(57)【要約】      （修正有）【課題】出来るだけ少ないサンプル量で、異常蛋白質の発現解析や遺伝子の発現解析を行うことが出来るマイクロアレイとそれを用いた蛋白質及び遺伝子の発現解析方法の提供。【解決手段】抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、疎水性のシートを貼り付けてなるマイクロアレイ及び該マイクロアレイを用いることを特徴とする蛋白質又は遺伝子の発現解析方法、並びに、抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、試料注入口となり得る間隙を残して、疎水性のシートを貼り付けてなるマイクロアレイ、就中、スライドガラス上の、少なくとも抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分の上面をカバーガラスで覆ってなる該マイクロアレイと、該マイクロアレイを用いることを特徴とする蛋白質又は遺伝子の発現解析方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、疎水性のシートを貼り付けてなるマイクロアレイ。
【請求項２】
疎水性のシートが１乃至複数枚のプラスチックシート、ラミネート紙又は／及びシリコーンシートである請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
疎水性のシートが、粘着シート又は粘着テープである請求項１又は２に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
貼付した疎水性のシート部分の厚さが０．５〜２ｍｍである請求項１〜３の何れかに記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、試料注入口となり得る間隙を残して、疎水性のシートを貼り付けてなるマイクロアレイ。
【請求項６】
疎水性のシートが１乃至複数枚のプラスチックシート、ラミネート紙又は／及びシリコーンシートである請求項５に記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
疎水性のシートが、粘着シート又は粘着テープである請求項５又は６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
貼付した疎水性のシート部分の厚さが０．０５〜０．５ｍｍである請求項５〜７の何れかに記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
スライドガラス上の、少なくとも抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分の上面をカバーガラス等で覆ってなる請求項５〜８の何れかに記載のマイクロアレイ。
【請求項１０】
抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、疎水性のシートを貼り付けてなるマイクロアレイを用いることを特徴とする蛋白質又は遺伝子の発現解析方法。
【請求項１１】
疎水性のシートが１乃至複数枚のプラスチックシート、ラミネート紙又は／及びシリコーンシートであるマイクロアレイを用いる請求項１０に記載の発現解析方法。
【請求項１２】
疎水性のシートが、粘着シート又は粘着テープであるマイクロアレイを用いる請求項１０又は１１に記載の発現解析方法。
【請求項１３】
疎水性のシート部分の厚さが０．５〜２ｍｍであるマイクロアレイを用いる請求項１０〜１２の何れかに記載の発現解析方法。
【請求項１４】
抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、試料注入口となり得る間隙を残して、疎水性のシートを貼り付けてなるマイクロアレイを用いることを特徴とする蛋白質又は遺伝子の発現解析方法。
【請求項１５】
疎水性のシートが１乃至複数枚のプラスチックシート、ラミネート紙又は／及びシリコーンシートであるマイクロアレイを用いる請求項１４に記載の発現解析方法。
【請求項１６】
疎水性のシートが、粘着シート又は粘着テープであるマイクロアレイを用いる請求項１４又は１５に記載の発現解析方法。
【請求項１７】
疎水性のシート部分の厚さが０．０５〜０．５ｍｍであるマイクロアレイを用いる請求項１４〜１６の何れかに記載の発現解析方法。
【請求項１８】
スライドガラス上の、少なくとも抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分の上面をカバーガラス等で覆ってなるマイクロアレイを用いる請求項１４〜１７の何れかに記載の発現解析方法。
【請求項１９】
