(57)【要約】【課題】本発明は、セカンド（第二）メッセンジャーＩＰ３の細胞内動態をリアルタイムで可視化し、かつ検出し、定量化できる生体内分子センサー、及びそれを用いた検出・定量方法を提供する。【解決手段】本発明は、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）に結合可能なドメインを有するペプチドにおいて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸を、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更し、当該標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸の結合サイトに標識物質を結合させて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により当該標識物質の標識状態が変化することを特徴とするイノシトール類の分子センサー、及びそれを用いたＩＰ３の細胞内での挙動を計測する方法に関する。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）に結合可能なドメインを有するペプチドにおいて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸を、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更し、当該標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸の結合サイトに標識物質を結合させて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により当該標識物質の標識状態が変化することを特徴とするイノシトール類の分子センサー。
【請求項２】
標識物質が、蛍光物質であり、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により蛍光物質の蛍光波長及び／又は蛍光強度が変化するものである請求項１に記載の分子センサー。
【請求項３】
蛍光物質が、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＤＡＮ）である請求項２に記載の分子センサー。
【請求項４】
標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸が、システインである請求項１〜３のいずれかに記載の分子センサー。
【請求項５】
ＩＰ３が結合可能なドメインが、ホスホリパーゼＣδのプレクストリン　ホモロジー　ドメイン（ＰＬＣδＰＨドメイン）である請求項１〜４のいずれかに記載の分子センサー。
【請求項６】
ホスホリパーゼＣδが、ホスホリパーゼＣδ１である請求項５に記載の分子センサー。
【請求項７】
ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えないアミノ酸が、ＰＬＣδ１ＰＨドメインの５６番目のアルギニン、５８番目のバリン、及び／又は１０６番目のアスパラギンである請求項６に記載の分子センサー。
【請求項８】
ペプチドが、ペプチドのＮ末端又はＣ末端にさらにシグナルペプチドを有する請求項１〜７のいずれかに記載の分子センサー。
【請求項９】
シグナルペプチドが、Ｔａｔ、Ｒ９、又はＲ７である請求項８に記載の分子センサー。
【請求項１０】
細胞培養系に請求項１〜９のいずれかに記載の分子センサーを添加し、当該分子センサーの標識物質の標識状態を測定することからなる、細胞内のイノシトール−三リン酸の濃度変化をリアルタイムで計測する方法。
【請求項１１】
標識物質が、蛍光物質であり、ＩＰ３と当該ドメインとの結合による当該蛍光物質の蛍光波長及び／又は蛍光強度の変化を測定するものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の分子センサーを含有する細胞培養系に、被検物質を添加して、被検物質の存在による当該分子センサーの標識物質の標識状態を測定することからなる、被検物質の細胞に対するメッセンジャーとしての機能をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
被検物質が、蛋白質である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ホスホリパーゼＣδのプレクストリン　ホモロジー　ドメイン（ＰＬＣδＰＨドメイン）の５６番目のアルギニン、５８番目のバリン、及び／又は１０６番目のアスパラギンの少なくとも１アミノ酸が、システインに置換され、当該システインのチオール基に蛍光物質が結合したペプチド。
【請求項１５】
蛍光物質が、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＤＡＮ）である請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
ペプチドが、ペプチドのＮ末端又はＣ末端にさらにシグナルペプチドを有する請求項１４又は１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
シグナルペプチドが、Ｔａｔ、Ｒ９、又はＲ７である請求項１６に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞内におけるイノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）の挙動を可視化してリアルタイムで計測できる分子センサーに関する。即ち、本発明は、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）に結合可能なドメインを有するペプチドにおいて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸を、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更し、当該標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸の結合サイトに標識物質を結合させて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により当該標識物質の標識状態が変化することを特徴とするイノシトール類の分子センサー、それを用いた細胞内のイノシトール−三リン酸の濃度変化をリアルタイムで計測する方法、及び被検物質の細胞に対するメッセンジャーとしての機能をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、本発明の前記した分子センサーを構成するペプチドにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は増殖因子、ホルモン、神経伝達物質などの外来情報に応じ、細胞内でセカンド（第二）メッセンジャーを生成し、それを介して細胞内情報伝達を行っている。この細胞内情報伝達系において、アゴニスト刺激により、細胞質内のカルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉを増加させることが知られている。ある場合において、これらのカルシウム増加は、アゴニストにより活性化されたホスフォリパーゼＣが、細胞膜に存在するホスファチジルイノシトール４、５二リン酸［ＰＩ（４，５）Ｐ２］を加水分解し、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）が産出され、そのＩＰ３が細胞内カルシウムストアを刺激し、カルシウムを放出することに起因していると考えられている。このＩＰ３を介した内膜小胞体からのカルシウムの流入は、高空間・時間分解能をもつＦｕｒａ−２といったカルシウムセンサーを用いて、単一細胞レベルで定量的によく研究されており、ＩＰ３と連動したカルシウムの重要性が明らかになりつつある。しかしながら細胞内での情報伝達を担う分子の生体内動態を検討するための技術は非常に限られており、近年次々と見いだされるシグナル伝達経路がどのように活性化されているかを細胞内で実証することは困難である。そのためには生体内でセカンドメッセンジャーを可視化できる技術、即ち分子センサーの開発が必須となってきている。
【０００３】
とりわけ、ポストゲノム科学では細胞内での情報伝達を担う分子の生体内動態の解析が重要となってきており、セカンドメッセンジャーの動態を細胞内で観測できるような分子センサーの開発が急務である。これまでに国内外で有機分子を用いてセカンドメッセンジャーを捕捉する人工リセプターを合成しようとする研究が活発に行われているが、選択性・親和性において実用レベルに達しているものはない。
