(57)【要約】【課題】培養液の中の細胞を良好に、しかも長時間観察することが可能な培養観察方法及び、それに使用する倒立顕微鏡を提供する。【解決手段】倒立顕微鏡１は、対物レンズ８の近傍に、容器３０内の細胞の活性を維持するための細胞活性維持装置３１が備わっている。また、対物レンズ８の先端部と容器の底面との間には、二価三価の塩化鉄を含む水５１が配置されている。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器の中の細胞を培養しながら観察する培養観察方法において、前記容器内の細胞を観察するための対物レンズの先端部と前記容器の底面との間に二価三価の塩化鉄を含む水を満たし、該二価三価の塩化鉄を含む水を介して前記対物レンズで観察することを特徴とする培養観察方法。
【請求項２】
容器の中の細胞を培養しながら観察する倒立顕微鏡において、前記細胞を照明する落射及び透過照明光学系と、前記容器を収納し、その内部を高湿度に維持させながら前記細胞の温度を維持するための細胞活性維持装置と、前記容器の底面とその先端部との間に満たされた二価三価の塩化鉄を含む水を介して前記容器の中の細胞を観察可能な対物レンズとを有することを特徴とする倒立顕微鏡。
【請求項３】
前記対物レンズの先端部に配置され、前記二価三価の塩化鉄を含む水を受けるための受け部材を具備することを特徴とする請求項２記載の倒立顕微鏡。
【請求項４】
前記細胞活性維持装置は、前記容器を載置し、該容器の底面を露出する開口を有する載置部材と、この載置部材に接触し、該載置部材を温めるサーモプレートと、前記載置部材の周囲を囲む周壁部と、この周壁部の内側に配置し、水を溜める水槽と、この水槽に炭酸ガスを供給する供給手段と、前記載置部材と前記周壁部とに囲まれる空間を覆い、それ該空間を密閉状態にするための透明な被覆部材と、この被覆部材を温める保温手段とを具備することを特徴とする請求項２または３記載の倒立顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞の培養観察のための方法及び、それに用いる倒立顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、培養した細胞を観察する手段としては、倒立顕微鏡による観察がよく知られている。例えば特開２００１−２７２６０６に記載されているように、培養液中の細胞を容器の底面から対物レンズで観察するものである。また、高ＮＡの対物レンズを使用する際には、その解像を高めるために、対物レンズの先端部と容器との間にイマ−ジョンオイルを満たした上で観察を行う。
【０００３】
さらに、このような培養観察を行う場合においては、容器内の細胞を所定の温度に維持することが一般的である。このような場合においては、容器にヒータを取り付け、このヒータからの熱により細胞の温度を一定にしている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特開２００１−２７２６０６に記載されたように対物レンズと容器との間にイマ−ジョンオイルを満たした場合、観察したい細胞が容器の底面から離れた位置にあると、細胞と容器の底面との間に培養液が存在することになる。この培養液の屈折率はほぼ水の屈折率（約１．３３）に等しいので、イマ−ジョンオイルの屈折率（約１．５２）と培養液の屈折率との差が大きくなり、収差が発生してしまい、良好な観察を行うことができない。
【０００５】
このような場合の対策としては、イマージョンオイルの代わりに水を使用することが考えられる。水と培養液の屈折率の差は小さく、その分、収差の発生を抑えることができる。しかし、水を使う場合は、長時間連続的に観察すると、水自体が蒸発してしまう可能性がある。また、上述したように、培養液を一定温度に保ちながら観察する場合においては、ヒータの熱により、より顕著に水が蒸発してしまう可能性がある。
【０００６】
本願発明は、このような事情に対してなされたものであり、その目的は、培養液の中の細胞を良好に、しかも長時間観察することが可能な培養観察方法及び、それに使用する倒立顕微鏡を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１に係る培養観察方法は、容器の中の細胞を培養しながら観察する培養観察方法において、前記容器内の細胞を観察するための対物レンズの先端部と前記容器の底面との間に二価三価の塩化鉄を含む水を満たし、該二価三価の塩化鉄を含む水を介して前記対物レンズで観察することを特徴とするものである。
【０００８】
