(57)【要約】【課題】植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼを得るための核酸配列の使用方法などの提供。【解決手段】本発明は、植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼに関する。植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼを得るための、保存されたアミノ酸または核酸配列の使用方法が記載されている。また、トランスジェニック植物においてヒドロキシル化脂肪酸のファミリーを産生させるための、植物ヒドロキシラーゼをコードするｃＤＮＡクローンの使用が記載されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４によりコードされるポリペプチドと６０％以上のアミノ酸同一性を有する脂肪酸ヒドロキシラーゼをコードする核酸配列からなる単離核酸フラグメント。
【請求項２】
配列番号：４によりコードされるポリペプチドとのアミノ酸同一性は９０％以上である請求項１記載の単離核酸フラグメント。
【請求項３】
配列番号：４によりコードされるポリペプチドとのアミノ酸同一性は１００％である請求項１記載の単離核酸フラグメント。
【請求項４】
配列番号：１，２または３のヌクレオチド配列と９０％以上の核酸同一性を有する単離核酸フラグメント。
【請求項５】
配列列番号：１，配列番号：２または配列番号：３のヌクレオチド配列を有する単離核酸フラグメント。
【請求項６】
フラグメントは油脂産生植物種から単離される請求項１記載の単離核酸フラグメント。
【請求項７】
トランスフォームされた植物細胞中のリシノール酸のレベルを変化させることが可能なキメラ遺伝子であって、そのキメラ遺伝子は請求項１記載の核酸フラグメントからなり、そのフラグメントは適当な調節配列と操作性に連結しているキメラ遺伝子。
【請求項８】
トランスフォームされた植物細胞中のレスケロール酸のレベルを変化させることが可能なキメラ遺伝子であって、そのキメラ遺伝子は請求項１記載の核酸フラグメントからなり、そのフラグメントは適当な調節配列と操作性に連結しているキメラ遺伝子。
【請求項９】
トランスフォームされた植物細胞中の脂肪酸のレベルを変化させることが可能なキメラ遺伝子であって、そのキメラ遺伝子は請求項１記載の核酸フラグメントからなり、そのフラグメントは適当な調節配列と操作性に連結しているキメラ遺伝子。
【請求項１０】
トランスフォームされた植物細胞中の脂肪酸のレベルを変化させることが可能なキメラ遺伝子であって、そのキメラ遺伝子は請求項２記載の核酸フラグメントからなり、そのフラグメントは適当な調節配列と操作性に連結しているキメラ遺伝子。
【請求項１１】
トランスフォームされた植物細胞中の脂肪酸のレベルを変化させることが可能なキメラ遺伝子であって、そのキメラ遺伝子は請求項４記載の核酸フラグメントからなり、そのフラグメントは適当な調節配列と操作性に連結しているキメラ遺伝子。
【請求項１２】
請求項７、８、９、１０または１１のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含有する植物。
【請求項１３】
請求項１２記載の植物の種子から得られた油脂。
【請求項１４】
フラグメントはトウゴマ（Ricinus communis (Ｌ)）から得られる請求項１記載の単離核酸フラグメント。
【請求項１５】
フラグメントはレスクェレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）から得られる請求項１記載の単離核酸フラグメント。
【請求項１６】
ヒドロキシル化脂肪酸のレベルが変化した種子油脂を製造する方法において、
（ａ）油脂産生種の植物細胞を請求項１記載の単離核酸含有するキメラ遺伝子でトランスフォーメーションし、
（ｂ）工程（ａ）のトランスフォーメーションされた植物細胞から稔性植物を生育させ、
（ｃ）工程（ｂ）の稔性植物から子孫種子をヒドロキシル化脂肪酸の所望のレベルについてスクリーニングし、ついで
（ｄ）工程（ｃ）の子孫種子を処理して不飽和脂肪酸のレベルが変化した種子油脂を得る、
各工程からなる方法。
【請求項１７】
栽培植物は、西洋アブラナ（rapeseed）、クランベ（Crambe）、カラシナ（Brassica juncea）、カノーラ（Canola）、アマ（flax）、ヒマワリ、ベニバナ、綿、キュフェア（Cuphea）、大豆、落花生、ココナッツ、ギネアアブラヤシ（oil palm）およびトーモロコシから選択される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ヒドロキシル化脂肪酸のレベルが変化した種子油脂を製造する方法において、
（ａ）配列番号：１，配列番号：２または配列番号：３のヌクレオチド配列を含有するキメラ遺伝子で油脂産生種の植物細胞をトランスフォーメーションし、
（ｂ）工程（ａ）のトランスフォーメーションされた植物細胞から稔性植物を生育させ、
（ｃ）工程（ｂ）の稔性植物から子孫種子をヒドロキシル化脂肪酸の所望のレベルについてスクリーニングし、ついで
（ｄ）工程（ｃ）の子孫種子を処理して不飽和脂肪酸のレベルが変化した種子油脂を得る、
各工程からなる方法。
【請求項１９】
栽培植物は、西洋アブラナ（rapeseed）、クランベ（Crambe）、カラシナ（Brassica juncea）、カノーラ（Canola）、アマ（flax）、ヒマワリ、ベニバナ、綿、キュフェア（Cuphea）、大豆、落花生、ココナッツ、ギネアアブラヤシ（oil palm）およびトーモロコシから選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
請求項１記載の植物のヒドロキシラーゼをコードする配列を含有するＤＮＡがゲノムに組み込まれた植物細胞を、その植物細胞内でのその植物ヒドロキシラーゼの転写および翻訳が可能な条件下に増殖させる方法によって、油脂の脂肪酸組成がヒドロキシル化脂肪酸を含有するように修飾されている西洋アブラナ（rapeseed）、クランベ（Crambe）、カラシナ（Brassica juncea）、カノーラ（Canola）、アマ（flax）、ヒマワリ、ベニバナ、綿、キュフェア（Cuphea）、大豆、落花生、ココナッツ、ギネアアブラヤシ（oil palm）およびトーモロコシからなる群より選択される植物からのトリグリセライド油脂。
【請求項２１】
脂肪酸ヒドロキシラーゼをコードする核酸フラグメントを単離する方法において
（ａ）配列番号：４および他の脂肪酸ヒドロキシラーゼ配列と脂肪酸デサチュラーゼを比較し、
（ｂ）工程（ａ）における比較から４個以上のアミノ酸の保存された配列を同定し、
（ｃ）工程（ｂ）で同定された配列に基づいて縮退オリゴマーを設計し、
（ｄ）工程（ｃ）の縮退オリゴマーを用い、配列依存性プロトコールによって脂肪酸ヒドロキシラーゼをコードする配列を単離し
（ｅ）その遺伝子のヌクレオチド配列からコードする遺伝子産物の推定アミノ酸配列を得て、ついで、
（ｆ）脂肪酸デサチュラーゼと脂肪酸ヒドロキシラーゼの間のアミノ酸配列の差を解析してヒドロキシラーゼ遺伝子をデサチュラーゼ遺伝子と識別する、
各工程よりなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列および核酸構築体の同定、それらに関連する方法、ならびに植物油、ワックスおよび関連化合物の脂肪酸組成を改変する目的で遺伝子修飾された植物を産生させるための、これらの配列および構築体の使用に関する。
【０００２】
定義
本発明の主題は、数種の異なる脂肪酸にヒドロキシル基を導入して数種の異なるヒドロキシル化脂肪酸の産生を生じる一群の酵素である。とくに、これらの酵素はオレイン酸の12- ヒドロキシオレイン酸およびイコセン酸の14- ヒドロキシイコセン酸へのヒドロキシル化を触媒する。他の脂肪酸たとえばパルミトレイン酸およびエルカ酸も基質とすることができる。この酵素は独特の基質または生成物を参照して言及することができないので、本発明者らは、この酵素がアシル鎖の中心付近に位置する二重結合から炭素３個だけ遠位に（すなわち、アシル鎖のカルボキシル炭素から離れて）ヒドロキシルを導入することを指示し、本明細書を通じてこの酵素をカッパ（κ）ヒドロキシラーゼと呼ぶことにした。
【０００３】
以下の脂肪酸、すなわちリシノール酸（ricinoleic acid），12- ヒドロキシオクタデカ-cis-9- エン酸（12ＯＨ-18:1 ｃｉｓΔ９）；レスケロール酸（lesquerolic acid），14- ヒドロキシ-cis-11-イコセン酸（14ＯＨ-20:1 ｃｉｓΔ１１）；デンシポール酸（densipolic acid），12- ヒドロキシオクタデカ-cis-9,15-ジエン酸（12ＯＨ-18:2 ｃｉｓΔ９，１５）；アウリコール酸（auricolic acid），14- ヒドロキシ-cis-11,17- イコサジエン酸(14 ＯＨ-20: 2 ｃｉｓΔ１１，１７);ヒドロキシエルカ酸(hydroxyerucic acid），16- ヒドロキシドコサ-cis-13-エン酸（16ＯＨ-22:1 ｃｉｓΔ１３）；ヒドロキシパルミトレイン酸（hydroxypalmitoleic acid），12- ヒドロキシヘキサデカ -cis-9- エン酸（12ＯＨ-16:1 ｃｉｓΔ９）；イコセン酸（20:1ｃｉｓΔ１１）も本発明の主題である。イコセン酸（icosenoic acid）は一部の国ではアイコセン酸（eicosenoic acid）と綴られることに注意すべきである。
【背景技術】
【０００４】
高等植物の様々な種からの種子油の脂肪酸組成に関する広範囲にわたる調査から１種または２種以上の植物種によって蓄積される、少なくとも33種類の構造的に異なるモノヒドロキシル化植物脂肪酸ならびに12種類の異なるポリヒドロキシル化脂肪酸が同定されている（非特許文献１：van de Looら，1993の総説参照）。トウゴマ植物、Ricinus communis（L.）からの種子油の主要な成分であるリシノール酸は商業的に重要である。本発明者らは、この種からの脂肪酸ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子のクローニング、および他の種のトランスジェニック植物においてリシノール酸を産生させるためのこの遺伝子の使用をすでに報告している。本発明を支持する科学的根拠は1995年に発表された。トランスジェニック植物において他のヒドロキシル化脂肪酸、たとえばレスケロール酸、デンシポール酸、ヒドロキシパルミトレイン酸、ヒドロキシエルカ酸およびアウリコール酸を産生させるためのトウゴマのヒドロキシラーゼ遺伝子の使用も本発明の主題である。さらに、レスクェレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）からの同種ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の同定、およびトランスジェニック植物においてこれらのヒドロキシル化脂肪酸を産生させるためのこの遺伝子の使用も本発明の主題である。
【０００５】
トウゴマはマイナーな油脂植物である。種子重量の約50％が油脂（トリアシルグリセロール）で、総脂肪酸の85〜90％がヒドロキシル化脂肪酸、リシノール酸である。トウゴマの種子から圧縮または抽出によって得られる油脂には、ヒドロキシル化脂肪酸がもつ性質に基づく多くの工業的用途がある。最も重要な用途はペンキおよびニス、ナイロン型の合成ポリマー、樹脂、滑沢剤、ならびに化粧料の製造である（非特許文献２：Atsmon, 1989）。油脂のほかに、トウゴマの種子は、極めて毒性の強い蛋白質リシン、アレルゲン蛋白質およびアルカロイドのリシニンを含有する。これらの成分が、通常は脂肪種子の利用に際しての重要な経済的側面である（油脂抽出後の）非処理種子ミールの家畜飼料としての使用を拒むことになる。さらに、トウゴマ植物には性質の変動があり、またその栽培への投資もないことから、トウゴマには耕種学的性質からもほとんど妙味がない。これらの理由が重なって、トウゴマは米国ではすでに栽培されていないので、これに代わるヒドロキシル化脂肪酸の国内資源の開発には興味がもたれる。ヒマシ油の重要な成分であるリシノール酸を遺伝子操作によって樹立された油脂植物において産生させることは、国内資源を創成する点でとくに有効な手段と思われる。
【０００６】
レスケロール酸、デンシポール酸およびアウリコール酸には近代農業実務に適合する実用的な資源がないことから、現時点ではこれらの脂肪酸には工業的に大規模な用途がない。しかしながら、これらの脂肪酸は、他の植物由来の脂肪酸に匹敵する経費で大規模に製造することが可能になれば、リシノール酸の場合と同様な用途が拓けるものと考えられる（非特許文献３：Smith, 1985）。レスクェリア属におけるある種の植物のようにこれらの脂肪酸を高い比率で蓄積する植物種も、これまでに国内栽培されていないので、現時点では脂肪酸の実用的な資源とは考えられない（非特許文献４：Hirsinger, 1989）。本発明は、農業的に重要なトランスジェニック植物におけるこれらのおよび他のヒドロキシル化脂肪酸の最終的な製造に向けた有用な一歩を提供するものである。
【０００７】
類似のまたは同一の種類の異例な脂肪酸を有する植物の間の分類学的関係が調べられている（非特許文献１：van de Looら，1993）。ある場合には、特定の脂肪酸は、関連する分類単位内に大部分またはもっぱら存在する。他の場合には、分類学的相関と異例な脂肪酸の存在の間に直接的な連鎖は認められない。この関連で、リシノール酸はこれまでに、10の科からの12の属で同定されている（非特許文献１：van de Looら，1993の総説参照）。したがって、ヒドロキシル化脂肪酸の合成能は、被子植物の照射時に独立に数回にわたって進化してきたものと思われる。これは、脂肪酸にヒドロキシル基を導入する酵素は関連する酵素の微小な修飾によって生じたことを示唆するものである。実際、本明細書に示すように、Δ12脂肪酸デサチュラーゼとトウゴマからのκヒドロキシラーゼの間の配列の類似性は極めて高く、ある特定の酵素がデサチュラーゼであるかヒドロキシラーゼであるかを科学文献における証明に基づいて疑いの余地なく決定することは不可能である。Δ12脂肪酸デサチュラーゼの単離および使用を教示するとされる特許出願（特許文献１：ＷＯ91/11516）の場合も同様で、デサチュラーゼからヒドロキシラーゼを識別する方法は教示されていない。植物油の遺伝子操作の目的では、これらの活性間の識別が可能であることが重要との観点からすれば、上述の出願の利用性は機能の帰属を支持する直接的な実験的証明（たとえば、トランスジェニック植物における脂肪酸組成の変化）が提供されている数種の例に限定されるものである。酵素のアミノ酸配列に基づいて脂肪酸デサチュラーゼと脂肪酸ヒドロキシラーゼを識別する方法も本発明の主題である。
