(57)【要約】【課題】2つの蛍光遺伝子を発現する組換えプラスミドを提供すること。【解決手段】組換えプラスミドは、(a)遍在性プロモーター、(b)前記遍在性プロモーターの下流に作動可能に結合され、挿入されている1つの蛍光遺伝子、(c)皮膚特異的または筋肉特異的プロモーター、および(d)前記皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターの下流に作動可能に結合され、挿入されている別の蛍光遺伝子を含み、遍在性プロモーターと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは逆方向特性を有しており、遍在性プロモーターと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは、前記遺伝子の転写を可能にする方向特性を有するように、それぞれ前記蛍光遺伝子および前記別の蛍光遺伝子の上流に位置している。本発明のプラスミドを含む宿主、遺伝子組換え魚の作成方法、および遺伝子組換え魚も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)遍在性プロモーター、(b)前記遍在性プロモーターの下流に作動可能に結合され、挿入されている1つの蛍光遺伝子、(c)皮膚特異的または筋肉特異的プロモーター、および(d)前記皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターの下流に作動可能に結合され、挿入されている別の蛍光遺伝子を含み、遍在性プロモーターと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは、逆方向特性を有しており、遍在性プロモーターと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは、前記遺伝子の転写を可能にする方向特性を有するように、それぞれ前記蛍光遺伝子および前記別の蛍光遺伝子の上流に位置している、組換えプラスミド。
【請求項２】
前記遍在性プロモーターが、β-アクチン、伸張因子-l-α、18S-rDNA、および5S-rDNAからなる群から選択される請求項1の組換えプラスミド。
【請求項３】
前記皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターが、α-アクチン、トロポニンT、トロポニンC、ミオシン重鎖、シトカロチンIIC型、およびS-100からなる群から選択される請求項1の組換えプラスミド。
【請求項４】
請求項1のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項５】
a)請求項1のプラスミドを魚の卵細胞または胚細胞に導入するステップと、
b)前記卵細胞または胚細胞を魚へと発育させるステップであって、ここで請求項1のプラスミドが魚のゲノムに導入されているステップ、
を含む、遺伝子組換え魚を産生する方法。
【請求項６】
魚が、メダカ、ゼブラフィッシュ、ディスカス、キンギョ、キリフィッシュ、シクリッド、グッピー、アロワナ、コイ、およびショーベタからなる群から選択される、請求項5の遺伝子組換え魚。
【請求項７】
(a)遍在性プロモーター、(b)前記遍在性プロモーターの下流に作動可能に結合され、挿入されている1つの蛍光遺伝子、(c)皮膚特異的または筋肉特異的プロモーター、および(d)前記皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターの下流に作動可能に結合され、挿入されている別の蛍光遺伝子を含み、遍在性プロモーターと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは逆方向特性を有しており、遍在性プロモーターと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは、前記遺伝子の転写を可能にする方向特性を有するように、それぞれ前記蛍光遺伝子および前記別の蛍光遺伝子の上流に位置している、遺伝子組換え魚。
【請求項８】
前記蛍光遺伝子が、緑、赤、黄および青色の蛍光遺伝子からなる群から選択される請求項7の遺伝子組換え魚。
【請求項９】
前記蛍光遺伝子が、緑色および赤色蛍光遺伝子からなる群から選択される請求項8の遺伝子組換え魚。
