(57)【要約】　　　（修正有）【課題】ヘモフィルス・パラガリナルムを原因とする鶏伝染性コリーザに対し、高い安全性と優れた有効性を示すコンポーネントワクチンの成分と成り得るポリペプチド及びその製造法を提供する。【解決手段】特定な配列で示される６７２のアミノ酸配列長を有し鶏伝染性コリーザの発症を阻止するヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチドを有効成分として含有するワクチン。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列における１もしくは複数個が欠失、置換されあるいは付加されたアミノ酸配列を有していて、鶏伝染性コリーザの発症を阻止する新規ポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列における１もしくは複数個が欠失、置換されあるいは付加されたアミノ酸配列を有していて、鶏伝染性コリーザの発症を阻止する新規ポリペプチドをコードする塩基配列を含有することを特徴とする新規ＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号：２で示される塩基配列である請求項２に記載の新規ＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号：２で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする新規ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２また３に記載の新規ＤＮＡを含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項４に記載の発現ベクターにより鶏伝染性コリーザの発症を防ぐ活性を有するポリペプチドを生産するように形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項７】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、形質転換体に請求項１に記載の新規ポリペプチドを生産させ、該新規ポリペプチドを精製することを特徴とする請求項１に記載の新規ポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
当該ポリペプチドがヘモフイルス・パラガリナルム由来であることを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載の新規ポリペプチドを成分として含有する鶏伝染性コリーザのワクチン。
【請求項１０】
請求項２または３に記載の新規ＤＮＡを有効成分として含有する鶏伝染性コリーザのワクチン。
【請求項１１】
請求項１に記載の新規ポリペプチドを認識することを特徴とする新規モノクローナルおよびポリクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載の新規ポリペプチド、請求項２または３に記載の新規ＤＮＡ、請求項６に記載の形質転換体又は請求項１１に記載の新規抗体を用いることを特徴とする鶏伝染性コリーザの診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、鶏伝染性コリーザの原因菌であるヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来の新規ポリペプチド、これをコードする遺伝子に関する。更に詳細には、鶏伝染性コリーザの発症を阻止する物質としての上記該ポリペプチドと、その製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
家禽の重要な急性呼吸器系疾病の一つとして鶏伝染性コリーザがある。鶏伝染性コリーザの原因はグラム陰性細菌であるヘモフィルス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）であり、感染鶏は顔面及び肉垂が浮腫性に腫脹し、鼻汁を漏出するといった特徴的な症状を呈する。また、本病り患鶏は産卵開始の遅延、産卵率の低下あるいは産卵停止が起きることから、その経済的損失は大きい。従来、鶏伝染性コリーザの予防には、ワクチンが広く用いられている。このワクチンの成分は、ヘモフィルス・パラガリナルムの培養菌体をホルマリンやチメロサール等により不活化して調整した全菌体不活化ワクチンであり、その有効性は広く認知されているところである。一方で、最近になって鶏に対するワクチン接種の利便性から多価ワクチンの開発が求められるようになった。このため、伝染性コリーザワクチンは他の鶏病原性ウイルス性ワクチンやマイコプラズマ性ワクチンと混合して製剤化される場合が多くなった。この多価化に際し、ヘモフィルス・パラガリナルム全菌体を用いたコリーザワクチンでは、混合した場合に他の成分の抗体応答を抑制するという問題が生じた。さらに、ヘモフィルス・パラガリナルム全菌体は、接種鶏の注射部位に硬結、腫脹等の接種反応を惹起しやすく、特に多価ワクチンで通常使用されるオイルアジュバントを用いた場合には、局所における接種反応がより顕著に発現されるという現象も明らかになった。このように、従来より使用されていたヘモフィルス・パラガリナルムの全菌体を成分としたコリーザワクチンは、より有効で安全な鶏ワクチンの多価製剤の開発における隘路となっている。
【０００３】
