(57)【要約】【課題】多能性細胞を多能性細胞を変性疾患および遺伝疾患の治療や胚の発達／分化のメカニズムの研究に使用でき、かつヒト胚操作の倫理上の問題を回避する細胞を提供すること。【解決手段】本発明の動物の培養体細胞は、正常核型を有し、かつインビトロで誘導された時に胚様体に発達するか、ＳＣＩＤマウスに導入された時に奇形腫に発達する。そのような細胞の生産方法も開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常核型を有し、インビトロで誘導された場合に胚様体に発達する、動物の培養体細胞。
【請求項２】
正常核型を有し、ＳＣＩＤマウスに導入された場合に奇形腫に発達する、動物の培養体細胞。
【請求項３】
インビトロで誘導された場合に胚様体に発達する、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
哺乳動物細胞である、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
ヒト細胞である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項４に記載の細胞。
【請求項８】
時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項３に記載の細胞。
【請求項９】
多能性動物細胞を生産する方法であって、
動物の組織から体細胞を分離する工程と、
前記分離細胞を飢餓条件下で培養する工程と、
培養細胞中の多能性細胞を同定し、濃縮する工程とから成り、
前記多能性細胞は、ＳＣＩＤマウスに導入された場合に奇形種に発達する、方法。
【請求項１０】
多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記動物は哺乳動物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織は臍帯血、骨髄、または羊水である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養工程は、細胞を０．５％の血清を含む培地に５〜７日間置くか、培地を変更せずに２０％の血清を含む培地に２週間置くことにより行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記培養工程は、細胞を０．５％の血清を含む培地に５〜７日間置くか、培地を変更せずに２０％の血清を含む培地に２週間置くことにより行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２９】
前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血である、請求項９に記載の方法。
【請求項３０】
多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組織は臍帯血、骨髄、または羊水である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれる、請求項９に記載の方法。
【請求項３６】
多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性である、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（発明の属する技術分野）
本発明は、動物の培養体細胞とその生産方法に関する。
（関連出願）
本願は、２００２年７月２６日に出願された米国仮出願出願番号第６０／３９８，８８３号の優先権を主張する。その出願の内容は引用により本願に組み込まれる。
【０００２】
【従来の技術】
多分化能すなわち多能性の胚性幹（ＥＳ）細胞は、哺乳類の初期胚に由来する。ＥＳ細胞はインビボですべての細胞系統に分化することができ、インビトロで誘導された場合にはほとんどの細胞の種類に分化する。ＥＳ細胞は、その多能性のために、変性疾患や遺伝疾患の治療に大きな見込みがあると考えられている。倫理上の問題により、ヒトＥＳ細胞の研究や治療での使用が妨げられている。非胚由来の多能性細胞（例えば体細胞）はこの障害を回避するだろう。
【０００３】
ある体細胞が、それとは無関係な種類の組織の細胞に発達できることが報告されている。しかしながら、その発達可能性は制限されている。無制限の発達可能性を有する体細胞が必要とされている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、変性疾患および遺伝疾患の治療や胚の発達／分化のメカニズムの研究に使用でき、かつヒト胚操作の倫理上の問題を回避することができる多能性細胞を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
１態様では、本発明は、正常核型を有し、インビトロで誘導された場合に胚様体に発達する、動物の培養体細胞、すなわち器官の特徴を有する構造体にさらに発達可能な細胞体をその特徴とする。そのような構造体の例には、規則的な収縮と緩和を示す原腸が含まれる。培養細胞は、非胚由来か非生殖細胞系列由来であるため、体細胞性である。
【０００６】
