(57)【要約】【課題】抗癌剤耐性克服剤の提供。【解決手段】一般式（１）【化１】2004123567.tif 000018［式中、Ｒ１は水素原子、基−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ４Ｒ５（ここで、ｎは１〜４を、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す）、又は基−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２Ｒ４（ここで、ｎ及びＲ４は前記と同じ）を示し；Ｒ２は水酸基、炭素数１〜４のアルコキシ基、置換基としてニトロ基を有してもよいフェニル基が置換した炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のアシルオキシ基又は燐酸基を示し；Ｒ３は水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を示す］で表される１，１，２−トリフェニル−１−ブテン誘導体又はその製薬上許容される塩を有効成分とする抗癌剤耐性克服剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2004123567.tif 000016
［式中、Ｒ１は水素原子、基−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ４Ｒ５（ここで、ｎは１〜４を、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す）、又は基−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２Ｒ４（ここで、ｎ及びＲ４は前記と同じ）を示し；
Ｒ２は水酸基、炭素数１〜４のアルコキシ基、置換基としてニトロ基を有してもよいフェニル基が置換した炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のアシルオキシ基又は燐酸基を示し；
Ｒ３は水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を示す］
で表される１，１，２−トリフェニル−１−ブテン誘導体又はその製薬上許容される塩を有効成分とする抗癌剤耐性克服剤。
【請求項２】
抗癌剤耐性が、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤に起因する抗癌剤耐性である請求項１記載の抗癌剤耐性克服剤。
【請求項３】
トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤がカンプトテシン類である請求項２記載の抗癌剤耐性克服剤。
【請求項４】
カンプトテシン類がイリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８又はそれらの薬学的に許容される酸付加塩である請求項２又は３記載の抗癌剤耐性克服剤。
【請求項５】
上記一般式（１）において、Ｒ１が基−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ４Ｒ５（ここで、ｎは１〜４を、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す）を示し；
Ｒ２が水酸基、置換基としてニトロ基を有してもよいフェニル基が置換した炭素数１〜４のアルコキシ基又は燐酸基を示し；
Ｒ３が水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を示す］
で表される１，１，２−トリフェニル−１−ブテン誘導体又はその製薬上許容される塩である請求項１〜５のいずれか１項記載の抗癌剤耐性克服剤。
【請求項６】
上記一般式（１）で表される化合物が、
１，１−ビス−４−ヒドロキシフェニル−２−（４−イソプロピルフェニル）−１−ブテン、
（Ｚ）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−メトキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン、
（Ｚ）−１−［４−［２−（メタンスルフォニル）エトキシ］フェニル］−１，２−ジフェニル−１−ブテン、
（Ｚ）−１−（４−ハイドロキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−（４−メトキシフェニル）−１−ブテン、
（Ｅ）−１−（４−アセトキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−フェニル−１−ブテン、
（Ｚ）−２−［４−（２−ハイドロキシ−１−メチルエチル）フェニル］−１−（４−ハイドロキシフェニル）−１−［４−［２−（メチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−ブテン、
（Ｅ）−１−（４−ベンジルオキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−フェニル−１−ブテン、
（Ｅ）−４−［１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−（４−イソプロピルフェニル）−１−ブテニル］フェニル　モノホスフェート、
４−［１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−（４−エトキシフェニル）−１−ブテニル］フェニル　モノホスフェート、
（Ｚ）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（４−エチルフェニル）−１−ブテン、
