(57)【要約】【課題】　疾患と密接に関連する、チロシンリン酸化ＣａｇＡタンパク質を認識する抗体を提供すると共に、さらにその抗体を用いた、胃潰瘍、胃癌等の疾患と密接に関連したＨ．ピロリ菌の感染を検出する方法、Ｈ．ピロリ菌の感染検出剤、疾患の発症または発症危険性判定方法、治療方法、及びワクチンを提案する。【解決手段】　ヘリコバクター・ピロリ菌が感染している宿主細胞に見出される、チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を特異的に認識する抗体を作製した。この抗体を用いることにより、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を高精度で検出することができるため、種々の疾患と密接に関連するＨ．ピロリ菌の感染を検出可能である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　ヘリコバクター・ピロリ菌が感染している宿主細胞に見出される、チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を特異的に認識する抗体。
【請求項２】
　配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１番目のシステイン残基を除く２〜１６番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、１０番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを含むリン酸化ＣａｇＡタンパク質を特異的に認識する抗体。
【請求項３】
　請求項１または２に記載の抗体を含有するヘリコバクター・ピロリ菌の宿主細胞への感染検出剤。
【請求項４】
　請求項１または２に記載の抗体を用いて、ヘリコバクター・ピロリ菌の宿主細胞への感染を検出する方法。
【請求項５】
　請求項１または２に記載の抗体を用いて、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、および胃癌のうち、いずれかの疾患の発症または発症危険性を判定する方法。
【請求項６】
　請求項１または２に記載の抗体を用いて、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、および胃癌のうち、いずれかの疾患を治療する方法。
【請求項７】
　配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、４番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを含有するワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、ヘリコバクター・ピロリ菌（Helicobacter pylori）由来のチロシンリン酸化ＣａｇＡタンパク質を認識する抗体、及びその利用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
　ヘリコバクター・ピロリ菌（以下、Ｈ．ピロリ菌と称する）は、ヒトの胃内から分離されたグラム陰性桿菌であり、ヒト等の動物の胃上皮細胞に接着し、感染することが知られている。そして、Ｈ．ピロリ菌の感染は、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍の主な原因と考えられており、さらに、胃癌との関連性も指摘されている。
【０００３】
　このようなＨ．ピロリ菌は、病原性関連因子として、ウレアーゼ、空胞化サイトトキシンＶａｃＡ（vaculoating cytotoxin）タンパク質、空胞化サイトトキシン関連遺伝子ＣａｇＡ（cytotoxin-associated gene A）タンパク質等を産生することが知られており、これらの病原性因子が、Ｈ．ピロリ菌の感染により引き起こされる種々の疾患の原因の一つと考えられている（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照。）。
【０００４】
　このように、Ｈ．ピロリ菌の感染が種々の疾患の原因となるため、上記疾患の早期発見、早期治療を行うために、Ｈ．ピロリ菌の感染を検出、診断する方法がいくつか考えられている。例えば、上記病原性関連因子の一つであるウレアーゼを標的としたウレアーゼ試験がある。具体的には、内視鏡的に採取した生検組織を用いて、ウレアーゼ活性を指標としてＨ．ピロリ菌が感染しているか否かを診断する方法である。その他には、血中、尿中のＨ．ピロリ菌に対するＩｇＧ抗体を測定する方法等も利用されている（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００５】
　上記方法によって、Ｈ．ピロリ菌が感染しているか否かを簡便に診断することができる。
【非特許文献１】ライナー・ハス（Rainer Haas）、ブレンダン・バーンズ（Brendan P. Burns）、朝日百百代共著、「Pathogenesis of Helicobacter pylori」、Current Opinion in Gastroenterology、リピンコット・ウイリアムズ　アンド　ウィルキンス（Lippincott Williams & Wilkins, Inc.）、2001年、第17巻、第1号（suppl 1）、S1-S5
【非特許文献２】朝日百百代、外11名共著、「Helicobacter pylori CagA Protein Can Be Tyrosine Phosphorylated in Gastric Epithelial Cells」、Journal of Experimental Medicine、ロックフェラー大学出版（Rockefeller University Press）、2000年2月21日、第191巻、第4号、p.593-602
【非特許文献３】坂本長逸著、「H.pylori感染胃・十二指腸粘膜における組織学的変化とその除菌後におよぼす影響」、Journal of Nippon medicine School、日本医科大学、2002年、第69巻、第1号、p.67-70
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
　しかし、Ｈ．ピロリ菌の感染者の全てに上記疾患が発生するわけではない。例えば、胃・十二指腸潰瘍等の消化性潰瘍は、Ｈ．ピロリ菌感染者のほんの一部、約２〜３％、さらに胃癌は１〜２％にしか発生しないことが知られている。
【０００７】
　このため、上述した従来の方法による診断では、網羅的にＨ．ピロリ菌の感染を調べることはできるが、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、さらに、胃癌といった疾患と密接に関連するＨ．ピロリ菌の感染を効率的に精度よく調べることはできない。即ち、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、さらに、胃癌等の疾患を効率的に、早期に検出、診断、治療することはできないという問題がある。
【０００８】
　本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、疾患と密接に関連する、チロシンリン酸化ＣａｇＡタンパク質を認識する抗体を提供するとともに、さらにその抗体を用いた、胃潰瘍、胃癌等の疾患と密接に関連したＨ．ピロリ菌の感染を検出する方法、Ｈ．ピロリ菌の感染検出剤、疾患の発症または発症危険性の判定方法、治療方法、及びワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
　本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、Ｈ．ピロリ菌に感染した宿主細胞に見出される、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を特異的に認識する抗体を作製し、ヒトの萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、胃癌等の患者から得られた生検標本に該抗体を作用させることにより、これらの疾患部位からチロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を検出できることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
