(57)【要約】【課題】対物レンズのＮＡや倍率に関わらず全反射照明による蛍光観察を行うこと。【解決手段】標本２５を挟んで対物レンズ２０と対向する位置にコンデンサレンズ２７を配置し、コンデンサレンズ２７から透過照明光源側の透過照明光路の最外部近傍に反射ミラー４７を移動可能に設け、レーザ発振器から出力されたレーザビームを反射ミラーで反射させてコンデンサレンズ２７に入射させる。【選択図】図１
2004318133.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本からの光を取り込む少なくとも１つの対物レンズと、
前記対物レンズに取り込んだ前記光を撮像する少なくとも１つの撮像素子と、
前記対物レンズに取り込んだ前記光を前記撮像素子に集光させる観察光路と、
前記標本を挟んで前記対物レンズと対向する位置に配置され、全反射照明が可能な開口数を有し、透過照明光を前記標本に導くコンデンサレンズと、
前記透過照明光の光路に対して略直交方向にレーザビームを入射し、当該入射したレーザビームを前記透過照明光路の最外部近傍で前記コンデンサレンズ側に導入する少なくとも１つのレーザ導入部と、
を具備することを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記観察光路上に配置され、前記観察光路を光学特性に依存して前記標本からの前記光を複数の前記撮像素子別に分割する分割光学系を有することを特徴とする請求項１記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記レーザ導入部は、前記コンデンサレンズにおける前記透過照明光の入射側でかつ前記透過照明光路の最外部近傍に移動可能に設けられ、前記レーザビームを反射して前記コンデンサレンズ側に導入する反射ミラーと、
前記反射ミラーを前記レーザビームの導入方向と平行な方向に移動させるミラー移動部と、
を有することを特徴とする請求項１又は２記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項４】
前記レーザ導入部は、前記レーザビームを出力するレーザ発振器と、
前記レーザ発振器から出力された前記レーザビームを伝送する光ファイバと、
前記光ファイバの出射端から発散して出射された前記レーザビームを収束光に変換して前記コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に集光させる集光レンズと、
を有することを特徴とする請求項１又は２記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記レーザ導入部は、前記集光レンズによる前記レーザビームの集光位置を変えず、前記集光位置に入射する前記レーザビームの開口数を変換するコンバージョンレンズユニットを有することを特徴とする請求項４記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項６】
前記コンバージョンレンズユニットは、前記光ファイバの出射端と前記集光レンズとの間に挿脱可能であることを特徴とする請求項５記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項７】
前記コンバージョンレンズユニットは、前記集光位置に入射する前記レーザビームの開口数を変換するレンズ群を有することを特徴とする請求項５記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項８】
前記コンバージョンレンズユニットは、前記光ファイバの前記出射端から発散して出射された前記レーザビームの開口数を変換する凸レンズと、
前記凸レンズにより開口数が変換された前記レーザビームを発散させる凹レンズと、
を有することを特徴とする請求項５記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項９】
前記凹レンズは、前記凸レンズと前記集光レンズとの間の前記レーザビームの光路方向に移動可能であることを特徴とする請求項８記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項１０】
それぞれ観察倍率が異なる複数の前記対物レンズと、
前記複数の対物レンズのうち１つの前記対物レンズを選択的に前記観察光路上に配置する対物レンズ切換部と、
前記観察光路上に配置された前記対物レンズの前記観察倍率に応じて前記コンバージョンレンズユニットを前記光ファイバの出射端と集光レンズとの間に挿脱制御する制御部と、
を有することを特徴とする請求項６記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項１１】
複数の前記対物レンズは、高倍観察用と低倍観察用とを有し、
前記制御部は、前記高倍観察用対物レンズを前記観察光路上に配置した場合、前記コンバージョンレンズユニットを前記光ファイバの出射端と前記集光レンズとの間に挿入させ、前記低倍観察用対物レンズを前記観察光路上に配置した場合、前記コンバージョンレンズユニットを前記光ファイバの出射端と前記集光レンズとの間から外すことを特徴とする請求項１０記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項１２】
前記コンバージョンレンズユニットは、前記光ファイバの出射端と前記集光レンズとの間に挿入させた場合、前記標本に対する前記レーザビームの照射範囲を前記高倍観察用対物レンズの観察範囲に略一致させ、前記光ファイバの出射端と前記集光レンズとの間から外した場合、前記標本に対する前記レーザビームの照射範囲を前記低倍観察用対物レンズの観察範囲に略一致させることを特徴とする請求項１１記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項１３】
前記レーザ導入部は、前記レーザビームの集光位置を前記コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に合わせ込むズームレンズユニットを有することを特徴とする請求項１又は２記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項１４】
前記ズームレンズユニットは、前記レーザビームの集光位置を前記コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に合わせ込むレンズ群を有することを特徴とする請求項１３記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項１５】
前記ズームレンズユニットは、前記光ファイバのファイバ出射端から発散して出射された前記レーザビームの開口数を変換する凸レンズと、
前記凸レンズにより開口数を変換された前記レーザビームを発散させる凹レンズと、
を有することを特徴とする請求項１３記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項１６】
前記凸レンズは、前記ファイバ出射端と前記集光レンズとの間の前記レーザビームの光路方向に移動可能であることを特徴とする請求項１５記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項１７】
前記凹レンズは、前記凸レンズと前記集光レンズとの間の前記レーザビームの光路方向に移動可能であることを特徴とする請求項１５記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項１８】
前記凸レンズの位置移動に応じて前記レーザビームの集光位置を前記コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に合わせ込むための前記凹レンズの移動位置を決定し、当該決定された前記凹レンズの移動位置の情報に基づいて前記凸レンズと前記凹レンズとを移動制御する制御部を有することを特徴とする請求項１５記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項１９】
それぞれ観察倍率が異なる複数の前記対物レンズと、
前記複数の対物レンズのうち１つの前記対物レンズを選択的に前記観察光路上に配置する対物レンズ切換部と、
前記観察光路上に配置された前記対物レンズの観察倍率に応じて前記ズームレンズユニットに有する前記レンズ群の各々の光軸方向の相対的な位置関係を決定する制御部と、
を有することを特徴とする請求項１４記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項２０】
前記ズームレンズユニットは、前記光ファイバのファイバ出射端から発散して出射された前記レーザビームの開口数を変換する凸レンズと、前記凸レンズにより開口数を変換された前記レーザビームを発散させる凹レンズとを有し、
前記制御部は、前記凸レンズの位置移動に応じて前記レーザビームの集光位置を前記コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に合わせ込むための前記凹レンズの移動位置を決定し、当該決定された前記凹レンズの移動位置の情報に基づいて前記凸レンズと前記凹レンズとを移動制御することを特徴とする請求項１９記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項２１】
前記レーザ導入部は、複数有し、前記透過照明光路を中心にかつ前記透過照明光路に対して略直交する方向に放射状に配置されたことを特徴とする請求項１又は２記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項２２】
前記分割光学系により分割された複数の前記分割観察光路のうち少なくも１つの前記分割観察光路上に配置され、それぞれ光路長を伸縮する少なくとも１つの光路長調整部を有することを特徴とする請求項１又は２記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項２３】
