(57)【要約】【課題】細胞が二次元で培養した状態で凍結保存することができ、更に、コンタミネーションの発生を極力防止することができる細胞の凍結保存方法を提供する。【解決手段】培地が漏出することの無いガス透過膜１２を有した容器１０を用い、この容器１０内において密閉状態にて細胞を付着培養した後、培地に凍結保護剤を加え、容器１０内において培養されたままの細胞を断熱容器２０に収容し、この断熱容器２０を−１５０℃以下の庫内温度環境を実現する冷凍庫２２の庫内に収納して、細胞を緩慢に凍結させる。【選択図】　　　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地が漏出することの無いガス透過膜を有した容器を用い、当該容器内において密閉状態にて細胞を付着培養した後、前記培地に凍結保護剤を加え、前記容器内において培養されたままの前記細胞を緩慢に凍結させることを特徴とする細胞の凍結保存方法。
【請求項２】
前記容器を断熱容器内に収容し、当該断熱容器を、−１５０℃以下の庫内温度環境を実現する冷凍庫の庫内に収納することを特徴とする請求項１の細胞の凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、付着培養した細胞の凍結保存方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来のこの種付着培養細胞の凍結保存方法は、図４に示すように培地の入ったシャーレ等の細胞培養用の容器１００に目的とする細胞を収容し、培養して増殖させる。細胞は容器１００の内壁面に付着して増殖する。その後、トリプトシン等のタンパク融解酵素を加えて、細胞を剥がして単細胞状態まで分散させ、この状態でグリセリンやＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）等の凍結保護剤の入った培地に懸濁する。この細胞懸濁養液をガラスアンプル等の凍結保存容器１０２に移して、凍結保存容器１０２を密閉した後、この凍結保存容器１０２を発泡スチロール等の断熱容器１０４に入れ、冷凍庫１０６で緩慢に凍結させた後、当該冷凍庫１０６や液体窒素で凍結保存するものであった。
【０００３】
そして、凍結保存した細胞を再び融解して利用する場合には、凍結保存した密閉容器を約＋３７℃の温湯中に投じて速やかに凍結保存容器１０２内の培地を融解させる。融解した後、細胞を取り出して再び培養用の容器１００に移し、培地を適量加え、常法に従って培養を行うものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような凍結保存方法では、細胞培養用の容器１００で細胞を培養した後に、前述する如くトリプトシン等のタンパク融解酵素を用いて細胞を剥がして単細胞まで分散させ、別途凍結保存容器１０２に移さなければならないため、これにより細胞が二次元で培養した状態、即ち、細胞同士の相互ネットワークは破壊される。
【０００５】
これは、例えば、肝細胞のような細胞は単一細胞としてだけではなく、これらの細胞同士の組織によって肝臓機能が働いているため、このように細胞を単一に剥がしてしまうと、肝臓機能が壊れてしまう。また、トリプトシン等の酵素の作用条件により、再融解後の細胞の生存率に大きく影響するほか、細胞の増殖能の回復に要する時間にも影響を及ぼすという問題が生じていた。
【０００６】
更に、従来の方法では細胞を細胞培養用の容器１００で培養した後、融解時に温湯が侵入しない密閉できる凍結保存容器１０２に移して凍結し、また、凍結保存しておいた細胞を融解した場合には、再び培養用の容器に移し換える必要があるため、コンタミネーション（雑菌による汚染）が発生する危険性が高いものであった。
【０００７】
本発明は、係る従来技術の課題を解決するために成されたものであり、細胞が二次元で培養した状態で凍結保存することができ、更に、コンタミネーションの発生を極力防止することができる細胞の凍結保存方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明の細胞の凍結保存方法は、培地が漏出することの無いガス透過膜を有した容器を用い、この容器内において密閉状態にて細胞を付着培養した後、培地に凍結保護剤を加え、容器内において培養されたままの細胞を緩慢に凍結させるものである。これにより、凍結した細胞を融解させる場合には、この容器のまま融解させることができるようになる。