細胞内カルシウム動態は、Ｆｕｒａ−２などのセンサーを用いてよく調べられている。一方、ＩＰ３の量を定量する技術として、トリチウムラベルしたイノシトール（［３Ｈ］−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を細胞内に取り込ませ、アゴニストによる刺激を加えたのち細胞を破砕し、イノシトールポリリン酸の代謝量を陰イオンクロマトグラフィーにより定量する方法が知られている（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，　Ｍ．　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　１９８３，　２１２，　４７３−４８２；　Ｈａｗａｋｉｎｓ，　Ｐ．　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　１９８６，　２３８，　５０７−５１６）。この方法を用いて、ホスファチジルイノシトールやイノシトールポリリン酸の代謝経路やイノシトールポリリン酸のカルシウムシグナルに対する役割が解明されている（Ｄｉｊｉｋｅｎ，　Ｐ．　Ｖ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．１９９５，　２７０，　２９７２４−２９７３１；　Ｈｕｎｙａｄｙ，　Ｌ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　１９９４，　２６９，　２４７９８−２４８０４；　Ｍａｔｋｏｖｉｃｈ，　Ｓ．　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２０００，　２７５，　１０８４５−１０８５０）。しかし、この方法は、単一細胞レベルでの空間かつ時間的なＩＰ３の変化量を測定することが不可能であるといった欠点がある。
【０００４】
最近、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を融合したホスホリパーゼ　Ｃのプレクストリン　ホモロジー　ドメイン（ＰＬＣδＰＨドメイン）を用いて、細胞内のＰＩ（４，５）Ｐ２、ＩＰ３の変化をリアルタイムで可視化する方法が報告されている（Ｓｔａｕｆｆｅｒ，　Ｔ．　Ｐ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒ．　Ｂｉｏｌ．，　１９９８，　８，　３４３−３４６；　Ｖａｒｎａｉ，　Ｐ．，ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１９９８，　１４３，　５０１−５１０；　Ｎａｓｈ，　Ｍ．　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２００１，　２７６，　１９２８６−１９２９３）。このＰＬＣδＰＨ−ＧＦＰは、非刺激時の細胞においてはＰＩ（４，５）Ｐ２と結合することにより細胞膜に局在化しており、アゴニストによる刺激後、ＰＩ（４，５）Ｐ２が加水分解されることにより細胞質に遊離する。その後のＰＩ（４，５）Ｐ２の再合成が起こりＰＬＣδＰＨ−ＧＦＰはまた細胞膜に移動する。このような一過的な細胞内の蛍光変化が種々の細胞で観測されている。特に、この方法を用いてイヌ腎臓上皮細胞におけるカルシウムオシレーションに同期したＩＰ３オシレーションも観測されている（Ｈｉｒｏｓｅ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９９９，　２８４，　１５２７−１５３０）。さらに最近、ＰＬＣδＰＨ−ＣＦＰとＰＬＣδＰＨ−ＹＦＰを細胞内で発現させ、そのＦＲＥＴにより同様の原理に基づいてＰＩ（４，５）Ｐ２、もしくはＩＰ３の変化を可視化する方法も報告されている（Ｗａｌ，　Ｊ．　Ｖ．　Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２００１，　２７６，　１５３３７−１５３４４）。
しかしながら、これらの方法はＰＩ（４，５）Ｐ２の加水分解に基づくものであり、ＩＰ３動態を直接観測できるものではない。これらの方法は、ＰＩ（４，５）Ｐ２の加水分解に基づく挙動から、ＩＰ３動態を推定するものに過ぎない。また、単一細胞内のＩＰ３の濃度変化を測定することは、これらの方法では不可能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、セカンド（第二）メッセンジャーＩＰ３の細胞内動態をリアルタイムで可視化し、かつ検出し、定量化できる生体内分子センサー、及びそれを用いた検出・定量方法を提供することを目的としている。また、本発明は、細胞内に導入可能な生体内分子センサーを提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＩＰ３とＰＨドメインの結合を検討し、ＰＨドメインにはＩＰ３と結合するための結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｏｃｋｅｔ）を形成することを報告してきた（Ｍｏｒｉｉ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　２００２，　１２４，　１１３８−１１３９）。本発明者らは、この結合ポケットを利用した新規な分子センサーとして、ＰＨドメインに蛍光物質のような標識物質を導入し、導入された標識物質が当該結合ポケットに収納され、かつＩＰ３とＰＨドメインの結合を阻害せず、そしてＩＰ３とＰＨドメインの結合により当該標識物質の物性が変化するものをデザインしたところ、蛍光物質による標識化によりＩＰ３とＰＨドメインの結合を選択的に可視化できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）に結合可能なドメインを有するペプチドにおいて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸を、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更し、当該標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸の結合サイトに標識物質を結合させて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により当該標識物質の標識状態が変化することを特徴とするイノシトール類の分子センサー、より詳細には、当該標識物質が、蛍光物質であり、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により蛍光物質の蛍光波長及び／又は蛍光強度が変化するものである前記分子センサーに関する。さらに詳細には、本発明の分子センサーとなるペプチドのＮ末端又はＣ末端にさらにシグナルペプチドを有することを特徴とする、細胞内に導入可能な分子センサーに関する。
【０００８】
また、本発明は、細胞培養系に前記した本発明の分子センサーを添加し、当該分子センサーの標識物質の標識状態を測定することからなる、細胞内のイノシトール−三リン酸の濃度変化をリアルタイムで計測する方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の分子センサーを含有する細胞培養系に、被検物質を添加して、被検物質の存在による当該分子センサーの標識物質の標識状態を測定することからなる、被検物質の細胞に対するメッセンジャーとしての機能をスクリーニングする方法に関する。
また、本発明は、ホスホリパーゼＣδのプレクストリン　ホモロジー　ドメイン（ＰＬＣδＰＨドメイン）の５６番目のアルギニン、５８番目のバリン、及び／又は１０６番目のアスパラギンの少なくとも１アミノ酸が、システインに置換され、当該システインのチオール基に蛍光物質が結合したペプチドにも関する。
【０００９】
本発明者らは、単一細胞内でのＩＰ３の変化をリアルタイムで可視化することを目的として、ＩＰ３に対して特異的に結合することで知られているＰＬＣδＰＨドメインを蛍光ラベルすることによりＩＰ３蛍光センサーからなる分子センサーを作製した。例えば、ホスホリパーゼＣδ１（ＰＬＣδ１）のＰＨドメインのＩＰ３結合部位周辺の１０６番目のアスパラギン残基をシステインに変異させ（Ｎ１０６Ｃ）、そのシステインに特異的に蛍光試薬６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（６−Ｂｒｏｍｏａｃｅｔｙｌ−２−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ（ＤＡＮ））を反応させたセンサー（ＤＡＮ１０６）を作製した。
