(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は個体における結腸直腸癌の存在を検出する方法に関し、ここで結腸直腸癌は、患者から得られる臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸もしくはアミノ酸分子の存在を検出することにより検出され、ここでＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の発現は結腸直腸癌の存在を示す。本発明はさらに、個体における結腸直腸癌の存在を検出する方法に関し、ここでは結腸癌は、１つまたは複数のさらなる結腸直腸癌関連マーカーの存在を検出することに加えて、臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸もしくはアミノ酸分子の存在を検出することにより検出される。 【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における結腸癌を診断する方法であって、
（ａ）前記個体から血清試料を得ること、
（ｂ）前記試料におけるＴＩＭＰ１の存在を検出することであって、前記試料におけるＴＩＭＰ１の存在が前記個体における結腸癌を示していること
を含む方法。
【請求項２】
前記検出工程は、
（ａ）前記血清試料を、ＴＩＭＰ１に結合することが可能であるポリペプチドリガンドと、前記ポリペプチドリガンドがＴＩＭＰ１に結合することが可能な条件下で接触させること、
（ｂ）前記ポリペプチドリガンドのＴＩＭＰ１への結合を検出することであって、結合の検出が前記試料におけるＴＩＭＰ１の存在を示していること
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドリガンドが抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドリガンドが検出可能な標識を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記個体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
個体における結腸癌を診断する方法であって、
（ａ）前記患者から血清試料を得ること、
（ｂ）前記試料におけるＴＩＭＰ１および少なくとも１つの他の結腸癌特異的マーカーの存在を検出することであって、ＴＩＭＰ１および前記少なくとも１つの他の結腸癌特異的マーカーの存在が前記個体における結腸癌を示していること
を含む方法。
【請求項７】
前記結腸癌特異的マーカーが、配列番号１、３、５〜７１の核酸分子、配列番号２、４、７２〜１３８のポリペプチド分子、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＴＦ、ｓＴｎ、Ｔｎ、ＣＡ５０、ＣＡ５４９、ＣＡ２４２、ＬＡＳＡ、およびＤｕ−ＰＡＮ１−５からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検出工程は、
（ａ）前記血清試料を、ＴＩＭＰ１に結合することが可能である第１のポリペプチドリガンドおよび前記結腸癌特異的マーカーに結合することが可能である第２のポリペプチドリガンドと、前記第１および第２のポリペプチドリガンドがそれぞれＴＩＭＰ１および前記結腸癌特異的マーカーに結合することが可能な条件下で接触させること、
（ｂ）前記第１のポリペプチドリガンドのＴＩＭＰ１への結合および前記第２のポリペプチドリガンドの前記結腸癌特異的マーカーへの結合を検出することであって、結合の検出が前記試料におけるＴＩＭＰ１および前記結腸癌特異的マーカーの存在を示していること
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記第１および第２のポリペプチドリガンドがそれぞれ抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１および第２のポリペプチドリガンドが検出可能な標識を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記個体がヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
個体における結腸癌を診断する方法であって、
（ａ）個体から血清試料を得ること、
（ｂ）前記試料におけるＴＩＭＰ１をコードする核酸分子の存在を検出することであって、前記試料における前記核酸分子のＴＩＭＰ１の存在が前記個体における結腸癌を示していること
を含む方法。
【請求項１３】
個体における結腸癌を診断する方法であって、
（ａ）個体から血清試料を得ること、
（ｂ）前記試料におけるＴＩＭＰ１をコードする核酸分子および少なくとも１つの他の結腸癌特異的マーカーをコードする少なくとも1つの他の核酸分子の存在を検出することであって、ＴＩＭＰ１をコードする前記核酸配列および前記少なくとも１つの他の結腸癌特異的マーカーをコードする前記核酸配列の存在が前記個体における結腸癌を示していること
を含む方法。
【請求項１４】
前記結腸癌特異的マーカーが、配列番号１、３、５〜７１の核酸分子、配列番号２、４、７２〜１３８のポリペプチド分子、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＴＦ、ｓＴｎ、Ｔｎ、ＣＡ５０、ＣＡ５４９、ＣＡ２４２、ＬＡＳＡ、およびＤｕ−ＰＡＮ１−５からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
個体における結腸癌を診断する方法であって、
（ａ）前記個体から血清試料を得ること、
（ｂ）前記試料におけるＲｅｇ1αの存在を検出することであって、前記試料におけるＲｅｇ１αの存在が前記個体における結腸癌を示していること
を含む方法。
【請求項１６】
前記検出工程は、
（ａ）前記血清試料を、Ｒｅｇ1αに結合することが可能であるポリペプチドリガンドと、前記ポリペプチドリガンドがＲｅｇ1αに結合することが可能な条件下で接触させること
（ｂ）前記ポリペプチドリガンドのＲｅｇ1αへの結合を検出することであって、結合の検出が前記試料におけるＲｅｇ1αの存在を示していること
を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドリガンドが抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドリガンドが検出可能な標識を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記個体がヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
個体における結腸癌を診断する方法であって、
（ａ）前記患者から血清試料を得ること、
（ｂ）前記試料におけるＲｅｇ1αおよび少なくとも１つの他の結腸癌特異的マーカーの存在を検出することであって、Ｒｅｇ1αおよび前記少なくとも１つの他の結腸癌特異的マーカーの存在が前記個体における結腸癌を示していること
を含む方法。
【請求項２１】
前記結腸癌特異的マーカーが、配列番号１、３、５〜７１の核酸分子、配列番号２、４、７２〜１３８のポリペプチド分子、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＴＦ、ｓＴｎ、Ｔｎ、ＣＡ５０、ＣＡ５４９、ＣＡ２４２、ＬＡＳＡ、およびＤｕ−ＰＡＮ１−５からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出工程は、
（ａ）前記血清試料を、Ｒｅｇ1αに結合することが可能である第１のポリペプチドリガンドおよび前記結腸癌特異的マーカーに結合することが可能である第２のポリペプチドリガンドと、前記第１および第２のポリペプチドリガンドがそれぞれＲｅｇ1αおよび前記結腸癌特異的マーカーに結合することが可能な条件下で接触させること、
（ｂ）前記第１のポリペプチドリガンドのＲｅｇ1αへの結合および前記第２のポリペプチドリガンドの前記結腸癌特異的マーカーへの結合を検出することであって、結合の検出が前記試料におけるＲｅｇ1αおよび前記結腸癌特異的マーカーの存在を示していること
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１および第２のポリペプチドリガンドがそれぞれ抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１および第２のポリペプチドリガンドが検出可能な標識を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記個体がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
個体における結腸癌を診断する方法であって、
（ａ）個体から血清試料を得ること、
（ｂ）前記試料におけるＲｅｇ1αをコードする核酸分子の存在を検出することであって、前記試料における前記核酸分子のＲｅｇ1αの存在が前記個体における結腸癌を示していること
を含む方法。
【請求項２７】
個体における結腸癌を診断する方法であって、
（ａ）個体から血清試料を得ること、
（ｂ）前記試料におけるＲｅｇ1αをコードする核酸分子および少なくとも１つの他の結腸癌特異的マーカーをコードする少なくとも1つの他の核酸分子の存在を検出することであって、Ｒｅｇ1αをコードする前記核酸配列および前記少なくとも１つの他の結腸癌特異的マーカーをコードする前記核酸配列の存在が前記個体における結腸癌を示していること
を含む方法。
【請求項２８】
前記結腸癌特異的マーカーが、配列番号１、３、５〜７１の核酸分子、配列番号２、４、７２〜１３８のポリペプチド分子、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＴＦ、ｓＴｎ、Ｔｎ、ＣＡ５０、ＣＡ５４９、ＣＡ２４２、ＬＡＳＡ、およびＤｕ−ＰＡＮ１−５からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
結腸直腸癌腫は悪性新生物性疾患である。欧米、特にアメリカ合衆国において結腸直腸癌腫は高い発生率である。このタイプの腫瘍は、リンパ管および血管を通じて転移する場合が多い。結腸直腸癌腫患者の多くは、最終的にはこの疾患により死亡する。実際に、米国だけで年間６２，０００人の人々が結腸直腸癌腫で死亡していると推定される。
【背景技術】
【０００２】
しかしながら、初期に診断されれば、結腸直腸癌は、癌性組織の外科的切除により効果的に治療され得る。結腸直腸癌は結腸直腸上皮から始まり、典型的に発達の初期段階おいて中には広く血管は新生しない（したがって浸潤性ではない）。結腸直腸癌は、結腸または直腸の上皮層中の単一の突然変異細胞のクローン性増殖に起因すると考えられる。高度な血管新生による転移で、浸潤性および最終的に転移性の癌が体中の至る所に蔓延するには通常１０年以上かかる。癌が浸潤前に検出されれば、癌性組織の外科的切除が効果的な治癒法である。しかしながら、結腸直腸癌は、疼痛および真っ黒なタール上の糞便のような臨床的症状の発現時のみに検出される場合が多い。一般に、かかる症状は、多くの場合転移が起こった後に、疾患が十分に確立された場合にのみ存在し、癌性組織の外科的切除の後でさえも患者の予後は乏しい。したがって、結腸直腸癌の初期検出は、その罹患率を著しく減少し得るという点で重要である。
【０００３】
内視鏡検査のような侵襲性診断方法により、ポリープのような潜在的な癌性増殖の直接的な視覚的同定、切除および生体組織検査が可能である。内視鏡は高価であり、不快感を感じ、本質的に危険性があり、したがって結腸直腸癌を有する集団を特定するための集団スクリーニングにおいては実用的なツールではない。結腸直腸癌または前癌の存在を示す特徴において糞便試料の非侵襲性分析は初期診断にとって好ましい代替法であるが、この目標を信頼性高く達成する有効な診断方法は知られていない。初期段階で結腸直腸癌を診断するための信頼性高く、非侵襲性で、かつ正確な技法は多くの生命を救う手助けとなろう。
【０００４】
膵臓の再生遺伝子（ＲｅｇＩ）の異所性発現がこれまでに結腸直腸腫瘍で特定されており、結腸直腸癌用の潜在的マーカーとして提唱されている（Zenilman et al., (1997) J. Gastrointest. Surg., 1:194、Watanabe et al., (1990) J. Biol. Chem., 265:7432、Birse and Rosen, 国際公開第０１／１２７８１号）。現在のところ、結腸直腸癌患者の血清中のＲｅｇ１αの迅速かつ正確な検出に関して当業者に既知の信頼性高い方法は存在しない(Satomura et al., (1995) J. Gastroenterol. 30:643)。したがって、血清中のＲｅｇ１αの発現を利用して、患者における結腸直腸癌を検出および／またはモニタリングする方法が当該技術分野で必要とされている。
【０００５】
［発明の概要］
本発明は、個体における結腸直腸癌の治療的応答を検出、モニタリングまたは確定する方法、ならびに上記方法を実施するための組成物およびキットを提供する。その最も一般的な態様では、上記方法は、上記個体から臨床試料を得ること、上記試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の存在を検出することであって、上記試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の存在が上記個体における結腸直腸癌の存在または段階を示している、検出することとを含む。
【０００６】
一実施形態では、検出工程は、上記臨床試料を、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１に結合することが可能であるリガンドと、上記リガンドがＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１に結合すること可能な条件下で接触させること、上記リガンドのＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１への結合を検出することであって、結合の検出が上記試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の存在を示している、検出することとを含む。ポリペプチドリガンドは、例えば、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１を特異的に結合する抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他の分子を包含し得る。現在好ましい実施形態では、臨床試料は血清を包含する。
【０００７】
本発明はさらに、個体における結腸直腸癌の存在を検出、モニタリングまたは確定する方法であって、上記個体から臨床試料を得ること、上記試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１および少なくとも１つの他の結腸直腸癌関連マーカーの存在を検出することであって、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１および上記少なくとも１つの他の結腸直腸癌関連マーカーの存在が上記個体における結腸癌を示している検出することとを含む方法を提供する。結腸直腸癌関連マーカーは、例えば、１つまたは複数の配列番号１、３もしくは５〜７１の核酸配列、または配列番号２、４もしくは７２〜１３８のアミノ酸配列、あるいは実質的に同じ結合特異性を有するそれらの誘導体または相同体を包含し得る。
【０００８】
好ましい実施形態では、上記検出工程は、上記血清試料を、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１に結合することが可能である第１のリガンドおよび上記結腸直腸癌関連マーカーに結合することが可能である第２のリガンドと、上記第１および第２のリガンドがそれぞれＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１および上記結腸直腸癌関連マーカーに結合することが可能な条件下で接触させること、各々；上記第１のリガンドのＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１への結合および上記第２のリガンドの上記結腸直腸癌関連マーカーへの結合を検出することであって、結合の検出が上記試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１および上記結腸直腸癌関連マーカーの存在を示している、検出することとを含む。ポリペプチドリガンドは、例えば、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１を特異的に結合する抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは他の分子を包含し得る。
【０００９】
本発明はまた、個体における結腸直腸癌の存在を検出、モニタリングまたは確定する方法であって、上記個体から臨床試料を得ること、上記試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１をコードする核酸分子の存在を検出することであって、上記試料における上記核酸分子の存在が上記個体における結腸直腸癌を示している、検出することとを含む方法も提供する。
【００１０】
本発明はさらに、個体における結腸直腸癌の存在を検出、モニタリングまたは確定する方法であって、上記個体から臨床試料を得ること、上記試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１をコードする核酸分子および少なくとも１つの他の結腸直腸癌関連マーカーをコードする少なくとも１つの他の核酸分子の存在を検出することであって、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１をコードする上記核酸配列および上記少なくとも１つの他の結腸直腸癌関連マーカーをコードする上記核酸配列の存在が上記個体における結腸癌を示している、検出することとを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、結腸直腸癌関連マーカーは、例えば、１つまたは複数の配列番号１、３もしくは５〜７１の核酸配列、または配列番号２、４もしくは７２〜１３８のアミノ酸配列、あるいは実質的に同じ結合特異性を有するそれらの誘導体または相同体を包含する。
［詳細な説明］
本発明は、ヒト島再生タンパク質であるＲｅｇ１αの発現が結腸直腸癌を伴う患者で増加され、したがってヒトにおける結腸直腸癌の同定用の貴重なマーカーであるという発見に幾分基づいている。本発明はさらに、個体からの臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１（および任意に、１つまたは複数のさらなる結腸直腸癌関連マーカー）の存在を検出することにより結腸直腸癌の初期検出を提供する。本発明はさらに、患者からの臨床試料中の存在するＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１ポリペプチドあるいはポリヌクレオチド配列のレベルをモニタリングすることにより、結腸直腸癌がすでに検出されている患者における結腸直腸癌の再発をモニタリングする能力を提供し、ここでは試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の増加が結腸直腸癌の再発を示している。本発明はさらに、治療薬に応答した結腸直腸癌の減少をモニタリングする能力を提供し、それによりＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１のレベルが結腸直腸癌のための治療的処置を施された患者から得られる臨床試料で測定され、ここでは患者からの臨床試料で検出されるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１のレベルの減少が治療薬の有効性を示している。上述の実施形態のいずれかでは、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１ポリヌクレオチドあるいはポリペプチド発現レベルが、少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカーと合わせて測定される。
【００１１】
したがって、本発明は、結腸組織のような正常組織における発現レベルに比較して、癌において過剰または過少発現される遺伝子あるいは遺伝子産物に関してスクリーニングすることにより、個体における癌、特に結腸直腸癌を特定する新規の方法に幾分関する。あるいは、本発明は、結腸直腸癌で過剰または過少発現され、かつ結腸直腸癌を伴う個体の臨床試料で検出可能である遺伝子あるいは遺伝子産物に関してスクリーニングすることにより、個体における癌を同定する方法を提供する。
【００１２】
好ましい実施形態では、本発明は、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の血清レベルを検出することによる、個体、好ましくはヒトの患者における結腸直腸癌の検出に有用な方法に関する。本発明は、個体の血清中あるいは個体からの臨床試料中におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１遺伝子の存在を検出するか、あるいはＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１コードポリペプチド産物の存在を検出する技法の一方または両方を利用する結腸直腸癌検出の方法に関する。
【００１３】
本発明はさらに結腸直腸癌の同定方法を提供し、ここで癌は、少なくとも１つの他の結腸直腸癌関連マーカーの同じ試料における発現と併用して、患者の臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１発現の同定により検出される。さらなる結腸癌マーカーの検出と合わせたＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１検出分析の組合せは、結腸直腸癌の存在を検出する有効かつ信頼性高い方法を提供する。
【００１４】
Ｒｅｇ１αの検出に具体に言及する本明細書中に記載する方法は、本明細書の開示に基づいて当業者によりＴＩＭＰ１の検出にも同様に適用され得る。
定義
本明細書中で使用する場合、「Ｒｅｇ１α」は、配列番号２または４のいずれかの配列を有するポリペプチド分子を指す。Ｒｅｇ１αは本明細書中で使用する場合、配列番号１または３のいずれかの配列によりコードされるポリペプチドも指す。配列番号２および４の配列はそれぞれ、機能的Ｒｅｇ１αタンパク質を表すが、タンパク質合成中に切断されるリーダー配列中の４つのアミノ酸が互いに異なる。
【００１５】
本明細書中で使用する場合、「ＴＩＭＰ１」は、配列番号１００の配列を有するポリペプチド分子を指す。ＴＩＭＰ１は本明細書中で使用する場合、配列番号３３の配列によりコードされるヌクレオチド、またはそれらの機能的相同体も指す。
【００１６】
本明細書中で使用する場合、「臨床試料」は、個体から得られる組織、細胞または液体試料を指す。「臨床試料」は本明細書中で使用する場合、細胞、循環細胞（例えば、血液中の循環細胞）、特定の解剖部位から得られる細胞、または特定の細胞型（例えば、結腸細胞、胃腸細胞、癌細胞等）、組織試料、あるいはリンパ、胆汁、血清、血漿、尿、滑液、血液、ＣＳＦ、粘膜（mucus membrane）分泌物のような生理学的液体または糞便のような他の生理学的試料を指すことができる。好ましくは、臨床試料は血清または血漿である。ＴＩＭＰ１のような本発明の結腸直腸癌関連マーカーは、特定の結腸直腸癌関連マーカーの検出に関して特定の型の臨床試料が適していることが当業者により容易に確定され得る適切な「臨床試料」で検出され得る。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、「検出すること」は、試料における分子の存在または非存在の同定を指す。検出されるべき分子がポリペプチドである場合、検出工程は、検出可能に標識された抗体を用いてポリペプチドを結合することにより実施され得る。検出可能な標識は、独立してあるいは刺激に応答して、観察可能なシグナルを発生することが可能である分子である。検出可能な標識は、蛍光標識、色素標識（chromogenic label）、発光標識、または放射性標識であり得るが、これらに限定されない。標識を「検出する」方法としては、標準的または共焦点顕微鏡法（confocal microscopy）に適応させた定量的および定性的方法、ＦＡＣＳ分析、ならびにマルチウェルプレート、アレイまたはマイクロアレイを包含する高速大量処理方法（high throughput methods）に適応させた方法が挙げられる。当業者は、既定の蛍光ポリペプチドまたは色素からの蛍光放出の検出用の適切なフィルターセットおよび励起エネルギー源を選択することができる。「検出すること」は本明細書中で使用する場合、検出されるべきポリペプチドに対する多重抗体の使用も包含することができ、ここで多重抗体は、検出されるべきポリペプチド上の異なるエピトープに結合する。この様式で使用される抗体は、２つ以上の検出可能な標識を使用することができ、例えばＦＲＥＴ対を包含することができる。Ｒｅｇ１αのようなポリペプチド分子は、検出可能なシグナルレベルが検出可能な標識のバックグラウンドレベルよりもとにかく大きい場合、あるいは測定される核酸レベルが対照試料で測定されるレベルよりもとにかく大きい場合に、本発明により「検出される」。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、「検出すること」は、それが標的核酸分子（例えば、Ｒｅｇ１αをコードする核酸分子または他の結腸直腸癌特異的配列）の存在を検出することを指す場合、直接的または間接的に標識されたプローブ核酸分子（標的、例えば血清試料におけるＲｅｇ１αをコードする配列にハイブリダイズすることが可能）により発生されるシグナルが測定または観察されるプロセスを指す。したがって、プローブ核酸の検出は、Ｒｅｇ１αをコードする配列のような標的核酸の存在を直接示し、したがって検出を示している。例えば、検出可能な標識が蛍光標識である場合、標的核酸（例えば、Ｒｅｇ１αをコードする核酸分子）は、プローブ核酸分子が適切な波長で励起される場合にプローブ核酸分子上の蛍光標識により放出される光を観察または測定することにより「検出され」、あるいは検出可能な標識が蛍光／励起エネルギー吸収剤対である場合、標的核酸は、プローブ核酸上に存在する蛍光／励起エネルギー吸収剤対の会合または解離時に放出される光を観察または測定することにより「検出され」、ここでプローブ核酸の検出は、標的核酸の検出を示す。検出可能な標識が放射性標識である場合、標的核酸は、放射性標識したプローブとのハイブリダイゼーション後に、例えばオートラジオグラフィにより「検出される」。蛍光、放射性および他の化学標識を「検出する」方法および技法は、Ausubel等(1995, Short Protocols in Molecular Biology, 3rdEd. John Wiley and Sons, Inc.)に見出され得る。あるいは、核酸は「間接的に検出され」てもよく、ここで適切な基質の存在の検出を可能にする酵素活性、あるいは抗体または他の特定の指標の添加により検出を可能にする特定の抗原または他のマーカーのような部分が、標的とハイブリダイズするプローブ核酸に結合される。あるいは、標的核酸分子は、標的核酸配列の一部とハイブリダイズするように特異的に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、患者の臨床試料から調製される核酸試料を増幅することにより検出され得る。ＴａｑＭａｎのような（しかし、これに限定されない）定量的増幅方法もまた、本発明による標的核酸を「検出する」のに使用され得る。核酸分子は、測定される（例えば定量的ＰＣＲにより）核酸レベル、または検出可能な標識により供給される検出可能なシグナルレベルがバックグラウンドレベルをとにかく上回る場合に、本明細書で使用されるように「検出される」。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、「検出すること」はさらに、患者における結腸直腸癌の初期検出を指し、ここで「初期」検出は、デュークス段階Ａにあるか、好ましくは結腸直腸癌が形態学的に特定のデュークス段階に分類され得る時点以前の結腸直腸癌の検出を指す。「検出すること」は本明細書中で使用する場合さらに、上述のような同じ検出基準を用いて、個体における結腸直腸癌の再発の検出を指す。「検出すること」は本明細書中で使用する場合さらに、治療薬により治療前および／または後の結腸直腸癌の度合いの変化を測定することを指す。この場合、治療薬に応答した結腸直腸癌の度合いの変化は、治療薬の非存在下での発現レベルに対して、治療薬の存在に応答して少なくとも１０％の臨床試料に存在するＲｅｇ１α（および任意に、１つまたは複数のさらなる結腸直腸癌関連マーカー）の発現、あるいはＲｅｇ１αポリペプチド（および任意に、１つまたは複数のさらなる結腸直腸癌関連マーカー）の量の増加あるいは減少を指す。
【００２０】
本明細書中で使用する場合、「個体」は哺乳類、好ましくはヒトを指す。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、「リガンド」は、ポリペプチドを結合することが可能である分子を指す。本発明で有用な「ポリペプチドリガンド」としては、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、またはＦａｂ）、小分子、または核酸アプタマーが挙げられるが、これらに限定されない。「リガンド」は本明細書中で使用する場合、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡのような「核酸リガンド」も指すことができ、これは、相補核酸分子、またはポリペプチド分子に結合することが可能である。
【００２２】
「抗体」という用語は本明細書中で使用する場合、例えば任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）の抗体全体を包含するものと意図され、また同様に脊椎動物、例えば哺乳類タンパク質と特異的に反応性を有するそれらの断片および一本鎖抗体を包含する。抗体は従来の技法を用いて断片化させることができ、断片は、抗体全体に関して上述するのと同じ様式で有用性に関してスクリーニングすることができる。したがって、この用語は、ある特定のタンパク質と選択的に反応することが可能である抗体分子のタンパク質分解的に切断された部分または組換え的に調製された部分のセグメントを包含する。かかるタンパク質分解的断片および／または組換え断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ならびにペプチドリンカーにより連結されたＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成するように共有結合的または非共有結合的に連結され得る。本発明は、ポリクローナル、モノクローナルまたは抗体および組換え抗体の他の精製調製物を包含する。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、「結腸直腸癌関連マーカー」は、結腸直腸癌を有さない個体から得られる細胞、組織または血清中の発現レベルに対して、結腸直腸癌を有する個体から得られる結腸直腸癌細胞、組織または血清中で少なくとも１０％の過剰または過少発現を示すポリペプチドあるいは核酸配列を指す。本発明で有用な結腸直腸癌関連マーカーの非限定的な例としては、配列番号１、３、５〜７１の核酸分子、および／または配列番号２、４、７２〜１３８のポリペプチド分子が挙げられる。一実施形態では、配列番号２、４、７２〜１３８のポリペプチド配列は、それぞれ１、３、５〜７１の核酸配列によりコードされる。本発明で有用な「結腸直腸癌特異的マーカー」は、上述のように結腸直腸癌で過剰または過少発現を示すが、他の非結腸直腸型の癌でも過剰または過少発現され得るポリペプチドまたは核酸配列であり得る。あるいは、「結腸直腸癌関連マーカー」は本明細書中で使用する場合、ポリペプチドもしくは核酸分子上に存在する糖鎖エピトープおよび／またはかかるエピトープを認識して、それに結合することが可能な抗体分子を指してもよい。糖鎖エピトープは、個体における結腸直腸癌の存在に関連することが知られている。かかる糖鎖エピトープは、２つ以上の未関連タンパク質またはポリペプチド上に存在し得る。一実施形態では、かかる糖鎖エピトープは、シアリルルイスaとしても知られるＣＡ１９−９であり、様々な糖タンパク質または糖脂質に共有結合される分岐状５糖構造から構成される血液型群抗原に関連した糖鎖エピトープとしてモノクローナル抗体により規定される腫瘍マーカーである。タンパク質は主としてムチンファミリーに属し、脂質は通常膜に関連している。ＣＡ１９−９エピトープは典型的にいずれかの巨大分上の複雑なＯ連結糖鎖構造の末端部分である。「結腸直腸癌関連マーカー」として本発明で有用な各種糖鎖エピトープとして同様に定義される他の腫瘍マーカーとしては、ＣＡ７２−４、ＴＦ、ｓＴｎ、Ｔｎ、ＣＡ５０、ＣＡ５４９、ＣＡ２４２、ＬＡＳＡ、およびＤｕ−ＰＡＮ’ｓ１−５が挙げられる。
【００２４】
「相互作用する」という用語は明細書で使用する場合、本質的にタンパク質−タンパク質間、タンパク質−核酸間、核酸−核酸間、およびタンパク質−小分子間または核酸−小分子間のような分子間の検出可能な相互作用（例えば、生化学的相互作用）を包含することを意味する。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを指す。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチド類縁体から作製されるＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの類縁体、および記載される実施形態に適用可能である場合、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを包含することが理解されるべきである。ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｒＲＮＡは、核酸として言及され得る分子の代表例である。
【００２６】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、遺伝子産物を指す場合に本明細書中で相互に使用される。本明細書中で使用する場合、「ポリペプチド」は、ペプチド、ヒトタンパク質、ヒトタンパク質の断片、非ヒト供給源由来のタンパク質もしくはタンパク質断片、操作型タンパク質もしくはタンパク質断片、酵素、抗原、薬剤、細胞シグナル伝達に関与した分子（例えば、受容体分子）、抗体（免疫グロブリンスーパーファミリーのポリペプチドを含む、例えば抗体ポリペプチドまたはＴ細胞受容体ポリペプチド）のような任意の種類のポリペプチドを指す。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、「発現レベル」という用語は、既定の核酸の測定可能な発現レベルを指す。核酸の発現レベルは、当該技術分野で既知の方法により確定される。「発現レベル」は、当該技術分野で既知の方法に従って標識標的核酸を用いたハイブリダイゼーション分析により測定されてもよい（例えば、Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rdEd. 1995, John Wiley and Sons, Inc.を参照）。標的核酸上の標識は、発光標識、酵素標識、放射性標識、化学標識または物理標識である。好ましくは、標的核酸は蛍光分子で標識される。好ましい蛍光標識としては、フルオレセイン、アミノクマリン酢酸、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ３およびＣｙ５が挙げられる。あるいは、「発現レベル」は、当業者に既知のＴａｑＭａｎのような定量的増幅プロトコルにより測定され得る。
【００２８】
「ベクター」という用語は、核酸分子が連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターのタイプの１つはエピソーム、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、ベクターが連結される核酸の自己複製および／または発現が可能なベクターである。ベクターが操作的に連結される遺伝子の発現を誘導することが可能であるベクターは、「発現ベクター」として本明細書中では称される。概して、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、一般に環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」の形態である場合が多く、このベクター形態では染色体に結合されない。本明細書中では、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」は相互に使用される。しかしながら、本発明は、等価な機能を供し、かつ後の当該技術分野で既知になる発現ベクターのかかる他の形態を包含すると意図される。
【００２９】
Ｒｅｇ１αおよびＴＩＭＰ１核酸
上述のように、本発明は、個体からの臨床試料、好ましくは血清または血漿試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１ポリペプチドの検出に関し、したがって結腸直腸癌の検出を可能にする。しかしながら、本発明は同様に、結腸直腸癌用のマーカーとしてＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１をコードする核酸配列の同定に関する。
【００３０】
Ｒｅｇ１αの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１または３、および配列番号２または４に示される。ＴＩＭＰ１の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３３および１００に示される。本発明は結腸直腸癌を検出する方法におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の配列のいずれかの直接的検出に関する一方で、本発明はさらに、それに相補的な配列、あるいは配列番号１、３または３３の配列に特異的にハイブリダイズする配列の検出に関する。本発明はまた、臨床試料における、配列番号２、４または１００の配列をコードする核酸分子、あるいはそれらの断片の存在を検出することによる結腸直腸癌の検出に関する。
【００３１】
本発明の別の態様は、１つまたは複数の配列番号１、３または３３により表される核酸配列、あるいはそれらに相補的な配列に低、中または高緊縮条件下でハイブリダイズする核酸の検出による結腸直腸癌の検出を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な緊縮性条件、例えば約４５℃での６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で結合後、５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄が当業者に既知であり、あるいはMolecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-12.3.6に見出すことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃での約２．０×ＳＳＣの低緊縮性から５０℃での約０．２×ＳＳの高緊縮性までから選択され得る。さらに、洗浄工程の温度は、室温、すなわち約２２℃での低緊縮性条件から約６５℃での高緊縮性条件にまで増加させることができる。温度および塩の両方を変化させてもよく、あるいは温度または塩濃度は、他方変数を変更しながら一定に保ってもよい。好ましい実施形態では、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１をコードする核酸は、中緊縮条件下で、例えば約２．０×ＳＳＣおよび約４０℃で配列番号１、３もしくは３３、またはそれらに相補的な配列、あるいはそれらの断片に結合する。特に好ましい実施形態では、患者の臨床試料中に存在するＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸配列は、高緊縮性条件下でそれぞれ配列番号１、３もしくは３３、またはそれらに相補的な配列、あるいはそれらの断片に結合する。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、室温での６×ＳＳＣ、続く室温での２×ＳＳＣでの洗浄の低緊縮性条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、約６５℃での２×ＳＳＣ、続く約６５℃での０．２×ＳＳＣでの洗浄の高緊縮性条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【００３４】
遺伝コードの縮重性に起因して配列番号１または３、あるいはそれらに相補的な配列で示されるヌクレオチド配列と異なる配列を有するＲｅｇ１α核酸の検出もまた本発明の範囲内である。かかる核酸は機能的に等価なペプチド（すなわち、等価または類似の生物活性を有するペプチド）をコードするが、遺伝コードの縮重性に起因して配列表に示す配列とは配列が異なる。例えば、多数のアミノ酸が２つ以上のトリプレットにより指定される。同じアミノ酸または同義を指定するコドン（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはそれぞれヒスチジンをコードする）は、ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」突然変異をもたらし得る。しかしながら、対象ポリペプチドのアミノ酸配列の変化を引き起こすＤＮＡ配列多型は哺乳類間に存在すると予測される。ポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、最大約３〜５％のヌクレオチド）のこれらの変動は天然対立遺伝子変動に起因して既定の種の個体間に存在し得ることが当業者には理解されよう。
【００３５】
本発明はまた、緊縮条件（６５℃での少なくとも４×ＳＳＣ、または４２℃での少なくとも約４×ＳＳＣ、例えば米国特許第５，７０７，８２９号（これは参照により本明細書に援用される））下で、配列番号１または３の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドをその範囲内に包含する。これにより、配列番号１または３の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドがプローブとして使用される場合、プローブは相補配列を含む遺伝子またはｍＲＮＡ（生物学的物質の）と優先的にハイブリダイズし、選択したプローブに一意的にハイブリダイズする生物学的物質の核酸（すなわち、Ｒｅｇ１α）の特定および回収が可能となることが意図される。１５個を上回るヌクレオチドのプローブを使用することができるが、１５個のヌクレオチドが、特有の特定に十分な配列を表す。
【００３６】
配列番号１または３の配列、それらの一部、あるいはそれらに相補的な配列を有し、かつ例えばプローブの生成に有用なポリヌクレオチドの構築物は合成的に産生され得るか、あるいは当業者に既知の方法を用いて天然供給源（例えば、ヒト細胞）から得られ得る（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989)を参照）。
【００３７】
配列ホモロジーの算出
