(57)【要約】【課題】ＧＡＳ  Ｍ３株およびＭ１８株の新規フィブロネクチン結合タンパク質の提供。【効果】本発明のタンパク質および組換え型タンパク質は、Ａ群レンサ球菌（ＧＡＳ）、特にＭ３株およびＭ１８株を特異的に検出することができる。該タンパク質に対する抗体は、ＧＡＳに起因する疾患の予防および／または治療のための医薬組成物、例えばワクチンとして有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換された配列を有するタンパク質。
【請求項２】
フィブロネクチン結合活性を有する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
レンサ球菌由来の、請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
レンサ球菌がＭ３またはＭ１８の血清型である、請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】
配列番号：２で表される塩基配列を有する、請求項１記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターにより形質転換された、非ヒト動物由来の形質転換株。
【請求項９】
非ヒト動物が大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞からなる群から選択される、請求項８記載の形質転換株。
【請求項１０】
請求項８または９記載の形質転換株を培養した結果得られる、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換された配列を有するタンパク質。
【請求項１１】
請求項１または１０記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項１２】
請求項１１記載の抗体を用いることを特徴とする、レンサ球菌感染の検出方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の抗体を含有することを特徴とする、レンサ球菌感染の検出キット。
【請求項１４】
請求項１１記載の抗体を含有してなる診断剤。
【請求項１５】
猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹の診断剤である、請求項１４記載の診断剤。
【請求項１６】
請求項１１記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項１７】
猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹の予防および／または治療剤である、請求項１６記載の医薬。
【請求項１８】
請求項１または１０記載のタンパク質を含有してなる診断剤。
【請求項１９】
猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹の診断剤である、請求項１８記載の診断剤。
【請求項２０】
請求項１または１０記載のタンパク質を含有してなる医薬。
【請求項２１】
猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹の予防および／または治療剤である、請求項２０記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は抗原に関し、より詳しくは予防および／または治療ワクチン成分として有用なＡ群レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）のタンパク質抗原に関する。すなわち、本発明は、この抗原に対する抗体、この抗体を含有するＡ群レンサ球菌の検出キットまたは診断剤、前記抗原を含有する医薬（ワクチン）等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ａ群レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ；以下、ＧＡＳと略記する）は、グラム陽性、非運動性の胞子形成をしない球菌で、ヒト、とりわけ乳幼児における易感染状態者における疾患の重要な病原細菌である。本邦において、死に至ることは多くないが、発展途上国では今なお猩紅熱およびリウマチ熱などを発症し、多くの罹患乳幼児が死亡している。また、成人においてもショックを伴った重篤な劇症化状態に陥り、死に至る例も見受けられ、その高い死亡率が世界的に問題となっている。ＧＡＳは疾患の原因となりうる多くの毒性因子を生産する。毒性因子としては、（１）Ｍタンパク質、（２）フィブロネクチン結合タンパク質、（３）リポテイコ酸、（４）ヒアルロン酸カプセル、（５）ストレプトキナーゼ、ヒアルロニダーゼ、（６）発赤毒素のような外毒素などが知られている。ＧＡＳを病原とする疾患の治療および／または予防方法としては、例えばペニシリン、セフェム、クリンダマイシンなどのような抗菌剤類を用いる方法とワクチンを用いる方法が考えられる。しかし、抗菌剤類による疾患の治療が奏効する一方、産生する毒性因子が多いこと、ＧＡＳの有する抗原性が多様であること、また宿主タンパク質とＧＡＳの抗原とが交差反応することなどの理由から、有効なＧＡＳワクチンは実用化されていない。したがって、有効なＧＡＳワクチンの実用化は、ＧＡＳに関連する疾患、例えば乳幼児の咽頭炎や膿痂疹の予防および／または治療に対し、有用性をもたらすものである。ＧＡＳは、上記疾患のほか、劇症型Ａ群溶連菌感染症（Ｔｏｘｉｃ  Ｓｈｏｃｋ−Ｌｉｋｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＴＳＬＳ）および壊疽性筋膜炎を含む重篤な侵入性感染症も引き起こす。
これらの疾患は全てＧＡＳが宿主の上皮細胞に付着することから始まる。ＧＡＳは病因となりうる多くの構造タンパク質および酵素タンパク質を細胞表面に発現するが、いくつかの表面タンパク質が、フィブロネクチン（以下、Ｆｎと略記する）、ラミニン、プラスミン、コラーゲン、免疫グロブリン、およびＣ４ｂのようなヒト宿主タンパク質に対する結合能を有することが示されている。さらに、ＧＡＳのＦｎ結合タンパク質が、宿主細胞に対する付着因子および侵入因子であることが報告されている。それぞれのＦｎ結合タンパク質はＭ血清型の特定の群に分布し、高毒性ＧＡＳ株は一つまたはそれ以上のＦｎ結合タンパク質を有している。例えば、Ｍ１株およびＭ４９株はＦｂａＡを発現し、また、Ｍ６株およびＭ１２株はタンパク質Ｆ１／ＳｆｂＩを保持し、Ｍ４株およびＭ２８株は両者を生産する。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７：  ４７４２８−４７４３５  （２００２）
【非特許文献２】
Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ３５：  １１３−１２５  （２００２）
【非特許文献３】
Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６９：  ９２４−９３０  （２００１）
【非特許文献４】
Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４２：  ７５−８６  （２００１）
【非特許文献５】
Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １０：  １０４９−１０５５  （１９９３）
【非特許文献６】
Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２１：  ３７３−３８４  （１９９６）
【非特許文献７】
Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３：  ５３１−５３９  （１９９４）
【非特許文献８】
Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １７：  １３７−１４５  （１９９５）
【非特許文献９】
Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６７：  ２７２０−２７２８  （１９９９）
【非特許文献１０】
Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６２：  ３９３７−３９４６  （１９９４）
【非特許文献１１】
Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３２：  ８９−９８  （１９９９）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
一方、Ｍ３株およびＭ１８株はＦ１／ＳｆｂＩおよびＳｆｂＩＩ／ＳＯＦばかりでなく、ＦｂａＡも有していないことが知られている。Ｍ３株はＴＳＬＳおよび他の重篤な侵入性疾患の患者から世界中で単離されている主要な血清型であり、またＭ１８株については、急性リウマチ熱に関係していることが遺伝学的および疫学的研究により示されている。これらの知見より、より強い病原としての可能性をもつＭ３株およびＭ１８株には、これまでに単離同定されていない、別のＦｎ結合タンパク質が存在すると考えられているが、未だにそのようなタンパク質についての報告はされていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は上記のような課題を検討し完成されたもので、以下のような新規レンサ球菌タンパク質抗原、該抗原に対する抗体等を提供する。
（１）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換された配列を有するタンパク質。
（２）フィブロネクチン結合活性を有する、上記（１）記載のタンパク質。
（３）レンサ球菌由来の、上記（１）または（２）記載のタンパク質。
（４）レンサ球菌がＭ３またはＭ１８の血清型である、上記（３）記載のタンパク質。
（５）配列番号：２で表される塩基配列を有する、上記（１）記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（６）ポリヌクレオチドがＤＮＡである、上記（５）記載のポリヌクレオチド。
（７）上記（６）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（８）上記（７）記載のベクターにより形質転換された、非ヒト動物由来の形質転換株。
（９）非ヒト動物が大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞からなる群から選択される、上記（８）記載の形質転換株。
（１０）上記（８）または（９）記載の形質転換株を培養した結果得られる、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換された配列を有するタンパク質。
（１１）上記（１）または（１０）記載のタンパク質に対する抗体。
（１２）上記（１１）記載の抗体を用いることを特徴とする、レンサ球菌感染の検出方法。
（１３）上記（１１）記載の抗体を含有することを特徴とする、レンサ球菌感染の検出キット。
（１４）上記（１１）記載の抗体を含有してなる診断剤。
（１５）猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹の診断剤である、上記（１４）記載の診断剤。
（１６）上記（１１）記載の抗体を含有してなる医薬。
（１７）猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹の予防および／または治療剤である、上記（１６）記載の医薬。
（１８）上記（１）または（１０）記載のタンパク質を含有してなる診断剤。
（１９）猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹の診断剤である、上記（１８）記載の診断剤。
（２０）上記（１）または（１０）記載のタンパク質を含有してなる医薬。
（２１）猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹の予防および／または治療剤である、上記（２０）記載の医薬。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
（本発明のタンパク質）
本発明のタンパク質は、（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換された配列を有するタンパク質である。また、本発明のタンパク質は、フィブロネクチン結合活性を有する。すなわち、本発明のタンパク質は、フィブロネクチン結合活性を有する限り、そのアミノ酸配列の一部に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、又は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【０００７】
また、本発明のタンパク質は、生理学的に許容される酸付加塩または塩基性塩の形であってもよい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
本明細書において、「本発明のタンパク質」は、本発明のタンパク質およびその塩を包含する意味で用いられる。
【０００８】
本発明のタンパク質は、公知の方法を用いてＧＡＳを培養し、その菌体から公知の方法を組み合わせることにより抽出ならびに精製することができる。
