(57)【要約】【課題】  アガリクス・ブラゼイを原料として用いた優れた抗腫瘍活性を有する食品を提供すること。【解決手段】  本発明は、アガリクス・ブラゼイに、乳酸菌を加えて乳酸発酵することで得られる乳酸発酵物と、ヘミセルラーゼを加えて酵素処理することで得られる酵素分解物を、主成分としてなることを特徴とする食用抗腫瘍性組成物である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガリクス・ブラゼイに、乳酸菌を加えて乳酸発酵することで得られる乳酸発酵物と、ヘミセルラーゼを加えて酵素処理することで得られる酵素分解物を、主成分としてなることを特徴とする食用抗腫瘍性組成物。
【請求項２】
乳酸発酵物と酵素分解物の配合重量比（乳酸発酵物は乾燥物として換算）が６０：４０〜８０：２０であることを特徴とする請求項１記載の食用抗腫瘍性組成物。
【請求項３】
乳酸発酵物と酵素分解物の配合重量比（乳酸発酵物は乾燥物として換算）が７２：２８〜７６：２４であることを特徴とする請求項１記載の食用抗腫瘍性組成物。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の食用抗腫瘍性組成物を加工してなることを特徴とする機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アガリクス・ブラゼイを原料として用いた優れた特性を有する食用抗腫瘍性組成物およびこれを加工してなる機能性食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
アガリクス・ブラゼイ（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ）は、ブラジル原産の担子菌類キノコであり、多糖の一種であるβ−グルカンを多く含むことで知られている。このβ−グルカンは、免疫賦活能力が高く、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞などの免疫細胞を活性化させることにより、ガン細胞を攻撃して殺滅させる効果を有することから、アガリクス・ブラゼイは、ガンやその他の成人病などに対して優れた効果を有し、健康食品などとして重宝されている。
【０００３】
近年、アガリクス・ブラゼイを原料として用いた新たな商品形態の食品が種々提案され、その中には既に市場に送り出されているものもある。例えば、下記の特許文献１に記載の、アガリクス・ブラゼイが有する優れた食効と機能を保持し、品質面、安全面、風味、食感などの点においても優れた食品として開発された、アガリクス・ブラゼイに乳酸菌を加えて乳酸発酵することで得られる乳酸発酵物や、下記の特許文献２や特許文献３に記載の、アガリクス・ブラゼイに含まれるβ−グルカンを多量に含有する生理活性物質を主材とする食品として開発された、アガリクス・ブラゼイに糖質分解酵素であるヘミセルラーゼを加えて酵素処理することで得られる酵素分解物などもそのうちの１つとして挙げられる。
【特許文献１】特開２００１−１２８６４１号公報
【特許文献２】特開平１０−２８７５８４号公報
【特許文献３】特開平１１−３２７２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、アガリクス・ブラゼイを原料として用いた新規な機能を有する食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の点に鑑みて種々の検討を行った結果、アガリクス・ブラゼイに、乳酸菌を加えて乳酸発酵することで得られる乳酸発酵物と、ヘミセルラーゼを加えて酵素処理することで得られる酵素分解物を、主成分としてなる組成物が、抗腫瘍活性に優れることを知見した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の食用抗腫瘍性組成物は、請求項１記載の通り、アガリクス・ブラゼイに、乳酸菌を加えて乳酸発酵することで得られる乳酸発酵物と、ヘミセルラーゼを加えて酵素処理することで得られる酵素分解物を、主成分としてなることを特徴とする。