【０００８】
ヒドロキシル化脂肪酸または他の異例の脂肪酸の特徴は、それらが一般に種子のトリグリセロールに局限されていて、未知の機構により極性脂質からはほとんど排除されていることである（Battey & Ohlrogge, 1989; Prasad ら，1987）。これは、ジアシルグリセロールがトリグリセロールおよび極性脂質、両者の前駆体であることからとくに興味がもたれる。トウゴマのミクロソームに関して、リシノレエート含有ジアシルグリセロールに対するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの優先性により、リシノレオイル含有極性脂質のプールは最小限になるとの証明はある（Bafor ら，1991）。植物組織の解析による異例の脂肪酸に関する報告は、クチクラに存在する脂肪酸を除いてほとんどない。クチクラは様々なヒドロキシル化脂肪酸を含有し、これらはエステル交換によって構造的役割を果たす高分子量ポリエステルを産生する。異例の脂肪酸が種子以外の組織に見出される例外はほかには少数しかない。
【０００９】
発育中のトウゴマ（Ricinus communis）の胚乳でのオレイン酸からリシノール酸の生合成が様々な方法で検討されてきた。Morris（1967）は、二重標識試験法を用いて、ヒドロキシル化はヒドロキシル置換により直接起こり、不飽和、ケトまたはエポキシ中間体を経由しないことを確立した。前駆体としてオレオイル-ＣｏＡを使用するヒドロキシル化は粗製のプレパレーションまたはミクロソームで証明できるが、ミクロソームにおける活性は不安定で変動し、ミクロソームを単離すると、活性のかなりの、また場合により完全な喪失を生じた（Galliard & Stumpf, 1966; Moreau & Stumpf, 1981）。オレイン酸は前駆体としてオレオイル- ＣｏＡを置換できるが、それはＣｏＡ，Ｍｇ２＋およびＡＴＰの存在下においてのみで（Galliard &Stumpf, 1966）、アシル- ＣｏＡへの活性化が必要なことが指摘された。しかしながら、放射能はリシノレオイル- ＣｏＡ中には検出できなかった（Moreau & Stumpf, 1981）。これらの結果、およびさらに最近の観察（Bafor ら，1991）はトウゴマのオレエートヒドロキシラーゼの基質がホスファチジルコリンまたは他のリン脂質にエステル化されたオレイン酸である証拠と解釈されてきた。
【００１０】
このヒドロキシラーゼはシアニドおよびアジドに感受性で、金属キレーターの透析により活性が低下し、これはＦｅＳＯ４の添加により回復し、酵素活性には鉄の関与が示唆される（Galliard & Stumpf, 1966）。リシノール酸の合成には分子状酸素が要求され（Galliard & Stumpf, 1966; Moreau & Stumpf, 1981）、ヒドロキシラーゼ反応の中間電子ドナーと考えられているシトクロームｂ５を減らすためにはＮＡＤ( Ｐ) Ｈを要求する（Smith, 1985）。一酸化炭素はヒドロキシル化を阻害せず、これは、シトクロームＰ450 は関与しないことを示している（Galliard & Stumpf, 1966; Moreau & Stumpf, 1981）。ヒドロキシラーゼの基質特異性の研究データは、すべての基質パラメーター（すなわち、鎖長および両末端からの二重結合の位置）が重要であることを示し、これらのパラメーターにおける逸脱はオレイン酸に比較して活性の低下を生じる（非特許文献５：Howling ら，1972）。ヒドロキシルが導入される位置は、しかしながら、二重結合の位置によって決定され、常に炭素３個遠位であった。すなわち、トウゴマのアシルヒドロキシラーゼ酵素は、基質の利用性に応じて、ヒドロキシル化された多様な脂肪酸のファミリーを産生することができる。したがって、この広い基質特異性を示すために、便宜上、本発明者らは本明細書を通じてこの酵素を（オレエートヒドロキシラーゼではなく）κヒドロキシラーゼと呼ぶことにした。
【００１１】
トウゴマのκヒドロキシラーゼにはミクロソームの脂肪族アシルデサチュラーゼと多くの外面的な類似性がある（Browse & Somerville, 1991）。とくに植物はΔ12位置で活性なミクロソームオレエートデサチュラーゼを有する。この酵素（Schmidt ら，1993）とヒドロキシラーゼ（Bafor, 1991）の基質は、ホスファチジルコリンの sn-2 位置にエステル化された脂肪酸であるように思われる。オレエートが基質である場合には炭素鎖の同一位置（Δ12）に修飾が起こり、同一の補因子、すなわち、シトクロームｂ５を介するＮＡＤＨからの電子および分子状酸素を要求する。いずれの酵素もシトクロームＰ450 酵素の特徴的インヒビターである一酸化炭素によって阻害されない（Moreau & Stumpf, 1981）。
レスクェレラ（Lesquerella）のヒドロキシラーゼ酵素の性質に関する生化学的研究はこれまで発表されていない。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９１/１１５１６号パンフレット
【非特許文献１】T.S. Moore Jr., Ed., CRC Press, Boca Raton, pp.91-126 (1993)
【非特許文献２】Robbelen, G., Downey, K.R., and Ashri, A., Eds., McGraw-Hill, New York pp.438-447 (1989)
【非特許文献３】Pryde E.H., Ed., American Oil Chemists' Society, Champaign, second edition, pp.29-47 (1985)
【非特許文献４】Robbelen, G., Downey, K.R., and Ashri, A., Eds., McGraw-Hill, New York pp.518-533 (1989)
【非特許文献５】Biochim. Biophys. Acta 260, 10, (1972)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の概念的基盤
初期の出願にはトランスジェニック植物におけるリシノール酸の産生のためのトウゴマからのｃＤＮＡの使用が記載されている。上述のように、他の研究者による生化学的研究から、トウゴマのヒドロキシラーゼはオレイン酸に対して厳格な特異性を示さず、他の脂肪酸たとえばイコセン酸（20:1ｃｉｓΔ１１）のヒドロキシル化も触媒する可能性も示唆されている（Howling ら，1972）。これらの研究に基づき、イコセン酸（20:1ｃｉｓΔ１１）およびエルカ酸（13- ドコセン酸；22:1ｃｉｓΔ１３）のような脂肪酸を蓄積するブラッシカ・ナプス（Brassica napus）およびアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のような種のトランスジェニック植物におけるトウゴマのヒドロキシラーゼの発現は、これらの脂肪酸に対するヒドロキシラーゼの活性により、これらの脂肪酸のヒドロキシル化誘導体の一部を蓄積させる可能性が期待される。本発明者らは今回さらに、リシノール、レスケロール、デンシポールおよびアウリコール脂肪酸のトランスジェニックアラビドプシス植物における産生に基づき、さらにこのような請求に対する直接的な証拠を得たものである。このような証拠は本明細書に例１として記述されている。
本発明者らはすでに、トウゴマのヒドロキシラーゼのクローンおよびそれに由来する配列を、種子油中にヒドロキシル化脂肪酸を蓄積することが知られている植物種たとえばレスクェレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）からの他のヒドロキシラーゼのクローンの同定に使用できる様々な方法を開示している。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この継続出願では、本発明者らは、レスクェレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）からの新規なヒドロキシラーゼ遺伝子の単離に関するこの発明の態様の利用例を提供する。
Δ12脂肪酸デサチュラーゼとトウゴマのヒドロキシラーゼの間の高度な配列類似性（van de Looら，1995）から見て、デサチュラーゼもしくはヒドロキシラーゼ遺伝子またはそれに由来する配列を他の種からの同一の機能の遺伝子の同定のために使用する請求の確実性は懐疑的に見られるに違いない。本出願においては本発明者らは、ヒドロキシラーゼ遺伝子をデサチュラーゼから識別する方法を教示し、デサチュラーゼをコードする遺伝子の修飾によってΔ12デサチュラーゼをヒドロキシラーゼに変換する方法を記述する。デサチュラーゼとヒドロキシラーゼの類似した反応機構の機構的基盤については初期の特許出願に示した。簡略に述べれば、脂肪酸デサチュラーゼは、酸素原子の転移が関与する反応を触媒する細菌酵素メタンモノオキシダーゼ（ＣＨ４→ＣＨ３ＯＨ）の場合と類似の機構を有することを示唆する証拠がある（van de Looら，1993）。メタンモノオキシダーゼのヒドロキシラーゼ成分における補因子には、μ- オキソ架橋ジ鉄クラスター（μ-oxo bridged diiron cluster ，Ｆe ＯＦe）の名称が与えられている。Ｆe ＯＦe クラスターの２個の鉄原子は蛋白質由来の窒素または酸素原子によってライゲートされ、共有結合で架橋した酸素原子による強固な酸化還元カップリングを受けている。Ｆe ＯＦe クラスターは酸素結合に先立ち２個の電子を受容し、ジ第一鉄の状態に還元される。酸素結合時に不均一開裂も起こり、強固にカップリングされたＦe ＯＦe クラスターの多分内部での共鳴配置によって安定化される高原子価のオキソ鉄反応性種を導くものと思われる。メタンモノオキシダーゼの安定化された高原子価オキソ鉄状態はメタンからのプロトンの引き抜きが可能で、ついで酸素転移によりメタンを与える。Ｆe ＯＦe 補因子が植物の脂肪酸修飾に直接関連することは、トウゴマのステアロイルＡＣＰデサチュラーゼがこのタイプの補因子を包含することの証明によって明らかにされている（Fox ら，1993）。
【００１４】
上述の考察に基づき、本発明者らは、トウゴマのオレエートヒドロキシラーゼが構造的に修飾された脂肪族アシルデサチュラーゼであることを、３つの論拠から仮定した。第一の論拠は、リシノール酸を含む植物の分類学的分布に関するものである。リシノール酸は高等植物の10の科の12の属に見出されている（van de Loo ら，1993の総説参照）。すなわち、リシノール酸が存在する植物は植物界を通して広く見出されるが、これらの植物の密接な類縁植物はこの異例の脂肪酸を含んでいない。このパターンは、リシノール酸を合成する能力が数回独立に発生し（そして喪失し）、したがってそれは全く最近の分岐であることを示唆する。換言すれば、リシノール酸を合成する能力は急速に進化したもであり、原型の酵素の構造の比較的微小な遺伝子変化がそれを達成するために必要であったことを示唆するものである。
【００１５】
第二の論拠は、トウゴマのκヒドロキシラーゼの生化学的性質が、上述のようにミクロソームデサチュラーゼの性質に類似することである（たとえば、いずれもホスファチジルコリンの sn-2 にエステル化された脂肪酸に優先的に作用し、いずれも中間の電子ドナーとしてシトクロームｂ５を使用し、いずれもシアニドで阻害され、いずれも基質として分子状酸素を要求し、いずれも小胞体に局在すると考えられる）。
【００１６】
第三の論拠は上述のオキシゲナーゼ補因子に関する考察に発するものであり、植物の膜結合脂肪酸デサチュラーゼはμ- オキソ架橋ジ鉄クラスター型補因子を有するものと考えられ、このような補因子は、蛋白質活性部位の電子的および構造的性質に依存して脂肪酸の不飽和化およびヒドロキシル化の両者を触媒できることの示唆である。
【００１７】
これらの３つの論拠を考え合わせて、トウゴマの内乳のκヒドロキシラーゼはすべての植物に見出されるミクロソームオレエートΔ12デサチュラーゼと同種であると仮定した。この仮説を支持する証拠は開示された通りである。
様々な種からのミクロソームΔ12デサチュラーゼをコードする多数の遺伝子が最近クローン化され（Okuleyら，1994）、これらの酵素の構造についての実質的な情報が現在は知られている。したがって、以下の発明において本発明者らは、脂肪族アシルデサチュラーゼに関する構造情報を本発明のκヒドロキシラーゼ遺伝子の単離にどのように使用するかを教示する。本例が教示する方法によれば、本技術分野の熟練者には、任意の一酸化炭素非感受性の植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼ遺伝子の同定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の概要
本発明は、植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼに関する。植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼを得るために保存されたアミノ酸またはヌクレオチド配列を使用する方法が記述されている。また、トランスジェニック植物においてヒドロキシ化された脂肪酸のファミリーを製造するための植物ヒドロキシラーゼをコードするｃＤＮＡクローンの使用も記載されている。
第一の実施態様においては、本発明は植物κヒドロキシラーゼ配列の転写または転写および翻訳（発現）を提供できる組換えＤＮＡ構築体を意図する。とくに植物宿主細胞内での転写または転写および翻訳が可能な構築体が好ましい。このような構築体は、植物の種子組織で優先的に発現する遺伝子から得られる転写開始領域を含めて様々な調節領域を含有することができる。第二の態様においては本発明はこのような構築体の、宿主細胞とくにその内部に発現された植物κヒドロキシラーゼを有する植物宿主細胞における存在に関する。
【００１９】
さらに他の態様においては、本発明は細胞内での構築体の発現を介した宿主細胞またはその子孫における植物κヒドロキシラーゼの製造方法に関する。植物κヒドロキシラーゼをコードする配列の産生の結果として植物κヒドロキシラーゼを含有する細胞も本発明において意図される。
