(57)【要約】【課題】安価・小型のうえ操作に熟練を要しないユビキタスな計測器として構築される差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置及びその測定方法を提供する。【解決手段】一定波長を持つ光源からの光４１を、プリズム４２とガラス基板４４からなるセンサに、線焦点を結ぶように当て、この線焦点上に一定間隔を保って配置された試料セルと参照セルの感応部で生じた表面プラズモン共鳴現象により強度の減少した反射光を、前記試料セルと参照セルの感応部の中心の間隔と同じに保持しながら、互いに角度の異なる光分割ミラー５２を用いて反射させ、試料光と参照光の２光路に分割して、一つのＣＣＤラインセンサ５６の異なる二つの領域で検出する光学系を用いて、プリズム４２の上にこのプリズム４２とその屈折率を整合させた粘着力を持つ光インターフェイス膜４３に試料部と参照部に対応した感応膜を併せ持った電極式複合型センサセル４７を押し付けることによって、センサ、光インターフェイス膜４３およびプリズム４２間の光整合性を保ち、試料セルと参照セルで生じる表面プラズモン共鳴現象を測定する。【選択図】図２
2004340922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）入射光の入射角が共鳴角を含んだ前後の角度になるような入射光学系と、
（ｂ）一束の入射光の照射範囲にプリズムに蒸着した薄膜上の試料溶液固定部と参照溶液固定部がともに含まれるように配置される試料セット装置と、
（ｃ）前記試料溶液固定部と参照溶液固定部からの反射光をそれぞれ分離し、それらの反射光の向きを変え１ライン上に投影する投影光学系と、
（ｄ）前記反射光を１ライン上のＣＣＤで受光するリニアＣＣＤセンサとを具備することを特徴とする差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置。
【請求項２】
請求項１記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置において、前記投影光学系は、前記試料溶液固定部と参照溶液固定部からの反射光をそれぞれ分離し、それらの反射光の向きを変え１ライン上に投影する複数個のミラーを具備することを特徴とする差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置。
【請求項３】
請求項２記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置において、前記複数個のミラーは、前記試料溶液固定部からの反射光を第１の角度で反射する第１のミラーと、前記参照溶液固定部からの反射光を第２の角度で反射する第２のミラーとを具備することを特徴とする差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置。
【請求項４】
請求項１記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置において、前記プリズムの上に該プリズムとその屈折率を整合させた粘着力を持つ光インターフェイス膜を具備することを特徴とする差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置。
【請求項５】
一定波長を持つ光源からの光をプリズムとガラス基板からなるセンサに線焦点を結ぶように当て、該線焦点上に一定間隔を保って配置された試料セルと参照セルの感応部で生じた表面プラズモン共鳴現象により強度が減少した反射光を、前記試料セルと参照セルの感応部の中心間隔と同じに保持しながら、互いに角度の異なる光分割ミラーを用いて反射させ、試料光と参照光を２光路に分割して、一つのＣＣＤラインセンサの異なる二つの領域で検出する光学系を用いて、前記プリズムの上に該プリズムとその屈折率を整合させた粘着力を持つ光インターフェイス膜に試料部と参照部に対応した感応膜を併せ持った電極式複合型センサセルを押し付けることによって、前記センサ、前記光インターフェイス膜およびプリズム間の光整合性を保ち、前記試料セルと参照セルで生じる表面プラズモン共鳴現象を測定することを特徴とする差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法。
【請求項６】
請求項５記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、前記光インターフェイス膜が高分子光インターフェイス粘着膜であることを特徴とする差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法。
【請求項７】
請求項６記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、前記高分子がポリ塩化ビニールであることを特徴とする差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法。
【請求項８】
請求項６又は７記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、前記光インターフェイス粘着膜上に前記プリズム及びガラス基板と同一の屈折率を持つマッチングオイルなしで前記試料セルを設定することを特徴とする差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法。
【請求項９】
請求項８記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、機能性物質と相互作用があり、かつその結果屈折率が変化するような物質の化学センサ化を行うことを特徴とする差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法。
【請求項１０】
請求項９記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、前記試料セルに抗体を固定することによって抗原−抗体反応を測定する免疫センサ化を行うことを特徴とする差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法。
【請求項１１】
請求項５記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、前記電極式複合型センサセルの押し付けは２０ニュートン程度の力によることを特徴とする差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置及びその測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
２０世紀後半の我が国における産業の高度発展は、我々の生活に物質的な豊かさをもたらしたが、一方ではその負の遺産として大気、水質、土壌汚染や青少年への乱用薬物の蔓延など人間社会に深刻な影響をもたらした。これらの中、無機物による大気、水質汚染についてはかなりの改善がなされたが、１９９０年代の初頭に明らかにされた生体への影響が心配されるダイオキシンなどに代表される環境ホルモン類、すなわち、ある種の人工低分子有機化合物による環境汚染や乱用薬物による心身の汚染、土壌汚染の解決は２１世紀へ委ねられ、現在早急に解決されなければならない社会問題とされている。このことを計測化学上からみると、これらの有機化合物の測定は、濃度が極微量であり、かつ測定結果の信頼性が要求されるため、現在のところ高価でしかも操作に熟練を必要とするガスクロマトグラフィー・質量分析法で実施されている。そのため、その汚染実態を知るための情報量が少ないことも解決に至っていない大きな要因である。
【０００３】
一般に有機物を計る方法としては、上記したガスクロマトグラフィー・質量分析法のほか、液体クロマトグラフィー、蛍光試薬や発光試薬を用いて化学反応に基づく光を計測する方法、酵素イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴測定法などがある。これらの方法の中で操作の簡便さを満足する方法は、表面プラズモン共鳴測定法であると考えられる。その理由を以下に述べる。
【０００４】
表面プラズモン共鳴測定法は、プラズマ化された金表面に光を当て、物質の相互作用に基づき１００ｎｍの領域で起こる光の共鳴現象（表面プラズモン共鳴現象；ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）を測定する方法である。この方法は、