一実施形態では、本発明は、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１配列の一部に相補的であるか、または高緊縮性条件下でのＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１配列へのプローブおよび／またはプライマーのハイブリダイゼーションを可能にするのにＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１配列の一部に十分に相同的であるプローブおよび／またはプライマーを用いてＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１あるいはそれらに相同的な配列の存在を検出することによる個体における結腸直腸癌の検出に関する。本発明の配列は、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１に対して少なくとも５０％相同であり、好ましくはＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１と（あるいは任意に、１つまたは複数のさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする配列に対して）６０％、７０％、８０％、９０％相同性〜完全配列同一性である。
【００３８】
本明細書中に提示する配列のいずれかに関する配列同一性は、任意の１つまたは複数の配列と別の配列との単純な「目による」比較（すなわち、綿密な比較）により確定することができ、他の配列が例えば配列（複数可）に対して少なくとも８０％配列同一性を有するかどうかを確認することができる。
【００３９】
相対的配列同一性はまた、例えばデフォルトパラメータを用いて同一性を決定するための任意の適切なアルゴリズムを用いた２つ以上の配列間の％同一性を算出することができる市販のコンピュータプログラムにより確定することができる。かかるコンピュータプログラムの典型的な例はＣＬＵＳＴＡＬである。２つの配列間の同一性および類似性を確定する他のコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムオパッケージ(Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12:387)およびＦＡＳＴＡ(Atschul et al 1990 J Molec Biol 403-410)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
％相同性は連続配列にわたって算出され得て、すなわち一方の配列を他方の配列と整列させて、一方の配列中の各アミノ酸を、１度に１残基ずつ他方の配列中の相当するアミノ酸と直接比較する。これは、「アンギャップド」アラインメントと呼ばれる。典型的に、かかるアンギャップドアラインメントは比較的短い残基数にわたってのみ実施される。
【００４１】
これは非常に簡単でかつ一貫した方法であるが、例えば別の同一配列対では、１つの挿入または欠失が続くアミノ酸残基がアラインメントから押し出され、したがって全体的なアラインメントが実施される場合に％相同性の大きな減少を潜在的にもたらすことが考慮されていない。したがって、たいていの配列比較方法は、全般的なホモロジースコアを過度に不利にすることなく考え得る挿入および欠失を考慮する最適なアラインメントを生じるように設計される。これは配列アラインメントにおいて「ギャップ」を挿入して、局所ホモロジーを最大限しようと試みることにより達成される。
【００４２】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントで発生する各ギャップに対して「ギャップペナルティ」を割り当てて、その結果同数の同一アミノ酸に関して、できるだけ少ないギャップを伴う配列アラインメント（これは２つの比較配列間のより高い関連性を反映する）が多くのギャップを伴って２つ以上のより高いスコアを達成する。ギャップの存在に関する比較的高いコストおよびギャップにおける各続く残基に関するより小さなペナルティを負荷する「アフィンギャップコスト」が典型的に使用される。これは最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然のことながらより少ないギャップを伴う最適化アラインメントを生じるであろう。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更させることが可能である。しかしながら、配列比較のためにかかるソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に関するデフォルトギャップペナルティは、ギャップに関して−１２、各伸長に関して−４である。
【００４３】
したがって、第一に最大％相同性の算出は、ギャップペナルティを考慮して、最適なアラインメントを生じることを必要とする。かかるアラインメントを実行するのに最適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｃｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ(University of Wisconsin, U.S.A; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387)である。配列比較を実施することができる他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ(Ausubel et al., 1995, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons)、ＦＡＳＴＡ(Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410)、および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方がオフラインおよびオンライン検索で利用可能である（上述のAusubel et al., 1999、７−５８頁〜７−６０頁）。
【００４４】
最終％相同性は同一性に関して測定され得るが、アラインメントプロセス自体は通常、あるかなしかの対比較に基づいてはいない。その代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいた各対の比較にスコアを割り当てるスケールド類似性スコア行列が一般に使用される。一般に使用されるかかる行列の例は、ＢＬＡＳＴプログラム一式用のデフォルト行列であるＢＬＯＳＵＭ６２行列である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは概して、公的デフォルト値または供給されればカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する。ＧＣＧパッケージに関しては公的デフォルト値を、あるいは他のソフトウェアの場合ではＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルト行列を使用することが好ましい。
【００４５】
好適には、デフォルト値に設定されたパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムが使用される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlにあるワールドウェブサイト（これは参照により本明細書に援用される）上で詳述されている。検索パラメータは以下のように規定され、好適には規定されたデフォルトパラメータに設定され得る。
【００４６】
好適には、ＢＬＡＳＴにより評価される場合の「実質的な同一性」は、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは少なくとも約１０以上のＥＸＰＥＣＴ値とマッチする配列に相等しい。ＢＬＡＳＴ検索におけるＥＸＰＥＣＴに関するデフォルト閾値は通常１０である。
【００４７】
ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）は、プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘで使用されるヒューリスティック検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、幾つか強化を伴ったKarlinおよびAltschulの統計学的方法（Karlin and Altschul 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7、http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlを参照）を用いて有意性がそれらの見解に帰すとする。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えばクエリー配列に対する相同体を特定するために、配列類似性検索用に適応される。配列データベースの類似性検索における基本的事項の考察に関しては、Altschul et al (1994) Nature Genetics 6:119-129を参照されたい。
【００４８】
ncbi.nlm.nih.govにあるワールドワイドウェブ上で利用可能な５つのＢＬＡＳＴプログラムは以下の作業を実施する：ｂｌａｓｔｐは、アミノ酸クエリー配列をタンパク質配列データベースに対して比較し、ｂｌａｓｔｎは、ヌクレオチドクエリー配列をヌクレオチド配列データベースに対して比較し、ｂｌａｓｔｘは、ヌクレオチドクエリー配列（両ストランド）の６フレームの概念的翻訳産物をタンパク質データベースに対して比較し、ｔｂｌａｓｔｎは、タンパク質クエリー配列を、６つのリーディングフレームすべてで劇的に翻訳されるヌクレオチド配列データベース（両ストランド）に対して比較し、ｔｂｌａｓｔｘは、ヌクレオチドクエリー配列の６フレーム翻訳物をヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳物に対して比較する。
【００４９】
ＢＬＡＳＴは以下の検索パラメータを使用する：
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ−各検索に関するスコアのヒストグラムを表示する。デフォルトはイエスである（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＨを参照）。
【００５０】
ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ−指定数に対して報告されるマッチング配列の短い描写数を制限する。デフォルト限界は１００描写である（マニュアル頁におけるパラメータＶを参照）。
【００５１】
ＥＸＰＥＣＴ−データベースは配列に対するマッチを報告するための統計学的有意性閾値。デフォルト値は１０であり、その結果、Karlin and Altshul(1990)の確率的モデルに従って、１０個のマッチが単に思いがけなく見出されると予測される。マッチに帰すとされる統計学的有意性がＥＸＰＥＣＴ閾値を上回る場合、マッチは報告されない。より低いＥＸＰＥＣＴ閾値がより厳格であり、より数少ない機会へと導くことでマッチが報告される。分数値が許容可能である（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＥを参照）。
【００５２】
ＣＵＴＯＦＦ−高スコアリングセグメント対を報告するためのカットオフスコア。デフォルト値はＥＸＰＥＣＴ値（上述を参照）から算出される。ＨＳＰは、それらに帰すとされる統計学的有意性がＣＵＴＯＦＦ値に等しいスコアを有する単独のＨＳＰに帰すであろうものと少なくとも同程度に高い場合にのみデータベース配列に関して報告される。より高いＣＵＴＯＦＦ値がより厳格であり、より数少ない機会へと導くことでマッチが報告される（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＳを参照）。典型的に、有意性閾値はＥＸＰＥＣＴを用いてより直観的に管理され得る。
【００５３】
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ−高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）が報告される指定数にデータベース配列を制限する。デフォルト限界は５０である。図らずもこれよりも多いデータ配列対が報告に関する統計学的有意性閾値を満たす（以下のＥＸＰＥＣＴおよびＣＵＴＯＦＦを参照）場合、最大統計学的有意性が帰すマッチが報告される（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＢを参照）。
【００５４】
ＭＡＴＲＩＸ−ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、およびＴＢＬＡＳＴＸに関する交互スコアリング行列を指定する。デフォルトマトリクスはＢＬＯＳＵＭ６２である。正当な代替的選択としては、ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０、およびＩＤＥＮＴＩＴＹが挙げられる。非交互スコアリング行列がＢＬＡＳＴＮに関して利用可能であり、ＢＬＡＳＴＮ要求において指示的なＭＡＴＲＩＸを指定することによりエラー応答が戻される。
【００５５】
ＳＴＲＡＮＤ−データベース配列まさにのトップストランドまたはボトムストランドにＴＢＬＡＳＴＮ検索を制限するか、あるいはクエリー配列のトップストランドまたはボトムストランド上のまさにリーディングフレームにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸまたはＴＢＬＡＳＴＸ検索に制限する。
【００５６】
ＦＩＬＴＥＲ−Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163のＳＥＧプログラムにより確定される場合に低組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント、あるいはClaverie & States (1993) Computers and Chemistry 17:191-201のＸＮＵプログラムにより、またはＢＬＡＳＴＮに関してはTatusov and LipmanのＤＵＳＴプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照）により確定される場合に短周期性内部反復から構成されるセグメントを遮断する。フィルタリングは統計学的に有意であるが、生物学的に興味がもたれないｂｌａｓｔ出力からの報告（例えば、共通の酸性、塩基性またはプロリンリッチな領域に対するヒット）を排除することができ、クエリー配列のより生物学的に興味がもたれる領域をデータベース配列に対する特定のマッチングに利用可能な状態にする。
【００５７】
フィルタープログラムにより見出される低複雑性配列は、ヌクレオチド配列では「Ｎ」という文字（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）、またタンパク質配列では「Ｘ」という文字（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）を用いて置換される。
【００５８】
フィルタリングは、データベース配列に対してではなく、クエリー配列（またはその翻訳産物）のみに適用される。デフォルトフィルタリングは、ＢＬＡＳＴＮに関してはＤＵＳＴであり、他のプログラムに関してはＳＥＧである。
【００５９】
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴにおける配列に適用される場合、何もかもがＳＥＧ、ＸＮＵまたはその両方により遮断されないことが例外的ではなく、したがってフィルタリングは必ずしも効果をもたらすことが期待されるべきではない。さらに、場合によっては、配列はその完全性が遮断され、フィルタリングされないクエリー配列に対して報告される任意のマッチの統計学的有意性が疑わしくなるはずであることを示す。
【００６０】
ＮＣＢＩ−ｇｉ−は、アクセッションおよび／またはローカス名に加えて、ＮＣＢＩ  ｇｉ識別子を出力で示させる。
【００６１】
最も好ましくは、配列比較は、ncbi.nlm.nih.gov/BLASTにあるワールドウェブサイト上に提供される簡単なＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて実施される。本発明の幾つかの実施形態では、配列同一性を確定する場合にギャップペナルティが使用されない。
【００６２】
Ｒｅｇα１またはＴＩＭＰ１のヌクレオチド配列は、血清、結腸細胞または組織のような患者試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸配列を特定するために設計されるプローブおよびプライマーの生成のために本発明で有用である。プローブ／プライマーとして有用なヌクレオチド配列として、配列番号１、３もしくは３３のすべてまたは一部、あるいはそれらに相補的な配列、あるいは配列番号１、３または３３のすべてまたは一部に緊縮条件下でハイブリダイズする配列が挙げられる。例えば、本発明はまた、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供し、このオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３もしくは３３、またはそれらに相補的な配列、あるいはそれらの天然に存在する突然変異体の少なくともおよそ８個、好ましくは約１２個、好ましくは約１５個、好ましくは約２５個、より好ましくは約４０個の連続ヌクレオチド〜最大完全長のセンスまたはアンチセンス配列に緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。例えば、配列番号１、３もしくは３３、またはそれらに相補的な配列で表される核酸に基づくプライマーは、患者の臨床試料から得られるｍＲＮＡ試料内に含まれる鋳型核酸（例えば、Ｒｅｇ１α）を増幅するための反応で使用され得る。
【００６３】
プローブはＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１を検出するのに有用なＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１をコードする核酸配列に基づいているだけでなく、それらは患者における野生型Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１における突然変異を検出する方法を提供することもできる。野生型Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１に相補的であり、かつ突然変異遺伝子とミスマッチを形成することができる核酸プローブが提供され、酵素的または化学的切断により、あるいは電気泳動移動度におけるシフトにより検出が可能である。同様に、対象配列に基づいたプローブは、例えば予後または診断アッセイで使用するための、同じかまたは同種のタンパク質をコードする転写物あるいはゲノム配列を検出するために使用され得る。好ましい実施形態では、核酸プローブはさらに、そこに結合され、かつ検出可能な標識群を含み、例えば標識群は、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、色素原性化合物、酵素および酵素補因子から選択される。
【００６４】
プローブ、プライマーの生成、あるいはＲｅｇ１αもしくはＴＩＭＰ１タンパク質自体またはそれらに対する抗体を産生するための転写に有用な開示された核酸を含む完全長ｃＤＮＡ分子は、以下のように得られ得る。配列番号１、３もしくは３３、あるいはそれらに相補的な配列の少なくともおよそ８個、好ましくは約１２個、好ましくは約１５個、好ましくは約２５個、より好ましくは約４０個のヌクレオチド〜完全長の配列を含むＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の核酸配列あるいはそれらの一部は、プローブ設計方法、クローニング方法、および米国特許第５，６５４，１７３号の「分泌タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチド(Secreted Proteins and Polynucleotides Encoding Them)」（参照により本明細書に援用される）を用いてｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイズする成員を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。ｃＤＮＡライブラリーは、正常または腫瘍組織のような選択組織から、あるいは例えば薬剤で治療した哺乳類の組織から作製され得る。好ましくは、組織は、核酸およびｃＤＮＡがともに発現遺伝子を表すため、核酸を生成するのに使用されるのと同じである。あるいは、多くのｃＤＮＡライブラリーが市販されている(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989))。ライブラリー構築に関する細胞型の選択は、核酸関連遺伝子によりコードされるタンパク質の独自性が既知となった後になされ得る。これにより、どの組織および細胞型が関連遺伝子を発現する可能性が高く、それによりｃＤＮＡを生成するためのｍＲＮＡを含有するかを示される。
【００６５】
核酸より大きなライブラリーの成員、好ましくは天然のメッセージの全配列を含有するライブラリーの成員が得られ得る。完全ｃＤＮＡが得られたことを確認するために、ＲＮＡ保護実験が以下のように実施され得る。完全ｃＤＮＡのｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、ＲＮアーゼ分解からＲＮＡを保護し得る。ｃＤＮＡが完全長でない場合、ハイブリダイズされないｍＲＮＡ部分がＲＮアーゼ分解され得る。これは、ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動移動度の変化により、あるいは放出されるモノリボヌクレオチドの検出により、当該技術分野で既知であるようにアッセイされ得る(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989)。部分的ｃＤＮＡの末端に対してさらなる配列５’を得るために、５’ＲＡＣＥ(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc. 1990))を実施してもよい。
【００６６】
ゲノムＤＮＡ（例えば、Ｒｅｇ１αゲノムＤＮＡ）は、完全長ｃＤＮＡの単離に類似した様式で核酸を用いて単離され得る。簡潔に述べると、核酸またはその一部はゲノムＤＮＡのライブラリーに対するプローブとして使用されてもよい。好ましくは、ライブラリーは、核酸を生成するのに使用された細胞型から得られる。最も好ましくは、ゲノムＤＮＡは、実施例において本明細書中に記載する生物学的物質から得られる。かかるライブラリーは、Sambrook et al., pages 9.4-9.30で詳述されるように、Ｐ１またはＹＡＣのようなゲノムの大きなセグメントを保有するのに適したベクター中に存在し得る。さらに、ゲノム配列は、例えばResearch Genetics, Inc., Huntville, Alabama, USAから市販されるヒトＢＡＣライブラリーから単離され得る。さらなる５’または３’配列を得るために、Sambrook等に記載されるように染色体歩行を実施してもよく、その結果ゲノムＤＮＡの隣接しかつ重複した断片が単離される。これらは、制限消化酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、当該技術分野で既知であるように、マッピングおよび統合され得る。
【００６７】
本発明の核酸を用いて、相当する完全長遺伝子は、ｃＤＮＡライブラリーを構築およびプローブするために古典的方法およびＰＣＲ方法の両方を用いて単離することができる。いずれかの方法を用いて、好ましくはノーザンブロットが、どの細胞系が最大の割合で所定の遺伝子を発現するかどうかを確定するために、多数の細胞型で実施され得る。
【００６８】
上述のSambrook等におけるｃＤＮＡライブラリーを構築する古典的な方法。これらの方法を用いて、ｃＤＮＡはｍＲＮＡから産生されて、ウイルスまたは発現ベクターに挿入され得る。典型的には、ポリ（Ａ）テールを含むｍＲＮＡのライブラリーは、ポリ（Ｔ）プライマーを用いて産生され得る。同様に、ｃＤＮＡライブラリーは、プライマーとして本Ｒｅｇ１α配列またはその一部を用いて産生され得る。
【００６９】
ＰＣＲ方法は、所望の挿入物を含むｃＤＮＡライブラリーの成員を増幅するのに使用され得る。この場合、所望の挿入物は、Ｒｅｇ１αをコードする配列に相当する完全長ｃＤＮＡ由来の配列を含有する。かかるＰＣＲ方法は、ジーントラップ法およびＲＡＣＥ方法を包含する。
【００７０】
ジーントラップ方法は、ｃＤＮＡライブラリーの成員をベクターに挿入することを伴い得る。続いて、ベクターを変性させて、一本鎖分子を産生し得る。次に、ビオチン化オリゴのような基質結合プローブを用いて、所定のｃＤＮＡ挿入物を捕捉し得る。ビオチン化プローブはアビジン結合固体基板に連結され得る。ＰＣＲ方法を用いて、捕捉されたｃＤＮＡを増幅することができる。完全長遺伝子に相当する配列を捕捉するために、標識プローブ配列は、配列番号１もしくは３、またはそれらに相補的な配列の核酸に基づき得る。ランダムプライマーまたはライブラリーベクターに特異的なプライマーを用いて、捕捉さされたｃＤＮＡを増幅することができる。かかるジーントラップ技法は、Gruber et al., ＰＣＴ国際公開第９５／０４７４５号およびGruber et al., 米国特許第５，５００，３５６号に記載されている。ジーントラップ法実験を実施するためのキットが、例えばLife Technologies, Gaithersburg, Maryland, USAから市販されている。
【００７１】
「ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅」、すなわちＲＡＣＥは、多数の異なるＲＮＡからｃＤＮＡを増幅するＰＣＲ方法である。ｃＤＮＡはオリゴヌクレオチドリンカーに連結されて、２つのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅され得る。一方のプライマーは本核酸由来の配列に基づいて得て、それは完全長配列が望ましく、第２のプライマーは、ｃＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズする配列を含み得る。この方法の説明は、ＰＣＴ国際公開第９７／１９１１０号で報告されている。
【００７２】
ＲＡＣＥの好ましい実施形態では、共通のプライマーがｃＤＮＡ末端に連結される随意のアダプター配列にアニーリングするように設計され得る（Apte and Siebert, Biotechniques 15:890-893, 1993、Edwards et al., Nuc. Acids Res. 19:5227-5232, 1991)。単一遺伝子特異的ＲＡＣＥプライマーが共通プライマーと対形成される場合、単一遺伝子特異的プライマーと共通プライマーとの間の配列の優先的な増幅が行われる。ＲＡＣＥで使用するために変更された市販のｃＤＮＡプールが入手可能である。
【００７３】
いったん完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子が得られればＤＮＡをコードする変異体は、Sambrook 15.3-15.63に詳述される部位特異的突然変異誘発により調製され得る。置き換えられるべきコドンまたはヌクレオチドの選択は、変更タンパク質構造および／または機能を達成するためのアミノ酸の任意の変化に関する本明細書中の開示に基づくことができる。
【００７４】
血清のような生物学的物質からＤＮＡまたはＲＮＡを得る代替的方法としては、本発明の１つまたは複数の核酸の配列を有するヌクレオチドを含む核酸を合成することができる。したがって、本発明は、約８個のヌクレオチド（配列番号１もしくは３、またはそれらに相補的な配列の核酸配列に緊縮条件下でハイブリダイズするか、あるいはそれらに対して少なくとも８０％同一である少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに相当する）から核酸分子の複製および発現を含む１つまたは複数の生物学的操作に適した最大長までの長さの範囲の核酸分子を包含する。本発明は、（ａ）完全Ｒｅｇ１α遺伝子またはそれらに相補的な配列のサイズを有する核酸、（ｂ）融合タンパク質の発現を可能にするように操作可能に連結される少なくとも１つのさらなる遺伝子も含む（ａ）の核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）を含む発現ベクター、（ｄ）（ａ）または（ｂ）を含むプラスミド、および（ｅ）（ａ）または（ｂ）を含む組換えウイルス粒子を包含するが、これらに限定されない。 
【００７５】
本発明の核酸配列は限定されず、Ａ、Ｔ、Ｇおよび／またはＣ（ＤＮＡに関して）、ならびにＡ、Ｕ、Ｇおよび／またはＣ（ＲＮＡに関して）あるいはそれらの修飾塩基（イノシンおよびプソイドウリジンを含む）の任意の配列であり得る。配列の選択は所望の機能に依存し、所望のコード領域、所望のイントロン様領域、および所望の調節領域により影響され得る。
【００７６】
プローブ調製
患者の試料へのプローブ核酸のハイブリダイゼーション前に、ハイブリダイゼーションの続く検出を容易にするために、核酸試料を調製しなくてはならない。結腸直腸癌に関してスクリーニングされるべき個体から得られる核酸試料（Ｒｅｇ１αおよび任意に少なくとも１つの他の結腸直腸癌関連マーカーをコードする核酸配列を含む）は、１つまたは複数のタイプの化学結合により、通常相補塩基対形成により、通常水素結合形成により、相補配列の核酸プローブにより結合されることが可能である。
【００７７】
Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１および任意に少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカーにハイブリダイズするための、したがってそれらの存在を特定するための本発明で有用なプローブは、Ｒｅｇ１αまたは任意に少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードするｍＲＮＡ転写物に由来するポリヌクレオチド分子にハイブリダイズするように設計され得る。本明細書中で使用する場合、「ｍＲＮＡ転写物に由来するポリヌクレオチド」は、ｍＲＮＡ転写物またはそれらの配列の合成が最終的に鋳型として作用したポリヌクレオチドを指す。したがって、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されるＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡ等はすべてｍＲＮＡ転写物に由来するものであり、かかる由来産物の検出は、試料における元の転写物の存在および／または存在量を示している。したがって、適切な標的核酸試料としては、遺伝子（単数または複数）（すなわち、Ｒｅｇ１αまたは結腸直腸癌関連マーカー）のｍＲＮＡ転写物、ｍＲＮＡから転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるｃＲＮＡ、遺伝子（単数または複数）から増幅されるＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用されるポリヌクレオチドプローブは、好ましくは、Ｒｅｇ１αまたは任意に少なくとも１つの他の結腸直腸癌関連マーカーをコードする配列にハイブリダイズするように設計される。
【００７８】
核酸プローブは、当業者に既知の技法を用いて生成され得る（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)を参照）。
【００７９】
試料中の標的配列へのプローブ核酸のハイブリダイゼーションを測定するために、プローブ核酸は、好ましくは検出可能な標識で標識される。分子に結合されるか、または分子に組み込まれる任意の分析的に検出可能なマーカーが本発明で使用され得る。分析的に検出可能なマーカーは、分析的に検出および定量化される任意の分子、部分または原子を指す。
【００８０】
本発明で使用するのに適した検出可能な標識としては、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物が挙げられる。本発明で有用な標識としては、標識ストレプトアビジン結合体で染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーン蛍光タンパク質等）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで一般に使用される他のもの）、および比色標識（例えば、コロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック製の（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズ）が挙げられる。かかる標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【００８１】
かかる標識を検出する手段は当業者に既知である。したがって、例えば、放射標識は写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出され得て、蛍光マーカーは、放出される光を検出するための光検出器を用いて検出され得る。酵素標識は通常、酵素に基質を供給し、基質上での酵素の作用により産生される反応生成物を検出することにより検出され、比色標識は、単に着色標識を可視化することにより検出される。
【００８２】
標識は、当業者に既知の多数の手段のいずれかにより核酸に組み込まれ得る。しかしながら、好ましい実施形態では、標識は、プローブポリヌクレオチドの調製における増幅工程中に同時にプローブに組み込まれる。したがって、例えば、標識プライマーまたは標識ヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または他の増幅反応は、標識増幅産物、したがって標識プローブを提供する。
【００８３】
あるいは、標識はプローブに直接付加されてもよい。標識をポリヌクレオチドへ結合する手段は当業者に既知であり、例えばニックトランスレーションまたは末端標識（例えば標識ＲＮＡを用いて）、および続く試料ポリヌクレオチドを標識（例えば、フルオロフォア）に連結するポリヌクレオチドリンカーの結合（連結）を包含する。
【００８４】
好ましい実施形態では、蛍光修飾は、シアニン色素、例えばＣｙ−３／Ｃｙ−５  ｄＵＴＰ、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５  ｄＣＴＰ(Amersham Pharmacia)またはアレクサ色素(Khan, J., Simon, R., Bittner, M., Chen, Y., Leighton, S.B., Pohida, T., Smith, P.D., Jiang, Y. Gooden, G.C., Trent, J.M. & Meltzer, P.S. (1998) Cancer Res. 58, 50095013)によるものである。
【００８５】
好ましい実施形態では、Ｒｅｇ１αにハイブリダイズすることが可能であるプローブ核酸、および少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする核酸配列にハイブリダイズすることが可能であるプローブ核酸は、試験試料（例えば、血清試料）に同時ハイブリダイズされる。この実施形態では、比較に使用される２つのプローブ試料は識別可能な検出シグナルを生じる異なる蛍光色素で標識され、例えば、Ｒｅｇ１αとハイブリダイズするプローブはＣｙ５で標識され、別の結腸直腸癌関連マーカーとハイブリダイズするプローブはＣｙ３で標識される。異なって標識された標的試料は同じマイクロアレイに同時にハイブリダイズされる。
【００８６】
好ましい実施形態では、対照プローブは、Ｒｅｇ１α用のプローブおよび／またはさらなる結腸直腸癌関連マーカー用のプローブと一緒に試料に同時にハイブリダイズされてもよく、ここで対照プローブは、臨床試料中に見出されることがわかっている核酸配列にハイブリダイズすることが可能であり、ここでは臨床試料は血清試料であり、対照配列は血清アルブミンまたはフィブリノゲンをコードする配列であり得る。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はさらに、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１あるいは他の結腸直腸癌関連マーカーの発現を検出するのに有用なベクターおよびプラスミドを提供し、さらに本明細書中に提供するベクターおよびプラスミドを発現する宿主細胞を提供する。以下に記載するようにベクターまたはプラスミドからの発現に有用な核酸配列としては、上述の方法により差次的に調節されると特定される任意の核酸または遺伝子配列が挙げられるが、これらに限定されず、さらにアンチセンス分子のような治療用核酸分子が挙げられる。宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。ポリヌクレオチド配列を発現ベクターのような遺伝子構築物に連結し、宿主（真核生物（酵母、鳥類、昆虫または哺乳類）または原核生物（細菌細胞）のいずれか）に形質転換またはトランスフェクトすることは、当該技術分野で既知の標準的な手順である。
【００８７】
ベクター
本発明による差次的に発現される核酸分子の発現に有用である当該技術分野で既知であり、かつ入手可能な広範囲の一連のベクターが存在する。特定のベクターの選択は、差次的に発現される核酸によりコードされるポリペプチドの対象とされる使用に明らかに依存する。例えば、選択ベクターは、細胞型が原核生物であろうと真核生物であろうと、所望の細胞型中でのポリペプチドの発現を駆動することが可能でなくてはならない。ベクターの多くは、操作可能に連結された遺伝子配列の原核生物ベクター複製および真核生物発現の両方を可能にする配列を含む。
【００８８】
本発明による有用なベクターは自己複製能を有し、すなわち、ベクター、例えばプラスミドは染色体外に存在し、その複製は必ずしも宿主細胞のゲノムの複製に直接関連されない。あるいは、ベクターの複製は宿主の染色体ＤＮＡの複製に関連されてもよく、例えば、ベクターはレトロウイルスベクターにより達成されるように宿主細胞の染色体に統合されてもよい。
【００８９】
本発明による有用なベクターは、好ましくは、配列の転写および翻訳を可能にする所定の配列（例えば、Ｒｅｇ１α）に操作可能に連結される配列を含む。所定の連結配列の転写を可能にする配列としてはプロモーターが挙げられ、任意に連結配列の強力な発現を可能にするエンハンサー要素（単数または複数）も挙げられる。「転写調節配列」という用語は、プロモーターおよび操作可能に連結された核酸配列に所望の発現特性（例えば、高レベル発現、誘導性発現、組織または細胞型特異的発現）を付与する任意のさらなる配列の組合せを指す。
【００９０】
選択プロモーターは、選択宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得て、宿主細胞で通常発現される遺伝子、あるいは他の細胞または生物で通常発現される遺伝子に由来し得る。プロモーターの例としては、以下の：Ａ）原核生物プロモーター−大腸菌  ｌａｃ、ｔａｃまたはｔｒｐプロモーター、λファージＰＲまたはＰＬプロモーター、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、Ｓｐ６プロモーター、枯草菌(B. subtilis)アルカリプロテアーゼプロモーター、およびＢ．ステアロサーモフィルスマルトゲニック(maltogenic)アミラーゼプロモーター等、Ｂ）真核生物プロモーター−酵母プロモーター（例えば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４および他の解糖作用遺伝子プロモーター（例えば、Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 12073-12080、Alber & Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1:419-434を参照）、ＬＥＵ２プロモーター(Martinez-Garcia et al., 1989, Mol Gen Genet. 217:464-470)、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(Young et al., 1982, in Genetic Engieering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al., eds., Plenum Press, NY)、またはＴＰＩ１プロモーター（米国特許第４，５９９，３１１号））、昆虫プロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター（米国特許第４，７４５，０５１号、Vasuvedan et al., 1992, FEBS Lett. 311:7-11)、Ｐ１０プロモーター(Vlak et al., 1988, J. Gen. Virol. 69:765-766)、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)ポリヘドロシスウイルス塩基性タンパク質プロモーター（欧州特許第３９７４８５号）、バキュロウイルス最初期遺伝子プロモーター遺伝子１プロモーター（米国特許第５，１５５，０３７号および同第５，１６２，２２２号）、バキュロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーター（同様に米国特許第５，１５５，０３７号および同第５，１６２，２２２号）、およびＯｐＭＮＰＶ最初期プロモーター２、哺乳類プロモーター−ＳＶ４０プロモーター(Subramani et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1: 854-864)、メタロチオネインプロモーター（ＭＴ−１、Palmiter et al., 1983, Science 222: 809-814）、アデノウイルス２主要後期プロモーター(Yu et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12:9309-21)、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）または他のウイルスプロモーター(Tong et al., 1998, Anticancer Res. 18:719-725)、あるいはさらには特定の細胞型における所定の遺伝子の内因性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
選択プロモーターはまた、それを誘導性または組織特異的にさせる配列に連結されてもよい。例えば、選択プロモーターの上流での組織特異的エンハンサー要素の付加は、プロモーターを既定の組織または細胞型でより活性にさせ得る。あるいは、またはさらには、誘導性発現は、例えば熱変化（温度感受性）、化学処理（例えば、金属イオンまたはＩＰＴＧ誘導性）、または抗生物質誘導剤（例えば、テトラサイクリン）の添加により誘導を可能にする多数の配列要素のいずれかにプロモーターを連結させることにより達成され得る。
【００９２】
調節可能発現は、例えば、薬剤誘導性（例えば、テトラサイクリン、ラパマイシン、またはホルモン誘導性）である発現系を用いて達成される。哺乳類細胞で使用するのに特に十分適した薬剤調節可能プロモーターとしては、テトラサイクリン調節可能プロモーター、およびグルココルチコイドステロイド調節可能プロモーター、性ホルモンステロイド調節可能プロモーター、エクジソン調節可能プロモーター、リポ多糖（ＬＰＳ）調節可能プロモーター、およびイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）調節可能プロモーターが挙げられる。哺乳類細胞で使用するための調節可能発現系は、理想的には、調節剤に応答して非哺乳類ＤＮＡモチーフを結合する（か、または結合することができない）転写調節因子、およびこの転写調節因子のみに応答性である調節配列を包含すべきであるが、必ずしもそうとは限らない。