（Ｚ）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（４−イソプロピルフェニル）−１−ブテン、
（Ｚ）−２−（４−ベンジルオキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン、
（Ｚ）−２−（４−ベンジルオキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン、
又は（Ｅ）−１−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−［４−（４−ニトロベンジルオキシ）フェニル］−２−フェニル−１−ブテン及びこれらの製薬上許容される塩である請求項１〜５のいずれか１項記載の抗癌剤耐性克服剤。
【請求項７】
一般式（１）
【化２】
2004123567.tif 000017
［式中、Ｒ１は水素原子、基−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ４Ｒ５（ここで、ｎは１〜４をＲ４及びＲ５は同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す）、又は基−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２Ｒ４（ここで、ｎ及びＲ４は前記と同じ）を示し；
Ｒ２は水酸基、炭素数１〜４のアルコキシ基、置換基としてニトロ基を有してもよいフェニル基が置換した炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のアシルオキシ基又は燐酸基を示し；
Ｒ３は水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を示す］
で表される１，１，２−トリフェニル−１−ブテン誘導体又はその製薬上許容される塩を有効成分とするＢＣＲＰ阻害剤。
【請求項８】
上記一般式（１）において、Ｒ１が基−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ４Ｒ５（ここで、ｎは１〜４を、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す）を示し；
Ｒ２が水酸基、置換基としてニトロ基を有してもよいフェニル基が置換した炭素数１〜４のアルコキシ基又は燐酸基を示し；
Ｒ３が水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を示すものである請求項７記載のＢＣＲＰ阻害剤。
【請求項９】
上記一般式（１）で表される化合物が、
１，１−ビス−４−ヒドロキシフェニル−２−（４−イソプロピルフェニル）−１−ブテン、
（Ｚ）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−メトキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン、
（Ｚ）−１−［４−［２−（メタンスルフォニル）エトキシ］フェニル］−１，２−ジフェニル−１−ブテン、
（Ｚ）−１−（４−ハイドロキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−（４−メトキシフェニル）−１−ブテン、
（Ｅ）−１−（４−アセトキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−フェニル−１−ブテン、
（Ｚ）−２−［４−（２−ハイドロキシ−１−メチルエチル）フェニル］−１−（４−ハイドロキシフェニル）−１−［４−［２−（メチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−ブテン、
（Ｅ）−１−（４−ベンジルオキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−フェニル−１−ブテン、
（Ｅ）−４−［１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−（４−イソプロピルフェニル）−１−ブテニル］フェニル　モノホスフェート、
４−［１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−（４−エトキシフェニル）−１−ブテニル］フェニル　モノホスフェート、
（Ｚ）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（４−エチルフェニル）−１−ブテン、
（Ｚ）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（４−イソプロピルフェニル）−１−ブテン、
（Ｚ）−２−（４−ベンジルオキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン、
（Ｚ）−２−（４−ベンジルオキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン、
又は（Ｅ）−１−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−［４−（４−ニトロベンジルオキシ）フェニル］−２−フェニル−１−ブテン及びこれらの製薬上許容される塩である請求項７又は９記載のＢＣＲＰ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は抗癌剤耐性克服剤及びＢＣＲＰ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
