(57)【要約】【課題】エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）関連疾患の免疫診断及び免疫療法に有用なエプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）に特異的ポリペプチドの提供。【解決課題】エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）関連疾患を有する個体からの検体中で抗体に結合できるポリペプチド、該ポリペプチドの保存的変異体及び混合物、これらのポリペプチドに対する抗体を検出する方法、ならびにこれらのポリペプチドを含む医薬組成物。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）関連疾患を有する個体からの検体中で抗体に結合できるポリペプチド。
（α　ＫＱＫＨＰＫＫＶＫＱＡＦＮＰＬ　β）ｎ　（Ｉ）
（式中、αとβは独立に０から５の天然に存在するアミノ酸であり、ｎは１から１０００である。）
【請求項２】
ｎが１である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列がＫＱＫＨＰＫＫＶＫＱＡＦＮＰＬである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列が（ＡＲＱＫＱＫＨＰＫＫＶＫＱＡＦＮＰＬＩ）ｎである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ｎが１である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
下記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）関連疾患を有する個体からの検体中で抗体に結合できるポリペプチド。
（α　ＧＭＬＥＡＳＥＧＬＤＧＷＩＨＱ　β）ｎ　（ＩＩ）
（式中、αとβは独立に０から５の天然に存在するアミノ酸であり、ｎは１から１０００である。）
【請求項７】
ｎが１である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列がＧＭＬＥＡＳＥＧＬＤＧＷＩＨＱである、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
下記式（ＩＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）関連疾患を有する個体からの検体中で抗体に結合できるポリペプチド。
（α　ＨＱＱＧＧＷＳＴＬＩＥＤＮＩＰ　β）ｎ　（ＩＩＩ）
（式中、αとβは独立に０から５の天然に存在するアミノ酸であり、ｎは１から１０００である。）
【請求項１０】
ｎが１である、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記式（ＩＩＩ）で表されるアミノ酸配列がＨＱＱＧＧＷＳＴＬＩＥＤＮＩＰである、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れかに記載のポリペプチドに対する抗体を検出する方法であって、検体を該ポリペプチドと接触させ、そして抗体が該ペプチドに結合するかどうかを確認することを含む方法。
【請求項１３】
検体が血液である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドが検出可能なように標識されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
検出可能標識が、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド状金属、化学発光化合物、生物発光化合物、リン光化合物、及び酵素からなる群から選ばれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ペプチドが固相に結合している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれに記載のポリペプチドに対する抗体を、かかる抗体を含有すると推測される検体中で検出するのに有用なキットであって、請求項１〜１１のいずれに記載のポリペプチドを含有する容器を含む１又は２以上の容器をその中に厳重に収納するように仕切られた運搬容器手段を含むキット。
【請求項１８】
少なくとも１回投与分の免疫原的有効量の請求項１から１１の何れかに記載のポリペプチドを製剤上の担体中に含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びそれに相補的なポリヌクレオチド配列。
【請求項２０】
請求項１から１１の何れかに記載のポリペプチドの保存的変異体。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、エプスタイン−バーウィルス関連疾患の診断及び治療に関する。より具体的には、これら様相は、ＥＢＶ特異的ペプチドの発見に基づく。
【０００１】
２．関連技術の説明
エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）は、全てのヒト集団に固有のヒトヘルペスウィルスである。殆どの人々は、幼児期にこのウィルスに感染して生涯このウィルスを保有している。初感染が青年期まで遅れると、感染性単核球症（ＩＭ）が頻繁に発生する。このウィルスは一定の種類の癌とも関係している。アフリカのマラリア地帯ではＥＢＶはバーキットリンパ腫の発生の寄与因子であり、東南アジアではこのウィルスは未分化鼻咽頭癌の高い罹患と関係している。
【０００２】
急性ウィルス感染は、特異性核抗原（ＥＢＮＡ−Ｉ及びＥＢＮＡ−ＩＩと呼ばれる）、“早期抗原（ＥＡ）”複合体、ウィルスキャプシッド抗原（ＶＣＡ）、及び他の関連分子の産生をもたらす。この“早期抗原複合体”は、細胞質＋核（即ち、拡散性分布）内又は細胞質内だけ（即ち、制限性）での免疫蛍光測定法でのそれらの分布に基づき、及びメタノール固定細胞内でのそれらの染色現象に基づき“早期抗原−拡散性（ＥＡ−Ｄ）”及び“早期抗原−制限性（ＥＡ−Ｒ）”抗原からなる。それぞれ分子量５０〜５５Ｋｄ、１７Ｋｄ、及び８５Ｋｄを有するこれらＥＡ抗原は、ＥＢＶ感染の“溶解”期の間に合成され、形質転換リンパ芽球様細胞内にはない。これら早期抗原に対する抗体は急性ＥＢＶ感染の間に存在し、次いでウィルスが潜伏期に入るときに消えてしまう。抗ＥＡ抗体の再出現はウィルス再活性化の信号を送って、鼻咽頭癌及びバーキットリンパ腫の如き疾患においてこのウィルスの可能な役割に糸口を提供する。
【０００３】
間接的な証拠が、シェーグレン症候群の患者におけるＥＢＶ再活性化のための可能な役割を示唆している。この症候群は、唾液腺（ＥＢＶ潜伏の普通の部位）のリンパ様浸潤物を特徴とする自己免疫疾患である。ＥＡ抗原に対する抗体は免疫蛍光測定法によって検出されるので、かかる抗体を自己免疫疾患の一部として抗核及び抗細胞質抗体を有する患者内で検出することはできない。従って、自己免疫疾患患者内の抗ＥＡ抗体の測定ができるようにするため及び急性又は再活性化ＥＢＶの他の患者内の抗ＥＡ抗体をより正確に定量するため、精製ＥＡ分子を有することが望ましいといえる。
【０００４】
最近、ＥＢＶのＤＮＡ配列が決定され　（Ｂａｅｒら，　Ｎａｔｕｒｅ　３１０：２０７，　１９８４）　ＥＡ−Ｄ抗原はゲノム内に局在していた。ＥＡ−Ｄタンパク質に向けられたモノクローナル抗体を用いて、部分アミノ酸配列決定及びかくしてそのコーディング配列の位置確認ができるように十分なタンパク質が精製された。その情報を用いて、そのＤＮＡ配列に基づく一連の合成ペプチドを調製することが可能となった。ＥＢＶのＥＢＮＡ−Ｉ抗原　（Ｒｈｏｄｅｓら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１３４：２１１，　１９８５）　及びＥＢＮＡ−ＩＩ抗原　（Ｄｉｌｌｎｅｒ，　Ｊ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８１：４６５２，　１９８４）　上の免疫学的に重要なエピトープを同定するのに同戦略が有用であることが判明した。ＩＭ及び他の疾患状態の患者からの免疫性ヒト血清と反応性のエピトープを含有するＥＡ−Ｄ分子から誘導した合成ペプチドも記載されている　（Ｆｏｘ　ら，　Ｊ．
Ｃｌｉｎ．　Ｌａｂ．　Ａｎａｌ．，　１：１４０，　１９８７）　。
【０００５】
最近の研究は、タンパク質の一次アミノ酸残基配列の短い線状セグメントに対応する化学的に合成されたポリペプチドを用いて天然タンパク質と免疫反応する抗体を誘発できることを示した　（Ｌｅｒｎｅｒら，　Ｎａｔｕｒｅ，　２９９：５９２，　１９８２；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２１９：２６０，　１９８３）　。加えて、幾つかの研究は、合成ポリペプチドが天然タンパク質によって誘発された抗体と免疫反応できることを示した　（Ｒｈｏｄｅｓら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１３４：２１１，　１９８５）。かくして、幾つかの合成ポリペプチドは、天然タンパク質の免疫原及び抗原決定基を免疫学的に擬態できる。
【０００６】
しかしながら、当該技術分野で周知のように、合成ペプチド技術の適用は、依然として幾つかの欠点を持っている。例えば、天然タンパク質上の抗原決定基を擬態できるペプチドを同定するには、そのタンパク質のアミノ酸残基配列を知ることが必要である。そのタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列からアミノ酸残基配列を予測することができるが、そのような予測は、その遺伝子の正確なリーディングフレームが既知である場合に行えるに過ぎない。
【０００７】
ＥＢＶゲノムの核酸配列は分かっている。しかしながら、たとえタンパク質のアミノ酸残基配列が分かっていても、免疫原及び抗原決定基を構成するタンパク質内の座を同定する方法は本来実験的なものであって予測可能な結果をもたらさない。これには少なくとも２つの理由がある。第１に、タンパク質の三次元構造が分からなければ、そのタンパク質の線状セグメントが宿主免疫系を利用できることを確認するための信頼できる方法はない。第２に、三次元構造が分かっているかどうかに関わらず、短い線状ポリペプチドは、適切な免疫原及び抗原決定基を構成するために要求される二次及び三次コンフォメーション構造を擬態する能力を有さないと思われる場合が多い　（Ｔａｉｎｅｒら，　Ｎａｔｕｒｅ，　３１２：１２７，　１９８４）。しかしながら、Ｔ又はＢ細胞と優先的に相互作用する分子の優勢エピトープの同定を可能にする　Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ　のアルゴリズム　（ＡＭＰＨＩ　ｐｒｏｇｒａｍ，　１９８７）　の如き方法が開発されている。
【０００８】
