(57)【要約】【課題】予め調製したものを随時使用でき、且つ抗体試験用反応容器の中に長期間保存可能な状態で封入できる血球試薬を提供することにより、簡便かつ容易に抗体試験を行うことを可能にする。【解決手段】血液中の血液型抗体を試験するための赤血球試薬であって、ゲル化剤を含む水性媒質中に赤血球を懸濁させ、冷蔵保存によりゲル化して固形を維持する一方、使用時の温度では液状に復帰することを特徴とする。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中の抗体を試験するための赤血球試薬であって、ゲル化剤を含む水性媒質中に赤血球を懸濁させ、冷蔵保存によりゲル化して固形を維持する一方、使用時の温度では液状に復帰する血球試薬。
【請求項２】
前記ゲル化剤がゼラチンである、請求項１に記載の赤血球試薬。
【請求項３】
前記ゼラチンの濃度が０．８〜１．５％である請求項２に記載の赤血球試薬。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のゲル化した赤血球試薬を収容してなる、血液中の抗体を試験するための反応容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト赤血球を試薬に用いた血液凝集反応により、血液中に存在する抗体を検出する技術の改良に関する。特に、保存性を改善したゲル化可能な血球試薬と、これを用いた血中抗体試験用の反応容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中には、自己と非自己を認識するために、自己以外の外来物質と反応してこれに結合する抗体が存在する。抗体試験とは、このような抗体の存在の有無、およびこれら抗体の反応性の強さを測定する試験であり、その例として、輸血試験として実施されている不規則性抗体試験、およびＡＢＯ式血液型試験の副試験が上げられる。これら輸血試験における抗体試験は何れもヒトの赤血球を試薬として用いるため、同様の問題を内包している。
【０００３】
ヒトの血液型は２０種類程度知られているが、輸血時にはＡＢＯ式血液型およびＲｈ式血液型のＤ因子の適合性のみをチェックすることが一般的であるため、それ以外のチェックされていない血液型抗原に対する抗体（不規則性抗体）が産生される場合が珍しくない。また、妊婦にも同様の不規則性抗体が産生されることが知られている。これら不規則性抗体の存在は輸血時に副作用を生じる一つの原因と考えられるため、輸血直前には不規則性抗体試験を行って、これら抗体の存在を確認することが一般的となっている。この不規則性抗体試験には、ヒトのＯ型赤血球を試薬として用いる必要があるが、ヒト赤血球試薬の使用期間は４週間程度と極めて短いため、試験時に、試験者が試薬用ヒトＯ型赤血球を洗浄および濃度調整を行って、Ｏ型血球試薬を調製することが多い。
【０００４】
一方、ＡＢＯ式血液型試験は、赤血球表面に存在するＡＢＯ式血液型抗原の存在と、これら抗原と反応する血液中の抗体の存在に基づき、下記の表１に従って判定される。
【０００５】
【表１】
2004170127.tif 000002
【０００６】
例えば、赤血球表面上にＡ抗原を有し且つ血液中に抗Ｂ抗体を持つ場合、血液型はＡ型と判定される。このように、ＡＢＯ式血液型の判定は、赤血球表面上のＡ抗原、Ｂ抗原の存在を確認する主試験と、血清中における抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体の存在を確認する副試験の両方の試験を行うことにより、初めてＡＢＯ式血液型を判定できることとなる。ＡＢＯ式血液型の不一致は死に至る重篤な副作用を生じることが多いため、ＡＢＯ式血液型の判定は、抗原試験である主試験および抗体試験である副試験を同時に行い、この二つの試験結果から総合的に判定することが法的にも求められている。
【０００７】
