(57)【要約】      （修正有）【課題】分析対象物に関して全血サンプルを分析する方法であって、全血サンプルからの赤血球の分離を要しない方法ならびに当該方法で有用な試薬キット及び用品を提供する。【解決手段】全血サンプル中の分析対象物の存在及び／又は量を測定する方法は、サンプルを非溶血性高張性塩組成物で処理して、赤血球のサイズを減らすことによってヘマトクリットを減らすステップを含む。光学検出系では、より小さい赤血球がより大きな散乱を生じさせ、それが、より正確な修正を二重波長検出系に加えることを可能にする。光学検出系だけでなく電気化学検出系においても、より小さい赤血球は、サンプル中の分析対象物及び試薬の拡散に対して障害となりにくく、その反応を容易にする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプル中の分析対象物の存在及び／又は量を測定する方法であって、
（ａ）分析対象物の定性又は定量のための血液サンプルを用意するステップと、
（ｂ）サンプルを非溶血性高張性塩組成物で処理してサンプルのヘマトクリットを調節するステップと、
（ｃ）サンプル中の分析対象物の存在及び／又は量を測定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記分析対象物が、グルコース、コレステロール、トリグリセリド、エタノール、乳酸、β−ヒドロキシブチレート、ケトン体及びフルクトサミンからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
サンプル中の分析対象物の存在及び／又は量を光学検出法によって測定する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記光学検出法が、反射率、吸光度及び透過率からなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
読みが分析対象物及びヘマトクリットの関数である波長で第一の光学計測を実施し、読みが実質的に分析対象物の関数ではない波長で第二の光学計測を実施し、第一の計測の読みを第二の計測の読みにしたがって修正する、請求項３記載の方法。
【請求項６】
サンプル中の分析対象物の存在及び／又は量を電気化学的方法によって測定する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記電気化学的方法が、電流滴定法及び電量分析法からなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記高張性組成物が、１種以上の有機塩又は１種以上の無機塩もしくはそれらの組み合わせを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法で使用するための試験用品であって、前記血液サンプルを受けるように適合されており、前記非溶血性高張性塩組成物を含む試験用品。
【請求項１０】
前記試験用品が試験片である、請求項９記載の試験用品。
【請求項１１】
前記試験片が、含浸、被覆、被着及びプリントからなる群より選択される方法により、前記非溶血性高張性塩で処理されている、請求項１０記載の試験用品。
【請求項１２】
前記試験用品がマイクロ流体装置である、請求項９記載の試験用品。
【請求項１３】
前記マイクロ流体装置が、前記高張性塩組成物が被着されているチャンバ又はウェルを含む、請求項１２記載の試験用品。
【請求項１４】
前記非溶血性高張性塩組成物がマイクロチャネルを介して前記サンプルに運ばれる、請求項１２記載の試験用品。
【請求項１５】
請求項９記載の試験用品を含む試験キット。
【請求項１６】
請求項１０記載の試験用品を含む試験キット。
【請求項１７】
請求項１２記載の試験用品を含む試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液サンプル中の分析対象物の存在及び／又は量を、計測に対するヘマトクリットの影響を減らすことによって改善された正確な及び精密な計測方法に関する。本発明はさらに、当該方法を実施するのに有用な試験用品及び当該試験用品を含む試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