前記光路長調整部は、前記分割観察光路上に固定配置された固定プリズム群と、
前記固定プリズム群に対して離れる方向と近付く方向とに移動可能な移動プリズムと、
を有することを特徴とする請求項２２記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項２４】
前記光路長調整部による前記光路長の伸縮量を演算処理する制御部を有することを特徴とする請求項２２記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項２５】
複数の前記レーザ導入部にそれぞれ設けられた複数のシャッタと、
複数の前記シャッタをそれぞれ開閉制御して前記レーザビームの導入又は遮断を制御する制御部と、
を有することを特徴とする請求項１又は２記載の全反射蛍光顕微鏡。
【請求項２６】
複数の前記レーザ導入部は、少なくとも２つの前記レーザ導入部が同一波長の前記各レーザビームを出力することを特徴とする請求項１又は２記載の全反射蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全反射照明により発生するエバネッセント光を用いて蛍光観察を行うための全反射蛍光顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物を蛍光観察する顕微鏡として全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ：Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy；以下、ＴＩＲＦＭと称する）が注目されている。このＴＩＲＦＭは、カバーガラスと標本との境界面で照明光を全反射させ、このときに標本側に数１００ｎｍ以下の僅かな領域に浸み出すエバネッセント光と呼ばれる光を用いて蛍光物質を励起する。このＴＩＲＦＭでは、カバーガラス近傍の僅かな領域の蛍光だけを観察する。ＴＩＲＦＭの観察像は、非常に暗いバックグランドとなる。これにより、高いコントラストの蛍光観察及び微弱な蛍光の観察が可能となる。
【０００３】
ところで、ＴＩＲＦＭを用いた生物研究の現場では、カバーガラスと標本の境界面近傍において浅い面内をコントラスト良く観察したい場合と、ある程度の深さまでエバネッセント光を届かせて広範囲を観察したい場合とがある。従って、標本に応じてエバネッセント光の浸み出し深さを変えられることが望ましい。
【０００４】
境界面からのエバネッセント光の浸み出し深さは、例えば非特許文献１において開示されている。これによれば、以下の公式が成り立つ。
【数１】
2004318133.tif 000003
【０００５】
ここで、ｄはエバネッセント光の浸み出し深さ、λは光の波長、ｎ１は入射側屈折率、θ１は入射角、ｎ２は出射側屈折率である。
【０００６】
従って、境界面に対する照明光の入射角θ１、すなわち境界面の垂線に対する照明光の傾射角が大きい程、エバネッセント光の浸み出し深さｄは浅くなる。実際のＴＩＲＦＭでは、コヒーレント性の高いレーザビームを使用し、照明光の入射角を揃えている。これにより、境界面へのレーザビームの入射角が変わり、エバネッセント光の浸み出し深さが調整される。
【０００７】
図１７（ａ）乃至図１７（ｃ）は特許文献１に開示されたＴＩＲＦＭの作用を示す図である。対物レンズ１は、全反射照明を可能とする開口数を有する。カバーガラス２上に標本３が載っている。ミラー４は、対物レンズ１の光軸方向に対して直交方向に移動可能である。
【０００８】
照明光として用いているレーザビーム５がミラー４に入射する。この状態で、ミラー４は、図１７（ａ）乃至図１７（ｃ）に示すように対物レンズ１の光軸方向に対して直交方向に移動する。これにより、対物レンズ１に入射するレーザビームの入射位置は、対物レンズ１の光軸から離れる方向に移動する。レーザビームの入射位置の移動により、対物レンズ１からカバーガラス２と標本３との境界面に向けて出射されるレーザビーム５の入射角度が変化する。対物レンズ１から出射されたレーザビーム５は、イマージョンオイル６を介して図１７（ｃ）に示すようにカバーガラス２と標本３との境界面で全反射する。
【０００９】
図１８は特許文献２に開示されたＴＩＲＦＭの構成図である。このＴＩＲＦＭは、レーザビーム５を出力するレーザ照明装置７を備えている。このＴＩＲＦＭは、透過照明用コンデンサレンズ８の先玉レンズ９の側面１０からレーザビーム５を入射することで全反射照明を可能としている。レーザ照明装置７は、顕微鏡本体１１に対して回転可能である。レーザ照明装置７は、カバーガラス２と標本３との境界面と観察光軸の交点を中心として回転する。これにより、レーザビーム５は、カバーガラス２と標本３との境界面に対する入射角度が変化する。
【特許文献１】特許第３０９３１４５号公報
【特許文献２】特開２００１−０１３４１３号公報
【非特許文献１】D.Axelrod著「Total Internal Reflection Fluorescence at Biological Surfaces」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、カバーガラス２と標本３との境界面でレーザビーム５を全反射させるためには、レーザビーム５の入射角を全反射が起こる臨界角以上に傾ける必要がある。ここで、カバーガラス２と標本３との境界面を挟むカバーガラス２側の屈折率をｎ１、標本３側の屈折率をｎ２とした場合、臨界角θｃは次式（２）により表される。
【００１１】
sinθｃ＝ｎ２／ｎ１                                        …（２）
従って、全反射照明を実現させるための入射角θ１の条件は、次式（３）により表わされる。
【００１２】
ｎ１・sinθ１＞ｎ２                                        …（３）
一方、図１７（ａ）乃至図１７（ｃ）に示す特許文献１のように対物レンズ１を通るレーザビーム５の入射光を傾ける場合、設定可能な最大入射角θmaxは、対物レンズ１のＮＡ（開口数）に依存し、次式（４）により表される。
【００１３】
ｎ１・sinθmax＝ＮＡ                                      …（４）
従って、全反射照明を実現させるための条件は、対物レンズ１のＮＡが、標本３側の屈折率ｎ２よりも大きいことを必要とする。
【００１４】
一般に、生物細胞の屈折率は１．３７〜１．３８程度である。使用する対物レンズ１のＮＡは、最低でも１．４程度を必要とする。
【００１５】
現在、１．４以上のＮＡを有する対物レンズは、倍率６０倍以上の高倍率に限定されている。この理由は、次の通りである。低倍の対物レンズ１により高いＮＡを実現するためには、対物レンズ１の有効径を大きくする必要が有る。しかし、対物レンズ１の取付けネジ径の規格値を保ったままで対物レンズ１の有効径を大きくすることを実現することが困難なためである。従って、図１７（ａ）乃至図１７（ｃ）に示すＴＩＲＦＭでは、倍率２０倍、４０倍程度での全反射蛍光観察が不可能である。
【００１６】
図１８に示すＴＩＲＦＭは、透過照明用コンデンサレンズ８側からレーザビーム５を入射すれば、照明範囲を対物レンズ１に依存せずに設定することができる。これにより、低倍の対物レンズ１を用いた全反射蛍光観察が可能になる。
【００１７】
しかしながら、図１８に示すＴＩＲＦＭは、透過照明用コンデンサレンズ８の先玉レンズ９の真横にレーザ照明装置７を配置している。しかもレーザ照明装置７自体を回転させる必要がある。このため、回転機構の保持部や回転するレーザ照明装置７の軌跡の空間を含めてかなりのスペースが必要である。しかるに、標本３を載置するスペースが圧迫されるる。作業性を著しく損なうことが考えられる。
【００１８】
低倍率の対物レンズ１の観察範囲を照明可能とするようにレーザビームの照射範囲を設定すると、高倍率の対物レンズ１で観察する場合、レーザビームの照射範囲の一部のみが観察されることになる。このため、他の部分に照射されているレーザビームは無駄になってしまう。
【００１９】
標本３の面上におけるレーザビームのエネルギー密度は、照射面積に反比例する。高倍率の対物レンズ１で観察する場合、観察に必要な範囲のみを照明するようにレーザビームの照射範囲を凝縮し、レーザビームのエネルギー密度を高めることが好ましい。
【００２０】
特に、単一分子の検出等、非常に微弱な蛍光の検出を目的とする実験がある。この実験では、レーザビームの照射エネルギー密度を可能な限り高くすることが求められる。一方、ＴＩＲＦＭでは、エバネッセント光の浸み出し深さを変えることができる。ＴＩＲＦＭが生物研究の現場に普及した最近では、更に進んで、複数の任意の波長を同時に、しかも各々を任意の深さで照明できることへの要求が出始めている。
【００２１】
この背景には、次のような実情がある。ＧＦＰ等の蛍光蛋白の改良が進み、生きた細胞の動態観察や機能観察を多色蛍光で行うことが容易になった。又、Axelrodの公式（式（１）)からも分かるように、エバネッセント光の浸み出し深さは光の波長にも依存する。このため、同一のレーザビーム入射角でも波長が異なれば、観察される範囲が異なるという原理的な問題がある。又、各々の波長に対応する細胞内組織の深さ位置が異なるという現実的な問題がある。
【００２２】
上記ＴＩＲＦＭでは、機械的手段やモータ等の電気的駆動手段を用いてレーザビームの入射角度や波長を高速で切り換えることは可能である。しかし、速い現象を追う場合等、厳密な意味での同時性を必要とする場合、ＴＩＲＦＭでは、高速切換での対応に限界がある。このようなケースでは、レーザビームの導入部を複数箇所に設けて同時に照明を行うことが必要となる。
【００２３】
しかしながら、図１７（ａ）に示すＴＩＲＦＭは、レーザビームを対物レンズ１側に反射すると共に、蛍光を観察側に透過させるため、ダイクロイックミラーが用いられる。
【００２４】
ところが照明する波長が複数になると、ダイクロイックミラーはそれに対応したマルチバンドの波長特性を有していることが必要になる。マルチバンドのダイクロイックミラーは、製造の難度が高く、高価である。さらにマルチバンドのダイクロイックミラーは、波長の分離レベルが悪く、蛍光像の明るさやＳＮ比を劣化させる。又、途中から更に照明波長を増やしたい場合、ダイクロイックミラーを新たに作成し直す必要が有る。
