(57)【要約】      （修正有）【課題】ＪＨシグナリング系をターゲットとした幼若ホルモン関連化合物を開発するための簡便なスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ショウジョウバエの培養細胞（Ｓ２  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）に、（１）ハマダラカからクローン化したアリルハイドロカーボン受容体（ＡｓＡｈＲ）の発現ベクター、（２）ホタルルシフェレース遺伝子の上流にヘルペスシンプレックスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）のチミジンカイネース（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）プロモーター（Ｐ−ｔｋ）を挿入しさらにその上流にダイオキシンレスポンスエレメント（ＤＲＥあるいは、ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  （ＸＲＥ））を挿入したレポーターベクター、及び（３）ウミシイタケルシフェレース遺伝子の上流にＰ−ｔｋを挿入したコレポータープラスミドを一過性に導入・発現させ、培養液に加えたＪＨＩＩＩまたはＪＨ類縁体（アゴニスト）によって、レポーター遺伝子の転写を起こすことができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１，配列番号３及び配列番号５からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ幼若ホルモン作用を仲介するタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１，配列番号３及び配列番号５からなる群より選択される塩基配列との相同性が、５０％以上の塩基配列を備え、かつ幼若ホルモン作用を仲介するタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ幼若ホルモン作用を仲介するタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列との相同性が、５０％以上のアミノ酸配列を有すると共に、幼若ホルモン作用を仲介するタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現用ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現用ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項７】
配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を備えたタンパク質。
【請求項８】
配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列において、これらの１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ幼若ホルモン作用を仲介することを特徴とするタンパク質。
【請求項９】
配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列との相同性が、５０％以上のアミノ酸配列を有すると共に、幼若ホルモン作用を仲介することを特徴とするタンパク質。
【請求項１０】
請求項７〜請求項９のいずれかに記載のタンパク質に被検物質を接触させ、前記タンパク質と被検物質とが相互作用した場合に、第２の遺伝子転写調節因子を通して、他の遺伝子の転写に影響を与えるか否かを検出することを特徴とする幼若ホルモン関連化合物のスクリーニング方法。
【請求項１１】
幼若ホルモン活性あるいは幼若ホルモン阻害活性を備えると共に適当に標識された既知物質と、請求項７〜請求項９のいずれかに記載のタンパク質との相互作用に対して、被検物質が影響を与えるか否かを検出することを特徴とする幼若ホルモン関連化合物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１のスクリーニング方法によってスクリーニングされたことを特徴とする幼若ホルモン関連化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、幼若ホルモン関連化合物のスクリーニング方法等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
幼若ホルモン（ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ、以下ＪＨと略記）は、昆虫のアラタ体から分泌される脂溶性のホルモンであり、エポキシセスキテルペノイドのメチルエステルで、動物界で知られている唯一のセスキテルペノイド系のホルモンである。幼若ホルモンは、３カ所の側鎖のアルキル残基がメチルかエチルかによって、ＪＨ  Ｉ、ＪＨ  ＩＩ、  ＪＨ  ＩＩＩ、ＪＨ  ０の４種に分けられる。
【０００３】
ＪＨの作用機構は文献的にも未だはっきりした結論が得られていないが、脂溶性のホルモンであることから、ステロイドホルモンのように、標的細胞に輸送されたＪＨが転写因子である仮想的ＪＨレセプターと結合して、標的遺伝子の発現を調節していると考えられている。その作用は、まず幼虫期においては、ＪＨ存在下で脱皮ホルモン（２０−ｈｙｄｒｏｘｙｅｃｄｙｓｏｎｅ、以下２０Ｅと略記）が作用すると次の令の幼虫への脱皮が起こり、ＪＨホルモンが無い状態で２０Ｅが作用すると蛹への脱皮あるいは成虫への羽化が起こる。成虫期の昆虫においては、生殖線の成熟、卵黄形成タンパク質の合成と放出、およびその卵母細胞での取り込みなどを支配している。それ以外にも、性フェロモンの生産の誘起、社会性昆虫のカースト分化、体色変化などもＪＨによって制御されている例が多い。このように、ＪＨは昆虫の生活史を通じ、発育・生殖に深く関わっている重要なホルモンである。したがって、この昆虫成長調整因子（ｉｎｓｅｃｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）を外部から昆虫に与えることにより、その内分泌系を攪乱することとなり、殺虫剤としての効果が期待できる。ＪＨは脂溶性のホルモンであるから、昆虫に外用した場合でも、昆虫表面のワックス層、節間膜を通過して体内に入るという利点を持っている。このような利点から、外界でより化学的に安定なＪＨ類縁体の検索がなされ、例えばメソプレン（ｍｅｔｈｏｐｒｅｎｅ  （ＺＲ５１５））、ピロプロキシフェン（ｐｙｒｉｐｒｏｘｙｆｅｎ）、フェノキシカルブ（ｆｅｎｏｘｙｃａｒｂ）等数種の化合物が実際に、農業害虫や衛生害虫用の殺虫剤として利用されている。
【０００４】
このような幼若ホルモン関連化合物を探索する方法として、従来から、バイオアッセイ方法が知られている。例えば、チャイロコメゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）のワックステスト、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）の黒色突然変異幼虫を用いたテスト、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓ  ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）の体色変異を用いたテスト、ハチミツガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌａｎｅｌｌａ）蛹の幼虫皮膚形成阻害を用いたテストなどがある。これらのバイオアッセイ法は、いずれも材料となる昆虫の発育ステージを揃えた状態で飼育し、特定の発育段階となったところで、昆虫の外皮に被検物質を塗布して数日間放置し、その後に得られた表現型が、予め規定された評価基準のいずれの段階に該当するかを評価するものである。従って、昆虫を大量に飼育するための設備に加えて、熟練した実験者が必須となることに加え、試験結果が得られるまでに数日以上を要するという欠点がある。
また、バイオアッセイ法に代える試験方法として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  アッセイ法の開発が進行している（例えば、特表２００２−５１０１９５、  Ｗｉｌｓｏｎ  ＴＧ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９５：２７６１−２７６６）。
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５１０１９５号公報
【非特許文献１】Ｗｉｌｓｏｎ  ＴＧ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９５：２７６１−２７６６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のバイオアッセイ法では、ＪＨ活性測定に昆虫を用いた生物検定法を利用するため、熟練した技術者による膨大な時間と費用の投資が必要となる。