【００９３】
組織特異的プロモーターはまた、本発明の差次的に発現される配列コード構築物で好適であるように使用され得る。広範囲の各種組織特異的プロモーターが既知である。本明細書中で使用する場合、「組織特異的」という用語は、既定のプロモーターが生物のすべてに満たない細胞または組織で転写的に活性である（すなわち、プロモーターのポリペプチド産物の検出を可能にするのに十分な連結配列の発現を誘導する）ことを意味する。組織特異的プロモーターは、好ましくは１つのみの細胞型で活性であるが、例えば細胞型の特定の種類または系統（例えば、造血細胞）で活性であってもよい。本発明による有用な組織特異的プロモーターは、事実上そのプロモーターに連結された遺伝子の発現の様式またはパターンと本質的に同じである様式またはパターンでの操作可能に連結される核酸配列の発現に必要かつ十分な配列を含む。以下に記載するものは、組織特異的プロモーターの非限定的リストおよび各々の組織でプロモーターの発現特性を達成するための必須配列を含む文献参照であり、これらの文献参照それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本発明で有用な組織特異的プロモーターの例は以下の通りである：
Bowman et al., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 12115-12119は、脳特異的トランスフェリンプロモーターについて記載しており、シナプシンＩプロモーターはニューロン特異的であり(Schoch et al., 1996 J. Biol. Chem. 271, 3317-3323)、ネスチンプロモーターは有糸分裂後ニューロン特異的であり(Uetsuki et al., 1996 J. Biol. Chem. 271, 918-924)、ニューロフィラメント軽プロモーターはニューロン特異的であり(Charron et al., 1995 J. Biol. Chem. 270, 30604-30610)、アセチルコリン受容体プロモーターはニューロン特異的であり(Wood et al., 1995 J. Biol. Chem. 270, 30933-30940)、およびカリウムチャネルプロモーターは高頻度発射ニューロン特異的である(Gan et al., 1996 J. Biol. Chem 271, 5859-5865)。当該技術分野で既知の任意の組織特異的転写調節配列は、疼痛にさらされた動物から得られる差次的に発現される核酸配列をコードするベクターを用いた場合に好適であるために使用され得る。  
【００９４】
プロモーター／エンハンサー要素のほかに、本発明による有用なベクターは、適切なターミネーターをさらに含み得る。かかるターミネーターとしては、例えばヒト成長ホルモンターミネーター（上述のPalmiter et al., 1983）、あるいは酵母または真菌宿主に関しては、ＴＰＩ１（上述のAlber & Kawasaki, 1982）またはＡＤＨ３ターミネーター(McKnight et al., 1985, EMBO J.4:2093-2099)が挙げられる。
【００９５】
本発明による有用なベクターはまた、ポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０またはＡｄ５Ｅ１ｂポリ（Ａ）配列）、および転写エンハンサー配列（例えば、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡ由来のもの）を含んでもよい。さらに、本発明による有用なベクターは、特定の細胞区画へと組換えポリペプチドを誘導するシグナル配列をコードしてもよく、あるいは組換えポリペプチドの分泌を誘導するシグナルをコードしてもよい。
【００９６】
ａ．プラスミドベクター
選択宿主細胞型での所定のコード配列（例えば、Ｒｅｇ１αのコード配列）の発現を可能にする任意のプラスミドベクターが本発明による使用に許容可能である。本発明で有用なプラスミドベクターは、本発明による有用なベクターの上述の特性のいずれかまたはすべてを有し得る。本発明による有用なプラスミドベクターとしては、以下の例：細菌性−ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９(Qiagen)、ｐＢｓ、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ(Stratagene)、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５(Pharmacia)、真核生物性−ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ(Stratagene)、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ(Pharmacia)が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、宿主において複製可能であり、かつ生存可能である限りは、任意の他のプラスミドまたはベクターを使用してもよい。
【００９７】
ｂ．バクテリオファージベクター
本発明による有用な多数の既知のバクテリオファージ由来のベクターが存在する。挿入物によりコードされるポリペプチドの誘導性発現を可能にするλＺａｐＩＩまたはλＺａｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓベクター(Stratagene)のようなλベースのベクターがこれらの中でも最も重要である。他としては、Ｍ１３ベースのファミリーのベクターのような繊維状バクテリオファージが挙げられる。
【００９８】
ｃ．ウイルスベクター
多数の種々のウイルスベクターは本発明により有用であり、細胞における１つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドの導入および発現を可能にする任意のウイルスベクターが本発明の方法で使用するのに許容可能である。外来核酸を細胞へ送達するのに使用され得るウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびセムリキ森林ウイルス（アルファウイルス）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。欠陥レトロウイルスは遺伝子移入で使用するのに十分に特性化されている（概説に関しては、Miller, A.D. (1990) Blood 76:271を参照）。組換えレトロウイルスを産生するためのプロトコルおよびかかるウイルスを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を感染させるためのプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14、および他の標準的な実験室マニュアルに見出すことができる。
【００９９】
レトロウイルス以外に、アデノウイルスは、それが所定の遺伝子産物をコードおよび発現するが、正常な溶解性ウイルスライフサイクルで複製するその能力に関しては不活性であるように操作することができる（例えば、Berkner et al., 1988, Bio Techniques 6:616、Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434、およびRosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155を参照）。アデノウイルス株Ａｄ型５  ｄｌ３２４またはアデノウイルスの他の株に（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）由来する適切なアデノウイルスベクターが当業者に既知である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および産生的なライフサイクルのためのヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような別のウイルスを必要とする天然に存在する欠陥ウイルスである（概説に関しては、Muzyczka et al., 1992, Curr. Topics in Micro. and Immunol. 158:97-129を参照）。Traschin等(1985, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260)に記載されるようなＡＡＶベクターは、核酸を細胞へ導入するのに使用することができる。各種核酸が、ＡＡＶベクターを用いて種々の細胞型へ導入されている（例えば、Hermonat et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470、およびTraschin et al., 1985. Cell. Biol. 4:2072-2081を参照）。
【０１００】
宿主細胞
所定の遺伝子（例えば、Ｒｅｇ１αをコードする配列）を保有する組換えベクターが導入されてもよく、またベクターが差次的に発現される配列によりコードされるペプチドの発現を駆動するように容認されている任意の細胞が本発明により有用である。本発明の差次的に発現される分子が発現され得て、好ましくは検出され得る任意の細胞が適切な宿主であり、ここで宿主は、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞である。各種の種々の生物（原核生物および真核生物の両方）由来の宿主細胞へ核酸配列を導入するのに適したベクターは、上述に記載しているか、または当業者に既知である。
【０１０１】
宿主細胞は、多数の細菌株のいずれかのような原核細胞であってもよく、あるいは酵母もしくは他の真菌細胞、昆虫もしくは両生類細胞、または哺乳類細胞（例えば、げっ歯類、サルまたはヒト細胞を含む）のような真核細胞であってもよい。細胞は、初代培養細胞、例えば初代ヒト線維芽細胞またはケラチノサイトであってもよく、あるいはＮＩＨ３Ｔ３、２９３ＴまたはＣＨＯ細胞のような樹立細胞系であってもよい。さらに、本発明で有用な哺乳類細胞は、表現型的に正常であってもよく、または発癌的に形質転換されてもよい。当業者は培養で選ばれた宿主細胞型を容易に樹立および維持することができると想定する。
【０１０２】
宿主細胞へのベクターの導入
本発明で有用なベクターは、当業者に既知の多数の適切な方法のいずれかにより選択宿主細胞へ導入され得る。例えば、ベクター構築物は、λまたはＭ１３のような大腸菌バクテリオファージベクター粒子の場合には感染により、あるいはプラスミドベクターまたはバクテリオファージＤＮＡに関する多数の形質転換方法のいずれかにより、適切な細菌細胞へ導入され得る。例えば、標準的な塩化カルシウム媒介性細菌形質転換は、裸のＤＮＡを細菌に導入するのに依然として一般的に使用される(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)が、エレクトロポレーションもまた使用され得る(Ausubel et al., 1988, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY, NY))。
【０１０３】
酵母または他の真菌細胞へのベクター構築物の導入に関して、化学的形質転換方法が一般に使用される（例えば、Rose et al., 1990, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)の形質転換に関しては、例えば、細胞を酢酸リチウムで処理して、およそ１０４コロニー形成ユニット（形質転換細胞）／μｇ（ＤＮＡ）の形質転換効率を達成する。続いて、形質転換細胞を、使用する選択マーカーに適した選択培地上で単離する。あるいは、またはさらには、プレートまたはプレートから取り上げたフィルターを、ＧＦＰ蛍光に関してスキャンして、形質転換コロニーを同定してもよい。
【０１０４】
哺乳類細胞への所定の配列を含むベクターの導入に関して、使用される方法はベクターの形態に依存する。プラスミドベクターは、多数のトランスフェクション方法（例えば、脂質媒介性トランスフェクション（「リポフェクション」）、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿を含む）のいずれかにより導入され得る。これらの方法は、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1988, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY)に詳述されている。
【０１０５】
広範囲の各種形質転換および非形質転換または一次細胞の一過性のトランスフェクションに適したリポフェクション試薬および方法は広く入手可能であり、リポフェクションを、培養で真核生物、特に哺乳類細胞へ構築物を導入する魅力的な方法にしている。例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）(Life Technologies)またはＬｉｐｏＴａｘｉ（商標）(Stratagene)キットが入手可能である。リポフェクション用の試薬および方法を提供する他の会社としては、Bio-Rad Laboratories、CLONTECH、Glen Research、InVitrogen、JBL Scientific、MBI Fermentas、Pan Vera、Promega、Quantum Biotechnologies、Sigma-Aldrich、およびWako Chemicals USAが挙げられる。
【０１０６】
本発明のベクターによるトランスフェクションに続いて、構築物を首尾よく組み込んでいる（染色体内にまたは染色体外に）真核生物（例えば、ヒト）細胞を、上述のように、トランスフェクトした集団を選択剤（例えば、耐性遺伝子がベクターによりコードされる抗生物質）で処理すること、あるいは例えば細胞集団のＦＡＣＳまたは接着培養の蛍光スキャニングを用いた直接的スクリーニングのいずれかにより選択され得る。頻繁に、両タイプのスクリーニングが使用されてもよく、ここでネガティブ選択を用いて、構築物を取り込む細胞を富化させ、ＦＡＣＳまたは蛍光スキャニングを用いて、それぞれ差次的に発現されるポリヌクレオチドを発現する細胞をさらに富化させるか、あるいは細胞の特定のクローンを特定する。例えば、ネオマイシン類縁体Ｇ４１８(Life Technologies, Inc.)によるネガティブ選択を用いて、ベクターを受け取った細胞を特定してもよく、蛍光スキャニングを用いて、最大程度でベクター構築物を発現する細胞または細胞のクローンを特定しても良い。
Ｒｅｇ１αおよびＴＩＭＰ１ポリペプチド
本発明は、個体からの臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の存在を検出することによる個体における結腸直腸癌の検出方法を提供する。さらに、本発明は、結腸組織または細胞におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１遺伝子産物を特定することによる癌の検出を包含する。あるいは、本発明は、個体における結腸直腸癌の検出方法に関し、ここで結腸直腸癌は、個体からの臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１および少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカーの存在を検出することにより特定される。本発明のポリペプチド（その検出が結腸直腸癌を示している）は、１つまたは複数の配列番号２、４または１００で示される配列を含むポリペプチド、あるいは１つまたは複数の配列番号１、３または３３によりコードされるポリペプチドを包含する。
【０１０７】
個体で検出することができ、したがって個体における結腸直腸癌を示している好ましいポリペプチドは、配列番号１、３または３３の核酸配列に相補的なｍＲＮＡ配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、または９８％同一である核酸配列によりコードされるものである。特に好ましいポリペプチドは、配列番号２、４もしくは９９を有するものまたはそれらの断片、あるいは１つまたは複数の配列番号２、４もしくは１００のアミノ酸配列に対して配列において少なくとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるポリペプチド配列である。
【０１０８】
個体からの臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１ポリペプチドの存在を特定することにより結腸直腸癌を検出する方法のほかに、本発明はさらに、同じ試料（例えば、同じ血清、組織または細胞試料）における少なくとも１つの他の結腸直腸癌関連マーカーに加えてＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の存在を特定することにより癌を検出する方法を含む。
【０１０９】
抗体
本発明は、個体からの臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１（および任意に、少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカー）の存在を検出する工程を含む結腸直腸癌検出方法を提供する。一実施形態では、かかる試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１、あるいは他のマーカーの存在は、好ましくは検出可能に標識され、かつ試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１、および存在すれば他のマーカーに結合することが可能であるポリペプチドリガンドを用いて検出される。好ましい実施形態では、ポリペプチドリガンドは抗体である。本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、抗イディオタイプ抗体、あるいは他のエピトープ結合性ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１（および任意に、少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカー）の検出のために本発明で有用な抗体は、ヒト抗体またはそれらの断片（ｓｃＦＶ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｄ、Ｆｖの一本鎖抗体を含む）である。本発明で有用な抗体としては、完全重鎖または軽鎖定常部またはそれらの一部、あるいはそれらの欠如が挙げられ得る。本発明で有用な抗体は、ウサギ、マウス、ラット、ロバ、ヒツジ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはトリのような当該技術分野で認識される宿主から得られ得る。一実施形態では、本発明で有用な抗体はヒト化抗体であり得て、ここではもとの結合能力を依然として保持しながら、より密接にヒト抗体に似せるために、アミノ酸を非抗原結合領域で置き換えている。ヒト化抗体の作製方法は、Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7308-7312、Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:7279、Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16、国際公開第９２／０６１９３号、欧州特許第０２３９４００号に記載されている。
【０１１０】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより大きな多重特異性であり得る。したがって、結腸直腸癌の検出に有用なＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１、および任意にさらなる結腸直腸癌関連マーカーは別個の抗体で検出されてもよく、あるいは同じ抗体で検出されてもよい。あるいは、多重特異性抗体は、同じタンパク質上の異なるエピトープ（例えば、Ｒｅｇ１α上の異なるエピトープ）に異なる特異性を示し得る。Ｒｅｇ１αあるいは１つまたは複数のさらなる結腸直腸癌関連マーカーのいずれかに対する本発明で有用な抗体の特異性が好ましいものの、結腸直腸癌の検出のための本発明で有用なポリペプチド（すなわち、Ｒｅｇ１αおよび／またはさらなる結腸直腸癌関連マーカー）に対して少なくとも９５％、９０％、８５％、７５％、６５％、５５％、および少なくとも５０％同一性を有するポリペプチドを結合する抗体もまた本発明で包含される。また、配列番号１、３または３３の配列に相補的であるか、またはそれらにハイブリダイズする１つまたは複数の核酸配列、あるいは本明細書中に記載されるようなさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする核酸配列に相補的であるか、またはそれらにハイブリダイズする１つまたは複数の配列によりコードされるリペプチド分子に結合する抗体も包含される。
【０１１１】
結腸直腸癌の検出に有用である本発明の抗体は、それらが結合するポリペプチド分子の活性のアゴニストまたはアンタゴニストとしてさらに作用してもよく、したがって結腸直腸癌の治療または防止用の治療用分子として有用であり得る。
【０１１２】
本発明の抗体の重要ではあるが限定的ではない役割は、患者試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１あるいは他の結腸直腸癌関連マーカーの精製あるいは検出（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ検出方法の両方を含む）を提供することである。本明細書中に記載するように結腸直腸癌の検出に有用な抗体は、単独で使用される必要はなく、抗体ポリペプチド配列のＮまたはＣ末端で異種ポリペプチドを含む他のポリペプチドに融合させることができる。例えば、本発明で有用な抗体は検出可能な標識と融合させて、標的ポリペプチドに結合される場合に抗体の検出を容易にし得る。
【０１１３】
本発明で有用な抗体の産生に関して、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む様々な宿主を、本発明の候補遺伝子のタンパク質産物（または免疫原性特性を保持するそれらの任意の部分、断片またはオリゴヌクレオチド）により注射により免疫化してもよい。宿主種に依存して、免疫学的応答を増強するために、様々なアジュバントを使用してもよい。かかるアジュバントとしては、フロイント、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えば、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン）、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)は潜在的に有用なヒトアジュバントである。
【０１１４】
ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の方法を用いて作製することができる。マウス、ハムスター、またはウサギのような哺乳類を、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１ポリペプチド、断片、それらの修飾形態、またはそれらの変異体の免疫原性形態を用いて免疫化することができる。あるいは、１つまたは複数のさらなる結腸直腸癌関連マーカーポリペプチドの免疫原性形態で動物を免疫化してもよい。かかる分子に免疫原性を付与する技法としては、担体への結合または当該技術分野で既知の他の技法が挙げられる。例えば、免疫原性分子は上述のようなアジュバントの存在下で投与することができる。免疫化は、血漿または血清中の抗体力価の検出によりモニタリングすることができる。標準的なイムノアッセイ手順は抗原としての免疫原とともに使用して、抗体のレベルおよび特異性を評価することができる。免疫化に続いて、抗血清を得ることができ、望ましい場合、血清からポリクローナル抗体を単離することができる。
【０１１５】
モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化動物から収集して、標準的な体細胞融合手順により骨髄腫細胞と融合させ、したがってこれらの細胞を不死化して、ハイブリドーマ細胞を生じることができる。かかる技法は当該技術分野で既知である（例えば、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497、Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72、Cole et al., 1985, In Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy, Allen R. Bliss, Inc. pages 77-96を参照）。さらに、一本鎖抗体の産生に関して記載される技法（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明による抗体を産生するように適応させることができる。
【０１１６】
Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１あるいは他の結腸直腸癌関連マーカーポリペプチド、それらの断片、それらの修飾形態、およびそれらの変異体のような本発明のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体断片もまた既知の技法により生成され得る。例えば、かかる断片としては、抗体分子のペプシン消化により産生され得るＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限定されない。ＶＨ領域およびＦＶ領域は、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌で発現される（例えば、Ward ert al., 1989, Nature 341:544-546、Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281、McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554）。
【０１１７】
キメラ抗体、すなわち非ヒト動物可変部およびヒト定常部を組み合わせる抗体分子もまた本発明の範囲内である。キメラ抗体としては、例えば、ヒト定常部を有するマウス、ラットまたは他の種由来の抗原結合ドメインが挙げられる。標準的な方法を用いて、本発明のＲｅｇ１α抗原の遺伝子産物を認識する免疫グロブリン可変部を含有するキメラ抗体を作製し得る（例えば、Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851、Takeda et al., 1985, Nature 314:452、米国特許第４，８１６，５６７号、米国特許第４，８１６，３９７号を参照）。
他の結腸直腸癌特異的分析
Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の発現を特定すること、あるいはＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１ポリペプチドを検出することによる結腸直腸癌の検出に加えて、本発明は結腸直腸癌を検出する方法をさらに含み、ここでＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１をコードする核酸分子、あるいはＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１ポリペプチドは、個体からの臨床試料における既知の結腸直腸癌関連マーカーをコードする少なくとも１つの他の核酸配列と組み合わせて同定される。あるいは、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の存在は、少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌マーカーアミノ酸配列と組み合わせて検出される。Ｒｅｇ１αに関して上述した方法と同様に、少なくとも１つの他の結腸直腸癌関連マーカーをコードする核酸分子は、患者試料における結腸直腸癌関連マーカー配列の検出用の核酸プローブを生成するのに使用してもよく、あるいは配列を含む患者試料から結腸直腸癌関連配列を増幅するための増幅プライマーを生成するのに使用してもよく、したがって試料における結腸直腸癌関連マーカーの存在を特定し、したがって結腸直腸癌の検出を示す。結腸直腸癌関連マーカーポリペプチド配列は、Ｒｅｇ１αに関して上述するように、臨床試料における結腸直腸癌関連マーカーの検出に有用な抗体を生成するのに使用され得る。結腸直腸癌関連マーカー核酸またはアミノ酸配列を検出する方法を以下に記載し、それらの方法は、臨床試料におけるＲｅｇ１α核酸またはアミノ酸の検出方法から適応され得る。
【０１１８】
本発明で有用な「結腸直腸癌関連マーカー」は、結腸直腸癌を有さない個体から得られる細胞、組織または血清における発現レベルに対して、結腸直腸癌を有する個体から得られる結腸癌細胞、組織または血清において少なくとも１０％の過剰または過少発現を示すポリペプチドまたは核酸配列を指す。本発明で有用な結腸直腸癌関連マーカーの非限定的な例としては、配列番号１、３、５〜７１の核酸分子、および／または配列番号２、４、７２〜１３８のポリペプチド分子が挙げられる。一実施形態では、配列番号２、４、７２〜１３８のポリペプチド配列は、それぞれ１、３、５〜７１の核酸配列によりコードされる。本発明の方法がＲｅｇ１αおよび少なくとも１つの他の結腸直腸癌関連マーカーの検出に関する場合、ＴＩＭＰ１は潜在的な「他の結腸直腸癌関連マーカー」として包含され得ることが当業者には理解されよう。同様に、検出方法がＴＩＭＰ１および少なくとも１つの他の結腸直腸癌関連マーカーの検出に基づく場合、Ｒｅｇ１αは「他の結腸直腸癌関連マーカー」として包含され得る。あるいは、本発明で使用される場合の結腸直腸癌関連マーカーは、ポリペプチドまたは核酸分子上に存在する糖鎖エピトープ、および／またはかかるエピトープを認識し、かつそれらに結合することが可能である抗体分子を指してもよく、ここで糖鎖エピトープは、個体における結腸直腸癌の存在に関連することが知られている。かかる糖鎖エピトープは、２つ以上の未関連タンパク質またはポリペプチド上に存在し得る。一実施形態では、かかる糖鎖エピトープは、シアリル−Ｌｅｗｉｓａとしても知られるＣＡ１９−９であり、様々な糖タンパク質または糖脂質に共有結合される分岐状５糖構造から構成される血液型群抗原に関連した糖鎖エピトープとしてモノクローナル抗体により規定される腫瘍マーカーである。タンパク質は主としてムチンファミリーに属し、脂質は通常膜に関連している。ＣＡ１９−９エピトープは典型的にいずれかの巨大分上の複雑なＯ連結糖鎖構造の末端部分である。「結腸直腸癌関連マーカー」として本発明で有用な各種糖鎖エピトープとして同様に定義される他の腫瘍マーカーとしては、ＣＡ７２−４、ＴＦ、ｓＴｎ、Ｔｎ、ＣＡ５０、ＣＡ５４９、ＣＡ２４２、ＬＡＳＡ、およびＤＵ−ＰＡＮ’ｓ１−５が挙げられる。
【０１１９】
以下の表１は、本発明で有用な「結腸直腸癌関連マーカー」のリストを示し（しかしながら、本発明で有用な結腸直胃癌関連マーカーは表１に示すものに限定されない）、「配列表」に記載する配列と対応させてある。
【０１２０】
【表１】
2004198419.tif 000002
2004198419.tif 000003
検出アッセイ
本発明は、結腸直腸癌を検出するか、あるいは開示したバイオマーカー（すなわち、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の核酸配列、および任意にさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする１つまたは複数の核酸配列、および／またはＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１、および任意に少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカーのようなポリペプチドマーカー）を、それらによりコードされる疾患または状態に関して検出することにより被験体が結腸直腸癌を発症する危険性を有するかどうかを確定する方法を提供する。
【０１２１】
臨床用途では、ヒト組織試料、好ましくは血清は、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１および／または本明細書中で特定される他の結腸直腸癌関連マーカーの存在および／または非存在に関してスクリーニングすることができる。かかる試料は、組織試料、細胞全体、細胞溶解産物、または単離核酸（例えば、針生検コア、外科的切除試料、リンパ節組織、または血清を含む）を包含し得る。本明細書中に記載するような分析用試料は、好ましくは血清試料である。血清試料は、当業者に既知の方法を用いて個体から得られ得る。簡潔に述べると、個体からの全静脈血または動脈血試料が試験管に収集される。全血試料を室温でおよそ１５〜３０分間インキュベートさせて、血液を凝固させる。いったん凝固したら、試料をおよそ１５００〜３０００ｒｐｍで５〜３０分間遠心分離して、細胞構成成分から血清を完全に分離させる。必要であればこの遠心分離を繰り返して、完全分離を達成してもよい。得られた血清試料は続いてＲｅｇ１α核酸またはアミノ酸および／または本明細書中に記載するような１つまたは複数のさらなる結腸直腸癌関連マーカーの存在に関してスクリーニングされ得る。
核酸分子に関するスクリーニング
一実施形態では、本発明の検出方法は、個体からの臨床試料が結腸直腸癌関連マーカー、好ましくはＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１を含有するが、同様に任意に本明細書中に記載するようなさらなる結腸直腸癌関連マーカーを含むかどうか確定することを含む。所定の核酸分子の存在を確定する技法としては、ノーザンブロット分析、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、および定量的増幅が挙げられる。
【０１２２】
臨床試料における標的核酸分子の検出より前に、まず試料からｍＲＮＡを単離して、標的配列（すなわち、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１をコードする配列）の検出を容易にすることが好ましい。生物学的試料からｍＲＮＡを単離する方法は当該技術分野で既知である。簡潔に述べると、試料が血清試料である場合、例えば、２Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４）０．１ｍｌ、水飽和フェノール１ｍｌ、および４９：１のクロロホルム／イソアミルアルコール０．２ｍｌを順次血清試料に添加する。各構成成分を添加した後に試料を混合し、構成成分すべてを添加した後、０〜４℃で１５分間インキュベートする。試料を１０，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離することで分離して、１００％イソプロパノール１ｍｌを添加することにより沈殿させ、−２０℃で３０分間インキュベートして、１０，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離することでペレット化する。得られたＲＮＡペレットを変性溶液０．３ｍｌ中に溶解して、マイクロフュージチューブに移して、１００％イソプロパノール０．３ｍｌの添加により−２０℃で３０分間沈殿させ、４℃にて１０，０００×ｇで１０分間遠心分離する。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄して、乾燥させて、ＤＥＰＣ処理水またはＤＥＰＣ処理０．５％ＳＤＳ  １００〜２００μｌ中に再懸濁させる(Chomczynski and Sacchi, 1987, Anal. Biochem., 162:156)。
【０１２３】
あるいは、Ｔｒｉｚｏｌ(Invitrogen, Carlsbad, CA)のような市販のＲＮＡ単離試薬を用いて、製造業者の説明書に従って本発明による臨床試料から全ＲＮＡを抽出してもよい。ＲＮＡの純度および完全性は、２６０／２８０ｎｍでの吸光度、および１％アガロースゲル上の単離、続く紫外線下での検査により評価される。
【０１２４】
ｍＲＮＡ単離後、当業者に既知の方法に従って、ｍＲＮＡを逆転写させて、ｃＤＮＡ試料を提供してもよい（例えば、Ausubel et al. (1995), Short Protocols in Molecular Biology, 3rdEd. John Wiley and Sons, Inc.を参照）。
【０１２５】
したがって、一態様では、本発明は、本明細書中に開示されるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸配列に特異的にハイブリダイズするか、または本明細書中に記載するようなさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする核酸分子にハイブリダイズすることができるプローブおよびプライマーを提供する。したがって、核酸プローブは、配列番号１、３または３３の配列に実質的に相補的な核酸とハイブリダイズするのに十分な配列番号１、３または３３の核酸配列領域を含む。プローブ／プライマーとして使用するための好ましい核酸分子は、配列番号１、３または３３の配列とハイブリダイズするのに十分な配列番号１、３または３３の配列に実質的に相補的な核酸配列領域をさらに含むことができる。さらに、プローブ／プライマーとして有用な核酸配列は、マーカー核酸配列（それらの核酸配列は、配列番号１、３または３３、あるいはそれらに相補的な配列で表される）のコード配列の一部に相補的であるコード配列の少なくとも約８ヌクレオチド長、少なくとも約１２ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは約２５個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも４０個のヌクレオチド、および最大それらのすべてまたはほぼすべてのヌクレオチド配列を含む。
【０１２６】
一実施形態では、上記方法は、臨床試料（例えば、血清試料またはそれらから抽出される核酸試料）におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸分子の存在を確定するために核酸プローブを使用することを含む。具体的には、上記方法は、以下：
１．配列番号１、３または３３により表される核酸配列、あるいはそれらに相補的な配列のコード配列の一部に相補的なコード配列の少なくとも約８ヌクレオチド長、少なくとも約１２ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２５個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチド、および最大それらのすべてまたはほぼすべてのヌクレオチド配列を含む核酸プローブを供給すること、
２．Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸配列を潜在的に含む患者から臨床試料を得ること、
３．結腸直腸癌を有さないことがわかっている個体からの第２の臨床試料を供給すること、
４．核酸プローブを、上記第１および第２の臨床試料それぞれのＲＮＡと緊縮下で接触させること（例えば、ノーザンブロットまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイで）、
５．（ａ）第１の血清試料のＲＮＡとのプローブのハイブリダイゼーション量を、（ｂ）第２の臨床試料のＲＮＡとのプローブのハイブリダイゼーション量と比較することであって、第２の臨床試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーション量と比較した場合の第１の臨床試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーション量の統計学的に有意な差異が第１の臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の存在を示している、比較することと
を含む。
【０１２７】
主として血清試料のような臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の検出が描かれるが、一態様では、本発明は、配列番号１、３または３３により表される核酸配列、あるいはそれらに相補的な配列に由来するプローブによる、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出を含む方法を提供する。好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブは検出可能に標識される。上記方法は、標識したハイブリダイゼーションプローブを、結腸直腸癌を有することが疑わしい個体からの組織または細胞試料と接触させること、任意の未結合プローブを洗い流すこと、および検出可能な標識により生じるシグナルを検出することであって、検出可能なシグナルの検出が試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の存在を示しており、したがって結腸直腸癌の検出を可能にする、検出することを含む。あるいは、組織または細胞は、少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカーをコードする核酸配列と特異的にハイブリダイズすることが可能である検出可能に標識した核酸プローブとさらにハイブリダイズされる。したがって、第２の検出可能に標識されたプローブの検出は、試料におけるさらなる結腸直腸癌関連マーカーの存在を示しており、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の検出と併用して、個体における結腸直腸癌の検出を可能にする。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの特定の方法は当該技術分野で既知である。
【０１２８】
あるいは、ＰＣＲ、ノーザン分析およびＴａｑｍａｎのような方法を用いて、診療試料におけるＲｅｇ１αをコードする核酸配列の発現を検出および／または定量化してもよい。一実施形態では、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、臨床試料から単離されるＲｅｇ１αｍＲＮＡ配列の規定部分に特異的にハイブリダイズするように設計されたプライマーを用いて実施される。したがって、かかる反応によるＰＣＲ産物の生成は、試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１配列の存在を示している。ＰＣＲ増幅用のプライマーを設計する技法は、当該技術分野で既知である。オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、５〜１００ヌクレオチド長、理想的には１７〜４０個のヌクレオチドであるが、種々の長さのプライマーおよびプローブが有用である。増幅用プライマーは、好ましくは約１７〜２５個のヌクレオチドである。本発明による有用なプライマーはまた、融解温度推定方法により特定の融解温度（Ｔｍ）を有するように設計される。Ｏｌｉｇｏ（登録商標）(MBI, Cascade, CO)を含む市販のプログラム、Ｐｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含むインターネット上で利用可能なプライマー設計およびプログラムを用いて、本発明による有用な核酸配列のＴｍを算出することができる。好ましくは、例えばＯｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒにより算出される場合の本発明による有用な増幅プライマーのＴｍは、好ましくは約４５〜６５℃、より好ましくは約５０〜６０℃である。好ましくは、本発明による有用なプローブのＴｍは、相当する増幅プライマーのＴｍよりも７℃高い。ＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡの生成に続いて、ｃＤＮＡ断片をＰＣＲＩＩベクター（ＴＡクローニングキット、Invitrogen）のような適切なシーケンシングベクターにクローニングすることが好ましい。続いて、クローニングした断片それぞれの独自性を、両方向でシーケンシングすることにより確認する。シーケンシングから得られる配列は、本明細書中で記載するようなＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の既知の配列と同じであると予測される。
