(57)【要約】【課題】海洋性藻類由来のＣＯ２応答性新規プロモーターを見出すと共に、それを利用した新たな遺伝子発現制御系を構築すること。【解決手段】本発明者は、海洋性珪藻Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの細胞内β型カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のプロモーター領域を同定すると共に、この新規プロモーターがＣＯ２応答性を示すことを見出した。このプロモーターの下流に目的遺伝子をつないだベクターを宿主細胞内に導入後、細胞生育環境中のＣＯ２濃度を調節することによって目的遺伝子の発現を誘導することができる。この遺伝子発現制御系は酵素や抗体等の有用蛋白質の生産に利用可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
海洋性藻類由来カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のプロモーター配列とその転写調節を受ける外来遺伝子とを宿主細胞内に導入後、細胞生育環境中の二酸化炭素濃度もしくは二酸化炭素分圧を調節することによって外来遺伝子の発現を誘導する遺伝子発現制御方法。
【請求項２】
前記プロモーター配列として、海洋性珪藻の一種フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）由来のプロモーター配列を使用することを特徴とする請求項１記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項３】
前記プロモーター配列として、下記▲１▼〜▲５▼の何れかの塩基配列を含むＤＮＡ配列を使用することを特徴とする請求項２記載の遺伝子発現制御方法。
▲１▼  配列番号１に示される塩基配列中、第１１７８番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲２▼  同塩基配列中、第１０６８番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲３▼  同塩基配列中、第８０９番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲４▼  同塩基配列中、第４６９番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲５▼  配列番号１に示される塩基配列
【請求項４】
宿主細胞に、海洋性藻類由来の細胞を使用することを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項５】
宿主細胞を二酸化炭素濃度１％以上のガスで通気培養後、環境中の二酸化炭素濃度を１％未満に切り替えることによって外来遺伝子の発現を誘導することを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の遺伝子発現制御方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の遺伝子発現制御方法を用いて外来遺伝子の発現を誘導後、その翻訳産物である蛋白質を回収もしくは精製する工程を含むことを特徴とする有用蛋白質生産方法。
【請求項７】
海洋性珪藻の一種フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）由来カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のプロモーター。
【請求項８】
下記▲１▼〜▲５▼の何れかの塩基配列を含むＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項７記載のプロモーター。
▲１▼  配列番号１に示される塩基配列中、第１１７８番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲２▼  同塩基配列中、第１０６８番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲３▼  同塩基配列中、第８０９番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲４▼  同塩基配列中、第４６９番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲５▼  配列番号１に示される塩基配列
【請求項９】
請求項７又は８記載のプロモーターとその転写調節を受ける遺伝子とが組み込まれた遺伝子発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の遺伝子発現ベクターが導入された形質転換細胞。
【請求項１１】
海洋性藻類由来の細胞であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換細胞。
【請求項１２】
