(57)【要約】【課題】ＮＡＤＨの供給能力が向上した微生物を用いた有用物質の製造法を提供する。【解決手段】本発明によれば、デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物であり、かつＮＡＤＨを補酵素とする酵素を生産する微生物を、該酵素の基質となる物質の存在下で培養し、培養物中に該物質が該酵素により還元されて生成する物質（以下、生成物質という）を蓄積させ、該培養物から該生成物質を採取することを特徴とする物質の製造法、および該微生物の培養物、または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、糖、および該酵素の基質となる物質を水性媒体中に存在させ、該水性媒体中に該物質が該酵素により還元されて生成する物質（以下、生成物質という）を蓄積させ、該水性媒体中から該生成物質を採取することを特徴とする物質の製造法が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＨを補酵素とする酵素を生産する能力を有する微生物であり、かつデオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物を、該酵素の基質となる物質の存在下で培養し、培養物中に該物質が該酵素により変換されて生成する物質（以下、生成物質という）を蓄積させ、該培養物から該生成物質を採取することを特徴とする物質の製造法。
【請求項２】
ＮＡＤＨを補酵素とする酵素を生産する能力を有する微生物であり、かつデオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物の培養物、または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、糖、および該酵素の基質となる物質を水性媒体中に存在させ、該水性媒体中に該物質が該酵素により変換されて生成する物質（以下、生成物質という）を蓄積させ、該水性媒体中から該生成物質を採取することを特徴とする物質の製造法。
【請求項３】
デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物が、デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼをコードするＤＮＡの一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有する微生物である、請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物が、デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する微生物である、請求項１または２記載の製造法。
【請求項５】
微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物である、請求項１〜４記載の製造法。
【請求項６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、請求項５記載の製造法。
【請求項７】
ＮＡＤＨを補酵素とする酵素が、ＮＡＤＨ依存性デヒロゲナーゼ、ＮＡＤＨ依存性レダクターゼおよびＮＡＤＨ依存性オキシゲナーゼからなる群より選ばれる酵素である、請求項１〜６記載の製造法。
【請求項８】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品である、請求項２〜７記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＮＡＤＨの供給能力が向上した微生物を用いる物質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＡＤＨを利用する酵素反応によって有用物質を生産する方法が数多く報告されている（非特許文献１〜３）。該生産方法におけるＮＡＤＨの供給方法としては、グルコースデヒドロゲナーゼを利用する方法が知られている（非特許文献４）。該方法では１分子のグルコースを酸化して１分子のグルコン酸が生じる際に、１分子のＮＡＤＨを供給することができる。
【０００３】
一方、微生物菌体内では、解糖系やＴＣＡサイクルを利用して、１分子のグルコースから多数のＮＡＤＨを生産し、該ＮＡＤＨを利用してさまざまな生体反応が行われている。よって、１分子のグルコースからより多くのＮＡＤＨを供給できる微生物を酵素源として使用することにより、ＮＡＤＨを必要とする酵素反応を利用した有用物質のより効率的で経済的な製造法を構築することが可能である。
【０００４】
しかしながら、特定の遺伝子の変異に起因してＮＡＤＨ供給能力が向上した微生物、およびＮＡＤＨ供給能力に関与する遺伝子は知られていない。
多くの微生物では、その染色体ＤＮＡの全塩基配列が明らかになっている（非特許文献５）。また、相同組換え手法を用いた、特定の遺伝子あるいは染色体ＤＮＡ領域が意図した通りに欠損した微生物の作製方法が知られている（非特許文献６）。上記した染色体ＤＮＡの全塩基配列情報、および相同組換え手法を利用して微生物の染色体ＤＮＡ上の各一遺伝子を網羅的に破壊したライブラリー、あるいは２０ｋｂｐ程度の削除可能染色体ＤＮＡ領域のそれぞれを網羅的に欠損させた変異株ライブラリーなどが作製されている（非特許文献７および８）。
【０００５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉのデオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼ遺伝子の塩基配列、および該遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列は既に知られている（非特許文献９）。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおいて、デオキシウリジン  三リン酸シンセターゼの致死的変異は、デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼを完全に不活性化することで、抑制されることが知られている（非特許文献１０）が、デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼ活性とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＮＡＤＨ供給能力との関係は知られていない。
【０００６】
【非特許文献１】
Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（アプライド  オブ  エンバイロメンタル  マイクロバイオロジー），  ６９，  ９３３（２００３）
【０００７】
【非特許文献２】
Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔａｌ．  Ｂ：  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ（ジャーナル  オブ  モレキュラー  カタリシス  Ｂ：エンザイマティック），  ６，  ４１（１９９９）
【０００８】
【非特許文献３】
Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔａｌ．  Ｂ：  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ（ジャーナル  オブ  モレキュラー  カタリシス  Ｂ：エンザイマティック），  １１，  ５１３（２００１）
【０００９】
【非特許文献４】
化学と生物、第３８巻、３１３ページ、２０００年
【００１０】
【非特許文献５】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｍｄｂ／ｍｄｂｃｏｍｐｌｅｔｅ．ｈｔｍｌ
【００１１】
【非特許文献６】
Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（ジャーナル  オブ  バクテリオロジー），  １８０，  ２０６３（１９９８）
【００１２】
【非特許文献７】
蛋白質  核酸  酵素、第４６巻、２３８６ページ、２００１年
【００１３】
【非特許文献８】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（ネイチャー  バイオテクノロジー），  ２０，  １０１８（２００２）
【００１４】
【非特許文献９】
Ｓｃｉｅｎｃｅ（サイエンス），  ２７７，  １４５３（１９９７）
【００１５】
【非特許文献１０】
Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  （ジャーナル  オブ  バクテリオロジー），  １７４，  ５６４７（１９９２）
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＮＡＤＨ供給能力が向上した微生物、および該微生物を用いた有用物質の製造法を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の（１）〜（８）に関する。
（１）  ＮＡＤＨを補酵素とする酵素を生産する能力を有する微生物であり、かつデオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物を、該酵素の基質となる物質の存在下で培養し、培養物中に該物質が該酵素により変換されて生成する物質（以下、生成物質という）を蓄積させ、該培養物から該生成物質を採取することを特徴とする物質の製造法。
