(57)【要約】【課題】細胞質雄性不稔回復遺伝子を用いて、イネの細胞質雄性不稔系統あるいは稔性回復系統を作出する。【解決手段】細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡのイネ植物への導入により、稔性を人為的に変更する。また細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡをマーカーとして育種に供する。【効果】細胞質雄性不稔系統やその維持系統あるいは稔性回復系統の育成における遺伝資源の飛躍的拡大ができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号：１に示されたアミノ酸配列と同一または実質的に同一なアミノ酸配列をコードする細胞質雄性不稔回復遺伝子。
【請求項２】
配列表の配列番号：２に示されたＤＮＡ塩基配列を含む細胞質雄性不稔回復遺伝子。
【請求項３】
以下のｉ）及びｉｉ）、必要によりｉｉｉ）の構成要素を含む発現カセットを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子。
ｉ）  植物細胞内で転写可能なプロモーター
ｉｉ）  該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向あるいは逆位反復配列を成すように結合した請求項１又は請求項２に記載の遺伝子ＤＮＡの全部または一部、
ｉｉｉ）  ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、植物細胞内で機能するシグナル
【請求項４】
請求項３に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子を保持するプラスミドＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子を保持する植物細胞。
【請求項６】
請求項３に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子が導入されたトランスジェニック植物体。
【請求項７】
請求項３に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植物に導入することにより、該植物に細胞質雄性不稔回復能を付与もしくは欠損させる方法。
【請求項８】
植物がイネであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１又は請求項２記載の細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡの一部より任意に選ばれるＤＮＡ断片（ＤＮＡマーカー）を含む、細胞質雄性不稔回復遺伝子検出用ＰＣＲプライマー。
【請求項１０】
請求項９に記載のＰＣＲプライマーを用いて、試料ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片中のＤＮＡマーカーの有無により、細胞質雄性不稔回復遺伝子を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イネ、特にハイブリッドライスおよびその親系統の育成または育成されたハイブリッドライスの種子生産に利用される細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡ、また、これをＤＮＡマーカーに用いて細胞質雄性不稔回復遺伝子を判別する方法に関する。さらに、本発明は、細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子、及びこれらのＤＮＡを導入することにより、細胞質雄性不稔回復遺伝子の発現制御が可能となったトランスジェニック植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）とは、細胞質内のミトコンドリアゲノムにコードされるＣＭＳ化因子によって正常な花粉が生産できなくなる現象である。このＣＭＳは高等植物に広く見られる現象で、核と細胞質の遺伝子産物の不親和によって生じると考えられている。一方、細胞質雄性不稔回復遺伝子とは、核ゲノムにコードされており、ＣＭＳ化因子を含む細胞質による花粉の不稔性を打ち消す機能を持つ。ＣＭＳは自身の花粉で稔実する事なく、大規模な交配によるハイブリッド種子の商業生産に利用されている。また、細胞質雄性不稔回復遺伝子はハイブリッド植物での結実を可能とし、特に、ハイブリッドライスやハイブリッドコーンの様にハイブリッド植物に結実する種子を収穫物とする植物においては必須となる遺伝子である。従って、ＣＭＳ化因子とそれを回復させる細胞質雄性不稔回復遺伝子は農業上極めて重要な遺伝子に挙げられている。にもかかわらず、細胞質雄性不稔とその稔性回復の分子機構については未だ明らかではない。この細胞質雄性不稔と稔性回復システムを効率的に利用するためにも、分子レベルでのメカニズムの解明が望まれている。
【０００３】
イネにおいては、野生種に栽培種を交配した場合や、インディカ種にジャポニカ種を交配した場合に、核と細胞質の不親和によってＣＭＳが生じることが知られている。特に、インディカ種の１つであるＣｈｉｎｓｕｒａｈ  Ｂｏｒｏ  ＩＩにジャポニカ種を交配した場合に生じるＣＭＳはＢＴ型として分類され、このＢＴ型ＣＭＳを回復させるイネの細胞質雄性不稔回復遺伝子はＲｆ−１と呼ばれている。ＢＴ型細胞質雄性不稔のイネは、核にＲｆ−１遺伝子を持っていれば花粉を正常に発達させることができ、種子の結実が可能となる。本発明で言う細胞質雄性不稔回復遺伝子とはＢＴ型のＣＭＳを回復させるもので、イネの第１０染色体に座乗するものを指し、本発明ではＲｆ−１と省略して示す。
【０００４】
ハイブリッドライス種子を商業生産する方法として、上記のＣＭＳと細胞質雄性不稔回復遺伝子を組み合わせた「三系法」が確立されている。「三系法」ではＣＭＳ化因子を持つ細胞質雄性不稔系統と稔性を回復させる細胞質雄性不稔回復遺伝子を有する稔性回復系統を用いた交配によってハイブリッドライス種子を大規模生産する。ジャポニカ種のハイブリッドライス採種には、ＢＴ型雄性不稔細胞質が利用されており、Ｒｆ−１遺伝子は不可欠となっている。
【０００５】
稔性回復系統としては細胞質雄性不稔回復遺伝子を有する事が必須となる。従来、この細胞質雄性不稔回復遺伝子の有無を判別するためには、まず、調査対象とする系統を細胞質雄性不稔系統と交配し、次に、得られた交配種子を播種して植物体を育成し、その植物の自殖種子の形成率を調査する必要があった。すなわち、この自殖種子の形成率が８０％以上の場合に、稔性回復遺伝子を有すると判別していた。しかし、このような方法では膨大な労力と時間を必要とするため、簡便でかつ確実に細胞質雄性不稔回復遺伝子の有無を判別する方法の開発が望まれていた。
