(57)【要約】【課題】皮下及び静脈内注射として可能であり、徐放性製剤としても使用でき、かつミセル化しているため骨髄にターゲットされ、さらに皮膚に塗布する医薬品及び医薬部外品としての外用剤及び化粧品にも使用できるレチノイン酸ナノカプセルを提供すること。【解決手段】レチノイン酸を極性の高い有機溶媒に溶解し、アルカリを含む水で分散させ、次に非イオン界面活性剤を添加することよりなる混合ミセルに、２価金属塩を添加し、次に２価陰イオンを持つ塩を添加してなる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイン酸を極性の高い有機溶媒に溶解し、アルカリを含む水で分散させ、次に非イオン界面活性剤を添加することよりなる混合ミセルに、２価金属塩を添加し、２価陰イオンを持つ塩を添加してなるレチノイン酸ナノカプセル。
【請求項２】
前記極性の高い有機溶媒がエタノール又はメタノールであることを特徴とする請求項１記載のレチノイン酸ナノカプセル。
【請求項３】
前記２価金属塩が塩化カルシウムであることを特徴とする請求項１記載のレチノイン酸ナノカプセル。
【請求項４】
前記２価陰イオンを持つ塩が炭酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１記載のレチノイン酸ナノカプセル。
【請求項５】
前記２価金属塩と２価陰イオンを持つ塩のモル比が1：0.05〜0.33であることを特徴とする請求項１，３又は４のいずれかに記載のレチノイン酸ナノカプセル。
【請求項６】
前記２価金属塩と２価陰イオンを持つ塩のモル比が1：0.2であることを特徴とする請求項１，３又は４のいずれかに記載のレチノイン酸ナノカプセル。
【請求項７】
前記レチノイン酸ナノカプセルを有効成分とする徐放性製剤。
【請求項８】
前記レチノイン酸ナノカプセルを有効成分とする医薬品及び医薬部外品としての外用剤。
【請求項９】
前記レチノイン酸ナノカプセルを主成分とする化粧品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レチノイン酸ナノカプセル（レチノイン酸−CaC03ナノパーティクル）、そのレチノイン酸ナノカプセルを有効成分とする徐放性製剤、医薬品及び医薬部外品としての外用剤及びそのレチノイン酸を主成分とする化粧品に関する。
【０００２】
【従来技術】
脂溶性物質で急性前骨髄性白血病の治療薬として臨床応用されているレチノイン酸に関しては、生分解性のポリ乳酸をキャリアーとしてドラッグデリバリーシステム（DDS）化した研究（例えば、非特許文献１参照）、及び生分解性ポリマーのポリ乳酸−グリコール酸共重合体を使って注射製剤として可能とした研究（例えば、非特許文献２参照）がなされている。又化粧品にレチノイン酸が使用されていることも公知である（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】
特表平９−５０３４９９号公報（１頁〜２頁）
【非特許文献１】
Cho CS, Cho KY, Park IK, Kim SH, Sasagawa T, Uchiyama M, Akaike T.
Receptor-mediated delivery of all trans-retinoic acid to hepatocyte using poly(L-lactic acid) nanoparticles coated with galactose-carrying polystyrene.
J Control Release. 2001 Nov 9;77(1-2):7-15.
【非特許文献２】
Giordano GG, Refojo MF, Arroyo MH.
Sustained delivery of retinoic acid from microspheres of biodegradable polymer in PVR.