【請求項１０】
a)請求項1で定義した断片a)およびb)を含むプラスミドIと、請求項1で定義した断片c)およびd)を含むプラスミドIIの、2つのプラスミド断片IおよびIIを得るために、請求項1のプラスミドを適当な制限部位で制限酵素で切断するステップと、
b)ステップa)の前記プラスミドIおよびIIの各々を、魚の卵細胞または胚細胞にそれぞれ導入するステップと、
c)前記魚にプラスミドIおよびIIを同時に発現させるステップ
を含む、同時に2つの異なる蛍光遺伝子を発現する遺伝子組換え魚を産生する方法。
【請求項１１】
前記蛍光遺伝子が、緑、赤、黄および青色の蛍光遺伝子からなる群から選択される請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記蛍光遺伝子が、緑色および赤色蛍光遺伝子からなる群から選択される請求項11に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えプラスミド、遺伝子組換え魚を産生する方法、宿主細胞、およびそれを含む遺伝子組換え動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え魚の研究には、調節要素の異種および同族の供給源によって駆動(drive)され、構成的または組織特異的な発現遺伝子に由来する遺伝子が利用される。制御要素には、不凍蛋白質、マウスメタロチオネイン、ニワトリδ-クリスタリン、コイβ-アクチン、サケヒストンH3、コイα-グロビンなどに由来する遺伝子がある。しかし、遺伝子組換え魚でのこれらのDNA要素の使用には、低い発現効率および組換え遺伝子パターンのモザイク発現(mosaic expression)を含めて重大な欠点がある。
【０００３】
メダカβ-アクチンプロモーターによって駆動されるlacレポーター遺伝子をメダカ卵へマイクロインジェクションすると、F1世代においてさえlacZ遺伝子の一過性の発現がもたらされるが、発現は低く高度にモザイク状である。Hamadaらは、メダカβ-アクチンプロモーターを融合した緑色蛍光蛋白質を微量注入した卵由来のメダカ胚において同様の結果を報告した(Hamadaら、1998年、Mol Marine Biol Biotechnol 7、173〜180頁)。
【０００４】
Chi-Yuan Chouらは、メダカで遺伝子組換え用遺伝子の効率的発現を増大させるために、ITRを両端に置いたDNA構築物を開示した。均一な組換え遺伝子の発現が、F0世代および続く2世代において実現された(Chi-Yuan Chouら、2001年、Transgenic Research 10、303〜315頁)。さらに、Chung-Der Hsiaoらは、組み換え遺伝子中へAAV ITPを取り込むと、ゼブラフィッシュにおいて、F0世代で均一な遺伝子発現、および安定した組み換え遺伝子の伝達がもたらされることを示した(Chung-Der Hsiaoら、2001年、Developmental Dynamics 220、323〜336頁)。
【０００５】
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、脊椎動物発生生物学の新規のモデル生物である。実験用モデルとして、ゼブラフィッシュは、卵および胚の入手が容易なこと、胚形成全体にわたる組織の明瞭さ、外部発生(external development)、短い世代時間、成魚および幼魚の維持が容易なことなど、いくつかの主要な利点を提供する。
【０００６】
GFP遺伝子(EGFP遺伝子を含む)などの既知の蛍光遺伝子は、様々な遺伝子プロモーターを使用してゼブラフィッシュに導入されており、それらには、ラットミオシン軽鎖エンハンサ(Moss, J. B.ら、「Green fluorescent protein marks skeletal muscle in murine cell lines and zebrafish」Gene 173,8998, 1996年)、ゼブラフィッシュおよびティラピアのインシュリン様成長因子Iプロモーター(Chen, J. Y.ら、「Isolation and characterization of tilapia (Oreochromis mossambicus) insulin-like growth factors gene and proximal promoter region」DNA Cell Biol.17、359〜376頁、1998年)が含まれる。これらの遺伝子組換え実験はすべて、遺伝子発現解析用GFP遺伝子組換え系の開発、または遺伝子プロモーター中の調節DNA要素を試験することを目的としている。