【０００６】
近年、ＤＮＡ解析技術の急速な進歩によって、ＤＮＡレベルで目的遺伝子または目的形質を判別する、いわゆるマーカー育種技術が開発され、育種効率の向上に貢献するようになってきた。この技術では、目的遺伝子そのものもしくは目的遺伝子と近接して存在する塩基配列を含むＤＮＡ（ＤＮＡマーカー）を用いる。ＤＮＡマーカーは目的とする遺伝子に近接しているほど育種への寄与度は高く、目的遺伝子そのものの利用が望ましい。しかしながら、イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子Ｒｆ−１は、その構造がまったく不明で、これを直接同定するＤＮＡマーカーは存在していなかった。
【０００７】
トウモロコシとペチュニアにおいて細胞質雄性不稔回復遺伝子が単離され、構造が明らかとなった（Ｃｕｉら（１９９６），  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．２７２：ｐ１３３４−，Ｂｅｎｔｏｌｉｌａら（２００２），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ．９９：ｐ１０８８７−）。これら２種の細胞質雄性不稔回復遺伝子は全く異なる遺伝子構造を有している。ＣＭＳを引き起こすミトコンドリア遺伝子構造変化は多岐にわたっており、個々のＣＭＳに対する細胞質雄性不稔回復遺伝子が存在する。
【０００８】
例えば、イネのＢＴ型雄性不稔細胞質では、ミトコンドリアのａｔｐ６遺伝子に構造変異が生じて新奇なキメラ遺伝子が存在することが明らかにされた。イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子Ｒｆ−１が共存した場合は、このキメラ遺伝子の転写産物がプロセッシングを受けていることが見出されている（Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３），    ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ｖｏｌ．１２：ｐ１４３７−，  Ａｋａｇｉら（１９９４），  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．，  ｖｏｌ２５：ｐ５２−）。このことから、Ｒｆ−１はミトコンドリアのｍＲＮＡ修飾に関与すると考えられる。Ｒｆ−１は、ＢＴ型細胞質雄性不稔を回復させるが、他のＷＡ型細胞質雄性不稔を回復させる機能のないことが遺伝学的に明らかにされている。イネでは様々な型の細胞質雄性不稔が知られており、それぞれに異なる細胞質雄性稔性回復遺伝子が作用していると考えられる。
【０００９】
このような事例からも明らかなように、トウモロコシやペチュニアの例をもとに細胞質雄性不稔回復遺伝子に共通の構造を容易に類推することはできない。従って、個々の細胞質雄性不稔回復遺伝子を単離・同定する必要がある。
【００１０】
また、細胞質雄性不稔系統の育成にあたっては、細胞質雄性不稔回復遺伝子の除去あるいは非発現化が必須であり、稔性回復系統の育成にあっては、細胞質雄性不稔回復遺伝子を付与することが必須である。従来、一般的には、細胞質雄性不稔回復遺伝子の除去あるいは付与の方法としては、細胞質雄性不稔回復遺伝子の存在の有無が確認されている植物との交配と数次にわたる戻し交配ならびに後代選抜育種の方法が用いられてきた。Ｒｆ−１が単離できれば、これを人為的に改変・制御することによって、イネの細胞質雄性不稔系統もしくは稔性回復系統の育成を迅速に実施することが可能となる。
本発明はこのような技術的背景に基づきなされたものである。
【００１１】
【非特許文献１】Ｃｕｉら（１９９６），  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．２７２：ｐ１３３４−
【非特許文献２】Ｂｅｎｔｏｌｉｌａら（２００２），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ．９９：ｐ１０８８７−
【非特許文献３】Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３），    ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ｖｏｌ．１２：ｐ１４３７−
【非特許文献４】Ａｋａｇｉら（１９９４），  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．，  ｖｏｌ２５：ｐ５２−
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子Ｒｆ−１の構造を明らかにし、ＤＮＡマーカー化して高精度にＲｆ−１の有無を判別する方法、もしくは、Ｒｆ−１を人為的に改変・制御することによって、細胞質雄性不稔系統あるいは稔性回復系統を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、染色体構造上でＲｆ−１のみが異なる準同質遺伝子系統を用いて、細胞質雄性不稔回復の原因となる単一の遺伝子を広大な染色体領域において同定し、Ｒｆ−１を単離することに成功した。また、得られた遺伝子は、構造変異で細胞質雄性不稔回復の機能欠損が生じることを確認し、これら知見に基づき本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］        配列表の配列番号：１に示されたアミノ酸配列と同一または実質的に同一なアミノ酸配列をコードする細胞質雄性不稔回復遺伝子。
［２］        配列表の配列番号：２に示されたＤＮＡ塩基配列を含む細胞質雄性不稔回復遺伝子。
［３］        以下のｉ）及びｉｉ）、必要によりｉｉｉ）の構成要素を含む発現カセットを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子。
ｉ）  植物細胞内で転写可能なプロモーター
ｉｉ）  該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向あるいは逆位反復配列を成すように結合した［１］又は［２］に記載の遺伝子ＤＮＡの全部または一部、および必要に応じて、
ｉｉｉ）  ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、植物細胞内で機能するシグナル
