(57)【要約】【課題】加水分解酵素を用いて高い光学純度の光学活性２−ピペラジンカルボン酸を工業的に高い収率で得る。【解決手段】一般式（Ｉ）【化１】2004321006.tif 0000072004321006.tif 000008（式中、Ｒは、Ｃ１〜３のアルキル基を、＊は、不斉炭素原子を示す。）で表されるピペラジンカルボン酸エステルをＣａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ株、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．株、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ株、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ株由来のリパーゼを使用して加水分解することにより式（Ｓ）−（ＩＩ）又は（Ｒ）−（ＩＩ）【化２】2004321006.tif 000009（Ｓ）−（ＩＩ）  （Ｒ）−（ＩＩ）で表される光学活性２−ピペラジンカルボン酸を高収率で得ることが出来る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2004321006.tif 000005
（式中、Ｒは、Ｃ１〜３のアルキル基を、＊は、不斉炭素原子を示す。）で表されるピペラジンカルボン酸エステルをＣａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ株、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．株、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ株、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ株由来のリパーゼを使用して加水分解することを特徴とする式（Ｓ）−（ＩＩ）又は（Ｒ）−（ＩＩ）
【化２】
2004321006.tif 000006
で表される光学活性２−ピペラジンカルボン酸の製造方法。
【請求項２】
請求項１の製造方法において、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ株又はＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ株由来のリパーゼを使用する（Ｓ）−（ＩＩ）で表されるＳ−体の製造方法。
【請求項３】
請求項１の製造方法において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．株、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ株、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ株由来のリパーゼを使用する（Ｒ）−（ＩＩ）で表されるＲ−体の製造方法。
【請求項４】
加水分解を有機溶媒と水もしくはｐＨ緩衝剤を溶解した水を用いて行う請求項１〜３記載の製造方法。
【請求項５】
リパーゼの使用量が、一般式（Ｉ）で表されるエステルに対して、１０〜１００ｇ／ｍｏｌである請求項１〜４記載の製造方法。
【請求項６】
加水分解における反応温度が、０〜６０℃である請求項１〜５記載の製造方法。
【請求項７】
リパーゼを再利用して加水分解反応を行う請求項１〜６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、式（Ｓ）−（ＩＩ）又は（Ｒ）−（ＩＩ）
【化３】
2004321006.tif 000002
で表される光学活性な２−ピペラジンカルボン酸の製造方法に関する。
本発明により製造される光学活性な２−ピペラジンカルボン酸は例えば、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤
【化４】
2004321006.tif 000003
等の原料として利用できる［文献Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ．，  ８（７），９７９（１９９７）］。
【０００２】
【従来の技術】
これら光学活性なピペラジン２−カルボン酸類の製造については、下記特許文献に示すような光学分割剤を用いる方法、例えばカンファースルホン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、汎用のアミノ酸もしくは、それぞれの誘導体を用いることが知られている。
【特許文献１】特開２０００−２３９２６６号公報
【特許文献２】特開２００２−１２８７６５号公報
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
