(57)【要約】【課題】日本人におけるヒトシトクローム  Ｐ４５０  ２Ｄ６の貧メタボライザーを簡便かつ高い精度で判定する方法を提供すること。【解決手段】ヒトシトクローム  Ｐ４５０  ２Ｄ６のうち、少なくとも２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種、好ましくは、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６の５〜１０種、より好ましくは、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６を含む６〜１０種の遺伝子多型を検出する工程を含む日本人におけるヒトシトクローム  Ｐ４５０  ２Ｄ６貧メタボライザーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち少なくとも２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種の遺伝子多型を検出することによって、ＣＹＰ２Ｄ６の貧メタボライザーを判定することを特徴とする日本人における貧メタボライザーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【請求項２】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち少なくとも２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種の遺伝子多型を検出することによって、ＣＹＰ２Ｄ６酵素活性の程度を判定することを特徴とする日本人におけるＣＹＰ２Ｄ６酵素活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【請求項３】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち少なくとも２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種の遺伝子多型を検出することによって、ＣＹＰ２Ｄ６が代謝に関与する薬物に対する感受性を判定することを特徴とする日本人における薬物感受性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【請求項４】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち少なくとも２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６を含む５〜１０種の遺伝子多型を検出する請求項１〜３のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【請求項５】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち少なくとも２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６を含む６〜１０種の遺伝子多型を検出する請求項１〜３のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【請求項６】
ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲ及びＴＭＡからなる群から選ばれる１又は２以上の核酸増幅方法を用いて遺伝子多型を検出する請求項１〜５のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【請求項７】
ｉｎｖａｄｅｒ法を用いて遺伝子多型を検出する請求項１〜５のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型を検出することによって、日本人における貧メタボライザーを簡便かつ適切に判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子には、点変異あるいは遺伝子の部分的あるいは全体の欠損および挿入または置換等の変異が含まれる場合がある。薬物代謝酵素の遺伝子に、これらの変異がある場合には、蛋白質である薬物代謝酵素が合成されず欠損する場合や、または、代謝能が低くなる場合があることが知られている。このことは同じ量の薬を投与された場合に、他の人より効きすぎる人がいることや、副作用が出やすい人がいることを意味している。
【０００３】
重要な薬物代謝酵素であるチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）のファミリーのうち、ＣＹＰ２Ｄ６は、アミノトリプチリンやフレカイニドなど、６５種類以上の抗鬱薬、抗不整脈薬、抗精神薬などの臨床上重要な薬物の代謝に関与し、最も重要な分子種の一つである。例えば、メトプロロールが投与された場合、投与された患者がＣＹＰ２Ｄ６の貧メタボライザーであった場合には、βレセプターの遮断作用が強くなる（非特許文献１参照）。
【０００４】
このように、薬物の応答性は個々人の遺伝子により異なり、投薬の対象となる患者のＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子多型を判定することは、薬物の投与量の決定、副作用の防止等の観点から臨床的意義が極めて高いと考えられる。
【０００５】
日本人におけるＣＹＰ２Ｄ６貧メタボライザーの頻度は、デブリソン、スパルテイン及びメトプロロールを用いたフェノタイピングにより、０．８４％と報告されている。一方、これまでにＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子多型は５０種類近く報告されているが、日本人の貧メタボライザーを説明する遺伝子多型については、未だ十分特定されていなかった。
【０００６】
これまでに幾つかの変異遺伝子を用いてＣＹＰ２Ｄ６貧メタボライザーの頻度を検討した例も報告されているが（非特許文献２及び３参照）、推定頻度は０．２９％又は０．３９％程度と、フェノタイピングで得られる値とは大きく異なっており、日本人の貧メタボライザーを十分に説明することはできなかった。
【０００７】
【非特許文献１】
遺伝子医学、ｖｏｌ．５、Ｎｏ．１、２００１、ｐ．１６−１９
【０００８】
【非特許文献２】
Ｍｉｃｈｉｈｉｒｏ  Ｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ１９９９，９：６０１−６０５