［４］        ［３］に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子を保持するベクター。
［５］        ［３］に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子を保持する植物細胞。
［６］        ［３］に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子が導入されたトランスジェニック植物体。
［７］        ［３］に記載の組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植物に導入することにより、該植物に細胞質雄性不稔回復能を付与もしくは欠損させる方法。
［８］        植物がイネであることを特徴とする［７］に記載の方法。
［９］        ［１］又は［２］記載の細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡの一部より任意に選ばれるＤＮＡ断片（ＤＮＡマーカー）を含む、細胞質雄性不稔回復遺伝子検出用ＰＣＲプライマー。
［１０］      ［９］に記載のＰＣＲプライマーを用いて、試料ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片中のＤＮＡマーカーの有無により、細胞質雄性不稔回復遺伝子を検出する方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡの利用に関する。本発明における稔性回復系統の育成は、細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を有するトランスジェニック植物を作出することにより行う。また、細胞質雄性不稔系統の育成は、細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡに１以上の変異を生じ、稔性回復因子としての機能が低下もしくは欠損した蛋白質をコードする遺伝子を有す植物の選抜、または細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子の導入によって細胞質雄性不稔回復遺伝子の発現を制御したトランスジェニック植物を作出することにより行う。一方、本発明における細胞質雄性不稔回復遺伝子のＤＮＡマーカーは、細胞質雄性不稔回復遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡであり、イネ細胞中の細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡ配列の存在を調べることにより、細胞質雄性不稔回復遺伝子の有無を判別可能にする。
【００１６】
イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子としては、例えば、イネ品種Ｃｈｉｎｓｕｒａｈ  ＢｏｒｏＩＩ由来の「Ｒｆ−１」が挙げられる。本発明者らにより単離された「Ｒｆ−１」のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：２に示す。
【００１７】
本発明における稔性回復系統もしくは細胞質雄性不稔系統の育成には、「Ｒｆ−１」蛋白質と同等の機能を有する蛋白質をコードする限り、「Ｒｆ−１」以外の遺伝子を用いることも可能である。このような遺伝子としては、「Ｒｆ−１」蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：１で表されるアミノ酸配列）と実質的に同一なアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで「配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列」とは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基について、欠失、置換、付加等の変化が生じた配列であって、配列番号：１で表されるアミノ酸配列から成る蛋白質と同一な作用効果、即ち、ＢＴ型細胞質雄性不稔の稔性回復因子として機能する蛋白質を構成するアミノ酸配列をいう。幾つかのアミノ酸残基について欠失、置換、付加等の変化を起こさせることは、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌら（１９８５），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ．８２：ｐ４８８−）により行うことができる。
【００１８】
本発明においては、「Ｒｆ−１」蛋白質と実質的に同一な蛋白質をコードする限り、「Ｒｆ−１」遺伝子の塩基配列との相同性を示す塩基配列を有する他の生物由来の細胞質雄性不稔回復遺伝子を用いることも可能である。このような細胞質雄性不稔回復遺伝子は、例えば「Ｒｆ−１」遺伝子のＤＮＡの全部もしくは一部をプローブとしたハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５），  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．９８：ｐ５０３−，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）により、選択することができる。
【００１９】
ここで、「Ｒｆ−１」遺伝子のＤＮＡの全部もしくは一部」とは、「Ｒｆ−１」遺伝子を構成するＤＮＡの任意の連続する少なくとも１４塩基以上のヌクレオチド配列をいう。
【００２０】
ハイブリダイゼーションの方法としては、具体的には、例えばＧｅｎｅＩｍａｇｅシステム（アマシャム社製）を利用することが可能で、製品プロトコールに従って、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、５０℃で６×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄後、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡを選択することができる。あるいはまた「Ｒｆ−１」蛋白質を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ技術（島本功、佐々木卓治  監修、「植物のＰＣＲ実験プロトコール」（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ２）秀潤社  １９９５年４月発行）を利用して、他の生物から「Ｒｆ−１」蛋白質と実質的に同一な蛋白質をコードする細胞質雄性不稔回復遺伝子を単離することも可能である。
