(57)【要約】【課題】細胞または細胞内領域といった導入対象に遺伝子を導入するときに、遺伝子とともに導入対象に入る溶液を低減でき、遺伝子導入量の精度を向上可能にする【解決手段】導入用ピペット３４は、導入されるべき遺伝子溶液を保持する。導入ピペット３４には第一の電極であるマイナス電極３６が配置される。第二の電極として、プラス電極４０が設けられる。マイクロマニュピュレータ３０を用いて、導入用ピペット３４が、導入対象に近接する位置まで移動される。そして、電圧印加手段であるエレクトロポレータ４４により、導入用ピペット３４から導入対象へ遺伝子溶液中の遺伝子が移動する電圧が、プラス電極３６とマイナス電極４０の間に印加される。【選択図】  図１
2004321136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子を細胞または細胞内領域といった導入対象に導入可能な遺伝子導入装置であって、
遺伝子溶液が保持される導入用ピペットと、
前記導入用ピペットに設けられる第一の電極と、
前記導入用ピペットと別に設けられる第二の電極と、
前記遺伝子溶液を保持した前記導入用ピペットを前記導入対象に近接する位置へ移動させるためのピペット移動手段と、
前記導入対象に近接する位置へ移動された前記導入用ピペットから前記導入対象へ前記遺伝子溶液中の遺伝子が移動する電圧を前記第一の電極と前記第二の電極の間に印加する電圧印加手段と、
を備えることを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子導入装置において、
前記導入用ピペットは、マイクロインジェクションに利用される形状のピペットであることを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子導入装置において、
一端がマイクロインジェクション用ピペットに接続され、他端が前記マイクロインジェクション用ピペットのホルダに接続されて、前記マイクロインジェクション用ピペットと前記ホルダを連結する連結部材を有し、
前記第一の電極は、前記連結部材から前記マイクロインジェクション用ピペット内へ延びるように前記連結部材に設けられていることを特徴とする遺伝子導入装置。
【請求項４】
遺伝子を細胞または細胞内領域といった導入対象に導入する遺伝子導入方法であって、
導入されるべき遺伝子溶液を導入用ピペット内に保持させるステップと、
前記遺伝子溶液を保持した前記導入用ピペットを前記導入対象に近接する位置へ移動させるステップと、
前記導入用ピペットに設けられる第一の電極および前記導入用ピペットと別に設けられる第二の電極に、前記導入用ピペットから前記導入対象へ前記遺伝子溶液中の遺伝子が移動する電圧を印加するステップと、
を含むことを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項５】
薬剤を細胞または細胞内領域といった導入対象に導入可能な薬剤導入装置であって、
薬剤溶液が保持される導入用ピペットと、
前記導入用ピペットに設けられる第一の電極と、
前記導入用ピペットと別に設けられる第二の電極と、
前記薬剤溶液を保持した前記導入用ピペットを前記導入対象に近接する位置へ移動させるためのピペット移動手段と、
前記導入対象に近接する位置へ移動された前記導入用ピペットから前記導入対象へ前記薬剤溶液中の薬剤が移動する電圧を前記第一の電極と前記第二の電極の間に印加する電圧印加手段と、
を備えることを特徴とする薬剤導入装置。
【請求項６】
請求項５に記載の薬剤導入装置において、
前記導入用ピペットは、マイクロインジェクションに利用される形状のピペットであることを特徴とする薬剤導入装置。
【請求項７】
請求項６に記載の薬剤導入装置において、
一端がマイクロインジェクション用ピペットに接続され、他端が前記マイクロインジェクション用ピペットのホルダに接続されて、前記マイクロインジェクション用ピペットと前記ホルダを連結する連結部材を有し、
前記第一の電極は、前記連結部材から前記マイクロインジェクション用ピペット内へ延びるように前記連結部材に設けられていることを特徴とする薬剤導入装置。
【請求項８】
薬剤を細胞または細胞内領域といった導入対象に導入する薬剤導入方法であって、
導入されるべき薬剤溶液を導入用ピペット内に保持させるステップと、
前記薬剤溶液を保持した前記導入用ピペットを前記導入対象に近接する位置へ移動させるステップと、
前記導入用ピペットに設けられる第一の電極および前記導入用ピペットと別に設けられる第二の電極に、前記導入用ピペットから前記導入対象へ前記薬剤溶液中の薬剤が移動する電圧を印加するステップと、
