(57)【要約】【課題】植物種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量を増大させるための、種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸の使用、および種子タンパク質輸送レセプターを含有してなる種子タンパク質輸送用担体を提供することを目的とする。また、機能欠損型種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸により種子タンパク質を種子の細胞外に蓄積させることを特徴とする、種子タンパク質の蓄積方法を提供することを目的とする。【解決手段】植物種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量を増大させるための、種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸の使用、種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸を含有してなる種子タンパク質輸送用担体、および機能欠損型種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸により種子タンパク質を種子の細胞外に蓄積させることを特徴とする、種子タンパク質の蓄積方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量を増大させるための、種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸の使用。
【請求項２】
種子タンパク質輸送レセプターが、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ種子タンパク質輸送活性を有するポリペプチド、および
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列との配列同一性が５０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつ種子タンパク質輸送活性を有するポリペプチド、
からなる群より選ばれるものである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸が、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列からなる核酸、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ種子タンパク質輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、および
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列との配列同一性が５０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつ種子タンパク質輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ）（ａ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、かつ種子タンパク質輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸
からなる群より選ばれるものである、請求項１記載の使用。
【請求項４】
植物が、アブラナ科植物、ウリ科植物、マメ科植物、イネ科植物である、請求項１〜３いずれか記載の使用。
【請求項５】
種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸を含有してなる種子タンパク質輸送用担体。
【請求項６】
種子に蓄積させる対象となる所望される外来ポリペプチドをコードする核酸をさらに含有してなる、請求項５記載の種子タンパク質輸送用担体。
【請求項７】
種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸が、請求項３において規定されるものである、請求項５または６記載の種子タンパク質輸送用担体。
【請求項８】
機能欠損型種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸により種子タンパク質を種子の細胞外に蓄積させることを特徴とする、種子タンパク質の蓄積方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量を増大させるための、種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸の使用、種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸を含む種子タンパク質輸送用担体、種子タンパク質輸送用担体、ならびに種子タンパク質の蓄積方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高等植物の種子は、大量の種子タンパク質およびレクチンを蓄積する。かかる種子タンパク質は、２つのクラスのプロテインボディに局在化される。一方は、トウモロコシおよびイネ胚乳において見出される小胞体（ＥＲ）に直接由来するプロラミンプロテインボディである（非特許文献１）。他方は、液胞に由来するグロブリンおよびアルブミンに対するプロテインボディ、すなわち、タンパク質蓄積型液胞である（非特許文献２）。種子成熟の間、グロブリンおよびアルブミンの前駆体は、粗面ＥＲにおいて合成され、タンパク質蓄積型液胞に選別輸送され（非特許文献３）、そこで成熟形態に変換され、蓄積される（非特許文献４）。しかし、多くの研究にも関わらず、種子タンパク質に関する選別輸送装置は決定されていない。
【０００３】
様々な植物種子が種々の生物にとって貴重な食料源となっている。食料あるいは家畜飼料としての種子の種子タンパク質自体を分子育種によって改変し、より高品質のタンパク質を含む作物を作り出そうとする試みがこれまで多数なされてきた。その一つとして、外来の種子タンパク質を種子に発現させる試みがある。しかし、この方法は、大量に種子タンパク質を発現させた場合、細胞内のタンパク質の集積機構が飽和することにより、種子への輸送効率が悪くなるという欠点を有するものであった。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｌａｒｋｉｎｓ，  Ｂ．  Ａ．  ＆  Ｈｕｒｋｍａｎ，  Ｗ．  Ｊ．  （１９７８）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ６２，  ２５６−２６３
【非特許文献２】
Ｏｋｉｔａ，  Ｔ．  Ｗ．  ＆  Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｊ．  Ｃ．  （１９９６）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４７，  ３２７−３５０
【非特許文献３】
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．  Ｇ．  ＆  Ｂａｕｍｅｒ，  Ｍ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １５２，  ６５９−６６７
【非特許文献４】
Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｉ．  ＆  Ｍａｅｓｈｉｍａ，  Ｍ．  （２０００）  ｉｎ  Ｖａｃｕｏｌａｒ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．，  ｅｄｓ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ａ．  Ｄ．  Ｇ．  ＆  Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｊ．  Ｃ．  （Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫ），  ｐｐ．  ２０−４２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、植物種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量を増大させるための、種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸の使用、および種子タンパク質輸送レセプターを含有してなる種子タンパク質輸送用担体を提供することを目的とする。
【０００６】
また、本発明は、機能欠損型種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸により種子タンパク質を種子の細胞外に蓄積させることを特徴とする、種子タンパク質の蓄積方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、
［１］  植物種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量を増大させるための、種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸の使用、
［２］  種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸を含有してなる種子タンパク質輸送用担体、
［３］  機能欠損型種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸により種子タンパク質を種子の細胞外に蓄積させることを特徴とする、種子タンパク質の蓄積方法、
に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量を増大させるための、種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸の使用に関する。本発明は、シロイヌナズナに由来する特定のタンパク質が、蓄積対象となるタンパク質を種子の蓄積部位に選別輸送する機能を有するという発明者らの驚くべき知見に基づくものである。
【０００９】
本発明の「使用」には、種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸が用いられているため、種子タンパク質輸送レセプターは、植物の細胞において、植物の蓄積対象となるタンパク質またはその前駆体と特異的に結合し、該タンパク質を種子の蓄積部位に選別輸送するという効果（本明細書中では種子タンパク質輸送活性とよぶ）を発揮するものである。
【００１０】
前記蓄積対象となるタンパク質としては、植物の内在性ポリペプチドであっても外来ポリペプチドであってもよい。内在性ポリペプチドおよび外来ポリペプチドとしては、例えば、貯蔵タンパク質、インヒビタータンパク質、抗菌性タンパク質、耐虫性タンパク質等が挙げられ、外来タンパク質としては、例えば、貯蔵タンパク質、インヒビタータンパク質、抗菌性タンパク質、耐虫性タンパク質等が挙げられる。貯蔵タンパク質としては、例えば、カボチャの１１Ｓグロブリン等のグロブリン類、カボチャの２Ｓアルブミン等のアルブミン類、レクチン類、ダイズのグリシニン、ダイズのコングリシニン、イネのグルテリン等が挙げられる。前記インヒビタータンパク質とは、各種酵素の活性を阻害するタンパク質であり、例えば、プロテアーゼインヒビター、アミラーゼインヒビター等が挙げられる。前記抗菌性タンパク質とは、植物に感染するカビ、細菌等により忌避されるタンパク質であり、例えば、グルカナーゼ、キチナーゼ、ディフェンシン、オスモチン等が挙げられる。前記耐虫性タンパク質とは、植物に寄生する虫等により忌避されるタンパク質であり、例えば、Ｂｔトキシン、プロテアーゼインヒビター等が挙げられる。
【００１１】
種子タンパク質輸送レセプターを用いる植物種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量の増大は、より具体的には、種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸を植物細胞に導入し、成熟した植物内において種子タンパク質輸送活性を有する該レセプターを発現させることにより達成される。ここで、植物細胞としては、カルス、プロトプラスト、ディスク状の葉切片（リーフディスク）等が挙げられる。
【００１２】
植物細胞への種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸の導入は、例えば、生物学的導入法、直接的導入法等により行なわれうる。
【００１３】
前記生物学的導入法としては、例えば、慣用のアグロバクテリウムを用いる方法が挙げられる。前記直接的導入法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガンを用いたボンバードメント法等が挙げられる。かかる直接的導入法においては、種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸または該核酸を含有した発現可能な構築物が用いられる。前記核酸が植物細胞に導入されたことは、例えば、植物から核酸含有試料を抽出し、該試料をＰＣＲに供することにより確認することができる。
【００１４】
種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸が植物細胞に導入されると、該植物細胞を植物体に再分化させることにより、その植物の種子において蓄積対象となるタンパク質の蓄積量を増大させることができる。ここで、「増大」とは、本発明の「使用」により得られた蓄積対象のタンパク質の蓄積量から種子タンパク質輸送レセプターが導入されていない植物由来の種子タンパク質の蓄積量を差し引いた値が正の値であることをいう。
【００１５】
また、本発明では、種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸とともに外来ポリペプチドをコードする核酸を植物細胞に導入し、植物体において発現させることができる。これにより、種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量をより効率的に増大させることができる。また、外来タンパク質として種子が本来保有しない性質を種子に付与することができる。ここで、外来ポリペプチドは、前記に記載のものと同様である。
【００１６】
種子タンパク質輸送レセプターは、好ましくは、シロイヌナズナＡｔＶＳＲ１タンパク質ともよばれる配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００１７】
また、種子タンパク質輸送レセプターとして、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ下記の種子タンパク質輸送活性を測定する方法により検出される種子タンパク質輸送活性を有するポリペプチドを使用することもできる。配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、特定のポリペプチドに少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、例えば、部位特異的変異誘発法により得られる。なお、本明細書中において「少なくとも１つ」とは、１または数個の意である。