蛋白質が異常蛋白質である請求項１０〜１８の何れかに記載の発現解析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、必要検体量がより少量化された、例えば癌等の異常蛋白質の発現解析や遺伝子の発現解析等に使用し得る新規なマイクロアレイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
既存の蛋白質の抗体アレイ（例えば、クロンテック社のＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓなど）の場合には、一回の抗体実験を行うために蛋白質量が１．１ｍｇ／ｍＬのものが最低１ｍＬは必要であり、そのためには細胞量や組織量（未処理組織）で〜１５０ｍｇが必要である。例えば、培養細胞では細胞の種類にもよるが、１００ｍｍφシャーレでおよそ４〜５枚分が必要であり、また組織量では、例えば癌細胞等の場合、ヒトの各臓器から癌と確実に判定される部位を１５０ｍｇ採取する必要があるが、この量はかなり進行度の高い癌のほぼ全量に相当する。剰え、採取法によっては、検体量が多く必要なあまりに正常組織も含まれかねない。
また、コントロールとしての正常組織もなるべく少ない採取量であるに超したことはないが、モデル実験動物の癌等については、例えば、マウス等では一匹から入手できる量は限られ、固体数を多くしてミックスすると、固体の効果はわからず、平均値となってしまうという問題点がある。
既存の抗体アレイでサンプル量が多く必要になる原因としては、スライドガラス上にスポットされた抗体と検体である蛋白質とを反応させる際に、インキュベーション用のトレイに蛋白質を含む溶液を入れ、その中にスライドガラスを浸して反応させるため、およそ５ｍＬのバッファー中に蛋白質を溶かすためであることなどが挙げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した如き現状に鑑みなされたもので、出来るだけ少ないサンプル量で、異常蛋白質の発現解析や遺伝子の発現解析を行うことが出来るマイクロアレイとそれを用いた蛋白質及び遺伝子の発現解析方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、疎水性のシートを貼り付けてなるマイクロアレイに関する。
【０００５】
また、本発明は、抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、試料注入口となり得る間隙を残して、疎水性のシートを貼り付けてなるマイクロアレイに関する。
【０００６】
更に、本発明は、抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、疎水性のシートを貼り付けてなるマイクロアレイを用いることを特徴とする蛋白質又は遺伝子の発現解析方法に関する。
【０００７】
更にまた、本発明は、抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、試料注入口となり得る間隙を残して、疎水性のシートを貼り付けてなるマイクロアレイを用いることを特徴とする蛋白質又は遺伝子の発現解析方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のマイクロアレイは、例えば、図１の（Ａ）（上面図）及び（Ｂ）（側面図）に示すように、抗体又はＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）がアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、疎水性のシート１乃至複数枚を貼り付けて、抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分をプール化した点に特徴を有する。
図１（Ａ）及び（Ｂ）中、１はスライドガラス、２は抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分、３は疎水性のシート、４は抗体又はＤＮＡのスポットである。
【０００９】
また、本発明のもう一つのタイプのマイクロアレイは、例えば、図２（Ａ）に示すように、抗体又はＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）がアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、試料注入口となり得る間隙を残して、疎水性のシート１乃至複数枚を貼り付けてなる点に特徴を有する。
そして、このタイプのマイクロアレイは、通常、スライドガラス上の、少なくとも抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分の上面をカバーガラス等で覆って（スライドガラス上の、少なくとも抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分の上面にカバーガラス等を密着させて）使用するが、その場合、即ち、少なくともアレイ化されている部分の上面をカバーガラス等で覆った場合の側面図（断面図）を図２（Ｂ）に示す。