【０００７】
WO0049150号は、GFPなどの単一蛍光遺伝子によって発現された蛍光遺伝子組換え鑑賞魚を開示している。しかし、2つの以上の蛍光遺伝子を均一に、安定して発現する魚は開発されていない。
【非特許文献１】Hamadaら、1998年、Mol Marine Biol Biotechnol 7、173〜180頁
【非特許文献２】Chi-Yuan Chou ら、2001年、Transgenic Research 10、303〜315頁
【非特許文献３】Chung-Der Hsiaoら、2001年、Developmental Dynamics 220、323〜336頁
【非特許文献４】Moss, J. B.ら、「Green fluorescent protein marks skeletal muscle in murine cell lines and zebrafish」Gene 173,8998, 1996年
【非特許文献５】Chen, J. Y.ら、「Isolation and characterization of tilapia (Oreochromis mossambicus) insulin-like growth factors gene and proximal promoter region」DNA Cell Biol.17、359〜376頁、1998年
【特許文献１】WO0049150号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、(a)遍在性(ubiquitous)プロモーター、(b)前記遍在性プロモーターの下流に作動可能に結合され、挿入されている1つの蛍光遺伝子、(c)皮膚特異的または筋肉特異的プロモーター、および(d)前記皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターの下流に作動可能に結合され、挿入されている別の蛍光遺伝子を含み、遍在性プロモーターと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは逆方向特性を有しており、遍在性プロモーターと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは、前記遺伝子の転写を可能にする方向特性を有するように、それぞれ前記蛍光遺伝子および前記別の蛍光遺伝子の上流に位置している、組換えプラスミドに関する。
【０００９】
本発明は、また、本発明のプラスミドを含む宿主細胞に関する。
【００１０】
本発明は、さらに、
a)魚の卵細胞または胚細胞に本発明のプラスミドを導入するステップと、
b)卵細胞または胚細胞を魚へと発育させるステップと
を含み、ここで本発明のプラスミドがその魚のゲノムに導入される、遺伝子組換え魚を産生する方法に関する。
【００１１】
本発明は、さらに、
a)本発明のプラスミド中で定義される断片a)およびb)を含むプラスミドIと、本発明のプラスミド中で定義される断片c)およびd)を含む前記プラスミドIIの、2つのプラスミド断片IおよびIIを得るために、本発明のプラスミドを適当な制限部位で制限酵素で切断するステップと、
b)ステップa)の前記プラスミドAおよびBの各々を、魚の卵細胞または胚細胞にそれぞれ導入するステップと、
c)前記魚にプラスミドIおよびIIを同時に発現させるステップと
を含む、同時に2つの蛍光遺伝子を発現する遺伝子組換え魚を産生する方法に関する。
【００１２】
本発明は、また、本発明のプラスミドによって形質転換した遺伝子組換え動物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、魚に(緑色および赤色蛍光など)2種以上の遺伝子を導入するための組換えプラスミドを提供する。その魚は、一般の光源下で均一で強力な蛍光を示す。
【００１４】
