこれらの技術の開発が進められてきた。
【０００３】
植物における形質転換の方法には、アグロバクテリウム菌を用いて遺伝子を間接的に導入する方法と、パーテクルガン法、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、エレクトロポーレション法などの遺伝子を直接細胞に導入する方法がある。アグロバクテリウム法は、土壌細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓが植物に感染するときにプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域と呼ばれる部分を植物染色体に挿入する仕組みを利用して遺伝子を導入する方法であるが、この方法は組織片からの再分化が可能でＡ．Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに感染する植物であれば適用できるという利点があり、多くの植物の形質転換法として用いられている。落葉果樹等の木本植物の形質転換方法としても、ほとんどはこの方法を用いたものである（Ｂｕｌｌ．  Ｎａｔｌ．  Ｉｎｓｔ．  Ｆｒｕｉｔ  Ｔｒｅｅ  Ｓｃｉ．３５，１１−３１，２００１）。パーティクルガン法は、外来遺伝子をコーテイングした金属の微粒子を植物の細胞や組織に打ち込んで遺伝子を導入する方法であり、落葉果樹ではブドウでの成功例が報告されている（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．，  １５，  ３１１−３１６，  １９９６、Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔｉｃ．，  ４４７，  ２７３−２７９，  １９９７）。ＰＥＧ法、エレクトロポーレション法は、ＰＥＧ処理や電圧処理によってプロトプラストに直接外来遺伝子を取り込ませる方法で、プロトプラスト培養系の形成が必須となるため、現在のところこの方法による落葉果樹のような木本植物の形質転換に成功した報告はない。
【０００４】
落葉果樹のような木本植物の遺伝子の導入において、リンゴでは「ｇｒｅｅｎｓｌｅｅｖｅｓ」の葉片からの不定芽形成系を利用してアグロバクテリウム法により形質転換体が作出されて以来（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．，  ６５８−６６１，  １９８９）、同様の手法を用いて様々な品種で形質転換系の開発がおこなわれた（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ．，  ５５，  ３１−３８，  １９９９、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．，  １５，  ５４９−５５４，  １９９６、Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔｉｃ．，  ５３８，  ６１９−６２４，  ２０００、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｈｏｒｔ．  Ｓｃｉ．，  １２２，  ７５８−７６３，  １９９７、Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔｉｃ．  ４８９，  ２５３−２５６，  １９９９、Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔｉｃ．  ５３８，  ６１１−６１６，  ２０００、Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３９，  ５６０−５６８，  １９９２、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３７，  ５４９−５５９，  １９９８、Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，  ７７，  １２３−１２８，  １９９４、Ｐｌａｎｔ  ｓｃｉ．，  １１９，  １２５−１３３，  １９９６、Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  ８５，  １３１−１３４，  １９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．，  １４，  ４０７−４１２，  １９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｓ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ．，  ３６，  ３１７−３２９，  １９９４）。リンゴでは、葉片からの不定芽形成系とアグロバクテリウム法の組み合わせにより安定した形質転換系がほぼ確立している。
