(57)【要約】【課題】癌組織における血管新生の状況を把握して、癌の進行度（予後）を測定・判定或いは診断する方法を提供すること。【解決手段】ＴＳＰ−１タンパク質のカルボキシル末端の一部を構成するアミノ酸配列であり、血管内皮細胞の管腔形成を特異的に阻害して抗血管新生作用を示す４Ｎ１Ｋペプチドの癌組織内の存在を検出することにより、癌の進行（予後）の測定・判定を行い、癌をもつ患者の生命予後の診断を行う。本発明において、癌組織内のこの４Ｎ１Ｋペプチドの存在を検出するには、この４Ｎ１Ｋペプチドに特異的に結合する抗体を作製し、その抗体の免疫反応を利用して行う。本発明の方法は、ヒトに発生した癌の、手術により摘出した標本、あるいは診断目的で試験切除された腫瘍組織で、最も一般的なホルマリン固定、パラフィン包埋された組織の顕微鏡観察用切片を用いて実施することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１記載のペプチド配列を有する血管新生抑制ペプチドの癌組織内の存在を検出・測定することを特徴とする癌進行度測定・判定方法。
【請求項２】
配列表の配列番号１記載のペプチドに特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする請求項１記載の癌進行度測定・判定方法。
【請求項３】
抗体が、ポリクロナール抗体であることを特徴とする請求項２記載の癌進行度測定・判定方法。
【請求項４】
抗体が、モノクロナール抗体であることを特徴とする請求項２記載の癌進行度測定・判定方法。
【請求項５】
配列表の配列番号１記載のペプチド配列を含む血管新生抑制ポリペプチドの存在状況の検出・測定が、該ペプチド配列を含む蛋白質の発現量であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の癌進行度測定・判定方法。
【請求項６】
癌組織内の配列表の配列番号１記載のペプチド配列を含む血管新生抑制ポリペプチドの存在状況の検出・測定を、検体癌組織の切片を用いた免疫染色により行うことを特徴とする請求項４又は５記載の癌進行度測定・判定方法。
【請求項７】
検体癌組織の切片が、検体癌組織をホルマリン固定及びパラフィン包理した顕微鏡用切片であることを特徴とする請求項６記載の癌進行度測定・判定方法。
【請求項８】
配列表の配列番号１記載のペプチドに特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする癌進行度診断用の試薬。
【請求項９】
配列表の配列番号１記載のペプチドに特異的に結合する抗体をセットしたことを特徴とする癌進行度診断用のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管新生を抑制するトロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）由来ペプチドの癌組織内存在状況を検出・測定することにより、癌進行度を測定・判定及び診断を行う方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血管新生とは、既存の血管から新しい血管ネットワークが形成される現象と定義されており、主として細小血管で観察される。血管新生は生理的な現象であり、胎生期の血管形成に不可欠であるが、成熟固体では、通常、子宮内膜、卵胞、創傷治癒など限られた時期・部位でしか観察されない。ところが、血管新生は、リウマチ様関節炎、網膜症及び悪性の腫瘍の成長等を含む、様々な病理学的過程において重要な役割を果たしている（Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　１，　２７−３１，　１９９５）。
【０００３】
悪性癌（腫瘍）において、血管新生は腫瘍の増殖と転移進行に関して根本的な重要性をもっている（Ｃｅｌｌ　８６，　３５３−３６４，　１９９６）。増殖性の細胞は拡大するために血管に依存し、血管新生も一次病巣から遠隔臓器への腫瘍細胞の転移を可能とする。したがって、血管新生を制御することは、腫瘍の成長阻害のような病気を抑えるための斬新な治療的方法となる（Ｃａｎｃｅｒ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖ．　１５，　２４１−２４５，　１９９６、Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｏｎｃｏｌ．　８，　６０−６５，　１９９６）。血管新生の間、血管内皮細胞はプロテアーゼを産生し、プロテアーゼにより血管基底膜が消化され、続いて内皮細胞の遊走、増殖および細胞内腔形成が起こる（Ｍｏｌ．　Ｍｅｄ．　Ｔｏｄａｙ　３，　１４−２３，　１９９７、Ｎａｔｕｒｅ　３８６，　６７１−６７４，　１９９７、Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　４９，　４５３−４６４，　１９８７）。最終的に、新しく形成された血管は周皮細胞によって覆われる。様々な研究によれば、腫瘍内微小血管密度によって転移の可能性を予見し、従って患者の予後を予見できると指摘されている（Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３２４，　１−８，　１９９１）。
