(57)【要約】【課題】多血小板血漿を効率的に輸送しうる徐放性製剤を提供すること。【解決手段】多血小板血漿およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多血小板血漿およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤。
【請求項２】
多血小板血漿およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなる、血管新生を促進するための医薬組成物。
【請求項３】
多血小板血漿およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなる、骨新生を促進するための医薬組成物。
【請求項４】
多血小板血漿およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなる、創傷を治療するための医薬組成物。
【請求項５】
多血小板血漿およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなる、皮膚潰瘍を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管新生促進ならびに骨新生促進用の徐放製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多血小板血漿（ＰＲＰ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｒｉｃｈ　Ｐｌａｓｍａ）とも称される）とは、末梢血を低速で遠心分離して赤血球を除くことにより得られる濃厚血小板血漿である。ＰＲＰには、血小板中に含まれる血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）などの成長因子が多く含まれており、これらの相乗的作用により血管新生、創傷治癒の促進、皮膚潰瘍の治療、骨組織再生の促進などにおける効果が報告されている。また、ＰＲＰに含まれる成長因子によりその再生、修復が促進されるあらゆる組織や臓器、例えば、軟骨、筋肉、神経、脂肪組織などの創傷治癒および修復の促進が期待される。また、その治癒修復の状態がより正常に近くなることも期待される。さらに、ＰＲＰには成長因子以外にも、種々のサイトカイン、リンホカイン、モノカイン、生理活性物質などが含まれていることから、広く患者自身の免疫系を介した治療薬としての可能性も示唆されている。さらに、このような有効成分を含むＰＲＰを患者自身の血液から簡単に採取することができるため、治療上の倫理的問題も全くなく、血液製剤の使用に伴うウイルス感染や免疫不適合などのリスクを回避しうるという長所を有する。
【０００３】
しかしながら、ＰＲＰ中に含まれる各種の成長因子などの生理活性をもつ有効成分は、通常、投与部位から拡散により排泄、酵素分解により失活するために生体内半減期が短く、ＰＲＰを局所投与した場合には、これらの有効成分の生理活性効果をほとんど得ることができなった。これの解決法として、例えば、フィブリン糊、アルギン酸、β−ＴＣＰなどとＰＲＰとを混合して用いることによって、ＰＲＰの生物効果を増強させる試みが報告されている。しかしながら、これらの試みは、現在臨床で使用されている材料との単なる組み合わせであり、ＰＲＰ中に含まれる有効成分を徐放し、持続的な効果を実現させることを目的としたものではない。
【０００４】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】
ＷＯ９４／２７６３０
【非特許文献１】
ｔｈｅ　Ｑｕｉｎｔｅｓｓｅｎｃｅ，　Ｖｏｌ．　２０，　Ｎｏ．　１，　２００１，　９５−１０４
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、ＰＲＰに含まれる有効成分を病巣部位に効率的に輸送しうる徐放性製剤を形成することにより、血管新生および骨新生を促進させ、創傷、皮膚潰瘍、骨欠損を有効に治療しうる薬剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＰＲＰを含むハイドロゲルを用いて作製したＰＲＰの徐放性製剤が、モデル動物において血管新生および骨新生に顕著な効果を有することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、ＰＲＰおよびゼラチンからなるハイドロゲルを含む徐放製剤を提供する。本発明にしたがって、ＰＲＰをゼラチンハイドロゲルに含浸させた粒子を病巣に局所投与して徐放させることにより、血管新生および骨新生の有意な促進効果が得られる。
【０００７】
