(57)【要約】【課題】多成分混在試料において、複数の成分間のＵＶ吸光係数比（ε比）を簡易に算出する方法、及びそのＵＶ吸光係数比を用いて各成分の真の存在比を簡易に求める方法を提供する。【解決手段】上記課題は、ＵＶ吸光係数が異なる成分間のＵＶ吸光係数比を求める方法であって、ＵＶ吸光係数比を求める対象となる基準成分と測定対象成分を選択し、各成分の任意量についてＮＭＲ積分値とＨＰＬＣピーク面積とを求め、各成分間のＮＭＲ積分値比及び各成分間のＨＰＬＣピーク面積比を用いて、各成分間のＵＶ吸光係数比を求める方法、及びそのＵＶ吸光係数比を用いて各成分の真の存在比を求める方法によって達成される。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＶ吸光係数が異なる成分間のＵＶ吸光係数比を求める方法であって、ＵＶ吸光係数比を求める対象となる基準成分と測定対象成分を選択し、各成分の任意量についてＮＭＲ積分値とＨＰＬＣピーク面積とを求め、各成分間のＮＭＲ積分値比及び各成分間のＨＰＬＣピーク面積比を用いて、各成分間のＵＶ吸光係数比を算出することを特徴とする、上記ＵＶ吸光係数比を求める方法。
【請求項２】
前記各成分のＮＭＲ積分値は、各成分のＮＭＲスペクトルからそれぞれ選ばれる一つのシグナルから求められる前記請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記測定対象成分の、前記基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する前記請求項１記載の方法。
（各測定対象成分のε比）＝（基準成分のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）
【請求項４】
下記の工程を含む請求項１記載の方法。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と前記測定対象成分とを任意の比率で混合した混合試料を調製する工程、
（３）前記混合試料中の各成分のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（４）一定の検出波長を用いて前記混合試料中の各成分のＨＰＬＣピ−ク面積を測定する工程、及び
（５）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程。
（各測定対象成分のε比）＝（基準成分のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）
【請求項５】
下記の工程を含む請求項１記載の方法。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と内標準物質とを任意の比率で混合して第１の混合試料を調製し、この試料中の基準成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定して、積分係数を算出する工程、
（３）前記第１の混合試料に、任意量の前記測定対象成分を加えて第２の混合試料を調製する工程、
（４）前記第２の混合試料中の測定対象成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（５）一定の検出波長を用いて、前記第２の混合試料中の基準成分と測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積を測定する工程、及び
（６）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程。
（ε比）＝（内標準物質のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）×（積分係数）
【請求項６】
下記の工程を含む請求項１記載の方法。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と内標準物質とを任意の比率で混合した第１の混合試料を調製し、この試料中の基準成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定して、積分係数を算出する工程、
（３）前記測定対象成分と前記内標準物質とを任意の比率で混合した第２の混合試料を調製して、この試料中の測定対象成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（４）第１の混合試料と第２の混合試料を混合して第３の混合試料を調製し、この混合試料中の基準成分と測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積を一定の検出波長を用いて測定する工程、
（５）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程、及び
（ε比）＝（内標準物質のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）×（積分係数）
【請求項７】
前記各成分のＮＭＲ積分値は、各成分のＮＭＲスペクトルからそれぞれ選ばれる一つのシグナルから求められる前記請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記測定対象成分として一つの成分が選択される請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記混合試料中の基準成分と測定対象成分との混合比がおよそ１：１である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記検出波長が前記基準成分のλｍａｘ近辺の波長である請求項７記載の方法。
【請求項１１】
ＵＶ吸光係数（ε）が異なる複数の成分を含有し、それらの成分の真の存在比が不明な測定対象試料の、各成分間のＵＶ吸光係数比（ε比）を算出する方法である請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記内標準物質が、４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−エチルヘキシル、アントラセン又はベンゼンである請求項５又は６記載の方法。
【請求項１３】
ＵＶ吸光係数が異なる複数の成分を含有する測定対象試料において、各成分の真の存在比を求める方法であって、（１）ＵＶ吸光係数比を求める対象となる基準成分と測定対象成分を選択し、各成分の任意量についてＮＭＲ積分値とＨＰＬＣピーク面積とを求め、各成分間のＮＭＲ積分値比及び各成分間のＨＰＬＣピーク面積比を用いて、各成分間のＵＶ吸光係数比を算出し、（２）得られたＵＶ吸光係数比を用いて前記測定対象成分のＨＰＬＣピーク面積を補正することを特徴とする、上記各成分の真の存在比を求める方法。
