(57)【要約】【課題】ヘモグロビン・リガンド分子複合体の結晶を得て、その立体構造を解明して、新薬候補物質のスクリーニングなどに利用できるようにすること。【解決手段】空間群Ｃ２２２１を有する、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶。ヘモグロビンとリガンド分子との複合体を含有する溶液に、ポリエチレングリコールおよび亜ジチオン酸ナトリウムを添加して、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶を析出させることを含む、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶の製造方法。被験物質とヘモグロビンとの結合様式を調べることを含む、ヘモグロビンのα鎖の５７位のアラニンから８７位のヒスチジンまでのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸を認識する物質を探索する方法。【選択図】　図３
2004123568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
空間群Ｃ２２２１を有する、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶。
【請求項２】
結晶の単位格子が、ａ＝６２．３９６±２０．０オングストローム、ｂ＝１０７．４９６±２０．０オングストローム、ｃ＝８６．７４５±２０．０オングストロームの大きさを持つ請求項１記載の結晶。
【請求項３】
ヘモグロビンとリガンド分子との複合体を含有する溶液に、ポリエチレングリコールおよび亜ジチオン酸ナトリウムを添加して、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶を析出させることを含む、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶の製造方法。
【請求項４】
被験物質とヘモグロビンとの結合様式を調べることを含む、ヘモグロビンのα鎖の５７位のアラニンから８７位のヒスチジンまでのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸を認識する物質を探索する方法。
【請求項５】
ヘモグロビンのα鎖の５７位のアラニンから８７位のヒスチジンまでのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸を認識する物質が、ヘモグロビンの酸素親和性を上昇または低下させることができるものである請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘモグロビン・リガンド分子複合体の結晶、その製造方法および物質の探索方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘモグロビンは、水で満たされた中心空洞の回りに配置された２つのαサブユニットおよび２つのβサブユニットからなる四量体タンパク質である。各サブユニットは、１個の酸素分子が可逆的に結合する１個のヘム基を担持している。各サブユニットの酸素親和性は、同一四量体内の他のヘムが酸素で飽和されると増大する。この協同的相互作用は、２つの四次構造の間の平衡が低親和性Ｔ状態から高親和性Ｒ状態へシフトした結果であると説明されてきた（１）。この四次コンホメーション変化は、対照的に関連するαβ二量体が互に対して約１５°回転すること、および回転軸に沿って約０．８Å並進することからなり、その結果、Ｒ状態においてＴ状態におけるよりも狭い中心空洞をもたらす（２）。
【０００３】
ヘモグロビンの酸素親和性は、Ｔ状態のヘモグロビンに優先的に結合することによって酸素親和性を低下させるプロトン（３）、塩化物イオン（４，５）および２，３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）１（６，７）等のいくつかの非ヘムリガンドによってさらに変調される。これらの天然のアロステリックエフェクターの他に、種々の合成分子がヘモグロビンの酸素親和性を低下させる能力について調べられた。なぜなら、そのようなアロステリックモジュレーターは研究および治療の両用途に有用でありうるからである（８−１０）。
【０００４】
１９８３年にＰｅｒｕｔｚおよびＰｏｙａｒｔ（８）は、抗高脂肪血症薬ベザフィブレート（ＢＺＦ）（図１参照）がヘモグロビンの酸素親和性を天然のエフェクターであるＤＰＧよりも強く低下させ、かつこれと相乗的に作用することを見いだした。これに続いて行われたヒトデオキシヘモグロビン・ＢＺＦ複合体の結晶学的研究は、ＢＺＦの２つの分子がＴ状態デオキシヘモグロビンの大きな中心空洞に対照的な様式で結合すること、そして各分子はＤＰＧ結合部位から離れて１つのβサブユニットおよび２つのαサブセットに接触することを示した（１１）。他方、ＢＺＦと共に共結晶化したＲ状態のヒト一酸化炭素結合型ヘモグロビンの以前に行われた結晶学的分析（４．８５Å分解能）は、Ｒ状態の分子に結合した薬剤を全く示さなかった（１１）。さらに、より初期の溶液結合試験は、ＢＺＦはＲ状態のヘモグロビンとは非特異的にしか結合しないと示した（１１，１２）。
【０００５】