以前の研究で、ウィルス複製サイクルの間に合成されるＥＢＶ誘発抗原に対する細胞性免疫応答が調べられた　（Ｐｏｔｈｅｎら，　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ，　４９：６５６，　１９９１）。その結果は、早期抗原（ＥＡ）複合体の幾つかの成分が、主要膜糖タンパク質、つまりｇｐ３５０／２５０で以前に認められたものと類似の強いＴ細胞増殖応答の誘発に非常に有効であることを証明した　（Ｕｌａｅｔｏら，　Ｅｕｒｏｐ．　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１８：１６８９，　１９８８）。ＥＢＶ感染ドナーからのＣＤ４＋　及びＣＤ８＋　両方のリンパ球集団が、ＥＡ複合体からイムノアフィニティクロマトグラフィーによって精製したポリペプチドの存在下で増殖した。ＥＡ−Ｄの主要ポリペプチド及びＥＡ−Ｒの主要ポリペプチドの１つが、このＴ細胞認識測定法で特に有効であった。そのデータは、ＥＡ複合体のこれら成分が、ＥＢＶ感染又は不死化細胞の免疫監視において重要な標的抗原として機能することを示唆した。ＥＡ−Ｒ複合体ポリペプチド上で発現される優勢Ｔ及びＢ細胞エピトープを同定すれば、ＥＢＶ関連リンパ増殖性疾患の個体の診断及び管理におけるこれら成分に対する抗体応答の重要性に関する情報が得られるであろう。
【０００９】
疾患と関連するＥＢＶの診断ができるような、検体中のＥＡ−Ｒ又はＥＡ−Ｄ及び抗ＥＡ−Ｒ又は抗ＥＡ−Ｄ抗体の存在を検査する改善された方法、並びに感染性単核球症の如き疾患の病期の診断法を開発することが望まれよう。ＥＡ−Ｒ／ＥＡ−Ｄポリペプチド上のＢ及びＴ細胞エピトープを同定することは、ＥＢＶ関連リンパ増殖性疾患の個体において診断及び疾患管理の目的で用いる分子の合成への重要なステップとなろう。
【００１０】
発明の要旨
本発明は、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）に特異的な免疫原部位を規定するポリペプチドを提供する。これらポリペプチドは、ＥＢＶ関連疾患の免疫診断及び免疫療法に、並びにこれらポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するのに用いることができる。これらモノクローナル抗体を用いて本発明のポリペプチドを含む抗原を検出することができ、また治療に用いてＥＢＶ関連疾患を改善することもできる。
【００１１】
本発明の好ましい態様の詳細を添付図面及び以下の説明で述べる。一旦本発明の詳細を理解すれば、更なる多数の改良及び変更が当業者に自明となろう。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様は、エピトープポリペプチド　ＥＴＦＴＥＴＷＮＲＦＩＴＨＴＥ（配列番号：１）、ＧＭＬＥＡＳＥＧＬＤＧＷＩＨＱ（配列番号：２）、ＨＱＱＧＧＷＳＴＬＩＥＤＮＩＰ（配列番号：３）、ＫＱＫＨＰＫＫＶＫＱＡＦＮＰＬ（配列番号：４）、及びこれらペプチドの保存的変異体及び混合物を含む。ここで用いる“保存的変異体”という用語は、他の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換体を意味する。保存的変異体の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの如き１疎水性残基の他の１残基との置換、又はアルギニンのリシンとの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸との置換、若しくはグルタミンのアスパラギンとの置換の如き１極性残基の他の１残基との置換、及びそれに類したものが含まれる。この“保存的変異体”という用語には、未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を用いることも含まれる。但し、その置換ポリペプチドに対して生じた抗体もその未置換ポリペプチドと免疫反応するものとする。かくして、ＥＢＶ関連疾患の患者からの血清で保存的変異体ポリペプチドを試験するなどの日常的スクリーニング方法を用いることによって、当業者は不当に実験を積むことなく変異体ポリペプチドが本発明のポリペプチドの必要な生物活性を有するかどうかを容易に確認できる。
【００１３】
本発明のエピトープポリペプチドは、それらの血清学的反応性を増すためにアミノ末端又はカルボキシ末端において追加のアミノ酸を含有してもよい。好ましくは、これら追加のアミノ酸残基は、これらアミノ酸の保存的変異体に関して、天然に存在するタンパク質のアミノ酸であって、独立に約０〜約５の数である。例えば、配列番号：１の変異体はエピトープポリペプチド　ＱＮＳＥＴＦＴＥＴＷＮＲＦＩＴＨＴＥＨＶＤ　を含み、配列番号：４の変異体はエピトープポリペプチド　ＡＲＱＫＱＫＨＰＫＫＶＫＱＡＦＮＰＬＩ　を含む。下線を引いたアミノ酸はもとのポリペプチドの延長部分を表す。本発明のポリペプチドは、１から約１００単位長に及ぶ繰り返し単位として用いることもできる。これら単位は、例えば、全ての単位が同じポリペプチドの繰り返しである同型のものであっても、本発明のポリペプチドの混合物であってもよい。
【００１４】
本発明のペプチドは、単独で用いても、混合物で用いても、凝集体、ポリマー及びそれに類したものの如き多量体として用いてもよい。従って、本発明は、そこに含まれる本発明の個々のポリペプチドに関して同種又は異種のポリマーを生成する１又は２以上の本発明の同じか又は異なるポリペプチドを含むポリペプチドを包含する。種々の混合物、凝集体、多量体及びそれに類したものを作る適切な技術は、当業者にとって既知であろう。例えば、本発明は、配列番号：１と配列番号：２、３若しくは４又はこれらのあらゆる組み合わせを含むポリペプチドであって、例えば、スペーサー又はリンカー部分を用いることによってそれら配列を直接又は間接に連結しているポリペプチドを包含する。
【００１５】
本発明のペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　８５：２１４９，　１９６２　及び　Ｓｔｅｗａｒｔ　と　Ｙｏｕｎｇ，　Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　（Ｆｒｅｅｍａｎ，　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，　１９６９，　ｐｐ．２７−６２）　に記載されている周知の固相ペプチド合成法により、０．１〜１．０ミリモルアミン／ｇポリマーを含有するスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーを用いて合成することができる。化学合成の終了時に液体ＨＦ−１０％アニソールで約　１／４〜１時間０℃で処理することによって、ペプチドを脱保護してこのポリマーから切り離すことができる。それら試薬を留去した後、ペプチドをポリマーから１％酢酸溶液で抽出し、次いで凍結乾燥して粗製物を得る。これは普通５％酢酸を溶媒として用いるセファデックスＧ−１５でのゲル濾過の如き技術によって精製できる。このカラムの適切な画分を凍結乾燥すると、均質なペプチド又はペプチド誘導体が生成するであろう。これは、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外線吸収スペクトル、モル旋光度、溶解性の如き標準的技術によってその特徴を明らかにすることができ、そして固相エドマン分解により定量することができる。
【００１６】
合成中又は合成後に、反応性のアミノ酸を種々の保護基で保護してもよい。例えば、システインを３，４−ジメチルベンジル（ＤＭＢ）基により、アルギニン及びヒスチジンをトシル（ＴＯＳ）基により、アスパラギン酸及びグルタミン酸をベンジル（Ｂｚｌ）基により、そしてリシンを２−クロロベンジルオキシカルボキシル（２−ＣＢＺ）基により保護することができる。他の保護基が周知であり、本発明に用いることができる。当業者は、ペプチド合成の他の技術を知っているか、又は不当に実験を積むことなくかかる技術を容易に探知できるであろう。
【００１７】
また、本発明のポリペプチドは、当業者に広く知られている組換え技術を用いてつくることができる（例えば、Ｃｏｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ａｕｓｂｅｌら編，　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９　を参照のこと。なお、これは参照によりここに組み入れられるものとする。）。
【００１８】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。ここで用いる場合“ポリヌクレオチド”は、別々の断片の形にあるか又は大きな構築体の成分としてのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのポリマーのことをいう。本発明のペプチドをコードするＤＮＡは、組換え転写装置内で発現されることができる合成遺伝子を提供するｃＤＮＡ断片からでもオリゴヌクレオチドからでも組み立てることができる。本発明のポリヌクレオチド配列には、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びｃＤＮＡ配列が含まれる。ポリヌクレオチド配列は遺伝子コードから推定することができるが、コードの縮重を考慮しなければならない。本発明のポリヌクレオチド配列には、遺伝子コードの結果としての縮重物である配列が含まれる。本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的であってハイブリダイズできる配列も包含する。
【００１９】
“ＥＢＶ関連疾患”という用語は、ＥＢＶにより直接又は間接に起こるあらゆる疾患並びに患者にＥＢＶによる感染を受けやすくする疾患を意味する。前者のカテゴリーに入る疾患の例には、感染性単核球症、鼻咽頭癌、及びバーキットリンパ腫が含まれる。後者のカテゴリーに入る疾患（即ち、患者をＥＢＶ感染の危険に曝す疾患）には、シェーグレン症候群が含まれ、広くは、臓器移植及び一定の癌治療を受けた患者の如き免疫抑制の又は免疫系の機能が低下した状態を起こすあらゆる状況が含まれる。
【００２０】
本発明は、更に、本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体並びにこれらモノクローナル抗体を診断及び治療に使用することに関する。この特異性により、このポリペプチド又はこのポリペプチドを含むアミノ酸鎖が検体又はヒトの如き宿主内に存在するときに、このモノクローナル抗体、及び類似の特異性を有する類似のモノクローナル抗体を本発明のポリペプチドに結合させるのに用いるのが可能になる。
【００２１】
不当な実験を積むことなく本発明のモノクローナル抗体を産生させるのに多くの技術を用いることができる。本発明のポリペプチドは性質が高度に規定されているので、かかるモノクローナル抗体の産生をかなりの程度まで定型的なものにすることができる。かくして、本発明のポリペプチドを免疫感作及び／又はスクリーニングに用いるかどうかに関わらず、そのポリペプチド上の免疫原決定基の数が非常に限定されているので、例えば、クローン発現のレパートリーをできるだけ限定することにより、本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞系の同定は非常に簡略化される。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体の産生に非常に有用な細胞系のタイプの１つはハイブリドーマである。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作るために用いる一般的な方法は周知である　（Ｋｏｈｌｅｒ　と　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，　Ｎａｔｕｒｅ，　２５６：４９５，　１９７５）　。次いで、得られたハイブリドーマを本発明のポリペプチドに結合できるモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングした。
