(57)【要約】【課題】本発明の課題は、安全性、生体適合性、生分解性に優れ、食品、医療・医薬、化粧品等、各種機能材料の合成原料としても有用な、構造が均一で高分子量の水溶性ポリウロン酸を提供することにある。【解決手段】重量平均分子量が３０，０００以上であり、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミヌロン酸（或いはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミヌロン酸のアルカリ金属塩）とＤ−グルコサミヌロン酸（或いはＤ−グルコサミヌロン酸のアルカリ金属塩）がβ−（１，４）−結合したポリウロン酸である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量平均分子量が３０，０００以上である、下記化学式（１）の構造よりなるポリウロン酸。
【化１】
2004189923.tif 000005
（式中、Ｘ、Ｙは水素またはアルカリ金属を示す。）
【請求項２】
前記重量平均分子量が５０，０００以上である、請求項１記載のポリウロン酸。
【請求項３】
前記化学式（１）中のｍ：ｎの比率が、８：２から１０：０の範囲である請求項１または２記載のポリウロン酸。
【請求項４】
アルカリで充分に膨潤または溶解処理したキチンを原料に、Ｎ−オキシル化合物の触媒の存在下、臭化アルカリ金属と酸化剤を用いて、５℃以下の低温、水系で、ｐＨを１０〜１１．５の範囲で酸化することにより得られた、請求項１乃至３のいずれかに記載のポリウロン酸。
【請求項５】
キトサンをＮ−アセチル化したものを原料として、Ｎ−オキシル化合物の触媒の存在下、臭化アルカリ金属と酸化剤を用いて、５℃以下の低温、水系で、ｐＨを１０〜１１．５の範囲で酸化することにより得られた、請求項１乃至３のいずれかに記載ポリウロン酸。
【請求項６】
前記Ｎ−オキシル化合物が、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシルであり、前記臭化アルカリ金属が臭化ナトリウムであり、前記酸化剤が次亜塩素酸ナトリウムである請求項４乃至５のいずれかに記載のポリウロン酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高分子量で構造が均一な水溶性ポリウロン酸の提供に関する。
【０００２】
【従来の技術】
天然に存在するポリウロン酸類としては、アルギン酸やペクチン等が挙げられ、これらはその安全性の高さから食品添加物、増粘剤、安定剤等として工業的に利用されている。さらに生体内に存在するムコ多糖（グリコサミノグリカン）類にも、ヒアルロン酸や、コンドロイチン硫酸等、ウロン酸（β−Ｄ−グルクロン酸）を構成単糖とするものがある。ポリウロン酸類は生体適合性、生分解性にも優れると言われており、化粧品材料、医療・医薬用材料等としての応用も検討され、工業化されているものもある。
現在、安全性、生体適合性、生分解性に優れる水溶性ポリウロン酸類を原料として、化学的・物理的修飾、誘導体化、他材料との複合化等、二次修飾することにより生分解性高機能材料を開発しようという検討も行われている。しかし前記の天然に存在するポリウロン酸類は、殆どがヘテロ多糖類であり、不均一な構造ゆえに材料設計を困難にしている。
【０００３】
一方で安価な天然多糖類材料を酸化してポリウロン酸類を得る試みもなされている。特に、甲殻類や昆虫類の骨格物質として存在するキチンを、ウロン酸化すると、ヒアルロン酸類似の構造となることから、その有用性が高いと考えられており、盛んに研究されている。しかしピラノース環のＣ６位の１級水酸基のみを選択的に酸化する手法は少なく、特に有効な溶媒の少ないキチンの選択的酸化は困難であった。現在提案されている酸化手法としては二酸化窒素による酸化、及び２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル（以下ＴＥＭＰＯと称する場合もある）等のＮ−オキシル化合物触媒による酸化が挙げられる。しかし、二酸化窒素による酸化では、ピラノース環のＣ６位の１級水酸基を全て酸化しようとすると、Ｃ３位等の２級水酸基も酸化されてしまったり、重合度低下が大きいことが報告されており、またＴＥＭＰＯ触媒による酸化では、反応条件を制御することで選択性高くＣ６位の１級水酸基を酸化して、構造の均一なポリウロン酸を得ることができるものの、重量平均分子量が１０，０００以下の重合度の低いものしか得られていない（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