【００１８】
ポリペプチドの種子タンパク質輸送活性の測定は、オオムギアリューレイン由来の液胞輸送シグナル配列（ＳＳＳＦＡＤＳＮＰＩＲＰＶＴＤＲＡＡＳＴＹＣ  配列番号：１５）を結合したアフィニティークロマトグラフィーにより行う。より詳細には、前記シグナル配列からなる合成ペプチド（５ｍｇ  ）をＳｕｌｆｏｌｉｎｋ  カップリングゲル（２ｍｌ  のベット体積；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ  ）に固定化する。被検ポリペプチドを、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  を含有するＨＥＰＥＳ  緩衝液（２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．０  、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ  および１％  ＣＨＡＰＳ）中でカラムにアプライする。結合した分子を、５  ｍＭＥＧＴＡを含むＨＥＰＥＳ  緩衝液で溶出する。
【００１９】
また、種子タンパク質輸送レセプターとして、配列番号：２に記載のアミノ酸配列との配列同一性が、活性保持の観点から５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつ前記種子タンパク質輸送活性を測定する方法により検出される種子タンパク質輸送活性を有するポリペプチドを使用することもできる。
【００２０】
本明細書においては、配列同一性とは、比較対象の配列の領域にわたって、例えば、ＨｉｇｇｉｎｓらによるＣｌｕｓｔａｌＷ法によるマルチプルアライメントにより、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較し、算出された値をいう。ここで、比較対象のポリペプチド又は核酸は、２つの配列の最適なアラインメントのための参考配列（例えば、コンセンサス配列等）と比べて、付加又は欠失（例えば、ギャップ等）を有していてもよい。かかる配列同一性は、例えば、日立製作所社製のＤＮＡＳＩＳプログラム（Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ５、Ｆｉｘｅｄ  Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  １０、ｗｉｎｄｏｗｓｓｉｚｅ  ５、Ｆｌｏａｔｉｎｇ  Ｇａｐ  １０）  等により求められうる。
【００２１】
種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸は、好ましくは、シロイヌナズナＡｔＶＳＲ１タンパク質ともよばれる配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸である。
【００２２】
種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸として、シロイヌナズナＡｔＶＳＲ１遺伝子ともよばれる配列番号：１に記載の塩基配列からなる核酸を使用することもできる。
【００２３】
種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸として、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ前記種子タンパク質輸送活性を測定する方法により検出される種子タンパク質輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用することもできる。アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸は、例えば、部位特異的変異誘発法により得られる。
【００２４】
また、種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸として、配列番号：２に記載のアミノ酸配列との配列同一性が、活性保持の観点から５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつ前記種子タンパク質輸送活性を測定する方法により検出される種子タンパク質輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用することもできる。
【００２５】
また、種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸として、配列番号：２に記載されるアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得、かつ前記種子タンパク質輸送活性を測定する方法により検出される種子タンパク質輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用することもできる。
【００２６】
本明細書において、前記「ストリンジェントな条件」とは、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス刊、１９８９〕等に記載の条件が挙げられる。具体的には、例えば、
▲１▼  ６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ    ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％  ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ  変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％  ホルムアミドを含む溶液中、プローブとともに４２℃で一晩保温するステップ、
▲２▼  非特異的にハイブリダイズしたプローブを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、よりストリンジェントには、３０℃下、さらにストリンジェントには、２５℃下、よりさらにストリンジェントには、１０℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なうことにより、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列と少なくとも約５０％、よりストリンジェントには、６０％以上、さらにストリンジェントには、７０％以上の配列同一性を有する核酸を得ることができる。なお、Ｔｍは、例えば、下記式：
Ｔｍ＝＝８１．５−１６．６  （ｌｏｇ１０［Ｎａ＋  ］）＋０．４１  （％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチド中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められる。
【００２７】
本発明の種子タンパク質輸送レセプターおよびそれをコードする核酸を使用することにより種子タンパク質の蓄積量を増大させることができる植物としては、アブラナ科植物、ウリ科植物、マメ科植物、イネ科植物であればよく、アブラナ科植物としては、例えば、シロイヌナズナ、アブラナ、ナズナ、ダイコン等が挙げられ、ウリ科植物としては、キャベツ、カボチャ、キュウリ、メロン、スイカ等が挙げられ、マメ科植物としては、ダイズ、エンドウ、アズキ、ラッカセイ、インゲンマメ、ソラマメ等が挙げられ、イネ科植物としては、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明の植物種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量を増大させるための、種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸の使用には、プレプロペプチドまたはそれをコードする核酸をさらに組み合わせることもできる。
