(57)【要約】【課題】乳酸菌の生育促進に優れた効果を有し、かつ製品の風味に悪影響を与えない乳酸菌生育促進剤及びその製造法を提供する。【解決手段】ホエータンパク質をタンパク質分解酵素処理して得られた分解物、及びその分解物を限外ろ過により分画したリテンテイト画分（保持画分）を有効成分とする乳酸菌生育促進剤を得る。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエータンパク質をタンパク質分解酵素処理して得られる分解物を有効成分とする乳酸菌生育促進剤。
【請求項２】
請求項１で得られる分解物を限外ろ過により分画したリテンテイト画分（保持画分）を有効成分とする乳酸菌生育促進剤。
【請求項３】
ホエータンパク質の水溶液をタンパク質分解酵素で酵素分解し、ついでこの分解物を限外ろ過により分画してリテンテイト画分（保持画分）を得ることを特徴とする乳酸菌生育促進剤の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホエータンパク質をタンパク質分解酵素で処理することにより得られる分解物、及びこの分解物を限外ろ過により分画したリテンテイト画分を有効成分とする乳酸菌生育促進剤に関する。また、本発明はこの乳酸菌生育促進剤を製造する方法に関する。
本発明の乳酸菌生育促進剤は、乳酸菌の生育促進に優れた効果を有する。また、本発明の乳酸菌生育促進剤を添加して得られる乳酸菌培養物は、そのまま乳酸菌飲料や乳酸菌添加食品等の飲食物に直接供することが可能であり、得られる乳酸菌培養物を粉末化して、乳酸菌添加食品等の飲食物に供することができる。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌は、古来より食品の製造に広く利用されており、チーズ、発酵乳、乳酸菌飲料、発酵バター等の乳製品、キムチや漬物といった食品、発酵ソーセージや発酵サラミなどの畜肉製品を製造する際に用いられている。また、パンのスターターや飼料用サイレージのスターターとしても利用されている。さらに最近では、乳酸菌の有する整腸効果等の生理効果が次々と明らかとなり、乳酸菌の菌体自体や乳酸菌培養物等を健康食品や医薬品等の素材として利用するための開発がなされている。このように、乳酸菌の利用は多岐にわたっており、乳酸菌の生育を促進させて菌体濃度を高めるとともに培養時間を短縮することは、乳酸菌培養物を簡便かつ安価に製造することを可能とし、産業上極めて大きな意義を有する。
【０００３】
しかし、乳酸菌は複雑な栄養要求性を示し、培養する場合には、ブドウ糖や乳糖等の炭素源に、酵母エキス、ビタミン、核酸、アミノ酸類、無機塩類、肉抽出物、金属塩等を添加して培地を作成する必要があり、乳酸菌の培養に使用する培地の調製は極めて煩雑であった。
また、乳酸菌体を取得することを目的として調製する場合には、通常乳酸菌を培養する場合に使用する乳を主体とする培地ではなく、ＭＲＳ培地やＧＡＭ培地等の合成培地を用いることとなる。しかし、これらの合成培地で乳酸菌を培養した場合には、乳を主体とする培地で培養した場合に比べて菌体濃度が高まらないのが一般的であり、合成培地を用いて乳酸菌の培養を行う際には、大量の培地が必要であり、工業化する上では、コストや設備の面でも問題があった。
【０００４】
このような理由から、従来より各種の乳酸菌増殖促進物質が検討されている。蛋白分解酵素処理した酒粕水抽出物を有効成分とする乳酸菌の増殖促進剤（特開平５−１５３６６号公報）、ローヤルゼリー由来の蛋白質の酵素分解物からなる微生物培養培地用ペプトン（特開平７−２６５０６６号公報）や蛋白分解酵素で処理した卵白を乳酸菌の増殖促進物質として用いる（特開２０００−９３１６６号公報）等の提案がされているが、十分な菌数の増加は得られていない。また、ホエー粉等のプロテアーゼ処理物を培地の主成分としたプロピオン酸菌の培養方法が開示されているが（特開平１０−３０４８７１号公報）、プロピオン酸菌が産生する比ビフィズス菌増殖活性を高めるためのプロピオン酸菌高濃度培養方法であり、乳酸菌を対象とはしていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
乳酸菌に対して生育促進効果を有する上記の従来物質は、調製が煩雑であったり、物質自体が高価であったり、また、製品を製造する場合に、特異な味や香りが製品に移行するのを防ぐため、製品への風味に影響しないようにごくわずかの量しか培地に添加できないという問題があった。したがって、本発明は、上記した現状に鑑み、乳酸菌の生育促進に優れた効果を有し、かつ製品の風味に悪影響を与えない乳酸菌生育促進剤を提供することを課題とする。また、本発明は、新規な乳酸菌生育促進剤を製造する方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
