(57)【要約】　　　（修正有）【課題】残液や残留分を失活させる処理を行うための、雑草防除活性化合物を防除活性のより低い化合物に変換する方法、又は、目的植物に雑草防除剤耐性を付与するための新たな方法等の開発に利用することができるものを提供する。【解決手段】以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質をコードするＤＮＡ等を提供する。特定な配列で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、特定な配列で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または特定な配列で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に式ＩＩ2004057194.tif 000441で示される化合物を式ＩＩＩ2004057194.tif 000442で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質をコードするＤＮＡ。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に式（ＩＩ）
2004057194.tif 000436
で示される化合物を式（ＩＩＩ）
2004057194.tif 000437
で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の群から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ。
＜塩基配列群＞
（ａ１）配列番号６で示される塩基配列。
（ａ２）配列番号７で示される塩基配列。
（ａ３）配列番号８で示される塩基配列。
（ａ４）配列番号１０９で示される塩基配列。
（ａ５）配列番号１３９で示される塩基配列。
（ａ６）配列番号１４０で示される塩基配列。
（ａ７）配列番号１４１で示される塩基配列。
（ａ８）配列番号１４２で示される塩基配列。
（ａ９）配列番号１４３で示される塩基配列。
（ａ１０）配列番号２２５で示される塩基配列。
（ａ１１）配列番号２２６で示される塩基配列。
（ａ１２）配列番号２２７で示される塩基配列。
（ａ１３）配列番号２２８で示される塩基配列。
（ａ１４）配列番号２２９で示される塩基配列。
（ａ１５）配列番号２３０で示される塩基配列。
（ａ１６）配列番号２３１で示される塩基配列。
（ａ１７）配列番号２３２で示される塩基配列。
（ａ１８）配列番号２３３で示される塩基配列。
（ａ１９）配列番号２３４で示される塩基配列。
（ａ２０）配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ａ２１）配列番号１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３または２３４で示される塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【請求項３】
ＧＣ含量が６０％以下４０％以上であって、かつ蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用率が、当該ＤＮＡが導入される宿主細胞が属する生物種の遺伝子のコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内である塩基配列を有する請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２１４で示される塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号３６８で示される塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号３９３で示される塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡの上流に、細胞内オルガネラへの移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが、その読み枠を合わせて連結されてなるＤＮＡ。
【請求項８】
請求項１に記載のＤＮＡと宿主細胞で機能可能なプロモーターとが機能可能な形で結合されてなるＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項１０】
宿主細胞内で複製可能なベクターに、請求項１に記載のＤＮＡを組込む工程を有することを特徴とするベクターの製造方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項１２】
宿主細胞が微生物細胞または植物細胞である請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
宿主細胞に、請求項１に記載のＤＮＡを導入する工程を有することを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項１４】
上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質を製造する方法であって、請求項１１に記載の形質転換体を培養し、産生された前記蛋白質を回収する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項１５】
上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質を製造するための、請求項１に記載のＤＮＡの使用。
【請求項１６】
雑草防除剤に対する耐性を植物に付与する方法であって、請求項１に記載のＤＮＡを植物の細胞に導入し発現させる工程を有することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のＤＮＡの部分塩基配列または該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項１８】
上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを検出する方法であって、請求項１に記載のＤＮＡまたは請求項１７に記載のポリヌクレオチドをプローブに用いるハイブリダイゼーションにおいて当該プローブがハイブリダイズするＤＮＡを検出する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項１９】
上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを検出する方法であって、請求項１７に記載のポリヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼチェイン反応において増幅されるＤＮＡを検出する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項２０】
プライマーの少なくとも一つが、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび配列番号１２９で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる群から選ばれるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得する方法であって、請求項１８または１９に記載の方法により検出されるＤＮＡを回収する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項２２】
上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する細胞をスクリーニングする方法であって、被験細胞から、請求項１８または１９に記載の方法により前記ＤＮＡを検出する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項２３】
以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【請求項２４】
以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質を認識する抗体。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【請求項２５】
以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質を検出する方法であって、
（１）前記蛋白質を認識する抗体と被験試料とを接触させる工程、および
（２）該接触により生じた前記の蛋白質と前記抗体との複合体を検出する工程、を有する方法。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【請求項２６】
請求項２４に記載の抗体を含むことを特徴とする分析・検査用キット。
【請求項２７】
以下の群から選ばれるフェレドキシンをコードするＤＮＡ。
＜蛋白質群＞
（Ｂ１）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ３）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ４）配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ５）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ６）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ７）配列番号１４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ８）配列番号１５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ９）配列番号１５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１０）配列番号１５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１１）配列番号１５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１２）配列番号１４９、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、もしくは２５３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５０、２５２もしくは２５４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１３）配列番号１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１４）配列番号２４５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１５）配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１６）配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１７）配列番号２４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１８）配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１９）配列番号２５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２０）配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２１）配列番号２５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２２）配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項２８】
以下の群から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ。
＜塩基配列群＞
（ｂ１）配列番号１５で示される塩基配列。
（ｂ２）配列番号１６で示される塩基配列。
（ｂ３）配列番号１７で示される塩基配列。
（ｂ４）配列番号１１２で示される塩基配列。
（ｂ５）配列番号１５４で示される塩基配列。
（ｂ６）配列番号１５５で示される塩基配列。
（ｂ７）配列番号１５６で示される塩基配列。
（ｂ８）配列番号１５７で示される塩基配列。
（ｂ９）配列番号１５８で示される塩基配列。
（ｂ１０）配列番号２５５で示される塩基配列。
（ｂ１１）配列番号２５７で示される塩基配列。
（ｂ１２）配列番号２５８で示される塩基配列。
（ｂ１３）配列番号２５９で示される塩基配列。
（ｂ１４）配列番号２６０で示される塩基配列。
（ｂ１５）配列番号２６１で示される塩基配列。
（ｂ１６）配列番号２６２で示される塩基配列。
（ｂ１７）配列番号２６３で示される塩基配列。
（ｂ１８）配列番号２６４で示される塩基配列。
（ｂ１９）配列番号１５、１６、１７、１１２、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、２５５、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３または２６４で示される塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列。
【請求項２９】
請求項２８に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項３０】
請求項２８に記載のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項３１】
以下の群から選ばれるフェレドキシン。
＜蛋白質群＞
（Ｂ１）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ３）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ４）配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ５）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ６）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ７）配列番号１４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ８）配列番号１５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ９）配列番号１５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１０）配列番号１５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１１）配列番号１５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１２）配列番号１４９、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１もしくは２５３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５０、２５２もしくは２５４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１３）配列番号１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１４）配列番号２４５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１５）配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１６）配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１７）配列番号２４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１８）配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１９）配列番号２５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２０）配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２１）配列番号２５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２２）配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項３２】
以下の群から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ。
＜塩基配列群＞
（ａｂ１）配列番号９で示される塩基配列。
（ａｂ２）配列番号１０で示される塩基配列。
（ａｂ３）配列番号１１で示される塩基配列。
（ａｂ４）配列番号１１０で示される塩基配列。
（ａｂ５）配列番号１４４で示される塩基配列。
（ａｂ６）配列番号１４５で示される塩基配列。
（ａｂ７）配列番号１４６で示される塩基配列。
（ａｂ８）配列番号１４７で示される塩基配列。
（ａｂ９）配列番号１４８で示される塩基配列。
（ａｂ１０）配列番号２３５で示される塩基配列。
（ａｂ１１）配列番号２３６で示される塩基配列。
（ａｂ１２）配列番号２３７で示される塩基配列。
（ａｂ１３）配列番号２３８で示される塩基配列。
（ａｂ１４）配列番号２３９で示される塩基配列。
（ａｂ１５）配列番号２４０で示される塩基配列。
（ａｂ１６）配列番号２４１で示される塩基配列。
（ａｂ１７）配列番号２４２で示される塩基配列。
（ａｂ１８）配列番号２４３で示される塩基配列。
（ａｂ１９）配列番号２４４で示される塩基配列。
【請求項３３】
請求項３２に記載のＤＮＡを含有するベクター。
【請求項３４】
請求項３２に記載のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。
【請求項３５】
宿主細胞が微生物細胞または植物細胞である請求項３４に記載の形質転換体。
【請求項３６】
宿主細胞に、請求項３２に記載のＤＮＡを導入する工程を有することを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項３７】
上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質を製造する方法であって、請求項３４に記載の形質転換体を培養し、産生された前記蛋白質を回収する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項３８】
以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する植物の栽培域に、以下の一般式（Ｉ）で示される化合物を施用する工程を有することを特徴とする雑草防除方法。
2004057194.tif 000438
［式中、Ｇは以下のＧ−１〜９のいずれかで示される基を表す。
2004057194.tif 000439
ここで、Ｘ　は酸素原子または硫黄原子を表し、
Ｙ　は酸素原子または硫黄原子を表し、
Ｒ１　は水素原子またはハロゲン原子を表し、
Ｒ２　は水素原子、Ｃ１−Ｃ８　アルキル基、Ｃ１−Ｃ８　ハロアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、−ＯＲ９　基、−ＳＨ　基、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ９　基、−ＣＯＲ９　基、−ＣＯ２Ｒ９　基、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ９　基、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２　基、−ＣＯＮＨ２基、−ＣＨＯ　基、−ＣＲ９＝ＮＯＲ１８　基、−ＣＨ＝ＣＲ１９ＣＯ２Ｒ９　基、−ＣＨ２ＣＨＲ１９ＣＯ２Ｒ９　基、−ＣＯ２Ｎ＝ＣＲ１３Ｒ１４　基、ニトロ基、シアノ基、−ＮＨＳＯ２Ｒ１５　基、−ＮＨＳＯ２ＮＨＲ１５　基、−ＮＲ９Ｒ２０　基、−ＮＨ２　基、または、１つ以上の同種もしくは異種の　Ｃ１−Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表し、
ｐ　は　０、１　または　２　を表し、
Ｒ３　は　Ｃ１−Ｃ２　アルキル基、Ｃ１−Ｃ２　ハロアルキル基、−ＯＣＨ３　基、−ＳＣＨ３　基、−ＯＣＨＦ２基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、または　環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３　ハロアルキル基、ＯＲ２８基、ＮＲ１１Ｒ２８基、ＳＲ２８基、シアノ基、ＣＯ２Ｒ２８基　または　ニトロ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基で置換されたＣ１−Ｃ３アルコキシ基を表し、
Ｒ４　は水素原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基、またはＣ１−Ｃ３　ハロアルキル基を表し、
Ｒ５　は水素原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基、Ｃ１−Ｃ３　ハロアルキル基、シクロプロピル基、ビニル基、Ｃ２　アルキニル基、シアノ基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２０　基、−ＣＯ２Ｒ２０　基、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２０Ｒ２１　基、−ＣＲ１６Ｒ１７ＣＮ　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｃ（Ｏ）Ｒ２０　基、−ＣＲ１６Ｒ１７ＣＯ２Ｒ２０　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｃ（Ｏ）ＮＲ２０Ｒ２１　基、−ＣＨＲ１６ＯＨ　基、−ＣＨＲ１６ＯＣ（Ｏ）Ｒ２０　基、または　−ＯＣＨＲ１６ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２０Ｒ２１　基を表すか、あるいは、Ｇ　が　Ｇ−２　もしくは　Ｇ−６　の場合に　Ｒ４　とＲ５とはこれらが結合している炭素原子とで　Ｃ＝Ｏ　基を表していてもよく、
Ｒ６　は　Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ６　アルコキシアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、または　Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基を表し、
Ｒ７　は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、ハロゲン原子、−Ｓ（Ｏ）２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）基、または　−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２２　基を表し、
Ｒ８　は水素原子、Ｃ１−Ｃ８　アルキル基、Ｃ３−Ｃ８　シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ８　アルキニル基、Ｃ１−Ｃ８　ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ８　アルコキシアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　アルコキシアルコキシアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロアルキニル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロアルケニル基、Ｃ１−Ｃ８　アルキルスルホニル基、Ｃ１−Ｃ８　ハロアルキルスルホニル基、Ｃ３−Ｃ８　アルコキシカルボニルアルキル基、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ８　アルキル）基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２３　基、またはフェニル環上で　Ｒ２４　で置換されていてもよいベンジル基を表し、
Ｒ９　は　Ｃ１−Ｃ８　アルキル基、Ｃ３−Ｃ８　シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ８　アルキニル基、Ｃ１−Ｃ８　ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ８　アルコキシアルキル基、Ｃ２−Ｃ８　アルキルチオアルキル基、Ｃ２−Ｃ８　アルキルスルフィニルアルキル基、Ｃ２−Ｃ８　アルキルスルフォニルアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　アルコキシアルコキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　シクロアルキルアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　シクロアルコキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　アルケニルオキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　アルキニルオキシアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロアルコキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　ハロアルケニルオキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　ハロアルキニルオキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８シクロアルキルチオアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　アルケニルチオアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　アルキニルチオアルキル基、
環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基および　Ｃ１−Ｃ３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェノキシ基で置換された　Ｃ１−Ｃ４　アルキル基、環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基および　Ｃ１−Ｃ３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ４　アルキル基、
Ｃ４−Ｃ８トリアルキルシリルアルキル基、Ｃ２−Ｃ８シアノアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロシクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロアルケニル基、Ｃ５−Ｃ８　アルコキシアルケニル基、Ｃ５−Ｃ８　ハロアルコキシアルケニル基、Ｃ５−Ｃ８　アルキルチオアルケニル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロアルキニル基、Ｃ５−Ｃ８　アルコキシアルキニル基、Ｃ５−Ｃ８　ハロアルコキシアルキニル基、Ｃ５−Ｃ８　アルキルチオアルキニル基、Ｃ２−Ｃ８　アルキルカルボニル基、
環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基、Ｃ１−Ｃ３　ハロアルキル基、−ＯＲ２８基、−ＮＲ１１Ｒ２８基、−ＳＲ２８基、シアノ基、−ＣＯ２Ｒ２８基　または　ニトロ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジル基、
−ＣＲ１６Ｒ１７ＣＯＲ１０　基、−ＣＲ１６Ｒ１７ＣＯ２Ｒ２０　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｐ（Ｓ）（ＯＲ１０）２　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｃ（Ｏ）ＮＨ２　基、　　−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）ＣＯＲ１０　基、−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）ＣＯ２Ｒ２０　基、−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２　基、−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）Ｐ（Ｓ）（ＯＲ１０）２　基、−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２　基、−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）Ｃ（Ｏ）ＮＨ２　基、環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６ハロアルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基、Ｃ３−Ｃ６ハロアルキニル基、Ｃ２−Ｃ８アルコキシアルキル基、−ＯＲ２８基、−ＳＲ２８基、−ＮＲ１１Ｒ２８基、Ｃ３−Ｃ８アルコキシカルボニルアルキル基、Ｃ２−Ｃ４カルボキシアルキル基、−ＣＯ２Ｒ２８基　およびシアノ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよい下記のＱ−１からＱ−７までのいずれかの環を表し、
2004057194.tif 000440
Ｒ１０　は　Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ２−Ｃ６　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基、またはテトラヒドロフラニル基を表し、
Ｒ１１　および　Ｒ１３　は独立して水素原子、または　Ｃ１−Ｃ４　アルキル基を表し、
Ｒ１２　はＣ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ３−Ｃ６　シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基、Ｃ２−Ｃ６　アルコキシアルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルキニル基、環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４　アルキル基および　Ｃ１−Ｃ４　アルコキシ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基　または　−Ｃ　Ｒ１６Ｒ１７ＣＯ２Ｒ２５基を表し
あるいは、
Ｒ１１と　Ｒ１２とで　−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）４−、または　−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−　を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、　Ｃ１−Ｃ３　アルキル基、フェニル基およびベンジル基からなるグループの中から選択される置換基で置換されていてもよく、
Ｒ１４　はＣ１−Ｃ４　アルキル基、または環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基およびＣ１−Ｃ３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基を表し、
あるいは、
Ｒ１３と　Ｒ１４とはこれらが結合している炭素原子とで　Ｃ３−Ｃ８　シクロアルキル基を表していてもよく、
Ｒ１５　は　Ｃ１−Ｃ４　アルキル基、Ｃ１−Ｃ４　ハロアルキル基、または　Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基を表し、
Ｒ１６　および　Ｒ１７　は独立して水素原子または　Ｃ１−Ｃ４　アルキル基、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ４　アルケニル基、Ｃ２−Ｃ４ハロアルケニル基、Ｃ２−Ｃ４　アルキニル基、Ｃ３−Ｃ４　ハロアルキニル基を表し、
あるいは、
Ｒ１６　と　Ｒ１７はこれらが結合している炭素原子とでＣ３−Ｃ６　シクロアルキル基を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基およびＣ１−Ｃ３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよく、
Ｒ１８　は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、または　Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基を表し、
Ｒ１９　は水素原子、Ｃ１−Ｃ４　アルキル基、またはハロゲン原子を表し、
Ｒ２０　は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ３−Ｃ６　シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基、Ｃ２−Ｃ６　アルコキシアルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルキニル基、環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４　アルキル基および−ＯＲ２８基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または　−Ｃ　Ｒ１６Ｒ１７ＣＯ２Ｒ２５基を表し、
Ｒ２１　は水素原子、Ｃ１−Ｃ２　アルキル基、または　−ＣＯ２（Ｃ１−Ｃ４アルキル）基を表し、
Ｒ２２　は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　アルコキシ基、または　ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６　アルキル）基を表し、
Ｒ２３　は　Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ１−Ｃ６　アルコキシ基、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６　アルキル）基、Ｒ２４　基で置換されていてもよいフェニル基、ベンジル基、または　Ｃ２−Ｃ８　ジアルキルアミノ基を表し、
Ｒ２４　は　Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、１　ないし　２　個のハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ６　アルコキシ基、または　ＣＦ３　基を表し、
Ｒ２５は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基、またはＣ３−Ｃ６　ハロアルキニル基を表し、
Ｒ２６　および　Ｒ２７　はそれぞれ独立して水素原子または　Ｃ１−Ｃ４　アルキル基、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ４　アルケニル基、Ｃ２−Ｃ４ハロアルケニル基、Ｃ２−Ｃ４　アルキニル基、Ｃ３−Ｃ４　ハロアルキニル基、−ＯＲ２８基、−ＮＨＲ２８基、または−ＳＲ２８基を表し、あるいは、
Ｒ２６　と　Ｒ２７はこれらが結合している炭素原子とでＣ３−Ｃ６　シクロアルキル基を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基およびＣ１−Ｃ３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよく、
Ｒ２８　は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルキニル基、Ｃ２−Ｃ４カルボキシアルキル基、Ｃ３−Ｃ８アルコシキカルボニルアルキル基、Ｃ３−Ｃ８ハロアルコキシカルボニルアルキル基、Ｃ５−Ｃ９アルケニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ５−Ｃ９ハロアルケニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ５−Ｃ９アルキニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ５−Ｃ９ハロアルキニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ５−Ｃ９シクロアルコキシカルボニルアルキル基　または　Ｃ５−Ｃ９ハロシクロアルコキシカルボニルアルキル基を表す。］
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【請求項３９】
以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する植物の栽培域に、上記一般式（Ｉ）で示される化合物を施用する工程を有することを特徴とする雑草防除方法。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【請求項４０】
上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対する細胞の耐性度を評価する方法であって、
（１）以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する細胞と、前記化合物とを接触させる工程、
（２）前記工程（１）で化合物と接触した細胞の傷害の度合いを評価する工程
を有することを特徴とする方法。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【請求項４１】
細胞が微生物細胞または植物細胞である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対して耐性を示す細胞の選抜方法であって、請求項４０に記載の方法で評価された耐性度に基づき細胞を選抜する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法で選抜された雑草防除剤耐性細胞またはその培養物。
【請求項４４】
上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対する植物の耐性度を評価する方法であって、
（１）以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する植物と、前記化合物とを接触させる工程、
（２）前記工程（１）で化合物と接触した植物の傷害の度合いを評価する工程
を有することを特徴とする方法。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【請求項４５】
上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対して耐性を示す植物の選抜方法であって、請求項４４に記載の方法で評価された耐性度に基づき植物を選抜する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５の方法で選抜された雑草防除剤耐性植物またはその後代。
【請求項４７】
上記一般式（Ｉ）で示される化合物を処理するための方法であって、電子供与体からの電子伝達系の存在下、前記化合物に、以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を作用させることを特徴とする方法。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【請求項４８】
４８．雑草防除剤代謝蛋白質をコードするＤＮＡが宿主細胞の発現可能な位置に導入されてなる形質転換体と前記化合物とを接触させることにより、前記化合物に前記蛋白質を作用させる請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
上記一般式（Ｉ）で示される化合物を処理するための、以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質の使用。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【請求項５０】
上記一般式（Ｉ）で示される化合物を処理するための、以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質をコードする核酸の使用。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、雑草防除活性化合物を代謝する能力を有する蛋白質（雑草防除剤代謝蛋白質）、その遺伝子およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
雑草防除剤は、散布に際し必要量を希釈して使用されるが、ときには余剰分の残液が生じる場合がある。また、散布された雑草防除剤が、散布後もしばらくの間、植物残渣や土壌中に残留する場合もある。
また、雑草防除剤の使用場面においては、作物と近縁の雑草とを明確に区別して、雑草のみを選択的に防除することが困難な場合がある。
【非特許文献１】
Ｓｃｉｅｎｃｅ、５（３）、１１６（２０００）
【非特許文献２】
Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、５５、８６７（１９９９）
【特許文献１】
米国特許第５２１２２９６号
【特許文献２】
米国特許第５３４９１２７号
【特許文献３】
米国特許第５１７９０１３号
【特許文献４】
国際特許出願第００／１７３５２号公開公報
【特許文献５】
国際特許出願第００／００５８５号公開公報
【特許文献６】
国際特許出願第００／００５０２号公開公報
【特許文献７】
国際特許出願第９９／１９４９３号公開公報
【特許文献８】
米国特許第６１２１５１２号
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
前者において、元来、雑草防除剤は安全性が確認されていることから、少量の残液や残留分が環境や次に栽培される作物の生育等に及ぼす影響は小さいが、これらに含まれる雑草防除活性化合物を防除活性のより低い化合物に変換する方法があれば、例えば前記のような残液や残留分を失活させる処理を随時行うことも可能となる。
また、後者において、目的植物に雑草防除剤耐性を付与するための新たな方法の開発が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはかかる状況の下、鋭意研究を行った結果、特定の蛋白質が、後述の一般式（Ｉ）で示されるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（以下、ＰＰＯと記すことがある。）阻害型雑草防除活性化合物を代謝し雑草防除活性のより低い化合物に変換し得ることを見出し本発明に至った。
すなわち本発明は、
１．以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質をコードするＤＮＡ；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に式（ＩＩ）
2004057194.tif 000002
で示される化合物を式（ＩＩＩ）
2004057194.tif 000003
で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
２．以下の群から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ；
＜塩基配列群＞
（ａ１）配列番号６で示される塩基配列。
（ａ２）配列番号７で示される塩基配列。
（ａ３）配列番号８で示される塩基配列。
（ａ４）配列番号１０９で示される塩基配列。
（ａ５）配列番号１３９で示される塩基配列。
（ａ６）配列番号１４０で示される塩基配列。
（ａ７）配列番号１４１で示される塩基配列。
（ａ８）配列番号１４２で示される塩基配列。
（ａ９）配列番号１４３で示される塩基配列。
（ａ１０）配列番号２２５で示される塩基配列。
（ａ１１）配列番号２２６で示される塩基配列。
（ａ１２）配列番号２２７で示される塩基配列。
（ａ１３）配列番号２２８で示される塩基配列。
（ａ１４）配列番号２２９で示される塩基配列。
（ａ１５）配列番号２３０で示される塩基配列。
（ａ１６）配列番号２３１で示される塩基配列。
（ａ１７）配列番号２３２で示される塩基配列。
（ａ１８）配列番号２３３で示される塩基配列。
（ａ１９）配列番号２３４で示される塩基配列。
（ａ２０）配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ａ２１）配列番号１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３または２３４で示される塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
３．ＧＣ含量が６０％以下４０％以上であって、かつ蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用率が、当該ＤＮＡが導入される宿主細胞が属する生物種の遺伝子のコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内である塩基配列を有する前項１に記載のＤＮＡ；
４．配列番号２１４で示される塩基配列を有するＤＮＡ；
５．配列番号３６８で示される塩基配列を有するＤＮＡ；
６．配列番号３９３で示される塩基配列を有するＤＮＡ；
７．前項１に記載のＤＮＡの上流に、細胞内オルガネラへの移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが、その読み枠を合わせて連結されてなるＤＮＡ；
８．前項１に記載のＤＮＡと宿主細胞で機能可能なプロモーターとが機能可能な形で結合されてなるＤＮＡ；
９．前項１に記載のＤＮＡを含有するベクター；
１０．宿主細胞内で複製可能なベクターに、前項１に記載のＤＮＡを組込む工程を有することを特徴とするベクターの製造方法；
１１．前項１に記載のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
１２．宿主細胞が微生物細胞または植物細胞である前項１１に記載の形質転換体；
１３．宿主細胞に、前項１に記載のＤＮＡを導入する工程を有することを特徴とする形質転換体の製造方法；
１４．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質を製造する方法であって、前項１１に記載の形質転換体を培養し、産生された前記蛋白質を回収する工程を有することを特徴とする方法；
１５．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質を製造するための、前項１に記載のＤＮＡの使用；
１６．雑草防除剤に対する耐性を植物に付与する方法であって、前項１に記載のＤＮＡを植物の細胞に導入し発現させる工程を有することを特徴とする方法；
１７．前項１に記載のＤＮＡの部分塩基配列または該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド；
１８．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを検出する方法であって、前項１に記載のＤＮＡまたは前項１７に記載のポリヌクレオチドをプローブに用いるハイブリダイゼーションにおいて当該プローブがハイブリダイズするＤＮＡを検出する工程を有することを特徴とする方法；
１９．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを検出する方法であって、前項１７に記載のポリヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼチェイン反応において増幅されるＤＮＡを検出する工程を有することを特徴とする方法；
２０．プライマーの少なくとも一つが、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するポリヌクレオチドおよび配列番号１２９で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドからなる群から選ばれるポリヌクレオチドであることを特徴とする前項１９に記載の方法；
２１．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得する方法であって、前項１８または１９に記載の方法により検出されるＤＮＡを回収する工程を有することを特徴とする方法；
２２．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する細胞をスクリーニングする方法であって、被験細胞から、前項１８または１９に記載の方法により前記ＤＮＡを検出する工程を有することを特徴とする方法；
２３．以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
２４．以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質を認識する抗体；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
２５．以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質を検出する方法であって、
（１）前記蛋白質を認識する抗体と被験試料とを接触させる工程、および
（２）該接触により生じた前記の蛋白質と前記抗体との複合体を検出する工程、
を有する方法：
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
２６．前項２４に記載の抗体を含むことを特徴とする分析・検査用キット；
２７．以下の群から選ばれるフェレドキシンをコードするＤＮＡ；
＜蛋白質群＞
（Ｂ１）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ３）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ４）配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ５）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ６）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ７）配列番号１４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ８）配列番号１５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ９）配列番号１５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１０）配列番号１５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１１）配列番号１５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１２）配列番号１４９、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、もしくは２５３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５０、２５２もしくは２５４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１３）配列番号１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１４）配列番号２４５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１５）配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１６）配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１７）配列番号２４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１８）配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１９）配列番号２５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２０）配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２１）配列番号２５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２２）配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
２８．以下の群から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ；
＜塩基配列群＞
（ｂ１）配列番号１５で示される塩基配列。
（ｂ２）配列番号１６で示される塩基配列。
（ｂ３）配列番号１７で示される塩基配列。
（ｂ４）配列番号１１２で示される塩基配列。
（ｂ５）配列番号１５４で示される塩基配列。
（ｂ６）配列番号１５５で示される塩基配列。
（ｂ７）配列番号１５６で示される塩基配列。
（ｂ８）配列番号１５７で示される塩基配列。
（ｂ９）配列番号１５８で示される塩基配列。
（ｂ１０）配列番号２５５で示される塩基配列。
（ｂ１１）配列番号２５７で示される塩基配列。
（ｂ１２）配列番号２５８で示される塩基配列。
（ｂ１３）配列番号２５９で示される塩基配列。
（ｂ１４）配列番号２６０で示される塩基配列。
（ｂ１５）配列番号２６１で示される塩基配列。
（ｂ１６）配列番号２６２で示される塩基配列。
（ｂ１７）配列番号２６３で示される塩基配列。
（ｂ１８）配列番号２６４で示される塩基配列。
（ｂ１９）配列番号１５、１６、１７、１１２、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、２５５、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３または２６４で示される塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列。
２９．前項２８に記載のＤＮＡを含有するベクター；
３０．前項２８に記載のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
３１．以下の群から選ばれるフェレドキシン；
＜蛋白質群＞
（Ｂ１）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ３）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ４）配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ５）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ６）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ７）配列番号１４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ８）配列番号１５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ９）配列番号１５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１０）配列番号１５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１１）配列番号１５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１２）配列番号１４９、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１もしくは２５３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５０、２５２もしくは２５４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１３）配列番号１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１４）配列番号２４５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１５）配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１６）配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１７）配列番号２４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１８）配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１９）配列番号２５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２０）配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２１）配列番号２５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２２）配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
３２．以下の群から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ；
＜塩基配列群＞
（ａｂ１）配列番号９で示される塩基配列。
（ａｂ２）配列番号１０で示される塩基配列。
（ａｂ３）配列番号１１で示される塩基配列。
（ａｂ４）配列番号１１０で示される塩基配列。
（ａｂ５）配列番号１４４で示される塩基配列。
（ａｂ６）配列番号１４５で示される塩基配列。
（ａｂ７）配列番号１４６で示される塩基配列。
（ａｂ８）配列番号１４７で示される塩基配列。
（ａｂ９）配列番号１４８で示される塩基配列。
（ａｂ１０）配列番号２３５で示される塩基配列。
（ａｂ１１）配列番号２３６で示される塩基配列。
（ａｂ１２）配列番号２３７で示される塩基配列。
（ａｂ１３）配列番号２３８で示される塩基配列。
（ａｂ１４）配列番号２３９で示される塩基配列。
（ａｂ１５）配列番号２４０で示される塩基配列。
（ａｂ１６）配列番号２４１で示される塩基配列。
（ａｂ１７）配列番号２４２で示される塩基配列。
（ａｂ１８）配列番号２４３で示される塩基配列。
（ａｂ１９）配列番号２４４で示される塩基配列。
３３．前項３２に記載のＤＮＡを含有するベクター；
３４．前項３２に記載のＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
３５．宿主細胞が微生物細胞または植物細胞である前項３４に記載の形質転換体；
３６．宿主細胞に、前項３２に記載のＤＮＡを導入する工程を有することを特徴とする形質転換体の製造方法；
３７．上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質を製造する方法であって、前項３４に記載の形質転換体を培養し、産生された前記蛋白質を回収する工程を有することを特徴とする方法；
３８．以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する植物の栽培域に、以下の一般式（Ｉ）で示される化合物を施用する工程を有することを特徴とする雑草防除方法；
2004057194.tif 000004
［式中、Ｇは以下のＧ−１〜９のいずれかで示される基を表す。
2004057194.tif 000005
ここで、Ｘ　は酸素原子または硫黄原子を表し、
Ｙ　は酸素原子または硫黄原子を表し、
Ｒ１　は水素原子またはハロゲン原子を表し、
Ｒ２　は水素原子、Ｃ１−Ｃ８　アルキル基、Ｃ１−Ｃ８　ハロアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、−ＯＲ９　基、−ＳＨ　基、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ９　基、−ＣＯＲ９　基、−ＣＯ２Ｒ９　基、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ９　基、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２　基、−ＣＯＮＨ２基、−ＣＨＯ　基、−ＣＲ９＝ＮＯＲ１８　基、−ＣＨ＝ＣＲ１９ＣＯ２Ｒ９　基、−ＣＨ２ＣＨＲ１９ＣＯ２Ｒ９　基、−ＣＯ２Ｎ＝ＣＲ１３Ｒ１４　基、ニトロ基、シアノ基、−ＮＨＳＯ２Ｒ１５　基、−ＮＨＳＯ２ＮＨＲ１５　基、−ＮＲ９Ｒ２０　基、−ＮＨ２　基、または、１つ以上の同種もしくは異種の　Ｃ１−Ｃ４アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表し、
ｐ　は　０、１　または　２　を表し、
Ｒ３　は　Ｃ１−Ｃ２　アルキル基、Ｃ１−Ｃ２　ハロアルキル基、−ＯＣＨ３　基、−ＳＣＨ３　基、−ＯＣＨＦ２基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、または　環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３　ハロアルキル基、ＯＲ２８基、ＮＲ１１Ｒ２８基、ＳＲ２８基、シアノ基、ＣＯ２Ｒ２８基　または　ニトロ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基で置換されたＣ１−Ｃ３アルコキシ基を表し、
Ｒ４　は水素原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基、またはＣ１−Ｃ３　ハロアルキル基を表し、
Ｒ５　は水素原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基、Ｃ１−Ｃ３　ハロアルキル基、シクロプロピル基、ビニル基、Ｃ２　アルキニル基、シアノ基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２０　基、−ＣＯ２Ｒ２０　基、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２０Ｒ２１　基、−ＣＲ１６Ｒ１７ＣＮ　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｃ（Ｏ）Ｒ２０　基、−ＣＲ１６Ｒ１７ＣＯ２Ｒ２０　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｃ（Ｏ）ＮＲ２０Ｒ２１　基、−ＣＨＲ１６ＯＨ　基、−ＣＨＲ１６ＯＣ（Ｏ）Ｒ２０　基、または　−ＯＣＨＲ１６ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２０Ｒ２１　基を表すか、あるいは、Ｇ　が　Ｇ−２　もしくは　Ｇ−６　の場合に　Ｒ４　とＲ５とはこれらが結合している炭素原子とで　Ｃ＝Ｏ　基を表していてもよく、
Ｒ６　は　Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ６　アルコキシアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、または　Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基を表し、
Ｒ７　は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、ハロゲン原子、−Ｓ（Ｏ）２（Ｃ１−Ｃ６アルキル）基、または　−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２２　基を表し、
Ｒ８　は水素原子、Ｃ１−Ｃ８　アルキル基、Ｃ３−Ｃ８　シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ８　アルキニル基、Ｃ１−Ｃ８　ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ８　アルコキシアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　アルコキシアルコキシアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロアルキニル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロアルケニル基、Ｃ１−Ｃ８　アルキルスルホニル基、Ｃ１−Ｃ８　ハロアルキルスルホニル基、Ｃ３−Ｃ８　アルコキシカルボニルアルキル基、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ８　アルキル）基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２３　基、またはフェニル環上で　Ｒ２４　で置換されていてもよいベンジル基を表し、
Ｒ９　は　Ｃ１−Ｃ８　アルキル基、Ｃ３−Ｃ８　シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ８　アルキニル基、Ｃ１−Ｃ８　ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ８　アルコキシアルキル基、Ｃ２−Ｃ８　アルキルチオアルキル基、Ｃ２−Ｃ８　アルキルスルフィニルアルキル基、Ｃ２−Ｃ８　アルキルスルフォニルアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　アルコキシアルコキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　シクロアルキルアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　シクロアルコキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　アルケニルオキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　アルキニルオキシアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロアルコキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　ハロアルケニルオキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　ハロアルキニルオキシアルキル基、Ｃ４−Ｃ８シクロアルキルチオアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　アルケニルチオアルキル基、Ｃ４−Ｃ８　アルキニルチオアルキル基、