Invest Ophthalmol Vis Sci 1993 Aug;34(9):2743-51
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前述のようにレチノイン酸のDDS化の研究、注射剤として可能とした研究は、ほとんどの場合前述した如くポリ乳酸などの高分子をキャリアーとして使用して徐放化する研究である。
【０００５】
しかし、レチノイン酸が皮下投与された場合、その高い刺激性と脂溶性から炎症もしくは投与部位の腫瘍化が見られ、水に不溶であることから注射剤として、徐放性製剤として不向きであった。
【０００６】
又レチノイン酸はしわとり、皮膚の活性化等のために一部の高級化粧品に極微量に用いられることがあるが、レチノイン酸は、酸なので前述の如く刺激性が強く炎症を起こす等の弊害があり、ほとんど化粧品には使用されていない。
【０００７】
そこで、本発明は、皮下及び静脈内注射として可能であり、徐放性製剤としても使用でき、かつミセル化しているため骨髄にターゲットされ、さらに皮膚に塗布する医薬品及び医薬部外品としての外用剤及び化粧品にも使用できるレチノイン酸ナノカプセルを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明のレチノイン酸ナノカプセルは、レチノイン酸を少量の極性の高い有機溶媒に溶解し、アルカリを含む水で分散させ、次に非イオン界面活性剤を添加することよりなる混合ミセルに、２価金属塩を添加し、次に２価陰イオンを持つ塩を添加してなるものである。
特に、２価金属塩に対しモル比で3分の1以下の２価陰イオンを持つ塩を添加してなるレチノイン酸ナノカプセルである。
前記極性の高い有機溶媒には、エタノール，メタノール，アセトン，酢酸エチル，又はジメチルスルホキシドなどがあるが、エタノール及びメタノールは溶解度が高く、皮膚刺激性が少ないため最も好適である。
又、前記２価金属塩には塩化カルシウム，塩化マグネシウム，酢酸亜鉛などがあるが、塩化カルシウムが最も好適である。
又、前記２価陰イオンを持つ塩には炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどがあるが、炭酸ナトリウムであることが最も好適である。
【０００９】
又、前記２価金属塩と２価陰イオンを持つ塩のモル比が1：0.05〜0.33が好適であるが1：0.2が最も好適である。
たとえば、塩化カルシウムと炭酸ナトリウムのモル比を1：1とした場合、30分以上経過すると徐々に濁ってきて約３時間ぐらい経過すると沈澱が生じるようになるが、1：0.05〜0.33、特に1：0.2迄の場合は透明で、長時間の攪拌でも沈澱を生じない。
濁ったり、沈澱が生じるのは粒子径が大きいからであり、粒子径が大きい場合は、皮膚透過性が悪くなり、注射する場合でも不都合が生じる。
しかし、透明で沈澱も生じない場合は粒子径が小さくかつ分布が狭いためである。したがって皮膚透過性も良く注射にも不都合が生じないものである。
【００１０】
又、本発明の徐放性製剤、医薬品及び医薬部外品である外用剤は、レチノイン酸ナノカプセルを有効成分とするものである。
【００１１】
又、本発明の化粧品は、レチノイン酸ナノカプセルを主成分とするものである。
【００１２】
脂溶性物質で急性前骨髄球性白血病（acute  promyelocytic  leukemia，APL）の治療薬として臨床応用されているレチノイン酸（all−trans  retinoic  acid）は、アルカリ及び少量のエタノールもしくはメタノールを添加することで水中で球状ミセルを形成する。このミセルの表面はマイナス電荷で覆われた状態になっているため、容易にカルシウムイオン（Ca２+）が吸着（結合）し、ナトリウムイオンとの交換反応が起こる。
【００１３】
カルシウムイオンはナトリウムイオンに比べ吸着（結合）力が高いので、ミセル表面の電荷は解離しにくくなり水に不溶化しミセルは沈殿する。沈殿してしまうと粒子同士の凝集が起こり非常に大きな粒子を形成してしまうので、この現象を防ぐため、非イオン界面活性剤（例えばTween  80）をレチノイン酸とともに添加した。
【００１４】
Tween  80はレチノイン酸と混合ミセルを作り、ミセル表面上にポリオキシエチレン鎖（水に親和性が高い）を突出させているために、たとえカルシウムイオンが吸着（結合）しても親水基としてのポリオキシエチレン鎖がミセル表面に存在しているので沈殿は起こさない。
【００１５】
次に塩化カルシウムを添加する。カルシウムは２価イオンなのでナトリウムイオンよりも吸着（結合）する力が強く、ナトリウムイオンと交換が生じる。その結果カルシウムイオンが優先的に吸着（結合）することになり、カルシウムイオンが多数レチノイン酸表面に吸着（結合）し、表面がカルシウムイオンでおおわれた球状、もしくは卵形等のミセルが形成される。
