(57)【要約】    【課題】ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を簡便かつ高感度で再現よく検出することができる免疫測定用試薬を提供すること。    【解決手段】  ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を検出するための免疫測定用試薬であって、配列番号（１）のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を構成単位としてなる蛋白質（Ｐ）と水不溶性担体（Ｂ）とが結合されてなることを特徴とする免疫測定用試薬を用いる。アミノ酸配列が、配列番号（２）のアミノ酸配列で表されるアデノウイルスＥ１Ａ結合領域に含まれるアミノ酸配列であることが好ましい。    【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を検出するための免疫測定用試薬であって、配列番号（１）のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を構成単位としてなる蛋白質（Ｐ）と水不溶性担体（Ｂ）とが結合されてなることを特徴とする免疫測定用試薬。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号（２）のアミノ酸配列で表されるアデノウイルスＥ１Ａ結合領域に含まれるアミノ酸配列である請求項１記載の免疫測定用試薬。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の試薬と、抗ヒトイムノグロブリン抗体を含有してなる免疫測定用試薬キット。
【請求項４】
抗ヒトイムノグロブリン抗体が標識化合物で標識されてなる請求項３記載の試薬キット。
【請求項５】
標識化合物が酵素である請求項４記載の試薬キット。
【請求項６】
ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体の免疫測定方法であって、請求項４又は５に記載の試薬キットをサンドイッチ法に適用し、標識化合物を定量することにより、検体中のＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体の有無を判断する工程を含む免疫測定方法。
【請求項７】
化学発光酵素免疫測定法による請求項６記載の免疫測定方法。
【請求項８】
検体中のＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体の有無を判断する工程において、検体として血液を用い、この検体に対する抗ヒトイムノグロブリン量と、複数の健常人の血液に対する抗ヒトイムノグロブリン量から設定される基準値とを比較することを含む請求項７又は８に記載の免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を検出するための免疫測定用試薬、これを含有する免疫測定用試薬キット及び抗ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体の免疫測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＲＢ１遺伝子は、分子量約１１０キロダルトンの蛋白質（以下、ＲＢ１遺伝子産物）をコードする癌抑制遺伝子である。種々のヒト癌において、ＲＢ１遺伝子に高頻度に欠失と点突然変異等が起こることが知られている（非特許文献１及び２）。一方、肺癌患者においては、血中にＲＢ１遺伝子産物と反応する自己抗体が出現することがウエスタンブロット法で認められている（非特許文献３）。
【０００３】
【非特許文献１】サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２４３，９３７頁，１９８９年
【非特許文献２】オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ），８，１９１３頁，１９９３年
【非特許文献３】インターナショナル  ジャーナル  オブ  オンコロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ），１９，１０３５頁，２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来、ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体はウエスタンブロット法によりその存在が確認されていた。ウエスタンブロット法は、電気泳動又はブロッティング等の煩雑かつ長時間の操作が必要であり、多数の検体を測定する場合、特に臨床検査薬等への適応は困難である。又、ウエスタンブロット法は感度及び再現性等に問題がある。すなわち、本発明の目的は、ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を簡便かつ高感度で再現性よく検出することができる免疫測定用試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために鋭意研究を行った結果、本発明者らは、ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を簡便かつ高感度で再現性良く検出できることを見いだし、本発明に到達した。すなわち、本発明の免疫測定試薬の特徴は、ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を検出するための免疫測定用試薬であって、配列番号（１）のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を構成単位としてなる蛋白質と水不溶性担体とが結合されてなる点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を検出するための免疫測定用試薬は、非特異的反応が少なく、感度及び特異性に極めて優れている。すなわち、自己抗体を保有しない健常人からの検体の測定値と自己抗体を保有する癌患者からの検体の測定値との差が充分に大きく（高感度）、また自己抗体を保有しない健常人の検体に対して非特異的反応が極めて少ないので高精度の測定ができる。また、簡便に測定することができるため、数多くの検体を短時間に容易に測定することができる。すなわち、本発明の免疫測定用試薬は、ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を簡便かつ高感度で再現よく検出することができる。従って、本発明の測定試薬、測定試薬キット及び測定法を用いると、極めて迅速かつ正確な癌の診断ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
ＲＢ１遺伝子からの発現産物であるＲＢ１遺伝子産物は、約１１０キロダルトンの蛋白質｛配列番号（１）のアミノ酸配列からなるポリペプチド｝である。
【０００８】
配列番号（１）のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列を構成単位とする蛋白質（Ｐ）としては、配列番号（１）又は配列番号（１）の一部のアミノ酸配列を構成単位とする蛋白質（Ｐ１，Ｐ２）等が使用できる。配列番号（１）のアミノ酸配列を構成単位とする蛋白質（Ｐ１）は調製が難しく、配列番号（１）の一部のアミノ酸配列を構成単位とする蛋白質（Ｐ２）を使用することが好ましい。
【０００９】
蛋白質（Ｐ２）としては、配列番号（１）のアミノ酸配列をアミノ酸２０〜６００個、好ましくは５０〜５００個、さらに好ましくは１００〜３６０個となるように分割した断片（アミノ酸配列）を構成単位としてなる蛋白質等が含まれ、例えば、配列番号（２）（アデノウイルスＥ１Ａ結合領域）、及び（３）〜（１９）からなる群より選ばれる配列番号のアミノ酸配列を構成単位とする蛋白質等が挙げられる。これらのうち、配列番号（２）、（３）、（５）、（６）、（７）、（９）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１７）又は（１８）のアミノ酸配列を構成単位としてなる蛋白質が好ましく、さらに好ましくは配列番号（２）、（３）、（５）、（６）、（７）、（９）、（１５）、（１７）又は（１８）のアミノ酸配列を構成単位としてなる蛋白質である。