請求項２に係る倒立顕微鏡は、容器の中の細胞を培養しながら観察する倒立顕微鏡において、前記細胞を照明する落射及び透過照明光学系と、前記容器を収納し、その内部を高湿度に維持させながら前記細胞の温度を維持するための細胞活性維持装置と、前記容器の底面とその先端部との間に満たされた二価三価の塩化鉄を含む水を介して前記容器の中の細胞を観察可能な対物レンズとを有することを特徴とするものである。
【０００９】
請求項３に係る倒立顕微鏡は、前記対物レンズの先端部に配置され、前記二価三価の塩化鉄を含む水を受けるための受け部材を具備することを特徴とする請求項２記載の倒立顕微鏡。
【００１０】
請求項４に係る倒立顕微鏡は、前記細胞活性維持装置は、前記容器を載置し、該容器の底面を露出する開口を有する載置部材と、この載置部材に接触し、該載置部材を温めるサーモプレートと、前記載置部材の周囲を囲む周壁部と、この周壁部の内側に配置し、水を溜める水槽と、この水槽に炭酸ガスを供給する供給手段と、前記載置部材と前記周壁部とに囲まれる空間を覆い、それ該空間を密閉状態にするための透明な被覆部材と、この被覆部材を温める保温手段とを具備することを特徴とするものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
（第１の実施の形態）
以下、本発明の第１の実施の形態の構成について図１から図３を用いて説明する。
【００１２】
図１は倒立顕微鏡の全体の説明をする図、図２は細胞活性維持装置を示す図、図３は対物レンズと容器との間の詳細図である。
図１及び２に示すように、第１の実施の形態に係る倒立顕微鏡１は、落射照明の光源としてのキセノンランプ２と、このキセノンランプ２の射出側に配置され、制御装置３により制御される電動シャッタ４と、この電動シャッタ４の射出側に配置され、電動シャッタ４を通過した光線の強度を弱めるための減光フィルタ５と、この減光フィルタ５の射出側に配置される視野絞り６と、この視野絞り６の射出側に配置され、光軸を９０度偏向させるためのミラーユニット７と、このミラーユニット７の射出側に設けられ、図示しないレボルバにより光軸から退避自在な対物レンズ８とを有する。
【００１３】
ミラーユニット７は、入射側（キセノンランプ側）に励起フィルタ９と、この励起フィルタ９により励起された光線を反射し、対物レンズ８からの蛍光光を透過するダイクロイックミラー１０と、このダイクロイックミラー１０を透過し不必要な光線を吸収する吸収フィルタ１１とを有する構成である。
【００１４】
また、ミラーユニット７の吸収フィルタ１１の射出側には吸収フィルタ１１を透過した光を撮像する冷却ＣＣＤカメラ１２が配置されている。
さらに、倒立顕微鏡１は、透過照明の光源としてのハロゲンランプ２０と、このハロゲンランプの射出側に、制御装置３により制御される電動シャッタ２１と、この電動シャッタ２１の射出側に配置されるコンデンサ２２とを有する。
【００１５】
また、倒立顕微鏡１は、対物レンズ８の近傍に、容器３０内の細胞の活性を維持するための細胞活性維持装置３１が備わっている。この細胞活性維持装置３１は、図２に示すように、容器３０を配置する中央部に開口３２が設けられている載置部材３３と、この載置部材３３の周囲を囲む周壁部３４と、この周壁部３４に保持されて、内部に水を溜めるためのドーナツ状の水槽３５と、この水槽３５に図示しない供給装置からの炭酸ガスを供給するための供給チューブ３６と、載置部材３３の温度を温め容器３０内を３７度前後に保つためのサーモプレート３７と、載置部材３３と周壁部３４とで内部を密閉し、図示しない電熱線を装備し内部を暖めるためのガラスからできているトップヒータ３８とを有する。炭酸ガスは、濃度が５％、流量が１５０ｍｌ／ｍｉｎの目安で供給装置から供給される。
【００１６】
さらに、対物レンズ８にはその先端部の外周を覆うリング状の対物レンズヒータ３９が装着されている。
容器３０は、図３に示すように、カバーガラス厚が０．１７ｍｍとして設計した高ＮＡの対物レンズに対応するために、その底面の中央部は、０．１７ｍｍの厚さに形成されている。
【００１７】
また、対物レンズ８の先端部と容器の底面との間には、二価三価の塩化鉄を含む水（以下、ペニウォータとする。）５１が配置されている。このペニウォータ５１は、二価三価鉄塩の結晶体を水に溶かし込んで生成されるものであり、水とほぼ同じ屈折率を有する。また、ペニウォータ５１は実験の結果、常温に２日以上放置しても蒸発せず、通常の水と比べて蒸発し難いという性質が判明された。
【００１８】
第１の実施の形態の作用について説明する。