ヘモグロビンの研究にＢＺＦを用いることの基底にある基礎的前提は、この薬剤がＴ状態ヘモグロビンとのみ相互作用する、というものであった（１３−１６）。しかし、いくつかの証拠が、この前提の正しくないことを示している。例えば、以前に行われた一酸化炭素結合型ヘモグロビンのレーザーフラッシュ光分解試験は、ＢＺＦがＲ状態ヘモグロビンのＣＯ会合速度の４倍以上の低下を引き起こすことを示した（１７，１８）。さらに、Ｃｏｌｅｔｔａら（１９）はＢＺＦ濃度の関数としての、オキシヘモグロビンからの酸素解離速度を測定し、Ｒ状態の分子はＢＺＦが飽和できる（ｓａｔｕｒａｂｌｅ）結合部位を有することを示した。より最近になって、Ｔｓｕｎｅｓｈｉｇｅ　ら（２０）は裸のヘモグロビンにＢＺＦを添加するとＲ状態の酸素親和性を顕著に低下させると報告し、エフェクターと結合した何らかの三次構造変化を示唆している。しかし、現在に至るまでそのような三次元的束縛（ｔｅｒｔｉａｒｙ　ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ）を説明する構造的基礎は欠けていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＢＺＦと複合体を形成しているウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンの高分解能（１．５５Å）Ｘ線結晶構造を提示し、そしてＲ状態ヘモグロビンのＢＺＦに対する推定される結合部位の位置および立体化学を示すことを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
Ｒ状態の機能に及ぼすＢＺＦの効果をさらに調べるため、本発明者らはウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビン・ＢＺＦ複合体の最初の（ｏｒｉｇｉｎａｌ）Ｒコンホメーションを湿潤した透明なゾル−ゲル中に封じ込むことによってトラップする。本発明者らの以前の研究は、封じ込まれたヘモグロビン分子は溶媒に接触しており、小さいリガンドと結合する、またはこれを放出することが可能であること；そして一方ではゲルマトリックスがヘモグロビンの四次構造変化を制限すること、を示した（２１−２４）。したがって、ゾル−ゲル中のＲ状態にロックされたヘモグロビン・ＢＺＦ複合体の酸素平衡特性を決定することができる。このトラップ技法がなければ、強いアロステリックエフェクターの存在下で出現しうる三重にリガンド化されたＴ状態は、真のＲ状態親和性の測定を妨げるであろう（１８）。この技法のさらなる利点は、αおよびβサブユニットに対するそれぞれの酸素親和性を解明できることである。
【０００８】
抗高脂血症薬ベザフィブレートは、ヘモグロビンの強力なアロステリックエフェクターとして知られている。この薬剤のアロステリック効果について以前に提案された作用機構は、Ｔ状態の大きな中心空洞に特異的に結合することによってこの薬剤がヘモグロビンのＴ状態を安定化させ、そしてＴ状態を強いる、というものであった。本明細書において、本発明者らは、完全にリガンド化されたＲ状態ヘモグロビンにおけるこの薬剤に対する新しいアロステリック結合部位を報告する。ベザフィブレートと複合体を形成したウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンの高分解能結晶構造は、ベザフィブレート分子が各αサブユニットのＥヘリックスの表面付近に存在すること、および該複合体がＲ状態の四次構造を維持していること、を明らかにする。結合はベザフィブレートが結合ポケット（これは数個の疎水性残基およびヘム末端によって構成されている）にぴったりはまる（ｃｌｏｓｅｆｉｔ）ことによって引き起こされ、このことは疎水性相互作用の重要性を示唆している。ベザフィブレートが結合すると、αサブユニットではＦｅと遠位Ｈｉｓ　Ｅ７　（α５８）のＮε２との距離が０．２２Åだけ短くなる。他方、βサブユニットには重大な構造変化は何ら伝達されない。湿潤多孔性ゾル−ゲル中の、ベザフィブレートと複合体を形成するＲ状態にロックされたヘモグロビンの酸素平衡研究は、ベザフィブレートがＲ状態において片方のサブユニットの酸素親和性を選択的に低下させることを示す。このことは構造データと一致する。これらの結果はベザフィブレートの新しいアロステリック作用機構を開示し、またアロステリックエフェクターがいかにしてＲ状態のヘモグロビンと相互作用するかを初めて示すものである。本発明は、これらの知見に基づいて、完成されたものである。
【０００９】
本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）　空間群Ｃ２２２１を有する、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶。
（２）　結晶の単位格子が、ａ＝６２．３９６±２０．０オングストローム、ｂ＝１０７．４９６±２０．０オングストローム、ｃ＝８６．７４５±２０．０オングストロームの大きさを持つ（１）記載の結晶。
（３）　ヘモグロビンとリガンド分子との複合体を含有する溶液に、ポリエチレングリコールおよび亜ジチオン酸ナトリウムを添加して、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶を析出させることを含む、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶の製造方法。
（４）　被験物質とヘモグロビンとの結合様式を調べることを含む、ヘモグロビンのα鎖の５７位のアラニンから８７位のヒスチジンまでのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸を認識する物質を探索する方法。
（５）　ヘモグロビンのα鎖の５７位のアラニンから８７位のヒスチジンまでのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸を認識する物質が、ヘモグロビンの酸素親和性を上昇または低下させることができるものである（４）記載の方法。
【００１０】
本明細書において、「リガンド」とは、ヘモグロビンに結合することができる全ての物質をいうものとする。
【００１１】
「認識」とは、２つの物質の間の結合を意味する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のヘモグロビン・リガンド分子複合体の結晶は、空間群Ｃ２２２１を有する。ヘモグロビンは、α鎖とβ鎖の二量体であるとよく、また、Ｒ状態（すなわち、ヘム鉄に配位子（例えば、酸素分子、一酸化炭素分子など）が結合している状態）であるとよい。Ｒ状態の配位子としては、一酸化炭素、酸素などを例示することができる。ヘモグロビンのα鎖のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ヘモグロビンのβ鎖のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００１３】
