(57)【要約】      （修正有）【課題】  生育が向上した微生物菌株、および該微生物を用いた有用物質の製造法を提供する。【解決手段】  大腸菌由来の特定な塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の相同性を有するＤＮＡの一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有し、かつ該欠損がない染色体ＤＮＡを有する親株より生育が向上した微生物、および特定のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有し、かつ該アミノ酸の欠失、置換若しくは付加がないアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する親株より生育が向上した微生物が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有し、かつ該欠損がない染色体ＤＮＡを有する親株より生育が向上した微生物。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の相同性を有するＤＮＡの一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有し、かつ該欠損がない染色体ＤＮＡを有する親株より生育が向上した微生物。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有し、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する親株より生育が向上した微生物。
【請求項４】
微生物が、Escherichia属に属する微生物である請求項１〜３記載の微生物。
【請求項５】
Escherichia属に属する微生物が、Escherichia coliである請求項４記載の微生物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の微生物を培地中で培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
【請求項７】
有用物質が、タンパク質、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質からなる群より選ばれる有用物質である請求項６記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生育が向上した微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の野生型株はさまざまな培地でよく生育する。これまでにさまざまな変異株が作製されているが、一般的にはそれら変異株は野生型株に比べ、一定の培養時間で得られる菌体量が少ない、生育速度が遅い、生育可能な温度範囲が狭い、栄養要求性を示す、各種ストレスに対する耐性度が低いなど生育特性が悪い場合が多い。これは一般的な変異処理では、複数の変異が染色体上に導入されてしまい、生育という複雑なプロセスを司る多数の遺伝子のどれかに有害な変異が入る可能性が高いため、変異剤などによる一般的な変異処理により作製した変異株ライブラリーから、生育良好株を取得することは困難であるためと考えられる。
【０００３】
したがって、特定の遺伝子の変異に起因して、生育が向上した微生物の変異株は知られていない。
一方、多くの微生物では、その染色体ＤＮＡの全塩基配列が明らかになっている（非特許文献１）。また、相同組換え手法を用いた、特定の遺伝子あるいは染色体ＤＮＡ領域が意図した通りに欠損した微生物の作製方法が知られている（非特許文献２）。上記した染色体ＤＮＡの全塩基配列情報、および相同組換え手法を利用して微生物の染色体ＤＮＡ上の各一遺伝子を網羅的に破壊したライブラリー、あるいは２０ｋｂｐ程度の削除可能染色体ＤＮＡ領域のそれぞれを網羅的に欠損させた変異株ライブラリーなどが作製されている（非特許文献３および４）。
【０００４】
大腸菌のｙｈｄＡ遺伝子は、染色体ＤＮＡ上７３．２７分に位置し、６４６アミノ酸からなるタンパク質をコードする遺伝子であることが知られているが、該タンパク質の機能は知られていない（非特許文献５）。
【非特許文献１】http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html
【非特許文献２】J. Bacteriol.（ジャーナル  オブ  バクテリオロジー）, 180, 2063(1998)
【非特許文献３】蛋白質  核酸  酵素、第４６巻、２３８６ページ、２００１年
【非特許文献４】Nature  Biotechnol.（ネイチャー  バイオテクノロジー）, 20, 1018(2002)
【非特許文献５】Science(サイエンス), 277, 1453(1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、生育が向上した微生物菌株、および該微生物を用いた有用物質の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１）  配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有し、かつ該欠損がない染色体ＤＮＡを有する親株より生育が向上した微生物。
（２）  配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の相同性を有するＤＮＡの一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有し、かつ該欠損がない染色体ＤＮＡを有する親株より生育が向上した微生物。
【０００７】
（３）  配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有し、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する親株より生育が向上した微生物。
（４）  微生物が、Escherichia属に属する微生物である上記（１）〜（３）の微生物。
【０００８】
（５）  Escherichia属に属する微生物が、Escherichia coliである上記（４）の微生物。
（６）  上記（１）〜（５）のいずれかの微生物を培地中で培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法。
【０００９】
（７）  有用物質が、タンパク質、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸および脂質からなる群より選ばれる有用物質である上記（６）の製造法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生育が向上した微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の微生物は、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡの一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有し、かつ該欠損がない染色体ＤＮＡを有する親株より生育が向上している微生物であればいずれの微生物であってもよく、該微生物としては、例えばEscherichia属に属する微生物などをあげることができ、Escherichia属に属する微生物としては、Escherichia coliなどをあげることができる。
【００１２】
上記Escherichia coliとしては、配列番号１で表されるＤＮＡの一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有するEscherichia coliをあげることができる。
