(57)【要約】【課題】アレルゲン特異的ヒトＴ細胞エピトープを植物へ集積させる方法、および該エピトープを集積させた植物の提供を課題とする。【解決手段】ヒトＴ細胞エピトープをコメの胚乳中に集積させる手法として、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチド（７ｃｒｐ）を直接種子中に集積させる方法、およびイネの主要な貯蔵タンパク質であるグルテリンの可変領域の中に挿入し、グルテリン貯蔵タンパク質の一部として発現・集積させる方法が開発された。本発明で開発されたＴ細胞エピトープ連結ペプチドを生産するイネは、スギ花粉症に対する食べるワクチンとして現実的に機能することが強く期待される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
貯蔵タンパク質プロモーターの制御下に以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡが配置された構造を有するＤＮＡ。
（ａ）アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡの５’末端に貯蔵タンパク質シグナル配列をコードするＤＮＡ、および／または３’末端に小胞体係留シグナル配列をコードするＤＮＡが付加されたＤＮＡ
（ｂ）アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドのＮ末端に貯蔵タンパク質シグナル配列、および／またはＣ末端に小胞体係留シグナル配列が付加されたポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｃ）貯蔵タンパク質の可変領域へ、アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドが挿入された構造を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含む、Ｔ細胞エピトープ集積植物作製用ベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ、または請求項２に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項４】
アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープを植物に集積させる方法であって、請求項１に記載のＤＮＡ、または請求項２に記載のベクターを植物へ導入することを特徴とする方法。
【請求項５】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、Ｔ細胞エピトープを植物に集積させる方法。
（ａ）アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡを取得する工程、
（ｂ）前記（ａ）で取得されたＤＮＡの５’末端に貯蔵タンパク質シグナル配列をコードするＤＮＡ、および／または３’末端に小胞体係留シグナル配列をコードするＤＮＡを付加する工程、
（ｃ）前記（ｂ）のＤＮＡを、植物において貯蔵タンパク質プロモーターの制御下で発現させる工程
【請求項６】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、Ｔ細胞エピトープを植物に集積させる方法。
（ａ）アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡを取得する工程、
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡを、植物の貯蔵タンパク質の可変領域をコードするＤＮＡ領域へ挿入し発現させる工程
【請求項７】
アレルゲンがスギ花粉アレルゲンである、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
スギ花粉アレルゲンがＣｒｙｊ１およびＣｒｙｊ２である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｔ細胞エピトープが植物の可食部位に集積されることを特徴とする、請求項４〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
可食部位が種子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項４〜１０のいずれかに記載の方法により作出される、Ｔ細胞エピトープが集積したトランスジェニック植物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の植物の子孫またはクローンである、トランスジェニック植物。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の植物に由来する細胞。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載の植物の繁殖材料。
【請求項１５】
請求項１１または１２に記載の植物の種子。
【請求項１６】
熱に安定であることを特徴とする、請求項１５に記載の種子。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法により作出される、Ｔ細胞エピトープが集積したコメ。
【請求項１８】
請求項１５もしくは１６に記載の種子、または請求項１７に記載のコメを有効成分とする、アレルギー性疾患の治療または予防のための食品組成物。
【請求項１９】
アレルギー性疾患がＩ型アレルギーである、請求項１８に記載の食品組成物。
【請求項２０】
請求項４〜１０のいずれかに記載の方法を用いた、Ｔ細胞エピトープが集積したトランスジェニック植物の製造方法。
【請求項２１】
請求項１０に記載の方法を用いた、Ｔ細胞エピトープが集積したコメの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術】
近年、アレルギー疾患に対する根治的治療法は、従来注射によりアレルゲンそのものを投与し、長期間にわたり段階的に増加させアレルゲン特異的な免疫反応性を鈍らせる減感作療法であった。しかしこの療法では、アレルギー症状を引き起こす肥満細胞に結合しているＩｇＥ抗体との反応性が残っており、アナフィラキシーショック等の副作用が見られる問題があることが指摘されている。
【０００２】
近年、アレルゲンに由来するＴ細胞エピトープペプチドを投与するペプチド免疫療法が注目されている。その作用機構として、アレルゲン特異的なヘルパーＩＩ型のＴ細胞の不応答や欠失が起こると考えられる。Ｔ細胞エピトープを利用するペプチド免疫療法は一般にアレルギー反応を起こすＢ細胞エピトープを含まず、アレルゲン特異的なＩｇＥ抗体との結合性もないことから、従来の減感作療法で起きている副作用が起きにくく安全である。
【０００３】
スギ花粉症のアレルゲンに由来するＴ細胞エピトープペプチドについても、特異的Ｔ細胞に対する高い反応性を示すことから、経口投与によりＴ細胞の不応答化を誘導する能力を持つことが示唆されている（例えば、非特許文献１〜４参照）。このことから、Ｔ細胞エピトープペプチドをペプチドワクチンとしてスギ花粉症の治療への応用が期待されていたものの、実際の応用形態については、未開発の状態であった。
【０００４】
アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープを実際に有用な植物へ集積させる方法、および集積された有用な植物等については、これまでのところ知られていなかった。
【０００５】
【非特許文献１】
ヒラハラ・カズキ（Ｋａｚｕｋｉ  Ｈｉｒａｈａｒａ）ら著，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  Ｖｏｌ．  １０２，  ｐ．９６１−９６７，  １９９８年
【０００６】
【非特許文献２】
ヒラハラ・カズキ（Ｋａｚｕｋｉ  Ｈｉｒａｈａｒａ）ら著，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  Ｖｏｌ．  １０８，  ｐ．９４−１００，  ２００１年
【０００７】
【非特許文献３】
ソネ・トシオ（Ｔｏｓｈｉｏ  Ｓｏｎｅ）ら著，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｐ．４４８−４５７，  １９９８年
【０００８】
【非特許文献４】
ヨシトミ・トモミ（Ｔｏｍｏｍｉ  Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ）ら著，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １０７，  ｐ．５１７−５２２，  ２００２年
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｔ細胞エピトープペプチドをペプチドワクチンとしてスギ花粉症の治療もしくは予防のために応用するために、該エピトープを集積させた植物を開発することにある。より詳しくは、本発明は、アレルゲン特異的Ｔ細胞エピトープを植物へ集積させる方法、および該エピトープを集積させた植物の提供を目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。本発明者らは、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ１およびＣｒｙｊ２に見られる抗原提示細胞（マクロファージ）により提示される、ヒトの７個の主要な１２〜１９アミノ酸残基からなるＴ細胞エピトープを連結させたハイブリッドペプチド（７ｃｒｐ）をコードする人工遺伝子を作出し、この遺伝子をコメの可食部である胚乳に特異的に発現させることにより、Ｔ細胞エピトープペプチドが集積したコメの開発に成功した。
【００１１】
本発明のコメを食べること（経口投与）で免疫寛容の機構によりヘルパーＩＩ型のスギアレルゲン特異的なＴ細胞を不応答化または死滅化させて、根治的にスギ花粉症を治療することが可能であるものと考えられる。