リガンドは、ヘモグロビンに結合することができる物質であればよく、例えば、抗高脂血症薬ベザフィブレート（ＢＺＦ）、イノシトールヘキサキスホスフェート（ＩＰＨ）、２，３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）、それらの類縁化合物などを挙げることができる。
【００１４】
本発明のヘモグロビン・リガンド分子複合体の結晶の単位格子は、例えば、ａ＝６２．３９６±２０．０オングストローム、ｂ＝１０７．４９６±２０．０オングストローム、ｃ＝８６．７４５±２０．０オングストロームの大きさを持つ。
【００１５】
本発明の結晶は、約２０オングストローム以下の分解能、好ましくは約１．５５オングストロームまたはそれ以下の分解能でＸ線を回折することができ、該結晶の立体構造を決定するのに有用である。
【００１６】
本発明の結晶は、表Ａに示す構造座標またはそれからの根平均二乗偏差が、結合長について０．００８オングストローム以下であり、結合角について０．０８２°以下である座標を有する、ヘモグロビンを含んでいるものであるとよい。
【００１７】
本発明の結晶の構造座標またはその一部を含むデータを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体（例えば、磁気テープ、カセットテープ、フレキシブルディスク、ハードディスク、ＭＯ／ＭＤ／ＤＶＤ、半導体メモリなど）に記憶させ、そのタンパク質構造を立体図形描写としてディスプレイすることができる。このようなデータは、他のヘモグロビン関連タンパク質（例えば、変異タンパク質、変種など）の構造の解明やヘモグロビンの酸素親和性を調節する新規な薬剤の同定、検索、設計といった目的に使用することができる。
【００１８】
例えば、出発点として構造が既知の分子を用いて、構造が未知の結晶サンプルの構造をモデル化する分子置換法により、表Ａに示す構造座標またはその一部を用いて、ヘモグロビンまたはその一部とベザフィブレート以外のリガンド分子との複合体の立体構造を決定することができる。
【００１９】
あるいはまた、未知構造のモデルをタンパク質、タンパク質ドメインまたはサブドメインの構造座標を用いて構築するホモロジーモデル化法により、表Ａに示す構造座標中のヘモグロビンの構造座標を用いて、ヘモグロビンの変異体や変種またはそれらの一部とリガンド分子との複合体の立体構造を決定することができる。
【００２０】
さらに、新規な薬剤の発見を目的として、ドッキングスタディなどの手法により、表Ａに示す構造座標またはその一部を用いて、種々の物質とヘモグロビンとの結合様式をコンピュータで評価するとよい。ヘモグロビンと結合することができる物質は、ヘモグロビンとその物質との相互作用に関連する生物学的機能を阻害する可能性がある。例えば、ヘモグロビンと結合することができる物質は、ヘモグロビンの酸素親和性を低下させる可能性がある。ヘモグロビンの酸素親和性を低下させる物質は、ガン細胞への酸素運搬量を増やすため、放射線治療に役立つので、ガン治療における放射線増感剤として利用可能である。
【００２１】
本発明は、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体を含有する溶液に、ポリエチレングリコールおよび亜ジチオン酸ナトリウムを添加して、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶を析出させることを含む、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶の製造方法を提供する。
【００２２】
ヘモグロビンは、例えば、Ｂｏｌｔｏｎ（２５）らが記述する方法により調製することができる。
【００２３】
ヘモグロビンを精製した後、リガンドと混合することにより、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体を形成させる。
【００２４】
次いで、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶を調製する。結晶化する方法としては、バッチ法、透析法、蒸気拡散法などの手法を用いることができる。バッチ法を採用する場合、ヘモグロビン濃度３０±２０ｍｇ／ｍｌ、リガンド濃度１０±５ｍＭ、ｐＨ＝６．８のクエン酸アンモニウム緩衝液中、温度２０℃の条件下で、沈殿剤として１６％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１０００および０．１％（ｗ／ｖ）亜ジチオン酸ナトリウムを添加することにより、ヘモグロビンとリガンド分子との複合体の結晶が得られる。この結晶の一例として、空間群Ｃ２２２１を有するものを挙げることができる。
【００２５】
また、本発明は、被験物質とヘモグロビンとの結合様式を調べることを含む、ヘモグロビンのα鎖の５７位のアラニンから８７位のヒスチジンまでのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸を認識する物質を探索する方法を提供する。ヘモグロビンのα鎖の５７位のアラニンから８７位のヒスチジンまでのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸を認識する物質は、ヘモグロビンの酸素親和性を上昇または低下させることができるものであるとよい。例えば、ヘモグロビンの酸素親和性を低下させる物質は、ガン治療におけう放射線増感剤として利用可能である。
【００２６】