【００１８】
（２）  ＮＡＤＨを補酵素とする酵素を生産する能力を有する微生物であり、かつデオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物の培養物、または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、糖、および該酵素の基質となる物質を水性媒体中に存在させ、該水性媒体中に該物質が該酵素により変換されて生成する物質（以下、生成物質という）を蓄積させ、該水性媒体中から該生成物質を採取することを特徴とする物質の製造法。
【００１９】
（３）  デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物が、デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼをコードするＤＮＡの一部または全部が欠損した染色体ＤＮＡを有する微生物である上記（１）または（２）の製造法。
（４）  デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物が、デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する微生物である上記（１）または（２）の製造法。
【００２０】
（５）  微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物である、上記（１）〜（４）の製造法。
（６）  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、上記（５）の製造法。
【００２１】
（７）  ＮＡＤＨを補酵素とする酵素が、ＮＡＤＨ依存性デヒロゲナーゼ、ＮＡＤＨ依存性レダクターゼおよびＮＡＤＨ依存性オキシゲナーゼからなる群より選ばれる酵素である、上記（１）〜（６）の製造法。
（８）  培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品である、上記（２）〜（７）の製造法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の製造法に用いられる微生物は、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素を生産する能力を有する微生物であり、かつデオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物であればいずれの微生物であってもよいが、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物などをあげることができる。
【００２３】
上記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物としてはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなど、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物としてはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物としてはＢａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓなど、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物としてはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物としてはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒなどをあげることができる。
【００２４】
上記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとしては、配列番号１で表されるＤＮＡが欠損した染色体ＤＮＡを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉをあげることができる。
デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下している微生物は、デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼ遺伝子に変異が生じているために、その活性が完全に失われている微生物、または野生型株より低下している微生物であれば、いずれの微生物でもよく、該変異としては、例えばデオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼをコードするＤＮＡの一部または全部が欠損している変異、およびデオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異などをあげることができる。
【００２５】
本発明において野生型株とは、自然集団中でその微生物が属する種において、最も高頻度にみられる型の微生物のことをいう。
デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼをコードするＤＮＡの一部が欠損しているとは、該ＤＮＡの塩基配列において、任意の１以上の塩基が欠損しているＤＮＡであり、かつ該ＤＮＡにコードされるデオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼが完全にその活性を消失しているか、または該欠損を有しないＤＮＡにコードされる野生型デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼより活性が低い変異型デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼをコードするＤＮＡをあげることがでる。該ＤＮＡとしては、例えば配列番号１で表される塩基配列において、任意の１以上の塩基、好ましくは任意の１〜５７８塩基、より好ましくは任意の５０〜５００塩基、さらに好ましくは任意の１００〜４００塩基、特に好ましくは任意の２００〜３００塩基が欠損しているＤＮＡをあげることができ、該欠損によりフレームシフト変異が生じる欠損ＤＮＡが好ましい。
【００２６】
デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異とは、デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼをコードするＤＮＡに対し、部位特異的変異導入法により導入可能な数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異であり、かつ変異を有するデオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼが完全にその活性を消失しているか、または該変異を有しない野生型デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼより活性が低い変異型デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼを与える変異をいい、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異をあげることができる。
【００２７】
部位特異的変異の導入は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １０，  ６４８７  （１９８２）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７９，  ６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，  ３４，  ３１５  （１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １３，  ４４３１  （１９８５）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２，  ４８８  （１９８５）等に記載の方法に準じて行うことができる。
上記したデオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼ遺伝子に変異を有する微生物のデオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼ活性が、野生型株より低下しているか否かは、該微生物と親株とのデオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼ活性を比較することにより確認できる。上記親株とは、上記変異処理に供した元株のことをいい、親株は野生型の微生物であっても、産業上有用な改良を施された変異株、細胞融合株、形質導入株あるいは遺伝子組換え技術を用いて造成した組換え株であってもよい。
【００２８】
微生物のデオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼの活性の測定法としては、微生物から調製した粗酵素抽出液または酵素の精製標品などを酵素源に用い、デオキシシチジン  三リン酸を基質にして反応を行ったときの▲１▼反応液の２８５ｎｍまたは２９０ｎｍの吸光度の減少を測定する方法［Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｇｕｌ．，  ５，  １７７（１９７２）］、▲２▼生成したアンモニアを測定する方法［Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５３，  ３５３６（１９７８）］などをあげることができる。
