(57)【要約】【課題】ダンマレンジオールＩＩシンターゼをコードするＤＮＡをクローニングし、ダンマレンジオールＩＩシンターゼを製造すること、およびダンマレンジオールＩＩから生合成される各種テルペノイドを製造すること。【解決手段】各種オキシドスクアレン閉環酵素間でよく保存されている配列をもとに、ニンジン毛状根より調製したｍＲＮＡから１種のオキシドスクアレン閉環酵素ｃＤＮＡをクローニングした。更に、得られたｃＤＮＡを酵母発現系で発現させた。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２に記載の配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列からなり、且つダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１の３３〜２３４２番目のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列からなり、且つダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むべクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のべクターで形質転換された細胞。
【請求項１２】
目的のポリペプチドの発現を促進する条件下で請求項１１に記載の細胞を培養することを含む、ダンマレンジオールＩＩシンターゼの製造方法。
【請求項１３】
目的のポリペプチドの発現を促進する条件下で請求項１１に記載の細胞を培養することを含む、ダンマレンジオールＩＩおよび／またはその誘導体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドを、無細胞系で２，３−オキシドスクアレンと反応させることを含む、ダンマレンジオールＩＩおよび／またはその誘導体の製造方法。
【請求項１５】
該誘導体がダンマレンジオールＩＩから生合成されるテルペノイドである請求項１３または１４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ダンマレンジオールＩＩの生合成酵素であるダンマレンジオールＩＩシンターゼおよび該酵素をコードするポリヌクレオチドに関する。また、本発明は、ダンマレンジオールＩＩシンターゼの製造方法、並びにダンマレンジオールＩＩおよび／またはこのダンマレンジオールＩＩから生合成される各種テルペノイドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ニンジン（原植物、オタネニンジン、Ｐａｎａｘ　ｇｉｎｓｅｎｇ）は、漢方処方において重要な生薬である。ニンジンの有効成分であるジンセノサイド（トリテルペンサポニン）には、オレアナン骨格をもつものもあるが、大部分はダンマレン骨格をもっている。ダンマレン骨格をもつプロトパナキサジオールまたはプロトパナキサトリオールをアグリコンとするジンセノサイドは、中枢抑制・賦活、抗疲労、抗ストレス、代謝活性、抗腫瘍活性等、極めて多様な作用を有することが多くの研究者によって報告されており（柴田承二、漢方の臨床、４８，　１４８１−１５０２，　２００１など）、極めて魅力的な化合物である。
【０００３】
ジンセノサイドは、メバロン酸経路により生成した２，３−オキシドスクアレンの閉環産物が、水酸化反応、配糖化反応を受けて生合成される（図１）。ニンジンの品質改良やジンセノサイドの他宿主での大量生産を行う上で、生合成遺伝子のクローニングは最初の課題である。しかしながら、これまでニンジンから単離されたジンセノサイド生合成遺伝子はβ−アミリンシンターゼ（Ｋｕｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２５６，　２３８−２４４，　１９９８）のみであり、ダンマレン骨格をもったジンセノサイドへ至るダンマレンジオールＩＩの生成を触媒するダンマレンジオールＩＩシンターゼ遺伝子のクローニングは、ニンジン由来のものを含めて全くなされていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ダンマレンジオールＩＩシンターゼをコードするＤＮＡをクローニングし、その塩基配列を決定し、更にクローニングした組換えＤＮＡを発現させた細胞を用いてダンマレンジオールＩＩシンターゼを製造すること、並びにダンマレンジオールＩＩおよび／またはダンマレンジオールＩＩから生合成される各種テルペノイドを製造することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、各種オキシドスクアレン閉環酵素間でよく保存されている配列をもとに縮重入りのＰＣＲプライマーをデザインし、ニンジン毛状根より調製したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により１種のオキシドスクアレン閉環酵素ｃＤＮＡをクローニングした。更に、得られたｃＤＮＡの全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を酵母発現ベクターに組込み、ラノステロールシンターゼを欠いた酵母に形質転換して機能解析を行った。その結果、該酵母において本来生合成されないダンマレンジオールＩＩの生産が認められたことから、得られたｃＤＮＡがダンマレンジオールＩＩシンターゼをコードしていることを確認した。本発明はこの知見に基づき完成したものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチドおよび／または配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供するものである。
また、本発明は、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および／または配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
