(57)【要約】【課    題】目的蛋白質とＣ末端を欠損させたシャペロニン（約６０ｋＤａ分子シャペロン、ヒートショックプロテイン６０ｋＤａ）とを、目的蛋白質のＮ末端とシャペロニンのＣ末端とをペプチド結合を介して連結させた融合蛋白質として発現させることによって、宿主に対して極めて毒性の強い目的蛋白質の効率的発現の可能な宿主生物を用いた組換え蛋白質の生産システムを提供すること。【解決手段】遺伝子３’末端を欠損させたシャペロニン遺伝子と目的蛋白質遺伝子とを含む遺伝子を転写・翻訳することによって、目的蛋白質をＣ末端が欠損したシャペロニンとペプチド結合を介して連結させた融合蛋白質として発現させる目的蛋白質の生産方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子３’末端を欠損させたシャペロニン遺伝子と目的蛋白質遺伝子とを含む遺伝子を転写・翻訳することによって、目的蛋白質をＣ末端が欠損したシャペロニンとペプチド結合を介して連結させた融合蛋白質として発現させる目的蛋白質の生産方法。
【請求項２】
Ｃ末端が欠損したシャペロニンが、そのＮ回連結体（Ｎは１〜２０）を形成し、そのＣ末端にペプチド結合を介して目的蛋白質が連結されている融合蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質生産方法。
【請求項３】
シャペロニンがＮ回連結体（Ｎは１〜２０）を形成し、そのＮ番目のシャペロニンが、Ｃ末端が欠損したシャペロニンであり、そのＣ末端にペプチド結合を介して目的蛋白質が連結されている融合蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質生産法。
【請求項４】
目的蛋白質が、Ｃ末端が欠損したシャペロニンからなるシャペロニンリング構造の内部にＣ末端が欠損したシャペロニンのＣ末端とペプチド結合を介して結合されて封入されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法。
【請求項５】
Ｃ末端を欠損したシャペロニンが大腸菌Ｋ−１２株由来であり、その欠損させたアミノ酸配列が少なくともＴｈｒ５２２を含んでこれよりＣ末端側であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の目的蛋白質生産法。
【請求項６】
Ｃ末端を欠損したシャペロニンが好熱性メタン菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来であり、その欠損させたアミノ酸配列が少なくともＧｌｙ５２５を含んでこれよりＣ末端側であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法。
【請求項７】
シャペロニンと目的蛋白質の間に限定分解型プロテアーゼの切断アミノ酸配列が介在し、目的蛋白質を限定分解型プロテアーゼでシャペロニンから切り出すことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法。
【請求項８】
融合蛋白質のＮ末端およびＣ末端にそれぞれ異なる２種類のタグがペプチド結合を介して付加されていて、それぞれのタグを用いて融合蛋白質を精製する過程を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法。
【請求項９】
目的蛋白質が哺乳動物由来のＧプロテイン共役型、イオンチャネル型、およびチロシンカイネ−ス型のいずれかの膜受容体蛋白質であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法。
【請求項１０】
目的蛋白質がウィルス蛋白質であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法。
【請求項１１】
シャペロニン：目的蛋白質の比が、１：１〜９：１であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法。
【請求項１２】
融合蛋白質を生産させる宿主生物がバクテリア，酵母，動物細胞，植物細胞，昆虫細胞，動物個体，植物個体及び昆虫個体の中から選ばれるいずれかであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法。
【請求項１３】
融合蛋白質を生産させる宿主生物である大腸菌がＲｅｃＡ−であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、宿主生物系での組換え蛋白質発現において、活性型蛋白質の発現が困難であった蛋白質発現、特に膜蛋白質の効率的発現と精製に好適に利用される新規蛋白質発現法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでにバクテリア、酵母、昆虫、動植物細胞、トランスジェニック動・植物等多くの宿主生物での組み換え蛋白質発現系が確立されてきた。なかでもバクテリアを宿主細胞とした組み換え蛋白質生産は、その増殖速度の速さなどから医薬品原料の工業スケール生産の標準システムとなっている。しかし、開発されてきた組み換え蛋白質発現系において活性型蛋白質を大量に得ることが困難な場合が多々ある。目的蛋白質が宿主細胞に対するなんらかの毒性を有するとき、発現が抑制され発現量が低下したり、細胞増殖量が低下したりする。目的蛋白質が可溶性蛋白質として発現しても宿主プロテアーゼによって分解されてしまい生産量が極めて少なくなる場合もある。また、目的蛋白質が発現しても折り畳みがうまくいかず、可溶化が困難な封入体を形成してしまい、可溶化して再折り畳みを行っても最終的に得られる活性型蛋白質の量は極めて少なくなってしまうことが多い。