【００１０】
蛋白質（Ｐ）のアミノ酸の個数が２０〜１００個（より好ましくは２０〜５０個）で構成されている蛋白質である場合、蛋白質（Ｐ）は、アミノ酸配列のみから構成されていてもよく、さらにＮ末端及び／又はＣ末端がビオチン、チオグリコール酸、及び／又はリンカーとして用いるアミノ酸（システイン、リジン、チロシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸等）等で修飾されていてもよい。また、さらにＮ末端が無水酢酸又はＮ−アセチルイミダゾール等でアセチル化されていてもよく、Ｃ末端が水溶性カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩）又はイソオキサゾリウム（例えば、Ｎ−メチル−５−フェニルイソオキサゾリウムフルオロボレート）等でアミド化されていてもよい。また、これらの修飾は組み合わせて用いることもできる。Ｎ末端及び／又はＣ末端がアミノ酸で修飾されている場合、このアミノ酸の個数は、Ｎ末端又はＣ末端当たり、１〜５が好ましく、さらに好ましくは１〜３、特に好ましくは１〜２である。Ｎ末端及び／又はＣ末端がビオチン及び／又はチオグリコール酸で修飾されている場合、ビオチン又はチオグリコール酸の個数は蛋白質（Ｐ）１分子当たり、１〜５が好ましく、さらに好ましくは１〜３、特に好ましくは１〜２である。これらのうち、ビオチン又はチオグリコール酸で修飾されていることが好ましく、蛋白質（Ｐ）と水不溶性担体（Ｂ）とを結合する場合の簡便性等の観点から、さらに好ましくはＮ末端及び／又はＣ末端がビオチンで修飾されていることである。
【００１１】
蛋白質（Ｐ）のアミノ酸の個数が１００個以上の場合、蛋白質（Ｐ）は配列番号（１）〜（１９）のアミノ酸配列のみから構成されていてもよく、上述の修飾をされていてもよく、蛋白質発現用ベクターから発現した蛋白質を含んでいてもよい。蛋白質発現用ベクターから発現した蛋白質としては、グルタチオントランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ（例えば、ヒスチジンが６個結合したペプチド）及びプロテインＡのＺＺ領域部分の蛋白質等が挙げられる。これらのうち好ましいのは、蛋白質発現用ベクターから発現した蛋白質であり、より好ましいのはグルタチオントランスフェラーゼ及びプロテインＡのＺＺ領域部分の蛋白質である。
【００１２】
蛋白質（Ｐ）は、遺伝子組み換え等で作成した融合蛋白質であってもよく、例えば配列番号（１）〜（１９）のいずれかのアミノ酸配列を構成単位としてなるポリペプチドを、ＧＳＴ（グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ）と融合した蛋白質等が含まれる。蛋白質（Ｐ）が、１００個以上のアミノ酸配列を構成単位としてなる場合、調製等の観点から融合蛋白質が好ましい。
【００１３】
蛋白質（Ｐ）は、従来公知のペプチド合成法、又は遺伝子組み換え法等で作成できる。ペプチド合成法によるとアミノ酸の個数が２０個を越えると蛋白質（Ｐ）の合成が極めて困難であるのに対して、遺伝子組み換え法であるとそれが容易であるため、調製の容易性等の観点から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００１４】
ペプチド合成法は、溶液中でも、あるいは固体支持体上でも達成できるが固相支持体を用いた固相合成法が好ましく、さらに好ましくは自動ペプチド合成機を用いた固相合成法である。ペプチド合成法は、一般に、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ基）又は９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（Ｆｍｏｃ基）で保護された活性化アミノ酸を使用する。この他、具体的な合成操作、側鎖保護の種類、および切断法等は、例えば、ソリッド  フェーズ  ペプタイド  シンセシス第２版、ピース  ケミカル社、１９８４年（Stewart及びYoung,“Solid Phase Peptide Synthesis",第２版,Pierce Chemical Company,1984）、及びソリッド  フェーズ  ペプタイド  シンセシス、アイ  アール  エル社、１９８９年（Atherton及びSheppard,“Solid Phase Peptide Synthesis",IRL Press,1989）に詳細に記述されている。
【００１５】
遺伝子組み換え法としては、ヒト細胞、例えばヒト血管内皮細胞又はヒト線維芽細胞等から抽出したｍＲＮＡから、目的とするアミノ酸配列に対応するプライマーを用いてｃＤＮＡを作製し、これをＰＣＲ法（ポリメラーゼチェーンリアクション法）によって増幅した後制限酵素で切断し、この断片をベクターに組み込み、得られた発現ベクターで大腸菌等の宿主を形質転換し、必要あれば誘導処理した後、宿主を培養し、菌体溶解物から目的とする融合蛋白質を抽出・精製する。このようにして、蛋白質（Ｐ）を含む融合蛋白質が作成できる（例えば、生化学実験法４５「組み換えタンパク質生産法」，学会出版センター社，２００１年）。以上の他に、ＲＢ１遺伝子アミノ酸配列から目的のアミノ酸配列に該当する遺伝子をＤＮＡ合成機で合成した後、その遺伝子をベクターに組み込み発現させることにより、蛋白質（Ｐ）を作成できる。
【００１６】
本発明の免疫測定用試薬は、このような蛋白質（Ｐ）の少なくとも１種を含んでいればよいが、２種以上の蛋白質（Ｐ）を含んでいることが、自己抗体との反応性（特異性及び感度）がより高くなる点で好ましい。なお、アミノ酸配列（１）を構成単位としてなる蛋白質であっても、他の種類の蛋白質を含んでいることが好ましい。さらに好ましくは配列番号（２）のアミノ酸配列を構成単位としてなる蛋白質に加えて、アミノ酸配列（１）のＮ末端領域｛配列番号（３）、（９）又は（１５）のアミノ酸配列等｝を構成単位としてなる蛋白質及び／又は配列番号（１）のＣ末端領域｛配列番号（８）、（１４）又は（１９）のアミノ酸配列等｝を構成単位としてなる蛋白質を含むことである。最も好ましくは、配列番号（２）のアミノ酸配列を構成単位としてなる蛋白質、配列番号（１）のＮ末端領域を構成単位としてなる蛋白質及び配列番号（１）のＣ末端領域を構成単位としてなる蛋白質を含むことである。
【００１７】
本発明の免疫測定用試薬の好ましい蛋白質の組合せ例としては、例えば、次の組合せが例示できる。なお、カッコ内の数字は、配列番号に対応しており、その配列番号のアミノ酸配列を構成単位としてなる蛋白質を表す。すなわち、（２）＋（３）は、配列番号（２）のアミノ酸配列を構成単位としてなる蛋白質と配列番号（３）のアミノ酸配列を構成単位としてなる蛋白質との組合せを表す。
【００１８】
すなわち、（５）＋（６）＋（７）、（１７）＋（１８）、（５）＋（６）＋（１８）、（５）＋（６）＋（１３）、（５）＋（１２）＋（７）、（５）＋（１２）＋（１８）、（５）＋（１２）＋（１３）、（１１）＋（６）＋（７）、（１１）＋（６）＋（１８）、（１１）＋（６）＋（１３）、（１１）＋（１２）＋（７）、（１１）＋（１２）＋（１８）、（１７）＋（６）＋（７）、（１７）＋（６）＋（１３）、（１７）＋（１２）＋（７）、（１７）＋（１２）＋（１３）、（２）＋（３）、（２）＋（９）、（２）＋（１５）、（２）＋（８）、（２）＋（１４）、（２）＋（１９）、（２）＋（３）＋（８）、（２）＋（３）＋（１４）、（２）＋（３）＋（１９）、（２）＋（９）＋（８）、（２）＋（９）＋（１４）、（２）＋（９）＋（１９）、（２）＋（１５）＋（８）、（２）＋（１５）＋（１４）、（２）＋（１５）＋（１９）、（５）＋（６）＋（７）＋（３）、（５）＋（６）＋（７）＋（９）、（５）＋（６）＋（７）＋（１５）、（５）＋（６）＋（７）＋（８）、（５）＋（６）＋（７）＋（１４）、（５）＋（６）＋（７）＋（１９）、（５）＋（６）＋（７）＋（３）＋（８）、（５）＋（６）＋（７）＋（３）＋（１４）、（５）＋（６）＋（７）＋（３）＋（１９）、（５）＋（６）＋（７）＋（９）＋（８）、（５）＋（６）＋（７）＋（９）＋（１４）、（５）＋（６）＋（７）＋（９）＋（１９）、（５）＋（６）＋（７）＋（１５）＋（８）、（５）＋（６）＋（７）＋（１５）＋（１４）、（５）＋（６）＋（７）＋（１５）＋（１９）、（９）＋（１１）＋（１２）＋（１３）＋（１４）、（１１）＋（１２）＋（１３）、（１７）＋（１８）＋（３）、（１７）＋（１８）＋（９）、（１７）＋（１８）＋（１５）、（１７）＋（１８）＋（８）、（１７）＋（１８）＋（１４）、（１７）＋（１８）＋（１９）、（１７）＋（１８）＋（３）＋（８）、（１７）＋（１８）＋（３）＋（１４）、（１７）＋（１８）＋（３）＋（１９）、（１７）＋（１８）＋（９）＋（８）、（１７）＋（１８）＋（９）＋（１４）、（１７）＋（１８）＋（９）＋（１９）、（１７）＋（１８）＋（１５）＋（８）、（１７）＋（１８）＋（１５）＋（１４）及び（１７）＋（１８）＋（１５）＋（１９）である。