他の実施態様においては、本発明は、細胞とくに植物細胞内で産生されるヒドロキシル化脂肪酸の割合を修飾するために、植物κヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ配列を使用する方法に関する。このようにヒドロキシル化脂肪酸の組成が修飾されている植物細胞も本発明において意図される。
本発明のさらに他の態様においては、植物κヒドロキシラーゼ蛋白質ならびにそれらに関連する配列が、アミノ酸配列および核酸配列を含めて、意図される。本明細書に例示される植物κヒドロキシラーゼには、レスクェレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）の脂肪酸ヒドロキシラーゼが含まれる。この例示される脂肪酸ヒドロキシラーゼは、本発明の他の植物脂肪酸ヒドロキシラーゼを得るために使用できる。
本発明のさらに他の態様においては、関連ポリペプチドをコードする配列の種子特異的発現を指図する核酸配列が開示される。この核酸配列またはそれに由来するフラグメントを、高等植物における任意の配列の種子特異的発現を達成するために使用することも本発明において意図される。
【００２０】
発明の詳細な説明
ヒドロキシル化脂肪酸を蓄積する本発明の遺伝的にトランスフォームされた植物は、本出願に記載の二本鎖ＤＮＡ分子の発現によって得ることができる。
本発明の植物脂肪酸ヒドロキシラーゼは、植物酵素の反応性条件下にＣｏＡ，ＡＣＰまたは脂質に連結したモノエン脂肪酸からのリシノール酸、レスケロール酸、ヒドロキシエルカ酸（16- ヒドロキシドコサ-cis-13-エン酸）またはヒドロキシパルミトレイン酸（12- ヒドロキシヘキサデカ-cis-9- エン酸）の産生を触媒する能力を示す植物原料から得られるアミノ酸の配列たとえば蛋白質、ポリペプチドもしくはペプチドフラグメント配列、またはこのようなポリペプチドをコードする核酸配列を包含する。「酵素反応性条件」とは、酵素が機能することを可能にするために環境に必要な条件（すなわち、温度、ｐＨ，阻害物質の不存在のようなファクター）を意味する。
【００２１】
植物脂肪酸ヒドロキシラーゼの特定の脂肪族アシル基質に向けての選択活性は様々な脂肪族アシル基質あたりの得られるヒドロキシル化脂肪酸生成物の量を比較して決定される。たとえば、「オレエート優先性」とは酵素プレパレーションのヒドロキシラーゼ活性が他の基質に比べてオレエート含有木質に優先的であることを意味する。トウゴマ脂肪酸ヒドロキシラーゼの正確な基質については不明であるが、リン脂質たとえばホスファチジルコリンにエステル化されているモノ不飽和脂肪酸残基であると考えられる。しかしながら、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸または中性脂質たとえばジアシルグリセロールもしくはコエンザイム- Ａチオエステルにエステル化されたモノ不飽和脂肪酸も基質となることが可能である。上述のように、有意な活性がオレエート以外の脂肪族アシル基質を用いた放射標識試験で観察されたことは（Howling ら，1972）、基質特異性が関連脂肪族アシル化合物のファミリーであることを示している。トウゴマヒドロキシラーゼが二重結合から脂肪酸のメチル炭素に対して炭素３つ近位にヒドロキシ基を導入することから、本発明者らはこの酵素をκヒドロキシラーゼと命名している。とくに興味があることとして、本発明では、非ヒドロキシル化前駆体を産生する植物種における発現によって12- ヒドロキシ-9- オクタデセン酸（リシノレエート）、12- ヒドロキシ-9- ヘキサデセン酸、14- ヒドロキシ -11-アイコセン酸、16- ヒドロキシ-13-ドコセン酸、9-ヒドロキシ-6- オクタデセン酸を製造するためにトウゴマのκヒドロキシラーゼを用いることが意図される。本発明ではまた、ヒドロキシル化脂肪酸（たとえば、この例では12- ヒドロキシ-9- オクタデセン酸）の不飽和化から生じる12- ヒドロキシ-9,15-オクタデカジエン酸のようにさらに修飾された脂肪酸の製造が意図されている。
【００２２】
本発明ではまた、植物の遺伝子操作の将来の進歩により、基質脂肪酸たとえばイコセン酸エステルおよびパルミトレイン酸エステルが、このような脂肪酸を通常は蓄積しない植物中で製造可能になることを想定している。ここに記載する発明はこのような将来の改良と連携して、目的とする遺伝子修飾を受けやすい任意の植物種において本発明のヒドロキシル化脂肪酸の製造に使用できることを想定している。すなわち、本発明の適用可能性は、本発明者の考えでは、現時点で適当な基質を蓄積する上述の種のみに限定されるものではない。
上述のように、本発明の植物κヒドロキシラーゼは、様々な脂肪族アシル基質に対して活性を発揮する。植物細胞中での脂質の生合成時に、脂肪酸は通常、アシルキャリヤー蛋白質（ＡＣＰ）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）または様々な細胞脂質と共有結合する。脂質連結アシル基質に選択的な活性を発揮する植物κヒドロキシラーゼは未成熟胚における貯蔵脂質の合成の正常な経路と密接に関連すると思われることからとくに好ましい。しかしながら、本発明においては、たとえばアシル- ＣｏＡ基質または他の合成基質に対する活性も意図される。
【００２３】
他の植物κヒドロキシラーゼは、本発明で提供される特定の例示配列から取得可能である。さらに、例示した植物κヒドロキシラーゼから、またこのような例示配列の使用によって得られる植物κヒドロキシラーゼから、修飾アミノ酸配列および合成蛋白質モデリングのための出発材料を含む天然および合成の植物κヒドロキシラーゼが得られることも自明の通りである。修飾アミノ酸配列には、突然変異、トランケーション、付加等を受けた配列が包含され、それが部分合成されたか全合成されたかは無関係である。実際に植物プレパレーションから精製された配列もしくはそれらと同一の配列またはそれらと同一の蛋白質をコードする配列は、その蛋白質または配列の獲得に使用された方法とは無関係に、等しく天然由来とみなされる。
【００２４】
すなわち、本技術分野の熟練者によれば、抗体プレパレーション、核酸プローブ（ＤＮＡおよびＲＮＡ）等を調製して、様々な植物原料からの「同種」または「類縁」κヒドロキシラーゼのスクリーニングおよび回収に使用することは容易に認識されるところである。通常、核酸プローブは検出が可能なように好ましくは放射能で標識されるが、酵素または他の方法も使用できる。免疫学的スクリーニング方法では、抗体プレパレーション、モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれかが利用される。ポリクローナル抗体の方が特異性は劣るものの、通常、遺伝子の単離には有用である。検出のためには、抗体は放射能または市販の様々な第二抗体／酵素接合系の一つを用いて標識される。
同種配列は、配列に同一性がある場合に見出され、配列情報、核酸もしくはアミノ酸の比較、または既知のκヒドロキシラーゼと候補試料の間のハイブリダイゼーションによって決定される。保存的変化たとえば、Glu/Asp, Val/Ile, Ser/Thr, Arg/Lysおよび Gln/Asnも配列のホモロジーの決定には考慮される。標的配列と興味のある与えられたκヒドロキシラーゼの間で、欠失があればそれを除いて、通常長い核酸配列に最低50〜60％さらに好ましくは少なくとも70％の配列同一性があれば類似するとみなされる。アミノ酸配列は２つの完全成熟蛋白質間に最低25％の配列同一性があれば相同とみなされる（一般には、Doolittle,R.F., OF URFS ana ORFS, University Science Book, Ca, 1986参照）。
【００２５】
興味ある候補植物原料から調製されたゲノムまたは他の適当なライブラリーを植物κヒドロキシラーゼからの保存的配列をプローブとして使用して、相同性の類似配列を検出することができる。短いプローブ配列が同定されない場合には、全ｃＤＮＡまたは他の配列が使用できる。ついで陽性のクローンを制限酵素消化および／または配列決定によって解析する。ゲノムライブラリーを使用した場合には、このような植物原料からκヒドロキシラーゼ遺伝子のコード領域ならびに転写調節エレメントの両者を与える１または２以上の配列が同定される。プローブは全配列よりかなり短くてもよい。たとえばオリゴヌクレオチドが使用できるが、その長さは少なくとも約10、好ましくは少なくとも約15、さらに好ましくは少なくとも20ヌクレオチドでなければならない。比較に長さの短い領域が用いられる場合には、長い配列を使用した場合よりも高度な配列同一性が要求される。短いプローブは、とくにポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）に有用なことが多く、この場合とくに高度に保存された配列を同定できる（分類学的に異なる種から相同遺伝子を単離するためにＰＣＲを用いる例は Gouldら，1989参照）。
長い核酸フラグメント（＞100 bp）をプローブとして使用する場合、とくに完全または大ｃＤＮＡ配列を用いる場合には、標的サンプルから20〜50％偏位したシグナルすなわち相同の配列を得るために、低緊縮条件（たとえば、プローブの融点以下40〜50℃）でスクリーニングが行われる（Beltz ら，1983）。
【００２６】
好ましい実施態様においては、本発明の植物κヒドロキシラーゼは、例示された植物κヒドロキシラーゼと少なくとも60％の総アミノ酸配列での類似性を有する。とくに、トウゴマまたはレスクェレラ（Lesquerella）κヒドロキシラーゼのアミノ酸または核酸配列から得られるκヒドロキシラーゼがとくに好ましい。植物κヒドロキシラーゼは、長鎖または短鎖脂肪族アシル基質に対して選択的活性を有するものと思われる。オレエート-12-ヒドロキシラーゼ活性およびアイコセノエート-14-ヒドロキシラーゼ活性を有する植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼはいずれも、インビトロでの証明（Howling ら，1972）およびトウゴマκヒドロキシラーゼが両基質に作用することの本明細書に開示された証明から、相同性の類似蛋白質であると考えられる。ヒドロキシル化脂肪酸は、通常存在するかまたは遺伝子操作法によって導入される他の酵素によりさらに酵素的修飾を受けることができる。たとえば、一部のレスクェレラ種に存在する14- ヒドロキシ-11, 17- アイコサジエン酸（Smith, 1985）は14- ヒドロキシ-11-アイコセン酸の不飽和化によって産生されるものと考えられる。
【００２７】
この場合も、遺伝子クローンおよびそれらに由来する材料は相同の植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼの同定に使用できるのみでなく、それらから得られた配列はさらに他の植物原料から植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼを得る方法を提供することもできる。とくに、ここで提供される配列データから類似の植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼを得るには、ＰＣＲが有用な方法である。本技術分野の熟練者には、配列の比較または通常高度に保存された領域に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを設計することが可能である。とくに興味がもたれるのは、トウゴマκヒドロキシラーゼとレスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）のヒドロキシラーゼ（配列番号：４）の間の保存された領域のアミノ酸配列に基づくポリメラーゼチェーン反応プライマーである。これらのプローブを用いるＰＣＲ反応のための設計および方法に関する詳細は実施例にさらに詳細に記述する。
【００２８】
様々の起源の脂肪族アシルヒドロキシラーゼが、広範囲の植物およびインビボ適用におけるヒドロキシル化現象の検討に使用できることも注目すべきである。すべての植物が共通の代謝経路を経て脂肪酸を合成するので、ある植物脂肪酸ヒドロキシラーゼの異種植物宿主での試験および／またはそれへの適用は様々な種において容易に達成できる。
核酸配列が得られたならば、植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼの宿主細胞内での転写または転写および翻訳（発現）が、酵素の簡便な原料の製造および／または遊離脂肪酸、エステル（とくにグリセロ脂質へのエステル化またはワックスエステルの成分として）、エストリドまたはエーテルの形で見出される脂肪酸の組成の修飾に望ましい。他の有用な適用は、宿主細胞がインビトロおよびインビボにおける植物宿主細胞の場合に見出される。
たとえば、植物に利用可能なκヒドロキシラーゼ量を増加させることにより、レシノレエートまたはレスケロレエート（14- ヒドロキシ-11-アイコセン酸）の比率の増加が達成される。
【００２９】
κヒドロキシラーゼ
本発明により、植物におけるリシノール酸の生合成機構が明らかにされる。すなわち、脂肪族アシル基質に対する選択的活性を有する特異的植物κヒドロキシラーゼが少なくとも一部の植物種におけるヒドロキシル化脂肪酸の蓄積に関与することである。リシノレエートまたはリシノール酸（レスケロレエートまたはレスケロール酸、デンシポーレエート等）の語の使用は、遊離酸、そのＡＣＰおよびＣｏＡエステル、これらの酸の塩、グリセロ脂質（とくに、トリアシルグリセロールエステル）、これらの酸のワックスエステル、エストリドおよびエーテル誘導体を包含することを意図するものである。
【００３０】
植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼがヒドロキシル化脂肪酸のインビボ産生に活性であることの確定は植物酵素の起源について幾つかの可能性を示唆するものである。そして実際、ヒドロキシル化脂肪酸は一部の天然の植物種に豊富に見出される。たとえば、リシノレエートに類似の３種のヒドロキシ脂肪酸が様々のレスクェレラ種からの種子油中に大量に存在する。とくに興味がもたれるのは、さらに２個の炭素原子を炭素鎖にのカルボキシル末端に有するリシノレエートの20炭素同族体のレスケロール酸である（Smith, 1985）。ヒドロキシル化脂肪酸の他の天然の植物原料にはそれらに限定されるものではないが、アマ（Linum）属の種子、ライティア種（Wrightia）、ヒカゲノカズラ種（Lycopodium）、ストロファンタス種（Strophanthus）、ヒルガオ種（Convolvulaces）、キンセンカ種（Calendula）および他の多くの種の種子に含まれる（van de Looら，1993）。