【０００９】
【非特許文献３】
Ｍｉｃｈｉｈｉｒｏ  Ｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ１９９９，９：２８７−２９３
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、日本人におけるＣＹＰ２Ｄ６貧メタボライザー（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）を簡便かつ高い精度で判定する方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記現状に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型の特定の種類を検出することで、日本人におけるＣＹＰ２Ｄ６貧メタボライザーをほぼ説明することが可能となることを見出し、更に鋭意検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、以下の事項に係る。
【００１３】
１．ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち少なくとも２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種の遺伝子多型を検出することによって、ＣＹＰ２Ｄ６の貧メタボライザーを判定することを特徴とする日本人における貧メタボライザーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【００１４】
２．ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち少なくとも２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種の遺伝子多型を検出することによって、ＣＹＰ２Ｄ６酵素活性の程度を判定することを特徴とする日本人におけるＣＹＰ２Ｄ６酵素活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【００１５】
３．ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち少なくとも２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種の遺伝子多型を検出することによって、ＣＹＰ２Ｄ６が代謝に関与する薬物に対する感受性を判定することを特徴とする日本人における薬物感受性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【００１６】
４．ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち少なくとも２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６を含む５〜１０種の遺伝子多型を検出する項１〜３のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【００１７】
好ましくは、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６の５種の遺伝子多型を検出する項１〜３のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法である。
【００１８】
５．ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち少なくとも２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６を含む６〜１０種の遺伝子多型を検出する項１〜３のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【００１９】
好ましくは、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型のうち２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６の６種の遺伝子多型を検出する項１〜３のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法である。
【００２０】
６．ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲ及びＴＭＡからなる群から選ばれる１又は２以上の核酸増幅方法を用いて遺伝子多型を検出する項１〜５のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【００２１】
７．ｉｎｖａｄｅｒ法を用いて遺伝子多型を検出する項１〜５のいずれかに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
判定方法
本発明は、ヒトシトクローム  Ｐ４５０  ２Ｄ６（ＣＹＰ２Ｄ６）遺伝子多型のうち、２Ｄ６＊３６の検出を必須とする４〜１０種の遺伝子多型を検出して日本人におけるＣＹＰ２Ｄ６貧メタボライザーの判定を行うことを特徴とする。２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種の遺伝子多型を重点的に検出することにより、日本人のＣＹＰ２Ｄ６貧メタボライザーを高い精度でかつ簡便に検出することが可能となる。
【００２４】
本発明において、貧メタボライザ−とは先天的に特定の薬物代謝活性が無いか、もしくは極端に低い人のことを指す。
【００２５】
また、遺伝子多型とは集団中に野生型（Ｗ；ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）以外の変異遺伝子（アリル；ａｌｌｅｌｅ）型が１％以上存在する遺伝子変異を指す。
【００２６】
２Ｄ６＊３６以外の検出すべき遺伝子多型の例としては、ヒトシトクローム  Ｐ４５０  ２Ｄ６の遺伝子多型のうち、ヒトシトクローム  Ｐ４５０  ２Ｄ６代謝活性が低下しているかまたは消失しており、日本人における発生確率の高いものから順次選ぶことが好ましい。
【００２７】
