(57)【要約】【課題】薬剤の開発等に際して、細胞などの生体試料内の酵素活性をコントロール用試料内の酵素活性と比較して検知し計測することができる簡便で迅速なアッセイシステムを提供する。【解決手段】酵素によって特異的に認識される基質のアミノ酸配列を含む１対のペプチドであって、一方に重水素原子含有官能基、他方に水素原子含有官能基が導入されて互いに３以上の分子量差を有するペプチド対から成る酵素活性検知用プローブとそれを用いる酵素活性検知方法。被検試料およびコントロール用試料に、プローブを構成するペプチドのそれぞれを添加して酵素反応を行なわせた後、その反応生成物のマススペクトルを測定する。プロテインキナーゼ等の酵素活性を計測するのに好適である。【選択図】　　　　図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料内の所定の酵素の活性を検知するのに用いられるプローブであって、
当該酵素によって特異的に認識される基質のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成り、そのいずれかのアミノ酸に重水素原子含有官能基または原子団が導入されている第１のペプチドと、
第１のペプチドにおける重水素原子含有官能基または原子団の重水素原子に相当する部分が通常の水素原子から成り第１のペプチドよりも分子量が３以上小さくなっている第２のペプチドとから構成されることを特徴とする酵素活性検知用プローブ。
【請求項２】
酵素がプロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼまたはプロテアーゼであることを特徴とする請求項１記載の酵素活性検知用プローブ。
【請求項３】
酵素がプロテインキナーゼであり、酵素によって特異的に認識される基質のアミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４よりなる群から選ばれるいずれかであることを特徴とする請求項１または２に記載の酵素活性検知用プローブ。
【請求項４】
重水素原子または水素原子含有官能基または原子団がアセチル基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の酵素活性検知用プローブ。
【請求項５】
第１のペプチドおよび第２のペプチドが４〜６個のヒスチジン残基から成るヒスチジンタグを含むことを特徴とする請求項４記載の酵素活性検知用プローブ。
【請求項６】
生体試料内の所定の酵素の活性を検知する方法であって、
（ｉ）　被検知生体試料およびコントロール用生体試料のいずれか一方に請求項１〜５のいずれかに記載の酵素活性検知用プローブのうちの第１のペプチドを添加し、且つ、被検知生体試料およびコントロール生体試料の他方に第２のペプチドを添加して、それぞれに酵素反応を行わせる工程、ならびに、
（ｉｉ）　酵素反応後の生成物を混合して、そのマススペクトルを測定し、未反応の第１のペプチドのピーク強度と第２のペプチドのピーク強度、および酵素反応後の第１のペプチドのピーク強度と第２のペプチドのピーク強度を比較する工程、を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法またはＥＳＩ法によりマススペクトル測定を行うことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項５の酵素活性検知用プローブを使用し、工程（ｉｉ）において酵素反応後の生成物を混合して、ＮＴＡ−Ｎｉ（ＩＩ）錯体から成るカラムに通して精製した後、マススペクトル測定に供することを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の酵素活性検知用プローブを含有することを特徴とする酵素活性検知用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬剤の開発等に際して細胞等の生体試料内の酵素活性を検知する新規な技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムプロジェクトによるヒトゲノムシーケンスの解明がほぼ終了した結果、多くの遺伝子が発見できるようになった。しかし、発見される遺伝子のほとんどは機能が未知であり、それらの機能が明らかとならなければ、ヒトゲノムプロジェクトの成果を創薬などに利用することは困難である。
【０００３】