環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基および　Ｃ１−Ｃ３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェノキシ基で置換された　Ｃ１−Ｃ４　アルキル基、環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基および　Ｃ１−Ｃ３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジルオキシ基で置換されたＣ１−Ｃ４　アルキル基、
Ｃ４−Ｃ８トリアルキルシリルアルキル基、Ｃ２−Ｃ８シアノアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロシクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロアルケニル基、Ｃ５−Ｃ８　アルコキシアルケニル基、Ｃ５−Ｃ８　ハロアルコキシアルケニル基、Ｃ５−Ｃ８　アルキルチオアルケニル基、Ｃ３−Ｃ８　ハロアルキニル基、Ｃ５−Ｃ８　アルコキシアルキニル基、Ｃ５−Ｃ８　ハロアルコキシアルキニル基、Ｃ５−Ｃ８　アルキルチオアルキニル基、Ｃ２−Ｃ８　アルキルカルボニル基、
環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基、Ｃ１−Ｃ３　ハロアルキル基、−ＯＲ２８基、−ＮＲ１１Ｒ２８基、−ＳＲ２８基、シアノ基、−ＣＯ２Ｒ２８基　または　ニトロ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジル基、
−ＣＲ１６Ｒ１７ＣＯＲ１０　基、−ＣＲ１６Ｒ１７ＣＯ２Ｒ２０　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｐ（Ｓ）（ＯＲ１０）２　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２　基、−ＣＲ１６Ｒ１７Ｃ（Ｏ）ＮＨ２　基、　　−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）ＣＯＲ１０　基、−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）ＣＯ２Ｒ２０　基、−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２　基、−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）Ｐ（Ｓ）（ＯＲ１０）２　基、−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２　基、−Ｃ（＝ＣＲ２６Ｒ２７）Ｃ（Ｏ）ＮＨ２　基、環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６ハロアルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基、Ｃ３−Ｃ６ハロアルキニル基、Ｃ２−Ｃ８アルコキシアルキル基、−ＯＲ２８基、−ＳＲ２８基、−ＮＲ１１Ｒ２８基、Ｃ３−Ｃ８アルコキシカルボニルアルキル基、Ｃ２−Ｃ４カルボキシアルキル基、−ＣＯ２Ｒ２８基　およびシアノ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよい下記のＱ−１からＱ−７までのいずれかの環を表し、
2004057194.tif 000006
Ｒ１０　は　Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ２−Ｃ６　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基、またはテトラヒドロフラニル基を表し、
Ｒ１１　および　Ｒ１３　は独立して水素原子、または　Ｃ１−Ｃ４　アルキル基を表し、
Ｒ１２　はＣ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ３−Ｃ６　シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基、Ｃ２−Ｃ６　アルコキシアルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルキニル基、環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４　アルキル基および　Ｃ１−Ｃ４　アルコキシ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基　または　−Ｃ　Ｒ１６Ｒ１７ＣＯ２Ｒ２５基を表し
あるいは、
Ｒ１１と　Ｒ１２とで　−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）４−、または　−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−　を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、　Ｃ１−Ｃ３　アルキル基、フェニル基およびベンジル基からなるグループの中から選択される置換基で置換されていてもよく、
Ｒ１４　はＣ１−Ｃ４　アルキル基、または環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基およびＣ１−Ｃ３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基を表し、
あるいは、
Ｒ１３と　Ｒ１４とはこれらが結合している炭素原子とで　Ｃ３−Ｃ８　シクロアルキル基を表していてもよく、
Ｒ１５　は　Ｃ１−Ｃ４　アルキル基、Ｃ１−Ｃ４　ハロアルキル基、または　Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基を表し、
Ｒ１６　および　Ｒ１７　は独立して水素原子または　Ｃ１−Ｃ４　アルキル基、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ４　アルケニル基、Ｃ２−Ｃ４ハロアルケニル基、Ｃ２−Ｃ４　アルキニル基、Ｃ３−Ｃ４　ハロアルキニル基を表し、
あるいは、
Ｒ１６　と　Ｒ１７はこれらが結合している炭素原子とでＣ３−Ｃ６　シクロアルキル基を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基およびＣ１−Ｃ３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよく、
Ｒ１８　は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、または　Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基を表し、
Ｒ１９　は水素原子、Ｃ１−Ｃ４　アルキル基、またはハロゲン原子を表し、
Ｒ２０　は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ３−Ｃ６　シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基、Ｃ２−Ｃ６　アルコキシアルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルキニル基、環上でハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４　アルキル基および−ＯＲ２８基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基、または　−Ｃ　Ｒ１６Ｒ１７ＣＯ２Ｒ２５基を表し、
Ｒ２１　は水素原子、Ｃ１−Ｃ２　アルキル基、または　−ＣＯ２（Ｃ１−Ｃ４アルキル）基を表し、
Ｒ２２　は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　アルコキシ基、または　ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６　アルキル）基を表し、
Ｒ２３　は　Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ１−Ｃ６　アルコキシ基、ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６　アルキル）基、Ｒ２４　基で置換されていてもよいフェニル基、ベンジル基、または　Ｃ２−Ｃ８　ジアルキルアミノ基を表し、
Ｒ２４　は　Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、１　ないし　２　個のハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ６　アルコキシ基、または　ＣＦ３　基を表し、
Ｒ２５は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基、またはＣ３−Ｃ６　ハロアルキニル基を表し、
Ｒ２６　および　Ｒ２７　はそれぞれ独立して水素原子または　Ｃ１−Ｃ４　アルキル基、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル基、Ｃ２−Ｃ４　アルケニル基、Ｃ２−Ｃ４ハロアルケニル基、Ｃ２−Ｃ４　アルキニル基、Ｃ３−Ｃ４　ハロアルキニル基、−ＯＲ２８基、−ＮＨＲ２８基、または−ＳＲ２８基を表し、あるいは、
Ｒ２６　と　Ｒ２７はこれらが結合している炭素原子とでＣ３−Ｃ６　シクロアルキル基を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ３　アルキル基およびＣ１−Ｃ３　ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよく、
Ｒ２８　は水素原子、Ｃ１−Ｃ６　アルキル基、Ｃ１−Ｃ６　ハロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６　アルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ６　アルキニル基、Ｃ３−Ｃ６　ハロアルキニル基、Ｃ２−Ｃ４カルボキシアルキル基、Ｃ３−Ｃ８アルコシキカルボニルアルキル基、Ｃ３−Ｃ８ハロアルコキシカルボニルアルキル基、Ｃ５−Ｃ９アルケニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ５−Ｃ９ハロアルケニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ５−Ｃ９アルキニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ５−Ｃ９ハロアルキニルオキシカルボニルアルキル基、Ｃ５−Ｃ９シクロアルコキシカルボニルアルキル基　または　Ｃ５−Ｃ９ハロシクロアルコキシカルボニルアルキル基を表す。］
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
３９．以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する植物の栽培域に、上記一般式（Ｉ）で示される化合物を施用する工程を有することを特徴とする雑草防除方法；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
４０．上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対する細胞の耐性度を評価する方法であって、
（１）以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する細胞と、前記化合物とを接触させる工程、
（２）前記工程（１）で化合物と接触した細胞の傷害の度合いを評価する工程
を有することを特徴とする方法；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
４１．細胞が微生物細胞または植物細胞である前項４０に記載の方法；
４２．上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対して耐性を示す細胞の選抜方法であって、前項４０に記載の方法で評価された耐性度に基づき細胞を選抜する工程を有することを特徴とする方法；
４３．前項４２に記載の方法で選抜された雑草防除剤耐性細胞またはその培養物；
４４．上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対する植物の耐性度を評価する方法であって、
（１）以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を発現する植物と、前記化合物とを接触させる工程、
（２）前記工程（１）で化合物と接触した植物の傷害の度合いを評価する工程
を有することを特徴とする方法；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
４５．上記一般式（Ｉ）で示される化合物に対して耐性を示す植物の選抜方法であって、前項４４に記載の方法で評価された耐性度に基づき植物を選抜する工程を有することを特徴とする方法；
４６．前項４５の方法で選抜された雑草防除剤耐性植物またはその後代；
４７．上記一般式（Ｉ）で示される化合物を処理するための方法であって、電子供与体からの電子伝達系の存在下、前記化合物に、以下の群から選ばれる１以上の雑草防除剤代謝蛋白質を作用させることを特徴とする方法；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
４８．雑草防除剤代謝蛋白質をコードするＤＮＡが宿主細胞の発現可能な位置に導入されてなる形質転換体と前記化合物とを接触させることにより、前記化合物に前記蛋白質を作用させる前項４７に記載の方法；
４９．上記一般式（Ｉ）で示される化合物を処理するための、以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質の使用；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
５０．上記一般式（Ｉ）で示される化合物を処理するための、以下の群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質をコードする核酸の使用；
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
以下の蛋白質群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質（以下、本発明蛋白質（Ａ）と記すことがある。）は、上記式（ＩＩ）で示される化合物（以下、化合物（ＩＩ）と記すことがある。）を、上記式（ＩＩＩ）で示される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）と記すことがある。）に変換する能力を有する。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２８）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓもしくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉの染色体ＤＮＡを鋳型とし配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
本発明蛋白質（Ａ）の具体例としては、
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１）と記すことがある。］、
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２）と記すことがある。］、
配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ３）と記すことがある。］、
配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ４）と記すことがある。］、
配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１１）と記すことがある。］、
配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１２）と記すことがある。］、
配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１３）と記すことがある。］、
配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１４）と記すことがある。］、
配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１５）と記すことがある。］、
配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１６）と記すことがある。］、
配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１７）と記すことがある。］、
配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１８）と記すことがある。］、
配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ１９）と記すことがある。］、
配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２０）と記すことがある。］、
配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２１）と記すことがある。］、
配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２２）と記すことがある。］、
配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２３）と記すことがある。］、
配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２４）と記すことがある。］、
配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ａ２５）と記すことがある。］等をあげることができる。
かかる本発明蛋白質（Ａ）を、例えば、上記一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物（以下、化合物（Ｉ）と記すことがある。）に作用させることにより、該化合物を雑草防除活性のより低い化合物に変換することができる。
また、化合物（Ｉ）を雑草防除活性のより低い化合物に変換する処理には、以下の蛋白質群から選ばれる雑草防除剤代謝蛋白質（以下、本蛋白質（Ａ）と記すことがある。）を利用することもできる。
＜蛋白質群＞
（Ａ１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ３）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ４）配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ５）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ６）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ７）配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ８）ストレプトミセス属またはサッカロポリスポラ属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いるポリメラーゼチェイン反応によって増幅され得るＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ９）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１１）配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１２）配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１３）配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１４）配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１５）配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１６）配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１７）配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１８）配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ１９）配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２０）配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２１）配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２２）配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２３）配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２４）配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２５）配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ａ２６）配列番号１５９、１３６、１３７、１３８、２１７、２１９、２２０、２２１もしくは２２３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１６０、２１５、２１６、２１８、２２２もしくは２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
（Ａ２７）配列番号１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有し、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質。
本蛋白質（Ａ）の例としては、上記の本発明蛋白質（Ａ）をあげることができる。また、その他の例としては、
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本蛋白質（Ａ９）と記すことがある。］、
配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本蛋白質（Ａ１０）と記すことがある。］等をあげることができる。
【０００６】
上記の蛋白質群のうち、（Ａ５）、（Ａ６）、（Ａ７）、（Ａ８）、（Ａ２６）、（Ａ２７）または（Ａ２８）に示される蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１、２、３、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列との間に認められることのある相違は、一部のアミノ酸の欠失、置換、付加等である。これらには、例えば、上記の配列番号１、２、３、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシングによる欠失が含まれる。また、該蛋白質が由来する生物の種差や個体差等により天然に生じる遺伝子変異や、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、突然変異処理等によって人為的に導入される遺伝子変異等により生じるアミノ酸の欠失、置換、付加等が含まれる。
かかる欠失、置換、付加等を受けるアミノ酸の数は、本蛋白質（Ａ）に、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を見出すことのできる範囲内の数であれば良い。また、アミノ酸の置換としては、例えば、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似したアミノ酸への置換をあげることができる。このような置換としては、具体的には例えば、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシン等のグループ内での置換が挙げられる。一方、本蛋白質（Ａ）において、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号３５７で示されるシステインに相当する位置にあるシステイン；例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５０で示されるシステイン、配列番号３で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３４４で示されるシステイン、配列番号１０８で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３６０で示されるシステイン、配列番号４で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５９で示されるシステイン、配列番号５で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５５で示されるシステイン、配列番号１５９で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５８で示されるシステイン、配列番号１６０で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３７４で示されるシステイン、配列番号１３６で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５１で示されるシステイン、配列番号１３７で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５８で示されるシステイン、配列番号１３８で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３５８で示されるシステイン、配列番号２２２で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３４７で示されるシステイン、配列番号２２４で示されるアミノ酸配列においてアミノ酸番号３４７で示されるシステイン等；は、保存される（欠失や置換を受けない）ことが好ましい。
かかるアミノ酸の欠失、付加もしくは置換（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う手法としては、例えば、配列番号１、２、３、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードするＤＮＡに対して部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４））、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。また、アミノ酸の改変を人為的に行う手法としては、例えば、配列番号１、２、３、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードするＤＮＡに対してランダムに変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法も挙げられる。ここでランダムに変異を導入する手法としては、例えば、上記のアミノ酸配列のいずれかをコードするＤＮＡを鋳型とし、それぞれのＤＮＡの全長を増幅できるようなプライマー対を用い、基質に用いるｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの各々の添加濃度を通常とは変化させた反応条件や、あるいはポリメラーゼの反応を促進させるＭｇ２＋の濃度を通常よりも増加させた反応条件でＰＣＲを行う方法等が挙げられる。このようなＰＣＲの手法としては、例えば、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　（３１），　１９９４，　９７−１１２　に記載の方法があげられる。また、ＷＯ０００９６８２号公報に記載の方法をあげることもできる。
【０００７】
本発明において「配列同一性」とは、２つの塩基配列または２つのアミノ酸配列間の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいては、付加又は欠失（例えばギャップ等）を許容してもよい。このような配列同一性は、例えば、ＦＡＳＴＡ［Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，４，　２４４４−２４４８（１９８８）］、ＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　２１５，　４０３−４１０（１９９０）］、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｇｉｂｓｏｎ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２２，　４６７３−４６８０（１９９４ａ）］等のプログラムを用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することができる。上記のプログラムは、例えば、ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ［国立遺伝学研究所　生命情報・ＤＤＢＪ研究センター　（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＤＮＡ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ　；ＣＩＢ／ＤＤＢＪ）内で運営される国際ＤＮＡデータバンク］のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）等において、一般的に利用可能である。また、配列同一性は市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。具体的には例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ　Ｖｅｒ．５（ソフトウェア開発株式会社製）」を用い、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法［Ｌｉｐｍａｎ，　Ｄ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏｎ，　Ｗ．Ｒ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２２７，　１４３５−１４４１，（１９８５）］により相同性解析を行ってアラインメントを作成することにより算出することができる。
【０００８】
（Ａ７）に記載の「ストリンジェントな条件」としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載される通常の方法に準じて行われるハイブリダイゼーションにおいて、例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１５Ｍ　クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）を含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎ．　Ｙ．　（１９８９），　６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣ（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×ＳＳＣ（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの条件から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
「配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズ」するＤＮＡとしては、具体的には、例えば、配列番号１、２、３、４、５、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号６、７、８、７８、８４、１０９、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３または２３４で示される塩基配列のいずれかを有するＤＮＡなどをあげることができ、配列番号６、７、８、７８、８４、１０９、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３または２３４で示される塩基配列のいずれかと約６０％程度以上の同一性を示す塩基配列を有するＤＮＡをあげることもできる。
【０００９】
本蛋白質（Ａ）の分子量は、ドデシル硫酸ナトリウムを含有するポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと記す。）で検出される分子量として、約３万程度〜約６万程度であり、一般に約４万程度〜約５万程度の分子量（例えば、配列番号１、２、３、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同等）が適している。また、本蛋白質（Ａ）は、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力が失われない限りにおいて、そのアミノ末端から上流側やカルボキシ末端から下流側に、アミノ酸配列が付加された蛋白質として利用されてもよい。
【００１０】
本蛋白質（Ａ）が有する、上記一般式で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を代謝する能力の指標としては、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力をあげることができる。かかる能力は、例えば、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下で、本蛋白質（Ａ）を化合物（ＩＩ）に作用させ、生成した化合物（ＩＩＩ）を検出することにより確認することができる。
「電子供与体からの電子伝達系」とは、酸化還元反応が連鎖的に起こって電子供与体から本蛋白質（Ａ）へと電子の移動が行われる系をいう。電子供与体としては、例えば補酵素ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ等があげられる。例えば、ＮＡＤＰＨから本蛋白質（Ａ）への電子伝達系を構成する蛋白質としては、フェレドキシンとフェレドキシン−ＮＡＤＰ＋還元酵素、チトクロムＰ−４５０還元酵素等があげられる。
化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を確認するには、例えば、本蛋白質（Ａ）、β−ＮＡＤＰＨ、フェレドキシン、フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋還元酵素および放射性同位元素等で標識された化合物（ＩＩ）を含有するｐＨ７程度の反応液を、約３０℃にて、約１０分間から約１時間保温する。次いで、前記反応液に塩酸を添加して酸性にした後、酢酸エチルで抽出する。得られた酢酸エチル層を薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと記す。）に供した後、オートラジオグラフィーを行って、標識体の化合物（ＩＩＩ）を検出することにより、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を確認することができる。
【００１１】
本蛋白質（Ａ）を調製するには、例えばまず、本蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡ（以下、一括して本ＤＮＡ（Ａ）と記すことがある。）を、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法）に準じて取得する。
本ＤＮＡ（Ａ）の例としては、上記の本発明蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ）と記すことがある。］をあげることができる。本発明ＤＮＡ（Ａ）の具体例としては、
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１）と記すことがある。］、
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２）と記すことがある。］、
配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ３）と記すことがある。］、
配列番号１０８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ４）と記すことがある。］、
配列番号１５９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１１）と記すことがある。］、
配列番号１６０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１２）と記すことがある。］、
配列番号１３６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１３）と記すことがある。］、
配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１４）と記すことがある。］、
配列番号１３８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１５）と記すことがある。］、
配列番号２１５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１６）と記すことがある。］、
配列番号２１６で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１７）と記すことがある。］、
配列番号２１７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１８）と記すことがある。］、
配列番号２１８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１９）と記すことがある。］、
配列番号２１９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２０）と記すことがある。］、
配列番号２２０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２１）と記すことがある。］、
配列番号２２１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２２）と記すことがある。］、
配列番号２２２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２３）と記すことがある。］、
配列番号２２３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２４）と記すことがある。］、
配列番号２２４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２５）と記すことがある。］等をあげることができる。
さらに、本発明ＤＮＡ（Ａ）のより具体的な例としては、
配列番号６で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号９で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１１で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１０９で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１１０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１３９で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４５で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４１で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４６で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１４８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２２５で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３５で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２２６で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３６で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２２７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２２８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２２９で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３９で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２４０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３１で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２４１で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２４２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２４３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２３４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２４４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号２１４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号３６８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号３９３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３または２３４で示される塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、かつ電子供与体からの電子伝達系の存在下に上記式（ＩＩ）で示される化合物を上記式（ＩＩＩ）で示される化合物に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
等をあげることができる。
また、本ＤＮＡ（Ａ）の例としては、上記のような本発明ＤＮＡ（Ａ）の他、
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本ＤＮＡ（Ａ９）と記すことがある。］、
配列番号７８で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本ＤＮＡ（Ａ１０）と記すことがある。］、
配列番号８４で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
配列番号８５で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
等をあげることもできる。
本ＤＮＡ（Ａ）としては、自然界からクローニングされたＤＮＡであってもよいし、自然界からクローニングされたＤＮＡに、例えば部位特異的変異導入法やランダム変異導入法などによって塩基の欠失、置換または付加が導入されたＤＮＡであってもよく、また、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。次いで、得られた本ＤＮＡ（Ａ）を通常の遺伝子工学的方法に準じて発現させることにより本蛋白質（Ａ）を製造・取得する。このようにして本蛋白質（Ａ）を調製することができる。
【００１２】
本ＤＮＡ（Ａ）は、例えば、以下のような方法で調製することができる。まず、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を有する微生物、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　ＩＦＯ　１２８７０ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ等のサッカロポリスポラ属に属する微生物、より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどから、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載される通常の遺伝子工学的方法に準じた方法により染色体ＤＮＡを調製する。次いで該染色体ＤＮＡを、例えばＳａｕ３ＡＩ等の制限酵素で部分消化処理した後、約２ｋｂ程度のＤＮＡを回収する。回収したＤＮＡを「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングする。ベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ　１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ　１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＫＫ３３１−１Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）などを利用することができる。得られたクローンからプラスミドを抽出することによって、染色体ＤＮＡライブラリーを得ることができる。
【００１３】
得られた染色体ＤＮＡライブラリーに、配列番号１、２、３または１０８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有する約２０塩基以上の塩基からなるＤＮＡをプローブとして、後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出しこれを回収することによって本ＤＮＡ（Ａ）を取得することができる。プローブとして用い得るＤＮＡの具体例としては、配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列のいずれかを有するＤＮＡ、配列番号６、７、８または１０９のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡ、該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ等があげられる。
プローブとして用いるＤＮＡは、放射性同位元素や蛍光色素等で標識される。ＤＮＡを放射性同位元素により標識するには、例えば、ベーリンガー社または宝酒造社製のＲａｎｄｏｍ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ等を用いることができる。また、通常のＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、３２Ｐ標識されたＤＮＡを調製することもできる。また、ＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には例えば、ＤＩＧ−Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｔａｒｔｅｒ　Ｋｉｔ　ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）等を用いることができる。プローブの調製の具体例を次に示す。例えば、上記のようにしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、配列番号９３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、例えばＰＣＲ　ＤＩＧ　Ｐｒｏｂｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ製）を用いて添付のマニュアルに従って後述の実施例に記載されるようにＰＣＲを行うと、配列番号６で示される塩基配列の全長を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡが得られる。また同様にして、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、配列番号１３０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１３１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うと、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号５７〜７３０で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡが得られる。また、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ９３８３ｔの染色体ＤＮＡから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、配列番号６１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うと、配列番号７で示される塩基配列の全長を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡが得られる。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９の染色体ＤＮＡから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、配列番号７０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号７１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行うと、配列番号８で示される塩基配列の全長を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡが得られる。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９の染色体ＤＮＡから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、配列番号１３２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１３３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド���プライマーとして用いてＰＣＲを行うと、配列番号８で示される塩基配列の塩基番号２１〜６９１で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡが得られる。
【００１４】
染色体ＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択するとよい。使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて構築されている場合には、コロニーハイブリダイゼーションを行う。具体的にはまず、ライブラリーのＤＮＡを、ライブラリーの作製に用いられたプラスミドベクターが複製可能な微生物に導入して形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈して寒天培地にまき、コロニーが現れるまで培養を行う。ライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合には、プラークハイブリダイゼーションを行う。具体的にはまず、ライブラリーの作製に用いられたファージベクターが複製可能な微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合した後、更に軟寒天培地と混合し、これを寒天培地にまく。その後、プラークが現れるまで培養を行う。
次いで、前記のいずれのハイブリダイゼーションの場合も、前記の培養を行った寒天培地の表面にメンブレンを載せ、形質転換体コロニーまたはプラーク中のファージ粒子を該メンブレンに転写する。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いで、形質転換体もしくはファージ粒子から溶出したＤＮＡを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的に例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地の上にニトロセルロースメンブレンまたはナイロンメンブレン等、具体的には例えば、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャムファルマシアバイオテク社登録商標）等を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｎ　ＮａＯＨ）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させてファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（１．５Ｍ　塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。該メンブレンを洗浄液（０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０　ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２Ｍ　トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間減圧下に保温することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）」　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ等の記載に準じて行うことができる。
ハイブリダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は多種存在するが、例えば、４５０ｍＭ〜９００ｍＭの塩化ナトリウムおよび４５ｍＭ〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと記す。）を０．１％〜１．０％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０％〜０．２％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液を、上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ２当たり５０μｌ〜２００μｌの割合で準備し、該溶液に前記メンブレンを浸して４２℃〜６５℃で１時間〜４時間程度保温する。次いで例えば、４５０ｍＭ〜９００ｍＭの塩化ナトリウムおよび４５ｍＭ〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１％〜１．０％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０％〜０．２％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液と、前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ２当たり１．０ｘ１０４ｃｐｍ〜２．０ｘ１０６ｃｐｍ相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ２当たり５０μｌ〜２００μｌの割合で準備し、該溶液にメンブレンを浸し４２℃〜６５℃で１２時間〜２０時間程度保温する。次いで、メンブレンを取り出し、１５ｍＭ〜３００ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭ〜３０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび０．１％〜１．０％のＳＤＳ等を含む４２℃〜６５℃の洗浄液等を用い、５分間〜１５分間の洗浄を２回〜４回程度行う。さらに、メンブレンを２ｘＳＳＣ溶液（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）等で軽くすすいだ後乾燥させる。このメンブレンを、例えば、オートラジオグラフィーなどに供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置を検出する。また、ＤＩＧ−Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｔａｒｔｅｒ　Ｋｉｔ　ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）等の市販のハイブリダイゼーション用キットを使用し、該キットに含まれるハイブリダイゼーション用溶液を用いてプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを行うこともできる。ハイブリダイゼーションの後、例えば、メンブレンを０．１％　ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ中、室温で５分間２回洗浄し、引き続き０．１％　ＳＤＳ　を含む０．５ＸＳＳＣ中、６５℃で１５分間２回洗浄する。洗浄されたメンブレンを、該キットに含まれる検出用処理液で順次処理してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置を検出する。
上記のようにして検出されたＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離することができる。
【００１５】
上記のようにして得られる本ＤＮＡ（Ａ）は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。ベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣＡ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶＡ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ３３１−１Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などを利用することができる。
また、上述のようにして得られる本ＤＮＡ（Ａ）の塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，　Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，　Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７）　７４：　５４６３−５４６７頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ等の市販の試薬を用いてもよい。
【００１６】
また、本ＤＮＡ（Ａ）は次のようにして調製することもできる。化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を有する微生物、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　ＩＦＯ　１２８７０ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ等のサッカロポリスポラ属に属する微生物、より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどから上記のようにして調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１、２、３、４、５、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７、１３８、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３または２２４で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列の５’末端側の約２０塩基程度以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、上記アミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列の３’末端近傍もしくは３’末端より下流の約２０塩基程度以上の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、以下に示すような反応条件にてＰＣＲを行うことにより、本ＤＮＡ（Ａ）を増幅することができる。尚、上記のようにしてＰＣＲに用いられるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等が付加されていてもよい。
より具体的には例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号５１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号６で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅することができる。また、配列番号５１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号９で示される塩基配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号７で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅することができる。また、配列番号６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１０で示される塩基配列（配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えばＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１０９で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅することができる。また、配列番号１１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１１０で示される塩基配列（配列番号１０８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１６５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１６６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４４で示される塩基配列（配列番号１５９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１７１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４５で示される塩基配列（配列番号１６０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１７７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４６で示される塩基配列（配列番号１３６で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４７で示される塩基配列（配列番号１３７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１８５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４８で示される塩基配列（配列番号１３８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを増幅することができる。
【００１７】
また、染色体ＤＮＡがベクターに挿入されてなるＤＮＡライブラリーを鋳型とする場合には、例えば、配列番号１、２、３、４、５、１０８、１５９、１６０、１３６、１３７または１３８で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列から選ばれる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の５’末端側の約２０塩基程度以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）と、ライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列を有する約２０塩基程度以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、本ＤＮＡ（Ａ）を増幅することもできる。尚、このようにしてＰＣＲに用いられるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等が付加されていてもよい。
