(57)【要約】【課題】脳炎・脳症の検出法、脳炎・脳症発症リスクを検定するための薬剤の検査法および脳炎・脳症処置用薬剤のスクリーニング法を提供する。【解決手段】脳炎・脳症の発症が疑われる患者由来の電位依存性陰イオンチャンネル（ＶＤＡＣ）を含む検体を用意し、該検体中のＶＤＡＣ発現レベルを測定し、該発現レベルの増加を指標として脳炎・脳症の発症および発症リスクを検出する方法、脳炎・脳症を誘起するおそれのある薬剤による脳炎・脳症の発症リスクを検定する方法、および脳炎・脳症の処置のための候補薬剤をスクリーニングする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳炎・脳症の発症が疑われる患者由来の電位依存性陰イオンチャネル（ＶＤＡＣ）を含む検体を用意し、該検体中のＶＤＡＣ発現レベルを測定し、該発現レベルの増加を指標として脳炎・脳症の発症および発症感受性（発症リスク）を検出することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
脳炎・脳症が、インフルエンザ脳炎・脳症である請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
ＶＤＡＣ発現レベルの測定が、ＶＤＡＣ遺伝子の転写物の測定によって行われる請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
ＶＤＡＣ発現レベルの測定が、ＶＤＡＣ蛋白の測定によって行われる請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
ＶＤＡＣが、ＶＤＡＣ−１、−２および−３からなる群から選ばれる少なくとも１種のアイソフォームである請求項１に記載の検出方法。
【請求項６】
薬剤による脳炎・脳症の発症リスクを検定するための薬剤の検査方法であって、薬剤存在系におけるＶＤＡＣ発現細胞のＶＤＡＣ発現レベルを測定し、該発現レベルを該薬剤非存在系におけるＶＤＡＣ発現細胞のＶＤＡＣ発現レベルと対比し、該発現レベルの変動を指標として上記発症リスクを検定する薬剤の検査方法。
【請求項７】
ＶＤＡＣ発現細胞の薬剤存在系が、被検動物への薬剤投与によって形成される請求項６に記載の薬剤の検査方法。
【請求項８】
ＶＤＡＣ発現細胞の薬剤存在系が、ＶＤＡＣ発現細胞培養液への薬剤添加によって形成される請求項６に記載の薬剤の検査方法。
【請求項９】
脳炎・脳症の処置のための候補薬剤のスクリーニング方法であって、被検物質存在系におけるＶＤＡＣ発現細胞のＶＤＡＣ発現レベルを測定し、該発現レベルを被検物質非存在系におけるＶＤＡＣ発現細胞のＶＤＡＣ発現レベルと対比し、該発現レベルを抑制する作用を有する被検物質を候補薬剤として選別することを特徴とする候補薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
ＶＤＡＣをレセプターとしてこれと結合するミニプラスミン、プラスミンまたはプラスミノーゲンの結合を阻害する候補薬剤をスクリーニングする方法であって、被検物質存在系におけるＶＤＡＣ蛋白とミニプラスミン、プラスミンまたはプラスミノーゲンとの結合性を測定し、被検物質非存在系におけるＶＤＡＣ蛋白とミニプラスミン、プラスミンまたはプラスミノーゲンとの結合性と対比し、該結合性を低下させる被検物質を候補薬剤として選別することを特徴とする候補薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項９および１０のいずれかに記載の方法によって選別された脳炎・脳症の処置のための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脳炎・脳症の発症および発症リスクの検出方法、脳炎・脳症の発症リスクを検定するための薬剤の検査法および脳炎・脳症処置用薬剤のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、インフルエンザウイルス感染に伴うあるいはこれに続く急速な意識障害と痙攣、特にしばしば致死的となる急速な脳浮腫の発症を主症状とする脳炎・脳症の報告が増加している。この脳炎・脳症はその死亡率の高さと後遺症の出現頻度の高さから社会的問題となっている。
【０００３】
インフルエンザ感染に伴って小児では、意識障害、熱性痙攣、重積痙攣、嘔吐などの中枢神経症状がしばしば認められ、時に急速な経過をたどって死に至ることがある。このような患者の中で、アスピリン（ａｓｐｉｒｉｎ）やジクロフェナックソジューム（ｄｉｃｌｏｐｈｅｎａｃ  ｓｏｄｉｕｍ）などの解熱剤の服用をきっかけにして脳症が起きる疾患をライ症候群（Ｒｅｙｅ’ｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍ）と呼び、インフルエンザウイルス感染に伴うその他の原因不明なケースを、我が国では特にインフルエンザ脳炎・脳症と呼んでいる。しかしながら、インフルエンザ脳炎・脳症は、その病態および発症機序が不明であり、一つの疾患としてはっきり定義されているものではなく、上記ライ症候群あるいは急性壊死性脳症（ａｃｕｔｅ  ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ；  ＡＮＥ）との区別も明確ではない（非特許文献１および非特許文献２参照）。
【０００４】
また、先天的脂肪酸代謝障害児の場合、特に日本に多いＣＰＴ  ＩＩ（Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＩＩ）またはＧＡ２（Ｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄｕｒｉａ  ｔｙｐｅ  ２）欠損症、欧米に多いＭＣＡＤ（Ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）欠損症では、インフルエンザ感染がなくともライ様症候群として脳症を発症することが知られている（非特許文献３参照）。
【０００５】
これまで、これらの疾患（ライ症候群、インフルエンザ脳炎・脳症、先天性脂肪酸代謝障害児のライ様症候群など）における脳浮腫や脳の機能障害の発症機序は不明であり、それら疾患の正確な鑑別診断法、治療法、予防法は確立されていない現状にあり、そのような診断法などの確立が当業界で切望されている。
【０００６】
尚、本発明者らは、インフルエンザウイルス感染においてその増殖サイクルに必須な因子としてのミニプラスミンの存在を明らかにしている（非特許文献４参照）。更に、ミニプラスミンは血液脳関門を破壊する因子として知られており（非特許文献５参照）、インフルエンザ脳炎・脳症時の血液脳関門障害による急速な脳浮腫と、時に脳内血管内皮細胞でのウイルス増殖、更にミニプラスミンの増加を特色とすることを示唆している（非特許文献６参照）。
【０００７】
また、ライ症候群との関係において、脂肪酸β−酸化の抑制の面からの報告がある（非特許文献７参照）。
【０００８】
【非特許文献１】
富樫武弘、「インフルエンザ脳炎・脳症」、日本臨床，  ５８巻，  １１号，  ｐｐ．８７−９２，  ２００２
【０００９】
【非特許文献２】
森島恒雄、「インフルエンザ脳炎・脳症の病態と戦略」、綜合臨牀，  Ｖｏｌ．４９，  Ｎｏ．２，  ｐｐ．３００−３０５，  ２０００
【００１０】
【非特許文献３】
Ｔａｍｏｋｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  β−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  １９８５  ｔｏ  ２０００”，  Ｂｒａｉｎ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ２４  （２００２）  ６７５−６８０
【００１１】
【非特許文献４】
Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｅｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ．”  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６８  （１０），  ２８４７−２８５５，  ２００１