この分子センサーは、ＩＰ３の結合前は蛍光物質がＰＨドメインの結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｏｃｋｅｔ）におさまっていると予想され、この状態が準安定状態となるため、ＩＰ３への選択性が向上するものと期待された。
【００１０】
さらに、前記ＤＡＮ１０６のＮ末端又はＣ末端にこれを細胞内に導入可能にするためのシグナルペプチドを結合させた。
図１に、本発明の前記した分子センサーの例を模式的に示す。図１（ａ）は、ＰＬＣδＰＨドメインの１０６番目のアスパラギンをシステインに変異させたＰＬＣδＰＨドメインをに示す。この変異させたシステインに蛍光試薬ＤＡＮを反応させて本発明の分子センサーを得た。この末端にシグナルペプチドＴａｔ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ｒ７（ＲＲＲＲＲＲＲ）、又はＲ９（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）を融合させた配列を有するペプチドがそれぞれ図１（ｂ）、図１（ｃ）、及び図１（ｄ）に示されている。以下、これらをそれぞれＴａｔ−ＤＡＮ１０６、Ｒ７Ｃ−ＤＡＮ１０６、及びＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６と呼ぶ。
これらのシグナルペプチドは、本体のペプチドを細胞内に導入可能にするものである。このシグナルペプチドを融合させたタンパク質は、種々の細胞において細胞と短時間インキュベートするだけで目的タンパク質を細胞内に導入可能であることが報告されている。これらＴａｔ−ＤＡＮ１０６、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６、Ｒ７Ｃ−ＤＡＮ１０６のセンサーをＨＥＫ２９３細胞やＣＨＯ細胞などに導入し、細胞内カルシウム濃度を上昇させるアゴニストで細胞を刺激したところ、細胞内のセンサーの蛍光変化を観測することができた。
【００１１】
得られたＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を用いてＩＰ３の非存在下、及び存在下での蛍光強度を検討した。インビトロでＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のＩＰ３添加（０−５０μＭ）に伴う蛍光変化の結果を図２に示す。図２の横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６では、ＩＰ３結合時、蛍光強度が大きく減少し、蛍光波長が長波長シフトするという特性を持っていることがわかる。シグナルペプチドの融合していないセンサーと同様の結果を示した。ＩＰ３濃度に対して蛍光強度変化率をプロットし、フィッティングすることによりＫｄを算出した結果、複合体の解離定数（Ｋｄ）は１．９７μＭであった。
図２の右上のグラフは、ＩＰ３濃度に対し、５００ｎｍの蛍光強度変化率（ΔＦ）をプロットしたものである。当該グラフの横軸はＩＰ３の濃度（μＭ）を示し、縦軸は蛍光強度変化率（ΔＦ）を示す。当該グラフ中のバーの位置は実測点である。バーに付されている幅は標準偏差を示している。蛍光強度変化率ΔＦはΔＦｍａｘを１．０として作製している。そして、次の式、
ΔＦ　＝　ΔＦｍａｘ　｛［ＩＰ３］　／（Ｋｄ　＋　［ＩＰ３］）｝
にフィッティングすることによりＫｄ値を算出した。
【００１２】
次に、本発明の分子センサーの細胞内での挙動を観察した。
ＨＥＫ細胞内Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のＨＥＫ細胞を１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６で室温下１時間処理し、ＣＣＤカメラで測定した結果を図３に図面に変わる写真で示す。図３ａはＨＢＳバッファーで１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像を示し、図３ｂはＨＢＳバッファーで１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示し、図３ｃは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像、図３ｄは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示す。
Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６で１時間処理した細胞においてわずかに蛍光が観測された（図３ｄ）。しかし、蛍光が観測された細胞は死んでいると思われ、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６が細胞毒性を示しているか、もしくは死んだ細胞に特異的にセンサーが取り込まれているのではないかと推定された。コントロールとしてＨＢＳバッファーで室温下１時間処理した細胞では蛍光が全く観測されなかった（図３ｂ）。
【００１３】
さらに、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による処理時間を２〜８時間と変化させたのち測定したが、細胞死の現象は時間が長くなるにつれより顕著になった。処理時間を短くして１５分行った結果を図４に図面に変わる写真で示す。図４ａは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を室温で１５分インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像を示し、図４ｂは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を室温で１５分インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示す。この条件でも充分細胞内に分子センサーが取り込まれており、細胞の状態も１時間処理した場合よりも良好であった。
【００１４】
次に、カルバコール刺激による細胞内のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光の変化の測定について検討した。ＨＥＫ細胞には細胞膜上にムスカリン酸受容体を発現しており、カルバコールにより刺激され、ＰＬＣβの活性化によりＩＰ３が産出され細胞内カルシウム増加を引き起こすことが知られている。
Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を導入したＨＥＫ細胞に対して蛍光測定を行った結果を図５に示す。図５の横軸は時間（秒）を示し、図５ａの縦軸はＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の蛍光強度変化の比を示し、図５ｂの縦軸はＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による相対蛍光強度を示す。図５ａはＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度変化を示し、０−５分（３００秒）まではＨＢＳバッファー中であり、５分−１０分は３０μＭ　カルバコールを添加した場合である。図５ｂはＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光変化を示し、０−５分（３００秒）はＨＢＳバッファー中であり、５分−１０分（６００秒）は３０μＭ　カルバコールを添加した場合であり、１０分−２０分は再びＨＢＳバッファーにした場合の結果である。
この結果、３０μＭのカルバコールにより刺激したところ、持続的に蛍光強度が減少し、約３分でほぼ平衡状態に達した。さらに５分後にＨＢＳ　バッファーで洗浄することにより蛍光が緩やかに回復するのが観測された（図５ｂ）。Ｆｕｒａ−２を導入した細胞において同様の操作を行った結果、カルバコール刺激により細胞内カルシウム濃度が一過的に増加しているのが観測された（図５−ａ）。この蛍光の減少はＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のインビトロのＩＰ３濃度増加に伴う減少と一致していることから（図２参照）、カルバコール刺激により細胞内でＩＰ３濃度が増加していることに起因していることが示された。
【００１５】