このうち、主試験で試薬に用いる「抗血清」は性状が比較的安定であるため、反応に使用する形態のまま長期間保存できるのに対して、副試験で用いる試薬であるＡ型およびＢ型の赤血球試薬は、不規則性抗体試験で用いるＯ型赤血球試薬と同様、その使用可能期間が４週間程度と極めて短い。従って、試験時にヒトＡ型赤血球およびＢ型赤血球を洗浄し、濃度調製を行って血球試薬を調製することが必要であった。このような事情から、主試験についての簡便な試験方法については種々の提案がなされているが、副試験、または主試験と副試験の両方を、試薬をその都度調整することなく同時に試験できる方法は提案されていない。
【０００８】
血液型検査を簡便に行うための従来技術としては、不活性粒子を応用して、凝集赤血球と非凝集赤血球とを簡便かつ容易に判別でき、しかも簡易に操作できるカード型の血液型試験用反応容器が提案されている（例えば、特許文献１参照）。この反応容器は、ＡＢＯ式血液型試験の主試験および副試験、並びに不規則性抗体試験の何れにも適用可能である。その場合、該容器内に予め「抗血清」を封入しておけば、試験時に被検体のみを注入することにより、ＡＢＯ式血液型試験の主試験を容易かつ簡便に実施できる。しかし、抗体試験であるＡＢＯ式血液型試験の副試験、および不規則性抗体試験を行うときは、やはり試験時にその都度「血球」試薬を調製しなければならず、その煩雑さは依然として解決されていない。
【０００９】
【特許文献１】
特公平８−７２１５
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その第一の課題は、「血球」試薬の保存性を改善することにより、予め調製しておいた血球試薬を随時使用できるようにすることである。また、本発明の第二の課題は、予め調製した「血球」試薬を長期間保存可能な状態で封入した抗体試験用反応容器を提供することにより、血清サンプルを反応容器に注入するだけで、簡便かつ容易に抗体試験を行うことを可能にすることである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、上記第一の課題は、血液中の抗体を試験するための血球試薬であって、ゲル化剤を含む水性媒質中に血球を懸濁させてなり、冷蔵保存中はゲル化して固形を維持する一方、使用時の温度では液状に復帰する血球試薬によって達成される。
【００１２】
また、上記第二の課題は、血液中の血液型抗体を試験するための反応容器であって、上記のゲル化させた赤血球試薬を収容してなる反応容器によって達成される。
【００１３】
【実施の形態】
本発明による赤血球試薬は、ヒドロゲルの中に赤血球を封入し、固形化した状態で冷蔵保存することを特徴とするものである。このようにゲル化した状態で冷蔵保存した赤血球試薬は、固形であるため取扱いが容易であり、後述するような極めて有利な態様で使用することができる。また、ゲル化させて冷蔵保存した本発明の赤血球試薬は、血液型抗原が変性することなく安定して保存が可能であるため、予め調製および保存してある赤血球試薬を使用して血液型抗体試験を行うことができる。
【００１４】
本発明において使用するゲル化剤としては、ゼラチン、寒天等の多糖類、ポリビニルアルコール等の高分子物質等が上げられるが、好ましくはゼラチンである。ゲル化剤の濃度は、本発明の赤血球試薬を保存する冷蔵温度においてゲル化した固形の状態を維持すると共に、使用時の血液型抗体試験の温度では液状に復帰するような濃度である。このような濃度は、保存温度、使用時の温度、およびゲル化剤の種類によって多少異なるので、一義的に規定することは困難である。しかし、例えばゼラチンの場合には０．８％〜１．５重量％が好ましい。
【００１５】
また、本発明の赤血球試薬を保存するための冷蔵温度は、２℃〜８℃が好ましく、試験時の使用温度は室温（略２０℃）である。保存時に水分が凍結すると、赤血球の血液型抗原が変性する惧れがあるので、凍結しないように注意を要する。
【００１６】