【００１２】
【非特許文献５】
Ｎａｇｙ，  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｂｙ  ｆｉｂｒｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ”，  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ＆  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．  ９  （６），  ４７１−４７８，  １９９８
【００１３】
【非特許文献６】
木戸博ら、「インフルエンザウイルスの感染性と感染憎悪を抑制する生体内プロテアーゼとインヒビター」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｖｏｌ．３９，  Ｎｏ．１，  ｐｐ．４８−５３，  ２００２
【００１４】
【非特許文献７】
Ｔｒａｕｎｅｒ，  Ｄ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｅｔａ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｙｅ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍ”，  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ３８，  ２３９−２４１，  １９８８
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、インフルエンザ脳炎・脳症の病態、発症因子乃至発症機序を解明することをその第１の目的とする。より詳しくは、本発明の目的は、インフルエンザ脳炎・脳症を初めとして、従来これと区別され得なかったライ症候群などの各種脳炎・脳症の発症因子乃至発症機序を解明することにある。
【００１６】
また、本発明の他の目的は、かかる脳炎・脳症の正確な診断法、治療法、予防法などを確立することにある。
【００１７】
本発明は、更に、例えば解熱剤や鎮痛剤などの各種薬剤による脳炎・脳症の発症リスクを検定するための薬剤の検査方法（安全性検査）、脳炎・脳症の処置のための候補薬剤をスクリーニングする方法、およびこれらの方法実施のための各種試薬などを提供することをも目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かねてから、インフルエンザ脳炎・脳症の発症因子、発症感受性因子乃至発症機序を解明するべく鋭意研究を重ねてきた。その過程で、インフルエンザ脳症・脳炎モデルマウスの脳では、脳浮腫に伴って脳血管内皮に血液脳関門を破壊するミニプラスミンが増加し、さらに血管内皮細胞に限局してウイルス増殖が起きることを解明している。
【００１９】
本発明は、脳、その他の臓器の細胞膜もしくはミトコンドリア外膜に局在するチャネル蛋白質ＶＤＡＣ（電位依存性陰イオンチャネル；ｖｏｌｔａｇｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ）が、ミニプラスミン、プラスミンおよびプラスミノーゲンのレセプターとして機能し、その発現増加を介して血管内皮にミニプラスミン、プラスミンおよびプラスミノーゲンの蓄積を惹起すること、従って、脳炎・脳症を発症させる直接の因子はＶＤＡＣであること、という新規な知見を基礎として完成されたものである。
【００２０】
より詳しくは、本発明者らは、ＶＤＡＣ乃至これをコードする遺伝子の発現レベルが増加すると、脳浮腫高感受性状態となり、これにインフルエンザウイルス感染、その他の炎症などが加わり引き金を引くと、血液脳血管関門の透過性の亢進と脳浮腫、神経細胞の機能不全を引き起こすことを解明した。具体的には、本発明者らは、（１）インフルエンザウイルス感染、その他のウイルス感染、例えばＲＳウイルス感染、アデノウイルス感染、麻疹ウイルス感染、小児麻痺ウイルス感染、マラリア感染など、（２）アスピリン、ジクロフェナックソジューム、メフェナム酸（ｍｅｆｅｎａｍｉｃ  ａｉｄ）などの解熱剤服用、（３）先天性代謝障害などによるミトコンドリアでの長鎖、中鎖脂肪酸代謝障害、（４）薬剤や人工透析などによって誘発される血液中カルニチン低下に起因するミトコンドリアでの脂肪酸代謝障害などの各種因子あるいは未知の因子によってＶＤＡＣの発現増加が生じている場合に、インフルエンザウイルスなどの病原体の感染が伴って更にＶＤＡＣの発現が増加すると、あるいは体内の種々炎症反応によりミニプラスミンやプラスミンが産生されこれがＶＤＡＣを介して脳血管内皮に蓄積されると、脳炎・脳症が発症することを解明した。本発明は、これらの新しい知見を基礎として完成されたものである。
【００２１】
本発明の要旨とするところは、下記項１−１１に記載されるとおりである。
【００２２】
項１．  脳炎・脳症の発症が疑われる患者由来のＶＤＡＣを含む検体を用意し、該検体中のＶＤＡＣ発現レベルを測定し、該発現レベルの増加を指標として脳炎・脳症の発症および発症感受性（発症リスク）を検出することを特徴とする検出方法。
【００２３】
項２．  脳炎・脳症が、インフルエンザ脳炎・脳症である項１に記載の検出方法。
【００２４】
項３．  ＶＤＡＣ発現レベルの測定が、ＶＤＡＣ遺伝子の転写物の測定によって行われる項１に記載の検出方法。
【００２５】
項４．  ＶＤＡＣ発現レベルの測定が、ＶＤＡＣ蛋白の測定によって行われる項１に記載の検出方法。
【００２６】
項５．  ＶＤＡＣが、ＶＤＡＣ−１、−２および−３からなる群から選ばれる少なくとも１種のアイソフォームである項１に記載の検出方法。
【００２７】
項６．  薬剤による脳炎・脳症の発症リスクを検定するための薬剤の検査方法であって、薬剤存在系におけるＶＤＡＣ発現細胞のＶＤＡＣ発現レベルを測定し、該発現レベルを該薬剤非存在系におけるＶＤＡＣ発現細胞のＶＤＡＣ発現レベルと対比し、該発現レベルの変動を指標として上記発症リスクを検定する薬剤の検査方法。
【００２８】
項７．  ＶＤＡＣ発現細胞の薬剤存在系が、被検動物への薬剤投与によって形成される項６に記載の薬剤の検査方法。
【００２９】
項８．  ＶＤＡＣ発現細胞の薬剤存在系が、ＶＤＡＣ発現細胞培養液への薬剤添加によって形成される項６に記載の薬剤の検査方法。
【００３０】
項９．  脳炎・脳症の処置のための候補薬剤のスクリーニング方法であって、被検物質存在系におけるＶＤＡＣ発現細胞のＶＤＡＣ発現レベルを測定し、該発現レベルを被検物質非存在系におけるＶＤＡＣ発現細胞のＶＤＡＣ発現レベルと対比し、該発現レベルを抑制する作用を有する被検物質を候補薬剤として選別することを特徴とする候補薬剤のスクリーニング方法。
【００３１】
項１０．  ＶＤＡＣをレセプターとしてこれと結合するミニプラスミン、プラスミンまたはプラスミノーゲンの結合を阻害する候補薬剤をスクリーニングする方法であって、被検物質存在系におけるＶＤＡＣ蛋白とミニプラスミン、プラスミンまたはプラスミノーゲンとの結合性を測定し、被検物質非存在系におけるＶＤＡＣ蛋白とミニプラスミン、プラスミンまたはプラスミノーゲンとの結合性と対比し、該結合性を低下させる被検物質を候補薬剤として選別することを特徴とする候補薬剤のスクリーニング方法。
【００３２】
項１１．  項９および１０のいずれかに記載の方法によって選別された脳炎・脳症の処置のための薬剤。
【００３３】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、核酸配列、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １３８：  ９  （１９８４）〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書などの作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００３４】
本明細書において「ＶＤＡＣ」とは、ＶＤＡＣ−１、−２および−３の各アイソフォームあるいはＶＤＡＣ遺伝子およびＶＤＡＣ蛋白などを区別することなく、これらを包含して総称するものである。ＶＤＡＣ自体は既知であり、例えばヒトＶＤＡＣ−１、−２および−３の核酸配列は、順次、「ＮＭ００３３７４」、「ＮＭ００３３７５」および「ＮＭ００５６６２」にて参照される。また、後記実施例の脳炎モデルマウスにおけるマウスＶＤＡＣ−１、ＶＤＡＣ−２およびＶＤＡＣ−３の核酸配列は、順次、「ＮＭ０１１６９４」、「ＮＭ０１１６９５」および「ＮＭ０１１６９６」にて参照される。
