(57)【要約】      （修正有）【課題】長鎖の反復配列クラスターからなる安定な核酸構築物及び該核酸構築物を安定に保持する形質転換体を提供すること。【解決手段】特定の塩基配列を基本反復単位とする反復配列クラスターとＢＡＣ誘導体ベクターの骨格とを含有し、かつ該反復配列クラスターの方向性が、シロイヌナズナの染色体上における方向性と実質的に同一である核酸構築物、個体間の多型を介して、前記反復配列クラスターとは基本反復単位の塩基配列及び／又は該基本反復単位の反復回数が異なる反復配列クラスターとＢＡＣ誘導体ベクターの骨格とを含有し、かつ該反復配列クラスターの方向性が、シロイヌナズナの染色体上における方向性と実質的に同一である核酸構築物、及び該核酸構築物により形質転換された細胞。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示される塩基配列を基本反復単位とする反復配列クラスターと、
ＢＡＣ誘導体ベクターの骨格と
を含有し、かつ該反復配列クラスターの方向性が、シロイヌナズナの染色体上における方向性と実質的に同一である核酸構築物。
【請求項２】
個体間の多型を介して、請求項１の反復配列クラスターとは基本反復単位の塩基配列及び／又は該基本反復単位の反復回数が異なる反復配列クラスターと、
ＢＡＣ誘導体ベクターの骨格と
を含有し、かつ該反復配列クラスターの方向性が、シロイヌナズナの染色体上における方向性と実質的に同一である核酸構築物。
【請求項３】
反復配列クラスターが、９〜１００ｋｂ長である、請求項２記載の核酸構築物。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の核酸構築物により形質転換された細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セントロメアに局在する長鎖の反復配列クラスターに関する。詳しくは、本発明は、セントロメアに局在する長鎖の反復配列クラスターからなる核酸構築物及び該核酸構築物を保持した形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、動物においては、アルファサテライトの長鎖の反復配列クラスターＤＮＡをヒト培養細胞に導入することが行なわれている〔非特許文献１〕。かかる動物の反復配列は、大腸菌内では不安定であるため、コピー数を増大させるが困難な場合がある。
【０００３】
一方、植物の反復配列は、大腸菌内等では、動物の反復配列よりも、より不安定であることが経験的に知られており、欠落する場合があり、安定な長鎖の反復配列クラスターＤＮＡを得ることは困難であるのが現状である。
【０００４】
【非特許文献１】
ハリントン（Ｊ．Ｊ．Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ）ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １５，  ３４５−３５５，
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、大腸菌等の宿主細胞において、増幅可能であり、反復配列が安定に保持されうる、長鎖の反復配列クラスターからなる核酸構築物を提供することを目的とする。また、本発明は、前記核酸構築物を安定に保持し、安定に供給することができる、形質転換細胞を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、
〔１〕  配列番号：１に示される塩基配列を基本反復単位とする反復配列クラスターと、
ＢＡＣ誘導体ベクターの骨格と
を含有し、かつ該反復配列クラスターの方向性が、シロイヌナズナの染色体上における方向性と実質的に同一である核酸構築物、
〔２〕  個体間の多型を介して、前記〔１〕の反復配列クラスターとは基本反復単位の塩基配列及び／又は該基本反復単位の反復回数が異なる反復配列クラスターと、
ＢＡＣ誘導体ベクターの骨格と
を含有し、かつ該反復配列クラスターの方向性が、シロイヌナズナの染色体上における方向性と実質的に同一である核酸構築物、
