(57)【要約】【課題】自己免疫性皮膚炎等に代表される皮膚症状，脱毛，掻痒に対する、被験物の作用を調べることのできる評価方法，当該評価に用いることのできるトランスジェニック動物，並びに皮膚炎，脱毛，掻痒の予防又は治療剤を提供すること。【解決手段】ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるインターロイキン−１８遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用い、被験物の脱毛又は掻痒に与える影響を評価する方法，又は当該マウスを使用し、評価指標として下記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）を用い、被験物の皮膚に与える影響を評価する方法。（Ａ）自然発症皮膚炎（Ｂ）起炎物初回投与時の皮膚炎症【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるインターロイキン−１８遺伝子を導入したげっ歯類を用い、被験物の皮膚に与える影響を評価する方法であって、評価指標として下記の（Ａ）及び／又は（Ｂ）を用いることを特徴とする被験物の評価方法。
（Ａ）自然発症皮膚炎
（Ｂ）起炎物初回投与時の皮膚炎症
【請求項２】
自然発症皮膚炎が、生後４〜１５日目にピークを迎えるものであることを特徴とする、請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
評価目的が、自己免疫性皮膚炎の予防又は治療剤のスクリーニングであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項４】
ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるインターロイキン−１８遺伝子を導入したげっ歯類を用い、被験物の、脱毛に与える影響を評価する方法。
【請求項５】
評価目的が、脱毛の予防又は治療剤のスクリーニングであることを特徴とする、請求項４に記載の評価方法。
【請求項６】
ＮＫ１．１抗原を有する細胞を抑制する物質を含むことを特徴とする、皮膚炎又は脱毛あるいは掻痒の予防又は治療剤。
【請求項７】
ＮＫ１．１抗原を有する細胞を抑制する物質が、ＮＫ１．１抗原を有する細胞に対する抗体であることを特徴とする、請求項６記載の皮膚炎又は脱毛あるいは掻痒の予防又は治療剤。
【請求項８】
ＮＫ１．１抗原を有する細胞に対する抗体が、AsialoＧＭ１抗原を認識する抗体，ＮＫ1.1抗原を認識する抗体，又はLy49抗原を認識する抗体の少なくとも一種であることを特徴とする、請求項７記載の皮膚炎又は脱毛あるいは掻痒の予防又は治療剤。
【請求項９】
被験物の脱毛に与える影響を評価するために用いられるトランスジェニック動物であって、げっ歯類にケラチノサイトプロモーターの制御下にあるインターロイキン−１８遺伝子を導入したものであることを特徴とするトランスジェニック動物。
【請求項１０】
評価目的が、脱毛の予防又は治療剤のスクリーニングであることを特徴とする、請求項９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
被験物の掻痒に与える影響を評価するために用いられるトランスジェニック動物であって、げっ歯類にケラチノサイトプロモーターの制御下にあるインターロイキン−１８遺伝子を導入したものであることを特徴とするトランスジェニック動物。
【請求項１２】
評価目的が、掻痒の予防又は治療剤のスクリーニングであることを特徴とする、請求項１１に記載のトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性皮膚炎等に代表される皮膚症状や脱毛に対する、被験物の作用を調べることのできる評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アトピー性皮膚炎を含む自己免疫皮膚炎における、インターロイキン−１８（以下IL-18と記載する。）の果たす役割が注目されており、ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるIL-18遺伝子を導入したトランスジェニックマウスが作成され、当該トランスジェニックマウスを用いて、炎症発生機構の解明が進められている。
【０００３】
特に、ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるIL-18を皮膚に過剰発現させたトランスジェニックマウスを用いた最近の研究では、IL-18がトリニトロクロロベンゼン（TNCB）等の起炎物の繰り返し投与によって誘発される接触性皮膚炎（遅延性アレルギーの一種と考えられる）の悪化に深く関与していることが明らかにされ、IL-18の拮抗剤が新規皮膚炎治療薬の創出に繋がることが示唆されている。
【非特許文献１】川瀬  裕介，他８名，“IL-18トランスジェニックマウスではtrinitrochlorobenzene誘発接触性皮膚炎が増強される”，平成１３年９月，日本研究皮膚科学会第２６会年次学術大会・総会・プログラム、144頁
【０００４】
