(57)【要約】【課題】斑点落葉病に耐病性を示す、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡを提供する。【解決手段】葉緑体シャペロニンαサブユニットをコードする１，７５８ｂｐのｃＤＮＡの翻訳開始点から１９３番目の塩基が、グアニン（Ｇ）であり、この部位のコドンに対応して発現するアミノ酸がアスパラギン酸である。【選択図】図１３
2004283002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の塩基配列で表されるリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡ。
【化１】
2004283002.tif 000006
【請求項２】
リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットをコードする１，７５８ｂｐのｃＤＮＡの翻訳開始点から１９３番目の塩基が、グアニンであり、この部位のコドンに対応して発現するアミノ酸がアスパラギン酸である、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡによってコードされるリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡであって、下記の塩基配列で表せられるリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡ。
【化２】
2004283002.tif 000007
【請求項４】
請求項１又は請求項２に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡによってコードされるリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡであって、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡの翻訳開始点から６６２番目の塩基が、グアニンであり、この部位のコドンに対応して発現するアミノ酸がアスパラギン酸である、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡを有するリンゴ。
【請求項６】
請求項１又は請求項２に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡを用いた、リンゴ斑点落葉病に強いリンゴの診断方法。
【請求項７】
請求項３又は請求項４に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡを用いた、リンゴ斑点落葉病に強いリンゴの診断方法。
【０００１】
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡ、このｃＤＮＡによってコードされるリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのＤＮＡ、このＤＮＡを有するリンゴに関し、特に、斑点落葉病に耐病性を示す、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡ、このｃＤＮＡによってコードされるリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのＤＮＡ、このＤＮＡを有するリンゴ及びリンゴ斑点落葉病に強いリンゴの診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
斑点落葉病は、１９５６年に岩手県で初めて発病が認められて以来、全国的に急速に蔓延し、現在では、わが国でのリンゴ栽培において最も重要な病害の一つとなっている。
【０００３】
この斑点落葉病に対する対処法としては、農薬散布が専ら行われている。例えば、鳥取県の場合には、リンゴ栽培者は、この病害を対象として、年に１０回程度の農薬散布を行っている。
【０００４】
ところで、リンゴ斑点落葉病は、糸状菌Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ  ａｐｐｌｅ  ｐａｔｈｏ−ｔｙｐｅ（Ａ．ｍａｌｉ）によって引き起こされ、この菌は、胞子発芽時に宿主特異的毒素（ＨＳＴ）の一種の、ＡＭ−ｔｏｘｉｎ  Ｉ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉｏｌｉｄｅ）を分泌し、感受性リンゴ組織が示す潜在的抵抗反応を抑制して病原菌に対する受容性を誘導するとともに、最終的に宿主細胞を死に至らしめる。この宿主特異的毒素（ＨＳＴ）は、下記化３に示す環状テトラデプシペプチドであることが知られている。
【０００５】
【化３】
2004283002.tif 000003
【０００６】
そして、従来は、リンゴ斑点落葉病に対する病害感受性を調べる際には、葉の表面組織に傷をつけ、その傷に、上記化３に示す環状テトラデプシペプチドを付け、組織が壊死するか否かによって行っていた。
【０００７】
より詳しく説明すると、従来は、リンゴ斑点落葉病に対する病害感受性を調べるための毒素検定は、以下のような方法によって行われていた。
【０００８】
まず、植物の幼葉（茎頂の展開葉から数えて３枚目の葉）を切り取り、針先で葉表面のクチクラ層に微少な傷を付ける。
【０００９】
次いで、リンゴの幼葉に付けた傷部に、例えば、１μＭ  ＡＭ−ｔｏｘｉｎ  Ｉ溶液を５マイクロリットル（μｌ）滴下し、２５℃、暗黒、湿室条件下で４８時間放置する。
【００１０】
すると、リンゴ斑点落葉病に対し感受性を示す植物では、褐色の明確な壊死斑が、傷口を中心に形成される。一方、リンゴ斑点落葉病に対し抵抗性若しくは耐病性を示す植物では、リンゴ斑点落葉病に対し感受性を示す植物に見られるような壊死斑は、形成されない。
【００１１】
即ち、リンゴ斑点落葉病に対する病害感受性は、この壊死斑の形成の有無を指標にして判定されている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のリンゴ斑点落葉病に対する病害感受性判定方法には、リンゴの生育環境における栄養条件や樹齢、材料の採取時期、採取器官の種類などによって、病害感受性の発現程度に大きな差異が生じる、という問題がある。
【００１３】
また、この従来のリンゴ斑点落葉病に対する病害感受性判定方法では、判定するまでに、試験開始から４８時間以上の時間がかかり、即日判定は困難である。
【００１４】
一方、リンゴは、病害に弱い果樹品目であるため、農薬を定期的に散布しなければならず、リンゴ栽培者に、農薬散布という過酷な労働を課すことになるとともに、農薬散布が環境汚染のおそれにつながるおそれもあり、環境保全を重視した持続的農業の展開が求められる今日、病害抵抗性の優良品種の開発が益々期待されており、従来のリンゴ斑点落葉病に対する病害感受性判定方法よりも精度が高く且つ迅速に判定が行なえる病害感受性判定方法の開発が望まれている。
【００１５】
本発明は、以上のような課題を解決するためになされたものであって、リンゴ斑点落葉病に強いリンゴのｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、このｃＤＮＡによってコードされるリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡ、このＤＮＡを有するリンゴ及びリンゴ斑点落葉病に強いリンゴの診断方法を提供することを目的としている。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、リンゴ斑点落葉病に対する感受性又は抵抗性の判別は、リンゴの遺伝子によって解析できると考え、鋭意努力した結果、本発明を完成するに至った。
【００１７】
即ち、請求項１に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡは、下記の塩基配列で表される。
【００１８】
【化４】
2004283002.tif 000004
【００１９】
