(57)【要約】【解決手段】凍結保存や解凍中の氷の再結晶化を防止し、水の凍結温度の低下作用を有することが知られている微生物由来の不凍タンパク質において、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属を含む微生物を使用することにより、高い熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質およびその製造方法を提供する。【効果】本発明により０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する低温微生物由来の不凍タンパク質を提供することができる。これまでに知られている植物、魚および微生物由来の不凍タンパク質に比べ、高い熱ヒステリシス活性を有しているため、様々な産業分野において利用可能である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質。
【請求項２】
請求項１記載の微生物がフラボバクテリウム(Flavobacterium)属である微生物由来の不凍タンパク質。
【請求項３】
以下の理化学的性質を有してなる微生物由来の不凍タンパク質。
(1)熱ヒステリシス活性：０.５℃以上であり、
(2)ｐＨ８.０の水溶液の存在下、５０℃で３０分の熱処理後も、８０％以上の残存活性率を有し、
(3)安定ｐＨ範囲：ｐＨが７〜９の範囲で安定であり、
(4)分子量：ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により約１９ｋＤａである。
【請求項４】
配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチド配列を有し、かつ請求項１〜３記載の熱ヒステリシス活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
請求項４記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
微生物由来の不凍タンパク質の製造方法であって、微生物を２０℃以下の環境下にさらす工程を用いてなる請求項１〜４記載の微生物由来の不凍タンパク質の製造方法。
【請求項７】
フラボバクテリウム(Flavobacterium)属の微生物を０℃〜２０℃で培養する工程を用いてなる請求項１〜４記載の微生物由来の不凍タンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜４記載の微生物由来の不凍タンパク質を含有する氷結晶成長抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜４記載の微生物由来の不凍タンパク質を用いてなる氷結晶成長抑制方法。
【請求項１０】
請求項１〜４記載の微生物由来の不凍タンパク質を用いてなる水溶液の凝固点低下方法。
【請求項１１】
請求項１〜４記載の微生物由来の不凍タンパク質を用いてなる生物の保存方法。
【請求項１２】
請求項１〜４記載の微生物由来の不凍タンパク質を用いてなる食品の改質方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は飲食品や医薬品、研究材料保存などの用途に有用な微生物由来の不凍タンパク質に関する。すなわち、低温微生物または低温微生物であるフラボバクテリウム(Flavobacterium)属由来の微生物由来の不凍タンパク質に関する。
また、本発明は熱ヒステリシス活性を有する不凍タンパク質を含有もしくは生産する微生物および該不凍タンパク質の製造方法に関する。
さらに、本発明は、微生物由来の不凍タンパク質を用いた氷結晶の成長抑制効果、水溶液の凝固点低下効果を利用する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不凍タンパク質は植物や魚類、昆虫などが産生することが知られている。該不凍タンパク質は、氷の結晶表面を認識し、氷結晶表面に吸着し氷結晶の成長を抑制する。すなわち凍結保存や解凍中の氷の再結晶化を極力防止する。また、水の凍結温度の低下作用を有することが知られている物質である。不凍タンパク質の活性の程度は、熱ヒステリシス活性が指標として示される。通常、水の凍結温度と融解温度は同一であるが、不凍タンパク質が存在すると氷結晶と結合するため、水の凍結温度が通常より低下する。この時に生じる氷の融解温度と水の凍結温度の差を「熱ヒステリシス」といい、この数値が高い程、不凍タンパク質の活性が高いことを意味する。不凍タンパク質は、霜害防除、冷凍食品の品質向上、細胞・組織の保存、低温手術での利用などにおける有用性が指摘され、アイスクリームなどの氷菓子への添加(特許文献１参照)や、リポソームの膜安定化(特許文献２参照)が期待されている。不凍タンパク質は、冷凍する際に生じる氷結晶の成長から奏される舌触りの改良や、解凍後に生じるドリップの発生を抑える効果を持っているとされている。不凍タンパク質の熱ヒステリシス活性は、一般的に植物由来の不凍タンパク質が０.２〜０.５℃、魚由来の不凍タンパク質が０.７〜１.５℃であり、昆虫にも不凍タンパク質があることが知られている。特に微生物由来の不凍タンパク質は、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)、マイクロコッカス・クライオフィラス(Micrococcus cryophilus)を、３℃の低温順化した後に取得した粗精製品の不凍タンパク質で０.３５±０.１１℃、もしくは０.２９±０.０１℃の熱ヒステリシス活性を持つことが知られている(非特許文献１参照)。また、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)GR12-2についても５℃の低温順化した後に取得した粗精製品の不凍タンパク質で０.１１±０.０２℃であること(非特許文献２参照)が知られている。しかし、これらはいずれも熱ヒステリシス活性が低く、さらに高い活性が望まれている。
