(57)【要約】【課題】  検体中のコエンザイムＱ−１０とその２電子還元体の含有量を正確に分析することができる分析方法ならびに分析システムを提供する。【解決手段】  前処理として、検体としてのヒトの血漿をイソプロピルアルコールと混合し、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体をイソプロピルアルコールに抽出する。抽出液は分析するまでの間４℃の温度で保管する。抽出液を分析試料として、送液機構１２、切り換え機構１４、濃縮カラム１６、分離カラム１８、還元カラム２０、紫外吸収検出器２２および電気化学検出器２４を備える分析システム１０で分析する。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含まれるコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体を定量する、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法において、
前処理として該コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の少なくともいずれかひとつを含む該検体を水溶性有機溶媒で抽出し、抽出液を分析試料として分析することを特徴とするコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法。
【請求項２】
前記水溶性有機溶媒がイソプロピルアルコールであることを特徴とする請求項１記載のコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法。
【請求項３】
前記抽出液を分析するまでの間、該抽出液を該抽出液の融点乃至室温の範囲内の温度で保管しておくことを特徴とする請求項１または２記載のコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法。
【請求項４】
前記分析試料をカラムスイッチング法により濃縮する予備処理を行うことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか1項に記載のコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法。
【請求項５】
前記コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の双方を含む検体からの抽出液を分析試料とし、該コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体をカラム分離し、さらに還元処理した後、検出器により検出することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法。
【請求項６】
請求項５記載のコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法に用いる分析システムであって、
分析試料を第１の移動相とともに送液する第１系列と第２の移動相のみを送液する第２系列とからなる送液機構と、
該送液機構の２つの系列の移動相の送液経路を切り換える切り換え機構と、
該第１系列の移動相を受け入れて該分析試料を濃縮した後、該第２の移動相を受け入れる濃縮カラムと、
該濃縮カラムから送り出される液を受け入れて分離する分離カラムと、
該分離カラムから送り出された液を受け入れて還元する還元カラムと、
該還元カラムから送り出された液を検出処理する電気化学検出器とを有することを特徴とするコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析システム。
【請求項７】
検出器としてさらに紫外吸収検出器を有することを特徴とする請求項６記載のコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法ならびに分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
コエンザイムＱ（補酵素Ｑ：ＣｏＱ）はベンゾキノン誘導体であり、広く生物界に存在することからユビキノンと命名されている。ユビキノンを２電子還元したヒドロキノン体がユビキノールである。
【０００３】
ユビキノンは、化合物名が2,3-シ゛メトキシ-5-メチル-6-ホ゜リフ゜レニル-1,4-ヘ゛ンソ゛キノンであり、イソフ゜レン単位がｎ＝１〜１２の多数の同族体が天然に存在し、ヒト等の高等動物についてはｎ＝１０である。以下の説明では、特に断らない限り、ヒト等のユビキノンについてコエンザイムＱ−１０と表示するとともに、ヒト等のユビキノールについてコエンザイムＱ−１０の２電子還元体と表示する。
【０００４】
コエンザイムＱ−１０の２電子還元体は、強い抗酸化作用があり、活性酸素による細胞の損傷を防ぐ等老化防止に効果があるといわれている。