【００２３】
感作及び／又は免疫感作、細胞融合、腹水産生、混合ハイブリドーマの選択、又はモノクローナルハイブリドーマのサブクローニングの技術は当該技術分野で広く周知である。Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　ら，米国特許第４，１７２，１２４号、Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　ら，　米国特許第４，１９６，２６５号、又は　Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ，　Ｊ．Ｙ．と　Ｈｏｆｆｍａｎ，　Ｔ．，　Ｂａｓｉｃ　Ｆａｃｔｓ　ａｂｏｕｔ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，　ｉｎ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌ．　ＩＩ，Ｌ．　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　編　（１９８１）　に留意のこと。なお、これらは参照によりここに組み入れられるものとする。
【００２４】
一般に、この精製エピトープペプチドは、この合成ペプチドが免疫原タンパク質に連結橋、例えば、マレイミドベンゾイル化（ＭＢ）キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）で非定方向的に結合できるように、Ｃ末端で結合したシスチンを有する。他の免疫原結合体、例えば、アルブミン及びそれに類したものも用いることができる。得られる構造体は１分子のタンパク質に連結した幾つかのペプチド構造体を有することができる。
【００２５】
この合成ペプチドに対して免疫感作された宿主から誘導される体細胞をいずれかの適する免疫感作技術により得ることができる。この抗原を、通常は上記のようなタンパク質結合体の形で、いずれかの適当な方法により、好ましくは腹腔内、静脈内、皮下、又は足蹠内のいずれかでの注射により投与することによって、宿主被験体を免疫感作する。この免疫感作手順にアジュバントを含めてもよい。
【００２６】
このタンパク質結合抗原で初回免疫感作した後、数回の追加抗原注射を数週間の間隔で周期的に投与してもよい。次いで、各宿主の血漿中に含有される抗体を本発明の免疫感作ポリペプチドとのその反応性について試験することができる。通常は最高の応答を有する宿主が、ハイブリドーマの産生に用いる体細胞を分泌する抗体のドナーとして最も好ましい。また、静脈内及び／又は腹腔内経路により追加量のペプチド−タンパク質結合体を繰り返し注射するこによって過免疫感作を行うことができる。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの単離は、興味の対象であるモノクローナル抗体の基本反応パターンの確認ができる日常的スクリーニング技術を用いて行うことができる。かくして、試験されるモノクローナル抗体が本発明のポリペプチドと結合するなら、試験されるその抗体と本発明のハイブリドーマによって産生される抗体は同等である。
【００２８】
また、本発明は、本発明の好ましいモノクローナル抗体の結合に具体的に要求されるポリペプチド又はアミノ酸配列を教示するので、今度はこれらポリペプチドを免疫感作の目的のために用いて、このポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体をつくるハイブリドーマを産生させることが可能になる。このアプローチは、このポリペプチドによる免疫感作で提示される抗原決定基の数を限定することによって生じるモノクローナル抗体のレパートリーを減少させるという追加の効果を有する。この方法によって産生されるモノクローナル抗体は、標準的技術を用いて、例えば、マイクロタイタープレートにポリペプチドを結合させてモノクローナル抗体の結合をＥＬＩＳＡ測定法により測定することによって、特異性をスクリーニングすることができる。
【００２９】
あるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを、前者が本発明のポリペプチドへの後者の結合を阻止するか否かを確認することによって、不当な実験を積むことなしに確認することも可能である。試験されるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合して本発明のモノクローナル抗体による結合の減少が示されるなら、これら２つのモノクローナル抗体は同じか又は密接に関連するエピトープに結合すると言えよう。
【００３０】
あるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを確認するなおもう１つの方法は、本発明のモノクローナル抗体をそれが正常では反応性である本発明のポリペプチドと予備インキュベートさせてから、試験されるモノクローナル抗体を添加して、その試験されるモノクローナル抗体がその抗原に結合する能力を阻害されるかどうかを確認する方法である。試験されるモノクローナル抗体が阻害されれば、多分、それは本発明のモノクローナル抗体と同じか又は密接に関連するエピトープ特異性を有するであろう。
【００３１】
異なる宿主受容種内で外来ドナー種からのモノクローナル抗体を　ｉｎ　ｖｉｖｏ　で用いるのは通常は複雑ではないが、生じ得る潜在的な問題は、そのドナー抗体上に存在する抗原決定基に対する宿主による免疫学的副作用の出現である。幾つかの場合には、この副作用は、宿主内でのドナー抗体の　ｉｎ　ｖｉｖｏ　使用を短縮させるほど重いものであり得る。更に、この宿主副作用は、ドナー抗体のＥＢＶ関連疾患抑制効力を遮るように働き得る。宿主内で起こる免疫副作用の可能性を回避することが可能な１つの方法は、キメラ抗体を用いることによる方法である　（Ｓｕｎ　ら，　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，　５　（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１）：　Ｓ１７，　１９８６；Ｏｉら，　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　４（３）：２１４，　１９８６）　。キメラ抗体は、抗体の重鎖及び軽鎖の種々のドメインが１を越える種からのＤＮＡによってコードされる抗体である。典型的には、キメラ抗体は、所期の抗原特異性の抗体を産生するドナー種から誘導される重鎖（ＶＨ　）及び軽鎖（ＶＬ　）の可変ドメイン、及び宿主受容種から誘導される重鎖（ＣＨ　）及び軽鎖（ＣＬ　）の可変ドメインを含むであろう。これらドナー抗体ドメインの抗原決定基、特にＣＨ　領域内のものに宿主免疫系を曝すのを減らすことによって、受容種内で起こる免疫学的副反応の可能性が軽減されると考えられる。従って、例えば、本発明のハイブリドーマから単離されるＤＮＡによりコードされるマウスＶＨ　及びＶＬ　ドメイン及びヒト白血球から単離されるＤＮＡでコードされるＣＨ　及びＣＬ　ドメインを含む、ヒトにおける　ｉｎ　ｖｉｖｏ　臨床用途のためのキメラ抗体を産生することが可能である。
【００３２】
一定の状況下では、１アイソタイプのモノクローナル抗体が他のものよりもそれらの診断的又は治療的効力の点でより好ましいかも知れない。例えば、抗体媒介細胞溶解の研究から、アイソタイプγ−２ａ及びγ−３の未修飾マウスモノクローナル抗体は、γ−１アイソタイプの抗体よりも標的細胞の溶解に概してより効果的であることが知られている。この効力の差は、標的細胞の細胞溶解的破壊に、より積極的に参加するγ−２ａ及びγ−３アイソタイプの能力のによるものと考えられる。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプを、初回融合体からの選択によって直接に調製しても、異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマからクラススイッチ変異体を単離するための同胞選択技術を用いることによって二次的に調製してもよい　（Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８２：８６５３，　１９８５；Ｓｐｉｒａ　ら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　７４：３０７，１９８４）。かくして、本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドに対する特異性を有するクラススイッチ変異体を含むことになろう。
【００３３】
当業者は、本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマの単離を抗イディオタイプ抗体を産生させることによって行うこともできる　（Ｈｅｒｌｙｎら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３２：１００，　１９８６）　。抗イディオタイプ抗体とは、興味の対象であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体上に存在する特有の決定基を認識する抗体のことである。これら決定基は、その抗体の超可変領域内に位置している。所与のエピトープに結合するのはこの領域であり、従ってその抗体の特異性を司っている。抗イディオタイプ抗体は、興味の対象であるモノクローナル抗体で動物を免疫感作することによって調製することができる。この免疫感作動物は、免疫感作抗体のイディオタイプ決定基を認識してそれに応答し、そしてこれらイディオタイプ決定基に対する抗体を産生するであろう。この第２動物を免疫感作するのに用いた単独ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に特異的であるこの免疫感作動物の抗イディオタイプ抗体を用いることによって、今度は免疫感作に用いたハイブリドーマの抗体と同じイディオタイプを有する他のクローンを同定することが可能になる。
【００３４】
２つのハイブリドーマのモノクローナル抗体間のイディオタイプの同一性が、それら２つのモノクローナル抗体が同じエピトープ決定基の認識に関して同じものであることを証明する。従って、抗イディオタイプ抗体を用いることによって、同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを同定することが可能である。
エピトープを擬態するモノクローナル抗体を産生するのに抗イディオタイプ技術を用いることも可能である。例えば、第１モノクローナル抗体に対して作った抗イディオタイプモノクローナル抗体は、その第１モノクローナル抗体により結合されるエピトープの“イメージ”である超可変領域内の結合ドメインを有するであろう。かくして、この抗イディオタイプモノクローナル抗体を免疫感作に用いることができるだろう。というのは、この抗イディオタイプモノクローナル抗体結合ドメインは抗原として働くからである。
【００３５】