更に、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
加えて、本発明は、上記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
更に加えて、本発明は、上記形質転換細胞を用いて、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ、並びにダンマレンジオールＩＩおよびその誘導体を製造する方法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、各種オキシドスクアレン閉環酵素間でよく保存されている配列をもとに縮重入りのＰＣＲプライマー（配列番号５〜７、配列中にそれぞれイノシンを含む）をデザインし、オタネニンジン毛状根より調製したｍＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ法により１種のオキシドスクアレン閉環酵素ｃＤＮＡをクローニングした。得られたｃＤＮＡの全長ＯＲＦ（配列番号１の３３〜２３４２番目）を酵母発現ベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込み、ラノステロールシンターゼを欠いた酵母ＧＩＬ７７（Ｋｕｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２５６，２３８−２４４，　１９９８）に形質転換して機能解析を行った。その結果、該酵母において本来生合成されないダンマレンジオールＩＩの産生が認められたことから、得られたｃＤＮＡがダンマレンジオールＩＩシンターゼをコードしていることが確認された。新規に得られたダンマレンジオールＩＩシンターゼはオタネニンジンのβ−アミリンシンターゼと５７％の配列相同性があった。また、既知のオキシドスクアレン閉環酵素配列中に繰り返し認められるＱＷモチーフ（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．１９，　１５７−１５８，　１９９４）は配列番号１の１１１〜１１７番目、１６１〜１６７番目、４６９〜４７５番目、６０６〜６１２番目および６８２〜６８８番目に、オキシドスクアレン閉環酵素の活性部位であることが指摘されているＤＣＴＡＥモチーフ（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９，　８０２−８０４，　１９９４）は配列番号１の４８８〜４９２番目に存在した。
【０００８】
したがって、本発明は、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチド（例えば配列番号２に記載のもの）およびそれをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号１の３３〜２３４２番目に示されるもの）に関する。
本発明において「ダンマレンジオールＩＩシンターゼ」とは、２，３−オキシドスクアレンからダンマレンジオールＩＩを生成する反応を触媒する酵素を意味する。そのような酵素の例として、たとえば以下の実施例に記載するようなオタネニンジンに由来するものの他、トチバニンジン（Ｐａｎａｘ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ　ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ）、人参三七（Ｐａｎａｘ　ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ）などに由来するものを挙げることができる。また、ダンマレンジオールＩＩは、カバノキ科シラカンバ（Ｂｅｔｕｌａ　ｐｌａｔｙｐｈｙｌｌａ）、モクセイ科オリーブ（Ｏｌｅａ　ｅｕｒｏｐａｅａ）などに含有されることも明らかになっており、ダンマレンジオールＩＩシンターゼの起源は上記植物に限定されるものではない。
ダンマレンジオールＩＩシンターゼの活性は、ダンマレンジオールＩＩの産生を確認することにより検出することができる。ダンマレンジオールＩＩの産生は、生成物をＮＭＲで測定し、文献値（１Ｈ−ＮＭＲ：　Ｂ．Ｌ．　Ｐｏｅｈｌａｎｄ　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　５０（４），　７０６−７１３，　１９８７，　１３Ｃ−ＮＭＲ：　Ｊ．　Ａｓａｋａｗａ　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．　３３，　１９３５−１９３９，　１９７７）と比較することにより確認することができる。あるいは、ＬＣＭＳによる保持時間と開裂様式を標品と比較することにより確認することもできる。また、放射標識２，３−オキシドスクアレンを基質とした無細胞系の反応生成物を液体クロマトグラフィーで精製、分取し、非標識ダンマレンジオールＩＩと混合後、再結晶を繰り返し、放射比活性が一定になることで確認できる（Ｔ．　Ｋｕｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．，　２９２−２９４，　１９９７）。
【０００９】
配列番号２に記載の配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。ここで、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により欠失、置換および／または付加できる程度の数のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されることを意味する。
【００１０】
さらに、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。ポリヌクレオチドにはＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。
