(57)【要約】【課題】　新規な抗炎症剤の提供。【解決手段】　（a）配列番号：１に示すアミノ酸配列、（b）配列番号：１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は置換により修飾されており且つ抗炎症作用を維持しているアミノ酸配列、（c）配列番号：２に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされており且抗炎症作用を維持しているアミノ酸配列、或いは（d）配列番号：１に記載のアミノ酸配列に対して90％以上配列同一性を有し且つ抗炎症作用を有するアミノ酸配列、を有するHSCO関連タンパク質を含んで成る、抗炎症剤。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　（a）配列番号：１に示すアミノ酸配列、（b）配列番号：１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は置換により修飾されており且つ抗炎症作用を維持しているアミノ酸配列、（c）配列番号：２に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされており且抗炎症作用を維持しているアミノ酸配列、或いは（d）配列番号：１に記載のアミノ酸配列に対して90％以上配列同一性を有し且つ抗炎症作用を有するアミノ酸配列、を有するHSCO関連タンパク質を含んで成る、抗炎症剤。
【請求項２】
　前記抗炎症剤が予防薬又は治療薬である、請求項１又は２に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
　被験細胞を培養し、HSCO（肝癌細胞サブトラクテッドcDNAライブラリークローン１）遺伝子が発現されたか否かを決定することを特徴とする、被験細胞が癌細胞であるか否かを決定する方法。
【請求項４】
　前記HSCO遺伝子が発現するか否かを、培養細胞中のHSCOをコードするmRNAの存否により決定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
　前記HSCO遺伝子が発現するか否かを、培養物中のHSCOの存否により決定する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
　前記HSCOが、（a）配列番号：１に示すアミノ酸配列、（b）配列番号：１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は置換により修飾されており且つ抗炎症作用を維持しているアミノ酸配列、（c）配列番号：２に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされており且抗炎症作用を維持しているアミノ酸配列、或いは（d）配列番号：１に記載のアミノ酸配列に対して90％以上配列同一性を有し且つ抗炎症作用を有するアミノ酸配列、を有する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
　被験物質の存在下で、HSCO（肝癌細胞サブトラクテッドcDNAライブラリークローン１）遺伝子を有する細胞を培養し、それによりHSCOの発現が抑制されたか否かを決定することを特徴とする、肝癌抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
　前記HSCO遺伝子の発現が抑制されるか否かを、培養細胞中のHSCOをコードするmRNAの生成量の変化により決定する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
　前記HSCO遺伝子の発現が抑制されるか否かを、培養物中のHSCOの生成量の変化により決定する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
　前記HSCOが、（a）配列番号：１に示すアミノ酸配列、（b）配列番号：１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は置換により修飾されており且つ抗炎症作用を維持しているアミノ酸配列、（c）配列番号：２に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされており且抗炎症作用を維持しているアミノ酸配列、或いは（d）配列番号：１に記載のアミノ酸配列に対して90％以上配列同一性を有し且つ抗炎症作用を有するアミノ酸配列、を有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、新規な抗炎症剤、肝癌細胞の新規な検出方法及び抗癌剤の新規なスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
　世界中の最も頻繁な癌の１つは、肝細胞癌（HCC）である（Murray and Lopez, 1997; Hamilton and Aaltonen, 2000）。HCCは高い致死性であり、そして診断の時点から約６ヶ月の生存見込みを有する。前記疾病は、北及び南アメリカ及びヨーロッパよりもアフリカ及びアジアの一部においてより流行しており、それはウィルス性肝炎、ヘモクロマト−シス、既知の発癌物質及びトキシンとの強い病原関連性がある。
【０００３】
　アフラトキシンB1への暴露が流行する地域においては、p53遺伝子、すなわち種々の型のヒト癌において同定される最も一般的に突然変異された遺伝子の１つの突然変異（Vogelsteinなど., 2000）は、HCCの50〜60％のおいて観察される（Tannapfel and Wittekind, 2002）。しかしながら、日本、ヨーロッパ及びUSAの地域においては、p53突然変異は、特に低分化度又は低いステージのHCCにおいては頻繁ではない（Konishiなど., 1993）。今日まで、多くの遺伝子がHCCにおいて変更されることが示されているが、しかし肝発癌の分子機構はまた十分には解明されていない（Feitelsonなど., 2002）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
　肝癌細胞を検出し、又は抗癌剤をスクリーニングする方法は種々知られているが、必ずしも満足できるものではない。従って、本発明は、肝癌を検出し治療するための新規な方法、及び抗癌剤の新規なスクリーニング方法を提供するものである。本発明はまた、新規な抗炎症剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、肝癌の約70％に特定のタンパク質（肝癌細胞サブトラクテッドcDNAライブラリークローン１；Hepatoma Subtracted-cDNA Library Clone One）が発現していることを見出し本発明を完成した。
　従って、本発明は、被験細胞を培養し、HSCO（肝癌細胞サブトラクテッドcDNAライブラリークローン１）遺伝子が発現されたか否かを決定することを特徴とする、被験細胞が癌細胞であるか否かを決定する方法を提供する。また、本発明は、HSCOまたはHSCO関連蛋白質を用いて、肝癌あるいは炎症性疾患を治療する方法を提供する。
【０００６】
　前記HSCO遺伝子が発現するか否かは、例えば培養細胞中のHSCOをコードするmRNAの存否により決定するすることが出来る。或いは、前記HSCO遺伝子が発現するか否かを、培養物中のHSCOの存否により決定することが出来る。前記HSCOは配列番号：１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の除去、付加又は置換により修飾されているアミノ酸配列を有する。
【０００７】
　本発明はまた、被験物質の存在下で、HSCO（肝癌細胞サブトラクテッドcDNAライブラリークローン１）遺伝子を有する細胞を培養し、それによりHSCOの発現が抑制されたか否かを決定することを特徴とする、肝癌抑制物質のスクリーニング方法を提供する。
　前記HSCO遺伝子の発現が抑制されるか否かは、例えば、培養細胞中のHSCOをコードするmRNAの生成量の変化により決定することが出来る。
　前記HSCO遺伝子の発現が抑制されるか否かは、例えば培養物中のHSCOの生成量の変化により決定することが出来る。前記HSCOは好ましくは配列番号：１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の除去、付加又は置換により修飾されているアミノ酸配列を有する。
【０００８】
　本発明はまた、（a）配列番号：１に示すアミノ酸配列、（b）配列番号：１に示すアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は置換により修飾されており且つ抗炎症作用を維持しているアミノ酸配列、（c）配列番号：２に示す塩基配列を有する核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされており且抗炎症作用を維持しているアミノ酸配列、或いは（d）配列番号：１に記載のアミノ酸配列に対して90％以上配列同一性を有し且つ抗炎症作用を有するアミノ酸配列、を有するHSCO関連タンパク質を含んで成る、抗炎症剤を提供する。前記抗炎症剤は予防薬又は治療薬であることが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