ＥＢＶ関連疾患の　ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断及び治療に特に好ましいのはヒトモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体分野における最近の発展により、今日では、組換えクローニング技術を用いることによってヒトモノクローナル抗体を簡単に産生させることができる。典型的には、これら技術は、興味の対象である抗原に対して表出された抗体を有する患者からのリンパ球を用い、これらリンパ球から単離される核酸から組換えライブラリーをつくる。このライブラリーは、宿主生物内の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のクローニングができるように適合させた発現ベクターを含有する。特定の抗原に対する所期の特異性を有する抗体を産生する個々のコロニーを、例えば、固体面にその抗原を付着させてその抗原について“パンニング”（“ｐａｎｎｎｉｎｇ”）することによって同定することができる。（例えば、Ｂｕｒｔｏｎら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８８：１０１３４，　１９９１　を参照のこと。なお、これは参照によりここに組み入れられるものとする。）。
【００３６】
かくして、当業者は、同じようにして、本発明のペプチドに特異的なヒトモノクローナル抗体を、ＥＢＶへの体液性免疫を有する個体のリンパ球からの核酸、好ましくはｍＲＮＡを用いて組換えライブラリーをつくり、そうしてつくったライブラリーを本発明のポリペプチドを用いてスクリーニングすることによって日常的な事柄として産生させることができる。本発明のポリペプチドの高度に規定された性質から見て、各ポリペプチドはほんの僅かのエピトープ（おそらく１又は２）しか持たないであろうから、このライブラリーのスクリーニングは、不当な実験を要さずに簡単かつ非常に限定的に行うことができる。
【００３７】
この発明で用いる“抗体”という用語は、完全な分子だけでなくＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２　の如きエピトープ決定基に結合することができるそれらの断片も含めようとするものである。
【００３８】
本発明のモノクローナル抗体は、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　又は　ｉｎ　ｖｉｖｏ　免疫診断又は免疫療法を施すことが望ましいあらゆる動物に用いることができる。ここに用いる“動物”という用語は、ヒト及び非ヒトの両者を含むことを意味するものである。
【００３９】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、それらを液相で用いることができるか又は固相キャリヤーに結合させることができる免疫測定法に用いるのに適している。加えて、これら免疫測定法におけるモノクローナル抗体を種々の方法で検出可能であるように標識することができる。本発明のモノクローナル抗体を用いることができる免疫測定法のタイプの例は、直接又は間接型のいずれかの競合及び非競合免疫測定法である。かかる免疫測定法の例は、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）及びサンドイッチ（免疫測定）法である。本発明のモノクローナル抗体を用いる抗原の検出は、生理学的サンプルでの免疫組織化学的測定法を含む、順向、逆向、又は同時モードのいずれかで作動する免疫測定法を用いて行うことができる。当業者は、不当な実験を要さずに他の免疫測定法を知り、容易に認識できるであろう。
【００４０】
本発明のモノクローナル抗体は多くの異なるキャリヤーに結合することができるので、本発明のポリペプチドを含む抗原の存在を検出するのに用いることができる。周知のキャリヤーの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄鉱が含まれる。キャリヤーの性質は、本発明の目的により可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者は、モノクローナル抗体を結合するのに適する他のキャリヤーを知っているか、又は日常的な実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。
【００４１】
当業者に知られている多くの異なる標識及び標識方法がある。本発明に用いることができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド状金属、化学発光化合物、リン光化合物、及び生物発光化合物が含まれる。当業者は、このモノクローナル抗体に結合させるのに適する他の標識を知っているか、又は日常的な実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。更には、本発明のモノクローナル抗体へのこれら標識の結合は、当業者にとって常識である標準的技術を用いて行うことができる。
【００４２】
本発明の目的のために、本発明のポリペプチドに特異的な抗体又は本発明のポリペプチドを含む抗原は、生物学的流体及び組織中に存在している場合に本発明のモノクローナル抗体によって検出することができる。検出可能な量のかかる抗原を含有するあらゆる検体を用いることができる。サンプルは、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清及びそれに類したものの如き液体であっても、又は組織、糞便、及びそれに類したものの如き固体若しくは半固体であっても、別に、組織診に普通に用いられるものの如き固体組織であってもよい。特に好ましいサンプルは血液である。
【００４３】
より高感度をもたらすことができるもう１つの技術は、低分子量ハプテンへの抗体のカップリングからなる。次いで、これらハプテンを第２反応によって特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、又は特異的抗ハプテン抗体と反応できるジニトロフェニル、ピリドキサール、及びフルオレセインの如きハプテンを用いるのが普通である。
【００４４】
この発明で用いる場合“エピトープ”という用語は、本発明のモノクローナル抗体と特異的相互作用ができるあらゆる決定基を含めようとするものである。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸又は糖側鎖の如き化学的に活性な分子の表面集合体からなり、通常は特有の三次元構造的特徴、並びに特有の電荷的特徴を有する。
【００４５】
抗原の　ｉｎ　ｖｉｖｏ　検出に本発明のモノクローナル抗体を用いるに際して、検出可能標識モノクローナル抗体を診断的に有効である量で与える。この“診断的に有効”という用語は、検出可能標識モノクローナル抗体の量が、そのモノクローナル抗体が特異的である本発明のポリペプチドを含む抗原を有する部位の検出を可能にできる十分な量で投与されることを意味する。
【００４６】
投与される検出可能標識モノクローナル抗体の濃度は、そのポリペプチドを有する細胞への結合がバックグランドに比較して検出できるように十分であるべきである。更に、最良の標的対バックグランドシグナル比が得られるように、検出可能標識モノクローナル抗体が循環系から速やかに除かれるのが望ましい。
【００４７】
一般に、ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断のための検出可能標識モノクローナル抗体の投与量は、個体の年齢、性別、及び疾患の程度の如き要因に依存して変動するであろう。モノクローナル抗体の投与量は、約０．０１〜約５００ｍｇ／ｍ２　、好ましくは０．１〜約２００ｍｇ／ｍ２　、最も好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／ｍ２　で変動してもよい。かかる投与量は、例えば、多数回注射をするかどうか、抗原荷重、及び当業者によって知られている他の要因に依存して変動してもよい。
【００４８】
ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断的画像化　（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｉｍａｇｉｎｇ）　については、利用できる検出装置のタイプが所与の放射性同位元素を選択するに際しての主要因である。選んだ放射性同位元素は、所与のタイプの装置について検出可能であるタイプの放射崩壊を有さなければならない。ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断用放射性同位元素を選択するに際してのいま１つの重要な要因は、その放射性同位元素の半減期が、標的による最大取り込み時間でも依然として検出可能であるよう十分に長いが、宿主に関して有害な照射が最小限になるよう十分に短いことである。理想的には、ｉｎ　ｖｉｖｏ　画像化に用いる放射性同位元素は粒子放射を欠くであろうが、従来のγカメラにより容易に検出できる１４０〜２５０ｋｅＶの範囲で多数の光子を発生するであろう。
【００４９】
ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断については、放射性同位元素を中間官能基を用いることによって直接にでも間接にでも免疫グロブリンに結合させることができる。金属イオンとして存在する放射性同位元素をイムノグロブリンに結合させるのに用いられることが多い中間官能基は、ジエチレントリアミン・五酢酸（ＤＴＰＡ）及びエチレンジアミン・四酢酸（ＥＤＴＡ）及び類似の分子の如き２官能性キレート剤である。本発明のモノクローナル抗体に結合することのできる金属イオンの典型的な例は、　１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、及び　２０１Ｔｌである。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）又は電子スピン共鳴（ＥＳＲ）におけるように、ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断の目的に常磁性同位元素で標識することもできる。一般に、診断的画像を可視化するあらゆる従来の方法を用いることができる。通常、γ及び陽電子放出性放射性同位元素が、カメラ画像化及びＭＲＩ用常磁性同位元素に用いられる。かかる技術に特に有用な元素には、　１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、　１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅが含まれる。
【００５１】
本発明のモノクローナル抗体は、動物におけるＥＢＶ関連疾患の改善の経過を追跡するために　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　及び　ｉｎ　ｖｉｖｏ　で用いることができる。従って、例えば、本発明のポリペプチドを含む抗原を発現する細胞の数の増加若しくは減少又は種々の体液中に存在するかかる抗原の濃度の変化を測定することによって、ＥＢＶ関連疾患の改善を目指した特定の療法が有効であるか否かを確認することが可能になるであろう。
【００５２】