また、文献に掲げた技術は、いずれも同じ発明者らによるものであり、ショウジョウバエのＭｅｔ遺伝子産物がＪＨ作用を仲介することを示唆している。しかしながら、Ｍｅｔ遺伝子産物による実際の転写活性の上昇を確認していないことから、幼若ホルモン関連化合物を探索できるか否か疑問の余地がある。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＪＨシグナリング系をターゲットとした幼若ホルモン関連化合物を開発するための簡便なスクリーニング方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段、発明の作用、及び発明の効果】
本発明者は、脊椎動物のアリルハイドロカーボン受容体（ａｒｙｌｈｙｄｏｒｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ；ＡｈＲ。一般には、ダイオキシンレセプターとして知られているが、無脊椎動物ではそのリガンドが明らかとなっていない。ショウジョウバエのホモログはＳｐｉｎｅｌｅｓｓ  （Ｓｓ）と呼ばれ、形態形成に関与することが知られている）のホモログをハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）からクローン化した（以下、このクローン化された受容体を「ＡｓＡｈＲ」という）。
【０００８】
次に、このＡｓＡｈＲが、ＪＨ作用を仲介するか否かを次の試験系によって検討した。すなわち、ショウジョウバエの培養細胞（Ｓ２  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）に、（１）ＡｓＡｈＲの発現ベクター、（２）ホタルルシフェレース遺伝子の上流にヘルペスシンプレックスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）のチミジンカイネース（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）プロモーター（Ｐ−ｔｋ）を挿入しさらにその上流にダイオキシンレスポンスエレメント（ＤＲＥあるいは、ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  （ＸＲＥ））を挿入したレポーターベクター、及び（３）ウミシイタケルシフェレース遺伝子の上流にＰ−ｔｋを挿入したコレポータープラスミドを一過性に導入・発現させ、培養液に加えた蚊の天然ＪＨであるＪＨ  ＩＩＩによって、レポーター遺伝子が転写するか否かを確認した。その結果、上記３個のベクターを一過性に導入した培養細胞では、ＪＨＩＩＩによって、レポーター遺伝子からの転写が活性化されることが判明し、基本的には本発明を完成するに至った。
【０００９】
加えて、この方法を用いて、ＪＨ  Ｉ、ＪＨ  ＩＩ、ＺＲ５１５によってもレポーターの活性化が起こること、更にＪＨあるいは合成ＪＨ類縁体と構造的に類似しているもののｉｎ  ｖｉｖｏではＪＨ活性を示さない化合物（例えば、ｆａｒｎｅｓｏｌ、ｆａｒｎｅｓｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ、ｇｅｒａｉｏｌ）を培養液に加えた場合には、レポーターの活性化が起こらないことを確認した。従って、この方法は、ＪＨ類縁化合物・ＪＨ拮抗阻害剤のスクリーニングを安価・簡便に行うことができる。
【００１０】
本発明のＡｓＡｈＲは、ハマダラカからクローニングしたものであるが、多くの昆虫において、同一あるいは非常に相同性の高い塩基配列／アミノ酸配列を備えているものと考えられる。このため、本発明のスクリーニング方法は、その他の昆虫（例えば、鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）（例えば、根を食べる線虫、タバコシバンムシ、ジャガイモハムシ、メキシコワタノミゾウムシ、および穀物害虫）、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）（ノミ）、直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）（ゴキブリ）、シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）（シロアリ）、アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）（アザミウマ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）（チョウおよびガ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）（コフキコガネ）、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）（アリ）および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）（ハエ））にも応用することができ得る。
【００１１】
本発明のＡｓＡｈＲを用いて、幼若ホルモン関連化合物をスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニング方法として、次のような方法が例示される。
＜ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合試験方法＞
ＡｓＡｈＲを標識したリガンド（ＡｓＡｈＲと結合することが既知である物質、例えば幼若ホルモンなど）と共にインキュベートして、ＡｓＡｈＲと結合した標識リガンドを被検物質が置換するか否かを測定することによって、幼若ホルモン関連化合物となり得るか否かを調べる。この試験によって見出された化合物は、殺虫剤となる可能性がある。ＪＨ  Ｉ，  ＪＨ  ＩＩ，ＪＨ  ＩＩＩ、またはそれらの類縁化合物（以下、「幼若ホルモン関連化合物」という）に、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、または生物発光標識によって検出可能に標識することができる。放射性標識の例としては、放射性同位元素を１個以上有する放射性同位体標識と共有結合した幼若ホルモン関連化合物が挙げられる。放射性同位体としては、＜ｓｕｐ＞３＜／ｓｕｐ＞Ｈ、＜ｓｕｐ＞１４＜／ｓｕｐ＞Ｃ、＜ｓｕｐ＞１２５＜／ｓｕｐ＞Ｉ、＜ｓｕｐ＞１３１＜／ｓｕｐ＞Ｉ、＜ｓｕｐ＞３２＜／ｓｕｐ＞Ｐ、＜ｓｕｐ＞３５＜／ｓｕｐ＞Ｓ、＜ｓｕｐ＞５１＜／ｓｕｐ＞Ｃｒ、＜ｓｕｐ＞３６＜／ｓｕｐ＞Ｃｌ、＜ｓｕｐ＞５７＜／ｓｕｐ＞Ｃｏ、＜ｓｕｐ＞５８＜／ｓｕｐ＞Ｃｏ、＜ｓｕｐ＞５９＜／ｓｕｐ＞Ｆｅおよび＜ｓｕｐ＞５８＜／ｓｕｐ＞Ｓｅが例示される。具体的には、［＜ｓｕｐ＞３＜／ｓｕｐ＞Ｈ］−１０Ｒ−ＪＨ  ＩＩＩおよび［＜ｓｕｐ＞３＜／ｓｕｐ＞Ｈ］メトプレンが挙げられる。
【００１２】
試験方法について具体的に説明する。殺虫剤スクリーニング方法は、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、および１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンのような緩衝液中で行われる。被検化合物および標識幼若ホルモン関連化合物は、有機溶媒（例えば、アルコール、ジメチルスルホキシドなど）に溶解して、試験用緩衝液にて希釈する。ＡｓＡｈＲをアッセイ緩衝液で希釈し、標識幼若ホルモン関連化合物（例えば、［＜ｓｕｐ＞３＜／ｓｕｐ＞Ｈ］−１０Ｒ−ＪＨ  ＩＩＩ）と共に室温で約３０分インキュベートする。アッセイ緩衝液２００μｌを試験管に加え、標識幼若ホルモン関連化合物（［＜ｓｕｐ＞３＜／ｓｕｐ＞Ｈ］−１０Ｒ−ＪＨ  ＩＩＩを用いる場合には、試験管あたり約１２，０００ｄｐｍ）と結合したＡｓＡｈＲを含む溶液１００μｌを加える。コントロールとして、非標識幼若ホルモン関連化合物（例えば、ＪＨＩ、ＪＨＩＩ  、ＪＨ  ＩＩＩなど）を適当な濃度（約０．０２３ｐｍｏｌ〜約３ｐｍｏｌ）に希釈して、一連の試験管に加える。試験溶液を混合した後、室温で３０分インキュベートする。次に、ＡｈＡｈＲと結合した標識幼若ホルモン関連化合物と結合していない標識幼若ホルモン関連化合物とを分離する。
【００１３】
分離方法としては、当業者にとって周知の方法（例えば、デキストランチャコール、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）を用いた方法）を適宜用いることができる。このうち、ＨＡＰを用いた方法について簡単に説明する。５％ＨＡＰを含む緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸［ｐＨ８．０］、１０ｍＭ  ＫＨ＜ＳＵＢ＞２＜／ＳＵＢ＞ＰＯ＜ＳＵＢ＞４＜／ＳＵＢ＞、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）懸濁液０．５ｍＬを加え、試験管をボルテックスミキサーによって緩く攪拌した後、溶液を室温で３０分インキュベートし、グラスファイバー濾紙を通じて濾過する。濾紙をＨＡＰ緩衝液で数回洗浄し、バイアルに入れて、１００℃で約１０分間乾燥させる。次に、シンチレーション用液体を試験管に加えて一晩インキュベートしてから計数する。非特異的結合は、大過剰（例えば、１００倍過剰）量の非標識幼若ホルモン関連化合物の存在下で測定する。データの解析については、従来公知であるため（例えば、スキャッチャードプロットを用いることができる）説明を省略する。なお、上記の試験方法については、単なる例示であり、本発明に限定を加えるものではない。例えば、溶液成分、時間、温度の値を適宜変更して実施することもできる。また、シンチレーション近接アッセイ法（ＳＰＡ）を用いることもできる（ボスワースら（Ｂｏｓｗｏｒｔｈ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：１６７（１９８９））。