【００１９】
これらのうち、（２）＋（３）＋（１４）、（２）＋（３）＋（１９）、（２）＋（９）＋（８）、（２）＋（９）＋（１４）、（２）＋（９）＋（１９）、（２）＋（１５）＋（８）、（２）＋（１５）＋（１４）、（２）＋（１５）＋（１９）、（５）＋（６）＋（７）＋（３）＋（８）、（５）＋（６）＋（７）＋（３）＋（１４）、（５）＋（６）＋（７）＋（３）＋（１９）、（５）＋（６）＋（７）＋（９）＋（８）、（５）＋（６）＋（７）＋（９）＋（１４）、（５）＋（６）＋（７）＋（９）＋（１９）、（５）＋（６）＋（７）＋（１５）＋（８）、（５）＋（６）＋（７）＋（１５）＋（１４）、（５）＋（６）＋（７）＋（１５）＋（１９）、（９）＋（１１）＋（１２）＋（１３）＋（１４）、（１１）＋（１２）＋（１３）、（１７）＋（１８）＋（３）＋（８）、（１７）＋（１８）＋（３）＋（１４）、（１７）＋（１８）＋（３）＋（１９）、（１７）＋（１８）＋（９）＋（８）、（１７）＋（１８）＋（９）＋（１４）、（１７）＋（１８）＋（９）＋（１９）、（１７）＋（１８）＋（１５）＋（８）、（１７）＋（１８）＋（１５）＋（１４）、及び（１７）＋（１８）＋（１５）＋（１９）が好ましく、さらに好ましくは（５）＋（６）＋（７）＋（３）＋（８）、（５）＋（６）＋（７）＋（３）＋（１４）、（５）＋（６）＋（７）＋（３）＋（１９）、（５）＋（６）＋（７）＋（９）＋（８）、（５）＋（６）＋（７）＋（９）＋（１４）、（５）＋（６）＋（７）＋（９）＋（１９）、（５）＋（６）＋（７）＋（１５）＋（８）、（５）＋（６）＋（７）＋（１５）＋（１４）、（５）＋（６）＋（７）＋（１５）＋（１９）、（１７）＋（１８）＋（３）＋（８）、（１７）＋（１８）＋（３）＋（１４）、（１７）＋（１８）＋（３）＋（１９）、（１７）＋（１８）＋（９）＋（８）、（１７）＋（１８）＋（９）＋（１４）、（１７）＋（１８）＋（９）＋（１９）、（１７）＋（１８）＋（１５）＋（８）、（１７）＋（１８）＋（１５）＋（１４）、及び（１７）＋（１８）＋（１５）＋（１９）である。
【００２０】
蛋白質（Ｐ）は、これ自体で免疫凝集法等の免疫測定用試薬として用いることができるが、本発明においては、蛋白質（Ｐ）が水不溶性担体（Ｂ）と結合したかたちで免疫用試薬に含まれる。なお、水不溶性担体の水不溶性とは、１〜５０℃のいずれの温度においても、水に対する溶解度が０．０１ｇ／水１００ｇ以下であることを意味し、担体とは１〜５０℃のいずれの温度においても固体（ゲルを含む）であってＲＢ１遺伝子産物と結合できる物質を意味する。水不溶性担体（Ｂ）としては、特開平２−２０５７７４号公報に記載の担体等が使用でき、無機物及び有機物等が使用でき、例えば、セルロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリウレタン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、絹、フィブロイン、リグニン、ヘミセルロース、キチン、エボナイト、ゴム、ガラス、石英、シリコン及びセラミックス等が挙げられる。これらのうち、ポリスチレン、ガラス、石英及びシリコンが好ましく、さらに好ましくはポリスチレン及びガラス、特に好ましくはガラスである。
【００２１】
水不溶性担体（Ｂ）の形状は、使用する目的に合わせて自由に決定でき、真球状や円盤状のビーズ、板状や棒状のスティック、試験管、及び不織布やフィルターのストリップ（短冊状の細片）、微粒子等が挙げられる。これらのうち、ビーズ及び微粒子が好ましく、さらに好ましくは真球状のビーズである。
【００２２】
水不溶性担体（Ｂ）の大きさは、使用する目的に合わせて自由に決定できるが、通常は内径４〜１０ｍｍ、深さ１０〜２０ｍｍ程度の円柱形反応容器（ビーカー等）に投入できる大きさである（水不溶性担体が試験管の場合を除く。）。真球状ビーズの場合、直径（ｍｍ）は１〜１０が好ましく、さらに好ましくは２〜８、特に好ましくは３〜７である。円盤状ビーズの場合、直径（ｍｍ）は１〜１０が好ましく、さらに好ましくは２〜８、特に好ましくは３〜７であり、厚さは（ｍｍ）は０．１〜５が好ましく、さらに好ましくは０．２〜２、特に好ましくは０．３〜１である。スティックの場合、長さ（ｍｍ）は２〜１０が好ましく、さらに好ましくは３〜８、特に好ましくは４〜７である。また、スティックの断面積（ｍｍ2）は１〜２５が好ましく、さらに好ましくは２〜１６、特に好ましくは３〜９である。なお、断面積とは、長軸方向に対して垂直に切断した際の切断部分の断面積を意味する。試験管の場合、長さ（ｍｍ）は５〜１００が好ましく、さらに好ましくは８〜８０、特に好ましくは１０〜２０である。また、試験管の内径（ｍｍ）は、５〜２０が好ましく、さらに好ましくは６〜１６、特に好ましくは８〜１２である。ストリップの場合、長さ（ｍｍ）は、５〜１００が好ましく、さらに好ましくは１０〜８０、特に好ましくは１０〜５０である。また、ストリップの幅（ｍｍ）は、１〜２０が好ましく、さらに好ましくは２〜１６、特に好ましくは３〜１０である。厚さは（ｍｍ）は０．１〜２が好ましく、さらに好ましくは０．１〜０．５である。不織布やフィルターの平均孔径（μｍ）は、０．１〜１０が好ましく、さらに好ましくは０．３〜５である。微粒子の場合、平均粒子径（μｍ）は０．０１〜２００が好ましく、さらに好ましくは０．１〜５０、特に好ましくは０．２〜１０である。平均粒子径は、透過型電子顕微鏡法、光学顕微鏡による整列測定法等で測定できる。
【００２３】
蛋白質（Ｐ）と水不溶性担体（Ｂ）とを結合する方法としては、化学的に結合する方法及び物理吸着により結合する方法等の従来公知の方法等で行うことができる。化学的に結合する方法としては、水不溶性担体（Ｂ）の表面に導入されたアミノ基及び／又はスルフヒドリル基等の官能基と、蛋白質（Ｐ）のアミノ基及び／又はスルフヒドリル基等の官能基とを結合剤（グルタルアルデヒド、サクシンアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロサクシンイミドエステル及びｏ−フェニレンビスマレイミド等）で架橋する方法（米国特許第４２８０９９２号明細書及び同第３６５２７６１号明細書等）等が挙げられる。物理吸着により結合する方法としては、水不溶性担体（Ｂ）がポリスチレンの場合、蛋白質（Ｐ）の０．００１〜０．０４％（Ｗ／Ｖ）炭酸緩衝水溶液（ｐＨ９．０）に水不溶性担体を適当時間浸漬する方法（バイオシム・バイオフィズ・アクタ、２５１巻、４２７頁、１９７１年）等が挙げられる。この方法は、担体がポリスチレン以外の物質、例えばポリプロピレン、シリコン、ガラス及びセルロース等にも適用できる。また、特異的結合物質（例えば、抗原−抗体、アビジン−ビオチン、レクチン−糖鎖、相補的遺伝子鎖等）を利用して間接的に、蛋白質（Ｐ）と水不溶性担体（Ｂ）とを結合することもできる。例えば、蛋白質（Ｐ）をビオチンで修飾し、アビジンを結合した水不溶性担体と反応することにより、蛋白質（Ｐ）を水不溶性担体（Ｂ）に結合できる。アビジンとしては、卵白由来アビジン及びストレプトアビジン等が使用でき、ストレプトアビジンが好ましい。これら特異的結合物質のうち抗原−抗体、アビジン−ビオチン、レクチン−糖鎖については、［生化学実験法１１「エンザイムイムノアッセイ」，東京化学同人社，１９８９年］に記載のもの、相補的な遺伝子としては公開特許公報平６−１８６２３２号に記載の相補的な遺伝子、例えばポリデオキシアデニル酸とポリチミジル酸の組み合わせ等が挙げられる。
