(57)【要約】【課題】タンパク質間の新規な相互作用を利用する高血圧症治療関連技術の提供。【解決手段】ＦＬＪ２２３２１タンパク質と新生リボゾーム合成に関与するタンパク質との間の相互作用を利用する高血圧症治療薬のスクリーニング方法、高血圧症治療薬製造のためのＦＬＪ２２３２１タンパク質と新生リボゾーム合成に関与するタンパク質との間の相互作用の使用、ＦＬＪ２２３２１タンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子からなる高血圧症診断用マーカー、ＦＬＪ２２３２１タンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子を用いる高血圧症の発症リスク評価方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＬＪ２２３２１タンパク質と新生リボゾーム合成に関与するタンパク質との間の相互作用を利用することを特徴とする高血圧症治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
高血圧症治療薬製造のためのＦＬＪ２２３２１タンパク質と新生リボゾーム合成に関与するタンパク質との間の相互作用の使用。
【請求項３】
ＦＬＪ２２３２１タンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子からなる高血圧症診断用マーカー。
【請求項４】
ＦＬＪ２２３２１タンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子を用いる高血圧症の発症リスク評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質間の新規な相互作用を利用する高血圧症治療関連技術に関する。より詳しくは、高血圧症関連疾病治療薬のスクリーニング方法、高血圧症治療薬製造における前記相互作用の使用、高血圧症診断用マーカー、高血圧症の発症リスク評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポスト・シークエンス時代を迎え、大規模な遺伝子機能解析が急務とされている。これまでの遺伝子機能解析は、破壊実験や過剰発現実験が主であった。即ち、ノックアウト、またその逆を行い、その結果生じる細胞の変化である「表現型」から、遺伝子の機能を予測してきた。
【０００３】
また、ポスト・ゲノム・シークエンスの取り組みの一つとして、機能未知の遺伝子の翻訳後産物の立体構造、即ち、タンパク質の立体構造解析から機能を予測する技術が生まれてきた。この構造ゲノム科学と称される技術は、タンパク質の持つ「姿・形」からその機能を同定することを主幹とする技術であるが、タンパク質の立体構造のみからの機能予測は、当該タンパクの機能を直接的に同定するものではないため、必ずしも有効な手段となり得ない場合が多い。このため、遺伝子機能解析の最も直接的な機能解析法として、遺伝子の翻訳後産物であるタンパク質間の相互作用解析が注目され始めている。なお、タンパク質間の相互作用とは、タンパク質間の非共有結合、共有結合を含む化学的結合あるいは解離をいう。
【０００４】
ここで、「高血圧症」はその原因がわかっているものは少なく、褐色細胞腫や腎性高血圧症などであり、その大部分が本態性高血圧症といわれるものである。この本態性高血圧症は、遺伝子因子の関与が大きく、動脈硬化が基本となっていることが多い疾病と考えられている。高血圧症を放置すると、脳梗塞や脳出血などの脳血管障害や、狭心症や心筋梗塞などの虚血性心臓病、心臓肥大（ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）、心筋虚血などの臓器障害を起こす。
【０００５】
現在、比較的軽い高血圧症には、食事療法の他に、β遮断薬やアンジオテンシン転換酵素阻害薬、カルシウム拮抗薬、降圧利尿薬などが単独又は組み合わされて投与され、程度の高い高血圧症には、前記治療薬にα１遮断薬や中枢性α２作用薬などが併用され、さらに程度の高い高血圧症に対しては血管平滑筋弛緩薬や抗アドレナリン効果薬等が用いられる。
【０００６】
近年、ラット心臓の大動脈圧の上昇が、ラット心臓におけるリボソームタンパク質の合成を促進し、新生リボソーム（ｎｅｗ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ）の合成に対して特異な影響を及ぼすことが、Ｃｈｕａ  ＢＨ、Ｒｕｓｓｏ  ＬＡらによって示された（非特許文献１参照）。また、心臓肥大の際において常に特徴となるタンパク質合成量の増加は、主として、促進されたリボソーム合成によって仲介されることが、Ｈａｎｎａｎ  ＲＤ、Ｒｏｔｈｂｌｕｍ  ＬＩによって示された（非特許文献２）。したがって、新生リボソームの合成系に直接的又は間接的に関与するタンパク質は、心臓肥大等の原因となる「高血圧症」の発症に関与すると考えることができる。
【０００７】
【非特許文献１】
Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９８７  Ｍａｒ；２５２（３  Ｐｔ  １）：Ｃ３２３−７。
