(57)【要約】【課題】ＤＮＡ一分子の特異的塩基配列を検出する方法の提供。【解決手段】カチオン性両親媒性物質と配列特異的にタンパク質が結合したＤＮＡとからなる複合単分子膜を気水界面に作製し、該複合単分子膜を固体基板上への移し取り、それにより固体基板上へＤＮＡを伸長固定化する方法を用い、ＤＮＡ一分子の特異的塩基配列を検出する方法を提供する。【効果】再現的に、効率よく、タンパク質を結合したＤＮＡを伸長固定化することにより、容易にＤＮＡ一分子の特異的塩基配列を検出することが可能となる。また、近接場光学顕微鏡を用いることにより、蛍光像および形状像の両者を観察測定でき、精度の向上をはかることが可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡの特異的塩基配列に蛍光標識したタンパク質を結合させる過程と、前記タンパク質を結合したＤＮＡを伸長固定化する過程と、伸長固定化したＤＮＡを光学的に観察する過程を含むＤＮＡ一分子の特異的塩基配列を検出する方法。
【請求項２】
測定対象であるＤＮＡとそれに結合させるタンパク質に、それぞれ蛍光波長の異なる蛍光標識を付加する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質を結合したＤＮＡを伸長固定化する過程が、ＤＮＡを含有してなるＤＮＡ水溶液上に、カチオン性両親媒性物質を展開し、前記カチオン性両親媒性物質と前記ＤＮＡとからなる複合単分子膜を形成することを含むＤＮＡの伸長固定化の過程である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記複合単分子膜を、前記ＤＮＡ水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取ることを含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記固体基板がガラス基板である請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記カチオン性両親媒性物質がジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩からなる群から選ばれる請求項１または３記載の方法。
【請求項７】
前記カチオン性両親媒性物質を展開するための展開液として、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルムからなる群から選ばれる請求項１または３記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が制限酵素、修飾酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、転写因子からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質が制限酵素である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
制限酵素がＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩＩからなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
蛍光標識したタンパク質を結合したＤＮＡを含有してなるＤＮＡ水溶液上に、カチオン性両親媒性物質を展開し、前記カチオン性両親媒性物質と前記ＤＮＡとからなる複合単分子膜を形成することを含む、ＤＮＡの伸長固定化法によって固定されたＤＮＡを、走査型近接場光学顕微鏡によって解析することを含むＤＮＡの解析方法。
【請求項１２】
前記複合単分子膜を、前記ＤＮＡ水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取ることを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記固体基板がガラス基板である請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
前記カチオン性両親媒性物質がジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩からなる群から選ばれる請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１５】