ヒトシトクローム  Ｐ４５０  ２Ｄ６の代謝活性が低下しているかまたは消失している遺伝子多型としては、例えば、２Ｄ６＊３、２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊６、２Ｄ６＊７、２Ｄ６＊８、２Ｄ６＊９、２Ｄ６＊１０、２Ｄ６＊１１、２Ｄ６＊１２、２Ｄ６＊１３、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１５、２Ｄ６＊１６、２Ｄ６＊１７、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊１９、２Ｄ６＊２０、２Ｄ６＊２１、２Ｄ６＊３８、２Ｄ６＊４０、２Ｄ６＊４１などが挙げられる。
【００２８】
中でも、日本人に発生頻度が高い、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊２１を必須とすることが好ましい。さらに２Ｄ６＊１８を加えて５〜１０種を選ぶことが好ましい。さらに上記５種以外で追加する場合には、活性が消失する塩基多型を選択することが好ましく、具体的には２Ｄ６＊３、２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊６、２Ｄ６＊７、２Ｄ６＊８、２Ｄ６＊１１などを選ぶことが好ましい。
【００２９】
さらにアングロサクソン系で多いとされている２Ｄ６＊４を加えた６種、即ち２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊３６および２Ｄ６＊２１の６種を必須とした約１０種、好ましくは１０種以下の遺伝子多型を検出することが最も好ましい。これら６種以外にさらに追加する場合には、上記した活性が消失する遺伝子多型を選択することが好ましい。なお、２Ｄ６＊４は日本人における頻度が非常に少なく存在しないとも考えられているため、２Ｄ６＊４の替わりに２Ｄ６＊３、２Ｄ６＊６、２Ｄ６＊７、２Ｄ６＊８、２Ｄ６＊１１のいずれかと交換した６種を必須としても良い。
【００３０】
報告されている５０種近くのＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型を網羅的に検出することは効率的でなく、実際上困難である。一方、２Ｄ６＊５や２Ｄ６＊４等のみの検出による判定では、日本人における貧メタボライザーを精度良く十分な確率で判定することはできない。
【００３１】
本発明において、２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種、特に２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６を含む５〜１０種、好ましくは、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１、及び２Ｄ６＊３６を含む６〜１０種の遺伝子多型が、日本人における主要な遺伝子多型であることが明らかとなった。
【００３２】
従って、２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種、好ましくは、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種、特に２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６の５〜１０種、好ましくは、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６の５種、更には２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６を含む６〜１０種、好ましくは、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６を含む６種の遺伝子多型を重点的に検出することにより、日本人におけるＣＹＰ  ２Ｄ６貧メタボライザーをより高い精度でかつ簡便に検出することが可能となる。なお、上限を１０種としているのは、検出効率の観点から好ましい範囲とするためであり、必要に応じて、１０種以上の遺伝子多型を検出してもよい。
【００３３】
本発明で検出対象とする主な遺伝子多型は以下のものである。
【００３４】
２Ｄ６＊４は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における次の各部位において一塩基置換を有する多型であり、活性を有さない。
１００Ｃ＞Ｔ，９７４Ｃ＞Ａ，９８４Ａ＞Ｇ，９９７Ｃ＞Ｇ，１０３９Ｃ＞Ｔ，１６６１Ｇ＞Ｃ，１８４６Ｇ＞Ａ，１８５８Ｃ＞Ｔ，２８５０Ｃ＞Ｔ，２９３８Ｃ＞Ｔ，  ３８８７Ｔ＞Ｃ，  ４１８０Ｇ＞Ｃ
２Ｄ６＊５は、ＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子全てが欠損している多型であり、活性を有さない。
【００３５】
２Ｄ６＊１４は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における次の各部位において一塩基置換を有する多型であり、活性を有さない。
１００Ｃ＞Ｔ，１６６１Ｇ＞Ｃ，１７５８Ｇ＞Ａ，２８５０Ｃ＞Ｔ，  ４１８０Ｇ＞Ｃ
２Ｄ６＊１８は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における４１２５−４１３３に９塩基（ＧＴＧＣＣＣＡＣＴ）の挿入を有する多型であり、活性を有さない。
【００３６】
２Ｄ６＊２１は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における以下の部位について一塩基置換を有する多型であり、活性を有さない。７４０Ｃ＞Ｔ，６７８Ｇ＞Ａ，６２９Ａ＞Ｇ，２１４Ｇ＞Ｃ，２２１Ｃ＞Ａ，２２３Ｃ＞Ｇ，２２７Ｔ＞Ｃ，３１０Ｇ＞Ｔ，６０１ｄｅｌＣ，１２３５Ａ＞Ｇ，１４２６Ｃ＞Ｔ，１５８４Ｃ＞Ｇ，１６６１Ｇ＞Ｃ，２５７３ｉｎｓＣ，，２８５０Ｃ＞Ｔ，３５８４Ｇ＞Ａ，４１８０Ｇ＞Ｃ，６２７２−６２７４ｄｅｌＡＣＡ
２Ｄ６＊３６は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における以下の部位について一塩基置換を有する多型であり、活性が低下している。
１００Ｃ＞Ｔ，１０３９Ｃ＞Ｔ，１６６１Ｇ＞Ｃ，４１８０Ｇ＞Ｃ，ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｏ  ＣＹＰ２Ｄ７  ｉｎ  ｅｘｏｎ９
