(57)【要約】【課題】アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、しかも持続性のある血圧降下作用を示す組成物の製造方法を提供すること。【解決手段】ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解してなる製造方法であり、より好ましくナタネ由来の蛋白質として、ナタネの種子から油脂を除去した油粕を用い、プロテアーゼとしてズブチリシンを用いてなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物の製造方法。
【請求項２】
ナタネ由来の蛋白質がナタネ種子から油脂を除去した油粕であることを特徴とする請求項１記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物の製造方法。
【請求項３】
プロテアーゼがズブチリシンであることを特徴とする請求項１あるいは２記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素阻害活性をもち、しかもかかる活性が持続する阻害剤含有組成物を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、食品中に含まれる蛋白質は栄養効果ばかりでなく種々の生理活性を有することが知られている。
例えば血圧を降下する活性を示すものとして、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドや動脈血管を弛緩させるペプチドが知られている。
アンジオテンシン変換酵素は、主として肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在し、アンジオテンシンＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用して、アンジオテンシンＩのＣ末端よりジペプチド（Ｈｉｓ９−Ｌｅｕ１０）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有するアンジオテンシンＩＩを生成させる酵素である。また、この酵素は生体内降圧物質であるブラジキニンを破壊し不活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与している。したがって、かかるアンジオテンシン変換酵素の活性を阻害すれば、血圧が降下して、臨床的には高血圧症の予防、治療に有効であると考えられている。
かかるアンジオテンシン変換酵素阻害物質としてはプロリン誘導体であるカプトプリルが合成されて、降圧活性が確認されて以来、種々のアンジオテンシン変換酵素阻害物質が合成され、近年天然物からの取得も盛んに試みられ、γ−ゼインをサーモリシンで加水分解してＣ末端のアミノ酸配列がＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏである重合度が３〜５のペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤が報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平２−３６１２７号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のアンジオテンシン変換酵素阻害剤は、試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）では阻害活性はあるものの、血圧降下作用の持続性がなく、例えば実験的に高血圧自然発症ラット（以下ＳＨＲと称する）に経口投与すると、投与後３時間以内で元の血圧にもどってしまうことが判明した。
昨今では経口投与においても有意な血圧降下作用を示し、更に従来のペプチドよりも血圧降下を示す時間が長くなる血圧降下の持続性のあるアンジオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物が求められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、かかる課題を解決すべく天然物質で血圧降下作用が持続する物質を鋭意探索した結果、ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解して製造した組成物が強いアンジオテンシン変換酵素阻害作用を示し、しかも血圧降下の持続性があることを見いだし本発明を完成した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物を製造するにあたっては、ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼによって加水分解して製造する。以下かかる方法について説明する。
【０００７】
かかる蛋白質として、ナタネ種子、その他のナタネの構成成分、ナタネの組織培養物等を直接用いてもよいが、ナタネ種子から油脂を除去した油粕を用いることが加水分解や精製が容易で、しかも食品としては未利用な資源である油粕を有効利用できる点で好ましい。
油脂を除去する方法は特に制限されるものではないが、通常溶剤による抽出、圧搾等により油脂が除去される。
【０００８】
プロテアーゼとしてはズブチリシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチン、サーモリシン、ペプシン、パパイン、アルカリプロテアーゼ等が挙げられるがズブチリシン、ペプシンが好ましく、中でもズブチリシンが好ましい。
【０００９】
かかる油粕をプロテアーゼで加水分解するにあたっては、油粕を水に分散させてそのまま加水分解を行ってもよいが、油粕から蛋白質を水で抽出して、かかる蛋白質を加水分解するのが分解率を上げる点で好ましく、かかる方法について説明するが、これに限定されるものではない。
油粕から蛋白質を水で抽出するにあたっては、油粕に１〜１００倍重量程度の水を加えて水分散液とした後、遠心分離やろ過により固形分をとり除けばよい。次いで、加水分解を行うにあたっては、得られた蛋白質の水溶液は、該水溶液を一旦凍結乾燥して粉末状の蛋白質とした後に、かかる蛋白質を水に溶解して加水分解を行えばよい。