【請求項１４】
前記各成分のＮＭＲ積分値は、各成分のＮＭＲスペクトルからそれぞれ選ばれた一つのシグナルから求められる前記請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記測定対象成分の、前記基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する前記請求項１３記載の方法。
（各測定対象成分のε比）＝（基準成分のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）
【請求項１６】
下記の工程を含む請求項１３記載の方法。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と前記測定対象成分とを任意の比率で混合した混合試料を調製する工程、
（３）前記混合試料中の各成分のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（４）一定の検出波長を用いて、前記混合試料中の各成分のＨＰＬＣピ−ク面積を測定する工程、
（５）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程、及び
（各測定対象成分のε比）＝（基準成分のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）
（６）各測定対象成分の真の存在比を下式により算出する工程。
（各測定対象成分の真の存在比）＝（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積比）／（各測定対象成分のε比）
【請求項１７】
下記の工程を含む請求項１３記載の方法。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と内標準物質とを任意の比率で混合して第１の混合試料を調製し、この試料中の基準成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定して、積分係数を算出する工程、
（３）前記第１の混合試料に、任意量の前記測定対象成分を加えて第２の混合試料を調製する工程、
（４）前記第２の混合試料中の測定対象成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（５）一定の検出波長を用いて、前記第２の混合試料中の基準成分と測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積を測定する工程、及び
（６）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程、及び
（ε比）＝（内標準物質のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）×（積分係数）
（７）各測定対象成分の真の存在比を下式により算出する工程。
（各測定対象成分の真の存在比）＝（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積比）／（各測定対象成分のε比）
【請求項１８】
下記の工程を含む請求項１３記載の方法。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と内標準物質とを任意の比率で混合した第１の混合試料を調製し、この試料中の基準成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定して、積分係数を算出する工程、
（３）前記測定対象成分と前記内標準物質とを任意の比率で混合した第２の混合試料を調製して、この試料中の測定対象成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（４）第１の混合試料と第２の混合試料を混合して第３の混合試料を調製し、この混合試料中の基準成分と測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積を一定の検出波長を用いて測定する工程、
（５）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程、及び
（ε比）＝（内標準物質のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）×（積分係数）
（６）各測定対象成分の真の存在比を下式により算出する工程。
（各測定対象成分の真の存在比）＝（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積比）／（各測定対象成分のε比）
【請求項１９】
前記各成分のＮＭＲ積分値は、各成分のＮＭＲスペクトルからそれぞれ選ばれる一つのシグナルから求められる前記請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記測定対象成分として一つの成分が選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記各試料中の各成分との混合比がおよそ１：１である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記検出波長が前記基準成分のλｍａｘ近辺の波長である請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記内標準物質が、４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−エチルヘキシル、アントラセン又はベンゼンである請求項１７又は１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＵＶ吸光係数（ε）が異なる複数の成分間のＵＶ吸光係数比（ε比）をＨＰＬＣおよびＮＭＲを用いて簡易に算出する方法、およびそのＵＶ吸光係数比を用いて、多成分混在試料における複数成分の真の存在比を算出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬品における分解物や不純物等の未知化合物の量的評価は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって行われる。