【００１８】
上記のようなＰＣＲの条件としては、具体的には例えば、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ含み、上記のような組合せの２種類のプライマーをそれぞれ３００ｎＭ含み、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ含み、１０×Ｅｘｐａｎｄ　ＨＦバッファー（ＭｇＣｌ２含有、ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）を５．０μｌ含み、Ｅｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックス（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）を０．７５μｌ含む５０μｌの反応液を用い、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６８℃で３０秒間さらに７２℃で２分間（１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温する条件をあげることができる。
また、染色体ＤＮＡを２５０ｎｇ含み、上記のような組合せの２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭ含み、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ含み、１０×ＥｘＴａｑバッファー（ＭｇＣｌ２含有、宝酒造社製）を５．０μｌ含み、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）を０．５μｌ含む５０μｌの反応液を用い、９７℃で２分間保温し、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で９０秒のサイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で４分間保温する条件をあげることもできる。
【００１９】
また、例えば、配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列において配列同一性が特に高い領域の塩基配列に基づきプライマー用オリゴヌクレオチドを設計して調製する。得られたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を有する微生物、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　ＩＦＯ　１２８７０ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ等のサッカロポリスポラ属に属する微生物、より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどから上記のようにして調製される染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことによって、本ＤＮＡ（Ａ）を取得することもできる。「配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列において配列同一性が特に高い領域」としては、例えば、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号２９０〜３１５、４５８〜４８５、４９６〜５２５、１０４６〜１０７３でそれぞれ示される領域に相当する領域等をあげることができる。かかる領域の塩基配列に基づいて設計されるプライマーとしては、例えば、次に示す配列番号１２４〜１２９のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーをあげることができる。
配列番号１２４；上記塩基番号２９０〜３１５で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
配列番号１２５；上記塩基番号４５８〜４８５で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
配列番号１２６；上記塩基番号４５８〜４８５で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
配列番号１２７；上記塩基番号４９６〜５２５で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
配列番号１２８；上記塩基番号４９６〜５２５で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
配列番号１２９；上記塩基番号１０４６〜１０７３で示される領域に相当する領域の塩基配列に基づく。
例えば、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマーに用いることにより、約８００ｂｐのＤＮＡが増幅される。配列番号１２５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマーに用いることにより、約６００ｂｐのＤＮＡが増幅される。配列番号１２６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマーに用いることにより、約６００ｂｐのＤＮＡが増幅される。配列番号１２７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマーに用いることにより、約５８０ｂｐのＤＮＡが増幅される。また、配列番号１２８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマーに用いることにより、約５８０ｂｐのＤＮＡが増幅される。
ここで、ＰＣＲの条件としては、具体的には例えば、染色体ＤＮＡを１０ｎｇ含み、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭ含み、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を０．５μｌ含み、５ｘＧＣゲノミックＰＣＲ反応バッファーを５μｌ含み、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２を１．１μｌ含み、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔを５μｌ含み、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）を０．５μｌ含む２５μｌの反応液を、９５℃で１分間保温し、９４℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で５分間保温する条件をあげることができる。
【００２０】
上記のようにして増幅されたＤＮＡを回収することにより、本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡを取得することができる。次いで、取得された「本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡ」が有する塩基配列に基づき、該塩基配列の約２０塩基程度以上の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドや、該塩基配列の約２０塩基程度以上の部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを設計し調製する。そして、例えば上記のような化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を有する微生物等から調製された染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、上記のように「本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡ」が有する塩基配列に基づき調製されたオリゴヌクレオチドを、上記ライブラリーの構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列を有する約２０塩基程度以上のオリゴヌクレオチドまたはかかる塩基配列に相補的な塩基配列を有する約２０塩基程度以上のオリゴヌクレオチドと組合わせてプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、上記のようにして取得された「本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡ」の５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡを得ることができる。上記のようにして得られた本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するＤＮＡを連結することによって、本ＤＮＡ（Ａ）を得ることができる。このような取得方法には、例えばユニバーサルゲノムウォーカーキット（クロンテック社製）等の市販のキットを用いることもできる。また、上記のようにして得られた本ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を連結することによって得られる本ＤＮＡ（Ａ）の全長塩基配列に基づいてプライマーを調製し、該プライマーを用いて上記染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行なうことにより、本ＤＮＡ（Ａ）を得ることもできる。
【００２１】
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１３９で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８に示される塩基配列（配列番号１５９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号１４４で示される塩基配列（配列番号１５９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号１４９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４０で示される塩基配列の塩基番号３６４〜１０９６に示される塩基配列（配列番号１６０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号１４５で示される塩基配列（配列番号１６０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号１５０で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４１で示される塩基配列の塩基番号２９５〜１０２７に示される塩基配列（配列番号１３６で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号１４６で示される塩基配列（配列番号１３６で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号１５１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４２で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８に示される塩基配列（配列番号１３７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号１４７で示される塩基配列（配列番号１３７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号１５２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４３で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８に示される塩基配列（配列番号１３８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号１４８で示される塩基配列（配列番号１３８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号１５３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２３２で示される塩基配列の塩基番号２８９〜１０１５に示される塩基配列（配列番号２２２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号２４２で示される塩基配列（配列番号２３２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号２５２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２３４で示される塩基配列の塩基番号２８９〜１０１５に示される塩基配列（配列番号２２４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の部分塩基配列）を有するＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡの塩基配列に基づき上述のようにして、その５’末端より上流側または３’末端より下流側に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを取得し、得られたＤＮＡを連結することによって、配列番号２４４で示される塩基配列（配列番号２３４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。）を有するＤＮＡを得ることができる。
【００２２】
上記のようにしてＰＣＲを用いて得られた本ＤＮＡ（Ａ）は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じた方法によりベクターにクローニングすることができる。具体的には、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴＡクローニングキットに含まれるプラスミドベクターやＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどのプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。
【００２３】
また、本ＤＮＡ（Ａ）は、例えば、以下のようにして調製することもできる。まず、本ＤＮＡ（Ａ）がコードする蛋白質のアミノ酸配列をコードし、ＧＣ含量が６０％以下４０％以上、好ましくは５５％以下４５％以上であって、かつ前記蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用率（ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ）が、該本ＤＮＡ（Ａ）が導入される宿主細胞が属する生物種の遺伝子のコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内である塩基配列を設計する。設計された塩基配列を有するＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製することにより、本ＤＮＡ（Ａ）を得ることができる。
例えば、本発明蛋白質（Ａ１）のアミノ酸配列（配列番号１）をコードし、ＧＣ含量が５５％以下４５％以上であって、かつ前記蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用率が、ダイズの遺伝子のコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内である塩基配列を以下のようにして設計する。まず、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から得られうる本発明蛋白質（Ａ１）のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号６）のコドン使用率（表２２および表２３）とダイズのコドン使用率（表２４および表２５）とを比較する。比較結果に基づいて、ＧＣ含量が５５％以下４５％以上であって、かつコドン使用率がダイズのコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内となるように、配列番号６で示される塩基配列に塩基置換を加える。かかる塩基置換としては、アミノ酸置換を生じない塩基置換を選択する。例えば、ロイシンをコードするＣＴＧコドンの使用率は、ダイズの遺伝子において１．２２％であるのに対し、配列番号６で示される塩基配列においては７．０９％である。そこで、例えば、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号１０６、１６３、１８１、２２６、２８９、２９２、５４４、１１１１、１２１０からそれぞれ始まるＣＴＧコドンをＣＴＴコドンに、塩基番号２１１、５４７、１０８４からそれぞれ始まるＣＴＧコドンをＣＴＡコドンに、塩基番号３３４から始まるＣＴＧコドンをＴＴＡコドンに、塩基番号６６４、７１８、７３３、７７２、８３５、１１２０、１１４１からそれぞれ始まるＣＴＧコドンをＴＴＧコドンに、塩基番号７８７から始まるＣＴＧコドンをＴＴＡコドンに、それぞれ置換する。このようにして設計された塩基配列の一例を配列番号２１４に示し、該塩基配列のコドン使用率を表２６および表２７に示す。配列番号２１４で示される塩基配列においては、例えば、上記のロイシンをコードするＣＴＧコドンの使用率は１．７１％であり、ダイズのコドン使用率（１．２２％）のプラスマイナス４％の範囲内となっている。配列番号２１４で示される塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．，　Ｆｒｉｓｃｈ　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ）等に記載されている部位特異的変異導入法等に準じて、配列番号６で示される塩基配列を有するＤＮＡに塩基置換を導入することにより調製することができる。また、後述の実施例４６に示すようなＰＣＲを利用したＤＮＡ合成方法等により、配列番号２１４で示される塩基配列を有するＤＮＡを調製することもできる。
同様にして、本発明蛋白質（Ａ２３）のアミノ酸配列（配列番号２２２）をコードし、ＧＣ含量が５５％以下４５％以上であって、かつ前記蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用率が、ダイズの遺伝子のコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内である塩基配列を設計した例として、配列番号３６８で示される塩基配列をあげることができる。また、本発明蛋白質（Ａ２５）のアミノ酸配列（配列番号２２４）をコードし、ＧＣ含量が５５％以下４５％以上であって、かつ前記蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列のコドン使用率が、ダイズの遺伝子のコドン使用率のプラスマイナス４％の範囲内である塩基配列を設計した例として、配列番号３９３で示される塩基配列をあげることができる。
上記のようにして得られる本ＤＮＡ（Ａ）は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。ベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣＡ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶＡ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ３３１−１Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などを利用することができる。
また、上記のようにして得られる本ＤＮＡ（Ａ）の塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，　Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，　Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７）　７４：　５４６３−５４６７頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。
【００２４】
上述のようにして得られる本ＤＮＡ（Ａ）にコードされる本蛋白質（Ａ）の、上記一般式で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を代謝する能力は、例えば以下のようにして化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を指標として確認することができる。まず、該ＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、これを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで、該形質転換体の培養物または該培養物を破砕して得られる抽出物を、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下に化合物（ＩＩ）に作用させ、その結果生じた反応生成物を分析して化合物（ＩＩＩ）を検出する。このようにして、化合物（ＩＩ）を代謝して化合物（ＩＩＩ）を生成する能力を有する形質転換体を特定することができ、当該形質転換体はかかる能力を有する蛋白質をコードする本ＤＮＡ（Ａ）を保有していると判断することができる。より具体的には例えば、上記形質転換体の培養物もしくは抽出物、終濃度２ｍＭ程度のβ−ＮＡＤＰＨ等の電子供与体、終濃度２ｍｇ／ｍｌ程度のホウレンソウ由来のフェレドキシン、終濃度０．１Ｕ／ｍｌ程度のフェレドキシン還元酵素および放射性同位元素で標識された３ｐｐｍ程度の化合物（ＩＩ）を含有する０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、約３０℃〜約４０℃で１０分間〜１時間保温する。保温後の反応液に、３μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し上清を回収する。該上清を減圧下で乾固した後、残渣を酢酸エチルに溶解させ、得られた溶解液をシリカゲルのＴＬＣプレートで展開する。該ＴＬＣプレートをラジオオートグラフィー分析して、放射性同位元素で標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットを検出することにより、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を確認することができる。
【００２５】
本発明ＤＮＡ（Ａ）や、該ＤＮＡの部分塩基配列もしくは該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いて、上述のようなハイブリダイゼーションやＰＣＲを行うことにより、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡや該ＤＮＡを有する微生物をさらに検索してもよい。
具体的には例えば、本発明ＤＮＡ（Ａ）、または、本発明ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列もしくは該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いて、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓなどのストレプトミセス属に属する微生物、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉなどのサッカロポリスポラ属に属する微生物等の天然の微生物由来のゲノムＤＮＡと上述のようなハイブリダイゼーションを行い、当該プローブがハイブリダイズするＤＮＡを検出する。プローブとして用い得るＤＮＡの具体例としては、配列番号６、７、８、１０９、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３または２３４のいずれかで示される塩基配列の全長を有するＤＮＡや、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号５７〜７３０で示される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号８で示される塩基配列の塩基番号２１〜６９１で示される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
また、本発明ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列もしくは該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドをプライマーとして使用し、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓなどのストレプトミセス属に属する微生物、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉなどのサッカロポリスポラ属に属する微生物等の天然の微生物由来のゲノムＤＮＡを鋳型として上述のようなＰＣＲを行い、増幅されるＤＮＡを検出してもよい。プライマーとしては、上述のような「配列番号６、７、８または１０９で示される塩基配列において配列同一性が特に高い領域」の塩基配列に基づいて設計されたプライマーをあげることができる。より具体的なプライマーの例としては、上述の配列番号１２４〜１２８のいずれかで示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１２９で示される塩基配列を有するプライマーとの組合わせ等があげられる。
このようにして検出されたＤＮＡを回収する。回収されたＤＮＡが本ＤＮＡ（Ａ）の全長塩基配列に満たない場合は、該ＤＮＡを利用して上述のようにして全長塩基配列に相当するＤＮＡを調製する。得られたＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換体を作出する。得られた形質転換体の培養物を用いて上述のようにして化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を検定することにより、該形質転換体に導入されたＤＮＡがコードする蛋白質が、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力を評価することができる。
【００２６】
本ＤＮＡ（Ａ）を宿主細胞で発現させるには、本ＤＮＡ（Ａ）を宿主細胞内の発現可能な位置に導入する。本ＤＮＡ（Ａ）を「発現可能な位置に」導入するとは、本ＤＮＡ（Ａ）が、その塩基配列からの転写及び翻訳を指向する（即ち、例えば、本蛋白質（Ａ）をコードするＲＮＡおよび本蛋白質（Ａ）の産生を促進する）塩基配列と隣接した位置に置かれるように宿主細胞に導入することを意味する。
本ＤＮＡ（Ａ）を、該ＤＮＡが発現可能な位置に置かれるように宿主細胞に導入するには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本ＤＮＡ（Ａ）とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを宿主細胞に導入する。ここで、「機能可能な形で」とは、該ＤＮＡが宿主細胞に導入された際に、本ＤＮＡ（Ａ）が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。
宿主細胞が微生物細胞である場合、機能可能なプロモーターとしては、例えば、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、Ｔ７ファージプロモーター、または、ｔａｃプロモーターもしくはｔｒｃプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーターなどをあげることができる。また、ストレプトミセス属、サッカロポリスポラ属等に属する微生物の染色体において本ＤＮＡ（Ａ）の上流に存在する元来のプロモーターを利用してもよい。
宿主細胞が植物細胞である場合には、機能可能なプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子プロモーター等のＴ−ＤＮＡ由来の構成型プロモーター、カリフラワーモザイクウィルス由来の１９Ｓプロモーターもしくは３５Ｓプロモーター等の植物ウィルス由来のプロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ遺伝子プロモーター、Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子プロモーター等の誘導型プロモーター、特開２０００−１６６５７７号公報に記載の植物プロモーターなどを挙げることができる。また、上記のような植物細胞で機能可能なプロモーターと本ＤＮＡ（Ａ）とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡに植物細胞で機能可能なターミネーターを連結させてもよい。この場合、本ＤＮＡ（Ａ）の下流にターミネーターが位置するように連結すると一般的によい。機能可能なターミネーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）ターミネーターなどのＴ−ＤＮＡ由来の構成型ターミネーター、ニンニクウィルスＧＶ１，ＧＶ２のターミネーターなどの植物ウィルス由来のターミネーター、特開２０００−１６６５７７号公報に記載の植物ターミネーターなどをあげることができる。
【００２７】
上記のように本ＤＮＡ（Ａ）を、該ＤＮＡが発現可能な位置に置かれるように植物細胞に導入する際に、例えば、細胞内オルガネラへの移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが、本ＤＮＡ（Ａ）の上流に、その読み枠を合わせて連結されてなるＤＮＡを用いることもできる。ここで「読み枠を合わせて連結されて」とは、細胞内オルガネラへの移行シグナル配列をコードする読み枠と、本ＤＮＡ（Ａ）にコードされる本蛋白質（Ａ）の読み枠とが接続されて一続きの読み枠が形成されるように連結されていることを意味する。植物細胞において蛋白質の細胞内オルガネラへの移行と局在化をもたらす移行シグナル配列としては、例えば、米国特許５７１７０８４号公報に記載される植物の葉緑体に局在するタンパク質の細胞質前駆体タンパク質由来の移行シグナル配列や、米国特許ＲＥ３６４４９号公報に記載される複数種の移行シグナル配列から構成されるキメラ配列等をあげることができる。より具体的には、後述の実施例１５に示される方法によって取得可能なダイズのｒｉｂｕｌｏｓｅ−１，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ小サブユニット由来の葉緑体トランジットペプチド等があげられる。
【００２８】
一般的には、本ＤＮＡ（Ａ）、細胞内オルガネラへの移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと上記のように連結されてなる本ＤＮＡ（Ａ）、またはこれらのＤＮＡと宿主細胞で機能可能なプロモーターとが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡ等は、それぞれ宿主細胞で利用可能なベクターに組込んで、これを宿主細胞に導入する。宿主細胞において機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターと本ＤＮＡ（Ａ）とが機能可能な形で結合するように、該プロモーターの下流に本ＤＮＡ（Ａ）を挿入すればよい。
ベクターとしては、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合、例えばｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴＶＡ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＫＫ３３１−１Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＥＴ１１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができる。選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子など）を含むベクターを用いると、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択する際に便利である。
【００２９】
宿主細胞が、大腸菌、枯草菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属細菌、乳酸菌、酢酸菌、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属細菌や、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ等の酵母、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ等のカビなどの微生物細胞である場合には、本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、日本生化学会編新生化学講座第１７巻微生物実験法（東京化学同人）等に記載の方法をあげることができる。また、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載される塩化カルシウム法や、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　／Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ」　Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　（１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法等を用いてもよい。
本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターが導入された形質転換体は、例えば、前述のような本ＤＮＡ（Ａ）が組込まれたベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選抜することができる。また、形質転換体が本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターを保有していることは、該形質転換体からＤＮＡを調製した後、調製されたＤＮＡについて、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ等に記載される遺伝子工学的分析方法（制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等）を行うことにより確認することができる。
【００３０】
また、例えば宿主細胞が植物細胞の場合、例えば、タバコ、ワタ、ナタネ、テンサイ、シロイヌナズナ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、バレイショ、アルファルファ、レタス、バナナ、ダイズ、エンドウ、その他のマメ類、マツ、ポプラ、リンゴ、ブドウ、オレンジ、レモン、その他の柑橘類、アーモンド、クルミ、その他のナッツ類等の双子葉植物、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ソルガム、オートムギ、サトウキビ、芝類等の単子葉植物等の植物種をあげることができ、本ＤＮＡ（Ａ）を導入する細胞としては、植物組織、植物個体、培養細胞、種子などを用いることができる。
本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、アグロバクテリウム感染方法（特公平２−５８９１７および特開昭６０−７００８０）、プロトプラストへのエレクトロポーレーション方法（特開昭６０−２５１８８７及び特開平５−６８５７５）、またはパーティクルガン方法（特表平５−５０８３１６及び特開昭６３−２５８５２５）等の手段をあげることができる。
この際、例えばハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等から選ばれる選択マーカー遺伝子を本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターと同時に植物細胞に導入すると、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。選択マーカー遺伝子と本ＤＮＡ（Ａ）とを同一のベクター上に組み込んで導入してもよいし、選択マーカー遺伝子を有するベクターと本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターとを同時に導入してもよい。また、本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターが導入された植物細胞を、上記一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を含む培地で培養し増殖可能なクローンを単離することによっても、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換体を選抜することができる。形質転換体が本ＤＮＡ（Ａ）を保有していることは、該形質転換体からＤＮＡを調製した後、調製されたＤＮＡについて、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ等に記載される遺伝子工学的分析方法（制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等）を行うことにより確認することもできる。植物細胞に導入された本ＤＮＡ（Ａ）は、核に含まれるＤＮＡの他、葉緑体等の細胞内オルガネラに含まれるＤＮＡに組み込まれて細胞内で維持されていても良い。
このようにして得られた形質転換植物細胞から、例えば、植物遺伝子操作マニュアル：トランスジェニック植物の作り方（内宮著、講談社サイエンティフィック１９９０年）、２７−５５頁などに記載されている植物細胞培養方法により植物体を再生させることによって、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換植物を得ることができる。さらに、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換植物と目的とする品種の植物とを交配させることにより、当該目的品種の植物の染色体に本ＤＮＡ（Ａ）を導入し、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された目的品種の植物を取得することもできる。
【００３１】
具体的には、例えば、モデル植物の実験プロトコール　イネ・シロイヌナズナ編（島本功、岡田清孝監修、秀潤社１９９６年）、第４章に記載の方法によって、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現するイネやシロイヌナズナを得ることができる。また、特開平３−２９１５０１に記載されている方法で、パーティクルガンを用いてダイズ不定胚に導入して、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現するダイズを得ることができる。同様に、Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　８；　ｐ８３８　（１９９０）に記載されている方法に準じて、パーティクルガンを用いてトウモロコシ不定胚に導入して、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現するトウモロコシを得ることができる。宅見ら著、育種学会雑誌、１９９５年、第４４巻、別冊１号、５７頁に記載されている通常の方法に準じて、パーティクルガンを用いて無菌培養したコムギ未熟胚盤に導入して、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現するコムギを得ることができる。同様に、萩尾ら著、育種学会雑誌、１９９５年、第４４巻、別冊１号、６７頁に記載されている通常の方法に準じて、パーティクルガンを用いて無菌培養したオオムギ未熟胚盤に導入して、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現するオオムギを得ることができる。
【００３２】
本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現する形質転換体は、その細胞内で、化合物（Ｉ）を雑草防除活性のより低い化合物に変換することによって、当該雑草防除活性化合物による植物傷害を軽減することができる。具体的には、例えば、目的品種の植物の種子を播種する前に、本蛋白質（Ａ）を発現する微生物を目的の栽培植物の栽培域土壌に散布することによって、土壌中に残留している上記雑草防除活性化合物を代謝し雑草防除活性化合物による目的植物の傷害を軽減することができる。また、本蛋白質（Ａ）を目的品種の植物で発現させることによって、該植物に、一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を活性のより低い化合物へと代謝する能力が付与される。その結果、当該植物において上記雑草防除活性化合物による植物傷害が軽減されたり、該化合物に対する耐性が付与されたりする。
【００３３】
本蛋白質（Ａ）は、例えば本ＤＮＡ（Ａ）を有する細胞を培養することによって調製することができる。かかる細胞としては、本ＤＮＡ（Ａ）を発現し本蛋白質（Ａ）を産生する能力を有する微生物であって、例えば、本ＤＮＡ（Ａ）を有する自然界から分離された微生物株、該微生物株から薬剤や紫外線等の処理によって誘導された変異株等をあげることができる。より具体的には例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　ＩＦＯ　１２８７０ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなどのストレプトミセス属に属する微生物や、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどのサッカロポリスポラ属に属する微生物等があげられる。また、本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターが宿主細胞に導入された形質転換体等をあげることもできる。具体的には例えば、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターまたはＴ７ファージプロモーターと機能可能な形で接続された本ＤＮＡ（Ａ）が大腸菌に導入されてなる形質転換体をあげることができ、より具体的な例としては、後述の実施例に記載されるＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮＳＣＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６１８Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４７４Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１４９１ＡＦ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５５ＡＦ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４Ｆ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９Ｆ等があげられる。
【００３４】
上記のような本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物を培養する為の培地としては、微生物の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。アミノレブリン酸などのヘムの前駆体となる化合物を培地に添加してもよい。
炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン等の糖類、グリセロール、ソルビトール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸等があげられる。これら炭素源の培地への添加量は、培地全量に対し、通常約０．１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）程度である。
窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンステイープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源又はアミノ酸類等があげられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は、多くの場合、炭素源としても使用することができる。窒素源の添加量は培地全量に対し通常、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）程度である。
無機塩類としては、例えば、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等のリン酸塩、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化コバルト６水和物等の塩化物塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン３水和物等の硫酸金属塩等をあげることができ、その添加量は培地全量に対し通常、約０．０００１％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）程度である。
また、Ｔ７ファージプロモーターの下流に接続された本ＤＮＡ（Ａ）と、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（λＤＥ３　ｌｙｓｏｇｅｎ）をコードする塩基配列がｌａｃＵＶ５プロモーターの下流に接続されてなるＤＮＡとを保有する形質転換体を培養する場合には、通常、本蛋白質（Ａ）の生産を誘導するための誘導剤として、例えばｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（以下、ＩＰＴＧと記す。）を培地に少量加える。ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等のラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本ＤＮＡ（Ａ）とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡが宿主細胞に導入されてなる形質転換体を培養する場合にも、ＩＰＴＧを培地に加えてもよい。
【００３５】
本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物の培養は、微生物の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば旋回振盪培養、往復振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養もしくはタンク培養等の液体培養、または、固体培養等の方法が可能である。ジャーファーメンターを用いる場合には、ジャーファーメンター内に無菌空気を導入する必要があり、通常、培養液容量の約０．１倍〜約２倍／分の通気条件が用いられる。培養温度は、微生物が生育可能な範囲で適宜変更できるが、約１５℃〜約４０℃の範囲の培養温度が一般的であり、培地のｐＨとしては、約６〜約８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが、通常は約１日間〜約１０日間程度である。
【００３６】
本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物によって産生される本蛋白質（Ａ）は、例えば、本蛋白質（Ａ）を産生する微生物の培養物、本蛋白質（Ａ）を産生する微生物の菌体、かかる菌体の処理物、無細胞抽出液、粗精製蛋白質、精製蛋白質等の種々の形態で、例えば上記一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物の処理に用いることができる。ここで菌体の処理物としては、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体のアルカリ処理物、菌体の有機溶媒処理物等をあげることができる。また、上記のような種々の形態の本蛋白質（Ａ）を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、ＤＥＡＥ−セルロース等の多糖類の誘導体、もしくはアンバーライトＩＲＡ９３５（商品名、ローム・アンド・ハース社製）等の合成高分子等へ吸着させる担体結合法や、ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲルもしくは寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に閉じ込める包括法などの公知の方法に準じて固定化して上記雑草防除活性化合物の処理に用いることもできる。
【００３７】
本蛋白質（Ａ）を本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物の培養物から精製する方法としては、蛋白質の精製において通常使用される方法を適用することができ、例えば次のような方法をあげることができる。
まず、微生物の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理もしくはフレンチプレス処理等の物理的破砕方法、または界面活性剤もしくはリゾチーム等の菌体溶菌酵素を用いる化学的破砕方法などによって破砕する。得られた破砕液から、遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって本蛋白質（Ａ）を精製することができる。クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基、もしくはブチル基等を導入したセルロース、デキストランまたはアガロース等の樹脂担体が挙げられる。市販の担体充填済みカラムを用いることもでき、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰ、ＰＤ−１０、ＨｉＬｏａｄ　２６／１０　ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰ（商品名、いずれもアマシャム　ファルマシア　バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等があげられる。
【００３８】
本蛋白質（Ａ）の精製操作の一例を示す。
本蛋白質（Ａ）を産生する微生物の菌体を遠心分離により集めた後、例えば０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）等の緩衝液に懸濁する。これを超音波破砕機にて破砕処理し、得られた菌体破砕液を約４０，０００×ｇで３０分間程度遠心分離した後、上清を回収してこれを１５０，０００×ｇで１時間程度遠心分離し、上清（無細胞抽出液）を回収する。得られた無細胞抽出液を硫安分画し、４５％飽和硫酸アンモニウム存在下に可溶性であり、５５％飽和硫酸アンモニウム存在下に沈殿する画分を得る。この画分の溶媒を、ＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を用いて例えば０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）等の硫酸アンモニウムを含まない緩衝液に置換した後、例えば　ＨｉＬｏａｄ　２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に導入し、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付した２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流して溶出液を分画回収し、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下に化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する活性が検出される画分を集める。次いで該画分を例えばＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を用いてバッファー置換した後、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ　Ｃｅｒａｍｉｃ　例えばＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　ＴｙｐｅＩｃｏｌｕｍ　ＣＨＴ１０−Ｉ（バイオラッド社製）に注入する。該カラムをＡバッファー（１．５ｍＭの塩化カルシウムを含む２ｍＭリン酸カリウムバッファー；ｐＨ７．０）で洗浄した後、Ｂバッファー（０．０３ｍＭの塩化カルシウムを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー；ｐＨ７．０）の添加による直線濃度勾配を付したＡバッファーを流し、溶出液を分画回収して、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下に化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する活性が検出される画分を集める。得られた画分を例えばＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等を用いてバッファー置換した後、例えば限外ろ過（マイクロコンフィルターユニットマイクロコン−３０、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にて濃縮する。得られた画分を例えばＨｉＬｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　ｐｇ　カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入し、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、溶出液を分画回収し、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下に化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する活性が検出される画分を集める。必要に応じて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画することにより、本蛋白質（Ａ）を精製することもできる。
【００３９】
上述のようにして本発明蛋白質（Ａ）を精製し、得られた本発明蛋白質（Ａ）を免疫抗原として用いることにより、本発明蛋白質（Ａ）を認識する抗体（以下、本発明抗体（Ａ）と記すことがある。）を作製することができる。
具体的には、例えば、上述のようにして精製した本発明蛋白質（Ａ）を抗原として動物を免疫感作化する。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ等の動物を免疫するには、例えば、Ｊ．ＡＳＳＯＣ．ＯＦＦ．ＡＮＡＬ．ＣＨＥＭ　７０（６）　１０２５−１０２７　（１９８７）等に記載されるＷ．Ｈ．Ｎｅｗｓｏｍｅ　等の通常の免疫感作の方法を用いて、抗原を１回またはそれ以上の回数投与する。投与のスケジュールとしては、例えば、７日ないし３０日間隔、好ましくは１２日ないし１６日間隔で、２または３回の投与等があげられる。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５ｍｇから約２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に行う注射が一般的な投与形態である。抗原は、適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント（Ａｒａｃｅｌ　Ａ．Ｂａｙｏｌ　Ｆ　　結核死菌を混合したもの）、ＲＡＳ〔ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ　Ｌｉｐｉｄ　Ａ）＋ＴＤＭ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　Ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ）＋ＣＷＳ（Ｃｅｌｌ　Ｗａｌｌ　Ｓｋｅｌｅｔｏｎ）　アジュバントシステム〕　、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するナトリウム系リン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いられるが、投与経路や条件等によっては、上記のようなアジュバントを使用しないこともある。アジュバントとは、抗原とともに投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質である。そして、上記のようにして抗原を投与した動物を、０．５ケ月間ないし４ケ月間飼育した後、該動物の血液を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇していたら、状況に応じて、抗原の投与をさらに適当回数実施する。例えば、約１００μｇないし約１０００μｇの投与量でもう１回抗原の投与を行う。最後の投与の１ケ月ないし２ケ月後に、免疫感作した動物から通常の方法により血液を採取する。採取された血液を、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いることによる沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分画することにより、ポリクローナル抗血清として本発明抗体（Ａ）を得ることができる。なお血清を、例えば、５６℃で３０分間保温することによって補体系の不活性化してもよい。
また、本発明蛋白質（Ａ）の部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを化学合成し、これを免疫抗原として動物に投与することにより、本発明抗体（Ａ）を作製することもできる。免疫抗原として用いるポリペプチドのアミノ酸配列としては、例えば、本発明蛋白質（Ａ）のアミノ酸配列の中から、他の蛋白質のアミノ酸配列とのホモロジーがなるべく低いアミノ酸配列を選択する。選択されたアミノ酸配列からなる１０アミノ酸から１５アミノ酸程度の長さのポリペプチドを、通常の方法に準じて化学合成し、Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｐｌｙｈｅｍｕｓのｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ等のキャリアー蛋白質とＭＢＳ等により架橋した後、上記と同様にウサギ等の動物に免疫する。
このようにして作製される本発明抗体（Ａ）と被験試料とを接触させ、被験試料中の蛋白質と前記抗体との複合体を、例えば、通常の免疫学的手法に準じて検出することにより、該被験試料中の本発明蛋白質（Ａ）もしくはその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを検出することができる。具体的には、例えば、後述の実施例４５または７３に示されるような本発明抗体（Ａ）を用いたウェスタンブロット分析によって、供試した試料中における本発明蛋白質（Ａ）の有無の判断や、本発明蛋白質（Ａ）の定量を行うことが可能である。
また、例えば、本発明抗体（Ａ）と被験細胞または被験細胞から調製された試料とを接触させ、被験細胞または被験細胞から調製された試料中の蛋白質と前記抗体との複合体を通常の免疫学的手法に準じて検出することにより、本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞を検出することもできる。このようにして本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞を検出することにより、種々の細胞の中から本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞を選抜することも可能である。例えば、本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞からゲノムＤＮＡを抽出して発現ベクターに挿入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、それらを細胞に導入する。得られた細胞集団の中から、上記のようにして本発明抗体（Ａ）を用いて本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞を選抜することにより、本発明蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡを含有するクローンを選抜・クローニングすることも可能である。
本発明抗体（Ａ）を含有するキットは、例えば、上述のような本発明蛋白質（Ａ）の検出や、本発明蛋白質（Ａ）を発現する細胞の分析、検出、検査等に利用することができる。かかる本発明のキットは、本発明抗体（Ａ）のほかに、上記のような分析手法に必要な試薬を含んでいてもよいし、かかる試薬と組合わせて使用しても良い。
【００４０】
上記一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物に、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下、本蛋白質（Ａ）を作用させると、前記化合物は代謝され、雑草防除活性がより低い化合物に変換される。具体的には例えば、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下、化合物（ＩＩ）に本蛋白質（Ａ）を作用させると、化合物（ＩＩ）は、雑草防除活性を実質的に示さない化合物（ＩＩＩ）に変換される。ここで本蛋白質（Ａ）としては、例えば、本発明蛋白質（Ａ）をあげることができる。本蛋白質（Ａ）のうちの１種類の蛋白質を作用させてもよいし、複数種の蛋白質を併用してもよい。
上記一般式（Ｉ）で示されるウラシル化合物の具体例としては、上記化合物（ＩＩ）や、以下の式（ＩＶ）〜（ＩＸ）のいずれかで示される化合物［以下、それぞれ化合物（ＩＶ）〜化合物（ＩＸ）と記す。］等をあげることができる。化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＸ）は特開２０００−３１９２６４号公報に、化合物（ＩＶ）および化合物（Ｖ）は米国特許５１８３４９２号公報に、化合物（ＶＩ）は米国特許５６７４８１０号公報に、化合物（ＶＩＩ）は特開平３−２０４８６５号公報に、化合物（ＶＩＩＩ）は特開平６−３２１９４１号公報に、それぞれ記載の方法に準じて合成することが可能である。
【００４１】
2004057194.tif 000007
【００４２】
また、上記一般式（Ｉ）で示される化合物の具体例として、以下の式（Ｘ）〜（ＸＶＩＩ）のいずれかで示される化合物［以下、それぞれ化合物（Ｘ）〜化合物（ＸＶＩＩ）と記す。］等をあげることもできる。
2004057194.tif 000008
【００４３】
本蛋白質（Ａ）による代謝反応の基質となり得る化合物は、例えば、該化合物を、補酵素ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系の存在下において、放射性同位元素等で標識された化合物（ＩＩ）に本蛋白質（Ａ）を作用させる反応系に共存させると、標識された化合物（ＩＩ）から標識された化合物（ＩＩＩ）への本蛋白質（Ａ）による変換反応が競争阻害されることを指標に選抜することができる。このようにして被験化合物による競争阻害の有無を検定する場合には、被験化合物は、標識された化合物（ＩＩ）に対して、通常、１倍〜１００倍程度のモル濃度となるよう添加する。
【００４４】
本蛋白質（Ａ）を化合物（Ｉ）に作用させる反応は、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩などの無機酸塩や、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩等を含む水性緩衝液中で行うことができる。上記一般式（Ｉ）で示される化合物の代謝反応液中における濃度は通常３０％（ｗ／ｖ）程度以下が適しており、好ましくは０．００１％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）程度である。ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系や本蛋白質（Ａ）の量は、例えば反応時間等を考慮して適宜決めることができる。反応温度は通常、約１０℃〜約７０℃の範囲から選ばれ、好ましくは約２０℃〜約５０℃程度である。反応液のｐＨは通常約４〜約１２の範囲から選ばれ、好ましくは約５〜約１０程度である。反応時間は、任意に設定することができ、通常は約１時間〜約１０日間程度である。
また、本蛋白質（Ａ）を化合物（Ｉ）に作用させる反応は、本ＤＮＡ（Ａ）を有する細胞の細胞内で行わせることもできる。本ＤＮＡ（Ａ）を有する細胞としては、例えば、本ＤＮＡ（Ａ）を発現し本蛋白質（Ａ）を産生する能力を有する微生物であって、例えば、自然界から分離された本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物株、該微生物株から薬剤や紫外線等の処理によって誘導された変異株、本ＤＮＡ（Ａ）または本ＤＮＡ（Ａ）を含むベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換微生物細胞等をあげることができる。また、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換植物細胞や、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換植物体の細胞をあげることもできる。このような場合、上記一般式（Ｉ）で示される化合物は、本ＤＮＡ（Ａ）を有する細胞に取り込まれるように、該細胞の培養液や該細胞が接触する土壌等に含有させてもよく、該細胞に直接施用してもよい。ＮＡＤＰＨ等の電子供与体からの電子伝達系は、該細胞が本来細胞内に保有する系を利用してもよいし、細胞外から添加されてもよい。