【０００４】
新血管形成は複雑な多段階課程から成っており、様々な異なる因子により促進あるいは抑制されることがある。腫瘍細胞は悪性の血管新生表現型を確立するために重要であるが、腫瘍関連のマクロファージ（ＴＡＭｓ）も同様に重大な役割を果たしている（Ｊ．　Ｎａｔ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　９０，　１６４８−１６５３，　１９９８）。様々な血管新生成長因子がＴＡＭｓによって産出可能であり、マクロファージ密度は乳癌において、微小血管密度及び予後と結びつけられてきた。（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５６，　４６２５−４６２９，　１９９６）。さらに、前立腺癌に関して、抗血管新生効果がマクロファージ抑制によって示されたという報告もされている（Ｊ．　Ｎａｔ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　９０，　１６４８−１６５３，　１９９８）。
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は血管新生を促す重要な役目を果たしていると考えられている。単一遺伝子からの選択的スプライシングは有効性及び生物学的活動の点で相違する異なったアイソフォームを生じ、今までに２種類の受容体が識別されてきた（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　３０，　１１６９−１１７４，　１９９８）。ＶＥＧＦは数多くの悪性腫瘍内で上方制御され予後に対する何らかの影響を持つ可能性がある（Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　３，　８６１−８６５，　１９９７）。
【０００５】
ＶＥＧＦとは対照的に、細胞外基質糖タンパク質、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）は血管新生に関し抑制的に役割を果たしていると見られる（Ｊ．　Ｎａｔ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　８９，　２１９−２２７，　１９９７）。トロンボスポンジンは基底膜などの細胞外マトリックスに沈着する大分子量糖タンパク質であり、互いに相同性を示す少なくとも５つのアイソフォームが存在するが、このうちトロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）には、内皮細胞の増殖を抑制して血管新生を抑制する作用がある（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７，　６６２４，　１９９０）。細胞外基質糖タンパク質である、ＴＳＰ−１は血小板のアルファ顆粒および細胞外基質に蓄えられている、重要な抗血管新生分子である（Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　３，　７９２−７９９，　１９９１、Ｊ．　Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．　１３０，　５０３−５０６，　１９９５）。
【０００６】
ＴＳＰ−１は、培養された内皮細胞での増殖（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　１７０，　８６７−８７２，　１９９０、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８７，　６６２４−６６２８，　１９９０、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，　Ｂａｓｅｌ，　Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ．　１９９２、Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　５３，　７４−８４，　１９９３、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．　１０７，　３９−４６，　１９９４）、遊走（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８７，　６６２４−６６２８，　１９９０、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，　Ｂａｓｅｌ，　Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ．　