(57)【要約】【課題】　VIII因子：Ｃ含有フォンビルブラント因子の濃縮物の提供。【解決手段】　この濃縮物は、VIII因子：Ｃおよびフォンビルブラント因子を含む液体からの分別沈殿によって得られる。フォンビルブラント因子の高分子量マルチマー含量が増大し、vWF：Agに対するvWF：RCoF活性の比が１より大きいVIII因子：Ｃ含有フォンビルブラント因子の濃縮物として治療的利点を有する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　VIII因子：Ｃおよびフォンビルブラント因子を含む液体からの分別沈殿によって得られ、フォンビルブラント因子の高分子量マルチマーの含量が増大しvWF：Agに対するvWF：RCoF活性の比が１より大きいVIII因子：Ｃ含有フォンビルブラント因子の濃縮物。
【請求項２】
　ヒト血漿、血漿分画、好ましくは寒冷沈殿物、または遺伝子的に修飾した細胞材料から得られた請求項１記載の濃縮物。
【請求項３】
　アミノ酸好ましくはグリシンおよびアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩好ましくはNaClを用いる分別沈殿によって得られた請求項１または２に記載の濃縮物。
【請求項４】
　請求項１〜３記載の濃縮物を含む血友病Ａおよびフォンビルブラント症候群の治療のための医薬。
【請求項５】
　安定化剤としてカルシウムイオンからなる請求項４記載の医薬。
【請求項６】
　組換え体または血漿FVIII：Ｃの免疫原性を低下させるために請求項１記載のvWF高分子量マルチマー含量を増大させた請求項４または５記載の医薬。
【請求項７】
　VIII因子：Ｃおよびフォンビルブラント因子を含む液体を、アミノ酸好ましくはグリシンおよびアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩好ましくはNaClを用いて分別沈殿に付すことからなる請求項１〜３記載の濃縮物の製造方法。
【請求項８】
　沈殿を70〜160ｇ／Ｌのグリシン濃度および100〜160ｇ／ＬのNaCl濃度によって実施する請求項７記載の方法。
【請求項９】
　濃縮物中におけるフォンビルブラント因子のマルチマー量、したがってリストセチン補因子活性の量をグリシンおよびNaClの濃度を調節することによって、低濃度においては高分子量マルチマーの沈殿を優先し、高濃度においては低分子量マルチマーの沈殿を優先させることによって制御する請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
　濃縮物またはその製造時に生じる前駆体が安定化および滅菌される請求項７〜９記載の方法。
【請求項１１】
　溶解した寒冷沈殿物を水酸化アルミニウム懸濁液と混合して少量捕捉されるプロトロンビン複合体を吸着させ、ついで攪拌し、除去し、フィブリノーゲンをグリシンで沈殿させて除去し、ついでvWF：FVIII：Ｃ複合体を沈殿させ、溶解、安定化および滅菌後、分別沈殿に付して請求項１〜３記載の濃縮物を製造する請求項７〜１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、その特定の組成により治療的利点を有するVIII因子：Ｃ含有フォンビルブラント因子の濃縮物に関する。
【背景技術】
【０００２】
　機能性のフォンビルブラント因子（vWF）は様々の分子量分布、いわゆるマルチマーで血流中を循環する糖タンパク質であり、マルチマーは500キロダルトン（kd）から20,000 kdまでの分子量分布を有する。その最小の単位は分子量約550 kdのダイマーであり、それはジスルフィド架橋によって互いに連結する２つのモノマーから構成される。さらにこれらのダイマーのジスルフィド結合はポリマー、分子量20,000 kdまでのいわゆるマルチマーを生じる。フォンビルブラントマルチマーの分子量分布は、アガロースゲル電気泳動によって、定量的および定性的の両方法で測定することができる（参考文献１、２、３)。フォンビルブラント因子の生理学的機能は、損傷した内皮へのその接着性と、血小板を凝集させる性質である（参考文献４）。これが、最初に血小板プラグを形成させて初期の出血を停止する、いわゆる一次止血を生じる。ついで凝血カスケードいわゆる二次止血が起こり、最終的に創傷は閉鎖する。
【０００３】