【非特許文献２】
Ｃａｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  １９９５  Ｏｃｔ；３０（４）：５０１−１０。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子機能解析の最も直接的な機能解析法であるタンパク質間の相互作用解析に基づいてタンパク質間の全く新規な相互作用の網羅的解析を行うことによって、まず、標的とするタンパク質が特定の疾病の発現等に関与することをまず明らかにし、次に、このタンパク質と相互作用を示すタンパク質（以下、「パートナータンパク質」と称する。）を見出す研究を行う。
【０００９】
この研究によって見出された前記標的タンパク質と前記パートナータンパク質の間での相互作用それ自体が、前記疾病の発症等に関与する新規な相互作用であると考えることができる。
【００１０】
そこで、本発明では、この相互作用を利用した疾病向けの医薬のスクリーニング方法、該医薬製造における前記相互作用の使用、さらには、前記疾病の診断用マーカー並びに発症リスク評価方法等を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
まず、ＦＬＪ２２３２１タンパク質は、従来その機能が未知であったが、本発明者らの鋭意研究によって、リボソーム合成に関与する複合体の構成員であることが明らかになった。従って、このＦＬＪ２２３２１タンパク質は、新生リボゾーム合成の亢進に伴って発現するタンパク質である。一方、新生リボゾーム合成系と高血圧症の発症は密接に関与していることがわかっているので、前記ＦＬＪ２２３２１タンパク質は高血圧症の発症に関与していると予測できる。
【００１２】
この予測に基づいて、本発明では、第一に、ＦＬＪ２２３２１タンパク質と新生リボゾーム合成に関与するタンパク質との間の相互作用を利用する高血圧症治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
なお、本発明におけるＦＬＪ２２３２１タンパク質には、配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するＦＬＪ２２３２１タンパク質それ自体に狭く限定されるのではなく、該タンパク質と同様に新生リボゾーム合成系に関与する生理的機能を少なくとも備えるものであって、前記アミノ酸配配列の一部アミノ酸が欠失、置換、付加あるいは挿入されているタンパク質も含まれる。
【００１４】
本発明に係るスクリーニング方法によって、対象とするタンパク質間の相互作用の結合特性を変化（阻害又は増進）させ得る化合物のスクリーニングを実施することができる。かかる化合物は、対象とするタンパク質間相互作用が関連する疾病（疾患）に対する治療薬又は予防薬の候補となり得る。このようなスクリーニングは、上記相互作用を検出するための反応条件に候補化合物を適切な濃度で添加して、相互作用に対する影響を調べる手法を含む。
【００１５】
この手法は、従来の酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ法）と同様の手法としてスクリーニング可能である。そして９６ウェルプレート上にＦＬＪ２２３２１タンパク質あるいはその相互作用の相手となるタンパク質（パートナータンパク質）を結合固定化し、そこにスクリーニング対象分子を添加し、さらにＦＬＪ２２３２１タンパク質（ＦＬＪ２２３２１タンパク質を固定化した場合であればパートナータンパク質）、標識抗体、基質の順で反応させ、スクリーニング対象物質の存在下でどのくらいＦＬＪ２２３２１タンパク質とパートナータンパク質との結合が変化するかを調べる。基質の発色が強い方が両者の結合は強いということになる。
【００１６】
なお、薬物のスクリーニングは、ＮＭＲ分光学やＸ線結晶解析や電子顕微鏡等による一分子直接観察によっても可能である。また表面プラズモン共鳴センサ（ＳＰＲ）を用いても効率よくスクリーニング可能で、ＦＬＪ２２３２１タンパク質かパートナータンパク質のいずれかをやはりＳＰＲのセンサーチップ上に固定化し、スクリーニング対象分子を添加したＦＬＪ２２３２１タンパク質（ＦＬＪ２２３２１タンパク質を固定化した場合ならパートナータンパク質）をセンサーチップ上に送液する。両者の結合は表面プラズモン共鳴によりリアルタイムに結合曲線が観察され、両者の結合が強まれば結合曲線は増高して、弱まれば減弱あるいは消失する。
【００１７】
次に、本発明では第二に、高血圧症治療薬製造のためのＦＬＪ２２３２１タンパク質と新生リボゾーム合成に関与するタンパク質との間の相互作用の使用を提供する。
【００１８】
高血圧症治療薬製造のための前記相互作用の使用は、例えば、高血圧症治療薬製造の過程において前記相互作用が直接的又は間接的に用いられる手段を意味する。一例を挙げれば、該相互作用を利用するスクリーニング方法を用いて目的の物質を選別し、この物質を高血圧症治療薬の製造に利用することができる。あるいは、高血圧症治療薬の候補となる物質が正しく活性を持っているか否かを検査（品質検査）する場合に、前記相互作用を利用することができる。
【００１９】
