(57)【要約】　　　（修正有）【課題】優れた光学純度及び生産性を有するシアノヒドリンの工業的製造方法を提供すること。【解決手段】カルボニル化合物とシアニドドナーとから酵素反応により光学活性なシアノヒドリンを製造する際に、ヒドロキシニトリルリアーゼを含む反応溶媒に対して、上記カルボニル化合物及び／又は上記シアニドドナーを分割添加する。分割添加することにより、酵素反応に伴う発熱を抑制し、かつ基質濃度を低く抑えることができる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボニル化合物とシアニドドナーとから酵素反応により光学活性なシアノヒドリンを製造する際に、
ヒドロキシニトリルリアーゼを含む反応溶媒に対して、上記カルボニル化合物及び／又は上記シアニドドナーを分割添加することを特徴とする光学活性シアノヒドリンの製造方法。
【請求項２】
上記分割添加は、上記カルボニル化合物及び／又は上記シアニドドナーを含む溶液を滴下することで行うことを特徴とする請求項１記載の光学活性シアノヒドリンの製造方法。
【請求項３】
上記カルボニル化合物及び上記シアニドドナーのいずれか一方を含む上記反応溶媒を予め調製し、当該反応溶媒に対して他方を分割添加することを特徴とする請求項１記載の光学活性シアノヒドリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒドロキシニトリルリアーゼによる酵素反応を利用した光学活性シアノヒドリンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性シアノヒドリンは、ピレスロイド系農薬製造や医薬合成の光学活性有機合成中間体として有用である。光学活性シアノヒドリンをシアン化水素（シアニドドナー）とカルボニル化合物とから直接合成する手段の一つとして、ヒドロキシニトリルリアーゼと呼ばれる酵素を使う合成方法が種々提唱されている。
【０００３】
通常、当該酵素を使う光学活性シアノヒドリンの合成は、当該酵素と基質であるシアン化水素及びカルボニル化合物を必須要素として含む、水系、水―有機溶媒二相系、有機溶媒―微水系、有機溶媒系で実施される。本反応は、生産性を考慮した場合、有機溶媒を含む反応系で実施する方が、生産物濃度を上げられること、反応生成物の分離の点で有利である。反応に用いる有機溶媒としては、水に難溶または不溶な有機溶媒が好ましく使用されている例が多く、特にエーテル系溶媒が使う例が多く報告されている（特開昭６３−２１９３８８号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述した方法を含む従来の光学活性シアノヒドリンの製造方法においては、製造されたシアノヒドリンの光学純度が十分なものとは言えず、生産性も十分でないといった問題があった。特に、光学活性シアノヒドリンを工業的に製造する場合には、酵素反応に起因する発熱によって光学純度が低下したり、基質濃度の高すぎるために酵素寿命が短くなり、その結果、光学活性シアノヒドリンの生産性が低下してしまうという問題があった。
【０００５】
そこで、本発明は、光学活性シアノヒドリンを工業的に製造する場合に好適であり、優れた光学純度及び生産性を達成することのできる光学活性シアノヒドリンの工業的製造方法を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述した目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒドロキシニトリルリアーゼを含む反応溶媒中に基質及びシアニドドナーを分割添加することで、酵素反応に伴う発熱を抑制でき、また、基質濃度を低く抑えることができるため、酵素反応の生成物であるシアノヒドリンの光学純度低下を防止でき、また酵素寿命も長くなることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）カルボニル化合物とシアニドドナーとから酵素反応により光学活性なシアノヒドリンを製造する際に、ヒドロキシニトリルリアーゼを含む反応溶媒に対して、上記カルボニル化合物及び／又は上記シアニドドナーを分割添加することを特徴とする光学活性シアノヒドリンの製造方法。
（２）上記分割添加は、上記カルボニル化合物及び／又は上記シアニドドナーを含む溶液を滴下することで行うことを特徴とする（１）記載の光学活性シアノヒドリンの製造方法。
（３）上記カルボニル化合物及び上記シアニドドナーのいずれか一方を含む上記反応溶媒を予め調製し、当該反応溶媒に対して他方を分割添加することを特徴とする（１）記載の光学活性シアノヒドリンの製造方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る光学活性シアノヒドリンの製造方法（以下、単に「本製造方法」と呼ぶ）は、ヒドロキシニトリルリアーゼを含む反応溶媒中で基質であるカルボニル化合物とシアニドドナーとから光学活性シアノヒドリンを製造する方法である。すなわち、本製造方法は、ヒドロキシニトリルリアーゼとカルボニル化合物とシアニドドナーとを含む反応溶液で酵素反応が進行し、光学活性シアノヒドリンを製造するものである。特に、本製造方法は、光学活性シアノヒドリンを工業的に製造する際に好適である。ここで、「工業的に製造する」とは、実験室と比較して大容量の反応系で製造することを意味し、例えば、数十〜数十万リットルの反応系で製造することを意味する。
