(57)【要約】【課題】Ｃａ２＋結合型の組換えミオシンを提供する。【解決手段】Ｃａ２＋結合型ミオシンの重鎖、Ｃａ２＋結合軽鎖、およびリン酸化軽鎖のそれぞれをコードするポリヌクレオチドの発現産物であって、野性型のＣａ２＋結合型ミオシンと実質的に同一の機能を有することを特徴とする。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃａ２＋結合型ミオシンの重鎖、Ｃａ２＋結合軽鎖、およびリン酸化軽鎖のそれぞれをコードするポリヌクレオチドの発現産物であって、野性型のＣａ２＋結合型ミオシンと実質的に同一の機能を有することを特徴とする組換えミオシン。
【請求項２】
ミオシン重鎖、Ｃａ２＋結合軽鎖および／またはリン酸化軽鎖のアミノ酸配列における１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換、１以上のアミノ酸残基が欠失、または１以上のアミノ酸残基が付加している請求項１の組換えミオシン。
【請求項３】
各々のポリヌクレオチドが、真性粘菌フィザルム由来である請求項１または２の組換えミオシン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、Ｃａ２＋結合型の組換えミオシンに関するものである。さらに詳しくは、この出願は、マイクロマシンにおけるアクチュエーターや、微少電子回路におけるスイッチ素子等としての有用性が期待されるＣａ２＋結合型組換えミオシンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年のナノテクノロジーの発展に伴って、分子サイズの大きさで機械的な動きをするマイクロマシンの開発が注目されている。このマイクロマシンの作成には、個々の要素デバイスや、それらの組立方法（マイクロマシニング）に至るまで、様々な技術開発が必要とされている。特に、マイクロマシン駆動部であるマイクロアクチュエーターの開発は、マシンの自律運動等にとって不可欠であり、様々な微細加工技術を利用したモーターデバイスの開発が進められている。しかしながら微細加工技術を応用した方法で作成できるマイクロアクチュエーターは、小さいものでも１００μｍ程度であり、ナノスケールのマイクロマシンに装備するには、その更なる微少化が求められている。
【０００３】
そこで、微細加工技術によってモーター装置を構築するのではなく、運動能を有する単一分子をモーターとして利用することが提案されている。
【０００４】
一般に、モーターとして利用できる分子は、外部エネルギーを運動に変換する動力機構があること、および１方向の運動を実現できることの２点を満たすことが求められている。そして、このような条件を満たす低分子有機化合物としては、（３Ｒ，３’Ｒ）−（Ｐ，Ｐ）−ｔｒａｎｓ−１，１’，２，２’，３，３’，４，４’−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−３，３’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４，４’−ｂｉｐｈｅａｎｔｈｒｙｄｉｅｎｅ（Ｎａｔｕｒｅ　４０１：１５２−１５５，　１９９９）やＴｒｉｐｔｙｃｙｌ（４）ｈｅｌｉｃｅｎｅ（Ｎａｔｕｒｅ　４０１：１５０−１５２，　１９９９）が知られている。しかしながら、これらの有機化合物は、速度が極めて低速であったり、駆動力が極力であったり、繰り返し回転ができないなどといった、マイクロマシンにおけるアクチュエーターとしての致命的な欠陥を有しており、実用化の目途は立っていないのが現状である。
【０００５】
一方、前記のような有機化合物とは別の単一分子モーターとしては、鞭毛モーター（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６：１−１８，　１９６７；　Ｎａｔｕｒｅ　２４５：３８０−３８２，　１９７３）、ＡＴＰ合成酵素（Ｎａｔｕｒｅ　３８６：２９９−３０２，　１９９７）、ミオシンモーター（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ．　１９９：１０５７−１０６３，　１９９４；　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　７：　８９−９３，　１９９５）、微小管系モーター（Ｃｅｌｌ　４２：３９−５０，　１９８５）、核酸合成酵素の運動タンパク質（Ｎａｔｕｒｅ　４０９：　１１３−１１９，　２００１）等の生体分子が知られている。
【０００６】
これらの生体分子も、もちろんマイクロマシンのアクチュエーター等に利用するためには、様々な技術開発を必要とするが、その安定的な駆動力等によって、将来のマイクロマシンにおける極めて有力なデバイスとなり得るものと期待されている。また、これらの生体分子は、電子回路のスイッチ素子等としても利用可能であることが提案されている。
【０００７】
これらの生体分子モーターの候補のうち、ミオシン（ｍｙｏｓｉｎ）は分子量約４８０ｋＤａの筋タンパク質であり、分子量約２２０ｋＤａのミオシン重鎖２本と、それぞれ２本ずつの２種のミオシン軽鎖で構成されている。ミオシン重鎖のＮ末端側はヘビーメロミオシン（ＨＭＭ）と呼ばれる機能的部位であり、ＡＴＰの分解によりアクチンとの間に「力」を発生するモータータンパク質として機能する。