【００３５】
本明細書において「インフルエンザ脳炎・脳症」とは、インフルエンザウイルス感染をきっかけとして発熱・痙攣と早期の意識障害が発症し、時にＣＴで脳浮腫、両側視床病変を伴う疾患をいう。該インフルエンザ脳炎・脳症は、インフルエンザ感染に伴って、発症因子としてのＶＤＡＣの発現上昇が認められる全ての脳炎・脳症を包含する。また、該インフルエンザ脳炎・脳症には、これまで一般的に定義されてきたライ症候群、急性壊死性脳症、出血性ショックを伴うＨＳＥＳ（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ａｎｄ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）などの疾患も含まれる場合がある他、これらの疾患には当てはまらないが発症機序としてインフルエンザ感染とＶＤＡＣの発現上昇を伴う脳炎・脳症も包含される。
【００３６】
また、本明細書に規定する「脳炎・脳症」は、上記インフルエンザ脳炎・脳症を初めとして、発症因子としてＶＤＡＣ発現レベルの上昇が認められる各種の脳炎・脳症を包含する。即ち、その原因に関わりなく、従来ライ症候群などに分類されてきた脳炎・脳症であっても、発症因子としてＶＤＡＣ発現レベルの上昇が認められる場合は、本発明に規定する脳炎・脳症に含まれるものとする。
【００３７】
本発明によれば、インフルエンザ脳炎・脳症を初めとする各種脳炎・脳症の発症因子乃至発症機序が解明され、かかる脳炎・脳症の正確な診断法、治療法、予防法などが確立できる。また本発明によれば、脳炎・脳症の発症リスクを検定するための薬剤の検査方法、脳炎・脳症の処置のための候補薬剤をスクリーニングする方法、およびこれらの方法実施のための各種試薬などが提供できる。
【００３８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明脳炎・脳症の診断法、薬剤の検査法およびスクリーニング法につき順次詳述する。
【００３９】
（１）脳炎・脳症の診断方法
本発明方法においては、まず脳炎・脳症の発症が疑われる患者に由来するＶＤＡＣを含む検体を用意する。該検体は、測定対象であるＶＤＡＣ遺伝子の転写物乃至翻訳物（ＶＤＡＣ蛋白）を含むものであれば特に限定はない。転写物を測定する場合、該検体としては、例えば末梢血、リンパ節、髄液、胸腔液、腹腔液、手術時の洗浄液などに由来する組織細胞および摘出組織、毛髪などの組織細胞などを含む各種生体試料を例示することができる。翻訳物を測定する場合、該検体としては、上記と同様の組織細胞に加えて、例えばそれらの由来する各種の体液などをそれぞれ例示することができる。これら検体の採取、調製は常法に従うことができる。
【００４０】
該検体中のＶＤＡＣ発現レベルの測定は、検体中のＶＤＡＣ遺伝子の発現レベルの測定（転写物の測定）およびその発現産物であるＶＤＡＣ蛋白の発現量の測定（翻訳物の測定）のいずれによることもできる。いずれの場合も、測定は一般的に知られている各種の方法によることができる。測定されるＶＤＡＣは、ＶＤＡＣ−１、−２および−３の各アイソフォームのいずれでもよく、また少なくともこれらの２種以上の混合であることができる。
【００４１】
具体的には、ＶＤＡＣ遺伝子発現レベルの測定は、例えばＲＴ−ＰＣＲ  （Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；  Ｅ．Ｓ．  Ｋａｗａｓａｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ．  Ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ＳａｎＤｉｅｇｏ，  ２１−２７  （１９９１））によるＲＮＡ増幅、ノーザンブロッティング解析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  （１９８９））、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ  （Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２１，  ３１５９−３１６６  （１９９３））、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定法、ＮＡＳＢＡ法  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５０，  ９１−９２  （１９９１））などの方法に従ってＶＤＡＣ遺伝子の転写物であるｍＲＮＡを測定することにより実施できる。
【００４２】
より好適な検出法としては、ＲＴ−ＰＣＲによる検出法を挙げることができる。これはより簡便には、目的のＰＣＲ増幅産物をリアルタイムに検出することを可能とするリアルタイムＰＣＲ法  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８８，  ７２７６−７２８０  （１９９１）；  特表平６−５０００２１号公報；  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ２２，  １７６−１８１  （１９９７）など）によることができる。
【００４３】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、より具体的には次のようにして実施できる。即ち、常法に従ってまず検体からＲＮＡを抽出し、該ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として標的とするＶＤＡＣ遺伝子の領域が増幅できるように設定された１対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をハイブリダイズさせる。その後、常法に従ってＰＣＲを行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する。この増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、リアルタイムＰＣＲ法に従い、あるいはその他方法、例えば予め放射線、蛍光物質などで標識しておいたプライマーを用いて上記ＰＣＲを行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせて標識プローブとハイブリダイズさせて検出する方法などによって行うことができる。
【００４４】
該方法に用いられるプライマーは、所望のＶＤＡＣを特異的に増幅できるものであればよく、公知のＶＤＡＣのＤＮＡ配列情報に基いて適宜設定することができる。通常、該プライマーは、１０−３５程度、好ましくは１５−３０程度のヌクレオチド長さを有するものであるのがよい。同様にプローブは、上記ＰＣＲ増幅産物と特異的にハイブリダイズし当該増幅産物の特異的検出を可能とするように設定される。当該プローブは、プライマーと同程度のヌクレオチド長さからなることができ、例えば、リアルタイムＰＣＲ法に従う検出に利用されるために、任意のレポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識され得る。
【００４５】
これらのプライマーおよびプローブは、常法に従って自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合成装置（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｐｌｕｓ：  ファルマシア社製）を使用して合成することができる。
【００４６】
尚、ＲＴ−ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法を実施するための装置や機器および汎用キットなどが市販されており、本発明にかかる測定を実施するに際しても、これら市販品を好適に利用することができる。
【００４７】