　即ち、本発明に係る抗体は、（ａ）ヘリコバクター・ピロリ菌が感染している宿主細胞に見出される、チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を特異的に認識する抗体である。
【００１１】
　上記抗体は、本発明者が今回新たに、ヘリコバクター・ピロリ菌が感染している宿主細胞に特異的に見出される、チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を認識する抗体として生産したものである。
【００１２】
　なお、本発明で「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含むものである。
【００１３】
　また、本発明に係る抗体は、（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１番目のシステイン残基を除く２〜１６番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、１０番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを含むリン酸化ＣａｇＡタンパク質を特異的に認識する抗体である。
【００１４】
　上記「ポリペプチド」とは、後述するように、Ｈ．ピロリ菌由来のＣａｇＡタンパク質の抗原決定基（エピトープ）領域であり、その１０番目のチロシン残基がリン酸化されているものである。配列番号１中、１番目のシステイン残基は抗体作製時にキャリアタンパク質との結合のため付加されたものであり、ＣａｇＡタンパク質の配列には存在しない。
【００１５】
　即ち、本発明に係る抗体は、１０番目のチロシン残基がリン酸化されている場合のみ、上記ポリペプチドを含むリン酸化ＣａｇＡタンパク質を特異的に認識する。実際、本発明者が作製した抗体は、胃潰瘍患者等から採取した胃上皮組織において、リン酸化ＣａｇＡタンパク質を特異的に認識することが示された（後述の実施例参照）。
【００１６】
　また、本発明に係るヘリコバクター・ピロリ菌の宿主細胞への感染検出剤は、上記（ａ）または（ｂ）の抗体を含有するものであり、本発明に係るヘリコバクター・ピロリ菌の宿主細胞への感染を検出する方法は、上記（ａ）または（ｂ）の抗体を用いて行うものである。上述したように、上記（ａ）または（ｂ）の抗体は、高精度でチロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を認識することができる。このため、本発明に係るヘリコバクター・ピロリ菌の感染検出剤、感染検出方法を用いることにより、高精度で、効率よく疾患と密接に関連するＨ．ピロリ菌の宿主細胞への感染を検出することができる。
【００１７】
　また、本発明に係る疾患の発症または発症危険性判定方法は、上記（ａ）または（ｂ）の抗体を用いて、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、および胃癌のうち、いずれかの疾患の発症または発症危険性を判定する方法である。この判定方法を用いることにより、容易に、上記疾患の発症または発症危険性を判定することができ、上記疾患の早期診断、早期治療または予防を行うことができる。
【００１８】
　また、本発明に係る疾患の治療方法は、上記抗体を用いて、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、および胃癌のうち、いずれかの疾患を治療する方法である。
【００１９】
　また、本発明に係るワクチンは、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、１０番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを含有するワクチンである。
【００２０】
　本発明のワクチンを用いることにより、Ｈ．ピロリ菌の感染、または萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、および胃癌のうち、いずれかの疾患を治療、または予防することができる。
【発明の効果】
【００２１】
　上述したように、本発明に係る抗体は、Ｈ．ピロリ菌が感染している宿主細胞に見出される、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を精度良く認識することができる。このため、本発明に係る抗体は、高精度で種々の疾患と密接に関連しているＨ．ピロリ菌の感染を、高精度、かつ効率的に検出できるという効果を奏する。
【００２２】
　また、本発明に係るＨ．ピロリ菌の感染検出剤、Ｈ．ピロリ菌の感染検出方法を用いることにより、高精度、かつ効率的に種々の疾患と密接に関連しているＨ．ピロリ菌の感染を検出することができるという効果を奏する。
【００２３】
　さらに、本発明に係る疾患の発症または発症危険性判定方法を用いることにより、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、胃癌等の疾患の発症または発症危険性を高精度、かつ効率的に判断することができ、上記疾患の予防、早期診断、早期治療に利用することができるという効果を奏する。
【００２４】
　また、本発明に係る疾患の治療方法を用いることにより、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、胃癌等の疾患の発症または発症危険性を高精度、かつ効率的に治療することができるという効果を奏する。
【００２５】
　また、本発明に係るワクチンを用いることにより、効果的にＨ．ピロリ菌の感染を治療することができ、ひいては、Ｈ．ピロリ菌の感染により引き起こされる種々の疾患を予防、治療することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
　本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
　本発明は、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、胃癌等の疾患と密接に関連するチロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を特異的に認識する新規な抗体を提供するとともに、その利用方法を提案するものである。
【００２８】
　ＣａｇＡタンパク質が、ヒトの胃上皮細胞内に注入され、チロシンリン酸化されると、胃上皮細胞内のシグナル伝達を阻害することが知られている。このことが胃上皮細胞に与える影響についての詳細は、未だ明らかとなっていない。しかし、ＣａｇＡタンパク質等の病原性関連因子は、胃上皮細胞に様々な影響を与えることが予想される。例えば、これら病原性関連因子の刺激により、胃上皮細胞からＩＬ−８（interleukin-8）をはじめとした種々のサイトカインが分泌され、好中球やその他の炎症細胞が粘膜固有層に遊走する。そして胃上皮細胞が障害を受け、さらに炎症細胞が遊走し、免疫反応が賦活されると考えられる。
【００２９】
　そのため、本発明者は、ＣａｇＡタンパク質のチロシンリン酸化は、Ｈ．ピロリ菌の感染が引き起こす種々の疾患（例えば、慢性胃炎、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、胃癌等）に特異的な現象であって、これら疾患の発症機構の１つではないかと注目した。
【００３０】
　そこで、本発明者は、種々の疾患における、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質の作用に注目し、Ｈ．ピロリ菌が感染している宿主細胞に特異的に見出される、チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を認識する抗体を生産し、該抗体を利用して、疾患と密接に関連するＨ．ピロリ菌の感染を高精度で、効率よく検出する手段を独自に開発した。
【００３１】