（１）センサ表面で起こる化学反応をリアルタイムで追跡することができる。
（２）物質相互間の相互作用が１００ｎｍの領域で起こるので分析用試料が微量でよい。
（３）上記（２）の理由より、少ない試料で高感度濃縮が可能である。
（４）検出系の材料にガラスプリズムを使用しているので、検出器を限りなく小さくできる。
（５）プラズモン共鳴を起こすために金薄膜を用いているので、抗体など感応物質の固定化が容易で、測定対象を選択的に検出する検出系を構築することができる。
【０００５】
以上の理由により、表面プラズモン共鳴測定法はパームサイズを指向する環境汚染低分子有機化合物を計測するためのユビキタスなフィールド機器を開発するために最適な方法と考えた。
【０００６】
表面プラズモン共鳴とは、金属膜を蒸着したプリズムに光を入射すると、プリズム表面において常時発生しているエバネッセント波と金表面において励起された表面プラズモン波が共鳴し、反射光が減少する現象である。この表面プラズモン共鳴現象を起こす入射角度は試料溶液の誘電率によって変化するので、金属薄膜の表面に測定対象物と相互作用する物質を機能性膜として固定化することで、様々な有機物を測定するための化学センサを構築することが可能である。
【０００７】
この現象は応用物理の光学分野では古くから知られていて、１９０２年にＷｏｏｄによって見出され、１９８２年にはＮｙｌａｎｄｅｒによってセンサ化された。これが科学的に応用されたのは最近で、金表面に抗体等を固定することによって生体膜と物質の相互作用をリアルタイムに計測することが可能になった。従来、生体膜と物質の相互作用を計測する方法としては、数日かけて相互の平衡状態を測る平衡法が一般的だったが、表面プラズモン共鳴測定法ではそれをリアルタイムで測定することができるので、免疫反応を測定する免疫センサ、蛋白質の相互作用の解析など、分析化学・生化学・薬品化学・医療計測などの広範囲な科学・産業分野で多彩な展開が図られている。
【０００８】
ここで、表面プラズモン共鳴現象の原理について更に詳しく説明する。
【０００９】
金あるいは銀のような金属をガラス基板の片面に蒸着して数十ｎｍの箔状にして金属が蒸着されていないガラス基板側から光を当てると、表面プラズモンと呼ばれる波動が発生する。表面プラズモンとは、金属中における拘束の度合いが小さい、自由電子群のゆらぎを量子化したものをいう。これは音波と同じ粗密度で金属表面を接線方向に伝播することができる。そこで、伝播速度が同一の電磁波でゆさぶってやると共鳴して表面プラズモンが発生する。
【００１０】
金属は陽イオンの周囲を電子が自由に動くため、固体プラズマと見なすことができる。このような固体プラズマの表面付近には電子の集団励起である表面プラズマ振動（この量子が表面プラズモン）が存在している。表面プラズモンは金属表面付近のみに局在する表面波で、その波数Ｋspと振動数ωの関係は金属の誘電率εm だけでなく、金属の接している媒質（試料）の屈折率ｎs にも依存し、次式で与えられる。
【００１１】
【数１】
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【００１２】
ここでｃは真空中の光速である。
【００１３】
上記（１）式より、試料に接する金属（誘電率εm が既知）の表面上での、振動数ωの表面プラズモンの波数Ｋspを知れば、試料屈折率ｎs が得られる。
【００１４】
図１８は表面プラズモン共鳴現象の原理を示す模式図である。
【００１５】
この図において、１はプリズム（屈折率ｎD ）、２は金属薄膜（誘電率ε）、３は溶液試料、４は入射光（波数Ｋp ）、５はエバネッセント波（波数Ｋev）、６は反射光、７はＣＣＤ検出器、８は表面プラズモン（波数Ｋsp）である。
【００１６】
この図に示すように、プリズム１に金属薄膜２を蒸着し、これを試料（ここでは溶液試料）３と接触させる。プリズム１側から臨界角以上の角度でプリズム１底面（センサ面）に入射光４を入射すると、エバネッセント波５が試料３中にしみだす。入射光４として平面波（波数Ｋp ）を入射角θで入射すると、エバネッセント波５の波数Ｋevは入射光４の空間周波数のプリズム底面方向成分
Ｋev＝Ｋp ｓｉｎθ                                          …（２）
となる。臨界角以上の入射角ではＫp ｓｉｎθ＞Ｋs （Ｋs は試料３中を伝搬する光の波数）なので、
Ｋev＝Ｋp ｓｉｎθ＞Ｋs                                     …（３）
となる。すなわち、エバネッセント波５の波数Ｋevは試料３中を伝播する光の波数Ｋs よりも大きい。このため、Ｋev＝Ｋspを満足する入射角θspが存在し、その角度θspで入射した光４は、そのエバネッセント波５によって表面プラズモン８を共鳴励起する。エバネッセント波５により表面プラズモン８が励起されると光のエネルギーの一部が表面プラズモン８に移り、プリズム１中に戻る反射光６の強度が減少する。このため、プリズム１側での反射率のエバネッセント波５の波数Ｋev依存性または平面波入射時の入射角依存性を測定すると、吸収ピークとして表面プラズモン８の励起が観測される。この吸収ピークの位置（波数Ｋevまたは入射角θsp）が表面プラズモン８の波数Ｋspを与え、これから上記（１）式と（２）式をもちいて試料屈折率ｎs を知ることができる。溶液試料３においてはその屈折率ｎs は溶液の濃度に依存するため屈折率測定より濃度の測定を行うことができる。
【００１７】
また、図１９に示すように、金属薄膜２表面上に測定物質と相互作用する物質を機能性膜９として固定化することで、この機能性膜９の誘電率と厚さは変化（各種の反応・結合）し、共鳴角は変化する。この角度変化をリアルタイムで測定することで各種の反応・結合の様子、速度、量およびサンプル濃度等を測定することができる。なお、図１９は表面プラズモン共鳴現象を利用する免疫計測の例を示している。
【００１８】
次に、従来のプラズモン共鳴現象測定装置について説明する。
【００１９】
図２０は差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の概要図である。
【００２０】
この図において、１１は光源、１２はビームスプリッター、１３はＳＰＲ検出器、１４は試料用光検出器、１５，１８はプリアンプ、１６，１９はＡ／Ｄコンバータ、１７は参照用光検出器、２０はインターフェイス（Ｉ／Ｆ）、２１はコンピュータである。
【００２１】
図２０に示すように、従来の光学系は光源１１からの光をビームスプリッター１２で二光路に分けて、プリズムで構成されるＳＰＲ検出器１３の定められた２点にあて、表面プラズモン共鳴現象によって生じた光の減少を二つの独立した光検出器１４，１７で検出し、各々プリアンプ１５，１８で増幅するという方式がとられていた。
【００２２】
図２１は従来の表面プラズモン共鳴測定装置の検出系を示す図である。
【００２３】
この図において、２２はプリズム、２３は光インターフェイスオイル膜、２４はセンサ、２５は試料、２６は送液ポンプ、２７はフローセル、２８はフローセルホルダー、２９は光である。
【００２４】
この図に示すように、従来の検出系は、送液ポンプ２６、フローセル２７、セルホルダー２８、センサ２４、及びプリズム２２との光整合性を保つための光インターフェイスオイル膜２３で構成されていた。
【特許文献１】特開２０００−０３９４０１号公報
【特許文献２】特開２００１−１８３２９２号公報
【特許文献３】特開２００１−２５５２６７号公報
【特許文献４】特許第３３５６２１２号公報
【特許文献５】特開２００３−１８５５７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
しかしながら、上記した図２０に示すような複光路方式では、ビームスプリッター１２で二光路に分けるためプリズムの小型化に限界があること、光検出系が二つ必要であることなどにより、構造的にある程度のスペースが必要であり、パームサイズを指向するにはその小型化に限界があった。
【００２６】
そもそも、表面プラズモン共鳴測定装置はビアコア株式会社や日本レーザー電子株式会社から既に市販されているが、そのサイズは７６０×３５０×６１０ｃｍ（Ｗ×Ｄ×Ｈ）と大きく、また重さは５０ｋｇ（ビアコア社：ＢＩＡｃｏｒｅ１０００）と重いため、実験室での使用に限られていた。
【００２７】