また、上記において採用され得る各種の操作、例えばＲＮＡの抽出、ＤＮＡまたはＤＮＡ断片の合成、切断、削除、付加または結合を目的とする酵素処理、ＲＮＡまたはＤＮＡの単離、精製、複製、選択、増幅などはいずれも常法に従うことができる（分子遺伝学実験法、共立出版（株）１９８３年発行；ＰＣＲテクノロジー、宝酒造（株）１９９０年発行など参照）。またこれらは必要に応じて適宜に修飾して用いることもできる。更に、増幅産物などの塩基配列を決定する場合にも、公知もしくは将来得られ得る各種の方法を広く採用することができる（例えばサイクルシークエンシング法：服部正平、「ＰＣＲを用いた直接塩基配列決定法」実験医学（増刊）新ＰＣＲとその応用、２９−３５  （１９９７）、羊土社など）。
【００４８】
ＶＤＡＣ蛋白の発現量の測定は、例えばＶＤＡＣ蛋白に対する抗体を利用して、常法に従ってウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などの公知の方法に従って実施することができる。より詳しくは、例えばウエスタンブロット法は、一次抗体としてＶＤＡＣ蛋白に対する抗体を用いた後、二次抗体として１２５Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質などで標識した標識抗体（一次抗体に結合する標識抗体）を用い、得られる標識結合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。
【００４９】
尚、上記において測定対象とするＶＤＡＣ蛋白の生理活性は既知であり、該蛋白質量と活性とは一定の相関関係を有していると推定される。従って、上記蛋白質量の測定に代えて、該蛋白質の活性の測定を行うことによっても、本発明の診断を実施することができる。即ち、本発明は、ＶＤＡＣ蛋白の活性を指標として、これを公知の方法に従って測定、評価することからなる、脳炎・脳症の診断方法をも包含する。
【００５０】
本発明診断法は、上述したようにして測定されるＶＤＡＣ発現レベル（ＶＤＡＣ遺伝子の発現レベル、ＶＤＡＣ蛋白質量またはＶＤＡＣ活性、本明細書においてはこれらを合わせて「ＶＤＡＣ発現レベル」という）が増加する場合に、脳炎・脳症の発症および発症リスクがあると判断する。この増加は、例えば予め健常者検体のＶＤＡＣ発現レベルを測定して平均値もしくは統計的中間値を決定しておき、この基準値として対比して判定することもでき、また対象患者について経時的に複数回の測定を行い、先の測定値を基準として、後の測定値をこれと対比して判定することもできる。
【００５１】
ＶＤＡＣ蛋白に対する抗体
ＶＤＡＣ蛋白に対する抗体は、ＶＤＡＣ蛋白を免疫抗原として調製することができる。該抗体には、抗血清（ポリクローナル抗体）およびモノクローナル抗体の両者が含まれる。抗体の製造法自体は、当業者によく理解されているところである。ＶＤＡＣ蛋白に対する抗体の製造もこれら常法に従うことができる（例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（１９８６）など参照）。かくして得られる抗体は、例えばＶＤＡＣ蛋白の精製、その免疫学的手法による測定ないし識別などに有利に利用できる。また、ＶＤＡＣ蛋白に対する抗体は一部市販されており、本発明においてはこれらの市販品をも好適に使用し得る。
【００５２】
抗体を利用した免疫学的手法によるＶＤＡＣ発現レベルの測定の具体例は、例えば後記実施例に示すとおりである。該抗体はこのように医薬品分野において、ＶＤＡＣ発現レベルの測定薬として、またＶＤＡＣが関与する脳炎・脳症の診断薬として有用である。また後述するように、該抗体はＶＤＡＣ活性を抑制（阻害）する候補薬剤のスクリーニングにも有用である。
【００５３】
尚、本発明にかかる脳炎・脳症の診断方法においては、上記ＶＤＡＣ発現レベルの測定を実施するための手段としての適当な試薬などを有効成分として含有する脳炎・脳症の診断剤（検出剤）を利用するのが好適である。
【００５４】
該診断剤には、ＶＤＡＣ発現レベルを測定するための方法に応じた特異的な試薬が必須成分として含有される。かかる特異的試薬は、採用する検出方法に従い適宜設定される。該試薬は、例えば前記したＶＤＡＣ蛋白に対する抗体、ＶＤＡＣ遺伝子の転写物検出用プローブおよび／または同検出用プライマーセットなどを包含する。即ち、該試薬は本発明にかかる測定対象を特異的に検出するための手段に必要な試薬として特徴付けられる。また、ＰＣＲの実施のための汎用試薬類は、かかる診断剤の必須成分とは考えられないが、これらもまた、例えばハイブリダイゼーションのための試薬類などと同様に、上記診断剤に含ませることができる。従って、本発明は、かかる脳炎・脳症の診断のための薬剤をも提供するものである。
【００５５】
（２）脳炎・脳症の発症リスクを検定する薬剤の検査法
本発明は、例えばインフルエンザ感染の処置に利用されるような既知の薬剤、あるいは新規な薬剤などが、その投与によって患者に脳炎・脳症を発症するリスクを有するかどうかを判定する薬剤の検査方法（安全性検査）をも提供する。
【００５６】
この薬剤の検査方法は、薬剤存在系におけるＶＤＡＣ発現細胞のＶＤＡＣ発現レベルを測定し、該発現レベルを該薬剤非存在系におけるＶＤＡＣ発現細胞のＶＤＡＣ発現レベルと対比し、該発現レベルの変動を指標として実施される。該発現レベルに少なくとも増加がないことをもって、検査された薬剤は脳炎・脳症を発症するリスクがないと判断できる。
【００５７】
上記において、薬剤存在系としては、（ａ）被検動物への薬剤投与によって形成される系（インビボ系）、および（ｂ）ＶＤＡＣ発現細胞培養液への薬剤添加によって形成される系（インビトロ系）を挙げることができる。
【００５８】
被検動物としては特に限定されることはないが、好ましくは、ミトコンドリアストレス状態のモデル動物を利用することができる。当該モデル動物は、ＶＤＡＣ発現レベルが増加して脳炎・脳症（脳浮腫）の発症準備段階（脳浮腫感受性増加）にあり、このようなモデル動物にインフルエンザウイルス感染などの引き金が加わると激しい浮腫が発症する（インフルエンザ脳炎・脳症発症モデル）ので、上記薬剤検査に好適に使用し得る。
【００５９】
当該ミトコンドリアストレス状態のモデル動物は、ミトコンドリア内膜中での長鎖脂肪酸代謝障害を誘導することにより作成することができる。該モデル動物の具体例としては、例えばカルニチン移送因子（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ  ＯＣＴＮ２）を欠損させたマウス（例えばＪＶＳ（ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）マウス）、カルニチンアンタゴニスト（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ、例えばｂ−（２，２，２−トリメチル−ヒドラジウム）プロピオネート；ＴＨＰ）を投与したマウスなどを例示することができる。
【００６０】
これらの被検動物に、被検薬剤を投与し、該動物の各組織乃至細胞、特に脳組織におけるＶＤＡＣ発現レベルを測定し、該発現レベルの増加（被検薬剤非投与の薬剤非存在系における同発現レベルを基準として）が認められる場合、該被検薬剤は、脳炎・脳症の発症リスクがあるものと判断できる。該発現レベルの増加がない場合もしくは発現レベルを減少させる場合、供試薬剤は安全性がある、即ち脳炎・脳症の発症リスクがないと判断できる。
【００６１】
本発明に従う薬剤の検査は、ＶＤＡＣ発現細胞培養液に被検薬剤を添加した系を利用しても実施することができる。この系に利用できるＶＤＡＣ発現細胞としては、ＶＤＡＣもしくはその遺伝子を保有する各種組織乃至細胞に由来するもの、例えば脳細胞、肺細胞、肝臓細胞、それらの樹立細胞などのいずれでもよい。また、ＶＤＡＣ発現細胞は、常法に従い、ＶＤＡＣ遺伝子を導入することによって人為的にＶＤＡＣ発現させた組換え細胞であることができる。更に、このＶＤＡＣ細胞には、上記ミトコンドリアアレスト状態のモデル動物に由来する細胞も包含される。
【００６２】
尚、本発明検査法に用いられる細胞には、細胞の集合体である組織、例えば脳組織、肺組織、肝臓組織なども含まれる。
【００６３】