前記したように、水溶性ポリウロン酸類を化学修飾して、生分解性高機能材料を合成しようとするときに、修飾反応における低分子量化が避けられない場合もあり、原料のポリウロン酸はできるだけ高分子量である方が望ましい。また水溶性ポリウロン酸類をアニオン性材料として、カチオン性の高分子と複合化して、ポリイオンコンプレックス材料を得ることも検討されているが、この場合、生成したポリイオンコンプレックスの強度物性には、原料ポリウロン酸の重合度は大きく影響する。またポリウロン酸水溶液はコーティング剤としても用いられるが、コーティング膜物性にもポリウロン酸の分子量は大きく影響する。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３９（１９９９）３６１−３６７
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、安全性、生体適合性、生分解性に優れ、食品、医療・医薬、化粧品等、各種機能材料の合成原料としても有用な、構造が均一で高分子量の水溶性ポリウロン酸を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１の発明は、重量平均分子量が３０，０００以上である、下記化学式（１）の構造よりなるポリウロン酸である。
【０００８】
【化２】
2004189923.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｘ、Ｙは水素またはアルカリ金属を示す。）
【００１０】
請求項２の発明は、前記重量平均分子量が５０，０００以上である、請求項１記載のポリウロン酸である。
【００１１】
請求項３の発明は、前記化学式（１）中のｍ：ｎの比率が、８：２から１０：０の範囲である請求項１または２記載のポリウロン酸である。
【００１２】
請求項４の発明は、アルカリで充分に膨潤または溶解処理したキチンを原料に、Ｎ−オキシル化合物の触媒の存在下、臭化アルカリ金属と酸化剤を用いて、５℃以下の低温、水系で、ｐＨを１０〜１１．５の範囲で酸化することにより得られた、請求項１乃至３のいずれかに記載ポリウロン酸である。
【００１３】
請求項５の発明は、キトサンをＮ−アセチル化したものを原料として、Ｎ−オキシル化合物の触媒の存在下、臭化アルカリ金属と酸化剤を用いて、５℃以下の低温、水系で、ｐＨを１０〜１１．５の範囲で酸化することにより得られた、請求項１乃至３のいずれかに記載のポリウロン酸である。
【００１４】
請求項６の発明は、前記Ｎ−オキシル化合物が、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシルであり、前記臭化アルカリ金属が臭化ナトリウムであり、前記酸化剤が次亜塩素酸ナトリウムである請求項４乃至５のいずれかに記載のポリウロン酸である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明におけるポリウロン酸は、下記化学式（１）に示す構造からなるもので、式中のＸ、Ｙは、水素またはアルカリ金属を示すものである。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミヌロン酸（或いはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミヌロン酸のアルカリ金属塩）とＤ−グルコサミヌロン酸（或いはＤ−グルコサミヌロン酸のアルカリ金属塩）がβ−（１，４）−結合したもので、化学構造が明確、均一であり、二次修飾する場合の合成原料として特に好ましい。また、化学式（１）中のＸ、Ｙが、水素またはナトリウムであれば、２５℃の蒸留水に対して、１０％以上の溶解性を示すため、水系のコーティング材料として、及び、水系での反応原料として有用である。
【００１６】
【化３】
2004189923.tif 000003
【００１７】
また、本発明におけるポリウロン酸は、前記化学式（１）中のｍ：ｎの比率、つまりＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミヌロン酸（或いはそのアルカリ金属塩）とＤ−グルコサミヌロン酸（或いはそのアルカリ金属塩）の比率が、８：２から１０：０の範囲であることを特徴とするものである。Ｄ−グルコサミヌロン酸（或いはそのアルカリ金属塩）は、カチオン性のアミノ基を有し、アニオン性のカルボキシル基とイオン結合を形成し易いことから、Ｄ−グルコサミヌロン酸（或いはそのアルカリ金属塩）が全体の２０％以上では、安定性の低下、及び水溶性の低下を招くため好ましくない。
【００１８】