これらの課題を解決するため、本発明者らは、新たに乳酸菌の生育促進に優れた効果を有する物質について鋭意検討をすすめたところ、ホエータンパク質をタンパク質分解酵素処理することにより得られる分解物、及び、その得られた分解物を限外ろ過により分画したときのリテンテイト画分（保持画分）に乳酸菌の生育を著しく促進する効果があることを発見した。さらに、乳酸菌用の合成培地にこのホエータンパク質分解物等を添加することで、乳酸菌の生育を促進できることを見出し、本発明を完成するに至った。微生物は、タンパク質より、タンパク質を分解したペプトンの方が利用しやすいのと同様に、低分子のアミノ酸の方が微生物にとって利用しやすいと一般的に言われてきた。ところが、本発明は意外にも、分子量の大きいホエータンパク質の酵素分解物、および限外ろ過により酵素分解物の低分子画分をさらに除いたリテンテイト画分（保持画分）のような分子量が大きい画分に、乳酸菌の生育を著しく促進する効果があることを見出した。　　　　本発明は、ホエータンパク質をタンパク質分解酵素処理して得られる分解物を有効成分とする、乳酸菌の生育促進に優れた乳酸菌生育促進剤を提供する。また、本発明はホエータンパク質をタンパク質分解酵素処理して得られる分解物を限外ろ過により分画したリテンテイト画分（保持画分）を有効成分とする、乳酸菌の生育促進に優れた乳酸菌生育促進剤を提供する。さらに、本発明はホエータンパク質の水溶液をタンパク質分解酵素で酵素分解し、ついでこの分解物を限外ろ過により分画してリテンテイト画分（保持画分）を得ることを特徴とする乳酸菌生育促進剤の製造法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明におけるホエータンパク質は、牛乳、水牛や山羊などの乳のホエー、その濃縮物、粉末あるいはホエータンパク質精製物をいい、これを酵素反応させるときは水溶液の状態で使用する。これらのホエータンパク質を０．５〜２０重量％含むように水溶液を調製する。ホエータンパク質水溶液を塩酸、クエン酸、乳酸、苛性ソーダ、水酸化カルシウム及びリン酸ソーダ等の溶液を用いてｐＨ６〜１０に調整し、６０〜８０℃程度加熱する。ホエータンパク質にタンパク質分解酵素を作用させる反応条件は、使用する酵素の最適条件に設定することが好ましく、一般には、１０〜９０℃、ｐＨ３〜９に調整して酵素反応を行う。使用する酵素は特に限定されず、トリプシン、ペプシン、パパイン、パンクレアチンなど、植物、動物、微生物由来のタンパク質分解に通常使用するタンパク質分解酵素であれば問題はなく、複数の酵素を組み合わせて利用することもできる。
タンパク質分解酵素処理を終了したホエータンパク質水溶液は、反応液を加熱して酵素を失活させる。酵素の失活は反応液を９０℃以上で１０分間以上の加熱履歴で加熱することにより行うことができ、１１５℃で３〜５秒間加熱して行うこともできる。
【０００８】
ホエータンパク質含有水溶液の酵素分解処理には耐熱性のタンパク質分解酵素も使用し得る。例えば、特開平４−１１２７５３号公報では、ホエータンパク質を耐熱性のタンパク質加水分解酵素で分解処理しており、このような条件にて酵素反応を行うこともできる。以下にその条件を示す。
ホエータンパク質水溶液を、ｐＨ６〜１０に調整し、加熱は６０〜８０℃で行う。耐熱性のタンパク質加水分解酵素を用いる場合には、この温度にして添加するよりもむしろ加熱前から加え、酵素分解を行ったほうが収率の面から好ましい。一般的なプロテアーゼの至適温度は６０℃以下であるが、耐熱性のタンパク質加水分解酵素は７０℃以上であり、このような至適温度を有する耐熱性のタンパク質加水分解酵素として知られているものであれば特に制限はなく使用することができる。このような耐熱性タンパク質加水分解酵素としてパパイン、プロテアーゼＳ（商品名）、プロレザー（商品名）、サモアーゼ（商品名）、アルカラーゼ（商品名）、プロチンＡ（商品名）等を例示することができる。これらは、８０℃で３０分間加熱して残存活性が約１０％あるいはそれ以上になるものが望ましい。また、単独よりも複数の酵素を併用するとより効果的である。反応は３０分〜１０時間行うことが好ましい。酵素の失活は反応液を９０℃以上で１０分間以上加熱することにより行う。
【０００９】
このようにして得られたホエータンパク質分解物は全固形分中に約５０％以上のタンパク質分解物を含有している状態にある。このホエータンパク質分解物はそのままで乳酸菌生育促進剤として使用することができるが、得られた分解物をさらに限外ろ過を通して濃縮し、そのリテンテイト画分（保持画分）を得て、これを乳酸菌生育促進剤として使用することがより好ましい。試験の結果によると、限外ろ過したリテンテイト画分（保持画分）からなる乳酸菌生育促進剤の方が、限外ろ過処理しないで酵素分解処理をしただけの乳酸菌生育促進剤より、菌体濃度が増加した。