〔３〕  反復配列クラスターが、９〜１００ｋｂ長である、前記〔２〕記載の核酸構築物、並びに
〔４〕  前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の核酸構築物により形質転換された細胞、
に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸構築物は、配列番号：１に示される塩基配列を基本反復単位とする反復配列クラスターを含有し、かつ該反復配列クラスターの方向性が、シロイヌナズナの染色体上における方向性と実質的に同一であることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の核酸構築物によれば、植物体、例えば、シロイヌナズナのプロトプラストに導入することにより、前記反復配列クラスターの機能を評価することができ、さらには、人工染色体の構築のための基本分子の開発を行なうことができる。
【０００８】
また、本発明の核酸構築物によれば、前記反復配列クラスターに加え、ＢＡＣ誘導体ベクターの骨格を含有しているため、長鎖の反復配列クラスターを大腸菌、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等において、かかるクラスターの短縮化を伴なうことなく、核酸構築物自体の量を増やすことができるという優れた効果を発揮する。
【０００９】
本発明の核酸構築物としては、具体的には、
配列番号：１に示される塩基配列を基本反復単位とする反復配列クラスターと、ＢＡＣ誘導体ベクターの骨格と
を含有し、かつ該反復配列クラスターの方向性が、シロイヌナズナの染色体上における方向性と実質的に同一である核酸構築物〔核酸構築物１という〕、及び
個体間の多型を介して、請求項１の反復配列クラスターとは基本反復単位の塩基配列及び／又は該基本反復単位の反復回数が異なる反復配列クラスターと、
ＢＡＣ誘導体ベクターの骨格と
を含有し、かつ該反復配列クラスターの方向性が、シロイヌナズナの染色体上における方向性と実質的に同一である核酸構築物〔核酸構築物２という〕、
が挙げられる。
【００１０】
配列番号：１に示される塩基配列は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の染色体上に存在する縦列反復配列における基本反復単位となる配列である。かかる基本反復単位の塩基配列は、個体により変動する場合があるが、１８０ｂｐ長前後であり、具体的には、１７６〜１８０ｂｐ長である場合が多く、より具体的には、１７８〜１８０ｂｐ長であるものが多い。したがって、本発明においては、前記基本反復単位となる配列には、自然発生バリアント配列も含まれる。なお、本明細書において、「自然発生バリアント配列」とは、配列番号：１  に示される塩基配列とは、自然界において発生しうる突然変異を介して異なる塩基配列をいい、例えば、自然界において発生しうる突然変異により塩基が置換、欠失、付加又は挿入されて生じる塩基配列をいう。「自然発生バリアント配列」としては、例えば、いわゆるホットスポット（突然変異多発域）における変異、脱アミノ化に伴う変異、単調な配列に生じやすいフレームシフトによる変異等により生じた塩基配列、核酸多型を介して前記配列番号：１とは異なる塩基配列等が挙げられる。
【００１１】
本明細書において、「反復配列クラスターの方向性が、シロイヌナズナの染色体上の方向性と実質的に同一である」とは、反復配列クラスターの５’末端側から３’末端への塩基配列が、シロイヌナズナの染色体上の対応部分の塩基配列と実質的に同じであることを意味し、具体的には、シロイヌナズナの染色体上の対応部分の塩基配列との配列同一性が、ＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づく解析（条件：期待値  １１及びワードサイズ（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）  １０）により、少なくとも８５％、好ましくは９０％以上、より好ましくは、９５％以上、特に好ましくは１００％であることを意味する。また、個体間では、前記基本反復単位の反復配列が異なる場合がある。そこで、本明細書においては、前記配列同一性は、前記反復配列クラスターにおいて、基本反復単位の反復回数が同一である場合について算出された値をいう。