これら細胞は、一般的な細胞培養用培地中で維持することができ、該培地に予め被検薬剤の所定量を存在させた後或いは非存在下に、常法に従って細胞のＶＤＡＣ発現レベルを測定すればよい。被検薬剤の存在系および非存在系の条件（温度、ｐＨ、培地組成など）は、常法と変わらず、細胞が死滅せず且つＶＤＡＣを発現できる条件から適宜選択される。また、上記検査方法において、ＶＤＡＣ発現レベルの測定は、前記（１）項に記載した各種の方法により行うことができる。
【００６４】
（３）脳炎・脳症の処置のための候補薬剤のスクリーニング方法
本発明は、被検物質存在系におけるＶＤＡＣ発現細胞のＶＤＡＣ発現レベルを測定し、該発現レベルを、被検物質非存在系におけるＶＤＡＣ発現レベルと対比し、このＶＤＡＣ発現レベルを抑制する作用を有する被検物質を候補薬剤として選別することからなる候補薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【００６５】
当該スクリーニング方法における被検物質存在系および非存在系としては、前記（２）項で詳述したインビボ系およびインビトロ系と同様の薬剤存在系および非存在系を利用できる。被検物質による処理（被検動物への投与および細胞培養液への添加）およびＶＤＡＣ発現レベルの測定も同様にして実施される。このスクリーニング方法に供される被検物質は、特に制限されるものではなく、核酸（ＶＤＡＣ遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含む）、ペプチド、蛋白質、有機化合物、無機化合物などのいずれでもよい。
【００６６】
本発明スクリーニング方法では、ＶＤＡＣ発現レベルを指標として、これを抑制乃至阻害する被検物質を候補薬剤として選別する。このスクリーニングによって、脳炎・脳症の予防、改善乃至治療などの処置を可能とする有力な候補薬剤を選別することができる。
【００６７】
また、本発明スクリーニング方法の他の好ましい一つの具体例としては、被検物質存在系におけるＶＤＡＣ蛋白とミニプラスミン、プラスミンまたはプラスミノーゲンとの結合性を測定し、これを被検物質非存在系におけるＶＤＡＣ蛋白とミニプラスミンなどとの対応する結合性測定結果と対比し、該結合性を低下させる被検物質を候補薬剤として選択する方法を挙げることができる。この方法は、ＶＤＡＣ蛋白の一つの機能、即ちミニプラスミン、プラスミンおよびプラスミノーゲンが該ＶＤＡＣ蛋白をレセプターとしてこれと結合する機能を利用している。ＶＤＡＣ蛋白をレセプターとしてこれと結合するミニプラスミンなどとの結合を阻害する被検物質は、脳炎・脳症の処置のための薬剤として有用である。
【００６８】
当該方法は、既知のＶＤＡＣ蛋白とミニプラスミン、プラスミンおよびプラスミノーゲンからなる群から選ばれる少なくとも１つを利用して、両者の結合に被検物質が与える影響を調べることにより実施できる。即ち、ＶＤＡＣ蛋白へのミニプラスミン、プラスミンまたはプラスミノーゲンの結合を、被検物質がどの程度低下（阻害）し得るかを調べることにより実施できる。ＶＤＡＣ蛋白とミニプラスミン、プラスミンまたはプラスミノーゲンとの結合性の測定は、例えばＶＤＡＣ蛋白、ミニプラスミン、プラスミンおよびプラスミノーゲンのそれぞれに特異的な既知抗体を利用して常法に従って行い得る。
【００６９】
（４）脳炎・脳症の処置のための薬剤
前記（３）項に示したスクリーニング方法によって選別された候補薬剤は、脳炎・脳症の処置のための薬剤として有用である。従って、本発明は該薬剤を有効成分とする脳炎・脳症の処置剤をも提供する。
【００７０】
本発明にかかる上記処置剤の有効成分は、本発明スクリーニング方法を利用して選別されたもののみならず、この選別された薬剤に関する情報に基づいて常法に従って化学・生化学的手法により、もしくは工業的に製造されたものであってもよい。
【００７１】
当該有効成分は、そのままでもしくは公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤など）などと混合して医薬組成物として調製することができる。有効成分が蛋白質である場合、医薬製剤は、好ましくは、通常の蛋白製剤に使用される各種成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、など張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。
【００７２】
当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）などに応じて経口投与または非経口投与することができる。また、本発明医薬製剤は、溶液製剤を凍結乾燥して保存し得る状態にした後、用時に水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製して使用することも可能である。
【００７３】
本発明医薬製剤は、薬理有効量の有効成分を含み、その投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なるが、動物試験による効果などを基に当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００７４】
尚、本発明者らは、脳炎・脳症の発症にＶＤＡＣが重要な役割を演じることを解明すると共に、該ＶＤＡＣの発現レベルの上昇が、ミトコンドリアでの脂肪酸代謝障害をその要因の一つとしていることを究明している。このことから、上記脂肪酸代謝障害を復旧乃至改善できる薬剤は、その投与によってＶＤＡＣ発現レベルの正常化に寄与し、かくして脳炎・脳症の治療および改善効果を奏し得るものと考えられる。従って、本発明に従い脳炎・脳症の発症を診断された患者であって、脂肪酸代謝障害が想定される患者においては、当該障害を改善するための医薬による処置が適当である。かかる薬剤としては、例えば、カルニチンおよび／またはグルコースを有効成分とする医薬を例示できる。当該医薬は、有効成分としてカルニチンおよびグルコースから選ばれる少なくとも１種を含むことを前提として、他は上記に示す医薬組成物と同様のものとすることができる。勿論、これは既に医療用医薬品として利用されているカルニチン製剤および／またはグルコース製剤であることができる。
【００７５】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。
【００７６】
【実施例１】
（試験材料および方法）
（１）    供試ウイルス株、動物実験および試薬
ウイルス株：非神経向性株インフルエンザＡ／Ａｉｃｈｉ／６８（Ｈ３Ｎ２）株を用いた。
【００７７】
実験動物：野生型（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）として正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＷＴ）を用いた。ミトコンドリアストレス状態のモデルマウスとして、カルニチン移送因子（Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ）ＯＣＴＮ２を欠損したＪｕｖｅｎｉｌｅ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  Ｓｔｅａｔｏｓｉｓを示すＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＪＶＳ）を用いた。実験は、Ｎｅｗ  Ｂｏｒｎ（授乳期）として生後２日目から離乳期（生後３週齢）までをインフルエンザ脳炎・脳症好発年齢マウスとして主に実験に用いた。
【００７８】
解熱剤：Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ  Ｓｏｄｉｕｍ、アスピリン（Ａｃｅｔｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｓｉｇｍａ）を用いた。
【００７９】
β−酸化障害誘発剤：体内脂肪酸のβ−酸化障害を一時的、可逆的に誘発し、ＪＶＳマウスに類似した体内状態を誘発する試薬としてカルニチンアンタゴニストであるｂ−（２，２，２−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−ｈｙｄｒａｚｉｕｍ）  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＴＨＰ）を使用した。
【００８０】
（２）    ウイルスの感染方法