その検出方法は多くの場合ＵＶによるものであり、主化合物（開発化合物）本体に対する純度として表される。しかし、未知化合物によってはＵＶに対する吸光係数（ε）が主化合物と異なるために、ＨＰＬＣにおけるピ−ク面積からだけでは真の存在量を求めることはできない。一方、ＮＭＲ（核磁気共鳴）における積分値は正確に物質の存在量を把握することができるが、複数の化合物が混在する系では単独のピ−クとして積分するのに十分な分離度を得るのが難しく、またＨＰＬＣほどのダイナミックレンジが無いために、存在量が数％程度以下であるような化合物を正確に評価することは出来ない。以上の理由から、未知化合物の真の存在量を知るためには、ＨＰＬＣを用いて、各未知化合物の吸光係数（ε）、または主化合物に対する吸光係数比（ε比）を求め、ＨＰＬＣピ−ク面積を補正する必要がある。従来、各未知化合物のε比を求めるには、まず各々のεを求め、別に求めた主成分のεに対する比を求める必要があった。ここで各々のεを求める際に、２００μＬ〜１ｍＬ程度のセルに十分濃度の試料溶液を満たしてＵＶ計にて測定するため、各未知化合物についてｍｇオーダーの量が必要であった。また、試料全体のＵＶ吸収を測定するため、試料中において測定対象となる未知化合物が高純度で存在している必要もあった。従って、未知化合物が他成分と混在している場合には、単離精製操作及びその大量分取の操作が必要であり、大変な労力が必要であった。
【０００３】
また、ＨＰＬＣとＮＭＲを組合せた既存技術にＬＣ−ＮＭＲがある。しかしながらＬＣ−ＮＭＲは本来、構造解析用に開発されたものであり、ＨＰＬＣにて分離されたピ−クをＮＭＲプロ−ブに順次送り込み、各々単独成分でＮＭＲスペクトルを測定する技術であって、ＵＶ吸光係数（ε）が異なる複数の成分が存在する系において、正確なＵＶ吸光係数比（ε比）を求めることはできなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上述した如く、ＵＶ吸光係数（ε）が異なる複数の成分が存在する系において、ＵＶ吸光係数比（ε比）を簡易に算出する方法は知られておらず、また、それらの成分の真の存在比を簡易に算出する方法も知られていなかった。このため、医薬品としての主化合物に、微量混入する主化合物の分解生成物や不純物等の未知化合物を簡易に量的評価する方法は知られていなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究した結果、ＨＰＬＣおよびＮＭＲを用いて簡易にＵＶ吸光係数比（ε比）を求める方法を見出した。本発明の方法によれば、ε比を求める測定対象成分は微量でよく（純度の高い目的化合物を大量に精製する必要もなく）、また、本発明の方法により求められたε比により、それら成分の真の存在比を簡易に算出することも可能である。
【０００６】
すなわち、本発明の第１の態様によれば、ＵＶ吸光係数が異なる成分間のＵＶ吸光係数比を求める方法であって、ＵＶ吸光係数比を求める対象となる基準成分と測定対象成分を選択し、各成分の任意量についてＮＭＲ積分値とＨＰＬＣピーク面積とを求め、各成分間のＮＭＲ積分値比及び各成分間のＨＰＬＣピーク面積比を用いて、各成分間のＵＶ吸光係数比を算出することを特徴とする、上記ＵＶ吸光係数比を求める方法が提供される。この方法において、各成分のＮＭＲ積分値は、好ましくは、各成分のＮＭＲスペクトルからそれぞれ選ばれる一つのシグナルから求められる。前記測定対象成分の、前記基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）は、例えば、下式により算出される。
（各測定対象成分のε比）＝（基準成分のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）
【０００７】
また、本発明は、上記第１の態様に係る方法（以下、「第１の方法」という）に基づいて、次の３つの具体的な方法を提供する。
すなわち、本発明の第１（ａ）の態様の方法によれば、上記第１の方法において、下記の工程を含む方法が提供される。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と前記測定対象成分とを任意の比率で混合した混合試料を調製する工程、
（３）前記混合試料中の各成分のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（４）一定の検出波長を用いて前記混合試料中の各成分のＨＰＬＣピ−ク面積を測定する工程、及び
（５）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程。
（各測定対象成分のε比）＝（基準成分のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）
【０００８】
本発明においては、ＮＭＲ測定において内標準物質を用いた方法を採用することもできる。すなわち、本発明の第１（ｂ）の態様によれば、上記第１の方法において、下記の工程を含む方法が提供される。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と内標準物質とを任意の比率で混合して第１の混合試料を調製し、この試料中の基準成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定して、積分係数を算出する工程、
（３）前記第１の混合試料に、任意量の前記測定対象成分を加えて第２の混合試料を調製する工程、
（４）前記第２の混合試料中の測定対象成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（５）一定の検出波長を用いて、前記第２の混合試料中の基準成分と測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積を測定する工程、及び
（６）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程。
（ε比）＝（内標準物質のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）×（積分係数）
【０００９】
本発明において、基準成分と測定対象成分において選択すべきＮＭＲのピークが全て重なる場合は、上記第１（ｂ）の態様によっては測定対象成分のＮＭＲ積分値を求めることができない。この場合は、次のような方法を提供することができる。すなわち、本発明の第１（ｃ）の態様によれば、上記第１の方法において、下記の工程を含む方法が提供される。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と内標準物質とを任意の比率で混合した第１の混合試料を調製し、この試料中の基準成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定して、積分係数を算出する工程、
