(57)【要約】【課題】ペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製する固相の合成方法等を提供する。【解決手段】合成方法は、固相でアミノ酸残基が保護されたペプチジル樹脂を合成し、ペプチジル樹脂にスペーサ及び脂質を共役させてペプチド−スペーサ−脂質を有するペプチド−スペーサ−脂質樹脂を形成し、ペプチド−スペーサ−脂質樹脂からペプチド−スペーサ−脂質を開裂させ、ペプチド−スペーサ−脂質の少なくとも一つのアミノ酸から少なくとも一つの側鎖を保護する基を取り除いてペプチド−スペーサ−脂質共役体を形成し、ペプチド−スペーサ−脂質共役体に、何も処理しないか又は前記ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を環状の形態へ変性させる過程を受けさせる、各ステップを含み、スペーサは、ペプチジル樹脂又は脂質へ一つの連結官能基によって共役する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製する固相の合成方法であって、
（１）固相でアミノ酸残基が保護されたペプチジル樹脂を合成するステップ、
（２）前記ペプチジル樹脂にスペーサ及び脂質を共役させることによって、ペプチド−スペーサ−脂質を有するペプチド−スペーサ−脂質樹脂を形成するステップ、
（３）前記ペプチド−スペーサ−脂質樹脂から前記ペプチド−スペーサ−脂質を開裂させるステップ、
（４）前記ペプチド−スペーサ−脂質の少なくとも一つのアミノ酸から少なくとも一つの側鎖を保護する基を取り除くことによって、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を形成するステップ、並びに、
（５）前記ペプチド−スペーサ−脂質共役体に、実質的に、
（ａ）さらに何も処理しないこと、
（ｂ）先のステップ（１）−（４）のいずれかの間に、前記ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を環状の形態へ変性させること、及び
（ｃ）先のステップ（１）−（４）のいずれかの後に、前記ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を環状の形態へ変性させること、
からなる群から選択される過程を受けさせるステップ、
を含み、
前記スペーサは、実質的に前記ペプチジル樹脂及び前記脂質からなる群から選択される成分へ一つの連結官能基によって共役することを含む、方法。
【請求項２】
前記ペプチジル樹脂は、実質的に、Ｆｍｏｃの固相のペプチド合成技術及びＢｏｃの固相のペプチド合成技術からなる群から選択される過程によって合成されることを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチド−スペーサ−脂質樹脂は、スペーサを前記ペプチジル樹脂に共役させてスペーサ−ペプチジル樹脂を得ることによって、及び引き続き脂質を前記スペーサ−ペプチジル樹脂に共役させることによって、形成することを含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチド−スペーサ−脂質樹脂は、スペーサ−脂質を前記ペプチジル樹脂に共役させることによって形成することを含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記スペーサは、直鎖の親水性重合体の鎖を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記スペーサは、実質的に、ポリグリシン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリメタクリルアミド、ポリジメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリラート、ポリヒドロキシプロピルメタクリラート、ポリオキシアルケン、及び親水性ペプチドからなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記スペーサは、おおよそ１００乃至おおよそ１０，０００ダルトンの範囲における平均分子量を有するポリエチレングリコールを含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記連結官能基は、実質的にアミン、ウレタン、アミド、チオエステル、及びチオエーテルからなる群から選択される成分を含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記連結官能基は、アミドを含む請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記アミド結合は、実質的にジシクロヘキシルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＣＣ／ＨＯＢｔ）、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ）、及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＨＯＳｕ）からなる群から選択される活性化試剤によって形成することを含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記アミド結合は、実質的にＤＣＭ、ＣＨＣｌ３、ＤＭＦ、ＴＨＦからなる群から選択される少なくとも一つの溶媒において形成することを含む請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記アミド結合は、おおよそ２０℃乃至おおよそ９０℃の温度範囲において形成することを含む請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチド部分の前記環状の形態は、実質的に二つのアミノ酸及び二つのアミノ酸の少なくとも一つの誘導体からなる群から選択される一組みの成分の間における分子内の連結によって形成することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記分子内の連結は、実質的に、ジスルフィド、アミド、エステル、チオエーテル、チオアセタート、及びチオアセタミンからなる群から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項１６】
前記ペプチドは、実質的にペプチド配位子及びペプチド配位子の擬態物からなる群から選択されるペプチド配位子の成分を含む請求項１５記載のペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項１７】
前記ペプチド配位子の成分は、受容体に結合する請求項１６記載のペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項１８】
前記受容体は、実質的にソマトスタチン受容体、血管作用性小腸ペプチド受容体、インテグリン受容体、繊維芽細胞成長因子受容体、肝細胞成長因子受容体、表皮成長因子受容体、インシュリン様成長因子受容体、神経成長因子受容体、血管内皮成長因子受容体、血小板由来成長因子受容体、及び形質転換成長因子受容体からなる群から選択される成分である請求項１７記載のペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項１９】
前記ペプチド配位子の成分は、実質的にホルモン、ケモタキシン、サイトカイン、毒素、及び細胞接着用の細胞外基質のペプチドからなる群から選択される少なくとも一つの物質を含む請求項１６記載のペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項２０】
前記ペプチド配位子の成分は、実質的にソマトスタチン、血管作用性小腸ペプチド、インテグリン結合阻害剤、繊維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、表皮成長因子、ラミニン結合阻害剤、神経成長因子、フィブロネクチン、インシュリン様成長因子、血管内皮成長因子、血小板由来成長因子、及び形質転換成長因子からなる群から選択される少なくとも一つの物質を含む請求項１９記載のペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項２１】
前記ペプチド配位子の成分は、実質的に
Ｈ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ、
Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＨ、
Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＨ、
Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−ＯＨ、
Ｈ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＯＨ、
Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＨ、
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−ＯＨ、
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ、
Ｈ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨ、
環状Ｈ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ（オール）、及び
環状Ｈ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ（オール）
からなる群から選択される少なくとも一つの物質を含む請求項２０記載のペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項２２】
前記共役体は、
シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール（ｃ−ＯＰＤ６００）、
シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール（ｃ−ＯＰＤ２０００）、
シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ３０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール（ｃ−ＯＰＤ３０００）、
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−オール、
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−オール、又は
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−オール
である請求項２１記載のペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項２３】
前記脂質は、実質的に、ホスホジクリセリド及びスフィンゴ脂質からなる群から選択されるリン脂質を含む請求項１５記載のペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項２４】
請求項１５記載のペプチド−スペーサ−脂質共役体を含む目標とされる治療に役立つリポソーム。
【請求項２５】
前記ペプチド−スペーサ−脂質共役体は、シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−  （Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール（ｃ−ＯＰＤ）である請求項２４記載の目標とされる治療に役立つリポソーム。
【請求項２６】
試剤成分は、実質的に、疾患を処置する治療薬、及び疾患を診断する診断薬からなる群から選択され、
前記薬の成分は、閉じ込められる請求項２４記載の目標とされる治療に役立つリポソーム。
【請求項２７】
前記疾患は、ソマトスタチン受容体が発現した癌である請求項２６記載の目標とされる治療に役立つリポソーム。
【請求項２８】
請求項２記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項２９】
請求項３記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項３０】
請求項４記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項３１】
請求項５記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項３２】
請求項６記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項３３】
請求項７記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項３４】
請求項８記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項３５】
請求項９記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項３６】
請求項１０記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項３７】
請求項１１記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項３８】
請求項１２記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項３９】
請求項１３記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【請求項４０】
請求項１４記載の方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製するための固相の合成方法、及びその共役体の使用に関係付けられる。
【０００２】
【従来の技術】
多くの試剤が、それらを人体へ直接適用するとすれば、好ましくない欠点を有するので、薬物の送達は、治療の処置に関する試剤の改善において決定的な役割を果たす。従って、特定の試剤に対して、副作用の減少、抗力の増強、及び使用法における利便性のようなその有効性を改善するために、送達システムを開発することは、必要である。例えば、抗腫瘍性の化学療法は、正常な組織に対するそれらの広まった毒性から結果として生じる逆の副作用によって限定される。従って、薬物の拡散を予防すると共に薬物を疾患の部位へ集中させることができるかもしれない送達システムが要求される。
【０００３】
リポソームは、というそれらが、生物学的なシステムに対して安全であるという理由のために、薬物送達システムとしての使用に関していくつかの利点を提供することができ、エーテルの親水性又は疎水性の薬物を運搬するための優れた球状の二層を有し、薬物を分解及び拡散から予防することができる。さらに、リポソームを、特定の目的用の追加機能を有するように、変性させることができる。ポリエチレン−グリセロール−グラフト（ＰＥＧ−グラフト）リポソームのような成功した例を示す。これらの変成したリポソームは、細網内系を回避すると共に血液中での循環時間を延長することができる。さらに、ＰＥＧ−グラフトリポソームに包まれる細胞毒性の癌の薬物は、抗腫瘍活性の効果における著しい増強を提供し、正常な細胞に対する毒性の副作用を減少させる。それによって、ＰＥＧ−グラフトリポソームは、商業的な用途を得て、目標とされる送達に関するこれらのＰＥＧ−グラフトリポソームのさらなる変性に対する可能性を開いた。
【０００４】
いくつかのタイプの目標とされるリポソームが開発されてきた（例えば、非特許文献１及び２参照）。一般的に使用される目標とされるリポソームは、（１）従来のリポソーム（タイプＡ）における脂質のヘッドグループで連結される標的にする配位子、（２）ＰＥＧ−グラフトリポソーム（タイプＢ）における脂質のヘッドグループで連結される標的にする配位子、及び（３）ＰＥＧ−グラフトリポソーム（タイプＣ）におけるＰＥＧ鎖の遠心端に付けられた標的にする配位子を含む。現在までのところ、研究は、タイプＣの目標とされるリポソームが、目標とされる送達に関してより良好なリポソームの構造を提供することを示してきた（例えば、非特許文献１参照）。このリポソームの構造に基づいて、抗体（例えば、非特許文献３及び４参照）、タンパク質（例えば、非特許文献５参照）、小さな合成分子（例えば、非特許文献６参照）、及びペプチド（例えば、非特許文献７参照）のような、いくつかのタイプの分子は、標的部位を結合するための標的にする配位子として開発されてきた。これらのタイプの分子間で、ペプチドは、受容体−配位子相互作用のようなタンパク質−タンパク質の相互作用における認識の成分として役立ち得るので、ペプチドは、高い潜在的な標的にする配位子として考慮される。さらに、疾患と関連する多くの細胞膜の受容体が、研究されてきた。
【０００５】
ＲＧＤ−ペプチド、ソマトスタチン、走化性ペプチド、血管作用性小腸ペプチド、及びそれらの擬態物のようなペプチドは、標的にする配位子としての良好な候補である。これらのペプチドの多くの対の受容体は、様々な腫瘍細胞に過剰発現されることが、発見されてきた。さらに、ペプチド及びペプチド擬態物は、他のタイプの分子（例えば、抗体）を超えるいくつかの独特の利点を有する。一般的に、これらのペプチドは、高い親和性の配位子−受容体の対合により標的細胞に結合し、受容体−間接エンドサイトーシスを通じて細胞間の区画に入る。しかしながら、抗体を主材料とした目標とされるリポソームは、細胞膜における抗原による細胞の内部へのエンドサイトーシスの経路を利用してはならない。さらに、ペプチドは、細網内系によって認識される機会をほとんど有さなず、このように血液循環システムから取り除かれる。ペプチド擬態物は、天然のペプチドよりも高い結合の親和性及びプロテアーゼの分解に対するより良好な抵抗性を提供することができる。
【０００６】
現在、ペプチドを主材料とした目標とされるリポソームを調製するための二つのアプローチが、開発されてきており、それらによってペプチド配位子を、ＰＥＧの遠心端に付けることができる。第一のアプローチは、末端基を官能性にしたＰＥＧ−脂質共役体をリポソーム中へ組み込んでおり、そしてペプチド配位子と共役している（例えば、非特許文献８参照）。しかしながら、末端基を官能性にしたＰＥＧを、ペプチド配位子に共役させるとき、ペプチド配位子に一つより多い反応基があるとすれば、不均質な共役が、起こる場合もある。さらに、官能性にしたＰＥＧの未反応の末端基は、定義することが困難であり、カップリング反応の後には、完全に不活性になる。第二のアプローチは、ペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体をリポソームの膜中へ直接組み込んでいる（例えば、非特許文献７参照）。このアプローチは、構造的に明確な目標とされるリポソームの成分を提供することができる。
【０００７】
ペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体は、目標とされるリポソームを調製するための期待される分子であるが、利用可能な共役体は、まだ非常に限定され、その合成は、困難である。これは、ペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体においてペプチドにおける側鎖の化学的特性が多様であるので、ＰＥＧの分子質量は、不均質であり、脂質の性質は、両親媒性である。これらの特性は、側鎖の保護、精製、及び反応の合成の過程において困難を引き起こし、ペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体がほとんど合成されてこなかったという点で、及びペプチド、スペーサ、及び脂質の共役体が、しばしば扱いにくいリンカー及び異常な官能基の形成を誘導するという点で明白である。
【０００８】
ＹＩＧＳＲ−ＰＥＧ−脂質共役体を合成するための方法は、開示されている（例えば、非特許文献７参照）。しかしながら、この方法を、ペプチドにアミノ基又は他のチオール基のような強い求核性の残留物を伴うブロモアセチル基の非特異的な反応が起こる場合があると、広い範囲のペプチド−ＰＥＧ脂質共役体を合成するための一般的な方法として使用することができない。さらに、ＹＩＧＳＲ−ＰＥＧ−脂質共役体において、ペプチド及びＰＥＧの末端でそれぞれブロモアセチル基およびチオール基への追加の変性が要求されるので工業化には好ましくない、チオアセチル（−ＳＣＨ２−ＣＯ−）リンカーを、ペプチド及びＰＥＧを共役させるために使用した。ＹＩＧＳＲ−ＰＥＧ−脂質共役体におけるＰＥＧ及び脂質の間におけるウレタン結合は、不自然で酸−塩基に不安定である。従って、広い範囲のペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製する合成方法に対する要求が存在する。
【０００９】
たとえオクトレオチド−スペーサ−ＰＥＧ−スペーサ−ＤＯＰＥ共役体の合成は、説明されている（例えば、特許文献１参照）としても、スペーサ−ＰＥＧ−スペーサによるオクトレオチド及びＤＯＰＥのカップリングは、四つの官能基及び三片のスペーサを伴い、分子をより複雑にすると共に分子の特性決定及び工業的使用法に関して好ましくなくすることになる。また、合成の手順、試薬、条件、及び精製過程については、明確に記載されてない（特許文献１参照）。結果として、オクトレオチド−スペーサ−ＰＥＧ−スペーサ−ＤＯＰＥ共役体の純度及び構造を、開示することはできなかった。従って、特許文献１の教示に基づいて、当業者は、オクトレオチド−スペーサ−ＰＥＧ−スペーサ−ＤＯＰＥ共役体の合成を実施することができない。
【００１０】
【特許文献１】
欧州特許第１１１８３３６号明細書
【非特許文献１】
Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９９５，  １２３４，  ７４−８０
【非特許文献２】
Ａｌｌｅｎ  ＴＭ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．  １９９４，  １５，  ２１５−２２０
【非特許文献３】
Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９３，  ５３，  １４８４−８
【非特許文献４】
Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．，  １９９５，  １２４５，  ９−１６
【非特許文献５】
Ｅａｖａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．  ２ＯＯＯ，  ５１，  ｌ０−４
【非特許文献６】
Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  １９９９，  １Ｏ，  ２８９−９８
【非特許文献７】
Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  １９９７，  ８，  １１１−８
【非特許文献８】
Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９５，  ６，  ７０５−８
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体を調製するための便利な固相の合成方法を提供し、ペプチド、スペーサ、及び脂質を共役させるための（アミド基のような）様々な連結基を提供する。本発明の固相の合成方法に従って、単純化された合成、自動化された合成、各反応段階における容易な精製過程、及び合成の間における最少化された生成物の損失のような、いくつかの利点を達成することができる。加えて、本合成方法は、広い範囲のペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製することに適切である。
【００１１】
また本発明は、本固相の合成方法によって調製されたペプチド−スペーサ−脂質共役体を提供する。ペプチド−スペーサ−脂質を、特定の細胞へのリポソームの薬物の送達に対する標的にする部分として、リポソーム中に組み込むことができる。
【００１２】
また本発明は、本ペプチド−スペーサ−脂質共役体を含む、目標とするリポソームを提供する。
【課題を解決するための手段】
上記課題の一つを達成するために、本発明は、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製する固相の合成方法であって、
（１）固相でアミノ酸残基が保護されたペプチジル樹脂を合成するステップ、
（２）前記ペプチジル樹脂にスペーサ及び脂質を共役させることによって、ペプチド−スペーサ−脂質を有するペプチド−スペーサ−脂質樹脂を形成するステップ、
（３）前記ペプチド−スペーサ−脂質樹脂から前記ペプチド−スペーサ−脂質を開裂させるステップ、
（４）前記ペプチド−スペーサ−脂質の少なくとも一つのアミノ酸から少なくとも一つの側鎖を保護する基を取り除くことによって、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を形成するステップ、並びに、
（５）前記ペプチド−スペーサ−脂質共役体に、実質的に、
（ａ）さらに何も処理しないこと、
（ｂ）先のステップ（１）−（４）のいずれかの間に、前記ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を環状の形態へ変性させること、及び
（ｃ）先のステップ（１）−（４）のいずれかの後に、前記ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を環状の形態へ変性させること、
からなる群から選択される過程を受けさせるステップ、
を含み、
前記スペーサは、実質的に前記ペプチジル樹脂及び前記脂質からなる群から選択される成分へ一つの連結官能基によって共役することを含む。
【００１３】
また、上記課題の一つを達成するために、本発明は、上記方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体である。
【００１４】
さらに、上記課題の一つを達成するために、本発明は、上記ペプチド−スペーサ−脂質共役体を含む目標とされる治療に役立つリポソームである。
【００１５】
本発明の更に他の目的、構成及び特長は、以下に述べる説明より明らかになると思われる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
ここで、本発明は、以下の化学命名法を使用して開示される。
【００１７】
２−Ｂｒ―Ｃｂｚ    ２−ブロモベンジルオキシカルボイル（ｃａｒｂｏｙｌ）
２−Ｂｒ−Ｚ        ２−ブロモベンジルオキシカルボニル
２−Ｃｌ−Ｃｂｚ    ２−クロロベンジルオキシカルボイル
２−Ｃｌ−Ｚ        ２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ａｂｕ              ４−アミノ酪酸
ＡＣ                アセチル
Ａｃｍ              アセトアミドメチル
Ｂｏｃ              ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｂｚ                ベンゾイル
Ｂｚｌ              ベンジル
Ｃｂｚ              ベンジルオキシカルボイル
ＤＣＣ              ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣ−Ｃｈｏｌ      ３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバミル］コレステロール
ＤＣＭ              ジクロロメタン
ＤＤＡＢ            ジメチルアンモニウム＝ブロミド
Ｄｄｅ              １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキス−１−イリデン）エチル
ＤＩＰＣＤＩ        １，３−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＭＡＰ            ジメチルアミノピリジン
ＤＭＥ              エチレングリコール  ジメチルエーテル
ＤＭＦ              Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＲＩＥ          Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム＝ブロミド
ＤＭＳ              ジメチルスルフィド
ＤＯＰＡＴ          １，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン
ＤＯＰＥ            ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＲＩＥ          Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］
−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム＝ブロミド
ＤＯＴＭＡ          Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム＝コリド（ｃｈｏｌｉｄｅ）
ＤＯＸ              ドキソルビシン
ＤＳＰＥ            ジステアリルホスファチジルエタノールアミン
ＥＤＣ              １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド
ＥＤＴ              エタンジチオール
ＥＧＦ              表皮成長因子
ＦＧＦ              繊維芽細胞成長因子
Ｆｍｏｃ            ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｆｏｒ              ホルミル
ＨＦ                フッ化水素
ＨＧＦ              肝細胞成長因子
ＨＯＢｔ            Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＳＰＣ            水素化された大豆のホスファチジルコリン
ＩＧＦ              インシュリン様の成長因子
Ｉｍ                イミダゾール−１−イル
ＭＢＨＡ            ４−メチルベンズヒドリルアミド
ＭｅＯＨ            メタノール
Ｍｍｔ              ４−メトキシトリチル
Ｍｔｒ              ４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼン−スルホニル
Ｍｔｓ              メシチレン−２−スルホニル
Ｍｔｔ              ４−メチルトリチル
ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ  メトキシポリエチレングリコール−ジステアリルホスファチジルエタノールアミン
ＮＧＦ              神経成長因子
ＮＨＳ              Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＰＡＣＡＰ          下垂体のアデニレートシクラーゼを活性化するペプチド
Ｐｂｆ              ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＤＧＦ            血小板由来成長因子
Ｐｄ−Ｃ            活性炭触媒に保持されたパラジウム
ＰＥＧ              ポリエチレングリコール
ｐＭｅｏＢｚｌ      ｐ−メトキシベンジル
Ｐｍｃ              ２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル
ｐＮＰ              パラ−ニトロフェニル
ＳＰＰＳ            固相のペプチド合成
ＳＳＴ              ソマトスタチン
Ｓｕ                スクシンイミド
ＴＣＰ              ２，４，５−トリクロロフェニル
ＴＥＡ              トリエチルアミン
ＴＦＡ              トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ              トリフルオロエタノール
ＴＦＭＳＡ          トリフルオロメタンスルホン酸
Ｔｆ                トリフルオロメタンスルホニル
Ｔｆａ              トリフルオロアセチル
ＴＧＦ              形質転換成長因子
ＴＨＰ              テトラヒドロピラニル
Ｔｏｓ              トシル
Ｔｒｔ              トリチル
ｔＢｕ              ｔｅｒｔ−ブチル
ｔＢｕｔｈｉｏ      ｔｅｒｔ−ブチルチオ
ＶＥＧＦ            血管内皮成長因子
ＶＩＰ              血管作用性小腸ペプチド
Ｚ                  ベンジルオキシカルボニル
（Ｉ．ペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製するための固相の合成方法）
本発明に従って、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製するための固相の合成方法は、
（１）固相においてアミノ酸残留物が保護されたペプチジル樹脂を合成する、
（２）ペプチジル樹脂へスペーサ及び脂質を共役させ、それによって、ペプチド−スペーサ−脂質を有するペプチド−スペーサ−脂質樹脂を形成する、
（３）ペプチド−スペーサ−脂質樹脂からペプチド−スペーサ−脂質を開裂させる、
（４）ペプチド−スペーサ−脂質の少なくとも一つのアミノ酸から少なくとも一つの側鎖を保護する基を取り除き、それによってペプチド−スペーサ−脂質共役体を形成する、
（５）実質的に
（ａ）さらなる処理をしないこと、
（ｂ）前述のステップ（１）−（４）のいずれかの間に、ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を環状の形態へ変性させること、及び
（ｃ）前述のステップ（１）−（４）のいずれかの後に、ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を環状の形態へ変性させること、
からなる群から選択される過程をペプチド−スペーサ−脂質共役体に受けさせる、ステップを含み、
スペーサは、実質的にペプチジル樹脂及び脂質からなる群から選択される成分と一つの連結官能基によって共役することを含む。
【００１８】
（Ａ．アミノ酸残留物が保護されたペプチジル樹脂の固相の合成）