請求項２に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡは、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットをコードする１，７５８ｂｐのｃＤＮＡの翻訳開始点から１９３番目の塩基が、グアニン（Ｇ）であり、この部位のコドンに対応して発現するアミノ酸がアスパラギン酸である。
【００２０】
ここに、翻訳開始点から１９３番目の塩基は、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットをコードする１，７５８ｂｐのｃＤＮＡの塩基配列中、開始コドンのＡＴＧ（アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）−グアニン（Ｇ））配列のアデニン（Ａ）を１番目とした場合、塩基配列の１９３番目の塩基を意味する。
【００２１】
請求項１に係る発明又は請求項２に係る発明では、斑点落葉病に対し耐病性を示すリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡを特定したので、これを用いて、斑点落葉病に対し耐病性を示すリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡを作製できる。
【００２２】
請求項３に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡは、請求項１又は請求項２に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡによってコードされるリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡであって、下記の塩基配列で表される。
【００２３】
【化５】
2004283002.tif 000005
【００２４】
請求項４に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡは、請求項１又は請求項２に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡによってコードされるリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡであって、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡの翻訳開始点から６６２番目の塩基が、グアニン（Ｇ）であり、この部位のコドンに対応して発現するアミノ酸がアスパラギン酸である。
【００２５】
ここに、翻訳開始点から６６２番目の塩基は、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットをコードする３，３４９ｂｐのゲノムＤＮＡの塩基配列中、開始コドンのＡＴＧ（アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）−グアニン（Ｇ））配列のアデニン（Ａ）を１番目とした場合、塩基配列の６６２番目の塩基を意味する。
【００２６】
請求項３に係る発明又は請求項４に係る発明では、斑点落葉病に対し耐病性を示すリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡを特定したので、これを用いて、ＤＮＡ鑑定することにより、斑点落葉病に抵抗性を示す品種・系統の選抜を実施する上で、このゲノムＤＮＡの情報は、プライマー設計等で有効に利用できる。
【００２７】
請求項５に記載のリンゴは、請求項３又は請求項４に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡを有する。
【００２８】
このリンゴ（果樹）は、斑点落葉病に対し耐病性を示すので、以下の効果を奏する。
【００２９】
１）リンゴ（果実）の収量の損失を防ぐことが期待できる。
２）農薬の使用量を減らすことができる。これにより安全性の高いリンゴ（果実）の収穫が可能になる。
３）リンゴ（果樹）の葉が枯れにくいので、糖度の高いリンゴ（果実）の収穫が可能になる。
【００３０】
請求項６に記載のリンゴ斑点落葉病に強いリンゴの診断方法は、請求項１又は請求項２に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡを用いた。
【００３１】
請求項７に記載のリンゴ斑点落葉病に強いリンゴの診断方法は、請求項３又は請求項４に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡを用いた。
【００３２】
請求項６又は請求項７に記載のリンゴ斑点落葉病に強いリンゴの診断方法では、遺伝子診断により、リンゴ斑点落葉病に強いリンゴを選抜できるので、従来の化３に示す環状テトラデプシペプチドを付け、組織が壊死するか否かによって行うリンゴ斑点落葉病に強いリンゴを選抜に比べ、正確且つ迅速に、リンゴ斑点落葉病に強いリンゴを選抜できる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について、更に詳しく説明する。
【００３４】
図１は、本発明者等が行った、リンゴ斑点落葉病に対する宿主感受性因子を特定するための解析手法を概略的に示す説明図である。
【００３５】
まず、本発明者等は、斑点落葉病菌の胞子発芽液から、ＡＭ−ｔｏｘｉｎ  Ｉを多量に単離した。
【００３６】
また、本発明者等は、斑点落葉病菌に対し、高度感受性を示すリンゴ（品種：「印度」）の芽条組織を試験館内で大量に培養増殖させた。
【００３７】
次に、リンゴ（品種：「印度」）の培養芽条にガンマ（γ）線を照射し、突然変異を誘発させた。
【００３８】
次に、このようにして作製した、リンゴ（品種：「印度」）の複数の突然変異種の各々に、１μＭ  ＡＭ−ｔｏｘｉｎ  Ｉ溶液を滴下し、２５℃、暗黒、湿室条件下で４８時間放置し、リンゴ（品種：「印度」）の複数の突然変異種の中から、４８時間経過後、組織に壊死を生じていない突然変異種（以下、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）という。）を選抜した。
【００３９】
尚、この耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）は、線量率５Ｇｙ／時間（ｈｒ）で総線量１２０Ｇｙのガンマ（γ）線を照射した処理区より選抜され、また、感受性原品種「印度」に対し、ＡＭ−ｔｏｘｉｎ  Ｉでのバイオアッセイで、毒素希釈限界が１０，０００倍以上の極めて高い耐病性を示した。
【００４０】
図２は、病原菌接種試験の試験結果であり、図２（ａ）は、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の試験結果を示しており、また、図２（ｂ）は、感受性原品種「印度」の試験結果を示している。
【００４１】
尚、病原菌接種試験は、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）及び感受性原品種「印度」を順化・育成させ、各々の茎頂より第４位の幼葉に、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒ−ｎａｔａ  ａｐｐｌｅ  ｐａｔｈｏｔｙｐｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｏ−１５９の胞子懸濁液を、５００，０００ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ濃度で噴霧し、２５℃、暗黒、湿室条件下で４８時間放置した後、発病状況を写真撮影することによって行った。
【００４２】
この耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の系統は、図２（ａ）と図２（ｂ）との対比からも明らかなように、病原菌接種試験においても顕著な耐病性を示した。
【００４３】
次に、本発明者等は、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）系統及び感受性原品種「印度」を用い、二次元電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）により、斑点落葉病菌に対する感受性関連蛋白質の検出を試みた。