【０００５】
落葉果樹のうち、ブドウでは葉柄、茎頂組織、体細胞胚の胚軸などの組織片からの不定芽形成系を利用してアグロバクテリウム法により、最初に形質転換体が作出された（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｏｔ．，  ４１  （２２９），  １０４５−１０４９，  １９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，  １０４１−１０４５，  １９９０）。その後、葉柄、葉片、体細胞胚の胚軸から、同様の方法で形質転換体が得られている。しかし、ブドウの場合、このように不定芽形成系を利用して得られた形質転換体は、導入された遺伝子の発現が植物内で不均一で、キメラを形成した。不定芽形成は細菌の感染部位とは異なる部分から生じることが多く、しかも多細胞であるため、得られた形質転換体はキメラとなった。そこで、単一細胞由来の形質転換体を得るために、ＥＣ（エンブリオジェニックカルス）や体細胞胚からの植物体再生系を利用してアグロバクテリウム法により、形質転換体を作出することが行われ、現在この方法が用いられている。しかし、品種によっては、ＥＣや体細胞胚の誘導が難しく、再分化系が確立していないものが多く、形質転換可能な品種が限られている。
【０００６】
ナシでは、セイヨウナシの葉片からの不定芽形成系を利用してアグロバクテリウム法により形質転換体の作出に成功して以来（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．１６，  ２４５−２４９，１９９６）、同様の手法でセイヨウナシ等の形質転換体の作出が行われている。例えば、マンシュウマメナシ、セイヨウナシのラ・フランス及びバートレッドの子葉からの不定芽形成系を利用してアグロバクテリウム法により形質転換体の作出に成功している（園学雑．６７（別２），２０７，１９９、園学雑．６９（別２），１３４，２０００）。しかし、ナシで形質転換に成功しているのは数品種のセイヨウナシとマンシュウマメナシに限られており、ニホンナシについては成功していない。また、セイヨウナシでも、品種によっては形質転換率が低いため、効率の良い方法の開発が望まれている。
【０００７】
モモについては、未熟胚由来カルスからの不定芽形成系（Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｈｏｒｔ．  Ｓｃｉ．  １１６，  １０９２−１０９７，  １９９１）及び未熟胚由来不定胚形成系（園学雑．６８（別１），１３９，１９９９）を用いてアグロバクテリウム法により形質転換体の作出に成功している。また、モモに近縁のアーモンドでは、実生葉片からの不定胚形成系を利用して、アグロバクテリウム法により形質転換体の作出に成功しているが（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．  １８，  ３８７−３９３，  １９９９）、これらはいずれも形質転率が極めて低く不安定であったりして、有効な形質転換方法にはなっていない。
上記するように、落葉果樹のような木本植物においては、葉柄、葉片、体細胞胚の胚軸（特開２００２−２５３０７０号公報）等からの不定芽形成系やＥＣ培養系を用いての形質転換が行なわれていたが、果樹の品種によっては組織からの不定芽形成やＥＣ誘導が困難なものが多いため、既存の有用品種への遺伝子の導入方法はいまだ有力な方法は開発されていない。
【０００８】
近年、カンキツにおいて腋芽又は節を含む茎（ｉｎｔｅｒｎｏｄａｌ  ｓｔｅｍ  ｓｅｇｍｅｎｔ）を用いてアグロバクテリウム法により遺伝子を導入する方法が報告されている（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  １４，  ６１６−６１９，  １９９５）。この方法は、温室内で生育した実生のスイート  オレンジの腋芽又は節を含む茎を０．