これを解決する手段として、コリーザワクチンの成分を従来のヘモフィルス・パラガリナルムの全菌体から感染防御抗原だけを含むコンポーネントワクチンに改良することが考えられる。そのためには、まずヘモフィルス・パラガリナルムの感染防御抗原を同定し、その遺伝子構造を明らかにする必要がある。感染防御抗原の遺伝子構造が明らかになれば、これを大腸菌等の宿主に移入して大量にタンパク質を発現し、これをワクチンの成分に応用することによって、安全で有効な鶏ワクチンの多価製剤に適した伝染性コリーザ対策用コンポーネントワクチンの開発が可能となる。
【０００４】
ヘモフィルス・パラガリナルムの感染防御抗原の候補としては赤血球凝集素（ＨＡ）および外膜タンパク質（ＯＭＰ）があげられる。ヘモフィルス・パラガリナルムの全菌体を鶏に免疫すると赤血球凝集抑制抗体（ＨＩ抗体）が誘導され、このＨＩ抗体価と防御効果とが相関することから、ＨＡは感染防御抗原の一つであると推定されている。ＹａｍａｇｕｃｈｉとＩｒｉｔａｎｉは、本菌の血清型ＡのＨＡをタイプ１ＨＡとタイプ２ＨＡの２種類に分類し（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．，　４２，　７０９−７１１，　１９８０）、一方、ＳａｗａｔａとＫｕｍｅは、Ａ型菌にはＨＡ−Ｌ、ＨＡ−ＨＬ、ＨＡ−ＨＳの少なくとも３種類のＨＡが存在すると報告している（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　１８，　４９−５５，　１９８３）。ＳａｗａｔａとＫｕｍｅのＨＡ−ＬとＨＡ−ＨＬがＹａｍａｇｕｃｈｉとＩｒｉｔａｎｉの２種類のＨＡに相当すると推定される。Ｃ型菌でもＡ型菌と抗原性の異なる別のＨＡが存在することが報告されている（Ａ．Ｓａｗａｔａ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，　４３，　１３１１−１３１４，　１９８２）。このようにヘモフィルス・パラガリナルムには、物質として複数のＨＡ抗原が存在するものと考えられる。
【０００５】
ＨＡ遺伝子のクローニングに関しては、Ｔａｋａｇｉら（Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，　５３，　９１７−９２０，　１９９１）はモノクローナル抗体によるスクリーニングにより、抗ＨＡ抗体と反応するＤＮＡ断片をクローン化している。このＤＮＡ断片の塩基配列は報告されていないためコードされるタンパク質の詳細は不明であるが、発現大腸菌を鶏に免疫して本菌で攻撃したとき、発生防御率４３％の弱い防御効果を示したことを報告している。徳永ら（特開平１０−８４９６９号公報）はヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌からＨＡをコードする遺伝子をクローン化し、その塩基配列を報告している。この抗原を発現大腸菌から精製し、鶏に免疫して攻撃試験を行ったところ、１００％の高い発症阻止率が得られたが、発現大腸菌自体を鶏に免疫原とした場合は、発症阻止率は７０％と従来の全菌体ワクチンの防御効果におよばなかったことを報告している。
【０００６】
このように、物質として複数存在すると考えられる本菌のＨＡのうち、遺伝子が同定されているものは上記１例にすぎず、ワクチンの成分として応用可能な高度な感染防御能をもつ他のＨＡタンパク質については、いまだ未知である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、従来の全菌体を成分としたコリーザワクチンを多価混合製剤として鶏に投与したとき、他成分に対する抗体応答を抑制すること及び局所に腫脹や遺残を生じるといった問題点があった。
【０００８】
そこで、本菌の感染防御抗原をコードする遺伝子を同定し、これを細菌、酵母または真核生物の細胞等に移入してタンパク質として発現させ、これをワクチンの成分として応用することにより上記問題は解決可能であると考えられる。
【０００９】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記の問題点に鑑み、ヘモフィルス・パラガリナルムを原因菌とする鶏伝染性コリーザに対する、副作用の少ない、有効なワクチン及びその製造法を提供することを目的として、該Ａ型菌よりゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、この中から該Ａ型菌に感染した鶏の血清中の抗体と反応するポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングすると同時に当該遺伝子を有する発現ベクターを得た。更に、この発現ベクターを用いて、該ポリペプチドを大腸菌にて発現させ、得られた該ポリペプチドがヘモフィルス・パラガリナルムによる鶏伝染性コリーザの発症を阻止することを見いだし、本発明にいたった。
【００１０】
すなわち、本願の請求項１の発明は（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を有するか、又は（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列における１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換されあるいは付加されたアミノ酸配列を有していて、鶏伝染性コリーザの発症を阻止する活性を有するポリペプチドであることを特徴とする。
【００１１】
上記のアミノ酸配列（ａ）を有し、鶏伝染性コリーザの発症を阻止する活性を有するヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチド（以下単に「発症阻止ポリペプチド」という）は配列番号：２の塩基配列を持つ遺伝子断片、あるいは該ポリペプチドをコードするゲノム遺伝子から翻訳されたものであってもよいし、化学合成法等により生産されるものであっても良い。また、配列番号２の塩基配列も、化学合成法、ＤＮＡ複製法などいずれの方法によって得たものであっても良い。
