(57)【要約】【課題】核酸の伸長反応における不純核酸による汚染の発生を防止する方法を提供する。【解決手段】鋳型核酸とプライマーとを用いポリメラーゼによって目的の核酸を伸長する方法において、（１）当該伸長反応を行うための反応系にヌクレアーゼと、抱埋剤およびそこに内包されるプライマーを具備する抱埋化プライマーとを存在させることと、（２）当該ヌクレアーゼが適切に核酸を分解する条件下に前記（１）に記載の反応系を維持することと、（３）前記（２）の維持することの後に、前記反応系の温度を上昇させることにより、当該ヌクレアーゼを不活性化し、且つ抱埋化プライマーからプライマーを流出させる条件下に維持することと、（４）前記（３）の維持することの後に、適切な伸長反応が得られる条件下に、前記（３）に記載の反応系を維持することとを具備することを特徴とする核酸汚染防止方法。【選択図】　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸とプライマーとを用いポリメラーゼによって目的の核酸を伸長する方法において、
（１）当該伸長反応を行うための反応系にヌクレアーゼと、抱埋剤およびそこに内包されるプライマーを具備する抱埋化プライマーとを存在させることと、
（２）当該ヌクレアーゼが適切に核酸を分解する条件下に前記（１）に記載の反応系を維持することと、
（３）前記（２）の維持することの後に、前記反応系の温度を上昇させることにより、当該ヌクレアーゼを不活性化し、且つ抱埋化プライマーからプライマーを流出させる条件下に維持することと、
（４）前記（３）の維持することの後に、適切な伸長反応が得られる条件下に、前記（３）に記載の反応系を維持することと、
を具備することを特徴とする核酸汚染防止方法。
【請求項２】
鋳型核酸とプライマーとを用いポリメラーゼによって目的の核酸を伸長する方法において、
（１）そこにおいて当該伸長反応を行うための反応系にヌクレアーゼと、抱埋剤およびそこに内包されるプライマーを具備する埋化プライマーと、ポリメラーゼと、基質とを存在させることと、
（２）当該ヌクレアーゼが適切に核酸を分解する条件下に前記（１）に記載の反応系を維持することと、
（３）前記（２）の維持することの後に、前記反応系の温度を上昇させることにより、当該ヌクレアーゼを不活性化し、且つ抱埋化プライマーからプライマーを流出させる条件下に維持することと、
（４）前記（２）の維持することの後に、前記反応系に鋳型核酸を添加することと、
（５）適切な伸長反応が得られる条件下に、前記（４）に記載の反応系を維持することと、
を具備することを特徴とする核酸汚染防止方法。
【請求項３】
前記抱埋化プライマーが、熱により流動化する抱埋剤と、前記抱埋剤の内包されるプライマーとを具備することを特徴とする請求項１または２に記載の核酸汚染防止方法。
【請求項４】
前記抱埋剤がゲル化剤であることを特徴とする請求項３に記載の核酸汚染防止方法。
【請求項５】
前記抱埋剤がポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、光架橋性樹脂、カラギーナン、アルギン酸、寒天およびアガロースからなる群より選択されることを特徴とする請求項３に記載の核酸汚染防止方法。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載の核酸汚染防止方法。
【請求項７】
熱により流動化する抱埋剤と、前記抱埋剤の内部に保持されたプライマーとを具備することを特徴とする抱埋化プライマー。
【請求項８】
前記抱埋剤がゲル化剤であることを特徴とする請求項７に記載の抱埋化プライマー。
【請求項９】
前記抱埋剤がポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、光架橋性樹脂、カラギーナン、アルギン酸、寒天およびアガロースからなる群より選択されることを特徴とする請求項７に記載の抱埋化プライマー。
【請求項１０】
容器と、前記容器に収容された請求項７から９の何れか１項に記載の抱埋化プライマーとを少なくとも具備する核酸伸長反応用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、汚染防止方法、それにおいて使用される抱埋化試薬およびそれを具備するキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
確定診断の根拠となる遺伝子検査方法、特に、核酸増幅検査（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応；以下、ＰＣＲ法と記す）では、測定の精度管理、信頼性の保証が重要である。核酸増幅法を用いる際に、最も注意が必要な点はコンタミネーションである。仮に１分子のゲノムが混入しただけでも、反応後には、それが数十万倍に増幅され、フォルスポジティブなどの誤診に繋がる。これまでの汚染防止対策としては、ウラシル−Ｎ−グリコシダーゼ（ＵＮＧ）を用いる方法が知られている。この方法は、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを用いて増幅反応を行い、反応後ＵＮＧを使って分解するものである。しかしながらＵＮＧ法では、増幅産物の汚染に対しての制御は可能であるが、微量な非増幅産物の汚染については対応できない。