培地としては、ＧＡＳを生育できるものであれば、いずれの培地でも良いが、具体的には本発明では、０．２％酵母エキスを添加したトッド−ヒューイット・ブロース（ＴＨＹ）が好ましく用いられる。また、抗生物質による選択を行う場合は、エリスロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）またはカナマイシン（３００μｇ／ｍｌ）をＴＨＹ培地に添加する。得られた菌体をホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダー等による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などの公知の方法により破砕した後、残渣を遠心除去する。この細胞破砕上清液より例えば、８Ｍ尿素、６Ｍグアニジン塩酸、界面活性剤を用いてタンパク質の抽出を行う。本発明では、８Ｍ尿素が好ましく用いられる。得られた抽出液から逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過などの技術を組み合わせることにより、本発明のタンパク質を精製することができる。
【０００９】
本発明のタンパク質の精製は、フィブロネクチン（Ｆｎ）への結合性を指標として行う。具体的には、リガンド・ブロッティング法により、Ｆｎへの結合性を測定する。すなわち、ヒトＦｎをＥＣＬタンパク質ビオチン化モジュール（アマシャム・バイオサイエンス）を用いてビオチン化し、濃度を１０μｇ／ｍｌに調整する。上記のように得られた細胞抽出物を、好ましくは７．５％または１０％アクリルアミド濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜にブロットする。ＰＶＤＦ膜を４℃で一晩、１０％膜ブロッキング剤（アマシャム・バイオサイエンス）を用いてブロックし、ビオチン化Ｆｎ、続いて西洋ワサビのパーオキシダーゼ標識したストレプトアビジンと反応する。バンドをＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（アマシャム・バイオサイエンス）を用いて検出し、Ｘ線フィルム（フジ写真フィルム）上にオートラジオグラフィーにより視覚化する。
【００１０】
（本発明のポリヌクレオチド）
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドがあげられる。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、いずれでもよいが、特にＤＮＡが好ましい。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリーから得られるいずれのものでもよい。また、ＧＡＳ株より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを市販のキット等を用いて調製し、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により、ｃＤＮＡを増幅することも可能である。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡをクローニングするためのプラスミドＤＮＡの調製、大腸菌の形質転換、およびＰＣＲ等は公知の方法（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）に従って行う。
【００１１】
具体的には、本発明のポリペプチド、好ましくはＤＮＡは、以下のようにして取得する。すなわち、ＧＡＳ  Ｍ３株の完全ゲノムデータベースから、ＬＰＸＴＧモチーフを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を検索し、得られたＯＲＦを含む遺伝子領域を解析する。その解析結果からプライマーを設計、作製し、ＰＣＲ法を用いて、ＧＡＳ  Ｍ３株のゲノムＤＮＡを鋳型として、本発明のタンパク質をコードする遺伝子領域を増幅する。
【００１２】
（組換えベクター）
得られた本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、そのまま又は所望により適当な制限酵素で消化し、あるいは適当なリンカーを連結して使用することができる。このＤＮＡを適当なベクターに連結することにより組換えベクターを得ることができる。ＤＮＡを組込むベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等があげられる。
プラスミドＤＮＡとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＧＥＭ４、ｐＱＥ３０、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１等があげられる。また、ファージＤＮＡとしては、例えば、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９、λｇｔ１０等があげられる。
ベクターに本発明のＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結する方法などが採用される。
本発明のＤＮＡは、そのＤＮＡの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、エンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合配列、スプライシングシグナル、またジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の選択マーカー等を組み込んでもよい。
【００１３】
（形質転換体）
本発明において、形質転換体は、上記のような組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリキア属、もしくはバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、もしくはシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母、ＣＯＳ細胞、もしくはＣＨＯ細胞等の動物細胞、またはＳｆ９、もしくはＳｆ２１等の昆虫細胞、等があげられる。
【００１４】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌またはファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されない。例えばカルシウムイオンを用いる方法［Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ６９：  ２１１０  （１９７２）］、エレクトロポレーション法等があげられる。
