(57)【要約】  【課題】変異GPR10遺伝子を含むコンジェニックラットなど、並びにGPR10蛋白の活性を抑制する化合物のスクリーニング方法およびうつ病もしくは不安の処置に用いられる化合物のスクリーニング方法を提供する。  【解決手段】変異GPR10遺伝子を含むコンジェニックラットであって、OLETFラット(ATCC No. 72016)と野生型ラットとの交配により得られ、野生型ラットと対比して強制水泳試験によるアッセイの結果延長された無動時間を示し且つ高架式十字迷路試験によって抗不安行動を示すことを特徴とするコンジェニックラット、その組織または細胞或いはそれらの培養物、変異GPR10遺伝子をコードする単離されたDNA分子およびその断片、GPR10蛋白の活性を抑制する化合物のスクリーニング方法、並びにうつ病もしくは不安の処置に用いられる化合物のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異GPR10遺伝子を含むコンジェニックラットであって、オオツカ・ロングエバンス・トクシマ・ファッティ・ラット(OLETFラット、ATCC No. 72016)と野生型ラットとの交配により得られ、野生型ラットと対比して強制水泳試験におけるアッセイの結果、延長された無動時間を示し且つ該野生型ラットに比して高架式十字迷路試験において抗不安行動を示すことを特徴とするコンジェニックラット。
【請求項２】
変異GPR10遺伝子が、配列番号:2のDNA配列から実質的になるものである請求項1に記載のコンジェニックラット。
【請求項３】
野生型ラットが、配列番号:1のDNA配列を有するGPR10遺伝子を含むものである請求項1に記載のコンジェニックラット。
【請求項４】
OLETFラットが、変異GPR10遺伝子を含むものである請求項1に記載のコンジェニックラット。
【請求項５】
請求項1に記載のコンジェニックラットから得られる組織または細胞であって、該組織または細胞が、該変異GPR10遺伝子を発現するものである組織または細胞。
【請求項６】
請求項5に記載の細胞の培養物。
【請求項７】
配列番号:7または9のアミノ酸配列から実質的になる変異GPR10蛋白をコードする単離されたDNA分子。
【請求項８】
配列番号:2または5のDNA配列から実質的になるDNA分子である請求項7に記載のDNA分子。
【請求項９】
配列番号:10のアミノ酸配列から実質的になるヒトGPR10の単離された断片。
【請求項１０】
GPR10蛋白の活性を抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)供試化合物と
(i)請求項1に記載のコンジェニックラット、および
(ii)請求項1に記載の野生型ラットとを接触させること、および
(b)得られるラット(i)および(ii)におけるGPR10活性をアッセイすることを含み、
該活性が、該ラット(i)および(ii)において相違する場合に、該供試化合物をGPR10蛋白の活性を抑制する化合物と同定するものである方法。
【請求項１１】
GPR10活性が、強制水泳試験における抑制または高架式十字迷路試験における恐怖および不安である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
GPR10蛋白の活性を抑制する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)供試化合物と
(i)請求項5に記載の組織または細胞、或いは請求項9に記載の単離された蛋白および
(ii)野生型GPR10蛋白を発現する野生型ラットから得られる組織または細胞、或いは野生型GPR10蛋白とを、それぞれ接触させること、および
(b)得られる(i)および(ii)の組織または細胞、或いは単離された蛋白におけるGPR10活性をアッセイすることを含み、
該活性が、該組織または細胞、或いは単離された蛋白(i)および(ii)において相違する場合に、該供試化合物をGPR10蛋白の活性を抑制する化合物と同定するものである方法。
【請求項１３】
GPR10蛋白の活性が、競合法において測定されるPrRPの結合であるかまたはアラキドン酸代謝産物の遊離である請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
うつ病もしくは不安の処置に用いられる化合物のスクリーニング方法であって、
(a)請求項10もしくは12に記載されたように同定された供試化合物をGPR10活性を抑制する化合物として、うつ病または不安を被っている哺乳動物に投与すること、および
(b)うつ病もしくは不安の処置に用いられる化合物を同定するために、得られる哺乳動物における該うつ病もしくは不安の改善をアッセイすることを含む方法。
Ｗｉ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、切断された形態のGPR10、即ち野生型GPR10のNH2-末端に存在する最初の64アミノ酸が切断された形態のGPR10を発現するコンジェニックラットに関する。また、本発明は、上記切断された形態のGPR10に結合するかまたは該GPR10の機能もしくは発現を調節する化合物であって、それ故、例えばうつ病、不安等の精神病の処置に有用な化合物を同定するためのインビトロ(in vitro)スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
OLETFラット(オオツカ・ロングエバンス・トクシマ・ファッティ・ラット、Otsuka Long Evans Tokushima Fatty rats)は、肥満、異脂肪血症および糖尿病の進展のメカニズムの研究に有用な動物モデルである（非特許文献1）。
【０００３】
全遺伝子の量的形質遺伝子座(QTL)分析は、OLETFラットにおける肥満、異脂肪血症およびII型糖尿病表現型に関連するDmo1からDmo12と名付けられた12の統計学的に有意なQTLを同定している。ラット第一番染色体長腕の遠位部位上に局在するDmo1は、体重、内臓脂肪重量および血漿トリアシルグリセロールレベルに強い影響を示す（非特許文献2;非特許文献3;および非特許文献4）。
【０００４】
Dmo1遺伝子座のためのコンジェニックな系統は、ブラウン-ノルウェー(Brown-Norway; BN)(非特許文献5)およびフィッシャー(Fischer 344; F344)ラット系統(非特許文献6)に由来する非糖尿病性Dmo1対立遺伝子を、OLETFラットバックグラウンドに導入することによって、既に確立されている。確立されたコンジェニックな系統は、非糖尿病性Dmo1対立遺伝子についてヘテロ接合型であり、各世代において、肥満、異脂肪血症、高インスリン血症、高グリセロール血症およびグルコース不寛容表現型において有意な改善を示す。
【０００５】
OLETF Dmo1対立遺伝子の両方がF344-由来対立遺伝子に置き換えられたコンジェニックな系統もまた生み出されている（非特許文献7、この文献全体を本明細書に参考として組み込む。）。これらのホモ接合型Dmo1-F344/F344コンジェニックラットは、体重、腹部脂肪重量、血中トリアシルグリセロール、総コレステロール、食餌量およびグルコース負荷後の血液グルコースにおいて、Dmo1-OLETF/OLETF動物と比較して、有意な減少を示す。
【０００６】
肥満、異脂肪血症、高インスリン血症および高グリセロール血症にとって重要な遺伝子の位置を見つけるために、本発明者は、OLETFバックグラウンドに非糖尿病性Dmo1ドメインを導入したコンジェニックラットを創製した。肥満および高脂血症における変化を観察することによって、ドメイン領域を狭めた後、ポジショナルクローニングおよびホジショナル候補アプローチ(positional candidate approch)を利用して、一つの変異(NH2-末端切断)GPR10を見出した。
【０００７】
GPR10は、染色体DNAライブラリー(非特許文献8)のスクリーニングによって同定されたG-蛋白結合レセプターである。また、プロラクチン遊離ペプチド(PrRP)は、GPR10の内在性リガンドである(非特許文献9)。GPR10は、視床下部、前下垂体および副腎髄質に豊富に発現される一方、PrRPは、主として視床下部、延髄および腸に発現される(非特許文献10)。PrRP神経細胞は、脳全体を通じて広く散在している。例えば室傍核(paraventricular nucleus; PVN)、視索上核(supraoptic nucleus; SON)に散在している。その散在パターンはPrRPが脳機能の多様性に含まれることを示唆している(非特許文献11)。PrRPのラットへの投与は、食餌摂取量および体重の減少(非特許文献12)、血漿オキシトシンの増加(非特許文献13)およびACTHの増加(非特許文献14)、並びに覚醒の推進(非特許文献15)を引き起こすことが認めている。
【０００８】
本発明においては、変異GPR10 (OLETF型)ドメインを、BNバックグラウンドに導入することによって、コンジェニックラットが創製される。変異GPR10コンジェニックラットが、正常BNラットと対比して、有意なうつ病および抗不安活性を示すが、肥満および高脂血症は示さないことは、驚くべき発見である。
【非特許文献１】Diabetes, 41: 1422 (1992)
【非特許文献２】Mamm. Genome, 9: 419 (1998)
【非特許文献３】Genomics, 58: 233 (1999)
【非特許文献４】Genomics, 62: 350 (1999)
【非特許文献５】Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 28: 28 (2001)
【非特許文献６】Genet. Res., 77: 183 (2001)
【非特許文献７】Diabetes Obes. Metab., 4: 309 (2002）
【非特許文献８】Genomics, 29: 335 (1995)
【非特許文献９】Nature, 393: 272 (1998)
【非特許文献１０】Endocrinol., 140: 5736 (1999)
【非特許文献１１】Neuroendocrinol., 71: 262 (2000)
【非特許文献１２】Nat. Neurosci., 3: 645 (2000)
【非特許文献１３】Neurosci. Lett., 276: 193 (1999)
【非特許文献１４】Neurosci. Lett., 285: 234 (2000)
【非特許文献１５】Psychiatry Clin. Neurosci., 54: 262 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、変異GPR10遺伝子を含むコンジェニックラット、該ラットから得られる組織または細胞、該細胞の培養物、変異GPR10遺伝子をコードする単離されたDNA分子、ヒトGPR10の単離された断片、GPR10蛋白の活性を抑制する化合物のスクリーニング方法、およびうつ病もしくは不安の処置に用いられる化合物のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、特に、GPR10の変異型を類遺伝子的に発現するブラウン-ノルウェー(BN)ラットに関する。該変異は野生型GPR10のNH2-末端に存在する最初の64のアミノ酸の切断である。野生型および切断されたGPR10を発現する同種ラット間の生物化学的、生理学的および行動性の相違は、GPR10の新規な機能的役割およびヒトの疾患に対するGPR10の強い病理学的関連性を同定するための有用なツールである。
【００１１】
また、本発明は、変異GPR10に結合するかまたはその活性を調節する化合物の同定のためのインビトロ(in vitro)スクリーニング方法に関する。そのような化合物は、中枢神経系(CNS)疾患、例えば限定されるものではないが、うつ病、不安および精神分裂病の処置に有用であると信じられる。これらのスクリーニング方法は、本発明における次の発見を基礎としている。即ち、PrRPは野生型GPR10のNH2-末端の最初の64アミノ酸配列内の2つの高親和性ドメインに結合するという事実、およびこの結合サイトがGPR10に対するPrRPのアゴニスト活性のために臨界的であるという事実の発見を基礎としている。これらのことはPrRP結合の不在および切断されたGPR10クローンを発現している細胞における機能の不在によって証明される。
【００１２】
本発明においては、NH2-末端の生理学的関連が、GPR10の野生型および変異型を発現する各ラットを対比することによって示される。後者のラットは、抗うつ病薬および抗不安薬の活性を予測するために通常用いられる動物モデルに、うつ病様および抗不安様の行動を提示することが認められる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
一実施態様において、本発明は野生型GPR10よりもN-末端64アミノ酸の短い変異GPR10を産生するコンジェニックラットに関している。即ち、変異GPR10遺伝子を含むコンジェニックラットであって、該コンジェニックラットは、OLETF(Otsuka Long-evans Tokushima Fatty)ラット(ATCC No. 72016)と野生型ラットとの交配によって得られ、また、該コンジェニックラットは、該野生型ラットと比較して、強制水泳試験におけるアッセイにて延長された無動時間を示し、且つ高架式十字迷路試験にて抗不安行動を示す。
【００１４】
上記コンジェニックラットを得るために利用されるOLETFラットの受精卵は、米国特許第5,789,652号明細書に記載されている。該明細書全体を本明細書に参考として組み込む。該受精卵はアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATTC)に、ATCC No. 72016として寄託されている。
【００１５】
利用される野生型ラットは、本発明において特に限定されない。例えば、該野生型ラットは、BNラットまたはF344ラットである。
【００１６】
全遺伝子のスキャンは、OLETFラットにおける異脂肪血症および肥満のための主要な量的形質遺伝子座としてDmo1を同定している（Genomics, 58: 233-239 (1999)）。
【００１７】
BN-由来Dmo1遺伝子領域をOLETF遺伝子バックグラウンドに移入したコンジェニックラットは、OLETFラットの肥満、異脂肪血症および糖尿病に対する実質的な治療効果を示す(Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 28: 28-42 (2001)。Dmo1領域のポジショナルクローニングおよびホジショナル候補アプローチ(positional candidate approch)は、本発明において、GPR10をコードする配列における変異を同定した。該変異GPR10の新しい生物学的機能をサーチするために、本発明においては、他のコンジェニックラットを創製した。OLETF-由来遺伝子インターバルを、4連続戻し交配(N5)によってBN遺伝子バックグラウンドに導入し、次いで、ヘテロ接合型動物と、確立されたホモ接合型コンジェニックラットとを交雑させた。このコンジェニックラットは、OLETFラットに見られた肥満、異脂肪血症および糖尿病のような極端な異常現象は認められなかった。かくして、このコンジェニックラットは、コントロールラットと体重差がないことから、行動性試験に有用と考えられた。