　フォンビルブラント因子のさらに重要な機能は、VIII因子：Ｃ（FVIII：Ｃ）と複合体を形成するその能力である。このvWFとの複合体形成が、血漿中におけるFVIII：Ｃを蛋白質分解的減成から保護する。健康な生体では、vWFとの複合体としてFVIII：Ｃは常に十分高いレベルで存在する。これに関連しては、２種のタンパク質、FVIII：ＣおよびvWFが、FVIII：Ｃ軽鎖のＮ末端とvWFサブユニットのＮ末端の間における非共有結合により連結すると推定されている（参考文献５、６）。
【０００４】
　このタイプの会合は、たとえば、フォンビルブラント患者における置換のための健康なドナー血漿からの寒冷沈殿物の使用によっても観察された。正常な寒冷沈殿物による置換は、患者に数時間持続するFVIII：Ｃの上昇を誘導した。低下は徐々にvWFの半減期で起こった。
【０００５】
　抗血友病因子、VIII因子凝固タンパク質（FVIII：Ｃ）は、vWFとともに、共有結合した複合体として血漿中を循環し、vWF／FVIII：Ｃ複合体のプレパラティブな解体はかなり困難である。vWFおよびFVIII：Ｃは生体内の異なる場所でも合成される２種の異なるタンパク質であることは長い間知られていなかった。FVIII：Ｃは肝臓で、vWFは内皮細胞および巨核球内で合成される（参考文献９、10）。
【０００６】
　vWFの不存在またはそのわずかな低下でも出血時間は延長し、重大な出血傾向を生じる。この病理学的状態は、フォンビルブラント症候群と呼ばれ、幾つかの形で表われる。これらのvWFマルチマーの異常なサイズ分布から機能性フォンビルブラント因子の部分的もしくは完全な不存在までの範囲がIII型フォンビルブラント症候群と呼ばれている。これらの症例では、高分子量マルチマーおよび低分子量マルチマーの両者が減少しているか、または完全に存在しないことがありうる。フォンビルブラント症候群（たとえば、III型）ではFVIII：Ｃの欠乏、したがって血遊病Ａを生じ、FVIII因子はvWFとの複合体により保護されので、これがないと短時間内に蛋白質分解的に減成される。
【０００７】
　血友病患者における置換に正常な寒冷沈殿物を使用すると、測定可能なFVIII：Ｃ活性における迅速かつ短時間の上昇が観察されるのみである（参考文献７、８）。しかしなが
ら、フォンビルブラント患者における置換に血友病ドナーからの血漿または寒冷沈殿物を使用すると、逆説的にFVIII因子の測定可能な上昇がみられた。これは、vWFによる安定化で説明することができる。フォンビルブラント患者はFVIII因子を合成するが、血漿中への放出後絶えず蛋白質分解的に切断される。
【０００８】
　vWFはFVIII：Ｃとともに、正常な血液凝固のためにきわめて重要である。vWFの血漿濃度は約10μg／mLである。FVIII：Ｃは、質量でのタンパク質含量では、さらに少なく約0.2μg／mLである。
【０００９】
　最初に述べたように、vWFが血小板の凝集を仲介し、したがって、損傷された血管の初期止血が達成される。他の前凝固因子、たとえばいわゆる接触因子、FVIII：Ｃ、ホスホリピドおよびカルシウムとともに、フィブリンが形成され創傷が閉鎖されるまでVIII因子の活性化を介して更なる凝血が起こる（参考文献11）。
【００１０】
　vWF／FVIII：Ｃ複合体の分離はきわめて困難であり、これはFVIII：Ｃが寒冷沈殿物中でvWFとともに見出され、また、ゲルろ過においてvWFとともに空隙容量中に溶出される理由である（参考文献12）。
【００１１】
　vWF／FVIII：Ｃを濃縮する血漿工業においてしばしば使用される方法は寒冷沈殿法である。この方法では不溶性の沈殿物（寒冷沈殿物）は超低温で凍結した血漿の解凍を制御することによって得られる。この沈殿物を分離すると、寒冷沈殿物のみでなく、いわゆるクリオプア（cryo−poor）な血漿も得られる。この寒冷沈殿物は濃縮されたvWF／FVIII：Ｃ複合体とともに一部の血漿タンパク質、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンを含有する。寒冷沈殿物中のvWFマルチマーのスペクトルは、正常血漿の場合と比較して効果的なマルチマー組成からなる。それは主として、この方法で沈殿する高分子量のマルチマーであり、事実上すべての高分子量vWFマルチマーが、血漿から寒冷沈殿物中に回収される。測定可能な活性を示さない約20％のvWFは、クリオプアな血漿中にFVIII：Ｃとともに残存する。