【０００３】
毒性を有する蛋白質を生産する場合、発現誘導剤や温度によって目的蛋白質の発現を厳密に制御可能なベクターを用いた方法が検討されている。これは、目的蛋白質を発現していない状態で宿主細胞を定常期まで増殖させた後、ＩＰＴＧなどの発現誘導物質を添加したり、培養温度を変化させたりすることによって、菌体内で目的蛋白質を発現させる二段階培養法である。しかし、菌体増殖ステージにおいて、目的蛋白質の発現を完全に抑制することは困難で、微量に目的蛋白質が発現し、宿主に毒性を及ぼすことによって菌体増殖や発現量が低下することがよくあった。
【０００４】
また、宿主のプロテアーゼ分解に対する解決法として、例えば大腸菌では、ｌｏｎ、ｏｍｐＴのようなプロテアーゼ構造遺伝子の一部を欠損させた宿主を用いる方法が考案されているが、大腸菌において現在判明しているプロテアーゼは３０種類以上あるため、これらの構造遺伝子を欠損させただけではプロテアーゼ分解の影響を回避できる場合は少なく、また、宿主のプロテアーゼを全て欠損させると他の弊害が起こるため、根本的に解決することはできなかった。
封入体が生成する場合、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やチオレドキシン、マルトース結合蛋白質等との融合蛋白質として発現させる方法や大腸菌が宿主である時は、ペリプラズム内に目的蛋白質を発現させたりする方法が用いられるが、封入体形成が高効率で解消される場合は少なかった。また、蛋白質の折り畳み反応を支援する蛋白質群である分子シャペロンと共発現させ、可溶性画分への発現量を増大させる方法もあるが、活性体の量は飛躍的に増加しないのが現状であった。
【０００５】
以上のように従来の蛋白質発現技術には宿主に対する毒性、宿主プロテアーゼによる分解および封入体形成といった大きな問題点があったため、発現させようとする蛋白質の種類によってまったく発現しなかったり、発現量が著しく少なくなってしまったりする場合があり、蛋白質ごとに発現条件を試行錯誤で検討する必要があった。
【０００６】
そこで、目的蛋白質をシャペロニン（約６０ｋＤａ分子シャペロン、ヒートショックプロテイン６０ｋＤａ、サーモゾーム）との融合蛋白質としてシャペロニンの立体構造内部に納めることにより、目的蛋白質の宿主への毒性発現、封入体形成、およびプロテアーゼによる分解を解消し、目的蛋白質を可溶性蛋白質として大量発現させることができる宿主生物を用いた組み換え蛋白質の生産法が提案された。この方法において封入体を形成する蛋白質などの発現量の低下は克服されたが、哺乳動物由来の膜受容体蛋白質などが発現量は極めて低下する傾向があった。これらの膜蛋白質は宿主に対して極めて強い毒性があるため、シャペロニン立体構造内部への格納が不充分でない時に、宿主に対する毒性を与えていたためであると考えられる。特に、目的蛋白質をシャペロニンのＣ末端に連結していた場合、シャペロニンＣ末端は一般的に、約２０アミノ酸程度のフレキシビリティの高い構造的にシャペロニンキャビティ外部に位置することが可能であるため（非特許文献１）、その後ろに連結された目的蛋白質がシャペロニンキャビティに確実に格納しきれていないことがよくあった。このような時、膜結合蛋白質や膜貫通性蛋白質が目的蛋白質を目的蛋白質として発現を試みると、宿主の細胞膜と相互作用してしまい、宿主に毒性を与え発現量が激減を招いてしまう。また、プラスミドが不安定であり、宿主との相同組換えが起こったりすることにより、目的蛋白質が設計どおりに格納されず宿主に対して毒性を及ぼすことがよくあった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｂｒａｉｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７１，５７８−５８６
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記に鑑み、目的蛋白質とＣ末端を欠損させたシャペロニン（約６０ｋＤａ分子シャペロン、ヒートショックプロテイン６０ｋＤａ）とを、目的蛋白質のＮ末端とシャペロニンのＣ末端とをペプチド結合を介して連結させた融合蛋白質として発現させることによって、宿主に対して極めて毒性の強い目的蛋白質の効率的発現の可能な宿主生物を用いた組換え蛋白質の生産システムを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、目的蛋白質とＣ末端を欠損させたシャペロニンとを、目的蛋白質のＮ末端とシャペロニンのＣ末端とをペプチド結合を介して連結させた融合蛋白質として発現させる方法である。以下に本発明を詳述する。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）遺伝子３’末端を欠損させたシャペロニン遺伝子と目的蛋白質遺伝子とを含む遺伝子を転写・翻訳することによって、目的蛋白質をＣ末端が欠損したシャペロニンとペプチド結合を介して連結させた融合蛋白質として発現させる目的蛋白質の生産方法、
（２）Ｃ末端が欠損したシャペロニンが、そのＮ回連結体（Ｎは１〜２０、好ましくは２〜２０）を形成し、そのＣ末端にペプチド結合を介して目的蛋白質が連結されている融合蛋白質であることを特徴とする上記（１）に記載の蛋白質生産方法、
（３）シャペロニンがＮ回連結体（Ｎは１〜２０）を形成し、そのＮ番目のシャペロニンが、Ｃ末端が欠損したシャペロニンであり、そのＣ末端にペプチド結合を介して目的蛋白質が連結されている融合蛋白質であることを特徴とする上記（１）に記載の蛋白質生産法、
