(57)【要約】【課題】高精度の自動合焦を達成する。【解決手段】照射光の光路上であって測定面３に共役な位置に視野絞り６を配置し、その像を測定面３に投影させる。測定面３に対し光は斜めに入射するため、測定面３と対物レンズ１０との間の距離が変化すると、その距離に応じて測定面３上での視野絞り像の位置が変化する。そこで予め、合焦状態における視野絞り像の位置を位置検出部１４により検出し、その位置情報を記憶部１５に記憶しておく。それ以降、合焦動作が指示されると、そのときの画像内での視野絞り像の位置を検出し、補正量算出部１６は記憶部１５に保存されている位置情報とのずれに基づき補正量を算出し、制御部１７はその補正量に応じて対物レンズ１０を移動させる。それによって、常に精度の高い合焦が達成される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光性試料に対し全反射角度で以て光を照射するための照射光学系と、その照射光により生じる近接場光を励起光として前記試料が放出する蛍光を対物レンズを介して受光する撮像手段と、を具備する全反射蛍光顕微測定装置において、
ａ）前記照射光学系の光路上にあって前記試料の測定面と共役である位置に配置された視野絞りと、
ｂ）合焦状態であるときに前記撮像手段により取得される画像に現れる前記視野絞りの投影像の位置を検出し、その合焦位置情報を記憶しておく合焦位置情報取得手段と、
ｃ）合焦動作時に、前記撮像手段により取得される画像に現れる前記視野絞りの投影像の位置を検出し、そのときの位置情報と前記合焦位置情報との差に対応した補正情報を算出する補正情報取得手段と、
ｄ）前記補正情報に基づいて前記試料と対物レンズとの距離を調節する制御手段と、
を備えることを特徴とする全反射蛍光顕微測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主として生化学や医学の分野で利用される全反射蛍光顕微測定装置（ＴＩＲＦＭ＝Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）に関し、更に詳しくは、全反射蛍光顕微測定装置における自動合焦（オートフォーカス）技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
全反射蛍光顕微鏡（全反射近接場光顕微鏡などとも呼ぶ）では、例えばカバーガラスの下面に臨界角よりも大きな入射角を以て光を照射することにより、光を全反射させる。その際、反射面の向こう側、つまりカバーガラスの上面に近接場光と呼ばれる光のしみ出しが存在する。試料が蛍光性を有している場合、この近接場光を励起光として、ごく狭い範囲の試料から蛍光が放出される。そこで、この蛍光による画像を直接顕微鏡で観察したり、或いはＣＣＤカメラ等で取り込んでモニタに映し出す。こうした装置では、例えば、試料に含まれる特定の成分を蛍光物質で標識しておくことにより、その成分の形態や挙動を選択的に観測することができる。
【０００３】
こうした全反射蛍光顕微鏡では、カバーガラスと試料（溶液）との境界面付近の高々数百ｎｍの狭い範囲を観測する。そのため、きわめて高精度の合焦が必要となる。一般に、顕微鏡における自動合焦方法として、従来より様々な方法が利用又は提案されている。例えば、対物レンズと測定面との間の距離を変化させながら試料像の信号強度やコントラストを検出し、その検出値の変化に基づいて最良の合焦位置を見い出すことが行われている（例えば、特許文献１、２など参照）。
【０００４】
【特許文献１】
特開平６−１１８２９６号公報
【特許文献２】
特開平８−７５９８０号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、蛍光物質で標識した試料を観測する場合、観測対象である蛍光の強度は時間的に変動する可能性があり、蛍光強度と合焦状態との関係が必ずしも線形の特性とはならないため、正確な合焦を達成することは困難である。また、蛍光による画像では合焦からずれた状態でもコントラストの変化が小さい場合も多いため、コントラストを利用して合焦を判断するのも困難である。即ち、こうした従来の合焦方法によっては、おおよその合焦を行うことは可能であっても、上述したような狭い範囲の試料像を明瞭に得るような高精度の合焦を行うことは非常に難しい。
【０００６】
本発明はかかる課題に鑑みて成されたものであり、その主たる目的とするところは、高い精度で自動的に合焦を行うことができる全反射蛍光顕微測定装置を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために成された本発明は、蛍光性試料に対し全反射角度で以て光を照射するための照射光学系と、その照射光により生じる近接場光を励起光として前記試料が放出する蛍光を対物レンズを介して受光する撮像手段と、を具備する全反射蛍光顕微測定装置において、
ａ）前記照射光学系の光路上にあって前記試料の測定面と共役である位置に配置された視野絞りと、
ｂ）合焦状態であるときに前記撮像手段により取得される画像に現れる前記視野絞りの投影像の位置を検出し、その合焦位置情報を記憶しておく合焦位置情報取得手段と、