５〜１ｃｍに切断し、これをＭＳ無機塩からなるＳＲＭ植物培養培地に垂直に設置して、この茎の切断面にアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の培養液をドロップし、約２日間共存培養した後、マグネット  ポットに移植して、培地にカナマイシンを添加して、遺伝子が導入された個体を選択し、その後８週間暗黒条件下で培養し、１６時間の光照射、６０％の相対湿度条件下で、４週間保持した後、再生したシュートの先端を収穫し、これを台木に接木する方法が開示されている。この方法では、腋芽を含む茎の材料として実生を用いている。カンキツの場合、株心胚実生であるため親と同じ形質を持った実生が得られる場合が多いが、バラ科果樹の種子の場合では親と同形質をもった実生は得られない。また、カンキツの場合でも、受精した種子からの実生では、品種の品質を保持することが難しく、また、アグロバクテリウム培養液による処理に技術を要する。更に、この方法では、シュートの先端を接木しなければならなく、そのための台木の用意等もあって、どのような植物、或いは植物の品種に適用できるものではなかった。特に、バラ科果樹のような木本植物に適用することは困難であった。
【０００９】
【特許文献１】
特開２００２−２５３０７０号公報。
【非特許文献１】
Ｎａｔｕｒｅ  ３０３，  ２０９−２１３，  １９８３。
【非特許文献２】
Ｂｕｌｌ．  Ｎａｔｌ．  Ｉｎｓｔ．  Ｆｒｕｉｔ  Ｔｒｅｅ  Ｓｃｉ．  ３５，  １１−３１，  ２００１。
【非特許文献３】
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．，  １５，  ３１１−３１６，  １９９６。
【非特許文献４】
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．，  ６５８−６６１，  １９８９。
【非特許文献５】
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ．，  ５５，  ３１−３８，  １９９９。
【非特許文献６】
Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｏｔ．，  ４１  （２２９），  １０４５−１０４９，  １９９０。
【非特許文献７】
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．１６，  ２４５−２４９，  １９９６。
【非特許文献８】
園学雑．６７（別２），２０７，１９９８。
【非特許文献９】
園学雑．６９（別２），１３４，２０００。
【非特許文献１０】
Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｓｏｃ．  Ｈｏｒｔ．  Ｓｃｉ．  １１６，  １０９２−１０９７，  １９９１。
【非特許文献１１】
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｔ．１８，  ３８７−３９３，  １９９９。
【非特許文献１２】
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  １４，  ６１６−６１９，  １９９５。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、広範囲の木本植物に遺伝子を導入する方法、特に、バラ科果樹のような個体再分化の難しい木本植物についても短期間で効率的に遺伝子を導入することができ、更に広範囲の植物及びその品種に対して適用が可能で、該植物の有用な形質をそのまま保持しながら目的とする遺伝子の導入が可能な遺伝子の導入方法、該方法を用いた形質転換植物の作出方法、及び該方法によって作出された形質転換植物、を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
従来、落葉果樹のような木本植物においては、葉柄、葉片、体細胞胚の胚軸等からの不定芽形成系を用いる方法等により、遺伝子の導入が行われていた。しかし、例えば、バラ科果樹のような木本植物においては、個体再分化が難しく、不定芽形成が困難であるので、木本植物の種類や品種によっては、該植物に遺伝子を導入して、形質転換した植物を作出することができなかった。そこで、本発明者はバラ科果樹のような個体再分化の難しい木本植物においても、短期間で効率的に遺伝子を導入することができる方法を開発すべく鋭意研究の結果、腋芽の直近に遺伝子導入のための切り口を設けた腋芽を含む茎からなる外植体を用いて遺伝子の導入処理を行い、更に、該処理を行った腋芽を含む茎を培養して多芽体を形成させ遺伝子が導入された芽を選抜することによって、木本植物への遺伝子の導入が可能となることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明の方法は、個体再分化を経由しないので、バラ科果樹のような個体再分化の難しい植物についても適用することができ、広い範囲の木本植物についての遺伝子の導入及び形質転換植物の作出が可能となる。