【００１６】
そこに、更に炭酸ナトリウムを添加すると、ミセル表面電価は完全に中和されていないため、さらに炭酸イオンが表面にあるカルシウムイオンに吸着（結合）して結晶化する。
【００１７】
この結果、レチノイン酸のミセル表面に炭酸カルシウム膜を形成することが出来た。塩化カルシウム及び炭酸ナトリウムによる沈殿法で形成される炭酸カルシウムは通常カルサイトと呼ばれる分解性の低い結晶を形成する。しかし、曲率を持ったミセル面に形成される炭酸カルシウム層は、硬い結晶構造をとりにくいと考えられ、いわゆるガラス構造をしているアモルファスもしくは準安定相であるバテライトを形成すると考えられる。アモルファスは結晶構造ではないことから、生分解性が高く容易に分解されるものである。又バテライトは一般に他の結晶構造であるカルサイトやアラゴナイトに比べ水への溶解度が高く、従って生分解性も高い。
【００１８】
本製剤は生体内で徐々に炭酸カルシウム層が分解し、薬物であるレチノイン酸が徐放され薬理効果を増強させることが期待される。また、従来、レチノイン酸が皮下投与された場合、その高い刺激性と脂溶性から炎症もしくは投与部位の腫瘍化が見られ、水に不溶であることから注射剤としては不向きであったが、本製剤は透明溶液の形態を持っているため、皮下及び静脈内注射としても可能である。しかも皮下投与部位は低刺激で炎症などは観察されなかった。
さらに、前述の如く透明溶液の形態なので粒子が小さい（数〜数100ナノメータのサイズ）こと、炭酸カルシウム膜により刺激性がなく炎症がないということから、皮膚に塗布した場合は、しわとり、皮膚の活性化等に効果があり、外用剤及び化粧品にも用いることが出来るものである。
このような利点を持つ本発明のレチノイン酸ナノカプセルは新たなＤＤＳ化の形態としても大いに期待できるものである。
【００１９】
【実施例】
以下本発明の実施例について記述する。
［試薬及び実験方法］
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2）実験方法
（実験方法１）
レチノイン酸ーCaCO3ナノカプセルの作製      レチノイン酸13.6 mgを900 μLのエタノールもしくはメタノールに溶解し、0.5 N NaOH 100 μLを加える（この時pH=7〜7.5）。この溶液を母液として100μＬ採取し、これをTween 80 100μLを含む蒸留水に加えよく攪拌する。約30分後、5 M CaCl2を15 μL加え攪拌し、30分後1 M Na2CO3を15 μL加え更に攪拌する。一昼夜攪拌後、溶液を１晩凍結乾燥する。実験に使用する際は凍結乾燥後のペーストを蒸留水で所定の濃度に再分散させて使用する。
（実験方法２）
レチノイン酸ーCaCO3ナノカプセルの作製      レチノイン酸13.6 mgを900 μLのエタノールもしくはメタノールに溶解し、0.5 N NaOH 100 μLを加える（この時pH=7〜7.5）。この溶液を母液として100μＬ採取し、これをTween 80 100μLを含む蒸留水に加えよく攪拌する。約30分後、5 M CaCl2を15 μL加え攪拌し、30分後1 M Na2CO3を75 μL加え更に攪拌する。一昼夜攪拌後、溶液を１晩凍結乾燥する。実験に使用する際は凍結乾燥後のペーストを蒸留水で所定の濃度に再分散させて使用する。
【００２０】
実験方法１及び実験方法２における炭酸ナトリウムを添加した際の溶液の透過度変化を下記の表１に示す。
表１    炭酸ナトリウムを添加した際の、溶液の透過度変化。
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横軸は、塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比を、縦軸は280 nmにおける透過性（数値が大きいほうが透明性が高い）を示す。炭酸ナトリウムを添加するに従って、溶液は徐々に濁り初め、最終的には沈殿が観察される。沈殿領域では、添加直後から30分までは透明もしくはやや白濁状態であるが、それ以上の時間の攪拌では沈殿を生じ始め、そのため上清の濁度は上昇する。
【００２１】
図１は、このレチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクルの写真を示す図面である。中央はレチノイン酸粉末、右はレチノイン酸を水で分散させたもの、左はレチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクルを示している。
【００２２】