前記カチオン性両親媒性物質を展開するための展開液として、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルムからなる群から選ばれる請求項１１または１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ一分子の特異的塩基配列を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡを用いて疾病の診断を行うためには、疾病に関係する特定の塩基配列をその遺伝子上で検索する必要がある。この際に、遺伝子を断片化することなく、一分子のレベルで調べることができれば、診断のための時間、コストなどを大きく軽減できると期待されている。すなわち、大きなサイズを有するＤＮＡの特異的塩基配列マッピングをその一分子のレベルで高速に行うことが重要である。そのためには、ＤＮＡを伸長した状態で固定化し、特定の塩基配列を検出するための標識となる分子をＤＮＡに付加する必要がある。
【０００３】
ＤＮＡ上の特定の塩基配列の位置を決定する方法として、ゲル電気泳動とハイブリダイゼーションの組合せが広く用いられている。また、単一分子を解析する別の方法として、蛍光  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）があげられる。しかし、これらの方法から得られる空間的な情報、例えばＤＮＡの大きさに関する解像度はそれほど高くない。そこで、この点を克服するような方法の開発が試みられ、いくつかの方法が報告されている。
ＤＮＡを伸長固定化する方法としては、Ａ．  ＢｅｎｓｉｍｏｎらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｍｂｉｎｇ法（非特許文献１：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５，  ２０９６  （１９９４））、本発明者らによる特許出願第２００２−３１５１６９号に開示される気水界面単分子膜を用いた方法等があげられる。
タンパク質マッピングとしては、タンパク質として制限酵素を用いて、制限酵素により切断されたＤＮＡの部位が蛍光を発しないことを光学的に検出するＤ．  Ｃ．  Ｓｃｈｗａｒｔｚによる方法（非特許文献２：Ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ．    Ｄ．  Ｃ．  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，  ｐ．  １１０  （１９９３））、同様に制限酵素を用いるが、ＤＮＡの切断なしに部位を検出するＭ．  Ｗａｓｈｉｚｕらによる方法（非特許文献３：Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２６５，  ｐ．  １４０  （１９９９））等があげられる。  前者は、融解したアガロース中でＤＮＡ分子を伸長し、ゲル化の間に固定化する原理に基づく方法である。また後者は、交流電場をかけることにより、サイズの大きなＤＮＡ分子が濃縮された中性直鎖ポリマー溶液（例えば、アクリルアミド溶液）中で伸長される原理に基づく方法である。
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５，  ２０９６  （１９９４）
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，  １１０  （１９９３）
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２６５，  １４０  （１９９９）
【０００５】
【発明が解決しようとする問題】
しかし、上記の方法には、（１）ゲル中でＤＮＡを伸長しているため、ＤＮＡの直線性が悪い、（２）ゲル中での伸長固定化であるので、取り扱いが困難である、（３）前者の場合、ＤＮＡを切断してしまうために精度が下がる、（４）特殊なチャンバー（装置）を必要とする、などの問題点があった。  そこで、試料を取り扱う上での煩雑さの軽減、固定化の再現性およびＤＮＡの伸長性の向上、試料の分解能および解析精度の向上したＤＮＡの塩基配列の解析法が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を検討して完成されたもので、次のようなＤＮＡ一分子の特異的塩基配列検出法を提供する。