【０００３】
従って、現在、全ての汚染に対応可能な汚染防止方法が求められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような状況に鑑み、本発明の目的は、核酸の伸長反応、特に増幅反応における核酸夾雑物による汚染の発生を防止するための手段を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するための本発明は、
鋳型核酸とプライマーとを用いポリメラーゼによって目的の核酸を伸長する方法において、
（１）当該伸長反応を行うための反応系にヌクレアーゼと、抱埋剤およびそこに内包されるプライマーを具備する抱埋化プライマーとを存在させることと、
（２）当該ヌクレアーゼが適切に核酸を分解する条件下に前記（１）に記載の反応系を維持することと、
（３）前記（２）の維持することの後に、前記反応系の温度を上昇させることにより、当該ヌクレアーゼを不活性化し、且つ抱埋化プライマーからプライマーを流出させる条件下に維持することと、
（４）前記（３）の維持することの後に、適切な伸長反応が得られる条件下に、前記（３）に記載の反応系を維持することと、
を具備することを特徴とする核酸汚染防止方法；
熱により流動化する抱埋剤と、前記抱埋剤の内部に保持されたプライマーとを具備することを特徴とする抱埋化プライマー；および
容器と、前記容器に収容された上記の抱埋化プライマーとを少なくとも具備する核酸伸長反応用キットである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、核酸検査における汚染対策のための試薬および核酸検査の精度管理方法に関する。
【０００７】
本発明に従うと、抱埋化プライマーとヌクレアーゼを使用することにより、核酸の伸長反応における核酸夾雑物による汚染の発生を防止する方法が提供される。
【０００８】
１．用語の説明
ここで使用される「核酸を伸長する」の語は、鋳型核酸と、その一部の塩基配列に相補的なプライマーとを用いて、ポリメラーゼを作用させることにより、目的とする核酸を伸長することをいい、更に、そのような伸長と、そのような伸長が繰り返し行われる増幅の両方を示す。
【０００９】
ここで使用される「抱埋化プライマー」の語は、抱埋剤の内部に具備され（即ち、内包された）プライマーをいう。ここで使用される「抱埋」とは、プライマーが抱埋剤に包まれることにより、その外界と隔絶され安定に存在することを指す。
【００１０】
ここで使用される「適切に伸長反応が得られる条件」とは、ポリメラーゼが核酸鎖を合成するための各種条件、例えば、温度、ｐＨ、塩濃度およびｄＮＴＰなどの条件が、ポリメラーゼの活性を適切に得るために十分であるような状態を示す。
【００１１】
ここで使用される「ヌクレアーゼが適切に核酸を分解する条件」とは、ヌクレアーゼが核酸を分解するための各種条件、例えば、温度、ｐＨ、塩濃度および補酵素などの条件が、ヌクレアーゼの活性を適切に得るために十分であるような状態を示す。
【００１２】
ここで使用される「反応系」の語は、反応を行うための空間を示す。例えば、容器の内部、およびそこにおいて反応を行うための基体の表面などであればよい。
【００１３】
１．汚染防止方法
本発明の１態様を図１を用いて以下に説明する。先ず、そこにおいて伸長反応を行おうとする反応系にヌクレアーゼを添加する。その際、目的とする伸長反応に必要な物質であって、鋳型および鋳型として使用される核酸以外の物質例えば、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝剤および抱埋化プライマーなどの伸長反応に必要な物質を存在させておいてよい。ただし好ましくは、鋳型核酸はヌクレアーゼ反応終了後の酵素を不活化した後に添加するのが良い。
【００１４】
次に、ヌクレアーゼが核酸分解反応を行い得る条件に、当該反応系を維持する。例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼの場合であれば、３７℃で数十秒から１時間維持すればよい。選択されるヌクレアーゼに応じて適切な条件が選択されてよい。
【００１５】
その後、エキソヌクレアーゼが不活性化され得る条件に、当該反応系を維持する。例えば、５’→３’λ−エキソヌクレアーゼの場合であれば、７５℃以上で１０分間維持すればよい。選択されるヌクレアーゼに応じて適切な条件が選択されてよい。
【００１６】
続いて、鋳型となる所望の核酸を当該反応系に添加し、所望の伸長反応を行う。
【００１７】