（４）目的蛋白質が、Ｃ末端が欠損したシャペロニンからなるシャペロニンリング構造の内部にＣ末端が欠損したシャペロニンのＣ末端とペプチド結合を介して結合されて封入されていることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法、
（５）Ｃ末端を欠損したシャペロニンが大腸菌Ｋ−１２株由来であり、その欠損させたアミノ酸配列が少なくともＴｈｒ５２２を含んでこれよりＣ末端側であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の目的蛋白質生産法、
（６）Ｃ末端を欠損したシャペロニンが好熱性メタン菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来であり、その欠損させたアミノ酸配列が少なくともＧｌｙ５２５を含んでこれよりＣ末端側であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法
に関する。
【００１１】
さらに又、本発明は、
（７）シャペロニンと目的蛋白質の連結間に限定分解型プロテアーゼの切断アミノ酸配列が介在し、目的蛋白質を限定分解型プロテアーゼでシャペロニンから切り出すことを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法、
（８）融合蛋白質のＮ末端およびＣ末端にそれぞれ異なる２種類のタグがペプチド結合を介して付加されていて、それぞれのタグを用いて融合蛋白質を精製する過程を含むことを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法、
（９）目的蛋白質が哺乳動物由来のＧプロテイン共役型、イオンチャネル型、およびチロシンカイネース型のいずれかの膜受容体蛋白質であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法、
（１０）目的蛋白質がウィルス蛋白質であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法、
（１１）シャペロニン：目的蛋白質の比が、１：１〜９：１であることを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法、
（１２）融合蛋白質を生産させる宿主生物がバクテリア，酵母，動物細胞，植物細胞，昆虫細胞，動物個体，植物個体及び昆虫個体の中から選ばれるいずれかであることを特徴とする上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法、
（１３）融合蛋白質を生産させる宿主生物である大腸菌がＲｅｃＡ−であることを特徴とする上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の目的蛋白質生産方法
に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
細胞に熱ショック等のストレスを与えると、一般的に分子シャペロンと呼ばれる蛋白質群の発現が誘導される。これらはエネルギー物質であるＡＴＰの存在下もしくは非存在下で蛋白質の折り畳みを支援したり、構造安定化に貢献したりする。分子シャペロンの中でも、その分子量が約６０ｋＤａのものはシャペロニンといわれ、バクテリア、古細菌、及び真核生物の全ての生物に存在し、蛋白質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。シャペロニンはグループ１型とグループ２型に大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、コシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａの蛋白質の環状複合体を補因子とし、ＡＴＰと共役した変性蛋白質の折り畳み機構等が詳細に研究されている。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられ、それらの構造や機能に関しては不明な点が多く残されており、グループ１型のコシャペロニンに相当する蛋白質も現在のところ見つかっていない。
【００１３】
一般的に、シャペロニンは１４〜１８個のサブユニットからなる２層のリング構造を形成し、それぞれのリングの内部に空洞（キャビティ）が有している。シャペロニンはこのキャビティ内部に、ポリペプチドや変性蛋白質を一時的に格納し、蛋白質の折り畳み構造形成を助ける機能をもつ。現在考えられているシャペロニンによる変性蛋白質の折り畳みには、上下のリングの協同的な作用が重要な役割を担っているとされている。例えば、大腸菌由来シャペロニンＧｒｏＥＬを例にとると、まず、片側のリングに変性または新生ポリペプチド結合し、次に、ＡＴＰが同じ側のリング（シスリング）に結合するとＧｒｏＥＳがシスリングに結合し、ＧｒｏＥＬの構造変化が起こりＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ複合体の内部に内径８０Å、高さ８０Åの巨大な空洞でき、内容積はＧｒｏＥＳ結合前の約２倍となる。このＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ複合体の構造内部に変性または新生ポリペプチドが閉じ込められ、親水的な空洞内部においてポリペプチドは折り畳みを開始する。折り畳みの過程において、ＡＴＰは徐々にＡＤＰへ加水分解される。シスリングで折り畳まれた蛋白質はＧｒｏＥＳの解離によってキャビティより放出されるが、そのためには、ポリペプチドの折り畳みが行われているリングと反対側のリング（トランスリング）でのＡＴＰの加水分解が必要となる。つまり、蛋白質の折り畳みの進行とは完全に独立した形で、トランスリング内部に結合したＡＴＰがＡＤＰへと加水分解されることによってＧｒｏＥＳがシスリングより解離する。このように、蛋白質の折り畳みに関与するシャペロニンの構造変化は、ＡＴＰの結合や加水分解のシグナルが、シャペロニンリングの会合面を通じてお互いのリングに協同的に起こっているとされている。