本発明は、(a)遍在性プロモーター、(b)前記遍在性プロモーターの下流に作動可能に結合され、挿入されている1つの蛍光遺伝子、(c)皮膚特異的または筋肉特異的プロモーター、および(d)前記皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターの下流に作動可能に結合され、挿入されている別の蛍光遺伝子を含み、遍在性プロモーターと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは逆方向特性を有しており、遍在性プロモーターと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは、前記遺伝子の転写を可能にする方向特性を有するように、それぞれ前記蛍光遺伝子および前記別の蛍光遺伝子の上流に位置している、組換えプラスミドを提供する。
【００１５】
本明細書では、「上流」および「下流」の語は、基準方向を蛍光遺伝子の開始コドンから終止コドンに向かう方向と定義した場合、ある点の基準方向と同じ方向に置かれている側が、その点の「下流」であり、基準方向の逆方向に置かれている側が、その点の「上流」であることを意味する。
【００１６】
本発明によれば、遍在性プロモーターは、本発明のプラスミド中で蛍光遺伝子の発現を駆動するために使用される。遍在性プロモーターと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは逆方向特性を有しており、遍在性プロモーターは、蛍光遺伝子の転写を可能にする方向特性を有するように、前記蛍光遺伝子の上流に位置している。遍在性プロモーターは、β-アクチン、伸張因子(elongation)-1-α、18S-rDNA、および5S-rDNAからなる群から選択することが好ましい。
【００１７】
本発明によれば、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは、蛍光遺伝子の発現を駆動するために使用される。皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは、蛍光遺伝子の転写を可能にする方向特性を有するように、前記蛍光遺伝子の上流に位置している。皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターは、α-アクチン、トロポニンT、トロポニンC、ミオシン重鎖、シトカロチン(cytokarotin)IIC型、およびS-100からなる群から選択することが好ましい。
【００１８】
本発明によれば、どんな種類の蛍光遺伝子も本発明のプラスミドのプロモーターの下流に挿入することができる。蛍光遺伝子は、緑、赤、黄および青色の蛍光遺伝子からなる群から選択することが好ましい。蛍光遺伝子は市販されており、たとえば、Clonteh Laboratories, Inc.、Lightools Research、BD Biosciences Pharmingenなどから入手することができる。蛍光遺伝子は、緑色および赤色蛍光遺伝子からなる群から選択されることがより好ましい。
【００１９】
Hiroshi Otsukiらは、遍在性プロモーターを使用した場合、カルス(calli)を含むイネ全体で緑色蛍光が観察される(Hiroshi Otsuki、2002年1月12〜16日、Plant, Animal & Microbe Genomes X Conference)ことを示した。本発明によれば、緑色蛍光遺伝子は、本発明の前記遍在性プロモーターの下流に作動可能に結合され、挿入される。緑色蛍光蛋白質(GFP)は、最初クラゲ(Aequorea victoria)から単離され、市販されている。GFPは、生物発光が報告されている他のものと異なり、紫外線または青色光に曝露するだけで明るい緑色光を発する。緑色光の発光は、生物の発光タンパク質エクオリン由来のエネルギーのGFPへの変換による。GFPは、分子量28kDaの238アミノ酸蛋白質であり、単一発光ピーク509nmを有し、主吸収ピークは395nm、副ピークは470nmである。好都合にも、その蛍光は種固有であり、緑色光を発光させるのに、いかなる基質、補因子、または追加の蛋白質も必要としない。GFPは、大腸菌、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、いくつかの宿主生物や細胞で発現に成功している。
【００２０】