　即ち、後述する実施例に示すように、本発明に係る抗体を用いることにより、萎縮性胃炎（腸上皮化性が見られる）の生検標本において、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質が検出されることが実験的に示された。この萎縮性胃炎、腸上皮化性は、胃癌や胃潰瘍の発生母地（前癌状態）と一般的に考えられている。このため、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質は、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、胃癌等の疾患と密接に関連していることがin vivoにて初めて示唆された。即ち、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質が検出されることは、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、及び胃癌等が発症している、あるいは発症する危険性が高いことを示すと考えられる。
【００３２】
　従って、この手段、即ち、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を検出する手段は、慢性胃炎、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、胃癌等のＨ．ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患の予防、早期発見、早期治療を行うための重要な手段となる可能性が高い。
【００３３】
　そこで以下に、まず本発明に係る抗体の特徴について説明し、次いで上記抗体の生産方法、機能、及び利用方法について説明することとする。
【００３４】
　（１）本発明に係る抗体の特徴
　本発明者は、以前、胃の上皮細胞に感染したＨ．ピロリ菌によって、ＣａｇＡタンパク質が宿主細胞（例えば、ヒトの胃上皮細胞）の細胞質内に注入された後、宿主細胞内のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫｓ）によって、リン酸化されることを明らかにした（上記非特許文献２：Asahi. M., et al. J. Exp. Med. 191, No.4: 2000 593-602）。そして、この現象に着目し、この現象を利用して効率的に、上記疾患と密接に関連するＨ．ピロリ菌の感染を検出する方法等を開発しようと鋭意努力を重ねた。
【００３５】
　その結果、本発明者は、効率的に、上記疾患と密接に関連するＨ．ピロリ菌の宿主細胞への感染を検出することを目的とし、Ｈ．ピロリ菌が感染している宿主細胞に見出される、チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を特異的に認識する抗体を生産することに成功し、本発明を完成するに至った。なお、本発明でいう「チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質」とは、ＣａｇＡタンパク質のチロシン残基にリン酸基が結合しているものをいう。Ｈ．ピロリ菌由来のＣａｇＡタンパク質には、その８９３番目と９１２番目と９６５番目と９９９番目と１０３３番目とにチロシン残基が存在するが、これら５つのチロシン残基の少なくとも一つのチロシン残基がリン酸化されていればよい。即ち、本発明に係る抗体は、上記５つのチロシン残基のリン酸化を認識するものである。なお、上記５つのチロシン残基のうち、９６５番目、９９９番目および１０３３番目に存在するチロシン残基はいずれも、ITAM（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）とよばれるモチーフと非常に類似する領域（ITAM様モチーフ）に存在する。そのため、上記９６５番目、９９９番目および１０３３番目のチロシン残基のリン酸化を特異的に認識する抗体であることがより好ましい。
【００３６】
　また、上記「宿主細胞」とは、例えば、Ｈ．ピロリ菌が感染することができる細胞であればよく、その細胞の由来生物種、器官、組織等は特に限定されるものではない。上記宿主細胞として、例えば、ヒトの胃上皮細胞や十二指腸上皮細胞等が挙げられる。
【００３７】
　また、本発明に係る抗体は、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質の抗原決定基（エピトープ）領域である、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、１０のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを特異的に認識するものであればよい。なお、上記「ポリペプチド」とは、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質のエピトープ領域（Ｈ．ピロリ菌由来のＣａｇＡタンパク質の９５７番目〜９７１番目のアミノ酸残基、９９１番目〜１００５番目のアミノ酸残基、１０２５番目〜１０３９番目のアミノ酸残基）に相当し、さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１０番目のチロシン残基がリン酸化されているものをいう。
【００３８】
　本実施の形態では、本発明に係る抗体の一例として、本発明者がＨ．ピロリ菌由来のチロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質のエピトープ領域（Ｈ．ピロリ菌由来のＣａｇＡタンパク質の９５７番目〜９７１番目のアミノ酸残基、９９１番目〜１００５番目のアミノ酸残基、１０２５番目〜１０３９番目のアミノ酸残基）に相当し、さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１０番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを抗原として生産したポリクローナル抗体を例に挙げて説明する。
【００３９】
　なお、上記本実施の形態に係る抗体は、後述する実施例に示すように、配列番号３に示すアミノ酸配列からなり、８番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドとアフィニティ結合するポリクローナル抗体として精製されたものである。このため、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、４番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを特異的に認識することができる。
【００４０】
　さらに、例えば、後述する実施例のアフィニティ精製において、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、１０番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドとアフィニティ結合するポリクローナル抗体を精製することで、ＣａｇＡタンパク質の９６５番目、９９９番目および１０３３番目のチロシン残基のリン酸化を特異的に認識する抗体を取得することもできる。
【００４１】
　また、本発明に係る抗体は、ポリクローナル抗体のみでなく、モノクローナル抗体も含むものである。ポリクローナル抗体、及びモノクローナル抗体は、免疫グロブリンクラス（immunoglobulin class）が、ＩｇＧのモノクローナル抗体であることが好ましいが、それ以外の免疫グロブリンクラス、例えば、ＩｇＭやＩｇＡ等であってもよく、特に限られるものではない。
【００４２】
　（２）本発明に係る抗体の生産方法
　（２−１）ポリクローナル抗体の生産方法
　本発明に係るポリクローナル抗体を生産する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、抗原タンパク質で動物を免疫した後、その動物から血清を採取し、ポリクローナル抗体を得ればよい。なお、「生産」とは、この抗体の生合成に加えて各種人為的な作用を含む、本発明に係る抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を含む）を得るための全体的な流れを指すものとする。
【００４３】