リシノレエートもしくはレスケロレエートまたはこれらの脂肪酸の不飽和化された他のもしくは修飾された誘導体の有意な存在が認められる植物は、天然由来のκヒドロキシラーゼを得るための好ましい候補植物である。たとえば、レスクェレラ・デンシピラ（L.densipila）はヒドロキシル基を有するジ不飽和18炭素脂肪酸であり（van de Looら，1993）、本発明の基盤となる理論によればトウゴマκヒドロキシラーゼに密接に関連する酵素によって産生されると考えられる。さらに、κヒドロキシラーゼと、オレエートの12- 炭素もしくはレスケロレエートの14- 炭素以外の位置またはオレイン酸もしくはイコセン酸以外の基質にヒドロキシル基を導入する植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼとの間の比較は、蛋白質モデリングまたは上述のような合成ヒドロキシラーゼの創成のための他の修飾に対する洞察力を与える。たとえば、Δ12デサチュラーゼとκヒドロキシラーゼの構造的比較から得られた情報を基に、本発明は、これらのデサチュラーゼをκヒドロキシラーゼに変換する遺伝子修飾を、Δ12デサチュラーゼの構造遺伝子に行うことを意図するものである。本発明はまた、Δ15ヒドロキシラーゼの改変、すなわちそのデサチュラーゼに匹敵する基質特異性をもつヒドロキシラーゼへの変換（たとえば、18:2Δ9,12の15ＯＨ-18:2 Δ9,12への変換）を行うことを意図するものである。ヒドロキシラーゼとデサチュラーゼの間の差は１個のプロトンの配置が関係することから、本発明は、この酵素の活性部位付近の領域における荷電基の系統的変化により、上記改変を行うことを意図するものである。
【００３１】
とくに興味がもたれるのは、オレエート以外の脂肪族アシル基質に向けて活性を示す脂肪族アシルヒドロキシラーゼ、または12炭素以外の位置にヒドロキシル基を導入する脂肪族アシルヒドロキシラーゼである。上述のように、他の植物原料も、たとえば、蛋白質精製、核酸プローブ、抗体プレパレーション、蛋白質モデリングまたは配列比較の使用により上述の酵素の原料を提供する可能性が考えられ、とくに興味があるのはこのような植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼに相当するそれぞれのアミノ酸および核酸配列である。同じくすでに述べたように、与えられた植物ヒドロキシラーゼについて核酸配列が得られたならば、それと相同性の類似ＤＮＡ配列を得るために、さらに他の植物配列の比較および／またはプローブによる探索等が可能になる。
【００３２】
遺伝子操作の適用
本技術分野においてよく知られているように、植物κヒドロキシラーゼをコードするｃＤＮＡクローンが得られたならば、それに相当するゲノム核酸配列を得るために使用することができる。
植物κヒドロキシラーゼをコードする核酸配列は、様々な構築体の形で、たとえば同一または他の種からさらに配列を得るためのプローブとして使用できる。また、これらの配列は、適当な調節配列と結合させて、ヒドロキシル化脂肪酸の製造または酵素のインビトロもしくはインビボでの研究の目的で、宿主細胞中の興味ある相当するヒドロキシラーゼレベルを上昇させるために、あるいは宿主細胞が植物細胞、植物部分（それらに限定されるものではないが、種子、挿木または組織）および植物を含む植物実体である場合にはある種の適用の目的で興味ある相当するヒドロキシラーゼレベルを低下もしくは上昇させるために、使用することができる。
【００３３】
本発明の植物κヒドロキシラーゼをコードする核酸配列にはゲノム、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列が包含される。「コードする」の語は、その配列がセンスまたはアンチセンス方向性のいずれかで特定のアミノ酸配列に対応することを意味する。「組換え」の語は、配列が突然変異誘発、制限酵素等を介した操作による遺伝子操作での修飾を含有することを意味する。ｃＤＮＡ配列はプレプロセッシング配列たとえばトランジットもしくはシグナルペプチドを含んでいてもいなくてもよい。トランジットもしくはシグナルペプチドは、与えられた小器官への蛋白質の送達を促進し、多くの場合、小器官に進入するとポリペプチドから切断され、「成熟」配列が遊離される。植物細胞発現カセットには前駆体ＤＮＡ配列の使用が好ましい。
【００３４】
さらに、上述のように植物κヒドロキシラーゼの完全ゲノム配列はゲノムライブラリーのプローブたとえばｃＤＮＡプローブによるスクリーニングおよび種子組織における発現を調節する配列の単離によって得られる。この方法で、植物κヒドロキシラーゼの転写および翻訳開始領域、イントロン、および／または転写終結領域が、κヒドロキシラーゼ構造遺伝子とともにまたはそれを含まないで、様々なＤＮＡ構築体における使用のために得られる。すなわち、本発明の植物κヒドロキシラーゼに相当する核酸配列はまた、小器官への輸送を指示するのに有用なシグナル配列、有用な組織的および時間的プロファイルを有する５' 上流非コード調節領域（プロモーター）、転写および翻訳調節領域として有用な３' 下流非コード調節領域を提供し、そして遺伝子の他の特徴の洞察力を与える。
【００３５】
所望の植物κヒドロキシラーゼの核酸配列が得られたならば、様々な方法で操作することができる。配列が非コード隣接領域を包含する場合には、切除、突然変異誘発等に付すことができる。すなわち、天然に存在する配列に転位変異、転換変異、欠失、および挿入を行うことができる。さらに、全配列または部分配列を合成することができる。構造遺伝子内には、修飾アミノ酸配列の提供のための１もしくは２以上のコドンの修飾、あるいは慣用の制限部位の導入または構築もしくは発現に関する他の目的での１もしくは２以上のコドンの突然変異誘発を行うことができる。構造遺伝子にはさらに１もしくは２以上の慣用の制限部位の導入等のために合成アダプター、リンカー等を用いた修飾を行うことができる。
本発明の植物κヒドロキシラーゼをコードする核酸もしくはアミノ酸配列は、他の非ネイティブなもしくは「異種」の配列と様々な方法で結合させることができる。「異種」の語は、天然にはその植物κヒドロキシラーゼと接合しては見出されない任意の配列を意味し、たとえば、天然にはそれと接合しては見出されない同一植物からの核酸配列の組合せが包含される。
【００３６】
本発明の植物κヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ配列は、通常κヒドロキシラーゼと会合している全遺伝子配列または部分遺伝子配列と接合させて用いられる。その成分部分において、κヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ配列は、５' から３' への転写方向で、宿主細胞における転写および翻訳を促進できる転写開始領域、植物κヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳終結領域を有するＤＮＡ構築体に結合されている。
使用できる可能性のある宿主細胞には、原核細胞および真核細胞の両者が包含される。宿主細胞は意図された使用に応じて単細胞または多重細胞の分化もしくは非分化生物体における細胞とすることができる。本発明の細胞は、野生型細胞に異種の植物κヒドロキシラーゼをその内部に有すること、たとえば植物κヒドロキシラーゼをコードする組換え核酸構築体を含むことによって識別される。
宿主によって、調節領域は、ウイルス、プラスミドまたは染色体遺伝子からの領域等を含めて変動させることになる。原核または真核微生物における発現、とくに単細胞宿主における発現には、広範囲の構成的または調節的プロモーターが使用できる。微生物における発現は植物酵素の簡便な起源を提供することができる。上述の転写開始領域には、細菌および酵母宿主たとえば大腸菌（E.coli）、枯草菌（B.subtilis）、サッカロミケス酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）からの領域があり、たとえばβガラクトシダーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファンＥ等が包含される。
【００３７】
大部分の場合、構築体は、植物κヒドロキシラーゼの産生が修飾され、その結果、脂肪酸組成が修飾されている植物内で機能する調節領域を包含する。植物κヒドロキシラーゼまたはその機能性フラグメントをコードするオープンリーディングフレームはその５' 末端で転写開始調節領域、たとえばκヒドロキシラーゼ構造遺伝子の５' 上流に天然に見出される野生型配列に接合される。構造遺伝子機能の広範囲の構成的または調節的、たとえば誘導的転写を提供する他の多くの転写開始領域も使用できる。植物に使用される転写開始領域には、たとえばノパリンおよびマンノピンシンターゼの構造遺伝子と会合している領域、またはナピン、大豆βコングリシニン、オレオシン、12Ｓ貯蔵蛋白質、カリフラワーモザイクウイルス35Ｓプロモーター等と連結している領域がある。このような構造遺伝子に対応する転写／翻訳開始領域はそれぞれの開始コドンの５' 上流直前に見出される。κヒドロキシラーゼ蛋白質の植物宿主内での発現が所望される実施態様においては、完全植物κヒドロキシラーゼ遺伝子のすべてまたは部分、すなわち構造遺伝子配列とともに、５' 上流非コード領域（プロモーター）および３' 下流非コード領域のすべてまたは部分の使用が望ましい。異なるプロモーター、たとえば関連植物宿主にネイティブなプロモーター、もしくは修飾プロモーターすなわち関連植物κヒドロキシラーゼをコードする配列を含めて転写開始領域は一つの遺伝子源に由来し翻訳開始領域は他の遺伝子源に由来するプロモーター、または強力プロモーターたとえば二重 35Ｓ ＣａＭＶプロモーターが望まれる場合には、それらの配列を標準技術を用いて互いに接合させる。
【００３８】
５' 上流非コード領域が種子の成熟時に調節される他の遺伝子から得られる場合の適用では、植物胚組織において選択的に発現される領域、たとえばブラッシカ・ナプス（B.napus）ナピン遺伝子、アラビドプシス（Arabidopsis）12Ｓ貯蔵蛋白質または大豆βコングリシニンからの転写開始制御領域（Brayら，1987）、または上述のレスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）κヒドロキシラーゼのプロモーターが望ましい。種子組織で選択的に発現される転写開始領域、すなわち他の植物部分では検出されない転写開始領域が、遺伝子産物の破壊または有害作用を最小限にするために脂肪酸修飾には望ましいと考えられる。
転写終結調節領域も同様に、本発明のＤＮＡ構築体中に提供できる。転写終結領域は、植物κヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡ配列、または異なる遺伝子源に由来する転写終結領域、たとえば転写開始領域と天然において関連する転写終結領域によって提供される。転写終結領域が異なる遺伝子源からのものである場合には、終結領域が誘導される構造遺伝子に対し少なくとも約 0.5 kb ，好ましくは約 1〜3 kbの配列を含有させる。
【００３９】
その発現を増大または低下させるための関心ＤＮＡ配列として植物κヒドロキシラーゼを有する植物発現または転写構築体は、広範囲の植物ライフとくに食用および工業用の植物油の産生にかかわる植物ライフに使用することができる。最も好ましい植物は中等度の脂肪種子植物である。興味ある植物には、それらに限定されるものではないが、菜種［カノーラ（Canola）および高エルカ酸品種］、クランベ（Crambe）、ブラッシカ・ジュンセア（Brassica juncea）、ブラッシカ・ニグラ（Brassica nigra）、メドウフォーム（meadowfoam）、アマ、ヒマワリ、ベニバナ、綿、キュフェア（Cuphea）、大豆、落花生、ココナツおよびギネアアブラヤシ、ならびにトーモロコシが包含される。κヒドロキシラーゼの導入に適当な植物の選択における重要な規準は、ヒドロキシラーゼに適当な基質が宿主植物中に存在することである。すなわち、たとえばリシノール酸の製造は種子脂質中に通常高レベルのオレイン酸を含有する植物で最善の結果が達成される。同様に、レスケロール酸の製造は種子脂質中に通常高レベルのイコセン酸を有する植物で最善の結果が得られる。
【００４０】
宿主細胞への組換え構築体の導入方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要になる。重要な点は、本発明が双子葉植物および単子葉植物に同様に適用できることであり、新規および／または改良トランスフォーメーションおよび調節技術に容易に適用できることである。本発明にはトランスフォーメーション方法の限定はない。植物のトランスフォーメーションには現在様々な方法が利用できる。新しい方法ほど植物のトランスフォーメーションに利用し易く、以下のように直接適用できる。たとえば、自然にアグロバクテリウム感染を受けやすい多くの植物はアグロバクテリウム誘導トランスフォーメーションのトリパータイトまたはバイナリーベクターベクター法によって効果的にトランスフォームできる。さらに、マイクロインジェクション法、ＤＮＡ粒子ボンバートメント、エレクトロポレーションが開発されていて、様々な単子葉ならびに双子葉植物種のトランスフォーメーションが可能になっている。
【００４１】
ＤＮＡ構築体の増殖には、構築体の各種成分またはそれらのフラグメントを通常、細菌宿主たとえば大腸菌内で複製可能な慣用のクローニングベクター中に挿入する。これまで文献に多数のベクターが報告されている。それぞれをクローニング後、プラスミドを単離し、制限、新フラグメントの挿入、ライゲーション、欠失、挿入、切断等の操作をさらに施して、所望の配列の成分を仕立て直す。構築体が完成したならば、ついでそれを適当なベクターに移し、宿主細胞のトランスフォーメーション方法に応じてさらに操作する。
通常、構造遺伝子には宿主内での発現とトランスフォーマント細胞の選択に必要な調節領域を有するＤＮＡ構築体を包含させる。遺伝子には、細胞毒性物質、たとえば抗生物質、重金属、トキシン等に対する抵抗性、栄養要求性宿主への原栄養性を付与する相補、ウイルス免疫性等を付加してもよい。異なる宿主種の数に応じて、発現構築体またはその成分が導入され、異なる宿主に異なる選択条件が用いられる場合には、１または２以上のマーカーが使用される。
