(57)【要約】【課題】プロテインＡとの親和性の向上した、マウスＩｇＧのＦｃ領域を含むポリペプチド変異体を提供すること。【解決手段】本発明のタンパク質の変異体は、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質であって、天然のＩｇＧのＦｃ領域の１又はそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質と比較してプロテインＡに対して親和性が向上していることを特徴とする。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質であって、天然のＩｇＧのＦｃ領域の１又はそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質と比較してプロテインＡに対して親和性が向上していることを特徴とする、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体。
【請求項２】
ＩｇＧのＦｃ領域がマウス由来のＩｇＧ１である、請求項１に記載のタンパク質の変異体。
【請求項３】
マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の第１５残基から第２２残基、第７５残基から第８３残基、又は第１９５残基から第２０４残基に相当する領域において１又はそれ以上アミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項２に記載のタンパク質の変異体。
【請求項４】
マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項３に記載のタンパク質の変異体。
【請求項５】
マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンで置換されている、請求項３に記載のタンパク質の変異体。
【請求項６】
マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の２１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項３に記載のタンパク質の変異体。
【請求項７】
マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の２１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンで置換されている、請求項３に記載のタンパク質の変異体。
【請求項８】
マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基、及び２１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項３に記載のタンパク質の変異体。
【請求項９】
マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンで置換され、２１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンで置換されている、請求項３に記載のタンパク質の変異体。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のタンパク質の変異体をコードする遺伝子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１３】
請求項１０に記載の遺伝子、又は請求項１１に記載の組換えベクターを保持する形質転換体を培養し、該形質転換体又はその培養上清から、発現させたタンパク質の変異体を回収する工程を含む、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のタンパク質の変異体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテインＡに対して親和性の向上した、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生化学や生物医工学の分野において、モノクローナル抗体の作成及び応用は一般的で有用な方法として普及している。
また、例えば生理活性ペプチドを大量に得るために、目的とするペプチドをコードするＤＮＡ（遺伝子）をＤＮＡ組換え技術を用いて発現させる試みが多く行われている。しかし、ペプチドが発現細胞内のプロテアーゼの作用によって分解を受けやすく、目的とするペプチドが得られないこともあり、そのため、融合タンパク質の形で発現させることがしばしば行われている。
【０００３】
研究対象となるタンパク質を簡単に効率よく入手することは、分子生物学、生化学をはじめ、薬学及び医学等の分野において非常に重要なことであるばかりでなく、生化学産業や製薬産業といった様々な産業において重要なことである。マウスＩｇＧのＦｃ領域と他の機能性タンパク質との融合タンパク質の作成も、多くの生化学的現象の解明に利用されている（例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｈｕｙｎｈ−Ｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。
【０００４】
しかし、上記抗体や融合タンパク質の精製には問題があり、最も主要な問題点として、マウスのＩｇＧ、特にＩｇＧ１のプロテインＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来：  ＩｇＧのＦｃ領域と親和性がある）に対する親和性が低いことである。ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の多くがＩｇＧ１であり、この問題を解決するため、塩濃度を増加させたり、ｐＨをアルカリ性に調整することが行われている。しかし、このような条件下ではプロテインＡと血清タンパク質等との非特異的な相互作用が問題になる。マウスＩｇＧ１とプロテインＡとの親和性が低いため、融合タンパク質作成にはヒトや他の種のＦｃ領域が用いられることが多い。しかし、生体への薬物等としての応用実験を考えた場合、免疫拒絶や炎症反応などを誘起する可能性が大きい。
従って、マウスＩｇＧ１とプロテインＡとの親和性を向上させることができれば上記問題を解決することができる。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｈｕｙｎｈ−Ｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、プロテインＡとの親和性の向上した、マウスＩｇＧのＦｃ領域を含むポリペプチド変異体、及びその製造方法等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、マウスＩｇＧ１のＦｃ領域の１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、プロテインＡに対する親和性を向上できるという知見を得た。
【０００８】
すなわち、本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質であって、天然のＩｇＧのＦｃ領域の１又はそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質と比較してプロテインＡに対して親和性が向上していることを特徴とする、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体を提供するものである。
【０００９】
ＩｇＧのＦｃ領域はマウス由来のＩｇＧ１であるものが好ましく用いられる。
本発明のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体としては、マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の第１５残基から第２２残基、第７５残基から第８３残基、又は第１９５残基から第２０４残基に相当する領域において１又はそれ以上アミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されているものが挙げられる。
また、本発明のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体としては、マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンで置換されているものが挙げられる。本明細書において、ＩｇＧ１のＦｃ領域中のアミノ酸残基の位置を示す番号は、ＣＨ２ドメインから開始するものとして定義する。