【００４５】
本蛋白質（Ａ）による化合物（Ｉ）の代謝は、例えば、化合物（Ｉ）の代謝により生成した化合物を検出することにより確認することができる。具体的には例えば、化合物（ＩＩ）の代謝により生成する化合物（ＩＩＩ）は、上述のようなＨＰＬＣ分析やＴＬＣ分析により検出することができる。
また、本蛋白質（Ａ）による化合物（Ｉ）の代謝は、化合物（Ｉ）に本蛋白質（Ａ）を作用させた後の反応液の雑草防除活性が、本蛋白質（Ａ）を作用させなかった場合と比べて低下することをもって確認することもできる。雑草防除活性の試験方法としては、例えば、イヌビエ、ノスズメノテッポウ、アメリカアサガオ、イチビ等の雑草に上記の反応液を散布し、雑草防除効果を調べる方法や、上記の反応液を散布した土壌で雑草を栽培し、雑草防除効果を調べる方法等をあげることができる。また、植物から採取した葉片に上記の反応液を滴下し、該反応液による植物傷害（白化）の有無を調べる方法をあげることもできる。
また、本蛋白質（Ａ）による化合物（Ｉ）の代謝は、化合物（Ｉ）に本蛋白質（Ａ）を作用させた後の反応液のＰＰＯ阻害活性が、化合物（Ｉ）に本蛋白質（Ａ）を作用させなかった反応液の該活性と比べて低下することを指標として確認することもできる。ＰＰＯは、プロトポルフィリノーゲンＩＸからプロトポルフィリンＩＸ（以下、ＰＰＩＸと記す。）への変換を触媒する酵素である。そこで、例えば、ＰＰＯの反応系に上記の反応液を添加した後、ＰＰＯの基質であるプロトポルフィリノーゲンＩＸを添加し、３０℃の暗所にて１時間〜２時間保温する。次いで、ＨＰＬＣ等を用いて各保温液中のＰＰＩＸの量を測定する。化合物（Ｉ）に本蛋白質（Ａ）を作用させた後の反応液を添加した系のＰＰＩＸ量が、化合物（Ｉ）に本蛋白質（Ａ）を作用させなかった反応液を添加した系のＰＰＩＸ量と比べて多い場合に、本蛋白質（Ａ）により化合物（Ｉ）が代謝されたと判定する。ＰＰＯとしては、植物等から精製された蛋白質を用いてもよいし、植物から抽出された葉緑体画分を用いてもよい。葉緑体画分を用いる場合には、ＰＰＯの反応系に、プロトポルフィリノーゲンＩＸの代わりに、クロロフィル・ヘム生合成経路におけるプロトポルフィリノーゲンＩＸの前駆体物質であるアミノレブリン酸などを用いてもよい。より具体的な例を、後述の実施例４２に示す。
【００４６】
このように本蛋白質（Ａ）を作用させることにより、上記一般式（Ｉ）で示されるＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を代謝し、該化合物をより雑草防除活性の低い化合物に変換する処理を行うことができる。植物の栽培域に散布された該化合物、具体的には例えば、植物の栽培域に散布され土壌や植物残渣等に残留した該化合物などに本蛋白質（Ａ）を作用させて処理することにより、該化合物による植物傷害を軽減することもできる。
【００４７】
本蛋白質（Ａ）を化合物（Ｉ）に作用させる際に利用され得る「電子供与体からの電子伝達系」としては、例えば、補酵素ＮＡＤＰＨ、フェレドキシンおよびフェレドキシン−ＮＡＤＰ＋還元酵素を含む系をあげることができる。
本蛋白質（Ａ）を化合物（Ｉ）に作用させる反応系に「電子供与体からの電子伝達系」を存在させる方法としては、例えば、ＮＡＤＰＨ、ホウレンソウ等の植物由来のフェレドキシン、ホウレンソウ等の植物由来のフェレドキシン−ＮＡＤＰ＋還元酵素を上記反応系に添加する方法をあげることができる。また、本蛋白質（Ａ）の反応系において電子伝達系として機能可能な成分を含む画分を、大腸菌などの微生物等から調製し、該反応系に添加してもよい。かかる画分を調製するには、例えば、上記のような微生物等の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理もしくはフレンチプレス処理等の物理的破砕方法、または界面活性剤もしくはリゾチーム等の菌体溶菌酵素を用いる化学的破砕方法などによって破砕する。得られた破砕液から、遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製する。該無細胞抽出液をそのまま、本蛋白質（Ａ）の反応系において電子伝達体として機能可能な成分を含む画分として、上記のフェレドキシンに替えて利用することができる。また、例えば本蛋白質（Ａ）と化合物（Ｉ）との反応が微生物や植物細胞等の細胞内で行われる場合のように、その細胞内に、電子供与体からの電子を本蛋白質（Ａ）に伝達可能な系が存在する場合には、電子伝達系を新たに反応系に添加しなくてもよい。
【００４８】
フェレドキシンとしては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉのサッカロポリスポラ属に属する微生物、より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどから調製され得るフェレドキシン［以下、一括して本蛋白質（Ｂ）と記すことがある。］を用いることもできる。具体的には例えば、以下の群から選ばれるフェレドキシン［以下、一括して本発明蛋白質（Ｂ）と記すことがある。］をあげることができる。
＜蛋白質群＞
（Ｂ１）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ１）と記すことがある。］。
（Ｂ２）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ２）と記すことがある。］。
（Ｂ３）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ３）と記すことがある。］。
（Ｂ４）配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ４）と記すことがある。］。
（Ｂ５）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ６）配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ７）配列番号１４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ７）と記すことがある。］。
（Ｂ８）配列番号１５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ８）と記すことがある。］。
（Ｂ９）配列番号１５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ９）と記すことがある。］。
（Ｂ１０）配列番号１５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ１０）と記すことがある。］。
（Ｂ１１）配列番号１５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質［以下、本発明蛋白質（Ｂ１１）と記すことがある。］。
（Ｂ１２）配列番号１４９、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１もしくは２５３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５０、２５２もしくは２５４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１３）配列番号１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシン。
（Ｂ１４）配列番号２４５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１５）配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１６）配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１７）配列番号２４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１８）配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ１９）配列番号２５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２０）配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２１）配列番号２５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（Ｂ２２）配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
【００４９】
本蛋白質（Ｂ）をコードするＤＮＡ（以下、本ＤＮＡ（Ｂ）と記すことがある。）は、例えば、本発明蛋白質（Ｂ）のアミノ酸配列である配列番号１２、１３、１４、１１１、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に基づいて、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載される通常の遺伝子工学的方法に準じた方法により取得することができる。
【００５０】
本発明蛋白質（Ｂ）をコードするＤＮＡ（以下、一括して本発明ＤＮＡ（Ｂ）と記すことがある。）としては、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ１）と記すことがある。］、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ２）と記すことがある。］、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ３）と記すことがある。］、
配列番号１１１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ４）と記すことがある。］、
配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシンをコードするＤＮＡ、
配列番号１２、１３、１４または１１１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシンをコードするＤＮＡ、
配列番号１４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ７）と記すことがある。］、
配列番号１５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ８）と記すことがある。］、
配列番号１５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ９）と記すことがある。］、
配列番号１５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明ＤＮＡ（Ｂ１０）と記すことがある。］、
配列番号１５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ［以下、本発明蛋白質（Ｂ１１）と記すことがある。］、
配列番号１４９、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１もしくは２５３で示されるアミノ酸配列のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１５０、２５２もしくは２５４で示されるアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するフェレドキシンをコードするＤＮＡ、
配列番号１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３もしくは２５４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するフェレドキシンをコードするＤＮＡ、
配列番号２４５で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２４９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２５１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２５３で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
をあげることができる。
本発明ＤＮＡ（Ｂ）のより具体的な例としては、配列番号１５、１６、１７、１１２、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、２５５、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３または２６４で示される塩基配列のいずれかを有するＤＮＡや、配列番号１５、１６、１７、１１２、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、２５５、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３もしくは２６４で示される塩基配列のいずれかと９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。かかるＤＮＡは、その塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲや該ＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション等の方法を、上述の本ＤＮＡ（Ａ）の調製方法において記載した条件等に準拠して行うことにより調製することができる。
具体的には例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１０５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１５で示される塩基配列を有するＤＮＡを得ることができる。
また、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔから調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１０６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１６で示される塩基配列を有するＤＮＡを得ることができる。
また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９から調製された染色体ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号１０７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１７で示される塩基配列を有するＤＮＡを得ることができる。
また、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ等のサッカロポリスポラ属に属する微生物　より具体的にはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどから上述のようにして調製された染色体ＤＮＡライブラリーに、配列番号１２、１３、１４、１１１、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３で示されるアミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有する約２０塩基以上の塩基からなるＤＮＡをプローブとして、上述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出しこれを回収することによって本発明ＤＮＡ（Ｂ）を取得することもできる。かかるプローブとして用いられるＤＮＡの具体例としては、配列番号１５、１６、１７、１１２、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、２５５、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３または２６４で示される塩基配列のいずれかを有するＤＮＡ、かかる塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡ、該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ等があげられる。
【００５１】
本ＤＮＡ（Ｂ）を宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本ＤＮＡ（Ｂ）とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．等に記載される通常の遺伝子工学的方法に準じた方法により調製し、これを宿主細胞に導入する。得られた形質転換体が本ＤＮＡ（Ｂ）を保有していることは、該形質転換体からＤＮＡを調製した後、調製されたＤＮＡについて、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ等に記載される遺伝子工学的分析方法（制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等）を行うことにより確認することができる。宿主細胞で機能可能なプロモーターと本ＤＮＡ（Ｂ）とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを、本ＤＮＡ（Ａ）を有する細胞に導入することにより、本ＤＮＡ（Ｂ）と本ＤＮＡ（Ａ）とを同一細胞内で発現させることもできる。
【００５２】
本蛋白質（Ｂ）は、例えば本ＤＮＡ（Ｂ）を有する細胞を培養することによって調製することができる。かかる細胞としては、本ＤＮＡ（Ｂ）を発現し本蛋白質（Ｂ）を産生する能力を有する微生物であって、例えば本ＤＮＡ（Ｂ）を有する自然界から分離された微生物株、該微生物株から薬剤や紫外線等の処理によって誘導された変異株等をあげることができる。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ等のストレプトミセス属に属する微生物、より具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔなど、または、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ等のサッカロポリスポラ属に属する微生物、より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔなどがあげられる。また、本ＤＮＡ（Ｂ）が宿主細胞に導入された形質転換体等をあげることもできる。具体的には例えば、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターまたはＴ７ファージプロモーターと機能可能な形で接続された本ＤＮＡ（Ｂ）が大腸菌に導入されてなる形質転換体をあげることができ、より具体的な例としては、後述の実施例に記載されるＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ＦＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３ＦＤ、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１ＦＤ等があげられる。
【００５３】
本ＤＮＡ（Ｂ）を有する微生物の培養は、微生物の培養に通常使用される方法に準じて、より具体的には、上述の本ＤＮＡ（Ａ）を有する微生物の培養方法において記載した条件等に準拠して行うことができる。
本ＤＮＡ（Ｂ）を有する微生物によって産生される本蛋白質（Ｂ）は、例えば、本蛋白質（Ｂ）を産生する微生物の培養物、本蛋白質（Ｂ）を産生する微生物の菌体、かかる菌体の処理物、無細胞抽出液、粗精製蛋白質、精製蛋白質等の種々の形態で本蛋白質（Ａ）の反応系に用いることができる。ここで菌体の処理物としては、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体のアルカリ処理物、菌体の有機溶媒処理物等をあげることができる。また、上記のような種々の形態の本蛋白質（Ｂ）を、例えば、合成高分子等へ吸着させる担体結合法や、高分子の網目構造の中に閉じ込める包括法などの公知の方法に準じて固定化して本蛋白質（Ａ）の反応系に用いることもできる。
【００５４】
本蛋白質（Ｂ）を、本ＤＮＡ（Ｂ）を有する微生物の培養物から精製する方法としては、蛋白質の精製において通常使用される方法を適用することができ、例えば次のような方法をあげることができる。
まず、微生物の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理等の物理的破砕方法、またはリゾチーム等の菌体溶菌酵素を用いる化学的破砕方法などによって破砕する。得られた破砕液から、遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって本蛋白質（Ｂ）を精製することができる。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で分画することにより、本蛋白質（Ｂ）をさらに精製することもできる。
【００５５】
本蛋白質（Ｂ）のフェレドキシンとしての機能は、本蛋白質（Ａ）を化合物（Ｉ）に作用させる反応系におけるフェレドキシン−ＮＡＤＰ＋還元酵素から本蛋白質（Ａ）への電子伝達体としての機能として確認することができる。具体的には例えば、本蛋白質（Ａ）を化合物（ＩＩ）に作用させる反応系に、ＮＡＤＰＨ、フェレドキシン−ＮＡＤＰ＋還元酵素、本蛋白質（Ａ）とともに本蛋白質（Ｂ）を添加し、化合物（ＩＩ）から化合物（ＩＩＩ）への変換を検出することにより確認することができる。
【００５６】
本発明の雑草防除方法においては、本蛋白質（Ａ）を発現する植物の栽培域に化合物（Ｉ）を施用する。かかる植物は、１種類の本蛋白質（Ａ）を発現していてもよいし、複数種の本蛋白質（Ａ）を発現していてもよい。本蛋白質（Ａ）としては、例えば、本発明蛋白質（Ａ）をあげることができる。本蛋白質（Ａ）を発現する植物は、例えば上述のようにして本ＤＮＡ（Ａ）を、該ＤＮＡが発現可能な位置に置かれるように植物細胞に導入し、得られた形質転換細胞から植物体を再生させることによって、本ＤＮＡ（Ａ）が導入された形質転換植物として得ることができる。植物細胞に導入される本ＤＮＡ（Ａ）には、その上流に、細胞内オルガネラへの移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡが、その読み枠を合わせて連結されていてもよい。
本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現する植物においては、その細胞中で、化合物（Ｉ）が雑草防除活性のより低い化合物へと代謝され、その結果として該化合物（Ｉ）による植物傷害が軽減されたり、該化合物（Ｉ）に対する耐性が付与されたりする。従って、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現する植物の栽培域に化合物（Ｉ）が施用された場合も良好に生育することができる。そこで、本ＤＮＡ（Ａ）が導入され本蛋白質（Ａ）を発現する植物を栽培してその栽培域に上記の雑草防除剤を施用することにより、該植物以外の雑草を効率よく取り除くことができ、該植物の収量の向上、高品質化、使用する除草剤の量の軽減、省力化などが可能となる。
【００５７】
本蛋白質（Ａ）を発現する細胞の上記一般式（Ｉ）で示される化合物または該化合物を含有する雑草防除剤に対する耐性度の評価は、本蛋白質（Ａ）をコードする遺伝子を発現する細胞と前記化合物または前記雑草防除剤とを接触させ、該細胞の傷害の度合いを評価することによって実施できる。
具体的には、本蛋白質（Ａ）を発現する微生物細胞の化合物（Ｉ）または該化合物を含有する雑草防除剤に対する耐性度を評価するには、例えば、特願平１１−１０２５３４に記載されたＰＰＯ活性阻害能を評価するために利用できる組換え大腸菌、より具体的には、Ｆ．Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｈ．Ｉｎｏｋｕｔｉ、Ｈ．Ｏｚａｋｉ，、（１９８８年）　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６３巻、２３７−２４９頁等に記載されているＰＰＯ遺伝子が欠失し増殖能を失った大腸菌ＢＴ３株等に、例えば、米国特許５９３９６０２号公報等に記載の植物のＰＰＯ遺伝子が機能可能な形で導入されてなり、該遺伝子を発現する組換え大腸菌に、さらに本ＤＮＡ（Ａ）を導入することにより、上記の植物のＰＰＯと本蛋白質（Ａ）とを発現する組換え大腸菌を作製する。当該組換え大腸菌を、化合物（Ｉ）または該化合物を含有する雑草防除剤を０〜１．０ｐｐｍ含む培養液中で３７℃で１８〜２４時間振とう培養し、当該組換え大腸菌の増殖を６００ｎｍの吸光度で測定することによって該化合物または該雑草防除剤に対する耐性度を評価することができる。本蛋白質（Ａ）としては、例えば、本発明蛋白質（Ａ）をあげることができる。
【００５８】
本蛋白質（Ａ）を発現する植物の上記一般式（Ｉ）で示される化合物または該化合物を含有する雑草防除剤に対する耐性度を評価する方法としては、該植物に雑草防除剤を散布し、該植物の生育度を測定する方法をあげることができる。より定量的に確認する方法としては、例えば、まず、該植物の葉片を様々な濃度の化合物（Ｉ）を含む水溶液中に浸すか、または、該植物の葉片に化合物（Ｉ）の水溶液を噴霧して寒天培地上で明所室温で放置する。数日後、該葉片からＭａｃｋｎｎｅｙ，　Ｇ．，　Ｊ．　Ｂｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，１４０；　ｐ３１５（１９４１）に記載の方法に準じてクロロフィルを抽出してクロロフィル含量を測定する。具体的には、例えば、該植物の葉を採取し主葉脈に沿って左右均等に２分割し、一方の葉片に雑草防除剤を全面に塗布し他方の葉片は未処理とする。これらの葉片を、０．８％寒天を含むＭＳ培地上に置き、明所、室温にて７日間放置する。次いで、各葉片を、それぞれ乳鉢と乳棒で５ｍｌの８０％アセトン水溶液中で磨砕してクロロフィルを抽出する。抽出液を８０％アセトン水溶液で１０倍に希釈した後、７５０ｎｍ、６６３ｎｍ、６４５ｎｍにおける吸光度を測定し、Ｍａｃｋｎｎｅｙ　Ｇ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　（１９４１）　１４０，　ｐ３１５記載の方法によって総クロロフィル含量を算出する。化合物（Ｉ）に対する耐性度は、処理した葉片の総クロロフィル含量の、未処理の葉片の総クロロフィル含量に対する百分率で表し比較評価することができる。本蛋白質（Ａ）としては、例えば、本発明蛋白質（Ａ）をあげることができる。
【００５９】
化合物（Ｉ）または該化合物を含有する雑草防除剤に対する耐性度を評価する上記の方法に基づいて、化合物（Ｉ）または該化合物を含有する雑草防除剤に対する耐性を示す植物や植物細胞を選抜することができる。例えば、該植物の栽培域に化合物（Ｉ）または該化合物を含有する雑草防除剤を散布し薬害が見られない植物を選抜するか、該植物細胞を化合物（Ｉ）の存在下で培養し継続的に生育する細胞を選抜する。具体的には、例えば、直径１０ｃｍ、深さ１０ｃｍの円筒形プラスチックポットに土壌を詰め、該植物の種子を播種し、温室内で栽培する。化合物（Ｉ）を含有する雑草防除剤５部、ソルポール３００５Ｘ（東邦化学）６部およびキシレン８９部をよく混合して乳剤とし、その所定量を、０．１％（Ｖ／Ｖ）の展着剤を含む１ヘクタールあたり１０００リットル相当の水で希釈し、上記のポットで栽培された植物体の上方からその茎葉部全面に均一に噴霧器で散布する。これらの植物体を１６日間温室内で栽培した後、該植物の薬害を調査し、薬害が認められない植物もしくは薬害が軽減されている植物を選抜するとよい。さらに、このようにして選抜された植物を交配させることにより、後代植物を得ることもできる。
【００６０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００６１】
実施例１、４１および４２における化合物の定量分析のためのＨＰＬＣ、ならびに化合物の分画精製のためのＨＰＬＣは、以下の条件にて行った。
（ＨＰＬＣ分析条件１）
カラム：スミパックスＯＤＳ２１１（住化分析センター製）
カラム温度：３５℃
流速：１ｍｌ／分
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
溶出液Ａ：０．０１％ＴＦＡ水溶液
溶出液Ｂ：アセトニトリル
溶出条件：溶出液Ａが９０％、溶出液Ｂが１０％の割合で混合された溶出液で平衡化されたカラムにサンプルを注入した後、溶出液Ａが９０％、溶出液Ｂが１０％の割合で混合された溶出液を５分間流し、続いて２０分間かけて溶出液Ｂの割合を１０％から９０％にまで上げながら溶出液Ａと溶出液Ｂとの混合液を流し、さらに溶出液Ａが１０％、溶出液Ｂが９０％の割合で混合された溶出液を８分間流した。
【００６２】
実施例１　微生物による化合物（ＩＩ）の代謝
（１）化合物（ＩＩ）の代謝
表１および表２に示す種々の微生物を、ＩＳＰ２寒天培地（麦芽エキス１．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．４％（ｗ／ｖ）、グルコース　０．４％（ｗ／ｖ）、寒天２．０％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．３）上に生育させ、それらの１白金耳をＴＧＹ培地（トリプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、グルコース　０．１％（ｗ／ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４　０．０１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃で２日間〜４日間振とう培養した。得られた培養液の０．１ｍｌを、化合物（ＩＩ）を１００ｐｐｍ含む３ｍｌの胞子形成培地（肉エキス０．１％（ｗ／ｖ）、トリプトース０．２％（ｗ／ｖ）、グルコース１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．１）に植菌して３０℃で７日間〜８日間振とう培養した。得られた培養液に５０μｌの２Ｎ塩酸を添加し、これを３ｍｌの酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層をＨＰＬＣで分析した。化合物（ＩＩ）（カラム保持時間２３．９分）の濃度は減少し、一方保持時間２１．６分と保持時間２２．２分の化合物（以下、それぞれ代謝物（Ｉ）と代謝物（ＩＩ）と記す。）の新たなピークが検出された。結果を表１および表２に示す。
【００６３】
【表１】
2004057194.tif 000009
【００６４】
【表２】
2004057194.tif 000010
表２中の注釈
１）　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ　ｖａｒ．ｔｏｙｏｎａｋｅｎｓｉｓ　ＡＴＣＣ２１４６８
２）　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｒｇｅｎｔｅｏｌｕｓ　ｖａｒ．ｔｏｙｏｎ　ＡＴＣＣ２１４６８ｔ
【００６５】
（２）代謝物（Ｉ）と代謝物（ＩＩ）の構造決定
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　　ＡＴＣＣ１１４２９　のグリセロールストックを３ｍｌの細菌用培地（ポリペプトン０．７％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、グルコース　１．０％（ｗ／ｖ）、Ｋ２ＨＰＯ４　０．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．２）に植菌し、試験管を用い３０℃で一晩振とう培養して前培養液を得た。この前培養液を、１００ｐｐｍの化合物（ＩＩ）を含む３００ｍｌの細菌用培地に植菌し、これを小型試験管１００本に３ｍｌずつ分注して３０℃で６日間往復振とう培養した。こうして得られた２５０ｍｌの培養液に塩酸を添加してｐＨ２に調整した後、２５０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層から溶媒を留去し、残渣を３ｍｌのアセトンに溶解し、シリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、トルエン−ぎ酸エチル−ぎ酸混合液（トルエン：ぎ酸：ぎ酸エチル＝５：７：１）を展開溶媒として展開し、Ｒｆ値０．５８付近のシリカゲルをかきとり、アセトンで抽出した。この抽出液からアセトンを留去し、残渣を１０ｍｌのアセトニトリルに溶解し、ＨＰＬＣによって分画して代謝物（Ｉ）と代謝物（ＩＩ）のみを含む画分を分取し、３．７ｍｇの代謝物（以下、代謝物Ａと記す。）を得た。
得られた代謝物Ａの質量分析を行った。代謝物Ａは化合物（ＩＩ）に比べて質量が１４小さかった。また、Ｈ‐ＮＭＲ解析により、代謝物Ａは上記式（ＩＩＩ）で示される構造を持つ化合物であることが判った。
【００６６】
（３）化合物（ＩＩＩ）の雑草防除活性試験
直径１０ｃｍ、深さ１０ｃｍの円筒形プラスチックポットに土壌を詰め、イヌビエ、ノスズメノテッポウおよびアメリカアサガオを播種し、温室内で１０日間栽培した。供試化合物５部、ソルポール３００５Ｘ（東邦化学）６部およびキシレン８９部をよく混合して乳剤とし、その所定量を、０．１％（Ｖ／Ｖ）の展着剤（特製リノー（日本農薬株式会社製））を含む１ヘクタールあたり１０００リットル相当の水で希釈し、上記のポットで栽培された植物体の上方からその茎葉部全面に均一に噴霧器で散布した。これらの植物体を１６日間温室内で栽培した後、供試化合物の雑草防除効力を調査した。結果を表３に示す。
【００６７】
【表３】
2004057194.tif 000011
直径１０ｃｍ、深さ１０ｃｍの円筒形プラスチックポットに土壌を詰め、イヌビエ、ノスズメノテッポウおよびアメリカアサガオを播種した。供試化合物５部、ソルポール３００５Ｘ（東邦化学）６部およびキシレン８９部を混合して乳剤とし、その所定量を、１ヘクタール当たり１０００リットル相当の水で希釈し、上記のポットの土壌表面全面に均一に噴霧器で散布した。これらのポットで１９日間温室内にて上記の植物を栽培した後、雑草防除効力を調査した。結果を表４に示す。
【００６８】
【表４】
2004057194.tif 000012
尚、上記の表３および表４において、雑草防除効力は、試験に用いた植物体の調査時の出芽または生育の状態が、供試化合物無処理のそれと比較してまったく違いが無いかもしくはほとんど違いが無い場合を「０」とし、植物体が完全枯死したかまたは出芽もしくは生育が完全に抑制された場合を「１０」として、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の１１段階で示す。
【００６９】
実施例２　本発明蛋白質（Ａ１）の調製
（１）菌体粗抽出液の調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８株のグリセロールストックを、１００ｍｌのＡ培地（グルコース０．１％（ｗ／ｖ）、トリプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）を入れた５００ｍｌ容三角フラスコに添加し、３０℃で一日間旋回培養して、前培養液を得た。この前培養液８ｍｌを２００ｍｌのＡ培地に植菌し、５００ｍｌ容羽付フラスコ内で３０℃で２日間、旋回培養した。このようにして得られた培養液から遠心分離（３，０００×ｇ、５分間）によって湿菌体を回収した。この湿菌体を１００ｐｐｍの化合物（ＩＩ）を含む１００ｍｌのＢ培地（グルコース１％（ｗ／ｖ）、牛肉エキス０．１％、トリプトース０．２％（ｗ／ｖ））に懸濁して、５００ｍｌ容坂口フラスコ内で３０℃で１６時間往復振とう培養した。このようにして得られた培養液１０Ｌから遠心分離（３，０００×ｇ、５分間）によって湿菌体を回収した。得られた湿菌体を１Ｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）にて２回洗浄し、１６２ｇの湿菌体を得た。
この湿菌体を、菌体湿重量１ｇあたり２ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、この懸濁液に、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５ｍＭ　ベンザミジン塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１ｍＭ　ジチオトレイトールを添加した。これをフレンチプレス（大岳製作所製）で２回繰り返し破砕（１０００ｋｇ／ｃｍ２）して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液を遠心分離（４０，０００×ｇ、３０分間）した後、上清を回収してこれを１５０，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清（以下、菌体粗抽出液と記す。）を分取した。
【００７０】
（２）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２．４ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（以下、Ａ成分と記す。オリエンタル酵母社製）、０．５ｍｇ／ｍｌ　ホウレンソウ由来のフェレドキシン（以下、Ｂ成分と記す。ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（以下、Ｃ成分と記す。ＳＩＧＭＡ社製）および実施例２（１）で回収された菌体粗抽出液１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させそのうち５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表５に示す。
【００７１】
【表５】
2004057194.tif 000013
【００７２】
（３）菌体粗抽出液の分画
実施例２（１）で得られた菌体粗抽出液に４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離して上清を回収した。得られた上清に５５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離し、沈殿を回収して２７．５ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。この溶解液をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分（以下、硫安沈殿４５−５５％画分と記す。）３８．５ｍｌを分取した。
【００７３】
（４）本発明蛋白質（Ａ１）の単離
実施例２（３）で調製された硫安沈殿４５−５５％画分を、ＨｉＬｏａｄ２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。次いで、前記カラムに１０６ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００１４１５Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲　０Ｍから　０．３７５Ｍ、流速３ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．２１Ｍ〜０．２２Ｍにて溶出された画分２５ｍｌを分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分を回収した。
回収された画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、Ａバッファー（１．５ｍＭの塩化カルシウムを含む２ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。次いで、該画分をＢｉｏ−ＳｃａｌｅＣｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　ＴｙｐｅＩｃｏｌｕｍ　ＣＨＴ１０−Ｉ（バイオラッド社製）に注入し、該カラムに３０ｍｌのＡバッファーを流した。次いで、前記カラムにＢバッファー（０．０３ｍＭの塩化カルシウムを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）の直線濃度勾配を付してＡバッファーを流し（Ａバッファー１００％から開始し、１００分間かけてＢバッファー濃度を５０％にまで増加させる直線濃度勾配、流速２ｍｌ／分）、Ｂバッファー濃度１７％〜２０％にて溶出された画分を分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収された画分を限外ろ過フィルター（マイクロコンＹＭ−３０、ミリポア社製）を用いて２０倍濃縮し、ＨｉＬｏａｄ１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　ｐｇカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。前記カラムに、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を流し（流速１ｍｌ／ｍｉｎ）、溶出液を２ｍｌずつ分画し、溶出体積５６ｍｌ〜６６ｍｌに溶出した画分をそれぞれ分取した。各画分に含まれる蛋白質をＳＤＳ−１０％〜２０％ＰＡＧＥで分析した。
分取された各画分を実施例２（２）に記載の反応液における菌体粗抽出液の代わりに添加し、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および１４Ｃで標識された化合物（ＩＩ）の存在下に、実施例２（２）と同様に保温した。保温後の反応液をＴＬＣ分析し、１４Ｃで標識された　化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度を調べた。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約４７ｋＤａの位置に泳動された蛋白質は、連続した画分における蛋白質バンドの濃さの変動と、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度の変動がパラレルに観察された。該蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから回収し、プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９４ＨＴ型、Ｐｕｌｓｅｄ　ｌｉｑｉｄ法で分析）によるアミノ末端アミノ酸配列解析に供した。その結果、配列番号１８で示されるアミノ酸配列が読み取られた。また、前記蛋白質をトリプシンにより消化した後、得られた消化物を質量分析した（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ社製イオントラップ質量分析計ＬＣＱ、カラム：ＬＣ　Ｐａｃｋｉｎｇｓ社製ＰｅｐＭＡＰ　Ｃ１８　７５μｍ×１５０ｍｍ、移動相Ａ：０．１％ＨＯＡｃ−Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＨＯＡｃ−メタノール、グラジエント：移動相Ａ９５％、移動相Ｂ５％の割合で混合された溶出液から開始し、３０分間かけて移動相Ｂ濃度を１００％にまで増加させる直線濃度勾配、流速：０．２μｌ／分）。その結果、配列番号１９で示されるアミノ酸配列が読み取られた。
【００７４】
実施例３　本発明ＤＮＡ（Ａ１）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８の染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８を５０ｍｌのＹＥＭＥ培地（酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ））で１日間〜３日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ湿重当り１ｍｌのバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ）に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【００７５】
（２）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８の染色体ＤＮＡライブラリーの調製
実施例３（１）で調製された染色体ＤＮＡ９４３ｎｇを１Ｕの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで３７℃で６０分間消化した。得られた消化液を、０．７％アガロースゲル電気泳動で分画して、約２．０ｋｂｐのＤＮＡをゲルから回収した。Ｐｒｅｐ−Ａ−ＧｅｎｅＲ　ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＢＩＯ‐ＲＡＤ社製）を用いて当該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製し、目的とするＤＮＡを含む溶液１０μｌを得た。得られたＤＮＡ溶液のうち１μｌと、制限酵素ＢａｍＨＩで消化され脱リン酸化処理されたプラスミドベクターｐＵＣ１１８　９８ｎｇとライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造社製）のＩ液１１μｌとを混合し、１６℃、終夜保温した。このライゲーション液５μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、該大腸菌を３０℃で一晩振とう培養した。得られた培養液から大腸菌を集菌してプラスミドを抽出し、染色体ＤＮＡライブラリーとした。
【００７６】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１）の単離
実施例３（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った（図１）。プライマーとしては、配列番号３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対１と記す。）を用いた。ここで、配列番号３５で示される塩基配列は配列番号１８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に基づいて設計した。また、配列番号３６で示される塩基配列は配列番号１９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列に基づいて設計した。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、上記染色体ＤＮＡを２５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）（クロンテック社製）を０．５μｌ、５ｘＧＣゲノミックＰＣＲ反応バッファー（クロンテック社製）を５μｌ、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２を１．１μｌ、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔ（クロンテック社製）を５μｌおよびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を２５μｌにした。ＰＣＲの反応条件は９５℃で１分間保温した後、９４℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で５分間保温した。保温後の反応液を４％のアガロースゲル電気泳動に供し、約１５０ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収されたゲルからＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）とＭ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）をプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号９で示される塩基配列の塩基番号３６〜１３２に示される塩基配列が読み取られた。該塩基配列には配列番号１８で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１２〜２３で示されるアミノ酸配列がコードされていた。従って、このＤＮＡは、本発明蛋白質（Ａ１）の一部をコードするＤＮＡであると推定された。
【００７７】
次に、実施例３（２）で調製された染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、上記と同様の条件でＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）によるＰＣＲを行った。プライマーとしては配列番号３７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対２と記す。）、または、配列番号３９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対３と記す。）を用いた。
次いで、プライマー対２を用いて得られた反応液を鋳型溶液とし、配列番号４１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの組合わせ（以下、プライマー対４と記す）をプライマーとして用いＰＣＲを行うことにより、配列番号９で示される塩基配列の塩基番号１３２で示される塩基より３’側下流に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。同様に、プライマー対３を用いて得られた反応液を鋳型溶液とし、配列番号４２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対５と記す）をプライマーとして用いＰＣＲを行うことにより、配列番号９で示される塩基配列の塩基番号３６で示される塩基の５’側上流に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。プライマー対４を用いて増幅された約２ｋｂｐのＤＮＡ、および、プライマー対５を用いて増幅された約１５０ｂｐのＤＮＡは、上記と同様にしてＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１にクローニングした。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）とＭ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）および配列番号４３〜５０で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。プライマー対４を用いて増幅された約２ｋｂｐのＤＮＡの塩基配列を解析した結果から、配列番号９で示される塩基配列の塩基番号１３３〜１４３９で示される塩基配列が読み取られた。また、プライマー対５を用いて増幅された約１５０ｂｐのＤＮＡの塩基配列を解析した結果から、配列番号９で示される塩基配列の塩基番号１〜３５で示される塩基配列が読み取られた。得られた塩基配列を連結した結果、配列番号９で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２２７塩基（終止コドンを含む）からなり４０８アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号６）と、２０１塩基（終止コドンを含む）からなり６６アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号１５）とが含まれた。配列番号６で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１）からなる蛋白質の分子量は４５２１３Ｄａと計算された。また、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列には、本発明蛋白質（Ａ１）のＮ末端アミノ酸配列解析から決定されたアミノ酸配列（配列番号１８）とトリプシン消化断片の質量分析によるアミノ酸配列解析から決定されたアミノ酸配列（配列番号１９）とが含まれていた。配列番号１５で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）からなる蛋白質の分子量は６８１８Ｄａと計算された。
【００７８】
実施例４　本発明蛋白質（Ａ１）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３（１）でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｅｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号５１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対１９と記す。）、または、配列番号５１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２０と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ３００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ、１０×Ｅｘｐａｎｄ　ＨＦバッファー（ＭｇＣｌ２含有）を５．０μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．７５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌとした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６８℃で３０秒間さらに７２℃で２分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液をそれぞれ１％アガロースゲル電気泳動に供し、プライマー対１９を用いた反応液を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、プライマー対２０を用いた反応液を供したゲルからは約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたそれぞれのゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡとｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、Ｍ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、配列番号４３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび４６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。得られた反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号６で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６５７とし、配列番号９で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣ��６５７Ｆとした。
一方、プラスミドｐＫＳＮ２４Ｒ２（Ａｋｉｙｏｓｈｉ−ＳｈｉｂａＴａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：　Ｐ３３５（１９９４）に記載）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｍｎＩで消化した。得られた約３ｋｂのＤＮＡに、配列番号１３４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１３５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをアニールさせて得られるリンカー（図４７）を挿入し、得られたプラスミドをｐＫＳＮ２（図４）とした。
次に、上記のプラスミドｐＣＲ６５７とｐＣＲ６５７Ｆをそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲ６５７の消化物を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲ６５７Ｆの消化物を供したゲルからは約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからそれぞれ、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたそれぞれのＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号６で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１）をコードする上記の約１．２ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６５７とした。また、配列番号９で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１）をコードする上記の約１．５ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６５７Ｆとした。これらプラスミドｐＫＳＮ６５７およびｐＫＳＮ６５７Ｆをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をそれぞれＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【００７９】
（２）本発明蛋白質（Ａ１）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１７時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む前記バッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収した。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、クマージ−ブリリアントブルー（以下、ＣＢＢと記す。）染色した。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆのいずれにおいても、分子量約４７ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドが検出された。このバンドは、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆにおいて大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７よりも、濃く検出された。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆのほうが、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７よりも本発明蛋白質（Ａ１）を多く発現していることが示された。
【００８０】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例４（２）で回収された上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表６に示す。
【００８１】
【表６】
2004057194.tif 000014
【００８２】
実施例５　本発明蛋白質（Ａ２）の調製
（１）菌体粗抽出液の調製
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔのグリセロールストックを、１０ｍｌのＡ培地（グルコース０．１％（ｗ／ｖ）、トリプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、りん酸水素二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）を入れた１０ｍｌ容試験管に添加し、３０℃で一晩往復振とう培養して、前培養液を得た。この前培養液８ｍｌを２００ｍｌのＡ培地に植菌し、５００ｍｌ容羽付フラスコ内で３０℃で２日間、旋回培養した。このようにして得られた培養液から遠心分離（３，０００×ｇ、１０分間）によって湿菌体を回収した。この湿菌体を１００ｐｐｍの化合物（ＩＩ）を含む１００ｍｌのＢ培地（グルコース１％（ｗ／ｖ）、牛肉エキス０．１％、トリプトース０．２％（ｗ／ｖ））に懸濁して、５００ｍｌ容坂口フラスコ内で３０℃で２０時間往復振とう培養した。このようにして得られた培養液１０Ｌから遠心分離（３，０００×ｇ、１０分間）によって湿菌体を回収した。得られた湿菌体を１Ｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）にて２回洗浄し、１１９ｇの湿菌体を得た。
この湿菌体を、菌体湿重量１ｇあたり２ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、この懸濁液に、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５ｍＭ　ベンザミジン塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、３μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、３μｇ／ｍｌ、ペプスタチンＡおよび１ｍＭ　ジチオトレイトールを添加した。これをフレンチプレス（大岳製作所製）で２回繰り返し破砕（１０００ｋｇ／ｃｍ２）して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液を遠心分離（４０，０００×ｇ、３０分間）した後、上清を回収してこれを１５０，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清（以下、菌体粗抽出液と記す。）を分取した。
【００８３】
（２）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２．４ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、０．５ｍｇ／ｍｌ　ホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例５（１）で回収された菌体粗抽出液１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表７に示す。
【００８４】
【表７】
2004057194.tif 000015
【００８５】
（３）菌体粗抽出液の分画
実施例５（１）で得られた菌体粗抽出液に４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、３０分間遠心分離して上清を回収した。得られた上清に５５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離し、沈殿を回収して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）に溶解して３２．５ｍｌとした。この溶解液をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分（以下、硫安沈殿４５−５５％画分と記す。）４５．５ｍｌを分取した。
【００８６】
（４）本発明蛋白質（Ａ２）の単離
実施例５（３）で調製された硫安沈殿４５−５５％画分を、ＨｉＬｏａｄ２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。次いで、前記カラムに１００ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００４Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲　０Ｍから０．５Ｍ、流速８ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．２５Ｍから０．２６Ｍにて溶出された画分３０ｍｌを分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収した画分をＰＤ１０カラムに供し、Ａバッファー（１．５ｍＭの塩化カルシウムを含む２ｍＭリン酸カリウムバッファー；ｐＨ７．０）で溶出させ、回収された蛋白質を含む画分を回収した。次いで、該画分をＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　ＴｙｐｅＩｃｏｌｕｍ　ＣＨＴ１０−Ｉ（バイオラッド社製）に注入し、該カラムに２０ｍｌのＡバッファーを流した。次いで、前記カラムにＢバッファー（０．０３ｍＭの塩化カルシウムを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）の直線濃度勾配を付してＡバッファーを流し（Ａバッファー１００％から開始し、１００分間かけてＢバッファー濃度を５０％にまで増加させる直線濃度勾配、流速２ｍｌ／分）、Ｂバッファー濃度２３％〜２５％にて溶出された画分１０ｍｌを分取した。さらにこの分取された画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収した画分を限外ろ過（マイクロコンフィルターユニットマイクロコン−３０、ミリポア社製）にて約７７０μｌにまで濃縮し、このうち７００μｌをＨｉＬｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　ｐｇ　カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。前記カラムに、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を流し（流速１ｍｌ／分）、溶出液を２ｍｌずつ分画し、溶出体積６１ｍｌ前後に溶出した数画分をそれぞれ分取した。各画分に含まれる蛋白質をＳＤＳ−１０％〜２０％ＰＡＧＥで分析した。
分取した各画分を実施例５（２）に記載の反応液における菌体粗抽出液の代わりに添加し、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および１４Ｃで標識された化合物（ＩＩ）の存在下に、実施例５（２）と同様に保温した。保温後の反応液をＴＬＣ分析し、１４Ｃで標識された　化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度を調べた。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約４７ｋＤａの位置に泳動された蛋白質は、連続した画分における蛋白質バンドの濃さの変動と、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度の変動がパラレルに観察された。該蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから回収し、プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９４ＨＴ型、Ｐｕｌｓｅｄ　ｌｉｑｉｄ法で分析）によるＮ末端アミノ酸配列解析に供した。その結果、配列番号２０で示されるアミノ酸配列が読み取られた。また、前記蛋白質をトリプシンにより消化した後、得られた消化物を質量分析した（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ社製イオントラップ質量分析計ＬＣＱ、カラム：ＬＣ　Ｐａｃｋｉｎｇｓ社製ＰｅｐＭＡＰ　Ｃ１８　７５μｍ×１５０ｍｍ、移動相Ａ：０．１％ＨＯＡｃ−Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＨＯＡｃ−メタノール、グラジエント：移動相Ａ９５％、移動相Ｂ５％の割合で混合された溶出液から開始し、３０分間かけて移動相Ｂを１００％にまで増加させるリニアグラジエント、流速：０．２μｌ／分）。その結果、配列番号２１で示されるアミノ酸配列が読み取られた。
