(57)【要約】【課題】試料の保存及び輸送が簡便で安全性が高く、解析にかかるコストが小さく、解析精度及び処理効率に優れたＨＬＡタイピング技術を提供する。【解決手段】生体試料から直接ＤＮＡ増幅反応を行って、生体試料中に含まれるＤＮＡの塩基配列を決定し、決定された塩基配列を用いてＨＬＡの型を決定するＨＬＡタイピング法。好ましくは、ＤＮＡ増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応を用い、生体試料として、濾紙に血液を含ませた後に乾燥させた濾紙血を用いる。【選択図】図１
2004283165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料から直接ＤＮＡ増幅反応を行って、前記生体試料中に含まれるＤＮＡの塩基配列を決定し、決定された前記塩基配列を用いてＨＬＡの型を決定する、ＨＬＡタイピング法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１に記載のＨＬＡタイピング法。
【請求項３】
前記生体試料が血液試料又は口腔粘膜細胞試料である、請求項１又は２に記載のＨＬＡタイピング法。
【請求項４】
前記血液試料が、濾紙に血液を含ませた後に乾燥させた濾紙血である、請求項３に記載のＨＬＡタイピング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療診断のためのＨＬＡタイピング技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＬＡ（human leukocyte antigen；ヒト白血球抗原）は、ヒトのＭＨＣ（major histocompatibility complex；主要組織適合遺伝子複合体）であり、全ての細胞表面上に存在する。ＨＬＡ分子は個体間でタイプが異なり、それに結合できる抗原ペプチドの差異が免疫応答の個体差となって現れる。従って、ＨＬＡ分子をコードするＨＬＡ領域に存在する遺伝子のタイプを決定すること（ＨＬＡタイピング）は、臓器移植におけるドナーとレシピエントとの適合性やある種の病気に対する個人の素質などを判定する場合に用いられる、大変重要な技術である。
【０００３】
ＨＬＡタイピングには血清学的タイピングとＤＮＡタイピングとがある。従来から、ＨＬＡタイピングとしては血清学的タイピングが行われてきた。血清学的ＨＬＡタイピングにおいては、抗ＨＬＡモノクローナル抗体とリンパ球との抗原抗体反応によってＨＬＡを同定する。しかしこの方法は、解析精度が低いことや、判定可能なＨＬＡのタイプが限られるという欠点がある。
【０００４】
一方、ＤＮＡタイピングは、ＨＬＡをコードしている第６染色体上の遺伝子を直接タイピングする技術である（ＲＦＬＰ法など）。例えば、特表２００２−５０３４９７号公報によると、ＤＮＡタイピングを行うためには、予め生体試料からＤＮＡを分離・精製し、それを鋳型に遺伝子座特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを行い、シーケンス反応鋳型を作成していた。
【０００５】
しかしこのような方法では、生体試料の保管時における保存性の問題及び生体試料の輸送時における簡便性の問題がある。特に生体試料が血液試料である場合は、病原微生物などの感染の可能性があるため検査などで血液試料を取り扱う人間に対して危険があり、安全性に問題がある。また、血液試料などの液体試料は、試料間のクロスコンタミネーションなど、試料自体のコンタミネーションの可能性という問題がある。さらに、生体試料からＤＮＡを分離・精製する時には、手間やコストがかかるという問題がある。近年、ＤＮＡの分離・精製は様々なキットを利用することで簡略化されてきているが、それでも多段階の操作が必要である。このため、多検体解析を行う場合には、試料の安全性が低下するうえに、解析にコストがかかるという問題がある。
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５０３４９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明の目的は、試料の保存及び輸送が簡便で安全性が高く、解析にかかるコストが小さく、解析精度及び処理効率に優れたＨＬＡタイピング技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、生体試料から直接ＤＮＡ増幅反応を行い、増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定し、決定された塩基配列の情報を用いてＨＬＡのタイピングを行うことによって、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  生体試料から直接ＤＮＡ増幅反応を行って、前記血液試料中に含まれるＤＮＡの塩基配列を決定し、決定された前記塩基配列を用いてＨＬＡの型を決定する、ＨＬＡタイピング法。