現在、ヒトゲノムプロジェクトの成果を創薬に反映させるための遺伝子の機能解析に提唱されているのは、主として、遺伝子から発現するタンパク質の発現状況や個々の機能を網羅的に調べ、それが疾病を引き起こすメカニズムを解明して創薬に結びつけるという、所謂プロテオームやメタボロームと言ったボトムアップ的な手法である。しかしながら、このような手法では、遺伝子から得られる情報を創薬に利用するまでに膨大な費用と時間を要してしまう。
【０００４】
ゲノム創薬に関する上記の問題点を解決するためには、機能未知遺伝子を発見した場合、遺伝子そのものの詳細な機能の検討を省き、その機能未知遺伝子の発現や疾病による細胞機能変化を指標とし、これを薬剤探索にそのまま利用する方が効果的である。すなわち、遺伝子機能の最も下流（疾病に関する表現型に最も近い部分）で観察される細胞内シグナル（酵素活性）の変化を網羅的に解析するのである。この手法を用いれば、機能未知遺伝子を細胞に発現させたり細胞が罹患した後の細胞シグナル全体の動きをプロファイリングすることができ、ボトムアップ的に遺伝子機能の解析をする必要なしに、これに影響を与える薬剤がスクリーニングできる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新しい薬剤の開発等に際して、以上のような酵素動態解析を可能とし、機能未知遺伝子を発現させた細胞や罹患細胞などの生体試料内の酵素活性を、遺伝子未導入細胞や正常細胞などのコントロール用生体試料内の酵素活性と比較することにより検知し計測することができる簡便且つ迅速なアッセイシステムを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、マススペクトル測定（質量分析）により検出可能な１対のペプチドから成る分子プローブを利用する酵素活性アッセイシステムを案出した。
すなわち、本発明は、先ず、細胞などの生体試料内の所定の酵素の活性を検知するのに用いられるプローブであって、
当該酵素によって特異的に認識される基質のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成り、そのいずれかのアミノ酸に重水素原子含有官能基または原子団が導入されている第１のペプチドと、
第１のペプチドにおける重水素原子含有官能基または原子団の重水素原子に相当する部分が通常の水素原子から成り第１のペプチドよりも分子量が３以上小さくなっているような第２のペプチドとから成ることを特徴とする酵素活性検知用プローブを提供するものである。
なお、本発明の説明において、重水素原子とは質量数２のジュウテリウム（Ｄ：２Ｈ）を指称し、また、通常の水素原子とは質量数１の水素原子（１Ｈ）を指称する。
【０００７】
本発明に従えば、さらに、上記のプローブを使用して生体試料内の所定の酵素の活性を検知する方法であって、
（ｉ）　被検知生体試料およびコントロール用生体試料のいずれか一方に上記の酵素活性検知用プローブのうちの第１のペプチドを添加し、且つ、被検知生体試料およびコントロール生体の試料の他方に第２のペプチドを添加して、それぞれに酵素反応を行わせる工程、ならびに、
（ｉｉ）　酵素反応後の生成物を混合して、そのマススペクトルを測定し、未反応の第１のペプチドのピーク強度と第２のペプチドのピーク強度、および酵素反応後の第１のペプチドのピーク強度と第２のペプチドのピーク強度を比較する工程、を含むことを特徴とする方法が提供される。
また、本発明は、別の視点として、上記のようなプローブを含有することを特徴とする酵素活性検知用キットを提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の原理は、各種の酵素につきその酵素活性を検知するのに適用され、本発明の酵素活性検知用プローブおよび酵素活性検知方法が適用されるのに好ましい酵素としては、プロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼ、またはプロテアーゼが挙げられる。特に、本発明は、細胞内シグナルの中でも最も一般的且つ重要なプロテインキナーゼの酵素活性を検知し、プロテインキナーゼシグナル全体を解析するアッセイとして好適である。なお、以下に示す本発明の酵素活性検知用プローブおよび酵素活性検知方法に関する説明は、プロテインキナーゼに適用される場合を中心に行うが、本発明の適用範囲はプロテインキナーゼに限られるものではない。
【０００９】
本発明の酵素活性検知用プローブを構成する１対のペプチドは、それぞれ、擬似基質として酵素の作用を受けてその生成物により酵素活性が計測されるよう分子設計されたものである。すなわち、本発明の酵素活性検知用プローブを構成する第１のペプチドおよび第２のペプチドの特徴は、いずれも、目的とする酵素によって特異的に認識される基質のアミノ酸配列を含むことにある。例えば、本発明が各種のプロテインキナーゼの酵素活性を検知するのに適用される場合には、第１および第２のペプチドは、それぞれ、以下に例示されるようなアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