全血中の化学成分及び生化学成分を定量することが医学にとってますます重要になってきた。このような能力は、危険物質、中毒性物質及び治療薬に対する暴露を試験する際ならびに診断において重要である。一部の用途では、素人が実験室環境の外で試験を実施することができ、迅速で正確な結果を得ることが重要である。たとえば、糖尿病患者は、食事及び投薬を節制するため、日に数回、グルコースに関して自らの血液サンプルを試験しなければならない。試験結果は、速やかに利用可能であり、かつ正確でなければならない。血漿又は全血中のグルコースの検査には、比色検出系又は電気化学検出系のいずれかを使用する酸化又は還元化学作用を利用することができる。対象となる血液中の他の分析対象物には、コレステロール、トリグリセリド、エタノール、乳酸、β−ヒドロキシブチレート、ケトン体及びフルクトサミンがある。
【０００３】
血液中のグルコース及び他の分析対象物の測定のための試験キットが当該技術で周知である。このような試験キットは通常、グルコースの存在で反応すると、電気化学的又は光学的方法もしくはそれらの組み合わせによって計測することができる用量依存性の応答を生じさせる１種以上の薬品が含浸、被覆、被着又はプリントされている試験片又マイクロ流体装置のような試験用品を含む。光学的計測は、透過率法、吸光度法及び反射率法を含むことができる。電気化学的計測は、電流滴定法又は電量分析法を含むことができる。
【０００４】
診断試験に使用される全血サンプル間のヘマトクリットの偏差が分析対象物の正確な計測を妨げるおそれがあることは周知である。全血ヘマトクリット（「ｈｃｔ」と省略する）は、全血量のうち赤血球によって占有される割合の測度である。これはまた、赤血球沈層容積（換言すると、血漿に対する赤血球の割合）とも呼ばれる。ヘマトクリット偏差によって生じる干渉は、少なくとも三つの要因から生じることができる。すなわち、１）光の反射、吸収又は散乱による、分析対象物計測に使用される光信号の検出への干渉、２）全血サンプル内での分析対象物の拡散を妨害することによる化学反応速度への干渉、及び３）試験片又は他の試験用品上の乾燥試薬の十分な再水和のためにサンプル中で利用可能な流体の量を減らすことによる干渉である。このように、従来技術の一部の試験キットは、ユーザがサンプルを希釈することを要するか、サンプルを試験装置に塗布する前に赤血球をサンプルからろ別する又は溶解させることを要するか、あるいはこれらの機能がユーザの介入なしに装置そのものによって実行されるように設計されている。
【０００５】
血中グルコースの比色測定におけるヘマトクリット干渉を減らすことに関する一連の特許には、すべて米カリフォルニア州Mountain  ViewのLifescan社を譲受け人とし、全体を引用例として本明細書に取り込む米国特許第４，９３５，３４６号、米国特許第５，０４９，４８７号、米国特許第５，０４９，３９４号、米国特許第５，１７９，００５号及び米国特許第５，３０４，４６８号がある。これらに開示されている方法は、不活性の両面多孔質マトリックスの片面から反射率を読み取ることを含む。マトリックスには、分析される流体が第一面に塗布され、マトリックスを通過して第二面に移動するとき分析対象物と相互作用して吸光性反応生成物を生成する試薬が含浸されている。第二面の反射率計測は、干渉を排除するため、二つの別々の波長で実施され、不活性マトリックスを通過する流体によって第二面が湿潤することによる反射率の初期低下によってタイミング回路が起動される。この方法は、血清又は血漿からの赤血球の分離を要しない。
【０００６】
同じくLifescan社を譲受け人とし、引用例として本明細書に取り込む米国特許第５，７８９，２５５号は、「Blood Glucose Strip Having Reduced Sensitivity to Hematcrit」と題するものである。この特許は、比較的大きな孔を有するサンプル側と、比較的小さな孔を有する試験側とを有する異方性膜を含み、試験サンプルがサンプル側に塗布され、膜を試験側に通過する間に比較的大きな赤血球が血液サンプルからろ別される試薬片を開示している。膜には、グルコース及び酸素と反応して過酸化水素を生成する成分と、過酸化水素と反応する色指示薬と、グルコース濃度計測に対する赤血球の影響を減らすアクリル酸ポリマーとを含む試験薬剤が含浸されている。
【０００７】
「Reagent test strip for analyte determination」と題する、Lifescan社を譲受け人とする国際公開番号ＷＯ０１／５７２３７９Ａ２は、血漿からの赤血球の分離を要しないよう、溶血剤を使用して赤血球を溶解させることを記載している。その中で次にように述べられている。「本発明の試薬試験片は、以下の成分―多孔質マトリックス、分析対象物酸化信号生成系の一以上の部材及び少なくとも１種の溶血剤―の少なくとも一つを有することを特徴とする」。