【００８７】
実施例６　本発明ＤＮＡ（Ａ２）の取得
（１）Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔの染色体ＤＮＡの調製
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔを５０ｍｌのＹＥＭＥ培地（酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ））で１日間〜３日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ湿重当り１ｍｌのバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ）に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【００８８】
（２）Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔの染色体ＤＮＡライブラリーの調製
実施例６（１）で調製された染色体ＤＮＡ１９μｇを、０．７８Ｕの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで３７℃で６０分間消化した。得られた消化液を、１％アガロースゲル電気泳動で分画して、約２．０ｋｂｐのＤＮＡをゲルから回収した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて当該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製し、さらにエタノール沈殿によって濃縮して、目的とするＤＮＡを含む溶液１０μｌを得た。得られたＤＮＡ溶液のうち８μｌと、制限酵素ＢａｍＨＩで消化され脱リン酸化処理されたプラスミドベクターｐＵＣ１１８　１００ｎｇとライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造社製）のＩ液１２μｌとを混合し、１６℃で３時間保温した。このライゲーション液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを寒天培地上から回収してプラスミドを抽出し、染色体ＤＮＡライブラリーとした。
【００８９】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２）の単離
実施例６（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型としてエキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を用いてＰＣＲを行った（図２）。プライマーとしては、配列番号５４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対６と記す。）を用いた。ここで配列番号５４で示される塩基配列は、配列番号２０で示されるＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に基づき設計された。また、配列番号５５で示される塩基配列は、配列番号２１で示される内部アミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列に基づいて設計された。ＰＣＲ反応液は、上記染色体ＤＮＡを３００ｎｇ、２種類のプライマーをそれぞれ７．５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を０．２μｌ、１０×バッファー（ＭｇＣｌ２含有）を２．５μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．１９μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を２５μｌにした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液を２％のアガロースゲル電気泳動に供し、約８００ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収されたゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）とＭ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）をプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号１０で示される塩基配列の塩基番号３６〜８１９で示される塩基配列が読み取られた。読み取られた塩基配列のうち、配列番号１０に示される塩基配列の塩基番号３７〜６０には、配列番号２０で示されるアミノ酸配列の一部がコードされていた。従って、このＤＮＡは本発明蛋白質（Ａ２）の一部をコードするＤＮＡであると推定された。
【００９０】
次に、実施例６（２）で調製された染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、上記と同様の条件でエキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）によるＰＣＲを行った。配列番号５６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対７と記す）をプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、配列番号１０で示される塩基配列の塩基番号３６で示される塩基より５’側上流に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。また、配列番号５８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対８と記す）をプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、配列番号１０で示される塩基配列の塩基番号８１９で示される塩基よりも３’側下流に伸長する塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。プライマー対７を用いて増幅された約１．３ｋｂｐのＤＮＡ、およびプライマー対８を用いて増幅された約０．４ｋｂのＤＮＡをそれぞれ、上記と同様にしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクターにクローニングした。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）とＭ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）および配列番号６０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。プライマー対７を用いて増幅された約１．３ｋｂのＤＮＡの塩基配列を解析した結果から、配列番号１０で示される塩基配列の塩基番号１〜３５で示される塩基配列が読み取られた。また、プライマー対８を用いて増幅された約０．４ｋｂのＤＮＡの塩基配列を解析した結果から、配列番号１０で示される塩基配列の塩基番号８１９〜１４１５で示される塩基配列が読み取られた。読み取られた全ての塩基配列を連結した結果、配列番号１０で示される塩基配列が得られた。該配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２０６塩基（終止コドンを含む）からなり４０１アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号７）と、１９８塩基（終止コドンを含む）からなり６５アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号１６）とが含まれた。配列番号７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２）からなる蛋白質の分子量は４３９８３Ｄａと計算された。また、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列には、本発明蛋白質（Ａ２）のＮ末端アミノ酸配列解析から決定されたアミノ酸配列（配列番号２０）とトリプシン消化断片の質量分析によるアミノ酸配列解析から決定されたアミノ酸配列（配列番号２１）とが含まれていた。配列番号１６で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１３）からなる蛋白質の分子量は６７０７Ｄａと計算された。
【００９１】
実施例７　本発明蛋白質（Ａ２）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６（１）でＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔから調製された染色体ＤＮＡを鋳型とし、エキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２１と記す。）、または、配列番号６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２２と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ３００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ、１０×Ｅｘｐａｎｄ　ＨＦバッファー（ＭｇＣｌ２含有）を５．０μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．７５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌとした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液をそれぞれ１％アガロースゲル電気泳動に供し、プライマー対２１を用いた反応液を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、プライマー対２２を用いた反応液を供したゲルからは約１．４ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたゲルからそれぞれＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡとｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、Ｍ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、配列番号５６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号６４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。得られた反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号７で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ９２３とし、配列番号１０で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ９２３Ｆとした。
次に、上記プラスミドｐＣＲ９２３とｐＣＲ９２３Ｆをそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲ９２３の消化物を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲ９２３Ｆの消化物を供したゲルからは約１．４ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからそれぞれＱＩＡ　ｑｕｉｃｋＧｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたそれぞれのＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号７で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２）をコードする上記の約１．２ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ９２３とした。また、配列番号１０で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２）をコードする上記の約１．４ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ９２３Ｆとした。これらプラスミドｐＫＳＮ９２３およびｐＫＳＮ９２３Ｆをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をそれぞれＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３Ｆとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【００９２】
（２）本発明蛋白質（Ａ２）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３Ｆ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養し、得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸　を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１７時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）した後、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収した。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色した。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３およびｐＫＳＮ９２３Ｆにおいて分子量約４７ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドが検出された。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３および大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３Ｆは本発明蛋白質（Ａ２）を発現していることが確認された。
【００９３】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例７（２）で回収された上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表８に示す。
【００９４】
【表８】
2004057194.tif 000016
【００９５】
実施例８　本蛋白質（Ａ１０）の調製
（１）菌体粗抽出液の調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ　１１７９６　のグリセロールストックを、２５０ｍｌのＢ培地（グルコース１％（ｗ／ｖ）、牛肉エキス０．１％、トリプトース０．２％（ｗ／ｖ））を入れた５００ｍｌ容羽付きフラスコに添加し、３０℃で３日間旋回培養して、前培養液を得た。この前培養液４０ｍｌを４００ｍｌのＢ培地に植菌し、１Ｌ容三角フラスコ内で３０℃で２４時間、旋回培養した。培養停止後静置し、上清のみ２２０ｍｌを除去して残りの約２２０ｍｌの培養液に、同様に調製した培養液約２２０ｍｌを加え、合計約４４０ｍｌとした。これに１００ｐｐｍとなるように化合物（ＩＩ）を添加し、１Ｌ容三角フラスコ内で３０℃で４０時間旋回培養した。このようにして得られた培養液約２．６Ｌから遠心分離（３，０００×ｇ、５分間）によって湿菌体を回収した。得られた湿菌体を１Ｌの０．１Ｍ　ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．８）にて洗浄し、２６ｇの湿菌体を得た。
この湿菌体を、菌体湿重量１ｇあたり３ｍｌの０．１Ｍ　ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．８）に懸濁し、この懸濁液に、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５ｍＭ　ベンザミジン塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、３μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、３μｇ／ｍｌ、ペプスタチンＡおよび１ｍＭ　ジチオトレイトールを添加した。これをフレンチプレス（大岳製作所製）で２回繰り返し破砕（１０００ｋｇ／ｃｍ２）して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液を遠心分離（４０，０００×ｇ、３０分間）した後、上清を回収してこれを１５０，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清（以下、菌体粗抽出液と記す。）を分取した。
【００９６】
（２）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２．４ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、０．５ｍｇ／ｍｌ　ホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例８（１）で回収された菌体粗抽出液１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表９に示す。
【００９７】
【表９】
2004057194.tif 000017
【００９８】
（３）菌体粗抽出液の分画
実施例８（１）で得られた菌体粗抽出液に４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、３０分間遠心分離して上清を回収した。得られた上清に５５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離し、沈殿を回収して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）に溶解して１０ｍｌとした。この溶解液をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分（以下、硫安沈殿４５−５５％画分と記す。）１４ｍｌを分取した。
【００９９】
（４）本蛋白質（Ａ１０）の単離
実施例８（３）で調製された硫安沈殿４５−５５％画分を、ＭｏｎｏＱ　ＨＲ　１０／１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。次いで、前記カラムに１６ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）でカラムを流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００６２５Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲　０Ｍから０．５Ｍ、流速４ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．２８Ｍ〜０．３１Ｍにて溶出された画分１５ｍｌを分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収された画分をＰＤ１０カラムに供し、Ａバッファー（１．５ｍＭの塩化カルシウムを含む２ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。次いで、該画分をＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　ＴｙｐｅＩｃｏｌｕｍ　ＣＨＴ１０−Ｉ（バイオラッド社製）に注入し、該カラムに５０ｍｌのＡバッファーを流した。次いで、前記カラムにＢバッファー（０．０３ｍＭの塩化カルシウムを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）の直線濃度勾配を付してＡバッファーを流し（Ａバッファー１００％から開始し、４０分間かけてＢバッファー濃度を５０％にまで増加させる直線濃度勾配、流速５ｍｌ／分）、Ｂバッファー濃度１６％〜３１％にて溶出された溶液を５ｍｌずつ分画した。さらにこの分取された画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。各画分に含まれる蛋白質をＳＤＳ−１０％〜２０％ＰＡＧＥで分析した。
分取した各画分を実施例８（２）に記載の反応液における菌体粗抽出液の代わりに添加し、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および１４Ｃで標識された化合物（ＩＩ）の存在下に、実施例８（２）と同様に保温した。保温後の反応液をＴＬＣ分析し、１４Ｃで標識された　化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度を調べた。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約４５ｋＤａの位置に泳動された蛋白質は、連続した画分における蛋白質バンドの濃さの変動と、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットの強度の変動がパラレルに観察された。該蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから回収し、トリプシンにより消化した後、得られた消化断片を質量分析した（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ社製イオントラップ質量分析計ＬＣＱ、カラム：ＬＣ　Ｐａｃｋｉｎｇｓ社製ＰｅｐＭＡＰ　Ｃ１８　７５μｍ×１５０ｍｍ、移動相Ａ：０．１％ＨＯＡｃ−Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＨＯＡｃ−メタノール、グラジエント：移動相Ａ９５％、移動相Ｂ５％の割合で混合された溶出液から開始し、３０分間かけて移動相Ｂを１００％にまで増加させるリニアグラジエント、流速：０．２μｌ／分間）。その結果、配列番号２２〜３４のいずれかでそれぞれ示されるアミノ酸配列が読み取られた。
【０１００】
実施例９　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６の染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６　を　５０ｍｌのＹＥＭＥ培地［酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ）］で１日間〜３日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ当り１ｍｌのバッファー［１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ］に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【０１０１】
実施例１０　本ＤＮＡ（Ａ１０）をコードするＤＮＡの取得と大腸菌での発現
（１）本ＤＮＡを有する形質転換大腸菌の作製
実施例９でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　　ＡＴＣＣ１１７９６　から調製された染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｅｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号８０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２３と記す。）、または、配列番号７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号８１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２４と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ３００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ、１０×Ｅｘｐａｎｄ　ＨＦバッファー（ＭｇＣｌ２含有）を５．０μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．７５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌとした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６８℃で３０秒間さらに７２℃で２分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液をそれぞれ１％アガロースゲル電気泳動に供しプライマー対２３を用いた反応液を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、プライマー対２４を用いた反応液を供したゲルからは約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたそれぞれのゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡとｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし、−２１Ｍ１３プライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、Ｍ１３Ｒｅｖプライマー（アプライドバイオシステムズジャパン社製）、配列番号８２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。得られた反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号８４で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１１７９６とし、配列番号８５で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ��１７９６Ｆとした。配列番号８５で示される塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２２１塩基（終止コドンを含む）からなり４０６アミノ酸残基（配列番号５で示されるアミノ酸配列）をコードする塩基配列（配列番号８４）と、２１０塩基（終止コドンを含む）からなり６９アミノ酸残基をコードする塩基配列とが含まれた。
次に、上記のｐＣＲ１１７９６とｐＣＲ１１７９６Ｆをそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲ１１７９６の消化物を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲ１１７９６Ｆの消化物を供したゲルからは約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからそれぞれ、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたそれぞれのＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号８４で示される塩基配列を含有し本蛋白質（Ａ１０）をコードする上記の約１．２ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ１１７９６とした。また、配列番号８５で示される塩基配列を含有し本蛋白質（Ａ１０）をコードする上記の約１．５ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ１１７９６Ｆとした。これらプラスミドｐＫＳＮ１１７９６およびｐＫＳＮ１１７９６Ｆをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をそれぞれＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６Ｆとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【０１０２】
（２）本蛋白質（Ａ１０）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６Ｆ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸　を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１７時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）した後、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収した。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色した。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６Ｆのいずれにおいても、分子量約４５ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドが検出された。このバンドは、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６Ｆにおいて大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６よりも、濃く検出された。大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６Ｆのほうが、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１１７９６よりも本蛋白質（Ａ１０）を多く発現していることが示された。
【０１０３】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例１０（２）で回収された上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表１０に示す。
【０１０４】
【表１０】
2004057194.tif 000018
【０１０５】
実施例１１　本発明ＤＮＡ（Ａ３）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９の染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９を５０ｍｌのＹＥＭＥ培地（酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ））で１日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ当り１ｍｌのバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ）に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【０１０６】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ３）の単離
実施例１１（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号６５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対９と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液は、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを２５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を４μｌ、１０ｘＥｘＴａｑバッファーを５μｌ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は９７℃で２分間保温し、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で９０秒のサイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で４分間保温した。保温後の反応液を０．８％のアガロースゲル電気泳動に供し、約１．４ｋｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収されたゲルからＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号６９で示される塩基配列が読み取られた。この塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１１８８塩基（終止コドンを含む）からなり３９５アミノ酸残基をコードする塩基配列と、１９５塩基（終止コドンを含む）からなり６４アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号１７）とが含まれた。配列番号１７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質の分子量は６６６６Ｄａと計算された。
【０１０７】
実施例１２　本発明蛋白質（Ａ３）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ３）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例１１（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、上記と同様の条件でＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造製）によるＰＣＲを行った。プライマーとしては配列番号７０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対１０と記す。）、または、配列番号７０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対１１と記す。）を用いた。プライマー対１０を用いて増幅された約１．２ｋｂのＤＮＡおよびプライマー対１１を用いて増幅された約１．５ｋｂのＤＮＡは、上記方法にてＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１にクローニングした。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号６８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号７３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、プライマー対１０を用いて増幅されたＤＮＡをクローニングしたプラスミドは配列番号８で示される塩基配列を有することが確認され、プライマー対１１を用いて増幅されたＤＮＡをクローニングしたプラスミドは配列番号１１で示される塩基配列を有することが確認された。配列番号１１で示される塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１１８８塩基（終止コドンを含む）からなり３９５アミノ酸残基をコードする塩基配列（配列番号８）と、１９５塩基（終止コドンを含む）からなり６４アミノ酸残基をコードする塩基配列とが含まれた。配列番号８で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質の分子量は４３７５２Ｄａと計算された。得られたプラスミドのうち、配列番号８で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６７１とし、配列番号１１で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６７１Ｆとした。
次に、上記のｐＣＲ６７１およびｐＣＲ６７１Ｆをそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲ６７１の消化物を供したゲルからは約１．２ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲ６７１Ｆの消化物を供したゲルからは約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからそれぞれ、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたそれぞれのＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号８で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ３）をコードする上記の約１２００ｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６７１とした。また、配列番号１１に示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ３）をコードする上記の約１４００ｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６５７Ｆとした。これらプラスミドｐＫＳＮ６７１とｐＫＳＮ６７１Ｆをそれぞれ大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をそれぞれＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１Ｆとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【０１０８】
（２）本発明蛋白質（Ａ３）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１Ｆ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸　を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１７時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間×６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収した。
【０１０９】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例１２（２）で回収した上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表１１に示す。
【０１１０】
【表１１】
2004057194.tif 000019
【０１１１】
実施例１３　本ＤＮＡ（Ａ９）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５の染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ　ＳＡＮＫ６２５８５（微工研条寄第１１４５号：ＢＰ−１１４５）を５０ｍｌのＹＥＭＥ培地（酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ））で１日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ当り１ｍｌのバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ）に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【０１１２】
（２）本ＤＮＡ（Ａ９）の単離
実施例１３（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号７４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対１２と記す。）、または、配列番号７６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせ（以下、プライマー対１３と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを２５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を４μｌ、１０ｘＥｘＴａｑバッファーを５μｌおよびＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は９７℃で２分間保温し、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で９０秒のサイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で４分間保温した。保温後の反応液をそれぞれ０．８％のアガロースゲル電気泳動に供し、プライマー対１２を用いたＰＣＲの反応液を分離したゲルからは約５００ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収し、プライマー対１３を用いたＰＣＲの反応液を分離したゲルからは約８００ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収された各ゲルからＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたそれぞれのＤＮＡを、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６８で示される塩基配列からオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、プライマー対１２を用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡからは、配列番号７８で示される塩基配列の塩基番号１〜４９８で示される塩基配列が、プライマー対１３を用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡからは、配列番号７８で示される塩基配列の塩基番号４６９〜１２３３で示される塩基配列が読み取られた。配列番号７８で示される塩基配列の塩基番号１〜４９８で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲＳＣＡ１、配列番号７８で示される塩基配列の塩基番号４６９〜１２３３で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲＳＣＡ２とした。
【０１１３】
実施例１４　本蛋白質（Ａ９）の大腸菌での発現
（１）本ＤＮＡ（Ａ９）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例１３（２）で得られたプラスミドのうち、上記のプラスミドｐＣＲＳＣＡ１を制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化し、また、ｐＣＲＳＣＡ２を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。それぞれの消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲＳＣＡ２の消化物を供したゲルからは約５００ｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲＳＣＡ２の消化物を供したゲルからは約８００ｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡ２種と、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号７８に示される塩基配列を含有し本蛋白質（Ａ９）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮＳＣＡとした。
【０１１４】
（２）本蛋白質（Ａ９）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮＳＣＡを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養した。得られた培養液を、ＯＤ６６０が約０．２となるように５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養した。ＯＤ６６０が約２．０になったところで、最終濃度５００μＭになるように５−アミノレブリン酸　を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度２００μＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに５時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮＳＣＡから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮＳＣＡと記す。）を回収した。
【０１１５】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例１４（２）で回収された上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表１２に示す。
【０１１６】
【表１２】
2004057194.tif 000020
【０１１７】
実施例１５　ダイズＲｕＢＰＣ遺伝子の単離
ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）を播種した後、２７℃で３０日間栽培し、緑葉を採取した。採取した緑葉０．２ｇ〜０．３ｇを液体窒素で凍結させ、これを乳鉢と乳棒で磨砕し、該磨砕物から、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて付属のマニュアルに従って全ＲＮＡを抽出した。さらに、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行ないｃＤＮＡを合成した。具体的にはプライマーとして前記キットに含まれるＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８　Ｐｒｉｍｅｒを用い、ダイズ全ＲＮＡを鋳型として使用し、前記キットに含まれる逆転写酵素を添加して１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを合成した。続いて、得られたｃＤＮＡを鋳型にして、配列番号８６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のｒｉｂｕｌｏｓｅ−１，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（以下、ＲｕＢＰＣと記す。）小サブユニットの葉緑体トランジットペプチド（以下、ｒＳｔと記すことがある。）とこれに続く成熟タンパク質の１２アミノ酸とをコードする塩基配列を含むＤＮＡ（以下、本ｒＳｔ１２ＤＮＡと記す。）を増幅した。ＰＣＲはＬＡ　Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、９４℃にて３分間の保温を１回行った後、９８℃にて２５秒間次いで６８℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０回実施し、最後に７２℃にて１０分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡをプラスミドｐＣＲ２．１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＰＣＲ産物クローニング部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＲｒＳｔ１２（図５）を得た。次いで、該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。さらに、選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３７３Ｓ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、配列番号８８で示される塩基配列が明らかとなり、プラスミドｐＣＲｒＳｔ１２は本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含むことが確認された。
【０１１８】
実施例１６　本発明ＤＮＡ（Ａ１）を有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１）の単離
実施例３（１）で得られた放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８のゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号９３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号６で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。また、配列番号９３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号９で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガー社製）を用いて、９７℃にて２分間の保温を１回行った後、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０回実施し、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５回実施し、最後に７２℃にて７分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡをプラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＰＣＲ産物クローニング部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＲ６５７ＥＴ（図６）およびｐＣＲ６５７ＦＥＴ（図７）を得た。また、ＰＣＲに用いるプライマーを配列番号９６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにすることの他は前記した方法と同様の操作でプラスミドｐＣＲ６５７Ｂｓ（図８）を得た。さらに、ＰＣＲに用いるプライマーを配列番号９７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号９６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにすることの他は前記した方法と同様の操作でプラスミドｐＣＲ６５７ＦＢｓ（図９）を得た。次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。さらに、選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ２．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＣＲ６５７ＥＴおよびｐＣＲ６５７Ｂｓは配列番号６で示される塩基配列を有することが確認された。プラスミドｐＣＲ６５７ＦＥＴおよびｐＣＲ６５７ＦＢｓは配列番号９で示される塩基配列を有することが確認された。
【０１１９】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１）を有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１）をパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドをコードする塩基配列（以下、葉緑体トランジットペプチドコード配列と記すことがある。）の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。
まず、上記のｐＣＲｒＳｔ１２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで消化し、本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。一方、ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩとで消化することにより約４０ｂｐのＤＮＡを除去して約２６４０ｂｐのＤＮＡを得た。次に仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で該ＤＮＡの５’末端を脱りん酸化し、ここにｐＣＲｒＳｔ１２から得た本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含む上記のＤＮＡを挿入し、ｐＵＣｒＳｔ１２（図１０）を得た。次に、プラスミドｐＣＲ６５７ＥＴおよびｐＣＲ６５７ＦＥＴをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化して本発明ＤＮＡ（Ａ１）を含むＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡをそれぞれ、ｐＵＣｒＳｔ１２のＥｃｏＴ２２Ｉ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７（図１１）およびｐＵＣｒＳｔ６５７Ｆ（図１２）を得た。
ｐＢＩＣＲ１６Ｇ６ＰＴ（特開２０００−１６６５７７号公報に記載）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して約３ｋｂのＤＮＡを単離した（以下、該ＤＮＡに含まれる上記公報記載のプロモーターをＣＲ１６Ｇ６プロモーターと記す。また、該ＤＮＡに含まれる上記公報記載のターミネーターをＣＲ１６ターミネーターと記す。）。ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で該ＤＮＡの５’末端を脱りん酸化し、ここに前記したｐＢＩＣＲ１６Ｇ６ＰＴ由来の約３ｋｂのＤＮＡを挿入して、プラスミドｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔ（図１３）を得た。ｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｃａＩで消化し、ＣＲ１６Ｇ６プロモーターを含むＤＮＡを単離した。一方、ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとで消化することにより５１ｂｐのＤＮＡを除去して残る２６３５ｂｐからなるＤＮＡを得た。次に仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で該ＤＮＡの５’末端を脱りん酸化し、ここにｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔから得たＣＲ１６Ｇ６プロモーターを含む上記のＤＮＡと、配列番号８９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをアニールさせることで得られるリンカーＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ（図１４）とを挿入し、ｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔΔ（図１５）を得た。ｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔΔを制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＣＲ１６ｔターミネーターの部分塩基配列を有するＤＮＡを単離した。一方、ベクタープラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとで消化して２６３５ｂｐのＤＮＡを取得した。該ＤＮＡの５’末端を仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で脱りん酸化し、ここに、ｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔΔから得たＣＲ１６ｔターミネーターの部分塩基配列を有する上記のＤＮＡと、配列番号９１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをアニールさせることで得られるリンカーＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（図１６）とを挿入し、ｐＮｄＧ６−ΔＴ（図１７）を得た。
次に、前記プラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７およびｐＵＣｒＳｔ６５７Ｆをそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化することにより、ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、プラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴの制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、それぞれプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７（図１８）およびプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７Ｆ（図１９）を得た。
【０１２０】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１）を有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１）をパーティクルガン法で植物に導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。まず、ベクタープラスミドｐＫＦ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＢｓｐＨＩで消化した後、ＫＯＤ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて２本鎖ＤＮＡのギャップにヌクレオチドを付加しＤＮＡ末端を平滑化し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを用いて自己環化させることによりプラスミドｐＫＦ１９ΔＢｓを得た。実施例１で得られたｐＣＲｒＳｔ１２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで消化し、本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。ｐＫＦ１９ΔＢｓを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩとで消化して、約２１６０ｂｐのＤＮＡを取得した。該ＤＮＡの５’末端を仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で脱りん酸化し、ここにｐＣＲｒＳｔ１２から得た本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含む上記のＤＮＡを挿入し、ｐＫＦｒＳｔ１２（図２０）を得た。次に、実施例１６（１）で得られたプラスミドｐＣＲ６５７ＢｓおよびｐＣＲ６５７ＦＢｓをそれぞれ制限酵素ＢｓｐＨＩとＳａｃＩとで消化し、それぞれから本発明ＤＮＡ（Ａ１）を含有するＤＮＡを単離した。これらのＤＮＡをそれぞれ、プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２のＢｓｐＨＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７（図２１）およびプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７Ｆ（図２２）を得た。
次に、前記プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７およびｐＫＦｒＳｔ１２−６５７Ｆをそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ１）を含有するＤＮＡを取得した。これらのＤＮＡをそれぞれ、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴの制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７（図２３）およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７Ｆ（図２４）を得た。
【０１２１】
実施例１７　本発明ＤＮＡ（Ａ１）のダイズへの導入
（１）増殖性不定胚の調製
ダイズ（品種；ＦａｙｅｔｔｅおよびＪａｃｋ）のさやを１％次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸して殺菌処理した後、未熟種子を取り出した。この種子の種皮を剥離して長径２〜５ｍｍの未熟胚を取り出し、得られた未熟胚の胚軸部をメスで切除して未熟子葉を調製した。この未熟子葉を２枚の子葉部に分け、各子葉部をそれぞれ不定胚誘導培地に置床した。不定胚誘導培地は、１８０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えｐＨ７．０に調整したＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地［Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　Ｔ．　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　Ｆ．，　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ．　（１９６２）　１５，　ｐ４７３に記載。以下、ＭＳ培地と記す。］に、０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地である。置床から約１ヶ月後に、形成された球状型胚を不定胚増殖培地に移植した。不定胚増殖培地は、９０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えてｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に、０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地である。以後、２〜３週間の間隔で５〜８回、球状型胚を新しい不定胚増殖培地に移植した。上記の不定胚誘導培地または不定胚増殖培地を用いた培養の条件は、いずれも、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃とした。
【０１２２】
（２）増殖性不定胚への遺伝子導入
実施例１７（１）で得られた球状型胚を新しい不定胚増殖培地に移植し、２〜３日培養した後、これを遺伝子導入の材料とした。実施例１６（２）および（３）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７Ｆ、ｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆを直径１．０μｍの金粒子にコートし、パーテイクルガン法を用いて遺伝子の導入を行った。金粒子１ｍｇ当たりのプラスミド量は１．６６μｇとした。遺伝子導入後さらに２日間〜３日間培養した。上記の培養の条件は、いずれも、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃とした。
【０１２３】
（３）不定胚のハイグロマイシンによる選抜
実施例１７（２）で得られた遺伝子導入後の球状型胚を不定胚選抜培地に移植した。不定胚選抜培地としては、９０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に、１５ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンと０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地を用いた。以降、２〜３週間の間隔で５〜８回、生存した球状型胚を新しい不定胚選抜培地に移植した。この場合の不定胚選抜培地は、９０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に、３０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンと０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地である。上記の不定胚選抜培地を用いた培養の条件は、いずれも、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃とした。
【０１２４】
（４）不定胚の化合物（ＩＩ）による選抜