塩酸イリノテカンはトポソメラーゼＩを阻害することにより、抗腫瘍作用を発揮し、日本において小細胞肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、胃癌、直腸・結腸癌、乳癌等の治療に広く用いられている。しかしながら白血球減少、骨髄抑制等の血液毒性、下痢、悪心、嘔吐などの消化器毒性などの強い副作用が報告されており、使用にあたっては慎重な投与が求められている。これら塩酸イリノテカン等のカンプトテシン類、ミトキサントロン等の抗癌剤は、患者によって、抗癌剤が効く癌と全く効かない癌があること、またこれら薬剤の長期連用により抗癌効果が低下する場合があることが指摘されている。この抗癌剤の効果が癌腫によって又は抗癌剤の長期使用によって低下する現象は癌細胞が耐性を獲得したものとして理解されている。
【０００３】
癌細胞による、これらの抗癌剤に対する耐性獲得のメカニズムについては、最近の研究によると、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターと呼ばれる一群の膜タンパク質が薬剤排出ポンプとして耐性に関与する。このトランスポーターはＡＴＰを加水分解し、そのエネルギーを利用して濃度勾配に逆らって薬物を細胞外へ排出する。ＡＢＣトランスポータの一つである耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）は、ミトキサントロンやドキソルビシン等のトポイソメラーゼＩＩ（ＴｏｐｏＩＩ）阻害剤やイリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８等のトポイソメラーゼＩ（ＴｏｐｏＩ）阻害剤で選択した細胞株にも高発現し、これらの薬剤に対する耐性に関与していることが知られている（非特許文献１及び２参照）。すなわち、抗癌剤が長期連用されると癌細胞内に抗癌剤の細胞内蓄積を減少させる作用を有することが判明した。
【０００４】
一方、タモキシフェンを代表とする１，１，２−トリフェニル−１−ブテン誘導体は強い抗エストロジェン作用を有し（特許文献１参照）、エストロジェンと強力に結合することによりホルモン依存性乳癌の増殖を抑制する治療薬として広く用いられている。
塩酸イリノテカンの副作用である下痢を軽減又は抑制する目的で、タモキシフェンをイリノテカン投与前に投与することが報告されている（特許文献２参照）。また、イリノテカンの副作用低減のためタモキシフェンを併用することが報告されている（特許文献３参照）。
【０００５】
またタモキシフェン以外にも多くの抗エストロジェン作用を有する１，１，２−トリフェニル−１−ブテン誘導体が報告されている（特許文献４〜９参照）が、これらの化合物が癌細胞による抗癌剤耐性獲得に対していかなる作用を有するかについては検討されていない。
【０００６】
【非特許文献１】
最新医学，　２００１年３月，　５６巻３号，　ｐ．８９−９５
【非特許文献２】
Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　１９９８年，　第９５巻，　ｐ．１５６６５−１５６７０，　１９９８
【特許文献１】
英国特許第１０１３９０７号明細書
【特許文献２】
国際公開第９８／３７８９２号パンフレット
【特許文献３】
国際公開第９６／０１１２７号パンフレット
【特許文献４】
特公昭４１−８３４６号公報
【特許文献５】
特開昭５４−４４６４４号公報
【特許文献６】
特開昭５５−６６５４７号公報
【特許文献７】
特開昭６２−９９３５２号公報
【特許文献８】
国際公開第８７／０７６０９号パンフレット
【特許文献９】
特開平２−２７９６５８号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、癌細胞による抗癌剤耐性獲得を阻害する薬剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは白血病細胞Ｋ５６２にＢＣＲＰ遺伝子を導入して、外来性ＢＣＲＰ遺伝子を保有し、ＢＣＲＰを発現するイリノテカン抗癌剤耐性細胞を樹立した。そして、さらにこの細胞を用いて抗癌剤耐性機構の研究および抗癌剤耐性克服作用を有する化合物について鋭意研究したところ、後記式（１）の１，１，２−トリフェニル−１−ブテン誘導体が優れたＢＣＲＰ阻害作用および抗癌剤耐性克服作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は一般式（１）
【００１０】
【化３】
2004123567.tif 000002
【００１１】
［式中、Ｒ１は水素原子、基−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ４Ｒ５（ここで、ｎは１〜４を、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す）、又は基−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２Ｒ４（ここで、ｎ及びＲ４は前記と同じ）；
Ｒ２は水酸基、炭素数１〜４のアルコキシ基、置換基としてニトロ基を有してもよいフェニル基が置換した炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のアシルオキシ基又は燐酸基を示し；
Ｒ３は水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基を示す］
で表される１，１，２−トリフェニル−１−ブテン誘導体又はその製薬上許容される塩を有効成分とする抗癌剤耐性克服剤、及びＢＣＲＰ阻害剤を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