【００２９】
前記プレプロペプチドを、そのＣ末端側に上記の外来タンパク質が連結された融合タンパク質として植物の細胞内で発現させることにより、該外来タンパク質を融合タンパク質の一部として種子のタンパク質蓄積部位に輸送し、蓄積させることができる（本明細書中ではプレプロペプチド活性とよぶ）。なお、前記融合タンパク質の前記プレプロペプチド部分は、外来タンパク質を蓄積させるのに機能を果たしうる。従って、種子タンパク質輸送活性を有する種子タンパク質輸送レセプターに前記プレプロペプチドを組み合わせて使用することにより、外来タンパク質を種子の蓄積部位により効率的に輸送し、蓄積させることができる。ここで、外来タンパク質は、前記に記載のものと同様である。
【００３０】
種子タンパク質輸送レセプターに前記プレプロペプチドを組み合わせた植物種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量の増大は、より具体的には、（ａ）該レセプターをコードする核酸、ならびに該プレプロペプチドをコードする核酸および（ｂ）種子に蓄積させる対象となる外来タンパク質をコードする核酸を含み、かつ（ａ）の核酸の３’側下流に（ｂ）の核酸が発現可能に連結されたものである核酸を植物細胞に導入し、成熟した植物内において種子タンパク質輸送活性を有する該レセプターを発現させることにより達成される。
【００３１】
前記プレプロペプチドは、例えば、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００３２】
また、前記プレプロペプチドとして、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ下記プレプロペプチド活性の測定法により検出されるプレプロペプチド活性を有するポリペプチドを使用することもできる。アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、部位特異的変異誘発法により得られる。
【００３３】
また、前記プレプロペプチドとして、配列番号：３に記載のアミノ酸配列との配列同一性が、活性保持の観点から、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつ前記種子タンパク質輸送活性を測定する方法により検出されるプレプロペプチド活性を有するポリペプチドを使用することもできる。
【００３４】
前記プレプロペプチドをコードする核酸は、例えば、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸である。
【００３５】
前記プレプロペプチドをコードする核酸として、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、かつ前記プレプロペプチド活性を測定する方法により検出されるプレプロペプチド活性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用することもできる。アミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸は、例えば、部位特異的変異誘発法により得られる。
【００３６】
また、前記プレプロペプチドをコードする核酸として、配列番号：３に記載のアミノ酸配列との配列同一性が、活性保持の観点から５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつ前記種子タンパク質輸送活性を測定する方法により検出される種子タンパク質輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用することもできる。
【００３７】
本発明はまた、種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸を含む種子タンパク質輸送用担体に関する。前記担体は、種子タンパク質輸送レセプターを含む核酸を植物細胞に導入させるために使用することができる。
【００３８】
本発明の種子タンパク質輸送用担体としては、前記種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸を、発現ベクター、金粒子、リポソーム等に担持させたものが挙げられる。
【００３９】
本発明の種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸含む種子タンパク質輸送用担体は、発現ベクターであることが望ましく、プロモーター領域、ターミネーター領域等、および植物宿主の複製起点等を含みうる。前記プロモーター領域を構成するプロモーターは、特に限定されるものではなく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ等のプロモーター、ターミネーター等の植物由来の遺伝子を発現させるために用いられるプロモーターであれば本発明の種子タンパク質輸送用担体に使用することができる。前記プロモーター領域は、前記核酸の上流領域に配置すればよい。ターミネーターとしては、ノパリン合成酵素の遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
【００４０】
本発明の種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸は、その発現のために前記プロモーター領域に作動可能に連結される。
【００４１】
また、本発明の種子タンパク質輸送用担体には、前記種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸のコピー数を増大させるために、細菌性宿主内における複製を可能にする複製起点配列を組み込むことができる。前記目的のために、本発明のタンパク質輸送用担体が導入された細菌性宿主を選択するためのマーカー、例えば、各種の抗生物質に対する薬剤耐性マーカーを、本発明のタンパク質輸送用担体に組み込むことも可能である。
【００４２】
本発明の種子タンパク質輸送用担体には、種子に蓄積させる対象となる所望される外来タンパク質をコードする核酸をさらに含ませることができる。外来タンパク質をコードする核酸をさらに含む種子タンパク質輸送用担体を用いて、外来タンパク質を種子に蓄積させることにより、種子タンパク質の蓄積量がより多い種子や新たな性質を有する種子を産生することができる。
【００４３】
本発明はまた、
（ａ）プレプロペプチドをコードする核酸、および
（ｂ）種子に蓄積させる対象となる外来タンパク質をコードする核酸
を含み、かつ（ａ）の核酸の３’側下流に（ｂ）の核酸が発現可能に連結されたものである核酸を含有してなる種子タンパク質輸送用担体に関する。なお、前記種子タンパク質輸送用担体は、種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸をさらに含んでもよい。また、前記（ａ）の核酸と（ｂ）の核酸とを含む種子タンパク質輸送用担体と、種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸とは、それぞれを別々に細胞に導入してもよい。
【００４４】
本発明はまた、機能欠損型種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸により種子タンパク質を種子の細胞外に蓄積させることを特徴とする、種子タンパク質の蓄積方法に関する。
【００４５】