請求項１０又は１１記載の形質転換細胞を培養もしくは生育する生育手段と、生育環境中の二酸化炭素濃度を調節する調節手段とを備えた有用蛋白質生産システム。
【請求項１３】
請求項６記載の有用蛋白質生産方法、又は請求項１２記載の有用蛋白質生産システムによって生産された抗体又は酵素等の有用蛋白質。
【請求項１４】
哺乳類タイプもしくは哺乳類由来の蛋白質であることを特徴とする請求項１３記載の有用蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、海洋性藻類由来のＣＯ２応答性新規プロモーターを利用した遺伝子発現制御方法に関するものである。本発明は、特に、医薬品や食品、検査器具など種々の産業用途を有する有用蛋白質の生産に利用可能な技術を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
海洋性藻類の中で、珪藻類や円石藻類などはいわゆる黄色植物と呼ばれるグループに属する単細胞真核生物である。これらの藻類は世界のＣＯ２固定量の２０−４０％程度を担うと見積もられており、ＣＯ２をめぐる地球環境に極めて重要な生物群であることが示されている。また、これらの藻類は二次共生といって、多重な共生現象の結果生まれた特殊な生物群に属し、遺伝子発現においても特殊な分子機構を有する可能性が考えられているが、その詳細はこれからの研究分野として残されている。また、珪藻類は、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）に代表されるような、人間にとって有用な油脂などを多量に合成する生物でもある。
【０００３】
最近報告された珪藻類の一種フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）のゲノム構造の一部は、この生物群の核遺伝子の多くが、ヒトをはじめとする哺乳類の遺伝子ホモログであることを示し、珪藻類が哺乳類遺伝子の発現工場としての可能性を持つことを強く示唆している。元来独立栄養生物である珪藻類は、その生育に有機栄養分を必要としない。海洋性藻類はさらに淡水資源を使わずに、地球上にほぼ無尽蔵に存在する海水をミネラル源として生育するため、これが食糧や物質生産工場として機能しうるならば、非常に安価な生産ラインを構築できると考えられる。
【０００４】
ところで、藻類では環境二酸化炭素濃度の変化に応答して遺伝子発現を促進したり抑制したりする機能の存在が知られている。しかし、その分子機構の研究はこれまで原核生物である藍藻類や真核緑藻類であるクラミドモナスなどの淡水性藻類でなされているものの、海洋性の真核藻類では研究が進んでいない。例えば淡水性藻類の研究成果として、下記の非特許文献１には、淡水性の単細胞緑藻であるクラミドモナスで同定されたＣＯ２応答性プロモーター領域について記載されている。このプロモーター領域は比較的長く、ＣＯ２以外に光にも応答してしまう性質を有している。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｋｅｎ−ｉｃｈｉ  Ｋｕｃｈｏ，  Ｋａｎｊｉ  Ｏｈｙａｍａ，  ａｎｄ  Ｈｉｄｅｙａ  Ｆｕｋｕｚａｗａ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９９，  Ｖｏｌ．１２１，  １３２９−１３３７頁
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、海洋性藻類は海水をミネラル源として生育するため、これが物質生産工場として機能しうるならば、非常に安価な生産ラインを構築できる。また、このうち海洋性珪藻類はそのゲノム構造から哺乳類遺伝子の発現工場としての利用可能性を強く持っている。さらに、海洋性藻類を遺伝子発現工場として利用するに際し、その遺伝子発現をＣＯ２で制御する系を構築することができれば、下記（１）〜（４）のような利点を有する。
（１）ＣＯ２の濃度を調節することによって、細胞の生育フェーズを、もっぱら分裂に費やす期間と、物質生産を主に行う期間とに明確に分離することが出来る。
（２）ＣＯ２は発電所や工場などの排気ガスとして安価に手に入る。
（３）ＣＯ２は温室効果ガスであるため、それを利用することは環境問題にも資する。
（４）遺伝子発現の制御法としてＩＰＴＧのような基質誘導法や、温度制御法が確立しているが、基質制御法は迅速な可逆性が期待できず、温度制御法は電気代などのコストがかかると考えられる。一方、ＣＯ２はガス分子であるので、これをスイッチング因子として使う場合、一度入れたＣＯ２は細胞が迅速に使うと同時に、通常の大気によるエアレーションによって簡単に除去が可能である。このため、上記（１）で述べたような分裂−生産フェーズの可逆性が極めて高い系を構築することが出来る。