【０００９】
即ち、二次元で培養した細胞同士のネットワークを維持したまま凍結、融解することが可能となり、単細胞でなく細胞組織として凍結保存・融解することができるようになる。また、細胞の死滅率も低下させられるので、これらにより、培養実験の効率化を図ることができるようになる。
【００１０】
更に、一つの容器にて培養から凍結・融解するまでの工程を行うことができるので、コンタミネーション（雑菌汚染）も極力低減することができる。
【００１１】
また、請求項２の発明では上記において容器を断熱容器内に収容し、この断熱容器を−１５０℃以下の庫内温度環境を実現する冷凍庫の庫内に収納するので、液体窒素を用いずに再結晶化による細胞の破壊を防止しながら凍結保存することができるようになる。
【００１２】
これにより、冷凍作業が容易となるので、作業性の向上を図ることができるようになる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
次に、図面に基づき本発明の実施の形態を詳述する。図１は本発明に使用する細胞培養及び凍結保存用の容器１０の斜視図、図２は図１の容器１０のガス透過膜１２−ガス透過膜１２間の横断面図、図３は本発明の細胞の凍結保存方法を示した流れ図である。
【００１４】
実施例の容器１０は図１に示す如く、２枚のガス透過膜１２、１２と、このガス透過膜１２、１２の外周を連結する枠体１４とから構成されている。２枚のガス透過膜１２、１２は、所定間隔を存して対峙しており、このガス透過膜１２、１２の外周は枠体１４にて囲繞されているため、ガス透過膜１２、１２の間には密閉空間１６が形成される。そして、この密閉空間１６に後述するアクセスポート１８から目的細胞や培地等を注入して、目的細胞の培養が行われる。
【００１５】
実施例のガス透過膜１２、１２は厚さ１００μｍのポリエチレンの膜により構成されており、この膜は図２に示すように培地や細胞等の液体を通さずに、二酸化炭素（ＣＯ２）や酸素（Ｏ２）等の気体を自在に通すことができる。従って、ガス透過膜１２、１２間に培地を注入しても漏出しない。
【００１６】
そして、目的細胞はこれらガス透過膜１２、１２それぞれの内表面に図２に示す如く付着した状態で二次元平面的に増殖する。
【００１７】
また、枠体１４には一側面に外部と密閉空間１６とを連通する前述したアクセスポート１８、１８（二箇所）が形成されている。このアクセスポート１８は、通常は外部と密閉空間１６とが連通しないように密閉空間１６を密閉している。そして、密閉空間１６内に培地等を注入したい場合には、アクセスポート１８に図示しない注入器を差し込むことで、外部から密閉空間１６内にアクセスすることができる。更に、培地等を注入した後、アクセスポート１８から注入器を抜くとアクセスポート１８は自閉し、密閉空間１６は外部と遮断されるものである。
【００１８】
このように、密閉空間１６内は常には密閉されていて、培地等を注入する際には注入器を用いてアクセスポート１８から、密閉空間１６内に注入するので、コンタミネーション（雑菌汚染）を極力防止することができるようになる。また、後述する如く融解のために温湯に投入しても、湯が密閉空間１６内に侵入することもない。
【００１９】
次に、本発明の細胞の凍結存方法の一実施例の手順を図３を用いて説明する。先ず、容器１０の枠体１４に形成されたアクセスポート１８から図示しない注入器を差し込んで、密閉空間１６に目的細胞と培地を注入する。この状態で、培養を行うと、細胞がガス透過膜１２、１２の表面に付着した状態で二次元平面的に付着して増殖する。
【００２０】
係る培養の終了後、或いは、培養の途中で増殖した細胞を凍結保存する際には、アクセスポート１８に図示しない注入器を差し込んで、密閉空間１６内の培地を一旦取り除く。この状態では細胞はガス透過膜１２、１２の表面に付着したままである。そこに、例えば細胞内の水分を取り除くためのグリセリンや氷の再結晶化を防止するためのＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）等の凍結保護剤の入った培地をアクセスポート１８から密閉空間１６に図示しない注入器で注入する。これら凍結保護剤により、目的細胞が凍結する時に細胞内の水分が氷になることで体積膨張し、細胞壁が破壊される不都合を回避することができるようになる。
