(57)【要約】      （修正有）【課題】ペチュニア属に属する植物の花持ちを向上させる。【解決手段】メロンのエチレン受容体をコードするＤＮＡまたは、該タンパク質のアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、付加及び置換されたアミノ酸配列であって、エチレン非結合下でヒスチジンキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをペチュニア属に属する植物に導入することを特徴とするペチュニア属に属する植物の作出方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡをペチュニア属に属する植物に導入することを特徴とするペチュニア属に属する植物の作出方法。
（ａ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、付加及び置換されたアミノ酸配列であって、エチレン非結合下でヒスチジンキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを導入したペチュニア属に属する植物由来の形質転換体。
（ａ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、付加及び置換されたアミノ酸配列であって、エチレン非結合下でヒスチジンキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを導入したペチュニア属に属する植物。
（ａ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、付加及び置換されたアミノ酸配列であって、エチレン非結合下でヒスチジンキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペチュニア属に属する植物の作出方法、ペチュニア属に属する植物由来の形質転換体及びペチュニア属に属する植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペチュニア等の花卉植物を輸送や貯蔵する場合には、できるだけ花持ちを良くして品質を保持するため、様々な技術が使用されている。花持ちを良くする技術として最も一般的な方法は、低温状態を維持して輸送や貯蔵を行う方法や、各種品質保持剤を添加する方法である。また、植物の種類によって、本来持っている性質として花持ちの善し悪しがあり、品質保持のための方法も細かく異なっている。
【０００３】
しかしながら、低温状態を維持したり、各種品質保持剤を用いたりして輸送や貯蔵を行う場合、設備費や電気代、薬品代等にかかるコストの増大が問題となる。また、品質保持剤としては、従前、チオ硫酸銀錯塩（ｓｉｌｖｅｒ  ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ：  ＳＴＳ）が頻繁に使用されてきた。しかしながら、ＳＴＳは銀を含有する薬品であるため、環境に対する配慮から使用が控えられる傾向にある。ＳＴＳの代替品の開発も見込まれるが、花持ち向上に有効な代替品が開発されたとしてもコストの増大といった問題は解決されない。
【０００４】
一方、近年、遺伝子組換え技術を用いて、カーネーション等の花卉植物の花持ちを向上させる技術が開発されている。具体的にカーネーションにおいては、エチレン合成系に関与するＡＣＣシンターゼやＡＣＣオキシターゼの合成を阻害し、エチレンの合成を抑制し、花持ちを向上させている。しかしながら、この場合、自身からのエチレン合成を抑制することはできるが、他の植物が近傍に存在すると、この他の植物から合成されたエチレンの影響を受けることとなる。このため、遺伝子組換え技術によりエチレン合成系に関与するＡＣＣシンターゼやＡＣＣオキシターゼの合成を阻害するといった方法は、花持ちの向上に対して有効な方法とは言えない。
【０００５】
したがって、植物の花持ちを向上させるため、エチレンそのものに対する感受性を低下させる遺伝子を植物に導入するといった技術が望まれている。例えば、遺伝子組換えによってエチレン感受性を低下させ、花持ちを向上させることに関しては、１９９３年にカルフォルニア工科大学のＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚのグループによりシロイヌナズナからエチレン受容体遺伝子がクローニングされたときから様々な検討が始まっている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
ところで、エチレン受容体遺伝子は全ての植物が有しているが、一般に、その配列は植物毎に異なっている。したがって、例えば、植物Ａのエチレン受容体遺伝子を植物Ｂに導入したとしても、植物Ｂ内で植物Ａ由来のエチレン受容体遺伝子が機能するか否かは不明である。
【０００７】
【特許文献１】
特許第３０３００１５号
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、ペチュニア属に属する植物の花持ちを向上させることができるペチュニア属に属する植物の作出方法及びペチュニア属に属する植物由来の形質転換体、並びに花持ちが向上したペチュニア属に属する植物を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）  以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡをペチュニア属に属する植物に導入することを特徴とするペチュニア属に属する植物の作出方法。