【００１２】
　健常人からプールした血漿は「定義によれば」、すべての凝固因子に基づいて１IU／mLの機能的活性を含有する。vWFの機能的活性は通常、無傷のvWF濃度と相関するリストセチン仲介血小板凝集によって測定される。これは、IU／mLで表示される濃度であるvWFリストセチン補因子活性（vWF：RCoF）として記載される。この会合タンパク質はvWF抗原と呼ばれ、vWF：Agと略される。
【００１３】
　重篤なフォンビルブラント病の場合、高機能的含量のFVIII：Ｃを有するvWF濃縮物を用いる置換はかなり有利である。一方では、結合した前凝固因子FVIII：Ｃは結合能力の指標であり、無傷のvWFを指示する。他方ではFVIII：Ｃの存在は出血時間の有意な短縮を導く。FVIII：Ｃがないと、フォンビルブラント病の治療には、さらにFVIII：Ｃ製品の投与による置換が必要である。フォンビルブラント病における迅速な効果のための前提条件は、したがって、正常なFVIII：Ｃ因子結合能力を有するvWF、高分子量vWFマルチマーの有利に豊富な含量、および無傷のFVIII：Ｃ因子の含量である。
【００１４】
　欧州特許出願EP 0 705 846（参考文献13）には、フォンビルブラント因子をvWFの高分子量分画と低分子量分画に分離するプレパラティブな方法が記載されている。この分離は、vWFを親和性支持体に結合させ、ついで様々な塩濃度でそれから溶出させることによって達成される。この方法によりとくに高い生理学的活性を有する高分子量vWF分画を得ることが可能である。
【００１５】
　vWFを高分子量および低分子量マルチマーに分別するクロマトグラフィー法は既に開示
されている。しかしながらこれらの場合、高分子量vWFマルチマーに富んだ至適vWF／FVIII：Ｃ複合体を特異的に得ることはできなかった。
【００１６】
　FVIII：Ｃは組換えであれ血漿FVIIIであれ、高濃度で反復して投与されると、投与様式および純度に依存して、抗体の産生が様々な程度に誘導されるので、フォンビルブラント因子から分離して望ましくない免疫応答を導くことが知られている。これらの抗体は、血友病ＡインヒビターまたはFVIII：Cインヒビターと呼ばれ、刊行物Thrombos. Diathes haemorrh. (Stuttg.), 1975, 34, 869（参考文献14）に開示されているように「Bethesda単位」で定量的に測定することが可能であり、望ましくない副作用および、適宜出血を招くことがある。
【００１７】
　これらのFVIII：Ｃ製品が、フォンビルブラント因子のマルチマーとプレインキュベートされると、これらの抗−FVIII免疫グロブリンの産生は実質的に防止され、比較的大量を、これらの副作用の懸念なく反復して使用することができる。すなわち、本発明の生成物は使用時に有意な利点を有する。この会合はマウスの血友病モデルにおいて証明されている（参考文献15）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
　請求項１において示された本発明は、高分子量のvWFマルチマーに富み、vWF：RCoF活性とvWF：Agの比が１より大きいVIII因子：Ｃ含有フォンビルブラント因子の濃縮物の製造における問題点に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
　上述の問題点は、請求項１に述べた濃縮物によって解決される。この濃縮物はVIII因子：Ｃおよびフォンビルブラント因子を含む液体から分別沈殿により得られ、フォンビルブラント因子の高分子量マルチマー含量が増大し、vWF：RCoF活性とvWF：Agの比が１より大きい。
【発明の効果】
【００２０】
　本発明の使用により達成される利点は、VIII因子：Ｃおよびフォンビルブラント因子を含む液体から単純なプレパラティブ分別沈殿により得ることができるVIII因子：Ｃ含有フォンビルブラント因子の濃縮物を提供できることであり、その濃縮物はフォンビルブラント因子の高分子量マルチマー含量が増大し、vWF：RCoF活性とvWF：Agの比は１より大きいことである。この方法により得られる濃縮物は重篤なフォンビルブラント病の症例における置換に適当であり、結合した前凝固因子FVIII：ＣがvWFによって安定化され、したがって出血時間の有意な短縮を導くことから、VIII因子：Cの存在はきわめて重要である。高分子量マルチマーの高含量での存在はその迅速な有効性に必須の前提条件である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