【００１４】
種々の細胞由来シャペロニン複合体の立体構造が近年、Ｘ線結晶構造解析によって詳細に明らかにされつつある。隣接するサブユニット間およびリング間の相互作用によるシャペロニン複合体の構成は、アミノ酸間の疎水的相互作用および静電相互作用によっている。また、シャペロニンのＮ末端およびＣ末端はともにキャビティ側に位置し、フレキシビリティの高い構造となっている。
【００１５】
特に、大腸菌Ｋ−１２株由来シャペロニンＧｒｏＥＬにおいては、Ｎ末端の３アミノ酸およびＣ末端の少なくとも２３アミノ酸はフレキシビリティの高い構造を示すことがわかっている。このうちＮ末端に位置するＡｌａ２、Ａｌａ３、Ｌｙｓ４はこれらのアミノ酸を欠損または置換すると、シャペロニンリングの形成が抑制またはなくなることが知られている（Ｈｏｒｏｖｉｔｚ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９３）２６８（１４），９９５７−９９５９，Ｈｏｒｏｖｉｔｚ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９３）２３１，５８−６４）。一方、Ｃ末端のフレキシビリティの高い２３アミノ酸についてはその機能が明確にされていないが、Ｔｈｒ５２２以降のアミノ酸配列を欠損させても、ＧｒｏＥＬのオリゴマー形成能やシャペロン活性に影響を与えない（Ｍｃｌｅｎｎａｎ，Ｎ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（１９９４）  １４（２），３０９−３２１）。
【００１６】
バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、遺伝子組換え手法により、大腸菌細胞質可溶性画分に容易に大量生産させることが可能である。さらに、精製した発現産物を電子顕微鏡観察することによって、様々のシャペロニンが大腸菌でも自己集合し、１４〜１８量体からなる２層リング構造のシャペロニン複合体を形成できることがわかっている。
【００１７】
本発明は、目的蛋白質とＣ末端を欠損させたシャペロニンとを、目的蛋白質のＮ末端とシャペロニンのＣ末端とをペプチド結合を介して連結させた融合蛋白質として発現させることによって、目的蛋白質、特に宿主に対する毒性の極めて強い蛋白質を可溶性蛋白質として効率的に大量発現させることを可能とするものである。
【００１８】
融合蛋白質として発現した目的蛋白質はシャペロニンのキャビティ内に確実に納められることによって宿主の環境から隔離され、宿主に対する毒性を与えにくくなる。シャペロニンは宿主生物の細胞質あるいは体液等の可溶性画分へ発現するため、シャペロニンに格納された蛋白質が膜結合性もしくは膜貫通性の蛋白質であっても膜へ移行し宿主生物の膜構造を破壊することもなく、宿主生物に対する毒性は発現しない。また、いかなる蛋白質も同一のシャペロニンに格納されているため、同一条件で融合蛋白質としての発現および精製が可能である。
【００１９】
本発明で使用する上記シャペロニンとしては、バクテリア、古細菌、および真核生物いずれの由来のものでも使用可能である。例えば、大腸菌Ｋ−１２株由来シャペロニンＧｒｏＥＬを用いた場合、Ｔｈｒ５２２までは欠損させてもシャペロニンリングの形成が可能である。また好熱性メタン菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来のシャペロニンの場合、同様に、Ｇｌｙ５２５までは欠損させてもシャペロニンリングが形成される。また、他の生物由来のシャペロニンであっても、そのＣ末端を欠損させることによっても、そのシャペロニンリングの形成が維持されるならば、本質的に使用可能である。
【００２０】
上記シャペロニン複合体の構造は由来生物によって異なった構造のものが形成される。例えば、バクテリア由来シャペロニンリングのシャペロニン（サブユニット）の構成数は７個であり、古細菌由来のそれは８〜９個、真核生物由来のものは８個である。本発明では、使用するシャペロニンの由来により、融合蛋白質におけるシャペロニンと目的蛋白質の数の比を選択することが好ましい。シャペロニン：目的蛋白質（ｎ：１）の比は１：１〜１２：１まで可能であるが、このましくは１：１〜９：１である。ｎが９を越える発現した融合蛋白質中の目的蛋白質の実質的な生産量が少なくなるとともに、リング構造の形成も困難となる可能性がある。
【００２１】
具体的には、バクテリア由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：目的蛋白質の数比が１：１あるいは７：１である融合蛋白質が好ましく、サブユニット構成数８個の古細菌由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：目的蛋白質の数比が１：１、２：１、４：１あるいは８：１のもが好ましい。但し、目的蛋白質の形状や分子量によっては上記以外の数比も適する可能性はある。
【００２２】
本発明では、シャペロニンがそのリング構造への自己集合能が維持されていれば、様々なアミノ酸変異体も使用可能である。例えば、シャペロニンの各サブユニットの会合力が弱められた変異体である場合、格納された目的蛋白の回収はより容易となり、また、シャペロニンのアピカルドメインのポリペプチド認識部位に変異を入れた場合、目的蛋白質のキャビティ内への格納が容易となることにより折り畳み活性が上昇し、活性のある目的蛋白質を回収することができる。
