(57)【要約】  【課題】    GGPP合成酵素阻害剤並びに抗腫瘍剤として有用な新規発酵生産物の提供。  【解決手段】    ボーべリア(Beauveria)属に属する微生物を培養し、その培養物から新規発酵生産物4-(2,3-ジヒドロキシ-5-メチルフェノキシ)-2-ヒドロキシ-6-メチル安息香酸を採取した。当該化合物は、ゲラニルゲラニル  ピロフォスフェート(GGPP)合成酵素阻害作用有することから、GGPP合成酵素阻害剤として、あるいはGGPP又はそのゲラニルゲラニル化が関与する病態、疾患の予防若しくは治療に有用である。殊に、本発明化合物は、各種ガン細胞において、細胞増殖抑制活性及び浸潤抑制活性を有することが確認され、抗腫瘍剤として有用である。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
4-(2,3-ジヒドロキシ-5-メチルフェノキシ)-2-ヒドロキシ-6-メチル安息香酸若しくはその塩又はそのエステル。
【請求項２】
エステルがC1〜C4アルキルエステルである請求項１記載の4-(2,3-ジヒドロキシ-5-メチルフェノキシ)-2-ヒドロキシ-6-メチル安息香酸若しくはその塩又はそのエステル。
【請求項３】
ボーベリア(Beauveria)属に属し、かつ4-(2,3-ジヒドロキシ-5-メチルフェノキシ)-2-ヒドロキシ-6-メチル安息香酸若しくはその塩を生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物から4-(2,3-ジヒドロキシ-5-メチルフェノキシ)-2-ヒドロキシ-6-メチル安息香酸若しくはその塩を単離することを特徴とする、4-(2,3-ジヒドロキシ-5-メチルフェノキシ)-2-ヒドロキシ-6-メチル安息香酸若しくはその塩の製造法。
【請求項４】
ボーベリア(Beauveria)属に属する微生物がボーベリア  フェリナ(Beauveria felina) QN22047株（FERM P-19056号）である請求項３記載の製造法。
【請求項５】
請求項1記載の安息香酸若しくはその塩又はそのエステルを有効成分として含有することを特徴とする医薬。
【請求項６】
ゲラニルゲラニル  ピロフォスフェート合成酵素阻害剤である請求項５記載の医薬。
【請求項７】
抗腫瘍剤である請求項５記載の医薬。
【請求項８】
ボーベリア フェリナ(Beauveria felina) QN22047株（FERM P-19056号）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬、殊にゲラニルゲラニル  ピロフォスフェート合成酵素阻害剤及び、抗腫瘍剤として有用な新規発酵生産物及びその塩又はそのエステルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲラニルゲラニル  ピロフォスフェート（Geranylgeranyl pyrophosphate：以下、GGPPと略記す）はGGPP合成酵素によって合成され、RhoファミリーやRacファミリーに属する低分子量Gタンパク質のゲラニルゲラニル化に供される(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 第87巻, 8960-8964頁, 1990年)。ゲラニルゲラニル化は上記の低分子量Gタンパク質が細胞膜や自身のレギュレーターと結合するために必須であり、活性化のために必要なステップである(J. Biol. Chem.  第271巻, 5289-5292頁, 1996年； Annu. Rev. Cell Biol. 第10巻, 181-205頁, 1994年； Biochem. Soc. Trans. 第20巻 497-499頁, 1992年；Annu. Rev. Biochem. 第65巻, 242-269頁, 1996年)。Rhoファミリーは細胞骨格の再構成や転移・浸潤に、また、Rhoファミリーの蛋白質であるRhoAがサイクリン（Cyclin） D1の発現を制御していること(Nat. Cell Biol. 第3巻、950-957頁, 2001年； 及びJ. Biol. Chem. 第273巻 3649-3653頁, 1998年)やp21、p27の発現を阻害していること(Nature 第394巻, 295-298頁 1998年；J. Biol. Chem. 第272巻, 32966-32971頁, 1997年；及びJ. Biol. Chem. 第272巻, 13-16頁, 1997年)、Racがサイクリン（Cyclin）D1プロモーターの転写を刺激していること(Mol. Cell. Biol. 第17巻, 1324-1335頁, 1997年)が報告され、RhoやRacファミリーの蛋白質が細胞骨格の構成や癌の転移だけでなく癌細胞の増殖にも重要な役割をしているとの報告が数多くなされた。したがって、GGPPの合成あるいは活性を阻害する薬剤は、新しいタイプの抗腫瘍剤となりうることが期待されている。また、近年GGPPが核内レセプターLXRα-RXRのDNA結合活性を阻害すること(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 第94巻 10588-10593頁, 1997年)、破骨細胞の生存にGGPPが重要であること(J. Bone Miner Res. 第15巻, 650-652頁, 2000年)などGGPPそのものが生体内で重要な役割を果たしていることが指摘され、GGPPの機能の更なる解明が期待されている。