を含むことを特徴とする薬剤導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子を細胞または細胞内領域に導入する遺伝子導入装置に関する。細胞内領域は、典型的には核またはオルガネラである。また、本発明は、薬剤を細胞または細胞内領域に導入する遺伝子導入装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バイオテクノロジーの分野では、細胞内に外部から遺伝子を導入することが有用とされている。従来、遺伝子の導入には、マイクロインジェクションが用いられる。そして、ポンプを用いた圧力注入により、遺伝子溶液が細胞内へ導入される。
【０００３】
マイクロインジェクションによる遺伝子導入については、例えば、特開２００２−１２２号公報（特許文献１）および特開２００２−２５３２４３号公報（特許文献２）に開示されている。
【０００４】
また、物質を移動させる技術としては、エレクトロポレータが知られている。エレクトロポレータは、移動すべき物質と移動先に電位差を与えることにより物質を移動させる。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−１２２号公報（要約書）
【特許文献２】
特開２００２−２５３２４３号公報（要約書）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来、マイクロインジェクションを使う遺伝子導入は、上述したように、ポンプを用いた圧力注入である。圧力注入で遺伝子溶液を細胞内に送り込むので、遺伝子とともに溶液も細胞内に入る。この溶液は、導入遺伝子の発現の阻害要因になる可能性があり、また、細胞の成育に悪影響を及ぼす可能性がある。また溶液が遺伝子と一緒に入ると、遺伝子の導入量を正確に制御するのが容易でない。
【０００７】
さらに、バイオテクノロジー分野の先端技術では、核およびオルガネラのような細胞内領域に遺伝子を導入することも考えられている。このような用途では、特に、遺伝子とともに溶液を入れてしまうことが好ましくなく、また、そのために圧力をかけることも好ましくない。
【０００８】
一方、エレクトロポレータは、電気パルスによって細胞膜を穿孔する装置であり、通常電極キュベットあるいは電極を備えたシャーレに大量の動物、植物または微生物の細胞を入れ、高電圧を印加することにより周囲の液中に存在する遺伝子およびその他の物質を導入する装置である。エレクトロポレータの導入の効率は通電条件や、細胞の種類によってかなり異なるが、概してそれほど高くはなく、一過的発現で数１０％の効率である。
【０００９】
上記のような従来のエレクトロポレータは、遺伝子を特定の細胞に導入することが困難である。そのため、雑多な細胞集団における特定の細胞を狙って導入することが困難である。また、多量の細胞が必要とされ、少量の細胞数では遺伝子導入が困難である。
【００１０】
また、エレクトロポレータの一つとして、イオントフォレーサ（Ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｅｒ）がある。イオントフォレーサは、イオン化した物質をガラス電極内に保持し、電流を流すことで局所的にイオンを投与する技術であり、細胞運動や神経の信号伝達の研究への利用例がある。しかし、これまでに行われている実験は、個体の特定部位へ物質を導入するレベルに留まっており、細胞内の特定の領域への注入は不可能であった。そして、イオントフォレーサを遺伝子導入に用いることはこれまで提案されていない。
【００１１】
以上に説明したように、従来のマイクロインジェクションは、圧力注入により遺伝子だけでなく溶液が細胞内に入ってしまうという難点があり、特に、核およびオルガネラといった細胞内領域への遺伝子導入は困難である。また、エレクトロポレータも、遺伝子の導入効率が低く、そして、遺伝子を特定の細胞に導入することが困難であり、そのようなニーズには応えられなかった。まして、エレクトロポレータが核およびオルガネラのような細胞内領域への遺伝子導入に使われることはなかった。
【００１２】
また、上記の説明では遺伝子の導入を取り上げたが、薬剤の導入にも同様の事項が当てはまり得る。薬剤とは、例えば上述の遺伝子であり、また例えばタンパク質である。
【００１３】
本発明は上記背景の下でなされたものであり、その目的は、特定の細胞または細胞内領域といった特定の導入対象に遺伝子を導入可能な技術であって、遺伝子とともに導入対象に入る溶液を低減でき、遺伝子導入量の精度も向上可能な技術を提供することにある。また、本発明は、同様の目的を薬剤導入において達成する技術を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の遺伝子導入装置は、遺伝子を細胞または細胞内領域といった導入対象に導入する。本装置は、遺伝子溶液が保持される導入用ピペットと、前記導入用ピペットに設けられる第一の電極と、前記導入用ピペットと別に設けられる第二の電極と、前記遺伝子溶液を保持した前記導入用ピペットを前記導入対象に近接する位置へ移動させるためのピペット移動手段と、前記導入対象に近接する位置へ移動された前記導入用ピペットから前記導入対象へ前記遺伝子溶液中の遺伝子が移動する電圧を前記第一の電極と前記第二の電極の間に印加する電圧印加手段と、を備える。