【０００８】
ミオシンの制御には、（ａ）骨格筋ミオシンのように外部制御を受けないタイプと、（ｂ）平滑筋や細胞性粘菌Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍミオシンのようにリン酸化によって制御を受けるタイプ、そして（ｃ）真性粘菌Ｐｈｙｓａｒｕｍ（フィザルム）やホタテガイ（ｓｃａｌｌｏｐ）のミオシンのようにカルシウム（Ｃａ２＋）を結合することによって制御を受けるタイプが存在する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、マイクロマシンのアクチュエーター（分子モーター）や電子回路のスイッチ素子としての生体分子の有用性が指摘されている。そしてそれぞれの生体分子は、個々の特性（回転、駆動メカニズムの違い等）によって、様々な適用や組み合わせが可能である。
【００１０】
一方、これらの生体分子をアクチュエーターやスイッチ素子等の機械的構成要素として使用するためには、他のデバイスとの機械的、電気的結合を可能とするような様々な改変（各種の修飾）が必要である。そして、そのような改変を確実に行うための最も有効な手段は、遺伝子工学的に生体分子を改変することである。
【００１１】
この点について、ミオシンの場合には、前記のタイプ（ａ）および（ｂ）については組換えミオシンの作成が報告されている（例えば、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ９２：７０４−７０８，　１９９５；　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：６５６−６５８，　１９８９）。しかしながら、タイプ（ｃ）のＣａ２＋結合型ミオシンについては、組換え体の作成は成功していない。
【００１２】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、Ｃａ２＋結合型の組換えミオシンを提供することを課題としている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、Ｃａ２＋結合型ミオシンの重鎖、Ｃａ２＋結合軽鎖、およびリン酸化軽鎖のそれぞれをコードするポリヌクレオチドの発現産物であって、野性型のＣａ２＋結合型ミオシンと実質的に同一の機能を有することを特徴とする組換えミオシンを提供する。
【００１４】
この発明における別の態様は、ミオシン重鎖、Ｃａ２＋結合軽鎖および／またはリン酸化軽鎖のアミノ酸配列における１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換、１以上のアミノ酸残基が欠失、または１以上のアミノ酸残基が付加している組換えミオシンである。
【００１５】
また、この発明の組換えミオシンにおいては、各々のポリヌクレオチドが、真性粘菌フィザルム由来であることを好ましい態様としている。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この発明の組換えミオシンは、Ｃａ２＋結合型ミオシンの重鎖（約２２０ｋＤａ）、Ｃａ２＋結合軽鎖（約１６ｋＤａ）、およびリン酸化軽鎖（約１８ｋＤａ）のそれぞれをコードするポリヌクレオチドの発現産物である。
【００１７】
「Ｃａ２＋結合型ミオシン」とは、Ｃａ２＋を結合することによって制御を受けるミオシンであり、具体的には、例えば真性粘菌Ｐｈｙｓａｒｕｍ（フィザルム）やホタテガイ（ｓｃａｌｌｏｐ）のミオシンである。また、「野性型のＣａ２＋結合型ミオシンと実質的に同一の機能を有する」とは、具体的には、ミオシンがＡＴＰを分解し、アクチンと結合して機械的エネルギーを発生することにＣａ２＋が変化を与えることを意味する。ただし、フィザルム由来の組換えミオシンは、Ｃａ２＋結合によってＡＴＰ分解および機械的エネルギーの発生を低下し、ホタテガイ由来の組換えミオシンはＣａ２＋結合によってＡＴＰ分解および機械的エネルギーの発生を増加せせることを意味する。
【００１８】
この発明の組換えミオシンは、前記のポリヌクレオチドをｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系または適当な宿主―ベクター系において発現させることによって作成することができる。
【００１９】