【００１８】
変異GPR10遺伝子は、配列番号:2のDNA配列から実質的になる。
【００１９】
野生型ラットは、配列番号:1のDNA配列を有するGPR10遺伝子を含んでいる。
【００２０】
OLETFラットは、上記変異GPR10遺伝子を含んでいる。
【００２１】
本発明はまた、上記コンジェニックラットから得られる組織または細胞であって、上記変異GPR10遺伝子を発現する組織または細胞、並びに該細胞の培養物に関している。
【００２２】
更に、本発明は、配列番号:7または9のアミノ酸配列から実質的になる変異GPR10蛋白をコードする単離されたDNA分子、好ましくは配列番号:2または5のDNA配列から実質的になるDNA分子のそれぞれに関している。
【００２３】
加えて、本発明は、配列番号:10のアミノ酸配列から実質的になる変異GPR10の単離された断片に関している。
【００２４】
本明細書において、「遺伝子」なる語は、二本鎖DNAおよびその構成一本鎖DNAを意味し、センス鎖であるかまたはアンチセンス鎖であるかを問わず、また、その長さも問わない。従って、特に言及しない限り、本発明遺伝子(DNA)には、染色体DNAを含む二本鎖DNA、cDNAを含む一本鎖DNA(センス鎖)、該センス鎖に相補的な配列を有する一本鎖DNA(アンチセンス鎖)、およびこれらDNAの断片が含まれる。
【００２５】
本発明遺伝子(DNA)は、リーダ配列、コード領域、エキソンおよびイントロンを含む。ポリヌクレオチドには、RNAおよびDNAの両者が含まれる。DNAは、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを含む。蛋白質は、その断片を含む。
【００２６】
本発明遺伝子は、本明細書に開示された本発明遺伝子の全ての具体例についての配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造および単離することができる〔例えばMolecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編（1986）など参照〕。
【００２７】
具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)およびScience, 222, 778 (1983)〕。
【００２８】
上記方法に用いられるcDNAの起源としては、本発明遺伝子を発現する各種の細胞および組織と共に、これらに由来する培養細胞など、特に脳組織を例示することができる。これら起源からの全RNAの分離、mRNAの分離および精製、cDNAの取得とそのクローニングは、いずれも常法に従って実施することができる。また、cDNAライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらcDNAライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.Inc.）より市販されている各種cDNAライブラリーを用いて実施することもできる。
【００２９】
本発明の遺伝子をcDNAのライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。
【００３０】
具体的スクリーニング方法としては、例えばcDNAによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するcDNAクローンを選択する方法、目的のDNA配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、およびこれらの組合せなどを例示できる。
【００３１】
上記方法において用いられるプローブとしては、本発明遺伝子のヌクレオチド配列に関する情報をもとにして化学合成されたDNAが一般的に使用できる。既に取得された本発明遺伝子やその断片も、プローブとして利用することができる。また、本発明遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づき設定したセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００３２】
前記プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、部分ヌクレオチド配列であって、10個以上の連続しヌクレオチド、好ましくは20個以上の連続したヌクレオチド、より好ましくは30個以上の連続したヌクレオチド、最も好ましくは50個以上の連続したヌクレオチドを有するものであってもよい。
【００３３】
本発明の遺伝子の取得に際しては、PCR法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるDNA／RNA増幅法が利用できる。殊に、ライブラリーから全長のcDNAが得られ難いような場合には、RACE法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に5'-RACE法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕が採用できる。
【００３４】
かかるPCR法に使用されるプライマーは、本明細書に記載された本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って合成できる。増幅させたDNA／RNA断片の単離および精製は、前述した通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などによることができる。
【００３５】
例えばGPR10における変異は、PEアプライドバイオシステムズ社製のTaqMan PCR試薬キットから提供される試薬から得られる反応混合物を用いて、同社の仕様書の記載に従って、PCRによって検出できる。例えば、TaqManプローブ1 (配列番号：11)およびプローブ2 (配列番号：12)、およびフォワードプライマーGR-F1 (配列番号：13)およびリバースプライマーGR-R1 (配列番号：14)を用いてラットGPR10変異を検出できる。全反応容量は25μLである。主要な反応混合物は、24μLの容量を光学PCRチューブに分注することができる。ラット染色体DNA(1.0μL)は、次いで反応混合物(下記参照)中に添加され、完全に混合される。PCRの熱サイクルプログラムは、最初のサイクルが95℃で10分、次いで95℃で15秒および62℃で1分の40サイクルである。反応プレートはPEアプライドバイオシステムズ7700シークエンスディテクターに負荷され、GPR10の変異部位のヌクレオチド配列がアッセイされる。
PCR混合物
プローブ1 (0.4  pmol/μL)      2.5μL
プローブ2 (0.4  pmol/μL)      2.5μL
プライマー混合物 (各3.0μM)    2.5μL
Univ. Mix (2×)                3.125μL
2×RB                          9.375μL
染色体                         1.0μL
dH2O                            4.0μL
合計                          25μL
上記で得られる本発明遺伝子或いは各種DNA断片のシークエンシングは、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサム-ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、実施することができる。
【００３６】
例えば、このようにして得られる本発明遺伝子を用いて、該遺伝子の一部または全部のヌクレオチド配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。
【００３７】
かかる検出は常法に従って行うことができ、例えばRT-PCR〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; Kawasaki, et al., "Amplification of RNA". In PCR Protocol: A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27頁 (1991)〕によるRNA増幅、ノーザンブロッティング分析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ RT-PCR〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕またはin situ ハイブリダイゼーションを利用した細胞レベルでの測定、NASBA法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕およびその他の通常の各種方法を挙げることができる。好ましい検出方法としては、RT-PCRによる検出法を挙げることができる。
【００３８】
PCR法を採用する場合に用いられるプライマーとしては、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限はなく、本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。通常プライマーとしては、約10〜35程度のヌクレオチド、好ましくは約15〜30ヌクレオチド程度の長さを有する本発明遺伝子の部分配列を有するものを挙げることができる。
【００３９】
このように、本発明の遺伝子には、本発明遺伝子を検出するための特異プライマーおよび／または特異プローブとして使用されるDNA断片もまた包含される。
【００４０】
当該DNA断片は、本発明遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドと定義することができる。上記ストリンジェントな条件としては、プライマーまたはプローブとして用いられる通常の条件を挙げることができ、特に制限はされないが、例えば、6×SSC中、65℃一夜の条件、または50%ホルムアミド中、4×SSC、37℃、一夜の条件を例示することができる。
【００４１】
本発明遺伝子を通常の遺伝子工学的手法に適用することにより、該遺伝子の発現産物（ポリペプチド）またはこれを含む蛋白質を容易に大量に、安定して製造することができる。
【００４２】
従って本発明は、更に、本発明遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド(本発明の発現産物)、該ポリペプチドの製造のための、本発明遺伝子を含有するベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、および該宿主細胞を培養する本発明ポリペプチドの製造方法をも提供する。
【００４３】
本発明ポリペプチドの具体的態様としては、示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド(GPR10蛋白)を挙げることができる。
【００４４】
本発明ポリペプチドは、本発明により提供される遺伝子の配列情報に基づいて、通常の遺伝子組換え技術〔例えば、Science, 224: 1431 (1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)参照〕に従って調製することができる。
【００４５】
より詳細には、該ポリペプチドの製造は、所望蛋白をコードする遺伝子の宿主細胞中での発現を許容する組換えDNA（発現ベクター）を作成し、該ベクターを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物からポリペプチドを回収することにより行われる。
【００４６】
上記宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。原核生物の宿主としては、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)および他の通常の細菌類が広く用いられる。好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12株を例示できる。真核生物の宿主細胞には、脊椎動物および酵母の細胞が含まれる。前者としては、例えばサルの細胞系統であるCOS細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕などが挙げられる。後者としては、サッカロミセス属酵母細胞が好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００４７】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびSD（シャイン・アンド・ダルガーノ）ヌクレオチド配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばATG）を付与した発現プラスミドを利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13などが用いられる。しかしながら、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばpGEX-4T（Amersham Pharmacia Biotech社）、pMAL-C2，pMAL-P2（New England Biolabs社）、pET21，pET21/lacq（Invitrogen社）およびpBAD/His（Invitrogen社）を例示できる。
【００４８】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有するものを用いることができる。このベクターは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの具体例としては、SV40の初期プロモーターを保有するpSV2dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕を例示することができる。上記以外にも、既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるベクターの市販品としては、例えばpEGFP-N，pEGFP-C（Clontech社）、pIND（Invitrogen社）、pcDNA3.1/His（Invitrogen社）などの動物細胞用ベクター、およびpFastBac HT（Invitrogen社）、pAcGHLT（PharMingen社）、pAc5/V5-His，pMT/V5-HisおよびpMT/Bip/V5-his（以上Invitrogen社）などの昆虫細胞用ベクターを挙げることができる。