　本実施の形態に係るポリクローナル抗体は、後述する実施例に示すように、１０番目のチロシン残基をリン酸化した配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として、ウサギを免疫した後、そのウサギの血液から血清を得て、さらに、この血清からＩｇＧを精製して取得された。
【００４４】
　なお、本実施形態では、免疫させる動物としてウサギを用いたが、マウス、ラット等のその他の実験動物を用いてもよく、特に限定されるものではない。
【００４５】
　さらに、本発明に係るポリクローナル抗体は、例えば、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質、その抗原決定基（エピトープ）を含むフラグメントまたはその誘導体、あるいはそれらのアナログ、またはそれらの変異体、もしくはそれらを発現する細胞を免疫源（抗原）として用いることにより産生することができる。
【００４６】
　即ち、本発明に係るポリクローナル抗体は、例えば、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質、その抗原決定基（エピトープ）を含むフラグメントまたはその誘導体、あるいはそれらのアナログ、またはそれらの変異体、もしくはそれらを発現する細胞を認識することができる。
【００４７】
　なお、ここにいう「変異体」は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／または付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたものをいう。
【００４８】
　また、上記抗原としては、ポリペプチドであれば特に限定されるものではないが、抗原決定基とする物質をキャリアタンパク質に結合してなる抗原タンパク質が用いられてもよい。
【００４９】
　具体的には、上記抗原がハプテンであれば、抗体の産生等を誘導する能力をもたないため、抗体を産生することができないが、抗原を異種由来のタンパク質などの生体高分子からなる担体と共有結合させて抗原タンパク質を得て、これで免疫すれば、抗体産生を誘導することができる。上記担体としては、特に限定されるものではなく、オボアルブミン、γグロブリン、ヘモシアニン等、この分野で従来公知の各種タンパク質を好適に用いることができる。
【００５０】
　なお、ここでいう「ポリペプチド」とは、アミノ酸が数個結合した短いペプチド、及び組換えタンパク質を含むものである。また、ポリペプチドは、天然に存在するもの、化学的、生物学的方法にて合成されたものを含む。
【００５１】
　また、本発明に係るポリクローナル抗体の生産においては、抗血清によって得られたポリクローナル抗体を、従来公知の方法で精製したり、修飾したりする工程が含まれていてもよい。
【００５２】
　（２−２）モノクローナル抗体の生産方法
　本発明に係るモノクローナル抗体を生産する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、抗原でマウスを免疫した後、そのマウス脾臓リンパ球とマウス由来のミエローマ細胞とを融合させてなる抗体産生ハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を得ればよい。なお、本実施の形態における「産生」とは、ハイブリドーマによる抗体の生合成を指すものとする。
【００５３】
　ハイブリドーマの生産方法は、従来公知の方法、例えば、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96(1985)）等を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。
【００５４】
　例えば、本発明に係るモノクローナル抗体は、１０番目のチロシン残基をリン酸化した配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として、ハイブリドーマを作製して取得することができる。
【００５５】
　なお、免疫させる動物としては、マウスの他にも、ラット、ウサギ等のその他の実験動物を用いてもよく、特に限定されるものではない。また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術等によっても生産できる。
【００５６】
　このようにして得られたハイブリドーマクローンは、本発明に係るモノクローナル抗体を大量に産生することができるものである。
【００５７】
　さらに、本発明に係るモノクローナル抗体は、上記ポリクローナル抗体と同様に、抗原として種々の物質を用いて生産することができる。例えば、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質、その抗原決定基（エピトープ）を含むフラグメントまたはその誘導体等を、免疫源（抗原）として用いることにより産生することができる。
【００５８】
　従って、本発明に係るモノクローナル抗体は、例えば、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質、その抗原決定基（エピトープ）を含むフラグメントまたはその誘導体、あるいはそれらのアナログ、またはそれらの変異体、もしくはそれらを発現する細胞を認識することができる。
【００５９】
　また、上記抗原としては、上記ポリクローナル抗体と同様に、ポリペプチド、ハプテン等を利用することができる。
【００６０】
　また、本発明に係るモノクローナル抗体の生産においては、ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体を、従来公知の方法で精製したり、修飾したりする工程が含まれていてもよい。
【００６１】
　（３）本発明に係る抗体の機能
　後述する実施例に示すように、本発明に係る抗体を用いて、Ｈ．ピロリ菌の感染により引き起こされた胃潰瘍、胃癌のそれぞれの患者から取り出した胃の生検組織の免疫染色を行った結果、萎縮性胃炎を裏付ける腸上皮化性細胞において、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を精度よく検出することができた。
【００６２】
　従って、本発明に係る抗体は、チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を精度良く認識できることが実験的に示された。さらに、上述したように、ＣａｇＡタンパク質のチロシンリン酸化は、Ｈ．ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患と密接に関連していると考えられる。
【００６３】
　このため、本発明に係る抗体は、胃や十二指腸における種々の疾患と密接に関連しているＨ．ピロリ菌の宿主細胞への感染を、精度よく、効率的に検出することができる。即ち、本発明に係る抗体は、Ｈ．ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患の発症、または発症危険性（可能性）を判断する際の指標に利用（換言すれば、疾患の診断方法に利用）することができる。
【００６４】
　（４）本発明に係る抗体の利用法
　上述したように、本発明に係る抗体は、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を特異的に認識する新規な抗体である。また、本発明者は、Ｈ．ピロリ菌が感染したヒトの胃上皮細胞において、チロシン残基がリン酸化されたＣａｇＡタンパク質が見出されることを明らかにしており、ＣａｇＡタンパク質のチロシンリン酸化は、Ｈ．ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患と密接に関連していると考えられる。そのため、本発明の抗体は、以下に示すように利用することができる。
【００６５】
　（４−１）本発明に係るＨ．ピロリ菌の感染検出剤
　本発明に係る抗体は、Ｈ．ピロリ菌の宿主細胞への感染を検出するためのＨ．ピロリ菌の感染検出剤として用いることができる。即ち、本発明に係るＨ．ピロリ菌の感染検出剤の具体的な組成は、上記抗体を含んでいればよく、特に限定されるものではない。具体的には、使用（検査）対象の生物個体、器官、組織、細胞塊、糞便、あるいは細胞等の種類に応じて、Ｈ．ピロリ菌の感染を検出するために、本発明に係る抗体の機能が発揮できるような緩衝液等が含まれていればよい。
【００６６】