同様にアゴニスト刺激による細胞内における蛍光変化をＣＨＯ、及びＤＴ４０細胞を用いて行った。ＣＨＯ細胞は細胞膜上にプリン受容体を発現しており、ＡＴＰ刺激によりＰＬＣβの活性化が起こり、ＩＰ３が産出され細胞内カルシウム増加を引き起こすことが知られている。また、ＤＴ４０細胞の場合は、細胞膜上にＢ細胞抗原（Ｂ　ｃｅｌｌ　ａｎｔｉｇｅｎ）受容体を発現しており、Ｍ４刺激によりＰＬＣγの活性化が起こり、ＩＰ３が産出され細胞内カルシウム増加を引き起こすことが知られている。
ＣＨＯ、及びＤＴ４０細胞に対しても、ＨＥＫ細胞の場合と同様にＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６の導入を行った。結果を図６に図面に変わる写真で示す。図６Ａは１％Ｆ−１２７を含む１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を３７℃で１０分インキュベートしたＣＨＯ細胞（ａ）、ＤＴ４０細胞（ｂ）の図面に代わる蛍光画像写真である。図６Ｂの横軸は時間（分）を示し、縦軸は相対比をそれぞれ示す。図６Ｂの（ａ）は、ＣＨＯ細胞における１００μＭ　ＡＴＰ刺激によるＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の変化を比で示したもの（上）、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光の変化を相対蛍光強度で示したもの（下）である。０−２分はＨＢＳバッファーで、２−３分は１００μＭ　ＡＴＰで、３−１０分はＨＢＳバッファーで、１０−１１．５分は１００μＭ　ＡＴＰで、１１．５−１５分はＨＢＳバッファーで、１５−１７分は１００μＭ　ＡＴＰで、１７−２０分はＨＢＳバッファーで処理した。図６Ｂの（ｂ）は、ＤＴ４０細胞における１ｍｇ／ｍｌ　Ｍ４刺激によるＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の変化を比で示したもの（上）、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光の変化を相対蛍光強度で示したもの（下）である。０−２分はＨＢＳバッファーで、２−３．５分は１ｍｇ／ｍｌ　Ｍ４で、３−６分はＨＢＳバッファーで処理した。
この結果、ＣＨＯ、及びＤＴ４０細胞共に細胞で蛍光が観測され（図６Ａ−ａ、ｂ）、細胞内への取り込み効率はＨＥＫ細胞よりも効率が高かった。Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を導入したＣＨＯ細胞に対して１００μＭ　ＡＴＰ刺激した結果、各刺激、洗浄に対応した可逆的な蛍光強度の変化が観測された（図６Ｂ−ａ）。しかし、ＤＴ４０細胞においては、１ｍｇ／ｍｌ　Ｍ４による明確な変化は観測されなかった（図６Ｂ−ｂ）。これは細胞毒性のほうが強かったためと思われる。
【００１６】
さらに、阻害剤処理したＣＨＯ細胞におけるＡＴＰ刺激によるＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６の蛍光強度の変化について検討した。ＣＨＯ細胞に１μＭ　Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を３７℃で１０分間インキュベートした後、１μＭのＵ７３３４３又は、１μＭのＵ７３１２２に１５分間インキュベートし測定を行った。結果を図７に示す。図７の横軸はインキュベートした時間（分）を示し、縦軸は相対蛍光強度を示す。図７の○印はコントロールを示し、○印は１μＭのＵ７３３４３を添加した場合を示し、○印は１μＭのＵ７３１２２を添加した場合を示す。各細胞培養系に与えた刺激を矢印で示す。
この結果、ＰＬＣの阻害剤であるＵ７３１２２処理したＣＨＯ細胞において、１００μＭ　ＡＴＰ刺激により蛍光強度の減少が抑制された。Ｕ７３１２２の類似体で阻害効果のないＵ７３３４３処理したＣＨＯ細胞では、１００μＭ　ＡＴＰ刺激により蛍光強度の変化が観測された。これにより、このアゴニスト刺激による蛍光の変化が、ＰＬＣ活性に依存した変化であり、これはＩＰ３の濃度の上昇に対応した変化であることが示された。
【００１７】
以上に具体的な例により説明してきたように、本発明者らは、細胞内ＩＰ３変化を可視化するのを目的として、本発明の分子センサーの例としてＰＬＣδＰＨドメインを基とするＩＰ３センサーを製造し、その機能を解析した。天然のＰＬＣδＰＨドメインはＩＰ３に対してすでに高い親和性（Ｋｄ＝０．２μＭ）をもっており、他のホスファチジルイノシトールポリリン酸やイノシトールポリリン酸に対しての親和性が低く、ＩＰ３に対して高選択性を保有しているドメインであることが知られている。特にＰＩ（４，５）Ｐ２との解離定数が２μＭとＩＰ３と比較して低い値が報告されており、ＰＩ（４，５）Ｐ２とＩＰ３を識別するのにはこのＰＬＣδＰＨドメインをＩＰ３センサーの土台にするのが好ましいが、必ずしもこれに限定される訳ではない。
本発明者らは、ＰＬＣδＰＨドメインのＩＰ３結合領域周辺の残基（Ｎ１０６）をシステインに変異させ、そのシステインに蛍光ラベルしたＰＨドメイン（ＤＡＮ１０６）は、ＩＰ３濃度依存的に蛍光強度が大きく減少し、かつ長波長シフトする性質を持つ事を見出し、報告してきた（Ｍｏｒｉｉ，　Ｔ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　２００２，　１２４，　１１３９−１１４０）。ＰＨドメインを蛍光ラベルした場合、解離定数が僅かに減少する（Ｋｄ＝〜２μＭ）が、細胞内でのＰＩ（４，５）Ｐ２加水分解後のＩＰ３変化を検出するのには適した解離定数になっていると考えられる。また、蛍光ラベルすることにより、他のイノシトールポリリン酸に対する親和性が減少し、よりＩＰ３に対する選択性が増加しているのが観測された。
そして、細胞外から細胞内にセンサーを簡便に導入することを目的としてＤＡＮ１０６の末端に細胞内に導入可能なシグナルペプチド（Ｔａｔ，Ｒ９，Ｒ７ペプチド）を融合させたものを製造した（Ｔａｔ−ＤＡＮ１０６、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６、Ｒ７Ｃ−ＤＡＮ１０６）。このシグナルペプチドを融合させたタンパク質は、種々の細胞において細胞と短時間インキュベートするだけで目的タンパク質を細胞内に導入可能であることが報告されている。このＲ９を融合したＤＡＮ１０６（Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６）は、シグナルペプチドＲ９と融合していないセンサーペプチドと同様のＩＰ３に対する蛍光変化を示した。
【００１８】
Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６はＨＥＫ細胞で１０分程度インキュベートするのみで細胞内に取り込まれ、さらにインキュベート時間を長くすると細胞が死んでいくのが観測された。細胞を蛍光顕微鏡で観測すると蛍光を強く発していることから、あまり細胞内に取り込ませると、センサーがホスファチジルイノシトールポリリン酸代謝を阻害することにより細胞の寿命に影響が出てくると考えられる。
ＨＥＫ細胞において、カルバコール刺激を加えることにより蛍光が穏やかに減少し、約３分で平衡に達した。これに比べ、Ｆｕｒａ−２によるカルシウム濃度変化は、刺激後５秒以内に一過的な変化が観測されている。このカルシウム濃度上昇とＩＰ３濃度上昇の速度の違いというのは次の３点が考えられる。
（ｉ）このセンサーのＩＰ３に対する解離定数は約２Ｍであり、ＩＰ３受容体のＩＰ３に対する解離定数が約数１０ｎＭである事から判断すると、カルシウムの一過的な変化を引き起こすのに必要なＩＰ３濃度上昇の段階を検出するのは困難であり、その後に続く持続的なＩＰ３濃度増加を観測している可能性がある。これは以前ラット耳下腺のスライスに［３Ｈ］−イノシトールを取り込ませその代謝生成物を定量する系で報告されているのだが（Ｄｏｗｎｅｓ，　Ｃ．　Ｐ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　１９８３，　２１６，　６３３−６４０）、カルバコール刺激後５秒以内に大きくＩＰ３増加が起こり、その後刺激を続けた場合数分の間持続的にＩＰ３が増加していく傾向が観測されていることからも示唆される。
（ｉｉ）　刺激後の細胞膜直下のＩＰ３濃度は急激に増加しているが、種々のＰＨドメインや他のイノシトールポリリン酸をターゲットとするタンパク質に補足され、実際細胞質内の有効濃度上昇が遅く観測されている。
（ｉｉｉ）　もしイノシトール１、３、４、５四リン酸、イノシトール１、３、４三リン酸などの代謝物にも結合しているならば、代謝されたイノシトールポリリン酸の総量として検出している分、時間的に遅れがでる可能性がある。しかし、このＩＰ３センサーはイノシトール１、３、４、５四リン酸に対してＩＰ３の約３０倍の大きい解離定数であり（Ｋｄ＝６４μＭ）、実際ＩＰ３が数Ｍに上昇するまでにイノシトール１、３、４、５四リン酸やイノシトール１、３、４三リン酸が数十μＭも上昇していると考えにくい。