【００２１】
ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術により得られる細胞質雄性不稔回復遺伝子は、「Ｒｆ−１」遺伝子と高い相同性を有する。高い相同性とは、それぞれの細胞質雄性不稔回復遺伝子がコードするアミノ酸の比較において、４５％以上の相同性、好ましくは６０％以上の相同性、さらに好ましくは７５％以上の相同性、さらに好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性を指す。ただし、得られる細胞質雄性不稔回復遺伝子によっては、コードするアミノ酸の複数の残基が欠失・付加・置換された結果として「Ｒｆ−１」との相同性が４５％以下となってもなお、稔性回復に必須な蛋白質の機能に必要な領域を保持し、実質的に同一の稔性回復に必須な機能を有する蛋白質をコードしていることも想定される。
【００２２】
このような細胞質雄性不稔回復遺伝子を単離するためのイネ以外の植物としては、一般に農作物として栽培されている植物、例えば、キュウリ、タマネギ、スイカ、カボチャ、メロン、カブ、ブロッコリー、カリフラワー、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ナタネ、ジャガイモ、ナス、トマト、ニンジン、ホウレンソウ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、タバコ、サトウダイコン、サトウキビ、ダイズ、ヒマワリ、ワタ、オレンジ、ブドウ、リンゴ、ラン、キク、ユリなどが挙げられるが、これら植物限定されない。
【００２３】
このようにして単離される遺伝子が細胞質雄性不稔回復遺伝子として機能するかを確認するには、該遺伝子ＤＮＡを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を有するトランスジェニック植物を作出することにより行うことができる。例えば、ＢＴ型細胞質雄性不稔系統のイネに該遺伝子を導入、発現させ、同植物における稔性の回復を確認する。あるいは、細胞質雄性不稔回復遺伝子を持たないイネに該遺伝子を導入、発現させた後に、同植物をＢＴ型細胞質雄性不稔系統のイネに交配して得られる植物における稔性の回復を確認する。
【００２４】
細胞質雄性不稔回復遺伝子の付与もしくは抑制には、これら細胞質雄性不稔回復遺伝子のＤＮＡを導入することにより、細胞質雄性不稔回復遺伝子の発現および制御が可能となったトランスジェニック植物を構築する方法を採ることができる。細胞質雄性不稔回復遺伝子およびその改変遺伝子を細胞内に導入して発現させるためには、（ｉ）細胞内で転写可能なプロモーター、（ｉｉ）プロモーターの下流にセンス方向またはアンチセンス方向あるいは逆位反復配列を成すように結合した細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡの全部または一部、（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、植物細胞内で機能するシグナルを含むＤＮＡ（発現カセット）を細胞に導入する。
【００２５】
ここで、「細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡの全部または一部」とは、細胞質雄性不稔回復遺伝子の抑制における該遺伝子の一部を指す場合には、細胞質雄性不稔回復能の低下を果たし得るＤＮＡの単位を指す。
【００２６】
このような発現カセットを含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子とは、発現カセットの他に該カセットの５’および／または３’側に宿主植物細胞への伝達、該細胞内での維持等の植物細胞の遺伝子組換え用の因子となるＤＮＡ配列を有する二本鎖のＤＮＡ分子を意味する。上記因子とは、組換え体選抜マーカー遺伝子や、Ｔ−ＤＮＡ領域の少なくとも３’側領域配列及び／又は５’側領域配列等の、導入されるべき細胞質雄性不稔回復遺伝子の隣接領域を指している。
【００２７】
組み換え二本鎖ＤＮＡ分子の細胞への導入に備えるために、大腸菌の複製シグナル及び形質転換された細菌の細胞を選抜するためのマーカー遺伝子を含むクローニングベクターが数多く利用できる。このようなベクターの例には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系ベクター、Ｍ１３ｍｐ系ベクター、クローニングベクターもしくはアグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合の特別のプラスミドすなわち中間ベクターまたはバイナリーベクター等がある。適当な制限酵素切断部位で、目的の配列（組換え二本鎖ＤＮＡ分子）をベクターに導入することでプラスミドＤＮＡを得ることができる。得られたプラスミドＤＮＡの特徴を明らかにするため、制限酵素切断部位分析、ゲル電気泳動、およびその他の生化学的−分子生物学的方法が一般に用いられる。各々の操作を終えた後、プラスミドＤＮＡを切断して、別のＤＮＡに結合させることができる。該プラスミドＤＮＡの組換え二本鎖ＤＮＡ分子の配列を、同じプラスミドＤＮＡまたは別のプラスミド又はベクター中にクローニングすることができる。
【００２８】
本発明における発現カセットは、挿入されているＤＮＡを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。本発明に使用し得る恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５），  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．３１３：ｐ８１０−）、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇら（１９９１），  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ｖｏｌ．３：ｐ１１５５−）などが挙げられる。また、本発明に使用し得る誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｘｕら（１９９６），  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．３０：ｐ３８７−）やタバコのＰＲ蛋白質遺伝子のプロモーター（Ｏｈｓｈｉｍａら（１９９０），  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ｖｏｌ．２：ｐ９５−）などが挙げられる。またイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲ蛋白質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によっても誘導される。