例えば、ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）は公知の塩基配列情報（例えば、フィザルムのミオシン重鎖：ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　ＡＦ３３５５００、Ｃａ２＋結合軽鎖：ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　Ｊ０３４９９、リン酸化軽鎖：ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　ＡＢ０７６７０５；ホタテガイのミオシン重鎖：ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　Ｘ５５７１４、軽鎖：ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　Ｍ１７２０８，　Ｍ１７２０１）に基づき合成したオリゴヌクレオチドを用いてそれぞれのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。また公知の塩基配列情報に基づいて作成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法によっても、目的とするポリヌクレオチドを取得することができる。
【００２０】
得られたポリヌクレオチドは、それぞれ別個に発現ベクターにクローニングし、それらを共発現させることによって、この発明の組換えミオシンを作成することができる。あるいは、それぞれのポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドとして発現ベクターにクローニングしてもよい。ただし、その場合には、重鎖、Ｃａ２＋結合軽鎖およびリン酸化軽鎖がそれぞれ成熟タンパク質として発現するように、各ポリヌクレオチドの３’端には停止コドンを設けるようにする。また、各ポリヌクレオチドの５’端にはそれぞれの発現制御配列（プロモーター／エンハンサー）を備えるようにしてもよい。
【００２１】
この発明の組換えミオシンをｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系で発現させる場合には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターにポリヌクレオチドを組換え、この組換えベクターをプロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系に添加する。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７　１８、ｐＴ７／３　１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩなどが例示できる。
【００２２】
また、ポリヌクレオチドを適当な宿主−ベクター系において発現させれば、組換えミオシンを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等の真核細胞などで生産することができる。例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターにポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的の組換えミオシンを大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。さらに、組換えミオシンを真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドをプロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、このベクターをトランスフェクトした真核細胞から目的の組換えミオシンを得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。また、バキュロウイルス科に属する核多角体病ウイルスのゲノムＤＮＡとともに前記の発現ベクターを昆虫細胞にトランスフェクションすれば、昆虫細胞から目的の組換えミオシンを得ることができる。昆虫細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５などを使用することができる。
【００２３】
発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させたポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２４】
この発明の別の態様は、ミオシン重鎖、Ｃａ２＋結合軽鎖および／またはリン酸化軽鎖のアミノ酸配列における１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換、１以上のアミノ酸残基が欠失、または１以上のアミノ酸残基が付加している改変型の組換えミオシンである。
【００２５】
この場合の「改変型」とは、前記のアミノ酸配列の変異によって、組換えミオシンの活性（例えば、Ｃａ２＋結合能、ＡＴＰ分解能、機械的エネルギー発生能など）が増加または低下することを意味する。あるいはまた、他の分子や化合物等との結合性を増加または低下させるようなアミン酸変異を意味する。
【００２６】