　本発明の更なる有利な実施態様は請求項２以下に指示される。
【００２２】
　本発明の濃縮物は、ヒト血漿、たとえば寒冷沈殿物のような血漿分画、または遺伝子的に修飾された細胞材料から得ることができる。そのための好ましい出発原料は、vWF−FVIII：Ｃ複合体に加えて血漿タンパク質、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンを含むヒト寒冷沈殿物である。この寒冷沈殿物は、制御された加熱（平衡化）により、すなわち０〜＋２℃の温度で液体状態に変換した、超低温凍結、加クエン酸血漿から得られ、一部のフィブリノーゲン、フィブロネクチン、およびvWF：FVIII：Ｃ複合体が沈殿物としてあとに残留し、たとえば、遠心分離により分離することができる。この方法で得られる寒冷沈殿物は一時的に超低温凍結で保存することが可能であり、精製されたvWF／FVIII：Ｃ複合体を得るための出発原料として有用である。
【００２３】
　本発明の濃縮物は好ましくは、アミノ酸とくにグリシン、およびアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、好ましくは塩化ナトリウムを用いる分別沈殿により得られる。これにはフィブリノーゲンが実質的に溶液から沈殿してしまうまで、グリシンを寒冷沈殿物の攪拌した水溶液に加えることが必要である。次に沈殿したフィブリノーゲンの残留物をついで遠心分離によって除去する。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、好ましい実施態様においては塩化ナトリウムを攪拌下に添加することにより上清からvWF／FVIII：Ｃ複合体を沈殿させ、遠心分離によって分離する。この方法で得られるvWF：FVIII：Ｃ含有の沈殿物を等張性緩衝液に溶解し、スクロースおよびグリシンで安定化し、ついで滅菌した。
【００２４】
　vWF／FVIII：Ｃ含有沈殿物の沈殿は、濃度70〜160ｇ／Lのグリシンおよび100〜160ｇ／Ｌの塩化ナトリウムで実施するのがとくに有利である。この濃度範囲への調整により、活性／高分子量のvWFマルチマーの豊富化を伴う好ましい高いvWF：RCoF活性比へのシフトが可能である。また、沈殿には、グリシンのほかに他の生理学的、またはさらに非生理学的アミノ酸、たとえばα−アラニン、α−、β−またはγ−アミノ酪酸、リジン、バリン、アスパラギンおよびグルタミン酸、ならびに類似の化学構造を有する物質が適当である。すなわち、たとえばグリシンと類似の方法でβ−アラニンを用いても、同様に沈殿物が得られる。
【００２５】
　沈殿剤、たとえばアミノ酸、好ましくはグリシンの特定の濃度範囲、およびアルカリ金属およびアルカリ土類金属の群からの塩、好ましくは塩化ナトリウム、５〜30質量％の範囲内の適当なイオン強度範囲に調整することによって、活性比を高いvWF：RCoF活性へシフトさせることが可能になり、これは高分子量vWFマルチマーの豊富化の結果である。ここで果たされる鍵となる役割は、本発明が関係するグリシン濃度によるものである。
【００２６】
　本発明の方法は、最初に溶解させた寒冷沈殿物を水酸化アルミニウムの懸濁液と混合し、プロトロンビン複合体を吸着させて少量を捕捉し、ついで攪拌除去することにより都合良く行われる。上清はこの時点で、VIII：Ｃ因子およびフォンビルブラント因子を含有し、これらは分別沈殿によって得られる。
【００２７】
　寒冷沈殿物を、等張性緩衝液中に、攪拌し、穏やかに加熱しながら溶解して、タンパク質濃度２〜３％を得る。この方法で得られた粗製のクリオ溶液を、ついで水酸化アルミニウムの懸濁液と混合してプロトロンビン複合体因子を吸着させ、残留したプロトロンビン因子は攪拌しながら吸着させ、Al(OH)3のペレットとともに除去する。プロトロンビン複合体因子を除去したのち、クリオ溶液を滅菌によりウイルス不活性化に付すか、またはアクリジンもしくはアクリジン誘導体によりDE 44 44 045に従って滅菌し、安定化する。この目的のためにはカルシウムイオンがとくに適している。