実施例１７（２）で得られた遺伝子導入後の球状型胚を不定胚選抜培地に移植した。不定胚選抜培地としては、９０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に、０．１ｍｇ／Ｌの化合物（ＩＩ）と０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地を用いた。以降、２週間〜３週間の間隔で５〜８回、生存した球状型胚を新しい不定胚選抜培地に移植した。この場合の不定胚選抜培地には、９０μＭの２，４−Ｄと３０ｇ／Ｌのスクロースとを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に、０．３〜１．０ｍｇ／Ｌの化合物（ＩＩ）と０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地を用いた。上記の不定胚選抜培地を用いた培養の条件は、いずれも、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃とした。
【０１２５】
（５）不定胚からの個体再生
実施例１７（３）または（４）で選抜された球状型胚を発生培地に移植し、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃で約４週間培養する。発生培地としては、６０ｇ／Ｌのマルトースを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に０．８（Ｗ／Ｖ）％の寒天（和光純薬、植物組織培養用）を添加して固化した培地を用いる。６週間〜８週間後、白〜黄色の子葉型胚が得られる。これらの子葉型胚を発芽培地に移植して２週間培養する。発芽培地には、３０ｇ／Ｌのスクロースを加えｐＨ５．８に調整したＭＳ培地に０．２（ｗ／ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地を用いる。その結果、本葉を展開し発根した個体が得られる。
【０１２６】
（６）再生個体の順化および栽培
実施例１７（５）で得られたダイズ個体を園芸用培土に移植し、明期２３時間：暗期１時間、終日２３〜２５℃の人工気象器内で馴化を行う。２週間後、根が活着した個体を直径９ｃｍの植木鉢に植え替え、温室内で栽培する。温室での栽培条件は自然日長、終日２３〜２５℃とする。２ヵ月〜４ヵ月後、採種する。
【０１２７】
（７）雑草防除活性を有する化合物（ＩＩ）に対する耐性の評価
上記再生植物個体の葉を採取し主葉脈に沿って左右均等に２分割し、一方の葉片に化合物（ＩＩ）を全面に塗布し、他方の葉片は未処理とする。これらの葉片を、０．８％寒天を含むＭＳ培地上に置き、明所、室温にて７日間放置し、次いで、各葉片を、それぞれ乳鉢と乳棒で５ｍｌの８０％アセトン水溶液中で磨砕してクロロフィルを抽出する。抽出液を８０％アセトン水溶液で１０倍に希釈した後、７５０ｎｍ、６６３ｎｍ、６４５ｎｍにおける吸光度を測定し、Ｍａｃｋｎｎｅｙ　Ｇ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　（１９４１）　１４０，　ｐ３１５記載の方法によって総クロロフィル含量を算出する。化合物（ＩＩ）に対する耐性度は、処理した葉片の総クロロフィル含量の、未処理の葉片の総クロロフィル含量に対する百分率で表し評価する。
また、直径１０ｃｍ、深さ１０ｃｍの円筒形プラスチックポットに土壌を詰め、上記植物個体の種子を播種し、温室内で栽培する。化合物（ＩＩ）５部、ソルポール３００５Ｘ（東邦化学）６部およびキシレン８９部をよく混合して乳剤とし、その所定量を、０．１％（Ｖ／Ｖ）の展着剤を含む１ヘクタールあたり１０００リットル相当の水で希釈し、上記のポットで栽培された植物体の上方からその茎葉部全面に均一に噴霧器で散布する。これらの植物体を１６日間温室内で栽培した後、該植物の薬害を調査し、化合物（ＩＩ）に対する耐性度を評価する。
【０１２８】
実施例１８　本発明ＤＮＡ（Ａ１）を有するアグロバクテリウム導入用葉緑体発現プラスミドの構築
本発明ＤＮＡ（Ａ１）をアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。まず、バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を制限酵素ＮｏｔＩで消化した後、ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ（宝酒造社製）を用いて２本鎖ＤＮＡのギャップにヌクレオチドを付加することによりＤＮＡ末端を平滑化し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを用いて自己環化させた。得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ（宝酒造社製）を用いて２本鎖ＤＮＡのギャップにヌクレオチドを付加しＤＮＡ末端を平滑化し、Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを用いて自己環化させプラスミドｐＢＩ１２１ΔＮｏｔＩＥｃｏＲＩを得た。該プラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、得られたＤＮＡの５’末端を、仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）で脱りん酸化し、配列番号９８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをアニールさせることで得られるリンカーＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ（図２５）を挿入して環化させ、バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１Ｓ（図２６）を得た。該プラスミドは、リンカーＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩが、β−グルクロニダーゼ遺伝子に近い位置からＨｉｎｄＩＩＩ切断部位、ＮｏｔＩ切断部位、ＥｃｏＲＩ切断部位の順に並ぶ方向に挿入された構造を有する。
次に、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７Ｆをそれぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡをそれぞれから得た。これらのＤＮＡをそれぞれ、上記バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７（図２７）およびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７Ｆ（図２８）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７Ｆをそれぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡをそれぞれから得た。これらのＤＮＡをそれぞれ、バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７（図２９）およびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７Ｆ（図３０）を得た。
【０１２９】
実施例１９　本発明ＤＮＡ（Ａ１）のタバコへの導入
実施例１８で得られたプラスミド　ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７Ｆ、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７ＦおよびプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆ　を用いて本発明ＤＮＡ（Ａ１）をアグロバクテリウム法でタバコへ導入した。
まず、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７ＦおよびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆをそれぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　社製）に導入した。これらを、３００ｍｇ／Ｌ　ストレプトマイシン、１００ｍｇ／Ｌリファンピシン、２５ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを含むＬＢ　寒天培地（０．５％　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１．０％　Ｂａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％　ＮａＣｌ）で培養して薬剤耐性コロニーを選抜することによって、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７またはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆを持つ組換えアグロバクテリウム株をそれぞれ単離した。
次いで、植物遺伝子操作マニュアル（内宮博文著、講談社サイエンティフィック、１９９２年）に記載されている方法に準じて、タバコへの遺伝子導入を行った。上記のプラスミドを持つ組換えアグロバクテリウム株を、それぞれ、３００ｍｇ／Ｌ　ストレプトマイシン、１００ｍｇ／Ｌ　リファンピシン、２５ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを含む　ＬＢ　液体培地中で　２８℃　にて終夜培養し、無菌培養したタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｓｔｒａｉｎ　ＳＲ１）より採取した葉片を該培養液に浸漬した。該タバコ葉片を、０．１ｍｇ／Ｌ　ナフタレン酢酸および　１．０ｍｇ／Ｌ　ベンジルアミノプリンを添加した　ＭＳ　寒天培地（ＭＳ　無機塩類、ＭＳ　ビタミン類、３％　蔗糖、０．８％　寒天；　　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　Ｔ．　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　Ｆ．，　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ．　（１９６２）　１５，　ｐ４７３）に植え込み、明所・室温で　２日間培養した。次に、該タバコ葉片を滅菌水で洗浄した後、０．１ｍｇ／Ｌ　ナフタレン酢酸、１．０ｍｇ／Ｌ　ベンジルアミノプリン、および、５００ｍｇ／Ｌ　セフォタキシムを添加したＭＳ　寒天培地上で　７日間培養した。次いで、該タバコ葉片を　０．１ｍｇ／Ｌ　ナフタレン酢酸、１．０ｍｇ／Ｌ　ベンジルアミノプリン、５００ｍｇ／Ｌ　セフォタキシム、および、１００ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを添加した　ＭＳ　寒天培地に移植し培養した。該培養は、前記タバコ葉片を　４週間毎に同一組成の新鮮な培地に移植しながら継続的に４ヶ月間実施した。この間に、該タバコ葉片から出現した不定芽を、３００ｍｇ／Ｌ　セフォタキシム、および、５０ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを添加した　ＭＳ　寒天培地に移植して発根させ再生個体を得た。該再生個体を　５０ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを添加した　ＭＳ　寒天培地に移植して培養しｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７ＦまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆの　Ｔ−ＤＮＡ　領域が組み込まれた組換えタバコ個体をそれぞれ取得した。
また、実施例１８で得られたプラスミドｐＢＩ１２１Ｓをアグロバクテリウム法でタバコへ導入した。プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７ＦおよびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７Ｆの代わりにプラスミドｐＢＩ１２１Ｓを使用する以外は上記と同様にして、プラスミドｐＢＩ１２１Ｓを持つ組換えアグロバクテリウム株を単離した。次いで、該組換えアグロバクテリウム株を用いて、上記と同様にしてプラスミドｐＢＩ１２１Ｓの　Ｔ−ＤＮＡ　領域が組み込まれた組換えタバコ個体を取得した。
取得した組換えタバコ個体から３枚の葉を切除して、各葉より一片　５〜７ｍｍ　の葉片を　４片採取した。それぞれの葉片を化合物（ＩＩ）を　０．１ｍｇ／Ｌ　添加した　ＭＳ　寒天培地に植え込み、明所・室温で培養した。培養　７日後にそれぞれの葉片の薬害程度を観察した。コントロールＤＮＡ（プラスミドｐＢＩ１２１ＳのＴ−ＤＮＡ領域）が導入されたタバコ由来の葉片は白化し枯死したのに対し、本発明ＤＮＡ（Ａ１）（プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７ＦまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２６５７ＦのＴ−ＤＮＡ領域）が導入されたタバコ由来の葉片は継続的に生育した。
【０１３０】
実施例２０　本発明ＤＮＡ（Ａ２）の植物への導入
本発明ＤＮＡ（Ａ２）をパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドおよびアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。まず、実施例６（１）で得られた放線菌Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ９３８３ｔのゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号１００で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１０１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号７で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２）を増幅した。ＰＣＲはＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガー社製）を用いて、９７℃にて２分間の保温を１回行った後、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０回実施し、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５回実施し、最後に７２℃にて７分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡをプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＰＣＲ産物クローニング部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐ（図３１）を得た。次いで、該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。さらに、選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３７３Ｓ（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐは配列番号７で示される塩基配列を含有することが確認された。
実施例１６（３）で作製されたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、本ｒＳｔ１２ＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、プラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２（図３２）を得た。プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐを制限酵素ＳｐｈＩとＫｐｎＩとで消化することにより、本発明ＤＮＡ（Ａ２）を含むＤＮＡを得た。上記プラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２を制限酵素ＳｐｈＩとＫｐｎＩとで消化することによりダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの最初の成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードするＤＮＡを除去し、これに換えて、プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐから得た本発明ＤＮＡ（Ａ２）を含む上記ＤＮＡを挿入し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３（図３３）を得た。
次に、プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐを制限酵素ＳｐｈＩで消化して得られるＤＮＡの末端をＫＯＤＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて平滑化した後、さらに制限酵素ＫｐｎＩで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ２）を含むＤＮＡを単離した。実施例１６（３）で作製されたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２を制限酵素ＢｓｐＨＩで消化して得られるＤＮＡの末端をＫＯＤ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて平滑化した後、さらに制限酵素ＫｐｎＩで消化し、約２０ｂｐのＤＮＡを除去して、これに替えて、ｐＣＲ９２３Ｓｐから得た本発明ＤＮＡ（Ａ２）を含む上記ＤＮＡを挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−９２３（図３４）を得た。ｐＫＦｒＳｔ１２−９２３を制限酵素ＳｐｈＩとＫｐｎＩとで消化することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの最初の成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードするＤＮＡと本発明ＤＮＡ（Ａ２）が連結されてなるキメラＤＮＡを得た。上記プラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２を制限酵素ＳｐｈＩとＫｐｎＩとで消化することによりダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの最初の成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードするＤＮＡを除去し、これに換えて、プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−９２３から得られる上記キメラＤＮＡを挿入し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２）が連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３（図３５）を得た。
得られたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３を用いて、本発明ＤＮＡ（Ａ２）を実施例１７記載の方法と同様の操作で、パーティクルガン法でダイズへ導入した。
【０１３１】
上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。実施例１８でｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７を作成したのと同様に、バイナリーベクターｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３から得たキメラＤＮＡを含む上記ＤＮＡを挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３　（図３６）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。バイナリーベクターｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に、ｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３から得たキメラＤＮＡを含む上記ＤＮＡを挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３（図３７）を得た。
該プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３および該プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３を、それぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４に導入し、これを３００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌリファンピシン、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地で培養して形質転換体を選抜することによって、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３を持つアグロバクテリウム株またはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３を持つアグロバクテリウム株を単離した。ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３を持つアグロバクテリウム株またはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３を持つアグロバクテリウム株をそれぞれ無菌培養したタバコの葉片に感染させ、実施例１９記載の方法と同様の操作で、本発明ＤＮＡ（Ａ２）が導入されたタバコを取得した。
取得した組換えタバコ個体から３枚の葉を切除して、各葉より一片　５〜７ｍｍ　の葉片を　４片採取した。それぞれの葉片を化合物（ＩＩ）を　０．１ｍｇ／Ｌ　添加した　ＭＳ　寒天培地に植え込み、明所・室温で培養した。培養　７日後にそれぞれの葉片の薬害程度を観察した。コントロールＤＮＡ（プラスミドｐＢＩ１２１ＳのＴ−ＤＮＡ領域）が導入されたタバコ由来の葉片は白化し枯死したのに対し、本発明ＤＮＡ（Ａ２）（プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ９２３、またはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３のＴ−ＤＮＡ領域）が導入されたタバコ由来の葉片は継続的に生育した。
【０１３２】
実施例２１　本発明ＤＮＡ（Ａ３）の植物への導入
本発明ＤＮＡ（Ａ３）をパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドおよびアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。
まず、実施例１１（１）で得た放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、配列番号１０２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号８で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ３）を増幅した。ＰＣＲはＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガー社製）を用いて、９７℃にて２分間の保温を１回行った後、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０回実施し、９７℃にて１５秒間次いで６０℃にて３０秒間次いで７２℃にて１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５回実施し、最後に７２℃にて７分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡをプラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＰＣＲ産物クローニング部位に挿入することにより、プラスミドｐＣＲ６７１ＥＴ（図３８）を得た。また、ＰＣＲに用いるプライマーを配列番号１０４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにすることの他は前記した方法と同様の操作でプラスミドｐＣＲ６７１Ｂｓ（図３９）を得た。次いで、該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。さらに、選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ２．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＣＲ６７１ＥＴおよびｐＣＲ６７１Ｂｓは配列番号８で示される塩基配列を含むことが確認された。
プラスミドｐＣＲ６７１ＥＴを制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＫｐｎＩとで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含むＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例３で得たｐＵＣｒＳｔ１２のＥｃｏＴ２２Ｉ切断部位とＫｐｎＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ６７１（図４０）を得た。該プラスミドｐＵＣｒＳｔ６７１を制限酵素ＮｈｅＩとＫｐｎＩとで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含むＤＮＡを単離した。実施例１６（２）で得たプラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２を制限酵素ＮｈｅＩとＫｐｎＩとで消化することにより約８０ｂｐのＤＮＡを除去し、これに換えて、プラスミドｐＵＣｒＳｔ６７１から得た本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含む上記ＤＮＡを挿入し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１（図４１）を得た。
プラスミドｐＣＲ６７１Ｂｓを制限酵素ＢｓｐＨＩとＫｐｎＩとで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含むＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（３）で得られたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２のＢｓｐＨＩ切断部位とＫｐｎＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６７１（図４２）を得た。該プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６７１を制限酵素ＮｈｅＩとＫｐｎＩとで消化し、本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含むＤＮＡを単離した。実施例２０で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２を制限酵素ＮｈｅＩとＫｐｎＩとで消化することにより約８０ｂｐのＤＮＡを除去し、これに換えて、ｐＫＦｒＳｔ１２−６７１から得た本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含む上記ＤＮＡを挿入し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１（図４３）を得た。
得られたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１およびｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１を用いて、本発明ＤＮＡ（Ａ３）を実施例１７記載の方法と同様の操作で、パーティクルガン法でダイズへ導入した。
【０１３３】
上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。実施例１８で得られたバイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１から得たキメラＤＮＡを含む上記ＤＮＡを挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１　（図４４）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ３）が連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１から得たキメラＤＮＡを含む上記ＤＮＡを挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１（図４５）を得た。
プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１および該プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１を、それぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４に導入し、これを３００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌリファンピシン、２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地で培養して形質転換体を選抜することによって、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１を持つアグロバクテリウム株およびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１を持つアグロバクテリウム株を単離した。ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１を持つアグロバクテリウム株およびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１を持つアグロバクテリウム株をそれぞれ無菌培養したタバコの葉片に感染させ、実施例１９記載の方法と同様の操作で、本発明ＤＮＡ（Ａ３）が導入されたタバコを取得した。
取得した組換えタバコ個体から３枚の葉を切除して、各葉より一片　５〜７ｍｍ　の葉片を　４片採取する。それぞれの葉片を化合物（ＩＩ）を　０．１ｍｇ／Ｌ　添加した　ＭＳ　寒天培地に植え込み、明所・室温で培養する。培養　７日後にそれぞれの葉片の薬害程度を観察する。
【０１３４】
実施例２２　本発明蛋白質（Ｂ１）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ｂ１）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３（１）でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８から調製された染色体ＤＮＡを鋳型としＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液は、配列番号１０５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを３００ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を４μｌ、１０ｘＥｘＴａｑバッファーを５μｌ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２５サイクル繰り返し、７２℃で４分間保温した。保温後の反応液とｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　ＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。該ＤＮＡを鋳型とし配列番号６７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。得られた反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果に基づき、配列番号１５で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６５７ＦＤとした。
次に、ｐＣＲ６５７ＦＤを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。約２００ｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。このＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号１５で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ｂ１）をコードする上記の約２００ｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６５７ＦＤとした。該プラスミドｐＫＳＮ６５７ＦＤを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ＦＤとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【０１３５】
（２）本発明蛋白質（Ｂ１）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ＦＤ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になった３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに２０時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁した。この菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ＦＤから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ＦＤ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収した。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色した。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ＦＤにおいて、分子量約７ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドが検出された。本発明蛋白質（Ｂ１）が大腸菌内で発現したことが確認された。
【０１３６】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する反応系への本発明蛋白質（Ｂ１）の利用
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、実施例２２（２）で回収された大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ＦＤを９μｌ、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、実施例４（２）で回収された大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆを１５μｌ（以下、Ｄ成分と記す。）を含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。また、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ＦＤの代わりに、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）を添加する反応液、および大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ＦＤの代わりに何も添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表１３に示す。
【０１３７】
【表１３】
2004057194.tif 000021
【０１３８】
実施例２３　本発明蛋白質（Ｂ２）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ｂ２）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６（１）でＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔから調製された染色体ＤＮＡを鋳型としＰＣＲを実施する。ＰＣＲ反応液は、配列番号１０６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを３００ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を４μｌ、１０ｘＥｘＴａｑバッファーを５μｌ、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにする。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２５サイクル繰り返し、７２℃で４分間保温する。保温後の反応液とｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入する。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製する。該ＤＮＡを鋳型とし配列番号６７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして、ダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行う。得られた反応物をＤＮＡシーケンサ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析する。その結果に基づき、配列番号１６で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ９２３ＦＤとする。
次に、ｐＣＲ９２３ＦＤを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供す。約２００ｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製する。このＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入する。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析する。配列番号１６で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ｂ２）をコードする上記の約２００ｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ９２３ＦＤとする。該プラスミドｐＫＳＮ９２３ＦＤを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３ＦＤとする。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とする。
【０１３９】
（２）本発明蛋白質（Ｂ２）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ９２３ＦＤおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養する。得られる培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になった３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに２０時間培養を行う。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む該バッファー１０ｍｌに懸濁する。この菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得る。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ＦＤから得られる該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収する。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色を行う。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤにおいて、分子量約７ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドを検出することによって、本発明蛋白質（Ｂ２）の大腸菌内発現が確認可能である。
【０１４０】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する反応系への本発明蛋白質（Ｂ２）の利用
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、実施例２３（２）で回収する大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤを９μｌ、終濃度０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、実施例４（２）で回収された大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆを１５μｌ（以下、Ｄ成分と記す。）を含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温する。また、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤの代わりに、終濃度２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）を添加する反応液、および大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤの代わりに何も添加しない反応液を調製し、同様に保温する。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収する。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットする。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光する。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）を確認する。Ａ成分、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３ＦＤ、Ｃ成分およびＤ成分を含む反応液での化合物（ＩＩＩ）の生成を確認することにより、本発明蛋白質（Ｂ２）が、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する反応系において、ホウレンソウ由来のフェレドキシンに替えて利用可能であることを確認することが出来る。
【０１４１】
実施例２４　本発明蛋白質（Ｂ３）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ｂ３）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例１１（１）でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９から調製された染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１０７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして使用する以外は、実施例２３（１）に記載の方法と同様にして、ＰＣＲを実施する。得られる反応液を用いて実施例２３（１）に記載の方法と同様にして、配列番号１７で示される塩基配列を有するプラスミドｐＣＲ６７１ＦＤを得る。
次に、該プラスミドを用いて実施例２３（１）に記載の方法と同様にして、本発明ＤＮＡ（Ｂ３）が、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドｐＫＳＮ６７１ＦＤを得る。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入することによって本発明ＤＮＡ（Ｂ３）を有する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１ＦＤを得ることが可能である。
【０１４２】
（２）本発明蛋白質（Ｂ３）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６７１ＦＤを用いて、実施例２３（２）に記載した方法と同様にして、上清画分（以下、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１ＦＤと記す。）を回収する。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色を行う。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１ＦＤにおいて、分子量約７ｋＤａに相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドを検出することによって、本発明蛋白質（Ｂ３）が大腸菌内で発現したことの確認が可能である。
【０１４３】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する反応系への本発明蛋白質（Ｂ３）の利用
実施例２４（２）で回収する大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１ＦＤを使用すること以外は実施例２３（３）に記載した方法と同様にして、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）を確認する。Ａ成分、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１ＦＤ、Ｃ成分およびＤ成分を含む反応液での化合物（ＩＩＩ）の生成を確認することにより、本発明蛋白質（Ｂ３）が、化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する反応系において、ホウレンソウ由来のフェレドキシンに替えて利用可能であることを確認することが出来る。。
【０１４４】
実施例２５　　本発明蛋白質（Ａ４）の調製
（１）菌体粗抽出液の調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２７３５株のグリセロールストックを、１０ｍｌのＡ培地（グルコース０．１％（ｗ／ｖ）、トリプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、りん酸水素二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）を入れた大型試験管に添加し、３０℃で一晩旋回培養して、前培養液を得た。この前培養液８ｍｌを２００ｍｌのＡ培地に植菌し、５００ｍｌ容羽付フラスコ内で３０℃で２日間、旋回培養した。このようにして得られた培養液から遠心分離（３，０００×ｇ、１０分間）によって湿菌体を回収した。この湿菌体を１００ｐｐｍの化合物（ＩＩ）を含む１００ｍｌのＢ培地（グルコース１％（ｗ／ｖ）、牛肉エキス０．１％、トリプトース０．２％（ｗ／ｖ））に懸濁して、５００ｍｌ容坂口フラスコ内で３０℃で２０時間往復振とう培養した。このようにして得られた培養液２Ｌから遠心分離（３，０００×ｇ、１０分間）によって湿菌体を回収した。得られた湿菌体を１Ｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）にて２回洗浄し、１３６ｇの湿菌体を得た。
この湿菌体を、菌体湿重量１ｇあたり２〜３ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、この懸濁液に、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５ｍＭ　ベンザミジン塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、３μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、３μｇ／ｍｌ、ペプスタチンＡ、および１ｍＭ　ジチオトレイトールを添加した。これをフレンチプレス（大岳製作所製）で２回繰り返し破砕（１０００ｋｇ／ｃｍ２）して菌体破砕液を得た。この菌体破砕液を遠心分離（４０，０００×ｇ、３０分間）した後、上清を回収してこれを１５０，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清（以下、菌体粗抽出液と記す。）を分取した。
【０１４５】
（２）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２．４ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、０．５ｍｇ／ｍｌ　ホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例２５（１）で回収された菌体粗抽出液１５μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１時間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうち１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収した。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットした。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光した。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。結果を表１４に示す。
【０１４６】
【表１４】
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【０１４７】
（３）菌体粗抽出液の分画
実施例２５（１）で得られた菌体粗抽出液に４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、３０分間遠心分離して上清を回収した。得られた上清に５５％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して氷上で攪拌した後、１２，０００×ｇ、１０分間遠心分離し、沈殿を回収して１２．５ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。この溶解液をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分（以下、硫安沈殿４５−５５％画分と記す。）１７．５ｍｌを分取した。
【０１４８】
（４）本発明蛋白質（Ａ４）の単離
実施例２５（３）で調製された硫安沈殿４５−５５％画分を、ＨｉＬｏａｄ２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。次いで、前記カラムに１００ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００４Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲　０Ｍから１Ｍ、流速４ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．１２Ｍから０．１６５Ｍにて溶出された画分３０ｍｌを分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、Ａバッファー（１．５ｍＭの塩化カルシウムを含む２ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。次いで、該画分をＢｉｏ−Ｓｃａｌｅ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　ＴｙｐｅＩｃｏｌｕｍ　ＣＨＴ１０−Ｉ（バイオラッド社製）に注入し、該カラムに２０ｍｌのＡバッファーを流した。次いで、前記カラムにＢバッファー（０．０３ｍＭの塩化カルシウムを含む１００ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０）の直線濃度勾配を付してＡバッファーを流し（Ａバッファー１００％から開始し、１００分間かけてＢバッファー濃度を５０％にまで増加させる直線濃度勾配、流速２ｍｌ／分）、Ｂバッファー濃度４％〜６％にて溶出された画分２０ｍｌを分取した。さらにこの分取した画分をＰＤ１０カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ蛋白質を含む画分を回収した。
回収した画分に、２．０Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を等体積添加して混合した後、ＲＥＳＯＵＲＳＥ　ＰＨＥ　１ｍｌカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に注入した。該カラムに１Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）５ｍｌを流した後、硫酸アンモニウム直線濃度勾配を付して０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を流し（硫酸アンモニウム濃度勾配０．１Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲　１Ｍから０Ｍ、流速２ｍｌ／分）、硫酸アンモニウム濃度約０．４〜０．５Ｍ付近にて溶出された画分をそれぞれ分取した。各画分に含まれる蛋白質をＳＤＳ−１０％〜２０％ＰＡＧＥで分析した。
分取した画分を実施例２５（２）に記載の反応液における菌体粗抽出液の代わりに添加し、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および１４Ｃで標識された化合物（ＩＩ）の存在下に、実施例２５（２）と同様に保温した。保温後の反応液をＴＬＣ分析し、１４Ｃで標識された　化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットを確認した。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約４５ｋＤａの位置に泳動された蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから回収し、プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９４ＨＴ型、Ｐｕｌｓｅｄ　ｌｉｑｉｄ法で分析）によるＮ末端アミノ酸配列の解析に供した。その結果、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列が読み取られた。
【０１４９】
実施例２６　本発明ＤＮＡ（Ａ４）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５を５０ｍｌのＹＥＭＥ培地（酵母エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、バクトペプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、麦芽エキス　０．３％（ｗ／ｖ）、グルコース１．０％（ｗ／ｖ）、ショ糖３４％（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　０．２％（ｖ／ｖ））で１〜３日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む上記ＹＥＭＥ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後に、菌体２００ｍｇ当り１ｍｌのバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），　１００ｍＭ　ＥＤＴＡ，　１０ｍＭ　ＮａＣｌ）に再懸濁し、２００μｇ／ｍｌ卵白リゾチームを添加し３０℃で１時間振とうした。さらに、０．５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加えて５５℃で３時間インキュベートした。この菌体懸濁液を、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで２回抽出してそれぞれ水層を回収し、次いでクロロホルム・イソアミルアルコールで１回抽出して水層を回収し、該水層からエタノール沈殿によって染色体ＤＮＡを得た。
【０１５０】
（２）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡライブラリーの調製
実施例２６（１）で調製された染色体ＤＮＡ３８μｇを３．２Ｕの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで３７℃で６０分間消化した。得られた消化液を、１％アガロースゲル電気泳動で分画して、約２．０ｋｂｐのＤＮＡをゲルから回収した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて当該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製し、さらにエタノール沈殿によって濃縮して、目的とするＤＮＡを含む溶液２０μｌを得た。得られたＤＮＡ溶液のうち８μｌと、制限酵素ＢａｍＨＩで消化され脱リン酸化処理されたプラスミドベクターｐＵＣ１１８　１００ｎｇとライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造社製）のＩ液１６μｌとを混合し、１６℃で４時間保温した。このライゲーション液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。得られたコロニーを寒天培地上から回収してプラスミドを抽出し、染色体ＤＮＡライブラリーとした。
【０１５１】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ４）の単離
実施例２６（２）で調製された染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行った（図３）。プライマーとしては、配列番号１１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いた。ここで、配列番号１１４で示される塩基配列は、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に基づき設計した。反応液の調製にはエキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた。ＰＣＲ反応液は、上記染色体ＤＮＡライブラリーを２．５μｌ、上記の２種類のプライマーをそれぞれ７．５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を０．２μｌ、１０×バッファー（ＭｇＣｌ２含有）を２．５μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．３８μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を２５μｌにした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６５℃で３０秒間さらに７２℃で１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液２．５μｌを鋳型溶液として、再度ＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号１１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いた。ここで、配列番号１１５で示される塩基配列は、配列番号１１３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に基づき設計した。そして上記の方法と同様にエキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を用いてＰＣＲを行った。反応後の反応液を２％のアガロースゲル電気泳動に供し、約８００ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。ゲルからＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号６８で示される塩基配列を有するプライマーを用い、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号１１０で示される塩基配列の塩基番号５７〜８３２に示される塩基配列が読み取られた。読み取られた塩基配列のうち、配列番号１１０で示される塩基配列の塩基番号５８〜６０には配列番号１１３で示される���ミノ酸配列のアミノ酸番号２０で示されるアミノ酸がコードされていた。
【０１５２】
次に、実施例２６（２）で調製された染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型として、上記の条件でエキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）によるＰＣＲを行った。プライマーとしては配列番号１１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いた。増幅された約１．４ｋｂｐのＤＮＡは、上記方法にてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクターにクローニングした。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７に示される配列を持つプライマーと配列番号６８に示される配列を持つプライマーを用い、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号１１０で示される塩基配列の塩基番号１〜５８に示される塩基配列が読み取られた。
また、ユニバーサルゲノムウォーカーキット（クロンテック社製）を用い付属の取り扱い説明書に従い、配列番号１１０で示される塩基配列の塩基番号８３２で示される塩基より３’側下流に伸張する塩基配列を有するＤＮＡのクローニングを行った。具体的には、実施例２６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡ１３μｇを、２００Ｕの制限酵素ＨｉｎｃＩＩを用いて３７℃で一晩消化し、フェノール抽出後、エタノール沈殿により精製した。得られたＤＮＡを２０μｌの水溶液とし、そのうちの４μｌと、１５μＭのＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒ　Ａｄａｐｔｏｒを１．９μｌ、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒを１．６μｌ、および６Ｕ／μｌのＴ４　ｌｉｇａｓｅを０．５μｌを混合し、１６℃で一晩保温した。その後、７０℃で５分間保温して７２μｌの蒸留水を加えてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーとした。該ライブラリーを鋳型とし、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＧＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＰＣＲ　ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリー１μｌ、プライマーＡＰ１（ユニバーサルゲノムウォーカーキットに付属）と配列番号１１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を１μｌ、５ｘＧＣゲノミックＰＣＲ反応バッファーを１０μｌ、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２を２．２μｌ、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔを１０μｌおよびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックスを１μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は、９５℃で１分間保温し、９４℃で１０秒間次いで７２℃で３分間のサイクルを７サイクル、９４℃で１０秒間次いで６８℃で３分間のサイクルを３６サイクル、さらに６８℃で７分間保温した。保温後の溶液を蒸留水で５０倍希釈して一次ＰＣＲ産物とし、これを鋳型にさらにＰＣＲを行った。ＰＣＲは、一次ＰＣＲ産物１μｌ、プライマーＡＰ２（ユニバーサルゲノムウォーカーキットに付属）と配列番号１１８で示されるオリゴヌクレオチドをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を１μｌ、５ｘＧＣゲノミックＰＣＲ反応バッファーを１０μｌ、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２を２．２μｌ、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔを１０μｌおよびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックスを１μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は、９５℃で１分間保温し、９４℃で１０秒間次いで７２℃で３分間のサイクルを５サイクル、９４℃で１０秒間次いで６８℃で３分間のサイクルを２０サイクル、さらに６８℃で７分間保温した。保温後の反応液を１％のアガロースゲル電気泳動に供し、約１３００ｂｐのＤＮＡを含むゲル部分を回収した。回収されたゲルからＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７に示されるオリゴヌクレオチドと配列番号６８に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号１１０で示される塩基配列の塩基番号６４４〜１４５４で示される塩基配列が読み取られた。解析した全ての塩基配列を連結させた結果、配列番号１１０で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３６塩基（終止コドンを含む）からなり４１１アミノ酸残基（配列番号１０８）をコードする塩基配列（配列番号１０９）と、１９２塩基（終止コドンを含む）からなり６３アミノ酸残基（配列番号１１１）をコードする塩基配列（配列番号１１２）とが含まれた。配列番号１０９で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１０８）からなる蛋白質の分子量は、４５４６５Ｄａと計算された。また、該塩基配列にコードされるアミノ酸配列には、本発明蛋白質（Ａ４）のＮ末端アミノ酸配列解析から決定されたアミノ酸配列（配列番号１１３）が含まれていた。配列番号１１２で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１１１）からなる蛋白質の分子量は６８７１Ｄａと計算された。