【０１２９】
あるいは、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１をコードするｍＲＮＡ配列の存在は、ノーザン分析により検出されてもよい。配列を確認したｃＤＮＡ、すなわちＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１（あるいはさらなる結腸直腸癌関連マーカー）をコードするｃＤＮＡを用いて、当該技術分野で既知の技法を用いて３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを産生する（例えば、上述のAusubelを参照）。ノーザン分析用の標識プローブはまた、市販のキット（Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキット、Stratagene, La Jolla, CA）を用いて産生され得る。臨床試料から得られる全ＲＮＡのノーザン分析は、古典的に記載される技術を用いて実施され得る。例えば、全ＲＮＡ試料をホルムアルデヒド／ホルムアミドで変性させて、１％アガロースのＭＯＰＳ−アセテート−ＥＤＴＡゲル中に２時間流す。続いて、ＲＮＡを上向きのキャピラリー作用によりニトロセルロース膜に転写して、ＵＶ架橋結合により固定する。膜を少なくとも９０分間プレハイブリダイズし、４２℃で一晩ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後に、当該技術分野で既知であるように洗浄を実施する（上述のAusubel）。続いて、膜を増感紙とともに−８０℃で一晩ｘ線フィルムに暴露させる。続いて、フィルムへの暴露後に、標識膜を可視化させる。次に、放射標識したｃＤＮＡプローブによりｘ線フィルム上に生じるシグナルを、フィルムのスキャニングおよびＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ(National Institutes of Health, Bethesda, MD)のようなコンピュータプログラムを用いた相対ピクセル強度の定量化のような当該技術分野で既知の任意の技法を用いて定量化することができ、ここで臨床試料へのＲｅｇ１α特異的プローブのハイブリダイゼーションの検出は、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の存在を示しており、したがって結腸直腸癌を検出するのに使用され得る。
【０１３０】
代替的実施形態では、臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の存在、および量は任意に、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）(Perkin-Elmer, Foster City, CA)技法を用いて確定されてもよく、それは転写物特異的アンチセンスプローブ（すなわち、Ｒｅｇ１αに特異的にハイブリダイズすることが可能なプローブ）を用いて実施される。このプローブはＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１  ＰＣＲ産物に特異的であり、オリゴヌクレオチドの５’末端に複合体形成される励起エネルギー吸収剤および蛍光レポータープローブを用いて調製される。種々の蛍光マーカーを種々のレポーターに結合させることができ、１つの反応で２つの産物の測定（例えば、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１、および少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカーの測定）を可能にする。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが活性化されると、それはその５’から３’へのヌクレオチド切断(nucleolytic)活性により蛍光レポーターを切断する。今や励起エネルギー吸収剤から解放されたレポーターは蛍光を発する。色彩変化は各特定の産物の量に比例し、蛍光測定器により測定される。したがって、各色彩の量を測定することができ、ＲＴ−ＰＣＲ産物を定量化することができる。ＰＣＲ反応は９６ウェルプレート中で実施することができ、その結果多くの個体に由来する試料を同時にプロセシングおよび測定することができる。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）系はゲル電気泳動を必要としないというさらなる利点を有し、標準曲線とともに使用されると定量化が可能である。
【０１３１】
ポリペプチド分子のスクリーニング
上述のＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１特異的抗体および結腸直腸癌マーカー特異的抗体は、当該技術分野で既知の任意の方法により臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１あるいはさらなる結腸直腸癌関連マーカーの存在を検出するのに使用され得る。使用することができるイムノアッセイとしては、例えばウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイのような技法を用いた競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York、これはその全体が参照により本明細書に援用される）。例示的なイムノアッセイについて以下に簡単に記載する（しかし、限定の手段として意図されない）。
【０１３２】
免疫沈降プロトコルは概して、プロテインホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）で補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０、１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２にて）、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中に細胞集団を溶解すること、所定の抗体を細胞溶解産物に添加すること、４℃で一定時間（例えば、１〜４時間）インキュベートすること、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解産物に添加すること、４℃で約１時間以上インキュベートすること、溶解緩衝液中でビーズを洗浄すること、およびＳＤＳ／試料緩衝液中にビーズを再懸濁させることを含む。しかしながら、血清試料の免疫沈降の場合では、上記プロトコルは細胞溶解工程なしで実施される。抗体の、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１（または他の結腸直腸癌マーカー）抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウェスタンブロット分析により評価され得る。抗原への抗体の結合を増加させ、かつバックグラウンドを減少させる（例えば、セファロースビーズで細胞溶解産物を予め清浄化すること）ために変更され得るパラメーターは当業者に既知である（上述のAusubel et al,）。
【０１３３】
Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１ポリペプチド、および任意に１つまたは複数のさらなる結腸直腸癌関連マーカーは、ウェスタンブロット分析を用いて患者の臨床試料において検出され得る。簡潔に述べると、ウェスタンブロット分析は、タンパク質試料の調製、ポリアクリルアミドゲル（例えば、８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でのタンパク質試料の電気泳動、ポリアクリルアミドゲルから膜（例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロン）へのタンパク質試料の転写、ブロック用溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは脱脂乳を有するＰＢＳ）での膜のブロック、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中での膜の洗浄、ブロック用緩衝液で希釈した一次抗体（所定の抗体）での膜のブロック、洗浄緩衝液中での膜の洗浄、ブロック用緩衝液で希釈した酵素基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合された二次抗体（これは一次抗体を認識する、例えば抗ヒト抗体）での膜のブロック、および抗原の存在の検出を含む。かかる分析の最適化方法は当該技術分野で既知である（上述のAusubel et al,）。
【０１３４】
あるいは、臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１および任意に１つまたは複数のさらなる結腸直腸癌関連マーカーの存在はＥＬＩＳＡで検出されてもよい。ＥＬＩＳＡは、抗原を調製すること、９６ウェルマイクロタイタープレート（または他の適切な容器）のウェルを抗原でコーティングすること、酵素基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合された所定の抗体をウェルに添加すること、および一定時間インキュベートすること、ならびに抗原の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡでは、所定の抗体は検出可能な化合物に結合される必要はなく、その代わりに、検出可能な化合物に結合された第２の抗体（これは所定の抗体を認識する、すなわちＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１あるいは第２の結腸直腸癌関連マーカーに結合する抗体）がウェルに添加されてもよい。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、検出可能な化合物に結合された第２の抗体は、コーティングされたウェルに所定の抗原を添加した後に添加され得る。この方法は、当業者に知られている技法に従って修正または最適化され得る。
【０１３５】
抗原への抗体の結合親和性、および抗体−抗原相互作用のオフレートは競合結合アッセイにより確定することができる。かかるアッセイの一例は、標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉで標識したＲｅｇ１α）を抗Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１抗体とともに増加量の未標識抗原の存在下でインキュベートすること、および標識抗原に結合される抗体を検出することを含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する所定の抗体の親和性、および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によりデータから確定することができる。第２の抗体との競合もまた、ラジオイムノアッセイを用いて確定することができる。この場合、抗原は、増加量の未標識の第２の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に結合された所定の抗体とともにインキュベートされる。
【０１３６】
好ましくは、上記検出アッセイは、配列番号１、３または３３の配列、あるいはそれらに相補的な配列を有する核酸によりコードされるタンパク質産物を検出するために抗体を用いて実施される。好ましくは、タンパク質産物は、１つまたは複数の配列番号２、４または１００の配列を有する。さらに、上記検出アッセイは、少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカーを特異的に認識し、かつそれらに結合する１つまたは複数の抗体を用いて実施され得る。したがって、一実施形態では、アッセイは、試験細胞のタンパク質を、配列番号１、３または３３、あるいはそれらに相補的な配列により表される核酸の遺伝子産物に特異的な抗体と接触させること、ならびに抗体および試験細胞のタンパク質により免疫複合体の固定化の概算量を確定することを包含し、ここではかかる免疫複合体の検出は抗原の存在を示しており、従って結腸直腸癌の検出を可能にする。
【０１３７】
本発明で有用なイムノアッセイとしては上述のものが挙げられ、同様に均一および不均一手段の両方（例えば、蛍光分極イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）および比濁分析阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ））を挙げることができる。
【０１３８】
別の実施形態では、患者の生物学的液体（例えば、血液または尿）中のコード産物、すなわち配列番号１、３または３３、あるいはそれらに相補的な配列によりコードされる産物のレベルは、その患者の細胞におけるマーカー核酸配列の発現レベルをモニタリングする手段として確定され得る。かかる方法は、患者から生物学的液体試料を得る工程、試料（または試料からのタンパク質）をコードマーカーポリペプチドに特異的な抗体と接触させる工程、および抗体による免疫複合体形成の量を確定する工程を包含し、免疫複合体形成の量は、試料におけるマーカーコード産物のレベルを示している。この確定は、正常な個体から採取された対照試料中あるいは同じ人物から予めもしくは後に得られる１つまたは複数の試料中での同じ抗体による免疫複合体形成の量と比較する場合に特に有益である。
【０１３９】
別の実施形態では、上記方法を用いて細胞中に存在するマーカーポリペプチドの量を確定することができ、続いて過剰増殖障害（例えば、結腸直腸癌）の進行と相関させることができる。マーカーポリペプチドのレベルは、細胞の試料が、形質転換細胞であるか、または形質転換細胞になる傾向にある細胞を含有するかどうかを予測的に評価するために使用することができる。さらに、本方法は、形質転換されることが既知である細胞の表現型を評価するのに使用することができ、表現型決定の結果は、特定の治療レジメンを計画するのに有用である。例えば、試料細胞における非常に高レベルのマーカーポリペプチドは、結腸直腸癌のような癌用の強力な診断および予後マーカーである。マーカーポリペプチドレベルの観察は、例えばより積極的な治療の使用に関する決定で利用され得る。
【０１４０】
上述のように、本発明の一態様は、患者から単離された細胞の状況で、マーカーポリペプチドレベルが試料細胞で有意に減少されるかどうかを確定するための検出アッセイに関する。「有意に減少される」という用語は、細胞が、同様の組織源の正常細胞に対して減少された細胞量のマーカーポリペプチドを保有する細胞表現型を指す。例えば、細胞は、正常対照細胞よりも約５０％、２５％、１０％または５％未満のマーカーポリペプチドを有してもよい。特に、アッセイは試料細胞におけるマーカーポリペプチドレベルを評価し、好ましくは、少なくとも１つの対照細胞、例えば正常細胞および／または既知の表現型の形質転換細胞で検出されるマーカーポリペプチドと、測定レベルを比較する。
【０１４１】
本発明で特に重要なのは、正常もしくは異常Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１発現のレベルを定量化する能力である。Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の発現、および／またはＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１の発現レベルは、患者が結腸直腸癌を発症する傾向にあるかどうかを予測的に評価するために、あるいは結腸直腸癌の重篤性を確定するのに使用することができる。
【０１４２】
一実施形態では、組織試料は、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１を発現する細胞（すなわち、結腸細胞）数を確定するのに使用され得る免疫組織化学染色によりＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１発現を測定するのに使用され得る。かかる染色に関して、組織のマルチブロックが生検材料または他の組織試料から採取され、プロテアーゼＫまたはペプシンのような作用物質を用いてタンパク質分解的加水分解にさらされる。ある特定の実施形態では、試料細胞から核分画を単離して、核分画におけるマーカーポリペプチドレベルを検出することが望ましい場合がある。
【０１４３】
組織試料は、ホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノール等のような試薬による処理により固定化される。続いて、試料は、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１および任意にさらなる結腸直腸癌関連マーカーに対して結合特異性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体とともにインキュベートされる。この抗体は、続く結合の検出用の標識に結合されてもよい。試料は免疫複合体の形成に十分な時間インキュベートされる。続いて、抗体の結合は、この抗体に結合された標識により検出される。抗体が未標識である場合、第２の標識抗体（例えば、抗マーカーポリペプチド抗体のアイソタイプに特異的な）を使用してもよい。使用され得る標識の例としては、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、酵素等が挙げられる。
【０１４４】
酵素が使用される場合、酵素用の基質を試料に添加して、着色または蛍光産物を提供してもよい。結合体で使用するのに適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。市販されていない場合、かかる抗体−酵素結合体は、当業者に既知の技法により容易に産生される。試料（血清または組織のいずれか）におけるポリペプチドの存在および／または量を確定するための当業者に既知の他のアッセイもまた本発明により包含される。
薬剤スクリーニング
幾つかのｉｎ  ｖｉｖｏ方法が、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸（配列番号１、３または３３、あるいはそれらに相補的な配列）の発現を調整し、かつ／またはコードポリペプチド（例えば、配列番号２、４または１００）の生理活性を変更させる（例えば、阻害する）化合物を特定するのに使用することができる。
【０１４５】
薬剤スクリーニングは、細胞試料に試験化合物を添加すること、およびその影響をモニタリングすることにより達成される。試験化合物を与えない並行試料もまた対照としてモニタリングされる。続いて、処理細胞および未処理細胞を、顕微鏡分析、生存度試験、複製する能力、組織学的検査、細胞に関連した特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、細胞または細胞溶解産物により発現される酵素活性のレベル、および他の細胞または化合物と相互作用する細胞の能力を含むがこれらに限定されない任意の適切な表現型基準により比較される。処理細胞と未処理細胞との間の差異は、試験化合物に起因する影響を示す。
【０１４６】
試験化合物の望ましい影響としては、癌関連マーカー核酸配列により付与された任意の表現型に対する影響が挙げられる。例としては、ｍＲＮＡの過多を制限する試験化合物、コードタンパク質の産生を制限する試験化合物、またはタンパク質の機能的影響を制限する化合物が挙げられる。試験化合物の影響は、処理細胞と未処理細胞との間の結果を比較すると明らかである。
【０１４７】
したがって、本発明はまた、作用物質がｍＲＮＡの産生を阻害することが可能であるかどうかを確定するために、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸ｍＲＮＡが検出可能である細胞または組織のいずれか、あるいはＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸を含み、かつそれらを発現することが可能な培養細胞を作用物質に暴露させること、および暴露細胞または組織におけるｍＲＮＡレベルを確定することを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸（配列番号１、３または３３、あるいはそれらに相補的な配列）の発現を阻害する作用物質に関してスクリーニングする方法を包含し、ここでは細胞株を作用物質に暴露した後のｍＲＮＡレベルの減少はマーカー核酸ｍＲＮＡ産生の阻害を示している。
【０１４８】
あるいは、スクリーニング方法は、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１タンパク質の産生を阻害することが疑わしい作用物質に対してＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１が検出可能である細胞または組織、あるいはＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１を発現する培養細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングすること、および細胞または組織におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１タンパク質のレベルを確定することを包含してもよく、ここでは細胞または組織を作用物質に暴露した後のマーカータンパク質のレベルの減少は、マーカータンパク質産生の阻害を示している。
【０１４９】
本発明はまた、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１  ｍＲＮＡあるいはタンパク質が検出可能である腫瘍細胞または血清を有する哺乳類を、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の産生を阻害することが疑わしい作用物質に暴露させること、および暴露哺乳類の血清または腫瘍細胞におけるマーカーｍＲＮＡあるいはタンパク質のレベルを確定することを含む、マーカー核酸の発現を阻害する作用物質に関するｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング方法を包含する。哺乳類を作用物質に暴露した後のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの減少は、マーカー核酸発現の阻害を示している。任意に、少なくとも１つのさらなる結腸直腸癌関連マーカーの発現に対する候補作用物質の影響もまた確定され得る。
【０１５０】
したがって、本発明は、マーカー核酸（配列番号１、３または３３、あるいはそれらに相補的な配列）を発現する細胞を試験化合物とともにインキュベートすること、およびｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定することを含む方法を提供する。本発明はさらに、細胞集団または臨床試料におけるマーカー核酸の発現のレベルを定量的に確定する方法、および作用物質が細胞集団または臨床試料におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸の発現レベルを増加あるいは減少させることが可能であるかどうかを確定する方法を提供する。作用物質が細胞集団におけるＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸の発現のレベルを増加あるいは減少させることが可能であるかどうかを確定する方法は、（ａ）対照および作用物質処理細胞集団から細胞抽出物を調製する工程、（ｂ）細胞抽出物からＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１ポリペプチドを単離する工程、（ｃ）Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１ポリペプチドと上記ポリペプチドに特異的な抗体との間に形成される免疫複合体の量を（例えば、並行して）定量化する工程を含む。本発明のＲｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１ポリペプチドはまた、その生理活性に関してアッセイすることにより定量化されてもよい。Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸発現における増加を誘導する作用物質は、対照細胞において形成される免疫複合体の量と比較した場合の処理細胞において形成される免疫複合体の量を増加させるそれらの能力により特定され得る。類似の様式では、Ｒｅｇ１αまたはＴＩＭＰ１核酸の発現を減少させる作用物質は、対照細胞と比較した場合の処理細胞抽出物において形成される免疫複合体の量を減少させるそれらの能力により特定され得る。
【０１５１】
ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより確定され得る。ｍＲＮＡレベルはまた、ＰＣＲを包含する方法により確定され得る。高速大量処理（high throughput）アッセイで使用することができるｍＲＮＡを測定する他の高感度方法、例えばＤＥＬＦＩＡ終点検出および定量化方法を用いた方法は、例えば、Webb and Hurskainen (1996) Journal of Biomolecular Screening 1:119に記載されている。Ｒｅｇ１αタンパク質レベルは、配列番号２、４または１００のタンパク質産物を特異的に認識する抗体を用いた免疫沈降または免疫組織化学により確定され得る。
【０１５２】
薬剤スクリーニングアッセイで活性であると特定される作用物質は、細胞増殖活性を阻止するそれらの能力に関して試験されるべき候補物である。これらに作用物質は、細胞、特に結腸細胞、特に結腸直腸癌の異常成長を含む傷害を治療するのに有用である。
【０１５３】
各種アッセイ方式が十分であり、本開示を鑑みて、本明細書中に明記していないものはそれにもかかわらず当業者に理解されるであろう。例えば、アッセイは多くの異なる方式で生成させることができ、無細胞系、例えば精製タンパク質または細胞溶解産物に基づいたアッセイ、ならびに無傷細胞を利用する細胞ベースのアッセイを包含する。
【０１５４】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムでは、既定の期間で調査される化合物数を最大限にするために、高速大量処理（high throughput）アッセイが望ましい。精製もしくは半精製タンパク質または溶解産物、あるいは血清からの精製もしくは半精製されたタンパク質を用いて得られ得るような無細胞系で実施される本発明のアッセイは、それらが試験化合物により媒介される分子標的における変更の迅速な展開および比較的容易な検出を可能にするように生成され得る点で、「一次」スクリーンとして好適である場合が多い。さらに、試験化合物の細胞毒性および／またはバイオアベイラビリティの影響は概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で無視することができ、代わりにアッセイは、他のタンパク質との結合親和性の変更または分子標的の酵素特性における変化で明白であり得るように、主に分子標的に対する薬物の影響に焦点を当てている。
【０１５５】
［実施例］
以下の実施例は非限定的であり、本発明の様々な態様および特徴の単なる代表例である。
実施例１：抗Ｒｅｇ１α抗体の生成
Ｒｅｇ１αに対する抗体を生成するために、Ｒｅｇ１α（配列番号１または３のいずれかに示す）の完全長オープンリーティングフレームを、Ｃ末端エピトープおよび精製タグを含むｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ(Invitrogen)のような哺乳類発現ベクターへ定方向的にクローニングした。挿入配列はジデオキシシーケンシングにより確証された（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sonsを参照）。組換え融合タンパク質は、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）における一過性の発現系で産生された。組換えタンパク質を、Ｃ末端Ｈｉｓタグを利用することで固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）により細胞培養上清から精製した。本発明の抗体の産生に使用されるＲｅｇ１αタンパク質の配列は配列番号２または４のいずれかに示しており、そのすべてが機能的Ｒｅｇ１αタンパク質を表し、かつそれぞれ配列番号１または３によりコードされる。精製組換えＲｅｇ１αタンパク質をフロイントアジュバント中に乳化させて、ウサギに注射した。動物がＲｅｇ１αに対する特異的抗体の合理的な血清力価を誘発するまで、動物に周期的に追加免疫した。抗体産生方法は当業者に既知であり、例えば、Harlow et al. Antibodies: A laboratory manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratoryに見出され得る。自然および変性Ｒｅｇ１αの両方を認識するポリクローナル抗体を利用して、マイクロタイターベースのＥＬＩＳＡアッセイを展開した。ＥＬＩＳＡアッセイを実施する方法は当業者に既知である（例えば、上述のAsubel等を参照）。
実施例２：結腸直腸癌患者の血清試料におけるＲｅｇ１αの検出
本発明は個体における結腸直腸癌の検出方法に関し、この方法は結腸直腸癌を有する個体からの血清試料におけるＲｅｇ１αポリペプチドの検出を包含し、ここでＲｅｇ１αの検出は、結腸直腸癌の存在を示している。したがって、Ｒｅｇ１α発現は、結腸直腸癌を有すると診断された患者から得られた血清試料において測定された。
【０１５６】
この研究で使用される患者はすべて、診察、血液分析、イメージングおよび内視鏡を含む従来の診断手段を用いて有資格医師によりめいめいの医療機関で診断された。いったん特定されれば、患者はＩＲＢ認証プロトコルによりインフォームドコンセントを提供した。各患者における結腸直腸癌の重篤性はデュークス病期分類スキームを用いて類別した。続いて、当業者に既知の方法を用いて、各患者から血清試料を収集した。次に、上述のＥＬＩＳＡアッセイによりＲｅｇ１αの存在に関して試料を評価した。図１は、未処置患者および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または肝硬変のいずれかを有すると診断されたさらなる患者から得られた試料と比較した、結腸直腸癌患者で測定したＲｅｇ１αタンパク質のレベルを示す。図２は、結腸直腸癌の重篤性の各病期で特定される図１の結腸直腸癌患者におけるＲｅｇ１α発現レベルを示す。図１および図２でわかるように、Ｒｅｇ１α発現は、結腸直腸癌を有すると診断された患者から得られた血清試料において明らかに上昇しており、したがって患者における結腸直腸癌の存在を検出するのに使用され得る。
実施例３：結腸直腸癌におけるＲｅｇ１α核酸配列の検出
一実施形態では、本発明は、患者から得られる血清試料におけるＲｅｇ１αをコードする核酸分子の存在を検出することにより患者における結腸直腸癌の存在を検出する方法を提供する。
【０１５７】
血清は、上記の方法および当業者に既知の方法により結腸直腸癌が疑わしい患者から得られ得る。Ｒｅｇ１αをコードする核酸分子は、例えばノーザン分析により検出され得る。簡潔に述べると、患者の試料におけるＲｅｇ１αｍＲＮＡの検出用のプローブは、当該技術分野で既知の技法に従ってＲＴ−ＰＣＲによりＲｅｇ１αコード配列を増幅することにより得られる。続いてこの様式で生成されるｃＤＮＡ断片を、ＴＡクローニングキット(Invitrogen)を用いてＰＣＲＩＩベクターにクローニング（subsequently cloned）する。各断片の独自性は、クローニングベクターに存在するＴ３およびＴ７ポリメラーゼ部位から各方向でシーケンシングすることにより確証され得る。次に、この様式で産生されるｃＤＮＡ分子を用いて、例えばStrageneからのＰｒｉｍｅ−Ｉｔキットを用いて３２Ｐ標識Ｒｅｇ１αｃＤＮＡプローブを産生する。続いて、結腸直腸癌を有することが疑わしい患者の血清から単離した総ＲＮＡ５〜１０μｇを１×ＭＯＰＳ緩衝液中のアガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分離する。血清のような患者試料からＲＮＡを単離する方法は当該技術分野で既知である（例えば、上述のAusubel等を参照）。ＲＮＡの完全な状態を確定するためのエチジウムブロマイドでの染色および紫外線下での可視化後に、０．０５Ｍ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌでの処理、続く０．５Ｍ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ７．４）／１．５Ｍ  ＮａＣｌとのインキュベーションによりＲＮＡを加水分解する。ＲＮＡを当該技術分野で既知の方法により市販のナイロンまたはニトロセルロース膜（例えば、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ膜、Amersham, Arlington Heights, IL）に転写する（上述のAusubel等、上述のSambrook等）。転写およびＵＶクロスリンキング（UV cross linking）後に、膜をハイブリダイゼーション溶液中（例えば、５０％ホルムアミド／２．５％デンハルト／変性サケ精子ＤＮＡ１００〜２００ｍｇ／０．１％ＳＤＳ／５×ＳＳＰＥ中）で３２Ｐ標識Ｒｅｇ１αｃＤＮＡプローブと６５℃で一晩ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション条件は、上述のAusubel等および上述のSambrook等に記載されるように必要に応じて変更させることができる。ハイブリダイゼーション後、膜を２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で室温にて、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４２℃にて、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６５℃にて洗浄し、増感スクリーンとともに−８０℃で一晩フィルムに暴露させた。洗浄緩衝液の緊縮性もまた、バックグラウンドシグナルの量に応じて変更させることができる（上述のAusubel等）。続いて、フィルムを展開して、ＲＮＡへハイブリダイズした放射標識プローブに相当するバンド強度を、当業者に既知の方法を用いて、例えばフィルムをデジタル化して、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ(NIH, Bethesda, MD)のようなコンピュータソフトウェアプログラムを用いてバンド強度を解析することにより定量化する。
【０１５８】
あるいは、Ｒｅｇ１αｍＲＮＡは、Ｒｅｇ１α配列に特異的にハイブリダイズすることが可能であるオリゴヌクレオチドプライマーを用いたリアルタイム増幅により患者試料において検出され得る。例えば、リアルタイムＰＣＲおよびＴａｑＭａｎ（商標）プローブを用いて、患者試料におけるＲｅｇ１αｍＲＮＡの存在を検出および定量化してもよい。リアルタイムＰＣＲの技法は当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第５，６９１，１４６号、同第５，７７９，９７７号、同第５，８６６，３３６号および同第５，９１４，２３０号を参照）。Ｒｅｇ１α配列の増幅に有用なプライマーを設計する方法は当該技術分野で既知である（例えば、上述のAusubel等を参照）。
【０１５９】
患者の血清試料から得られるｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ試料を用いて、ＡＢＩ  ７７００配列検出システム(Applied Biosystems, Foster City, CA)によりＰＣＲ産物を生成してもよい。続いて、Ｒｅｇ１αｍＲＮＡレベルが上昇するかどうかを確定するために、患者試料におけるＲｅｇ１αの発現レベルの測定がなされてもよく、したがって患者における結腸直腸癌の検出手段を提供する。
実施例４：他の患者試料におけるＲｅｇ１αの検出
本発明の一実施形態では、結腸直腸癌は、血清試料ではない臨床患者試料のＲｅｇ１αの発現を検出することにより患者において検出され得る。例えば、循環細胞試料は、血液、糞便または他の身体液のような試料を収集することにより患者から得られ得る。続いて、例えば試料を適切な溶解緩衝液（例えば、３０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを含有する緩衝液（核酸の単離用））で処理することにより、試料を処理して、その中に存在する細胞を溶解する。続いて、得られた試料を、上述および上述のAusubel等に記載されるように試料から総ＲＮＡを単離することによりＲｅｇ１α発現に関して分析するか、あるいは試料をウェスタンブロットにより分析用のポリアクリルアミドゲル上で分離し得るか、または実施例２で上述するようにＥＬＩＳＡベースのアッセイで利用され得る。
実施例５．患者の血清試料におけるＴＩＭＰ１の検出
本発明は、患者試料、好ましくは血漿試料におけるＴＩＭＰ１ポリペプチドのレベルを測定することにより、患者における結腸直腸癌の検出およびモニタリングを提供する。ＴＩＭＰ１発現は、３５人の健常個体におけるＴＩＭＰ１の発現レベルに対する結腸直腸癌を有すると診断された患者からの６３個の試料で確定された。結果は、１つまたは複数の他の結腸直腸癌関連マーカーに加えて、ＴＩＭＰ１が正常試料に対して結腸直腸癌試料において過剰発現されることを実証し、したがって、ＴＩＭＰ１が患者における結腸直腸癌の検出用の貴重なマーカーであることを示す（図３）。
【０１６０】
ＴＩＭＰ１ポリペプチド発現レベルを評価するために、結腸直腸癌を有する患者からの６３個の前処理血漿試料、および健常ドナーからの３５個の試料を、市販のＥＬＩＳＡ（オステオポンチン）、ＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒイムノアッセイ（ＣＥＡおよびフェリチン）、または社内で開発したＥＬＩＳＡ（ＴＩＭＰ１）のいずれかで試験した。この研究に使用した患者はすべて、診察、血液分析、イメージングまたは内視鏡を含む従来の診断手段を用いて有資格医師によりめいめいの医療機関で診断された。いったん特定されれば、患者はＩＲＢ認証プロトコルによりインフォームドコンセントを提供した。各患者における結腸直腸癌の程度はデュークス病期分類スキームを用いて確定した。続いて、血清および血漿試料を当業者に既知の方法を用いて各患者から収集した。
【０１６１】
適切なカットオフ値での特異性を、正常試料を評価することにより各マーカー（例えば、ＴＩＭＰ１、オステオポンチン、ＣＥＡおよびフェリチン）に関して確定した。例えば、任意の既定のマーカーに関する１００％特異性カットオフは、最高の正常試料のマーカー値に等しい。カットオフとしてこれらの値を使用して、６３個の癌試料における各マーカーのレベルを、それら各々のカットオフ値と比較した。癌試料におけるレベルが確定したカットオフ値よりも高い場合、試料は「陽性」であると考えられ、斜線付きボックスで表される（図３）。この同じプロセスを９７％特異性で繰り返した（２番目に高い正常を用いて、例えば３５個の試料のうち３４個がこの値に等しいか、またはそれ以下であった）。全パネルに関する全体の特異性レベルは、パネルにおける各マーカーの特異性を乗じることにより算出される（例えば、９７％×９７％×９７％×９７％＝パネルに関する８９％特異性）。マーカーは、癌試料におけるそれらの過剰発現の頻度に従って、図３に示すグラフ上に配列させた（ＴＩＭＰ１は癌患者の最高数で過剰発現され、したがって第１に列挙される）。ＴＩＭＰ１の感度に最大を付加するマーカーは第２に位置づけられる。例えば、５７％感度／１００％特異性のグラフは、ＴＩＭＰ１が６３個の結腸直腸癌患者の血漿試料のうちの１９個で上昇し、したがってグラフ上で第１に列挙されることを示す。オステオポンチンに関して試料を評価することにより、７個のさらなる陽性患者試料が得られ、したがって、オステオポンチンはグラフ上で第２に列挙される。
【０１６２】
パネルの感度は、少なくとも１つのマーカーに関して陽性である試料の累積数を癌試料の総数（６３）で除算することにより確定された。
【０１６３】
他の実施形態
他の実施形態は当業者に明白である。上記に詳述した説明は単に明瞭性のために提供されるものであり、単なる例示である。本発明の精神（spirit）および範囲は上記実施例に限定されず、特許請求の範囲により包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】正常な対照患者（ｎ＝３５）、炎症性腸疾患を有すると診断された患者（ＩＢＤ、ｎ＝７）、肝硬変を有すると診断された患者（ｎ＝７）、および結腸直腸癌を有すると診断された患者（ｎ＝６３）から得られた血漿中に存在するＲｅｇ１αポリペプチドのレベルを示す。
【図２】癌の重症度に基づいて識別された結腸直腸癌患者群（ｎ＝６３）で測定したＲｅｇ１αポリペプチドのレベルを示す。癌の度合いはデュークス分類により確立されたものであり、デュークスＡ、Ｂ、ＣおよびＤの患者からのデータを示す。
【図３】結腸直腸癌を有する患者から得られた１つまたは複数の他の結腸直腸癌関連マーカーと一緒に表したＴＩＭＰ１ポリペプチドの血漿レベルのグラフ表示を示す。
【図１】
2004198419.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【配列表】
2004198419000001.app
【外国語明細書】
DETECTION METHODS USINGTIMP1
BACKGROUND OF THE INVENTION
Colorectal carcinoma is a malignant neoplasticdisease.  There is a high incidenceof colorectal carcinoma in the Western world, particularly in the UnitedStates.  Tumors of this type oftenmetastasize through lymphatic and vascular channels.  Many patients with colorectal carcinomaeventually die from this disease. In fact, it is estimated that 62,000 persons in the United States alonedie of colorectal carcinoma annually.