　NF−κBは、アポトーシスから保護するか又はそれに寄与する転写因子であり、生体内で炎症を引き起こすことが知られている。ここで本発明者は、NF−κBに結合し、その機能を阻害するHSCOの同定を行なった。HSCO mRNAは、分析された30の肝細胞癌のうち20において過剰発現していた。HSCOの過剰発現は、カスパーゼ９活性化、及びDNA損傷剤により誘発されるアポトーシスを阻害し、他方、TNFαにより誘発されたアポトーシスを増強した。
【００１０】
　IκBαと同様、HSCOはNF−κB活性を阻害し、そしてp53−誘導されるアポトーシスを阻害した。しかしながら、根本的な機構は異なっていた。HSCOは、RelA NF−κBに結合し、その核から細胞質への排出を促進することによりRelA NF-κBを細胞質に留める、核−細胞質シャトルタンパク質である。これらの結果から、HSCOの過剰発現は、シグナル伝達の間、NF−κBの核局在化を妨げることによってp53−誘導アポトーシスを抑制し、肝発癌に寄与することを示唆している。
【００１１】
　本発明者らは、新規の発生系統的に保存されたタンパク質、すなわち実質的な数のヒトHCCにおいて過剰発現され、そしてその結果、臨床学的癌におそらく関連しているHSCOを同定した。HSCOの機能は、p53−介在性アポトーシスの阻害をもたらす、RelA NF-κBの細胞質隔離であると同定された。従って、HSCOは、特にDNA−損傷剤と組合してのHCCを治療するための有望な標的である。この研究は、癌におけるp53によるアポトーシス誘導を回復させるための治療ストラテジーの開発に寄与するであろう。また、NF−κBの機能抑制による抗炎症薬の開発に寄与するであろう。
【００１２】
　上記HSCO関連タンパク質は、は配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する。
　また、生理活性タンパク質は、その活性に必須でない領域において、１〜数個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されていても生来の活性を維持しうることが知られている。従って、本発明のためには、上記のHSCOタンパク質において、１〜数個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており且生来の活性を維持しているものであっても良い。
【００１３】
　更に、本発明に使用しうるタンパク質としては、配列番号：２に示す、HSCOタンパク質をコードする核酸と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされており且つ抗炎症作用をを維持しているタンパク質であっても良い。更に、配列番号：１に記載のアミノ酸配列に対して、90％以上、好ましくは95％以上の配列同一性を有し、且つ抗炎症作用を有するものであってもよい。
　本発明においては、上記の種々の類似体を含めて、「HSCO関連タンパク質」と称する。
【００１４】
　従って、本発明の抗癌剤は、上記のHSCO関連タンパク質のいずれかを医薬として許容される担体と共に含んで成るものである。
　本発明の方法において、発現されたHSCOを検出するには、HSCOに対する抗体、例えば抗血清又はモノクローナル抗体を用いれば良い。また、HSCHをコードするmRNAを検出するには、mRNAの塩基配列に対して相補的なDNAプローブを用いて直接検出してもよく、或いはmRNAをPCR増幅した後に、特異的なプローブを用いて検出しても良い。
【００１５】
　世界中の最も頻繁な癌の１つは、肝細胞癌（HCC）である（Murray and Lopez, 1997; Hamilton and Aaltonen, 2000）。HCCは診断された時点から約６ヶ月しか生存できないほど急速に進展する。前記疾病は、北及び南アメリカ及びヨーロッパよりもアフリカ及びアジアの一部においてより流行しており、それはウィルス性肝炎、ヘモクロマト−シス、既知の発癌物質及びトキシンとの強い病原関連性がある。アフラトキシンB1への暴露が流行する地域においては、p53遺伝子、すなわち種々の型のヒト癌において同定される最も一般的に突然変異された遺伝子の１つの突然変異（Vogelsteinなど., 2000）は、HCCの50〜60％のおいて観察される（Tannapfel and Wittekind, 2002）。
【００１６】
　しかしながら、日本、ヨーロッパ及びUSAの地域においては、p53突然変異は、特に低分化度又は低いステージのHCCにおいては頻繁ではない（Konishiなど., 1993）。今日まで、多くの遺伝子がHCCにおいて変異することが示されているが、しかし肝発癌の分子機構はまた十分には解明されていない（Feitelsonなど., 2002）。
【００１７】
　転写因子の脊椎動物NF−kB/Relファミリーは、次の5種のメンバーを包含する：RelA (p65), RelB, c-Rel, NF-κB1（p105）/p50及びNF−κB2（p100）/p52（Baldwin, 1996; Pahl, 1999）。それらは、DNA標的部位に対する明白な親和性を有する、ホモダイマー又はヘテロダイマーのほとんどの組合せを形成することができる。最も富んでいる形は、RelA−p50ヘテロダイマー及びRelA−RelAホモダイマーである。NF−κB/Relファミリーは、炎症、宿主防御、細胞生存及び増殖に関与する多数の遺伝子の誘発可能発現において主用役割を演じる。NF−κBは、アポトーシス応答を調節するキータンパク質の１つである（Barkett and Gilmore, 1999; Karin and Lin, 2002）。
【００１８】
　rela ノックアウトマウスは、広範囲の肝臓アポトーシスの結果として子宮内において死亡する（Begなど., 1995）。relaノックアウトマウスから確立された線維芽細胞は、腫瘍壊死因子α（TNFα）誘発されたアポトーシスに対して高い感受性を示し、そしてRelA発現はそれらの細胞においてTNFαに対するそれらの感受性を回復させる（Beg and Baltimore, 1996）。様々なデーターから、はアポトーシスを抑制する役割を持つことを示唆している。しかしながら、いくつかの条件下では、NF−κBの活性化が、アポトーシスのために必要である（Barkett and Gilmore, 1999）。
【００１９】
　例えば、デング熱ウィルス感染されたHepG2肝細胞は、インビトロでアポトーシスを受けるが、NF−κBデコイで処理した細胞は、ウィルス誘発による細胞死が阻害される（Marianneauら., 1997）。Ryanら. (2000) は、NF−κB活性化がp53介在性アポトーシスに必要であり、そしてrela−/−マウス胚線維芽細胞がp53誘導細胞死に対して耐性であることを示している。種々の環境、例えば細胞や誘導剤の種類に依存して、NF−κB複合体は、アポトーシス促進効果又は抗−アポトーシス効果の両面を有するように思える。
【００２０】
　肝発癌に関与する遺伝子を同定し、治療剤の標的分子を見出すために、本発明者は、HCCにおいて過剰発現する遺伝子の濃縮された、サブトラクションcDNAライブラリーから、ガンキリン（gankyrin）をこれまでに同定している（Higashitsujiなど., 2000）。ガンキリンは、腫瘍形成アンキリンリピートタンパク質であり、すべての試験されたHCCにおいて過剰発現され、そして網膜芽腫遺伝子生成物（Rb）の分解を促進する。今回、本発明者は、HSCOを同定しその性質を明らかにしたので報告する。HSCOはNF−κBに結合し、その核外輸送を促進し、そしてp53−介在性アポトーシスを阻害した。
【００２１】
　HSCO、すなわちHCC細胞において過剰発現される新規グリオキサラーゼII関連タンパク質の同定
　HCCにおいて過剰発現されるクローンの１つは、HSCO（Hepatoma Subtracted-cDNA library Clone One）として命名された新規タンパク質をコードする遺伝子であった。HSCOのアミノ酸配列は、ヒトグリオキサラーゼのアミノ酸配列への類似性を示したが、しかしマウス、ショウジョウバエ、C.エレガンス（C. elegans）、アラビドプシス（Arabidopsis）及びシネコシスチス（Synechocystis）、並びに酵母GLO4のHSCOと推定されるアミノ酸配列に対してより高い相同性を示した（図１及び図２）。
【００２２】
　アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）においては、５種のアイソザイムがグリオキサラーゼに関して知られており、そしてHSCOはアミノ酸配列においてGLX2−３に対して最も高い相同性を示した。HSCOは、アミノ酸配列において35〜196を包含するメタロ−β−ラクタマーゼ様領域を含んだ。このメタロ−β−ラクタマーゼ様領域は、関連するタンパク質内に保存され、そしてこのファミリーを通して保存されるHXHXD(X)iH(X)jC(X)kH（アミノ酸についての１文字コードにおいて、Xはいずれかのアミノ酸を示し、そしてｉ＝55〜74、ｊ＝18〜24及びk＝37〜41）のコンセンサス配列は、Zn(II) リガンドであると思われる（Daiyasuなど., 2001; Zangなど., 2001）。N−末端及びC−末端延長部分は、既知のタンパク質に対する相同性を有さない。