また、請求項２記載の食用抗腫瘍性組成物は、請求項１記載の食用抗腫瘍性組成物において、乳酸発酵物と酵素分解物の配合重量比（乳酸発酵物は乾燥物として換算）が６０：４０〜８０：２０であることを特徴とする。
また、請求項３記載の食用抗腫瘍性組成物は、請求項１記載の食用抗腫瘍性組成物において、乳酸発酵物と酵素分解物の配合重量比（乳酸発酵物は乾燥物として換算）が７２：２８〜７６：２４であることを特徴とする。
また、本発明の機能性食品は、請求項４記載の通り、請求項１乃至３のいずれかに記載の食用抗腫瘍性組成物を加工してなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、アガリクス・ブラゼイを原料として用いた優れた抗腫瘍活性を有する食品が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の食用抗腫瘍性組成物は、アガリクス・ブラゼイに、乳酸菌を加えて乳酸発酵することで得られる乳酸発酵物と、ヘミセルラーゼを加えて酵素処理することで得られる酵素分解物を、主成分としてなることを特徴とするものである。原料として用いるアガリクス・ブラゼイは、子実体であっても菌糸体であってもよく、これらは天然物であっても栽培物または培養物であってもよい。
【０００９】
本発明の食用抗腫瘍性組成物の主成分の１つである、アガリクス・ブラゼイに乳酸菌を加えて乳酸発酵することで得られる乳酸発酵物は、例えば、上記の特許文献１に記載された方法で得ることができる。乳酸菌としてはケフィア菌が好適に用いられる。乳酸発酵は、例えば、アガリクス・ブラゼイと乳酸菌液を５：９５〜６０：４０（重量比）の割合で混合し、３０℃〜４５℃で、１２時間〜３６時間培養して行えばよい。このような条件を採用することにより、アガリクス・ブラゼイの自己消化酵素の作用促進を図り、乳酸発酵を促進させることができる。その後、冷蔵庫内などで、５℃〜１５℃で、３６時間〜６０時間熟成させれば、ほどよい酸味を有する乳酸発酵食品を得ることができる。
【００１０】
本発明の食用抗腫瘍性組成物の主成分の１つである、アガリクス・ブラゼイにヘミセルラーゼを加えて酵素処理することで得られる酵素分解物は、例えば、上記の特許文献２や特許文献３に記載された方法で得ることができる。酵素処理は、例えば、アガリクス・ブラゼイに対してヘミセルラーゼを０．０１重量％〜０．５重量％の割合で添加し、ｐＨ３．０〜８．５の条件下、２５℃〜６０℃で、２０分〜１２０分間行えばよい。酵素反応がある程度まで進行したら、反応液を７０℃〜１００℃で約１０分間加熱してヘミセルラーゼを失活させて反応を止め、反応液を濃縮や乾燥することで酵素分解物が得られる。
【００１１】
本発明の食用抗腫瘍性組成物における乳酸発酵物と酵素分解物の配合重量比（乳酸発酵物は乾燥物として換算）は、６０：４０〜８０：２０であることが望ましく、７２：２８〜７６：２４であることがより望ましい。このような配合重量比とすることにより、アガリクス・ブラゼイの、乳酸発酵物と酵素分解物の各々に基づく活性酸素除去活性やインターロイキン１２（以下、ＩＬ−１２と称する）産生促進活性などに基づいて、優れた抗腫瘍活性を有する組成物となる。
【００１２】
本発明の食用抗腫瘍性組成物は、所定の方法で加工することで、粉末形態や錠剤形態などの機能性食品とされ、腫瘍の治療と予防に有効な食品として食することができる。製剤化に際しては、必要に応じて、多糖類や酵母類やきのこ類などを結合剤として添加したり、所定の食品添加剤を添加したりしてもよいことはいうまでもない。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定して解釈されるものではない。
【００１４】
実施例１：本発明の食用抗腫瘍性組成物の製造
（１）アガリクス・ブラゼイに乳酸菌を加えて乳酸発酵することで得られる乳酸発酵物の調製
自体公知の方法で栽培して得られたアガリクス・ブラゼイ子実体２００ｇと乳酸菌液（乳酸菌としてケフィア菌を用い、基質として乳糖とホエーパウダーを、乳酸菌液１００重量部に対し、乳糖を５重量部、ホエーパウダーを７重量部混合し、４０℃で、１２時間培養して、スターターとして約１億個／リットルまで増殖させたもの）８００ｇを混合し（重量比２０：８０）、４０℃で１日間培養した後、冷蔵庫内で１０℃で２日間熟成させて、ヨーグルト状の乳酸発酵物（以下、発酵アガリクスと称する）を１０００ｇ得た。