被験物質とヘモグロビンとの結合様式は、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、中性子回折などの立体構造解析、電子顕微鏡や原子間力顕微鏡などの複合体の形状を観察する方法、表Ａに示すヘモグロビンの立体構造（あるいは、公知の立体構造でもよい）に対する任意の構造の被験物質との安定な結合様式をコンピュータでシュミレートするドッキングスタディなどの手法などを用いることができる。
【００２７】
例えば、ヘモグロビンのα鎖の５７位のアラニンから８７位のヒスチジンまでのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸を認識する化合物を、化学構造のデータベース（例えば、”Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｄａｔａｂａｓｅ”，　”ＲＣＳＢ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａｂａｓｅ”，　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔなど）から選択することができる。この場合、本発明のヘモグロビン・リガンド分子複合体の結晶におけるヘモグロビンの構造座標またはその一部を利用する。その立体構造において、ヘモグロビンと結合できる点を、１または２以上の官能基との相互作用の有利性に関して特徴化する。次いで、この特徴化に基づいてヘモグロビンと有利な相互作用をしうる１または２以上の官能基を含む候補化合物を探すため、化学構造のデータベースを探索する。ヘモグロビンの立体構造との有利な相互作用の点に最もよく適合する構造を持つ化合物がこうして同定される。このような探索は、ＤＯＣＫ（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　（１９８６）　２９，　２１４９−２１５３）、ＳＹＢＹＬ（トライポス社）などのソフトウェアを用いて、コンピュータ上で行うことができる。
【００２８】
ヘモグロビンのα鎖の５７位のアラニンから８７位のヒスチジンまでのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸を認識する物質としては、以下の（ａ）−（ｇ）からなる群より選択されるの少なくとも一つの結合様式を有するものを挙げることができる。
（ａ）　ヘモグロビンのα鎖の５７位のアラニンとの疎水結合
（ｂ）　ヘモグロビンのα鎖の６１位のリシンとの水素結合（水分子を介してもよい）
（ｃ）　ヘモグロビンのα鎖の６４位のアスパラギン酸との水素結合（水分子を介してもよい）
（ｄ）　ヘモグロビンのα鎖の６５位のアラニンとの疎水結合
（ｅ）　ヘモグロビンのα鎖の６８位のロイシンとの疎水結合
（ｆ）　ヘモグロビンのα鎖の８０位のロイシンとの疎水結合
（ｇ）　ヘモグロビンのα鎖の８３位のロイシンとの疎水結合
上記物質は、さらに、ヘムのＡピロルのメチル基と疎水結合するものであってもよい。
【００２９】
本発明の探索方法においては、さらに、前記の手法のいずれかにより選択された構造を持つ物質を、ヘモグロビンへの結合能力、ヘモグロビンの酸素親和性を上昇または低下させる能力、および／またはヘモグロビンにより媒介される生物学的機能の増強または阻害能力について試験してもよい。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３１】
［実施例１］
実験方法
ウマヘモグロビンの調製：ウマ溶血物をＢｏｌｔｏｎら（２５）が記述するように調製した。１０　ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ　６．８５）から１５　ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ　７．６０）の線勾配でＣＭ５２セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ）カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーによっていわゆる「遅速度成分」画分を単離した。
【００３２】
結晶化および構造決定：ＢＺＦ　（Ｓｉｇｍａ）と複合体を形成しているウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビン（遅速度成分）の単結晶を、１６％　（ｗ／ｖ）　ＰＥＧ１０００、　８　ｍＭ　ＢＺＦ、　０．１％　（ｗ／ｖ）亜ジオチン酸ナトリウム、および５０　ｍＭクエン酸アンモニウムバッファー（ｐＨ　６．８）を含有するＣＯ飽和０．２５％　（ｗ／ｖ）ヘモグロビン溶液からバッチ法を用いて２０℃で成長させた。２０％　（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する母液を凍結保護剤として用い、液体窒素中でフラッシュ凍結を行う前にこの中で結晶を軽くすすいだ。日本国播磨所在のＳＰｒｉｎｇ−８理研ビームラインＢＬ４４Ｂ２ステーションの放射光源を用いて高分解能Ｘ線回折データを１００Ｋで得た（２６）。ＭＡＲ　ＣＣＤ検出器を用いて強度データを収集した。結晶はｂ軸が回転軸に近くなるようにマウントした。入射Ｘ線の波長は０．７Åであった。回折データをまとめ、ＨＫＬ２０００およびＳＣＡＬＥＰＡＣＫを用いて評価した（２７）。ウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビン・ＢＺＦ複合体の最初のモデルはプログラムＭＯＬＲＥＰを用いた分子置換法によって得られた（２８）。検索モデルは、最近報告されたウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンの座標から構築された（２９）。ＭＯＬＲＥＰによる回転および並進に関するパラメータの精密化（２８）は、１０−３Å分解能のデータに対して０．６８９という相関係数および０．４２３というＲ因子を与えた。上記モデルを、Ｘ−ＰＬＯＲ　３．８５１のスロー−クール（ｓｌｏｗ−ｃｏｏｌ）プロトコールを用いた厳格な焼きなまし法による精密化に付した。