【００２９】
ＮＡＤＨを補酵素とする酵素を生産する微生物は、該酵素を生産する微生物であれば特に限定されないが、該酵素の活性が強化された微生物が好ましい。酵素活性が強化された微生物としては、ニトロソグアニジンなどの変異処理剤を用いた変異手法によって得られる該酵素活性が強い変異株、強力なプロモーターの支配下に該酵素をコードする遺伝子をおいたＤＮＡを有する遺伝子組換え微生物、該遺伝子を連結したプラスミドを有する組換え微生物などをあげることができる。
【００３０】
ＮＡＤＨを補酵素とする酵素は、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素であれば特に限定されないが、例えばＮＡＤＨ依存性デヒロゲナーゼ、ＮＡＤＨ依存性レダクターゼ、およびＮＡＤＨ依存性オキシゲナーゼなどをあげることができる。
上記ＮＡＤＨ依存性デヒロゲナーゼとしては、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ［Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５８，  ２６７４（１９８３）］、エリスロース  ４リン酸デヒドロゲナーゼ［Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １４６，  ４８７（２０００）］、および乳酸デヒドロゲナーゼ［Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １４４，  ３６７（１９８４）］などをあげることができる。
【００３１】
ＮＡＤＨ依存性デヒロゲナーゼとしてアルコールデヒドロゲナーゼを用いる場合、該酵素の基質になる物質であれば、いずれの物質を基質として用いてもよいが、基質としては例えばアセトアルデヒドおよび３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドなどをあげることができ、エリスロース  ４リン酸デヒドロゲナーゼを用いる場合、基質としてはエリスロース  ４リン酸をあげることができ、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼまたはＬ−乳酸デヒドロゲナーゼを用いる場合、基質としてピルビン酸をあげることができる。
【００３２】
上記ＮＡＤＨ依存性レダクターゼとしては、例えばキシルロースレダクターゼ［Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  １７８８３（２００２）］などをあげることができる。ＮＡＤＨ依存性レダクターゼとして、キシルロースレダクターゼを用いる場合、基質としてはキシルロースをあげることができる。
上記ＮＡＤＨ依存性オキシゲナーゼとしては、ＮＡＤＨ依存性Ｐ−４５０などをあげることができる。
【００３３】
ＮＡＤＨ依存性Ｐ−４５０としては、ｆｋｂＤ遺伝子産物［Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７８，  ５２４３（１９９６）］、ｅｒｙＦ遺伝子産物［Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２３０，  １２０（１９９１）］、Ｐ−４５０ＶＤ２５［Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １２１９，  １７９（１９９４）］およびＰ−４５０ｓｃａ−２［Ｇｅｎｅ，  １６３，  ８１（１９９５）］などをあげることができる。Ｐ−４５０としてｆｋｂＤ遺伝子産物を用いる場合、基質としては９−ｄｅｏｘｏ−３１−Ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌ−ＦＫ５０６、ｅｒｙＦ遺伝子産物を用いる場合、基質としては６−ｄｅｏｘｏｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ  Ｂ、Ｐ−４５０ＶＤ２５遺伝子産物を用いる場合、基質としてはビタミン  Ｄ３、Ｐ４５０ｓｃａ−２を用いる場合、基質としてはメバスタチン（シグマ  アルドリッチ社製）などをあげることができる。
【００３４】
デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物の製造法としては、▲１▼微生物の染色体ＤＮＡ上の各一遺伝子を網羅的に破壊した遺伝子欠損株ライブラリー、あるいは２０ｋｂｐ程度の削除可能染色体ＤＮＡ領域のそれぞれを網羅的に欠損させた欠損変異株ライブラリーを用いて、該ライブラリーから親株よりＮＡＤＨの供給能力が向上した株を選択する方法、▲２▼相同組換え法などを用いて、デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼ遺伝子の全部または一部が欠損した微生物を製造する方法、▲３▼相同組換え法などを用いて、デオキシシチジン  三リン酸デアミナーゼ遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する微生物を製造する方法などをあげることができる。
【００３５】
▲１▼の方法でいう親株とは、上記遺伝子破壊または染色体ＤＮＡ領域欠損処理に供した元株のことをいい、親株は野生型の微生物であっても、産業上有用な改良を施された変異株、細胞融合株、形質導入株あるいは遺伝子組換え技術を用いて造成した組換え株であってもよい。
【００３６】
上記▲１▼の遺伝子または領域欠損株ライブラリーの作製法としては、欠損させたい遺伝子または領域の末端配列を含むＤＮＡをサブクローニングし、次に該ＤＮＡで薬剤耐性遺伝子を挟んだＤＮＡ断片を構築した後、該ＤＮＡ断片を二回相同組換えにより染色体ＤＮＡに導入することで遺伝子または領域欠損株ライブラリーを構築する方法［蛋白質  核酸  酵素、４６、２３８６（２００１）］をあげることができる。
【００３７】
上記の遺伝子あるいは領域欠損株ライブラリーをスクリーニングソースとして用いることにより、明確に限定された一遺伝子あるいは遺伝子群の破壊のみがＮＡＤＨ供給能力に及ぼす影響を観察することができる。
【００３８】
上記ライブラリーからＮＡＤＨの供給能力が向上した株を選択する方法としては、該ライブラリーの各菌株にＮＡＤＨ依存性の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子の発現プラスミドを導入して得られる形質転換株を培養し、得られた菌体を酵素源に用い、グルコースと該酵素の基質の存在下で反応を行い、該反応により生成した物質を定量する方法をあげることができる。反応産物の蓄積が多いほど、グルコースを代謝することによるＮＡＤＨの供給量が多いと考えられる。
【００３９】
ＮＡＤＨ依存性の反応を触媒する酵素は、該性質を有する酵素であれば特に限定されないが、例えばバニリン酸脱メチル酵素などをあげることができ、具体的なバニリン酸脱メチル酵素としてはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のｖａｎＡ遺伝子およびｖａｎＢ遺伝子［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １４４，  ９６５（１９９８）］にコードされる蛋白質からなる酵素をあげることができる。
【００４０】
ｖａｎＡ遺伝子およびｖａｎＢ遺伝子の発現プラスミドは、両遺伝子を発現させることができるプラスミドであれば特に限定されないが、微生物としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いる場合は、例えばｖａｎＡ遺伝子およびｖａｎＢ遺伝子をｐＭＷ１１８に連結した低コピー発現プラスミドｐＭＱｖａｎＡＢをあげることができる。
【００４１】
ライブラリーの各菌株にｐＭＱｖａｎＡＢを常法に従い導入して形質転換株を取得し、該形質転換株および形質転換に供した親株をそれぞれ培養して得られる菌体を酵素源として用い、グルコースおよび基質であるバニリン酸の存在下で反応を行い、ＮＡＤＨ依存的に進行するバニリン酸の脱メチル化反応により生成するプロトカテキ酸の生成量と、基質であるバニリン酸の減少量を測定することにより、親株よりＮＡＤＨの供給能力が向上した菌株を選択することができる。
【００４２】
ｐＭＱｖａｎＡＢを有する形質転換株の培養は、バニリン酸脱メチル酵素が発現する培養法であれば特に限定されないが、ｐＭＱｖａｎＡＢを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの場合は、例えば５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地［１０ｇ／ｌ  バクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ  バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ  水酸化ナトリウム溶液］を前培養の培地として用いて一晩培養後、得られた培養液を終濃度が０．５〜２％になるように、５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＭ９最少培地（１．２％  グルコース、０．６％  リン酸ナトリウム、０．３％  リン酸二水素カリウム、０．０５％  塩化ナトリウム、０．１％  塩化アンモニウム、２ｍｍｏｌ／ｌ  硫酸マグネシウム・七水和物、１００μｍｏｌ／ｌ  塩化カルシウム）に接種して培養し、６６０ｎｍの吸光度が０．３〜１．５のいずれかに到達した時点で終濃度が１〜５ｍｍｏｌ／ｌになるようにＩＰＴＧを添加してバニリン酸脱メチル酵素の発現を誘導し、さらに１〜３時間培養する方法をあげることができる。