ＰＫＡ（プロテインキナーゼＡ）：ＧＬＲＲＡＳＬＧ（配列番号１）
ＰＫＢ（プロテインキナーゼＢ）：ＲＰＲＡＡＴＦ（配列番号２）
ＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）：ＡＡＫＩＱＡＳＦＲＧＨＭＡＰＫＫ（配列番号３）
ＭＡＰＫ（ＭＡＰキナーゼ）：ＫＱＡＥＡＶＴＳＰＲ（配列番号４）
【００１０】
本発明の酵素活性検知用プローブを構成する１対のペプチドの更なる特徴は、重水素原子または水素原子を含有する官能基または原子団が導入されていることである。すなわち、第１のペプチドには、該ペプチドを形成するアミノ酸のいずれかに重水素原子含有官能基または原子団が導入され、また、第２のペプチドには、第１のペプチドにおける重水素原子含有官能基または原子団の重水素原子に相当する部分が通常の水素原子から成るような官能基または原子団が導入されており、この結果、第２のペプチドは第１のペプチドよりも分子量（質量）が３以上小さくなっている。
【００１１】
そのような重水素原子含有官能基（または原子団）および水素原子含有官能基（または原子団）は、第１のペプチドおよび第２のペプチドを形成するいずれかのアミノ酸のアミノ基、カルボキシル基、水酸基またはスルフヒドリル基を介して導入することができる。すなわち、重水素原子含有官能基（原子団）や水素原子官能基（原子団）は、一般的には、それぞれのペプチドのＮ末端のアミノ基またはＣ末端のカルボキシル基を介して導入されるが、いずれかのアミノ酸の側鎖にあるアミノ基、カルボキシル基、水酸基またはスルフヒドリル基を介して導入することもできる。
別の手段として、第１のペプチドを形成するアミノ酸のいずれかに重水素化アミノ酸を用いることもできる。すなわち、第１のペプチドのアミノ酸のいずれかとして、当該アミノ酸を構成する水素原子が重水素原子から成るものを用い、第２のペプチドには通常の水素原子から成る対応するアミノ酸を用いることもできる。
【００１２】
本発明の酵素活性検知用プローブを構成するペプチドに導入される重水素原子含有官能基（原子団）および対応する水素原子含有官能基（原子団）は、酵素反応条件下において化学的に安定であることに加えて、第１のペプチドの官能基（原子団）が重水素原子を含むことにより、対応する官能基（原子団）が導入された第２のペプチドよりも分子量が３以上大きくなること、ならびに、重水素含有官能基（原子団）を導入するための重水素を含む原料化合物が入手し易いことが必要である。このような要件を満たす点から好適な重水素原子含有官能基（原子団）または水素原子含有官能基（原子団）としてはアセチル基が挙げられるが、その他の官能基（原子団）を使用することもできる。
【００１３】
図１〜図４には、本発明の酵素活性検知用プローブを構成する第１のペプチドに、重水素含有官能基（原子団）を導入するのに使用される重水素を含む原料化合物の例が示されている。各図において、四角枠内に示しているのが、用いられる原料化合物の化学構造式であり、図１には、ハライド類（ハロゲン化合物）、図２には、アルコール類およびアルデヒド類とケトン類、図３には酸と酸無水物、図４には、アミン類、イソシアネート類、チオール類がそれぞれ例示されている。図１〜図４において四角枠の下方に示されているように、各原料化合物が、アミノ酸の末端または側鎖にあるアミノ基（Ｒ−ＮＨ２）、カルボキシル基（Ｒ−ＣＯＯＨ）、水酸基（Ｒ−ＯＨ）またはスルフヒドリル基（Ｒ−ＳＨ）と反応することにより、重水素原子含有官能基（原子団）が導入される（図中、Ｒ’は四角枠内に示されている原料化合物に由来する部位である）。なお、図４の最下方に示すのは既述のように重水素化アミノ酸を用いる場合の例を示すものである。第２のペプチドについては、図１〜図４に示される原料化合物の重水素原子（Ｄ）の代わりに水素原子（Ｈ）を含む原料化合物を用いる。
【００１４】
本発明の酵素活性検知用プローブを構成する第１のペプチドおよび第２のペプチドは、以上のように、重水素原子含有官能基（原子団）および水素原子含有官能基（原子団）がそれぞれ導入されていることにより、それらの間に３以上の分子量差があり、これによって、後述するように、対比すべき細胞等の生体試料における酵素反応前後の基質濃度に相当するペプチドの定量評価が質量分析（マススペクトル測定）により可能となる。
【００１５】