【００１２】
本発明におけるヒトＴ細胞エピトープをコメの胚乳中に集積させる手法として、７ｃｒｐペプチドを直接種子中に集積させる方法、およびイネの主要な貯蔵タンパク質であるグルテリンの可変領域の中に挿入し、グルテリン貯蔵タンパク質の一部として発現・集積させる方法が開発された。本発明によるこれらの手法により、イネ種子中でＴ細胞エピトープ７連結ペプチド（７ｃｒｐ）を高度に集積させることに成功した。該種子では、１粒あたり最大６０μｇ  のＴ細胞エピトープ連結ペプチドが集積した。この集積量は、種子に含まれる全タンパク質の約４  ％に相当する。
【００１３】
こうした可食部に集積させたアレルゲンのエピトープペプチドは、高度に集積されている場合、経口で摂取することで、こうしたアレルゲンに由来するアレルギー反応を免疫寛容機構で治療することが可能になる。
【００１４】
これまでにマウスを対象としてマウスＴ細胞エピトープ連結ペプチドを経口投与した研究が報告され、４０〜２００μｇまたは２．５〜２５０μｇの投与により免疫寛容が誘導されることが示されている（Ｈｉｒａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．    Ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｌｌｅｒｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＨ１  ａｎｄ  ＴＨ２  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｃｒｙｊ２−ｐｒｉｍｅｄ  ｍｉｃｅ  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ    １９９８  １０２，  ９６１−９６７、Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００２，  １０７，５１７−５２２）。この結果をヒトに適応すると、マウス重量を２０ｇ、ヒトの重量を６０ｋｇと仮定したとき、ヒトにおいて免疫寛容を誘導するために必要なＴ細胞エピトープ連結ペプチドの量は７．５ｍｇ（２．５μｇ）〜２５０ｍｇと推定される。この推定必要量の場合は、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドを生産する種子（１粒あたり３０μｇ集積する種子の場合、１種子の重量は約２０ｍｇ）３．７５ｍｇ〜３７５ｍｇが必要となり、その種子量で換算すると２．５ｇ〜２５０ｇで充分であることから、日常の食事量（１００ｇ〜１５０ｇ）で充分免疫寛容できる量といえる。従って、本発明で開発したＴ細胞エピトープ連結ペプチドを生産するイネは、スギ花粉症に対する食べるワクチンとして現実的に機能することが強く期待される。
【００１５】
さらに、本発明の方法で集積させた７ｃｒｐペプチドは、胚乳中での集積部位が異なることから、粘膜免疫系を介した誘導機構も若干異なると期待される。
【００１６】
また、本発明の形質転換体種子に対する２０分間の加熱処理の前後で、種子中のＴ細胞エピトープ連結ペプチドに変化が認められないことから、お米を炊飯してもＴ細胞エピトープ連結ペプチドが安定に存在することが分かった。また、お米の主要なアレルゲンタンパク質についても大きな変化は認められないことや、アレルギーを引き起こす可能性のある糖鎖はＴ細胞エピトープ連結ペプチドには結合していないことなど、現在までの研究において、花粉症に対する食べるワクチンとしての機能や安全性に関して、危険性を危惧されるような知見は得られていない。
【００１７】
さらに、従来の大腸菌等の培養によるペプチドタンパク質の生産に比較して、安価に生産できる。すなわち１種子からイネの場合、１０００〜２０００個の種子を作出できる。また種子で生産できることから、精製することなく、そのまま経口摂取できる。種子で生産されたペプチドは極めて安定であり、室温で種子を放置しても１年以上分解、活性が失われることがない。またタンク培養と比較して、生産量をコントロールことが容易である。播種するタネの数で生産量をコントロールできる。
【００１８】
上記の如く本発明者らは、アレルゲン特異的Ｔ細胞エピトープを植物へ集積させる方法、および該エピトープを集積させた植物の開発に成功し、本発明を完成させた。より詳しくは、本発明は、
〔１〕  貯蔵タンパク質プロモーターの制御下に以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡが配置された構造を有するＤＮＡ、
（ａ）アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡの５’末端に貯蔵タンパク質シグナル配列をコードするＤＮＡ、および／または３’末端に小胞体係留シグナル配列をコードするＤＮＡが付加されたＤＮＡ
（ｂ）アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドのＮ末端に貯蔵タンパク質シグナル配列、および／またはＣ末端に小胞体係留シグナル配列が付加されたポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｃ）貯蔵タンパク質の可変領域へ、アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドが挿入された構造を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
〔２〕  Ｔ細胞エピトープペプチドが、ヒトＴ細胞エピトープを少なくとも２個以上、好ましくは７回連結させたものである、〔１〕に記載のＤＮＡ、
〔３〕  ヒトＴ細胞エピトープを７個連結させたものである、〔２〕に記載のＤＮＡ、
〔４〕  貯蔵タンパク質プロモーターが、グルテリンＧｌｕＢ−１プロモーターである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔５〕  小胞体係留シグナル配列が、ＫＤＥＬ配列、ＳＥＫＤＥＬ配列、またはＨＤＥＬ配列である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＤＮＡ、
〔６〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡを含む、Ｔ細胞エピトープ集積植物作製用ベクター、
〔７〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡ、または〔６〕に記載のベクターを保持する宿主細胞、
〔８〕  アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープを植物に集積させる方法であって、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＤＮＡ、または〔６〕に記載のベクターを植物へ導入することを特徴とする方法、
〔９〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、Ｔ細胞エピトープを植物に集積させる方法、
（ａ）アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡを取得する工程、
（ｂ）前記（ａ）で取得されたＤＮＡの５’末端に貯蔵タンパク質シグナル配列をコードするＤＮＡ、および／または３’末端に小胞体係留シグナル配列をコードするＤＮＡを付加する工程、
（ｃ）前記（ｂ）のＤＮＡを、植物において貯蔵タンパク質プロモーターの制御下で発現させる工程
〔１０〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、Ｔ細胞エピトープを植物に集積させる方法、
（ａ）アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡを取得する工程、
（ｂ）前記（ａ）のＤＮＡを、植物の貯蔵タンパク質の可変領域をコードするＤＮＡ領域へ挿入し発現させる工程
〔１１〕  貯蔵タンパク質がグルテリンである、〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法、
〔１２〕  エピトープペプチドが、ヒトＴ細胞エピトープを少なくとも２個以上、好ましくは７回連結させたものである、〔８〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法、
〔１３〕  アレルゲンがスギ花粉アレルゲンである、〔８〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１４〕  スギ花粉アレルゲンがＣｒｙｊ１およびＣｒｙｊ２である、〔１３〕に記載の方法、
〔１５〕  Ｔ細胞エピトープが植物の可食部位に集積されることを特徴とする、〔８〕〜〔１４〕のいずれかに記載の方法、
〔１６〕  可食部位が種子である、〔１５〕に記載の方法、
〔１７〕  植物が被子植物である、〔８〕〜〔１６〕のいずれかに記載の方法、
〔１８〕  被子植物がイネ科植物である、〔１７〕に記載の方法、
〔１９〕  イネ科植物がイネである、〔１８〕に記載の方法、
〔２０〕  〔８〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法により作出される、Ｔ細胞エピトープが集積したトランスジェニック植物、
〔２１〕  〔２０〕に記載の植物の子孫またはクローンである、トランスジェニック植物、
〔２２〕  〔２０〕または〔２１〕に記載の植物に由来する細胞、
〔２３〕  〔２０〕または〔２１〕に記載の植物の繁殖材料、
〔２４〕  〔２０〕または〔２１〕に記載の植物の種子、
〔２５〕  熱に安定であることを特徴とする、〔２４〕に記載の種子、
〔２６〕  〔１９〕に記載の方法により作出される、Ｔ細胞エピトープが集積したコメ、
〔２７〕  〔２４〕もしくは〔２５〕に記載の種子、または〔２６〕に記載のコメを有効成分とする、アレルギー性疾患の治療または予防のための食品組成物、