図２（Ａ）及び（Ｂ）中、１はスライドガラス、２は抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分、３は疎水性のシート、４は抗体又はＤＮＡのスポット、５は試料注入口（間隙部）、６はカバーガラス等、７は試料を収容し得る微少空間である。
【００１０】
本発明で用いられる疎水性のシートとしては、例えば、プラスチックシート、ラミネート紙、シリコーンシート等が挙げられる。
プラスチックシートの材質としては、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン等が代表的のものとして挙げられるが、通常、シート、シール、テープ、ワッペン等に用いられているものであれば、何れの材質のものでも良い。
また、ラミネート紙のラミネート材としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、アルミ箔等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、防湿性、耐油性、ヒートシール性、耐薬品性等、ラミネート材として必要な特性を備えたものであればどのようなものでも良い。
更に、シリコーンシートとしてはシリコーン樹脂やシリコーンゴムからなるシート等がこれに該当する。
【００１１】
本発明で用いられるこれらの疎水性のシートは、予め片面（又は両面）に粘着剤が塗布された、所謂粘着シート、粘着テープの形になっているものを使用するのが便利であり好ましいが、粘着剤が塗布されていない単なるシート状或いはテープ状のものに粘着剤を塗布して使用しても勿論一向に構わない。
また、シリコーンシートとして超低硬度シリコーンゴム等から成るものを用いた場合等はそれ自体に粘着性があるので特に粘着剤等は用いる必要はない。
本発明で用いられる粘着シートや粘着テープに塗布される粘着剤、或いは単なるシート状或いはテープ状のものに使用時塗布される粘着剤としては、汎用の粘着シート、粘着テープに通常使用されているゴム系エラストマーやアクリル樹脂等が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、スライドガラスに貼り付けた疎水性のシートをスライドガラスから比較的容易に剥がすことが出来、且つ、剥がした後のスライドガラス上に実質的に殆ど何も残らないようなものであればどのような粘着剤であっても良い。
【００１２】
本発明で用いられる疎水性のシートは、試料注入口となり得る間隙を残さずに、アレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に貼り付けて、抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分をプール化して使用する場合は、シートの部分の厚さが０．５〜２ｍｍ、好ましくは０．５〜１．５ｍｍ、より好ましくは１ｍｍ前後となるように、必要に応じて複数枚重ねて用いられるが、１枚でそのような厚さのものがある場合は勿論１枚で構わない。
また、試料注入口となり得る間隙を残して、アレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に疎水性のシートを貼り付け、更にその上面をカバーガラス等で覆って使用する場合は、シート部分の厚さが０．０５〜０．５ｍｍ、好ましくは０．１〜０．２ｍｍのものが良いので、そのような厚さになるように要すれば複数枚重ねて用いられるが、１枚でそのような厚さのものがある場合は勿論１枚で構わない。
【００１３】
本発明で用いられる疎水性のシートの横幅及び長さは、抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）のスペースにより自ずから定まる。
即ち、例えば、３０ｍｍ×６５ｍｍ×１ｍｍのスライドガラス上の上部に２５ｍｍ×２５ｍｍのアレイ化されている部分が存在する場合は、疎水性のシートの横幅は２．５ｍｍとなり、その長さは、試料注入口となり得る間隙を残して、或いは残さずに、２５ｍｍ×２５ｍｍのアレイ化されている部分の周囲を囲み得る長さと言うことになる。
【００１４】
本発明で用いられる疎水性のシートとして、便宜的に、食料品等のビンに貼付されている商品表示用シール等を使用することも可能である。
即ち、これら商品表示用シール等は、以前は接着剤を用いて貼付されていた為、なかなかきれいには剥がれなかったが、最近はきれいに剥がせるタイプのものもあるので、そのようなシールでアレイ化されている部分よりも大きなシールがあれば、アレイ化されている部分に相当する面積をくり抜いて、アレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に貼り付けてもよい。