また、本発明は、上記タンパク質の変異体をコードする遺伝子を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクターを提供するものである。
また、本発明は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供するものである。
また、本発明は、上記遺伝子、又は組換えベクターを保持する形質転換体を培養し、該形質転換体又はその培養上清から、発現させたタンパク質の変異体を回収する工程を含む、上記タンパク質の変異体の製造方法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について説明する。
本発明のタンパク質の変異体は、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質であって、天然のＩｇＧのＦｃ領域の１又はそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり、天然のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質と比較してプロテインＡに対して親和性が向上していることを特徴とする。本明細書において、親和性が向上するとは、中性で生理的な塩濃度の緩衝液中におけるＩｇＧ１とプロテインＡとの親和性が向上することを意味する。
【００１２】
本発明の好ましいタンパク質の変異体は、ＩｇＧのＦｃ領域がマウス由来のＩｇＧ１であるものである。本発明の好ましいタンパク質の変異体は、配列番号１で表わされるアミノ酸配列よりなるタンパク質と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の第１５残基から第２２残基、第７５残基から第８３残基、又は第１９５残基から第２０４残基に相当する領域において、１又はそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている。
【００１３】
本発明のタンパク質の変異体の具体例としては、例えば、第１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸、好ましくはメチオニンで置換されているものが挙げられる。
また、他の具体例としては、第２１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸、好ましくはセリンで置換されているものが挙げられる。
マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、ヒトＩｇＧ１及びウサギＩｇＧの第２３１残基から第４４６残基に相当する領域のアミノ酸配列を図１に示す。なお、図１においては、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列を基準としており、図１に示すアミノ酸配列における２３４番目のアミノ酸が、本明細書におけるＦｃ領域の開始部である。図１中、四角で囲った部分はＩｇＧ分子とプロテインＡとの相互作用に関与する部分である（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３５９：  ９７５−９８５（１９７８）、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：  ２３６１−２３７０（１９８１）、Ｓａｕｅｒ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，  Ａ．Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ３：  ２６５−２７８（１９９５）、Ｂｒｏｗｎ，  Ｎ．Ｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  ９−１６（１９９８））。ＩｇＧのアミノ酸配列は動物種やサブタイプによって若干相違するが、プロテインＡとの相互作用領域付近のアミノ酸配列はよく保存されていることがわかる。本発明においては、マウスＩｇＧ１のＦｃ領域のアミノ酸配列のプロテインＡとの相互作用領域を、プロテインＡとの親和性の高いヒトＩｇＧ１のアミノ酸残基で置換した。
【００１４】
上述した、「実質的に同一」とは、タンパク質の活性が実質的に同一であることを意味し、一部のアミノ酸が欠失、置換または付加された場合、その欠失、置換または付加がなされたポリペプチドは、欠失、置換または付加がなされていないものと活性が同一であれば、実質的に同一である。一般的に、相同性の程度が、全体の９０％、好ましくは９５％であるアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、実質的に同一であると解釈される。一般には、アミノ酸配列中の一部（好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸からなるタンパク質は実質的に同一である。すなわち、本発明のタンパク質の変異体は、天然のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質と比較してプロテインＡに対して親和性が向上する限り、更に他のアミノ酸残基の一部が欠失又は置換されていてもよく、他のアミノ酸が付加されていてもよい。
本発明のタンパク質の変異体は、抗体であってもよく、ＩｇＧのＦｃ領域と、他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。
ＩｇＧのＦｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質は、当該技術分野において公知の方法によって製造することができる。
【００１５】
本発明のタンパク質の変異体をコードする遺伝子は、天然のＩｇＧのＦｃ領域をコードする遺伝子において、配列番号１で表わされるアミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号２）を、変異すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することによって構築することができる。
このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野において知られている。例えば、遺伝子に変異を導入する方法としては、例えばＫｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、変異の導入を行うことができる。
このようにして得られた変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主に形質転換する。外来性タンパク質を発現させるための多くのベクター・宿主系は当該技術分野において知られている。
【００１６】
本発明のタンパク質の変異体をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。例えば、適当なベクターに、本発明のタンパク質の変異体をコードする遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより実施される。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５又はｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、ＹＥｐ１３又はＹＣｐ５０等）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス又はバキュロウイルス等の動物ウイルス等を利用することができる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＸＹＬプロモーター、ＨＷＰプロモーター、ＣＷＰプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、ＯｐｌＥ２プロモーター等が好ましい。
【００１７】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ及びプロテインＡ）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。
【００１８】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、ＤＨ５α及びＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕及びバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びハンセヌラ・ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞及びＨＥＫ２９３細胞等が用いられる。