１９９２、Ｃｅｌｌ　５６，　４５−３５５，　１９８９、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１１１，　７６５−７７２，　１９９０、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１２２，４９７−５１１，　１９９３）及び管腔構造の形成（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８８，　５０２６−５０３０，　１９９１、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．　１０８，　７９７−８０９，　１９９５、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．　Ｒｅｓ．　５４，　１３−２６，１９９７）を抑制する。ＴＳＰ−１は血管内皮を含む様々な種類の細胞で産生される（Ａｍ．　Ｊ．　Ｐａｔｈｏｌ．　１４７，　１０６８−１０８０，　１９９５）。膀胱癌におけるＴＳＰ−１発現は、正常尿路上皮比較して腫瘍組織内では減少し（Ｊ．　Ｎａｔ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　８９，　２１９−２２７，　１９９７）、少ないＴＳＰ−１が生存低減に著しく関連していた（Ｊ．　Ｎａｔ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　８９，　２１９−２２７，　１９９７）。さらに、ＴＳＰ−１は直接的に腫瘍細胞増殖を抑制する可能性がある（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５８，　３１５４−３１６２，　１９９８）。
【０００７】
近年、このＴＳＰ−１の血管新生抑制作用が、内皮細胞膜のＣＤ３６との結合に依存することが報告された（Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１３８，　７０７−７１７，　１９９７）。また、ＴＳＰ−１は、癌抑制遺伝子ｐ５３によってその産生が調節されており、ｐ５３の変異によるＴＳＰ−１の産生減少が、腫瘍血管新生促進の一つの要因になると考えられている（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６５，　１５８２−１５８４，　１９９４、Ｊ．　Ｎａｔ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　８９，　２１９−２２７，　１９９７）。癌抑制遺伝子ｐ５３は、ＴＳＰ−１産生を上方制御し、血管新生を抑制する結果をもたらす（Ｓｃｉｅｎｓｅ　２６５，　１５８２−１５８４，　１９９４）。ＴＳＰ−１は、αｖβ３及びαＩＩβ３インテグリン、インテグリン結合型タンパク（ＩＡＰ；又はＣＤ４７とも表される）（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７１，　２１−２４，　１９９６）、ＣＤ３６（Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１３８，　７０７−７１７，　１９９７）を含む様々な種類の細胞表面受容体及びｈｅｐ　Ｉペプチド（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７３，　１７５５−１７６３，　１９９８）の未だ未判明の受容体を結合する。ＣＤ３６は、ウシ副腎血管内皮細胞において、ＦＧＦ−２によって誘導される遊走及びマトリゲルによって誘導される管腔形成に対しＴＳＰ−１の抑制受容体として識別された。ｈｅｐ　Ｉ結合部位は、ウシ大動脈内皮細胞において、接着斑（ｆｏｃａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ）の分解のために、ホスホイノシチド３キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ　３−ｋｉｎａｓｅ）依存的に、シグナルを変換する。
【０００８】
抗血管新生分子は通常、増殖及び／又は遊走の抑制剤と識別されている（Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｏｎｃｏｌ．　８，　６０−６５，　１９９６、Ｍｏｌ．　Ｍｅｄ．　Ｔｏｄａｙ　３，　１４−２３，　１９９７）。本発明者によって、ＴＳＰ−１から由来した４Ｎ１Ｋペプチドが、増殖には影響を与えずに、ＩＢＥ細胞によるＦＧＦ−２誘導の管腔形成を抑制できることが報告されている（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２５２，　２６２−２７２，　１９９９）。