【００４３】
上記で得られた菌体のＮＡＤＨの供給能力を測定する方法としては、上記で得られた培養液に、バニリン酸およびグルコースを添加してバニリン酸脱メチル化反応を行い、一定時間経過後のプロトカテキ酸の生成量と、基質であるバニリン酸の減少量を測定する方法をあげることができる。必要であれば内部標準物質としてベンゼン酸を反応液に添加してもよい。
【００４４】
反応に用いる培養液は、３７℃で１分間に１μｍｏｌのプロトカテキ酸を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、１ｍＵ／ｌ〜１０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜１００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
バニリン酸は、１０μｍｏｌ／ｌ〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは１００μｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌの濃度になるよう反応液に添加する。グルコースは、５μｍｏｌ／ｌ〜５００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは５０μｍｏｌ／ｌ〜５０ｍｍｏｌ／ｌの濃度になるように反応液に添加する。
【００４５】
反応液のバニリン酸脱メチル化活性は、ペルオキシターゼを用いる方法やＨＰＬＣを用いる方法でプロトカテキ酸を定量する方法により測定することができる。ペルオキシターゼを用いたプロトカテキ酸の定量は以下のように行うことができる。
１０〜５００μｌの反応液に対し、０．５〜５０μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ペルオキシターゼ溶液、および０．５〜５０μｌの０．３％  過酸化水素水溶液を添加して撹拌後、３０〜３７℃で５〜３０分間反応させ、プロトカテキ酸の重合反応を行う。重合反応後、反応液を５〜５０倍に希釈して、分光光度計を用いて４６０ｎｍの吸収を測定する。プロトカテキ酸の標準液も同様に重合反応を行い、標準液の吸光度と反応液の吸光度を比較することで、反応液中のプロトカテキ酸濃度を定量することができる。
【００４６】
また、ＨＰＬＣを用いてプロトカテキ酸濃度を定量することもでき、例えば反応液を遠心分離して培養液上清を調製し、該上清を分析サンプルとして、逆相カラムを用い、２５４ｎｍの吸光度を測定することで培養液のプロトカテキ酸の濃度を定量することができる。
同一時間反応したとき、親株より高いプロトカテキ酸生産性を示す株を選択することにより、親株よりＮＡＤＨの供給能力が向上した菌株を取得することができる。
【００４７】
次に、上記方法にて選択した菌株それぞれが持つ遺伝子欠損を、形質導入法にて、親株とは系統が異なる同種の株、または親株として変異株を用いた場合は該変異株と同じ系統の野生型株に形質転換する。遺伝子欠損を導入する株は野生型株が好ましいが、該欠損が導入可能な株であれば、変異株であってもよい。例えば、親株としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株の変異株を用いた場合、選択したＮＡＤＨ供給能力が向上した菌株が有する遺伝子欠損をＰ１ファージによる形質導入法によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株に導入する方法をあげることができる。
【００４８】
形質導入法としてはファージによる形質導入［Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２，  ２４５（１９６８）］、ナチュラルコンピテンシーを用いる方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，  ３３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．（１９９０）］などをあげることができる。微生物としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いる場合、Ｐ１ファージによる形質導入方法が好ましい。
【００４９】
上記のように、一度選択したＮＡＤＨ供給能力が向上した菌株それぞれが持つ遺伝子欠損を、形質導入法にて、親株とは系統が異なる同種の株、または親株として変異株を用いた場合は該変異株と同じ系統の野生型株に導入して得られる形質転換株を再度、バニリン酸脱メチル酵素などを用いたスクリーニングに供し、ＮＡＤＨの供給能力が野生型株よりも高い株を選択することにより、生育向上株が取得できたことを確認することができる。
【００５０】
上記のようにして取得されるＮＡＤＨの供給能力が向上した微生物としては、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７，  １４５３  （１９９７）に示されたｂ番号表記で、ｂ２０６４−ｂ２０８１間の欠損、ｂ２２９２−ｂ２３０４間の欠損、またはｂ２０６５で表されるデオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ遺伝子（以下、ｄｃｄ遺伝子と略す）の単独の欠損を染色体ＤＮＡ上に有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉをあげることができる。
【００５１】
上記▲２▼の方法としては、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組換えが可能な微生物を用いる方法をあげることができる。
直鎖ＤＮＡとしては、クロラムフェニコール耐性遺伝子の両端にｄｃｄ遺伝子の末端の配列と相同性を有するＤＮＡを配置した直鎖ＤＮＡをあげることができる。
【００５２】
該直鎖ＤＮＡを、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組換えが可能な微生物に、コンピテントセルを用いたエレクトロポレーションなどの方法により導入し、クロラムフェニコール耐性株を選択することで、ｄｃｄ遺伝子欠損微生物を取得することができる。
上記▲３▼の方法としては、ｄｃｄ遺伝子に、部位特異的変異を導入することにより、該遺伝子がコードするアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする変異型遺伝子を取得し、相同組換え法を用いることにより、ｄｃｄ遺伝子が変異型ｄｃｄ遺伝子に置換された染色体ＤＮＡを有する微生物を製造する方法などをあげることができる。
【００５３】
本発明の製造法に用いられる微生物は、上記方法で製造されるデオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物に、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え等の手法を用いて導入することにより製造することができるが、デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物が、すでに目的とするＮＡＤＨを補酵素とする酵素をコードする遺伝子を有している場合は必ずしも該遺伝子を導入する必要はない。
【００５４】
また、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素として、ＮＡＤＨ依存性Ｐ−４５０を用いる場合、必要に応じて、該Ｐ−４５０をコードする遺伝子とともに、ＮＡＤＨ−Ｐ４５０レダクターゼまたはフェレドキシン−ＮＡＤＨレダクターゼ（ＥＣ  １．１８．１．３）をコードする遺伝子を導入することができる。
ＮＡＤＨを補酵素とする酵素をコードする遺伝子を有する形質転換体の作製は、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により行うことができる。
【００５５】
即ち、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素をコードする遺伝子を基にして、必要に応じて蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合したデオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物に導入することにより形質転換体を作製することができる。
【００５６】