【０００８】
富士写真フィルム社を譲受け人とする「Dry process total blood analytical element - used esp. for detecting a high concn. of glucose in total blood」と題する抄録ＪＰ０１２６２４７０に対応する「乾式全血分析要素」と題する特開平１−２６２４７０は、赤血球を含有する血液中の所与の成分を測定するための要素を開示している。要素は、いずれも水浸透性である試薬層及び多孔質展開層を含む。層の一方が、分析対象物の存在で光学的に検出可能な物質を形成することができる物質を含有する。多孔質展開層は、赤血球からさらなる液体を展開させて試験系の他の層を湿潤させる。多孔質展開層は、ＮａＣｌ又はＫＣｌを少なくとも５g/m2含有する。
【０００９】
Pegg, D.E.による記事「Red Cell Volume in glycerol/sodium chloride/water mixtures」 Cryobiology, (1984), 21, (2), 234-9は、赤血球の低温保存に対して赤血球量を維持する方法を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の一つの目的は、分析対象物に関して全血サンプルを分析する方法であって、全血サンプルからの赤血球の分離を要しない方法ならびに当該方法で有用な試験キット及び用品を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、分析対象物に関して全血サンプルを分析する方法であって、分析される種々の血液サンプル間のヘマトクリットの偏差によって生じる干渉を減らす方法ならびに当該方法で有用な試験キット及び用品を提供することである。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、分析対象物に関して全血サンプルを分析する方法であって、ヘマトクリットの偏差による干渉を減らすための血液の溶解を要しない方法ならびに当該方法で有用な試験キット及び用品を提供することである。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、分析対象物に関して全血サンプルを分析する方法であって、ヘマトクリットの偏差による干渉を減らすための血液の希釈を要しない方法ならびに当該方法で有用な試験キット及び用品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明のこれらの目的及び他の目的は、分析対象物読み取りを実施する前に、非溶血性高張性塩組成物でサンプルを処理してサンプル中の赤血球の平均細胞容積を減らすことによって血液サンプルのヘマトクリットを調節する本発明の方法によって達成される。特に、本方法は、（ａ）分析対象物の定性又は定量のための血液サンプルを用意するステップと、（ｂ）サンプルを高張性塩組成物で処理してサンプルのヘマトクリットを調節するステップと、（ｃ）サンプル中の分析対象物の存在及び／又は量を測定するステップとを含む。
【００１５】
本発明によると、血液サンプル中の分析対象物を測定する方法であって、血液サンプル中の平均細胞容積を減らして測定の正確さに対するヘマトクリットの干渉効果を減らす方法が提供される。本発明の方法によると、診断手順におけるどこかの時点でサンプルを非溶血性高張性塩組成物で処理することにより、サンプルの平均細胞容積を減らす。本特許明細書で使用する「高張性塩組成物」とは、等張流体の浸透圧よりも高い浸透圧を血液サンプル中に生じさせるのに十分である、有機塩又は無機塩もしくはそれらの混合物の組成物をいう。本特許明細書で使用する「非溶血性」とは、組成物が、本方法による分析を受けるサンプル中で赤血球の実質的な溶解を誘発しないことをいう。
【００１６】
より具体的には、本発明の方法は、（ａ）分析対象物の定性又は定量のための血液サンプルを用意するステップと、（ｂ）サンプルを非溶血性高張性塩組成物で処理してサンプルのヘマトクリットを調節するステップと、（ｃ）サンプル中の分析対象物の存在及び／又は量を測定するステップとを含む。
【００１７】