焼きなまし法のスロー−クールアニーリングのいくつかの工程を実施し、次にグラフィックスプログラムＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯを用いてモデルの再構築を行った（３１）。スロー−クールプロトコール（Ｔ＝３０００　Ｋ）を用いて偏りのない（ｕｎｂｉａｓｅｄ）オミットマップを計算した。１５０個の溶媒分子を包含させ、そしてそれぞれの等方性因子によって熱運動をモデル化すると、２０．０から１．７０ÅのデータについてＲ因子は２１．７％で、またｆｒｅｅ　Ｒ因子は２４．４％であった。このモデルを、ＳＨＥＬＸのコンジュゲート勾配最小化を用いてさらに精密化した（３２）。精密化のこの段階で、測定された強度およびそれらの推定される標準偏差の実施セットを標準ＳＨＥＬＸ重みつけスキームと共に最小化公式に使用した。ＳＨＥＬＸ精密化の各ラウンド後に標準反射セットからｆｒｅｅ　Ｒ因子を計算した。手作業による溶媒およびタンパク質側鎖のリモデリングと並行して、分解能を１．５５　Åまで上げた。溶媒分子を、球状電子密度ピークが｜２Ｆｏ−Ｆｃ｜マップの１．５σの上および｜Ｆｏ−Ｆｃ｜マップの３．０σの上に見いだされる位置であって、かつ立体化学的に妥当な水素結合が可能な位置に配置した。一酸化炭素結合型ヘモグロビン・ＢＺＦ複合体の最終モデルのＰＲＯＣＨＥＣＫ　（２８）を用いた構造評価は、残基の９３．５％がラマチャンドラン（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ）プロットの最も好ましい領域内に存在し、「許容されない」領域には残基が存在しないことを示した。データ収集および最終精密化統計の要約を表１に示��。座標および構造因子はＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）にＩＤコード１ＩＷＨとして寄託された。
【００３３】
ゾル−ゲル封じ込めおよび酸素平衡測定：ＢＺＦと複合体を形成している、またはしていないウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンのゾル−ゲルトラッピング、およびそれに続く酸素平衡測定はＳｈｉｂａｙａｍａ　（２２）の改変プロトコールによって実施した。これは以前のプロトコール（２２）、平衡化（２２）、ヘモグロビンのコンホメーション変化を以前のプロトコールよりも有効に防ぐために別の緩衝化ゾルへの浸漬２、ＣＯの除去（２３）、および酸素平衡測定（２４）を含む。ＢＺＦの存在下における典型的な実験は以下の通りである。すなわち、Ｅｌｌｅｒｂｙら（３３）の方法に従ってオルトケイ酸テトラメチル（東京化成）からシリカゾルを合成した。このゾルを、密閉した回転するガラス製試験管（直径１　ｃｍ）内で、このゾルを４　ｍＭ　ＢＺＦ含有５０　ｍＭ　クエン酸アンモニウムバッファー（ｐＨ　６．７）に溶解した１．５容量の０．８７％　（ｗ／ｖ）ウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビン（遅速度成分）とＣＯ雰囲気下で混合した（２１−２４）。０℃で６分以内にゲル化が起こった。得られた一酸化炭素結合型ヘモグロビンを塗布された薄いフィルム（厚さ０．０２−０．０５　ｍｍ）（これは上記試験管の内側表面に付着した）をＣＯ飽和、４　ｍＭ　ＢＺＦ含有５０　ｍＭ　クエン酸アンモニウムバッファー（ｐＨ　６．７）に浸し、０℃で１時間放置した。次に、２　ｍＭ亜ジオチン酸ナトリウムおよびカタラーゼ（６０００　ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を含有する新鮮なバッファーとバッファーを交換し、ＣＯ雰囲気下で３５℃で６３時間平衡化した。平衡化ゾル−ゲルサンプルをＣＯ飽和、ジオチン酸不含バッファーで洗浄し、そして１容量のオルトケイ酸テトラメチルおよび７．５容量の４　ｍＭ　ＢＺＦ　含有５０　ｍＭクエン酸アンモニウムバッファー（ｐＨ　６．７）
からなる緩衝化ゾルに浸した。０℃で１０分間インキュベートした後、過剰なゾルを捨てた。次に、サンプルを２５℃の水浴に入れ、１５分間放置した。この段階で第２のゾル−ゲルが最初のゾル−ゲルフィルムの細孔中に形成されていた。得られたゾル−ゲルサンプルを４　ｍＭ　ＢＺＦ　含有５０　ｍＭクエン酸アンモニウムバッファー（ｐＨ　６．７）で洗浄した。次に、封じ込められた一酸化炭素結合型ヘモグロビンをオキシヘモグロビンに変換した（２３）。封じ込められたヘモグロビンの酸素平衡曲線を以前に記述された方法（２４）によって１５℃で測定した。測定中、メトヘモグロビン含有量の増加量は常に１０％未満であった。脱酸素化データおよび対応する酸素化データの一致によって各酸素平衡曲線の可逆性が確認された。したがって、脱酸素化データをＳｈｉｂａｙａｍａ（２２）に記述されているようにニ成分分析に用いた。
【００３４】
プロトンＮＭＲ測定：Ｂｒｕｋｅｒ　Ａｖａｎｃｅ　６００　ＮＭＲ分光計を用いて、プロトンＮＭＲスペクトルを２７℃で測定した。プロトン化学シフトは内部ナトリウム３−トリメチルシリルプロピオナート−２，２，３，３−ｄ４　（ＴＳＰ−ｄ４）を参考にした。水による溶媒ピークの抑制は、グラジエントパルスを有する３−９−１９パルスシーケンスを用いて達成した（ｗａｔｅｒｇａｔｅ法）。通常、スペクトル幅１０　ｋＨｚに対して５１２個のフィッド（ｆｉｄ）
を収集した。１　Ｈｚの指数関数的ラインブロードニング（ｌｉｎｅ　ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ，線の広がり）を適用してシグナルのノイズに対する比を増大させた。
【００３５】
結果および考察
