(57)【要約】【課題】ＤＮＡ等の核酸検出用センサの検出感度を向上させることを目的とした、核酸検出用チップにおける手段を提供すること。【解決手段】親水性ポリマーが、チップ表面に起立した状態で固定されているセンサチップ表面において、当該親水性ポリマー同士のチップ表面上における隙間に、核酸が、チップ表面に対して起立した状態で、直接的または間接的に固定されている、核酸検出用チップ表面等を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ポリマーが、チップ表面に起立した状態で固定されているセンサチップ表面において、当該親水性ポリマー同士のチップ表面上における隙間に、核酸が、チップ表面に対して起立した状態で、直接的または間接的に固定されている、核酸検出用チップ表面。
【請求項２】
親水性ポリマーが、炭素原子数が２〜４のアルキレンオキシドをモノマー単位とする、重合度が２〜１００００のポリアルキレンオキシドである、請求項１記載の核酸検出用チップ表面。
【請求項３】
アルキレンオキシドが、エチレンオキシドをモノマー単位とする、重合度が２〜１００００のポリエチレンオキシドである、請求項２記載の核酸検出用チップ表面。
【請求項４】
親水性ポリマーが、下記（ａ）および（ｂ）の特徴を有するブロックポリマーの第１のブロックを構成する親水性ポリマーセグメントであり、かつ、第２のブロックを構成するポリマーセグメントの、センサチップ表面の支持体に配位能を有する官能基を介して、下記のブロックポリマーがセンサチップ表面に固定されている、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸検出用チップ表面。（ａ）上記親水性ポリマーセグメントを第１のブロックとする。
（ｂ）センサチップ表面の支持体に配位能を有する官能基を有するモノマーをモノマー単位とする、重合度が１〜２００のポリマーセグメントを第２のブロックとする。
【請求項５】
センサチップ表面の支持体に配位能を有する官能基が、メルカプト基、ジチオール基、スルフィド基、アミノ基、カルボキシル基、シラノール基、または、炭素原子数が１〜５のトリアルキルシリル基である、請求項４記載の核酸検出用チップ表面。
【請求項６】
ブロックポリマーの第２のブロックが、式（５）
【化１】
2004226384.tif 000010
［式中、ｍは１〜１０の整数、ｎは１〜１００の整数を表し、Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、炭素原子数が１〜５のアルキル基、アミノ基、メルカプト基、または、スルフィド基を表す］で表される、メタクリル酸ポリマーのセグメントである、請求項１〜４のいずれかに記載のセンサチップの表面。
【請求項７】
核酸が、メルカプト基、ジチオール基、スルフィド基を介して、ブロックポリマーの他ブロックに結合することにより、チップ表面に担持されている、請求項４〜６のいずれかに記載の核酸検出用チップの表面。
【請求項８】
親水性ポリマーおよび核酸が、０．０１〜１分子／ｎｍ２の密度で担持されている、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸検出用チップの表面。
【請求項９】
さらに、マスキング処理がなされている、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸検出用チップの表面。
【請求項１０】
マスキング処理に用いられるマスキング剤が、式（９）
【化２】
2004226384.tif 000011
［式中、ｑは、１〜２００の整数であり、Ｒ６は、水酸基、炭素原子数が１〜６のアルキル基であり、Ｒ７は、水素原子、炭素原子数が１〜６のアルキル基、または、ピリジルチオ基である］
で表される物質である、請求項９記載の核酸検出用チップの表面。
【請求項１１】
マスキング処理に用いられるマスキング剤が、２−メルカプトエタノールである、請求項９記載の核酸検出用チップの表面。
【請求項１２】
センサチップ表面の支持体が、金、銀、銅、および、アルミニウムからなる群から選ばれる素材で形成されている、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸検出用チップの表面。
【請求項１３】
センサチップ表面の支持体が、ガラス、半導体、カーボン、金属酸化物、および、合金酸化物からなる群から選ばれる素材で形成されている、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸検出用チップの表面。
【請求項１４】
核酸が、１本鎖ＤＮＡである、請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸検出用チップの表面。
【請求項１５】
核酸の一方の末端に、直接的または間接的に付加されている、メルカプト基、スルフィド基、アミノ基、シラノール基、若しくは、カルボキシル基を介してセンサチップ表面に、当該核酸が結合している、請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸検出用チップの表面。
【請求項１６】
核酸の一方の末端にビオチニル基が、直接的または間接的に付加され、かつ、アビジニル基を介してなる、アビジン−ビオチン結合によって、当該核酸がセンサチップ表面に結合している、請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸検出用チップの表面。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の表面を有する核酸検出用チップ。
【請求項１８】
核酸検出用チップと、核酸試料を接触させて、当該センサチップの固定化核酸とのハイブリダイズを検出する、請求項１７記載の核酸検出用チップの使用方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の核酸検出用チップの使用方法において、核酸同士のハイブリダイズの検出が、表面プラズモン共鳴を利用するセンサによって行われる、核酸検出用チップの使用方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれかに記載の核酸検出用チップの使用方法において、核酸同士のハイブリダイズの検出が、電気化学発光源を標識物質として用いることにより行われる、核酸検出用チップの使用方法。
【請求項２１】
電気化学発光源が、ルテニウム錯体である、請求項２０記載の核酸検出用チップの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオセンサにおいて用い得る、センサチップに関する発明であり、特に、核酸検出用のセンサチップに関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