【００１４】
また、別の殺虫剤スクリーニング方法としては、本発明のＡｓＡｈＲタンパク質を被検化合物と共に予めインキュベートしてから、エポキシファルネシルジアゾアセテートのような、標識した幼若ホルモンの光親和性類似体と共にインキュベートする。このアッセイ法において、被検化合物がＡｓＡｈＲと結合すると、ＡｓＡｈＲは光親和性標識されない。
【００１５】
また、ＡｓＡｈＲと相互作用することが明らかとなった被検化合物については、その被検化合物を標識（例えば、放射性標識、蛍光標識、発光標識）しておき、ＡｓＡｈＲとの結合性を定量的に測定することができる。
なお、コントロールとなる幼若ホルモン関連化合物としては、ＪＨ  Ｉ  ，  ＪＨ  ＩＩ  等に加えて、ＡｓＡｈＲのリガンド結合ドメインに結合することによって、幼若ホルモン作用を模倣する抗体または抗体断片を用いることもできる。
【００１６】
このアッセイ方法で検出された化合物には、幼若ホルモンのアゴニスト、アンタゴニスト、パーシャルアゴニスト、パーシャルアンタゴニストなどが含まれている。そこで、そのような化合物が、実際にどのような作用を有するかを、次のような細胞を用いた  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  試験方法で評価することができる。
【００１７】
＜  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用試験方法＞
殺虫剤をスクリーニングするための適した作用試験方法としては、培養細胞を用いた１ハイブリッド系を用いることができる。ＡｓＡｈＲ発現用ベクターとしては、酵母、哺乳類、および昆虫発現系を用いることができる。酵母を用いる場合には、組換え型タンパク質は、ユビキノンとのインフレーム融合体として発現され、内因性の酵母ユビキチナーゼが融合タンパク質を開裂して、成熟した組換え型タンパク質を放出する。構成型または誘導型のプロモータを用いることができる。哺乳類細胞では、候補となる転写活性剤を調べるために２ハイブリッド系を用いることができる。
【００１８】
１ハイブリッド系では、本発明のＡｓＡｈＲタンパク質と、このタンパク質が幼若ホルモン作用を有する化合物と結合したときにのみ転写の活性化を起こさせる第２の遺伝子転写調節タンパク質との１ハイブリッドタンパク質と、他の遺伝子（レポーター遺伝子、例えば、ホタルルシフェレースのように活性等の測定により転写・翻訳を検出することが可能なタンパク質（レポータータンパク質）をコードする遺伝子）とを含む系が存在する。１ハイブリッド系の一例としては、ダイオキシンのような低分子量の分子を用いることを含む。ダイオキシンはＡｈＲ（ダイオキシン受容体とも呼ばれる）に結合して、目的とする遺伝子（例えば、上流にＸＲＥ（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ、ダイオキシンレスポンスエレメント）を挿入したホタルルシフェレース遺伝子）の転写を活性化する。
【００１９】
こうして、上記の課題を解決するために第１の発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１，配列番号３及び配列番号５からなる群より選択される塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ幼若ホルモン作用を仲介するタンパク質をコードすることを特徴とする。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」とは、複数のヌクレオチド（塩基と糖が  Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドの糖部分に、リン酸がエステル結合したもの）において、糖とリン酸とが交互に結合したものを意味しており、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれをも含んでいる。
【００２１】
「ストリンジェントな条件」とは、例えば、（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成は、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ７．０］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌである。）、約４０℃以上で、少なくとも約３０分、（２）２×ＳＳＣ、約５０℃以上で、少なくとも約３０分、（３）０．１×ＳＳＣ、約６５℃以上で、少なくとも約１時間、（４）０．７５Ｍの二塩基性リン酸ナトリウム／０．５Ｍの一塩基性リン酸ナトリウム／１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム／１％サルコシル、約４２℃で、少なくとも約３０分間、（５）６．０Ｍ尿素／０．４％のラウリル硫酸ナトリウム／０．１％  ＳＳＸ、約４２℃で、少なくとも約３０分間、（６）０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ、約６８℃で、少なくとも約２０分間、（７）１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ、約５５℃で約１時間、（８）１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ、約６２℃で約１時間、（９）１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ、約６８℃で約１時間、（１０）０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ、約５５℃で約１時間、（１１）０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ、約６２℃で約１時間、および（１２）０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ、約６８℃で約１時間などがあるが、これらの条件に制限されるものではない。この条件以外にも、モレキュラー・クローニング（第２版）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  （１９９５）等に記載されているハイブリダイゼーションの条件に準じることができる。
【００２２】
「幼若ホルモン作用を仲介する」とは、直接あるいは間接に幼若ホルモンと結合し、最終的にはその幼若ホルモンのシグナルを細胞核に伝えて、標的遺伝子の活性化を引き起こし得ることを意味しており、例えばダイオキシンレスポンスエレメント（ＤＲＥあるいは、ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  （ＸＲＥ））などの遺伝子転写調節因子に作用して、他の遺伝子の転写を起こすことを意味している。
「タンパク質」とは、モノマーであるアミノ酸残基が、互いにアミド結合で一緒に結合されたポリマーのことを意味する。本明細書中において、「ポリペプチド」または「タンパク質」という単語は、いかなるアミノ酸配列も含み、かつグリコプロテインのような修飾されたアミノ酸配列を含む。また、「ポリペプチド」には、自然に生じているタンパク質と共に、組換えまたは化学合成によって形成されたタンパク質をも含む。本発明のタンパク質は、発明者によって、ＡｓＡｈＲ（より詳細には、タンパク質の大きさの相違に依って、ＡｓＡｈＲ−ａ  ，  ＡｓＡｈＲ−ｂ  ，  ＡｓＡｈＲ−ｃ  。なお、単にＡｓＡｈＲというときには、これら三種類のタンパク質の全てを含む。）と銘々された。
【００２３】
第２の発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１，配列番号３及び配列番号５からなる群より選択される塩基配列との相同性が、５０％以上の塩基配列を備え、かつ幼若ホルモン作用を仲介するタンパク質をコードすることを特徴とする。
「相同性」とは、二種類の塩基配列（またはアミノ酸配列）の相違を比較して数値化したものであり、例えば、ＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ等のデータベースにおいて、所定の塩基配列（またはアミノ酸配列）と既存のデータベースに記録された塩基配列（またはアミノ酸配列）との相同性について、例えばＢｌａｓｔ２  ｓｅｐｕｅｎｃｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈなどのソフトウエアを用いて計算することができる。