本発明では第三に、ＦＬＪ２２３２１タンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子からなる高血圧症診断用マーカーを提供し、第四には、ＦＬＪ２２３２１タンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子を用いる高血圧症の発症リスク評価方法を提供する。
【００２０】
ＦＬＪ２２３２１タンパク質の発現状態や該タンパク質をコードする遺伝子の変異あるいは一塩基多型等を調べることによって、高血圧症治療薬の創薬技術、診断技術、検査技術、発症リスクの評価技術等に役立てることができるという技術的意義を有する。
【００２１】
【実施例】
まず、本願発明者らは、添付の配列表の「配列番号１」に示されたＦＬＪ２２３２１タンパク質が新生リボゾーム合成に関与するか否かを検証するための解析実験を行った。
【００２２】
本願発明者らは、配列番号１のＦＬＪ２２３２１タンパク質を認識し、相互作用するパートナータンパク質を以下の方法によって、効率的に探索した。
【００２３】
このパートナータンパク質を見つけることを目的に使用される前記ＦＬＪ２２３２１タンパク質の遺伝子（配列番号２）をｃＤＮＡとして準備した。なお、前記ＦＬＪ２２３２１タンパク質の遺伝子は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）から購入し、ＣＭＶプロモーターを有す哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んだ。
【００２４】
これに、タンパク質に構造的、機能的に影響を及ぼさないタグ（エピトープタグ）を選択して融合した。具体的には、エピトープタグとして「ＦＬＡＧタグ」を選択した。
【００２５】
タグの融合はＩｎｈｅｒｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いた（論文：Ｉｍａｉ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９１，  １９，  ２７８５）。ＦＬＪ２２３２１タンパク質のカルボキシル末端に前記タグが付くように、ｃＤＮＡが組み込まれている発現ベクターに対するＰＣＲプライマーを設計し，増幅し目的のクローンを得た。
【００２６】
続いて、前記タグが融合されたＦＬＪ２２３２１タンパク質遺伝子を培養細胞に導入した（トランスフェクト）。遺伝子導入する培養細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞，トランスフェクション試薬はキアゲン（株）のＰｏｌｙＦｅｃｔを用いた。なお、導入の手順は同製品のプロトコールに従った。
【００２７】
前記培養細胞に導入された遺伝子は、前記タグが融合した組み換えタンパク質として細胞内に発現し、該細胞内に存在するパートナータンパク質と相互作用し複合体を形成する。この複合体は、前記タグが付加されている。このため、前記タグに対する抗体を用いた公知の「免疫沈降法」によって、細胞内から抽出した。
【００２８】
抽出方法は、次の通りである。遺伝子導入した細胞を可溶化バッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌ，５０ｍＭＮａＦ，１ｍＭＮａ３ＶＯ４，１ｍＭＰＭＳＦ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を用いて可溶化した。この可溶化バッファーを加えたのち細胞を掻き取り遠心管に回収し超遠心（５５，０００回転，４℃，２０分）した。
【００２９】
遠心後の細胞抽出液（上清）にＦＬＡＧペプチド抗体を固定化したアガロースビーズ（ＳＩＧＭＡ社から購入）を加え４℃で３時間撹拌した．撹拌後のビーズを遠心（１，０００回転，４℃，１分）して集め可溶化バッファーで洗浄後，ＦＬＡＧペプチドを含むバッファーを加えることによりビーズに結合したＦＬＪ２２３２１タンパク質を溶出し、このＦＬＪ２２３２１タンパク質を含むタンパク質複合体を回収した。
【００３０】
抽出後は、公知のタンデム質量計（ＭＳ／ＭＳ）により、相互作用の相手となるたんぱく質を、「質量タグ法」と称される公知の方法（羊土社「プロテオーム解析法」、磯辺俊明、高橋信弘編、Ｐ１２９〜Ｐ１４２）によって同定した。
【００３１】
具体的には、まず解析前に抽出したサンプルを、特定のアミノ酸を認識し切断する酵素である「トリプシン」あるいは「リジルエンドペプチダーゼ」により消化分解する。なお、本実験では、リジルエンドペプチダーゼを用いた。
【００３２】
具体的には、回収されたタンパク質複合体を遠心濃縮後、酵素反応用バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．８）に溶解した。酵素基質比（重量比）が１／１００から１／５０になるようにリジルエンドペプチダーゼを加え３７℃で１２時間反応させ、消化物を得た。
【００３３】
前記消化分解作業後、タンデムマス・スペクトロメトリーを用いて、分解された各ペプチドの質量値と内部アミノ酸配列情報を取得した。
【００３４】