本発明のペプチジル樹脂を、当技術において知られている任意の固相の合成技術によって調製してもよい。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８５，  ２１４９  （１９６３）、Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  （１９６９））、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  （１９８４））、及びＡｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ．  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９８９））のような関連する技術は、ここでは、完全に参照によって組み込まれる。
【００１９】
本発明に従って、Ｆｍｏｃ及びＢｏｃの固相のペプチド合成（ＳＰＰＳ）方法は、ペプチジル樹脂を調製するための好適な方法である。
【００２０】
ＦｍｏｃのＳＰＰＳが、アルファ−アミノ基を保護するような塩基に不安定なＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）基を使用するのに対して、ＢｏｃのＳＰＰＳは、アルファ−アミノ基を保護するような酸に不安定なＢｏｃ（１−ブチルオキシカルボニル）基を使用する。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃのＳＰＰＳは、当技術において、例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  （１９８４）、及びＣｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｉｔｅ，  ＦｍｏｃＳｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  （２０００）に知られている。
【００２１】
初期の付着後、過剰の試薬及び副産物は、洗浄溶液によって洗浄される。
【００２２】
（１）脱保護試薬でアルファ−アミノ保護基を脱保護する、及び
（２）有機溶媒中におけるカップリング試薬とのアミノ酸のカップリング
のステップを含む過程によってペプチド鎖を引き伸ばすために、引き続きアミノ酸を添加する。
【００２３】
洗浄溶液で洗浄するステップは、各脱保護及びカップリングのステップの後に行なわれる。カイザー試験（Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９７０，  ３４，  ５９５−８）を、カップリング反応が完了したかどうかを決定するために、使用することができる。カップリング反応は、その試験が“陰性”であるとき、停止する。所望のペプチドを完了した後、結果として生じるペプチジル樹脂を、次にスペーサと共役させる。
【００２４】
本発明に従って、カップリング試剤を、ペプチド結合の形成のための試薬から選択することができる。このようなカップリング試薬の例は、ジシクロヘキシルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＣＣ／ＨＯＢｔ）、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ）、及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）を含むが、限定はされない。カップリング試剤の好適な実施例は、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔである。
【００２５】
本発明に従って、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基に対する脱保護試剤は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり得ると共に、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基に対する脱保護試剤は、ピペリジンであり得る。
【００２６】
本発明に従って、脱保護、カップリング、及び洗浄に使用される一次溶媒は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含むが、限定はされない。
【００２７】
（樹脂）
本発明に従って、様々な樹脂を、ペプチジル樹脂の合成に使用することができる。Ｆｍｏｃの固相のペプチド合成（ＳＰＰＳ）に適切な樹脂は、ヒドロキシメチル樹脂、Ｗａｎｇ樹脂、２−クロロトリチル＝クロリド樹脂、及びＲｉｎｋのアミド樹脂を含むが、限定はされない。ＢｏｃのＳＰＰＳに適切な樹脂は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミド（ＭＢＨＡ）、及びオキシム樹脂を含むが、限定はされない。Ｗａｎｇ樹脂及びヒドロキシメチル樹脂を、Ｆｍｏｃの化学において、Ｃ末端にカルボン酸（−ＣＯＯＨ）、アルキルアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ）、ジ−（アルキル）アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２）、又はエステル（−Ｃ（Ｏ）ＯＲ）を有するペプチドを合成するために、使用することができる。Ｒａｎｋのアミド樹脂を、Ｆｍｏｃの化学において、Ｃ末端にアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）を有するペプチドを合成するために、使用することができる。２−クロロトリチル＝クロリド樹脂を、Ｆｍｏｃの化学において、Ｃ末端にカルボン酸、アミン、又はヒドロキシル官能基を有するペプチドを合成するために、使用することができる。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂を、Ｂｏｃの化学において、Ｃ末端にカルボン酸又はエステルを有するペプチドを合成するために、使用することができる。ＭＢＨＡ樹脂を、Ｂｏｃの化学において、Ｃ末端にアミドを有するペプチドを合成するために、使用することができる。オキシム樹脂を、Ｂｏｃの化学において、Ｃ末端にアルキルアミド又はエステルを有するペプチドを合成するために、使用することができる。
【００２８】
本発明の好適な実施例において、ペプチド−スペーサ−脂質共役体の合成は、Ｆｍｏｃの化学において、Ｗａｎｇ樹脂、２−クロロトリチル＝クロリド樹脂、及びＲｉｎｋのアミド樹脂を使用することによって行なわれる。
【００２９】
（アミノ保護基）
本発明に従って、ペプチド鎖の引き延ばしに使用される、アミノ酸におけるアミノ基を、延びているペプチドへのアミノ酸のカップリングの間、保護することができる。カップリング反応の後に、次の、アミノ基が保護されるアミノ酸のカップリングのために、保護基を取り除く。
【００３０】
本発明に従って、適切な保護基は、ホルミル、トリフルオロアセチル、及びアセチルのようなアシルタイプの保護基、Ｆｍｏｃ、ベンジルオキシカルボイル（Ｃｂｚ）、及び置換されたＣｂｚのような芳香族ウレタンタイプの保護基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、及びシクロヘキシルオキシカルボニルのような脂肪族ウレタンの保護基、並びに、ベンジル、及びトリフェニルメチルのようなアルキルタイプの保護基を含むが、限定はされない。しかしながら、Ｆｍｏｃ及びＢｏｃは、好適な保護基である。
【００３１】
（側鎖の保護基）
本発明に従って、側鎖の保護基は、化学反応の間、側鎖を保護するために、アミノ酸の側鎖に付けることができるが要求される反応の後に容易に取り除くこともできる基に向けられる。アミノ基に対する適切な側鎖の保護基は、アセチル（ＡＣ）、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、２−クロロベンジルオキシカルボイル（２−Ｃｌ−Ｃｂｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−ＢｒＣｂｚ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｆｍｏｃ、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキス−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）、及びトリフルオロアセチル（Ｔｆａ）を含むが、限定はされない。ヒドロキシル基に対する適切な側鎖の保護基は、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）、及びトリチル（Ｔｒｔ）を含むが、限定はされない。チオール基に対する適切な側鎖の保護基は、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、Ｂｚｌ、ｔＢｕ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、（ｔＢｕｔｈｉｏ）、ｐ−メトキシベンジル（ｐＭｅｏＢｚｌ）、及び４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）を含むが、限定はされない。フェノール性水酸基に対する適切な側鎖の保護基は、テトラヒドロピラニル、ｔＢｕ、Ｔｒｔ、Ｂｚｌ、Ｃｂｚ、ｚ−Ｂｒ−Ｃｂｚ、及び２，５−ジクロロベンジルを含むが、限定はされない。イミダゾールに対する適切な側鎖の保護基は、Ｂｏｃ、Ｍｔｔ、トシル（Ｔｏｓ）、及びＴｒｔを含むが、限定はされない。インドールに対する適切な側鎖の保護基は、Ｂｏｃであり得るが、限定はされない。カルボン酸に対する適切な側鎖の保護基は、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｔＢｕ、及びシクロヘキシルを含むが、限定はされない。グアニジオ（ｇｕａｎｉｄｉｏ）基に対する適切な側鎖の保護基は、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼン−スルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、及びＴｏｓを含むが、限定はされない。
【００３２】
（Ｂ．脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂の合成）
本発明の好適な実施例において、脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂を、スペーサ−ペプチジル樹脂を得るために、スペーサをペプチジル樹脂と共役させ、次に脂質をスペーサ−ペプチジル樹脂と共役させることによって、合成する。
【００３３】
本発明の別の実施例において、脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂を、スペーサ−脂質をペプチジル樹脂と共役させることによって、合成する。
【００３４】
（ペプチジル樹脂とスペーサの共役）
本発明に従って、親水性重合体のスペーサを、様々な連結官能基を通じてペプチジル樹脂と共役させることができる。連結官能基の例を、以下の表Ｉに列挙する。
【００３５】
表Ｉ．連結官能基を生成するためのペプチドのＮ−末端、脂質のヘッド、及びスペーサの端の官能基
【００３６】
【表１】
2004189617.tif 000002
典型的には、適切な溶媒中で官能性にした又は活性化したスペーサの端の基をペプチジル樹脂とカップリングすること、及び、カイザー試験が“陰性”になるまで、おおよそ０℃乃至おおよそ９０℃の範囲の温度で振とうさせることによって、リンキング反応は、によって行なわれる。反応が完了した後、過剰の試薬及び副産物を、洗浄溶液によって取り除き、次にペプチジル樹脂に、脂質とのカップリングを受けさせる。
【００３７】
本発明の好適な実施例において、端の基を官能性にしたスペーサは、官能性にしたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。様々な端の基を官能性にした又は活性化したＰＥＧの調製に対する調査は、Ｚａｌｉｐｓｋｙ．  Ｓ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ６，  １５０−１６５  （１９９５）の技術に示されている。
【００３８】
ペプチジル樹脂とＰＥＧの共役は、ＰＥＧの端及びペプチドのＮ末端に適切な官能基を要求する。アミン（−ペプチド−ＮＨ−ＰＥＧ）が、連結官能基であるとき、ハロゲン化物（例えば、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉ）又はスルホナート（例えば、−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端でアミノ基とカップリングするように使用することができる。ウレタン（−ペプチド−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−ＰＥＧ）が、連結官能基であるとき、活性なカルボナート（例えば、−Ｃ（Ｏ）−Ｉｍ、−ＯＣ（Ｏ）−ｐＮＰ、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨＳ、−ＯＣ（Ｏ）−ＴＣＰ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端でアミノ基とカップリングするように使用することができる。アミド（−ペプチド−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ）が、連結官能基であるとき、活性化したカルボキシル基（例えば、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＤＣＣ／ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ、及びＥＤＣ／ＮＨＳによって活性化したカルボキシル基）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端でアミノ基とカップリングするように使用することができる。チオエステル（−ペプチド−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）−ＰＥＧ）が、連結官能基であるとき、チオ酸（−ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）Ｓ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端とカップリングするように使用することができ、ペプチジル樹脂のＮ末端は、ブロモアセチル（樹脂−ペプチド−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ）へ変性する。チオエーテル（−ペプチド−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＳＣＨ２−ＰＥＧ）が、連結官能基であるとき、チオール基（−ＰＥＧ−ＣＨ２ＳＨ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端とカップリングするように使用することができ、ペプチジル樹脂のＮ末端は、ブロモアセチル（樹脂−ペプチド−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ）へ変性する。マレイミド／チオ共役体のチオエーテルが、連結官能基であるとき、チオール基（Ｃ（Ｏ）−ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端とカップリングするように使用することができ、ペプチジル樹脂のＮ末端は、マレイミド基（マレイミド−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−ペプチド−樹脂）へ変性する。
【００３９】
カップリング反応に対する適切な溶媒を、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、ＤＭＦ、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択することができる。
【００４０】
洗浄溶液を、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、メタノール（ＭｅＯＨ）、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ＣＨ３ＣＮ、水、緩衝剤、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択することができる。
【００４１】
本発明の好適な実施例において、連結官能基は、ペプチジル樹脂のＮ末端のアミノ基と共役するカルボキシル基を官能性にしたＰＥＧである、アミド結合である。アミド結合のカップリング反応において、その反応におけるカルボキシル基に対する活性化試剤は、実質的に、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ、又はＥＤＣ／ＮＨＳのような、ペプチド結合の形成に使用される試薬からなる群から選択される。カップリング反応に対する適切な溶媒は、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦ、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択される。洗浄溶液は、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、ＭｅＯＨ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、シアン化水素、水、緩衝剤、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択される。反応温度は、おおよそ２０℃乃至おおよそ９０℃の範囲にある。カルボキシル基に対する好適な活性化試剤は、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔであり、溶媒は、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、及びＤＭＦからなる群から選択される。好適な洗浄溶液は、実質的にクロロホルム、ＭｅＯＨ、水、ＤＭＦ、緩衝剤（ｐＨ３．０−１１．０）、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択される。好適な反応温度は、おおよそ２０℃乃至おおよそ６０℃の範囲にある。
【００４２】
（スペーサ−ペプチジル樹脂と脂質の共役）
本発明に従って、脂質を、上述の連結官能基を通じてスペーサ−ペプチジル樹脂と共役させる。典型的には、カップリング反応は、適切な溶媒中で端の基を官能性にした又は活性化したスペーサ−ペプチジル樹脂へ脂質を添加すること、及び、おおよそ２４時間までの継続時間におおよそ０℃乃至おおよそ９０℃の温度範囲で振とうさせることによって行なわれる。反応が完了した後、過剰の試薬及び副産物を、洗浄溶液によって取り除く。
【００４３】
本発明の実施例において、スペーサ−ペプチジル樹脂におけるスペーサは、ＰＥＧである。ＰＥＧの端の基の官能化を、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  Ｓ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ６，  １５０−  １６５  （１９９５）に関して上で述べた。
【００４４】
スペーサ−ペプチジル樹脂と脂質の共役は、ＰＥＧの端及び脂質のヘッドグループに適切な官能基を要求する。アミン（脂質−ＮＨ−ＰＥＧ−）が、連結官能基であるとき、ハロゲン化物（例えば、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉ）又はスルホナート（例えば、−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質のヘッドグループにおいてアミノ基とカップリングするように使用することができる。ウレタン（脂質−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−ＰＥＧ−）が、連結官能基であるとき、活性なカルボナート（例えば、−Ｃ（Ｏ）−Ｉｍ、−ＯＣ（Ｏ）−ｐＮＰ、−ＯＣ（Ｏ）Ｓｕ、−ＯＣ（Ｏ）−ＴＣＰ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質のヘッドグループにおいてアミノ基とカップリングするように使用することができる。アミド（脂質−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ−）が、連結官能基であるとき、活性化したカルボキシル基（例えば、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＤＣＣ／ＤＭＡＰ、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ、ＥＤＣ／ＮＨＳによって活性化したカルボキシル基）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質のヘッドグループにおいてアミノ基とカップリングするように使用することができる。チオエステル（脂質−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）−ＰＥＧ−）が、連結官能基であるとき、チオ酸（−スペーサ−Ｃ（Ｏ）Ｓ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質とカップリングするように使用することができ、ヘッドグループは、ブロモアセチル（脂質−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ）へ変性する。チオエーテル（脂質−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＳＣＨ２−ＰＥＧ−）が、連結官能基であるとき、チオール基（−スペーサ−ＣＨ２ＳＨ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質とカップリングするように使用することができ、ヘッドグループは、ブロモアセチル（脂質−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ）へ変性する。マレイミド／チオ共役体のチオエーテルが、連結官能基であるとき、チオール基（−ＰＥＧ−ＣＨ２ＳＨ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質とカップリングするように使用することができ、ヘッドグループは、マレイミド基（マレイミド−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−脂質）に付けられる。
【００４５】
本発明の好適な実施例において、ＰＥＧ−ペプチジル樹脂と脂質の共役は、アミド結合によって形成され、それによって、ＰＥＧ−ペプチジル樹脂の末端におけるカルボキシル基は、脂質のヘッドグループにおいてアミノ基へ連結される。一般的に、カップリング反応は、カルボキシル−ＰＥＧ−ペプチジル樹脂の端のカルボキシル基を活性化するための活性化試剤を添加することによって開始する。次に脂質を、塩基を伴う適切な溶媒中で活性化したカルボキシル−ＰＥＧ−ペプチジル樹脂へ添加し、次にその混合物を、おおよそ０℃乃至おおよそ９０℃の温度範囲において窒素下で振とうさせる。反応が完了した後、過剰の試薬及び副産物を、洗浄溶液によって取り除く。
【００４６】
その反応におけるカルボキシル基に対する活性化試剤は、実質的に、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ、又はＥＤＣ／ＨＯＳｕのような、ペプチド結合の形成に使用される試薬からなる群から選択され得る。カップリング反応に対する適切な溶媒は、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦ、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択され得る。洗浄溶液は、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、ＭｅＯＨ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ＣＨ３ＣＮ、水、緩衝剤、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択され得る。反応温度は、おおよそ２０℃乃至おおよそ９０℃の温度範囲にある。その反応におけるカルボキシル基に対する好適な活性化試剤は、ＥＤＣ／ＮＨＳである。カップリング反応における好適な塩基は、トリエチルアミン（ＴＥＡ）である。カップリング反応における好適な溶媒は、クロロホルム及びＤＭＦの混合物である。好適な反応温度は、おおよそ４５℃乃至おおよそ８５℃の範囲にある。
【００４７】
（ペプチジル樹脂とスペーサ−脂質の共役）
本発明に従って、脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂を、
（１）端の基を官能性にしたスペーサ−脂質の共役体を調製する、及び
（２）その共役体をペプチジル樹脂とカップリングさせる、
ステップを含む過程によって合成することができる。端の基を官能性にしたスペーサ−脂質の共役体を、端の基を官能性にしたスペーサを脂質と共役させることによって、合成することができる。本発明の一つの実施例において、端の基を官能性にしたスペーサは、官能性にしたＰＥＧである。様々な端の基を官能性にした又は活性化したＰＥＧの調製に対する調査を、Ｚａｌｉｐｓｋｙ．  Ｓ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ６，  １５０−１６５  （１９９５）の技術に見ることができる。端の基を官能性にしたＰＥＧ−脂質の共役体を合成するための例は、Ｂｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １１４９，  １８０−１８４  （１９９３）、及びＺａｌｉｐｓｋｙ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ４，  ２６９−２９９  （１９９３）に記載されている。
【００４８】
本発明に従って、端の基を官能性にしたＰＥＧ−脂質の共役体を、上述の方法に従って、ペプチジル樹脂とカップリングさせることができる。
【００４９】
（Ｃ．樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質の開裂）
本発明に従って、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質の開裂は、脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂と共に開裂試薬を振とうさせることによって達成される。一般的に、本発明において使用される開裂試薬及び手順は、ＳＰＰＳの技術において使用される処理と同じである。
【００５０】
Ｃ末端にカルボキシル基をもつペプチド−スペーサ−脂質共役体を合成するために、Ｗａｎｇ樹脂、２−クロロトリチル＝クロリド樹脂、及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂を使用するとき、脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂を、開裂試薬（少なくとも一つの酸、捕捉剤、及び溶媒の混合物）によって開裂させることができる。
【００５１】
酸を、実質的にＴＦＡ、フッ化水素（ＨＦ）、及びトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）からなる群から選択することができる。捕捉剤を、実質的にチオアニソール、アニソール、エタンジチオール（ＥＤＴ）、ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）、エチルメチルスルフィド、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、４−メチルメルカプトフェノール、ベンジルメルカプタン、トリエチルシラン、及び水からなる群から選択することができる。ペプチド−スペーサ−脂質の開裂に対する適切な溶媒は、ＤＣＭ、クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦ、及びそれらの異なる比の混合物を含むが、限定はされない。樹脂からの脂質−スペーサ−ペプチドの開裂は、Ｂｏｃの化学の場合におけるＨＦ又はＴＦＭＳＡ、及びＦｍｏｃの化学におけるＴＦＡのような強酸を要求する。ＤＣＭ及びＤＭＦは、開裂に使用される一次溶媒である。
【００５２】
ペプチド−スペーサ−脂質共役体の低級アルキルアミドのＣ末端を合成するために、ヒドロキシメチル樹脂又はＷａｎｇ樹脂を使用するとき、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質共役体の開裂は、好ましくは、アルキルアミン、塩化アルミニウム、及びＤＣＭの混合物の下で、進行することができる。当技術においては、ここでは参照によって組み込まれるＣ．  Ｒ．  ＭｃＡｒｔｈｕｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８２），  Ｃａｎ．Ｊ．  Ｃｈｅｍ．，  ６０，  １８３６のような開裂の手順が知られている。ペプチド−スペーサ−脂質共役体の低級のアルキル化されたカルボキシルＣ末端を合成するために、ヒドロキシメチル樹脂又はＷａｎｇ樹脂を使用するとき、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質共役体の開裂は、好ましくは、アルキルアルコール、ＴＥＡ、シアン化カリウム、及びベンゼンの混合物の下で、進行することができる。当技術においては、ここでは参照によって組み込まれるＭｏｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４），  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３５，  ８９１５のような開裂の手順が知られている。ペプチド−スペーサ−脂質共役体のアミド化されたカルボキシルＣ末端を合成するために、Ｒｉｎｋのアミド樹脂を使用するとき、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質共役体の開裂は、好ましくは、ＴＦＡ、捕捉剤、及びＤＣＭの混合物の下で、進行することができる。ペプチド−スペーサ−脂質共役体のアミド化されたカルボキシルＣ末端を合成するために、ＭＢＨＡ樹脂を使用するとき、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質共役体の開裂は、好ましくは、ＨＦ及び捕捉剤の混合物の下で、進行することができる。ペプチド−スペーサ−脂質共役体のアルキルアミドのＣ末端を合成するために、オキシム樹脂を使用するとき、好ましく使用される開裂試薬は、ＲＮＨ２である。ペプチド−スペーサ−脂質共役体のアルキルエステルのＣ末端を合成するために、オキシム樹脂を使用するとき、好ましく使用される開裂試薬は、アルキルアルコール及びＴＦＥである。
【００５３】
（Ｄ．側鎖を保護する基の除去）
一般的に、本発明における側鎖を保護する基は、ＳＰＰＳの技術において使用される同じ過程によって取り除かれる。アミノ酸のｔ−Ｂｕ、Ｂｏｃ、Ｍｔｓ、Ｍｍｔ、Ｐｂｆ、Ｐｍｃ、Ｔｏｓ、Ｔｒｔのような、ほとんどの側鎖を保護する基を、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質の開裂の間に、ＴＦＡ又はＨＦによって取り除くことができる。他の側鎖を保護する基を、適切な脱保護試剤によって選択的に取り除くことができる。Ａｃｍを取り除くための好適な脱保護試剤は、Ｈｇ（ＩＩ）、Ａｇ（Ｉ）、Ｔｌ（ＩＩＩ）、及びＩ２を含むが、限定はされない。Ｂｚｌ、Ｚ、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）を取り除くための好適な脱保護剤は、活性炭触媒（Ｐｄ−Ｃ）／水素ガスに保持されたパラジウム（Ｐｄ）である。ｔＢｕｔｈｉｏを取り除くための好適な脱保護剤は、チオ及びトリブチルホスフィンを含む。Ｆｍｏｃを取り除くための好適な脱保護剤は、ピペリジンである。
【００５４】
（Ｅ．共役体のペプチド部分の変性）
本発明に従って、ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を、当技術において知られている方法に従ってペプチド内の二つのアミノ酸又はそれらの誘導体の間に分子内の連結を形成することによって、環状の形態に変性させてもよい。分子内の連結の例は、以下に示すジスルフィド、アミド、エステル、チオエーテル、チオアセタート、及びチオアセタミン（ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｎｅ）を含むが、限定はされない。
【００５５】
【化１】
2004189617.tif 000003
ここでＸ及びＹは、１乃至３の範囲の整数を表し、Ｘは、Ｃｌ又はＢｒのいずれかを表し、Ｙは、ＮＨ又はＯのいずれかを表す。
【００５６】
分子内のジスルフィド結合を、ペプチド内のチオールを特異的に酸化するためのＩ２、Ｔｌ（ＩＩＩ）及び空気のような酸化剤を使用することによって、形成することができる。ペプチド内に、アミノ基をもつアミド結合を形成するために、又はヒドロキシ基をもつエステル結合を形成するために、アミド及びエステル結合を、ＤＣＣ／ＨＯＢｔのようなカルボキシル基の活性剤を使用することによって、調製することができる。チオエーテル結合及びアルファ位が置換された酢酸の連結を、クロロ又はブロモ基を硫黄群で置換することによって、調製することができる。各々がここでは参照によって組み込まれる、Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ，  Ｄ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９９５，  ３６，  ８８７１−８８７４、Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９２，  ３５，  ２０４０−２０４８、及びＯｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９１，  ５６，  ３１４６−３
１４９の例を参照のこと。
【００５７】
（Ｆ．ペプチド−スペーサ−脂質共役体の精製）
本発明に従って、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を精製するための方法は、カラムクロマトグラフィー、膜透析、及びそれらの組み合わせを含むが、限定はされない。
【００５８】