これら分割剤を用いた光学分割法は操作が煩雑であり、大量生産に適した簡便な方法により光学活性ピペラジン２−カルボン酸又は光学活性ピペラジン２−カルボン酸エステルを得る方法の開発が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、ピペラジン２−カルボン酸のカルボン酸部位を種々アルコールを用いてエステル化し、このエステル体に酵素を作用させて不斉加水分解を行えば光学活性体を取得できると考え、検討を重ねてきた。その結果、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する微生物或いはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属もしくはアルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する微生物或いは該微生物から得られる酵素を作用させ、不斉的に加水分解し、（Ｓ）−（ＩＩ）と（Ｒ）−ピペラジン２−カルボン酸エステルＲ−（Ｉ）を生成させた後、有機溶媒で分離、抽出することにより（Ｓ）−（ＩＩ）と（Ｒ）−（Ｉ）を夫々採取でき、更に採取した（Ｒ）−（Ｉ）をアルカリ加水分解、又は酵素分解を行って（Ｒ）−（ＩＩ）を生成、採取できることを見い出し、本発明を完成した。即ち、本発明は一般式（Ｉ）
【化５】
2004321006.tif 000004
（式中、ＲはＣ１〜３のアルキル基を、＊は不斉炭素原子を示す。）で表わされるピペラジン２−カルボン酸エステルをＣａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ株、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．株、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ株、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ株由来のリパーゼを使用して加水分解することを特徴とする式（Ｓ）−（ＩＩ）又は（Ｒ）−（ＩＩ）で表される光学活性２−ピペラジンカルボン酸の製造方法である。
【０００５】
Ｒで表されるＣ１−３のアルキル基として、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基が挙げられ、その中でもイソプロピル基が好ましい。
【０００６】
一般式（Ｉ）で表されるピペラジン２−カルボン酸エステルは例えば次のようにして得られる。即ち（Ｒ，Ｓ）−ピペラジン２−カルボン酸２塩酸塩に溶媒と反応試剤とを兼ねたアルコールを加え、ピペラジン２−カルボン酸の濃度５〜３０％（ｗ／ｖ）の範囲で、濃硫酸などの強酸性下、６０℃〜還流温度の範囲で１〜３０時間脱水反応を行う。更に、この反応液に水と有機溶媒を加え、ｐＨ９．０に調整後、有機溶媒と水層を分離する。その有機溶媒を減圧濃縮により有機溶媒と過剰のアルコールを除去する。濃縮液にヘキサン等の疎水性有機溶媒を用いて結晶化し、その結晶を濾過後、乾燥すれば高純度の（Ｒ，Ｓ）−ピペラジン２−カルボン酸エステルが得られる。
【０００７】
一般式（Ｉ）で表されるラセミ体を不斉的に加水分解し、式（Ｓ）−（ＩＩ）で表される化合物を生成させる立体選択的エステラーゼを有する微生物としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ又はＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ（Ｌｉｐａｓｅ  ＣｈｉｒｏＣＬＥＣＴＭ−ＣＲ）があり、該微生物を１０〜１００ｇ／ｍｏｌ用いる。
【０００８】
式（Ｒ）−（ＩＩ）で表される化合物を生成させる立体選択的エステラーゼを有する微生物として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉがある。
【０００９】
ピペラジン２−カルボン酸エステルの微生物による不斉加水分解反応においては、一般に用いることのできる有機溶媒例えばトルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、アセトニトリル、クロロホルムを用いることができる。
【００１０】
不斉加水分解に用いられる反応試剤としては水もしくはイオン抑制剤を溶解させたｐＨ７の水を基質に対し、１〜２０倍ｍｏｌ量好ましくは１〜１０倍ｍｏｌ量を使用する。
【００１１】
反応条件は温度０〜５０℃、好ましくは０〜２５℃の範囲であり、ｐＨは５〜８、好ましくは６．５〜７．５の範囲で行い、反応時間は基質と酵素量の比により変化するが、未反応のエステルと生成物のカルボン酸がモル比５０％に達したところで止めれば良い。但し、酵素の反応活性の観点から通常３〜２４時間で５０％に達するように基質の添加量を決めるのが望ましい。