【００１２】
なお、本明細書において、前記「個体間の多型」の語は、反復単位の反復回数の異同を意味する。
【００１３】
前記反復配列クラスターは、前記個体間の多型により異なるが、９〜１００ｋｂ長である。
【００１４】
本発明の核酸構築物に用いられうるベクターの骨格としては、例えば、ＢＡＣ誘導体ベクター等のベクターの骨格が挙げられる。前記ベクターの骨格のなかでは、宿主細胞内で、安定に長鎖の核酸を維持し、宿主細胞による反復配列クラスターの短縮化を防ぐ観点から、好ましくは、ＢＡＣ誘導体ベクター、具体的には、ＢＡＣベクター、ＢＡＣ由来バイナリーベクター等の骨格である。より具体的には、ｐＢｅｌｏＰＡＣ１１の骨格、ｐＢａｌｏＢＡＣＴ１の骨格等のＢＡＣベクターの骨格、ＢｉＢＡＣの骨格等のＢＡＣ由来のバイナリーベクターの骨格等が挙げられる。なお、本明細書において、「ベクターの骨格」とは、前記ベクターに含まれるエレメントのうち、生体内で複製可能な複製開始起点、転写制御配列、生体内におけるマーカーとなりうるマーカー遺伝子を含有するものをいう。
【００１５】
本発明の核酸構築物は、例えば、後述の実施例と同様の方法により構築されうる。本発明の核酸構築物は、具体的には、例えば、
ａ）シロイヌナズナの染色体を鋳型とし、反復配列クラスターを増幅するに適した２種のプライマーからなるプライマー対を用いて、伸長時のヌクレオチドの取り込みエラーを実質的に生じないＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを行ない、ついで、得られた産物を、制限酵素Ａで消化し、断片を得る工程（図１参照）、
ａ’）制限酵素Ｂで前記ベクターを消化することにより、ベクターの骨格を得る工程（図１参照）、ここで、前記制限酵素Ｂは、前記制限酵素Ａにより生じた突出末端と該制限酵素Ｂにより生じた突出末端とが連結されることにより自己の認識部位を消失するものであり、かつベクターにユニークサイトを有するものである、
ｂ）前記工程ａ）で得られたＰＣＲ産物と、前記工程ａ’）で得られたベクターの骨格とを連結させ、組換え構築物を得る工程（図１参照）、
ｃ）前記工程ｂ）で得られた組換え構築物を鋳型とし、下記プライマー▲１▼及び▲２▼：
▲１▼  反復配列クラスターを増幅するに適し、かつ前記制限酵素Ａの認識部位を有するプライマー、
▲２▼  反復配列クラスターを増幅するに適し、かつ前記制限酵素Ｂの認識部位を有するプライマー、
からなるプライマー対を用いて、伸長時のヌクレオチドの取り込みエラーを実質的に生じないＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを行ない、ついで、得られた産物を、前記制限酵素Ａと前記制限酵素Ｂとで消化し、それにより、染色体上での方向性が前記制限酵素Ａ及び前記制限酵素Ｂの認識部位によりマッピングされた断片を得る工程（図２参照）、
ｃ’）前記制限酵素Ｂで前記ベクターを消化することにより、ベクターの骨格を得る工程（図２参照）、
ｄ）前記工程ｃ）で得られた断片と、前記工程ｃ’）で得られたベクターに連結させ、組換え構築物を得る工程（図２参照）、ここで、該組換え構築物において、前記制限酵素Ａの認識部位は消失する
ｅ）前記工程ｄ）で得られた組換え構築物を鋳型として、
前記プライマー▲１▼と、
反復配列クラスターを増幅するに適し、かつ前記組換え構築物において前記制限酵素Ｂの認識部位の５’末端上流に位置する制限酵素Ｃの認識部位を有するプライマー▲３▼と
からなるプライマー対を用いて、伸長時のヌクレオチドの取り込みエラーを実質的に生じないＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを行ない、ついで、得られた産物を、前記制限酵素Ａと前記制限酵素Ｃとで消化し、それにより、染色体上での方向性が前記制限酵素Ａ及び前記制限酵素Ｃの認識部位によりマッピングされた断片を得る工程（図３参照）、
ｅ’）前記制限酵素Ｂと前記制限酵素Ｃとで前記工程ｄ）で得られた組換え構築物を消化する工程（図３参照）、