【００２４】
これらのうち、蛋白質（Ｐ）のアミノ酸個数が２０〜１００の場合、特異的結合物質を用いる方法が好ましく用いられ、特異的結合物質を用いる方法のうち、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が特に好ましい。蛋白質（Ｐ）のアミノ酸個数が１００以上の場合、化学的に結合する方法及び物理吸着による方法が好ましく、最も好ましくは化学的に結合する方法である。なお、アミノ酸個数２０〜１００個の蛋白質と、アミノ酸個数１００個以上の蛋白質とを結合する場合、例えば、アビチンとアミノ酸個数１００個以上の蛋白質を混合して、水不溶性担体（Ｂ）と結合させた後、ビオチンで修飾した蛋白質と反応させる。
【００２５】
本発明の免疫測定用試薬は、適当な緩衝液に浸漬した状態でもよいが、蛋白質（Ｐ）と水不溶性担体（Ｂ）とを結合した後、糖類及び／又は蛋白質でコーティングし乾燥した状態が好ましい。緩衝液としては、リン酸緩衝液及びグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液等が使用でき、蛋白、塩及び／又は界面活性剤等を含有していてもよい。蛋白としては、アルブミン（牛血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、マウス血清アルブミン、オバルブミン、コナルブミン及びラクトアルブミン等）、抗体（正常ウサギIleｇＧ及び正常マウスＩｇＧ等の蛋白質（Ｐ）との結合性がない抗体）及びゼラチン等が挙げられる。塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び臭化リチウム等が挙げられる。界面活性剤としては、ソルビタンラウリン酸モノエステルエチレンオキシド付加物（商品名：ツイーン２０及びツイーン４０、ＩＣＩアメリカ社）等のノニオン界面活性剤等が挙げられる。コーティング・乾燥方法としては、少なくとも糖類を含有する溶液中に浸漬したのち乾燥させる方法（特開平０９−３１８６２８号公報及び特公平５−４１９４６号公報）等が挙げられる。糖類としては、ニ糖類及び単糖類が好ましく、ニ糖類としては、麦芽糖、セロビオース、ゲンチオビオース、メリビオース、ショ糖、ラクトース及びイソサッカロース等が挙げられ、単糖類としては、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、アラビノース及びキシリトース等が挙げられる。これらのうち、ラクトース、ショ糖、グルコース及びフルクトースが好ましく、さらに好ましくはラクトース及びショ糖、特に好ましくはショ糖である。コーティングするとき、コーティング量（糖類などの含有量）、糖類などを含む溶液（コーティング液）の濃度、及び溶液の種類等は、公知の範囲でよく、例えば、特開平０９−３１８６２８号公報及び特公平５−４１９４６号公報等に記載されている。
【００２６】
本発明の免疫測定用試薬キットは、本発明の免疫測定用試薬と共に、抗ヒトイムノグロブリン抗体とを含有していることが好ましい。抗ヒトイムノグロブリン抗体は、従来公知の方法で作成されたものが使用でる。例えば、ヒトイムノグロブリンを適当な動物（例えば、マウス、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ等）に免疫し、得られた抗血清から塩析、イオン交換カラムクロマトグラフィー等で抗体を精製して作成できる。抗ヒトイムノグロブリン抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、また、（Ｆａｂ’）2、Ｆａｂ’等の抗体断片でもよい。なお、ヒトイムノグロブリンとは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等の全てのイムノグロブリンを含むが、通常はＩｇＧ及びＩｇＭであり、主にＩｇＧである。
【００２７】
抗ヒトイムノグロブリン抗体は、標識されていなくでもよいが、感度、測定の簡便性等の点から標識化合物で標識されていることが好ましい。抗ヒトイムノグロブリン抗体が標識化合物で標識されていない場合、抗ヒトグロブリン抗体を認識する抗体（例えば抗ヒトイムノグロブリン抗体がマウスのIgＧである場合、ウサギで作成した抗マウスIgＧ抗体）を標識した試薬等が用いられる。標識化合物としては従来公知のものが使用でき、ラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質及び酵素等が用いられる。アイソトープとしては、125Ｉ等が挙げられ、蛍光物質としてはユーロピウム錯体等が挙げられ、発光物質としてはＮ−メチルアクリジウムエステル等が挙げられ、酵素としては西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。これらの標識化合物のうち、酵素が好ましく、さらに好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼ、特に好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼである。
【００２８】
標識化合物を抗ヒトイムノグロブリン抗体に標識する方法は従来公知の方法等が適用でき、「続生化学実験講座５  免疫生化学実験法」（日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年発行、１０２〜１１２頁に記載の方法等が用いられ、例えば、次の（１）〜（４）の方法等が適用できる。
（１）標識化合物がアイソトープの場合、クロラミンＴを酸化剤として用いて放射性ヨウ素を抗ヒトイムノグロブリン抗体のチロシン残基に導入する方法。
（２）標識化合物が蛍光物質の場合、フルオレセインイソチオシアネートを緩衝液中で抗ヒトイムノグロブリン抗体に反応させ、抗ヒトイムノグロブリン抗体のリシン残基に結合させる方法。
（３）標識物質が発光物質の場合、商品名「アクリジニウム誘導体−Ｉ」（同人化学研究所社製）を緩衝液中で抗ヒトイムノグロブリン抗体に反応させ、抗ヒトイムノグロブリン抗体のアミノ基に結合させる方法。
（４）標識物質が酵素の場合、酵素の持つアミノ基と抗ヒトイムノグロブリン抗体の持つチオール基をＮ−スクシンイミジル−６−マレイドヘキサノエート等のニ架橋性試薬で結合する方法。
【００２９】
本発明の免疫測定用試薬キットには、本発明の免疫測定用試薬を含めば、試薬の剤型及び試薬キットの構成等に制限はない。すなわち本発明の試薬キットは、ラテックス凝集法及びラテックス比濁法等のホモジニアス免疫測定法にも、ヘテロジニアス免疫測定法にも適用できる。これらのうち、測定感度の点で、ヘテロジニアス免疫測定方法が好ましく、標識化合物を標識され抗ヒトイムノグロブリン抗体を含むヘテロジニアスなサンドイッチ免疫測定法用の試薬キットが最も好ましい。すなわち、本発明の免疫測定用試薬と検体とを反応させるとＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体のみが特異的に蛋白質（Ｐ）と結合する。そこで、抗ヒトイムノグロブン抗体を加えると、この抗体は自己抗体と結合し、免疫複合体「蛋白質（Ｐ）−自己抗体−抗ヒトイムノグロブリン抗体」を形成する。この免疫複合体中の抗ヒトイムノグロブリン抗体を定量することにより自己抗体量を定量できる。抗ヒトイムノグロブリン抗体が標識化合物で標識している場合、抗ヒトイムノグロブリン抗体量は標識化合物の量を測定することにより定量することができる。
【００３０】
標識化合物の測定は、標識化合物の種類により従来公知の方法等で実施できる。標識化合物が蛍光物質の場合、例えば適当な波長の励起光の照射によって生じる蛍光量を光電子増倍管により定量する。標識化合物が化学発光物質の場合、例えばアクリジニウムエステルではアルカリ溶液を加えることにより生じる発光量を光電子増倍管により定量する。
【００３１】
