(57)【要約】【課題】アポトーシス誘導剤は充分な効果をあげる用量では正常細胞に対する副作用が発現し、充分な効果が発揮できていない。【解決手段】アポトーシス誘導剤と併用するための、ＡＭＦの作用を抑制する物質を有効成分とする新規なアポトーシス増強剤を用いた癌の治療剤の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシス誘導剤と併用するための、ＡＭＦ阻害活性を有する物質を有効成分とするアポトーシス増強剤。
【請求項２】
ＡＭＦ阻害活性を有する物質がＡＭＦもしくはＡＭＦ受容体に結合することによりＡＭＦとＡＭＦ受容体との結合を阻害し、ＡＭＦ阻害活性を示す化合物である、請求項１に記載のアポトーシス増強剤。
【請求項３】
ＡＭＦ阻害活性を有する物質が抗ＡＭＦ抗体である請求項１に記載のアポトーシス増強剤。
【請求項４】
抗ＡＭＦ抗体がポリクローナル抗ＡＭＦ抗体である請求項３に記載のアポトーシス増強剤。
【請求項５】
抗ＡＭＦ抗体がモノクローナル抗ＡＭＦ抗体である請求項３に記載のアポトーシス増強剤。
【請求項６】
抗ＡＭＦ抗体がヒト化抗ＡＭＦ抗体である請求項３に記載のアポトーシス増強剤。
【請求項７】
アポトーシス誘導剤が制癌剤である、請求項１〜６いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
【請求項８】
２重鎖ＤＮＡへの架橋形成を介してＤＮＡの複製を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物の群から選ばれるアポトーシス誘導剤と併用することを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
【請求項９】
ＩもしくはＩＩ型トポイソメラーゼを阻害することによってＤＮＡ合成を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物の群から選ばれるアポトーシス誘導剤と併用することを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
【請求項１０】
ＤＮＡに結合することによってＤＮＡ合成を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物の群から選ばれるアポトーシス誘導剤と併用することを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
【請求項１１】
ＤＮＡに結合しＲＮＡポリメラーゼを阻害することによってＤＮＡ合成を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物の群から選ばれるアポトーシス誘導剤と併用することを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
【請求項１２】
微小管蛋白質の重合を促進することにより細胞分裂を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物の群から選ばれるアポトーシス誘導剤と併用することを特徴とする請請求項１〜６いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
【請求項１３】
アポトーシス誘導剤が、マイトマイシンＣ、塩酸イリノテカン、エトポシド、シスプラチン、アドリアマイシン、及びタキソールからなる群より選択される１種以上である、請求項１〜６いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
【請求項１４】
アポトーシス誘導剤が癌性腹膜炎もしくは癌性胸膜炎の原因となる癌の治療剤である、請求項１〜６いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
【請求項１５】
制癌効果が増強される請求項１〜１４いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
【請求項１６】