【０００５】
酸化ストレスは、生体内の酸化と抗酸化のバランスが崩れて酸化に傾いた、生体にとって好ましくない状態とされているが、コエンザイムＱ−１０とその２電子還元体の比率は、この酸化ストレスの度合いを反映していると考えられるので、酸化ストレスの良好なマーカーになりうるものと考えられている。
【０００６】
このように、コエンザイムＱ−１０とその２電子還元体の挙動を知ることは非常に有用であるため、これらの成分を的確に分析する方法が求められる。
【０００７】
分析方法として、古典的なものとして紫外吸収法等があるが、第三物質の影響を受けやすく、煩雑な前処理を要する。
【０００８】
近年では、高感度で正確に分析できる方法として高速液体クロマトグラフィ（以下、ＨＰＬＣと表示する。）が広く用いられている。コエンザイムＱ−１０の検出には２７５ｎｍの紫外吸収が利用されている。しかしながら、従来のＨＰＬＣによる分析方法は、血漿中のコエンザイムＱ−１０を検出するためには感度が不十分である。
【０００９】
このため、コエンザイムＱ−１０を２電子還元体に還元して、還元前後の差をコエンザイムＱ−１０として定量する方法も提案されている。ところが、この分析方法では、検体の前処理を行うとともに、ＨＰＬＣへの試料注入を２度行う必要がある。
【００１０】
このため、本出願人は、図１に示すように、逆相の分離カラム（スペルコ社製ＬＣ−８）１でコエンザイムＱ−１０とその２電子還元体を分離した後、還元カラム（資生堂製ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＱ）２あるいはク−ロメトリック電極を用いてコエンザイムＱ−１０を２電子還元体に還元して電気化学検出器３で測定する方法を、先に提案している（例えば、非特許文献１参照。）。なお、図１中、参照符号４は移動相を、参照符号５はポンプを、参照符号６は試料注入器を、参照符号７は保護カラムを、参照符号８は紫外吸収検出器を、それぞれ示す。
【００１１】
上記の分析方法を用いることにより、コエンザイムＱ−１０とその２電子還元体の高感度同時測定が可能である。得られるクロマトグラムの一例を図２に示す。図２中、「１」がコエンザイムＱ−１０のピークであり、「２」がコエンザイムＱ−１０の２電子還元体のピークである。
【００１２】
この場合、検体中の例えばビタミンＣや尿酸等の水溶性抗酸化物質が測定に影響することから、検体をメタノール／ヘキサンで抽出処理し、水溶性抗酸化物質をメタノール相に、コエンザイムＱ−１０等をヘキサン相に分配する前処理を行っている。
【非特許文献１】Satosi Yamasita and Yorihiro Yamamoto ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 250,66-73（1997）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上記のメタノール／ヘキサンで抽出処理する前処理方法は、ヘキサン抽出液中のコエンザイムＱ−１０が化学的に不安定であり、前処理後、処理液をＨＰＬＣに注入して分析するまでの間において、図３に示すように、かなりの率でコエンザイムＱ−１０の２電子還元体が酸化されてしまうために、検体抽出後、速やかに分析することが必要であった。正確な分析を行うためには、ＨＰＬＣに注入する直前に抽出操作を行うことが必須であるため、大量の検体を一括して処理することが極めて困難であった。なお、図３中、各温度はヘキサン抽出液の保管温度を示す。
【００１４】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、検体中のコエンザイムＱ−１０とその２電子還元体の含有量を正確に定量することができる分析方法ならびに分析システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の課題を解決するために本出願人が鋭意検討した結果、前処理に用いる抽出溶剤としてメタノール／ヘキサンに変えてイソプロピルアルコールを用いることがより好適であることを見出し、この知見に基づいて以下の発明に至った。
【００１６】
本発明に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法は、前処理として該コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の少なくともいずれかひとつを含む該検体を水溶性有機溶媒で抽出し、抽出液を分析試料として分析することを特徴とする。
【００１７】