【００１１】
また、配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｖｏｌ．　１、ｐｐ．１．１０１−１０４、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、１９８９に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。よりストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さなどの要因にしたがって、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
【００１２】
別の態様において、本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列からなり、且つダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含む。
同様に、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列からなり、且つダンマレンジオールＩＩシンターゼ活性を有するポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、国立遺伝研究所がウェブ上（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）で公開しているプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷにおいて算出することが可能である。また、ＤＮＡＳＩＳ　ｖｅｒ．３．７（日立ソフトウエアエンジニアリング（株）製）など、他の配列比較のプログラムも使用可能である。
【００１３】
また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。このようなベクターは、上記ポリヌクレオチドを常法にしたがい、適当な発現ベクターに組み込むことにより作製することができる。発現ベクターの例としては、バキュロウイルス（例えば、ｐＢＫ２８３、ｐＢＫｂｌｕｅなど）、酵母プラスミド（例えばｐＹＥＳ２、ｐＡＵＲ２２４、ｐＥＳＰ−１など）、ピキアプラスミド（例えば、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９など）、大腸菌プラスミド（例えば、ｐＥＴ３ａ−ｄ、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ−Ｅなど）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
さらに、本発明は、目的のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現するように上記ベクターで形質転換した細胞に関する。宿主細胞の例としては、カイコ、酵母、ピキア、大腸菌等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。形質転換の方法としては、特に限定はされないが、エレクトロポレーション、塩化カルシウム法、ポリエチレングリコール法、酢酸リチウム法などを用いることができる。
【００１５】
さらに、本発明は、目的のポリペプチドの発現を促進する条件下で上記細胞を培養することを含む、ダンマレンジオールＩＩシンターゼの製造方法に関する。例えば、酵母発現系を用いて製造する場合、培養条件、ガラクトースによる発現誘導、生成物の分離は文献に記載されている方法（Ｋｕｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５６，　２３８−２４４，　１９９８）と同様に行うことができる。
【００１６】
さらに、本発明は、目的のポリペプチドの発現を促進する条件下で上記細胞を培養することを含む、ダンマレンジオールＩＩおよび／またはその誘導体の製造方法に関するものである。誘導体とは、ダンマレンジオールＩＩから生合成されるテルペノイドを意味する。例えば、生成したダンマレンジオールＩＩが、酵母に内在する酸化酵素あるいは別途に酵母へ導入した酸化酵素等により酸化されたもの、および、酵母に内在する配糖化酵素あるいは別途に酵母へ導入した配糖化酵素等により配糖化されたものをいう。宿主細胞として、ラノステロール合成酵素が欠損している酵母、例えば、Ｋｕｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２５６，　２３８−２４４，　１９９８に記載されているＧＩＬ７７株などを用いることが好ましい。通常の酵母、例えば、Ｔ．　Ｈｕｓｓｅｌｓｔｅｉｎ−Ｍｕｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　４５，　７５−９２，　２００１に記載されているＷＡ６株などを用いる場合は、外部からスクアレン、オキシドスアレン等の前駆体を投与することで生産性を向上させることができる。例えば、酵母発現系を用いて製造する場合、培養条件、ガラクトースによる発現誘導、生成物の分離は文献に記載されている方法（Ｋｕｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５６，　２３８−２４４，　１９９８）と同様に行うことができる。
本発明のダンマレンジオールＩＩシンターゼを無細胞系で２，３−オキシドスクアレンと反応させることにより、ダンマレンジオールＩＩおよび／またはその誘導体を製造することも可能である。この場合、反応条件はＴ．　Ｋｕｓｈｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．，　２９２−２９４，　１９９７に記載されている方法を用いることができる。
【００１７】
