(57)【要約】【課題】植物体の抽出液や再溶解液中に存在するポリフェノールを高感度で簡便に測定する方法を提供すること。【解決手段】植物体のＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液中にアルカリ条件下で存在するポリフェノールラジカルを電子スピン共鳴装置で測定する工程を含むことを特徴とする、植物体内に含まれるポリフェノールの測定方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体のＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液中にアルカリ条件下で存在するポリフェノールラジカルを電子スピン共鳴装置で測定する工程を含むことを特徴とする、植物体内に含まれるポリフェノールの測定方法。
【請求項２】
植物体のＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液に炭酸緩衝液を添加してアルカリ条件にすることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
植物体のＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液に、ポリフェノールのラジカル化促進剤を添加して測定することを特徴とする請求項１または２に記載の測定方法。
【請求項４】
ラジカル化促進剤が酸化剤であることを特徴とする請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
ラジカル化促進剤が酸素、フェリシアン化カリウムまたはペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項３に記載の測定方法。
【請求項６】
ラジカル化促進剤がペルオキシダーゼであって、測定対象となるポリフェノールがタンニンである請求項５に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物体内に存在するポリフェノールの測定方法に関するものである。より詳しくは、植物体の抽出液か再溶解液中に特定条件下で存在するポリフェノールラジカルを電子スピン共鳴装置で測定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ポリフェノールは、同一ベンゼン環上に２個以上のヒドロキシル基を有する化合物の総称である。ポリフェノールは、ほとんどの植物体内に含まれており、光合成によって生成することが知られている。例えば、お茶のカテキン、そばのルチン、コーヒーのクロロゲン酸、タマネギのクエルセチン、むらさき芋のアントシアニンに代表されるように、ポリフェノールの種類は極めて多岐にわたる。
【０００３】
ポリフェノールは、さまざまな機能を有していることから広範な用途に供せられている。例えば、ポリフェノールは活性酸素に対するスカベンジャーとしての機能を有しており、このことから最近では、ポリフェノール含有食品やポリフェノール含有飲料が健康食品として大いに注目されるようになっている。また、ポリフェノールの中には、殺菌作用、毛細血管の強化作用、発癌性物質の除去作用、肝機能向上作用を有するものも知られており、医薬用途にも利用しうるものとして研究が進められている。さらに、ポリフェノールは、種々の有用化合物の合成原料としても使用されており、例えば汎用樹脂や機能性化合物の製造のために広く利用されている。
【０００４】
このような有用な機能や用途を有していることから、ポリフェノールに関する研究は数多く行われている。特に植物体中には、多種多様なポリフェノールが含まれていることから、植物体を利用したポリフェノールの研究も注目されている。しかしながら、植物体内に含まれるポリフェノールを簡単に測定することができる有用な方法は、これまで提供されるに至っていない。
【０００５】
ポリフェノールの測定に関する報告例として、ポリフェノールの標準品を酸化させポリフェノールラジカルを測定したものは数多く存在する。たとえば　Ｙａｍａｓａｋｉらは、クロロゲン酸（ＣＧＡ）を過酸化水素とＨＲＰ（西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ）を用いてラジカル化し、そのＥＳＲスペクトルを解析した結果を報告している（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４２２．１９９８．３７７−３８０）。このように標準品を用いてポリフェノールラジカルを測定した報告例はあるが、植物体の抽出液や再溶解液中に夾雑物質共存下で存在するポリフェノールラジカルを測定した報告例は殆どない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような従来技術の問題点を考慮して、本発明は、植物体の抽出液や再溶解液中に存在するポリフェノールを高感度で簡便に測定する方法を提供することを課題とした。特に、植物の葉、花、茎などを測定試料とし、試料中に含まれるポリフェノールを高感度に検出する方法を確立し、各種ポリフェノールの構造とポリフェノールラジカルの関連を明確化する手段を提供することを課題とした。また、ポリフェノールラジカルは、ラジカル生成時の環境、特に溶媒の種類によりスペクトルの形が異なる場合のあることを明確にすることも課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ポリフェノールラジカルを高感度に検出するためには環境条件（溶媒、ｐＨ、酸化条件）の設定が重要と考え鋭意検討した。