【００１５】
本発明において、遺伝子とは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。さらに、遺伝子は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを含み、ＰＮＡも含む。さらに、遺伝子は、これらの誘導体でもよい。
【００１６】
また、本発明において、細胞内領域は例えば核であり、また例えばオルガネラであり、オルガネラは例えば葉緑体である。導入用ピペットは、細胞または細胞内領域といった導入対象に応じた細い形状を有することが好適である。より詳細には、導入用ピペットのサイズは、外径が遺伝子導入先の細胞以下（導入対象の細胞以下、または、導入対象の細胞内領域を含む細胞以下）であり、導入先の細胞よりも小さいことがより好ましい。ピペット先端のサイズは、例えば、フェムトチップの内径０．５マイクロメートル、外径１．０マイクロメートル（±０．２マイクロメートル）である。
【００１７】
本発明によれば、導入用ピペットに遺伝子が保持され、この導入用ピペットが導入対象に近接する位置へ移動される。そして、導入用ピペットに設けた電極に、ピペット内の遺伝子が導入対象に移動する電圧が印加される。これにより、主として遺伝子が導入対象の細胞または細胞内領域へと移動する。
【００１８】
したがって、本発明によれば、遺伝子溶液中の遺伝子を電気的に導入対象に導入できるので、遺伝子とともに導入対象に入る溶液を大幅に低減でき、あるいは導入対象に入る溶液を実質的になくすことができる。そして、これにより、遺伝子の導入量の精度を向上可能である。
【００１９】
また、本発明は、特定な細胞または細胞内領域といった特定の導入対象に遺伝子を導入できる点で従来のエレクトロポレータと比べて大幅に有利である。すなわち、遺伝子を特定の細胞に導入することができるので、雑多な細胞集団に対しても、特定の細胞を狙って遺伝子を導入できる。また、非常に少量の細胞数しか必要とせず、すなわち、細胞数が少なくても遺伝子導入ができる。そして、上記のように、細胞内の核またはオルガネラのような領域に対しても遺伝子導入が可能である。
【００２０】
本発明の遺伝子装置は、マイクロインジェクションにエレクトロポレータの技術を適用することにより実現できる。マイクロインジェクションに利用可能なピペットが用意され、ピペットに電極が装着され、電極にエレクトロポレータが接続され、そして、圧力注入に代えて、ピペットの電極に電圧が付与される。このような構成により本発明の遺伝子導入装置を実現できる。従来の圧力注入型のマイクロインジェクションでは不可能であった、溶液中の遺伝子を移動させる遺伝子導入が可能になる。
【００２１】
また、好ましくは、本発明の遺伝子装置は連結部材を有し、この連結部材は、一端がマイクロインジェクション用ピペットに接続され、他端が前記マイクロインジェクション用ピペットのホルダに接続されて、前記マイクロインジェクション用ピペットと前記ホルダを連結する。そして、前記第一の電極は、前記連結部材から前記マイクロインジェクション用ピペット内へ延びるように前記連結部材に設けられる。
【００２２】
このように、本発明によれば、マイクロインジェクション用ピペットに、簡単な構成で、電圧印加のための電極を装着できる。ホルダは、マイクロマニピュレータのようなピペット移動手段に取り付けられる。
【００２３】
なお、本発明の範囲内で、そして、遺伝子導入が達成される範囲で、本発明の装置を使うとき、導入用ピペットが導入対象に突き刺されてもよい。本発明では、突刺し動作も、導入対象へ近接する位置へ導入用ピペットを移動する動作に含まれてよい。導入時の導入用ピペットの適切な配置は、導入対象と導入される遺伝子に応じて設定されればよい。
【００２４】
また、本発明は、既に述べたように、遺伝子を細胞または細胞内領域といった導入対象に導入する装置であるが、これは、本発明の範囲内で、導入対象が細胞である装置も、導入対象が細胞内領域である装置も、導入対象が細胞と細胞内領域である装置も含む。なお、細胞内領域が導入対象であっても、遺伝子の一部が細胞内領域以外の部分に漏れることもあり得るが、この場合は、細胞内領域を導入対象とする遺伝子導入に相当すると考えてよい。
【００２５】