マイトマイシンＣ、塩酸イリノテカン、エトポシド、シスプラチン、アドリアマイシン、及びタキソールからなる群より選択されるアポトーシス誘導剤と、請求項１〜６いずれかに記載のアポトーシス増強剤を含む腹水もしくは胸水を伴う癌治療用のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬品として特に腫瘍や自己免疫疾患などアポトーシスの異常に伴う疾患の治療に併用して使用されるものであり、アポトーシス誘導剤によるＤＮＡ断片化を伴うアポトーシスを増強する作用を有するＡＭＦ阻害剤、特に抗ＡＭＦ抗体を有効成分とするアポトーシス増強剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは個体発生の過程、組織の形成、ホメオスタシスの維持、生体の防御などに深く関わり、生命の維持に重要な役割をしている。しかし、遺伝子により制御されたアポトーシスの過程が何らかの原因で障害を受けると、アポトーシスが過剰に誘発されたりあるいは強度に抑制されたりして様々な臓器の機能障害を引き起こし、病気となる。アポトーシスが過剰に誘発された場合の疾患として臓器形成不全、エイズウイルスによる免疫不全症等が知られている。逆にアポトーシスが抑制された疾患としては癌、自己免疫疾患等が知られている。（例えば、細胞工学別冊；アポトーシス実験プロトコール、秀潤社、（１９９４）、ｐ．２６〜３０及びＬａｎｃｅｔ，（１９９３）３４１，ｐ．１２５１〜１２５４）
【０００３】
Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＡＭＦ）はそのアミノ酸配列の相同性から、フォスフォヘキソースイソメラーゼ（ＰＨＩ）（非特許文献１参照）、ニューロロイキン（ＮＬＫ）（特許文献１、非特許文献２参照）、マチュレーションファクター（ＭＦ）（非特許文献３参照）と同一の蛋白質と報告されている。ＡＭＦ／ＰＨＩ／ＮＬＫ／ＭＦは細胞内の解糖系を構成するハウスキーピング酵素の一つであり、グルコース６リン酸とフルクトース６リン酸の変換を行う作用を持つ事が知られている（非特許文献４参照）。ＡＭＦの分泌機構は未だ不明ではあるものの、癌細胞から細胞外へ分泌され、癌細胞自身の浸潤や転移を促進する（非特許文献５、６参照）他に、ＮＬＫとしては脊髄神経・感覚神経の生存増強作用があり、また、レクチンに刺激されたＴ細胞からも分泌され、免疫グロブリンの分泌亢進作用もあるとの報告もある（非特許文献２参照）。ＭＦとして骨髄性白血病細胞の分化と成熟にも関与していると報告されている（非特許文献３参照）。ＡＭＦ受容体は７回膜貫通型受容体であり、癌細胞の細胞膜上での発現が癌細胞の悪性度と転移能とに関係が深いとされている（非特許文献７参照）。
【０００４】
特にＡＭＦの癌細胞転移促進作用については大きく注目され、特許文献２にはヒト患者の生体試料を対象とし、ＡＭＦ抗体を用いてＡＭＦ感受性癌の存在を検出する方法、並びに腫瘍の攻撃性／転移活性を検出する方法について記載がある。
また特許文献３には、ＰＨＩ阻害剤がＡＭＦ阻害活性を持つことに着目し、ＰＨＩ阻害剤を、ＡＭＦ阻害を作用機作とする癌転移抑制剤としてクレームしている。
【０００５】
特許文献４には、腫瘍細胞の転移可能性をＡＭＦ受容体とＡＭＦの発現レベルを測定することにより判定する方法について記載されている。
又、ＡＭＦ受容体の発現が癌細胞の悪性度と転移能と関係が深いということから特許文献５にはＡＭＦ受容体がＡＭＦを細胞内へ取り込むことを利用したターゲット療法について記載されている。
【０００６】
【特許文献１】
特表平０１−５０２７４７号公報
【特許文献２】
特許第２８５１２８８号公報（第２−６頁）
【特許文献３】
特開平０８−２４５３９７号公報（第２−４頁）
【特許文献４】
特表平０８−５０１９２９号公報（第４−８頁）
【特許文献５】
国際公開９９／６１０６０号パンフレット（第１−４頁）
【０００７】
【非特許文献１】
Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｈ．ｅｔ．ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６，ｐ．２９６０−２９６３
【非特許文献２】
Ｇｕｒｎｅｙ、Ｍ．Ｅ．ｅｔ．ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４，ｐ．５７４−５８１
【非特許文献３】
Ｘｕ、Ｗ．ｅｔ．ａｌ．（１９９６）Ｂｌｏｏｄ，８７，ｐ．４５０２−４５０６
【非特許文献４】
Ｔａｎａｋａ、Ｎ．ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１８，ｐ．９８５−９９７
【非特許文献５】
Ｎｉｉｎａｋａ、Ｙ．ｅｔ．ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，ｐ．２６６７−２６７４
【非特許文献６】
Ｌｉｏｔｔａ、Ｌ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３、ｐ．３３０２−３３０６