【００４９】
酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するpAM82〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕を例示することができる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、pPICZ（Invitrogen社）およびpPICZα（Invitrogen社）が包含される。
【００５０】
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、トリプトファン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、PL/PRプロモーターなどを利用することができる。宿主がバチルス属菌である場合は、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが好ましく利用できる。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、pH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどを利用することができる。動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、SV40-由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびSRαプロモーターを例示することができる。
【００５１】
本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも利用することができる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白として発現させるためのpGEX（Promega 社）を例示することができる。
【００５２】
成熟ポリペプチドをコードする配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列には、分泌配列、リーダ配列、およびマーカー配列(ヘキサヒスチジンタグ、ヒスチジンタグ)が含まれる。該マーカー配列は、細菌宿主の場合は融合成熟ポリペプチドの精製に使用される。哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン(HA)タグであってもよい。
【００５３】
本発明はまた、後記実施例1-2に記載するように、ラットおよびヒトGPR10並びに変異GPR10をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関している。
【００５４】
所望の組換えDNA（発現ベクター）の宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００５５】
得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した本発明遺伝子によりコードされる目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
【００５６】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用できる。培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００５７】
かくして得られる本発明の組換え蛋白質(GPR10蛋白質)は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第1版第1刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行; Biochemistry, 25(25): 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕により分離、精製できる。
【００５８】
そのような方法としては、通常の再構成処理法、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、およびこれらの組合せを例示することができる。特に好ましい方法としては、本発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーを例示することができる。
【００５９】
本発明ポリペプチドをコードする目的遺伝子の設計に際しては、該遺伝子のヌクレオチド配列を利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。
【００６０】
更に、遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸残基または部分配列は、置換、欠失または付加によって改変することができる。そのような改変は公知の各種の方法によりなし得る。例えばサイトスペシフィクミュータジェネシスによって上記改変を行い得る。
【００６１】
本発明ポリペプチドは、本明細書に示すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。
【００６２】
かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明蛋白質の合成は、上記2つの方法のいずれによって実施することも可能である。
【００６３】
上記ペプチド合成に採用される縮合法は、常法に従うことができる。該方法は、アジド法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、酸化還元法、DPPA（ジフェニルホスホリルアジド）法、DCC＋添加物（添加物：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、N-ヒドロキシサクシンアミド、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2，3-ジカルボキシイミドなど）法およびウッドワード法を含んでいる。
【００６４】
これら各方法に利用できる溶媒も、この種のペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（THF）、酢酸エチルなどおよびこれらの混合溶媒を挙げることができる。
【００６５】
上記ペプチド合成反応を実施するに当たって、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、メチルエステル、エチルエステル、第3級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、或いはベンジルエステル、p-メトキシベンジルエステル、p-ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルとして保護することができる。
【００６６】
側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第3級ブチル基などで保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、p-メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン-2-スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。
【００６７】
上記保護基を有するアミノ酸、ペプチドおよび最終的に得られる本発明蛋白質におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法または液体アンモニア/ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などの試薬を用いる方法に従って実施することができる。
【００６８】
かくして得られる本発明ポリペプチドは、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される各種の方法に従って、適宜精製を行うことができる。
【００６９】
本発明ポリペプチドは、その特異抗体を作成するための免疫抗原としても利用することができる。この抗原を利用することによって、抗血清（ポリクローナル抗体）およびモノクローナル抗体を取得することができる。
【００７０】
該抗体の製造法自体は、当業者によく理解されているところであり、本発明においてもこれら常法に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（1986）〕。
【００７１】
例えば、所望の抗血清を収得するための免疫動物としては、通常の動物、例えばラビット、モルモット、セット、マウス、ニワトリなどを適宜選択できる。免疫原を用いた免疫化および血液の採取もまた一般的な方法により実施することができる。
【００７２】
モノクローナル抗体の製造も、該免疫原で免役した動物の形質細胞(免疫細胞)と形質細胞腫細胞とのハイブリドーマの構築、所望抗体を産生するクローンの選択、および該クローンの培養を含む一般的な手法により実施することができる。
【００７３】
免疫動物は、一般には、これとの細胞融合に用いられる形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択される。通常マウスまたはラットが好ましい。免疫化方法は、前記抗血清の製造に用いられる方法と同じであることができる。必要なら、該免疫化は通常のアジュバントを用いて実施することができる。
【００７４】
上記ハイブリダイゼーションに用いられる形質腫細胞は、特に限定されるものではなく、各種のミエローマ細胞を含んでいる。マウスのミエローマ細胞株としては、p3 (p3X63-Ag8) (Nature, 256: 495-497 (1975))、p3-U1 (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81: 1-7 (1978))、NS-1 (Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976))、MPC-11 (Cell, 8: 405-415 (1976))、SP2/O (Nature, 276, 269-271 (1978))などが挙げられる。ラット由来のミエローマ細胞株としては、R210 (Nature, 277, 131-133 (1979)などが挙げられる。またそれらに由来する細胞であってもよい。
【００７５】
免疫細胞と細胞腫細胞との細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って、通常のハイブリダイゼーション促進剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)またはセンダイウイルス(HVJ)の存在下に行われる。また、目的とするハイブリドーマの分離もまた公知の方法に従い実施できる（Meth in Enzymol., 73: 3 (1981); 続生化学実験講座(同上))。
【００７６】
目的とする抗体産生細胞クローンの検索およびモノクローナル抗体の製造は、常法に従って実施することができる。例えば、抗体産生細胞クローンの検索は、本発明蛋白を抗原として利用して、抗体の検出に通常用いられる各種の方法、例えばELISA法(Meth. in Enzymol., 70: 419-439 (1980)、プラーク法、スポット法、凝集反応法、オクテロニー法(Ouchterlony method)、ラジオイムノアッセイ法などに従って行うことができる。
【００７７】
得られるハイブリドーマからの本発明抗体の収得は、該ハイブリドーマを常法に従って培養し、培養上清として抗体を回収する方法に従って、またはハイブリドーマを適合性のある哺乳動物に投与し、腹水として抗体を回収する方法に従って実施することができる。前者の方法は、高純度の抗体の収得に適しており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。産生された抗体は、更に通常の方法、例えば塩析、ゲル濾過法、アフィニティクロマトグラフィーなどに従って、精製することができる。
【００７８】
得られる抗体は、本発明GPR10蛋白との結合親和性を有することによって特徴づけられる。該抗体は、GPR10蛋白の精製および該蛋白の免疫学的手法による測定ないし識別に利用することができる。更に、この抗体はGPR10蛋白のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングにも利用することができる。
【００７９】
本発明は上述した新規な抗体をも提供するものである。
【００８０】
更に、本発明によれば、遺伝子の存在を検出するために、生物学的サンプル、例えば血液または血漿を調製し、必要に応じて核酸を抽出し、それを遺伝子のためにアッセイすることができる。
【００８１】
遺伝子の検出方法は、本発明遺伝子のDNA断片を製造し、これを該遺伝子および／またはその増幅物のスクリーニングのために用いるように設計することを含んでいる。より詳細には、例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などにおけるプローブとしての性質を有するもの、またはヌクレオチド配列をポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、増幅した本発明遺伝子の全部または一部のDNA断片を得るためのプローブとしての性質を有するものを作成できる。そのためにはまず遺伝子と同じ配列を持つプライマーを作成する。次いで、このプライマーをスクリーニング用プローブとして用いて、生物学的試料（核酸試料）と反応させることにより、当該遺伝子配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。該核酸試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製してもよい。
【００８２】
前記スクリーニング方法としては、特にPCR法を用いるのが感度の点から好ましい。該方法は、本発明遺伝子断片をプライマーとして用いる方法であればとくに制限されない。従って、従来公知の各種の方法(Science, 230: 1350-1354 (1985))や新たに開発され或いは将来使用されるPCR変法(榊 佳之、ほか編、羊土社、実験医学、増刊, 8 (9) (1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共立出版(株), 35 (17) (1990))のいずれも利用することが可能である。