マススペクトル測定において酵素反応前後におけるペプチド間のピークが明瞭に分離され、質量分析の感度を高めるためには、第１のペプチドと第２のペプチドとの間の分子量差がある程度大きいことが好ましい。しかし、実際には、分子量差が２０より大きくなると、却って、他の混在成分のピークとの区別が困難になり、取り扱いにくくなる場合も考えられる。したがって、多くの場合、第１のペプチドと第２のペプチドとの分子量差は、一般に３〜２０の範囲にあることが好ましく、特に６〜９の範囲にあることが好ましい。
【００１６】
本発明のプローブを構成する第１および第２のペプチドは、上述のように、基質ペプチドに相当するアミノ酸配列および重水素原子または水素原子含有官能基（原子団）に加えて、精製に供されるためのアミノ酸配列を含んでいてもよい。そのようなアミノ酸配列として代表的なものは、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）として知られている４〜６個のヒスチジン残基から成るオリゴヒスチジンである。第１のペプチドおよび第２のペプチドにこのヒスチジンタグが含まれていれば、酵素反応後の反応生成物を、よく知られているように、ＮＴＡ−Ｎｉ（ＩＩ）錯体（ＮＴＡ：ニトリロトリ酢酸）のカラムに通すと、それらのペプチドは該ニッケル錯体に選択的に結合するので、この結合後にイミダゾールで解離することにより、酵素反応前後の第１および第２のペプチドから夾雑物を分離してそれらのペプチドを精製することができる。本発明の酵素活性検知用プローブを構成する第１のペプチドおよび第２のペプチドがこのようなオリゴヒスチジンを含む場合には、重水素原子含有官能基（原子団）および水素原子含有官能基（原子団）は、末端のヒスチジンまたはこのオリゴヒスチジンの末端に結合しているアミノ酸のアミノ基等を介して導入されるのが一般的である。
【００１７】
図５は、以上のようにして得られる本発明の酵素活性検知用プローブの典型例を模式的に示すものである。図において、（Ａ）は分子量差３のプローブであり、プローブを構成する１対のペプチドの各々は、酵素によって特異的に認識される基質のアミノ酸配列から成るペプチド（基質ペプチド）にオリゴヒスチジンが連結されたアミノ酸配列から成る。第１のペプチドにおいては、末端のヒスチジンのアミノ基を介してアセチル基が導入され、第２のペプチドにおいては、対応するアセチル基の重水素原子が水素原子から成っている。図５の（Ｂ）は、（Ａ）と同様のアミノ酸配列から成るが、オリゴヒスチジンの末端に結合しているリシンのアミノ基を介してアセチル基が２個導入されていることにより、第１のペプチドと第２のペプチドとの間の分子量差が６となっているプローブを示すものである。
【００１８】
図６は、如上のプローブを用いて本発明に従い細胞等の生体試料内の酵素活性を検知する方法の原理をプロテインキナーゼの場合を例にして模式的に示すものである。図に示されるように、コントロール（対照）となる細胞の細胞抽出液に第２のペプチドを添加し、また、検査対象の細胞の細胞抽出液に第１のペプチドを添加し（これとは逆に、被検細胞抽出液に第２のペプチドを添加し、コントロール用細胞抽出液に第１のペプチドを添加してもよい）、それぞれに、所定時間、酵素反応を行わせ、酵素反応後の両細胞の生成物を混合する。図６に示す場合は、既述のように、酵素反応後の両細胞の生成物を混合してニッケル錯体カラムに通して精製しているが、検知対象に応じてこの精製工程は省略することができる。
【００１９】
酵素反応後のコントロール細胞および被検細胞の生成物は混合されて、次に、マススペクトル測定（質量分析）に供される。プローブを構成するペプチドで、酵素の作用を受けたものは、酵素反応後は、その分子量が変化する。例えば、図６に示す場合は、標的キナーゼによりリン酸化されることにより分子量が増加（増加分子量８０）する。そして、本発明のプローブを用いればコントロール用細胞および被検細胞に用いられるペプチドの分子量が互いに異なるため、両酵素反応後の両細胞の生成物を混合しても、それぞれの細胞における諸成分が分離されたマススペクトログラムが得られる。
【００２０】
すなわち、図６の最下方に示しているように、酵素の作用を受けない（未反応の）第１のペプチドのピークと第２のペプチドのピークおよび酵素の作用を受けた（酵素反応後の）第１のペプチドのピークと第２のペプチドのピークから成るマススペクトログラムが得られ、それぞれのピークの強度から各成分の存在を定量的に知ることができ、それらの値から、コントロール用細胞（例えば、機能未知遺伝子未導入細胞や正常細胞）と比較して被検細胞（例えば、機能未知遺伝子を発現させた細胞や罹患細胞）の酵素活性を評価することができる。一方、プロテインフォスファターゼやプロテアーゼの場合は、酵素反応後の各ペプチドの分子量は減少するが、同様に、被検細胞およびコントロール用細胞について互いに分離した未反応および酵素反応後の各成分を示すマススペクトログラムが得られる。