【０００３】
【特許文献１】米国特許第４７２５００号
【特許文献２】米国特許第５８６９０９２号
【非特許文献１】CRYOBIOLOGY 30:322-328(1993)
【非特許文献２】Can.J.Microbiol. 41:776-784(1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記のとおり、不凍タンパク質は様々な産業分野においての有用性が指摘されており、多くの試みがなされている。しかし、これまでに知られている植物、魚および微生物由来の不凍タンパク質は熱ヒステリシス活性が低く、安全性や生産性に問題があり実用化にまでは至っていない。
本発明の発明者らは、安全にしかも安価に、生産効率が高く製造可能な不凍タンパク質を取得するために、高い熱ヒステリシス活性を有する新規な不凍タンパク質と、その製造方法、および新規な不凍タンパク質の利用方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、極めて解決困難な上記課題を解決すべく、極めて有効でかつ効果的な方法を提供するために鋭意研究を行った結果、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属を含む低温微生物が、熱ヒステリシス活性が極めて高い微生物由来の不凍タンパク質を生産することを見いだした。
【０００６】
本発明は、０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質に関する。該不凍タンパク質を生産する微生物は、例えば、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属に属する微生物を含む低温微生物である。
本発明は、該微生物を用いた熱ヒステリシス活性が極めて高い微生物由来の不凍タンパク質の製造方法に関する。先ず該微生物を２０℃以下で培養することで熱ヒステリシス活性が極めて高い不凍タンパク質を製造し、例えば、微生物を２０℃以下の温度環境下にて、不凍タンパク質を誘導もしくは蓄積せしめた後に０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を取得する製造方法に関する。
本発明の熱ヒステリシス活性の高い微生物由来の不凍タンパク質の理化学的性質は、該不凍タンパク質濃度が１.０mg/ml以上のタンパク質溶液の熱ヒステリシス活性が０.５℃以上である。熱ヒステリシス活性は、アンモニウムイオンの共存下により増加する。さらに、ｐＨ８.０の水溶液の存在下、５０℃で３０分の熱処理後も、８０％以上の残存活性率として耐熱性を有している。ｐＨが７〜９の範囲で安定である。分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により約１９ｋＤａである。
本発明は、熱ヒステリシス活性を有し、かつ配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドを提供する。すなわち、本発明の熱ヒステリシス活性の高い微生物由来の不凍タンパク質は、ペプチド配列の一部または全部に、配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチド配列を有する。また、本発明の微生物由来の不凍タンパク質は、配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチド配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチド配列を有しかつ熱ヒステリシス活性を有するポリペプチドを含む。さらに、本発明は該ポリペプチドの製造方法を提供する。
本発明は、熱ヒステリシス活性を有し、かつ配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。すなわち、本発明は、微生物由来の不凍タンパク質のペプチド配列の一部または全部に、配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドに関する。また、本発明の微生物由来の不凍タンパク質のペプチド配列の一部または全部に、配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチド配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドに関し、かつ熱ヒステリシス活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いた微生物由来の不凍タンパク質の製造方法を提供する。
【０００７】
本発明は、０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を含有する組成物およびその使用方法に関する。すなわち、本発明は熱ヒステリシス活性の極めて高い微生物由来の不凍タンパク質を用いた組成物であり、氷結晶の成長抑制効果、水溶液の凝固点低下効果を有効に発揮できる微生物由来の不凍タンパク質を含有する組成物である氷結晶成長抑制剤およびその効果を利用した使用方法である氷結晶成長抑制方法ならびに凝固点低下方法などに関する。例えば、微生物由来の不凍タンパク質を含有する該氷結晶成長抑制剤の使用方法は、熱ヒステリシス活性の極めて高い微生物由来の不凍タンパク質を用いた、例えば臓器、組織、細胞、微生物などの生物もしくは生物材料の低温領域における保存方法に関し、また、飲料、食品、栄養食品などの飲食品の改質方法に関し、広く利用できるものである。