【００８３】
プライマーとして使用されるDNA断片は、化学合成したオリゴDNAであり、これらオリゴDNAの合成は自動DNA合成装置など、例えばDNA合成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: ファルマシア社製)を使用して合成することができる。合成されるプライマー(センスプライマーまたはアンチセンスプライマー)の長さは約10〜30ヌクレオチド程度が好ましい。前記スクリーニングに用いられるプローブは、通常は標識したプローブであるが、非標識であってもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。適当な標識、並びにプローブおよびリガンドを標識する方法は、本発明の技術分野で知られている。例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングムおよびキナーゼ処理のような、既知の方法によって取り込ませることができる放射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体などがこれらの技術に包含される。
【００８４】
検出のために用いるPCR法としては、例えばRT-PCR法が例示されるが、当該分野で用いられる種々の変法を適応することができる。
【００８５】
また、上記アッセイ方法は、試料中の遺伝子の検出を行うための試薬キットを利用することによって、簡便に実施することができる。
【００８６】
故に、本発明は本発明遺伝子のDNA断片を含有する遺伝子検出用試薬キットを提供する。
【００８７】
該試薬キットは、ヌクレオチド配列もしくはその相補的ヌクレオチド配列の一部または全てにハイブリダイズするDNA断片を少なくとも必須構成成分として含んでおり、他の成分として、例えば標識剤およびPCR試薬（例えば、TaqDNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマーなど）を含むこともできる。
【００８８】
標識剤としては、放射性同位元素または蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられるが、DNA断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。更に当該試薬キットは、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などを含んでいてもよい。
【００８９】
前記方法を用いることにより、被検試料中から得られた遺伝子を直接的もしくは間接的にシークエンシングすることにより、野生型遺伝子と相同性の高い新たな遺伝子関連遺伝子を見出すことができる。
【００９０】
従って、本発明は被検試料中に含まれる遺伝子のアッセイおよびシークエンシングを行うことを含む、被検試料中のGPR10遺伝子関連遺伝子のスクリーニング方法をも提供するものである。
【００９１】
本発明GPR10遺伝子によってコードされる蛋白、該配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、これらの断片、もしくはこれらの蛋白に対する抗体を利用することによって、野生型GPR10および／または変異GPR10の測定が可能である。
【００９２】
従って、本発明は、抗-野生型GPR10および／または変異GPR10抗体の測定方法または該抗原の測定方法を提供するものである。該測定法によって、野生型GPR10(ポリペプチド)における変化から、脳神経障害の程度を検出することが可能である。かかる変化は、前述した慣用技術によるGPR10のシークエンシングによっても決定できる。より好ましくは、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、GPR10ポリペプチドにおける相違またはGPR10ポリペプチドの有無を検出することによって決定することができる。
【００９３】
以下、野生型および／または変異GPR10の測定の具体例につき詳述する。抗GPR10抗体は、血液もしくは血清などのヒトより採取した生物学的試料を含有する溶液からGPR10ポリペプチドを免疫沈降させるのに用いることができる。また、該抗体は、ウェスタンブロットまたはイムノブロットのポリアクリルアミドゲル上でGPR10ポリペプチドと反応させるのに用いることができる。該抗GPR10抗体を用いた免疫組織化学的技術によって、パラフィンまたは凍結組織切片中のGPR10ポリペプチドを検出することができる。抗体産生技術および精製技術は、当該分野においてよく知られているので、これらの技術を適宜選択することができる。
【００９４】
野生型GPR10またはその突然変異体を検出する方法に関連するより好ましい技術には、モノクローナル抗体および／または、ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)、放射線免疫検定法(RIA)、免疫放射線検定法(IRMA)および免疫酵素法(IEMA)が含まれる。
【００９５】
上述したように、本発明は、ラットおよびヒトのGPR10および変異GPR10をコードするヌクレオチド配列を含むベクター(例えば発現ベクターなど)をも提供するものである。
【００９６】
本発明コンジェニックラット(またはそれらの組織もしくは細胞)と野生型ラット(またはそれらの組織もしくは細胞)とを対比することによって、GPR10の生物学的機能を選別することが可能である。また下記(a)および(b)によってGPR10蛋白の活性を抑制する化合物を選別することが可能である。
(a)  供試化合物と(i)請求項1に記載のコンジェニックラットおよび(ii)請求項1に記載の野生型ラットとを接触させる、および
(b)  得られるラット(i)および(ii)におけるGPR10活性をアッセイする。
【００９７】
上記において、該活性が該ラット(i)および(ii)において相違する場合、該供試化合物はGPR10蛋白の活性を抑制する化合物であると同定される。
【００９８】
GPR10活性は、好ましくは、強制水泳試験における抑制であるかまたは高架式十字迷路試験における恐怖および不安である。
【００９９】
また、下記(a)および(b)によっても、GPR10蛋白の活性を抑制する化合物を選別することが可能である。
(a)  供試化合物と、(i)変異GPR10を発現する組織または細胞或いは単離された変異GPR10蛋白とを接触させ、また、(ii)野生型GPR10蛋白を発現する野生型ラットから得られる組織または細胞或いは野生型GPR10蛋白とを接触させる、および
(b)  得られる(i)および(ii)の組織または細胞或いは単離された蛋白におけるGPR10活性をアッセイする。
【０１００】
上記において、該活性が該組織または細胞或いは単離された蛋白(i)および(ii)において相違する場合、それぞれ該供試化合物がGPR10蛋白の活性を抑制する化合物であると同定される。
【０１０１】
上記スクリーニング系の具体例としては、ポリペプチドまたはその断片をコードするリコンビナントDNAで安定に形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞系を用いることができる。好ましくは、競合結合アッセイ系、またはアラキドン酸代謝物遊離系を用いることができる。より好ましくは、GPR10蛋白の活性は、競合アッセイにおいて[125I]-PrRPを用いて決定されるような供試化合物とGPR10蛋白との結合である。GPR10活性は、[3H]-アラキドン酸代謝物の遊離を測定することによって決定される。
【０１０２】
上記の代わりに、宿主細胞は、遊離形態であるかまたは固定化されているかに拘わらず、標準結合アッセイに利用できる。より詳しくは、上記スクリーニングは、候補化合物の存在下に、GPR10ポリペプチドまたはその断片と、PrRPとを反応させて複合体を形成させ、上記候補化合物による形成された複合体の程度の抑制を検出することを含む。
【０１０３】
かくして、本発明によれば、候補化合物とGPR10ポリペプチドまたはその断片とを接触させ、次いで、得られるリガンド-複合体の存在またはリガンド-GPR10ポリペプチドまたはその断片複合体の存在を、公知の方法に従って検出することを含むスクリーニング方法が提供される。更に、GPR10活性のアッセイによって、候補化合物がPrRPに拮抗するかどうか、従って、上記GPR10活性を変更できるか否かを評価することができる。
【０１０４】
このような競合結合アッセイにおいて、GPR10またはその断片は標識される。遊離のGPR10またはその断片を、蛋白-蛋白複合体から分離し、遊離物質の(非複合形成)標識量を測定する時、該測定値は供試因子のPrRPに対する結合の基準となる。該測定値は、また、PrRPのGPR10への結合の抑制の尺度となる。このようにして、GPR10ポリペプチドの小さいペプチド(仮ペプチド, pseudopeptide)のアッセイによって、候補化合物はPrRPアンタゴニスト活性を有する物質としてアッセイできる。
【０１０５】
更なるドラッグスクリーニングとして、本発明GPR10ポリペプチドまたは本発明GPR10遺伝子産物は、GPR10ポリペプチドまたはGPR10遺伝子産物の活性を促進(agonists)または抑制(antagonists or inhibitors)する化合物のスクリーニングが可能である。
【０１０６】
本発明のGPR10ポリペプチドまたはGPR10遺伝子産物を利用することによって、細胞、細胞フリーの調製物、化学ライブラリーおよび自然発生組成物から、アゴニストまたはアンタゴニストが同定できる。これらのアゴニストまたはアンタゴニストは、天然物または修飾された物質、リガンド、酵素または本発明GPR10ポリペプチドのレセプター或いは本発明ポリペプチドの構造的もしくは機能的コピーであってもよい(Coligan et al, Current Protocols in Immunology, 1 (2), Chapter 5 (1991))。
【０１０７】
GPR10蛋白またはGPR10遺伝子産物のアゴニストまたはアンタゴニストは、中枢神経系(CNS)疾患、例えば、限定されるものではないが、うつ病、不安および精神分裂病の治療または予防のための適用が期待できる。
【０１０８】
上記GPR10遺伝子-関連疾患、例えば、うつ病、不安および精神分裂病のための候補薬剤のスクリーニングによって得ることができる化合物は、本発明蛋白(本発明遺伝子の発現産物)の機能を有している。本発明蛋白(遺伝子発現産物、その部分ペプチドおよびそれらの塩を含む)は、本発明蛋白の機能を促進する化合物のスクリーニングのための試薬として有用である。
【０１０９】
本発明は、本発明蛋白の機能を促進する化合物(以下、本発明蛋白の機能的エンハンサーということがある)のスクリーニング方法を提供する。より詳しくは、本発明は、(a)本発明蛋白の機能的エンハンサーをスクリーニングする方法であって、(1)一方で本発明蛋白と神経細胞または神経組織とを接触させ、(2)他方で本発明蛋白および供試化合物と神経細胞または神経組織とを接触させ、結果を比較する方法、および(b)本発明蛋白の機能的エンハンサーをスクリーニングする方法であって、(1)一方で本発明蛋白を脊椎動物に投与し、(2)他方で本発明蛋白および供試化合物を脊椎動物に投与し、結果を比較する方法を提供する。
【０１１０】
具体的には、上記スクリーニング方法(a)において、中枢神経系における生理学的活性を、上記コンデション(1)および(2)で測定し、その結果を比較する。上記スクリーニング方法(b)において、脳における記憶増進(記憶形成)の活性を、例えば上記コンデション(1)および(2)で測定し、その結果を比較する。
【０１１１】
上記スクリーニングに用いられる神経細胞(神経および神経膠細胞)には、神経芽細胞、グリオーマ細胞およびそれらのハイブリッド細胞(例えば、N18TG-2, IMR-32, GOTO (例えばGOTO-P3), NB1, C6BU-1, U251, KNS42, KNS81およびNG108-15細胞、および神経細胞に分化する能力を有するPC12細胞)が含まれる。利用される神経組織には、マウス神経上皮細胞、ラット海馬初代培養細胞、マウス胎児培養プルキンエ(prukinje)細胞およびマウス後根神経節が含まれる。供試化合物には、ペプチド、蛋白、非蛋白性化合物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物および血漿が含まれる。これらの化合物は新規化合物であっても、公知化合物であってもよい。
【０１１２】
上記スクリーニング方法(a)を実施するには、本発明蛋白質(その部分ペプチドおよび塩を含む)を、スクリーニングに適した緩衝液に溶解または懸濁することによって本発明蛋白質のサンプルを調製する。緩衝液は、本発明蛋白質と神経細胞もしくは組織との接触を阻害しない各種の緩衝液でよく、例えば、pH約4〜10、望ましくはpH約6〜8のリン酸バッファー、トリス-塩酸バッファなどを例示することができる。接触期間は、通常約1-10日間、好ましくは約7-10日間である。接触温度は一般には約37℃である。中枢神経系における本発明蛋白の活性は、公知の方法、例えば軸索伸長の視覚的判定、細胞内Ca2+濃度の測定などに準じて測定することができる。
【０１１３】
上記コンデション(1)におけるそれと対比して上記コンデション(2)における生理学的活性を約20％以上、好ましくは約30％以上、より好ましくは約50％以上促進する供試化合物を、本発明蛋白質の機能的エンハンサーとして選択することができる。
【０１１４】
また、本発明は、うつ病または不安の処置に有用な化合物のスクリーニング方法であって、
(a)  GPR10活性を調節する化合物をうつ病または不安に罹病している哺乳動物に投与し、
(b)  処置動物におけるうつ病もしくは不安の寛解をアッセイして、
うつ病または不安の処置に有用な化合物を同定する方法を提供する。
【０１１５】
上記スクリーニング方法の実施において、本発明蛋白は単独でまたは供試化合物と共に、供試動物に投与される。該投与は静脈内投与、皮内投与または筋肉注射或いは経口投与でよい。本発明蛋白の経口投与による投与量は、一般には哺乳動物(50kg体重を基準とする)当たり、約0.1-100mg/日、好ましくは約1.0-50mg/日、より好ましくは約1.0-20mg/日である。非経口的投与による投与量は、患者および投与方法に従って選択される。通常、静脈内投与の場合、哺乳動物(50kg体重を基準とする)当たり、約0.01-30mg/日、好ましくは約0.1-20mg/日、より好ましくは約0.1-10mg/日である。
【０１１６】
供試動物には、ヒト、サル、チンパンジー、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコおよびイヌ並びにウオ(例えばコイ、サケ、ニシン、ニジマス、キンギョなど)が含まれる。