このようなアミン酸変異は、公知の方法により前記のポリヌクレオチドに変異を導入し、その変異ポリヌクレオチドを前記と同様に発現させることによって行うことができる。例えば、任意のアミノ酸コドンを他のアミノ酸残コドンに置換したポリヌクレオチドを作成する場合には、公知のＫｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，　Ｔ．　Ａ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：４８８，　１９８５およびＫｕｎｋｅｌ，　Ｔ．　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５４：３６７，　１９８７）を採用することができる。すなわち、ｄｕｔ−、ｕｎｇ−の遺伝型で示される大腸菌（ＢＷ３１３、ＣＪ２３６等）は、ｄＵＴＰａｓｅ（Ｄｕｔ）とＵｒａｃｉｌ−ＤＮＡ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（Ｕｎｇ）を欠損しているため、ＤＮＡ中のチアミン（Ｔ）の一部がデオキシウラシル（ｄＵ）に置き換わったＤＮＡを合成する。この大腸菌を宿主菌として、変異導入の目標となるポリヌクレオチドに対して、目的残基を他のアミノ酸残基で置換するように設計したオリゴヌクレオチドを試験管内でハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼ反応とＤＮＡリガーゼ反応により相補ＤＮＡ鎖を合成する。このＤＮＡをｕｎｇ＋の大腸菌株（ＤＨ５α等）に導入すると、もとのｄＵの含まれているＤＮＡ鎖はＵｎｇによって分解を受けるが、試験管内で合成された相補ＤＮＡ鎖は分解されずに複製される。このようにして変異を導入した側のＤＮＡ鎖が選択的に増幅され、目的変異を含むミオシンをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。また、変異ポリヌクレオチドは、ミューテーション・キット等を使用する方法や、変異導入型のＰＣＲ法、あるいは公知のポリヌクレオチド合成法（例えば、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ．　２５：３４４０−３４４４，　１９９７等）によっても得ることができる。
【００２７】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２８】
【実施例】
（１）材料と方法
（１−１）化学物質
制限酵素およびその他酵素類は、宝酒造株式会社（京都）のものを使用した。その他の試薬類は全て、市販の特級試薬を用いた。水溶液作成時には、ミリＱ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いた。
（１−２）バキュロウイルス導入ベクターの構築
フィザルム由来ミオシン重鎖のサブフラグメント−１重鎖（Ｓ１−ＨＣ；Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ８４１）をコードするｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法（ＫＯＤ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；東洋紡株式会社、東京）により合成した。ＰＣＲプライマーは、既知の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．　ＡＦ３３５５００）を基に設計した以下を使用した。
【００２９】
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＣＡＡＣ−３’（配列番号１）
５’−ＡＴＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＧＧＡＣＧＣＧ−３’（配列番号２）
ＰＣＲ条件は、変性（９４℃１分）、アニーリング（５５℃１分）、伸長（７２℃３分）を１サイクルとし、３５サイクルを行った。
【００３０】
また、組換えミオシンを発現させるために、ヘキサＨｉｓ−タグの配列をＣ末端にＰＣＲによって付した。Ｓ１−ＨＣの終末端の以下のプライマー：
５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣ−３’（配列番号３）
には、ヘキサＨｉｓタグ配列、停止コドンおよびＳａｌＩ制限サイトを含ませた。
ネストＰＣＲは以下のプライマーを用いて行った。
【００３１】
５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＣＡＡＣ−３’（配列番号４）
以上のより得られたＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩサイトにクローニングし、ＤＮＡ配列を確認した。得られたこのプラスミドをｐＢＢ／Ｓ１とした。
【００３２】
ミオシン重鎖のヘビーメロミオシン（ＨＭＭ）重鎖（Ｍｅｔ１−Ｌｙｓ１１８１）の導入ベクターも上記と同様な方法で構築した。ミオシン重鎖の一部分であるコイルドコイル構造領域をＰＣＲにてＳ１−ＨＣのＣ末端に付与した。ＳｍａＩ制限サイト（ミオシン重鎖の２０４４ｂｐ）を有するプライマー：
５’−ＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧ−３’（配列番号５）と、
終末端にＨＭＭ断片（Ｌｙｓ１１８１）を含んだプライマー：
５’−ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＧ−３’（配列番号６）