本発明の別の態様は、遺伝子を細胞または細胞内領域といった導入対象に導入する遺伝子導入方法である。本方法は、導入されるべき遺伝子溶液を導入用ピペット内に保持させるステップと、前記遺伝子溶液を保持した前記導入用ピペットを前記導入対象に近接する位置へ移動させるステップと、前記導入用ピペットに設けられる第一の電極および前記導入用ピペットと別に設けられる第二の電極に、前記導入用ピペットから前記導入対象へ前記遺伝子溶液中の遺伝子が移動する電圧を印加するステップと、を含む。本態様によれば、上述した本発明の効果が同様に得られる。
【００２６】
本発明の別の態様は、薬剤を細胞または細胞内領域といった導入対象に導入可能な薬剤導入装置であり、この装置は、薬剤溶液が保持される導入用ピペットと、前記導入用ピペットに設けられる第一の電極と、前記導入用ピペットと別に設けられる第二の電極と、前記薬剤溶液を保持した前記導入用ピペットを前記導入対象に近接する位置へ移動させるためのピペット移動手段と、前記導入対象に近接する位置へ移動された前記導入用ピペットから前記導入対象へ前記薬剤溶液中の薬剤が移動する電圧を前記第一の電極と前記第二の電極の間に印加する電圧印加手段と、を備える。本態様によれば、上述の本発明の利点が薬剤導入において得られる。
【００２７】
本発明において、薬剤とは、上記の遺伝子を含み、また、タンパク質を含む。タンパク質とは、抗体および酵素を含む。薬剤は、細胞増殖因子、サイトカイン、ホルモン、転写因子、色素および蛍光物質でもよい。
【００２８】
好ましくは、前記導入用ピペットは、マイクロインジェクションに利用される形状のピペットである。本態様によれば、上述の本発明の利点が薬剤導入において得られる。
【００２９】
また、好ましくは、本発明の装置は、一端がマイクロインジェクション用ピペットに接続され、他端が前記マイクロインジェクション用ピペットのホルダに接続されて、前記マイクロインジェクション用ピペットと前記ホルダを連結する連結部材を有し、前記第一の電極は、前記連結部材から前記マイクロインジェクション用ピペット内へ延びるように前記連結部材に設けられている。本態様によれば、上述の本発明の利点が薬剤導入において得られる。
【００３０】
本発明の別の態様は、薬剤を細胞または細胞内領域といった導入対象に導入する薬剤導入方法であり、本方法は、導入されるべき薬剤溶液を導入用ピペット内に保持させるステップと、前記薬剤溶液を保持した前記導入用ピペットを前記導入対象に近接する位置へ移動させるステップと、前記導入用ピペットに設けられる第一の電極および前記導入用ピペットと別に設けられる第二の電極に、前記導入用ピペットから前記導入対象へ前記薬剤溶液中の薬剤が移動する電圧を印加するステップと、を含む。本態様によれば、上述の本発明の利点が薬剤導入において得られる。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
【００３２】
図１は、本実施の形態の遺伝子導入装置を示している。遺伝子導入装置１０は、概略的には、既存のマイクロインジェクション用ピペットにエレクトロポレータの電極を装着した構成を有する。
【００３３】
図１に示されるように、クリーンベンチ１２は水平気流式であり、クリーンベンチ１２内には、エアーコンプレッサ１４を備えた除振台１６が配置されている。除振台１６の上には、倒立型の顕微鏡１８が配置されている。顕微鏡１８にはＣＣＤカメラ２０が取り付けられており、ＣＣＤカメラ２０は顕微鏡１８の拡大像を撮影する。拡大像はエンコーダ２２を経てモニタ２４に表示され、また、ビデオテープレコーダ２６にて記録される。また、除振台１６の下方には蛍光装置電源ユニット２８が設けられている。蛍光装置電源ユニット２８は、本装置を使った実験で蛍光物質を導入するときに落射蛍光装置と共に用いられる。そして、顕微鏡１８、落射蛍光装置、ＣＣＤカメラ２０、モニタ２４、ビデオテープレコーダ２６によりモニタリング装置が構成される。
【００３４】
次に、遺伝子導入のための構成を説明する。遺伝子とは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。さらに、遺伝子は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを含み、ＰＮＡも含む。さらに、遺伝子は、これらの誘導体でもよい。
【００３５】
図１に示されるように、顕微鏡１８のステージ１９に臨むように、２つのマイクロマニュピュレータ３０、３１が設けられている。マイクロマニュピュレータ３０，３１は、除振台１６上に設けられたコントローラ３２、３３を用いて作業者により操作される。マイクロマニュピュレータ３０には、導入用ピペット３４が取り付けられており、導入用ピペット３４にはマイナス電極３６が装着されている。もう一つのマイクロマニュピュレータ３１には、ホールド用ピペット３８が取り付けられており、さらに、ホールド用ピペット３８の隣にプラス電極４０が取り付けられている。ホールド用ピペット３８は、除振台１６上のセルトラム４２と共に動作する。また、マイナス電極３６およびプラス電極４０は、図示されない配線によりエレクトロポレータ４４へと接続されている。