【００２８】
　次にウイルスの不活性化後に得られるクリオ溶液に、攪拌しながらグリシンを加え、フィブリノーゲンを沈殿させ、遠心分離で除去する。次に得られた上清に、攪拌下でNaClを添加してvWF／FVIII：Ｃを沈殿させ、次に遠心分離により分離する。得られたvWF／FVIII：Ｃ−含有沈殿物を等張性緩衝液に溶解し、スクロースとグリシンで安定化し、ついで60℃に10時間加熱する。滅菌を行ったのちに、得られた溶液は高分子量のマルチマー含量に富んだvWF／FVIII：Ｃ複合体を得るための出発原料として有用である。
【００２９】
　本発明の例示的な実施態様を以下の実施例１〜６に記載する。
【実施例１】
【００３０】
　寒冷沈殿物の溶解、Al (OH)3吸着およびフィブリノーゲン除去
　200ｇの寒冷沈殿物を800 mLの0.1 M NaCl／グリシン溶液に溶解させ、分解した。クリオ溶液を、1.5％強度のAl(OH)3懸濁液10容量％と混合し、15分間攪拌し、遠心分離した。分離されたAl(OH)3のペレットは廃棄した。攪拌したAl(OH)3の上清（820 mL）に、溶液からフィブリノーゲンが沈積するまでグリシンを加えた。沈殿物を遠心分離し、vWF／FVIII：Ｃ複合体含有上清をさらに処理した。
【００３１】
　vWF／FVIII：Ｃ複合体の沈殿、溶解、安定化、滅菌
　攪拌したグリシン含有上清に15％のNaClを加え、vWF／FVIII：Ｃ複合体を定量的に沈殿させた。沈殿物を64mLのNaCl／グリシン緩衝液に溶解し、スクロース（１ｇ／mL）およびグリシン（150ｇ／Ｌ）で安定化し、60℃で10時間滅菌した。冷却後、滅菌溶液を同容量のグリシン／NaCl緩衝液で希釈した。
【００３２】
　高分子量マルチマーの含量が上昇したvWF／FVIII：Ｃ分画の沈殿
　1.6ｇ／ＬのNaClおよび124.4ｇ／Ｌのグリシンを含有する希釈溶液（220mL）に、各場合とも、攪拌しながら0.75部の沈殿メジウムを加え、３つのバッチａ、ｂ、ｃにおけるグリシン含量が沈殿バッチ中：
　　ａ）80ｇ／Ｌ
　　ｂ）90ｇ／Ｌ
　　ｃ）100ｇ／Ｌ
になるようにし、NaClの最終濃度はすべての場合、122ｇ／Ｌに到達するようにした。これにより、各場合とも微細な沈殿物を生じた。これを約45分間攪拌したのち、遠心分離した。分画（各場合、44mL）を等張性緩衝液に溶解すると、高分子量マルチマーに富んだvWFおよびFVIII：Ｃを含有し、数字の比は以下の表1に示すとおりであった。vWF：RCoF活性、vWF：AgおよびFVIII：Ｃの解析により以下の比が得られた。
【００３３】
【表１】
2004123744.tif 000002
【００３４】
　表１は出発原料におけるvWF：RCoFに対するvWF：Agの比が１に近いことを示している。バッチａ）〜ｃ）では、その比はvWF：Agに比較してvWF：RCoF活性の方が３倍まで上昇した。
【実施例２】
【００３５】
　高分子量マルチマーに富む分画を得るための出発原料は、この場合、寒冷沈殿物から得られる分画前の、滅菌vWF／FVIII：Ｃ含有溶液であった。この溶液は澄明で均一であり、このプロセスの段階では1.6ｇ／ＬのNaClと124.4ｇ／Ｌのグリシンを含有した。
【００３６】
　本発明によるvWF／FVIII：Ｃ複合体の最初の沈殿物を沈殿させるためには、NaCl／グリシン平衡を、各場合数バッチで、高分子量vWFマルチマーが優先的に沈殿するように、適合させた沈殿メジウムを添加することによって調整した。これは、vWF：Agに対するvWF：RCoF活性の濃度比によりチェックすることが可能であり、１よりもはるかに大きかった。
【００３７】
　最初の沈殿物の遠心分離後、上清中のグリシン濃度は各場合（第二の沈殿）とも上昇していて、上清中に残留したvWFも沈殿した。この第二の沈殿物中の高分子量含量は著しく低下し、これは、抗原濃度に対するvWF：RCoF活性の比における低下から明らかであった。
【００３８】
　３種の沈殿物バッチＡ、Ｂ、Ｃの説明：
　0.75倍の容量の沈殿メジウム（150 mL）を、各場合200 mLの出発原料に加え、添加が完了するまで攪拌した。微細な沈殿物が生成し、これを遠心分離した。200 mLのvWF／FVIII：Ｃ−含有出発原料は既に以下の濃度のNaClおよびグリシンを含んでいた。すなわち、1.