落射照明の場合においては、キセノンランプ２から発せられた光は、ミラーユニット７で９０度に偏向し、対物レンズ８に入射する。この対物レンズ８を通過した光は、ペニウォータ５１を透過して容器３０内の細胞を照射する。照射された細胞からの光は、再度ペニウォータ５１を通過し、ミラーユニット７を通過した後、冷却ＣＣＤカメラ１２に入射する。
【００１９】
一方、落射照明の場合においては、ハロゲンランプ２０から発せられた光は、コンデンサ２２を通過し、容器３０内の細胞を照射する。細胞からの光は、ペニウォータ５１を通過し、ミラーユニット７を通過した後に、冷却ＣＣＤカメラ１２に入射する。
【００２０】
細胞活性維持装置３１では、サーモプレート３７及びトップヒータ３８からの熱は容器３０に伝導し容器３０内の細胞を約３７度に保温する。また、対物レンズヒータ３９からの熱は対物レンズ８を温める。
【００２１】
水が溜められている水槽３５には、供給チューブ３６から濃度が５％の炭酸ガスが流量１５０ｍｌ／ｍｉｎで供給され、細胞活性維持装置３１の内部を高湿度に維持している。
【００２２】
次に、第１の実施の形態の効果について説明する。
本発明の第１の実施の形態では、ペニウォータ５１を介して細胞を観察するので、容器３０の底面から離れた位置に観察したい細胞が位置する場合であっても、イマージョンオイルを使用した場合に比べて、収差の発生が抑えられるので、良好な観察を行うことができる。
【００２３】
また、ペニウォータ５１は水と比べて蒸発し難いので、水に比べて長時間連続的に観察を行うことができる。
また、ペニウォータ５１はイマージョンオイルに比べて、熱伝導が小さいので、サーモプレート３７等からの熱を対物レンズ８側に伝導し難く、効率的に細胞の保温を行うことができる。
【００２４】
さらに、本実施の形態では、炭酸ガスの供給により、細胞活性維持装置３１の内部を高湿度に維持することができる。このため、培養液のｐＨを所望の値に維持することができる。
【００２５】
また、本実施の形態では、容器３０及び対物レンズ８をサーモプレート３７及び対物レンズヒータ３９を用いているので、各部位の温度を一定にすることができる。このために、対物レンズ８等の温度変化による極微量の対物レンズ８と細胞との距離の変化によるピントずれを極力抑えることが可能である。
【００２６】
（第２の実施の形態）
次に、第２の実施の形態の構成について、図４を用いて説明する。
図４は、受け部材を示す図である。
【００２７】
第２の実施の形態は、ペニウォータ５１が対物レンズ８側に流れ出さないように改善したものであり、第１の実施の形態と異なる部分のみ説明する。
図４に示すように、受け部材６０は、全体がゴム等の弾性部材から成形されており、対物レンズ８の先端部に取り付くための円筒状の取付部６１と、この取付部６１より対物レンズ８の先端部の形状に沿って先端側に延出する延出部６２とを有している。延出部６２の先端部には、対物レンズの有効径に邪魔にならないように程度に開口６３が設けられている。また、この開口６３には、ペニウォータを受けるための壁部６４が形成されている。
【００２８】
第２の実施の形態の作用を説明する。
対物レンズ８の先端部と容器の底面との間のペニウォータ５１は壁部６４により対物レンズ８側に流れ出さず、対物レンズ８の先端部と底面との間に存在している。
【００２９】
次に第２の実施の形態の効果について説明する。
第２の実施の形態は、第１の実施の形態と同様の効果に加えて、受け部材６０の壁部６４により、ペニウォータ５１が対物レンズ８側に流れ出すのを防止している。
【００３０】
また、受け部材は、弾性部材の弾性力により対物レンズに取り付けられているので、簡単に着脱することができる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、培養観察において、長時間にわたり良好に培養観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】倒立顕微鏡の全体の説明をする図
【図２】細胞活性維持装置を示す図
【図３】対物レンズと容器との間の詳細図
【図４】受け部材を示す図
【符号の説明】
８…対物レンズ
３０…容器
３１…細胞活性維持装置
３３…載置部材
３４…周壁部
３５…水槽
３６…供給チューブ
３７…サーモプレート
３８…トップヒータ
５１…ぺ二ウォータ
６０…受け部材
６４…壁部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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