【００４４】
まず、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）系統の幼葉及び感受性原品種「印度」の幼葉の各々を液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いて摩砕し、その粉末を図３にその組成を示す、抽出溶媒に入れ、氷冷下で、３０分間攪拌し、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）系統の幼葉及び感受性原品種「印度」の幼葉の各々に含まれる蛋白質を抽出した。
【００４５】
次に、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）系統の幼葉に含まれる蛋白質を抽出した溶解緩衝液及び感受性原品種「印度」の幼葉に含まれる蛋白質を抽出した溶解緩衝液の各々を、４℃で、３０分間、遠心分離（５，０００×ｇ）した後、得られた上澄み液の各々を、更に、４℃で、３０分間、超遠心分離（５０，０００×ｇ）した。続いて、以上のようにして得られた耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）系統の幼葉に含まれる蛋白質を含む上澄み液及び感受性原品種「印度」の幼葉に含まれる蛋白質を含む上澄み液の各々を、解析を行うまで、−９０℃で冷凍保存した。
【００４６】
二次元電気泳動は、二次元電気泳動装置（製品名：Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ  ｆｌａｔｂｅｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｕｎｉｔ（ファルマシアバイオテク社）を用い、一次元目に、固定化ｐＨ勾配ゲル（ＩＰＧ）を用いた等電点電気泳動、二次元目に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ｐｏｌｉａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））により行った。
【００４７】
両電気泳動は、１５℃の恒温条件下で行った。
【００４８】
一次元目において、固定化ｐＨ勾配ゲル（イモビラインドライストリップ（ＩＰＧ  ｇｅｌ  ｓｔｒｉｐｓ）（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ，１１０ｍｍ，ｐＨ３−１０．５））又は（イモビラインドライストリップ（ＩＰＧ  ｇｅｌ  ｓｔｒｉｐｓ）（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ，１１０ｍｍ，  ｐＨ４−７，ファルマシアバイオテク社））は、図４にその組成を示す溶液によって再膨潤処理した。
【００４９】
電気泳動用試料を図３の組成からＰｏｌｙｃｌａｒ  ＳＢ−１００を除いた溶液で希釈し、容量１００  μｌ，  ０．５  ｍｇ蛋白質総量となるよう調製した。その試料は再膨潤処理した固定化ｐＨ勾配ゲルにアプライし、ＥＰＳ  ３５００ＸＬパワーサプライ（ファルマシアバイオテク社）を用いて、図５に示した電圧設定プログラムにより泳動した。
【００５０】
泳動の終了した固定化ｐＨ勾配ゲルは図６に示した溶液を用いて平衡化処理した。
【００５１】
その平衡化は、図６の組成に２％（ｗｔ／ｖｏｌ）  （±）−ジチオトレイトールを加えた溶液中で１０分間インキュベートし、その後、図６の組成に２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ヨードアセトアミドを加えた溶液に置き換え、さらに１０分間インキュベートした。
【００５２】
二次元目のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、大型プレキャストポリアクリルアミドグラジュエントゲル〔Ｅｘｃｅｌ  Ｇｅｌ  ＸＬ  １２−１４  （２４５  ｘ  １８０  ｍｍ，  Ｔ  ＝  １２−１４％  アクリルアミド、ファルマシアバイオテク社）〕に上記の平衡化したゲルをセットし、ＥＰＳ  ３５００ＸＬパワーサプライ（ファルマシアバイオテク社）を用いて、２０  ｍＡ定電流で４０分間、続いて、４０  ｍＡ  で１５５  分間の泳動を行った。二次元目の泳動が終了した後、分離した蛋白質は銀染色キット〔２Ｄ−銀染色試薬ＩＩ（第一化学薬品社）〕を用いて検出した。蛋白質の分子量と等電点のキャリブレーションはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  スタンダード  Ｌｏｗ  （日本バイオ・ラッドラボラトリーズ社）及びカルバミライトキャリブレーションキット（ファルマシアバイオテク社）を用いて試料とスタンダードを同時に泳動することにより実施した。二次元に分離された蛋白質スポットの画像は６００ｄｐｉ  の解像度でパソコンに取り込み、画像解析ソフトＣｏｌｌａｇｅ  （フォトダイン社）及び  ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．５５  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  アメリカ合衆国）を用いて解析を行った。
【００５３】
次に、最初の試験として、葉組織での蛋白質の発現状態を俯瞰的に調べるために、ｐＨ  ３−１０  の広範な分離領域をもつ固定化ｐＨ勾配ゲルを一次元目に用いた二次元電気泳動を行った。
【００５４】
その結果、約９００  スポットの分離した蛋白質が検出され、それらのパターンのマッチング解析を行ったが、耐病性変異系統とその原品種間でのスポットパターンに顕著な差違を検出することはできなかった。また、この実験では、水平軸（等電点）の蛋白質の分離度が低く、多くのスポットの癒合がみられた。
【００５５】
そこで、その分離度を向上させるために、一次元目の等電点電気泳動をｐＨ  ４−７の固定化ｐＨ勾配ゲルに切り替えて同様の実験を行った結果、検出された分離スポット数は約１，４００  に増加し、解像度が向上した。図７に耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）と感受性原品種「印度」でのその蛋白質分離パターンの差違を示す。
【００５６】
図７（ａ）は、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の系統から抽出した蛋白質の二次元電気泳動パターンであり、また、図７（ｂ）は、感受性原品種「印度」から抽出した蛋白質の二次元電気泳動パターンである。
【００５７】
図７（ａ）と図７（ｂ）との対比により、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の系統には、６０ｋＤａ，ｐｌ５の蛋白（ＳＡ６０）の欠損が認められた。
【００５８】
即ち、耐病性突然変系統（ＩＤ−１２０）と感受性原品種とでは、顕著な相違が６０  ｋＤａ，  ｐＩ  ５  のスポットにみられ、耐病性変異系統（ＩＤ−１２０）ではそれが欠損し、感受性原品種ではそれらが検出された。その他の顕著なスポットパターンの差違はみられなかった。
【００５９】
画像解析ソフトＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いた蛋白質発現量の解析で、差違のみられた蛋白質Ｎｏ．３（ＳＡ６０）は耐病性変異体で９５％以上抑制が認められた。なお、蛋白質ＳＡ６０に隣接するホモログと推定されるスポットＮｏ．  ２  及びＮｏ．３  （ＲＢＰ−１  及びＲＢＰ−２）の発現量の減少は１０％以下であった。一方、耐病性変異体（ＩＤ−１２０）  から感受性に先祖返りした系統（ＩＤ−１２０−Ｓ１）  では蛋白質ＳＡ６０の発現量は原品種「印度」と同等であった。
【００６０】
以上の結果から、蛋白質ＳＡ６０は斑点落葉病の感受性に密接に関わる因子であると推定された。
【００６１】