本発明の一つの実施例において、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を、ゲル濾過の媒質を使用するカラムクロマトグラフィーの方法によって、精製することができる。ゲル濾過の媒質は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ及びＬＨシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、及びＳｕｐｅｒｏｓｅシリーズを含むが、限定はされない。
【００５９】
本発明の別の実施例において、逆相クロマトグラフィーを使用するカラムクロマトグラフィーの方法によって、ペプチド−スペーサ−脂質共役体もまた精製することができる。逆相クロマトグラフィーは、Ｃ８及びＣ１８シリーズのクロマトグラフィーを含むが、限定はされない。
【００６０】
本発明のさらなる実施例において、凝集した形態のペプチド−スペーサ−脂質共役体を、ペプチド−スペーサ、ペプチド、及び他の遊離の小さな分子のような所望されない成分を含有する混合物から、膜透析によって隔離することができる。透析膜は、１００，０００ダルトンより小さく切られた分子量の孔の大きさを有することが好ましい。
【００６１】
（ＩＩ．ペプチド−スペーサ−脂質共役体）
本発明に従って、ペプチド−スペーサ−脂質共役体は、本方法によって合成され、一方の端でペプチド配位子及び他方の端で脂質と電子対を共有して共役する、各端に連結官能基を有する直鎖の親水性の重合体の鎖で構成される。ペプチド−スペーサ−脂質共役体を、リポソーム中へ組み込むことができ、共役体の脂質は、共役体を細胞膜に固定するためにリポソームの二層中へ挿入されることによって、共役体のペプチド配位子は、細胞膜の外側における露出を促進させ、細胞又は組織へ選択的に結合することを促進させる。
【００６２】
（Ａ．ペプチド配位子）
本発明に従って、ペプチド配位子は、天然のアミノ酸で構成される合成ペプチドである。本発明の好適な実施例において、ペプチド配位子は、受容体に結合することができる。受容体を、実質的に、ソマトスタチン受容体、血管作用性小腸ペプチド受容体、インテグリン受容体、繊維芽細胞成長因子受容体、肝細胞成長因子受容体、表皮成長因子受容体、インシュリン様成長因子受容体、神経成長因子受容体、血管内皮成長因子受容体、血小板由来成長因子受容体、及び形質転換成長因子受容体からなる群から選択することができる。
【００６３】
本発明の別の実施例において、ペプチド配位子を、実質的に、ホルモン、サイトカイン、毒素、ケモタキシン（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｎ）、及び細胞接着用の細胞外基質のペプチドからなる群から選択することができる。
【００６４】
ペプチド配位子及び配位子−受容体の組みの例を、以下の表ＩＩに列挙する。
【００６５】
表ＩＩ．配位子−受容体の組み及びペプチド配位子の例
【００６６】
【表２】
2004189617.tif 000004
本発明の別の実施例において、ペプチド配位子は、ホルモンである。本発明に従って、ホルモンは、ソマトスタチン、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含むが、限定はされない。
【００６７】
本発明の別の好適な実施例において、ペプチド配位子は、インテグリン又はラミニン受容体に結合する、細胞外基質のペプチドの断片である。これらのペプチドの例は、実質的にＲＧＤ、ＲＧＥ、ＤＧＥＡ、ＥＩＬＤＶ、ＧＰＲＰ、ＫＱＡＧＤＶ、及びＱＫＲＬＤＧＳからなる群から選択されるアミノ酸配列順序を含有するペプチドを含むが、限定はされない。
【００６８】
本発明の別の好適な実施例において、ペプチド配位子は、
ＥＧＦ（２０−３１）
Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ、
ＦＧＦ  Ｉ．酸性の脳由来（１−１１）
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、
ラミニン結合阻害剤（ラミニンＢ−１（４４２−４４７））
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、
インテグリン結合阻害剤（フィブロネクチンＣＳ−３）
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、
フィブロネクチンＣＳ−１（１３７８−１３８２）
Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ、
ＦＧＦ（１１９−１２６）
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、
ＩＧＦ  Ｉ（３０−４１）
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ、
ＨＧＦ
Ｇｌｙ−Ｈｌｓ−Ｌｙｓ、
プレプロ−神経成長因子（９９−１５）
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ、
血小板由来成長因子の拮抗体（ＰＤＧＦ  Ａ−鎖  １９４−２１１）
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ、
ＴＧＦ  アルファ（３４−４３）
Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ、
ＶＩＰ（１−１２）
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ、
ＶＥＧＦ（ＧＳＴ−ＥＸｏｎ  ７（１−２０））
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ、
エンドスタチン（脈管形成のホモロジー領域）
Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ、
オクトレオチド（ソマトスタチンの類似）
環状の（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−  Ｃｙｓ−Ｔｈｒ（オール）
である。
【００６９】
本発明に従って、ペプチド配位子は、一つ又はそれ以上の以下の変性を含有する上で定義したペプチド配位子の類似体である、ペプチド擬態物であり得る。
【００７０】
（１）ペプチド内のアミノ酸を、天然でないアミノ酸で置き換える。
【００７１】
（２）ペプチド内のアミノ酸を、Ｄ形の天然のアミノ酸で置き換える。
【００７２】
（３）ペプチドのＣ末端のカルボキシル基を、アミド、低級アルキルアミド、ジ−（低級アルキル）アミド、低級エステル誘導体、ヒドロキシ、又は低級アルコキシに変性させる。
【００７３】
（４）ペプチドを環化させる。
【００７４】
（アミノ酸）
本発明に従って、アミノ酸は、少なくとも一つのカルボン酸基及び一つのアミノ基を含有する有機化合物として定義される。好適なアミノ酸は、Ｄ又はＬ形の天然のアミノ酸及び天然でないアミノ酸を含む。
【００７５】
天然のアミノ酸は、アミノ基及びカルボキシル基がある炭素に付けられる、２０のアルファ−アミノ酸を含有する。天然のアミノ酸は、無極性又は疎水性の側鎖を有する、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、及びトリプトファンを含み、酸性の側鎖を有する、アスパラギン酸、及びグルタミン酸を含み、塩基性の側鎖を有する、リシン、アルギニン、及びヒスチジンを含み、帯電してない親水性の側鎖を有する、アスパラギン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、及びシステインを含む。
【００７６】
本発明の天然でないアミノ酸は、側鎖を変性させたアミノ酸、非アルファ−アミノ酸、及びＮ−メチルアミノ酸を含む。
【００７７】
側鎖を変性させたアミノ酸は、アルファ−アミノ酸であり、ここで各アミノ酸の側鎖は、天然ではないか、又は天然のアミノ酸から変性する。側鎖を変性させたアミノ酸の例は、２−アミノ酪酸、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸、アルファ−アミノイソ酪酸、ビフェニルアラニン、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン、アルファ−ｔ−ブチルグリシン、３−シクロヘキシルアラニン、アルファ−シクロヘキシルグリシン、（Ｓ）−２，３−ジアミノプロピオン酸、（Ｓ）−２，３−ジアミノ酪酸、２−アミノ−４−フェニル酪酸、ホモセリン、ホモチロシン、（Ｓ）−（−）−インドリン−２−カルボン酸、ベータ−２−ナフチルアラニン、３−（１−ナフチル）−アラニン、３−（２−ナフチル）−アラニン、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、ペニシラミン、ｐ−アミノフェニルアラニン、４−ブロモフェニルアラニン、２−クロロフェニルアラニン、３−クロロフェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、３，４−ジフルオロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、５−ヒドロキシトリプトファン、４−ヨードフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、ピペコリン酸、プロパルギルグリシン、チアゾリジン−４−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３，５−ジヨードチロシン、３−ヨードチロシン、３−ニトロチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、ジエチルグリシン、ジ−ｎ−プロピルグリシン、ジ−ｎ−ブチルグリシン、１−アミノ−１−シクロプロパン−１−カルボン酸、１−アミノ−１−シクロペンタン−カルボン酸、１−アミノ−１−シクロヘキサン−１−カルボン酸、及び４−ヒドロキシプロリンを含むが、限定はされない。
【００７８】
非アルファ−アミノ酸は、そのアミノ基およびカルボキシル基が、同じ炭素に付いてないアミノ酸である。非アルファ−アミノ酸の例は、２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、４−（アミノメチル）安息香酸、４−（アミノメチル）シクロヘキサン、ベータ−アラニン、ガンマ−アミノ酪酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノヘキサン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸、１１−アミノウンデカン酸、１２−アミノドデカン酸、イソニペコチン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸、及び４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸を含むが、限定はされない。
【００７９】
Ｎ−アルキルアミノ酸は、アルファ−アミノ基がモノアルキル化されたアミノ酸である。アルキル基は、メチル、エチル、及びプロピルを含むが、限定はされない。
【００８０】
（アミノアルコール）
本発明に従って、アミノアルコールは、カルボキシル基がヒドロキシ基に変成した、変性したアミノ酸である。アミノアルコールを、ペプチド鎖のＣ末端に共役させることができる。
【００８１】
（ペプチド配位子の環化）
本発明に従って、ペプチド配位子を、上述の方法のようなペプチド配位子における二つのアミノ酸又はそれらの誘導体の間で分子内の連結を形成することによって、環化させることができる。
【００８２】
（Ｂ．連結官能基）
本発明に従って、連結官能基は、電子対を共有してスペーサに脂質又はペプチド配位子を連結することができる任意の官能基である。表Ｉに列挙したものを含むが、限定はされない、多種多様な官能基が、ペプチド−スペーサ−脂質共役体における使用に適切である。
【００８３】
（Ｃ．スペーサ基）
本発明に従って、スペーサは、ペプチド及び脂質を付けるために鎖の各端に連結官能基を含有する、直鎖の親水性重合体の鎖である。本発明における適切なスペーサは、ポリグリシン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリメタクリルアミド、ポリジメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリラート、ポリヒドロキシプロピルメタクリラート、ポリオキシアルケン、及び親水性ペプチドを含むが、限定はされない。
【００８４】
本発明の好適な実施例において、スペーサは、１００−１０，０００ダルトンの間における、より好ましくは１００−５，０００ダルトンの間における分子量を有するポリエチレングリコールである。
【００８５】
（Ｄ．脂質）
本発明に従って、脂質は、水中に二層の小胞を自然に形成することができる、又は脂質の二層中へ安定に組み込むことができる、同じ分子に親水性及び疎水性部分を所有する天然又は合成の両親媒性分子のいずれかである。
【００８６】
本発明の実施例において、脂質は、ホスホジグリセリド及びスフィンゴ脂質を含むリン脂質である。ホスホジグリセリドは、１及び２位でエステル又はエーテル結合を通じて二つの炭化水素の鎖及び３位でホスホリルヘッドグループへ連結される、三つの炭素のグリセロールをもつ構造を有する。スフィンゴ脂質は、ホスホリルヘッドグループへ連結される、アミド結合を通じてスフィンゴシンの窒素に連結される炭化水素の鎖からなる。リン脂質のホスホリルヘッドグループは、ホスホリルコリン、ホスホリルエタノールアミン、ホスホリルセリン、ホスホリルグリセロール、ホスホリルイノシトール、及びリン酸塩の酸であり得る。リン脂質における炭化水素の鎖は、典型的には、鎖長において１４−２２個の炭素原子を有し、飽和したもの又は数個程度の不飽和であり得る。
【００８７】
本発明の別の好適な実施例において、脂質は、ジステアリルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。
【００８８】
脂質の二層中へ安定に組み込むことができる脂質は、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミタート、グリセロールリシノレアート、ヘキサデシルミリスタート、イソプロピルミリスタート、両性のアクリル重合体、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアクリルグリセロールスクシナート、ジアシルグリセロール、脂肪酸などを含むが、限定はされない。
【００８９】
本発明の別の実施例において、ステロール、炭化水素の鎖、又は二つの炭化水素の鎖のような中性の親油性部分に連結する、アミン、ポリアミン、又はポリリシンのような、正に帯電したヘッドグループからなる脂質は、陽イオンの脂質である。陽イオンの脂質の例は、１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＰＡＴ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム＝ブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム＝ブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム＝コリド（ＤＯＴＭＡ）、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバミル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、及びジメチルアンモニウム＝ブロミド（ＤＤＡＢ）を含む。
【００９０】
（ＩＩＩ．目標とされる治療に役立つリポソーム）
本発明は、本方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体を含有する目標とされる治療に役立つリポソームをさらに提供する。
【００９１】
本発明における目標とされる治療に役立つリポソームは、
（ｉ）リポソームの膜を形成するための一つ又はそれ以上の脂質、
（ｉｉ）標的にする部分としてリポソームの膜に組み込まれる一つ又はそれ以上のペプチド−スペーサ−脂質共役体、
（ｉｉｉ）リポソームに組み込まれる治療又は診断の試剤、及び
（ｉｖ）自由選択で、リポソームに組み込まれる、その表面を変性させるための、親水性重合体−脂質共役体、
を含む。
【００９２】
（Ａ．目標とされる治療に役立つリポソームの成分）
（脂質）
リポソームの調製に適切な脂質は、実質的に、上で定義した脂質からなる群から選択される一つ又はそれ以上の脂質であり得る。
【００９３】
本発明の実施例において、リポソームに使用される脂質は、リン脂質及びコレステロールを含む。好適なリン脂質は、実質的に水素化した大豆のホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵のホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、及びジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなる群から選択される。
【００９４】
本発明の別の実施例において、リポソームに使用される脂質は、ＤＯＰＥ又はコレステロールのような脂質及び天然の脂質を含む。
【００９５】
（親水性重合体−脂質共役体）
本発明におけるリポソームの表面を、リポソームの二層中へ組み込む重合体−脂質共役体を通じて、親水性重合体によって変性させることができる。本発明における重合体−脂質共役体は、繰り返し単位及び脂質のヘッドグループに付く連結官能基を有する直鎖の親水性重合体の鎖である。このような親水性重合体は、ポリグリシン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリメタクリルアミド、ポリジメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリラート、ポリヒドロキシプロピルメタクリラート、ポリオキシアルケン、及び親水性ペプチドを含むが、限定はされない。
【００９６】
本発明の好適な実施例において、重合体−脂質共役体における重合体は、１００−１０，０００ダルトンの間における、より好ましくは１００−５，０００ダルトンの間における平均分子量を有するＰＥＧである。モノメトキシ又はモノエトキシＰＥＧ誘導体もまた、脂質共役体に対する好適な重合体である。
【００９７】
（ペプチド−スペーサ−脂質共役体）
本発明に従って、リポソーム中へ組み込むための適切なペプチド−スペーサ−脂質共役体は、上述の方法によって合成される一つ又はそれ以上のペプチド−スペーサ−脂質共役体である。
【００９８】
（治療薬）
医療の用途における使用のためにリポソーム中に組み込むことに適切な様々な治療薬は、当技術において知られている。しかしながら、本発明に従って、適切な治療薬は、抗腫瘍性、抗脈管形成、抗菌性、抗ウィルス性、駆虫性、抗真菌性、免疫増強、免疫抑制、抗偏頭痛、解熱性、抗血清、抗炎症、抗凝固性、代謝拮抗、抗利尿、抗てんかん作用、抗有糸分裂性、抗関節炎、抗不整脈性、抗老化、鎮痛性、麻酔、止血性、ホルモン性、ホルモン性抑制、高カルシウム緩和、低カルシウム緩和、高血糖緩和、低血糖緩和、筋弛緩、神経伝達、向精神性、心血管性、血栓崩壊性、及び血管拡張性である、治療効果を有する天然及び合成の化合物を含むが、限定はされない。
【００９９】
本発明に従って、リポソームにおける取り込みのための適切な治療薬は、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤、脈管形成阻害剤、ＤＮＡ転写酵素阻害剤、カンプトテシン及び類似体、抗生物質、駆虫性物質、抗腫瘍性物質、抗炎症剤、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害剤、ＤＮＡと反応する又は結合する抗癌剤、免疫変性剤（ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、化学的放射線増感剤及び防護剤、並びに光化学活性抗癌剤を含むが、限定はされない。
【０１００】
本発明の好適な実施例において、組み込まれる治療薬は、Ｆｏｙｅ  Ｗ．  Ｏ．  （ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ，  （１９９５））に記載されているような当技術において知られているカンプトテシン及び類似体を含むが、限定されない、トポイソメラーゼＩ阻害剤である。
【０１０１】
本発明の別の好適な実施例において、組み込まれる治療薬は、トポイソメラーゼＩＩを阻害するアントラサイクリンである。この種の薬物の例は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、及びイダルビシンである。
【０１０２】
本発明の別の好適な実施例において、組み込まれる治療薬は、ビンブラスチン、ナベルビン、ビンクリスチン、ビングリシナート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）、ビントリポール（ｖｉｎｔｒｙｐｏｌ）、及びビンゾリジン（ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ）のような有糸分裂阻害剤である。
【０１０３】
本発明の別の実施例において、組み込まれる治療薬は、抗炎症剤である。
【０１０４】
別の実施例において、組み込まれる治療薬は、デキストリン  ２−サルファート、ウクレイン（ｕｋｒａｉｎ）、サリドマイド、アンギオスタチン、エンドスタチン、及び１−［１１−（ドデシルアミノ）−１０−ヒドロキシウンデシル］−３，７−ジメチル−キサンチンのような脈管形成阻害剤である。
【０１０５】
本発明の別の実施例において、組み込まれる治療薬は、遺伝子、遺伝子の部分、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、及びそれらの類似体を含むが限定はされない、核の遺伝子を含む。治療薬としての使用のための適切な遺伝子は、
（１）ｐ５３、ＢＲ１、ＡＰＣ、Ｒｂ、ＤＣＣ、ＨＮＰＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＢＲＣＡ１、又はＢＲＣＡ２のような、突然変異による遺伝子の欠乏した機能を補償してもよい癌抑制遺伝子、
（２）ＨＳＶ−ｔｋのような、宿主細胞において不活性なプロドラッグを細胞毒性化合物へ変換してもよい毒素遺伝子、
（３）ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、又はＧＭ−ＣＳＦのような、免疫系の細胞の成分を腫瘍に向けて変性させてもよいか、又は免疫応答を誘導するために腫瘍細胞を変性させてもよい、免疫遺伝子、
（４）肝臓チトクロームＰ４５０遺伝子、ＣＹＰ２Ｂ１、又はｔｋ遺伝子のような、化学療法剤及び放射線治療に対する細胞の感受性に影響を及ぼす、化学的増感作用又は放射性増感作用に対する遺伝子、
（５）ＴＮＦ／ＴＮＦＲ１、Ａｐｏ３Ｌ／ＤＲ３、Ａｐｏ２Ｌ／ＤＲ４若しくは５、チトクロームｃ、ＴＰ５３、Ｅ１Ａ、バックス（ｂａｘ）、ｂｃｌ−ｘｓ、アポプチン、ｂｃｌ−２、サバイビング（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）、ＸＩＡＰ、ＩＡＰ−１、又はＩＡＰ−２のような、細胞の消滅過程を調節する遺伝子又はタンパク質が符号化された遺伝子、及び
（６）ＭＤＲ１のような、薬物抵抗性に対応する遺伝子
を含むが、限定はされない。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドは、遺伝子の翻訳又は転写を規制するためにｍＲＮＡ又はＤＮＡに結合してもよいアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むが、限定はされない。アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的遺伝子は、癌抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、ＢＲ１、Ｅ１Ａ、及びＢＲＣＡ１）の突然変異体、癌遺伝子（例えば、ｋ−ｒａｓ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、及びｃ−ｆｏｓ）、成長因子の遺伝子（例えば、ＩＧＦ１、ＰＤＧＦ、酸性及び塩基性のＦＧＦ、並びにＴＧＦβ）、多剤抵抗性に応じるタンパク質を符号化している遺伝子（例えば、ＭＤＲ１）を含むが、限定はされない。
【０１０７】
（診断薬）
本発明で使用される診断薬は、ガンマシンチグラフィーにおける撮像試剤用のガンマを放出する放射性ヌクレオチド、コンピュータ断層撮影用の放射線不透物質、及び磁気共鳴用の常磁性の金属イオンを含むが、限定はされない。
【０１０８】
本発明の好適な実施例において、ガンマを放出する放射性核種は、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、及び９９ｍＴｃである。
【０１０９】
本発明の好適な実施例において、常磁性の金属イオンは、Ｇｄである。
【０１１０】
（Ｂ．リポソーム）
本発明に従って、目標とされる治療に役立つリポソームを調製することに適切なリポソームは、一つ又はそれ以上の脂質によって形成される二層の膜からなる球状の粒子であり、一つ又はそれ以上の水性の区画をそれらの中に囲む。
【０１１１】
本発明に従って、リポソームの大きさは、標的器官又は組織及び送達される治療薬に依存して、おおよそ３０ｎｍからおおよそ１０００ｎｍまでの範囲にわたる。例えば、好適なリポソームの大きさは、血流送達治療薬に関しては、おおよそ５０ｎｍ乃至おおよそ１５０ｎｍの範囲にあり、組織又は腫瘍の部位へ直接適用される治療薬に関しては、好適なリポソームの大きさは、おおよそ３０ｎｍ乃至おおよそ８０ｎｍの範囲にある。
【０１１２】
本発明の好適な実施例において、リポソームは、（１）大豆又は卵から抽出される天然のリン脂質、（２）コレステロール、（３）重合体−脂質共役体で構成される。
【０１１３】
本発明の別の実施例において、リポソームは、ＤＯＰＥ及びコレステロールのような、陽イオンの脂質及び一つ又はそれ以上の中性の脂質の成分を含む、陽イオンのリポソームである。
【０１１４】
（Ｃ．目標とする治療に役立つリポソームの調製）
本発明に従って、リポソームを含有する治療薬中に本方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体を組み込むことによって、目標とされる治療に役立つリポソームを調製することができる。
【０１１５】
本発明のリポソームを、当技術において知られている多種多様な方法、例えば、ここでは参照によって組み込まれる、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ｇ．，  ｅｄ．  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．，  Ｉ，  ＩＩ，  ＩＩＩ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．，  １９８４、Ｓｚｏｋａ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９：４７６  （１９８０）、及びＮｅｗ，  Ｒ．Ｒ．Ｃ．，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，  ａ  Ｐｒａｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９０によって調製することができる。
【０１１６】
本発明の実施例において、脂質のフィルムを水和させることによってリポソームを調製して、初期の多層の小胞を生成させ、押し出し又は均質化の方法を受けて、小胞の大きさを減少させる。典型的には、有機溶媒中における親水性重合体−脂質共役体をもつ又はもたない脂質（又は脂質の組み合わせ）を、真空中で蒸発及び乾燥させて、容器中に薄いフィルムを形成する。脂質のフィルムを、渦運動させることによって水溶液中で水和させて、初期の多層の小胞を形成する。次に、水性の小胞に、数サイクルの凍結及び解凍を行なう。ここでは参照によって組み込まれる、Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ８１２，  ５５−６５  （１９８５）、Ｍａｙｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ７７５，  １６９−１７４  （１９８４）、及びＢｒａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ．  Ｇ．，  ｅｄ．  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  Ｉ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ．  Ｆｌａ．，  １９９２，  ｐｐ．  ４９−６５に記載されているような膜の押し出し又は均質化の方法のいずれかによって、懸濁する多層の小胞の大きさを小さくする。
【０１１７】
リポソームに治療又は診断の試剤を投入することは、水溶性の、疎水性及びイオン性の化合物を投入する方法を含む。一般的に、水溶性化合物は、水溶液中で試剤を溶解させると共に脂質のフィルムと混合させることによって、リポソーム中に包まれる。疎水性の試剤を、適切な有機溶媒中で脂質又は脂質の組み合わせを共に試剤を溶解させて、次に溶媒を蒸発させて薄いフィルムを生成させることによって、リポソーム中に閉じ込めるか又は脂質の二層中に組み込むことができる。イオン性の試剤を投入する方法を、ここでは参照によって組み込まれるＭａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７，  ２０５３−２０６０  （１９８８）、及びＨａｒａｎ．  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １１５１，  ２０１−２１５  （１９９３）に記載されているようなｐＨ、イオンの勾配の方法によって行なうことができる。
【０１１８】
ＤＮＡを、（１）ＤＮＡをリポソーム中へ閉じ込めること、（２）リポプレックス（ＤＮＡ−リポソーム複合体）を形成すること、及び（３）リポポリプレックス（リポソーム、ポリカチオン性重合体、及びＤＮＡの複合体）を形成すること、を含むが、限定はされないいくつかの方法によって、リポソームに組み込むことができる。これらのＤＮＡが組み込まれたリポソームを調製するための方法は、当技術、例えば、ここでは参照によって組み込まれるＨｕｇ  Ｐ  ａｎｄ  Ｓｌｅｉｇｈｔ  Ｒ．Ｇ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １０９７：１−１７  （１９９１）、Ｎａｂｅｌ，  Ｇ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９０，  １１３０７−１１３１１  （１９９３）、Ｇａｏ，  Ｘ．  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ  Ｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３５，  １０２７−ｌ０３６  （１９９６）、及びＷｈｉｔｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ６，  １８６７−１８７５  （１９９９）において、知られている。
【０１１９】
本発明に従って、治療薬を含有するリポソームと共にペプチド−スペーサ−脂質共役体／メトキシポリエチレングリコール−ジステアリルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）のミセルを、脂質も膜の転移温度よりも高い温度で保温することによって、ペプチド−スペーサ−脂質共役体をリポソームの膜中へ組み込むことを達成することができる。一般的に、ペプチド−スペーサ−脂質共役体／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥの乾燥させた脂質のフィルムを、共役体の臨界のミセルの濃度より高い濃度における水性の緩衝材中で、上昇させた温度における混合物の穏やかな渦運動と共に、水和させる。脂質のフィルムを溶融させて混合物が澄んだミセルの溶液になった後、次にミセルの溶液を、挿入を完了するための時間の間にリポソームの膜の転移温度よりも高い温度で、治療薬を含有するリポソーム中へ移す。次に、サイズ排除カラムを通じて溶液を通過させて、ミセル及び目標とされるリポソームを分離する。ミセル及び目標とされるリポソームのフラクションを、定量分析用に別々に蓄える。
【０１２０】
本発明に従って、脂質の膜の転移温度は、目標とされる治療に役立つリポソームの調製を遂げる。本発明におけるリポソームの適切な転移温度は、おおよそ３℃−おおよそ７０℃の範囲にある。
【０１２１】
【実施例】
以下の例を、本発明を限定するためでなく、説明のために使用する。
【０１２２】
（例１：アミノアルコールの調製）
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−アルコール（Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール）の調製
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（１当量，０．６６３ｇ，１．６７ｍｍｏｌ）を、２ｍｌのエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）中に懸濁させ、窒素下で−１５℃以下に冷やした。Ｎ−メチルモルホリン（１当量，０．１９ｍｌ，１．６７ｍｍｏｌ）及びイソブチル＝クロロホルマート（１当量，０．２２ｍｌ，１．６７ｍｍｏｌ）の添加後、混合物を、−１５℃で攪拌した。５分の攪拌後、沈殿を除去し、５ｍｌの水中におけるＮａＢＨ４（３当量）の懸濁液を添加して、別の１時間攪拌した。反応の終了において、４０ｍｌの水を添加した。混合物を、ＤＣＭ（２０ｍｌ×３）で抽出し、組み合わせた有機層を、５％のＮａＨＣＯ３で洗浄し、引き続き塩性溶液（例えば、ＮａＣｌ）で水洗し、無水Ｎａ２ＳＯ４（又はＭｇＳＯ４）で乾燥させた。溶媒を蒸発させた。粗Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−アルコールを、溶離剤としてＤＣＭを使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって精製した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．１６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，ＣＨＣＨ３），１．２０（９Ｈ，ｓ，ｔＢｕ），２．８８（１Ｈ，広い，ＯＨ），３．６１（１Ｈ，広い，ＣＨＣＨ２ＯＨ），３．６６（２Ｈ，広い，ＣＨＣＨ２ＯＨ），３．９４（１Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ３），４．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＣＨＣＨ２ＣＯ），４．４０（２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ２ＣＯ），５．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＮＨ），７．３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，芳香族），７．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，芳香族），７．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，芳香族），７．７４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，芳香族）
