(57)【要約】      （修正有）【課題】  公知の蛍光検出試薬は、使用される励起光源が主として光のＵＶおよび緑色領域に限定されるので、例えば、特に強い青色および赤色のＬＥＤを用いることができる化合物で知られているものは数が充分でない。アナライトの蛍光測定用の検出試薬として新たな酸化還元活性化合物を提供する。【解決手段】ＮＢＤ−アミンのＮ−オキサイドまたはその誘導体を酸化還元指示薬として提供する。還元によって形成されるＮＢＤ−アミンは高い蛍光を特徴とし、青色光照射によって非常に容易に励起することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化還元反応および蛍光測定によってアナライトを検出する方法であって、前記アナライトを含むサンプルを、蛍光酸化還元指示薬として下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含む検出試薬と接触させることを特徴とする方法。
【化１】
2004264296.tif 000003
［式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＲ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲおよびＯＣＯＲから選択され；
Ｒ３は各場合において独立に、ＮＯ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＳＲおよびハロゲンから選択され；
Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、その場合にアルキルはハロゲン、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＳＯ３Ｒおよびその塩および／またはＰＯ（ＯＲ）３およびその塩で置換されていても良く；
ｍは、１〜20の整数であり；
ｎは１、２または３である。］
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が、ＯＨで置換されたＣ１−２アルキル基である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ３がＮＯ２である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化還元指示薬（Ｉ）が電子を直接受容することができる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記酸化還元指示薬（Ｉ）がメディエータを介して電子を受容することができる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記アナライトとして酸化可能物質を検出する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記アナライトを還元または酸化するための１種以上の酵素および場合により補酵素をさらに含む検出試薬を用いる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
グルコース、ラクテート、アルコール、ガラクトース、コレステロール、果糖、グリセリン、ピルベート、クレアチニン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、トリグリセリドまたはHDLコレステロールをアナライトとして検出する請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
グルコースオキシダーゼ、グルコース色素オキシドレダクターゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼ／ジアフォラーゼを用いてグルコースを検出する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
酸化還元反応を触媒する酵素または反応をオキシドレダクターゼ反応と組み合わせることができる酵素を前記アナライトとして検出する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
グルタミン酸−オキサル酢酸トランスアミナーゼ（GOT）、（AST）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）またはクレアチンキナーゼ（CK）をアナライトとして検出する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
酸化還元反応および蛍光測定によってアナライトを検出するための試薬であって、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含むことを特徴とする試薬。
【化２】
2004264296.tif 000004
［式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＲ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲおよびＯＣＯＲから選択され；
Ｒ３は各場合において独立に、ＮＯ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＳＲおよびハロゲンから選択され；
Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、その場合にアルキルはハロゲン、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＳＯ３Ｒおよびその塩および／またはＰＯ（ＯＲ）３およびその塩で置換されていても良く；
ｍは、１〜20の整数であり；
ｎは１、２または３である。］
【請求項１３】
酵素、補酵素、補助物質、緩衝剤およびメディエータから選択されるさらに別の成分を含む請求項１２に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アナライトの蛍光測定を行うための方法および試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば診断用途におけるアナライトの測定には多くの方法がある。一つの手法は、酸化還元反応および酸化還元指示薬によってアナライトを測定するというものである。その場合、酸化系または還元系が酸化還元指示薬に直接またはメディエータを介して作用する。アナライトが存在すると、酸化還元指示薬の還元または酸化が生じて、それによって定性的または定量的測定の実施が可能となる。
【０００３】