【００１５】
本発明のマイクロアレイは、抗体又はＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）がアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、試料注入口となり得る間隙を残して、或いは残さずに、疎水性のシートを貼り付けてなる点に特徴を有するものであるが、疎水性のシートを貼り付ける、抗体又はＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）がアレイ化されている部分を有するスライドガラスとしては、既存の（商品化されているもの等）、抗体又はＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）がアレイ化されているマイクロアレイであっても、また、然るべき表面処理を施したスライドガラス上に目的に応じて適宜抗体又はＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）をスポットし、アレイ化したものであっても何れでも良い。
【００１６】
本発明に係る、抗体又はＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）がアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、試料注入口となり得る間隙を残して、疎水性のシートを貼り付けてなるマイクロアレイは、先に述べた如く、通常、スライドガラス上の、少なくとも抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分の上面をカバーガラス等で覆って（スライドガラス上の、少なくとも抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分の上面にカバーガラス等を密着させて）使用するが、カバーガラス等としては、通常、抗体又はＤＮＡがアレイ化されているスライドガラスと同様のスライドガラス等が用いられる。なお、カバーガラス等は、抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分の上面だけでなく、スライドガラスの上面全体を覆うものであっても勿論構わない。
【００１７】
抗体又はＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）がアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、試料注入口となり得る間隙を残さずに、疎水性のシート１乃至複数枚を貼り付けて、抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分をプール化したマイクロアレイを用いて、蛋白質又は遺伝子の発現解析を行う場合の操作手順としては、先ず、スライドガラス上のプール化されている部分に、例えばマイクロピペットや注射器等を用いて蛋白質又はＤＮＡを含む試料溶液を注入する。
この場合の該プールの広さは、例えば、抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分の面積が２５ｍｍ×２５ｍｍであって、疎水性のシートの厚さがｌｍｍとした場合、２５ｍｍ×２５ｍｍ×１ｍｍ＝６２５μＬ分となる。
従って、蛋白質量／試料溶液が従来の場合には（〜５０μｇ／５ｍＬ）×４バッチであるのに対し、仮にプールに満杯に試料溶液を入れたとしても、（６．２５μｇ／６２５μＬ）×４となり、蛋白質量は従来の８分の１でよく、試料溶液をシート部分の厚さの半分の高さ０．５ｍｍまで入れるとした場合は、蛋白量は更にその半分の１６分の１でよい。即ち、従来１５０ｍｇの組織や細胞が必要であったのが、１０ｍｇでよいことになる。
【００１８】
かくして、抗体又はＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）がアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に疎水性のシート１乃至複数枚を貼り付けて作製したプールに試料溶液を注入後、スライドガラス上にアレイ化された抗体又はＤＮＡと試料溶液とを、マイクロアレイを時々振盪させながら、所定温度（通常室温）で、所定時間（通常３０分間）反応（インキュベーション）させた後、疎水性のシートを取り外し、適当な洗浄バッファーでスライドガラス（インキュベーション後のマイクロアレイ）を洗浄する。洗浄後のスライドガラスを遠心等により乾燥した後、常法に従ってスキャンを行う。以後の操作は、通常のマイクロアレイを用いた蛋白質又は遺伝子の発現解析方法のそれと全く同じである。