従って、現状では試料の表面プラズモン共鳴現象を測る場合には、試料を実験室に持ち帰らなければならず、現場で生きた測定結果を得ることは不可能であった。
【００２８】
さらに、図２１に示すような検出系の構成では、計測システムは必然的に大型となり、いつでも、どこでも計測できるユビキタス、オンサイト、フィールドユースを指向するパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の仕様を満足することはできなかった。
【００２９】
本発明は、このような表面プラズモン共鳴計測の現状を打破するために、光学系と検出系に新たな考えを導入して、小型・安価であって操作に熟練を要さず、野外においても、誰でもが、どこでも、いつでも気軽に使えて、しかも測定結果に信頼性のある、ｐＨ測定用ガラス電極のようにセンサ感覚で使えるパームサイズの差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置を環境汚染有機物計測用として提供する。
【００３０】
すなわち、本発明は、上記状況に鑑みて、安価・小型のうえ操作に熟練を要しないユビキタスな計測器として構築される差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置及びその測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置において、入射光の入射角が共鳴角を含んだ前後の角度になるような入射光学系と、一束の入射光の照射範囲にプリズムに蒸着した薄膜上の試料溶液固定部と参照溶液固定部がともに含まれるように配置される試料セット装置と、前記試料溶液固定部と参照溶液固定部からの反射光をそれぞれ分離し、それらの反射光の向きを変え１ライン上に投影する投影光学系と、前記反射光を１ライン上のＣＣＤで受光するリニアＣＣＤセンサとを具備することを特徴とする。
【００３２】
〔２〕上記〔１〕記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置において、前記投影光学系は、前記試料溶液固定部と参照溶液固定部からの反射光をそれぞれ分離し、それらの反射光の向きを変え１ライン上に投影する複数個のミラーを具備することを特徴とする。
【００３３】
〔３〕上記〔２〕記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置において、前記複数個のミラーは、前記試料溶液固定部からの反射光を第１の角度で反射する第１のミラーと、前記参照溶液固定部からの反射光を第２の角度で反射する第２のミラーとを具備することを特徴とする。
【００３４】
〔４〕上記〔１〕記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置において、前記プリズムの上にこのプリズムとその屈折率を整合させた粘着力を持つ光インターフェイス膜を具備することを特徴とする。
【００３５】
〔５〕差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、一定波長を持つ光源からの光をプリズムとガラス基板からなるセンサに線焦点を結ぶように当て、この線焦点上に一定間隔を保って配置された試料セルと参照セルの感応部で生じた表面プラズモン共鳴現象により強度が減少した反射光を、前記試料セルと参照セルの感応部の中心間隔と同じに保持しながら、互いに角度の異なる光分割ミラーを用いて反射させ、試料光と参照光を２光路に分割して、一つのＣＣＤラインセンサの異なる二つの領域で検出する光学系を用いて、前記プリズムの上にこのプリズムとその屈折率を整合させた粘着力を持つ光インターフェイス膜に試料部と参照部に対応した感応膜を併せ持った電極式複合型センサセルを押し付けることによって、前記センサ、前記光インターフェイス膜およびプリズム間の光整合性を保ち、前記試料セルと参照セルで生じる表面プラズモン共鳴現象を測定することを特徴とする。
【００３６】
〔６〕上記〔５〕記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、前記光インターフェイス膜が高分子光インターフェイス粘着膜であることを特徴とする。
【００３７】
〔７〕上記〔６〕記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、前記高分子がポリ塩化ビニールであることを特徴とする。
【００３８】
〔８〕上記〔６〕又は〔７〕記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、前記光インターフェイス粘着膜上に前記プリズム及びガラス基板と同一の屈折率を持つマッチングオイルなしで前記試料セルを設定することを特徴とする。
【００３９】
〔９〕上記〔８〕記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、機能性物質と相互作用があり、かつその結果屈折率が変化するような物質の化学センサ化を行うことを特徴とする。
【００４０】
〔１０〕上記〔９〕記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、前記試料セルに抗体を固定するとによって抗原−抗体反応を測定する免疫センサ化を行うことを特徴とする。
【００４１】
〔１１〕上記〔５〕記載の差動式表面プラズモン共鳴現象測定方法において、前記電極式複合型センサセルを押し付けは２０ニュートン程度の力によることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、複合型センサセルの採用により真の意味で表面プラズモン共鳴現象のリアルタイム計測という利点を機器として具現化したもので、小型であり、外乱に強く、操作は極めて簡便である。
【００４３】
詳細には、環境汚染物質測定のためのユビキタスな計測器の具備すべき条件として
（１）高感度、（２）簡便操作、（３）装置に可動部がない、（４）小型、（５）軽量、（６）オンサイト計測ができる、（７）ポータブルである、（８）安価、（９）電池駆動、（１０）信頼性が高い、（１１）化学センサ化されている、ということが必要であるが、本発明は、かかるユビキタスな計測器としての条件を十分に満足するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明は、誰でもどこでも使えるユビキタスな表面プラズモン共鳴現象測定センサを目指したもので、（１）光照射範囲の薄膜上に試料感応部分と参照感応部分が含まれるようにし、両部分からの反射光を分割ミラーでそれぞれからの反射光に分割したうえで、一つのリニアＣＣＤラインセンサ上に並べて結像させる光学系、（２）試料感応部分と参照感応部分をプリズムに蒸着された薄膜上に簡便にセット、支持できるセンサセルを中心とする検出系、および（３）粘着性に優れ屈折率もマッチングオイルと同等で、かつマッチングオイル使用時に不可欠なセンサ基盤とプリズムとの機械的押し付けが不要となる、従来のマッチングオイルに代わるフィールド計測で扱いやすい光インターフェイス粘着膜、とから構成される。本発明によれば、試料と参照の両部分を同時に計測することができるので、計測のリアルタイム性が達成されるばかりでなく、ユビキタス使用に適した小型・簡便な高感度センサが実現できる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００４６】
図１は本発明の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の概要図である。
【００４７】
この図において、３１は光源、３２は試料セル３２Ａと参照セル３２ＢからなるＳＰＲ検出器、３３は光分割ミラー、３４は試料光、３５は参照光、３６は光検出器、３７はプリアンプ、３８はＡ／Ｄコンバータ、３９はインターフェイス、４０はコンピュータである。
【００４８】
本発明の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置は、従来法のＳＰＲ測定装置の小型化における構造上の限界を打破するために、図１に示すように、光分割ミラー３３を用いて単一光源、単一光検出器を用いたＳＰＲのための新規光学系を提供することにより、ＳＰＲ測定装置のパームサイズ化〔１０×１７０×５０ｃｍ（Ｈ×Ｗ×Ｄ）〕と装置の軽量化（７７０ｇ）を実現した。本発明に基づくパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置は、光学系、検出系、電気系の各ユニットと、ノート型コンピュータ〔ＷＩＮＤＯＷＳ  ＸＰ（登録商標）対応〕及びＳＰＲ信号を取り込んで濃度変換するためのコンピュータソフトウェア（ＤＵＡＬＳＰＲＷＩＮ）で構成される。