発育鶏卵あるいはＭＤＣＫ細胞（上皮細胞株）で増殖させたインフルエンザウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／６８  （Ｈ３Ｎ２）を生理食塩水で希釈した後、その４μｌをエーテル麻酔下に生後３日目のマウスに１．２×１０４ＰＦＵ経鼻感染させた。また離乳期マウスには８μｌをエーテル麻酔下に３．３×１０４ＰＦＵを経鼻感染させた。ウイルス感染後、毎日体重測定と死亡率を測定した。ウイルス量の検定には、エーテル麻酔下に安楽死させた後、各臓器を採取して実験に用いた。
【００８１】
（３）    解熱剤およびＴＨＰの投与
Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ  Ｓｏｄｉｕｍを生理食塩水に溶解させた後（１μｇ／ｍｌ）２５μｌを、アスピリンは３０μｇ／ｍｌ，２５μｌを、それぞれマウスの背側頚部に１日２回皮下注射した。１日の投与量は、体重当たりＤｉｃｌｏｆｅｎａｃ  Ｓｏｄｉｕｍ  ４ｍｇ／Ｋｇ／日、アスピリン１２０ｍｇ／Ｋｇ／日とした。ＴＨＰは生理食塩水に溶解した後１日２回に分けて２５μｌをマウス背側頚部位に３００ｍｇ／Ｋｇ／日投与した。
【００８２】
（４）    エバンスブルーによる脳浮腫の検定
マウスをエーテルで麻酔した後、左の胸郭のみを開胸し左心室からマイクロキャピラリーを用いてエバンスブルー液１０μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を投与した。１０分後に右心房を切開し、左心室から体重の６倍量の生理食塩水で環流し、全身血管内のエバンスブルーを取り除き、組織内に浸潤したエバンスブルーを再抽出して量を測定して、浮腫の指標とした。
【００８３】
（５）    インフルエンザウイルスＲＮＡの定量
脳、肺、肝臓などの各臓器のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出は、各組織から全ＲＮＡ  をＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて抽出し、１μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ  （Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）で検出した。用いたプライマーは、いずれも自動合成機で合成した。インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｅ；  ＨＡ）の塩基配列から、Ｐ１：配列番号：１およびＰ２：配列番号：２をＦｉｒｓｔ  ＰＣＲに使用して５７８  ｂｐの検出を行った。また、Ｐ３：配列番号：３およびＰ４：配列番号：４をＳｅｃｏｎｄ  ＰＣＲに使用して２３２  ｂｐの検出を行った。蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲには、Ｐ５：配列番号：５およびＰ６：配列番号：６と、Ｔａｑ  Ｍａｎ  ｐｒｏｂｅ  （配列番号：７、５’端にＦＡＭを、３’端にＴＲＭＲＡを結合させたもの）を用い、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００にて測定した。尚、検量線はインフルエンザウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／６８（Ｈ３Ｎ２）のＨＡ    ｃＤＮＡをｐ−ＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）に入れたプラスミドを用いて、これを標準検量線として検量した。
【００８４】
（６）    ＲＴ−ＰＣＲによるＶＤＡＣｍＲＮＡの発現増加の検討
実験動物の脳と肺のＲＮＡを、前記に準じて、Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｇｉｂｃｏ）を用いて同社添付マニュアルに従って抽出した。
【００８５】
（７）    リアルタイムＰＣＲによるＶＤＡＣの定量
組織や細胞から抽出したＲＮＡ１μｇを用いて、Ｍ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、  Ｒｎａｓｅ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ、Ｐｏｉｎｔ  Ｍｕｔａｎｔ  ｌｉｔ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）とｏｌｉｇｏ（ｄＴ）による逆転写反応によってｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡを鋳型として、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＴ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、０．３μＭプライマーセットを含む反応液を調整し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＲ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて、９５℃−１５分間の熱変性後、９４℃−１５秒間、５５−６０℃−３０秒間、７２℃−３０秒間のサイクルを３０−４０サイクル繰り返してＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅産物を解析した。
【００８６】
尚、ＶＤＡＣには３種のアイソマーがあり、それぞれの検出には以下の各プライマーセット（いずれも自動合成機で合成）を用いた（マウスの場合）。
【００８７】
2004264066.tif 000002
尚、内部標準としてのβ−アクチンの検出には、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとして配列番号：１４のプライマーとＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとして配列番号：１５のプライマーを用いた。
【００８８】
また、上記ＲＴ−ＰＣＲで得たｃＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  （ＰＲＯＭＥＧＡ）にクローニングし、Ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いてアイソトープ標識し、ノーザンブロッティングのプローブとして用いた。
【００８９】
上記において、ヒトＶＤＡＣの検出用プライマーセットとしては、各アイソマーに対して下記の各セットを用いることができる。
【００９０】
2004264066.tif 000003
（８）    免疫組織化学的解析によるインフルエンザウイルス抗原、ミニプラスミンおよびＶＤＡＣの検出
インフルエンザウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／６８（Ｈ３Ｎ２）をウサギに免疫して得られた抗体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて精製して用いた。さらにこのＩｇＧを、マウス全血清蛋白質を固相化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムに通すことで非特異的反応を示すＩｇＧを取り除いた後、未吸着ＩｇＧ分画を抗インフルエンザウイルス一次抗体とした。
【００９１】
ミニプラスミンに対する特異一次抗体は、Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｍ．，らの方法（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６８，  ２８４７−２８５５，  ２００１）により作成したものを利用した。また、プラスミンとプラスミノーゲンに対する一次抗体としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａから市販の市販品を利用した。
【００９２】