ｆ）前記工程ｅ）で得られた断片と、前記工程ｅ’）で得られた産物とを連結させ、組換え構築物を得る工程（図３参照）、ここで、該組換え構築物において、前記制限酵素Ａの認識部位は消失する
を行ない、ついで、前記ｅ）、ｅ’）及びｆ）と同様の工程を任意に追加して行なうことにより得られる。かかる工程を行なうことにより、反復配列クラスターの方向性を、シロイヌナズナの染色体上の方向性と実質的に同一にすることができる。
【００１６】
前記工程ａ）においては、慣用の核酸単離方法によりシロイヌナズナから抽出された染色体を用いればよい。前記染色体の供給源となるシロイヌナズナの系統としては、例えば、エコタイプ  コロンビア株等が挙げられる。。
【００１７】
ついで、ＰＣＲによる反復配列クラスターの増幅に用いられうるプライマー対としては、反復配列クラスターを増幅するに適したプライマーからなるプライマー対が挙げられ、例えば、配列番号：２に示される塩基配列のプライマーと配列番号：３に示される塩基配列のプライマーとのプライマー対等が挙げられる。
【００１８】
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、伸長時のヌクレオチドの取り込みエラーを実質的に生じないＤＮＡポリメラーゼであり、好ましくは、長鎖の伸長能を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００１９】
また、ベクターの骨格の作製〔前記工程ａ’）〕は、前記工程ａ）と同時又は並行して行なえばよい。
【００２０】
ここで、前記制限酵素Ｂは、前記制限酵素Ａにより生じた突出末端と該制限酵素Ｂにより生じた突出末端とが連結されることにより自己の認識部位を消失するものである。前記制限酵素Ａと前記制限酵素Ｂとの組み合わせの例としては、特に限定されないが、順に、ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩとの組み合わせ等が挙げられる。
【００２１】
前記工程ａ）で得られたＰＣＲ産物を、前記工程ａ’）で得られたベクターの骨格に連結させることにより、反復配列クラスターを含有して組換え構築物を得ることができる。
【００２２】
さらに、前記工程ｃ）、ｃ’）、ｄ）、ｅ）、ｅ’）及びｆ）を行なうことにより、より長鎖の反復配列クラスターを含有し、かつ反復配列クラスターの方向性が、シロイヌナズナの染色体上における方向性と実質的に同一である核酸構築物を得ることができる。
【００２３】
得られた核酸構築物は、大腸菌等の慣用の微生物宿主細胞内でも、その反復配列クラスターの短縮化を伴うことなく、安定に保持されうる。したがって、本発明の核酸構築物を、大腸菌等の慣用の微生物宿主細胞内で増やすことができる。
【００２４】
なお、本発明の核酸構築物は、岡山大学資源生物学研究所〔郵便番号：７１０００４６、岡山県倉敷市中央二丁目２０番１号〕に保存され、本発明者ら及び／又は出願人の許諾により分譲されうる形質転換細胞から、容易に単離することもできる。
【００２５】
さらに、本発明の核酸構築物により形質転換された細胞（形質転換細胞という）も本発明に含まれる。
【００２６】
本発明の形質転換細胞は、本発明の核酸構築物を、宿主細胞に導入することにより得られる。
【００２７】
前記宿主細胞は、本発明の核酸構築物に用いられるベクターの骨格に適したものであればよく、大腸菌、アグロバクテリウム等が挙げられる。操作の容易性等の観点から、宿主は、好ましくは、大腸菌が望ましい。また、前記大腸菌のなかでは、安定性の観点から、ＤＨ１０Ｂが望ましい。
【００２８】
宿主細胞への核酸構築物の導入は、例えば、エレクトロポレーション等の慣用の方法で行なわれうる。
【００２９】
本発明の形質転換細胞によれば、反復配列クラスターを含有した核酸構築物を、該反復配列クラスターを短縮化させることなく、大量にかつ安定に供給することができる。
【００３０】