（３）前記測定対象成分と前記内標準物質とを任意の比率で混合した第２の混合試料を調製して、この試料中の測定対象成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（４）第１の混合試料と第２の混合試料を混合して第３の混合試料を調製し、この混合試料中の基準成分と測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積を一定の検出波長を用いて測定する工程、
（５）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程、及び
（ε比）＝（内標準物質のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）×（積分係数）
【００１０】
なお、上記第１（ａ）〜（ｃ）の態様に係る方法は、ＵＶ吸光係数（ε）が異なる複数の成分を含有し、それらの成分の真の存在比が不明な測定対象試料の、各成分間のＵＶ吸光係数比（ε比）を算出する方法として利用できる。
【００１１】
次に、本発明の第２の態様によれば、ＵＶ吸光係数が異なる複数の成分を含有する測定対象試料において、各成分の真の存在比を求める方法であって、（１）ＵＶ吸光係数比を求める対象となる基準成分と測定対象成分を選択し、各成分の任意量についてＮＭＲ積分値とＨＰＬＣピーク面積とを求め、各成分間のＮＭＲ積分値比及び各成分間のＨＰＬＣピーク面積比を用いて、各成分間のＵＶ吸光係数比を算出し、（２）得られたＵＶ吸光係数比を用いて前記測定対象成分のＨＰＬＣピーク面積を補正することを特徴とする、上記各成分の真の存在比を求める方法が提供される。この方法において、各成分のＮＭＲ積分値は、好ましくは、各成分のＮＭＲスペクトルからそれぞれ選ばれる一つのシグナルから求められる。前記測定対象成分の、前記基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）は、例えば、下式により算出される。
（各測定対象成分のε比）＝（基準成分のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）
【００１２】
また、本発明は、上記第２の態様に係る方法（以下、「第２の方法」という）に基づいて、次の３つの具体的な方法を提供する。
すなわち、本発明の第２（ａ）の態様の方法によれば、上記第２の方法において、下記の工程を含む方法が提供される。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と前記測定対象成分とを任意の比率で混合した混合試料を調製する工程、
（３）前記混合試料中の各成分のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（４）一定の検出波長を用いて、前記混合試料中の各成分のＨＰＬＣピ−ク面積を測定する工程、
（５）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程、及び
（各測定対象成分のε比）＝（基準成分のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）
（６）各測定対象成分の真の存在比を下式により算出する工程。
（各測定対象成分の真の存在比）＝（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積比）／（各測定対象成分のε比）
【００１３】
さらに、本発明においては、上記第２（ａ）の態様のＮＭＲ測定において内標準物質を用いる方法を採用することもできる。すなわち、本発明の第２（ｂ）の態様によれば、上記１の方法において、下記の工程を含む方法が提供される。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と内標準物質とを任意の比率で混合して第１の混合試料を調製し、この試料中の基準成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定して、積分係数を算出する工程、
（３）前記第１の混合試料に、任意量の前記測定対象成分を加えて第２の混合試料を調製する工程、
（４）前記第２の混合試料中の測定対象成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（５）一定の検出波長を用いて、前記第２の混合試料中の基準成分と測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積を測定する工程、及び
（６）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程、及び
（ε比）＝（内標準物質のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）×（積分係数）
（７）各測定対象成分の真の存在比を下式により算出する工程。
（各測定対象成分の真の存在比）＝（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積比）／（各測定対象成分のε比）
【００１４】
さらに本発明においては、上記第１（ｃ）の態様のＵＶ吸光係数比を算出する方法を利用して、多成分混在試料中の各成分の真の存在比を算出することができる。すなわち、本発明の第２（ｃ）の態様によれば、上記２の方法において、下記の工程を含む方法が提供される。
（１）単離されている複数の成分の中から基準成分として一つの成分を、測定対象成分として一以上の成分を選択する工程、
（２）前記基準成分と内標準物質とを任意の比率で混合した第１の混合試料を調製し、この試料中の基準成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定して、積分係数を算出する工程、
（３）前記測定対象成分と前記内標準物質とを任意の比率で混合した第２の混合試料を調製して、この試料中の測定対象成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定する工程、
（４）第１の混合試料と第２の混合試料を混合して第３の混合試料を調製し、この混合試料中の基準成分と測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積を一定の検出波長を用いて測定する工程、