【非特許文献７】
Ｓｉｌｌｅｔｔｉ、Ｓ．ｅｔ．ａｌ．（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８，ｐ．１６４９−１６６０
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
癌、自己免疫疾患等の治療薬剤はこれまでに数多く開発され、治療に大きな成果を上げてきた。しかしながら、これらの薬剤は癌細胞、異常増殖免疫担当細胞、異常滑膜細胞等が正常細胞よりも代謝回転や増殖が速いことに基づいたものであり、細胞増殖に必須の核酸合成やタンパク合成、あるいは細胞分裂に必須であるチューブリンの脱重合を阻害するものであった。このため、正常細胞でも増殖の盛んな造血臓器、粘膜、肝臓、腎臓、毛根などに毒性を示し、投与された患者に貧血、嘔吐、肝障害、腎障害、脱毛等の甚だしい苦痛を与える。しかも、これらは一般に有効量と最大耐容量の幅が狭いので、投与量には細心の注意を払わねばならない。
【０００９】
加えて癌、自己免疫疾患等の原因である異常細胞はこれまでの薬剤に対して薬剤耐性を身に付けることで薬剤によるアポトーシスの誘導を回避する。このため薬剤の投与量が増加し、正常細胞にもアポトーシスを誘導し、毒性発現の原因となっている。異常細胞の薬剤への感受性を上げることができれば、投与量を少なくすることができ、投与量が減じた分、毒性の発現率が抑えられることが期待できる。
以上のように、今までの対処療法と異なる、根本的な全く新しい概念の治療として期待されているアポトーシス誘導剤の効果を増強し、かつアポトーシス誘導剤による副作用を最小限にするために少ない投与量でも治療効果を奏することのできる臨床的に投与可能な新たな薬剤が望まれている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討の結果、アポトーシス誘導剤の効果を増強する薬剤を用いれば、上記の課題が解決されると考え、そのような薬剤を鋭意検索してきたところ、抗ＡＭＦ抗体によってアポトーシス誘導剤の効果を高めることを見出したことにより、本発明に到達した。
【００１１】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１６）に関するものである。
１．アポトーシス誘導剤と併用するための、ＡＭＦ阻害活性を有する物質を有効成分とするアポトーシス増強剤。
２．ＡＭＦ阻害活性を有する物質がＡＭＦもしくはＡＭＦ受容体に結合することによりＡＭＦとＡＭＦ受容体との結合を阻害し、ＡＭＦ阻害活性を示す化合物である、１項に記載のアポトーシス増強剤。
３．ＡＭＦ阻害活性を有する物質が抗ＡＭＦ抗体である１項に記載のアポトーシス増強剤。
４．抗ＡＭＦ抗体がポリクローナル抗ＡＭＦ抗体である３項に記載のアポトーシス増強剤。
【００１２】
５．抗ＡＭＦ抗体がモノクローナル抗ＡＭＦ抗体である３項に記載のアポトーシス増強剤。
６．抗ＡＭＦ抗体がヒト化抗ＡＭＦ抗体である３項に記載のアポトーシス増強剤。
７．アポトーシス誘導剤が制癌剤である、１〜６項いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
８．２重鎖ＤＮＡへの架橋形成を介してＤＮＡの複製を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物の群から選ばれるアポトーシス誘導剤と併用することを特徴とする１〜６項いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
【００１３】
９．ＩもしくはＩＩ型トポイソメラーゼを阻害することによってＤＮＡ合成を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物の群から選ばれるアポトーシス誘導剤と併用することを特徴とする１〜６項いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
１０．ＤＮＡに結合することによってＤＮＡ合成を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物の群から選ばれるアポトーシス誘導剤と併用することを特徴とする１〜６項いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
１１．ＤＮＡに結合しＲＮＡポリメラーゼを阻害することによってＤＮＡ合成を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物の群から選ばれるアポトーシス誘導剤と併用することを特徴とする１〜６項いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