　即ち、本発明に係るＨ．ピロリ菌の感染検出剤中に含まれる上記抗体は、特異的な抗原抗体反応によって、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を認識、検出する。このため、上記抗体を、顕微鏡等による目視で、または機械的に識別できる手段を用いて標識する等の処理を施すと、抗体が結合したチロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質も高精度で標識される。その結果、種々の疾患と密接に関連したＨ．ピロリ菌の感染を高精度で、効率よく検出可能となる。
【００６７】
　従って、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を指標に、Ｈ．ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患についての診断を行う際に、容易に疾患と密接に関連するＨ．ピロリ菌の感染を検出することができ、上記疾患に対する早期診断、早期治療に用いることができる。
【００６８】
　上記抗体の標識手段としては、従来公知の方法を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、後述する実施例に示すように、従来公知の抗原抗体反応を利用して、免疫染色により標識する方法が挙げられる。即ち、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を認識する抗体を１次抗体とし、この１次抗体に対する抗体を２次抗体として、この２次抗体を例えば、ペルオキシダーゼ等の酵素等により標識しておけば、染色処理により、目視的にチロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を検出できる。その結果、種々の疾患と密接に関連したＨ．ピロリ菌の感染を高精度で、効率よく検出可能となる。
【００６９】
　その他にも、例えば、蛍光物質で本発明の抗体を直接標識する方法が挙げられる。即ち、上記抗体を蛍光物質で標識した場合、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質は蛍光物質により標識される。従って、その蛍光を指標に顕微鏡等を用いて観察することにより、Ｈ．ピロリ菌の感染を検出することができる。なお、上記抗体を標識する方法は蛍光物質によるものに限られない。
【００７０】
　（４−２）本発明に係るＨ．ピロリ菌の感染検出方法
　また、本発明に係る抗体は、Ｈ．ピロリ菌の宿主細胞への感染を検出するための手段として用いることができる。即ち、本発明に係るＨ．ピロリ菌の感染検出方法は、上記抗体を用いていればよく、その他の構成手段は特に限定されるものではない。
【００７１】
　本発明に係るＨ．ピロリ菌の感染を検出する方法の一例をより具体的に説明すれば、検体取得工程、標識工程、検出工程を含んでいればよく、特に限定されるものではない。
【００７２】
　検体取得工程とは、目的とする組織、細胞塊、糞便、細胞等の生検標本を取得する工程であればよく、特に限定されるものではない。目的の生検標本を取得するための手段としては、例えば、生物の個体そのものから、または生物の器官や組織等から目的の生検標本を採取する工程であればよく、従来公知の方法を利用でき、特に限定されるものではない。例えば、生物個体、器官や組織等から内視鏡を用いて細胞を取得する工程等が挙げられる。糞便は、防腐剤の入った溶液に縣濁させる工程などが挙げられる。
【００７３】
　標識工程とは、上記検体取得工程にて取得した生検標本を用いて、本発明に係る抗体により、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を標識する工程であればよく、このときの反応条件、例えば、細胞等の濃度、抗体の濃度、反応温度や反応時間、塩の濃度（使用するバッファーの種類）等については特に限定されるものではない。また、標識手段も従来公知の方法であればよく、例えば、目視で、または機械的に識別できるように標識すればよい。具体的には、後述する実施例に示すように、従来公知の抗原抗体反応や蛍光物質等を用いることができるが、特に限定されるものではない。
【００７４】
　検出方法とは、上記標識工程で標識されたチロシンリン酸化ＣａｇＡタンパク質を検出する工程であればよく、特に限定されるものではない。具体的には、顕微鏡等による目視観察により、または、蛍光等の情報を感知できる機器（例えば、フローサイトメトリー機器）により機械的にチロシンリン酸化ＣａｇＡタンパク質を検出する工程等が挙げられる。糞便縣濁液は、抗体を固定したマイクロプレートを用いた酵素抗体法で検出する工程が挙げられる。
【００７５】
　また、本発明に係る抗体は、例えば、後述する実施例に示すように、本発明に係る抗体で標識した生検標本と、ＣａｇＡタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体で標識した生検標本とを、比較分析することにより、より高精度で、胃や十二指腸において発生する種々の疾患と密接に関連するＨ．ピロリ菌の宿主細胞への感染を検出、診断することもできる。
【００７６】
　また、上記抗体を用いて、所定の領域がチロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質の検出剤を開発することも可能であり、また、上記抗体を用いた、所定の領域がチロシンリン酸化ＣａｇＡタンパク質を検出する方法を開発することもできる。なお、「所定の領域」とは、ＣａｇＡタンパク質の８９３番目、９１２番目、９６５番目、９９９番目、１０３３番目のチロシン残基のうち、少なくとも一つのチロシン残基をいい、より好ましくは、９６５番目、９９９番目、１０３３番目のチロシン残基をいう。
【００７７】
　（４−３）本発明に係る疾患の発症または発症危険性判定方法（診断方法）
　また、本発明に係る抗体は、萎縮性胃炎、胃潰瘍、MALTリンパ腫、および胃癌等のＨ．ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患の発症または発症危険性を判定するための手段として用いることができる。即ち、本発明に係る上記疾患の発症または発症危険性判定方法（診断方法）は、上記抗体を用いていればよく、その他の構成手段は特に限定されるものではない。
【００７８】
　本発明に係る上記疾患の発症または発症危険性を判定する方法の一例をより具体的に説明すれば、上述したＨ．ピロリ菌の感染検出方法と同様の検体取得工程、標識工程、検出工程に加えて、さらに判定工程を含んでいればよく、特に限定されるものではない。
【００７９】
　検体取得工程、標識工程、および検出工程は、上記（４−２）で述べたものと同様の工程であればよい。
【００８０】
　判定方法とは、上記検出工程において得られた、チロシンリン酸化ＣａｇＡタンパク質の検出の有無およびＨ．ピロリ菌の感染状態等の情報に基づき、用いた生検標本において萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、及び胃癌のうち、いずれかの疾患が発症しているか、あるいは発症する危険性（可能性）があるか否かを判定する工程であればよい。具体的には、例えば、チロシンリン酸化ＣａｇＡタンパク質が一定量以上検出された場合、またはチロシンリン酸化ＣａｇＡタンパク質が器官や組織等の特定の部位において検出された場合、上記疾患が発症している、あるいは発症する危険性があると判断することができるが、特に限られるものではない。
【００８１】
　この疾患の発症または発症危険性の判定方法を用いることにより、例えば、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を指標に、Ｈ．ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患の発症または発症危険性（可能性）を容易に判定することができる。従って、本発明に係る上記疾患の発症または発症危険性判定方法は、上記疾患に対する予防、早期診断、早期治療に用いることができる。
【００８２】
　（４−４）本発明に係る抗体を用いた治療方法等
　本発明に係る抗体は、さらに、Ｈ．ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患の治療に利用できる可能性がある。即ち、上記疾患の原因の一つと考えられるチロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を標的として、本発明に係る抗体を用いた治療剤または治療方法等を開発することができる。