ここで、コエンザイムＱ−１０がユビキノンを指し、コエンザイムＱ−１０の２電子還元体がユビキノールを指すことは前記のとおりである。水溶性有機溶媒は、イソプロピルアルコールが好適であるが、これに限らず、イソプロピルアルコールと同等の極性を有する溶媒を用いることができ、例えば、メタノール、エタノール、ブタノールおよびｎ−プロピルアルコールを混合して極性を調整した混合溶媒等を用いることができる。なお、前処理後の分析試料を分析する方法は、以下に説明する本発明の分析方法に限らず、前記した従来の分析方法等、適宜の方法を採用することもできる。
【００１８】
本発明の上記の構成により、分析試料の分析までの間の成分の変化を抑制することで正確に分析することができる。また、検体を抽出した後に直ちに分析を行う必要がない。
【００１９】
この場合、前記抽出液を分析するまでの間、該抽出液を該抽出液の融点乃至室温の範囲内の温度、より好ましくは４℃前後の温度で保管しておくと、成分の変化をより確実に抑制することができて好適である。ここで、抽出液の融点は、抽出に用いる水溶性有機溶剤の融点と実質的に同じである。
【００２０】
また、この場合、前記分析試料（抽出液）をカラムスイッチング法により濃縮する予備処理を行うと、分析試料のコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の濃度が低い場合においても正確にかつ高感度で分析することができて、好適である。
【００２１】
また、この場合、前記コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の双方を含む検体からの抽出液を分析試料とし、該コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体をカラム分離し、さらに還元処理した後、検出器により検出すると、従来のようにＨＰＬＣに分析試料を２度注入する必要がなく、能率的に分析することができて好適である。
【００２２】
また、上記本発明の分析方法を好適に実現するために、本発明に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析システムは、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法に用いる分析システムであって、分析試料を第１の移動相とともに送液する第１系列と第２の移動相のみを送液する第２系列とからなる送液機構と、該送液機構の２つの系列の移動相の送液経路を切り換える切り換え機構と、該第１系列の移動相を受け入れて該分析試料を濃縮した後、該第２の移動相を受け入れる濃縮カラムと、該濃縮カラムから送り出される液を受け入れて分離する分離カラムと、該分離カラムから送り出された液を受け入れて還元する還元カラムと、該還元カラムから送り出された液を検出処理する電気化学検出器とを有することを特徴とする。
【００２３】
この場合、検出器としてさらに紫外吸収検出器を有すると、検体中のコレステロール等の電気化学検出では高感度で検出できない成分を同時分析することができて、好適である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法によれば、前処理としてコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の少なくともいずれかひとつを含む検体を水溶性有機溶媒で抽出し、抽出液を分析試料として分析するため、正確に分析することができる。また、検体を採取した後に直ちに分析を行う必要がない。
【００２５】
また、本発明に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法によれば、分析試料をカラムスイッチング法により濃縮する予備処理を行うため、分析試料のコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の濃度が低い場合においても正確にかつ高感度で分析することができる。
【００２６】
また、本発明に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法によれば、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の双方を含む検体からの抽出液を分析試料とし、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体をカラム分離し、さらに還元処理した後、検出器により検出するため、能率的に分析することができる。
【００２７】
また、本発明に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析システムによれば、分析試料を第１の移動相とともに送液する第１系列と第２の移動相のみを送液する第２系列とからなる送液機構と、送液機構の２つの系列の移動相の送液経路を切り換える切り換え機構と、第１系列の移動相を受け入れて分析試料を濃縮した後、第２の移動相を受け入れる濃縮カラムと、濃縮カラムから送り出される液を受け入れて分離する分離カラムと、分離カラムから送り出された液を受け入れて還元する還元カラムと、還元カラムから送り出された液を検出処理する電気化学検出器とを有するため、好適に本発明の分析方法を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法ならびに分析システムの好適な実施の形態（以下、形態例という。）について、図を参照して、以下に説明する。