１２．微小管蛋白質の重合を促進することにより細胞分裂を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物の群から選ばれるアポトーシス誘導剤と併用することを特徴とする１〜６項いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
【００１４】
１３．アポトーシス誘導剤が、マイトマイシンＣ、塩酸イリノテカン、エトポシド、シスプラチン、アドリアマイシン、及びタキソールからなる群より選択される１種以上である、１〜６項いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
１４．アポトーシス誘導剤が癌性腹膜炎もしくは癌性胸膜炎の原因となる癌の治療剤である、１〜６項いずれかに記載のアポトーシス増強剤。
１５．制癌効果が増強される１〜１４項いずれかに記載のアポトーシス増強剤．
１６．マイトマイシンＣ、塩酸イリノテカン、エトポシド、シスプラチン、アドリアマイシン、タキソールからなる群より選択されるアポトーシス誘導剤と、１〜６項いずれかに記載のアポトーシス増強剤を含む腹水もしくは胸水を伴う癌治療用のキット。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明において、アポトーシス増強剤とは外来から投与されたアポトーシス誘導剤の効果を増強させるための物質を示し、本発明においては特にＡＭＦ阻害活性を有する物質が相当する。ＡＭＦ阻害活性を有する物質としては、抗ＡＭＦ抗体、抗ＡＭＦ受容体抗体、又はＰＨＩ阻害剤等（特許文献１、並びにＥｎｚｙｍｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，（１９９０）などを参照）が挙げられるが、本発明においては特に抗ＡＭＦ抗体が好ましい。
例えば、抗ＡＭＦ抗体としては、ポリクローナル抗ＡＭＦ抗体、モノクローナル抗ＡＭＦ抗体、ヒト化抗ＡＭＦ抗体等が挙げられる。さらには抗ＡＭＦ受容体抗体としては、ポリクローナル抗ＡＭＦ受容体抗体、モノクローナル抗ＡＭＦ受容体抗体、ヒト化抗ＡＭＦ受容体抗体等が挙げられる。
【００１６】
ポリクローナル抗ＡＭＦ抗体並びにポリクローナル抗ＡＭＦ受容体抗体は、文献（西岡久壽彌ら、講談社、（１９８７）第４刷  役にたつ免疫実験法、ｐ．８−４１）に記載の方法に従って作成して得ることが出来る。
モノクローナル抗ＡＭＦ抗体並びにモノクローナル抗ＡＭＦ受容体抗体は、文献（西岡久壽彌ら、講談社、（１９８７）第４刷  役にたつ免疫実験法、ｐ．４２−５２）に記載の方法に従って作成して得ることが出来る。
ヒト化抗ＡＭＦ抗体並びにヒト化抗ＡＭＦ受容体抗体は文献（Ｊｏｎｅｓ、Ｐ．Ｔ．ｅｔ．ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐ．５２２−５２５ならびにＦｉｇｉｎｉ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３９，ｐ．６８−７８）に記載の方法に従って作成して得ることが出来る。
【００１７】
本発明で用いられる抗ＡＭＦ抗体並びに抗ＡＭＦ受容体抗体は、生体内のＡＭＦを阻害することにより、ＡＭＦの高発現により減少するアポトーシス増強分子（たとえばカスパーゼー９、ＡＰＡＦ−１）の発現量を回復させ、アポトーシス誘導を増強することが作用メカニズムとして考えられる。
【００１８】
本発明に用いられるアポトーシス誘導剤とは、例えば、２重鎖ＤＮＡへの架橋形成を介してＤＮＡの複製を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物（マイトマイシンＣなど）、ＩもしくはＩＩ型トポイソメラーゼを阻害することによってＤＮＡ合成を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物（エトポシド、塩酸イリノテカンなど）、ＤＮＡに結合することによってＤＮＡ合成を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物（シスプラチンなど）、ＤＮＡに結合しＲＮＡポリメラーゼを阻害することによってＤＮＡ合成を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物（アドリアマイシンなど）、微小管蛋白質の重合を促進することにより細胞分裂を阻害し抗腫瘍効果作用を有する化合物（タキソールなど）などが挙げられる。