この“改善”という用語は、治療を受けている動物におけるＥＢＶ関連疾患の好ましくない影響を軽減することを意味する。“治療的に有効”という用語は、用いるモノクローナル抗体又はポリペプチドの量がＥＢＶ関連疾患を改善するのに十分な量であることを意味する。
【００５３】
本発明で用いる場合“免疫原的有効量”という用語は、例えば、本発明のポリペプチドを含む抗原に結合するであろう抗体の産生を刺激することによって、ＥＢＶ関連疾患に対する改善的免疫応答を誘発するのに必要なポリペプチドの量のことである。
【００５４】
本発明のポリペプチドに対する免疫応答の誘発に際しては、そのポリペプチドを、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収により非経口で、及び経口で投与することができる。非経口投与用製剤には、滅菌した水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、及び乳剤が含まれる。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油の如き植物油、及びオレイン酸エチルの如き注射可能な有機エステルである。閉鎖包帯のための製剤上の担体を用いて、皮膚透過性を高めて抗原吸収を増進させることができる。経口投与のための液体製剤は、一般に、その液体投与製剤を含有するリポソーム溶液を含む。このリポソームを懸濁するのに適する製剤には、精製水の如き当該技術分野で普通に用いられる不活性希釈剤を含有する乳剤、懸濁剤、溶液剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が含まれる。不活性希釈剤の他に、かかる組成物は、アジュバント、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、及び甘味剤、矯味剤、及び香料も含むことができる。
【００５５】
本発明のポリペプチドを含有する抗原性製剤がアジュバントを含むのも可能である。アジュバントは、特異的免疫応答を非特異的に増大させるために用いられる物質である。普通、免疫系に供給する前にアジュバントと抗原を混合するか、又は免疫感作される動物の同一部位に別々に供給する。アジュバントはそれらの組成に基づいて幾つかのグループに大まかに分けることができる。これらグループには、油性アジュバント（例えば、フロイント完全及び不完全）、無機塩（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２　、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２　、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２　、カオリン、及び炭素）、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣ及びポリＡＵ酸）、並びに一定の天然物（例えば、結核菌からのワックスＤ、及びコリネバクテリウム・パーブム　（ｐａｒｖｕｍ）　、百日咳菌、及びブルセラ属のメンバーに見出される物質）が含まれる。
【００５６】
動物を免疫感作するのに用いるポリペプチド抗原の物理的形態は、凝集体であっても非凝集体であってもよい。凝集ポリペプチドは、例えば、グルタルアルデヒド又は他の架橋剤での処理の如き普通の技術により、非凝集ポリペプチドから作ることができる。次いで、こうして誘導された凝集ポリペプチドは、活性免疫反応を誘発するのに有効なＥＢＶ関連疾患改善組成物の製造用に用いることができるであろう。しかしながら、凝集体又は非凝集体のいずれで動物を免疫感作するかに関わらず、これら両方の形態のポリペプチドは、このポリペプチドに対する抗体を産生させる筈である。従って、これら抗ポリペプチド抗体を、例えば、検体中のポリペプチドの存在を検出するためのキット中におけるように、診断に用いることが可能である。
【００５７】
上記のように、本発明のポリペプチド抗原製剤は、このポリペプチドのエピトープ決定基に結合するであろう抗体の産生を誘発するのに用いることができる。ポリペプチドに対する抗体の産生を増進する特に有用な方法は、本発明のポリペプチド抗原製剤で初回免疫感作してから後の免疫感作を行う方法である。多数回免疫感作法を用いる場合は、免疫感作の時期を定める多くの異なる技術が存在する。本発明の抗原性製剤を１回より多く用いて、免疫感作動物により発現される免疫グロブリンレパートリーの発現のレベル及び多様性を向上させることが可能である。典型的には、多数回免疫感作を行う場合には、それらには１〜２ヶ月の間隔をあけるだろう。一般に、動物に投与されるポリペプチドの量は、年齢、状態、性別及び疾患の程度の如き要因に依存して変動するであろう。そして、もし他の変動要因があっても、当業者により調節され得る。本発明の抗原性ポリペプチド製剤は１回投与としてでも多数回投与としてでも投与でき、投与当たり約５０〜約５００ｍｇ、より好ましくは投与当たり約５０〜約３００ｍｇ、最も好ましくは投与当たり約１００〜約２００ｍｇのポリペプチド抗原で変動させることができる。本発明のモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体と反応性のエピトープを有するＥＢＶ関連疾患を有する動物における免疫療法に、単独で用いてもエフェクター細胞　（Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ　ら，　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，　５　（Ｓｕｐｐ．　１：Ｓ１３９，　１９８６）　と組み合わせて用いてもよい。
【００５８】
免疫療法に用いる場合、本発明のモノクローナル抗体を治療剤で標識しなくても標識してもよい。これら治療剤は、本発明のモノクローナル抗体と直接にでも間接にでもカップリングすることができる。間接カップリングの一例は、スペーサー部分の使用によるものである。これらスペーサー部分は不溶性であっても可溶性であってもよく　（Ｄｉｅｎｅｒら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３１：１４８，　１９８６）　、標的部位においてモノクローナル抗体分子から医薬品放出ができるように選択することができる。免疫療法用に本発明のモノクローナル抗体にカップリングさせることのできる治療剤の例は、医薬品、放射性同位元素、レクチン、及びトキシンである。
【００５９】
本発明のモノクローナル抗体に結合できる医薬品には、非タンパク質医薬品のみならずタンパク質医薬品も含まれる。この“非タンパク質医薬品”という用語は、古典的に医薬品と言われている化合物、例えば、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、及びビンブラスチンを包含する。
【００６０】
本発明のモノクローナル抗体を標識してもよいタンパク質医薬品には、免疫調節剤及び他の生物学的応答調節剤が含まれる。この“生物学的応答調節剤”という用語は、例えば、本発明のモノクローナル抗体が特異的である本発明のポリペプチドを含むＥＢＶ抗原を有するＥＢＶ関連疾患細胞の破壊を増進するようなやり方で、免疫応答の調節に関与する物質を含めようとするものである。免疫応答調節剤の例には、リンフォカインのような化合物が含まれる。リンフォカインには、腫瘍壊死因子、インターロイキン１、２及び３、リンフォトキシン、マクロファージ活性化因子、遊走阻止因子、コロニー刺激因子、及びインターフェロンが含まれる。本発明のモノクローナル抗体を標識してもよいインターフェロンには、α−インターフェロン、β−インターフェロン、及びγ−インターフェロン及びそれらのサブタイプが含まれる。
【００６１】
免疫療法用に放射性同位元素を結合させた本発明のモノクローナル抗体を用いるに際しては、白血球分布並びにアイソタイプ安定性及び放射性のような要因に依っては、一定のアイソタイプが他のものよりも好ましいといえる。所望により、腫瘍細胞分布は、上記の　ｉｎ　ｖｉｖｏ　診断技術により評価することができる。悪性度に依っては、あるエミッターが他のものより好ましいといえる。一般に、α及びβ粒子放出性の放射性同位元素が免疫療法に好ましい。例えば、動物が中実の腫瘍病巣を有する場合は、９０Ｙの如き数ミリメーターの組織を透過できる高エネルギーβエミッターが好ましいといえる。一方、悪性腫瘍が白血病の場合のような単純な標的細胞からなる場合は、　２１２Ｂｉの如き短レンジの高エネルギーαエミッターが好ましいといえる。治療目的で本発明のモノクローナル抗体に結合させてもよい放射性同位元素の例は、　１２５Ｉ、　１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、　２１２Ｂｉ、　２１１Ａｔ、　２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、　１０９Ｐｄ、及び　１８８Ｒｅである。
【００６２】
レクチンは、通常は植物原料から単離されるタンパク質であって、特異的糖部分に結合する。多くのレクチンは細胞の凝集及びリンパ球の刺激もできる。しかしながら、リシン（ｒｉｃｉｎ　）は、免疫療法に用いられてきた毒性レクチンである。これは、好ましくは、毒性の原因になっているリシンのαペプチド鎖をこの抗体分子に結合させて、その毒性作用の部位特異的送逹を可能にすることによって行われる。
【００６３】
トキシンは、植物、動物、又は微生物により作られる有毒物質であって、十分量でしばしば致命的となる。ジフテリアトキシンは、コリネバクテリウム・ジフテリアによって産生される治療に用いることができる物質である。このトキシンは、適当な条件下で分離できるα及びβサブユニットからなる。その毒性Ａ成分は抗体に結合することができるので、本発明のモノクローナル抗体が特異的であるＥＢＶ抗原保有細胞への部位特異的送逹に用いることができる。本発明のモノクローナル抗体にカップリングさせてもよい他の治療剤は、当業者により知られているか、又は容易に探知され得る。
【００６４】
本発明の標識又は非標識モノクローナル抗体は、上記の如き治療剤と組み合わせて用いることもできる。特に好ましいのは、本発明のモノクローナル抗体及び免疫調節剤及び他の生物学的応答調節剤を含む治療的組み合わせである。かくして、例えば、本発明のモノクローナル抗体をα−インターフェロンと組み合わせて用いることができる。この治療法は、モノクローナル抗体反応性抗原の発現を増やすことによってＥＢＶ含有細胞のモノクローナル抗体指向性を高める　（Ｇｒｅｉｎｅｒ　ら，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３５：８９５，　１９８７）。また、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、γ−インターフェロンと組み合わせて用い、それによってエフェクター細胞によるＦｃレセプターの発現を活性化及び増やすことができるだろう。このことは、そのエフェクター細胞へのモノクローナル抗体の結合を増進して標的腫瘍細胞を死滅させるだろう。当業者は、本発明のモノクローナル抗体の効力を高める所期のエフェクター機能を創り出す種々の生物学的応答調節剤からを選択できるであろう。
【００６５】