加水分解時の蛋白質濃度は０．１〜２０重量％となるように調整し、プロテアーゼを蛋白質に対して０．１〜３重量％程度添加して行うのが好ましい。かかる添加量が０．１重量％未満では加水分解が十分行われず、３重量％を超えても収率の向上は望めない。このときプロテアーゼは粉末のまま添加しても、水溶液として添加してもよい。プロテアーゼを添加した後、温度１０〜８５℃程度、好ましくは３０〜６０℃で０．１〜４８時間、好ましくは１〜１０時間加水分解を行う。この時のｐＨも特に制限されず１〜９程度で実施されるが、ズブチリシンの場合は６〜８程度、ペプシンの場合は１〜３で実施することが好ましい。蛋白質の分解率が所定の範囲に達した時、分解液に塩酸等の酸水溶液を添加したり、あるいは煮沸することにより加水分解を停止させる。
【００１０】
上記の加水分解により得られた組成物は、各種のペプチドを含む混合物であり、実用にあたってはかかる混合物をそのまま用いればよいが、必要に応じて混合物からアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを精製、単離することも可能である。
【００１１】
本発明の製造方法で得られた組成物は、医薬品、機能性をもつ食品等として有用であり、以下医薬品として用いる場合について説明する。
該組成物の投与経路としては、経口投与、血管内投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。該組成物の人に対する投与量は、投与方法、患者の症状・年令等により一概に言えないが、通常は組成物中のペプチドとして、１日あたり０．１〜１００ｇ、更には２〜１０ｇとすることが好ましく、投与回数は１日あたり１〜３回程度である。該組成物は通常、製剤の形で投与される。製剤に用いられる担体や助剤としては、製剤分野において常用され、かつ本該組成物と反応しない物質が用いられる。
【００１２】
具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００１３】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、上記組成物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１４】
これらの製剤は、本発明の方法で得られた組成物を、ペプチドとして０．０１重量％以上、好ましくは０．５〜７０重量％の割合で含有させることが好ましく、０．０１重量％未満では、血圧降下を示すために必要な量を摂取するのに多量の製剤を摂取しなければないないことがあり好ましくない。
これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００１５】
【実施例】
次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
実施例１
ナタネ種子をヘキサンで抽出して油脂を除去した油粕１０ｇに水１００ｍｌを加えた水分散液を充分撹拌し、遠心分離して固形分を沈殿せしめた後、上澄み液を凍結乾燥して粉末状の蛋白質を得た。次いで得られた蛋白質１ｇを２重量％濃度となるように水に溶解させ、それにズブチリシン（シグマ社製、バシラス　リチェニフォルミス由来、タイプＶＩＩＩ）を、０．０１ｇ添加してｐＨ７．５、３７℃の条件で５時間加水分解を行った。加水分解後１０分間煮沸して加水分解を停止させてペプチド１ｇを含むアンジオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物を得た。
【００１６】
（アンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定）
上記の組成物のアンジオテンシン変換酵素阻害活性の測定を、Ｃｈｅｕｎｇ　Ｃｕｓｈｍａｎの方法の山本らの改良法〔日本胸部疾患会誌，（１８），１２９７（１９８０）〕に準じて以下の要領で行った。
酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
酵　素　；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製）
最終濃度；１００ｍＭ硼酸、塩化ナトリウム４００ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．３）、上記酵素基質５ｍＭ、酵素３μＵ
【００１７】
上記の最終濃度になるように緩衝液、酵素基質、酵素を混合し、水で全体を２００μｌとした後、３７℃で３０分間反応を行った。反応は１Ｎ−塩酸２００μｌを用いて終了させた。反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れＶｏｒｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢酸エチル層から１．０ｍｌをとり出して、酢酸エチルを留去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（ＯＤ２２８）を測定した。
【００１８】
阻害率はペプチドなしで反応したときのＯＤ２２８を１００％とし、反応時間０分のときのＯＤ２２８を０％として求めた。阻害率５０％の時のペプチドの濃度ＩＣ５０は０．１６ｍｇ／ｍｌであった。
【００１９】
（血圧降下作用の測定）
２０週齢のＳＨＲ（ｎ＝４）に上記の組成物をペプチドとして２５０、５００ｍｇ／ｋｇとなるようにゾンデ針を使用して経口投与して、尾動脈部の血圧をｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法にて経時的に測定し、収縮期血圧における最大降圧値を調べて以下の表１にその結果を示した。
【００２０】
2004123549.tif 000002
＊　Ｐ＜０．０５：組成物を含まない同量の生理食塩水を投与した場合の血圧の変化の平均値（ｎ＝４）に対して有意水準５％で有意性を示した。
＊＊Ｐ＜０．０１：組成物を含まない同量の生理食塩水を投与した場合の血圧の変化の平均値（ｎ＝４）に対して有意水準１％で有意性を示した。
かかる表１からも明らかなように、投与量２５０ｍｇ／ｋｇでも４時間以上の持続性のある血圧降下作用を示し、投与量を５００ｍｇ／ｋｇにすると、６時間以上の持続性のある血圧降下作用を示す。
【００２１】
【発明の効果】
本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物の製造方法は、ナタネ由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解する方法であり、かかる方法により得られたアンジオテンシン変換酵素阻害剤含有組成物は、強いアンジオテンシン変換酵素阻害作用を示し、しかも持続性のある血圧降下作用を示す。