【０００９】
特に、本製造方法では、ヒドロキシニトリルリアーゼを含む反応溶媒に対して、カルボニル化合物及び／又はシアニドドナーを分割添加することによって、上記反応溶液を調製する。詳細には、シアニドドナーを含まず、ヒドロキシニトリルリアーゼ及びカルボニル化合物を含む反応溶媒に対しては、シアニドドナーを分割添加することによって反応溶液を調製する。また、カルボニル化合物を含まず、ヒドロキシニトリルリアーゼ及びシアニドドナーを含む反応溶媒に対しては、カルボニル化合物を分割添加することによって反応溶液を調製する。さらに、カルボニル化合物及び／又はシアニドドナーいずれも含まず、ヒドロキシニトリルリアーゼを含む反応溶媒に対しては、カルボニル化合物及びシアニドドナーを分割添加することによって反応溶液を調製する。
【００１０】
本製造方法において、分割添加とは、反応溶媒に対してカルボニル化合物及び／又はシアニドドナーを添加するに際して、当該カルボニル化合物及び／又はシアニドドナーを一括して添加せず、複数回に分けて添加することを意味する。すなわち、分割添加によれば、最終的に添加するカルボニル化合物及び／又はシアニドドナー全量が同時に酵素反応に供されるのではなく、最終的に添加するカルボニル化合物及び／又はシアニドドナーの一部が順次酵素反応に供されることになる。
【００１１】
分割添加は、特に限定されないが、例えば、反応溶媒に対して、カルボニル化合物及び／又はシアニドドナーを含む溶液を複数回に分けて添加する方法や、反応溶媒に対して、カルボニル化合物及び／又はシアニドドナーを含む溶液を滴下する方法が挙げられる。
【００１２】
分割添加によれば、一括添加する場合と比較して酵素反応に伴う発熱を低く抑えることができ、反応系の急激な温度上昇を抑えることができる。なお、反応系に冷水等の冷媒を循環させることで、反応系を冷却することもできる。例えば、数百リットルの反応系で分割添加を行うことによって、反応溶媒の温度を０〜４０℃の範囲に維持することができる。
【００１３】
また、本製造方法によれば、一括添加する場合と比較して、分割添加することで基質濃度を低く抑えることができる。
【００１４】
本製造方法によれば、分割添加によって反応系の温度を０〜４０℃、より好ましくは４〜３０℃に維持することができ、また、基質濃度を低く抑えることができるため、純度の高い光学活性シアノヒドリンを製造することができる。また、本製造方法によれば、分割添加によって基質濃度を低く抑えることができるため、ヒドロキシニトリルリアーゼの酵素寿命を延ばすことができる。
【００１５】
ここで、光学活性シアノヒドリンとは、一方の鏡像異性体（例えばＲ体）が他方の鏡像異性体（例えばＳ体）より多く含まれているシアノヒドリンのこと、又は、いずれか一方の鏡像異性体のみからなるシアノヒドリンのことをいう。なお、シアノヒドリンがいずれか一方の鏡像異性体のみからなる場合、光学純度１００％という。
【００１６】
ヒドロキシニトリルリアーゼとは、シアニドドナーの存在下、カルボニル化合物からシアノヒドリンを合成する活性を有するものを意味する。Ｒ体のシアノヒドリンを合成するヒドロキシニトリルリアーゼ（（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ　ａｍｙｇｄａｌｕｓ）などのバラ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ及びアマ科植物由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを例示できる。Ｓ体のシアノヒドリンを合成するヒドロキシニトリルリアーゼ（（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ）としては、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ）などのイネ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）などのトウダイグサ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、キシメニア（Ｘｉｍｅｎｉａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ）などのボロボロノキ科植物由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを例示できる。
【００１７】
前記ヒドロキシニトリルリアーゼは、生物組織からの抽出によって調製することができるが、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を組み込んで作製した遺伝子組換え生物によっても生産することもできる。また、天然型のヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を改変し、酵素機能を改変したヒドロキシニトリルリアーゼについても、上記の活性を有するものであれば本発明に用いることができる。抽出は常法によって実施すればよく、調製物にはヒドロキシニトリルリアーゼ以外の成分が含まれていても反応に悪影響を与えなければ特に精製する必要はない。