その結果、ポリフェノールラジカルはＤＭＳＯ中にて最も安定であり、アルカリ緩衝液として炭酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ１０）を用いることが好ましいことが明らかになり、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち本発明は、植物体のＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液中にアルカリ条件下で存在するポリフェノールラジカルを電子スピン共鳴装置で測定する工程を含むことを特徴とする、植物体内に含まれるポリフェノールの測定方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法では、植物体のＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液に炭酸緩衝液を添加してアルカリ条件にすることが好ましい。また、ＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液に、ポリフェノールのラジカル化促進剤を添加して測定することが好ましい。ラジカル化促進剤としては、酸素、フェリシアン化カリウム、ペルオキシダーゼなどの酸化剤を用いることができる。本発明によってタンニンを測定しようとする場合は、ラジカル化促進剤としてペルオキシダーゼを使用することが好ましい。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明のポリフェノールの測定方法について詳細に説明する。なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
【００１１】
本発明の測定対象となる植物体の種類は特に制限されない。また、本発明の測定対象となる植物体の部位も特に制限されず、例えば、葉、茎、花、実などを用いて測定することができる。ほとんどすべての植物体はポリフェノールを含有しているが、ポリフェノールを含まない植物体を本発明の測定対象としてもよい。すなわち、本発明の方法を用いて、測定した植物体にポリフェノールが含まれていないことを確認する場合も、本発明を利用したものとみなす。
【００１２】
本発明の測定方法では、まず測定対象となる植物体のＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液を調製する。抽出液や再溶解液を調製するにあたって、植物体を細片化したり擂り潰したりすることができる。また、植物体を搾出してもよい。これらの方法は適宜組み合わせて用いることができる。植物体のＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液に、不溶性成分が存在する場合は、ろ過などの手段により除去することが好ましい。
【００１３】
本発明で用いる抽出用または再溶解用の溶媒は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含む。ＤＭＳＯのみからなる溶媒を用いることが好ましいが、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内でＤＭＳＯ以外の溶媒を含んでいてもよい。ＤＭＳＯとＤＭＳＯ以外の溶媒との混合溶媒を用いる場合は、ＤＭＳＯ以外の溶媒が２０重量％以下であることが好ましく、１０重量％以下であることがより好ましく、５重量％以下であることがさらにより好ましく、１重量％以下であることが特に好ましい。
【００１４】
本発明では、植物体のＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液をアルカリ条件下に置いて測定する。ここでいうアルカリ条件とは、ｐＨ７〜１２を意味し、好ましいｐＨ範囲は８〜１１であり、より好ましいｐＨ範囲は９．５〜１０．５である。アルカリ条件にするには種々の方法があるが、本発明ではラジカル還元能を有しない緩衝液やラジカル還元能が極めて低い緩衝液を添加する方法を採用することが好ましい。特に、炭酸緩衝液を添加する方法を採用することが好ましい。炭酸緩衝液を用いれば、ＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液中で発生するポリフェノールラジカルを比較的安定に維持することができるため、ポリフェノールラジカルの検出が容易になる。炭酸緩衝液としては、例えば、０．１Ｍ濃度でｐＨ１０の炭酸緩衝液を挙げることができる。
【００１５】
本発明では、植物体のＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液に、ポリフェノールのラジカル化促進剤を添加して測定してもよい。ラジカル化促進剤は、ポリフェノールのラジカル化を少しでも促進する作用を有するものであればその種類は特に制限されない。典型的なラジカル化促進剤として、酸化剤を挙げることができる。酸化剤は、酸素やフェリシアン化カリウムのような化合物であってもよいし、ペルオキシダーゼのような酵素であってもよい。このようなラジカル化促進剤を添加すれば、ＤＭＳＯ抽出液やＤＭＳＯ再溶解液中のポリフェノールラジカルの濃度を上げることができるため、測定を容易化することができる。ラジカル化促進剤の添加量は、ＤＭＳＯ抽出液やＤＭＳＯ再溶解液中の植物体の濃度やポリフェノールの濃度などに応じて、適宜決定することができる。また、ラジカル化促進剤は、緩衝液と同時に添加してもよいし、緩衝液とは別のタイミングで添加してもよい。
【００１６】