を用いた。ヘキサＨｉｓタグ配列を付与するには、プライマー：
５’−ＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＴＧ−３’（配列番号７）と、
ヘキサＨｉｓタグ配列、停止コドン、ＳａｌＩ制限サイトを含んだプライマー：
５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＣ−３’（配列番号８）
を用いて、ネストＰＣＲを行った。
【００３３】
得られたＰＣＲ産物は、ｐＢＢ／Ｓ１プラスミドのＳｍａＩ／ＳａｌＩにクローニングし、プラスミドをｐＢＢ／ＨＭＭを構築した。
【００３４】
さらに、既知の配列情報に基づいて設計したプライマーを用い、Ｃａ２＋結合軽鎖（ＣａＬＣ）とリン酸化軽鎖（ＰＬＣ）のそれぞれをコードするポリヌクレオチドの導入ベクターを構築した。なお、ＰＬＣおよびＣａＬＣの５’端にはＢａｍＨＩまたはＫｐｎＩ制限酵素サイトをに付与した。また、ＰＬＣおよびＣａＬＣの３’端にはＫｐｎＩまたはＥｃｏＲＩサイトを付与した。得られたＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ａ　のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩおよびＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ制限サイトに各々サブクローニングし、プラスミドｐＢＢ／ＰＬＣおよびｐＢＢ／ＣａＬＣを構築した。
（１−３）組換えウイルスの感染および選択
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ−９）細胞を７５ｃｍ２のフラスコで、２７℃で培養した。培養液（ＴＮＭ−ＦＨ）は、Ｇｒａｃｅ’ｓ昆虫細胞培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）および１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＵＳＡ）を加えた。Ｓｆ−９細胞に、核多角病ウイルスＡｕｔｏ−ｇｒａｐｈｉｃａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの直鎖状ＤＮＡ（Ｂａｃ−Ｍ−ＢｌｕｅＴＭ　ＤＮＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）と、導入ベクターｐＢＢ／Ｓ１、ｐＢＢ／ＨＭＭ、ｐＢＢ／ＰＬＣおよびｐＢＢ／ＣａＬＣのいずれか一つとを感染導入した。感染導入の効率を高めるため、ＩｎｓｅｃｔｉｎＰｌｕｓＴＭリポソーム試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。７日後、Ｘ−ｇａｌ含有プレート上でプラークアッセイを行い、組換えバキュロウイルスを単離した。青いプラークを拾い上げ、Ｓｆ−９細胞（２５ｃｍ２の培養容器）に感染させ、組換えバキュロウイルスを増幅させた。４日後、上清中にある組換えバキュロウイルスを前記の７５ｃｍ２フラスコで１１日間培養したＳｆ−９細胞に感染させ、高いウイルス力価を有するストックを調製した。組換えバキュロウイルスに組込んだ各種の導入ｃＤＮＡは、ＰＣＲにて確認し、続いて塩基配列解析機においても確認した。得られたこの組換えバキュロウイルスを、再び上記の方法によって増殖させた。
（１−４）組換えＳ１およびＨＭＭの精製
７２ｃｍ２の培養容器（１０個）のそれぞれに、１×１０７個のＳｆ−９細胞を播種した。Ｓｆ−９細胞に、Ｓ１−重鎖またはＨＭＭ−重鎖、リン酸化軽鎖およびＣａ２＋結合軽鎖をそれぞれコードするポリヌクレオチドを導入したバキュロウイルスを各々個別に共感染させた。いずれの場合においても、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）は５であった。感染させたＳｆ−９細胞は、２７℃で３日間成長させた後、４℃で１０分、１５００ｒｐｍの速度で遠心し、細胞を回収した。回収した細胞はペレット状のため、７ｍｌホモゲナイズ緩衝液［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、５ｍＭ　２−メルカプトエタノール、タンパク質分解酵素阻害因子１ｍＭ　ｐ−ＡＢＳＦ（和光純薬化学工業株式会社）、１０μｇ／ｍｌロイペプチンおよびＨｉｓタグタンパク質分解酵素阻害因子混合液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＵＳＡ）］で懸濁し、均質化した。均質化の後、内在性アクチンから組換えミオシンを放出するため０．２Ｍ　ＮａＣｌと１ｍＭ　ＡＴＰに合わせて調節し、細胞の破片や破砕されていない細胞を取り除くたに１５０００×ｇで１５分、遠心分離を行った。上清を０．２ｍｇ／ｍｌウサギ骨格筋アクチン（ウサギ骨格筋アセトン粉から精製）と混合し、緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ｐ−ＡＢＳＦおよび１μｇ／ｍｌロイペプチン）で、２４時間透析を行った。