使用する酸化還元指示薬の種類に応じて、指示薬は比色、蛍光または電気化学的検出方法によって測定することができる。比色検出試薬の例には、ヘテロポリ酸類（特許文献１）、テトラゾリウム化合物（特許文献２）、ニトロソ芳香族化合物（特許文献３）、RIND化合物（特許文献４）、フェナジン類（特許文献５）およびインダントロン類（特許文献６）がある。電気化学的検出試薬の例には、ニトロソ芳香族化合物、フェナジン類、ヘキサシアノ鉄酸カリウムおよびベンゾキノン（例えば、特許文献７および特許文献８参照）がある。蛍光検出試薬の例には、レサズリン（特許文献９）、遷移金属錯体（非特許文献１; および非特許文献２）ならびにスコポレチン、エスクレチン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ジクロロフルオレセイン、Ｎ−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンおよび専らＨ２Ｏ２の検出に用いられるMNBDHがある（非特許文献３も参照）。
【特許文献１】欧州特許第0431456号明細書
【特許文献２】欧州特許第0574769号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第0620283号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第0190740号明細書
【特許文献５】国際公開第93/06487号パンフレット
【特許文献６】欧州特許第0831327号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開第0441222号明細書
【特許文献８】欧州特許出願公開第0505494号明細書
【特許文献９】米国特許第5,912,139号明細書
【非特許文献１】Ryabovら, JBIC 4, 1999年, p.175-182
【非特許文献２】Woltmanら, Anal. Chem., 1999年, 71, p.1504-1512
【非特許文献３】R. Haughland著, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 第6版, 1996年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、先行技術から公知の蛍光検出試薬には、いくつか欠点がある。例えば、大部分の公知の蛍光指示薬では、グルコースオキシダーゼによって発生するＨ２Ｏ２を検出することでグルコースなどの代謝物を測定する必要がある。この反応は通常、酵素であるペルオキシダーゼによって触媒的に助ける必要があり、尿素やビリルビンなどの電子供与体による干渉を非常に受けやすい。その試薬はまた、長期間における安定性に欠ける。
【０００５】
対照的に、グルコースの酸素依存的検出を可能とする酸化還元指示薬、すなわち酸素ではなく酸化酵素から電子を直接受容する酸化還元指示薬が有利である。しかしながら、これに適した電子受容体として知られているのは、レサズリンならびにＯｓおよびＲｕ錯体のみである。しかしながらレサズリンの場合、酸化還元反応によって形成されるレゾルフィンの発光バンドが、未反応のレサズリンの吸収バンドと強く重なるため、アナライト測定の感度が大幅に低下する。遷移金属錯体は、酸化還元電位が高いため（例：Ｒｕ錯体）、アスコルビン酸などの化合物による強い干渉を示す。その錯体の蛍光効率は、サンプルの酸素含有量によっても変動する。
【０００６】
さらに公知の蛍光指示薬の場合、使用される励起光源が主として光のUVおよび緑色領域に限定される。よって、例えば、特に強い青色および赤色のLEDを用いることができる化合物で知られているものは数が十分ではない。
【０００７】
従って本発明の課題は、少なくとも部分的に先行技術の欠点を解消することができる、アナライトの蛍光測定用の検出試薬としての新たな酸化還元−活性化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題は、NBD−アミンのＮ−オキサイドまたはその誘導体を酸化還元指示薬として提供することにより、本発明に従って達成された。還元によって形成される前記NBD−アミンは高い蛍光を特徴とし、青色光照射によって非常に容易に励起することができる。
【０００９】
従って本発明の１態様は、酸化還元反応および蛍光測定によってアナライトを検出する方法であって、前記アナライトを含むサンプルを、蛍光酸化還元指示薬として下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2004264296.tif 000002
［式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＲ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲおよびＯＣＯＲから選択され；
Ｒ３は各場合において独立に、ＮＯ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＳＲおよびハロゲンから選択され；
Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、その場合にアルキルはハロゲン、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＳＯ３Ｒおよびその塩および／またはＰＯ（ＯＲ）３およびその塩で置換されていても良く；
ｍは、１〜20の整数、好ましくは１〜10の整数であり；
ｎは１、２または３である。］
で表される化合物を含む検出試薬と接触させることを特徴とする方法である。
【００１０】
本発明の別の態様は、酸化還元反応および蛍光測定によってアナライトを検出するための試薬であって、蛍光酸化還元指示薬として前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を含む試薬である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、酸化還元反応によって測定することができるアナライトを検出する上で好適である。その検出は、定性的、半定量的または定量的であることができる。本発明の１実施形態では、アナライトは還元可能または酸化可能な物質、例えば血液、血清、血漿、尿などの体液中に存在する代謝物であることができる。この場合、酸化還元指示薬に加えて、アナライトを還元または酸化するための１種以上の酵素ならびに適宜にニコチンヌクレオシド誘導体（例：NAD+、NADP+）またはフラビンヌクレオシド誘導体（例：FAD）などの補酵素も含む検出試薬を使用することが適切である。そのようなアナライトの好ましい例には、グルコース、ラクテート(lactate)、アルコール、ガラクトース、コレステロール、果糖、グリセリン、ピルベート(pyruvate)、クレアチニン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、トリグリセリド、HDL-コレステロールがある。例えばグルコースは、グルコースオキシダーゼ（GOD）、グルコース色素オキシドレダクターゼ（Gluc-DOR）、またはグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）／ジアフォラーゼを用いる公知の方法によって検出することができる。
【００１２】