【００１９】
また、抗体又はＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）がアレイ化されているスライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に、試料注入口となり得る間隙を残して、疎水性のシートを貼り付け、抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分の上面をカバーガラスで覆った本発明のマイクロアレイを用いて、蛋白質又は遺伝子の発現解析を行う場合の操作手順としては、先ず、スライドガラス上のアレイ化されている部分の外郭部分（周縁部）に貼り付けた疎水性のシートの間隙（試料注入口）から、スライドガラスと疎水性のシートとカバーガラス等で囲まれた空間に、例えばマイクロピペットや注射器等を用いて蛋白質又はＤＮＡを含む試料溶液を注入する。
この場合の該空間の広さは、例えば、抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分の面積が２５ｍｍ×２５ｍｍであって、疎水性のシートの厚さが０．ｌｍｍとした場合、２５ｍｍ×２５ｍｍ×０．ｌｍｍ＝６２．５μＬ分となる。
従って、蛋白質量／試料溶液が従来の場合には（〜５０μｇ／５ｍＬ）×４バッチであるのに対し、仮に該空間に満杯に試料溶液を入れたとしても、（０．６２５μｇ／６２．５μＬ）×４となり、蛋白質量は従来の８０分の１でよい。即ち、従来１５０ｍｇの組織や細胞が必要であったのが、２ｍｇでよいことになる。
【００２０】
かくして、スライドガラスと疎水性のシートとカバーガラスで囲まれた空間に試料溶液を注入後、スライドガラス上にアレイ化された抗体又はＤＮＡと試料溶液とを、マイクロアレイを時々振盪させながら、所定温度（通常室温）で、所定時間（通常３０分間）反応（インキュベーション）させた後、カバーガラス及び疎水性のシートを取り外し、適当な洗浄バッファーでスライドガラス（インキュベーション後のマイクロアレイ）を洗浄する。洗浄後のスライドガラスを遠心等により乾燥した後、常法に従ってスキャンを行う。以後の操作は、通常のマイクロアレイを用いた蛋白質又は遺伝子の発現解析方法のそれと全く同じである。
【００２１】
なお、上記どちらの方法の場合も、疎水性のシートとして容易に剥がすことが出来、且つ粘着剤等が後に残らないものを使用すれば、スキャン中の妨害にはならない。また、元々当該測定において妨害にならないような材質のシートや粘着剤を用いた場合は、インキュベーション後、必ずしもこれを取り外す必要はない。
【００２２】
本発明のマイクロアレイを用いた蛋白質又は遺伝子の発現解析方法において使用に供される試料溶液の調製方法は、通常のマイクロアレイを用いた蛋白質又は遺伝子の発現解析方法において使用に供される試料溶液の調製方法と全く同じでよい。
即ち、例えば蛋白質の発現解析を行う場合は、細胞又は組織（未処理組織）等から所定の操作手順に従って蛋白質を抽出し、蛋白質濃度を測定した後、所定の濃度に希釈する。
次いで、この溶液中の蛋白質を蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）等で標識し、未結合色素等を除去して試料溶液とする。
また、遺伝子の発現解析を行う場合は、細胞又は組織（未処理組織）等から所定の操作手順に従って、例えばトータルＲＮＡ等を単離し、収量と純度を分析した後、これを蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等）或いは放射性物質で標識してプローブを作製する。これを適当なバッファーに溶解して試料溶液とする。
【００２３】
このように、本発明に係る蛋白質又は遺伝子の発現解析方法は、マイクロアレイとして本発明のマイクロアレイを用い、先に述べた如き方法によりインキュベーションを行うこと以外は、試料溶液の調製からマイクロアレイのスキャンまで、自体公知の、マイクロアレイを用いる蛋白質又は遺伝子の発現解析方法と全く同じ操作手順で実施することが出来る。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２５】
参考例１
（１）サンプルの準備
ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳバッファー）で培養したジャルカット細胞を１×１０７個ずつ分注し、ＨＥＰＥＳバッファーに置換し、３７℃で１時間プレカルチャーの後、３７℃又は５１℃で３０分間熱処理を行った（以下、それぞれのサンプルをサンプルＡ、サンプルＢとする。）。
それぞれのサンプルをＰＢＳ（シグマ社製）で４回洗浄（１回の洗浄に３０ｍＬ使用）後、上清を十分除去した後、−８０℃のディープフリーザで一旦凍結した。