特に、本発明のポリウロン酸をアニオン性材料として、キトサン等のカチオン性多糖類とポリイオンコンプレックスを形成する際には、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミヌロン酸１００％からなるポリウロン酸を用いるよりも、１０％程度のＤ−グルコサミヌロン酸を含有する方が、生成したポリイオンコンプレックスの強度物性が向上する傾向も有する。
【００１９】
さらに本発明のポリウロン酸は、その重量平均分子量が３０，０００以上、より好ましくは５０，０００以上であることを特徴とし、上記したように、化学構造が明確、均一であり、且つ高分子量である点が大きな特徴である。そのため、本発明のポリウロン酸水溶液をコーティング材料として用いる場合には、塗工性が向上し、塗膜の耐湿性や膜物性の向上も期待できる。さらに、前記のようにポリイオンコンプレックスとした際も、その物性や安定性を向上させる。さらに本発明のポリウロン酸を原料に化学修飾する場合も、生成物の物性向上、及び物性の安定化に寄与し得る。
【００２０】
ここに記載した重量平均分子量とは、標準物質としてプルランを用いて、サイズ排除クロマトグラフィー法により測定した、プルラン換算重量平均分子量である。
【００２１】
さらに本発明のポリウロン酸は、キチン等を原料として、Ｎ−オキシル化合物触媒による酸化手法を用いることにより得られるが、本発明の特徴である均一な構造を有して且つ高分子量のポリウロン酸を得るためには、基質のアクセシビリティーを充分に高め、Ｃ６位の１級水酸基を選択的に全てカルボキシル基に変換するとともに、穏やかな条件で酸化することで分子量の低下やＣ３位の酸化などの副酸化をおさえることが重要となる。つまり、アルカリで充分に膨潤または溶解処理したキチンを原料として、又は、キトサンをＮ−アセチル化したものを原料として、Ｎ−オキシル化合物の触媒の存在下、臭化アルカリ金属と酸化剤を用いて、５℃以下の低温、水系で、ｐＨを１０〜１１．５の範囲で一定に保ちながら酸化することにより、本発明のポリウロン酸が得られる。ここでＮ−オキシル化合物としては、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジン−Ｎ−オキシル（ＴＥＭＰＯ）が、臭化アルカリ金属としては臭化ナトリウムが、酸化剤としては次亜塩素酸ナトリウムが特に好ましい。
【００２２】
前記のキチン、及びキトサンは、下記化学式（２）に示す構造を有するもので、キチンは、カニやエビなどの甲殻類、また昆虫類の骨格物質として存在し、一般的には、ほぼＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから成るものであるが、精製過程における脱アセチル化等により、Ｄ−グルコサミンも含むものである。キチンは結晶性が高く、水には不溶であるが、高濃度のアルカリに浸漬後、氷を加えながら低温下で希釈していくことにより、粘調な液体となる。ここに塩酸を加えて中和すると、フレーク状のキチンが析出するが、ほぼ非晶質化したキチンが得られ、これを充分に水洗して乾燥させずに上記酸化反応に供することにより、ほぼ全てのＣ６位の１級水酸基が選択性高く酸化され、分子量低下は抑えられる。但し、アルカリ雰囲気下では、キチンの脱アセチル化の反応も進行することから、アルカリによる溶解および中和処理、さらに酸化反応中の系内の温度は５℃以下の低温に維持することが重要である。
【００２３】
【化４】
2004189923.tif 000004
【００２４】
さらにキトサンは、キチンを脱アセチル化することにより得られる物質で、一般的には前記化学式（２）中のｎの比率の方が高い物質であり、酸に対して溶解する。キトサン溶液に無水酢酸を添加すると容易にＮ−アセチル化され、再びキチンの化学構造に戻すことが可能である。この操作を経て、充分に水洗したものを乾燥させずに上記酸化反応に供することにより、前記同様にＣ６位の１級水酸基のみ選択性高く酸化して、高分子量の本発明のポリウロン酸を得ることができる。また、この場合は、ｍ／ｎの比率を任意に設定することが可能である。
【００２５】
ここで上記酸化手法は、例えばＴＥＭＰＯと臭化ナトリウムを溶解した水溶液に、上記の湿潤原料を加えて均一に分散させ、系内を５℃以下に冷却、ｐＨを１０に調整し、酸化剤の次亜塩素酸ナトリウム溶液を反応の進行に応じて添加するとともに、水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、系内のｐＨを１０〜１１．５の範囲で一定に保つ。また反応中は系内の温度を５℃以下に維持する。酸化が進むにつれ、系内は溶解し、均一な溶液となる。この反応条件においては、添加される水酸化ナトリウムの量は、ほぼ酸化により導入されたカルボキシル基の量に対応しており、原料のＣ６位の１級水酸基量と当モルの添加量に達した時点で、エタノールを添加して過剰の酸化剤を失活させ、過剰量のエタノール中で再沈させる。生成物はアセトンと水の混合溶液を用いて十分洗浄後、アセトンで脱水してから減圧乾燥することにより、本発明のポリウロン酸のナトリウム塩が得られる。