【０１５３】
実施例２７　本発明蛋白質（Ａ４）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ４）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例２６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡを鋳型とし、エキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号１１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２５と記す。）、または、配列番号１１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせ（以下、プライマー対２６と記す。）を用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ３００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ、１０×Ｅｘｐａｎｄ　ＨＦバッファー（ＭｇＣｌ２含有）を５．０μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　ＨｉＦｉ酵素ミックスを０．７５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌとした。保温条件は、９７℃で２分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で１分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で１分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに、７２℃で７分間保温した。保温後の反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、プライマー対２５を用いた反応液を供したゲルからは約１．３ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、プライマー対２６を用いた反応液を供したゲルからは約１．６ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたそれぞれのゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡとｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションし、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号６７と配列番号６８と配列番号１２２と配列番号１２３に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１０９で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６４６とし、配列番号１１０で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６４６Ｆとした。
次に、ｐＣＲ６４６およびｐＣＲ６４６Ｆをそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供した。ｐＣＲ６４６の消化物を供したゲルからは約１．３ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出し、ｐＣＲ６４６Ｆの消化物を供したゲルからは約１．６ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからそれぞれ、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。このＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号１０９で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ４）をコードする上記の約１．３ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６４６とした。また、配列番号１１０で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ４）をコードする上記の約１．６ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ６４６Ｆとした。これらプラスミドｐＫＳＮ６４６またはｐＫＳＮ６４６Ｆを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６またはＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６Ｆとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【０１５４】
（２）本発明蛋白質（Ａ４）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６Ｆ、およびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地（トリプトン１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２．４％（ｗ／ｖ）、グリセロール０．４％（ｖ／ｖ）、リン酸二水素カリウム１７ｍＭ、リン酸水素二カリウム７２ｍＭ）で３７℃で一晩培養し、得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸を添加し培養を継続する。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１７時間培養する。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む前記バッファー１０ｍｌに懸濁する。この菌体懸濁液を超音波破砕機（ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ　社登録商標））を用いてｏｕｔ　ｐｕｔ　３、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で３分間ずつ６回超音波処理して菌体破砕液を得る。得られた破砕液を、遠心分離（１，２００×ｇ、５分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（１５０，０００×ｇ、７０分間）した後、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を回収する。該上清画分のうち１μｌをＳＤＳ−１５％〜２５％ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢ染色する。その結果、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６や大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６Ｆにおいて、分子量約４５ｋＤａ程度に相当する泳動位置に、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２よりも顕著に濃いバンドを検出することによって、本発明蛋白質（Ａ４）が大腸菌内で発現したことの確認が可能である。
【０１５５】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例２７（２）で回収された上清画分１８μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温する。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分およびＣ成分のうちの１以上の画分を添加しない反応液を調製し、同様に保温する。保温後の各反応液に、３．０μｌの２Ｎ塩酸および９０μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８，０００×ｇで遠心分離し７５μｌの酢酸エチル相を回収する。該酢酸エチル相を減圧下で乾固させた後、残渣を６．０μｌの酢酸エチルに溶解させその内５．０μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（ＴＬＣプレートシリカゲル６０Ｆ２５４、２０ｃｍ×２０ｃｍ、０．２５ｍｍ厚、メルク社製）にスポットする。該ＴＬＣプレートを、クロロホルム−酢酸−酢酸エチル混合液（クロロホルム：酢酸：酢酸エチル＝６：１：２）を展開溶媒として約１時間展開した後、溶媒を蒸発させ、イメージングプレート（富士写真フィルム社製）に一晩露光する。次いで、イメージングプレートをイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フィルム社製）で解析し、１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べる。Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６を含む反応液、あるいはＡ成分、Ｂ成分、Ｃ成分、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６Ｆを含む反応液で化合物（ＩＩＩ）の生成が確認できる。
【０１５６】
実施例２８　本発明蛋白質に関する配列同一性
ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ　Ｖｅｒ．５（ソフトウェア開発株式会社製）」を用い、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法［Ｌｉｐｍａｎ，　Ｄ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏｎ，　Ｗ．Ｒ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２２７，　１４３５−１４４１，（１９８５）］により相同性解析を行ってアラインメントを作成することにより、本発明の蛋白質および本発明のＤＮＡに関する配列同一性を解析した。
本発明蛋白質（Ａ１）〜（Ａ４）のアミノ酸配列について、相互の配列同一性および最も相同性の高い公知の蛋白質との配列同一性を求めた。結果を表１５に示す。
【０１５７】
【表１５】
2004057194.tif 000023
＊：配列同一性の値を上段に示し、当該蛋白質のＥｎｔｒｅｚデータベース（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ提供、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）におけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を下段に示す。
【０１５８】
配列番号６で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ１）、配列番号７で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２）、配列番号８で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ３）、および配列番号１０９で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ４）の塩基配列について、相互の配列同一性および最も相同性の高い公知の遺伝子との配列同一性を求めた。結果を表１６に示す。
【表１６】
2004057194.tif 000024
＊：配列同一性の値を上段に示し、当該遺伝子のＥｎｔｒｅｚデータベース（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ提供、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）におけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を下段に示す。
【０１５９】
本発明蛋白質（Ｂ１）〜（Ｂ４）のアミノ酸配列について、相互の配列同一性および最も相同性の高い公知の蛋白質との配列同一性を求めた。結果を表１７に示す。
【表１７】
2004057194.tif 000025
＊：配列同一性の値を上段に示し、当該蛋白質のＥｎｔｒｅｚデータベース（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ提供、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）におけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を下段に示す。
【０１６０】
配列番号１５で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ｂ１）、配列番号１６で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ｂ２）、配列番号１７で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ｂ３）、および配列番号１１２で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ｂ４）の塩基配列について、相互の配列同一性および最も相同性の高い公知の遺伝子との配列同一性を求めた。結果を表１８に示す。
【表１８】
2004057194.tif 000026
＊：配列同一性の値を上段に示し、当該遺伝子のＥｎｔｒｅｚデータベース（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ提供、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）におけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号を下段に示す。
【０１６１】
実施例２９　本発明ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ
実施例２で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２８９８の染色体ＤＮＡ、実施例５で調製されたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ　９３８３ｔの染色体ＤＮＡ、実施例９で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ　ＡＴＣＣ　１１７９６の染色体ＤＮＡ、実施例１１で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ　２１４６９の染色体ＤＮＡ、実施例２６で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡ、ならびに実施例２と同様の方法で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ　ＩＦＯ　１２８７０ｔ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｅｒ　ＩＦＯ　１３４４５のそれぞれの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーとしては、表１９に示す５組のプライマー対を用いた。配列番号６に示される塩基配列に基づいてそれぞれのプライマー対を用いたＰＣＲで増幅されると予想されるＤＮＡの大きさを表１９に示した。
【０１６２】
【表１９】
2004057194.tif 000027
【０１６３】
ＰＣＲ反応液には、表１９に示した組合わせの２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを１０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を０．５μｌ、５ｘＧＣゲノミックＰＣＲ反応バッファーを５μｌ、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２を１．１μｌ、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔを５μｌおよびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）を０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を２５μｌにした。保温条件は９５℃で１分間保温し、９４℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間次いで７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル繰り返し、さらに７２℃で５分間保温した。保温後の反応液をそれぞれ３％のアガロースゲル電気泳動にて解析した。結果を図４６並びに表２０および表２１に示す。いずれの菌株から調製した染色体ＤＮＡを鋳型に用いた場合にでも、プライマー対１４、１５、１６，１７、１８のいずれかあるいは全ての場合において、予測された大きさのＤＮＡの増幅が観察された。
【０１６４】
【表２０】
2004057194.tif 000028
（＊；＋は予測される大きさのＤＮＡが検出されたことを示し、−は検出されなかったことを示す。）
【０１６５】
【表２１】
2004057194.tif 000029
（＊；＋は予測される大きさのＤＮＡが検出されたことを示し、−は検出されなかったことを示す。）
【０１６６】
実施例３０　本発明ＤＮＡ（Ａ）または本発明ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列からなるＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーション
（１）プローブの作製
本発明ＤＮＡ（Ａ１）または本発明ＤＮＡ（Ａ１）の部分塩基配列からなるＤＮＡをジゴシキゲニンで標識したプローブ（ＤＩＧ標識プローブ）を作製した。実施例３で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８の染色体ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号９３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲ　ＤＩＧ　Ｐｒｏｂｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ製）を用いて添付のマニュアルに従ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液には、上記の２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰ　ｓｔｏｃｋ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を２．５μｌ、ＰＣＲ　ＤＩＧ　ｍｉｘ（それぞれ２．０ｍＭの４種類のＤＩＧ標識ｄＮＴＰの混合物）を２．５μｌ、１０ｘＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、およびＥｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）を０．７５μｌを添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。保温条件は、９５℃で２分間保温した後、９５℃で１０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで７２℃で２分間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル行い、さらに、９５℃で１０秒間、次いで６０℃で３０秒間、次いで７２℃で２分間（７２℃での保温は１サイクル毎に２０秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに７２℃で７分間保温した。保温後の反応液を１％アガロース電気泳動に供した。その結果、約１．３ｋｂのＤＮＡの増幅が確認された。この増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号６で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡを得た。同様の方法で、実施例３で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８の染色体ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号１３０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１３１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号６で示される塩基配列の塩基番号５７〜７３０で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡを得た。
同様の方法で、実施例６で調製されたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｔａｂｅｒｉ　ＪＣＭ９３８３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号６１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号７で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡを得た。
さらに同様の方法で、実施例１１で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｅｓｔａｃｅｕｓ　ＡＴＣＣ２１４６９の染色体ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号７０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号７１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号８で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡを得た。また、上記染色体ＤＮＡを鋳型として用い、配列番号１３２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１３３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号８で示される塩基配列の塩基番号２１〜６９１で示される塩基配列を有しジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡを得た。
【０１６７】
（２）ドットブロットハイブリダイゼーション
実施例４で作製されたｐＫＳＮ６５７のＤＮＡ（本発明ＤＮＡ（Ａ１）を含むＤＮＡ）、実施例７で作製されたｐＫＳＮ９２３のＤＮＡ（本発明ＤＮＡ（Ａ２）を含むＤＮＡ）、実施例１２で作製されたｐＫＳＮ６７１のＤＮＡ（本発明ＤＮＡ（Ａ３）を含むＤＮＡ）、実施例１４で作製されたｐＫＳＮＳＣＡのＤＮＡ（本ＤＮＡ（Ａ９）を含むＤＮＡ）、および実施例１０で作製されたｐＫＳＮ１１７９６のＤＮＡ（本ＤＮＡ（Ａ１０）を含むＤＮＡ）を、それぞれ１００ｎｇ及び１０ｎｇ相当量ずつナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ　Ｎ＋（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製）にブロットした。得られたメンブレンにトランスイルミネーターで５分間紫外線を照射した。
ハイブリダイゼーションと検出はＤＩＧ−Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｔａｒｔｅｒ　Ｋｉｔ　ＩＩ（Ｒｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ＧｍｂＨ製）を用いて添付のマニュアルに従って行った。プローブとしては、実施例３０（１）で作製されたジゴシキゲニンで標識されたＤＮＡをそれぞれ、１００℃で５分間保温した後、氷上で急冷して用いた（以下、ＤＩＧ標識プローブと記す。）。上記のＤＮＡがブロットされたナイロンメンブレンを、上記キット添付の２．０ｍｌのＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ中で４２℃にて３０分間振とうした。次いで、２．０ｍｌのＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ、５．０μｌのＤＩＧ標識プローブ及び上記メンブレンをハイブリバック中に封入し４２℃で１８時間保温した。メンブレンを取り出し、０．１％　ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ中で室温にて５分間の振とうを液を２回行い、次いで０．１％　ＳＤＳ　を含む０．５ＸＳＳＣ中で６５℃にて１５分間の振とうを２回行った。続いてメンブレンを５０ｍｌのＷａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ中で２分間振とうし、次いで５０ｍｌのＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で室温にて３０分間振とうし、さらに２．０ｍｌのＡｎｔｉｂｏｄｙ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ中で３０分間振とうした後、５０ｍｌのＷａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ中で１５分間の振とうを２回行った。さらに、メンブレンを５０ｍｌのＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ中で５分間振とうした後、２．０ｍｌのＣｏｌｏｒ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎとともにハイブリバックに封入し１８時間室温で保温した。いずれのＤＩＧ標識プローブでハイブリダイゼーションを行った場合でも、ｐＫＳＮ６５７、ｐＫＳＮ９２３、ｐＫＳＮ６７１、ｐＫＳＮＳＣＡおよびｐＫＳＮ１１７９６のそれぞれ１００ｎｇ及び１０ｎｇのいずれの試料についてもシグナルが検出された。
【０１６８】
実施例３１　本発明ＤＮＡ（Ａ１１）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｏｒ　ＩＦＯ１３４４５染色体ＤＮＡの調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｏｒ　ＩＦＯ１３４４５を５０ｍｌのＴＧＹ培地（酵母エキス　０．５％（ｗ／ｖ）、トリプトン　０．５％（ｗ／ｖ）、グルコース　０．１％（ｗ／ｖ）、Ｋ２ＨＰＯ４　０．１％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．０）で３日間、３０℃で振とう培養した後、集菌した。得られた菌体を、グリシン１．４％（ｗ／ｖ）、６０ｍＭ　ＥＤＴＡを添加したＴＧＹ培地に懸濁し、さらに１日間振とう培養した。得られた培養液から菌体を集めて、蒸留水で１回洗浄した後、３．５ｍｌのバッファーＢ１（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０），　５０ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０，　０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）に懸濁した。得られた懸濁液に８０μｌの１００ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液と１００μｌのＱＩＡＧＥＮ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ（６００ｍＡＵ／ｍｌ、キアゲン社製）を添加して、３７℃で１時間保温した。次に１．２ｍｌのバッファーＢ２（３Ｍ　ｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ＨＣｌ，　２０％　Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加して混合し５０℃で３０分間保温した。得られた溶菌液をバッファーＱＢＴ（７５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　５０ｍＭ　ＭＯＰＳ　（ｐＨ７．０），　１５％イソプロパノール，　０．１５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）で平衡化したキアゲンゲノミックチップ１００Ｇ（キアゲン社製）に添加した。次いで、このチップを７．５ｍｌのバッファーＱＣ［５０ｍＭ　ＭＯＰＳ　（ｐＨ７．０），　１５％イソプロパノール］で２回洗浄した後、５ｍｌのバッファーＱＦ［１．２５Ｍ　ＮａＣｌ，　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．５），　１５％イソプロパノール］を流してＤＮＡを溶出させた。得られたＤＮＡ溶液に３．５ｍｌのイソプロパノールを混合し、染色体ＤＮＡを沈殿させて回収した。回収された染色体ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、１ｍｌのＴＢバッファーに溶解させた。
【０１６９】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１１）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例３１（１）で調製された染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションした後、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号５７で示される塩基配列を有するプライマーまたは配列番号５９で示される塩基配列を有するプライマーを用い、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。その結果、配列番号１３９で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例３１（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法に準じてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１［ユニバーサルゲノムウォーカーキット（クロンテック社製）に付属］とを用いて実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１６２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２［ユニバーサルゲノムウォーカーキット（クロンテック社製）に付属］とを用いて実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４４で示される塩基配列の塩基番号１〜３３０で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例３１（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。、得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１６４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４４で示される塩基配列の塩基番号９８３〜１４４９で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１１）　の塩基配列解析
実施例３１（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号１４４で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３０塩基（終止コドンを含む）からなり４０９アミノ酸残基（配列番号１５９）をコードする塩基配列（配列番号１３９）と、２０７塩基（終止コドンを含む）からなり６８アミノ酸残基（配列番号１４９）をコードする塩基配列（配列番号１５４）とが含まれた。配列番号１３９で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１５９）からなる蛋白質の分子量は、４５１７７Ｄａと計算された。また、配列番号１５４で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１４９）からなる蛋白質の分子量は７１４７Ｄａと計算された。
【０１７０】
実施例３２　本発明蛋白質（Ａ１１）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１１）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３１（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｏｒ　ＩＦＯ　１３４４５の染色体ＤＮＡを鋳型とし、エキスパンドハイファイＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号１６５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１６６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせを用いた。ＰＣＲの反応液組成および保温は実施例２７（１）に記載の条件と同じとした。保温後の反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。回収されたゲルから、ＱＩＡ　ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡとｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とを、該ベクター添付の取扱説明書に従ってライゲーションした後、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡＧＥＮ　Ｔｉｐ２０　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列番号５７、５９、１８６に示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングＦＳレディリアクションキット（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて該キット付属の取扱説明書に従いシークエンス反応を行った。反応物をＤＮＡシーケンサ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１４４で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ８４９ＡＦとした。
次に、ｐＣＲ８４９ＡＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを含むゲルを切り出した。得られたゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて該キットに付属の取扱説明書に従いＤＮＡを精製した。このＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とを、ライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造社製）を用い、該キット付属の取扱説明書に従いライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、その構造を解析した。配列番号１４４で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１１）をコードする上記の約１．５ｋｂｐのＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミドをｐＫＳＮ８４９ＡＦとした。このプラスミドｐＫＳＮ８４９ＡＦを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦとした。また、プラスミドｐＫＳＮ２を大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２とした。
【０１７１】
（２）本発明蛋白質（Ａ１１）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ８４９ＡＦ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
１４Ｃで標識された３ｐｐｍの化合物（ＩＩ）、２ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、２ｍｇ／ｍｌのホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例３２（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ８４９ＡＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）２３μｌを含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。実施例４（３）と同様にして、保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ８４９ＡＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
【０１７２】
実施例３３　本発明ＤＮＡ（Ａ１２）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１７３】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１２）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例３３（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２の染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４０で示される塩基配列の塩基番号３６４〜１０９６で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例３３（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１６７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１と用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１６８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４５で示される塩基配列の塩基番号１〜３９２で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例３３（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。、得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１６９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１７０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４５で示される塩基配列の塩基番号１０４８〜１４８０で示される塩基配列が読み取られた。
【０１７４】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１２）　の塩基配列解析
実施例３３（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号１４５で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２７８塩基（終止コドンを含む）からなり４２５アミノ酸残基（配列番号１６０）をコードする塩基配列（配列番号１４０）と、１９８塩基（終止コドンを含む）からなり６５アミノ酸残基（配列番号１５０）をコードする塩基配列（配列番号１５５）とが含まれた。配列番号１４０で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１６０）からなる蛋白質の分子量は、４６５４９Ｄａと計算された。配列番号１５５で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１５０）からなる蛋白質の分子量は６５１０Ｄａと計算された。
【０１７５】
実施例３４　本発明ＤＮＡ（Ａ１２）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１２）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３３（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にして、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの反応液から、実施例３２（１）と同様にして、ＤＮＡを精製しｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、１７１、１７２、１８７で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１４５で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１６１８Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１６１８Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号１４５で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１２）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１６１８Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６１８Ｆとした。
【０１７６】
（２）本発明蛋白質（Ａ１２）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６１８ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６１８Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６１８Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３４（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６１８Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いる以外は実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６１８Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
【０１７７】
実施例３５　本発明ＤＮＡ（Ａ１３）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
【０１７８】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１３）　の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例３５（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４１で示される塩基配列の塩基番号２９５〜１０２７で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例３５（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩした。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１７３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１と用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１７４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４６で示される塩基配列の塩基番号１〜３７０で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例３５（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１７５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１７６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４６で示される塩基配列の塩基番号９６０〜１４７３で示される塩基配列が読み取られた。
【０１７９】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１３）　の塩基配列解析
実施例３５（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号１４６で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２０９塩基（終止コドンを含む）からなり４０２アミノ酸残基（配列番号１３６）をコードする塩基配列（配列番号１４１）と、２５２塩基（終止コドンを含む）からなり８３アミノ酸残基（配列番号１５１）をコードする塩基配列（配列番号１５６）とが含まれた。配列番号１４１で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１３６）からなる蛋白質の分子量は、４４６２９Ｄａと計算された。配列番号１５６で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１５１）からなる蛋白質の分子量は８６３５Ｄａと計算された。
【０１８０】
実施例３６　本発明ＤＮＡ（Ａ１３）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１３）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３５（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｓ　ＩＦＯ　１４２７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１７８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にして、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの反応液から、実施例３２（１）と同様にして、ＤＮＡを精製しｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、１７３、１７５、１８８で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１４６で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ４７４Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ４７４Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号１４６で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１３）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ４７４Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４７４Ｆとした。
【０１８１】
（２）本発明蛋白質（Ａ１３）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４７４ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４７４Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４７４Ｆ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３６（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４７４Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いる以外は実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４７４Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
【０１８２】
実施例３７　本発明ＤＮＡ（Ａ１４）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
【０１８３】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１４）　の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例３７（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４２で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例３７（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１８０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４７で示される塩基配列の塩基番号１〜３３０で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例３７（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１８１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１８２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４７で示される塩基配列の塩基番号９８２〜１４４９で示される塩基配列が読み取られた。
【０１８４】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１４）　の塩基配列解析
実施例３７（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号１４７で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３０塩基（終止コドンを含む）からなり４０９アミノ酸残基（配列番号１３７）をコードする塩基配列（配列番号１４２）と、２０７塩基（終止コドンを含む）からなり６８アミノ酸残基（配列番号１５２）をコードする塩基配列（配列番号１５７）とが含まれた。配列番号１４２で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１３７）からなる蛋白質の分子量は、４５０８９Ｄａと計算された。配列番号１５７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１５２）からなる蛋白質の分子量は７１７４Ｄａと計算された。
【０１８５】
実施例３８　本発明ＤＮＡ（Ａ１４）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１４）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３７（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にして、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの反応液から、実施例３２（１）と同様にして、ＤＮＡを精製しｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、１８９で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１４７で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１４９１ＡＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１４９１ＡＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号１４７で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１４）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１４９１ＡＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１４９１ＡＦとした。
【０１８６】
（２）本発明蛋白質（Ａ１４）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１４９１ＡＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１４９１ＡＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１４９１ＡＦ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
【０１８７】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３８（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１４９１ＡＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いる以外は実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１４９１ＡＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
【０１８８】
実施例３９　本発明ＤＮＡ（Ａ１５）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４の染色体ＤＮＡを調製した。
【０１８９】
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１５）　の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例３９（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号１４３で示される塩基配列の塩基番号３１６〜１０４８で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例３９（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたＤＮＡを鋳型とし、配列番号１７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１８０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４８で示される塩基配列の塩基番号１〜３３０で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例３９（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１８１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１８２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号１４８で示される塩基配列の塩基番号９８２〜１４４９で示される塩基配列が読み取られた。
【０１９０】
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１５）　の塩基配列解析
実施例３９（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号１４８で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３０塩基（終止コドンを含む）からなり４０９アミノ酸残基（配列番号１３８）をコードする塩基配列（配列番号１４３）と、２０７塩基（終止コドンを含む）からなり６８アミノ酸残基（配列番号１５３）をコードする塩基配列（配列番号１５８）とが含まれた。配列番号１４３で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１３８）からなる蛋白質の分子量は、４５１１６Ｄａと計算された。配列番号１５８で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１５３）からなる蛋白質の分子量は７１７９Ｄａと計算された。
【０１９１】
実施例４０　本発明ＤＮＡ（Ａ１５）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１５）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例３９（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４の染色体ＤＮＡを用い、配列番号１８５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にして、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの反応液から、実施例３２（１）と同様にして、ＤＮＡを精製しｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、１８９で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号１４８で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５５５ＡＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５５５ＡＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号１４８で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１５）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５５５ＡＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５５ＡＦとした。
【０１９２】
（２）本発明蛋白質（Ａ１５）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５５ＡＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５５ＡＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５５ＡＦ、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
【０１９３】
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例４０（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５５ＡＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いる以外は実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５５ＡＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
【０１９４】
実施例４１　本発明蛋白質（Ａ１）による化合物の代謝
（１）プラスチド画分の調製
葉ダイコン種子１００ｇ（タキイ種苗社製）をバット中の湿らせた紙ウェス上に播種し、２５℃にて、暗黒下で６日間栽培した後、蛍光灯下で４時間栽培した。緑化した子葉３０ｇを磨砕バッファー［１ｍＭ　塩化マグネシウム、２０ｍＭ　Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、１０ｍＭ　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペリジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　システイン、０．５Ｍ　ショ糖；ｐＨ７．７］中にて、Ｎｉｓｓｅｉ　ＡＭ−８　ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＥＲ（日本精機製作所製）で磨砕（１８，０００〜２０，０００ｒｐｍ、４℃、５秒間）した。得られた磨砕液を４層のナイロンガーゼでろ過し、得られたろ液を遠心分離（１３，１７０×ｇ、４℃、１分間）した。得られた沈殿画分を６０ｍｌの磨砕バッファーに懸濁し、遠心分離（２，６４０×ｇ、４℃、２分間）した。沈殿画分を再び１０ｍｌの磨砕バッファーに懸濁し、遠心管に入れた２０ｍｌの高密度バッファー［１ｍＭ　塩化マグネシウム、２０ｍＭ　Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、３０ｍＭ　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペリジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　システイン、０．６Ｍ　ショ糖；ｐＨ７．７］に重層した。遠心分離（６７５×ｇ、４℃、１５分間）し、沈殿を３ｍｌの懸濁バッファー［１ｍＭ　塩化マグネシウム、２０ｍＭ　Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、３０ｍＭ　Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペリジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ；ｐＨ７．７］に懸濁し、プラスチド画分とした。
【０１９５】
（２）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）、３ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、１ｍｇ／ｍｌホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１５Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液１００μｌを調製し３０℃で１０分間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分を含まない５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液１００μｌを調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に１０μｌの２Ｎ塩酸および５００μｌの酢酸エチルを加えて攪拌し、８０００×ｇで遠心分離し４９０μｌの酢酸エチル層を回収した。該酢酸エチル層を減圧下で乾固させた後、残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１）と記す。］のうち４０μｌをＨＰＬＣで分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１）では検出されないピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。該ピークに含まれる化合物の質量は、化合物（ＸＩＩ）の質量に比べて１４小さかった。
【０１９６】