【０００８】
本発明の微生物由来の不凍タンパク質は、０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質であればよく、該微生物由来の不凍タンパク質であれば、微生物の抽出物であっても、単離精製された該微生物由来の不凍タンパク質単独もしくは混合物であってもよい。本発明の微生物由来の不凍タンパク質は、少なくとも微生物由来の不凍タンパク質を使用し、生産する微生物菌株は１種単独もしくは２種以上を組合せて使用しても良い。本発明の０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質の製造方法は、タンパク質を生物から抽出、精製する通常の方法に順じて行えばよい。本発明の微生物由来の不凍タンパク質を含有する組成物としては、少なくとも本発明の０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を含有すればよく、さらに熱ヒステリシス活性を増強するための増強物質、本発明の微生物由来の不凍タンパク質の安定剤、保護剤などを含めた物質と組合せても使用できる。また、本発明は、氷結晶の成長抑制、氷の再結晶化抑制、水溶液の凝固点の降下、凍結の阻害(例えば、霜害防除)、乳化の安定化、微生物の増殖抑制、変色防止、酸化防止などに最適な微生物由来の不凍タンパク質を含有する組成物が含まれる。
【０００９】
本発明の微生物は、０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を生産する微生物であれば良く、特に限定はない。例えば、２０℃以下の低温領域でも増殖する微生物が挙げられ、特に低温微生物が好ましい。例えばフラボバクテリウム(Flavobacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、マイクロコッカス(Micrococcus)属、バチルス・グロビスポラス(Bacillus globis
porus)などのバチルス(Bacillus)属、カンジダ・エスピー(Candida sp.)、カンジダ・スコッチイ(Candida scottii)などのカンジダ(Candida)属、クラドスポリウム・ヘルバレム(Cladosporium herbarum)などのクラドスポリウム(Cladosporium)属などが好ましい。サイトファーガ(Cytophaga)属も好ましいが、遺伝子レベルなどの解析に基づいて、サイトファーガ(Cytophaga)属はフラボバクテリウム(Flavobacterium)属にも再分類されている(Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 50:1055-1063(2000))。
【００１０】
本発明の微生物は、フラボバクテリウム(Flavobacterium)属に属する低温微生物が好ましく、本発明のフラボバクテリウム(Flavobacterium)属は、好気性でセルロース、キチンなどの多糖類を分解して増殖する微生物である。本発明のフラボバクテリウム（Flavobacterium）属は、フラボバクテリウム・キサンタム（Flavobacterium  xanthum）、フラボバクテリウム・ハイダティス（Flavobacterium hydatis）、フラボバクテリウム・コラムナレ（Flavobacterium columnare）、フラボバクテリウム・フレベンス（Flavobacterium flevense）、フラボバクテリウム・ペクチノボラム（Flavobacterium pectinovorum）、フラボバクテリウム・サイクロフィラム（Flavobacterium psychrophilum）、フラボバクテリウム・サッカロフィラム（Flavobacterium saccharophilum）、フラボバクテリウム・サクシニカンス（Flavobacterium succinicans）、フラボバクテリウム・ウリジノサム（Flavobacterium uliginosum）などが属する微生物であり、好ましくはフラボバクテリウム・キサンタム（Flavobacterium  xanthum）が挙げられる。また、前記の０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を生産する能力を有するフラボバクテリウム(Flavobacterium)属であれば全て使用することができる。例えば、ＩＦＯ１４９５８、ＩＦＯ１４９６０、ＩＦＯ１４９０５、ＩＦＯ１４９６２、ＩＦＯ１４９７２などの菌株は、受託番号でＩＦＯやＡＴＣＣに寄託されており、全て公知の分譲機関、法人より入手可能である。なお、本発明においては、上記菌株の変異株も使用できる。変異株は、紫外線、エックス線などの放射線または化学的変異剤(ＮＴＧなど)などの処理によって取得できる。
【００１１】