機能欠損型種子タンパク質輸送レセプターは、種子タンパク質輸送活性を欠失しているため、種子タンパク質輸送レセプターの代わりに機能欠損型種子タンパク質レセプターを有する植物体では、種子タンパク質の多くは種子の蓄積部位には輸送されず細胞の外に分泌される。そのため、本方法により種子タンパク質を蓄積させた種子は、細胞内に種子タンパク質を貯蔵している野生型の種子に比べて、消化酵素の働きを受けやすく、消化に優れるという特徴を有する。
【００４６】
機能欠損型種子タンパク質輸送レセプター、種子タンパク質輸送レセプターのアミノ酸配列の改変により種子タンパク質輸送活性を有さないポリペプチドである。
【００４７】
前記機能欠損型種子タンパク質輸送レセプターとは、例えば、
（ａ）種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸に対して、フレームシフト変異を生じさせるように少なくとも１ヌクレオチド塩基が付加もしくは欠失された核酸によりコードされるポリペプチド、
（ｂ）種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸に１ｋｂ長以上、好ましくは２ｋｂ長以上のＴ−ＤＮＡもしくはトランスポゾンが挿入された核酸によりコードされるポリペプチド、
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリペプチドに少なくとも１つのアミノ酸が置換もしくは挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
等をいう。
【００４８】
機能欠損型種子タンパク質輸送レセプターは、
前記（ａ）のポリペプチドの場合、例えば、種子タンパク質輸送レセプターをコードする核酸に対して、フレームシフト変異を生じさせるように少なくとも１ヌクレオチド塩基が付加もしくは欠失された核酸を植物細胞内で生じさせること、
前記（ｂ）の場合、ポリペプチドの場合、例えば、植物細胞中の種子タンパク質輸送レセプターをコードする遺伝子にＴ−ＤＮＡまたはトランポゾン等の断片が挿入されるように該断片を導入すること
により植物細胞内に存在させることができる。
【００４９】
挿入断片が挿入されたか否かは、
前記（ａ）の場合、抗種子タンパク質輸送レセプター抗体を用い、植物細胞由来のタンパク質含有試料に対しイムノアッセイを行なうこと、
前記（ｂ）の場合、該Ｔ−ＤＮＡまたはトランスポゾンを用いた植物のゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ等により確認することができる。
【００５０】
前記（ｃ）のポリペプチドは、天然の変異型ポリペプチドまたは人工的に変異が導入された変異型ポリペプチドである。
【００５１】
本方法において、種子タンパク質の細胞外への蓄積は、機能欠損型種子レセプターを過剰発現させること、すなわち、植物内の正常な種子タンパク質輸送レセプターの量に対し、機能欠損型種子タンパク質輸送レセプターの量が多くなるように過剰発現させることによって達成される。また、種子タンパク質の細胞外への蓄積は、種子タンパク質輸送レセプターが全て機能欠損型種子レセプターに改変された種子タンパク質輸送レセプター機能欠損型植物を用いても達成される。
【００５２】
また、本方法では、機能欠損型種子タンパク質輸送レセプターの代わりに相同組換え等により植物細胞中の種子タンパク質輸送レセプターをコードする遺伝子を完全に欠失させてもよい。
【００５３】
【実施例】
実施例１
ＡｔＶＳＲノックアウト変異体を単離するために、ウィスコンシン大学のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  （ＡＫＦ）  のＴ−ＤＮＡ変異誘発シロイヌナズナ植物のコレクションをスクリーニングした。
【００５４】
ＰＣＲによるスクリーニングにおいて、ＡｔＶＳＲ１（フォワードプライマー５’−ＡＧＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＴＧＡＡＧＣＡＡＧＣＡＴＴＴＧＴＧ−３’  （配列番号：４）およびリバースプライマー５’−ＣＡＣＡＴＧＡＧＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡＡ−３’  （配列番号：５））およびＴ−ＤＮＡの左境界のプライマーＪＬ−２０２のユニークプライマーのセットを使用した。同様に、本発明者らは、各フォワードプライマーおよびリバースプライマーの各セット、ＡｔＶＳＲ３については５’−ＣＣＡＡＡＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＴＴ−３’  （配列番号：６）および５’−ＴＣＧＴＴＡＡＧＧＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＡＣ−３’  （配列番号：７）、ＡｔＶＳＲ４については５’−ＣＧＴＣＧＴＣＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＡＴＡ−３’  （配列番号：８）および５’−ＣＡＧＡＡＧＴＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＡ−３’  （配列番号：９）、ＡｔＶＳＲ５については５’−ＴＣＡＣＡＴＧＧＣＴＣＧＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＡ−３’  （配列番号：１０）および５’−ＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＧＴＴＣＣ−３’  （配列番号：１１）、ならびにＡｔＶＳＲ６については５’−ＣＣＡＴＡＣＣＴＴＴＴＴＡＡＣＧＴＴＴＴＧＣＣＡＣＴＴＧＡ−３’  （配列番号：１２）および５’−ＴＧＡＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＡ−３’  （配列番号：１３）を用いて変異体ａｔｖｓｒ３−１、ａｔｖｓｒ４−１、ａｔｖｓｒ５−１およびａｔｖｓｒ６−１を単離した。ａｔｖｓｒ１−１、ａｔｖｓｒ３−１、ａｔｖｓｒ４−１、ａｔｖｓｒ５−１およびａｔｖｓｒ６−１変異体（Ｗｓ−２）としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  （Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により寄贈されたものを用いた。ａｔｖｓｒ７−１変異体（Ｃｏｌ−０）の種子としては、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  、およびａｔｖｓｒ２−１変異体（Ｌｅｒ）の種子はＣｏｌｄ  Ｓｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  により寄贈されたものを用いた。変異体におけるＴ−ＤＮＡ挿入部位を決定するために、Ｔ−ＤＮＡ挿入部位に隣接するＤＮＡ断片をクローニングし、配列決定した。
【００５５】
ａｔｖｓｒ１変異体は、開始コドンの１３６４ヌクレオチド下流にＴ−ＤＮＡ挿入を有していた。これは、ＡｔＶＳＲ１の第３エキソンに位置していた。挿入部位は、ＡｔＶＳＲ１のルーメンドメインに対応する。ＡｔＶＳＲ１遺伝子特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲは、ＡｔＶＳＲ１  ｍＲＮＡの発現を決定するためにａｔｖｓｒ１変異体および野生型植物から抽出した全ＲＮＡを用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーは、