【００４９】
図２は本発明によるパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の光学系の模式図、図３はそのプラズモン共鳴現象測定装置の測定点を複合型ダブルセンサセルの上部から示した図である。
【００５０】
これらの図において、４１は光源ＬＥＤ（波長７７０ｎｍ）からの入射光、４２はプリズム、４３は高分子光インターフェイス粘着膜、４４はガラス基板、４５は感応膜、４５Ａは試料感応膜、４５Ｂは参照感応膜、ｄは試料感応膜４５Ａと参照感応膜４５Ｂの中心からの距離（それぞれの測定点４５ａ，４５ｂ間の距離）で、本実施例では全体的なサイズとの兼ね合いでその間隔は５ｍｍとした。４６はセンサ支持体、４７は電極式複合型ダブルセンサセルであり、その下部にはＳＰＲを測定するポイントである試料感応膜４５Ａと参照感応膜４５Ｂが配置されており、これらの感応膜４５の下面に配置されるガラス基板４４に高分子光インターフェイス粘着膜４３を押し付けて試料と参照のＳＰＲを測定するセンサを構成している。４８はシリンドリカルレンズ、４９は平凸レンズ、５０はＳＰＲ反射光、５１は反射ミラー、５２はスリット、５３は一方の分割ミラー５３Ａと他方の分割ミラー５３Ｂからなる分割ミラー、５４は一方の分割ミラー５３Ａからの反射光、５５は他方の分割ミラー５３Ｂからの反射光、５６は両反射光５４，５５を１ライン上に投影するリニアＣＣＤラインセンサである。
【００５１】
上記したように、二つのミラー５３Ａ、５３Ｂから構成される光分割ミラー５３で、試料感応膜４５Ａの測定点４５ａ（図３参照）からの反射光と参照感応膜４５Ｂの測定点４５ｂ（図３参照）からの反射光を二つにわける。つまり、ダブルセンサセル４７下部に配置された試料・参照それぞれの感応膜４５Ａ，４５Ｂにおいて試料と参照の誘電率に基づいて発生するＳＰＲよって生じた反射光５０を、二枚の光分割ミラー５３Ａ，５３Ｂによって試料からの反射光５４と、参照からの反射光５５とに分割し、これらの反射光５４，５５を１ライン上に投影するリニアＣＣＤラインセンサ５６に投影させる。
【００５２】
本発明では単一光源からの光４１を試料と参照の感応膜４５Ａ，４５Ｂに線焦点を結ぶように当て、試料及び参照の感応膜４５Ａ，４５Ｂ面で表面プラズモン現象を生ぜしめ、両者における反射光５０を分割ミラー５３を用いて試料光と参照光とに分割して、そのエネルギーを失うことなく、一つのリニアＣＣＤラインセンサ５６の１ライン上に投影する。つまり、差動法の電極式複合型ダブルセンサセル４７と線焦点結像方式及び反射光分割ミラーがその特徴である。
【００５３】
以下、そのプラズモン共鳴現象測定装置の分割ミラーの詳細な配置を示す。
【００５４】
図４はそのプラズモン共鳴現象測定装置の分割ミラーの構成図（その１）、図５はそのプラズモン共鳴現象測定装置の分割ミラーの構成図（その２）、図６はその分割ミラーを用いる一光検出器二光検出の概要を示す図である。
【００５５】
感応膜４５Ａと４５Ｂからの反射光５０を二つの分割ミラー５３Ａ，５３Ｂを用いてリニアＣＣＤラインセンサ５６の等分なセンサ領域に投影するには、二つのミラー５３Ａ，５３Ｂを２段階にわたって角度調整することが必要となる。
【００５６】
以下に分割ミラー５３Ａ及び５３Ｂの配置と角度調整について詳細に説明する。
【００５７】
反射光５０を試料光と参照光に分割するための分割ミラー５３Ａ及び５３Ｂは、図６に示すように、それぞれの分割ミラー５３Ａ，５３Ｂ上にある光分割点５８Ａおよび５８Ｂが、Ｚ軸５７上に位置し、かつ試料感応膜の測定点４５ａ及び参照感応膜の測定点４５ｂからの光をそれぞれ含んで、距離ｄを置くような位置に配置した。
【００５８】
図４に示したように、分割ミラー５３Ａ及び５３Ｂを、光分割点５８Ａおよび５８Ｂ点上のＺ軸５７を中心にして、リニアＣＣＤラインセンサ５６方向（図の右方向）へ試料感応膜の測定点４５ａおよび参照感応膜の測定点４５ｂにおけるＳＰＲ反射光５０を二分割するように、角度α，βを持つように配置した。
【００５９】
さらに、図５に示すように分割ミラー５３Ａ及び５３Ｂは、Ｚ軸５７からリニアＣＣＤセンサ５６のライン状光素子を含むＸＹ平面とリニアＣＣＤセンサ５６のライン上へ試料感応膜の測定点４５ａと参照感応膜の測定点４５ｂにおけるＳＰＲ反射光５０を集光するように、その角度をθ，γに調整した。
【００６０】
以上述べたように試料感応膜の測定点４５ａと参照感応膜の測定点４５ｂにおける反射光の間隔を距離ｄに保つように、二つの分割ミラー５３Ａ，５３Ｂの角度を２段階に調整して、検出点から受光点に至るまでの光路差のない二つの反射光５４，５５を作ることによって、試料感応膜の測定点４５ａおよび参照感応膜の測定点４５ｂからの反射光５０、すなわちＳＰＲシグナル像を歪みのない同じサイズの光として、リニアＣＣＤセンサ５６のライン状光素子の上に等分割する。この結果、装置のパームサイズ化を実現することができた。
【００６１】
次に、本発明のパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴測定装置の検出系について説明する。
【００６２】
パームサイズ差動式表面プラズモン共鳴測定装置を構築するに当たっては、光学系のみならず検出系も合わせてパームサイズ化する必要がある。そのため、本来の目的を達成するためには、送液ポンプなどを必要としない化学センサ感覚で使用することのできる検出系を開発する必要があった。
【００６３】
図７は本発明におけるパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴測定装置の検出系の概要図であり、図７（ａ）はパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴測定装置の検出系の模式図、図７（ｂ）は図７（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。
【００６４】
これらの図において、６１はプリズム、６２は高分子光インターフェイス粘着膜、６３はセンサ、６４は試料セル６４Ａと参照セル６４Ｂからなるダブルセンサセル、６５はセンサセルガイド、６６はセンサセル支持管、６７はセンサセルキャップである。
【００６５】
この図から明らかなように、本発明による差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の検出系にはポンプもセンサホルダーも必要としない。例えば、化学センサとしてよく知られているものにｐＨ測定用ガラス電極がある。このセンサは、ガラスまたはプラスチック製のセンサセル支持管の先端にセンサとしてのｐＨ応答性ガラス膜が装着されていて、銀−塩化銀で構成される参照電極と組み合わせて試料に挿入すると、試料のｐＨに応じた電位差が発生するものである。そこで、本発明のＳＰＲ計測の化学センサ化の概念を明確にするために、従来のｐＨ測定用ガラス電極を用いｐＨを測定する場合〔図８（ａ）〕と対比して、表面プラズモン共鳴現象（ＳＰＲ）を計測する場合〔図８（ｂ）〕の化学センサ化の概念を示した。
【００６６】
図８（ａ）において、７１は試料、７２はｐＨ測定用ガラス電極７３と銀−塩化銀参照電極７４で構成される円筒状の複合型ｐＨ電極、７５はｐＨ測定用ガラス電極７３と銀−塩化銀参照電極７４の間で発生する電位を測定するための電位差計である。複合型ｐＨ電極７２は、その直径が１２ｍｍ、長さが１５０ｍｍ程度の棒状のものである。このように検出部分が化学センサ化されると、検出部が本体から分離されるため本体の構成が簡単になり、装置の小型化が容易になる。この類のものには、他に溶存酸素計、イオン濃度計などがある。
【００６７】
図８（ｂ）は、本発明に基づく化学センサ化されたＳＰＲ計測の概要を最も単純な化学計測システムであるｐＨ測定用ガラス電極〔図８（ａ）〕と対比して示したものである。
【００６８】