本発明におけるゲルの分散媒である水性媒質としては、精製水を用いることができ、必要に応じて種々の添加剤を加えることができる。このような添加剤の例としては、塩化ナトリウム等の電解質、クエン酸三ナトリウム二水和物等のキレート化剤、グルコース等の糖類、アデニンおよびイノシン等のヌクレオシド、カナマイシン等の抗生物質、その他が上げられる。
【００１７】
本発明の赤血球試薬を製造するためには、先ず、ヒトから採決した血液から遠心分離等により血球を分離し、洗浄して分離された赤血球を得る。この分離された赤血球を、必要に応じてグルタルアルデヒド等による溶血防止のための表面処理を施した後、ゼラチン溶液中に懸濁浮遊させる。この赤血球を含むゼラチン溶液は、適切な冷蔵温度で保存することによりゲル化して固形化する。
【００１８】
上記のようにして得られた本発明の赤血球試薬は、ゲル化させた状態で少なくとも６ヶ月間は安定に保存でき、抗体試験に使用できる特性を維持することが分かった。従って、血液型抗体試験を行うための反応容器内に予め収容した形態で保存しておけば、試験時に、これを室温に戻して赤血球試薬を液状とし、血清サンプルおよび必要な緩衝液等を注入するだけで、目的の凝集試験を行うことができる。なお、本発明の赤血球試薬の特性が安定に維持される一つの理由は、赤血球表面に存在する抗原分子がゲルマトリックスの中に埋設されることにより、該抗原分子の立体コンホメーションが安定に保持されることによると思われる。
【００１９】
加えて、本発明の赤血球試薬は反応容器の内壁に付着させたまま容易に固化させることができるので、更なる特有の効果を得ることができる。例えば、反応容器の底部には抗体試験に必要な緩衝液を充填しておき、緩衝液が満たされていない反応容器の上方部分の側壁に、本発明の赤血球試薬を付着固化させた状態で冷蔵保存することができる。こうして、使用前には緩衝液および赤血球試薬を相互に分離して冷蔵保存できると共に、使用時に反応容器を使用時に室温に戻すと、ゲル化していた赤血球試薬が液化し、緩衝液中に落下して混合されるので、血清サンプルを添加するだけで所期の抗体試験を実施することができる。なお、このような反応容器としては、先に述べた特公平８−７２１５（特許文献１）に記載されているカード型の血液型試験用反応容器が好ましい。
【００２０】
上記のように、本発明による赤血球試薬を、ＡＢＯ式血液型試験用等の血球凝集反応を利用する抗体試験用反応容器に応用することにより、試薬調製や試薬分注といった操作が不必要になるため、それらの操作に必要な器具・容液類が不要にすることができる。しかも、従来血球試薬調製に必要であった習熟した技術者が不要となるため、経験の浅い技術者でも短時間で、精度の高いＡＢＯ式血液型試験および不規則性抗体試験を実施することができる。
【００２１】
【実施例】
以下、実験例に従って、本発明による赤血球試薬の製造例および使用例を更に詳細に説明する。
【００２２】
実験例１：ヒト血球試薬の単離
常法に従って健康人より採血を行うが、ヒトの血液は採血しただけでは血球が凝固してしまうため、それを防止するために抗凝固剤を使用する。具体的にはＡＣＤ−Ａ液を３ｍＬ入れた試験管に、採血直後のヒト血液２０ｍＬを加えて充分混和することで凝固を防止する。抗凝固剤として、ここではＡＣＤ−Ａ液を使用したが、古くから知られているヘパリン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、クエン酸、ＣＰＤ溶液等も用いることができる。なお、ＡＣＤ−Ａ液の調製法は下記に示す通りである。
【００２３】
＜ＡＣＤ−Ａ液の調製方法＞
クエン酸ナトリウム二水和物２２．０ｇ、クエン酸８．０ｇ、グルコース２７．０ｇを精製水１０００ｍＬで熔解し、これをＡＣＤ−Ａ液として使用した。
【００２４】
次に、上記ＡＣＤ−Ａ液３ｍＬを含むヒト血液２０ｍＬを、室温に数分間放置した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。この遠心分離の後、血球だけを残すように、駒込ピペットにて上清を静かに吸引除去した。その後、５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）を約１０ｍＬ加え、転倒混和した後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、前回と同様に上澄みを除去する。この操作を３回実施し、洗浄ヒト赤血球を作成した。