6ｇ／ＬのNaClと124.4ｇ／Ｌのグリシンである。
【００３９】
　最初の沈殿物を得るためには、沈殿メジウムは以下の濃度のNaClおよびグリシンを含有した。
　　バッチＡの沈殿メジウム  　NaCl 283ｇ／Ｌ 　　グリシン　なし  
バッチＢの沈殿メジウム　　NaCl 283ｇ／Ｌ 　　グリシン　45ｇ／Ｌ
バッチＣの沈殿メジウム  　NaCl 283ｇ／Ｌ 　　グリシン　90ｇ／Ｌ
【００４０】
　バッチＡ〜Ｃの各場合とも、200 mLの出発原料に、相当する沈殿メジウム150 mLを添加し、特定の沈殿バッチにおけるNaClおよびグリシンの最終濃度は、次のように得られた。
　　　　　　　　　　NaCl    　　　  グリシン 
　　バッチＡ     122.2ｇ／Ｌ  　  　71.1ｇ／Ｌ 
　　バッチＢ   　122.2ｇ／Ｌ   　   90.4ｇ／Ｌ 
　　バッチＣ   　122.2ｇ／Ｌ     　109.6ｇ／Ｌ 
【００４１】
　得られた沈殿物を分離して、溶解した。vWF：RCoF、vWF：AgおよびFVIII：Ｃ濃度は溶解した沈殿物について測定し（約42mL）、以下の表２に示した。
【００４２】
【表２】
2004123744.tif 000003
【００４３】
　活性のそれぞれの比は表２から計算し、表３に示した。
【００４４】
【表３】
2004123744.tif 000004
【００４５】
　バッチＡ〜Ｃで達成されたvWF：RCoF活性に対するvWF：Ag活性の比は、出発原料と比較してvWF：RCoF活性に有利となるように変化した。
【００４６】
バッチＡ〜Ｃの上清からの沈殿物または第二の沈殿物
　バッチＡ〜Ｃの上清に、攪拌しながら、３つのすべてのバッチで各場合とも160ｇ／Ｌのグリシン濃度が達成されるまでグリシンを加えた。得られた沈殿物を遠心分離し、溶解させた。ついで、vWF：RCoF, vWF：AgおよびFVIII：Ｃの濃度を、数値比の計算によって決定した。この比は表４に示した。
【００４７】
【表４】
2004123744.tif 000005
【００４８】
　表４に掲げた第二の沈殿物はvWF：RCoF活性においてvWF：RCoFに対する vWF：Agの著しい低下を示す。これは、高分子量マルチマー量の低下、また、すなわち vWF機能性の低下を指示している。
【実施例３】
【００４９】
　実施例２の場合と同様に、製造のこの段階における分別前の滅菌vWFおよびFVIII：Ｃ−を含有する完全に澄明な、1.6ｇ／Ｌ NaClおよび124.4ｇ／Ｌグリシンを含む溶液を使用した。各場合、同じNaClおよびグリシン濃度を有し、添加およびインキュベーション時間が異なる４つの沈殿バッチを使用した。
【００５０】
　実施例１および実施例２と比較して、グリシン濃度は沈殿バッチにおいて高く、沈殿バッチ１〜４は、vWF：Ag／vWF：RCoF比が露出時間のみでなく、一次的にグリシン濃度に依存して沈殿を生じることを確立し、証明するために、添加およびインキュベーション時間のみを変動させた。
【００５１】
　バッチ１〜４の各場合とも200mLの出発原料を攪拌しながら、各場合とも、NaCl 283.01ｇ／Ｌおよびグリシン133.58ｇ／Ｌを含有する沈殿メジウム150mLを添加した。変動させたのは添加およびインキュベーション時間のみで、表５から明らかなように、すべてのバ
ッチでNaClおよびグリシンの濃度は同一とした。
【００５２】
【表５】
2004123744.tif 000006
【００５３】
　得られた沈殿物を遠心分離し、溶解した。バッチ１からの上清にはさらに結晶グリシンを加えて、濃度を160ｇ／Ｌに調整し２時間攪拌した。得られた沈殿物を同様に溶解させた。FVIII：Ｃ、vWF：RCoFおよびvWF：Ag活性含量を測定し、相互の比を計算した。それらを表６に示す。
【００５４】
【表６】
2004123744.tif 000007
【００５５】
　この場合には、添加およびインキュベーション時間が異なるにもかかわらず、バッチ１〜４における測定された活性比は実際上、匹敵するものであることが明らかになった。NaCl濃度およびグリシンの濃度は４つのバッチすべてで同一であった。
【００５６】