（５）各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を下式により算出する工程、及び
（ε比）＝（内標準物質のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）×（積分係数）
（６）各測定対象成分の真の存在比を下式により算出する工程。
（各測定対象成分の真の存在比）＝（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積比）／（各測定対象成分のε比）
【００１５】
上記第１（ａ）〜（ｃ）及び２（ａ）〜（ｃ）の態様に係る方法においては、各成分のＮＭＲ積分値は、好ましくは、各成分のＮＭＲスペクトルからそれぞれ選ばれる一つのシグナルから求められる。また、測定対象成分としては、ＮＭＲスペクトルのピークが重ならない限り、複数の成分を対象とすることができるが、通常は、一つの成分が選択される。また、上記工程（２）または（３）において調製される混合試料中の、各成分の混合比は、任意に設定することができるが、各成分の比率をおよそ１：１とするのが便宜的である。なお、上記ＨＰＬＣ測定工程で用いられる検出波長としては、例えば、基準成分のλｍａｘ近辺の波長が好ましく、具体的には基準成分のλｍａｘが挙げられる。内標準物質としては、例えば、４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−エチルヘキシル（パラベン）、アントラセン、ベンゼンなどが用いられる。
【００１６】
なお、本明細書において、「λｍａｘ」は最大吸収波長を、「ＵＶ吸光係数」は紫外吸光係数を、「ＮＭＲ積分値」はＮＭＲスペクトルの積分値を、「ＨＰＬＣピーク面積」はＨＰＬＣクロマトグラムのピーク面積を、「各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積比」は全体（全成分）のＨＰＬＣピーク面積の各測定対象成分のＨＰＬＣピーク面積に対する比を意味する。λｍａｘ近辺の波長としては、例えば±１０ｎｍ、好ましくは±５ｎｍの波長が用いられる。
【００１７】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明は、ＵＶ吸光係数（ε）が異なる複数の成分間のＵＶ吸光係数比（ε比）を算出する方法であって、より具体的には、ＵＶ検出ＨＰＬＣ法にて検出される既知物質に対する未知物質のＵＶ吸光係数比（ε比）を求める方法に関するものである。したがって、本発明の対象とする多成分混在試料は、例えば、既知物質に微量の未知物質が混在している試料である。より具体的には、本発明の対象とする多成分混在試料は、医薬物質である主化合物、その分解生成物や不純物などの未知の化合物を含む試料である。本発明は、このような多成分混在試料における未知物質の存在比を簡易かつ正確に測定することを可能とする。
【００１８】
まず、本発明のＵＶ吸光係数比算出法の準備工程として、測定の対象となる多成分試料から各成分を単離しておく。多成分混在試料中の各成分は、多成分混在試料中からＨＰＬＣ分取、液−液抽出、固相抽出法等により単離されることによって得ることが出来る。この試料は必ずしも純品である必要は無く、ＨＰＬＣピ−クおよびＮＭＲにおいて単独成分として解析できれば、他成分が混在していてもなんら問題とはならない。なお、試料の必要量はＮＭＲスペクトルが得られる必要最小量（１００μｇ程度）あれば十分であり、試料の調製法に関しては、目的化合物が純化される方法であれば、上述の限りではない。
【００１９】
本発明の方法においては、まず、上記のようにして単離された成分の中から基準成分と、測定対象成分を選択する。基準成分は、通常、構造既知の成分であり、測定対象成分は、例えば、その既知成分の分解生成物、あるいはその他の不純物などの未知化合物である。
【００２０】
次に、その基準成分と測定対象成分とを任意の比率で混合し、混合比のわかっている混合試料を調整する。ここで、測定対象成分は、ＮＭＲにおいてピークが重ならない限り複数選択することができるが、通常は、一つの成分を選択する。複数選択任意の比率は、適宜に選択できるが、およそ１：１とするのが、便宜的である。
【００２１】
そして、上記のようにして調製した混合試料をＮＭＲによって分析し、その混合試料中の各成分のＮＭＲ積分値を測定する。本発明において使用するＮＭＲの方式は、特に限定されず、公知のものがいずれも使用できるが、１Ｈ−ＮＭＲが特に好適に用いられる。ＮＭＲ装置としては、公知あるいは市販のものが使用できる。例えば、市販のＮＭＲ装置としては、ＤＲＸ−５００（Ｂｒｕｋｅｒ社製）などを用いることができる。ＮＭＲの測定条件などについては、使用するＮＭＲ装置に添付されるマニュアルなどを参照して当業者が適宜設定可能である。
【００２２】
ここで、「ＮＭＲ積分値」としては、１Ｈ−ＮＭＲを用いる場合は、通常、基準成分と各測定対象成分において、一つのプロトン分の積分値を用いる。尚、１Ｈ−ＮＭＲを用いる場合において、各測定対象成分が未知化合物である場合は、積分ピ−クのプロトン数は以下のように把握することができる。
【００２３】
本発明におけるＵＶ吸光係数比（ε比）の算出には、ＮＭＲスペクトル上のピ−クを積分する必要がある。この際、算出式には、通常１つ分のプロトン積分値を用いるので、未知化合物の積分対象ピ−クがいくつのプロトンから構成されているものかを把握しなければならない。未知化合物の構造が不明な以上、構造からのプロトン数把握はできないが、各ピ−クの積分値の比較から明らかに出来る。すなわち、未知化合物のＮＭＲスペクトルにおいて各ピ−クを積分し、低磁場側（５ｐｐｍ）以降のピ−クを積分するとき、ほとんどのピ−クはプロトン１つ分のピ−クとして考えられ、その他の高磁場側のピ−クはそれらの整数倍のピ−クとして積分されるはずである。以上の経験則より、積分対象のピ−クがいくつのプロトンから構成されているかを知ることができ、対象とするプロトン一つ分の積分値を求めることができる。
【００２４】