【００２３】
上記融合蛋白質におけるシャペロニンと目的蛋白質の連結パターンとしては、目的蛋白質がキャビティ内に納まるように、シャペロニンのＣ末端に目的蛋白質を配置する必要がある。ただし、連結している全てのシャペロニンのＣ末端を欠損させる必要はなく、目的蛋白質を連結するｎ番目のシャペロニンのＣ末端を欠損し、残りのｎ−１番目までのシャペロニン二ついては、Ｃ末端を欠損させなくてもよい。これは、シャペロニンのなんらかの機能に寄与している可能性のあるＣ末端のフレキシビリティの高い配列を残すことによって、シャペロニンの本来もつ機能および構造安定性をほぼ維持したまま、目的蛋白質を確実にキャビティ内に格納することが可能である。
【００２４】
そもそも、シャペロニン複合体は単に、外部環境から仕切られたスペースを提供するだけでなく、蛋白質折り畳み機能を有するため、目的蛋白質の折り畳みも正常に行われ、かつ目的蛋白質の構造が安定することも期待できる。通常シャペロニン複合体の蛋白質折り畳み反応は基質蛋白質（シングルポリペプチドとして）と１：１で起こるため、本発明においてシャペロニンによる折り畳み機能を発現させるには、シャペロニンリングもしくはシャペロニン複合体に１個の目的蛋白質が格納されるよう融合蛋白質を設計することが好ましいが、目的蛋白質の分子量によっては２分子以上格納させても正常に折り畳まれる可能性はある。
【００２５】
一般的に、大腸菌等では発現プラスミドは１０ｋｂ以上になるとコピー数が減少し、結果的に目的蛋白質の発現量が低下することがある。例えば、シャペロニンが８つ連結した融合蛋白質を生産する場合、発現プラスミドは１５ｋｂｐ以上になる。これに対しては同一のシャペロニン融合蛋白質を発現させる同一遺伝子を異なる複製領域、および薬剤耐性遺伝子を有する２種類のベクターに導入し、これら２種類のベクターで２種の薬剤の存在下で大腸菌等に形質転換、発現させることで、高発現をもたらすことが可能である。
【００２６】
また、本発明の融合蛋白質を生産する場合において、融合蛋白質を発現させる遺伝子とシャペロニンのみを発現させる遺伝子をそれぞれ含む、異なる薬剤耐性および複製領域を有する２種類のベクターを導入して２種類の薬剤の存在下で共発現することにより、シャペロニン複合体の構造を制御してもよい。例えばシャペロニンと目的蛋白質の数比が４：１である融合蛋白質を生産する場合において、１個もしくは２〜４個連結したシャペロニンのみを含むベクターを導入して共発現させることにより、シャペロニンと目的蛋白質の数比が８：１のシャペロニンリングを形成することが可能である。上記にも記すように、プラスミドの巨大化はプラスミドのコピー数の減少につながり発現量が低下する可能性があるため、この方法は、発現量増加に有効である。
【００２７】
本発明ではベクターにシャペロニンの繰返し配列が含まれるため、プラスミドが不安定となったり、宿主細胞とシャペロニンの由来生物が同じであるときは特に、プラスミドＤＮＡとゲノムＤＮＡの相同組換えが起こったりする可能性がある。しかし、宿主として大腸菌を用いる場合は、遺伝子の相同組換えに関する遺伝子であるＲｅｃＡを欠損させた宿主を用いることで、プラスミドの安定性を向上させ、さらに相同組換えの抑制が可能である。
また、本発明が提供する蛋白質発現法は生産される蛋白質の分子量が巨大（約６５から６００ｋＤａ）であるため、転写されたｍＲＮＡの特定のリボヌクレアーゼによる分解、翻訳された融合蛋白質のプロテアーゼによる２段階の切断を受ける可能性がある。例えば大腸菌を宿主として用いる場合はｍＲＮＡの分解に関与するリボヌクレアーゼである、ＲＮａｓｅＥ遺伝子を欠損させた宿主を用いることでｍＲＮＡの分解は抑制可能である。翻訳後、プロテアーゼによる分解を抑制することは、１５〜２５℃の低温で発現させたり、ｌｏｎ、ｏｍｐＴのようなプロテアーゼの構造遺伝子を欠損させた大腸菌宿主を用いたりすることで可能である。
【００２８】
上記のように融合蛋白質にすることにより、宿主細胞質可溶性画分に外来蛋白質を産出させ、目的蛋白質のみを取り出す組み換え目的蛋白質の生産方法もまた本発明の一つである。この場合には、トロンビン、エンテロカイネース、活性型血液凝固第１０因子、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ等の限定分解型プロテアーゼの切断配列をシャペロニンと目的蛋白質の間、もしくはさらにシャペロニンの連結間にも配置することが好ましい。本発明の融合蛋白質を目的に応じてそのまま用いる場合は、プロテアーゼ等の切断配列を介在させる必要はない。目的蛋白質にメチオニン残基が存在しない場合には、シャペロニンと目的蛋白質の連結間にメチオニンを存在させると、ＣＮＢｒ処理によって容易に目的蛋白質をシャペロニンから遊離させることができる。
【００２９】