【００８３】
　上記治療剤としては、本発明に係る抗体を含んでいればよい。即ち、例えば、使用（検査）対象の生物個体、器官、組織、細胞塊、あるいは細胞等の種類に応じて、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質と結合するために、本発明に係る抗体の機能が発揮できるような緩衝液等を含んでいればよい。
【００８４】
　また、上記治療方法は、本発明に係る抗体を用いるものであればよい。即ち、具体的には、緩衝液等と混合した上記抗体を注射等により、直接患部（器官、組織等）に接種する方法や、上記抗体を可溶性カプセルに内包させ、経口的に患者に与えて治療する方法等が挙げられるが、特に限られるものではない。
【００８５】
　即ち、上記治療剤または治療方法は、本発明に係る抗体とチロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質とを結合させて、ＣａｇＡタンパク質の機能を阻害するようになっていればよい。
【００８６】
　従って、上記治療剤または治療方法を用いることにより、Ｈ．ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患の治療を行うことができる。
【００８７】
　また、ＣａｇＡタンパク質、またはその一部を含むワクチンを作製することができる。このワクチンは、Ｈ．ピロリ菌の感染やＨ．ピロリ菌の感染により引き起こされる種々の疾患の治療または予防に用いることができるものである。
【００８８】
　このワクチンの具体的な構成としては、免疫原性を損なわないように低毒化または無毒化したＣａｇＡタンパク質、またはその一部の領域を含んでいればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。より具体的には、ワクチンは、例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、４番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを含んでいることが好ましい。即ち、前記ワクチンは、ITAM様モチーフを含む領域からなるポリペプチドを含んでいることが好ましい。なお、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、１番目のシステイン残基を除く２〜１６番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、１０番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを含んでいることがより好ましい。
【００８９】
　また、本発明のワクチンには、Ｈ．ピロリ菌が産生する他の病原性因子、例えば、ウレアーゼやＶａｃＡ等を、免疫原性を損なわないように低毒化または無毒化処理を施したもの（例えば、ポリペプチド等）を含んでいてもよい。この場合、複数の病原性因子を同時に標的としているため、より効率的に、Ｈ．ピロリ菌の感染やＨ．ピロリ菌の感染により引き起こされる種々の疾患の治療や予防に用いることができる。
【００９０】
　なお、ここでいう「ポリペプチド」とは、アミノ酸が数個結合した短いペプチド、及び組換えタンパク質を含むものである。また、ポリペプチドは、天然に存在するもの、化学的、生物学的方法にて合成、生産されたものを含む。
【００９１】
　前記ワクチンを用いることにより、より効率的にＨ．ピロリ菌の感染やＨ．ピロリ菌の感染により引き起こされる種々の疾患の治療や予防に用いることができる。
【００９２】
　上述したように、本発明に係る抗体、Ｈ．ピロリ菌の宿主細胞への感染検出剤、Ｈ．ピロリ菌の宿主細胞への感染を検出する方法、または萎縮性胃炎等の疾患の発症または発症危険性判定方法、治療方法、ワクチン（以下、本発明に係る抗体等と称する）は、Ｈ．ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患の効率的な早期診断、早期治療、または予防等に利用することができる。さらに、本発明に係る抗体等を利用し、未だ明らかとなっていないＨ．ピロリ菌の感染によって引き起こされる種々の疾患の発生メカニズムについて詳細な解析を行うこともでき、基礎研究的な利用もできる。
【００９３】
　即ち、本発明に係る抗体等は、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質の検出を通して、Ｈ．ピロリ菌の感染により引き起こされる疾患、特に萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、胃癌等の早期診断、予防、臨床検査、及び治療等に利用できる可能性があるだけでなく、Ｈ．ピロリ菌の感染により引き起こされる種々の疾患の発病機序解明という基礎的研究への利用も利用可能である。
【００９４】
　以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【実施例】
【００９５】
　以下に、本発明の抗体のうち、ポリクローナル抗体について具体的に説明する。
【００９６】
　〔実施例１〕ポリクローナル抗体の作製
　以下にポリクローナル抗体の作製方法を説明する。
【００９７】
　（１-１）抗原調製
　具体的には、以下の方法で行った。まず、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、１０番目のチロシン残基がリン酸化されている、リン酸化ペプチドを合成した。より詳細には、アミノ酸残基を活性化させるＨＢＴＵ、あるいはジイソプロピルカルボジイミドを用いた、Fmoc-based化学固相法を利用した。合成したポリペプチドは保護剤（プロテクト）を外し、チオアニソール等からなるスカベンジャーを含んだトリフルオロ酢酸を用いて、レジンベースのポリスチレンからなる固相支持体から切り離した。その後、抽出したポリペプチドは、エーテル内で沈殿させ、5,000rpmにて遠心回収し、エーテルで洗浄した。その後、ＨＰＬＣにて精製を行った。
【００９８】
　逆相ＨＰＬＣによるポリペプチドの精製には、粒子型１０μｍカラムであるＣ１８カラムを用いて、BioCad 60装置（Perkin-Elmer, Foster City CA）にて行った。流速２０ｍｌ／分で、４５分間にわたって、直線勾配を１０％〜８０％までかけた（溶液Ａ：0.05％ＴＦＡ溶液、溶液Ｂ：0.05％ＴＦＡ含有アセトニトリル）。主ピークを、Lasermat 2000（Finnigan Ma, San Jose, CA）にて、タイムオブフライトマススペクトメトリー（MALDI-TOF）により解析した。フラクションは、正確な重量で集めて、抗原として凍結乾燥した。
【００９９】
　（１−２）免疫処理
　上記方法により得られた合成リン酸化ポリペプチドを抗原として、メスのニュージーランド白ウサギ（平均年齢：６ヶ月、平均重量：5-6 lbs）を用いて免疫処理を行った。
【０１００】
　抗原と補助剤との混合物を、ウサギ背中皮下と後ろ足の筋肉とに接種した。接種量は、１箇所につき0.1ｍｌ以下で行った。最初の接種では、1.0ｍｌの抗原に対して、同量の完全補助剤（Complete Freund’s Adjuvant）を混合して用い、それ以外の接種では、抗原と同量の非完全補助剤（Incomplete Freund’s Adjuvant）を混合して用いた。接種は、背中皮下に１０箇所、後ろ足筋肉に10箇所行った。
【０１０１】
　より詳細には、１日目に抗原200μｇを結合溶液0.5ｍｌに溶解させ、同量の完全補助剤と混ぜたものを0.1ｍｌずつ10箇所に接種した。その１４日後に抗原200μｇを結合溶液0.5ｍｌに溶解させ、同量の非完全補助剤と混ぜたものを0.1ｍｌずつ10箇所に接種した。さらに、最初の接種日から２８日後、４２日後、５６日後に抗原溶液を接種した。
【０１０２】
　そして、最初の接種日から４２日後、５６日後、７０日後にそれぞれ20ｍｌずつ血清採取できるように採血した。採血した血液は、室温に２時間放置し、その後、１晩冷蔵庫に放置した。翌日、この血液を5,000rpm、15分遠心分離し、血清を得た。得られた血清は、さらにクロット塊を取り除き、さらに5,000rpm、5分遠心を行った。最終的に得られた血清はバイアルに入れられ、−20℃にて保存された。