別の態様では、本発明は、正常核型を有し、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに導入された場合に奇形種に発達する、動物の培養体細胞をその特徴とする。奇形腫は、３つすべての胚葉層（すなわち外胚葉、中胚葉、内胚葉）に由来する組織を含む腫瘍である。組織の例には、角膜レンズおよび発達中の表皮（外胚葉）、軟骨および横紋筋（中胚葉）、ならびに肝臓および胃腸管（内胚葉）が含まれる。１実施態様では、動物の培養体細胞は、インビトロで誘導された場合に、胚様体に発達することができる。別の実施態様では、培養細胞は時期特異的な胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１）を発現しない。すなわち、ＳＳＥＡ−１陰性である。
【０００７】
さらに別の態様では、本発明は、上述したような多能性動物細胞を生産する方法をその特徴とする。方法は、（１）動物の組織から体細胞を分離する工程と、（２）分離細胞を飢餓条件下で培養する工程と、（３）培養細胞中の多能性細胞を同定し、濃縮する工程とから成る。濃縮された多能性細胞は、ＳＣＩＤマウスに導入された場合に奇形種へと発達する。ヒトを始めとする哺乳動物から体細胞を分離することができる。この方法で使用する体細胞を分離するためには、いかなる適切な組織も使用することができる。そのような組織の例には、臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤および末梢血が含まれる。
【０００８】
多能性細胞を生産するために、分離された細胞は、細胞が成長するのに不利な飢餓条件下で、例えば０．５％〜２％の血清を含む飢餓培地中で５〜１０日間または培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む標準培地中で７〜２１日間培養される。標準培地は、細胞増殖を促進する栄養素および因子を含んでいる。飢餓培地は、細胞増殖のための栄養素および因子の量が少ない。栄養素には、血清や血清代用物が含まれる。因子には、インスリン、表皮成長因子（ＥＧＥ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が含まれる。飢餓条件で培養された細胞のうち、多能性細胞は、例えばその形態や細胞表面マーカー（例えばＳＳＥＡ−１陰性）に基づいて同定および濃縮される。
【０００９】
請求項１に記載の発明は、正常核型を有し、インビトロで誘導された場合に胚様体に発達する動物の培養体細胞を要旨とする。
請求項２に記載の発明は、正常核型を有し、ＳＣＩＤマウスに導入された場合に奇形腫に発達する動物の培養体細胞を要旨とする。
【００１０】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の細胞において、インビトロで誘導された場合に胚様体に発達することを要旨とする。
請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の細胞において、哺乳動物細胞であることを要旨とする。
【００１１】
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の細胞において、ヒト細胞であることを要旨とする。
請求項６に記載の発明は、請求項５に記載の細胞において、時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
【００１２】
請求項７に記載の発明は、請求項４に記載の細胞において、時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
請求項８に記載の発明は、請求項３に記載の細胞において、時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
【００１３】
請求項９に記載の発明は、多能性動物細胞を生産する方法であって、動物の組織から体細胞を分離する工程と、前記分離細胞を飢餓条件下で培養する工程と、培養細胞中の多能性細胞を同定し、濃縮する工程とから成り、前記多能性細胞は、ＳＣＩＤマウスに導入された場合に奇形種に発達することを要旨とする。
【００１４】
請求項１０に記載の発明は、請求項９に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
請求項１１に記載の発明は、請求項９に記載の方法において、前記動物は哺乳動物であることを要旨とする。
【００１５】
請求項１２に記載の発明は、請求項１１に記載の方法において、前記哺乳動物はヒトであることを要旨とする。
請求項１３に記載の発明は、請求項１２に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
【００１６】
請求項１４に記載の発明は、請求項１２に記載の方法において、前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血であることを要旨とする。
請求項１５に記載の発明は、請求項１４に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
【００１７】
請求項１６に記載の発明は、請求項１４に記載の方法において、前記組織は臍帯血、骨髄、または羊水であることを要旨とする。
請求項１７に記載の発明は、請求項１６に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
【００１８】
請求項１８に記載の発明は、請求項１６に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【００１９】
請求項１９に記載の発明は、請求項１８に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を０．５％の血清を含む培地に５〜７日間置くか、培地を変更せずに２０％の血清を含む培地に２週間置くことにより行われることを要旨とする。