本願発明者等は、新規皮膚炎治療薬のスクリーニングに、当該トランスジェニックマウスを用いることを企図したが、このスクリーニング方法は、起炎物の繰り返し投与（週一回・６週間等の投与日数）が必要とされる為、時間がかかるうえ操作が煩雑であるなど実施しづらい面があった。
【０００５】
一方、IL-18過剰発現と脱毛との関係については、未だ知られておらず、IL−18遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを、脱毛の評価等に用いることができるとは、全く考えられていなかった。
【０００６】
また、このトランスジェニックマウスで、皮膚炎や脱毛を予防又は治療する物質を具体的にスクリーニングした例は報告されていなかった。
【０００７】
更に、掻痒の動物モデルは、従来ほとんど報告されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者等は、ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるIL-18遺伝子を導入したトランスジェニックマウスが、生後間もない時期に自然発症的な炎症のピークを迎えること，及び当該ピークが治まった後に、起炎物を一度投与するだけで、皮膚炎を強力に発症することを見いだした。
【０００９】
また、本発明者等は、ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるIL-18遺伝子を導入したトランスジェニックマウスが、１５週齢前後から脱毛を発症するとともに掻痒症状を示すこと，及び当該トランスジェニックマウスを用いたスクリーニングによって得られた物質が、脱毛等の原因となる皮膚炎、毛包炎や掻痒症状を予防又は治療できることを見いだした。
【００１０】
本発明者等は、これらの知見に基づき、本発明に到達した。
【００１１】
従って、本発明の目的とするところは、自己免疫性皮膚炎等に代表される皮膚症状に対する、被験物の作用を、簡便かつ短期間で調べることのできる評価方法を提供すること，脱毛又は掻痒に対する被験物の作用を調べることのできる評価方法を提供すること，当該脱毛評価に用いることのできるトランスジェニック動物を提供すること，皮膚炎，脱毛，掻痒の予防又は治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるIL-18遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用い、被験物の皮膚に与える影響を評価する方法であって、評価指標として下記の（Ａ）又は（Ｂ）を用いることを特徴とする被験物の評価方法，自然発症皮膚炎が、生後およそ４〜１５日目にピークを迎えるものであることを特徴とする、当該評価方法、及び評価目的が、自己免疫性皮膚炎の予防又は治療剤のスクリーニングであることを特徴とする、当該評価方法によって達成される。
【００１３】
（Ａ）自然発症皮膚炎
（Ｂ）起炎物初回投与時の皮膚炎症
【００１４】
本発明の目的は、ＮＫ１．１抗原を有する細胞を抑制する物質を含むことを特徴とする皮膚炎の予防又は治療剤によって達成される。
【００１５】
また、本発明の目的は、ＮＫ１．１抗原を有する細胞を抑制する物質を含むことを特徴とする脱毛の予防又は治療剤によって達成される。
【００１６】
更に、本発明の目的は、ＮＫ１．１抗原を有する細胞を抑制する物質を含むことを特徴とする掻痒の予防又は治療剤によって達成される。
【００１７】
また、本発明の目的は、被験物の脱毛に与える影響を評価するために用いられるトランスジェニック動物であって、ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるインターロイキン−１８遺伝子を導入したものであることを特徴とするトランスジェニック動物，又は評価目的が、脱毛の予防又は治療剤のスクリーニングであることを特徴とする、当該トランスジェニック動物によって達成される。
【００１８】
更に、本発明の目的は、ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるインターロイキン−１８遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用い、被験物の、脱毛に与える影響を評価する方法，又は評価目的が、脱毛の予防又は治療剤のスクリーニングであることを特徴とする、当該評価方法によって達成される。
【００１９】
加えて、本発明の目的は、被験物の掻痒に与える影響を評価するために用いられるトランスジェニック動物であって、げっ歯類にケラチノサイトプロモーターの制御下にあるインターロイキン−１８遺伝子を導入したものであることを特徴とするトランスジェニック動物，及び、評価目的が、掻痒の予防又は治療剤のスクリーニングであることを特徴とする、当該トランスジェニック動物によって達成される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の評価方法によって、従来、起炎物の繰り返し投与のために更に６週間に亘る長期間を要していた、接触皮膚炎に対する被験物の評価が、生後約８〜１２日という短期間で、しかも起炎物の投与を一切行わないで評価することができる。あるいは、起炎物の繰り返し投与という面倒な作業を経ることなく、簡便に行うことができる。