【００１８】
更に、前記酵素は、粉末状酵素、緩衝液等に溶解した酵素液、適当な担体に固定化してなる固定化酵素などの状態のものを使用することができる。反応終了後の反応液からの酵素の回収及び再利用が容易となることから、固定化酵素を使用するのが好ましい。
【００１９】
カルボニル化合物とは、アルデヒド又はケトンをいい、具体的には、次式（Ｉ）：
Ｒ１−ＣＯ−Ｒ２　　（Ｉ）
（式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子又は炭素数２２以下の１価の炭化水素基を表し、前記炭化水素基中、−ＣＨ２−並びに−ＣＨ３のＣＨ２はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく、＝ＣＨ２は＝Ｏ又は＝Ｓで置き換えられていてもよく、また−ＣＨ２−のＣ−Ｈ、−ＣＨ３のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈ並びに＝ＣＨ２のＣ−Ｈは、Ｎ又はＣ−ハロゲンで置き換えられていてもよく、また、Ｒ１及びＲ２は、共同して２価の基を表してもよい。）
で示される。
【００２０】
前記式（Ｉ）において、炭素数２２以下の１価の炭化水素基とは、直鎖状又は分岐状の鎖状炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある単環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある多環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のあるスピロ炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある環集合構造の炭化水素基、あるいは、前記の環式炭化水素基が置換した鎖状炭化水素基のいずれをも含む。また、飽和な炭化水素基並びに不飽和な炭化水素基のいずれをも含むが、不飽和な炭化水素基において、Ｃ＝Ｃ＝Ｃのアレン構造を含む基は除く。
【００２１】
なお、以下においては、側鎖のない芳香族基、側鎖のある芳香族基、並びに、フェニルフェニル基又は側鎖のあるフェニルフェニル基などを併せて、アリール基といい、このアリール基で置換された直鎖状又は分岐状のアルキル基をアラルキル基という。他の環式炭化水素基に関しても、特に明記しない場合、環上に側鎖のないものとあるものを併せて指す場合には、単にシクロアルキル基等の名称を用いる。鎖状炭化水素基についても、直鎖状のものと分岐状のものを併せて指す場合には、単にアルキル基等の名称を用いる。
【００２２】
前記炭化水素基中、−ＣＨ２−がカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられると、それぞれケトン、スルホン、エーテル又はチオエーテルの構造が導入され、−ＣＨ３の−ＣＨ２−がカルボニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換わると、それぞれホルミル基（アルデヒド）、水酸基又はメルカプト基に変わり、あるいは、末端の＝ＣＨ２が＝Ｏ又は＝Ｓに置き換わると、ケトン、チオケトンの構造が導入されることを意味し、また、−ＣＨ２−のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ−となり、＞ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＞Ｎ−となり、＝ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＝Ｎ−となり、末端の−ＣＨ３のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ２が導入され、＝ＣＨ２のＣ−ＨがＮに変わると、＝ＮＨとなる。また、−ＣＨ３、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、≡ＣＨ又は＞ＣＨ−のＣ−ＨがＣ−ハロゲンで置き換えられると、当該炭素上へハロゲン原子を置換することになる。なお、炭素鎖中における−Ｏ−、−Ｓ−、Ｎへの置き換えは、当該炭化水素基に対する、それぞれオキサ置換、チア置換、アザ置換に当たり、例えば、炭化水素環の環の骨格炭素で起こると、炭化水素環のそれぞれ含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環への変換となる。該炭化水素基中、ＣＨ２並びにＣ−Ｈにおける置き換えは、それぞれ独立に行われてよく、加えて、前記の置き換えを行った後、なお当該炭素上にＣＨ２又はＣ−Ｈが残存する際には、更に置き換えがなされてもよい。更には、前記の置き換えにより、−ＣＨ２−ＣＨ３の−ＣＯ−Ｏ−Ｈ；カルボン酸構造への変換などもなされる。
【００２３】
本明細書において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を指すが、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましい。