バイオセンサは、例えば、生物学的な試料を検体とした、特定の被検物質の検出に適しており、現在、様々なバイオセンサが提案されている。バイオセンサの典型的な態様として、センサチップ表面に担持された核酸におけるハイブリダイズ等を検出するための、核酸検出用センサが挙げられる。
【０００３】
核酸検出用センサとしても好適に用い得る、主要なバイオセンサの一つとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用するバイオセンサ（以下、ＳＰＲセンサともいう）が提供されている。このＳＰＲセンサは、プリズムの底面に金や銀等の金属薄膜を形成し、金属薄膜の裏面からレーザーなどの光を、入射角度を変えながら入射して、その反射光を測定し、金属表面プラズモンと共鳴して吸収される、特定入射角度の光を指標として、当該金属表面で起きている、核酸のハイブリダイゼーション等の反応を検出することが可能なバイオセンサであり、金属薄膜の表面およびその近傍における屈折率の変化に対して鋭敏であることが知られている（例えば、Ａ．Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｎｃｔ．Ｂｉｏｌ．５（１９９５）６９９−７０５）。
【０００４】
特に、近年、遺伝子の解読が進み、１塩基置換変異等の、核酸の微妙な変異を感度良く検出することが要求されており、非特異的な反応が抑制され、簡便、かつ、鋭敏に、所望する核酸の変異を検出可能な核酸検出用センサの提供が待ち望まれている。
【０００５】
後述する本発明に関連する先行文献として、例えば、以下に掲げる文献が挙げられる。
１．特開平７−３１６２８５号公報（特許文献１）
特許文献１には、ＳＰＲセンサのチップの表面において用い得る、ポリアルキレンオキシド誘導体の製造方法が記載されているが、この文献自体には、ポリアルキレンオキシド誘導体のバイオセンサへの応用に関する開示はなされていない。
【０００６】
２．特開平１１−３２２９１６号公報（特許文献２）
特許文献２には、ＳＰＲセンサの表面において、さらに好適に用い得る、ビオチン残基をω末端に有する、ポリオキシエチレン誘導体について開示されているが、この文献自体には、このヘテロポリオキシエチレン誘導体のバイオセンサへの応用に関する開示はなされていない。
【０００７】
３．特開２００１−２０００５０号公報（特許文献３）
特許文献３には、ポリエチレングリコール誘導体が担持された、金等の金属微粒子が、分散性が良好である旨等が記載されているが、この文献自体には、この金属微粒子のバイオセンサへの応用に関する開示はなされていない。
【０００８】
４．特開２００２−８０９０３号公報（特許文献４）
特許文献４には、ポリエチレングリコールをブロックとして有し、かつ、特定のメタクリル酸ポリマーを他のブロックとして有する、ブロックポリマー誘導体が担持された、金等の金属微粒子について開示されているが、この文献自体には、この金属微粒子のバイオセンサへの応用に関する開示はなされていない。なお、この特許文献４のブロックポリマーは、本発明においても用い得るブロックポリマーである。
【０００９】
５．特許第２８１５１２０号公報（特許文献５）
特許文献５には、ＨＳ−Ｒ−Ｙ（Ｒは、炭素原子数が１０を超える、ヘテロ原子で中断されていてもよい炭化水素基であり、Ｙは、リガンド又は生適合性多孔質マトリックスを共有結合させるための活性基である）で表される有機分子を用いて、そのチオール基を介して、金、銀等の自由金属の膜表面へ結合させて、この有機分子が密に詰め込まれた単層を設け、次いで、生適合性多孔質マトリックスとして、アガロース、デキストラン、ポリエチレングリコール等からなるヒドロゲルを共有結合した表面が記載されている。
【００１０】
６．特許第３０７１８２３号公報（特許文献６）
特許文献６には、保持材上へ、チオール基の硫黄原子を介して結合したスペーサー分子に、親水性リンカー部とビオチン誘導体残基等の固相反応物質が順に共有結合した表面が記載されている。
【００１１】
７．特開２００１−１７８４４２号公報（特許文献７）
特許文献７には、末端部にチオール基を有するＤＮＡ断片と、当該チオール基と反応して共有結合を形成し得る反応性置換基を有する鎖状分子が、一方の末端で表面に固定された固相担体とを液相にて接触させることにより、当該ＤＮＡ断片と鎖状分子との間で共有結合を形成させることを特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法、が記載されている。
【００１２】
８．「Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１９９８，１２０，６５４８−６５５５」（非特許文献１）非特許文献１には、ＨＳ−スペーサー分子−親水性リンカーをベースとする化合物を用い、チオール基を介して、金表面に自己集積した単層が記載されている。また、親水性リンカー部が、エチレンオキシド単位３個の化合物と、エチレンオキシド単位６個の化合物との混合物から形成された表面は、細胞のリガンド特異的結合を促進するが、付着した細胞による蛋白質の堆積を低減することも教示されている。
【００１３】
９．「Ｐａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０（１９９９）８８５−８９０（非特許文献２）
非特許文献２には、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシドのトリブロックポリマーの様々な２種の組み合わせ物を、ＳＰＲの検出用金属薄膜上に付着させた表面が記載されている。また、当該表面においては、溶液中に、ポリエチレンオキシド鎖が伸長し、ブラシ様構造物（ｂｒｕｓｈ−ｌｉｋｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を形成し得ることが示唆されている。
【００１４】
【特許文献１】
特開平７−３１６２８５号公報
【特許文献２】
特開平１１−３２２９１６号公報
【特許文献３】
特開２００１−２０００５０号公報
【特許文献４】
特開２００２−８０９０３号公報
【特許文献５】
特許第２８１５１２０号公報
【特許文献６】
特許第３０７１８２３号公報
【特許文献７】
特開２００１−１７８４４２号公報
【非特許文献１】
Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１９９８，１２０，６５４８−６５５５
【非特許文献２】
Ｐａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０（１９９９）８８５−８９０
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、核酸検出用のセンサ等のバイオセンサにおいて用いるチップにおける共通の課題の一つとして、バイオセンサの検出感度の向上が挙げられる。