GGPPの機能解明、更には、GGPPやそのゲラニルゲラニル化が関与する病態、疾患の予防若しくは治療剤として有用であることが期待されているものの、GGPP合成酵素を阻害する化合物は未だ報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
GGPP合成酵素を阻害し、GGPPの機能解明に有用な化合物の創製、並びにゲラニルゲラニル化が関与する病態や疾患の予防若しくは治療剤として有用なGGPP阻害剤の創製が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは天然に存在する多くの微生物が生産する物質について鋭意研究を行ったところ、ボーべリア属に属する不完全糸状菌ボーべリア フェリナ (Beauveria felina) ＱＮ２２０４７株が、GGPP合成酵素阻害活性、癌細胞増殖抑制活性並びに癌細胞浸潤抑制活性を有する新規化合物を生産することを見い出した。そして、この微生物を培養し、培養物から当該新規化合物を単離することに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は下記式で示される4-(2,3-ジヒドロキシ-5-メチルフェノキシ)-2-ヒドロキシ-6-メチル安息香酸若しくはその塩又はそのエステルに関する。
【化１】
2004161745.tif 000002
【０００５】
また、本発明は、ボーベリア属に属し、かつ4-(2,3-ジヒドロキシ-5-メチルフェノキシ)-2-ヒドロキシ-6-メチル安息香酸（以下、QN22047-5A物質と略記する）若しくはその塩を生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物からQN22047-5A物質若しくはその塩を単離することを特徴とする、QN22047-5A物質若しくはその塩の製造法に関する。QN22047-5A物質若しくはその塩を生産する能力を有するボーベリア属に属する微生物としては、例えば本発明者らが土壌から分離したボーべリア フェリナ (Beauveria felina) QN22047株が挙げられ、これは本発明において最も有効に使用される菌株の１つである。本発明は、当該ボーべリア フェリナ (Beauveria felina) QN22047株自体にも関する。
更に、本発明は、QN22047-5A物質若しくはその塩又はそのエステルを有効成分として含有することを特徴とする医薬、殊に、ゲラニルゲラニル  ピロフォスフェート合成酵素阻害剤並びに抗腫瘍剤に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のQN22047-5A物質若しくはその塩又はそのエステルは、後記実施例に示すように、GGPP合成酵素阻害作用を有することから、GGPP合成酵素阻害剤として、あるいはGGPP又はそのゲラニルゲラニル化が関与する病態、疾患の予防若しくは治療剤として有用である。殊に、本発明化合物は、各種癌細胞に対して、良好な細胞増殖抑制活性を有し、更に、癌細胞の浸潤抑制活性を有することから、癌の転移抑制作用をも有する抗腫瘍剤として有用である。また、本発明化合物はGGPPの機能解明にも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明はQN22047-5A物質若しくはその塩又はそのエステルの、各種の水和物や溶媒和物及びこれらの結晶並びにその結晶多形の物質をも包含する。
QN22047-5A物質はカルボキシ基を１つ有しており、その製薬学的に許容されるエステルも本発明に包含される。本発明のエステルとしては、脂肪族又は芳香族の周知のエステル残基からなるエステルが挙げられ、好ましくは、C1〜C4アルキルエステルであり、特に好ましくはメチル又はエチルエステルである。また、本発明のエステルは、生体内で容易に加水分解されてカルボキシ基に変換するアセトキシメチル及びピバロイルオキシメチル基等のエステル残基からなるエステルをも包含する。このようなプロドラッグを形成するエステル残基としては、Prog. Med. 5:2157-2161(1985)に記載されている基や廣川書店1990年刊「医薬品の開発」第７巻  分子設計163-198に記載されている基が挙げられる。
【０００８】
