(57)【要約】【課題】短時間に多量の細菌を識別、同定できる方法を提供する。【解決手段】以下の工程を含む細菌の識別方法。（１）ポリンを認識するペプチドを、識別しようとする細菌と接触させる工程（２）ポリンを認識するペプチドが、識別しようとする細菌と結合するかどうかを確認する工程【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む細菌の識別方法。
（１）ポリンを認識するペプチドを、識別しようとする細菌と接触させる工程
（２）ポリンを認識するペプチドが、識別しようとする細菌と結合するかどうかを確認する工程
【請求項２】
ポリンを認識するペプチドが、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドである請求項１記載の細菌の識別方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつポリンを認識するペプチド
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチド。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつポリンを認識するペプチド
【請求項４】
請求項３記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌の識別方法、並びにその方法に用いられるペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
大腸菌等細菌の識別は、診断、および環境保全、衛生化学にとって非常に重要である。従来取られていた手法は培養を伴うものや、Ｈ抗原等の鞭毛を抗原に用い、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用いて染色する方法である。菌の同定に関しては、病原菌の汚染感染等、緊急を要するものも多く、培養を伴う方法はその煩雑さと培養に用する時間が問題となっていた。また、鞭毛を抗原とした抗体を用いて染色する方法は、自然界に存在するものの多くが鞭毛の脱落したものであることが多いこと等が問題である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、短時間に多量の菌体を識別、同定できる方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、抗原として従来用いられてきた鞭毛のＨ抗原の代わりに細胞の外膜蛋白であるポリンを用いること、及び抗体の代わりにランダムペプチドライブラリーから選択される親和性ペプチドを用いることにより、短時間で多量の細菌の識別及び同定が可能であることを見出した。ポリンは細胞の外膜に存在する栄養素の透過チャンネルであり、Ｈ抗原等と同様に多くの抗原型が存在することが知られている（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　（２０００），　２８（３），　１５７−１６７，　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９９９），　２７４（２），　２８９−２９５）。また、抗体ではなく、親和性ペプチドを用いることにより、多様な抗原に対応することが可能になる。
【０００５】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の工程を含む細菌の識別方法である。
（１）ポリンを認識するペプチドを、識別しようとする細菌と接触させる工程
（２）ポリンを認識するペプチドが、識別しようとする細菌と結合するかどうかを確認する工程
【０００７】
また、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドである。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつポリンを認識するペプチド
更に、本発明は、上記のペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明の識別方法は、以下の（１）及び（２）の工程を含む。
（１）ポリンを認識するペプチドを、識別しようとする細菌と接触させる工程
（２）ポリンを認識するペプチドが、識別しようとする細菌と結合するかどうかを確認する工程
【００１０】
識別しようとする細菌はどのようなものでもよく、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ネズミチフス菌）などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００１１】
ポリンを認識するペプチドは、ポリンを認識できる限り特に限定されない。このようなペプチドは、実施例で示したように、ポリンとの結合性を指標としてランダムペプチドライブラリーから選択してくることにより得られる。この際、使用するポリンは、識別しようとする細菌と同じ種に由来するものが好ましい。ポリンを認識するペプチドとしては、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すペプチドを例示することができる。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６記載のアミノ酸配列により表されるペプチド
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、又は配列番号１６記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつポリンを認識するペプチド
（ｂ）のペプチドにおける欠失等されたアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常は７個以下であり、好ましくは５個以下であり、更に好ましくは２個以下である。
【００１２】
細菌とペプチドを接触させる方法は、両者の結合を確認できる方法であれば特に限定されない。
【００１３】
細菌とペプチドとの結合を確認する方法は、抗体様作用を持つペプチドとその抗原との結合確認に常用される方法を適用でき、ラテックス凝集法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などを例示できる。
【００１４】
本発明の識別法により細菌とペプチドとの結合が確認された場合、その細菌は、ペプチドを選択する際に使用したポリンの元となる細菌と同じ抗原型であると識別できる。一方、細菌とペプチドとの結合が確認されなかった場合、識別対象とした細菌は、ポリンの元となる細菌と異なる抗原型であると識別できる。
【００１５】
【実施例】
〔実施例１〕　ポリンの調製
Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ　Ｖ−１１５５株（海洋生物より単離）　１．６５ｇに２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、ＤＮａｓｅ（２０μｇ／μｌ）、ＲＮａｓｅ（１０μｇ／μｌ）を添加し、３７℃で１時間処理した。その後フレンチプレスで１５００ｋｇ／ｃｍ２の圧力をかけ、細胞をホモジナイズした。リゾチーム（１μｇ／ｍｌ）を加え、２０℃で１時間、０℃で１時間放置した。１７４００ｇで３０分遠心分離した後、上清をとり、１７７０００ｇで再び３０分遠心分離した。沈殿を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ　８．０）で１回洗浄した後、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液に懸濁し、溶解させた。さらに１７７０００ｇで１時間遠心分離した後、上清を、２０％グリセロールを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に透析し、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分離後、ポリン画分を切りだし、抽出した。
【００１６】
〔実施例２〕　ポリン認識ペプチドを含むクローンの選択
精製したポリンをポリスチレンのカラムに固相化し、次いで、２％カゼイン溶液によりポリンの付着していない部分をブロッキングした。ランダムペプチドライブラリーを加え、１〜数時間反応させた。ランダムペプチドライブラリーは、ＮＥＢ社の＃８１２０Ｓ　Ｐｈ．Ｄ．　−Ｃ７ＣＴＭ　Ｋｉｔを用いた。このライブラリーでは、９アミノ酸残基からなる約１０１０種類のペプチドがファージのコートタンパク質ＰＩＩＩと融合した状態で提示される。
【００１７】
反応終了後、０．０５〜０．５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（以下、「Ｔｗｅｅｎ　２０」という）含有ＰＢＳで１０〜数十回洗浄し、その後、５％カゼイン溶液を加え１〜数時間静置した。再びＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄したのち、トリエチルアミン（１００ｍＭ）を加え、１０分間、ゆっくりと室温にて揺すった後、半量の１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ　７．４）を加えヴォルッテクスし、得られた画分を溶出画分とした。
【００１８】
溶出画分をＥ．ｃｏｌｉ　（ＥＲ２５３７）に感染させ、ＩＰＴＧ−Ｘ　Ｇａｌ　プレート上に生育させた。そこから１００クローンを拾い培養した後、精製ポリン固相化プレートを用いてＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡは、以下のように行った。まず、精製ポリン（１０μｇ／ｍｌ，　１００μｌ）をプレートに固定し、これにペプチド提示ファージ溶液（１００μｌ）を加え、室温で２時間静置した。次に、プレートを洗浄し、未結合のファージを取り除いた後、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体（ファルマシア社製抗Ｍ１３ファージ抗体、２０００倍希釈）１００μｌを加え、室温で２時間静置した。プレートを洗浄後、ＡＢＴＳ基質溶液（フナコシ社製）を加え、発色させた。ＥＬＩＳＡの結果、ポリンと強く反応するクローン（♯３〜♯１１）が幾つかみつかった。これらのクローンを含む溶液の吸光度、及びバックグラウンド（ポリンをプレートに固定せず、他は同様の操作を行った。）の吸光度を図１に示す。
【００１９】
〔実施例３〕　特異性の確認
実施例２で選択したクローンのポリンに対する特異性を更に詳細に検討するため、ウエスタンブロットを行った。
【００２０】
陽性クローン（♯３）を培養し、その培養液をＰＥＧ／ＮａＣｌで濃縮した。この濃縮培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。２％ゼラチン含有ＰＢＳ溶液に浸漬し、ブロッキングを行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄した後、精製ポリンを溶液に浸漬した。１時間室温にて静置した後、再び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄した。抗ポリン抗血清を１０００倍希釈したものに再び１時間浸漬した。１時間静置したあと、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄し、西洋わさびパーオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（カッペル社製）を２０００倍希釈した溶液１ｍｌに浸漬し、室温にて１時間静置した。再度、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄した後、ＥＣＬ（化学発光基質）を加え反応させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に、ウエスタンブロットの結果を図３に示す。図２及び図３中の矢印により示されるバンドが、提示ペプチドを含むＰＩＩＩのバンドである。図３に示すように、クローン♯３に含まれるペプチドは、ポリンと特異的に結合する。
【００２１】
〔実施例４〕　ペプチドのアミノ酸配列の解析
実施例２でポリンに対する反応性が確認されたクローン（♯３〜♯６、♯８〜♯１１）の培養上清中に含まれるＤＮＡを、キアゲン社のＱＩＡｐｒｅｐ　Ｍ１３システムにより精製した。得られたＤＮＡをエタノール沈殿し、配列解析の鋳型とした。ＡＢＩ社製３７００シークエンサーで配列を解析し、前記クローンが提示していたペプチドのアミノ酸配列を決定した。クローン♯３、♯４、♯５、♯６、♯８、♯９、♯１０、♯１１が提示していたペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６に示す。また、これらのペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ１、３、５、７、９、１１、１３、１５に示す。
【００２２】
【発明の効果】
本発明の細菌の識別方法は、短時間に多量の菌体を識別することが可能であり、疾患の診断などに有用である。
【００２３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のペプチドとポリンとの反応性を示す図である。
【図２】陽性クローンの培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示す図である。
【図３】陽性クローンが提示するペプチドのポリンとの反応性を調べるためのウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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