(57)【要約】【課題】高圧凍結装置と凍結割断装置に共通に使用できる高圧凍結装置の凍結割断用試料保持体を提供する。【解決手段】キャリア１１の試料部１１ｂには、円盤状凹部（試料載置部）１１ｃが形成されている。生物試料８は試料載置部１１ｃ上に載せられている。キャリア１１の中心には圧力導入用の貫通孔１１ｄが開けられており、貫通孔１１ｄの一端は貫通孔５ｄに通じており、貫通孔１１ｄの他端は試料載置部１１ｃに通じている。保持体１０の蓋１２は円盤状に形成されており、蓋１２の片面には、鍋底状の窪み１２ａが形成されている。窪み１２ａの孔径は、試料載置部１１ｃの孔径とほぼ同じであり、窪み１２ａが形成された面が生物試料８と対向している。【選択図】  図３
2004198347.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料載置部を有し、その試料載置部に通ずる圧力導入用の貫通孔を有するキャリアと、
前記試料載置部に置かれる試料を覆うように前記キャリア上に置かれる蓋
とを備えた高圧凍結装置の凍結割断用試料保持体。
【請求項２】
前記蓋の試料と対向する面には、窪みが形成されていることを特徴とする請求項１記載の高圧凍結装置の凍結割断用試料保持体。
【請求項３】
前記凍結割断用試料保持体は凍結割断装置の試料ホルダに装着可能であり、前記凍結割断用試料保持体は、凍結割断装置の割断用ナイフの衝突によって前記蓋が前記キャリアから外れるように、前記試料ホルダに保持されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の高圧凍結装置の凍結割断用試料保持体。
【請求項４】
試料載置部を有し、その試料載置部に通ずる圧力導入用の貫通孔を有するキャリアと、
前記試料載置部に置かれる試料を覆うように前記キャリア上に置かれる蓋と、
前記蓋が前記キャリアから外れないように前記キャリアと前記蓋を保持すると共に、前記キャリアの貫通孔に通ずる圧力導入用貫通孔を有するポットと、
前記ポットの圧力導入用貫通孔に接続された圧力供給装置と、
前記キャリアを冷却する手段
とを備えた高圧凍結装置。
【請求項５】
前記蓋の試料と対向する面には、窪みが形成されていることを特徴とする請求項４記載の高圧凍結装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、透過電子顕微鏡などの試料作製において用いられる高圧凍結装置の凍結割断用試料保持体に関する。
【０００２】
【従来の技術】高圧凍結装置は、透過電子顕微鏡の試料作製において用いられ、水分を含んだ生物試料などを高圧下で凍結するための装置である。
【０００３】
たとえば２００Ｍｐａ（２０００ｂａｒ）の高圧下では、水の氷点が下がり、−９０℃位まで氷晶を形成する核ができないため、生物試料の無氷晶凍結深度は数１００μｍに達する。生物試料の細胞の大きさは、通常数μｍ〜３０μｍであるから、たとえば無氷晶凍結深度を２００μｍとすると、およそ細胞１０個分（細胞の大きさ２０μｍとして）の厚さの細胞構造が破壊されることなく観察が可能となる。
【０００４】
一方、常圧下で生物試料を凍結したときは、その試料の無氷晶凍結深度は１０〜２０μｍと浅く、細胞１個分の厚さの無氷晶凍結層が得られるにすぎない。このようなことから、現在、高圧凍結装置は特に注目を集めている。
【０００５】
さて、図１は、従来の高圧凍結装置を示した図である。図１において、１はチャンバである。このチャンバ１内の処理室２には、高圧装置３と冷却剤噴射装置４が配置されている。そして、ポット５を保持したポット保持ロッド６が、チャンバ１側のロッド装着部７に装着されている。
【０００６】
前記ポット５は、図１中の斜視図にも示すように、開放空間部５ａと、円盤状の固定部５ｂと、その固定部５ｂに繋がる連結部５ｃとを有している。この固定部５ｂと連結部５ｃの中心には、圧力導入用の貫通孔５ｄが開けられており、貫通孔５ｄは、連結部５ｃの終端部において前記高圧装置３に接続されている。
【０００７】
さらに、ポット５には押えネジ５ｅがねじ込まれており、この押えネジ５ｅの締め付けによって、生物試料８を保持した円盤状キャリア９が前記固定部５ｂに固定されている。前記生物試料８は、キャリア９に形成された円盤状凹部９ａ上に載せられており、生物試料８の表面は前記圧力導入用貫通孔５ｄに対向している。なお、前記凹部９ａが開放空間部５ａに対して密閉されるように、前記キャリア９と固定部５ｂは互いに連結されている。