発現ベクターとしては、上記デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物において自立複製可能ないしは染色体ＤＮＡ中への組込が可能で、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素をコードする遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素をコードする遺伝子を含有してなる組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００５７】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００  ［Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ４８，  ６６９  （１９８４）］、ｐＬＳＡ１  ［Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５３，  ２７７  （１９８９）］、ｐＧＥＬ１  ［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２，  ４３０６  （１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０  ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２  ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１  （ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＧＨＡ２  ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＧＫＡ２  ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００  ［Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７２，  ２３９２  （１９９０）］、ｐＧＥＸ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ｐＩＪ７０２、ｐＩＪ９２２等をあげることができる。
【００５８】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００５９】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
ＮＡＤＨを補酵素とする酵素をコードする遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００６０】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、原核細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６９，  ２１１０  （１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、またはＧｅｎｅ，  １７，  １０７  （１９８２）やＭｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １６８，  １１１  （１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
【００６１】
本発明の製造法は、デオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物であり、かつＮＡＤＨを補酵素とする酵素を生産する微生物を、該酵素の基質となる物質の存在下で培養し、培養物中に該物質が該酵素により変換されて生成する物質（以下、生成物質という）を蓄積させ、該培養物から該生成物質を採取することを特徴とする物質の製造法に関する。
【００６２】
本発明の製造法に用いられる微生物の培養は、以下に記載した通常の方法に従って行うことができる。
本発明の製造法に用いられる微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６３】
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００６４】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
ＮＡＤＨを補酵素とする酵素の基質となる物質は、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素の基質となる物質であれば、特に限定されないが、例えばアルデヒド、糖、有機酸、ＮＡＤＨ依存性Ｐ−４５０の基質となる物質などをあげることができ、アルデヒドとしてはアセトアルデヒドおよび３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドなど、糖としてはキシルロースおよびエリスロース  ４リン酸など、有機酸としてはピルビン酸など、ＮＡＤＨ依存性Ｐ−４５０の基質となる物質としては、９−ｄｅｏｘｏ−３１−Ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌ−ＦＫ５０６、６−ｄｅｏｘｏｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ  Ｂ、ビタミン  Ｄ３、メバスタチンなどをあげることができる。
【００６５】
該基質は、反応開始時に一括して添加してもよいし、反応中分割して、あるいは連続的に添加することもでき、０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜２．０ｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常  １６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００６６】
生成物質が、菌体外に生成、蓄積した場合には、培養終了後、培養物から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、培養物から目的する生成物質を単離、精製することができる。
生成物質が、菌体内に生成、蓄積される場合には、培養終了後、培養物から菌体を回収した後、機械的または科学的方法等の適切な方法で破砕する。該菌体破砕液から、イオン交換処理法、濃縮法、塩析法などを併用することにより、該菌体破砕液から目的とする生成物質を単離、精製することができる。
【００６７】
生成物質は、本発明に用いられるＮＡＤＨを補酵素とする酵素により生成される物質であれば特に限定されないが、例えばＮＡＤＨを補酵素とする酵素としてアルコールデヒドロゲナーゼを用いた場合は、エタノールおよび１，３−プロパンジオールなどのアルコール、ＮＡＤＨ依存性キシルロースレダクターゼを用いた場合は、キシリトール、エリスロース  ４リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、エリスリトール  ４リン酸、ＮＡＤＨ依存性Ｐ−４５０を用いた場合は、９−ｈｙｄｒｏｘｙ−３１−Ｏ−ｄｅｍｅｔｙｌ−ＦＫ６０６、Ｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ  Ｂ、２５−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３、およびプラバスタチンなど、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼまたはＬ−乳酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、Ｄ−乳酸およびＬ−乳酸をあげることができる。
【００６８】
また、本発明の製造法としては、上記の培養により得られた微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、糖、およびＮＡＤＨを補酵素とする酵素の基質となる物質を水性媒体中に存在させ、該水性媒体中に該物質が該酵素により還元されて生成する物質（以下、生成物質という）を蓄積させ、該水性媒体中から生成物質を採取することを特徴とする物質の製造法することができる。
【００６９】
本発明の製造法に用いられる糖としてはグルコース、フラクトース等をあげることができる。該糖は、精製品を用いてもよいし、これらを含有するもので、夾雑物が反応を阻害しないものであればいずれも用いることができる。糖は反応開始時に一括して添加してもよいし、反応中分割して、あるいは連続的に添加することもでき、０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜２．０ｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。
【００７０】
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、または該菌体の固定化物などをあげることができる。
酵素源は、微生物の培養物または該培養物の処理物として、３７℃で１分間に１μｍｏｌの生成物質を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、０．１ｍＵ／ｌ〜１０，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
【００７１】
本発明の製造法に用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
【００７２】
また、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を水性媒体に添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、生成物質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０  ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０  ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