別の観点においては、本発明は、多血小板血漿およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなることを特徴とする、血管新生を促進するための医薬組成物、骨新生を促進するための医薬組成物、創傷を治療するための医薬組成物、ならびに皮膚潰瘍を治療するための医薬組成物を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で使用されるゼラチンは、牛、豚、魚類などを始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの身体のあらゆる部位から採取できるコラーゲン、あるいはコラーゲンとして用いられている物質から、アルカリ加水分解、酸加水分解、および酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。ゼラチンの性質は、用いる材料および処理方法により様々であるが、そのいずれの性質をもつゼラチンも本発明においてＰＲＰの徐放のためのハイドロゲル材料として利用することができる。
【０００９】
ゼラチンの性質を表す尺度としては、例えば、等電点、分子量、ジータ電位などがある。例えば、市販のゼラチンとしては、シグマ社製タイプＡゼラチン、和光社製ゼラチンがあり、水溶液中のジータ電位が以下のとおりである：
シグマ社製タイプＡゼラチン：約０〜約５ｍＶ
和光社製ゼラチン：約−５〜約−２ｍＶ
ジータ電位は、物質（ゼラチン）の静電的な荷電の程度を表す尺度である。
【００１０】
本発明において用いるのに特に好ましいゼラチンは、以下の物性：
コラーゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンであり、
分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの非還元条件下で約１０〜約２０万ダルトンであり、
水溶液中のジータ電位が、約−１５〜約−２０ｍＶである
を有するゼラチンである。また好ましくは、ウシの骨由来のＩ型コラーゲンをアルカリ処理して調製した酸性ゼラチンを用いることができ、新田ゼラチン社の試料等電点（ＩＥＰ）５．０として入手することもできる。なお、酸処理して調製した塩基性ゼラチンは同じく新田ゼラチン社の試料ＩＥＰ９．０として入手することができるが、ジータ電位は以下のように大きく相違する。
酸性ゼラチン　（新田ゼラチン社試料ＩＥＰ５．０）：約−１５〜約−２０ｍＶ
塩基性ゼラチン　（新田ゼラチン社試料ＩＥＰ９．０）：約＋１２〜約＋１５ｍＶ
【００１１】
本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルとは、上記ゼラチンを用いて種々の化学的架橋剤とゼラチン分子間に化学架橋を形成させて得られるハイドロゲルのことである。化学的架橋剤としては、例えばグルタルアルデヒド、例えばＥＤＣ等の水溶性カルボジイミド、例えばプロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基などの間に化学結合を作る縮合剤を用いることができる。好ましいものは、グルタルアルデヒドである。また、ゼラチンは、熱処理又は紫外線照射によっても化学架橋することができる。また、これらの架橋処理を組み合わせて用いることもできる。さらに、塩架橋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用などを利用した物理架橋によりハイドロゲルを作製することも可能である。
【００１２】
ゼラチンの架橋度は、所望の含水率、すなわちハイドロゲルの生体吸収性のレベルに応じて適宜選択することができる。ゼラチンハイドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度の好ましい範囲は、ゼラチン濃度１〜２０ｗ／ｗ％、架橋剤濃度０．０１〜１ｗ／ｗ％である。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、０〜４０℃、１〜４８時間で行うことができる。一般に、ゼラチンおよび架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。
【００１３】
ゼラチンハイドロゲルの形状は、特に制限はないが、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状などがある。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、通常埋込片として用いられることが多く、あるいは細かく砕いて粒子状にして用いることも可能である。また、球状、粒子状、ペースト状のものは注射投与も可能である。
【００１４】