本発明の微生物由来の不凍タンパク質は、上記の微生物から生産することが可能で熱ヒステリシス活性は、０.５℃以上、好ましくは１.０℃以上、より好ましくは３.０℃以上である。熱ヒステリシス活性は、アンモニウムイオンの共存下により増加する。また、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）の存在下、５０℃で３０分の熱処理後も、８０％以上の残存活性率として耐熱性を有している。ｐＨが７〜９の範囲で安定である。分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により約１９ｋＤａである。例えばフラボバクテリウム・キサンタム(Flavobacterium xanthum)由来の不凍タンパク質は、１.０mg/ml濃度の場合の熱ヒステリシス活性が２.０〜５.０℃であり、クエン酸三ナトリウム二水和物で熱ヒステリシス活性が増強する。さらに、安定温度域は５０℃以下であり、安定なｐＨ範囲はｐＨ７〜９である。
【００１２】
本発明は、上述の熱ヒステリシス活性を有し、かつ配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドが含まれる。
本発明の熱ヒステリシス活性の高い微生物由来の不凍タンパク質は、そのペプチド配列の一部または全部に、配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチド配列を有する。本発明のポリペプチドとしては、配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加され、かつ配列番号１または２で表されるアミノ酸配列とＢＬＡＳＴ(Basic local alignment search tool)やＦＡＳＴＡ(Fast all)などを用いて計算したときに、少なくとも８０％以上、特には９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ熱ヒステリシス活性を有するポリペプチドをあげることができる。欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、例えば部位特異的変異法などの周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜５個である。
【００１３】
本発明は、上述の熱ヒステリシス活性を有し、かつ配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が含まれる。
本発明の熱ヒステリシス活性の高い微生物由来の不凍タンパク質は、そのペプチド配列の一部または全部に、配列番号１および/または配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチド配列を含む限り、特に限定されるものではない。なお、本発明のポリヌクレオチドとは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれる。本発明の該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡは、一般に１つのアミノ酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するが、本発明のポリペプチドをコードしていれば本発明のＤＮＡに含まれる。さらに本発明のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列と８０％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつ熱ヒステリシス活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも含まれる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ(Basic local alignment search tool)やＦＡＳＴＡ(Fast all)などを用いて計算したときに、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。本発明によるポリヌクレオチドは、例えば、天然由来であっても、全合成してもよい。更には、天然由来の一部を利用して合成を行なってもよい。本発明によるポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを有する熱ヒステリシス活性を有する不凍タンパク質の製造方法に関する。
【００１４】
本発明の０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を取得するための製造方法は、上記の微生物が良く生育して目的とする熱ヒステリシス活性の高い微生物由来の不凍タンパク質を生産しうる条件で製造することが望ましく、微生物の性質により、培地のｐＨ、培養期間などは適宜変更して行えば良い。例えば、培養方法としては液体培養、固体培養のいずれでも良く、好ましくは、液体培養が利用される。液体培養としては例えば、以下のようにして行うことができる。使用できる培地としては、熱ヒステリシス活性の高い微生物由来の不凍タンパク質を生産する微生物が生育可能な培地であれば、いかなるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸などの炭素源、さらに硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、肉エキスなどの窒素源、さらにカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩などの無機塩を添加したものを用いることができる。