また、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の芽条増殖過程で感受性に先祖帰りした系統（ＩＤ−１２０−Ｓ１）を選抜し、上記と同様の二次元電気泳動を行ったところ、この系統（ＩＤ−１２０−Ｓ１）には、原品種「印度」から抽出した蛋白質の二次元電気泳動パターンと同等程度の蛋白質ＳＡ６０の発現が認められた。
【００６２】
更に、「王鈴」、「レッドゴールド」、「北斗」、「ふじ」、「やたか」等の斑点落葉病菌に対し感受性の品種や系統に対し、上記と同様の二次元電気泳動を行った所、これらの品種や系統からは、蛋白質ＳＡ６０が検出された。
【００６３】
一方、「ローヤルガラ」、「恵」、「マヘ７」、「祝」、「紅玉」等の斑点落葉病に対し耐病性の品種や系統を用いて、上記と同様の二次元電気泳動を行ったところ、これらの品種や系統からは、蛋白質ＳＡ６０が検出されなかった（以上の結果については、図８を参照。図８中、黒矢印は、蛋白質ＳＡ６０の存在を示しており、〇は、蛋白質ＳＡ６０が欠損していることを示している）。
【００６４】
ところで、斑点落葉病菌に対する宿主の感受性には、器官特異性がみられ、感受性リンゴの葉緑体が存在する組織でのみ発病する。
【００６５】
そこで、蛋白質ＳＡ６０の発現と器官特異性との間の相関を調べる目的で、二次元電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）解析により、「ふじ」の各種器官・組織の各々についての蛋白質の解析を行った。その結果、葉緑体を含む組織の葉肉、葉柄、外樹及び果皮からは、蛋白質ＳＡ６０が検出された。
【００６６】
一方、葉緑体を含まない根、内樹皮、木質部、果肉、外種皮及び内種皮からは、蛋白質ＳＡ６０は、検出されなかった。また、ガンマ（γ）線照射により作出した、「印度」のクロロシス突然変異系統（ＩＤ−８０−ＣＬ）の葉でも、蛋白質ＳＡ６０が極微量しか検出されず、この系統は、斑点落葉病に対して耐病性を示した。
【００６７】
以上の結果からも、リンゴ斑点落葉病の感受性には、蛋白質ＳＡ６０の発現が深く関与していることが、明らかになった。
【００６８】
次に、リンゴ斑点落葉病に感受性の品種である、「印度」の葉から従来公知の方法により無傷葉緑体を単離した。
次に、単離した無傷葉緑体を磨砕して溶解し、液体等電点電気泳動（Ｒｏｔｏｆｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ社製を使用））及び限外濾過によって、蛋白質ＳＡ６０を予備精製した。
【００６９】
次に、蛋白質ＳＡ６０スポット及びその酸性側に隣接した２種類の蛋白質（以下、蛋白質ＲＢＰ−１、蛋白質ＲＢＰ−２という。）を明確に分離できる解像度で二次元電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）を行い、各々のゲルスポットを切り取って回収し、ゲル内酵素消化法により蛋白質内部断片の一次元構造解析をプロテインシークエンサー（ＰＰＳＱ−１０、島津製作所社）を用いて行なった。
【００７０】
次に、得られた配列情報をアミノ酸データベース（ＤＤＢＪ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＤＡＤ））によって相同性検索を行なった結果、各スポットが、葉緑体ストロマに局在するシャペロニンのαサブユニット（ＲｕＢｉｓＣＯ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ  α  ｓｕｂｕｎｉｔ）であることが、判明した。
【００７１】
また、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置
（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ｐｒｏ、アプライドバイオシステムジャパン社）を用いたペプチド質量フィンガープリンティング実験からも各スポットが、葉緑体ストロマに局在するシャペロニンのαサブユニット（ＲｕＢｉｓＣＯ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  α  ｓｕｂｕｎｉｔ）であることが、判明した。
【００７２】
葉緑体シャペロニンは、核にコードされる遺伝子の翻訳産物である。
【００７３】
その前駆体でのＮ末端オリゴペプチドは、葉緑体への移行に必要なシグナル配列（Ｔｒａｎｓｉｔ  ｓｉｇｎａｌ）となっている。
【００７４】
そこで、酵素消化を行わない上記のゲルスポットから電気溶出法によって３種のホモログを抽出し、Ｎ末端アミノ酸配列を決定して、シグナル配列（Ｔｒａｎｓｉｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の領域を特定した。
【００７５】
尚、病害感受性を誘起すると推定される蛋白質ＳＡ６０が核ゲノム支配の遺伝子産物であることは、品種、「印度」などが示す高度の感受性がメンデリズムに従って優性に遺伝することと矛盾しない。更に、ＡＭ−ｔｏｘｉｎ  Ｉの初期作用点が葉緑体であることは、ＲｕＢｉｓＣＯ等の葉緑体中の重要分子の制御を司るシャペロニンのホモログ（蛋白質ＳＡ６０）が毒素の標的分子となっている可能性を示唆している。
ところで、高等植物の葉緑体シャペロニンαサブユニットに関する遺伝子情報は、シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、コムギ等で数件のｃＤＮＡおよびゲノム  ＤＮＡの配列が既にデータベース上に存在する。
【００７６】
しかし、リンゴでのデータ登録は、本発明者等の知る限り、現在のところ確認されていない。
【００７７】
そこで、図９に示したように既存データでのｃＤＮＡの相同性が高い領域にディジェネレートプライマーを設定して、ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子増幅を行った。
【００７８】
供試材料は、リンゴ斑点落葉病に感受性の品種である「印度」と、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）とした。
【００７９】
次に、３’−及び５’−ＲＡＣＥを行って、完全長のｃＤＮＡ塩基配列（２，１０２ｂｐ）を決定した。
【００８０】
より詳しく説明すると、リンゴ斑点落葉病に感受性の原品種である「印度」及びリンゴ斑点落葉病に耐病性の突然変異系統（ＩＤ−１２０）の各々の幼葉１００ｍｇからＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてＲＮＡを抽出した。葉緑体シャペロニンαサブユニットの遺伝子配列が報告されている５種の植物（セイヨウアブラナ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｚ２７２２２及びＭ３５５９９），エンドウ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｕ２１１０５及びＵ２１１３９），コムギ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｘ０７８５１），トウゴマ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｘ０７８５２），シロイヌナズナ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｍ３５５９７））のデータの相同性の高い領域にディジェネレートプライマーを設定してＲＴ−ＰＣＲを行った。更に、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（クロンテック社）及びＲＮＡ  ＬＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔｖｅｒ．１．１（タカラバイオ社）を用いて、５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥを行って完全長ｃＤＮＡを得た。
【００８１】
次に、塩基配列解析を行った。
【００８２】