〔２８〕  アレルギー性疾患がＩ型アレルギーである、〔２７〕に記載の食品組成物、
〔２９〕  Ｉ型アレルギーが花粉症またはダニアレルギーである、〔２８〕に記載の食品組成物、
〔３０〕  花粉がスギ、ヒノキ、ハンノキ、ブタクサ、またはカモガヤである、〔２９〕に記載の食品組成物、
〔３１〕  アレルギーが食物アレルギーである、〔２７〕に記載の食品組成物、
〔３２〕  食物がソバである、〔３１〕に記載の食品組成物、
〔３３〕  〔８〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法を用いた、Ｔ細胞エピトープが集積したトランスジェニック植物の製造方法、
〔３４〕  〔１９〕に記載の方法を用いた、Ｔ細胞エピトープが集積したコメの製造方法、を提供するものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明は、アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープを植物へ集積させる方法を提供する。
本発明は、アレルゲンを抗原として抗原提示細胞（マクロファージ）によって提示されるＴ細胞抗原決定基（エピトープ）を、植物中において発現させることを特徴とする方法である。本発明において「アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープ」とは、アレルゲンを抗原として抗原提示細胞によって提示されるＴ細胞エピトープを言う。
【００２０】
アレルゲンとは一般的に、アレルギー疾患（アレルギー反応）の原因となる抗原物質を言う。本発明におけるアレルゲンには、特に限定されるものではないが、タンパク質、糖タンパク質等の自然界にある物質のみならず、合成されたタンパク質も含まれる。自然界におけるアレルゲンとしては、例えば、花粉（スギ、ヒノキ、ハンノキ、ブタクサ、イネ科のカモガヤ花粉等）アレルゲン、動物（イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウマ、ウシ等）由来アレルゲン、昆虫アレルゲン、寄生虫アレルゲン、食物アレルゲン、カビアレルゲン等を挙げることができる。
【００２１】
本発明において好適に使用されるアレルゲンとしては、花粉アレルゲン、ダニアレルゲン、食物アレルゲン等を挙げることができ、さらに好ましくは、スギ花粉由来の花粉アレルゲンである。より具体的には、上記スギ花粉アレルゲンとして、Ｃｒｙｊ１（Ｈ．  Ｙａｓｕｅｄａ，  Ｙ．  Ｙｕｉ，  Ｔ．  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｔ．  Ｓｈｉｄａ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｆｒｏｍ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃｅｄａｒ  （Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）  ｐｏｌｌｅｎ．  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８３；  ｖｏｌ．  ７１，  ｐ．  ７７−８６．；  Ｔ  Ｓｏｎｅ，  Ｎ．  Ｋｏｍｉｙａｍａ，  Ｋ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｔ  Ｋｕｓａｋａｂｅ，  Ｋ．  Ｍｏｒｉｋｕｂｏ  ａｎｄ  Ｋ  Ｋｉｎｏ    Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｃｒｙ  ｊＩ，ａ  ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃｅｄａｒ  ｐｏｌｌｅｎ    Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １９９，  ６１９−６２５  （１９９４））またはＣｒｙｊ２（Ｍ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  Ｓ．  Ｉｎｏｕｅ，  Ｍ．  Ｔａｎｉａｉ，  Ｓ．  Ａｎｄｏ，  Ｍ．  Ｕｓｕｉ，  Ｔ．  Ｍａｔｕｈａｓｉ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃｅｄａｒ  ｐｏｌｌｅｎ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  １９９０；  ｖｏｌ．  ４５，  ｐ．  ３０９−３１２．；  Ｎ  Ｋｏｍｉｙａｍａ，  Ｔ  Ｓｏｎｅ，  Ｋ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｋ  Ｍｏｒｉｋｕｂｏ  ａｎｄ  Ｋ  Ｋｉｎｏ，  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｙ  ｊ  ＩＩ，  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃｅｄａｒ  ｐｏｌｌｅｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ  ２０１，，  １０２１−１０２８  （１９９４））等を例示することができる。また、上記「食物」として、例えば、ソバ、コムギ、卵、牛乳、落花生等を挙げることができる。
【００２２】
上記方法に使用されるＴ細胞抗原決定基（本明細書においては、「エピトープ」もしくは「エピトープペプチド」と記載する場合あり）は、通常、上記のアレルゲンが抗原提示細胞によって分解され（抗原処理され）、細胞表面に提示される抗原ペプチド、もしくは該ペプチドの部分領域である。即ち、本発明のエピトープは、Ｔ細胞レセプターによってアレルゲン由来抗原ペプチドとして認識し得るようなペプチドであれば、そのアミノ酸配列は、特に制限されない。
【００２３】
本発明のＴ細胞エピトープは、特に制限されるものではないが、好ましくは、ヒトＴ細胞エピトープである。
【００２４】
本発明のエピトープ（エピトープペプチド）は、アレルゲンの種類等によりそのペプチド長は異なるため、特定することは困難であるが、通常、約１０〜２５アミノ酸残基からなり、より好ましくは１２〜１９アミノ酸残基からなる。
【００２５】
また、本発明のエピトープは、好ましくはヒトＴ細胞エピトープを２個以上連結させたものがよい。２個以上連結させることにより、免疫寛容機構の誘導効果が上昇することが期待される。より具体的には、本発明のエピトープとして、後述の実施例で示すようにエピトープを７個連結させたペプチド（例えば、７ｃｒｐ（配列番号：１）等）を好適に使用することができる。また、複数個連結させた、例えば７ｃｒｐ等のエピトープペプチドを、さらに２回（配列番号：２）、３回と複数回タンデムに繋いだペプチドもまた、本発明に利用可能である。
【００２６】
エピトープを利用したペプチド免疫の場合、個々人の遺伝子型により認識されるエピトープが異なるため、多くのひとに効果を持たせるために、本発明においては複数のエピトープが好適に使用される。
【００２７】
本発明の方法の好ましい態様においては、本発明のエピトープを植物体内において貯蔵タンパク質プロモーターの支配下（制御下）で発現させる方法である。より具体的には、まずアレルゲン特異的なヒトＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡを取得し（工程（ａ））、次いで、工程（ａ）で取得されたＤＮＡの５’末端に貯蔵タンパク質シグナル配列をコードするＤＮＡ、および／または３’末端に小胞体係留シグナル配列をコードするＤＮＡを付加する（工程（ｂ））。次いで、前記（ｂ）のＤＮＡを、植物において貯蔵タンパク質プロモーターの制御下で発現させる（工程（ｃ））。
【００２８】
本発明における貯蔵タンパク質とは、通常、植物体で主にエネルギー源として種子中に貯わえられるタンパク質を指す。貯蔵タンパク質としては、例えば、単純タンパク質であるグルテリン（ｇｌｕｔｅｌｉｎ）やプロラミン（ｐｒｏｌａｍｉｎ）を挙げることができる。本発明の貯蔵タンパク質としては、好ましくはグルテリンを示すことができる。グルテリンをコードする遺伝子のＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号は、Ｘ５４３１４（Ｏ．ｓａｔｉｖａ  ＧｌｕＢ−１  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｇｌｕｔｅｌｉｎ）であり、該遺伝子のｃＤＮＡのアクセッション番号は、ＸＯ５６６４である。
【００２９】
本発明におけるプロモーターは、発現させたい遺伝子の種類や導入する細胞の種類に応じて、当業者においては公知のプロモーターを適宜選択、もしくは改変して使用することができる。本発明の好ましい態様においては、貯蔵タンパク質プロモーターが利用することができる。本発明において用いられる貯蔵タンパク質プロモーターの一例を示せば、グルテリンＧｌｕＢ−１プロモーターを挙げることができる。該プロモーターの長さは、通常１．３ｋｂ以上であり、好ましくは２．３ｋｂ以上であるが、本発明のプロモーターと同等の機能を有する限り、この長さに特に制限されるものではない。好ましくは、２．３ｋ  ＧｌｕＢ−１プロモーターを挙げることができる。通常、プロモーターを長くすることにより、下流に存在する遺伝子によってコードされるタンパク質の発現・集積効率が高くなる。グルテリンＧｌｕＢ−１プロモーターは強力なプロモーター活性を有するため、イネまたはイネ以外の穀類についても好適に使用することができる。
【００３０】