培地のｐＨは例えば約３〜１０、好ましくは約７〜８程度に調整し、培養温度は通常−２０〜２０℃程度、好ましくは約１０℃以下、より好ましくは７℃以下で、１〜２０日間、好ましくは３〜１５日間程度好気的条件下で培養する。培養方法としては、例えば静置培養、振盪培養法、ジャーファーメンターによる好気的培養法が利用できる。本発明の微生物由来の不凍タンパク質は、本発明の上記の微生物を培養することで取得する培養液または/および培養微生物菌体内に生成し蓄積している。さらに、本発明の微生物由来の不凍タンパク質は、該培養液または/および培養微生物菌体内から通常の抽出方法、精製方法を利用し取得することができる。例えば、本発明の微生物由来の不凍タンパク質が培養微生物菌体内に蓄積する場合は、低温領域で微生物を培養後、培養液を遠心分離して培養微生物を取得する。ついで、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離などによって、熱ヒステリシス活性の高い微生物由来の不凍タンパク質を含有する抽出液を取得することができる。本抽出液を、そのまま本発明の微生物由来の不凍タンパク質として用いても良いが、さらに微生物由来の不凍タンパク質を単離精製し、例えば遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換樹脂などの各種クロマトグラフィーを組み合わせ、常法により処理することで、本発明の熱ヒステリシスの高い微生物由来の不凍タンパク質の精製品を取得することができる。
【００１５】
本発明の微生物由来の不凍タンパク質の熱ヒステリシス測定は、水溶液の融解温度と凍結温度間の差を測定することを原理としており、DeVriesら(Methods Enzymol. 127, 293-303(1986))の方法に準じて行えばよい。つまり、該微生物由来の不凍タンパク質を含有する水溶液を徐々に冷却し、該水溶液の凝固点をモニターすることにより行われる。凍結点は、制御できない結晶成長か、あるいは結晶成長がおこる際のごくわずかの温度である。融解点は、一つの氷結晶が溶けずに安定な状態で留まっている最高温度である。
【００１６】
本発明の０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を含有する氷結晶成長抑制剤および氷結晶成長抑制方法は、０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を少なくとも含有することで、溶媒の氷結晶の成長を抑制または/および阻害作用を有し、霜害防除剤、動物・植物などの細胞・組織、食品の保存などでの利用が挙げられる。本発明の氷結晶成長抑制剤は、該微生物由来の不凍タンパク質を溶液または粉末形態として製剤化することができ、あるいは添加対象とする製品の性状や工程などに合せて、溶液状やペースト状の最も効果が期待できる剤形に加工することができる。また、本発明の氷結晶成長抑制剤は、前記の本発明の微生物由来の不凍タンパク質と他の成分との混合形態であってもよい。そのような成分としては、該微生物由来の不凍タンパク質の上記効果を損なわないものを使用することができる。さらに、本発明の微生物由来の不凍タンパク質を含有してなる氷結晶成長抑制剤は、該微生物由来の不凍タンパク質は最適の濃度、ｐＨなどの条件で、適宜選択して使用することができる。
【００１７】
微生物由来の不凍タンパク質を用いてなる食品の改質方法は、例えば、果実、魚介類、麺類、グラタン、雑炊・リゾット等の米飯、ハンバーグ、パン、ピザ、スポンジケーキ、カステラ、ホットケーキ、たい焼き、たこ焼き、まんじゅう、団子、つくね、スープ、シチュー、ソース、豆腐、ブイヨン、調味料、調理済食品などの冷凍食品、また、例えばアイスクリームとそれを食す際に可食の器となるモナカの皮などを含めた冷菓類などを製造する際に、本発明の微生物由来の不凍タンパク質をそのまま使用したり、他の食品ないし食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用することができる。本発明に係る食品は、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれの飲食品の形態でもよい。本発明の不凍タンパク質を用いることにより、該冷凍食品を長期間冷凍保存したものであっても、良好な食感や美味しさを維持することができる。
【００１８】
本発明の０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を含有する水溶液の凝固点の低下剤および低下方法は、少なくとも０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を含有することで、溶媒の凝固点の低下作用を有し、霜害防除剤、動物・植物などの細胞・組織、食品の保存などでの利用が挙げられる。本発明の水溶液の凝固点の低下剤は、該微生物由来の不凍タンパク質を溶液または粉末形態として製剤化することができ、あるいは添加対象とする製品の性状や工程などに合せて、溶液状やペースト状の最も効果が期待できる剤形に加工することができる。また、本発明の水溶液の凝固点の低下剤は、前記の本発明の微生物由来の不凍タンパク質と他の成分との混合形態であってもよい。そのような成分としては、微生物由来の不凍タンパク質の上記効果を損なわないものを使用することができる。さらに、本発明の微生物由来の不凍タンパク質を含有してなる水溶液の凝固点の低下剤は、該微生物由来の不凍タンパク質は最適の濃度、ｐＨなどの条件で、適宜選択して使用することができる。
【００１９】