【００７３】
また、必要に応じて、塩化マグネシウム、塩化マンガン等を水性媒体に添加してもよく、ＮＡＤＨ依存性Ｐ−４５０を生産する微生物を酵素源として用いる場合は、フェレドキシンを水性媒体に添加してもよい。
生成物質の生成反応は水性媒体中、ｐＨ  ５〜１０、好ましくは  ｐＨ  ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。
【００７４】
反応液中に生成した生成物質は、上記した方法により精製することができる。
【００７５】
【実施例】
実施例１  染色体ＤＮＡの部分欠損株ライブラリーの作製
染色体ＤＮＡの部分欠損株ライブラリーは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５（ｒｐｓＬ，  ｐｏｌＡ１２）株を親株として作製した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５（ｒｐｓＬ，  ｐｏｌＡ１２）株は、公知の方法に従ってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ７００９２６）に温度感受性変異を付与することにより取得した。
【００７６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５（ｒｐｓＬ，  ｐｏｌＡ１２）株を親株として、蛋白質  核酸  酵素、４６、２３８６（２００１）記載の方法に従い、染色体上の一部分を欠損している変異株ライブラリーを作製した。
【００７７】
実施例２  ＮＡＤＨ依存性バニリン酸脱メチル化酵素発現プラスミドｐＭＱｖａｎＡＢの作成
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ  ＰｐＹ１０１株由来のＮＡＤＨ依存性バニリン酸脱メチル化酵素構造遺伝子であるｖａｎＡ遺伝子、およびｖａｎＢ遺伝子を含むプラスミドｐＶａｎＡＢ（東京農工大学・片山義博助教授より分与）から制限酵素ＳｍａＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いてｖａｎＡおよびＶａｎＢ両遺伝子を含む２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片の両末端をタカラバイオ社製のＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して平滑化した後、プラスミドｐＱＥ３２（キアゲン社製）のＳｍａＩ部位に再クローニングした。用いた遺伝子工学的手法はモレキュラー・クローニング第３版記載の方法に準拠し、使用した各制限酵素やプラスミドの供給メーカーの指示書に従って行った。得られたプラスミドｐＱｖａｎＡＢでは、Ｎ末端にヒスチジンタグが融合した形でＶａｎＡが、一方のＶａｎＢは本来のアミノ酸配列で生産される構造を有している。次にｐＱｖａｎＡＢを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、ヒスチジンタグが付いたｖａｎＡ遺伝子およびｖａｎＢ遺伝子を含む２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、低コピー数プラスミドｐＭＷ１１８（ニッポンジーン社製）上のＥｃｏＲＩとＸｂａＩ部位にクローニングすることで、図１に示すＮＡＤＨ供給力評価用プラスミドｐＭＱｖａｎＡＢを作製した。ｐＭＱｖａｎＡＢではラクトースプロモーター発現制御系が使われており、イソプロピル  １−チオ−β−Ｄ−ガラクピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地に添加することにより、プロモーター下流にあるヒスチジンタグが付いたｖａｎＡおよびｖａｎＢが発現する。該ｐＭＱｖａｎＡＢを実施例１で作製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株の染色体部分欠損ライブラリーを構成する各菌株に導入し、実施例３で用いた組換え株を構築した。
【００７８】
実施例３  バニリン酸脱メチル化反応を指標としたＮＡＤＨ供給力向上株の一次スクリーニング
実施例２にて作製した組換え株を５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地を用いて３０℃で一晩振とう培養した。５０μｌの該培養液を５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＭ９培地（１．２％  グルコース、０．６％  リン酸ナトリウム、０．３％  リン酸二水素カリウム、０．０５％  塩化ナトリウム、０．１％  塩化アンモニウム、２ｍｍｏｌ／ｌ  硫酸マグネシウム・七水和物、１００μｍｏｌ／ｌ  塩化カルシウム）に接種し、３０℃で振とう培養し、ＯＤ６６０ｎｍ＝０．８〜１．０の時点でＩＰＴＧを終濃度２ｍｍｏｌ／ｌになるように添加した。２時間後、培養液を十分に氷冷してから、基質であるバニリン酸と内部標準物質としてベンゼン酸をそれぞれ終濃度１ｍｍｏｌ／ｌになるように添加し、十分懸濁してから１ｍｌサンプリングした後、３０℃で振とうすることで、バニリン酸脱メチル化反応を行った。反応開始時のグルコース量は、１ｇ／ｌ程度であったので、反応に必要なグルコースとして、培地に残存しているグルコースを用いた。グルコースの定量には日立製自動分析装置７０７０を使用し、協和メデックス社製の試薬デタミナーＧＬＵＩＩを用いた。
【００７９】
反応液からは一定時間（１、３、１８時間目）ごとに１ｍｌずつサンプリングした。サンプリングした培養液のうち１００μ１を９６穴ウェルプレートに分注した。各ウェルに１ｍｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ溶液を５μｌ、０．３％の過酸化水素水を５μｌ添加して撹拌後、３７℃で１５分間反応させ、プロトカテキ酸の重合反応を行った。重合反応後、反応液を１０倍に希釈して、分光光度計を用いて４６０ｎｍの吸収を測定し、プロトカテキ酸濃度を算出した。
【００８０】
その結果、表１に示すように、野生型株であるＭＧ１６５５株にｐＭＱｖａｎＡＢを導入した株は、反応１８時間で０．３６ｍｍｏｌ／ｌのプロトカテキ酸を生成した。そこで反応１８時間でのプロトカテキ酸の生成がＭＧ１６５５（ｐＭＱｖａｎＡＢ）株よりも多くなる株として、以下の９つの欠損領域を持つ株を選択した。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
実施例４  Ｐ１ファージによる欠損領域の他系統株への導入とＮＡＤＨ供給能力評価
実施例３で取得した変異株が有するそれぞれの染色体上の欠損を、Ｐ１ファージを用いてＭＧ１６５５株に形質導入した。実施例３で取得した各欠損のマーカーがカナマイシン耐性遺伝子であるため、カナマイシン耐性を利用したＰ１ファージを用いた形質導入を行った。まず各欠損株よりＰ１ファージを調製した。
【００８３】
実施例３で取得した変異株を、２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３０℃で一夜培養した。０．５ｍｌの該培養液を、１．４ｍｌの新しいＬＢ液体培地および１００μｌの０．１ｍｏｌ／ｌ  塩化カルシウム溶液と混合した。３０℃で５から６時間振とう培養した後、４００μｌを滅菌したチューブに移し、２μｌのＰ１ファージストックを添加し、３７℃にて１０分間保温した。そこへ５０℃に保温したソフトアガー溶液（１０ｇ／ｌ  バクトトリプトン、５ｇ／ｌ  バクトイーストエキストラクト、５ｍｍｏｌ／ｌ  塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム、３ｇ／ｌ  寒天）を３ｍｌ添加し、よく攪拌した後に、Ｃａ−ＬＢ寒天培地プレート（１０ｇ／ｌ  バクトトリプトン、５ｇ／ｌ  バクトイーストエキストラクト、５ｍｍｏｌ／ｌ  塩化カルシウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ  水酸化ナトリウム、１５ｇ／ｌ  寒天、プレートの直径は１５ｃｍ）上にまいた。このプレートを３７℃で７時間培養した後、スプレッダーでソフトアガー部分を細かく砕いて回収した。これを１５００ｇ、４℃、１０分間遠心分離して得られた上清に、１．５ｍｌの上清に対し１００μｌの割合でクロロホルムを添加し、４℃にて一晩保存した。翌日該溶液を１５０００ｇにて２分間遠心分離し、得られた上清をファージストックとして４℃で保存した。
【００８４】
次に取得したファージを用いてＭＧ１６５５株を形質転換した。Ｃａ−ＬＢ液体培地を用いて３０℃で４時間培養したＭＧ１６５５株の培養液を２００μｌ分取し、該培養液にファージストックを１μｌ添加した。３７℃で１０分間保温した後、５ｍｌのＬＢ液体培地（１０ｇ／ｌ  バクトトリプトン、５ｇ／ｌ  バクトイーストエキストラクト、５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム、１ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ  水酸化ナトリウム）と２００μｌの１ｍｏｌ／ｌ  クエン酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した。１５００ｇ、２５℃にて１０分間遠心分離して上清を捨て、沈殿した細胞に１ｍｌのＬＢ液体培地と１０μｌの１ｍｏｌ／ｌ  クエン酸ナトリウム溶液を加え、３０℃にて２時間保温した。この溶液１００μｌを２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天平板培地（０．１５％  肉エキス、０．１５％  酵母エキス、０．５％  ペプトン、０．１％  グルコース、０．３５％  塩化ナトリウム、０．１３２％  リン酸水素二カリウム、１．５％  寒天、ｐＨ７．０）に塗布し、３０℃で培養した。翌日出現したコロニー２４個をそれぞれ、２０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むアンチバイオティックメディウム３寒天平板培地に塗布し、その薬剤感受性をチェックした。そこからカナマイシン耐性株を選抜することにより、各欠損領域が形質導入されたＭＧ１６５５株を作製した。