本発明では、ＤＭＳＯ抽出液もしくはＤＭＳＯ再溶解液中に存在するポリフェノールラジカルを電子スピン共鳴装置で測定する。電子スピン共鳴装置は、通常用いられているものを使用することができる。特定条件は、ポリフェノールラジカルを検出しうる条件に適宜設定する。
【００１７】
電子スピン共鳴装置による測定によって得られたポリフェノールラジカルのスペクトルを分析することによって、植物体に含まれているポリフェノールの種類を同定することが可能である。例えば、標準品のスペクトルと照合することによって、ポリフェノールの種類を同定することができる。複数のポリフェノールラジカルの混合物がスペクトルに現れている場合は、複数の標準品の混合物のスペクトルと照合するなどの方法により、混合物を構成するポリフェノールの種類を特定することができる。また、混合物を構成する各ポリフェノールの存在比も、おおよそ把握することが可能である。
【００１８】
本発明の方法によって測定することができるポリフェノールの種類は特に制限されない。例えば、クロロゲン酸、オイゲノール、クエルセチン、カテキン、ルチン、ルテオリン、ケルシトリン、アントシアニンなど多種多様なポリフェノールを挙げることができる。また、本発明では、従来知られていない新規ポリフェノールを検出してもよい。
【００１９】
本発明の方法は、測定しようとするポリフェノールの種類に応じて、条件を適宜最適化することができる。例えば、タンニンを測定しようする場合は、ラジカル化促進剤としてペルオキシダーゼを使用することが特に好ましい。このような条件の最適化は、当業者に知識の範囲内で試行錯誤のうえ行うことができる。
【００２０】
本発明の方法によれば、酸化に対して高い反応性を有するポリフェノール種を選択的に同定することが可能である。例えば、植物体中に複数のポリフェノールが存在している可能性がある場合に、酸化に対して高い反応性を有するポリフェノール種だけを選択的に同定することができる。
【００２１】
本発明の方法によれば、植物体中に含まれるポリフェノールの種類や含有量を容易に知ることができる。このため、本発明の方法を用いることにより、特定の成分を多量に含有する植物種のスクリーニングを迅速に行うことが可能になる。得られた結果を科、属ごとに集計することにより、目的とするポリフェノールを含有する植物種を明確にすることができる。したがって、多様な植物体に対して本発明の方法を適用すれば、植物体に含まれるポリフェノール種のデータベースを構築することが可能である。また、本発明の方法は、植物体の部位に応じたポリフェノールの分布特性や、植物体の生長段階に応じたポリフェノールの生成特性などの解析にも役立つ。さらに、新規ポリフェノールの検出やポリフェノールの生成機構の解明などにも利用しうる。したがって、本発明は、幅広い用途に供することができる点で応用範囲は極めて広い。
【００２２】
【実施例】
以下に試験例と実施例を挙げて本発明の特徴をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。なお、ここでは電子スピン共鳴装置として、日本電子社製のＦＲ３０を使用した（３３６．０００±２．５ｍＴ、Ｐｏｗｅｒ　４ｍＷ、ＭｏｄＷｉｄ　２５μＴ、ＴｉｍｅＣ　０．３秒、ＳｗＴｉｍｅ　４分、Ａｍｐ　４００）。
【００２３】
［例１］
クロロゲン酸ラジカルへの緩衝液の影響について、検討を行った。
ＤＭＳＯ　２００μｌにクロロゲン酸（１０ｍＭ、和光純薬）１０μｌと各種緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ１０）５０μｌを添加し、生成したポリフェノールラジカルのスペクトルを添加から１分後に電子スピン共鳴装置で計測した。緩衝液として、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液を用い、さらに０．０１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を添加した場合についても計測した。結果は図１に示すとおりであった。
【００２４】
図１から明らかなように、炭酸緩衝液中にて最も強いシグナルが観測された。０．０１Ｎの水酸化ナトリウム溶液も良好な結果を示したがラジカルの安定性は炭酸緩衝液に比し劣っていた。グリシン緩衝液、ＣＨＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液中では、クロロゲン酸ラジカルが観測されなかったが、その理由はこれらの緩衝液に弱いラジカル還元能が存在するためと考えられた。
【００２５】
［例２］
各種溶媒のスペクトルへの影響について、検討を行った。
ダイサンボクの花のメタノール抽出液を５０μｌずつ分注し、Ｎ２ガスにて乾固し、各種溶媒２００μｌに再溶解した後、炭酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ１０）５０μｌを添加した。溶媒として、ＤＭＳＯ、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンを用いた。炭酸緩衝液の添加から１分後に生成したポリフェノールラジカルのスペクトルを電子スピン共鳴装置で計測した。本スペクトルはアクテオシド由来のラジカルと同定された。結果は図２に示すとおりであった。
【００２６】
図２から明らかなように、水、メタノールとエタノール、ＤＭＳＯ系では明らかにスペクトルは異なり、スペクトルの溶媒依存性が確認された。またＤＭＳＯ使用時に最も明確なハイバーファイン構造を示すスペクトルが得られた。このことより、植物体の抽出液に、ＤＭＳＯと炭酸緩衝液を組み合わせて添加することが好ましいことが確認された。