【００１９】
刺激後、洗浄を行うことにより約５分後に初期値にまで蛍光が回復していくのが観測された。これは、ＩＰ３が他のイノシトールポリリン酸に代謝され、センサーからＩＰ３が解離したことに起因すると考えられる。これは以前に、ラット耳下腺のスライスをカルバコール刺激した後、アトロピン（ムスカリン受容体のアンタゴニスト）により阻害をかけた場合、数分オーダーでＩＰ３が代謝され減少してくという報告があり（Ｄｏｗｎｅｓ，　Ｃ．　Ｐ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　１９８３，　２１６，　６３３−６４０）、今回得られた蛍光の回復していく時間的にも合っている。
【００２０】
本発明は、新規な分子センサーを提供するものである。本発明の分子センサーは、対象となる分子種に標識物質を導入するのではなく、対象となる分子種を結合する分子種に標識物質を導入し、両者の結合に実質的な影響を与えないないようにしながら、両者の結合の有無により標識物質の標識の状態を変化させることにより対象となる分子種の分子センサーとするというコンセプトに基づくものである。即ち、本発明は、第一の蛋白質（対象となる分子種）に結合し得る第二の蛋白質（対象となる分子種が結合する分子種）であって、当該第二の蛋白質は標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸を少なくとも１個有し、当該結合サイトに標識物質が結合しており、かつ当該第二の蛋白質に第一の蛋白質が結合することにより標識物質の物性が変化し、標識の状態が変化し、当該物性又は標識の状態の変化を検出又は定量化できることを特徴とする分子センサーを提供するものである。また、それを利用した第一の蛋白質の挙動を計測する方法を提供するものである。
【００２１】
より詳細には、本発明は、対象となる分子種としてイノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）を選定したものであり、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）に結合可能なドメインを有するペプチドにおいて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸を、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更し、当該標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸の結合サイトに標識物質を結合させて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により当該標識物質の標識状態が変化することを特徴とするイノシトール類、好ましくはＩＰ３の分子センサーを提供するものである。
本発明の第一の蛋白質（対象となる分子種）としては、第一の蛋白質が結合し得る第二の蛋白質が存在するものの中から選定することができるが、標識物質を目的に沿って第二の蛋白質の中に結合できるサイトを有するものでなければならず、好ましい第一の蛋白質としては、袋状になっている、例えばポケットのような結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｏｃｋｅｔ）を有する第二の蛋白質に結合する蛋白質が挙げられる。本発明の好ましい第一の蛋白質としては、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）が挙げられる。
【００２２】
本発明における第二の蛋白質（対象となる分子種に結合する分子種）としては、第一の蛋白質（対象となる分子種）に結合し得るものであればよく、当該結合としては、イオン結合や水素結合のような化学結合であってもよいが、物理的な吸着であってもよく、単なる解合のようなものであってもよいが、両者が選択的に結合することが必要である。このような選択的な結合は、競争的なものであってもよいが、結合又は解離定数が一定であるのが好ましい。
好ましい第二の蛋白質（対象となる分子種に結合する分子種）としては、第一の蛋白質が選択的に結合する蛋白質またはその特定の結合ドメインが挙げられる。第二の蛋白質（対象となる分子種に結合する分子種）の長さには特に制限は無いが、第一の蛋白質が結合するに十分なアミノ酸長があればよい。第一の蛋白質としてイノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）を想定する場合には、好ましい第二の蛋白質としては、ホスホリパーゼＣ、好ましくはホスホリパーゼＣδのプレクストリン　ホモロジー　ドメイン（ＰＬＣδＰＨドメイン）が挙げられる。より好ましい第二の蛋白質としては、ホスホリパーゼＣδ１のプレクストリン　ホモロジー　ドメイン（ＰＬＣδ１Ｈドメイン）が挙げられる。
【００２３】
本発明における第二の蛋白質に結合させる標識物質としては、第一の蛋白質と第二の蛋白質の結合を阻害しない物質であって、両者の結合の有無により物性又は標識の状態に変化が生じるものであれば特に制限はないが、可視光によりその変化を確認することができるものが好ましい。好ましい標識物質としては蛍光物質が挙げられる。このような蛍光物質は、第一の蛋白質と第二の蛋白質との結合の有無により、当該蛍光物質の蛍光波長及び／又は蛍光強度が変化するものであり、このいずれか一方又は両者の変化により結合の有無を検出し、定量できるものであればよい。
好ましい蛍光物質としては、例えば、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＤＡＮ）、５−ヨードアセタミドフルオレセン（５−ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（５Ｆ）、６−ヨードアセタミドフルオレセン（６−ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（６Ｆ）、２−［４’−（２”−ヨードアセタミド）フェニル］アミノナフタレン−６−スルホン酸（ＡＮＳ）などのチオール基との反応性を揺する物質が挙げられるがこれに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の分子センサーにおける、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸としては、両者の結合に実質的な影響を与えない、即ち、両者の選択的な結合を実質的に阻害しない位置のアミノ酸であって、かつ当該アミノ酸をシステインのような他のアミノ酸に変更することによっても両者の結合に実質的な影響を及ぼさない位置のアミノ酸である。例えば、ＩＰ３が結合するドメインとしてＰＬＣδ１ＰＨドメインを用いる場合には、ＰＬＣδ１ＰＨドメインの５６番目のアルギニン（Ｒ）、５８番目のバリン（Ｖ）、１０６番目のアスパラギン（Ｎ）などが挙げられる。
例示のために、本発明の具体例で使用したＰＬＣδ１ＰＨドメインのアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記で以下に示しておく。
【００２５】
１１　ＨＧＬＱＤＤＰＤＬＱＡＬＬＫＧＳＱＬＬＫＶＫＳＳＳＷＲＲＥＲ
４１　ＦＹＫＬＱＥＤＳＫＴＩＷＱＥＳＲＫＶＭＲＳＰＥＳＱＬＦＳＩＥ
７１　ＤＩＱＥＶＲＭＧＨＲＴＥＧＬＥＫＦＡＲＤＩＰＥＤＲＳＦＳＩＶ
１０１　ＦＫＤＱＲＮＴＬＤＬＩＡＰＳＰＡＤＡＱＨＷＶＱＧＬＲＫＩＩＨ
１３１　ＨＳＧＳＭＤＱＲＱＫ
【００２６】
このペプチドにおける前記した３箇所のアミノ酸、即ち５６番目のアルギニン（Ｒ）、５８番目のバリン（Ｖ）、１０６番目のアスパラギン（Ｎ）は、ＩＰ３との結合に寄与しておらず、かつこれらのアミノ酸のβ−炭素原子はＩＰ３のＣ２炭素原子から約８〜９．７オングストローム離れている。したがって、これらのアミノ酸は、丁度、結合ポケットに位置していることになる。
このような位置にあるアミノ酸が本発明のＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えないアミノ酸として好ましいものである。
【００２７】