（例２：ペプチジル樹脂の調製）
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄの固相合成技術（Ｓｔｅｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  （１９８４）、及びＭｅｒｒｉｆｉｅｄ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  ８５，  ２１４９−２１５４  （１９６３）を参照のこと）に従ってペプチジル樹脂を調製した。本発明においては、Ｆｍｏｃ合成技術におけるＷａｎｇ樹脂、２−クロロトリチル＝クロリド樹脂、Ｒａｎｋのアミド樹脂を使用した。Ｗａｎｇ樹脂を使用して、それらがＣ末端でカルボン酸部分を有する、ペプチジル部分を合成した。２−クロロトリチル＝クロリド樹脂を使用して、それらがＣ末端でＰｒｏ、Ｃｙｓ、又はアミノアルコールを有する、ペプチジル部分を合成した。Ｒｉｎｋのアミド樹脂を使用して、それらがＣ末端でアミドを有する、ペプチジル部分を合成した。ＳＰＰＳにおけるこれらの樹脂の適用は、当技術、例えば、Ｗａｎｇ樹脂に関しては、Ｓ．−Ｓ．  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ９５，  １３２８  （１９７３）、及びＧ．  Ｌｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ４６，  ３４３３  （１９８１）、２−クロロトリチル＝クロリド樹脂に関しては、Ｋ．  Ｂａｒｌｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，  ３７，  ５１３  （１９９１）、及びＫ．  Ｂａｒｌｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，  ３８，  ５６２  （１９９１）、Ｒｉｎｋ樹脂に関しては、Ｈ．  Ｒｉｎｋ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ２８，  ３７８７  （１９８７）、Ｍ．  Ｓ．  Ｂｅｍａｔｏｗｉｃｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３０，  ４６４５  （１９８９）において記載されていた。
【０１２３】
ペプチド鎖の形成のためにアミノ基を、Ｆｍｏｃ基によって保護した。ｔ−ブチルを、チロシン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸に対する側鎖を保護する基として使用した。アスパラギン及びヒスチジンに対してはＴｒｔを使用した。リシン及びトリプトファンに対してはＢｏｃを使用した。アルギニンに対してはＰｂｆを使用した。システインに対してはＡｃｍを使用した。
【０１２４】
一般的に、ペプチドを、（１）３０分の２０％ピペリジン−ＤＭＦでＦｍｏｃ保護基を除去すること、並びに（２）ＤＭＦ中におけるＤＩＰＣＤＩ（２当量）及びＨＯＢｔ（２当量）とのＦｍｏｃアミノ酸誘導体（２当量）の２時間のカップリングからなるサイクルに従って合成した。樹脂が、カイザー試験（Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔａｌ．，  １９７０）に対して陽性になったときは、カップリング反応を繰り返した。所望のペプチドを合成した後、ペプチジル樹脂の小さな部分を、ＴＦＡ、クロロホルム、チオアニソール、ＥＤＴ、及びアニソールの開裂のカクテルによって開裂させた。開裂したペプチドを、ＨＰＬＣによって精製し、ＭＳによって同定した。構築されたペプチドを、以下のように列挙する。
【０１２５】
ＥＧＦ
Ｈ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ
ＭＳ予測：１５４３．７，  ＭＳ実測：１５４３．８、
ＦＧＦ  Ｉ
Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＨ
ＭＳ予測：１２８９．７，  ＭＳ実測：１２９０．４、
ラミニン結合阻害剤
Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＨ
ＭＳ予測：５５６．３，  ＭＳ実測：５５７、
インテグリン結合阻害剤
Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−ＯＨ
ＭＳ予測：５０４．２，  ＭＳ実測：５０５、
フィブロネクチンＣＳ−１フラグメント
Ｈ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＯＨ
ＭＳ予測：５８７．６，  ＭＳ実測：５８７．６、
ＦＧＦ（１１９−１２６）
Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＨ
ＭＳ予測：９９３．２，  ＭＳ実測：９９３．３、
ＩＧＦ  Ｉ（３０−４１）
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−ＯＨ
ＭＳ予測：１２６６．４，  ＭＳ実測：１２６７、
ＨＧＦ
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ
ＭＳ予測：３４０．３，  ＭＳ実測：３４０．１、
プレプロ神経成長因子（９９−１５）
Ｈ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨ
ＭＳ予測：２００３．２，  ＭＳ実測：２００３．０、
ソマトスタチンの類似体（オクトレオチド）
環状Ｈ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ（オール）
ＭＳ予測：１０１９．２，  ＭＳ実測：  １０１９．４、及び
ソマトスタチンの類似
環状Ｈ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ（オール）
ＭＳ予測：８９０，  ＭＳ実測：８９０
（例３：端の基を官能性にしたＰＥＧ誘導体の合成）
（カルボキシル−ＰＥＧ及びそれの活性なエステル）
カルボキシル−ＰＥＧ
ＰＥＧ２０００（８．６ｇ）及びカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２０ｇ）を、３００ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルアルコール中に溶解させ、４０℃まで温めた。エチル＝ブロモアセタート（１０ｍｌ）を２０分の間にわたって添加した。混合物を２時間攪拌し、次に溶媒を取り除くために蒸発させた。残留物を、２００ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨ中で加水分解し、室温で２時間攪拌した。加水分解の終了において、混合物のｐＨを、２まで調節し、ＣＨＣｌ３（２×２００ｍｌ）によって抽出した。組み合わせた抽出物を、水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて濃縮し、真空中で乾燥させた。白色のカルボキシル−ＰＥＧ粉末を得て、収量は６．８８ｇだった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３．６６（ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ），４．１３（ｓ，ＨＯ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｏ）
ＰＥＧ−オキシベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ（２．６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＤＩ（１．９１ｍｍｏｌ）、及びカルボキシル−ＰＥＧ３０００（０．８７ｍｍｏｌ）を、４ｍｌのＤＭＦ中で混合し、室温で２０分間、窒素下で攪拌した。混合物を加えて、ＰＥＧ−オキシベンゾトリアゾールのさらなる精製無しで、ペプチジル樹脂と共役させた。
【０１２６】
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）によるカルボキシル−ＰＥＧの活性化
ＤＭＡＰ（１．９１ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１．９１ｍｍｏｌ）及びカルボキシル−ＰＥＧ３０００（０．８７ｍｍｏｌ）を、４ｍｌのＤＭＦ中で混合し、室温で２０分間、窒素下で攪拌した。混合物を加えて、活性化したカルボキシル−ＰＥＧのさらなる精製無しで、ペプチジル樹脂と共役させた。
【０１２７】
カルボキシル−ＰＥＧのスクシンイミジルエステル（Ｓｕ−ＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ）
ＨＮＳ（２．６ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（２．６ｍｍｏｌ）を、４ｍｌのＤＭＦ中におけるカルボキシル−ＰＥＧ２０００（０．８７ｍｍｏｌ）の混合物中に添加し、室温で一晩、窒素下で攪拌した。反応の終了において、混合物を、溶媒を取り除くために蒸発させた。残留物を、１０ｍｌのＨ２Ｏに添加し、２０ｍｌのＤＣＭで三回抽出した。組み合わせた抽出物を、飽和の塩性溶液（例えば、ＮａＣｌ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、次に濃縮し、真空中で乾燥させた。粗生成物を、エーテルによって沈殿させ、さらにイソプロパノール／エーテルから精製して４５％を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．８７（ｓ，Ｏ−Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）２），３．６６（ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ），４．５３（ｓ，−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＯＳｕ）
ＰＥＧのｐ−ニトロフェニルカルボナート（ｐＮＰ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＰＥＧ）ｐ−ニトロフェニル＝クロロホルマート（２．２２ｇ）を、４０ｍｌのＤＣＭ中におけるＰＥＧ２０００（１０ｇ）及びＴＥＡ（１．３１ｍｌ）の混合物中に添加し、室温で一晩、窒素下で攪拌した。攪拌の終了において、混合物を濾過してＴＥＡ−ＨＣｌの塩を取り除き、蒸発させて溶媒を取り除いた。粗生成物を、イソプロピルエーテルによって沈殿させ、エチル＝アセタート及びエチルエーテルから二回再結晶させた。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３．６６（ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ），３．８０（４Ｈ，ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｈ４ＮＯ２），４．４４（４Ｈ，ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｈ４ＮＯ２），７．３８＆８．２８（８Ｈ，ｄｄ，−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｈ４ＮＯ２）
Ｔｏｓ−ＰＥＧ（ＣＨ３Ｃ６Ｈ４Ｓ（Ｏ２）Ｏ−ＰＥＧ）
Ｐ−トルエンスルホニルクロリド（２．２９ｇ）を、１５ｍｌのＤＣＭ中におけるＰＥＧ２０００（１０ｇ）及びピリジン（１．２１ｍｌ）の混合物中に添加し、室温で一晩、窒素下で攪拌した。反応の終了において、混合物を、溶媒を取り除くために蒸発させた。白色の粗生成物を、氷浴中において１／１．３の比のイソプロパノール／イソプロピルエーテルの混合溶媒によって沈殿させた。粗生成物を、１／１の体積比のエチル＝アセタート／エチルエーテルによって二回再結晶させた。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．３４（６Ｈ，ｓ，−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３），３．６６（ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ），４．１５（４Ｈ，ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３），７．１６＆７．７９（８Ｈ，ｄｄ，−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３）
（例４：スペーサ−脂質共役体の調製）
ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＤＳＰＥの調製
Ｓｕ−ＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００（０．６ｍｍｏｌ）を、ＤＳＰＥ（０．４４９ｇ，０．６ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．２ｍｌ，１．４ｍｍｏｌ）、及びＤＭＦ（５ｍｌ）を含有する混合物に添加した。混合物を、４時間の継続時間の間、４０℃乃至４５℃の温度範囲内で攪拌した。生成物を、クロロホルム／メタノール／水（３：１：０．１  ｖ／ｖ）の溶液を使用する薄層クロマトグラフィーによって確認した。
【０１２８】
Ｐｎｐ−Ｏ−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＤＳＰＥの調製
ｐＮＰ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００（０．６ｍｍｏｌ）を、ＤＳＰＥ（０．４５ｇ，０．６ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．６ｍｍｏｌ）、及びクロロホルム（１０ｍｌ）を含有する混合物に添加した。混合物を、おおよそ２時間の継続時間の間、４０℃乃至４５℃の温度範囲内で攪拌した。生成物を、クロロホルム／メタノール／水（３：１：０．１  ｖ／ｖ）の溶液を使用する薄層クロマトグラフィーによって確認した。
【０１２９】
（例５：ペプチジル樹脂へのスペーサの共役）
ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
２−クロロトリチル＝クロリド樹脂による固相のペプチド合成から得られたＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂（０．１３  ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ中における２０％ピペリジンの５ｍｌで処理し、ペプチジル樹脂のＮ末端からＦｍｏｃ保護基を取り除いた。Ｆｍｏｃを取り除いた後、樹脂を、ＤＭＦ（５ｍｌ×３）で洗浄した。５ｍｌのＤＭＦ中においてＨＯＢｔ（０．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＤＩ（０．８ｍｍｏｌ）、及びカルボキシル−ＰＥＧ６００（０．４ｍｍｏｌ）を混合することによって得られる、ＰＥＧ−オキシベンゾトリアゾールの混合物を、Ｈ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂に添加した。カップリング反応は、振とうと共に２時間、室温で進行した。反応の完了を、カイザー試験によって確かめた。反応の終了において、過剰の試薬及び副産物を洗浄して落とした。ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の小さい部分を、開裂させ、ＮＭＲ及びＭＳ分光法によって同定した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）は、δ３．５ｐｐｍにエチレングリコールのピーク及びペプチドのプロトンを示した。質量スペクトルにおいて、鈴形状の分子の分布が、ＰＥＧの異なる分子質量によって観察された。ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールに対する１７６３．５の測定された中央の分子量は、事実上、１７６３．６の計算した分子量と合う。
【０１３０】
ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
反応の条件及び手順を、カルボキシル−ＰＥＧ２０００を使用してカルボキシル−ＰＥＧ６００を置き換えたことを除いて、上述のように行なった。
【０１３１】
ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ３０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
反応の条件及び手順を、カルボキシル−ＰＥＧ３０００を使用してカルボキシル−ＰＥＧ６００を置き換えたことを除いて、上述のように行なった。
【０１３２】
ｐＮＰ−ＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
固相のペプチド合成から得られたＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂（０．１３  ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ中における２０％ピペリジンの５ｍｌで処理し、ペプチジル樹脂のＮ末端からＦｍｏｃ保護基を取り除いた。Ｆｍｏｃを取り除いた後、樹脂を、ＤＭＦ（５ｍｌ×３）で洗浄した。５ｍｌのＤＭＦ中におけるｐＮＰ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００（０．３９ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（１．１５ｍｍｏｌ）の混合物を、Ｈ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂に添加した。カップリング反応は、一晩、室温で進行した。反応の完了を、カイザー試験を使用して実証した。反応の終了において、過剰の試薬及び副産物を洗浄して落とした。合成されたＨＯ−ＰＥＧ２０００−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オール共役体の小さい部分を、樹脂から開裂させ、１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって同定した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）は、δ３．５ｐｐｍにエチレングリコールのピーク及びペプチドのプロトンを示した。
【０１３３】
（例６：スペーサ−ペプチジル樹脂への脂質の共役）
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
２ｍｌのＤＭＦ中のＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂  （０．１３ｍｍｏｌ）を、ＮＨＳ（０．４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（０．４ｍｍｏｌ）に添加し、次に混合物を、４時間、室温で振とうさせた。その後、ＤＳＰＥ（０．２６ｍｍｏｌ）を添加して、一晩、５５℃で混合溶媒中（４ｍｌのクロロホルム及び０．５ｍｌのＴＥＡ）で、活性化したＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂（０．１３ｍｍｏｌ）とカップリングさせた。反応後、樹脂を、クロロホルム、ＤＭＦ、及びＭｅＯＨで洗浄し、開裂を受けさせた。
【０１３４】
（例７：ペプチジル樹脂へのスペーサ−脂質の共役）
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（０．４ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＣＤＩ（０．８ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ（０．８ｍｍｏｌ）に添加した。溶液を、３０分間、室温で攪拌し、次にペプチジル樹脂へ添加した。カップリング反応は、振とうと共に、おおよそ２時間、おおよそ室温で進行する。反応の完了を、カイザー試験を使用して実証した。反応の終了において、過剰の試薬を洗浄して落とし、樹脂に開裂を受けさせた。
【０１３５】
（例８：脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂の開裂）
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂を、開裂のカクテル（５０％ＴＦＡ、４５％ＣＨＣｌ３、３．７５％アニソール、及び１．２５％ＥＤＴ）によって開裂させた。開裂した混合物を、追加の１０分間、室温で振とうさせて、保護基を完全に取り除いた。混合物を、氷浴中で冷却し、次に、冷えたエーテルを添加して生成物を沈殿させた。沈殿物を回転させ、冷えたエーテルで三回洗浄した。粗生成物を、Ｃ８シリカカラムをもつ液体クロマトグラフィーによって精製し、水中のメタノール勾配（０乃至８５％  ｖ／ｖ）で溶離させ、白色固体粉末を得た（２００ｍｇ／樹脂のｇ）。ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールを、１Ｈ−ＮＭＲ及びＭＳによって同定した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）δ（ｐｐｍ）：０．９０（６Ｈ，ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（５６Ｈ，ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），１．９７（６Ｈ，ｓ，−ＮＨＣ（Ｏ）−ＣＨ３），１．５９（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），２．３３（４Ｈ，ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），３．６３（２６８Ｈ，ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２３（１Ｈ，ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン），６．８５−８．５０（１５Ｈ，フェニルの芳香族プロトン，インドール）質量スペクトルの２４５１の測定された中央の分子量は、２４５０の計算した分子量に合う。
【０１３６】
（例９：脂質−スペーサ−ペプチド共役体のジスルフィドの環化）
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールを、１０当量のＩ２（１ｍｌのメタノール中で４０μｌの２０％のＩ２）で１．０ｍｇ／ｍｌより少ない濃度でメタノール中に溶解させ、混合物を、１時間、室温で振とうさせた。溶液を、Ｓｐｅｃｔｒａ／ＰｏｒＴＭの透析管（ＭＷＣＯ  ２，０００）のような透析管中へ移し、４℃の水に対して透析させた（３×１０００ｍｌ，８−１６時間毎周期）。次に、溶液を、凍結乾燥させて、白色のふわふわした固体を得た。環化したＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール（ｃ−ＯＰＤ６００）の質量スペクトルの測定された中央の分子量２３５１は、２３５１の計算した分子量に合う。１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）δ（ｐｐｍ）：０．９０（６Ｈ，ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（５６Ｈ，ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），１．５９（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），２．３１（４Ｈ，ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），３．６４（２６８Ｈ，ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２２（１Ｈ，ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン），６．８５−８．５０（１５Ｈ，フェニルの芳香族プロトン，インドール）
（例１０：ペプチド−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ共役体の追加の合成）
シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール（ｃ−ＯＰＤ２０００）の合成
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オール−樹脂を、ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オール−樹脂の合成と類似の手順によって合成した。簡単に、ペプチジル樹脂を、例２に記載した手順に従って調製した。ペプチジル樹脂へのＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＯＨの共役を、一晩、４５℃で、５ｍｌのＤＭＦ中のＨＯＢｔ（０．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＤＩ（０．８ｍｍｏｌ）、カルボキシル−ＰＥＧ２０００（０．４ｍｍｏｌ）、及びペプチジル樹脂（０．１３ｍｍｏｌ）を攪拌することによって進行させた。反応を実施した後、ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂（０．１３ｍｍｏｌ）を、５５℃で、２ｍｌのＤＭＦ中のＮＨＳ（０．４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（０．４ｍｍｏｌ）によって活性化した。ＰＥＧ−ペプチジル樹脂への脂質の共役を、混合溶媒中（４ｍｌのクロロホルム及び０．２ｍｌのＴＥＡ）で活性化したＰＥＧ−ペプチジル樹脂（０．１３ｍｍｏｌ）へＤＳＰＥを添加し、一晩、６０℃の油浴で加熱することによって行なった。樹脂からの共役体の開裂を、例８に記載したように行なった。得られた混合物を、１／１（ｖ／ｖ）の比のメタノール／Ｈ２Ｏの溶媒に溶解させ、次に、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ膜（ＭＷＣＯ：２５，０００ダルトン）を通じた透析を行なって、ペプチド−スペーサ、ペプチド、及び他の遊離の小さい分子のような望まれない成分を取り除いた。さらに、ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールを、例９に記載した過程を使用して、ジスルフィド結合の形成によって、環化した。環化した共役体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーを通じて精製し、得られたシクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オールを、１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）：δ（ｐｐｍ）：０．９０（６Ｈ，ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（５６Ｈ，ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），１．５９（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），２．３２（４Ｈ，ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），３．６０（１８０Ｈ，ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２２（１Ｈ，ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン），６．８５−８．５０（１５Ｈ，フェニルの芳香族プロトン，インドール）によって構造的に確認した。
【０１３７】
シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ３０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール（ｃ−ＯＰＤ３０００）の合成
シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ３０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オールを、使用したカルボキシル−ＰＥＧが３０００ダルトンの平均分子量を有したことを除いて、シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オールと同じ手順によって合成した。得られたシクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ３０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オールは、計算した平均分子量を合った約４６００の中央の分子量を有した。
【０１３８】
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−オールの合成
Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−オール−樹脂のペプチジル樹脂を、例２に記載したようなＦｍｏｃの化学において２−クロロトリチル＝クロリド樹脂を使用することによって合成した。以下の反応を、ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールの調製において記載したのと同じ手順によって行った。得られたＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−オールは、１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）δ（ｐｐｍ）：０．９０（ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），１．８０（ｄｄ，Ａｒｇのガンマ−炭素におけるＨ），１．９３（ｍ，Ａｒｇのベータ−炭素におけるＨ），２．３２（ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），２．８２（ｄｄ，Ａｓｐのベータ−炭素におけるＨ），２．９２（ｄｄ，Ａｓｐのベータ−炭素におけるＨ），３．６３（ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２２（ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン）を示した。ペプチドにおけるアルファ炭素及び残留物の他のプロトンは、δ１．５−４．７ｐｐｍの間に分布した。
【０１３９】
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−オールの合成
Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−オール−樹脂のペプチジル樹脂を、例２に記載したようなＦｍｏｃの化学において２−クロロトリチル＝クロリド樹脂を使用することによって合成した。以下の反応を、ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールの調製において記載したのと同じ手順によって行った。得られたＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−オールは、１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）δ（ｐｐｍ）：０．９０（ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），２．３２（４Ｈ，ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），３．６３（ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２２（１Ｈ，ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン）を示した。ペプチドにおけるアルファ炭素及び残留物のプロトンは、δ１．５−４．７ｐｐｍの間に分布した。
【０１４０】
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−オールの合成
Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−オール−樹脂のペプチジル樹脂を、例２に記載したようなＦｍｏｃの化学において２−クロロトリチル＝クロリド樹脂を使用することによって合成した。以下の反応を、ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールの調製において記載したのと同じ手順によって行った。得られたＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−オールは、１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）δ（ｐｐｍ）：０．９０（ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），２．３２（ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），３．６３（ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２２（ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン）を示した。ペプチドにおけるアルファ炭素及び残留物のプロトンは、δ１．５−４．７ｐｐｍの間に分布した。ペプチドにおける芳香環のプロトンは、δ６．５−８．６の間に分布した。
【０１４１】
（例１１：治療薬が含有されたリポソームの調製）