これらの遺伝子多型を重点的に検出することにより、日本人におけるＣＹＰ  ２Ｄ６貧メタボライザーをより高い精度でかつ簡便に判定することが可能となる。更に、検出した遺伝子多型の種類を調べることにより、ＣＹＰ  ２Ｄ６の酵素活性の程度、具体的にはＣＹＰ２Ｄ６の代謝活性が通常か、低下しているか、又は完全に消失しているかなどを判定できる。更には、遺伝子多型の検出結果に基づいて、ＣＹＰ２Ｄ６が代謝に関与する薬物に対する感受性も判定し得る。具体的には、薬物の作用の強弱や薬物による副作用の有無などを判定することが可能となる。
【００３７】
ＣＹＰ２Ｄ６によって代謝される薬物には、ＣＹＰ２Ｄ６が代謝に関与する種々の薬物が包含されるが、例えば、アルプレノロール（ａｌｐｒｅｎｏｌｏｌ）、カルベディロール（ｃａｒｖｅｄｉｌｏｌ）、フレカイニド（ｆｌｅｃａｉｎｉｄｅ）、メトプロロール（ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ）、メキシレチン（ｍｅｘｉｌｅｔｉｎｅ）、プロパフェノン（ｐｒｏｐａｆｅｎｏｎ）、プロパノロール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）、チモロール（ｔｉｍｏｌｏｌ）、アミトリプチリン（ａｍｉｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ）、クロミプラミン（ｃｌｏｍｉｐｒａｍｉｎｅ）、フルボクサミン（ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅ）、ハロペリドール（ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ）、イミプラミン（ｉｍｉｐｒａｍｉｎｅ）、ノルトリプチリン（ｎｏｒｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ）、パロキセチン（ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ）、パーフェナジン（ｐｅｒｐｈｅｎａｚｉｎｅ）、リスペリドン（ｒｉｓｐｅｒｉｄｏｎｅ）、チオリダジン（ｔｈｉｏｒｉｄａｚｉｎｅ）、コデイン（ｃｏｄｅｉｎｅ）、デキストロメトロファン（ｄｅｘｔｒｏｍｅｔｈｏｒｐｈａｎ）、メトキシフェナミン（ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎａｍｉｎｅ）、トラマドール（ｔｒａｍａｄｏｌ）などが挙げられる。
【００３８】
これらの薬物の投与に際し、遺伝子多型を判定することは、患者に最適な薬剤を適切な態様で投与する個別薬物療法を行う上で重要であり、ＣＹＰ２Ｄ６が代謝に関与する薬物の薬効や副作用等の臨床評価の予測や予知にも有効である。
【００３９】
遺伝子多型の検出
本発明においては、日本人である被験者から調製した遺伝子試料中で、核酸が予想される変異を数カ所有しているか否かを  ｉｎ  ｖｉｔｒｏで検査し、被験者の有するＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型の種類を検出することによって、上記判定を行う。遺伝子多型の検出方法としては、一般に用いられている方法を適宜用いることができる。
【００４０】
例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの核酸増幅方法（遺伝子増幅法）、ナイロン膜上に増幅核酸を固定し、標識プローブを用いて検出するサザンブロット法、個体担体上に固定した補足プローブで捕捉した後検出プローブを作用させて検出するサンドイッチハイブリダイゼーション法（ＡＳＯ法）、一対のオリゴヌクレオチドを用いて変異箇所を含む部位を増幅後、一本鎖核酸として電気泳動することにより、変異の有無に応じて電気泳動の移動距離が異なることを利用する方法（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法）、Ｉｎｖａｄｅｒ法などを用いることができる。
【００４１】
核酸配列決定法は、核酸配列中に含まれる塩基配列を検出、同定する方法であり、自動シークエンサー等を用いて試料核酸の塩基配列を読み取り、変異箇所の配列を調べることによって多型を検出する方法である。
【００４２】
核酸増幅方法（遺伝子増幅法）としては、前記ＰＣＲの他に、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲ、ＴＭＡ等がある。
【００４３】
ＰＣＲは、一本鎖に変性した標的核酸に、オリゴヌクレオチド、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核酸を鋳型とするオリゴヌクレオチド伸長反応が起こり核酸配列の相補鎖が合成される反応を繰り返し行うことによって標的核酸を増幅させる方法である。
【００４４】
ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡは、ＲＮＡから逆転写反応によって１本鎖ＤＮＡを合成後、該ＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡポリメラーゼを作用させ逆転写反応およびＲＮＡ合成反応を繰り返すことによって標的核酸を増幅させる方法である。
【００４５】
ＬＣＲは、標的核酸に２種類のオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とリガーゼを作用させ標的核酸上で２種類のオリゴヌクレオチドを結合させる反応を繰り返すことによって標的核酸を増幅させる方法である。
【００４６】
ＳＤＡは、その配列に制限酵素サイトを有する鋳型と相補的に結合するオリゴヌクレオチドを用い、伸長反応と制限酵素処理を繰り返すことによって核酸を増幅させる方法である。
【００４７】
ＲＣＲは、環状の標的核酸に対し相補的なオリゴヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼを作用させることによって、新たに生成したオリゴヌクレオチドが、鋳型から離されながら、連続的に標的核酸を増幅させる方法である。
【００４８】
また、ＰＣＲの中でも、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、  Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ法、Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ法等の種々の方法を適宜用いることもできる。