【００２５】
一方、ダイクロイックミラーを使わないために、図１９に示すように対物レンズ１の瞳の最外部の位置に全反射ミラー１２を配置することは可能である。しかしながら、標本３との境界面で全反射したレーザビーム５を観察側に通さないために、反対側の対物レンズ１の瞳の最外部にも別の全反射ミラー１３を配置する必要がある。
【００２６】
従って、本来観察用に１００％使用できる筈であった対物レンズ１の瞳のかなりの部分を各全反射ミラー１２、１３によって失う。このため、対物レンズ１の性能を劣化させることになる。
【００２７】
図１８に示すＴＩＲＦＭは、上述したように、透過照明用コンデンサレンズ８の先玉レンズ９の真横にレーザ照明装置７を配置し、しかもレーザ照明装置７自体を回転させる必要がある。このため、回転機構の保持部や回動するレーザ照明装置７の軌跡の空間を含めてかなりのスペースが必要である。このような構成では、独立したレーザビームの出射角度調整部を持つレーザ照明装置を配置しようとすれば、このレーザ照明装置の配置は、透過照明用コンデンサレンズ８の左右側の２つが精一杯である。
【００２８】
又、各ＴＩＲＦＭには、共通の課題がある。複数の波長を異なる深さの各エバネッセント光を用いて観察する場合がある。例えばＢ励起で浅い領域を観察し、Ｇ励起で深い領域を観察するとしたら、Ｂ励起とＧ励起を同時観察できるのは浅い領域のみである。この場合、Ｇ励起の像は、デフォーカスされた背景像として観察できるだけである。このため、深い領域のＴＩＲＦＭ像は、例えば細胞膜全体を蛍光試薬により染めて、細胞の大体の大きさを把握する等の限られた用途でしか使用することができない。
【００２９】
対物レンズを固定したままで、異なる深さの面を同時に観察することが出来れば、細胞膜近傍と細胞内部の小器官の形態の同時観察等、多波長ＴＩＲＦＭの用途を更に広げることが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、標本からの光を取り込む少なくとも１つの対物レンズと、対物レンズに取り込んだ光を撮像する撮像素子と、対物レンズに取り込んだ光を撮像素子に集光させる観察光路と、標本を挟んで対物レンズと対向する位置に配置され、全反射照明が可能な開口数を有し、透過照明光を標本に導くコンデンサレンズと、透過照明光の光路に対して略直交方向にレーザビームを入射し、当該入射したレーザビームを透過照明光路の最外部近傍でコンデンサレンズ側に導入するレーザ導入部とを具備する全反射蛍光顕微鏡である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、対物レンズのＮＡや倍率に関わらず全反射照明による蛍光観察を行うことができる全反射蛍光顕微鏡を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の第１の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００３３】
図１は正立型の全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の構成図である。対物レンズ２０の観察光路Ｑ上には、結像レンズ２１、吸収フィルタ２２、撮像素子２３が配置されている。吸収フィルタ２２は、後述するレーザ発振器３２から出力されるレーザビームの波長λＬ１より長い特定の波長帯λＥ１のみの光を透過するバンドパスフィルタである。撮像素子２３は、結像レンズ２１の焦点位置に配置されている。
【００３４】
対物レンズ２０の下方には、観察用のスライドガラス２４が配置される。スライドガラス２４上には、標本２５が載置されている。カハーガラス２６が標本２５上に被されている。
【００３５】
スライドガラス２４を介して対物レンズ２０の対向位置には、コンデンサレンズ２７が配置されている。コンデンサレンズ２７は、ベース２８上に設けられている。コンデンサレンズ２７の先端には、イマージョンオイル２９が点着される。これにより、コンデンサレンズ２７とスライドガラス２４との間には、イマージョンオイル２９が充填されている。
【００３６】
コンデンサレンズ２７のＮＡ（開口数）は、標本２５の屈折率よりも大きく設計されている。すなわち、イマージョンオイル２９及びスライドガラス２４の屈折率をｎ１、標本２５の屈折率をｎ２とした場合、上記式（３）及び式（４）から次の関係が成り立つ。
【００３７】
ＮＡ＝ｎ１・sinθmax＞ｎ２                                  …（５）
ここで、θmaxは、コンデンサレンズ２７からイマージョンオイル２９、スライドガラス２４を通して入射できる最大入射角に相当する。
【００３８】
一般に生物細胞の屈折率は１．３７〜１．３８程度である。これにより、コンデンサレンズ２７の開口数は、生物細胞の屈折率１．３７〜１．３８よりも大きい値、具体的には１．６５〜１．４５程度を有するものとする。
【００３９】
コンデンサレンズ２７の透過照明光路Ｔ上には、コレクタレンズ３０及び透過照明光源３１が設けられている。コレクタレンズ３０は、透過照明光源３１から出力された照明光をコンデンサレンズ２７に導入する。
【００４０】
レーザ導入部Ｌ１がベース２８の下部に設けられている。レーザ導入部Ｌ１は、レーザ発振器３２を有する。レーザ発振器３２は、例えばレーザダイオードを用いる。レーザ発振器３２の発振波長は、単波長のλＬ１である。
【００４１】
レーザ発振器３２のレーザ出力端には、光ファイバ３３が接続されている。光ファイバ３３の一端は、好ましくはシングルモードファイバである。光ファイバ３３の他端には、ファイバ出射端３４が設けられている。ファイバ出射端３４は、光ファイバ３３を伝送してきたレーザビームを発散光線として出射する。ファイバ出射端３４は、例えば中空構造の支持部３５の一端部に接続されている。
【００４２】
支持部３５は、例えばベース２８の底面に固定支持されている。支持部３５内には、集光レンズ３６が設けられている。集光レンズ３６は、ファイバ出射端３４から出射された発散光線を収束光線に変換し、コンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍に集光させる。
【００４３】
支持部３５の下部には、下垂支持部３７が一体的に設けられている。下垂支持部３７には、移動用孔３８及び支持用孔３９が設けられている。移動用孔３８及び支持用孔３９は、それぞれ透過照明光路Ｔに対して略直交する方向に設けられている。
【００４４】
ミラー保持部４０が移動用孔３８内に移動可能に設けられている。ミラー保持部４０は、ミラー支持部４１と移動案内部４２とを一体的に形成している。移動案内部４２は、移動用孔３８内に挿入され、移動用孔３８内を移動可能である。ミラー支持部４１は、移動案内部４２に対して略直交方向に設けられている。
【００４５】
マイクロメータ４３が支持用孔３９内に設けられている。マイクロメータ４３は、マイクロメータヘッド４４及びマイクロメータ操作部４５を有する。マイクロメータヘッド４４は、ミラー支持部４１の下部に当接する。マイクロメータ操作部４５は、回転することによりマイクロメータヘッド４４を直動する。マイクロメータヘッド４４の直動方向は、透過照明光路Ｔに対して略直交する方向に一致する。
【００４６】
バネ４６がミラー支持部４１と下垂支持部３７との間に設けられている。バネ４６は、ミラー支持部４１をマイクロメータヘッド４４側に付勢する引っ張り力を有する。これにより、マイクロメータヘッド４４は、ミラー支持部４１に当接維持される。
【００４７】
反射ミラー４７がミラー支持部４１の上端部に設けられている。従って、マイクロメータ操作部４５を回転させると、マイクロメータヘッド４４は、透過照明光路Ｔに対して略直交する方向に直動する。これに応動してミラー支持部４１は、透過照明光路Ｔに対して略直交する方向に直動する。この結果、反射ミラー４７は、透過照明光路Ｔと略直交な方向に直動する。なお、ミラー保持部４０、マイクロメータ４３及びバネ４６は、ミラー移動部を構成する。
【００４８】
反射ミラー４７は、コンデンサレンズ２７の開口径の最も外側近傍に配置される。反射ミラー４７は、透過照明光路Ｔに対して略直交する方向から導入されるレーザビームを略直交の角度で上方に反射する。
【００４９】
次に、上記の如く構成されたＴＩＲＦＭの動作について説明する。
【００５０】
レーザ発振器３２は、波長λＬ１のレーザビームをする。波長λＬ１のレーザビームは、光ファイバ３３に導入され、ファイバ出射端３４から発散光線として出射される。発散光線として出射されたレーザビームは、集光レンズ３６を通って収束光線に変換され、反射ミラー４７に入射する。
【００５１】
反射ミラー４７に入射したレーザビームは、透過照明光路Ｔの最も外側近傍の位置でコンデンサレンズ２７側に反射される。反射ミラー４７で反射したレーザビームは、集光レンズ３６によりコンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍で一旦集光される。そして、レーザビームは、コンデンサレンズ２７に入射し、コンデンサレンズ２７から斜め方向に進む平行光線として出射される。コンデンサレンズ２７から出射されたレーザビームは、イマージョンオイル２を伝送してスライドガラス２４と標本２５との境界面に入射する。
【００５２】
スライドガラス２４と標本２５との境界面へのレーザビームの入射角θＬ１が全反射の臨界角より大きければ、レーザビームは境界面で全反射する。これにより、標本２５側にエバネッセント光が浸み出す。
【００５３】
標本２５中に存在する特定の蛍光物質は、波長λＬ１のエバネッセント光により励起される。この励起により蛍光物質は、蛍光の最大輝度波長が吸収フィルタ２２の透過波長帯λＥ１の中に有るような蛍光を発する。蛍光は、カバーガラス２６を通って対物レンズ２０に入射する。さらに、蛍光は、結像レンズ２１及び吸収フィルタ２２を透過し、撮像素子２３に入射する。撮像素子２３は、波長帯λＥ１の蛍光像を撮像する。
【００５４】