　バッチ１の第二の沈殿物のみが、著しく相違した。すなわち、vWFリストセチン補因子含量は著しく低下し、vWF：Ag含量は著しく増大した。高分子量マルチマーは、溶解された第二の沈殿物中には明らかに存在しなかった（示していない）。
【実施例４】
【００５７】
　この場合の出発原料は同じく、精製したvWF／FVIII：Ｃ分画であり、1.6ｇ／Ｌ NaClおよび124.4ｇ／Ｌグリシンを含有した。
【００５８】
　バッチ１：この場合は、283.01ｇ／Ｌの NaClと133.5ｇ／Ｌのグリシンを含有する150 mLの沈殿メジウムを、攪拌しながら200 mLの出発原料に加えた。攪拌は沈殿の完結まで継続し、ついで沈殿物を遠心分離し、溶解し、活性を測定した。
【００５９】
　バッチ１ａ：残留した上清に、攪拌しながらさらにグリシンを加え（第二の沈殿）、グリシン濃度を160ｇ／Ｌにし、第二の沈殿からの沈殿物を遠心分離して、溶解し、活性をバッチ１と同様に測定した。
【００６０】
　バッチ２：300ｇ／Ｌの NaClを含有し、グリシン含まない別の沈殿メジウム１部を、同じ出発原料１部に加えた。添加完了後、グリシン濃度を66.7ｇ／Ｌにし、NaCl濃度を151.5ｇ／Ｌにした。得られた沈殿物を遠心分離し、溶解し、バッチ１と同様に活性を測定した。
【００６１】
　バッチ２ａ：バッチ２からの残った上清に、さらにグリシンを、グリシン濃度が160ｇ／Ｌに達するまで加えて同様に沈殿させた。沈殿物を遠心分離し、溶解して、活性を測定した（第二の沈殿物）。
【００６２】
【表７】
2004123744.tif 000008
【００６３】
　vWF：RCoF、vWF：AgおよびFVIII：Ｃの測定は以下の表８に示すような比を与えた。
【００６４】
【表８】
2004123744.tif 000009
【００６５】
　表８に関して：バッチ１およびバッチ２は、vWF濃縮物について有利なマルチマー分布を示し、バッチ２では、高分子量マルチマーがより高い表示であった。高分子量含量はバッチ１ａとくにバッチ２ａで低下した（示していない）。
【実施例５】
【００６６】
　バッチＡ
　高分子量vWFマルチマーに富んだ濃縮物の製造
　実施例１におけるように、3.64kgの寒冷沈殿物を処理して、vWFおよびFVIII：Ｃを含有
する希釈滅菌溶液約4,000 mLにした。
【００６７】
　高分子量vWFマルチマーならびにFVIII：Ｃに富む分画を与える沈殿のための操作：
　3,000 mLの沈殿メジウム（24.44ｇのNaClおよび24.15ｇのグリシン, 2,000mLのWFI, pH
6.8）を、4000 mLの滅菌、希釈vWF／FVIII：Ｃ溶液に攪拌しながら60分を要して添加し、インキュベーションを攪拌しないで90分継続した。形成した沈殿物を遠心分離機で6000×ｇで45分間遠心分離した。得られた沈殿物（沈殿物1）を溶解緩衝液400mLを加えて溶解した（溶解緩衝液：1.46ｇ NaCl, 10.14ｇグリシン, 500mL WFI, pH 7.0）。
【００６８】
　安定化、最終処方、凍結乾燥
　高分子量vWFマルチマーに富む、得られた溶液を0.5％ヒトアルブミンで安定化し、3.5ｇ／Ｌ NaCl, 5.8ｇ／Ｌ クエン酸三ナトリウム×２H2O, 20ｇ／Ｌのグリシンを含有する緩衝液pH 7.0に対して透析した。透析に続いて、その溶液を30,000×ｇで60分間、超遠心分離に付した。超遠心分離後の上清を傾瀉した。ついで超遠心分離した溶液をＩ部およびII部に分割した。
【００６９】
　Ｉ部はろ過滅菌し、瓶に詰めて凍結乾燥した。II部はそのままで同様に瓶に詰めて、凍結乾燥した。高速での超遠心分離の間に大部分の微生物は除去されることが知られている。分割の目的は、その比に対するろ過滅菌の効果、およびろ過滅菌ののちも、高分子量マルチマーのスペクトルが変化しないで残存するか否かを検討するためであった。
【００７０】
　以下の表９に示すように、その比もまた高分子量マルチマーのスペクトルも、わずかな製品の希釈および処理ロスを除いて維持された。
【００７１】
　凍結乾燥およびWFIによる再構築は、vWF：Agに比べて高いvWF：RCoF濃度を与えた。これは、高分子量vWFマルチマーの相対的に高い含量に帰することができるものであり、vW症候群の適応にとくに利点を提供する。
【００７２】