より詳しく説明すると、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（アプライドバイオシステムジャパン社）によるラベリングを行い、サイクルシークエンス反応の後、ＡＢＩ３７７及びＡＢＩ３１０オートシークエンサー（アプライドバイオシステムジャパン社）により塩基配列を解析した。
【００８３】
図１０に、リンゴ斑点落葉病に対し、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の完全長のｃＤＮＡ塩基配列（２，１０２ｂｐ）を示す。
【００８４】
また、図１１に、リンゴ斑点落葉病に感受性の品種である「印度」の完全長のｃＤＮＡ塩基配列（２，１０２ｂｐ）を示す。
【００８５】
次に、葉緑体シャペロニンαサブユニット蛋白質を精製し、プロテインシークエンサー（ＨＰＧ１００５Ａ、ヒューレットパッカード社）によって、Ｎ端末アミノ酸配列を解読し、ｃＤＮＡ配列解析データを基に、シグナルペプチド領域を推定した。
【００８６】
図１２は、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットｃＤＮＡ及びその翻訳産物における感受性原品種と抵抗性変異体での塩基配列の相違を説明する説明図である。
【００８７】
リンゴ斑点落葉病に感受性の原品種である「印度」の葉緑体シャペロニンαサブユニットをコードする１，７５８ｂｐのｃＤＮＡと、リンゴ斑点落葉病に耐病性を示す突然変異種系統（ＩＤ−１２０）の葉緑体シャペロニンαサブユニットをコードする１，７５８ｂｐのｃＤＮＡとを対比し、これらの間のｃＤＮＡ配列の相違を調べたところ、「印度」では、翻訳領域１，７５８ｂｐの中、１０カ所において一塩基多型（ＳＮＰ）が見出された。
【００８８】
一方、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の塩基配列は、基本的には、原品種の「印度」と同一であるが、一塩基多型（ＳＮＰ）は、全く認められなかった。このことから、耐病性変異系統（ＩＤ−１２０）は、葉緑体シャペロニンをコードするアレルでの感受性と関連する一方の鎖が部分的に欠損したハプロタイプであると考えられた。
【００８９】
また、上記１０カ所の一塩基多型（ＳＮＰ）の中、８カ所の一塩基多型（ＳＮＰ）はアミノ酸の変化、換言すれば表現型の変化を伴わないｓｉｌｅｎｔ  ＳＮＰ（ｓＳＮＰ）であった。
【００９０】
残りの２カ所、翻訳開始点から１９３番目及び７５１番目のヌクレオチドはアミノ酸の変化が起こるｃｏｄｉｎｇ  ＳＮＰ（ｃＳＮＰ）であった。
【００９１】
また、葉緑体シャペロニンαサブユニット蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を５残基解析した結果、その配列は、Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−であった。ｃＤＮＡ配列から推定した結果、５’側から１３５ｂｐの領域（アミノ酸４５残基）がシグナルペプチドと考えられた。
【００９２】
以上の結果から、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）は葉緑体シャペロニンαサブユニット対立遺伝子の感受性を発現する鎖が欠如した突然変異体であると推定された。また、翻訳開始点から１９３番目及び７５１番目のヌクレオチドに起因する蛋白質のＮ端末から６５残基目のアスパラギン又は２５１残基目のプロリンの発現が斑点落葉病に対する感受性を支配していると考えられた。
【００９３】
図１３は、翻訳開始点から１９３番目の一塩基多型（ＳＮＰ）の周辺のダイレクトシークエンシング法を用いた、品種「印度」のヌクレオチドの解析データ（図１３（ａ））と耐病性ハプロタイプ（ＩＤ−１２０）のヌクレオチドの解析データ（図１３（ｂ））である。
【００９４】
すなわち、図１３（ａ）及び図１３（ｂ）を参照して説明すると、翻訳開始点から１９３番目の一塩基多型（ＳＮＰ）では、感受性ディプロタイプである品種「印度」のヌクレオチドは、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）となっており、発現するアミノ酸は、アスパラギン（Ａｓｎ）とアスパラギン酸（Ａｓｐ）の両方であり、耐病性ハプロタイプ（ＩＤ−１２０）のヌクレオチドは、Ｇのみで、Ａｓｐが発現する。
【００９５】
また、翻訳開始点から７５１番目の一塩基多型（ＳＮＰ）では、品種「印度」がシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）とになっており、プロリン（Ｐｒｏ）とアラニン（Ａｌａ）の両方が発現し、耐病性変異系統（ＩＤ−１２０）では、アラニン（Ａｌａ）のみが発現する。
【００９６】
このように、各々の一塩基多型（ＳＮＰ）において、感受性ディプロタイプのみで発現しているアミノ酸が感受性決定因子の重要な候補となる。
【００９７】
そして、上記の解析法（ＳＮＰ  ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ）は、大量のＳＮＰ情報から疾病の原因を示唆する最大限の意味を引き出すためのアプローチとして重要視されている。
【００９８】
しかしながら、上記の解析法（ＳＮＰ  ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ）のみでは、病原因子を断定するまでには至らないことから、本発明者等は、病害感受性及び抵抗性の多数のサンプルに対して、候補として絞り込んだ翻訳開始点から１９３番目の一塩基多型（ＳＮＰ）及び翻訳開始点から７５１番目の一塩基多型（ＳＮＰ）での表現型と感受性の相関を調べた。
【００９９】
その結果、一塩基多型（ＳＮＰ）において、供試した１１種類の、リンゴ斑点落葉病に対する感受性品種・系統の中、全てのサンプルが、ＡｓｎとＡｓｐのヘテロ接合型を示した。
【０１００】
また、抵抗性品種・系統の２８種類の、リンゴ斑点落葉病に対する抵抗性品種・系統の中、全てのサンプルが、ＳＮＰに相当する部位において、Ａｓｐのみのホモ接合型を示した。
【０１０１】
さらに、データベース上に存在する、シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、コムギ等で数件のｃＤＮＡおよびゲノム  ＤＮＡの配列を検索した結果、リンゴ以外の植物での翻訳開始点から１９３番目の一塩基多型（ＳＮＰ）に相当する部位のアミノ酸は、ほとんど、アスパラギン酸（Ａｓｐ）となっており、アスパラギン（Ａｓｎ）は一例も見つからなかった。
【０１０２】
本発明者等の知る限り、翻訳開始点から１９３番目の一塩基多型（ＳＮＰ）の部位での、斑点落葉病に対する感受性植物に見られるアスパラギン（Ａｓｎ）の発現が、ホモ接合型である事例は現在確認されていない。
【０１０３】
以上の結果から、本発明者等は、翻訳開始点から１９３番目の一塩基多型（ＳＮＰ）の部位において、野生型は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）を発現し、感受性突然変異型は、アスパラギン（Ａｓｎ）とアスパラギン酸（Ａｓｐ）のホモログ蛋白質として各々発現し、Ａｓｎのみを発現するホモ接合型植物は、致死を示す、と考えた。
【０１０４】
一方、翻訳開始点から７５１番目の一塩基多型（ＳＮＰ）では、一塩基多型（ＳＮＰ）のような明確な表現型と感受性の関連が見られなかった。
【０１０５】
以上のことから、斑点落葉病に対する感受性は、葉緑体シャペロニンαサブユニットにおけるＮ末端近傍の一カ所のアミノ酸、Ｎ末端より２０残基目・翻訳開始点より６５残基目のＡｓｎが極めて重要な役目を担っていると考えられた。
【０１０６】
次に、リンゴ種苗の斑点落葉病に対する感受性を鑑定する方法について説明する。
【０１０７】
（Ａ）ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物の塩基配列解析
【０１０８】
まず、検定するリンゴ種苗の若い葉の一部、０．１ｇ程度を採取し、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で磨砕する。
【０１０９】