However, if diagnosed early, colorectal cancer may betreated effectively by surgical removal of the cancerous tissue.  Colorectal cancers originate in thecolorectal epithelium and typically are not extensively vascularized (and thereforenot invasive) during the early stages of development.  Colorectal cancer is thought to resultfrom the clonal expansion of a single mutant cell in the epithelial lining ofthe colon or rectum.  The transitionto a highly vascularized, invasive and ultimately metastatic cancer whichspreads throughout the body commonly takes ten years or longer.  If the cancer is detected prior toinvasion, surgical removal of the cancerous tissue is an effective cure.  However, colorectal cancer is oftendetected only upon manifestation of clinical symptoms, such as pain and blacktarry stool.  Generally, suchsymptoms are present only when the disease is well established, often aftermetastasis has occurred, and the prognosis for the patient is poor, even aftersurgical resection of the cancerous tissue.  Early detection of colorectal cancertherefore is important in that detection may significantly reduce itsmorbidity.
Invasive diagnostic methods such as endoscopicexamination allow for direct visual identification, removal, and biopsy ofpotentially cancerous growths such as polyps.  Endoscopy is expensive, uncomfortable,inherently risky, and therefore not a practical tool for screening populationsto identify those with colorectal cancer. Non-invasive analysis of stool samples for characteristics indicative ofthe presence of colorectal cancer or precancer is a preferred alternative forearly diagnosis, but no known diagnostic method is available which reliablyachieves this goal.  A reliable,non-invasive, and accurate technique for diagnosing colorectal cancer at anearly stage would help save many lives.
Ectopicexpression of the pancreatic regenerating gene (RegI) has been identifiedpreviously in colorectal tumors, and suggested as a potential marker forcolorectal cancer (Zenilman et al., (1997) J.Gastrointest. Surg., 1: 194; Watanabe et al., (1990) J. Biol. Chem., 265: 7432; Birse and Rosen, WO01/12781).  At present, there is no reliable methodknown to those of skill in the art for the rapid and accurate detection ofReg1α in the serum of colorectal cancer patients (Satomura et al., (1995) J. Gastroenterol. 30: 643).  There is thus a need in the art for amethod of detecting, and/or monitoring colorectal cancer in a patient utilizingthe expression of Reg1α in serum.
SUMMARY OF THE INVENTION
Thepresent invention is provides a method of detecting, monitoring or determiningthe therapeutic response of colorectal cancer in an individual as well ascompositions, and kits for performing the method.  In its most general aspect, the methodcomprises: obtaining a clinical sample from the individual and detecting thepresence of Reg1α or TIMP1 in said sample, wherein the presence of Reg1α orTIMP1 in the sample is indicative of the presence or stage of colorectal cancerin the individual.
Inone embodiment, the step of detecting comprises: contacting said clinicalsample with a ligand which is capable of binding to Reg1α or TIMP1 underconditions which permit the ligand to bind to Reg1α or TIMP1; and detecting thebinding of the ligand to Reg1α or TIMP1, wherein detection of binding isindicative of the presence of Reg1α or TIMP1 in the sample.  The polypeptide ligand may comprise, forexample, an antibody, peptide, oligonucleotide, or other molecule thatspecifically binds Reg1α or TIMP1. In a currently preferred embodiment, the clinical sample comprisesserum.
Thepresent invention further provides a method of detecting, monitoring, ordetermining the presence of colorectal cancer in an individual comprising:obtaining a clinical sample from said individual; and detecting the presence ofReg1α or TIMP1 and at least one other colorectal cancer associated marker inthe sample, wherein the presence of Reg1α or TIMP1 and the at least one othercolorectal cancer associated marker is indicative of colorectal cancer in theindividual.  The colorectal cancerassociated marker may comprise, for example, one or more of the nucleic acidsequences of SEQ ID Nos 1, 3, or 5-71, or the amino acid sequences of SEQ IDNos 2, 4, or 72-138, or derivatives or homologs thereof having substantiallythe same binding specificity.
Ina preferred embodiment embodiment, the above step of detecting comprisescontacting a serum sample with a first ligand which is capable of binding toReg1α or TIMP1 and a second ligand which is capable of binding to thecolorectal cancer associated marker, under conditions which permit the firstand second ligands to bind to Reg1α or TIMP1 and the colorectal cancerassociated marker, respectively; and detecting the binding of the first ligandto Reg1α or TIMP1 and the second ligand to the colorectal cancer associatedmarker, wherein detection of binding is indicative of the presence of Reg1α orTIMP1 and the colorectal cancer associated marker in said sample. Thepolypeptide ligand may comprise, for example, an antibody, peptide,oligonucleotide, or other molecule that specifically binds Reg1α or TIMP1.
Thepresent invention also provides a method of detecting, monitoring or determiningthe presence of colorectal cancer in an individual comprising: obtaining aclinical sample from an individual; and detecting the presence of a nucleicacid molecule which encodes Reg1α or TIMP1 in said sample, wherein the presenceof the nucleic acid molecule in the sample is indicative of colorectal cancerin the individual.
Theinvention still further provides a method of detecting, monitoring ordetermining the presence of colorectal cancer in an individual comprising:obtaining a clinical sample from an individual; and detecting the presence of anucleic acid molecule which encodes Reg1α or TIMP1 and at least one othernucleic acid molecule which encodes at least one other colorectal cancerassociated marker in the sample, wherein the presence of the nucleic acidsequence encoding Reg1α or TIMP1 and the nucleic acid sequence encoding the atleast one other colorectal cancer associated marker is indicative of colorectalcancer in the individual.  In a preferredembodiment, the colorectal cancer associated marker is one or more of thenucleic acid sequences of SEQ ID Nos 1, 3, or 5-71, or the amino acid sequencesof SEQ ID Nos 2, 4, or 72-138, or derivatives or homologs thereof havingsubstantially the same binding specificity.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Figure1 shows the level of Reg1α polypeptide present in serum obtained from normalcontrol patients (n=35), patients diagnosed with inflammatory bowel disease(IBD; n=7), patients diagnosed with cirrhosis (n=7), and patients diagnosedwith colorectal cancer (n=63).
Figure2 shows the level of Reg1α polypeptide measured in the colorectal cancerpatient group (n=63) differentiated based on cancer severity.  The degree of cancer has beenestablished by Dukes’-type staging, and data from patients with Dukes’-type A,B, C, and D is shown.
Figure3 shows a graphical representation of the plasma level of TIMP1 polypeptides,along with one or more other colorectal cancer associated markers obtained frompatients with colorectal cancer.
DETAILED DESCRIPTION
Thepresent invention is based, in part, on the discovery that the expression ofthey human islet regenerating protein, Reg1α, is increased in patients withcolorectal cancer, and as such is a valuable marker for the identification ofcolorectal cancer in humans.  Thepresent invention further provides for the early detection of colorectal cancerby detecting the presence of Reg1α or TIMP1 (and optionally, one or moreadditional colorectal cancer associated markers) in a clinical sample from anindividual.  The invention providesfurther, the ability to monitor the recurrence of colorectal cancer in apatient wherein colorectal cancer has been previously detected, by monitoringthe levels of Reg1α or TIMP1 polypeptide or polynucleotide sequences present ina clinical sample from the patient, wherein an increase in Reg1α or TIMP1 inthe sample is indicative of the recurrence of colorectal cancer.  The invention provides still further,the ability to monitor the decrease in colorectal cancer in response to atherapeutic agent, whereby the levels of Reg1α or TIMP1 are measured in aclinical sample obtained from a patient who has received therapeutic treatmentfor colorectal cancer, wherein a decrease in the levels of Reg1α or TIMP1detected in the clinical sample from the patient is indicative of the efficacyof the therapeutic treatment.  Inany of the preceding embodiments, Reg1α or TIMP1 polynucleotide or polypeptideexpression levels are measured in concert with at least one additionalcolorectal cancer associated marker.
Accordingly,the present invention relates in part to novel methods for identifying cancerin an individual, particularly colorectal cancer, by screening for genes orgene products, which are over or underexpressed in cancer relative to the levelof expression in normal tissue, such as colon tissue.  Alternatively, the invention provides amethod for the identification of cancer in an individual by screening for genesor gene products which are over- or underexpressed in colorectal cancer, andwhich are detectable in a clinical sample of an individual with colorectalcancer.
Ina preferred embodiment, the present invention relates to methods useful for thedetection of colorectal cancer in an individual, preferably a human patient bydetecting serum levels of Reg1α or TIMP1. The invention relates to methods for colorectal cancer detection thatutilize either or both techniques of detecting the presence of the Reg1α orTIMP1 gene or detecting the Reg1α or TIMP1 encoded polypeptide product in theserum of an individual, or alternatively in a clinical sample from anindividual.  
Thepresent invention further provides methods for the identification of colorectalcancer wherein cancer is detected by the identification of Reg1α or TIMP1expression in a patient clinical sample, in combination with the expression inthe same sample of at least one other colorectal cancer associated marker.  This combination of Reg1α or TIMP1detection analysis, in concert with the detection of additional colon-cancermarkers provides an efficient and reliable method for detecting the presence ofcolorectal cancer.
Themethods described herein which specifically refer to the detection of Reg1α,may equally be applied to the detection of TIMP1 by one of skill in the art, basedon the disclosure of the present specification.
Definitions
Asused herein, “Reg1α” refers to a polypeptide molecule having the sequence ofeither of SEQ ID Nos 2 or 4.  Reg1αas used herein, also refers to a polypeptide which is encoded by either of thesequences of SEQ ID Nos. 1 or 3. The sequences of SEQ ID Nos 2 and 4 each represent a functional Reg1αprotein, but differ from each other by four amino acids in the leader sequencewhich is cleaved off during protein synthesis. 
Asused herein, “TIMP1” refers to a polypeptide molecule having the sequence ofSEQ ID NO: 100.  TIMP1 as usedherein, also refers to a nucleotide which is encoded by the sequence of SEQ IDNO: 33, or a functional homolog thereof.
Asused herein, a “clinical sample” refers to a tissue, cellular, or fluid sampleobtained from an individual.  A“clinical sample”, as used herein, can refer to a cells, circulating cells(e.g., circulating cells in blood), cells obtained from specific anatomicallocations, or specific cell types (e.g., colon cell, gastrointestinal cell,cancerous cell, etc.), a tissue sample, or physiological fluids such as lymph,bile, serum, plasma, urine, synovial fluid, blood, CSF, mucus membranesecretions, or other physiological samples such as stool.  Preferably, the clinical sample is serumor plasma.  A colorectal cancerassociated marker of the invention, such as TIMP1, may be detected in asuitable “clinical sample” where the suitability of a particular type ofclinical sample for the detection of a specific colorectal cancer associatedmarker may be readily determined by one of skill in the art.
Asused herein, “detecting” refers to the identification of the presence orabsence of a molecule in a sample. Where the molecule to be detected is a polypeptide, the step ofdetecting can be performed by binding the polypeptide with an antibody that isdetectably labeled.  A detectablelabel is a molecule which is capable of generating, either independently, or inresponse to a stimulus, an observable signal.  A detectable label can be, but is notlimited to a fluorescent label, a chromogenic label, a luminescent label, or aradioactive label.  Methods for“detecting” a label include quantitative and qualitative methods adapted forstandard or confocal microscopy, FACS analysis, and those adapted for highthroughput methods involving multiwell plates, arrays or microarrays.  One of skill in the art can selectappropriate filter sets and excitation energy sources for the detection offluorescent emission from a given fluorescent polypeptide or dye.  “Detecting” as used herein can alsoinclude the use of multiple antibodies to a polypeptide to be detected, whereinthe multiple antibodies bind to different epitopes on the polypeptide to bedetected.  Antibodies used in thismanner can employ two or more detectable labels, and can include, for example aFRET pair.  A polypeptide molecule,such as Reg1α, is “detected” according to the present invention when the levelof detectable signal is at all greater than the background level of the detectablelabel, or where the level of measured nucleic acid is at all greater than thelevel measured in a control sample.
Asused herein, “detecting” as it refers to detecting the presence of a targetnucleic acid molecule (e.g., a nucleic acid molecule encoding Reg1α, or othercolorectal cancer-specific sequence) refers to a process wherein the signalgenerated by a directly or indirectly labeled probe nucleic acid molecule(capable of hybridizing to a target, e.g., a sequence encoding Reg1α, in aserum sample) is measured or observed. Thus, detection of the probe nucleic acid is directly indicative of thepresence, and thus the detection, of a target nucleic acid, such as a sequenceencoding Reg1α.  For example, if thedetectable label is a fluorescent label, the target nucleic acid (e.g., the nucleicacid molecule encoding Reg1α) is “detected” by observing or measuring the lightemitted by the fluorescent label on the probe nucleic acid when it is excitedby the appropriate wavelength, or if the detectable label is afluorescence/quencher pair, the target nucleic acid is “detected” by observingor measuring the light emitted upon association or dissociation of thefluorescence/quencher pair present on the probe nucleic acid, wherein detectionof the probe nucleic acid indicates detection of the target nucleic acid.  If the detectable label is a radioactivelabel, the target nucleic acid, following hybridization with a radioactivelylabeled probe is “detected” by, for example, autoradiography.  Methods and techniques for “detecting”fluorescent, radioactive, and other chemical labels may be found in Ausubel etal. (1995, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed. JohnWiley and Sons, Inc.). Alternatively, a nucleic acid may be “indirectly detected” wherein amoiety is attached to a probe nucleic acid which willhybridize with the target, such as an enzyme activity, allowing detection inthe presence of an appropriate substrate, or a specific antigen or other markerallowing detection by addition of an antibody or other specific indicator.  Alternatively, a target nucleic acidmolecule can be detected by amplifying a nucleic acid sample prepared from apatient clinical sample, using oligonucleotide primers which are specificallydesigned to hybridize with a portion of the target nucleic acid sequence.  Quantative amplification methods, suchas, but not limited to TaqMan, may also be used to “detect” a target nucleicacid according to the invention.  Anucleic acid molecule is “detected” as used herein where the level of nucleicacid measured (such as by quantitative PCR), or the level of detectable signalprovided by the detectable label is at all above the background level.
Asused herein, “detecting” refers further to the early detection of colorectalcancer in a patient, wherein “early” detection refers to the detection ofcolorectal cancer at Dukes stage A or preferably, prior to a time when thecolorectal cancer is morphologically able to be classified in a particularDukes stage.  “Detecting” as used hereinfurther refers to the detection of colorectal cancer recurrence in anindividual, using the same detection criteria as indicated above.  “Detecting” as used herein still furtherrefers to the measuring of a change in the degree of colorectal cancer beforeand/or after treatment with a therapeutic agent.  In this case, a change in the degree ofcolorectal cancer in response to a therapeutic agent refers to an increase ordecrease in the expression of Reg1α (and optionally, one or more additionalcolorectal cancer associated markers), or alternatively, in the amount of Reg1αpolypeptide (and optionally, one or more additional colorectal cancerassociated markers) present in a clinical sample by at least 10% in response tothe presence of a therapeutic agent relative to the expression level in the absenceof the therapeutic agent.
Asused herein, “individual” refers to a mammal, preferably a human.
Asused herein, a “ligand” refers to a molecule which is capable of binding apolypeptide.  A “polypeptide ligand”useful in the present invention includes, but is not limited to an antibody, amonoclonal antibody, a polyclonal antibody, an antibody fragment (e.g., Fv,scFV, or Fab), a small molecule, or a nucleic acid aptamer.  A “ligand” as used herein can also referto a “nucleic acid ligand”, such as an oligonucleotide, polynucleotide, DNA,RNA, mRNA, or cDNA, which is capable of binding to a complementary nucleic acidmolecule, or polypeptide molecule.
The term “antibody” as used herein is intended toinclude whole antibodies, e.g., of any isotype (IgG, IgA, IgM, IgE, etc), andincludes fragments thereof, and single-chain antibodies, which also arespecifically reactive with a vertebrate, e.g., mammalian, protein.  Antibodies can be fragmented usingconventional techniques and the fragments screened for utility in the samemanner as described above for whole antibodies.  Thus, the term includes segments ofproteolytically-cleaved or recombinantly-prepared portions of an antibodymolecule that are capable of selectively reacting with a certain protein.  Nonlimiting examples of such proteolyticand/or recombinant fragments include Fab, F(ab’)2, Fab’ , Fv, and single chainantibodies (scFv) containing a V[L] and/or V[H] domain joined by a peptidelinker.  The scFv’s may becovalently or non-covalently linked to form antibodies having two or morebinding sites.  The subjectinvention includes polyclonal, monoclonal, or other purified preparations ofantibodies and recombinant antibodies.
Asused herein, a “colorectal cancer associated marker” refers to a polypeptide ornucleic acid sequence which exhibits over- or underexpression of at least 10%in colorectal cancer cells, tissue, or serum obtained from an individual havingcolorectal cancer, relative to the level of expression in cells, tissue, orserum obtained from an individual that does not have colorectal cancer.  Non-limiting examples of colorectalcancer associated markers useful in the present invention include the nucleicacid molecules of SEQ ID Nos 1, 3, 5-71, and/or the polypeptide molecules of SEQID Nos 2, 4, 72-138.  In oneembodiment, the polypeptide sequences of SEQ ID Nos 2, 4, 72-138 are encoded bythe nucleic acid sequences of 1, 3, 5-71, respectively.  A “colorectal cancer specific marker”useful in the invention may be a polypeptide or nucleic acid sequence whichexhibits over- or underexpression in colorectal cancer as described above, butwhich may also be over or underexpressed in other, non-colorectal types ofcancer.  Alternatively, a “colorectalcancer associated marker”, as used herein, may refer to a carbohydrate epitopepresent on a polypeptide or nucleic acid molecule and/or an antibody moleculewhich recognizes and is capable of binding to such an epitope, wherein thecarbohydrate epitope is known to be associated with the presence of colorectalcancer in an individual.  Suchcarbohydrate epitopes may be present on more than one unrelated protein orpolypeptide.  In one embodiment,such a carbohydrate epitope is CA 19-9, also known as sialyl-Lewisa,is a tumor marker defined by a monoclonal antibody as a carbohydrate epitope,related to the blood group antigens, composed of a branching, 5-sugar structurecovalently bound to a variety of glycoproteins or glycolipids.  The proteins primarily belong to themucin family and the lipids are usually membrane associated.  The CA 19-9 epitope is typically theterminal moiety of a complex, O-linked carbohydrate structure on eithermacromolecule.  Other tumor markersalso defined as various carbohydrate epitopes useful in the present inventionas a “colorectal cancer associated marker” include CA 72-4, TF, sTn, Tn, CA 50,CA 549, CA 242, LASA, and the Du-PAN's 1 -5.
The term “interact” as used herein is meant to includedetectable interactions (e.g., biochemical interactions) between molecules,such as interaction between protein-protein, protein-nucleic acid, nucleicacid-nucleic acid, and protein-small molecule or nucleic acid-small molecule innature.
As used herein, the term “nucleic acid” refers topolynucleotides such as deoxyribonucleic acid (DNA), and, where appropriate,ribonucleic acid (RNA).  The termshould also be understood to include, as equivalents, analogs of either RNA orDNA made from nucleotide analogs, and, as applicable to the embodiment beingdescribed, single (sense or antisense) and double-strandedpolynucleotides.  ESTs, chromosomes,cDNAs, mRNAs, and rRNAs are representative examples of molecules that may bereferred to as nucleic acids.
The terms “protein”, “polypeptide”, and “peptide” areused interchangeably herein when referring to a gene product.  As used herein, “polypeptide” refers toany kind of polypeptide such as peptides, human proteins, fragments of humanproteins, proteins or fragments of proteins from non-human sources, engineeredversions proteins or fragments of proteins, enzymes, antigens, drugs, moleculesinvolved in cell signaling, such as receptor molecules, antibodies, includingpolypeptides of the immunoglobulin superfamily, such as antibody polypeptidesor T-cell receptor polypeptides.  
Asused herein, the term “level of expression” refers to the measurable expressionlevel of a given nucleic acid.  Thelevel of expression of a nucleic acid is determined by methods well known inthe art.  The “level of expression”may measured by hybridization analysis using labeled target nucleic acidsaccording to methods well known in the art (see, for example, Ausubel et al., ShortProtocols in Molecular Biology, 3rd Ed. 1995, John Wiley andSons, Inc.).  The label on thetarget nucleic acid is a luminescent label, an enzymatic label, a radioactivelabel, a chemical label or a physical label.  Preferably, the target nucleic acids arelabeled with a fluorescent molecule. Preferred fluorescent labels include fluorescein, amino coumarin aceticacid, tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), Texas Red, Cy3 and Cy5.  Alternatively, the “level of expression”can be measured by quantitative amplification protocols, such as TaqMan, knownto those of skill in the art.
The term “vector” refers to a nucleic acid molecule capableof transporting another nucleic acid to which it has been linked.  One type of preferred vector is anepisome, i.e., a nucleic acid capable of extra-chromosomal replication.  Preferred vectors are those capable ofautonomous replication and/or expression of nucleic acids to which they arelinked.  Vectors capable ofdirecting the expression of genes to which they are operatively linked arereferred to herein as “expression vectors”.  In general, expression vectors ofutility in recombinant DNA techniques are often in the form of “plasmids” whichrefer generally to circular double stranded DNA loops which, in their vectorform are not bound to the chromosome. In the present specification, “plasmid” and “vector” are usedinterchangeably as the plasmid is the most commonly used form of vector.  However, the invention is intended toinclude such other forms of expression vectors which serve equivalent functionsand which become known in the art subsequently hereto.
Reg1α andTIMP1 nucleic acid
As described above, the present invention relates to thedetection of Reg1α or TIMP1 polypeptide in a clinical sample from anindividual, preferably a serum or plasma sample, thus permitting the detectionof colorectal cancer.  The presentinvention, however, equally relates to the identification of the nucleic acidsequence which encodes Reg1α or TIMP1 as a marker for colorectal cancer.
Nucleic acid and amino acid sequences of Reg1α are shownin SEQ ID Nos 1 or 3, and 2 or 4, respectively.  Nucleic acid and amino acid sequences ofTIMP1 are shown in SEQ ID NO: 33 and 100 respectively.  While the invention relates to thedirect detection of either of the sequences of Reg1α or TIMP1 in a method fordetecting colorectal cancer, the invention further relates to the detection ofsequences complementary thereto, or a sequence which specifically hybridizes toa sequence of SEQ ID Nos. 1, 3, or 33. The present invention also relates to the detection of colorectal cancerby detecting the presence, in a clinical sample, of a nucleic acid moleculewhich encodes the sequence of SEQ ID Nos. 2, 4, or 100, or a fragment thereof.
Another aspect of the invention provides the detectionof colorectal cancer by the detection of a nucleic acid which hybridizes underlow, medium, or high stringency conditions to a nucleic acid sequencerepresented by one or more of SEQ ID Nos. 1, 3, or 33, or a sequencecomplementary thereto.  Appropriatestringency conditions which promote DNA hybridization, for example, 6.0 xsodium chloride/sodium citrate (SSC) at about 45 °C, followed by a wash of 2.0x SSC at 50°C, are known to those skilled in the art or can be found in CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989),6.3.1-12.3.6.  For example, the saltconcentration in the wash step can be selected from a low stringency of about2.0 x SSC at 50°C to a high stringency of about 0.2 x SSC at 50°C.  In addition, the temperature in the washstep can be increased from low stringency conditions at room temperature, about22 °C, to high stringency conditions at about 65 °C.  Both temperature and salt may be varied,or temperature or salt concentration may be held constant while the othervariable is changed.  In a preferredembodiment, a nucleic acid encoding Reg1α or TIMP1 will bind to SEQ ID Nos. 1,3 or 33, or a sequence complementary thereto, or a fragment thereof, undermoderately stringent conditions, for example at about 2.0 x SSC and about40°C.  In a particularly preferredembodiment, a Reg1α or TIMP1 nucleic acid sequence present in a patientclinical sample will bind of SEQ ID Nos. 1, 3, or 33, respectively, or asequence complementary thereto, or fragment thereof, under high stringencyconditions.
In one embodiment, the invention provides nucleic acidswhich hybridize under low stringency conditions of 6 x SSC at room temperaturefollowed by a wash at 2 x SSC at room temperature.
In another embodiment, the invention provides nucleicacids which hybridize under high stringency conditions of 2 x SSC at about 65°C followed by a wash at 0.2 x SSC at about 65 °C.
Detection of Reg1α nucleic acids having a sequence thatdiffers from the nucleotide sequences shown in SEQ ID Nos. 1 or 3, or asequence complementary thereto, due to degeneracy in the genetic code, are alsowithin the scope of the invention. Such nucleic acids encode functionally equivalent peptides (i.e., apeptide having equivalent or similar biological activity) but differ insequence from the sequence shown in the sequence listing due to degeneracy inthe genetic code.  For example, anumber of amino acids are designated by more than one triplet.  Codons that specify the same amino acid,or synonyms (for example, CAU and CAC each encode histidine) may result in“silent” mutations which do not affect the amino acid sequence of apolypeptide.  However, it isexpected that DNA sequence polymorphisms that do lead to changes in the aminoacid sequences of the subject polypeptides will exist among mammals.  One skilled in the art will appreciatethat these variations in one or more nucleotides (e.g., up to about 3-5% of thenucleotides) of the nucleic acids encoding polypeptides having an activity of apolypeptide may exist among individuals of a given species due to naturalallelic variation.
The invention also includes within its scope apolynucleotide which hybridizes under stringent conditions (at least about 4 xSSC at 65 °C, or at least about 4 x SSC at 42 °C; see, for example, U.S. PatentNo. 5,707,829, incorporated herein by reference) with at least 15 contiguousnucleotides of SEQ ID Nos. 1 or 3. By this is intended that when at least 15 contiguous nucleotides of SEQID Nos. 1 or 3 is used as a probe, the probe will preferentially hybridize witha gene or mRNA (of the biological material) comprising the complementarysequence, allowing the identification and retrieval of the nucleic acids (i.e.,Reg1α) of the biological material that uniquely hybridize to the selectedprobe. Probes of more than 15 nucleotides can be used, but 15 nucleotidesrepresents enough sequence for unique identification.
Constructs of polynucleotides having the sequence of SEQID Nos. 1 or 3, a portion thereof, or a sequence complementary thereto, anduseful, for example for generating a probe, can be produced synthetically, orobtained from natural sources (e.g., human cells) using methods well known tothose of skill in the art (see, for example, Sambrook et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor, NY 1989).
Calculationof Sequence Homology
Inone embodiment, the present invention relates to the detection of colorectalcancer in an individual by detecting the presence of Reg1αor TIMP1 or a sequence homologous thereto, by using probes and/or primers whichare complementary to portions of the Reg1α or TIMP1 sequence, or aresufficiently homologous to portions of the Reg1α or TIMP1 sequence to permithybridization of the probes and/or primers to Reg1α or TIMP1 under highstringency conditions.  Sequences ofthe invention are at least 50% homologous to Reg1α or TIMP1, and are preferably60%, 70%, 80%, 90% homologous up to complete sequence identity with Reg1α orTIMP1 (or optionally to a sequence encoding one or more additional colorectalcancer associated markers).
Sequenceidentity with respect to any of the sequences presented herein can bedetermined by a simple “eyeball” comparison (i.e. a strict comparison) of anyone or more of the sequences with another sequence to see if that othersequence has, for example, at least 80% sequence identity to the sequence(s).
Relativesequence identity can also be determined by commercially available computerprograms that can calculate % identity between two or more sequences using anysuitable algorithm for determining identity, using for example defaultparameters.  A typical example ofsuch a computer program is CLUSTAL. Other computer program methods to determine identity and similaritybetween two sequences include but are not limited to the GCG program package(Devereux et al 1984 Nucleic AcidsResearch 12: 387) and FASTA (Atschul etal 1990 J Molec Biol 403-410).
%homology may be calculated over contiguous sequences, i.e. one sequence isaligned with the other sequence and each amino acid in one sequence is directlycompared with the corresponding amino acid in the other sequence, one residueat a time.  This is called an“ungapped” alignment.  Typically,such ungapped alignments are performed only over a relatively short number ofresidues.
Although this is a very simple and consistentmethod, it fails to take into consideration that, for example, in an otherwiseidentical pair of sequences, one insertion or deletion will cause the followingamino acid residues to be put out of alignment, thus potentially resulting in alarge reduction in % homology when a global alignment is performed.  Consequently, most sequence comparisonmethods are designed to produce optimal alignments that take into considerationpossible insertions and deletions without penalising unduly the overallhomology score.  This is achieved byinserting “gaps” in the sequence alignment to try to maximise local homology.