【００２５】
実験例２：血球の表面処理方法
例１で得られた洗浄ヒト赤血球のままでも、血球試薬として以降の操作に使用することができる。しかし、更に保存性を高めるために、血球の表面処理を施したものを使用することもできる。下記に表面処理の一例を示す。
【００２６】
洗浄したヒト赤血球の沈渣２ｍＬを５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）６ｍＬに加え、２５％ヒト赤血球浮遊液を調製する。この２５％ヒト赤血球浮遊液５ｍＬに、１０ｍＭグルダールアルデヒド溶液５ｍＬを静かに添加した後、２０℃〜２５℃で１分間攪拌する。その後直ちに、５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）を約４０ｍＬ加えた後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行って上清を除去する。この洗浄操作を３回実施し、得られた血球を表面処理済み赤血球として用いた。
【００２７】
実験例３：ゲル化赤血球試薬の調製
表面処理済み血球を、ゼラチン溶液等の固化剤溶液に浮遊させ、必要な処置を行って固化状態の血球を作成する。ここでは、固化剤としてゼラチンを使用しているが、ゼラチン以外の寒天やポリビニルアルコール等の高分子物質を固化剤として使用することもできる。
【００２８】
本発明を、特公平８−７２１５でイヴ・ラピエールらが提案しているカード型反応容器に適用するために、使用時に０．８％の血球浮遊液になるように、上記の例で得られた赤血球のゼラチン懸濁液を調製する。すなわち、表面処理済みの血球８０μＬをゼラチン保存液１０ｍＬに添加した後、緩やかに混和する。この０．８％血球含有ゼラチン溶液５０μＬを、上記のカード型反応容器に加え、異物混入や蒸発を防止する目的でその容器を密封する。その密封したカード型反応容器を直ちに冷蔵庫保存することにより、０．８％血球含有ゼラチン溶液を固化状態とする。
【００２９】
この固化状態の血球は、冷蔵保存することで数ヶ月単位で安定である。また、この固化状態血球は室温に戻すだけで液状になるため、使用する前には冷蔵庫より取り出す以外の操作は不要である。
【００３０】
実験例４：ゼラチン保存液の調製方法
実験例３で使用したゼラチン保存液の調製法は次の通りである。
【００３１】
ゼラチン１０ｇおよび精製水２００ｍＬをビーカーに入れ、約４０℃の温浴中で静かに攪拌しながら、ゼラチンを溶解する。
【００３２】
これとは別に、塩化ナトリウム４．２ｇ、クエン酸ナトリウム二水和物８ｇ、グルコース１８．７ｇを６００ｍＬの精製水で溶解する。得られた水溶液中に、アデニン塩酸塩０．７ｇ、イノシン２．７ｇを添加し、更に、必要に応じてカナマイシン硫酸塩０．３ｇ、クロラムフェニコール０．５ｇ、ゲンタマイシン硫酸塩０．２ｇ、フラジオマイシン硫酸塩０．３ｇを加え、充分溶解させて、添加物水溶液を得る。
【００３３】
その後、予め加温調製しておいたゼラチン溶液を上記添加物水溶液中に静かに注ぎ、泡立ちを最小限にするよう静かに攪拌する。溶液の液温が室温に戻ったことを確認した後、精製水を加えて総量を１０００ｍＬとする。その後、０．２μｍのフィルターを通し不要物を除いたものをゼラチン保存液とした。
【００３４】
実験例５：ゲル状血球試薬の反応性
従来の方法で調製した血球試薬と、ゼラチンで固化状態にした血球試薬とを用いて擬集反応の反応性を検討した。
【００３５】
例１で得た洗浄済みのＢ型ヒト血球を５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に懸濁させて、０．８％血球浮遊液とした従来血球試薬と、例３で得た血球試薬と、例２で得た表面処理血球をゼラチン保存液でゲル化したゲル化表面処理血球試薬の３種類の血球を用いて、血清サンプルの凝集試験を行った。