４Ｎ１Ｋは、コラーゲンゲル（管腔形成条件）で成育されたＩＢＥ細胞内において、接着斑キナーゼ（ｆｏｃａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｋｉｎａｓｅ：ＦＡＫ）のインテグリン依存性リン酸化チロシン、及びホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）のＦＧＦ−２誘導のリン酸化チロシンを抑制するが、フィブロネクチン（増殖条件）で成育された細胞内では抑制を起こさない。また、４Ｎ１Ｋが生体内のＦＧＦ−２誘導の抗血管新生を抑制することが、マウスの角膜試験法により明らかにされている。このような結果から、４Ｎ１Ｋペプチドはインテグリン及びＦＧＦＲ−１を経由した、ＩＢＥ細胞を管腔形成に導くシグナル伝達経路を抑制すると考えられている（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２５２，　２６２−２７２，　１９９９）。
【０００９】
上記するように、血管新生は複雑な多段階課程から成っており、様々な異なる因子により促進あるいは抑制される。悪性癌（腫瘍）において、血管新生は腫瘍の増殖と転移進行に関して基本的な重要性をもっており（Ｃｅｌｌ　８６，　３５３−３６４，　１９９６）、多くの研究によれば、腫瘍内微小血管密度によって転移の可能性を予見し、従って患者の予後を予見できると指摘されている（Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　３２４，　１−８，　１９９１）。例えば、癌の進行状況（生命予後）について、微小血管密度は子宮内膜癌における予後に著しく影響を与えることが報告されている（Ｂｒｌｔ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　７７，　１１４０−１１４４，　１９９８）。このように、血管新生が癌の進行に大きな役割を持つことは社会的にも認識されているところであり、悪性癌（腫瘍）における血管新生の正確な情報を得ることは、患者の予後を予見するために何よりも必要なこととなる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、癌組織における血管新生の状況を把握して、癌の進行度（予後）を測定・判定或いは診断する方法、特には、癌組織における血管新生抑制ペプチドの存在を検出・測定することにより癌組織における血管新生の状況を把握して、癌の進行度（予後）を測定・判定或いは診断する方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
血管新生においては、血管内皮細胞によるプロテアーゼを介した基底膜の消化、引き続き、内皮細胞の遊走、増殖を経て、血管内腔側と基底膜側への分化（管腔形成）によってすでにある血管から新しく血管が作られる。この血管新生は、細胞増殖因子により厳密に制御されている。癌における血管新生では、遺伝子変異した癌細胞が、活発な増殖を行う上で必要な、酸素、栄養を補給するため、血管新生を促進する増殖因子を分泌し、正常細胞である血管内皮細胞を刺激する。プロテアーゼを介した基底膜の消化、細胞の遊走、増殖が、癌細胞でも認められる。
このように血管新生が癌の進行に大きな役割を持つことは既に知られており、癌細胞内の微小血管密度によって、癌転移の可能性等、患者の癌の進行度（予後）を予見することも指摘されている。
【００１２】
癌組織における血管新生と癌進行度（予後）に関して、生体内に広く分布するタンパクで、血管新生阻害作用、および促進作用、さらに癌の進行を助ける働きをもつ多機能タンパク質であるトロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）についても広く研究されてきた。そして、その抗体も既に多数作成されているが、何れも機能のはっきりしない部分に対する抗体であったり、抗血管新生作用のない部分の抗体、あるいは認識部位がわかっていない抗体などで、癌の血管新生との関連については明確でなかった。このように、従来の報告では、ＴＳＰ−１のありなしと癌の進行などとの関連については、はっきりしていなかったのが現状である。
【００１３】
本発明者は、癌組織における血管新生及び癌の進行（予後）におけるＴＳＰ−１発現の重要性について研究する中で、ＴＳＰ−１タンパク質のカルボキシル末端の一部を構成するアミノ酸配列である４Ｎ１Ｋペプチド（配列表の配列番号１）が、血管内皮細胞の管腔形成を特異的に阻害して抗血管新生作用を示すこと、及び、癌組織内のこの４Ｎ１Ｋペプチドの存在を検出することにより癌の進行（予後）の推測が可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、癌組織内における４Ｎ１Ｋペプチドの存在を検出することにより癌の進行（予後）の測定・判定或いは診断を行うことよりなるものである。本発明において、癌組織内のこの４Ｎ１Ｋペプチドの存在を検出するには、この４Ｎ１Ｋペプチドに特異的に結合する抗体を作製し、その抗体の免疫反応を利用して行うことができる。例えば、本発明では、ヒトに発生した癌の、手術により摘出した標本、あるいは診断目的で試験切除された腫瘍組織で、最も一般的なホルマリン固定、パラフィン包埋された組織の顕微鏡観察用切片を対象に、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体で免疫学的に染色し、陽性反応を示すかどうかで、検索された癌をもつ患者の生命予後を測定・判定或いは診断することができる。