【０１０３】
　なお、免疫する物質が十分に免疫原性をもつには、分子量が10,000以上必要であるため、本発明者は、Ｎ末端またはＣ末端にシステイン残基を導入し、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）を用いてキャリアタンパク質に結合させて、抗原タンパク質として免疫に用いた。キャリアタンパク質としては、ＫＬＨ(Keyhole Limpet Hemocyanin)を用いた。
【０１０４】
　（１−３）アフィニティ精製用カラム作製
　以下にアフィニティ精製用カラム作製について説明する。
【０１０５】
　まず、ポリペプチド結合ゲルカラム（アフィニティ精製用カラム）は以下のように作製した。10ｍｌの硫酸結合ゲル（Sulfo-Link Coupling Gel）を加えて、2ｍｌのカラムを一度に5本作製した。次いで、カップリング溶液（50ｍＭ Tris溶液、pH 8.5）により平衡化し、カラムの底部にキャップをした。次に、カラムに結合させるポリペプチド（抗原等）がシステインを有するか否かを調べた。
【０１０６】
　そして、上記ポリペプチドをカップリング溶液1ｍｌに溶解させた（5ｍｇのポリペプチドを1ｍｌに溶解させた）。
【０１０７】
　次いで、4〜5ｍｇのTCEP-HCLを用いて、上記ポリペプチドを減らした。溶液をpH 5.0に調製し、30分間放置した。
【０１０８】
　2倍量のカップリング溶液を、上記ポリペプチド溶液に添加し、pH7.0〜7.5に調製した。カラムに、このポリペプチド溶液を添加し、カラムの上部と底部とにキャップした。4℃で1晩、カラムを静置してゲルを安定化させた。その後、1時間カラムを室温に放置し、リガンド溶液をチューブに回収した。その後、2ｍｌのカップリング溶液をカラムに添加し、同じチューブに回収した（この溶液は、ポリペプチドがゲルに結合していない場合は保存しておく）。その後、15ｍｌのカップリング溶液をカラムに流し、洗浄し、アフィニティ精製用カラムを得た。
【０１０９】
　なお、上記カラムに結合させるポリペプチドとして、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（非リン酸化ポリペプチド）と、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、８番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドとを用いた。即ち、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（非リン酸化ポリペプチド）を結合させたカラムＡと、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、８番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドを結合させたカラムＢとの２種類のアフィニティ精製用カラムを作製した。
【０１１０】
　（１−４）アフィニティ精製用カラムのブロッキング
　上記カラムの底部にキャップがされていることを確認した後、15.8ｍｇのL-システイン-HCｌを2ｍｌのカップリング溶液に添加し、上記ゲルカラムにアプライした。そして、1時間室温にてインキュベートした。その後、10〜15ｍｌの1M NaClにて洗浄し、フィルターをセットした。次いで、10〜15ｍｌの0.5％アザイドNaにて洗浄し、3〜4ｍｌのアザイドNaにてカラム内を満たし、キャップをしっかり閉めて4℃にて保存した。
【０１１１】
　（１−５）血清精製
　上記２種類のアフィニティ精製用カラムＡ、Ｂを用いて、血清精製を行った。具体的には、まず、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを結合させたアフィニティ精製用カラムＡに血清を通した。次いで、前記カラムＡからパスしてきた溶液を、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、８番目のチロシン残基がリン酸化されているポリペプチドが結合しているアフィニティ精製用カラムＢに通した。そして、前記カラムＢに結合した抗体を、チロシンリン酸化ＣａｇＡタンパク質を特異的に認識する抗体として取得した。
【０１１２】
　具体的な方法は以下のように行った。まず、カラムを10〜15ｍｌの1×PBS溶液（phosphate-buffered saline；137ｍＭ NaCl、2.7ｍＭ KCl、1.5ｍＭ KH2PO4、8.0ｍＭ Na2HPO4、pH7.2）で洗浄した。次に、血清 1ｍｌとPBS 1ｍｌとを混合し、上記カラムにアプライした。そして、カラムの底部にキャップをし、1〜2時間室温にてインキュベートした。
【０１１３】
　次に、再びカラムを10〜15ｍｌの1×PBS溶液にて洗浄した。次いで、溶出溶液（100ｍM Glycine溶液、pH 2.8）を1ｍｌ添加し、カラムから溶出してきた回収液をチューブに集めた。この処理を6回繰り返した。得られた各回収液から50μｌ採取し、10μｌのBioRad溶液でコーティングしたマイクロウェルプレートに添加し試験した。その結果、BioRad溶液が青色に変化した回収液1ｍｌに対して、1Ｍ Tris（pH 9.5）溶液を50μｌずつ加えた。そして、その回収液を4リットルの1×PBS溶液で、24時間透析を行った。そして、スペクトロメーターを用いて、280ｎｍのODを測定した（消滅係数は1.4）。使用し終わったカラムは10〜15ｍｌのアザイドNa溶液にて洗浄した後、約4ｍｌのアザイドNa溶液でカラムを満たし、4℃にて保存した。
【０１１４】
　上述の処理により、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、４番目のチロシンがリン酸化されているポリペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体を取得できた。即ち、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を特異的に認識するポリクローナル抗体を取得できた。
【０１１５】
　（１−６）ＩｇＧ精製
　ＩｇＧ精製は以下の手順で行った。まず、カラムを10ｍｌの1×PBS（pH7.3）溶液で洗浄した。次に、上記血清 3ｍｌとPBS 3ｍｌとを2本のＩｇＧカラムにアプライした。カラムを透過した血清をテストチューブに集めた。この血清を再びカラムにかけるという工程を５〜６回繰り返した。
【０１１６】
　次に、再びカラムを10ｍｌの1×PBS溶液にて洗浄した。そして、1Ｍ Tris（pH 9.5）溶液を50μｌずつ加えた1ｍｌチューブを準備した。次いで、溶出溶液（100ｍM Glycine溶液、pH 2.8）を1ｍｌ添加し、カラムから溶出してきた回収液を前記チューブに集めた。この処理を繰り返した後、得られた各回収液から50μｌ採取し、10μｌのBradford Assay溶液の入ったELISAプレートに添加して、試験した。その結果、陽性だったサンプル1ｍｌを4リットルの1×PBS溶液（pH 7.2）内で、24時間透析を行った。そして、溶液中のＩｇＧの濃度を280ｎｍのスペクトロメーターを用いて測定した（消滅係数は1.4）。得られたＩｇＧ溶液は、−20〜−4℃にて保存した。なお、ゲルの容量は、各カラム1ｍｌのゲルを用いた。
【０１１７】
　〔実施例２〕ポリクローナル抗体の機能解析
　上記実施例１に記載した方法により得たポリクローナル抗体の機能を免疫組織染色法により、以下のように解析した。
【０１１８】
　まず、生検標本を、10％のホルマリン溶液にて固定した。これらは、処理した後、端を揃えてパラフィンにはめ込んだ。そして、4〜5ｍｍ角に切断した。生検標本は、インフォームド・コンセントの後に、福井病院（日本）の患者から集められた。胃粘膜の生検標本は、Ｈ．ピロリ菌が感染している患者から、計１５標本（胃潰瘍：3、胃癌：9、十二指腸潰瘍：2、MALTリンパ腫：1）、Ｈ．ピロリ菌に感染していない患者から２標本を得られた。
【０１１９】