標識化合物が酵素の場合、適当な基質を反応させることにより酵素活性を吸光度（吸光度測定法）、蛍光量（蛍光量測定法）又は発光量（化学発光量測定法）として測定できる。例えば、酵素がペルオキシダーゼの場合、基質としては２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム（ＡＢＴＳ）（吸光度測定法）及びルミノール／過酸化物（化学発光量測定法）等を選択できる。酵素がアルカリフォスファターゼの場合、基質としてはｐ−ニトロフェニルフォスフェート（吸光度測定法）、４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）（蛍光量測定法）及び３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’’ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム（ＡＭＰＰＤ）（化学発光量測定法）等を選択できる。吸光度は分光光度計、蛍光量及び化学発光量は光電子増倍管により定量される。これらのうち、化学発光量測定法が好ましく（すなわち、本発明の試薬キットを用いて自己抗体を定量する方法としては化学発光酵素免疫測定法が好ましい。）、さらに好ましくはペルオキシダーゼとルミノール／過酸化物との組合せ又はアルカリフォスファターゼとＡＭＰＰＤとの組み合わせによる化学発光量測定法である。
【００３２】
ルミノールとしては、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びこれらの金属塩等が含まれる。これらの金属塩としては、アルカリ金属（ナトリウム及びカリウム等）塩及びアルカリ土類金属（カルシウム及びマグネシウム等）塩等が使用できる。これらのうち、ルミノール及びルミノールの金属塩が好ましく、さらに好ましくはルミノールの金属塩、特に好ましくはルミノールのナトリウム塩である。過酸化物としては、無機過酸化物及び有機過酸化物のいずれも使用できる。無機過酸化物としては、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ酸カリウム、過酸化酸、過酸化炭酸、過酸化二炭酸、次亜塩素酸、次亜塩素酸カリウム、亜塩素酸、塩素酸、塩素酸ナトリウム、過塩素酸、過臭素酸、ペルオクソ硫酸及びペルオクソリン酸等が挙げられる。有機過酸化物としては、過酢酸、過プロピオン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トリエチルアミンオキサイド、メチルジエチルアミンオキサイド及び過酸化フタロイル等が挙げられる。これらのうち、保存安定性等の観点から、無機過酸化物が好ましく、さらに好ましくは過酸化水素である。
【００３３】
本発明の免疫測定用試薬キットには、蛋白質（Ｐ）と水不溶性担体（Ｂ）とが結合してなる試薬（本発明の免疫測定用試薬）に好ましくは抗ヒトイムノグロブリンを含む試薬を加えて、さらに免疫反応用緩衝液、Ｂ／Ｆ分離用緩衝液及びコントロール試料等を含むことができる。免疫反応用緩衝液及びＢ／Ｆ分離用緩衝液としては従来免疫測定に使用される緩衝液等が使用でき、蛋白、塩及び／又は界面活性剤等を含有するリン酸緩衝液及びグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液等が使用できる。蛋白、塩及び界面活性剤としては上記と同じもの等が挙げられる。
【００３４】
コントロール試料は、検体にＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体が存在するかを判断するための比較試料として用いるものであり、通常、自己抗体を含まない試料（陰性コントロール）及び自己抗体を含む試料（陽性コントロール）が用意される。陰性コントロールとしては、免疫反応用緩衝液と同様な蛋白等を含有した緩衝液、ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を保有しないヒトプール血清等が使用できる。陽性コントロールとしては、ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を保有するヒトプール血清、及びＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を含む血清を添加した緩衝液（免疫反応用緩衝液と同様な蛋白等を含有）等が使用できる。
【００３５】
本発明の免疫測定用試薬キットで測定される検体は、ヒト由来の体液であれば特に限定されず、例えば血液、尿、唾液、リンパ液、胆汁、胃液、膵液等が挙げられ、さらに生体から採取された組織のホモジネート抽出液等も用いることができる。これらのうち、血液及び尿が好ましく、さらに好ましくは血液（全血、血清又は血漿等を含む）である。
【００３６】
本発明の試薬キットを用いたＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を検出する方法（サンドイッチ測定法）の具体例（工程１〜６）を以下に示す。
工程１．検体と、蛋白質（Ｐ）と水不溶性担体（Ｂ）が結合されてなる免疫測定用試薬（本発明の免疫測定用試薬）とを反応させて反応混合物（工程２の複合体１を含む）を得る。
工程２．工程１の反応混合物から未反応物を除き（Ｂ／Ｆ分離）、複合体１を得る。
工程３．工程２で得られた複合体１と、標識化合物で標識された抗ヒトイムノグロブリン抗体とを反応させて反応混合物（工程４の複合体２を含む）を得る。
工程４．工程３の反応混合物から未反応物を除き（Ｂ／Ｆ分離）、複合体２を得る。
工程５．複合体２の標識化合物の量を測定する。
工程６．標識化合物の量を用いて、基準値（陰性コントロール及び／又は陽性コントロール）と比較し、自己抗体の有無を判定する。
【００３７】
検体中のＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体の有無を判断する工程（上述の例では工程６）において、検体である血液に対する抗ヒトイムノグロブリン抗体量（抗ヒトイムノグロブリンに標識された標識化合物量として測定される）と、複数の健常人の血液での抗ヒトイムノグロブリン量（抗ヒトイムノグロブリンに標識された標識化合物量として測定される）から設定される基準値とを比較することにより自己抗体の有無を判定することが好ましい。基準値の設定方法は、例えば「臨床検査薬ガイド１９９９〜２０００，ｐ６４〜７１、文光堂（１９９９）」、「臨床検査データブック１９９７−１９９８、ｐ８〜１３，医学書院（１９９７）」に記載された方法で行うことができる。すなわち複数の健常人（少なくとも５０人以上、好ましくは１２０人以上）を測定し、標識化合物量を求める（化学発光酵素免疫測定法の場合、発光量となる）。標識化合物量を統計処理｛パラメトリック法、ノンパラメトリック法等［パラメトリック法は母集団が正規分布（べき乗変換しても可）を示す場合に使用し、ノンパラメトリック法は母集団が正規分布しない場合に使用される。］｝し、標本群の９５％を含む範囲を求める基準範囲とし、上限を上限基準値、下限を下限基準値と設定する。従って、上限基準値を越えた検体については自己抗体を有する可能性が高いが、５％の確率で健常人でも越える場合がある。これを防ぐため、通常は上限基準値にさらに係数を乗じ、及び／又は付加したカットオフ値を設定することが行われる。すなわちカットオフ値を超えた検体を自己抗体が有るものとして判定する。カットオフ値の設定は、上限基準値とＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体を有する検体の分布下限の値との関係で設定するが、通常は上限基準値の１．５〜３倍程度の値である。
【００３８】
上述の陰性コントロール及び陽性コントロールは、設定したカットオフ値を簡易に再現できるように調製したものである。例えば、陰性コントロールの測定値（標識化合物量）の３倍がカットオフ値となる、陰性コントロールと陽性コントロールの平均値がカットオフ値となる等、の設定が可能である。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
＜作成例１＞ＲＢ１遺伝子産物（ＧＳＴ融合蛋白質）の作製