本発明のモノクローナル抗体をここに記載したものの如き種々の治療剤と組み合わせて用いる場合、そのモノクローナル抗体と治療剤は、通常は実質的に同時に投与される。この“実質的に同時に”という用語は、このモノクローナル抗体と治療剤が時間に関して適度に接近して一緒に投与されることを意味する。通常、モノクローナル抗体より先に治療剤を投与するのが好ましい。例えば、モノクローナル抗体より１〜６日間先に治療剤を投与してもよい。治療剤の投与は、例えば、腫瘍の性質、患者の状態及びその治療剤の半減期の如き要因に依って、毎日であっても、何らかの他の間隔をあけて行ってもよい。
【００６６】
本発明のモノクローナル抗体を用いると、ここに記載した全ての特徴を組み合わせた治療法をデザインすることが可能である。例えば、所与の状況において、単一又は複数の治療剤を投与してから、本発明のモノクローナル抗体をエフェクター細胞及び同じか又は異なる単一又は複数の治療剤と組み合わせて投与するのが望ましいといえる。かくして、白血病又はリンパ腫の患者を、まずγ−インターフェロン及びインターロイキン−２を毎日３〜５日間投与し、そして５日目に本発明のモノクローナル抗体をエフェクター細胞並びにγ−インターフェロン及びインターロイキン−２と組み合わせて投与することにより治療するのが望ましいといえる。
【００６７】
リポソームをその膜内にある本発明のモノクローナル抗体と共に用いて、ＥＢＶ関連疾患細胞の領域にこのリポソームを特異的に送逹することも可能である。これらリポソームは、それらがモノクローナル抗体に加えて上記の如き免疫治療剤を含有するように作ることができ、そうすればそれら治療剤は腫瘍部位で放出されるであろう　（Ｗｏｌｆｆ　ら，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ａｃｔａ，　８０２：２５９，　１９８４）　。
【００６８】
本発明のモノクローナル抗体の投与量の範囲は、ＥＢＶ関連疾患の症状が改善される所期の作用をもたらすのに十分多い量である。この投与量は、望ましくない交叉反応、アナフィラキシー反応、及びそれに類したものの如き副作用を起こすほど多くあるべきではない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度で変動するであろうが、当業者が決定することができる。投与量は、複雑な場合には個々の医師が調節してもよい。投与量は、毎日１又は２以上の投与で１日又は数日間、約０．１〜約２０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇで変動してもよい。一般に、本発明のモノクローナル抗体を治療剤と併せて投与する場合には、ｉｎ　ｖｉｖｏ　免疫診断的画像化に用いる量に比較して、より少ない投与量を用いることができる。
【００６９】
本発明のモノクローナル抗体は、注射により又は時間をかけて徐々に灌流することにより非経口で投与することができる。本発明のモノクローナル抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、洞内、又は経皮で、単独で投与してもエフェクター細胞と組み合わせて投与してもよい。非経口投与用製剤には、滅菌した水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、及び乳剤が含まれる。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油の如き植物油、及びオレイン酸エチルの如き注射可能な有機エステルである。製剤上の水性担体には、食塩水及び緩衝媒質を含む水、アルコール／水性の溶液、乳濁液又は懸濁液が含まれる。非経口用賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、又は固定油が含まれる。静脈内用賦形剤には、流体及び栄養補液、電解質補液（例えば、リンガーのデキストロースを主成分としたもの）、及びそれらに類したものが含まれる。保存剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス、及びそれらに類したものの如きものが存在してもよい。
【００７０】
本発明は、本発明のポリペプチド、又はモノクローナル抗体を含む医薬品又は医薬組成物を製造する方法であって、該医薬品がＥＢＶ関連疾患の治療に用いられる方法にも関する。
【００７１】
ＥＡ−Ｄ，５０．１０ペプチド又は抗ＥＡ−Ｄペプチド抗体とのサンプルの反応性は、好ましくは、鼻咽頭癌及び感染性単核球症に関係している。同様に、ＥＡ−Ｒ，１７．１ペプチド又は抗ＥＡ−Ｒペプチド抗体との反応性は、好ましくは、リンパ腫に関係している。これら特定のペプチド及びそれらの対応するモノクローナル抗体は、特定の疾患状態と関係するＥＡ−Ｄ及びＥＡ−Ｒ移行を検出するのに特に有用である。
【００７２】
以上の開示は本発明を一般的に説明するものである。以下の具体的な実施例を参照することによってより完全な理解を得ることができる。それらは、説明することだけを目的として示されたものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【００７３】
【実施例】
実施例１　ｐ１７及びｐ５０ポリペプチドの合成
ｐ１７タンパク質上の潜在的Ｔ細胞エピトープを　Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙのアルゴリズム　（ＡＭＰＨＩ　ｐｒｏｇｒａｍ）　（１９８７）　を用いて同定した。このアルゴリズムは、Ｔ細胞が、両親媒性でありかつαヘリックス構造を形成するペプチドと優先的に相互作用することを前提とする。これら特徴に基づき、ｐ１７及びｐ５０タンパク質上の候補エピトープをマッピングして、この分子全体に散在していることが分かった。最高の両親媒性評点を有するエピトープを合成してこの研究に用いた。ｐ１７上の８の予測エピトープから、最高評点を有する３つのエピトープを、これら推定エピトープをコードするヌクレオチド配列に基づく１５アミノ酸残基として合成した（図１，表１）。ペプチド合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢＩ　４３０−Ａ　自動ペプチド合成装置で　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（１９６３）　の固相法を用い、記載された通りにヒドロキシベンゾトリアゾール水和物／ジシクロヘキシルカルボジイミド活性化を用いて行った　（Ｃｕｒｔｉｓｓ，　Ｌ．Ｋ．　ら，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２６３：１３７７９−１３７８５，　１９８８）。生成したペプチド樹脂を１０％アニソール／フッ化水素で−４℃で１時間処理した　（Ｌｅｎａｒｄ，　Ｊ．ら，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　８９：１８１−１８２，　１９６７）。このペプチド試料（１０μｇ／分析）を　ＶＹＤＡＣ　Ｃ１８カラムを用いてＨＰＬＣにより分析した。出発緩衝液は、水中の０．１％トリフルオロ酢酸（溶媒Ａ）とアセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸（溶媒Ｂ）を含むものであった。溶媒Ｂを２０分間に２０〜７０％勾配で増加させながら４０℃で分析した。２１４ｎｍの吸収で分離を追跡した。このペプチドの分取精製に、ＷＡＴＥＲＳ　ＡＵＴＯ　５００　分取ＨＰＬＣ（５０×２５０ｍｍ　ＶＹＤＡＣ　Ｃ１８カラム，１５〜２０μｍ）でのクロマトグラフィーを、分析クロマトグラフィーについて記載したのと同じ条件で用いた。全てのペプチドのアミノ酸組成を、Ｂｅｃｋｍａｎ　６３００　高速分析装置と内部標準とで、加水分解後に測定した。全てのペプチドを凍結乾燥して減圧下で保存した。ｐ５０ポリペプチドの合成は、ｐ１７について上に記載した通りに行った。
【００７４】
【表１】
2004057208.tif 000002
【００７５】
実施例２　合成ペプチドに対するＰＢＬの増殖応答
細胞　Ｐ３　ＨＲ−１細胞系、つまりアフリカバーキットリンパ腫（ＡＢＬ）生検材料をこれら実験におけるＥＡ−Ｒ複合体の天然ｐ１７成分の供給源とした　（Ｈｉｍｕｎａ，　Ｙ．ら，　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．，　１：１０４５−１０５１，　１９６７）　。これら細胞を１０％熱不活性化（５６℃、３０分間）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地の存在下で３７℃で生育させた。これら細胞を新鮮な培地で５×１０５　細胞／ｍｌの細胞濃度に希釈することによって３〜４日毎に継代した。
【００７６】
抗原を作るために、Ｐ３　ＨＲ−１細胞を２０ｎｇ／ｍｌＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイル−フォルボール−１３−アセテート）及び３ｍＭ酪酸ナトリウムで４８時間活性化した。この操作は、一般に、免疫蛍光測定法により測定して７０％を越える細胞内でこの抗原の発現の誘発をもたらす　（Ｐｅａｒｓｏｎ　ら，　Ｖｉｒｏｌ．，　１６０：１５１−１６１，　１９８７）。
【００７７】
ＥＬＩＳＡ　ｐ１７、ｐ５０又は合成ペプチドに対して特異的な抗体を測定するためのＥＬＩＳＡを以前に詳細に記載されたようにして行った　（Ｌｕｋａら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　６７：１４５−１５６，　１９８４）。異なる抗原濃度のアリコートを０．５Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３　緩衝液（ｐＨ９．５）で希釈して、ポリスチレンマイクロタイタープレート　（Ｌｉｎｂｒｏ）内のウェルに添加し、そしてこれらプレートを４℃で一晩インキュベートした。インキュベート時間が経過した後、これらプレートを、０．０５％ツィーン２０、５０ｍＭ　ＮａＣｌ及び１００ｍｇ／ｌアルブミン　（Ｓｉｇｍａ）　を含有するトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で５回洗浄し、そして室温で２０分間乾燥した。これらプレートを異なる抗ＥＡ−Ｒ又はＥＡ−Ｄ抗体陽性ヒト血清及びｐ１７又はｐ５０に対するモノクローナル抗体でスクリーニングして、血清学的研究に用いる抗原の最適濃度を特定した。アルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ　（Ｓｉｇｍａ）　又はヤギ抗マウスＩｇＧ　（Ｓｉｇｍａ）　を指示系として用いた。
【００７８】
天然ｐ１７、ｐ５０又は合成ペプチドに対する抗体についてヒト血清を試験するために、ＥＬＩＳＡ緩衝液で血清を１：１０に希釈し、最適濃度の抗原をコーティングしたウェルに０．１ｍｌ容量で添加し、そしてこれらプレートを室温で６０分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ緩衝液で４回洗浄した後、ＥＬＩＳＡ緩衝液中のアルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ　１００μｌを各ウェルに添加し、そしてそれらプレートを室温で１時間インキュベートした。緩衝液中で４回以上洗浄してから、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２　及び０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２　を含有する１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１０．４）中に１ｍｇ／ｍｌの　Ｓｉｇｍａ　アルカリ性ホスファターゼ基質を溶解し、次いで１００μｌのこの混合液を各ウェルに添加することによって酵素反応を行った。反応を３７℃で３０分間進行させてから、プレートを直接にマイクロプレートリーダー，ＴＩＴＥＲＴＥＫ　ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ　ＭＣ　（Ｆｌｏｗ）　で４２０ｎｍでスクリーニングした。抗体陰性血清で認められたバックグランドの２倍である０．１を越える読み取り値を陽性反応と考えた。