本態様では、当該反応系へのヌクレアーゼの添加の前、同時またはその後に、目的とする伸長反応に必要な物質であって、鋳型として使用される核酸以外の物質、例えば、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝剤および抱埋化プライマーなどの伸長反応に必要な物質を存在させている。その状態で当該反応系の温度を変更して、ヌクレアーゼを活性化し、その後、更に当該温度を変更してヌクレアーゼを不活性化している。抱埋化プライマーは、ヌクレアーゼの不活性化の際の温度により流動化する。流動化により、抱埋剤の内部に存在するプライマーが反応系に放出される。このようにヌクレアーゼの不活性化と同時に抱埋剤の流動化を行うことは当該方法を簡便にしたり、且つ工程を少なくするために有利である。
【００１８】
しかしながら、それらの試薬の添加は上述の時期に限定するものではない。即ち、鋳型として使用される核酸以外の目的とする伸長反応に必要な物質、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝剤および抱埋化プライマーなどの試薬は、上述のようなヌクレアーゼの添加の前、同時またはその後に限定するものではなく、所望の伸長反応が開始される時点で反応系に存在していればよい。しかしながら、伸長反応に使用される試薬中に目的としない核酸夾雑物が存在している可能性もあるので、それらの試薬についてもヌクレアーゼで処理することが好ましい。
【００１９】
また、ヌクレアーゼの不活性化と抱埋剤の流動化とを同時に行わなくてもよく、ヌクレアーゼの不活性化を温度の調節またはその他の条件の変更により行い、その後、抱埋剤の流動化が達成される温度に反応系の温度を上昇させ、プライマーを放出してもよい。しかしながら、ヌクレアーゼの不活性と、抱埋剤の流動化の後に核酸の伸長反応を行うため、所望の伸長反応を阻害しないようにヌクレアーゼの活性化および不活性化、並びに抱埋剤の流動化が行われることが必要である。
【００２０】
このような本発明の態様により、核酸の伸長反応における不純核酸による汚染の発生が防止された状態で目的とする増幅などの伸長反応が達成される。このような本願発明の態様に従うと、簡便な操作により核酸汚染が防止され、より高い信頼性を有する伸長方法が提供される。
【００２１】
２．抱埋化プライマー
本発明の態様に従って使用され得る抱埋化プライマーとは、それ自身公知の伸長反応において使用されるプライマーと、このプライマーをその内部に抱埋するための抱埋剤とを具備する試薬である。抱埋剤によって抱埋化されることにより、当該プライマーは必要時まで外部環境から隔絶されて安定に保たれる。
【００２２】
そのような抱埋化プライマーの例を図２に示す。本発明の態様に従う抱埋化プライマー１は、それ自身公知の伸長反応において使用されるプライマー２と、このプライマーをその内部に抱埋するための抱埋剤３とを具備する試薬である。
【００２３】
本発明の態様において使用され得るプライマーは、それ自身公知の核酸の伸長において使用され得るプライマーであればよく、例えば、ＤＮＡプライマーであっても、ＲＮＡプライマーであってもよい。また、所望に応じて種々の修飾または標識などを施したプライマーが使用されてもよい。また、プライマーの末端はリン酸化されている事が望ましい。
【００２４】
本発明の態様に従って使用され得る抱埋剤は、温度に依存して以下のような性質を示す物質であればよい。即ち、比較的低い温度、例えば、好ましくは約５０℃〜約７５℃以下では固まって流動性を失い、例えば、ゼリー状のような固形形態をとる。その場合にはその内部に抱埋されるプライマーを、当該抱埋剤の存在によってその外部環境から隔絶する。一方、当該抱埋剤は、その流動化温度（若しくは融解温度）またはそれ以上の温度に曝されると、固形形態が崩壊して流動性のある形態になり、その結果、その内容物であるプライマーを当該外部環境に放出する。ここで好ましい流動化温度（若しくは融解温度）は約５０〜約７５℃以上である。
【００２５】
抱埋剤の例は、これらに限定するものではないが、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミドおよび光架橋性樹脂などの合成高分子、並びにカラギーナン、アルギン酸、寒天およびアガロースなどの天然高分子からなるゲル化剤等が挙げられる。
【００２６】
抱埋剤によるプライマーの抱埋は、それ自身公知の何れの手段により行ってもよい。例えば、ポリビニルアルコールを抱埋剤として用いる場合には、所望のプライマーをポリビニルアルコール溶液に懸濁し、凍結融解を繰り返してゲルビーズを作製すればよい。得られたゲルビーズを抱埋化プライマーとして使用すればよい。また、アガロースを使う場合は、７０℃以上で溶解したアガロース溶液にプライマーを添加して室温に戻すことで抱埋化プライマーを作製できる。更に、作製の際、低温の緩衝溶液中にアガロース溶液を滴下すると簡単にビーズ状のゲルを作製できるので、操作性が向上する。
【００２７】