【０００８】
このような構成の装置において、生物試料８を高圧凍結するときには、まず、流体（たとえばメタルシクロヘキサン）が高圧装置３から貫通孔５ｄに供給され、その流体を介して生物試料８に０．４〜０．５Ｍｐａの圧力がかけられる。次に、高圧装置３からの高圧力（たとえば２００Ｍｐａ）が、貫通孔５ｄ内の前記流体を介して試料８にかけられる。
【０００９】
そして、その高圧下において、冷却剤噴射装置４から冷却剤（たとえば液体窒素）が噴射され、液体窒素が開放空間部５ａを介してキャリア９および固定部５ｂに吹き付けられる。こうして、生物試料８は、高圧凍結される。
【００１０】
なお、図１に示したような高圧凍結装置は、たとえば、下記の特許文献１などにおいて知られている。
【００１１】
【特許文献１】
特開２００１−３１８０３５号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】ところで、透過電子顕微鏡の試料作製に用いられる装置として、上述した高圧凍結装置とは別に、凍結割断装置がある。この凍結割断装置は、図２（ａ）に示すように、割断用ナイフを矢印方向に移動させて、凍結試料を割断する装置である。このような凍結割断装置を用いれば、凍結試料は細胞面に沿って割れ、凹凸状の細胞面が現れた透過電子顕微鏡用試料を得ることができる。
【００１３】
そこで、本件発明者は、図１の高圧凍結装置によって高圧凍結された試料８を、図２（ａ）に示した凍結割断装置で割断するために、前記キャリア９を凍結割断装置の試料ホルダにセットすることを考えた。しかしながら、図２（ｂ）に示すように、凍結試料８の表面はキャリア９の上面と同一面であるため、これでは、割断用ナイフによる試料割断は行えない。
【００１４】
そもそも、高圧凍結装置におけるキャリア９は、凍結割断装置で使用する目的で作られていない。通常、高圧凍結装置において高圧凍結された試料８は、凍結置換処理のため、キャリア９ごと置換処理液に２〜３日浸される。そして、置換処理が行われた試料８は包埋材で包埋され、その後、刃先が鋭利なミクロトームで薄く切り取られて透過電子顕微鏡用試料とされる。このように、図１の高圧凍結装置におけるキャリア９は、凍結置換用として作られたものであって、凍結割断装置用として作られたものでない。
【００１５】
本発明はこのような点に鑑みて成されたもので、その目的は、高圧凍結装置と凍結割断装置に共通に使用できる高圧凍結装置の凍結割断用試料保持体を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】この目的を達成する本発明の凍結割断用試料保持体は、試料載置部を有し、その試料載置部に通ずる圧力導入用の貫通孔を有するキャリアと、前記試料載置部に置かれる試料を覆うように前記キャリア上に置かれる蓋とを備えている。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下、図面を用いて本発明の実施の形態について説明する。
【００１８】
図３は、本発明の凍結割断用試料保持体の一例を示した図である。図３において、図１と同じ構成要素には図１と同じ番号が付けられており、その説明を省略する。
【００１９】
図３において、１０は本発明の凍結割断用試料保持体であり、保持体１０以外の構成は図１と同じである。保持体１０はキャリア１１と蓋１２とで構成されており、前記押えネジ５ｅの締め付けによって、生物試料８を保持した保持体１０が前記固定部５ｂに固定されている。
【００２０】
保持体１０のキャリア１１は、円盤状の鍔部１１ａと、円盤状の試料部１１ｂとを有しており、鍔部１１ａの径は前記固定部５ｂの径とほぼ同じである。また、試料部１１ｂには、図３中の斜視図にも示すように円盤状凹部（試料載置部）１１ｃが形成されており、その試料載置部１１ｃの孔径は１．４ｍｍ程度、試料載置部１１ｃの深さは０．２ｍｍ（すなわち２００μｍ）程度である。前記生物試料８はこの試料載置部１１ｃ上に載せられている。さらに、キャリア１１の中心には圧力導入用の貫通孔１１ｄが開けられており、この貫通孔１１ｄの一端は前記貫通孔５ｄに通じており、また、貫通孔１１ｄの他端は前記試料載置部１１ｃに通じている。
【００２１】