一般式（１）中、炭素数１〜４のアルキル基としてはメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル基等の直鎖状又は分枝状のアルキル基が挙げられる。炭素数１〜４のアルコキシ基としてはメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ブチルオキシ、イソプロピルオキシ基等の直鎖状又は分枝状のアルコキシ基が挙げられる。炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基としては前記定義した炭素数１〜４の直鎖状又は分枝状のアルキル基にヒドロキシ基が１つ置換したものを表し、具体的にはヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、４−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル基等が例示される。
【００１３】
式−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ４Ｒ５で示される基、すなわちアミノアルキル基又はモノもしくはジアルキルアミノアルキル基としては、アミノメチル、アミノエチル、ジメチルアミノメチル、ジエチルアミノメチル、メチルエチルアミノメチル、ジメチルアミノエチル、ジエチルアミノエチル、ジメチルアミノプロピル、メチルアミノメチル、エチルアミノメチル、メチルアミノエチル、プロピルアミノエチル等が例示される。また、式−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ２Ｒ４で示される基、すなわちスルフォニルアルキル基又はアルキルスルフォニルアルキル基としては、スルフォニルメチル、スルフォニルエチル、メチルスルフォニルメチル、エチルスルフォニルメチル、プロピルスルフォニルメチル、メチルスルフォニルエチル、エチルスルフォニルエチル、プロピルスルフォニルエチル、メチルスルフォニルプロピル等が例示される。
【００１４】
置換基としてニトロ基を有していてもよいフェニル基が置換した炭素数１〜４のアルコキシ基としては、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ、フェニルプロポキシ、フェニルブトキシ、ｐ−ニトロベンジルオキシ、ｐ−ニトロフェネチルオキシ基が挙げられ、好ましくはベンジルオキシ又はｐ−ニトロベンジルオキシ基である。アシルオキシ基としては、例えばホルミルオキシ、アセトキシ、プロピオニルオキシ、ブチリルオキシ等の炭素数１〜４のアシルオキシ基が挙げられ、好ましくはアセトキシ基である。
【００１５】
一般式（１）の化合物の製薬上許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、塩酸塩、硝酸塩、硫酸鉛、燐酸塩等の無機酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、トシル酸塩の有機酸塩が例示される。
【００１６】
本発明化合物において、好ましい化合物としては、上記一般式（１）において、Ｒ１が基−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲ４Ｒ５（ここで、ｎは１〜４を、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す）を示し；
Ｒ２が水酸基、置換基としてニトロ基を有してもよいフェニル基が置換した炭素数１〜４のアルコキシ基又は燐酸基を示し；
Ｒ３が水素原子、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を示す化合物又はその製薬上許容される塩である。
本発明化合物において、より好ましいものとしては表１の化合物が例示できる。
【００１７】
【表１】
2004123567.tif 000003
【００１８】
ＴＡＧ−１：１，１−ビス−４−ヒドロキシフェニル−２−（４−イソプロピルフェニル）−１−ブテン
ＴＡＧ−２：（Ｚ）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−メトキシフェニル）−２−フェニル−１−ブテン
ＴＡＧ−３：（Ｚ）−１−［４−［２−（メタンスルフォニル）エトキシ］フェニル］−１，２−ジフェニル−１−ブテン
ＴＡＧ−５：（Ｚ）−１−（４−ハイドロキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−（４−メトキシフェニル）−１−ブテン
ＴＡＧ−７：（Ｅ）−１−（４−アセトキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−フェニル−１−ブテン
ＴＡＧ−８：（Ｚ）−２−［４−（２−ハイドロキシ−１−メチルエチル）フェニル］−１−（４−ハイドロキシフェニル）−１−［４−［２−（メチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−ブテン
ＴＡＧ−１１：（Ｅ）−１−（４−ベンジルオキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−フェニル−１−ブテン　塩酸塩
ＴＡＧ−１２：（Ｅ）−４−［１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−（４−イソプロピルフェニル）−１−ブテニル］フェニル　モノホスフェートナトリウム塩
ＴＡＧ−１３：４−［１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−２−（４−エトキシフェニル）−１−ブテニル］フェニル　モノホスフェートナトリウム塩
ＴＡＧ−５４：（Ｚ）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（４−エチルフェニル）−１−ブテン　塩酸塩
ＴＡＧ−７２：（Ｚ）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（４−イソプロピルフェニル）−１−ブテン　塩酸塩
ＴＡＧ−１００：（Ｚ）−２−（４−ベンジルオキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン
ＴＡＧ−１２６：（Ｚ）−２−（４−ベンジルオキシフェニル）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ブテン　塩酸塩
ＴＡＧ−１３９：（Ｅ）−１−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−１−［４−（４−ニトロベンジルオキシ）フェニル］−２−フェニル−１−ブテン　塩酸塩
【００１９】
一般式（１）で表される１，１，２−トリフェニル−１−ブテン誘導体は全て公知化合物であり、特公昭４１−８３４６号公報、特開昭５４−４４６４４号公報、特開昭５５−６６５４７号公報、特開昭６２−９９３５２号公報、国際公開第８７／０７６０９号パンフレット、特開平２−２７９６５８号公報に記載された方法で容易に合成可能である。
【００２０】
一般式（１）の化合物は、後記実施例に示すように、ＢＣＲＰを阻害し、優れた抗癌剤耐性を克服する作用を有し、抗癌剤耐性克服剤として有用である。その抗癌剤耐性は、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤に起因する耐性が特に好ましい。
【００２１】
本発明の抗癌剤耐性克服剤の対象となる抗癌剤としては、ＢＣＲＰにより耐性を生じるトポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害作用を有する抗癌剤が好ましく、例えば塩酸イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８等のカンプトテシン類；ミトキサントロン等のアンスラキノン類；７−ヒドロキシスタロウスポリン等のスタウロスポリン類；アドリアマイシン等のアンスラサイクリン類が挙げられる。また、本発明の抗癌剤耐性克服剤の対象癌は、前記の抗癌剤の適用対象となる癌であれば特に制限されない。
【００２２】
本発明の（Ａ）抗癌剤耐性克服剤と（Ｂ）前記の癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤とを併用すれば、耐性を克服した癌に対する治療効果が回復するので、これら成分（Ａ）および（Ｂ）を含有する組成物は新たな抗癌剤として有用である。
【００２３】
本発明の抗癌剤耐性克服剤又は新たな抗癌剤は、これらの成分が従来用いられている製剤をそのまま併用することにより投与しても良いが、これらの成分を含む新たな製剤としてもよい。製剤としては、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、液剤、丸剤、乳剤、懸濁剤等の経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、硬膏剤、貼付剤等の非経口剤のいずれでもよく、それぞれ当業者に公知慣用の製造方法により製造できる。
【００２４】
経口用固形製剤を調製する場合には、本発明の有効成分に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤等を製造することができる。賦形剤としては、例えば乳糖、マンニトール、蔗糖、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等が、結合剤としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、アラビアゴム、シェラック、白糖等が、崩壊剤としては乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウム、タルク等が、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が使用できる。その他、着色剤、矯臭剤等は公知のものを用いることができる。なお、錠剤とする場合は周知の方法によりコーティングしてもよい。
【００２５】
経口用液体製剤を調製する場合は、本発明の有効成分に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味剤としては上記のものが、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が使用できる。
【００２６】
上記の各投与単位形態中に配合されるべき式（１）の化合物の量は、これを適用すべき患者の症状、その剤型、投与法等により異なるが１日あたり１ｍｇ〜１０ｇ、特に１００ｍｇ〜３ｇが好ましい。また、癌細胞が耐性を獲得し得る抗癌剤（Ｂ）の投与量は、通常の薬効量でよく、例えば、１ｍｇ〜１ｇ、特に２ｍｇ〜３００ｍｇが好ましい。
【００２７】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１（ＢＣＲＰ発現細胞の作成）
（１）ＢＣＲＰ遺伝子
本発明では、ＰＣＲ法を用いてヒト胎盤ｍＲＮＡより単離したヒトＢＣＲＰｃＤＮＡを用いた。このＰＣＲでは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＨｕｍａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーとしてヒトＢＣＲＰのｃＤＮＡの５’側のプライマー１Ｓ（ＣＣＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＣＴＧ　ＡＧＣ　ＣＴＴ　ＴＧＧ　ＴＴ）（配列番号１）及び３’側のプライマー５ＡＳ（ＧＡＴ　ＧＧＣ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡＣ　ＡＡＣ　Ａ）（配列番号２）の２本のオリゴヌクレオチドを用いて、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社の　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ｃＤＮＡ　ＰＣＲ　ｋｉｔを用いて、９４℃で１分の反応を１回行った後、９４℃で３０秒、６８℃で３分の反応を３５回繰り返し、最後に９４℃で３０秒、６８℃で１５分の反応を１回おこない、約２１５０ｂｐの増幅されたｃＤＮＡを得た。