（ａ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、付加及び置換されたアミノ酸配列であって、エチレン非結合下でヒスチジンキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（２）  以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを導入したペチュニア属に属する植物由来の形質転換体。
（ａ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、付加及び置換されたアミノ酸配列であって、エチレン非結合下でヒスチジンキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）  以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを導入したペチュニア属に属する植物。
（ａ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、付加及び置換されたアミノ酸配列であって、エチレン非結合下でヒスチジンキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明者は、ペチュニア属に属する植物（以下、単に「ペチュニア植物」という）の花持ち性を調節するため、花持ちに関与する因子の１種であるエチレンに着目した。エチレンは、植物ホルモンとして、花の老化や果実の成熟促進に関与している。そのため、植物体内でエチレンの働きが高まると花の老化が進む。
【００１１】
本発明者は、ペチュニア植物に対してメロンのエチレン受容体遺伝子を導入することによって、当該ペチュニア植物の花持ちを向上させることができることを見いだした。特に、本発明者は、ペチュニア植物に対してメロンのエチレン受容体遺伝子を導入することによって、当該ペチュニア植物を切花としたときに花持ちを向上させることができることを見いだした。
【００１２】
本発明において、ペチュニア植物とは、例えばＰ．ｈｙｂｒｉｄａ種、Ｐ．ａｘｉｌｌａｒｉｓ種、Ｐ．ｉｎｆｌａｔａ種、Ｐ．ｖｉｏｌａｃｅａ種、及びＰ．ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａが挙げられる。
【００１３】
本発明において、メロンのエチレン受容体遺伝子とは、配列番号１又は２に示したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有するか、配列番号１又は２に示したアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸が欠失、付加及び置換されたアミノ酸配列であって、エチレン非結合下でヒスチジンキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを有するものである。ここで、配列番号１に示したアミノ酸配列は、特許第３０３００１５号における「ＭＥＥＲＳ」と同一のアミノ酸配列である。また、配列番号２に示したアミノ酸配列は、配列番号１に示したアミノ酸配列における７０番目のヒスチジンがアラニンに変異したアミノ酸配列である。
【００１４】
ここで、複数のアミノ酸とは、２〜２０個のアミノ酸、好ましくは２〜１０個のアミノ酸、より好ましくは２〜４個のアミノ酸を意味する。すなわち、配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が欠失、付加及び置換されたアミノ酸配列であっても、当該アミノ酸配列からなるタンパク質がエチレン非結合下でヒスチジンキナーゼ活性を有するのであれば、当該アミノ酸配列をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
【００１５】
本発明において「エチレン非結合下」とは、エチレンが存在しない場合及びエチレンに対する結合能が欠如している場合の両方を含む意味である。「ヒスチジンキナーゼ活性」は、例えば、測定対象のタンパク質とグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ；  ｇｌｔａｔｈｉｏｎ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）との融合タンパク質を、３２Ｐ−ＡＴＰを含む反応液中で自己リン酸化（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動後、オートラジオグラフィーによって可視化することによって確認することができる（Ｒｅｂｅｋａｈ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＴＲ１  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．  ９５，  ｐｐ．  ７８２５−７８２９，  Ｊｕｎｅ  １９９８における”ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ”の欄”Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ．”の項を参照）。
【００１６】
本発明において、メロンのエチレン受容体遺伝子は、特許第３０３００１５号に記載された方法に準じて調製することができる。また、特許第３０３００１５号に開示されたメロンのエチレン受容体遺伝子を含むｃＤＮＡ塩基配列（配列番号３に示す）に基づいてプライマーを設計し、このプライマーを用いてメロン由来のゲノムＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲによってメロンのエチレン受容体遺伝子を調製することができる。