次に、得られた混合試料を、一定の検出波長を用いて、混合試料中の各成分のＨＰＬＣピ−ク面積を測定する。本発明においては、ＨＰＬＣの種類・装置は特に限定されず、公知あるいは市販のＨＰＬＣ装置を利用することができる。すなわち、本発明のシステムは、順相ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、イオン対ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣなどのいずれも使用可能である。市販のＨＰＬＣ測定装置としては、例えば、Ａｌｌｉａｎｃｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）などが知られている。ＨＰＬＣの測定条件（カラムのサイズ、充填剤・溶離液の種類など）についても、使用するＨＰＬＣ装置の添付マニュアルなどを参照して、当業者が適宜設定できるものである。本発明においては、検出装置として紫外線吸光検出装置が用いられる。ここで用いられる検出波長としては、基準成分のλｍａｘ近辺の波長が好ましく、具体的には基準成分のλｍａｘが用いられる。
【００２５】
なお、本発明において一般的に採用される測定手順をまとめると次のようになる。まず、測定対象化合物と、基準成分のＮＭＲスペクトルを各々確認しておき、混合した際に単独で積分できるピ−クを確認しておく。単独に任意量の基準成分と、任意量の測定対象成分とを混合した試料を調製し、ＮＭＲスペクトル上で各々の単独ピ−クを積分する。この混合試料をそのままＨＰＬＣに注入し、ＨＰＬＣチャ−ト上で各々のピ−ク面積を確認する。
【００２６】
このようにして得られた、基準成分と測定対象成分のＨＰＬＣピーク面積とＮＭＲ積分値をもとに、下記式に基づいて各測定対象成分の、基準成分に対するＵＶ吸光係数比（ε比）を算出する。
【００２７】
（ε比）＝（基準成分のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）
【００２８】
次に、本発明は、多成分混在試料における各成分の真の存在比を算出する方法をも提供する。すなわち、多成分混在試料中の、基準成分と各測定対象成分の真の存在比を算出する場合は、上述した方法によって求めたε比と各測定対象成分のＨＰＬＣピーク面積を用いて、各測定対象成分の真の存在比を下式により算出することができる。
【００２９】
（各測定対象成分の真の存在比）＝（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積比）／（各測定対象成分のε比）
【００３０】
このような本発明の方法によって、未知化合物が微量混入する試料において、そのような未知化合物の混入量を簡易かつ正確に測定することができるのである。
【００３１】
本発明は、測定対象成分と基準成分とがＮＭＲスペクトル上にて単独積分できることが望ましいが、単独積分できない場合、内標準物質を用いて実施することが可能である。内標準物質としては、ＮＭＲスペクトルにて基準成分または測定対象成分と単独で測定できることが条件であり、使用する溶媒に溶解するものであれば何を用いてもよい。このような内標準物質としては、例えば、４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−エチルヘキシル（パラベン）、アントラセン、ベンゼン等の低磁場に出現するプロトンを有する低分子化合物が挙げられる。
【００３２】
内標準物質を用いる場合、あらかじめ内標準物質と基準成分（または各測定対象成分）を任意の比率で（例えば、１：１）混合して第１の混合試料を調製しておく。この混合溶液についてＮＭＲスペクトルを測定し、内標準物質と基準成分（または各測定対象成分）との積分値比を積分係数として求めておく。ここで、「積分係数」とは、基準成分／内標準物質混合溶液における基準成分と内標準物質のＮＭＲ積分値比（基準成分のＮＭＲ積分値／内標準物質のＮＭＲ積分値）をいう。次いで、この第１の混合試料に、任意量の測定対象成分を混合して第２の混合試料を調製し、この試料中の測定対象成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定する。さらに、一定の検出波長を用いて、第２の混合試料中の基準成分と測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積を測定する。このようにして、必要な数値を求めた後、下式に基づいてε比を算出する。
【００３３】
（ε比）＝（内標準物質のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）×（積分係数）
【００３４】
さらに、基準成分と各測定対象成分との真の存在比を求める場合は、上述したと同様に下記式によって算出することができる。
（各測定対象成分の真の存在比）＝（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積比）／（各測定対象成分のε比）
【００３５】
さらに、本発明においては、基準成分と測定対象成分において選択すべきＮＭＲのピークがすべて重なる場合は、上記の第２の混合試料によっては、測定対象成分のＮＭＲ積分値を測定することができない。この場合は、基準成分と内標準物質とを任意の比率で混合した第１の混合試料を調製し、この試料中の基準成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定して、積分係数を算出しておき、これと別個に、前記測定対象成分と前記内標準物質とを任意の比率で混合した第２の混合試料を調製して、この試料中の測定対象成分と内標準物質のＮＭＲ積分値を測定しておく。次いで、第１の混合試料と第２の混合試料を混合して第３の混合試料を調製し、この混合試料中の基準成分と測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積を一定の検出波長を用いて測定する。このようにして必要な数値を全て求め、上述の式にそれらの数値を代入することによって、各測定対象成分のε比あるいは各測定対象成分の真の存在比を求めることができる。
【００３６】
なお、本発明を実施する際に、ＮＭＲの積分値の真度が問題となる場合がある。ＮＭＲにおける積分値の真値からのずれは、主にベ−スラインのゆがみによる積分曲線のゆがみに由来する。従って、本発明方法においては、ベ−スラインのゆがみの影響を受けないように積分曲線の両端を水平に保つ補正操作を行うことが好ましい。
【００３７】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例により何ら制限されるものではない。
【００３８】
【実施例】
以下の実施例においては、ＮＭＲスペクトルは核磁気共鳴装置　ＤＲＸ−５００（Ｂｒｕｋｅｒ株式会社製）を用いて測定し、ＨＰＬＣピーク面積はＡｌｌｉａｎｃｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて測定した。
【００３９】
〔参考例１〕本発明の算出方法の真度