ｐｒｉｍｅｒ−Ｆ：  ５’−ＧＴＴＣＡＧＧＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＣ−３’  （配列番号：１６）、およびｐｒｉｍｅｒ−Ｒ：  ５’−ＡＴＡＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＴＣＣＡＴＣＴＧ−３’  （配列番号：１７）
であった。また、ＰＣＲの温度条件は、以下の通りであった：
９４℃ｘ５分；以下を３５サイクル、
９４℃ｘ０．５分；
５５℃ｘ０．５分；
７２℃ｘ０．５分。
【００５６】
実施例２
免疫電子顕微鏡観察のために野生型およびａｔｖｓｒ−１変異体植物の乾燥種子を固定液（４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  、１％ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅおよび０．０５  Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ−ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ、ｐＨ７．４  ）に浸し、室温で２時間固定した。緩衝液（０．０５  Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ−ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ、ｐＨ７．４  ）で洗浄した後に、ジメチルホルムアミド濃度勾配系列により−２０  度で脱水した。試料は商品名：ＬＲ  Ｗｈｉｔｅ  樹脂（Ｌｏｎｄｏｎ  Ｒｅｓｉｎ  Ｃｏ，  Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に包埋し、紫外線重合装置（ＵＶポリリンカー、堂阪イーエム社）を用いて重合させた。ミクロトーム（商品名：ウルトラカットＥ  、ライヘルト社）で超薄切片を作製し、ニッケルグリッドにマウントした。サンプルを、本発明者が調製したシロイヌナズナ２Ｓに対する抗体（希釈率１：５０）およびシロイヌナズナ１２Ｓグロブリンに対する抗体（希釈率１：５０）で処理した。切片を、８０ｋＶで透過電子顕微鏡（商品名：１２００ＥＸ；ＪＥＯＬ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）で調べた。野生型およびａｔｖｓｒ１−１変異型植物に由来する乾燥種子を、共焦点レーザー走査ユニット（商品名：ＣＳＵ，Ｙｏｋｏｇａｗａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ  ）を備えた蛍光顕微鏡（商品名：Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，  Ｊｅｎａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ  ）で調べた。乾燥種子におけるプロテインボディの自動蛍光イメージを、ＣＣＤカメラ（商品名：ＯｒｃａＥＲ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ  ）により取得した。
【００５７】
実施例３
タンパク質抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中の乾燥種子または実生から調製した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、続いてＧＶＨＰフィルター（Ｎｉｈｏｎ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ  ）へブロッティングまたはＣＢＢ染色のいずれかに供した。フィルターをＡｔＥＬＰ（１：２０００；Ｒｏｓｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ  ）、シロイヌナズナ２Ｓアルブミンに対する抗体（１：１００００）、シロイヌナズナ１２Ｓグロブリンに対する抗体（１：１００００）またはオオムギアリューレインに対する抗体（２Ｆ５、１：５０００）で処理した。免疫反応性シグナルをＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ  ）で検出した。
【００５８】
実施例４
本発明者らは、１２Ｓグロブリン（ＣＲＡ１）のＣ末端ペプチド（ＣＰＡＳＹＧＲＰＲＶＡＡＡ  ）（配列番号：１４）を結合したアフィニティーカラムを調製した。合成ペプチド（５ｍｇ）をＳｕｌｆｏｌｉｎｋカップリングゲル（２ｍｌのベッド体積；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に固定化した。シロイヌナズナ由来タンパク質抽出物を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１％ＣＨＡＰＳ）カラムにアプライした。結合した分子を、５ｍＭ  ＥＧＴＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出した。各画分を抗ＡｔＥＬＰを有する免疫ブロット解析に供した。
【００５９】
実施例５
本発明者らは、カボチャＰＶ７２に相同である各遺伝子が外来Ｔ−ＤＮＡにより破壊されたシロイヌナズナ変異体を単離した。図１Ａは、ＰＶ７２とＡｔ／ＶＳＲ１−ＡｔＶＳＲ７、エンドウマメＢＰ−８０（Ｐａｒｉｓ，  Ｎ．，  Ｒｏｇｅｒｓ，  Ａ．  Ｗ．，  Ｊｉａｎｇ，  Ｌ．，  Ｋｉｒｓｃｈ，  Ｔ．，  Ｂｅｅｖｅｒｓ，  Ｌ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｔ．  Ｅ．  ＆  Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｊ．  Ｃ．  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１５，  ２９−３９）および黒ヒヨコマメＶｍＶＳＲ（Ｔｓｕｒｕ−Ｆｕｒｕｎｏ，  Ａ．，  Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｔ．  ＆  Ｍｉｎａｍｉｋａｗａ，  Ｔ．  （２００１）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４２，  １０６２−１０７０  ）を含むホモログとの間の関係を示す系統樹を示す。免疫ブロット解析において、ＡｔＥＬＰに対する抗体は、約８０ｋＤａおよび約６０ｋＤａの分子量（図１Ｂ、ＷＴ）に対応する野生型種子における２つのバンドと反応した。６０ｋＤａバンドは、８０ｋＤａバンドに由来するのかもしれない。ａｔｖｓｒ１−１変異体の種子から得られた抽出物は、図１Ｂに示すように６０ｋＤａバンド（ＡｔＶＳＲ１−Ｓ）および８０ｋＤａバンド（ＡｔＶＳＲ１−Ｌ）を欠失していた。ａｔｖｓｒ１−１変異体のブロット上の８０ｋＤａのかすかなシグナルは、他のＡｔＶＳＲホモログと抗体との交差反応性によるものであった。他の変異体（ａｔｖｓｒ２−１、ａｔｖｓｒ３−１、ａｔｖｓｒ４−１、ａｔｖｓｒ５−１、ａｔｖｓｒ６−１およびａｔｖｓｒ７−１）の種子は、野生型種子と同様に２つのバンドを示した。ＡｔＶＳＲ１遺伝子の第３エキソンにおいてＴ−ＤＮＡ挿入を有し（図１Ｃ）、かつ遺伝子の機能的転写物を発現しなかったａｔｖｓｒ１−１変異体に焦点をあてた。
【００６０】
実施例６