また、本発明の方法は個体再分化を経由しないので、短期間で組換えシュートが得られ、更に、葉片を用いた場合等に比較して高効率で遺伝子を導入することが可能となる。また、本発明の方法は、遺伝子導入後の選抜培養中に、多芽体状のシュートを形成するために、得られた組換体が、遺伝子が導入されていない細胞が混入してキメラとなる可能性が低い。更に、本発明の方法は形質の変化する実生苗のようなものを新たに作製する必要が無く、従来の有用な品種にそのまま適用することができるので、該品種の形質を変化させることなく、新しく有用な形質転換体の作出を行うことができる。
【００１３】
すなわち本発明は、腋芽の直近に遺伝子導入のための切り口を設けた培養シュートの茎からなる外植体を用いて遺伝子の導入を行う処理、及び該処理を行った培養用シュートを培養して多芽体を形成させ遺伝子が導入された芽を選抜する処理を行うことを特徴とする木本植物への遺伝子導入法（請求項１）や、外植体が、腋芽の直近０．５ｍｍ以内に遺伝子導入のための切り口を設けた茎からなることを特徴とする請求項１記載の木本植物への遺伝子導入法（請求項２）や、腋芽を含んだ外植体が、２〜３ｍｍであることを特徴とする請求項１又は２記載の木本植物への遺伝子導入法（請求項３）や、外植体を用いた遺伝子の導入を、アグロバクテリウム法による感染処理により行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の木本植物への遺伝子導入法（請求項４）や、外植体のアグロバクテリウム法による感染処理を、アグロバクテリウム菌を分散させた感染液への浸漬で行うことを特徴とする請求項４記載の木本植物への遺伝子導入法（請求項５）や、外植体のアグロバクテリウム法による感染処理を、アグロバクテリウム菌を分散させた感染液への浸漬後、暗黒条件下、共存培養により行うことを特徴とする請求項５記載の木本植物への遺伝子導入法（請求項６）や、遺伝子が導入された芽の選抜を、抗生物質耐性遺伝子の導入により行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の木本植物への遺伝子導入法（請求項７）や、遺伝子が導入された芽の選抜を、抗生物質含有培地を用いて選抜培養することにより行うことを特徴とする請求項７記載の木本植物への遺伝子導入法（請求項８）や、遺伝子が導入された芽の選抜を、多芽体を形成させる条件の培地で選抜培養することにより行うことを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の木本植物への遺伝子導入法（請求項９）や、木本植物が、バラ科果樹であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の木本植物への遺伝子導入法（請求項１０）や、バラ科果樹が、セイヨウナシ、ニホンナシ、リンゴ又はオウトウであることを特徴とする請求項１０記載の木本植物への遺伝子導入法（請求項１１）からなる。
【００１４】
また本発明は、請求項１〜１１のいずれか記載の遺伝子導入法により遺伝子が導入された外植体に、発根処理を行うことを特徴とする遺伝子導入木本植物の作出法（請求項１２）や、請求項１２記載の遺伝子導入木本植物の作出法により作出されたことを特徴とする遺伝子導入木本植物（請求項１３）からなる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、腋芽の直近に遺伝子導入のための切り口を設けた培養シュートの茎からなる外植体を用いて遺伝子の導入を行う処理、及び該処理を行った培養用シュートを培養して多芽体を形成させ遺伝子が導入された芽を選抜する処理を行うことにより、木本植物への遺伝子の導入を行うことよりなる。本発明の実施の形態の一つを概念的に示すと、図１のようになる。以下に、本発明の遺伝子導入方法及び該方法を用いた木本植物の形質転換体の作出方法について、詳述する。
【００１６】
（本発明の方法を適用する木本植物）
本発明の方法が適用できる植物としては、落葉果樹のような木本植物の広い範囲の種類及び品種の植物を挙げることができるが、特に、バラ科果樹のような、従来遺伝子の導入に際して、葉片等の組織からの再分化の難しかった木本植物に対して特に有利に適用することができる。バラ科果樹の例としては、セイヨウナシ、ニホンナシ、リンゴ及びオウトウ等を挙げることができる。
【００１７】