【００１２】
酵素を用いる方法としては、市販されているＣａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ属もしくはＣａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ属を起源とするもの等を使用することにより式（Ｓ）−（ＩＩ）で表される化合物を生成させることができる。
【００１３】
不斉加水分解反応は、基質のラセミ体Ｉを濃度１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で好ましくは１〜５％の反応液に懸濁もしくは溶解し、酵素を適量、例えば酵素と基質の重量比として１：５ないし１：２〜１０の割合で加え、温度０〜５０℃、好ましく０〜２０℃の範囲で反応を行い、高速液体クロマトグラフィーによってカルボン酸の生成量及びカルボン酸エステルの減少量を測定し、反応液中の一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ体（Ｒ）−（Ｉ）と（Ｓ）−（ＩＩ）のモル比５０％になった時点で反応を止めれば良い。また加水分解を行う際のｐＨ範囲は４〜８．５であれば良く、好ましくはイオン抑制剤を用いてｐＨ７．０に調整することが望ましい。更に、上記の不斉加水分解反応を、酵素を固定化させることにより繰り返し行うこともできる。
【００１４】
酵素を用いて不斉加水分解した後、反応液中の（Ｓ）−（ＩＩ）と（Ｒ）−（Ｉ）を分離する方法としては、反応液をそのまま濾過し、反応液中に析出している（Ｓ）−（ＩＩ）と使用した酵素を濾別し、濾別して得られた（Ｓ）−（ＩＩ）及び酵素を水に添加し、室温で攪拌し（Ｓ）−（ＩＩ）を溶解させ、酵素を濾別し、水で洗浄して（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸の水溶液を得る。
【００１５】
分離して得られた光学活性ピペラジン２−カルボン酸エステルは、そのまま濃縮すれば高光学純度のエステル体で得られるが、更に次のようにして光学活性ピペラジン２−カルボン酸とすることができる。即ち、光学活性ピペラジン２−カルボン酸エステル（Ｒ）−（Ｉ）を室温下、ｐＨ１０〜１３．５の範囲で２〜５時間アルカリ加水分解を行えば、（Ｒ）−（ＩＩ）が生成する。また、（Ｒ）−（Ｉ）を加水分解する能力を有する酵素、例えばＮｏｖｏｚｙｍｅ  ＳＰ  ４３５を作用させて前記酵素による加水分解条件下に加水分解を行って（Ｒ）−（ＩＩ）を得ることもできる。
【００１６】
このようにして得られた加水分解液は冷却下で攪拌し、ＨＣｌ水溶液をゆっくり加え（Ｓ）−（ＩＩ）の２塩酸塩を析出させ、析出した結晶を桐山ロ−トで濾別した後に塩酸水もしくは、（Ｓ）−（ＩＩ）の２塩酸塩が溶解しない溶媒例えば、メノール、エタノールなどで洗浄し、乾燥させて高光学純度の（Ｓ）−（ＩＩ）の２塩酸塩を容易に得ることができる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸・２塩酸塩の製造：
ｒａｃ−２−ピペラジンカルボン酸イソプロピルエステル１．７２ｇ（０．０１ｍｏｌ）をＴＨＦ５０ｍｌに溶解し、リン酸Ｂｕｆｆｅｒ１．６２ｇ（１６２ｇ／ｍｏｌ）、Ｌｉｐａｓｅ（Ａｌｔｕｓ社製：ＣｈｉｒｏＣＬＥＣＴＭ−ＣＲ）０．８６ｇ（８６ｇ／ｍｏｌ）をそれぞれ加え、その混合物を５℃で６時間攪拌した。得られた反応液から反応中に析出した（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸及びＬｉｐａｓｅを桐山ロ−トを用いて濾別した後にＴＨＦ１５ｍｌで洗浄した。濾別して得られた（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸及びＬｉｐａｓｅを水５ｍｌに添加し、室温で１０分間攪拌し（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸を溶解させ、桐山ロ−トを用いてＬｉｐａｓｅを濾別し、水１．５ｍｌで洗浄して（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸の水溶液を得た。得られた（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸の水溶液を５℃で攪拌下、３５％ＨＣｌ水溶液３．６ｍｌをゆっくり加え（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸の２塩酸塩を析出させ、３５％ＨＣｌ水溶液全量滴下後５℃で１時間攪拌し、桐山ロ−トで濾別した後にＭｅＯＨ１０ｍｌで洗浄し、乾燥させて（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸の２塩酸塩０．３８ｇを得た。化学純度９８．０％、光学純度９８．７％ｅｅ、収率１８．７％。