【００３６】
先ず、特公平８−７２１５で提案されているカード型反応容器の所定のチューブ５０μＬに、上記の赤血球試薬を注入した。この反応容器に、５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）で所定倍率に希釈した抗Ｂ血清５０μＬを注入し、所定の操作法に従って試験を行った。その結果、下記の表２に示したように、従来血球試薬に比べて、ゼラチンで固化状態とした血球試薬では反応性が増強することが確認された。更に、表面処理を行った後に固化状態とした血球試薬では、２５６倍希釈の抗Ｂ血清についても＋４という強い凝集反応を示し、更に２０４８倍という高倍率に希釈された抗Ｂ血清でも、＋１の凝集反応を示すことが確認された。なお、ここには示していないが、サンプル中に反応すべき抗体がない場合、使用したゲル化血球試薬が鮮明な陰性反応を示すことは確認済みである。
【００３７】
【表２】
2004170127.tif 000003
【００３８】
実験例６：ＡＢＯ式血液型試験
次に、本発明による赤血球試薬をＡＢＯ式血液型試験に応用した例を示す。
【００３９】
特公平８−７２１５で提案されているカード型反応容器の別々のチューブに、予め抗Ａ血清および抗Ｂ血清を封入することにより、それぞれＡＢＯ式血液型試験の主試験用チューブとして構成されたカード型反応容器を用いた。一方、実験例３で調製したＡ型およびＢ型血球試薬５０μＬずつを用いて、ＡＢＯ式血液型試験の副試験用チューブを作製した。即ち、反応用バッファー液のみが予め注入されている特公平８−７２１５のカード型反応容器のチューブ内壁に、実施例３で調製したゲル状のＡ型赤血球試薬またはＢ型赤血球試薬を、上記のバッファー液に接触しないようにその液面面よりも上方に離間した位置に付着、固化させることで副試験用チューブを作製した。各々のチューブを密封し、冷蔵保存することでＡＢＯ式血液型の副試験用カード型反応容器を準備した。
【００４０】
上記で準備したＡＢＯ式血液型試験用のカード型反応容器を冷蔵庫より取り出し、全体を室温に戻した後、この容器の二つの主試験用チューブ各々に被検検体血球の５％血球浮遊液１０μＬずつを滴下した。一方、二つの副試験用チューブには、被検検体の血清５０μＬずつを滴下し、所定の操作法に従って試験を行った。その結果、下記に示したように、Ａ型血液およびＢ型血液の何れについても期待どおりの判定結果が得られることが確認された。
【００４１】
【表３】
2004170127.tif 000004
【００４２】
例６：ゼラチン濃度設定について
上記の実験例では１．０％濃度のゼラチン溶液を保存液として使用したが、適切なゼラチン濃度を設定するための検討を行った。
【００４３】
ゼラチン濃度の異なるゼラチン保存液を作製し、その冷蔵状態での固化状態について検討を行った。その結果、下表に示すように、ゼラチン溶液は０．５％以上の濃度であれば固化状態とすることができるが、好ましくは０．８％以上の濃度である。但し、表には示していないが２．０％以上では冷蔵庫から室温に戻した際に血球浮遊液状態となるのに時間を要するため、ゼラチンは０．８％〜１．５％の範囲の濃度で使用するのが現実的であった。
【００４４】
【表４】
2004170127.tif 000005
【００４５】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明の赤血球試薬を抗体試験用の反応容器に応用することにより、赤血球試薬の調製や試薬分注といった操作が不必要になるばかりでなく、経験の浅い技術者でも短時間で精度の高いＡＢＯ式血液型試験や不規則性抗体試験を実施することができる。
【００４６】
また、多施設および長期間に亘って同一の試薬を用いて試験ができるため、今まで使用試薬の統一化が困難なために標準化が遅れていた抗体試験分野において、試験の標準化にも貢献するものである。