【００３６】
図２は、上記の顕微鏡１８のステージ１９上の構成を詳細に示している。図示のように、第１のマイクロマニュピュレータ３０には、導入用ピペット３４の固定用ホルダ４６が取り付けられている。導入用ピペット３４のマイナス電極３６からは接続コード４８が延び、エレクトロポレータ４４へと続いている。
【００３７】
また、第２のマイクロマニュピュレータ３１には、ホールド用ピペット３８の固定用ホルダ５０が取り付けられている。ホールド用ピペット３８は、バキュチップタイプであり、陰圧発生ポンプであるセルトラム４２と共に機能し、陰圧によりサンプルを保持する。ホールド用ピペット３８は、植物細胞や浮遊系の動物細胞を保持するときに使用される。
【００３８】
第２のマイクロマニュピュレータ３１には、さらに、プラス電極４０の固定用ホルダ５２が取り付けられている。プラス電極４０の位置は適当でよいことから、本実施の形態では、プラス電極４０がホールド用ピペット３８と同じマイクロマニュピュレータ３１で移動される。プラス電極４０からは接続コード５４が延び、エレクトロポレータ４４へと続いている。
【００３９】
図３は、導入用ピペット３４の分解組立図である。図示のように、導入用ピペット３４に、円柱形状の連結部材５６の一端が接続され、連結部材５６の他端が固定用ホルダ４６に接続されて、導入用ピペット３４と固定用ホルダ４６が連結部材５６で連結されている。そして、連結部材５６から、導入用ピペット３４の内部へ延びるようにマイナス電極３６が取り付けられている。
【００４０】
導入用ピペット３４は、導入対象である細胞または細胞内領域に応じた細い形状を有することが好適である。より詳細には、導入用ピペット３４のサイズは、外径が遺伝子導入先の細胞以下（導入対象の細胞以下、または、導入対象の細胞内領域を含む細胞以下）であり、導入先の細胞よりも小さいことが好ましく、これにより特定の導入対象を狙って遺伝子を導入できる。ピペット先端のサイズは、例えば、フェムトチップの内径０．５マイクロメートル、外径１．０マイクロメートル（±０．２マイクロメートル）である。
【００４１】
導入用ピペット３４は、マイクロインジェクションに利用可能なピペットでよく、市販のガラスピペットでよく、上記のサイズの要求が満たすことができる。そして、固定用ホルダ４６も、マイクロインジェクションに利用可能なホルダでよい。したがって、導入用ピペット３４と固定用ホルダ４６は直接連結可能である。このような導入用ピペット３４と固定用ホルダ４６の間に、本実施の形態では、連結部材５６を介在させている。
【００４２】
より詳細には、連結部材５６の一端５８は、固定用ホルダ４６の端部と同じ形状のめねじを有し、他端６０は、導入用ピペット３４の基端と同じ形状のおねじを有する。これにより、連結部材５６の一端５８は導入用ピペット３４に適合し、他端６０は固定用ホルダ４６に適合し、連結部材５６は導入用ピペット３４と固定用ホルダ４６の間に介在できる。
【００４３】
そして、連結部材５６の一端５８からは、連結される導入用ピペット３４の中心線に沿うようにマイナス電極３６が延びている。マイナス電極３６の先端は、組立状態で導入用ピペット３４の先端付近まで達する。マイナス電極３６の基端には接続コード４８が取り付けられており、接続コード４８はエレクトロポレータ４４へつながれる。
【００４４】
このように、本実施の形態では、導入用ピペット３４と固定用ホルダ４６に適合する連結部材５６を設け、連結部材５６にマイナス電極３６を設けたので、マイナス電極３６を設ける構成が簡素でよく、低コストで本発明の装置を実現できる。
【００４５】
次に、本実施の形態の遺伝子導入装置を用いた遺伝子の導入について説明する。図３に示されるように導入用ピペット３４を取り外した状態で、導入用ピペット３４へと、マイクロローダを用いて遺伝子溶液が注入される。これにより、導入用ピペット３４は遺伝子溶液を先端部に保持する。
【００４６】
導入用ピペット３４は連結部材５６に取り付けられ、さらに、連結部材５６に固定用ホルダ４６が取り付けられる（図３）。そして、固定用ホルダ４６が、マイクロマニュピュレータ３０に取り付けられて、顕微鏡１８のステージ１９に臨むように配置される（図２）。
【００４７】