（２）  前記ＤＮＡ増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、（１）に記載のＨＬＡタイピング法。
（３）  前記生体試料が血液試料又は口腔粘膜試料である、（１）又は（２）に記載のＨＬＡタイピング法。
（４）  前記血液試料が、濾紙に血液を含ませた後に乾燥させた濾紙血である、（３）に記載のＨＬＡタイピング法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、試料の保存及び輸送が簡便で安全性が高く、解析にかかるコストが小さく、解析精度及び処理効率に優れたＨＬＡタイピング技術が提供される。また本発明によれば、直接ＰＣＲにおいて適切なバッファーを選択することにより、全ローカスのＨＬＡタイピングを行うことが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、生体試料から直接ＤＮＡ増幅反応を行うことを特徴とする、ＨＬＡタイピング法である。本発明で直接とは、ＤＮＡ増幅に先立って、生体試料に含まれるＤＮＡの分離・精製を行う過程が不要という意味である。本発明のＨＬＡタイピング法においては、生体試料から直接ＤＮＡ増幅反応を行い、増幅されたＤＮＡの塩基配列から生体試料中に含まれるＤＮＡの塩基配列を決定し、決定された塩基配列を用いてＨＬＡの型を決定する。なお、ＨＬＡタイピングは、通常Ａ、Ｂ、ＤＲの各ローカスについて行う。
【００１２】
本発明においてＨＬＡタイピングすべき生体試料としては特に限定されない。例えば、血液試料や口腔粘膜試料などは試料採取が簡便であり好ましい。
【００１３】
血液試料としては、全血を用いることができる。ＤＮＡを精製したものやＥＤＴＡなどで処理を行ったものを用いてもよい。試料の形態としては、ＤＮＡが残存していれば、新鮮血、保存血液及び乾燥血液のいずれであっても良い。保存血液としては、冷蔵保存、冷凍保存を問わない。本発明においては、頻繁に凍結・融解を繰り返した冷凍血液であっても安定して核酸増幅産物が得られる。乾燥血液としては、濾紙に血液を含ませた後に乾燥させたもの（濾紙血）を用いても良い。本発明において濾紙血を用いることは、試料の保存性や輸送時の簡便性、及び安全性の観点から好ましい。濾紙に血液試料を含ませることで試料が液体状態でなくなるため、試料をこぼしたり、飛散させたりする危険性が少なくなる。従って、試料の安全性が高く、コンタミネーションの可能性が少なくなる。
【００１４】
本発明においては、前記血液試料中に存在するＤＮＡを分離・精製することなくＤＮＡ増幅反応を行う。本発明においては、増幅反応における反応溶液に後述するものを用いることによって、試料の前処理を行うことなく直接ＤＮＡ増幅反応を行うことができる。このことによって、前処理の手間やコストを省くことができる。例えば、濾紙血を用いる場合は、少量の血液を濾紙に含ませ、乾燥させた後、血液付着部分の一部を打ち抜いたものをそのまま増幅反応に用いることができる。
【００１５】
ＤＮＡ増幅には、ＰＣＲを用いると良い。ＰＣＲに用いるＰＣＲ反応溶液は、バッファー、プライマーのセット、dNTP（デオキシヌクレオシド三リン酸）各種、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００１６】
分離・精製などの前処理を行わない試料には、ＤＮＡ増幅反応を阻害する物質が含まれている。ＤＮＡ増幅反応を阻害する物質とは、生物の体液中に存在する正電荷物質（ある種のタンパク質など）や負電荷物質（ある種の糖、色素など）などである。タンパク質などの正電荷物質はＤＮＡに吸着することで増幅反応を阻害する。一方、糖や色素などの負電荷物質はＤＮＡポリメラーゼに吸着することで増幅反応を阻害する。本発明においては、ＤＮＡ増幅反応阻害物質の作用を抑制する働きを持つものをバッファーに用いる。
【００１７】