円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のゼラチンハイドロゲルは、ゼラチン水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、あるいは、架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、所望の形状の鋳型に流し込んで、架橋反応させることにより調製することができる。また、成形したゼラチンゲルにそのまま、あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋反応を停止させるには、エタノールアミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいは、ｐＨ２．５以下の水溶液を添加する。反応に用いられた架橋剤および低分子物質を完全に除去する目的で、得られたゼラチンハイドロゲルは、蒸留水、エタノール、２−プロパノール、アセトン等により洗浄し、製剤調製に供される。
【００１５】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルは、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、ＥＹＥＬＡ　ｍｉｎｉＤ．Ｃ．　スターラー等）とテフロン（登録商標）用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置にゼラチン溶液を入れ、ここにオリーブ油等の油を加えて２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンとし、これに架橋剤水溶液を添加するか、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中にて前乳化（例えば、ボルテックスミキサーＡｄｖａｎｔｅｃ　ＴＭＥ−２１、ホモジナイザー、ｐｏｌｙｔｒｏｎ　ＰＴ１０−３５等を用いて）しておいたものをオリーブ油中に滴下し、微粒子化したＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加して架橋反応させ、遠心分離によりゼラチンハイドロゲルを回収した後、アセトン、酢酸エチル等で洗浄し、さらに２−プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋反応を停止させることにより、調製することができる。得られたゼラチンハイドロゲル粒子は、２−プロパノール、Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄し、製剤調製に供される。ゼラチンハイドロゲル粒子が凝集する場合には、例えば、界面活性剤などの添加あるいは超音波処理（冷却下、１分以内程度が好ましい）等を行ってもよい。
【００１６】
得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は、上述の粒子作製時におけるゼラチン濃度、ゼラチン水溶液とオリーブ油との体積比、および撹拌スピードなどにより変化する。一般には粒径は１〜１０００μｍであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。さらに、前乳化することによって、粒子サイズが２０μ以下の微粒子状のゼラチンハイドロゲルを得ることができる。
【００１７】
球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルを調製する別法として以下の方法も挙げられる。上記の方法と同様の装置にオリーブ油を入れ、２００〜６００ｒｐｍ程度の速度で攪拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下してＷ／Ｏ型エマルジョンを調製し、これを冷却後、アセトン、酢酸エチル等を加えて攪拌し、遠心分離により未架橋ゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子を、さらにアセトン、酢酸エチル等、次いで２−プロパノール、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。この乾燥ゼラチン粒子を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１００ｍＭグリシン水溶液又は０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む０．００４Ｎ　ＨＣ１等にて洗浄し、架橋反応を停止することによりゼラチンハイドロゲル粒子を調製することができる。本法で得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は上記の方法の場合と同様である。
【００１８】
