(57)【要約】【課題】複数のダイクロイックミラーを交換使用するのではなく、１つの高反射ミラーのみの使用により、多色の蛍光画像を同時に計測できると共に蛍光の受光効率も改善された共焦点光スキャナを実現する。【解決手段】２色以上の色素でそれぞれの成分が識別可能な試料を測定するニポウディスク型の共焦点光スキャナにおいて、前記試料に照射する励起光と試料から発せられる蛍光を分離するために使用される高反射ミラーの反射率が、少なくとも励起光波長域と蛍光波長域を合わせた測定波長域において実質上８０％以上１００％以下になるように形成する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２色以上の色素でそれぞれの成分が識別可能な試料を測定するニポウディスク型の共焦点光スキャナにおいて、
前記試料に照射する励起光と試料から発せられる蛍光を分離するために使用される高反射ミラーの反射率が、少なくとも励起光波長域と蛍光波長域を合わせた測定波長域において実質上８０％以上１００％以下になるように形成されたことを特徴とする共焦点光スキャナ。
【請求項２】
前記測定波長域は、前記励起光波長域と蛍光波長域を合わせた波長域に、蛍光画像に重ね合わせる透過また落射蛍光画像の波長域を合わせた波長域であることを特徴とする請求項１記載の共焦点光スキャナ。
【請求項３】
前記蛍光波長域が、紫外域または可視光域または近赤外域または赤外域であることを特徴とする請求項１または２記載の共焦点光スキャナ。
【請求項４】
前記励起光が多光子励起の場合は、前記蛍光波長域での蛍光反射率が実質上１００％であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の共焦点光スキャナ。
【請求項５】
前記試料に付加する蛍光試薬が量子ドットの場合は、前記蛍光波長域で蛍光反射率が実質上１００％であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の共焦点光スキャナ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点光スキャナにおける光学系に関するものであり、さらに詳しくは、試料から発せられる複数種類の蛍光（多色の蛍光という）を同時に計測するためのダイクロイックミラーの改良、および蛍光効率の改善に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、顕微鏡と共に使用される共焦点光スキャナはよく知られている（例えば、非特許文献１参照）。図１０は、この種の共焦点光スキャナの原理的構成図である。励起光であるレーザ１はマイクロレンズディスク２に配置された各マイクロレンズ３により個別の光束に集光され、マルチクロイックミラー（本来はマルチクロイックミラーと呼ぶべきであるが、以降ここではマルチ波長用ダイクロイックミラーと呼ぶ）４を透過後、ピンホールディスク（ニポウディスクともいう）５に設けられた個々のピンホール６を通過し、対物レンズ７により試料８に集光される。
【０００３】
試料８から発生した蛍光は再び対物レンズ７を通り、ピンホールディスク５の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホール６を通過した蛍光はマルチ波長用ダイクロイックミラー４で反射され、リレーレンズ９により、センサ１０上に蛍光画像を結像する。
ここで使用されるマルチ波長用ダイクロイックミラー４は、励起光１を透過し、試料８からの蛍光を反射するように設計されている。
【０００４】
マイクロレンズディスク２とピンホールディスク５は部材１１で機械的に連結され、回転軸１２の周りを一体で回転する。ピンホールディスク５上に形成された個々のピンホール６からの励起光が試料８の観察平面を走査するように、個々のマイクロレンズ３とピンホール６は配置されている。また、ピンホール６が並んでいる平面と、試料８の観察平面と、センサ１０の受光面とが互いに光学的に共役な関係に配置されているため、センサ１０上には試料８の光学的断面像、すなわち共焦点画像が結像される。
【０００５】