次に、植物ＤＮＡ抽出試薬キット〔Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ  （アマシャムバイオサイエンス社）、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （キアゲン社）等  〕を用いて上記の試料から全ＤＮＡを抽出する。
【０１１０】
次に、抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明において解明した葉緑体シャペロニンαサブユニット遺伝子の斑点落葉病感受性を支配する一塩基多型（ＳＮＰ）（５’−ＧＧＡＡＴＴＲＡＴＡＡＧＣ−３’，  Ｒ：アデニン（Ａ）及びグアニン（Ａ）の一塩基多型）を挟み込む約２００〜３００ｂｐのＤＮＡ  領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。このＰＣＲに利用する上流側および下流側のプライマーのセットは、本発明において決定した葉緑体シャペロニン遺伝子（ゲノムＤＮＡ）の配列を基に設定する〔例：  上流プライマーとして５’−ＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＡＧＧＧ−３’，下流プライマーとして５’−ＧＧＴＴＡＣＣＡＡＣＧＣＡＣＡＣＣＣＡＡ−３’を用いた場合、ＰＣＲによって一塩基多型（ＳＮＰ）を含む２１０  ｂｐ  のＤＮＡが増幅される〕。
【０１１１】
次に、増幅したＤＮＡはアガロースゲル電気泳動を行ってサイズを確認し、目的の増幅サイズのバンドを切り出し、ＤＮＡ精製キット〔Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ  ＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ社）、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社）等〕を用いて抽出・精製する。
【０１１２】
次に、精製した一塩基多型（ＳＮＰ）を含む約２００〜３００ｂｐのＤＮＡは、ダイターミネーターシークエンシングキット〔Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＩＩ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ    Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社）  〕を用いて蛍光ラベリングとサイクルシークエンシングを行い、ＤＮＡシークエンサー〔ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  （アプライドバイオシステムズジャパン社）等〕により塩基配列を解読する。
【０１１３】
解読した配列中の一塩基多型（ＳＮＰ）の部位の塩基のシークエンスシグナルを読み取り、グアニン（Ｇ）の単一シグナルが得られれば抵抗性、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）の重複シグナルまたはアデニン（Ａ）の単一シグナルが得られれば感受性と判定する。
【０１１４】
（Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ産物の塩基配列解析
【０１１５】
まず、検定するリンゴ種苗の若い葉の一部、０．１ｇ程度を採取し、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で磨砕する。
【０１１６】
次に、植物ＲＮＡ抽出試薬キット〔Ｒ  Ｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （キアゲン社）、Ｐｌａｎｔ  ＲＮＡ  ｋｉｔ，  Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（オメガバイオテック社）等  〕を用いて上記の試料から全ＲＮＡを抽出する。
【０１１７】
次に、抽出したＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。
【０１１８】
次に、本発明において解明した葉緑体シャペロニン遺伝子の斑点落葉病感受性を支配する一塩基多型部位ＳＮＰ（５’−ＧＧＡＡＴＴＲＡＴＡＡＧＣ−３’，  Ｒ：アデニン（Ａ）及びグアニン（Ａ）  の一塩基多型）を挟み込む約２００〜３００ｂｐのｃＤＮＡ  領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。このＰＣＲに利用する上流側および下流側のプライマーのセットは、本発明において決定した葉緑体シャペロニン遺伝子（ｃＤＮＡ）の配列を基に設定する〔例：  上流プライマーとして５’−ＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＡＧＧＧ−３’，下流プライマーとして５’−ＣＣＡＴＣＧＣＡＴＣＡＧＧＴＡＡＣＴＣＡ−３’を用いた場合、ＰＣＲによってＳＮＰを含む２５４  ｂｐ  のｃＤＮＡが増幅される〕。
【０１１９】
次に、増幅したｃＤＮＡはアガロースゲル電気泳動を行ってサイズを確認し、目的の増幅サイズのバンドを切り出し、ＤＮＡ精製キット〔ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社）、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ社）等〕を用いて抽出・精製する。
【０１２０】
次に、精製した一塩基多型（ＳＮＰ）を含む約２００〜３００ｂｐのＤＮＡは、ダイターミネーターシークエンシングキット〔Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＩＩ  Ｄｙｅ  ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社）  〕を用いて蛍光ラベリングとサイクルシークエンシングを行い、ＤＮＡシークエンサー〔ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  （アプライドバイオシステムズジャパン社）等〕により塩基配列を解読する。
【０１２１】
解読した配列中の一塩基多型（ＳＮＰ）の部位の塩基のシークエンスシグナルを読み取り、グアニン（Ｇ）の単一シグナルが得られれば抵抗性、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）の重複シグナルもしくはアデニン（Ａ）の単一シグナルが得られれば感受性と判定する。
【０１２２】
次に、上記以外の手法での遺伝子解析による種苗診断について説明する。
【０１２３】
（Ｃ）アレル特異的蛍光標識オリゴヌクレオチドを鋳型としたハイブリダイゼーションによる一塩基多型の解析
【０１２４】
まず、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法（アプライドバイオシステムズ社）、やＩｎｖａｄｅｒ法（サードウェーブテクノロジー社）などのアレル特異的蛍光標識オリゴヌクレオチドを鋳型としたハイブリダイゼーションによる一塩基多型のタイピングにより、本発明で解明したリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニット遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ１９３）の部位の塩基のタイピングを行い、グアニン（Ｇ）の単一シグナルが得られれば抵抗性、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）の重複シグナルもしくはアデニン（Ａ）の単一シグナルが得られれば感受性と判定する。
【０１２５】
（Ｄ）ＳＮａＰｓｈｏｔ  法による一塩基多型の解析
【０１２６】