（１）ＤＮＡの特異的塩基配列に蛍光標識したタンパク質を結合させる過程と、前記タンパク質を結合したＤＮＡを伸長固定化する過程と、伸長固定化したＤＮＡを光学的に観察する過程を含むＤＮＡ一分子の特異的塩基配列を検出する方法。
（２）測定対象であるＤＮＡとそれに結合させるタンパク質に、それぞれ蛍光波長の異なる蛍光標識を付加する、上記（１）記載の方法。
（３）前記タンパク質を結合したＤＮＡを伸長固定化する過程が、ＤＮＡを含有してなるＤＮＡ水溶液上に、カチオン性両親媒性物質を展開し、前記カチオン性両親媒性物質と前記ＤＮＡとからなる複合単分子膜を形成することを含むＤＮＡの伸長固定化の過程である、上記（１）記載の方法。
（４）前記複合単分子膜を、前記ＤＮＡ水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取ることを含む上記（３）記載の方法。
（５）前記固体基板がガラス基板である上記（３）記載の方法。
（６）前記カチオン性両親媒性物質がジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩からなる群から選ばれる上記（１）または（３）記載の方法。
（７）前記カチオン性両親媒性物質を展開するための展開液として、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルムからなる群から選ばれる上記（１）または（３）記載の方法。
（８）前記タンパク質が制限酵素、修飾酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、転写因子からなる群から選択される、上記（１）記載の方法。
（９）前記タンパク質が制限酵素である、上記（８）記載の方法。
（１０）制限酵素がＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩＩからなる群から選択される、上記（９）記載の方法。
（１１）蛍光標識したタンパク質を結合したＤＮＡを含有してなるＤＮＡ水溶液上に、カチオン性両親媒性物質を展開し、前記カチオン性両親媒性物質と前記ＤＮＡとからなる複合単分子膜を形成することを含む、ＤＮＡの伸長固定化法によって固定されたＤＮＡを、走査型近接場光学顕微鏡によって解析することを含むＤＮＡの解析方法。
（１２）前記複合単分子膜を、前記ＤＮＡ水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取ることを含む上記（１１）記載の方法。
（１３）前記固体基板がガラス基板である上記（１１）または（１２）記載の方法。
（１４）前記カチオン性両親媒性物質がジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩からなる群から選ばれる上記（１１）または（１２）記載の方法。
（１５）前記カチオン性両親媒性物質を展開するための展開液として、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルムからなる群から選ばれる上記（１１）または（１２）記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＤＮＡ一分子の特異的塩基配列を検出する方法に関する。すなわち本発明は、タンパク質を結合したＤＮＡを伸長させ、固体基板上へ固定化することにより、ＤＮＡ一分子の特異的塩基配列を検出する方法に関する。具体的には、カチオン性両親媒性物質とタンパク質を結合したＤＮＡとからなる複合単分子膜を気水界面に作製し、該複合単分子膜を固体基板上へ移し取り、それにより固体基板上へＤＮＡを伸長固定化する。この固体基板上のＤＮＡを光学的に観察し、特異的塩基配列を検出する方法に関するものである。ここで、「伸長」とは、例えばランダムなコイル状態にある部分を線状に引き伸ばすことをいう。固体基板上へのタンパク質を結合したＤＮＡの固定化は、それぞれ異なる蛍光色素を結合させたタンパク質およびＤＮＡを試料として用いることにより、近接場光学顕微鏡等でその蛍光像および形状像を観察することにより確認できる。また、種々の結合特性を示す蛍光色素をＤＮＡ試料に結合させることによって、そのＤＮＡ試料の解析に役立てることができる。
【０００８】