本発明の分子センサーは、前記した位置のアミノ酸の少なくとも１個のアミノ酸が、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更するものであるが、第二の蛋白質が元も当該位置にそのようなアミノ酸を有している場合には必ずしも変更する必要はない。本発明における標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸としては、ペプチド結合を形成するアミノ基とカルボキシル基以外に、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基などの官能基を有するものであればよいが、このような官能基としてはチオール基が好ましい。したがって、好ましい標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸としては、チオール基を有するアミノ酸、例えばシステインなどが挙げられる。
【００２８】
本発明の分子センサーの他の特徴は、本発明の分子センサーのペプチドのＮ末端又はＣ末端にさらにシグナルペプチドを有することである。このようなシグナルペプチドを有することにより、本発明の分子センサーを細胞外から供給することが可能となる。本発明のシグナルペプチドとしては、ペプチドを細胞内に取り込ませる作用を有するものであればよく、例えば、Ｔａｔ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ｒ７（ＲＲＲＲＲＲＲ）、Ｒ９（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）などが挙げられる（カッコ内は、当該シグナルペプチドのアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記で示したものである。）。
【００２９】
本発明は、前記してきた本発明の分子センサーを用いて細胞内のイノシトール−三リン酸の濃度変化をリアルタイムで計測する方法を提供するものである。本発明の分子センサーは、細胞培養系における細胞内に直接導入してもよいが、本発明の分子センサーが前記したシグナルペプチドを有するものである場合には、細胞外に添加することにより細胞内に取り込まれることから、細胞外の培養液中に添加するだけであってもよい。
本発明のこの方法における標識物質の標識状態としては、可視化の可能なものが好ましい。例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合には、ＩＰ３と当該分子センサーとの結合による当該蛍光物質の蛍光波長及び／又は蛍光強度の変化を測定する方法が好ましい。また、測定方法としては目視でもよいが蛍光強度を測定できる機器による測定が、特に定量化にためには好ましい。
本発明のこの方法により、細胞内のイノシトール−三リン酸の濃度変化をリアルタイムで検出、定量又は同定することが可能となり、細胞内におけるイノシトール−三リン酸の挙動をリアルタイムで可視化でき、かつ必要に応じて検出、定量又は同定することもできる。
【００３０】
また、本発明は、前記した本発明の分子センサーを利用して、ある物質の細胞に対する作用をスクリーニングすることができる。本発明の分子センサーの対象となる分子種として、細胞内のセカンドメッセンジャーとして知られているイノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）を採用した場合には、細胞膜に存在する受容体の挙動に応じて当該ＩＰ３が特定の挙動を示すのであるから、当該受容体に反応する物質（メッセンジャー）であるか否かを当該ＩＰ３の挙動を本発明の分子センサーにより計測することにより、判定することができる。
例えば、本発明の分子センサーを含有する細胞培養系に、ある物質（被検物質）を添加して、被検物質の存在による当該分子センサーの標識物質の標識状態を測定することにより、被検物質の存在に対応した細胞内におけるＩＰ３の挙動を測定することができ、その結果として、被検物質が当該細胞に対するメッセンジャーであるか否かをスクリーニングすることが可能となる。この方法におけるメッセンジャーとしては、受容体に対するアゴニスト、リガンド、アンタゴニストなどのいずれであってもよい。
また、被検物質としては、生理活性物質、合成化学物質、天然物、蛋白質などのいずれの物質であってもよいが、プロテオーム解析などにこの方法を応用することにより簡便でかつ可視化できることから非常に有用な方法となることから、被検物質として蛋白質を使用する方法が好ましい例として挙げられる。
【００３１】
さらに本発明は、新規かつ有用なペプチドを提供するものである。本発明のペプチドは、第一の蛋白質（対象となる分子種）に結合し得る第二の蛋白質（対象となる分子種が結合する分子種）からなるペプチドであって、当該第二の蛋白質は標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸を少なくとも１個有し、当該結合サイトに標識物質が結合しており、かつ当該第二の蛋白質に第一の蛋白質が結合することにより標識物質の物性が変化し、標識の状態が変化し、当該物性又は標識の状態の変化を検出又は定量化できる標識物質が結合していることを特徴とするペプチドを提供するものである。
【００３２】
より詳細には、本発明のペプチドは、対象となる分子種としてイノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）を選定したものであり、イノシトール−１、４、５−三リン酸（ＩＰ３）に結合可能なドメインを有するペプチドにおいて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合に直接影響を与えない少なくとも１個のアミノ酸を、標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸に変更し、当該標識物質を結合し得る結合サイトを有するアミノ酸の結合サイトに標識物質を結合させて、ＩＰ３と当該ドメインとの結合により当該標識物質の標識状態が変化する標識物質が結合していることを特徴とするペプチドを提供するものである。
さらに詳細には、本発明のペプチドは、ホスホリパーゼＣδのプレクストリンホモロジー　ドメイン（ＰＬＣδＰＨドメイン）、好ましくはＰＬＣδ１ＰＨドメインの５６番目のアルギニン、５８番目のバリン、及び／又は１０６番目のアスパラギンの少なくとも１アミノ酸が、システインに置換され、当該システインのチオール基に蛍光物質が結合したペプチドを提供するものである。本発明のペプチドは、ＰＬＣδ１ＰＨドメインの５６番目のアルギニン、５８番目のバリン、又は１０６番目のアスパラギンのいずれか１個又は２個以上がシステインに置換されたものであればよいが、好ましくは１０６番目のアスパラギンがシステインに置換されたものが挙げられる。
【００３３】
本発明のペプチドにおける蛍光物質としては、例えば、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＤＡＮ）、５−ヨードアセタミドフルオレセン（５−ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（５Ｆ）、６−ヨードアセタミドフルオレセン（６−ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（６Ｆ）、２−［４’−（２”−ヨードアセタミド）フェニル］アミノナフタレン−６−スルホン酸（ＡＮＳ）などのチオール基との反応性を揺する物質が挙げられ、より好ましい蛍光物質としてはが、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＤＡＮ）が挙げられる。
また、本発明のペプチドは、当該ペプチドのＮ末端又はＣ末端にさらにシグナルペプチドを有することもできる。好ましいシグナルペプチドとしては、前記してきたＴａｔ、Ｒ９、又はＲ７などが挙げられる。
本発明の好ましいペプチドとしては、次のアミノ酸配列、
【００３４】
１１　ＨＧＬＱＤＤＰＤＬＱＡＬＬＫＧＳＱＬＬＫＶＫＳＳＳＷＲＲＥＲ
４１　ＦＹＫＬＱＥＤＳＫＴＩＷＱＥＳＲＫＶＭＲＳＰＥＳＱＬＦＳＩＥ
７１　ＤＩＱＥＶＲＭＧＨＲＴＥＧＬＥＫＦＡＲＤＩＰＥＤＲＳＦＳＩＶ
１０１　ＦＫＤＱＲＣＴＬＤＬＩＡＰＳＰＡＤＡＱＨＷＶＱＧＬＲＫＩＩＨ
１３１　ＨＳＧＳＭＤＱＲＱＫ
【００３５】
即ち、１０６番目のアミノ酸がシステインに置換されたアミノ酸配列を有し、当該システインのチオール基に６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（ＤＡＮ）が結合したペプチド（ＤＡＮ１０６）、そのＮ末端にシグナルペプチドＴａｔが結合したペプチド（Ｔａｔ−ＤＡＮ１０６）、そのＣ末端にシグナルペプチドＲ９が結合したペプチド（Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６）、そのＣ末端にシグナルペプチドＲ７が結合したペプチド（Ｒ７Ｃ−ＤＡＮ１０６）などが挙げられる。