本発明の形質転換細胞から得られた本発明の核酸構築物は、シロイヌナズナ等の植物に導入することにより、反復配列クラスターのシロイヌナズナ等の植物体内における生理機能を調べることができる。例えば、シロイヌナズナ等の植物から、プロトプラストを調製し、エレクトロポレーション法、ボンバードメント法等により、該プロトプラストに核酸構築物を導入すればよい。なお、植物に本発明の核酸構築物を導入する場合、該核酸構築物には、植物体内でのマーカーとなりうる遺伝子が配置されていることが望ましい。
【００３１】
前記プロトプラストは、葉等の植物組織、植物のカルス、懸濁培養細胞等をペクチナーゼとセルラーゼとで処理し、それにより、細胞集合体からの個々の細胞の分離及び細胞壁の除去を行なうことにより得られる。例えば、シロイヌナズナの場合、２％  セルラーゼオノズカＲ１０又はＲＳ（キンキヤクルト社製）と０．１％  ペクトリアーゼ２３と０．１Ｍ  マンニトールとを含有した溶液に、表皮を剥がしたシロイヌナズナの葉を処理することにより得ることができる。
【００３２】
本発明の核酸構築物に含まれる反復配列クラスターは、シロイヌナズナの植物体内において、セントロメアの機能に役割を果たすことが期待される。
【００３３】
前記セントロメアの機能としては、真核生物の染色体の分配を司り、娘細胞が染色体の完全な一組を確実に受け取るための姉妹染色分体の分離における機能等が挙げられる。
【００３４】
したがって、本発明の核酸構築物を植物に導入して、核酸構築物の動態を調べることにより、人工染色体の作製のための基本分子として機能する核酸を開発することが可能になる。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例などにより本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１
長鎖の反復配列クラスターからなる核酸は、ｐＵＣ１９等の一般的なベクターに組込み、得られた組換えプラスミドを大腸菌に導入すると、細胞内で、挿入断片が短くなってしまう等、非常に不安定であることが知られている。
【００３７】
そこで、このような反復配列が多く繰り返された配列からなる核酸を安定に保持することができる組換えプラスミドの構築を行なった。
【００３８】
シロイヌナズナ  コロンビアエコタイプから、ＣＴＡＢ法を用いてゲノムＤＮＡを単離した。
【００３９】
得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、下記プライマー：
５’−ｇｇａａａｃａｃｔａｃｔｔａｇｇｃｔｔｔｔａｇｇａｔａａｇｇ−３’（ＬＡ  ｃｅｎＦ；配列番号：２）
５’−ａａｇａｃｔｃａｔａｔｇｇａｃｔｔｔｇｇｃｔａａａｃｃ−３’  （ＬＡ  ｃｅｎＲ；配列番号：３）
からなるプライマー対を用いて、ＰＣＲを行なった。種々条件を検討したところ、プライマー濃度を各２０ｐｍｏｌ、鋳型量を１．５ｎｇ、Ｍｇ２＋濃度を２．５ｍＭとし、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．５Ｕを用いて、９６℃６０秒の反応を行ない、９６℃２５秒と６８℃２５分とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行ない、ついで、７２℃１０分間インキュベーションを行なうことにより、増幅産物を得ることができた。
【００４０】
得られた増幅産物を鋳型とし、もう一度、前記と同じ条件で、ＰＣＲを行なった。ここで、プライマーは、
５’−ｇａａｇａｔｃｔｔｃｇｔｇａｇｔｇｔｔｔｔｇｇａｇｔｃｇａａｔａｔｇ−３’  （ＬＡ  ｃｅｎＲＢｇ  ；配列番号：４）
５’−ｃｇｇｇａｔｃｃｃｇａａｇｔｃｃａｔａｔｇａｇｔｃｔｔｔｇｔｃｔ−３’  （ＬＡ  ｃｅｎＦＢｍ  ；配列番号：５）  と
とを用いた。増幅産物を、制限酵素ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩとで消化し、得られた断片を、ベクターのＢａｍＨＩ部位に連結させ、組換えプラスミド（クローンＡ９）を得た（図１）。
【００４１】
ついで、得られた組換えプラスミド（クローンＡ９）を鋳型とし、下記プライマー：
５’−ｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｃｇｇａｇａｔｃｔｔａａａ−３’      （Ａ９Ｆ  ；配列番号：６）