【００２４】
従って、前記炭化水素基としては、鎖状炭化水素基並びに環式炭化水素基など環構造を有する炭化水素基のいずれをも選択でき、例えば、飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルキル基、不飽和鎖状炭化水素基である直鎖状又は分岐状のアルケニル基、直鎖状又は分岐状のアルキニル基、直鎖状又は分岐状のアルカジエニル基など、飽和な環式炭化水素基であるシクロアルキル基、不飽和な環式炭化水素基であるシクロアルケニル基、シクロアルキニル基、シクロアルカジエニル基など、芳香族炭化水素基であるアリール基、アラルキル基、アリールアルケニル基などが挙げられる。
【００２５】
更に詳しくいえば、直鎖状又は分岐状のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、ヘキシル基、１−メチルペンチル基、ヘプチル基、１−メチルヘキシル基、１−エチルペンチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、２−メチルプロピル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、メチルヘキシル基、メチルヘプチル基、メチルオクチル基、メチルノニル基、１，１−ジメチルエチル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，６−ジメチルヘプチル基、３，７−ジメチルオクチル基、２−エチルヘキシル基など、シクロアルキルアルキル基としては、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基など、シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、メチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基など、ビシクロアルキル基としては、ノルボルニル基、ビシクロ［２．２．２］オクチル基、アダマンチル基などが挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、クロチル基（２−ブテニル基）、イソプロペニル基（１−メチルビニル基）など、シクロアルケニル基又はシクロアルカジエニル基としては、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサンジエニル基などが挙げられる。直鎖状又は分岐状のアルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。アリール基としては、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、２−フェニルフェニル基、３−フェニルフェニル基、４−フェニルフェニル基、９−アントリル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、トリメチルフェニル基、エチルフェニル基、メチルエチルフェニル基、ジエチルフェニル基、プロピルフェニル基、ブチルフェニル基などが挙げられる。アラルキル基としては、例えばベンジル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、フェネチル基（２−フェニルエチル基）、１−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルベンジル基、ジメチルフェネチル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、ジエチルベンジル基などが挙げられる。アリールアルケニル基としては、例えばスチリル基、メチルスチリル基、エチルスチリル基、ジメチルスチリル基、３−フェニル−２−プロペニル基などが挙げられる。
【００２６】
前記炭化水素基中のＣＨ２がカルボニル基、スルホニル基、Ｏ又はＳで、又はＣ−ＨがＮ又はＣ−ハロゲンで置き換えられた基としては、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、スルホン、エーテル、チオエーテル、アミン、アルコール、チオール、ハロゲン、複素環（例えば、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環）などの構造を一つ以上含む基が挙げられる。なお、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環とは、環式炭化水素基の環骨格の炭素がそれぞれ酸素、硫黄、窒素で置き換わるものを意味し、更には、これらヘテロ原子置換が二種以上ある複素環であってもよい。