【００４９】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、一対のオリゴヌクレオチドを用いて変異箇所を含む部位を増幅後、制限酵素で処理し電気泳動で分離することにより、変異の有無に応じて異なるサイズの断片を検出する方法である。
【００５０】
Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ法は、遺伝子増幅法に用いる一対のオリゴヌクレオチドのうち、一方のオリゴヌクレオチドとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型用オリゴヌクレオチドと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型用オリゴヌクレオチドとを用いる方法である。変異型のオリゴヌクレオチドは、その３’末端が予想される点突然変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。試料遺伝子が野生型であれば、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には、オリゴヌクレオチドの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型用オリゴヌクレオチドを用いた場合には増幅が起きず、変異型用オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きる。従って、各オリゴヌクレオチドを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の点突然変異を同定することができる。この時増幅がおきたか否かを調べる方法として、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した後、エチジウムブロマイド等の核酸特異的結合蛍光試薬を用いて染色の後、ＵＶ照射して増幅核酸の有無を検出する方法である。
【００５１】
Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ法は、ＰＣＲ法と方法及び原理は変わらないが増幅領域が０．５Ｋｂ以上好ましくは１Ｋｂ以上であるＰＣＲ法である。
【００５２】
また、ｉｎｖａｄｅｒ法とは、ＤＮＡターゲットフラグメントに対して相補的配列を持つインベーダーオリゴと５’のフラップ構造を持ち、ＳＮＰを検出するための相補的オリゴ（シグナルプローブ）を使用する。まずターゲットＤＮＡに対してインベーダーオリゴとシグナルプローブをハイブリダイズさせる。この時、インベーダーオリゴとプローブは１塩基がオーバーラップする構造（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を持つ。この部分にＣｌｅａｖａｓｅが作用し、ＳＮＰ部位のシグナルプローブの塩基とターゲットの塩基が相補的（ＳＮＰなし）の場合にはシグナルプローブの５’フリップが切断される。切断された５’フリップはＦＲＥＴ  Ｐｒｏｂｅ  （Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｂｅ）にハイブリダイズする。ＦＲＥＴ  プローブ上には蛍光色素とクエンチャー（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が近接しており、蛍光が抑制されているが、５’フリップＤＮＡが結合することによりＣｌｅａｖａｓｅによって蛍光色素の部分が切断され、蛍光シグナルが検出可能である。
【００５３】
また、他の検出方法としては、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼを利用し一対のオリゴヌクレオチドと変異部位と相補的に結合する両端が蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲ反応により遊離された蛍光物質を検出する方法、あるいは、予め一本鎖とした試料ＤＮＡを変異箇所と相補的に結合するオリゴヌクレオチドが固定化された担体に結合させ、結合担体を徐々に昇温させることによって、遊離されるＤＮＡを検出する方法などがある。
【００５４】
本発明においては、これら各種の方法を適宜使い分けて用いることができる。特にＰＣＲ等の核酸増幅方法や、ｉｎｖａｄｅｒ法を用いた検出方法が好ましい。
【００５５】
具体的な態様としては、例えば、核酸増幅方法を利用して遺伝子多型を検出する場合、野生型用オリゴヌクレオチドと１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを、試料に別々、又は同時に作用させる。
本発明において、野生型検出用オリゴヌクレオチドとは、通常の表現型を有している遺伝子多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。変異型検出用オリゴヌクレオチドとは、野生型とは異なる配列を有している遺伝子多型部位を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。好ましくは、野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応するように設計されたオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、野生型検出用及び変異型検出用オリゴヌクレオチドの３’末端から２番目のヌクレオチドが野生型または変異型配列のヌクレオチドと相補的に対応し、かつ野生型及び変異型両方に相補的でない塩基を３’末端から３〜７番目に有するよう設計されたオリゴヌクレオチドである。このように設計した場合野生型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸の組合せにおいて、各オリゴヌクレオチドは少なくとも３’  末端から２番目の配列までは一致する為、伸長反応は起こる。一方、野生型用オリゴヌクレオチド／変異型核酸及び変異型用オリゴヌクレオチド／野生型核酸の組合せにおいてはオリゴヌクレオチドの３’末端もしくは３‘末端より２番目の塩基、さらにもう１塩基の人為的ミスマッチがあるため伸長反応が起こらない。
【００５６】
オリゴヌクレオチドの長さは、１３〜３５塩基、好ましくは、１６〜３０塩基である。上記ミスマッチ部位は、該オリゴヌクレオチド中に少なくとも１つ存在する。その位置は、３’末端の３番目から５’末端までのいずれかであれば、特に限定されないが、好ましくは、３’末端の３番目に近い位置、より好ましくは、３’末端から３番目が好ましい。