【００１２】
配列番号１のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換されあるいは付加された上記アミノ酸配列（ｂ）の発症阻止ポリペプチドは、配列番号２の塩基配列から、上記アミノ酸の欠失、置換、付加に対応する塩基が欠失、置換、付加された塩基配列をもつ遺伝子によってコードされ、上述の場合と同様にこの遺伝子から翻訳されたものであってもよいし、化成合成法等によリ生産されるものであっても良い。
【００１３】
上記アミノ酸配列を有するタンパク質の発明によれば、発症阻止ポリペプチドを有効成分して含有する動物用医薬組成物を提供でき、ヘモフィルス・パラガリナルムの感染による鶏伝染性コリーザに対するワクチンとして有効に用いられる。
【００１４】
また、この感染防御ポリペプチドを用いて公知の手法により特異抗体を得ることができる。この抗体は、該ポリペプチド投与後の鶏での該ポリペプチドに対する抗体を検出するのに用いることができ、したがって発症阻止ポリペプチドに対する抗体価の検査、診断用のセンサーとして当該抗体を用いることができる。また、次記する形質転換体が産生した該ポリペプチドを分離、精製するアフィニティークロマトグラフィーに利用することができる。
【００１５】
本願の発明は、上記発症阻止ポリペプチドをコードする遺伝子を用いて、遺伝子組換え技術によリ当該タンパク質を産生するように作製した宿主（形質転換体）を提供し、更にこの形質転換体を用いて安価に感染防御ポリペプチドを製造する方法を提供することを他の特徴とする。
【００１６】
上記の形質転換体は、例えば発症阻止ポリペプチド生産細胞として作出することができる。
【００１７】
すなわち、宿主細胞が真核細胞の場合は、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する感染防御ポリペプチド遺伝子断片を有するＤＮＡ断片をウイルス等のプロモーターと結合させ、真核細胞を形質転換させて感染防御ポリペプチド生産細胞を作出することができる。また、バキュロウイルス等の組換えウイルスベクターを用いた場合は、例えば、Ｓｍｉｔｈらの方法（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．Ｃｅ１．Ｂｉｏｌ．，　３，　ｐ２１５６−２１６５）に基づいて、組換えウイルスベクターを作出することができる。すなわち、感染防御ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片をバキュロウイルスの多核体ブロモータと連結し、そのトランスファーベクターをバキュロウイルスＤＮＡとともに昆虫細胞に導入し、得られた組換バキュロウイルスの内、感染防御ポリペプチドを生産する組換えウイルスクローンを選択し、その組換えクローンを昆虫細胞に感染させ発症阻止ポリペプチドを生産する細胞を作出することができる。また該組換えクローンを昆虫に感染させて感染防御ポリペプチドを産生する昆虫を作出することができる。
【００１８】
また、宿主細胞が原核生物である場合は、例えば発現ベクターに発症阻止ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を連結し、原核細胞を形質転換させて発症阻止ポリペプチド産生細胞を作出することができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現するようなベクターを選択しても良い。
【００１９】
これらの遺伝子組換え操作は、既知の手法に従って行えば良く、特に限定されない。遺伝子操作技術・細胞工学技術によって、たとえばシグナル配列の付加や宿主−ベクター系の好適選択、遺伝子の発現制御部位の改良等によリ発現効率の調節などを図ることができる。
【００２０】
形質転換された細胞を培養し、生産されたタンパク質を回収することによって目的の発症阻止ポリペプチドを得ることができる。
【００２１】
本発明の形質転換体として作出した細胞等を用いる方法によれば、発症阻止ポリペプチドを大量に生産することができ、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌による鶏伝染性コリーザに対するワクチンとして用いることができる。
【００２２】
なお、以上の操作は、サムブロックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａ１．，　１９８９，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａ１．　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）等の既知の遺伝子操作技術・細胞工学技術にしたがって行うことができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明のヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来の新規ポリペプチドは以下の方法により得られる。
【００２４】
