(57)【要約】【課題】酵素標識抗体によって多孔性の吸着性領域が閉塞することを抑制して、検出限界を向上させる。【解決手段】多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプタを結合させる。このリガンドまたはレセプタに標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。次に酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと結合させるが、その前に、吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターで酵素標識抗体を濾過する。濾過した酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように通過させて標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を反応させて、発光量を検出する。【選択図】　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記吸着性領域を横切るように通過させて前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を反応させる化学発光法において、
前記酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンド結合させる前に、前記吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターで前記酵素標識抗体を濾過することを特徴とする生化学解析用ユニットを利用した化学発光法。
【請求項２】
多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記吸着性領域にリガンドまたはレセプタを結合させ、該リガンドまたはレセプタに標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記吸着性領域を横切るように通過させて前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を反応させる化学発光法において、
前記酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと結合させる前に、前記吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターで前記酵素標識抗体を濾過することを特徴とする生化学解析用ユニットを利用した化学発光法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識レセプタまたは標識リガンドを化学発光法（ケミカルルミネッサンス法）により検出する方法に関し、詳しくは多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットを利用して、標識レセプタまたは標識リガンドを化学発光法により検出する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、例えば、生化学解析用ユニットの複数の多孔性の吸着性領域（メンブレンフィルタなど）に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知のリガンドまたはレセプタをスポッター装置を用いて滴下した後、これを固定し、次いで、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質であって、蛍光物質、蛍光色素などの蛍光標識物質によって標識されたリガンドまたはレセプタを、ハイブリダイゼーションなどによって吸着性領域に固定されたレセプタまたはリガンドと特異的に結合させ、この生化学解析用ユニットに励起光を照射して、蛍光物質、色素などの標識物質から発せられた蛍光を光電的に検出して、生体由来の物質を解析する生化学解析用ユニットを用いた解析システムが開発されている。
【０００３】
この生化学解析用ユニットを利用した解析システムによれば、メンブレンフィルタなどの担体表面上の異なる位置に、数多くのリガンドまたはレセプタのスポットを高密度に形成して、蛍光標識物質によって標識されたレセプタまたはリガンドをハイブリダイズさせること等によって、短時間で生体由来の物質を解析することが可能になるという利点がある。
【０００４】
従来、生化学解析用ユニットを利用した解析システムにおいては、上記ハイブリダイゼーション等を行う際に、生化学解析用ユニットを反応液中で浸盪するという方法がとられていた。
【０００５】
しかし、この方法の場合、蛍光標識物質によって標識されたリガンドまたはレセプタが生化学解析用ユニットの吸着性領域の内部にまで充分に浸透せず、標識されたリガンドまたはレセプタが結合していない吸着性領域の発光量（ノイズあるいはバックグラウンド）に対する、標識されたリガンドまたはレセプタが結合した量に対応する発光量（信号）の比（Ｓ／Ｎ比）が小さく、吸着性領域に結合する標識されたリガンドまたはレセプタが微量となると検出することが困難になるという問題があった。
【０００６】
このような問題を解決するために、吸着性領域に反応液を強制的に循環させ、標識されたリガンドまたはレセプタを生化学解析用ユニットの吸着性領域の内部にまで充分に浸透させる方法が検討されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
生化学解析用ユニットを用いて標識されたリガンドまたはレセプタを解析する別の方法として、化学発光法を用いた検出方法が知られている。これは、生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプタを固定し、抗原などで標識されたレセプタまたはリガンド（以下、標識レセプタまたは標識リガンドという）をハイブリダイゼーションなどによって、吸着性領域に固定されたリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、続いて、標識レセプタまたは標識リガンドを標識している抗原などの物質に対する抗体を、酵素のように化学発光を生じさせる標識物質で標識した標識抗体（以下、酵素標識抗体という）を、標識レセプタまたは標識リガンドの抗原と特異的に結合させ、さらに酵素標識抗体の酵素と特異的に結合する化学発光基質を接触させて、化学発光基質と酵素との接触によって生ずる可視光波長領域の化学発光を光電的に検出して生化学解析用画像データを生成する解析方法あるいはシステムである。