本発明によれば、赤色蛍光遺伝子は、BD Bioscience Clontechから購入することができる。本発明の実施形態では、pDsRed2-1を赤色蛍光遺伝子の供給源として使用する。pDsRed2-1は、成熟を早め非特異的凝集を低くするように改変されたDsRed変異体であるDsRed2をコードする。サンゴ(Discosoma sp.)の赤色蛍光蛋白質(drFP583、Matz, M. V.ら、(1999) Nature Biotech. 17、969〜973頁)に由来するDsRed2は、哺乳動物細胞中で高発現させるためのヒトコドン使用選択(usage preference)に相当する、一連のサイレントな塩基対変化(silent base-pair changes)を含む(Haas, J.ら、(1996) Curr. Biol. 6、315〜324頁)。哺乳動物細胞培養でDsRed2が構成的に発現された場合、赤色発光細胞は、形質移入から24時間以内ならば蛍光顕微鏡で検出することができる。DsRed1を発現する細菌細胞系および哺乳動物細胞系でしばしば観察される、蛋白質の大きな不溶性凝集物は、DsRed2を発現する細胞中では劇的に減少する。成熟が速く、より溶けやすい赤色蛍光蛋白質は、宿主細胞にもよく受け入れられ、DsRed2を形質移入した哺乳動物細胞培養は、生存率(viability)低下のどんな明白な徴候も示さない。試験したこれらの細胞系では、DsRed2を発現する細胞は、形質非移入対照と同じ形態(たとえば付着性、光屈折)および増殖上の特徴を示す。pDsRed2-1は、複数のクローニング部位(MCS)に挿入された異なるプロモーターおよびプロモーター/エンハンサ結合体からの転写をモニタするために使用することができる、プロモーターのないDsRed2ベクターである。DsRed2の上流にある配列は、真核細胞で翻訳効率を上げるために、Kozakコンセンサス翻訳開始部位(Kozak, M.、(1987)Nucleic Acids Res. 15、8125〜8148頁)に変換されている。DsRed2遺伝子下流のSV40ポリアデニル化シグナルは、DsRed2のmRNAの3'末端の適切なプロッピングを指令する。ベクターの骨格は、SV40のT抗原を発現する哺乳動物細胞中のSV40複製起点、大腸菌中で増殖するためのpUC複製起点、および一本鎖DNA産生のためのf1起点を含む。ネオマイシン耐性カセット(Neo')は、安定的に形質移入された真核細胞を、G418を使用して選択できるようにする。このカセットは、SV40初期プロモーター、Tn5のネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子、および単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ(HSV TK)遺伝子由来ポリアデニル化シグナルからなる。そのカセットの上流の細菌性プロモーターは、大腸菌中でカナマイシン耐性を発現する。
【００２１】
本発明によれば、組換えプラスミドは、当技術分野で公知の標準的分子技術を使用して、遍在性プロモーターおよび1つの蛍光遺伝子を含むプラスミドと、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターおよび別の蛍光遺伝子を含むプラスミドを結合して構築される。本発明の一実施形態では、遍在性プロモーターおよび緑色蛍光遺伝子を含むプラスミドを制限酵素で切断すると4.7kbの断片が得られる。皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターならびに赤色蛍光遺伝子を含むプラスミドを制限酵素で切断すると7.5kbの断片が得られる。得られた4.7kbの断片および7.5kbの断片をライゲーション手順によって融合させる。
【００２２】
本発明は、本発明のプラスミドを含む宿主細胞を提供する。本発明によれば、本発明のプラスミドを含ませるためにいくつかの宿主系を利用することができる。これらには、それだけには限らないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物;酵母発現ベクターで形質転換した酵母、ウイルス発現ベクターに感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクターまたは細菌発現ベクターで形質転換した植物細胞系、動物細胞系が含まれる。