５’−ｃａｇｇｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃａａｔａｃｔ−３’  （Ａ９Ｒ  ；配列番号：７）
からなるプライマー対を用いて、ＰＣＲを行なった。種々条件を検討したところ、プライマー濃度を各１０ｍｍｏｌ、鋳型量を０．１μｇとし、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．５Ｕを用いて、９６℃６０秒の反応を行ない、９６℃２５秒と６８℃１０分とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行ない、ついで、７２℃１０分間インキュベーションを行なうことにより、増幅産物を得ることができた。ついで、得られた増幅産物を、制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩとで消化して、約５．５ｋｂの断片を得た。得られた断片を、ベクターのＢａｍＨＩ部位に連結して、プラスミド（クローンＡ９−１−５）を得た（図２）。
【００４２】
ついで、前記プラスミド（クローンＡ９−１−５）を鋳型とし、前記Ａ９Ｆプライマーと、５’−ｇａａｔｇｇｃａｇａａａｔｔｃｇａｔｇａｔａａｇｃｇｇ−３’      （Ａ９−１−５Ｒ  ；配列番号：８）とからなるプライマー対を用いて、ＰＣＲを行なった。種々条件を検討したところ、プライマー濃度を各１０ｍｍｏｌ、鋳型量を０．１μｇ、Ｍｇ２＋濃度を、１．５ｍＭとし、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕを用いて、９５℃３０分の反応を行ない、９５℃２０秒と６５℃２０秒と６８℃１０分とを１サイクルとする３０サイクルの反応を行なうことにより、増幅産物を得ることができた。
【００４３】
ついで、得られた増幅断片を、前記プラスミド（クローンＡ９−１−５）を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｐｈＩとで消化して得られたプラスミドに連結して、プラスミド（クローンＩ−１９）を得た（図３）。
【００４４】
前記と同様にＰＣＲ断片を前記プラスミド（クローンＩ−１９）の制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位とＳｐｈＩ認識部位との間に連結し、プラスミドＡを得た。得られたプラスミドＡを鋳型として用い、前記と同様にＰＣＲ断片を前記プラスミドＡの制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位とＳｐｈＩ認識部位との間に連結し、プラスミドＢを得た。さらに、前記と同様にＰＣＲ断片を前記プラスミドＢの制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位とＳｐｈＩ認識部位との間に連結し、プラスミドＣを得た。前記と同様にＰＣＲ断片を前記プラスミドＣの制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位とＳｐｈＩ認識部位との間に連結し、プラスミドＤを得た。前記と同様にＰＣＲ断片を前記プラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位とＳｐｈＩ認識部位との間に連結し、プラスミド（クレーンＸＩＩ−１）を得た（図４）。
【００４５】
前記プラスミド（クローンＸＩＩ−１）を、ＢｇｌＩＩとＳｐｈＩとで消化し、２５ｋｂの断片を得た。得られた断片を、ＸＩＩ−１のＢａｍＨＩ認識部位とＳｐｈＩ認識部位との間に連結し、プラスミド（クローンＸＩＶ−２７）を得た（図４）。
【００４６】
前記プラスミド（クローンＸＩＶ−２７）をＢｇｌＩＩとＳｐｈＩとで消化し、約５０ｋｂの断片を得た。得られた断片をプラスミド（クローンＸＩＶ−２７）のＢａｍＨＩ認識部位とＳｐｈＩ認識部位との間に連結し、プラスミド（クローンＸＶ−１７）を得た（図５）。得られた断片をプラスミド（クローンＸＶ−１７）のＢａｍＨＩ認識部位とＳｐｈＩ認識部位の間に連結し、プラスミド（クローンＸＶＩ−４）を得た（図５）。