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の相同性を有するＤＮＡとは、配列番号１で表される塩基配列を有する遺伝子の相同遺伝子のことをいい、該遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡの全部または一部をプローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより取得することができる。
【００１３】
具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、1.0 mol/lの塩化ナトリウム存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、150 mmol/l塩化ナトリウム、15 mmol/lクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１４】
また、配列番号１で表される塩基配列をクエリーに用い、各種微生物の染色体ＤＮＡまたは遺伝子ライブラリーのデータベースを検索することにより、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の相同性を有するＤＮＡを特定することができる。
アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
【００１５】
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡと８０％以上の相同性を有するＤＮＡの一部または全部が欠損したＤＮＡとは、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡと８０％以上の相同性を有するＤＮＡにおいて、１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する変異ＤＮＡであり、かつ該変異ＤＮＡを有する染色体ＤＮＡを有する微生物が、該変異ＤＮＡを有さない染色体ＤＮＡを有する親株より生育が向上した微生物となることを特徴とするＤＮＡをいう。
【００１６】
具体的には、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の相同性を有するＤＮＡにおいて、任意の１以上の塩基、好ましくは任意の１０〜１５００塩基、より好ましくは任意の１００〜１０００塩基、さらに好ましくは任意の２００〜５００塩基が欠損したＤＮＡをあげることができ、該欠損によりフレームシフト変異が生じているＤＮＡが好ましい。
【００１７】
また、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡと８０％以上の相同性を有するＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより、該ＤＮＡにおいて１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するＤＮＡであり、かつ該変異ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列が、部位特異的変異導入前のＤＮＡにコードされるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードするＤＮＡをあげることができる。部位特異的変異の導入は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００１８】
欠失、置換若しくは付加される塩基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
上記の変異ＤＮＡを有さない染色体ＤＮＡを有する親株より生育が向上した微生物とは、欠損が導入された微生物と該欠損が導入されていない親株である微生物を同一の培地を用いて同一時間培養したとき、親株より菌体数が多い微生物のことをいう。培養する時間は、上記ＤＮＡが欠損した染色体ＤＮＡを有する微生物と該微生物の親株の菌体数を正確に比較できる時間であればいずれの時間でもよいが、好ましくは対数増殖期後半、より好ましくは定常期に到達する時間をあげることができる。上記の親株とは、上記欠損に供した元株のことをいい、親株は野生型の微生物であっても、産業上有用な改良を施された変異株、細胞融合株、形質導入株あるいは遺伝子組換え技術を用いて造成した組換え株であってもよい。
【００１９】
また、本発明の微生物としては配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有し、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する親株より生育が向上した微生物であれば、いずれの微生物であってもよく、該微生物としては、例えばEscherichia属に属する微生物などをあげることができ、Escherichia属に属する微生物としては、Escherichia coliなどをあげることができる。
【００２０】
上記Escherichia coliとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡの一部または全部が欠損している染色体ＤＮＡを有するEscherichia coliをあげることができる。
配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する微生物は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。部位特異的変異の導入は、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２１】
欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加があることを意味し、欠失、置換若しくは付加が同時に生じてもよく、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する微生物が、欠失、置換若しくは付加前のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する該微生物の親株より生育が向上していればいずれのアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してもよいし、置換または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、L-システインなどがあげられる。
【００２２】
上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がないアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する親株より生育が向上した微生物とは、１以上のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が導入された微生物と該微生物の親株を同一の培地を用いて同一時間培養したとき、親株より菌体数が多い微生物のことをいう。培養する時間は、１以上のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が導入された微生物と該微生物の親株の菌対数を正確に比較できる時間であればいずれの時間でもよいが、好ましくは対数増殖期後半、より好ましくは定常期に到達する時間をあげることができる。上記の親株とは、上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加に供した元株のことをいい、親株は野生型の微生物であっても、産業上有用な改良を施された変異株、細胞融合株、形質導入株あるいは遺伝子組換え技術を用いて造成した組換え株であってもよい。