これをｐＣＲ２．１プラスミドにサブクローニングして、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７７　ＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列を決定した。独立な４クローンの塩基配列を決定し、ＰＣＲによる変異と推定される部分は除いて、本遺伝子のコード領域の塩基配列とそれから予想されるアミノ酸配列を推定した。この塩基配列を配列番号３、推定されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。本発明では、この配列を野生型ＢＣＲＰの配列とする。本発明のＢＣＲＰの配列はＤＤＢＪ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＡＢ０５６８６７　として登録されている。
【００２９】
（２）ＢＣＲＰ発現プラスミドの作成
次に、このＢＣＲＰ　ｃＤＮＡにＭｙｃエピトープを付けてレトロウイルスベクターに挿入するために、末端の修飾を目的とした２度目のＰＣＲを行った。Ｍｙｃエピトープタグを付加するためのＰＣＲでは、上記のＰＣＲ反応で得られたヒトＢＣＲＰ　ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｍｙｃエピトープタグを含む５’側のプライマー５Ｍｙｃ−２０４Ｓ　（ＣＣＣ　ＣＧＣ　ＧＧＣ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＣＴＣ　ＡＴＣ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＣＣ　ＡＧＴ　ＡＡＴ　ＧＴＣ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＡＴＣ　ＣＣＣＡ　ＧＴＧ　ＴＣ　）（配列番号５）および３’側のプライマー８ＡＳ（ＣＧＣ　ＣＴＣ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＧＧＣ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡＣ　ＡＡＣ　Ａ）（配列番号６）の２本のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ＰＣＲはＣｌｏｎｔｅｃｈ社のＡｄｖａｎｔａｇｅ　ｃＤＮＡ　ＰＣＲ　ｋｉｔを用いて、９４℃で１分の反応を１回行った後、９４℃で３０秒、６８℃で３分の反応を２０回繰り返し、最後に９４℃で３０秒、６８℃で１５分の反応を１回おこない、約２２００ｂｐの増幅されたｃＤＮＡを得た。増幅されたｃＤＮＡをサブクローニングして塩基配列を決定し、ＰＣＲによる変異が起きていないことを確認した。
【００３０】
このｃＤＮＡの両末端をＳｓｔＩＩ　とＸｈｏＩの２種の制限酵素で切断後、ＳｓｔＩＩ　とＸｈｏＩで切断したｐＨａプラスミドベクターとＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションした。このライゲーション反応液をＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａｌｐｈａに導入し、ｐＨａプラスミドベクターのＳｓｔＩＩサイトとＸｈｏＩサイトの間にＢＣＲＰ　ｃＤＮＡが挿入されたクローンｐＨａＭｙｃＢＣＲＰを得た。
【００３１】
（３）ＢＣＲＰレトロウイルスの作成
最初に、マウスのａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅであるＰＡ３１７細胞にリン酸カルシウム法を用いてｐＨａＭｙｃＢＣＲＰを導入した。遺伝子導入後の細胞を１　ｎｇ／ｍｌのミトキサントロンで選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞の培養上清を集めて０．４５μｍのフィルターで濾過してレトロウイルス液とした。
【００３２】
（４）Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の作成
ＭｙｃＢＣＲＰレトロウイルス液をヒト白血病Ｋ５６２細胞の培養に加えて遺伝子導入を行った。レトロウイルスを添加した細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン：塩酸イリノテカンの活性代謝物）で選択し、遺伝子導入細胞を得た。この細胞をＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞と名付けた。Ｋ５６２細胞及びＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞は７％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞にＢＣＲＰ蛋白が発現していることは、抗ＢＣＲＰ抗体を用いたウエスタンブロットにて確認した。Ｋ５６２細胞はヒトの白血病細胞であるが、もともとＢＣＲＰを発現していないこと、培養が容易であること、ミトキサントロン、塩酸イリノテカンなどのＢＣＲＰによって輸送される抗癌剤に高い感受性を示すことから、ＢＣＲＰ遺伝子導入細胞の親株として適している。
【００３３】
実施例２（細胞増殖試験）
Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のＳＮ−３８（イリノテカンの活性代謝物）およびミトキサントロンに対する感受性を細胞増殖阻害試験にて調べた。両細胞を１２穴プレート（イワキ）に１万個／１ｍｌ／ウエルでまき、続いてメディウムで各濃度に希釈した薬剤をウエルあたり１ｍｌ加えた。このプレートを５％炭酸ガス培養器で３７℃、５日間培養した。５日後、９．５ｍｌのセルパック希釈液（東亞医用電子）を入れたビーカーに各ウエルの細胞液をそれぞれ加え、Ｓｙｓｍｅｘ　ＣＤＡ−５００自動細胞数計測装置（東亞医用電子）にて細胞数を計測した。
【００３４】
図１には、各濃度の薬剤添加時における細胞数を薬剤無添加の細胞数で除し
（（％）対コントロール）で表した。これより、各細胞に対するＩＣ５０を算出し、Ｋ５６２細胞のＩＣ５０とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のＩＣ５０より耐性の度合いを算出した（表２）。その結果、Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞はＳＮ−３８に２１倍の耐性を、ミトキサントロンに１１倍の耐性を示した。また、同様の実験を行った結果、トポテカンについては１０倍の耐性を示した。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
参考例１（Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の増殖に対するタモキシフェンの効果）
次に、ＢＣＲＰによる抗癌剤耐性に対するタモキシフェンの効果を調べた。Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の両細胞を１２穴プレート（イワキ）に１万個／１ｍｌ／ウエルでまき、続いてメディウムで各濃度に希釈したタモキシフェンをウエルあたり０．５ｍｌ加え、メディウムで各濃度に希釈したＳＮ−３８あるいはミトキサントロンをウエルあたり０．５ｍｌ加えた。このプレートを５％炭酸ガス培養器で３７℃、５日間培養した。５日後、９．５ｍｌのセルパック希釈液（東亞医用電子）をいれたビーカーに各ウエルの細胞液をそれぞれ加え、Ｓｙｓｍｅｘ　ＣＤＡ−５００自動細胞数計測装置（東亞医用電子）にて細胞数を計測した。
【００３７】
図２に、０．５μＭ、１μＭあるいは２μＭのタモキシフェンによるＢＣＲＰの抗癌剤耐性の克服を示す。タモキシフェンはＢＣＲＰを発現しないＫ５６２細胞のミトキサントロンに対する抗癌剤感受性を増大させた。Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の培養にタモキシフェンを加えると、ＳＮ−３８、ミトキサントロンに対する感受性はほとんど亢進しなかった。
【００３８】
参考例２（トレミフェン、タモキシフェンによるＢＣＲＰ発現細胞のトポテカン取り込み試験）
タモキシフェンおよびトレミフェンが抗癌剤の細胞への取り込みに影響を与えるかどうかを調べた。Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞を１００μＭのトレミフェン、タモキシフェンの存在下あるいは非存在下で２０μＭのトポテカンと３７℃、３０分間加温したのち、細胞外の薬剤を氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄除去した。細胞に取り込まれたトポテカンの蛍光を日本ベクトン社のＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒで測定した。その結果を図３に示す。トレミフェン、タモキシフェンはＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のトポテカンの細胞内取り込みには影響しなかった。よって、トレミフェン、タモキシフェンはＢＣＲＰによる抗癌剤の細胞外排出を阻害する作用は弱いと考えられた（図３）。
【００３９】
実施例３（式（１）の化合物によるＢＣＲＰ発現細胞のトポテカン取り込みの増大：その１）
式（１）の化合物が抗癌剤の細胞への取り込みに影響を与えるかどうかを調べた。Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞を３０μＭの式（１）の化合物の存在下あるいは非存在下で２０μＭのトポテカンと３７℃、３０分間加温したのち、細胞外の薬剤を氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄除去した。細胞に取り込まれたトポテカンの蛍光を日本ベクトン社のＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒで測定した。
【００４０】
その結果を図４に示す。式（１）の化合物はＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のトポテカンの細胞内取り込みを増加させた。特に、ＴＡＧ−８およびＴＡＧ−１１は特に強いＢＣＲＰ阻害作用を示した。
また、Ｋ５６２細胞におけるトポテカンの細胞内取り込みも同様に検証したが、式（１）の化合物はＫ５６２細胞においてトポテカンの細胞内取り込みには影響を与えなかった。
【００４１】
実施例４（Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の増殖に対する式（１）の化合物ＴＡＧ−１１の効果）
次に、ＢＣＲＰによる抗癌剤耐性に対するＴＡＧ−１１の効果を調べた。Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の両細胞を１２穴プレート（イワキ）に１万個／１ｍｌ／ウエルでまき、続いてメディウムで各濃度に希釈したＴＡＧ−１１をウエルあたり０．５ｍｌ加え、メディウムで各濃度に希釈したＳＮ−３８あるいはミトキサントロンをウエルあたり０．５ｍｌ加えた。このプレートを５％炭酸ガス培養器で３７℃、５日間培養した。５日後、９．５ｍｌのセルパック希釈液（東亞医用電子）をいれたビーカーに各ウエルの細胞液をそれぞれ加え、Ｓｙｓｍｅｘ　ＣＤＡ−５００自動細胞数計測装置（東亞医用電子）にて細胞数を計測した。