本発明の０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を含有する水溶液の凝固点の低下方法は、例えば微生物、動物、植物などの細胞や組織、血液や酵素などのタンパク質、ワクチン、または細胞性抽出物などの生物学的サンプル（生物材料）である生物の保存方法に係る。さらに、生物を含有する水溶液に、本発明の微生物由来の不凍タンパク質を添加し保存することで、水溶液の凝固点を低下させ、より該生物学的サンプルの生存性、機能性を維持し、保存期間を向上する作用を有する。例えば、本発明の生物の保存方法は、移植手術または病院への輸送時での使用が挙げられる。本発明の微生物由来の不凍タンパク質は、水溶液の凝固点を低下するばかりでなく、氷点以下の保存中に生じる氷結晶の成長を抑制する効果を有する。その効果を利用し、生物の分解や変性を最小化する上、氷結晶の成長に由来する細胞の損傷を抑制する。また、本発明の微生物由来の不凍タンパク質は細胞膜の安定化に寄与すると考えられ、細胞の保存性を向上させる。前記の保存される細胞としては、細菌、酵母を含む真菌、および特に高等真核生物細胞(例えば、ハイブリドーマ株または組織培養細胞株など)などが挙げられる。細胞性抽出物としては、インビトロタンパク質合成系、酵素調製物、および膜成分を含むサンプルなどが挙げられる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、０.５℃以上の熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質を提供することができる。該微生物由来の不凍タンパク質は、これまでに知られている植物、魚および微生物由来の不凍タンパク質に比べ、極めて高い熱ヒステリシス活性を有しているため、食品、医薬、研究用試薬など様々な産業分野において利用可能である。さらに、本発明の微生物由来の不凍タンパク質の製造方法により、安全性や生産性に優れ、生産効率が高く新規な微生物由来の不凍タンパク質を取得することが可能となった。
【００２１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって限定されるものではない。本発明の実施例において、不凍活性の強さを比較する場合には熱ヒステリシスの測定を適用した。
【実施例１】
【００２２】
フラボバクテリウム・キサンタム(Flavobacterium xanthum)IFO 14972の培養
ＴＳＢ培地(DIFCO社製)(３.０％)をそれぞれ２００ml容三角フラスコに３０ml分注し、１２１℃、２０分間殺菌して冷却したのち、フラボバクテリウム・キサンタム(Flavobacterium xanthum)IFO 14972を一白金耳ずつ接種し、５℃で１週間振盪培養して、種培養液を調製した。５Ｌ容量の培養ジャーに、上記ＴＳＢ培地３Ｌを入れ、これを１２１℃で２０分間殺菌して冷却したのち、上記の種培養液２７mlを接種し、５℃で６日間、培養液に通気しながら撹拌培養を行った。培養終了後、遠心分離により菌体を回収した。
【実施例２】
【００２３】
菌体からの熱ヒステリシス活性を有する抽出液の精製
以下のステップにより熱ヒステリシス活性を有する微生物由来の不凍タンパク質の抽出液を取得した。
１)無細胞抽出液の調製：
上記培養で取得した菌体をトリス・塩酸緩衝液(２０ｍＭ、ｐＨ８)に懸濁したのち、氷浴中で冷却しつつ超音波破砕装置「INSONATOR 201M」(久保田商事株式会社製)で４０分間破砕した。破砕液を遠心分離して菌体残渣を除き、無細胞抽出液を取得した。
【００２４】
２)硫安分画による精製：
前記無細胞抽出液に２０％(ｗ/ｖ)飽和量となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で１５時間緩やかに撹拌した。４℃、１０,０００ｇ、２０分間遠心分離することにより上澄液を回収した。上澄液に６０％(ｗ/ｖ)飽和量となるよう硫酸アンモニウムを加え、４℃で７時間緩やかに撹拌した。４℃、１０,０００ｇ、２０分間遠心分離により沈殿を回収し、これをトリス-塩酸緩衝液(２０ｍＭ、ｐＨ８)に溶解させて、抽出液として回収した。この抽出液をＳｐｅｃｔｒｕｍ社製の透析チューブ(分画分子量：３,５００)に入れ、透析外液として使用した５Ｌのトリス・塩酸緩衝液(２０ｍＭ、ｐＨ８)を３回交換することにより、６６時間透析を行って抽出液を取得した。
【００２５】
３)イオン交換クロマトグラフィーによる精製：
前記の抽出液を予めトリス塩酸緩衝液(２０ｍＭ、ｐＨ８)で平衡化したDEAE-Cellulofineを充填したガラスカラム(直径１.０ｃｍ×高さ５.８ｃｍ)に通液して、同緩衝液で洗浄して、活性画分を集めた。この活性画分は、凍結乾燥機「EYELA FREEZE DRYER FD-1」(東京理化器械製)で濃縮を行い、蒸留水に溶解した。ここで取得した抽出液は、蛋白濃度１mg/mlで熱ヒステリシス活性が２.５〜４.７℃であった。上記熱ヒステリシス活性の測定については後記実施例３の方法で測定した。
【００２６】
４)疎水クロマトグラフィーによる精製：
前記の抽出液に２０％濃度となるよう硫安を加え、予め２０％硫安を含むトリス塩酸緩衝液(２０ｍＭ、ｐＨ７.５)で平衡化したButyl-Toyopearlを充填したガラスカラム(直径０.８ｃｍ×高さ５.４ｃｍ)に通液して、同緩衝液で洗浄後、硫安を含まないトリス塩酸緩衝液(２０ｍＭ、ｐＨ７.５)への直線濃度勾配にて活性画分を集めた。さらに本活性画分をトリス塩酸緩衝液(５ｍＭ、ｐＨ８)で透析後、２０％濃度となるよう硫安を加え、予め２０％硫安を含むトリス塩酸緩衝液(２０ｍＭ、ｐＨ７.５)で平衡化したButyl-Toyopearlを充填したガラスカラム(直０.８ｃｍ×高さ５.４ｃｍ)に通液して、同緩衝液で洗浄後、硫安を含まないトリス塩酸緩衝液(２０ｍＭ、ｐＨ７.５)への直線濃度勾配にて活性画分を集めた。本活性画分をトリス塩酸緩衝液(５ｍＭ、ｐＨ８)で透析後、濃縮した。