本発明において限外ろ過に用いる膜の分画分子量の大きさは、酵素分解の程度により、自由に選択することができる。上記の限外ろ過したパーミエイト画分には低分子の分解物が多く含まれ、本発明において分解酵素として耐熱性酵素を使用した場合、このパーミエイト画分は特開平４−１１２７５３号公報に開示されている低アレルゲン化ホエータンパク質加水分解物に近い組成となり、低アレルゲン化食品の原料として使用することができる。逆に、低アレルゲン化食品原料の取得を主たる目的とする場合には、そのリテンテイト画分を乳酸菌生育促進剤として最適に利用する本発明は、資源の有効利用につながるという多大な利点を持つ。
【００１０】
また、このリテンテイト画分（保持画分）をさらにＤＦ（ｄｉａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に供して濃縮し、この濃縮リテンテイト画分を乳酸菌生育促進剤として使用することもできる。試験の結果では、この濃縮リテンテイト画分（保持画分）からなる乳酸菌生育促進剤の方が、限外ろ過処理しないで酵素分解処理をしただけの乳酸菌生育促進剤より菌体濃度が増加したが、試験に供した乳酸菌の種類によっては、限外ろ過処理したリテンテイト画分（保持画分）からなる乳酸菌生育促進剤とは菌体濃度には差が無かった。
【００１１】
このタンパク質分解酵素処理により得られる分解物は、従来より乳酸菌を培養する際に使用されている合成培地に固形換算で０．１〜１５重量％、好ましくは１〜５重量％となるように添加すれば良い。なお、乳酸菌生育促進剤の添加量を増やすことにより、乳酸菌の菌体濃度も増加する。このように本発明の生育促進剤を添加することにより、乳酸菌の菌体濃度を容易に高めることが可能であり、培地の使用量を著しく減少させることができるため、安価に乳酸菌体及び乳酸菌培養物を製造することができる。乳酸菌で、このような高い生育促進効果が認められた物質は、今までに報告されていない。
【００１２】
本発明の乳酸菌生育促進剤は、水溶液のままで、あるいは濃縮して、または、凍結乾燥等の適宜の方法によって粉末とした状態で使用可能である。
本生育促進剤は、乳由来のホエータンパク質を原材料としているため、この生育促進剤を添加して得られた乳酸菌培養物は、そのまま乳酸菌飲料や乳酸菌添加食品等の飲食物に直接供することが可能である。特に、前記の様に、耐熱性酵素により分解して得られた酵素分解物は、分解物に特有の苦味が少なく、食品素材としてそのまま利用できることは大きな利点である。また、得られた乳酸菌培養物を、凍結乾燥、噴霧乾燥等の乾燥手段で粉末化して、乳酸菌添加食品等の飲食物に供することもできる。さらに、得られた乳酸菌培養液から、ろ過や遠心分離等の処理にて乳酸菌体のみを分離し、その乳酸菌体を凍結乾燥、噴霧乾燥等で粉末化処理することにより、取扱の容易な形態の機能性食品原料として供給することも可能である。
【００１３】
次に実施例を示し、本発明を詳細に説明する。なお、以下に記載する実施例は本発明を説明するものであり、酵素やその反応条件などを実施例の記述に限定するものではない（％は重量％をあらわす）。
【００１４】
【実施例１】
ホエープロテインコンセントレイト（Ｌａｃｐｒｏｄａｎ　８０　、Ａｒｌａ　Ｆｏｏｄ　社製）のタンパク質濃度５％溶液を調製し、水酸化カリウムによりｐＨ７．０に調整した。ついで７５℃、２分間加熱後、５０℃まで冷却し、水酸化カルシウムによりｐＨ８．０に調整した。ついで基質に対して０．５％のプロテアーゼＰ６Ｇ（天野エンザイム社製）を添加し５０℃、２時間酵素反応させた。反応終了後、ｐＨを水酸化カルシウムにより８．０に調整し、アルカラーゼ（ノボノルディスクバイオインダストリー社製）を基質に対して２％添加し、６０℃、４時間処理後、１１５℃、３〜５秒間加熱することによりホエータンパク質分解物を得た。得られた分解物の固形分あたりの成分組成比率を表１に示す。
【００１５】
【表１】
2004057047.tif 000002
【００１６】
【実施例２】
ホエープロテインコンセントレイト（Ｌａｃｐｒｏｄａｎ　８０　、Ａｒｌａ　Ｆｏｏｄ　社製）のタンパク質濃度５％溶液を調製し、水酸化カリウムによりｐＨを７．０に調整した。ついで７５℃、２分間加熱後、５０℃まで冷却し、水酸化カルシウムによりｐＨを８．０に調整した。この基質に対して０．５％のプロテアーゼＰ６Ｇ（天野エンザイム社製）を添加し５０℃、２時間酵素反応させた。反応終了後、ｐＨを水酸化カルシウムにより８．０に調整し、アルカラーゼ（ノボノルディスクバイオインダストリー社製）を基質に対して２％添加し、６０℃、４時間処理後、１１５℃、３〜５秒間加熱することによりホエータンパク質分解物を得た。