【００３６】
本発明のペプチドは、１アミノ酸変異体の製造方法によって製造することができ、このようにして得られたペプチドをコードするＤＮＡをさらに同様な変異法により２個以上のアミノ酸変異体ペプチドを製造することができる。また、シグナルペプチドを結合させる場合は、シグナル配列をコードするＤＮＡを用いて同様に製造することができる。このようにして製造されたペプチドを目的の蛍光物質と反応させることにより、本発明のペプチドを製造することができる。
【００３７】
本発明は、天然に存在するタンパク質モチーフをリセプターの土台として用いているために、設計初期段階においても目的とする分子に対して選択性及び親和性についてかなり高いものである。さらに、ＩＰ３の結合前は蛍光物質がＰＨドメインの結合ポケット（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｏｃｋｅｔ）におさまっており、この状態が準安定状態となるためＩＰ３への選択性がさらに向上している。このような特徴を有する本発明の分子センサーは、目的とする分子の対して高い選択性を示し、低濃度から高濃度への範囲で感度よく測定できるという特徴を有し、さらに細胞内でのセカンドメッセンジャーを可視化することができるものであり、刺激に応じた細胞内でのシグナル伝達を定量的に解析することができる。このような手法は、ポストゲノム科学でのシグナル伝達研究において必須の手法であり、多様な生体内セカンドメッセンジャーに対する分子センサーのひとつとして本発明の分子センサーは有用かつ重要なものである。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００３９】
実施例１　（Ｔａｔ−１０６、Ｒ９Ｃ−１０６、及びＲ７Ｃ−１０６をコードす
るＤＮＡを含有するプラスミドの構築）
Ｎ１０６Ｃ　ＰＨドメインのコンストラクトの製造は、ラットのＰＬＣδ１ＰＨドメインを用いてＰＣＲ法を用いたサイト特異的変異法により構築した。このＮ１０６Ｃ　ＰＨドメインのプラズミドを基にして、Ｔａｔ、Ｒ７及びＲ９のアミノ酸をコードする配列を含むプライマーをおりごエキスプレス（Ｏｌｉｇｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ）より購入し、ＰＣＲ法によりＴａｔ、Ｒ９、及びＲ７を、それぞれ融合したＰＨドメインのＤＮＡを作製した。Ｎｄｅ　Ｉ、及びＢａｍ　ＨＩで制限酵素消化後、ｐｅｔ系発現ベクターにライゲーションして目的のプラスミドを構築した。
【００４０】
実施例２　（Ｔａｔ−１０６、Ｒ９Ｃ−１０６、Ｒ７Ｃ−１０６の大量発現）
実施例１で製造したＴａｔ−１０６、Ｒ９Ｃ−１０６、及びＲ７Ｃ−１０６の各コンストラクトを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにトランスフォームし、ＬＢ培地中３７℃で培養した。Ａ６００＝０．６になったところで１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導をかけた。３時間後２５００ｒｐｍで遠心し大腸菌を回収し、１０ｍＭリン酸（ｐＨ　７．０）、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＤＴＴ、５０ｍＭ　グルコースを含むバッファーに懸濁させ、凍結融解後超音波破菌を行った。９０００ｒｐｍで遠心し、上清とペレットを分離しＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ本タンパク質はインクルージョンボディを形成し、全てペレット中回収された。このペレットを−２０℃で保存した。
【００４１】
実施例３　（Ｔａｔ−１０６、Ｒ９Ｃ−１０６、Ｒ７Ｃ−１０６の精製及び蛍光
試薬ＤＡＮとの反応）
インクルージョンボディとして保存しておいたＴａｔ−１０６、Ｒ９Ｃ−１０６、Ｒ７Ｃ−１０６を、それぞれ４Ｍ尿素、１０ｍＭ　リン酸（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＤＴＴを含むバッファーに溶かし、１５０００ｒｐｍで遠心し、不純物を除去後、ハイトラップＳＰカラム（Ｈｉｔｒａｐ　ＳＰ　ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ））による陽イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、モノＳ（Ｍｏｎｏ　Ｓ）（４Ｍ尿素、１０ｍＭ　リン酸（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ　ＮａＣｌを含むＡバッファー、及び４Ｍ尿素、１０ｍＭ　リン酸（ｐＨ７．０）、１．５Ｍ　ＮａＣｌを含むＢバッファー）により最終精製を行った。精製後脱気し、ＰＨドメインの約１０倍量のＤＡＮをＤＭＦに溶かし、撹拌しながら滴下した。氷冷しながら約３時間反応させ、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）により反応を止めた。精製はリソースＲＰＣ（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ＲＰＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ））により行い（１０％　アセトニトリル、０．１％ＴＦＡを含むＡバッファー、８０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡを含むＢバッファー）、生成物の確認は蛍光試薬に由来する吸収（３９０ｎｍ）を追跡することにより行った。生成物を回収後、ＮＡＰ−５ゲルろ過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＨＢＳバッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ　１０７ｍＭ、６ｍＭ　ＫＣｌ、グルコース　１１．５ｍＭ、１．２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、２ｍＭ　ＣａＣｌ２）に置換した。濃度はＤＡＮ固有の吸収帯である３９０ｎｍ（ε＝２２０００）測定から算出した。
【００４２】
実施例４　（Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のインビトロでの蛍光測定）
蛍光の測定には、蛍光スペクトロファプテムメーターＦ４５００（ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔｓｐｅｃｔｒｏｐｈｐｔｐｍｅｔｅｒ　Ｆ４５００　（Ｈｉｔａｃｈｉ））を用いた。測定条件は、１００ｎＭ　Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６、１０ｍＭ　リン酸（ｐＨ　７．０）、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．００５％　ツイーン２０（ｔｗｅｅｎ　２０）で行った。励起、蛍光スリット幅は５ｎｍ、ＤＡＮの励起波長は３９０ｎｍで測定を行い、ＩＰ３の濃度を０〜５０μＭに変化させて蛍光挙動を記録した。
結果を図２に示す。図２の上側の太い黒実線が初期値（ＩＰ３の濃度が０μＭ）の場合であり、下側にいくに従ってＩＰ３の濃度が大きい場合を示しており、下側の太い灰色が最終濃度（ＩＰ３の濃度が５０μＭ）の場合を示している。
【００４３】
実施例６　（６Ｆ１０６、ＤＡＮ５６、６Ｆ５８、及びＤＡＮ５８の製造）
実施例１〜３に記載の方法に準じて、蛍光物質として６Ｆを使用したもの、また実施例１に記載の方法に準じてラットのＰＬＣδ１ＰＨドメインを用いてシステインを置換した部位が５６番目のもの（Ｒ５６Ｃ）及び５８番目のもの（Ｖ５８Ｃ）を製造した。
これらの分子センサー及びＤＡＮ１０６の、５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび０．００５％のツイーン２０を含むリン酸バッファー（ｐＨ７．０）中で２５℃における蛍光変化比及び解離定数Ｋｄ（μＭ）の値を次の表１に示す。なお、Ｋｄ値はいずれも蛍光滴定による。
【００４４】
2004057015.tif 000002
【００４５】
実施例５　（細胞内のＴａｔ−ＤＡＮ１０６、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６、Ｒ７Ｃ−ＤＡＮ１０６のＣＣＤカメラ測定）