上記工程（ａ）におけるアレルゲン特異的なヒトＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。アレルゲンの由来となる生物（例えば、イネ等）からのゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、アレルゲンの由来となる生物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作成し、これを展開して、アレルゲン特異的なヒトＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列情報を基に作製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明のアレルゲン特異的なヒトＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡに特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、アレルゲンの由来となる生物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
【００３１】
本発明のエピトープペプチドをコードするＤＮＡは、好ましくは、該ペプチドのアミノ酸配列情報を基に、適宜、人工的に合成することも可能である。その際、貯蔵タンパク質遺伝子でよく使用されるコドンを参考に、アミノ酸の縮重等を考慮して目的のＤＮＡを合成することができる。また、本発明のエピトープペプチド、例えば、７ｃｒｐを用いる場合、イネ種子で効率良く翻訳されるように、該ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、イネ種子貯蔵タンパク質遺伝子において高頻度に使用されるコドンを使用して作製することができる。
【００３２】
本発明において好適に使用されるコドンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、表１のコドンを示すことができる。
【００３３】
【表１】
2004321079.tif 000002
【００３４】
ＤＮＡの合成は、当業者においては、市販のＤＮＡ合成機等を利用して、適宜実施することができる。
【００３５】
上記工程（ｂ）における貯蔵タンパク質シグナル（ペプチド）配列としては、公知の種々の貯蔵タンパク質シグナル配列を、適宜、使用することが可能である。本発明の貯蔵タンパク質シグナル配列のアミノ酸配列に関する情報は、当業者においては公知の文献等により容易に入手することが可能である。貯蔵タンパク質シグナルは、本発明のエピトープペプチドを、小胞体へ移行させる働きを有し、該ペプチドが細胞質へ移行し分解を受けたり、あるいは細胞外へ分泌されることを防ぐ役割を担う。
【００３６】
本発明の貯蔵タンパク質シグナル配列としては、好ましくは、グルテリン（ＧｌｕＢ−１）タンパク質のシグナル配列を用いることができる。具体的には、本発明に使用可能な貯蔵タンパク質シグナル配列として、以下の配列を示すことができる。ＭＡＳＳＶＦＳＲＦＳＩＹＦＣＶＬＬＬＣＨＧＳＭＡ（配列番号：３）
また、他のグルテリン（ＧｌｕＡ−２）のシグナル配列である、ＭＡＳＩＮＲＰＩＶＦＦＴＶＣＬＦＬＬＣＤＧＳＬＡ（配列番号：４）、あるいは、２６ｋＤのグロブリンのシグナル配列である、ＭＡＳＫＶＶＦＦＡＡＡＬＭＡＡＭＶＡＩＳＧＡＱ（配列番号：５）を用いることも可能である。
【００３７】
また、本発明の小胞体係留シグナル（ＥＲ−ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）配列としては、例えば、ＫＤＥＬ配列、ＳＥＫＤＥＬ配列、またはＨＤＥＬ配列等を利用することができるが、これらに特に制限されるものではない。また、本発明の小胞体係留シグナル配列をコードするＤＮＡは、例えば、ＫＤＥＬ配列をコードするＤＮＡの下流の３’非翻訳領域を含んでいてもよい。この３’非翻訳領域は、特に制限されるものではないが、通常１００〜１０００  ｂｐ程度の長さである。一例を示せば、本発明の小胞体係留シグナル配列をコードするＤＮＡとして、ＫＤＥＬ配列をコードするＤＮＡと該ＤＮＡの下流の約６５０ｂｐ程度のグルテリン３’非翻訳領域を含む領域を合わせたＤＮＡを示すことができる。一般的に、上記３’非翻訳領域として、グルテリン等の貯蔵タンパク質遺伝子の３’非翻訳領域を好適に使用することができる。また、ＮＯＳターミネータ、または３５ＳＣａＭＶターミネータを使用することも可能である。上記の配列は、種子等の貯蔵部位において、外来タンパク質の集積量を向上させる機能を有する。
【００３８】
上記貯蔵タンパク質シグナル配列または小胞体係留シグナル配列をコードするＤＮＡは、当業者においては、アミノ酸配列の縮重等を考慮して、適宜、市販のＤＮＡ合成機等を利用して取得（合成）することができる。
【００３９】
また、工程（ａ）で取得されるＤＮＡの５’末端への貯蔵タンパク質シグナル配列をコードするＤＮＡの付加、および３’末端に小胞体係留シグナル配列をコードするＤＮＡの付加は、当業者においては、公知の遺伝子工学技術を利用して行うことができる。上記の「５’末端」または「３’末端」とは、通常、プロモーターから転写を受ける方向が、５’末端→３’末端であるような向きを示す末端として定義される。従って、プロモーター側（方向）のＤＮＡの末端部は、「５’末端」として定義される。
【００４０】
上記工程（ｃ）において、ＤＮＡを植物体内において貯蔵タンパク質プロモーターの制御下で発現させるためには、通常、該ＤＮＡの発現が可能なように貯蔵タンパク質プロモーターと該ＤＮＡとを結合させたＤＮＡを植物体へ導入することによって実施することができる。プロモーターの制御を受けるように該プロモーターの下流に発現させたい所望のＤＮＡを配置させることは、当業者においては一般的な遺伝子工学技術を用いて容易に行い得ることである。
【００４１】
また、本発明の方法によってエピトープの集積が可能な植物としては、特定の種に限定されるものではないが、通常、被子植物であり、好ましくは単子葉植物であり、より好ましくはイネ科植物である。本発明の植物は、双子葉植物であってもよく、例えば、双子葉植物の種子プロモーター（例えば、子葉や胚特異的）を利用することにより、マメ等の植物へもエピトープを集積させることが可能である。また、イネ科植物の例としては、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ等の穀類を挙げることができるが、本発明の植物として最も好ましくは、イネである。本発明の方法においては、使用するプロモーターを植物の種類を考慮して、適宜選択することにより、多くの種類の植物においてエピトープを集積させることが可能である。
【００４２】
本発明の方法においてエピトープが集積される植物体における部位が、可食部位である場合には、例えば、該部位をヒトが食することにより、本発明のエピトープを容易に体内に取り入れることが可能である。例えば、本発明の植物がイネである場合には、エピトープを胚乳中に集積させることが可能である。
【００４３】
本発明の方法は、Ｔ細胞エピトープが、好ましくは植物体の可食部位に集積されることを特徴とする有用な方法である。可食部位は、植物の種類によって異なるため、必ずしも限定されるものではないが、例えば、種子、葉、根等を挙げることができる。
【００４４】
集積部位として、より具体的には、イネ、コムギ、トウモロコシ等の場合胚乳、ダイズなどのマメの場合子葉や胚、ジャガイモ等の塊茎、にんじんの根、トマト、バナナ等の果実を挙げることができる。
【００４５】
本発明の上記方法において使用される本発明のエピトープを植物体内において発現し得るＤＮＡもまた、本発明に含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、貯蔵タンパク質プロモーターの制御下に以下のいずれかに記載のＤＮＡが配置された構造を有するＤＮＡを示すことができる。
（ａ）アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡの５’末端に貯蔵タンパク質シグナル配列をコードするＤＮＡ、および／または３’末端に小胞体係留シグナル配列をコードするＤＮＡが付加されたＤＮＡ
（ｂ）アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドのＮ末端に貯蔵タンパク質シグナル配列、および／またはＣ末端に小胞体係留シグナル配列が付加されたポリペプチドをコードするＤＮＡ
【００４６】
上記の「貯蔵タンパク質プロモーターの制御下にＤＮＡが配置された」とは、該ＤＮＡの発現が可能なように貯蔵タンパク質プロモーターと該ＤＮＡとが結合していることを言う。即ち、プロモーターの転写の活性化に伴い、下流のＤＮＡの発現が誘導されるようにプロモーターと下流のＤＮＡが結合していることを指す。
【００４７】
また本発明の別の態様においては、Ｔ細胞エピトープを貯蔵タンパク質の中へ挿入し、該エピトープを貯蔵タンパク質の一部として発現・集積させる方法を提供する。
【００４８】
上記方法の好ましい態様においては、まず、アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドをコードするＤＮＡを取得し、次いで、該ＤＮＡを、植物の貯蔵タンパク質の可変領域をコードするＤＮＡ領域へ挿入し発現させる。
【００４９】
上記方法においてエピトープが挿入される貯蔵タンパク質における部位は、貯蔵タンパク質の可変領域であることが好ましい。「可変領域」とは、進化過程でアミノ酸配列の種類や長さなどで極めて変異に富んだ領域を言う。従って、外来ペプチドを挿入しても立体構造に影響を及ぼさないことから、外来ペプチドを貯蔵タンパク質の一部として集積することが可能であり、また貯蔵タンパク質の一部として挙動するため、導入した貯蔵タンパク質と同じ貯蔵部位に集積させることが可能である。
【００５０】