得られたホエータンパク質分解物３６ｋｇを限外ろ過（分画分子量１万）により６倍濃縮し、リテンテイト６ｋｇ、パーミエイト３０ｋｇを得た。リテンテイト画分は凍結乾燥し、４℃で保存した。得られたリテンテイト画分の固形分あたりの成分組成比率を表２に示す。
【００１７】
【表２】
2004057047.tif 000003
【００１８】
【実施例３】
ホエープロテインコンセントレイト（Ｌａｃｐｒｏｄａｎ　８０　、Ａｒｌａ　Ｆｏｏｄ　社製）のタンパク質濃度５％溶液を調製し、水酸化カリウムによりｐＨを７．０に調整した。ついで７５℃、２分間加熱後、５０℃まで冷却し、水酸化カルシウムによりｐＨを８．０に調整した。ついで基質に対して、０．５％のプロテアーゼＰ６Ｇ（天野エンザイム社製）を添加し５０℃、２時間酵素反応させた。反応終了後、ｐＨを水酸化カルシウムにより８．０に調整し、アルカラーゼ（ノボノルディスクバイオインダストリー社製）を基質に対して２％添加し、６０℃、４時間処理後、１１５℃、３〜５秒間加熱することによりホエータンパク質分解物を得た。
得られたホエータンパク質分解物３６ｋｇを限外ろ過（分画分子量１万）により６倍濃縮し、リテンテイト６ｋｇ、パーミエイト３０ｋｇを得た。さらにリテンテイトをＤＦ（ｄｉａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に供し２倍濃縮した。リテンテイト画分は凍結乾燥し、４℃で保存した。得られた濃縮リテンテイト画分の固形分あたりの成分組成比率を表３に示す。
【００１９】
【表３】
2004057047.tif 000004
【００２０】
【試験例１】
本試験には、乳酸菌として、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）　ＪＣＭ１１３２、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）　ＪＣＭ１１３１、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）　ＦＥＲＭ　Ｐ−１５５３、ラクトバチルス・デルブリッキ・サブスピーシズ・ブルガリカス　（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＪＣＭ１００２の４株を供試した。試験培地には、表４に示す組成の合成培地に、実施例１で得られた乳酸菌生育促進剤を試験培地１：無添加、試験培地２：１％添加、試験培地３：３％添加および試験培地４：５％添加し、乳酸菌培養用培地を調製した。まず、ネジ口試験管に各培地を１０ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分間高圧滅菌し試験培地とした。一方、ＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製、ＵＳＡ）で継代培養した各乳酸菌を同培地で３７℃、１６時間培養し乳酸菌前培養物とした。この乳酸菌前培養物を遠心分離し、菌体をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（−）で２回洗浄後、ＰＢＳ（−）に懸濁した。ついで、試験培地１〜４にこの洗浄菌体を３％ずつ接種して３７℃で１６時間培養し、培養終了後、ＭＲＳ寒天培地を用いたプレートカウント法により各試験培地の乳酸菌の生菌数を測定した。その結果を表５に示す。
【００２１】
【表４】
2004057047.tif 000005
【００２２】
【表５】
2004057047.tif 000006
表４に示す合成培地には微生物の窒素源として一般的に使用されるペプトンが配合されているが、乳酸菌生育促進剤を添加していない試験培地１での乳酸菌の生育は比較的良くない。ところが、本発明の乳酸菌生育促進剤を添加するといずれの菌株においても顕著に生育性は改善され、さらに添加する乳酸菌生育促進剤の添加量が増加するとともに乳酸菌の生菌数も増加するという結果となった。
【００２３】
【試験例２】
本試験には、乳酸菌として、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）　ＪＣＭ１１３２、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）　ＪＣＭ１１３１、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）　ＦＥＲＭ　Ｐ−１５５３、ラクトバチルス・デルブリッキ・サブスピーシズ・ブルガリカス　（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＪＣＭ１００２の４株を供試した。