相同性の値としては、好ましくは６０％、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、更にさらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００２４】
第３の発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ幼若ホルモン作用を仲介するタンパク質をコードすることを特徴とする。
第４の発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列との相同性が、５０％以上のアミノ酸配列を有すると共に、幼若ホルモン作用を仲介するタンパク質をコードすることを特徴とする。
相同性の値としては、好ましくは６０％、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、更にさらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００２５】
第５の発明に係る発現用ベクターは、第１の発明〜第４の発明のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
第６の発明に係る宿主細胞は、第５の発明に係る発現用ベクターを含むことを特徴とする。
宿主細胞としては、例えば昆虫細胞、酵母細胞、哺乳類細胞などを用いることができ、好ましくは昆虫細胞を用いることができる。
【００２６】
第７の発明に係るタンパク質は、配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を備えたことを特徴とする。第８の発明に係るタンパク質は、配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ幼若ホルモン作用を仲介することを特徴とする。
「１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換および／または付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の当業者にとって周知の方法により、欠失、置換および／または付加できる程度の個数のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されるということを意味している。
【００２７】
第９の発明に係るタンパク質は、配列番号２，配列番号４及び配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列との相同性が、５０％以上のアミノ酸配列を有すると共に、幼若ホルモン作用を仲介することを特徴とする。
相同性の値としては、好ましくは６０％、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、更にさらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００２８】
第１０の発明に係る幼若ホルモン関連化合物のスクリーニング方法は、第７の発明〜第９の発明に記載のタンパク質に被検物質を接触させ、前記タンパク質と被検物質とが相互作用した場合に、第２の遺伝子転写調節因子を通して、他の遺伝子の転写に影響を与えるか否かを検出することを特徴とする。
「幼若ホルモン関連化合物」とは、幼若ホルモンと同様の作用を示す化合物（アゴニスト）、幼若ホルモンの作用を阻害する化合物（アンタゴニスト）、あるいは部分的にアゴニスト／アンタゴニスト作用を示す化合物（パーシャルアゴニスト、パーシャルアンタゴニスト）のいずれをも含んでいる。
【００２９】
「第２の遺伝子転写調節因子」とは、本発明のタンパク質と被検物質とが相互作用を起こすことにより、影響を与え得る因子のことを意味しており、例えばダイオキシンレスポンスエレメント（ＤＲＥあるいは、ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  （ＸＲＥ））、や以下の転写因子の応答配列が含まれるが、これらに限定されるものではない：Ｇａｌ４、Ｇｃｎ５、Ｈａｐ１、Ａｒｄ１、Ｓｗｌ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｅｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、ＱａｌＦ、ＬｅｘＡ、非哺乳類核受容体（例えば、エクジソン受容体）、または哺乳類の核受容体（例えば、エストロゲン、アンドロゲン、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、レチン酸およびプロゲステロン受容体）。
【００３０】
「他の遺伝子」とは、第２の遺伝子転写調節因子によって、転写調節を受ける遺伝子のことを意味している。例えば、ルシフェレース等のように適当な酵素活性を有しているタンパク質をコードしている遺伝子であれば、転写・翻訳後のそのタンパク質の活性を評価することで、被検物質の性質を評価できる。その他に利用可能なレポータータンパク質としては、例えば、大腸菌に由来するβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）；ＣＹＨ２のような化学物質に対する感受性、シクロヘキシミド感受性、およびＣＡＮ１、カナバニン感受性、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するアルギニンパーミアーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。毒性物質（シクロヘキシミド等）の存在下においてこれらのレポーター遺伝子が発現されると、細胞増殖の抑制が起こるので、アンタゴニスト化合物を調べることができる。その他のレポータータンパク質としては、ヌクレオシドおよびＵＲＡＢ  ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＨＩＳ３、ＨＩＳ４、ＴＲＰ１およびＡＲＧ４遺伝子産物のようなアミノ酸代謝に関係するポリペプチド；ヒグロマイシン、チュニカマイシン、シクロヘキサミド、およびネオマイシンのような薬剤に対する耐性を与えるポリペプチド；ならびに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれる。レポーター遺伝子の発現は、当業者に周知の方法を用いて行われる。
【００３１】
第１１の発明に係る幼若ホルモン関連化合物のスクリーニング方法は、幼若ホルモン活性あるいは幼若ホルモン阻害活性を備えると共に適当に標識された既知物質と、第７の発明〜第９の発明に記載のタンパク質との相互作用に対して、被検物質が影響を与えるか否かを検出することを特徴とする。
第１２の発明に係る幼若ホルモン関連化合物は、第１０の発明または第１１の発明によってスクリーニングされた化合物である。
このように本発明によれば、幼若ホルモンに結合して、ホルモン活性を起こさせるタンパク質、及びそのタンパク質をコードする遺伝子を提供できる。また、そのような遺伝子を用いて、幼若ホルモン関連化合物をスクリーニングすることが可能となる。
【００３２】
なお、本明細書中において、一般に用いられる四種類の塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）に加えて、Ｉ（イノシン）、Ｂ（  ＝  Ｔ  ＋  Ｃ  ＋  Ｇ）、Ｄ（  ＝  Ａ  ＋  Ｔ  ＋  Ｇ）、Ｈ（  ＝  Ａ  ＋  Ｔ  ＋  Ｃ）、Ｋ（  ＝  Ｔ  ＋  Ｇ）、Ｍ（  ＝  Ａ  ＋  Ｃ）、Ｎ（  ＝  Ａ  ＋  Ｃ  ＋  Ｇ  ＋  Ｔ）、Ｒ（  ＝  Ａ  ＋  Ｇ）、Ｓ（  ＝  Ｃ  ＋  Ｇ）、Ｖ（  ＝  Ａ  ＋  Ｃ  ＋  Ｇ）、Ｗ（  ＝  Ａ  ＋  Ｔ）、及びＹ（  ＝  Ｃ  ＋  Ｔ）というコードを用いる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の一実施形態について、図表を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００３４】
＜蚊の飼育と組織の解剖＞
ハマダラカ（Ａ．  ｓｔｅｈｅｐｎｓｉ）は摂氏２５度で飼育し、卵形成に必要な成虫の吸血にはマウスを用いた。脂肪体（脊椎動物の肝臓と脂肪組織を併せたような器官）、及び卵巣を実体顕微鏡下で未吸血および吸血後の種々のステージのメス成虫から切除し、液体窒素で急速凍結後、摂氏−８０℃に保存した。
【００３５】
＜ＲＮＡの抽出とＲＴ−ＰＣＲ＞