【００２９】
以下説明する第１の形態例においては、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体を含む検体としてヒトの血漿を用いる。また、第２の形態例においては、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体を含む検体としてヒトの唾液を用いる。
【００３０】
まず、第１の形態例に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法における前処理について、図４を参照して説明する。
【００３１】
検体としてのヒトの血漿を５０μｌ採取し（図４中、Ｓ−１）、これにイソプロピルアルコールを９５０μｌ加え（図４中、Ｓ−２）、十分に混合させる。ついで、４℃の温度下、１２０００ｒｐｍの回転速度で３分間、遠心機にかける。これにより、検体からコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体がイソプロピルアルコール相に抽出される（図４中Ｓ−３）。
【００３２】
そして、コエンザイムＱ−１０等を抽出した抽出液は、４℃前後の温度で保管することにより（図４中、Ｓ−４）、図５に示すように、少なくとも１１時間後においてもコエンザイムＱ−１０の２電子還元体が殆ど酸化を受けておらず、保管中の分析試料の変質を防止することができる。なお、図５（ｂ）中、縦軸のコエンザイムＱ−１０は、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の総量に占めるコエンザイムＱ−１０の比率（モル比）を表す。
【００３３】
以上説明した本実施に係る第１の形態例の前処理方法によれば、検体からコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体を抽出した分析試料を長時間安定した状態で保管することができる。そして、この抽出液を分析試料とすることで、正確に分析することができる。また、このため、例えば、４℃に温度を制御したオートサンプラーに抽出液を分析試料としてセットすることで、大量の検体を連続自動処理することができる。
【００３４】
なお、４℃という温度は、生体試料を検体とするときの通常の取り扱い温度であり、この温度に生体試料を保つことにより、他の成分の変質も避けることができる。この温度を大きく超える温度で生体試料を取り扱うと、コエンザイムＱ−１０の２電子還元体をはじめとする成分の変質を避けることができず、一方、生体試料を冷凍保管すると、分析に際して生体試料を解凍する手順が必要となり、また、上記したオートサンプラー等を用いた連続自動処理を容易に実現することができない。
【００３５】
したがって、本発明で言う４℃前後という温度は、上記した生体試料の取り扱いを可能とする限り、４℃よりも高い温度および４℃よりも低い温度の両方を含む意である。すなわち、抽出液の保管温度は、抽出用の水溶性有機溶媒の融点乃至常温の範囲であってもよい。第１の形態例においては、抽出用の水溶性有機溶媒としてイソプロピルアルコールを用いるため、保管温度の下限値は、イソプロピルアルコールの融点である−８９．５℃ということになる。
【００３６】
つぎに、上記の前処理を施し、所要時間保管した抽出液を分析試料として、ＨＰＬＣで分析する方法について、以下説明する。
【００３７】
まず、図６を参照して、本実施に係る分析方法に用いる分析システムについて説明する。本実施に係る分析システム１０は、送液機構１２と、切り換え機構１４と、濃縮カラム１６と、分離カラム１８と、還元カラム２０と、電気化学検出器２２と、紫外吸収検出器２４とを備える。
【００３８】
送液機構１２は、第１および第２の２系列で構成され、各系列は、それぞれ、移動相の貯留容器２５ａ、２５ｂと、貯留容器２５ａ、２５ｂの移動相を送液するポンプ２６ａ、２６ｂとを備える。第１系列には、試料注入器２８をさらに備える。
【００３９】
第１系列の貯留容器２５ａには、移動相として、過塩素酸ナトリウム５０ｍＭを含むメタノールと水の混合溶液（メタノール９５％水溶液）を貯留する。一方、第２系列の貯留容器２５ｂには、移動相として、過塩素酸ナトリウム５０ｍＭを含むメタノールとイソプロピルアルコールの混合溶液（メタノール９０％溶液）を貯留する。
【００４０】
ポンプ２６ａ、２６ｂは、例えば、いずれも、資生堂製のイナートポンプ３００１を用いることができる。このイナートポンプ３００１は、パルスモータによる定流量、定圧方式のデュアルピストンポンプであり、流量が１〜３０００μｌ／ｍｉｎ、吐出上限圧力３５ＭＰａである。