ＨＥＫ細胞に、１ｍＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を３７℃で時間（１０分〜８時間）を変えてインキュベートした。ＨＢＳバッファーで洗浄後、ＣＣＤカメラ測定を行った。フィルターは、３９０ｎｍ励起、４８０ｎｍ〜５２０ｎｍの蛍光を検出可能なＷＵフィルター（ＢＰ３３０〜３８５、ダイクロイックミラー４００、ＢＡ４２０以上）を使用した。
結果を図３及び図４に示す。
【００４６】
実施例５　（アーガス（Ａｒｇｕｓ）によるＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のインビボ蛍光測定）
ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、及びＤＴ４０細胞に、各々１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を３７℃で１０分間インキュベートした後、ＨＢＳバッファーで洗浄した。バッファーはＨＢＳ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ　１０７ｍＭ、６ｍＭＫＣｌ、グルコース１１．５ｍＭ、１．２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、２ｍＭ　ＣａＣｌ２）バッファーを用い、刺激はＣＨＯ細胞には１００μＭ　ＡＴＰ、ＨＥＫ細胞には３０μＭカルバコール、ＤＴ４０細胞には１ｍｇ／ｍｌ　Ｍ４を含むＨＢＳバッファーを流すことにより行った。
結果を図５及び図６に示す。
【００４７】
【発明の効果】
本発明は、細胞内のセンカンドメッセンジャーに対する新規な分子センサーを提供するものであり、本発明の分子センサーによりこれまで不可能であった細胞内でのイノシトール三リン酸の濃度変化をリアルタイムに計測し、可視化することが出来る。また、本発明の分子センサーを用いることにより、アゴニストやアンタゴニストなどの細胞に対する作用を簡便にかつ可視化して計測することができ、蛋白質の機能解析をはじめ、細胞機能の解析などの広い分野に応用可能な技術を提供するものである。さらに本発明は、ＩＰ３にとどまらず、生体内セカンドメッセンジャーに対するテーラーメイドの人工リセプター及び分子センサー構築への一般的な設計概念を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の分子センサーのペプチドの構造の例を模式的に示したものである。図１の（ａ）はシグナルペプチドなしのＰＬＣδＰＨドメインの配列、図１の（ｂ）はＴａｔペプチドをＮ末端に融合した配列、図１の（ｃ）はＲ７ペプチドをＣ末端に融合した配列、図１の（ｄ）はＲ９ペプチドをＣ末端に融合した配列をそれぞれ示す。図１中の＊印は、１０６番目アスパラギンをシステインに変異したことを示している。
【図２】図２は、インビトロでの本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６のＩＰ３添加（０−５０μＭ）に伴う蛍光変化の結果を示す。図２の横軸は蛍光波長を示し、縦軸は蛍光強度を示す。図２の上側の太い黒実線が初期値（ＩＰ３の濃度が０μＭ）の場合であり、下側にいくに従ってＩＰ３の濃度が大きい場合を示しており、下側の太い灰色が最終濃度（ＩＰ３の濃度が５０μＭ）の場合を示している。
図２の右上のグラフは、ＩＰ３濃度に対し、５００ｎｍの蛍光強度変化率（ΔＦ）をプロットしたものである。当該グラフの横軸はＩＰ３の濃度（μＭ）を示し、縦軸は蛍光強度変化率（ΔＦ）を示す。
【図３】図３は、ＨＥＫ細胞を１μＭの本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６で処理し、ＣＣＤカメラで測定した結果を示す図面に変わる写真である。図３ａはＨＢＳバッファーで１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像を示し、図３ｂはＨＢＳバッファーで１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示し、図３ｃは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像、図３ｄは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を１時間インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示す。
【図４】図４は、ＨＥＫ細胞を、本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６で１５分処理し、ＣＣＤカメラで測定した結果を示す図面に変わる写真である。図４ａは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を室温で１５分インキュベートしたＨＥＫ細胞の透過光画像を示し、図４ｂは１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を室温で１５分インキュベートしたＨＥＫ細胞の蛍光画像を示す。
【図５】図５は、本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を導入したＨＥＫ細胞に対してアゴニスト刺激を行ったときの蛍光変化測定の結果を示す。図５の横軸は時間（秒）を示し、図５ａの縦軸はＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の蛍光強度変化の比を示し、図５ｂの縦軸はＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による相対蛍光強度を示す。図５ａはＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度変化を示し、０−５分（３００秒）まではＨＢＳバッファー中であり、５分−１０分は３０ｍＭ　カルバコールを添加した場合である。図５ｂはＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光変化を示し、０−５分（３００秒）はＨＢＳバッファー中であり、５分−１０分（６００秒）は３０μＭカルバコールを添加した場合であり、１０分−２０分は再びＨＢＳバッファーにした場合の結果である。
【図６】図６は、本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を導入したＣＨＯ細胞及びＤＴ４０細胞に対してアゴニスト刺激を行ったときの蛍光変化測定の結果を示す図面に代わる写真である。図６Ａは１％Ｆ−１２７を含む１μＭのＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６を３７℃で１０分インキュベートしたＣＨＯ細胞（ａ）、ＤＴ４０細胞（ｂ）の図面に代わる蛍光画像写真である。図６Ｂの横軸は時間（分）を示し、縦軸は相対比をそれぞれ示す。図６Ｂの（ａ）は、ＣＨＯ細胞における１００μＭ　ＡＴＰ刺激によるＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の変化を比で示したもの（上）、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光の変化を相対蛍光強度で示したもの（下）である。０−２分はＨＢＳバッファーで、２−３分は１００μＭ　ＡＴＰで、３−１０分はＨＢＳバッファーで、１０−１１．５分は１００μＭ　ＡＴＰで、１１．５−１５分はＨＢＳバッファーで、１５−１７分は１００μＭ　ＡＴＰで、１７−２０分はＨＢＳバッファーで処理した。図６Ｂの（ｂ）は、ＤＴ４０細胞における１ｍｇ／ｍｌ　Ｍ４刺激によるＦｕｒａ−２によるカルシウム濃度の変化を比で示したもの（上）、Ｒ９Ｃ−ＤＡＮ１０６による蛍光の変化を相対蛍光強度で示したもの（下）である。０−２分はＨＢＳバッファーで、２−３．５分は１ｍｇ／ｍｌ　Ｍ４で、３−６分はＨＢＳバッファーで処理した。
【図７】図７は、阻害剤処理したＣＨＯ細胞におけるＡＴＰ刺激による、本発明のＲ９Ｃ−ＤＡＮ１０６の蛍光強度変化の結果を示す。図７の横軸はインキュベートした時間（分）を示し、縦軸は相対蛍光強度を示す。図７のＡはコントロールを示し、Ｃは１μＭのＵ７３３４３を添加した場合を示し、Ｂは１μＭのＵ７３１２２を添加した場合を示す。各細胞培養系に与えた刺激を矢印で示す。
【図１】
2004057015.tif 000003
【図２】
2004057015.tif 000004
【図３】
2004057015.tif 000005
【図４】
2004057015.tif 000006
【図５】
2004057015.tif 000007
【図６】
2004057015.tif 000008
【図７】
2004057015.tif 000009