【００２１】
また、本発明の皮膚炎の予防又は治療剤によって、脱毛，乾癬，自己免疫性疾患，アレルギー性皮膚炎等の皮膚炎を含む皮膚障害全般，これらの中でも、特に、IL-18の過剰発現に由来するものを、有効に治療・予防することができる。
【００２２】
また、本発明のトランスジェニック動物によって、脱毛予防又は治療剤のスクリーニングが可能となる。更に本発明の評価方法によって、被験物の脱毛に与える影響を調べることができる。
【００２３】
また、本発明のトランスジェニック動物は、掻痒症状を示すことから、掻痒モデル動物として有用であり、本発明の評価方法によって、被験物の掻痒に与える影響を調べることができる。
【００２４】
更に、本発明の皮膚炎又は脱毛あるいは掻痒の予防又は治療剤は、皮膚炎，脱毛，掻痒の予防又は治療に有効であるほか、ステロイド等のホルモン剤に比べて、安全性が高いという利点を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
〈トランスジェニック動物〉
本発明の評価方法で使用するトランスジェニック動物は、例えば次のような方法で、作成することができる。
【００２６】
本発明のトランスジェニック動物に用いられるげっ歯類としてはマウス、ラット等が挙げられるが、マウスが好ましく、マウスは、例えば、C57BL/6Nマウス（B6マウス）、Balb/cマウス等が好ましく用いられ、中でも、B6マウスが好ましい。以下本発明の説明においては、おもに、導入げっ歯類がマウスの場合を例に挙げて説明することがあるが、本発明は、マウスに関するものに限定されるものではない。
【００２７】
げっ歯類に導入する組換遺伝子は、ケラチノサイトプロモーター及びその制御下にあるIL-18遺伝子を含むものである。
【００２８】
ケラチノサイトプロモーターとしては、ヒトケラチノサイト５プロモーター（以下、ｈＫ５プロモーターと記載する。）等が挙げられる。
【００２９】
組換遺伝子には、このほか、導入遺伝子の細胞外への放出を促進するためのシグナルペプチド遺伝子や、発現遺伝子の釣り出し等に有用なポリＡ配列を導入することが好ましい。
【００３０】
シグナルペプチドとしては、例えばマウスの免疫グロブリン（以下Igと記載する。）κ−チェーン・シグナルペプチド等が挙げられる。
【００３１】
ポリＡ配列としては、牛由来のポリＡ配列等が挙げられる。
【００３２】
上記を含む組換遺伝子の作出方法としては、遺伝子組み換えの公知の方法を用いることができるが、例示すると、以下の通りである。
【００３３】
マウスIgκ−チェーンの、V-J2-C領域から取り出したシグナルペプチドと、マウスのプロIL-18ｃＤＮＡを用い、シグナルペプチドを持つ成熟IL-18ｃＤＮＡを、ＰＣＲ法によって取得する。
【００３４】
次に、pCR2.1ベクターを用いてサブクローニングし、続いてヒト伸長因子１αのプロモーターと牛由来ポリＡを含むpcdEF3ベクターで、サブクローニングされ、pEF-IL-18SPとする。
【００３５】
KpnI／BbsIの制限酵素切断部位で切断された、pEF-IL-18SPのＤＮＡフラグメントは、ヒトK5プロモーターを含むpBSKベクターのNotI部位において、サブクローニングする。
【００３６】
BssHIIの制限酵素部位で切断することによって、直鎖状ＤＮＡフラグメント（K5/SP/IL-18/polyA）を得ることができる（図１）。
【００３７】
組換遺伝子をマウスに導入する方法としては、公知の遺伝子導入方法を用いることができるが、例えば、マウスの受精卵に上述のようにして得られた組換遺伝子を注入したマウスを、野生型のマウスと掛け合わせ、その子孫のうち、IL-18を発現しているものを選別することで、行うことができる。選別する方法としては、尻尾のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ分析，血清中の成熟IL-18のＥＬＩＳＡ分析，皮膚の成熟IL-18のウェスタンブロッティング分析等が挙げられる。
【００３８】
また、このようにして得られたトランスジェニックマウスは、２０週以降、毛包炎や慢性皮膚炎像が認められ、雌のほぼ全例と、雄の２０〜４０％で、局所的な脱毛が発生することが、本発明者によって、初めて確認された（図２）。また、雄雌ともに、全例について、掻痒症状が確認された。
【００３９】
従って、ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるインターロイキン−１８遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用いることによって、被験物の、脱毛等の原因となる皮膚炎に与える影響，及び掻痒に与える影響を評価し、育毛剤，養毛剤，掻痒予防又は治療剤等をスクリーニングすることが可能となる。
このように、ケラチノサイトプロモーターの制御下にあるインターロイキン−１８遺伝子を導入したトランスジェニック動物が、被験物の、脱毛や掻痒に与える影響を評価する方法に用いられるのは、初めてのことであり、本発明のトランスジェニック動物は、被験物の脱毛や掻痒に与える影響を評価するために用いられるトランスジェニック動物として、新規なものである。