前記の置換を有する炭化水素基としては、例えば、ケトン構造のアセチルメチル基、アセチルフェニル基；スルホン構造のメタンスルホニルメチル基；エーテル構造のメトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、メトキシプロピル基、ブトキシエチル基、エトキシエトキシエチル基、メトキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、フェノキシメチル基；チオエーテル構造のメチルチオメチル基、メチルチオフェニル基；アミン構造のアミノメチル基、２−アミノエチル基、２−アミノプロピル基、３−アミノプロピル基、２，３−ジアミノプロピル基、２−アミノブチル基、３−アミノブチル基、４−アミノブチル基、２，３−ジアミノブチル基、２，４−ジアミノブチル基、３，４−ジアミノブチル基、２，３，４−トリアミノブチル基、メチルアミノメチル基、ジメチルアミノメチル基、メチルアミノエチル基、プロピルアミノメチル基、シクロペンチルアミノメチル基、アミノフェニル基、ジアミノフェニル基、アミノメチルフェニル基；含酸素複素環のテトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、モルホリルエチル基；含酸素複素芳香環のフリル基、フルフリル基、ベンゾフリル基、ベンゾフルフリル基；含硫黄複素芳香環のチエニル基；含窒素複素芳香環のピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、テトラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、ピリジルメチル基；アルコール構造の２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、３−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシブチル基、２，３−ジヒドロキシブチル基、２，４−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジヒドロキシブチル基、２，３，４−トリヒドロキシブチル基、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、ヒドロキシメチルフェニル基、ヒドロキシエチルフェニル基；チオール構造の２−メルカプトエチル基、２−メルカプトプロピル基、３−メルカプトプロピル基、２，３−ジメルカプトプロピル基、２−メルカプトブチル基、３−メルカプトブチル基、４−メルカプトブチル基、メルカプトフェニル基；ハロゲン化炭化水素基である２−クロロエチル基、２−クロロプロピル基、３−クロロプロピル基、２−クロロブチル基、３−クロロブチル基、４−クロロブチル基、フルオロフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、ジフルオロフェニル基、ジクロロフェニル基、ジブロモフェニル基、クロロフルオロフェニル基、トリフルオロフェニル基、トリクロロフェニル基、フルオロメチルフェニル基、トリフルオロメチルフェニル基；アミン構造とアルコール構造を有する２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル基、３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基、２−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、２，４−ジアミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２，４−ジヒドロキシブチル基、２，３−ジアミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２，３−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジアミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−３，４−ジヒドロキシブチル基、アミノヒドロキシフェニル基；ハロゲンと水酸基で置換された炭化水素基であるフルオロヒドロキシフェニル基、クロロヒドロキシフェニル基；カルボン構造のカルボキシフェニル基などが挙げられる。
【００２７】
Ｒ１及びＲ２で表される非対称の２価の基としては、特に制限はなく、例えば、ノルボルナン−２−イリデン、２−ノルボルネン−５−イリデンが挙げられる。
【００２８】
前記式（Ｉ）で示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。
【００２９】
一方、シアニドドナーとは、反応系へ添加することによって、シアニド、すなわちシアン化物イオン（ＣＮ−）を生じる物質を意味し、例えば、シアン化水素、青酸（シアン化水素酸）、シアン化ナトリウムやシアン化カリウムなどのシアン化水素の塩、又は、アセトンシアノヒドリン等のシアノヒドリン類が挙げられる。特に回収リサイクルが容易な青酸（シアン化水素酸）を用いるのが好ましい。
【００３０】