ＤＮＡコードの縮重により、一部のコドン置換はアミノ酸配列の相当する修飾を生じることなくＤＮＡ配列の改変を可能にすることに留意すべきである。
上述のように、ＤＮＡ構築体を植物細胞内に導入する方法は本発明を限定するものではない。効率的なトランスフォーメーションを与える任意の方法が使用できる。植物細胞のトランスフォーメーションの様々な方法にはＴi-またはＲi-プラスミドの使用、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション、インフィルトレーション、インビビション、ＤＮＡ粒子ボンバートメント、リボソーム融合、ＤＮＡボンバートメント等がある。多くの例で、構築体をＴ- ＤＮＡの一方または両境界配列で縁取ることが望ましく、とくに左および右境界配列、さらに好ましくは右境界配列を結合させることが望ましい。これは、構築体のトランスフォーメーションの方法として、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾジェネス（A.rhizogenes）を用いる場合にとくに有用であるが、Ｔ- ＤＮＡ境界配列は他のトランスフォーメーション様式でも有用なことが見出されている。
【００４２】
植物細胞のトランスフォーメーションにアグロバクテリウムを用いる場合は、アグロバクテリウム宿主中に存在するＴ- ＤＮＡまたはＴi-もしくはＲi-プラスミドでの相同組換えのためにアグロバクテリウム宿主中に導入できるベクターを使用する。組換えのためのＴ- ＤＮＡを含有するＴi-またはＲi-プラスミドは病原部をもっていても（ゴールの形成が可能）もっていなくても（ゴールの生成不能）よく、後者もトランスフォームされたアグロバクテリウム宿主中に virが存在する限り差し支えない。病原部をもつプラスミドは正常植物細胞とゴールの混合物を与えることができる。
植物細胞のトランスフォーメーションにビヒクルとしてアグロバクテリウムを用いる場合には、Ｔ- ＤＮＡ境界配列で縁取りされた発現構築体を広域宿主スペクトルを有するベクターに挿入することになる。広域宿主スペクトルを有するベクターについては文献に記載されている。普通よく用いられるものはｐＲＫ2 またはその誘導体である（Ditta ら，1980参照）。発現構築体およびＴ- ＤＮＡとともにトランスフォームされたアグロバクテリウムおよびトランスフォームされた植物細胞の選択を可能にするための１または２以上のマーカーが包含される。多数のマーカーが植物細胞と使用するために開発されている。カナマイシン、アミノグリコシドＧ418 、ハイグロマイシンに対する抵抗性等がある。使用される特定のマーカーは本発明の本質ではない。特定の宿主および構築の様式に応じて１種以上の好ましいマーカーがある。
【００４３】
アグロバクテリウムを用いる植物細胞のトランスフォーメーションでは、外植片をトランスフォームされたアグロバクテリウムと混合し、トランスフォーメーションに十分な時間インキュベートし、細菌を殺滅し、植物細胞を適当な選択培地中で培養する。カルスが形成されたならば、既知の方法に従い適当な植物ホルモンを用いて苗条形成を促進させ、苗条を発根培地に移して植物を発生させる。ついで植物を生育させて種子を得、種子を用いて世代の反復を確立し、植物油を単離する。
本発明を以上、一般的に説明したが、以下の実施例を参照すれば理解はさらに容易であろう。この実施例は例示のみの目的で記述されるもので、本発明を限定するものではない。
【００４４】
実施例
以下の実験的開示においては、とくに他の指示がない限り、すべて、温度は摂氏（°）で、重量はグラム（ｇ）、ミリグラム（ｍｇ）もしくはマイクログラム（μｇ）、濃度はモル（Ｍ）、ミリモル（ｍＭ）またはマイクロモル（μＭ）、容量はリットル（ｌ）、マイクロリットル（μｌ）またはミリリットル（ｍｌ）で示す。
【００４５】
例１−アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）における新規なヒドロキシル化脂肪酸の製造
概要
以前に記載されたトウゴマからの fah12遺伝子（米国特許出願第08/320,982号）によってコードされるκヒドロキシラーゼを用い、トランスジェニックアラビドプシス植物内でリシノール酸、レスケロール酸、デンシポール酸およびアウリコール酸を製造した。この例は先行する出願の実施例２に教示された方法の実践に帰するものである。
【００４６】
トランスジェニック植物の製造
植物宿主のゲノム中に関心のあるＤＮＡ配列を挿入してその配列の転写および翻訳によって表現型を変化させるためには、多くの方法が開発されている。以下の方法は、トランスジェニック植物を発生させてヒドロキシラーゼ遺伝子の発現を起こさせる多くの均等な手段の一つのみを提示したものである。
アラビドプシス植物は、バイナリーＴi プラスミドｐＢ6 上、トウゴマ fah12遺伝子によりコードされたκヒドロキシラーゼを用い、アグロバクテリウム誘導トランスフォーメーションによってトランスフォームした。このプラスミドは以前に、リシノール酸の製造のために、タバコ（Nicotiana tabacum）のトランスフォーメーションに使用されている（米国特許出願第08/320,982号）。
【００４７】
バイナリーＴi プラスミドｐＢ6 を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（A.tumefaciens）ＧＶ3101株の移植体を、50μg/mlのカナマイシンを含むＬ- ブロス平板にプレーティングして37℃で２日間インキュベートした。アラビドプシス植物のトランスフォーメーションに使用するため、単一のコロニーを用いて大量の液体培養液（50 mg/l のリファンピシン、110 mg/lのゲンタマイシンおよび 200 mg/mlのカナマイシン含有Ｌ- ブロス培地）に播種した。
アラビドプシス植物は Bechtold ら（1993）によって報告されたインプランタトランスフォーメーション操作にほぼ従ってトランスフォームした。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ3101（ｐＢ６）の細胞を液体培養液から遠心分離によって収穫し、ついで浸潤培地にＯＤ６００＝0.8 で再懸濁した［浸潤培地は 6- ベンジルアミノプリン 10 mg/lならびに５％グルコース含有する Murasige &Skoog大量および微量栄養素培地（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）］。12〜15植物のバッチを土壌を含む 3.5インチのポット内で自然光下、平均日中温度約25℃で３〜４週間生育させた。無傷の植物を細菌懸濁液に浸漬し、ついで真空室に移して実験室用真空ポンプによる 600 mm の真空下に、組織が均一に水で濡れてくるまで（約10分）置いた。植物を25℃にて４週間、連続光（400 〜700 nm範囲の 100μmol m −１s −１照射）下に生育させた。１個のポットの全植物から得られた種子を１バッチとして収穫した。種子をエタノールにより２分間ついで家庭用の漂白剤（Chlorox）、水およびツイーン80の混合物（50％, 50％, 0.05％）により10分間連続処理して滅菌し、ついで滅菌水で完全に濯いだ。種子を 100mmのペトリ皿中、Ｂ５ビタミン（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）を強化しカナマイシン50 mg/l を含有させた 1/2×Murasige & Skoog塩培地を含むアガール固化培地上に、高密度（2000〜4000/ プレート）にプレーティングした。４℃で48時間インキュベートして発芽を刺激したのち、苗条を７日間生育させると、トランスフォーマントは、褪緑カナマイシン感受性苗条のバックグランドに対して、健康な緑色の苗条として明瞭に確認できた。トランスフォーマントを土壌に移し、２週後に葉組織をＤＮＡおよび脂質分析に使用した。20以上のトランスフォーマントが得られた。
【００４８】
無傷の fah12遺伝子の存在を確認するために、トランスフォーマントの若い葉からＤＮＡを抽出した。ｐＢ6 からの挿入体を増幅するためにポリメラーゼチェーン反応を用い、多数のトランスジェニック系列候補から導入遺伝子が確認された。使用したプライマーは、
ＨＦ２＝ＧＣＴＣＴＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＣＡＴＣＣ（配列番号：12）と
ＨＲ１＝ＣＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＡＣＧＣＣＴＴＧ（配列番号：13）で、
700 bpフラグメントの増幅が可能なように設計された。各プライマー 25 pmol，1.5 ＵのＴａｑポリメラーゼ（Boehringer Manheim），200 μＭのｄＮＴＰｓ，50ｍＭのＫＣｌ，10ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ 9），0.1 ％（v/v）トリトンＸ-100，1.5 ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３％（v/v）ホルムアミドを含有する溶液に約 100 ngのゲノムＤＮＡを添加し、最終容量を 50 μl とした。増幅条件は、94℃４分の変性工程に続いて、92℃１分、55℃１分、72℃２分を30サイクルとした。最終の伸長工程は72℃５分としてプログラムを終了させた。トランスフォーマントは特徴的な 1 kb 増幅フラグメントのエチジウムブロミド染色アガロースゲル上での可視化によって陽性に同定された。試験したすべてのトランスジェニック系列が期待されたゲノタイプに一致するサイズのＰＣＲ生成物を与え、これらの系列が真にトランスジェニックであることが確認された。以後の実験はすべて 1-3，4D，7-4 と命名された３つの野生型の代表的トランスジェニック系列および fad 2 突然変異体系列ＪＢ12の１つのトランスジェニック系列を用いて行った。トランスジェニックＪＢ12系列は、この突然変異体におけるオレイン酸の蓄積の増加がトランスジェニック植物に蓄積するリシノール酸の量に影響するか否かを試験するために包含させた。
【００４９】
トランスジェニック植物の分析
fah12 トランスジェニックアラビドプシス植物からの葉および種子について、ヒドロキシル化脂肪酸の存在をガスクロマトグラフィーを用いて分析した。脂質を 100〜200 mgの葉組織または50個の種子から抽出した。脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥＳ）は、テフロン（登録商標）張りキャップで栓をした 13 ×100 mmガラススクリューキャップ試験管内の 1.0Ｍメタノール性塩酸（Supelco Co.）1.5 ml中に組織を取り、80℃に２時間加熱して調製した。冷却して 1 ml の石油エーテルを加え、エーテル相を吸引してＦＡＭＥＳを採取し、これをついで試験管中窒素気流下に乾燥した。100 μl のＮ, Ｏ- ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ，Pierce Chemical Co）および 200μl のアセトニトリルを加えてヒドロキシル基を誘導体化した。反応は70℃で15分間行った。生成物を窒素下に乾燥し、100 μl のクロロホルムに再溶解し、ガスクロマトグラフバイアルに移した。各サンプル 2μl を、Hewlett-Packard 5890ＩＩシリーズガスクロマトグラフを用い、ＳＰ2340溶融シリカ毛細管カラム（30 m, 内径 0.75 mm, 0.20フィルム, Supelco）上で分析した。サンプルはスプリットされず、温度プログラムは、195 ℃で18分、25℃/ 分で230 ℃に上昇させ、230 ℃に５分間保持し、ついで25℃/ 分で195 ℃に下降とし、火焔イオン化検出器を用いた。
【００５０】
リシノール酸、レスケロール酸およびアウリコール酸のメチルエステルおよびＯ- ＴＭＳ誘導体のクロマトグラフィー溶出時間は、レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）の種子からの脂質サンプルのＧＣ- ＭＳおよびこの種からの脂肪酸の公表されているクロマトグラム（Carlson ら,1990）との比較によって確立された。Ｏ- ＴＭＳ- メチルリシノーレエート標準は Sigma Chemical Co（St. Louis, MO）から入手したリシノール酸から調製した。Ｏ- ＴＭＳ- メチルレスケローレエートおよびＯ- ＴＭＳ- メチルアウリコーレエート標準はレスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）の種子から精製したトリアシルグリセロールより調製した。Ｏ- ＴＭＳ- メチルリシノーレエート、Ｏ- ＴＭＳ- メチルデンシポーレエート、Ｏ- ＴＭＳ- メチルレスケローレエートおよびＯ- ＴＭＳ- メチルアウリコーレエートのマススペクトルは図１Ａ〜Ｄにそれぞれ示す。これらの誘導体のマススペクトル測定時に生成した特徴的なイオンの構造を図２に示す。
【００５１】
トランスジェニック組織から抽出された液体を、ヒドロキシル化脂肪酸の存在についてガスクロマトグラフィーおよびマススペクトルによって分析した。参考資料としては、アラビドプシス野生型および fad2 突然変異体系列における葉の平均脂肪酸組成が Miquel & Browse（1992）によって報告されている。野生型および fah12トランスジェニック野生型植物の種子からのメチル化およびシリル化脂肪酸のガスクロマトグラフムは、それぞれ図３Ａおよび３Ｂに示す。３つの小さいが明瞭な 14.3, 15.9 および 18.9 分におけるピークの存在を除けば両者の像は極めて類似していた。20.15 分の極めて小さいピークも明白であった。14.3および 18.9 のピークの溶出時間は比較のために調製されたリシノール酸およびレスケロール酸標準の溶出時間にそれぞれ正確に相当した。野生型および fah12トランスジェニック野生型系列の葉および根から抽出した脂質の間には有意な差は認められなかった（表１）。すなわち、fah12 遺伝子は植物全体で発現されているという事実にもかかわらず、脂肪酸組成に対する影響は種子の組織にのみ観察された。これと似た観察が以前に米国特許出願第08/320,982号におけるトランスジェニック fah12タバコで記載されている。
【００５２】
【表１】
2004321189.tif 000002
【００５３】