【００４１】
第１系列に設けられる試料注入器２８は、第１系列の移動相に分析試料を同伴させるためのものであり、適宜の装置を用いることができるが、好適にはオートサンプラーを用いる。
【００４２】
試料注入器２８としてオートサンプラーを用いる場合、例えば資生堂製のオートサンプラー３０２３を用いることができる。オートサンプラー３０２３は、試料注入量０．１〜４００μｌ（０．１μｌ単位で制御可能）、試料処理数１００〜２００本であり、電子冷却により４〜２０℃の範囲内で温度を制御できる。
【００４３】
切り換え機構１４は、送液機構１２の２つの系列の移動相の送液経路を切り換えるためのものである。図６中、矢印Ａ１のモード（以下モードＡ１という。）において、第１系列の移動相が濃縮カラム１６に送られ、濃縮カラム１６を出た、コエンザイムＱ−１０等を取り除かれた液が排出される。
【００４４】
一方、第２系列の移動相が濃縮カラム１６をバイパスして分離カラム１８に直接送られる。これに対して、矢印Ａ２のモード（以下、モードＡ２という。）において、第１系列の移動相が系外に排出されて濃縮カラム１６への送液が停止されるとともに、第２系列の移動相が濃縮カラム１６に送られ、濃縮された分析試料を同伴した液（第２の移動相を主体とする液）が濃縮カラム１６から分離カラム１８に送られる。これにより、濃縮された分析試料が第２系列の移動相に同伴して分離カラム１８に送られる。
【００４５】
切り換え機構１４は、例えば切り換えバルブで構成され、このような切り換えバルブとしては、例えば、資生堂製の高圧切換六方バルブ３０１１を用いることができる。高圧切換六方バルブ３０１１は、ＳＵＳ６ポート２ポジションバルブであり、耐圧が３５ＭＰａである。なお、この切り換え機構１４で用いられる配管類をはじめとして分析システム１０で用いられる配管類の接続関係は図６より明らかであり、また、配管材料については、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の吸着を防ぐために、ＳＵＳを用いる。
【００４６】
濃縮カラム１６は、既に説明したように、例えば充填剤の吸着作用等を用いて分析試料を濃縮するためのものであり、例えばスペルコ社製のＬＣ−８を用いることができる。
【００４７】
分離カラム１８は、濃縮カラム１６から送り出された液を分離するためのものであり、例えばスペルコ社製のＬＣ−８を用いることができる。
【００４８】
還元カラム２０は、分離カラムから送り出された液を還元するためのものであり、具体的には、分析試料中のコエンザイムＱ−１０をその２電子還元体に変換することを目的としたカラムである。還元カラム２０は、例えば、資生堂製ＳＨＩＳＥＩＤＯ  ＣＱを用いることができる。
【００４９】
電気化学検出器２２は、電気化学的に高感度で検出することができるコエンザイムＱ−１０の２電子還元体を分析することを目的とするものであり、例えば資生堂製の電気化学検出器３００５を用いることができる。電気化学検出器３００５は、三極ポテンシオスタット方式であり、±１９９０ｍＶの範囲内で１０ｍＶ単位で加電圧をデジタル設定することができる。
【００５０】
紫外吸収検出器２４は、分析試料である血漿に含まれるコレステロール等の紫外線の吸収感度が高い成分を必要に応じて分析するためのものである。紫外吸収検出器２２は、例えば、資生堂製のＵＶ−ＶＩＳ検出器３００２を用いることができる。ＵＶ−ＶＩＳ検出器３００２は、ダブルビームシングルセル方式であり、波長範囲が１９５〜７００ｎｍである。
【００５１】
以上説明した本実施に係る分析システム１０を用いた第１の形態例に係る分析方法を、つぎに説明する。
【００５２】
前記した前処理後の抽出液を分析試料として４０μｌ用意する。この４０μｌの分析試料中には、２．０μｌのヒトの血漿が含まれる。
【００５３】
まず、切り換え機構１４をモードＡ２にして、貯留容器２５ｂに貯留した第２系列の移動相（メタノール９0％溶液）をポンプ２６ｂで濃縮カラム１６、分離カラム１８および還元カラム２０の各カラムに流して、各カラムを安定化させる。このとき、必要に応じて分離カラム１８および還元カラム２０へは、モードＡ１で送液してもよい。
【００５４】
このカラムの安定化操作は、基本的に１度行えばよく、その後、複数の分析試料を順次分析する場合においてもその都度上記の安定化操作を繰り返す必要はない。但し、カラムスイッチング法において、より安定した状態で処理することを目的として、切り換え機構１４の切り換え前後を通じて第２系列の移動相を定常的に各カラムに送ってもよい。
【００５５】
ついで、貯留容器２５ａに貯留した第１系列の移動相（メタノール９５％水溶液）をポンプ２６ａで、途中で試料注入器２８によって上記の分析試料を同伴させて濃縮カラム１６に送液する。このときの流速は４００μｌ／ｍｉｎであり、ポンプ吐出圧は１ＭＰａである。濃縮カラム１６では分析試料中のコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体等の主要な成分が保持される。残余の液は、系外に排出する。