このような共焦点光スキャナでは、多波長同時測定用のマルチ波長用ダイクロイックミラー４を用いている。そのマルチ波長用ダイクロイックミラーの特性は、例えば図１１の（ａ）に示すような特性である。なお、対応する特性すなわち試料８から発せられる蛍光波長の特性は同図（ｂ）に示すような特性である。
従来の共焦点光スキャナにおいては、このようなマルチ波長用ダイクロイックミラー４を用いて、反射率の低い波長帯で励起光を透過し、試料８からの蛍光は反射率の高い波長帯により反射してセンサ１０に導いている。
【０００６】
単波長ダイクロイックミラーを用いる場合は、特性の異なる３つのダイクロイックミラーを機械的に切替えて使用する必要があるが、上記のようなマルチ波長用ダイクロイックミラーを使用した場合は、交換・切替えを行うことなく多色の蛍光画像を同時に計測できる利点がある。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｃ．Ｇｅｎｋａ，  Ｋ．Ｉｓｈｉｄａ，  Ｋ．Ｉｃｈｉｍｏｒｉ，  Ｙ．Ｈｉｒｏｔａ，  Ｔ．Ｔａｎａａｍｉ，  Ｈ．Ｎａｋａｚａｗａ、「Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｐｈａｓｉｃ  Ｃａ２＋  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｙｔｏｓｏｌ  ｔｏ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｎｇ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｕｌｔｒａ−ｆａｓｔ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ」、セル  カルシウム［Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ］  Ｖｏｌｕｍｅ  ２５、Ｉｓｓｕｅ  ３、Ｐ．１９９−２０８
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような従来の共焦点光スキャナでは次のような課題があった。
（１）このマルチ波長用ダイクロイックミラーでは、試料から発せられる本来の蛍光のかなりの部分が反射できない。
例えば、シアン色の蛍光標識タンパク質ＥＣＦＰ、黄色の蛍光標識タンパク質ＥＹＦＰ、赤色の蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄの各発現ベクターについて考察すると以下の通りである。
【０００９】
・ＥＣＦＰについては、４８０ｎｍより長波長側が６割程度カットされる。
・ＥＹＦＰについては、５６０ｎｍより長波長側が３割程度カットされる。
・ＤｓＲｅｄについては、６００ｎｍより短波長側のピークを含む波長が６割程度カットされる。
このようなマルチ波長用ダイクロイックミラーの特性では極めて効率が悪く、得られる蛍光画像は暗くなり、Ｓ／Ｎも悪化する。
【００１０】
（２）蛍光試薬の種類ごとに専用のフィルタが必要となる。
図１１の（ｂ）に示すように、蛍光試薬の波長特性は試薬の種類ごとに異なる。さらにその組み合わせごとに、それに対応するマルチ波長用ダイクロイックミラーを設計し準備しなければならない。これはコスト、在庫、交換時間や交換時の汚れの点で望ましくない。また、交換した場合には、大きな画像ズレが生じ、画像を重ね合わせて観察する場合の大きな課題となっている。
【００１１】
（３）透過画像やＤａｐｉ色素による青色の核染色の落射蛍光像を上記共焦点蛍光画像に重ねて測定する場合、透過画像や落射蛍光画像では図１１（ａ）中の１点鎖線で示すような青色の画像などが、このマルチ波長用ダイクロイックミラーでカットされてしまう。このため正確な測定ができず、また重ね合わせ画像が暗くなってしまう。
【００１２】
本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、複数のダイクロイックミラーを交換使用するのではなく、１つの高反射ミラーのみの使用により、多色の蛍光画像を同時に計測できると共に蛍光の受光効率も改善された共焦点光スキャナを実現することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するために、請求項１に係る発明では、