ｃ）合焦動作時に、前記撮像手段により取得される画像に現れる前記視野絞りの投影像の位置を検出し、そのときの位置情報と前記合焦位置情報との差に対応した補正情報を算出する補正情報取得手段と、
ｄ）前記補正情報に基づいて前記試料と対物レンズとの距離を調節する制御手段と、
を備えることを特徴としている。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に係る全反射蛍光顕微測定装置では、照射光学系より測定面に対して光が斜めに入射するため、対物レンズと測定面との間の距離が変化すると、この距離の変化に応じて視野絞り像の位置が移動する。そこで、合焦位置情報取得手段は、合焦状態であるときに撮像手段により取得される画像に現れる視野絞り像の位置を検出し、その合焦位置情報を記憶しておく。この作業は高い頻度で行う必要はないので、例えば作業者が撮影画像を目視で確認して合焦か否かを判断すればよい。もちろん、目視に代わる他の方法で合焦か否かを判断してもよい。
【０００９】
それ以降の試料の顕微測定の際の合焦動作時には、補正情報取得手段が、撮像手段により取得される画像に現れる視野絞り像の位置を検出し、そのときの位置情報と合焦位置情報記憶手段に記憶されている合焦位置情報との差に対応した補正情報を算出する。この視野絞り像の位置の相違は、測定面と試料との間の距離において合焦状態からのずれ量に対応している。そこで、制御手段はその補正情報に応じて試料と対物レンズとの間の距離を調節するべく、試料と対物レンズのいずれか一方又はその両方を移動させる。
【００１０】
【発明の効果】
このように、本発明に係る全反射蛍光顕微測定装置によれば、一旦、目視等によって合焦を判断した後は、常に高い精度で合焦を達成することができる。また、距離のずれに対応した補正情報を直接的に求め、それを補正するように距離を調節しているので、調節の繰り返し回数が少なくて済み、迅速に合焦を達成することができる。
【００１１】
【実施例】
以下、本発明の一実施例である倒立型の全反射蛍光顕微測定装置について、図１〜図３を参照して説明する。図１は本実施例の全反射蛍光顕微測定装置の要部の構成図、図２及び図３はこの装置の動作説明図である。
【００１２】
まず、図１により本装置の構成を説明する。蛍光性の試料２は溶液状であって、カバーガラス１の上に図示しないウェル又はフローセル等によって封止されている。このカバーガラス１の下方には試料２に対向して対物レンズ１０が上下に移動可能に配置されている。光源４から発せられたレーザ光は、反射鏡５により所定の角度で装置後方の入力ポート７から導入される。この入力ポート７には集光レンズ８が配置され、入力ポート７と反射鏡５との間には所定サイズの開口部を有する視野絞り６が挿設されている。即ち、視野絞り６により光径の制限を受けた光は集光レンズ８により集光され、さらにダイクロックミラー９により上方に反射されて対物レンズ１０に導入される。
【００１３】
ここでは、カバーガラス１の厚さは０．１７ｍｍ、屈折率ｎ１は１．５２５５であり、試料２の屈折率ｎ２は１．３３である。また、カバーガラス１と対物レンズ１０との間はカバーガラス１と同等の屈折率ｎ１を有するオイル１１で満たされている。また、対物レンズ１０は倍率６０×１．５（つまり倍率：６０〜９０）、ＮＡ＝１．４５の特性を有し、その上下の作動範囲は０．２ｍｍである。レーザ光は、この対物レンズ１０により、カバーガラス１と試料２との境界面である測定面３に対し、その臨界角度θよりも大きな全反射角度で以て入射される。一般に臨界角度θは次の式で求まる。
ｓｉｎθ＝ｎ２／ｎ１＝１．３３／１．５２５５
よって、臨界角度θは６０．６７°である。そこで、ここでは入射角度を６３°としている。
【００１４】
入射光は測定面３で全反射するが、その際に光の一部は近接場のしみだしを生じ、この近接場光がカバーガラス１近傍の試料２を励起し、試料２から自発的な蛍光が放出される。このときの蛍光を、対物レンズ１０を介してＣＣＤセンサ１２により検出する。例えば入射光の入射角度が６３°である場合には、近接場光のしみだしの範囲は波長λ＝５３２ｎｍにおいて約１５６．１ｎｍである。従って、試料２の中で、この近接場光の到達するごく狭い範囲に含まれる成分（例えば蛍光性物質で標識された分子）だけが励起を受け、蛍光を発する。
【００１５】
ＣＣＤセンサ１２による画像信号は画像処理部１３に入力され、ここで２次元画像が構成されてモニタ２０に画像が表示される。さらに、本実施例の装置では、後述するような合焦動作を実行するために、視野絞り像位置検出部１４、視野絞り像位置記憶部１５、補正量算出部１６が備えられ、補正量算出部１６により算出された補正量に基づいて、制御部１７は対物レンズ駆動部１８を介して対物レンズ１０の移動を制御する。ここでは、ＣＣＤセンサ１２は、１ピクセルが１２．９μｍ□（但し２ビニング）で、画素数は６４０×５１２のものを使用している。従って、倍率が９０倍であるときには、１ピクセルが捉える範囲は０．１４３μｍ□である。
【００１６】