【０００７】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、海洋性藻類由来のＣＯ２応答性新規プロモーターを見出すと共に、それを利用した新たな遺伝子発現制御系を構築することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、前記海洋性珪藻Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの細胞内β型カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のプロモーター領域を同定すると共に、このプロモーターがＣＯ２応答性を示すこと等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、産業上有用な方法および物として、下記Ａ）〜Ｎ）の発明を含むものである。
Ａ）  海洋性藻類由来カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のプロモーター配列とその転写調節を受ける外来遺伝子とを宿主細胞内に導入後、細胞生育環境中の二酸化炭素濃度もしくは二酸化炭素分圧を調節することによって外来遺伝子の発現を誘導する遺伝子発現制御方法。
Ｂ）  前記プロモーター配列として、海洋性珪藻の一種フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）由来のプロモーター配列を使用することを特徴とする上記Ａ）記載の遺伝子発現制御方法。
Ｃ）  前記プロモーター配列として、下記▲１▼〜▲５▼の何れかの塩基配列を含むＤＮＡ配列を使用することを特徴とする上記Ｂ）記載の遺伝子発現制御方法。
▲１▼  配列番号１に示される塩基配列中、第１１７８番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲２▼  同塩基配列中、第１０６８番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲３▼  同塩基配列中、第８０９番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲４▼  同塩基配列中、第４６９番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲５▼  配列番号１に示される塩基配列
Ｄ）  宿主細胞に、海洋性藻類由来の細胞を使用することを特徴とする上記Ａ）〜Ｃ）の何れかに記載の遺伝子発現制御方法。
Ｅ）  宿主細胞を二酸化炭素濃度１％以上のガスで通気培養後、環境中の二酸化炭素濃度を１％未満に切り替えることによって外来遺伝子の発現を誘導することを特徴とする上記Ａ）〜Ｄ）の何れかに記載の遺伝子発現制御方法。
Ｆ）  上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載の遺伝子発現制御方法を用いて外来遺伝子の発現を誘導後、その翻訳産物である蛋白質を回収もしくは精製する工程を含むことを特徴とする有用蛋白質生産方法。
Ｇ）  海洋性珪藻の一種フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）由来カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のプロモーター。
Ｈ）  下記▲１▼〜▲５▼の何れかの塩基配列を含むＤＮＡ配列であることを特徴とする上記Ｇ）記載のプロモーター。
▲１▼  配列番号１に示される塩基配列中、第１１７８番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲２▼  同塩基配列中、第１０６８番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲３▼  同塩基配列中、第８０９番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲４▼  同塩基配列中、第４６９番目から第１３５３番目までの塩基配列
▲５▼  配列番号１に示される塩基配列
Ｉ）  上記Ｇ）又はＨ）記載のプロモーターとその転写調節を受ける遺伝子とが組み込まれた遺伝子発現ベクター。
Ｊ）  上記Ｉ）記載の遺伝子発現ベクターが導入された形質転換細胞。
Ｋ）  海洋性藻類由来の細胞であることを特徴とする上記Ｊ）記載の形質転換細胞。
Ｌ）  上記Ｊ）又はＫ）記載の形質転換細胞を培養もしくは生育する生育手段と、生育環境中の二酸化炭素濃度を調節する調節手段とを備えた有用蛋白質生産システム。
Ｍ）  上記Ｆ）記載の有用蛋白質生産方法、又は上記Ｌ）記載の有用蛋白質生産システムによって生産された抗体又は酵素等の有用蛋白質。
Ｎ）  哺乳類タイプもしくは哺乳類由来の蛋白質であることを特徴とする上記Ｍ）記載の有用蛋白質。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
【００１１】
（１）  本発明のプロモーター