【００１４】
すなわち本発明は、配列表の配列番号１記載のペプチド配列を有する血管新生抑制ペプチドの癌組織内の存在を検出・測定することを特徴とする癌進行度測定・判定方法（請求項１）や、配列表の配列番号１記載のペプチドに特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする請求項１記載の癌進行度測定・判定方法（請求項２）や、抗体が、ポリクロナール抗体であることを特徴とする請求項２記載の癌進行度測定・判定方法（請求項３）や、抗体が、モノクロナール抗体であることを特徴とする請求項２記載の癌進行度測定・判定方法（請求項４）や、配列表の配列番号１記載のペプチド配列を含む血管新生抑制ポリペプチドの存在状況の検出・測定が、該ペプチド配列を含む蛋白質の発現量であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の癌進行度測定・判定方法（請求項５）や、癌組織内の配列表の配列番号１記載のペプチド配列を含む血管新生抑制ポリペプチドの存在状況の検出・測定を、検体癌組織の切片を用いた免疫染色により行うことを特徴とする請求項４又は５記載の癌進行度測定・判定方法（請求項６）や、検体癌組織の切片が、検体癌組織をホルマリン固定及びパラフィン包理した顕微鏡用切片であることを特徴とする請求項６記載の癌進行度測定・判定方法（請求項７）からなる。
【００１５】
また本発明は、配列表の配列番号１記載のペプチドに特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする癌進行度診断用の試薬（請求項８）や、配列表の配列番号１記載のペプチドに特異的に結合する抗体をセットしたことを特徴とする癌進行度診断用のキット（請求項９）からなる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、トロンボスポジン１（ＴＳＰ−１）タンパク質のカルボキシ末端由来の一部を構成するアミノ酸配列である４ＮＩＫペプチドの、癌組織内の存在を検出することにより、癌の進行度（予後）を測定・判定し、癌の進行度の診断を行うことよりなる。４ＮＩＫペプチドは、配列表の配列番号１で示されるペプチド配列を有し、血管内皮細胞の管形成を特異的に阻害して、抗血管新生作用を示す。本発明において、該４ＮＩＫペプチドの癌組織内の存在を検出・測定するには、該ペプチドに特異的に結合する抗体を作製し、該抗体を用いて免疫反応により検出・測定することができる。
【００１７】
本発明で使用する抗体としては、４ＮＩＫペプチドに特異的に結合する抗体であれば、いずれの抗体でもよく、４ＮＩＫペプチドの配列を抗原として用いて、感作し、常法により分離・精製して容易に作製することができる。そのような抗体としては、ポリクロナール抗体或いはモノクロナール抗体のいずれもが使用することができる。本発明の抗体を用いた免疫反応による測定法としては、適宜公知の方法を用いることができる。例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）などの免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等公知の免疫学的測定法を用いることができる。
【００１８】
本発明において、特に、簡便かつ適合した免疫反応による検出・測定法として、検体癌組織の切片を用いた免疫染色の方法を用いることができる。すなわち、例えば、ヒトに発生した癌の、手術により摘出した標本、あるいは診断目的で試験切除された腫瘍組織を、ホルマリン固定し、更にパラフィン包埋した組織の顕微鏡観察用切片を対象に、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体で免疫学的に染色し、陽性反応を示すかどうかで、４Ｎ１Ｋペプチドの存在を検出する方法を用いることができる。この方法によって癌をもつ患者の生命予後を測定・判定或いは診断することができる。本発明の方法によって、４Ｎ１Ｋ血管新生抑制ポリペプチド配列を含む蛋白質の発現量を定量的に測定することもできる。
本発明の４Ｎ１Ｋペプチドに特異的に結合する抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体は、この抗体を用いた癌進行度診断用の試薬として調製することができる。また、該抗体をセットして、該抗体を用いた癌進行度診断用のキットとして調製することもできる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１．抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体の特異性