値は３つの独立のトランスジェニック系列からのサンプル、または野生型および fad2 系列の３つの独立のサンプルの分析から得られた平均値である。
【００５４】
トランスジェニック系列において認められた新しいピークがリシノール酸、レスケロール酸、デンシポール酸およびアウリコール酸の誘導体に相当することを確認するために、マススペクトルを使用した。脂肪酸誘導体は、以前の実験で用いた火焔イオン化検出器に代えて Hewlett-Packard 5971 シリーズ質量選択検出器を使用した以外は上述のようにしてガスクロマトグラフィーで分割した。図３Ｂにおける４つの新しいピーク（ピーク番号10, 11, 12および13）のスペクトルをそれぞれ図４Ａ〜Ｄに示す。標準について得られたスペクトルをトランスジェニック系列からの４つのピークについて得られたスペクトルと比較して、４つの新しいピークの同一性が確認された。ピーク10は、Ｍ/ Ｚ 187, 270 および 299における特徴的な３つのピークに基づいて疑いなくＯ- ＴＭＳ- メチルリシノーレエートと同定された。ピーク11は、Ｍ/ Ｚ 185, 270 および 299における特徴的な３つのピークに基づいて疑いなくＯ- ＴＭＳ- メチルデンシポーレエートと同定された。ピーク12は、Ｍ/ Ｚ 187, 298 および 327における特徴的な３つのピークに基づいて疑いなくＯ- ＴＭＳ- メチルレスケローレエートと同定された。ピーク13は、Ｍ/ Ｚ 185, 298 および 327における特徴的な３つのピークに基づいて疑いなくＯ- ＴＭＳ- メチルアウリコーレエートと同定された。これらの結果は、オレイン酸をヒドロキシル化してリシノール酸を産生し、また、イコセン酸をヒドロキシル化してレスケロール酸を産生するヒドロキシラーゼをコードする fah12ｃＤＮＡの同一性を明確に証明するものである。これらの結果はまた、そのヒドロキシラーゼが異種植物種で機能的に発現し、触媒として機能できることの付加的な証明を提供するものである。これらの結果はまた、このヒドロキシラーゼ遺伝子の発現は、通常は抽出可能な脂質中にヒドロキシル化脂肪酸を蓄積しない植物種中にリシノール酸、レスケロール酸、デンシポール酸およびアウリコール酸の蓄積を招来できることを証明するものである。
【００５５】
トランスジェニック植物内におけるレスケロール酸の存在についてはκヒドロキシラーゼの広い基質特異性を示唆する生化学的証明に基づいて以前の特許出願（第08/320,982号）に予測されていた。これに反し、デンシポール酸およびアウリコール酸の蓄積はそれほど予想できるものではなかった。アラビドプシスは正常時には、このヒドロキシラーゼの基質として働くことができる可能性のあるこれらの脂肪酸の非ヒドロキシル化前駆体の有意な量を含まないので、アラビドプシス中の既知の３種の n-3脂肪酸デサチュラーゼ（たとえば fad3, fad7, fad8, Gibsonら，1995の総説参照）の１または２以上がヒドロキシル化化合物を n-3位で不飽和化できると考えられる。すなわち、デンシポール酸はリシノール酸への n-3デサチュラーゼの作用によって産生される。アウリコール酸はレスケロール酸への n-3デサチュラーゼの作用によって産生される。それは小胞体中に局在するので、fad3が応答できることはほぼ確実である。これは将来、アラビドプシスの fad3 欠損突然変異体の fah12含有トランスジェニック植物によって試験できる（同様の試験は fad7 および fad8 でも可能である）。また、形式的には、通常 18:1 ｃｉｓΔ９を 20:1 ｃｉｓΔ１１に延長する酵素は、12ＯＨ-18:1 ｃｉｓΔ９を 14ＯＨ-20:1 ｃｉｓΔ１１および12ＯＨ-18:2 ｃｉｓΔ９，１５を14ＯＨ-20:2 ｃｉｓΔ１１，１７に延長することも可能である。
【００５６】
対照およびトランスジェニック植物の種子、葉および根の脂質中の各種脂肪酸の量は表１に示す。この例で産生されたヒドロキシル化脂肪酸の量は、植物からのリシノール酸および他のヒドロキシル化脂肪酸の経済的製造に望ましい量より低いが、本発明者らは、fah12 または関連ヒドロキシラーゼ遺伝子を発現する植物中におけるヒドロキシル化脂肪酸の蓄積レベルを増加させる本発明の多くの改良を意図している。ヒドロキシラーゼ遺伝子の発現のレベルおよび組織特異性の改良が意図されている。これを、強力な種子特異的プロモーターたとえばブラッシカ・ナプス（B.napus）ナピンプロモーターまたはトウゴマ fah12遺伝子もしくはレスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）からの相当するヒドロキシラーゼ遺伝子のネイティブなプロモーターの使用によって達成する方法は、本技術分野の熟練者には自明であろう。さらに他の改良には、ヒドロキシル化脂肪酸をホスファチジルコリンから切断する酵素の修飾、ヒドロキシル化脂肪酸を分解する酵素の活性の低下、ならびにヒドロキシル化脂肪酸をグリセロ脂質の sn-1, sn-2および sn-3 位置に導入するアシルトランスフェラーゼの置換を包含する改良が意図される。これらの酵素の遺伝子はまだ科学文献には記載されていないが、リシノーレエート合成の生化学的検討の結果に基づいて、ヒドロキシル化脂肪酸の産生レベルの改良におけるそれらの有用性は容易に想到できる。
【００５７】
アラビドプシスは経済的に重要な植物種ではないが、植物生物学者には高等植物のモデルとして広く受け入れられている。したがって、この例の包含は、ここに記載した本発明の、高等植物における油脂成分の修飾に対する一般的有用性を証明する意図によるものである。アラビドプシスにおけるこの新規な遺伝子の発現を試験する一つの利点は、この系における脂質代謝に関する大量の知識の存在ならびに植物種における脂肪酸ヒドロキシル化の生化学に関する有用な情報を獲得するために使用できる突然変異体の宝庫の利用可能性である。他の利点は、アラビドプシスにおいてリシノーレエートの代謝に関して得られた任意の情報が、工業的用途のためのリシノーレエート、レスケローレエートまたは他のヒドロキシル化脂肪酸の大量生産のために、密接に関連する種たとえば野菜植物ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）、ブラッシカ・ジュンセア（Brassica juncea）またはクランベ・アビスシニカ（Crambe abyssinica）に容易に移行できることである。κヒドロキシラーゼは、リシノーレエートまたはレスケローレエートをその前駆体、オレイン酸およびイコセン酸の有意なレベルを蓄積する任意の植物種で製造するために有用である。とくに興味があるのは、高レベルのオレイン酸を蓄積する遺伝的に修飾された変種である。このような変種は現在では、サンフラワーおよび菜種（Canola）に利用できる。レスケロール酸および他の関連ヒドロキシ脂肪酸の製造は高レベルのイコセン酸または他の長鎖モノエン酸を蓄積する種において達成できる。このような植物は将来、正常ではこのような前駆体を蓄積しない植物の遺伝子操作によって産生できると思われる。すなわち、本発明者らはκヒドロキシラーゼの使用が全般的に有用であることを想定している。
【００５８】
例２−レスクェレラ（Lesquerella）κヒドロキシラーゼのゲノムクローンの単離
概説
トウゴマκヒドロキシラーゼおよびアラビドプシス fad2 Δ12脂肪酸デサチュラーゼの両者に保存されたヌクレオチド配列の領域を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これらを、レスクェレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）からのゲノムＤＮＡとともに用いて数種の相同遺伝子のフラグメントを増幅した。これらの増幅されたフラグメントをついで、ハイブリダイゼーションプローブとして使用し、レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）のゲノムライブラリーから完全長ゲノムクローンを同定した。ヒドロキシル化脂肪酸はレスクェレラ種の種子組織に特異的であり、栄養組織には、検出可能な程度には見出されない。この方法で同定された２つの遺伝子の一方は、葉および発育中の種子の両者に発現し、したがってΔ12脂肪酸デサチュラーゼに相当すると考えられる。他方の遺伝子は発育中の種子では高レベルで発現したが、葉では全く発現されないか極めて低レベルでしか発現せず、この種からのκヒドロキシラーゼである。この遺伝子の同定は、この遺伝子をトランスジェニックアラビドプシス植物に導入し、それが種子脂質中にリシノール酸、レスケロール酸、デンシポール酸およびアウリコール酸の蓄積を生じることを示すことによって確立される。この遺伝子のプロモーターも、貯蔵脂質が蓄積する時点で発育中の種子に特異的に遺伝子の発現を指示できることから有用である。このプロモーターはしたがって、種子、とくにアブラナ科（Brassicacea）のメンバーの種子の遺伝子操作の多くの適用に極めて有用である。この方法に包含される様々な工程を以下に詳細に記述する。とくに指示がない限り、核酸、細菌およびファージの取扱いの定常的な方法は Sambrook ら（1989）に記載された通りとした。
【００５９】
レスクェレラκヒドロキシラーゼ遺伝子のフラグメントの単離
レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）のκヒドロキシラーゼの増幅のためには、トウゴマのκヒドロキシラーゼおよびアラビドプシスΔ12デサチュラーゼ（fas2）間の推定アミノ酸配列のホモロジーが高い領域を選択して設計した。大部分のアミノ酸は数種の異なるコドンでコードされるので、これらのオリゴヌクレオチドは、相当するアミノ酸をコードできるすべての可能なコドンをコードするように設計された。これらの混合オリゴヌクレオチドの配列は、
オリゴ１＝ＴＡＹＷＳＮＣＡＹＭＧＮＭＧＮＣＡＹＣＡ（配列番号：14）
オリゴ２＝ＲＴＧＲＴＧＮＧＣＮＡＣＲＴＧＮＧＴＲＴＣ（配列番号：15）
（式中、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ；Ｗ＝Ａ＋Ｔ；Ｓ＝Ｇ＋Ｃ；Ｎ＝Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ；Ｍ＝Ａ＋Ｃ；Ｒ＝Ａ＋Ｇ）であった。
これらのオリゴヌクレオチドは、レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）ゲノムＤＮＡからＤＮＡのフラグメントを、以下の条件を用いてポリメラーゼチェーン反応で増幅するために使用した。約 100 ng のゲノムＤＮＡを、各プライマー 25 pmol，1.5 ＵのＴａｑポリメラーゼ（Boehringer Manheim），200 μＭのｄＮＴＰｓ，50ｍＭのＫＣｌ，10ｍＭトリス塩酸塩（ｐＨ 9），0.1 ％（v/v）トリトンＸ-100，1.5 ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３％（v/v）ホルムアミドを含有する溶液に添加し、最終容量を50μl とした。増幅条件は、94℃４分の変性工程に続いて、92℃１分、55℃１分、72℃２分を30サイクルとした。最終の伸長工程は72℃５分としてプログラムを終了させた。
【００６０】
ＰＣＲ反応の生成物をアガロースゲル中で電気泳動により分離すると、約 540 bpのＰＣＲ生成物が観察された。これらのフラグメントの２つを pBluescript（Stratagene）にクローン化するとプラスミドｐＬｅｓｑ２とｐＬｅｓｑ３が得られた。これらの２つのプラスミド中の挿入体の配列をチェーンターミネーター法で決定した。ｐＬｅｓｑ２における挿入体の配列を図５に（配列番号：１）、ｐＬｅｓｑ３の挿入体の配列を図６に（配列番号：２）に示す。２つのクローンの間の高度の配列同一性は、両者ともに可能な候補であり、Δ12脂肪酸デサチュラーゼまたはγヒドロキシラーゼであることを指示している。
【００６１】
ノーザン分析
レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）においては、ヒドロキシル化脂肪酸は種子油脂中に大量に認められるが、葉には検出可能な量はみられない。したがって、脂肪族アシルデサチュラーゼとκヒドロキシラーゼを識別する重要な規準は、κヒドロキシラーゼ遺伝子は、ヒドロキシル化脂肪酸が高レベルに存在する組織において他の組織よりも、高度に発現することが期待されるのに対して、ジ不飽和脂肪酸は大部分またはすべての植物ですべての組織の脂質中に見出されることから、すべての植物組織はω６脂肪族アシルデサチュラーゼのｍＲＮＡを含有すると思われることである。したがって、ｐＬｅｓｑ２に相当する遺伝子が種子中のみで発現されるかまたは他の組織でも発現されるかを決定することは極めて興味がある。この問題には発育中の種子および葉から精製したＲＮＡに対するｐＬｅｓｑ２のハイブリダイゼーションを試験することによって対処した。
レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）の発育中の種子および若葉から、Rneasy RNA抽出キット（Qiagen）を製造業者の説明書に従って用いて総ＲＮＡを精製した。ＲＮＡ濃度はλ＝260 および 280 nm においてＵＶ分光光度法により定量した。ノーザンブロッティングに使用されるゲルへの均等な負荷を保証するために、ＲＮＡ濃度は、エチジウムブロミドで染色し、試験変性ゲル上を流したＲＮＡサンプルのＵＶ光下の蛍光を記録したのちに、さらに調整した。
【００６２】
葉および発育中の種子から上述のようにして調製した総ＲＮＡは、ホルムアミド含有アガロースゲルを通し電気泳動に付した（Ibe ら，1993）。等量（10μg）のＲＮＡを２つのレーンに負荷し、ＲＮＡ標準（0.16〜1.77 kb ラダー, Gibco-BRL）は第３のレーンに負荷した。電気泳動後に、ＲＮＡをゲルからナイロン膜（Hybond H+, Amersham）に移し、ＵＶ光に暴露することによりフィルターに固定した。３２Ｐ- 標識プローブをクローンｐＬｅｓｑ２の挿入ＤＮＡからランダムプライミングにより調製し、２時間プレハイブリダイズしたのち、52℃で一夜、膜にハイブリダイズした。プレハイブリダイゼーション溶液には、５×ＳＳＣ，10×デンハルト溶液、0.1 ％ＳＤＳ，0.1 ＭＫＰＯ４ｐＨ 6.8，100 μg サケ精子ＤＮＡを含有させた。ハイブリダイゼーション溶液は、同一の基本組成を有するが、ＳＤＳを含まず、10％デキストラン硫酸ならびに30％ホルムアミドを添加した。ブロットは65℃において２×ＳＳＣ，0.5 ％ＳＤＳで１回、ついで同温度にて１×ＳＳＣで洗浄した。