【００２３】
本発明の微生物の製造法としては、１）微生物の染色体ＤＮＡ上の各一遺伝子を網羅的に破壊した遺伝子欠損株ライブラリー、あるいは２０ｋｂｐ程度の削除可能染色体ＤＮＡ領域のそれぞれを網羅的に欠損させた欠損変異株ライブラリーを用いて、該ライブラリーから親株より生育が向上した株を選択する方法、２）相同組換え法などを用いて、ｙｈｄＡ遺伝子の全部または一部が欠損したEscherichia coliを製造する方法、３）相同組換え法などを用いて、ｙｈｄＡ遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有するEscherichia coliを製造する方法、４）相同組換え法などを用いて、染色体ＤＮＡ上にある、Escherichia coliのｙｈｄＡ遺伝子と８０％以上の相同性を有する遺伝子の全部または一部が欠損した微生物の製造する方法などをあげることができる。
【００２４】
１）の方法でいう親株とは、上記遺伝子破壊または染色体ＤＮＡ領域欠損処理に供した元株のことをいい、親株は野生型の微生物であっても、産業上有用な改良を施された変異株、細胞融合株、形質導入株あるいは遺伝子組換え技術を用いて造成した組換え株えあってもよい。
上記１）の遺伝子または領域欠損株ライブラリーの作製法としては、欠損させたい遺伝子または領域の末端配列を含むＤＮＡをサブクローニングし、次に該ＤＮＡで薬剤耐性遺伝子を挟んだＤＮＡ断片を構築した後、該ＤＮＡ断片を二回相同組換えにより染色体ＤＮＡに導入することで遺伝子または領域欠損株ライブラリーを構築する方法〔蛋白質 核酸 酵素、46、2386(2001)〕をあげることができる。
【００２５】
上記の遺伝子または領域欠損株ライブラリーをスクリーニング源として用いることにより、明確に限定された一遺伝子あるいは遺伝子群の破壊のみが生育に及ぼす影響を観察することができ、変異剤を用いたときのように不明な変異が生育に悪影響を及ぼす現象を排除することができる。
生育が向上した株を選択する具体的な方法としては、グルコースを含む完全培地に、遺伝子または領域欠損株ライブラリーの各菌株を植菌し、親株と生育を比較する方法をあげることができる。例えば、親株としてEscherichia coliの野生型株であるＷ３１１０株などを用いた場合、グルコースを含む完全培地として、アンチバイオティクメディウム３（ディフコ社製）を用いて生育を比較することができる。
【００２６】
生育を比較する方法としては、親株とライブラリーの各菌株を液体培地で培養したときの培養液の５８０〜６６０ｎｍ、好ましくは６６０ｎｍの吸光度を計測し、親株とライブラリーの各菌株の培養液の該吸光度を比較する方法をあげることができる。
同一時間培養したとき、親株より高い濁度を示す菌株を選択することにより、親株より生育が向上した菌株を取得することができる。
【００２７】
次に、上記方法にて選択した菌株それぞれが持つ遺伝子欠損を、形質導入法にて、親株とは異なる同種の株に形質転換する。形質導入法としてはファージによる形質導入［Ann. Rev. Genetics, 2, 245(1968)］、ナチュラルコンピテンシーを用いる方法［Molecular Biological Method for Bacillus, 33，John Wiley & Sons Ltd.(1990)］などをあげることができる。微生物としてEscherichia coliを用いる場合、Ｐ１ファージによる形質導入方法が好ましい。各欠損を導入する株は野生型株が好ましいが、該各欠損が導入可能な株であれば、変異を有する株であってもよい。例えば、親株としてEscherichia coli Ｗ３１１０株を用いた場合、選択した生育が向上した菌株が有する遺伝子欠損をＰ１ファージによる形質導入法によって野生型株であるEscherichia coli ＭＧ１６５５株に導入する方法をあげることができる。
【００２８】
上記のようにそれぞれの欠損を野生株に形質導入して作製された菌株ライブラリーを再度、濁度を指標としたスクリーニングに供し、同一時間培養したときの培養液の吸光度が野生型株よりも高い株を選抜することにより、最終的な生育向上株を取得することができる。
上記方法により取得される微生物としては、Science 277, 1453(1997）に記載されたｂ番号表記で、ｂ３２５２−ｂ３２５４間とｂ２２３６−ｂ２２５９間が欠損した染色体ＤＮＡを有するEscherichia coli、およびｂ３２５２で表される遺伝子（以下、ｙｈｄＡ遺伝子と呼ぶ）のみを欠損破壊したEscherichia coliをあげることができる。
【００２９】
上記２）の方法としては、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組換えが可能なEscherichia coliを用いる方法をあげることができる。
直鎖ＤＮＡとしては、クロラムフェニコール耐性遺伝子の両端にｙｈｄＡ遺伝子の末端の配列と相同性を有するＤＮＡを配置した直鎖ＤＮＡをあげることができる。
該直鎖ＤＮＡを、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組換えが可能なEscherichia coliに、コンピテントセルを用いたエレクトロポレーションなどの方法により導入し、クロラムフェニコール耐性株を選択することで、ｙｈｄＡ遺伝子欠損Escherichia coliを取得することができる。
【００３０】
上記３）の方法としては、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡに、部位特異的変異を導入することにより、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする変異型ＤＮＡを取得し、相同組換え法を用いることにより、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡが該変異型ＤＮＡに置換された染色体ＤＮＡを有する微生物を製造する方法などをあげることができる。
【００３１】
上記４）の方法としては、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡをクエリーに用いて、各微生物の染色体ＤＮＡの塩基配列データベースから、該ＤＮＡと相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子を同定し、各微生物において確立されている相同組換え法を用いて該遺伝子が欠損した微生物を製造する方法をあげることができる。
【００３２】
本発明の製造法は、本発明の微生物を培地に培養し、培養物中に有用物質を生成、蓄積させ、該培養物から該有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造法に関する。
該有用物質としては、微生物を用いて製造される有用物質であれば特に限定されないが、例えばタンパク質、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、脂質などあげることができる。
【００３３】
本発明の製造法に用いられる微生物の培養は、以下に記載した通常の方法に従って行うことができる。
本発明の製造法に用いられる微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３４】
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００３５】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常 16時間〜7日間である。培養中のpHは3. 0〜9.0に保持することが好ましい。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００３６】