本発明者らは、乾燥種子における種子タンパク質の蓄積に対するＡｔＶＳＲ１欠損の影響を明かにした。種子タンパク質は、プロテインボディにおいて蓄積し、これは、種子の乾燥と関連する種子成熟の後期にタンパク質蓄積型液胞から形成される。図２Ａは、野生型種子およびａｔｖｓｒ１−１変異型種子の子葉細胞および自家蛍光プロテインボディの形態を示す。ａｔｖｓｒ１−１変異型種子は、歪んだ細胞を有し、プロテインボディは、野生型種子のプロテインボディよりも小さい。歪んだ細胞に対するこの知見は、ＡｔＶＳＲ１がプロテインボディの形成に関与することを示唆した。シロイヌナズナのプロテインボディは、２つの主要な種子タンパク質、１２Ｓグロブリンおよび２Ｓアルブミンを蓄積する。種子タンパク質は、より大きな前駆体として合成され、次いでＶＰＥ（液胞プロセシング酵素）（Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｉ．  ＆  Ｍａｅｓｈｉｍａ，  Ｍ．  （２０００）  ｉｎ  Ｖａｃｕｏｌａｒ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．，  ｅｄｓ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ａ．  Ｄ．  Ｇ．  ＆  Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｊ．  Ｃ．  （Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫ），  ｐｐ．  ２０−４２  ）（Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｉ．，  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｔ．，  Ｈｉｒａｉｗａ，  Ｎ．  ＆  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｍ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １４５，  ６３２−６４０）の作用により成熟形態に変換されるタンパク質蓄積型液胞に送達される。種子タンパク質の質および量に対するＡｔＶＳＲ１欠損の影響を決定するために、野生型種子とａｔｖｓｒ１−１変異型種子との間の種子タンパク質のタンパク質プロフィールを比較した。図２Ｂに示されるように、ａｔｖｓｒ１−１変異型種子は、大量の１２Ｓグロブリンおよび２Ｓアルブミンの前駆体を蓄積し、一方、野生型種子は、１２Ｓグロブリンおよび２Ｓアルブミンの成熟形態のみを蓄積した。ａｔｖｓｒ１変異型種子における成熟１２Ｓグロブリンの量の明確な減少（図２Ｂ）は、変異体のプロテインボディのより小さなサイズの原因でありうる（図２Ａ、右）。他の変異体（ａｔｖｓｒ２−１、ａｔｖｓｒ３−１、ａｔｖｓｒ４−１、ａｔｖｓｒ５−１、ａｔｖｓｒ６−１およびａｔｖｓｒ７−１）の種子は、種子タンパク質前駆体を蓄積しなかった。
【００６１】
ａｔｖｓｒ１−１変異型種子における前駆体タンパク質の蓄積は、変異体細胞における種子タンパク質の細胞内輸送のいくつかの欠損を意味する。タンパク質蓄積型液胞に輸送されなかった種子タンパク質は、細胞外に蓄積されるはずである。電子顕微鏡は、ａｔｖｓｒ１−１変異型種子（図３Ｂ）の細胞間隙が、野生型種子と比べて異常に拡大され、電子密度の高い物質で満たされていたことを示した。予測されるように、ａｔｖｓｒ１−１変異型種子は、これらの電子密度の高い物質が高濃度の種子タンパク質１２Ｓグロブリン（図３Ｄ）および２Ｓアルブミン（図３Ｆ）を有することを示した。これらの種子タンパク質は、ａｔｖｓｒ１−１変異型種子におけるプロテインボディおよび電子密度の高い細胞外空間に分布するが、１２Ｓグロブリンおよび２Ｓアルブミンは、野生型種子におけるプロテインボディにおいてのみ沈着する（それぞれ、図３ＣおよびＥ）。これらの観察は、ａｔｖｓｒ１変異体が、種子タンパク質をミスソートすることにより種子タンパク質を細胞外に分泌し、細胞間隙が拡大され、電子密度の高い物質が蓄積し、細胞の収縮を生じる（図２Ａ、右）。これらの結果は、ＡｔＶＳＲ１が種子細胞の成熟におけるタンパク質蓄積型液胞への種子タンパク質の輸送に関与することを示す。
【００６２】
実施例７
ＡｔＶＳＲ１は、大きなルーメンドメインと潜在的なチロシンベースモチーフを含む短い細胞質ドメインとからなるＩ型内在性膜タンパク質である。以前に本発明者らは、カボチャにおけるＰＶ７２、ＡｔＶＳＲ１ホモログがＣａ２＋依存性様式でカボチャ２Ｓアルブミンの前駆体に結合することを報告した（Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｔ．，  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｅ．，  Ｔａｍｕｒａ，  Ｋ．，  Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｍ．  ＆  Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｉ．  （２００２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４３，  １０８６−１０９５  ）（Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｅ．，  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｔ．，  Ｋｕｒｏｙａｎａｇｉ，  Ｍ．，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｍ．  ＆  Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｉ．  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７，  ８７０８−８７１５）。これは、ＰＶ７２が２Ｓアルブミンの選別輸送レセプターとして機能することを示していた。ａｔｖｓｒ１種子の上記表現型は、ＡｔＶＳＲ１が２Ｓアルブミンだけでなく、１２Ｓグロブリンの選別輸送に関与することを示す。１２Ｓグロブリンに結合するＡｔＶＳＲ１の能力を決定するために、１２ＳグロブリンのＣ末端ペプチドが結合したカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行った。ＡｔＶＳＲ１−Ｓを、Ｃａ２＋の存在下においてカラムに特異的に結合させ、次いでＥＧＴＡの溶液で溶出した（図４、上部のパネル）。ＡｔＶＳＲ１−Ｌは、種子由来の全抽出物のブロットにおいて、おそらくＡｔＶＳＲ１−Ｌの低い溶解性または低い安定性のために有意なシグナルを示さなかった。予想されるように、ａｔｖｓｒ１−１変異型種子は、アフィニティークロマトグラフィーの各画分のブロットにバンドを有さなかった（図４、下部のパネル）。これらの結果は、ＡｔＶＳＲ１が種子タンパク質に結合することを示す。
【００６３】
細胞間隙における種子タンパク質の分泌および蓄積にもかかわらず、ａｔｖｓｒ１種子は、正常な発芽および成長を示した（データ示さず）。種子タンパク質の前駆体の運命を明らかにするために、本発明者らは、発芽後のタンパク質プロフィールを調査した。１２Ｓグロブリンおよび２Ｓアルブミンの前駆体は、ａｔｖｓｒ１−１変異型種子の発芽後に分解した（図５Ａ、右パネルの矢印により示される）。いくつかのプロテイナーゼが、ａｔｖｓｒ−１−１種子の発芽後に細胞間隙に分泌されるようである。１２Ｓグロブリンおよび２Ｓアルブミンの成熟型は、野生型種子のそれと同様に発芽後に正常に分解した（図５Ａ）。種子タンパク質の分解は、プロテインボディから分解型液胞への変換により達成されることが示された。本発明者の観察は、種子タンパク質の分解を担うプロテイナーゼがａｔｖｓｒ１−１実生の液胞に正常に輸送されることを示唆する。ＡｔＶＳＲ１は、分解型液胞へのかかるプロテイナーゼの選別輸送を担わないようである。
【００６４】
実施例８