サンプルを非溶血性高張性塩組成物で処理するステップは、たとえば、所定量の非溶血性高張性塩組成物をサンプルに加えることによって達成することができる。しかし、好ましくは、このステップは、適量の非溶血性高張性塩組成物をすでに付与されている試験用品にサンプル（又はその一部）を被着させることによって達成される。
【００１８】
本発明はまた、本発明の方法を実施するのに有用である、高張性塩組成物で処理されている用品を含む。このような用品は、非溶血性高張性塩組成物試薬をたとえば含浸、被覆、被着又はプリントすることによって処理されている試験片の形態であることができる。血液サンプルが試験片に配置されると、塩組成物がサンプルのヘマトクリットを調節して、分析対象物の正確な測定を可能にする。あるいはまた、このような用品は、サンプルを受けるためのウェル又はチャンバを有するマイクロ流体装置の形態であることもできる。非溶血性高張性塩組成物は、ウェル又はチャンバに事前に、たとえばその製造の間に被着させることもできるし、マイクロ流体装置中の別のウェル又はチャンバもしくは別の供給源、たとえば外部ポンプからマイクロチャネルを介してウェル又はチャンバに送ることもできる。このような試験片又はマイクロ流体装置を読むための機器は分析技術の分野で周知であり、市販されている。このような機器は、たとえば、前述の米国特許第５，３０４，４６８号に記載されている。
【００１９】
本発明はさらに、このような試験片又はマイクロ流体装置を含む試験キットに関する。本発明の方法を実施するのに有用な試験キットは、前記用品の１個以上ならびに穿刺針又は患者から血液サンプルを抽出するための他の手段及び場合によっては測定される特定の分析対象物の分析を実施するために必要な試薬又は溶液を含む。本発明は、家庭用又は研究室用、たとえば診療所もしくは病院用のキットに使用することができる。
【００２０】
本発明は、赤血球のサイズを減らすことにより、全血中の分析対象物の正確な測定における赤血球による干渉を減らす。本発明の方法における赤血球サイズの減少は、少なくとも二つの機構によって赤血球による干渉を減らすと考えられる。第一に、光学検出系では、より小さな赤血球が光散乱を増大させる。赤血球によって散乱する光が干渉源になることもあるが、この干渉は、分析対象物が計測されるところの波長とは異なる波長で散乱光を計測することによって、および計測された干渉に関して補正することによって、補正することができる。より小さな粒子はより大きな粒子よりも多くの光を散乱させる。本発明の方法では、より小さな干渉性赤血球の信号を本来の赤血球の信号よりも増大させる。増大した散乱信号は、赤血球による干渉の計測をより正確にし、それにより、赤血球による干渉に関する補正をより正確にして、最終分析対象物測定がより正確になるようにする。
【００２１】
分析対象物の光学的測定に使用される試験キットの場合、読みは、分析対象物計測のために選択された第一の波長及び分析対象物計測波長とほとんど又は全く重複しない第二の波長の両方で得る。分析対象物計測波長では、読みは、分析対象物の量及び存在する赤血球の誘発散乱によるヘマトクリットの関数である。第二の非分析対象物波長では、読みは、赤血球の誘発散乱によるヘマトクリットの関数であり、実質的に分析対象物の関数ではない。第二の非分析対象物波長での読みがサンプルのヘマトクリットの測定を可能にする。そして、分析対象物波長で得られた読みを、サンプルのヘマトクリットを考慮するように修正して、サンプル中の分析対象物の量を測定することができる。したがって、分析対象物測定の正確さは、ヘマトクリット測定の正確さに依存する。大部分の診断試験は、散乱を減らし、ひいては計測に対するヘマトクリットの影響を減らそうとするが、本出願人は、驚くことに、本発明の方法にしたがって散乱及び／又は反射の量の増大を利用して、計測においてヘマトクリットのより正確な測定を達成しうるということを見いだした。これは、分析対象物波長で実施された計測に対してより正確な修正を加えることを可能にし、したがって、血液サンプル中の分析対象物の量のより正確な測定を可能にする。
【００２２】
第二に、光学系及び電気化学系の両方で、より小さな赤血球はまた、分析装置中で分析対象物粒子が赤血球の周囲を移動して反応区域に達するための拡散経路をより短くする。これは、電気化学的分析装置において特に重要である。平均細胞容積の減少及び異なる本来のヘマトクリットのサンプル間の赤血球沈層容積範囲の減少が、これらの拡散経路を減らすことによって干渉を減らす。
【００２３】