実際に分子量が既知で純度が保証されている化合物として、ＧＭ−６１１（検体開発コ−ド名、下記構造式（Ｉ）で表される化合物の１／２フマル酸塩）および４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−エチルヘキシルを用い真度の確認を行った。
【００４０】
【化１】
2004077264.tif 000002
【００４１】
なお、ＧＭ−６１１のＵＳＡＮ登録名は、［２Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１１Ｒ，１２Ｒ］−９−［（２，６−ジデオキシ−３−Ｃ−メチル−３−Ｏ−メチル−α−Ｌ−リボ−ヘキソビラノシル）オキシ］−５−エチル−４−メトキシ−２，４，８，１０，１２，１４−ヘキサメチル−１１−［［３，４，６−トリデオキシ−３−（イソプロピルメチルアミノ）−β−Ｄ−キシロ−ヘキソピラノシル］オキシ］−６，１５−ジオキサビシクロ［１０．２．１］ペンタデセ−１４（１）−エン−３，７−ジオン（Ｅ）−２−ブテンジオイック酸塩　（２：１）（［２Ｓ，４Ｒ，５Ｒ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１１Ｒ，１２Ｒ］−９−［（２，６−ｄｉｄｅｏｘｙ−３−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌ−３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−α−Ｌ−ｒｉｂｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｏｘｙ］−５−ｅｔｈｙｌ−４−ｍｅｔｈｏｘｙ−２，４，８，１０，１２，１４−ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌ−１１−［［３，４，６−ｔｒｉｄｅｏｘｙ−３−（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−β−Ｄ−ｘｙｌｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］ｏｘｙ］−６，１５−ｄｉｏｘａｂｉｃｙｃｌｏ［１０．２．１］ｐｅｎｔａｄｅｃ−１４（１）−ｅｎｅ−３，７−ｄｉｏｎｅ（Ｅ）−２−ｂｕｔｅｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｓａｌｔ（２：１））である。ＧＭ−６１１は、国際公開ＷＯ０２／１８４０３号公報および国際公開ＷＯ０２／３０９４３号公報の方法に従って製造した。
【００４２】
ＧＭ−６１１（１５．２３ｍｇ）および４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−エチルヘキシル（２．０１ｍｇ）を精密に秤量し、１ｍＬのＣＤＣｌ３に溶解した溶液を調製した。ベ−スラインのゆがみの影響を受けないように積分曲線の両端を水平に保つ補正操作を行った後に、この混合溶液について１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、ＧＭ−６１１として５．６ｐｐｍのピーク、４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−エチルヘキシルとして７．９７ｐｐｍのピークについて積分値比を算出した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルとそれぞれの積分値比を図１に示す。この結果、ＧＭ−６１１と４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−エチルヘキシルの積分値比は１．００００：０．９６３０であった。これは秤量値から以下の式で求められる理論積分値比１．００００：０．９６２０と一致した。
従って、本発明におけるＮＭＲスペクトル積分値の真度は保証されたと考えられた。
【００４３】
〔理論積分値比〕
ＧＭ−６１１のシグナル強度：４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ヘキシルのシグナル強度＝ＧＭ−６１１秤量値（ｍｇ）／ＧＭ−６１１の分子量：４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ヘキシル秤量値（ｍｇ）×２／４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ヘキシルの分子量
【００４４】
ＧＭ−６１１の分子量＝８１４．０２
４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−ヘキシル＝２２２．２８
【００４５】
〔実施例１〕ＧＭ−６１１における熱分解物ＴＤ２の対ＧＭ−６１１ＵＶ吸光係数比（ε比）を求めた例
室温−６１箇月経過後におけるＧＭ−６１１原体の純度試験のＨＰＬＣクロマトグラム（測定波長２６０ｎｍ）を図２に示す。
図２のｆのピ−クを単離し、凍結乾燥した（以下、これをＴＤ２という）。ＴＤ２をＣＤＣｌ３約０．６ｍＬに溶解し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した（図３）。
【００４６】
このＴＤ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルとＧＭ−６１１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルとの比較において、重複しないシグナルを各々一つずつ選択し、ε比算出用シグナルとした。両者のＮＭＲスペクトル全体を比較した例を図４に示す。選択したシグナルは、図中、矢印で示した。
ＴＤ２試料溶液にＧＭ−６１１のＣＤＣｌ３溶液を少量ずつ、ＴＤ２：ＧＭ−６１１がほぼ１：１となるよう添加し、選択したＴＤ２由来シグナルと、ＧＭ−６１１由来のシグナルの正確な積分値を求めた（図５）。
この混合溶液を５０μＬとり、移動相にて１ｍＬに希釈したあと、そのうち５０μＬをＨＰＬＣに注入したときのクロマトグラムを図６に示す。ＵＶ２６０ｎｍにおけるＴＤ２とＧＭ−６１１のピ−ク面積により、ＴＤ２のＵＶ吸光係数比（ε比）を以下の式に代入して求めた。
【００４７】
ε比＝（基準成分のＮＭＲ積分値＊１）／各測定対象成分のＮＭＲ積分値＊１））×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）＝１．０５４／１×７４１５９４／１３３７７４＝５．８４
＊１）：　プロトン１つ分の積分値。
【００４８】
〔実施例２〕ＧＭ−６１１における熱分解物ｈ’の対ＧＭ−６１１ＵＶ吸光係数比（ε比）を求めた例