本発明の可変領域としては、例えばイネのグルテリンの場合、酸性サブユニットの３ヶ所（グルテリンＧｌｕＢ−１遺伝子の場合Ｎ末端からアミノ酸１４０，２１０、２７０〜３１０の領域）、および塩基性サブユニットのＣ末端領域を挙げることができ、これらの領域へ発現させたい所望の外来ペプチドを挿入することができる。また、上記のそれぞれの可変領域に本発明のエピトープを１個ずつ挿入することも可能である。また、グルテリンは１１Ｓグロブリンファミリー（ダイズのグリシニンやエンバクのグロブリンが仲間）に属し、このファミリーに属するグルテリン以外のタンパク質であっても、上記で例示した可変領域へ、外来ペプチドを挿入することができる。ただし、イネグロブリン（エンバクグロブリンとは異なる仲間）の場合には、Ｎ末端から１１０くらいの可変領域にエピトープを挿入することが可能である。
【００５１】
上記方法の一例を示せば、ヒトＴ細胞エピトープをグルテリン貯蔵タンパク質の一部として集積させるには、グルテリンＧｌｕＡ−２遺伝子、ｐＲＥＥ９９  ｃＤＮＡクローンのグルテリン前駆体コード領域のアミノ酸残基Ｎｏ２７５から３０５の間（酸性サブユニットコード領域）に７ｃｒｐコード領域９６アミノ酸配列を１個（１×７ｃｒｐ）、または２個（２×７ｃｒｐ）直列に挿入して、グルテリンの一部として発現させる方法が挙げられる。
【００５２】
上記方法において、本発明のエピトープをコードするＤＮＡを、貯蔵タンパク質の可変領域をコードするＤＮＡ領域へ挿入することは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術を用いて容易に行い得ることである。
【００５３】
上記方法において使用されるＴ細胞エピトープが貯蔵タンパク質の中へ挿入された構造を有するポリペプチドをコードするＤＮＡもまた、本発明に含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、貯蔵タンパク質プロモーターの制御下に、（ｃ）貯蔵タンパク質のアミノ酸配列中（好ましくは、可変領域）へ、アレルゲン特異的なＴ細胞エピトープペプチドが挿入された構造を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、を挙げることができる。通常、貯蔵タンパク質の上流に本来備わっているプロモーターを、上記のプロモーターとして利用することができる。
【００５４】
また本発明は、本発明のＤＮＡを含むベクター、および本発明のＤＮＡもしくは本発明のベクターを保持する宿主細胞を提供する。本発明のベクターとしては、本発明のＤＮＡを安定に保持するものであれば特に制限されない。本発明のベクターは、当業者においては、発現させたい植物の種類を適宜考慮して、公知の種々のベクターへ上記ＤＮＡをクローニングすることにより、作製することができる。公知ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４−１１．１１）。
【００５５】
本発明のベクターの一例として、後述の実施例に記載のベクターｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬを挙げることができる。本発明のベクターは、本発明のエピトープ集積方法に使用可能であり、Ｔ細胞エピトープ集積植物作製用ベクターとして有用である。
【００５６】
本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の公知の細胞が用いられる。ここでいう「宿主細胞」には、種々の形態の植物細胞が含まれ、その形態としては、植物体に再生可能なあらゆる種類の形態の植物細胞が含まれる。例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根、カルスなどが含まれるが、これらに制限されない。また、本ベクターの保存、複製等が目的の場合には、本発明の宿主細胞は、必ずしも植物由来の細胞である必要はなく、例えば、大腸菌、酵母または動物細胞等であってもよい。
【００５７】
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．１−９．９）、リポフェクタミン法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、マイクロインジェクション法等の公知の方法で行うことができる。
【００５８】
また本発明は、本発明の上記ＤＮＡもしくはベクターを植物へ導入することを特徴とするＴ細胞エピトープを植物に集積させる方法、並びに、本発明のＤＮＡもしくはベクターを植物へ導入することを特徴とするＴ細胞エピトープを集積した植物の製造方法に関する。本発明の好ましい態様においては、本発明の方法を用いた、Ｔ細胞エピトープが集積したトランスジェニック植物の製造方法、および、本発明の方法を用いた、Ｔ細胞エピトープが集積したコメの製造方法を提供する。
【００５９】
本発明のＤＮＡを利用して、アレルゲン特異的なヒトＴ細胞エピトープが集積した形質転換植物体を作製する場合には、例えば、本発明のＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を生育（再生）させる。植物体の生育（再生）は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉら  （１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １００：１５０３−１５０７参照）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を生育（再生）させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．  （１９９５）  Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅｄｓ．）  ｐｐ６６−７４）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を生育（再生）させる方法（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １００，  １５０３−１５０７）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を生育（再生）させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ９：  ９５７−９６２．）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を生育（再生）させる方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６：  ２７１−２８２．）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を適宜利用することができる。上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばＮａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９０，  ６７，  ３２５．）が用いられる。この方法によれば、ベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により植物細胞へ導入する。
【００６０】
また、本発明のＤＮＡまたはベクターを導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「植物細胞」は、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。
【００６１】
また、本発明のＤＮＡまたは核酸の導入により形質転換された植物細胞を効率的に選択するために、本発明のＤＮＡまたはベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用される選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００６２】
組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
【００６３】
形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、植物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることも可能である。
【００６４】
なお、このように生育（再生）された形質転換植物体へ導入された本発明のＤＮＡの存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのＤＮＡの抽出は、公知のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に準じて実施することができる。
【００６５】
さらに本発明は、本発明の方法によって作出される、Ｔ細胞エピトープが集積したトランスジェニック植物（形質転換植物）、該植物に由来する細胞を提供する。例えば、本発明の方法により、スギ花粉アレルゲンヒトＴ細胞エピトープを種子に集積させた植物は、スギ花粉症緩和作物として有用である。
【００６６】
一旦、本発明のＴ細胞エピトープが集積した形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明の方法により作出されるＴ細胞エピトープが集積したトランスジェニック植物の子孫またはクローン、該トランスジェニック植物あるいは子孫やクローン由来の細胞、繁殖材料、並びに種子が含まれる。本発明の種子は熱に安定な性質を有するものと期待される。本発明の好ましい態様においては、例えば、アレルゲン特異的なヒトＴ細胞エピトープが集積したコメ（イネ）を挙げることができる。
【００６７】
さらに本発明は、アレルギー性疾患の治療または予防のための食品組成物を提供する。本発明の食品組成物は、本発明の方法によって作出される植物のエピトープが集積した部位（例えば、種子、コメ）、またはこれらから抽出されるエピトープを含む抽出物から構成される。より具体的には、本発明の方法によって得られるエピトープが集積した種子もしくはコメ、またはこれらから抽出される成分を含む、アレルギー性疾患の治療または予防のための食品組成物である。本発明の「組成物」は、必ずしも、種子もしくはコメにさらに複数種の物質が添加されている必要はなく、本発明の種子またはコメのみから構成される食品であってもよい。