有用物質が菌体外に生成、蓄積した場合には、培養終了後、培養物から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、培養物から目的する有用物質を単離、精製することができる。
有用物質が、菌体内に生成、蓄積される場合には、培養終了後、培養物から菌体を回収した後、機械的または化学的方法等の適切な方法で破砕する。該菌体破砕液から、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、該菌体破砕液から目的とする有用物質を単離、精製することができる。
【００３７】
以下実施例にて、本発明を詳細に記述する。
【実施例１】
【００３８】
染色体部分欠損株の一次スクリーニング
野生型株ＭＧ１６５５株を親株として、蛋白質  核酸  酵素、46、2386(2001)記載の方法に従い、染色体上の一部分を欠損している変異株ライブラリーを作製した。
上記変異株ライブラリーの各菌株と野生型株であるＷ３１１０株およびＭＧ１６５５株のグリセロールストックを、５０μｇ／ｍｌのジアミノピメリン酸を含むアンチバイオティクメディウム３寒天平板培地（０．１５％ 肉エキス、０．１５％ 酵母エキス、０．５％ ペプトン、０．１％ グルコース、０．３５％ 塩化ナトリウム、０．１３２％ リン酸水素二カリウム、１．５％ 寒天、ｐＨ７．０）に塗布し、３０℃にて一晩培養した。生育してきた菌をエーゼにて約１μｌかきとり、５０μｇ／ｍｌのジアミノピメリン酸を含む８ｍｌのアンチバイオティクメディウム３液体培地（０．１５％ 肉エキス、０．１５％ 酵母エキス、０．５％ ペプトン、０．１％ グルコース、０．３５％ 塩化ナトリウム、０．１３２％ リン酸水素二カリウム、ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃にて一晩振とう培養し、前培養液を調製した。
【００３９】
８０μｌの該前培養液を、５０μｇ／ｍｌのジアミノピメリン酸を含む８ｍｌのアンチバイオティクメディウム３液体培地に植菌し、植菌後一時間おきに比色計を用いて６６０ｎｍの吸光度を測定し、２０〜２４時間培養したときの吸光度を最終到達濁度とした。７時間目以降は、培養液を１０倍希釈したときの吸光度も測定し、必要に応じて濁度の算出に用いた。その結果を表１に示す。なお、一晩培養した後の野生型株Ｗ３１１０株の濁度を１００％とする比濁度を最終到達比濁度として示した。その結果、表１に示すように、Ｗ３１１０株よりも１０％以上濁度が高くなる株として、以下の５つの欠損領域を持つ株を取得した。上記培養評価は、独立した２回の実験において、各々の株を５本の試験管を用いて培養することで行い、すべての培養において表１に示す結果が得られた。
【００４０】
【表１】
2004321169.tif 000002
【実施例２】
【００４１】
Ｐ１ファージによる欠損領域の他系統株への導入と培養評価
実施例１で取得した生育向上候補株が持つそれぞれの染色体欠損を、Ann. Rev. Genetics, 2, 245(1968)記載の方法に従い、Ｐ１ファージを用いて野生型株Ｗ３１１０株に形質導入した。
実施例１で作製した染色体欠損ライブラリーの各欠損株の薬剤耐性マーカー遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子なので、カナマイシン耐性を指標にしてＰ１ファージ形質導入法により野生型株Ｗ３１１０株に形質導入することができる。
【００４２】
まず各欠損株よりＰ１ファージを以下の方法により調製した。各欠損株を２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地［１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム］を用いて３０℃にて一晩培養した後、０．５ｍｌの各欠損株の培養液と１．４ｍｌの新しいＬＢ液体培地および１００μｌの０．１ｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム溶液と混合した。
【００４３】
該混合溶液を３０℃で５〜６時間振とう培養した後、４００μｌの該混合液を滅菌したチューブに移した。そこに２μｌのＰ１ファージストック溶液を添加し、３７℃で１０分間保温した後、５０℃に保温したソフトアガー溶液（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、３ｇ／ｌ寒天）を３ｍｌ添加して、よく攪拌し、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート（１０ｇ／ｌ バクトトリプトン、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト、５ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、１５ｇ／ｌ寒天、プレートの直径は１５ｃｍ）上にまいた。該プレートを３７℃で７時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収し、１５００ｇ、４℃、１０分間遠心分離した。上清１．５ｍｌに対し１００μｌのクロロホルムを添加し、４℃にて一晩保存した。翌日溶液を１５０００ｇにて２分間遠心分離し、上清をファージストックとして４℃で保存した。
【００４４】
次に、取得したファージを用いてＷ３１１０株を形質転換した。Ｃａ−ＬＢ液体培地で３０℃、４時間培養したＷ３１１０株培養液を２００μｌ分取し、ファージストックを１μｌ添加した。３７℃で１０分間保温した後、５ｍｌのＬＢ液体培地と２００μｌの１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。１５００ｇ、２５℃、１０分間遠心分離した後、上清を捨て、沈殿した細胞に１ｍｌのＬＢ液体培地と１０μｌの１ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム溶液を加え３０℃で２時間保温した。１００μｌの該溶液を２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天平板培地に塗布し、３０℃で一晩培養した。各々の欠損導入株毎に出現したコロニー２４個をそれぞれ、２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天平板培地に塗布し、その薬剤感受性を確認し、カナマイシン耐性株を選抜することにより、各欠損領域が形質導入されたＷ３１１０株を取得した。これら菌株を実施例１と同様の方法で培養し、培養評価を行った。その結果、表２に示すように、野生型株Ｗ３１１０よりも１０％以上の濁度上昇を示す株として以下の２つの欠損領域を持つ株を取得した。上記培養評価は、独立した２回の実験において、各々の株を５本の試験管を用いて培養することで行い、すべての培養において表２に示す結果が得られた。
【００４５】
【表２】
2004321169.tif 000003
【実施例３】
【００４６】
ＯＣＬ−２５欠損領域内の各遺伝子破壊株作製と培養評価
実施例２で選択した欠損領域ＯＣＬ−２５には３つの推定遺伝子領域（ＣＤＳ）が存在した。そこで各ＣＤＳを薬剤耐性遺伝子で破壊した菌株を作製し、濁度を指標として液体培養時の生育を測定した。
ＯＣＬ−２５領域に含まれる各遺伝子の欠損株は以下のように作製した。実施例２記載の方法に従い、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組換えが可能なEscherichia coli ＫＭ２２株［Δ(recC ptr recB recD)::Plac-red kan）、Gene, 246, 321 (2000)］より、Ｐ１ファージを調製した。実施例２記載の方法に従い、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組換えを可能とする染色体領域［Δ(recC ptr recB recD)::Plac-red kan］をＰ１形質導入法にて野生株Ｗ３１１０に形質導入し、Ｗ３１１０ｒｅｄ株を取得した。
