(57)【要約】【課題】、薬理学的試験、生理学的試験や毒性試験に用いられる細胞生物試験法において、安定した培養と高倍率での顕微鏡観察が可能な細胞培養基材を提供すること。【解決手段】基材を炭素、水素、窒素、及び酸素から選ばれる少なくと２つの元素からなる素材と共存させプラズマ処理した後、細胞接着性蛋白質又は細胞接着性高分子を被覆する神経細胞培養基材の製造方法であり、好ましくは、素材が合成高分子であり、基材がガラス又は石英からなる神経細胞培養基材の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材を炭素、水素、窒素、及び酸素から選ばれる少なくと２つの元素からなる素材と共存させてプラズマ処理した後、細胞接着性蛋白質又は細胞接着性高分子を被覆することを特徴とする神経細胞培養基材の製造方法。
【請求項２】
素材が合成高分子である請求項１記載の神経細胞培養基材の製造方法。
【請求項３】
基材がガラス又は石英からなる請求項１又は２記載の神経細胞培養基材の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか記載の神経細胞培養基材の製造方法で製造された神経細胞培養基材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養基材に関するものである。特に神経細胞培養に用いる基材とその製造法に関するもので、神経細胞の培養安定化に効果を示し、細胞レベルの研究、医薬品の効果を試験する薬理学的、生理学的試験、化学物質の生物毒性を判定する生物試験などに用いられるものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の培養技術は、生物を対象とする様々な分野で用いられる基本技術である。特に生命科学の分野で医薬品の開発や病態メカニズムの解明などには欠くことのできない技術となっている。
細胞は一定の容器の中で栄養成分である培養液とともに培養が行われる。この細胞はその性状から、この培養液の中で浮遊した状態で培養されるものと容器の底面に付着した状態で培養されるものに大きく２分される。神経細胞は、後者の接着性細胞に分類される。
【０００３】
容器の底面に接着して培養されるこれらの接着性細胞に対して、ガラス、表面親水化処理プラスチックを基材とする容器がよく用いられる。このような親水性基材には通常の細胞は良く接着し、増殖させたり生存を維持したりすることができる。
ただし、単に親水性というだけでは接着しない細胞も多数ある。接着性細胞を、接着できない状態においた場合には長時間の生存を維持することはできない。
親水性基材に接着を起こさない細胞を接着させるためには細胞接着性蛋白質をコートする方法が知られている。コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどが代表的な蛋白質である。また。塩基性の合成高分子も同様の用途に用いられている。ポリリジン、ポリエチレレンイミン、ポリアリルアミン塩酸塩などがある。
【０００４】
親水化プラスチック基材の場合、細胞接着性の改善は、これらをコートすることにより、特に問題なく行うことができる。しかし、ガラス基材などの場合には、
同様な方法を用いても、効果的な培養が行えない場合が多い。これは、プラスチック基材に比べて上記の細胞接着性蛋白質や合成高分子のコートが確実に行えないことが、その主因である。
【０００５】
このコートの不完全さが、ガラス表面の不均一性や何らかの汚れ、または表面官能基の問題であると考えられており、その対処法として、有機溶剤（非特許文献１参照）、硝酸などの酸、又は水酸化ナトリウムなどのアルカリで表面を処理する方法が用いられる。確かにこれらの方法で改善は認められるが、酸やアルカリを用いた場合、細胞毒性を充分に除くために過剰な洗浄操作が必要で煩雑な工程が必要となる。
ガラス、石英などの基材はプラスチック基材に比べ加工性は劣るが、光透過性が良い、材料自体の発蛍光が少ないなどの優れた点も多く、細胞像を高倍率で蛍光観察する場合など欠かせない基材となっている（非特許文献２）。
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社）  、４６２−４７６ページ、（１９９８年）
【非特許文献２】実験医学、２０巻（１５号）、２２４７−２２５２ページ、（２００２年）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、薬理学的試験、生理学的試験や毒性試験に用いられる細胞生物試験法において、安定した培養と高倍率での顕微鏡観察が可能な細胞培養基材を提供することである。
【０００８】
【問題を解決するための手段】
本発明者は、プラスチック基材のコートの容易さ、表面均一処理の検討、及び神経細胞培養の安定性などの比較検討を行い、ガラス基材表面を単にクリーニングするだけではコートを効率的に行うことはできず、ここにプラスチック基材様の薄層を形成することが効果的で、目的とする安定培養につながることに着目し、効率的な表面処理法の検討を進めた結果、本発明に至ったものである。