一方、マイクロメータ操作部４５を回転すると、反射ミラー４７が透過照明光路Ｔに略直交する方向に直動する。反射ミラー４７の位置が透過照明光路Ｔに略直交する方向に移動すると、レーザビームのコンデンサレンズ２７への入射位置が移動する。これにより、コンデンサレンズ２７から出射されるレーザビームの出射角度、すなわちスライドガラス２４と標本２５との境界面へのレーザビームの入射角θＬ１が変化する。
【００５５】
全反射照明におけるエバネッセント光の浸み出し深さは、スライドガラス２４と標本２５との境界面へのレーザビームの入射角θＬ１によって変わる。従って、マイクロメータ操作部４５を回転させて反射ミラー４７を透過照明光路Ｔに略直交する方向に微小移動させる。すなわち、反射ミラー４７を透過照明光路Ｔに対して近づけたり遠ざけたりすると、エバネッセント光の浸み出し深さｄＬ１が任意に変化できる。
【００５６】
なお、透過照明光源３１から出力される照明光を用いて透過照明観察を行う場合、反射ミラー４７は、透過照明光路Ｔから完全に退避させる。
【００５７】
このように上記第１の実施の形態によれば、標本２５を挟んで対物レンズ２０と対向する位置にコンデンサレンズ２７を配置し、コンデンサレンズ２７から透過照明光源３１側の透過照明光路Ｔの最外部近傍に反射ミラー４７を移動可能に設け、レーザ発振器３２から出力されたレーザビームを反射ミラー４７で反射させてコンデンサレンズ２７に入射させる。すなわち、標本２５に染色された蛍光物質を励起するレーザビームは、対物レンズ２０を透過せずに、対物レンズ２０に対向位置されたコンデンサレンズ２７を透過する。
【００５８】
これにより、スライドガラス２４と標本２５との境界面に入射するレーザビームの最大入射角θmaxは、上記式（５）により表わされるコンデンサレンズ２７のＮＡのみに依存する。従って、対物レンズ２０のＮＡや倍率に関わらず全反射照明による蛍光観察が可能である。
【００５９】
レーザ導入部Ｌ１は、標本２５及びコンデンサレンズ２７から離れたところに設けられている。これにより、標本２５の近傍に設置する構造物がなく、標本２５の近傍のスペースを圧迫しない。
【００６０】
レーザ導入部Ｌ１は、反射ミラー４７をマイクロメータ４３により移動させる構造である。レーザ導入部Ｌ１は、単純な構造であり、動作範囲も狭い。従って、レーザ導入部Ｌ１は、ＴＩＲＦＭ自体をコンパクトにでき、かつＴＩＲＦＭを優れた作業性を有するものとすることができる。
【００６１】
上記第１の実施の形態は、次のように変形してもよい。
【００６２】
スライドガラス２４は、ガラスボトムディッシュを用いてもよい。これにより、カバーガラス２６は、除外してもよい。この場合、対物レンズ２０の作動距離が短い場合、対物レンズ２０は、液浸対物レンズを用いる。
【００６３】
反射ミラー４７を移動させるためのマイクロメータ４３は、例えば電動モータ又はピエゾアクチュエータ等を用いてもよい。
【００６４】
反射ミラー４７は固定する。ファイバ出射端３４及び集光レンズ３６は、透過照明光路Ｔと平行な方向に一体的に移動させる。このような構成にしても、上記第１の実施の形態と同様の作用が得られる。この場合、ファイバ出射端３４及び集光レンズ３６の移動は、例えばマイクロメータ、電動モータ又はピエゾアクチュエータ等を用いて行う。
【００６５】
上記第１の実施の形態は、正立型に限らず、倒立型顕微鏡にも適用可能である。
【００６６】
観察光学系は、結像レンズ２１、吸収フィルタ２２及び撮像素子２３による構成に限らず、レーザ導入部Ｌ１の励起波長に対する蛍光波長を選別して撮像できる構成であれば、任意に構成することが可能である。
【００６７】
上記第１の実施の形態は、ファイバ出射端３４から出射されるレーザビームを単一の集光レンズ３６により収束光線に変換し、当該収束光線を反射ミラー４７で反射させてコンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍に集光させている。これに限らず、例えばファイバ出射端３４から出射されるレーザビームを単一若しくは複数のレンズで平行光束に変換し、当該平行光束を反射ミラー４７で反射させてコンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍に入射するまでの光路上の任意の位置に集光レンズを設け、当該集光レンズにより集光するようにしてもよい。
【００６８】
次に、本発明の第２の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００６９】
図２は正立型の全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の構成図である。コンバージョンレンズユニット５０がファイバ出射端３４と集光レンズ３６との間に設けられている。コンバージョンレンズユニット５０は、ファイバ出射端３４と集光レンズ３６との間のレーザ導入光路に対して一体的に挿脱可能である。
【００７０】
図３及び図４はコンバージョンレンズユニット５０の上面拡大図である。中空構造の支持部３５の側面には、退避空間部５１が設けられている。コンバージョンレンズユニット５０には、ノブ５２が設けられている。ノブ５２は、退避空間部５１の壁を貫いて退避空間部５１の外部に突出している。コンバージョンレンズユニット５０は、ノブ５２の操作により支持部３５内のレーザ導入光路上と退避空間部５１内との間に挿脱可能である。例えば、図３に示すようにノブ５２を引き出すと、コンバージョンレンズユニット５０は、レーザ導入光路から外れる。図４に示すようにノブ５２を押し込むと、コンバージョンレンズユニット５０は、レーザ導入光路に挿入される。
【００７１】
コンバージョンレンズユニット５０は、例えば中空構造を有する。コンバージョンレンズユニット５０内には、凸レンズ５３及び凹レンズ５４が設けられている。凸レンズ５３は、ファイバ出射端３４から出射された発散レーザビームのＮＡを変換する。
【００７２】
凹レンズ５４は、凸レンズ５３と集光レンズ３６の間のレーザ導入光路の光軸方向に移動可能に配置されている。凹レンズ５４は、凸レンズ５３によりＮＡ変換されたレーザビームを発散させる。これにより、凹レンズ５４をレーザ導入光路の光軸方向に移動させれば、レーザビームは、集光レンズ３６を通してコンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍に集光可能である。従って、凹レンズ５４は、集光レンズ３６の焦点距離を調整可能とする。
【００７３】
次に、上記の如く構成されたＴＩＲＦＭの動作について説明する。
【００７４】
図４に示すようにノブ５２を押し込むと、コンバージョンレンズユニット５０は、レーザ導入光路に挿入される。この状態で、ファイバ出射端３４から発散されたレーザビームは、凸レンズ５３によってＮＡが変換される。
【００７５】
この後、レーザビームは、凹レンズ５４及び集光レンズ３６を通ることでコンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍に集光される。このときのレーザビームのコンデンサレンズ２７への入射ＮＡは、凸レンズ５３及び凹レンズ５４をレーザ導入光路から外れた場合に比べて小さくなる。これにより、レーザビームは、小さい入射ＮＡでコンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍に集光される。
【００７６】
この結果、コンデンサレンズ２７を通った後の斜め方向に進む平行光線の光線束径、すなわち標本２５におけるレーザビーム照射範囲は凝縮される。これにより、レーザビームのエネルギー密度は高くなる。
【００７７】
このように上記第２の実施の形態によれば、凸レンズ５３及び凹レンズ５４を有するコンバージョンレンズユニット５０をレーザ導入光路上に挿脱可能にした。これにより、標本２５上におけるレーザビームの照射範囲を凝縮できる。すなわち、標本２５上に照射されるレーザビームのエネルギー密度を例えば高く変換できる。
【００７８】
従って、強いパワーで微弱蛍光を観察したい場合は、コンバージョンレンズユニット５０をレーザ導入光路に挿入する。広い範囲を蛍光観察したい場合は、コンバージョンレンズユニット５０をレーザ導入光路から外す。このように標本２５の観察の用途に応じた使い分けが可能である。
【００７９】
上記第２の実施の形態は、次のように変形してもよい。
【００８０】
コンバージョンレンズユニット５０の挿脱手段は、ノブに限定されず、例えば電動モータ等によってもよく、自由に構成することが可能である。
【００８１】
コンバージョンレンズユニット５０は、凸レンズ５３と凹レンズ５４との組み合わせに限らず、同一の作用を得られる凸レンズと凸レンズとの組み合わせであってもよい。
【００８２】
コンバージョンレンズユニット５０は、一種類のユニットをファイバ出射端３４と集光レンズ３６との間で挿脱するように構成していたが、これに限ることはない。例えば、コンバージョンレンズユニット５０は、異なる入射ＮＡに変換する構成とし、ファイバ出射端３４と集光レンズ３６との間に選択的に挿脱するようにしてもよい。このような構成であれば、標本２５に３通り以上の異なる入射ＮＡのレーザビームを照射することができる。これにより、より細かいレーザ光の照射範囲、ひいてはエネルギー密度の調整ができる。
【００８３】
次に、本発明の第３の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図２と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【００８４】
図５は正立型の全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の構成図である。対物レンズ切換部６０には、高倍観察用対物レンズ６１と低倍観察用対物レンズ６２とが取り付けられている。
【００８５】
図６は各対物レンズ６１、６２の切換機構を示す図である。対物レンズ切換部６０の側面には、例えばラック等の切換用部材６３が設けられている。切換用部材６３には、例えば電動モータ等の倍率切換駆動部６４がピニオン等を介して連結されている。倍率切換駆動部６４が回転駆動すると、この回転駆動が切換用部材６３に伝達されて矢印Ａ方向の直動に変換される。これにより、対物レンズ切換部６０が矢印Ａ方向に移動し、高倍観察用対物レンズ６１又は低倍観察用対物レンズ６２が観察光路Ｑ上に設けられる。