【０１１７】
本発明蛋白の脳における活性は、例えば、強制水泳試験プロトコール(Morris, J. Neurosci. Meth., 11: 47-60 (1984))に従ってアッセイされる。上記コンデション(1)におけるそれと対比して上記コンデション(2)における記憶増進効果を約20％以上、好ましくは約30％以上、より好ましくは約70％以上促進する供試化合物を、本発明蛋白質の機能的エンハンサーとしてアッセイすることができる。
【０１１８】
本発明の更なる実施態様としてのスクリーニングキットは、必須成分として、本発明蛋白質(該遺伝子の発現産物、その部分ペプチドおよびそれらの塩を含む)を含有する。本発明スクリーニングキットの例は下記1-4成分からなっている。
成分1：アッセイバッファとしてのハンクス溶液
成分2：標準蛋白(本発明蛋白またはその塩)
成分3：神経細胞または神経組織(該神経細胞または神経組織の24-ウエルプレート内培養物、104細胞/ウエル、イーグルスMEM、ハンクス溶液を用いて5%CO2中、37℃で生育させたもの)、および
成分4：観察のための反転顕微鏡。
【０１１９】
上記スクリーニングキットを用いたスクリーニングは、例えば以下のようにして実施される。
[方法]
供試化合物を含むウエル内の軸索延長陽性細胞の一視野当たりの数をカウントし、コントロール(供試化合物フリー)ウエルにおける軸索延長陽性細胞の一視野当たりの数と対比し、相違を統計学的に調べる。
【０１２０】
上記スクリーニング法によってまたは本発明スクリーニングキットの利用によって、得られる化合物およびその塩は、上述したペプチド、蛋白、非蛋白性化合物、合成化合物、発酵産物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物などのクラスに属する一員であり、本発明蛋白の機能を促進することができる化合物である。そのような本発明蛋白の機能を促進する化合物は、それ自体では生理学的活性を示さないが、本発明蛋白などの機能を追加的にもしくは相乗的に促進する生理学的活性を示し、もって本発明蛋白の機能を促進するものであってもよい。
【０１２１】
これら化合物の塩の例としては、生理学的に許容される塩基(例えばアルカリ金属)または酸(例えば有機酸、無機酸)の塩を挙げることができる。特に好ましいものは、生理学的に許容される酸付加塩、例えば無機酸(例えば塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)または有機酸(例えば酢酸、蟻酸、プロピオン酸フマール酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)の塩である。
【０１２２】
本発明蛋白の機能を促進する化合物またはその塩は、安全で、低毒性で、前述したような中枢神経系の各種疾患に対する予防および治療剤として特に価値あるものである。
【０１２３】
上記スクリーニング方法は、細胞表面上にGPR10ポリペプチドを発現する細胞または本発明蛋白に応答する細胞の使用を含んでいる。これらの細胞としては、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエおよび大腸菌に由来する細胞を挙げることができる。GPR10ポリペプチドを発現する細胞(または発現されたポリペプチドを有する細胞膜)またはGPR10ポリペプチドに応答する細胞を、供試化合物と接触させて、刺激または結合の抑制または機能的応答を観察する。次いで、候補化合物と接触させた細胞のGPR10活性を、接触させない細胞のそれと対比する。
【０１２４】
上記アッセイは、候補化合物に直接的にまたは間接的に結合する標識を利用して、GPR10ポリペプチドを保有する細胞の接着性を検出することによって、または標識した競合物質との競合反応を利用するアッセイ系で、実施することができる。このようにして、候補化合物の結合が容易に試験できる。更に、このようなアッセイにおいてGPR10ポリペプチドを保有する細胞に適した検出系を利用することによって、候補化合物がGPR10ポリペプチドの活性に起因するシグナルを生み出すかどうかを試験することができる。上記活性の抑制剤は、一般に公知のアゴニストの存在下にアッセイでき、候補化合物のアゴニストに基づく活性化の効果が観察できる。
【０１２５】
上記アッセイは、候補化合物とGPR10ポリペプチドを含む溶液とを混合して混合物を作製し、該混合物におけるGPR10活性を決定し、該混合物のGPR10活性と標準のそれとを比較する方法を含んでいてもよい。
【０１２６】
GPR10蛋白と結合する低分子量化合物（アゴニストまたはアンタゴニスト）は、例えばBIACORE2000を用いたスクリーニングによって得ることかできる(Markgren et al, Analytical Biochemistry, 265: 340-350 (1998) )
本発明によれば、より活性な、または安定したGPR10ポリペプチド誘導体、またはイン・ビボ(in vivo)においてGPR10ポリペプチドの機能を高めるかもしくはブロックする薬剤を開発するために、それらが相互作用する目的の生物学的に活性なポリペプチドまたは構造アナログ、例えばGPR10アゴニスト、GPR10アンタゴニスト、GPR10インヒビターなどを作製することが可能である。前記構造アナログは、例えばGPR10と他の蛋白質との複合体の三次元構造をX線結晶学、コンピューター・モデリングまたはこれらの組み合わせた方法によって決定することによって得ることができる。また、該構造アナログの構造に関する情報は、相同性蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって知ることも可能である。
【０１２７】
上記より活性な、または安定したGPR10ポリペプチド誘導体を得る方法としては、アラニンスキャンによってアッセイする方法を用いることができる。該方法は各アミノ酸残基をAlaで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を測定する方法である。ペプチドの各アミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によって、より活性な、または安定なGPR10ポリペプチド誘導体を設計することができる。
【０１２８】
また機能性アッセイによって選択した標的-特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。原則として、このアプローチにより、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmacore)を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり単離したりすることが可能である。故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると予測される。
【０１２９】
上記方法により、改善されたかまたは安定化されたGPR10活性を有する薬剤を設計・開発することができる。即ち、GPR10活性に対してインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０１３０】
以上詳述したように、本発明は精神医学的疾患、例えば限定はされないが、うつ病および不安の処置に有用な化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。インビトロの方法は、野生型GPR10(図4参照)および細胞においてヘテロ発現するクローン化されたヒトGPR10の切断型(図5参照)と結合および／または調節する候補化合物（例えばペプチド、低分子物質、抗体、他の医薬品）の同定を可能とする。これらの方法は、また、GPR10の他の哺乳動物形態、例えばラットGPR10の野生型および切断型(図1および2のそれぞれを参照)を用いたスクリーニング方法として適用することができる。
【０１３１】
加えて、これらのスクリーニング方法は、実施例6-8のそれぞれに記載されるように、候補化合物を多様な濃度で試験し且つ統計学的方法を利用することによって、クローン化されたGPR10レセプターの結合活性、強度および相対的内在性活性のインビトロにおける評価を予測するのに用いることができる。
クローン化された野生型GPR10と結合する化合物の検出のための[125I]PrRP競合結合アッセイ
後述する実施例2-3に記載の方法を用いて、クローン化された野生型GPR10レセプター(pcDNA3.1(+)-hGPR10:CHO-hGPR10細胞)を安定に発現させるチャイニースハムスター卵巣細胞系統を発生させた。CHO-hGPR10細胞を、約70%コンフリューエントとなるまで、シグマアルドリッチ社製(Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO))の哺乳動物プロテアーゼインヒビターカクテルと共に培養し、氷冷したホモジネーションバッファ(20mM HEPES/Na HEPESおよび10mM EDTA (pH7.4)を用いて3回洗浄し、細胞スクレーパー(フィロマス社(Philomath, OR)製ジーンツール(GeneTools))を用いてホモジネーションバッファに懸濁させた。懸濁させた細胞を次いでホモジナイズし、遠心分離(40,000×g，10分間、4℃)し、得られるペレットをホモジネーションバッファに再懸濁させ、同様にホモジナイズおよび遠心分離した。残存する膜ペレットを次いで、2回洗浄し、ホモジネーションバッファ中で遠心分離し、最終的膜ペレットを20mM HEPES/Na-HEPESおよび0.1mM EDTA (pH7.4)を含むバッファに再懸濁させ、ウシ胎児血清アルブミン(最終濃度=1.0%(w/v))の存在下に、-135℃にて貯蔵した。CHO-hGPR10細胞膜中の蛋白濃度を、市販のブラッドフォードアッセイ(Bradford assay, Sigma-Aldrich Corporation)を用いて決定した。
【０１３２】
かくして調製されたCHO-hGPR10細胞膜(20μg蛋白)を、0.05nM [125I]PrRP (Amersham Biociences UK Limited; カタログNo. IM341, 特異活性=2000 Ci/mmol)、供試化合物および20mM Tris (pH7.4), 2.0mM EGTA, 5.0mM C4H6MgO4, 0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオライド, 1.0μg/mLペプスタチン(pepstatin), 1.0μL/mLプロテアーゼインヒビターカクテルおよび0.1% (w/v) BSAを含むバッファ中でインキュベートした。全ての反応は、96-ウエルのベーシックフラッシュプレート(Basic Flashplate(登録商標), PerkinElmer Life Sciences)中で実施し、室温で90分のインキュベーション後に遠心分離(3,000 g×7分)により停止させた。膜結合[125I]PrRPに関連する放射活性のカウントは、各ウエルについて、マイクロベータトリルックスマイクロシンチレーションカウンター(Microbeta TriLux microscintillation counter, PerkinElmer Life Sciences)を用いて実施した。供試化合物は、該化合物がCHO-hGPR10細胞膜から[125I]PrRP特異結合の≧50%を示す場合に、「ヒット」として分類した。この方法は、96-ウエルベーシックフラッシュプレート1枚について、80化合物、8ネガティブ(ビヒクル；最終濃度=0.5%(v/v)ジメチルスルホキシド)および8ポジティブコントロール(PrRP; 1.0nM最終濃度)を、同時に選別するのに用いることができる。
クローン化された野生型または切断型GPR10の機能を活性化または抑制する化合物の検出のためのインビトロ機能アッセイ
後述する実施例1-2に記載の方法を用いて、クローン化された野生型(pcDNA3.1(+)-hGPR10:CHO-hGPR10細胞)および切断型(pcDNA3.1(+)-hGPR10-306:CHO-T-hGPR10)ヒトGPR10を安定に発現させるチャイニースハムスター受精卵細胞系統を発生させた。CHO-hDMO1およびCHO-T-hGPR10細胞を、約70%コンフリューエントとなるまで培養し、600nCi/mL [3H]アラキドン酸(Perkin-Elmer Life Sciences; カタログNo. NET298, 特異活性=189Ci/mmol)を含む培養培地に懸濁させた(150,000細胞/mL)。この細胞懸濁液250μLを次いで2つの殺菌した48-ウエルプレートの全ウエルに添加し、17-24時間、37℃でインキュベートした。試験開始日に、培養培地をアスピレーションによって除去し、Ca2+およびMg2+、20mM HEPESおよび0.1%(W/v)脂肪酸フリーのBSAを含有するHBSSバッファ250μLと交換し、5分間37℃でインキュベートした。更に2回の洗浄およびHBSSバッファ中でのインキュベーションの後、HBSSバッファ240μLおよびDMSOヴィヒクル(最終濃度=0.25%(v/v))、PrRPまたは供試化合物とPrRPとの混合物のいずれか10μLを、各ウエルに加え、プレートを次いで96-ウエルプレートシェーカー上で室温でインキュベートした。PrRP含有ウエルにおける最終濃度は常に1.0nMである。次いで、各ウエルから200μLを取り出し、ベーシックフラッシュプレートに添加した。該ベーシックフラッシュプレートを次いでシールし、5分間、室温で、96-ウエルプレートシェーカーを用いてシェークし、次いで各ウエル中に存在する[3H]アラキドン酸の量を、マイクロベータトリルックスマイクロシンチレーションカウンターを用いて計算した。この操作は、96-ウエルベーシックフラッシュプレート1枚について、80化合物、8ネガティブ(ビヒクル；最終濃度=0.5%(v/v)ジメチルスルホキシド)および8ポジティブコントロール(PrRP; 1.0nM最終濃度)を選別するのに用いることができる。
【０１３３】
供試化合物は、該化合物が基準[3H]アラキドン酸を、1.0nM PrRPの平均効果の≧190%増加させる場合に、「アゴニストヒット」と分類した。また該化合物が基準[3H]アラキドン酸遊離を1.0nM PrRPの平均効果の≦10%抑制する場合に、「アンタゴニスト／逆アゴニストヒット」と分類した。
【０１３４】
以下の実施例は、記述の目的のために提供されるものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【０１３５】
ラットおよびヒトGPR10および変異GPR10のための組換え体発現ベクターの製造