【００１７】
ペチュニア植物に対してメロンのエチレン受容体遺伝子を導入する際には、植物の形質転換方法として知られている如何なる方法を用いてもよい。メロンのエチレン受容体遺伝子の導入対象となるペチュニア植物としては、例えば、上述したペチュニア植物の培養細胞、栽培植物の植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、又は植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）のいずれをも意味するものである。
【００１８】
メロンのエチレン受容体遺伝子を組み込んだ発現ベクターは、適当なベクターに、メロンのエチレン受容体遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。メロンのエチレン受容体遺伝子を連結するためのベクターとしては、植物宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡウイルス、バイナリーベクター系などが挙げられる。
【００１９】
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＢＵ１１０、ｐＴＰ５等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。また、アグロバクテリウム法（後述参照）を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター系（ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＳＭＡＫ２５１等）を使用することができる。
【００２０】
当該ベクターにメロンのエチレン受容体遺伝子を挿入するには、まず、メロンのエチレン受容体遺伝子を含む精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断した後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入する方法などが採用される。
【００２１】
このとき、メロンのエチレン受容体遺伝子は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこでベクターには、発現カセットとして、（ｉ）植物細胞内で転写可能なプロモーター配列、（ｉｉ）プロモーター配列の下流にメロンのエチレン受容体遺伝子、並びに（ｉｉｉ）メロンのエチレン受容体遺伝子の下流に結合された、転写の終結及びポリアデニル化に必要な配列を含むターミネーター配列を連結する。発現カセットには、プロモーター以外にも転写をさらに促進するためのＤＮＡ配列、例えばエンハンサー配列などのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。
【００２２】
用いられるプロモーターとしては、植物内で機能するものであれば特に制限されない。例えば、３５Ｓプロモーターなどの恒常的な発現のためのプロモーターや、特定の条件下で誘導可能なプロモーターを用いることも可能である。また、用いられるターミネーター配列としては、カリフラワーモザイクウイルス由来ターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターなどが挙げられる。ただし、植物内で機能することが知られているターミネーターであればこれに限定されるものではない。
【００２３】
さらに、効率的に目的とする形質転換植物を選択するために、有効な選択マーカー遺伝子を発現ベクターに連結することが望ましい。その際に使用する選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＴＰＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子などが挙げられる。
【００２４】
得られた発現ベクターを、当該発現ベクターに組み込まれたメロンのエチレン受容体遺伝子が機能し得るように植物宿主中に導入することにより得ることにより、形質転換細胞ができる。得られた発現ベクターは、公知の種々の方法を用いて植物宿主に導入することができる。例えば、アグロバクテリウムを利用した間接導入法や、エレクトロポレーション法、ポリエチエレングリコール法、パーティクルガン法等の直接導入法を用いることができる。これらのうち、ペチュニア属に属する双子葉植物に対しては、アグロバクテリウムを用いる方法が安定な形質転換を確実に行える点から極めて有効である。この方法では、アグロバクテリウムが保持しているＴｉプラスミドの一部分であるＴ−ＤＮＡ領域が転移して植物のゲノムに組み込まれる。Ｔ−ＤＮＡの転移及び組み込みには、Ｔ−ＤＮＡの両端にある２５塩基対の不完全な繰り返し配列が必須である。従って、この境界配列の間に外来ＤＮＡを挿入することによって、植物ゲノムへ目的とするＤＮＡを取り込むことができる。また、Ｔ−ＤＮＡ領域の転移には、Ｔｉプラスミド上のＶｉｒ領域の遺伝子産物が必要である（植物遺伝子操作マニュアル，内宮博文ら編，講談社サイエンティフィク，１９８４）。
【００２５】