【００８６】
コンバージョンレンズユニット５０の入射側端面には、例えばラック等の挿脱用部材６５が設けられている。挿脱用部材６５には、例えば電動モータ等の挿脱駆動部６６がピニヨン等を介して連結されている。挿脱駆動部６６が回転駆動すると、この回転駆動が挿脱用部材６５に伝達されて矢印Ｂ方向の直動に変換される。これにより、コンバージョンレンズユニット５０が矢印Ｂ方向に移動し、レーザ導入光路に対して挿脱される。
【００８７】
コンバージョンレンズユニット５０をレーザ導入光路に挿入した状態では、レーザビーム照射範囲が高倍観察用対物レンズ６１の観察範囲と略一致するように設定されている。コンバージョンレンズユニット５０をレーザ導入光路から外した状態では、レーザビーム照射範囲が低倍観察用対物レンズ６２の観察範囲と略一致するように設定されている。
【００８８】
倍率切換駆動部６４及び挿脱駆動部６６は、ドライバ６７を介して制御部６８に接続されている。ドライバ６７は、制御部６８から発せられる駆動指令を受けて倍率切換駆動部６４及び挿脱駆動部６６を駆動する。
【００８９】
制御部６８は、パーソナルコンピュータ等を有する。制御部６８は、切換プログラムを実行することにより、高倍観察用対物レンズ６１を観察光路Ｑ上に配置したときに、コンバージョンレンズユニット５０をレーザ導入光路に挿入する駆動指令をドライバ６７に発する。制御部６８は、切換プログラムを実行することにより、低倍観察用対物レンズ６２を観察光路Ｑ上に挿入したときに、コンバージョンレンズユニット５０をレーザ導入光路から外す駆動指令をドライバ６７に発する。
【００９０】
次に、上記の如く構成されたＴＩＲＦＭの動作について説明する。
【００９１】
高倍観察用対物レンズ６１が観察光路Ｑ上に配置されると、コンバージョンレンズユニット５０がレーザ導入光路に挿入される。これにより、標本２５に対するレーザビーム照射範囲は、高倍観察用対物レンズ６１の観察範囲と略一致する。
【００９２】
低倍観察用対物レンズ６２が観察光路Ｑ上に挿入されると、コンバージョンレンズユニット５０はレーザ導入光路から外れる。これにより、標本２５に対するレーザビーム照射範囲は、低倍観察用対物レンズ６２の観察範囲と略一致する。
【００９３】
従って、上記第３の実施の形態によれば、高倍観察用対物レンズ６１又は低倍観察用対物レンズ６２を切り換えて観察倍率を切り換えたときに、標本２５を観察する視野の大きさに略一致したレーザビーム照射範囲への切換が連動してできる。
【００９４】
なお、上記第３の実施の形態は、次の通りに変形してもよい。
【００９５】
対物レンズは、それぞれ倍率の異なる３本以上を用いてもよい。この場合、複数の対物レンズにそれぞれ対応した各レーザビーム照射範囲の縮小率の異なる複数のコンバージョンレンズユニットが設けられる。制御部６８は、各対物レンズの切換に連動して該当するコンバージョンレンズユニットをレーザ導入光路に挿入する。
【００９６】
各対物レンズの切換とコンバージョンレンズユニットのレーザ導入光路への挿脱との連動が必要でない場合は、各対物レンズの切換とコンバージョンレンズユニットの挿脱とは、それぞれ独立に切り換えてもよい。この場合、各対物レンズの切換とコンバージョンレンズユニットの挿脱とは、それぞれ手動により行ってもよい。
【００９７】
次に、本発明の第４の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００９８】
図７（ａ）及び図７（ｂ）は全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）におけるズームレンズユニット６９の構成図である。ズームレンズユニット６９内には、凸レンズ７０と凹レンズ７１とが設けられている。凸レンズ７０は、ファイバ出射端３４と集光レンズ３６の間のレーザ導入光路の光軸方向に移動可能に配置されている。凸レンズ７０は、ファイバ出射端３４から出射される発散レーザビームのＮＡを変換する。
【００９９】
凹レンズ７１は、凸レンズ７０と集光レンズ３６の間のレーザ導入光路の光軸方向に移動可能に配置されている。凹レンズ７１は、凸レンズ７０によりＮＡ変換されたレーザビームを発散させる。これにより、凹レンズ７１をレーザ導入光路の光軸方向に移動させれば、レーザビームは、集光レンズ３６を通してコンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍に集光可能である。従って、凹レンズ７１は、集光レンズ３６の焦点距離を調整可能とする。
【０１００】
凸レンズ７０には、移動部７２が設けられている。移動部７２は、凸レンズ７０をレーザ導入光路の光軸方向（矢印Ｂ方向）に移動する。移動部７２は、例えば電動モータ等を有する。
【０１０１】
凹レンズ７１には、移動部７３が設けられている。移動部７３は、凹レンズ７１をレーザ導入光路の光軸方向（矢印Ｃ方向）に移動する。移動部７３は、例えば電動モータ等を有する。
【０１０２】
各移動部７２、７３は、ドライバ７４を介して制御部７５に接続されている。ドライバ７４は、制御部７５から発せられる駆動指令を受けて各移動部７２、７３を駆動する。
【０１０３】
制御部７５は、パーソナルコンピュータ等を有する。制御部７５は、駆動プログラムを実行することにより、凸レンズ７０の位置移動に応じてレーザビームの集光位置をコンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍に合わせ込むための凹レンズ７１の移動位置を決定する。制御部７５は、決定された凹レンズ７１の移動位置の情報に基づいて各移動部７２、７３の移動駆動量を制御する。
【０１０４】
次に、上記の如く構成されたＴＩＲＦＭの動作について説明する。
【０１０５】
制御部７５は、駆動プログラムを実行し、ドライバ７４に対して駆動指令を発する。ドライバ７４は、制御部７５から発せられる駆動指令を受けて各移動部７２、７３を駆動する。これにより、移動部７２は、図７（ａ）及び図７（ｂ）に示すように凸レンズ７０をレーザ導入光路の光軸方向（矢印Ｂ方向）に移動する。移動部７３は、図７（ａ）及び図７（ｂ）に示すように凹レンズ７１をレーザ導入光路の光軸方向（矢印Ｃ方向）に移動する。
【０１０６】
このとき、制御部７５は、凸レンズ７０の位置移動に応じてレーザビームの集光位置をコンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍に合わせ込むための凹レンズ７１の移動位置を決定し、当該決定された凹レンズ７１の移動位置の情報に基づいて各移動部７２、７３の移動駆動量を制御する。
【０１０７】
これにより、ファイバ出射端３４から出射された発散レーザビームは、位置移動された凸レンズ７０によってＮＡを変換される。ＮＡを変換されたレーザビームは、凹レンズ７１及び集光レンズ３６を通ることで焦点距離が調整される。この結果、レーザビームは、コンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍に集光される。
【０１０８】
従って、レーザビームの集光位置を変えることなく、入射ＮＡのみが連続的に変換できる。この結果、コンデンサレンズ２７を通った後の斜め方向に進む平行光線の光線束径、すなわち標本２５におけるレーザビーム照射範囲の大きさは、連続的に変換される。レーザビーム照射範囲の大きさの変化に対応してレーザビームのエネルギー密度が連続的に変換される。
【０１０９】
このように上記第４の実施の形態によれば、ズームレンズユニット６９内の凸レンズ７０と凹レンズ７１とをそれぞれレーザ導入光路の光軸方向に移動可能に設けた。これにより、標本２５におけるレーザ光照射範囲、すなわちレーザビームのエネルギー密度が連続的に変換できる。強いパワーで微弱蛍光を検出したい場合は、レーザビーム照射範囲を凝縮する。広い範囲を蛍光観察したい場合は、レーザビーム照射範囲を拡大する。このように標本２５の観察目的等の用途に応じた使い分けが可能となる。
【０１１０】
なお、上記第４の実施の形態は、次の通りに変形してもよい。
【０１１１】
図８は変形例の構成図である。なお、図７（ａ）及び図７（ｂ）と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。対物レンズレボルバ（対物レンズ切換部）７６には、それぞれ観察倍率の異なる複数の対物レンズ７７〜８２が取り付けられている。対物レンズレボルバ７６は、回転軸８３を中心に回転し、各対物レンズ７７〜８２のうちいずれか１つの対物レンズを選択して観察光路Ｑ上に配置する。
【０１１２】
観察倍率切換部８４は、対物レンズレボルバ７６を回転させて各対物レンズ７７〜８２のうちいずれか１つの対物レンズを選択して観察光路Ｑ上に設定する。観察倍率切換部８４は、例えば電動モータ等を有する。
【０１１３】
観察倍率切換部８４は、ドライバ８５を介して制御部７５に接続されている。ドライバ７４は、制御部７５から発せられる駆動指令を受けて観察倍率切換部８４を駆動する。
【０１１４】
制御部７５は、駆動プログラムを実行することにより、各対物レンズ７７〜８２の観察倍率を選択する切換指令を観察倍率切換部８４に発する。これと共に制御部７５は、各対物レンズ７７〜８２の観察倍率での観察範囲と略一致するレーザビーム照射範囲を得るように凸レンズ７０及び凹レンズ７１の各位置を決定し、決定された位置情報に基づいて観察倍率切換部８４に対して駆動指令を発する。
【０１１５】
このような構成であれば、任意の観察倍率を有する対物レンズ７７〜８２を選択した場合、選択した対物レンズに連動して、当該対物レンズの観察範囲と略一致したレーザビーム照射範囲が切換設定できる。
【０１１６】
ズームレンズユニット６９は、凸レンズ７０と凹レンズ７１との組み合わせに限らず、同一の作用を得られる凸レンズと凸レンズとの組み合わせであってもよい。
【０１１７】
次に、本発明の第５の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図１と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【０１１８】