However,these more complex methods assign “gap penalties” to each gap that occurs inthe alignment so that, for the same number of identical amino acids, a sequencealignment with as few gaps as possible - reflecting higher relatedness betweenthe two compared sequences - will achieve a higher score than one with manygaps.  “Affine gap costs” aretypically used that charge a relatively high cost for the existence of a gapand a smaller penalty for each subsequent residue in the gap.  This is the most commonly used gapscoring system.  High gap penaltieswill of course produce optimized alignments with fewer gaps.  Most alignment programs allow the gappenalties to be modified.  However,it is preferred to use the default values when using such software for sequencecomparisons.  For example, whenusing the GCG Wisconsin Bestfit package the default gap penalty for amino acidsequences is -12 for a gap and -4 for each extension.
Calculation of maximum % homology thereforefirstly requires the production of an optimal alignment, taking intoconsideration gap penalties.  Asuitable computer program for carrying out such an alignment is the GCGWisconsin Bestfit package (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic AcidsResearch 12:387). Examples of other software that can perform sequencecomparisons include, but are not limited to, the BLAST package (Ausubel et al.,1995, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley& Sons), FASTA (Atschul et al.,1990, J. Mol. Biol., 403-410) and the GENEWORKS suite of comparison tools. BothBLAST and FASTA are available for offline and online searching (Ausubel et al., 1999 supra, pages 7-58 to 7-60).
Althoughthe final % homology can be measured in terms of identity, the alignmentprocess itself is typically not based on an all-or-nothing paircomparison.  Instead, a scaledsimilarity score matrix is generally used that assigns scores to each pairwisecomparison based on chemical similarity or evolutionary distance.  An example of such a matrix commonlyused is the BLOSUM62 matrix - the default matrix for the BLAST suite ofprograms.  GCG Wisconsin programsgenerally use either the public default values or a custom symbol comparisontable if supplied.  It is preferredto use the public default values for the GCG package, or in the case of othersoftware, the default matrix, such as BLOSUM62.
Advantageously,the BLAST algorithm is employed, with parameters set to default values.  The BLAST algorithm is described indetail on the World Wide Web at ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html, which isincorporated herein by reference. The search parameters are defined as follows, and can be advantageouslyset to the defined default parameters.
Advantageously,“substantial identity” when assessed by BLAST equates to sequences which matchwith an EXPECT value of at least about 7, preferably at least about 9 and mostpreferably 10 or more.  The defaultthreshold for EXPECT in BLAST searching is usually 10.
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) is the heuristic search algorithm employedby the programs blastp, blastn, blastx, tblastn, and tblastx; these programsascribe significance to their findings using the statistical methods of Karlin andAltschul (Karlin and Altschul 1990, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7;see http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html) with a fewenhancements.  The BLAST programsare tailored for sequence similarity searching, for example to identifyhomologues to a query sequence.  Fora discussion of basic issues in similarity searching of sequence databases, seeAltschul et al (1994) Nature Genetics6:119-129.
Thefive BLAST programs available on the World Wide Web at ncbi.nlm.nih.gov performthe following tasks: blastp - comparesan amino acid query sequence against a protein sequence database; blastn - compares a nucleotide querysequence against a nucleotide sequence database; blastx - compares the six-frame conceptual translation products ofa nucleotide query sequence (both strands) against a protein sequence database;tblastn - compares a protein querysequence against a nucleotide sequence database dynamically translated in allsix reading frames (both strands); tblastx- compares the six-frame translations of a nucleotide query sequenceagainst the six-frame translations of a nucleotide sequence database.
BLASTuses the following search parameters:
HISTOGRAM- Display a histogram of scores for each search; default is yes. (See parameterH in the BLAST Manual).
DESCRIPTIONS- Restricts the number of short descriptions of matching sequences reported tothe number specified; default limit is 100 descriptions. (See parameter V inthe manual page).
EXPECT- The statistical significance threshold for reporting matches against databasesequences; the default value is 10, such that 10 matches are expected to befound merely by chance, according to the stochastic model of Karlin andAltschul (1990).  If the statisticalsignificance ascribed to a match is greater than the EXPECT threshold, thematch will not be reported.  LowerEXPECT thresholds are more stringent, leading to fewer chance matches beingreported. Fractional values are acceptable.  (See parameter E in the BLAST Manual).
CUTOFF- Cutoff score for reporting high-scoring segment pairs.  The default value is calculated from theEXPECT value (see above).  HSPs arereported for a database sequence only if the statistical significance ascribedto them is at least as high as would be ascribed to a lone HSP having a scoreequal to the CUTOFF value.  HigherCUTOFF values are more stringent, leading to fewer chance matches beingreported. (See parameter S in the BLAST Manual).  Typically, significance thresholds canbe more intuitively managed using EXPECT.
ALIGNMENTS- Restricts database sequences to the number specified for which high-scoringsegment pairs (HSPs) are reported; the default limit is 50.  If more database sequences than this happento satisfy the statistical significance threshold for reporting (see EXPECT andCUTOFF below), only the matches ascribed the greatest statistical significanceare reported.  (See parameter B inthe BLAST Manual).
MATRIX- Specify an alternate scoring matrix for BLASTP, BLASTX, TBLASTN andTBLASTX.  The default matrix isBLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, 1992). The valid alternative choices include: PAM40, PAM120, PAM250 andIDENTITY.  No alternate scoringmatrices are available for BLASTN; specifying the MATRIX directive in BLASTNrequests returns an error response.
STRAND- Restrict a TBLASTN search to just the top or bottom strand of the databasesequences; or restrict a BLASTN, BLASTX or TBLASTX search to just readingframes on the top or bottom strand of the query sequence.
FILTER- Mask off segments of the query sequence that have low compositionalcomplexity, as determined by the SEG program of Wootton & Federhen (1993)Computers and Chemistry 17:149-163, or segments consisting of short-periodicityinternal repeats, as determined by the XNU program of Claverie & States(1993) Computers and Chemistry 17:191-201, or, for BLASTN, by the DUST programof Tatusov and Lipman (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov).  Filtering can eliminate statisticallysignificant but biologically uninteresting reports from the blast output (e.g.,hits against common acidic-, basic- or proline-rich regions), leaving the morebiologically interesting regions of the query sequence available for specificmatching against database sequences.
Lowcomplexity sequence found by a filter program is substituted using the letter“N” in nucleotide sequence (e.g., “NNNNNNNNNNNNN”) and the letter “X” inprotein sequences (e.g., “XXXXXXXXX”).
Filteringis only applied to the query sequence (or its translation products), not todatabase sequences. Default filtering is DUST for BLASTN, SEG for otherprograms.
Itis not unusual for nothing at all to be masked by SEG, XNU, or both, whenapplied to sequences in SWISS-PROT, so filtering should not be expected toalways yield an effect. Furthermore, in some cases, sequences are masked in their entirety,indicating that the statistical significance of any matches reported againstthe unfiltered query sequence should be suspect.
NCBI-gi- Causes NCBI gi identifiers to be shown in the output, in addition to theaccession and/or locus name.
Mostpreferably, sequence comparisons are conducted using the simple BLAST searchalgorithm provided on the World Wide Web at ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.  In some embodiments of the presentinvention, no gap penalties are used when determining sequence identity.
Probesand Primers
The nucleotide sequence of Reg1α or TIMP1 is useful inthe present invention for the generation of probes and primers designed foridentifying the Reg1α or TIMP1 nucleic acid sequence in a patient sample suchas serum, colon cells or tissue. Nucleotide sequences useful as probes/primers may include all or aportion of SEQ ID Nos. 1, 3 or 33, or a sequence complementary thereto, orsequences which hybridize under stringent conditions to all or a portion of SEQID No. 1, 3 or 33.  For instance,the present invention also provides a probe/primer comprising a substantiallypurified oligonucleotide, which oligonucleotide comprising a nucleotidesequence that hybridizes under stringent conditions to at least approximately8, preferably about 12, preferably about 15, preferably about 25, morepreferably about 40 consecutive nucleotides up to the full length of the senseor anti-sense sequence of SEQ ID Nos. 1, 3 or 33, or a sequence complementarythereto, or a naturally occurring mutant thereof.  For instance, primers based on thenucleic acid represented in SEQ ID No. 1, 3 or 33, or a sequence complementarythereto, can be used in a reaction to amplify a template nucleic acid (e.g.,Reg1α) contained within an mRNA sample derived from a patient clinical sample.
Not only are probes based on the nucleic acid sequenceencoding Reg1α or TIMP1 useful for detecting Reg1α or TIMP1, but they can alsoprovide a method for detecting mutations in wild-type Reg1α or TIMP1 in apatient.  Nucleic acid probes whichare complementary to a wild-type Reg1α or TIMP1 and can form mismatches withmutant genes are provided, allowing for detection by enzymatic or chemicalcleavage or by shifts in electrophoretic mobility.  Likewise, probes based on the subjectsequences can be used to detect transcripts or genomic sequences encoding thesame or homologous proteins, for use, for example, in prognostic or diagnosticassays.  In preferred embodiments,the nucleic acid probe further comprises a label group attached thereto andable to be detected, e.g., the label group is selected from a radioisotope, afluorescent compound, a chemiluminescent compound, a chromagenic compound, anenzyme, and enzyme co-factor.
Full-length cDNA molecules comprising the disclosednucleic acids, useful for the generation of probes, primers, or fortranscription to produce the Reg1α or TIMP1 protein itself, or antibodiesthereto may be obtained as follows. The nucleic acid sequence of Reg1α or TIMP1 or a portion thereofcomprising at least approximately 8, preferably about 12, preferably about 15,preferably about 25, more preferably about 40 nucleotides up to the full lengthof the sequence of SEQ ID Nos. 1, 3 or 33, or a sequence complementary thereto,may be used as a hybridization probe to detect hybridizing members of a cDNAlibrary using probe design methods, cloning methods, and clone selectiontechniques as described in U.S. Patent No. 5,654,173, “Secreted Proteins andPolynucleotides Encoding Them,” incorporated herein by reference.  Libraries of cDNA may be made fromselected tissues, such as normal or tumor tissue, or from tissues of a mammaltreated with, for example, a pharmaceutical agent.  Preferably, the tissue is the same asthat used to generate the nucleic acids, as both the nucleic acid and the cDNArepresent expressed genes. Alternatively, many cDNA libraries are availablecommercially.  (Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, NY 1989).  The choiceof cell type for library construction may be made after the identity of theprotein encoded by the nucleic acid-related gene is known.  This will indicate which tissue and celltypes are likely to express the related gene, thereby containing the mRNA forgenerating the cDNA.
Members of the library that are larger than the nucleicacid, and preferably that contain the whole sequence of the native message, maybe obtained.  To confirm that theentire cDNA has been obtained, RNA protection experiments may be performed asfollows.  Hybridization of afull-length cDNA to an mRNA may protect the RNA from RNase degradation.  If the cDNA is not full length, then theportions of the mRNA that arc not hybridized may be subject to RNasedegradation.  This may be assayed,as is known in the art, by changes in electrophoretic mobility onpolyacrylamide gels, or by detection of released monoribonucleotides.  Sambrook et al., Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY1989).  In order to obtainadditional sequences 5’ to the end of a partial cDNA, 5’ RACE (PCR Protocols: AGuide to Methods and Applications (Academic Press, Inc. 1990)) may beperformed.
Genomic DNA (e.g., Reg1α genomic DNA) may be isolatedusing nucleic acids in a manner similar to the isolation of full-lengthcDNAs.  Briefly, the nucleic acids,or portions thereof, may be used as probes to libraries of genomic DNA.  Preferably, the library is obtained fromthe cell type that was used to generate the nucleic acids.  Most preferably, the genomic DNA isobtained from the biological material described herein in the Example.  Such libraries may be in vectorssuitable for carrying large segments of a genome, such as P1 or YAC, asdescribed in detail in Sambrook et al.,pages 9.4-9.30.  In addition, genomic sequences can beisolated from human BAC libraries, which are commercially available fromResearch Genetics, Inc., Huntville, Alabama, USA, for example.  In order to obtain additional 5’ or 3’sequences, chromosome walking may be performed, as described in Sambrook etal., such that adjacent and overlapping fragments of genomic DNA areisolated.  These may be mapped andpieced together, as is known in the art, using restriction digestion enzymesand DNA ligase.
Using the nucleic acids of the invention, correspondingfull length genes can be isolated using both classical and PCR methods toconstruct and probe cDNA libraries. Using either method, Northern blots, preferably, may be performed on anumber of cell types to determine which cell lines express the gene of interestat the highest rate.
Classical methods of constructing cDNA libraries inSambrook et al., supra.  With thesemethods, cDNA can be produced from mRNA and inserted into viral or expressionvectors.  Typically, libraries ofmRNA comprising poly(A) tails can be produced with poly(T) primers.  Similarly, cDNA libraries can beproduced using the instant Reg1α sequence or portions thereof as primers.
PCR methods may be used to amplify the members of a cDNAlibrary that comprise the desired insert. In this case, the desired insert may contain sequence from the fulllength cDNA that corresponds to the sequence encoding Reg1α.  Such PCR methods include gene trappingand RACE methods.
Gene trapping may entail inserting a member of a cDNAlibrary into a vector.  The vectorthen may be denatured to produce single stranded molecules.  Next, a substrate-bound probe, such abiotinylated oligo, may be used to trap cDNA inserts of interest.  Biotinylated probes can be linked to anavidin-bound solid substrate.  PCRmethods can be used to amplify the trapped cDNA.  To trap sequences corresponding to thefull length genes, the labeled probe sequence may be based on the nucleic acidof SEQ ID Nos. 1 or 3, or a sequence complementary thereto.  Random primers or primers specific tothe library vector can be used to amplify the trapped cDNA.  Such gene trapping techniques aredescribed in Gruber et al., PCT WO 95/04745 and Gruber et al., U.S. Pat. No.5,500,356.  Kits are commerciallyavailable to perform gene trapping experiments from, for example, LifeTechnologies, Gaithersburg, Maryland, USA.
“Rapid amplification of cDNA ends,” or RACE, is a PCRmethod of amplifying cDNAs from a number of different RNAs.  The cDNAs may be ligated to anoligonucleotide linker and amplified by PCR using two primers.  One primer may be based on sequence fromthe instant nucleic acids, for which full length sequence is desired, and asecond primer may comprise a sequence that hybridizes to the oligonucleotidelinker to amplify the cDNA.  A descriptionof this method is reported in PCT Pub. No. WO 97/19110.
In preferred embodiments of RACE, a common primer may bedesigned to anneal to an arbitrary adaptor sequence ligated to cDNA ends (Apteand Siebert, Biotechniques 15:890-893, 1993; Edwards et al., Nuc.Acids Res. 19:5227-5232, 1991).  When a single gene-specific RACE primeris paired with the common primer, preferential amplification of sequencesbetween the single gene specific primer and the common primer occurs.  Commercial cDNA pools modified for usein RACE are available.
Once the full-length cDNA or gene is obtained, DNAencoding variants can be prepared by site-directed mutagenesis, described indetail in Sambrook  15.3-15.63.  The choice of codon or nucleotide to bereplaced can be based on the disclosure herein on optional changes in aminoacids to achieve altered protein structure and/or function.
As an alternative method to obtaining DNA or RNA from abiological material, such as serum, nucleic acid comprising nucleotides havingthe sequence of one or more nucleic acids of the invention can besynthesized.  Thus, the inventionencompasses nucleic acid molecules ranging in length from about 8 nucleotides(corresponding to at least 12 contiguous nucleotides which hybridize understringent conditions to or are at least 80% identical to the nucleic acidsequence of SEQ ID Nos. 1 or 3, or a sequence complementary thereto) up to amaximum length suitable for one or more biological manipulations, includingreplication and expression, of the nucleic acid molecule.  The invention includes but is notlimited to (a) nucleic acid having the size of the full Reg1α gene, or asequence complementary thereto; (b) the nucleic acid of(a) also comprising atleast one additional gene, operably linked to permit expression of a fusionprotein; (c) an expression vector comprising (a) or (b); (d) a plasmidcomprising (a) or (b); and (e) a recombinant viral particle comprising (a) or(b).  
The sequence of a nucleic acid of the present inventionis not limited and can be any sequence of A, T, G, and/or C (for DNA) and A, U,G, and/or C (for RNA) or modified bases thereof, including inosine andpseudouridine.  The choice ofsequence will depend on the desired function and can be dictated by codingregions desired, the intron-like regions desired, and the regulatory regionsdesired.
Probe preparation
Priorto hybridization of a probe nucleic acid to a patient sample, the nucleic acidsamples must be prepared to facilitate subsequent detection ofhybridization.  The nucleic acidsamples obtained from an individual (including nucleic acid sequences encodingReg1α, and optionally, at least one other colorectal cancer associated marker)to be screened for colorectal cancer are capable of being bound by a nucleicacid probe of complementary sequence through one or more types of chemicalbonds, usually through complementary base pairing, usually through hydrogenbond formation.
Probesuseful in the invention for hybridizing to and thus identifying the presence ofReg1α or TIMP1, and optionally, at least one additional colorectal cancerassociated marker may be designed to hybridize to a polynucleotide moleculederived from an mRNA transcript coding for Reg1α, or optionally, at least oneadditional colorectal cancer associated marker.  As used herein, a “polynucleotidederived from an mRNA transcript” refers to a polynucleotide for which synthesisof the mRNA transcript or a subsequence thereof has ultimately served as atemplate. Thus, a cDNA reverse transcribed from an mRNA, an RNA transcribedfrom that cDNA, a DNA amplified from the cDNA, an RNA transcribed from theamplified DNA, etc., are all derived from the mRNA transcript and detection ofsuch derived products is indicative of the presence and/or abundance of theoriginal transcript in a sample. Thus, suitable target nucleic acid samplesinclude, but are not limited to, mRNA transcripts of a gene or genes (i.e.,Reg1α or a colorectal cancer associated marker), cDNA reverse transcribed fromthe mRNA, cRNA transcribed from the cDNA, DNA amplified from a gene or genes,RNA transcribed from amplified DNA, and the like.  The polynucleotide probes used hereinare preferably designed to hybridize to Reg1α, or optionally to a sequenceencoding at least one other colorectal cancer associated marker.  
Nucleicacid probes may be generated using techniques which are well known to those of skillin the art (see, e.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989), or CurrentProtocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed. Greene Publishing andWiley-Interscience, New York (1987). 
Inorder to measure the hybridization of a probe nucleic acid to a target sequencein a sample, the probe nucleic acid is preferably labeled with a detectablelabel.  Any analytically detectablemarker that is attached to or incorporated into a molecule may be used in theinvention.  An analyticallydetectable marker refers to any molecule, moiety or atom which is analyticallydetected and quantified. 
Detectablelabels suitable for use in the present invention include any composition detectableby spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical,optical or chemical means. Useful labels in the present invention includebiotin for staining with labeled streptavidin conjugate, magnetic beads (e.g.,DynabeadsTM), fluorescent dyes (e.g., fluorescein, texas red, rhodamine, greenfluorescent protein, and the like), radiolabels (e.g., 3H, 125I,35S, 14C, or 32P), enzymes (e.g., horse radishperoxidase, alkaline phosphatase and others commonly used in an ELISA), andcolorimetric labels such as colloidal gold or colored glass or plastic (e.g.,polystyrene, polypropylene, latex, etc.) beads. Patents teaching the use ofsuch labels include U.S. Pat. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345;4,277,437; 4,275,149; and 4,366,241. 
Meansof detecting such labels are well known to those of skill in the art. Thus, forexample, radiolabels may be detected using photographic film or scintillationcounters, fluorescent markers may be detected using a photodetector to detectemitted light. Enzymatic labels are typically detected by providing the enzymewith a substrate and detecting the reaction product produced by the action ofthe enzyme on the substrate, and colorimetric labels are detected by simplyvisualizing the colored label. 
Thelabels may be incorporated into a nucleic acid probe by any of a number ofmeans well known to those of skill in the art.  However, in a preferred embodiment, thelabel is simultaneously incorporated into the probe during an amplificationstep in the preparation of the probe polynucleotides.  Thus, for example, polymerase chainreaction (PCR), or other amplification reaction, with labeled primers orlabeled nucleotides will provide a labeled amplification product, and thus alabeled probe. 
Alternatively,a label may be added directly to the probe.  Means of attaching labels topolynucleotides are well known to those of skill in the art and include, forexample nick translation or end-labeling (e.g. with a labeled RNA) andsubsequent attachment (ligation) of a polynucleotide linker joining the samplepolynucleotide to a label (e.g., a fluorophore).  
Ina preferred embodiment, the fluorescent modifications are by cyanine dyes e.g.Cy-3/Cy-5 dUTP, Cy-3/Cy-5 dCTP (Amersham Pharmacia) or alexa dyes (Khan, J.,Simon, R., Bittner, M., Chen, Y., Leighton, S. B., Pohida, T., Smith, P. D.,Jiang, Y., Gooden, G. C., Trent, J. M. & Meltzer, P. S. (1998) Cancer Res. 58, 50095013.).  
Ina preferred embodiment, a probe nucleic acid which is capable of hybridizing toReg1α and a probe nucleic acid which is capable of hybridizing to a nucleicacid sequence encoding at least one additional colorectal cancer associatedmarker, are co-hybridized to a test sample (e.g., a serum sample).  In this embodiment, the two probesamples used for comparison are labeled with different fluorescent dyes whichproduce distinguishable detection signals, for example, probes hybridizablewith Reg1α are labeled with Cy5 and probes hybridizable with another colorectalcancer associated marker are labeled with Cy3.  The differently labeled target samplesare hybridized to the same microarray simultaneously. 
Ina preferred embodiment, a control probe may be co-hybridized to a sample alongwith a probe for Reg1α and/or a probe for an additional colorectal cancerassociated marker, wherein the control probe is capable of hybridizing to anucleic acid sequence known to be found in the clinical sample, for example,where the clinical sample is a serum sample, a control sequence may be a sequenceencoding serum albumin, or fibrinogen. 
Vectors and Host Cells
The present invention further provides vectors andplasmids useful for directing the expression of Reg1α or TIMP1 or othercolorectal cancer associated markers, and further provides host cells whichexpress the vectors and plasmids provided herein.  Nucleic acid sequences useful for theexpression from a vector or plasmid as described below include, but are notlimited to any nucleic acid or gene sequence identified as being differentiallyregulated by the methods described above, and further include therapeuticnucleic acid molecules, such as antisense molecules.  The host cell may be any prokaryotic oreukaryotic cell.  Ligating thepolynucleotide sequence into a gene construct, such as an expression vector,and transforming or transfecting into hosts, either eukaryotic (yeast, avian,insect or mammalian) or prokaryotic (bacterial cells), are standard procedureswell known in the art.
Vectors
Thereis a wide array of vectors known and available in the art that are useful forthe expression of differentially expressed nucleic acid molecules according tothe invention.  The selection of aparticular vector clearly depends upon the intended use the polypeptide encodedby the differentially expressed nucleic acid.  For example, the selected vector must becapable of driving expression of the polypeptide in the desired cell type,whether that cell type be prokaryotic or eukaryotic.  Many vectors comprise sequences allowingboth prokaryotic vector replication and eukaryotic expression of operablylinked gene sequences.
Vectorsuseful according to the invention may be autonomously replicating, that is, thevector, for example, a plasmid, exists extrachromosomally and its replicationis not necessarily directly linked to the replication of the host cell’sgenome.  Alternatively, thereplication of the vector may be linked to the replication of the host’schromosomal DNA, for example, the vector may be integrated into the chromosomeof the host cell as achieved by retroviral vectors.  
Vectorsuseful according to the invention preferably comprise sequences operably linkedto the sequence of interest (e.g., Reg1α) that permit the transcription andtranslation of the sequence. Sequences that permit the transcription of the linked sequence ofinterest include a promoter and optionally also include an enhancer element orelements permitting the strong expression of the linked sequences.  The term “transcriptional regulatorysequences” refers to the combination of a promoter and any additional sequencesconferring desired expression characteristics (e.g., high level expression,inducible expression, tissue- or cell-type-specific expression) on an operablylinked nucleic acid sequence.  
Theselected promoter may be any DNA sequence that exhibits transcriptionalactivity in the selected host cell, and may be derived from a gene normallyexpressed in the host cell or from a gene normally expressed in other cells ororganisms.  Examples of promotersinclude, but are not limited to the following: A) prokaryotic promoters - E. coli lac, tac, or trp promoters,lambda phage PR or PL promoters, bacteriophage T7, T3,Sp6 promoters, B. subtilis alkalineprotease promoter, and the B.stearothermophilus maltogenic amylase promoter, etc.; B) eukaryoticpromoters - yeast promoters, such as GAL1, GAL4 and other glycolytic genepromoters (see for example, Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:12073-12080; Alber & Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 419-434), LEU2promoter (Martinez-Garcia et al., 1989, Mol Gen Genet. 217: 464-470), alcoholdehydrogenase gene promoters (Young et al., 1982, in Genetic Engineering ofMicroorganisms for Chemicals, Hollaender et al., eds., Plenum Press, NY), orthe TPI1 promoter (U.S. Pat. No. 4,599,311); insect promoters, such as thepolyhedrin promoter (U.S. Pat. No. 4,745,051; Vasuvedan et al., 1992, FEBSLett. 311: 7-11), the P10 promoter (Vlak et al., 1988, J. Gen. Virol. 69:765-776), the Autographa californicapolyhedrosis virus basic protein promoter (EP 397485), the baculovirusimmediate-early gene promoter gene 1 promoter (U.S. Pat. Nos. 5,155,037 and5,162,222), the baculovirus 39K delayed-early gene promoter (also U.S. Pat.Nos. 5,155,037 and 5,162,222) and the OpMNPV immediate early promoter 2;mammalian promoters - the SV40 promoter (Subramani et al., 1981, Mol. Cell.Biol. 1: 854-864), metallothionein promoter (MT-1; Palmiter et al., 1983,Science 222: 809-814), adenovirus 2 major late promoter (Yu et al.,1984, Nucl.Acids Res. 12: 9309-21), cytomegalovirus (CMV) or other viral promoter (Tong etal., 1998, Anticancer Res. 18: 719-725), or even the endogenous promoter of agene of interest in a particular cell type.  
Aselected promoter may also be linked to sequences rendering it inducible ortissue-specific.  For example, theaddition of a tissue-specific enhancer element upstream of a selected promotermay render the promoter more active in a given tissue or cell type.  Alternatively, or in addition, inducibleexpression may be achieved by linking the promoter to any of a number ofsequence elements permitting induction by, for example, thermal changes(temperature sensitive), chemical treatment (for example, metal ion- orIPTG-inducible), or the addition of an antibiotic inducing agent (for example,tetracycline).
Regulatableexpression is achieved using, for example, expression systems that are druginducible (e.g., tetracycline, rapamycin or hormone-inducible). Drug-regulatable promoters that are particularly well suited for use inmammalian cells include the tetracycline regulatable promoters, andglucocorticoid steroid-, sex hormone steroid-, ecdysone-, lipopolysaccharide(LPS)- and isopropylthiogalactoside (IPTG)-regulatable promoters.  A regulatable expression system for usein mammalian cells should ideally, but not necessarily, involve atranscriptional regulator that binds (or fails to bind) nonmammalian DNA motifsin response to a regulatory agent, and a regulatory sequence that is responsiveonly to this transcriptional regulator.
Tissue-specificpromoters may also be used to advantage in differentially expressedsequence-encoding constructs of the invention.  A wide variety of tissue-specificpromoters is known.  As used herein,the term “tissue-specific” means that a given promoter is transcriptionallyactive (i.e., directs the expression of linked sequences sufficient to permitdetection of the polypeptide product of the promoter) in less than all cells ortissues of an organism.  A tissuespecific promoter is preferably active in only one cell type, but may, forexample, be active in a particular class or lineage of cell types (e.g.,hematopoietic cells).  A tissuespecific promoter useful according to the invention comprises those sequencesnecessary and sufficient for the expression of an operably linked nucleic acidsequence in a manner or pattern that is essentially the same as the manner orpattern of expression of the gene linked to that promoter in nature.  The following is a non-exclusive list oftissue specific promoters and literature references containing the necessary sequencesto achieve expression characteristic of those promoters in their respectivetissues; the entire content of each of these literature references isincorporated herein by reference. Examples of tissue specific promoters useful in the present inventionare as follows: 
Bowmanet al., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,12115-12119 describe a brain-specific transferrin promoter; thesynapsin I promoter is neuron specific (Schoch et al., 1996 J. Biol. Chem. 271,3317-3323); the nestin promoter is post-mitotic neuron specific (Uetsuki etal., 1996 J. Biol. Chem. 271, 918-924); the neurofilament light promoter isneuron specific (Charron et al., 1995 J. Biol. Chem. 270, 30604-30610); theacetylcholine receptor promoter is neuron specific (Wood et al., 1995 J. Biol.Chem. 270, 30933-30940); and the potassium channel promoter is high-frequencyfiring neuron specific (Gan et al., 1996 J. Biol. Chem 271, 5859-5865).  Any tissue specific transcriptionalregulatory sequence known in the art may be used to advantage with a vectorencoding a differentially expressed nucleic acid sequence obtained from ananimal subjected to pain.
Inaddition to promoter/enhancer elements, vectors useful according to theinvention may further comprise a suitable terminator.  Such terminators include, for example,the human growth hormone terminator (Palmiter et al., 1983, supra), or, foryeast or fungal hosts, the TPI1 (Alber & Kawasaki, 1982, supra) or ADH3terminator (McKnight et al., 1985, EMBO J. 4: 2093-2099).  
Vectorsuseful according to the invention may also comprise polyadenylation sequences(e.g., the SV40 or Ad5E1b poly(A) sequence), and translational enhancersequences (e.g., those from Adenovirus VA RNAs).  Further, a vector useful according tothe invention may encode a signal sequence directing the recombinantpolypeptide to a particular cellular compartment or, alternatively, may encodea signal directing secretion of the recombinant polypeptide. 
a.  Plasmid vectors.
Anyplasmid vector that allows expression of a coding sequence of interest (e.g.,the coding sequence of Reg1α)in a selected host cell type is acceptable for useaccording to the invention.  Aplasmid vector useful in the invention may have any or all of the above-notedcharacteristics of vectors useful according to the invention.  Plasmid vectors useful according to theinvention include, but are not limited to the following examples: Bacterial -pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) pBs, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS,pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3,pDR540, and pRIT5 (Pharmacia); Eukaryotic - pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVL (Pharmacia). However, any otherplasmid or vector may be used as long as it is replicable and viable in thehost. 
b.  Bacteriophage vectors.
Thereare a number of well known bacteriophage-derived vectors useful according tothe invention.  Foremost among theseare the lambda-based vectors, such as Lambda Zap II or Lambda-Zap Expressvectors (Stratagene) that allow inducible expression of the polypeptide encodedby the insert.  Others includefilamentous bacteriophage such as the M13-based family of vectors.   
c.  Viral vectors.
Anumber of different viral vectors are useful according to the invention, andany viral vector that permits the introduction and expression of one or more ofthe polynucleotides of the invention in cells is acceptable for use in themethods of the invention.  Viralvectors that can be used to deliver foreign nucleic acid into cells include butare not limited to retroviral vectors, adenoviral vectors, adeno-associatedviral vectors, herpesviral vectors, and Semliki forest viral (alphaviral)vectors.  Defective retroviruses arewell characterized for use in gene transfer (for a review see Miller, A.D.(1990) Blood 76:271).  Protocols for producing recombinantretroviruses and for infecting cells invitro or in vivo with suchviruses can be found in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14,and other standard laboratory manuals. 