【０００８】
従来、化学発光法においても、標識レセプタまたは標識リガンド、酵素標識抗体あるいは化学発光基質を接触させる場合、生化学解析用ユニットをそれぞれ、標識レセプタまたは標識リガンド、酵素標識抗体あるいは化学発光基質を含む反応液中で浸盪するという方法がとられていた。このため、蛍光物質を標識物質として利用した上記方法の場合と同様に、標識レセプタまたは標識リガンド、酵素標識抗体あるいは化学発光基質が生化学解析用ユニットの吸着性領域の内部にまで充分に浸透せず、吸着性領域に結合する標識レセプタまたは標識リガンドが微量になると検出することが困難になるという問題があった。
【０００９】
蛍光物質を標識物質として利用した上記方法と同様、化学発光法においても、吸着性領域に標識レセプタまたは標識リガンド、酵素標識抗体あるいは化学発光基質を含む反応液を強制的に循環させれば、これらを生化学解析用ユニットの吸着性領域の内部にまで充分に浸透させることができ、検出限界を上げることができるものと考えられるが、この循環方法を化学発光法における、酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドの抗原と特異的に結合する段階に用いると、酵素標識抗体が多孔性の吸着性領域に詰まってしまい、吸着性領域の発光量のバックグラウンドが大きく上昇し、測定が行えないという新たな問題が生じる。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、解析対象物質である標識レセプタまたは標識リガンドが微量であっても検出することが可能であって、多孔性の吸着性領域が酵素標識抗体によって閉塞することのない、生化学解析用ユニットを利用した化学発光法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、リガンドまたはレセプタが結合された多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記リガンドまたはレセプタに標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記吸着性領域を横切るように通過させて前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を反応させる化学発光法において、前記酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと結合させる前に、前記吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターで前記酵素標識抗体を濾過することを特徴とする方法である。
【００１２】
また、別の態様としては、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの前記吸着性領域にリガンドまたはレセプタを結合させ、該リガンドまたはレセプタに標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、酵素標識抗体を前記吸着性領域を横切るように通過させて前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を反応させる化学発光法において、前記酵素標識抗体を前記標識レセプタまたは標識リガンドと結合させる前に、前記吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターで前記酵素標識抗体を濾過することを特徴とする方法である。
【００１３】
酵素標識抗体を前記吸着性領域を横切るように通過させるとは、酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように循環させる場合はもちろんのこと、単に一巡させる場合も含む意味である。
【００１４】
酵素標識抗体の濾過は標識レセプタまたは標識リガンドと結合させる前に行うが、標識レセプタまたは標識リガンドと結合させる直前に行うことがより好ましい。
【００１５】
酵素標識抗体の濾過は、吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターで行うが、吸着性領域の孔径の半分以下の孔径のフィルターで行うことがより好ましい。なお、吸着性領域の孔径およびフィルターの孔径はともに、平均細孔径を意味する。
【００１６】
【発明の効果】
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法は、酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと結合させる前に、吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターで酵素標識抗体を濾過するので、酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように通過させて標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる場合に、多孔性の吸着性領域に酵素標識抗体が詰まることがなく、従って、吸着性領域の内部にまで充分に酵素標識抗体を浸透させることができるので、標識レセプタまたは標識リガンドが微量であってもＳ／Ｎ比の大きい検出を行うことが可能であるとともに、より正確な検出を行うことができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。図１は本発明のの化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図である。図１に示す生化学解析用ユニット１は、孔３が複数設けられた基板２と、孔３の内部に充填され、多孔性材料が基板２と接着された吸着性領域４とからなる。この吸着性領域４には、構造または特性が既知のリガンドまたはレセプタ５が滴下され、その後の処理により固定化されている。