【００６８】
本発明の食品組成物は加熱等の調理法に供することも可能である。また、食品衛生上許容される配合物を混合して、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品等に加工して利用することができる。例えば安定化剤、保存剤、着色料、香料、ビタミン等の配合物を上記食品組成物に適宜添加し、混合し、常法により、錠剤、粒状、顆粒状、粉末状、カプセル状、液状、クリーム状、飲料等の組成物に適した形態とすることができる。
【００６９】
また本発明の方法によって作出される植物由来のエピトープが集積した部位（種子、コメ等）を有効成分とする、アレルギー性疾患の治療または予防のための医薬組成物も、本発明に含まれる。
【００７０】
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。代表的なアレルギー性疾患として例えば、花粉症、気管支喘息、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎、または昆虫アレルギー等を示すことができる。また、アレルギー性疾患は、通常、Ｉ〜ＩＶ型アレルギー反応を示す疾患に区別することができる。本発明のアレルギー性疾患としては、特に限定されるものではないが、好ましくはＩ型アレルギーである。Ｉ型アレルギーとしては、例えば、花粉症、ダニアレルギー、気管支喘息、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎等を挙げることができる。本発明のアレルギー性疾患として好ましくは、スギ花粉症またはダニアレルギーを挙げることができる。上記疾患に対応したアレルゲン特異的なエピトープを用いた本発明の方法によって、所謂テーラーメイド医療と呼ばれる治療への応用が期待される。
【００７１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕  Ｔ細胞エピトープ連結ペプチド発現プラスミドの作製とイネキタアケへの導入
スギ花粉アレルゲンＴ細胞エピトープ連結ペプチドをイネ種子中で発現させるための発現プラスミドを作製した。イネ種子主要タンパク質であるグルテリンＧｌｕＢ−１のプロモーター（従来は１．３ｋｂを用いていたが、本発明では２．３ｋｂを用いた；プロモーター活性は５倍以上高まる）、シグナル配列とＴ細胞エピトープ連結ペプチド遺伝子を連結した後、種子における外来遺伝子産物の集積量を向上させる機能を持つＥＲ係留シグナルＫＤＥＬ配列をＴ細胞エピトープ連結ペプチドの３’末端に付加することにより、発現プラスミドｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬを構築した。２．３Ｋｂ  ＧｌｕＢ−１プロモーター配列、グルテリンシグナル配列、７ｃｒｐエピトープ配列、ＫＤＥＬ配列、および０．６Ｋ  ＧｌｕＢ−１  ３’配列を有する実施例において使用したＤＮＡの塩基配列を配列番号：６に示し、該ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を配列番号：７に示す。
【００７２】
また、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチド発現に対するシグナル配列やＫＤＥＬ配列の作用を調べるため、ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬからシグナル配列を除いたプラスミドｐＧｌｕＢ７ＣｒｐＫＤＥＬやＫＤＥＬ配列を除いたプラスミドｐＧｌｕＢｓｉｇ７Ｃｒｐを構築した。
【００７３】
またイネの主要な貯蔵タンパク質であるグルテリン（ＧｌｕＡ−２）の酸性サブユニットの可変領域に７ｃｒｐペプチド配列を挿入して、７ｃｒｐペプチドをグルテリンの一部として発現させた。これらのプラスミドをアグロバクテリア法によりイネキタアケに導入して、ハイグロマイシン耐性を指標として形質転換体の選抜を行った。これらの解析にはそれぞれのコンストラクトについて３０系統以上の形質転換体を用いた。
【００７４】
〔実施例２〕  形質転換体種子におけるＴ細胞エピトープ連結ペプチドの検出
シグナル配列を持たないｐＧｌｕＢ７ＣｒｐＫＤＥＬ形質転換体の登熟種子から全ＲＮＡ画分を回収して、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチド遺伝子をプローブとしたノーザン解析を行った。その結果、３２系統のうち２７系統で転写産物が検出されたことから、種子におけるＴ細胞エピトープ連結ペプチドの集積が期待された。
【００７５】
そこで、完熟種子からタンパク質を抽出して電気泳動で分離した後、ＣＢＢ染色あるいは特異抗体を用いたウェスタンブロット解析により可視化した。その結果、期待に反して、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドのシグナルは検出されなかった。その理由として、シグナル配列を持たないため、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドが粗面小胞体に移行せず細胞質へと移行して分解を受けているか、あるいは細胞外へ分泌されていることが考えられる。
【００７６】
次に、シグナル配列を持つｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬ形質転換体の解析を行った。登熟種子から調製した全ＲＮＡ画分に対するノーザン解析の結果、３４系統のうち２９系統で転写産物のシグナルが検出され、特に１番、５番、１０番の系統で強いシグナルが認められた（図１）。そこで、系統番号１０番の完熟種子から全タンパク質を調製して解析した結果、非形質転換体では認められない分子量約１１，０００の移動度を示すシグナルが検出された。この見かけの分子量はＴ細胞エピトープ連結ペプチドの遺伝子配列から推定される分子量１１，２２９とよく一致することから、このシグナルがＴ細胞エピトープ連結ペプチドに由来するものであると判断した。
【００７７】
次に、ウェスタンブロット解析におけるシグナル強度を指標として、種子中のＴ細胞エピトープ連結ペプチドの集積量を推定した。シグナル強度の基準タンパク質として、大腸菌で発現させ精製したＴ細胞エピトープ連結ペプチド−ヒスチジンタグ融合タンパク質を使用した。その結果、１番、１０番、１５番、１７番、３１番、３４番などの系統で比較的多くのＴ細胞エピトープ連結ペプチドが蓄積した。このうち、最も高い集積量が認められた系統番号１０番の種子では、全種子タンパク質の４  ％に相当する６０μｇのＴ細胞エピトープ連結ペプチドの集積が確認された。
【００７８】
一方、ＫＤＥＬ配列を除いたｐＧｌｕＢｓｉｇ７Ｃｒｐ形質転換体について解析した結果、３８系統のうち２５系統で転写産物が検出され、完熟種子タンパク質に対するウェスタン解析の結果、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドの蓄積が認められた。しかし、ＫＤＥＬ配列を持つ  ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬ形質転換体と比較すると、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドの蓄積量は大きく減少しており、最も高い蓄積量を示した系統の種子でも、全種子タンパク質の１．１  ％  に相当する１６μｇであった（図２）。
【００７９】
以上の結果から、ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬプラスミドの導入により、イネ種子でのＴ細胞エピトープ連結ペプチドの生産に成功したこと、そしてＴ細胞エピトープ連結ペプチドの発現にはシグナル配列が必須であること、ＫＤＥＬ配列の付加により集積量が向上することが分かった。
【００８０】
〔実施例３〕  イネに導入したＴ細胞エピトープ連結ペプチド遺伝子の検出
形質転換体のゲノムに導入されたＴ細胞エピトープ連結ペプチド遺伝子を検出してそのコピー数を同定するため、サザンブロット法による形質転換体のゲノムＤＮＡの解析を行った。得られた形質転換体のうちＴ細胞エピトープ連結ペプチドの発現量の高い系統の形質転換体の葉からゲノムＤＮＡを調製して制限酵素Ｓａｃ  Ｉで処理した後、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチド遺伝子の全領域をプローブとして用いたサザンブロット解析を行った。形質転換に用いたプラスミドはＳａｃ  Ｉにより１箇所だけ切断されることから、サザン解析で検出されるバンドの数がイネゲノムに導入されたＴ細胞エピトープ連結ペプチド遺伝子のコピー数に相当する。サザンブロット解析の結果、ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬ形質転換体では、１番では２コピー、１０番では４コピー、１７番では２コピーのＴ細胞エピトープ連結ペプチド遺伝子が形質転換体のゲノムに導入されていることが確認された。また、ｐＧｌｕＢｓｉｇ７Ｃｒｐ形質転換体では、１７番で２コピー、１９番で１コピー、２５番では２コピーの遺伝子の導入が確認された（図３）。
【００８１】
〔実施例４〕  イネ種子におけるＴ細胞エピトープ連結ペプチドの発現特性
Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドの発現量が最も高いｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬの系統番号１０番の種子に対して、種子登熟期におけるＴ細胞エピトープ連結ペプチドの発現経過を解析するため、開花後種々の時点で種子からタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットにより解析した。Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドのシグナルは、開花後  ５日後に初めて検出され、その後徐々に増加し、完熟種子のレベルに至った。この結果は、ＧｌｕＢ−１タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて解析した  ＧｌｕＢ−１  タンパク質の発現経過とよく一致している（図４）。