in vitro 実験（B16 melanoma 細胞への添加実験）    B16 melanoma 細胞(2 x 104)を２４時間培養する。その後レチノイン酸及びレチノイン酸-CaCO3ナノパーティクルを培地に添加、更に48時間培養した。3H-thymidine  取り込み量を測定し、細胞のDNA合成能を比較検討した。
in vivo実験（ラットに皮下投与後の血中動態）    Wistar rat (♂、７週齢)の皮下にレチノイン酸及びレチノイン酸-CaCO3ナノパーティクル（3Hラベル化したものを使用）を投与した。その後時間ごとに血液を採取、血中のレチノイン酸量をシンチレーションカウンターにて測定した。
【００２３】
１）レチノイン酸-CaCO3ナノパーティクルの物理化学的性質
レチノイン酸-CaCO3製剤の粒子径及び表面電荷を動的光散乱装置で測定した結果を下記の表２に示す。
表２
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レチノイン酸のミセルに比べCaCO3コーティングした粒子は20〜40ｎｍ小さくなってる。これはミセル表面にCaCO3膜が形成されたために、表面の吸着（結合）水層が破壊されてしまったために測定値が小さく検出されたと考えられる。
CaCO3膜が形成された証拠の一つとして、ゼータ電位が減少していることからもその結果を反映している。
塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比が1.0の場合は、攪拌時間とともに粒子は見掛け上凝集魂を形成してしまうため、測定された粒子直径は大きい結果が得られている。しかしながら塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比0.2の場合は、凝集しにくいため孤立（単独）に分散化された小さい粒子径が得られている。ゼータ電位も塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比０.2では表面が充分に炭酸カルシウム膜で被覆されていることを示唆している。
【００２４】
図２及び図３は、それぞれレチノイン酸ミセルの形成濃度とレチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクル（炭酸ナトリウム量が塩化カルシウムに対してモル比で1.0で、攪拌を１時間行った場合）の流体力学的直径（水和層を含んだ大きさ）を動的光散乱法により測定した結果を示す図である。ミセル形成濃度（critical  micellar  concentration，CMC）は電気伝導度法による比伝導度値変化の屈曲点より決定した。
【００２５】
さらに、炭酸ナトリウム量が塩化カルシウムに対してモル比で0.2で、攪拌を一昼夜行った場合と、炭酸ナトリウム量が塩化カルシウムに対してモル比で1.0で、攪拌を１時間行った場合の、レチノイン酸ナノパーティクルの粒子径（流体力学的直径）分布を以下図４に示す。
上記の図４により、モル比が0.2の場合は長時間の攪拌を続けてもその粒子径はほぼ一定であることがわかる。一方、モル比が1.0の場合は、１時間の攪拌ですでに粒子径分布は非常に広く、平均粒子径もモル比0.2の場合よりも大きい。攪拌を続けることで、粒子はさらに凝集し、最終的に沈殿が生じる。
濁ったり、沈澱が生じるのは粒子径が大きいからであり、粒子径が大きい場合は、皮膚透過性が悪くなり、注射する場合でも不都合が生じる。
しかし、透明で沈澱も生じない場合は粒子径が小さくかつ分布が狭いためである。したがって皮膚透過性も良く注射にも不都合が生じないものである。
【００２６】
図５は、レチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクルの凍結割断透過型電子顕微鏡の写真を示す図（freeze-fracture Transmittance Electron Microscopy, ff-TEM）である。真横に割断されたミセルの断面にはいわゆるコアーシェル構造が観察された。従って、レチノイン酸をコアにCaCO3膜をシェルとした構造が形成されていると思われる。バーの長さは1μmに相当する。
【００２７】
２）in  vivo実験の結果
図６は、レチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクル（炭酸ナトリウムの塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比は1.0）をラットの皮下に投与した際の血中動態の結果を示す図である。レチノイン酸ミセルの場合は、約１時間で血中に放出されてしまうが、レチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクルの場合、初期値は抑えられその放出は約７日間続いた。