【００１６】
例えば、上記の従来技術のうち、バイオセンサにおいて用いるチップと直接関係がある技術（特許文献５，６、非特許文献１，２）は、すべて、チップ表面における非特異的な反応を可能な限り抑制して、バイオセンサの検出感度の向上を目的とするものである。
【００１７】
また、本発明者の一部は、上記の非特異的な反応を抑制することを目的として、ＳＰＲセンサチップの表面に、鎖長の異なるポリエチレンオキシド誘導体のブラシ状構造物を担持することによって、検出感度が向上することを見いだし、特許出願を行った（特願２００２−６５２９８号）。さらに、ポリエチレンオキシド誘導体で処理した金属微粒子を、ＳＰＲセンサチップの表面に担持することによっても、検出感度が向上することを見いだし、特許出願を行った（特願２００２−１０１１３４号）。
【００１８】
このように、バイオセンサの検出感度を向上させることを目的とした、センサチップに関する検討は、バイオセンサの検出感度の、さらなる向上を目指してなされており、依然として、この課題が、バイオセンサの分野においては重要である。
【００１９】
本発明が解決すべき課題は、バイオセンサの中でも、特に、ＤＮＡ等の核酸検出用センサの検出感度を向上させることを目的とした、核酸検出用チップにおける手段を提供することにある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、この課題を解決するために、さらに、非特異的な反応が抑制され得る、核酸検出用のセンサチップの表面構造について検討を行った。その結果、センサチップの表面に、親水性ポリマーのブラシ状構造を設けて、核酸を、このブラシ状構造の間に担持させることによって、チップ表面において核酸をハイブリダイズさせる際の、非特異的な反応が、著しく抑制されることを見いだし、本発明を完成した。
【００２１】
すなわち、本発明は、親水性ポリマーが、チップ表面に起立した状態で固定されているセンサチップ表面において、当該親水性ポリマー同士のチップ表面上における隙間に、核酸が、チップ表面に対して起立した状態で、直接的または間接的に固定されている、核酸検出用チップ表面（以下、本チップ表面ともいう）、本チップ表面を有するセンサチップ（以下、本チップともいう）、および、本チップの使用方法（以下、本使用方法ともいう）、を提供する発明である。
【００２２】
なお、上述した特許文献７には、本発明のように、親水性ポリマーのブラシ状構造物を設けたチップ表面への核酸分子の担持については、記載も示唆もなされていない。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本チップは、表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサ（ＳＰＲセンサ）における検出に用いるのが好適であるが、これに限定されるものではなく、核酸とその相補鎖の組における結合対の形成により、チップ表面に生ずる何らかの変化を検出することが可能なセンサであれば、いかなる範疇のセンサにおいても用いることができる。検出対象となる変化としては、上記の表面プラズモン共鳴以外に、放射能、接触角、沈降、紫外分光、蛍光、化学発光、電気化学発光等を挙げることができる。
【００２４】
ブラシ状構造物
本チップ表面に担持され得るブラシ状構造物として用いる親水性ポリマーは、具体的には、式（１）
【００２５】
Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｂ          （１）
［式中、Ａは、本チップ表面の支持体に配位可能な官能基であり、Ｌは、２価の基または原子価結合であり、Ｐは、親水性ポリマーセグメントであり、Ｂは、１価の基である］
で表される、親水性ポリマー誘導体として，官能基Ａの本チップ表面の支持体に対する配位を行い、本チップ表面に担持することにより、所望するブラシ状構造物とすることができる。
【００２６】
官能基Ａとしては、具体的には、例えば、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、スルフィド基、または、式（２）
【００２７】
【化３】
2004226384.tif 000002
【００２８】
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一であっても異なってもよく、炭素原子数が１〜６のアルキル基を表す］で表される基を挙げることができる。
これらの基のうち、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、または、スルフィド基は、本チップ表面の支持体の素材が、金、銀、銅、アルミニウム等の金属であることが好適である。また、式（２）で表される基は、同素材が、ガラス；ＣｄＳ、ＺｕＳ等の半導体；グラファイト等のカーボン；酸化チタン、Ａｌ２Ｏ３等の金属酸化物であることが好適である。
【００２９】
なお、本チップ表面の素材、すなわち、本チップ表面の支持体の素材は、本チップの基板の素材と同一（すなわち、基板自体が、本チップ表面を形成する）とすることも可能であり、基板の表面に、金属等の薄膜を形成して、この金属等を支持体とすることも可能である。
【００３０】
親水性ポリマーセグメントＰとしては、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸等を例示することができるが、ポリアルキレンオキシドが好適である。
【００３１】
特に、ポリアルキレンオキシドが、炭素原子数が２〜４のアルキレンオキシド、すなわち、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、または、ブチレンオキシドをモノマー単位とする、ポリアルキレンオキシドであることが、好適である。また、ポリアルキレンオキシドにおける、アルキレンオキシド単位の重合度は、２〜１００００が好適であり、特に好適には、１０〜３０００である。
【００３２】
１価の基Ｂは、ブラシ状構造物の先端に相当する、親水性ポリマーセグメントＰの末端を構成し得る基であることが好適である。具体的には、水素原子、炭素原子数が１〜６のアルキル基、水酸基、アセタール基等を例示することができる。
【００３３】
また、Ｌがとり得る２価の基としては、例えば、炭素原子数が１〜１２，好適には１〜３のアルキレン基、さらに、基（３）
【００３４】
【化４】
2004226384.tif 000003
【００３５】
［式中、Ｌ１は、−ＣＯＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−等の２価基を表し、ｐは、１〜１２、好適には、１〜３である］
等を挙げることができる。
【００３６】