（免疫ブロット法による検討）
抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体の特異性を検討し、４Ｎ１Ｋペプチド配列を含むタンパク質検出の有用性を検討するため、本抗体の特異性を免疫ブロット法により解析した。なお、抗体として、４Ｎ１Ｋペプチド（ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ：配列表の配列番号１）をウサギに免疫し、４Ｎ１Ｋペプチドそのものと反応する免疫グロブリンを精製したものを用いた。
【００２０】
未処理のＴＳＰ−１若しくはプロテアーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ３；ＭＭＰ３）消化したＴＳＰ−１をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により分子量別に分けた。該タンパク質と抗体との反応は次のようにして行った：メタノールで活性化させたｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にタンパク質を移し、５％のスキムミルク及び３％のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理的食塩水中で６０分間ブロッキングを行った。メンブレンをリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した後、一次抗体反応として、１００ｎｇ／ｍｌの抗４Ｎ１Ｋ抗体を含むリン酸緩衝生理的食塩水中で、常温で５日間反応させた。次に、メンブレンを０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理的食塩水で十分洗浄した後、二次抗体反応として、西洋わさび由来ペルオキシダーゼの結合した抗ウサギ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を含むリン酸緩衝生理的食塩水中で３０分間反応させた。メンブレンを０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理的食塩水で十分洗浄した後、ＥＣＬ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）によりペルオキシダーゼ反応を誘導することにより、抗体が認識するタンパク質を可視化した。
【００２１】
その結果、未処理のＴＳＰ−１が分子量１８５，０００Ｄａ付近に１本のバンドとして検出され、プロテアーゼ処理したＴＳＰ−１では分子量の小さいバンドが２本（図中に▲で示した。）検出された（図１Ａ）。さらに、免疫反応では非特異的なバンドが検出されることがあるため、４Ｎ１Ｋペプチドそのものと反応した後の抗体で調べたところ、Ａの左の図で見られたバンドは全て検出されなかった。従って、この抗体は、４Ｎ１Ｋペプチド配列を含むタンパク質を特異的に反応することが明らかになった。
【００２２】
（組織を用いた免疫染色法による検討）
血管に富む（血管新生の盛んな）癌である腎細胞癌用いて、実際に組織をホルマリン固定、パラフィン包埋し、該組織を免疫染色して検討した。
この実験で、組織のホルマリン固定、パラフィン包埋し、該組織の免疫染色は次のようにして行った：５μｍの厚さのホルマリン固定組織切片を切り出し、キシレンに３回浸した後、８０％、９０％、９５％、１００％と段階的に濃度を上げたエタノールに浸してパラフィンを除くことにより、脱パラフィン操作を行った。蒸留水に溶かした１ｎｇ／ｍｌのトリプシン（Ｓｉｇｍａ社製：Ｃａｔ．　Ｎｏ．　Ｔ−８１２８）中で、組織切片を３７℃で３分間反応させることにより、抗原の賦活化を行った後、内因性ペルオキシダーゼを失活させるため、３％過酸化水素入りメタノールに組織切片を３０分浸した。次に、抗体の非特異的吸着を防ぐため、５０％のスキムミルク及び２％のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理的食塩水に組織切片を６０分つけた後、一次抗体反応として、組織切片を１００ｎｇ／ｍｌの抗４Ｎ１Ｋ抗体を含むリン酸緩衝生理的食塩水中で、４℃下で一晩反応させた。
【００２３】
なお、ネガティブコントロールとして、同様の組織切片を１００ｎｇ／ｍｌの正常ウサギ免疫グロブリンを含むリン酸緩衝生理的食塩中で反応させたものを用いた。さらに、組織切片を、ビオチンブロッキングシステム（ＤＡＫＯ社製）を用いて内因性のビオチンを阻害した後、組織切片を０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄した。二次抗体反応として、組織切片をビオチン化抗ウサギ免疫グロブリンと反応させた後、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理的食塩水で十分洗浄し、さらに西洋わさび由来ペルオキシダーゼの結合したアビシン（ビオチンと特異的に結合する）を含むリン酸緩衝生理的食塩水で十分洗浄した。組織切片を０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理的食塩水で十分洗浄した後、ＤＡＢ基質キット（Ｚｙｍｅｄ社）にて、ペルオキシダーゼ反応を誘導して褐色の色素を作らせ、顕微鏡で観察を行った。染色結果の判定は、Ｇｒｏｓｓｆｅｌｄらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　８９，　２１９−２２７，　１９９７）に準じて行い、ほとんど褐色に染色されない切片を陰性、中程度あるいは高度に染色されている切片を陽性と判定した。