ＨＳＰＣ（０．１２１ｍｍｏｌ）／Ｃｈｏｌ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（１０：７：０．４モル比）の脂質の成分を、クロロホルム／メタノール（１：１）に溶解させ、どんな有機溶媒も取り除くために蒸発させ、次に真空中で乾燥させて脂質のフィルムを得た。脂質のフィルムは、１５０ｍＭの硫酸アンモニウムの緩衝材において水和のために活発な渦運動を受け、凍結−解凍のサイクルを、１０回進行させた。ＬｉｐｏｓｏｆａｓｔＴＭ（Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）からの押し出しデバイスを使用して、混合物を、二重に積層したポリカルボナートの膜（４００から１００ｎｍまでの孔の大きさ）を通じて押し出して、リポソームを生成させた。リポソームの外側の緩衝剤の溶液を、ゲル濾過のカラムを通過させることによって、３００ｍＭのヒスチジンまで変化させた。ＤＯＸの投入を、１時間、６５℃で、１ｍｌの３００ｎＭのヒスチジン中に１０ｍｇのＤＯＸの溶液とリポソームを混合することによって行なった。次に、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＮａＣｌの緩衝剤（ｐＨ７．２）中でゲル濾過のカラムを通過させることによって、遊離のＤＯＸを取り除いた。リポソームのリン脂質の濃度を、それらのリンの含有量によって決定し、小胞の大きさを、動的なレーザー散乱によって決定し、ＤＯＸの含有量を、ＵＶによって決定した。リポソームは、１３５ｎｍの平均の小胞の大きさを、＜２５％の標準偏差及び通常の大きさの分布で有していた。リポソーム中のＤＯＸの含有量は、０．２８の薬物／脂質のモル比に到達する。
【０１４２】
（例１２：目標とされる治療に役立つリポソームの調製）
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（０．００４／０．０１２ｍｍｏｌ）を、３ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：１）に溶解させ、蒸発させて乾燥した脂質のフィルムを製造した。乾燥させた脂質のフィルムを、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＮａＣｌの１ｍｌ溶液（ｐＨ７．２）中で、混合物の穏やかな渦運動と共に、６０℃で水和させた。脂質のフィルムが溶融し、混合物が、澄んだミセルの溶液になった後、ミセルの溶液を、次に６０℃で４時間、４ｍｌの、ＤＯＸが含有されたリポソーム（含有された０．２１ｍｍｏｌの全脂質及び０．０５８ｍｍｏｌのＤＯＸ・ＨＣｌ）へ移し、挿入を完了した。次に、溶液を、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈＴＭ）カラムのような、ゲル濾過のカラムに通過させ、ミセル及び目標とされる治療に役立つリポソームを分離する。ミセル及び目標とされる治療に役立つリポソームのフラクションを、定量分析のために別々に蓄えた。リポソームにおいて挿入されたペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体は、リポソームの全脂質の約１％であった。
【０１４３】
（例１３：ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）とｃ−ＯＰＤ共役体の結合の評価分析）
ＳＳＴＲ２とｃ−ＯＰＤ６００及びｃ−ＯＰＤ２０００共役体の結合の評価分析を、Ｐａｔｅｌ．  Ｙ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｓｒｉｋａｎｔ，  Ｃ．  Ｂ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５，  ２８１４−２８１７  （１９９４）、及びＬｉａｐａｋｉｓ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１，  ２０３３１−２０３３９  （１９９６）に記載されている方法に従って行なった。簡単に、ヒトのソマトスタチンＳＳＴＲ２のプラスミドと共に移入したＣＨＯ−ＫＩの細胞膜を、結合の評価分析に使用した。結合の評価分析を、細胞膜への０．０３ｎＭの［１２５Ｉ］ソマトスタチン−１４の結合に対して競争するｃ−ＯＰＤ共役体の濃度を増加させることによって行なった。非特異的な結合を、ｃ−ＯＰＤ共役体の添加無しで、１μＭの［１２５Ｉ］ソマトスタチン−１４のものよりも低い放射能として定義した。２５℃で４時間、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する緩衝剤（ｐＨ７．４）中の細胞膜、［１２５Ｉ］ソマトスタチン−１４、及びｃ−ＯＰＤ共役体を保温することによって結合反応を進行させた。結合反応を、ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルターを通じて急速に濾過することによって停止させた。次に、フィルターを、４ｍｌの氷で冷やした緩衝剤で３回洗浄し、次に結合した［１２５Ｉ］−ソマトスタチン−１４の放射能を測定した。阻害定数（Ｋｉ）の値を、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ、  Ｃｈｅｎｇ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｐｒｕｓｏｆｆ，  Ｗ．  Ｈ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２２，  ３０９９−３１０８  （１９７３）の式を使用することによって計算した。ｃ−ＯＰＤ６００に対する得られたＫｉの値は、２５ｎＭであり、ｃ−ＯＰＤ２０００に対しては１１ｎＭであった。
【０１４４】
ここで詳細に示し記載した情報は、本発明の上述の目的を達成することが十分可能であり、本発明の現在の好適な実施例であり、よって、本発明によって広く熟慮される主題の典型である。本発明の範囲は、当業者に明らかになる場合もある他の実施例を十分に包含し、従って、添付した請求項以外には何によっても限定され得ず、ここで単数の要素に対する表示は、“一つ及び唯一”を意味することを、明確にそのように述べない限り、意図せず、むしろ“一つ又は複数”である。上述の好適な実施例及び当業者に知られる追加の実施例の要素に対する全ての構造、組成、及び機能の均等物は、これによって明白に参照によって組み込まれ、本請求項によって包含されることが意図される。
【０１４５】
さらに、本発明による解決に対して探索される各々の及びあらゆる問題を扱うためのデバイス又は方法に関する、本請求項に包含されるそのようなものに関する必要条件は存在しない。さらに、本開示における要素、成分、又は方法のステップは、要素、成分、又は方法のステップが請求項に明確に述べられるかどうかに関らず、公に供されることを意図してない。しかしながら、形式、試薬、及び合成の詳細における様々な変化及び変更が、添付した請求項に示すような本発明の主旨及び範囲から逸脱することなくなされてもよいことは、当業者には容易に明らかであるはずである。
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月13日(2003.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製するための固相の合成方法、及びその共役体の使用に関係付けられる。
【０００２】
【従来の技術】
多くの試剤が、それらを人体へ直接適用するとすれば、好ましくない欠点を有するので、薬物の送達は、治療の処置に関する試剤の改善において決定的な役割を果たす。従って、特定の試剤に対して、副作用の減少、抗力の増強、及び使用法における利便性のようなその有効性を改善するために、送達システムを開発することは、必要である。例えば、抗腫瘍性の化学療法は、正常な組織に対するそれらの広まった毒性から結果として生じる逆の副作用によって限定される。従って、薬物の拡散を予防すると共に薬物を疾患の部位へ集中させることができるかもしれない送達システムが要求される。
【０００３】
リポソームは、というそれらが、生物学的なシステムに対して安全であるという理由のために、薬物送達システムとしての使用に関していくつかの利点を提供することができ、エーテルの親水性又は疎水性の薬物を運搬するための優れた球状の二層を有し、薬物を分解及び拡散から予防することができる。さらに、リポソームを、特定の目的用の追加機能を有するように、変性させることができる。ポリエチレン−グリセロール−グラフト（ＰＥＧ−グラフト）リポソームのような成功した例を示す。これらの変成したリポソームは、細網内系を回避すると共に血液中での循環時間を延長することができる。さらに、ＰＥＧ−グラフトリポソームに包まれる細胞毒性の癌の薬物は、抗腫瘍活性の効果における著しい増強を提供し、正常な細胞に対する毒性の副作用を減少させる。それによって、ＰＥＧ−グラフトリポソームは、商業的な用途を得て、目標とされる送達に関するこれらのＰＥＧ−グラフトリポソームのさらなる変性に対する可能性を開いた。
【０００４】
いくつかのタイプの目標とされるリポソームが開発されてきた（例えば、非特許文献１及び２参照）。一般的に使用される目標とされるリポソームは、（１）従来のリポソーム（タイプＡ）における脂質のヘッドグループで連結される標的にする配位子、（２）ＰＥＧ−グラフトリポソーム（タイプＢ）における脂質のヘッドグループで連結される標的にする配位子、及び（３）ＰＥＧ−グラフトリポソーム（タイプＣ）におけるＰＥＧ鎖の遠心端に付けられた標的にする配位子を含む。現在までのところ、研究は、タイプＣの目標とされるリポソームが、目標とされる送達に関してより良好なリポソームの構造を提供することを示してきた（例えば、非特許文献１参照）。このリポソームの構造に基づいて、抗体（例えば、非特許文献３及び４参照）、タンパク質（例えば、非特許文献５参照）、小さな合成分子（例えば、非特許文献６参照）、及びペプチド（例えば、非特許文献７参照）のような、いくつかのタイプの分子は、標的部位を結合するための標的にする配位子として開発されてきた。これらのタイプの分子間で、ペプチドは、受容体−配位子相互作用のようなタンパク質−タンパク質の相互作用における認識の成分として役立ち得るので、ペプチドは、高い潜在的な標的にする配位子として考慮される。さらに、疾患と関連する多くの細胞膜の受容体が、研究されてきた。
【０００５】
ＲＧＤ−ペプチド、ソマトスタチン、走化性ペプチド、血管作用性小腸ペプチド、及びそれらの擬態物のようなペプチドは、標的にする配位子としての良好な候補である。これらのペプチドの多くの対の受容体は、様々な腫瘍細胞に過剰発現されることが、発見されてきた。さらに、ペプチド及びペプチド擬態物は、他のタイプの分子（例えば、抗体）を超えるいくつかの独特の利点を有する。一般的に、これらのペプチドは、高い親和性の配位子−受容体の対合により標的細胞に結合し、受容体−間接エンドサイトーシスを通じて細胞間の区画に入る。しかしながら、抗体を主材料とした目標とされるリポソームは、細胞膜における抗原による細胞の内部へのエンドサイトーシスの経路を利用してはならない。さらに、ペプチドは、細網内系によって認識される機会をほとんど有さなず、このように血液循環システムから取り除かれる。ペプチド擬態物は、天然のペプチドよりも高い結合の親和性及びプロテアーゼの分解に対するより良好な抵抗性を提供することができる。
【０００６】
現在、ペプチドを主材料とした目標とされるリポソームを調製するための二つのアプローチが、開発されてきており、それらによってペプチド配位子を、ＰＥＧの遠心端に付けることができる。第一のアプローチは、末端基を官能性にしたＰＥＧ−脂質共役体をリポソーム中へ組み込んでおり、そしてペプチド配位子と共役している（例えば、非特許文献８参照）。しかしながら、末端基を官能性にしたＰＥＧを、ペプチド配位子に共役させるとき、ペプチド配位子に一つより多い反応基があるとすれば、不均質な共役が、起こる場合もある。さらに、官能性にしたＰＥＧの未反応の末端基は、定義することが困難であり、カップリング反応の後には、完全に不活性になる。第二のアプローチは、ペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体をリポソームの膜中へ直接組み込んでいる（例えば、非特許文献７参照）。このアプローチは、構造的に明確な目標とされるリポソームの成分を提供することができる。
【０００７】
ペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体は、目標とされるリポソームを調製するための期待される分子であるが、利用可能な共役体は、まだ非常に限定され、その合成は、困難である。これは、ペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体においてペプチドにおける側鎖の化学的特性が多様であるので、ＰＥＧの分子質量は、不均質であり、脂質の性質は、両親媒性である。これらの特性は、側鎖の保護、精製、及び反応の合成の過程において困難を引き起こし、ペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体がほとんど合成されてこなかったという点で、及びペプチド、スペーサ、及び脂質の共役体が、しばしば扱いにくいリンカー及び異常な官能基の形成を誘導するという点で明白である。
【０００８】
ＹＩＧＳＲ−ＰＥＧ−脂質共役体（配列番号：１  Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｙ）を合成するための方法は、開示されている（例えば、非特許文献７参照）。しかしながら、この方法を、ペプチドにアミノ基又は他のチオール基のような強い求核性の残留物を伴うブロモアセチル基の非特異的な反応が起こる場合があると、広い範囲のペプチド−ＰＥＧ脂質共役体を合成するための一般的な方法として使用することができない。さらに、ＹＩＧＳＲ−ＰＥＧ−脂質共役体において、ペプチド及びＰＥＧの末端でそれぞれブロモアセチル基およびチオール基への追加の変性が要求されるので工業化には好ましくない、チオアセチル（−ＳＣＨ２−ＣＯ−）リンカーを、ペプチド及びＰＥＧを共役させるために使用した。ＹＩＧＳＲ−ＰＥＧ−脂質共役体におけるＰＥＧ及び脂質の間におけるウレタン結合は、不自然で酸−塩基に不安定である。従って、広い範囲のペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製する合成方法に対する要求が存在する。
【０００９】
たとえオクトレオチド−スペーサ−ＰＥＧ−スペーサ−ＤＯＰＥ共役体の合成は、説明されている（例えば、特許文献１参照）としても、スペーサ−ＰＥＧ−スペーサによるオクトレオチド及びＤＯＰＥのカップリングは、四つの官能基及び三片のスペーサを伴い、分子をより複雑にすると共に分子の特性決定及び工業的使用法に関して好ましくなくすることになる。また、合成の手順、試薬、条件、及び精製過程については、明確に記載されてない（特許文献１参照）。結果として、オクトレオチド−スペーサ−ＰＥＧ−スペーサ−ＤＯＰＥ共役体の純度及び構造を、開示することはできなかった。従って、特許文献１の教示に基づいて、当業者は、オクトレオチド−スペーサ−ＰＥＧ−スペーサ−ＤＯＰＥ共役体の合成を実施することができない。
【００１０】
【特許文献１】
欧州特許第１１１８３３６号明細書
【非特許文献１】
Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  １９９５，  １２３４，  ７４−８０
【非特許文献２】
Ａｌｌｅｎ  ＴＭ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．  １９９４，  １５，  ２１５−２２０
【非特許文献３】
Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９３，  ５３，  １４８４−８
【非特許文献４】
Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．，  １９９５，  １２４５，  ９−１６
【非特許文献５】
Ｅａｖａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．  ２ＯＯＯ，  ５１，  ｌ０−４
【非特許文献６】
Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  １９９９，  １Ｏ，  ２８９−９８
【非特許文献７】
Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  １９９７，  ８，  １１１−８
【非特許文献８】
Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９５，  ６，  ７０５−８
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体を調製するための便利な固相の合成方法を提供し、ペプチド、スペーサ、及び脂質を共役させるための（アミド基のような）様々な連結基を提供する。本発明の固相の合成方法に従って、単純化された合成、自動化された合成、各反応段階における容易な精製過程、及び合成の間における最少化された生成物の損失のような、いくつかの利点を達成することができる。加えて、本合成方法は、広い範囲のペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製することに適切である。
【００１１】
また本発明は、本固相の合成方法によって調製されたペプチド−スペーサ−脂質共役体を提供する。ペプチド−スペーサ−脂質を、特定の細胞へのリポソームの薬物の送達に対する標的にする部分として、リポソーム中に組み込むことができる。
【００１２】
また本発明は、本ペプチド−スペーサ−脂質共役体を含む、目標とするリポソームを提供する。
【課題を解決するための手段】
上記課題の一つを達成するために、本発明は、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製する固相の合成方法であって、
（１）固相でアミノ酸残基が保護されたペプチジル樹脂を合成するステップ、（２）前記ペプチジル樹脂にスペーサ及び脂質を共役させることによって、ペプチド−スペーサ−脂質を有するペプチド−スペーサ−脂質樹脂を形成するステップ、
（３）前記ペプチド−スペーサ−脂質樹脂から前記ペプチド−スペーサ−脂質を開裂させるステップ、
（４）前記ペプチド−スペーサ−脂質の少なくとも一つのアミノ酸から少なくとも一つの側鎖を保護する基を取り除くことによって、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を形成するステップ、並びに、
（５）前記ペプチド−スペーサ−脂質共役体に、実質的に、
（ａ）さらに何も処理しないこと、
（ｂ）先のステップ（１）−（４）のいずれかの間に、前記ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を環状の形態へ変性させること、及び
（ｃ）先のステップ（１）−（４）のいずれかの後に、前記ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を環状の形態へ変性させること、
からなる群から選択される過程を受けさせるステップ、
を含み、
前記スペーサは、実質的に前記ペプチジル樹脂及び前記脂質からなる群から選択される成分へ一つの連結官能基によって共役することを含む。
【００１３】
また、上記課題の一つを達成するために、本発明は、上記方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体である。
【００１４】
さらに、上記課題の一つを達成するために、本発明は、上記ペプチド−スペーサ−脂質共役体を含む目標とされる治療に役立つリポソームである。
【００１５】
本発明の更に他の目的、構成及び特長は、以下に述べる説明より明らかになると思われる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
ここで、本発明は、以下の化学命名法を使用して開示される。
【００１７】
２−Ｂｒ―Ｃｂｚ    ２−ブロモベンジルオキシカルボイル（ｃａｒｂｏｙｌ）
２−Ｂｒ−Ｚ        ２−ブロモベンジルオキシカルボニル
２−Ｃｌ−Ｃｂｚ    ２−クロロベンジルオキシカルボイル
２−Ｃｌ−Ｚ        ２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ａｂｕ              ４−アミノ酪酸
ＡＣ                アセチル
Ａｃｍ              アセトアミドメチル
Ｂｏｃ              ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｂｚ                ベンゾイル
Ｂｚｌ              ベンジル
Ｃｂｚ              ベンジルオキシカルボイル
ＤＣＣ              ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣ−Ｃｈｏｌ      ３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバミル］コレステロール
ＤＣＭ              ジクロロメタン
ＤＤＡＢ            ジメチルアンモニウム＝ブロミド
Ｄｄｅ              １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキス−１−イリデン）エチル
ＤＩＰＣＤＩ        １，３−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＭＡＰ            ジメチルアミノピリジン
ＤＭＥ              エチレングリコール  ジメチルエーテル
ＤＭＦ              Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＲＩＥ          Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム＝ブロミド
ＤＭＳ              ジメチルスルフィド
ＤＯＰＡＴ          １，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン
ＤＯＰＥ            ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＲＩＥ          Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム＝ブロミド
ＤＯＴＭＡ          Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム＝コリド（ｃｈｏｌｉｄｅ）
ＤＯＸ              ドキソルビシン
ＤＳＰＥ            ジステアリルホスファチジルエタノールアミン
ＥＤＣ              １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド
ＥＤＴ              エタンジチオール
ＥＧＦ              表皮成長因子
ＦＧＦ              繊維芽細胞成長因子
Ｆｍｏｃ            ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｆｏｒ              ホルミル
ＨＦ                フッ化水素
ＨＧＦ              肝細胞成長因子
ＨＯＢｔ            Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＳＰＣ            水素化された大豆のホスファチジルコリン
ＩＧＦ              インシュリン様の成長因子
Ｉｍ                イミダゾール−１−イル
ＭＢＨＡ            ４−メチルベンズヒドリルアミド
ＭｅＯＨ            メタノール
Ｍｍｔ              ４−メトキシトリチル
Ｍｔｒ              ４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼン−スルホニル
Ｍｔｓ              メシチレン−２−スルホニル
Ｍｔｔ              ４−メチルトリチル
ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ  メトキシポリエチレングリコール−ジステアリルホスファチジルエタノールアミン
ＮＧＦ              神経成長因子
ＮＨＳ              Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＰＡＣＡＰ          下垂体のアデニレートシクラーゼを活性化するペプチド
Ｐｂｆ              ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＤＧＦ            血小板由来成長因子
Ｐｄ−Ｃ            活性炭触媒に保持されたパラジウム
ＰＥＧ              ポリエチレングリコール
ｐＭｅｏＢｚｌ      ｐ−メトキシベンジル
Ｐｍｃ              ２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル
ｐＮＰ              パラ−ニトロフェニル
ＳＰＰＳ            固相のペプチド合成
ＳＳＴ              ソマトスタチン
Ｓｕ                スクシンイミド
ＴＣＰ              ２，４，５−トリクロロフェニル
ＴＥＡ              トリエチルアミン
ＴＦＡ              トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ              トリフルオロエタノール
ＴＦＭＳＡ          トリフルオロメタンスルホン酸
Ｔｆ                トリフルオロメタンスルホニル
Ｔｆａ              トリフルオロアセチル
ＴＧＦ              形質転換成長因子
ＴＨＰ              テトラヒドロピラニル
Ｔｏｓ              トシル
Ｔｒｔ              トリチル
ｔＢｕ              ｔｅｒｔ−ブチル
ｔＢｕｔｈｉｏ      ｔｅｒｔ−ブチルチオ
ＶＥＧＦ            血管内皮成長因子
ＶＩＰ              血管作用性小腸ペプチド
Ｚ                  ベンジルオキシカルボニル
（Ｉ．ペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製するための固相の合成方法）
本発明に従って、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を調製するための固相の合成方法は、
（１）固相においてアミノ酸残留物が保護されたペプチジル樹脂を合成する、
（２）ペプチジル樹脂へスペーサ及び脂質を共役させ、それによって、ペプチド−スペーサ−脂質を有するペプチド−スペーサ−脂質樹脂を形成する、
（３）ペプチド−スペーサ−脂質樹脂からペプチド−スペーサ−脂質を開裂させる、
（４）ペプチド−スペーサ−脂質の少なくとも一つのアミノ酸から少なくとも一つの側鎖を保護する基を取り除き、それによってペプチド−スペーサ−脂質共役体を形成する、
（５）実質的に
（ａ）さらなる処理をしないこと、
（ｂ）前述のステップ（１）−（４）のいずれかの間に、ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を環状の形態へ変性させること、及び
（ｃ）前述のステップ（１）−（４）のいずれかの後に、ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を環状の形態へ変性させること、
からなる群から選択される過程をペプチド−スペーサ−脂質共役体に受けさせる、ステップを含み、
スペーサは、実質的にペプチジル樹脂及び脂質からなる群から選択される成分と一つの連結官能基によって共役することを含む。
【００１８】
（Ａ．アミノ酸残留物が保護されたペプチジル樹脂の固相の合成）
本発明のペプチジル樹脂を、当技術において知られている任意の固相の合成技術によって調製してもよい。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８５，  ２１４９  （１９６３）、Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  （１９６９））、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  （１９８４））、及びＡｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ．  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９８９））のような関連する技術は、ここでは、完全に参照によって組み込まれる。
【００１９】
本発明に従って、Ｆｍｏｃ及びＢｏｃの固相のペプチド合成（ＳＰＰＳ）方法は、ペプチジル樹脂を調製するための好適な方法である。
【００２０】
ＦｍｏｃのＳＰＰＳが、アルファ−アミノ基を保護するような塩基に不安定なＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）基を使用するのに対して、ＢｏｃのＳＰＰＳは、アルファ−アミノ基を保護するような酸に不安定なＢｏｃ（１−ブチルオキシカルボニル）基を使用する。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃのＳＰＰＳは、当技術において、例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  （１９８４）、及びＣｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｉｔｅ，  ＦｍｏｃＳｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  （２０００）に知られている。
【００２１】
初期の付着後、過剰の試薬及び副産物は、洗浄溶液によって洗浄される。
【００２２】
（１）脱保護試薬でアルファ−アミノ保護基を脱保護する、及び
（２）有機溶媒中におけるカップリング試薬とのアミノ酸のカップリング
のステップを含む過程によってペプチド鎖を引き伸ばすために、引き続きアミノ酸を添加する。
【００２３】
洗浄溶液で洗浄するステップは、各脱保護及びカップリングのステップの後に行なわれる。カイザー試験（Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９７０，  ３４，  ５９５−８）を、カップリング反応が完了したかどうかを決定するために、使用することができる。カップリング反応は、その試験が“陰性”であるとき、停止する。所望のペプチドを完了した後、結果として生じるペプチジル樹脂を、次にスペーサと共役させる。
【００２４】
本発明に従って、カップリング試剤を、ペプチド結合の形成のための試薬から選択することができる。このようなカップリング試薬の例は、ジシクロヘキシルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＣＣ／ＨＯＢｔ）、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ）、及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）を含むが、限定はされない。カップリング試剤の好適な実施例は、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔである。
【００２５】
本発明に従って、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基に対する脱保護試剤は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり得ると共に、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基に対する脱保護試剤は、ピペリジンであり得る。
【００２６】
本発明に従って、脱保護、カップリング、及び洗浄に使用される一次溶媒は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含むが、限定はされない。
【００２７】
（樹脂）
本発明に従って、様々な樹脂を、ペプチジル樹脂の合成に使用することができる。Ｆｍｏｃの固相のペプチド合成（ＳＰＰＳ）に適切な樹脂は、ヒドロキシメチル樹脂、Ｗａｎｇ樹脂、２−クロロトリチル＝クロリド樹脂、及びＲｉｎｋのアミド樹脂を含むが、限定はされない。ＢｏｃのＳＰＰＳに適切な樹脂は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミド（ＭＢＨＡ）、及びオキシム樹脂を含むが、限定はされない。Ｗａｎｇ樹脂及びヒドロキシメチル樹脂を、Ｆｍｏｃの化学において、Ｃ末端にカルボン酸（−ＣＯＯＨ）、アルキルアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ）、ジ−（アルキル）アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２）、又はエステル（−Ｃ（Ｏ）ＯＲ）を有するペプチドを合成するために、使用することができる。Ｒａｎｋのアミド樹脂を、Ｆｍｏｃの化学において、Ｃ末端にアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）を有するペプチドを合成するために、使用することができる。２−クロロトリチル＝クロリド樹脂を、Ｆｍｏｃの化学において、Ｃ末端にカルボン酸、アミン、又はヒドロキシル官能基を有するペプチドを合成するために、使用することができる。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂を、Ｂｏｃの化学において、Ｃ末端にカルボン酸又はエステルを有するペプチドを合成するために、使用することができる。ＭＢＨＡ樹脂を、Ｂｏｃの化学において、Ｃ末端にアミドを有するペプチドを合成するために、使用することができる。オキシム樹脂を、Ｂｏｃの化学において、Ｃ末端にアルキルアミド又はエステルを有するペプチドを合成するために、使用することができる。
【００２８】
本発明の好適な実施例において、ペプチド−スペーサ−脂質共役体の合成は、Ｆｍｏｃの化学において、Ｗａｎｇ樹脂、２−クロロトリチル＝クロリド樹脂、及びＲｉｎｋのアミド樹脂を使用することによって行なわれる。
【００２９】
（アミノ保護基）
本発明に従って、ペプチド鎖の引き延ばしに使用される、アミノ酸におけるアミノ基を、延びているペプチドへのアミノ酸のカップリングの間、保護することができる。カップリング反応の後に、次の、アミノ基が保護されるアミノ酸のカップリングのために、保護基を取り除く。