また、これらアポトーシス誘導剤は一種以上併用して用いることで何ら差し支えない。いずれも臨床上既に制癌剤として用いられており、これらを入手して用いてもよい。
【００１９】
また、本発明においては、アポトーシス誘導剤とともに併用する抗ＡＭＦ抗体等のアポトーシス増強剤は、生体内のＡＭＦを阻害することにより、ＡＭＦの高発現により減少するアポトーシス増強分子の発現量を回復させてアポトーシス誘導を増強すると考えられ、ＡＭＦの高発現が示される部位での疾患に対してはより有効である。例えばそれらの疾患としては腫瘍、感染性結核菌等の細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、マイコプラズマなどの感染症、肺塞栓症、全身性エリテマトーデス、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫などの自己免疫疾患等が挙げられ、特に腫瘍では卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、大腸癌、膵癌、乳がん等の癌性腹膜炎を誘発しやすい癌、もしくは腹水を伴う肝転移癌、もしくは肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、悪性リンパ腫等の癌性胸膜炎を誘発しやすい癌が挙げられ、いずれも本発明による治療効果が達成される。
【００２０】
本発明において、抗ＡＭＦ抗体等をアポトーシス増強剤として使用するには、主に注射剤が適用され、医薬的に許容し得る滅菌水、ヒト血清アルブミン、生理食塩液その他公知の生理学的に許容される担体と混合して製剤学的に許容される組成物として使用される。また、本発明の製剤組成物は、塩、希釈液、他の担体、緩衝剤、界面活性剤、保存剤のような生理的に許容される成分も含有していてもよい。本発明の製剤組成物における抗ＡＭＦ抗体の含量は０．０１〜２０重量％程度である。抗ＡＭＦ抗体の投与用量は、患者の年齢、体重、症状等により決定されるが、例えば成人１日１回約０．０１ｍｇ／ｍ２〜約２０００ｍｇ／ｍ２であり、好ましくは０．１ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２である。投与経路は、例えば皮下、筋肉内、腹膜内、腹腔内、胸膜内、胸腔内または静脈内等である。
【００２１】
アポトーシス誘導剤については既に臨床で用いられている製剤を用いることが可能であり、注射剤、経口剤などいずれの投与経路も可能である。また、抗ＡＭＦ抗体との併用にあたり、アポトーシス誘導剤の投与用量、投与経路、投与スケジュールは通常の使用法と同様に、患者の年齢、体重、症状等により決定される。例えばマイトマイシンＣをアポトーシス誘導剤として用いる場合は、１日１回あたり０．５ｍｇ〜１０ｍｇ（成人）程度を投与し、適宜症状等により変更することが可能であるが、好ましくは、０．５ｍｇ〜２ｍｇである。
また、本発明のアポトーシス誘導剤とアポトーシス増強剤の投与スケジュールは増強剤を投与してから誘導剤を投与するのを原則とするが治療経過をみて交互に追加投与することが好ましい。
更に、マイトマイシンＣ、塩酸イリノテカン、エトポシド、シスプラチン、アドリアマイシン、及びタキソールからなる群より選択されるアポトーシス誘導剤と、抗ＡＭＦ抗体等のアポトーシス増強剤を含む腹水もしくは胸水を伴う癌治療用のキットにおいては、上記した抗ＡＭＦ抗体等の製剤と市販のアポトーシス誘導剤の製剤とを組み合わせてキットとすることで差し支えない。
【００２２】
【実施例】
次に、本願発明による実施例として薬理実験例を示すが、本願ではこれらに限定されるものではない。
なお、本実施例における略語は下記を意味する。
ＭＭＣ：マイトマイシンＣ
ＰＢＳ（−）：リン酸バッファー
ＦＣＡ：フロイントコンプリートアジュバント
ＦＩＡ：フロイントインコンプリートアジュバント
ＥＬＩＳＡ：エンザイムイムノアッセイ
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＴＰＢＳ：０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（−）
ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＴＭＢ：３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ
Ｈ２Ｏ２：過酸化水素
ＦＢＳ：非動化ウシ胎児血清