例えば、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株を培養、回収した後、ＤＮＡを抽出、精製し、これを適当な制限酵素（例えばＳａｕ３ＡＩ）で切断し、市販の発現ベクター（例えばｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋））に挿入し、ＤＮＡライブラリーを調製する。これを大腸菌（例えばＸＬ１−Ｂｌｕｅ）に導入し、形質転換を行う。この中から、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌に感染した鶏の血清中の抗体と反応するタンパク質を発現しているクローンを選択する。このようにして得られた組換えベクターＤＮＡ中の外来遺伝子の塩基配列を決定する。また、得られたＤＮＡ断片の新規性は、その全塩基配列と既存のデータベース（例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋ、ＥＭＢＬなど）とのホモロジー検索を行うことにより確認できる。得られた組換えベクターで形質転換された大腸菌を培養し、ＩＰＴＧにより誘導することによって、該ポリペプチドはβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現する。
【００２５】
融合タンパク質を発現した細胞を超音波で破砕した後、遠心し、沈殿を高塩溶液で溶解し、この溶液で免疫された鶏のヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌（例えば２２１株）の攻撃に対する鶏伝染性コリーザ発症率を確認することで新規ポリペプチドの発症阻止能力を確認することができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００２７】
実施例１
（１）ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
（１−１）ゲノムＤＮＡの抽出
ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株を鶏血清加鶏肉汁培地（培地１０００ｍｌ中、鶏肉水３００ｍｌ、鶏血清１０ｍｌ、ポリペプトン５ｇ、ブドウ糖１ｇ、カザミノ酸１ｇ、グルタミン酸ナトリウム５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド０．０２５ｇを含む）１０００ｍｌに接種し、３７℃で一夜振盪培養した後、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を３８ｍｌのＴＥバッファー（１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸バッファー、ｐＨ８．０）で懸濁し、１０％ＳＤＳを２ｍｌとプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を４００μｌ加えてよく混合した。この混合物を３７℃で１時間ゆるやかに振盪した後、５ＭＮａＣｌを７．２ｍｌとＣＴＡＢ−ＮａＣｌ（１０％ＣＴＡＢを含む０．７ＭＮａＣｌ）を６ｍｌ加えてよく混合し、６５℃で２０分加熱した後、クロロホルム抽出及びフェノール・クロロホルム処理を行った。回収した水層に等量の２−プロパノールを加えてよく混ぜた後、パスツールピペットで糸状のＤＮＡを回収し、７０％エタノール中に浮遊させて２回洗浄を行った。４℃、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心により生じたペレットを５ｍｌのＴＥバッファーに懸濁した。
【００２８】
ゲノムＤＮＡ溶液５００μｌに５μｌのＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で１時間静置した後、フェノール・クロロホルム処理を行い、エタノール沈殿により回収したＤＮＡを３００μｌのＴＥバッファーに懸濁した。
【００２９】
（１−２）ゲノムＤＮＡ断片のベクターへの挿入
市販のベクタープラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）１μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、アルカリフォスファターゼで末端のリン酸を除去した後、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、臭化エチジウムにて染色し、紫外線照射下でバンドをＧｅｎｅＣｌｅａｎ　Ｓｐｉｎ　ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１、Ｉｎｃ．社製）を用いて添付のプロトコールにしたがって切り出した。
【００３０】
ゲノムＤＮＡ２０μｇは制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで３０分消化し、フェノール・クロロホルム処理及びクロロホルム処理を行った後、水層よりＧｅｎｅＣｌｅａｎ　Ｓｐｉｎ　ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡ断片を回収した。
【００３１】
ゲノムＤＮＡ断片と開裂したｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）をＴＡＫＡＲＡ社製のＬｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて連結した。この溶液をゲノムライブラリーとした。
【００３２】
（２）ゲノムライブラリーからのスクリーニング
（２−１）スクリーニング用血清の処理