【００２３】
　生体反応では、メチルグリオキサールは、グリオキサラーゼIにより還元型グルタチオンを補因子としてS−D−ラクトイルグルタチオンに解毒され、そしてS−D−ラクトイルグルタチオンはグルタチオンの同時再生を伴なってグリオキサラーゼIIによりD−乳酸に転換される（Zangなど., 2001）。グリオキサラーゼIはいくつかのヒト腫瘍細胞において選択的に過剰発現され、そして抗腫瘍剤−誘発されたアポトーシスに対して耐性因子として機能することができる（Sakamoto, H. など. 2000）。アポトーシスの誘発を担うグリオキサラーゼIの標的物は同定されない。
【００２４】
　グリオキサラーゼ系が腫瘍細胞内で細胞毒性を有するメチルグリオキサールを解毒する主要な役割を担うと推定されること、、及びHSCOがグリオキサラーゼIIに対して構造的に類似しているために、本発明者はHSCOのグリオキサラーゼII活性をインビトロで分析した。図３に示されるよう、対照GST−グリオキサラーゼII融合タンパク質は、期待通りの酵素活性を示した。しかしながら、HSCOはいずれの活性も示さず、このことは、HSCOがグリオキサラーゼIIに関連するが、しかしそれとは異なる系統発生的保存されたタンパク質であることを示している。HSCOの可能な酵素活性及びその基質はまだ決定されていない。
【００２５】
　HSCOのmRNAレベルは、研究された30種のHCCの20種において、155％〜1198％（平均332％）、高かった。図４のBに示されるように、HSCOは約27kDaのサイズのタンパク質をコードし、そしてその発現は非癌性肝組織における発現に比較して、HCCにおいて高かった。免疫組織学的分析は、HSCOタンパク質が腫瘍細胞の細胞質に主に局在化することを示した（図４のC）。次に、本発明者は、HSCOの過剰発現と、臨床病理学的発現、例えばウィルス感染、α−フェトプロテイン、HCCの組織学的等級、肝門脈関与、腫瘍数及び臨床学的段階との間の関連性を試験したが、しかし有意な関連性は同定されなかった（データは示されていない）。
【００２６】
　HSCOによりもたらされるp53−依存性アポトーシス対する耐性と、TNFα誘導性アポトーシスに対する感受性
　肝発癌におけるHSCOの役割を解明するために、本発明者は、マウスNIH/3T3線維芽細胞において、HCCとほとんど同等のレベルまでHSCOを安定して過剰発現した（図５のA）。細胞形態学、細胞倍化時間、又は足場依存的増殖の変化は、分析されたクローンにおいてはみられなかった（データは示されていない）。
【００２７】
　それらの安定したトランスフェクタントを用いて、本発明者は、アポトーシスにおけるHSCOの関与を調べた。抗腫瘍剤及びTNFαが、それぞれp53−依存性及びp53−非依存性アポトーシスを誘発するために使用された（Evan and Vousden，2001; Johnstoneなど., 2002）。HSCOを過剰発現するNIH−3T3細胞は、ベクタートランスフェクトされた対照細胞に比較して、アドリアマイシン及びエトポシドに対してより耐性であった（図5B）。p53タンパク質レベルは、それらの細胞間で同等であった（データは示されていない）。HSCO−過剰発現された細胞においてエトポシドにより誘発されたカスパーゼ９の活性は、対照細胞において誘発されたその活性の21±3％であり（それぞれ、ｎ＝３）、これは、HSCOがp53−依存性アポトーシスに対する耐性を付与したことと一致する。一方、HSCOは、TNFαにより誘発されたアポトーシスに対して細胞の感受性を増加させた（図5のB）。
【００２８】
　いくつかの研究は、NF−κBがTNF−に介在される細胞死の感受性を変化させるのに決定的な役割を演じることを示している（Linなど., 1996; Beg and Baltimore, 1996）。TNF感受性はまた、腫瘍遺伝子及びウィルス感染により調節されることが示されている（Perez and White, 2000; Youなど., 2002）。観察された発現がHSCOの過剰発現よりもむしろトランスフェクタントのクローン差異のためである可能性を排除するために、本発明者は、HA−標識されたHSCOがドキシサイクリン（Dox）の存在下でのみHCCと同等レベルに発現されるHela Tet-On-HSCO細胞を作製した（図6のC）。NIH/3T3トランスフェクタントにおける発見に類似して、HSCOはアドリアマイシン及びエトポシドにより誘発されたアポトーシスに対して耐性を付与し、またTNFαにより誘発されたアポトーシスに対しては細胞を感受性にした（図6のD）。
【００２９】
　最近、遺伝子発現の効果的及び特異的ダウン−レギュレーションは、哺乳類細胞における低分子干渉性RNA（siRNA）を用いることによってなされている（Brummelkamp など., 2002）。アポトーシス感受性に対するHSCOの効果が一般的であるか、及びHSCOの過剰発現がHCCにどのように関連するかの問題を解決するために、本発明者は、siRNAによりHSCOの発現を阻害し、そしてアポトーシスに対する感受性の変化を調べた。図7のEに示されるように、siRNAはHeLa細胞における内因性HSCOタンパク質のレベルを低下させることが可能であった。
【００３０】
　それらの細胞は、対照のHeLa細胞に比較して、アドリアマイシン及びエトポシドにより誘発されたアポトーシスに対してより感受性であるが、ところがTNFαに対する感受性には影響しなかった（図7のF）。本質的に類似する結果が、HSCO転写物に対するsiRNA又はオリゴDNAアンチセンスを用いて、ヒトHCC細胞株、すなわちHuh−７及びPLC/PRF/5において観察された（データは示されない）。HSCOのレベルの低下がTNFαに対する感受性の低下をなぜもたらさなかったかの理由は、現在未知であるが、しかし１つの可能性は、癌細胞株の確立及び/又は維持の間、TNFα感受性のが増加しなくなった細胞が、培養で生き残ったと考えられる。
【００３１】
　最近、NF−κBは、p53−誘導性のアポトーシスに必須であることが示されている（Ryanなど., 2000）。このNF−κB−依存性アポトーシスに対するHSCOの効果を調べるするために、本発明者は、Saos−２細胞、すなわち野生型p53を発現誘導可能なように内因性p53を発現しない腫瘍細胞系を構築した（図8のA）。Ryanなど. (2000) の報告のように、それらの細胞におけるp53の誘導は、細胞にアポトーシスを引き起こした。そしてこのアポトーシスは、NF−κB活性を完全に阻害するスーパーリプレッサーIκBα（SRIκBα）を発現させることにより完全に阻害された（図8のB）（Brockmanなど., 1995）（図8のC）。
【００３２】
　HSCOは、SRIκBαと同じように効果的に、それらの細胞においてp53の発現により誘発されるアポトーシスを阻害した（図7のC）。ウェスターンブロット分析の結果、SRIκBα又はHSCOの発現はp53タンパク質のレベル影響しないを示した（データは示されていない）。それらの結果は、HSCOが抗腫瘍剤−誘発された、p53−依存性アポトーシスに対すしては耐性をもたらすが、しかしHCC及び他の細胞系においてTNFα−誘発されたアポトーシスに対しては感受性にをもたらすことを示し、そしてHSCOがNF−κB活性に対する抑制効果を有することを示唆する。それらはまた、HSCOが化学療法に対するHCCの耐性に関連することを示唆している。
【００３３】
　NF−κB活性に対するHSCOの抑制効果及びIκBαではなく、RelA/p65との相互作用
　次に、本発明者は、NF−κBのトランスアクチベーション活性に対するHSCOの効果を試験した。血清飢餓の後、ルシフェラーゼ活性を、NF−κB−依存性ルシフェラーゼレポーター遺伝子をトランスフェクトした293細胞に誘導した（図9のA）。HSCOは、このトランスアクチベーションを、用量依存的に抑制した。HSCOは、MEKK、及びNF−κBのRelA/p65サブユニットにより誘発されたNF−κB活性を抑制した（図9のB及び10のC）。それらの効果はNF−κB活性に対して特異的であった。HSCOは、AP−１活性にもE2F−１活性にも影響を与えなかった（図10のD及びデータは示されていない）。
【００３４】
　HSCOはグリオキサラーゼIIに対する構造的類似性を有するが（図１）、グリオキサラーゼIIの発現はNF−κBのトランスアクチベーション活性に対する効果を有さなかった（図11のE）。さらに、本発明者は、その内因性レベルを低めることによって、NF−κB活性に対するHSCOの抑制効果を確かめた。HeLa細胞においては、HSCOタンパク質のレベルは、HSCO転写体に対するsiRNA又はオリゴDNAアンチセンスを生成するいずれかのpSUPERプラスミドによるトランスフェクションにより減少した（図11のE、及びデータは示されていない）。図9のFに示されるように、HSCOレベルが減少すると、エトぽシド−誘発されたNF−κｂ活性は増加した。