【００７９】
天然ｐ１７の精製　ｐ１７を発現する細胞を食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．５％ＮＰ−４０及び０．５％デオキシコール酸ナトリウムを０．０２Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭβ−メルカプトエタノール及び１０ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）中に含有する抽出緩衝液中に再懸濁し、そして各２０秒間で５サイクル音波処理した。次いで、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＪＡ−２０　ローターで４０，０００×ｇで４℃で６０分間遠心分離することによってこの抽出液を清澄にして、生成した細胞不含上澄み液をｐ１７に対するモノクローナル抗体で調製したアフィニティカラムに通した（Ｐｅａｒｓｏｎ　ら，　Ｃａｎｃｅｒ，　５１：２６０−２６８，　１９８３）　。このカラムを５容量の抽出緩衝液で１回洗浄してから洗浄剤なしの緩衝液で１回洗浄した後、結合したｐ１７を２０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で緩衝した３Ｍ　ＭｇＣｌ２　で溶離させた。これら溶出物をウェスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡにより特異性について試験し、そしてＥＬＩＳＡにより特異性抗原活性について滴定した　（Ｌｕｋａら，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　６７：１４５−１５６，　１９８４）。タンパク質濃度は　Ｂｉｏ−Ｒａｄ　測定法を用いて測定した。次いで、ｐ１７含有溶離物を１００容量の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ　ＮａＣｌに対して透析した後、１０％ヒトＡ　ＥＢＶ抗体陰性血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に対して透析した。この抗原をアリコートに分けて異なる免疫学的測定法に用いるまで−７０℃で保存した（ｐ５０の精製は、ｐ１７について上に記載した通りに行った）。
【００８０】
増殖反応測定法　　陰性ｐ１７又はｐ５０ポリペプチド又は合成ペプチドを用いるＴ細胞増殖反応測定法を以前に詳細に記載された通りに行った　（Ｐｏｔｈｅｎら，　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ，　４９：６５６−６６０，　１９９１）。簡単に説明すると、血清陽性ドナーからの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を　ＦＩＣＯＬＬ−ＨＹＰＡＱＵＥ　勾配で単離し、血清陰性ドナーからの１０％熱不活性化ヒトＡ＋　血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁した。次いで、細胞（０．１ｍｌ当たり１×１０５　）を９６ウェル丸底組織培養プレート　（Ｃｏｓｔａｒ，　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　ＭＡ）　中の各ウェルに添加した。異なる抗原試料を０．１ｍｌ容量で３ウェルずつに添加して、それらプレートを３７℃で５日間インキュベートした。　３Ｈ−チミジン（５Ｃｉ／ｍＭ）を１μＣｉ／ウェルの濃度で培養の最後の４時間にわたって添加した。次いで、それら細胞を多用途サンプル採取器で採取し、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅｌ　ＬＳ　３８０１　液体シンチレーションカウンターを用いて　３Ｈ−チミジン取り込みを測定した。試験抗原についての刺激指数を、試験抗原についての分当たりの平均カウント（ＣＰＭ）を培地コントロールウェルの平均ＣＰＭで割ることによって計算した。
【００８１】
無症候性ＥＢＶ感染個体からのＰＢＬを、陰性ｐ１７の存在下で増殖することを前もって示したリンパ球を用いる増殖反応測定法により、これら３種のｐ１７合成ペプチド（表１）のいずれかに対する応答について試験した　（Ｐｏｔｈｅｎら，　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ，　４９：６５６−６６０，　１９９１）。異なる濃度の合成ペプチドをこのＰＢＬと５日間インキュベートしてから、　３Ｈ−チミジンの取り込みにより増殖を検査した。抗ＶＣＡ陽性、抗ＥＡ陽性ドナーからのＰＢＬを用いるこの初回実験からの結果を表２に示す。活性化Ｐ３　ＨＲ−１細胞から精製した天然ｐ１７は、この実験で１５．８の　Ｓ．Ｉ．を示した。５０及び１２．５μｇ／ｍｌの濃度では、ｐ１７．１ペプチドも有意な増殖応答を誘発した（それぞれ１０．８及び４．７の　Ｓ．Ｉ．）。他の合成ペプチドのいずれも試験した濃度で増殖応答を誘発しなかった。ＥＢＶ抗体陰性個体からのＰＢＬもいずれの合成ペプチドにも応答しなかった。
【００８２】
抗ＶＣＡ陽性　抗ＥＡ抗体陰性個体からのＰＢＬも、これら３種の合成ペプチドでの増殖反応測定法で検査した。これら結果を図２に示す。やはり、全ての３ＰＢＬ試料は、最高濃度のｐ１７．１に３．５〜１１の範囲の　Ｓ．Ｉ．　で応答した。これら試料のうち２種（図２Ａ、Ｃ）も、より低い濃度の抗原の存在下でそれぞれ３及び５の　Ｓ．Ｉ．　で増殖した。これらＰＢＬ試料のどれもｐ１７．２及びｐ１７．３の存在下では増殖しなかった。これら実験は、ＥＢＶ感染個体からのＴリンパ球が、ＥＡに対する抗体の存在に関わらず、ｐ１７上の優勢エピトープを認識することを証明した。
【００８３】
【表２】
2004057208.tif 000003
【００８４】
実施例３　ＣＤ４＋　及びＣＤ８＋　亜集団へのＰＢＬの分画
Ｔ細胞亜集団について富化したＰＢＬを、抗体／補体媒介細胞障害により特定集団を減らすことによって単離した。ＣＤ４＋　細胞は抗ＣＤ８抗体及びウサギ補体でＣＤ８＋　細胞を溶解することによって調製し、ＣＤ８＋　Ｔ細胞亜集団は抗ＣＤ４抗体及びウサギ補体でＣＤ４＋　細胞を溶解することによって富化した。
【００８５】
ＰＢＬを２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ＨＥＰＥＳ培地）中に２０×１０６　細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。Ｔ細胞特異性ＭＡｂ、つまりＯＫＴ４又はＯＫＴ８　（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ．）　をこれら細胞に最適濃度（最大の溶解が得られるように滴定によって前もって測定しておいた）で添加して、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を新鮮なＨＥＰＥＳ培地で洗浄し、そしてＨＥＰＥＳ培地で適当な濃度（最大の抗体特異的細胞障害が得られるように前もって測定しておいた）に希釈した乳児ウサギ補体　（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）　中で１０×１０６　細胞／ｍｌで再懸濁した。３７℃水浴中で１５分毎に緩やかに混合しながら細胞を４５分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＨＥＰＥＳ培地で徹底的に洗浄し、少量の細胞（１〜２×１０６　）を取って以下に記載するようにして行ったフロー・サイトメトリー分析用に染色した。各ドナー内のＣＤ４＋　及びＣＤ８＋　のもとのパーセンテージを確認するために、抗体及び補体のいずれともインキュベートしていないＰＢＬも並行してフロー・サイトメトリー用に処理した。＞９５％純度及び生存度をもたらす集団を増殖反応測定法に用いた。
【００８６】
血清陽性ドナーからのＣＤ４＋　又はＣＤ８＋　富化ＰＢＬを用いる増殖反応測定法を上記のように合成ペプチドの濃度を変動させて行った。しかしながら、これら実験においては更に照射した自家ＰＢＬを抗原提示細胞（ＡＰＣ）として５×１０５　ＡＰＣ対１×１０５　ＣＤ４＋　又はＣＤ８＋　細胞の比率で用いた。
【００８７】
ＦＡＣＳ分析　　上のインキュベーション後に取った細胞（１〜２×１０６　）を、フルオレセインイソチオシアネート結合抗ｌｅｕ３ａ（ＣＤ４マーカー）及びフィコエリトリン結合抗ｌｅｕ２ａ（ＣＤ８マーカー）を含有する２０μｌの　ＳＩＭＵＬＴＥＳＴ　試薬　（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）　で４℃で４５分間染色した。細胞を徹底的に洗浄して、５％ＦＣＳ及び０．０２％ナトリウムアジドを含むＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁し、そして細胞選別機　（ＦＡＣＳＴＡＲ　Ｐｌｕｓ，　Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）　で分析した。
【００８８】
ＣＤ４＋　及びＣＤ８＋　Ｔ細胞亜集団の両方がｐ１７．１に対して応答していたかどうかを確認するために、２ドナーからのリンパ球をこれら２種の亜集団に分け、この増殖反応測定法に用いた。結果を図３に示す。両ドナーからのＰＢＬは、この実験で試験した最高濃度（ドナーＡについては１００μｇ／ｍｌでありドナーＢについては５０μｇ／ｍｌ）のｐ１７．１の存在下で増殖した。ドナーＡからのＣＤ４＋　亜集団も異なる濃度のｐ１７．１に対して５．３もの　Ｓ．Ｉ．　で活発に応答した。このドナーからのＣＤ８＋　亜集団はこの合成ペプチドに対して応答しなかった。この応答パターンは、もう１つの血清陽性ドナーから分画したＣＤ４＋　及びＣＦ８＋　Ｔ細胞でも認められた。対照的に、ドナーＢからのＣＤ４＋　及びＣＤ８＋　Ｔ細胞亜集団の両方がｐ１７．１に対して応答し、ＣＤ８＋　亜集団は試験した最高抗原濃度（５０μｇ／ｍｌ）で３を越える　Ｓ．Ｉ．　を示した。従って、これら結果は、ＣＤ４＋　及びＣＤ８＋　Ｔ細胞の両方がこのｐ１７エピトープを認識したことを示した。
【００８９】
実施例４　ｐ１７合成エピトープに対する血清学的応答