さらにアナライトとしては酸化還元反応を触媒する酵素も可能であり、例えばグルコースオキシダーゼ、グルコース色素オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼまたは反応をオキシドレダクターゼ反応と組み合わせることができる酵素などのオキシドレダクターゼがある。
【００１３】
酸化還元指示薬および必要に応じてアナライトの還元または酸化のための酵素以外に、検出試薬はさらに補酵素、補助物質、緩衝剤および場合によりメディエータなどの一般的な成分を含むことができる。酸化還元指示薬（Ｉ）による電子の受容を助ける物質は、メディエータとして好適である。しかしながら、一般に、電子を直接受容することができる酸化還元指示薬が好ましい。
【００１４】
本発明による方法は、乾式または湿式試験などの従来の試験方式で行う。乾式試験では、例えばテストストリップ形態の吸収材を、検出試薬を乾燥形態で、例えば凍結乾燥物として付与することができる支持体として用いる。液体試験は、例えばキュベット、マイクロタイタープレートなどの好適な反応容器内で液相中で行い、その場合、検出試薬は反応容器自体に入れてもよく、または乾燥形態もしくは液体形態で別個の容器に入れて提供することができる。
【００１５】
蛍光測定の場合、サンプルに所定波長の励起光を照射し、異なる波長を有するサンプルが出す蛍光発光を公知の方法によって測定する。置換基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の好適なものにより、本発明によってアナライトの測定に至適な試験様式を提供することができる。
【００１６】
酸化還元指示薬（Ｉ）には１以上の親水性基、例えばＯＨ基、ＣＯＯＨ基などを持たせることで、溶解度を高めることが好ましい。特に好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、ヒドロキシエチル基またはポリオキシエチレン基などのＯＨで置換されたＣ１−２アルキル基である。Ｒ３は好ましくはＮＯ２であり、ｎは１である。本発明による酸化還元指示薬の特に好ましい例を図１に示してある。
【００１７】
本発明の別の態様は、酸化還元反応および蛍光測定によってアナライトを検出するための試薬であって、酸化還元指示薬として上記の一般式（Ｉ）で表される化合物を含む試薬である。
【００１８】
酸化還元指示薬以外に、本発明による前記試薬は酵素、補酵素、補助物質、緩衝剤およびメディエータから選択される他の成分を含むこともできる。
【００１９】
添付の図面および実施例によって、本発明についての理解を深めることができる。
【実施例】
【００２０】
実施例：酸化還元指示薬としてNBD−アミン−Ｎ−オキサイドを用いるグルコース測定
３ｍＬ蛍光キュベットに下記の化合物を加えた（記載の濃度は、キュベット中での最終濃度を指す；NBD−アミンのＮ−オキサイドは、文献（P.B. Ghosh, M.W. Whitehouse, J. Med. Chem., 11, 305-311 (1968)）に従って製造した）。
【００２１】
グルコースデヒドロゲナーゼ（GlucDH）：1.3Ｕ／ｍＬ；
ジアフォラーゼ：1.3Ｕ／ｍＬ；
NAD+：36.9μｍｏｌ／Ｌ；
NBD−アミンのＮ−オキサイド：35.4μｍｏｌ／Ｌ。
【００２２】
グルコース水溶液（１％ＮａＣｌ含有0.1Ｍリン酸緩衝液、pH7.4）を加えることで、反応を開始した。反応の速度論を、励起波長470ｎｍおよび発光波長560ｎｍで各種グルコース濃度について記録した。実験結果を図２に示してある。
【００２３】
インパルス／秒（cps）単位での蛍光シグナルの強度（強度）を秒（sec）単位での時間に対してプロットした図２から、サンプル中に存在するグルコース濃度に比例した蛍光増加が認められることがわかる。この場合、曲線１〜５は、０、0.06、1.2、2.4および４（それぞれｍｇ／ｄＬ単位）のグルコース濃度に相当する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明による酸化還元指示薬の１例としてのNBD−アミンのＮ−オキサイドを示す図である。
【図２】各種グルコース濃度でのグルコース検出系におけるNBD−アミン−N−オキサイド還元の速度論を示す図である。
【図１】
2004264296.tif 000005
【図２】
2004264296.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月24日(2004.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化還元反応および蛍光測定によってアナライトを検出する方法であって、前記アナライトを含むサンプルを、蛍光酸化還元指示薬として下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含む検出試薬と接触させることを特徴とする方法。
【化１】
2004264296.tif 000007
［式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＲ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲおよびＯＣＯＲから選択され；
Ｒ３は各場合において独立に、ＮＯ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＳＲおよびハロゲンから選択され；
Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、その場合にアルキルはハロゲン、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＳＯ３Ｒおよびその塩および／またはＰＯ（ＯＲ）３およびその塩で置換されていても良く；
ｍは、１〜20の整数であり；
ｎは１、２または３である。］
【請求項２】
酸化還元反応および蛍光測定によってアナライトを検出するための試薬であって、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含むことを特徴とする試薬。
【化２】
2004264296.tif 000008
［式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＲ、ＣＯＲ、ＣＯＯＲおよびＯＣＯＲから選択され；
Ｒ３は各場合において独立に、ＮＯ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＳＲおよびハロゲンから選択され；
Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、その場合にアルキルはハロゲン、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ２、ＳＯ３Ｒおよびその塩および／またはＰＯ（ＯＲ）３およびその塩で置換されていても良く；
ｍは、１〜20の整数であり；
ｎは１、２または３である。］
【外国語明細書】
2004264296000001.pdf