【００１９】
実施例２
ｒａｃ−２−ピペラジンカルボン酸イソプロピルエステル３．４４ｇ（０．０２ｍｏｌ）をトルエン１００ｍｌに溶解し、ハイフロ２ｇ、リン酸Ｂｕｆｆｅｒ０．５４ｇ（２７ｇ／ｍｏｌ）、Ｌｉｐａｓｅ（Ａｌｔｕｓ社製：ＣｈｉｒｏＣＬＥＣＴＭ−ＣＲ）０．８６ｇ（４３ｇ／ｍｏｌ）をそれぞれ加え、その混合物を５℃で３時間攪拌した。得られた反応液から反応中に析出した（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸及びハイフロ、Ｌｉｐａｓｅを桐山ロ−トを用いて濾別した後にトルエン３０ｍｌで洗浄した。濾別して得られた（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸及びハイフロ、Ｌｉｐａｓｅを水１２ｍｌに添加し、室温で１５分間攪拌し（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸を溶解させ、桐山ロ−トを用いてハイフロ、Ｌｉｐａｓｅを濾別し、水３ｍｌで洗浄して（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸の水溶液を得た。得られた（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸の水溶液を  ５℃で攪拌下、３５％ＨＣｌ水溶液７．１ｍｌをゆっくり加え（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸の２塩酸塩を析出させ、３５％ＨＣｌ水溶液全量滴下後５℃で１時間攪拌し、桐山ロ−トで濾別した後にＭｅＯＨ２０ｍｌで洗浄し、乾燥させて（Ｓ）−２−ピペラジンカルボン酸の２塩酸塩１．００ｇを得た。化学純度１００％、光学純度８９．２％ｅｅ、収率２４．６％。
【００２０】
実施例３
ｒａｃ−２−ピペラジンカルボン酸イソプロピルエステル０．１ｇ（０．５８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ３ｍｌに溶解し、リン酸Ｂｕｆｆｅｒ０．０３ｇ（５１．７ｇ／ｍｏｌ）、Ｌｉｐａｓｅ（ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製：ｎｏｖｏｚｙｍ４３５）０．０５ｇ（８６ｇ／ｍｏｌ）をそれぞれ加え、その混合物を５℃で１０時間攪拌した。得られた反応液から反応中に析出した（Ｒ）−２−ピペラジンカルボン酸及びＬｉｐａｓｅを桐山ロ−トを用いて濾別した後にＴＨＦ１０ｍｌで洗浄した。濾別して得られた（Ｒ）−２−ピペラジンカルボン酸及びＬｉｐａｓｅを水１２ｍｌに添加し、室温で１５分間攪拌し（Ｒ）−２−ピペラジンカルボン酸を溶解させ、桐山ロ−トを用いてＬｉｐａｓｅを濾別し、水３ｍｌで洗浄して（Ｒ）−２−ピペラジンカルボン酸の水溶液を得た。得られた（Ｒ）−２−ピペラジンカルボン酸の水溶液を以下のＨＰＬＣで分析して収率、光学純度を求めた。収率４２．３％、光学純度９１．３％ｅｅ。
【００２１】
ＨＰＬＣ分析条件
カラム      Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ    ＲＰ−１８ＧＰ  ＡＱＵＡ  ２５０−４．６（５μｍ）
移動相      ４％ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  （ｗｔ）
Ｂｕｆｆｅｒ＝３ｍＭ  １−オクタンスルホン酸ナトリウム、４０ｍＭリン酸二水素カリウム、８５％リン酸２４ｍＭ
カラム温度  ４０℃
流量        １．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長    ２１０ｎｍ
注入量      ８μｌ
内部標準物質  テオフィリン
光学純度は、以下のＨＰＬＣ条件で分析をおこない、その結果をもとに算出した。
カラム      ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００  （５μｍ）４．６ｍｍφ×２５ｃｍ
移動相      ２．０ｍＭ  ＣｕＳＯ４ａｑ
カラム温度  ４０℃
ＵＶ        ２５４ｎｍ
ｆｌｏｗ    １．０ｍｌ／ｍｉｎ
注入量      ２μｌ
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、立体選択性をもつ加水分解酵素エステラーゼ又は、同加水分解能を有する酵素を適宜選んで使用することにより、（Ｒ，Ｓ）−ピペラジン２−カルボン酸エステルから該エステルの光学活性体の（Ｒ）体、（Ｓ）体を、あるいは光学活性なピペラジン−２−カルボン酸の（Ｒ）体もしくは（Ｓ）体を得ることが出来る。