【００３５】
　NF−κBの活性は、IκBαにより調節されることが知られている（Karin and Lin, 2002）。NF−κBの活性化は、IκBαのリン酸化により進行される、細胞質NF−κB−IκBαの解離により引き起こされる。ヒト乳頭腫ウィルス腫瘍タンパク質E7は、IκBキナーゼ複合体を標的とし、Iκβαのリン酸化及び分解を減少させ、NF−κB活性化を阻害する（Spitkovsky, など., 2002）。しかしながら、HSCOが、TNFα又はエトポシドによる刺激により、その量又は燐酸化状態に影響を及ぼさないので、NF−κB活性化に対するHSCOの抑制効果は、IκBαを介さないと思われる（図12のA）。免疫沈降分析の結果、HSCOとIκBαとの間で複合体形成が起こらないことが示された（データは示されていない）。
【００３６】
　HSCOはSRIκBα活性に類似する活性を示したので、本発明者は、HSCOがNF−κBに結合すると想定した。可能性を調べるために、本発明者は、HSCOがDoxの存在下で発現されるHeLa Tet-On-HSCO細胞を使用した（図6のC）。TNFα又はエトポシドによる刺激を行い、さらにDoxを存在させた条件でのみ、HA−HSCOは抗−RelA抗体及び内因性RelAにより同時免疫沈殿された（図12のB、上部パネル）。抗−ｃ−Rel、又は抗―p50抗体では免疫沈殿されかった（データは示されていない）。
【００３７】
　抗−HA抗体により沈降した逆の免疫複合体においては、RelAを検出したが、しかしc−Rel又はp50は検出されなかった（図12のB、下部パネル、及びデータは示されていない）。外因性RelA及びHA−HSCOを発現する293細胞を用いても類似する結果が得られた（データは示されていない）。内因性HSCOとRelAとの間の相互作用はまた、エトポシドによる刺激の後のHeLa細胞においても観察された（図13のC）。それらの結果は、過剰発現された内因性HSCO及びRelAがヒト腫瘍細胞において特異的に相互作用することを示した。
【００３８】
　相互作用はさらに、インビトロタンパク質結合アッセイにより分析された。本発明者は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）に融合される組換え野生型HSCOタンパク質を調製した。GST−HSCO融合タンパク質は、インビトロ−翻訳された完全長のRelAをプルダウンした（図13のD）。RelAの相互作用は、対照GSTタンパク質に関しては観察されなかった。種々の変異体RelAタンパク質の分析は、HSCO−相互作用ドメインがRelAの残基１〜300に存在することを示し（図13のD）、このことは、RelAの核局在化シグナル（NLS）がこの相互作用に包含されないことを示す。
【００３９】
　核外輸送の促進により引き起こされたHSCO−過剰発現する細胞における核NF−κBの低められた活性及び量
　HSCOがNF−κBの活性を阻害する機構を明確にするために、本発明者は、ゲルシフトアッセイ（EMSA）により、NF−κB DNA−阻害活性に対するHSCOの効果を分析した（14）。エトポシドによる293細胞の処理は、核抽出物におけるNF−κB DNA−結合活性の上昇を誘発した。発現ベクターにおけるHSCO cDNAの同時トランスフェクションは、DNAプローブに対して特異的に結合される核NF−κBの量を、容量依存的に低めた。
【００４０】
　バンドの特異性は、100倍過剰のラベルされていない野生型κBオリゴヌクレオチドによるバンドの消出と、κB−結合部位において突然変異導入されたオリゴヌクレオチドでは消失しないことで確認された。抗−RelA、抗−p50又は抗―cRel抗体を用いてのスーパーシフトアッセイにより、誘発されたタンパク質−DNA複合体がRelA−RelAホモダイマーから主に構成されることを示された。それらの結果は、DNA−結合活性、及び/又は核NF−κBの量がHSCOの過剰発現により低められることを示した。
【００４１】
　従って、本発明者は、インビトロでのNF−κBのDNA−結合活性に対するHSCOの効果を試験した（図15のB）。放射性ラベルされたκB−DNAとインビトロ−翻訳されたRelAをGST−IκBαとインキュベートした場合、GST-IκBを増加させるほど結合されるNF−κBの量は減少した。一方、RelAよりも10倍モル過剰のGST−HSCOは、RelAとκB部位との間での複合体形成に対して効果を有さなかった。しかしながら、RelA及びGST−HSCOをまず、30分間インキュベートし、次に、放射性ラベルされたκB部位を添加した場合、HSCOは、κB部位に結合するRelA−RelAホモダイマーの量を、用量依存的に減少させた（図15のC）。
【００４２】
　GST−グリオキサラーゼIIはそのような効果を示さなかった。それらの結果は、HSCOがRelAに結合し、そしてκB−部位への結合を部分的に妨げるが、しかしこの効果は、IκBαに比較して弱く、HSCOはκB部位に結合したRelAを解離することができないことを示した。次に、本発明者は、HSCOを過剰発現する細胞の核におけるRelAの量を調べた。図16に示されるように、HSCOの発現は、核NF−κｂの量を、用量依存的に減少させた。最近、ｃ−mycが、NF−κBの核トランスロケーションではなく、RelAトランスアクチベーションを妨げることによってTNF−介在性アポトーシスに対して細胞の感受性を高めるが、ことが示された（Youなど., 2002）。しかし、HSCOは、RelAの核蓄積を妨げることによって、TNF−介在性アポトーシスに対して細胞の感受性を高めた。
【００４３】
　免疫組織化学的分析は、HSCOがHCC細胞の細胞質に主に局在化することを示唆した（図4のC）。図17のAに示されるように、HSCOは、HeLa細胞における細胞質及び核に分散していた。レプトマイシンB、すなわちCRM1/エクスポルチン１（exportin）と核輸送シグナルとの間の相互作用を破壊する核輸送インヒビター（Kudoなど., 1999）の存在下で、HSCOは核に蓄積したが、このことは、HSCOが核−細胞質シャトルタンパク質であることを示す。HSCOのアミノ酸配列からは、ロイシンに富んでおり、核外輸送シグナルとして作用すると思われるいくつかの領域が存在する（図１A）。本発明者は、５種の異なった二重変異体、すなわちHSCOの24A/25A, 68A/70A, 70A/72L, 214A/217A及び229A/231Aを作製し、COS7、 HeLa及び293細胞にそれぞれ発現したが、しかし核における変異体タンパク質の蓄積は認められなかった（Higashitsuji, H and Fujita, J., 未公開）。従って、核外輸送シグナルの正体は現在、不明である。
【００４４】
　293細胞にRelA発現プラスミドをトランスフェクトした場合、RelAは核に蓄積した（図17のB、上部パネル）。しかしながら、HSCO発現のプラスミドによる同時トランスフェクトの結果、RelAはHSCOと同じく局在し、細胞質に隔離された（図17B, 中部パネル）。これは、HSCOの発現が核NF−κBの量を用量依存的に低める上記発見と一致する（図12のD）。レプトマイシンBの存在下で、HSCO及びRelAの両者は、主に核に局在し（図17のB、低部パネル）、このことは、HSCOがRelAの核トランスロケーションを阻害しないが、しかし核からのその輸送を促進することを示す。RelAに対するHSCOの効果は、それが核−細胞質シャトルタンパク質CIRPの局在化に影響しないので、特異的であった（Nishiyamaなど., 1998）（データは示されていない）。
【００４５】
　TNFαによりHeLa Tet-On HSCO細胞を処理することによって、、HSCOがシグナル化の間、内因性RelAの細胞質蓄積を引き起こすことが観察された（図18のC）。HCC細胞において観察される、HSCOの過剰発現が、トランスフェクト細胞と同様に、内因性RelAを隔離する機能があるかどうかを評価するために、本発明者は、TNFα又はエトポシドによりHSCOを過剰発現するヒトHCC細胞株、すなわちHuh−７を処理し、そして次に、RelAの局在化を分析した。
【００４６】
　RelAは、刺激の後、Huh−７細胞の核にトランスロケーションされなかった（データは示されていない）。同様の結果が、siRNAを生成しないpSUPERベクターによりトランスフェクトされたHuh−７細胞を、エトポシドにより処理した場合に得られた（図18のD, 上部パネル）。しかしながら、HSCOの発現をsiRNAにより抑制すると、RelAは核に蓄積し（図18のD、下部パネル）、このことは、過剰発現された内因性HSCOがヒトHCC細胞において細胞質にRelAを隔離することを示す。
【００４７】