このようなバッファーとしては、例えば、AmpdirectR-A、AmpdirectR-G/C（ともに（株）島津製作所製）が挙げられる。また、必要に応じ増幅効率向上のためのAmp Addition-1又はAmp Addition-4（ともに（株）島津製作所製、以下、Amp Additionと総称する。）をAmpdirectR-A又はAmpdirectR-G/Cに加えたものをバッファーとして使用しても良い。本発明においては、AmpdirectR-G/Cを用いることが好ましい。また、AmpdirectR-G/CにはAmp Addition-4を加えて用いることがより好ましい。AmpdirectR-AやAmpdirectR-G/Cは、ＤＮＡ増幅反応溶液中に存在する上記の阻害物質を中和する作用があるため、未精製の試料であってもＰＣＲを可能にする。このことにより、生体試料から直接核酸増幅することが可能となる。その他、上記作用を有するバッファーとしては、例えばAmpdirectR-B、AmpdirectR-Dが挙げられ、バッファー中に必要に応じ含まれるAmp Additionとしては、例えばAmp Addition-2、Amp Addition-3が挙げられる。
本発明においては、上記したバッファーに限定されることなく、タイピングするローカスに応じて適した組成を有するバッファーを適宜選択することができる。
【００１８】
プライマーとしては、ＨＬＡ領域に特異的な増幅プライマーセットを用いる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、TaqＤＮＡが好ましく、TaKaRaZ-TaqTM、ExTaq（それぞれ宝酒造（株）製）がより好ましい。
【００１９】
本発明のＰＣＲ反応溶液の上記成分は、例えば以下の配合量（ＰＣＲ反応溶液全体を基準とする。）で用いることができる。すなわち、バッファーは１０〜４０体積％、例えば２０体積％、プライマーは各々０．１〜２μＭ、例えば０．５μＭ、ｄＮＴＰは各々１００〜３００μＭ、例えば２００μＭ、ＤＮＡポリメラーゼは０．５〜１．２５Ｕ／μｌ、例えば１．２５Ｕ／μｌ用いることができる。また、Amp AdditionをAmpdirectR-AやAmpdirectR-G/Cなどに加えたものをバッファーとして用いる場合、Amp Additionの量の上限は特に限定されないが、例えばAmpdirectR-AやAmpdirectR-G/Cなどの量に対して１５０体積％程度まで、例えば１００体積％使用することができる。例えば試料となる血液は０．５μｌ〜２μｌ用いることができ、血液試料１μｌに対し上記ＰＣＲ反応溶液は１０〜２００μｌ、好ましくは２０〜１００μｌ用いることができる。これら諸条件は、当業者が適宜決めることができる。また、ＰＣＲ反応の条件についても、当業者が適宜定めることができる。
【００２０】
増幅されたＤＮＡは、精製を行うことが好ましい。精製には、例えばエキソヌクレアーゼとアルカリホスファターゼとを用いると良い。これらは、未反応プライマーヌクレオチドを不活性化する作用があり、従って増幅されたＤＮＡが精製される。
【００２１】
精製されたＤＮＡはその塩基配列が決定される。すなわち本発明はＤＮＡタイピング法であって、ＨＬＡ領域の塩基配列を決定することで従来の血清学的タイピングに比べて高精度のタイピングが可能となる。
【００２２】
塩基配列の決定には、サンガー法、マクサム・ギルバート法などを用いることができる。例えばサンガー法においては、通常の操作に従って反応を行うことによって鎖長の異なる部分複製ＤＮＡの混合物を得る。得られた部分複製ＤＮＡ混合物の配列は電気泳動法を用いたキャピラリー型又は平板（スラブゲル）型ＤＮＡシーケンサーによって解析を行うと良い。本発明においては、キャピラリー型ＤＮＡシーケンサー（ＲＩＳＡ−３８４（（株）島津製作所製）、ＡＢＩ−３７３０ｘｌ（アプライド・バイオシステムズ社製））を用いることが好ましい。シーケンスデータはコンピュータプログラムにより解析し、ヘテロ接合体由来の二重ピークを自動検出し、コンセンサス配列を決定する。決定された塩基配列は、ＨＬＡ型データベースからの検索を行うことによってＨＬＡ型を自動判定する。
【００２３】
以上のように本発明によると、ＤＮＡタイピングの高い解析精度を保ちながら従来に比べてＤＮＡ解析の手間やコストを大幅に削減することによって、より多くの試料をより効率よく処理することが可能である。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２５】
［実施例１］
４０人の被験者から指先に針を突き刺して採取したそれぞれの少量の血液（およそ１μｌ）を、濾紙に吸着させた。濾紙の血液付着部分の一部分をパンチャーで打ち抜きし（直径２ｍｍ）、９６穴ＰＣＲプレートに挿入した。下記に示すＰＣＲ反応溶液２０μｌをプレートのそれぞれの血液濾紙に加え、蒸発防止シールをプレートに貼った。
【００２６】