【００８２】
同様に、ノーザン分析により種子登熟過程での７ｃｒｐ遺伝子の発現パターンを調査した。７ｃｒｐ  ｍＲＮＡの発現レベルは開花後１５日目でピークになり、その後減少することが示された。この発現パターンは７ｃｒｐ遺伝子の発現に用いたグルテリン遺伝子プロモーターときわめて類似していた（図５）。また、タンパク質同様、他の組織での発現はｍＲＮＡレベルでも検出されなかった。
【００８３】
次に、ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬ  １０番の種子におけるＴ細胞エピトープ連結ペプチドの発現部位を解析するため、登熟種子を胚、胚乳、穎に分離した後、それぞれの画分からタンパク質を抽出して、ウェスタンブロット解析を行った。その結果、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドのシグナルは、胚乳にのみ検出され、胚、穎、葉から抽出した試料ではシグナルは検出されなかった（図６）。また、形質転換体種子の断面切片を調製して特異抗体を用いた組織免疫染色解析を行ったところ、やはりＴ細胞エピトープ連結ペプチドのシグナルは、胚乳にのみ検出され、胚では検出されなかった。これらのことから、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドは、形質転換体種子の胚乳に特異的に蓄積されることが確認された。これらの結果は、ＧｌｕＢ−１タンパク質や、ＧｌｕＢ−１プロモーターとシグナル配列を用いた外来タンパク質の発現部位と一致することから、本発明で作出したＴ細胞エピトープ連結ペプチドの発現系においても、ＧｌｕＢ−１プロモーターの特性が発揮されていることが示された。
【００８４】
また、世代が進んだ形質転換体種子におけるＴ細胞エピトープ連結ペプチドの蓄積量の変化の有無を検討する目的で、ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬ形質転換体１番、１０番、１７番の系統それぞれについて  Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３  完熟種子を回収し、種子から抽出したタンパク質に対するウェスタンブロット解析を行った。その結果、１番、１０番、１７番全ての系統について、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３  種子でＴ細胞エピトープ連結ペプチドのシグナルに変化は認められなかった。このことから、形質転換体の世代が進んでも、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドは種子で生産され、その集積量は変化しないことが分かった（図７）。
【００８５】
〔実施例５〕  イネ種子で発現するＴ細胞エピトープ連結ペプチド産物の特性
Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドを最も多く集積するｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬ形質転換体１０番の種子を対象として、沸騰水中で２０分間加熱処理したときの種子中のＴ細胞エピトープ連結ペプチドの安定性を検討した。ウェスタンブロット解析によりＴ細胞エピトープ連結ペプチドのシグナルを比較した結果、加熱処理の前後で変化は認められなかった（図８）。このことから、炊飯器などでイネ種子を炊飯した後でも、種子中に集積したＴ細胞エピトープ連結ペプチドは安定であることが分かった。
【００８６】
また、いくつかのアレルゲンタンパク質では、アレルゲンに結合している糖鎖がアレルギー反応を引き起こす主要な原因であることが指摘されている。本発明で研究対象としているスギ花粉アレルゲン由来のＴ細胞エピトープ連結ペプチドの場合、一次構造配列上典型的なＮ−型糖鎖結合配列は存在しないことから、糖鎖は結合していないと考えられる。そこで、イネ種子で生産されたＴ細胞エピトープ連結ペプチドに対して、糖鎖が結合していないことをペプチドレベルで確かめる実験を行った。
【００８７】
エンドグリコシダーゼは、Ｎ−型糖鎖の結合部に作用して糖鎖を遊離する活性を持つ酵素であり、Ｎ−型糖鎖の解析に用いられている。Ｎ−型糖鎖が結合している場合は、エンドグリコシダーゼによりタンパク質から糖鎖が遊離されるため、反応の前後でタンパク質の分子量が変化する。そこで、イネの種子からＴ細胞エピトープ連結ペプチドを含むタンパク質画分を抽出してエンドグリコシダーゼと反応させ、ウェスタンブロットによりＴ細胞エピトープ連結ペプチドの分子量を解析した。その結果、エンドグリコシダーゼ反応前後でＴ細胞エピトープ連結ペプチドの分子量に変化が認められなかった（図９）。このことから、イネ種子で生産されたＴ細胞エピトープ連結ペプチドに対して、Ｎ−型糖鎖が結合していないことが示された。
【００８８】
一方、ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬ形質転換体種子中に集積したＴ細胞エピトープ連結ペプチドのＮ末端アミノ酸残基の同定を目的として、種子タンパク質を抽出して二次元電気泳動により分離してＰＶＤＦ膜に転写した後、特異抗体によりＴ細胞エピトープ連結ペプチドのシグナルを検出した。その結果、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドは塩基性タンパク質としての挙動を示した。この結果は、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドのアミノ酸配列から求められる推定等電点が  ９．７６であることと符合する。
【００８９】
このＴ細胞エピトープ連結ペプチドのスポットを回収して、Ｎ末端アミノ酸配列解析を依頼した。その結果、Ｎ末端アミノ酸残基の同定は困難であり、Ｎ末端が修飾を受けていることが示唆された。そこで、被修飾末端を解析する方法として現在使用可能な試薬である、Ｎ−ホルミル基、Ｎ−ピログルタミル基、Ｎ−アセチル基それぞれの修飾基を特異的に遊離する酵素を利用して、それぞれの修飾基を除去した後、Ｎ末端アミノ酸配列解析を行うことにより、Ｎ末端残基の同定を試みた。しかし、Ｔ細胞エピトープ連結ペプチドのＮ末端のアミノ酸残基を同定することはできなかった。このことから、種子中のＴ細胞エピトープ連結ペプチドのＮ末端は、ホルミル基、ピログルタミル基、アセチル基以外の修飾を受けていることが示唆された。
【００９０】
〔実施例６〕  Ｔ細胞エピトープ連結ペプチド発現系の導入によるイネアレルゲンタンパク質への影響
ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬの導入による種子の主要アレルゲンタンパク質への影響を調べるため、これらのアレルゲンに対する特異抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った。その結果、非形質転換体種子と比較して、ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬ  １０番の種子では、グルテリンＡの前駆体の増加及び１４  −  １６  ｋ  アレルゲンタンパク質の減少が認められた。現在、これらの差異が認められる理由は不明である。その他のアレルゲン（２６ｋおよび３３ｋ  グロブリン）に対する抗体を使用した場合では、アレルゲンタンパク質のシグナルに認められるような変化はなかった（図１０）。
【００９１】
〔実施例７〕  ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼプロモーターによるＴ細胞エピトープ連結ペプチドの集積
スギ花粉アレルゲンＴ細胞エピトープ連結ペプチドをイネ種子中で発現させるための発現プラスミドを作製した。ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼのプロモーター、シグナル配列とＴ細胞エピトープペプチドを連結した後、ＫＤＥＬ配列、Ｎｏｓ−Ｔ配列を３’末端に付加することにより、発現プラスミドｐＡＧＰａｓｅ  ｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬを構築した。プラスミドの構造を図１１上段に示す。
【００９２】
次に、７ｃｒｐ遺伝子の発現パターンを調査したところ、種子の胚乳および胚又は維管束でも発現し、器官としては種子で最も強く発現したことから、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼプロモーターを用いても、種子で蓄積できることが分かった。
【００９３】
次に、得られた形質転換体完熟種子中の７ｃｒｐの集積量を、実施例２と同様にウェスタンブロットにより解析した。図１１中段に７Ｃｒｐ集積量の定量結果を示す。２．３  ｋ  ＧｌｕＢ−１  プロモーターを用いた場合に比べて７Ｃｒｐの集積量は減少していたが、多くの系統で７Ｃｒｐの集積が認められた。また、Ｔ０世代形質転換体の登熟期種子における７Ｃｒｐ遺伝子の転写産物を、ノーザン解析により検討した。結果を図１１下段の写真に示す。
【００９４】
上記よりグルテリンプロモーター以外のプロモーター（種子の胚乳および胚、または維管束でも発現し、器官としては種子で最も強く発現）を用いた場合であっても、本発明の集積方法を実施することが可能であることが示された。
【００９５】
〔実施例８〕  可変領域へ２個の７ｃｒｐを挿入した貯蔵タンパク質の集積
グルテリンＧｌｕＡ−２遺伝子のｃＤＮＡクローンｐＲＥＥ９９の可変領域に、２個の７ｃｒｐペプチドを直列に挿入し発現させた。図１２上段に、プラスミドｐＲＥＥ９９  ２ｘ７Ｃｒｐ  の構造を示す。