ラット野生型GPR10およびラット変異GPR10のヌクレオチド配列は、図1-2にそれぞれ示すとおりである。ラット野生型GPR10およびラット変異GPR10のアミノ酸配列は、図6-7にそれぞれ示すとおりである。この例で用いたラットGPR10発現ベクターの構造は図11に示すとおりである。
【０１３６】
野生型(WT)および変異(MT)ラットGPR10 ORFのクローニングのために、以下のプライマーセットを設計した。
野生型フォワードプライマー；rGPR10WTF-EcoRI（配列番号：15）
変異型フォワードプライマー；rGPR10MTF-EcoRI（配列番号：16）
普遍リバースプライマー；rGPR10R-NotI（配列番号：17）
フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ各5'末端にEcoRI制限酵素サイト(GAATTC)およびNotI制限酵素サイト(GCGGCCGC)を有している。WTおよびMT GPR10 ORFを、BNおよびOLETFラット染色体遺伝子のそれぞれを鋳型として、増幅させた。これらの増幅断片を、EcoRIおよびNotI制限酵素を用いて消化させ、次いでpcDNA3.1(+)(インビトロゲン社)のEcoRIおよびNotIサイトに挿入した。WTおよびMT GPR10-発現ベクターを、それぞれpcDNA3.1(+)-rGPR10およびpcDNA3.1(+)-rGPR10-MTと名付けた。
【０１３７】
ヒト野生型GPR10およびヒト変異GPR10のヌクレオチド配列は、図4-5にそれぞれ示すとおりである。ヒト野生型GPR10およびヒト変異GPR10のアミノ酸配列は、図8-9にそれぞれ示すとおりである。この例で用いたヒトGPR10発現ベクターの構造は図11に示すとおりである。
【０１３８】
ヒト野生型GPR10 ORFのクローニングのために、以下のプライマーセットを用いたPCRによって、ヒト染色体DNA(プロメガ社、カタログ番号G3041、ロット番号88299)からDNA断片を増幅させた。
フォワードプライマー；hGPR10F-EcoRI（配列番号：18）
リバースプライマー；hGPR10R-NotI（配列番号：19）
フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ各5'末端にEcoRI制限酵素サイト(GAATTC)およびNotI制限酵素サイト(GCGGCCGC)を有している。得られた増幅断片を、pcDNA3.1(+)に挿入した。発現ベクターを、pcDNA3.1(+)-hGPR10と名付けた。
【０１３９】
ヒト変異型GPR10発現ベクターの構築のために、以下のプライマーを用いた。
hGPR10/del1-F（配列番号：20）
hGPR10del1-FおよびhGPR10R-NotIプライマーを用いてPCRを実施した。増幅されたDNA断片を、EcoRIおよびNotIで消化させた後、pcDNA3.1(+)ベクターのEcoRIおよびNotI制限酵素サイトに導入した。このベクターを、pcDNA3.1(+)-hGPR10-306と名付けた。
【実施例２】
【０１４０】
CHO細胞におけるラットおよびヒトGPR10および変異GPR10のクローニング
CHO細胞におけるラットおよびヒトGPR10および変異GPR10のクローニングのために、以下の通りGPR10安定発現系統を確立した。
【０１４１】
各発現ベクター1.0μgをScaIで消化させることによって線状化した後、CHO-K1細胞(24-ウエルプレート中1.2×105細胞／ウエル)を、リポフェクタミン2000(LipofectAMINE2000, インビトロゲン社)の2.5μLを用いて、同社付属のプロトコールに従って形質移入した。形質移入1日後、形質転換体をF-12培地、10%(v/v)FCSおよび0.35mg/mLジェネチシン(Geneticin)からなる選択培地で選択し、限界希釈法により単一クローンを単離した。各細胞のGPR10発現レベルをノーサンブロット分析により解析した。
【実施例３】
【０１４２】
変異GPR10発現コンジェニックラットの製造
BNラットとOLETFラットとの交配による変異GPR10発現コンジェニックラットの世代の概略を図12に示す。近交系BNラットは、日本チャールズリバー研究所(Charles River Japan Laboratories)より購入した。OLETFラットは米国特許第5,789,652号明細書に記載されており、その受精卵はATCC No.72016として寄託されている。
【０１４３】
OLETFラットおよびBNラットを交配させ、N1ラットをBNラットと戻し交配させて、コンジェニックラット第一世代(N2)を得た。N2および引き続く世代のために、OLETFおよびBNの対立遺伝子を区別することができるマイクロサテライトマーカーを用いて、尾先端部から単離した染色体DNAを分析した。4連続戻し交配(N5)によって、D1Rat169からD1Rat459にOLETF由来染色体領域が残存しており、他の染色体領域はBNラットによって置換されていることを確認した。このN5世代においては、ラットのバックグラウンド染色体が既に97〜99%BN染色体に置換されていた。
【０１４４】
ヘテロ接合型ラットを選抜し、引き続いて交雑させてホモ接合型コンジェニックラットを確立した(N5F1)。
【０１４５】
各世代において、OLETF-感受性ハプロタイプの完全さの証明のために、Dmo1領域内における遺伝子マーカー(D1Rat169, D1Rat305, D1Rat312, D1Rat90, D1Rat459; それぞれリサーチジェネティクス社(Research Genetics Inc)より購入した)を用いた。
【０１４６】
カネモトら(Kanemoto et al., Mammalian Genome, 9: 419-425 (1998)によって記載されたマイクロサテライトマーカーのPCR増幅によって、ラットを遺伝子型に分類した。更に、OLETFラットにおけるGPR10変異の発見後、PEアプライドバイオシステム7700シークエンスディテクター(PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector)を用いて、上述したTaqManプローブを用いたPCR増幅後に、GPR10変異(開始コドン：ATG→ATA)の検出を行った。ホモ接合型遺伝子のプロフィルを有するラットを引き続く強制水泳試験に利用した。
【０１４７】
かくして得られたコンジェニックラットの受精卵は、2003年12月5日(原寄託日)に、日本国茨城県つくば市東1-1-1  中央第6に住所を有する独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、「Dmo1コンジェニックラットとBNラットの戻し交配由来受精卵」なる表示で受託されており、その受託番号は「FERM BP-08562」である。
【実施例４】
【０１４８】
強制水泳試験
ポーソルトらの方法（Porsolt, R. D. et al., Eur. J. Pharmacol., 47: 379 (1978)）に若干の改良を加えて、強制水泳法(FST)を実施した。より詳しくは、23-25℃に保持した水を深さ17.5cmまで入れた垂直アクリル製シリンダー(高さ：40cm、直径：17cm)に、ラットをそれぞれ別個に収容して強制的に泳がせ、無動状態の全期間(無動時間、秒)を、15分間に亘って、動物行動分析システム(SCANET MV-10 AQ, TOYO SANGYO CO. Ltd.)を用いて測定した。水泳後、ラットを取り出し、そのホームケージに戻す前に電気ランプ下で乾燥した。翌日、ラットを再度シリンダーに5分間入れ、無動時間を測定した。得られたスキャンデータより無動時間の合計を算出した。タンク中の水を交換して動物フェロモンの沈着を避け、各試験におけるセンサーの感度低下を回避した。
【０１４９】
結果(各8匹の平均±SD)を、図13（縦軸：無動時間（秒）、横軸：コントロールラット(+/+)および本発明コンジェニックラット(-/-)のそれぞれ）に示す。
【０１５０】
図中、＊＊印はBNコントロールラット(+/+)／本発明コンジェニックラットにおけるP<0.01を示す。
【０１５１】
図13に示すように、変異GPR10遺伝子を保有するコンジェニックラットは、最初のFST(15分間)および2度目のFST(5分間)の両者において、コントロール+/+ラットのそれと対比して、顕著な無動時間の増加を示した。この行動上の相違に影響を与え得る数種のファクターがある。その第一は、コンジェニックラットとコントロール+/+ラットとの間で異なるうつ病レベルを強調する。ポーソルトらによってたてられた仮説を越えて、無動状態は、弱められた憂鬱もしくは絶望状態を反映することが示唆される。かくして、コンジェニックラットはコントロール+/+ラットに比してより重篤なうつ病を被る。第二に、水泳ストレスの感受性はコンジェニックラットとコントロール+/+ラットとの間で異なっている。ホーキンスら(Hawkins et al., Nature, 274: 512 (1978))によって推論されるように、行動的不動は、ストレス状態に対する適応の結果であり、コンジェニックラットは、コントロール+/+ラットと対比して、水泳ストレスに対してより心配性の少ないことを意味しているかもしれない。
【実施例５】
【０１５２】
高架式十字迷路試験
高架式十字迷路試験においては、オープンアームが探究値を提供する十字アームによって安全性のセンスが提供される。従って、不安ラットは、より心配の少ないラットに比して該オープンアームにより短い時間しか滞在しない。不安の程度は、オープンアームおよびクローズドアームにおける滞在時間および各アームへの進入回数を測定することによって評価される。
【０１５３】
ベンゾジアゼピン類、バルビチュレート類および時には5-HT1Aレセプターアゴニスト類が、この試験で抗不安薬として見出されている（Pellow et al., Neuroscience Methods, 14: 149 (1985)）。
【０１５４】
この試験はまた、アンキシオジォニック薬(anxiogenic drugs)に対しても感受性であり、その予想される有効性を強くサポートするのに役立つ。
【０１５５】
高架式十字迷路試験を利用して、情動性因子の可能な干渉を決定するために、コントロール(+/+)ラットおよびコンジェニック(-/-)ラットにおける不安を評価した。迷路は床から60cmの高さに設置し、中心に位置するプラットフォーム(15×15cm)からそれぞれ広がった2つの対立するオープンアーム(42cm×幅15cm)および2つの対立するクローズドアーム(42 cm×15cm×壁高さ30cm)からなっている。照明はオープンアームの床面が17〜30Lux、クローズドアームの床面が5〜16Luxになるようにセットした。
【０１５６】
ラットを一方のオープンアームに向けて、中心プラットフォームに置き、5分間該装置に曝した。ビデオ行動解析システム装置を用いて、ラットの行動を記録し、オープンアーム、クローズドアームおよびプラットフォームの３つのゾーン指定により自動的にスコアを算出した。
【０１５７】
各ラットについて、オープンおよびクローズドアームへの進入回数、各アーム中滞在時間および総運動距離を計数した。ラットの試験時間は午前9時から12時に限定した。得られた試験結果を下記表1に示す。
【０１５８】
【表１】
2004321184.tif 000002
表1中、各値は、コントロール(+/+)ラット(n=10)およびコンジェニック(-/-)ラット(n=8)のそれぞれの平均値±標準誤差にて表示する。
【０１５９】
コンジェニック-/-ラット群とコントロール+/+ラット群とを比較するために、F-テストを使用して、分散における差を検定した。
【０１６０】
分散が等分散の場合は、スチューデンツのt-テスト(Student's t-test)を行い、不等分散の場合は、アスピン-ウェルヒt-テスト(Aspin-Welch t-test)を行った。表1中、オープンアーム滞在時間およびクローズドアーム滞在時間における星印は、アスピン-ウェルヒt-テストによるP<0.05を示す。また、総運動距離における星印は、スチューデントt-テストによるP<0.05を示す。
【０１６１】
表1に示されるように、コンジェニック-/-ラットは、コントロール+/+ラットと比較して、オープンアーム内の滞在時間が長く、クローズドアーム内滞在時間が短い。また総運動距離は、コンジェニック-/-ラットの方がコントロール+/+ラットより長い。これらの結果から、コンジェニック-/-ラットは、コントロール+/+ラットよりもより不安の少ないものであることが示唆される。
【実施例６】
【０１６２】
クローン化されたヒト野生型および変異GPR10を安定に発現するCHO細胞に結合する[125I]PrRPに対するPrRPおよび化合物Xの効果
実施例1-2に記載されるように、野生型(pcDNA3.1(+)-hGPR10:CHO-hGPR10細胞)またはヒトGPR10レセプターのNH2末端64アミノ酸の切断を有する変異型(pcDNA3.1(+)-hGPR10:CHO-hGPR10細胞)を安定に発現させるチャイニースハムスター卵巣細胞系統を発生させた。
【０１６３】
以下の操作を利用してCHO-hGPR10細胞及びCHO-T-hGPR10細胞から薄膜を調製した。即ち、各細胞系統を約70%コンフリューエントとなるまで、シグマアルドリッチ社(Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO))の哺乳動物プロテアーゼインヒビターカクテルと共に培養し、氷冷したホモジネーションバッファ(20mM HEPES/Na HEPESおよび10mM EDTA (pH7.4)を用いて3回洗浄し、細胞スクレーパー(フィロマス社(Philomath, OR)製ジーンツール(GeneTools))を用いてホモジネーションバッファに懸濁させた。懸濁させた細胞を次いでホモジナイズし、遠心分離(40,000×g，10分間、4℃)し、得られるペレットをホモジネーションバッファに再懸濁させ、同様にホモジナイズおよび遠心分離した。残存する膜ペレットを、次いで、2回洗浄し、ホモジネーションバッファ中で遠心分離し、最終的膜ペレットを20mM HEPES/Na-HEPESおよび0.1mM EDTA (pH7.4)を含むバッファに再懸濁させ、ウシ胎児血清アルブミン(最終濃度=1.0%(w/v))の存在下に、-135℃にて貯蔵した。CHO-hGPR10細胞膜およびCHO-T-hGPR10細胞膜中の蛋白濃度を、市販のブラッドフォードアッセイ(Bradford assay, Sigma-Aldrich Corporation)を用いて決定した。
【０１６４】
次いで、CHO-hGPR10細胞膜およびCHO-T-hGPR10細胞膜に結合する [125I]PrRPの解離定数(KD)、および各調製膜におけるレセプター発現の密度(BMAX)を測定するために飽和結合アッセイを実施した。
【０１６５】