　バッチＢ
高分子量マルチマーが減少したvWF／FVIII：Ｃ−含有濃縮物分画の製造
　さらに後期のバッチ調製物（バッチＢおよび沈殿物２ともいう）から低分子量マルチマーに富む分画が得られた。
【００７３】
　実施例１に示すように、3.64kgの寒冷沈殿物を処理して、vWFおよびFVIII：Ｃを含む希釈、滅菌溶液約4,000 mLを得た。沈殿は、高分子量vWFマルチマーおよびFVIII：Ｃが減少した分画を与えるように実施した。
【００７４】
　沈殿メジウム3,000 mL（350ｇのNaCl, 165.1ｇのグリシン, 1000mLのWFI, pH 6.8）を4000 mLの滅菌、希釈vWF／FVIII：Ｃ溶液に攪拌しながら60分を要して添加し、インキュベーションをさらに90分間攪拌しないで継続した。形成した沈殿物を遠心分離機で6000×ｇで45分間遠心分離した。得られた沈殿物に溶解緩衝液400 mLを加えて溶解させた（溶解緩衝液：1.46ｇ NaCl, 10.14ｇグリシン, 500 mL WFI, pH 7.0）。
【００７５】
　この分画は事実上、バッチAからの沈殿物１と同一であり、さらに用いるまで超低温で凍結した。このバッチから得られた上清は、低分子量vWFマルチマー分画の取得に有用であった。
【００７６】
　上清はグリシン濃度を上昇させることにより、さらに沈殿させた。
　約40Ｌの上清を、25±２℃で攪拌しながら60分を要してさらに30ｇ／Ｌのグリシンを添加することにより沈殿させ、さらに90分間攪拌しないでインキュベートした。そのバッチ
における最終濃度は122ｇ／Ｌ NaClおよび158ｇ／Ｌであった。形成した沈殿物を遠心分離機で6000×ｇで60分間遠心分離した。このようにして得られた沈殿物（沈殿物２）に、溶解緩衝液250 mLを加えてに溶解した（溶解緩衝液：1.46ｇ NaCl, 10.14ｇグリシン, 500mL WFI, pH 7.0）。上清は、廃棄した。
【００７７】
　高分子量vWFマルチマーの含量が低下した、得られた溶液を0.5％ヒトアルブミンで安定化し、3.5ｇ／Ｌ NaCl, 5.8ｇ／Ｌ クエン酸三ナトリウム×２H2O, 20ｇ／Ｌのグリシン,
pH 7.0を含有する緩衝液に対して透析した。
【００７８】
　透析に続いて、その溶液を30,000×ｇで60分間、超遠心分離に付した。超遠心分離後の上清を傾瀉し、ろ過によって滅菌し、瓶に詰めた。
【００７９】
　凍結乾燥およびWFIによる再構築により、vWF：Agに比較してvWF：RCoF濃度の低い濃縮物が得られた。
【００８０】
【表９】
2004123744.tif 000010
【実施例６】
【００８１】
　78 IU／mLのvWF：RCoF, 80 IU mLのvWF：Agおよび微量のFVIII：Ｃを含むフォンビルブラント因子濃縮物からの血漿、各３バッチ（Ａ、Ｂ、Ｃ）中に100 IUの組換えFVIII：Ｃを含む200 mLの培養上清に加えた。培養上清は1.6ｇ／Ｌ NaCl および124ｇ／Ｌグリシンに調整した。以下のグリシン／NaCl組成を有する沈殿メジウム150 mLをそれぞれのバッチに加え、攪拌した：
　バッチＡ     122.2ｇ／Ｌ　NaCl  　　 71.1ｇ／Ｌ　グリシン
　バッチＢ     122.2ｇ／Ｌ  NaCl  　　 90.4ｇ／Ｌ　グリシン
　バッチＣ     122.2ｇ／Ｌ  NaCl　  　109.6ｇ／Ｌ　グリシン
【００８２】
形成した沈殿物を遠心分離機で3000×ｇで60分間遠心分離した。得られた沈殿物を溶解緩衝液に溶解し（溶解緩衝液：1.46ｇ NaCl, 10.14ｇグリシン, 500 mL WFI, pH 7.0）、解析した。この場合は、主として、FVIII：Ｃ活性を有する高分子量マルチマーが同一のNaCl含量および低グリシン濃度で最初に沈殿することが観察された。
【００８３】
　サイズによるvWFマルチマーの分割は、組換えFVIII：Ｃおよび血漿vWFの両者を含有する培養上清においてもNaClおよびグリシンでの平衡を適当に調整することによって達成できることが、これから明らかであった。
【００８４】
　参考文献一覧表
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