本発明の遺伝子発現制御方法に使用可能なプロモーター配列として、まず、海洋性珪藻の一種フェオダクチルム・トリコルヌーツム（以下、「Ｐ．  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ」という）由来のプロモーター配列を挙げることができる。このプロモーター配列は、後述の実施例に示すように、本発明者によって同定されたものである。即ち、Ｐ．  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの細胞内β型カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のプロモーター領域を同定すべく、本発明者は同遺伝子の転写開始部位の上流域とそれに続く５’−ＵＴＲコード領域とからなる５種類のプロモーター候補部位を調製した。そして、これらの候補部位の下流にレポーター遺伝子を配したコンストラクトを作製し各プロモーター活性を調べたところ、いずれの配列にもＣＯ２応答性の高いプロモーター活性が認められた（図３参照）。
【００１２】
上記５種類のプロモーターは、図２に示すように、互いに長さが異なるが、−１１５から＋６１までのＤＮＡ配列を共通に有する。尚、これらの数字は転写開始部位を基点「＋１」、上流方向を「−」、下流方向を「＋」として、各ヌクレオチドの位置を数字で示すものである。最も短いプロモーターは、図中下から二番目に示される−１１５から＋６１までの長さ１７６ヌクレオチドのものであり、残り４種類のプロモーターは、長さが短い順番にそれぞれ、−２２５から＋６１までの２８６ヌクレオチド、−４８４から＋６１までの５４５ヌクレオチド、−８２４から＋６１までの８８５ヌクレオチド、−１２９２から＋６１までの１３５３ヌクレオチド、からなる。
【００１３】
配列表の配列番号１には、最長のプロモーター配列、つまり、−１２９２から＋６１までの１３５３ヌクレオチドの塩基配列が示される。同塩基配列中、１１７８番目から１３５３番目の配列が最も短いプロモーター配列に相当し、以下、１０６８番目から１３５３番目の配列が二番目に短いプロモーター配列に、８０９番目から１３５３番目の配列が三番目に短いプロモーター配列に、４６９番目から１３５３番目の配列が四番目に短いプロモーター配列にそれぞれ相当する。尚、５種類の各プロモーターは、これらの塩基配列とその相補配列とからなる二本鎖ＤＮＡとして取得されたものである。
【００１４】
図４には、最も短いプロモーターのプロモーター配列が示される。図中、大文字で示される領域が転写開始部位の上流域に相当し、小文字で示される領域が５’−ＵＴＲ領域に相当する。前述したように、ＣＯ２応答性のプロモーター活性が認められた上記５種類のプロモーターはこの１７６ヌクレオチドの塩基配列を共通に有することから、この配列領域がプロモーター活性に必須の領域と考えられる。
【００１５】
このように、上記５種類のプロモーターが本発明の遺伝子発現制御方法に利用可能であるが、本発明のプロモーターはこの５種類に限定されるものではない。例えば、プロモーターの長さはこの５種類に限定されるものではなく、これより長いものであってもよい。また、プロモーター活性に必須の領域を上記１７６ヌクレオチドよりさらに絞り込むことができれば、より短いプロモーター配列を使用することも可能である。
【００１６】
また、上記５種類のプロモーターの塩基配列中、プロモーター活性に非本質的な１または複数の塩基を公知の遺伝子工学的手法により改変（即ち、塩基の置換、欠失、挿入、又は付加）したものも同様のＣＯ２応答性プロモーター活性を示すものと考えられる。このような改変プロモーター配列も本発明のプロモーターに含まれる。
【００１７】
上記５種類のプロモーターは、Ｐ．  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの細胞内β型カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のプロモーター領域から本発明者によって取得されたものであるが、他の海洋性珪藻のカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のプロモーター領域からも同様の活性を有するプロモーターが得られる可能性が高い。さらに、海洋性藻類、とりわけ珪藻類と近縁の不等毛植物門またはハプト植物門に属する海洋性藻類の同遺伝子のプロモーター領域からも同様の活性を有するプロモーターが得られる可能性が高い。本発明の遺伝子発現制御方法にはこのようなプロモーターを使用してもよい。
【００１８】
また上記５種類のプロモーターは、前述した各塩基配列とその相補配列とからなる二本鎖ＤＮＡであったが、本発明のプロモーターは、ＣＯ２応答性のプロモーター活性を発揮する限り、一本鎖のものであっても、またＲＮＡであってもよい。
【００１９】
以上説明した本発明のプロモーターを用いて目的遺伝子（外来遺伝子）の発現を制御する方法としては、形質転換ベクター（遺伝子発現ベクター）を作製してこれを宿主細胞に導入する方法が簡便であるので、以下ではこの方法について簡単に説明する。
【００２０】
（２）  遺伝子発現ベクターの作製と宿主細胞への導入