遺伝子の導入は、作業者により、モニタ２４上での顕微鏡拡大像の表示を見ながら行われる。遺伝子の導入対象は、細胞または細胞内領域（核またはオルガネラ）である。サンプルの細胞が顕微鏡１８のステージ１９上で保持される。導入対象が植物細胞または浮遊系の動物細胞のときは、ホールド用ピペット３８の引圧を利用してサンプルが保持される。このとき、顕微鏡拡大像を見ながら、作業者がコントローラ３３を操作してマイクロマニュピュレータ３１を動かし、ホールド用ピペット３８を移動させる。
【００４８】
次に、作業者は、顕微鏡拡大像を見ながら、マイクロマニュピュレータ３０を操作して、導入用ピペット３４を動かす。このときはコントローラ３２が操作される。本実施の形態では、マイクロマニュピュレータ３０が、本発明の導入用ピペットの移動手段に相当する。導入用ピペット３４は、導入対象である細胞または細胞内領域に近接する位置まで移動される。
【００４９】
次に、エレクトロポレータ４４が操作され、導入用ピペット３４のマイナス電極３６と、もう一つの電極であるプラス電極４０との間に電圧が印加される。ここでは、エレクトロポレータの原理が利用され、導入用ピペット３４から導入対象へと遺伝子溶液中の遺伝子が移動する電圧が印加される。これにより、マイナスに帯電した遺伝子が、電気泳動により、導入ピペット３４の入口から導入対象へと移動する。
【００５０】
なお、エレクトロポレータでは、電圧、パルス通電時間、パルス休止時間およびパルス回数の設定条件が適当に定められる。
【００５１】
図４は、本実施の形態の遺伝子導入の原理を示している。図４では、遺伝子導入の一例として、動物培養細胞の核に遺伝子が導入される。図示のように、導入用ピペット３４は、細胞膜の近傍に配置される。このとき、細胞膜の直下の核に近接するように導入用ピペット３４が配置される。そして、パルス通電が行われる。これにより、細胞膜に一次的に穿孔が開き、同時にピペット内部から電気泳動されてきた遺伝子が穿孔を通って細胞内へ入り、核内まで泳動される。
【００５２】
図４の例では、上記のように、導入用ピペット３４は細胞膜の外側に配置されている。しかし、導入用ピペット３４の配置は、図４に限られない。導入用ピペット３４の到達する位置は、導入対象および導入される遺伝子の種類に応じて適当に設定される。
【００５３】
なお、例えば、導入対象が細胞のとき、導入用ピペット３４が導入対象内に突き刺される場合もあり得る。このような突刺し動作も、本実施の形態では、導入ピペット３４を導入対象に近接させる動作に含まれる。
【００５４】
図５は、本実施の形態の遺伝子導入の原理を示すもう一つの模式図である。図５の例では、導入対象が葉緑体であり、導入ピペットは葉緑体へと運ばれる。導入ピペットのマイナス極と、プラス極との間の電位差により遺伝子が葉緑体へ導入される。
【００５５】
以上、本発明の好適な実施の形態を説明した。本実施の形態によれば、導入用ピペットに遺伝子が保持され、この導入用ピペットが導入対象に近接する位置へ移動される。そして、導入用ピペットに設けた電極に、ピペット内の遺伝子が導入対象に移動する電圧が印加される。これにより、遺伝子溶液中の遺伝子を電気的に導入対象に導入できる。したがって、主として遺伝子のみを導入対象に導入できるので、圧力注入と比べて遺伝子とともに導入対象に入る溶液を大幅に低減でき、あるいは導入対象に入る溶液を実質的になくすことができる。そして、これにより、溶液の影響が抑えられ、遺伝子の導入量の精度を向上可能である。
【００５６】
また、本実施の形態によれば、特定な細胞または細胞内領域といった特定の導入対象に遺伝子を導入できるので、雑多な細胞集団に対しても、特定の細胞を狙って遺伝子を導入でき、また、非常に少量の細胞数しか必要とせず、さらに、上記のように細胞内の核またはオルガネラのような領域に対しても遺伝子導入が可能であり、これらの点で従来のエレクトロポレータより大幅に有利である。
【００５７】
また、本実施の形態では、導入用ピペットとそのホルダに適合する連結部材を設け、連結部材に電極を設けたので、本発明の遺伝子導入装置を簡素な構成で、低コストで実現できる。
【００５８】
なお、本実施の形態は、遺伝子導入装置であった。これに対し、本発明の別の実施の形態は薬剤導入装置である。薬剤導入装置は、上記の遺伝子導入装置と同様の構成を有し、同様に動作する。ただし、導入ピペットには薬剤溶液が保持され、この薬剤溶液の薬剤が細胞等に導入される。この導入動作に適するように、電圧が制御されればよい。
【００５９】
ここで、薬剤とは、上記の遺伝子を含み、また、タンパク質を含む。タンパク質とは、抗体および酵素を含む。薬剤は、細胞増殖因子、サイトカイン、ホルモン、転写因子、色素および蛍光物質でもよい。
【００６０】
以下、本実施の形態の遺伝子導入装置を用いて行われた一連の実験を説明する。以下の実験に示されるように、本実施の形態の遺伝子導入装置は、遺伝子溶液の代わりに蛍光色素を導入するためにも利用できる。このために遺伝子導入装置は落射蛍光装置を備えている。蛍光色素は、本実施の形態の遺伝子導入装置の開発にて導入過程を観察するために便利に用いられる。