図８（ｂ）において、８１はＳＰＲ信号の変化を検出するためのＳＰＲ検出器、８２は一定のエネルギーを持つ光をプリズムを介してセンサに伝えるための高分子光インターフェイス粘着膜であり、プリズムに密着している。８３は、図８（ａ）における複合型ｐＨ電極７２に相当するＳＰＲ用電極式複合型ダブルセンサセルであって、複合型ＳＰＲ電極というべきもので、その形状は直径が１４ｍｍ、長さ２５ｍｍ程度の円筒形である。電位や電流を測定する棒状のセンサを電極すなわちＥＬＥＣＴＲＯＤＥというのに対し、このセンサセルは、ＳＰＲを測定するための棒状のセンサという意味において、ＳＰＲ電極即ちＳＰＲＯＤＥとして定義付けることができる。８４は計測時にセンサセルを固定するためのセンサセルガイドである。８５は試料セル、８６は参照セル、８５Ａは試料液、８６Ｂは参照液である。８７はセンサセルの基盤を成す厚さが０．１ｍｍ程度のガラス基板（膜）、８８はガラス基板８７に蒸着された厚さ４５ｎｍの金薄膜、８９はその金薄膜８８に化学的に固定された抗体等の感応膜である。９０はプラスチック製のセンサセル支持体、９１は厚さ１ｍｍ程度のシリコンシート、９２はセンサセルキャップである。
【００６９】
図９は、電極式ＳＰＲ用複合型センサセルの光照射面を示したものである。図９において１０１はプリズムとセンサセルの界面で線焦点に結像した光、１０４Ａは試料セル底部に位置する試料感応膜の中心点、１０４Ｂは参照セル底部に位置する参照感応膜すなわち金蒸着膜の中心点である。これらの点１０４Ａと１０４Ｂの距離は、５ｍｍ一定とした。１１２はガラス基板（膜）、１１３はガラス基板１１２の上側に位置する参照感応膜、１１４はガラス基板１１２の上側に位置する抗体などが固定化された試料感応膜、１１５はセンサセル支持管である。
【００７０】
図１０は、ＳＰＲ用センサセルの位置設定ガイドを示したものである。図１０において、１０９はセンサセルガイド、１１７はセンサセルキャップである。１１８Ａと１１８Ｂは、センサセルガイド１０９を本体であるＳＰＲ検出器に固定するためのネジ孔である。１１９Ａはセンサセルガイド側の測定位置設定ガイドライン、１１９Ｂはセンサセル側の測定位置設定ガイドラインである。
【００７１】
本発明ではＳＰＲを起こすために線焦点幅として１００μｍ、長さ１０ｍｍ程度の光をプリズムに当てている。従って、試料感応膜と参照感応膜のＳＰＲを起こすための反応点は、試料感応膜と参照感応膜の各々の中心点がその距離ｄ＝５ｍｍの間隔を保って、かつ線焦点上に位置を決め、線焦点上に合わせてセンサセルガイド側の測定位置設定ガイドライン１１９Ａを線焦点上に合わせた後、ネジ孔１１８Ａと１１８Ｂで本体とセンサセルガイド１０９を固定している。ネジ孔１１８Ａと１１８Ｂはセンサセルガイド１０９と本体の固定およびＳＰＲを検出するための位置決めの二役を担っており、その孔径は自由度を持って設計されている。
【００７２】
次に、高分子光インターフェイス粘着膜について説明する。
【００７３】
従来、基本的に、センサのベースとなる金蒸着膜は、プリズムに直接蒸着される。この方法では、計測時のランニングコストが上がるために、通常は顕微鏡観察に用いるカバーガラスに金を蒸着してこれをセンサ基盤にしている。このような測定方式では、プリズムとセンサ基盤であるガラス基板との間の光整合性をとるためにプリズム及びガラス基板と同一の屈折率を持つマッチングオイルを塗る必要があった。また、表面プラズモン共鳴現象は、金表面１００ｎｍ以下の領域で起こる現象であるため、フローセルとガラス基板およびプリズムをオイルを介して均一に機械的に押し付けて、平滑性を保ちながら測定しなければならなかった。しかしながら、このような方法はフィールド計測にはそぐわない。そこで本発明では、光整合性をとりセンサセルを簡単に固定するための高分子光インターフェイス粘着膜を新たに開発した。
【００７４】
オイルを使わない光インターフェイス粘着膜については、既に本発明者らの報告がある。しかしながらこの方法は、膜の再現性、透明性、粘着性に難点があった。本発明の高分子光インターフェイス粘着膜は、先に本発明者らが提案した膜を改良したものとして位置づけることができる。
【００７５】
高分子膜をマッチングオイルに代わる光インターフェイス粘着膜として使用するためには、（１）無色透明で、（２）粘着性が大きいこと、（３）屈折率がマッチングオイルと同じかあるいはそれにほとんど近く、（４）分析化学的には、マッチングオイルと比較してＳＰＲ信号が絶対的に等しいか、あるいは相対的に対応するかなどを考慮しなければならない。これらの条件を満たすために、まず最初に上記条件を満足させるための高分子膜の作製方法を検討した。高分子材料として、入手しやすいポリ塩化ビニール（ＰＶＣ：重合度７００）を用い、通常のＰＶＣラッピングフィルムを作る操作に倣って新しい光インターフェイス粘着膜を開発した。
【００７６】
図１１はその高分子光インターフェイス粘着膜を用いた検出系の模式図である。
【００７７】
この図において、１２１はプリズム、１２２は高分子光インターフェイス粘着膜、１２３はガラス膜（基板）、１２４は金蒸着膜、１２５は試料感応膜、１２６は試料溶液である。この図に示すように、光インターフェイスの固体膜化が図られている。
【００７８】
図１２はその高分子光インターフェイス粘着膜の作製方法の概要図であり、この図を参照しながら以下に基本的な操作を示す。
【００７９】
ＰＶＣ粉末をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で溶解し、可塑剤としてフタル酸−２−エチルヘキシル（ＤＯＰ）とリン酸トリトル（ＴＣＰ）を加えた後、シャーレを用いてキャスチングし、温度制御のできるコーニング製プレート乾燥機を用いて、１２０℃で２時間加熱乾燥させることによって、無色透明な膜が再現性よくできることが明らかになった。次に乾燥温度の影響を調べた。その結果、ＳＰＲ用の膜としては、乾燥温度は低い方がよく、実験の結果、８０℃で作製した膜が粘着と脱着性能においてＳＰＲ用として優れていた。
【００８０】
この検討結果は、ＰＶＣに対して高い親和性を持ち、相互作用を弱め、結果的には融点を低下させる働きをしている可塑剤は、乾燥温度を８０℃に制御することによって、ＰＶＣの分子間の滑りを向上し、その結果ゴム弾性と粘着性が発現したものと考えられた。一方、ＰＶＣは可塑剤と温度の影響によって分子間力から解放され、分子間の滑りがよくなって柔らかくなり、結晶から無色透明のガラス状膜へ転移されたものと考えられた。
【００８１】
次に可塑剤とＰＶＣの組成が異なる種々のＰＶＣ膜を作製し屈折率を測定した。屈折率測定は、ＡＴＡＧＯ社製のアッベ屈折計を用いた。その結果、ＰＶＣ０．２ｇに対してＤＯＰとＴＣＰの量がそれぞれ０．５ｇの組成の膜が屈折率１．５２１１を示し、マッチングオイルの屈折率１．５１５０に最も屈折率が近かったので、この組成の膜を光インターフェイス粘着膜として新たに採用することにした。この膜をあらかじめ、センサセルの先端、あるいはプリズムに密着させた後、センサセルのガイドラインに合わせて、センサセルの円筒状のサポーター中へローディングし、センサセルを人差し指で、プリズムに約２０ニュートン（Ｎ）の力で押し付けることによって最適なＳＰＲ信号を得ることができる。
【００８２】
以上、本発明の基幹をなす光学系、検出系、高分子光インターフェイス粘着膜についてその詳細を述べたが、これらの発明を盛り込んだパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴測定装置は次のような仕様を持つ。
（１）装置
原理：表面プラズモン共鳴現象（ＳＰＲ）
差動方式：分割ミラー・一受光素子
ＳＰＲ計測配置：Ｋｒｅｃｈｍａｎｎ配置
測定範囲：６５〜７５°
電源：交直両用（１００Ｖまたは９Ｖバッテリー）
最大連続時間：１０時間
サイズ：１７０×１００×５０ｍｍ
本体重量：７７０ｇ
（２）光学系
光源：点光源型ＬＥＤ（波長７７０ｎｍ、半値幅５０ｎｍ）
プリズム材質：ＢＫ７
偏光フィルタ：消光比０．０００７１
受光素子：２０４８ｐｉｘｅｌＣＣＤラインセンサ
金基盤サイズ：１４ｍｍ角以内
光インターフェイス：粘着性ＰＶＣ膜
（３）検出系
センサセル：複合型エスピーロード
フローセル：流量１〜１００μｌ／ｍｉｎ
試料サイズ：１μｌ以上
（４）性能
共鳴角安定性
シングルライン：０．０００２°
差動ライン：０．０００４°
次に、本発明によって試作した差動方式表面プラズモン共鳴現象測定装置の実施例について説明する。
【００８３】
本発明に基づいて、差動方式表面プラズモン共鳴現象を検出するための光学系、複合型センサセル及びＰＶＣ光インターフェイス粘着膜を試作し、差動方式表面プラズモン共鳴現象測定装置としてシステム化して、装置の性能評価を行った。
１．ＳＰＲ強度と共鳴角変化の関係