試験培地には、表４に示す組成の合成培地に、実施例２で得られた乳酸菌生育促進剤を試験培地１：無添加、試験培地２：１％添加、試験培地３：３％添加および試験培地４：５％添加し、乳酸菌培養用培地を調製した。まず、ネジ口試験管に各培地を１０ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分間高圧滅菌し試験培地とした。一方、ＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製、ＵＳＡ）で継代培養した各乳酸菌を同培地で３７℃、１６時間培養し乳酸菌前培養物とした。この乳酸菌前培養物を遠心分離し菌体をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（−）で２回洗浄後、ＰＢＳ（−）に懸濁した。ついで、試験培地１〜４にこの洗浄菌体を３％接種して３７℃で１６時間培養し、培養終了後、ＭＲＳ寒天培地を用いたプレートカウント法により各試験培地の乳酸菌の生菌数を測定した。その結果を表６に示す。
【００２４】
【表６】
2004057047.tif 000007
【００２５】
表４に示す合成培地には微生物の窒素源として一般的に使用されるペプトンが配合されているが、乳酸菌生育促進剤を添加していない試験培地１での乳酸菌の生育は比較的良くない。ところが、本発明の乳酸菌生育促進剤を添加するといずれの菌株においても明らかに生育性は改善され、さらに添加する乳酸菌生育促進剤が増加するとともに乳酸菌の生菌数も増加するという結果となった。また、実施例１で得られたタンパク質分解物に比べて、本実施例の限外ろ過によるリテンテイト画分は１．３〜１．５倍程度の菌体濃度の増加があった。
【００２６】
【試験例３】
本試験には、乳酸菌として、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）　ＪＣＭ１１３２、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）　ＪＣＭ１１３１、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）　ＦＥＲＭ　Ｐ−１５５３、ラクトバチルス・デルブリッキ・サブスピーシズ・ブルガリカス　（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）　ＪＣＭ１００２の４株を供試した。
試験培地には、表４に示す組成の合成培地に、実施例３で得られた乳酸菌生育促進剤を試験培地１：無添加、試験培地２：１％添加、試験培地３：３％添加および試験培地４：５％添加し、乳酸菌培養用培地とした。まず、ネジ口試験管に各培地を１０ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分間高圧滅菌し試験培地とした。一方、ＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製、ＵＳＡ）で継代培養した各乳酸菌を同培地で３７℃、１６時間培養し乳酸菌前培養物とした。この乳酸菌前培養物を遠心分離し菌体をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（−）で２回洗浄後、ＰＢＳ（−）に懸濁した。ついで、試験培地１〜４にこの洗浄菌体を３％接種して３７℃で１６時間培養し、培養終了後、ＭＲＳ寒天培地を用いたプレートカウント法により各試験培地の乳酸菌の生菌数を測定した。その結果を表７に示す。
【００２７】
【表７】
2004057047.tif 000008
【００２８】
本結果によると、乳酸菌生育促進剤の添加によりいずれの菌株においても明らかに生育性は改善され、さらに添加する乳酸菌生育促進剤を増加させるとともに乳酸菌の生菌数も増加する。また、実施例１で得られたタンパク質分解物に比べて、本実施例の濃縮リテンテイト画分は１．３〜１．５倍程度の菌体濃度の増加があった。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により新規な乳酸菌培養用生育促進剤が提供される。本生育促進剤を添加することにより得られる乳酸菌及び乳酸菌培養物は、顕著に生育が促進され、到達生菌数が高く、効率的に乳酸菌体を得ることが可能であり、乳酸菌菌体製造及び乳酸菌培養物製造において製造コストを削減することができる。また乳酸菌の高濃度培養の場合にも有用である。