（２）アガリクス・ブラゼイにヘミセルラーゼを加えて酵素処理することで得られる酵素分解物の調製
自体公知の方法で液体培養して得られたアガリクス・ブラゼイ菌糸体を培地と分離した後、粗粉砕した。得られた粉砕物と酵素液（ヘミセルラーゼとペクチナーゼを２：１（重量比）の割合で含む混合酵素を０．１ｗ／ｖ％で含む溶液）を１：２（体積比）の割合で混合し、ｐＨ４．５の条件下、４５℃で、６０分酵素処理を行った。その後、反応液を７０℃で１０分加熱して酵素を失活させて反応を止め、反応液を凍結乾燥することで酵素分解物（以下、ＡＢＰＣ純末と称する。なお、ＡＢＰＣは株式会社応微研の登録商標である）を得た。
（３）食用抗腫瘍性組成物の製造
（１）で得た発酵アガリクスと（２）で得たＡＢＰＣ純末を混合し、凍結乾燥することで、発酵アガリクスとＡＢＰＣ純末の配合重量比（発酵アガリクスは乾燥物として換算）が１：４，２：３，３：２，４：１の４種類の食用抗腫瘍性組成物を得た（発酵アガリクスの乾燥物重量は発酵アガリクス重量の約１５％）。
【００１５】
参考例１：本発明の食用抗腫瘍性組成物の活性酸素除去活性
以下の検体について、活性酸素除去活性を２種類の評価方法により評価した。
【００１６】
１．比較区：実施例１に記載のＡＢＰＣ純末（以下、検体Ｘと称する）
２．試験区：実施例１で製造した発酵アガリクスとＡＢＰＣ純末の配合重量比が１：４の組成物（以下、検体Ａと称する）
３．試験区：同、２：３の組成物（以下、検体Ｂと称する）
４．試験区：同、３：２の組成物（以下、検体Ｃと称する）
５．試験区：同、４：１の組成物（以下、検体Ｄと称する）
６．比較区：実施例１に記載の発酵アガリクスの乾燥物（以下、検体Ｙと称する）
【００１７】
評価方法１：ＳＯＤ様活性の測定
Ａ．方法（Ｎｉｔｒｉｔｅ法）
１．試薬
（ａ）基質
ヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）１３．６ｍｇと、ヒドロキシルアミン−Ｏ−スルフォン酸１００ｍｇを、１００ｍＭのＫＨ2ＰＯ4・ほう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２：以下、単に緩衝液と略称する）１００ｍＬに溶解したものを用いた。
（ｂ）酵素液
キサンチンオキシダーゼ（Ｘａｎｔｈｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ：和光純薬工業株式会社）１０μＬと、ＥＤＴＡ・２Ｎａ３７２ｍｇを緩衝液１００ｍＬに溶解した溶液０．５ｍＬと、緩衝液９．５ｍＬを混合したものを用いた。
（ｃ）発色液
スルファニル酸２２５ｍｇと、Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン・２ＨＣｌ５ｍＬと、酢酸１２５ｍＬを混合し、蒸留水で全量を５００ｍＬにしたものを用いた。
【００１８】
２．サンプル液
検体１５０ｍｇを蒸留水３ｍＬに懸濁し、ボルテックスミキサーにて３０秒間混和した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、上清を回収した。回収した上清を孔径０．４５μｍのフィルターにて濾過し、濾液をサンプル原液とした。このサンプル原液より希釈系列を調製し、サンプル液とした。
【００１９】
３．測定方法
試験管にサンプル液０．１ｍＬと蒸留水０．５ｍＬと基質０．２ｍＬを入れ、３７℃の温浴で５分間加熱した。その後、酵素液０．２ｍＬを加え、３７℃の温浴でさらに３０分間加熱した後、発色液２ｍＬを加え、室温で２時間放置してから５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして蒸留水を用い、各サンプル液の希釈倍率における発色阻害率（％）を｛(コントロール吸光度−サンプル液吸光度)／コントロール吸光度｝×１００から求めた。