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
温度は全て摂氏である。
【００２３】
実施例１
ＡＭＦ免疫血清（ポリクローナル抗ＡＭＦ抗体）によるＭＭＣの細胞増殖阻害活性の増強作用
（方法）
ヒトＡＭＦを大腸菌でＧＳＴ融合蛋白質として大量発現させ、ＧＳＨカラム並びにＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅによりＡＭＦのみを精製した（Ｆｕｎａｓａｋａ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８５，ｐ．１１８−１２８）。
精製ＡＭＦをＰＢＳ（−）で２００μｇ／ｍＬに調製し、ＦＣＡと等量混合したものを１ｍＬ、白色在来種のウサギ背中皮下に１０−２０箇所に分けて免疫した。１週間後に同条件で免疫し、その後１週間ごとに３回、ＦＣＡをＦＩＡに変更したものを免疫した。
次いで、最終免疫（計５回免疫）から１週間後に耳動脈より採血し、血液を４℃に一晩静置して血清を分離した。
分離した血清の抗体価を免疫に使用したヒトＡＭＦで作製したＥＬＩＳＡプレートにて測定した。５μｇ／ｍＬ  ヒトＡＭＦ  ＰＢＳ（−）溶液を０．１ｍＬずつ９６ウェルプレートに分注し、４℃にて一晩静置した。プレートからヒトＡＭＦ溶液を吸引除去し、ＰＢＳ（−）にて各ウェルを洗浄した．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）溶液をウェルに分注し、３７℃で３時間インキュベートし、ブロッキングを行った。３％ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）溶液を吸引除去した後、ＴＰＢＳにて各ウェルを洗浄した。免疫前のウサギ血清と免疫後のウサギ血清を１００、５００、２５００、１２５００倍にＰＢＳ（−）で希釈したものを０．０５ｍＬずつ各ウェルに分注し、３７℃で３時間インキュベートした。血清を吸引除去した後、ＴＰＢＳにて各ウェルを洗浄した。ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体の４０００倍希釈液を０．０５ｍＬずつ各ウェルに分注し、室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体の希釈液を吸引除去した後、ＴＰＢＳにて各ウェルを洗浄した。ＴＭＢとＨ２Ｏ２（ＢＩＯＲＡＤ）の混合液を０．０５ｍＬずつ各ウェルに分注し、室温で１０分間インキュベートした。１Ｎ硫酸を０．０５ｍＬずつ各ウェルに分注した後、プレートをボルテックスにてよく混合し、吸光度計にて各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。免疫前の血清の吸光度をコントロールとして免疫後の血清の抗体価を算出し、免疫後血清の抗体価が上昇していることを確認した。
【００２４】
次に、エーリッヒ腹水腫瘍細胞（エーリッヒ細胞）をＢＡＬＢ／ｃＡマウスの腹腔内に５×１０６個移植し、１週間後に細胞を移植マウスより回収した。トリパンブルー染色により生細胞数を測定し、２．５×１０４個／ｍＬに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ）を用いて調製した。９６ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を０．２ｍＬずつ分注した。抗ＡＭＦ抗体を含むウサギ血清を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩを用いて最終濃度が５００、２５００、１２５００倍になるよう希釈した。ＭＭＣは１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩを用いて溶解し、同培地を用いて最終濃度が０、４、２０ｎＭとなるように調製した。
エーリッヒ細胞を分注したウェルに調製したウサギ血清とＭＭＣを単剤群に０．０２μＬ、併用群には０．０１μＬずつ添加し、５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター内で２４時間培養した。
２４時間の培養後、９６ウェルプレートを取り出し、各ウェルにＷＳＴ−１／１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ＝９／１の混合液を０．０２μＬずつ添加し、更に５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター内で３時間培養した。