【００４７】
得られた増幅産物について、ＰＣＲを用いたダイレクトシークエンスにより、塩基配列を調べたところ、１８０ｂｐの核酸を基本単位として、約５５０コピー含有した長鎖のクラスターが得られていることがわかった。
【００４８】
ついで、得られた産物を用いて、大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。形質転換は、大腸菌  約１×１０７  細胞に対し、得られた産物  ０．１μｇ相当量を用い、エレクトロポレーション法に従って行なった。
【００４９】
得られた形質転換体を任意に選別し、該形質転換体が保持するプラスミドに、増幅産物が、短縮化されることなく、組み込まれているかどうかを調べた。
【００５０】
その結果、ＢＡＣベクターｐＢｅｌｏＰＡＣ１１を用いた場合、約１８０ｂｐの核酸を基本単位として、約５５０コピー含有した長鎖の反復配列クラスターを有する組換えプラスミドが、安定に保持されていることがわかった（図６）。
【００５１】
ついで、１８０ｂｐの核酸を基本単位として、約５５０コピー含有した長鎖のクラスターを有する組換えプラスミドを保持した形質転換体について、継代培養し、安定性を調べた。その結果、かかる形質転換体により、安定に、組換えプラスミドが保持されることが示された。
【００５２】
配列表フリーテキスト
配列番号：２は、プライマーＬＡ  ｃｅｎＦの配列である。
【００５３】
配列番号：３は、プライマーＬＡ  ｃｅｎＲの配列である。
【００５４】
配列番号：４は、プライマーＬＡ  ｃｅｎＲＢｇの配列である。
【００５５】
配列番号：５は、プライマーＬＡ  ｃｅｎＦＢｍの配列である。
【００５６】
配列番号：６は、プライマーＡ９Ｆの配列である。
【００５７】
配列番号：７は、プライマーＡ９Ｒの配列である。
【００５８】
配列番号：８は、プライマーＡ９−１−５Ｒの配列である。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の核酸構築物によれば、大腸菌等の宿主細胞において、増幅可能であり、反復配列が保持され、シロイヌナズナ植物体内における反復配列の方向性が保持され、安定であるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の核酸構築物は、人工染色体の構築のための基本分子の開発に用いられうる。また、本発明の形質転換細胞によれば、前記核酸構築物を安定に保持することができ、該核酸構築物を安定して供給することができるという優れた効果を奏する。
【００６０】
【配列表】
2004283029.tif 000002
2004283029.tif 000003
2004283029.tif 000004
2004283029.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミド（クローンＡ９）の構築の概略図を示す。
【図２】図２は、プラスミド（クローンＡ９）からプラスミド（クローンＡ９−１−５）の構築の概略図を示す。
【図３】図３は、プラスミド（クローンＡ９−１−５）からプラスミド（クローンＩ−１９）の構築の概略図を示す。
【図４】図４は、プラスミド（クローンＸＩＩ−１）からプラスミド（クローンＸＩＶ−２７）の構築の概略図を示す。
【図５】図５は、プラスミド（クローンＸＶ−１７）からプラスミド（クローンＸＶＩ−４）の構築の概略図を示す。
【図６】図６は、プラスミド（クローンＸＶ−１７）の挿入断片を確認した結果を示す。レーン１、３、５、７、９、１１及び１３は、プラスミド（クローンＸＶ−１７）を、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化した産物、レーン２、４、６、８、１０、１２及び１４は、該プラスミド（クローンＸＶ−１７）を、ＢａｍＨＩとＳｐｈＩとで消化した産物を示す。７．５ｋｂの位置は、ベクターを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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