【００３０】
本発明に従って、適切な保護基は、ホルミル、トリフルオロアセチル、及びアセチルのようなアシルタイプの保護基、Ｆｍｏｃ、ベンジルオキシカルボイル（Ｃｂｚ）、及び置換されたＣｂｚのような芳香族ウレタンタイプの保護基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、及びシクロヘキシルオキシカルボニルのような脂肪族ウレタンの保護基、並びに、ベンジル、及びトリフェニルメチルのようなアルキルタイプの保護基を含むが、限定はされない。しかしながら、Ｆｍｏｃ及びＢｏｃは、好適な保護基である。
【００３１】
（側鎖の保護基）
本発明に従って、側鎖の保護基は、化学反応の間、側鎖を保護するために、アミノ酸の側鎖に付けることができるが要求される反応の後に容易に取り除くこともできる基に向けられる。アミノ基に対する適切な側鎖の保護基は、アセチル（ＡＣ）、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、２−クロロベンジルオキシカルボイル（２−Ｃｌ−Ｃｂｚ）、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−ＢｒＣｂｚ）、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｆｍｏｃ、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキス−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）、及びトリフルオロアセチル（Ｔｆａ）を含むが、限定はされない。ヒドロキシル基に対する適切な側鎖の保護基は、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）、及びトリチル（Ｔｒｔ）を含むが、限定はされない。チオール基に対する適切な側鎖の保護基は、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、Ｂｚｌ、ｔＢｕ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、（ｔＢｕｔｈｉｏ）、ｐ−メトキシベンジル（ｐＭｅｏＢｚｌ）、及び４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）を含むが、限定はされない。フェノール性水酸基に対する適切な側鎖の保護基は、テトラヒドロピラニル、ｔＢｕ、Ｔｒｔ、Ｂｚｌ、Ｃｂｚ、ｚ−Ｂｒ−Ｃｂｚ、及び２，５−ジクロロベンジルを含むが、限定はされない。イミダゾールに対する適切な側鎖の保護基は、Ｂｏｃ、Ｍｔｔ、トシル（Ｔｏｓ）、及びＴｒｔを含むが、限定はされない。インドールに対する適切な側鎖の保護基は、Ｂｏｃであり得るが、限定はされない。カルボン酸に対する適切な側鎖の保護基は、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｔＢｕ、及びシクロヘキシルを含むが、限定はされない。グアニジオ（ｇｕａｎｉｄｉｏ）基に対する適切な側鎖の保護基は、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼン−スルホニル（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、及びＴｏｓを含むが、限定はされない。
【００３２】
（Ｂ．脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂の合成）
本発明の好適な実施例において、脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂を、スペーサ−ペプチジル樹脂を得るために、スペーサをペプチジル樹脂と共役させ、次に脂質をスペーサ−ペプチジル樹脂と共役させることによって、合成する。
【００３３】
本発明の別の実施例において、脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂を、スペーサ−脂質をペプチジル樹脂と共役させることによって、合成する。
【００３４】
（ペプチジル樹脂とスペーサの共役）
本発明に従って、親水性重合体のスペーサを、様々な連結官能基を通じてペプチジル樹脂と共役させることができる。連結官能基の例を、以下の表Ｉに列挙する。
【００３５】
表Ｉ．連結官能基を生成するためのペプチドのＮ−末端、脂質のヘッド、及びスペーサの端の官能基
【００３６】
【表１】
2004189617.tif 000005
典型的には、適切な溶媒中で官能性にした又は活性化したスペーサの端の基をペプチジル樹脂とカップリングすること、及び、カイザー試験が“陰性”になるまで、おおよそ０℃乃至おおよそ９０℃の範囲の温度で振とうさせることによって、リンキング反応は、によって行なわれる。反応が完了した後、過剰の試薬及び副産物を、洗浄溶液によって取り除き、次にペプチジル樹脂に、脂質とのカップリングを受けさせる。
【００３７】
本発明の好適な実施例において、端の基を官能性にしたスペーサは、官能性にしたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。様々な端の基を官能性にした又は活性化したＰＥＧの調製に対する調査は、Ｚａｌｉｐｓｋｙ．  Ｓ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ６，  １５０−１６５  （１９９５）の技術に示されている。
【００３８】
ペプチジル樹脂とＰＥＧの共役は、ＰＥＧの端及びペプチドのＮ末端に適切な官能基を要求する。アミン（−ペプチド−ＮＨ−ＰＥＧ）が、連結官能基であるとき、ハロゲン化物（例えば、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉ）又はスルホナート（例えば、−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端でアミノ基とカップリングするように使用することができる。ウレタン（−ペプチド−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−ＰＥＧ）が、連結官能基であるとき、活性なカルボナート（例えば、−Ｃ（Ｏ）−Ｉｍ、−ＯＣ（Ｏ）−ｐＮＰ、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨＳ、−ＯＣ（Ｏ）−ＴＣＰ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端でアミノ基とカップリングするように使用することができる。アミド（−ペプチド−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ）が、連結官能基であるとき、活性化したカルボキシル基（例えば、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＤＣＣ／ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ、及びＥＤＣ／ＮＨＳによって活性化したカルボキシル基）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端でアミノ基とカップリングするように使用することができる。チオエステル（−ペプチド−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）−ＰＥＧ）が、連結官能基であるとき、チオ酸（−ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）Ｓ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端とカップリングするように使用することができ、ペプチジル樹脂のＮ末端は、ブロモアセチル（樹脂−ペプチド−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ）へ変性する。チオエーテル（−ペプチド−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＳＣＨ２−ＰＥＧ）が、連結官能基であるとき、チオール基（−ＰＥＧ−ＣＨ２ＳＨ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端とカップリングするように使用することができ、ペプチジル樹脂のＮ末端は、ブロモアセチル（樹脂−ペプチド−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ）へ変性する。マレイミド／チオ共役体のチオエーテルが、連結官能基であるとき、チオール基（Ｃ（Ｏ）−ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、ペプチジル樹脂のＮ末端とカップリングするように使用することができ、ペプチジル樹脂のＮ末端は、マレイミド基（マレイミド−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−ペプチド−樹脂）へ変性する。
【００３９】
カップリング反応に対する適切な溶媒を、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、ＤＭＦ、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択することができる。
【００４０】
洗浄溶液を、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、メタノール（ＭｅＯＨ）、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ＣＨ３ＣＮ、水、緩衝剤、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択することができる。
【００４１】
本発明の好適な実施例において、連結官能基は、ペプチジル樹脂のＮ末端のアミノ基と共役するカルボキシル基を官能性にしたＰＥＧである、アミド結合である。アミド結合のカップリング反応において、その反応におけるカルボキシル基に対する活性化試剤は、実質的に、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ、又はＥＤＣ／ＮＨＳのような、ペプチド結合の形成に使用される試薬からなる群から選択される。カップリング反応に対する適切な溶媒は、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦ、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択される。洗浄溶液は、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、ＭｅＯＨ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、シアン化水素、水、緩衝剤、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択される。反応温度は、おおよそ２０℃乃至おおよそ９０℃の範囲にある。カルボキシル基に対する好適な活性化試剤は、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔであり、溶媒は、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、及びＤＭＦからなる群から選択される。好適な洗浄溶液は、実質的にクロロホルム、ＭｅＯＨ、水、ＤＭＦ、緩衝剤（ｐＨ３．０−１１．０）、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択される。好適な反応温度は、おおよそ２０℃乃至おおよそ６０℃の範囲にある。
【００４２】
（スペーサ−ペプチジル樹脂と脂質の共役）
本発明に従って、脂質を、上述の連結官能基を通じてスペーサ−ペプチジル樹脂と共役させる。典型的には、カップリング反応は、適切な溶媒中で端の基を官能性にした又は活性化したスペーサ−ペプチジル樹脂へ脂質を添加すること、及び、おおよそ２４時間までの継続時間におおよそ０℃乃至おおよそ９０℃の温度範囲で振とうさせることによって行なわれる。反応が完了した後、過剰の試薬及び副産物を、洗浄溶液によって取り除く。
【００４３】
本発明の実施例において、スペーサ−ペプチジル樹脂におけるスペーサは、ＰＥＧである。ＰＥＧの端の基の官能化を、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  Ｓ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ６，  １５０−  １６５  （１９９５）に関して上で述べた。
【００４４】
スペーサ−ペプチジル樹脂と脂質の共役は、ＰＥＧの端及び脂質のヘッドグループに適切な官能基を要求する。アミン（脂質−ＮＨ−ＰＥＧ−）が、連結官能基であるとき、ハロゲン化物（例えば、−Ｃｌ、−Ｂｒ、及び−Ｉ）又はスルホナート（例えば、−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質のヘッドグループにおいてアミノ基とカップリングするように使用することができる。ウレタン（脂質−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−ＰＥＧ−）が、連結官能基であるとき、活性なカルボナート（例えば、−Ｃ（Ｏ）−Ｉｍ、−ＯＣ（Ｏ）−ｐＮＰ、−ＯＣ（Ｏ）Ｓｕ、−ＯＣ（Ｏ）−ＴＣＰ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質のヘッドグループにおいてアミノ基とカップリングするように使用することができる。アミド（脂質−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ−）が、連結官能基であるとき、活性化したカルボキシル基（例えば、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＤＣＣ／ＤＭＡＰ、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ、ＥＤＣ／ＮＨＳによって活性化したカルボキシル基）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質のヘッドグループにおいてアミノ基とカップリングするように使用することができる。チオエステル（脂質−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）−ＰＥＧ−）が、連結官能基であるとき、チオ酸（−スペーサ−Ｃ（Ｏ）Ｓ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質とカップリングするように使用することができ、ヘッドグループは、ブロモアセチル（脂質−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ）へ変性する。チオエーテル（脂質−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＳＣＨ２−ＰＥＧ−）が、連結官能基であるとき、チオール基（−スペーサ−ＣＨ２ＳＨ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質とカップリングするように使用することができ、ヘッドグループは、ブロモアセチル（脂質−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ）へ変性する。マレイミド／チオ共役体のチオエーテルが、連結官能基であるとき、チオール基（−ＰＥＧ−ＣＨ２ＳＨ）によって官能性にした端の基をもつＰＥＧを、脂質とカップリングするように使用することができ、ヘッドグループは、マレイミド基（マレイミド−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−脂質）に付けられる。
【００４５】
本発明の好適な実施例において、ＰＥＧ−ペプチジル樹脂と脂質の共役は、アミド結合によって形成され、それによって、ＰＥＧ−ペプチジル樹脂の末端におけるカルボキシル基は、脂質のヘッドグループにおいてアミノ基へ連結される。一般的に、カップリング反応は、カルボキシル−ＰＥＧ−ペプチジル樹脂の端のカルボキシル基を活性化するための活性化試剤を添加することによって開始する。次に脂質を、塩基を伴う適切な溶媒中で活性化したカルボキシル−ＰＥＧ−ペプチジル樹脂へ添加し、次にその混合物を、おおよそ０℃乃至おおよそ９０℃の温度範囲において窒素下で振とうさせる。反応が完了した後、過剰の試薬及び副産物を、洗浄溶液によって取り除く。
【００４６】
その反応におけるカルボキシル基に対する活性化試剤は、実質的に、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ、又はＥＤＣ／ＨＯＳｕのような、ペプチド結合の形成に使用される試薬からなる群から選択され得る。カップリング反応に対する適切な溶媒は、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦ、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択され得る。洗浄溶液は、実質的にＤＣＭ、クロロホルム、ＭｅＯＨ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ＣＨ３ＣＮ、水、緩衝剤、及びそれらの異なる比の混合物からなる群から選択され得る。反応温度は、おおよそ２０℃乃至おおよそ９０℃の温度範囲にある。その反応におけるカルボキシル基に対する好適な活性化試剤は、ＥＤＣ／ＮＨＳである。カップリング反応における好適な塩基は、トリエチルアミン（ＴＥＡ）である。カップリング反応における好適な溶媒は、クロロホルム及びＤＭＦの混合物である。好適な反応温度は、おおよそ４５℃乃至おおよそ８５℃の範囲にある。
【００４７】
（ペプチジル樹脂とスペーサ−脂質の共役）
本発明に従って、脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂を、
（１）端の基を官能性にしたスペーサ−脂質の共役体を調製する、及び
（２）その共役体をペプチジル樹脂とカップリングさせる、
ステップを含む過程によって合成することができる。端の基を官能性にしたスペーサ−脂質の共役体を、端の基を官能性にしたスペーサを脂質と共役させることによって、合成することができる。本発明の一つの実施例において、端の基を官能性にしたスペーサは、官能性にしたＰＥＧである。様々な端の基を官能性にした又は活性化したＰＥＧの調製に対する調査を、Ｚａｌｉｐｓｋｙ．  Ｓ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ６，  １５０−１６５  （１９９５）の技術に見ることができる。端の基を官能性にしたＰＥＧ−脂質の共役体を合成するための例は、Ｂｌｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １１４９，  １８０−１８４  （１９９３）、及びＺａｌｉｐｓｋｙ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ４，  ２６９−２９９  （１９９３）に記載されている。
【００４８】
本発明に従って、端の基を官能性にしたＰＥＧ−脂質の共役体を、上述の方法に従って、ペプチジル樹脂とカップリングさせることができる。
【００４９】
（Ｃ．樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質の開裂）
本発明に従って、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質の開裂は、脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂と共に開裂試薬を振とうさせることによって達成される。一般的に、本発明において使用される開裂試薬及び手順は、ＳＰＰＳの技術において使用される処理と同じである。
【００５０】
Ｃ末端にカルボキシル基をもつペプチド−スペーサ−脂質共役体を合成するために、Ｗａｎｇ樹脂、２−クロロトリチル＝クロリド樹脂、及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂を使用するとき、脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂を、開裂試薬（少なくとも一つの酸、捕捉剤、及び溶媒の混合物）によって開裂させることができる。
【００５１】
酸を、実質的にＴＦＡ、フッ化水素（ＨＦ）、及びトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）からなる群から選択することができる。捕捉剤を、実質的にチオアニソール、アニソール、エタンジチオール（ＥＤＴ）、ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）、エチルメチルスルフィド、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、４−メチルメルカプトフェノール、ベンジルメルカプタン、トリエチルシラン、及び水からなる群から選択することができる。ペプチド−スペーサ−脂質の開裂に対する適切な溶媒は、ＤＣＭ、クロロホルム、ＤＭＦ、ＴＨＦ、及びそれらの異なる比の混合物を含むが、限定はされない。樹脂からの脂質−スペーサ−ペプチドの開裂は、Ｂｏｃの化学の場合におけるＨＦ又はＴＦＭＳＡ、及びＦｍｏｃの化学におけるＴＦＡのような強酸を要求する。ＤＣＭ及びＤＭＦは、開裂に使用される一次溶媒である。
【００５２】
ペプチド−スペーサ−脂質共役体の低級アルキルアミドのＣ末端を合成するために、ヒドロキシメチル樹脂又はＷａｎｇ樹脂を使用するとき、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質共役体の開裂は、好ましくは、アルキルアミン、塩化アルミニウム、及びＤＣＭの混合物の下で、進行することができる。当技術においては、ここでは参照によって組み込まれるＣ．  Ｒ．  ＭｃＡｒｔｈｕｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８２），  Ｃａｎ．Ｊ．  Ｃｈｅｍ．，  ６０，  １８３６のような開裂の手順が知られている。ペプチド−スペーサ−脂質共役体の低級のアルキル化されたカルボキシルＣ末端を合成するために、ヒドロキシメチル樹脂又はＷａｎｇ樹脂を使用するとき、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質共役体の開裂は、好ましくは、アルキルアルコール、ＴＥＡ、シアン化カリウム、及びベンゼンの混合物の下で、進行することができる。当技術においては、ここでは参照によって組み込まれるＭｏｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４），  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３５，  ８９１５のような開裂の手順が知られている。ペプチド−スペーサ−脂質共役体のアミド化されたカルボキシルＣ末端を合成するために、Ｒｉｎｋのアミド樹脂を使用するとき、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質共役体の開裂は、好ましくは、ＴＦＡ、捕捉剤、及びＤＣＭの混合物の下で、進行することができる。ペプチド−スペーサ−脂質共役体のアミド化されたカルボキシルＣ末端を合成するために、ＭＢＨＡ樹脂を使用するとき、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質共役体の開裂は、好ましくは、ＨＦ及び捕捉剤の混合物の下で、進行することができる。ペプチド−スペーサ−脂質共役体のアルキルアミドのＣ末端を合成するために、オキシム樹脂を使用するとき、好ましく使用される開裂試薬は、ＲＮＨ２である。ペプチド−スペーサ−脂質共役体のアルキルエステルのＣ末端を合成するために、オキシム樹脂を使用するとき、好ましく使用される開裂試薬は、アルキルアルコール及びＴＦＥである。
【００５３】
（Ｄ．側鎖を保護する基の除去）
一般的に、本発明における側鎖を保護する基は、ＳＰＰＳの技術において使用される同じ過程によって取り除かれる。アミノ酸のｔ−Ｂｕ、Ｂｏｃ、Ｍｔｓ、Ｍｍｔ、Ｐｂｆ、Ｐｍｃ、Ｔｏｓ、Ｔｒｔのような、ほとんどの側鎖を保護する基を、樹脂からのペプチド−スペーサ−脂質の開裂の間に、ＴＦＡ又はＨＦによって取り除くことができる。他の側鎖を保護する基を、適切な脱保護試剤によって選択的に取り除くことができる。Ａｃｍを取り除くための好適な脱保護試剤は、Ｈｇ（ＩＩ）、Ａｇ（Ｉ）、Ｔｌ（ＩＩＩ）、及びＩ２を含むが、限定はされない。Ｂｚｌ、Ｚ、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）を取り除くための好適な脱保護剤は、活性炭触媒（Ｐｄ−Ｃ）／水素ガスに保持されたパラジウム（Ｐｄ）である。ｔＢｕｔｈｉｏを取り除くための好適な脱保護剤は、チオ及びトリブチルホスフィンを含む。Ｆｍｏｃを取り除くための好適な脱保護剤は、ピペリジンである。
【００５４】
（Ｅ．共役体のペプチド部分の変性）
本発明に従って、ペプチド−スペーサ−脂質共役体のペプチド部分を、当技術において知られている方法に従ってペプチド内の二つのアミノ酸又はそれらの誘導体の間に分子内の連結を形成することによって、環状の形態に変性させてもよい。分子内の連結の例は、以下に示すジスルフィド、アミド、エステル、チオエーテル、チオアセタート、及びチオアセタミン（ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｎｅ）を含むが、限定はされない。
【００５５】
【化１】
2004189617.tif 000006
ここでＸ及びＹは、１乃至３の範囲の整数を表し、Ｘは、Ｃｌ又はＢｒのいずれかを表し、Ｙは、ＮＨ又はＯのいずれかを表す。
【００５６】
分子内のジスルフィド結合を、ペプチド内のチオールを特異的に酸化するためのＩ２、Ｔｌ（ＩＩＩ）及び空気のような酸化剤を使用することによって、形成することができる。ペプチド内に、アミノ基をもつアミド結合を形成するために、又はヒドロキシ基をもつエステル結合を形成するために、アミド及びエステル結合を、ＤＣＣ／ＨＯＢｔのようなカルボキシル基の活性剤を使用することによって、調製することができる。チオエーテル結合及びアルファ位が置換された酢酸の連結を、クロロ又はブロモ基を硫黄群で置換することによって、調製することができる。各々がここでは参照によって組み込まれる、Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ，  Ｄ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９９５，  ３６，  ８８７１−８８７４、Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９２，  ３５，  ２０４０−２０４８、及びＯｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９１，  ５６，  ３１４６−３１４９の例を参照のこと。
【００５７】
（Ｆ．ペプチド−スペーサ−脂質共役体の精製）
本発明に従って、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を精製するための方法は、カラムクロマトグラフィー、膜透析、及びそれらの組み合わせを含むが、限定はされない。
【００５８】
本発明の一つの実施例において、ペプチド−スペーサ−脂質共役体を、ゲル濾過の媒質を使用するカラムクロマトグラフィーの方法によって、精製することができる。ゲル濾過の媒質は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ及びＬＨシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、及びＳｕｐｅｒｏｓｅシリーズを含むが、限定はされない。
【００５９】
本発明の別の実施例において、逆相クロマトグラフィーを使用するカラムクロマトグラフィーの方法によって、ペプチド−スペーサ−脂質共役体もまた精製することができる。逆相クロマトグラフィーは、Ｃ８及びＣ１８シリーズのクロマトグラフィーを含むが、限定はされない。
【００６０】
本発明のさらなる実施例において、凝集した形態のペプチド−スペーサ−脂質共役体を、ペプチド−スペーサ、ペプチド、及び他の遊離の小さな分子のような所望されない成分を含有する混合物から、膜透析によって隔離することができる。透析膜は、１００，０００ダルトンより小さく切られた分子量の孔の大きさを有することが好ましい。
【００６１】
（ＩＩ．ペプチド−スペーサ−脂質共役体）
本発明に従って、ペプチド−スペーサ−脂質共役体は、本方法によって合成され、一方の端でペプチド配位子及び他方の端で脂質と電子対を共有して共役する、各端に連結官能基を有する直鎖の親水性の重合体の鎖で構成される。ペプチド−スペーサ−脂質共役体を、リポソーム中へ組み込むことができ、共役体の脂質は、共役体を細胞膜に固定するためにリポソームの二層中へ挿入されることによって、共役体のペプチド配位子は、細胞膜の外側における露出を促進させ、細胞又は組織へ選択的に結合することを促進させる。
【００６２】
（Ａ．ペプチド配位子）
本発明に従って、ペプチド配位子は、天然のアミノ酸で構成される合成ペプチドである。本発明の好適な実施例において、ペプチド配位子は、受容体に結合することができる。受容体を、実質的に、ソマトスタチン受容体、血管作用性小腸ペプチド受容体、インテグリン受容体、繊維芽細胞成長因子受容体、肝細胞成長因子受容体、表皮成長因子受容体、インシュリン様成長因子受容体、神経成長因子受容体、血管内皮成長因子受容体、血小板由来成長因子受容体、及び形質転換成長因子受容体からなる群から選択することができる。
【００６３】
本発明の別の実施例において、ペプチド配位子を、実質的に、ホルモン、サイトカイン、毒素、ケモタキシン（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｎ）、及び細胞接着用の細胞外基質のペプチドからなる群から選択することができる。
【００６４】
ペプチド配位子及び配位子−受容体の組みの例を、以下の表ＩＩに列挙する。
【００６５】
表ＩＩ．配位子−受容体の組み及びペプチド配位子の例
【００６６】
【表２】
2004189617.tif 000007
本発明の別の実施例において、ペプチド配位子は、ホルモンである。本発明に従って、ホルモンは、ソマトスタチン、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含むが、限定はされない。
【００６７】
本発明の別の好適な実施例において、ペプチド配位子は、インテグリン又はラミニン受容体に結合する、細胞外基質のペプチドの断片である。これらのペプチドの例は、実質的にＲＧＤ（配列番号：２１）、ＲＧＥ（配列番号：２２）、ＤＧＥＡ（配列番号：２３）、ＥＩＬＤＶ（配列番号：２４）、ＧＰＲＰ（配列番号：２５）、ＫＱＡＧＤＶ（配列番号：２６）、及びＱＫＲＬＤＧＳ（配列番号：２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列順序を含有するペプチドを含むが、限定はされない。
【００６８】
本発明の別の好適な実施例において、ペプチド配位子は、
ＥＧＦ（２０−３１）
Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（配列番号：９）、
ＦＧＦ  Ｉ．酸性の脳由来（１−１１）
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ（配列番号：１１）、
ラミニン結合阻害剤（ラミニンＢ−１（４４２−４４７））
Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号：７）、
インテグリン結合阻害剤（フィブロネクチンＣＳ−３）
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号：６）、
フィブロネクチンＣＳ−１（１３７８−１３８２）
Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（配列番号：５）、
ＦＧＦ（１１９−１２６）
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号：１２）、
ＩＧＦ  Ｉ（３０−４１）
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（配列番号：１５）、
ＨＧＦ
Ｇｌｙ−Ｈｌｓ−Ｌｙｓ（配列番号：８）、
プレプロ−神経成長因子（９９−１５）
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：１７）、
血小板由来成長因子の拮抗体（ＰＤＧＦ  Ａ−鎖  １９４−２１１）
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列番号：２０）、
ＴＧＦ  アルファ（３４−４３）
Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ（配列番号：２８）、
ＶＩＰ（１−１２）
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（配列番号：２）、
ＶＥＧＦ（ＧＳＴ−ＥＸｏｎ  ７（１−２０））
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ（配列番号：１９）、
エンドスタチン（脈管形成のホモロジー領域）
Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ（配列番号：２９）、
オクトレオチド（ソマトスタチンの類似）
環状の（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−  Ｃｙｓ−Ｔｈｒ（オール）
である。
【００６９】
本発明に従って、ペプチド配位子は、一つ又はそれ以上の以下の変性を含有する上で定義したペプチド配位子の類似体である、ペプチド擬態物であり得る。
【００７０】
（１）ペプチド内のアミノ酸を、天然でないアミノ酸で置き換える。
【００７１】
（２）ペプチド内のアミノ酸を、Ｄ形の天然のアミノ酸で置き換える。
【００７２】
（３）ペプチドのＣ末端のカルボキシル基を、アミド、低級アルキルアミド、ジ−（低級アルキル）アミド、低級エステル誘導体、ヒドロキシ、又は低級アルコキシに変性させる。
【００７３】
（４）ペプチドを環化させる。
【００７４】
（アミノ酸）
本発明に従って、アミノ酸は、少なくとも一つのカルボン酸基及び一つのアミノ基を含有する有機化合物として定義される。好適なアミノ酸は、Ｄ又はＬ形の天然のアミノ酸及び天然でないアミノ酸を含む。
【００７５】