【００２４】
結果を、図１−Ｂに示す。図１−Ｂにおいて、左右は同一の切片である。図１−Ｂの左の図では、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体で陽性に染色された褐色（ややオレンジ色調）の部位が、右の、４Ｎ１Ｋペプチドそのものと反応させた後の抗体で染色したところ、褐色の発色が消えている。つまり、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体で陽性に染色された部位には４Ｎ１Ｋペプチド配列を含むタンパクが存在していることになる。
【００２５】
実施例２．抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体の反応と癌の進行の判定
（抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体染色と腎細胞癌症例）
腎細胞癌患者のうち、Ｓｔａｇｅ１及び２であった患者の腎組織を摘出し、１０％中性ホルマリンで固定した後、パラフィン包埋をすることにより標本を作製した。全１１９例の腎細胞癌症例からの組織について、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体及び市販の抗ＴＳＰ−１抗体（商品名：ＡＰ−１、カルビオケム・ノバビオケム社製）による染色を行った。該１１９例の腎癌細胞の染色結果を表１にまとめた。その結果、抗ＴＳＰ−１抗体に対して陽性のものが４９例、陰性のものが７０例、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体に対して陽性のものが３２例、陰性のものが８７例であった。抗ＴＳＰ−１抗体では陽性であるが、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体では陰性だった場合の理由としては、ＴＳＰ−１抗体の認識部位が４Ｎ１Ｋペプチドを含むタンパクとは異なるためであると考えられた。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
（癌の大きさと抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体による染色結果との関係）
上記と同様の方法により、腎組織を摘出し、１０％中性ホルマリンで固定した後、パラフィン包埋をすることにより標本を作製した。また、腎組織を摘出し、切開した後、腫瘍部の直径を直接メジャーで測定することにより、腫瘍径を調べた。図２に、癌の大きさと抗ＴＳＰ−１抗体又は抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体の染色結果を示した。抗ＴＳＰ−１抗体で染色した場合、陽性率と癌の腫瘍径との間に関係が認められないが（図２Ａ）、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体で陽性に染色された癌の腫瘍径は陰性の癌に比べて有意に小さかった（図２Ｂ）。なお、危険度ｐ＜０．０５を有意差と見なした。
【００２８】
（抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体を用いた染色結果と癌の進行度との関係）
全症例の癌の進行度と、抗ＴＳＰ−１抗体又は抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体を用いた染色結果との関連性を調べ、表２にまとめた。Ｔ分類とは腎癌の原発巣に関する評価であり、Ｔ１では癌も小さく、腎臓内にとどまっているが、Ｔ４では大きく、腎臓の外にまで連続して進入していることを示す。抗ＴＳＰ−１抗体での染色性は原発巣の評価との間に関係が見られなかった（危険度ｐ＝０．４４８）。一方、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体で陽性の癌は全てＴ２以内であったが、陰性のものでは癌がＴ１からＴ４まで広く分布しており、陽性のものと比べ有意な差が認められた（危険度ｐ＜０．００１）。Ｎ分類はリンパ節転移で、Ｎ０は転移がなく、Ｎ１と２は転移がある症例を示す。Ｎ分類における結果でも、抗ＴＳＰ−１抗体での染色性は、リンパ節転移との間に関係が見られなかった（危険度ｐ＝０．