アクチン組換えＨＭＭは透析中に形成され沈殿し、１０００００×ｇで１時間、遠心分離を行い回収した。沈殿物より分離されたＳ１／ＨＭＭの沈殿物を、緩衝液［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、７ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１００μＭ　ｐ−ＡＢＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１ｍＭ　ＡＴＰ］を用いてホゲナイズし、１０００００×ｇで９０分間遠心分離を行い、得られた上清をＮｉ−ＮＴＡスパーフロー（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）カラムに添加した。このカラム内でＨｉｓタグ融合組換えＳ１またはＨＭＭをトラップし、抽出液［２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、４０ｍＭ　ＫＣｌ、７ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１μｇ／ｍｌロイペプチンおよび１００ｍＭ　イミダゾール］で抽出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、組換えＳ１／ＨＭＭを含む泳動バンド部分を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）を用いて蓄積および濃縮した。次いで、組換えミオシンを緩衝液［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、４０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ　ＤＴＴ、２０μＭ　ｐ−ＡＢＳＦおよび０．６μｇ／ｍｌロイペプチン］で透析した。タンパク質の精製は４℃以下の温度条件で行った。典型的な組換えＳ１／ＨＭＭを０．１ｍｇを採取し、ＢＳＡを標準値として用いてＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質測定液で定量した結果、１×１０８個のＳｆ−９細胞が得られた。
（１−５）ゲル電気泳動
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、文献（Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　６４：１４７−１５５，　１９７２）の記載に従い、文献（Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５，　１９７０）記載の緩衝液システムを用いて調製した１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。ＳＤＳ−サンプル緩衝液は、４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　６．８）、５０ｍＭ　ＤＴＴ、１％　ＳＤＳ、７．５％グリセロール、０．００２％　ブロモフェノールブルーにて構成した。
（１−６）電子顕微鏡による観察
精製したＨＭＭ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を雲母シートに載置し、これを３０％グリセロール含有０．１Ｍ酢酸アンモニウムで３回洗浄し、２％酢酸ウラニル水溶液で染色し、３回洗浄した。この雲母シートに別の分割した雲母シートを被覆し、押し付け、剥離して、ＢＡＦ　０６０ロータリー影像システムにおいて低角度でプラチナにロータリー複製し、この複製した試料を試料台固定し、ＪＥＭ−１０１０電子顕微鏡で観察した。
（１−７）ＡＴＰａｓｅ活性による解析
Ｓ１／ＨＭＭにおけるＡＴＰａｓｅ活性測定は、文献（Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２９３：２１２−２１５，　２００１）の記載に従って行った。全ての解析は、２５℃で行った。基本的なＭｇ２＋−ＡＴＰａｓｅ活性は、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　ＡＴＰ、ウサギ骨格筋由来の重合型アクチンおよび０．５μＭ組換えＳ１／ＨＭＭで解析を行った。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔを用いて行い、Ｐ＜０．０５を統計的有意とした。
（１−８）Ｃａ２＋結合の測定