【００２９】
イネの細胞質雄性不稔回復遺伝子、例えば配列番号：２に示した「Ｒｆ−１」遺伝子ＤＮＡの蛋白質をコードする全領域を上記プロモーターの下流にセンス方向に連結した場合は、用いたプロモーターの性質に従って、細胞質雄性不稔回復遺伝子を恒常的または誘導的に発現させることが可能である。このような発現カセットを細胞に導入すれば、細胞内で稔性回復に必須な蛋白質が恒常的または誘導的に発現し、その結果、細胞質雄性不稔回復を恒常的または誘導的に引き起こすことが可能となる。一方、細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡの全部もしくは一部、例えば配列番号：２に示した「Ｒｆ−１」遺伝子ＤＮＡの全領域または蛋白質をコードする一部領域を上記プロモーターの下流にアンチセンス方向あるいは逆位反復配列を成すように連結した場合は、用いたプロモーターの性質に従って、細胞質雄性不稔回復遺伝子のアンチセンスＲＮＡあるいはヘヤピンＲＮＡを恒常的または誘導的に発現させることが可能である。このような発現カセットを細胞に導入すれば、細胞内の稔性回復に必須な蛋白質の発現が、恒常的または誘導的に阻害され、その結果、細胞質雄性不稔を恒常的または誘導的に引き起こすことが可能となる。
【００３０】
このような方法により、誘導的に細胞質雄性不稔回復を引き起こす植物が得られれば、細胞質雄性不稔維持系統との交配を経ることなく細胞質雄性不稔系統の採種が可能となる。
【００３１】
発現カセットを宿主細胞の中に導入するためには、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストへの直接導入（インジェクション法、エレクトロポレーション法など）、パーティクルガン法などや、その他の可能性が含まれる。
【００３２】
プロトプラストへの直接導入では、特別に必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要になることもある。例えばＴｉプラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、ＴｉおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも右の端の配列、大抵は両側の端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。
【００３３】
アグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき発現カセットを特別のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクターの中にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列と相同な領域をもつため、相同的組換えによって、アグロバクテリウム属菌のＴｉプラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領域が含まれている必要がある。通常Ｔｉプラスミドにｖｉｒ領域が含まれており、その働きにより、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００３４】
一方、バイナリーベクターはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００３５】
なお、このようにして得られた発現カセットを含む中間ベクターまたはバイナリーベクター、及びこれを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象である。
【００３６】
形質転換された植物細胞は、再生過程を経ることにより植物体に変換することができる。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばＦｕｊｉｍｕｒａら（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５），  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔ．，  ｖｏｌ．２：ｐ７４−）の方法が挙げられる。これらの方法により作出された植物体またはその繁殖媒体から得た植物体は、野生型の植物体と比較して細胞質雄性不稔回復の挙動が変化する。このようにして得られたトランスジェニック植物は本発明の対象である。
【００３７】
また、細胞質雄性不稔系統の育成には、細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡに１以上の変異を生じ、稔性回復因子としての機能が低下もしくは欠損した蛋白質をコードする遺伝子を有す植物を選抜する方法を採ることも可能である。細胞質雄性不稔回復遺伝子のＤＮＡに１以上の変異を生じ、稔性回復因子としての機能が低下もしくは欠損した蛋白質をコードする遺伝子を有す植物は、例えば、ＥＭＳやＤＥＢなどの化学変異剤やガンマ線などの放射線で変異誘発処理された細胞を有する個体あるいは、ｃｈｉｍｅｒａｐｌａｓｔ法（Ｂｅｅｔｈａｍら（１９９９），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ．９６：ｐ８７７４−，  Ｚｈｕら（１９９９），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ．９６：ｐ８７６８−）でゲノムＤＮＡ塩基配列を改変処理された細胞を有する個体から選抜して得られる。選抜には、該目的遺伝子ＤＮＡの１塩基以上の構造変化をＰＣＲならびに塩基配列決定の手法を組合せて検索する方法を用いることが可能である。このようにして得られる稔性回復因子としての機能が低下もしくは欠損した蛋白質をコードする遺伝子を保有するイネ植物は、該遺伝子を染色体上でホモに有する個体に育成された後に、細胞質雄性不稔系統として用いられる。
【００３８】