また，本発明化合物は，塩を形成する場合がある。製薬学的に許容される塩であれば，特に制限はないが，無機若しくは有機塩基との塩であり，具体的にはナトリウム，カリウム，マグネシウム，カルシウム，アルミニウムなど無機塩基，メチルアミン，エチルアミン，エタノールアミンなどの有機塩基，リジン，オルニチンなどの塩基性アミノ酸との塩等を挙げることができる。
【０００９】
（製造法）
本発明のQN22047-5A物質若しくはその塩は、ボーべリア属に属しQN22047-5A物質の生産能を有する微生物を用いて製造することができる。このようなQN22047-5A物質若しくはその塩の生産能を有する微生物としては、例えば、山梨県南巨摩郡鰍沢町で採集された土壌より分離されたボーべリア属に属する不完全糸状菌ボーべリア フェリナ (Beauveria felina) QN22047株を挙げることができる。本菌株の菌学的性状は次の通りである。
【００１０】
１．各種培地における性状
（１）バレイショ・ブドウ糖寒天培地
２４℃、１４日間の培養でコロニーは直径２１ｍｍになる。コロニー表面はビロード状で多数のしわが入り、基底菌糸層は多少盛り上がる。周辺部はうす黄色で中心部はうす紫色を帯びる。分生子の形成は良好である。コロニー裏面は黄茶色である。
（２）麦芽エキス寒天培地
２４℃、１４日間の培養でコロニーは直径３２．５ｍｍになる。気生菌糸はほとんど形成されず、平たんで薄いコロニーとなる。分生子は形成されない。コロニー表面、裏面ともにうす黄茶色である。
（３）ツァペック寒天培地
２４℃、１４日間の培養でコロニーは直径７ｍｍと非常に生育が悪い。気生菌糸は全く形成されず、平たんで薄いコロニーとなる。分生子は形成されない。コロニー表面、裏面ともに白色である。
（４）サブロー寒天培地
２４℃、１４日間の培養でコロニーは直径２３ｍｍになる。コロニー表面はビロード状〜綿毛状で多数のしわが入り、基底菌糸層は多少盛り上がる。周辺部はうす茶色、中心部は灰白色となる。分生子は形成されない。コロニー裏面は黄茶色である。
【００１１】
２．生理学的性質
生育温度：１５〜３５℃の範囲で生育し、最適生育温度は２４〜２８℃である。
生育ｐH： ５〜１１の範囲で生育し、最適生育ｐHは６〜１０である。
【００１２】
３．形態的特徴
バレイショ・ブドウ糖寒天培地に生育した菌株を顕微鏡下で観察した。菌糸は無色で隔壁を有し、表面は平滑である。分生子柄は気菌糸より生じ、直立あるいは不規則に向き、単生あるいは数個がかたまる。分生子形成細胞は膨らんだ形、フラスコ形、曲がった形が見られ、基部が伸長することもある。大きさは３〜８×２〜３μmで、多くは２〜４の小突起を生じる。分生子は無色、滑面、亜球形、長円形または卵形で、大きさは３〜４×２．５〜３μmである。培養が進むと分生子は各枝ごとにクラスターとなる。厚膜胞子の形成は認められない。
【００１３】
以上の菌学的性質から、QN22047株の分類学上の位置を公知の真菌の中から検索すると、ボーベリア フェリナ (Beauveria felina) の記載とほぼ一致した。従って、本菌株をボーベリア フェリナ (Beauveria felina) QN22047株と命名した。なお、本菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-19056号として寄託されている。また、微生物は人工的に又は自然に変異を起こすので、本発明のボーベリア フェリナ (Beauveria felina) QN22047株は、天然から分離された微生物の他に、これに紫外線、X線、化学薬剤などで人工的に変異させたもの及びそれらの天然変異株についても包含する。
【００１４】
培養は一般微生物の培養方法に準じて行われる。培養に用いられる培地は、使用する微生物が生育可能な培地であればよく、合成培地、半合成培地あるいは天然培地を用いることができる。
培地に添加する栄養物としては、微生物の栄養源として公知のものを使用できる。例えば，炭素源としては，市販されている糖蜜、グルコース、マルトース、フルクトース、マンニトール、ポテトスターチ、コーンスターチ、デキストリン、可溶性デンプン等の炭水化物あるいは油脂、脂肪類などが、窒素源としては、市販されているペプトン類、肉エキス類、コーンスティープリカー、綿実粕、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺ−アミン、小麦胚芽、カゼイン類、魚粉、及び硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の無機又は有機の窒素源が用いられる。
【００１５】
また金属塩としては、Na、K、Mg、Ca、Zn、Fe、Mn、Co、Cu等の硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、燐酸塩、炭酸塩等を必要に応じて添加できる。さらに必要に応じてバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸や、ビタミン類、オレイン酸、オレイン酸メチル、ラード油、シリコン油、界面活性剤等の二次代謝物生産促進物質又は消泡剤を適宜使用できる。これらのもの以外でも、本発明化合物生産菌が利用し、本発明化合物の生産に役立つものであれば、いずれの添加物も使用することができる。