例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した発現ベクター（例えば、Ｔ−ＤＮＡ領域を有するｐＢＩ１２１などのバイナリーベクター）を、適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）  Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ、ＥＨＡ１０５等、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＬＢＡ９４０２等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法などを利用して導入する。続いてこのアグロバクテリウム株を、フローラルディップ法、リーフディスク法などに従って植物宿主の無菌培養物に感染させて、形質転換植物を得ることができる。また、アグロバクテリウム感染法には、中間ベクター法、バイナリーベクター法などがあり、本発明においてはいずれの感染法を利用しても遺伝子導入を行うことができる。
【００２６】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官若しくは植物組織、又はそれらの切片、あるいはカルスやプロトプラストなどの種々の試料を使用することができる。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）等）を用いて処理することによって、植物宿主に発現ベクターを導入する。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、発現ベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。
【００２７】
組換え効率及び取り扱いの容易性の観点から、本発明の好ましい例として、以下にバイナリーベクター系を用いたアグロバクテリウム感染法による形質転換植物の作出を具体的に説明する。
【００２８】
アグロバクテリウム感染法により発現ベクターを導入する場合、メロンのエチレン受容体遺伝子を含む発現ベクターを保有するアグロバクテリウムを植物宿主に感染させる工程が必要である。この工程をフローラルディップ法などのｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ法により行う場合には、形質転換対象の植物宿主を生育させ、メロンのエチレン受容体遺伝子を有する発現プラスミドを含むアグロバクテリウムを懸濁した溶液に植物宿主の花芽を直接浸漬し、その後、植物を生育させて種子を収穫する。次いで、導入ＤＮＡ保有個体を選択するために、得られた種子を適切な抗生物質を加えたＭＳ寒天培地に播種する。この培地で生育した植物を鉢に移植し、生育させることにより、メロンのエチレン受容体遺伝子が導入された形質転換植物を得ることができる（植物のゲノム研究プロトコール，佐々木卓治ら監修，秀潤社，２００１）。
【００２９】
一方、アグロバクテリウムを植物宿主に感染させる工程をリーフディスク法により行う場合には、無菌培養した植物宿主の無菌葉から採取したリーフディスクを、メロンのエチレン受容体遺伝子を含む発現プラスミドを保有するアグロバクテリウムの培養液に浸漬した後に、茎葉分化培地にて培養してカルスを形成させ、増殖させる。茎葉分化培地としては、例えばＭＳ培地等の公知の培地に植物ホルモンを添加したものを使用することができる。その後に選択用の茎葉分化培地を用いてカルスの選択を行う。選択用の培地としては、上記の茎葉分化培地にさらに、形質転換体の選抜のために例えばカナマイシンを、またアグロバクテリウムの殺菌のためにセフォタキシム等の殺菌剤を加えたものを使用すればよい。
【００３０】
形質転換の結果得られるカルス、シュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能である。また従来知られている植物組織培養法を用いて、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）投与などにより植物体に再生させることができる。
【００３１】
メロンのエチレン受容体遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００３２】
メロンのエチレン受容体遺伝子が導入されたペチュニア植物は、メロンのエチレン受容体遺伝子を導入していないペチュニア植物と比較して花持ちが向上したものとなるため、観賞用花卉植物として商業的に価値が高いものとなる。また、メロンのエチレン受容体遺伝子が導入されたペチュニア植物では、メロンのエチレン受容体遺伝子を導入していないペチュニア植物と比較して、特に切花としたときに花持ちが向上したものとなるため、ペチュニア植物の切花として流通させることができる。
【００３３】
花持ちに関する評価は、メロンのエチレン受容体遺伝子を導入した形質転換植物と非形質転換植物（野生型植物）を同様の条件で栽培し、それぞれの開花から花枯れまでの期間を比較することにより行うことができる。例えば、ペチュニアの花持ち試験は、以下の方法により行うことができる。すなわち、開花後２日後までの花を試験に使用して、その花の花首から下約３ｃｍのところで茎を切り取り、花の部分を水の入ったフラスコ（例えば１００ｍｌ三角フラスコ）に入れ、これを２５℃の人工気象室（１６時間明期、８時間暗期）内に置き、その後の花弁の変化を観察する。その他、花持ち性を評価する方法についての詳細な説明は、例えば、切り花の鮮度保持マニュアル（（財）日本花普及センター監修，（株）流通システム研究センター，１９９７）、切り花の鮮度保持（市村一雄著，筑波書房，２０００）などを参照されたい。
【００３４】
さらに、上記のアグロバクテリウム感染細胞からの植物体の分化／誘導の手順を用いて、形質転換された植物体の組織（例えば、根、茎、葉）又は器官（例えば、成長点、花粉）を組織培養することによって、生殖過程（種子）を介することなく、さらなる形質転換植物を得ることができる。このような技術及び手順は当業者には公知であり、組織培養の一般的な方法は、種々の実験マニュアルに記載されている。
【００３５】