本発明の細胞および製造方法を用いることにより、ダンマレンジオールＩＩおよびこのダンマレンジオールＩＩから生合成される各種テルペノイドを大量生産することが可能である。また、配列番号８〜１７に記載のプライマーは、ダンマレンジオールＩＩシンターゼのクローニングに有用である。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】ｃＤＮＡクローニング
（１）オタネニンジン毛状根培養からのｃＤＮＡの調製
植え継ぎ後２８日目のオタネニンジン毛状根培養（Ｋｕｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２５６，　２３８−２４４，　１９９８）から、フェノール／クロロフォルム法により全ＲＮＡを抽出した。これを鋳型として、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）と、配列番号３に示すプライマーを用いてｃＤＮＡを調製した。
【００１９】
（２）ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ法による、ダンマレンジオールＩＩシンターゼｃＤＮＡ断片のクローニング
各種オキシドスクアレン閉環酵素間でよく保存されているアミノ酸残基を基に配列番号５〜７に示す縮重入りプライマー（以下、「共通プライマー」と称する）をデザインした。
上記（１）で得られたｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号５および６に示す共通プライマーを用いて、９４℃で１分間の変性、４２℃で２分間のアニール、７２℃で３分間の伸長反応を１サイクルとして、ＰＣＲを３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動で精製後、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、１７クローンについて塩基配列を決定した。その結果、１５クローンは既にオタネニンジンからクローニングされている３つのオキシドスクアレン閉環酵素（Ｋｕｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２５６，　２３８−２４４，　１９９８）と同一であった。残り２クローンは同一のクローンであり既知の配列とは異なる配列を持っていた。以後、このクローンの全長クローンを「ＰＮＡ」と呼ぶ。
【００２０】
（３）ＰＮＡ断片のクローニング
上記（１）で得られたｃＤＮＡを鋳型として、配列番号７の共通プライマーと、上記（２）で得られた配列を基にアンチセンス方向にデザインした配列番号８のプライマーを用いて、アニール温度を５２℃に変えた以外は上記と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動で精製したのち、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。得られた配列は、上記ｃＤＮＡ断片の配列を内部に一部持ち、且つその配列が５’側に配列番号７の共通プライマーまで伸長した配列であることが分かった。得られた配列を基にアンチセンス方向にプライマー（配列番号９、１０および１１）をデザインした。
【００２１】
同様に、上記（１）で得られたｃＤＮＡを鋳型として、上記（２）で得られたｃＤＮＡ断片の配列を基にセンス方向にデザインした配列番号１２と配列番号３に示すプライマーを用いて、アニール温度を６０℃に変えた以外は上記と同様の条件でＰＣＲを行った。反応液中からプライマーを除去したのち、ｃＤＮＡ断片の配列を基にセンス方向にデザインした配列番号１３と配列番号３に示すプライマーを用いて、アニール温度を６０℃に変えた以外は上記と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定したところ、上記（２）で得られたｃＤＮＡ断片の配列を内部に一部持ち、且つ３’側に、ｐｏｌｙ（Ａ）　ｔａｉｌまで伸長した配列であることが分かった。
【００２２】
最後に、得られた配列を５’末端まで伸長する操作を以下のようにして行なった。初めに、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ製）と、配列番号９のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ産物の３’末端に、ｄＡＴＰとターミナルデオキシヌクレオチヂルトランスフェラーゼ（東洋紡社製）を用いて、Ｐｏｌｙ（Ａ）鎖を付加した。得られたＤＮＡを鋳型として、配列番号３および１０に示すプライマーを加え、アニール温度を５２℃に変えた以外は上記と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動で精製したのち、それを鋳型として配列番号４および１１に示すプライマーを加え、アニール温度を５４℃に変えた以外は上記と同様の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定したところ、これまでに得た配列が５’側に、開始コドンを越え、非翻訳領域まで伸長した配列であることが分かった。本クローン（ＰＮＡ）は２３１０塩基からなるＯＲＦを含む２５３５塩基からなり、分子量８８．３ｋＤ、７６９アミノ酸からなる翻訳産物ポリペプチドが想定された。ｃＤＮＡ配列中には、既知のオキシドスクアレン閉環酵素配列中に繰り返し認められるＱＷモチーフ（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．１９，　１５７−１５８，　１９９４）やオキシドスクアレン閉環酵素の活性部位であることが指摘されているＤＣＴＡＥモチーフ（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６９，　８０２−８０４，　１９９４）が存在した。
【００２３】
（４）ＰＮＡのクローニング