培養法としては、一般の抗生物質の製造等の培養法と同様に行えば良く、その培養方法は固体培養でも液体培養でも良い。液体培養の場合は静置培養、振とう培養、攪拌培養のいずれを実施してもよいが、特に通気攪拌培養が望ましい。培養条件として、培養温度は生産菌が発育し、本発明の化合物を生産しうる温度、すなわち１５〜３５℃の範囲で適宜適用できるが約２４〜２８℃が好ましい。pHは５〜１１の範囲で適宜適用できるが、６〜１０が好ましい。培養時間は種々の条件によって異なり、通常１〜３０日程度、好ましくは３〜１０日程度で培地中に本発明化合物が蓄積される。
【００１６】
培養物から目的とする化合物を単離するには、微生物の代謝産物を単離する際に用いる通常の抽出、精製の手段が適宜利用できる。培養物中の該物質は培養液をそのままか、又は遠心分離あるいは培養物に濾過助剤を加えて濾過して得られた培養濾液に酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼン、トルエン等の水と混和しない有機溶剤を加えて抽出する。また、培養液を適宜の担体に接触させ、濾液中の生産物質を吸着させ、次いで適当な溶媒で溶出することにより該物質を抽出することができる。例えば、アンバーライト（登録商標）XAD-2、ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）HP-20、ダイヤイオンCHP-20P、又はダイヤイオンSP-850のような多孔性吸着樹脂に接触させて該物質を吸着させ、次いでメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル等の有機溶媒と水の混合液を用いて該物質を溶出させる。このときの有機溶媒の混合比率を低濃度より段階的に又は連続的に高濃度まで上げていくことにより、該物質を含む画分を効率よく得ることができる場合がある。
【００１７】
次に、上記の各操作法を用いて得た該物質含有画分は、シリカゲル、ODS、トヨパール（登録商標、以下同じ）HW-40等を用いたカラムクロマトグラフィー、遠心液々分配クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ODS等を用いた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 等の常法により、さらに純粋に分離精製することができる。
以上のようにして得られたQN22047-5A物質は所望により常法の造塩反応に付して製薬学的に許容される塩として得ることもできる。
【００１８】
所望により、QN22047-5A物質を常法のエステル化反応に付すことにより、QN22047-5A物質のエステルを得ることができる。反応は、例えば日本化学会編「実験化学講座(第４版)」22巻（1992年）（丸善）や、グリーン(Greene)及びウッツ(Wuts)著「Protective Groups in Organic Synthesis」第３版に記載された方法により行うことができる。具体的には、QN22047-5A物質とアルコール類を、酸触媒による脱水縮合法、酸ハライド経由法、カルボジイミド類による脱水縮合法などに付すことによって、又は、トリメチルシリル化されていても良いジアゾメタン等のジアゾアルカン誘導体を用いたエステル化（Bradford P. Mundyら著「Name Reactions and Reagents in Organic Synthesis」p.322-323（JOHN WILEY&SONS））によって行うことができる。
【００１９】
本発明のQN22047-5A物質若しくはその塩又はそのエステルの１種又は２種以上を有効成分として含有する本発明の医薬組成物は，当分野において通常用いられている薬剤用担体，賦形剤等を用いて通常使用されている方法によって調製することができる。投与は錠剤，丸剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，液剤等による経口投与，又は，静注，筋注等の注射剤，坐剤，点眼剤，眼軟膏，経皮用液剤，軟膏剤，経皮用貼付剤，吸入剤，経粘膜液剤，経粘膜貼付剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
【００２０】
本発明による経口投与のための固体組成物としては，錠剤，散剤，顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては，一つ又はそれ以上の活性物質が，少なくとも一つの不活性な賦形剤，例えば乳糖，マンニトール，ブドウ糖，ヒドロキシプロピルセルロース，微結晶セルロース，デンプン，ポリビニルピロリドン，メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は，常法に従って，不活性な添加剤，例えばステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等の崩壊剤，溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性コーティング剤で被膜してもよい。