【００１５】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等が用いられる。この場合のプロモーターとしては、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＧＡＰプロモーター等が挙げられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法［Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｄ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｌ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ  ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９４：  １８２  （１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｈｉｎｎｅｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ７５：  １９２９  （１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｉｔｏｈ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １５３，  １６３  （１９８３）］等があげられる。
【００１６】
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＳＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等が用いられる。この場合、プロモーターとしてヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等があげられる。
【００１７】
昆虫細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えば、ｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＭＢａｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）等が用いられる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等があげられる。
【００１８】
（組換えタンパク質）
本発明はまた、上記のようにして得られた形質転換体を培養した結果として得られた組換えタンパク質を提供する。本発明の組換えタンパク質は以下のようにして得られる。
【００１９】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン、マルトース、デキストリン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ＮＺアミン等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化コバルト等が用いられる。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３０℃で２４〜９６時間行う。培養期間中、ｐＨは５．０〜８．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００２０】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、またはこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、２０〜３０℃で１〜７日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００２１】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｇｒａｃｅ，  Ｔ．Ｃ．Ｃ．  Ｎａｔｕｒｅ，  １９５：  ７８８  （１９６２）］に１０％ウシ胎児血清などの添加物を適宜加えたものなどがあげられる。培地のｐＨは６．０〜７．０に調整し、通常２５℃で１〜７日培養を行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。
【００２２】
培養後、本発明の組換えタンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には菌体または細胞を破砕する。一方、本発明の組換えタンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去し、上清を得る。そして、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で、または適宜組み合わせて用いることにより、上記培養物中（細胞破砕液、培養液、またはそれらの上清中）から本発明の組換えタンパク質を単離精製することができる。
【００２３】
本発明において、具体的には本発明のタンパク質の発現ベクターを以下のように構築する。すなわち、本発明のＤＮＡを、例えばＧＡＳ  Ｍ３株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により増幅し、そのＰＣＲ断片をｐＱＥ３０ベクター（ＱＩＡＧＥＮ）にクローニングする。得られたプラスミドベクターを用いて、大腸菌ＸＬ−１０Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換する。この大腸菌の形質転換株を培養し、Ｎ末端のシグナルペプチドとＣ末端の細胞付着領域がなくなっている、本発明のタンパク質の３３から７３４番目のアミノ酸に相当する組換えタンパク質を産生させる。この組換えタンパク質をＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓタンパク質精製システム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、使用説明書の記載に従い精製する。
【００２４】
（抗体）
本発明は、本発明のタンパク質に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する）を提供する。本発明の抗体は、本発明のタンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。また、本発明の抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
より詳細には、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物、好ましくはウサギ、マウス、ラットなど、さらに好ましくはウサギなどを用い、抗原として本発明のタンパク質それ自体あるいは担体、希釈剤とともに、さらには抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントと混合して、前記動物の抗体産生が可能な部位に投与し、動物を免疫する。抗原の投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。
【００２５】