【００４０】
〈本発明の評価方法〉
以下に説明する本発明の「被験物の評価方法」とは、主に評価目的がスクリーニングであるものが挙げられるが、本発明で言うスクリーニングには、複数候補の中から、目的の予防又は治療剤等を選択するための、いわゆる一次スクリーニングの他、被験物の予防又は治療効果を確認するための、二次スクリーニング（確認試験）も、含まれる。
【００４１】
〈被験物の皮膚炎に与える影響の評価方法〉
本発明の、被験物の皮膚に与える影響の評価方法において、評価指標として用いられる現象は、以下の２つの炎症反応である。
（Ａ）自然発症皮膚炎
（Ｂ）起炎物初回投与時の皮膚炎症
【００４２】
本発明の評価は、上記の（Ａ），（Ｂ）の２つの一方又は両方において、被験物の効果を確認することによって行われる。
【００４３】
（Ａ）の自然発症皮膚炎とは、IL-18導入マウスが生後約４〜１５日目にピークを迎え、およそ４週以降に消失する炎症で、本発明者らによって今回初めて確認された症状である。この炎症は、病理学的には、皮膚組織において、表皮肥厚，角質増殖，真皮内に好中球を含む炎症性細胞浸潤を認め、表皮基底部には軽度の海綿状態が存在し、表皮向性の好中球浸潤により角質内膿瘍形成が認められる（図３）。
【００４４】
従って、生後約４〜１５日間，場合によっては８〜１２日間のこれらの症状確認を指標とすることで、従来に比べて極めて短期間で、被験物の炎症予防又は治療効果を確認することができ、炎症治療・予防剤のスクリーニングを実施することが可能となる。
【００４５】
（Ｂ）の起炎物初回投与時の皮膚炎症とは、例えば自然発症皮膚炎のピーク後等に、自然発症皮膚炎のピーク残存中、或いは当該症状が一旦消失した後、起炎物を初めて投与した際に誘発される皮膚炎症のことである。
【００４６】
これら（Ａ），(Ｂ)の発症には、いずれもIL-18の過剰発現が関与しており、これらの症状は、従前報告された起炎物の６週間に亘る繰り返し投与に起因して発症する接触過敏症と、発症機構が共通していることが確認された。
【００４７】
従って、本発明の、（Ａ），（Ｂ）を指標とする評価方法は、接触過敏症の短期間・かつ簡便な評価方法としても、利用することが可能である。つまり、（Ａ）を指標とすることによって、従来、一旦皮膚炎が治まった後、更に６週間に亘る起炎物の繰り返し投与という長期間を要していた接触過敏症の予防又は治療薬のスクリーニングが、生後約４〜１５日，場合によっては８〜１２日前後まで短縮される。また、（Ｂ）を指標とすることによって、（一旦皮膚炎が消失した後、例えばクロトンオイル等の起炎物で処理することにより惹起される皮膚炎を指標にして）簡便に被験物を評価することもできる。更に、これら（Ａ），（Ｂ）の双方を指標としてスクリーニングを行うこともできる。
【００４８】
本発明の評価方法は、主に自己免疫性皮膚炎の予防又は治療剤のスクリーニング方法として実施することができる。スクリーニングは、例えば自然発症皮膚炎のピーク発生前，発生後のいずれかの段階において被験物を投与し、ピーク発生の有無，ピークの大きさ，ピーク消失の速さ等を、非投与マウス（コントロール）と比較する等の手順によって、行うことができる。
【００４９】
〈被験物の脱毛に与える影響の評価方法〉
本発明の、被験物の脱毛に与える影響を評価する方法は、主に脱毛の予防又は治療剤のスクリーニング方法として実施することができる。スクリーニングは、例えば脱毛発生前，発生後のいずれかの段階において被験物を投与し、ピーク発生の有無，ピークの大きさ，ピーク消失の速さ等を、非投与マウス（コントロール）と比較する等の手順によって、行うことができる。
【００５０】
〈被験物の掻痒に与える影響の評価方法〉
本発明の、被験物の掻痒に与える影響を評価する方法は、主に掻痒の予防又は治療剤のスクリーニング方法として実施することができる。スクリーニングは、例えば掻痒発生前，発生後のいずれかの段階において被験物を投与し、ピーク発生の有無，ピークの大きさ，ピーク消失の速さ等を、非投与マウス（コントロール）と比較する等の手順によって、行うことができる。
【００５１】
〈本発明の皮膚炎，脱毛，掻痒の、予防又は治療剤〉
本発明の皮膚炎，又は脱毛，あるいは掻痒の予防又は治療剤の有効成分は、ＮＫ１．１抗原を有する細胞を抑制する物質である。
【００５２】
ＮＫ１．１抗原を有する細胞としては、ＮＫ細胞やＮＫＴ細胞等が挙げられる。本発明で用いられるＮＫ１．１抗原を有する細胞を抑制する物質としては、抗ＮＫ細胞抗体や抗ＮＫＴ細胞抗体等の、ＮＫ１．１抗原を有する細胞に対する抗体，soluble HLA-class I蛋白，ＦＫ５０６等の免疫抑制剤，ＮＫレセプターの下流に存在するDAP12,SHP等のＮＫ細胞のシグナルトランスダクションに関与する分子の阻害剤等が挙げられるが、ＮＫ１．１抗原を有する細胞に対する抗体が好ましい。
【００５３】