親水性ポリマー誘導体（１）は、その具体的な構造に応じて、すでに公知の手段で製造することができる。例えば、親水性ポリマーセグメントＰが、ポリアルキレンオキシドの場合には、特開平７−３１６２８５号公報（特許文献１）等に記載の方法と条件に従い、または、改変して製造することができる。
【００３７】
ここに、このブロックポリマー誘導体（１）として、アセタール−ＰＥＧ−ＳＨの製造工程の一例を開示する。なお、この製造工程において、ｒは正の整数を意味する。
【００３８】
【化５】
2004226384.tif 000004
【００３９】
チップ表面に、上記の親水性ポリマーセグメントＰに相当するブラシ状構造物を構築する際に、親水性ポリマー誘導体（１）の官能基Ａが、メルカプト基、アミノ基、カルボキシル基、または、スルフィド基である場合は、適切な緩衝化した水溶液に、ブロックポリマー誘導体（１）を溶解し、このポリマー溶液を、適温、例えば、２０〜３７℃程度で、浸漬等により、チップの支持体（金、銀、銅、アルミニウム等の金属）表面に接触させた状態で、数１０分〜数時間のインキュベートを行うことにより、所望するブラシ状構造物が設けられたチップ表面を製造することができる。このポリマー溶液における、ブロックポリマー誘導体（１）の濃度は、用いるブロックポリマーの分子量により異なるが、通常、溶液の０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、好適には１ｍｇ／ｍｌ程度である。
【００４０】
また、官能基Ａが、基（２）である場合には、ブロックポリマー誘導体（１）を好適には無水の有機溶媒（例えば、トルエン等のポリマー易溶性有機溶媒）に溶解した溶液を用い、チップの支持体（ガラス、半導体、セラミック、カーボン、金属酸化物）の表面へのポリマーの結合または付着処理を行い、溶媒を留去した後、表面に対して未反応のポリマーを、当該有機溶媒で洗浄除去することの他は、上記の官能基Ａがメルカプト基等の場合と同様に処理することにより、所望するブラシ状構造物が設けられたチップ表面を製造することができる。
【００４１】
ブロックポリマー誘導体
本発明の好適な態様として、チップ表面上のブラシ状構造物を構成する親水性ポリマーが、下記の特徴（ａ）および（ｂ）を有するブロックポリマー（４）の第１のブロックを構成する親水性ポリマーセグメントであり、かつ、第２のブロックを構成するポリマーセグメントの、センサチップ表面の支持体に配位能を有する官能基を介して、下記のブロックポリマーがセンサチップ表面に固定されている態様を挙げることができる。
【００４２】
（ａ）上記の親水性ポリマーセグメントを第１のブロックとする。
（ｂ）センサチップ表面の支持体に配位能を有する官能基を有するモノマーをモノマー単位とする、重合度が１〜２００のポリマーセグメントを第２のブロックとする。
【００４３】
第１のブロックにおける親水性ポリマーセグメントは、上述した親水性ポリマーセグメントＰと同一である。
また、第２のブロックにおけるポリマーセグメントにおける、センサチップ表面の支持体に配位能を有する官能基としては、例えば、メルカプト基、ジチオール基、スルフィド基、アミノ基、カルボキシル基、シラノール基、または、炭素原子数が１〜５のトリアルキルシリル基等を挙げることができる。これらの官能基を有するモノマー単位としては、例えば、メタクリル酸（２−ジエチルアミノエチル）、メタクリル酸（２−ジメチルアミノエチル）、ポリシステイン、ポリリジン、ポリグルタミン、メタクリル酸（３−トリメトキシシリルプロピル）等を挙げることができる。これらのモノマー単位を、常法に従い、重合反応を、当該ブロックポリマー誘導体（４）の製造工程において行うことにより、所望する官能基を有する第２のブロックを形成することができる。
【００４４】
さらに、第２のブロックの好適な態様の一つとして、式（５）
【００４５】
【化６】
2004226384.tif 000005
【００４６】
［式中、ｍは１〜１０の整数、ｎは１〜１００の整数を表し、Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、炭素原子数が１〜５のアルキル基、アミノ基、メルカプト基、または、スルフィド基を表す］で表される、メタクリル酸ポリマーのセグメントを挙げることができる。
【００４７】
このメタクリル酸ポリマー（５）を第２のブロックとする、ブロックポリマー誘導体（４）の製造工程については、特開２００２−８０９０３号公報（特許文献４）において詳細に開示されており、これに従い、所望するメタクリル酸ポリマー（５）を第２のブロックとする、ブロックポリマー誘導体（６）を製造することができる。
【００４８】
すなわち、例えば、式
Ａ−Ｌ−Ｐ−ＯＨ          （７）
［式中のＡ、Ｌ、Ｐの定義は、それぞれ、親水性ポリマー誘導体（１）における定義と同一である］
の化合物（７）［この化合物（７）の製造方法自体も、公知である（例えば、特開平７−３１６２８５号公報：特許文献１、特開平１１−３２２９１６号公報：特許文献２、特開２００１−２０００５０号公報：特許文献３等を参照のこと）］に対して、ポリメタクリル酸ジメチルアミノエチルを、所望する重合度になるように、重合反応することにより、ブロックポリマー誘導体（６）を得ることができる。
【００４９】
ここに、このブロックポリマー誘導体（６）として、アセタール−ＰＥＧ／ＰＡＭＡの製造工程の一例を開示する。なお、この製造工程において、ｓおよびｔは、それぞれ正の整数を意味する。
【００５０】
【化７】
2004226384.tif 000006
【００５１】
上述のようにして得られるブロックポリマー誘導体（４）または（６）を、第１のブロックをブラシ状構造物となるように担持する際には、上述した親水性ポリマー誘導体（１）についての担持工程と実質的には同一の担持工程を行うことができる。
【００５２】
まず、ブロックポリマー誘導体（４）または（６）を担持させる、本チップ表面の素材、すなわち、本チップ表面の支持体の素材は、本チップの基板の素材と同一とすることも可能であり、基板の表面に、金属等の薄膜を形成して、この金属等を支持体とすることも可能である。なお、支持体として用い得る素材として、例えば、金、銀、銅、アルミニウム等の金属とすることができる。また、ガラス；ＣｄＳ、ＺｎＳ等の半導体；グラファイト等のカーボン；酸化チタン、酸化アルミニウム等の金属酸化物；酸化イリジウムスズ等の合金酸化物；とすることができる。
【００５３】
これらの本チップ表面の支持体の素材に応じて、適切な官能基を有するブロックＰ２をセグメントとするブロックポリマー誘導体（４）または（６）を選択して用いることが好ましい。すなわち、各本チップ表面の支持体の素材に配位可能な官能基を有する第２のブロックをセグメントとするブロックポリマー誘導体（５）または（７）を用いることで、容易に、ブロックポリマー誘導体（４）または（６）をチップ表面上に固定することができる。
【００５４】