発色阻害率が５０％であるサンプルの希釈倍率を求めて、その値を１ユニット（１  Ｎｉｔｒｉｔｅ  ｕｎｉｔ）とした。これに希釈倍率をかけてサンプル原液のユニット数を求めた。サンプル原液は検体５０ｍｇ／ｍＬで調製してあるので、サンプル原液のユニット数を２０倍して検体１ｇあたりのユニット数を求め、これをＳＯＤ様活性値とした。すなわち、例えば、原液を２倍希釈してなるサンプル液の阻害率が５０％であった場合、サンプル原液のユニット数は１（ユニット）×２（希釈率）＝２ユニットとなり、サンプル原液は検体５０ｍｇ／ｍＬで調製してあるので、サンプル原液のユニット数を２０倍して検体１ｇあたりのユニット数を求めると４０ユニットとなり、これをＳＯＤ様活性値とした。
【００２０】
評価方法２：ＸＹＺ微弱発光法に基づくＹ活性の測定
大久保一良らのＸＹＺ微弱発光法（ジャパンフードサイエンス、第３８巻、８号、１８−２１（１９９９））に従って測定した。本方法は、天然ラジカル消去物質が活性酸素及びアセトアルデヒド存在下で微弱発光する現象を利用して、活性酸素消去能の測定に用いられている。この微弱発光は、Ｘ（活性酸素種）、Ｙ（プロトン、エレクトロン供与体）、Ｚ（触媒種）の三つ巴反応で生じ、Ｙ（活性酸素消去電子供与体）としての作用、及びＺ（活性酸素消去反応触媒）としての能力、つまり活性酸素消去能力の強弱が発光輝度としてビットマップイメージ上に現れ、数値化することができるので、活性酸素消去物質の分析に有用である。
具体的な測定方法は次の通りである。Ｘ試薬として２％過酸化水素水溶液、Ｙ試薬として１０％アセトアルデヒド没食子酸飽和溶液、Ｚ試薬として１０％アセトアルデヒド炭酸水素ナトリウム飽和溶液を用い、２４穴マイクロプレートのウェル中にて、検体５０ｍｇに、Ｘ活性を測定するためにはＹ試薬とＺ試薬を、Ｙ活性を測定するためにはＸ試薬とＺ試薬を、Ｚ活性を測定するためにはＸ試薬とＹ試薬を、それぞれ５００μＬ添加し、さらに１−ブタノールを添加して重層後、反応させることによって発せられた光の輝度を、高感度ＣＣＤカメラを備えた東洋紡績社のＬｕｍｉｎｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＦＡＳ−１０００を用いて３０分間測定し、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃ社のＧｅｌ−Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて定量した。
【００２１】
評価結果：
試験区と比較区の、各検体の１ｇあたりのＳＯＤ様活性値と各検体のＹ活性を図２に示す。図２から明らかなように、発酵アガリクスはＳＯＤ様活性に優れてＹ活性に劣る一方、ＡＢＰＣ純末はＹ活性に優れてＳＯＤ様活性に劣り、発酵アガリクスとＡＢＰＣ純末を組み合わせることで、ＳＯＤ様活性とＹ活性をともに有する組成物となることがわかった。また、ＳＯＤ様活性とＹ活性をともに適度に有する組成物を得るためには、発酵アガリクスとＡＢＰＣ純末の配合重量比（発酵アガリクスは乾燥物として換算）を７４：２６とすればよいことがわかった。
【００２２】
参考例２：本発明の食用抗腫瘍性組成物のＩＬ−１２産生促進活性
実施例１と同様にして製造した、発酵アガリクスとＡＢＰＣ純末の配合重量比（発酵アガリクスは乾燥物として換算）が７４：２６の食用抗腫瘍性組成物のＩＬ−１２産生促進活性を以下のようにして測定した。
【００２３】
Ａ．試薬
・  ＩＬ−１２アッセイキット（和光純薬工業株式会社）
・  Ｈａｎｋ’ｓ液（ペニシリン、ストレプトマイシン含有）
・  １０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液（ＲＰＭＩ１６４０（和光純薬工業株式会社）溶液と牛胎児血清（ＦＣＳ）とを容量比９：１で混合したもの）
・  リポポリサッカライド（ＬＰＳ：和光純薬工業株式会社）溶液（１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液を用いて１００ｎｇ／ｍＬに調製したもの）
【００２４】
Ｂ．サンプル液