このようにして作出したペチュニア植物から得られる種子もまた正常に発芽及び成長し、そして花持ち性が向上しているものである。これは導入されたメロンのエチレン受容体遺伝子が次世代においても保存されることを示し、それゆえ優れた花持ち性が安定して後代に受け継がれることを示す。従って、本発明により、花持ち性が高められた実用的で有用な植物が得られる。
【００３６】
【実施例】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
〔実施例１〕ペチュニア植物の形質転換
本実施例では、ペチュニア植物としてベルベットカーペット（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｘ  ｈｙｂｒｉｄａ  ｈｏｒｔ．”Ｖｅｌｖｅｔ  Ｃａｒｐｅｔ”）を用いた。先ず、ベルベットカーペットの種子をフィルターペーパー（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）に包んで、約１％の有効塩素濃度を持つ次亜塩素酸ナトリウム水溶液で滅菌後、滅菌水で十分洗浄したものを、シュークロース２０ｇ／Ｌの１／２ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．，Ｓｋｏｏｇ．Ｆ．）に播種し、樹脂製の透明角型ポット内で無菌的に生育した。播種後、２５℃の培養室で、１６時間明期、８時間暗期で培養を行った。播種後、５０日で遺伝子導入が行えるほどの大きさに植物体が成長した。
【００３８】
次に、透明角型ポットをクリーンベンチ内に入れ、その中で蓋を開けて植物体を取り出し、無菌的にメスとピンセットで葉を切り取り、葉を約１ｃｍ角の葉片に切り分けた。切り分けたペチュニア植物の切片は、０．８％寒天（培地成分を含まないもの）を入れたプレート上に重ならないように並べた。
【００３９】
一方、ペチュニア植物に導入するメロンのエチレン受容体遺伝子（以下「Ｃｍ−ＥＲＳ１」と称する）は、茨城県農業センター生物工学研究所においてクローン化された。本例では、分譲されたＣｍ−ＥＲＳ１（配列番号３）とＣｍ−ＥＲＳ１において７０番目のアミノ酸がヒスチジンからアラニンになるように変異を導入した遺伝子（以下、「Ｃｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａ」と称する）とを用いた。
【００４０】
形質転換の際に用いるベクターとしては、Ｃｍ−ＥＲＳ１及びＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａを、それぞれｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ製）のＧＵＳ遺伝子部分を除いた領域に挿入したものを使用した。Ｃｍ−ＥＲＳ１或いはＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａを有するベクターをアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株に導入し、Ｃｍ−ＥＲＳ１を有するアグロバクテリウム及びＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａを有するアグロバクテリウムをそれぞれ調製した。そして、これらアグロバクテリウムを、ＬＢ液体培地中で２８℃、１８０ｒｐｍで１６時間それぞれ培養した。
【００４１】
次に、切り分けた葉片を並べたプレートに、それぞれのアグロバクテリウムについて培養液を２ｍ１加え、葉片がアグロバクテリウムの培養液に浸るようにした。そして、２分後、葉片を、滅菌したろ紙上に移し、葉片の表面上の培養液を取り除いた。このアグロバクテリウム培養液に接触させた葉片を、抗生物質を含まない共存培地（ＭＳ培地、ＢＡＰ１ｍｇ／ｌ，  ＮＡＡ０．１ｍｇ／ｌ，  シュークロース３０ｇ／ｌ，  ｐＨ５．７，  ゲルライト２．５ｇ／ｌ）に置床し、明期１６時間、暗期８時間の条件下で、５日間培養した。
【００４２】
次に、アグロバクテリウムを除菌（殺菌）する抗生物質カルベニシリンとマーカー遺伝子によるセレクション用の抗生物質、カナマイシンを含む選択培地に葉片を移し培養を継続した。なお、選択培地は、２週間ごとに新しい培地に交換した。培養１ヶ月でカルス組織及びシュート（幼葉）が形成された。また、遺伝子導入が行われていない組織は、抗生物質により緑色から白色組織に変化して枯死した。
【００４３】
次に、抗生物質培地で生き残ったシュートを切除して、新しい選択培地に移した。選択培地上で、シュートが４〜５枚形成後、カナマイシン濃度を２００ｍｇ／ｌから５０ｍｇ／ｌに低下させた発根培地に移植をした。１〜２週間で発根が確認された。さらに１〜２週間後、培養ポットから外に出し、バーミキュライトの中に移植した。
．外気に順化できるまで、透明のプラスチックカバーをかぶせておいた。２〜３日目で順化を終了し、カバーをはずした。さらに、バーミキュライト上で１〜２週間栽培を継続した。
【００４４】
最後に、植物体が健全に成長していることを確認して、培養土の入った７．５ｃｍポットに１本ずつ植物を移植した。以上により、メロンのエチレン受容体遺伝子を導入したペチュニア植物を作出した。なお、上記の方法で、育成された植物体を遺伝子導入０世代のＴ−０植物と呼ぶ。本例においては、Ｃｍ−ＥＲＳ１を導入したＴ−０植物及びＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａを導入したＴ−０植物を、それぞれ５４系統（８０個体）を育成した。
【００４５】
〔実施例２〕実施例１で作出したペチュニア植物の花持ちの検討