反応溶媒は、上述したヒドロキシニトリルリアーゼと、ヒドロキシニトリルリアーゼを用いた酵素反応に通常用いられる溶媒とを含むものである。溶媒としては、反応原料の濃度を高め、生産性を高めるために、水と実質的に混和しない有機溶媒を用いることが好ましい。ここで、「水と実質的に混和しない有機溶媒」とは、水に任意の割合で溶解する溶媒を除く有機溶媒を意味する。有機溶媒としては、水と実質的に混和せず、基質及び生成物を充分に溶解し、酵素反応に悪影響を与えないものであれば特に制限なく用いることができる。このような有機溶媒は、原料のアルデヒド又はケトンの物性、生成物であるシアノヒドリンの物性に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
水と実質的に混和しない有機溶媒としては、具体的には、ハロゲン化されていてもよい炭化水素系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素）、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルムなど；ハロゲン化されていてもよいアルコール系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族アルコール、アラルキルアルコール）、例えば、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ−アミルアルコールなど；ハロゲン化されていてもよいエーテル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エーテル、芳香族エーテル）、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど；ハロゲン化されていてもよいエステル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エステル、芳香族エステル）、例えば、ギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等が挙げられ、これらを単独で用いてもまた２種以上を混合して用いてもよい。特に、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチルを用いるのが好ましい。
【００３２】
前記有機溶媒は、水又は水性緩衝液で飽和されているのが好ましい。ここで水性緩衝液としては、特に制限はないが、酵素活性の最適ｐＨ（ｐＨ４〜７）の付近において緩衝能を発揮する緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸などの塩等によって構成される緩衝液等が好ましく用いられる。
【００３３】
なお、反応溶媒に含まれる溶媒としては、水、或いは水と混和する有機溶媒であっても良い。また、反応溶媒には、カルボニル化合物又はシアニドドナーのいずれか一方を予め含んでいてもよい。この場合、本製造方法においては、反応溶媒に対して、カルボニル化合物及びシアニドドナーのうち反応溶媒に含まれていない他方を分割添加する。
【００３４】
本製造方法において、シアノヒドリンを合成する酵素反応の形態については制限しない。即ち、酵素反応が進行する反応溶液は、水・有機溶媒混合系、有機溶媒系、有機溶媒水二相系、固定化酵素を使う反応系などのいずれであってもよい。
【００３５】
本製造方法では、反応溶媒に対して、カルボニル化合物及び／又はシアニドドナーを分割添加することによって、高い光学純度でシアノヒドリンを製造することができる。したがって、本製造方法によれば、光学純度の高いシアノヒドリンの生産性を大幅に向上させることができる。
【００３６】
また、本製造方法においては、分割添加に際して反応溶媒の温度を１０〜３０℃の範囲に制御することによって、反応溶液の温度を、ヒドロキシニトリルリアーゼの活性を十分に発揮できる範囲に維持することができる。
【００３７】
なお、本製造方法において、ヒドロキシニトリルリアーゼ、カルボニル化合物及びシアニドドナーの使用量、反応温度は、用いる基質に応じて適宜決定される。通常、ヒドロキシニトリルリアーゼの使用量は基質であるカルボニル化合物５０ｍｍｏｌに対して２５０〜１００，０００単位、好ましくは５００〜５０，０００単位である。カルボニル化合物の濃度は通常０．１〜１０ｍｏｌ／Ｌの範囲に設定し、シアニドドナーは用いるカルボニル化合物に対して０．８〜５倍モル、好ましくは１〜４倍モル、より好ましくは１．１〜３倍モルの濃度とする。酵素反応はカルボニル濃度によって酵素活性及び反応速度が変化するので、用いるカルボニル化合物の種類に応じてその濃度を適宜決定する。反応時間は、カルボニル化合物の転換率が８０％以上、好ましくは９０％以上に達するまでの時間が適当であるが、これに限定されない。
【００３８】
本製造方法をいわゆる回分式で行う場合には、分割添加の最中及び／又は分割添加の終了後、撹拌などにより酵素が反応系内に分散するようにする。本製造方法を、カラムなどに充填した固定化酵素を用いて行う場合には、カルボニル化合物及び／又はシアニドドナーを含む溶液を、カラムに分割添加し、流出液を採取することで実施できる。回分式の場合には、反応が完結した時点で混合を止め、シアノヒドリンが溶解している有機相を常法により取り出すことで当該シアノヒドリンを回収できる。なお、いずれの方式であってもヒドロキシニトリルリアーゼは、再使用することができる。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００４０】