【００２１】
その後、容器１０を発泡スチロール等の断熱材で構成された断熱容器２０内に収納し、当該断熱容器２０ごと−１５０℃以下の庫内温度環境を実現する冷凍庫２２（超低温フリーザー）の庫内に収納して、所定時間放置する。これにより、容器１０内の目的細胞は緩やかに冷却されて凍結し、以後保存される。
【００２２】
一方、凍結保存した細胞を再び融解して再培養を行う場合には、容器１０を約＋３７℃の温湯中に投じて、速やかに容器１０内の凍結保護剤の入った培地を融解させる。融解した後、凍結保護剤の入った培地を図示しない注入器で抜き取る。この状態でも細胞はガス透過膜１２、１２の表面に付着したままである。次に、培地を適量加えてることにより培養を再開する。
【００２３】
このように、培地が漏出することの無いガス透過膜１２を有した容器１０を用い、この容器１０内において密閉状態にて細胞を付着培養した後、培地に凍結保護剤を加え、容器１０内において培養されたままの細胞を緩慢に凍結させるので、この細胞を凍結融解させる場合にはこの容器１０のまま融解させることができるようになる。
【００２４】
これにより、細胞同士のネットワークを維持したまま凍結、融解することができるようになり、単細胞でなく細胞組織として凍結保存・融解することができるようになる。
【００２５】
従って、タンパク融解酵素を用いて細胞を単一状態に剥がしたり、細胞を容器に移したりすることによって細胞にダメージを与える作業が無くなるので、細胞の死滅率を著しく低下することができるようになる。
【００２６】
また、容器１０を断熱容器２０内に収容し、この断熱容器２０を−１５０℃以下の庫内温度環境を実現する冷凍庫の庫内に収納するので、液体窒素を用いずに、氷の再結晶化を防止できる温度まで緩慢に凍結させることができるようになり、冷凍作業が容易となるため、作業性の向上を図ることができるようになる。
【００２７】
尚、実施例で使用した容器はそれに限定されるものでは無く、本発明を実施可能なものであれば、その形態は限定されるものではない。
【００２８】
【発明の効果】
以上詳述する如く本発明の細胞の凍結保存方法は、培地が漏出することの無いガス透過膜を有した容器を用い、この容器内において密閉状態にて細胞を付着培養した後、培地に凍結保護剤を加え、容器内において培養されたままの細胞を緩慢に凍結させるものである。これにより、凍結した細胞を融解させる場合には、この容器のまま融解させることができるようになる。
【００２９】
即ち、二次元で培養した細胞同士のネットワークを維持したまま凍結、融解することが可能となり、単細胞でなく細胞組織として凍結保存・融解することができるようになる。また、細胞の死滅率も低下させられるので、これらにより、培養実験の効率化を図ることができるようになる。
【００３０】
更に、一つの容器にて培養から凍結・融解するまでの工程を行うことができるので、コンタミネーション（雑菌汚染）も極力低減することができる。
【００３１】
また、請求項２の発明では上記において容器を断熱容器内に収容し、この断熱容器を−１５０℃以下の庫内温度環境を実現する冷凍庫の庫内に収納するので、液体窒素を用いずに再結晶化による細胞の破壊を防止しながら凍結保存することができるようになる。
【００３２】
これにより、冷凍作業が容易となるので、作業性の向上を図ることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に使用する細胞培養用の容器の斜視図である。
【図２】本発明に使用する容器１０のガス透過膜−ガス透過膜間の横断面図である。
【図３】本発明の細胞の凍結保存方法を示した流れ図である。
【図４】従来の細胞の凍結保存方法を示した流れ図である。
【符号の説明】
１０　容器
１２　ガス透過膜
１４　枠体
１６　密閉空間
１８　アクセスポート
２０　断熱容器
２２　冷凍庫
【図１】
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【図２】
2004057031.tif 000004
【図３】
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【図４】
2004057031.tif 000006