【００６３】
ブロットをＸ- 線フィルムに短時間（30分）露出すると、種子ＲＮＡレーンの単一バンドのみにプローブｐＬｅｓｑ２がハイブリダイズした（図７）。ブロットをｐＬｅｓｑ３遺伝子からの挿入体で再プローブしたところ、種子と葉レーンに類似の強度のバンドを与えた（図７）。
これらの結果は、クローンｐＬｅｓｑ２に相当する遺伝子はレスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）の種子中に高度にかつ特異的に発現したことを示す。ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の知識と考え合わせ、ｐＬｅｓｑ２中の挿入体に相当する遺伝子の強度に種子特異的な発現は種子油脂中のヒドロキシル化脂肪酸の合成におけるこの酵素の役割の確信できるインディケーターである。
【００６４】
γヒドロキシラーゼのゲノムクローンの特性
レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）の若い葉から Murray & Thompson（1980）の記載に従ってゲノムＤＮＡを調製した。ベクターλＤａｓｈＩＩ（Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla CA 92037）中に構築されたＳａｕ３ＡＩ- 部分消化ゲノムライブラリーは、500 μg のＤＮＡの部分消化、スクロース勾配上ＤＮＡのサイズ選択（Sambrookら，1989）ならびにλＤａｓｈＩＩのＢａｍＨＩ- 消化アームへのそのＤＮＡ（平均サイズ 12 kb）のライゲーションによって調製された。全ライゲーションを製造業者の説明書に従ってパッケージし、大腸菌株 XL1-Blue MRA-P2（Stratagene）上でプレーティングした。これにより、５×10５の一次組換えクローンが得られた。ライブラリーをついで製造業者の説明書に従って増幅した。ゲノムライブラリーの分画を大腸菌 XL1-Blue 上にプレーティングし、生じたプラーク（150,000）を製造業者の説明書に従って荷電ナイロン膜（Hybond H+, Amersham）上に載せた。ＤＮＡを Stratalinker（Stratagene）中ＵＶ下にフィルターに架橋した。
【００６５】
レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）のヒドロキシラーゼに相当するゲノム配列を有する数個のクローンは、内部プライマーでＰＣＲ- 増幅しランダムプライミングにより３２Ｐで標識したｐＬｅｓｑ２からの挿入体で膜をプロービングすることにより単離された。フィルターを65℃で２時間、7 ％ＳＤＳ，１ｍＭＥＤＴＡ，0.25Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ7.2），１％ＢＳＡ中でプレハイブリダイズし、同じ溶液中で16時間プローブにハイブリダイズさせた。フィルターを順次２×ＳＳＣ，１×ＳＳＣ，0.5 ×ＳＳＣを 0.1％ＳＤＳに加えて含有する溶液で洗浄した。γヒドロキシラーゼの完全コード配列と約 1 kb の５' 上流領域を含む 2.6 kb のＸｂａＩフラグメントを pBluescript KS の相当する部位にサブクローニングしてプラスミドｐＬｅｓｑ- Ｈｙｄを産生させ、自動シークェンサーを用いジデオキシチェーンターミネーション法によって配列を完全に決定した。配列データはプログラムＤＮＡＳＩＳ（Hitachi Compan）を用いて解析した。
【００６６】
クローンｐＬｅｓｑ- Ｈｙｄ中の挿入体の配列は図８ＡおよびＢに示す。配列は 1855 bpの連続的ＤＮＡ配列（配列番号：３）を有する。クローンは 401 bp の５' 非翻訳領域（すなわち最初のＡＴＧコドンに先立つヌクレオチド）、1152 bp のオープンリーディングフレーム、および 302 bp の３' 非翻訳領域をコードする。オープンリーディングフレームは推定分子量 44,370 の 384個のアミノ酸の蛋白質をコードする（配列番号：４）。アミノ末端は典型的なシグナルペプチドの特徴を欠いている（von Heijne, 1985）。
正確な翻訳開始メチオニンは実験的には決定されていないが、トウゴマκヒドロキシラーゼに対する推定アミノ酸配列のホモロジーに基づいて（下記参照）、ヌクレオチド 402における最初のＡＴＧコドンによってコードされるメチオニンであると考えられる。
【００６７】
ｐＬｅｓｑ- Ｈｙｄの推定アミノ酸配列を膜結合デサチュラーゼおよびトウゴマヒドロキシラーゼの配列（図９ＡおよびＢ）と比較するとｐＬｅｓｑ- Ｈｙｄは後者の遺伝子と同種であることがわかる。この図９は、レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）ヒドロキシラーゼ（配列番号：４）の、トウゴマヒドロキシラーゼ（van de Looら，1995）、小胞体局在Δ12デサチュラーゼ（fad2と呼ばれる）をコードするアラビドプシス（Arabidopsis）fad2ｃＤＮＡ（Okuleyら，1994）、２つの大豆からの fad2 デサチュラーゼのクローン、ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）からの fad2 クローン、ゼア・メイス（Zea mays）からの fad2クローン、およびトウゴマ（R.communis）fad2クローンの部分配列とのアラインメントを示す。高度の配列の相同性は遺伝子産物が同様の機能をもつことを指示するものである。たとえば、レスクェレラ（Lesquerella）ヒドロキシラーゼとアラビドプシス（Arabidopsis）fad2デサチュラーゼの間の全体的ホモロジーは、92.2％の類似性、84.8％の同一性を示し、２つの配列の長さの差はわずか１アミノ酸であった。
【００６８】
サザンハイブリダイゼーション
サザン分析はクローンｐＬｅｓｑ- Ｈｙｄに相当するレスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）ゲノム中の遺伝子のコピー数を調べるために用いた。ゲノムＤＮＡ（５μg）をＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、0.9 ％アガロースゲル上で分離した。ＤＮＡは、荷電ナイロン膜（Hybond H+, Amersham）に製造業者のプロトコールに従ってアルカリブロットした。ブロットは、65℃で２時間、7 ％ＳＤＳ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，0.25Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ7.2），１％ＢＳＡ中でプレハイブリダイズし、内部プライマーでＰＣＲ- 増幅しランダムプライミングにより３２Ｐで標識したｐＬｅｓｑ- Ｈｙｄの挿入体を、同一の溶液中で16時間、プローブにハイブリダイズさせた。フィルターを順次２×ＳＳＣ，１×ＳＳＣ，0.5 ×ＳＳＣを 0.1％ＳＤＳに加えて含有する溶液で洗浄し、ついでＸ線フィルムに暴露した。
レスクェレラ・フェンドレリＤＮＡの各消化物中の単一バンドとハイブリダイズしたプローブは（図10）、ｐＬｅｓｑ- Ｈｙｄが転写された遺伝子はレスクェレラ・フェンドレリのゲノムに単一コピーで存在することを示している。
【００６９】
トランスジェニック植物におけるｐＬｅｓｑ- Ｈｙｄの発現
トランスジェニック植物中のクローン化遺伝子の組織特異的発現を引き起こすために使用できる植物プロモーター配列には広範囲の配列がある。たとえば、ナピンプロモーターおよびアシルキャリヤー蛋白質プロモーターは、デサチュラーゼのアンチセンス型の発現による種子油脂の組成の修飾に以前に使用されている（Knutson ら，1992）。同様に、大豆βコングリシニンのβサブユニットのプロモーターが高い活性を示し、大豆以外の種のトランスジェニック植物で組織特異的な発現を生じた（Brayら，1987）。すなわち、本明細書に記載の実施例にはレスクェレラ・フェンドレリκヒドロキシラーゼプロモーターの使用を示したが、修飾された種子油脂組成を生じさせるためには、種子特異的発現を導く他のプロモーターを使用することができる。ここに記載された発明のこのような修飾は本技術分野の熟練者には自明の通りである。
【００７０】
レスクェレラ・フェンドレリκヒドロキシラーゼの植物細胞内での発現のための構築体は以下のようにして調製する。ｐＬｅｓｑ- Ｈｙｄ遺伝子を含む 13 kbのＳａｌＩフラグメントを、バイナリーＴｉプラスミドベクターｐＳＬＪ44024（Jones ら，1992）（図11）のＸｈｏＩ部位にライゲートしてプラスミドｐＴｉ - Ｈｙｄを生成させ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ3101株にエレクトロポレーションによりトランスフォームした。ＧＶ3101株（Koncz & Schell, 1986）は病原部を除いたＴi プラスミドを含有する。エレクトロポレーション用の細胞は以下のように調製した。ＧＶ3101をＮａＣｌを減量した（5 g/l）ＬＢ培地中で増殖させた。250 mlの培養液をＯＤ６００＝0.6 まで増殖させたのち、ついで 4000 rpm（Sorvall GS-Aローター）で15分間遠心分離した。ルーズなペレットから直ちに上清を吸引し、ペレットを 500 ml の氷冷水中に静かに再懸濁した。細胞を前回と同様に遠心分離し、30 ml の氷冷水中に再懸濁し、30 ml の試験管に移して 5000 rpm（Sorvall GS-Aローター）で５分間遠心分離した。これを３回繰り返して、細胞を続けて 30 mlの氷冷水、30 ml の氷冷10％グリセロール、最後に0.75 ml の氷冷10％グリセロールに懸濁した。これらの細胞をアリコートに分け、液体窒素で凍結し、−80℃で保存した。エレクトロポレーションは、Biorad遺伝子パルサー装置により、40μl の細胞および 1μl のＤＮＡを水中に含む冷却した 2 mm-ギャップのキューベットを使用し、電圧 2.5 KV および抵抗 200オームで実施した。エレクトロポレーションを行った細胞は 1 ml のＳＯＣ培地（Sambrookら，1989, A2頁）で希釈して、28℃で２〜４時間インキュベートしたのち、カナマイシン含有（50 mg/l）培地にプレーティングした。
アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）は上記例１に記載のように、ｐＴｉ- Ｈｙｄ含有アグロバクテリウム細胞でトランスフォームできる。同様に、トランスジェニックアラビドプシス植物中におけるヒドロキシル化脂肪酸の存在は上記例１に記載の方法で証明することができる。
【００７１】
トランスジェニック植物中でのレスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）ヒドロキシラーゼの構成的発現
ヒドロキシラーゼの全コード領域からなるｐＬｅｓｑ- Ｈｙｄから 1.5 kb のＥｃｏＲＩフラグメントをゲル精製し、ついで pBluescript KS（Stratagene）の相当する部位にクローン化した。ついで、多数の組換えクローンからのプラスミドＤＮＡをＰｓｔＩで制限し、挿入体中で１回のみ、ベクターポリリンカー中で１回切断する。ＰｓｔＩによる 920 bp フラグメントの放出は、挿入体の右オリエンテーションをさらに操作すべきことを指示した。このようなクローンからのＤＮＡをさらにＳａｌＩで制限し、５' オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで充填し、ついでＳａｃＩで切断した。挿入体フラグメントをゲル精製し、カリフラワーモザイクウイルス35Ｓプロモーターの後部、ｐＢＩ121（Clontech）のＳｍａＩおよびＳａｃＩ部位の間にクローン化した。挿入体とベクターＤＮＡの間の接合部の配列が適当なことをチェックしたのち、組換えクローンからのプラスミドＤＮＡを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＧＶ3101）のトランスフォーメーションに使用した。ついでカナマイシン抵抗性コロニーを前述のように、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のインプランタトランスフォーメーションに使用した。
【００７２】
ＤＮＡはカナマイシン抵抗性苗条から抽出し、入れ子プライマーを用いて、ヒドロキシラーゼから選択されたフラグメントのＰＣＲ- 増幅に用いた。期待されたサイズのフラグメントが増幅されたならば、相当する植物を温室またはアガールプレート上で生育させ、十分に生育した葉、根および乾燥種子から脂肪酸を抽出した。ついでＧＣ- ＭＳを前述のように行い、様々な脂肪酸種の特性解析およびトランスジェニック植物中のヒドロキシ脂肪酸の蓄積の検出を行った。
【００７３】
例３−他の植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼの取得
前の特許出願に、本発明者らは、トウゴマ fah12配列が、ＰＣＲおよび異種ハイブリダイゼーションのような方法により他のκヒドロキシラーゼの同定に使用可能であった方法を記述した。しかしながら、Δ12デサチュラーゼとκヒドロキシラーゼの間の高度な配列類似性のために、トランスジェニック植物または他の適当な宿主（たとえば、トランスジェニック微生物または動物細胞）における活性の証明のような機能試験がなくては、従来技術ではこの２種類の酵素を識別する方法は教示されていない。レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）ヒドロキシラーゼの同定によって、ヒドロキシラーゼとデサチュラーゼを、推定アミノ酸配列の情報のみに基づいて識別する規準が提供された。
【００７４】
図９ＡおよびＢはトウゴマおよびレスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）ヒドロキシラーゼ配列の、トウゴマヒドロキシラーゼ配列およびすべてのミクロソームΔ12デサチュラーゼについての公開されているすべての配列との配列アラインメントを示す。トウゴマヒドロキシラーゼ配列の 384アミノ酸残基中、95％以上は少なくとも１種のデサチュラーゼにおける相当する残基と同一である。したがって、これらの残基はどれも、ヒドロキシラーゼとデサチュラーゼの間の触媒的な差には関係がない。残りのトウゴマのヒドロキシラーゼにおける16個の残基およびレスクェレラ・フェンドレリのヒドロキシラーゼにおける14個の残基中６個を除くすべては、ヒドロキシラーゼ配列が１または２以上のデサチュラーゼ配列と比較して保存的置換基をもつ例であるか、各種デサチュラーゼがアミノ酸に広範な変動性を有する位置である。