本発明の方法によって固定化される「ＤＮＡ」は、例えばλＤＮＡ等の配列既知のＤＮＡ、および配列未決定のＤＮＡを含む。また、「ＤＮＡ」は直鎖状、環状いずれの形状であってもよい。本発明によって固定化されるＤＮＡのサイズ（塩基対）は特に限定されないが、例えば、１ｋ〜１Ｍｂｐ、より好ましくは２ｋ〜１００ｋｂｐである。実施例等で具体的に示すが、配列既知のＤＮＡの場合、本発明をそのＤＮＡに特異的に結合するタンパク質の結合配列の特性解析等に用いることができる。また、配列未決定のＤＮＡ、例えば疾患関連遺伝子の場合、疾患に関連する特定の塩基配列の解析等を行い、疾患の診断等に用いることができる。ＤＮＡ試料は、水に溶解しＤＮＡ水溶液とする。ここで用いられる水としては、固定化されたＤＮＡの解析の妨げとならないように、不純物の混入量ができるだけ少ない純水が好ましい。ここで用いられる純水としては、好ましくは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ＳＰシステム（日本ミリポア社製）等により比抵抗値１８．３Ωｃｍ以上に精製された超純水が用いられる。なお、ＤＮＡ水溶液は、例えば、１×１０−６〜３０×１０−６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５×１０−６〜２０×１０−６ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは６×１０−６〜１０×１０−６ｍｇ／ｍｌの濃度で調製される。
【０００９】
本明細書中、「カチオン性両親媒性物質」とは、分子内に親水基と疎水基を有する物質を指し、例えば、細胞膜の構成物であるリン脂質、糖脂質などがあげられる。本発明では、カチオン性のものであればいずれでも構わないが、ジドデシルアンモニウム塩、ジテトラデシルアンモニウム塩、ジヘキサデシルアンモニウム塩、ジオクタデシルアンモニウム塩などが好ましく用いられる。なかでも、水に溶けにくく、安定な単分子膜を形成するという理由から、ジオクタデシルアンモニウム塩がより好ましい。前記カチオン性両親媒性物質は例えば、ベンゼン、エタノール、スペクトロゾールクロロホルム、好ましくはスペクトロゾールクロロホルムのような溶媒に溶解し、展開溶液とする。この展開溶液は、例えば、０．１〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で調製される。
【００１０】
本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、制限酵素、修飾酵素（メチラーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、転写因子等があげられるが、ＤＮＡ、特に二本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列を認識し、結合するものであれば、いずれのタンパク質でもかまわない。なかでも、制限酵素は、その特性、反応条件等が明らかであり、また種類が豊富であるという理由から、好ましく用いられる。本発明では具体的には、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いる。制限酵素は室温で静置することにより、純水中に完全に溶解される。本発明で用いられるタンパク質のＤＮＡへの結合を確認するために、タンパク質を蛍光色素により標識する必要がある。タンパク質に蛍光色素標識する方法としては例えば、チオール標識、アミノ基標識等の方法があげられるが、何れの方法でもかまわない。本発明では、ビオチン−アビジン（ストレプトアビジン）を介在させた標識方法が好ましく用いられる。具体的には、ビオチン水溶液をタンパク質の１０〜２５倍、好ましくは１２〜２０倍のモル数となるようにタンパク質溶液に添加し、０℃〜１０℃（好ましくは０℃〜４℃）で３０分〜２時間（好ましくは１〜２時間）、さらに室温で０〜３０分間（好ましくは２０〜３０分間）反応させる。さらに、１ｎｍｏｌのタンパク質に対して、１μｇのストレプトアビジンが反応するように、ビオチン修飾したタンパク質にストレプトアビジン結合型蛍光色素を添加し、蛍光色素標識タンパク質を作製する。ここで標識に用いられる蛍光色素はいずれのものでも構わないが、後述するＤＮＡを標識する蛍光色素とは異なる波長で蛍光を発する色素が好ましい。具体的には、ストレプトアビジンＣｙ３、ストレプトアビジンＴＲＩＴＣ等があげられるが、本発明ではストレプトアビジン結合型Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２が好ましく用いられる。
【００１１】