図１３は、本発明における差動方式によるＳＰＲ強度と共鳴角変化の関係を示したものである。図１３（ａ）は複合型センサセルの試料セルＡと参照セルＢにｐＨ７．４緩衝液を入れたブランクにおけるＳＰＲ曲線を示したものである。ブランクにおいてはＳＰＲ強度は試料セルＡと参照セルＢにおいて同じであるからＳＰＲは重なっている。図１３（ｂ）は、参照セルＢはそのままに、試料セルＡをｐＨ７．４緩衝液で０．１ｍｏｌ／ｌ濃度のグルコースに変化させた場合のＳＰＲ曲線の変化を示したものである。共鳴角はグルコース濃度の変化に従って変化していることが分かり、この試料と参照の共鳴角の差をとることによって、差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置を構築することができることが明らかになった。このようなＳＰＲ曲線の変化が観察されるということは、複合型センサセルの２点におけるＳＰＲ現象の差が、分割ミラーによって正しく二分割されていることを示しているものと考えられた。
２．本発明による共鳴角の安定性
図１４は、本発明におけるＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）における共鳴角の安定性を示したものである。図１４（ｂ）は、参照セルの共鳴角の変化を示すシングルライン〔Ｂ〕、図１４（ａ）は、試料セルと参照セルの共鳴角の変化の差を示す差動ライン〔Ａ−Ｂ〕を示したものである。この結果、本発明による共鳴角度の安定性は、シングルラインで０．０００２°、差動ラインで０．０００４°であった。一方、同様の原理に基づくシングル方式表面プラズモン共鳴現象測定装置で得られる安定性は、図１５に示したように、０．００１°で本発明による差動方式はシングル方式に比べ角度分解能が５倍上がっていることが明らかになった。差動ラインの角度安定性は、０．０００４°とシングルラインに比べて大きくなっているが、試料セルＡと参照セルＢの共鳴角の差をとることによるマイナスのばらつきの影響と考えられた。本発明の光学系は、シングル方式と同じ２０４８ｐｉｘｅｌ数のＣＣＤラインセンサを使用している。差動方式においては、センサセルからの反射光を分割ミラーによって二分割しているために、実用ｐｉｘｅｌ数を９００から、約半分の５００に落としている。その結果、シングルラインの分解能が５倍向上したのではないかと考えられたため、分割ミラーを調整して実用ｐｉｘｅｌ数を２５０に落としてみた。その結果を表１に示した。
【００８４】
【表１】
2004340922.tif 000004
【００８５】
この表１から明らかなように、予想どおり、シングルラインの共鳴角の安定性は０．００００４°と更に５倍分解能が向上した。同様の理由で差動ラインの共鳴角の安定性は０．００００８°であった。以上述べたように、本発明における光学系を用いた差動方式表面プラズモン共鳴現象測定装置で得られる共鳴角の分解能は、実用ｐｉｘｅｌ数に反比例するという新しい知見が得られた。
３．免疫計測への適用
本発明に基づく差動方式表面プラズモン共鳴現象測定装置による免疫計測の可能性を明らかにするために、複合型センサセルを試作し、ダイオキシン類似物として知られる２−４ジクロロフェノールのＳＰＲ計測を検討した。
【００８６】
試作した複合型センサセルの構造を図１６に示した。この図に示したように、本体φ１４ｍｍ、高さ２０ｍｍのサイズを持つ複合型センサセル１３０は、４５ｎｍの厚さの金膜１３６を蒸着したガラス基板１３５、エポキシ樹脂製の支持管１３４、φ１６ｍｍのセンサセルキャップ１３１で構成した。試料セル１３２と参照セル１３３の内径はφ３．５ｍｍ、両者の中心間の距離は５ｍｍとした。この複合型センサセル１３０の試料セル１３２に常法に従って２−４ジクロロフェノール抗体を固定して２−４ジクロロフェノール複合型免疫センサとした。２−４ジクロロフェノール複合型免疫センサを４個用意し、参照セル１３３にはＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を参照液として注入した。試料セル１３２にはそれぞれＰＢＳ緩衝液で濃度を調整した１０，２５，５０，１００ｐｐｍの２−４ジクロロフェノール溶液を注入し、測定用センサセルとした。定量操作はあらかじめ測定装置本体に固定されているＰＶＣ光インターフェイス粘着膜にセンサガイドを通じて複合型センサセルを静かに落とし込み、約２０Ｎの力をかけて人差し指で押さえつけ、プリズムに結像した１０ｍｍの線焦点上で試料セル１３２と参照セル１３３のＳＰＲ感応面の１点で生じるＳＰＲによって減少する試料と参照の反射光をＣＣＤ受光素子で計測した。
【００８７】
このようにして得られた検量線を図１７に示した。この図から明らかなように、センサセル間に固体差があるにも関わらず２−４ジクロロフェノールの濃度が１０から１００ｐｐｍの濃度領域において、良好な検量線が得られ、その重相関係数は０．９７３であった。これらの結果から、本発明に基づく差動方式表面プラズモン共鳴現象測定装置は、複合型センサセルの試料セルに抗体を固定することによって、抗体を標識することなく、抗原−抗体反応を簡単にリアルタイムで測定できることがわかった。なお、ここではＳＰＲ法の免疫センサ化について述べたが、本発明はＳＰＲ計測の化学センサ化という点において汎用性があり、機能性物質と相互作用があり、かつその結果屈折率が変化するような物質であれば、すべて化学センサ化することができることは言うまでもない。
【００８８】
以上、本発明における実施例を示した。本発明は、従来ラボにおいて、研究用にその用途が限定されていたＳＰＲ計測を、
（１）光学系を創案することによって、小型化、差動化、高分解能化を実現し、
（２）定量操作の簡便化を図るために、高分子光インターフェイス粘着膜と複合型センサセルを考案して、安価で、誰でもが、どこでも、手軽に操作できるユビキタスなポータブルの小型機器として、化学センサ化したことに意義があると考えられる。
【００８９】
現在、しのびよる化学物質汚染としてダイオキシンなどの環境ホルモンや覚醒剤、麻薬などの低分子有機化合物による社会的な影響が憂慮されている。しかしながら、上記有害な有機化合物に関しては、測定用の機器が高価でしかも操作が難しいために、科学的な情報が乏しく、オンサイトで誰でもがどこでも簡単に操作でき、多面的な情報を得ることのできる携帯用機器への要望が高い。しかし、従来、化学物質をセンサによって簡便に測定するセンサ侵漬型パームサイズ機器としてはｐＨ、ＤＯ（溶存酸素）、ある種のイオン等、無機物に測定対象が限定されており、有機物用の簡易測定装置というものは存在しなかった。本発明は認識物質を固定化した試料感応膜と参照感応膜を組み合わせた複合型センサセルという概念を提供することによって、有機物に対するセンサープッシュ式新規ＳＰＲ簡易計測法（エスピーロード法：Ｓｐｒｏｄｅｍｅｔｒｙ）への道を開くものであると考えられる。しかしながら、環境ホルモンなど低分子有機化合物の環境における濃度は極めて小さく、通常ｐｐｔ（ｐｇ／ｍｌ）からｐｐｂ（ｎｇ／ｍｌ）もオーダーである。
【００９０】
一方、分子量が２００前後の低分子有機化合物に対するＳＰＲ法による免疫計測における直接計測における検出感度は、１００ｎｇ／ｌ程度である。一般に２−４ジクロロフェノール（分子量：１７５）のような低分子有機化合物の免疫計測の高感度化には、抗体と抗原を添加して抗体固定化センサと競合させる競合法がよく用いられている。この方法の感度は５ｐｐｄ程度である。しかしながら、このような方法では定量操作が一つ増えることになり、ＳＰＲ法の特色であるリアルタイム計測の利点を損なうので好ましくない。しかしながら、ＳＰＲ法の絶対感度不足は、直接測定が可能な固相抽出によって補完することができる。固相抽出法は、その汎用性と１０００倍濃縮が簡単にできるので、ＳＰＲ法の感度不足を補完する手段として有効である。表２は、固相抽出法の可能性を知るために、２−４ジクロロフェノールに対する１２５倍濃縮を検討した結果である。
【００９１】
【表２】
2004340922.tif 000005
【００９２】