【００２１】
以上のように、本発明に従えば、互いに分子量の異なるペプチド対から成るプローブを用いて酵素反応を行なわせ、その反応生成物を質量分析することにより、その酵素の活性を簡便、迅速に検知、評価することができる。本発明の酵素活性検知用プローブは、一般に、当該プローブと他の測定用試薬等（例えば、細胞溶解剤）とから成る酵素活性検知用キットとして使用に供するのが便利である。また、本発明には、従来から知られた各種のイオン化方式や装置を用いる質量分析（マススペクトル測定）が適用可能であるが、試料が分解せず分子量がそのまま計測できる点から、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間）法またはＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）法によるものが特に好ましい。
【００２２】
【実施例】
以下に本発明の特徴を更に具体的に明らかにするため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１：プローブの合成
例としてプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）に対するプローブを合成した。先ず、図５の（Ａ）に概示するような分子量差３のプローブを合成した。アミノ酸配列（ＨＨＨＨＨＧＬＲＲＡＳＬＧ：配列番号５）から成るペプチドのＮ末端に通常のアセチル基を導入したもの（第２のペプチド）、および重水素化したアセチル基を導入したもの（第１のペプチド）の２種類を合成した。すなわち、Ｆｍｏｃ−ＳＡＬ−ＰＥＧ樹脂４７６ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、各Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（０．４ｍｍｏｌ）を用いて、自動ペプチド固相合成装置（ＰＥバイオシステムズ社製パイオニア）にてペプチドを合成した。最終ステップで、無水酢酸あるいは重水素化無水酢酸を用い、アミノ末端のアミノ基をアセチル化した。その後、樹脂を純水：トリフルオロ酢酸：イソプロピルシラン（９５：２．５：２．５ｖ／ｖ）１０ｍｌに加え、室温にて２時間攪拌してペプチドを脱樹脂した。その後、樹脂をろ別し、ろ液にエーテル（８０〜１００ｍｌ）を加えてペプチドを沈殿させ、ろ取した。得られた粗ペプチドは、逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。すなわち、０．１％のトリフロオロ酢酸水溶液７５％とアセトニトリル２５％の混合溶液から１５分間でそれぞれ３５％と６５％を含む溶液まで直線的に変化させて、目的成分を分取した。なお、用いた機器は、アプライドバイオシステムズ社製ＢｉｏＣＡＤ／Ｓｐｒｉｎｔ　２Ａである。収量は、１５〜２０ｍｇであった。
また、図５の（Ｂ）に示すような分子量差６のプローブも合成した。すなわち、ペプチドのアミノ酸配列を（ＫＨＨＨＨＨＧＬＲＲＡＳＬＧ：配列番号６）とした他は、上述の分子量差３のプローブと全く同様にして合成した。
【００２３】
実施例２：プローブの性能評価（１）
実施例１で合成した分子量差３のプローブの性能を評価するため、第１のペプチド（ＣＤ３型）および第２のペプチド（ＣＨ３型）について、表１に示すようなサンプルを調製した。室温で３時間攪拌しながら反応させた後、両サンプルから１μｌずつ採取して混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳにより測定を行った。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
マススペクトル測定の結果を図７に示す。図に示されるように、ＰＫＡを２倍量加えたＣＤ３型の方でリン酸化されたピークがＣＨ３型の約２倍となっており、本プローブを用いればマススペクトル測定によりＰＫＡの活性評価を行なえることが分かる。
【００２６】
実施例３：ＰＫＡ活性計測
実施例１で合成した分子量差３のプローブを用いて細胞抽出液のＰＫＡ活性を計測した。培養した３Ｔ３細胞の培地を除き、ＰＢＳで２回洗浄した後、５ｍｌのＰＢＳを加えラバーポリスマンで細胞をはがし取った。得られた細胞懸濁液を遠心管に移し８００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを除いた。得られたペレットにＰＢＳ１ｍｌを加え、プロテアーゼ阻害剤であるフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、アプロチニンを最終濃度１ｍＭとなるように加えた。その後、細胞を１分半超音波処理して細胞溶解液を得た。これを３９００ｒｐｍで７分間遠心し、上澄みを回収した。