Ｃａ２＋の結合範囲は、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３９：３８２７−３８３４，　２０００）の記載に従い、３．５μＭ　ＨＭＭ、５０μＭの組換えＣａ２＋軽鎖または５０μＭの組換えリン酸化軽鎖の存在下で、ＣａＣｌ２（Ｄｕ−Ｐｏｎｔ−ＮＥＮ）を含む０．１ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２およびＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）を用いた流動透析法を利用して２５℃下で測定した。リン酸化軽鎖またはＣａ２＋軽鎖それぞれのＯＲＦの５’末端にＮｄｅＩ制限酵素サイトを、３’末端にＢａｍＨＩサイトをＰＣＲによって付与した。このＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで酵素処理をして、ｐＥＴ１９ｂ発現ベクターシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社、ＵＳＡ）の同じサイトに挿入した。メーカーの説明書に従い、ｐＥＴ１９ｂ／ＰＬＣまたはｐＥＴ１９ｂ／ＣａＬＣを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にて発現および精製した。全てのデータは、Ａｄｉａｒの式に適合させることによって分析した。
（１−９）Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏにおける運動力の解析
Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏにおける運動力の解析は、文献（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１０６：９５５−９５７，　１９８９）の記載に従って行った。すなわち、ガラス表面に組換えＨＭＭをコーティングした。重合型アクチン（０．１２５ｍｇ／ｍｌ）をローダミンファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ、ＵＳＡ）でラベルし、運動解析用培地［１０ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　イミダゾール（ｐＨ　７．５）、１４ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび０．１ｍＭ　ＥＧＴＡまたは０．１ｍＭ　ＣａＣｌ２］上に乗せた。ＡＴＰ依存性の運動は、蛍光顕微鏡で観察し、またビデオカメラに撮影し記録した。アクチン運動の速度は、動いた距離とその動きをビデオカメラ撮影で収めた時間経過から算出した。統計解析はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔを用いて行い、Ｐ＜０．０５を統計的有意とした。
（２）結果
Ｓ１−重鎖の組換えバキュロウイルスをＳｆ−９細胞に感染させた。培養３日後、これら細胞を回収し、ホモゲナイズし、遠心分離を行った。発現産物は沈殿物中にあることから（図１）、Ｓ１−重鎖は不溶性であることが示された。同様に、Ｓ１−重鎖のバキュロウイルスとＣａ２＋結合軽鎖のバキュロウイルスとの共感染導入に発現産物を不溶性物質として得られた。しかしながら、このＳ１−重鎖の組換えバキュロウイルスとリン酸化軽鎖の組換えバキュロウイルスおよびＣａ２＋結合軽鎖の組換えバキュロウイルスとの共感染導入では、Ｓｆ−９細胞内で可溶性のＳ１−重鎖が生産された（図２）。ＨＭＭ−重鎖の場合も同様に、リン酸化軽鎖およびＣａ２＋結合軽鎖の組換えバキュロウイルスとの共感染を行うと、可溶性産物が得られた（図３）。
【００３５】
Ｓ１−重鎖、リン酸化軽鎖およびＣａ２＋結合軽鎖の組換えバキュロウイルスを感染させたＳｆ−９細胞の未加工抽出物から、可溶性Ｓ１−重鎖を回収するために、多量のアクチンをこの抽出物と混合し、遠心分離を行った。得られたペレットをＡＴＰ含有の緩衝液で懸濁し、Ｓ１−重鎖をペレットから放出させた。再度遠心分離を行うことによって、残存アクチンを除去し、得られた上清をＮｉ−ＮＴＡスパーフローカラムに注入した。図２に示したように、抽出物は、９８ｋＤａ（Ｓ１−重鎖）、１８ｋＤａ（リン酸化軽鎖）、１６ｋＤａ（Ｃａ２＋結合軽鎖）の３つの大きなバンドで構成されている。これにより、抽出物にＳ１が含まれていることが分かる。ＨＭＭは、ＨＭＭ−重鎖のペプチド１３５ｋＤａ、リン酸化軽鎖のペプチド１８ｋＤａおよびＣａ２＋結合軽鎖のペプチド１６ｋＤａの複合体（図３）と類似している。双頭のＨＭＭが、電子顕微鏡による観察で示された（図４）。Ｓ１およびＨＭＭのＡＴＰａｓｅ活性を、少量のサンプルでも数量化が可能な高速液体クロマトグラフィーによって解析した。組換えＳ１において、ＡＴＰａｓｅ活性が確認でき、この活性は次のとおり、アクチンによって活性化された。すなわち、０．１２±０．０１（ｓ−１ｈｅａｄ−１）（ｎ＝３）（ｍ±ＳＥＭ）のＭｇ２＋−ＡＴＰａｓｅ活性（図５）；また種々の濃度のアクチン存在下では、その活性がＫｍ＝２．５μＭと共にＶｍａｘ＝０．６１（ｓ−１ｈｅａｄ−１）に上昇した（図６）。このように、Ｓ１はアクチンによって約５倍まで活性化され、機能性Ｓ１が発現されたことが確認された。ＨＭＭも同様に、０．２１±０．０２（ｓ−１ｈｅａｄ−１）（ｎ＝３）（ｍ±ＳＥＭ）のＭｇ２＋−ＡＴＰａｓｅ活性を示した（図７）。アクチンは、Ｋｍ＝１．８μＭによって活性をＶｍａｘ＝１．２７（ｓ−１ｈｅａｄ−１）に増加させ（図８）、ＨＭＭがアクチンによって約６倍まで活性化されたことが確認された。
【００３６】