（ＰＣＲ反応溶液（２０μｌ中））
プライマー
TTCTCCCCAGACGCCGAGGATGGCC（配列表の配列番号１）  ０．５μＭ
TGTTGGTCCCAATTGTCTCCCCTC （配列表の配列番号２）  ０．５μＭ
AmpdirectR-G/C（（株）島津製作所製）                   ４μｌ
dATP、dCTP、dGTP、dTTP                           各２００μＭ
ExTaq（宝酒造（株）製）                              ０．５Ｕ
【００２７】
ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製、GeneAmp9700）を用い、９６℃−３分間のプレヒーティングの後、９６℃−３０秒間、６３℃−１分間、７２℃−３分間の条件で４０サイクルを行った。最後に、７２℃−５分間のポリメライゼーションを行った。
【００２８】
それぞれの反応溶液１０μｌを回収し、エキソヌクレアーゼ及びアルカリフォスファターゼの混合物（アマルシャム社製、ExoSAP-IT）１μｌを加えることにより精製を行った。
【００２９】
下記に示すシーケンス反応液５μｌを用いて、上記精製によって得られたＰＣＲ産物を下記の４つのプライマ−を用いてそれぞれシーケンスを行った。
【００３０】
（シーケンス反応液（５μｌ中））
上記精製によって得られたＰＣＲ産物                    ０．２５μｌ
プライマ−                                                  １μＭ
BigDye Terminator Ver3.1（アプライド・バイオシステムズ社製）１μｌ
（プライマ−）
CACTCCATGAGGTATTTC（配列表の配列番号３）
TCTGGTTGTAGTAGC   （配列表の配列番号４）
GGCCAGGGTCTCACA   （配列表の配列番号５）
CAATTGTCTCCCCTC   （配列表の配列番号６）
【００３１】
上記シーケンス反応によって得られた部分複製ＤＮＡをエタノール沈殿法で精製し、水に再溶解させ、キャピラリーＤＮＡシーケンサー（ＲＩＳＡ−３８４、（株）島津製作所製）によって部分複製ＤＮＡの配列データを解析した。ヘテロ接合体由来の二重ピークを検出してコンセンサス配列を決定し、決定されたコンセンサス配列データは、http://square.umin.ac.jp/JSHI/mhc.htmlにおいて公開されているＨＬＡ型データからの検索を行い、ヒットした型を列挙した。
【００３２】
上述のタイピング方法によって得られたＨＬＡの型と、血清学的タイピング方法によって得られたＨＬＡの型とを比較すると、４０試料全てについて一致を示した。
【００３３】
なお、濾紙血から直接ＰＣＲが行われたかどうかは、得られた増幅産物の一部を電気泳動することによって確認した。電気泳動の図を図１に示す。図１中、レーン１は、実施例１で行われたＰＣＲで用いたバッファーAmpdirectR-G/C４μｌを、ExTaq（宝酒造（株）製）添付ＰＣＲバッファー２μｌに置き換えた結果である。レーン２は、実施例１で行われたＰＣＲの結果である。レーン３は、実施例１で行われたＰＣＲで用いたバッファーAmpdirectR-G/C４μｌを、AmpdirectR-G/C：Amp Addition-4＝１：１（体積比）の混合溶液８μｌに置き換えた結果である。図１が示すように、従来型のＰＣＲバッファーではＤＮＡの増幅は確認できない（レーン１）が、AmpdirectR-G/Cや、AmpdirectR-G/CとAmp Addition-4との混合物をバッファーに用いると明確にＤＮＡの増幅が確認できた（レーン２及び３）。
【００３４】
［実施例２］
５人の被験者は口に少量の水を含み、口の中を軽く洗浄した。次に市販の歯ブラシで、片頬１０回ずつ（両頬計２０回）のブラッシングを行った後、歯ブラシを１０ｍｌの１重量％NaCl水溶液が入った遠沈管の中に入れ、数回振ることにより、採取した口腔粘膜を１重量％NaCl水溶液に懸濁し、サンプル懸濁液とした。
【００３５】
下記に示すＰＣＲ反応溶液４５μｌを入れたチューブに、上記サンプル懸濁液の５μｌを加えた。
【００３６】
（ＰＣＲ反応溶液（５０μｌ中））
プライマー
フォワードプライマー
ACCCACCCGGACTCAGAATCTCCT（配列表の配列番号７）   ０．５μＭ                      
リバースプライマー（下記２種のプライマーの混合プライマーとして用いた。）
GGAGGCCATCCCCGGCGACCTAT （配列表の配列番号８） ０．２５μＭ