４５３）が、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体で陽性の癌はすべて転移が認められなかった。Ｍ分類はリンパ節以外の転移であり、Ｍ０は転移がなく、Ｍ１は転移がある症例を示す。ＴＳＰ−１抗体での染色性は転移の有無にかかわらず関係が認められないが（危険度ｐ＝０．２８７）、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体で陽性の癌はすべて転移が認められなかった。さらに、顕微鏡での観察により、癌細胞の血管への浸潤を調べた結果、抗ＴＳＰ−１抗体での染色性は血管浸潤との間に関係が見られないが、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体で陽性の癌は有意に血管浸潤が少ないことが観察された。これらの結果より、抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体で免疫学的に染色される癌組織は、癌の増殖が遅れることが示唆された。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
（癌の進行度・大きさと血管新生阻害との関係）
抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体で陽性を示した癌の進行が遅く、かつ腫瘍径が小さいことと、血管新生阻害との関連性を検討した（結果を表３に示す）。はじめに、細胞増殖マーカーである抗Ｋｉ−６７抗体を用いて増殖している細胞の核を染色することにより、全体の細胞数に対する増殖細胞の割合（＝Ｋｉ−６７陽性細胞数／全細胞数；Ｋｉ−６７ラベリングインデックス：Ｋｉ−６７　ＬＩ）を調べた。その結果、抗ＴＳＰ−１抗体及び抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体における染色性とＫｉ−６７　ＬＩとの間に関連性が認められないことから、４Ｎ１Ｋペプチドを含むタンパク質の存在が、癌細胞の増殖を直接抑えていないことが推測された（表３）。また、血管新生の程度を示す指標である微小血管密度（ＭＶＤ）を、抗ＣＤ３１抗体を用いた免疫染色により陽性反応を示した、１ｍｍ２あたりの微小血管数を計数して解析した結果、抗ＴＳＰ−１抗体を用いた染色結果との間に関連性が認められないことから（表３）、ＴＳＰ−１の存在だけで血管新生の程度を知るには限界があると考えられた。一方、ＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ　ｎｉｃｋ　ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ）法により、アポトーシス細胞の核を染色し、細胞死の全細胞に対する比率（＝アポトーシス細胞／全細胞数；アポトーシスインデックス：ＡＩ）を測定した。その結果、４Ｎ１Ｋペプチドを含むタンパク質の存在は、有意にＭＶＤが低く、栄養や酸素の不足に起因するＡＩが有意に高いことが明らかになった（表３）。従って、４Ｎ１Ｋペプチドを含むタンパク質は、血管新生を阻害し、癌の増殖を遅らせることが示唆された。なお、ＬＩ、ＡＩとも２０００個以上の細胞を計数することにより判定した。
【００３１】
【表３】
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【００３２】
【発明の効果】
従来血管新生阻害分子と一定の癌進行度との関連を明確に示すことは難しかったが、本発明により、４Ｎ１Ｋペプチドのような血管新生阻害分子の癌組織内での存在を、本発明の抗４Ｎ１Ｋペプチド抗体のような抗体を用いて検出することにより、癌進行度（予後）のクリアーな予測が可能となった。また、本発明の方法は、評価する対象を、対象となる組織を、一般的に用いられているホルマリン固定並びにパラフィン包埋された組織の形で、顕微鏡切片として調製して、実施することが可能で、医療現場での診断に簡便なかつ有力な手段となることが期待できるものである。
【００３３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１−Ａは、本発明の実施例において、未処理のＴＳＰ−１或いはプロテアーゼ消化したＴＳＰ−１を電気泳動して分子量別に分けたものを抗体と反応させ、抗４Ｎ１Ｋ抗体の特異性を免疫ブロット法により解析した結果を示す図である。また、図１−Ｂは、本発明の実施例において、ホルマリン固定、パラフィン包埋した組織を用いて、免疫染色し、抗４Ｎ１Ｋ抗体の特異性を解析した結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、ＴＳＰ−１抗体又は４Ｎ１Ｋペプチド抗体での染色性と癌の大きさとの関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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