２色以上の色素でそれぞれの成分が識別可能な試料を測定するニポウディスク型の共焦点光スキャナにおいて、
前記試料に照射する励起光と試料から発せられる蛍光を分離するために使用される高反射ミラーの反射率が、少なくとも励起光波長域と蛍光波長域を合わせた測定波長域において実質上８０％以上１００％以下になるように形成されたことを特徴とする。
【００１４】
このような構成により、１つの高反射ミラーを用いて、多色の蛍光画像を同時に計測でき、同時に蛍光の受光効率も従来に比べて大幅に改善することができる。
この場合、測定波長域としては、請求項２のように、前記励起光波長域と蛍光波長域を合わせた波長域に、さらに、画像を重ね合わせる透過また落射蛍光画像の波長域を合わせてもよい。
【００１５】
また、蛍光波長域としては、請求項３のように、紫外域または可視光域または近赤外域または赤外域であってもよい。
また、励起光が多光子励起の場合は、請求項４のように蛍光波長域での蛍光反射率を実質上１００％とし、試料に付加する蛍光試薬が量子ドットの場合は、請求項５のように蛍光波長域での蛍光反射率を実質上１００％としてもよい。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明に係る共焦点光スキャナの一実施例を示す要部構成図である。図１において、図１０と同等部分には同一符号を付しその説明は省略する。図１０と異なるところは、高反射ミラー４０である。
【００１７】
高反射ミラー４０は、図２に示すように、使用する全波長域（測定波長域）で反射率９６％を確保している。なお、測定波長域とは、励起光波長域と蛍光波長域を合わせた波長域である。さらに、この測定波長域に、重ね合わせる透過または落射蛍光画像の波長域を合わせてもよい。
このような高反射ミラーによれば、図３に示すように、励起光１は４％だけ高反射ミラー４０を透過して試料８に照射され、試料８からの蛍光は９６％が高反射ミラー４０で反射される。
【００１８】
この反射は、波長に依存しないため、高反射ミラー４０によるロスは４％のみとなる。
励起光の利用効率は悪くなるが、本来重要な試料励起のための照射光量と試料から発生する蛍光量との関係（いわゆる効率）には、前記利用効率の悪さは全く関係しない。
【００１９】
通常使用する励起用のレーザとしては、入手し易さの面から本体出射５０ｍＷ等のＡｒレーザが用いられる。しかし、このままのパワーでは試料８にダメージを与えるためＮＤフィルタなどを用いてパワーを１／１０〜１／２０に減衰させて使用することが多い。この場合、レーザ本体のパワーの５〜１０％しか利用していない。
【００２０】
したがって、本発明においては、わざわざＮＤフィルタなどを使用して減衰することなく、高反射ミラー４０の４％の透過率のみによって、適切な励起光量を試料に与えている。
【００２１】
実際の観察画像を図４〜６に示す。図４はＨｅＬａ細胞にＧＦＰの黄色変異体Ｖｅｎｕｓを導入し、Ａｒレーザで励起した場合の光軸方向へ０．５μｍずつ位置を変えたときの画像である。ただし、図では便宜上２値化して示してある。同図（ａ）は従来のマルチ波長用ミラー４による測定画像、同図（ｂ）は本発明の高反射ミラー４０による測定画像である。両者はよく一致しており、本発明の実用性が確かめられる。
【００２２】
図５は細胞の画像である。ただし、図では便宜上２値化して示してある。上段は本発明の高反射ミラー４０による測定画像、下段は通常の落射蛍光顕微鏡による測定画像である。なお、上下ともその左側の画像はｃｏｘＩＶ−ＳＥＹＦＰによるミトコンドリアの画像（緑色）、中央の画像はｎｌｓ−ｍＲＦＰによる核の画像（赤色）、右側の画像は左側と中央の２つの画像の合成画像である。
図５では、各色により、細胞内小器官は明瞭に区別されており、そして落射蛍光顕微鏡よりも本発明の共焦点光スキャナの方が、共焦点のスライス画像化によりシャープな画像を得ていることが分る。
【００２３】
図６は単一細胞を３色で測定し、それを合成した画像である。ただし、図では便宜上２値化して示してある。図において、左上の画像はＳＥＲＣＡ−ＥＣＦＰによる小胞体膜の画像（水色）であり、右上の画像はｃｏｘＩＶ−ＳＥＹＦＰによるミトコンドリアの画像（黄色）であり、左下の画像はｎｌｓ−ｄｓＲｅｄによる核と核小体の画像（赤）であり、右下の画像は上記３つの合成画像である。