【００４７】
次に、pHSG398プラスミドＤＮＡ（宝酒造社製）を鋳型にしたＰＣＲにより、ｙｈｄＡ遺伝子（ｂ３２５２）破壊用ＤＮＡ断片を取得した（図１）。ＰＣＲには宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用い、添付の説明書に従い、該説明書記載の組成からなる反応液を作製した。ＰＣＲは、５０μｌの反応液量、９４℃で１分間保温後、９８℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回行った後、７２℃で１０分間保温する反応条件で行った。鋳型ＤＮＡとしては精製pHSG398プラスミドＤＮＡ ４０ｎｇを用いた。ＰＣＲのプライマーＤＮＡには、センス鎖プライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、アンチセンス鎖プライマーとして配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いた。該プライマーＤＮＡのそれぞれの３’末端の２０ｍｅｒはpHSG398中のクロラムフェニコール耐性遺伝子の両末端にハイブリダイズするように設計した。またそれぞれのプライマーの５’末端４０ｍｅｒは、破壊したいｙｈｄＡ遺伝子の末端の配列と相同性を持つように設計した。このように設計したプライマーを各々１０ｐｍｏｌずつ上記反応液に添加した。上記ＰＣＲにて、クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat遺伝子）を含み、両末端にｙｈｄＡ遺伝子末端４０塩基と相同な領域を持つＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片をQIA quick ＰＣＲ Purification Kit（QIAGEN社製）を用いて精製し、５０μｌのＤＮＡ溶液を得た。
【００４８】
エタノール沈殿法にてこの溶液中のＤＮＡを沈殿として回収し、全量を４０μｌのＷ３１１０ｒｅｄ株コンピテントセル溶液に添加して形質転換を行った。Ｗ３１１０ｒｅｄ株コンピテントセルの作製方法はGene, 246, 321 (2000)記載の方法に従った。また形質転換は、精製したＤＮＡを数μｌ程度の少量の純水で溶解した後、コンピテントセル溶液４０μｌに添加し、０．１ｃｍのキュベット(BioRad社製)中で、１．８ＫＶ、２５μＦの条件下、エレクトロポレーションにより行った。１ｍｌのＳＯＣ液体培地（２０ｇ／ｌ バクトトリプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、０．５ｇ／ｌ   塩化ナトリウム、０．２ｍｌ／ｌの５ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、２０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ グルコース、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウム、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 硫酸マグネシウム）を用いて３７℃で２時間培養した後、遠心分離により集菌した全量を、１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を１．５％含むもの。以下、ＬＢｃｍ寒天培地プレートと略す）上に塗布し、３７℃で一晩培養し、クロラムフェニコール耐性株を取得した。
【００４９】
上記のようにしてｙｈｄＡ遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換的に削除した、Ｗ３１１０ΔＲｙｈｄＡ株を取得した（図１）。また、ｂ３２５３（ｙｈｄＨ）、ｂ３２５４の各遺伝子を削除した菌株（それぞれＷ３１１０ΔｙｈｄＨ株、Ｗ３１１０Δｂ３２５４株と呼ぶ）も同様の方法で作製した（図２）。またＷ３１１０ΔＲｙｈｄＡ株とは逆方向にクロラムフェニコール耐性遺伝子を挿入してｙｈｄＡ遺伝子を削除した株（Ｗ３１１０ΔｙｈｄＡ株）ならびにｙｈｄＡからｂ３２５４までの３つの遺伝子を同時に削除した株（Ｗ３１１０ΔＬ２５株）も作製した（図２）。
【００５０】
それぞれの欠損株を作製する際に使用したプライマーを表３に示した。
【００５１】
【表３】
2004321169.tif 000004
【００５２】
上記のようにして作製した各菌株を、実施例１と同様の方法で培養し、培養評価を行った。その結果を表４に示した。上記培養評価は、独立した２回の実験において、各々の株を５本の試験管を用いて培養することで行い、すべての培養において表４に示す結果が得られた。
【００５３】
【表４】
2004321169.tif 000005
【実施例４】
【００５４】
合成培地を用いたｙｈｄＡ欠損株の培養評価
実施例３で作製したＷ３１１０ΔＲｙｈｄＡ株ならびにＷ３１１０ΔＬ２５株の培養評価を、合成培地を用いて行った。比較対照には野生型株Ｗ３１１０株を用いた。
各菌株のグリセロールストックを５０μｇ／ｍｌのジアミノピメリン酸を含むアンチバイオティクメディウム３寒天平板培地に塗布し、３０℃にて一晩培養した。生育してきた菌をエーゼにて約１μｌかきとり、５０μｇ／ｍｌのジアミノピメリン酸を含む８ｍｌのアンチバイオティクメディウム３液体培地に植菌し、３０℃にて一晩振とう培養し、前培養液を調製した。３００μｌの該前培養液を、３０ｍｌの最少液体培地（１．２％ グルコース、０．６％ リン酸二ナトリウム、０．３％ リン酸二水素カリウム、０．０５％ 塩化ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、２ｍｍｏｌ／ｌ 硫酸マグネシウム・七水和物、１２．５μｍｏｌ／ｌ 硫酸鉄、１００μｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム）に植菌した。植菌直後ならびに培養開始から１２、１６、２０、２４、３６、４０、４４および４８時間目の培養液をサンプリングし、６６０ｎｍの吸光度（図３）と培養液あたりのタンパク量（図４）を測定した。タンパク量の測定は以下の方法で行った。
【００５５】
１００μｌの培養液から遠心分離（１０，０００ｇ×１０分間）にて回収した菌体を、１ｍｌの純水で洗浄した後に再度遠心分離を行い（１０，０００ｇ×１０分間）、得られた菌体を１６０μｌの純水にけん濁後、４０μｌの５％ ＳＤＳ溶液を添加して１００℃で３分間加温し、室温に戻した後、８００μｌの１％ＳＤＳ溶液を添加した。該溶液を用いて、バイオラッド社製のＤＣプロテインアッセイキットにより、菌体由来の総タンパクを定量し、培地あたりのタンパク量を計算した。検量線作成用の標準タンパク質には、ウシのＩｇＧを用いた。その結果、いずれの欠損株も、図３に示すように、培養３６時間目において濁度で約２０％、また図４に示すように、培地あたりのタンパク量で約１０％、野生株よりも高かった。
【実施例５】
【００５６】
ＯＣＬ−２５領域欠損株によるプロリンの製造
実施例２記載の方法により、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組換えが可能なEscherichia coli ＫＭ２２株よりＰ１ファージを調製した。また、実施例２記載の方法に従い、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組換えを可能とする染色体領域［Δ(recC ptr recB recD)::Plac-red kan］をＰ１形質導入法にて野生株Ｗ３１１０に形質導入し、Ｗ３１１０ｒｅｄ株を取得した。
【００５７】