　従来のモデルは、刺激されていない細胞においては、NF−κBがIκB阻害タンパク質と結合し不活性形で細胞質に隔離されていると仮定している（Foo and Nolan, 1999; Ghushなど., 1998; Cyert, 2001）。IκBは、RelAのNLSに結合しマスクする。刺激が入ると、IκBは、急速にリン酸化され、ユビキチン化され、続いて、プロテアソームにより分解される。これにより、NF−κBが放出され、核へ移行し、種々の遺伝子の発現を誘導する。本発明者は、HSCOがIκBαではなくNF−κB活性影響を与えることを見出した。本発明者は、HSCOがNF−κBのRelAサブユニットに結合し、細胞質への局在化を引き起こすことを見出した。しかしながら、RelAのNLSは、その結合に関与しなかった。
【００４８】
　レプトマイシンBを用いることによって、本発明者は、核内へのトランスロケーションの減少ではなくむしろ、核外への輸送の促進が、RelAの細胞質蓄積の原因であることを示した。本発明者は、HSCOが核−細胞質シャトルタンパク質であることを示した。最近、IκBαがまた、核と細胞質との間でシャトルすることが示されている（Arenzana-Seisdedosなど., 1997; Johnsonなど., 1999; Tamなど., 2000; Carlottiなど., 2000）。さらにChenなど. (2001)は、、RelAが核においてアセチル化による調節を受け、アセチル化型RelAがIκBαと弱く相互作用することを示している。
【００４９】
　転写因子として作用した後、アセチル化されたRelAは脱アセチル化され、IκBαに結合し、そして核から輸送されることが推定される。HSCOは主に、RelAの非アセチル化された形に結合され（Higashitsnji, H. and Fujita, J., 未公開）、そしてHSCOは、DNAとRelAの結合を解離させないので、HSCOはたぶん、RelAがアセチル化される前、核においてRelAと結合し、そしてCRM−１−依存性経路を通して細胞質に輸送し、NF−κB活性の阻害をもたらす。
【００５０】
　いくつかの腫瘍タンパク質、例えばヒト乳頭腫ウィルスE6及びE7（Spitkovskyなど., 2002）及びｃ−Myc（Youなど., 2002）は、種々の機構によりNF−κB活性を阻害することが示されている。本発明の研究においては、本発明者は、過剰発現されたHSCOがNF−κB活性を阻害することによって抗−アポトーシス活性を示すことを明らかにした。ほとんどの情況下でNF−κBは抗−アポトーシス活性を示すが、それはまた、アポトーシス促進活性も有する（Barkett and Gilmore, 1999; Ryonなど., 2000）。さらに、Gapuzanなど. (2002)は、最近、RelAが腫瘍抑制活性を有することを示している。
【００５１】
　本発明者はまた、HSCOの発現が試験されたHCCの67％で高められ、そして過剰発現された内因性HSCOが、HCC及び子宮癌細胞株においてアドリアマイシン及びエトポシドにより誘発されたp53−依存性アポトーシスに対して耐性を付与することを示した。HCCは、化学療法剤耐性の腫瘍と捉えられている（Treiber, 2001）。ある研究においては、治療された21人の患者のうち、わずか１人の患者がエトポシドに対してPartial Responseを示した。単独の化学療法では、奏効率は約20％であるが、生存率は多くの場合改良されていなくの満足の行くものではないなく、また。多剤併用化学療法は、幾分高い奏効率を有するが、しかし重大な副作用を伴なう。癌において検出される最も共通する抗−アポトーシス病変は、p53腫瘍−サプレッサー経路の不活性化である（Vousden and Ln, 2002）。
【００５２】
　TP53遺伝子（p53をコードする）自体の突然変異が、すべての癌の約半分において、しかししばしば、悪性進行におけるかなりの後期段階で見出されている。ほとんどの癌は１つか二つの機構によりp53機能を失っているが、HCC、特に初期段階でのHCCにおいては、多くが野生型p53（Konishiなど., 1993）を有しており、少なくとも部分的に、アポトーシス促進活性を抑制するHSCOの発現増加を伴なっていると予測される。それらのHCCのHSCOを阻害し、p53によるアポトーシス誘導を修復することによって、効果的な治療をデザインことができるであろう。HSCOの調節及び機能に対するさらなる研究は、肝癌発症の分子機構及びHCCに対する治療戦略の開発に寄与できるであろう。
【実施例】
【００５３】
　次に、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
　一般的実験方法：
　細胞培養：
　NIH/3T3, COS-7, 293, Saos-2, HeLa, Huh-7及びPLC/PRF/５細胞及びそれらに由来する細胞は、10％ウシ胎児血清添加されたダルベッコ変性イーグル培地において、５％CO2の条件下で37℃で維持した。アポトーシスの誘発のために、細胞を、エトポシド（100μg/ml）、アドリアマイシン（0.5μg/ml）又はTNFα（50ng/ml）及びシクロヘキシミド（10μg/ml）により処理した。血清飢餓実験において、293細胞を、ウシ胎児血清を有さない培地において32時間、培養した。
【００５４】
　SRIκBαを発現するプラスミドは、Dr. D.W. Ballard, Nashcille, TNより寄贈を受けた。安定したクローンのトランスフェクション及び単離を、Higashitsujiなど., 2000に記載のようにして、行った。
【００５５】
　HSCOを安定して発現する、293及びNIH/3T3細胞クローンは、HSCO cDNAを含むpMkit-Neo-HSCOプラスミドにより細胞をトランスフェクトすることによって得た。対照として、ベクターのみをトランスフェクトした。Saos−2Tat−On−p53細胞は、p53 cDNAを含むpTet−Onプラスミド及びpTRE2プラスミド（Clontech, Tokyo, Japan）によるSaos−2細胞の同時トランスフェクション、続いて、p53を過剰発現誘導されるクローンの選択により作製した。同様に、293 Tet-On-HSCO細胞及びHeLa Tet-On-HSCO細胞は、HA−tagを付加したHSCO cDNAを含むpTet-Onプラスミド及びpTRE2プラスミドをそれぞれ、293細胞及びHela細胞にトランスフェクトすることによって作製した。生存細胞の数は、顕微鏡下で血球計を用いて、トリパンブルー色素排除方法により計数するか、又はMTTアッセイにより評価した。
【００５６】
　細胞におけるsiRNAの生成は、BrummelKampなど. (2002) により記載のように、ポリメラーゼ−III H1-RNA遺伝子、及び同じ19−nt配列の相補鎖の逆配列由来の短いスペーサー（９−ntの長さ）、標的遺伝子に由来する19−ntの配列をを含むpSUPERベクターを作製した。pSUPER−HSCOwtは、標的配列として、HSCO cDNA由来の19−nt（nt番号393〜411；GenBank受託番号D83198）を含んだ。対照として、本発明者は、HSCO cDNA nt番号406（A→G）及び408（A→C）で突然変異を含むpSUPER-HSCOmutを作製した。HSCO mRNAに対するオリゴDNAアンチセンスの配列を、cDNA nt番号55〜74から誘導した。スクランブルされた20−マーのオリゴDNAが対照として作用した。
【００５７】
　cDNAクローニング及び遺伝子発現の分析：
　HCC組織及び非癌性肝臓組織を、Kyoto University Hospitalで手術を受ける患者から得た。告知に基づく同意をすべての患者から得た。cDNA控除、cDNAクローニング及びヌクレオチド配列分析は記載されている（Higashitsujiなど., 2000）。免疫組織化学、及びウェスターン及びノザンブロット分析を、記載のようにして行った（Ponnoなど., 2000）。
【００５８】
　抗−HSCOポリクローナル抗体は、カルボキシル末端オリゴヌクレオチド（NMRCGVQTPTA）によりウサギを免疫することによって作製した。核/細胞質分離のために、細胞質抽出物を、プロテアーゼインヒビター、及びホスファターゼインヒビターの混合物を含む低張緩衝液への細胞の溶解により調製した。核抽出物を、0.5mMのDTT、10mMのHEPES、pH8.0，10mMのKCl及び1.5mMのMgCl2を含む低張緩衝液による細胞膜透過法により調製した。次に、核を、20mMのHEPES、pH8.0、420ｍMのNaCl、1.5mMのMgCl2, 0.2mMのEDTA, 25%(V/v)のグリセロール、0.5mMのDTT及びプロテアーゼインヒビターを含む高張緩衝液に溶解した。
【００５９】
　細胞質及び核抽出物を、ウサギ抗−IκBα（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、抗−ヒストンH3（Santa Cruz Biotech.）、ヤギ抗−p65/RelA (Santa Cruz Biotechnology)、抗−アクチン（Santa Cruz Biotech.）、マウス抗−SC35（Sigma Aldrich Japan, Tokyo, Japan）、抗−phospho−IκBα（Ser32/36）（Cell Signaling Tech., INC．，Beverly，MA）、及びマウス抗−HA（Roche Diagnostics, Japan）抗体を用いて、ウェスタンブロットにより分析した。カスパーゼー９活性を、カスパーゼ熱量計プロテアーゼアッセイキット（MBL、Nagoya，Japan）により、その製造業者のプロトコールに従って測定した。