GGAGGCCATCCCCGGCGATCTAT （配列表の配列番号９） ０．２５μＭ
AmpdirectR-G/C（（株）島津製作所製）                 １０μｌ
AmpAddition-4（（株）島津製作所製）                  １０μｌ
dATP、dCTP、dGTP、dTTP                           各２００μＭ
Z-Taq（宝酒造（株）製）                          １．２５Ｕ
【００３７】
ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社製、GeneAmp9700）を用い、８０℃ー１５分の前処理、続いて９６℃−３分間のプレヒーティングの後、９６℃−３０秒間、６３℃−１分間、７２℃−３分間の条件で４０サイクルを行った。最後に、７２℃−５分間のポリメライゼーションを行った。
【００３８】
それぞれの反応溶液１０μｌを回収し、エキソヌクレアーゼ及びアルカリフォスファターゼの混合物（アマルシャム社製、ExoSAP-IT）１μｌを加えることにより精製を行った。
【００３９】
下記に示すシーケンス反応液５μｌを用いて、上記精製によって得られたＰＣＲ産物を、下記の４種のプライマーを用いてシーケンスを行った。
【００４０】
（シーケンス反応液（５μｌ中））
上記精製によって得られたＰＣＲ産物                        ０．２５μｌ
プライマ−                                                      １μＭ
BigDye Terminator Ver3.1（アプライド・バイオシステムズ社製）    １μｌ
（プライマ−）
１．  CACTCCATGAGGTATTTC（配列表の配列番号３）
２．  TCTGGTTGTAGTAGC   （配列表の配列番号４）
３．  GGCCAGGGTCTCACA   （配列表の配列番号５）
４．  下記２種のプライマーの混合プライマー
CCCCGGCGACCTAT    （配列表の配列番号１０）
GGAAGGCTCCCCACT   （配列表の配列番号１１）
【００４１】
上記シーケンス反応によって得られた部分複製ＤＮＡをエタノール沈殿法で精製し、水に再溶解させ、キャピラリーＤＮＡシーケンサー（ＲＩＳＡ−３８４、（株）島津製作所製）によって部分複製ＤＮＡの配列データを解析した。ヘテロ接合体由来の二重ピークを検出してコンセンサス配列を決定し、決定されたコンセンサス配列データは、http://square.umin.ac.jp/JSHI/mhc.htmlにおいて公開されているＨＬＡ型データからの検索を行い、ヒットした型を列挙した。
【００４２】
上述のタイピング方法によって得られたＨＬＡの型と、血清学的タイピング方法によって得られたＨＬＡの型とを比較すると、５試料全てについて一致を示した。
【００４３】
なお、口腔粘膜から直接ＰＣＲが行われたかどうかは、得られた増幅産物の一部を電気泳動することによって確認した。電気泳動の図を図２に示す。図２中、レーン１は、実施例２で行われたＰＣＲで用いたバッファーAmpdirectR-G/C４μｌを、ExTaq（宝酒造（株）製）添付ＰＣＲバッファー２μｌに置き換えた結果である。レーン３は、実施例２で行われたＰＣＲの結果である。図２が示すように、従来型のＰＣＲバッファーではＤＮＡの増幅は確認できない（レーン１）が、AmpdirectR-G/CとAmp Addition-4との混合物をバッファーに用いると明確にＤＮＡの増幅が確認できた（レーン３）。
【００４４】
上記実施例では、本発明の範囲における具体的な２つの形態について示したが、本発明は、これらに限定されることなく他のいろいろな形態で実施することができる。そのため、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、クレームの均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】濾紙血から直接ＰＣＲを行った結果を表す電気泳動の図である。
【図２】口腔粘膜から直接ＰＣＲを行った結果を表す電気泳動の図である。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号１〜１１は、合成プライマーである。
【図１】
2004283165.tif 000003
【図２】
2004283165.tif 000004
【配列表】
2004283165000001.app