【００７５】
保存的置換では、以下のアミノ酸、Ser/Thr, Ile/Leu, Val/Met, Asp/Gluは機能的に均等であることを意味する。すなわち、これらの構造的置換もデサチュラーゼとヒドロキシラーゼの間の触媒的な差を説明することはできない。この残ったわずか６個のアミノ酸は、トウゴマのヒドロキシラーゼおよびレスクェレラのヒドロキシラーゼ両者とも既知のデサチュラーゼのすべてと異なり、しかも、すべての既知のミクロソームΔ12デサチュラーゼはここに同一のアミノ酸残基をもっている。これらの残基は図９のアラインメントの位置 69, 111, 155, 226, 304 および 331に存在する。したがってこれらの６つの部位がデサチュラーゼからヒドロキシラーゼを識別する。この分析に基づき、図９に掲げた酵素の１つと60％以上の配列同一性を有する酵素は、これらの６つの位置でデサチュラーゼの配列と異なれば、ヒドロキシラーゼとして分類できることを見出したのである。特定の蛋白質では残基の数にわずかながら差があるため、蛋白質間で番号のつけ方に変動があるが、問題の蛋白質を本明細書に示した位置番号系を用いてトウゴマヒドロキシラーゼとアラインすれば、この位置番号系の目的は明白であろう。すなわち、同種遺伝子を単離するためのレスクェレラヒドロキシラーゼ遺伝子の使用方法を組み合わせれば、ここに開示された構造的規準は脂肪酸組成を修飾することを目的に植物κヒドロキシラーゼを単離、同定する方法を教示するものである。
【００７６】
６つのどの置換が本発明のヒドロキシラーゼおよびデサチュラーゼの触媒活性の差をもっぱらまたは一義的に決定しているかを考察すると、位置 226における Tyrに代えて Pheの置換が、酵素触媒におけるチロシン残基の既知の関係から触媒活性におけるこの差のもっぱらの原因であるように思われる。他の置換たとえば位置 331における Serに代えて Alaの置換は反応の全体的速度を修飾する効果をもつ可能性がある。本発明においては、この基盤に基づくΔ12デサチュラーゼの部位特異的突然変異誘発による新規なκヒドロキシラーゼの創成が意図される。また、部位特異的突然変異誘発の同様な使用によるΔ15デサチュラーゼおよびΔ9 デサチュラーゼのヒドロキシラーゼへの変換も意図される。
【００７７】
結語
上記実施例により、トウゴマからのκヒドロキシラーゼ遺伝子のトランスジェニック植物における発現による新規なヒドロキシル化脂肪酸の製造に重要な因子の実験的裏付けを記述した。さらにレスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）κヒドロキシラーゼの完全ｃＤＮＡ配列も提供する。トウゴマのヒドロキシラーゼの完全配列も宿主細胞における使用のための各種構築体とともに示した。本発明によれば、様々な原料から様々な適用のために、植物脂肪族アシルヒドロキシラーゼをコードするアミノ酸および核酸配列を得ることができる。
以上、本発明を、理解を容易にする目的で例示および実例によって一部詳細に説明したが、本発明の範囲内において、ある種の改変および修飾が可能なことは自明の通りである。
【００７８】
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2004321189.tif 000005
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【００７９】
配列表
配列番号：１
配列の長さ：５４３
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列：
2004321189.tif 000007
【００８０】
配列番号：２
配列の長さ：５４４
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列：
2004321189.tif 000008
【００８１】
配列番号：３
配列の長さ：１７４０
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノム
配列：
2004321189.tif 000009
【００８２】
配列番号：４
配列の長さ：３８４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列：
2004321189.tif 000010
【００８３】
配列番号：５
配列の長さ：３８７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列：
2004321189.tif 000011
【００８４】
配列番号：６
配列の長さ：３８３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列：
2004321189.tif 000012
【００８５】
配列番号：７
配列の長さ：３８４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列：
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【００８６】
配列番号：８
配列の長さ：３０９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列：
2004321189.tif 000014
【００８７】
配列番号：９
配列の長さ：３０２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列：
2004321189.tif 000015
【００８８】
配列番号：１０
配列の長さ：３７２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列：
2004321189.tif 000016
【００８９】
配列番号：１１
配列の長さ：２２４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列：
2004321189.tif 000017
【００９０】
配列番号：１２
配列の長さ：２０
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：
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【００９１】
配列番号：１３
配列の長さ：２０
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：
2004321189.tif 000019
【００９２】
配列番号：１４
配列の長さ：２０
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：
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【００９３】
配列番号：１５
配列の長さ：２１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
配列：
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、ヒドロキシ脂肪酸標準のマススペクトルを示す。図１Ａ，Ｏ- ＴＭＳ- リシノレール酸メチルエステル。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｄは、ヒドロキシ脂肪酸標準のマススペクトルを示す。図１Ｂ，Ｏ- ＴＭＳ- デンシポール酸メチルエステル。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｄは、ヒドロキシ脂肪酸標準のマススペクトルを示す。図１Ｃ，Ｏ- ＴＭＳ- レスケロール酸メチルエステル。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、ヒドロキシ脂肪酸標準のマススペクトルを示す。図１Ｄ，Ｏ- ＴＭＳ- アウリコール酸メチルエステル。
【図２】図２は、ヒドロキシ脂肪酸のトリメチルシリル化メチルエステルのフラグメンテーションパターンを示す。
【図３】図３のＡは、野生型アラビドプシス（Arabidopsis）植物の種子から抽出された脂肪酸のガスクロマトグラムを示す。図３のＢは、fah12 ヒドロキシラーゼ遺伝子を含有するトランスジェニックアラビドプシス（Arabidopsis）植物の種子から抽出された脂肪酸のガスクロマトグラムを示す。    数字は、以下の脂肪酸を示す：[1] 16:0；[2] 18:0；[3] 18:1ｃｉｓΔ９；[4] 18:2ｃｉｓΔ９，１２；[5] 20:0；[6] 20:1ｃｉｓΔ１１；[7] 18:3 ｃｉｓΔ９，１２，１５；[8] 22:1ｃｉｓΔ１３；[9] 24:1ｃｉｓΔ１３；[10]リシノール酸；[11]デンシポール酸；[12]レスケロール酸；[13]アウリコール酸
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｄは、トランスジェニック植物の種子に見出された新規な脂肪酸のマススペクトルを示す。図４Ａは図３Ｂからのピーク10のマススペクトルを示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｄは、トランスジェニック植物の種子に見出された新規な脂肪酸のマススペクトルを示す。図４Ｂは図３Ｂからのピーク11のマススペクトルを示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｄは、トランスジェニック植物の種子に見出された新規な脂肪酸のマススペクトルを示す。図４Ｃは図３Ｂからのピーク12のマススペクトルを示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｄは、トランスジェニック植物の種子に見出された新規な脂肪酸のマススペクトルを示す。図４Ｄは図３Ｂからのピーク13のマススペクトルを示す。
【図５】図５は、ｐＬｅｓｑ２のヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。
【図６】図６は、ｐＬｅｓｑ３のヌクレオチド配列（配列番号：２）を示す。
【図７】図７は、プローブとしてｐＬｅｓｑ２またはｐＬｅｓｑ３を用いた、レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）の種子からの総ＲＮＡのノーザンブロットを示す。ＳはＲＮＡが種子からのものであること、ＬはＲＮＡが葉からのものであることを示す。
【図８Ａ】図８ＡおよびＢは、ｐＬｅｓｑ- ＨＹＤをコードするゲノムクローンのヌクレオチド配列（配列番号：３）およびその遺伝子によってコードされるヒドロキシラーゼの推定アミノ酸配列を示す。
【図８Ｂ】図８ＡおよびＢは、ｐＬｅｓｑ- ＨＹＤをコードするゲノムクローンのヌクレオチド配列（配列番号：３）およびその遺伝子によってコードされるヒドロキシラーゼの推定アミノ酸配列を示す。
【図９Ａ】図９ＡおよびＢはκヒドロキシラーゼおよびミクロソームΔ12デサチュラーゼの推定アミノ酸配列の多重配列アラインメントを示す。
【図９Ｂ】図９ＡおよびＢはκヒドロキシラーゼおよびミクロソームΔ12デサチュラーゼの推定アミノ酸配列の多重配列アラインメントを示す。略号は次の通りである。    Rcfah12：トウゴマ（R.communis）からの fah12ヒドロキシラーゼ遺伝子（van de Looら，1995）    Lffah12：レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）からのκヒドロキシラーゼ遺伝子    Atfad2：アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）からの fad2デサチュラーゼ（Okuleyら，1994）    Gmfad2-1：グリシン・マックス（Glycine max）からの fad2 デサチュラーゼ（遺伝子バンク受入番号 L43920）    Zmfad2：ゼア・メイス（Zea mays）からの fad2 デサチュラーゼ（ＷＯ 94/11516）    Rcfad2：トウゴマ（R.communis）からの fad2 デサチュラーゼのフラグメント（ＷＯ 94/11516）    Bnfad2：ブラッシカ・ナプス（Brassica napus）からの fad2 デサチュラーゼ（ＷＯ 94/11516）    ＬＦＦＡＨ12.ＡＭＩ：配列番号：４    ＦＡＨ12.ＡＭＩ：配列番号：５    ＡＴＦＡＤ2.ＡＭＩ：配列番号：６    ＢＮＦＡＤ2.ＡＭＩ：配列番号：７    ＧＭＦＡＤ2-1.ＡＭＩ：配列番号：８    ＧＭＦＡＤ2-2.ＡＭＩ：配列番号：９    ＺＭＦＡＤ2.ＡＭＩ：配列番号：10    ＲＣＦＡＤ2.ＡＭＩ：配列番号：11
【図１０】図１０は、プローブとしてｐＬｅｓｑ- ＨＹＤを用いた、レスクェレラ・フェンドレリ（L.fendleri）からのゲノムＤＮＡのサザンブロットを示す。    Ｅ＝ＥｃｏＲＩ    Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ    Ｘ＝ＸｂａＩ
【図１１】図１１は、バイナリーＴｉプラスミドｐＳＬＪ44024 の地図を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2004321189.tif 000025
【図２】
2004321189.tif 000026
【図３】
2004321189.tif 000027
【図４Ａ】
2004321189.tif 000028
【図４Ｂ】
2004321189.tif 000029
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2004321189.tif 000031
【図５】
2004321189.tif 000032
【図６】
2004321189.tif 000033
【図８Ａ】
2004321189.tif 000034
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図７】
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