【００４２】
図５に、０．５μＭ、１μＭあるいは２μＭのＴＡＧ−１１によるＢＣＲＰの抗癌剤耐性の克服を示す。Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の培養にＴＡＧ１１−を加えると、ＳＮ−３８、ミトキサントロンに対する感受性がＴＡＧ−１１の濃度依存的に増大した。
【００４３】
実施例５（式（１）の化合物によるＢＣＲＰ発現細胞のトポテカン取り込みの増大：その２）
ＴＡＧ−１１がＢＣＲＰ阻害作用を示したことから、ＴＡＧ−１１の構造類似体を中心に、抗癌剤の細胞への取り込みに影響を与えるかどうかを再度調べた。Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞を３０μＭの式（１）の化合物の存在下あるいは非存在下で２０μＭのトポテカンと３７℃、３０分間加温したのち、細胞外の薬剤を氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄除去した。細胞に取り込まれたトポテカンの蛍光を日本ベクトン社のＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒで測定した。その結果を図６に示す。式（１）の化合物はＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞のトポテカンの細胞内取り込みを増加させた。なかでも、ＴＡＧ−５４、ＴＡＧ−７２、ＴＡＧ−１００、ＴＡＧ−１２６、ＴＡＧ−１３９は特に強いＢＣＲＰ阻害作用を示した。
【００４４】
実施例６（Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の増殖に対するＴＡＧ−１３９の効果）
次に、ＢＣＲＰによる抗癌剤耐性に対するＴＡＧ−１３９の効果を調べた。Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の両細胞を１２穴プレート（イワキ）に１万個／１ｍｌ／ウエルでまき、続いてメディウムで各濃度に希釈したＴＡＧ−１３９をウエルあたり０．５ｍｌ加え、メディウムで各濃度に希釈したＳＮ−３８あるいはミトキサントロンをウエルあたり０．５ｍｌ加えた。このプレートを５％炭酸ガス培養器で３７℃、５日間培養した。５日後、９．５ｍｌのセルパック希釈液（東亞医用電子）をいれたビーカーに各ウエルの細胞液をそれぞれ加え、Ｓｙｓｍｅｘ　ＣＤＡ−５００自動細胞数計測装置（東亞医用電子）にて細胞数を計測した。
【００４５】
図７に、０．５μＭ、１μＭあるいは２μＭのＴＡＧ１３９によるＢＣＲＰの抗癌剤耐性の克服を示す。ＴＡＧ−１３９はＢＣＲＰを発現しないＫ５６２細胞のミトキサントロンに対する抗癌剤感受性を増大させた。Ｋ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の培養にＴＡＧ−１３９を加えると、ＳＮ−３８、ミトキサントロンに対する感受性がＴＡＧ−１３９の濃度依存的に増大した。
【００４６】
以上より、式（１）の化合物は、ＢＣＲＰの発現により低下した抗癌剤の細胞内取り込みを上昇（回復）させることにより、ＢＣＲＰによる抗癌剤耐性を克服すること、その耐性克服作用は既知の耐性克服剤よりも強いものであることが判明した。
【００４７】
【発明の効果】
本発明の抗癌剤耐性克服剤によれば耐性発生により充分に薬効の発現できなかった抗癌剤の効果を良好に回復できることから、抗癌剤の投薬量の管理が容易となり、その結果、副作用を抑制した癌化学療法が可能となる。
【００４８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の各薬剤に対する感受性を示す図である。白四角はＫ５６２細胞、黒四角はＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞での結果を示す。
【図２】Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の増殖に対するタモキシフェンの効果を示す図である。
【図３】トレミフェン、タモキシフェンによるＢＣＲＰ発現細胞のトポテカン取り込み試験結果を示す図である（縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度を示し、太線はトポテカンを含んだ場合、点線はトポテカンを含まない場合を示す。ＢＣＲＰ阻害活性が強いと、蛍光強度のピークが右側へシフトする）。
【図４】式（１）の化合物によるＢＣＲＰ発現細胞のトポテカン取り込みの増大を示す図である。
【図５】Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の増殖に対するＴＡＧ−１１の効果を示す図である。白丸、白菱形、白三角及び白四角はＫ５６２細胞、黒丸、黒菱形、黒三角及び黒四角はＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞での結果を示す。
【図６】式（１）の化合物によるＢＣＲＰ発現細胞のトポテカン取り込みの増大を示す図である。
【図７】Ｋ５６２細胞とＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞の増殖に対するＴＡＧ−１３９の効果を示す図である。白丸、白菱形、白三角及び白四角はＫ５６２細胞、黒丸、黒菱形、黒三角及び黒四角はＫ５６２／ＭｙｃＢＣＲＰ細胞での結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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