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）及びＡＢＩ    Ｐ１ｒｉｓｍ  ＳＮａＰｓｈｏｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｋｉｔ  を用いた一塩基多型のタイピングにより、本発明で解明したリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニット遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）の部位の塩基のタイピングを行い、グアニン（Ｇ）の単一シグナルが得られれば抵抗性、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）の重複シグナルもしくはアデニン（Ａ）の単一シグナルが得られれば感受性と判定する。
【０１２７】
次に、Ｎｕｃｌｅｏｎ  ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社）を用い、リンゴ斑点落葉病に耐病性を示す耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の幼葉１００ｍｇから総ＤＮＡ（Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ）を抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型とした。
【０１２８】
次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、リンゴ斑点落葉病に対し、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の完全長のｃＤＮＡ塩基配列（２，１０２ｂｐ）を基に、３’及び５’側の非翻訳領域に上流及び下流プライマーを各々設定した（５’−ＡＣＧＴＣＧＴＣＧＧＴＴＣＴＧＴＣＧＣＣ−３’，  ５’−ＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＧＡＡＴＣＣＡ−３’）。アニ−リング温度は、６５℃とし、常法により３５サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡの増幅反応を行った。ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ｔａｑ  （タカラバイオ社）を使用した。
【０１２９】
以上により得られた約３．４ｋｂｐの増幅産物をＰｒｅｐ−Ａ−ｇｅｎｅ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ社）を用いて精製し、シークエンシング用試料とした。
【０１３０】
次に、このシークエンシング用試料を、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（アプライドバイオサイエンスジャパン社）によるラベリングを行い、サイクルシークエンス反応の後、ＡＢＩ３７７  オートシクエンサー（アプライドバイオサイエンスジャパン社）により塩基配列を解析し、エクソンとイントロン（ｅｘｏｎ／ｉｎｔｒｏｎ）の領域を明らかにした。
【０１３１】
図１４に結果を示す。
【０１３２】
この葉緑体シャペロニンαサブユニットをコードする遺伝子領域は、３，３４９ｂｐのゲノムＤＮＡであり、転写解読枠（Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）は、３，２２０ｂｐで、エクソン（図１４中、アンダーラインを引いた部分）は、８カ所あり、イントロンは、７カ所であった。
【０１３３】
尚、斑点落葉病に耐病性を示す塩基部位（一塩基多型の部位）は、第２番目のエクソン上に存在した（図１４中、７８５塩基目の部位）。
【０１３４】
より詳しく説明すると、リンゴの葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡを読み取り、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡの翻訳開始点から６６２番目の塩基が、グアニン（Ｇ）のみのホモ接合型の場合には、斑点落葉病に対し耐病性の品種であり、リンゴの葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡの翻訳開始点から６６２番目の塩基が、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）とのヘテロ接合型の場合には、斑点落葉病に対し感受性の品種であると判定できる。
【０１３５】
また、リンゴのリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡを読み取り、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡの翻訳開始点から１９３番目の塩基が、Ｇのみのホモ接合型の場合には、斑点落葉病に対し耐病性の品種であり、リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡの翻訳開始点から１９３番目の塩基が、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）とのヘテロ接合型の場合には、斑点落葉病に対し感受性の品種であると判定できる。
【０１３６】
本発明者等は、「ふじ」、「北斗」、「静香」、「ハックナイン」、「レッドゴールド」、「白竜」、「印度」、「リチャードデリシャス」、「ＦｊｘＩＤ１２０−６」、「ＦｊｘＩＤ１２０−１１４」、「ＦｊｘＩＤ１２０−４９５」、「つがる」、「千秋」、「陸奥」、「あかね」、「さんさ」、「陽光」、「東光」、「国光」、「アルプス乙女」、「恵」、「ローヤルガラ」、「マヘ７」、「紅玉」、「花祝」、「ワインサップ」、「スプレンダー」、「ボレロ」、「テラモン」、「黄秋」、「４−２３」、「紅奥」、「紅月」、「となみ」、「選抜印度１号」、「ＦｊｘＩＤ１２０−４４」、「ＦｊｘＩＤ１２０−４７」、「ＦｊｘＩＤ１２０−１６０」、「ＦｊｘＩＤ１２０−３９０」、「ＦｊｘＩＤ１２０−７１４」について、従来の化３に示す環状テトラデプシペプチドを用い、リンゴの葉組織に傷を付け、その傷に、上記化３に示す環状テトラデプシペプチドを付け、組織が壊死するか否かにより、リンゴ斑点落葉病に対する病害感受性を調べる方法と、本発明に係るリンゴ斑点落葉病に強いリンゴの診断方法とを行った。
【０１３７】
従来の、上記化３に示す環状テトラデプシペプチドを付け、組織が壊死するか否かにより、リンゴ斑点落葉病に対する病害感受性を調べる方法は、１μＭ    ＡＭ−ｔｏｘｉｎ  Ｉ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉｏｌｉｄｅ）の有傷滴下接種により、上記した各々の品種の幼葉に対する壊死斑を観察することにより行った。
【０１３８】
一方、本発明に係るリンゴ斑点落葉病に強いリンゴの診断方法は、以下の方法により行った。
【０１３９】
まず、ＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を行った。
【０１４０】
より詳しく説明すると、上記した各々の品種の幼葉１００ｍｇからＲＮＡ        ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて全てのＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を取り出した。
【０１４１】
次に、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＸＬ（タカラバイオ社）を用いて逆転写を行い、それらを鋳型として図１５に示す各プライマーを用いて、一塩基多型（ＳＮＰ）及び一塩基多型（ＳＮＰ）を含む領域（各々２６４ｂｐ、３００ｂｐ）を増幅した。
【０１４２】
次に、各々の品種の塩基配列を解析した。
【０１４３】
より詳しく説明すると、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（アプライドバイオシステムズジャパン社）によるラベリングを行い、サイクルシークエンス反応の後、ＡＢＩ  ３７７及びＡＢＩ  ３１０オートシークエンサー（アプライドバイオシステムズジャパン社）により塩基配列を解析した。
【０１４４】