【００２７】
５)ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製：
前記の濃縮液を０.２ＭのＮａＣｌを含むトリス塩酸緩衝液(５０ｍＭ、ｐＨ７.５)に溶解し、予め同緩衝液で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィー TSKgel G3000SW(カラムサイズ：直径０.７５ｃｍ×長さ６０ｃｍ)にかけ、同緩衝液にて溶出した。得られた活性画分を濃縮後、トリス塩酸緩衝液(５ｍＭ、ｐＨ８)で透析後、濃縮して不凍タンパク質溶液を得た。
【実施例３】
【００２８】
熱ヒステリシス活性の測定
本発明の微生物由来の不凍タンパク質を含有する水溶液の熱ヒステリシスの測定は、該微生物由来の不凍タンパク質を含有する水溶液を徐々に冷却し、該水溶液の凝固点をモニターすることにより行われる。凍結点は、制御できない結晶成長か、あるいは結晶成長がおこる際のごくわずかの温度である。融解点は、一つの氷結晶が溶けずに安定な状態で留まっている最高温度である。本実施例においては、Devriesら(Methods Enzymol. 127, 293-303(1986))の方法に準じて行った。詳しくは、以下の方法によって熱ヒステリシスを測定した。直径１６ｍｍ、厚さ０.１２ｍｍの円形ガラスに１μｌのサンプルをのせた。温度制御顕微鏡ステージ(リンカム社製LK-600PM)にスライドをのせ、微細な氷をたくさん作るためにステージを５０℃/分の速度で−４０℃まで急速凍結した。氷結晶を顕微鏡でモニターしながら、ステージの温度を０.０２℃/分の速度で緩やかに上昇させ、最後の結晶が消失した温度を融点とした。再び、ステージを５０℃/分の速度で−４０℃まで急速凍結し、微細な氷をたくさん作った。ステージの温度を０.０２℃/分の速度で緩やかに上昇させて氷を融解し、一つの直径１０μｍ程度の氷結晶核種ができる平衡温度に到達させた。その後、１℃/分の速度で温度を低下させ、氷結晶の大きさをモニターした。不凍タンパク質を含まないサンプルにおいては氷結晶が急激に成長し始め、それゆえ融解温度と凍結温度は同一となる。一方、不凍タンパク質が存在すると、温度低下時、氷結晶の大きさはしばらく一定を保ち、ヒステリシス凍結点において劇的に氷結晶は成長する。すなわち、融解温度と凍結温度との間に差が生じる。この熱ヒステリシスの温度差は不凍タンパク質の濃度と比活性に依存している。本発明においては３回測定した値の平均値を熱ヒステリシス値として採用した。
蛋白質濃度の測定は、BIO RAD株式会社製の蛋白質濃度測定用キットを使用して行った。測定においては０.２mg/mlのBSA溶液を標準液として用い、いずれも３回の測定値の平均値を用いた。
【実施例４】
【００２９】
菌体からの熱ヒステリシス活性を有する抽出液の性質試験  
実施例２の５)で得られた精製不凍タンパク質溶液について、温度安定性、ｐＨ安定性、分子量、内部アミノ酸配列を調べた。また、有機酸、糖および塩の添加による熱ヒステリシス活性への影響を調べると共に、氷の再結晶化を阻害する効果を調べた。なお、微生物由来の不凍タンパク質の熱ヒステリシス活性の測定についても実施例３に示した方法に従って行った。
【００３０】
１.温度安定性：
実施例２の５)で取得した精製不凍タンパク質溶液について、温度安定性を測定した。
微生物由来の不凍タンパク質を含む精製液(蛋白濃度：１０mg/ml)５０μｌを１.５ml容エッペンドルフチューブに入れた後、４０、５０、６０、７０℃の各温度で３０分間保持する。各々の温度に保持した後、直ぐに氷冷し、微生物由来の不凍タンパク質の熱ヒステリシス活性を測定した。なお、熱処理をせず０℃で３０分間保持した微生物由来の不凍タンパク質の熱ヒステリシス活性を１００％とした場合の各温度の活性値から比率を算出し残存活性率として示し、本実施例の温度安定性として評価した。
その結果、該微生物由来の不凍タンパク質の温度安定性は、０〜５０℃までの残存活性が約９０％以上であり、６０℃での残存活性はほとんどなかった。よって、本発明の微生物由来の不凍タンパク質は０℃〜５０℃の温度まで安定であり、熱ヒステリシス活性を有効に維持すること可能な微生物由来の不凍タンパク質であることが示唆された。
【００３１】
２.ｐＨ安定性：
実施例２の５)で取得した精製不凍タンパク質溶液について、ｐＨ安定性を測定した。
微生物由来の不凍タンパク質を含む抽出液(蛋白濃度：１０mg/ml)に、酢酸緩衝液(ｐＨ４.１、あるいはｐＨ５.０)、リン酸カリウム緩衝液(ｐＨ７.２)、またはグリシン-ＮａＯＨ緩衝液(ｐＨ８.９、あるいは９.９)の５種類の緩衝液を用い、各々の緩衝液が最終濃度２０ｍＭとなるように添加した。各々のｐＨ環境下の微生物由来の不凍タンパク質を含む溶液を４℃で１１日間保存し、０時間、１日後、３日後、７日後、１１日後と経時的に熱ヒステリシス活性を測定した。
その結果、該微生物由来の不凍タンパク質はｐＨ７〜９で安定であることが示唆された。よって、このｐＨ範囲の微生物由来の不凍タンパク質は、中性付近が安定であり熱ヒステリシス活性を有効に維持することが可能な微生物由来の不凍タンパク質であることが示唆された。
【００３２】
３.分子量(ゲル濾過法)：