一方、保持体１０の蓋１２は円盤状に形成されており、蓋１２の径は前記試料部１１ｂの径とほぼ同じである。この蓋１２の片面には、図３中の斜視図にも示すように鍋底状の窪み１２ａが形成されており、窪み１２ａの孔径は、前記試料載置部１１ｃの孔径とほぼ同じである。このような窪み１２ａが形成された面が生物試料８と対向するように、蓋１２はキャリア１１の試料部１１ｂ上に置かれている。
【００２２】
なお、生物試料８を試料載置部１１ｃにセットする際、生物試料８の表面が試料部１１ｂの上面より高くなるように生物試料８はセットされているので、図３に示すように、窪み１２ａの部分も生物試料８で満たされている。そして、このように生物試料８で満たされた部屋、すなわち、窪み１２ａと試料載置部１１ｃで形成された部屋が前記開放空間部５ａに対して密閉されるように、前記キャリア１１と蓋１２は互いに連結されている。
【００２３】
このような構成の装置において、生物試料８を高圧凍結するときには、まず、流体（たとえばメタルシクロヘキサン）が高圧装置３から貫通孔５ｄ，１１ｄに供給され、その流体を介して生物試料８に０．４〜０．５Ｍｐａの圧力がかけられる。次に、高圧装置３からの高圧力（たとえば２００Ｍｐａ）が、貫通孔５ｄ，１１ｄ内の前記流体を介して試料８にかけられる。そして、その高圧下において、冷却剤噴射装置４から冷却剤（たとえば液体窒素）が噴射され、液体窒素が開放空間部５ａを介してキャリア１１および蓋１２に吹き付けられる。この結果、貫通孔１１ｄ側に２００μｍ程度の無氷晶凍結層をもつ凍結試料８が得られる。
【００２４】
こうして、生物試料８が高圧凍結されると、前記ポット５は、チャンバ１外の液体窒素槽（図示せず）に取り出される。そして、試料作製者は、液体窒素中でポット５の押えネジ５ｅを補助器具を使って緩め、凍結試料８の入っているキャリア１１と蓋１２をポット５から取り出す。さらに試料作製者は、その蓋１２のついたキャリア１１を、図４に示すように、液体窒素中で凍結割断装置の試料ホルダ１３に取り付ける。
【００２５】
図４において、１３は凍結割断装置の試料ホルダであり、試料ホルダ１３の側面にはネジ１３ａが切られている。また、試料ホルダ１３の上面には、前記キャリア１１を載せるための円盤状凹部（キャリア載置部）１３ｂが形成されている。試料作製者は、液体窒素中でキャリア１１を補助器具を使って掴み、蓋１２のついたキャリア１１をキャリア載置部１３ｂにセットする。
【００２６】
そして試料作製者は、液体窒素中で、キャップ１４を補助器具を使って試料ホルダ１３に取り付ける。このキャップ１４の内側にはネジが切られており、また、キャップ１４の上面には、前記蓋１２の径より若干大きい孔１５が開けられている。
【００２７】
その後、試料作製者は、試料ホルダ１３を液体窒素から取り出し、試料ホルダ１３を凍結割断装置の試料ステージに取り付ける。図５は、凍結割断装置の試料ステージ１６にセットされた試料ホルダ１３を示した図（断面図）である。なお、試料ステージ１６は冷却機構を備えており、凍結試料８はその冷却機構によって低温に冷却されている。また、試料ホルダ１３が配置されている凍結割断装置の試料室は、排気装置によって排気されている。
【００２８】
図５から分かるように、キャリア１１の上面とキャップ１４の上面はほぼ同一面上にあり、蓋１２はキャップ１４の上面より高く突出している。また、キャリア１１の上面より高く盛り上がった凍結試料８の表面は、キャップ１４の上面より高く突出している。このような状態において、凍結割断装置の割断用ナイフが図中矢印方向に移動され、割断用ナイフは蓋１２に衝突する。この衝突によって蓋１２はキャリア１１から取り除かれ、そして、キャップ１４の上面より高く盛り上がった凍結試料８は、割断用ナイフによって割断される。
【００２９】
この割断により、凍結試料８はキャリア１１の上面に沿うように割れ、その際、凍結試料８は細胞面に沿って割れる。この結果、凹凸状の細胞面が現れた凍結試料８が得られる。また、このようにキャリア１１の上面に沿って割れた凍結試料８の厚さは、試料載置部１１ｃの深さと同じ２００μｍ程度であり、この得られた凹凸状の細胞面は、上述した無氷晶凍結層内の細胞面である。このため、細胞構造が破壊されていない細胞面が得られたことになる。なお、凍結割断装置の試料室は排気されているので、試料割断後において割断面（細胞面）に霜が付くことはなく、細胞面は破壊されることなく良い状態に維持される。
【００３０】