【００２６】
（２）蛋白質の抽出
それぞれのサンプルを室温に戻してＡｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ３８０（クロンテック社製）のキットに備え付けのＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ／ＬａｂｅｌｉｎｇＢｕｆｆｅｒを２０μＬ×１５０添加して、ボルテックスで十分混和した。室温にて１０分間振盪後、懸濁液を４℃で３０分間遠心し、上清を蛋白質サンプルとした。ＢＣＡ試薬（ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ：ピアス社製）によって蛋白質濃度を１．１ｍｇ／ｍＬに調整した。
【００２７】
（３）蛍光色素ラベリング
Ｃｙ５  ｍｏｎｏ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ  Ｐａｃｋ及びＣｙ３  ｍｏｎｏ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ  Ｐａｃｋ（アマーシャム社製）のそれぞれ１ｍｇ分の色素量に、Ａｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ３８０（クロンテック社製）のキットに備え付けのＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ／Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒをそれぞれ１１０μＬ添加して溶解させた。２０秒間ボルテックスにて十分混和の後、１０秒間遠心しそれぞれ５０μＬずつ各２本、１．５μＬマイクロチューブに分注した（以下、これらをそれぞれＡ−Ｃｙ３，Ｂ−Ｃｙ３，Ａ−Ｃｙ５，Ｂ−Ｃｙ５とする。）。  サンプルＡをＡ−Ｃｙ３及びＡ−Ｃｙ５に、また、サンプルＢをＢ−Ｃｙ３及びＢ−Ｃｙ５にそれぞれ添加した。各マイクロチューブをそれぞれ３回ずつ転倒混和した後、１０秒間遠心した。これを氷上（４℃）で９０分間インキュベートした。この間、２０分毎に各チューブを転倒混和した。Ａｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ３８０（クロンテック社製）のキットに備え付けのＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ４μＬを各チューブに添加した。これを氷上（４℃）で３０分間インキュベートした（１０分毎に転倒混和）。
【００２８】
（４）精製
Ｍｉｌｉ−Ｑグレードの水を使用してＡｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ３８０（クロンテック社製）のキットに備え付けの１０×Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを希釈して１×Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  １００ｍＬ（ｐＨ７．４）を調製した。ＰＤ−１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ（アマーシャム社製）を４本用意し、上で調製した１×Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒでカラムを平衡化した。（３）で調製したＡ−Ｃｙ３，Ａ−Ｃｙ５，Ｂ−Ｃｙ３，Ｂ−Ｃｙ５のサンプルをカラムに加え、１×Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを各２ｍＬ加え、更に、１×Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを各２ｍＬずつ添加し、通過液を精製蛋白質としてマイクロチューブに集めた。精製後、ＢＣＡ試薬（ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ：ピアス社製）により蛋白質濃度を測定し、精製蛋白質それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬを得た。Ａ−Ｃｙ５とＢ−Ｃｙ３及びＡ−Ｃｙ３とＢ−Ｃｙ５をそれぞれ１００μｇずつ混合し、抗体反応用蛋白質混合物Ａ−Ｃｙ５／Ｂ−Ｃｙ３及びＡ−Ｃｙ３／Ｂ−Ｃｙ５を作製した。
【００２９】
（５）抗体反応
Ａｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ３８０（クロンテック社製）のキットに備え付けのＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｒｅｄｕｃｅｒ  ４．５ｍＬとＳｔｏｃｋ  Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４０．５ｍＬを混和してＩｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ４５ｍＬを調製した。Ａｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ３８０（クロンテック社製）のキットに備え付けのトレイの２箇所に、上で調製したＩｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒをそれぞれ５ｍＬずつ添加した。ステップ（４）で作製した抗体反応用蛋白質混合物をＡ−Ｃｙ５／Ｂ−Ｃｙ３及びＡ−Ｃｙ３／Ｂ−Ｃｙ５それぞれをトータル蛋白量５０μｇ分ずつ加えた。トレイを振盪しながら室温にて３０分間インキュベートした。
Ａｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ３８０（クロンテック社製）のキットに備え付けのＳｔｏｃｋ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ及びｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを用いてＡｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（クロンテック社製）の抗体付スライドガラスを洗浄した。洗浄後の抗体アレイのスライドガラスを一枚ずつインキュベーショントレイに入れ、室温で３０分間インキュベートした。
【００３０】
（６）スライドガラスの洗浄
Ａｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ３８０（クロンテック社製）のキットに備えつけのＩｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを５ｍＬずつ、トレイの残りの２箇所に入れ、反応後のスライドガラスをこれに移して浸漬し、室温で５分間インキュベートした。Ａｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ３８０（クロンテック社製）のキットに備えつけのＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ１〜７を用い、バッファーを順次交換しながら、それぞれ５分間ずつ洗浄した。洗浄後、遠心してスライドガラスを乾燥した。
【００３１】
（７）スキャニング及びデータ解析
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５６５ＡＡ（アジレント社製）のマイクロアレイスキャナーを用いてスキャニングを行った。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（アジレント社製）ソフトウエア及びアレイ解析ソフトＧｅｎｅ  Ｐｉｘ  Ｐｒｏを用いて解析を行い、ラベルされた蛋白質混合液Ａ−Ｃｙ３／Ｂ−Ｃｙ５に関しては、図３のＡ（Ｃｙ３），図３のＢ（Ｃｙ５）及び図４を、また、Ｂ−Ｃｙ３／Ａ−Ｃｙ５に関しては、図５のＡ（Ｃｙ３）、図５のＢ（Ｃｙ５）及び図６を得た。
【００３２】
実施例１
Ａｂ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ３８０（クロンテック社製）のキット中の抗体アレイのスライドガラスを使用し、その抗体アレイスポット部の外郭部分（周縁部）に、抗体アレイスポット部を囲み込むようにくり抜いた、厚さ１ｍｍのシリコーンシート（超低硬度シリコーンゴム  ２°：（株）サンプラテック社製）を密着させてプールを作った（図１の（Ａ）及び（Ｂ））。超低硬度シリコーンゴムは粘着性がありスライドガラスに完全密着した。参考例１のステップ（１）〜（４）で作製された抗体反応用蛋白質混合物Ａ−Ｃｙ５／Ｂ−Ｃｙ３をトータル蛋白量として２μｇ分Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ２００μＬに溶かした蛋白質溶液を作製し、上記プールにマイクロピペットを用いて注入し（図１の（Ｃ））、室温で３０分間、時々振盪させながら反応させた。途中、反応効率を上げるため、軽くピペッティングを行った。反応後、参考例１と同様にＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５６５ＡＡ（アジレント社製）のマイクロアレイスキャナーを用いてスキャンを行った。
結果を図７の（Ａ）（Ｃｙ３）及び（Ｂ）（Ｃｙ５）に示す。