【００６０】
　タンパク質−タンパク質相互作用の分析：
　HeLa Tet-On-HSCO細胞を、Doxの存在又は非在下で培養した。内因性RelA NF-κB活性を、それらの細胞をTNFα（50ng/ml）を共に１時間、又はエトポシド（50μg/ml）と共に４時間インキュベートすることによって誘発した。次に、細胞溶解物を調製し、そして免疫沈殿及びウェスターンブロット分析を、ヤギ又はウサギ抗−RelA、ウサギ抗−cRel、抗−p50、抗−IκBα及び抗−HSCO、マウス抗−RelA及び抗−HA抗体を用いて、Higashitsujiなど., 2000に記載のようにして行った。内因性HSCOと内因性RelAとの間の相互作用を分析するために、HeLa細胞をエトポシドにより処理し、そして細胞溶解物を、プロテインG支持体（Seize X Mammalian Immunoprecipitation Kit, Pierce, Rockford, IL）に固定された、ウサギ抗−HSCO又はヤギ抗−RelA抗体を用いて免疫沈殿せしめ、続いてウェスターンブロットにより分析した。
【００６１】
　HSCOと内因性RelAとの相互作用を、Dr. T. Okamoto, Nagoya, Japanにより提供されたプラスミドpCMV−RelA（Yangなど., 1999）、及びpCMV4発現ベクターにおけるHA−標識されたHSCO cDNA又はHA cDNAにより293細胞を同時トランスフェクトすることにより試験した。次に、免疫沈殿及びウェスターンブロット分析を、上記のようにして行った。GSTプロダウンアッセイのために、HSCO cDNAを、発現ベクターpGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotechnology, Tokyo, Japan) 中にクローン化し、そしてGST−HSCO融合タンパク質として発現した。35S−ラベルされたRelA及びその変異体タンパク質を、TNT転写/翻訳システム（Promega, Madison, Wisconsin）を用いることにより調製し、そしてHigashitsujiなど., 2000に記載のようにしてアッセイした。
【００６２】
　電気泳動移動性シフトアッセイ（EMSA）
　293細胞を、プラスミドによりトランスフェクトし、そして24時間後、核抽出物を、Schreiberなど. (1989) により記載のようにして調製した。結合反応を、10μgのウシ血清アルブミン及び２μgのポリ（dI−dC）：ポリ（dI−dC）を含む、20μlの結合緩衝液（10mMのトリス、pH7.5、10mMのEDTA、0.5mMのDTT、50mMのNaCl及び５％グリセロール）に、0.1ngの32P−ラベルされた二本鎖κB部位オリゴDNA（野生型κB部位：5’−AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’, Rel DNA結合ドメインにおいてG→C置換を有する変異体κB部位（配列番号：3)；5’−AGTTGAGGCGACTTTCCCAGGC-3’(配列番号：4)）を含む混合物に、10μgの核抽出物を添加することによって行った。スーパーシフト実験のために、RelA、p50、ｃ−Rel又はSp−１（Santa Cruz Biotech.）に対する抗体１μgを、抽出物のアリコートに添加し、そして氷上で30分間インキュベートし、続いて、反応混合物を添加した。競合反応混合物は、100倍モル過剰の非放射性κB部位を添加した。
【００６３】
　インビトロEMSAのために、ヒトRelA cDNAを、上記のようにTNT転写/翻訳システム（Promega）を用いることによって、インビトロで生成した。ヒトIκBα、HSCO及びグリオキサラーゼII cDNAを、pGEX4Tベクターシリーズ（Amersham Pharmacia）中に導入し、そして個々のGST融合タンパク質を、製造業者のプロトコールに従って精製した。放射性ラベルされていないコンセンサス及び変異体κBオリゴDNAを、競争アッセイに使用した。抗体を、上記のようにしてスーパーシフトアッセイにおいてEMSA反応混合物に添加した。
【００６４】
　解離アッセイを、放射性ラベルされたκBプローブと共にRelAを25℃で15分間プレインキュベートし、続いて、１：２又は1：10のGST−IκBα、GST−HSCO又はGST−グリオキサラーゼIIを添加することによって行った。前記混合物を25℃で15分間インキュベートした。さらなるインビトロRelA EMSA研究を、GST−IκBα、GST−HSCO又はGST−グリオキサラーゼIIと共にRelAを25℃で30分間プレインキュベートし、そして次にκBプローブを添加することによって行った。前記混合物をさらに25℃で15分間インキュベートした。遊離及び結合されたBNAを、非変性４％ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動により分離した。ゲルを乾燥し、そして強化スクリーンを伴なって−80℃でフィルムに照射した。
【００６５】
　グリオキサラーゼII活性についてのアッセイ：
　GST−グリオキサラーゼII融合タンパク質及びGST−HSCO融合タンパク質を、それぞれ、完全長のヒトグリオキサラーゼII cDNA及びHSCO cDNAを含むプラスミドを用いて、上記のようにして調製した。グリオキサラーゼII活性を、Di Ilioなど. (1995) により記載のようにして、GSH及びD−乳酸へのS−D−ラクトイルグルタチオンの加水分解の初期速度を測定することによってアッセイした。アッセイ溶液は、0.5mMのトリス−HCl緩衝液、pH7.5, 300μMのS−D−ラクトイルグルタチオン及び適切な量の精製されたタンパク質を含んだ。ウシ肝臓からのグリオキサラーゼII（Sigma）及びGSTのみが、それぞれ正及び負の対照として作用した。
【００６６】
　レポーター遺伝子アッセイ
　プロモーターにNF−κB−結合部位（pNF−κB−Luc）又はAP−１−結合部位（pAP−１−Luc）を含むルシフェラーゼレポーターベクターを、Stratagene（La Jolla, CA）から購入した。E2F−１−結合部位を含むルシフェラーゼレポーターベクターは、Dr. A. Harel-Bellan, Centre National de la Recherche Scientifique, Franceにより提供された。レポータープラスミド及びpRL-TK (Promega) を、リン酸カルシウム法により、発現ベクターpCMV4−3HAに組み込んだHSCO cDNAをいろいろな量で、あるいはさらにpFC-MEKK、pCMV−RelA、ヒトグリオキサラーゼを発現するpCMV-GLXIIとともに、293細胞中に同時トランスフェクトした。
【００６７】
　48時間後、細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼ活性を、二重ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）により、その製造業者のプロトコールに従って測定した。内因性RelA活性に対するHSCOの効果を、上記のように、レポータープラスミド、pRL−TK及び上昇する量のHSCO cDNAにより同時トランスフェクトし、そして次に血清を伴なわないで培養された293細胞を用いて分析した。HSCOタンパク質レベルを低める効果を分析するために、HeLa細胞を、レポータープラスミド、pRL−TK, 及びいずれかのオリゴDNA又はpSUPER構造体により同時トランスフェクトし、次にエトポシドにより処理し、そして上記のようにして分析した。
【００６８】
　免疫蛍光染色
　細胞を、トランスフェクションの後、チャンバースライド上に再プレートし、そしてDr. M. Yoshida, Tokyo, Japan により提供されるレプトマイシンB（2ng/ml）の存在又は不在下で培養した。いくつかの実験のために、Dox, TNFα、エトポシド又はビークルのみを、トランスフェクションを伴なっては又は伴わないで、培養物に添加した。細胞を、４％パラホルムアルデヒドを含むPBSにより30分間、固定し、次に室温で30分間0.2％Triton X-100を含むPBSにより透過性にした。
【００６９】
　ウシ血清アルブミンにより非特異的抗体−結合部位を阻止した後、細胞を、ウサギ抗−HSCO及び/又はマウス抗−RelA抗体と共にインキュベートした。結合された抗体を、TRITC又はFITCに接合されるヤギ抗−ウサギ第２抗体（Dako Japan, Kyoto, Japan）、及びFITCに接合される羊抗−マウス第２抗体（BD PharMingen, San Diego, CA）により検出し、そして共焦点顕微鏡（Olympus, Tokyo, Japan）下で調べた。染色体DNAを、青色蛍光4’, 6-ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI, Molecular Probes, Inc., Eugen, OR）による染色により可視化した。