モノクローナル抗体を作製する場合、免疫された動物、例えばウサギから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５  （１９７５））に従い、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させ、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製する。モノクローナル抗体の選別は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地を用い、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。さらに、モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法（例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行うことができる。
【００２６】
ポリクローナル抗体を作製する場合は、例えば、免疫抗原自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に前記のような動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
【００２７】
（ＧＡＳの検出法−酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ））
本発明はＧＡＳ、特にＭ３株およびＭ１８株を特異的に検出する方法を提供する。検出方法としては、酵素免疫吸着法と後述する生細胞への付着・侵入を測定する方法が挙げられる。
本発明のタンパク質のフィブロネクチン（Ｆｎ）への結合能を測定するために、ＥＬＩＳＡを既に記載の方法に従って実施する。好ましくは０．１から１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１から１０μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１または１０μｇ／ｍｌのＦｎで９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（ナルゲ−ヌンク）をコートし、４℃で２から１２時間、好ましくは１２時間放置する。さらに５％ＢＳＡをウェルに添加し、３７℃で、１から３時間、好ましくは３時間、ブロッキングのために反応させる。ウェルを洗浄後、組換えタンパク質を加え、３７℃で０．５から１時間、好ましくは１時間結合させる。ＧＡＳをリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄し、Ｆｎに結合させるためにウェルに添加する。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄後、本発明のタンパク質に対するウサギ抗血清、あるいは対照実験として抗Ｍ３血清を添加し、３７℃で０．５から１時間、好ましくは１時間反応させる。ついで、結合反応を視覚化するために、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（セル・シグナリング）と、３７℃で０．５から１時間、好ましくは１時間インキュベートし、さらに０．１％ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩溶液（和光純薬）と１５分間反応させる。発色をＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍで測定する。得られた結果に関する統計解析は、母数に依存しないマンホイットニーＵ検定を用いる。
【００２８】
（ＧＡＳの検出法−宿主細胞への付着と侵入の測定）
細胞への付着と侵入についての測定は、公知の文献（Ｔｅｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４２，  ７５−８６）に記載されている標準的な方法を用いる。例えば、ＨＥｐ−２細胞を２４ウェルのプレートで、好ましくはウェルあたり１×１０５細胞の密度で培養し、好ましくはウェルあたり１×１０７ＣＦＵの細菌を１から３時間、好ましくは３時間感染させる（多重感染度、１：１００）。細菌の付着を調べるため、細胞をＤＭＥＭで３回洗浄し、１ｍｌの滅菌蒸留水に溶解する。生存ＧＡＳの数を決定するために、溶解物の連続希釈液をＴＨＹ寒天プレートに播く。細胞の侵入については、細胞をゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびペニシリン（１００単位／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭで３回洗浄し、さらに１時間インキュベートする。細胞を洗浄、溶解し、ＧＡＳに侵入された細胞を数えるためにプレートに播く。データの統計解析は母数に依存しないマンホイットニーＵ検定により行われる。
【００２９】
（ＧＡＳの検出キット、検出方法および診断剤）
本発明の抗体を用いて、ＧＡＳ、具体的にはＧＡＳ  Ｍ３株およびＭ１８株を検出するためのキットを構成することができる。すなわち、該キットは、本発明の抗体の他、本発明のタンパク質、フィブロネクチン（Ｆｎ）、本発明のタンパク質に対するウサギ抗血清、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１％ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩酸溶液から構成される。該キットを用い、前記のＥＬＩＳＡ法によりＧＡＳを検出することができる。
具体的には、好ましくは０．１から１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１から１００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１または１０μｇ／ｍｌのＦｎで９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（ナルゲ−ヌンク）をコートし、４℃で２から１２時間、好ましくは１２時間放置する。さらに５％ＢＳＡをウェルに添加し、３７℃で、１から３時間、好ましくは３時間、ブロッキングのために反応させる。ウェルを洗浄後、組換えタンパク質を加え、３７℃で１から２時間、好ましくは１時間結合させる。ＧＡＳをリン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄し、Ｆｎに結合させるためにウェルに添加する。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄後、本発明のタンパク質に対するウサギ抗血清、あるいは対照実験として抗Ｍ３血清を添加し、３７℃で０．５から１時間、好ましくは１時間反応させる。ついで、結合反応を視覚化するために、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（セル・シグナリング）と、３７℃で０．５から１時間、好ましくは１時間インキュベートし、さらに０．１％ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩溶液（和光純薬）と１５分間反応させる。発色をＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍで測定する。