図９は正立型の全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の構成図である。ベース２８の下部には、図１０に示すように例えば４つのレーザ導入部（以下、第１乃至第４のレーザ導入部と称する）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４が設けられている。第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、透過照明光路Ｔを中心に等角度毎に設けられている。すなわち、第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、透過照明光路Ｔに対して略直交する方向に放射状に配置されている。第１及び第２の各レーザ導入部Ｌ１、Ｌ２は、透過照明光路Ｔを介して対向配置されている。第３及び第４の各レーザ導入部Ｌ３、Ｌ４は、透過照明光路Ｔを介して対向配置されている。第２乃至第４の各レーザ導入部Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、第１のレーザ導入部Ｌ１と同一構成を有するので、その詳しい構成の説明は省略する。
【０１１９】
但し、第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４から出射される各レーザビームの各波長は、互いに異なる。第１のレーザ導入部Ｌ１は、単波長のλＬ１のレーザビームを出力する。第２のレーザ導入部Ｌ２は、単波長のλＬ２のレーザビームを出力する。第３のレーザ導入部Ｌ３は、単波長のλＬ３のレーザビームを出力する。第４のレーザ導入部Ｌ４は、単波長のλＬ４のレーザビームを出力する。
【０１２０】
次に、観察光路Ｑ側の構成について説明する。第１のダイクロイックミラー９３が観察光路Ｑ上に配置されている。第１のダイクロイックミラー９３は、基準とする波長λ１よりも短波長側の光を反射し、波長λ１よりも長波長側の光を透過する特性を有する。
【０１２１】
第１の結像レンズ２１及び第２のダイクロイックミラー９４が第１のダイクロイックミラー９３の反射光路上に配置されている。第２のダイクロイックミラー９４は、波長λ１よりも短い波長λ２を基準とし、波長λ２よりも短波長側の光を反射し、長波長側の光を透過する特性を有する。
【０１２２】
第２のダイクロイックミラー９４の反射光路上に第１の吸収フィルタ２２及び第１の撮像素子２５が配置されている。第１の吸収フィルタ２２は、波長λ２よりも短い特定の波長帯λＥ１のみの光を透過するバンドパスフィルタである。第１の撮像素子２５は、第１の結像レンズ２１の焦点位置に配置されている。
【０１２３】
第２のダイクロイックミラー９４の透過光路上には、第２の吸収フィルタ９５及び第２の撮像素子９６が配置されている。第２の吸収フィルタ９５は、波長λ２から波長λ１までの間の特定の波長帯λＥ２のみの光を透過するバンドパスフィルタである。第２の撮像素子９６は、第１の結像レンズ２２の焦点位置に配置されている。
【０１２４】
一方、第１のダイクロイックミラー９３の透過光路上には、第２の結像レンズ９７及び全反射プリズム９８が配置されている。全反射プリズム９８の反射光路上には、第３のダイクロイックミラー９９が配置されている。
【０１２５】
第３のダイクロイックミラー９９は、波長λ１よりも長い波長λ３を基準とし、波長λ３よりも短波長側の光を反射し、長波長側の光を透過する特性を有する。第３のダイクロイックミラー９９の反射光路上には、第３の吸収フィルタ１００及び第３の撮像素子１０１が配置されている。第３の吸収フィルタ１００は、波長λ１から波長λ３までの間の特定の波長帯λＥ３のみの光を透過するバンドパスフィルタである。第３の撮像素子１０１は、第２の結像レンズ９７の焦点位置に配置されている。
【０１２６】
第３のダイクロイックミラー９９の透過光路上には、第４の吸収フィルタ１０２及び第４の撮像素子１０３が配置されている。第４の吸収フィルタ１０２は、波長λ３よりも長い特定の波長帯λＥ４のみの光を透過するバンドパスフィルタである。第４の撮像素子１０３は、第２の結像レンズ９７の焦点位置に配置されている。
【０１２７】
図１１は第１乃至第３のダイクロイックミラー９３、９４、９９及び第１乃至第４の吸収フィルタ２２、９５、１００、１０２により各分離される各波長の関係を示する。各特定の波長帯λＥ１〜λＥ４は、λＥ１＜λＥ２＜λＥ３＜λＥ４の関係を有する。
【０１２８】
次に、上記の如く構成されたＴＩＲＦＭの動作について説明する。
【０１２９】
第１のレーザ導入部Ｌ１におけるレーザ発振器３２は、波長λＬ１のレーザビームをする。波長λＬ１のレーザビームは、光ファイバ３３に導入され、ファイバ出射端３４から発散光線として出射される。発散光線として出射されたレーザビームは、集光レンズ３６を通って収束光線に変換され、反射ミラー４７に入射する。
【０１３０】
反射ミラー４７に入射したレーザビームは、透過照明光路Ｔの最も外側近傍の位置でコンデンサレンズ２７側に反射される。反射ミラー４７で反射したレーザビームは、集光レンズ３６によりコンデンサレンズ２７の前側焦点位置近傍で一旦集光される。そして、レーザビームは、コンデンサレンズ２７に入射し、コンデンサレンズ２７から斜め方向に進む平行光線として出射される。コンデンサレンズ２７から出射されたレーザビームは、イマージョンオイル２を伝送してスライドガラス２４と標本２５との境界面に入射する。
【０１３１】
スライドガラス２４と標本２５との境界面へのレーザビームの入射角θＬ１が全反射の臨界角より大きければ、レーザビームは境界面で全反射する。これにより、標本２５側にエバネッセント光が浸み出す。
【０１３２】
標本２５中に存在する特定の蛍光物質は、波長λＬ１のエバネッセント光により励起される。この励起により蛍光物質は、蛍光の最大輝度波長が吸収フィルタ２２の透過波長帯λＥ１の中に有るような蛍光を発する。蛍光は、カバーガラス２６を通って対物レンズ２０に入射する。さらに、蛍光は、結像レンズ２１及び第１の吸収フィルタ２２を透過し、第１の撮像素子２３に入射する。第１の撮像素子２３は、波長帯λＥ１の蛍光像を撮像する。
【０１３３】
一方、第１のレーザ導入部Ｌ１におけるマイクロメータ操作部４５を回転すると、反射ミラー４７が透過照明光路Ｔに略直交する方向に直動する。反射ミラー４７の位置が透過照明光路Ｔに略直交する方向に移動すると、レーザビームのコンデンサレンズ２７への入射位置が移動する。これにより、コンデンサレンズ２７から出射されるレーザビームの出射角度、すなわちスライドガラス２４と標本２５との境界面へのレーザビームの入射角θＬ１が変化する。
【０１３４】
全反射照明におけるエバネッセント光の浸み出し深さは、スライドガラス２４と標本２５との境界面へのレーザビームの入射角θＬ１によって変わる。従って、マイクロメータ操作部４５を回転させて反射ミラー４７を透過照明光路Ｔに略直交する方向に微小移動させる。すなわち、反射ミラー４７を透過照明光路Ｔに対して近づけたり遠ざけたりすると、エバネッセント光の浸み出し深さｄＬ１が任意に変化できる。
【０１３５】
なお、透過照明光源３１から出力される照明光を用いて透過照明観察を行う場合、反射ミラー４７は、透過照明光路Ｔから完全に退避させる。
【０１３６】
第２のレーザ導入部Ｌ２についても第１のレーザ導入部Ｌ１と同様である。第２のレーザ導入部Ｌ２におけるマイクロメータ操作部４５を回転すると、スライドガラス２４と標本２５との境界面に入射する波長λＬ２のレーザビームの入射角θＬ２が変化する。これにより、エバネッセント光の浸み出し深さｄＬ２が任意に変化できる。
【０１３７】
標本２５中に存在する特定の蛍光物質は、波長λＬ２のエバネッセント光により励起される。この励起により標本２５中に存在する特定の蛍光物質は、蛍光の最大輝度波長が第２の吸収フィルタ９５の透過波長帯λＥ２中に存在する波長の蛍光を発する。波長帯λＥ２の蛍光は、カバーガラス２６を通って対物レンズ２０に入射する。
【０１３８】
対物レンズ２０を通った波長帯λＥ２の蛍光は、観察光路Ｑ中の第１のダイクロイックミラー９３で反射され、結像レンズ２１を通って第２のダイクロイックミラー９４に入射する。波長帯λＥ２の蛍光は、第２のダイクロイックミラー９４で反射され、第２の吸収フィルタ９５を透過し、第２の撮像素子９６に入射する。第２の撮像素子９６は、波長帯λＥ２の蛍光像を撮像する。
【０１３９】
第３と第４のレーザ導入部Ｌ３、Ｌ４についても第１のレーザ導入部Ｌ１と同様である。第３のレーザ導入部Ｌ３におけるマイクロメータ操作部４５を回転すると、スライドガラス２４と標本２５との境界面に入射する波長λＬ３のレーザビームの入射角θＬ３が変化する。これにより、波長λＬ３のエバネッセント光の浸み出し深さｄＬ３が任意に変化できる。
【０１４０】
波長帯λＥ３の蛍光は、第１のダイクロイックミラー９３を透過し、第２の結像レンズ９７、全反射プリズム９８を通って第３のダイクロイックミラー９９に入射する。波長帯λＥ３の蛍光は、第３のダイクロイックミラー９９で反射し、第３の吸収フィルタ１００を透過し、第３の撮像素子１０１に入射する。第３の撮像素子１０１は、波長帯λＥ３の蛍光像を撮像する。
【０１４１】
第４のレーザ導入部Ｌ４におけるマイクロメータ操作部４５を回転すると、スライドガラス２４と標本２５との境界面に入射する波長λＬ４のレーザビームの入射角θＬ４が変化する。これにより、波長λＬ４のエバネッセント光の浸み出し深さｄＬ４が任意に変化できる。
【０１４２】
波長帯λＥ４の蛍光は、第１のダイクロイックミラー９３を透過し、第２の結像レンズ９７、全反射プリズム９８を通って第３のダイクロイックミラー９９に入射する。波長帯λＥ４の蛍光は、第３のダイクロイックミラー９９を透過し、第４の吸収フィルタ１０２を透過し、第４の撮像素子１０３に入射する。第４の撮像素子１０３は、波長帯λＥ４の蛍光像を撮像する。
【０１４３】
このように上記第５の実施の形態によれば、上記第１の実施の形態と同様に、スライドガラス２４と標本２５との境界面に入射する各波長λＬ１〜λＬ４のレーザビームの各最大入射角θmaxは、コンデンサレンズ２７のＮＡのみに依存する。従って、対物レンズ２０のＮＡや倍率に関わらず全反射照明による蛍光観察が可能である。