抽出カラムは、ＩＳＴ社のジビニールベンゼン系カラム、ＥＮＶ+ （固相重量２００ｍｇ、リザーバー容量６ｍｌ）を用いた。濃縮条件は、試料１Ｌ（ｐＨ２）、流量６０ｍｌ／ｍｉｎ、溶出条件は、０．１％ギ酸／５０％メタノール８ｍｌであった。この表２から明らかなように、抽出過程でのロスはあるものの、ｐｐｂオーダーの２−４ジクロロフェノールが、平均−８．７％の濃縮誤差で確実にｐｐｍオーダーに濃縮されることが明らかになった。現時点においても上記の検討した結果と固相抽出を組み合わせることで、本発明による測定装置を用いてｐｐｂオーダーの２−４ジクロロフェノールの定量ができるといえる。ＳＰＲは、センサー界面１００ｎｍの領域で起こるため、定量に用いる試料は１μｌ程度で十分である。従って、このＳＰＲの利点を生かして、分析用試料は１μｌを得るための抽出カラムのマイクロサイズ化を行うことにより、さらに濃縮効率を向上させることができる。この場合には、１Ｌの原水で１ｐｐｔの２−４ジクロロフェノールの定量が可能になると考えられる。
【００９３】
以上、本発明の実施例について述べた。本発明による差動方式表面プラズモン共鳴現象測定装置は、ＳＰＲ計測用としてパームサイズながら、ラボ用として使用が限定されていた従来の装置と同等またはそれ以上の基本性能を有していることが明らかになった。また、従来装置がなしえなかった、どこでも、誰でもという携帯性と簡便性をも具備している。本発明が社会に具現した暁には、有機物が関与する環境、分析化学、医薬、安全、化学産業、研究などのそれぞれの分野において、本発明に基づく差動方式プラズモン共鳴現象測定装置によって、ユビキタスなアプローチが行われ、多くの有力な化学情報が生まれ、そしてそれらの情報に基づいて各分野において適切な判断が行われ、結果として、人間社会の改善や進歩に本発明が貢献することは確実である。
【００９４】
最後に本発明の効果について概括する。
【００９５】
１．光学系
本発明による光学系の特徴は次の通りである。従来型の光学系では、プリズム上のサンプルチップの１点を測定していたが、本発明では、ＳＰＲシグナルを含むプリズム上の２点からの反射光を光検出器へ入射する際に、その手前に置かれた２個の分割ミラーにより光検出器の２位置にそれぞれ分けて投影することにより、プリズム上のセンサ上の２点を測定可能にしたことにある。得られるＳＰＲシグナルの理論分解能は、従来と同じ素子を持つリニアＣＣＤ素子を使用した場合、半分となるが、従来のコンピュータ演算による高分解能ピーク検出に必要なデータポイント数は十分にあるので、角度分解能上の問題はないと考えられる。
【００９６】
一方、従来の光学系のまま、リニアＣＣＤセンサを２個用意した場合、エレクトロニクスとしてプリアンプ２台、Ａ／Ｄ変換器２台が必要となり、コストもサイズもアップせざるを得ないことになる。従って、本発明の光学系の効果は、次に述べる各項目において明らかである。
（１）差動化及び小型化
単一のリニアＣＣＤセンサの構成を生かして、表面プラズモン共鳴現象測定装置を差動化及び小型化するための新規光学系としてその意義が認められる。事実試作器においてその大きさとサイズは、１７０×１００×５０ｃｍ（Ｗ×Ｈ×Ｄ）、７７０ｇを実現した。また、本発明による光学系は、分割ミラーを反射ミラーに変えることにより、従来同様の単能光学系としても利用することができる。
（２）温度補償
従来型のサンプル１点のみの測定では、ＳＰＲシグナルは原理的にサンプルの屈折率（または誘電率）を測定しているため、温度によるドリフトがある。これを補償する手段は、別途温度計測用として高分解能を持つ半導体温度センサ等を設け、得られる温度データよりＳＰＲシグナルデータを演算により校正する必要があった。ＳＰＲシグナルは、バイオセンサとして抗原−抗体反応に使用される場合、その変化量は極めて少ない。そこで、差動式ＳＰＲで同一サンプルチップ上の２点の測定位置にサンプル溶液１点、温度補償用として温度係数の大きなサンプルを１点用意することにより、この温度センサの代替目的での使用が可能となる。また、前記に加えて、ＳＰＲシグナルの温度補償を行う場合、その温度特性とマッチングした温度センサが必要となるが、本発明では、同一センサ上の２点の測定位置にそれぞれ試料溶液、温度補償用としてサンプルと同一溶液組成でかつ分析対象を含まない参照溶液を用意することにより、同一組成溶液で屈折率及び温度変化をリアルタイムで補償して、抗原抗体反応本来のＳＰＲ信号を計測することが出来る。
（３）ＳＰＲリアルタイム計測
同一センサ上の試料セルと参照セル２点に試料液と、試料と同じ溶液組成で分析対象を含まない参照液を用意し、この２点を同時に測定することにより、ＳＰＲ信号の反応前ゼロ点を常時測定し、このゼロ点と試料計測時におけるＳＰＲ信号を同時に計測し、その差を求めることによって、分析対象との反応後のＳＰＲ信号をリアルタイムに計測することができる。また、同一センサ上の試料セルに試料液を、参照セル２点の測定位置に試料と同じ溶液組成で既知の濃度の分析対象を含む参照液を用意し、２点を同時に測定することにより、反応量基準となる参照液のＳＰＲ信号を常時測定し、この参照液によるＳＰＲ信号と試料液によるＳＰＲ信号との差を１つの検出器上で同時に観測し、分析対象との大小比較をリアルタイムに観測することができるので、スクリーニング的、オンオフ警報的利用も可能となる。
（４）多点計測
本発明の詳細を述べるに当たって、プリズムとＰＶＣ光インターフェイス粘着膜を介して、ＳＰＲ複合型センサセルの５ｍｍ間隔の２点におけるＳＰＲ信号を分割ミラーによって、試料部と参照部におけるＳＰＲ信号に分けて一つの光検出器上に分けて測定する２点差動方式を中心に説明してあるが、測定点の間隔をさらに短くしたり、センサをマイクロチップ化することによって、あるいは逆にセンサやプリズムをある程度大きくすることによって、基本的に同じ光学系で分割ミラーを３，４，５…ｎ分割ミラーを用いて、一つに光検出器で３，４，５…ｎ点の測定点を同一検出器上で、多点ＳＰＲ計測することも可能となる。
２．検出系
（１）複合型センサセル（ＳＰｒｏｄｅ）
複合型センサセルは、従来の表面プラズモン計測の可能性を更に発展させ、ＳＰＲ計測の化学センサ化を実現したものである。一般に、ｐＨ測定用ガラス電極は、水素イオン濃度に選択的に応答するガラス膜の界面で生じる電気化学的な現象を棒状のセンサで測定するという意味においてｐＨ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ（ピーエッチエレクトロード）と称されている。本発明において提案するＳＰＲ用複合型センサセルは、測定対象と選択的応答する感応膜界面で生じる光の変化である表面プラズモン共鳴現象をｐＨ電極同様の棒状のセンサで測定するものである。従って、本発明に基づく複合型センサセルは、ＳＰＲに基づく光を検出原理とする新たな化学センサ、即ちＳＰｒｏｄｅ（エスピーロード）として定義付けることができ、化学センサ分野における新領域が誕生したことになる。
【００９７】
以上述べたように、本発明によるＳＰＲ計測の化学センサ化によって、従来研究用に限られていた表面プラズモン計測がより簡便化され、誰でもが、どこでも、いつでも使用することのできるオンサイト用のフィールド機器として、新たな展開が期待される。
【００９８】
表面プラズモン共鳴現象を検出するための従来法は、光整合性オイルを介してセンサの上にフローセルをセルホルダーを用いて機械的に密着させてから、まず最初にフローセルにポンプで参照液を送液して、この際生じるＳＰＲの光強度を記憶し、次に試料について同様の操作を行い、ＳＰＲ信号の差を測定対象成分の濃度に対応させていた。しかしながら、小型化、フィールド機器化に際して、このような方法では、試料を送液するための高価なポンプ及びフローセルを機械的に押さえつけるためのセルホルダーをＳＰＲの計測のために必要とするため、小型化と計測操作の簡便化に限界があること、参照液と試料液の測定に時間差があり、真の意味でリアルタイム計測ではないこと、差動化するためには少なくとも２流路が必要で、構造的にスペースに限界があることなど検出系サイドにおいても解決すべき問題が残されていた。
【００９９】
本発明では以上述べた従来法の持つ問題点が複合型センサセルおよび高分子光インターフェイス粘着膜の考案により解決された。本発明により、ＬＥＤ光源（波長７７０ｎｍ）を用いて、ＳＰＲを起こすためのエネルギーとしての可視光線を複合型センサセル上の試料感応膜と参照感応膜に線焦点として当て、試料感応膜と参照感応膜の１点で同時に起こるＳＰＲ信号を同時に測定するため、試料と参照のＳＰＲ信号の相対値は真の意味でリアルタイムになった。また本発明によれば、計測すべき試料が多い場合には、参照セルに基準液を入れておくことにより、オンオフ／スクリーニング的応用も容易となる。
（２）センシングにおけるリアルタイム計測