非溶血性高張性塩溶液の使用は、赤血球の粒径を減らすことにより、サンプルの平均赤血球量を減らす。これは、それぞれ０mM、５０mM、１００mM、２００mM及び４００mMの濃度レベルのＮａ−ＨＥＰＥＳ溶液で処理した約４０％のヘマトクリットレベルを有する全血サンプル中の赤血球の形態を示す図１のＡ〜Ｅに見ることができる。５０、１００、２００及び４００mMで調製したＮａ−ＨＥＰＥＳバッファの５００μlアリコートを１．５mlマイクロフュージ管に加え、SpeedVac濃縮器（Savant  Instruments社）を使用して３０℃で液体を蒸発させた。そして、乾燥バッファの各アリコートを、種々のヘマトクリット濃度で調製した全血サンプルで再構成した。ヘマトクリット２０、４０及び６０％の全血のサンプルを標的にし、沈層赤血球と血漿とを混合することによって調製した。各アリコートの少量のサンプルを使用して顕微鏡ガラススライド上に血液の塗抹標本を調製して、赤血球の形態を顕微鏡下で観察することができるようにした。より高いバッファ濃度では、赤血球はサンプルのうち実質的により小さい容積を占有するということが見てとれる。これらより小さい赤血球がサンプルからの光の散乱を増す。
【００２４】
以下の表１は、ヘマトクリット（赤血球沈層容積）に対する高張性バッファ塩Ｎａ−ＨＥＰＥＳの影響を示す。データは、種々のヘマトクリットレベルの全血を種々の濃度のＮａ−ＨＥＰＥＳバッファと混合した後で得られたヘマトクリット読みを表す。塩に加える前後で各サンプルのヘマトクリットレベルをCompur  M-1100ミクロ毛管読み取り機器によってチェックして沈層赤血球を計測した。表１及び図２のデータは、バッファ塩濃度の増大とともに赤血球サイズが減るにつれ赤血球沈層容積が減少し、それによってヘマトクリットが減少するということを実証する。図２に示す理論上の傾向線は、予想されるヘマトクリットが塩によって押し退けられた容積によるものであることを示す。ヘマトクリットに対する影響は、理論的に予想されるよりも実質的に大きく、より高いｈｃｔレベルでは、増大したバッファ塩濃度の影響がより低いｈｃｔレベルの場合よりもより高いｈｃｔの場合で実質的に大きいということが見てとれる。
【００２５】
図３は、赤血球散乱を使用するヘマトクリット修正のための波長の例として選択された９４０nmで計測される反射率に対する高張性バッファ塩濃度の影響を示す。グラフ中、縦軸は、血漿サンプルで計測された反射率と、はじめに６０％ｈｃｔを有する全血サンプルで計測された反射率との差異を表す。各サンプルは、指示されたバッファ濃度を有するものであった。Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で指定濃度に緩衝されたグルコース試薬のアリコートに血液サンプルを加えた後で得られる混合物の反射率を、２００２年４月１９日出願の同時係属出願第６０／３７３，５８３号に記載の装置を使用して計測することにより、データを収集した。これらのデータは、増大したバッファ濃度が高ｈｃｔサンプルの反射率に対して及ぼす有意な影響を実証する。
【００２６】
本発明の方法はまた、非光学的測定、たとえば電気化学的測定にも有用である。より小さい赤血球は、全血サンプル中の分析対象物及び試薬の拡散に対して障害となりにくく、分析対象物測定に必要な化学反応がより容易に進行することができ、それがより正確な結果を出すことになる。
【００２７】
したがって、本発明の方法は、（ａ）分析対象物の定性又は定量のための血液サンプルを用意するステップと、（ｂ）サンプルを非溶血性高張性塩組成物で処理してサンプルのヘマトクリットを調節するステップと、（ｃ）サンプル中の分析対象物の存在及び／又は量を測定するステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ａ〜Ｅにおいて、赤血球形態に対する種々の濃度の高張性バッファ塩組成物の影響を示す顕微鏡写真である。
【図２】種々のバッファ塩濃度における、初期ヘマトクリット２０、４０、６０％の全血サンプルのヘマトクリットの変化を示すグラフである。
【図３】種々のＮａＨＥＰＥＳバッファ濃度レベルでの、ｈｃｔ６０％の全血サンプルと対応する血漿サンプルとの反射率の差違を示すグラフである。
【図１】
2004340923.tif 000002
【図２】
2004340923.tif 000003
【図３】
2004340923.tif 000004
【外国語明細書】
2004340923000001.pdf