【００７０】
　実施例１.　HSCOの同定及びグリオキサラーゼIIとのその関連性
　図１及び図２に、ヒトHSCOの推定されるアミノ酸配列及びそれらとヒトグリオキサラーゼII（受託番号X90999）、マウス、ショウジョウバエ（AE003826）、C.エレガンス（Z68493）、アラビドプシス（U74610）及びシネコシスチス（D90909）における推定上のHSCO、及び酵母GLO4（CAA99230）との一列整列を示す。同一及び保存されたアミノ酸残基がそれぞれ、星印及び点により示されている。ヒト及びマウス配列データは、それぞれ受託番号D83198及びAB049623としてGenBank/EMBL/DDBJから入手できる。
【００７１】
　図３に、酵素活性の測定結果を示す。図３はグリオキサラーゼII活性はHSCOにおいて検出されなかったことを示す。左：GST−HSCO, GST−ヒトグリオキサラーゼII（GLXII）及びGSTが、グルタチオンビーズにより細菌溶解物から精製された。複数対のサンプルが、SDS/PAGEにより分離され、そして銀により染色された。レーン２，４及び７、精製されたサンプル。レーン３及び５、溶解物。レーン１及び６、分子量マーカー。右：精製されたタンパク質におけるグリオキサラーゼII活性。
【００７２】
　実施例２.　肝細胞癌（HCC）細胞におけるHSCOの高められた発現
　HCCにおけるHSCO mRNAの発現増加を図４に示す。A：５対のHCC（1T〜5T）及び非癌性肝臓組織（1N〜5N）からの合計RNAを、プローブとしてヒトHSCO（上部パネル）又は18S rRNA (下部パネル)cDNAを用いて、ノザンブロットにより分析した。矢印はHSCO mRNAの移動度を示す。B：HCCにおけるHSCOタンパク質の発現。３対のHCC（2T, 6T, 7T）及び非癌性肝臓組織（2N, 6N, 7N）からの細胞溶解物を、抗−HSCO抗体（上部パネル）又は抗−アクチン抗体（下部パネル）を用いて、ウェスターンブロットにより分析した。C：腫瘍細胞におけるHSCOタンパク質の発現。HCC薄切片の免疫組織化学的染色を、抗−HSCO抗体（左側パネル）又は正常ウサギIgG（右側パネル）を用いて行った。結合された抗体を、基質としてジアミノベンジジンを用いて可視化した。バー、50μｍ。
【００７３】
　実施例３.　抗腫瘍剤及びTNFαにより誘発されたアポトーシスに対するHSCOの異なる効果
　図５のA及び Bは、NIH/3T3トランスフェクタントにおけるアポトーシスに対する安定して過剰発現されたHSCOの効果を示す。HSCO（レーン３及び４）及びベクタートランスフェクトされた対照（レーン１及び２）を安定して過剰発現するNIH/3T3トランスフェクタント及びHCC（レーン５）のそれぞれ２種のクローンにおけるHSCOタンパク質レベルを、抗−HSCO抗体を用いて、ウェスターンブロットにより分析した（A）。
【００７４】
　HSCO（＋、×）及び対照（△，▽）を過剰発現するNIH/3T3トランスフェクタントのそれぞれ２種のクローンを、アドリアマイシン（左側パネル）、エトポシド（中央パネル）、又はシクロヘキシミドと共にTNFα（右側パネル）に暴露し、そして生存する細胞数を、MTTアッセイにより評価した（B）。
【００７５】
　図６のC及びDはHeLa細胞におけるアポトーシスに対する誘発的に発現されたHSCOの効果を示す。HCC（レーン１）及びドキシサイクリン（Dox）と共に（＋）、又はそれを伴なわないで（−）、培養された２種のHeLa Tet-On-HSCOクローン（レーン２〜４は、１つのクローンからである）におけるHSCOタンパク質レベルを、示されるような抗−HSCO、抗−HA又は抗−アクチン抗体を用いて、ウェスターンブロットにより分析した（C）。Doxの存在（＋, ×）又は不在（△、▽）下で培養されたHeLa Tet-On-HSCOクローンを、Bにおけるようにして分析した（D）。
【００７６】
　図７のE及びFに HeLa細胞におけるアポトーシスに対する低められたHSCOレベルの効果を示す。それぞれ、野生型又は変異体HSCO cDNA由来の配列を含む、pSUPER−HSCOwt (レーン２及び４)又はpSUPER−HSCOmut (レーン１及び３)によりトランスフェクトされたHeLa細胞におけるHSCO mRNA及びタンパク質レベルを、示されるようなcDNAプローブ及び抗体を用いて、ノザン（レーン１及び２）及びウェスターン（レーン３及び４）ブロットにより分析した（E）。pSUPER−HSCOwt (x) 又はpSUPER−HSCOmut（△）の存在下で培養されたHeLa細胞を、Bにおけるようにして分析した（F）。
【００７７】
　実施例４.　Saos−２細胞におけるNF−κB−介在性アポトーシスに対するHSCOの効果
　図８のAにおいて、抗−p53 (上部パネル)及び抗−アクチン（下部パネル）抗体を用いてのウェスターンブロット分析により検出される、ドキシサイクリン（Dox）の不在（−）下ではなく、存在（＋）下でのSaos−2Tet−On−p53細胞におけるp53の発現を示す。BはDoxの不在下ではなく、存在下で誘発されたSaos-2 Tet-On-p53細胞のアポトーシスを示す。Cは、HSCOによるp53−誘発されたアポトーシスの排除を示す。Saos−2 Tet-On-p53細胞を、HSCO、SRIκBα又は空のベクターをコードするプラスミドによりトランスフェクトし、そしてDoxの存在下で培養した。生存細胞の数を、示されるようにして計数した。データは、三重反復試験の平均±s.d. を表す。３種の独立的に確立されたSaos−2 Tet-On-p53細胞クローンは類似する結果を付与し、そして代表的な結果が示されている。
【００７８】
　実施例５.　NF−κB活性に対するHSCOの阻害効果
　図９のAに、血清飢餓により誘発されたNF−κB活性に対する効果を示す。293細胞を、NF−κB−応答性ルシファラーゼレポーター、及び示されるようなHA−標識されたHSCO（HSCO）及びHAのみ（ベクター）を発現するプラスミドにより同時トランスフェクトした。細胞を、32時間の血清飢餓にゆだね、そして次に、ルシフェラーゼ活性を決定した。図９のB及び図10のCにはMEKK又はRelAの過剰発現により誘発されたNF−κB活性に対する効果を示す。293細胞を、NF−κB−応答性レポーターと共にMEKK（pFC−MEKK）又はRelA（pCMV-RelA）を発現するプラスミド、HA−HSCOを発現するプラスミドによりトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの48時間後に決定した。
【００７９】
　図10のDには、AP−１活性に対するHSCOの効果は存在しないことを示す。293細胞を、示されるようにAR−１−応答性シルフェラーゼレポーター、及びHA−HSCOを発現するプラスミドにより同時トランスフェクトした。
　図11のEでは、NF−κB活性に対するヒトグリオキサラーゼIIの効果は存在しない。293細胞を、示されるようにHA−グリオキサラーゼII（GLXII）及びHAのみ（ベクター）を発現するプラスミドと共に、pCMV-RelA及びNF−κB−応答性レポーターにより同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの48時間後に決定した。
【００８０】
　図11のFは、低められたHSCO発現により誘発された、高められたNF−κB活性を示す。HeLa細胞を、レポータープラスミド、及びいずれかのオリゴDNA（それぞれ、ASN−対照及びASN−HSCO、対照及びHSCOに対するアンチセンス）又はpSUPER構造体（それぞれ、pSUPER-HSCOmut及びpSUPER−HSCOwt、siRNA−非生成及びsiRNA−生成構造体）により同時トランスフェクトし、次にエトポシドにより処理し、そして上記のようにして分析した。値は、ベクタートランスフェクトされた対照における値に対する％として表される。データは、三重反復試験の平均±s.d.を表す。
【００８１】
　実施例６.　インビトロ及びインビボでのRelAとHSCOとの相互作用
　図12のAに、IκBαタンパク質の量及びリン酸化に対するHSCOの効果は存在しないことを示す。HeLa Tet-On-HSCO細胞を、示されるように、ドキシサイクリン（Dox）の存在（＋）又は不在（−）下で培養した。次に、それらを、ビークルのみ（レーン１）、TNFα（レーン２及び３）又はエトポシド（レーン４及び５）により処理した。核抽出物（上記の２つのパネル）又は全細胞溶解物（下部の４個のパネル）を調製し、そして示されるように抗−RelA、抗−ヒストンH3、抗−IκBα、抗−ホスホ−IκBα（Ser32/36）、抗−HA及び抗−アクチン抗体を用いて、ウェスターンブロットにより分析した。
【００８２】