従来の簡易免疫法としては、イライザー法として知られている酵素免疫法が一般的である。この方法は、抗原−抗体反応を酵素の系に導いて定量すること、物理的な非特異的吸着の影響を除くためＢ／Ｆ分離が必要であることなどの理由でリアルタイム計測ではない。このような方法では定量操作に時間がかかり、オンサイト、フィールド計測には適当でない。一方、ＳＰＲ計測は原理的にリアルタイム計測である。しかしながら、フローセルを用いる計測では、ブランクの測定をした後に試料の測定を行い、その信号の差をとるので厳密にはリアルタイムではない。試料やブランクのセンサへの導入のためにポンプを用いない本発明の複合型センサセル方式では試料セルと参照セルの線焦点上の一定間隔の一点でＳＰＲが起こるため、ＣＣＤラインセンサ上で検出される反射光は時間差がなくリアルタイム計測される。
（３）ＳＰＲ免疫計測の信頼性
従来のイライザー法は上記（２）で述べたように、免疫反応に基づく情報を得るためにＢ／Ｆ分離が必要であった。本発明の複合型センサセル方式では試料セルと参照セルで起こるＳＰＲを同じに測定できるので、試料セルで免疫反応に基づく信号、非特異的信号、バルク成分の信号を、参照セルで非特異的信号、バルク成分の信号を同時に計測することによって、Ｂ／Ｆ分離操作をすることなしに、選択的に免疫反応に基づく信号測定をすることができる。
３．高分子光インターフェイス粘着膜
従来法ではプリズムとセンサ間の光整合性をとるために、プリズムとセンサ基盤であるガラス基板と同じ屈折率を持つマッチングオイルを測定を開始する前にその都度プリズム表面に塗り、その上にガラス基板からなるセンサをセットし、かつセンサとプリズムとの密着性を図るためにセンサホルダーで機械的に押し付ける必要があった。また、マッチングオイルには毒性があるので、その使用に細心の注意が必要である。従って、このようなオイルの使用はフィールドユースを指向する装置には不適当である。本発明では最初にプリズムにＰＶＣインターフェイス粘着膜を固定しておけば、あとは複合型センサセルをインターフェイス粘着膜に人差し指で押し付けるだけでよい。その膜には粘着性があるのでセンサセルホルダーを必要としない。また、その膜の溶剤は、ＰＶＣにより固体化されているのでオイルに比べると遙かに安全性は高い。本発明による差動式表面プラズモン共鳴測定装置は、高分子光インターフェイス粘着膜の採用により、より小型化され、定量操作はより安全、簡便になった。
【０１００】
以上、本発明における主な効果を述べたが、本発明による差動式表面プラズモン共鳴測定装置は、複合型センサセルの採用により真の意味でＳＰＲ計測のリアルタイム計測という利点を機器として具現化したもので、小さくて、外乱に強く、操作は極めて簡便である。
【０１０１】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置及びその測定方法は、パームサイズを指向する環境汚染低分子有機物を計測するためのユビキタスなフィールド機器として好適である。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の概要図である。
【図２】本発明によるパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の光学系の模式図である。
【図３】本発明によるパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の測定点を複合型ダブルセンサセルの上部から示した図である。
【図４】本発明によるパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の分割ミラーの構成図（その１）である。
【図５】本発明によるパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の分割ミラーの構成図（その２）である。
【図６】本発明によるパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の分割ミラーを用いる一光検出器二光検出の概要を示す図である。
【図７】本発明によるパームサイズ差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の検出系の概要図である。
【図８】表面プラズモン共鳴現象計測の化学センサ化を示す図である。
【図９】電極式ＳＰＲ用複合型センサセルの光照射面を示す図である。
【図１０】ＳＰＲ用センサセルの位置設定ガイドを示す図である。
【図１１】光インターフェイス粘着膜を用いた検出系の模式図である。
【図１２】高分子光インターフェイス粘着膜の作製方法の概要図である。
【図１３】本発明における差動方式によるＳＰＲ強度と共鳴角変化の関係を示す図である。
【図１４】本発明におけるＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）における共鳴角の安定性を示す図である。
【図１５】シングル式装置による共鳴角信号の安定性を示す図である。
【図１６】本発明にかかる試作した複合型センサセルの構造を示す図である。
【図１７】本発明による差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置への２−４ジクロロフェノールの濃度変化追従性を示す図である。
【図１８】表面プラズモン共鳴現象の原理を示す模式図である。
【図１９】表面プラズモン共鳴現象を利用する免疫計測の模式図である。
【図２０】従来の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の概要図である。
【図２１】従来の差動式表面プラズモン共鳴現象測定装置の検出系の模式図である。
【符号の説明】
【０１０４】
３１    光源
３２，８１    ＳＰＲ検出器
３２Ａ    試料セル
３２Ｂ    参照セル
３３    光分割ミラー
３４    試料光
３５    参照光
３６    光検出器
３７    プリアンプ
３８    Ａ／Ｄコンバータ
３９    インターフェイス
４０    コンピュータ
４１    入射光
４２，６１，１２１    プリズム
４３，６２，８２，１２２    高分子光インターフェイス粘着膜
４４    ガラス基板
４５    感応膜
４５Ａ，１２５    試料感応膜
４５ａ    試料感応膜の測定点
４５Ｂ    参照感応膜
４５ｂ    参照感応膜の測定点
ｄ    試料感応膜と参照感応膜の中心からの距離
４６    センサ支持体
４７，８３    電極式複合型ダブルセンサセル
４８    シリンドリカルレンズ
４９    平凸レンズ
５０    ＳＰＲ反射光
５１    反射ミラー
５２    スリット
５３    分割ミラー
５３Ａ    一方の分割ミラー
５３Ｂ    他方の分割ミラー
５４    一方の分割ミラーからの反射光
５５    他方の分割ミラーからの反射光
５６    １ライン上に投影するリニアＣＣＤラインセンサ
５７    Ｚ軸
５８Ａ，５８Ｂ    光分割点
６３    センサ
６４    ダブルセンサセル
６４Ａ，８５，１３２    試料セル
６４Ｂ，８６，１３３    参照セル
６５，８４，１０９    センサセルガイド
６６，１１５    センサセル支持管
６７，９２，１１７，１３１    センサセルキャップ
８５Ａ    試料液
８６Ｂ    参照液
８７，１１２，１２３，１３５    ガラス基板  
８８，１２４    金薄膜（金蒸着膜）
８９    化学的に固定された抗体等の感応膜
９０    プラスチック製のセンサセル支持体
９１    厚さ１ｍｍ程度のシリコンシート
１０１    プリズムとセンサセルの界面で線焦点に結像した光
１０４Ａ    試料セル底部に位置する試料感応膜の中心点
１０４Ｂ    参照セル底部に位置する参照感応膜（金蒸着膜）の中心点
１１３    ガラス基板の上側に位置する参照感応膜
１１４    ガラス基板の上側に位置する抗体などが固定化された試料感応膜
１１８Ａ，１１８Ｂ    ネジ孔
１１９Ａ    センサセルガイド側の測定位置設定ガイドライン
１１９Ｂ    センサセル側の測定位置設定ガイドライン
１２６    試料溶液
１３０    複合型センサセル
１３４    エポキシ樹脂製の支持管
１３６    ４５ｎｍの厚さの金膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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