また、上述した本発明の態様に従う核酸の伸長反応における不純核酸による汚染の発生を防止する方法では、プライマーのみを抱埋剤に抱埋した例を示したが、本発明の趣旨によれば、少なくともプライマーが抱埋化されておればよく、従って、ヌクレアーゼ以外の試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、ｄＮＴＰなどの基質、またはそれらの一部を抱埋剤に抱埋し、抱埋化物質として使用してもよい。その場合、プライマーと共に抱埋してもよく、所望の物質を単数で、または複数組み合わせて抱埋してもよい。また、使用されるプライマーのセンス鎖およびアンチセンス鎖は一緒に抱埋されてもよく、別々に抱埋されてもよい。
【００２８】
このような抱埋化プライマーおよびそれと組み合わせて使用する抱埋化物質は、汚染防止を達成しつつ核酸を伸長するための抱埋化試薬として、本発明の更なる態様として提供される。
【００２９】
３．伸長反応
本発明の態様に従って利用され得る伸長反応は、それ自体公知の一般的に核酸を伸長するために使用される手段であっても、および核酸を増幅するために使用される手段であってもよく、そのような手段で有れば何れも使用してよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（一般的にＰＣＲと称される、以下、ＰＣＲと記す）や逆転写ＰＣＲなどを利用した方法を用いることが可能である。また更に、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｔｒａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）、Ｌｉｇａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）、Ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｎｄ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ（ＩＣＡＮＮ）および　Ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｉｒｃｌｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法などの手段も本発明の態様に従って利用することが可能である。
【００３０】
本発明の態様に従って使用され得るヌクレアーゼは、それ自身公知の何れの核酸分解酵素も使用することが可能である。そのようなヌクレアーゼの例は、これに限定するものではないが、例えば、エキソヌクレアーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ、λ−エキソヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、Ｔ７ジーン６エキソヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ　Ｉ、およびＲＮａｓｅなどであり、λ−エキソヌクレアーゼが好ましい。
【００３１】
４．抱埋化プライマーを具備するキット
上述した抱埋化プライマーを具備するキットも本発明の１態様である。図３にそのようなキットの１例を示す。本願発明の態様に従うキット４は、少なくとも抱埋化プライマー１と容器５を具備する。キットに具備される抱埋化プライマー１と容器５は、独立してキットに具備されても、容器５に収容されて抱埋化プライマー１が具備されてもよい。
【００３２】
容器５は、抱埋化プライマーの乾燥を防止したり、汚染を防止したり、また、そこにおいて実施される反応に有利であるように蓋６を具備していてもよい。図３では容器５と蓋６が一体化している例を示したが、これらが別体で独立して具備されてもよい。また、キット４には、抱埋化プライマーを安定に維持するための溶液７が具備されてもよい。しかしながら、溶液７の存在は必須ではない。更に、キット４には、使用の際までその活性が維持されるような状態でヌクレアーゼが具備されてもよく、例えば、容器５に収容され具備されてもよく、容器５に収容されずに具備されてもよい。
【００３３】
本発明の態様に従うと、当該キットに具備される容器５は、そこにおいて核酸の伸長反応を行える容器であってもよく、単に試薬を維持するための容器であってもよい。そのような容器は、一般的に使用されるそれ自身公知の容器を用いることが可能である。例えば、容器の大きさは内容量が約１０μＬ〜約２ｍＬであればよい。また、容器は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネートおよびフルオロカーボンなどの樹脂製またはガラス製などの容器であってよく、例えば、マイクロチューブや試験管などであってよい。また、当該容器は、それ自身公知の複数のウェルを有するマルチウェルプレートまたはマイクロタイタープレートなどの容器であってもよい。
【００３４】