（調製例１）（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
（１）アーモンド種子粉砕物１００ｇにアセトン２００ｍｌを混合し、２時間攪拌した後、濾過し、固形分を回収した。この固形分を乾燥したものに水６００ｇを加え、アンモニア水でｐＨ７．５に調整した後、攪拌混合を一晩行った。次いで、このスラリーを遠心分離し、上澄液を回収した。この上澄液のｐＨを５．５に調整した後、遠心分離し、不溶分を除去した液を回収した。
（２）前記（１）で調製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液の活性を測定した。酵素活性はＤＬ−マンデロニトリルを基質として基質が酵素によって分解されベンズアルデヒドが生成される速度を２４９．６ｎｍの吸光度変化を測定することによって測定し、活性を算出した。ここで、１単位（Ｕ；ｕｎｉｔ）は１分間にベンズアルデヒド１μｍｏｌを生成する活性と定義した。この方法で前記（１）で調製した酵素液の酵素活性を測定したところ、６０．５７Ｕ／ｍｌの活性で酵素を２．５万単位回収することができたことがわかった。
【００４１】
（調製例２）固定化（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの調製
調製例１の方法で調製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ酵素液を硫安沈澱処理し、酵素を濃縮し、１０００Ｕ／ｍｌの酵素液を調製した。この酵素液１ｍｌに対して１ｇの固定化担体（多孔性シリカゲル、ｍｉｃｒｏｂｅａｄ　ｓｉｌｉｃａｇｅｌ　３００Ａ、富士シリシア化学（Ｆｕｊｉ　Ｓｉｌｙｓｉａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌｔｄ．）製）を混合した。これをこのまま合成反応に用いることにした。
【００４２】
（実施例１）
ｔ−ブチルメチルエーテル６２３ｇと青酸３５ｇを混合したものに、０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を添加し、撹拌混合した後、静置してから有機相を分離した。次いで、この有機相に調製例２で調製した固定化酵素（１７万単位）を添加し、次いで、この有機相を室温で撹拌しながら、２−クロロベンズアルデヒド１４１ｇを一定流量で１時間かけて滴下した。すなわち、本例では、ヒドロキシニトリルリアーゼ及びシアニドドナーを含む反応溶媒に対して、カルボニル化合物を滴下により分割添加した。このとき、反応溶媒である有機相の温度を３０℃以下に保持した。本例では、以上のようにして（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの合成を行った。３時間反応させた後、反応液を回収し、ＨＰＬＣによりアルデヒドの転換率及び（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの光学純度を測定した。
次いで、反応終了後の固定化酵素を回収し、回収した固定化酵素を用い、上述の方法と同じ条件で繰り返し反応を行った。
【００４３】
（比較例１）
比較例１では、２−クロロベンズアルデヒド１４１ｇを一括添加する以外は、実施例１と同様にして、（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの合成反応を繰り返し行った。なお、比較例１では、有機相の温度が最大３８℃まで上昇していた。
【００４４】
（結果）
実施例１及び比較例１の結果として、酵素反応の繰り返し数（バッチ数）における転化率及び光学純度を測定した結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2004057005.tif 000002
【００４６】
表１から判るように、２−クロロベンズアルデヒドを一括添加した比較例１と比較して、２−クロロベンズアルデヒドを分割添加した実施例１では、光学純度が３％以上も良い値を示した。このことから、反応溶媒に対して、カルボニル化合物及び／又はシアニドドナーを分割添加することによって、光学純度の高いシアノヒドリンを製造できることが実証された。
【００４７】
また、比較例１ではバッチ数が増加するに従って転化率が急激に低下していた。これに対して、実施例１では、バッチ数が増加しても転化率が急激に低下することはなかった。このことから、反応溶媒に対して、カルボニル化合物及び／又はシアニドドナーを分割添加することによって、反応溶媒に含まれるヒドロキシニトリルリアーゼの酵素活性を長寿命化できることが実証された。
【００４８】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明によれば、優れた光学純度でシアノヒドリンを製造できるといった優れた光学活性シアノヒドリンの製造方法を提供することができる。本発明に係る光学活性シアノヒドリンの製造方法によれば、光学純度の高いシアノヒドリンの製造に際して非常に高い生産性を実現することができる。さらに、本発明に係る光学活性シアノヒドリンの製造方法によれば、ヒドロキシニトリルリアーゼの酵素活性を長期に亘って維持できる。