【００２０】
請求項２０に記載の発明は、請求項１９に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
請求項２１に記載の発明は、請求項１４に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【００２１】
請求項２２に記載の発明は、請求項２１に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
請求項２３に記載の発明は、請求項２１に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を０．５％の血清を含む培地に５〜７日間置くか、培地を変更せずに２０％の血清を含む培地に２週間置くことにより行われることを要旨とする。
【００２２】
請求項２４に記載の発明は、請求項２３に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
請求項２５に記載の発明は、請求項１２に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【００２３】
請求項２６に記載の発明は、請求項２５に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
請求項２７に記載の発明は、請求項１１に記載の方法において、前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血であることを要旨とする。
【００２４】
請求項２８に記載の発明は、請求項１１に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【００２５】
請求項２９に記載の発明は、請求項９に記載の方法において、前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血であることを要旨とする。
請求項３０に記載の発明は、請求項２９に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
【００２６】
請求項３１に記載の発明は、請求項２９に記載の方法において、前記組織は臍帯血、骨髄、または羊水であることを要旨とする。
請求項３２に記載の発明は、請求項３１に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
【００２７】
請求項３３に記載の発明は、請求項３１に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【００２８】
請求項３４に記載の発明は、請求項２９に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【００２９】
請求項３５に記載の発明は、請求項９に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を０．５％〜２％の血清を含む培地に５〜１０日間置くか、培地を変更せずに１０％〜２０％の血清を含む培地に７〜２１日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【００３０】
請求項３６に記載の発明は、請求項３５に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−１陰性であることを要旨とする。
本発明の多能性体細胞を飢餓条件下で生産できることは予想していなかった。本発明の他の特徴または利点は、以下の詳細な説明と、さらには特許請求の範囲とから明らかとなろう。
【００３１】
【発明の実施の形態】
本発明は動物の培養体細胞に関する。この細胞は、インビトロで誘導された場合に胚様体に発達するか、ＳＣＩＤマウスに導入された場合に奇形腫に発達するため、多能性である。該細胞は、正常細胞の染色体の特徴であるすべての染色体を有しており、顕著な変化を有しない。言いかえれば、該細胞は正常核型を有している。
【００３２】
該細胞は未分化のＥＳ細胞に特徴的な表現型を有する。１例において、該細胞は、培養物中で自然に平らな球状コロニーを形成する。同様のコロニーが未分化のＥＳ細胞の培養物中に見出されている。例えばＴｈｏｍｓｏｎ　Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５−１１４７，１９９８を参照されたい。該細胞はさらに、例えば時期特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）−１を発現しないがＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−ｌ−６０、ＴＲＡ−１−８１およびＯｃｔ−４を発現するというような、未分化のＥＳ細胞に特徴的な抗原特性も示す。Ｏｃｔは多能性細胞の発達に重要な転写因子のファミリーである。哺乳類生殖細胞系列細胞や幹細胞で特異的に発現されるＯｃｔ−４は、細胞の多能性を維持するのに不可欠である（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ｃｅｌｌ、９５：３７９−３９１，１９９８を参照）。
【００３３】