ＮＫ１．１抗原を有する細胞に対する抗体としては、AsialoＧＭ１抗原を認識する抗体，ＮＫ1.1抗原を認識する抗体，又はLy49抗原を認識する抗体等が挙げられる。尚、Ly49抗原とは、Ly49遺伝子ファミリーのことで、例えば、Ly49A，Ly49C，Ly49D等があるがこれらに限られるものではない。これらは、その機能上、下記のように分類することができる。（１）A sialoＧＭ１抗原を認識する抗体や、ＮＫ1.1抗原を認識する抗体を含む抗killer inhibitory receptor (KIR)抗体等の、ＮＫ１．１抗原を有する細胞を抑制する抗体の他、（２）ＮＫ細胞を活性化する抗体，（３）Lｙ４９D等のＮＫ細胞を活性化する抗原に対する抗体（抗Lｙ４９D抗体）等もあるが、本発明においては、（１）のＮＫ細胞を機能的に抑制する抗体が好ましい。
【００５４】
本発明で用いられる、AsialoＧＭ１抗原を認識する抗体としては、モノクロナール、ポリクロナール、もしくはキメラ抗体やヒト化抗体のいずれであっても良い。
【００５５】
具体的には、例えばウサギに抗原分子として糖脂質であるアシアロＧＭ１を免疫し、そのウサギから得た血清から取得することができる、ポリクローナル抗体の一種である抗AsialoＧＭ１抗体があるが、ヒトの皮膚炎や脱毛を予防又は治療する場合には、ヒト由来のアシアロＧＭ１抗原を免疫した抗体を使って、キメラ抗体やヒト化抗体にしたものが好ましい。
【００５６】
本発明で用いられる、ＮＫ1.1抗原を認識する抗体としては、モノクロナール、ポリクロナール、もしくはキメラ抗体やヒト化抗体のいずれであっても良い。      
【００５７】
具体的には、例えばマウスに抗原分子としてマウスＮＫ細胞を免疫し、そのマウスから得たモノクロナール抗体であり、マウスNK1.1抗原(NKR-P1B, NKR-P1C)を認識する同種抗体である抗NK1.1抗体があるが（BD Bioscience Pharmingen Technical Data Sheet Catalog Number 553161，revision No. 011，2002年10月発行）、ヒトの皮膚炎や脱毛を予防又は治療する場合には、ヒトＮＫ細胞を免疫して得られたヒトNK1.1抗原(CD161)を認識する抗体を使って、キメラ抗体やヒト化抗体にしたものが好ましい。
【００５８】
本発明の皮膚炎の予防又は治療剤，脱毛の予防又は治療剤，あるいは掻痒の予防又は治療剤は、注射等による全身投与の他、局部投与が挙げられるが、皮膚炎を発症し易い皮膚や頭皮等への局部に直接投与する局部投与が好ましい。全身投与の場合、静脈内への投与等が挙げられる。また、局部投与の場合、皮下または筋肉内への投与や、塗り薬や貼り薬（パッチ）等による、皮膚や頭皮への塗布等が挙げられる。
【００５９】
注射剤の調製は、常法によって行うことができる。即ち、注射剤の調製は、抗AsialoGM１抗体，抗ＮＫ1.1抗体を、生理食塩液や、ＰＢＳ等の緩衝溶液に溶解又は懸濁し、当該溶液を無菌的に凍結乾燥することによって行うことができる。
【００６０】
また、塗り薬や貼り薬の調製も、常法によって行うことができる。
剤形としては、クリーム、軟膏、乳液、エマルジョン、溶液、ゲル、パウダー、スティック等の固体、等が挙げられ、商品形態としては、パック、ローション（化粧水）、等の各種皮膚化粧料の他、シャンプー、リンス、トリートメント、育毛剤、養毛剤等の頭髪用化粧料等の形態とすることができる。
【００６１】
本発明の皮膚炎の予防又は治療剤，脱毛の予防又は治療剤，あるいは掻痒の予防又は治療剤には、必要に応じて、適宜、安定化剤、防腐剤、無痛化剤など通常医薬品に添加される種々の助剤を加えることができる。
【００６２】
また、本発明の皮膚炎の予防又は治療剤，脱毛の予防又は治療剤，あるいは掻痒の予防又は治療剤は、他の成分とともに、皮膚化粧料等の化粧料、医薬部外品、指定医薬部外品、外用医薬品等の原料として用いることができる。他の成分としては、通常化粧料、医薬部外品、指定医薬部外品、外用医薬品等の原料として用いられているものであれば良い。具体的には、例えば、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等の、界面活性剤，粘剤、油剤、粉体（顔料、色素、樹脂）、防腐剤、香料、保湿剤、生理活性成分、塩類、溶媒、酸化防止剤、キレート剤、パール化剤、中和剤、ｐＨ調整剤、昆虫忌避剤、酵素等の成分等が挙げられる。これらの成分は、本発明の皮膚炎の予防又は治療剤，あるいは脱毛の予防又は治療剤の効果を阻害しない範囲で、適宜、化粧料、医薬部外品、指定医薬部外品、外用医薬品等に含有させることができる。
【００６３】
また、本発明の皮膚炎の予防又は治療剤，脱毛予防又は治療剤，あるいは掻痒の予防又は治療剤は、ドラック・デリバリー・システム（DDS）を適用した製剤として用いることもできる。
【００６４】
投与量は、例えば患者の疾病、病態、投与経路、年齢、体重、有効成分の種類及び投与形態等によっても異なるが、成人１日当たり、通常、有効成であるＮＫ１．１抗原を有する細胞を抑制する物質の量として、体重当たり０．００１〜１００mg/kg，好ましくは、０．００１〜１０mg/kgを、１度にまたは２〜３回に分けて投与する。尚、毎日投与しなくとも、数日間隔で投与してもよく、例えば１〜４日毎に投与されても良い。
【実施例】
【００６５】