一方、本発明に係るＤＮＡマーカーとは、本発明に係る細胞質雄性不稔回復遺伝子ＤＮＡから任意に選ばれるＤＮＡ断片を指す。このＤＮＡマーカーの長さは概ね１００ｂｐ〜１０００ｂｐであるが、その長さに制限されるものではない。本発明に係るＰＣＲプライマーとはＤＮＡマーカーを含むＰＣＲ用のプライマーであって、好ましくはＤＮＡマーカーを含有する１組のプライマーである。ＰＣＲプライマーは細胞質雄性不稔回復遺伝子の検出用のＤＮＡマーカーを有するので、ＰＣＲに用いることにより該ＤＮＡマーカーの存在を指標として細胞質雄性不稔回復遺伝子を検出することが出来る。
【００３９】
本発明のＰＣＲプライマーの長さとしては、１５から４０ｍｅｒ程度のものを用いることで、安定してＰＣＲによる増幅が行える。
【００４０】
これまで細胞質雄性不稔回復遺伝子そのものをＤＮＡマーカーに用いることができず、染色体上で細胞質雄性不稔回復遺伝子に遺伝的距離の短いＤＮＡ配列をＤＮＡマーカーとして代用されてきたために分析に支障をきたす場合があったが、本発明に係るＤＮＡマーカーは、いかなる分析集団を用いた場合でも、育種上有効に利用することができる。
【００４１】
本発明に係るＤＮＡマーカーとしては、例えば配列番号２の塩基配列を有するイネのＲｆ−１のＤＮＡから任意に選ばれるＤＮＡ断片が挙げられる。
Ｒｆ−１を持つイネと持たないイネは、ＤＮＡマーカーの塩基配列の相違の特徴により、識別することができる。Ｒｆ−１を持たないイネでＤＮＡマーカーの塩基配列が完全に欠損している場合は、ＤＮＡマーカーの塩基配列から任意に設定された１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによってＤＮＡ断片は増幅されない。また、Ｒｆ−１を持たないイネでＤＮＡマーカーに１塩基の置換があれば、ＰＣＲによってこれらを識別することができる。すなわち、異なる塩基をＰＣＲプライマーの３’末端に位置させて、鋳型ＤＮＡとＰＣＲプライマーの３’末端の塩基が対合できない場合は、ＰＣＲによってＤＮＡ断片が増幅されない。また、Ｒｆ−１を持たないイネでＤＮＡマーカーに塩基の挿入または欠失変異があれば、ＰＣＲによってこれらを識別することができる。すなわち、ＤＮＡマーカーの挿入または欠失変異点を挟む塩基配列から任意に設定された１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによって、増幅ＤＮＡ断片長の多型を検出できる。
【００４２】
ＤＮＡマーカーを用いたＲｆ−１の有無の判別には、まず、イネからＰＣＲの鋳型となるＤＮＡを抽出するが、ＤＮＡ（試料ＤＮＡ）を抽出するための組織としては根、葉、種子など植物体のあらゆる部分を利用でき、また精米も用いることができる。試料ＤＮＡの抽出方法としては、どの様な方法も用いることができ、粗精製のＤＮＡを用いることもできる。次に、抽出されたＤＮＡを鋳型としてＤＮＡマーカーであるＤＮＡ断片を上記のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅する。ＤＮＡ断片の増幅の有無を電気泳動法等で解析し、Ｒｆ−１に特異的なＤＮＡ断片が増幅された場合にはＲｆ−１を有すると判定する。
【００４３】
このような細胞質雄性不稔回復遺伝子を検出するためのＤＮＡマーカー用プライマーは、本発明の対象である。
【００４４】
【実施例】
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、特に記載のない限り、各操作に使用する市販の試薬、機器装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）」）に基本的に従った。また、イネの土壌を用いた育成、交配操作、ゲノムＤＮＡの調製、遺伝学的解析などは、特に記載のない限り、実験書（例えば「モデル植物の実験プロトコール」島本功、岡田清孝  監修    秀潤社  細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ４、１９９６年４月発行）に基本的に従った。
【００４５】
実施例１  Ｒｆ−１位置特定用のＤＮＡマーカーの作成
Ｒｆ−１遺伝子とＢＴ型雄性不稔細胞質を持つインディカ種のイネ品種「Ｃｈｉｎｓｕｒａｈ  ＢｏｒｏＩＩ」に、Ｒｆ−１遺伝子を持たないジャポニカ種のイネ品種「台中６５号」を交配し、数次にわたる戻し交配で育成した準同質遺伝子系統「ＭＴＣ−１０Ｒ」および「ＭＴＣ−１０Ａ」を材料に用いた。すなわち、「ＭＴＣ−１０Ｒ」は細胞質が「Ｃｈｉｎｓｕｒａｈ  ＢｏｒｏＩＩ」由来で核がＲｆ−１領域を除いて「台中６５号」由来となっているイネの稔性回復系統である。また、「ＭＴＣ−１０Ａ」は細胞質が「Ｃｈｉｎｓｕｒａｈ  ＢｏｒｏＩＩ」由来で核がＲｆ−１領域も「台中６５号」由来に置換したイネの細胞質雄性不稔系統である。
【００４６】
「ＭＴＣ−１０Ａ」と「ＭＴＣ−１０Ｒ」を交配したＦ１イネ植物の花粉を「ＭＴＣ−１０Ａ」に授粉して得たＢＣ１Ｆ１とその自殖後代植物を対象にして、各個体より常法に従いＤＮＡを抽出し、各種ＤＮＡマーカーと稔性回復形質との遺伝的連鎖度を解析することで、Ｒｆ−１の位置を染色体上にマップした。
本発明者らは、既に開発していたＲｆ−１近傍のマイクロサテライトマーカーｆＬ６０１とＯＳＲＲｆ（特開平０９−３１３１８７号公報）が第１０染色体にあり、両マーカーの間にＲｆ−１が位置することを明らかにした。ｆＬ６０１のＰＣＲプライマーには、合成オリゴヌクレオチド「ＴＴＧＡＣＧＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＴＡＣ」（配列番号：３）と「ＡＧＡＣＧＴＡＡＣＡＡＧＡＴＧＡＴＣＧＡ」（配列番号：４）の組み合わせ、ＯＳＲＲｆのＰＣＲプライマーには、合成オリゴヌクレオチド「ＡＣＧＡＧＡＴＡＣＣＧＴＡＣＧＣＣＴＴＴＧ」（配列番号：５）と「ＡＡＣＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＴＡＣＴＴＡ」（配列番号：６）の組み合わせを用いた。
【００４７】
そこで、ｆＬ６０１とＯＳＲＲｆを含むＢＡＣクローン２種（ＯＳＪＮＢａ００１７Ｅ０８およびＯＳＪＮＢａ００７８Ｏ０１）を塩基配列の検索により見出した。これらＢＡＣクローンのゲノム配列はインターネット上で公開されており（ＯＳＪＮＢａ００１７Ｅ０８（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＣ０６８９２３）およびＯＳＪＮＢａ００７８Ｏ０１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＣ０７９８８８））、塩基配列情報を基に、ＰＣＲプライマーを設計し、この領域での「ＭＴＣ−１０Ａ」と「ＭＴＣ−１０Ｒ」のＤＮＡ構造の違いを多型として検出するＤＮＡマーカー１４種を新たに作出してＲｆ−１の座乗領域の絞込みに用いた。ＤＮＡマーカー１４種の配置は、図１に示した。