さらに該細胞は高レベルのテロメラーゼ活性を有し得る。テロメラーゼは、細胞の複製中に染色体の末端にテロメア反復部を付加するリボ核タンパク質であり、そのためテロメアと染色体の長さが維持される。高レベルのテロメラーゼの発現は、生殖細胞系列の細胞、ＥＳ細胞および胚組織で見出されるが、体細胞では見出されない。その結果、テロメア（および染色体）は細胞分裂後ごとに体細胞ではより短くなる。最後に、有限の寿命の後に、体細胞は染色体ＤＮＡの損失により老化期に入る。体細胞でのテロメラーゼ発現の回復は細胞の寿命を延ばすため、本発明の細胞での高レベルのテロメラーゼ活性は、本発明の細胞の寿命がＥＳ細胞の寿命と等しいことを示唆している。
【００３４】
本発明の多能性細胞は、動物の組織から体細胞を分離し、分離した細胞を飢餓条件下で培養し、培養細胞を同定および濃縮することにより、生産することができる。多能性細胞は、例えば以下に実施例２で説明する方法や当該技術分野においてよく知られている類似の方法を用いて、例えば臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血細胞から分離された間充織幹細胞より生産することができる。例えばＥｒｉｃｅｓ　Ａ．ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．Ｈａｅｍａｘｏｌ、１０９：２３５−２４２，２０００、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ　Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４：１４３−１４７，１９９９、Ｓａｆｆｏｒｄ　Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍ．２９４：３７１−３７９，２００２、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ　Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍ．２９０：７６３−７６９、２００２を参照。間充織幹細胞は、１０〜２０％ＥＳ細胞選別ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびｂＦＧＦを含むα改変ＭＥＭで維持することもできるし、上述の飢餓条件下で培養してもよい。間充織幹細胞を飢餓条件下で多能性細胞に変換する際には、細胞融合も核移植も要しない。飢餓プロセス後、多能性体細胞は、その形態（例えば細胞の大きさと形状）、酵素活性（例えばアルカリ性フォスファターゼとテロメラーゼ）および表面マーカー（例えばＳＳＥＡ−ｌ陰性、ＳＳＥＡ−３陽性およびＳＳＥＡ−４陽性）によって同定することができる。同定された細胞は、当該技術分野で周知のどのような適切な細胞分離技術を使用して濃縮してもよい。例えば、細胞はコロニーを形成する傾向があるので、顕微鏡下でマイクロピペットを使用して直接コロニーを拾い上げることができる。大量の細胞をより急速に濃縮するためには、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）法を使用することができる。例えば、種々の蛍光標識と結合された抗ＳＳＥＡ−３モノクローナル抗体、抗ＳＳＥＡ−４モノクローナル抗体、および抗ＳＳＥＡ−ｌモノクローナル抗体を使用して、ＳＳＥＡ−３陽性、ＳＳＥＡ−４陽性、かつＳＳＥＡ−ｌ陰性である細胞を濃縮することができる。それらの細胞はその多能性についてさらに精査することができる。
【００３５】
任意の適切な方法を使用して細胞の多能性を試験することができる。例えば、以下に実施例５で説明するようなインビボ奇形腫形成アッセイを使用する。奇形腫は３つのすべての胚葉層の誘導物を含むため、細胞が奇形腫を形成する能力は、細胞が多能性であることを示す。代わりに、以下に実施例６に説明するようなインビトロ胚様体形成アッセイを使用することもできる。胚様体の形成は、細胞が多能性であることを示す。
【００３６】
本発明の細胞は様々な方法で使用することができる。本発明の細胞を変性疾患や遺伝疾患の治療に使用して、ヒト胚操作の倫理上の問題を回避することができる。これを行うために、例えば組織または器官の適切な発達に不可欠な機能的遺伝子を欠いた間充織幹細胞を患者から分離し得る。多能性細胞を生産した後に、該分離細胞に遺伝子の機能的形式をコードする発現核酸ベクターを導入することができる。リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介形質移入、リポフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、またはウイルスを介した技術を含めた様々な技術により、細胞にベクターを導入することができる。細胞の多能性に影響を及ぼさない方法が好まれる。そのような技術の説明は、例えば米国特許第５，５９１，６２５号および米国特許出願第２００２０１２７７１５号に見出すことができる。細胞に機能的遺伝子を導入した後に、当該技術分野で周知の方法を用いて患者に細胞を戻して移植することができる。該細胞は該患者から作られているので、この治療は免疫拒絶を引き起こさない。移植された細胞は適切な条件下で機能的な組織または器官に発達することができる。この発達を促進するために、細胞の発達を誘導する因子を患者を投与してもよい。そのような因子は小分子化合物、ペプチドおよび核酸であり得る。実施例はトランスフォーミング成長因子β、骨形成タンパク質、および神経成長因子を含むが、それらに限定されない。
【００３７】