上記目的蛋白質としては、特に限定されないがＢ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、インフルエンザ等の病原性ウィルスゲノムにコードされる蛋白質（外被蛋白質、コア蛋白質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ等）、ｓｃＦＶ（単鎖抗体）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、および完全抗体型である治療・診断用抗体、７回膜貫通型受容体（Ｇ蛋白質共役型受容体）、イオンチャネル型受容体およびチロシンカイネース型受容体などの膜結合蛋白質や膜貫通蛋白質、血小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子等の成長因子に属するもの、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミン、ヒト成長ホルモン等に属するものが挙げられる。その他、ヒト、マウス等高等動物由来の疾病関連遺伝子産物の全てが、本発明の発現系の対象蛋白質となり得る。また、化学プロセス食品加工、その他の産業分野に有効な酵素、蛋白質も本発明の対象である。なかでも、遺伝子組換え発現系において宿主に対し極めて強い毒性を及ぼす膜結合型受容体や膜貫通型受容体などは本発現系において効果的に発現することができる。
【００３０】
本発明の融合蛋白質の生産方法としては、融合蛋白質をコードする遺伝子を制限酵素やＰＣＲによる方法等の通常の遺伝子工学的に作製し、これを導入した発現ベクターを用いて宿主内で発現させることによって得ることができる。
上記宿主としては特に限定されず、例えば大腸菌等の細菌、その他の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物培養細胞、植物培養細胞、およびトランスジェニック動・植物が挙げられる。なかでも、培養コストが安価である点、培養日数が短い点、培養操作が簡便な点から、宿主は、細菌もしくは酵母であることが好ましい。
【００３１】
上記宿主内で融合蛋白質を発現させた後、細胞を回収・破砕し、上清を回収する。シャペロニンは疎水性が非常に強いため、１０〜２０％飽和程度の硫安添加後、疎水クロマトグラフィーによって融合蛋白質の存在するフラクションを回収できる。この際、２０％程度のメタノールを含む緩衝液でカラムを洗浄すると、多くの夾雑蛋白質を除去することができる。これらを限外ろ過によって濃縮した後、濃縮液を５〜５０ｍＭ程度の塩化マグネシウムおよび５０〜３００ｍＭ程度の塩化ナトリウム、塩化カリウムもしくは硫酸ナトリウムが含有された緩衝液を展開液としてゲルろ過を行い、融合蛋白質の存在するピークを回収することによって融合蛋白質の発現を確認し、精製することができる。融合蛋白質のＮ末端もしくはＣ末端に６から１０個のヒスチジンが並んだタッグを連結させた場合には、ニッケル等の金属キレートカラムを用いれば、融合蛋白質の回収はより簡便で効率的である。また、用いるシャペロニンに対する抗体を用いて、免疫沈降もしくはアフィニティクロマトグラフィーによっても迅速・簡便に精製することも可能である。しかしながら、リング構造を形成した融合蛋白質のみを回収するためには、これらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過を組み合わせることが好ましい。シャペロニンが耐熱性のものである場合、大腸菌の抽出液を６０〜８０℃で熱処理することによって大部分の大腸菌由来蛋白質は沈殿してしまい、融合蛋白質の精製をより簡略化させることができる。目的蛋白質自身が耐熱性のものでなくとも、シャペロニンの空洞内部に保持されているので、変性することはない。上記いずれの方法によっても融合蛋白質の形態は透過型電子顕微鏡によって観察可能である。目的蛋白質がシャペロニンリングに格納されている場合、外径１４〜１６ｎｍ程度のシャペロニン特有のリング構造が観察される。融合蛋白質のリング構造が不安定な場合は、精製の過程でマグネシウムおよびＡＴＰを存在させておくことで、リング構造である融合蛋白質を効率的に回収することが可能である。
【００３２】
多くのシャペロニンサブユニット間の会合は、マグネシウムイオンおよびＡＴＰによって安定化されている。したがって、融合蛋白質から目的蛋白質のみを分離する場合には、上記のようにして回収した画分をＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）処理した後、マグネシウムおよびＡＴＰが入っていない緩衝液に対して透析を行いマグネシウムおよびＡＴＰを取り除く。シャペロニンサブユニット間の相互作用は解除され立体構造は壊れ、目的蛋白質が露出することによって目的蛋白質の限定分解型プロテアーゼによる切り出しが可能となる。
目的蛋白質の回収のみが目的である場合は、融合蛋白質は必ずしも均一に精製する必要はなく、粗精製サンプルに直接、限定分解型プロテアーゼを作用させ、目的蛋白質に応じた精製操作を施せば良い。目的蛋白質にメチオニンが存在しない場合は、シャペロニンと目的蛋白質の間にメチオニンを存在させることによって、ＣＮＢｒによって切断可能なので、融合蛋白質をＥＤＴＡ処理および透析操作は必要ない。
【００３３】
目的蛋白質が膜結合性もしくは膜貫通性蛋白質である場合には、目的蛋白質とシャペロニンの切断によって不溶化することもあるが、不溶化物のみを遠心分離によって回収した後、疎水性アルキル鎖がオクチル（Ｃ８）からドデシル（Ｃ１２）あたりの長さである非イオン性界面活性剤等を用いると、ミセルの直径がほぼ生体膜に相応し、可溶化しやすい。例えば、β―オクチルグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｔｗｅｅｎ２０等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００３４】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
（Ｃ末端欠損ＧｒｏＥＬ融合セロトニン受容体の発現）