例えば、上記の官能基が、アミノ基、または、メルカプト基である場合には、本チップ表面の支持体の素材は、金、銀、銅、アルミニウム等の金属；ＣｄＳ、ＺｎＳ等の半導体；酸化チタン、酸化アルミニウム等の金属酸化物；であることが好適である。また、同官能基が、シラノール基である場合には、チップの支持体の素材は、ガラス、シリコーン、酸化チタンであることが好適である。また、同官能基が、カルボキシル基である場合には、チップの支持体の素材は、カーボンが好適である。
【００５５】
所望するチップ表面を製造する際には、ブロックポリマー誘導体（４）または（６）を含有する溶液の中に、チップを浸漬させて、接触させることにより、第２のブロックの、センサチップ表面の支持体に配位能を有する官能基がチップ表面に結合して、ブロックポリマー誘導体（４）または（６）を、チップ表面に固定することができる。その結果、ブロックポリマー誘導体（４）または（６）の第１のブロック側がブラシ状に起立した、本チップ表面を製造することができる。
【００５６】
すなわち、適切な緩衝化した水溶液に、ブロックポリマー誘導体（４）または（６）を溶解し、このポリマー溶液を、適温、例えば、２０〜３７℃程度で、浸漬等により、チップの支持体表面に接触させた状態で、数１０分〜数時間のインキュベートを行うことにより、本チップ表面を製造することができる。このポリマー溶液における、ブロックポリマー誘導体（４）または（６）の濃度は、用いるブロックポリマーの分子量により異なるが、通常、溶液の０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、好適には１ｍｇ／ｍｌ程度である。
【００５７】
核酸の担持
本チップ表面は、上述のようにして、ブラシ状構造物を担持したチップ表面上に、さらに、核酸が、チップ表面に対して起立した状態で、直接的または間接的に固定されていることが必要である。
【００５８】
この核酸の担持工程においては、核酸を、チップ表面上に固定可能な核酸誘導体を調製することが前提となる。
まず、本チップ表面において担持する核酸は、特に限定されず、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよく、また、１本鎖であっても、２本鎖であってもよいが、１本鎖のＤＮＡであることが好適である。また、核酸は、直鎖状であっても、特定の構造（例えば、ヘアピン構造やループ構造）を有していてもよいが、直鎖状であることが好適である。さらに、鎖長は、特に限定されないが、好適には、
５〜２０００００塩基対程度、さらに好適には、１０〜２００００塩基対程度である。
【００５９】
核酸としては、所望する塩基配列を有する核酸を、例えば、特定の生物の遺伝子ＤＮＡやｃＤＮＡから、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法による増幅産物を用いることも可能である。また、核酸の塩基配列が完全に既知であり、かつ、比較的短い場合には、所望する塩基配列の核酸を、ホスファイト  トリエステル法等の化学合成法によって合成することも可能であり、核酸合成機を用いて合成することも可能である。
【００６０】
このように入手した核酸の一方の末端、例えば、５’末端のリン酸基や、３’末端の水酸基を利用して、チップ表面の支持体の素材、および／または、担持したブロックポリマー誘導体（４）（６）の第２のブロックを構成するポリマーセグメントに対して、配位可能な官能基、例えば、メルカプト基、ジチオール基、ジスルフィド基、スルフィド基、アミノ基、シラノール基、カルボキシル基等を導入して付加することにより、所望する核酸誘導体（８）を合成することが可能である。
【００６１】
また、同じく核酸の一方の末端に、常法により、ビオチニル基を導入して付加することによっても、所望する核酸誘導体（８）を合成することも可能である。なお、この場合は、チップ表面、および／または、担持したブロックポリマー誘導体（４）（６）の第２のブロックを構成するポリマーセグメントに、アビジニル基が導入して付加されていることが、核酸を、アビジン−ビオチン結合により、チップ表面に結合させるために必要である。このアビジニル基とビオチニル基の核酸の末端またはチップ表面若しくはポリマーセグメントへの導入は、常法により行うことができる。
【００６２】
また、プローブとなる塩基配列を有する核酸の末端に、直接的に上記の官能基（ビオチニル基を含む）を導入して付加すること（直接的な官能基の付加）も可能であるが、核酸の実質的にプローブとする部分と、上記の官能基の間に、リンカーＤＮＡや、スペーサー分子を設けて固定すること（間接的な官能基の付加）が好適である。
【００６３】
通常、リンカーＤＮＡとしては、オリゴｄＴやオリゴｄＡ等を好適に用いることができる（通常は、３〜１００塩基程度のオリゴヌクレオチド）。また、スペーサー分子としては、炭素原子数が２〜１００程度の直鎖状アルキル基、オリゴエチレングリコール等を挙げることができる。
【００６４】
かかる核酸誘導体（８）の合成法としては、常法を用いることができる。また核酸誘導体（８）の市販品を用いることもできる。
ブラシ状構造物が設けられたチップ表面への、核酸誘導体（８）の担持は、例えば、当該チップ表面に、核酸誘導体（８）を含有する適切な緩衝液を接触させて、当該緩衝液を乾燥させないようにして、適切な条件下で放置することにより、容易に行うことができる。すなわち、核酸誘導体（８）の官能基を介して、チップ表面に直接的に固定する、および／または、ブロックポリマーの第２のブロックを介して間接的に固定することができる。
【００６５】
担持工程の順番
上述した、本チップ表面の製造工程においては、ブラシ状構造物の担持工程の後に、核酸の担持工程を行っているが、これとは逆に、核酸の担持工程の後に、ブラシ状構造物の担持工程を行うこともできる。ただし、ブラシ状構造物の担持工程の後に、核酸の担持工程を行う方が、一般的には好適である。
【００６６】
担持密度の調整
なお、親水性ポリマー誘導体（１）を含有するポリマー溶液を用いて、ブラシ状構造物をチップ表面上に構築する場合は、当該溶液中の親水性ポリマー誘導体（１）の濃度を調整することにより、チップ上のブラシ状構造物の担持密度を調整することが可能である。
【００６７】
また、ブロックポリマー誘導体（４）または（６）を含有するポリマー溶液を用いて、ブラシ状構造物をチップ表面上に構築する場合は、当該溶液中のブロックポリマー誘導体（４）または（６）の濃度を調整することにより、チップ上のブラシ状構造物の担持密度を調整することが可能である。
【００６８】
すなわち、これらのポリマー溶液における親水性ポリマー誘導体（１）、あるいは、ブロックポリマー誘導体（４）または（６）の濃度が高ければ、本チップ表面上のブラシ状構造物の担持密度が高くなり、逆に前記濃度が低ければ、同担持密度は低くなる。本チップ表面においては、ブラシ状構造物が、０．００１〜１分子／ｎｍ２の密度で担持されていることが好適である。この担持密度が、０．００１分子／ｎｍ２未満であると、目的とする非特異的反応を十分に抑制することが困難な傾向があり、１０分子／ｎｍ２を超えると、親水性ポリマー誘導体（１）がチップ状で多層化して、検出感度に悪影響を及ぼす可能性がある。