本発明の方法において、基板上への試料の固定化を確認するために、蛍光物質をＤＮＡ水溶液に添加し、ＤＮＡに結合させることが好ましい。好ましく用いられる蛍光物質としては、例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｉｌｉｎｄｏｌｅ  （ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ））、ＹＯＹＯ（登録商標）−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ：  Ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ，  １，１’−［１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｙｌｂｉｓ［（ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）−３，１−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｙｌ］］ｂｉｓ［４−［（３−ｍｅｔｈｙｌ−２（３Ｈ）−ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］］−，  ｔｅｔｒａｉｏｄｉｄｅ）などがあげられるが、本発明では特に、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合性を示すＤＡＰＩ、ＹＯＹＯ（登録商標）−１などが好ましく、より強い蛍光を発し、ＤＮＡ単一分子の観察に適することから、ＹＯＹＯ（登録商標）−１が最適である。ＹＯＹＯ（登録商標）−１は、ＤＮＡの塩基対に対してのモル比で１：８以下のときビスインターカレーターとして、また１：８以上のモル比でグルーヴバインダーとして作用すると考えられている。本発明では、好ましくは１：８以下の比率、具体的には例えば、１：８〜１：１０の比率で使用される。
【００１２】
複合単分子膜の作製するには、まず、ＤＮＡ水溶液をガラスセル、ラングミュアトラフ等の容器に入れる。ここでは、特にポリフッ化エチレン（テフロン（登録商標））コーティングしたラングミュアトラフが好ましく用いられる。水溶液量は、後述の固体基板が完全に沈む量であれば、いかなる量であっても構わない。ＤＮＡ水溶液は、例えば、１０℃から３０℃、好ましくは１８℃から２２℃に保持する。次に、マイクロシリンジ等を用いて、１０〜２５ｍｌ、好ましくは１５〜２０ｍｌの展開溶液をＤＮＡ溶液表面に展開し、展開溶媒が蒸発するまで一定時間、例えば２から１５分、好ましくは３から１０分、より好ましくは４から６分間静置する。静置後、フィルムバランスＦＳＤ−３００を用いてバリアーによる圧縮を、例えば、０．０５〜０．２ｍｍ／ｓｅｃ、好ましくは０．１〜０．１２５ｍｍ／ｓｅｃの速度で行う。この結果、カチオン性両親媒性物質によって形成される単分子膜は正電荷を有するので、負電荷を有しているＤＮＡはその単分子膜に引き寄せられ、気水界面にＤＮＡ−カチオン性両親媒性物質の複合単分子膜が形成される。
【００１３】
次に、上記のようにして形成されたＤＮＡ−カチオン性両親媒性物質の複合単分子膜を基板に移し取る操作を行なう。例えば、複合単分子膜を、ＤＮＡ水溶液に予め沈めておいた固体基板を垂直に引き上げることによって、その固体基板上に移し取る。ここで、垂直とは、ほぼ垂直を意味し、複合単分子膜にしわがよることなく引き上げることができる限り多少傾斜していてもかまわない。複合膜を移し取るための基板としては、平坦であれば何れの基材を用いたものでもよい。例えば、固定化後に蛍光を観察する場合は、基板自身の蛍光を少なくするために、カバーガラスを用いることが好ましい。ガラス基板は、通常、界面活性剤、例えばデコン９０（Ｄｅｃｏｎ  ９０、ＡＲ  ＢＲＯＷＮ社製）溶液、続いて超純水を用いて超音波にて洗浄する。上記（１）において作製した複合単分子膜を、予めＤＮＡ溶液中に沈めておいた洗浄済みのガラス基板を一定速度、例えば０．５〜５ｍｍ／ｓｅｃ、好ましくは１〜２ｍｍ／ｓｅｃで引き上げることにより、基板上へ移し取る。
ここで、複合単分子膜の形成及びその引き上げ操作について、図１を参照して説明する。図１（ａ）は、単分子複合膜を形成する器具の概要を示す図、図１（ｂ）は、ラングミュアトラフ中で単分子膜が形成される状況を示す図、そして図１（ｃ）は、複合単分子膜を引き上げる操作を示す図である。