【００２３】
本発明は、本発明のプラスミドで形質転換した遺伝子組換え動物を提供する。本発明によれば、この遺伝子組換え動物は、たとえば、げっ歯類や魚などの実験室試験手順で使用される非ヒト哺乳動物など、どんな好都合な動物でよい。本発明の遺伝子組換え動物は、マイクロインジェクションまたは組換えベクターによる感染など、従来の好都合な遺伝子操作技術を使用して、動物に本発明のプラスミドを導入することによって好都合に得られる。遺伝子は、一細胞、または細胞前駆体への導入によって、動物の全細胞に直接または間接に導入することができる。遺伝子操作技術には、通常の交雑育種、試験管内受精、染色体内への組込みまたは染色体外でのDNA複製でもよい組換えDNA分子導入が含まれる。遺伝子組換え動物は、遺伝子組換え魚が好ましい。遺伝子組換え魚は、メダカ、ゼブラフィッシュ、ディスカス、キンギョ、キリフィッシュ、シクリッド、グッピー、アロワナ、コイ、ショーベタ、および他の鑑賞魚からなる群から選択することがより好ましい。本発明によれば、本発明の遺伝子組換え魚は、緑色と赤色の混ざった色を発現する。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、本発明のプラスミドは、単一蛍光、混合蛍光、および同時に異なる蛍光を発現する魚の産生に使用することができる。単一蛍光遺伝子を発現させるためには、本発明のプラスミドを適当な制限酵素で切断して、単一蛍光遺伝子を含むプラスミド断片を生成する。得られた単一プラスミドを魚の卵細胞または胚細胞に導入して、単一蛍光遺伝子を発現する魚を得る。混合蛍光を発現させるためには、本発明のプラスミドを魚の卵または胚細胞に導入して、混合蛍光を発現する魚を得る。同時に異なる蛍光を発現させるためには、異なる蛍光遺伝子を含む異なるプラスミド(pasmids)を、魚の卵細胞または胚細胞に同時に導入して、同時に異なる蛍光遺伝子を発現する魚を得る。
【００２５】
本発明のプラスミドは、単一緑色蛍光遺伝子、単一赤色蛍光遺伝子、緑色および赤色混合蛍光遺伝子、または同時に緑色および赤色蛍光遺伝子を発現する魚の産生に使用することができることが好ましい。緑色蛍光を発現する魚の場合は、本発明のプラスミドを適当な部位で制限酵素で切断して、遍在性プロモーターと、前記遍在性プロモーターの下流に作動可能に結合され挿入された緑色蛍光遺伝子とを含むプラスミドを得、得られたプラスミドを魚の卵または胚に導入して緑色蛍光を発現させる。赤色蛍光を発現する魚の場合は、本発明のプラスミドを適当な部位で制限酵素で切断して、皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターと、前記皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターの下流に作動可能に結合され挿入された赤色蛍光遺伝子とを含むプラスミドを得、得られたプラスミドを魚の卵細胞または胚細胞に導入して赤色蛍光を発現させる。
【００２６】
本発明の好ましい一実施形態によれば、本発明は、a)魚の卵細胞または胚細胞に本発明のプラスミドを導入するステップと、b)卵細胞または胚細胞を魚に生育させるステップとを含み、混合蛍光を発現する魚を得るために本発明のプラスミドをその魚のゲノムに導入する、混合蛍光を発現する遺伝子組換え魚を産生する方法を提供する。蛍光遺伝子は、緑、赤、黄、および青色の蛍光遺伝子からなる群から選択することが好ましい。蛍光遺伝子は、緑色および赤色蛍光遺伝子からなる群から選択することがより好ましい。
【００２７】
本発明の好ましい一実施形態によれば、本発明は、
a)請求項1で定義した断片a)およびb)を含むプラスミドIと、請求項1で定義した断片c)およびd)を含むプラスミドIIの、2つのプラスミド断片IおよびIIを得るために、請求項1のプラスミドを適当な制限部位で制限酵素で切断するステップと、
b)ステップa)の前記プラスミドAおよびBの各々をそれぞれ魚の卵細胞または胚細胞に導入するステップと、
c)前記魚に同時にプラスミドIおよびIIを発現させるステップと
を含む、同時に2つの異なる蛍光遺伝子を発現する遺伝子組換え魚を産生する方法を提供する。
【００２８】