実施例１で作出した２種類のＴ−０植物（Ｃｍ−ＥＲＳ１を導入したペチュニア植物及びＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａを導入したペチュニア植物）を自家交配し、それぞれから種子を取った。系統によっては、種子が極めてできにくいものがあった。これは、Ｃｍ−ＥＲＳ１或いはＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａの導入により、花粉稔性が低下したためであることが考えられる。また、Ｔ−０植物において、花粉の形状の奇形や核が不在のものが観察された。
【００４６】
そして、得られた種子を播種し、Ｔ−０植物の次世代の植物を作出した。Ｔ−０植物の次世代の植物をＴ−１植物と呼ぶ。本例では、Ｃｍ−ＥＲＳ１導入Ｔ−１植物を３４系統（９３株）栽培し、その特性を調査した。なお、Ｃｍ−ＥＲＳ１導入Ｔ−１植物３４系統のＴ−１植物の中で、Ｔ−０植物の時の種子形成率（稔性）が低い系統は、２３系統であった。また本例では、Ｃｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａ導入Ｔ−１植物を１５系統（７３株）栽培し、その特性を調査した。なお、Ｃｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａ導入Ｔ−１植物１５系統のＴ−１植物の中で、Ｔ−０植物の時の種子形成率（稔性）が低い系統は、１０系統であった。
【００４７】
このようにして得られたＣｍ−ＥＲＳ１導入Ｔ−１植物及びＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａ導入Ｔ−１植物を用いて以下のように切花試験を行った。すなわち、両Ｔ−１植物で開花直後の株の茎を約１０ｃｍで切断し、３００ｍｌの三角フラスコに２００ｍｌの水道水をいれたものに挿して花持ちを調査した。
【００４８】
その結果、Ｃｍ−ＥＲＳ１導入Ｔ−１植物３４系統のうち花持ちが向上した（切花で平均７日間以上開花）系統が４系統得られた。またＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａ導入Ｔ−１植物１５系統のうち花持ちが向上した系統が４系統得られた。これに対して、野生型のベルベットカーペットは、花弁の色が赤紫で花が萎れると直ちに全体が紫色になる（図１参照）。これと比較して、花持ちが向上したＴ−１植物では、花色が紫色になるまでの期間が長くなり、花弁が完全に乾燥するまで萎れずに花の形状を保つものも見られた（図２及び３参照）。
【００４９】
〔実施例３〕  Ｃｍ−ＥＲＳ１およびＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａ導入Ｔ−１植物のエチレンガス環境における試験
実施例３では、実施例２で作出したＣｍ−ＥＲＳ１導入Ｔ−１植物及びＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａ導入Ｔ−１植物を用いて、エチレンガス環境下での花持ちに関して調査した。
【００５０】
先ず、Ｃｍ−ＥＲＳ１導入Ｔ−１植物及びＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａ導入Ｔ−１植物の花の茎を長さ３ｃｍで切り、水道水１０ｍ１を入れた樹脂製のチューブに挿した。この花を容積２．８Ｌの樹脂製容器に入れ、蓋をしてから内部のエチレンガス濃度が１ｐｐｍになるようにシリンジによりエチレン標準ガスを加えた。容器内部のエチレンガス濃度が１ｐｐｍとなっているかは、ガス検知管によってエチレンガス濃度を測定して確認した。４８時間後に蓋を開け、花の状態を観察するとともに容器内部のエチレンガス濃度を測定した。
【００５１】
その結果、実施例２で作出したＴ−１植物のうち、花持ちの向上が確認されている系統に関しては、４８時間後も開花を維持した。これに対して、いずれの遺伝子も導入していない野生型の植物では、花が完全に萎れていた（図４参照）。なお、４８時間後の容器内のガス濃度はエチレンガス濃度１ｐｐｍが維持されていた。
【００５２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】野生型のペチュニア植物（ベルベットカーペット）における花の開花から萎れまでを説明するための写真である。図中右側から順に「つぼみ段階」、「開花段階」、「萎れ段階」及び「乾燥段階」の写真である。
【図２】実施例２で作出したＣｍ−ＥＲＳ１導入Ｔ−１植物及び野生型のペチュニア植物の写真である。図中、「Ｃｍ−ＥＲＳ１  Ｔ−１  ＮＯ．  ６４」はＣｍ−ＥＲＳ１導入植物Ｔ−１世代のＮＯ．  ６４株を示し、「Ｃｍ−ＥＲＳ１  Ｔ−１  ＮＯ．  ９１」はＣｍ−ＥＲＳ１導入植物Ｔ−１世代のＮＯ．  ９１株を示し、「ＷＴ」は野生型のペチュニア植物を示す。
【図３】実施例２で作出したＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａ導入Ｔ−１植物の開花後１２日目の写真である。
【図４】実施例３で行ったエチレンガス環境における試験の結果を示す写真である。図中、左側はエチレンガス曝露前のＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａ導入Ｔ−１植物及び野生型ペチュニア植物の写真であり、右側はエチレンガス曝露４８時間後のＣｍ−ＥＲＳ１−Ｈ７０Ａ導入Ｔ−１植物及び野生型ペチュニア植物の写真である
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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