インターナショナル  ジャーナル  オブ  オンコロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ），１９，１０３５頁，２００１年に記載の方法に準じて、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）との融合蛋白質を以下の通り作製した。
【００４１】
１．ＲＢ１遺伝子の調製
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞｛Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ（フナコシ社より購入）｝からＲＮＡを抽出した。抽出は、ＡＧＰＣ（Acetate buffer,Guanidinium thiocyanate,phenol,chloroform）法を用いて、次のようにして行った。
【００４２】
（ＡＧＰＣ法試薬の調製）
（１）１Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の調製
クエン酸三ナトリウムの２９．４ｇを蒸留水８０ｍｌに溶解した後、クエン酸を加えて、ｐＨ７．０にあわせた後、２５℃で蒸留水を加えて１００ｍｌとした。そして、オートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）してから使用した。
（２）Ｄ液の調製
ＧＴＣ（グアニジウムチオシアネート）２３６．３ｇ（４Ｍ）、ザルコシル （Ｌ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ）２．５ｇ（０．８重量％）、１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.０） １２.５ｍｌ(２５ｍＭ)及び蒸留水２５０ｍｌを８５℃で均一溶解した後、室温（２５℃）に戻し、蒸留水で４９６ｍｌにあわせた。細孔径０．４５μｍボトルトップフィルターで濾過して保存した。使用時にこの保存溶液５０ｍｌに対して２−メルカプトエタノール３６０μｌ（０．１Ｍ）を加え、Ｄ液とした。
（３）２Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）の調製
酢酸ナトリウム・トリハイドレート２７．２ｇを蒸留水１０ｍｌに溶解させた後、酢酸を用いてｐＨ４．０にあわせ、２５℃で蒸留水を加えて１００ｍｌとした。細孔径０．４５μｍボトルトップフィルターで濾過して使用した。
【００４３】
（ＡＧＰＣ法の操作）
（１）チューブにＤ液０．５ｍｌを加え、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を分散し、細胞を破壊した。
（２）さらに、２Ｍ 酢酸ナトリウム５０μｌ、フェノール０．５ｍｌ及びクロロホルム／イソアミルアルコール(体積比４９/ｌ)１００μｌを順次加え、１種類いれるごとに、チューブを２〜３回振り、混ぜた。
（３）１０秒間激しく混ぜた後、１５分間氷冷した。
（４）遠心加速度１０，０００Ｇで１０℃、２０分間遠心した後、下部に分離した水層を、ＤＮＡを含む中間層が混入しないように、別のチューブに分取した。
（５）分取した水層に、イソプロパノール０．５ｍｌを加え、−２０℃で１時間冷やした。次に、１０分間遠心（１０，０００Ｇ、０℃）し、ＲＮＡを沈殿させた。
（６）沈殿したＲＮＡを０．５ｍｌのＤ液に再び溶解し、イソプロパノール０．５ｍｌを加え、−２０℃で１時間置く。
（７）遠心してＲＮＡを沈殿させ、沈殿を８０重量％エタノール水溶液１ｍＬで洗い、乾燥させた後、水に溶解する。
【００４４】
このようにして抽出したＲＮＡから、商品名「レディ−トゥ−ゴウ  ＲＴ−ＰＣＲ  ビーズ」（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ，アマシャム社）を使用して、ｃＤＮＡの合成及び増幅を行った。すなわち、レディ−トゥ−ゴウ  ＲＴ−ＰＣＲ  ビーズにＲＮＡ及び表１の作成例１記載のアミノ酸配列に対応した３’プライマー溶液を加え、４２℃、１時間反応した後、９５℃、５分間加温処理し、ｃＤＮＡを合成した。引き続き、ｃＤＮＡを含む反応液に５’プライマーを加え、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）をデナチュレイション反応（９５℃、１分）、アニーリング反応（６０℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）の条件でＰＣＲ用サーマルサイクラー（ＭＰ  ＰＣＲ  サーマルサイクラー、宝酒造製）を用いて３０サイクルで行い、増幅されたｃＤＮＡを得た。
【００４５】
２．組み換え遺伝子の作成及び発現
得られたｃＤＮＡを発現用ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（アマシャム社より購入）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位にモレキュラークローニング，ア  ラボラトリー  マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ），１９８９年記載の方法で組み込んだ。シークエンス法にてｃＤＮＡの挿入方向が正しく組み込まれていることを確認した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３），ＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にトランスフォーム後、０．１ｍＭのイソプロピルチオベータガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む培地にて３７℃、２時間誘導をかけた。超音波破砕により調製した大腸菌の細胞ライゼイトより目的の融合蛋白質をグルタチオン結合アフィニティーゲル（商品名：グルタチオンセファロース４Ｂ、アマシャム社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィー法にて精製（溶出液：１０ｍＭの還元型グルタチオンを含む０．０２Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／塩酸緩衝液）し、ＧＳＴ融合蛋白質ＧＳＴ１｛配列番号（２）のアミノ酸配列を構成単位としてなる蛋白質｝を調製した。
【００４６】
＜作成例２〜７＞
表１に示した３’プライマー及び５’プライマーを使用した以外は作成例１と同様にして、ＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ２〜７）を調製した。
【００４７】
【表１】
2004264294.tif 000002
【００４８】
＜実施例１＞
１．ＧＳＴ１結合ビーズの作成
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液２０ｍLの入った蓋付きポリエチレン瓶に直径３．２ｍｍのガラスビーズ（イムノケミカル社製）１０００個を加え、１時間、２５℃で反応させ、反応残液をアスピレーターで吸引除去した。
次いで脱イオン水２０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
次いで、この洗浄後のガラスビーズ１０００個を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、１時間、２５℃で反応させ、反応残液をアスピレーターで吸引除去した。そして、脱イオン水２０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
さらにこの洗浄後のガラスビーズ１０００個をＧＳＴ１を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、１時間、２５℃で反応させた。