【００１８】
基板２の材質としては、生化学解析用ユニット内部での光の散乱を防止するために、光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【００１９】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−６やナイロン−６，６などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【００２０】
基板２に開ける孔３の開口部の面積（サイズ）は、孔３の密度を高めるために、一般には５ｍｍ２　未満であり、好ましくは１ｍｍ２　未満であり、０．３ｍｍ２　未満がより好ましく、さらには０．０１ｍｍ２　未満であることが好ましい。そして、より好ましくは０．００１ｍｍ２　以上であることが好ましい。
【００２１】
孔３のピッチ（隣接する二つの孔の中心から中心までの距離）は０．０５〜３ｍｍの範囲であることが好ましく、孔３の間隔（隣接する二つの孔の端部から端部までの最短距離）は、０．０ｌ〜１．５ｍｍの範囲であることが好ましい。孔３の数（密度）は、一般には１０個／ｃｍ２　以上であり、好ましくは１００個／ｃｍ２　以上、より好ましくは５００個／ｃｍ２　以上、さらには１０００個／ｃｍ２　以上であることが好ましい。そして、好ましくは１０００００個／ｃｍ２　以下、さらには１００００個／ｃｍ２　以下であることが好ましい。なお、必ずしも、孔３は全て図１に示したように等間隔で設けられている必要はなく、幾つかのブロック（単位）に別れてブロック毎に複数の孔が設けられていてもよい。
【００２２】
本発明において、吸着性領域を形成する多孔性材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。本発明において、吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機／無機複合体でもよい。
【００２３】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。
【００２４】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【００２５】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えぱ、ヒドロキシァパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などがあげられる。
【００２６】
基板２に複数の孔３を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。貼り合わせる際に、吸着性領域を形成するための多孔性材料を加熱して軟化すると、孔内部に吸着性領域が容易に形成される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に１枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを２つのロール間に連続搬送してもよい。
【００２７】
なお、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法においては、上記の材料や方法によって作製した生化学解析用ユニットを使用することも可能であるが、市販されている生化学解析用ユニットを用いてもよく、また多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いることも可能である。
【００２８】
図２は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの実施の形態を示す概略断面図である。リアクタは、反応容器８と溶液循環パイプ１４とポンプ１５とからなり、反応容器８は、生化学解析用ユニット１を保持するとともに液漏れを防止するシール機能を有する生化学解析用ユニット保持部７を有しており、反応容器本体９は、反応容器上半部１０と反応容器下半部１１とからなり、反応容器上半部１０は反応容器本体９に取り外し可能に設けられており、生化学解析用ユニット１は反応容器上半部１０を取り外すことによってセットすることができるように構成されている。
【００２９】
また、図２に示されるように、反応容器下半部１１の底壁には溶液が流通可能な溶液流入口１２が形成され、反応容器上半部１０の頂壁には同様に溶液が流通可能な溶液流出口１３が形成されている。さらに流入口１２および流出口１３には、溶液循環パイプ１４が取り外し可能に取り付けられている。リアクタは、ポンプ１５によって溶液が流入口１２から反応容器本体９に入り、生化学解析用ユニット１を通過した後、流出口１３から出て、溶液循環パイプを通って循環するように構成されている。
【００３０】
図３は、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図である。このリアクタは、図２に示すポンプの代わりにシリンジ１６とピストン１７が設けられているもので、溶液が反応容器内で往復流動するように構成したものである。
【００３１】
図２および図３はともに、反応溶液が生化学解析ユニットを循環するタイプのリアクタを示しているが、反応溶液が生化学解析ユニットの下から上（あるいは上から下）に通過し、反応溶液が循環しないタイプのリアクタを用いることも可能である。
【００３２】
次に、本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法を順を追って説明する。
本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法では、まず、多孔性の吸着性領域を有する生化学解析用ユニットの吸着性領域にリガンドまたはレセプタを結合させる。
【００３３】