【００５６】
ついで、上記の主要な成分が保持された濃縮カラム１６に、貯留容器２５ｂに貯留した第２系列の移動相（メタノール９０％溶液）をポンプ２６ｂで濃縮カラム１６に送液する。このときの流速は８００μｌ／ｍｉｎであり、ポンプ吐出圧は１０．１ＭＰａである。
【００５７】
なお、これらの操作は、前記したように切り換え機構１４を介して行われる。
【００５８】
ここで、試料注入器２８としてオートサンプラーを用いて、４℃の温度に保持された分析試料を連続的に自動処理するときは、分離カラム１８以降のカラムには、濃縮された分析試料を送らない間、切り換え機構１４を介して第２系列の移動相を常時送液しておくと、より好適である。このときの流速は８００μｌ／ｍｉｎであり、ポンプ吐出圧は７．６ＭＰａである。
【００５９】
これにより、主要な成分が濃縮された分析試料を同伴した液が、分離カラム１８、還元カラム２０に順次送液され、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体を主体（分析対象成分）とする分析試料中の主要な成分の分離が行われ、さらに、コエンザイムＱ−１０を主とする被還元性成分が還元される。
【００６０】
還元カラム２０で処理された液は、電気化学検出器２２および紫外吸収検出器２４に順次送られ、検出処理される。
【００６１】
電気化学検出器２２により得られる、検体としてヒトの血漿を用いたクロマトグラムの一例を図７に示す。電気化学検出器２２の設定加電圧は６００ｍＶである。図７中矢印１ａがコエンザイムＱ−１０の２電子還元体（ユビキノール）のピークを示し、矢印２ａがコエンザイムＱ−１０（ユビキノン）のピークを示す。
【００６２】
続いて、第２の形態例に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法における前処理について説明する。前記した第１の形態例とは、検体が異なる（第１の形態例ではヒトの血漿）だけであるため、第１の形態例の説明と同様に図４を用いて説明する。
【００６３】
まず、検体としてのヒトの唾液を４０μｌ採取し（図４中、Ｓ−１）、これにイソプロピルアルコールを９５０μｌ加え（図４中、Ｓ−２）、十分に混合させる。ついで、４℃の温度下、１２０００ｒｐｍの回転速度で３分間、遠心機にかける。これにより、検体からコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体がイソプロピルアルコール相に抽出される（図４中Ｓ−３）。
【００６４】
そして、コエンザイムＱ−１０等を抽出した抽出液は、４℃前後の温度で保管される（図４中、Ｓ−４）。本第２の形態例においても、第１の形態例と同様に、保管中の分析試料の変質を防止することができる。よって、本実施に係る第２の形態例によっても、検体からコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体を抽出した分析試料を長時間安定した状態で保管することができる。そして、この抽出液を分析試料とすることで、正確に分析することができる。なお、他の条件等については、先に説明した第１の形態例と同一であるため、その説明は省略する。
【００６５】
つぎに、上記の前処理を施し、所要時間保管した抽出液を分析試料として、ＨＰＬＣで分析する方法について以下説明する。本実施に係る第２の形態例における分析方法も、基本的には前記した第１の形態例における分析方法と同一である。このため、第２の形態例における分析方法については簡略的に説明するものとする。なお、分析に使用するＨＰＬＣ及び分析システムは、先に図６を用いて説明したものをそのまま使用するため、ＨＰＬＣ及び分析システムの説明は省略するものとする。
【００６６】
前記した前処理後の抽出液を分析試料として４０μｌ用意する。この４０μｌの分析試料中には、２．０μｌのヒトの唾液が含まれる。
【００６７】
まず、切り換え機構１４をモードＡ２にして、貯留容器２５ｂに貯留した第２系列の移動相（メタノール９0％溶液）をポンプ２６ｂで濃縮カラム１６、分離カラム１８および還元カラム２０の各カラムに流して、各カラムを安定化させる。この際、濃縮カラム１６としては直径2.0mm×長さ35mmであるCapcel Pack C18 AQ S5（商品名）を用いることができる。また、分離カラム１８としては直径2.0mm×長さ250mmであるCapcel Pack C18 AQ S5（商品名）を用いることができる。さらに、還元カラム２０としては直径2.0mm×長さ20mmであるSHISEIDO CQ（商品名）を用いることができる。
【００６８】