本発明の抗体は単独で、あるいは上記のキットの形態で、ＧＡＳに起因する疾患（例えば、猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹）の診断剤として用いることができる。ＧＡＳに感染している、あるいはＧＡＳに起因する疾患（例えば、猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹）を発症している場合、患者の組織の抽出物、血液等と本発明の抗体を反応させ、その交差反応を調べることにより、ＧＡＳを検出する。
【００３０】
（本発明のタンパク質または抗体を用いた医薬）
本発明の抗体の、本発明のタンパク質に対する中和活性とは、該タンパク質の関与するＦｎ結合機能を不活性化する活性を意味する。すなわち、該抗体が中和活性を有する場合は、Ｆｎ結合活性を不活性化することができる。その結果として、このような抗体は、ＧＡＳによる宿主細胞への付着と侵入の活性を低下させ、猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹のようなＧＡＳに起因する疾患の予防および／または治療のための医薬として用いることができる。
【００３１】
猩紅熱、リウマチ熱、咽頭炎、膿痂疹のようなＧＡＳに起因する疾患の予防および／または治療のために、本発明のタンパク質または抗体を有効成分として、経口投与、非経口投与または外用（局所）投与に適した有機または無機の固体または液体の賦形剤などの医薬として許容される担体と共に、これを含有する医薬製剤の形で用いることができる。該医薬製剤は、カプセル剤、錠剤、糖剤、顆粒、吸入剤、坐剤、液剤、ローション剤、懸濁液、乳剤、軟膏、ゲル剤などであってもよい。必要ならば、上記製剤に、補助剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、緩衝剤およぴ他の通常使用される添加剤を含有させてもよい。上記の医薬製剤には、本発明のタンパク質をその成分として含むワクチン（以下、本発明のワクチンと称する）も含まれる。本発明のタンパク質またはその抗体を含有する医薬は、製剤中０．０１〜９９．９９重量％、好ましくは０．０１〜５０重量％含有される。
【００３２】
本発明のワクチンを使用して、受動的免疫または能動的免疫のいずれかによってＧＡＳ感染に対する耐性を付与し得る。本発明のワクチンが、能動免疫によってＧＡＳ感染に対する耐性を付与するために使用される場合、本発明のワクチンは、ＧＡＳ感染を予防するかまたは減弱するかのいずれかである保護免疫応答を誘発するために動物に投与される。本発明のワクチンが受動免疫によってＧＡＳ感染に対する耐性を付与するために使用される場合、ワクチンは宿主動物（例えば、ヒト、イヌ、またはマウス）に提供され、そしてこの抗血清によって誘発された抗血清を回収し、そしてＧＡＳによって生じた感染を有すると疑われるレシピエントに直接提供される。
ワクチン（または、それが誘発する抗血清）の投与は、「予防的」または「治療的」のいずれかの目的であり得る。予防的に提供される場合、化合物は、ＧＡＳ感染の任意の症状に先んじて提供される。化合物の予防的投与は、任意の引き続く感染を予防または減弱するのに役立つ。治療的に提供される場合、化合物は、動物がＧＡＳに感染し得ることを示す症状の検出時またはその後に提供される。化合物の治療的投与では、任意の実際の感染を減弱するのに役立つ。従って、本発明のタンパク質は、感染の発症の前（予期される感染を予防するかまたは減弱するため）または実際の感染の開始後のいずれかに提供され得る。
【００３３】
本発明のワクチンが動物に提供される場合、塩、緩衝剤、アジュバント、または組成物の効力を改良するために所望される他の物質を含む組成物中に存在しうる。アジュバントは、特異的免疫反応を特異的に増強するのに使用され得る物質である。これらの物質は、一般に、２つの機能、すなわち、（１）投与後の迅速な代謝からの本発明のタンパク質の保護、および（２）非特異的な免疫応答の刺激、を発揮する。
通常、アジュバントおよび組成物は、免疫系への提示前に混合されるか、または別個ではあるが免疫される動物の同一部位に提示される。アジュバントは、それらの組成物に基づいていくつかの群に大まかに分類され得る。これらの群は、油アジュバント（例えば、フロイントの完全または不完全アジュバント）、無機塩（例えば、シリカ、カオリン、および炭素）、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、および特定の天然物質（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のワックスＤ）を含む。アジュバントとして有用な他の物質はサポニンである。本発明における使用に好ましいアジュバントは、アルミニウム塩（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４））を含む。ワクチン組成物における使用に適した物質の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｏｓｏｌ、Ａ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１３２４〜１３４１頁（１９８０））に提供される。
【００３４】
本発明のタンパク質または抗体を用いた医薬をＧＡＳに起因する疾患の治療に用いる場合、その医薬製剤は、注射、迅速な注入、食道吸収（食道内吸収）、皮膚吸収非経口的によって、または経口によって投与され得る。医薬製剤はまた、筋肉内、または静脈内に投与され得る。非経口投与のための医薬製剤は、滅菌水性または非水性の溶液、懸濁液、または乳濁液を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および注入可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）を含む。キャリアまたは密封包帯は、皮膚透過性を増大させ、そして本発明のタンパク質の吸収を増強するために使用され得る。経口投与のための液体剤形は、一般に、液体剤形を含むリポソーム溶液を含む。リポソームを懸濁するのに適切な形態は、当該分野で通常使用される不活性希釈剤（例えば、精製水）を含む、乳濁液、懸濁液、溶液、シロップ、およびエリキシルを含む。不活性希釈剤のほかに、このような組成物はまた、アジュバント、湿潤化剤、乳化剤、および懸濁剤、あるいは甘味料、風味料、または香料を含み得る。該医薬製剤はまた、カプセル形態で投与され得る。
【００３５】