【００６９】
また、本チップ表面におけるブラシ状構造物の嵩高は、すべて、実質的に同一であってもよいし、異なってもよい。
次いで、本チップ表面上における、核酸の担持密度は、核酸を担持させるために、チップ表面に接触させる核酸誘導体（８）溶液の濃度に依存する。
【００７０】
すなわち、当該核酸誘導体溶液における核酸誘導体（８）の濃度が高ければ、本チップ表面上のブラシ状構造物の担持密度が高くなり、逆に前記濃度が低ければ、同担持密度は低くなる。本チップ表面においては、核酸が、０．００１〜１分子／ｎｍ２の密度で担持されていることが好適である。この担持密度が、０．００１分子／ｎｍ２未満であると、目的とする非特異的反応を十分に抑制することが困難な傾向があり、１分子／ｎｍ２を超えると、親水性ポリマー誘導体（１）がチップ状で多層化して、検出感度に悪影響を及ぼす可能性がある。
【００７１】
なお、上述したブラシ状構造物と核酸のチップ表面における密度は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により確認することが可能であり、さらに、ＳＰＲ等により確認することも可能である。
【００７２】
マスキング処理
上記のようにして提供される、本チップ表面に、さらにマスキング処理を行うことにより、さらに非特異的な反応を抑制することができる。
【００７３】
このマスキング処理は、上述のようにして得られる本チップ表面に、マスキング剤を接触させて、当該マスキング剤を本チップ表面上に固定化することにより行われる。
【００７４】
マスキング剤としては、式（９）
【００７５】
【化８】
2004226384.tif 000007
【００７６】
［式中、ｑは、１〜２００の整数であり、Ｒ６は、水酸基、炭素原子数が１〜６のアルキル基であり、Ｒ７は、水素原子、炭素原子数が１〜６のアルキル基、または、ピリジルチオ基である］
で表されるチオ化合物を挙げることができる。また、マスキング処理の好適な態様の一つとして、マスキング剤を２−メルカプトエタノールとする態様を挙げることができる。
【００７７】
マスキング処理は、上述のようにして製造され得る本チップ表面を、マスキング剤の溶液と接触させることにより行うことができる。この場合のマスキング剤の溶液におけるマスキング剤の濃度は、マスキング剤の種類等によっても異なるが、概ね、０．００１〜１０００ｍＭ，好適には、０．１〜１０ｍＭ程度である。また、マスキング処理の時間は、好適には、３分〜１日程度である。さらに、マスキング処理は、２０〜３７℃程度の温度下で行うことが好適である。
【００７８】
このようにして、ブロックＰ２が平面固定され、かつ、ブロックＰ１が嵩高に起立し、ブラシ状構造物の主要部を構成している、ブロックポリマー誘導体（１）が担持された本チップ表面、および、本チップ表面を有する本チップが提供される。本チップ表面において、生物学的な結合反応を行うと、非特異的な反応を著しく抑制することが可能となり、本チップを用いたセンサによる検出感度を向上させることができる。
【００７９】
本使用方法
上述のようにして提供される本チップは、バイオセンサにおける核酸検出を目的とするバイオチップである。すなわち、本発明は、本チップと、核酸試料を接触させて、本チップの固定化核酸とのハイブリダイズを検出する、本チップの使用方法（本使用方法）を提供する発明である。
【００８０】
本使用方法において用いるバイオセンサは、上述したように、ＳＰＲセンサにおける検出に用いるのが好適であるが、これのみに限定されず、核酸とその相補鎖の組における結合対の形成により、チップ表面に生ずる何らかの変化を検出することが可能なセンサであれば、表面プラズモン共鳴以外に、放射能、接触角、沈降、紫外分光、蛍光、化学発光、電気化学発光等に基づく標識を検出可能な、いかなる範疇のセンサにおいても用いることができる。また、核酸試料も特に限定されず、生体試料から抽出した核酸、生体細胞、血液検体、リンパ液、滑液、唾液、尿等を、必要に応じて用いることができる。
【００８１】
また、本使用方法において、核酸同士のハイブリダイズの検出を、電気化学発光源を用いることにより行うことが好適である。電気化学発光源としては、例えば、特に好適なものとして、ルテニウムビピリミジン錯体、ルテニウムソラーレン錯体等のルテニウム錯体等を挙げることができる。
【００８２】
オリゴペプチド等の担持
ここまで、ブラシ状構造物を設けたチップ表面に、核酸を担持させる態様について説明したが、核酸に代えて、または、核酸と共に、ペプチド鎖、糖鎖、または、糖タンパク鎖のような、分子認識能が認められ得るオリゴ分子とすることも可能である。この場合も、本チップ表面の、前記ブラシ状構造物や、前記ブロックポリマーセグメント、さらには、マスキング剤により、非特異的な反応が抑制され、検出感度の飛躍的向上を見込むことができる。
【００８３】
すなわち、本発明は、親水性ポリマーが、チップ表面に起立した状態で固定されているセンサチップ表面において、当該親水性ポリマー同士のチップ表面上における隙間に、核酸、ペプチド鎖、糖鎖、および、糖タンパク鎖からなる群から選ばれる１種または２種以上の分子認識能を有する分子が、チップ表面に対して起立した状態で、直接的または間接的に固定されている、核酸検出用チップ表面を提供する発明である。
【００８４】
なお、ペプチド鎖、糖鎖、糖タンパク鎖の、アミノ酸および／または単糖単位数は、概ね、２〜５００単位が好適である。
【００８５】
【実施例】以下に、本発明の実施例を記載するが、この実施例により、本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
〔参考例〕  ブロックポリマー誘導体（１）等の製造
（１）アセタール−ＰＥＧ−ＳＨ（Ｍｎ＝５，０００）の合成
アルゴン（Ａｒ）置換下、室温のフラスコ中、に溶媒としてＴＨＦ６０ｍｌを入れ、これに開始剤３，３−ｄｉｅｔｈｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ  １ｍｍｏｌとＫ−Ｎａｐｈ（０．３１６８ｍｏｌ／ｌ）  １ｍｍｏｌを攪拌しながら加え、メタル化を行った。充分攪拌後、ＥＯを１１２．９９ｍｍｏｌ加え水冷しながら二日間攪拌し、重合を行った。
【００８６】
二日間攪拌後、この溶液に再メタル化を目的としてＫ−Ｎａｐｈ  ０．５ｍｍｏｌとｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  ４．５ｍｍｏｌを加えた。Ａｒ置換下のナスフラスコ中にＴＨＦ溶媒１０ｍｌと停止剤として、ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ３．５ｍｍｏｌを溶解させ、これに等圧滴下漏斗を用いてＰＥＧ重合溶液を滴下した。滴下後、ｅｔｈｅｒ再沈により回収し、その後、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍと飽和食塩水で抽出を行い、無水Ｎａ２ＳＯ４により脱水、ベンゼン凍結乾燥にて回収した。