上記（３）で得られた配列の、全長クローンであるＰＮＡを得るため、上記（１）で調製したｃＤＮＡを鋳型として、非翻訳領域に対してデザインした配列番号１４および１５に示すプライマーを用いて、アニール温度を５８℃に変えた以外は上記と同様の条件でＰＣＲを行った。反応液中からプライマーを除去したのち、新たに配列番号１６および１７に示す、ポリペプチドのＮ末端とＣ末端に相当する箇所のプライマーを加え、アニール温度を６０℃に変えた以外は上記と同様の条件でＰＣＲを行い、ＰＮＡを得た。
【００２４】
【実施例２】ＰＮＡの機能同定
実施例１で得られたＰＮＡを制限酵素ＫｐｎＩとＸｈｏＩで処理し、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２のＫｐｎＩとＸｈｏＩサイトに組み込み、これをｐＹＥＳ２−ＰＮＡとした。これにより、ＰＮＡはＧＡＬ１プロモーターの下流にセンス方向に導入される。ｐＹＥＳ２−ＰＮＡを、ラノステロール合成酵素欠損株である酵母変異株ＧＩＬ７７に酢酸リチウム法により導入した。培養条件、ガラクトースによる発現誘導、生成物の分離方法はＫｕｓｈｉｒｏ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２５６，　２３８−２４４，　１９９８に記載されている方法と同様に行なった。ただし、培養スケールは６Ｌ、ガラクトースによる誘導時間は１日間とした。ガラクトースによる発現誘導後、形質転換酵母から生成物を抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ベンゼン−アセトン）で精製して生成物を得た。
【００２５】
得られた生成物についてＮＭＲスペクトル（１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲ：ＪＥＯＬ　Ａ−５００）を測定した。溶媒にはＣＤＣｌ３を用いた。結果を以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ：
（　０．７７　（３Ｈ，　ｓ　Ｃ−２９），　０．８４　（３Ｈ，　ｓ，　Ｃ−１８），　０．８７　（３Ｈ，　ｓ，　Ｃ３０），　０．９６＊　（３Ｈ，　ｓ，　Ｃ−１９），　０．９７＊　（３Ｈ，　ｓ，　Ｃ−２８），　１．１４　（３Ｈ，　ｓ，　Ｃ−２１），　１．６２　（３Ｈ，　ｓ，　Ｃ−２６），　１．６９　（３Ｈ，　ｓ，　Ｃ−２７），　３．２０　（１Ｈ，　ｄｄ，　Ｊ　＝　５．０，　１０．５　Ｈｚ，　Ｃ−３），　５．１２　（１Ｈ，　ｔ，　Ｊ　＝７．０　Ｈｚ，　Ｃ−２４）．
＊：文献値ではＣ−１９とＣ−２８のメチル基はともに０．９７ｐｐｍであるが、高分解能ＮＭＲでの測定により、二次元ＮＭＲの相関から分離して帰属した。
１３Ｃ−ＮＭＲ：
（　１５．３３（Ｃ−２９），　１５．４７　（Ｃ１９），　１６．２０　（Ｃ−１８），　１６．４３　（Ｃ−３０），　１７．７０　（Ｃ−２７），　１８．２６　（Ｃ−６），　２１．５１　（Ｃ−１１），　２２．５３　（Ｃ−２３），　２４．８０＊　（Ｃ−１２），　２５．３８＊　（Ｃ−２１），　２５．７４　（Ｃ−２６），　２７．４０　（Ｃ−２），　２７．５２　（Ｃ−１６），　２７．９８　（Ｃ−２８），　３１．１６　（Ｃ−１５），　３５．２０　（Ｃ−７），　３７．１　（Ｃ−１０），　３８．９６　（Ｃ−４），　３９．０１　（Ｃ−１），　４０．３４　（Ｃ−８），　４０．４５　（Ｃ−２２），４２．２６　（Ｃ−１３），　４９．８２　（Ｃ−１７），　５０．２８　（Ｃ−１４），　５０．６０　（Ｃ−９），　５５．８２　（Ｃ−５），　７５．４２　（Ｃ−２０），　７８．９６　（Ｃ−３），　１２４．６８４　（Ｃ−２４），　１３１．６１　（Ｃ−２５）．
＊：Ｃ−１２とＣ−２１の帰属を二次元ＮＭＲの相関から分離した。
得られたスペクトルは、ダンマラレジン及びオタネニンジンから単離されたダンマレンジオールＩＩの文献値（１Ｈ−ＮＭＲ：　Ｂ．Ｌ．　Ｐｏｅｈｌａｎｄ　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　５０（４），　７０６−７１３，　１９８７，　１３Ｃ−ＮＭＲ：　Ｊ．　Ａｓａｋａｗａ　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．　３３，　１９３５−１９３９，　１９７７）と一致した。
【００２６】
また、ＪＥＯＬ　ＪＭＳ−ＳＸ１０２Ａを用いて、マススペクトル（ＥＩ−ＭＳ）を測定した。結果を以下に示す。
ＥＩ−ＭＳ：
ｍ／ｚ　４２６　［Ｍ＋−Ｈ２Ｏ］　（１５％），　４１１［Ｍ＋−Ｈ２Ｏ−ＣＨ３］　（５％），　３６８　（１２％），　２５７　（１０％），　２０７　（３８％），　１３５　（５０％），　１０９　（９６％），　６９　（１００％），　５５（９３％）．
得られたスペクトルは標品のダンマレンジオールＩＩ（ダンマラレジンから分離精製したもの）のスペクトルと一致した。
以上の結果から、生成物はオタネニンジンのダンマレンジオールＩＩと同定した。
したがって、ＰＮＡは、高等植物から得られたオキシドスクアレン閉環酵素の１つに位置付けられるダンマレンジオールＩＩシンターゼをコードしているものと結論づけた。
【００２７】
【発明の効果】
以上記載のごとく、ダンマレンジオールＩＩシンターゼをコードするｃＤＮＡのクローニングに初めて成功し、更にクローニングした組換えＤＮＡを発現させた細胞を用いて、ダンマレンジオールＩＩシンターゼ、該酵素をコードするポリヌクレオチド、並びにダンマレンジオールＩＩおよび／またはこのダンマレンジオールＩＩから生合成される各種テルペノイドを製造することが可能となる。
【００２８】
【配列表】
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2004057154.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
【図１】ジンセノサイドの生合成経路を示す図である。
【図１】
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