本発明によれば、本発明の方法で産生した魚は、同時に2つの異なる蛍光を発現することができる。本発明のプラスミドを適当な部位で制限酵素で切断して、1つのプラスミドが遍在性プロモーターと、前記遍在性プロモーターの下流に作動可能に結合されている1つの蛍光遺伝子とを含み、別のプラスミドが皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターと、前記皮膚特異的または筋肉特異的プロモーターの下流に作動可能に結合され挿入された別の蛍光遺伝子とを含む、2つのプラスミドを得る。次に、得られた2つのプラスミドをそれぞれ魚に導入し、それぞれ異なる蛍光遺伝子を発現させる。蛍光遺伝子は、緑、赤、黄および青色の蛍光遺伝子からなる群から選択することが好ましい。蛍光遺伝子は、緑色および赤色蛍光遺伝子からなる群から選択することがより好ましい。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の方法で得られた魚は、同時に赤色および緑色蛍光を示すことができる。均一で安定した赤色および緑色蛍光を発現する魚を得るために、本発明の方法で得た魚を、さらに、当技術分野で公知の技術を使用して繁殖させることができることが好ましい。
【００３０】
以下の実施例は限定のためではなく例示として提供するものである。
【実施例】
【００３１】
実施例１
GFP配列を含むプラスミドの構築
皮膚特異的、筋肉特異的および偏在的に発現されるゼブラフィッシュcDNAクローンの単離:cDNAクローンを単離し、Gong, Z.ら、(1997年)、Gene 201、87〜98頁の記載のように配列決定した。基本的に、ゼブラフィッシュの胚性、および成体cDNAライブラリからランダムにcDNAクローンを選択し、単一配列決定反応によって各クローンを部分的に配列決定した。次いで、潜在機能および組織特異性に関して、配列決定したクローンを部分配列を用いて同定した。
【００３２】
プラスミドAは、図1に示したプラスミド構築体の構造であった。GFPは、遍在性プロモーターによって駆動された。プラスミドを制限酵素NotlおよびPstlによって直線化した後、粘着末端をdNTPで埋めて平滑化した。4.7kbの断片をアガロースゲルから回収した。このプラスミドは、本発明による構築体組成物の例であった。
【００３３】
実施例２
赤色蛍光蛋白質配列を含むプラスミドの構築
実施例1と同様に、プラスミドBは、図1に示したプラスミド構築体の構造であった。DsRedは、皮膚または筋肉特異的プロモーターによって駆動された。プラスミドを制限酵素PstIによって直線化した後、粘着末端をdNTPで埋めて平滑化した。7.5kbの断片をアガロースゲルから回収した。このプラスミドは、本発明による構築体組成物の例示であった。
【００３４】
実施例３
プラスミドAおよびBの結合によるプラスミドの構築
プラスミドCは、制限酵素Notlによって直線化した断片、または制限酵素NotIおよびSallによって直線化した断片を表す、図1に示したプラスミド構築体の構造であった。このプラスミドは、本発明による遺伝子組換え用構築体組成物の例であった。
【００３５】
実施例４
2つの蛍光遺伝子を発現する遺伝子組換えゼブラフィッシュの産生
ゼブラフィッシュの繁殖
雌雄のゼブラフィッシュのプールを28.5℃、および14時間の光周期に設定した60×20×30cmのガラス水槽で飼育する。魚に1日2度アルテミアを給餌する。その後、数組の丈夫な雌雄のゼブラフィッシュを選択し、卵を回収するための網を備えた30×10×20cmの繁殖ケージに入れる。遺伝子組換え系統用に、遺伝子組換え個体と野生型からなる対を22×14×13cm水槽で飼育する。
【００３６】
遺伝子伝達、および遺伝子組換え初代生物(founders)のスクリーニング
受精卵をプラスチック・キャピラリで採取しホルダに入れる。10μmの開口部を有するガラス針を直線化プラスミド溶液で満たし鉱油を載せる。次いで、DNA試料を単細胞受精卵中に2〜4nlの容量で微量注入する。注入した受精卵を、低濃度メチレンブルー溶液を入れ28℃に設定したインキュベーター中に置いた皿の中でインキュベートする。3日目に蛍光顕微鏡を使用して胚の蛍光発現が観察される。5日後、飼育のために蛍光ゼブラフィッシュを水槽に移す。12週間後、性成熟に達する。
【００３７】
蛍光遺伝子組換えゼブラフィッシュの生殖細胞伝達の発生
蛍光発現する推定初代生物を野生型株と交配する。遺伝子組換えF2(第2世代)は、2種の蛍光F1間の交雑(inter-crossing)から生じる。その魚で全生存期間を通して蛍光発現を観察することができる。