摂氏−８０℃に保存した脂肪体・卵巣からＡＧＰＣ変法により、全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｔｏｇｅｎ）を用いて、ランダムプライマー（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｉｎｇ）により１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成し、蚊のＡｓＡｈＲの部分クローニングのためのＲＴ−ＰＣＲの鋳型とした。縮重プライマー（ＡｈＲ−Ｆｄ（配列番号７：ＧＫＴＳＩＡＡＲＣＡＹＡＡＩＹＴＩＧＡＹＴＴ）とＡｈＲ−Ｒｄ（配列番号８：ＡＴＣＡＴＫＣＣＮＳＷＩＫＣＩＣＣＩＧＴＹＴＴ））は、ヒトのＡｈＲ  （ＨｓＡｈＲ）、及びショウジョウバエのＳｓのアミノ酸配列を参考に保存性の高い領域からデザインした。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲ後、増幅された予想されるサイズのＰＣＲ産物をゲルから回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングし、蛍光自動シーケンサ（ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３１０Ａ）により塩基配列の決定を行った。全長のＡｓＡｈＲのクローニングには５’  ＲＡＣＥ法、及び３’  ＲＡＣＥ法を用いた。ＲＡＣＥ法によるＡｓＡｈＲの全長クローニングはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の３’ＲＡＣＥ用キット、５’  ＲＡＣＥ用キット、及びＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｓｅを用いて行った。３’  ＲＡＣＥは吸血後の雌成虫の脂肪体から抽出したＲＮＡを鋳型として行った。ｄＴのホモポリマーの５’側にアンカー配列を加えたプライマー（ＡＰ、配列番号１６：ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）を用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＩＩにより４２℃で逆転写反応を行って一本鎖ｃＤＮＡを得た。
【００３７】
このｃＤＮＡを鋳型としてｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ（ＧＳＰ１、配列番号１０：ＣＧＡＣＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＡＣＡＡ）とアンカー配列プライマー（ＡＵＡＰ、配列番号１７：ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ）を用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行い、二本鎖ｃＤＮＡを得た。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離後、陽性荷電ナイロン膜にトランスファーし、既知断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。シグナルの確認された付近のバンドを切り出し、ＱｉａＥＸ  ＩＩ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを回収した。このｃＤＮＡを鋳型としてＧＳＰ２（配列番号１１：ＣＧＡＡＣＡＣＡＣＴＣＧＧＡＴＡＣＴＣＣＧＡＴＴＣ）とＡＵＡＰにより２ｎｄ  ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーションを行い、増幅されたバンドを回収した。
【００３８】
回収したＤＮＡはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩにサブクローニングし、シーケンシングの鋳型とした。３’  ＲＡＣＥで得た塩基配列については、複数の独立クローンの完全シーケンスを行いそれらからコンセンサス配列を得た。
５’  領域のクローニングには、３’  ＲＡＣＥと同様のＲＮＡを鋳型としてｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｉｎｇを用いて、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅにより６５〜７０℃で逆転写反応を行って１本鎖ｃＤＮＡプールを得た。この一本鎖ｃＤＮＡを鋳型に、ＧＳＰ３（配列番号１２：ＡＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＣＣＡＣＧＴＡ）と、より上流の種間の保存性の高い領域をもとにデザインした縮重プライマー（ＡｈＲ−Ｆｄ２、配列番号９：ＡＡＧＷＳＫＡＡＹＣＣＩＷＳＩＡＡＲＭＧＩＣＡ）を用いてハーフウエイ（ｈａｌｆ−ｗａｙ）のホモログＰＣＲ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＰＣＲ）を行い、既知領域より５’側に約０．８  ｋｂｐ伸長したｃＤＮＡ断片を得た。
【００３９】
この配列をもとにさらにＧＳＰ４（配列番号１３：ＡＴＣＧＡＣＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＣＧＴＡ）、ＧＳＰ５（配列番号１４：ＴＣＧＣＧＣＡＣＧＡＴＡＡＣＴＴＴＣＧＴ）、及びＧＳＰ６（配列番号１５：ＧＣＡＧＡＡＴＧＴＧＡＣＡＣＣＡＧＴＣＣＧＴＴ）をデザインし、５’  ＲＡＣＥを行った。６５〜７０℃でＧＳＰ４により逆転写反応を行って得た１本鎖ｃＤＮＡをＧＬＡＳＳ  ＭＡＸによって精製し、ＴｄＴでヌクレオチドホモポリマー（ここではｄＣのポリマー）を付加した。ＴｄＴ処理をした一本鎖ＤＮＡを鋳型として相補的なホモポリマー配列の５’側にアンカー配列を加えたプライマー（ＡＡＰ、配列番号１８：ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧＧＧＩＩＧ）とＧＳＰ５を用いて１ｓｔ  ＰＣＲを行い、二本鎖ｃＤＮＡを得た。得られたＰＣＲ産物をサザンハイブリダイゼーションにより解析し、該当するバンドを切り出し、ｃＤＮＡを回収した。
【００４０】
回収したｃＤＮＡを鋳型としてアンカープライマー（ＡＵＡＰ）とＧＳＰ６を用いて２ｎｄ  ＰＣＲを行い、同様にサザンハイブリダイゼーションにより目的のバンドを特定し、回収した。回収したＤＮＡはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩにサブクローニングし、複数のサブクローンからコンセンサス配列を得た。
【００４１】
＜ｃＤＮＡクローニングとシーケンシング＞
ＲＡＣＥ法で得られた配列情報をもとに、全ＯＲＦをカバーするＡｓＡｈＲのｃＤＮＡをＬＡ−Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ）とＫｐｎ  Ｉタグ付き、及びＸｂａ  Ｉタグ付きのプライマー（ＡｓＡｈＲ−ＫｐｎＩ−Ｆ、配列番号１９：ＧＣＧＧＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＧＡＴＴＣ、及びＡｓＡｈＲ−Ｘｂａ−Ｒ、配列番号２０：ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＧＴＡＣＴＡＧＣＧＧＣＡＡＴＡ）を用い、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩにサブクローニングした。塩基配列の決定には蛍光自動シーケンサを用い、プライマーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ  ｗａｌｋｉｎｇ）により行った。塩基配列の結合やアミノ酸配列への翻訳など、一般的な編集にはＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＤＣ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖ．Ｃｏ．）を用い、アミノ酸配列の多重アライメントにはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ｐｒｏｇｒａｍを、また分子系統樹の作製にはＮＪ法を利用した。
【００４２】
＜細胞培養＞
ショウジョウバエ胚由来のＳ２細胞は小林淳博士（三重大学工学部）より提供をうけ、無血清培地であるショウジョウバエＳＦＭ  （ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、通常のインキュベータを使用して２７℃で培養した。
【００４３】
＜Ｓ２細胞へのトランスフェクションとルシフェレースアッセイ＞
２４ウエルプレートを用い、２．５  ｘ  １０５  ｃｅｌｌｓ  ／  ｗｅｌｌの濃度で細胞を播種し、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクションを行った。用いた条件は、ウエル当たり（Ａ）１５０  ｎｇのＤＮＡ（具体的にはｐＡｃ５．１／Ｖ５−ＨｉｓＡ−ＡｓＡｈＲ、ｐＧＬ３−ｔｋ−ＸＲＥ、ｐＲＬ−ｔｋを各５０  ｎｇ）を２５  μｌのショウジョウバエＳＦＭと混合したもの、（Ｂ）前もって３５分間２  μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎと混合したものを用意し、この（Ａ）（Ｂ）を混合して１５分間室温に放置した後、２００μｌのＳＦＭを加え再び混合した（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）。実際の手順においては、必要なウエル数分のｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅを上述の倍数で作成した。なお、プラスミドの構造については後述する。
【００４４】