一酸化炭素結合型ヘモグロビン・ＢＺＦ複合体の構造：ＢＺＦと複合体を形成しているウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンの結晶構造を分解能１．５５Åで測定した（表１）。図２は、ＢＺＦと複合体化していないＲ状態のウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンのα１およびβ１サブユニットと重ね合わせた、上記複合体のα１およびβ２サブユニットを示す（２９）。α１β２接触（スライドする接触（ｓｌｉｄｉｎｇ　ｃｏｎｔａｃｔｓ））には重大な構造的差異は何ら見いだされず、これは上記複合体の四次元構造がＢＺＦと複合体化していないＲ状態のそれと同一であることを示している。本発明者らはまた、水素結合領域においてプロトン核磁気共鳴分光法によって証明されるように（３４）、ＢＺＦの添加が溶解したウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンのＲ状態四次元構造を変更しないことを確認した。
本発明者らは、２個のＢＺＦ分子が１個の４量体一酸化炭素結合型ヘモグロビンに、Ｔ状態デオキシヘモグロビンの結合部位（すなわち、Ｔ状態における大きな中心空洞）（文献１１参照）から離れた結合部位で、対称な様式で結合することを見いだした。一酸化炭素結合型ヘモグロビンに結合したＢＺＦ分子は、２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップ（図３ａ）によって示されるように、整然と配置されている（ｗｅｌｌ　ｏｒｄｅｒｅｄ）。興味深いことに、各ＢＺＦ分子はαサブユニットのＥヘリックスの表面近くに位置し、そのクロロベンゼン環はヘムメチル基の１つと相互作用している（図３ｂ、３ｃおよび４）。また、ＢＺＦの塩化物部分は、残基Ａｌａ　Ｅ１４（α６５）、Ｌｅｕ　Ｅ１４（α６８）、Ｌｅｕ　Ｆ１（α８０）および　Ｌｅｕ　Ｆ４　（α８３）に囲まれた疎水性空洞内にぴったりはまる（図４）。さらに、この薬剤のメチル基の１つはＡｌａ　Ｅ６（α５７）の側鎖にファンデルワールス接触している（図４）。他方、この薬剤の最も極性のカルボキシレート基は溶剤に完全に暴露されている。これらを考え合わせると、結合エネルギーの大半は疎水性相互作用に起因する。
ＢＺＦとタンパク質部分の間の水素結合を媒介する２個の水分子は、ＢＺＦの結合全体に対して重大な寄与をしている：片方の水分子（Ｗ１０５３）はＢＺＦのカルボニル基酸素をＬｙｓ　Ｅ１０（α６１）の側鎖に結合し、他方もう１個の水分子（Ｗ１００１）はＢＺＦのアミド基水素とＡｓｐ　Ｅ１３　（α６４）の側鎖を架橋している（図４）。これらの２個の水分子は、それらのＢ因子が低い（Ｗ１０５３およびＷ１００１についてそれぞれ１９．１および１０．０Å２）ことから判断されるように、整然と配置されている。
ＢＺＦの結合は、αヘムの回りに小さいが重大な立体化学的変化を誘導する（図３ｄ）。特に、ＢＺＦが結合すると、Ｆｅと遠位Ｈｉｓ　Ｅ７　（α５８）のＣαとの距離が短くなる（８．５３Åから８．３６Åへ）ことから明らかなようにＥヘリックス全体がαヘムに対してシフトするため、Ｆｅと遠位Ｈｉｓ　Ｅ７　（α５８）のＮε２との距離は重大な程度に短くなる（４．５０Åから４．２８Åへ）。遠位Ｈｉｓ　Ｅ７　（α５８）のこの動きはＣＯに対するその立体障害を増大させるであろう。なぜなら、ＢＺＦの存在下では（ＢＺＦの不在下における距離３．３６Åと比較して）Ｎε２はＣＯの酸素原子からやや近距離（３．１３Å）にあるからである。
ＣＯおよび酸素のヘモグロビンへの結合に及ぼす遠位Ｈｉｓ　Ｅ７の影響がＯｌｓｏｎら（３５）によって研究された。彼らは天然のヒトヘモグロビンおよびその遠位ポケット突然変異体を手段として、Ｒ状態αサブユニットの遠位Ｈｉｓ　Ｅ７はＣＯおよび酸素両方の２分子結合速度を抑制し、結合したＣＯを立体的に妨害し、そして結合した酸素を水素結合によって安定化させることを示した。したがって、少なくともリガンドがＣＯである場合、ＢＺＦはＲ状態ヘモグロビンのリガンド結合親和性を重大な程度に低下させるだろう、と合理的に予測することができる。この結論は、ＢＺＦの添加はＲ状態ヒトヘモグロビンのＣＯ会合速度を４倍以上低下させる、という以前の所見（１７，１８）と一致する。しかし、酸素結合の場合には、遠位ＨｉｓのＮε２と結合した酸素との間の水素結合の形成によって好ましくない立体障害がいかにして補償されるのかについて不確実さが残る（３５，３６）。
ＢＺＦが結合するとＶａｌ　Ｅ１１（α６２）のＣγ２（この残基のうちＦｅに対して最も近い炭素原子）が少し動くが（図３ｄ）、ＦｅとＣγ２との距離は本質的に不変である。したがって、ＢＺＦ結合後のＶａｌ　Ｅ１１（α６２）の動きはＲ状態機能の変更に些細な寄与しかしないと推定される。他の高度に保存された（機能的に相応する）残基、例えばＨｉｓ　Ｆ８（α８７）およびＰｈｅ　ＣＤ１（α４３）などの配向は本質的に不変のままである。ＢＺＦ結合によって誘導される構造的歪みがβサブユニットに伝達されるという証拠はない。
本発明者らが観察したウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンのＢＺＦ結合ポケットは、Ｒ状態のヒトヘモグロビンにおいても恐らく機能するであろう。なぜなら、本発明者らが観察したＢＺＦ結合ポケットの全ての残基は、ＧｌｙおよびＡｓｎによってそれぞれ置換されているＡｌａ　Ｅ６（α５７）およびＬｅｕ　Ｅ１７（α６８）の２個を除いて、ヒトヘモグロビンにおいて保存されているからである。さらに、いくつかの証拠はＢＺＦが完全にリガンド化されたＲ状態のヒトヘモグロビンに機能的に相応する方法で特異的に結合することを示している（１７−２０）。以前に行われた溶液結合試験がなぜＢＺＦとヒト一酸化炭素結合型ヘモグロビンとの非特異的結合しか見いださなかったのか（１１，１２）、本発明者らはその理由をまだ完全に理解していない。
Ｒ状態ウマヘモグロビンのβサブユニットに結合したＢＺＦは全く見いだされなかった。ＢＺＦはなぜαサブユニットとそのように特異的に結合するのだろう？考えうる説明の１つは、βサブユニットにおいてはＢＺＦの塩化物部分のための対応する結合ポケットがより狭く、かつＡｌａ　Ｅ１４（α６５）のＳｅｒへの置換、Ｌｅｕ　Ｅ１７（α６８）のＧｌｕへの置換およびＬｅｕ　Ｆ１（α８０）のＰｈｅへの置換によって疎水性がより低い、というものである。同様の傾向がヒトヘモグロビンにも見出される。