目的遺伝子が本発明のプロモーターによる転写調節を受けるようにするためには、例えば本発明のプロモーターの下流に目的遺伝子を連結したものを発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入し、この発現ベクターを宿主細胞内に導入すればよい。
【００２１】
発現ベクターにはプラスミド、ファージ、コスミドなど様々なものがあるので、使用する宿主細胞、目的遺伝子のサイズ等に応じて適切なものを選択すればよい。後述の実施例では、図１に示される構造のプラスミド（ｐＰｔＧｕｓベクター）を使用し、図２に示される各種プロモーター−レポーター遺伝子コンストラクトをそのＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩサイトの部分に連結し、ベクターを作製した。
【００２２】
宿主細胞も特に限定されるものではなく、藻類由来の細胞以外に、各種の植物由来細胞、動物由来細胞、哺乳類由来細胞などを使用してもよい。また、体細胞、生殖細胞、幹細胞、腫瘍細胞、ハイブリドーマなどいずれの細胞であってもよい。もっとも、安価な生産システム構築のためには、独立栄養生物であり基本的に光と海水だけで生育可能な海洋性藻類（またはその由来）の細胞を使用することが好ましい。さらに、海洋性藻類のうち珪藻類などの黄色植物はそのゲノム構造に哺乳類と類似する面が見られるため、哺乳類タイプや哺乳類由来の蛋白質の生産に適していると考えられる。
【００２３】
後述の実施例では、宿主細胞に海洋性珪藻のＰ．  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ＵＴＥＸ６４２株を用いた。
宿主細胞へ目的遺伝子を導入する方法についても、分子銃法（パーティクルガン法）、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、ウイルス法、エレクトロポレーション法、など種々の遺伝子導入方法が知られているので、公知の遺伝子導入方法の中から適切なものを選択すればよい。
【００２４】
宿主細胞をこのように形質転換後、本発明の遺伝子発現制御方法では、得られた形質転換細胞の生育環境中のＣＯ２濃度（換言すれば、二酸化炭素分圧ｐＣＯ２）を調節することによって目的遺伝子の発現を誘導する。目的遺伝子はＣＯ２応答性プロモーターによる転写調節を受けるため、ＣＯ２濃度を変化させることで遺伝子発現の促進／抑制を容易に切り替えることができる。以下では、この遺伝子発現制御系を利用した有用蛋白質生産システムについて説明する。
【００２５】
（３）  有用蛋白質生産システム
例えば、宿主細胞に海洋性藻類由来の細胞を使用しこれを形質転換した場合には、形質転換細胞は基本的に光と海水だけで生育（培養）可能である。この生育環境中のＣＯ２濃度を調節するには、例えば海水中に高濃度のＣＯ２を含むガスを通して通気培養し、一定期間経過後、ガスの供給を停止し、あるいは供給するガスを低濃度ＣＯ２またはＣＯ２を含まないものに切り替える等すればよい。本発明のプロモーターは５％程度の高濃度ＣＯ２条件下では遺伝子発現を抑制する一方、大気と同様の０．０３４％程度の低濃度ＣＯ２条件下では遺伝子発現を促進する（図３参照）。したがって、形質転換細胞を少なくともＣＯ２濃度１％以上のガスで通気培養後、その生育環境中のＣＯ２濃度を１％未満に切り替えることによって目的遺伝子の発現を誘導することが可能である。例えば、細胞生育期間では生育に適した濃度として環境中のＣＯ２濃度を１％以上（好ましくは２％以上、より好ましくは３％以上１０％以下）に設定・維持し、細胞が十分成育・分裂した後に、ＣＯ２濃度を１％未満（好ましくは０．５％以下、より好ましくは通常大気分圧近傍に相当する０．０３０％〜０．０４０％程度）に切り替える。これによって、遺伝子発現を誘導し、有用物質を効率よく生産できる。
【００２６】
このように、本発明の有用蛋白質生産システムは、形質転換細胞を培養生育する生育手段と、生育環境中のＣＯ２濃度を調節する調節手段とを備えていればよい。調節手段は、ガスの供給、ガスの供給停止、供給ガスの切り替え、供給したガスの除去などの機能を有する公知の通気システムを利用すれば容易に実現可能である。
【００２７】
例えば、実験室などで通常使用する細胞培養用プレートにて形質転換細胞を培養するときは、ＣＯ２濃度調節手段としてＣＯ２インキュベーターなどを使用すればよい。動物細胞などを宿主細胞に使用する場合は、必要に応じて培地にアミノ酸、ビタミン、ブドウ糖、塩類、血清などを添加すればよい。
【００２８】
海洋性藻類細胞を使用する場合は、基本的に光と海水だけで生育可能である。海水は、人工海水または天然海水を必要に応じて濾過して使用すればよい。また光は、自然光でも蛍光灯などの人工光であってもよい。例えば、大容量の培養用タンクに海水を入れ、海洋性藻類細胞を培養・生育する場合は、タンク全体にわたってＣＯ２濃度を均一に制御できるよう濃度調節手段を設計するとよい。また均一な光照射を実現するため、タンク容器には透光性材料（透光性プラスチックなど）を使用するとよい。さらに、必要に応じてタンク内部に攪拌手段などを設けてもよい。