【００９６】
次に、得られた形質転換体完熟種子における７Ｃｒｐの集積量を、実施例２と同様にウェスタンブロットにより定量した。可変領域に挿入された２個の７Ｃｒｐは、グルテリンの一部として集積した。結果を図１２中段に示す。また、Ｔ０世代形質転換体の登熟期種子におけるｐＲＥＥ９９に挿入された７Ｃｒｐ遺伝子の転写産物をノーザン解析により検討した。結果を図１２下段の写真に示す。
【００９７】
【発明の効果】
本発明により、スギ花粉症を緩和（治療）する効果を持つＴ細胞エピトープ連結ペプチドのイネ種子における生産に成功した。本発明の成果によって、現在行われている化学合成法を用いたＴ細胞エピトープ連結ペプチド合成系や大腸菌での合成よりも、より低コストでの生産が可能になる。
【００９８】
種子中に蓄積されたＴ細胞エピトープペプチドは室温で貯蔵されても極めて安定である（１年以上）。また生産量の制御も容易である。また特別な施設も必要とせず、圃場のみである。さらに、日常の食生活を通じて経口摂取することにより、従来行われてきた皮下注射等による投与に必要な費用、医療費を省くことができ、より低コストでＴ細胞エピトープ連結ペプチドを投与することが可能になる。これらの利点を持つイネ種子生産システムを活用することにより、アレルギー疾患に対するワクチンや生活習慣病を緩和するペプチドなど、医学的に有用な成分をより低コストで生産して供給するという、新しい事業の創出も期待される。
【００９９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のベクター  ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬによる形質転換体における７Ｃｒｐの発現解析結果を示す図および写真である。上図は、プラスミド  ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬの構造を示す図である。グルテリンＧｌｕＢ−１  遺伝子の  ２．３  ｋプロモーターの制御により７Ｃｒｐ  が発現する。中図は、得られた形質転換体完熟種子における７Ｃｒｐ  集積量の定量結果を示す図であり、系統番号  ＃１、＃１０、＃１５、＃１７、＃３１、＃３４番などの種子で比較的高い集積量が認められる。下図は、Ｔ０世代の形質転換体の登熟期種子（開花後１５日ころ）における７Ｃｒｐ遺伝子の転写産物を解析したノーザン解析の結果を示す写真である。
【図２】本発明のベクターｐＧｌｕＢｓｉｇ７Ｃｒｐによる形質転換体における７Ｃｒｐの発現解析結果を示す図および写真である。上図は、プラスミドｐＧｌｕＢｓｉｇ７Ｃｒｐの構造を示す図であり、７Ｃｒｐ  の３’末端にＫＤＥＬ配列は付加されていない。中図は、得られた形質転換体完熟種子における７Ｃｒｐ集積量の定量結果を示す図である。図１の７Ｃｒｐ  ３’末端にＫＤＥＬ配列を付加した場合に比べて、７Ｃｒｐの集積量が減少している。下図は、Ｔ０世代形質転換イネ登熟期種子における７Ｃｒｐ遺伝子の転写産物を解析したノーザン解析の結果を示す写真である。
【図３】本発明のベクター  ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬによる形質転換体のゲノムＤＮＡのサザン解析の結果を示す写真である。非形質転換体イネおよび系統番号＃１、＃１０、＃１７、＃３４番形質転換体の葉から抽出したゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を、制限酵素Ｓａｃ  Ｉで消化し、０．９  ％  （ｗ／ｖ）アガロース電気泳動により分離した後、ナイロン膜へ転写した。その後、ラジオアイソトープで標識した７Ｃｒｐ遺伝子全長ＤＮＡをプローブとして７Ｃｒｐ遺伝子の検出を行った。
【図４】ウェスタン解析による種子登熟過程でのグルテリンと７Ｃｒｐペプチドの発現パターンを示す写真である。本発明のベクター  ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬによる形質転換体＃１０番の種子の全蛋白質を、開花後  ５、１０、１５、２０、２５日の時点で抽出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜へ転写した。その後、抗グルテリン抗体あるいは抗７Ｃｒｐ抗体を用いて、グルテリンあるいは７Ｃｒｐペプチドを検出した。
【図５】ノーザン分析による種子登熟過程でのグルテリン遺伝子と７Ｃｒｐ遺伝子の発現パターンを示す写真である。本発明のベクター  ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬ  による形質転換体＃１０番の種子、葉、茎それぞれの全ＲＮＡを抽出して、アガロースゲル電気泳動により分離し、ナイロン膜へ転写した。その後、ラジオアイソトープで標識したグルテリンあるいは７Ｃｒｐ遺伝子全長ＤＮＡをプローブとして、グルテリンあるいは７Ｃｒｐの転写産物を検出した。上図では２５Ｓおよび１７ＳのｒＲＮＡが可視化され、中図ではグルテリン、下図では７Ｃｒｐ  の転写産物の解析結果が示されている。
【図６】本発明のベクターｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬによる形質転換体＃１０番の種子中における７Ｃｒｐペプチドの集積部位の解析結果を示す写真である。左図は、胚乳、胚、穎、葉それぞれから抽出した蛋白質画分に対する抗７Ｃｒｐ抗体を用いたウェスタン解析の結果を示す。右図では、抗７Ｃｒｐ抗体を用いた登熟種子断面の組織免疫染色の結果が示されている。７Ｃｒｐのシグナルを可視化するため、抗ウサギＩｇＧアルカリフォスファターゼ標識抗体を用いた。
【図７】本発明のベクター  ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬ  による形質転換体のＴ１、Ｔ２、Ｔ３世代の種子における７Ｃｒｐペプチドの集積量を比較した結果の写真である。ホモ接合体として選抜し、生育させた形質転換体（系統番号＃１−３、＃１０−１、＃１０−４、＃１７−１）について、それぞれの世代の種子から全蛋白質を抽出して抗７Ｃｒｐ抗体を用いたウェスタン解析を行った。
【図８】本発明のベクターｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬによる形質転換体種子に集積した７Ｃｒｐペプチドの熱処理に対する安定性を解析した結果を示す写真である。形質転換体系統番号＃１０の種子を沸騰水中で２０分間加熱した後、全蛋白質を抽出してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。対照として、熱処理を行わない種子の全蛋白質を分離した。左図ではＣＢＢを用いて蛋白質を可視化し、右図では抗７Ｃｒｐ抗体を用いたウェスタン解析により７Ｃｒｐを検出した。
【図９】本発明のベクター  ｐＧｌｕＢｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬによる形質転換体種子に集積した７Ｃｒｐペプチドに対するＮ−結合型糖鎖の解析結果を示す写真である。まず、形質転換体系統番号  ＃１０の種子から抽出した全蛋白質画分をＮ−グリコシダーゼＦと反応させた。グリコシダーゼ反応のコントロール基質として、Ｎ−結合型糖蛋白質であるトランスフェリンおよびリボヌクレアーゼＢを用いた。次に、酵素との反応の前後での基質分子量の変化をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。左図では抗７Ｃｒｐ抗体を用いたウェスタン解析により、右図ではＣＢＢを用いた染色により、７Ｃｒｐペプチドや基質蛋白質の可視化を行った。
【図１０】７Ｃｒｐ  ペプチドの発現によるイネアレルゲン蛋白質の発現への影響を解析した結果を示す写真である。非形質転換体イネおよび形質転換体系統番号  ＃１０の種子から抽出した全蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、イネアレルゲン蛋白質それぞれを特異的に認識する抗体を用いたウェスタン解析により、アレルゲン蛋白質を検出した。
【図１１】本発明のベクターｐＡＧＰａｓｅｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬによる形質転換体における７Ｃｒｐの発現解析結果を示す図および写真である。上図は、プラスミドｐＡＧＰａｓｅ  ｓｉｇ７ＣｒｐＫＤＥＬの構造を示す図であり、７Ｃｒｐの発現はＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼのプロモーターにより制御される。中図は、得られた形質転換体完熟種子における７Ｃｒｐ集積量の定量結果を示す図である。２．３  ｋ  ＧｌｕＢ−１プロモーターを用いた場合に比べて７Ｃｒｐの集積量は減少しているが、多くの系統で７Ｃｒｐの集積が認められる。下図は、Ｔ０世代形質転換体の登熟期種子における７Ｃｒｐ遺伝子の転写産物を解析したノーザン解析の結果である。
【図１２】本発明のベクターｐＲＥＥ９９  ２ｘ７Ｃｒｐによる形質転換体における７Ｃｒｐの発現解析結果を示す図および写真である。上図は、プラスミド  ｐＲＥＥ９９  ２ｘ７Ｃｒｐ  の構造を示す図である。グルテリン  ＧｌｕＡ−２  遺伝子の  ｃＤＮＡ  クローン  ｐＲＥＥ９９  の可変領域へ、  ２  個の  ７Ｃｒｐ  が直列に挿入されている。中図は、得られた形質転換体完熟種子における  ７Ｃｒｐ  集積量の定量結果を示す図であり、可変領域に挿入された  ２  個の  ７Ｃｒｐ  はグルテリンの一部として集積する。下図は、Ｔ０  世代形質転換体の登熟期種子において  ｐＲＥＥ９９  に挿入された  ７Ｃｒｐ  遺伝子の転写産物を解析したノーザン解析の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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