【００１９】
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換する方法が記載されている。Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；  Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８  新  細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及び  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
【００２０】
大腸菌等の細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００２１】
動物細胞を宿主とする場合は、動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００２２】
昆虫細胞を宿主とする場合は、昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２３】
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かを確認するための方法としては、例えばＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために用いた条件と同様の条件にて行われる。次いで、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、次いで増幅産物を１本のバンドとして検出し、形質転換されたことを確認することができる。予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出してもよい。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させた後、蛍光又は酵素反応を用いて増幅産物を確認する方法を用いることもできる。
【００２４】
本発明のタンパク質の変異体は、前記形質転換体を培養し、本発明のタンパク質の変異体を生成、蓄積し、該変態を採取することにより製造することができる。本発明のタンパク質の変異体が蓄積されるのは、培養上清のほか、培養細胞もしくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明において形質転換体を培養する方法は、特に制限はなく、宿主の培養において用いられる通常の方法でよい。
【００２５】
例えば、宿主が大腸菌や酵母等の微生物の場合、形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、又はその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鐵、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、浸透培養又は通気攪拌培養等の好気的条件の下で行う。培養温度、培養時間は、宿主が大腸菌の場合、約１５〜４３℃の温度で約１２〜４８時間行う。宿主がバチルス属菌の場合、約３０〜４０℃の温度で約１２〜１００時間行う。宿主が酵母の場合は、約２０〜３５℃の温度で約２４〜１００時間行う。また、必要に応じて通気や攪拌を加えることができる。ｐＨの調製を行う必要がある場合、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
【００２６】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して培養を行う。例えば、Ｔ７プロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＰＴＧ等を培地に添加して培養を行ってもよい。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターの場合、ＩＡＡ等を培地に添加してもよい。
【００２７】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する場合、用いられる培地としては、一般に用いられているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が挙げられる。培養は、通常、５％程度の二酸化炭素の存在下で約３７℃の温度で１〜３０日間行う。
【００２８】
培養後、タンパク質の変異体が菌体内又は細胞内に生産される場合には、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法が挙げられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標）等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。すなわち、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のタンパク質の変異体を生成することができる。
【００２９】
本発明のタンパク質の変異体存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００３０】
本発明のタンパク質の変異体を製造するためには、本発明のタンパク質の変異体を恒常的に発現するトランスジェニック動物を作製し、タンパク質の変異体を製造してもよい。本発明のタンパク質の変異体を恒常的に発現するトランスジェニック動物を作製するためには、適宜の非ヒト哺乳動物を用いることができるが、マウスを用いることが好ましい。トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製するためのマウスとしては、種々のものが利用できるが、例えばＣ５７ＢＬ／６、ＤＡ／２等が挙げられる。本発明のタンパク質の変異体をコードする遺伝子が導入された発現ベクターを、例えば、（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）Ｆ１受精卵に導入することにより、トランスジェニックマウスを作製することができる。
トランスジェニックマウスを作製することにより、トランスジェニックマウスにより作製されたモノクローナル抗体、又は融合タンパク質を製造し、この抗体又は融合タンパク質はプロテインＡによる精製や免疫沈降法など生化学実験の高効率化が期待できる。
【００３１】
本発明のＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体は、プロテインＡとの親和性が向上しているため、モノクローナル抗体やマウスＩｇＧのＦｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質を、より効果的にかつ能率的に精製することが可能となる。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。なお、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等の一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  （Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）」）に基本的に従った。
【００３３】
実施例１
ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１を発現するハイブリドーマｋｕ−ＨＤ−２Ａ  （慶応義塾大学理工学部教授  星元紀先生より譲渡）を用いた。ＴＲＩｚｏｌ試薬  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを調製し、Ｍ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により逆転写を行ってハイブリドーマのｃＤＮＡを作成した。得られたｃＤＮＡをもとに、配列番号３及び配列番号４で表わされるプライマーを用いて、Ｐｗｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲ法によりマウスＩｇＧ１  Ｆｃ領域のｃＤＮＡ  （７０８  ｂｐ）を増幅した。ＰＣＲ産物を１％アガロース電気泳動によって分離した後、プレップＡジーンＤＮＡ精製キット  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．  ２  （ＴａＫａＲａ）によってクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込み、Ｆｃ領域を含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｆｃを作成した。作成したプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、ＱＩＡＧＥＮカラム  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。シークエンスの確認には、ＬＩ−ＣＯＲ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｒａｐｉｄ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。