次に、以下の方法により、Ｗ３１１０ｒｅｄ株のカナマイシン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子とを置換した株であるＷ３１１０ｒｅｄ＿ｔｅｔ株を作製した。
Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡ（１０ｎｇ）を鋳型とし、配列番号１３および１４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセット（各５０ｐｍｏｌ）に用いて、LA-Taq（宝酒造社製）に添付の指示書に従いＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲは、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。
【００５８】
増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法にて分離した後、常法によりゲルから切り出して精製した（以下、ＤＮＡ断片１と称す）。
また、Ｔｎ１０トランスポゾンを染色体上に持つＣＧＳＣ７４６５株（米国Ｙａｌｅ大学のColi Genetic Stock Centerから入手）の染色体ＤＮＡ（１０ｎｇ）を鋳型とし、配列番号１５および１６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセット（各５０ｐｍｏｌ）に用いて、LA-Taqに添付の指示書に従いＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲは、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で９０秒間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。
【００５９】
増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法にて分離した後、常法によりゲルから切り出して精製した（以下、ＤＮＡ断片２と称す）。
また、Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡ（１０ｎｇ）を鋳型とし、配列番号１７および１８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセット（各５０ｐｍｏｌ）に用いて、LA-Taqに添付の指示書に従いＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲは、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。
【００６０】
増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法にて分離した後常法によりゲルから切り出して精製した（以下、ＤＮＡ断片３と称す）。
次に、上記で得られたＤＮＡ断片１〜３（それぞれ１０ｎｇ）を鋳型とし、配列番号１９および２０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセット（各５０ｐｍｏｌ）に用いて、LA-Taqに添付の指示書に従いＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲは、９４℃で２分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。
【００６１】
増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法にて分離した後、常法によりゲルから切り出して精製した（以下、ＤＮＡ断片４と称す）。該ＤＮＡ断片はカナマイシン耐性遺伝子に相同性のある配列を両端に持ち、中央部にテトラサイクリン耐性遺伝子をもつものである。
１μｇのＤＮＡ断片４を３０μｌのＷ３１１０ｒｅｄ株のコンピテントセル溶液に添加して、形質転換を行った。Ｗ３１１０ｒｅｄ株のコンピテントセルは、Gene, 246, 321 (2000)に記載の方法に従って調製した。形質転換は、０．１ｃｍのキュベット(BioRad社製)を用い、１．８ＫＶ、２５μＦの条件で、エレクトロポレーションにより行った。形質転換に供した細胞は、２ｍｍｏｌ／ｌのＩＰＴＧを含む１ｍｌのＳＯＢ液体培地[２０ｇ／ｌ バクトトリプトン（Difco社製）、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト（Difco社製）、０．５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、０．２ｍｌ／ｌの５ｍｏｌ／ｌ 水酸化ナトリウム、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 塩化マグネシウム、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ 硫酸マグネシウム]を用いて３０℃で３時間培養した後、１００μｌを、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を１．５％含むもの）上に塗布し、３７℃で一晩培養した。テトラサイクリン耐性株として染色体上のカナマイシン耐性遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と置換された、目的とする形質転換株Ｗ３１１０ｒｅｄ＿ｔｅｔ株を取得した。
【００６２】
次に、以下の方法によりＷ３１１０ｒｅｄ株を親株として、プロリン生産株を作製した。
まず、Ｗ３１１０ｒｅｄ株を親株として、プロリン分解酵素構造遺伝子putAを破壊した株Ｗ３１１０ｒｅｄΔputA::cat株を作製した。pHSG398プラスミドＤＮＡを鋳型にし、配列番号２１および２２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲは、宝酒造社製のEX-Taqを用いて、精製プラスミドＤＮＡ ２０ｎｇ、各プライマー ５０ｐｍｏｌを含む反応液１００μｌをEX-Taqに添付の指示書に従い調製し、９５℃で１分間保温後、９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で３分間保温するという条件で行った。反応液全量をQIA quick ＰＣＲ Purification Kitを用いて精製し、３０μｌのＤＮＡ溶液を得た。次に混入している微量のプラスミドpHSG398を分解するため、ＤＮＡ溶液全量に対して制限酵素pstIとbglIそれぞれを１０Ｕずつ添加した反応液１００μｌを制限酵素添付の指示書に従い調製し、３７℃で２時間保温後、全量をQIA quick ＰＣＲ Purification Kitを用いて精製し、３０μｌのＤＮＡ溶液を得た。
【００６３】
次に、該ＤＮＡ溶液０．１μｌを鋳型として、配列番号２３および２４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を中央部に持ち、両端にputA遺伝子の５’末端（配列番号２５で表される塩基配列からなるＤＮＡ）と３’末端（配列番号２６で表される塩基配列からなるＤＮＡ）を配したＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲは、EX-Taqを用いて、精製鋳型ＤＮＡ ０．１μｌ（約１０ｎｇのＤＮＡを含む）、各プライマー ５０ｐｍｏｌを含む反応液１００μｌをEX-Taqに添付の指示書に従い調製し、９５℃で１分間保温後、９４℃で３０秒間、５１℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で３分間保温するという条件で行った。反応液全量をQIA quick ＰＣＲ Purification Kitを用いて精製した。