本発明の細胞は、胚の発達／分化のメカニズムを研究するのにも有用である。多能性細胞をモデル系として使用して、多能性細胞の特定の組織または器官への発達を誘導するための条件を同定することができる。さらには、例えばＳｈｅｎＭ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２４：４２９−４２，１９９７に記述されているようなディファレンシャルｃＤＮＡスクリーニングを使用して、胚の発達中に重要な役割を果たす遺伝子を分離することができる。例えば上述の胚様体に発達するように誘導された多能性細胞からｃＤＮＡライブラリを作製することができる。ライブラリは２セットのレプリカフィルタ上に蒔かれる。一方のセットのフィルタ（セットＡ）は非誘導細胞から作製したｃＤＮＡでスクリーニングする。他方のセットのフィルタ（セットＢ）は誘導細胞から作製した同量のｃＤＮＡでスクリーニングする。ライブラリのスクリーニングに使用するｃＤＮＡには標識して、当該技術分野において周知の方法を用いて視覚化することができる。その後、ライブラリから、セットＡでよりもセットＢでより強いハイブリダイゼーションシグナルを示すｃＤＮＡクローンを選択することができる。それらのｃＤＮＡは、誘導細胞で過剰発現している遺伝子をコードする。逆に、非誘導多能性細胞で過剰発現している遺伝子を分離することもできる。同じ理由で、上述の飢餓プロセスの前後に細胞で過剰発現している遺伝子も分離することができる。分離された遺伝子はすべて、それぞれのプロセスにおけるその役割を定義するためにさらに詳しく調べることができる。
【００３８】
非ヒト動物から生産された多能性細胞を使用し、例えばＣａｍｐｂｅｌｌ　Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：６４−６６、１９９６に記述されているような方法を使用して、動物の器官またはクローンに発達させることができる。従って、それらの細胞はペット業界や畜産業で価値があり、絶滅の危機に瀕した動物を保存するために使用することができる。
【００３９】
本発明の多くの実施態様について説明した。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な改変を行い得ることがと理解される。従って、特許請求の範囲には他の実施態様が包含される。
【００４０】
以下の特定の実施例は単なる例であって、本開示の残りの部分を如何様にも限定するものではないと解釈されるべきである。これ以上詳述しなくとも、本明細書の説明に基づいて、当業者は本発明を最大限に利用できるものと考えられる。本明細書に引用したすべての刊行物はその全体を引用により組み込むものとする。
【００４１】
（実施例１）
細胞マーカーを検査するために免疫細胞化学染色を行なった。
細胞表面マーカーを染色するために、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０℃で１０分間固定した。細胞骨格タンパク質を染色するために、細胞をメタノールで−２０℃で２分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で１０分間透過処理した。他の細胞内分子を染色するために、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０℃で１０分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で１０分間透過化処理した。
【００４２】
固定した細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１次抗体を作製した種と同じ種からの１％血清（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス所在）を含むブロック溶液で３０分間インキュベートした。その後、細胞を、ブロック溶液で適切に希釈した１次抗体、ビオチン化抗マウス２次抗体、およびストレプトアビジン共役西洋ワサビペルオキシダーゼと共に各々６０分間、連続的にインキュベートした。各ステップ間で、細胞を０．３％ＢＳＡを含むＰＢＳで１０分間洗浄した。ジアミノベンジジンクロマゲン（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州）と共にインキュベートすることにより、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を視覚化した。視覚化後、細胞を顕微鏡で調べ、写真を撮影した。
【００４３】
（実施例２）
骨髄および臍帯血から間充織細胞を分離した。
Ｂｉｏ　Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社（メリーランド州ウォーカーズビル所在）からヒト骨髄を購入した。臍帯血をインフォームドコンセントした被験者から得た。間充織幹細胞を分離するために、例えばＥｒｉｃｅｓ　Ａ．ら、ＢｒｉｔｉｓｈＪ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１０９：２３５−２４２，２０００またはＰｉｔｔｅｎｇｅｒＭ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４：１４３−１４７，１９９９に記述されているようなＦｉｃｏｌ−ｐａｑｕｅ（ｄ＝１．０７７ｇ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）密度勾配法を使用して、ヒト骨髄または臍帯血から単核細胞を調製した。
【００４４】