このように、本発明による多色測定により細胞内小器官の明瞭な区別も可能であることが分る。
【００２４】
なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
【００２５】
例えば、高反射ミラー４０の反射率は、図２に示すように９６％だけでなく、実質上８０〜９９％程度でも十分に効果がある。
また、波長域は図２や図１０（ａ）に示すような可視域だけではなく、紫外、近赤外などでも構わない。
【００２６】
また、量子ドット励起や多光子励起では、励起光波長域と蛍光波長域が大きく離れていてもよい。量子ドットは直径数ｎｍの半導体素子からなるナノクリスタルであり、粒径のサイズが小さくなるほど蛍光波長が短くなるという特性を有する。そして、波長のスペクトルは図７に示すように狭く、かつシンメトリックである。量子ドット型蛍光試薬の場合、励起光は図８に示すように短波長側の方が励起効率が高い。
【００２７】
また、多光子型励起の場合、励起光は通常の２倍の波長であるので、図９に示すように蛍光波長域より長波長側に離れていてもよい。
この量子ドットおよび多光子励起の場合、蛍光の波長域では反射率は１００％（ここでは実質上の１００％を指す）でも良い。また、励起光の波長域では、反射率は実質上２０％以下（透過率が実質上８０％以上）でも十分実用になる。
【００２８】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば次のような効果がある。
（１）１つの高反射ミラーで、交換せずに多色の画像を同時に計測できるという利点を残したまま、蛍光の受光効率を大幅に改善できる。
（２）蛍光試薬の種類ごとの専用のフィルタを必要としない。これはコスト、在庫、交換の時間や交換時の汚れの点で大変に有利である。また、高反射ミラーは交換不要であるため、ダイクロイックミラーの交換に伴う取り付け角度や板厚に起因する多色画像の画像ずれの問題も生じない。
【００２９】
（３）特に画像ずれが生じないことと、任意の波長を観察できることは、蛍光画像の重ね合せや、透過光像との重ね合せでも大変有利である。例えば従来落射ＵＶ蛍光観察像（青〜緑色）を青色励起ダイクロイックミラーを利用して観察しようとすると約５１０ｎｍ以上の光（緑色）しか見えなかったが、本発明の高反射ミラーを使えば適当なバリアフィルタとの組み合せで、例えば４００ｎｍ（青色）から約５１０ｎｍ以上の光（緑色）まで測定することができるため、正確で明るい重ね合わせ画像が得られるようになる［図１１（ａ）の１点鎖線の波長域も測定可能である］。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る共焦点光スキャナの一実施例を示す要部構成図である。
【図２】本発明の高反射ミラーの特性図である。
【図３】高反射ミラーにおける透過率と反射率を説明するための図である。
【図４】従来の共焦点光スキャナと本発明の共焦点光スキャナによる測定画像の比較例である。
【図５】従来の落射蛍光顕微鏡と本発明の共焦点光スキャナによる他の測定画像の比較例である。
【図６】単一細胞の３色での測定画像およびその合成画像を示す図である。
【図７】量子ドットの蛍光波長のスペクトラムを示す図である。
【図８】量子ドット型蛍光試薬の場合の励起光の波長域を示す図である。
【図９】多光子型励起の場合の励起光の波長域を示す図である。
【図１０】従来の共焦点光スキャナの一例を示す構成図である。
【図１１】従来のマルチ波長用ダイクロイックミラーの特性と試料からの蛍光の波長特性を示す図である。
【符号の説明】
１  レーザ
２  マイクロレンズディスク
３  マイクロレンズ
５  ニポウディスク
６  ピンホール
７  対物レンズ
８  試料
９  リレーレンズ
１０  センサ
１１  部材
４０  高反射ミラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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