ダイレクトシークエンシングにより、一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型を解析した結果、斑点落葉病に感受性の品種・系統は、いずれも、一塩基多型（ＳＮＰ）が、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）のヘテロ接合型に分類された。また、斑点落葉病に抵抗性の品種・系統は、いずれも、一塩基多型（ＳＮＰ）が、グアニン（Ｇ）のホモ接合型に分類され、アデニン（Ａ）のホモ接合型を示す植物は認められなかった。
【０１４５】
また、この結果は、従来の、上記化３に示す環状テトラデプシペプチドを付け、組織が壊死するか否かにより、リンゴ斑点落葉病に対する病害感受性を調べる方法の診断結果と合致していた（結果については、図１６を参照）。
【０１４６】
尚、一塩基多型（ＳＮＰ）には、上記のような遺伝子型と、抵抗性・感受性との明瞭な関連性は認められなかった。
【０１４７】
以上の結果から、斑点落葉病の感受性は葉緑体シャペロニンαサブユニットの一塩基多型（ＳＮＰ）の部位でのアスパラギン（Ａｓｎ）の発現によって支配されていること、及び、この一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型を調べることにより、正確で迅速な斑点落葉病に対する病害抵抗性種苗選抜が可能になることが明らかになった。
【０１４８】
また、ＤＮＡ鑑定により、斑点落葉病に抵抗性を示す品種・系統の選抜を実施する上で、このゲノムＤＮＡの情報は、プライマー設計等で有効に利用できることも明らかになった。
【０１４９】
【発明の効果】以上、詳細に説明した通り、請求項１又は請求項２に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットｃＤＮＡでは、斑点落葉病に対し耐病性を示すリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡを特定したので、これを用いて、斑点落葉病に対し耐病性を示すリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡを作製できる。
【０１５０】
請求項３又は請求項４に記載のリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡでは、斑点落葉病に対し耐病性を示すリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡを特定したので、これを用いて、ＤＮＡ鑑定することにより、斑点落葉病に抵抗性を示す品種・系統の選抜を実施する上で、このゲノムＤＮＡの情報は、プライマー設計等で有効に利用できる。
【０１５１】
請求項５に記載のリンゴは、斑点落葉病に対し耐病性を示すので、以下の効果を奏する。
【０１５２】
１）リンゴ（果実）の収量の損失を防ぐことが期待できる。
２）農薬の使用量を減らすことができる。これにより安全性の高いリンゴ（果実）の収穫が可能になる。
３）リンゴ（果樹）の葉が枯れにくいので、糖度の高いリンゴ（果実）の収穫が可能になる。
【０１５３】
請求項６又は請求項７に記載のリンゴ斑点落葉病に強いリンゴの診断方法では、遺伝子診断により、リンゴ斑点落葉病に強いリンゴを選抜できるので、従来の化３に示す環状テトラデプシペプチドを付け、組織が壊死するか否かによって行うリンゴ斑点落葉病に強いリンゴを選抜に比べ、簡単且つ迅速に、リンゴ斑点落葉病に強いリンゴを選抜できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明者等が行った、リンゴ斑点落葉病に対する宿主感受性因子を特定するための解析手法を概略的に示す説明図である。
【図２】病原菌接種試験の試験結果であり、図２（ａ）は、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の試験結果を示しており、また、図２（ｂ）は、感受性原品種「印度」の試験結果を示している。
【図３】溶出溶媒の組成を示すテーブルである。
【図４】再膨潤処理に用いた溶液の組成を示すテーブルである。
【図５】二次元電気泳動に用いた電圧設定プログラムのテーブルである。
【図６】平衡化処理に用いた溶液の組成を示すテーブルである。
【図７】耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）と感受性原品種「印度」でのその蛋白質分離パターンの差違を示す図であり、図７（ａ）は、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の系統から抽出した蛋白質の二次元電気泳動パターンの写真であり、また、図７（ｂ）は、感受性原品種「印度」の原系統のから抽出した蛋白質の二次元電気泳動パターンの写真である。
【図８】種々の品種・系統のリンゴに対し、二次元電気泳動を行なった結果を示す写真である。
【図９】リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットをコードする完全長のｃＤＮＡを増幅する方法を概略的に説明する説明図である。
【図１０】リンゴ斑点落葉病に対し、耐病性突然変異系統（ＩＤ−１２０）の完全長のｃＤＮＡ塩基配列（２，１０２ｂｐ）を示す。
【図１１】リンゴ斑点落葉病に感受性の原品種である「印度」の完全長のｃＤＮＡ塩基配列（２，１０２ｂｐ）を示す。
【図１２】リンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットｃＤＮＡ及びその翻訳産物における感受性原品種と耐病性突然変異体での塩基配列の相違を説明する説明図である。
【図１３】翻訳開始点から１９３番目の一塩基多型（ＳＮＰ）の周辺のダイレクトシークエンシング法を用いた、原品種「印度」のヌクレオチドの解析データ（図１３（ａ））と耐病性ハプロタイプ（ＩＤ−１２０）のヌクレオチドの解析データ（図１３（ｂ））である。
【図１４】斑点落葉病に耐病性を示すリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのゲノムＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図１５】葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡにおける一塩基多型（ＳＮＰ，ＳＮＰ）及びそれらを含む領域を増幅するためのプライマー設定部位を説明する説明図である。
【図１６】一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝型及び表現型とリンゴの品種・系統のタイピング結果との関係を示す説明図である。
【図１】
2004283002.tif 000008
【図２】
2004283002.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2004283002.tif 000018
【図１２】
2004283002.tif 000019
【図１３】
2004283002.tif 000020
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2004283002.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月12日(2004.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の塩基配列で表されるリンゴ葉緑体シャペロニンαサブユニットのｃＤＮＡ。
【化１】
2004283002.tif 000024
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
【化４】
2004283002.tif 000025
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
2004283002.tif 000026
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
2004283002.tif 000027