【０１４４】
第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、それぞれ標本２５及びコンデンサレンズ２７から離れたところに設けられている。これにより、標本２５の近傍に設置する構造物がなく、標本２５の近傍のスペースを圧迫しない。第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、ベース２８に放射状に配置できる。
【０１４５】
第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、それぞれ反射ミラー４７をマイクロメータ４３により移動させる構造である。第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、単純な構造であり、動作範囲も狭い。従って、第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、ＴＩＲＦＭ自体をコンパクトにでき、かつＴＩＲＦＭを優れた作業性を有するものとすることができる。
【０１４６】
第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、各波長λＬ１〜λＬ４とエバネッセント光の浸み出し深さｄＬ１〜ｄＬ４とをそれぞれ個別に設定できる。
【０１４７】
従って、観察対象となる標本２５中の各部位を複数の種類の蛍光物質、例えばＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光物質を用いて標識することがある。この場合、標識する各部位の位置する深さに応じて、各々を励起する波長のエバネッセント光の浸み出し深さを最適に調整することが可能である。
【０１４８】
第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、互いに完全に独立した構成である。これにより、使用者の用途に応じて光学特性が独立に設定できる。第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４に限らず、当該レーザ導入部の必要個数の設置や増設、取り外しが可能である。すなわち、レーザ導入部の個数は、スペースの余裕が有れば更に追加することもできる。
【０１４９】
照明側（コンデンサレンズ２７側）と観察側（対物レンズ２０側）とが分離している。これにより、マルチバンドのダイクロイックミラーが必要なく、取り扱いが容易である。
【０１５０】
従って、上記第５の実施の形態によれば、以下のような優れたシステム性を有する全反射蛍光顕微鏡とすることができる。コンパクトで取り扱いが容易である。複数のレーザ導入部の増設が容易である。複数波長のレーザビームを用いて、各々独立してエバネッセント光の浸み出し深さが設定できる。複数波長のレーザビームを同時に標本２５に照射することが可能である。
【０１５１】
なお、上記第５の実施の形態は、次の通りに変形してもよい。
【０１５２】
ガラスボトムディッシュがスライドガラス２４の代わりに用いることができる。これにより、カバーガラス２６が除外できる。この場合、対物レンズ２０は、短い作動距離の場合、液浸対物レンズを用いる。
【０１５３】
反射ミラー４７は、マイクロメータに限らず、例えば電動モータ又はピエゾアクチュエータ等を用いて移動してもよい。
【０１５４】
反射ミラー４７は固定し、ファイバ出射端３４及び集光レンズ３６は透過照明光路Ｔの光軸と平行な方向に一体的に移動させてもよい。ファイバ出射端３４及び集光レンズ３６の移動は、例えばマイクロメータ、電動モータ又はピエゾアクチュエータ等を用いることができる。
【０１５５】
正立型顕微鏡に限らず、倒立顕微鏡にも適用可能である。
【０１５６】
観察光路Ｑ上の構成は、各々の励起波長に対する蛍光波長を選別して撮像する構成であれば、任意の構成してもよい。
【０１５７】
図１２に示したように第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４のそれぞれに各シャッタ１１０〜１１３を設けてもよい。各シャッタ１１０〜１１３は、それぞれ第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４内においてレーザビームの導入と遮断とを選択する。シャッタコントローラ１１４は、各シャッタ１１０〜１１３の開閉を個別に制御する。これにより、標本２５に導入するレーザビームを取捨選択できる。
【０１５８】
複数のレーザ導入部、例えば第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４のうち少なくとも２つのレーザ導入部から導入される各レーザビームの波長は、同一に設定する。そして、各レーザビームの標本２５への導入を各シャッタ、例えば各シャッタ１１０、１１１の開閉により交互に行う。これにより、各レーザビームの励起により発生する各エバネッセント光の浸み出し深さを変える。この結果、同じ蛍光物質による蛍光の浸み出し深さの違いによる観察像を比較すれば、その蛍光の発生源の深さを特定することが可能である。
【０１５９】
第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４に用いるレーザダイオード等のレーザ発振器は、それぞれ単一波長のレーザビームを発振する。これに限らず、レーザ発振器は、多波長のレーザビームを発振してもよい。
【０１６０】
例えば図１３に示すレーザコンバイナ１２０を用いてもよい。レーザコンバイナ１２０は、それぞれ異なる波長の各レーザビームを発振する各レーザ発振器１２１〜１２３を有する。各レーザ発振器１２１、１２２から出力される各レーザビームの光路上には、それぞれ各ダイクロイックミラー１２４、１２５が設けられている。レーザ発振器１２３から出力されるレーザビームの光路上には、ミラー１２６が設けられている。ミラー１２６の反射光路上には、各ダイクロイックミラー１２４、１２５及び集光レンズ１２７が設けられている。
【０１６１】
このような構成であれば、レーザ発振器１２３から出射されたレーザビームは、ミラー１２６により反射される。各レーザ発振器１２１、１２２からそれぞれ出射された各々のレーザビーム光は、各ダイクロイックミラー１２４、１２５により反射される。
【０１６２】
これにより、各レーザ発振器１２１、１２２からそれぞれ出射された各々のレーザビーム光は、レーザ発振器１２３から出射されたレーザビームと合成される。合成されたレーザビームは、集光レンズ７４によって光ファイバ３３に集光される。この結果、合成された各波長のレーザビームは、光ファイバ３３内を伝送し、コンバージョンレンズユニット５０に送られる。
【０１６３】
このような多波長のレーザビームを用いることで、一つのレーザ導入部で異なる励起波長域を持つ複数の蛍光物質を励起させることができる。
【０１６４】
各レーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、図３及び図４に示すようにコンバージョンレンズユニット５０を光ファイバ３３の出射端３４と集光レンズ３６との間に挿脱可能にしてもよい。
【０１６５】
観察倍率が異なる複数の対物レンズ、例えば図５に示すように高倍観察用対物レンズ６１及び低倍観察用対物レンズ６２を備えた顕微鏡にも適用できる。このような顕微鏡に適用した場合、高倍観察用対物レンズ６１を観察光路Ｑ上に配置したときに、各レーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、それぞれコンバージョンレンズユニット５０をレーザ導入光路に挿入する。低倍観察用対物レンズ６２を観察光路Ｑ上に挿入したときに、各レーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、それぞれコンバージョンレンズユニット５０はレーザ導入光路から外す。
【０１６６】
各レーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４は、図７（ａ）及び図７（ｂ）に示すズームレンズユニット６９を適用可能である。
【０１６７】
次に、本発明の第６の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、図９及び図１０と同一部分には同一符号を付してその詳しい説明は省略する。
【０１６８】
図１４は正立型の全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ）の構成図である。第２のダイクロイックミラー９４と第２の吸収フィルタ９５との間の光路上には、光路長調整部１３０が設けられている。光路長調整部１３０は、固定プリズム群１３１と、移動プリズム１３２と、プリズム移動部１３３とを有する。
【０１６９】
固定プリズム群１３１は、固定した位置に設けられている。
【０１７０】
移動プリズム１３２は、第２のダイクロイックミラー９４と第２の吸収フィルタ９５との間の光路に対して垂直方向（矢印Ｄ方向）に移動可能である。すなわち、移動プリズム１３２は、固定プリズム群１３１に対して離れる方向と近付く方向とに移動可能である。
【０１７１】
プリズム移動部１３３は、移動プリズム１３２を固定プリズム群１３１に対して離れる方向と近付く方向とに直動駆動する。プリズム移動部１３３は、移動プリズム１３２を直動するために、例えば電動モータ又はピエゾアクチュエータ等を用いる。
【０１７２】
従って、光路長調整部１３０は、移動プリズム１３２を固定プリズム群１３１に対して離れる方向と近付く方向とに直動駆動することにより、標本２５の蛍光物質から発せられた蛍光の結像位置を伸長する。蛍光の結像位置を伸長するときの基準位置は、第１の結像レンズ２１の結像位置とする。
【０１７３】
プリズム移動部１３３には、ドライバ１３４を介して制御部１３５が接続されている。ドライバ１３４は、制御部１３５から発せられる駆動信号を受けてプリズム移動部１３３を駆動する。
【０１７４】