【００３８】
実施例５
蛍光遺伝子組換え魚の潜在的適用
蛍光遺伝子組換え魚を鑑賞魚として市場で使用した。GFP遺伝子組換え個体と、野生型魚または別の遺伝子組換え魚を交配させることによって、安定した遺伝子組換え系統を開発することができるであろう。さらに、眼特異的、骨特異的、尾特異的などのゼブラフィッシュ遺伝子プロモーターを単離することによって、かつ/またはこれらの遺伝子組換えゼブラフィッシュを従来の方法で交配させることよって、より様々な蛍光遺伝子組換えゼブラフィッシュを産生することができるであろう。
【００３９】
青色蛍光蛋白質(BFP)遺伝子、黄色蛍光蛋白質(YFP)遺伝子およびシアン色蛍光蛋白質(CFP)遺伝子は、Clonetechから入手可能だったので、同じ技術によって多色の蛍光魚を生成することができる。たとえば、眼特異的プロモーター下のGFP、皮膚特異的プロモーター下のBFP、および筋肉特異的プロモーター下のYFPで遺伝子組換えした魚は、複数の蛍光色、つまり緑色の眼、青色の皮膚、および黄色の筋肉を示すはずである。異なる組織特異的プロモーターと蛍光蛋白質遺伝子を組み合わせることによって、異なる蛍光色パターンを有する、より様々な遺伝子組換え魚が作り出せるはずである。同じ組織中で2つの以上の異なる蛍光蛋白質を発現させることにより、中間色が作り出せるかもしれない。
【００４０】
(カドミウム、コバルト、クロムなどの)重金属誘発性プロモーター、または(エストロゲン、アンドロゲン、または他のステロイドホルモンなどの)ホルモン誘発性プロモーターを使用することよって、環境汚染をモニタするための、またヒト飲料用および水産養殖目的で水質を評価するためのバイオセンサ系を開発できるかもしれない。このようなバイオセンサ系では、水生環境で重金属やエストロゲン(または、それらの誘導体)などの汚染物質が閾値濃度に達した場合、遺伝子組換え魚は、緑色蛍光(または使用する蛍光蛋白質遺伝子に応じた他の色)を発光するはずである。このようなバイオセンサ系は、伝統的な分析法に比べて利点を有していた。というのは、それは迅速で、可視化可能で、水生環境中で見出される複雑な混合物中で特定の化合物を直接同定することができ、また携帯可能であり、あるいは機器依存性が低いからである。さらに、このバイオセンサ系は、生物毒性に関する直接情報も提供した。この系は、生分解性であり再生可能である。
【００４１】
いくつかの物質の環境モニタリングは、各物質に反応してプロモーターによって駆動される、異なる色の蛍光蛋白質をコードする遺伝子を有する、1つの遺伝子組換え魚を作り出すことによって実現することができよう。そうすると、魚が環境中で示した特定の色を観察することができる。あるいは、いくつかの魚を個々のベクターで形質転換することもでき、次いで、環境をモニタするために、それらの魚を集団にし、各魚が発現する色を観察することもできよう。
【００４２】
さらに、蛍光遺伝子組換え魚は、科学研究のツールとして市場価値があるはずである。というのは、細胞系譜および細胞移動の追跡など、胚研究に使用できるからである。GFP発現遺伝子組換え魚に由来する細胞は、細胞移植および核移植実験において細胞マーカーおよび遺伝子マーカーとして使用することもできる。
【００４３】
本発明において、ゼブラフィッシュで2つの蛍光遺伝子が首尾よく実証された構築体は、メダカ、キンギョ、コイを含むカープ、ドジョウ、ティラピア、グラスフィッシュ、ナマズ、エンゼルフィッシュ、ディスカス、ウナギ、テトラ、ハゼ、グーラミ、グッピー、クシフォフォルス(ソードテール)、ハチェットフィッシュ、モリーフィッシュ(Molly fish)、パンガシウス(pangasius)など、他の魚種にも適用可能なはずである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】プラスミドAとプラスミドBを連結することによってプラスミドCを産生するスキームを示す図である。
【図２】2つの蛍光遺伝子を発現している遺伝子組換え魚の写真である。
【図１】
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【図２】
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