第２の疑問は、本発明者らが観察した新しいＢＺＦ結合ポケットはＴ状態の分子で機能するかどうかに関する。この可能性はありそうである。なぜなら、各ヘモグロビンサブユニットの表面はＴからＲへの遷移の間に徹底的に変化するものではないからである。また、以前に行われたＢＺＦとデオキシヘモグロビンとの溶液結合試験（１２）は、Ｔ状態における２種類のＢＺＦ結合部位の存在を示した。デオキシヘモグロビン四量体１個につき２個の結合したＢＺＦ分子を有する主要な種類の結合部位は、中心空洞の深部にあるαおよびβサブユニットの境界面　に存在する元の「ＢＺＦ結合部位」であると結晶学的に同定された（１１）。他方、もう１種類の部位の位置に関する明確な結論は引き出せなかった。より初期の研究によって示唆された、可能性のある候補部位はＴｒｐ　Ａ１２（α１４）およびＴｒｐ　Ａ１２（β１５）に近い分子表面であったが、ＢＺＦはそれらの部位にぴたりとはまらなかった（１２）ことに注意されたい。
【００３６】
酸素平衡に及ぼす効果：酸素平衡測定の間ヘモグロビンの最初のＲコンホメーションをロックしておくため、ＢＺＦと複合体化している、またはしていないウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンを湿潤多孔性ゾル−ゲル中に封じ込めた。図５は、そのようにＲ状態にロックされた、ＢＺＦを含む、または含まないサンプルの１５℃における、結晶化条件とほぼ同一条件下での酸素解離曲線のヒルプロットを示す。Ｒ状態にロックされた、ＢＺＦを含まないサンプルは、溶解したＲ状態ヒトヘモグロビンの１５℃における酸素親和性（２０）に対応する、酸素に対する非常に高い親和性（すなわち、Ｐ５０＝０．１４　ｍｍＨｇ；　Ｐ５０は半飽和時の酸素圧）を示す。図５に見られるように、このサンプルの酸素解離曲線は１．０の傾斜を有する直線に非常に近くなる。これはαおよびβサブユニット間の酸素親和性に不等価が存在しないか、または非常に小さいことを示している。
対照的に、Ｒ状態にロックされた、ＢＺＦを含むサンプルの酸素解離曲線はヒル係数が１未満の時、２フェース性挙動の兆候を示す。この２フェース性曲線からより定量的な情報を得るため、本発明者らは異なる酸素平衡定数を有する独立した２つの非協同的成分が存在すると仮定した分析を用いた。この分析は、得られた２つの成分は親和性が約５倍異なること、およびより重要なことに、ＢＺＦによって誘導される効果は親和性が低い方の成分（これは全体の３６％にあたる；図５の説明参照）に対してのみ発揮されること、を示す。これはＢＺＦがＲ状態において片方のサブユニットの酸素親和性を選択的に低下させることを示唆する。この結論は本発明者らの現在もっている構造データと完全に一致する。これらのデータは、ＢＺＦ結合によって誘導される構造の歪みはαヘムの遠位ヘムポケットに局在し、βサブユニットには伝達されないことを示している。恐らくはαサブユニットに起因する、低親和性成分の分画集団は５０％未満（すなわち３６％）であったという本発明者らの観察は、ＢＺＦと結合していない四量体の存在からさらに生じる寄与（結晶における結合ＢＺＦのほぼ完全な占有（図３ａ参照）はこの寄与は大きくないと示唆しているが）を完全に排除することは不可能であるという事実に鑑みて、驚くにあたらない。
ＢＺＦと複合体を形成している、またはしていない、Ｒ状態にロックされたヘモグロビンに関する本発明者らが現在もっている機能データは、少なくとも質的には最近のヒトヘモグロビンの酸素平衡研究（１９，２０）と一致しており、裸のヘモグロビンにＢＺＦを添加するとＲ状態ヘモグロビンの酸素親和性を（ｐＨ　７．０で）８から１０倍低下させることを示している。
【００３７】
結論：本発明者らはＲ状態ウマヘモグロビンにおけるＢＺＦとの新規なアロステリック結合部位を見出した。本発明者らのデータは、ＢＺＦによる新しい阻害作用機構を開示する。すなわち、αサブユニットのヘムならびにＥおよびＦヘリックスと直接相互作用し、そしてそれによってＲ状態の四次元構造を変化させることなくリガンド結合ポケットを狭めるのである。ヘテロトロピックエフェクターによるアロステリック阻害の他の殆どの作用機構は、サブユニット間水素結合の形成、またはＴ状態四次元構造を特異的に安定化させ、制約するファンデルワールス接触を伴う。対照的に、本発明者らが観察した結合部位は、Ｒ状態の四次元構造における各αサブユニットの表面近くに存在する。さらに、デオキシヘモグロビン・ＢＺＦ複合体に関する以前の観察と組合わせたこれらの所見は、われわれにＢＺＦは別個の結合部位を用いてＴ状態のヘモグロビンのみでなくＲ状態のヘモグロビンとも相互作用する新規な多機能アロステリックエフェクターであると結論させる。
【００３８】
脚注
１　使用した略語は以下の通りである。
ＤＰＧ：　２，３−ジホスホグリセリン酸
ＢＺＦ：　ベザフィブレート
ＩＰＨ：　イノシトールヘキサキスホスフェート
２　Ｎ．　Ｓｈｉｂａｙａｍａ、原稿準備中
【００３９】
【表１】
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ａ　括弧内の数値は外殻（１．５５−１．６１Å）を示す。
ｂ　Ｒｍｅｒｇｅ＝　Σ｜Ｉｉ−＜Ｉｉ＞｜／Σ　｜Ｉｉ｜
Ｉｉは観察強度で、＜Ｉ＞はその反射の平均値であり、合計は全反射の合計値である。
ｃ　Ｒ因子＝Σｈ‖Ｆｏ（ｈ）　｜−｜Ｆｃ（ｈ）‖／ΣｈＦｏ（ｈ）
ＦｏおよびＦｃは、それぞれ観察された、および計算された構造因子の大きさ（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）である。Ｒｆｒｅｅ因子は精密化から除外されたデータの５％を用いて計算した。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、ヘモグロビン・リガンド分子複合体の結晶およびその構造座標が提供された。それらを利用することにより、新規な薬剤の同定、検索、設計などができるようになった。