大腸菌Ｋ１２株ゲノムを鋳型とし、５’末端にＳｐｅＩサイトを、３’末端にＸｂａＩサイトが導入されるプライマーを用いたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって、大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ遺伝子をクローニングした。３’末端側のプライマーとしては、５’−ＡＧＣＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＣＡＴＧＣＣＧＣＣＣＡＴＧＣＣ−３’（配列番号１）および５’−ＡＧＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＡ−３’  （配列番号２）を用いた。前者のプライマーによってＧｒｏＥＬ全長が、一方、後者のプライマーによってＧｒｏＥＬのＴｈｒ５２２以降を欠損させたＧｒｏＥＬｓが得られた。ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア）を用いて、取得したＧｒｏＥＬ全長が一方向に１、２、３、４、５、６回連結した遺伝子断片が挿入された発現ベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）ｎ（ｎは１〜６）を構築し、さらにその後ろにＧｒｏＥＬｓを同方向に挿入した発現ベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ｓを作製した。各発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入しカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地（バクトトリプトン  １６ｇ、酵母エキス  １０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ）で２３℃、１１０ｒｐｍで２４時間培養し、シャペロニン連結体を発現させた。培養終了後、回収した菌体を超音波で破砕し、遠心分離で上清を回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびにクマシーブリリアントブルー染色によって分析した結果、（ＧｒｏＥＬ）ｎ  （ｎは１〜６）および（ＧｒｏＥＬ）７ｓが可溶性画分に大量発現していることが確認できた。
【００３６】
ｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ｓ発現ベクターに連結したＧｒｏＥＬのＣ末端にＦＬＡＧが付加されるよう８残基のアミノ酸をコードする合成ＤＮＡを挿入した。このベクターをｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ｓＴＣＦとした。セロトニン受容体（ＨＴ１ａＲ）遺伝子をＰＣＲによって５’末端にＢｇｌＩＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトを設け、連結したＧｒｏＥＬとＨｉｓＴａｇの間にＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ処理が施されたｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ｓＴＣＦに導入した発現ベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ｓＴＣＦ−ＨＴ１ａＲを作製した。本ベクターをＲｅｃＡ−であるＢＬＲ（ＤＥ３）株に形質転換した後、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地で２３℃、１１０ｒｐｍで２４時間培養し、融合蛋白質の発現を行った。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリリアントブルー染色によって分析した結果、図１に示すように（ＧｒｏＥＬ）７ｓ−ＨＴ１ａＲ融合蛋白質に相当するサイズのバンドが検出された（図１、Ｌａｎｅ５）。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写し、抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ）を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、（ＧｒｏＥＬ）７ｓのみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合蛋白質の場合のみ、そのサイズ相当（約４７０ｋＤａ）の陽性バンドが検出された。このことからセロトニン受容体が融合蛋白質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。セロトニン受容体での発現実験では、大腸菌の可溶性画分にも沈殿画分にも相当サイズのバンドは認めることができなかった。本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり融合蛋白質として約５０ｍｇのＧｒｏＥＬ融合セロトニン受容体が可溶性画分に発現していると推定できた。
【００３７】
実施例２
（Ｃ末端欠損ＧｒｏＥＬ融合エンドセリン受容体、ＶＩＰ１受容体の発現）