Inaddition to retroviral vectors, Adenovirus can be manipulated such that itencodes and expresses a gene product of interest but is inactivated in terms ofits ability to replicate in a normal lytic viral life cycle (see for exampleBerkner et al., 1988, BioTechniques 6:616;Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431-434;and Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155).  Suitable adenoviral vectors derived fromthe adenovirus strain Ad type 5 dl324 or other strains of adenovirus (e.g.,Ad2, Ad3, Ad7 etc.) are well known to those skilled in the art.  Adeno-associated virus (AAV) is anaturally occurring defective virus that requires another virus, such as anadenovirus or a herpes virus, as a helper virus for efficient replication and aproductive life cycle. (For a review see Muzyczka et al., 1992, Curr. Topics inMicro. and Immunol. 158:97-129).  An AAV vector such as that described inTraschin et al. (1985, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260) can be used to introducenucleic acid into cells.  A varietyof nucleic acids have been introduced into different cell types using AAVvectors (see, for example, Hermonat et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA81: 6466-6470; and Traschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081).
Host cells
Anycell into which a recombinant vector carrying a gene of interest (e.g., asequence encoding Reg1α) may be introduced and wherein the vector is permittedto drive the expression of the peptide encoded by the differentially expressedsequence is useful according to the invention.  Any cell in which a differentiallyexpressed molecule of the invention may be expressed and preferably detected isa suitable host, wherein the host cell is preferably a mammalian cell and morepreferably a human cell.  Vectorssuitable for the introduction of nucleic acid sequences to host cells from avariety of different organisms, both prokaryotic and eukaryotic, are describedherein above or known to those skilled in the art. 
Hostcells may be prokaryotic, such as any of a number of bacterial strains, or maybe eukaryotic, such as yeast or other fungal cells, insect or amphibian cells,or mammalian cells including, for example, rodent, simian or human cells.  Cells may be primary cultured cells, forexample, primary human fibroblasts or keratinocytes, or may be an establishedcell line, such as NIH3T3, 293T or CHO cells.  Further, mammalian cells useful in thepresent invention may be phenotypically normal or oncogenicallytransformed.  It is assumed that oneskilled in the art can readily establish and maintain a chosen host cell typein culture.
Introductionof vectors to host cells.
Vectorsuseful in the present invention may be introduced to selected host cells by anyof a number of suitable methods known to those skilled in the art.  For example, vector constructs may beintroduced to appropriate bacterial cells by infection, in the case of E. colibacteriophage vector particles such as lambda or M13, or by any of a number oftransformation methods for plasmid vectors or for bacteriophage DNA.  For example, standardcalcium-chloride-mediated bacterial transformation is still commonly used tointroduce naked DNA to bacteria (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY), but electroporation may also be used (Ausubel et al., 1988, CurrentProtocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, Inc., NY, NY)).
Forthe introduction of vector constructs to yeast or other fungal cells, chemicaltransformation methods are generally used (e.g. as described by Rose et al.,1990, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY).  Fortransformation of S. cerevisiae, for example, the cells are treated withlithium acetate to achieve transformation efficiencies of approximately 104colony-forming units (transformed cells)/μg of DNA.  Transformed cells are then isolated onselective media appropriate to the selectable marker used.  Alternatively, or in addition, plates orfilters lifted from plates may be scanned for GFP fluorescence to identifytransformed clones.  
Forthe introduction of vectors comprising a sequence of interest to mammaliancells, the method used will depend upon the form of the vector.  Plasmid vectors may be introduced by anyof a number of transfection methods, including, for example, lipid-mediatedtransfection (“lipofection”), DEAE-dextran-mediated transfection,electroporation or calcium phosphate precipitation.  These methods are detailed, for example,in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1988, John Wiley& Sons, Inc., NY, NY).  
Lipofectionreagents and methods suitable for transient transfection of a wide variety oftransformed and non-transformed or primary cells are widely available, makinglipofection an attractive method of introducing constructs to eukaryotic, andparticularly mammalian cells in culture. For example, LipofectAMINETM(Life Technologies) or LipoTaxiTM(Stratagene) kits areavailable.  Other companies offeringreagents and methods for lipofection include Bio-Rad Laboratories, CLONTECH,Glen Research, InVitrogen, JBL Scientific, MBI Fermentas, PanVera, Promega,Quantum Biotechnologies, Sigma-Aldrich, and Wako Chemicals USA.  
Followingtransfection with a vector of the invention, eukaryotic (e.g., human) cellssuccessfully incorporating the construct (intra- or extrachromosomally) may beselected, as noted above, by either treatment of the transfected populationwith a selection agent, such as an antibiotic whose resistance gene is encodedby the vector, or by direct screening using, for example, FACS of the cellpopulation or fluorescence scanning of adherent cultures.  Frequently, both types of screening maybe used, wherein a negative selection is used to enrich for cells taking up theconstruct and FACS or fluorescence scanning is used to further enrich for cellsexpressing differentially expressed polynucleotides or to identify specificclones of cells, respectively.  Forexample, a negative selection with the neomycin analog G418 (Life Technologies,Inc.) may be used to identify cells that have received the vector, andfluorescence scanning may be used to identify those cells or clones of cellsthat express the vector construct to the greatest extent.  
Reg1α and TIMP1Polypeptides
The present invention provides a method for thedetection of colorectal cancer in an individual by detecting the presence ofReg1α or TIMP1 in a clinical sample from an individual.  In addition the invention encompassesthe detection of cancer by identifying Reg1α or TIMP1 gene product in colontissue or cells.  Alternatively, theinvention relates to a method for the detection of colorectal cancer in anindividual wherein colorectal cancer is identified by detecting the presence ofReg1α or TIMP1 and at least one additional colorectal cancer associated markerin the clinical sample from an individual. Polypeptides of the present invention, the detection of which isindicative of colorectal cancer include those having the sequence shown in oneor more of SEQ ID Nos. 2, 4, or 100, or alternatively, which are encoded by oneor more of SEQ ID Nos. 1, 3 or 33.  
Preferred polypeptides which can be detected and arethus indicative of colorectal cancer in an individual are those that areencoded by nucleic acid sequences at least about 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%,or 98% identical to a mRNA sequence complementary to the nucleic acid sequenceof SEQ ID Nos. 1, 3 or 33. Particularly preferred polypeptides are those of SEQ ID Nos. 2, 4, or99, or fragments thereof, or polypeptide sequences which are at least about70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98% or 99% identical in sequence to the amino acidsequence of one or more of SEQ ID Nos. 2, 4, or 100. 
In addition to a method for detecting colorectal cancerby identifying the presence of the Reg1α or TIMP1 polypeptide in a clinicalsample from an individual, the invention further comprises a method ofdetecting cancer by identifying the presence of Reg1α or TIMP1 in addition toat least one other colorectal cancer associated marker in the same sample(e.g., in the same serum, tissue, or cell sample).
Antibodies 
The invention provides a method for colorectal cancerdetection comprising the step of detecting the presence of Reg1α or TIMP1 (andoptionally, at least one additional colorectal cancer associated marker) in aclinical sample from an individual. In one embodiment, the presence of Reg1α or TIMP1 , or other marker, insuch a sample is detected using a polypeptide ligand which is preferably detectablylabeled, and is capable of binding to Reg1α or TIMP1 , and if present, theother marker, in the sample.  In apreferred embodiment, the polypeptide ligand is an antibody.  Antibodies of the invention include, butare not limited to, polyclonal, monoclonal, multispecific, human, humanized, orchimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments, Fv fragmentsF(ab’) fragments, fragments produced by a Fab expression library,anti-iodiotypic antibodies, or other epitope binding polypeptide.  Preferably, an antibody, useful in thepresent invention for the detection of Reg1α or TIMP1 (and optionally at leastone additional colorectal cancer associated marker), is a human antibody orfragment thereof, including scFv, Fab, Fab’, F(ab’), Fd, single chain antibody,of Fv.  Antibodies, useful in theinvention may include a complete heavy or light chain constant region, or aportion thereof, or an absence thereof. An antibody, useful in the invention, may be obtained from an artrecognized host, such as rabbit, mouse, rat, donkey, sheep, goat, guinea pig,camel, horse, or chicken.  In oneembodiment, an antibody, useful in the invention can be a humanized antibody,in which amino acids have been replaced in the non-antigen binding regions inorder to more closely resemble a human antibody, while still retaining theoriginal binding ability.  Methodsfor making humanized antibodies are described in Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, ImmunologyToday 4: 7279; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92: 3-16; WO 92/06193; EP 0239400.  
Antibodies of the present invention may be monospecific,dispecific, trispecific, or of greater multispecificity.  As such, Reg1α or TIMP1 and optionallyan additional colorectal cancer associated marker useful for the detection ofcolorectal cancer may be detected with separate antibodies, or may be detectedwith the same antibody. Alternatively, a multispecific antibody may exhibit differentspecificities for different epitopes on the same protein (e.g., differentepitopes on Reg1α).  Whilespecificity of an antibody useful in the present invention to either Reg1α orone or more additional colorectal cancer associated markers is preferred,antibodies that bind polypeptides with at least 95%, 90%, 85%, 75%, 65%, 55%,and at least 50% identity to a polypeptide useful in the present invention forthe detection of colorectal cancer (i.e., Reg1α, and/or an additionalcolorectal cancer associated marker) are also included in the presentinvention.  Also encompassed in thepresent invention are antibodies which bind to polypeptide molecules which areencoded by one or more nucleic acid sequences which are complementary to, orhybridize to the sequences of SEQ ID Nos. 1, 3 or 33, or one or more sequenceswhich are complementary to, or hybridize to a nucleic acid sequence whichencodes an additional colorectal cancer associated marker as described herein.
Antibodies of the present invention which are useful forthe detection of colorectal cancer may further act as agonists or antagonistsof the activity of the polypeptide molecules to which they bind, and may thusbe useful as therapeutic molecules for the treatment or prevention of colorectalcancer.
An important, but not limiting, role of an antibody ofthe present invention is to provide for the purification, or detection of Reg1αor TIMP1 or other colorectal cancer associated markers in a patient sample,including both in vitro and in vivo detection methods.  Antibodies useful for the detection ofcolorectal cancer as described herein do not have to be used alone, and can befused to other polypeptides, including a heterologous polypeptide at the N- orC-terminus of the antibody polypeptide sequence.  For example, an antibody useful in thepresent invention may be fused with a detectable label to facilitate detectionof the antibody when bound to a target polypeptide.  Methods for detectably labeling anantibody polypeptide are known to those of skill in the art.
Forthe production of antibodies useful in the present invention, various hostsincluding goats, rabbits, rats, mice, etc., may be immunized by injection withthe protein products (or any portion, fragment, or oligonucleotide thereofwhich retains immunogenic properties) of the candidate genes of theinvention.  Depending on the hostspecies, various adjuvants may be used to increase the immunologicalresponse.  Such adjuvants includebut are not limited to Freund’s, mineral gels such as aluminum hydroxide, andsurface active substances such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions,peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, and dinitrophenol. BCG(bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacteriumparvum are potentially useful human adjuvants.
Polyclonalantisera or monoclonal antibodies can be made using methods known in theart.  A mammal such as a mouse,hamster, or rabbit, can be immunized with an immunogenic form of a Reg1α orTIMP1 polypeptide, fragment, modified form thereof, or variant formthereof.  Alternatively, an animalmay be immunized with an immunogenic form of one or more additional colorectalcancer associated marker polypeptides. Techniques for conferring immunogenicity on such molecules includeconjugation to carriers or other techniques well known in the art.  For example, the immunogenic moleculecan be administered in the presence of adjuvant as described above.  Immunization can be monitored bydetection of antibody titers in plasma or serum.  Standard immunoassay procedures can beused with the immunogen as antigen to assess the levels and the specificity ofantibodies.  Following immunization,antisera can be obtained and, if desired, polyclonal antibodies isolated fromthe sera. 
Toproduce monoclonal antibodies, antibody producing cells (lymphocytes) can beharvested from an immunized animal and fused with myeloma cells by standardsomatic cell fusion procedures thus immortalizing these cells and yieldinghybridoma cells.  Such techniquesare well known in the art (see, e.g., Kohler and Milstein, 1975, Nature 256: 495-497; Kozbor etal., 1983, Immunol. Today 4:72, Cole et al., 1985, In MonoclonalAntibodies in Cancer Therapy, Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96).  Additionally, techniques described forthe production of single-chain antibodies (U.S. Patent No. 4,946,778) can beadapted to produce antibodies according to the invention.  
Antibodyfragments which can specifically bind to a polypeptide of the invention such asReg1α or TIMP1 or other colorectal cancer associated marker polypeptides,fragments thereof, modified forms thereof, and variants thereof, also may begenerated by known techniques.  Forexample, such fragments include, but are not limited to, F(ab')2fragments which can be produced by pepsin digestion of the antibody moleculeand the Fab fragments which can be generated by reducing the disulfide bridgesof the F(ab')2 fragments. VH regions and FV regions can be expressed in bacteria using phageexpression libraries (e.g., Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546; Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552-554). 
Chimericantibodies, i.e., antibody molecules that combine a non-human animal variableregion and a human constant region also are within the scope of theinvention.  Chimeric antibodymolecules include, for example, the antigen binding domain from an antibody ofa mouse, rat, or other species, with human constant regions.  Standard methods may be used to makechimeric antibodies containing the immunoglobulin variable region whichrecognizes the gene product of Reg1α antigens of the invention (see, e.g.,Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 81: 6851; Takedaet al., 1985, Nature 314: 452;U.S. Patent No. 4,816,567; U.S. Patent No. 4,816,397).  
OtherColorectal cancer Specific Analysis
In addition to the detection of colorectal cancer byidentifying expression of Reg1α or TIMP1, or detecting Reg1α or TIMP1polypeptides, the present invention further comprises a method for detectingcolorectal cancer wherein a nucleic acid molecule encoding Reg1α or TIMP1, orReg1α or TIMP1 polypeptide is identified in combination with at least one othernucleic acid sequence encoding a known colorectal cancer associated marker in aclinical sample from an individual. Alternatively, the presence of Reg1α or TIMP1 is detected in combinationwith at least one additional colorectal cancer marker amino acid sequence.  Similar to the methods described abovefor Reg1α, a nucleic acid molecule which encodes at least one other colorectalcancer associated marker may be used to generate a nucleic acid probe fordetection of the colorectal cancer associated marker sequence in a patientsample, or may be used to generate amplification primers to amplify thecolorectal cancer associated marker sequence from a patient sample comprisingthe sequence, thus identifying the presence of the colorectal cancer associatedmarker in the sample, and thus indicating the detection of colorectalcancer.  A colorectal cancerassociated marker polypeptide sequence may be used, as described above for Reg1αto generate antibodies useful for detection of the colorectal cancer associatedmarker in a clinical sample. Methods for detecting a colorectal cancer associated marker nucleic acidor amino acid sequence are described below, and may be adapted from the methodsfor the detection of Reg1α nucleic acid or amino acid in a clinical sample.
A “colorectal cancer associated marker” useful in thepresent invention, refers to a polypeptide or nucleic acid sequence whichexhibits over- or underexpression of at least 10% in colorectal cancer cells,tissue, or serum obtained from an individual having colorectal cancer, relativeto the level of expression in cells, tissue, or serum obtained from anindividual that does not have colorectal cancer.  Non-limiting examples of colorectalcancer associated markers useful in the present invention include the nucleicacid molecules of SEQ ID Nos 1, 3, 5-71, and/or the polypeptide molecules ofSEQ ID Nos 2, 4, 72-138.  In one embodiment,the polypeptide sequences of SEQ ID Nos 2, 4, 72-138 are encoded by the nucleicacid sequences of 1, 3, 5-71, respectively.  It will be appreciated by one of skillin the art that, where the method of the invention relates to detection ofReg1α and at least one other colorectal cancer associated marker, TIMP1 may beincluded as a potential “other colorectal cancer associated marker”.  Likewise, where the detection method isbased on the detection of TIMP1 and at least one other colorectal cancer associatedmarker, Reg1α may be included as a potential “other colorectal cancerassociated marker”.  Alternatively,a colorectal cancer associated marker, as used in the present invention, mayrefer to a carbohydrate epitope present on a polypeptide or nucleic acidmolecule and/or an antibody molecule which recognizes and is capable of bindingto such an epitope, wherein the carbohydrate epitope is known to be associatedwith the presence of colorectal cancer in an individual.  Such carbohydrate epitopes may bepresent on more than one unrelated protein or polypeptide.  In one embodiment, such a carbohydrateepitope is CA 19-9, also known as sialyl-Lewisa, is a tumor markerdefined by a monoclonal antibody as a carbohydrate epitope, related to theblood group antigens, composed of a branching, 5-sugar structure covalentlybound to a variety of glycoproteins or glycolipids.  The proteins primarily belong to themucin family and the lipids are usually membrane associated.  The CA 19-9 epitope is typically theterminal moiety of a complex, O-linked carbohydrate structure on eithermacromolecule.  Other tumor markersalso defined as various carbohydrate epitopes useful in the present inventionas a “colorectal cancer associated marker” include CA 72-4, TF, sTn, Tn, CA 50,CA 549, CA 242, LASA, and the Du-PAN's 1 -5.
Table 1 below shows a list of “colorectal cancerassociated markers” useful in the invention (although colorectal cancerassociated markers useful in the invention are not limited to those shown inTable 1), and there correspondence with the sequences set forth in the“Sequence listing”.
2004198419.tif 000007
2004198419.tif 000008
2004198419.tif 000009
2004198419.tif 000010
DetectionAssays
The present invention provides method for detectingcolorectal cancer, or alternatively, determining whether a subject is at riskfor developing colorectal cancer by detecting the disclosed biomarkers (i.e.,the nucleic acid sequence of Reg1α or TIMP1 and optionally, one or more nucleicacid sequences encoding an additional colorectal cancer associated markerand/or polypeptide markers such as Reg1α or TIMP1 and optionally, at least oneadditional colorectal cancer associated marker) for the disease or conditionencoded thereby.
In clinical applications, human tissue samples,preferably serum, can be screened for the presence and/or absence of Reg1α orTIMP1 and/or other colorectal cancer associated markers identified herein.  Such samples may comprise tissuesamples, whole cells, cell lysates, or isolated nucleic acids, including, forexample, needle biopsy cores, surgical resection samples, lymph node tissue, orserum.  A sample for analysis asdescribed herein is preferably a serum sample.  A serum sample may be obtained from anindividual using methods which are well known to those of skill in theart.  Briefly, a whole venous or arterialblood sample from an individual is collected into a test tube.  The whole blood sample is permitted toincubate at room temperature for approximately 15-30 to allow the blood toclot.  Once clotted, the sample iscentrifuged at approximately 1500 to 3000 rpm for 5-30 minutes to completely separatethe serum from the cellular components. This centrifugation may be repeated if necessary to achieve completeseparation.  The resulting serumsample may be subsequently screened for the presence of Reg1α nucleic acid oramino acid and/or one or more additional colorectal cancer associated markersas described herein.
Screening fornucleic acid molecules
In one embodiment, the detection method of the presentinvention comprises determining whether a clinical sample from an individualcontains mRNA of a colorectal cancer associated marker, preferably Reg1α orTIMP1, but also optionally including additional colorectal cancer associatedmarkers as described herein. Techniques for determining the presence of a nucleic acid molecule ofinterest include Northern blot analysis, reverse transcription-polymerase chainreaction (RT-PCR), in situ hybridization, PCR, and quantitativeamplification.  
Prior to detection of target nucleic acid molecules in aclinical sample, it is preferred to first isolate the mRNA from the sample tofacilitate detection of the target sequence (i.e., a sequence encoding Reg1α orTIMP1).  Methods for isolation ofmRNA from a biological sample are well known in the art.  Briefly, where the sample is a serumsample, for example, 0.1 ml of 2 M sodium acetate, pH 4, 1 ml water-saturatedphenol, and 0.2 ml of 49:1 chloroform/isoamyl alcohol are added to the serumsample sequentially.  The sample ismixed after the addition of each component, and incubated for 15 min at 0-4°Cafter all components have been added. The sample is separated by centrifugation for 20 min at 10,000 x g, 4°C,precipitated by the addition of 1 ml of 100% isopropanol, incubated for 30minutes at -20°C and pelleted by centrifugation for 10 minutes at 10,000 x g,4°C.  The resulting RNA pellet isdissolved in 0.3 ml denaturing solution, transferred to a microfuge tube,precipitated by the addition of 0.3 ml of 100% isopropanol for 30 minutes at-20°C, and centrifuged for 10 minutes at 10,000 x g at 4°C.  The RNA pellet is washed in 70% ethanol,dried, and resuspended in 100-200μlDEPC-treated water or DEPC-treated 0.5% SDS (Chomczynski and Sacchi, 1987,Anal. Biochem., 162: 156). 
Alternatively, total RNA may be extracted from aclinical sample according to the present invention using a commerciallyavailable RNA isolation reagent such as Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA),following the manufacturers instructions. Purity and integrity of RNA is assessed by absorbance at 260/280 nm  and separation of RNA samples on a 1%agarose gel followed by inspection under ultraviolet light.
Following mRNA isolation, the mRNA may be reversetranscribed to provide a cDNA sample according to methods well known to thoseof skill in the art (see, e.g., Ausubel et al. (1995), Short Protocols inMolecular Biology, 3rd Ed. John Wiley and Sons, Inc.)
Accordingly, in one aspect, the invention providesprobes and primers that specifically hybridize to the Reg1α or TIMP1 nucleicacid sequences disclosed herein, or which can hybridize to a nucleic acidmolecule encoding an additional colorectal cancer associated marker asdescribed herein.  Accordingly, thenucleic acid probes comprise a region of a nucleic acid sequence of SEQ ID Nos1, 3, or 33 sufficient to hybridize with a nucleic acid substantiallycomplementary to the sequence of SEQ ID Nos 1, 3 or 33.  Preferred nucleic acid molecules for useas probes/primers can further comprise a region of nucleic acid sequencesubstantially complementary to the sequence of SEQ ID Nos. 1, 3 or 33sufficient to hybridize with the sequence of SEQ ID Nos. 1, 3 or 33.  In addition, nucleic acid sequencesuseful as probes/primers comprise a nucleotide sequence at least about 8nucleotides in length, at least about 12 nucleotides in length, preferably atleast about 15 nucleotides, more preferably about 25 nucleotides, and mostpreferably at least 40 nucleotides, and up to all or nearly all of the codingsequence which is complementary to a portion of the coding sequence of a markernucleic acid sequence, which nucleic acid sequence is represented by SEQ IDNos: 1, 3 or 33, or a sequence complementary thereto.
In one embodiment, the method comprises using a nucleicacid probe to determine the presence of a Reg1α or TIMP1 nucleic acid moleculein a clinical sample (such as a serum sample or a nucleic acid sample extractedtherefrom).  Specifically, themethod comprises:
1.         Providinga nucleic acid probe comprising a nucleotide sequence at least about 8nucleotides in length, at least about 12 nucleotides in length, preferably atleast about 15 nucleotides, more preferably about 25 nucleotides, and mostpreferably at least about 40 nucleotides, and up to all or nearly all of thecoding sequence which is complementary to a portion of the coding sequence of anucleic acid sequence represented by SEQ ID Nos: 1, 3 or 33, or a sequencecomplementary thereto;
2.         Obtaininga clinical sample from a patient potentially comprising a Reg1α or TIMP1nucleic acid sequence;
3.         Providinga second clinical sample from an individual known to not have colorectalcancer;
4.         Contactingthe nucleic acid probe under stringent conditions with RNA of each of saidfirst and second clinical samples (e.g., in a Northern blot or in situ hybridization assay); and 
5.         Comparing(a) the amount of hybridization of the probe with RNA of the first serumsample, with (b) the amount of hybridization of the probe with RNA of thesecond clinical sample; wherein a statistically significant difference in theamount of hybridization with the RNA of the first clinical sample as comparedto the amount of hybridization with the RNA of the second clinical sample isindicative of the presence of Reg1α or TIMP1 in the first clinical sample.
Although, primarily drawn to detection of Reg1α or TIMP1in a clinical sample such as serum, in one aspect, the present inventionprovides a method comprising in situhybridization detection of Reg1α or TIMP1 with a probe derived from a nucleicacid sequence represented by SEQ ID Nos: 1, 3 or 33, or a sequencecomplementary thereto.  Preferably,the hybridization probe is detectably labeled.  The method comprises contacting thelabeled hybridization probe with a tissue or cell sample from an individualsuspected of having colorectal cancer, washing off any unbound probe, anddetecting the signal produced by the detectable label, wherein the detection ofthe detectable signal is indicative of the presence of Reg1α or TIMP1 in thesample, and thus permits the detection of colorectal cancer.  Alternatively, the tissue or cell isadditionally hybridized with a detectably labeled nucleic acid probe which iscapable of specifically hybridizing with a nucleic acid sequence that encodesat least one additional colorectal cancer associated marker.  Detection of the second detectablylabeled probe is thus indicative of the presence of the additional colorectalcancer associated marker in the sample, and in conjunction with the detectionof Reg1α or TIMP1, permits the detection of colorectal cancer in theindividual.  Specific methods for in situ hybridization are well known inthe art.
Alternatively,methods such as PCR, Northern analysis, and Taqman may be used to detect and/orquantitate the expression of a nucleic acid sequence encoding Reg1α in aclinical sample.  In one embodiment,reverse transcription PCR (RT-PCR) is performed using primers designed tospecifically hybridize to a predetermined portion of the Reg1α mRNA sequenceisolated from a clinical sample. Generation of a PCR product by such a reaction is thus indicative of thepresence of the Reg1α or TIMP1 sequence in the sample.  The technique of designing primers forPCR amplification is well known in the art.  Oligonucleotide primers and probes are 5to 100 nucleotides in length, ideally from 17 to 40 nucleotides, althoughprimers and probes of different length are of use.  Primers for amplification are preferablyabout 17-25 nucleotides.  Primersuseful according to the invention are also designed to have a particularmelting temperature (Tm) by the method of melting temperature estimation.  Commercial programs, including OligoTM(MBI, Cascade, CO), Primer Design and programs available on the internet,including Primer3 and Oligo Calculator can be used to calculate a Tm of anucleic acid sequence useful according to the invention.  Preferably, the Tm of an amplificationprimer useful according to the invention, as calculated for example by OligoCalculator, is preferably between about 45 and 65° C and more preferablybetween about 50 and 60° C. Preferably, the Tm of a probe useful according to the invention is 7° Chigher than the Tm of the corresponding amplification primers.  It is preferred that, followinggeneration of cDNA by RT-PCR, the cDNA fragment is cloned into an appropriatesequencing vector, such as a PCRII vector (TA cloning kit; Invitrogen).  The identity of each cloned fragment isthen confirmed by sequencing in both directions.  It is expected that the sequenceobtained from sequencing would be the same as the known sequence of Reg1α toTIMP1 as described herein.
Alternatively,the presence of an mRNA sequence encoding Reg1α or TIMP1 may be detected byNorthern analysis.  Sequenceconfirmed cDNAs, that is, cDNAs encoding Reg1α or TIMP1 (or alternatively anadditional colorectal cancer associated marker) are used to produce 32P-labeledcDNA probes using techniques well known in the art (see, for example, Ausubel, supra).  Labeled probes for Northern analysis mayalso be produced using commercially available kits (Prime-It Kit, Stratagene,La Jolla, CA).  Northern analysis oftotal RNA obtained from a clinical sample may be performed using classicallydescribed techniques.  For example,total RNA samples are denatured with formaldehyde / formamide and run for twohours in a 1% agarose, MOPS-acetate-EDTA gel.  RNA is then transferred tonitrocellulose membrane by upward capillary action and fixed by UVcross-linkage.  Membranes arepre-hybridized for at least 90 minutes and hybridized overnight at 42oC.  Post hybridization washes areperformed as known in the art (Ausubel, supra).  The membrane is then exposed to x-rayfilm overnight with an intensifying screen at -80o C.  Labeled membranes are then visualizedafter exposure to film.  The signalproduced on the x-ray film by the radiolabeled cDNA probes can then bequantified using any technique known in the art, such as scanning the film andquantifying the relative pixel intensity using a computer program such as NIHImage (National Institutes of Health, Bethesda, MD), wherein the detection ofhybridization of a Reg1α-specific probe to the clinical sample is indicative ofthe presence of Reg1α or TIMP1 and thus may be used to detect colorectalcancer.
Inan alternate embodiment, the presence and optionally the quantity of Reg1α orTIMP1 in a clinical sample may be determined using the TaqmanTM (Perkin-Elmer,Foster City, CA) technique, which is performed with a transcript-specificantisense probe (i.e., a probe capable of specifically hybridizing toReg1α).  This probe is specific fora Reg1α or TIMP1 PCR product and is prepared with a quencher and fluorescentreporter probe complexed to the 5’ end of the oligonucleotide.  Different fluorescent markers can beattached to different reporters, allowing for measurement of two products inone reaction (e.g., measurement of Reg1α or TIMP1 and at least one additionalcolorectal cancer associated marker). When Taq DNA polymerase is activated, it cleaves off the fluorescentreporters by its 5’-to-3’ nucleolytic activity.  The reporters, now free of thequenchers, fluoresce.  The colorchange is proportional to the amount of each specific product and is measuredby fluorometer; therefore, the amount of each color can be measured and theRT-PCR product can be quantified. The PCR reactions can be performed in 96 well plates so that samplesderived from many individuals can be processed and measuredsimultaneously.  The TaqmanTM systemhas the additional advantage of not requiring gel electrophoresis and allowsfor quantification when used with a standard curve.
Screening forpolypeptide molecules
TheReg1α- or TIMP1-specific and colorectal cancer marker-specific antibodiesdescribed above may be used to detect the presence of Reg1α or TIMP1 or anadditional colorectal cancer associated marker in a clinical sample by anymethod known in the art. The immunoassays which can be used include but are notlimited to competitive and non-competitive assay systems using techniques suchas western blots, radioimmunoassays, ELISA (enzyme linked immunosorbentassay),"sandwich" immunoassays, immunoprecipitation assays,precipitation reactions, gel diffusion precipitin reactions, immunodiffusionassays, agglutination assays, complement-fixation assays, immunoradiometricassays, fluorescent immunoassays, protein A immunoassays, to name but a few.Such assays are routine and well known in the art (see, e. g., Ausubel et al,eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley &Sons, Inc., New York, which is incorporated by reference herein in itsentirety). Exemplary immunoassays are described briefly below (but are notintended by way of limitation).
Immunoprecipitationprotocols generally comprise lysing a population of cells in a lysis buffersuch as RIPA buffer (1% NP-40 or Triton X-100,1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS,0.15 M NaCI, 0.01 M sodium phosphate at pH 7.2,1% Trasylol) supplemented withprotein phosphatase and/or protease inhibitors (e. g., EDTA, PMSF, aprotinin,sodium vanadate), adding the antibody of interest to the cell lysate,incubating for a period of time (e. g., 1-4 hours) at 4 C, adding protein Aand/or protein G sepharose beads to the cell lysate, incubating for about anhour or more at 4 C, washing the beads in lysis buffer and resuspending thebeads in SDS/sample buffer.  In thecase of immunonprecipitation of a serum sample, however the above protocol iscarried out absent the cell lysis step. The ability of the antibody to immunoprecipitate Reg1α or TIMP1 (orother colorectal cancer marker) antigen can be assessed by, e. g., western blotanalysis.  The parameters that canbe modified to increase the binding of the antibody to an antigen and decreasethe background (e. g., preclearing the cell lysate with sepharose beads) arewell known to those of skill in the art (Ausubel et al, supra).