【００２６】
なお上記により得られたポリウロン酸のナトリウム塩を水溶後酸処理し、上記のエタノールで再沈、洗浄、乾燥の操作を繰り返すことで脱塩したポリウロン酸を得ることができる。
【００２７】
さらに、本発明のポリウロン酸は、構造が均一な、β−（１、４）−ポリウロン酸であるため、重水に溶解させて13Ｃ−ＮＭＲを測定すると、ピラノース環Ｃ６位の水酸基を持つ炭素に由来するピーク（δ＝６０〜６５ｐｐｍ付近）は見られず、カルボキシル基に由来するピーク（δ＝１７０〜１８０ｐｐｍ付近）を有し、さらに、Ｃ３位の２級水酸基の酸化により生じるケトンなどのピーク（δ＝２００〜２１０ｐｐｍ付近）は検出されないことを特徴とする。
【００２８】
【実施例】
以下実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。
【００２９】
＜実施例１＞
キチン（和光純薬工業（株）製）を５ｇ、４５％水酸化ナトリウム水溶液５０ｇに浸漬し、容器の周囲を氷水で冷却しながら、２時間攪拌した。これに、砕いた氷１７５ｇを、攪拌しながら添加した。このアルカリ処理によりキチンはほぼ溶解する。低温に維持したまま、塩酸で中和し、十分に水洗した後、乾燥させずに、５％のアルカリ処理キチン懸濁液とした。ここに、ＴＥＭＰＯ  ７５ｍｇ、臭化ナトリウム  １．０ｇを溶解させた水溶液を加え、キチンの固形分濃度が約２ｗｔ％になるよう調製した。反応系を冷却し、１１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液１０ｇを添加し、酸化反応を開始する。反応温度は常に５℃以下に維持した。反応中は系内のｐＨが低下するが、０．５Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を逐次添加し、ｐＨ１０．８付近に調整するとともに、さらに１１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液３５ｇを反応の進行に応じて調整しながら滴下した。６位の１級水酸基の全モル数に対し、１００％のモル数に対応するアルカリ添加量に近づくと、次亜塩素酸ナトリウム水溶液の滴下に関係なく、アルカリの添加速度（反応速度）は遅くなり、系内は完全に溶解してくる。アルカリ添加量が前記の１００％（４９．２ｍｌ）に達した時点で、エタノールを添加して反応を停止させた。反応時間は２時間であった。この反応溶液は、濾過により不溶の不純物を除いてから、過剰量のエタノール中に投入して、生成物を再沈させた。さらに水：アセトン＝１：７の溶液により充分洗浄した後、アセトンで脱水して、４０℃減圧乾燥して、白色粉末状のポリウロン酸のナトリウム塩５．３ｇを得た。
【００３０】
＜実施例２＞
脱アセチル化度１００％のキトサン（大日精化工業（株）製）を５ｇ、１０％酢酸９５ｇに溶解した。濾過により不溶分を除去し、メタノール５００ｍｌで希釈して、攪拌しながら無水酢酸４．７６ｇを添加すると数分でゲル化した。１晩静置後、ホモジナイザーで多量のメタノール中に分散させた。メタノール及び水：アセトン＝１：７の溶液により充分洗浄し、さらに水洗してメタノールおよびアセトンを完全に除き、Ｎ−アセチル化キトサンの５％濃度の懸濁液とした。
このＮ−アセチル化キトサンの懸濁液の一部を凍結乾燥して、元素分析によりＮ−アセチル化度を求めたところ、９５％であった（前記化学式（２）におけるｍ：ｎ＝９５：５）。
さらに前記Ｎ−アセチル化キトサンの５％濃度の懸濁液１００ｇに対し、実施例１と同様の酸化処理を行った。反応時間は１時間１０分であり、白色粉末状のポリウロン酸のナトリウム塩５．３ｇが得られた。
【００３１】
＜実施例３＞
実施例１のポリウロン酸のナトリウム塩２ｇを４０ｍｌの蒸留水に溶解し、攪拌しながら、ｐＨ１になるまで２Ｎ−塩酸を添加した。溶液は透明な溶液のままであった。この溶液を過剰量のエタノール中に投入し、生成物を再沈させた。さらに水：アセトン＝１：７の溶液により充分洗浄した後、アセトンで脱水して、４０℃減圧乾燥して、白色粉末状の脱塩したポリウロン酸１．６ｇを得た。
【００３２】
得られた実施例１〜３のポリウロン酸を以下の方法で評価した。
（水溶性）
実施例１〜３のポリウロン酸１．０ｇを、２５℃の蒸留水１０ｍｌに溶解させた。いずれも完全に溶解し、さらに高濃度での溶解も可能であった。
【００３３】
（ＮＭＲによる構造分析）