ヒト由来の膜蛋白質である３種のＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、エンドセリンＡ受容体（ＥＴＡＲ）遺伝子、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）遺伝子およびＶａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ１受容体（ＶＩＰ１Ｒ）遺伝子をＰＣＲによって５’末端にＢｇｌＩＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトを設け、連結したＧｒｏＥＬとＦＬＡＧの間にＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ処理が施されたｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ｓＴＣＦに導入した発現ベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ｓＴＣＦ−ＥＴＡＲ、ｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ｓＴＣＦ−ＥＴＢＲ、ｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ｓＴＣＦ−ＶＩＰ１Ｒを作製した。得られた発現ベクターを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に形質転換し、実施例１と同条件で発現を行った。超音波による菌体破砕後、上清を遠心分離によって回収し、抗ＦＬＡＧ抗体固定化ビーズ（シグマ）を用いて免疫沈降を行った。結果を図２に示す。３種全てのＧＰＣＲについて、いずれも融合蛋白質として４７０ｋＤａ付近にバンドが確認でき、またそれら全てが、抗ＦＬＡＧ抗体に対して結合した。このことから  、これら３種のＧＰＣＲの全てが大腸菌可溶性画分に発現することが確認できた。
【００３８】
比較例
（セロトニン受容体の直接発現およびＣ末端を欠損していないＧｒｏＥＬとの融合発現）
実施例１に示したｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクターに、セロトニン受容体ＨＴ１ａＲをコードする遺伝子を挿入し、セロトニン受容体の直接発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ−ＨＴ１ａＲを作製した。さらに、実施例１に示したｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）６にさらに同一方向にＣ末端を欠損していない野生型のＧｒｏＥＬをコードする遺伝子を挿入し、ｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７を作製した。本発現ベクターに実施例１と同様にＨｉｓＴａｇをコードする遺伝子、さらに、セロトニン受容体ＨＴ１ａＲをコードする遺伝子を挿入し、（ＧｒｏＥＬ）７−セロトニン受容体融合蛋白質発現ベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ＴＣＦ−ＨＴ１ａＲを構築した。
【００３９】
これら２種の発現ベクターを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に形質転換し、実施例１と同一条件下で発現を行った。菌体を回収し、超音波による破砕、さらに遠心分離を行った後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。結果を図１に示す。対照としてｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクターを形質転換した細胞破砕液上清の分析も同時に行った（図１、Ｌａｎｅ１）。セロトニン受容体の直接発現ではセロトニン受容体に由来すると思われる相当サイズのバンドは確認できなかった（図１、Ｌａｎｅ２）。さらに、Ｃ末端を欠損させていないＧｒｏＥＬにセロトニン受容体を融合させた場合、融合蛋白質はほとんど発現しなかった（図１、Ｌａｎｅ４）。
【００４０】
【発明の効果】
本発明の融合蛋白質及び組み換え目的蛋白質の生産方法は、上述の構成より成るので、大量発現が困難である目的蛋白質からなる融合蛋白質、及び可溶性画分への発現が困難であった組み換え目的蛋白質、特に、宿主に対して極めて毒性の強い目的蛋白質の発現量を増加させるのに有用である。
【００４１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＧｒｏＥＬ融合セロトニン受容体の発現を示し、Ｌａｎｅ１〜Ｌａｎｅ５は、下記の発現ベクターを示す。
Ｌａｎｅ１：ｐＴｒｃ９９Ａ
Ｌａｎｅ２：ｐＴｒｃ９９Ａ−ＨＴ１ａＲ
Ｌａｎｅ３：ｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ｓ
Ｌａｎｅ４：ｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ＴＣＦ−ＨＴ１ａＲ
Ｌａｎｅ５：ｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７ｓＴＣＦ−ＨＴ１ａＲ
【００４２】
【図２】ＧｒｏＥＬ融合エンドセリンＡ受容体、エンドセリンＢ受容体、ＶＩＰ１受容体の発現を示し、（ａ）〜（ｃ）およびＬａｎｅ１〜Ｌａｎｅ４は下記の意義を有する。
（ａ）：ＧｒｏＥＬ融合エンドセリンＡ受容体
（ｂ）：ＧｒｏＥＬ融合エンドセリンＢ受容体
（ｃ）：ＧｒｏＥＬ融合ＶＩＰ１受容体
Ｌａｎｅ１：細胞破砕液上清
Ｌａｎｅ２：抗ＦＬＡＧ抗体免疫沈降非吸着画分
Ｌａｎｅ３：抗ＦＬＡＧ抗体免疫沈降洗浄画分
Ｌａｎｅ４：抗ＦＬＡＧ抗体免疫沈降吸着画分
【図１】
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【図２】
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