天然のアミノ酸は、アミノ基及びカルボキシル基がある炭素に付けられる、２０のアルファ−アミノ酸を含有する。天然のアミノ酸は、無極性又は疎水性の側鎖を有する、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、及びトリプトファンを含み、酸性の側鎖を有する、アスパラギン酸、及びグルタミン酸を含み、塩基性の側鎖を有する、リシン、アルギニン、及びヒスチジンを含み、帯電してない親水性の側鎖を有する、アスパラギン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、及びシステインを含む。
【００７６】
本発明の天然でないアミノ酸は、側鎖を変性させたアミノ酸、非アルファ−アミノ酸、及びＮ−メチルアミノ酸を含む。
【００７７】
側鎖を変性させたアミノ酸は、アルファ−アミノ酸であり、ここで各アミノ酸の側鎖は、天然ではないか、又は天然のアミノ酸から変性する。側鎖を変性させたアミノ酸の例は、２−アミノ酪酸、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸、アルファ−アミノイソ酪酸、ビフェニルアラニン、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン、アルファ−ｔ−ブチルグリシン、３−シクロヘキシルアラニン、アルファ−シクロヘキシルグリシン、（Ｓ）−２，３−ジアミノプロピオン酸、（Ｓ）−２，３−ジアミノ酪酸、２−アミノ−４−フェニル酪酸、ホモセリン、ホモチロシン、（Ｓ）−（−）−インドリン−２−カルボン酸、ベータ−２−ナフチルアラニン、３−（１−ナフチル）−アラニン、３−（２−ナフチル）−アラニン、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、ペニシラミン、ｐ−アミノフェニルアラニン、４−ブロモフェニルアラニン、２−クロロフェニルアラニン、３−クロロフェニルアラニン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、３，４−ジフルオロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、５−ヒドロキシトリプトファン、４−ヨードフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、ピペコリン酸、プロパルギルグリシン、チアゾリジン−４−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、３，５−ジヨードチロシン、３−ヨードチロシン、３−ニトロチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、ジエチルグリシン、ジ−ｎ−プロピルグリシン、ジ−ｎ−ブチルグリシン、１−アミノ−１−シクロプロパン−１−カルボン酸、１−アミノ−１−シクロペンタン−カルボン酸、１−アミノ−１−シクロヘキサン−１−カルボン酸、及び４−ヒドロキシプロリンを含むが、限定はされない。
【００７８】
非アルファ−アミノ酸は、そのアミノ基およびカルボキシル基が、同じ炭素に付いてないアミノ酸である。非アルファ−アミノ酸の例は、２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、４−（アミノメチル）安息香酸、４−（アミノメチル）シクロヘキサン、ベータ−アラニン、ガンマ−アミノ酪酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノヘキサン酸、８−アミノオクタン酸、９−アミノノナン酸、１０−アミノデカン酸、１１−アミノウンデカン酸、１２−アミノドデカン酸、イソニペコチン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸、及び４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸を含むが、限定はされない。
【００７９】
Ｎ−アルキルアミノ酸は、アルファ−アミノ基がモノアルキル化されたアミノ酸である。アルキル基は、メチル、エチル、及びプロピルを含むが、限定はされない。
【００８０】
（アミノアルコール）
本発明に従って、アミノアルコールは、カルボキシル基がヒドロキシ基に変成した、変性したアミノ酸である。アミノアルコールを、ペプチド鎖のＣ末端に共役させることができる。
【００８１】
（ペプチド配位子の環化）
本発明に従って、ペプチド配位子を、上述の方法のようなペプチド配位子における二つのアミノ酸又はそれらの誘導体の間で分子内の連結を形成することによって、環化させることができる。
【００８２】
（Ｂ．連結官能基）
本発明に従って、連結官能基は、電子対を共有してスペーサに脂質又はペプチド配位子を連結することができる任意の官能基である。表Ｉに列挙したものを含むが、限定はされない、多種多様な官能基が、ペプチド−スペーサ−脂質共役体における使用に適切である。
【００８３】
（Ｃ．スペーサ基）
本発明に従って、スペーサは、ペプチド及び脂質を付けるために鎖の各端に連結官能基を含有する、直鎖の親水性重合体の鎖である。本発明における適切なスペーサは、ポリグリシン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリメタクリルアミド、ポリジメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリラート、ポリヒドロキシプロピルメタクリラート、ポリオキシアルケン、及び親水性ペプチドを含むが、限定はされない。
【００８４】
本発明の好適な実施例において、スペーサは、１００−１０，０００ダルトンの間における、より好ましくは１００−５，０００ダルトンの間における分子量を有するポリエチレングリコールである。
【００８５】
（Ｄ．脂質）
本発明に従って、脂質は、水中に二層の小胞を自然に形成することができる、又は脂質の二層中へ安定に組み込むことができる、同じ分子に親水性及び疎水性部分を所有する天然又は合成の両親媒性分子のいずれかである。
【００８６】
本発明の実施例において、脂質は、ホスホジグリセリド及びスフィンゴ脂質を含むリン脂質である。ホスホジグリセリドは、１及び２位でエステル又はエーテル結合を通じて二つの炭化水素の鎖及び３位でホスホリルヘッドグループへ連結される、三つの炭素のグリセロールをもつ構造を有する。スフィンゴ脂質は、ホスホリルヘッドグループへ連結される、アミド結合を通じてスフィンゴシンの窒素に連結される炭化水素の鎖からなる。リン脂質のホスホリルヘッドグループは、ホスホリルコリン、ホスホリルエタノールアミン、ホスホリルセリン、ホスホリルグリセロール、ホスホリルイノシトール、及びリン酸塩の酸であり得る。リン脂質における炭化水素の鎖は、典型的には、鎖長において１４−２２個の炭素原子を有し、飽和したもの又は数個程度の不飽和であり得る。
【００８７】
本発明の別の好適な実施例において、脂質は、ジステアリルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。
【００８８】
脂質の二層中へ安定に組み込むことができる脂質は、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミタート、グリセロールリシノレアート、ヘキサデシルミリスタート、イソプロピルミリスタート、両性のアクリル重合体、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアクリルグリセロールスクシナート、ジアシルグリセロール、脂肪酸などを含むが、限定はされない。
【００８９】
本発明の別の実施例において、ステロール、炭化水素の鎖、又は二つの炭化水素の鎖のような中性の親油性部分に連結する、アミン、ポリアミン、又はポリリシンのような、正に帯電したヘッドグループからなる脂質は、陽イオンの脂質である。陽イオンの脂質の例は、１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＰＡＴ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム＝ブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウム＝ブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム＝コリド（ＤＯＴＭＡ）、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバミル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、及びジメチルアンモニウム＝ブロミド（ＤＤＡＢ）を含む。
【００９０】
（ＩＩＩ．目標とされる治療に役立つリポソーム）
本発明は、本方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体を含有する目標とされる治療に役立つリポソームをさらに提供する。
【００９１】
本発明における目標とされる治療に役立つリポソームは、
（ｉ）リポソームの膜を形成するための一つ又はそれ以上の脂質、
（ｉｉ）標的にする部分としてリポソームの膜に組み込まれる一つ又はそれ以上のペプチド−スペーサ−脂質共役体、
（ｉｉｉ）リポソームに組み込まれる治療又は診断の試剤、及び
（ｉｖ）自由選択で、リポソームに組み込まれる、その表面を変性させるための、親水性重合体−脂質共役体、
を含む。
【００９２】
（Ａ．目標とされる治療に役立つリポソームの成分）
（脂質）
リポソームの調製に適切な脂質は、実質的に、上で定義した脂質からなる群から選択される一つ又はそれ以上の脂質であり得る。
【００９３】
本発明の実施例において、リポソームに使用される脂質は、リン脂質及びコレステロールを含む。好適なリン脂質は、実質的に水素化した大豆のホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵のホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、及びジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなる群から選択される。
【００９４】
本発明の別の実施例において、リポソームに使用される脂質は、ＤＯＰＥ又はコレステロールのような脂質及び天然の脂質を含む。
【００９５】
（親水性重合体−脂質共役体）
本発明におけるリポソームの表面を、リポソームの二層中へ組み込む重合体−脂質共役体を通じて、親水性重合体によって変性させることができる。本発明における重合体−脂質共役体は、繰り返し単位及び脂質のヘッドグループに付く連結官能基を有する直鎖の親水性重合体の鎖である。このような親水性重合体は、ポリグリシン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリメタクリルアミド、ポリジメタクリルアミド、ポリヒドロキシエチルアクリラート、ポリヒドロキシプロピルメタクリラート、ポリオキシアルケン、及び親水性ペプチドを含むが、限定はされない。
【００９６】
本発明の好適な実施例において、重合体−脂質共役体における重合体は、１００−１０，０００ダルトンの間における、より好ましくは１００−５，０００ダルトンの間における平均分子量を有するＰＥＧである。モノメトキシ又はモノエトキシＰＥＧ誘導体もまた、脂質共役体に対する好適な重合体である。
【００９７】
（ペプチド−スペーサ−脂質共役体）
本発明に従って、リポソーム中へ組み込むための適切なペプチド−スペーサ−脂質共役体は、上述の方法によって合成される一つ又はそれ以上のペプチド−スペーサ−脂質共役体である。
【００９８】
（治療薬）
医療の用途における使用のためにリポソーム中に組み込むことに適切な様々な治療薬は、当技術において知られている。しかしながら、本発明に従って、適切な治療薬は、抗腫瘍性、抗脈管形成、抗菌性、抗ウィルス性、駆虫性、抗真菌性、免疫増強、免疫抑制、抗偏頭痛、解熱性、抗血清、抗炎症、抗凝固性、代謝拮抗、抗利尿、抗てんかん作用、抗有糸分裂性、抗関節炎、抗不整脈性、抗老化、鎮痛性、麻酔、止血性、ホルモン性、ホルモン性抑制、高カルシウム緩和、低カルシウム緩和、高血糖緩和、低血糖緩和、筋弛緩、神経伝達、向精神性、心血管性、血栓崩壊性、及び血管拡張性である、治療効果を有する天然及び合成の化合物を含むが、限定はされない。
【００９９】
本発明に従って、リポソームにおける取り込みのための適切な治療薬は、トポイソメラーゼＩ及びＩＩ阻害剤、脈管形成阻害剤、ＤＮＡ転写酵素阻害剤、カンプトテシン及び類似体、抗生物質、駆虫性物質、抗腫瘍性物質、抗炎症剤、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害剤、ＤＮＡと反応する又は結合する抗癌剤、免疫変性剤（ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、化学的放射線増感剤及び防護剤、並びに光化学活性抗癌剤を含むが、限定はされない。
【０１００】
本発明の好適な実施例において、組み込まれる治療薬は、Ｆｏｙｅ  Ｗ．  Ｏ．  （ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ，  （１９９５））に記載されているような当技術において知られているカンプトテシン及び類似体を含むが、限定されない、トポイソメラーゼＩ阻害剤である。
【０１０１】
本発明の別の好適な実施例において、組み込まれる治療薬は、トポイソメラーゼＩＩを阻害するアントラサイクリンである。この種の薬物の例は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、及びイダルビシンである。
【０１０２】
本発明の別の好適な実施例において、組み込まれる治療薬は、ビンブラスチン、ナベルビン、ビンクリスチン、ビングリシナート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）、ビントリポール（ｖｉｎｔｒｙｐｏｌ）、及びビンゾリジン（ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ）のような有糸分裂阻害剤である。
【０１０３】
本発明の別の実施例において、組み込まれる治療薬は、抗炎症剤である。
【０１０４】
別の実施例において、組み込まれる治療薬は、デキストリン  ２−サルファート、ウクレイン（ｕｋｒａｉｎ）、サリドマイド、アンギオスタチン、エンドスタチン、及び１−［１１−（ドデシルアミノ）−１０−ヒドロキシウンデシル］−３，７−ジメチル−キサンチンのような脈管形成阻害剤である。
【０１０５】
本発明の別の実施例において、組み込まれる治療薬は、遺伝子、遺伝子の部分、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、及びそれらの類似体を含むが限定はされない、核の遺伝子を含む。治療薬としての使用のための適切な遺伝子は、
（１）ｐ５３、ＢＲ１、ＡＰＣ、Ｒｂ、ＤＣＣ、ＨＮＰＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＢＲＣＡ１、又はＢＲＣＡ２のような、突然変異による遺伝子の欠乏した機能を補償してもよい癌抑制遺伝子、
（２）ＨＳＶ−ｔｋのような、宿主細胞において不活性なプロドラッグを細胞毒性化合物へ変換してもよい毒素遺伝子、
（３）ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、又はＧＭ−ＣＳＦのような、免疫系の細胞の成分を腫瘍に向けて変性させてもよいか、又は免疫応答を誘導するために腫瘍細胞を変性させてもよい、免疫遺伝子、
（４）肝臓チトクロームＰ４５０遺伝子、ＣＹＰ２Ｂ１、又はｔｋ遺伝子のような、化学療法剤及び放射線治療に対する細胞の感受性に影響を及ぼす、化学的増感作用又は放射性増感作用に対する遺伝子、
（５）ＴＮＦ／ＴＮＦＲ１、Ａｐｏ３Ｌ／ＤＲ３、Ａｐｏ２Ｌ／ＤＲ４若しくは５、チトクロームｃ、ＴＰ５３、Ｅ１Ａ、バックス（ｂａｘ）、ｂｃｌ−ｘｓ、アポプチン、ｂｃｌ−２、サバイビング（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）、ＸＩＡＰ、ＩＡＰ−１、又はＩＡＰ−２のような、細胞の消滅過程を調節する遺伝子又はタンパク質が符号化された遺伝子、及び
（６）ＭＤＲ１のような、薬物抵抗性に対応する遺伝子
を含むが、限定はされない。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドは、遺伝子の翻訳又は転写を規制するためにｍＲＮＡ又はＤＮＡに結合してもよいアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むが、限定はされない。アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的遺伝子は、癌抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、ＢＲ１、Ｅ１Ａ、及びＢＲＣＡ１）の突然変異体、癌遺伝子（例えば、ｋ−ｒａｓ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、及びｃ−ｆｏｓ）、成長因子の遺伝子（例えば、ＩＧＦ１、ＰＤＧＦ、酸性及び塩基性のＦＧＦ、並びにＴＧＦβ）、多剤抵抗性に応じるタンパク質を符号化している遺伝子（例えば、ＭＤＲ１）を含むが、限定はされない。
【０１０７】
（診断薬）
本発明で使用される診断薬は、ガンマシンチグラフィーにおける撮像試剤用のガンマを放出する放射性ヌクレオチド、コンピュータ断層撮影用の放射線不透物質、及び磁気共鳴用の常磁性の金属イオンを含むが、限定はされない。
【０１０８】
本発明の好適な実施例において、ガンマを放出する放射性核種は、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、及び９９ｍＴｃである。
【０１０９】
本発明の好適な実施例において、常磁性の金属イオンは、Ｇｄである。
【０１１０】
（Ｂ．リポソーム）
本発明に従って、目標とされる治療に役立つリポソームを調製することに適切なリポソームは、一つ又はそれ以上の脂質によって形成される二層の膜からなる球状の粒子であり、一つ又はそれ以上の水性の区画をそれらの中に囲む。
【０１１１】
本発明に従って、リポソームの大きさは、標的器官又は組織及び送達される治療薬に依存して、おおよそ３０ｎｍからおおよそ１０００ｎｍまでの範囲にわたる。例えば、好適なリポソームの大きさは、血流送達治療薬に関しては、おおよそ５０ｎｍ乃至おおよそ１５０ｎｍの範囲にあり、組織又は腫瘍の部位へ直接適用される治療薬に関しては、好適なリポソームの大きさは、おおよそ３０ｎｍ乃至おおよそ８０ｎｍの範囲にある。
【０１１２】
本発明の好適な実施例において、リポソームは、（１）大豆又は卵から抽出される天然のリン脂質、（２）コレステロール、（３）重合体−脂質共役体で構成される。
【０１１３】
本発明の別の実施例において、リポソームは、ＤＯＰＥ及びコレステロールのような、陽イオンの脂質及び一つ又はそれ以上の中性の脂質の成分を含む、陽イオンのリポソームである。
【０１１４】
（Ｃ．目標とする治療に役立つリポソームの調製）
本発明に従って、リポソームを含有する治療薬中に本方法によって合成されるペプチド−スペーサ−脂質共役体を組み込むことによって、目標とされる治療に役立つリポソームを調製することができる。
【０１１５】
本発明のリポソームを、当技術において知られている多種多様な方法、例えば、ここでは参照によって組み込まれる、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ｇ．，  ｅｄ．  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．，  Ｉ，  ＩＩ，  ＩＩＩ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．，  １９８４、Ｓｚｏｋａ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９：４７６  （１９８０）、及びＮｅｗ，  Ｒ．Ｒ．Ｃ．，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，  ａ  Ｐｒａｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９０によって調製することができる。
【０１１６】
本発明の実施例において、脂質のフィルムを水和させることによってリポソームを調製して、初期の多層の小胞を生成させ、押し出し又は均質化の方法を受けて、小胞の大きさを減少させる。典型的には、有機溶媒中における親水性重合体−脂質共役体をもつ又はもたない脂質（又は脂質の組み合わせ）を、真空中で蒸発及び乾燥させて、容器中に薄いフィルムを形成する。脂質のフィルムを、渦運動させることによって水溶液中で水和させて、初期の多層の小胞を形成する。次に、水性の小胞に、数サイクルの凍結及び解凍を行なう。ここでは参照によって組み込まれる、Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ８１２，  ５５−６５  （１９８５）、Ｍａｙｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  ７７５，  １６９−１７４  （１９８４）、及びＢｒａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ．  Ｇ．，  ｅｄ．  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  Ｉ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ．  Ｆｌａ．，  １９９２，  ｐｐ．  ４９−６５に記載されているような膜の押し出し又は均質化の方法のいずれかによって、懸濁する多層の小胞の大きさを小さくする。
【０１１７】
リポソームに治療又は診断の試剤を投入することは、水溶性の、疎水性及びイオン性の化合物を投入する方法を含む。一般的に、水溶性化合物は、水溶液中で試剤を溶解させると共に脂質のフィルムと混合させることによって、リポソーム中に包まれる。疎水性の試剤を、適切な有機溶媒中で脂質又は脂質の組み合わせを共に試剤を溶解させて、次に溶媒を蒸発させて薄いフィルムを生成させることによって、リポソーム中に閉じ込めるか又は脂質の二層中に組み込むことができる。イオン性の試剤を投入する方法を、ここでは参照によって組み込まれるＭａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７，  ２０５３−２０６０  （１９８８）、及びＨａｒａｎ．  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １１５１，  ２０１−２１５  （１９９３）に記載されているようなｐＨ、イオンの勾配の方法によって行なうことができる。
【０１１８】
ＤＮＡを、（１）ＤＮＡをリポソーム中へ閉じ込めること、（２）リポプレックス（ＤＮＡ−リポソーム複合体）を形成すること、及び（３）リポポリプレックス（リポソーム、ポリカチオン性重合体、及びＤＮＡの複合体）を形成すること、を含むが、限定はされないいくつかの方法によって、リポソームに組み込むことができる。これらのＤＮＡが組み込まれたリポソームを調製するための方法は、当技術、例えば、ここでは参照によって組み込まれるＨｕｇ  Ｐ  ａｎｄ  Ｓｌｅｉｇｈｔ  Ｒ．Ｇ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １０９７：１−１７  （１９９１）、Ｎａｂｅｌ，  Ｇ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９０，  １１３０７−１１３１１  （１９９３）、Ｇａｏ，  Ｘ．  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ  Ｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３５，  １０２７−ｌ０３６  （１９９６）、及びＷｈｉｔｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ６，  １８６７−１８７５  （１９９９）において、知られている。
【０１１９】
本発明に従って、治療薬を含有するリポソームと共にペプチド−スペーサ−脂質共役体／メトキシポリエチレングリコール−ジステアリルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）のミセルを、脂質も膜の転移温度よりも高い温度で保温することによって、ペプチド−スペーサ−脂質共役体をリポソームの膜中へ組み込むことを達成することができる。一般的に、ペプチド−スペーサ−脂質共役体／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥの乾燥させた脂質のフィルムを、共役体の臨界のミセルの濃度より高い濃度における水性の緩衝材中で、上昇させた温度における混合物の穏やかな渦運動と共に、水和させる。脂質のフィルムを溶融させて混合物が澄んだミセルの溶液になった後、次にミセルの溶液を、挿入を完了するための時間の間にリポソームの膜の転移温度よりも高い温度で、治療薬を含有するリポソーム中へ移す。次に、サイズ排除カラムを通じて溶液を通過させて、ミセル及び目標とされるリポソームを分離する。ミセル及び目標とされるリポソームのフラクションを、定量分析用に別々に蓄える。
【０１２０】
本発明に従って、脂質の膜の転移温度は、目標とされる治療に役立つリポソームの調製を遂げる。本発明におけるリポソームの適切な転移温度は、おおよそ３℃−おおよそ７０℃の範囲にある。
【０１２１】
【実施例】
以下の例を、本発明を限定するためでなく、説明のために使用する。
【０１２２】
（例１：アミノアルコールの調製）
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−アルコール（Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール）の調製
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（１当量，０．６６３ｇ，１．６７ｍｍｏｌ）を、２ｍｌのエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）中に懸濁させ、窒素下で−１５℃以下に冷やした。Ｎ−メチルモルホリン（１当量，０．１９ｍｌ，１．６７ｍｍｏｌ）及びイソブチル＝クロロホルマート（１当量，０．２２ｍｌ，１．６７ｍｍｏｌ）の添加後、混合物を、−１５℃で攪拌した。５分の攪拌後、沈殿を除去し、５ｍｌの水中におけるＮａＢＨ４（３当量）の懸濁液を添加して、別の１時間攪拌した。反応の終了において、４０ｍｌの水を添加した。混合物を、ＤＣＭ（２０ｍｌ×３）で抽出し、組み合わせた有機層を、５％のＮａＨＣＯ３で洗浄し、引き続き塩性溶液（例えば、ＮａＣｌ）で水洗し、無水Ｎａ２ＳＯ４（又はＭｇＳＯ４）で乾燥させた。溶媒を蒸発させた。粗Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−アルコールを、溶離剤としてＤＣＭを使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって精製した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．１６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，ＣＨＣＨ３），１．２０（９Ｈ，ｓ，ｔＢｕ），２．８８（１Ｈ，広い，ＯＨ），３．６１（１Ｈ，広い，ＣＨＣＨ２ＯＨ），３．６６（２Ｈ，広い，ＣＨＣＨ２ＯＨ），３．９４（１Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ３），４．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＣＨＣＨ２ＣＯ），４．４０（２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ２ＣＯ），５．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＮＨ），７．３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，芳香族），７．３８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，芳香族），７．５９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，芳香族），７．７４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，芳香族）
（例２：ペプチジル樹脂の調製）
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄの固相合成技術（Ｓｔｅｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  （１９８４）、及びＭｅｒｒｉｆｉｅｄ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  ８５，  ２１４９−２１５４  （１９６３）を参照のこと）に従ってペプチジル樹脂を調製した。本発明においては、Ｆｍｏｃ合成技術におけるＷａｎｇ樹脂、２−クロロトリチル＝クロリド樹脂、Ｒａｎｋのアミド樹脂を使用した。Ｗａｎｇ樹脂を使用して、それらがＣ末端でカルボン酸部分を有する、ペプチジル部分を合成した。２−クロロトリチル＝クロリド樹脂を使用して、それらがＣ末端でＰｒｏ、Ｃｙｓ、又はアミノアルコールを有する、ペプチジル部分を合成した。Ｒｉｎｋのアミド樹脂を使用して、それらがＣ末端でアミドを有する、ペプチジル部分を合成した。ＳＰＰＳにおけるこれらの樹脂の適用は、当技術、例えば、Ｗａｎｇ樹脂に関しては、Ｓ．−Ｓ．  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ９５，  １３２８  （１９７３）、及びＧ．  Ｌｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ４６，  ３４３３  （１９８１）、２−クロロトリチル＝クロリド樹脂に関しては、Ｋ．  Ｂａｒｌｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，  ３７，  ５１３  （１９９１）、及びＫ．  Ｂａｒｌｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，  ３８，  ５６２  （１９９１）、Ｒｉｎｋ樹脂に関しては、Ｈ．  Ｒｉｎｋ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ２８，  ３７８７  （１９８７）、Ｍ．  Ｓ．  Ｂｅｍａｔｏｗｉｃｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３０，  ４６４５  （１９８９）において記載されていた。
【０１２３】
ペプチド鎖の形成のためにアミノ基を、Ｆｍｏｃ基によって保護した。ｔ−ブチルを、チロシン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸に対する側鎖を保護する基として使用した。アスパラギン及びヒスチジンに対してはＴｒｔを使用した。リシン及びトリプトファンに対してはＢｏｃを使用した。アルギニンに対してはＰｂｆを使用した。システインに対してはＡｃｍを使用した。
【０１２４】
一般的に、ペプチドを、（１）３０分の２０％ピペリジン−ＤＭＦでＦｍｏｃ保護基を除去すること、並びに（２）ＤＭＦ中におけるＤＩＰＣＤＩ（２当量）及びＨＯＢｔ（２当量）とのＦｍｏｃアミノ酸誘導体（２当量）の２時間のカップリングからなるサイクルに従って合成した。樹脂が、カイザー試験（Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔａｌ．，  １９７０）に対して陽性になったときは、カップリング反応を繰り返した。所望のペプチドを合成した後、ペプチジル樹脂の小さな部分を、ＴＦＡ、クロロホルム、チオアニソール、ＥＤＴ、及びアニソールの開裂のカクテルによって開裂させた。開裂したペプチドを、ＨＰＬＣによって精製し、ＭＳによって同定した。構築されたペプチドを、以下のように列挙する。
【０１２５】
ＥＧＦ
Ｈ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ（配列番号：９）ＭＳ予測：１５４３．７，  ＭＳ実測：１５４３．８、
ＦＧＦ  Ｉ
Ｈ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号：１１）
ＭＳ予測：１２８９．７，  ＭＳ実測：１２９０．４、
ラミニン結合阻害剤
Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号：７）
ＭＳ予測：５５６．３，  ＭＳ実測：５５７、
インテグリン結合阻害剤
Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−ＯＨ（配列番号：６）
ＭＳ予測：５０４．２，  ＭＳ実測：５０５、
フィブロネクチンＣＳ−１フラグメント
Ｈ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号：５）
ＭＳ予測：５８７．６，  ＭＳ実測：５８７．６、
ＦＧＦ（１１９−１２６）
Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＨ（配列番号：１２）
ＭＳ予測：９９３．２，  ＭＳ実測：９９３．３、
ＩＧＦ  Ｉ（３０−４１）
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−ＯＨ（配列番号：１４）
ＭＳ予測：１２６６．４，  ＭＳ実測：１２６７、
ＨＧＦ
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ（配列番号：８）
ＭＳ予測：３４０．３，  ＭＳ実測：３４０．１、
プレプロ神経成長因子（９９−１５）
Ｈ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＯＨ（配列番号：１７）
ＭＳ予測：２００３．２，  ＭＳ実測：２００３．０、
ソマトスタチンの類似体（オクトレオチド）
環状Ｈ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ（オール）
ＭＳ予測：１０１９．２，  ＭＳ実測：  １０１９．４、及び
ソマトスタチンの類似
環状Ｈ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ（オール）
ＭＳ予測：８９０，  ＭＳ実測：８９０
（例３：端の基を官能性にしたＰＥＧ誘導体の合成）
（カルボキシル−ＰＥＧ及びそれの活性なエステル）
カルボキシル−ＰＥＧ