本発明のゼラチンハイドロゲルは適宜、適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンハイドロゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で３０分以上、又は−８０℃で１時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で１〜３日間乾燥させることにより行うことができる。
【００１９】
本発明で使用されるＰＲＰは、末梢血を低速で遠心分離して、赤血球成分を除去することにより容易に得ることができる。当業者は、用いる遠心分離器の種類に応じて、血球成分を効率的に除去する回転数および時間を適宜選択することができる。さらに、血球成分を除去した後、再度遠心分離することにより血小板を濃縮してもよい。あるいは、膜を用いる血液分離装置により調製することもできる。本発明のＰＲＰ含有徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、例えば、上記の凍結乾燥した酸性ゼラチンハイドロゲルにＰＲＰを滴下するか、あるいはゼラチンをＰＲＰ中に浸漬させ、ハイドロゲル内にＰＲＰを含浸させることにより得ることができる。この含浸操作は、通常、４−３７℃で１５分間−１時間、好ましくは４−２５℃で１５−３０分間で終了し、その間にハイドロゲルはＰＲＰで膨潤し、ＰＲＰ中に含まれるの有効成分がゼラチン分子と相互作用することによって、有効成分がゼラチン分子と複合体を形成し、ＰＲＰがゼラチンハイドロゲル内に物理的相互作用によって固定される。ＰＲＰとゼラチンとの間の複合体の形成には、両者の間の静電的相互作用だけでなく、疎水結合、水素結合等の他の相互作用も大きく寄与していると考えられる。
【００２０】
ゼラチン（乾燥重量）に対するＰＲＰの重量比は約１倍から約１００００倍の範囲内であることが好ましい。より好ましくは、ゼラチンに対してＰＲＰは約２倍から約５０００倍の重量比であり、さらに好ましくは約１０倍から約１０００倍の重量比である。
【００２１】
本発明のＰＲＰ徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、ＰＲＰの徐放性効果と安定化効果を持つため、ＰＲＰに含まれる各種成長因子等の有効成分の機能を少量で長時間にわたって発揮し得る。そのため、局所投与した部位において、これらの有効成分の血管新生促進機能および骨新生機能が効果的に発揮される。
【００２２】
この徐放のメカニズムは、ＰＲＰに含まれる各種成長因子等の有効成分が、ハイドロゲル内のゼラチンに物理的に固定化されていることに基づく。本発明者らは、これまで、成長因子、サイトカイン、モノカイン、リンホカイン、その他の生理活性物質などの生体吸収性高分子ハイドロゲルを用いた徐放化を試み、これにより他の材料では達成できない生理活性を有した有効成分の徐放化とその徐放期間のコントロールに成功してきた。本発明においては、ＰＲＰに含まれる有効成分が同様のメカニズムによってハイドロゲルから徐放されると考えられる。ゼラチンハイドロゲルに固定化された状態では、有効成分はハイドロゲルから放出されない。生体内でハイドロゲルが分解されるにつれて、ゼラチン分子が水可溶性となり、それに伴って、ゼラチン分子に固定化されている有効成分が放出されるようになる。すなわち、ハイドロゲルの分解によって、有効成分の徐放性を制御することができる。ハイドロゲルの分解性は、ハイドロゲル作製時における架橋程度を調節することにより変えることができる。また、ＰＲＰに含まれる各種成長因子等の有効成分がゼラチンと相互作用することによって、これらの生体内での安定性、例えば酵素分解抵抗性などが向上する。
【００２３】
本発明のゼラチンハイドロゲルの架橋度を評価する指標として含水率がある。これは膨潤ハイドロゲルの重量に対するハイドロベル中の水の重量パーセントである。含水率が大きければハイドロゲルの架橋度は低くなり、分解されやすくなる。つまり、この含水率の値がＰＲＰの徐放（徐々に放出）を左右する。ハイドロゲルの生体内での酵素分解性は、この含水率によって変化する。体内の場所、動物の種類によって多少の差はあるが、分解期間が５日間から３か月間で分解するハイドロゲルの含水率は９９−８５ｗｔ％である。ハイドロゲルの分解期間はＰＲＰの徐放期間と一致するため、この場合の徐放期間も５日間から３か月の間で変化する。好ましい徐放性効果を示す含水率としては約８０〜９９ｗ／ｗ％であり、さらに好ましいものとしては、約９５〜９８ｗ／ｗ％のものが挙げられる。
【００２４】
本発明のＰＲＰゼラチンハイドロゲル製剤は、薬学的に許容しうる水性注射溶液中に懸濁させることにより、注射用製剤として非経口的に使用することができる。例えば、皮下、筋肉内、静脈内、体腔内、結合組織内、骨内膜あるいは障害臓器等に投与することができる。