その後にウエルから培地を取り除いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ２５０  μｌを細胞に重層した。２７℃で５時間培養後、被検物質を含む培地と交換した後、同温度で２５時間さらに培養後、生理的濃度の塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で細胞を一回洗浄した後、ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  １００  μｌを加え、−８０℃で１５分凍結した後、室温で緩やかに浸透しながら３０分間細胞を溶解した。
【００４５】
次に、ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞溶解液中のレポーターのホタルルシフェレース活性及びコレポーターのウミシイタケルシフェレース活性をルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｍｏｄｅｌ  ２０／２０）により測定した。レポーター活性は、それぞれのウエル毎のホタルルシフェレース活性をウミシイタケルシフェレース活性で補正し、相対的ルシフェレース（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性として示した。
【００４６】
実験は複数回繰り返して、結果の再現性を確認し、また各実験においてはそれぞれのカテゴリーごとに最低３ウエルを用い、得られた測定値の平均値と標準偏差を計算した。幼若ホルモンＩＩＩ  （ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ＩＩＩ，  ＪＨ  ＩＩＩ）はエタノール溶液として−８０℃に保存した。培養液には、コントロールとしてはエタノールのみ、実験区には終濃度０．５  μＭ、５μＭ、５０μＭとなるように添加した。そのほか天然のＪＨ及び合成ＪＨ類縁体としてＪＨ  Ｉ、ＪＨ  ＩＩ、ＺＲ５１５を終濃度５μＭで培養液に添加した。更に、構造的には天然ＪＨ及び合成ＪＨ類縁体に類似しているもののｉｎ  ｖｉｖｏでＪＨ活性を示さないファルネソール（ｆａｒｎｅｓｏｌ）、ファルネシルアセテート（ｆａｒｎｅｓｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）、及びゲライオール（ｇｅｒａｉｏｌ）について、終濃度５μＭで培養液に添加した。各培養液のエタノール終濃度はいずれも０．１％（ｖ／ｖ）とした。
【００４７】
＜プラスミド＞
ＡｓＡｈＲの発現プラスミドは、全ＯＲＦおよび５’  非翻訳領域、３’非翻訳領域を含むｃＤＮＡ断片をｐＡｃ５．１／Ｖ５−ＨｉｓＡ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に融合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）して作成し、ｐＡｃ５．１／Ｖ５−ＨｉｓＡ−ＡｓＡｈＲと命名した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ効率を補正するためのコレポーター（ｃｏｒｅｐｏｒｔｅｒ）としては、ウミシイタケルシフェレース完全長ＯＲＦをＨＳＶ  Ｐｔｋで誘導（ｄｒｉｖｅ）するｐＲＬ−ｔｋ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。ダイオキシン応答配列（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ，  ＸＲＥ）を上流にもつホタルルシフェレースレポーター・ｐＧＬ３−ｔｋ−ＸＲＥは以下のようにして作成した。まず、プロモータを持たないベクターであるｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）のホタルルシフェレース完全長ＯＲＦ上流にｐＲＬ−ｔｋ由来のＰｔｋを含むＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を導入し、さらにその上流のＸｈｏＩサイトに、５’末端にＸｈｏＩオーバーハングをもちＸＲＥのコンセンサス配列を含む正逆両方向のオリゴヌクレオチドをアニーリング後にｌｉｇａｔｉｏｎすることにより、この実験レポータープラスミドを得た。
【００４８】
＜実施例１＞
ＡｓＡｈＲのｃＤＮＡクローニング
ＡｓＡｈＲのクローニングは、通常のライブラリーのスクリーニングではクローンが得られなかった。このため、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲにより得られた１８１ｂｐの断片を元にして、３’方向と５’方向にＲＡＣＥおよびｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＰＣＲを行うことにより、全ＯＲＦの情報を得た。図１には、ＡｓＡｈＲのクローニング手順の概要を示した。ＤｍＡｈＲ（ショウジョウバエ）のＯＲＦとの比較により明らかなように、３’側はＯＲＦのＣ末端を含む断片が比較的容易に得られたが、５’側は通常の４２  〜  ５０℃での逆転写により得た１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型とした場合には、５’  ＲＡＣＥにより０．２  ｋｂ程度の断片しか伸長しなかった。しかし、耐熱性の逆転写酵素を用いて逆転写の温度を通常の４２〜５０℃から６５〜７０℃へと、より高温での逆転写反応へと変更することにより、ｈａｌｆ−ｗａｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＲＴ−ＰＣＲ法で既知領域から５’側へ０．８  ｋｂ程度伸長した断片が得られた。この断片の配列情報をもとに、高温で逆転写した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型として、さらに５’側へＲＡＣＥをかけることにより、さらに約０．８ｋｂの断片が伸長し、３’  ＲＡＣＥで得られた配列情報とあわせて、完全長ＯＲＦを含む配列が得られた。
【００４９】
ＡｓＡｈＲの配列の解析
配列解析の結果、蚊のＡｈＲホモログと思われるＯＲＦをコードするｃＤＮＡには３種類のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）があることが明らかとなった（図１を参照）。これらはスプライスバリアントであり、全長３４６７  ｂｐのクローンは２０７７  〜  ２１５９  ｎｔの位置に、また全長３４６４  ｂｐのクローンは３３２５  〜  ３４０４  ｎｔの位置にそれぞれスプライスアウトされないイントロン様配列が見いだされた。このため、前者のＯＲＦが９８１ａａ／２９４５ｂｐであるのに対し、後者では５３８ａａ／１６１６ｂｐであった。これらは４７５  ｎｔから始まる翻訳開始シグナル（１ｓｔ  ＡＴＧ）は共通であったが、前者では３４２０  ｎｔの位置にＴＧＡが、後者ではスプライスアウトされないイントロン様配列上の２０９１  ｎｔの位置に  ＴＡＡがみられた。更に、この両方のイントロン様配列をもつバリアントも存在し、それぞれを順にＡｓＡｈＲ−ａ（塩基配列：配列番号１、アミノ酸配列：配列番号２）、ＡｓＡｈＲ−ｂ（塩基配列：配列番号３、アミノ酸配列：配列番号４）およびＡｓＡｈＲ−ｃ（塩基配列：配列番号５、アミノ酸配列：配列番号６）  と名付けた。
【００５０】
４２〜５０℃のコンベンショナルな逆転写反応の温度では５’側へ短い断片しか伸長しなかった原因としては、最初にｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＰＣＲで得られた１８１  ｂｐの断片より５’側ではｍＲＮＡが非常に強い二次構造をとっていることが考えられる。
ＡｓＡｈＲの予想されるアミノ酸配列と他の生物種のホモログとの多重アライメントと分子系統樹をそれぞれ図２、及び図３に示した。蚊のＡｓＡｈＲ−ａと他の生物種におけるホモログとの間の類縁性を計算すると、全長での比較では、ショウジョウバエのＡｈＲ（ＤｍＳｓ）とはアイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が４４．４％、シミラリティ（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）が５１．４％であり、ヒトのＡｈＲ（ＨｓＡｈＲ）とはｉｄｅｎｔｉｔｙが２０．２％、ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙが２８．９％であった。図３の分子系統樹においてもＡｓＡｈＲとＤｍＳｓはおなじノード上にマップされ、両者の類縁性が高いことが示された。
【００５１】
ＡｈＲはｂＨＬＨ−ＰＡＳファミリーに属する転写因子で、その構造上の特徴として、分子内にｂＨＬＨドメインおよびＰＡＳドメイン（サブドメインとしてＰＡＳ−Ａ、ＰＡＳ−Ｂドメインを含む）を有しているが、Ｎ末端からこのＰＡＳドメインＣ末端までの配列（ＰＡＳドメインはＨｓＡｈＲではＱ１１３からＧ３４７までである）の多重整列を行い、この領域における蚊のＡｓＡｈＲ−ａと他の生物種におけるホモログとの間の類縁性を計算すると、ＤｍＳｓとはｉｄｅｎｔｉｔｙが８１．７％、ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙが８９．２％であり、ＨｓＡｈＲとはｉｄｅｎｔｉｔｙが４３．５％、ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙが５７．３％であった。このことから種々のＡｈＲホモログ間で、ｂＨＬＨドメインおよびＰＡＳドメインはよく保存されており、またＡｓＡｈＲはＤｍＳｓと最も類縁性が高いことが示された。