ＰＥＧ２０００（８．６ｇ）及びカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２０ｇ）を、３００ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルアルコール中に溶解させ、４０℃まで温めた。エチル＝ブロモアセタート（１０ｍｌ）を２０分の間にわたって添加した。混合物を２時間攪拌し、次に溶媒を取り除くために蒸発させた。残留物を、２００ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨ中で加水分解し、室温で２時間攪拌した。加水分解の終了において、混合物のｐＨを、２まで調節し、ＣＨＣｌ３（２×２００ｍｌ）によって抽出した。組み合わせた抽出物を、水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて濃縮し、真空中で乾燥させた。白色のカルボキシル−ＰＥＧ粉末を得て、収量は６．８８ｇだった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３．６６（ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ），４．１３（ｓ，ＨＯ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｏ）
ＰＥＧ−オキシベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ（２．６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＤＩ（１．９１ｍｍｏｌ）、及びカルボキシル−ＰＥＧ３０００（０．８７ｍｍｏｌ）を、４ｍｌのＤＭＦ中で混合し、室温で２０分間、窒素下で攪拌した。混合物を加えて、ＰＥＧ−オキシベンゾトリアゾールのさらなる精製無しで、ペプチジル樹脂と共役させた。
【０１２６】
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）によるカルボキシル−ＰＥＧの活性化
ＤＭＡＰ（１．９１ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１．９１ｍｍｏｌ）及びカルボキシル−ＰＥＧ３０００（０．８７ｍｍｏｌ）を、４ｍｌのＤＭＦ中で混合し、室温で２０分間、窒素下で攪拌した。混合物を加えて、活性化したカルボキシル−ＰＥＧのさらなる精製無しで、ペプチジル樹脂と共役させた。
【０１２７】
カルボキシル−ＰＥＧのスクシンイミジルエステル（Ｓｕ−ＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ）
ＨＮＳ（２．６ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（２．６ｍｍｏｌ）を、４ｍｌのＤＭＦ中におけるカルボキシル−ＰＥＧ２０００（０．８７ｍｍｏｌ）の混合物中に添加し、室温で一晩、窒素下で攪拌した。反応の終了において、混合物を、溶媒を取り除くために蒸発させた。残留物を、１０ｍｌのＨ２Ｏに添加し、２０ｍｌのＤＣＭで三回抽出した。組み合わせた抽出物を、飽和の塩性溶液（例えば、ＮａＣｌ）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、次に濃縮し、真空中で乾燥させた。粗生成物を、エーテルによって沈殿させ、さらにイソプロパノール／エーテルから精製して４５％を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．８７（ｓ，Ｏ−Ｎ（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）２），３．６６（ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ），４．５３（ｓ，−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＯＳｕ）
ＰＥＧのｐ−ニトロフェニルカルボナート（ｐＮＰ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＰＥＧ）ｐ−ニトロフェニル＝クロロホルマート（２．２２ｇ）を、４０ｍｌのＤＣＭ中におけるＰＥＧ２０００（１０ｇ）及びＴＥＡ（１．３１ｍｌ）の混合物中に添加し、室温で一晩、窒素下で攪拌した。攪拌の終了において、混合物を濾過してＴＥＡ−ＨＣｌの塩を取り除き、蒸発させて溶媒を取り除いた。粗生成物を、イソプロピルエーテルによって沈殿させ、エチル＝アセタート及びエチルエーテルから二回再結晶させた。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３．６６（ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ），３．８０（４Ｈ，ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｈ４ＮＯ２），４．４４（４Ｈ，ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｈ４ＮＯ２），７．３８＆８．２８（８Ｈ，ｄｄ，−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｈ４ＮＯ２）
Ｔｏｓ−ＰＥＧ（ＣＨ３Ｃ６Ｈ４Ｓ（Ｏ２）Ｏ−ＰＥＧ）
Ｐ−トルエンスルホニルクロリド（２．２９ｇ）を、１５ｍｌのＤＣＭ中におけるＰＥＧ２０００（１０ｇ）及びピリジン（１．２１ｍｌ）の混合物中に添加し、室温で一晩、窒素下で攪拌した。反応の終了において、混合物を、溶媒を取り除くために蒸発させた。白色の粗生成物を、氷浴中において１／１．３の比のイソプロパノール／イソプロピルエーテルの混合溶媒によって沈殿させた。粗生成物を、１／１の体積比のエチル＝アセタート／エチルエーテルによって二回再結晶させた。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．３４（６Ｈ，ｓ，−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３），３．６６（ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ），４．１５（４Ｈ，ｓ，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３），７．１６＆７．７９（８Ｈ，ｄｄ，−ＯＳＯ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３）
（例４：スペーサ−脂質共役体の調製）
ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＤＳＰＥの調製
Ｓｕ−ＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００（０．６ｍｍｏｌ）を、ＤＳＰＥ（０．４４９ｇ，０．６ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．２ｍｌ，１．４ｍｍｏｌ）、及びＤＭＦ（５ｍｌ）を含有する混合物に添加した。混合物を、４時間の継続時間の間、４０℃乃至４５℃の温度範囲内で攪拌した。生成物を、クロロホルム／メタノール／水（３：１：０．１  ｖ／ｖ）の溶液を使用する薄層クロマトグラフィーによって確認した。
【０１２８】
Ｐｎｐ−Ｏ−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＤＳＰＥの調製
ｐＮＰ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００（０．６ｍｍｏｌ）を、ＤＳＰＥ（０．４５ｇ，０．６ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．６ｍｍｏｌ）、及びクロロホルム（１０ｍｌ）を含有する混合物に添加した。混合物を、おおよそ２時間の継続時間の間、４０℃乃至４５℃の温度範囲内で攪拌した。生成物を、クロロホルム／メタノール／水（３：１：０．１  ｖ／ｖ）の溶液を使用する薄層クロマトグラフィーによって確認した。
【０１２９】
（例５：ペプチジル樹脂へのスペーサの共役）
ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
２−クロロトリチル＝クロリド樹脂による固相のペプチド合成から得られたＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂（０．１３  ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ中における２０％ピペリジンの５ｍｌで処理し、ペプチジル樹脂のＮ末端からＦｍｏｃ保護基を取り除いた。Ｆｍｏｃを取り除いた後、樹脂を、ＤＭＦ（５ｍｌ×３）で洗浄した。５ｍｌのＤＭＦ中においてＨＯＢｔ（０．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＤＩ（０．８ｍｍｏｌ）、及びカルボキシル−ＰＥＧ６００（０．４ｍｍｏｌ）を混合することによって得られる、ＰＥＧ−オキシベンゾトリアゾールの混合物を、Ｈ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂に添加した。カップリング反応は、振とうと共に２時間、室温で進行した。反応の完了を、カイザー試験によって確かめた。反応の終了において、過剰の試薬及び副産物を洗浄して落とした。ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の小さい部分を、開裂させ、ＮＭＲ及びＭＳ分光法によって同定した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）は、δ３．５ｐｐｍにエチレングリコールのピーク及びペプチドのプロトンを示した。質量スペクトルにおいて、鈴形状の分子の分布が、ＰＥＧの異なる分子質量によって観察された。ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールに対する１７６３．５の測定された中央の分子量は、事実上、１７６３．６の計算した分子量と合う。
【０１３０】
ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
反応の条件及び手順を、カルボキシル−ＰＥＧ２０００を使用してカルボキシル−ＰＥＧ６００を置き換えたことを除いて、上述のように行なった。
【０１３１】
ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ３０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
反応の条件及び手順を、カルボキシル−ＰＥＧ３０００を使用してカルボキシル−ＰＥＧ６００を置き換えたことを除いて、上述のように行なった。
【０１３２】
ｐＮＰ−ＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
固相のペプチド合成から得られたＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂（０．１３  ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ中における２０％ピペリジンの５ｍｌで処理し、ペプチジル樹脂のＮ末端からＦｍｏｃ保護基を取り除いた。Ｆｍｏｃを取り除いた後、樹脂を、ＤＭＦ（５ｍｌ×３）で洗浄した。５ｍｌのＤＭＦ中におけるｐＮＰ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００（０．３９ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（１．１５ｍｍｏｌ）の混合物を、Ｈ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂に添加した。カップリング反応は、一晩、室温で進行した。反応の完了を、カイザー試験を使用して実証した。反応の終了において、過剰の試薬及び副産物を洗浄して落とした。合成されたＨＯ−ＰＥＧ２０００−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オール共役体の小さい部分を、樹脂から開裂させ、１Ｈ−ＮＭＲ分光法によって同定した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）は、δ３．５ｐｐｍにエチレングリコールのピーク及びペプチドのプロトンを示した。
【０１３３】
（例６：スペーサ−ペプチジル樹脂への脂質の共役）
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
２ｍｌのＤＭＦ中のＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂  （０．１３ｍｍｏｌ）を、ＮＨＳ（０．４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（０．４ｍｍｏｌ）に添加し、次に混合物を、４時間、室温で振とうさせた。その後、ＤＳＰＥ（０．２６ｍｍｏｌ）を添加して、一晩、５５℃で混合溶媒中（４ｍｌのクロロホルム及び０．５ｍｌのＴＥＡ）で、活性化したＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂（０．１３ｍｍｏｌ）とカップリングさせた。反応後、樹脂を、クロロホルム、ＤＭＦ、及びＭｅＯＨで洗浄し、開裂を受けさせた。
【０１３４】
（例７：ペプチジル樹脂へのスペーサ−脂質の共役）
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂の調製
ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（０．４ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＣＤＩ（０．８ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ（０．８ｍｍｏｌ）に添加した。溶液を、３０分間、室温で攪拌し、次にペプチジル樹脂へ添加した。カップリング反応は、振とうと共に、おおよそ２時間、おおよそ室温で進行する。反応の完了を、カイザー試験を使用して実証した。反応の終了において、過剰の試薬を洗浄して落とし、樹脂に開裂を受けさせた。
【０１３５】
（例８：脂質−スペーサ−ペプチジル樹脂の開裂）
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂を、開裂のカクテル（５０％ＴＦＡ、４５％ＣＨＣｌ３、３．７５％アニソール、及び１．２５％ＥＤＴ）によって開裂させた。開裂した混合物を、追加の１０分間、室温で振とうさせて、保護基を完全に取り除いた。混合物を、氷浴中で冷却し、次に、冷えたエーテルを添加して生成物を沈殿させた。沈殿物を回転させ、冷えたエーテルで三回洗浄した。粗生成物を、Ｃ８シリカカラムをもつ液体クロマトグラフィーによって精製し、水中のメタノール勾配（０乃至８５％  ｖ／ｖ）で溶離させ、白色固体粉末を得た（２００ｍｇ／樹脂のｇ）。ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールを、１Ｈ−ＮＭＲ及びＭＳによって同定した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）δ（ｐｐｍ）：０．９０（６Ｈ，ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（５６Ｈ，ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），１．９７（６Ｈ，ｓ，−ＮＨＣ（Ｏ）−ＣＨ３），１．５９（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），２．３３（４Ｈ，ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），３．６３（２６８Ｈ，ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２３（１Ｈ，ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン），６．８５−８．５０（１５Ｈ，フェニルの芳香族プロトン，インドール）質量スペクトルの２４５１の測定された中央の分子量は、２４５０の計算した分子量に合う。
【０１３６】
（例９：脂質−スペーサ−ペプチド共役体のジスルフィドの環化）
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールを、１０当量のＩ２（１ｍｌのメタノール中で４０μｌの２０％のＩ２）で１．０ｍｇ／ｍｌより少ない濃度でメタノール中に溶解させ、混合物を、１時間、室温で振とうさせた。溶液を、Ｓｐｅｃｔｒａ／ＰｏｒＴＭの透析管（ＭＷＣＯ  ２，０００）のような透析管中へ移し、４℃の水に対して透析させた（３×１０００ｍｌ，８−１６時間毎周期）。次に、溶液を、凍結乾燥させて、白色のふわふわした固体を得た。環化したＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール（ｃ−ＯＰＤ６００）の質量スペクトルの測定された中央の分子量２３５１は、２３５１の計算した分子量に合う。１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）δ（ｐｐｍ）：０．９０（６Ｈ，ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（５６Ｈ，ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），１．５９（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），２．３１（４Ｈ，ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），３．６４（２６８Ｈ，ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２２（１Ｈ，ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン），６．８５−８．５０（１５Ｈ，フェニルの芳香族プロトン，インドール）
（例１０：ペプチド−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ共役体の追加の合成）
シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール（ｃ−ＯＰＤ２０００）の合成
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オール−樹脂を、ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オール−樹脂の合成と類似の手順によって合成した。簡単に、ペプチジル樹脂を、例２に記載した手順に従って調製した。ペプチジル樹脂へのＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＯＨの共役を、一晩、４５℃で、５ｍｌのＤＭＦ中のＨＯＢｔ（０．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣＤＩ（０．８ｍｍｏｌ）、カルボキシル−ＰＥＧ２０００（０．４ｍｍｏｌ）、及びペプチジル樹脂（０．１３ｍｍｏｌ）を攪拌することによって進行させた。反応を実施した後、ＨＯＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−オール−樹脂（０．１３ｍｍｏｌ）を、５５℃で、２ｍｌのＤＭＦ中のＮＨＳ（０．４ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（０．４ｍｍｏｌ）によって活性化した。ＰＥＧ−ペプチジル樹脂への脂質の共役を、混合溶媒中（４ｍｌのクロロホルム及び０．２ｍｌのＴＥＡ）で活性化したＰＥＧ−ペプチジル樹脂（０．１３ｍｍｏｌ）へＤＳＰＥを添加し、一晩、６０℃の油浴で加熱することによって行なった。樹脂からの共役体の開裂を、例８に記載したように行なった。得られた混合物を、１／１（ｖ／ｖ）の比のメタノール／Ｈ２Ｏの溶媒に溶解させ、次に、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ膜（ＭＷＣＯ：２５，０００ダルトン）を通じた透析を行なって、ペプチド−スペーサ、ペプチド、及び他の遊離の小さい分子のような望まれない成分を取り除いた。さらに、ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールを、例９に記載した過程を使用して、ジスルフィド結合の形成によって、環化した。環化した共役体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーを通じて精製し、得られたシクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オールを、１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）：δ（ｐｐｍ）：０．９０（６Ｈ，ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（５６Ｈ，ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），１．５９（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），２．３２（４Ｈ，ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），３．６０（１８０Ｈ，ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２２（１Ｈ，ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン），６．８５−８．５０（１５Ｈ，フェニルの芳香族プロトン，インドール）によって構造的に確認した。
【０１３７】
シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ３０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール（ｃ−ＯＰＤ３０００）の合成
シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ３０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オールを、使用したカルボキシル−ＰＥＧが３０００ダルトンの平均分子量を有したことを除いて、シクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オールと同じ手順によって合成した。得られたシクロ−ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ３０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オールは、計算した平均分子量を合った約４６００の中央の分子量を有した。
【０１３８】
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−オールの合成
Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−オール−樹脂のペプチジル樹脂を、例２に記載したようなＦｍｏｃの化学において２−クロロトリチル＝クロリド樹脂を使用することによって合成した。以下の反応を、ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールの調製において記載したのと同じ手順によって行った。得られたＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−オールは、１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）δ（ｐｐｍ）：０．９０（ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），１．８０（ｄｄ，Ａｒｇのガンマ−炭素におけるＨ），１．９３（ｍ，Ａｒｇのベータ−炭素におけるＨ），２．３２（ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），２．８２（ｄｄ，Ａｓｐのベータ−炭素におけるＨ），２．９２（ｄｄ，Ａｓｐのベータ−炭素におけるＨ），３．６３（ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２２（ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン）を示した。ペプチドにおけるアルファ炭素及び残留物の他のプロトンは、δ１．５−４．７ｐｐｍの間に分布した。
【０１３９】
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−オールの合成
Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−オール−樹脂のペプチジル樹脂を、例２に記載したようなＦｍｏｃの化学において２−クロロトリチル＝クロリド樹脂を使用することによって合成した。以下の反応を、ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールの調製において記載したのと同じ手順によって行った。得られたＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−オールは、１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）δ（ｐｐｍ）：０．９０（ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），２．３２（４Ｈ，ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），３．６３（ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２２（１Ｈ，ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン）を示した。ペプチドにおけるアルファ炭素及び残留物のプロトンは、δ１．５−４．７ｐｐｍの間に分布した。
【０１４０】
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−オールの合成
Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−オール−樹脂のペプチジル樹脂を、例２に記載したようなＦｍｏｃの化学において２−クロロトリチル＝クロリド樹脂を使用することによって合成した。以下の反応を、ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−オールの調製において記載したのと同じ手順によって行った。得られたＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ２０００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−オールは、１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）δ（ｐｐｍ）：０．９０（ｔ，ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−），１．２９（ｂｒ．ｓ，−（ＣＨ２）ｎ−），２．３２（ｔ，−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−），３．６３（ｓ，−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−），５．２２（ｓ，グリセロールのｓｎ２プロトン）を示した。ペプチドにおけるアルファ炭素及び残留物のプロトンは、δ１．５−４．７ｐｐｍの間に分布した。ペプチドにおける芳香環のプロトンは、δ６．５−８．６の間に分布した。
【０１４１】
（例１１：治療薬が含有されたリポソームの調製）
ＨＳＰＣ（０．１２１ｍｍｏｌ）／Ｃｈｏｌ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（１０：７：０．４モル比）の脂質の成分を、クロロホルム／メタノール（１：１）に溶解させ、どんな有機溶媒も取り除くために蒸発させ、次に真空中で乾燥させて脂質のフィルムを得た。脂質のフィルムは、１５０ｍＭの硫酸アンモニウムの緩衝材において水和のために活発な渦運動を受け、凍結−解凍のサイクルを、１０回進行させた。ＬｉｐｏｓｏｆａｓｔＴＭ（Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）からの押し出しデバイスを使用して、混合物を、二重に積層したポリカルボナートの膜（４００から１００ｎｍまでの孔の大きさ）を通じて押し出して、リポソームを生成させた。リポソームの外側の緩衝剤の溶液を、ゲル濾過のカラムを通過させることによって、３００ｍＭのヒスチジンまで変化させた。ＤＯＸの投入を、１時間、６５℃で、１ｍｌの３００ｎＭのヒスチジン中に１０ｍｇのＤＯＸの溶液とリポソームを混合することによって行なった。次に、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＮａＣｌの緩衝剤（ｐＨ７．２）中でゲル濾過のカラムを通過させることによって、遊離のＤＯＸを取り除いた。リポソームのリン脂質の濃度を、それらのリンの含有量によって決定し、小胞の大きさを、動的なレーザー散乱によって決定し、ＤＯＸの含有量を、ＵＶによって決定した。リポソームは、１３５ｎｍの平均の小胞の大きさを、＜２５％の標準偏差及び通常の大きさの分布で有していた。リポソーム中のＤＯＸの含有量は、０．２８の薬物／脂質のモル比に到達する。
【０１４２】
（例１２：目標とされる治療に役立つリポソームの調製）
ＤＳＰＥ−ＮＨＣ（Ｏ）−ＰＥＧ６００−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（０．００４／０．０１２ｍｍｏｌ）を、３ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：１）に溶解させ、蒸発させて乾燥した脂質のフィルムを製造した。乾燥させた脂質のフィルムを、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＮａＣｌの１ｍｌ溶液（ｐＨ７．２）中で、混合物の穏やかな渦運動と共に、６０℃で水和させた。脂質のフィルムが溶融し、混合物が、澄んだミセルの溶液になった後、ミセルの溶液を、次に６０℃で４時間、４ｍｌの、ＤＯＸが含有されたリポソーム（含有された０．２１ｍｍｏｌの全脂質及び０．０５８ｍｍｏｌのＤＯＸ・ＨＣｌ）へ移し、挿入を完了した。次に、溶液を、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈＴＭ）カラムのような、ゲル濾過のカラムに通過させ、ミセル及び目標とされる治療に役立つリポソームを分離する。ミセル及び目標とされる治療に役立つリポソームのフラクションを、定量分析のために別々に蓄えた。リポソームにおいて挿入されたペプチド−ＰＥＧ−脂質共役体は、リポソームの全脂質の約１％であった。
【０１４３】
（例１３：ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）とｃ−ＯＰＤ共役体の結合の評価分析）
ＳＳＴＲ２とｃ−ＯＰＤ６００及びｃ−ＯＰＤ２０００共役体の結合の評価分析を、Ｐａｔｅｌ．  Ｙ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｓｒｉｋａｎｔ，  Ｃ．  Ｂ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５，  ２８１４−２８１７  （１９９４）、及びＬｉａｐａｋｉｓ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１，  ２０３３１−２０３３９  （１９９６）に記載されている方法に従って行なった。簡単に、ヒトのソマトスタチンＳＳＴＲ２のプラスミドと共に移入したＣＨＯ−ＫＩの細胞膜を、結合の評価分析に使用した。結合の評価分析を、細胞膜への０．０３ｎＭの［１２５Ｉ］ソマトスタチン−１４の結合に対して競争するｃ−ＯＰＤ共役体の濃度を増加させることによって行なった。非特異的な結合を、ｃ−ＯＰＤ共役体の添加無しで、１μＭの［１２５Ｉ］ソマトスタチン−１４のものよりも低い放射能として定義した。２５℃で４時間、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する緩衝剤（ｐＨ７．４）中の細胞膜、［１２５Ｉ］ソマトスタチン−１４、及びｃ−ＯＰＤ共役体を保温することによって結合反応を進行させた。結合反応を、ＧＦ／Ｃガラス繊維フィルターを通じて急速に濾過することによって停止させた。次に、フィルターを、４ｍｌの氷で冷やした緩衝剤で３回洗浄し、次に結合した［１２５Ｉ］−ソマトスタチン−１４の放射能を測定した。阻害定数（Ｋｉ）の値を、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ、  Ｃｈｅｎｇ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｐｒｕｓｏｆｆ，  Ｗ．  Ｈ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２２，  ３０９９−３１０８  （１９７３）の式を使用することによって計算した。ｃ−ＯＰＤ６００に対する得られたＫｉの値は、２５ｎＭであり、ｃ−ＯＰＤ２０００に対しては１１ｎＭであった。
【０１４４】
ここで詳細に示し記載した情報は、本発明の上述の目的を達成することが十分可能であり、本発明の現在の好適な実施例であり、よって、本発明によって広く熟慮される主題の典型である。本発明の範囲は、当業者に明らかになる場合もある他の実施例を十分に包含し、従って、添付した請求項以外には何によっても限定され得ず、ここで単数の要素に対する表示は、“一つ及び唯一”を意味することを、明確にそのように述べない限り、意図せず、むしろ“一つ又は複数”である。上述の好適な実施例及び当業者に知られる追加の実施例の要素に対する全ての構造、組成、及び機能の均等物は、これによって明白に参照によって組み込まれ、本請求項によって包含されることが意図される。
【０１４５】
さらに、本発明による解決に対して探索される各々の及びあらゆる問題を扱うためのデバイス又は方法に関する、本請求項に包含されるそのようなものに関する必要条件は存在しない。さらに、本開示における要素、成分、又は方法のステップは、要素、成分、又は方法のステップが請求項に明確に述べられるかどうかに関らず、公に供されることを意図してない。しかしながら、形式、試薬、及び合成の詳細における様々な変化及び変更が、添付した請求項に示すような本発明の主旨及び範囲から逸脱することなくなされてもよいことは、当業者には容易に明らかであるはずである。
【０１４６】
【配列表】
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