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを１００ｍｌのＬＢ培地で３７℃にて一晩振盪培養し、遠心して回収した菌体を１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、超音波処理した。この大腸菌破砕液２５０μｌにヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌による伝染性コリーザに感染した鶏の血清を３μｌ加え、室温で３０分緩やかに撹拌した後、４℃にて１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した。
【００３３】
遠心上清にさらに２５０μｌの大腸菌破砕液を加え、上記と同様に撹拌、遠心を行った。遠心上清に５００μｌの５％スキムミルクを含むＰＢＳを加え、下記のイムノスクリーニングに希釈血清として用いた。
【００３４】
（２−２）イムノスクリーニング
上記ゲノムライブラリー液を用いてコンピテント化した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅの形質転換を行った。形質転換された大腸菌の選択は５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で作製した径９ｃｍアガロースプレートで行った。３７℃にて一晩培養し、プレートにコロニーを生育させた。
【００３５】
次に、１０ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む２×ＹＴ培地に浸し、風乾したニトロセルロース膜を上記のプレートに重ねてコロニーの一部を膜上に写し取った後、新たなアガロースプレート上に逆さにして置き、さらに３７℃で３時間インキュベートした。
【００３６】
その後、ニトロセルロース膜をプレートよりはがし、クロロホルム中に入れて１５分間室温で振盪した後、溶解バッファー（１００ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ２、１．５％Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ、４０ｍｇ／ｍｌ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ）に入れ、一晩室温で振盪して菌体を溶解させた。
【００３７】
菌体を溶解させた膜をＴＢＴ（１０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１５分間２回洗浄し、５％スキムミルクを含むＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングを行った。ブロッキング処理した膜を上記（２−１）の処理した希釈血清と３７℃にて１時間反応させた後、ＴＢＴで室温にて１５分間２回洗浄した。
【００３８】
洗浄後、膜を５％スキムミルクを含むＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗鶏ＩｇＧウサギ血清（Ｂｅｔｈｙｌ社製）と３７℃にて１時間反応させ、室温にて５分間ＴＢＴで２回、ＰＢＳで１回洗浄し、反応溶液（３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩１０ｍｇ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．００５％過酸化水素を含む２０ｍｌのＰＢＳ）に浸して反応させた。
【００３９】
反応によって確認された陽性コロニーは元のプレートからかき取って新たなアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むアガロースプレートに広げ、上記と同様にして二次スクリーニング、三次スクリーニングをくり返した。最終的に４個の陽性クローン（ＨＰＡ２．０、ＨＰＡ１．１、ＨＰＡ０．７、ＨＰＡ０．６）を得た。
【００４０】
（３）陽性クローンにクローニングされている遺伝子の塩基配列
陽性クローンを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌで３７℃にて一晩振盪培養し、培養液からＱｉａｇｅｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｐｉｎ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールに従い操作し、プラスミドＤＮＡを抽出、精製した。
【００４１】
精製したプラスミド中の挿入遺伝子はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）社製のＢｉｇ−Ｄｙｅ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔを用いたジデオキシシークエンス法によりシークエンサーＡ３１０（ＡＢＩ社製）を使用して塩基配列を決定した。
【００４２】
その結果、４個のクローンにクローニングされている遺伝子断片はいずれも同じ遺伝子の一部と考えられ、その位置関係を図１に示した。最も長い遺伝子断片を含むクローンであるＨＰＡ２．０の塩基配列を配列表の配列番号：２に示した。この配列内には開始及び終止コドンは存在しなかった。対応するアミノ酸配列は配列番号：１に示す。既存のデータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ等）とのホモロジー検索により、既知の塩基配列あるいはアミノ酸配列と５０％以上のホモロジーを示すものはなく、クローンＨＰＡ２．０にコードされるポリペプチドは新規物質であることが判明した。