【００４８】
実施例２  Ｒｆ−１近傍での染色体組換え個体の選抜
まず、稔性を有するＢＣ１Ｆ１の３００個体の中から、ＯＳＲＲｆまたはｆＬ６０１とＲｆ−１の間で染色体の組換えを起こした７個体を選抜した。具体的には、ｆＬ６０１では、「ＭＴＣ−１０Ｒ」由来のＤＮＡ断片５９０ｂｐが増幅されなかった個体を選抜し、一方、ＯＳＲＲｆでは、増幅ＤＮＡ断片を２％ＭｅｔａＰｈｏｒアガロース（ＦＭＣ社）で分画し、「ＭＴＣ−１０Ｒ」由来の３４５ｂｐのＤＮＡ断片を持たず「ＭＴＣ−１０Ａ」由来の３２９ｂｐのＤＮＡ断片のみを有する個体を選抜した。それら選抜個体の自殖によりＢＣ１Ｆ２種子を得た。
【００４９】
ＢＣ１Ｆ２世代を育成し、３種のＤＮＡマーカーＣ１３６１Ａ、Ｃ１３６１Ｒ、６８９２３−２がヘテロ遺伝子型を示す２２個体を選抜した。マーカーＣ１３６１ＡのＰＣＲプライマーには、合成オリゴヌクレオチド「ＴＧＧＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＣ」（配列番号：７）と「ＣＡＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＧＣＴＡＡＴＣ」（配列番号：８）の組み合わせ、マーカーＣ１３６１ＲのＰＣＲプライマーには、合成オリゴヌクレオチド「ＧＴＣＡＣＴＴＣＡＧＴＧＴＣＧＴＴＣ」（配列番号：９）と「ＧＧＡＧＧＣＴＡＡＧＧＴＣＡＣＧＣＴＧＴＴＣ」（配列番号：１０）の組み合わせ、マーカー６８９２３−２のＰＣＲプライマーには、合成オリゴヌクレオチド「ＴＣＧＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＧＧＡＴＡＣＧＧ」（配列番号：１１）と「ＡＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧ」（配列番号：１２）の組み合わせを用いた。Ｃ１３６１ＲとＣ１３６１Ａの増幅ＤＮＡ断片を１％アガロースで同時に分画し、１６０ｂｐのＤＮＡ断片と３０６ｂｐのＤＮＡ断片が検出された個体をヘテロ型と判定した。一方、６８９２３−２は共優性のマイクロサテライトマーカーで、増幅ＤＮＡ断片は２．５％ＭｅｔａＰｈｏｒアガロース（ＦＭＣ社）で分画し、２本のＤＮＡ断片を持つ個体をヘテロ型と判定した。
【００５０】
実施例３  Ｒｆ−１位置の特定
実施例２で選抜したＢＣ１Ｆ２世代２２個体の自殖によりＢＣ１Ｆ３世代の種子を形成させた。ＢＣ１Ｆ３世代の６１０４個体で染色体の組換え点を分析した結果、ＤＮＡマーカー６８９２３−６と６８９２３−９の間にＲｆ−１の位置を絞り込むことができた。これらＤＮＡマーカーはゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅して得ることができる。すなわち、マーカー６８９２３−６のＰＣＲプライマーには、合成オリゴヌクレオチド「ＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＴＣ」（配列番号：１３）と「ＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＴＡＧＧＧＧＴＧＡＡ」（配列番号：１４）の組み合わせ、マーカー６８９２３−９のＰＣＲプライマーには、合成オリゴヌクレオチド「ＴＧＴＡＧＴＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＧＡＡ」（配列番号：１５）と「ＡＣＴＧＴＴＴＧＡＣＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧ」（配列番号：１６）の組み合わせを用いた。６８９２３−６の増幅ＤＮＡ断片は、制限酵素ＭｂｏＩで処理した後、１％アガロースで分画して判定した結果、７個体が「ＭＴＣ−１０Ａ」のみに由来するＤＮＡマーカーを持つｒｒ型であった。６８９２３−９の増幅ＤＮＡ断片は、制限酵素ＭｓｐＩで処理した後、１％アガロースで分画して判定した結果、１個体のみがｒｒ型であった。ｒｒ型の領域にはＲｆ−１は存在しないので、Ｒｆ−１は、ＤＮＡマーカー、６８９２３−６と６８９２３−９の間に座乗すると考えられる。
【００５１】
実施例４  Ｒｆ−１の構造解析
イネのゲノム塩基配列が決定された品種「日本晴」は、Ｒｆ−１を持っていない。また上述のＢＡＣクローンは品種「日本晴」由来である。そこで、実施例３で絞り込んだ領域に関して、Ｒｆ−１を有する「ＭＴＣ−１０Ｒ」のゲノム塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、「ＭＴＣ−１０Ｒ」のゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得た対象領域を含むクローン、あるいは、対象領域に特異的なＰＣＲプライマーを作成して「ＭＴＣ−１０Ｒ」のゲノムＤＮＡから直接増幅したＤＮＡ断片を用いた。
【００５２】
解析の結果、この領域内には、高度に保存された塩基配列が直列反復するように配置されていることを見出した。これら保存領域の構造を詳細に解析した結果、イントロンを含まない、２種のＯＲＦを見出した。これらのＯＲＦをＲｆ−１候補遺伝子とし、Ｒｆ−１ＡおよびＲｆ−１Ｂとした。
【００５３】
これらの候補遺伝子にコードされるアミノ酸配列の構造解析を行った結果、何れも１０個のＰＰＲモチーフ（Ｓｍａｌｌ  ＆  Ｐｅｅｔｅｒｓ（２０００），  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ｖｏｌ．２５；ｐ４６−）を含むＰＰＲタンパク質であることを見出した。さらに、これら候補遺伝子の構造を比較解析した結果、Ｒｆ−１Ａでは、コードするタンパク質のＮ末部分にミトコンドリアへの移行シグナルが存在することを見出した。このシグナルをコードする部分もＲｆ−１ＡとＲｆ−１Ｂの塩基配列は高度に保存されていたが、Ｒｆ−１Ｂでは、配列表の配列番号：１７に示す９１番から９６番の塩基Ｇの繰り返し数が６となっており、Ｒｆ−１Ａに対して１塩基の挿入変異が生じていた。この変異のために、Ｒｆ−１Ｂの産物は、移行シグナルが欠失しているか、あるいは、僅か６２残基のペプチドとなり、細胞質雄性不稔の原因遺伝子を含むミトコンドリアで正常に機能し得るタンパク質をＲｆ−１Ｂはコードできないと考えられた。
【００５４】
更に、Ｒｆ−１を持たない「ＭＴＣ−１０Ａ」の塩基配列を解析した結果では、Ｒｆ−１Ａ内部には１塩基の欠失と５７４塩基の欠失が生じており、Ｒｆ−１Ｂ内部にも、２１塩基の欠失と２６塩基の欠失、さらに、９７０塩基の挿入が生じていることが明らかとなった。これらの構造変異により、「ＭＴＣ−１０Ａ」では、Ｒｆ−１ＡとＲｆ−１Ｂの何れも遺伝子としての機能が失われていることが判明した。