【００６４】
次に、１μｇの該ＤＮＡを３０μｌのＷ３１１０ｒｅｄ株のコンピテントセル溶液に添加して、形質転換を行った。Ｗ３１１０ｒｅｄ株の形質転換は、上記と同様の条件でエレクトロポレーションにより行った。
形質転換した細胞溶液１００μｌを、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を１．５％含むもの。以下、ＬＢｃｍ寒天培地プレートと略す）上に塗布し、３７℃で一晩培養した。クロラムフェニコール耐性株として染色体上のputA遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換された、目的とする形質転換株Ｗ３１１０ｒｅｄΔputA::cat株を取得した。
【００６５】
次にＷ３１１０ｒｅｄΔputA::cat株を親株として、proBAオペロンを破壊したＰＫ株を作製した。プラスミドpFastBACdual（インビトロジェン社製）を鋳型にし、配列番号２７および２８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲは、pFastBACdual １０ｎｇ、各プライマー ２０ｐｍｏｌを含む反応液２５μｌをLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、９４℃で３分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。反応終了後、反応液全量をQIA quick ＰＣＲ Purification Kitを用いて精製し、５０μｌのＤＮＡ溶液を得た。
【００６６】
次に、該ＤＮＡ溶液１μｌを鋳型として、配列番号２９および３０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ゲンタマイシン耐性遺伝子を中央部に持ち、両端にproBAオペロンの５’末端（配列番号３１で表される塩基配列からなるＤＮＡ）と３’末端（配列番号３２で表される塩基配列からなるＤＮＡ）を配したＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲは、精製鋳型ＤＮＡ１μｌ（約１０ｎｇのＤＮＡを含む）、各プライマー ２０ｐｍｏｌを含む反応液２５μｌをLA -Taqに添付の指示書に従い調製し、９４℃で３分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。反応液全量をQIA quick ＰＣＲ Purification Kitを用いて精製した（以下、ＤＮＡ断片５と称す）。
【００６７】
また、proBAオペロンの５’側上流および３’側下流のそれぞれ１ｋｂｐの領域を染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにて、作製した。５’上流領域（以下、ＤＮＡ断片６と称す）の作製には配列番号３３と配列番号３４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットを用いた。３’下流領域（以下、ＤＮＡ断片７と称す）の作製には配列番号３５と配列番号３６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いた。それぞれのＰＣＲは、プライマーセットが異なるのみであり、次の条件で行った。すなわち、Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡ（１０ｎｇ）を鋳型とし、各プライマー２０ｐｍｏｌずつを含む反応液２５μｌをLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、９4℃で3分間保温後、９４℃で15秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。反応液全量をQIA quick ＰＣＲ Purification Kitを用いて精製した。
【００６８】
次に、上記で得られたＤＮＡ断片５〜７を鋳型としたＰＣＲを行い、３つの断片を連結したものを作製した。すなわち、ＤＮＡ断片５〜７（それぞれ１０ｎｇ）を鋳型にし、配列番号３３、配列番号３６に示したプライマーを各２０ｐｍｏｌ含むＰＣＲ反応液２５μｌをLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、９４℃で３分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。
【００６９】
増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法にて分離した後、ゲルから切り出して精製した（以下、ＤＮＡ断片８と称す）。該ＤＮＡ断片８はproBAオペロンの５’上流１ｋｂｐの領域に相同性のある配列を一方の端に持ち、中央部にゲンタマイシン耐性遺伝子を配し、もう一方の端にproBAオペロンの３’下流１ｋｂｐの領域に相同性のある配列を持つＤＮＡ断片である。
【００７０】
精製した１μｇのＤＮＡ断片８を５０μｌのＷ３１１０ｒｅｄΔputA::cat株のコンピテントセル溶液に添加して、形質転換を行った。Ｗ３１１０ｒｅｄΔputA::cat株のコンピテントセルは、前述のＷ３１１０ｒｅｄ株コンピテントセル作製と同様の方法により作製した。形質転換は、前述のＷ３１１０ｒｅｄ株の形質転換法と同様の方法により行った。ただし、形質転換株の選択培地は５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＬＢ寒天プレートを用いた。
【００７１】
ゲンタマイシン耐性株として染色体上のproBAオペロンがゲンタマイシン耐性遺伝子と置換された、目的とする形質転換株ＰＫ株を取得した。
Ｍ９最小寒天培地（１．５％  寒天、１．２％ グルコース、０．６％ リン酸二ナトリウム、０．３％ リン酸二水素カリウム、０．０５％ 塩化ナトリウム、０．１％ 塩化アンモニウム、２ｍｍｏｌ／ｌ 硫酸マグネシウム・七水和物、１２．５μｍｏｌ／ｌ 硫酸鉄、１００μｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウム）ならびにプロリン（８ｍｇ／ｌ）を含むＭ９最小寒天培地、それぞれにＰＫ株を塗布して３０℃にて一晩培養し生育を調べたところ、プロリンを含む最小培地では生育したが、プロリンを含まない最小培地では生育せず、ＰＫ株は明確なプロリン要求性を示すことが確認された。
【００７２】
次に、ＰＫ株に変異型proBAオペロンを導入することにより、プロリン生産性変異株ＰＫＢ７４株を以下の方法により作製した。
Ｗ３１１０ｒeｄ株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３３および３６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、proBAオペロンを含む４ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、染色体ＤＮＡ １０ｎｇ、各プライマー ２０ｐｍｏｌを含む反応液２５μｌをLA-Taqに添付の指示書に従い調製し、９４℃で３分間保温後、９４℃で１５秒間、５５℃で２０秒間、６８℃で４分間のサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で１０分間保温するという条件で行った。
【００７３】
増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法にて分離した後、常法によりゲルから切り出して精製した後、市販のキット（キアゲン社製PCR-Script Cloning Kit）を用いて、プラスミドpPCR-Script Ampにクローン化し、プラスミドpPCR proBA を作製した。