即ち本発明は、
（１）基材を炭素、水素、窒素、及び酸素から選ばれる少なくと２つの元素からなる素材を共存させプラズマ処理した後、細胞接着性蛋白質又は細胞接着性高分子を被覆する神経細胞培養基材の製造方法、
（２）素材が合成高分子である（１）記載の神経細胞培養基材の製造方法、
（３）基材がガラス又は石英からなる（１）又は（２）記載の神経細胞培養基材の製造方法、
（４）（１）〜（３）いずれか記載の神経細胞培養基材の製造方法で製造された神経細胞培養基材、
である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
ガラス、石英基材などにプラスチック基材様の薄い層を形成する方法は種々の方法が可能である。しかし、基材の特性を維持するためには、この層はできるかぎり薄い層であることが効果的である。プラスチック基材を有機溶剤に溶解しコートするとか、プラズマ重合、プラズマ開始重合、化学蒸着法のような方法でも可能ではある。しかし層をできる限り薄くするという目的には適する方法ではない。
【００１０】
本発明では、基材のプラズマ表面処理空間に、同時に合成高分子等の素材を共存させることにより基材表面を活性化すると同時に、この薄層の形成が可能である。基材と合成高分子等の素材の配置は、プラズマが発生している空間なら、時間、加えるパワーを変えることにより、種々の配置が可能であるが、電極上に配置する方法が効率的である。素材の種類は、炭素、水素、窒素、及び酸素から選ばれる少なくとも２つの元素からなるものであり、硫黄やハロゲン系元素を含むものは好ましくない。金属元素も不適である。
【００１１】
本発明においてプラズマ処理に使うガス種は、特に限定されるものではないが、プラズマ重合が起こるものは制御が難しく適切ではない。また基材のエッチングが著しいものも適切ではない。反応性の低いアルゴン、ネオン、窒素、酸素などがこれらの混合物とともに好適である。アンモニア、水素なども適用できる。反応時間、印加電力などは、プラズマ反応装置、処理基材量などにより適切な条件を選択することが可能である。
【００１２】
本発明に使用する基材は、ガラス、石英が好適であるが、他の透明素材も適用可能である。細胞の構造や細胞内での特定分子の分布を観察する場合など、微量の蛍光を観察する場合が多く、このような用途に供するには基材自体に蛍光がない、あるいは少ないものを用いることが必要である。また厚みも、明瞭な顕微鏡像を観察するためには薄いものが好ましい。基材の平坦性は必須である。
【００１３】
本発明においてプラズマ処理後は、細胞接着性蛋白質又は細胞接着性合成高分子の溶液をコーティングする。細胞接着性蛋白質としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等が挙げられる。細胞接着性合成高分子としては、ポリリジン、ポリエチレレンイミン、ポリアリルアミン塩酸塩等が挙げられる。
コーティング法は限定を受けるものではなく、塗布法、スプレー法、浸漬法、スピンコーティング法、などいずれでもよい。この後洗浄操作を行い過剰なものを除去する。ポリエチレンイミンなどの塩基性合成高分子は適切な量を超えると細胞毒性を示し、充分な洗浄が必要である。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例にもとづき説明する。
（実施例）
実施例の基材調製：直径１５ｍｍのカバーガラス（厚み０．１２ｍｍ、マツナミガラス製）を洗浄後、直径６０ｍｍのポリスチレンディシュ（住友ベークライト製）に６枚配置し、酸素ガス雰囲気下、プラズマ処理を５０Ｗで５分間行った。処理後５０μｇ／ｍＬのポリリジン溶液（ＳＩＧＭＡ製）に、冷蔵庫内で一夜浸漬した。純水で３回洗浄後風乾した。
【００１５】
（比較例）
比較例の基材調製：実施例と同様の基材を用いてプラズマ処理の段階を除いた以外は実施例と同様に調製した。
【００１６】
神経細胞の培養試験：ラット胎児（胎生１７日）の大脳を定法により切り出し細切。神経細胞分散液（酵素パパイン処方液、住友ベークライト製）中で３０分間酵素処理した。再分散後、神経細胞用培養液（住友ベークライト製）で細胞濃度５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。調製した基材を入れた１２ウェルの培養プレート（住友ベークライト製）に１ｍＬ／ウェル量加え３日間培養した。
蛍光染色剤Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学製）で染色し、蛍光顕微鏡下培養状態を観察したところ、実施例の基材では突起を伸張した神経細胞が、鮮明に、かつ多数認められた。
比較例の基材では少数の神経細胞のみ認められたに過ぎず、かつ突起の慎重も不充分で、顕微鏡観察中に細胞が剥がれるなどの現象も認められた。
【００１７】
【発明の効果】
本発明の神経細胞培養基材を用いることにより安定した神経細胞培養系を得ることができるとともに、これを用いて細胞や細胞内小器官、細胞内のおける特定分子の分布状態の観察など、細胞生物学的な検討が効果的に行える。これは薬理試験や毒性試験の精度の向上に寄与する。