【００５５】
これらの結果より、Ｒｆ−１ＡがＲｆ−１であると結論付けた。
Ｒｆ−１は、コードするアミノ酸配列がＰＰＲモチーフを含む点において、ペチュニアで単離された細胞質雄性不稔回復遺伝子と共通性があり、両者アミノ酸配列は２１％が一致する構造を有する。
【００５６】
ＰＰＲタンパク質の遺伝子は、植物ゲノム中に多数存在し、植物ゲノムで最大の遺伝子ファミリーの一つである（Ｓｍａｌｌ  ＆  Ｐｅｅｔｅｒｓ（２０００），  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ｖｏｌ．２５；ｐ４６−）。ＰＰＲタンパク質に共通してＮ末部分は、オルガネラへの移行シグナルを含み、オルガネラにおけるＲＮＡ分子の修飾に関与していると推測されている。このような特徴を有するＰＰＲタンパク質が細胞質雄性不稔の稔性回復に関与している可能性が示唆されるが、極めて多数存在するＰＰＲタンパク質を個別に調査していくには膨大な労力を要し容易でない。また、イネでは様々な型の雄性不稔が知られており、遺伝学的解析の結果から、それぞれに異なる稔性回復遺伝子が作用すると考えられている。個々の型の雄性不稔を回復する細胞質雄性不稔回復遺伝子については、個別に単離・同定を行ない、解明を待つ必要がある。
【００５７】
実施例５  Ｒｆ−１の発現解析
実施例４でＲｆ−１候補遺伝子とし、Ｒｆ−１ＡおよびＲｆ−１Ｂを特定した。これらの遺伝子の転写産物を解析することで、遺伝子の構造を確定した。まず、「ＭＴＣ−１０Ｒ」の葉および穂孕み期の頴花から全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出した。このＲＮＡをＤＮａｓｅＩで処理し、混入したＤＮＡを完全除去した。この全ＲＮＡを鋳型に用いて、オリゴｄ（Ｔ）をプライマーとした１ｓｔストランドｃＤＮＡを合成した。１ｓｔストランドのｃＤＮＡの合成にはＴＡＫＡＲＡ社のＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＮＡ  ＰＣＲキットを用いた。この１ｓｔストランドｃＤＮＡを鋳型として、Ｒｆ−１ＡおよびＲｆ−１Ｂのそれぞれに特異的な様々な塩基配列を組み合わせてプライマーとして、ＰＣＲを行った。また、１ｓｔストランドｃＤＮＡの合成に用いたオリゴｄ（Ｔ）アダプタープライマーに相補的なプライマーを利用し、各遺伝子特異的なプライマーを組み合わせて増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、各遺伝子の３’末端の構造を確定した。
【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲの結果、何れの遺伝子においても転写産物が検出され、これらの遺伝子が転写されていることが明らかとなった。さらに、３’末端の決定により、ゲノムの塩基配列から推定した、これらの遺伝子構造が正しいことが確認された。また、ＲＮＡは葉と頴花の何れの組織でも確認された。
【００５９】
実施例６  Ｒｆ−１のＤＮＡマーカー
Ｒｆ−１Ａの塩基配列を基にＰＣＲプライマーを設計し、Ｒｆ−１ＤＮＡマーカーとしての適正を評価した。
【００６０】
「ＭＴＣ−１０Ｒ」のゲノムＤＮＡの塩基配列を基に作成された合成オリゴヌクレオチドプライマー「ＴＣＣＣＴＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＡＣＴＧ」（配列番号：１８）と「ＧＧＴＧＴＣＧＴＡＴＡＣＣＡＣＴＧＴＣＡ」（配列番号：１９）を用いてＰＣＲを行なった。イネ品種４種（「ＭＴＣ−１０Ｒ」、「ＭＴＣ−１０Ａ」、「Ｃｈｉｎｓｕｒａｈ  ＢｏｒｏＩＩ」、「日本晴」）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用いた場合、Ｒｆ−１を有する品種「ＭＴＣ−１０Ｒ」と「Ｃｈｉｎｓｕｒａｈ  ＢｏｒｏＩＩ」では、１８５４ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されたが、Ｒｆ−１を持たない品種「ＭＴＣ−１０Ａ」と「日本晴」では、１２８０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が検出された。増幅ＤＮＡ断片長の差異によって、Ｒｆ−１有無が特異的に検出でき、これらをＲｆ−１ＤＮＡマーカーとして有効に利用できることが示された。
【００６１】
【発明の効果】
本発明は、細胞質雄性不稔回復遺伝子Ｒｆ−１のＤＮＡを提供する。
該ＤＮＡを変異誘発処理によって植物細胞内で改変する、もしくは該ＤＮＡを加工して植物に導入し発現させることにより、当該植物の稔性を変更することが可能となる。また、細胞質雄性不稔回復遺伝子そのものをＤＮＡマーカーに用いれば、育種過程における選抜効率を向上させることができる。
これらを利用すれば、細胞質雄性不稔系統やその維持系統あるいは稔性回復系統の育成における遺伝資源の飛躍的拡大、新規な稔性制御に基づく採種システムの提供が行なわれ、大規模な交配によるハイブリッド種子の商業生産に貢献する産業上重要な価値を生ずる。
【００６２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｒｆ−１の遺伝子領域の絞込みを示す模式図である。ＤＮＡマーカーの配置を上部に示した。選抜したＢＣ１Ｆ３個体における各ＤＮＡマーカーの遺伝子型を下段棒線に示した。下段の棒線の白抜き部分は「ＭＴＣ−１０Ａ」に由来する染色体のみからなる領域、黒塗り部分は「ＭＴＣ−１０Ｒ」に由来する染色体を含む領域である。最下段には、遺伝子の構造と向きを模式的に示した。
【符号の説明】
ＯＳＪＮＢａ００１７Ｅ０８：ＢＡＣクローンを表す。
ＯＳＪＮＢａ００７８Ｏ０１：ＢＡＣクローンを表す。
ＯＳＲＲｆ：ＤＮＡマーカーの位置を表す。
Ｃ１３６１：ＤＮＡマーカーの位置を表す。
６８９２３−２：ＤＮＡマーカーの位置を表す。
６８９２３−６：ＤＮＡマーカーの位置を表す。
６８９２３−９：ＤＮＡマーカーの位置を表す。
ｆＬ６０１：ＤＮＡマーカーの位置を表す。
Ｒｆ−１Ａ：Ｒｆ−１の位置を表す。
Ｒｆ−１Ｂ：Ｒｆ−１の類似塩基配列の位置を表す。
ＭＴＣ−１０Ａ：細胞質雄性不稔系統「ＭＴＣ−１０Ａ」の染色体を表す。
ＭＴＣ−１０Ｒ：稔性回復系統「ＭＴＣ−１０Ｒ」の染色体を表す。
【図１】
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