【００８５】
上記で取得した菌株を宿主として、実施例２と同様の方法によりプラスミドｐＭＱｖａｎＡＢを用いて形質転換し、組換え株を作成した。次に実施例３と同様の方法で培養、反応を行い、ＮＡＤＨ依存的なプロトカテキ酸生成量を比較した。ただし、バニリン酸脱メチル化反応は、以下のようにして行った。
ＬＢ培地を用いた前培養で得られた１ｍ１の培養液を、１００μｍｏｌ／ｌの硫酸鉄および５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＭ９培地に接種し、終濃度が２ｍｍｏｌ／ｌになるようにＩＰＴＧを添加して、本培養を行った。本培養開始後１．５時間目に培養液を十分に氷冷して増殖を停止させた。次に、１０ｍｌの培養液を分取し、２ｍｏｌ／ｌのグルコース溶液５０μｌを加え、さらにバニリン酸とベンゼン酸をそれぞれ終濃度が１ｍｍｏｌ／ｌになるように添加し、十分懸濁してから１ｍｌサンプリングした後、３０℃で振とうしながら反応を行った。反応１時間目と２時間目に基質であるバニリン酸を終濃度で１ｍｍｏｌ／ｌ増加するように添加した。プロトカテキ酸の定量はＨＰＬＣを用いて行った。
【００８６】
その結果、表２に示すように、３時間の反応で、野生株であるＭＧ１６５５にｐＭＱｖａｎａＡＢを導入した株よりもプロトカテキ酸生成量が増加する株としてＯＣＬ−７４−３欠損領域を持つ株（ＭＧ１６５５ΔＯＣＬ−７４−３株）が選択された。上記反応におけるプロトカテキ酸の生産量は、これまでに報告されている組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるプロトカテキ酸の生産性（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７９，  ２５９５（１９９７）、８時間の反応で１ｍｍｏｌ／ｌ以下）を大きく上回るものであった。
【００８７】
【表２】
2004321114.tif 000003
【００８８】
実施例５  ＯＣＬ−７４−３欠損領域内の２領域破壊株の作製とＮＡＤＨ供給力の評価
実施例４で選択した欠損領域ＯＣＬ−７４−３には１８個の推定遺伝子領域（ＣＤＳ）が存在した。そこでｂ２０６４−ｂ２０７３（領域Ｉ）とｂ２０７４−ｂ２０８１（領域ＩＩ）の二つに分けて、それぞれをクロラムフェニコール耐性遺伝子で破壊した菌株を作製し、実施例２と同様の方法でＮＡＤＨ供給力を評価した。
【００８９】
上記領域欠損株は以下のようにして作製した。直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組換えが可能なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＭ２２株［Δ（ｒｅｃＣ  ｐｔｒ  ｒｅｃＢ  ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ−ｒｅｄ  ｋａｎ］［Ｇｅｎｅ，  ２４６，  ３２１−３３０（２０００）］よりＰ１ファージを調製した。実施例３記載の方法に準じて、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組換えを可能とする染色体領域［Δ（ｒｅｃＣ  ｐｔｒ  ｒｅｃＢ  ｒｅｃＤ）：：Ｐｌａｃ−ｒｅｄ  ｋａｎ］をＰ１形質導入法にて野生株Ｗ３１１０に形質導入し、Ｗ３１１０ｒｅｄ株を取得した。Ｗ３１１０ｒｅｄ株に、破壊したい遺伝子の両末端に相同な領域をクロラムフェニコール耐性遺伝子の両末端に有する直鎖ＤＮＡ断片を導入し、置換的に目的遺伝子を欠損させた。
【００９０】
上記領域Ｉが欠損したＷ３１１０株は以下のように作製した。ｐＨＳＧ３９８プラスミドＤＮＡ（宝酒造社より購入可能）を鋳型にし、配列番号３および４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子の５’上流に配列番号５で示した配列、３’下流に配列番号６で示した配列が付加したＤＮＡ断片を増幅させた。それぞれのプライマーＤＮＡの３’末端の２０ｍｅｒはｐＨＳＧ３９８中のクロラムフェニコール耐性遺伝子の両末端にハイブリダイズするように設計した。ＰＣＲは、宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用いて、精製プラスミドＤＮＡ  １０ｎｇ、各プライマー  １２．５ｐｍｏｌを含む反応液をＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で１０分間保温後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間のサイクルを２５回繰り返した後、７２℃で７分間保温するという条件で行った。
【００９１】
増幅したＤＮＡ断片は、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。次に該ＤＮＡ  １０ｎｇを鋳型として、配列番号７および８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いたＰＣＲを上記と同様の条件で行った。配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡは、５’側に４０ｍｅｒのｂ２０６４遺伝子との相同配列を有し、３’側に２５ｍｅｒの配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡとの相同配列を有するＤＮＡであり、配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡは、５’側に４０ｍｅｒのｂ２０７３遺伝子との相同配列を有し、３’側に２５ｍｅｒの配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡとの相同配列を有するＤＮＡである。上記ＰＣＲにて、両末端にｂ２０６４Ａ遺伝子末端４０塩基ならびにｂ２０７３Ａ遺伝子末端４０塩基と相同な領域を有するクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を取得した。
【００９２】
該ＤＮＡ断片をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。該ＤＮＡ  １μｇを３０μｌのＷ３１１０ｒｅｄ株のコンピテントセル溶液に添加して形質転換を行った。Ｗ３１１０ｒｅｄ株のコンピテントセルは、Ｇｅｎｅ，  ２４６，  ３２１  （２０００）に記載の方法に従って調製した。形質転換は、０．１ｃｍのキュベット（ＢｉｏＲａｄ社製）中で、１．８ＫＶ、２５μＦの条件で、エレクトロポレーションにより行った。形質転換に供した細胞は、２ｍｍｏｌ／ｌのＩＰＴＧを含む１ｍｌのＳＯＢ液体培地［２０ｇ／ｌ  バクトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｇ／ｌ  バクトイーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム、０．２ｍｌ／ｌの５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨ、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ  塩化マグネシウム、１０ｍｌ／ｌの１ｍｏｌ／ｌ  硫酸マグネシウム］を用いて３０℃で３時間培養した後、１００μｌを、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート（ＬＢ液体培地に寒天を１．５％含むもの。以下、ＬＢｃｍ寒天培地プレートと略す）上に塗布し、３７℃で一晩培養した。クロラムフェニコール耐性株として形質転換株を取得した。
【００９３】
上記した方法により、ｂ２０６４からｂ２０７３までの領域をクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換的に欠損させた、Ｗ３１１０ｒｅｄΔｒｅｇｉｏｎＩ株を取得した。該菌株から実施例４と同様の方法によりＰ１形質導入ファージを調製し、該ファージを用いて該欠損領域をＭＧ１６５５株に形質導入することにより、ＭＧ１６５５ΔｒｅｇｉｏｎＩ株を取得した。
【００９４】
ＭＧ１６５５ΔｒｅｇｉｏｎＩ株の作製と同様の方法によって、ｂ２０７４からｂ２０８１までの領域を欠損させた菌株（ＭＧ１６５５ΔｒｅｇｉｏｎＩＩ株）を作製した。該菌株の作製においては、上記した配列番号７および８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いる代わりに、配列番号９および１０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いた。配列番号９は、５’側に４０ｍｅｒのｂ２０７４遺伝子との相同配列を有し、３’側に２５ｍｅｒの配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡとの相同配列を有するＤＮＡである。配列番号１０は、５’側に４０ｍｅｒのｂ２０８１遺伝子との相同配列を有し、３’側に２５ｍｅｒの配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡとの相同配列を有するＤＮＡである。