【００８７】
減圧乾燥されたｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｏ  −ｅｔｈｙｌｄｉｔｈｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ  ０．４４ｍｍｏｌにＡｒ下で溶媒としてＴＨＦ  ５０ｍｌとＤＭＦ３．６ｍｌを加え攪拌した。この溶液を減圧乾燥させたａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ＭＳ  ０．２ｇに加え、室温で４時間反応させた。反応後、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍと飽和食塩水で抽出を行い、無水Ｎａ２ＳＯ４により脱水、ｅｔｈｅｒ再沈により精製、ベンゼン凍結乾燥にて回収した。
【００８８】
更に、減圧乾燥させたａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ｄｉｔｈｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ  ０．１ｇにＡｒ下で溶媒としてＴＨＦ  １０ｍｌを加えた、ここにｎ−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅを１．４Ｍ  ＴＨＦ溶液になるように加え、室温で３時間攪拌し反応させた。反応後、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍと飽和食塩水で抽出を行い、無水Ｎａ２ＳＯ４により脱水、ｅｔｈｅｒ再沈により精製、ベンゼン凍結乾燥にて回収した。
【００８９】
回収後、１Ｈ−ＮＭＲにより構造解析、ＧＰＣ測定を行った。
（２）アセタール−ＰＥＧ／ＰＡＭＡ（ＰＥＧ＝６，０００，  ＰＡＭＡ＝１０，０００）の合成
Ａｒ下の反応容器中に、反応溶媒としてテトラヒドロキシフラン（ＴＨＦ）を４５ｍｌ、反応開始物質として３，３−ジエトキシ‐１−プロパノールを１ｍｍｏｌ加え、等モル量のカリウムナフタレン（Ｋ−Ｎａｐｈ）ＴＨＦ溶液を加えて開始物質をメタル化し、開始剤を調製した。続けてエチレンオキシド（ＥＯ）１３７ｍｍｏｌを液体窒素で冷却したシリンジを用いて加え、室温下で２日間攪拌し、重合を行なった。ＥＯ重合後、シリンジでＧＰＣ測定用のサンプルを少量抜き取り、２‐メタクリル酸ジメチルアミノエチル（ＡＭＡ）３１ｍｍｏｌをシリンジで素早く加え、水冷下で２０分間反応させ、少量の酢酸を用いて反応を停止した。生成物は−２０℃に冷却した２−プロパノールに沈殿させ、遠心分離（−１０℃，  ５０００  ｒｐｍ，  ６０ｍｉｎ）により沈殿物を分離し、沈殿物はエバポレーターにより溶媒を除去した後、ベンゼン凍結乾燥を経て白色粉末として回収した。この回収したポリマー１ｇを蒸留水約１００ｍｌに溶解させ、塩酸を用いてｐＨ５に調整し、凍結乾燥した。さらにこのポリマーをＴＨＦ約１００ｍｌに溶解させ、ポリマーの沈殿物を吸引ろ過で濾別し、ＴＨＦで数回リンスした。濾別した沈殿物は蒸留水約１００ｍｌに溶解させ、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ９に調整した。その後、ベンゼンに溶解させ凍結乾燥を経て白色粉末を回収した。ＧＰＣ，Ｈ−ＮＭＲ測定により生成物の構造を確認した。
【００９０】
〔製造例〕  本チップ等の製造
（１）まず、金表面のＳＰＲセンサチップ（ＳＩＡキット：ＢＩＡＣＯＲＥ社、以下、同様である）の、いわゆるピラニア洗浄を行った。洗浄液として、特級濃硫酸：特級過酸化水素水＝３：１（容量比）とし、洗浄は、室温で１分間、洗浄液中にチップを浸漬することにより行った。次に、上記の参考例において製造した、Ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＡＭＡ（ＰＥＧ：ＭＷ６０００、ＰＡＭＡ：ＭＷ１００００）を、５０ｍＭ  リン酸Ｎａ緩衝液に溶解し、０．２ｍＭになるように調整した。次に、チップを、このＡｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＡＭＡ  溶液に、４時間浸漬して、チップ表面におけるＡｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＡＭＡ  の固定を行った。この固定化工程は、１回行った。なお、この固定化の工程終了後に、チップの洗浄を行ったが、固定化工程後の洗浄は、５０ｍＭ  ＮａＯＨで１回行い、次いで、５０ｍＭ  リン酸Ｎａ緩衝液で２回行った。
【００９１】
このようにして、Ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＡＭＡを担持させたチップを得た。
次に、配列番号１で示されるプローブＤＮＡを、ＤＮＡ合成機で化学合成し、次いで、このプローブＤＮＡの５’末端を、−ＳＨ化して、プローブＤＮＡ誘導体を調製した。
【００９２】
配列番号１：５’−ＳＨ−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣ−３’
また、同様に、配列番号２で示されるターゲットＤＮＡを、ＤＮＡ合成機で化学合成した。
【００９３】
配列番号２：５’−ＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’
上記のプローブＤＮＡを、ＴＥ（ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝液で、１０μＭとなるように希釈して、このプローブＤＮＡの希釈液を、チップの作用極に、１５μｌ添加し、室温で１日静置して、プローブＤＮＡのチップ表面における担持を行い、その後、チップ表面を、２×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ：ｐＨ７．０）で洗浄した。
【００９４】
このようにして、チップ表面に、ブラシ状構造物とプローブＤＮＡが担持され、かつ、チップ表面が、ブロックポリマーのポリマーセグメントで被覆された、本チップ（実施例１）を得た。
実施例１のチップ表面を、ＳＰＲで解析したところ、チップ表面上に、０．２本／ｎｍ２程度の密度で、ブラシ状構造物と核酸分子が認められた。
【００９５】
（２）金表面のＳＰＲセンサチップ（ＳＩＡキット）の、いわゆるピラニア洗浄を行った。洗浄液として、特級濃硫酸：特級過酸化水素水＝３：１（容量比）とし、洗浄は、室温で１分間、洗浄液中にチップを浸漬することにより行った。
【００９６】