（外植体の調製）
外植体の調製には、まず、遺伝子を導入する木本植物（品種）の腋芽を含んだ茎を切り出す。切り出しには、ＭＳ液体培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ  １９６２）を含むろ紙の上で行うのが好ましい。この培養シュートの腋芽を含む茎を外植体として用いるが、通常は、長さ２〜３ｍｍの程度に切り出すのが望ましい。この外植体を用いて、アグロバクテリウムによる感染処理を行うことにより、茎の切り口からアグロバクテリウムが吸収され、腋芽生長点部位の細胞に外来遺伝子を導入することができる。この場合、腋芽生長点が、切り口の直近に位置するように、切り口を設けることが重要である。望ましくは、切り口から０．５ｍｍ以内に腋芽生長点があるのが望ましい。切り口は通常、腋芽生長点の直近部で茎部を切断して形成されるが、腋芽生長点の直近部に茎部の切り口を設けることにより形成しても良い。さらに、選抜培養中に、多芽体を形成させる条件の培地で培養することにより、腋芽生長点が多芽体状になるため、そこから遺伝子が組換えられた芽を切り出して培養することにより、キメラ性を回避した遺伝子組換え体を作出することができる。切り出した外植体は、共存培養培地（例えば、ＮＮ培地，ＴＤＺ  ５ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ  ０．２ｍｇ／Ｌ、３．０％  シュークロース、０．４％  ゲルライト、ｐＨ５．２）上に置床して、次の処理に備えるのが望ましい。
【００１８】
（外植体への遺伝子の導入）
上記培養用シュートからなる外植体に、アグロバクテリウム法を用いて目的とする遺伝子を導入する。遺伝子の導入には、予め、導入を目的とする遺伝子や選択マーカーを導入して構築したベクターを導入したアグロバクテリウムを作製しておく。用いる菌液は、通常２４時間程度培養し、感染液として調製しておく。遺伝子の導入処理は、前記のようにして形成した外植体を上記アグロバクテリウム感染液に浸漬（感染処理）することにより、行うことができる。感染液での浸漬（感染処理）は、短時間の浸漬処理で行うことができ、通常１０分間程度の浸漬処理で行うことができる。感染処理後は、ろ紙を敷いた共存培養培地等の適宜の培地に、外植体の基部を下にして置床する。この外植体を、暗黒条件下、常温（例えば、２５℃）で、約５日間程度共存培養を行う。
【００１９】
（遺伝子導入外植体の選抜）
遺伝子が導入された植物個体（外植体）の選抜は、次のようにして行うことができる。すなわち、遺伝子の導入処理を行った外植体を、例えば抗生物質耐性遺伝子を組み込んだ外植体では、該抗生物質を添加した選抜培地を用いて、通常約２ヶ月間程度選抜培養を行い、遺伝子導入外植体の選抜を行う。例えば、カナマイシン耐性遺伝子等を組み込んだ導入遺伝子を用いた場合は、カナマイシン  ５ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン  ３７５ｍｇ／Ｌを含む選抜培地（ＮＮ培地，ＴＤＺ５ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ  ０．２ｍｇ／Ｌ、３．０％  シュークロース、０．８％寒天、ｐＨ５．８）で２ヶ月間選抜培養を行う．このような選抜培養を行うと、腋芽は、多芽体状のシュート（シュートの腋芽などの部分が、次から次へと苗条原基に発達し、形成されるもので、シュートが塊状になっているもの）となり，遺伝子が導入されていない部分は、白く枯死する。生き残った緑色シュート（遺伝子組換え体）を、例えば、カナマイシン  ５０ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン  ５００ｍｇ／ｌを含むＭＳ培地（ＢＡ  ２．０ｍｇ／Ｌ、３．０％  シュークロース、０．８％  寒天、ｐＨ５．８）のような培養培地に移植することにより、遺伝子導入植物（外植体）の選抜を行う。
【００２０】
（遺伝子導入木本植物の作出）
上記のようにして遺伝子を導入した外植体を，発根処理し、目的とする遺伝子の導入された木本植物の作出を行う。本発明の遺伝子を導入した外植体は、公知の発根培地を用いて培養することにより、植物体を作出することができる。したがって、本発明の方法は、カンキツについて用いられていた類似の従来の技術のように、遺伝子を導入したシュート頂部の接木を行う必要がなく、また、接木に適合する台木の用意を行う必要もないので、広い範囲の植物に対して、適用することが可能である。発根処理は、公知の発根培地を用いて培養することにより、行うことができるが、例えば、培養用シュートを発根培地（１／２Ｎ  ＭＳ＋１ｍｇ／ｌ  ＩＢＡ、ｐＨ５．８、寒天  ０．７５％）に挿し、常温（２５℃）、暗黒条件下で、約２週間培養することにより、行うことができる。発根した植物体は鉢等の土に移植することができる。