ＶＤＡＣの一次抗体としては、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社のＶＤＡＣ  Ａｂ−５を用いた。
【００９３】
各特異精製抗体ＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）を緩衝液パラホルムアルデヒドで固定化した脳の切片と、４℃で一晩反応させた後、二次抗体を室温で１時間反応させ、次いでＡｖｉｄｉｎｅ−ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ法に従って各々の抗原を検出した。
（研究結果および考察）
（１）    インフルエンザ感染に伴う脳浮腫
ミトコンドリアでのＡＴＰ産生は、主としてアセチル補酵素Ａ（Ａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ）を介してＴＣＡサイクルによって行われるが、アセチル補酵素Ａを低下させる様々な原因、具体的には長鎖脂肪酸がアシルカルニチン（Ａｃｙｌ  ｃａｒｎｉｔｉｎｅ）を介してβ−酸化されて代謝される経路の障害、例えば中鎖脂肪酸代謝障害、グルコースからアセチル補酵素Ａを介する経路の障害などが知られている。前記ＪＶＳマウスおよびＴＨＰ投与マウスは、ミトコンドリア内膜中での長鎖脂肪酸代謝障害を細胞膜レベルで誘導したミトコンドリアストレス状態のモデル動物である。
【００９４】
このＪＶＳマウスを用いてインフルエンザ感染に伴う脳浮腫の経時変化を調べた結果（前記（４）に従いエバンスブルーの組織侵入を指標にした脳浮腫の測定）、インフルエンザウイルス感染後、経時的に脳浮腫が増加した。この脳浮腫の増加は、同様にして試験した野生型マウス（ＷＴ）に比しても明らかに著しいものであり、脳実質のエバンスブルーの経時的な増加が観察された。インフルエンザ感染のない状態（ウイルス感染させなかった供試マウス）について同一試験を行った結果では、ＷＴおよびＪＶＳの両者とも脳の浮腫を認めなかったことから、ミトコンドリアストレスは脳浮腫にとって感受性の増加を引き起こすものの、それ単独では脳浮腫の引き金を引くことはなく、この試験系の場合は、インフルエンザウイルス感染が引き金を引いていることが明確となった。
【００９５】
（２）    脳のインフルエンザウイルス抗原とミニプラスミン
インフルエンザ感染したＪＶＳの脳におけるインフルエンザウイルス抗原とミニプラスミンの免疫組織化学染色によれば、感染後数日より、ＪＶＳの脳血管内皮にミニプラスミンの蓄積が始まり、これに伴って脳血管内皮でのウイルス増殖も確認された。この脳で蓄積されるミニプラスミンは、肺の炎症局所で多量に作られた後血液を介して全身に輸送され、特に脳の血管内皮で蓄積されたものと推定された。
【００９６】
図１のａ（ＲＴ−ＰＣＲ）に、ＷＴおよびＪＶＳの感染後の脳（図中Ｂｒａｉｎ）、肺（図中Ｌｕｎｇ）、肝（図中Ｌｉｖｅｒ）および血液（図中Ｂｌｏｏｄ）におけるインフルエンザウイルスゲノムのコピー数を比較した結果を示す。尚、図中「１ｓｔ−ＰＣＲ」および「２ｎｄ−ＰＣＲ」は、それぞれ前記ＲＴ−ＰＣＲの１ｓｔ−ＰＣＲおよび２ｎｄ−ＰＣＲの結果であり、「ＧＡＰＤＨ」は内部標準の結果である。また図中レーンにおける「Ｍ」はマーカー（ＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ）を示す。
【００９７】
図１のｂ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）に、ＷＴおよびＪＶＳの感染後の脳（図中Ｂｒａｉｎ）、肺（図中Ｌｕｎｇ）および肝組織（図中Ｌｉｖｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ）におけるインフルエンザウイルスゲノムのコピー数を比較した結果を示す。図の縦軸は前記リアルタイムＰＣＲに従い測定されたウイルスゲノムのコピー数（対数表示、ＩＡＶ  ｌｏｇ１０  ｃｏｐｉｅｓ／μｇＴｏｔａｌ  ＲＮＡ）であり、黒いバーはＪＶＳ  の結果を、白いバーはＷＴの結果を示している。
【００９８】
図１に示される結果から、ＷＴおよびＪＶＳにおいて、肺のウイルス増殖数には大きな差は認められなかったが、脳と肝ではＷＴに比べてＪＶＳでは数千から数百倍のウイルスが増殖していることが確認された。
【００９９】
（３）    ミニプラスミンとＶＤＡＣ蛋白との結合性
ヒトのプラスミノーゲン、ミニプラスミンおよびミクロプラスミンの各５０ｎｇをニトロセルロース膜にドットブロットした後、精製マウスＶＤＡＣ蛋白溶液１００ｎｇ／ｍｌと反応させた。結合したＶＤＡＣ蛋白は抗ＶＤＡＣ蛋白抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社）を用いてＥＣＬケミルミネッセンス試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。尚、マウスの脳および心筋からのＶＤＡＣ蛋白の精製は、文献記載の方法に従った（Ｂｕｒｅａｕ，  Ｍ．  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ−ｌｉｋｅ  Ｍｒ  ３６，０００  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ”，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６７，  ８６７９−８６８４，  １９９２）。
結果を図２に示す。
【０１００】
図２に示される結果から、次のことが判る。即ち、精製ＶＤＡＣ蛋白はクリングル１−５を持つプラスミノーゲンおよびクリングル５を持つミニプラスミンとは結合したが、クリングル領域を持たないミクロプラスミンとは結合しなかった。このことから、少なくともクリングル５領域が、ＶＤＡＣ蛋白との結合に関与していることが明らかになった。
【０１０１】
ＶＤＡＣ蛋白はミトコンドリア外膜に見い出されるチャネルであるが、細胞膜においてもその発現が確認されている。マウスの脳では、細胞膜上のＶＤＡＣ蛋白がミトコンドリアにおけるよりも多く発現することが認められた。そのため、ミニプラスミンとＶＤＡＣ蛋白との結合は、クリングル５を介して行われ、かくしてＶＤＡＣ蛋白をレセプターとしてミニプラスミンが細胞膜に蓄積すると推定された。
【０１０２】
（４）    ＶＤＡＣの発現レベル
ＶＤＡＣには３種類のアイソマー（ＶＤＡＣ−１，  −２，  −３）が存在する。ＷＴマウス脳のＶＤＡＣの発現は、通常状態では比較的低レベルにあるが、インフルエンザ脳症や脳炎の誘因物質にさらされると、ＶＤＡＣの発現は増加して脳浮腫の準備状態（感受性増加状態）になる。具体的には、脳浮腫はこの状態でほとんど認められないが、インフルエンザウイルス感染が伴うと激しい浮腫が発症する。
【０１０３】
この試験は、ＷＴマウスの脳における各種薬剤の処理、インフルエンザウイルス感染時のＶＤＡＣ−１ｍＲＮＡの発現量（前記ＲＴ−ＰＣＲ）を調べたものである。
【０１０４】
試験は、授乳期のＷＴにインフルエンザウイルスを経鼻感染させ、感染５日後にＶＤＡＣ−１ｍＲＮＡを測定するか（ａ群）、ＷＴにカルニチンアンタゴニストであるＴＨＰを３００ｍｇ／Ｋｇ／Ｄａｙで５日間投与後、同様にしてＶＤＡＣ−１ｍＲＮＡを測定するか（ｂ群）、インフルエンザ感染させたＷＴにカルニチンアンタゴニストであるＴＨＰを３００ｍｇ／Ｋｇ／Ｄａｙで５日間投与後、同様にしてＶＤＡＣ−１ｍＲＮＡを測定するか（ｃ群）、インフルエンザ感染させたＷＴにアスピリン１２０ｍｇ／Ｋｇ／Ｄａｙを５日間投与後、同様にしてＶＤＡＣ−１ｍＲＮＡを測定する（ｄ群）ことにより実施した。また、対照としてインフルエンザ感染させなかったＷＴに生理食塩水を注射した群（ｅ群）を設けた。各群は２匹のマウスで構成した。
【０１０５】
上記の結果を図３（ＲＴ−ＰＣＲ分析結果）に示す。
【０１０６】
図３において、Ｗは供試マウス（ＷＴ）を示す。各レーンの表示におけるＩｎｆｅｃｔｉｏｎ−はインフルエンザ感染なしの群を示し、＋はインフルエンザウイルスを感染させた群を示す。ＴＨＰはＴＨＰ単独処理群（インフルエンザ感染なし）を示し、ＴＨＰ＋はインフルエンザ感染マウスに対するＴＨＰ処理群を示し、Ａ＋はインフルエンザ感染マウスに対するアスピリン処理群を示す。
【０１０７】