分離した単核細胞を、標準培地、すなわち２０％ＥＳ細胞選別ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ユタ州ローガン所在）、４ｎｇ／ｍｌ　ｂ−ＦＧＦ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、およびｌ００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド所在）を含むα改変最小必須培地（ＭＥＭ）を含む組織培養皿に１×１０６細胞／ｃｍ２の濃度で接種した。２週間の培養後、多くの細胞が培養皿に付着した。これらの形態学的に同種の細胞は３２〜３６時間の倍加時間で自己複製した。
【００４５】
付着細胞を、上述と同じ免疫細胞化学を用いてさらに特徴づけた。ＣＤ３４またはＣＤ４５（造血系統の細胞表面抗原）に対する抗体を、Ｂａｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（カリフォルニア州マウンテンビュー所在）より購入した。染色結果によると、細胞はＣＤ３４およびＣＤ４５陰性であり、細胞が造血系統に属しないことが示唆された。さらに、細胞は、例えばＰｉｔｔｅｎｇｅｒ　Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４：１４３−１４７，１９９９に記述されている方法に従って適切な培地を用いて、骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞に分化するように誘導させることができた。分化した骨細胞はｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ染色法を使用して分析した。分化した軟骨細胞はサフラニンＯで染色した。脂肪細胞はオイルレッドＯで染色した。以上の方法は、例えばＣｏｌｔｅｒ　Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８；７８４１−７８４５、２００１に見出すことができる。その結果は、分離細胞が間充織幹細胞であることを示していた（Ｐｒｏｃｋｏｐ　Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２７６：７１−７４，１９９７）が、それらの細胞はＳＣＩＤマウスに誘導された時には奇形種に発達せず、また、誘導された時に胚様体に発達しなかったので、それらの細胞の発達可能性は限定されている。実施例５，６を参照されたい。
【００４６】
（実施例３）
上述の分離間充織幹細胞を、多能性細胞を生成するために飢餓条件下で培養した。
間充織幹細胞を、実施例２に記述した標準培地で３〜５代、継代培養した。その後、細胞を、ｂ−ＦＧＦを欠いた０．５％ＦＢＳを含むα改変ＭＥＭ（飢餓培地）に５〜７日間置いた。別法として、細胞を培地を２週間変えずに標準培地中に維持した。上記の飢餓プロセスの間、顕微鏡下で細胞を毎日モニタした。細胞の融合は見出されなかった。飢餓プロセスの終わりに、丸くて平らなコロニーが培養物中に現われた。コロニーの各々をマイクロピペットを使用して採取し、２０％ＥＳ選別ＦＢＳ、４ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦおよび０．１ｍＭ　２−メルカプトエタノールを含むＩｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地中でマウス支持細胞（例えばマイトマイシン処理マウスＳＴＯ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１５０３）またはマウス胚繊維芽細胞）上で未分化の状態で維持した。各コロニーからの細胞は未分化の状態で維持することができ、４か月を超えて（または１５継代を超えて）増殖し続けることができた。
【００４７】
（実施例４）
コロニーからの細胞の形態、細胞マーカー発現、酵素活性、および核型を調べた。
細胞を光学顕微鏡または走査電子顕微鏡の下で検査した。走査電子顕微鏡試験のため、細胞をＭｅｌｉｎｅｘフィルム（ＤｕＰｏｎｔ社、バージニア州ホープウェル所在）上で培養し、２％四酸化オスミウム（ｗ／ｖ）、０．ｌＭ　リン酸緩衝液ｐＨ７．４で１６時間４℃で固定し、一連の勾配エタノールで脱水した。液体二酸化炭素を使用して臨界点乾燥し、クロミウムでスパッタコーティングした後、２ｋＶで稼働させた走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）Ｌｅｏ　９８２（ＬＥＯ　Ｅｌｅｋｔｒｏｎｅｎｍｉｋｒｏｓｋｏｐｉｅ社、ドイツ）の電場放射下で細胞を検査した。例えばＢｏｚｚｏｌａ　Ｊ．ら、１９９２、Ｓｐｅｃｉｍｅｎ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　Ｉｎ：Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ　４０〜６２ページ　Ｊｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｂａｒｔｌｅｔｔ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎを参照されたい。顕微鏡写真が示すように、細胞の形態は、Ｔｈｏｍｓｏｎ　Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５−１１４７、１９９８に説明されているような、未分化ＥＳ細胞の形態に類似していた。
【００４８】