反応後、ＧＳＴ１含有リン酸緩衝液を除去し、２０ｍＬの０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に４℃、８時間浸漬した。その後、緩衝水溶液をアスピレーターで吸引除去し、２０ｍＬの０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）でビーズを２回洗浄した後、１０重量％のショ糖を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に３０分間浸漬後、リン酸緩衝液をアスピレーターで除き、ビーズをろ紙上に撒き室温（約２５℃）で風乾し、ＧＳＴ融合蛋白質結合ビーズ１（本発明の免疫測定用試薬１）を調整し、乾燥剤（シリカゲル）を入れた密閉容器中で冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００４９】
２．免疫反応用緩衝液の作成
０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、カゼインを３ｇ／Ｌ及び塩化ナトリウムを８．５ｇ／Ｌの濃度になるように添加し、免疫反応用緩衝液を作成した。使用時まで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００５０】
３．ペルオキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリン抗体の作成
抗ヒトイムノグロブリンポリクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）及び西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡（株）製）を用い、文献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１９８２年）１４１３−１４２４頁］に記載の方法でペルオキシダーゼ標識抗β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体［１ｍｇ／ｍＬの蛋白質濃度である０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の溶液］を調製し、冷凍（−３０℃）保存した。
【００５１】
４．酵素標識抗体液の作成
上記で作成した免疫反応緩衝液及びペルオキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリン抗体を用いて次の通り酵素標識抗体液を作成した。すなわち、免疫反応用緩衝液１００ｍＬにペルオキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリン抗体を蛋白量で１００μｇ添加し、攪拌混合し、これを酵素標識抗体液とした。
【００５２】
５．過酸化水素液の調製
２００μｌの３５重量％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解し、過酸化水素水とした。使用するまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００５３】
６．基質液の調製
ルミノール（東京化成製）０．１８ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇ（三新化学製）を０．１Ｍ（モル／Ｌ）、ｐＨ８．５のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／塩酸緩衝液１リットルに溶解した。使用するまで遮光、冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００５４】
＜実施例２〜１０＞
１．ＲＢ１遺伝子産物（ＧＳＴ融合蛋白質）結合ビーズの作成
ＧＳＴ１に換えて、表２に示したＧＳＴ融合蛋白質を用いた以外実施例１と同様にして、ＧＳＴ融合蛋白質結合ビーズ２〜１０（本発明の測定用試薬２〜１０）を調整し、乾燥剤（シリカゲル）を入れた密閉容器中で冷蔵（２〜１０℃）保存した。
なお、複数のＧＳＴ融合蛋白質を組み合わせて使用する場合（実施例８〜１０）、各ＧＳＴ融合蛋白質の量は同じとし、総量が２０μｇ／ｍＬになるようにした。また、免疫反応用緩衝液、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリン抗体、酵素標識抗体液、過酸化水素液及び基質液は、実施例１で作成したものを用いた。
【００５５】
＜実施例１１＞
健常人プール血清及び癌患者血清を測定した例である。
１.検体
健常人ボランティア５０名から採取した血清を各０．２ｍＬずつ混合し、健常人プール血清１０ｍＬを作成し検体１とした。又、癌患者から得た血清（患者１〜３）を各１０ｍＬを用意し検体２〜４として用いた。
【００５６】
２．免疫反応操作
１２×７５ｍｍ試験管中に、免疫測定用緩衝液３００μＬ、検体１（健常人プール血清）１０μＬ、及びＧＳＴ融合蛋白質結合ビーズ１個を加え、３７℃で、１０分間反応させた。反応残液をアスピレータで除去した後、生理食塩水２ｍＬを加てビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去した。さらに生理食塩水２ｍＬを加え同様に洗浄した。次に、酵素標識抗体液３００μＬを、洗浄後のビーズに加え３７℃、１０分反応させた。反応液をアスピレーターで除去し、生理食塩水２ｍＬを加えビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去した。さらに生理食塩水２ｍＬを加え同様に２回洗浄した。洗浄後のビーズについて、次のようにして酵素活性の測定を行った。また、検体２〜４についても同様にして酵素活性の測定を行った。
【００５７】
３．酵素活性測定操作
洗浄後のビーズが入った試験管（１２×７５ｍｍ）をアロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホルダーにセットし、基質液２００μＬ及び過酸化水素水２００μＬを加え化学発光反応を開始した。発光反応開始４０秒後から１０秒間の発光量を積算計測し、これを酵素活性を示す発光量とした。
【００５８】
４．測定結果
発光量の測定結果を表２に示した。なお、表２中の数値は、上段が発光量を示し、下段は健常人プール血清の発光量を１．０としたときの各発光量の相対値である。
癌患者では、測定発光量が健常人プール血清の発光量より高く、発光量比（表中下段の数値で、各測定発光量を健常人プール血清の測定発光量で除した値）が大きいことが判る。又、患者血清では個別のＧＳＴ融合蛋白質に対して反応性が低い場合があっても、複数のＧＳＴ融合蛋白質を組み合わせることにより感度が向上することが判る。特に、Ｅ１Ａ結合領域の全領域を含む組み合わせが発光量比が高く、感度が向上している。
【００５９】
【表２】
2004264294.tif 000003
【００６０】
＜比較例１＞
本比較例は従来技術による方法で測定を行った例である。
１．ＧＳＴ融合蛋白質のブロッティング
作成例１〜７で作成したＧＳＴ１〜ＧＳＴ７の各１μｇをファルマシア社製「ファストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ）」を用いてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びニトロセルロースフィルターへのブロッティングを行った。電気泳動は、ゲルとしてファルマシア社製「ファストゲルホモジニアス（ＰｈｓｔＧｅｌ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）１２．５」、泳動バッファーとしてファルマシア社製「ファストゲルスディエスバッファーストリップ（ＰｈｓｔＧｅｌ  ＳＤＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｔｒｉｐｓ）」を用い、温度１５℃、電圧２５０Ｖ、泳動２時間で行った。泳動したゲルからＧＳＴ蛋白質をファルマシア社製「ファストトランスファー（ＰｈｓｔＴｒａｎｓｆｅｒ）セミドライブロッティング」を用いてニトロセルロースメンブレン（ミリポア社製）にブロッティングした。ブロッティングバッファーは、１９２ｍＭグリシン及び１０容量％メタノールを含む２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．３）を用いた。ブロッティングは、温度１５℃、電圧２０Ｖ、泳動３０分で行った。