【００４３】
次に、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現している各陽性クローン由来のポリペプチドを免疫し、生菌攻撃試験を行うことによって各ポリペプチドが鶏伝染性コリーザの発症に対して防御効果を示すかどうかを調べた。
【００４４】
（４）陽性クローンにコードされる各ポリペプチド免疫鶏での発症防御効果
（４−１）ポリペプチドの発現
ＨＰＡ２．０，１．１，０．７及び０．６の４つの陽性クローンを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地２００ｍｌで３７℃にて一晩振盪培養し、５ｍＭ　ＩＰＴＧを含む５×ＹＴ培地を５０ｍｌ（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ　２．５ｇ、ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　１．２５ｇ）加えてさらに４時間培養を続けた後、遠心して菌体を回収した。回収した菌体は２５ｍｌのＰＢＳに懸濁し、超音波にて破砕した。
【００４５】
菌体破砕液を４℃にて、１００００ｒｐｍで３０分間遠心し、沈殿を５ｍｌの８Ｍ尿素（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波にて破砕した。破砕液を４℃にて、１００００ｒｐｍで３０分間遠心して得た上清をポリペプチド溶液として免疫に用いた。
【００４６】
（４−２）ポリペプチドの免疫と攻撃試験
総タンパク質量約１００μｇとなるように調整したポリペプチド溶液をオイルアジュバントと混合し、９あるいは１０羽の５週齢のＳＰＦ鶏脚部筋肉内に０．２ｍｌずつ注射して免疫した。免疫後４週にヘモフイルス・パラガリナルムＡ型菌２２１株（約１．０×１０８ＣＦＵ）を鼻腔内に接種して攻撃した。陽性対照として市販の全菌体不活化ワクチン（ＩＣＡＣＮ、日生研社製）で同様に免疫した群を設定した。陰性対象はワクチンを接種せず攻撃のみを行った。攻撃後から一週間、臨床観察を行い、発症の有無を確認した。
【００４７】
非免疫対照群は１０羽中８羽（８０％）顔面腫脹、鼻汁漏出等の典型的な伝染性コリーザの症状を示した（表１）。市販の全菌体不活化ワクチンでは発症はみられなかった。ＨＰＡ２．０免疫群では１０羽中で発症したものはなく、市販ワクチンと同等以上の防御効果が認められた。一方、ＨＰＡ２．０の部分断片を含む各クローンの免疫群では含まれる断片の長さに相当した防御効果が認められ、ＨＰＡ１．１で発症率２０％とある程度の防御効果がみられたが、これより短い断片を含むＨＰＡ０．７及びＨＰＡ０．６ではそれぞれ７０％及び７８％の発症率で、ほとんど非免疫対照群と変わりなかった。このことから、少なくともＨＰＡ２．０に含まれるポリペプチドの鎖長があれば、市販ワクチンと同等以上の発病防御効果が得られることが判明した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
（４−３）伝染性コリーザ感染鶏の血清を用いたウエスタンブロッティング
免疫に用いたポリペプチド溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、その後ＰＶＤＦ膜に転写した。上記（２−２）と同様にして、膜のブロッキング処理、抗体との反応及びポリペプチドの検出を行った。
【００５０】
その結果、ＨＰＡ２．０で発現されたポリペプチドを含め、その部分断片であるＨＰＡ１．１、ＨＰＡ０．７及びＨＰＡ０．６はすべて感染回復鶏血清と反応することが判明した（図２）。このようにＨＰＡ２．０にコードされる配列番号１に示されるポリペプチドは、感染血清中に含まれる抗体と特異的に反応することから、該ポリペプチドは鶏伝染性コリーザ感染鶏における抗体測定ならびに血清診断用の抗原として応用できることが示された。
【００５１】
【発明の効果】
本願の請求項１の発明によれば、鶏伝染性コリーザの発症を阻止するポリペプチドを得ることができ、請求項９、１０の鶏伝染性コリーザに対するワクチンとして用いることができる医薬組成物を提供することができる。
【００５２】
また、請求項２の発明によれば、このポリペプチドをコードする遺伝子が得られ、この遺伝子を用いて請求項５、６及び１０の遺伝子学的手法により発現させることで、ポリペプチドを大量に製造することができ、鶏伝染性コリーザに対するワクチンを提供できる。
【００５３】
更に請求項１１、１２の発明によれば、ヘモフィルス・パラガリナルムＡ型菌由来のポリペプチドに特異的な抗体を得て、これを用いて鶏伝染性コリーザの診断あるいはポリペプチドを鶏に免疫した場合の抗体の検出を行うことができる。
【００５４】
【配列表】
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【００５５】
【図面の簡単な説明】
【図１】４つの陽性クローンから得られたＤＮＡ断片の位置関係を模式的に示した。ＨＰＡ２．０の挿入ＤＮＡ断片の開始位置を０とし、それぞれのクローンの挿入ＤＮＡ断片間で塩基配列が一致する部分を重ねて記載した。
【図２】４つのクローンにコードされる遺伝子を大腸菌で発現させ、これと鶏伝染性コリーザに感染して回復した鶏血清との反応性をウエスタンブロッティングにより調べた結果を示す。各クローンの発現タンパク質は鶏の感染回復血清に対して陽性反応を示している。
【図１】
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【図２】
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