【００６１】
【実施例】
遺伝子導入装置は、顕微鏡ＯＬＹＮＰＡＳ  ＩＸ７１、マイクロマニュピュレーターＮＫ２（エッペンドルフ）およびエレクトロポレーターＣＵＹ−２１（ネッパジーン）で構成した。遺伝子装置は水平気流式クリーンベンチ内に置かれ、クリーンベンチ内には除振台（いずれも日本医科器械製作所ＨＩＳ−Ｍ−１６００Ａ−ＨＯＡ）を置いた。導入用ピペットは、市販のガラスピペット・フェムトチップＩ・ＩＩ（エッペンドルフ）であり、ガラスピペットにはマイクロローダー（エッペンドルフ）を用いて蛍光色素および遺伝子溶液を注入した。
【００６２】
「蛍光色素の導入試験」
ルシファーイエローは負電荷を有する蛍光物質であり、電場をかけることによりプラス方向へ移動する。この原理を利用して、ルシファーイエローを特定の細胞およびオルガネラに電気的に導入することを試みた。
【００６３】
実験に用いた細胞はアブラナ科植物葉肉プロトプラストおよびタマネギ鱗茎表皮細胞である。プラス電極およびホールド用ピペット・バキュチップ（エッペンドルフ）をステージにセットし、また、導入用ピペット（電極内蔵ガラスピペット；エッペンドルフ、ネッパジーン）をステージにセットした。導入用ピペットの内部にはルシファーイエロー溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を保持した。エレクトロポレーターＣＵＹ−２１（ネッパジーン）を用い、導入条件としては以下のパラメーターを設定した。（１）Ｖｏｌｔａｇｅ（Ｖ）：電圧、（２）Ｐｏｎ  （ｍｓｅｃ．）：パルスの通電時間、（３）Ｐｏｆｆ  （ｍｓｅｃ．）：パルスの休止時間、（４）Ｎｏ．（回）：パルスの回数。
【００６４】
プロトプラストをバキュチップ（ホールド用ピペット）で固定し、導入用ピペットを細胞内に刺入し通電を行ったところ、ルシファーイエローの蛍光が導入用電極から細胞内に導入されるのが観察された（図６）。同じようにタマネギ表皮細胞にも同様に通電を試みたところ、これも成功した（図７）。通電条件の電圧・Ｐｏｎ・Ｎｏ．の値が大きいほど導入量が増大した。また当然のことながら通電時のみにルシファーイエローは導入された。圧力注入の場合、圧力制御に問題が生じ注入時間がすぎても注入が止まらないことがあったが、本実験の結果から電気的制御で簡便にかつ厳密に導入量が制御でき、また理論的に限りなく微量を導入できることが示された。
【００６５】
また、プロトプラストの場合、高電圧をかけると細胞膜が完全に壊れてしまい、プロトプラストの死ぬ頻度が高いことが実験によって明らかになった（図８）。そこでアブラナ科植物プロトプラストでは、通電の条件で特に電圧を下げる必要があった。アブラナ科植物の場合通常４Ｖ以上の電圧をかけるとプロトプラストは破壊された。電圧を下げるとパルス一回あたりの色素の導入量も低下したが、パルスの回数を増やし合計の導入時間を増加させることで、高電圧と同等の注入量が得られた。
【００６６】
ルシファーイエローと同様の条件でＦＩＴＣ−デキストラン（シグマ）の導入を試みたところ、ほとんど同じように導入が可能であった。このことは分子量が約５００程度のルシファーイエローと、分子量４３，０００のＦＩＴＣ−デキストランでは、泳動時の移動速度に差がないことを意味しており、高分子の物質でも瞬間的に注出することが可能であることが示された。
【００６７】
「ガラス電極外への遺伝子の注出試験」
前項で細胞内に物質を電気的に注入できることが示されたので、次に遺伝子の導入試験を行った。遺伝子が注出されている様子を可視化するために、遺伝子と特異的に結合し、結合すると蛍光を発するサイバーグリーンＩ溶液を用いた。導入用ピペット内部に遺伝子溶液を保持し、ルシファーイエローの場合と同様に通電した。その結果サイバーグリーンＩ溶液に遺伝子が注出された部分に蛍光が観察された（図９）。電圧を変えて導入を行ったところ、注出される遺伝子の量が増大するのが観察され、通電条件によって導入する遺伝子を厳密に制御できることが示された。
【００６８】
「植物細胞への遺伝子導入試験」
前項までに遺伝子が電気的に排出できることが示されたので、実際に植物の細胞に導入を行った。細胞はアブラナ科植物のプロトプラスト、およびタマネギ鱗形表皮細胞を用いた。
【００６９】
導入に用いた遺伝子はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）の下流にレポーター遺伝子としてＥＧＦＰをつないだコンストラクトを用いた。
【００７０】
導入４８時間後、タマネギ鱗形表皮細胞の核においてＧＦＰの発現が観察された（図１０）。またアブラナ科植物プロトプラストにおいてＧＦＰの発現が観察された（図１１）。