【００２５】
本発明のＰＲＰ徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤あるいはその複合体は、それぞれの用途に応じて適宜剤型を工夫することができる。例えば、シート状、スティック状、粒子状、ロッド状、ペースト状の剤型にして投与することができる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与、結合組織内投与、骨内膜投与などが考えられる。
【００２６】
本発明の徐放製剤中のＰＲＰの用量は、疾患の重篤度、患者の年齢、体重等により適宜調製することができるが、通常成人患者当たり約０．１〜約５００ｍｌの範囲、好ましくは、約１〜約５０ｍｌの範囲から投与量が選択され、これを患部またはその周辺部位に注入することができる。また１回の投与で効果が不十分であった場合は、該投与を複数回行うことも可能である。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００２８】
実施例１．ＰＲＰ含有ゼラチンハイドロゲルの作製
酸性ゼラチン（等電点５．０）は、新田ゼラチン（大阪）から入手した。また、フィブリンはＴｉｓｓｅｅｌ（（登録商標））（Ｂａｘｔｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用した。その他の試薬は特に精製せずに用いた。ゼラチン２．５ｇと蒸留水４７．５ｇをビーカーに入れ、３０分間室温で撹拌した。その後、４０℃に加温しながら、さらに３０分間撹拌し、５ｗｔ％ゼラチン水溶液を作製した。新しいビーカーにこのゼラチン水溶液を４０ｍｌ入れ、撹拌しながら７０μｌのグルタルアルデヒド水溶液を滴下した。すぐに反応溶液をポリエチレンディッシュ（８×８ｃｍ２）に流延して、アルミホイルで蓋をして、４℃、２４時間架橋反応させた。得られたゼラチンハイドロゲルを適当な大きさに切り、０．１Ｍグリシン水溶液に入れて、室温で１時間撹拌することにより未反応のアルデヒド基をブロックした。その後、蒸留水中で室温で１時間撹拌を２回行い、−８０℃の冷凍庫において２４時間凍結した。凍結後、凍結乾燥を行い、インビボ実験に用いる前にエチレンオキサイドガスによるガス滅菌を行った。得られたハイドロゲルの含水率は９８ｗｔ％であった。なお、含水率は膨潤時のハイドロゲル重量に対するハイドロゲル内の水の量のパーセンテージで表す。
【００２９】
実施例２．血管新生に及ぼす効果の評価
実験モデルとして体重２５０−３００ｇの雄性ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットを用いた。０．２ｍｌペントバルビタール（ネンブタール（登録商標）、大日本製薬、大阪）の腹腔投与による全身麻酔を行った。麻酔奏効確認後、腹部皮下に５ｗｔ％ブドウ糖液５ｍｌを注射した。その後、大腿部にＮｏ．１０のメスで約１ｃｍの切開を行った。大腿動・静脈を露出し、同血管から２４ゲージ留置針と５ｍｌシリンジにて血液を４．５ｍｌ採血した。このとき、注射筒にはあらかじめ血液抗凝固液としてＡＣＤ液（２．２ｗｔ％クエン酸ナトリウム、０．８ｗｔ％クエン酸、２．２ｗｔ％ブドウ糖）を０．５ｍｌ入れておいた。採血した血液を１０ｍｌ遠沈管に入れ、遠心器にて２４００ｒｐｍで１０分間の遠心を行った。遠心終了後、血清成分と血球成分に分離するので、血清成分のみを１８ゲージ注射針と５ｍｌシリンジにて採取し、新しい１０ｍｌ遠沈管に入れ、３５００ｒｐｍで１５分間、再度遠心した。遠心終了後、遠沈管下方に溜まったＰＲＰを１８ゲージ注射針と１ｍｌシリンジにて採取した。
【００３０】
凍結乾燥ゼラチンハイドロゲル７ｍｇにＰＲＰ６００ｍｇを滴下し、室温で１５分間静置し、ＰＲＰを十分に含浸させることにより、ＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。フィブリン（Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標））の調製は製造元の指針にしたがって行い、凝固する直前にＰＲＰを混合した。このフィブリン糊とＰＲＰとの混合は従来より行われている方法であり、比較試験として行った。
【００３１】
ラット背部に７０％エタノールの噴霧にて消毒した後、同部をバリカンにて剃毛を行い、手術台に乗せて上肢、下肢を固定した。背部をイソジンにて消毒後、Ｎｏ．１０のメスで約２ｃｍの皮膚切開を行った。その後、皮膚と筋層を剥離剪刀にて約１．５ｃｍ×１．５ｃｍ剥離した。同様の剥離を合計４箇所行い、以下のものを留置した。
１．ＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲル
２．フィブリンとＰＲＰの混合物（ＰＲＰ含有フィブリン糊）