【００９５】
上記方法で取得したＭＧ１６５５ΔｒｅｇｉｏｎＩ株およびＭＧ１６５５Δｒｅｇｉｏｎ  ＩＩ株を、実施例３と同様の方法で培養し、バニリン酸脱メチル化反応を行った。ただし、実施例３に記載の方法において、ＩＰＴＧ添加後の培養時間を２時間から１．５時間に、培養液を氷冷後、反応を開始する際に、２ｍｏｌ／ｌのグルコース溶液を２５μｌ加え、さらにバニリン酸とベンゼン酸をそれぞれ終濃度で１ｍｍｏｌ／ｌになるように添加し、十分懸濁してから１ｍｌサンプリングした後、３０℃で振とうしながら、反応を行うように変更した。また、反応１時間目と２時間目に基質であるバニリン酸を終濃度で１ｍｍｏｌ／ｌ増加となるように添加した。プロトカテキ酸の定量はＨＰＬＣを用いて行った。
【００９６】
その結果、表３に示すように、ＯＣＬ−７４−３領域を欠損させたときに見られるＮＡＤＨの供給能力向上の原因は、ｒｅｇｉｏｎＩの欠損によるものであることが確認された。
【００９７】
【表３】
2004321114.tif 000004
【００９８】
実施例６  ｒｅｇｉｏｎＩ領域内の一遺伝子破壊株作製とＮＡＤＨ供給能力の評価
欠損領域ｒｅｇｉｏｎＩには１０個の推定遺伝子領域（ＣＤＳ）が存在していた。Ｗ３１１０株を親株として、それぞれの遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で破壊した菌株を作製し、実施例３と同様の方法でＮＡＤＨ供給能力を評価した。
【００９９】
実施例５と同様に、Ｗ３１１０ｒｅｄ株に、破壊したい遺伝子の両末端に相同な領域をその両端に有するカナマイシン耐性遺伝子を含む直鎖ＤＮＡ断片を導入し、置換的に目的遺伝子を欠損させた。
ｒｅｇｉｏｎＩ領域内にあるｄｃｄ遺伝子が欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、以下に記載の方法により作製した。
【０１００】
Ｗ３１１０ｒｅｄ株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、３’末端の２５ｍｅｒは、Ｗ３１１０ｒｅｄ株染色体上のカナマイシン耐性遺伝子の両末端にハイブリダイズするように設計してある配列番号１１および１２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用い、実施例５と同様な条件でＰＣＲ反応を行い、カナマイシン耐性遺伝子の５’上流に配列番号１３で表される塩基配列、３’下流に配列番号１４で表される塩基配列が付加したＤＮＡ断片を取得した。
【０１０１】
該ＤＮＡ断片をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。次に該ＤＮＡ  １０ｎｇを鋳型として、実施例５と同様の反応条件にてＰＣＲを行った。ただし配列番号７および８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いる代わりに、配列番号１５および１６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いた。配列番号１５で表される塩基配列を有するＤＮＡは、５’側に４０ｍｅｒのｄｃｄ遺伝子のＮ末領域付近との相同配列を有し、３’側に２５ｍｅｒの配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡとの相同配列を有するＤＮＡである。配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡは、５’側に４０ｍｅｒのｄｃｄ遺伝子のＣ末領域付近との相同配列を有し、３’側に２５ｍｅｒの配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡとの相同配列を有するＤＮＡである。
【０１０２】
上記ＰＣＲによって、その両末端にｄｃｄ遺伝子の両末端４０塩基と相同な領域を有するカナマイシン耐性遺伝子（ｋｍ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。該ＤＮＡ  １μｇを３０μｌのＷ３１１０ｒｅｄ株のコンピテントセル溶液に添加して、実施例５と同様の方法で形質転換を行った。エレクトロポレーション後に回復培養を行った培養液  １００μｌを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上に塗布し、３７℃で一晩培養することにより、カナマイシン耐性株を取得した。
【０１０３】
上記方法により、ｄｃｄ遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子によって置換的に削除した、Ｗ３１１０ｒｅｄΔｄｃｄ株を取得した。該菌株からＰ１形質導入ファージを実施例４と同様の方法によって調製し、該ファージを用いて該欠損領域をＷ３１１０株に形質導入し、Ｗ３１１０Δｄｃｄ株を取得した。
Ｗ３１１０Δｄｃｄ株作成と同様の方法により、ｒｅｇｉｏｎＩに含まれる、表４に記載した各遺伝子を破壊した菌株を作製した。各遺伝子欠損用のＤＮＡ断片を作製するために使用したプライマーを表４に示した。
【０１０４】
【表４】
2004321114.tif 000005
【０１０５】
上記で作製した各菌株を、実施例３と同様の方法で培養し、ＮＡＤＨの供給能力を評価した。ただし実施例５に記載の方法に対して、サンプリング間隔は２０分ごとに行った点、反応２０分後と４０分後に基質であるバニリン酸を終濃度で１ｍｍｏｌ／ｌの増加となるように添加した点を変更した。
また、プロトカテキ酸の蓄積量は、実施例３に示した重合反応を用いた測定法および以下の条件で行ったＨＰＬＣ分析によるプロトカテキ酸の直接定量法の両方で測定した。
【０１０６】
ＨＰＬＣ分析条件
使用カラム：Ｐｕｒｅ  ＳｉｌＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：分析時間０〜２分間は、移動相Ａ（メタノール：１％  酢酸＝１：１  ）：移動相Ｂ（１％  酢酸）＝１：１の溶液を用い、２〜３分間は、その間に移動相Ａが１００％になるように濃度勾配をかけ、３〜８分間は、移動相Ａが１００％の溶液を用い、８〜９分間は、その間に移動相Ａ：移動相Ｂ＝１：１になるように濃度勾配をかけ、９〜１５分間は、移動相Ａ：移動相Ｂ＝１：１の溶液を用いた。
カラム温度：３０℃
流量：１ｍｌ／ｍｉｎ．
検出波長：２８０ｎｍ
【０１０７】
反応６０分間後の測定結果を表５に示す。下表の重合反応の列中、〇は親株Ｗ３１１０株と同程度の重合反応を示したもの、◎は親株より強い、×は親株より弱い重合反応を示したものを表す。
【０１０８】
【表５】
2004321114.tif 000006
【０１０９】
実施例７  ｄｃｄ欠損株によるバニリン酸からプロトカテキ酸の生産反応
実施例６で作製したＷ３１１０Δｄｃｄ株ならびにＷ３１１０株にＯＣＬ−７４−３欠損領域を導入した株（Ｗ３１１０ΔＯＣＬ−７４−３株）のＮＡＤＨ供給能力を評価した。比較対照としては野生株Ｗ３１１０株とＭＧ１６５５株を用いた。各菌株について、実施例２で作成したプラスミドｐＭＱｖａｎＡＢを導入した組換え株を作成し、実施例６と同様の方法でＮＡＤＨ供給力を測定した結果を図２に示す。Ｗ３１１０Δｄｃｄ株およびＷ３１１０ΔＯＣＬ−７４−３株を宿主としてｐＭＱｖａｎＡＢを導入した株では、野生株にｐＭＱｖａｎＡＢを導入した株と比べて大幅に反応性が上昇していることがわかった。
【０１１０】
【発明の効果】
本発明によれば、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素を生産する能力を有する微生物であり、かつデオキシシチジン三リン酸デアミナーゼ活性が喪失、または野生型株より低下した微生物を用いた、ＮＡＤＨを補酵素とする酵素により還元されて生成する物質を効率よく製造する方法を提供することができる。
【０１１１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【０１１２】
【配列表】
2004321114.tif 000007
2004321114.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＮＡＤＨ供給力評価用プラスミドｐＭＱｖａｎＡＢの構造を示す図である。
【図２】図２は、ｄｃｄ欠損株によるバニリン酸からのプロトカテキ酸の生産能力を示す図である。図の縦軸はプロトカテキ酸の生産量、横軸は反応時間を示す。図中、●はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５／ｐＭＱｖａｎＡＢ、×はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  Ｗ３１１０／ｐＭＱｖａｎＡＢ、○はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  △ＯＣＬ−７４−３／ｐＭＱｖａｎＡＢ、◇はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  △ｄｃｄ／ｐＭＱｖａｎＡＢ、を用いたときのプロトカテキ酸の生産量を示す。
【符号の説明】
６×Ｈｉｓ−ｔａｇ：ヒスチジンが６個連結したタグ
ｌａｃＰ：ラクトースプロモーター
【図１】
2004321114.tif 000024
【図２】
2004321114.tif 000025