20mM Tris (pH7.4)、2.0mM EGTA、5.0mM C4H6MgO4、0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオライド、1.0μg/mLペプスタチン(pepstatin)、1.0μL/mLプロテアーゼインヒビターカクテルおよび0.1% (w/v) BSA(各バッファ成分はいずれもシグマ-アルドリッチ社より購入した)を含むバッファ中、CHO-hGPR10細胞膜蛋白質またはCHO-T-hGPR10細胞膜蛋白質の20μgを混合した9つの異なる濃度(0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.10, 0.25, 0.35, 0.50および0.75nM)における[125I]PrRP (Amersham Biociences UK Limited; カタログNo. IM341, 特異活性=2000 Ci/mmol)を、4回評価した。
【０１６６】
非特異的結合が1.0μM PrRPの存在下に決定された。全ての反応は96ウエルベーシックフラッシュプレート(Basic Flashplate(登録商標))中で実施し、室温で90分のインキュベーション後に遠心分離(3,000 g×7分)により停止させた。膜結合[125I]PrRPに関連する放射活性のカウントを、各ウエルについて、マイクロベータトリルックスマイクロシンチレーションカウンター(Microbeta TriLux microscintillation counter, PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA)を用いて実施した。KDおよびBMAXの評価は、ウインドウズ用グラフパッド(GraphPad Prism version 3.00 for Windows（登録商標）, GraphPad Software, San Diego, CA)を用いた完全飽和結合データのコンピュータ化された非線状回帰アッセイにより計算した。
【０１６７】
結果を図14-15に示す。
【０１６８】
各図において、縦軸は[125I]PrRP結合(Fmol/mg)を、横軸は[125I]PrRP濃度(nM)を示し、図14中、黒三角印は総結合を、黒ダイヤ印は非特異的結合を、また黒四角印は特異的結合のそれぞれの結果である。図15中、黒四角印は総結合を、黒三角印(上向き)は非特異的結合を、また黒三角印(下向き)は特異的結合のそれぞれの結果である。
【０１６９】
図14に示されるように、このデータの飽和アッセイは2-サイト競合結合モデル(適合性、R2=0.87)に一致した。[125I]PrRPは、CHO-hGPR10細胞膜上によく似た密度(BMAX1=147.5nM; BMAX2=147.4nM)で発現する2つの高親和性サイト(KD1=0.070; KD2=0.072nM)に結合する。
【０１７０】
[125I]PrRP結合は、飽和することができ、評価されたKD値にアプローチする[125I]PrRP濃度において、総[125I]PrRP結合の80%以上が特異的である。
【０１７１】
これと対比して、図15に示されるように、[125I]PrRPはCHO-T-hGPR10膜に非特異的且つ非飽和的に結合したことから、[125I]PrRPはGPR10のこの変異体には結合しないことが明らかである。両者を考慮して、これらの結果は、[125I]PrRP結合サイトがヒトGPR10レセプターのNH2-末端の最初の64アミノ酸配列中に存在し、この結合サイトはnM以下の結合親和性にて各[125I]PrRPと接触する2つの結合ドメインからなることの直接的証明を提供する。
【０１７２】
次いで、PrRPおよび化合物X(分子量=318.38)を、nMからμMの濃度(PrRPについては0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50および100nM; 化合物Xについては100, 300, 1000, 3000および10,000nM)で4回試験して、それらのそれぞれのCHO-hGPR10細胞膜に対する[125I]PrRP(Amersham Biociences UK Limited; カタログNo. IM341, 特異活性=2000 Ci/mmol)の結合の置換を決定した。各細胞膜(20μg蛋白)を0.05nM[125I]PrRP、化合物Xまたはヴィヒクルおよび20mM Tris (pH7.4)、2.0mM EGTA、5.0mM C4H6MgO4、0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオライド、1.0μg/mLペプスタチン(pepstatin)、1.0μL/mLプロテアーゼインヒビターカクテルおよび0.1% (w/v) BSAを含むバッファと共にインキュベートした。全ての反応は96ウエルベーシックフラッシュプレート(Basic Flashplate(登録商標))中で実施し、室温で90分のインキュベーション後に遠心分離(3,000 g×7分)により停止させた。膜結合[125I]PrRPに関連する放射活性を、各ウエルについて、マイクロベータトリルックスマイクロシンチレーションカウンター(Microbeta TriLux microscintillation counter, PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA)を用いてカウントした。競合結合データの非線状回帰アッセイを用いて、結合定数抑制(IC50およびKi)を算出した。これは0.05nM[125I]PrRPによってCHO-hGPR10レセプターが特異的に結合する結合の半分を占める化合物Xの濃度である。化合物Xに対するCHO-hGPR10レセプターの結合親和性(Ki)は、下記式によって算出される。
【０１７３】
Ki=(IC50)/(1+([[125I]PrRP]/KD)
CHO-hGPR10=0.07nMにおける[125I]PrRPに対するKDは、上述した飽和結合アッセイによって計算される。
【０１７４】
CHO-hGPR10レセプターについてPrRPおよび化合物Xの評価された結合親和性は、ウインドウズ用グラフパッド(GraphPad Prism version 3.00 for Windows（登録商標）, GraphPad Software, San Diego, CA)を用いて計算した。
【０１７５】
結果を図16-17に示す。
【０１７６】
図16はPrRPの[125I]PrRPに対する結合性(% Vehicle±SEM)を、図17は化合物Xの[125I]PrRPに対する結合性(% Vihicle±SEM)を示し、横軸はLog[PrRP](M)(図16)およびLog[化合物X](M)である。
【０１７７】
図16に示されるように、PrRPの濃度の増加につれて、CHO-hGPR10細胞膜に結合する[125I]PrRPは、競合的に置換された。これらの置換データは、推定されたPrRPがCHO-hGPR10細胞膜上の2つのnM以下の親和性サイト(IC50(1)=0.0007; Ki(1)=0.0004nM,  IC50(2)=0.50nM, Ki(2)=0.29nM)からの[125I]PrRP結合に置換する2-サイト競合モデル(適合性、(R2)=0.97)によく一致した。これらの結果は、飽和結合によって推定されたCHO-hGPR10に対する[125I]PrRPの2サイト結合と一致している。
【０１７８】
これに対して、しかしながら、図17に示されるように、化合物Xは、CHO-hGPR10膜上の単一サイトから[125I]PrRP特異結合のほぼ40%を置換した。適合性(R2)=0.86、IC50=4.63μM、Ki=2.70μM。
【０１７９】
PrRPおよび化合物Xによる[125I]PrRP結合の置換におけるこの相違は、(1)化合物XはCHO-hGPR10のNH2-末端上に存在する2つの結合サイトの内の一つから[125I]PrRPと競合的に置換する、または(2)化合物XはCHO-hGPR10の識別可能な細胞内配列と結合し、この結合はCHO-hGPR10に構造的変化を与え、CHO-hGPR10の細胞外NH2-末端から[125I]PrRP結合の非競合的置換の結果をもたらす。
【０１８０】
PrRP、蛋白および化合物X、低分子、の間の分子量、サイズおよび全表面負荷の比較的大きな相違に基づいて、化合物XはCHO-hGPR10のNH2-末端上の2つの[125I]PrRP結合サイトの一つを占めることによって、[125I]PrRPと競合的に置換すると考えられる。
【０１８１】
他のGPRに結合するペプチドの低分子置換は、常にではないが、しばしば、細胞外NH2-末端ペプチド結合とは離れて位置する細胞内ドメインの低分子占有に次いで非競合的ペプチド置換をもたらす(J. Biol. Chem., 274: 8694 (1999))。
【０１８２】
同様のアロステリックな非競合的置換が化合物Xと[125I]PrRPの非競合的置換を可能とすると考えられる。
【実施例７】
【０１８３】
クローン化されたヒト野生型GPR10を安定に発現するCHO細胞からの[3H]アラキドン酸の遊離に対するPrRPおよび化合物Xの効果
クローン化されたヒト野生型GPR10を安定に発現するCHO細胞(CHO-hGPR10細胞)を実施例2-3に記載のようにして発生させた。CHO-hGPR10細胞を、2.0mM L-グルタミン、10%(v/v)透析ウシ胎仔血清、1.0%ヒポキサンチン-チミジン液および1.0% G-418選択試薬を含むF-12 HAM培地中で培養した。全細胞を5%CO2雰囲気下、37℃に保持し、約80%コンフリューエントとなった時点で非酵素的細胞解離バッファ(シグマ-アルドリッチ社)を用いて継代した。CHO-hGPR10細胞が約70%コンフリューエントとなった時点で、 [3H]アラキドン酸遊離アッセイに用いるために細胞を回収した。
【０１８４】
[3H]アラキドン酸遊離アッセイは以下の方法により実施した。即ち、CHO-hGPR10細胞を12ウエル培養プレートに150,000細胞／ウエルの濃度で入れ、24時間後カルシウムおよびマグネシウムフリーのハンクスバランスト塩溶液(Hank's Balanced Salt Solution, インビトロゲン(Invitrogen Corp. CA)社)で洗浄し、 [3H]アラキドン酸100nCi/mLを含むF-12培養培地(1.0mL/ウエル)中で4時間インキュベートした。
【０１８５】
次いで細胞を洗浄し、20mM HEPESバッファ(シグマ-アルドリッチ社)および0.1%(w/v)脂肪酸フリーのウシ胎児血清アルブミン(シグマ-アルドリッチ社)を含むハンクスバランスト塩溶液(インビトロゲン社)の1.0mL/ウエル中で5分間インキュベートした。この洗浄およびインキュベーション操作を3回繰り返した後、1.0mLのヴィヒクル、PrRPまたは化合物Xを各ウエルに加え、プレートを37℃で30分間インキュベートした。
【０１８６】
各ウエルに存在する細胞外液400μLを液体シンチレーションカクテル2.6mLと混合し、液体シンチレーションカウンティング(1272クリニガンマ(1272 Clinigamma, LKB/Wallach))によりカウントして、各ウエルに存在する [3H]放射活性を計算した。全ての反応は、0.01〜10,000nMの濃度範囲で3回繰り返し、CHO-hGPR10細胞からの [3H]アラキドン酸の遊離に対するPrRPおよび化合物Xの影響を決定した。
【０１８７】
各反応の3回で検出された平均放射カウント[±SEM,N=3]を計数し、結合等温曲線をウインドウズ用グラフパッド(GraphPad Prism version 3.00 for Windows（登録商標）, GraphPad Software, San Diego, CA)を用いて非線状回帰アッセイにより解析し、強度(95%信頼区間を有するEC50)および相対内在性活性(EMAX、1nM PrRP±SEMの%として)をPrRPおよび化合物Xについて評価した。
【０１８８】
結果を図18に示す。
【０１８９】
図18において、縦軸は[3H]アラキドン酸遊離(% 1nM PrRP±SEM)を、横軸は各供試化合物(PrRPおよび化合物X)の濃度(Log表示)であり、黒三角印がPrRPの結果であり、黒四角印が化合物Xの結果である。
【０１９０】
図18に示されるように、PrRPおよび化合物Xは、いずれも、CHO-hGPR10細胞からの[3H]アラキドン酸遊離における濃度依存的増加を刺激した。PrRP (EC50=0.043nM, 0.01-0.19nM; EMAX=105.4±6.1%)は、化合物X (EC50=1.68jm μM, 0.95-2.97μM; EMAX=108.4±5.4%)よりもより強力であった。両化合物とも、同様の相対内在性活性を示した。PrRPおよび化合物Xの両者のこの試験における強度は、CHO-hGPR10細胞膜を用いた[125I]PrRP競合結合アッセイにおいてPrRPおよび化合物Xについて示された、それぞれのnM以下および低μMにおける結合親和性、と一致するものであった。この試験は、CHO細胞におけるヒト野生型GPR10ヘテロ発現クローンのアゴニスト試薬の活性測定に対して、インビトロにおける[3H]アラキドン酸遊離アッセイの有用性を示している。
【実施例８】
【０１９１】
クローン化されたヒト変異GPR10を安定に発現するCHO細胞からの[3H]アラキドン酸の遊離に対するPrRPおよび化合物Xの効果
クローン化されたヒトGPR10の切断型を安定に発現するCHO細胞を実施例2-3に記載のようにして発生させた。これらのCHO-T-hGPR10細胞、即ち、ヒト野生型GPR10クローンに存在する最初の64アミノ酸の切断物を発現する細胞を、2.0mM L-グルタミン、10%(v/v)透析ウシ胎仔血清、1.0%ヒポキサンチン-チミジン液および1.0% G-418選択試薬を含むF-12 HAM培地中で培養した。全細胞を5%CO2雰囲気下、37℃に保持し、約80%コンフリューエントとなった時点で非酵素的細胞解離バッファ(シグマ-アルドリッチ社)を用いて継代した。CHO-T-hGPR10細胞が約70%コンフリューエントとなった時点で、 [3H]アラキドン酸遊離アッセイを以下のように実施した。
【０１９２】
CHO-T-hGPR10細胞からの基準[3H]アラキドン酸遊離におけるPrRPおよび化合物Xの効果の試験は、実施例7に記載の方法と正確に同じアッセイ方法を利用して実施した。PrRPおよび化合物Xはそれぞれ0.01-10,000nmの濃度範囲で3回繰り返し試験した。
【０１９３】
各3回の反応で検出された平均放射カウント[±SEM,N=3]を計数し、結合等温曲線をウインドウズ用グラフパッド(GraphPad Prism version 3.00 for Windows（登録商標）, GraphPad Software, San Diego, CA)を用いて非線状回帰アッセイにより解析し、強度(95%信頼区間を有するEC50)および相対内在性活性(EMAX、%遊離±SEM)をPrRpおよび化合物Xについて、評価した。
【０１９４】