留置後、皮膚を３−０絹糸にて縫合し、最後に創部をイソジンにて消毒した。
【００３２】
１週間後に創部を観察することにより血管新生の程度を評価した。結果を図１に示す。ＰＲＰ含浸ゼラチン埋入部位周辺には血管新生が見られている。これに対して、従来法であるＰＲＰフィブリン糊では、血管新生は見られるものの軽微であった。なお、同量のＰＲＰを投与した場合には、血管新生は全く認められなかった（図には示されていない）。また、顕微鏡下に単位面積あたりの新生血管の数を測定した。結果を図２に示す。これらの結果は、ゼラチンハイドロゲルによりＰＲＰが徐放化され、その生物活性が有効に発現されたことを示す。
【００３３】
実施例３．骨新生に及ぼす効果の評価
実験モデルとして、体重３−４ｋｇのニュージーランドホワイトラビットを用いた。ケタミン（ケタラール（登録商標）、三共、東京）３ｍｌ、キシラジン（セラクタール（登録商標）、バイエル、東京）１．５ｍｌの臀部筋肉注射により全身麻酔を行った。麻酔奏効確認後、背部皮下に５ｗｔ％ブドウ糖液１０ｍｌを注射した。その後、耳部の動脈より２２ゲージ留置針と１０ｍｌシリンジにて血液を９ｍｌ採血した。このとき、注射筒にはあらかじめ血液抗凝固液としてＡＣＤ液（２．２ｗｔ％クエン酸ナトリウム、０．８ｗｔ％クエン酸、２．２ｗｔ％ブドウ糖）を１．０ｍｌ入れておいた。採血した血液を１０ｍｌ遠沈管に入れ、遠心器にて２４００ｒｐｍで１０分間の遠心を行った。遠心終了後、血清成分と血球成分に分離するので、血清成分のみを１８ゲージ注射針と５ｍｌシリンジにて採取し、新しい１０ｍｌ遠沈管に入れ、３５００ｒｐｍで１５分間、再度遠心した。遠心終了後、遠沈管下方に溜まったＰＲＰを１８ゲージ注射針と１ｍｌシリンジにて採取した。
【００３４】
凍結乾燥ゼラチンハイドロゲル２０ｍｇにＰＲＰ１．５ｇを滴下し、室温で１５分間静置し、ＰＲＰを十分に含浸させることにより、ＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。フィブリン（Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標））の調製は製造元の指針にしたがって行い、凝固する直前にＰＲＰを混合した。
【００３５】
家兎両側前腕（前足）の第一関節から第二関節まで７０％エタノールの噴霧にて消毒した後、同部をバリカンにて剃毛を行い、手術台に乗せて右側上腕を固定した。手術部位をイソジンにて消毒後、Ｎｏ．１０のメスで肘関節から約４ｃｍの点を中心点とした約２ｃｍの皮膚切開を行った。その後、筋層を剥離子にて剥離し尺骨を露出させ、尺骨の骨膜をＮｏ．１５のメスにて切開し、骨膜剥離子にて骨膜を剥離し、筋組織および骨膜を開創器にて固定した。肘関節から約４ｃｍの点にエアータービンバーを用いて印を入れ、その点から遠位に１ｃｍの点の骨を生理食塩水注入下にてエアータービンバーを用いて削った。同様に、同点から近位に１ｃｍの点の骨を生理食塩水注入下にてエアータービンバーを用いて削り、２ｃｍの骨を尺骨から切り離した。無鈎鑷子にて切り取った骨を摘出し、骨欠損部を生理食塩水にて十分に洗浄し、同部に以下のものを留置した。
１．ＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲル
２．フィブリンとＰＲＰの混合物（ＰＲＰ含有フィブリン糊）
留置後、尺骨周囲の筋組織を５−０プロリン糸にて縫合し、皮膚を３−０絹糸にて縫合し、最後に創部をイソジンにて消毒した。
【００３６】
４週間後に、軟Ｘ線観察を行うことにより、骨欠損部における骨新生の程度を評価した。結果を図３に示す。ＰＲＰ含有ゼラチンを用いた実験群においては、骨欠損部における骨新生が認められた。これに対して、ＰＲＰ含浸フィブリン糊実験群では骨再生がほとんど見られなかった。なお、骨欠損部に等量のＰＲＰを投与した場合には、骨再生は全く見られなかった（図には示していない）。これらの結果は、ゼラチンハイドロゲルによるＰＲＰの徐放化により、ＰＲＰの骨再生能の発現が増強されたことを示す。
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したラットにおける血管新生を示す写真図面である。
【図２】図２は、本発明のＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したラットにおける血管新生を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のＰＲＰ含浸ゼラチンハイドロゲルを投与したウサギ尺骨骨欠損部における骨新生を示すＸ線写真図面である。
【図１】
2004123576.tif 000002
【図２】
2004123576.tif 000003
【図３】
2004123576.tif 000004