【００４１】
表Ａ．
ウマ由来の一酸化炭素結合型ヘモグロビン・ベザフィブレート複合体の１．５５Å分解能の結晶構造
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【００４２】
表Ａにおいて、ＴＥＲで始まる行以外は、各原子の３次元座標を記述している。ＴＥＲで始まる行は、各サブユニット構造の終わりを示している。１列目のＡＴＯＭは２０個のアミノ酸を構成する原子であることを示し、ＨＥＴＡＴＯＭはそれ以外の原子であることを示している。２列目の数字（１〜２６１５）はその原子の順番を、３列目のアルファベット（Ｎ，ＣＡ，Ｃ，Ｏなど）は原子の種類を、４列目の記号はアミノ酸や分子の種類を（ＡＬＡ，　ＶＡＬ，　ＬＥＵ，　ＩＬＥ，　ＰＲＯ，　ＰＨＥ，　ＴＲＰ，　ＭＥＴ，　ＧＬＹ，　ＳＥＲ，　ＴＨＲ，　ＣＹＳ，　ＧＬＮ，　ＡＳＮ，　ＴＹＲ，　ＬＹＳ，　ＡＲＧ，　ＨＩＳ，　ＡＳＰ，　ＧＬＵはアミノ酸の種類を、ＨＥＭはヘムを、ＣＭＯは一酸化炭素を、ＨＯＨは水を、ＰＥＮはベザフィブレートを表す）、５列目のＡはヘモグロビンのα鎖を、５列目のＢはヘモグロビンのβ鎖を、６列目の数字はその原子を含む分子の番号を示す。７，８，９列目の数値は、その原子のｘ、ｙ、ｚ座標を示す（単位はオングストローム）。１０列目の数値は占有率を、１１列目の数値は温度因子を示す。１２列目のアルファベットは原子の種類を示す。本表は、プロテイン・データ・バンク（ＰＤＢ）の形式に従って表記してある。
【００４３】
表Ａの３次元座標は、ヘモグロビンのα１鎖およびβ１鎖の各１本、ヘムの２つのピロル（Ａ，Ｂ）、一酸化炭素１分子、ベザフィブレート１分子、水２９７分子中のヘテロ原子の座標である。
【００４４】
なお、コンピュータによる計算を行う場合などに、各原子の相対的な配置を変化させずに、３次元空間内で並進、回転、対称などの数学的な移動操作を行うことがある。表Ａの３次元座標にこのような数学的な移動操作を行った結果得られる新たな構造座標も本発明の範囲内である。
【００４５】
【表２】
引用文献
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【００４６】
【配列表】
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【００４７】
【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、ウマ由来のヘモグロビンのα鎖のアミノ酸配列を示す。
【００４８】
【配列番号２】
配列番号２は、ウマ由来のヘモグロビンのβ鎖のアミノ酸配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベザフィブレート（ＢＺＦ）の構造。
【図２】ウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビン・ＢＺＦ複合体のα１およびβ２サブユニットとＢＺＦを含まないＲ状態ウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンの対応するサブユニットを重ね合わせた立体図。これらの２つの構造は、それらの主鎖Ｃα原子間の二乗平均の平方根の差を最小化する剛体回転および並進によって重ね合わせている。
【図３】ウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンにおけるＢＺＦのための新しい結合ポケット。（ａ）　１．３σで描かれた結合したＢＺＦおよびその近傍の最終電子密度マップ（２Ｆｏ−Ｆｃマップ）の立体図。（ｂ）αサブユニットの結合したＢＺＦ、ＥおよびＦヘリックス、ならびにヘムの立体図。（ｃ）ウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビン・ＢＺＦ複合体のαサブユニットの分子表面の静電ポテンシャル（立体図）。正および負のポテンシャルに対応して表面の点を灰色に着色している。中性の点は白に着色している。灰色の最も濃い影は、それぞれ＋１０．０　ｋｃｌ（正のポテンシャルの場合）　および−１０．０　ｋｃａｌ（負のポテンシャルの場合）を表わす。ＢＺＦ分子は棒の形（ｓｔｉｃｋ　ｍｏｄｅｌ）で示す。（ｄ）一酸化炭素結合型ヘモグロビン・ＢＺＦ複合体のαヘムおよびＢＺＦを含まないウマ一酸化炭素結合型ヘモグロビンのαヘムを重ね合わせた後のαサブユニットにおける活性部位の立体図。
【図４】αサブユニットにおけるＢＺＦとその周囲のグロビン残基、ヘムおよび構造的に保存された水分子との接触の模式図。幅の狭い破線は水素結合および静電相互作用を示し、幅広の破線は疎水性接触を示す。
【図５】ゾル−ゲル中の、Ｒ状態にロックされた、ＢＺＦを含む、または含まないウマヘモグロビンサンプルの１５℃における酸素解離曲線のヒルプロット。ＰはＯ２の部分圧（ｍｍＨｇ）を、そしてＹは酸素の飽和分率を示す。黒塗りの丸（●）および白抜きの丸（○）はそれぞれＢＺＦの存在下および不在下における酸素解離曲線を表わす。データポイントは３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｅ．（バー）である。データポイントを結ぶ実線は、異なる酸素解離平衡定数を有する２つの独立した非協同的な成分の存在を仮定した分析の結果である。ＢＺＦの存在下における高および低親和性成分の計算された酸素解離平衡定数は、それぞれ０．０８　ｍｍＨｇ　（６６％）および０．５７　ｍｍＨｇ　（３６％）である（括弧内の数字は分画集団を示す）。ＢＺＦの不在下ではこれらの定数は０．１４　ｍｍＨｇという等しい値になる。この図には、Ｐ５０＝０．１　ｍｍＨｇ　（ｎ＝１；　ｎはヒル係数）に対応する破線の直線が酸素親和性の基準として描かれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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