実施例２の５)で取得したゲル濾過後の精製された不凍タンパク質溶液について、分子量をゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した。ここで、充填剤としてはTSKgel G3000SW(カラムサイズ：直径０.７５ｃｍ×長さ６０ｃｍ)を用い、０.２ＭのＮａＣｌを含むトリス塩酸緩衝液(５０ｍＭ、ｐＨ７.５)を溶出液とした。標準蛋白として、ビタミンＢ１２[ 分子量１,３５０]、馬ミオグロビン[ 分子量１７,０００]、鶏卵白アルブミン [ 分子量４４,０００]、ウシガンマグロブリン[ 分子量１５８,０００]、チオグロブリン[ 分子量６７０,０００]の蛋白を用いて検量線を作成した。その結果、実施例２の５)で取得した不凍タンパク質溶液は単一にまで精製されたことが分かった。この方法によりこの発明に係る不凍タンパク質の分子量は約３８ｋＤａ と決定した。
【００３３】
４.分子量(ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動)：
実施例２の５)で取得したゲル濾過後の精製された不凍タンパク質溶液について、分子量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて測定した。分離ゲル「パジェルSPG-520L」(ＡＴＴＯ社製)を用いて電気泳動を行なった。ゲル中の緩衝液として、０.１％のＳＤＳを含む２５ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１９２ｍＭグリシン(ｐＨ８.６)を用いた。２０ｍＡで１.２時間電気泳動した後に、蛋白をCBB R-250にて染色した。約１９ｋＤａの位置に単一のバンドが確認された。前記の結果と併せて、この発明に係る不凍タンパク質は同一サブユニットの２量体であると分かった。
【００３４】
５.内部アミノ酸配列：
実施例２の５)で取得したゲル濾過後の精製された不凍タンパク質溶液について、臭化シアン分解して断片化し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にて各ペプチド断片を分画した。うち２つのペプチド断片をプロテインシークエンサーに供し、配列決定を行なった。決定された部分アミノ酸配列を以下に記す。なお、(Ｎ)はＮ端末、(Ｃ)はＣ端末を示す。
【００３５】
配列番号１;
(N)−Leu Glu Ala Gln Lys Gln Leu Asp Lys Leu Ser Thr Thr Tyr Asp Ala Asp −(C)
【００３６】
配列番号２;
(N)−Glu Glu Tyr Gln Gly Lys Lys Tyr Glu Ala Glu Ala Ala Thr Val Thr Glu Ala Val Asn Gly Glu −(C)
【００３７】
６.有機酸、糖、塩の添加による影響：
実施例２の５)で取得したゲル濾過後の精製された不凍タンパク質溶液について、熱ヒステリシス活性の増強作用について測定した。
微生物由来の不凍タンパク質を含む精製液(蛋白濃度：１０mg/ml)に、クエン酸三ナトリウム二水和物、コハク酸一ナトリウム、酢酸ナトリウム一水和物、乳酸、硫酸アンモニウム、ソルビトール、シュークロース、Ｌ-グルタミン酸ナトリウム一水和物、Ｌ-アスパラギン酸ナトリウムを、それぞれの添加物を各々最終濃度が１００ｍＭ、５００ｍＭまたは１Ｍとなるように調整し添加した。各々の条件下の熱ヒステリシス活性を測定した。なお、微生物由来の不凍タンパク質に蒸留水を添加しコントロールとして使用した。
その結果、添加物による該微生物由来の不凍タンパク質の熱ヒステリシス活性の増強効果が認められた。該増強効果は、各添加物により異なり、本実施例の微生物由来の不凍タンパク質の熱ヒステリシス活性に増強効果として、より高い影響を与えた添加物は、５００ｍＭ クエン酸三ナトリウム二水和物、５００ｍＭ コハク酸一ナトリウム、５００ｍＭ Ｌ-グルタミン酸ナトリウム一水和物、１Ｍ ソルビトールであった。
【００３８】
７.氷の再結晶化を阻害する効果：
実施例２の５)で取得したゲル濾過後の精製された不凍タンパク質溶液について、氷の再結晶化を阻害する効果について評価した。
水を含む不凍タンパク質サンプルをシュクロース濃度３０％に調製し、直径１６mmの円形ガラススライドに１μｌのサンプルをのせた。その上に同形状のガラススライドをのせ、スライドの厚さを均一にするため２００ｇ重をサンプルにかけた。リンカムL-600A温度制御顕微鏡ステージにサンプルをのせ、小さい氷をたくさん作るためにステージを５０℃/minの速度でマイナス４０℃まで急速凍結した。ステージの温度をマイナス９℃まで急速に昇温し、温度を一定に保ち、顕微鏡で氷サイズを観察した。氷結晶を顕微鏡カメラで０分と１０分、３０分後に記録した。氷結晶の直径は０分後には全て５μｍ以下からスタートしたが、コントロールとして不凍タンパク質サンプルの代わりに水を用いた場合は、１０ないし３０分後には氷結晶が再結晶化し、平均直径が５μｍを超え１０μｍに達するほどにまで成長した。一方、不凍タンパク質サンプルが１mg/ml含まれるシュクロース溶液を用いた場合は、氷結晶の平均直径は３０分後でも５μｍ以下であった。
【００３９】
以上の実施例の結果より、この発明に係る不凍タンパク質は氷の再結晶化を阻害することにより、氷結晶の成長を抑制することが示唆された。そのため、細胞や組織などを低温保存した場合に引き起こされる凍結濃縮や氷結晶の成長にともない生じる細胞死、また食品においては味質、歯ごたえ、鮮度の悪化、またはビタミンＣ、タンパク質などの栄養成分や葉緑素などの有用成分の分解など様々な問題が回避できることが期待される。
【配列表】
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