【００２９】
上記有用蛋白質生産システムによって目的遺伝子の発現を誘導した後、既知の回収精製方法により、その翻訳産物である蛋白質を回収精製する。蛋白質は精製を容易にするため、エピトープ標識したものを発現させてもよいし、本発明のシステムを利用して融合蛋白質や変異蛋白質など人為的に改変・改良を施した蛋白質を生産してもよい。
【００３０】
このように、本発明の生産システムを利用して抗体医薬等に用いられる各種抗体、あるいは検査薬等に使用される酵素などの有用蛋白質を安価に生産することが可能である。尚、本システムを利用して哺乳類タイプや哺乳類由来の蛋白質を生産する場合には、宿主細胞に哺乳類タイプの細胞を使用するか、もしくは珪藻類などの黄色植物の細胞を使用するとよい。前述のように、海洋性珪藻等はそのゲノム構造が哺乳類と類似しており、哺乳類タイプや哺乳類由来の蛋白質の生産に適していると考えられるからである。
【００３１】
後述の実施例では、加水分解酵素であるＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子をレポーター遺伝子に使用し、実際に本発明の方法による当該酵素の発現が確認された。したがって、本発明は有用酵素の生産に利用可能である。一例として、薬物代謝酵素Ｐ４５０の生産への利用が挙げられる。Ｐ４５０は薬品の安全評価、毒物の毒性評価などに利用される酵素であるが、ヒトのＰ４５０分子種には様々のものが知られており、大腸菌などを用いた既存の方法では未だ生産体制が確立していないタイプのものも存在する。同様にバクテリアや酵母で発現させた場合には適切な糖鎖修飾が出来ない有用タンパク質（例えば抗体タンパク質など）も数多く存在する。また人由来ホルモンレセプターとレポーター遺伝子を組み合わせることによって、沿岸海洋域で汚染が深刻な内分泌撹乱物質のモニタリングに利用し得る系の開発も可能である。本発明は、このようなタイプの酵素やタンパク質の生産などに利用可能である。
【００３２】
また、本発明のシステムを利用して副次的な有用物質を生産することも可能である。例えば、珪藻類はＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）を合成するが、この合成経路に関わる酵素等を本発明の方法により発現誘導し、有用物質であるＥＰＡを大量生産する形質転換体を得るといった具合である。このような海洋性珪藻の形質転換体も本発明に含まれる。
【００３３】
【実施例】
以下図面を参照して、本発明の実施例について説明する。
【００３４】
〔実施例１：ＣＯ２濃度調節によるＧＵＳ遺伝子の発現誘導〕
〔Ａ〕細胞と生育方法
宿主細胞には海洋性珪藻Ｐ．  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ  ＵＴＥＸ６４２株を用い、これをｐＨ７−８に調整した人工海水内で育てた。培養液には５％あるいは０．０３４％のＣＯ２を通気し、光強度は約１００μＥ  ｍ−２とした。
【００３５】
〔Ｂ〕Ｐ．  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの形質転換
ａ）  細胞の調製：  細胞を対数増殖期初期から中期程度まで人工海水中で生育し、約５×１０７個を遠心して集藻、２００μＬの人工海水に懸濁後、寒天培地上に直径３  ｃｍ程度になるようにまいた。その後表面を乾かし、１時間程度放置した。
ｂ）  形質転換ベクターの作製：ＣＯ２応答性プロモーター候補としてＰ．  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの細胞内β型カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子（ＰｔＣＡ）のプロモーター部位約１．３ｋｂｐをＰＣＲで増幅し、図１に示される形質転換ベクターのＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩサイトの部分に連結した。なお、プロモーター領域は図２に示すように−１２９２〜＋６１，  −８２４〜＋６１，  −４８４〜＋６１，  −２２５〜＋６１，  −１１５〜＋６１の５種類作製し、ネガティブコントロールとしてプロモーター領域を持たないコンストラクトを用意した。これらのコンストラクトをプラスミドに継いだ。
ｃ）  ＤＮＡのタングステン粒子へのコーティング：本実験の遺伝子導入は分子銃法を採用し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（商標）  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍのプロトコールに準じた。なお細胞への粒子撃ち込み条件は以下のように設定した。
Ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ：  ６  ｃｍ
Ｃｈａｍｂｅｒ  ｖａｃｕｕｍ  ：  ２７”Ｈｇ