図３に示される結果から次のことが明らかである。即ち、ａ群では明らかに脳のＶＤＡＣ−１の発現増加が認められた。ｂ群およびｃ群、即ちミトコンドリアストレス状態、特にカルニチンアンタゴニストであるＴＨＰで処理することによって脂肪酸代謝障害を引き起こした群では、ＶＤＡＣ−１の著名な増加が認められた。またライ症候群の誘因物質として知られているアスピリンで処理したｄ群の場合もＶＤＡＣ−１の発現増加が認められた。
【０１０８】
（５）    脳と肺におけるＶＤＡＣ−１、ＶＤＡＣ−２およびＶＤＡＣ−３  の発現レベル
前記（４）に示された結果を更に詳細に検討するために、以下の各群において、ＷＴの脳と肺におけるＶＤＡＣ−１、ＶＤＡＣ−２およびＶＤＡＣ−３  ｍＲＮＡの定量を前記リアルタイムＰＣＲにて検討した。
Ｃ群：生理食塩水投与の対照ＷＴ群（インフルエンザ感染なし）
Ｉ群：インフルエンザ感染５日目のＷＴ群
Ａ群：アスピリン１２０ｍｇ／Ｋｇ／Ｄａｙを５日間投与のＷＴ群
Ａ＋Ｉ群：インフルエンザ感染初日からアスピリン１２０ｍｇ／Ｋｇ／Ｄａｙを５日間投与のＷＴ群
Ｄ群：Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ  Ｓｏｄｉｕｍ  ４ｍｇ／Ｋｇ／Ｄａｙを５日間投与のＷＴ群
ＴＨＰ群：ＴＨＰ３００ｍｇ／Ｋｇ／Ｄａｙを５日間投与のＷＴ群
ＴＨＰ＋群：インフルエンザ感染初日からＴＨＰ３００ｍｇ／Ｋｇ／Ｄａｙを５日間投与のＷＴ群
尚、各群の供試動物５匹で構成し、得られた結果は各群５匹の平均で示した。またＣ群と比べた有意差検定をＳｔａｔｖｉｅｗ  ４．０ソフトウェアを用いてｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔにて行った。
【０１０９】
結果を、内部標準として利用したβ−アクチンに対する各ＶＤＡＣの相対量にて図４−６に示す。図４はＶＤＡＣ−１発現量の結果を、図５はＶＤＡＣ−２発現量の結果を、図６はＶＤＡＣ−３発現量の結果をそれぞれ示す。
【０１１０】
ＶＤＡＣ−１、−２および−３のそれぞれによって発現量増加の感受性は異なるものの、生理食塩水処理（Ｃ群）に比して、インフルエンザ感染（Ｉ群）、アスピリン投与（Ａ群）、Ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ  Ｓｏｄｉｕｍ投与（Ｄ群）およびＴＨＰ投与（ＴＨＰ群）の脳と肺では、それぞれのＶＤＡＣｍＲＮＡの発現増加が認められた。
【０１１１】
一般にＶＤＡＣ−１と−２は、脳において上記の処理に敏感に反応して発現増加が認められるが、ＶＤＡＣ−３では肺で敏感に反応していた。これらのことは、ヒトのＶＤＡＣ発現検索において、脳以外の臓器や細胞、例えば髄液中の白血球や末梢血中のＶＤＡＣの発現の変化を調べることで、個体としてのＶＤＡＣの発現状況ひいては脳での発現状況（脳浮腫の準備状態）の程度を推定できることを明らかにしている。
【０１１２】
（６）    ＪＶＳマウス脳のＶＤＡＣ蛋白の発現
インフルエンザウイルスの経鼻感染に伴うＪＶＳマウスの脳血管内皮と神経細胞におけるＶＤＡＣ発現の増加を、各組織をエバンス染色後、顕微鏡観察して調べた（免疫組織化学染色）。
【０１１３】
インフルエンザ非感染のＪＳＶマウス脳顕微鏡写真撮影結果を図７に、インフルエンザ感染５日目のＪＳＶマウス脳顕微鏡写真撮影結果を図８に示す。
【０１１４】
図７においてａ）およびｃ）は×１４０の弱拡大像であり、ｂ）およびｄ）は×４２０の強拡大像である。該図７に示されるように、血管内皮は染色されていないが、ｄ）に示すように神経細胞は染色されている。
【０１１５】
また、図８においてａ）およびｄ）は×１４０の弱拡大像であり、ｂ）、ｃ）およびｅ）は×４２０の強拡大像である。該図のａ）〜ｃ）に示すようにＶＤＡＣ蛋白は、ウイルス感染後、血管内皮細胞に特異的かつ著明に発現増加している。またｄ）およびｅ）に見られるように神経細胞での発現も増加している。
【０１１６】
ミトコンドリア内膜中の長鎖脂肪酸代謝障害を持つＪＶＳマウスでは、ＷＴに比べて脳におけるＶＤＡＣ発現レベルは僅かに高い。図７に示すように、ＶＤＡＣの発現は主に神経細胞のみで観察され、血管内皮でははっきり確認できない。しかし、インフルエンザウイルスの経鼻感染５日目の脳では、図８に示すようにＶＤＡＣの脳血管内皮での著明な増加と、神経細胞での増加が認められた。ここには示していないがコントロール実験として用いたＮｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ＩｇＧでは、いずれの検体も全く染色されず、図７および８で検出された蛋白質は、ＶＤＡＣの抗体に特異的に反応して染色されたと推定された。
【０１１７】
以上のことから、インフルエンザ脳炎・脳症の発症機序は次のように推定できる。即ち、インフルエンザ脳炎・脳症は様々な原因（解熱剤、抗痙攣薬、抗生物質、種々の病原体感染、先天性脂肪酸代謝障害など）によりＶＤＡＣの発現が増加して脳浮腫発症の準備状況（脳浮腫高感受性状態）が作られる。この状態に、インフルエンザウイルス感染を始めとした各種の感染症や様々な原因による炎症反応が生じると、脳炎・脳症が発症する。
【０１１８】
（７）    考察
ＶＤＡＣの発現が異常に増加して、脳浮腫の準備状態（脳浮腫高感受性状態）にあり、これに病原体の感染が伴ってさらにＶＤＡＣの発現が増加するか、体内の炎症反応によるミニプラスミンが産生されて脳血管内皮に蓄積されると、血液脳関門の破壊や不安定化が生じ、脳炎・脳症が起きると推定された。具体的な脳炎・脳症の引き金には、インフルエンザウイルス感染やその他のウイルス感染、例えばＲＳウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、小児麻痺ウイルス、マラリア感染などが挙げられる。病原微生物感染以外では、種々の炎症反応が脳浮腫高感受性状態に加わることで、脳炎・脳症が発症すると推定される。従って本発明で明らかにしたＶＤＡＣの発現レベルを調べることで、脳浮腫発症の準備状況（脳浮腫高感受性状態）を調べることができる。また、インフルエンザ脳炎・脳症に対する解熱剤や抗痙攣剤、抗生物質などの安全性の検索を判定する検査法として、ＶＤＡＣの発現を調べることは重要である。さらに、本発明診断方法は、ライ症候群、インフルエンザ脳炎・脳症、先天性の脂肪酸の代謝障害時のライ様症候群の脳炎・脳症発症の準備状態にあるかないかを診断できる新規な方法として、また、外傷や外科手術に時に伴う脳浮腫発症の感受性を予め診断できる方法として、非常に有用である。
【０１１９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＷＴおよびＪＶＳマウスの脳、肺、肝および血液におけるインフルエンザウイルスゲノムのコピー数をＰＣＲにより測定、対比した結果を示す図面である。
【図２】プラスミノーゲン、ミニプラスミンおよびミクロプラスミンとＶＤＡＣとの結合性を求めた図面である。
【図３】ＷＴマウスの脳におけるインフルエンザ感染を初めとする各種発症誘発因子によるＶＤＡＣ−１発現レベルの増加を明らかにするＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す図面である。
【図４】ＷＴマウスの脳および肺におけるＶＤＡＣ−１  ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲにより定量した結果を示すグラフである。
【図５】ＷＴマウスの脳および肺におけるＶＤＡＣ−２  ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲにより定量した結果を示すグラフである。
【図６】ＷＴマウスの脳および肺におけるＶＤＡＣ−３  ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲにより定量した結果を示すグラフである。
【図７】ＪＶＳマウスの脳におけるＶＤＡＣ蛋白質の発現を示す免疫組織化学的解析の顕微鏡写真である。
【図８】インフルエンザ感染ＪＶＳマウスの脳におけるＶＤＡＣ蛋白質の発現を示す免疫化学的解析の顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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