細胞をさらに上述の免疫細胞化学染色を用いて特徴づけた。ＳＳＥＡ−１（ＭＣ−４８０、１：５０）、ＳＳＥＡ−３（ＭＣ−６３１、１：５０）およびＳＳＥＡ−４（ＭＣ−８１３−７０、１：５０）に対する抗体を、アイオワ州立大学Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｂａｎｋ（アイオワ州アイオワシティ）から得た。抗ＴＲＡ−１−６０抗体および抗ＴＲＡ−ｌ−８１抗体をＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州サンタクルス）から得た。結果は、細胞がＳＳＥＡ−１陰性で、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−ｌ−８１陽性であることを示した。さらに転写因子Ｏｃｔ−４の発現を、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ　Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３９９−４０４，２０００に記述されるような逆転写ＰＣＲにより検出した。
【００４９】
細胞のアルカリ性フォスファターゼ活性を生産の使用説明書（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス所在）に従ってＳｉｇｍａ　８６−Ｒキットを使用して検出した。細胞は高レベルのアルカリ性フォスファターゼ活性を示した。ＫｉｍＮ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：２０１１−２０１５，１９９４に記述されるようなＴＲＡＰｅｚｅ　ＥＬＳＩＡテロメラーゼ検出法を用いて、細胞のテロメラーゼ活性を調べた。その結果、細胞のテロメラーゼ活性が高レベルであることが明らかになった。
【００５０】
細胞の核型を、例えばＩＳＣＮ　１９９５：ヒト細胞遺伝学的命名法のための国際制度（Ａｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）、Ｆ．Ｍｉｔｅｌｍａｎ編、Ｋａｒｇｅｒ、Ｂａｓｅｌ（１９９５）に記述された方法を用いて、決定した。要約すると、細胞を回収前の１２時間、１：４希釈で継代培養した。細胞をトリプシンＥＤＴＡで収集し、１．５時間コルセミドとインキュベートした後、低張性ＫＣｌで溶解し、酸／アルコールで固定した。例えばＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ、「動物細胞の培養−基本技術の手引き（Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｎｉｍａｌ　ｃｅｌｌｓ−Ａ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｂａｓｉｃ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」第３版」Ａ　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９４）、ｐｐ２０５−２０９に記述されているような方法を用いて、分裂中期を分析した。その結果、細胞はヒトの４６本の染色体をすべて有していることが明らかとなった。その染色体に、正常なヒトの染色体と比較して顕著な変化はなかった。
【００５１】
（実施例５）
実施例３に記述したように調製した細胞の多能性を試験するために、奇形種形成アッセイを行った。
約１×１０５個の細胞をＳＣＩＤマウスの後脚の筋系に移植した。注入６〜８週間後に奇形種が観察された。奇形種を回収し、Ｔｈｏｍｓｏｎ　Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：１１４５−１１４７，１９９８に記述されている方法を使用して、組織の検査に供した。調べた腫瘍はすべて、３つの胚葉層すべて、すなわち発達中の胃腸管（内胚葉）；軟骨、骨および横紋筋（中胚葉）；ならびに角膜レンズ、破砕ケラチンおよび発達中の表皮（外胚葉）に由来した。対照として、実施例２に記述した間充織幹細胞は、ＳＣＩＤマウス中で奇形種へは発達しなかった。
【００５２】
（実施例６）
実施例３で調製した細胞の多能性を試験するために、胚様体形成アッセイを行なった。
細胞は被覆を施していない細菌用ペトリ皿で４〜６日間培養した。細胞は増殖し、懸濁液中で球体（胚様体）を形成した。胚様体を０．１％ゼラチンで被覆されたチャンバースライド上に移して接種した。一週間後、培養物中に、球体の成長物から多数のクラスターが現れた。クラスターの各々は１２時間を越える時間の間、１サイクル当たり５〜７秒で規則的な収縮と弛緩を示した。この機械的活動は、Ｙａｍａｄａ　Ｔ．ら、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　２０：４１−４９，２００２に記述されるようなＥＳ細胞から発達した腸様の器官（原腸）の機械的活動に類似していた。これとは対照的に、同じ条件下で誘導しても、間充織幹細胞は胚様体へ発達することができなかった。
【００５３】
（他の実施態様）
本明細書に開示した特徴のすべてをいかなる組合せで組み合わせてもよい。本明細書で開示した各特徴は、同じか、等価か、または同様な目的を果たす代替特徴と置き換えてもよい。したがって、別段明記しない限り、開示した各特徴は、一連の包括的な等価または同様な特徴の一例にすぎない。
【００５４】
上記の説明から、当業者は容易に本発明の本質的特徴を確認することができ、本発明の範囲の精神および範囲から逸脱せずに、本発明を様々な使用方法や様々な条件に適合させる本発明の種々の変更および改変を行うことができる。したがって、他の実施態様も特許請求の範囲に包含される。
【００５５】
【発明の効果】
本発明によれば、多能性細胞を変性疾患および遺伝疾患の治療や胚の発達／分化のメカニズムの研究に使用でき、かつヒト胚操作の倫理上の問題を回避することができる。