【００３４】
上述のようにして得られたｐＧＥＭ−Ｆｃを鋳型として、ＰＣＲにより変異を導入した。用いたプライマーは以下の通りである（図２、配列番号５〜７）。
マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンで置換された変異体（以下、Ｔ２５２Ｍという）を作成するためには、下記プライマーを用いた（配列番号５）。
2004321100.tif 000002
また、マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の２１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンで置換されている変異体（以下、Ｔ２５４Ｓという）を作成するためには、下記プライマーを用いた（配列番号６）。
2004321100.tif 000003
また、マウス由来のＩｇＧ１のＦｃ領域の１９番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンで置換され、２１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンで置換されている変異体（以下、Ｔ２５２Ｍ−Ｔ２５４Ｓという）を作成するためには、下記プライマーを用いた（配列番号７）。
2004321100.tif 000004
【００３５】
部位特異的変異は以下の通りに行った。Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲにより行い、ＰＣＲ産物をＤｐｎＩにより処理して鋳型ＤＮＡを切断した。反応液で直接形質転換し、Ｇｅｎｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（登録商標）により変異を導入した遺伝子配列を確認した。発現ベクターを作成するために、変異を導入したプラスミドからＨｉｎｄ  ＩＩＩとＮｏｔ  Ｉで切断したものに組み込み、それぞれの変異導入プラスミド（Ｔ２５２Ｍ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５２Ｍ−Ｔ２５４Ｓ）を作成した。
【００３６】
実施例２
ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ  （ＤＭＥＭ）  に１０％の牛胎児血清を添加して培養した。上述のようにして得られたプラスミドをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（登録商標）を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した培地で２日間培養し、培養後に培地を回収し、遠心により細胞及び残査を除去し、培養上清を回収した。
【００３７】
実施例３
実施例２で回収した培養上清を、ＰＢＳで５ｍｌに希釈し、０．２２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通した後、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｏｌｕｍｎを用いて精製した。洗浄には２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、溶出には０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ２．７）を用い、溶出液を１／５量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ９．０）で中和した。カラムに吸着しなかった画分、洗浄画分、溶出画分の容量を５ｍｌに合わせ、ウェスタンブロット法により含まれる融合タンパク質を検出した。ウェスタンブロット法は以下のように実施した。
【００３８】
サンプルと等量の２×Ｌａｅｍｍｌｉ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ６．８，  ４％ＳＤＳ，１．２％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，  ２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）と混合し、９５℃で５分間加熱してタンパク質を変性させた後、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。電気泳動後のゲルを、ＰＶＤＦ膜  （Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ：  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にセミドライ法により２０  Ｖの定電圧で９０分間転写した。変性されたタンパク質を転写したＰＶＤＦ膜を０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを溶解したＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−Ｂ）中に４℃で２４時間ブロッキングを行った。Ｆｃ部位を確認するためにはｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１／１０，０００希釈液を室温で１．５時間反応させた。検出にはＥＣＬ試薬  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて発光させＸ線フィルムに露光した。
【００３９】
ウェスタンブロットの結果を図３に示す。図３において、ｉｎｔａｃｔはカラムに吸着させる前のサンプル、ｔｈｒｏｕｇｈはカラムに吸着しなかった画分、ｗａｓｈは洗浄画分、ｅｌｕａｔｅは溶出画分を意味する。また、ＷＴは、変異させていない融合タンパク質である。
【００４０】
図３に示すように、変異させていない融合タンパク質は、カラムに吸着しなかった画分、及び洗浄画分に存在が確認されたが、溶出画分には全く存在が確認されなかった。すなわち、変異させていない融合タンパク質はプロテインＡとの親和性は低いものである。
Ｔ２５４Ｓにおいては、カラムに吸着しなかった画分には、融合タンパク質は存在がほとんど確認されず、洗浄画分においては存在が確認されたが、溶出画分においても存在が確認された。
【００４１】
Ｔ２５２Ｍ、及びＴ２５２Ｍ−Ｔ２５４Ｓにおいては、カラムに吸着しなかった画分、及び洗浄画分には融合タンパク質は存在がほとんど確認されず、溶出画分に存在が確認された。
上記結果より、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５２Ｍ、及びＴ２５２Ｍ−Ｔ２５４Ｓは、プロテインＡに対する親和性が、変異させていないものに対して親和性が向上していることがわかる。
【００４２】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明によれば、ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質のプロテインＡに対する親和性を向上させることができるので、抗体、融合タンパク質の精製を容易に行うことが可能となる。モノクローナル抗体の多くはＩｇＧ１であり、従来はプロテインＡ等による精製は困難であったが、本発明により、プロテインＡに対する親和性を向上させることができ、プロテインＡによって、容易に精製することができる。
【００４３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】各種のＩｇＧのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】融合タンパク質に変異を導入するために用いたプライマーの塩基配列を示す図である。
【図３】ウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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