食用抗腫瘍性組成物２００ｍｇを乳鉢で粉砕した後、Ｈａｎｋ’ｓ液１．８ｍＬに溶解した。これを１５ｍＬチューブに移し、室温にて１時間静置した。その後、１０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、上清０．５ｍＬを回収した。回収した０．５ｍＬを原液とし、Ｈａｎｋ’ｓ液４ｍＬを加えサンプル液とした。
【００２５】
Ｃ．ＩＬ−１２産生促進活性の測定方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（♀６週齢、ｎ＝８）を１週間予備飼育した７週齢の実験マウスの腹腔内に、調製した各サンプル液をそれぞれ０．５ｍＬ投与した（コントロール群にはＨａｎｋ’ｓ液のみを投与）。サンプル液の投与から１８時間後に腹腔内細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液にて洗浄し、溶血バッファーにて赤血球を除去した後、細胞数を算定し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液を用いて１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、２４穴カルチャープレートにて培養した。その際に、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを１０μＬ加えた場合と加えなかった場合との２通りで培養した。ＬＰＳ添加から１８時間後に培養上清を回収し、ＩＬ−１２アッセイキットを用い、その製品プロトコールに準じてＩＬ−１２産生量を測定した。
【００２６】
Ｄ．測定結果
サンプル液を投与したマウスの細胞毎に、ＬＰＳを加えて培養した細胞におけるＩＬ−１２産生量と、ＬＰＳを加えずに培養した細胞におけるＩＬ−１２産生量の差を求め、その平均値を検体とした食用抗腫瘍性組成物のＩＬ−１２産生量として、ＡＢＰＣ純末と発酵アガリクス（いずれも実施例１に記載のもの）のＩＬ−１２産生量とともに図３に示す。図３から明らかなように、この食用抗腫瘍性組成物は、ＡＢＰＣ純末と発酵アガリクスに比べて優れたＩＬ−１２産生促進活性を有していた。
【００２７】
実施例１：本発明の食用抗腫瘍性組成物の抗腫瘍活性
Ａ．測定方法
実施例１と同様にして製造した、発酵アガリクスとＡＢＰＣ純末の配合重量比（発酵アガリクスは乾燥物として換算）が７４：２６の食用抗腫瘍性組成物(400mg/kgおよび800mg/kg)とポジティブコントロールとしてのKrestin(1000mg/kg)をC57BL/6マウスにそれぞれ経口投与した(n=10)。被検物質は経口ゾンデを用いて1日1回連日投与した。投与開始8日後（day0）に被検動物腰背部にEL-4（1.5×104cells/0.2ml/head s.c）を接種した。さらに被検物質を20日間経口投与を継続するとともに、ノギスにて腫瘍の径を測定した。21日目に各群マウスを頚椎脱臼にて屠殺し、脾臓、胸腺及び腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。
Ｂ．結果
図１に示す。図１から明らかなように、本発明の食用抗腫瘍性組成物は、優れた抗腫瘍活性を示し、腫瘍の退縮効果は、ポジティブコントロールとしてのKrestinよりも遥かに優れたものであった。
【００２８】
製造例１：錠剤品の製造
発酵アガリクスとＡＢＰＣ純末の配合重量比（発酵アガリクスは乾燥物として換算）が７４：２６の食用抗腫瘍性組成物を打錠機にて打錠し、機能性食品としての錠剤品を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は、アガリクス・ブラゼイを原料として用いた優れた抗腫瘍活性を有する食品を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】試験例１における抗腫瘍活性を示すグラフ。
【図２】参考例１における活性酸素除去活性を示すグラフ。
【図３】参考例２におけるＩＬ−１２産生促進活性を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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