本発明者らは、パパイン型システインプロテイナーゼ、ＡｔＡＬＥＵを調査した。これは、種子発芽後に新たに合成され、分解型液胞に蓄積される。ＡｔＡＬＥＵ前駆体は、典型的な液胞輸送シグナル（ＮＰＩＲ）を有する（Ａｈｍｅｄ，  Ｓ．  Ｕ．，  Ｂａｒ−Ｐｅｌｅｄ，  Ｍ．  ＆  Ｒａｉｋｈｅｌ，  Ｎ．  Ｖ．  （１９９７）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１４，  ３２５−３３６  ）。このシグナルの欠損は、ＡｔＡＬＥＵのホモログであるオオムギアリューレイン前駆体では、細胞外への分泌を引き起こした。また、オオムギアリューレインは細胞外においても前駆体形態のままであった（Ｈｏｌｗｅｒｄａ，  Ｂ．  Ｃ．，  Ｐａｄｇｅｔｔ，  Ｈ．  Ｓ．  ＆  Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｊ．  Ｃ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４，  ３０７−３１８）。液胞輸送シグナルＮＰＩＲ配列を用いたインビトロ結合アッセイは、ＡｔＶＳＲ１（Ａｈｍｅｄ，  Ｓ．  Ｕ．，  Ｒｏｊｏ，  Ｅ．，  Ｋｏｖａｌｅｎｔｉｎａ，  Ｖ．，  Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，  Ｓ．，  Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｍａｔｓｕｏｋａ，  Ｋ．  ＆  Ｒａｉｋｈｅｌ，  Ｎ．  Ｖ．  （２０００）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４９，  １３３５−１３４４  ）およびエンドウマメＢＰ−８０（Ｋｉｒｓｃｈ，  Ｔ．，  Ｐａｒｉｓ，  Ｎ．，  Ｂｕｔｌｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｂｅｅｖｅｒｓ，  Ｌ．  ＆  Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｊ．  Ｃ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，  ３４０３−３４０７  ）が、溶解酵素の液胞選別輸送レセプターであることを示唆した。しかし、図５Ｂは、ＡｔＡＬＥＵの前駆体がａｔｖｓｒ１−１実生において蓄積しなかったことを示す。この結果は、ＡｔＶＳＲ１が分解型液胞へのＡｔＡＬＥＵの選別輸送に関与しないことを示唆する。他のＡｔＶＳＲホモログのいくつかが、おそらく、分解性酵素の分解型液胞への輸送において役割を果たすのであろう。
【００６５】
実施例９
ＡｔＡＬＥＵ前駆体のプレプロ領域と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ  ）の融合タンパク質をシロイヌナズナ培養細胞で一過的に発現させるとＧＦＰ  は液胞に輸送された。図６中、Ａは用いたタンパク質を模式的に示したものである。ＡｔＡＬＥＵ前駆体はシグナルペプチド（ＳＰ）、プロペプチド（ＮＴＰＰ）および成熟型プロテアーゼドメインからなる（模式図上）。プロテアーゼドメインをＧＦＰ  に置換した融合タンパク質（模式図下）を実験に用いた。図６中、Ｂは一過的発現を行ったシロイヌナズナ培養細胞の蛍光像（左）および微分干渉像（右）である。ＧＦＰ  蛍光が液胞内に検出された。
【００６６】
【発明の効果】
本発明の種子タンパク質輸送レセプターまたはそれをコードする核酸の使用により、植物種子における蓄積対象となるタンパク質の蓄積量を増大させることができるという優れた効果が奏される。また、本発明の種子タンパク質の蓄積方法により、種子タンパク質を種子の細胞外に蓄積させることができるという優れた効果が奏される。
【００６７】
【配列表】
2004283079.tif 000002
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、高等植物におけるＶＳＲタンパク質とシロイヌナズナのＶＳＲ遺伝子のノックアウト変異体を示す図である。図中、Ａは、シロイヌナズナ、カボチャ、エンドウマメおよび黒ヒヨコマメのＶＳＲ（液胞選別輸送レセプター）タンパク質の系統樹を示す。バーはアミノ酸当たりの置換の数で表される進化的距離を表す。ＢはシロイヌナズナのＶＳＲノックアウト変異体（ａｔｖｓｒ１−  １からａｔｖｓｒ７−  １）の乾燥種子の免疫ブロット解析を示す図である。Ｃは、ＡｔＶＳＲ１遺伝子のａｔｖｓｒ１−  １対立遺伝子におけるＴ−ＤＮＡ挿入位置の模式図である。白四角はエキソンを示し、実線はイントロンを示す。
【図２】図２は、ａｔｖｓｒ１変異株はより小さなプロテインボディを有し、大量の種子タンパク質の前駆体を蓄積することを示す図である。図中、Ａは、野生型（ＷＴ）およびａｔｖｓｒ１−  １変異体の乾燥種子のプロテインボディの自家蛍光を示すイメージ図である。白抜きバーは１０ｍｍを示すスケールである。Ｂは、野生型（ＷＴ）およびａｔｖｓｒ１−  １変異体の乾燥種子のタンパク質プロフィールを示す。
【図３】図３は、野生型およびａｔｖｓｒ１−  １変異体の種子細胞の超微細構造を示す図である。図中、ａｔｖｓｒ１−  １株の細胞間隙が異常に肥大し、電子密度の高い物質で充填されている。１２Ｓ  グロブリン（Ｃ、Ｄ）または２Ｓ  アルブミン（Ｅ、Ｆ）に対する抗体を用いた免疫解析を行ったところ。これら２つの種子タンパク質は、ａｔｖｓｒ１−  １変異株のプロテインボディ（ＰＢ）と電子密度の高い細胞間隙（Ｄ、Ｆの矢尻）に分配されていた。ＣＷは細胞壁を示す。スケールバーは、５ｍｍ（Ａ、Ｂ）と１ｍｍ（Ｃ〜Ｆ）である。
【図４】図４は、１２Ｓ  グロブリンへのＡｔＶＳＲ１のＣａ２＋依存的結合を示す図である、１２Ｓ  グロブリン由来のペプチドを結合させたカラムに、野生型植物体の抽出物をアプライすることにより、ＡｔＶＳＲ１はカラムに結合した。この結合は、Ｃａ２＋のキレート剤であるＥＤＴＡにより解離し、溶出された（レーン５）。ａｔｖｓｒ１−  １変異株で、同様の実験を行った結果を底部パネルに示す。底部パネルの矢尻はＡｔＶＳＲ１−Ｓの予想される位置を示す。
【図５】図５は発芽後の野性株およびａｔｖｓｒ１−  １変異株における種子タンパク質およびＡｔＡＬＥＵの量的変動を示す電気泳動の図である。変異株に蓄積している貯蔵タンパク質の前駆体（ｐ１２Ｓ  とｐ２Ｓ  ）は、成熟型種子タンパク質（１２Ｓ−Ａ、１２Ｓ−Ｂと２Ｓ）と同様に分解される（Ａ）。また、ＮＰＩＲを含む液胞システインプロテイナーゼであるＡＬＥＵに対するモノクローナル抗体を用いた免疫解析を行った（Ｂ）。ＡｔＡＬＥＵ前駆体は検出されなかったので、ＡｔＶＳＲ１はＡｔＡＬＥＵの輸送には関与していないと推測される。ｍおよびｐは、それぞれ成熟型ＡｔＡＬＥＵおよびＡｔＡＬＥＵ前駆体の予想された位置を示す。
【図６】図６は、ＡｔＡＬＥＵ前駆体のプレプロ領域と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ  ）の融合タンパク質をシロイヌナズナ培養細胞で一過的に発現させるとＧＦＰ  は液胞に輸送されたことを示す図である。図中、Ａは用いたタンパク質の模式図である。ＡｔＡＬＥＵ前駆体はシグナルペプチド（ＳＰ）、プロペプチド（ＮＴＰＰ）および成熟型プロテアーゼドメインからなる（上）。プロテアーゼドメインをＧＦＰ  に置換した融合タンパク質（下）を実験に用いた。図中、Ｂは一過的発現を行ったシロイヌナズナ培養細胞の蛍光像（左）および微分干渉像（右）を示す図である。ＧＦＰ  蛍光が液胞内に検出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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