制御部１３５は、パーソナルコンピュータ等を有する。制御部１３５は、移動プリズム１３２を固定プリズム群１３１に対して離れる方向又は近付く方向に直動駆動する駆動指令をドライバ１３４に対して発する。制御部１３５は、第１乃至第４の撮像素子２３、９６、１０１、１０３から出力される各画像信号をそれぞれ画像処理する。
【０１７５】
図１５は標本２５の内部及び観察光路の拡大図である。第１の蛍光物質Ｆ１は、レーザ導入部Ｌ１から導入されるレーザビームの波長λＬ１により励起されて蛍光を発する。蛍光の最大輝度波長は、第１の吸収フィルタ２４の透過波長帯λＥ１内にある。
【０１７６】
第２の蛍光物質Ｆ２は、レーザ導入部Ｌ２から導入されるレーザビームの波長λＬ２により励起されて蛍光を発する。蛍光の最大輝度波長は、第２の吸収フィルタ９５の透過波長帯λＥ２内にある。
【０１７７】
第１及び第２の蛍光物質Ｆ１、Ｆ２は、それぞれ特定の小器官で特異的に発現するように標本２５内の細胞に導入されている。第１の蛍光物質Ｆ１は、細胞膜に近接する小器官に発現する。第２の蛍光物質Ｆ２は、細胞膜から若干離れた位置にある小器官に発現する。
【０１７８】
蛍光物質Ｆ１を励起するためのエバネッセント光の浸み出し深さｄＬ１は、浅めに設定される。一方、蛍光物質Ｆ２を励起するためのエバネッセント光の浸み出し深さｄＬ２は、浸み出し深さｄＬ１よりも深めに設定される。
【０１７９】
対物レンズ２０の焦点は、第１の蛍光物質Ｆ１が発現する小器官に合わせてある。
【０１８０】
従って、第２の蛍光物質Ｆ２が発現する小器官の位置は、対物レンズ２０の焦点位置より対物レンズ２０側に近付いた位置にある。
【０１８１】
次に、上記の如く構成されたＴＩＲＦＭの動作について説明する。
【０１８２】
レーザ導入部Ｌ１のマイクロメータ操作部４５を回転すると、波長λＬ１のエバネッセント光の第１の蛍光物質Ｆ１に届く深さが調整される。同様に、レーザ導入部Ｌ２のマイクロメータ操作部４５を回転すると、波長λＬ２のエバネッセント光の第２の蛍光物質Ｆ２に届く深さが調整される。
【０１８３】
第１の蛍光物質Ｆ１は、対物レンズ２０の焦点位置にある。第１の蛍光物質Ｆ１から発した蛍光は、対物レンズ２０を通って平行光線となり、第１のダイクロイックミラー９３で反射され、第１の結像レンズ２１を通って収束光線となり、第２のダイクロイックミラー９４、第１の吸収フィルタ２２を経て、第１の撮像素子２３の撮像面上で結像される。
【０１８４】
一方、第２の蛍光物質Ｆ２は、対物レンズ２０の焦点位置より対物レンズ２０側にずれた位置にある。第２の蛍光物質Ｆ２から発した蛍光は、図１５の点線で示すように、対物レンズ２０を通って僅かに発散する光線となる。当該蛍光は、第１のダイクロイックミラー９３で反射され、第１の結像レンズ２１を通って収束光線となる。
【０１８５】
このとき、移動プリズム１３２が基準位置にある状態では、第２のダイクロイックミラー９４、光路長調整部Ｃ１、第２の吸収フィルタ９５を経た後の結像位置は、第２の撮像素子９６の撮像面を通り過ぎた後の位置になる。これにより、第２の撮像素子９６で撮像される第２の蛍光物質Ｆ２の蛍光像は、焦点が合っていないピンぼけ像になる。
【０１８６】
制御部１３５は、ドライバ１３４に対して駆動指令を発する。これにより、プリズム移動部１３３は、移動プリズム１３２を固定プリズム群１３１から離れる方向に直動させる。この直動により第２の撮像素子９６に至る光路長が伸長される。第２の蛍光物質Ｆ２から発した蛍光の結像位置は、第２の撮像素子９６の撮像面に近付く。
【０１８７】
図１６は第２の蛍光物質Ｆ２から発した蛍光の結像位置が第２の撮像素子９６の撮像面と合致した状態を示す。この状態で、対物レンズ２０の焦点位置より対物レンズ２０側にずれた位置にある第２の蛍光物質Ｆ２から発した蛍光は、第２の撮像素子９６の撮像面上で結像される。
【０１８８】
このとき、制御部１３５は、移動プリズム１３２の基準位置からの移動量を基にして対物レンズ２０の焦点位置に対する第２の蛍光物質Ｆ２の位置ずれ量を計算する。これと共に制御部１３５は、第２の撮像素子９６の撮像面上での拡大倍率のずれ量を計算する。そして、制御部１３５は、撮像された画像を倍率補正する画像処理を行う。
【０１８９】
このように上記第６の実施の形態によれば、対物レンズ２０を固定し、標本２５上の異なる深さの面を全反射照明し、高いコントラストで同時観察できる。例えば、標本２５上の異なる深さ位置にある各小器官、例えば第１の蛍光物質Ｆ１が発現する小器官と第２の蛍光物質Ｆ２が発現する小器官となどを全反射照明し、高いコントラストで同時観察できる。
【０１９０】
上記第６の実施の形態は、次のように変形してもよい。
【０１９１】
光路長調整部１３０と同様な構成の光路長調整部は、第２の撮像素子９６以外の他の撮像素子、例えば第１、第３及び第４の撮像素子２３、１０１、１０３に至る各分割観察光路上にそれぞれ配置してもよい。この場合は、ドライバ１３４は、複数の光路長調整部をそれぞれ駆動するための複数のチャンネルを有する。各チャンネルは、制御部１３５からの駆動指令により独立に制御される。
【０１９２】
光路長調整部１３０を設ける代わりに、例えば第２の撮像素子９６自体を光路と平行な方向に直動させても同様な効果が得られる。例えば第１、第３及び第４の撮像素子２３、１０１、１０３自体を光路と平行な方向に直動させても同様な効果が得られる。
【０１９３】
図１２に示すと同様に、第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４のそれぞれに各シャッタ１１０〜１１３を設けてもよい。各シャッタ１１０〜１１３の開閉をシャッタコントローラにより制御すれば、標本２５に導入されるレーザビームが取捨選択できる。
【０１９４】
複数のレーザ導入部、例えば第１乃至第４のレーザ導入部Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４のうち少なくとも２つのレーザ導入部から導入される各レーザビームの波長は、同一に設定する。そして、各レーザビームの標本２５への導入を各シャッタ、例えば各シャッタ１１０、１１１の開閉により交互に行う。これにより、各レーザビームの励起により発生する各エバネッセント光の浸み出し深さを変える。この結果、同じ蛍光物質による蛍光の浸み出し深さの違いによる観察像を比較すれば、その蛍光の発生源の深さを特定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】本発明の全反射蛍光顕微鏡の第１の実施の形態を示す構成図。
【図２】本発明の全反射蛍光顕微鏡の第２の実施の形態を示す構成図。
【図３】同全反射蛍光顕微鏡におけるコンバージョンレンズユニットの上面拡大図。
【図４】同全反射蛍光顕微鏡におけるコンバージョンレンズユニットの上面拡大図。
【図５】本発明の全反射蛍光顕微鏡の第３の実施の形態を示す構成図。
【図６】同全反射蛍光顕微鏡における各対物レンズ切換機構を示す図。
【図７】本発明の全反射蛍光顕微鏡の第４の実施の形態におけるコンバージョンレンズユニットを示す構成図。
【図８】同全反射蛍光顕微鏡の変形例を示す構成図。
【図９】本発明の全反射蛍光顕微鏡の第５の実施の形態を示す構成図。
【図１０】同全反射蛍光顕微鏡における各レーザ導入部の配置を示す図。
【図１１】同全反射蛍光顕微鏡における各ダイクロイックミラー及び各吸収フィルタにより分離される各波長の関係を示す図。
【図１２】同全反射蛍光顕微鏡の変形例を示す構成図。
【図１３】同全反射蛍光顕微鏡におけるレーザコンバイナの構成図。
【図１４】本発明の全反射蛍光顕微鏡の第５の実施の形態を示す構成図。
【図１５】同全反射蛍光顕微鏡における標本の内部及び観察光路の拡大図。
【図１６】同全反射蛍光顕微鏡において蛍光物質から発した蛍光の結像位置が撮像素子の撮像面と合致した状態を示す図。
【図１７】従来の全反射蛍光顕微鏡の作用を示す図。
【図１８】従来の全反射蛍光顕微鏡の構成図。
【図１９】従来の全反射蛍光顕微鏡の構成図。
【符号の説明】
【０１９６】
２０：対物レンズ、２１：結像レンズ、２２：吸収フィルタ、２３：撮像素子、２４：スライドガラス、２５：標本、２６：カハーガラス、２７：コンデンサレンズ、２８：ベース、２９：イマージョンオイル、３０：コレクタレンズ、３１：透過照明光源、３２：レーザ発振器、３３：光ファイバ、３４：ファイバ出射端、３５：支持部、３６：集光レンズ、３７：下垂支持部、３８：移動用孔、３９：支持用孔、４０：ミラー保持部、４１：ミラー支持部ね４２：移動案内部、４３：マイクロメータ、４４：マイクロメータヘッド、４５：マイクロメータ操作部、４６：バネ、４７：反射ミラー、５０：コンバージョンレンズユニット、５１：退避空間部、５２：ノブ、５３：凸レンズ、５４：凹レンズ、６０：対物レンズ切換部、６１：高倍観察用対物レンズ、６２：低倍観察用対物レンズ、６３：切換用部材、６４：倍率切換駆動部、６５：挿脱用部材、６６：挿脱駆動部、６７：ドライバ、６８：制御部、６９：ズームレンズユニット、７０：凸レンズ、７１：凹レンズ、７２，７３：移動部、７４：ドライバ、７５：制御部、７６：対物レンズレボルバ、７７〜８２：対物レンズ、８３：回転軸、８４：観察倍率切換部、Ｌ１〜Ｌ４：レーザ導入部、９３：第１のダイクロイックミラー、９４：第２のダイクロイックミラー、９５：第２の吸収フィルタ、９６：第２の撮像素子、９７：第２の結像レンズ、９８：全反射プリズム、９９：第３のダイクロイックミラー、１００：第３の吸収フィルタ、１０１：第３の撮像素子、１０２：第４の吸収フィルタ、１０３：第４の撮像素子、１１０〜１１３：シャッタ、１１４：シャッタコントローラ、１２０：レーザコンバイナ、１２１〜１２３：レーザ発振器、１２４，１２５：ダイクロイックミラー、１２６：ミラー、１２７：集光レンズ、１３０：光路長調整部、１３１：固定プリズム群、１３２：移動プリズム、１３３：プリズム移動部、１３４：ドライバ、１３５：制御部。
【図１】
2004318133.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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