【００２１】
（本発明の方法の特徴）
（１）本発明の遺伝子導入方法は、器官からの個体再分化が困難な植物や効率が低い木本植物などにも適用することが可能で、広い範囲の木本植物や、その品種に対して適用することができる。
従来の遺伝子導入法は、葉片などの植物栄養器官からの個体再分化を利用して行われていた。しかし、殆どの木本植物においては、葉片からの再分化効率が低いため、遺伝子組換えにおいて大きいネックとなっている。本発明の方法は、アグロバクテリウムにより感染された腋芽が直接遺伝子組換えシュートになるため、再分化効率の問題を回避することができる。したがって、広い範囲の木本植物や、その品種に対して適用することができる。また、再分化を介さないので、葉片を外植体とした場合より、培養変異が生じる可能性も低い。この遺伝子導入系は，葉片からの遺伝子導入が困難なバラ科果樹のような樹種（たとえば、セイヨウナシ、ニホンナシ、リンゴ、オウトウなど）への応用も可能である。
【００２２】
（２）短期間かつ高効率で遺伝子導入することが可能である。
本発明では、外植体の腋芽生長点が、切り口の直近（望ましくは、切り口から０．５ｍｍ以内）に位置するように、切り口を設けるので、腋芽生長点への感染を高効率で行うことができる。更に、本発明の方法は、個体再分化を経由しないので，短期間で組換えシュートが得られる（通常、約２ヶ月）。本発明の組換え効率は，葉片を用いた組換え効率の平均１％以下に対して、腋芽を用いた場合は４〜５％であるというように、高効率で遺伝子を導入することが可能である。
【００２３】
（３）キメラ性を回避することができる。
外植体の腋芽生長点の直近の茎の切り口から吸収されたアグロバクテリウムが、腋芽に感染することにより、生長点単独に感染させるよりも、アグロバクテリウムによるダメージが少ないと考えられる。また、選抜培養中に、多芽体状のシュートとなっているため、得られた組換え体では、遺伝子が導入されていない細胞が混入したもの（キメラ体）になる可能性が非常に低い。
【００２４】
（４）広い範囲の木本植物及びその品種についての適用が可能であるため、有用な親の形質を保持しつつ、形質転換植物の作出を行うことが可能となる。
従来の方法では、実生の植物について遺伝子の導入が行われたり、個体再分化可能な品種のみに遺伝子の導入が可能であったりして、有用な形質転換植物の作出には、制約があった。本発明の方法は、広い範囲の木本植物及びその品種についての適用が可能であるため、有用な形質を有する木本植物及びその品種について、有用な親の形質を保持しつつ、目的とする遺伝子を導入することが可能であり、有用な形質を有する形質転換植物の作出を行うことが可能となる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例．
セイヨウナシの主要品種（ラ・フランスなど）は、葉片からの再分化率が低く、それに伴い葉片を外植体とした形質転換体も非常に低くなってしまう。そこで、再分化率に左右されない形質転換体の作製を行うために、腋芽を含む茎からなる培養用シュートを外植体として用いて、遺伝子の導入を行い、遺伝子が導入された個体を選抜し、発根させて、形質転換体を作出した。
【００２６】
［方法］
（外植体の作出）
１．セイヨウナシの主要品種（ラ・フランス）の腋芽を含んだ茎を、ＭＳ液体培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ  １９６２）を含むろ紙の上で切り出した。切り口からアグロバクテリウムが吸引されて感染するので、腋芽の直近（できるだけ切り口に近い部分に生長点がくるように）切り出した。切り出した茎の長さは、２〜３ｍｍ程度、腋芽は、切り口から０．５ｍｍ以内の範囲に存在した（図２）。
２．切り出した外植体（培養材料）を共存培養培地（ＮＮ培地、ＴＤＺ  ５ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ  ０．２ｍｇ／Ｌ、３．０％  シュークロース、０．４％  ゲルライト、ｐＨ５．２）状に置床した。
【００２７】
（アグロバクテリウムによる感染及び共存培養）