図７の（Ａ）及び（Ｂ）から明らかなように、Ｃｙ３，Ｃｙ５共に十分な蛍光強度が得られ、抗体反応は極めて良好であった。
【００３３】
実施例２
抗体アレイのスライドガラスの抗体アレイスポット部の外郭部分（周縁部）に、試料注入口となり得る間隙を残して、抗体アレイスポット部を囲み込むようにくり抜いた、厚さ２８μｍのシート５枚を重ねて、厚さ１４０μｍの微小プールを、作製した（図２の（Ａ））。次いで、その上にカバーガラス（３０×３０ｍｍ）を密着させ固定して微少空間を作製した（図２の（Ｂ））。参考例１のステップ（１）〜（４）で作製された抗体反応用蛋白質混合物Ａ−Ｃｙ５／Ｂ−Ｃｙ３のトータル蛋白量として０．８μｇ分をＩｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ８０μＬに溶かしたものを作製し、試料注入口から上記微小空間にマイクロピペットを用いて注入し（図２の（Ｃ））、３０分間、室温で反応させた。参考例１と同様Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５６５ＡＡ（アジレント社製）のマイクロアレイスキャナーを用いてスキャンを行った。
結果を図８の（Ａ）（Ｃｙ３）及び（Ｂ）（Ｃｙ５）に示す。
図８の（Ａ）及び（Ｂ）から明らかなように、Ｃｙ３，Ｃｙ５共に十分な蛍光強度が得られ、抗体反応は極めて良好であった。
【００３４】
従来法では反応効率の悪い、トレイ溶液を用いているため、５ｍｌの反応溶液が必要であり、蛋白質のサンプルＡ、サンプルＢのミクスチャーが、ラベリング精製後の蛋白重量として、サンプルの由来によっても異なるが１０μｇ〜５０μｇ必要であるのに対し、本発明の実施例１の方法では蛋白量２μｇで、また、実施例２の方法では蛋白量０．８μｇで分析可能であり、反応スケールのマイクロ化が達成された。
【００３５】
【発明の効果】
本発明は、例えば癌等の異常蛋白質の発現解析や遺伝子の発現解析等に使用し得る新規なマイクロアレイとこれを用いた蛋白質又は遺伝子の発現解析方法を提供するものであり、従来の方法では、検体としての組織や細胞は１５０ｍｇ必要であったが、本発明の方法によればそれより遙かに少量で済み、特にカバーガラスで上面を覆う方法によれば、検体量が２ｍｇ程度乃至それ以下でもよく、ＤＮＡ或いは蛋白質抗体アレイの必要検体量の少量化が達成された。
即ち、微量の蛋白質やＲＮＡで解析が可能となり、蛋白質や遺伝子の発現解析が大幅に飛躍すると考えられる。
本発明のマイクロアレイ及びこれを用いた蛋白質又は遺伝子の発現解析方法は、癌等の蛋白質発現解析の研究や、病気のメカニズム及び治療法の研究に貢献するところ極めて大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のマイクロアレイの一例を示し、図１の（Ａ）は上面図、図１の（Ｂ）は側面図（断面図）、図１の（Ｃ）は試料溶液を入れた側面図（断面図）である。
【図２】図２は、アレイ化されている部分の上面をカバーガラス等で覆ったタイプの本発明のマイクロアレイを示し、図２の（Ａ）は上面図、図２の（Ｂ）は側面図（断面図）、図２の（Ｃ）は試料溶液を入れた側面図（断面図）である。
【図３】図３は、参考例１で得られたラベルされた蛋白質混合液Ａ−Ｃｙ３／Ｂ−Ｃｙ５に関するデータ解析の結果を示し、図３の（Ａ）はＣｙ３、図３の（Ｂ）はＣｙ５の蛍光発色をそれぞれ示す。
【図４】図４は、参考例１で得られたラベルされた蛋白質混合液Ａ−Ｃｙ３／Ｂ−Ｃｙ５に関するデータ解析の結果を示すもので、Ａ−Ｃｙ３とＢ−Ｃｙ５の相関図である。
【図５】図５は、参考例１で得られたラベルされた蛋白質混合液Ｂ−Ｃｙ３／Ａ−Ｃｙ５に関するデータ解析の結果を示し、図５の（Ａ）はＣｙ３、図５の（Ｂ）はＣｙ５の蛍光発色をそれぞれ示す。
【図６】図６は、参考例１で得られたラベルされた蛋白質混合液Ｂ−Ｃｙ３／Ａ−Ｃｙ５に関するデータ解析の結果を示すもので、Ｂ−Ｃｙ３とＡ−Ｃｙ５の相関図である。
【図７】図７は、実施例１で得られたラベルされた蛋白質混合液Ａ−Ｃｙ３／Ｂ−Ｃｙ５に関するデータ解析の結果を示し、図７の（Ａ）はＣｙ３、図７の（Ｂ）はＣｙ５の蛍光発色をそれぞれ示す。
【図８】図８は、実施例２で得られたラベルされた蛋白質混合液Ａ−Ｃｙ３／Ｂ−Ｃｙ５に関するデータ解析の結果を示し、図８の（Ａ）はＣｙ３、図８の（Ｂ）はＣｙ５の蛍光発色をそれぞれ示す。
【符号の説明】
１  スライドガラス
２  抗体又はＤＮＡがアレイ化されている部分
３  疎水性のシート
４  抗体又はＤＮＡのスポット
５  試料注入口（間隙部）
６  カバーガラス等
７  試料を収容し得る微少空間
８  蛋白質溶液（試料溶液）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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