図１（ａ）中、ポリフッ化エチレン（テフロン（登録商標））コーティングしたラングミュアトラフ１中にタンパク質−ＤＮＡ水溶液２が入れられている。タンパク質−ＤＮＡ水溶液２には、引き上げ用の取っ手を有する固体基板３が浸漬される。カチオン性両親媒性物質を含む展開液（不図示）は、マイクロシリンジ４からタンパク質−ＤＮＡ水溶液２上に展開される。なお、５は温度センサー、６は、カチオン性両親媒性物質の展開液に圧力を与えるバリアー、７は表面圧を測定するためのウィルヘルミー・プレートである。図１（ｂ）に示すように、タンパク質−ＤＮＡ試料２ａを含有するタンパク質−ＤＮＡ水溶液２の表面に、カチオン性両親媒性物質８ａの単分子膜８が形成されている。このカチオン性両親媒性物質８ａにタンパク質−ＤＮＡ試料２ａが静電吸着し、複合単分子膜を形成する。固体基板３はタンパク質−ＤＮＡ水溶液２中に予め浸漬されている。形成された複合単分子膜を引き上げる際は、図１（ｃ）に示すように、バリアー６を移動し、カチオン性両親媒性物質８ａに圧力をかけてカチオン性両親媒性物質８ａからなる単分子膜８の密度を高くする。そして、固体基板３をゆっくりと垂直に引き上げることによって、タンパク質−ＤＮＡ試料２ａを伸長させながら固体基板３に移し取る。
【００１４】
上記のように固定化されたタンパク質−ＤＮＡ試料は、塩基配列解析のための試料として有効に用いられる。すなわち、複合膜を移し取った基板を十分乾燥させた後、走査型近接場光学顕微鏡ＳＰＡ３００／ＳＮＯＡＭ（ＳＥＩＫＯインストルメンツ）を用いて、基板上のＤＮＡ分子の形状を観察することができる。
具体的には、波長４８８ｎｍの励起光のアルゴンイオンレーザーＳｔａｂｉｌｉｔｅ２０１７（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）を用いて、近接場光学顕微鏡のファイバープローブ先端において出力が適当に得られるように、例えば約３００μＷの出力となるように調整し、ＹＯＹＯ（登録商標）−１からの蛍光を対物レンズで集光する。これをシングルフォトンカウンティングモジュールＳＰＣＭ−ＡＱＲ−１４（ＥＧ＆Ｇ）にて検出し、得られた検出フォトン数をＳＰＩ３８００Ｎ（ＳＥＩＫＯインストルメンツ）を用いて画像化し、蛍光像を構成した。また、ファイバープローブをＤＦＭモードで使用することにより、形状像を検出する。
得られた蛍光像および形状像より、タンパク質が結合するＤＮＡの位置を計測できる。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【００１６】
実施例１
（１）試薬
気液界面に展開するカチオン性脂質として、ジオクタデシルアンモニウム塩（相互薬工）を使用した。これをスペクトロゾールクロロホルム（和光純薬）を溶媒として、濃度約０．５ｍｇ／ｍｌの展開溶液を調製した。
二重鎖ＤＮＡとして、λＤＮＡ（日本ジーン）を使用した。ＤＮＡの蛍光プローブとして、ＹＯＹＯ（登録商標）−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を使用した。
マッピングを行うための制限酵素として、ＥｃｏＲＩ（宝酒造）を使用した。
【００１７】
（２）制限酵素の蛍光色素標識
ＥｃｏＲＩを室温で静置することにより、純水中に完全に溶解した。超純水を用いて作製した１０ｍＭ  Ｓｕｌｆｏ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）  ｈｅｘａｎｏａｔｅ（ＥＺ−ＬｉｎｋＴＭ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＰＩＥＲＣＥ）水溶液をＥｃｏＲＩの２０倍のモル数となるように添加し、０℃で２時間、さらに室温で３０分間反応させることで、ビオチン修飾ＥｃｏＲＩを得た。さらに、１ｎｍｏｌのＥｃｏＲＩに対して、１μｇのストレプトアビジンが反応するように、ビオチン修飾ＥｃｏＲＩに１０μｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ水溶液を添加し、蛍光色素標識されたＥｃｏＲＩを作製した。
【００１８】
（３）下水相ＤＮＡ水溶液の調製
λＤＮＡを一晩室温で放置することにより超純水に完全に溶解し、濃度が１塩基対あたり１．０×１０−５Ｍとなるように調製した。この水溶液に前記（２）で調製した１．０×１０−９Ｍの蛍光色素標識ＥｃｏＲＩを加え、室温で一晩静置した。静置後、最終的なＤＮＡ濃度が１塩基対あたり１．０×１０−８Ｍとなるように超純水でメスアップした。λＤＮＡを染色するために、ＹＯＹＯ（登録商標）−１を、ＤＮＡ塩基対に対して、モル比が１：１０となるようにＤＮＡ水溶液に添加した。ＹＯＹＯ（登録商標）−１をＤＮＡ分子に結合させるために、溶液調製後２時間以上静置した。