以下に実施例を上げて本発明を更に具体的に説明する。尚、評価方法の実施例に先立ち、（Ｂ）起炎物初回投与時の皮膚炎症を、発症させる系（コントロール）を確立した。これは、本発明の被験物の皮膚に与える影響の評価方法において用いられる評価指標の一つである。
【００６６】
（Ｂ）起炎物初回投与時の皮膚炎症の発症
雄の、K5/IL-18トランスジェニックB6マウス（11週令）、Ig/IL-18トランスジェニックB6マウス（10−12週令）（T. Hoshino, J. Immunology,2001,7014-7018）及び当該週令のB6マウス（ワイルドタイプ）の右の耳に夫々10μlのアセトン/オリーブオイル（4：1,v/v）にクロトンオイルを2％(v/v)溶解させたクロトンオイル溶液を塗付し、左の耳に10μlのアセトン/オリーブオイル（4：1,v/v）を塗付した。夫々、０、６、２４、４８時間及び7日後に耳の厚さを計測した。
【００６７】
結果を図４に示した。
図４に示すとおりK5/IL-18トランスジェニックB6マウスにおいては４８時間後まで有意な耳介の腫脹が認められた。一方、Ig/IL-18トランスジェニックB6マウスや、ワイルドタイプマウスでは、４８時間後には、耳介の腫脹は消失していた。
【００６８】
実施例１（自己免疫性皮膚炎予防又は治療剤のスクリーニング）
被験物（予防又は治療剤の候補化合物）をアセトン/オリーブオイル（4：1,v/v）等の適当な溶剤（左耳に塗布する溶剤と同じもの）に溶解又は懸濁させたものを、2%(v/v)クロトンオイル溶液塗布の前又は同時或いは塗布後に、適宜右の耳に塗付するほかは上記の（Ｂ）と同様にして処理し、２４時間後の耳介の腫れを計測し、コントロールの系との比較により、被験物による耳介の腫脹の抑制効果を判定する。
【００６９】
次に、本発明の皮膚炎の予防又は治療剤に関し、実施例を上げて更に具体的に説明する。尚、マウスは、５〜７匹を一群とし、各群ごとに、実施例，比較例，参考例等の被験物を投与した。
【００７０】
実施例２（抗AsialoGM1抗体投与による皮膚炎抑制）
生後１日以内のK5/IL-18 Tg (IL-18 transgene (+); 以下、「Tg (+)」と記載する。) マウスに、PBS 0.1 mLに溶解した[A]コントロール抗体rabbit IgG(Sigma) 2mgまたは[B]抗AsialoGM1抗体(Wako) 2mgを、腹腔内投与した。
【００７１】
抗体投与後10日後に、上記A，B２群のマウスの、背中の皮膚を取り、20%ホルマリンで固定した。HE染色にて皮膚炎を検討した。
【００７２】
抗体投与後10日後、外見の観察で、[A] 投与群（参考例１）では、皮膚炎が起こっていたのに対し、[B]投与群（実施例２）では、皮膚炎が抑制されていることが認められた。
【００７３】
そして、これらの病理像を観察したところ、[A] 投与群（参考例１）では、Tg(+)マウスに角質肥厚、表皮の肥厚、真皮への好中球優位の侵潤がみられ、コントロール抗体rabbit IgGではTg(+)マウスの皮膚炎を抑制していないことが確認できた（図５）。
【００７４】
一方、[B]投与群（実施例２）では、角質肥厚、表皮の肥厚、真皮へのリンパ球侵潤の抑制がみられ、抗AsialoGM1抗体によってTg(+)マウスの皮膚炎が抑制されることが確認できた（図６）。
【００７５】
この結果、抗AsialoGM1抗体は、皮膚炎の予防又は治療剤として有効であり、更には皮膚炎が原因で起こる脱毛の予防又は治療剤としても有効であることが分かった。
【００７６】
実施例３，比較例１〜２（抗NK1.1抗体投与による皮膚炎抑制）
生後１日以内のTg (+)マウスに、PBS 50 μLに溶解した[A]コントロール抗体mouse IgG (Sigma) 0.5mg、[B]抗マウスNK1.1抗体(PK136) 0.5 mg, [C] 抗マウスCD4抗体(GK1.5) 0.5 mg、[D]抗マウス CD8抗体 (2.43) 0.5 mgを、腹腔内投与した。
【００７７】
抗体投与後10日後に、上記A-D4群のマウスの、背中の皮膚を取り、20%ホルマリンで固定した。HE染色にて皮膚炎を検討した。
【００７８】
抗体投与後10日後、外見の観察で、[A] 投与群（参考例２）、[C] 投与群（比較例１）及び[D]投与群（比較例２）では、皮膚炎が起こっていたのに対し、 [B] 投与群（実施例３）では、皮膚炎が抑制されていることが認められた。
【００７９】
そして、これらの病理像を観察したところ、[A] 投与群（参考例２）では、Tg(+)マウスに角質肥厚、表皮の肥厚、真皮への好中球優位の侵潤と角質部(corneum)に微少膿瘍がみられ、コントロール抗体mouse IgGでは、抑制していないことが確認できた（図７）。
【００８０】
また、[C]投与群（比較例１）では、Tg(+)マウスに角質肥厚、表皮の肥厚、真皮への好中球優位の侵潤と角質部(corneum)に微少膿瘍がみられ、むしろ[A] 投与群よりも、悪化の傾向が見られ、抗CD4抗体はマウスの皮膚炎を抑制しないことが確認できた（図８）。また、[D]投与群（比較例２）でも、Tg(+)マウスに角質肥厚、表皮の肥厚、真皮への好中球優位の侵潤と角質部(corneum)に微少膿瘍がみられた（図９）。
【００８１】