結果を図19(縦軸：[3H]アラキドン酸遊離(% Basal±SEM)、横軸：Log[供試化合物](M)、黒三角印=PrRPの結果、黒四角印=化合物X)に示す。
【０１９５】
図19に示されるように、PrRPは、CHO-T-hGPR10細胞機能のこのアッセイに不活性であった。けれども、化合物Xは、CHO-T-hGPR10細胞における基準[3H]アラキドン酸遊離を濃度依存的に増加させた(EC50=1.73μM, 0.70-4.25μM; EMAX=189.9±13.3%)、
CHO-hGPR10およびCHO-T=hGPR10細胞におけるPrRPの活性および不活性の対比は、それぞれ、PrRPがヒト野生型GPR10クローンのNH2-末端の最初の64アミノ酸内に局在するGPR10を活性化することを示している。この結論は、実施例6に記載したように、PrRPがCHO-hGPR10に特異的に結合する(図14)が、CHO-T-hGPR10細胞とは結合しない(図15)ことを明らかにしている、[125I]PrRP飽和および競合結合試験の結果とよく一致する。
【０１９６】
これに対して、CHO-hGPR10およびCHO-T-hGPR10細胞からの[3H]アラキドン酸遊離を刺激した化合物Xは、該化合物Xがヒト野生型GPR10クローンのNH2-末端の最初の64アミノ酸の外に局在するGPR10を活性化することを示唆している。これらのデータはまた
、ヒトGPR10クローンのオルソステリックな(orthosteric)結合サイトがNH2-末端の最初の64アミノ酸内に局在することのインビトロにおける証拠としても役立つ。内在性ペプチドアゴニストPrRPは、野生型を含む細胞にのみ活性で、GPR10のNH2-末端切断型には活性ではない。同一レセプター内の他の位置に局在するアロステリックな結合サイトの存在は、また野生型および切断型GPR10発現細胞における化合物Xの活性によって示唆される。化合物Xのより強力なアナログは、例えばGPR10発現またはシグナル伝達における遺伝子異常に由来して起こるGPR10-介在シグナル伝達の欠乏に関連する病理状態に対して治療的利益を提供するかもしれない。
【実施例９】
【０１９７】
クローン化されたヒト野生型GPR10を安定に発現するCHO細胞からの、PrRPで刺激した[3H]アラキドン酸の遊離に対する化合物Xの相乗的効果
実施例8は、PrRPおよび化合物Xがクローン化されたヒトGPR10レセプター内の異なる位置に局在するオルソステリックな、およびアロステリックなサイトにおけるそれぞれの活性化によって、CHO-hGPR10細胞を活性化することを示唆している。
【０１９８】
本試験は、CHO-hGPR10細胞からのPrRP-介在[3H]アラキドン酸遊離が、化合物Xの濃度の増加によって影響を受けるか否かを研究するために計画された。化合物Xは、0.01〜10,000nMの範囲の濃度で、1.0nM PrRPの存在下および非存在下に、各3回試験された。
【０１９９】
実施例2-3に記載したように、CHO細胞はクローン化されたヒト野生型GPR10を安定に発現するために生み出された。これらのCHO-hGPR10細胞を、2.0mM L-グルタミン、1-0%(v/v)透析ウシ胎仔血清、1.0%ヒポキサンチン-チミジン液および1.0% G-418選択試薬を含むF-12 HAM培地中で培養した。全細胞を5%CO2雰囲気下、37℃に保持し、約80%コンフリューエントとなった時点で非酵素的細胞解離バッファ(シグマ-アルドリッチ社)を用いて継代した。CHO-hGPR10細胞が約70%コンフリューエントとなった時点で、 [3H]アラキドン酸遊離アッセイのために回収した。 [3H]アラキドン酸遊離アッセイは前述したようにして実施された。
【０２００】
3回の各反応で検出された平均放射カウント[±SEM,N=3]を計数し、結合等温曲線をウインドウズ用グラフパッド(GraphPad Prism version 3.00 for Windows（登録商標）, GraphPad Software, San Diego, CA)を用いて非線状回帰アッセイにより解析し、強度(95%信頼区間を有するEC50)および相対内在性活性(EMAX、1.0nM PrRP±SEM %として)を1.0nM PrRPの存在下および非存在下で化合物Xについて評価した。CHO-hGPR10細胞における基準[3H]アラキドン酸遊離について、化合物Xと、化合物X+1.0nM PrRPとの間の有意差(P<0.05)を検出するために対応のないt-テストを用いた。
【０２０１】
結果を図20(縦軸：[3H]アラキドン酸遊離(% 1nM PrRP±SEM)、横軸：Log[化合物X](M)、黒三角印=化合物X + 1nM PrRPの結果、黒四角印=化合物Xの結果、黒丸印=1nM PrRPの結果)に示す。
【０２０２】
図20に示されるように、化合物Xは、1.0nM PrRPと併用したとき、単独で試験した場合の2倍の強度の応答を示した。更に、化合物Xは、1.0nM PrRPまたは化合物X+1.0nM PrRPによって産生されるそれよりも有意な(P<0.0001)4倍も高い相対内在性活性を示した(化合物X, EC50=1.68μM, 0.95-2.96μM; EMAX=108.4±5.4%、化合物X+1.0nM PrRP, EC50=3.0μM, 1.17-7.74μM; EMAX=459.0±18.8%、1.0nM PrRP, EMAX=75.3±6.1%)。
【０２０３】
更に、この相互反応は明らかに相乗的である。即ち、1.0nM PrRPおよび化合物Xの合計の相対内在活性は、1.0nM PrRPの存在下における化合物Xの場合のそれと比較して、2.5倍低い。このPrRPと化合物Xとの相乗的相互反応は、実施例8において見出された結果と同様に、ヒトGPR10クローン内の区別される領域に局在するオルソステリックおよびアロステリックなサイトにて、これらの化合物の結合された各相対活性の結果と考えられる。
【実施例１０】
【０２０４】
クローン化されたヒト変異GPR10を安定に発現するCHO細胞からの、PrRPで刺激した[3H]アラキドン酸の遊離に対する化合物Xの効果
実施例8および9は、PrRPおよび化合物Xがクローン化されたヒトGPR10内の異なる位置に局在するオルソステリックおよびアロステリックなサイトにおけるそれぞれの活性化によって、CHO-hGPR10細胞を活性化することを示唆している。
【０２０５】
本試験は、実施例9に記載したように、PrRPおよび化合物X間の相乗的相互反応をメディエートする提案されたオルソステリックなNH2-末端結合サイトの重要性を決定するために計画された。本試験では、化合物Xは、CHO-T-hGPR10細胞からの基準[3H]アラキドン酸遊離に対する効果のために、0.01〜10,000nMの範囲の濃度で3回試験した。
【０２０６】
実施例2-3に記載したように、CHO細胞はクローン化されたヒト切断型GPR10を安定に発現するために生み出された。これらのCHO-T-hGPR10細胞、即ち、クローン化された野生型ヒトGPR10に存在する最初の64アミノ酸の切断型を発現する細胞を、2.0mM L-グルタミン、10%(v/v)透析ウシ胎仔血清、1.0%ヒポキサンチン-チミジン液および1.0% G-418選択試薬を含むF-12 HAM培地中で培養した。全細胞を5%CO2雰囲気下、37℃に保持し、約80%コンフリューエントとなった時点で非酵素的細胞解離バッファ(シグマ-アルドリッチ社)を用いて継代した。CHO-T-hGPR10細胞が約70%コンフリューエントとなった時点で、 [3H]アラキドン酸遊離アッセイのために上述したように回収した。
【０２０７】
3回の各反応で検出された平均放射カウント[±SEM,N=3]を計数し、結合等温曲線をウインドウズ用グラフパッド(GraphPad Prism version 3.00 for Windows（登録商標）, GraphPad Software, San Diego, CA)を用いて非線状回帰アッセイにより解析し、強度(95%信頼区間を有するEC50)および相対内在性活性(EMAX、基本遊離±SEM %として)を、1.0nM PrRPの存在下および非存在下における供試化合物Xについて評価した。CHO-T-hGPR10細胞における基準[3H]アラキドン酸遊離について、化合物Xと、化合物X+1.0nM PrRPとの間の有意差(P<0.05)を検出するために対応のないt-テストを用いた。
【０２０８】
結果を図21(縦軸：[3H]アラキドン酸遊離(% Basal Release±SEM)、横軸：Log[化合物X](M)、黒三角印=化合物X + PrRPの結果、黒四角印=化合物Xの結果、黒丸印=1μM PrRPの結果)に示す。
【０２０９】
図21に示されるように、化合物Xは、CHO-T-hGPR10細胞における基準[3H]アラキドン酸遊離を濃度依存的に増加させた(EC50=1.73μM, 0.70-4.25μM; EMAX=189.9±13.3%)。またこの応答の相対内在性活性は、化合物Xを1.0nM PrRPの存在下に試験したとき、30%有意に(P<0.0001)上昇した(EC50=1.88μM, 0.47-7.46μM; EMAX=248.1±17.7%)。
【０２１０】
このPrRPによる化合物Xの活性の強化は、PrRPと化合物Xとの間の強力な相互反応を示している。1.0nM PrRP単独ではCHO-T-hGPR10細胞における基準 [3H]アラキドン酸遊離に影響を与えない(EMAX=3.6±4.4%)。
【０２１１】
これらの結果から、PrRPは化合物Xの活性を強化する能力を有していると結論できる。この効果は、クローン化されたヒトGPR10の機能のPrRP-誘発活性およびクローン化されたヒトGPR10活性の化合物X-誘発活性におけるPrRPの4倍の相乗効果の両者に応答し得る提案されたオルソステリックな結合サイトを欠損したCHO-T-hGPR10細胞では非常に減少される。
【０２１２】
以上、本発明の特定の実施態様を挙げて本発明を詳細に説明したが、本発明のスピリットおよび範囲から逸脱しない限りにおいて種々の変化および変更が可能であることは当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０２１３】
本発明は、変異GPR10遺伝子を含むコンジェニックラット、GPR10蛋白の活性を抑制する化合物のスクリーニング方法などを提供するものであって、該方法によってスクリーニングされる化合物は、うつ病、不安などの精神医学的疾患の改善処置に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】ラット野生型GPR10をコードするヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:1)。
【図２】OLETFラットから単離されたラット変異GPR10をコードするヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:2)。
【図３】ヒトGPR10のNH2-末端断片をコードするヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:3)。
【図４】ヒト野生型GPR10のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:4)。
【図５】ヒト変異GPR10のヌクレオチド配列である(SEQ ID NO:5)。
【図６】ラット野生型GPR10(370アミノ酸)のアミノ酸配列である(SEQ ID NO:6)。
【図７】OLETFラットから単離されたラット変異GPR10(306アミノ酸)のアミノ酸配列である(SEQ ID NO:7)。
【図８】ヒト野生型GPR10(370アミノ酸)のアミノ酸配列である(SEQ ID NO:8)(アクセッション番号AB015745)。
【図９】ヒト野生型GPR10(306アミノ酸)のアミノ酸配列である(SEQ ID NO:9)。
【図１０】ヒトGPR10のN-末端断片のアミノ酸配列である(SEQ ID NO:10)。
【図１１】実施例で使用したラットおよびヒトGPR10発現ベクターの構造を示す図である。
【図１２】GPR10-変異コンジェニックラットの製造のための概要を示す図である。
【図１３】変異GPR10発現コンジェニックラットを用いた強制水泳試験の結果を示すグラフである。p<0.01(両側検定t-テストによる)
【図１４】[125I]PrRPが、クローン化されたヒト野生型GPR10を安定に発現するCHO細胞に結合することを示すグラフである。全データ値は同一試験を4回繰り返した平均値である。
【図１５】[125I]PrRPが、クローン化されたヒトGPR10のNH2-末端断片を安定に発現するCHO細胞に結合することを示すグラフである。全データ値は同一試験を4回繰り返した平均値である。
【図１６】[125I]PrRPの0.05nMを代替したPrRPが、クローン化されたヒト野生型GPR10を安定に発現するCHO細胞に結合することを示すグラフである。全データ値は同一試験を4回繰り返した平均値である。
【図１７】[125I]PrRPの0.05nMを代替した化合物Xが、クローン化されたヒト野生型GPR10を安定に発現するCHO細胞に結合することを示すグラフである。全データ値は同一試験を4回繰り返した平均値である。
【図１８】PrRPおよび化合物Xが、クローン化されたヒト野生型GPR10を安定に発現するCHO細胞から[3H]アラキドン酸を遊離させる効果を示すグラフである。全データ値は同一試験を3回繰り返した平均値である。
【図１９】PrRPおよび化合物Xが、クローン化されたヒトNH2-末端切断GPR10を安定に発現するCHO細胞から[3H]アラキドン酸を遊離させる効果を示すグラフである。全データ値は同一試験を3回繰り返した平均値である。
【図２０】クローン化されたヒト野生型GPR10を安定に発現するCHO細胞から[3H]アラキドン酸を遊離させる、PrRPで刺激された化合物Xの相乗効果を示すグラフである。化合物Xと化合物X + 1.0μM PrRPカクテルとの間に有意な差(p<0.0001)(対応のないt-test)が検出される。
【図２１】クローン化されたヒトNH2-末端切断GPR10を安定に発現するCHO細胞から[3H]アラキドン酸を遊離させる、PrRPで刺激された化合物Xの効果を示すグラフである。全データ値は同一試験を3回繰り返した平均値である。化合物Xと化合物X + 1.0μM PrRPカクテルとの間に有意な差(p<0.0001)(対応のないt-test)が検出される。
【配列表フリーテキスト】
【０２１５】
配列番号11〜14各配列は、それぞれGPR10 (TaqMan Probe 1)、GPR10 (TaqMan Probe 2)、GPR10 (Forward Primer GR-F1)およびGPR10 (Reverse Primer GR-R1)である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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