ｐ１７合成エピトープとの血清学的反応性を測定するための研究をデザインした。この目的のために、８７抗ＥＡ抗体陽性血清（力価＞１６０）を前もって測定したｐ１７合成ペプチドの最適濃度（２μｇ／ウェル）に対してＥＬＩＳＡで試験した。これら血清は、ガーナ・バーキット腫瘍プロジェクトの間に集めたアフリカバーキットリンパ腫（ＡＢＬ）の２８の患者から、及び中度大細胞又は高度非ホジキンリンパ腫（ＮＡＮＨＬ）の２８の北アメリカ人患者から得た。これらドナーには、ＨＩＶ陽性及びＨＩＶ陰性個体の両方が含まれていた。加えて、３１の北アメリカ鼻咽頭癌（ＮＡＮＰＣ）患者からの血清をこの研究で調べた　（Ｐｅａｒｓｏｎ，　Ｇ．Ｒ．　ら，　Ｃａｎｃｅｒ，　５１：２６０−２６８，　１９８３）　。血清学的反応のＥＡ特異性を確認するために、これら血清での結果を２３ＶＣＡ及びＥＡ抗体陰性血清及び３０ＶＣＡ抗体陽性、ＥＡ抗体陰性血清での結果と比較した。結果を図４に示す。Ｔ細胞増殖結果と対照的に、３種全ての合成ペプチドが程度のバラツキはあるもののＥＡ抗体陽性血清と反応し、ｐ１７．１がやはり優勢エピトープであった。約６０％の抗ＥＡ陽性血清がｐ１７．１と、４８％がｐ１７．２と、そして２３％がｐ１７．３と反応した。これら血清学的結果の抗ＥＡ特異性は、これら３種いずれかの合成ペプチドとのいずれかの５３抗ＥＡ抗体陰性血清の反応性の欠如によって確認された。従って、これら結果によりｐ１７上の３種のＢ細胞エピトープが同定された。
【００９０】
幾つかの抗ＥＡ抗体血清がこれら合成ペプチドと反応するのになぜ他のものは反応しないのかを確認するために、血清ドナーに応じてこれらデータを解析した。これら結果を図５に示す。顕著な特異性が、正常では抗ＥＡ−Ｄ陽性ＮＰＣに対立するものとして彼らの血清中に抗ＥＡ−Ｒ抗体を有するリンパ増殖性疾患の患者で認められた。ＡＢＬ患者からの血清の７１％及びＮＡＮＨＬ患者からの血清の９３％がｐ１７．１と反応し、これは北アメリカ人ＮＰＣ患者からの血清の２３％に対立するものとなった。類似の特異性がｐ１７．２及びｐ１７．３で認められた。これら結果は、リンパ増殖性疾患の患者の血清中の抗ＥＡ−Ｒ抗体を測定するための１又は２以上のこれら合成ポリペプチドの潜在的価値を証明したものであり、表３に纏めた。
【００９１】
【表３】
2004057208.tif 000004
【００９２】
実施例５　ＥＡ−Ｄ領域からのｐ５０．１０
ＥＢＶのＥＡ−Ｄ領域内に見出される５０Ｋｄタンパク質は、５０．１０と呼ばれる優勢エピトープを含有する。このエピトープは、Ｂａｅｒらの前記文献（実施例１の表１を参照のこと）のプロトタイプＥＢＶ（Ｂ９５．８）ＤＮＡ配列に基づき、ＥＢＶゲノム上で８１．０６３〜８１．１０８に位置する。実施例１に記載した方法に従い、５０．１０の合成ペプチドを調製した。このエピトープの合成ペプチドのアミノ酸配列は、
【００９３】
【化１】
2004057208.tif 000005
【００９４】
上に下線を引いた部分Ａを含む８１．０３６〜８１．０７８からのエピトープの領域は感染性単核球症（ＩＭ）血清と弱い反応性を示すに過ぎず、部分Ｂを含有する８１．０８１〜８１．１２０からの領域はＩＭ血清との反応性を示さない。全縁５０．１０ペプチドをＩＭ血清と処理した場合には、この血清の２４／３２又は７５％がＥＡ−Ｄ反応性抗体（ＩｇＧ）を含有した（表４）。比較すると、試験したＩＭ血清の１２／３２又は３８％がＥＡ−Ｒ反応性抗体を示した。
【００９５】
【表４】
2004057208.tif 000006
【００９６】
＞０．５の値が陽性と考えられる（Ｏ．Ｄ．読み取り４２０ｎｍ）。
【００９７】
それらのアミノ末端及びカルボキシ末端に追加のアミノ酸を含有するＥＡペプチドｐ１７．１及びｐ５０．１の血清学的反応性を、Ａ陽性であるＥＢＶ　ＩＭ急性血清で試験した。表５に示すＥＬＩＳＡの結果は、これら追加のアミノ酸が両ＥＡペプチドについて反応性を向上させたことを示している。
【００９８】
【表５】
2004057208.tif 000007
【００９９】
実施例６　ｐ５０．１０での血清学的結果
ｐ５０．１０合成ペプチドでの異なる血清（ＶＣＡ−ＥＡ−、ＶＣＡ＋ＥＡ＋、ＶＣＡ＋ＥＡ−）の血清学的反応性を　Ｐｏｔｈｅｎ　らの前記文献に従って、実施例１に記載した通りに行った。この血清学的結果の抗ＥＡ特異性は、抗ＥＡ抗体陰性血清とのｐ５０．１０ペプチドの反応性の欠如によって確認した。従って、これら結果はｐ５０上のＢ細胞エピトープを示している。
【０１００】
免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）を　Ｈｅｎｌｅら　（Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ，　８：２７２−２８２，　１９７１）　により記載された通りに行った。ウェスタンブロット分析は、当該技術分野で普通に用いられている方法により行った（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ　ら，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，　１９９１，　Ｕｎｉｔ　１２　を参照のこと）。ＥＢＶ感染細胞溶解産物（Ｐ３　ＨＲ−１）を、陽性のヒトからのヒト全抗血清で試験した　（Ｐｅａｒｓｏｎ　ら，　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　１６０：１５１−１６１，　１９８７）。ＥＡ−Ｄ５０．１ペプチド抗血清を用いるＩＦＡによるＥＡ血清学と５０．１ペプチドを用いるＥＬＩＳＡ血清学（実施例２を参照のこと）とを比較した。試験したサンプルはウェスタンブロット分析によりＩＭ陽性かつＥＡ陽性であった（５０〜５５Ｋ陽性反応性）が、表６に見られるように、これらサンプルは１：１０の希釈度でもＩＦＡ−ＥＡ陰性であった。
【０１０１】
【表６】
2004057208.tif 000008
【０１０２】
１）　抗ＥＡ陰性、ＶＣＡ陰性（ウィルスキャプシッド抗原）；　２）　抗ＥＡ−Ｒ陽性リンパ腫；及び　３）　抗ＥＡ−Ｄ陽性，鼻咽頭癌からの血清の血清学的反応性をＥＬＩＳＡにより検討した。表７に見られるように、ｐ１７．１反応性とリンパ腫及びｐ５０．１０反応性と鼻咽頭癌の間に高い相関関係がある。
【０１０３】
【表７】
2004057208.tif 000009
【０１０４】
実施例７　早期抗原Ｄ−Ｒ移行の検出
早期抗原Ｄ−Ｒ移行を急性感染性単核球症経過中の患者において追跡した。ペプチド５０．１０（ＥＡ−Ｄ）及び１７．１（ＥＡ−Ｒ）に対する抗体を６ヶ月かけて集めた検体についてＥＬＩＳＡにより検出した。表８のデータは、ペプチド５０．１０に対する抗体が８８年６月２７日にピークに達し、ペプチド１７．１に対する抗体が８８年７月１８日にピークに達することを示している。従って、本発明のペプチドは患者のＥＢＶ関連疾患の経過を追跡するのに有用である。
【０１０５】
【表８】
2004057208.tif 000010
【０１０６】
１　Ｏ．Ｄ．読み取り；血清を１．２０希釈度で試験した；（＋）　＞０．２５
【０１０７】
ここまで記載した明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考える。当業者には、ここに示しかつ説明したものの他に種々の修飾が前述の説明から明らかになるであろうが、それらは添付した請求の範囲内に入るであろう。
【０１０８】
配列のまとめ
配列番号：１は、ＥＢＶの１７Ｋｄ早期抗原（ＥＡ−Ｒ）領域からのペプチドｐ１７．１のアミノ酸配列である。
配列番号：２は、ＥＢＶの１７Ｋｄ早期抗原（ＥＡ−Ｒ）領域からのペプチドｐ１７．２のアミノ酸配列である。
配列番号：３は、ＥＢＶの１７Ｋｄ早期抗原（ＥＡ−Ｒ）領域からのペプチドｐ１７．３のアミノ酸配列である。
配列番号：４は、ＥＢＶの５０Ｋｄ早期抗原（ＥＡ−Ｄ）領域からのペプチドｐ５０．１０のアミノ酸配列である。
【０１０９】
配　列　表
（２）　配列番号：１の情報：
（ｉ）　配列の特性：
（Ａ）　長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）　型：アミノ酸
（Ｃ）　鎖の数：一本鎖
（Ｄ）　トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）　配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）　配列の特徴：
（Ａ）　名称／記号：Ｐｅｐｔｉｄｅ
（Ｂ）　存在位置：１．．１５
（ｘｉ）　配列；配列番号：１：
2004057208.tif 000011
【０１１０】
（２）　配列番号：２の情報：
（ｉ）　配列の特性：
（Ａ）　長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）　型：アミノ酸
（Ｃ）　鎖の数：一本鎖
（Ｄ）　トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）　配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）　配列の特徴：
（Ａ）　名称／記号：Ｐｅｐｔｉｄｅ
（Ｂ）　存在位置：１．．１５
（ｘｉ）　配列；配列番号：２：
2004057208.tif 000012
【０１１１】
（２）　配列番号：３の情報：
（ｉ）　配列の特性：
（Ａ）　長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）　型：アミノ酸
（Ｃ）　鎖の数：一本鎖
（Ｄ）　トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）　配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）　配列の特徴：
（Ａ）　名称／記号：Ｐｅｐｔｉｄｅ
（Ｂ）　存在位置：１．．１５
（ｘｉ）　配列；配列番号：３：
2004057208.tif 000013
【０１１２】
（２）　配列番号：４の情報：
（ｉ）　配列の特性：
（Ａ）　長さ：１５アミノ酸
（Ｂ）　型：アミノ酸
（Ｃ）　鎖の数：一本鎖
（Ｄ）　トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）　配列の種類：ペプチド
（ｉｘ）　配列の特徴：
（Ａ）　名称／記号：Ｐｅｐｔｉｄｅ
（Ｂ）　存在位置：１．．１５
（ｘｉ）　配列；配列番号：４：
2004057208.tif 000014
【０１１３】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＢａｍＨＩ　ＨＲＦ１リーディングフレーム及びこの
合成ペプチドをコードするＢＨＲＦ１内の領域を表すＥＢＶゲノムの概略地図を示す。
【図２】図２は、３種のｐ１７合成ペプチドの異なる濃度に対する３種の抗ＶＣＡ陽性、抗ＥＡ陰性個体（Ａ〜Ｃ）からのＰＢＬの増殖応答を示す。
【図３】図３は、合成ペプチドｐ１７．１の異なる濃度に対する２ドナー（ＡとＢ）からのＣＤ４＋　及びＣＤ８＋　Ｔ細胞亜集団の増殖応答を示す。
【図４】図４は、ｐ１７合成ペプチド（１７．１、１７．２、１７．３）との異なる血清の血清学的反応性を示す。全ての血清を１：１０の希釈度でＥＬＩＳＡで試験した。それぞれの列の括弧内の数字は非反応性血清（吸収＜０．１）の数を表す。
【図５】図５は、ｐ１７合成ペプチドに対する異なる疾患カテゴリーからの抗ＥＡ陽性血清の血清学的反応性を示す。全ての血清を１：１０の希釈度で試験した。ＡＢＬ，アフリカバーキットリンパ腫；ＮＡＮＨＬ，中度大細胞リンパ腫又は高度Ｂ細胞リンパ腫を含む北アメリカ非ホジキンリンパ腫；ＮＡＮＰＣ，北アメリカ鼻咽頭癌。それぞれの列の括弧内の数字は非反応性血清（吸収＜０．１）の数を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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