　図12のBは、誘発的に過剰発現されたHSCOとRelAとのインビボ相互作用を示す。HeLa Tet-On-HSCO細胞を、示されるようにDoxの存在（＋）又は不在（−）下で培養した。次に、それらを、TNFα（レーン１，２，５及び６）又はエトポシド（レーン３，４，７及び８）により処理し、そして溶解物をそれらから調製した。入力溶解物（レーン５〜８）の５％、及び抗−RelA抗体（上部パネル、レーン１〜４）又は抗―HA抗体（下部パネル、レーン１〜４）により沈殿された免疫複合体の1/4を、示されるような抗−HA又は抗−RelA抗体を用いて、ウェスターンブロットにより分析した。矢印は、HA−HSCO（上部パネル）及び内因性RelA（下部パネル）の移動度を示す。
【００８３】
　図13のCは、内因性RelAと内因性HSCOとのインビボでの相互作用を示す。HeLa細胞を、エトポシドの存在（レーン２，３，５及び６）又は不在（レーン１及び４）下で培養し、そして溶解物をそれらから調製した。抗−RelA抗体（レーン１及び２）又は抗―HSCO抗体（レーン４及び５）により沈殿された免疫複合体の1/4、及び入力溶解物（レーン３及び６）の10％を、示されるような抗−HSCO又は抗−RelA抗体を用いて、ウェスターンブロットにより分析した。
【００８４】
　図13のDは、RelAとHSCOとのインビトロでの相互作用を示す。上部パネル：RelA（完全長）及びその変異体（del−１〜４）の図示。バー上の数字は、野生型RelAにおけるアミノ酸残基数を示す。黒のボックス：核局在化シグナル。斜線のボックス：Rel−相同ドメイン。下部パネル：Relアミノ末端とHSCOとの相互作用。35S−ラベルされた野生型RelA（完全長）又はその欠失変異体（del-1, del-3, 及び他のデータは示されていない）を、GST−HSCO融合タンパク質（レーン１）又はGSTのみ（レーン２）を含むグルタチオンビースと共にインキュベートした。特異的に結合されたタンパク質を、SDS−PAGE及びオートラジオグラフィーにより分解した。前記入力の1/10は同時展開された（レーン３）。矢印は、予測される組換えタンパク質の移動度を示す。
【００８５】
　実施例７.　HSCOを過剰発現する細胞における核NF−κBの低められた活性及び量
　図14は、エトポシド−誘発された核NF−κB DNA結合活性のインビボでのHSCOによる阻害を示す。等量（10μg）の核抽出物を、放射性ラベルされたコンセンサスκB部位オリゴDNAを伴なって、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）にゆだねた。293細胞を、示されるようにHAのみ又はHA−標識されたHSCOを発現するプラスミドによりトランスフェクトし、エトポシド（レーン３〜14）により処理し、そして核溶解物をそれらから調製した。
【００８６】
　比較分析のために、100倍過剰のラベルされていない野生型（レーン５）又は変異体（レーン６）κB部位オリゴDNAを、反応混合物に添加した。スーパーシフトアッセイのために、核抽出物を、１μgの抗体と共にインキュベートした（レーン７〜10）。NF−κB特異的複合体及びスーパーシフトされた複合体の移動度は矢印により示される。種々の核抽出物の比較を、放射性ラベルされたSp1プローブを用いてEMSAにより確かめた（データは示されていない）。
【００８７】
　図15のBは、HSCOによってではなく、IκBαによりインビトロで誘発された、結合されたDNAからのRelAの解離を示す。放射性ラベルされたκBプローブを、RelAと共にプレインキュベートし、そして次に、上昇する量（RelAに対するモル比、１：０、１：２及び１：10）のGST−IκBα、GST−HSCO又は−グリオキサラーゼII（GLXII）を、示されるように反応混合物に添加した。それらを、さらなるインキュベーションの後、分析した。
【００８８】
　図15のCは、HSCOとのプレインキュベーションによるDNAに結合するRelAの阻害を示す。インビトロEMSAを、Bに記載のようにして行った。但し、RelA及びGST−HSCO又はGST−GLXIIを25℃で30分間プレインキュベートし、そして次に、放射性ラベルされたκB部位プローブと共に混合した。いくつかの反応においては、放射性ラベルされていない野生型又は変異体κB競争体又は抗体を、示されるようにして添加した。
【００８９】
　図16は、HSCOにより誘発された、低められた量の核RelAを示す。293細胞を、示されるようなRelA、HSCOを発現するか、又はなにも発現しない（ベクター）、プラスミドにより同時トランスフェクトした。核抽出物（上部の２つのパネル）及び全細胞抽出物（低部パネル）を、抗−ReLA抗体（上部及び低部パネル）又は抗―SC35抗体（中央パネル）を用いて、ウェスターンブロットにより分析した。
【００９０】
　実施例８.　核からの促進された輸送によるNF−κBのHSCO−誘発された細胞質遊離
　図17のAは、HSCOの核−細胞質シャトルを示す。HeLa細胞を、レプトマイシンB（LMB）の存在（＋）又は不在（−）下で培養し、そしてウサギ抗−HSCO抗体及びFITC−接合された第２抗体による染色後、共焦顕微鏡により分析した。青シグナルは、DAPIにより染色された核の局在化を示す。
【００９１】
　図17のBは、HSCOの過剰発現による外因性RelAの細胞質隔離を示す。COS−７細胞を、RelA cDNAのみ（上部パネル）により、又はHSCO cDNA（中央及び低部パネル）と組合してトランスフェクトした。次に、それらを、LMBの存在（＋）又は不在（−）下で培養し、そして抗−HSCO抗体、抗−RelA抗体、それぞれの第２抗体及びDAPIによる染色の後、共焦顕微鏡により分析した。赤、緑及び青色のシグナルは、それぞれ、HSCO、RelA及び核の局在化を示す。黄色シグナル（併合）は、HSCO及びRelAの同時局在化を示す。
【００９２】
　図18のCは、HSCOを過剰発現する細胞における内因性RelAの細胞質隔離を示す。HeLa Tet-On-HSCO細胞を、ドキシサイクリン（Dox）の存在（＋）又は不在（−）下で培養し、TNFαにより処理し、そして次に、Bに記載のようにして、抗−HSCO及び抗−RelA抗体による染色の後、共焦顕微鏡により分析した。
　図18のDは、HCC細胞における内因性RelAの細胞質隔離及びsiRNAによるその修正を示す。HSCOを過剰発現するHuh−７細胞を、HSCOに対して特異的なsiRNAを生成するpSUPER-HSCOwt, 又はsiRNAを生成しないpSUPER-HSCOmutによりトランスフェクトした。それらを、エトポシドにより刺激し、そして次に、Bに記載のようにして、抗−HSCO及び抗−RelA抗体、及びDAPIによる染色の後、共焦顕微鏡により分析した。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、HSCOの同定及びグリオキサラーゼIIとのその関連性を示す配列の比較を示す。
【図２】図２は、図１の続きである。
【図３】図３は、関連タンパク質の酵素活性を示すグラフである。
【図４】図４は、肝細胞癌（HCC）細胞におけるHSCOの高められた発現を示す。
【図５】図５は、抗腫瘍剤及びTNFαにより誘発されたアポトーシスに対するHSCOの異なる効果を示す。
【図６】図６は、抗腫瘍剤及びTNFαにより誘発されたアポトーシスに対するHSCOの異なる効果を示す。
【図７】図７は、抗腫瘍剤及びTNFαにより誘発されたアポトーシスに対するHSCOの異なる効果を示す。
【図８】図８は、Saos−２細胞におけるNF−κB−介在性アポトーシスに対するHSCOの効果を示す。
【図９】図９は、NF−κB活性に対するHSCOの阻害効果を示す。
【図１０】図10は、NF−κB活性に対するHSCOの阻害効果を示す。
【図１１】図11は、NF−κB活性に対するHSCOの阻害効果を示す。
【図１２】図12のAに、IκBαタンパク質の量及びリン酸化に対するHSCOの効果は存在しないことを示す。図12のBは、誘発的に過剰発現されたHSCOとRelAとのインビボ相互作用を示す。
【図１３】図13のCは、内因性RelAと内因性HSCOとのインビボでの相互作用を示す。図13のDは、RelAとHSCOとのインビトロでの相互作用を示す。
【図１４】図14は、図14は、エトポシド−誘発された核NF−κB DNA結合活性のインビボでのHSCOによる阻害を示す。
【図１５】図15のBは、HSCOによってではなく、IκBαによりインビトロで誘発された、結合されたDNAからのRelAの解離を示す。図15のCは、HSCOとのプレインキュベーションによるDNAに結合するRelAの阻害を示す。
【図１６】図16は、HSCOにより誘発された、低められた量の核RelAを示す。
【図１７】図17のAは、HSCOの核−細胞質シャトルを示す。図17のBは、HSCOの過剰発現による外因性RelAの細胞質隔離を示す。
【図１８】図18のCは、HSCOを過剰発現する細胞における内因性RelAの細胞質隔離を示す。図18のDは、HCC細胞における内因性RelAの細胞質隔離及びsiRNAによるその相互関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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