一方、[B] 投与群（実施例３）では、角質肥厚、表皮の肥厚、真皮へのリンパ球侵潤等について、抑制がみられ、抗NK1.1抗体によって、Tg(+)マウスの皮膚炎が著明に抑制されていることが、確認できた（実施例３：図１０）。
【００８２】
この結果、抗NK1.1抗体は、皮膚炎の予防又は治療剤として有効であり、更には皮膚炎が原因で起こる脱毛の予防又は治療剤としても有効であることが分かった。
【００８３】
比較例３（ステロイド・Dexamethasone投与による皮膚炎抑制）
生後３日のTg (+)マウスに、[A] 0.5% CMC-Na/PBS（関東化学、カタログ番号37140-02）100 μLのみ(vehicle)もしくは [B]0.5% CMC-Na/PBS 100 μLに溶解した1% Dexamethasone (10 mg/mL)を、連日７日マウスの背中の皮膚に塗布した。
【００８４】
初回投与から７日後（つまり最終投与の１日後で生後１０日後）に上記２群マウスの背中の皮膚を取り20%ホルマリンで固定した。HE染色にて皮膚炎を検討した。
【００８５】
Dexamethasone塗布後８日後、外見の観察で、[A] 投与群（参考例３）では、皮膚炎が起こっていたのに対し、[B]投与群（比較例３）では、皮膚炎が抑制されていることが認められた。
【００８６】
そして、これらの病理像を観察したところ、[A] 投与群（参考例３）では、Tg(+)マウスに角質肥厚、表皮の肥厚、真皮への好中球優位の侵潤と角質部(corneum)に微少膿瘍がみられ、vehicleではTg(+)マウスの皮膚炎を抑制しないことが確認できた（図１１）。
【００８７】
一方、[B]投与群（比較例３）では、角質肥厚、表皮の肥厚、真皮へのリンパ球侵潤の抑制がみられ、皮膚炎が有る程度抑制されていることが確認できた（図１２）。しかしながら、抑制効果は実施例２の抗NK1.1抗体ほど強くなく、特に角質肥厚はほとんど抑制していなかった。また、[B]のDexamethasone塗布群の約半数が、副作用のため死亡した。
【００８８】
この結果から、この容量(1％ Dexamethasone)でのステロイド剤によって、皮膚炎は有る程度抑制されるものの、副作用が強く、実用上問題があることが確認された。
【００８９】
実施例４，参考例４（ＦＫ５０６投与による皮膚炎抑制）
生後3日のTg (+)マウスを用いた。0.5% [A] CMC-Na/PBS（関東化学、カタログ番号37140-02）100μLのみ(vehicle)，もしくは [B]0.5% CMC-Na/PBS 100 μLに溶解した1% FK506(10 mg/mL, 藤沢薬品より供与)を、連日７日マウスの背中の皮膚に塗布した。初回投与から７日後（つまり最終投与の１日後で生後１０日後）に上記2群マウスの背中の皮膚を取り20%ホルマリンで固定した。HE染色にて皮膚炎を検討した。
【００９０】
FK506塗布の  初回投与から７日後（つまり最終投与の１日後で生後１０日後）、外見の観察で、[A] 投与群（参考例４）では、皮膚炎が起こっていたのに対し、 [B] 投与群（実施例４）では、皮膚炎が抑制されていることが認められた。
そして[B] 投与群（実施例４）は、[A] 投与群（参考例４）に比べて、病理学的にも炎症細胞の真皮への浸潤も抑制されていた（参考例４：図１３／実施例４：図１４）。
つまり、FK506塗布によっても、抗AsialoGM1抗体（実施例２）や抗NK1.1抗体（実施例３）程ではないものの、皮膚炎が抑制されることが分かった。
【００９１】
実施例５（抗Ly49D抗体投与による皮膚炎抑制）
生後１日以内のTg (+)マウスを用いた。このTg (+)マウスに、PBS 50 μLに溶解した抗Ly49D抗体(4E5) 0.5mgを、腹腔内投与した。
抗体投与後１０日後に、上記マウスの背中の皮膚を取り20%ホルマリンで固定。HE染色にて皮膚炎を検討した。
抗体投与後10日後、外見の観察で抗Ly49D抗体投与群では、皮膚炎が抑制されていることが認められた。
そして、これらの病理像を観察したところ、抗Ly49D抗体投与群では、Tg(+)マウスの角質肥厚、表皮の肥厚、真皮への好中球優位の侵潤と角質部(corneum) の膿瘍は、いずれも微少であった。（図１５）
【００９２】
これらの結果から、本発明の皮膚炎や脱毛の予防又は治療剤が、ステロイド剤よりも、脱毛の原因ともなる皮膚炎の抑制効果に優れているにも拘わらず、副作用もなく、極めて優れた予防又は治療剤として有用であることが分かった。
【００９３】
試験例
以下の試験例により、皮膚炎が、脱毛に関係していることを確認した。前述の図３に示した通り、Tg (+)マウスでは、２０週以降、毛包炎や慢性皮膚炎像が認められ、雌のほぼ全例と、雄の２０〜４０％で、局所的な脱毛が発生し、また、雄雌全例に掻痒症状が発生することが、確認された。
【００９４】
また、９月齢の雌Tg (+)マウスの皮膚の病理像を調べるため、顔面、背中の皮膚を取り、20%ホルマリンで固定し、HE染色にて皮膚炎を検討したところ、毛根炎が起こっていることが確認された（顔面：図１６，背中：図１７）。
【００９５】