Ｈｅｌｉｕｍ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ：  １５５０  ｐｓｉ
ｄ）  形質転換体の選抜：撃ち込み後の細胞を６００μＬの人工海水に懸濁し、３００μＬずつ１００μｇ／ｍＬ  Ｚｅｏｃｉｎ（商標）入り人工海水寒天培地上にまいて３〜４週間通常光下通常大気下で培養し、Ｚｅｏｃｉｎ耐性クローンを選抜した。
【００３６】
〔Ｃ〕ＧＵＳ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）活性の測定
形質転換体を５％及び０．０３４％のＣＯ２濃度で対数増殖期中期程度まで通気培養し、１０  ｍＬを遠心して集藻した。１  ｍＬの抽出Ｂｕｆｆｅｒ（５０  ｍＭ  ＮａＰＯ４，  ｐＨ７．０、１０  ｍＭ  ｂｅｔａ−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、０．１％  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｕｒｙｌ  Ｓａｒｃｏｓｉｎｅ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に懸濁し、超音波破砕機で１分間破砕した。Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（抽出ｂｕｆｆｅｒ＋１０  ｍＭ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄｅ）９８０μＬに上記の細胞抽出液を２０μＬ加え、３７℃で反応させ、総タンパク量１  ｍｇ、１分間当たりに生成するＰＮＰ量としてＧＵＳ活性を算出した。
【００３７】
上記実験結果を図３に示す。同図に示すように、試験したそれぞれの長さのプロモーター領域すべてについて、高ＣＯ２生育下ではＧＵＳ活性がほぼ完全に抑制され（図中、白抜きのバー）、０．０３４％ＣＯ２環境下ではＧＵＳ活性が誘導されていることが示された（図中、黒塗りのバー）。尚、グラフ中、「１」「２」は形質転換後それぞれ異なるコロニーから得られた細胞を使用した実験結果であり、いずれの場合もＣＯ２応答性の高いプロモーター活性が認められた。
【００３８】
上記実験結果からＣＯ２に応答するプロモーター領域としては−１１５〜＋６１の配列（図４参照）が十分な機能を有することが分かった。この配列はこれまでに知られている、淡水性緑藻クラミドモナスにおけるカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のＣＯ２応答領域よりもはるかに短く、現時点で一切の明確なホモロジー配列を持たないものであることが分かった。
【００３９】
〔実施例２：ＣＯ２濃度調節によるＧＦＰ遺伝子の発現誘導〕
次に、ＧＵＳ遺伝子の代わりにＧＦＰ遺伝子を使用して同様の実験を行い、ＧＦＰ遺伝子の発現誘導を調べた。尚、使用したＧＦＰ遺伝子はｅｇｆｐと呼ばれるヒトのコドンバイアスを考慮して改変しているものである。ｐｔＣＡプロモーター領域にｅｇｆｐを継いだコンストラクトを発現した形質転換体は、図５に示すように葉緑体蛍光の無い部位に特異的に発現していることが示された。このことから、ＧＦＰが細胞質内に機能を持った状態で発現していることが示された。このことはさらに、ヒトタイプのコドンバイアスを持つ遺伝子の発現宿主として海洋性珪藻Ｐ．  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍが適していることを示しており、本細胞のゲノム構造がヒトとホモロジーが高い結果とも一致していた。また、このことは同時にｐｔＣＡプロモーターのような配列が、海洋性珪藻以外の哺乳類タイプの細胞内でも機能する可能性をも示唆するものと考えられる。
【００４０】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、海洋性藻類由来のＣＯ２応答性新規プロモーターを利用した遺伝子発現制御方法に関するものであり、前述したとおり、酵素や抗体等の有用蛋白質の生産に利用できるほか種々の有用性を有するものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例で使用した形質転換ベクターの構造を示す図である。
【図２】本発明の実施例で作製したプロモーター−レポーター遺伝子コンストラクトを示す図である。
【図３】ＧＵＳ活性の測定結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例で作製したプロモーターの塩基配列を示す図である。
【図５】ＧＦＰ遺伝子の発現誘導を調べた実験結果を示す図であり、Ａは透過光イメージ、Ｂは葉緑体蛍光、ＣはＧＦＰ蛍光イメージ、ＤはＢとＣのイメージを重ね合わせたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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