【００２７】
［例３］
標準物質と植物試料より得られるスペクトルの比較を行った。
各種植物体のＤＭＳＯ抽出液２００μｌに、炭酸緩衝液５０μｌとフェリシアン化カリウム（１０ｍＭ）３０μｌを添加し、生成したポリフェノールラジカルのスペクトルを電子スピン共鳴装置で計測した。植物体として、オエノセラシスキューの花、ガガイモの茎、キンケイギクの花、カタバミの花を用いた。一方、標準物質であるケルシトリン、ルチン、クロロゲン酸またはルテオリン２００μｌに、炭酸緩衝液５０μｌとフェリシアン化カリウム（１０ｍＭ）３０μｌを添加し、生成したポリフェノールラジカルのスペクトルを電子スピン共鳴装置で計測した。
ラベンダーの葉のＤＭＳＯ抽出液２００μｌに、炭酸緩衝液５０μｌを添加し、生成したポリフェノールラジカルのスペクトルを電子スピン共鳴装置で計測した。一方、標準物質であるロズマリン酸２００μｌに炭酸緩衝液５０μｌを添加し、生成したポリフェノールラジカルのスペクトルを電子スピン共鳴装置で計測した。
【００２８】
これらの結果を図３にまとめて示した。上段は各種標準物質のスペクトル、下段は植物体のＤＭＳＯ抽出液より得られたスペクトルである。得られたスペクトルは単一成分によるものであり、同定が容易であった。本発明の方法によれば、被検植物体の最も特徴的なポリフェノールを提示することができることが確認された。
【００２９】
［例４］
測定原理を明らかにするために以下の試験を行った。
例３の方法にしたがって、ダイサンボクの葉のＤＭＳＯ抽出液に炭酸緩衝液を添加し、Ｎ２ガスにて脱気した場合と脱気しなかった場合について、ポリフェノールラジカルのスペクトルを電子スピン共鳴装置で計測した。さらに、既知成分であるルテオリン（１０ｍＭ濃度）１０μｌを未脱気の条件下で添加した場合についてもスペクトルを計測した。結果は図４に示すとおりであった。
【００３０】
図４から明らかなように、脱気によりダイサンボク由来のアクテオシドのシグナル強度は１／２０以下へと激減した。このことから、ＤＭＳＯ抽出液と炭酸緩衝液からなる系におけるポリフェノールのラジカル化は酸素によるものであることが確認された。また溶存酸素存在下で多量のルテオリンを添加した場合、アクテオシドのシグナル強度は激減し、ルテオリンのシグナルが支配的となった。このことから、ＤＭＳＯ抽出液と炭酸緩衝液からなる系における酸化剤が酸素であって、ルテオリンとアクテオシドの間で競合的な酸素の取り合いがあることが明らかになった。酸化剤であるフェリシアン化カリウムを添加した場合も同様の結果が期待される。本発明の方法により検出されるポリフェノールのシグナルは、酸化剤の競合的取り合いに勝ち残ったポリフェノール種であると考えられる。
【００３１】
［例５］
タンニンの検出を行った。
各種植物体のＤＭＳＯ抽出液１００μｌに、ＭＯＰＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０、Ｈ２Ｏ２　０．０１５％含）５０μｌとＨＲＰ（１−１０ｕ／ｍｌ）１０μｌを順に添加し、生成したポリフェノールラジカルのスペクトルを電子スピン共鳴装置で計測した。植物体として、ミソハギの花、ゲンノショウコの葉、ザクロの皮、サザンカの葉を用いた。結果は図５に示すとおりであった。
【００３２】
タンニン含有サンプルを測定すると、微細構造を有しないブロードなシグナルが得られることが多いため同定には一般に困難が伴うが、上記の系ではタンニンに共通するシンプルなスペクトルが得られた。したがって、上記の系は、複雑な構造を有するタンニンの確認方法として有効であることが確認された。
【００３３】
［例６］
二成分系スペクトルの同定を行った。
ミゾソバの花および葉、またはナズナの根生葉のＤＭＳＯ抽出液２００μｌに、炭酸緩衝液５０μｌとフェリシアン化カリウム（１０ｍＭ）３０μｌを添加し、生成したポリフェノールラジカルのスペクトルを電子スピン共鳴装置で計測した。スペクトルから、クロロゲン酸をベースに第二の成分が共存するパターンと判断された。そこで、クロロゲン酸に各種ポリフェノールを添加した混合系について、電子スピン共鳴装置で計測してスペクトルを比較した。その結果、ミゾソバはクロロゲン酸とルチンの混成系、ナズナはクロロゲン酸とルテオリンの混成系であることが明らかになった。同定に用いたスペクトルをまとめて図６に示す。
同様にして、ケヤキ、ネコヤナギ、シラカシの葉からはクロロゲン酸とタンニンの混成系のスペクトルが得られた。
【００３４】
［例７］
シソ科植物のポリフェノール種の分析を行った。
シソ科植物１０例について本発明の方法によりスペクトル測定を行った。結果をまとめると、ロズマリン酸７例、クロロゲン酸１例、クロロゲン酸とカフェー酸の混成系１例、クロロゲン酸とアクテオシドの混成系１例であった。本結果よりシソ科を代表するポリフェノール種はロズマリン酸であることが確認できた。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、植物体の抽出液や再溶解液中に存在するポリフェノールを簡便な方法で高感度に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】例１で計測したスペクトルを示す。
【図２】例２で計測したスペクトルを示す。
【図３】例３で計測したスペクトルを示す。
【図４】例４で計測したスペクトルを示す。
【図５】例５で計測したスペクトルを示す。
【図６】例６で計測したスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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