【００２１】
経口投与のための液体組成物は，薬剤的に許容される乳剤，液剤，懸濁剤，シロップ剤，エリキシル剤等を含み，一般的に用いられる不活性な溶剤，例えば精製水，エタノールを含む。この組成物は不活性な溶剤以外に可溶化剤、湿潤剤，懸濁化剤のような補助剤，甘味剤，矯味剤，芳香剤，防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては，無菌の水性又は非水性の液剤，懸濁剤，乳剤を含有する。水性の溶剤としては，例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水性の溶剤としては，例えばプロピレングリコール，ポリエチレングリコール，オリーブ油のような植物油，エタノールのようなアルコール類，ポリソルベート８０（商品名）等がある。このような組成物は，さらに等張化剤、防腐剤，湿潤剤，乳化剤，分散剤，安定化剤，溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過，殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し，使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解、懸濁して使用することもできる。
【００２２】
通常、経口投与の場合，成人1日当り経口で0.1〜500mg、非経口で0.01〜100mgがそれぞれ適当であり，これを１日１回乃至複数回に分けて投与する。投与量は症状，年令，性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。
【００２３】
以下、本発明を実施例により、さらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって何等限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
グルコース30g、コーンスティープリカー 10g、ドライイースト 5g、ファーマメディア 5g、ＳIIIミート 5g、炭酸カルシウム2g、蒸留水1Lを含む培地 (pH 6.5)を100mlずつ500ml容の三角フラスコに分注し、120℃で20分間滅菌した。ポテトデキストロース寒天培地に良く生育させたボーベリア  フェリナ  ＱＮ２２０４７株を掻き取って接種し、24℃、200回転／分の条件で５日間振とう培養し、種培養液とした。次にグルコース 30g、グリセロール 20g、デキストリン 10g、麦芽エキス 10g、酵母エキス 2g、トリプトン 1g、硝酸アンモニウム 1g、リン酸２水素カリウム 1g、蒸留水1Lを含む培地 (pH6.5) を100mlずつ500ml容の三角フラスコに分注し、120℃で20分間滅菌した。この培地20本に前記種培養液を3mlずつ接種し、24℃、200回転／分の条件で６日間、振とう培養を行った。
このようにして培養した培養液2Ｌについてアスピレーターによって菌体と上清を分離した。上清液を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムを添加して脱水した後、減圧下で濃縮乾固した。油状の粗抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、クロロホルム−メタノール（１０：１）で展開し、活性画分を濃縮した。次に、トヨパールHW-40カラムクロマトグラフィーに供しメタノールで溶出し、活性画分を濃縮した。最後に、薄層クロマトグラフィーに供し、クロロホルム−メタノール（５：１）で展開し、活性を示したピークを分取し、QN22047-5A物質32.1mgを単離した。
【００２５】
単離したQN22047-5A物質は以下の物理化学的性質より、4-(2,3-ジヒドロキシ-5-メチルフェノキシ)-2-ヒドロキシ-6-メチル安息香酸と同定された。
（１）色及び形状： 白色の無定型半透明固体
（２）酸性、中性、塩基性の区分： 酸性
（３）溶解性： メタノールに可溶、水、ヘキサンには不溶
（４）紫外部吸収スペクトル（溶剤：メタノール）： 258, 215nmに吸収極大を示す
（５）分子量： 290.27
（６）分子式： C15H14O6
（７）HPLC分析：
カラム： DOCOSIL B（センシュウ科学；4.6φ×250mm）
溶出溶媒： アセトニトリル-65mM酢酸アンモン水 (30:70) の混合溶液
流出速度： 0.7ml/min
検出波長： 210nm
検出時間： 7.0分
（８）1H-NMRスペクトル (500MHz, CDCl3)：図１に示す通り
（９）13C-NMRスペクトル (125MHz, CDCl3)：図２に示す通り