【００５２】
ｂＨＬＨドメインは他の転写因子にもよく見られる構造で、ＤＮＡ結合および二量体形成ドメインとして、またこのドメインのＮ末端側の塩基性アミノ酸領域が核移行シグナルとしても働いており、またＰＡＳドメインもＨＬＨドメインと同様に他のＰＡＳドメインを持った因子とダイマーを形成する機能を持っているため、この領域でのアミノ酸の保存性が高く保たれていると考えられる。一方のＣ末端側半分では今回、異なる生物種間、特に脊椎動物と昆虫での間の保存性が低いことが示された。ＨｓＡｈＲではＣ末端側のグルタミンに富む領域を含んだ広い範囲が転写活性化ドメインであることが示されている。全長の長いＡｓＡｈＲ−ａ，−ｃではＣ末端寄りのドメインが長いが、ＡｓＡｈＲ−ｂでは全長が非常に短く、この２カテゴリー間では転写活性化能の違いが生ずることが予想される。
【００５３】
＜実施例２＞ＡｓＡｈＲ  は、Ｓ２細胞を用いたｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ／ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ系において、ＪＨ  ＩＩＩ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔに、ＸＲＥをもつレポーターからの転写を増強させる
クローニングしたＡｓＡｈＲ−ｃをショウジョウバエ由来の培養細胞Ｓ２で発現させ、ＡｓＡｈＲがＪＨ依存的にレポーター活性に影響を与えるかどうか検討した。実験レポーターとしては、現在のところ、ＡｓＡｈＲの結合ＤＮＡ配列が明らかではないので、脊椎動物のＸＲＥを上流に挿入したホタルルシフェレース遺伝子を用いた。ショウジョウバエにおいては脊椎動物ＡｈＲのホモログＳｓとａｒｌｙｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ（Ａｒｎｔ）ホモログであるｔｇｏがヘテロ２量体を形成して、同様のＸＲＥに結合することが示されている。Ｓ２細胞にＡｓＡｈＲ−ｃの発現ベクターを実験レポーター、コレポーターとともに導入した。ネガティブコントロール（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒａｌ）としては、ＡｓＡｈＲ−ｃの発現ベクターのかわりに、空の発現ベクターを同重量だけトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、種々の濃度のＪＨ  ＩＩＩ、あるいは溶媒のエタノールのみを加えた実験区を設定し、さらに培養を２５時間続けた後、レポーター活性を測定した。
【００５４】
結果を図４に示した。まず、エタノールのみを加えた実験区では、ＡｓＡｈＲ−ｃを導入した場合、コントロールに比べ、ある程度のレポーター活性の上昇が観察された。次に、加えるＪＨ  ＩＩＩの量を増やしてゆくと、発現ベクターのみを導入したコントロールでは、レポーター活性はほとんど変化しなかったが、ＡｓＡｈＲ−ｃの存在下では、ＪＨ  ＩＩＩの濃度依存的にレポーター活性が統計的に有意に上昇した。
【００５５】
それぞれのＪＨ  ＩＩＩ濃度の実験区での（ＡｓＡｈＲ−ｃ有りのレポーター活性）／（空の発現ベクターのみのレポーター活性）の比をとると、濃度０  μＭ、０．５  μＭ、５．０  μＭ、５０  μＭでそれぞれ１．５５倍、１．９９倍、２．１８倍、２．１０倍となり、濃度０．５μＭでもかなりの効果があり、またｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎは濃度濃度５．０  μＭでピークに達していることがわかる。これらの値はＪＨの生理的な濃度に近く、生理的な条件下において、この系はＪＨ  ＩＩＩに反応性を示すことが明らかとなった。これより蚊のＡｈＲホモログはＪＨ  ＩＩＩ依存的な転写を司ることが示唆される。
【００５６】
なお、ここには示していないが、ＡｈＲのヘテロダイマー形成のパートナーである蚊のＡｒｎｔホモログをＡｓＡｈＲと同時にＳ２細胞に導入した場合には、ＡｓＡｈＲのみを導入した場合と比べ、むしろレポーター活性がやや下がるという結果を得た。このことは、Ｓ２細胞中に既に十分量のショウジョウバエＡｒｎｔ  （ｔｇｏ）が存在しているか、あるいは、一般に理解されている事実と異なり、昆虫のＡｈＲはＪＨシグナリングにおいて、単量体あるいはホモ２量体として機能していることが推定される。後者の場合には、ＸＲＥが最適な応答配列ではない可能性が高く、真の応答配列の検索、あるいは既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインとＡｓＡｈＲを融合タンパクとして発現させ、その既知の転写因子の応答配列を含むレポーター遺伝子を用いた実験を行う必要があると思われる。
【００５７】
＜実施例３＞ＡｓＡｈＲ  は、Ｓ２細胞を用いたｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ／ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ系において、ＪＨ  ＩＩＩのみならずＪＨ  Ｉ、ＪＨ  ＩＩによっても、ＸＲＥをもつレポーターからの転写を増強させる
上記実施例２と同一の実験系を用いて、ＸＲＥを持つルシフェレースレポーター遺伝子の転写に及ぼすＡｓＡｈＲの効果をＪＨ  Ｉ、ＪＨＩＩ、ＪＨＩＩＩの存在下で検討した。
【００５８】
結果を図５に示した。ここで明らかなように、ＡｓＡｈＲは蚊のｎａｔｕｒａｌなＪＨであるＪＨ  ＩＩＩ以外にも、ＪＨ  Ｉ、ＪＨ  ＩＩを培地に添加した場合でも明らかにレポーターからの転写を上昇させた。レポーター活性の絶対値の高い順はＪＨ  ＩＩＩ、ＪＨ  ＩＩ、ＪＨ  ＩＩＩであった。しかしながら、それぞれの実験区での（ＡｓＡｈＲ−ｃ有りのレポーター活性）／（空の発現ベクターのみのレポーター活性）の比をとるとすべて３倍強程度となり、ＪＨ  Ｉ、ＪＨ  ＩＩ、ＪＨ  ＩＩＩの間で大きな差はみられなかった。このことから、  このＡｓＡｈＲを用いた実験系では、ＪＨ  ＩＩＩのみならず、他のｎａｔｕｒａｌなＪＨについても、ＪＨ  ＩＩＩと同様のレポーター活性が得られることが明らかになった。農作物害虫として最大のグループをなすのは鱗翅目（ガやチョウの仲間）であるが、鱗翅目のｎａｔｕｒａｌなＪＨは一般にＪＨ  Ｉであることが知られている。したがって、この実験系は重要な農業害虫である鱗翅目幼虫に効果があると予想されるＪＨ  Ｉの機能的類縁化合物のスクリーニングにも有効であると考えられる。
【００５９】
＜実施例４＞ＡｓＡｈＲ  は、Ｓ２細胞を用いたｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ／ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ系において、機能的合成ＪＨ類縁化合物によってのみ、ＸＲＥをもつレポーターからの転写を増強させる
更に、上記実施例２と同一の実験系を用いて、ＸＲＥを持つルシフェレースレポーター遺伝子の転写に及ぼすＡｓＡｈＲの効果を、殺虫剤としても既に用いられているｍｅｔｈｏｐｒｅｎｅ  （ＺＲ５１５）および、構造的にはＪＨあるいは機能的合成ＪＨ類縁化合物と類似するもののｉｎ  ｖｉｖｏでのＪＨ作用が認められないｓｑｕａｌａｎｅ、ｆａｒｎｅｓｏｌ、ｆａｒｎｅｓｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ、ｇｅｒａｎｉｏｌの存在下で検討した。ポジティブコントロール（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、上述のように既に効果を確認した蚊のｎａｔｕｒａｌ  ＪＨであるＪＨ  ＩＩＩを用いた。
【００６０】
結果を図６に示した。図より明らかなように、ｓｑｕａｌａｎｅ、ｆａｒｎｅｓｏｌ、ｆａｒｎｅｓｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ、ｇｅｒａｎｉｏｌの４種の化合物は全くレポーター活性を上昇させなかった。一方、既にＪＨ効果が一般に認められているＺＲ５１５は、ＪＨ  ＩＩＩと同等のレポーター活性の増強を示した。このことは、この実験系がＪＨ作用のある化合物をスクリーニングするのに有効であることを示している。
このように、本実施形態によれば、ＪＨ類縁化合物・ＪＨ拮抗阻害剤のスクリーニングを安価・簡便に行うことができる。
【００６１】
また、ＡｓＡｈＲを昆虫細胞系（Ｓ２）に適用した試験方法によれば、２５℃程度のインキュベータを用いれば良いので、哺乳類の培養細胞のように炭酸ガスを用いる必要がなく、簡易な設備で済む。
また、レポーター遺伝子の転写活性は、ＪＨ  ＩＩＩの濃度が０．５μＭ〜５μＭという生理的な濃度に近いところから開始されていることから、従来技術に比べて、より天然のものに近いアッセイ系を提供できる。