ついで、貯留容器２５ａに貯留した第１系列の移動相（メタノール９５％水溶液）をポンプ２６ａで、途中で試料注入器２８によって上記の分析試料を同伴させて濃縮カラム１６に送液する。この時の流速は、例えば２００μｌ／ｍｉｎである。この濃縮カラム１６では分析試料中のコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体等の主要な成分が保持される。残余の液は、系外に排出する。
【００６９】
ついで、上記の主要な成分が保持された濃縮カラム１６に、貯留容器２５ｂに貯留した第２系列の移動相（メタノール９０％溶液）をポンプ２６ｂで濃縮カラム１６に送液する。ここで、試料注入器２８としてオートサンプラーを用いて、４℃の温度に保持された分析試料を連続的に分離カラム１８に供給する。
【００７０】
これにより、主要な成分が濃縮された分析試料を同伴した液が、分離カラム１８、還元カラム２０に順次送液され、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体を主体（分析対象成分）とする分析試料中の主要な成分の分離が行われ、さらに、コエンザイムＱ−１０を主とする被還元性成分が還元される。この時の流速は、例えば４００μｌ／ｍｉｎである。還元カラム２０で処理された液は、電気化学検出器２２および紫外吸収検出器２４に順次送られ、検出処理される。
【００７１】
電気化学検出器２２により得られる、検体としてヒトの唾液を用いたクロマトグラムの一例を図８に示す。図８中、矢印３ａがコエンザイムＱ−１０のピークを示している。
【００７２】
以上説明した第１及び第２の形態例に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法ならびに分析システムによれば、検体からコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体を抽出した抽出液を分析試料とし、この分析試料を濃縮したものを分析するため、高感度で正確に分析することができる。
【００７３】
また、第１及び第２の形態例に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法ならびに分析システムによれば、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体を同時分析し、また、好ましくは大量の検体を連続的かつ自動的に処理するため、能率的に分析することができる。
【００７４】
さらに、第２の形態例に係るコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法ならびに分析システムによれば、検体として唾液を用いてる。唾液の採取は血液（血漿）の採取と異なり非侵襲であるため、自己採取可能であり、体内におけるコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の量を容易に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、従来のコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析システムの概略構成を示す図である。
【図２】図２は、図１の分析システムで得られるクロマトグラムの一例である。
【図３】図３は、図１の分析システムの供試試料を保管したときの成分の経時変化を示すグラフ図であり、図３（ａ）はコエンザイムＱ−１０の２電子還元体についてのものであり、図３（ｂ）はコエンザイムＱ−１０についてのものである。
【図４】図４は、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析方法における前処理工程を説明するための図である。
【図５】図５は、前処理後の抽出液を保管するときの成分の経時変化を示すグラフ図であり、図５（ａ）はコエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の量について、図５（ｂ）はコエンザイムＱ−１０のモル分率についてのものである。
【図６】図６は、コエンザイムＱ−１０およびその２電子還元体の分析システムの概略構成を示す図である。
【図７】図７は、検体として血漿を用いた場合において、図６の分析システムで得られるクロマトグラムの一例である。
【図８】図８は、検体として唾液を用いた場合において、図６の分析システムで得られるクロマトグラムの一例である。
【符号の説明】
【００７６】
１０  分析システム
１２  送液機構
１４  切り換え機構
１６  濃縮カラム
１８  分離カラム
２０  還元カラム
２２  電気化学検出器
２４  紫外吸収検出器
２５ａ、２５ｂ  貯留容器
２６ａ、２６ｂ  ポンプ
２８  試料注入器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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