Ｓ１のＡＴＰａｓｅ活性におけるＣａ２＋の効果は、アクチンによる最大限の活性化状態の下で試験した。Ｃａ２＋のキレート剤であるＥＧＴＡの存在下では、活性は０．４９±０．０７（ｓ−１ｈｅａｄ−１）（ｎ＝３）であった。０．１ｍＭ　Ｃａ２＋が存在した場合、活性は０．４５±０．０４（ｓ−１ｈｅａｄ−１）（ｎ＝３）にわずかに減少した（図５）。しかし、この減少は統計学的には有意ではなかった。Ｃａ２＋の効果をＨＭＭで同様に試験した。しかし、その効果は、たとえあったとしても極わずかなものであった（図７）。
【００３７】
Ｃａ２＋の効果が検出されなかったことから、Ｓ１およびＨＭＭがＣａ２＋に結合するか否かという疑問が発生する。そのため、ＨＭＭによるＣａ２＋結合を流動透析法によって確認した。図９に示したとおり、リン酸化軽鎖はＣａ２＋と結合しなかった。しかしＣａ２＋結合軽鎖はＣａ２＋結合活性が確認された。ＨＭＭの結合活性は劇的に増加した；最大結合活性は、２ｍｏｌ／ｍｏｌ　ＨＭＭに対して、Ｋｄが１０μＭレベルであった。
【００３８】
組換えＨＭＭに対するＣａ２＋結合の効果を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ運動力解析を用いて調べた。すなわち、ＨＭＭをコーティングしたガラス表面上でアクチンのＡＴＰ依存性運動を観察した（図１０）。ＥＧＴＡ存在下での平均速度は０．６１±０．１６μｍ／ｓｅｃ（ｎ＝２５）であるのに対し、Ｃａ２＋存在下では０．３２±０．２１μｍ／ｓｅｃ（ｎ＝２５）に減少した。この結果から、組換えＨＭＭがＣａ２＋結合活性を有することと、Ｃａ２＋が組換えＨＭＭの運動機能活性に作用することが確認された。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、Ｃａ２＋結合型の組換えミオシンが提供される。この組換えミオシンは、マイクロマシンにおけるアクチュエーターや電子回路のスイッチ素子等として有用である。
【００４０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓｆ−９細胞で発現させた組換えＳ１−重鎖のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は非感染Ｓｆ−９細胞のホモジネート、レーン３は感染Ｓｆ−９細胞ホモジネートの沈殿物、レーン４は感染Ｓｆ−９細胞ホモジネートの上清である。
【図２】Ｓ１精製過程でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レーン１は分離量マーカー、レーン２はホモジナイズし、遠心分離した非感染Ｓｆ−９細胞の上清、レーン３は同細胞の沈殿物、レーン４はＳ１−重鎖、リン酸化軽鎖およびＣａ２＋結合軽鎖を感染させたＳｆ−９細胞をホモジナイズし、遠心分離した上清、レーン５は同細胞の沈殿物、レーン６はＳ１とアクチンとの複合体から精製したＳ１、レーン７はＮｉ−ＮＴＮカラムにより精製したＳ１である。
【図３】組換えＨＭＭ精製過程でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は非感染Ｓｆ−９細胞ホモジネートの遠心分離上清、レーン３はその沈殿、レーン４はＳ１−重鎖、リン酸化軽鎖およびＣａ２＋結合軽鎖を感染させたＳｆ−９細胞ホモジネートの上清、レーン５は同感染細胞の沈殿、レーン６はＮｉ−ＮＴＡカラム前のサンプル、レーン７はＮｉ−ＮＴＮカラムから溶出した精製ＨＭＭである。
【図４】図３の工程で精製した組換えＨＭＭの電子顕微鏡写真である。
【図５】Ｓ１のＡＴＰａｓｅ活性の測定結果である。１は０．１ｍＭ　ＥＧＴＡ存在下での基準Ｍｇ２＋−ＡＴＰａｓｅ活性、２は０．１ｍＭ　ＥＧＴＡおよび５μＭアクチン存在下でのアクチン活性化ＡＴＰａｓｅ活性、３は０．１ｍＭ　Ｃａ２＋存在下でのアクチン活性化ＡＴＰａｓｅ活性である。値は３回の測定の平均±ＳＥＭである。
【図６】様々な濃度のアクチン存在下におけるＳ１のＡＴＰａｓｅ活性測定結果である。Ｓ１およびＥＧＴＡの濃度はそれぞれ０．５μＭおよび０．１ｍＭに固定した。他の測定条件は図５と同様とした。
【図７】組換えＨＭＭのＡＴＰａｓｅ活性の測定結果である。１は０．１ｍＭ　ＥＧＴＡ存在下での基準Ｍｇ２＋−ＡＴＰａｓｅ活性、２は０．１ｍＭ　ＥＧＴＡおよび５μＭアクチン存在下でのアクチン活性化ＡＴＰａｓｅ活性、３は０．１ｍＭ　Ｃａ２＋および５μＭアクチン存在下でのアクチン活性化ＡＴＰａｓｅ活性である。値は３回の測定の平均±ＳＥＭである。
【図８】様々な濃度のアクチン存在下における組換えＨＭＭのＡＴＰａｓｅ活性測定結果である。
【図９】組換えＨＭＭのカルシウム結合活性の測定結果である。黒丸はＨＭＭ、白丸はＣａＬＣ、黒菱型はＰＬＣである。
【図１０】ＨＭＭの運動活性に対するＣａ２＋の効果を測定した結果である。Ａは０．１ｍＭ　ＥＧＴＡ存在下での測定結果、Ｂは０．１ｍＭ　Ｃａ２＋存在下での測定結果である。矢印はアクチンのＡＴＰ依存性運動の平均速度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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