また、抱埋化プライマーの他に、上述の他の抱埋化試薬や非抱埋化試薬が、溶液中または溶液外で当該キットに具備されてもよい。
【００３５】
５．汚染防止方法の更なる態様
上述した汚染防止方法の更なる態様を図４を用いて説明する。先ず、そこにおいて伸長反応を行おうとする反応系にヌクレアーゼと抱埋化プライマーを添加する。
【００３６】
次に、ヌクレアーゼが核酸分解反応を行い得る条件に、当該反応系を維持する。例えば、λ−エキソヌクレアーゼの場合であれば、３７℃で１分間維持すればよい。
【００３７】
その後、エキソヌクレアーゼが不活性化され得る条件に、当該反応系を維持する。例えば、λ−エキソヌクレアーゼの場合であれば、７５℃に１０分間維持すればよい。
【００３８】
続いて、当該反応系に鋳型となる所望の核酸と、目的とする伸長反応に必要な物質、例えば、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝剤および抱埋化プライマーなどの伸長反応に必要な物質を添加し、所望の伸長反応を行う。
【００３９】
このような本発明の態様により、核酸の伸長反応における不純核酸による汚染の発生が防止された状態で目的とする増幅などの伸長反応が達成される。このような本願発明の態様に従うと、簡便な操作により核酸汚染が防止され、より高い信頼性を有する伸長方法が提供される。
【００４０】
実施例
第１の実施例
図２に示すような、本発明の態様に従う抱埋化試薬を作製した。５’末端をリン酸化したプライマーをポリビニルアルコール溶液に懸濁し、凍結融解を繰り返しゲルビーズを作製した。得られたゲルビーズが抱埋化試薬である抱埋化プライマーである。
【００４１】
第２の実施例
図３に示すような本発明の態様に従う抱埋化プライマーを具備するキットを作製した。０．２ｍＬのマイクロチューブ内に、ポリビニルアルコールに抱埋した５’リン酸化プライマーおよび５’ビオチン化プライマー、並びにｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ、１０×ＰＣＲ緩衝液、λ−ヌクレアーゼを添加し、チューブの蓋を閉めた。これを抱埋化プライマーを具備するキットとした。
【００４２】
当該キットは、核酸の増幅を行う際は、使用時に鋳型ＤＮＡなどの鋳型核酸を含む溶液を前記マイクロチューブに添加し、所望の条件下で反応を行えばよい。
【００４３】
第３の実施例
図５は、本発明の態様に従うに係る汚染防止方法を行った。図２の実施例に記載した通りに作製したキットを使用し、核酸の伸長反応としてＰＣＲ増幅反応を行った。また、予め同じプライマーで増幅される異なる長さの鋳型（夾雑物）を添加した。まず、３７℃で１分間ヌクレアーゼの反応を行った。次に、７５℃で１０分間反応させてヌクレアーゼを失活させた。その後、当該チューブ内に鋳型核酸を添加し、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒を４０サイクル行い、その前に９５℃で１０分、後に７２℃で１０分の処理を行った。これにより核酸鎖が合成された。比較のためにヌクレアーゼのみを除いた反応チューブを用意し同様の実験を行なった。その後、アビジン標識磁気微粒子を用いて、反応産物中のビオチンをこれに結合させることによって反応産物を回収した。続いて、得られた反応産物を温度によって一本鎖核酸にした。次に電気泳動により得られた一本鎖の同定をした。その結果、ヌクレアーゼを添加した系では目的とする反応産物以外の汚染核酸に由来すると思われる夾雑物のバンドは見られなかったが、ヌクレアーゼを添加しなかった系では、夾雑物のバンドが見られた。
【００４４】
このような本発明の態様に従う方法により、チューブ内に増幅産物またはゲノムが混入していた場合であっても、ヌクレアーゼによって分解することによって汚染を除去することが可能である。それにより、汚染による誤診などを未然に防ぐことが可能になる。
【００４５】
【発明の効果】
上述のような本発明によれば、核酸の伸長反応における不純核酸による汚染の発生を防止するための手段が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の態様に従う核酸伸長反応を示すスキーム図。
【図２】本発明の態様に従う抱埋化プライマーの例を模式的に示す図。
【図３】本発明の態様に従う抱埋化プライマーを具備するキットの例を模式的に示す図。
【図４】本発明の態様に従う核酸伸長反応を示すスキーム図。
【図５】第３の実施例で行った方法の手順をを示すスキーム図。
【符号の説明】
１．抱埋化プライマー　　２．プライマー　　３．抱埋剤　　４．キット　　５．容器　　６．蓋　　７．溶液
【図１】
2004057055.tif 000003
【図２】
2004057055.tif 000004
【図３】
2004057055.tif 000005
【図４】
2004057055.tif 000006
【図５】
2004057055.tif 000007