【００５７】
３番目に人為的ミスマッチを用いた場合、伸長反応を期待しない核酸配列を鋳型とした時には、塩基多型部位と併せて２塩基のミスマッチとなり、伸長反応が強く阻害される。
本発明において、オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼと共に、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
【００５８】
該伸長反応は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の方法に従って行うことができる。本発明において、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片の増幅方法も、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及びリバースプライマーと共に、野生型検出用オリゴヌクレオチドと、１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてファワードオリゴヌクレオチドとリバースオリゴヌクレオチドの間で増幅される。核酸増幅方法としては、上記したＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲ、ＴＭＡなどが利用できる。
【００５９】
上記のような方法では、野生型核酸を増幅できる野生型検出用オリゴヌクレオチドと、変異型核酸を増幅できる変異型検出用オリゴヌクレオチドをそれぞれ別個又は同時に用いて核酸増幅方法を行う。
【００６０】
野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、変異型では反応が起きない。逆に、変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が変異型であれば反応が起きるが、野生型であれば反応は起こらない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、他方は変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることができる。特に、ヒトを始め、高等生物は、１種類の遺伝子について、父親由来の遺伝子と母親由来の遺伝子をそれぞれ１つずつ有しているが、この方法によれば、試料遺伝子が野生型のホモか、変異型のホモか、あるいは、両方のヘテロかを区別することもできる。すなわち、ヘテロの場合には、野生型遺伝子と変異型遺伝子が共に存在するから野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いた場合も反応が起きる。
【００６１】
また、オリゴヌクレオチドが反応したか否かを検出するには、特定の塩基多型部位を含む染色体又は断片を含む核酸試料に、一定量の野生型検出用オリゴヌクレオチドと及び１種又は２種の変異型検出用オリゴヌクレオチド（フォーワードプライマーに相当）を同時にまたはそれぞれ別々に用いて反応を行った後、２本鎖核酸特異的結合物質と反応させることによって前記増幅反応により生じたオリゴヌクレオチド量を検出できる。
【００６２】
検出に際し、標識したオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。例えば、該各オリゴヌクレオチドを、予め酵素、２本鎖核酸特異的結合物質、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識しておき、伸長又は増幅反応後に、反応したオリゴヌクレオチドの標識を検出することによって、遺伝子多型の検出を行うことができる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。２本鎖核酸特異的結合物質としては、エチレンブロマイド、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩなどが挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。
発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。該標識は、オリゴヌクレオチドの伸長反応に影響を与えることがなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、５’  部位である。
【００６３】
野生型検出用オリゴヌクレオチドと変異型検出用オリゴヌクレオチドに異なる標識を用いた場合には、１つの反応槽で検出ができる。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６５】
実施例
日本人におけるヒトシトクロームＰ４５０  ２Ｄ６貧メタボライザ−の原因遺伝子を特定するために、ＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子多型として報告されている＊２、＊３、＊４、＊５、＊１０、＊１８、＊２１、＊３６についてその頻度を調べるための検討を行った。
【００６６】
まず、１６２人の日本人健常成人からゲノムＤＮＡを抽出し試料とした。そして、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下のように、ＰＣＲによるタイピングを行った。
【００６７】
２Ｄ６＊２  の検出
１試料当たりミリＱ水１７．１μｌに２ｍＭｄＮＴＰｓ  ２．５μｌ、ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ各１５ｐｍｏｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１．２５ｕ、Ｍｇを終濃度１．５ｍＭとなるように最終液量２５μｌを調製し１００ｎｇ／μｌのゲノムを１μｌ加え９５℃・３０秒、６６℃・３０秒、７２℃・３０秒の反応を３５回繰り返し行い、増幅産物を得た。ＰＣＲ反応には野生型を検出するＰｒｉｍｅｒ（ｗ）と変異型を検出するｐｒｉｍｅｒ（ｍ）を用いたアリル特異的ＰＣＲ法を用いた。
用いたＰｒｉｍｅｒ配列を以下に示す。
2004283049.tif 000002
【００６８】
２Ｄ６＊３  の検出