pPCR proBAを鋳型とし、キアゲン社製QuickChange Kitを用いてin vitroにてproBAに、既報の点突然変異proB74〔L.Csonka, and et al ： Gene, 64, 199-205 (1988)〕を導入した。QuickChange Kitを用いたin vitro変異導入は、添付の指示書に従って行い、proBAオペロン中のproB遺伝子に上記変異が導入されたプラスミドpPCR proB74を作製した。上記変異点導入のために用いた変異型配列を持つプライマーＤＮＡの塩基配列は配列番号３７に示した。
【００７４】
次に、pPCR proB74を制限酵素BsrGIを用いて切断した後、アガロース電気泳動法にて変異型proBAオペロンを含むＤＮＡ断片を分離し、ゲルから回収精製した。
精製した変異型proBAオペロンを含むＤＮＡ断片２μｇを、Gene, 246, 321 (2000)に記載の方法に従って調製したＰＫ株のコンピテントセル ５０μｌに添加し、形質転換を行った。形質転換は、前述のエレクトロポレーション法により行った。ただし、形質転換株の選択培地はＭ９最小寒天培地にて行い、プロリン要求性を示さない株を選択することにより、目的とするプロリン生産性変異株ＰＫＢ７４株を取得した。
【００７５】
ＰＫＢ７４株はその染色体上にカナマイシン耐性遺伝子（kan）を保有する［Δ(recC ptr recB recD)::Plac-red kan］。以下の方法により、該カナマイシン耐性遺伝子をテトラサイクリン耐性遺伝子に置換した。
上記で作製したＷ３１１０ｒｅｄ＿ｔｅｔ株を用いて、Ｐ１形質導入ファージを調製した。該ファージを用いて、ＰＫＢ７４株を形質転換した。形質転換体の選択は２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天平板培地を用いた。テトラサイクリン耐性株を選択することにより、カナマイシン耐性遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子に置換したＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株を取得した。
【００７６】
次に、ＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株に各種染色体欠失を導入した。染色体部分欠損株ＯＣＬ−２５株からＰ１形質導入ファージを上記方法にて取得し、該ファージを用いてＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株を形質転換した後、２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天平板培地でカナマイシン耐性株を選択することによりＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株のＯＣＬ−２５領域が欠失した菌株ΔＯＣＬ−２５を取得した。
【００７７】
上記で取得したＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株およびΔＯＣＬ−２５株の種菌をＬＢ寒天培地（１５ｇ／ｌ  寒天、１０ｇ／ｌ バクトトリプトン、５ｇ／ｌ バクトイーストエキストラクト、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ  水酸化ナトリウム）に塗布し、３０℃にて一晩培養した。十分に生育したコロニーをかきとり、それぞれ５ｍｌのＬＢ液体培地が入った試験管に植菌し、３０℃にて２０時間、振とう培養した。５００μｌの該培養液を、それぞれ５０ｍｌのＭｅｄ７液体培地（３％ グルコース、０．８％  ペプトン、０．１％  リン酸二水素カリウム、０．０５％  硫酸マグネシウム・７水和物、０．００２％  塩化カルシウム、１％  炭酸カルシウム、１％  硫酸アンモニウム、０．２％  塩化ナトリウム、０．０３％  硫酸鉄）が入った３００ｍｌ三角フラスコに植菌し、３０℃にて振とう培養した。
【００７８】
経時的に培養物をサンプリングし、該培養物は遠心分離して、その上清を１０００倍に希釈した。該希釈液をダイオネクス社製アミノ酸直接分析システムＤＸａ−５００にて分析することで、培養液中のプロリン濃度を定量した。その結果、親株であるＰＫＢ７４＿ｔｅｔ株よりもΔＯＣＬ−２５株はプロリン生産量が増大していることがわかった。結果を表５に示す。
【００７９】
【表５】
2004321169.tif 000006
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は染色体ＤＮＡ上のｙｈｄＡ遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換的に欠損させたＷ３１１０ΔＲｙｈｄＡ株の作製法を示す図である。図中、白抜き線は、染色体ＤＮＡ上においてｙｈｄＡ遺伝子の両末端に存在するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相同性のあるＤＮＡを示す。
【図２】図２は、野生型株であるEscherichia coli Ｗ３１１０株、ｙｈｄＡ遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換的に欠損させたEscherichia coli Ｗ３１１０ΔＲｙｈｄＡ株、ｙｈｄＨ遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換的に欠損させたEscherichia coliＷ３１１０ΔｙｈｄＨ株、E. coli ｂ３２５４遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換的に欠損させたE. coli Ｗ３１１０Δｂ３２５４株、E. coli Ｗ３１１０ΔＲｙｈｄＡ株とは逆方向にクロラムフェニコール耐性遺伝子を挿入してｙｈｄＡ遺伝子を欠損させたE. coliＷ３１１０ΔｙｈｄＡ株、およびｙｈｄＡからｂ３２５４までの３つの遺伝子を同時にクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換的に欠損させたE. coliＷ３１１０ΔＬ２５株の染色体ＤＮＡの構造を示す図である。図中、白抜き矢印、および白抜き線は、クロラムフェニコール耐性遺伝子を示す。
【図３】図３は、Escherichia coli Ｗ３１１０ΔＲｙｈｄＡ株（△）、E. coli Ｗ３１１０ΔＬ２５株（◆）、およびE. coli Ｗ３１１０株（●）を合成培地で培養したときの生育を示す図である。縦軸は、６６０ｎｍにおける吸光度、横軸は培養時間を表す。
【図４】図４は、Escherichia coli Ｗ３１１０ΔＲｙｈｄＡ株（△）、E. coli Ｗ３１１０ΔＬ２５株（◆）、およびE. coli Ｗ３１１０株（●）を合成培地で培養したときの培養液あたりのタンパク質濃度を示す図である。縦軸は、タンパク質濃度、横軸は培養時間を表す。
【符号の説明】
【００８２】
cat：クロラムフェニコール耐性遺伝子
lacZ：β−ガラクトシダーゼ遺伝子
Ｗ３１１０：Escherichia coli Ｗ３１１０株
ΔｙｈｄＡ：Escherichia coli Ｗ３１１０ΔｙｈｄＡ株
ΔＲｙｈｄＡ：Escherichia coli Ｗ３１１０ΔＲｙｈｄＡ株
ΔｙｈｄＨ：Escherichia coli Ｗ３１１０ΔｙｈｄＨ株
Δｂ３２５４：Escherichia coli Ｗ３１１０Δｂ３２５４株
ΔＬ２５：Escherichia coli Ｗ３１１０ΔＬ２５株
【図１】
2004321169.tif 000007
【図２】
2004321169.tif 000008
【図３】
2004321169.tif 000009
【図４】
2004321169.tif 000010
【配列表】
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