【００６２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】蚊のＡｈＲの３種のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）のＰＣＲを利用したｃＤＮＡクローニング手順の概要を示す図である。
【図２】蚊、ショウジョウバエ、及びヒトのＡｈＲのアミノ酸配列の多重アライメントを示す図である。但し、図中、ＡｓＡｈＲ−ａはＡ．  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ  ＡｈＲ−ａ  ｉｓｏｆｏｒｍを、ＤｍＳｓはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ｓｐｉｎｅｌｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎを、ＨｓＡｈＲはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＡｈＲをそれぞれ示す。
【図３】種々の生物種のＡｈＲの分子系統樹を示す図である。但し、図中、ＡｓＡｈＲ−ａはＡ．  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ  ＡｈＲ−ａ  ｉｓｏｆｏｒｍを、ＤｍＳｓはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ｓｐｉｎｅｌｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎを、ＨｓＡｈＲはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＡｈＲを、ＣｅＡｈＲはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｄｉｓ  ｅｌｅｇａｎｃｅ  ＡＨＲ−１を、ＯｍＡｈＲ−ａはＯｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ  ＡｈＲをそれぞれ示す。
【図４】ＡｓＡｈＲ−ｃをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたＳ２細胞において、ＸＲＥを持つルシフェレースレポーター遺伝子の活性に及ぼすＪＨ  ＩＩＩの効果を示すグラフ図である。
【図５】ＡｓＡｈＲ−ｃをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたＳ２細胞において、ＸＲＥを持つルシフェレースレポーター遺伝子の活性に及ぼすＪＨ  Ｉ、ＪＨ  ＩＩおよびＪＨ  ＩＩＩの効果を示すグラフ図である。
【図６】ＡｓＡｈＲ−ｃをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしたＳ２細胞における、ＸＲＥを持つルシフェレースレポーター遺伝子の活性に及ぼすＪＨ  ＩＩＩ、合成ＪＨ類縁体（ＺＲ５１５）およびＪＨ−ＪＨ類縁体の構造類似化合物の効果を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年3月27日(2003.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明のＡｓＡｈＲを用いて、幼若ホルモン関連化合物をスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニング方法として、次のような方法が例示される。
＜ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合試験方法＞
ＡｓＡｈＲを標識したリガンド（ＡｓＡｈＲと結合することが既知である物質、例えば幼若ホルモンなど）と共にインキュベートして、ＡｓＡｈＲと結合した標識リガンドを被検物質が置換するか否かを測定することによって、幼若ホルモン関連化合物となり得るか否かを調べる。この試験によって見出された化合物は、殺虫剤となる可能性がある。ＪＨ  Ｉ，  ＪＨ  ＩＩ，ＪＨ  ＩＩＩ、またはそれらの類縁化合物（以下、「幼若ホルモン関連化合物」という）に、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、または生物発光標識によって検出可能に標識することができる。放射性標識の例としては、放射性同位元素を１個以上有する放射性同位体標識と共有結合した幼若ホルモン関連化合物が挙げられる。放射性同位体としては、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅおよび５８Ｓｅが例示される。具体的には、［３Ｈ］−１０Ｒ−ＪＨ  ＩＩＩおよび［３Ｈ］メトプレンが挙げられる。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
試験方法について具体的に説明する。殺虫剤スクリーニング方法は、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、および１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンのような緩衝液中で行われる。被検化合物および標識幼若ホルモン関連化合物は、有機溶媒（例えば、アルコール、ジメチルスルホキシドなど）に溶解して、試験用緩衝液にて希釈する。ＡｓＡｈＲをアッセイ緩衝液で希釈し、標識幼若ホルモン関連化合物（例えば、［３Ｈ］−１０Ｒ−ＪＨ  ＩＩＩ）と共に室温で約３０分インキュベートする。アッセイ緩衝液２００μｌを試験管に加え、標識幼若ホルモン関連化合物（［３Ｈ］−１０Ｒ−ＪＨ  ＩＩＩを用いる場合には、試験管あたり約１２，０００ｄｐｍ）と結合したＡｓＡｈＲを含む溶液１００μｌを加える。コントロールとして、非標識幼若ホルモン関連化合物（例えば、ＪＨＩ、ＪＨＩＩ  、ＪＨ  ＩＩＩなど）を適当な濃度（約０．０２３ｐｍｏｌ〜約３ｐｍｏｌ）に希釈して、一連の試験管に加える。試験溶液を混合した後、室温で３０分インキュベートする。次に、ＡｈＡｈＲと結合した標識幼若ホルモン関連化合物と結合していない標識幼若ホルモン関連化合物とを分離する。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
分離方法としては、当業者にとって周知の方法（例えば、デキストランチャコール、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）を用いた方法）を適宜用いることができる。このうち、ＨＡＰを用いた方法について簡単に説明する。５％ＨＡＰを含む緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸［ｐＨ８．０］、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）懸濁液０．５ｍＬを加え、試験管をボルテックスミキサーによって緩く攪拌した後、溶液を室温で３０分インキュベートし、グラスファイバー濾紙を通じて濾過する。濾紙をＨＡＰ緩衝液で数回洗浄し、バイアルに入れて、１００℃で約１０分間乾燥させる。次に、シンチレーション用液体を試験管に加えて一晩インキュベートしてから計数する。非特異的結合は、大過剰（例えば、１００倍過剰）量の非標識幼若ホルモン関連化合物の存在下で測定する。データの解析については、従来公知であるため（例えば、スキャッチャードプロットを用いることができる）説明を省略する。なお、上記の試験方法については、単なる例示であり、本発明に限定を加えるものではない。例えば、溶液成分、時間、温度の値を適宜変更して実施することもできる。また、シンチレーション近接アッセイ法（ＳＰＡ）を用いることもできる（ボスワースら（Ｂｏｓｗｏｒｔｈ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：１６７（１９８９））。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
＜Ｓ２細胞へのトランスフェクションとルシフェレースアッセイ＞
２４ウエルプレートを用い、２．５  ｘ  １０５  ｃｅｌｌｓ  ／  ｗｅｌｌの濃度で細胞を播種し、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクションを行った。用いた条件は、ウエル当たり（Ａ）１５０  ｎｇのＤＮＡ（具体的にはｐＡｃ５．１／Ｖ５−ＨｉｓＡ−ＡｓＡｈＲ、ｐＧＬ３−ｔｋ−ＸＲＥ、ｐＲＬ−ｔｋを各５０  ｎｇ）を２５  μｌのショウジョウバエＳＦＭと混合したもの、（Ｂ）前もって３５分間２  μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎと混合したものを用意し、この（Ａ）（Ｂ）を混合して１５分間室温に放置した後、２００μｌのＳＦＭを加え再び混合した（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）。実際の手順においては、必要なウエル数分のｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅを上述の倍数で作成した。なお、プラスミドの構造については後述する。