１ｓｔ−ＰＣＲ反応として、１試料当たりミリＱ水３７．６μｌに２ｍＭｄＮＴＰｓ  ４μｌ、ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ各２ｐｍｏｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２ｕ、Ｍｇを終濃度１．５ｍＭとなるように最終液量４９μｌを調製し１００ｎｇ／μｌのゲノムを１μｌ加え９４℃・１分、６６℃・１．５分、７２℃・１．５分の反応を３０回繰り返し行い、増幅産物を得た。次いで、得られた増幅産物０．１μｌを用いて２ｎｄＰＣＲ反応を行った。すなわち、ミリＱ水３８．５μｌに２ｍＭｄＮＴＰｓ  ４μｌ、ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、Ｍｇ終濃度１．５ｍＭ、Ｐｒｉｍｅｒ各２ｐｍｏｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ２ｕを最終液量４９．９μｌとなるように調製し９４℃・１分、５５℃・１分、７２℃・１分の反応を１５回繰り返し行い、増幅産物を得た。２ｎｄＰＣＲ反応は野生型を検出するＰｒｉｍｅｒ（ｗ）と変異型を検出するｐｒｉｍｅｒ（ｍ）を用いたアリル特異的ＰＣＲ法を用いた。
１ｓｔＰＣＲで用いたＰｒｉｍｅｒ配列を以下に示す。
Ｆｏｒｗａｒｄ  ：ＴＣＴ  ｇＴＡ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ｇＴＣ  Ａ
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ：  ＣＣＴ  ｇｇｇ  ＣＣＣ  ＣＴｇ  ＣＡＣ  ＴｇＴ  ＴＴ
２ｎｄＰＣＲで用いたＰｒｉｍｅｒ配列を以下に示す。
野生型検出用：ｇＣＴ  ＡＡＣ  ＴｇＡ  ｇＣＡ  ＣＡｇ
変異型検出用：ｇＣＴ  ＡＡＣ  ＴｇＡ  ｇＣＡ  Ｃｇ
Ｒｅｖｅｒｅｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ：ＣＣｇ  ｇＡＴ  ｇＴＡ  ｇｇＡ  ＴＣＡ  ＴｇＡ  ｇＣ
【００６９】
２Ｄ６＊４  の検出
１試料当たりミリＱ水１６．３μｌに２ｍＭｄＮＴＰｓ  ２μｌ、ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ各１０ｐｍｏｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１ｕ、Ｍｇを終濃度２．０ｍＭとなるように最終液量２４μｌを調製し１００ｎｇ／μｌのゲノムを１μｌ加え９４℃・３０秒、６１℃・１０秒、７２℃・１．分の反応を４０回繰り返し行った後、７２℃で７ｍｉｎ保持し、増幅産物を得た。得られた増幅産物１０μｌにＭｖａＩ（１０ｕ／μｌ）１μｌとｂｕｆｆｅｒ２μｌおよびミリＱ水７μｌ添加後、３７℃にて２時間以上インキュベートした。その後電気泳動にて得られた泳動像よりタイピングを行った。
用いたＰｒｉｍｅｒ配列を以下に示す。
Ｆｏｒｗａｒｄ    ：ＣＣｇ  ＣＣＴ  ＴＣｇ  ＣＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＴ
Ｒｅｖｅｒｒｓｅ  ：ｇＡＡ  ＡＣＣ  ＴＡＡ  ＡＡＴ  ＣｇＡ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  Ｔｇ
【００７０】
２Ｄ６＊５  の検出
１試料当たりミリＱ水１７．９μｌに２ｍＭｄＮＴＰｓ  ２μｌ、ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ各１２．５ｐｍｏｌ、ＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１．２５ｕ、Ｍｇを終濃度１．１ｍＭとなるように最終液量２４μｌを調製し１００ｎｇ／μｌのゲノムを１μｌ加え９３℃・１分、６５℃・３０秒、６８℃・５．分の反応を３５回繰り返し行った後、７２℃で１０ｍｉｎ保持し、増幅産物を得た。得られた増幅産物を電気泳動にて検出しタイピングを行った。
用いたＰｒｉｍｅｒ  配列を以下に示す。
Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＣＣ  ｇｇｇ  ＣＡＣ  ＣＴｇ  ＴＡＣ  ＴＣＣ  ＴＣＡ
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇＣＡ  ＴｇＡ  ｇＣＴ  ＡＡｇ  ｇＣＡ  ＣＣＣ  ＡｇＡ  Ｃ
【００７１】
２Ｄ６＊  １０の検出
１試料当たりミリＱ水１７．１μｌに２ｍＭｄＮＴＰｓ  ２．５μｌ、ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ各１５ｐｍｏｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１．２５ｕ、Ｍｇを終濃度１．２ｍＭとなるように最終液量２５μｌを調製し１００ｎｇ／μｌのゲノムを１μｌ加え９５℃・３０秒、６６℃・３０秒、７２℃・３０秒の反応を３５回繰り返し行い、増幅産物を得た。ＰＣＲ反応には野生型を検出するＰｒｉｍｅｒ（ｗ）と変異型を検出するｐｒｉｍｅｒ（ｍ）を用いたアリル特異的ＰＣＲ法を用いた。
用いたＰｒｉｍｅｒ配列を以下に示す。
2004283049.tif 000003
【００７２】
２Ｄ６＊１８  の検出
１試料当たりミリＱ水１６．８μｌに２ｍＭｄＮＴＰｓ  ２．５μｌ、ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ各１０ｐｍｏｌ、ａｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１ｕ、Ｍｇを終濃度１ｍＭとなるように最終液量２４μｌを調製し１００ｎｇ／μｌのゲノムを１μｌ加え９６℃・１分、５９℃・１分、７２℃・１．分の反応を３５回繰り返し行い、増幅産物を得た。得られた増幅産物を電気泳動にて検出しタイピングを行った。
用いたＰｒｉｍｅｒ配列を以下に示す。
Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡｇＣ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＣＣ
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＡｇ  ｇＡＡ  ＡｇＣ  ＡＡＡ  ｇＡＣ  ＡＣＣ  ＡＴｇ
【００７３】
２Ｄ６＊２１  の検出