Reg1αor TIMP1 polypeptides, and optionally one or more additional colorectal cancerassociated markers may be detected in a patient clinical sample using Westernblot analysis.  Briefly, Westernblot analysis comprises preparing protein samples, electrophoresis of theprotein samples in a polyacrylamide gel (e. g., 8%-20% SDS-PAGE), transferringthe protein sample from the polyacrylamide gel to a membrane such asnitrocellulose, PVDF or nylon, blocking the membrane in blocking solution (e.g., PBS with 3% BSA or non-fat milk), washing the membrane in washing buffer(e. g., PBS-Tween 20), blocking the membrane with primary antibody (theantibody of interest) diluted in blocking buffer, washing the membrane inwashing buffer, blocking the membrane with a secondary antibody (whichrecognizes the primary antibody, e. g., an antihuman antibody) conjugated to anenzymatic substrate (e. g., horseradish peroxidase or alkaline phosphatase) orradioactive molecule (e. g., 32P or 125I) diluted in blocking buffer, washingthe membrane in wash buffer, and detecting the presence of the antigen.  Methods for the optimization of such ananalysis are well known in the art (Ausubel, et al., supra).
Alternatively,the presence of Reg1α or TIMP1 and optionally one or more additional colorectalcancer associated markers in a clinical sample may be detected by ELISA.  ELISAs comprise preparing antigen,coating the well of a 96 well microtiter plate (or other suitable container)with the antigen, adding the antibody of interest conjugated to a detectablecompound such as an enzymatic substrate (e. g., horseradish peroxidase oralkaline phosphatase) to the well and incubating for a period of time, anddetecting the presence of the antigen. In ELISAs the antibody of interest does not have to be conjugated to adetectable compound; instead, a second antibody (which recognizes the antibodyof interest, that is, the antibody which will bind to Reg1α or TIMP1 or asecond colorectal cancer associated marker) conjugated to a detectable compoundmay be added to the well. Further, instead of coating the well with theantigen, the antibody may be coated to the well. In this case, a secondantibody conjugated to a detectable compound may be added following theaddition of the antigen of interest to the coated well.  This method may be modified or optimizedaccording techniques which are known to those of skill in the art.  
Thebinding affinity of an antibody to an antigen and the off-rate of anantibodyantigen interaction can be determined by competitive bindingassays.  One example of such anassay is a radioimmunoassay comprising the incubation of labeled antigen (e.g., Reg1α labeled with 3H or 125I) with an anti-Reg1α or TIMP1 antibody in thepresence of increasing amounts of unlabeled antigen, and the detection of theantibody bound to the labeled antigen. The affinity of the antibody of interestfor a particular antigen and the binding off-rates can be determined from thedata by scatchard plot analysis. Competition with a second antibody can also be determined usingradioimmunoassays.  In this case,the antigen is incubated with antibody of interest conjugated to a labeledcompound (e. g., 3H or 125I) in the presence of increasing amounts of anunlabeled second antibody.
Preferably,the above detection assays re be carried out using antibodies to detect theprotein product encoded by a nucleic acid having the sequence of SEQ ID Nos: 1,3 or 33, or a sequence complementary thereto.  Preferably, the protein product has thesequence of one or more of SEQ ID Nos. 2, 4, or 100.  In addition, the above detection assaysmay be conducted using one or more antibodies which specifically recognize andbind to at least one additional colorectal cancer associated marker.  Accordingly, in one embodiment, theassay would include contacting the proteins of the test cell with an antibodyspecific for the gene product of a nucleic acid represented by SEQ ID Nos: 1, 3or 33, or a sequence complementary thereto, and determining the approximateamount of immunocomplex formation by the antibody and the proteins of the testcell, wherein a detection of such an immunocomplex is indicative of thepresence of the antigen, and thus, permits the detection of colorectalcancer.  
Immunoassays, useful in the present invention includethose described above, and can also include both homogeneous and heterogeneousprocedures such as fluorescence polarization immunoassay (FPIA), fluorescenceimmunoassay (FIA), enzyme immunoassay (EIA), and nephelometric inhibitionimmunoassay (NIA).  
In another embodiment, the level of the encoded product,i.e., the product encoded by SEQ ID Nos 1, 3 or 33, or a sequence complementarythereto, in a biological fluid (e.g., blood or urine) of a patient may bedetermined as a way of monitoring the level of expression of the marker nucleicacid sequence in cells of that patient. Such a method would include the steps of obtaining a sample of abiological fluid from the patient, contacting the sample (or proteins from thesample) with an antibody specific for a encoded marker polypeptide, anddetermining the amount of immune complex formation by the antibody, with the amountof immune complex formation being indicative of the level of the marker encodedproduct in the sample.  Thisdetermination is particularly instructive when compared to the amount of immunecomplex formation by the same antibody in a control sample taken from a normalindividual or in one or more samples previously or subsequently obtained fromthe same person.
In another embodiment, the method can be used todetermine the amount of marker polypeptide present in a cell, which in turn canbe correlated with progression of a hyperproliferative disorder, e.g.,colorectal cancer.  The level of themarker polypeptide can be used predictively to evaluate whether a sample ofcells contains cells which are, or are predisposed towards becoming,transformed cells.  Moreover, thesubject method can be used to assess the phenotype of cells which are known tobe transformed, the phenotyping results being useful in planning a particulartherapeutic regimen.  For instance,very high levels of the marker polypeptide in sample cells is a powerfuldiagnostic and prognostic marker for a cancer, such as colorectal cancer.  The observation of marker polypeptidelevel can be utilized in decisions regarding, e.g., the use of more aggressivetherapies.
As set out above, one aspect of the present inventionrelates to detection assays for determining, in the context of cells isolatedfrom a patient, if the level of a marker polypeptide is significantly reducedin the sample cells.  The term“significantly reduced” refers to a cell phenotype wherein the cell possesses areduced cellular amount of the marker polypeptide relative to a normal cell ofsimilar tissue origin.  For example,a cell may have less than about 50%, 25%, 10%, or 5% of the marker polypeptidethat a normal control cell.  Inparticular, the assay evaluates the level of marker polypeptide in the testcells, and, preferably, compares the measured level with marker polypeptidedetected in at least one control cell, e.g., a normal cell and/or a transformedcell of known phenotype.
Of particular importance to the subject invention is theability to quantitate the level of normal or abnormal Reg1α or TIMP1expression.  The expression of Reg1αor TIMP1, and/or the level of expression of Reg1α or TIMP1 can be usedpredictively to evaluate whether a patient is predisposed towards developingcolorectal cancer, or for determining the severity of colorectal cancer. 
In one embodiment, tissue samples may be used to measureReg1α or TIMP1 expression by immunohistochemical staining which may be used todetermine the number of cells (i.e., colon cells) expressing Reg1α orTIMP1.  For such staining, amultiblock of tissue is taken from the biopsy or other tissue sample andsubjected to proteolytic hydrolysis, employing such agents as protease K orpepsin.  In certain embodiments, itmay be desirable to isolate a nuclear fraction from the sample cells and detectthe level of the marker polypeptide in the nuclear fraction.
The tissue samples are fixed by treatment with a reagentsuch as formalin, glutaraldehyde, methanol, or the like.  The samples are then incubated with anantibody, preferably a monoclonal antibody, with binding specificity for Reg1αor TIMP1 and optionally an additional colorectal cancer associated marker.  This antibody may be conjugated to alabel for subsequent detection of binding. Samples are incubated for a time sufficient for formation of theimmunocomplexes.  Binding of theantibody is then detected by virtue of a label conjugated to this antibody.Where the antibody is unlabeled, a second labeled antibody may be employed,e.g., which is specific for the isotype of the anti-marker polypeptideantibody. Examples of labels which may be employed include radionuclides,fluorescers, chemiluniinescers, enzymes and the like.
Where enzymes are employed, the substrate for the enzymemay be added to the samples to provide a colored or fluorescent product.Examples of suitable enzymes for use in conjugates include horseradishperoxidase, alkaline phosphatase, malate dehydrogenase and the like. Where notcommercially available, such antibody-enzyme conjugates are readily produced bytechniques known to those skilled in the art.  Other assays, known to those of skill inthe art for determining the presence and/or quantity of a polypeptide in asample (either serum or tissue) are also encompassed by the present invention.
Drug screening
Several in vivo methods can be used to identifycompounds that modulate expression of Reg1α or TIMP1 nucleic acids (SEQ ID Nos:1, 3 or 33, or a sequence complementary thereto) and/or alter for example,inhibit the bioactivity of the encoded polypeptide (e.g., SEQ ID Nos: 2, 4, or100).
Drug screening is performed by adding a test compound toa sample of cells, and monitoring the effect.  A parallel sample which does not receivethe test compound is also monitored as a control.  The treated and untreated cells are thencompared by any suitable phenotypic criteria, including but not limited tomicroscopic analysis, viability testing, ability to replicate, histologicalexamination, the level of a particular RNA or polypeptide associated with thecells, the level of enzymatic activity expressed by the cells or cell lysates,and the ability of the cells to interact with other cells or compounds.Differences between treated and untreated cells indicates effects attributableto the test compound.
Desirable effects of a test compound include an effecton any phenotype that was conferred by the cancer-associated marker nucleicacid sequence.  Examples include atest compound that limits the overabundance of mRNA, limits production of theencoded protein, or limits the functional effect of the protein.  The effect of the test compound would beapparent when comparing results between treated and untreated cells.
The invention thus also encompasses methods of screeningfor agents which inhibit expression of Reg1α or TIMP1 nucleic acid (SEQ ID Nos:1, 3 or 33, or a sequence complementary thereto) in vitro, comprising exposing either a cell or tissue in whichReg1α or TIMP1 nucleic acid mRNA is detectable or cultured cells comprising andcapable of expressing Reg1α or TIMP1 nucleic acid to an agent in order todetermine whether the agent is capable of inhibiting production of the mRNA;and determining the level of mRNA in the exposed cells or tissue, wherein adecrease in the level of the mRNA after exposure of the cell line to the agentis indicative of inhibition of the marker nucleic acid mRNA production.
Alternatively, the screening method may include in vitroscreening of a cell or tissue in which Reg1α or TIMP1 is detectable, orcultured cells which express Reg1α or TIMP1, to an agent suspected ofinhibiting production of Reg1α or TIMP1 protein; and determining the level ofthe Reg1α or TIMP1 protein in the cells or tissue, wherein a decrease in thelevel of marker protein after exposure of the cells or tissue to the agent isindicative of inhibition of marker protein production.
The invention also encompasses in vivo methods ofscreening for agents which inhibit expression of the marker nucleic acids,comprising exposing a mammal having tumor cells or serum in which Reg1α orTIMP1 mRNA or protein is detectable to an agent suspected of inhibitingproduction of marker mRNA or protein; and determining the level of marker mRNAor protein in serum or tumor cells of the exposed mammal. A decrease in thelevel of marker mRNA or protein after exposure of the mammal to the agent isindicative of inhibition of marker nucleic acid expression.  Optionally, the effect of the candidateagent on the expression of at least one additional colorectal cancer associatedmarker may also be determined.
Accordingly, the invention provides a method comprisingincubating a cell expressing the marker nucleic acids (SEQ ID Nos: 1, 3 or 33,or a sequence complementary thereto) with a test compound and measuring themRNA or protein level.  Theinvention further provides a method for quantitatively determining the level ofexpression of the marker nucleic acids in a cell population or clinical sample,and a method for determining whether an agent is capable of increasing ordecreasing the level of expression of the Reg1α or TIMP1 nucleic acid in a cellpopulation or clinical sample.  Themethod for determining whether an agent is capable of increasing or decreasingthe level of expression of Reg1α or TIMP1 nucleic acid in a cell populationcomprises the steps of (a) preparing cell extracts from control andagent-treated cell populations, (b) isolating the Reg1α or TIMP1 polypeptidefrom the cell extracts, (c) quantifying (e.g., in parallel) the amount of animmunocomplex formed between Reg1α or TIMP1 polypeptide and an antibodyspecific to said polypeptide.  TheReg1α or TIMP1 polypeptide of this invention may also be quantified by assayingfor its bioactivity.  Agents thatinduce an increase in Reg1α or TIMP1 nucleic acid expression may be identifiedby their ability to increase the amount of immunocomplex formed in the treatedcell as compared with the amount of the immunocomplex formed in the controlcell. In a similar manner, agents that decrease expression of Reg1α or TIMP1nucleic acid may be identified by their ability to decrease the amount of theimmunocomplex formed in the treated cell extract as compared to the controlcell.
mRNA levels can be determined by Northern blothybridization. mRNA levels can also be determined by methods involving PCR.Other sensitive methods for measuring mRNA, which can be used in highthroughput assays, e.g., a method using a DELFIA endpoint detection andquantification method, are described, e.g., in Webb and Hurskainen (1996) Journal of Biomolecular Screening 1:119.  Reg1α protein levels can be determinedby immunoprecipitations or immunohistochemistiy using an antibody thatspecifically recognizes the protein product of SEQ ID Nos: 2, 4, or 100.
Agents that are identified as active in the drugscreening assay are candidates to be tested for their capacity to block cellproliferation activity.  Theseagents would be useful for treating a disorder involving aberrant growth ofcells, especially colon cells, especially colorectal cancer.
A variety of assay formats will suffice and, in light ofthe present disclosure, those not expressly described herein will neverthelessbe comprehended by one of ordinary skill in the art.  For instance, the assay can be generatedin many different formats, and include assays based on cell-free systems, e.g.,purified proteins or cell lysates, as well as cell-based assays which utilizeintact cells.
In many drug screening programs which test libraries ofcompounds and natural extracts, high throughput assays are desirable in orderto maximize the number of compounds surveyed in a given period of time. Assaysof the present invention which are performed in cell-free systems, such as maybe derived with purified or semi-purified proteins or with lysates, or withproteins purified or semi-purified from serum, are often preferred as “primary”screens in that they can be generated to permit rapid development andrelatively easy detection of an alteration in a molecular target which ismediated by a test compound. Moreover, the effects of cellular toxicity and/orbioavailability of the test compound can be generally ignored in the in vitro system, the assay instead beingfocused primarily on the effect of the drug on the molecular target as may bemanifest in an alteration of binding affinity with other proteins or changes inenzymatic properties of the molecular target.
EXAMPLES
Theexamples below are non-limiting and are merely representative of variousaspects and features of the present invention.
Example 1:  Generation of anti- Reg1α antibodies
Togenerate antibodies to Reg1α, the full-length open reading frame of Reg1α(shown in either SEQ ID NO: 1 or 3) was directionally cloned into a mammalianexpression vector, such as pcDNA3.1/V5-His (Invitrogen), which includesC-terminal epitope and purification tags. The insert sequence was verified by dideoxy sequencing (see, forexample, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley and Sons).  Recombinant fusionprotein was produced in a transient expression system in mammalian cells (e.g.CHO cells).  The recombinant proteinwas purified from the cell culture supernatants by immobilized metal affinitychromatography (IMAC) by utilizing the C terminal His-tag.  The sequence of the Reg1α protein usedfor the production of antibodies of the present invention is shown in either ofSEQ ID Nos 2 or 4, all of which represent a functional Reg1α protein, and whichare encoded by SEQ ID Nos 1 or 3, respectively.  The purified, recombinant Reg1α proteinwas emulsified in Freund’s adjuvant and injected into rabbits.  The animals were periodically boosteduntil they elicited a reasonable serum titer of specific antibody toReg1α.  Methods for antibodyproduction are well known to those of skill in the art and may be found, forexample, in Harlow et al. Antibodies: A laboratory manual, 1988, ColdSpring Harbor Laboratory.  Thepolyclonal antibodies, which recognized both native and denatured Reg1α, wereutilized to develop a microtiter-based ELISA assay.  Methods of performing an ELISA assay arewell known to those of skill in the art (see, for example, Asusbel et al., supra).
Example 2:  Detection of Reg1α in Colorectal cancerPatient Serum Samples
Thepresent invention relates to a method for the detection of colorectal cancer inan individual, which method includes the detection of Reg1α polypeptides in aserum sample from an individual with colorectal cancer, wherein the detectionof Reg1α is indicative of the presence of colorectal cancer.  Accordingly, Reg1α expression wasmeasured in serum samples obtained from patients having been diagnosed withcolorectal cancer.  
Allpatients used in this study were diagnosed at their respective medicalinstitutions by qualified physicians using conventional diagnostic means,including physical exam, blood analysis, imaging, and endoscopy.  Once identified, patients providedinformed consent through an IRB approved protocol. The severity of colorectalcancer in each patient was graded using the Dukes staging scheme.  Serum samples were subsequentlycollected from each patient using methods known to those of skill in theart.  Samples were subsequentlyassessed for the presence of Reg1α by the ELISA assay described above.  Figure 1 shows the levels of Reg1αprotein measured in the colorectal cancer patients compared to samples obtainedfrom naive patients and additional patients diagnosed with either inflammatorybowel disease (IBD) or cirrhosis of the liver.  Figure 2 shows the levels of Reg1αexpression in the colorectal cancer patients of Figure 1, identified at eachstage of colorectal cancer severity. As can be seen in Figures 1 and 2, Reg1α expression is clearly elevatedin serum samples obtained from patients diagnosed with colorectal cancer, andtherefore may be used to detect the presence of colorectal cancer in a patient.
Example 3:  Detection of Reg1α Nucleic Acid Sequencein Colorectal cancer
Inone embodiment, the present invention provides for a method of detecting thepresence of colorectal cancer in a patient by detecting the presence of nucleicacid molecules encoding Reg1α in a serum sample obtained from a patient.
Serummay be obtained from a patient suspected of having colorectal cancer by methodsdescribed above and known to those of skill in the art.  Nucleic acid molecules encoding Reg1αmay be detected, for example, by Northern analysis.  Briefly, probes for detection of Reg1αmRNA in a patient sample are derived by amplifying the Reg1α coding sequence byRT-PCR according to techniques known in the art. The cDNA fragments generatedin this manner are subsequently cloned into a PCRII vector using the TA cloningkit (Invitrogen).  The identity ofeach fragment can be verified by sequencing in each direction from the T3 andT7 polymerase sites present in the cloning vector.  The cDNA molecules produced in thismanner are then used to produce 32P-labeled Reg1α cDNA probes using,for example, the Prime-It kit from Stratagene.  Subsequently, 5 to 10 μg of total RNAisolated the serum of a patient suspected of having colorectal cancer isseparated on an agarose/formaldehyde gel in 1X MOPS buffer.  Methods of isolating RNA from a patientsample such as serum are well known in the art (see, for example, Ausubel etal., supra).  Following staining with ethidium bromideand visualization under ultra violet light to determine the integrity of theRNA, the RNA is hydrolyzed by treatment with 0.05M NaOH/1.5MNaCl followed byincubation with 0.5M Tris-Cl (pH 7.4)/1.5M NaCl.  The RNA is transferred to a commerciallyavailable nylon or nitrocellulose membrane (e.g. Hybond-N membrane, Amersham,Arlington Heights, IL) by methods well known in the art (Ausubel et al., supra,Sambrook et al., supra).  Followingtransfer and UV cross linking, the membrane is hybridized with a 32P-labeledReg1α cDNA probe in hybridization solution (e.g. in 50% formamide/2.5%Denhardt’s/100-200mg denatured salmon sperm DNA/0.1% SDS/5X SSPE) overnight at65°C.  The hybridization conditionscan be varied as necessary as described in Ausubel et al., supra and Sambrooket al., supra.  Following hybridization,the membrane is washed at room temperature in 2X SSC/0.1% SDS, at 42°C in 1XSSC/0.1% SDS, at 65°C in 0.2X SSC/0.1% SDS, and exposed to film overnight withan intensifying screen at -80o C.  The stringency of the wash buffers canalso be varied depending on the amount of background signal (Ausubel et al.,supra).  The film is subsequentlydeveloped and the intensity bands corresponding to the radiolabeled probehybridized to RNA are quantified using methods known to those of skill in theart, for example, by digitizing the film and analyzing the band intensity witha computer software program such as NIH Image (NIH, Bethesda, MD).
Alternatively,Reg1α mRNA may be detected in a patient sample by real-time amplification usingoligonucleotide primers capable of specifically hybridizing to the Reg1αsequence.  For example, real-timePCR and TaqMan(R) probes may be used to detect and quantitate the presence ofReg1α mRNA in a patient sample.  Thetechnique of real-time PCR is well known in the art (see, for example, U.S.Pat. Nos. 5,691,146; 5,779,977; 5,866,336; and 5,914,230).  Methods of designing primers useful forthe amplification of Reg1α sequences are well known in the art (see, forexample, Ausubel et al., supra)
cDNAsamples, reverse transcribed from mRNA obtained from patient serum samples maybe used to generate PCR products via an ABI 7700 sequence detection system(Applied Biosystems, Foster City, CA). A measurement may then be made of the level of expression of Reg1α inthe patient sample to determine if Reg1α mRNA levels are elevated, thus,providing a means for the detection of colorectal cancer in the patient.
Example 4:  Detection of Reg1α in Other PatientSamples
Inone embodiment of the present invention, colorectal cancer may be detected in apatient by detecting the expression of Reg1α in a clinical patient sample,which is not a serum sample.  Forexample, a circulating cell sample may be obtained from a patient by collectinga sample such as blood, stool, or other bodily fluid.  The sample is then subsequently treatedto lyse the cells present therein, for example by treating the sample with asuitable lysis buffer, such as a buffer containing 30 mM Tris-Cl, pH 7.4, 100mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% (w/v) SDS, and 100 μg/ml proteinase K (for isolation ofnucleic acid).  The resulting sampleis then analyzed for Reg1α expression either by isolating total RNA from thesample, as described above, and in Ausubel et al., supra, or the sample may be separated on a polyacrylamide gel foranalysis by Western blot, or may be utilized in an ELISA-based assay asdescribed above in Example 2.
Example 5.  Detection of TIMP1 in patient serumsamples
Thepresent invention provides for the detection and monitoring of colorectalcancer in a patient by measuring the level of TIMP1 polypeptide in a patientsample, preferably in a plasma sample. TIMP1 expression was determined in 63 samples from patients diagnosedwith colorectal cancer relative to the expression level of TIMP1 in 35 healthyindividuals.  The resultsdemonstrate that TIMP1, in addition to one or more other colorectal cancer associatedmarkers is overexpressed in colorectal cancer samples relative to normalsamples, thus indicating that TIMP1 is a valuable marker for the detection ofcolorectal cancer in a patient (Figure 3).
Toassess TIMP1 polypeptide expression levels, 63 pre-treatment plasma samplesfrom patients with colorectal cancer, and 35 samples from healthy donors weretested in either commercially available ELISAs (Osteopontin), ADVIA CentaurImmunoassays (CEA and Ferritin), or in-house developed ELISA (TIMP1).  All patients used in this study werediagnosed at their respective medical institutions by qualified physiciansusing conventional diagnostic means, including physical exam, blood analysis,imaging, or endoscopy.  Onceidentified, patients provided informed consent through an IRB approvedprotocol. The extent of colorectal cancer in each patient was determined usingthe Dukes’ staging scheme.  Serumand plasma samples were subsequently collected from each patient using methodsknown to those of skill in the art.
Specificityat appropriate cutoff values was determined for each marker (e.g., TIMP1,osteopontin, CEA, and ferritin) by evaluating the normal samples.  For example, the 100% specificity cutofffor any given marker is equal to the marker value of the highest normalsample.  Using these values as thecutoffs, the levels of each marker in the 63 cancer samples were compared totheir own respective cutoff values. If the level in the cancer sample was higher than the determined cutoffvalue, the sample was deemed "positive" and is represented by ashaded box (Figure 3).  This sameprocess was repeated at 97% specificity (using the second highest normal; e.g.,34 of the 35 samples were equal to or below this value).   The overall specificity level forthe entire panel is calculated by multiplying the specificity of each marker inthe panel (e.g., 97% x 97% x 97% x 97% = 89% specificity for the panel).  The markers were arranged on the graphsshown in Figure 3, according to the frequency of their overexpression in thecancer samples (TIMP1 was overexpressed in the highest number of cancerpatients and is therefore listed first). The marker adding the most to the sensitivity of TIMP1 is ranked second.For example, the 57% sensitivity/100% specificity graph shows that TIMP1 waselevated in 19 of the 63 colorectal cancer patient plasma samples, and is thuslisted first on the graph. Evaluating the samples for osteopontin yielded seven additional positivepatient samples, and osteopontin is thus listed second on the graph.  
Thesensitivity of the panel was determined by dividing the cumulative number ofsamples that were positive for at least one marker by the total number ofcancer samples (63).
OTHER EMBODIMENTS
Other embodimentswill be evident to those of skill in the art. It should be understood that theforegoing detailed description is provided for clarity only and is merelyexemplary.  The spirit and scope ofthe present invention are not limited to the above examples, but areencompassed by the following claims.
CLAIMS
1.                 A method of diagnosing coloncancer in an individual comprising:
(a)               obtaining a serum sample fromsaid individual; and
(b)              detecting the presence of TIMP1 in said sample, wherein the presence of TIMP1in said sample is indicative of colon cancer in said individual.
2.                 The method of claim 1, whereinsaid step of detecting comprises:
(a)               contacting said serum samplewith a polypeptide ligand which is capable of bindingto TIMP1under conditions which permit said polypeptide ligandto bind to TIMP1; and 
(b)              detecting the binding of said polypeptide ligand toTIMP1, wherein detection of binding is indicative of the presence of TIMP1insaid sample.
3.                 The method of claim 2, whereinsaid polypeptide ligand is an antibody.
4.                 The method of claim 2, whereinsaid polypeptide ligand comprises a detectable label.
5.                 The method of claim 1, whereinsaid individual is a human.
6.                 A method of diagnosing coloncancer in an individual comprising:
(a)               obtaining a serum sample fromsaid individual; and 
(b)              detecting the presence of TIMP1and at least one other colon cancer specificmarker in said sample, wherein the presence of TIMP1and said at least one othercolon cancer-specific marker is indicative of colon cancer in said individual.
7.                 The method of claim 6, whereinsaid colon cancer-specific marker is selected from the group consisting of thenucleic acid molecules of SEQ ID Nos 1, 3, 5-71, thepolypeptide molecules of SEQ ID Nos 2, 4, 72-138, CA19-9, CA 72-4, TF, sTn, Tn,CA 50, CA 549, CA 242, LASA, and Du-PAN 1 - 5.
8.                 The method of claim 6, whereinsaid step of detecting comprises:
(a)               contacting said serum samplewith a first polypeptide ligand which is capable ofbinding to TIMP1and a second polypeptide ligand whichis capable of binding to said colon cancer-specific marker, under conditionswhich permit said first and second polypeptide ligandsto bind to TIMP1and said colon cancer-specific marker, respectively; and 
(b)              detecting the binding of said first polypeptide ligandto TIMP1and said second polypeptide ligand to saidcolon cancer-specific marker, wherein detection of binding is indicative of thepresence of TIMP1and said colon cancer-specific marker in said sample.
9.                 The method of claim 8, whereinsaid first and second polypeptide ligand are each anantibody.
10.             The method of claim 8, whereinsaid first and second polypeptide ligand comprises adetectable label.
11.             The method of claim 6, whereinsaid individual is a human.
12.             A method of diagnosing coloncancer in an individual comprising:
(a)               obtaining a serum sample froman individual; and
(b)              detecting the presence of a nucleic acid molecule which encodes TIMP1in saidsample, wherein the presence of TIMP1of said nucleic acid molecule in saidsample is indicative of colon cancer in said individual.
13.             A method of diagnosing coloncancer in an individual comprising:
(a)               obtaining a serum sample froman individual; and
(b)              detecting the presence of anucleic acid molecule which encodes TIMP1and at least one other nucleic acidmolecule which encodes at least one other colon cancer-specific marker in saidsample, wherein the presence of said nucleic acid sequence encoding TIMP1andsaid nucleic acid sequence encoding said at least one other coloncancer-specific marker is indicative of colon cancer in said individual.
14.             The method of claim 13, whereinsaid colon cancer specific marker is selected from the group consisting of SEQID Nos 1, 3, 5-71, the polypeptide molecules of SEQID Nos 2, 4, 72-138, CA 19-9, CA 72-4, TF, sTn, Tn, CA 50, CA 549, CA 242,LASA, and Du-PAN 1 - 5.
15.             A method of diagnosing coloncancer in an individual comprising:
(a)               obtaining a serum sample fromsaid individual; and
(b)              detecting the presence of Reg1α in said sample, wherein the presence of Reg1αin said sample is indicative of colon cancer in said individual.
16.             The method of claim 15, whereinsaid step of detecting comprises:
(a)               contacting said serum samplewith a polypeptide ligand which is capable of bindingto Reg1α under conditions which permit said polypeptide ligandto bind to Reg1α; and 
(b)              detecting the binding of said polypeptide ligand toReg1α, wherein detection of binding is indicative of the presence of Reg1α insaid sample.
17.             The method of claim 16, whereinsaid polypeptide ligand is an antibody.
18.             The method of claim 16, whereinsaid polypeptide ligand comprises a detectable label.
19.             The method of claim 15, whereinsaid individual is a human.
20.             A method of diagnosing coloncancer in an individual comprising:
(a)               obtaining a serum sample fromsaid individual; and 
(b)              detecting the presence of Reg1α and at least one other colon cancer specificmarker in said sample, wherein the presence of Reg1α and said at least oneother colon cancer-specific marker is indicative of colon cancer in saidindividual.
21.             The method of claim 20, whereinsaid colon cancer-specific marker is selected from the group consisting of thenucleic acid molecules of SEQ ID Nos 1, 3, 5-71, thepolypeptide molecules of SEQ ID Nos 2, 4, 72-138, CA19-9, CA 72-4, TF, sTn, Tn,CA 50, CA 549, CA 242, LASA, and Du-PAN 1 - 5.
22.             The method of claim 20, whereinsaid step of detecting comprises:
(a)               contacting said serum samplewith a first polypeptide ligand which is capable ofbinding to Reg1α and a second polypeptide ligandwhich is capable of binding to said colon cancer-specific marker, underconditions which permit said first and second polypeptide ligandsto bind to Reg1α and said colon cancer-specific marker, respectively; and 
(b)              detecting the binding of said firstpolypeptide ligand to Reg1α and said secondpolypeptide ligand to said colon cancer-specificmarker, wherein detection of binding is indicative of the presence of Reg1α andsaid colon cancer-specific marker in said sample.
23.             The method of claim 22, whereinsaid first and second polypeptide ligand are each anantibody.
24.             The method of claim 22, whereinsaid first and second polypeptide ligand comprises adetectable label.
25.             The method of claim 20, whereinsaid individual is a human.
26.             A method of diagnosing coloncancer in an individual comprising:
(a)               obtaining a serum sample froman individual; and
(b)              detecting the presence of a nucleic acid molecule which encodes Reg1α in saidsample, wherein the presence of Reg1α of said nucleic acid molecule in saidsample is indicative of colon cancer in said individual.
27.             A method of diagnosing coloncancer in an individual comprising:
(a)               obtaining a serum sample froman individual; and
(b)              detecting the presence of anucleic acid molecule which encodes Reg1α and at least one other nucleic acidmolecule which encodes at least one other colon cancer-specific marker in saidsample, wherein the presence of said nucleic acid sequence encoding Reg1α andsaid nucleic acid sequence encoding said at least one other coloncancer-specific marker is indicative of colon cancer in said individual.
The method of claim 27, wherein said coloncancer specific marker is selected from the group consisting of SEQ ID Nos 1, 3, 5-71, the polypeptide molecules of SEQ ID Nos 2, 4, 72-138, CA 19-9, CA 72-4, TF, sTn,Tn, CA 50, CA 549, CA 242, LASA, and Du-PAN 1 - 5.
DETECTION METHODS USING REG1α
ABSTRACT OF THE DISCLOSURE
Thepresent invention relates to a method for detecting the presence of colorectalcancer in an individual, wherein colorectal cancer is detected by detecting thepresence of Reg1α or TIMP1 nucleic acid or amino acid molecules in a clinicalsample obtained from the patient, wherein Reg1α or TIMP1 expression isindicative of the presence of colorectal cancer.  The invention further relates to amethod for detecting the presence of colorectal cancer in an individual,wherein colorectal cancer is detected by detecting the presence of Reg1α orTIMP1 nucleic acid or amino acid molecules in a clinical sample, in addition todetecting the presence of one or more additional colorectal cancer associatedmarkers.
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【配列表】
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