　そして、これらの粘膜層は、以下に示す免疫組織染色に用いられた。脱パラフィンされた生検標本の画分を、室温にてキシレン（Xylene）と5分間インキュベートし（2回繰り返す）、そして100％エタノールと3分間インキュベートし（3回繰り返す）、80％エタノールと3分間インキュベートした。
【０１２０】
　その後、前記画分を水で洗浄した後、内在性のペルオキシダーゼをブロックするために、0.2％アザイドNa含有0.03％過酸化水素溶液にて20分間インキュベートした。そして、前記画分をPBS溶液で洗浄した後、室温にて、チロシンリン酸化ＣａｇＡタンパク質に対するポリクローナル抗体、またはＣａｇＡタンパク質に対するモノクローナル抗体とともに、60分間インキュベートした。
【０１２１】
　なお、ＣａｇＡタンパク質に対するモノクローナル抗体は、リン酸化されていないＣａｇＡタンパク質とリン酸化されているＣａｇＡタンパク質の両方を認識するものであり、市販のものを使用した（AUSTRAL Biologicals, HPM-5001-5）。
【０１２２】
　そして、前記抗体処理した画分を、ペルオキシダーゼでラベルした抗ウサギ抗体、または抗マウス抗体（DAKO Envision System, DAKO Corp., Carpinteria, CA）とともに30分間インキュベートした。その後、過酸化水素（DAKO Envision System）含有3-アミノ-9-エチルカルバゾール溶解アセトン溶液にて染色した。また、ヘマトキシリンにてカウンター染色した後、水溶性のマウント培地にのせて顕微鏡観察した。
【０１２３】
　その結果を図１〜図７に示す。図１（ａ）は、Ｈ．ピロリ菌に感染している胃潰瘍患者から採取した生検標本をＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン）染色し、倍率２０倍にて顕微鏡観察した結果を示し、図１（ｂ）は、図１（ａ）の生検標本を倍率４０倍にて顕微鏡観察した結果を示すものである。
【０１２４】
　図２は、ＣａｇＡタンパク質を認識するモノクローナル抗体にて、Ｈ．ピロリ菌に感染している胃潰瘍患者から採取した生検標本を免疫染色し、倍率４０倍にて顕微鏡観察した結果を示すものである。図３は、チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を認識するポリクローナル抗体にて、Ｈ．ピロリ菌に感染している胃潰瘍患者から採取した生検標本を免疫染色し、倍率４０倍にて顕微鏡観察した結果を示すものである。
【０１２５】
　また、図４は、Ｈ．ピロリ菌に感染している胃癌患者から採取した生検標本をＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン）染色し、倍率４倍にて顕微鏡観察した結果を示すものである。図５は、チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を認識するポリクローナル抗体にて、Ｈ．ピロリ菌に感染している胃癌患者から採取した生検標本を免疫染色し、倍率４０倍にて顕微鏡観察した結果を示すものである。そして、図６は、チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を認識するポリクローナル抗体にて、他のＨ．ピロリ菌に感染している胃癌患者から採取した生検標本を免疫染色し、倍率４０倍にて顕微鏡観察した結果を示すものである。
【０１２６】
　また、図７（ａ）は、Ｈ．ピロリ菌に感染している胃癌の患者から採取した癌細胞の生体標本（Tumor Cells）を、ＨＥ染色した結果を示し、図７（ｂ）は、前記癌細胞の生体標本を、リン酸化ＣａｇＡタンパク質を認識するポリクローナル抗体を用いて免疫染色した結果を示す図であり、図７（ｃ）は、前記癌細胞の生体標本を、ＣａｇＡタンパク質を認識するモノクローナル抗体を用いて免疫染色した結果を示した図である。また、図７（ｄ）は、Ｈ．ピロリ菌に感染している胃癌の患者から採取した通常の細胞の生体標本（Normal Cells）を、ＨＥ染色した結果を示す図であり、図７（ｅ）は、前記通常の細胞の生体標本を、リン酸化ＣａｇＡタンパク質を認識するポリクローナル抗体を用いて免疫染色した結果を示す図であり、図７（ｆ）は、前記通常の細胞の生体標本を、ＣａｇＡタンパク質を認識するモノクローナル抗体により免疫染色した結果を示した図である。
【０１２７】
　図１（ａ）（ｂ）、図４に示すように、Ｈ．ピロリ菌に感染している胃潰瘍患者、及び胃癌患者から採取した生検標本は、ＨＥ染色の結果、萎縮性胃炎を裏付ける腸上皮化性が起こっていることがわかった。
【０１２８】
　そして、図２に示すように、胃上皮細胞の近傍で、ＣａｇＡタンパク質が検出された。さらに、図３、図５、及び図６に示すように、その腸上皮化性細胞において、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を検出することができた（図中の黒い点がＣａｇＡタンパク質）。なお、結果は示さないが、その他のMALTリンパ腫や、十二指腸潰瘍等の患者から採取した生検標本でも同様に、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質を検出することができた。
【０１２９】
　また、図７（ａ）〜（ｃ）に示すように、癌細胞において、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質が検出された。なお、図７（ｄ）〜（ｆ）に示すように、癌化していない細胞においてもチロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質が検出されたが、これら癌化していない細胞は、癌前段階の胃縮性胃炎や胃潰瘍の細胞と相関があると考えられる。
【０１３０】
　これらの結果から、Ｈ．ピロリ菌の感染により引き起こされた萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、MALTリンパ腫、胃癌等の疾患と、チロシンリン酸化されたＣａｇＡタンパク質とは、密接に関連していることが示された。そして、この知見は、Ｈ．ピロリ菌の感染と関連している疾患の発生機構の解明に繋がるだけでなく、Ｈ．ピロリ菌の感染の防止や、分析、検査等に応用可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
　本発明は、Ｈ．ピロリ菌の感染の予防、診断、分析、検査といった医学的、生理学的な分野だけでなく、製薬産業への利用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】（ａ）は、胃潰瘍患者から採取した生検標本のＨＥ染色の結果を倍率２０倍にて顕微鏡観察した図を示し、（ｂ）は、（ａ）の生検標本を倍率４０倍にて顕微鏡観察した図を示すものである。
【図２】ＣａｇＡタンパク質に対するモノクローナル抗体にて、胃潰瘍患者から採取した生検標本を免疫染色した結果を、倍率４０倍にて顕微鏡観察した図を示すものである。
【図３】チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を認識するポリクローナル抗体にて、胃潰瘍患者から採取した生検標本を免疫染色した結果を、倍率４０倍にて顕微鏡観察した図を示すものである。
【図４】胃癌患者から採取した生検標本をＨＥ染色した結果を、倍率４倍にて顕微鏡観察した図を示すものである。
【図５】チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を認識するポリクローナル抗体にて、胃癌患者から採取した生検標本を免疫染色した結果を、倍率４０倍にて顕微鏡観察した図を示すものである。
【図６】チロシンリン酸化されているＣａｇＡタンパク質を認識するポリクローナル抗体にて、他のＨ．ピロリ菌に感染している胃癌患者から採取した生検標本を免疫染色した結果を、倍率４０倍にて顕微鏡観察した図を示すものである。
【図７】（ａ）〜（ｆ）は、Ｈ．ピロリ菌に感染している胃癌の患者から採取した癌細胞と通常の細胞との生体標本をそれぞれ、ＨＥ染色、リン酸化ＣａｇＡタンパク質を認識するポリクローナル抗体による免疫染色、ＣａｇＡタンパク質を認識するモノクローナル抗体による免疫染色の結果を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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