【００６１】
２．検体中の自己抗体の検出
このメンブレンを５重量％脱脂粉乳含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に室温（２５℃）で８時間浸した。メンブレンを取り出し、検体１（健常人プール血清）を５重量％脱脂粉乳含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で４００倍に希釈した溶液に浸漬し、２５℃、３時間反応させた。次いでフィルターを取り出し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（７．０）に２５℃、１時間振とうしながら放置した後、液をアスピレーターで除くことによりフィルターを洗浄した。この洗浄を３回実施した。洗浄したフィルターを実施例１で作成した酵素標識抗体液に浸漬し、２５℃、１時間反応した。上述の洗浄を同様に６回行った。洗浄したフィルターを５０ｍｇの３，３’−ジアミノベンジジンを含む１００ｍＬの０．０５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に浸漬し、２５℃、１０分反応した。上述の洗浄を５回（ただし放置時間は１０分）行った後、フィルターを２５℃で風乾した後、生じた発色バンドを目視で確認した。また、検体２〜４（癌患者１〜３の血清）についても同様にして、発色バンドを目視確認した。
【００６２】
３．評価
健常人ブール血清の場合のバンド（ほとんど生じないか、極弱い）と比較して、健常人ブール血清と同じ程度の場合を−、僅かに強い場合を±、強い場合を＋で表した結果を表３に示した。実施例１１で明らかにＳ／Ｎ差がある場合でも、比較例１では−あるいは±判定となる場合があった。また、比較例１の判定は目視による主観的な判断であり、判定者によって結果が異なる恐れがあるほど微妙なものであった。一方、本発明の方法は、実施例１１で示したように数値として明確に測定できるため、こういった問題は無い。
【００６３】
【表３】
2004264294.tif 000004
【００６４】
＜実施例１２＞
複数の健常人血清を測定して基準値を求め、カットオフ値を設定し、癌患者１０名からの血清を測定し、ＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体の有無を判断した例である。
【００６５】
１．検体の測定
実施例１０で調製したＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ４、ＧＳＴ５、ＧＳＴ６、ＧＳＴ２及びＧＳＴ７）結合ビーズ１０を用いて、実施例１１の方法と同様にして、健常人ボランティア１２０名からの血清検体及び実施例１１の検体１（健常人プール血清）を測定した。
健常人ボランティア１２０名の測定値（発光量）の分布を図１に示した。なお、図の横軸は発光量（ｃｐｓ）であり、点は検体の分布（１点が１検体に対応）を示す。
【００６６】
２．カットオフ値の設定
健常人ボランティア１２０名からの血清検体及び検体１の測定値（発光量）を統計処理ソフト「ＳＴＡＴＦＬＥＸ  ｖ．４．１」（アーテック社製）を用いて分布型を解析した結果、発光量分布は、歪度１．４９、尖度４．９０であった。なお、この分布は正規分布していなかった。ノンパラメトリック法で９５％の信頼区間を求めたところ、基準値は、発光量１６０６〜７５４７であった。ここで上限発光量の１．５倍の発光量をカットオフ値と設定すると、発光量１１３２１であった。この時、検体１（健常人プール血清）の発光量は３４０６であり、カットオフ値の１／３．３２であった。従って、検体１（健常人プール血清）を、陰性コントロールとして測定した場合、カットオフ値＝「健常人プール血清測定発光量」×３．３２と設定された。
【００６７】
３．検体の測定
癌患者１０名（患者４〜１３）から採取した血清検体５〜１４及び陰性コントロールとして実施例１１で作成した検体１（健常人プール血清）を測定した。測定は、実施例１０のＧＳＴ融合蛋白質結合ビーズ１０を用いて実施例１１と同様にして行った。
【００６８】
４.判定結果
検体１（健常人プール血清）を陰性コントロールとし、上記２で設定した係数でカットオフ値（「健常人プール血清測定発光量」×係数）を求めた。発光量がカットオフ値以上（カットオフ比１．０以上）の測定値を自己抗体陽性、一方、発光量がカットオフ値未満（カットオフ比１．０未満）の測定値を自己抗体陰性と判断した。これらの結果を表４に示した。
【００６９】
【表４】
2004264294.tif 000005
【００７０】
表４から、癌患者では高頻度（１０人中８人）でＲＢ１遺伝子産物に対する自己抗体が陽性と判定された。本発明の方法が、癌の診断に有用である可能性が示された。
【００７１】
＜作成例８〜１５＞
表５に示した３’プライマー及び５’プライマーを使用した以外は作成例１と同様にして、ＧＳＴ融合蛋白質（ＧＳＴ８〜１５）を調製した。
【００７２】
【表５】
2004264294.tif 000006
【００７３】
＜実施例１３〜２８＞
１．ＲＢ１遺伝子産物（ＧＳＴ融合蛋白質）結合ビーズの作成
ＧＳＴ１に換えて、表６又は７に示したＧＳＴ融合蛋白質を用いた以外実施例１と同様にして、ＧＳＴ融合蛋白質結合ビーズ１１〜２６（本発明の測定用試薬１１〜２６）を調整し、乾燥剤（シリカゲル）を入れた密閉容器中で冷蔵（２〜１０℃）保存した。
なお、複数のＧＳＴ融合蛋白質を組み合わせて使用する場合（実施例１９〜２６）、各ＧＳＴ融合蛋白質の量は同じとし、総量が２０μｇ／ｍＬになるようにした。また、免疫反応用緩衝液、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトイムノグロブリン抗体、酵素標識抗体液、過酸化水素液及び基質液は、実施例１で作成したものを用いた。
【００７４】
＜実施例２９＞
実施例１１と同様にして、検体を測定し表６及び７に示した（表６及び７中の数値は、上段が発光量を示し、下段は健常人プール血清の発光量を１．０としたときの各発光量の相対値である。）。
癌患者では、測定発光量が健常人プール血清の発光量より高く、発光量比（表中下段の数値で、各測定発光量を健常人プール血清の測定発光量で除した値）が大きいことが判る。又、患者血清では個別のＧＳＴ融合蛋白質に対して反応性が低い場合があっても、複数のＧＳＴ融合蛋白質を組み合わせることにより感度が向上することが判る。特に、Ｅ１Ａ結合領域の全領域を含む組み合わせが発光量比が高く、感度が向上している。
【００７５】
【表６】
2004264294.tif 000007
【００７６】
【表７】
2004264294.tif 000008
【００７７】
＜比較例２＞
作成例１〜７で作成したＧＳＴ１〜ＧＳＴ７を作成例８〜１５で作製したＧＳＴ８〜１５に変えた以外、比較例１と同様にして検体を測定した。そして、健常人ブール血清の場合のバンド（ほとんど生じないか、極弱い）と比較して、健常人ブール血清と同じ程度の場合を−、僅かに強い場合を±、強い場合を＋で表した結果を表８に示した。実施例２９で明らかにＳ／Ｎ差がある場合でも、比較例２では−あるいは±判定となる場合があった。また、比較例２の判定は目視による主観的な判断であり、判定者によって結果が異なる恐れがあるほど微妙なものであった。一方、本発明の方法は、実施例２９で示したように数値として明確に測定できるため、こういった問題は無い。
【００７８】
【表８】
2004264294.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ＧＳＴ融合蛋白質結合ビーズ（本発明の免疫測定用試薬１０）を用いて、健常人ボランティア１２０名の血清について測定した発光量の分布を示したグラフである（実施例１２）。
【図１】
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【配列表】
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