【実施例２】
【００２６】
QN22047-5A物質5mgに無水ジクロロメタン150μlを添加し、氷冷下で攪拌しながら無水メタノール50μlおよび2MのTMS-ジアゾメタン17μlを添加した。これをさらに室温にて2時間攪拌し、反応液を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムを添加して脱水した後、減圧下で濃縮乾固した。得られた反応生成物を薄層クロマトグラフィーに供し、へキサン−酢酸エチル（２：１）で展開し、目的とする生成物のピークを分取し、QN22047-5A物質のメチルエステル3.3mgを得た。
【００２７】
（１）紫外部吸収スペクトル（溶剤：メタノール）：262, 214nmに吸収極大を示す
（２）分子量： 304.0964
（３）分子式： C16H16O6
（４）1H-NMRスペクトル (500MHz, CDCl3)：図３に示す通り
【００２８】
【化２】
2004161745.tif 000003
【実施例３】
【００２９】
本発明のQN22047-5A物質及びそのメチルエステルのGGPP合成酵素阻害活性を以下の方法で確認した。
まずGGPP合成酵素阻害活性を検出するため、in  vitroでのスクリーニング系を構築した。
ヒトGGPP合成酵素のcDNAをpGEX-2Tベクターにサブクローニングし、大腸菌JM109株に形質転換した後、一晩培養しIPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)刺激によりGST-GGPP合成酵素融合蛋白質を発現させた。その後、遠心操作により大腸菌を回収し、超音波破砕機により菌体を破砕後、さらに遠心して上清の目的蛋白質を得た。この上清をGSH (glutathione)ビーズと混合し、1時間回転攪拌した後、溶出緩衝液（Elution Buffer：50mM  Tris：pH8.0、20mM  還元型グルタチオン(reduced  glutathione)）によりGST-GGPP合成酵素融合蛋白質を溶出した。
上記のように精製したGST-GGPP合成酵素融合蛋白質を[14C]IPP（isopentenyl  pyrophosphate）、FPP（falnesyl  pyrophosphate）および阻害剤サンプルと共に反応液（0.1M  Tris-HCl  pH7.5、MnCl2  0.3mM、MgCl2  0.2mM、BHT (2,6-di-t-butyl-4-methylphenol)  10μg/ml）中にて37℃、45分間反応させた。生成した[14C]GGPPを１−ブタノールによって抽出し、１−ブタノール層の放射活性を液体シンチレーションカウンターにより測定した。
その結果、本発明のQN22047-5A物質及びそのメチルエステルはともに1〜300μMの濃度域でGGPP合成酵素による[14C]GGPP生成量を減少させた。
【実施例４】
【００３０】
本発明QN22047-5A物質及びＢの細胞増殖抑制活性を、トリパンブルー細胞外排出試験法（Sherwood SW(1995) Methods Cell Biol. 46 : 77-97）を用いて測定した。ヒト大腸ガンHT29細胞、ヒト食道ガンEC109細胞、ヒト食道ガン細胞EC17およびヒト小細胞肺ガンMs-1細胞において、QN22047-5A物質は34.5〜103.4μM、またそのメチルエステルは9.9〜32.9μMの濃度域でそれぞれ細胞増殖抑制活性を示した。
【実施例５】
【００３１】
本発明のQN22047-5A物質及びそのメチルエステルの癌細胞浸潤抑制活性を、トランスウェルチャンバーアッセイを用いて測定した。
ヒト黒色腫高転移細胞B16BL6C2を6穴プレートにまき一晩培養した後、本発明化合物を添加しさらに48時間培養した。この細胞をトリプシン処理してはがし、血清濃度を0.5％にして、マトリゲルコートしたケモタキセルチャンバーの上層に細胞をまいた。下層には5%の血清を含む培養液を満たし、37℃で12時間浸潤させた後、メタノールで細胞を固定化し、ヘマトキシリン染色液を用いて細胞を染色して、下層に浸潤した細胞数を顕微鏡観察により測定した。
その結果、QN22047-5A物質は34.5μM、またそのメチルエステルは9.87μMの濃度域でそれぞれ癌細胞の浸潤に対し強い抑制活性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】QN22047-5A物質の1Ｈ−ＮＭＲスペクトラムを示す。
【図２】QN22047-5A物質の13Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示す。
【図３】QN22047-5A物質メチルエステルの1Ｈ−ＮＭＲスペクトラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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