【００７１】
「動物培養細胞への蛍光色素の電気的導入」
動物培養細胞としてはＨｅＬａを用い、最適な条件を検索した。実験の結果、電圧が高いほど、また通電時間が長いほど導入される蛍光色素の量が増加した。また図１２に示したように最初から微分干渉像で確認できる核をターゲットに導入が可能であった。図では細胞全体に蛍光が広がっているが、高分子の遺伝子を導入する場合は、核のみに導入可能であると期待できる。
【００７２】
「動物培養細胞への遺伝子導入」
電気的導入には、Ｈｅｌａ、膵癌細胞ＳＵＩＴ２、繊維肉腫細胞ＨＴ１０８０を用いた。ｐＴａｒｇｅｔ（ＴＭ）ベクターにＥＧＦＰを導入したコンストラクトを作製し、これを導入遺伝子として用いた。濃度は１００ｎｇ／μｌで用いた。プロモーターはサイトメガロウイルスＳＶ４０を用いている。
【００７３】
導入４８時間後の観察の結果、細胞中にＧＦＰの蛍光が確認できた（図１３）。蛍光は分裂したと思われる細胞数個に認められ、ＧＦＰを発現させたまま細胞が分裂したと推察された。トランスフェクション法と電気的導入法を比較すると、トランスフェクション法は遺伝子が導入された細胞がある程度の割合で得られるが、遺伝子導入細胞の割合を１００％近くに高めるためには、数ヶ月間選抜圧存在下で継代培養を行い、クローニングを行う必要がある。それに対し、電気的導入の場合は、細胞１個をターゲットにしているため、導入細胞を単離しクローニングを行えば、解析を行う程度の細胞数に増えた時点でサンプリングが可能であり時間的に大幅に短縮できる。リアルタイムＰＣＲの解析であれば細胞１個からでも解析が可能であり、労働力、時間、設備の面で大幅な節約が可能であるため、実験としては既存技術にない新しい手法になり得ると考えられる。
【００７４】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明によれば、導入用ピペットを遺伝子導入対象の近傍までもっていき、導入用ピペットに備えた電極に電圧を印加して遺伝子を導導入するので、遺伝子溶液中の遺伝子を主として導入対象に導入でき、したがって、遺伝子とともに導入対象に入る溶液を低減でき、また、遺伝子の導入量の精度を向上可能である。
【００７５】
また、本実施の形態によれば、特定な細胞または細胞内領域といった特定の導入対象に遺伝子を導入できるので、雑多な細胞集団に対しても、特定の細胞を狙って遺伝子を導入でき、また、非常に少量の細胞数しか必要とせず、さらに、上記のように細胞内の核またはオルガネラのような領域に対しても遺伝子導入が可能であり、これらの点で従来のエレクトロポレータより大幅に有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態の遺伝子導入装置を示す図である。
【図２】図１の装置の遺伝子導入のための構成を示す図である。
【図３】導入用ピペットの分解組立図である。
【図４】本実施の形態の遺伝子導入の原理を示す図である。
【図５】導入対象が葉緑素であるときの本実施の形態の遺伝子導入の原理を示す図である。
【図６】蛍光色素の導入試験で、ルシファーイエローの蛍光が導入用電極から細胞内に導入されるのが観察されたことを示す図である。
【図７】蛍光色素の導入試験で、タマネギ表皮細胞通電を試みた結果を示す図である。
【図８】蛍光色素の導入試験で、プロトプラストに高電圧をかけると細胞膜が完全に壊れることを示す図である。
【図９】ガラス電極外への遺伝子の注出試験で、サイバーグリーンＩ溶液に遺伝子が注出された部分に蛍光が観察されたことを示す図である。
【図１０】植物細胞への遺伝子導入試験で、タマネギ鱗形表皮細胞の核においてＧＦＰの発現か観察されたことを示す図である。
【図１１】植物細胞への遺伝子導入試験で、アブラナ科植物プロトプラストにおいてＧＦＰの発現が観察されたことを示す図である。
【図１２】動物培養細胞への蛍光色素の電気的導入の試験で、微分干渉像で確認できる核をターゲットに導入が可能であったことを示す図である。
【図１３】動物培養細胞への遺伝子導入の試験で、細胞中にＧＦＰの蛍光が確認できたことを示す図である。
【符号の説明】
１０  遺伝子導入装置
１８  顕微鏡
２０  ＣＣＤカメラ
２４  モニタ
３０，３１  マイクロマニュピュレータ
３２，３３  コントローラ
３４  導入用ピペット
３６  マイナス電極
３８  ホールド用ピペット
４０  プラス電極
４４  エレクトロポレータ
４６，５０，５２  固定用ホルダ
５６  連結部材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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