１．２４時間培養したアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（導入する遺伝子として、ＧＵＳ遺伝子（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ遺伝子）及び耐病性遺伝子のグルカナーゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子として、カナマイシン耐性遺伝子を組込んだバイナリー  ベクターを導入したＡ．ツメファシエンス）を１０倍希釈した。希釈液は、アグロバクテリウム懸濁液（１／１０×ＮＮ培地、６．３％  シュークロース、３．６％  グルコース、０．０２％  Ｐｒｕｌｏｎｉｃ  Ｆ６８、１００μＭ  アセトシリンゴン、ｐＨ５．２）を用いた。
２．あらかじめ切り出した外植体を、滅菌したコニカルビーカーに分注したアグロ菌液に１０分間浸漬した。外植体を浸漬している間、共存培養培地に滅菌したろ紙を敷いた。
３．感染後、外植体についた余分な水分を滅菌ペーパータオルで取り除き、ろ紙を敷いた共存培養培地に、基部を下にして外植体を置床した。
５．共存培養培地に置床した外植体を、暗黒条件下、２５℃で、５日間、共存培養した。
【００２８】
（遺伝子導入個体の選抜）
１．共存培養した外植体を、カナマイシン  ５ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン  ３７５ｍｇ／Ｌを含む選抜培地（ＮＮ培地、ＴＤＺ  ５ｍｇ／Ｌ、ＮＡＡ  ０．２ｍｇ／Ｌ、３．０％  シュークロース、０．８％  ファイトアガー、ｐＨ５．８）で２ヶ月間選抜培養を行った。この間、腋芽は、図のような多芽体状のシュートとなり、エスケープの部分は、白く枯死した。
２．生き残った緑色シュートをカナマイシン  ５０ｍｇ／Ｌ、及びカルベニシリン（或いはリラシリン）５００ｍｇ／Ｌを含むＭＳ培地（ＢＡ  ２．０ｍｇ／Ｌ、３．０％  シュークロース、０．８％  ファイトアガー、ｐＨ５．８）に移入した。
【００２９】
（培養シュートの馴化（発根）処理）
１．５ｃｍ位高さになった培養シュート（外植体）を発根培地（１／２Ｎ  ＭＳ＋１ｍｇ／ＩＢＡ、ｐＨ５．８、寒天０．７５％）に挿し、２５℃、暗黒条件下で２週間培養した。
２．２５℃、１６時間日長条件下に移し、続いて培養した。１〜２ヶ月経って、シュートの基部から多くの根が発生し、根が２、３ｃｍほどになったところで、オートクレーブしたバーミキュライトとバーライト（１：１に混和）を入れたイチゴパックに植え換え、更に、オートクレーブした１０００倍希釈のハイポネックスで灌水し、施蓋した。
３．パックの下から新しく伸びた根が見えた時点で、蓋に穴をあけ、徐々に穴を大きくし、同時にバーミキュライトを乾かさないように灌水を行った。
４．パックの蓋をほぼ完全に開けた状態になったら、根を折れないように小植物体を出し、土の鉢に移植した。
【００３０】
（結果）
本発明の実施例により、ＧＵＳ遺伝子あるいは耐病性遺伝子のグルカナーゼ遺伝子を導入した組換え“ラ・フランス”十数個体を獲得した。遺伝子導入効率は４〜５％であった。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の方法は、個体再分化を経由しないので、バラ科果樹のような個体再分化の難しい植物についても適用することができ、広い範囲の木本植物についての遺伝子の導入及び形質転換植物の作出が可能となる。また、本発明の方法は個体再分化を経由しないので、短期間で組換えシュートが得られ、更に、葉片を用いた場合等に比較して高効率で遺伝子を導入することが可能となる。また、本発明の方法は、遺伝子導入後の選抜培養中に、多芽体状のシュートを形成するために、得られた組換体が、遺伝子が導入されていない細胞が混入してキメラとなる可能性が低い。更に、本発明の方法は形質の変化する実生苗のようなものを新たに作成する必要が無い。また、広い範囲の木本植物についての遺伝子の導入及び形質転換植物の作出が可能となるため、従来の方法にあった制約を解除して、有用な品種にそのまま適用することができるので、有用な品種の有用な形質をそのまま保持させ、目的とする遺伝子を導入した形質転換体の作出を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の木本植物への遺伝子の導入方法、及び該方法を用いた遺伝子の導入木本植物の作出方法を概念的に示す図である。
【図２】本発明の実施例で作製した腋芽を含んだ茎からなる外植体の形状を示す図である。
【図３】本発明の実施例において、選抜培養の結果得られた多芽体を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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