本発明のタンパク質または抗体を用いた医薬製剤の有効量は、所望の生物学的効果を達成するに充分な量である。一般に、組成物の有効量を提供するに必要とされる投薬量は、動物またはヒトの年齢、状態、性別、および疾患の程度、もし存在すれば他の変数のような因子に依存する。また医薬製剤は、有効量の単回投薬または複数投薬によって投与され得る。該有効量は、一用量あたり０．０１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは、一用量あたり０．０１〜５００μｇ／ｍｌ、最も好ましくは一用量あたり１０〜３００μｇ／ｍｌと変化し得る。
【００３６】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］
本発明のタンパク質のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２］
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：３］
実施例３で用いたプライマーＮ３４−ＢａｍＨＩの塩基配列を示す。
［配列番号：４］
実施例３で用いたプライマーＮ７３４−ＳａｌＩの塩基配列を示す。
［配列番号：５］
実施例４で用いたフォワードプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：６］
実施例４で用いたリバースプライマーの塩基配列を示す。
【００３７】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
実施例１  Ｍ３株のＦｎ結合タンパク質の検出
ＴＳＬＳまたは咽頭炎の患者から単離されたＧＡＳ  Ｍ３株から、８Ｍ尿素を用いてその表面に存在するタンパク質を抽出した。２７株のＭ３について、リガンド・ブロッティングによりＦｎ結合タンパク質の発現を調べた。ビオチン化ヒトＦｎに対する結合をオートラジオグラムにより視覚化したところ、ＴＳＬＳ患者に由来するいくつかの単離株で、Ｆｎ結合タンパク質を発現することがわかった。すなわち、約８０ｋＤａと約８８ｋＤａのタンパク質が、Ｆｎ結合タンパク質として既知のＭ３タンパク質（５５ｋＤａ）よりもさらに強い結合能でＦｎに結合することがわかった（図１Ｃ）。しかし、これら２種のタンパク質の回収量は、Ｍタンパク質よりもかなり少なかった（図１ＡおよびＢ）。
【００３９】
実施例２  本発明のタンパク質をコードする遺伝子の解析
ＴＳＬＳ患者から単離したＧＡＳ  Ｍ３株ＳＳＩ−１の完全ゲノムシーケンシングを行い、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩデータバンクに受託番号ＢＡ００００３４として登録した。約８８ｋＤａの計算上の分子量とＬＰＸＴＧモチーフをもつＯＲＦを全ての推定されるＯＲＦから検索したところ、１個のＯＲＦを得た。Ｎ末端領域に推定されるシグナル配列と、Ｃ末端に細胞への付着のためのＬＰＡＴＧＥ配列とＦｎ結合繰り返しモチーフを見出したので、このＯＲＦがＦｎ結合タンパク質であると推定し、ＦｂａＢタンパク質（以下、ＦｂａＢと略記する）、その遺伝子をｆｂａＢ遺伝子と命名した。さらに、実施例１で得られた約８８ｋＤａのタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を解析した結果、ＦｂａＢの推定アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をＮ末端に有していた。ｆｂａＢ遺伝子はレンサ球菌に共通のシャイン−ダルガノ配列（ＧＧＡＧＡＧ）、−１０配列（ＴＡＧＧＣＴ）および−３５配列（ＴＴＧＴＣＣ）を開始コドンＡＴＧの前に有していた。ＯＲＦは２２０２ヌクレオチドからなり、予想分子量８１ｋＤａの７３３アミノ酸残基のタンパク質をコードしていた。また、成熟タンパク質は７９ｋＤａと計算された。
【００４０】
実施例３  本発明の組換えタンパク質
本発明のタンパク質の発現ベクターを以下のように構築した。ｆｂａＢ遺伝子をＧＡＳ株ＳＳＩ−１の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマーＮ３４−ＢａｍＨＩ（配列番号：３）およびプライマーＮ７３４−ＳａｌＩ（配列番号：４）を用いて、ＰＣＲ法により増幅し、そのＰＣＲ断片をｐＱＥ３０ベクター（ＱＩＡＧＥＮ）にクローニングした。Ｎ末端のシグナルペプチドとＣ末端の細胞固着領域がなくなっている、ＦｂａＢ（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩデータバンク  受託番号ＡＢ０８４２７２）の３３から７３４番目のアミノ酸に相当する組換え型ＦｂａＢ（ｒＦｂａＢ）タンパク質を作製した。取扱説明書に従って、ｒＦｂａＢをＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓタンパク質精製システム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
【００４１】
実施例４  ｆｂａＢ遺伝子の不活化とＦｂａＢ欠損変異株の特性解析
ｆｂａＢ遺伝子を不活化するために、まずｆｂａＢ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子であるａｐｈＡ３遺伝子をもつプラスミドｐＹＴ１１８５を構築した（図２Ａ）。プラスミドｐＹＴ１１８５を電気穿孔法により、ＳＳＩ−１株に形質転換し、交叉組換えによりＳＳＩ−１の染色体ＤＮＡに組込んだ。その結果、ｆｂａＢ遺伝子を欠損する変異株ＴＲ−４７を得た。ｆｂａＢの組み込みと不活化はｆｂａＢ遺伝子特異的フォワードプライマー（配列番号：５）とａｐｈＡ３特異的リバースプライマー（配列番号：６）を用いてＰＣＲ法により確認した。生成した変異株ＴＲ−４７を、抗ＦｂａＢ血清を用いたウェスタンブロット分析にかけ、ＦｂａＢタンパク質が細菌細胞表面で発現していないという結果を得た（図２Ｂ）。ｆｂａＢを不活化すると約８０ｋＤａと約８８ｋＤａの両タンパク質が消失した。この結果から、約８０ｋＤａのＦｎ結合タンパク質は、約８８ｋＤａのＦｎ結合タンパク質の分解産物であると考えられた。これらの結果から、ｆｂａＢ遺伝子は実施例１で得られた新規Ｆｎ結合タンパク質で、ＦｂａＢと命名されたタンパク質をコードしていることが明らかとなった。
生きた細菌におけるＦｂａＢの能力を調べるために、Ｆｎをコートしたプレートを用いたＥＬＩＳＡにより、ＳＳＩ−１株とＴＲ−４７株の違いを調べた。Ｆｎをコートしたマイクロタイタープレート上で、それぞれの株を培養した。ウサギ抗Ｍ３ポリクローナル抗体とアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて、結合活性を定量した（図２ＣおよびＤ）。ＴＲ−４７株のＦｎ親和性はＳＳＩ−１株よりも低かったが、両株とも細胞密度に依存して固定化Ｆｎに結合した。これらの結果は明らかに、ＦｂａＢはＧＡＳの表面においてＦｎ結合タンパク質として機能していることを示唆している。