３時間後９６ウェルプレートを取り出し、吸光度計にて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。単剤群ではウサギ血清並びにＭＭＣを入れていないものを対照とし、細胞の生存率を算出した。併用群ではウサギ血清のみを入れたものを対照とし、細胞の生存率を算出した。細胞の生存率（％）は次式より求めた。
細胞の生存率（％）＝（薬剤添加吸光度／対照吸光度）×１００
【００２５】
結果を表１並びに表２に示した。更に、図１及び図２としても示した。薬剤未処理の細胞生存率（％）を１００として、ＭＭＣ単剤並びにＡＭＦ免疫前血清（ＡＭＦ非免疫血清）、ＡＭＦ免疫血清ではエーリッヒ細胞に対する細胞障害作用を細胞の生存率（％）でみると、それぞれの最高用量で９９、１２７、１２８％と細胞障害作用は全く認められなかった。また、ＭＭＣとＡＭＦ免疫前ウサギ血清の最高用量同士の併用でも１１５％と細胞障害作用は認められなかった。一方で、ＭＭＣとＡＭＦ免疫血清との併用では、例えば２０ｎＭのＭＭＣに対してＡＭＦ免疫血清（ポリクローナル抗ＡＭＦ抗体）の用量に依存して、１２３、７８、６２％と細胞の生存率が著しく低下した。このことにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＡＭＦ免疫血清はエーリッヒ細胞に対するＭＭＣの細胞障害作用を増強することが確かめられた。
【００２６】
2004161671.tif 000002
【００２７】
2004161671.tif 000003
【００２８】
実施例２
ポリクローナル抗ＡＭＦ抗体によるＭＭＣのアポトーシス活性の増強作用
（方法）
実施例１で述べた方法によりＡＭＦをウサギに免疫し、血清を得た後、ポリクローナル抗ＡＭＦ抗体を精製した。
ＢＡＬＢ／ｃＡマウスの腹腔内に５×１０６個のエーリッヒ細胞を移植し、１０日後に４００μｇの精製ポリクローナル抗ＡＭＦ抗体を含むＰＢＳ（−）を腹腔内に投与した。精製ポリクローナル抗ＡＭＦ抗体の投与から６時間後にＭＭＣを２ｍｇ／ｋｇとなるようマウスに腹腔内投与した。ＭＭＣの投与から２４時間後にエーリッヒ細胞をマウス腹腔より回収し、アポトーシスを起こしているエーリッヒ細胞をアポトーシスに際して起こるＤＮＡ断片化を検出するＴＵＮＥＬ法（田沼靖一ら、秀潤社、（１９９４）細胞工学別冊  改定アポトーシス実験プロトコール  １．基礎編、２章−４）により共焦点レーザー顕微鏡下に５視野撮影し、ＦＩＴＣ蛍光強度をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅにより算出した。
結果を表３に示した。コントロールのエーリッヒ細胞におけるＤＮＡの断片化度を１とすると、２ｍｇ／ｋｇ  ＭＭＣは単独でＤＮＡの断片化度を２．８２倍とした。これに対して、２ｍｇ／ｋｇ  ＭＭＣと４００μｇ精製ポリクローナル抗ＡＭＦ抗体との併用ではＤＮＡの断片化度が９．３５倍と顕著に亢進され、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても精製ポリクローナル抗ＡＭＦ抗体がＭＭＣのアポトーシス誘導作用を強く増強することが確かめられた。
【００２９】
表３
コントロール                              １．００
２  ｍｇ／ｋｇ  ＭＭＣ                    ２．８２
２  ｍｇ／ｋｇ  ＭＭＣ＋抗ＡＭＦ抗体      ９．３５
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、アポトーシス耐性獲得に関わるＡＭＦの作用を抑制することで、アポトーシス誘導剤によるアポトーシス誘導作用が増強されることが確かめられた。すなわち、抗ＡＭＦ抗体を併用することにより低用量のアポトーシス誘導剤で高用量を使用した際の効果が期待され、副作用の少ない癌の予防あるいは治療が可能となった。特に抗ＡＭＦ抗体が前記のアポトーシス誘導作用の増強を通じて癌の治療に有効であることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＭＦ非免疫血清とＭＭＣの併用におけるエーリッヒ細胞の細胞生存率を図１に示す。
【図２】ＡＭＦ免疫血清とＭＭＣの併用におけるエーリッヒ細胞の細胞生存率を図２に示す。
【符号の説明】
図１、図２において、白抜きは０ｎＭ  ＭＭＣを、黒は４ｎＭ  ＭＭＣを、斜線は２０ｎＭ  ＭＭＣをそれぞれ示す。
【図１】
2004161671.tif 000004
【図２】
2004161671.tif 000005