【００１９】
（４）単分子膜の作製
表面圧−分子占有面積（π−Ａ）等温線の測定には、マイクロプロセッサー制御のフィルムバランスＦＳＤ−３００（ＵＳＩシステム）を用いた。ポリフッ化エチレン（テフロン（登録商標））コーティングされたラングミュアトラフに下水相水溶液を満たし、２０℃に保持した。その後、マイクロシリンジにて適当量分取した展開溶液を下水相の表面に静かに展開し、展開溶媒が蒸発するまで５分間静置した。静置後、ＦＳＤ−３００を用いてバリアーによる圧縮を０．１ｍｍ／ｓｅｃの速度で行った。表面圧は１ｃｍ四方の濾紙片を用いたウィルヘルミー法により測定した。
【００２０】
（５）複合膜の移し取り
複合膜を移し取るための基板としてカバーガラスを用いた。ガラス基板を界面活性剤であるｄｃｎ９０溶液（３０ｍｌ／Ｌ  ｉｎ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に浸漬し、約１５分間超音波洗浄した後、さらに超純水中で１５分間の超音波洗浄を３回繰り返した。種々の条件下で作製した複合膜を、予め下水相ＤＮＡ水溶液に沈めておいたガラス基板を２ｍｍ／ｍｉｎの速度で引き上げることにより、基板上へそれぞれ１層ずつ移し取った。
【００２１】
（６）蛍光イメージの観察
前記（５）にて得られた複合膜を移し取った基板を十分乾燥させた後、走査型近接場光学顕微鏡ＳＰＡ３００／ＳＮＯＡＭ（ＳＥＩＫＯインストルメンツ）を用いて、基板上のＤＮＡ分子の形状を観察した。波長４８８ｎｍの励起光のアルゴンイオンレーザーＳｔａｂｉｌｉｔｅ２０１７（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）を用いて、近接場光学顕微鏡のファイバープローブ先端において、約３００μＷの出力となるように調整した。ＹＯＹＯ（登録商標）−１からの蛍光を対物レンズで集光し、シングルフォトンカウンティングモジュールＳＰＣＭ−ＡＱＲ−１４（ＥＧ＆Ｇ）にて検出した。得られた検出フォトン数をＳＰＩ３８００Ｎ（ＳＥＩＫＯインストルメンツ）を用いて画像化し、蛍光像を構成した。また、ファイバープローブをＤＦＭモードで使用することにより、形状像を検出した。
【００２２】
（７）ＥｃｏＲＩのマッピング−蛍光顕微鏡による解析
蛍光顕微鏡で得られた画像を図２に示す。
図２に示した画像を解析した結果、観察された一本の伸長したＤＮＡの長さが約２１μｍであることから、単一のλＤＮＡであることは明らかである。また、赤色の蛍光がＤＮＡ上に観察された（図中、矢印でその位置を示した）。この赤色の蛍光はＥｃｏＲＩに由来するものである。ＥｃｏＲＩは、λＤＮＡの５ヶ所に認識結合（および切断）部位を有し、ＤＮＡの伸長率を考慮すると、５’端から最初に出現する認識部位に蛍光があると考えられる。
【００２３】
（８）ＥｃｏＲＩのマッピング−近接場顕微鏡による解析
近接場顕微鏡で得られた形状像および蛍光像を図３に示す。
図３（ｂ）に示したように、伸長したＤＮＡの蛍光像が観察され、高い蛍光強度を示す個所が２ヶ所存在することがわかった。形状像（図３（ａ））を解析すると、蛍光像で高い蛍光強度を示した２ヶ所に対応する個所に、１０ｎｍ程度の大きさの物体が観察された。
また、蛍光強度分布を解析したところ、図４に示したように、２ヶ所のピークは形状像のピーク間隔と一致し、この結果から、ＥｃｏＲＩの結合部位がλＤＮＡの５’端から３番目および４番目であることが示唆される。
【００２４】
【発明の効果】
再現的に、効率よく、タンパク質を結合したＤＮＡを伸長固定化することにより、容易にＤＮＡ一分子の特異的塩基配列を検出することが可能となる。また、近接場光学顕微鏡を用いることにより、蛍光像および形状像の両者を観察測定でき、精度の向上をはかることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（ａ）は、単分子複合膜を形成する器具の概要を示す図、図１（ｂ）は、ラングミュアトラフ中で単分子膜が形成される状況を示す図、そして図１（ｃ）は、複合単分子膜を引き上げる操作を示す図である。
【図２】ＥｃｏＲＩが結合したλＤＮＡの蛍光像を示す。
【図３】λＤＮＡを用いて得られた形状像（ａ）および蛍光像（ｂ）を示す。
【図４】蛍光強度分布とＥｃｏＲＩの推定結合部位を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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