次に、上記の参考例において製造した、Ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ＳＨを、１．０Ｍ    ＮａＣｌ含有の５０ｍＭ  ＰＢＳに溶解し、０．２ｍＭになるように調整した。次に、チップを、このＡｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ＳＨ溶液に、２０分間浸漬して、チップ表面におけるＡｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ＳＨの固定を行った。この固定化工程を、計３回行った。なお、各固定化の工程終了後に、チップの洗浄を行ったが、各固定化工程後の洗浄は、１．０Ｍ  ＮａＣｌ含有５０ｍＭ  ＰＢＳで１回行い、次いで、５０ｍＭ  ＮａＣｌで１回行い、次いで、１．０Ｍ  ＮａＯＨ含有５０ｍＭ  ＰＢＳで２回行った。
【００９７】
このようにして、Ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ＳＨを担持させたチップを得た。このチップ表面を、ＡＦＭで解析したところ、チップ表面上に、０．３本／ｎｍ２程度の密度で、ブラシ状構造物が認められた。
【００９８】
次に、上記の配列番号１で示されるプローブＤＮＡを、ＤＮＡ合成機で化学合成し、次いで、このプローブＤＮＡの５’末端を、−ＳＨ化して、プローブＤＮＡ誘導体を調製した。
【００９９】
上記のプローブＤＮＡを、ＴＥ（ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝液で、１０μＭとなるように希釈して、このプローブＤＮＡの希釈液を、チップの作用極に、１５μｌ添加し、室温で１日静置して、プローブＤＮＡのチップ表面における担持を行い、その後、チップ表面を、２×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ：ｐＨ７．０）で洗浄した。
【０１００】
このようにして、チップ表面に、ブラシ状構造物とプローブＤＮＡが担持された、本チップ（実施例２）を得た。
この実施例２のチップ表面を、ＡＦＭで解析したところ、チップ表面上に、０．３本／ｎｍ２程度の密度で、ブラシ状構造物が認められた。
【０１０１】
［試験例］ターゲットＤＮＡのハイブリダイズテスト
（１）上述のようにして製造した実施例１の本チップの作用極に、滅菌超純水で希釈したターゲットＤＮＡ（１０μＭ溶液）を、１５μｌ添加し、室温下で、ハイブリダイゼーションを２時間静置して行った。ハイブリダイゼーション終了後、チップの作用極を、２×ＳＳＣと、５０ｍＭＰＢＳ（１．０Ｍ  ＮａＣｌ）で、１回ずつ洗浄した。
【０１０２】
このターゲットＤＮＡとのハイブリダイズを行った、ハイブリダイズチップと、対照として、ハイブリダイズを行っていない実施例１のチップの作用極に対して、ルテニウムビピリジン錯体（以下、Ｒｕ錯体ともいう）溶液（２μＭ）を添加し、室温で１０分間静置した。その後、各表面から、Ｒｕ錯体を除去し、ＨＥＰＥＳｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で１回洗浄後、電子供給物質であるｎ−ｔｒｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ（ＴＰＡ）１００ｍＭでリンスし、紫外線（３５０ｎｍ）を１０分間照射し、Ｒｕ錯体の発光強度の測定を、ルテニウムキレート型電気化学発光装置（松下電器産業における注文生産品）を用いて行った。
【０１０３】
その結果を、第１図に示す（縦軸に、Ｒｕ錯体の発光強度を示す。ｓｓＤＮＡとあるのは、対照の結果を示し、ｄｓＤＮＡとあるのは、実施例１のチップについての結果を示す）。この図により、実施例１のチップの発光強度が、対照よりも明らかに（約４．３倍）強いことが示された。Ｒｕ錯体は、２本鎖ＤＮＡに特異的に取り込まれる金属錯体であるので、この結果は、本チップ表面が、著しく、核酸のハイブリダイズに際しての非特異的な反応を抑制し得ることを示している。
【０１０４】
（２）金表面、実施例１のチップ表面（Δθ＝０．１８°）、実施例２のチップ表面（Δθ＝０．１９°）上に、プローブＤＮＡを接触させて（ＤＮＡ溶液濃度：１０μＭ、温度：２５℃、接触時間：６０分）、このプローブＤＮＡの、チップ表面における固定化を行い、このときの固定化量を、ＳＰＲを用いて検討した。
その結果を、第２図に示す。第２図の結果から、プローブＤＮＡの固定化量は、実施例１のブロックポリマーを担持させたタイプが、最も多かった。
【０１０５】
（３）次に、実施例１と実施例２のチップに、連続的（３分間）にＤＮＡ溶液（ターゲットＤＮＡ：配列番号２と、ミスマッチＤＮＡ：配列番号３）を流した際の、ＳＰＲ角度変化について検討した。その結果を、第３図に示す。第３図（１）は、実施例１のチップについての結果を示し、（２）は、実施例２のチップについての結果を示す。この結果から、実施例１のチップも、実施例２のチップも、３分間という短時間にもかかわらず、ターゲットＤＮＡとミスマッチＤＮＡとの間で、明確なΔθの差異が認められた。また、実施例１のチップでは、乖離状態（ＤＮＡ溶液をやめた後の状態）においても、ターゲットＤＮＡとミスマッチＤＮＡとの間で、Δθの差異が認められた（乖離後は、ターゲットＤＮＡの方が脱離が遅い）。
【０１０６】
ミスマッチＤＮＡ：５‘−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣ−３’（配列番号３）
（４）実施例１のチップ表面において、ターゲットＤＮＡ溶液を流す時間を変えることによって、ＤＮＡハイブリダイゼーション量を調節することができた。すなわち、３分間または６０分間、ＤＮＡ溶液を流した後に、ランニングバッファーを３分間流した際の、ＳＰＲの変化量を測定すると、３分間では、
２１×１０−４（°）であったのに対し、６０分間では、３６４×１０−４（°）であった。
【０１０７】
【発明の効果】
本発明により、ＤＮＡ等の核酸検出用センサの検出感度を向上させることを目的とした、核酸検出用チップが提供される。
【０１０８】
【配列表】
2004226384.tif 000008
2004226384.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｒｕ錯体の発光強度を指標として、実施例のチップの、核酸のハイブリダイズ反応における、非特異的な反応の抑制について示した図面である。
【図２】各表面における、プローブＤＮＡの固定化量を検討した図面である。
【図３】ＤＮＡハイブリダイゼーションの、ＳＰＲによる計測値の変化について、経時的に検討した図面である。
【図１】
2004226384.tif 000012
【図２】
2004226384.tif 000013
【図３】
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