１試料当たりミリＱ水５．１μｌに２ｍＭｄＮＴＰｓ  １．６μｌ、ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  １．０μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ各２ｐｍｏｌ、ａｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．５ｕ、Ｍｇを終濃度２．５ｍＭとなるように最終液量９μｌを調製し１００ｎｇ／μｌのゲノムを１μｌ加え９８℃・２０秒、６８℃・４分、７２℃・１０．分の反応を３０回繰り返し行い、増幅産物を得た。次に得られた増幅産物をミリＱ水にて５倍に希釈した溶液１μｌにミリＱ水１７．５５μｌと２．５ｍＭｄＮＴＰｓ  ２．０μｌ、ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ各１０ｐｍｏｌ、ａｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ１ｕ、Ｍｇを終濃度０．７５ｍＭとなるように最終液量２４μｌを調製し１００ｎｇ／μｌのゲノムを１μｌ加え９６℃・１分、６８℃・１分、７２℃・１分の反応を２０回繰り返し行い、増幅産物を得た（２ｎｄＰＣＲ）。２ｎｄＰＣＲ反応は野生型を検出するＰｒｉｍｅｒ（ｗ）と変異型を検出するｐｒｉｍｅｒ（ｍ）を用いたアリル特異的ＰＣＲ法を用いた。
得られた増幅産物を電気泳動にて検出しタイピングを行った。
１ｓｔＰＣＲで用いたＰｒｉｍｅｒ配列を以下に示す。
Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＣｇ  ＣＣＴ  ＴＣｇ  ＣＣＡ  ＡＣＣ  ＡＣＴ
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＣＡ  ｇＣＣ  ＴＣＡ  ＡＣｇ  ＴＡＣ  ＣＣＣ  Ｔ
２ｎｄＰＣＲで用いたＰｒｉｍｅｒ配列を以下に示す。
Ｆｏｒｗａｒｄ：ｇＡＣ  ＣＣＣ  ｇＴＴ  ＣＴｇ  ＴＣＴ  ｇｇＣ  ｇＴ
2004283049.tif 000004
【００７４】
２Ｄ６＊３６  の検出
１試料当たりミリＱ水１７．６５μｌに２．５ｍＭｄＮＴＰｓ  ２μｌ、ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ各５ｐｍｏｌ、ＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１．２５ｕ、Ｍｇを終濃度１．１ｍＭとなるように最終液量２４μｌを調製し１００ｎｇ／μｌのゲノムを１μｌ加え９４℃・１０秒、６８℃・５分、７２℃・１０．分の反応を３０回繰り返し行い、増幅産物を得た。得られた増幅産物を電気泳動にて検出しタイピングを行った。
用いたＰｒｉｍｅｒ配列を以下に示す。
Ｆｏｒｗａｒｄ：ｇＣＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ｇＴｇ  ＴＣｇ  ＴＣＡ  ｇＣＴ  ＴＴ
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｇＣ  ＡＴｇ  ＡｇＣ  ＴＡＡ  ｇｇＣ  ＡＣＣ
【００７５】
上記検出により得られた結果を表１に示す。表１に示されるように、日本人の健常成人１６２名において、２Ｄ６＊３６及び２Ｄ６＊２１が存在することが確認された。また、ＣＹＰ２Ｄ６の変異遺伝子として、２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊１８が日本に存在することが報告されているものの、今回の対象１６２名には確認されなかった。
【００７６】
これら検出結果に基づいて、ＣＹＰ２Ｄ６変異遺伝子の頻度を算出した（表１）。
【００７７】
【表１】
2004283049.tif 000005
【００７８】
得られた頻度情報をもとに、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇの法則より貧メタボライザ−になりうる遺伝的多型の頻度を算出した。ＣＹＰ２Ｄ６は常染色体上に存在する遺伝子であり、貧メタボライザ−の原因遺伝子は劣性遺伝することから、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇの平衡に当てはめて考えることが可能である。
【００７９】
算出した結果を表２に示す。
【００８０】
【表２】
2004283049.tif 000006
【００８１】
表２に示されるように、上記ジェノタイプにより得られた結果から算出されるＣＹＰ２Ｄ６の貧メタボライザーの予測頻度は０．９２％であった。この予測頻度０．９２％は、従来の予測頻度と比較して、フェノタイピングにより得られた実測値０．８４％をより説明し得るものであり、日本人におけるＣＹＰ２Ｄ６貧メタボライザーの予測精度が格段に高まることが明らかとなった。
【００８２】
【発明の効果】
上述したように、本発明により、日本人におけるＣＹＰ２Ｄ６の貧メタボライザ−を高い精度で且つ簡便に検出できる方法が提供される。ＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子多型としては、約５０種類が知られているが、本発明を用いれば、４〜１０種、好ましくは５〜１０種、より好ましくは６〜１０種という少数の遺伝子多型を検出することによって、簡便かつ精度の高い方法で日本人における貧メタボライザーを判定することが可能になる。
【００８３】
具体的には、２Ｄ６＊３６を含む４〜１０種、好ましくは２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６の５〜１０種、より好ましくは、２Ｄ６＊５、２Ｄ６＊１４、２Ｄ６＊４、２Ｄ６＊１８、２Ｄ６＊２１及び２Ｄ６＊３６を含む６〜１０種の遺伝子多型を重点的に検出することによって、日本人におけるＣＹＰ  ２Ｄ６貧メタボライザーを高い精度でかつ簡便に判定することが可能となる。
【００８４】
また、検出した遺伝子多型の種類に基づいて、ＣＹＰ２Ｄ６代謝活性が低下しているか、又は完全に消失しているのかなどの判定も行うことができる。更には、ＣＹＰ２Ｄ６が代謝に関与する薬物に対する感受性、具体的には、投与薬物の薬効や副作用の有無などの判定も行うことができる。
【００８５】
本発明は、薬効や副作用の有無等の予測や予知に有効であって、個々人の体質に応じた適切な医療を可能にするものであり、医療の質を向上させる、優れた手段を提供するものである。