多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。リガンドまたはレセプタは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって、吸着性領域に固定することができる。なお、上述したように、多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いる場合には、この段階は省略される。
【００３４】
次に、吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。レセプタまたはリガンドを標識する標識物質としては、ジゴキシゲニン、ビオチン、アビジン、フルオロセインなどの抗原、及びこれらの抗原に対する抗体などを好ましくあげることができる。
【００３５】
なお、標識レセプタまたは標識リガンドが、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタとではなく、生化学解析用ユニットに設けられた吸着性領域に直接結合または吸着することを防止するために、標識レセプタまたは標識リガンドを含む溶液を生化学解析用ユニットに接触させる前に、いわゆるブロッキング剤を生化学解析用ユニットの吸着性領域に接触させておくことが好ましい。
【００３６】
標識レセプタまたは標識リガンドを多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタと特異的に結合させたら、生化学解析用ユニットを上記図２または図３に示す反応容器に取り付ける。なお、標識レセプタまたは標識リガンドが吸着性領域を閉塞させるようなものではない、例えば標識ＤＮＡのような場合には、吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる段階から反応容器に取り付けてもよい。この場合には、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタと標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合する段階から、酵素標識抗体に化学発光基質を反応させる段階まで、吸着性領域をそれぞれの反応溶液を通過させる方法により行うことができるので、工程を単純化することができるとともに、より精度の高い検出を可能とすることができる。
【００３７】
反応容器に取り付けた生化学解析ユニットは、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合しなかった標識レセプタまたは標識リガンドを除去するために、吸着性領域にいわゆる洗浄液を通過させて洗浄することが好ましい。なお、この洗浄工程は、後述する酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように通過させて標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させた後、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去する場合にも行うことが好ましい。
【００３８】
吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに特異的に結合した標識レセプタまたは標識リガンドに、酵素標識抗体を結合させる前に、吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターで酵素標識抗体を濾過する。吸着性領域の孔径はＰＭＩ（Ｐｏｒｏｕｓ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，　Ｉｎｃ．）社製の多孔質材料自動細孔測定システムにより測定できる。測定手順は、試液で濡らした多孔性の吸着性領域に徐々に圧力を上げて空気を送り込んで空気透過流量を測定し（濡れ流量曲線）、一方、同じ圧力で吸着性領域が試液で濡れていない時の空気透過流量を測定する（乾き流量曲線）。この２つの透過流量を比較することによって（乾き流量曲線の１／２の傾きの曲線と濡れ流量曲線の交わる点の圧力を求め）、圧力と細孔細孔径の関係式から平均細孔径を計算により求めることができる。酵素標識抗体を濾過するフィルターは通常、ある大きさの粒子を通して粒子が通るか通らないかで孔径が規定されているから、上記により測定した吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターを選択し、このフィルターで酵素標識抗体を濾過して用いる。選択されるフィルタの孔径は、吸着性領域の孔径の半分以下であることがより好ましい。
【００３９】
次に、酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように通過させて標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。酵素標識抗体は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質に対する抗体（標識レセプタまたは標識リガンドが抗体である場合には抗原）を酵素で標識したものである。酵素標識抗体の酵素としては、アルカリホスファターゼ、フェロオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。
【００４０】
続いて、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を反応させる。酵素標識抗体に反応させる化学発光基質は、酵素がアルカリホスファターゼ、フェロオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。
【００４１】
化学発光基質と酵素との反応によって可視光波長領域の化学発光を生ずるので、これを光電的に検出して生化学解析用画像データを生成すれば、標識レセプタまたは標識リガンドを検出、測定することができる。
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。
【００４２】
【実施例】
（実施例１）