【００４２】
実施例５  各種ＧＡＳ株におけるｆｂａＢ遺伝子の分布およびＦｂａＢタンパク質のフィブロネクチン結合能
各種のＧＡＳ  Ｍ株におけるｆｂａＢ遺伝子の分布をＰＣＲで、ＦｂａＢタンパク質の発現を抗ＦｂａＢ血清を用いたウェスタンブロッティングとビオチン化Ｆｎを用いたリガンド・ブロッティングで調べた結果を表１に示す。
【表１】
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その結果、ｆｂａＢ遺伝子はＧＡＳのＭ３株およびＭ１８株の染色体上にのみ見出された。また、抗ＦｂａＢ血清とビオチン化Ｆｎは、ＴＳＬＳ患者から単離されたＧＡＳの細胞表面抽出物と反応したが、咽頭炎患者からのものとは反応しなかった。
実施例３で得られたｒＦｂａＢをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜にブロットし、ビオチン化Ｆｎとインキュベートした。固定化ｒＦｂａＢは可溶性のＦｎと強く結合することが明らかとなった（図３Ａ）。可溶性ｒＦｂａＢの結合活性を解析するために、各種の濃度のｒＦｂａＢをＦｎをコートしたマイクロタイタープレートに加え、結合したｒＦｂａＢをウサギ抗ＦｂａＢ血清とアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて定量した。その結果、可溶性ｒＦｂａＢは、投与量依存的に固定化されたＦｎに結合することが示された（図３Ｂ）。
【００４３】
実施例６  ＧＡＳ中のＦｂａＢの局在性
ＦｂａＢの局在性を調べるために、抗ＦｂａＢとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４を結合した二次抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡の観察を行った。その結果、ＦｂａＢがＧＡＳ細胞表面に局在していることが明らかとなった。この結果および実施例４の結果（図２ＣおよびＤ）、さらにはＦｂａＢタンパク質のＣ末端のＬＰＸＴＧモチーフの存在から、ＦｂａＢはＧＡＳの表面に局在すると結論した。
【００４４】
実施例７  宿主細胞への侵入性とＦｂａＢの機能
実施例６の結果は、ＦｂａＢはＧＡＳが宿主細胞へ付着し、その細胞内へ侵入する際に機能することを示唆する。そこで、ＦｂａＢの機能を調べるために、ＳＳＩ−１株とＴＲ−４７株の宿主細胞への付着および侵入効率を比較した。これらの株のヒト咽頭上皮細胞ＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２３）への付着と侵入について、それぞれ測定した。図４に示したように、ＴＲ−４７株の付着および侵入は、ＳＳＩ−１株に比べ、それぞれ１／６程度に減少していた。この結果は、ＧＡＳの宿主細胞への付着と侵入にＦｂａＢが機能していることを示す。
また、図５に示したように、ＦｂａＢの欠損はＧＡＳ投与後のマウスの死亡率の減少をもたらすことが明らかとなった。すなわち、ＳＳＩ−１株は２日目に死亡率８０％、４日目に死亡率９０％であったが、一方、ＴＲ−４７株では、２日目でもたったの４０％であった。この結果は、ＦｂａＢがＧＡＳの宿主細胞への付着と侵入に機能した結果、宿主細胞へのＧＡＳの侵入性が低下し、マウスの死亡率が減少したことを示唆する。
【００４５】
【発明の効果】
本発明のタンパク質および組換え型タンパク質は、Ａ群レンサ球菌（ＧＡＳ）、特にＭ３株およびＭ１８株を特異的に検出することができる。該タンパク質に対する抗体は、ＧＡＳに起因する疾患の予防および／または治療のための医薬組成物、例えばワクチンとして有用である。
【００４６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＳＬＳ患者から単離されたＭ３株の８Ｍ尿素抽出物のウェスタンブロット解析を示す。Ａ、クーマシー・ブリリアント・ブルー染色。Ｂ、ウサギ抗Ｍ３血清を用いたウェスタンブロット。Ｃ、ビオチン化ヒトＦｎを用いたリガンド・ブロッティング。
【図２】ＦｂａＢ欠損変異株の機能解析を示す。Ａ、ＧＡＳ  ＳＳＩ−１株（ＴＳＬＳ患者から単離されたＭ３）のｆｂａＢ遺伝子の標的突然変異導入。ｐＹＴ１１８５はｆｂａＢ遺伝子の内部断片とａｐｈＡ３遺伝子（カナマイシン耐性）をもつ。電気穿孔法を用いることにより、ＦｂａＢ欠損突然変異株ＴＲ−４７を交叉組換えにより得た。Ｂ、ＧＡＳ株の８Ｍ尿素抽出物の抗ＦｂａＢを用いたウェスタンブロット解析とＦｎ結合。レーンａ、クーマシー・ブリリアント・ブルー染色。レーンｂ、抗ＦｂａＢを用いたウェスタンブロット解析。レーンｃ、ビオチン化ヒトＦｎ（１０μｇ／ｍｌ）との結合。ＣおよびＤ、ＧＡＳ株の固定化Ｆｎへの結合（Ｃ、１μｇ／ｍｌ；Ｄ、１０μｇ／ｍｌ）。Ｆｎコートを施したマイクロタイタープレートを各種密度のＧＡＳ株とインキュベートした。結合したＧＡＳ生物を抗Ｍ３抗体を用いて検出した。結合活性はＡ４０５の値として表した。これらの実験は３回ずつ行われ、データは一つの代表的な実験における３回の試料の平均を表す。Ｓ．Ｅ．（標準誤差）を縦線で示した、＊、ｐ＜０．０５。黒三角および黒丸はＳＳＩ−１株での結果を、白三角および白丸はＴＲ−４７株での結果をそれぞれ表す。
【図３】組換えＦｂａＢのＦｎ結合活性について示す。Ａ、ＦｎのｒＦｂａＢへの結合。レーンａ、クーマシー・ブリリアント・ブルー染色。レーンｂ、ビオチン化ヒトＦｎ（１０μｇ／ｍｌ）との結合。Ｂ、ＥＬＩＳＡによるＦｎ結合活性の解析。Ｆｎコートを施したマイクロタイタープレート（１μｇ／ｍｌ）をＢＳＡでブロックし、各種濃度のｒＦｂａＢを１時間３７℃で結合させた。ｒＦｂａＢのＦｎ結合は抗ＦｂａＢ血清を用いて検出した。３連の実験を３回行い、データを一つの代表的な実験における３回の試料の平均で表す。Ｓ．Ｅ．を縦線で示した。
【図４】ＧＡＳ  ＳＳＩ−１株とＴＲ４７株のＨＥｐ−２細胞への付着と侵入を示す。ＧＡＳ株を１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁し、明細書に記載されるとおりにＨＥｐ−２細胞へ添加した（多重感染度、１００：１；ＨＥｐ−２細胞あたり細菌１００）。Ａ、付着のパーセンテージを、（付着と侵入のＣＦＵ／接種したＣＦＵ）×１００として計算した。Ｂ、侵入のパーセンテージを、（侵入のＣＦＵ／接種したＣＦＵ）×１００として計算した。３回の実験を行い、データを１回の代表的な実験の６ウェルの平均で表した。Ｓ．Ｅ．の結果を縦線で表す。＊、ｐ＜０．００５。
【図５】ＧＡＳを感染したマウスの生存率を示す。約４×１０６ＣＦＵのＧＡＳをマウス腹腔内に注射した（ｎ＝１０）。生存マウスの頭数を毎日モニターした。＊、ｐ＜０．０５（χ２検定）。黒丸はＳＳＩ−１株での結果を、白丸はＴＲ−４７株での結果をそれぞれ表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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