次に、本装置における合焦方法について説明する。上記構成において、視野絞り６は測定面３と共役な位置に設けられる。そのため、測定面３には視野絞り６の結像（以下「視野絞り像」という）が明瞭に投影されるが、測定面３への入射光は大きな角度を有しているため、測定面３と対物レンズ１０との間の距離が変化して、例えば図２に描出したように測定面３が位置ＡからＡ’に移動すると、撮像範囲内に現れる視野絞り像の位置が移動する。具体的には、対物レンズ１０と試料２との間の距離がΔｄだけ変化した場合、視野絞り像の位置は測定面３上でΔｄ・ｔａｎθ１（但しθ１は入射角度）だけ移動する。ここでは入射角度θ１は６３°であるから、視野絞り像の移動距離はΔｄの約２倍となる。
【００１７】
このように、視野絞り像の位置は対物レンズ１０と試料２との間の距離に対応しているから、逆に言えば、この距離を常に或る決まった値にしたい場合には、視野絞り像の位置が或る決まった位置に来るように対物レンズ１０（又は試料２でもよい）の位置を制御すればよい。
【００１８】
そこで、本装置では、測定に先立ついわゆる校正作業の一つとして、まず合焦位置情報を取得する。即ち、作業者は操作部１９によるマニュアル操作で対物レンズ１０を少しずつ移動させながら、モニタ２０で適宜の試料（例えば標準試料などが好ましい）の観測画像を確認し、目視により合焦位置を探索する。そして、合焦位置が見い出されたならば、操作部１９により合焦位置である旨を指示する。すると、制御部１７の制御の下に、視野絞り像位置検出部１４は取得した２次元画像信号を処理することにより、視野絞り像の位置として例えばその像の中心の位置を計算し、その位置情報を視野絞り像位置記憶部１５に記憶しておく。つまり、この位置情報が合焦状態を表す基準となる。例えば図３（ａ）に示すように２次元画像２１中のほぼ中央に視野絞り像２２が現れているときに、合焦状態であるものとする。
【００１９】
それ以降、様々な試料の顕微測定を行う際には、作業者が試料をセットした後に例えば操作部１９で所定の操作を行うと、制御部１７は自動合焦動作を実行する。即ち、ＣＣＤセンサ１２により視野絞り像が現れている画像を取り込み、視野絞り像位置検出部１４はその２次元画像中での視野絞り像の位置を検出する。焦点ずれが在る場合、例えば図３（ｂ）に示すように、視野絞り像２２は位置ずれを生じて現れる。補正量算出部１６は、その時点での視野絞り像の位置情報と視野絞り像位置記憶部１５に保存されている位置情報とに基づいてずれ量ΔＤを算出し、これを補正量として制御部１７へと送る。これを受けて制御部１７は、そのずれを補正する方向（つまり上又は下）に、該補正量から換算した距離だけ対物レンズ１０を移動するように対物レンズ駆動部１８を制御する。
【００２０】
１回の制御のみで対物レンズ１０の位置を決めてもよいが、一旦、対物レンズ１０を移動させた後に視野絞り像位置検出部１４で視野絞り像の位置を確認し、これを２回以上、繰り返すことによって対物レンズ１０の位置を決めてもよい。但し、この合焦方法では、計算により直接補正量を求めているので、通常（例えば機械的な精度がかなり劣る場合などを除いて）、１回乃至少数回の調整で済む。
【００２１】
本実施例の装置によれば、例えば、±５ピクセルの範囲内に収まるように調整するという条件を設定すれば、±０．３５μｍの合焦調整精度が達成できる。この値は近接場の範囲（約１５０ｎｍ）や対物レンズ１０の焦点深度（±１００ｎｍ）と比べると大きいが、実際の観測上ではこの程度の範囲であれば、いわゆるピンぼけと認められない範囲の明瞭な画像が得られる。一方、既述のような従来の合焦方法によっては、６０倍の倍率では±１〜５μｍ程度の合焦調整精度しか得られない。このように、本装置の合焦方法によれば、従来よりも大幅に合焦精度を高めることができる。
【００２２】
なお、上記説明した合焦方法によって調整可能な範囲は、或る程度、明瞭な視野絞り像が得られ、しかも撮像範囲から視野絞り像がはみ出さないという条件を満たす必要がある。従って、上記実施例の場合には合焦動作開始時の状態が、合焦位置に対して±５μｍ程度の範囲に収まっている必要がある。そこで、こうした条件が保証できない場合には、まず従来の合焦方法によって±５μｍ程度の範囲に収まるように粗調整を行った後、本発明のような合焦方法によって高精度な調整を行えばよい。
【００２３】
なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変更や修正を行えることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例である全反射蛍光顕微測定装置の要部の構成図。
【図２】本実施例の全反射蛍光顕微測定装置の動作説明図。
【図３】本実施例の全反射蛍光顕微測定装置の動作説明図。
【符号の説明】
１…カバーガラス
２…試料
３…測定面
４…光源
５…反射鏡
６…視野絞り
７…入力ポート
８…集光レンズ
９…ダイクロックミラー
１０…対物レンズ
１１…オイル
１２…ＣＣＤセンサ
１３…画像処理部
１４…視野絞り像位置検出部
１５…視野絞り像位置記憶部
１６…補正量算出部
１７…制御部
１８…対物レンズ駆動部
１９…操作部
２０…モニタ
【図１】
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【図２】
2004226771.tif 000004
【図３】
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