大きさが８０ｍｍ×８０ｍｍ、厚み１００μｍのＳＵＳ３０４シート（基板材料シート）に、孔径０．２ｍｍの開口部が円形の微細孔を、エッチングによって孔ピッチ０．３ｍｍ、孔間隔０．１ｍｍで、１０×１０個を一単位として計６４００個形成した。
【００４３】
次に、ナイロン６（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）１４部、ギ酸６６部、水２０部を均一に溶解して、多孔性の吸着性領域形成材料の溶液を調整した。この溶液を安定した溶液状態で、乾燥膜の厚みが１６０μｍになるように、基板材料シート上にキャスティングコーターにより流延して貫通孔内に溶液を注入した後、ブレードにより基板材料シート表面の余分な溶液を掻き落とした。続いて、直ちに、基板材料シートをギ酸４０％水溶液を満たした凝固槽に浸漬して、貫通孔内の膜内に多数の微細孔を形成した。その後、水洗、乾燥してステンレス障壁と多数孔のポリマー充填領域とからなる生化学解析用ユニットを作製した。吸着性領域の平均孔径は０．４５μｍであった（ＰＭＩ社製多孔質材料自動細孔測定システムによって測定）。
【００４４】
ＴＥバッファーに溶解した分子量マーカーｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩ（２５０ｎｌ／μｇ）を５分煮沸後、１分間氷冷しｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを１本鎖とした。これを上記で作製した生化学解析用ユニットの吸着性領域にスポットし、その後紫外線照射（２５４ｎｍ、３３ｍＪ／ｃｍ２　）して、吸着性領域に１本鎖のｐＢＲ３２８／ＢｇＩＩ，ＨｉｎｆＩを固定した。
【００４５】
次にジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されたｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液（ロッシュ社製）１０ｐｇを熱変性し、ハイブリダイゼーションバッファー（６×ＳＳＣ，０．０１ＭＥＤＴＡ，５×ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，０．５％ＳＤＳ，１００μｇＳｈｅａｒｄ，ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｓａｌｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ）５ｍｌに添加した。
【００４６】
上記生化学解析用ユニットを図２に示す反応容器に固定し、６５℃のプレハイブリダイゼーションバッファー（上記ハイブリダイゼーションバッファーと同じもの）５ｍｌを１時間循環させた（線速度０．２ｃｍ／ｓｅｃ）。次に、６５℃のＤＩＧ標識ｐＢＲ３２８−ＤＮＡ溶液が添加されたハイブリダイゼーションバッファーを１８時間循環させてハイブリダイゼーションを行った。続いて、洗浄バッファー１（２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）で５分間２回、洗浄バッファー２（０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）で５分間２回循環洗浄した（バッファー温度はいずれも６５℃）。その後、ブロッキングバッファー（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの）を室温で１０分間循環した後、５０分間循環を停止した。
【００４７】
次に、アルカリホスファターゼ標識ＤＩＧ抗体をあらかじめ、孔径０．２２μｍのウルトラフリー（ミリポア社製）にて濾過し、濃度が１／１００００となるようにブロッキングバッファーで希釈し、これを１分間循環した後、６０分間停止した。
【００４８】
続いて、ケミルミ洗浄液（ロッシュ社製ＤＩＧ、Ｗａｓｈ　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ　に記載のもの）を１５分間循環させた。これを３回繰り返し、最後に化学発光基質であるＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＣＤＰ−ｓｔａｒ，ｒｅａｄ　ｔｏ　ｕｓｅ）を含む溶液と１時間反応させて、ＬＡＳ１０００（富士写真フィルム社製）にて生化学解析ユニットの吸着性領域の発光量を検出した。
【００４９】
（比較例１）
アルカリホスファターゼ標識ジゴキシゲニン抗体を濾過しなかった以外は、実施例１と同様にして発光量を検出した。
実施例１と比較例１のバックグラウンドの発光量を表１に示す。
【００５０】
【表１】
2004077286.tif 000002
【００５１】
表１から明らかなように、本発明の方法による実施例１は、酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと結合させる前に、吸着性領域の孔径よりも小さい孔径のフィルターで酵素標識抗体を濾過したので、酵素標識抗体を吸着性領域を横切るように通過させて標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させた場合に、多孔性の吸着性領域に酵素標識抗体が詰まることがなく、酵素標識抗体を濾過しなかった比較例１に比較して、バックグラウンドの発光量を１００分の１以下に抑えることができた。これによって、微量の標識レセプタまたは標識リガンドを正確に検出することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化学発光法に用いられる生化学解析用ユニットの概略斜視図
【図２】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの実施の形態を示す概略断面図
【図３】本発明の生化学解析用ユニットを利用した化学発光法に用いられるリアクタの別の実施の形態を示す概略断面図
【符号の説明】
１　　生化学解析用ユニット
２　　基板
３　　孔
４　　吸着性領域
５　　リガンドまたはレセプタ
【図１】
2004077286.tif 000003
【図２】
2004077286.tif 000004
【図３】
2004077286.tif 000005