【００２７】
第１のペプチド（ＣＤ３型）および第２のペプチド（ＣＨ３型）について表２に示す反応溶液を調製した後、３７℃で３０分間インキュベートした。その後両サンプルから１μｌずつとって混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳにより測定を行った。
【００２８】
【表２】
2004057093.tif 000004
【００２９】
本実施例では、細胞のＰＫＡは活性化していないため、細胞のバックグラウンドの酵素活性を検出することになる。マススペクトル測定の結果を図８に示す。図に示されるように３０分後のサンプルでは酵素活性が低いため、リン酸化されたピークはほとんど見られなかった。その後、５時間反応させたところ、ペプチドは十分にリン酸化された。これらの結果から、本発明の酵素活性検知用プローブを用いれば、刺激なしのバックグラウンドレベルでも実際に細胞内のＰＫＡ活性を計測できることが分かる。
【００３０】
実施例４：プローブの性能評価（２）
実施例１で合成した分子量差６のプローブがＰＫＡ活性の計測に適用できることを確認するため、第１のペプチド（ＣＤ３型：分子量１９０６）および第２のペプチド（ＣＨ３型：分子量１９００）について下記の表３に示すサンプルを調製し、酵素反応を行った。反応は室温で行なった。反応後５、１０、１５、２０、２５、３０分の時点でサンプルから２０μｌ取り、これにインヒビターを加え反応を停止した後、１μｌずつとって混合しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳにより測定を行った。
【００３１】
【表３】
2004057093.tif 000005
【００３２】
マススペクトル測定の結果を図９に示す。図に示されるように、分子量差６のプローブを用いると、１５分後に片方（ＣＤ３型）の未反応リン酸化ピークが消失するまで、ＣＨ３型およびＣＤ３型双方のピークが明瞭に判定でき、両者の活性比較が未反応およびリン酸化双方のピークでより明瞭に行なえることが分かる。
【００３３】
【発明の効果】
以上の記述から明らかなように、本発明の方法に従えば、コントロール用の試料と比較しながら、細胞などの生体試料内の所定の酵素の活性を簡便且つ迅速に検知することができる。本発明の酵素活性検知用プローブは各種の酵素について簡単に設計、合成することができるので、本発明のプローブを用いれば、例えば、多種類のプロテインキナーゼの活性比較を同時に行なえる計測法が確立でき、それらの活性変化をコントロール用細胞における値と相対評価することによって、細胞内の種々のプロテインキナーゼの活性プロフィールを得ることが可能となる。
【００３４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素活性検知用プローブを構成するペプチドに重水素含有官能基または原子団を導入するための重水素を含む原料化合物として用いられるハライド類の化学構造式を示す。
【図２】本発明の酵素活性検知用プローブを構成するペプチドに重水素含有官能基または原子団を導入するための重水素を含む原料化合物として用いられるアルコール類およびアルデヒド類とケトン類の化学構造式を示す。
【図３】本発明の酵素活性検知用プローブを構成するペプチドに重水素含有官能基または原子団を導入するための重水素を含む原料化合物として用いられる酸と酸無水物の化学構造式を示す。
【図４】本発明の酵素活性検知用プローブを構成するペプチドに重水素含有官能基または原子団を導入するための重水素を含む原料化合物として用いられるアミン類、イソシアネート類、チオール類およびアミノ酸の化学構造式を示す。
【図５】本発明の酵素活性検知用プローブの典型例を模式的に示す。
【図６】本発明に従い細胞等の生体試料内の酵素活性を検知する方法の原理を模式的に示す。
【図７】本発明に従う分子量差３のプローブの性能を評価するために行なったマススペクトル測定の結果を示す。
【図８】本発明に従う分子量差３のプローブを用いて細胞抽出液のＰＫＡ活性を計測するために行なったマススペクトル測定の結果を示す。
【図９】本発明に従う分子量差６のプローブの性能を評価するために行なったマススペクトル測定の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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