実施例１〜３のサンプルを重水に溶解させ、１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。その結果を図１〜３に示す。ＮＭＲスペクトルから、キチンのピラノース環Ｃ６位の水酸基をもつ炭素に由来するピーク（δ＝６０〜６５ｐｐｍ付近）が完全に消えて、カルボキシル基（δ＝１７０〜１８０ｐｐｍ付近）に変換しており、２位、３位の炭素に由来するピークは変化せず、ケトンなどのピーク（δ＝２００〜２１０ｐｐｍ付近）は確認されなかった。従って、本発明のポリウロン酸は、ほぼ構造が均一な、β−（１，４）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミヌロン酸であると言える。
【００３４】
（重量平均分子量の測定）
実施例１〜３のポリウロン酸の重量平均分子量（Ｍｗ）を、ＧＰＣ法により測定した。カラムはＴＳＫ−ｇｅｌＧ６０００ＰＷＸＬ、ＴＳＫ−ｇｅｌＧ３０００ＰＷＸＬを用い、０．１Ｍ−ＮａＣｌを溶離液とし、ＲＩ検出器を用い測定した。分子量既知の標準プルランから検量線を作成し、プルラン換算の重量平均分子量を算出した。その結果、実施例１から順にＭｗ＝６２，０００、７８，０００、６５，０００といずれも分子量３０，０００以上のポリウロン酸であった。さらに数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、いずれも３以下で、分子量分散としては決して広くはなかった。従って分子量分散が広いために、計算上の重量平均分子量が高くなった訳ではないと言える。
【００３５】
（生分解性の測定）
実施例１のポリウロン酸の生分解性を以下の手法で評価したところ、試験１０日後の生分解度は４３％、試験２０日後の生分解度は６２％であった。なお対照として用いた微結晶セルロースは試験１０日後の生分解度は３９％、試験２０日後の生分解度は６０％であり、セルロースと同等以上の高い生分解性を有することが分かる。
（生分解性の評価方法）
八幡物産（株）製の微生物酸化分解測定装置（ＭＯＤＡ）を用い、試験土壌として、水分６０％に調整した標準コンポスト（八幡物産（株）製  ＹＫ−２）２５０ｃｃと、水分１８％に調整した海砂２５０ｃｃを混合したものを用いた。試料１０ｇを試験土壌と均一に混合して、カラム状の反応筒に充填し、反応筒内の温度を３５℃で一定に保持した。さらに反応筒下方より水蒸気を飽和した脱炭酸空気を４０ｍｌ／分で通気し、反応筒上部からはガス漏れなく配管されて、アンモニアガスを除くために硫酸水浴中を通り、水分を除くためにシリカゲルと塩化カルシウムを充填した吸湿筒を通り、さらにソーダタルク及びソーダライムを充填した吸収筒に導かれる。試料が好気的に生分解して発生する二酸化炭素は全て、吸収筒に吸収されるため、吸収筒の重量変化から生分解により発生した二酸化炭素量を定量できるものである。なお試料を入れない試験土壌のみの空試験を同時に行い、空試験で発生した二酸化炭素量を差し引いて、分解により発生した二酸化炭素量を求めた。試料１０ｇ中の炭素含量から理論的に発生する二酸化炭素量を算出し、理論量に対する発生二酸化炭素量の割合を生分解度とした。試料としては、実施例１のポリウロン酸と、対照として、微結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）を用いた。
【００３６】
【発明の効果】
以上より、本発明のポリウロン酸は（化１）の構造よりなる、β−（１，４）−ポリウロン酸であり、その重量平均分子量は３０，０００以上を有し、高い水溶性を示す。また生分解性も良好で、安全性に優れる。従って、構造が明確ゆえに、各種機能と化学構造の関係を解析していく上で、極めて有効な材料であり、材料設計のし易い合成原料となり得る。また、高分子量で水溶性が良好なことから、水系のコーティング材料として、及び水系の反応原料として好ましく用いることができる。さらには、ポリウロン酸単体、或いは二次修飾や複合化した材料の物性の向上にも寄与し、食品、医療・医薬、化粧品等、様々な機能性材料として応用されることが期待できる。
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１のポリウロン酸ナトリウム塩を重水に溶解して測定した１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】実施例２のポリウロン酸ナトリウム塩を重水に溶解して測定した１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】実施例３のポリウロン酸を重水に溶解して測定した１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１】
2004189923.tif 000006
【図２】
2004189923.tif 000007
【図３】
2004189923.tif 000008