室温−６１箇月経過後におけるＧＭ−６１１原体の純度試験のＨＰＬＣクロマトグラム（測定波長２６０ｎｍ）を図２に示す。参考例１のとおりに、ＧＭ−６１１および内標準物質４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−エチルヘキシルを各々ＣＤＣｌ３約０．６ｍＬに溶解し、両者の積分値がほぼ１：１になるように混合した。得られた混合溶液の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは図１に示した通りである。
一方で、単離されたｈ’凍結乾燥品をＣＤＣｌ３約０．６ｍＬに溶解し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。得られた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図７に示す。
【００４９】
ｈ’とＧＭ−６１１および内標準物質溶液の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルとの比較において、重複しないシグナルを各々一つずつ選択し、ε比算出用シグナルとした。三者のＮＭＲスペクトル全体を比較した例を図８に示す。図中、選択したシグナルを矢印で示す。尚、図８において「Ｐａｒａｂｅｎ」は内標準物質である４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−エチルヘキシルを示す。
ｈ’試料溶液にＧＭ−６１１／内標準物質溶液のＣＤＣｌ３溶液を少量ずつ添加し、選択したｈ’由来シグナルと、内標準物質（Ｉ．Ｓ．）由来のシグナルの正確な積分値を求めた（図９）。
この混合溶液を５０μＬとり、移動相にて１ｍＬに希釈したあと、そのうち５０μＬをＨＰＬＣに注入したときのクロマトグラムを図１０に示す。ＵＶ２６０ｎｍにおけるｈ’とＧＭ−６１１のピ−ク面積比により、ｈ’のＵＶ吸光係数比（ε比）を以下の式に代入して求めた。
【００５０】
ε比＝（内標準物質のＮＭＲ積分値／各測定対象成分のＮＭＲ積分値）×（各測定対象成分のＨＰＬＣピ−ク面積／基準成分のＨＰＬＣピ−ク面積）×積分係数＊２）＝１．２１２３／１×７６５９４７／１３９７６８×１．０３８＝６．９０＊２）：　基準成分／内標準物質混合溶液における基準成分と内標準物質の積分値比
【００５１】
〔実施例３〕
２５℃−１２箇月経過後のＧＭ−６１１原体中のＧＭ−６１１純度を、ＨＰＬＣピーク比によって求めたところ、９２．２％であった。一方、実施例１または２と同様にして図２に示された１４のピークそれぞれにつき、ＧＭ−６１１に対するε比を求め、それらε比より同一試料のＧＭ−６１１純度を求めたところ、９７．８重量％となった。本発明方法での結果は、ＵＶ吸光係数比（ε比）に影響を受けない従来方法（以下に示される定量試験）にて同一試料のＧＭ−６１１含量を調べた結果（９６．５重量％）とほぼ一致し、信頼性の高いものと考えられた。なお、この定量試験における変動係数（ＣＶ）は０．２８％であった。
【００５２】
（定量試験）
内部標準物質と、ほぼ１００％の純度を持つＧＭ−６１１標準品とを一定比率で混合した標準溶液を調整した。同様に内部標準物質と、含量未知のＧＭ−６１１とを一定比率で混合した試料溶液を調製した。これらを各々ＨＰＬＣにて分析し、試料に用いたＧＭ−６１１の含量を以下の式で求めた。
ＧＭ−６１１含量（％）＝（試料溶液のＧＭ−６１１ＨＰＬＣピーク面積／標準溶液中のＧＭ−６１１ＨＰＬＣピーク面積）×（標準溶液中の内部標準物質ＨＰＬＣピーク面積／試料溶液中の内部標準物質ＨＰＬＣピーク面積）×（ＧＭ−６１１標準品秤量値／ＧＭ−６１１試料秤量値）
【００５３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法によれば、ＵＶ吸光係数（ε）が異なる複数の成分間が存在する系において、ＨＰＬＣおよびＮＭＲを用いてＵＶ吸光係数比（ε比）を簡易に算出することができる。また、本発明は、ε比を求める測定対象成分は微量でよいので、純度の高い測定対象成分を大量に調製する必要もないという利点を有する。さらに、本発明の方法により求められたε比により、それら成分の真の存在比を簡易かつ正確に算出することも可能である。したがって、本発明によれば、医薬化合物に微量混入するその分解物あるいは不純物の量を、簡易かつ正確に測定できる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＭ−６１１および４−ヒドロキシ安息香酸ｎ−エチルヘキシルを混合した溶液の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である（同時に積分値比を算出し表示している）。
【図２】室温−６１箇月経過後におけるＧＭ−６１１原体の純度試験のＨＰＬＣクロマトグラム（測定波長２６０ｎｍ）の一例である。
【図３】ＴＤ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図４】ＧＭ−６１１およびＴＤ−２を混合した溶液の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図５】選択された（１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて重複しない）ＴＤ２由来シグナルと、ＧＭ−６１１由来のシグナルの一例である（同時に積分値比を算出し表示している）。
【図６】図５で測定に供された混合溶液のＨＰＬＣクロマトグラム（測定波長２６０ｎｍ）の一例である。
【図７】成分ｈ’の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図８】ＧＭ−６１１／内標準物質および成分ｈ’を混合した溶液の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの一例である。
【図９】選択された（１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて重複しない）成分ｈ’由来シグナルと、内標準物質由来のシグナルの一例である（同時に積分値比を算出し表示している）。
【図１０】図９で測定に供された混合溶液のＨＰＬＣクロマトグラム（測定波長２６０ｎｍ）の一例である。
【図１】
2004077264.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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