このような試料割断が行われた後、引き続き凍結割断装置の試料室において、試料８の前記割断面に対して金蒸着処理が行われる。いわゆるレプリカ法における金蒸着が行われる。そして、この金蒸着処理後、試料ホルダ１３は試料ステージ１６から取り外され、試料８は試料溶解液の中に浸される。この結果、試料８は溶けて、試料８表面に蒸着された金のコーティング膜だけが残る。そして、この金のコーティング膜が透過電子顕微鏡の試料ホルダにセットされて、透過電子顕微鏡による像観察が行われる。
【００３１】
以上、図３〜図５を用いて本発明の凍結割断用試料保持体の一例を説明したが、上述した凍結割断用試料保持体１０を用いれば、試料８を高圧凍結装置において良好に高圧凍結することができる。さらに、凍結割断用試料保持体１０の蓋１２の窪み１２ａによって、試料８の表面はキャリア１１の上面より高く盛り上がるので、高圧凍結された凍結試料を凍結割断装置において確実に割断することができる。このように、本発明の凍結割断用試料保持体１０は、高圧凍結装置と凍結割断装置に共通に使用することができる。
【００３２】
なお、上記例では、蓋１２に窪み１２ａが形成されているが、このような窪みのない扁平な蓋を用いても、生物試料８を割断できる場合がある。それは、図５における割断において、割断用ナイフの衝突によってその扁平な蓋がキャリア１１から取り除かれる際、凍結試料８の表面層が蓋の表面にくっついた状態で蓋が取り除かれた場合である。このように凍結試料の表面層が剥ぎ取られた場合にも、凹凸状の細胞面（割断面）が現れた凍結試料を得ることができる。また、この場合においても、凍結試料は割断まで蓋で覆われるので、キャリアや蓋が大気に触れても凍結試料は大気に触れることはない。このため、凍結試料の表面に霜がつくことはなく、霜による細胞面の破壊を防止することができる。
【００３３】
また、図６は、本発明の他の例を示した図である。図６において、１７はポットであり、ポット１７の上下には冷却剤通過孔１８が開けられている。また、ポット１７の固定部１９には、圧力導入用の貫通孔２０が開けられている。そして、固定部１９に形成された円盤状凹部２１には、円盤状のキャリア２２が置かれている。
【００３４】
キャリア２２の上面には、円盤状凹部（試料載置部）２３が形成されており、生物試料２４がその上に載せられている。また、キャリア２２には圧力導入貫通孔２５が開けられており、貫通孔２５の一端は前記試料載置部２３に通じ、その他端は前記貫通孔２０に通じている。そして、キャリア２２は押えネジ２６で押さえられており、押えネジ２６には窪み２７が形成されている。この窪みによって試料２４の山盛り部分がつくられている。
【００３５】
このようなポット１７は、図３に示した高圧凍結装置に装着され、試料２４に高圧装置３からの高圧力がかけられた状態で、冷却剤噴射装置４からの液体窒素が押えネジ２６などに吹き付けられて、生物試料２４は高圧凍結される。この場合、液体窒素は試料面に対して垂直な方向から吹き付けられて、薄く作られた押えネジ２６の表面に均一に吹き付けられる。このため、この例では特に、生物試料２４を効率良く冷却でき、試料を急速凍結することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の高圧凍結装置を示した図である。
【図２】従来の問題点を説明するために示した図である。
【図３】本発明の一例を示した図である。
【図４】凍結割断装置の試料ホルダを示した図であり、図３の凍結割断用試料保持体がセットされる試料ホルダを示した図である。
【図５】凍結割断装置の試料ステージにセットされた試料ホルダを示した図（断面図）である。
【図６】本発明の他の例を示した図である。
【符号の説明】
１…チャンバ、２…処理室、３…高圧装置、４…冷却剤噴射装置、５…ポット、５ａ…開放空間部、５ｂ…固定部、５ｃ…連結部、５ｄ…貫通孔、５ｅ…押えネジ、６…ポット保持ロッド、７…ロッド装着部、８…試料、９…キャリア、９ａ…凹部、１０…凍結割断用試料保持体、１１…キャリア、１１ａ…鍔部、１１ｂ…試料部、１１ｃ…試料載置部、１１ｄ…貫通孔、１２…蓋、１２ａ…窪み、１３…試料ホルダ、１３ａ…ネジ、１３ｂ…凹部、１４…キャップ、１５…孔、１６…試料ステージ、１７…ポット、１８…冷却剤通過孔、１９…固定部、２０…貫通孔、２１…円盤状凹部、２２…キャリア、２３…試料載置部、２４…試料、２５…圧力導入貫通孔、２６…押えネジ、２７…窪み
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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