図１６，図１７の毛根炎は、いずれも、毛包周囲の強い炎症細胞浸潤（毛包周囲炎）と伴に、一部には毛包を形成する扁平上皮内にも炎症細胞浸潤を生じており、深在性の毛包炎であった。図１６では、重度の皮膚炎のため皮膚の角質部分が欠損して潰瘍化している。図１７では、毛根部に著明な炎症細胞浸潤、毛包炎を伴った脱毛と皮膚炎が生じている。
【００９６】
以上の結果から、本発明のトランスジェニック動物は、被験物の脱毛又は掻痒に与える影響を評価するために使用できると考えられる。また、上記の結果からは、本発明の皮膚炎の予防又は治療剤によって、皮膚炎が抑制される結果、毛根炎も予防され、脱毛が予防され、また掻痒も予防されると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明によって、自己免疫性皮膚炎等に代表される皮膚症状や脱毛・掻痒に対する、被験物の作用を調べることができ、また、本発明の、皮膚炎，脱毛，あるいは掻痒の予防又は治療剤は、各種の医薬品，医薬部外品，皮膚化粧料，頭髪化粧料等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明で用いられる組換遺伝子の一例である。
【図２】Tg (+)マウスの脱毛発症率を示す図である。
【図３】生後１０日目で自然発症皮膚炎のピークを迎えたK5/IL-18トランスジェニックマウスの皮膚の病理標本（生物の形態）を示す図面代用写真である。ＨＥ染色（ｘ５０倍）
【図４】（Ｂ）起炎物初回投与時の皮膚炎症の発症を示す図である。
【図５】Tg(+)マウスへの[A] コントロール抗体rabbit IgG投与群（参考例１）の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図６】Tg(+)マウスへの[B] 抗AsialoGM1抗体投与群（実施例２）の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図７】Tg(+)マウスへの[A] コントロール抗体mouse IgG投与群（参考例２）の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図８】Tg(+)マウスへの[C] 抗マウスCD4抗体投与群（比較例１）の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図９】Tg(+)マウスへの[D] 抗マウス CD8抗体投与群（比較例２）の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図１０】Tg(+)マウスへの[B] 抗マウスNK1.1抗体投与群（実施例３）の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図１１】Tg(+)マウスへの[A] コントロールvehicle投与群（参考例３）の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図１２】Tg(+)マウスへの[B] Dexamethasone投与群（比較例３）の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図１３】Tg(+)マウスへの[A] コントロールvehicle投与群（参考例４）の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図１４】Tg(+)マウスへの[B] ＦＫ５０６投与群（実施例４）の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図１５】Tg(+)マウスへの[B]抗Ｌｙ４９Ｄ抗体投与群（実施例５）の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図１６】９月齢の雌Tg (+)マウスの顔面の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【図１７】９月齢の雌Tg (+)マウスの背中の皮膚病理像である。ＨＥ染色（ｘ２００倍）。
【符号の説明】
【００９９】
hＫ５ promoter：  ヒトケラチノサイト5プロモーター
ＳＰ          ：  シグナルペプチド
mature mIL-18 ：  成熟マウスIL-18遺伝子
ｐＡ          ：  ポリＡ配列
Ｋ５ＴＧ      ：  K5/IL-18トランスジェニックB6マウス
ＷＴ          ：  ワイルドタイプB6マウス
K5/IL-18Tg    ：  K5/IL-18トランスジェニックB6マウス
Ig/IL-18Tg    ：  Ig/IL-18トランスジェニックB6マウス
ＴＧ          ：  K5/IL-18Tg，又はIg/IL-18Tg
vehicle       ：  アセトン／オリーブオイル（4：1,v/v）
croton oil    ：  クロトンオイルの2％(v/v) アセトン／オリーブオイル（4：1,v/v）溶液
【図１】
2004340921.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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