酵素消化されたペプチド断片の質量値を用いて、データベース上から候補アミノ酸シークエンスを自動検索して選び出し、かつその配列が各アミノ酸でフラグメント化したときの質量値セットを計算した。
【００３５】
なお、前記データベースは、既に公開されているタンパク質データベースである「ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ」（インターネットアドレス：ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｓｐ＿ｔｒ＿ｎｒｄｂ／ｆａｓｔａ／ｓｐｒｏｔ．ｆａｓ．Ｚ）と核酸データベースである「ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ」（インターネットアドレス：ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ／Ｈ＿ｓａｐｉｅｎｓ／ｍＲＮＡ＿Ｐｒｏｔ／ｈｓ．ｆａａ．ｇｚ）を使用した。
【００３６】
この計算値と実測のフラグメントイオン（ＭＳ／ＭＳスペクトラム）を比較することによって、パートナータンパク質を同定した。
【００３７】
この実験の結果、リボゾームを構成する６０Ｓサブユニット由来の３２種ペプチドとリボゾームを構成する４０Ｓサブユニット由来の１７種ペプチドが、ＦＬＪ２２３２１タンパク質と相互作用することがデータベース検索によって示された（データベース検索結果を示す「図１」参照）。
【００３８】
また同時に、ＦＬＪ２２３２１タンパク質に対して、ヌクレオリン（Ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）及びヌクレオフォスミン（Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ）も相互作用していることが判明した（データベース検索結果を示す「図１」参照）。
【００３９】
ここで、ヌクレオリン及びヌクレオフォスミンは、新生リボゾーム合成に関与することが知られている（Ｙａｎａｇｉｄａ  Ｍ，  Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  Ａ，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ，  Ｆｕｒｕｉｃｈｉ  Ｙ，  Ｉｓｏｂｅ  Ｔ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ．Ｌｉｎｋｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．  ２００１  Ｎｏｖ；１（１１）：１３９０−４０４．）。
【００４０】
従って、従来機能未知であったＦＬＪ２２３２１タンパク質は、リボソーム合成に関与する複合体の構成員であり、新生リボゾーム合成の亢進に伴って発現するタンパク質であることが証明できた。即ち、当該ＦＬＪ２２３２１タンパク質は新生リボゾーム合成系に関与するタンパク質であることが明らかになった。
【００４１】
本解析実験で検出したパートナータンパク質の酵素（リジルエンドペプチダーゼ）消化ペプチドのアミノ酸配列は、添付した図２の通りである。なお、図２に示されたペプチド群のアミノ酸配列は、上から順番に、上述の図１に示されたデータベース検索結果のペプチドの一文字アミノ酸配列を三文字アミノ酸配列に置き換えて示したものである。
【００４２】
以上の解析実験の結果等から明らかなように、高血圧症の発症と密接に関連していることが知られている新生リボゾーム合成系に関与するタンパク質であることが判明したＦＬＪ２２３２１タンパク質や該タンパク質をコードする遺伝子（「配列番号２」参照）、並びにＦＬＪ２２３２１タンパク質（配列番号１参照）とヌクレオリン（Ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）やヌクレオフォスミン（Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ）などの新生リボゾーム合成系タンパク質との間の相互作用は、高血圧症の発症に関与している。
【００４３】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、ＦＬＪ２２３２１タンパク質と新生リボゾーム合成に関与するタンパク質との間の相互作用を利用した疾病向けの医薬のスクリーニング方法、該医薬製造における前記相互作用の使用、さらには、前記疾病の診断用マーカー並びに発症リスク評価方法に特に有用である。
【００４４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＦＬＪ２２３２１タンパク質に対する相互作用したペプチド群のデータベース検索結果を示す図
【図２】図１に示されたデータベース検索結果に示されたペプチド群の一文字アミノ酸配列番号記を三文字アミノ酸配列番号記に置き換えて示す図
【図１】
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【図２】
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