この結果より、レチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクルはレチノイン酸の徐放化製剤として 有用であることが見出された。
図７は、皮膚に塗布した場合のラットの血中動態試験の結果であるが、使用した製剤の塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比が0.2の場合である。塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比が1.0の場合よりも、短い時間から血中に効率良く入っていることがわかる。
【００２８】
図８は、投与後１０日目の投与皮下部位の写真を示す図である。左がレチノイン酸単独、右がレチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクルを投与したものである。レチノイン酸は刺激が高く、炎症を起こしているのがよくわかるが、レチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクルは全くそのような症状は見られず皮膚刺激性も低く外用剤及び化粧品への応用も期待できる。
【００２９】
３）in  vitro  実験の結果
図９は、レチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクルの薬理効果を確認するために、B１６メラノーマ細胞に対する増殖抑制効果を実験したものである。レチノイン酸が、B１６メラノーマ細胞に対し増殖抑制効果があることはよく知られていることから、この系を使って製剤化したものの活性及び効果を検討した。レチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクルは、添加量の増加に伴いレチノイン酸単独よりも高い抑制効果を示すことがわかった。
【００３０】
図１０は、HB-EGF mRNA産生量の比較（動物実験）である。ddY mouseの耳介に、各ワセリン基剤製剤（レチノイン酸として0.1%）を１日30 mg/ear塗布し、4日間塗布を続けた。5日目に耳を切除し、RNAを抽出、real-time PCR法により、HB-EGF mRNAを測定した。同時にHouse-keeping geneとしてGAPDH mRNAも合成及び測定し、相対値として定量した。
この図１０より、塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比0.2の場合は、塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比1.0の場合よりも優位に産生量が高いことがわかる。
【００３１】
なお、図２，図３，図６及び図９におけるRAはレチノイン酸，RA- CaCO3はレチノイン酸ーCaCO3ナノパーティクルのことである。
【図面の簡単な説明】
【図１】レチノイン酸−CaCO3ナノパーティクルの写真を示す図である。
【図２】レチノイン酸の臨界ミセル濃度を示す図である。
【図３】レチノイン酸ミセル及びレチノイン酸−CaCO3ナノパーティクルの、塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比1．0の場合の、流体力学的直径を示す図である。
【図４】レチノイン酸−CaCO3ナノパーティクルの、塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比1．0及び0．2の場合の、流体力学的直径を示す図である。
【図５】凍結割断透過性顕微鏡の写真を示す図である。
【図６】塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比1.0の場合の、レチノイン酸−CaCO3ナノパーティクルをラットの皮下に投与後の血中放出レチノイン酸濃度推移を示す図である。
【図７】塩化カルシウムに対する炭酸ナトリウムのモル比0.2の場合の、レチノイン酸−CaCO3ナノパーティクルをラットの皮膚に塗布した場合の血中放出レチノイン酸濃度推移を示す図である。
【図８】１０日後の皮下投与部位の写真を示す図である。
【図９】メラノーマ細胞のRA刺激による３H−チミジン取り込み量を示す図である。
【図１０】HB-EGF mRNA産生量の比較（動物実験）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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