上記（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌおよび実施例４１（１）で調製されたプラスチド画分６０μｌを混合し、暗条件下、２０μｌの基質溶液（１０ｍＭ　アデノシン三リン酸、５ｍＭ　アミノレブリン酸、４ｍＭ　還元型グルタチオン、０．６ｍＭ　ＮＡＤ＋；ｐＨ６．５）（以下、該基質溶液を、ＰＰＯ基質溶液と記す。）を添加して３０℃で１．５時間保温した。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌに替えて（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌを添加した反応液を調製し、同様にＰＰＯ基質溶液を添加して保温した。保温後の各反応液に３００μｌのジメチルスルホキシド−メタノール混合液（ジメチルスルホキシド：メタノール＝７：３）を加え、遠心分離（８０００×ｇ、４℃、１０分間）した。上清を回収し、以下の分析条件２にて逆相ＨＰＬＣ分析に供して、ＰＰＩＸ量を測定した。（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量は、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量よりも多かった。
【０１９７】
（ＨＰＬＣ分析条件２）
カラム：スミパックスＯＤＳ２１２（住化分析センター製）
流速：２ｍｌ／分
検出波長：蛍光　Ｅｘ＝４１０ｎｍ　Ｅｍ＝６３０ｎｍ
溶出液：メタノール−１Ｍ　酢酸アンモニウム（ｐＨ５．７）混合液（メタノール：１Ｍ　酢酸アンモニウム＝９５：５）
【０１９８】
（３）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）の代わりに５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩＩ）を使用する以外は実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１）では検出されないピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。該ピークに含まれる化合物の質量は、化合物（ＸＩＩＩ）の質量に比べて１４小さかった。
【０１９９】
上記（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）の１２８倍希釈液２０μｌおよびプラスチド画分６０μｌを混合し、暗条件下、２０μｌのＰＰＯ基質溶液を添加して３０℃で１．５時間保温した。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）の１２８倍希釈液２０μｌに替えて（ＸＩＩＩ）コントロール（Ａ１）の１２８倍希釈液２０μｌを添加した反応液を調製し、同様にＰＰＯ基質溶液を添加して保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様に処理して上記分析条件２にて逆相ＨＰＬＣ分析に供し、ＰＰＩＸ量を測定した。（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量は、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量よりも多かった。
【０２００】
（４）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＸＶＩ）の代謝
５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）の代わりに１２．５ｐｐｍの化合物（ＸＶＩ）を使用する以外は実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を２００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩ）　代謝液（Ａ１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＶＩ）の濃度と比較して、（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＶＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）から、（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１）では検出されないピークが検出された。
【０２０１】
上記（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）の８倍希釈液２０μｌおよびプラスチド画分６０μｌを混合し、暗条件下、２０μｌのＰＰＯ基質溶液を添加して３０℃で１．５時間保温した。また、（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）の８倍希釈液２０μｌに替えて（ＸＶＩ）コントロール（Ａ１）の８倍希釈液２０μｌを添加した反応液を調製し、同様にＰＰＯ基質溶液を添加して保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様に処理して上記分析条件２にて逆相ＨＰＬＣ分析に供し、ＰＰＩＸ量を測定した。（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量は、（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量よりも多かった。
【０２０２】
（５）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＸＶＩＩ）の代謝
５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）の代わりに１２．５ｐｐｍの化合物（ＸＶＩＩ）を使用する以外は実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を２００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩＩ）　代謝液（Ａ１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＶＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された化合物（ＸＶＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）から、（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１）では検出されないピークが検出された。
【０２０３】
上記（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌおよびプラスチド画分６０μｌを混合し、暗条件下、２０μｌのＰＰＯ基質溶液を添加して３０℃で１．５時間保温した。また、（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌに替えて（ＸＶＩＩ）コントロール（Ａ１）の３２倍希釈液２０μｌを添加した反応液を調製し、同様にＰＰＯ基質溶液を添加して保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様に処理して上記分析条件２にて逆相ＨＰＬＣ分析に供し、ＰＰＩＸ量を測定した。（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量は、（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量よりも多かった。
【０２０４】
（６）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＶＩ）の代謝
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＴＢ培地で３７℃にて一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに２０時間培養した。
培養液から菌体を回収し、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１％グルコースを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液に終濃度１００ｐｐｍとなるように化合物（ＶＩ）を添加し３０℃で振とう培養した。振とう開始０時間後、１日後に菌体懸濁液２ｍｌを分取してそれぞれに５０μｌの２Ｎ塩酸を添加し、これを２ｍｌの酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層を分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＶＩ）の濃度と比較して、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＶＩ）の濃度は低かった。また、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から、振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層では検出されないピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。該ピークに含まれる化合物の質量は、化合物（ＶＩ）の質量に比べて１４小さかった。
【０２０５】
（７）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＶＩＩＩ）の代謝
化合物（ＶＩ）の代わりに化合物（ＶＩＩＩ）を使用する以外は、実施例４１（６）に記載した方法に従って、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆの培養、菌体懸濁液の調製、該菌体懸濁液に化合物（ＶＩＩＩ）を添加した振とう培養、菌体懸濁液からの試料調製、および該試料のＨＰＬＣ分析を行った。振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＶＩＩＩ）の濃度と比較して、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＶＩＩＩ）の濃度は低かった。また、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から、振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層では検出されない２種のピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。化合物（ＶＩＩＩ）の質量に比べて、１つのピークに含まれる化合物の質量は１４小さく、もう１つのピークに含まれる化合物の質量は２８小さかった。
【０２０６】
（８）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（Ｘ）の代謝
化合物（ＶＩ）の代わりに化合物（Ｘ）を使用する以外は、実施例４１（６）に記載した方法に従って、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆの培養、菌体懸濁液の調製、該菌体懸濁液に化合物（Ｘ）を添加した振とう培養、菌体懸濁液からの試料調製、および該試料のＨＰＬＣ分析を行った。振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（Ｘ）の濃度と比較して、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（Ｘ）の濃度は低かった。また、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から、振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層では検出されない２種のピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。化合物（Ｘ）の質量に比べて、１つのピークに含まれる化合物の質量は４０小さく、もう１つのピークに含まれる化合物の質量は５４小さかった。
【０２０７】
（９）本発明蛋白質（Ａ１）による化合物（ＸＩ）の代謝
化合物（ＶＩ）の代わりに化合物（ＸＩ）を使用する以外は、実施例４１（６）に記載した方法に従って、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆの培養、菌体懸濁液の調製、該菌体懸濁液に化合物（ＸＩ）を添加した振とう培養、菌体懸濁液からの試料調製、および該試料のＨＰＬＣ分析を行った。振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＸＩ）の濃度と比較して、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（ＸＩ）の濃度は低かった。また、振とう開始１日後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から、振とう開始０時間後の菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層では検出されない２種のピークが検出された。該ピークに含まれる化合物の質量分析を行った。化合物（ＸＩ）の質量に比べて、１つのピークに含まれる化合物の質量は１４小さく、もう１つのピークに含まれる化合物の質量は１６大きかった。
【０２０８】
実施例４２　本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物の代謝
（１）本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物（Ｘ）の代謝
大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦまたはＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＴＢ培地で３７℃にて一晩培養した。得られた培養液のうち１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＴＢ培地に植菌して２６℃で培養し、ＯＤ６６０が約０．５になったところで、最終濃度５００μＭになるよう５−アミノレブリン酸を添加し培養を継続した。その３０分後に最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加しさらに１８時間培養した。
各培養液から菌体を回収し、それぞれ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１％グルコースを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー１０ｍｌに懸濁した。得られた菌体懸濁液に終濃度２５ｐｐｍとなるように化合物（Ｘ）を添加し３０℃で振とう培養した。振とう開始０時間後、４日後に菌体懸濁液２ｍｌを分取して５０μｌの２Ｎ塩酸を添加し、これを２ｍｌの酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層を分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（Ｘ）の濃度と比較して、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦ菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から検出された化合物（Ｘ）の濃度は低かった。また、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦ菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層から、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層では検出されない３種のピークが検出された。この３種のピークのうち、１つのピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（８）で検出された化合物（Ｘ）よりも質量が４０小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。また、他の１つのピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（８）で検出された化合物（Ｘ）よりも質量が５４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２０９】
上記のＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層１ｍｌおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦ菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層１ｍｌをそれぞれ減圧下で乾固させた後、残渣を１ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解させた［以下、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２菌体懸濁液から調製された酢酸エチル層由来の溶解液を（Ｘ）コントロール液（Ａ１１）と記す。また、ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ８４９ＡＦ菌体懸濁液から調製した酢酸エチル層由来の溶解液を（Ｘ）代謝液（Ａ１１）と記す。］。
（Ｘ）代謝液（Ａ１１）の１２８倍希釈液２０μｌおよびプラスチド画分６０μｌを混合し、暗条件下、２０μｌのＰＰＯ基質溶液を添加して３０℃で１．５時間保温した。また、（Ｘ）代謝液（Ａ１１）の１２８倍希釈液２０μｌの代わりに（Ｘ）コントロール液（Ａ１１）の１２８倍希釈液２０μｌを添加した反応液を調製し、同様にＰＰＯ基質溶液を添加して保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様に処理して上記分析条件２にて逆相ＨＰＬＣ分析に供し、ＰＰＩＸ量を測定した。（Ｘ）代謝液（Ａ１１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量は、（Ｘ）コントロール液（Ａ１１）が添加された反応液におけるＰＰＩＸ量よりも多かった。
【０２１０】
（２）本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１１）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１１】
（３）本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１１）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１２】
（４）本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物（ＸＶＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は実施例４１（４）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を２００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１１）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＶＩ）の濃度と比較して、（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＶＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１１）から、（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（４）で（ＸＶＩ）代謝液（Ａ１）からは検出され（ＸＶＩ）コントロール液（Ａ１）からは検出されなかったピークの溶出時間と一致した。
【０２１３】
（５）本発明蛋白質（Ａ１１）による化合物（ＸＶＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は実施例４１（５）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を２００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１１）と記す。）を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＶＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１１）から検出された化合物（ＸＶＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１１）から、（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（５）で（ＸＶＩＩ）代謝液（Ａ１）からは検出され（ＸＶＩＩ）コントロール液（Ａ１）からは検出されなかったピークの溶出時間と一致した。
【０２１４】
実施例４３　本発明蛋白質（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ１２）、（Ａ１３）、（Ａ１４）もしくは（Ａ１５）、または本蛋白質（Ａ１０）による化合物の代謝
（１）本発明蛋白質（Ａ２）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例７（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例７（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１５】
（２）本発明蛋白質（Ａ３）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例１２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ３）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ３）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ３）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１６】
（３）本蛋白質（Ａ１０）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例１０（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１０（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１０）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１２（０）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１０）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１０）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１０）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１０）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１０）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１７】
（４）本発明蛋白質（Ａ１２）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３４（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１２）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１２）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１２）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１８】
（５）本発明蛋白質（Ａ１３）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３６（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３６（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３６（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１３）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２１９】
（６）本発明蛋白質（Ａ１４）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３８（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３８（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１４）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３８（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１４）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１４）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１４）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１４）から、（ＸＩＩ）コントロール（Ａ１４）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２０】
（７）本発明蛋白質（Ａ１５）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例４０（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４０（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１５）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４０（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１５）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１５）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１５）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１５）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１５）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２１】
（８）本発明蛋白質（Ａ２）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例７（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例７（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２２】
（９）本発明蛋白質（Ａ３）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例１２（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１２（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１２（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ３）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ３）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ３）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２３】
（１０）本蛋白質（Ａ１０）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例１０（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１０（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１０）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例１０（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１０）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１０）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１０）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１０）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１０）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２４】
（１１）本発明蛋白質（Ａ１２）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３４（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３４（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１２）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３４（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１２）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１２）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１２）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１２）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）５検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２５】
（１２）本発明蛋白質（Ａ１３）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３６（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３６（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３６（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１３）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１３）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１３）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２６】
（１３）本発明蛋白質（Ａ１４）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例３８（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３８（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１４）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例３８（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１４）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１４）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１４）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１４）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１４）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２７】
（１４）本発明蛋白質（Ａ１５）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例４（２）で回収された上清画分２０μｌ　の代わりに実施例４０（２）で回収された上清画分２０μｌを使用する以外は、実施例４１（３）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例４１（２）と同様にして酢酸エチル抽出し、得られた残渣を１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解させた。得られた溶解液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４０（２）で回収された上清画分２０μｌを含む反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１５）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４０（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該溶解液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１５）と記す。］を上記分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１５）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１５）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１５）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１５）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と一致した。
【０２２８】
実施例４４　本発明蛋白質（Ａ１）を認識する本発明抗体（Ａ）［以下、本発明抗体（Ａ１）と記す。］の調製
（１）本発明蛋白質（Ａ１）を発現する大腸菌抽出液の調製
実施例４（２）に記載の方法に従い、本発明蛋白質（Ａ１）を発現する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７Ｆを一晩前培養した後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地１Ｌで培養した。培養液から菌体を回収し、破砕した後、得られた菌体破砕液から上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆ）を調製した。
（２）本発明蛋白質（Ａ１）の精製
実施例４４（１）で得られた上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆ）を、実施例２（４）に記載の方法に準じて、ＨｉＬｏａｄ２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰ　カラム、次いで、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ，　Ｔｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｕｍｎ　ＣＨＴ１０−１　カラムに供し本発明蛋白質（Ａ１）を精製した。精製された画分をＳＤＳ−１０％〜２０％ＰＡＧＥ解析し、本発明蛋白質（Ａ１）のみを含む画分であることを確認した。
（３）本発明抗体（Ａ１）の調製
実施例４４（２）で精製された本発明蛋白質（Ａ１）を１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した。得られた溶液２ｍｌに、あらかじめ４２℃から４３℃にインキュベートされたＲＡＳ〔ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ　Ｌｉｐｉｄ　Ａ）＋ＴＤＭ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　Ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ）＋ＣＷＳ（Ｃｅｌｌ　Ｗａｌｌ　Ｓｋｅｌｅｔｏｎ）　アジュバントシステム〕（Ｓｉｇｍａ　社製）４０μｌを加え、よく混合した。得られた混合物を、ニュージーランドホワイト種ウサギ（雌、１４週齢、平均２．４ｋｇ）一羽あたり１ｍｌずつ投与した。その内訳は、１００μｌずつ背部１０ケ所に皮下投与であった。３週間後および５週間後に、それぞれ初回投与量の１／２量を同様に投与した。この間ウサギの耳静脈から少量の血液をサンプリングし、抗体価を測定した。３回目の投与後に抗体価が上昇したため、３回目投与の約２週間後に免疫感作したウサギの頚動脈から全採血した。得られた血液をセパラピットチューブ（積水化学社製）に入れ、３７℃で２時間インキュベートした後、遠心分離（３０００ｒｐｍ　、２０ｍｉｎ、室温）して上清を回収することにより、抗血清［本発明抗体（Ａ１）を含む。］を得た。
【０２２９】
実施例４５　本発明抗体（Ａ１）による本蛋白質の検出および本蛋白質を発現する細胞の検出
各種大腸菌抽出液に対し、実施例４４で得た本発明抗体（Ａ１）を用いてイムノブロッティングを行った。実施例４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７Ｆ（約０．５ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１）を含む、約０．７８ｍｇの蛋白質を含む）、実施例４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２（約０．７８ｍｇの蛋白質を含む）、実施例７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ９２３Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２）を含む）、実施例１２（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６７１Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ３）を含む）、実施例２７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ４）を含む）、実施例１０（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１１７９６Ｆ（約２ｐｍｏｌの本蛋白質（Ａ１０）を含む）、実施例１４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮＳＣＡ（約２ｐｍｏｌの本蛋白質（Ａ９）を含む）、実施例３２（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ８４９ＡＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１１）を含む）、実施例３４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６１８Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１２）を含む）、実施例３６（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４７４Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１３）を含む）、実施例３８（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１４９１ＡＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１４）を含む）、実施例４０（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５５ＡＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１５）を含む）をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動（４０ｍＡ、１　時間）した。このゲルにＰＶＤＦ膜を重ね、転写用緩衝液（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、１９２ｍＭ　グリシン、１０％　メタノール）中に浸した状態で、ＢＩＯ−ＲＡＤ　社製のブロッティング装置により、４　℃、３０Ｖ、２時間処理することにより、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜へと移動させた。得られたＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　溶液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　）で洗浄した後、３％のＢＳＡを含むＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　溶液中で、３０分間インキュベートし、その後、３％のＢＳＡを含むＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　溶液で３００００倍希釈した上記抗血清と、３０分間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　溶液で２回洗浄した後、３％のＢＳＡを含むＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　溶液にて３０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識した抗ウサギＩｇＧヤギ抗血清（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と、３０分間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ　＋Ｔｗｅｅｎ２０　で２　回洗浄した後、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ溶液（シグマ社製）に浸した。本発明蛋白質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ１１）、（Ａ１２）、（Ａ１３）、（Ａ１４）および（Ａ１５）、ならびに、本蛋白質（Ａ９）およびＡ１０）にそれぞれ相当するバンドの発色が検出された。実施例４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２（約０．７８ｍｇの蛋白質を含む）の試料では、発色バンドが検出されなかった。
実施例４６　ダイズでの発現用にコドン使用率が調整された本発明ＤＮＡ（Ａ１）［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓと記す。］の作製と発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓの作製
配列番号１９２で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１３で示される塩基配列を有するプライマーとを用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造社製）を用いて付属の取り扱い説明書に従いＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１２で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９０で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１１で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液１とした。
配列番号１９５で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２１０で示される塩基配列を有するプライマーとを用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造社製）を用いて付属の取り扱い説明書に従いＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９４で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０９で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９３で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０８で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液２とした。
配列番号１９８で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０７で示される塩基配列を有するプライマーとを用いＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造社製）を用いて付属の取り扱い説明書に従いＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９７で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０６で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９６で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０５で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液３とした。
配列番号２０１で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０４で示される塩基配列を有するプライマーとを用いＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造社製）を用いて付属の取り扱い説明書に従いＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号２００で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０３で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号１９９で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０２で示される塩基配列を有するプライマーとを用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液４とした。
こうして得られた反応液１〜４を混合し、その一部を鋳型として、配列番号１９０で示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２０２で示される塩基配列を有するプライマーとを用いＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（宝酒造社製）を用いて付属の取り扱い説明書に従いＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡの塩基配列を確認し、配列番号２１４で示される塩基配列の５’末端上流に塩基配列５’−ｃａｔ−３’が、また３’末端下流に塩基配列５’−ａａｇｃｔｔ−３’がそれぞれ連結されてなる配列を有するＤＮＡを得た。
配列番号６で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ１）のコドン使用率（ＧＣ含量７０．５８％）を表２２および表２３に、ダイズのコドン使用率［ＧＣ含量４６．１２％。かずさＤＮＡ研究所ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ　ｄａｔａｂａｓｅ　（ｈｔｔｐ／／：ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）　より引用］を表２４および表２５に、配列番号２１４で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ１）のコドン使用率（ＧＣ含量５１．５９％）を表２６および表２７に、それぞれ示す。
【０２３０】
【表２２】
2004057194.tif 000030
【０２３１】
【表２３】
2004057194.tif 000031
【０２３２】
【表２４】
2004057194.tif 000032
【０２３３】
【表２５】
2004057194.tif 000033
【０２３４】
【表２６】
2004057194.tif 000034
【０２３５】
【表２７】
2004057194.tif 000035
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓを有する形質転換大腸菌の作製
実施例４６（１）で得られた配列番号２１４で示される塩基配列を含むＤＮＡを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。該ＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２１４で示される塩基配列を有するＤＮＡがｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙとした。
（３）本発明蛋白質（Ａ１）の大腸菌での発現と蛋白質の回収
実施例４６（２）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙおよび実施例４（１）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７を、実施例４（２）と同様にしてそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６５７から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７と記す。）を調製した。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７ｓｏｙに含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量は、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６５７に含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量と比較して多かった。
【０２３６】
実施例４７　本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓの植物への導入
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（１）
本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓをパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。
まず、実施例４６（２）で得たｐＫＳＮ６５７ｓｏｙを鋳型にして、配列番号３９４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３９５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９４℃にて２分間の保温を１回行った後、９４℃にて３０秒間次いで５０℃にて３０秒間次いで６８℃にて６０秒間の保温を１サイクルとしてこれを３０回実施し、最後に６８℃にて３分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ−Ｃｌｅａｎ　ｕｐ−（東洋紡績社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行うことにより回収精製した。精製されたＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化した後、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。実施例１６の（２）で得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７を制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩで消化した後、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列およびベクタープラスミドｐＵＣ１９由来の塩基配列を含む約２．９ｋｂｐのＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡと上記の配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７ｓｏｙ（図４８）を得た。
得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡが、ＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙ（図４９）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙは配列番号２１４で示される塩基配列を有することが確認された。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（２）
本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓをパーティクルガン法で植物に導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。まず、実施例４６で得られたｐＫＳＮ６５７ｓｏｙを鋳型にして、配列番号３９６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３９５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９４℃にて２分間の保温を１回行った後、９４℃にて３０秒間次いで４６℃にて３０秒間次いで６８℃にて６０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２５回実施し、最後に６８℃にて３分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ−Ｃｌｅａｎ　ｕｐ−（東洋紡績社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行うことにより回収精製した。得られたＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで消化し、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。
次に、実施例１６（３）で得られたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７を制限酵素ＢｓｐＨＩで消化した後、ＴａＫａＲａ　ＢＫＬＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて付属のマニュアルに従って処理することにより、このＤＮＡの末端平滑化および５’末端のりん酸化を行った。次いで、前記ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩで消化した後、プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２由来のＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、上記の配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＳａｃＩ消化されたＤＮＡとライゲーションすることにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙ（図５０）を得た。
得られたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号２１４で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙ（図５１）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙは配列番号２１４で示される塩基配列を有することが確認された。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２１）Ｓのダイズへの導入
ＭＳ培地のビタミン類をＢ５培地［Ｏ．　Ｌ．　Ｇａｍｂｏｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｘｐ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．　（１９８６）５０　ｐ１５１に記載。］のビタミン類に置換する以外は、実施例１７（１）に記載した方法に従って、ダイズ（品種；ＦａｙｅｔｔｅおよびＪａｃｋ）の球状型胚を調製した。
得られた球状型胚を新しい不定胚増殖培地に移植し、２〜３日培養した。前記球状型胚に、実施例４７（１）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙまたは実施例４７（２）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙを、実施例１７（２）に記載の方法に従って導入した。
（４）不定胚のハイグロマイシンによる選抜
ＭＳ培地のビタミン類をＢ５培地のビタミン類に置換する以外は、実施例１７（３）に記載した方法に従って、実施例４７（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚のハイグロマイシンによる選抜を行なった。ただし、移植２回目以降は、不定胚選抜培地として、０．２（Ｗ／Ｖ）％のゲルライトを加えて固化した培地、または、ゲルライトを加えていない液体の培地を用いた。液体の培地の場合は、１分間に９０回程度緩やかに旋回して培養した。
（５）不定胚の化合物（ＩＩ）による選抜
ＭＳ培地のビタミン類をＢ５培地のビタミン類に置換する以外は、実施例１７（４）に記載した方法に従って、実施例４７（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚の化合物（ＩＩ）による選抜を行なう。
（６）不定胚からの個体再生、順化および栽培
実施例１７（５）に記載の方法に準じて、実施例４７（４）または（５）で選抜された球状型胚からの個体再生を行なう。ただし、発生培地の寒天濃度を０．８（Ｗ／Ｖ）％、または、１．０（Ｗ／Ｖ）％とする。また、発芽培地のＭＳ培地のビタミン類をＢ５培地のビタミン類に置換する。
本葉を展開し発根した個体について、実施例１７（６）に記載の方法に従って、順化および栽培を行い、採種する。
（７）雑草防除活性を有する化合物（ＩＩ）に対する耐性の評価
実施例１７（４）に記載した方法に従って、実施例４７（６）で得られた再生植物個体の化合物（ＩＩ）に対する耐性度を評価する。
（８）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓを有するアグロバクテリウム導入用葉緑体発現プラスミドの構築
本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓをアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを実施例１８で得たバイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＮｏｔＩ切断部位に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙ（図５２）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１ＳのＮｏｔＩ切断部位に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙ（図５３）を得た。
（９）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓのタバコへの導入
実施例４７（８）で得られたプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙおよびプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙを用いて本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓをアグロバクテリウム法でタバコへ導入した。
まず、実施例１９に記載の方法に従って、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙおよびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙをそれぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　社製）に導入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙを持つ組換えアグロバクテリウム株をそれぞれ単離した。
次いで、上記のプラスミドを持つ組換えアグロバクテリウム株を用いて、これらの株を２５ｍｇ／Ｌ　カナマイシンを含む　ＬＢ　液体培地中で３０℃にて終夜培養した他は実施例１９に記載の方法に従って、タバコへの遺伝子導入を行った。ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙのＴ−ＤＮＡ　領域が組み込まれた組換えタバコ個体がそれぞれ取得された。
（１０）本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓ組換えタバコの葉片を用いた耐性の評価
実施例４７（９）で取得された組換えタバコ３５個体から葉を切除して、一片　５〜７ｍｍ　の葉片を採取した。それぞれの葉片を化合物（ＩＩ）を０、０．０５、０．１、または０．２　ｍｇ／Ｌ　添加した　ＭＳ　寒天培地に植え込み、明所・室温で培養し、培養　１１日後にそれぞれの葉片の薬害の程度を観察した。また、それぞれの葉片を化合物（ＸＩＩ）を０、０．０１、０．０２、０．０５、または０．１　ｍｇ／Ｌ　添加したＭＳ　寒天培地に植え込み、明所・室温で培養し、培養　７日後にそれぞれの葉片の薬害の程度を観察した。コントロールとしては、遺伝子導入を行っていないタバコ（以下、野生型タバコと記す。）の葉片を各濃度で２０枚用いた。継続的に生存する葉片を１、薬害認められる半枯死の葉片を０．５、白化して枯死した葉片を０としてスコアリングし、各群のスコアの平均を求めた。本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓ（プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙのＴ−ＤＮＡ領域）が導入されたタバコの葉片は、化合物（ＩＩ）および化合物（ＸＩＩ）のいずれに対しても、野生型タバコよりも高いスコアを示した。
実施例４８　本発明ＤＮＡ（Ａ１６）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１６）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例４８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２２５で示される塩基配列の塩基番号３４３〜１０６９で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例４８（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２６５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２６６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３５で示される塩基配列の塩基番号１〜５０１で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例４８（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２６７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２６８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３５で示される塩基配列の塩基番号１０４４〜１４５４で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１６）の塩基配列解析
実施例４８（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２３５で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２５１塩基（終止コドンを含む）からなり４１６アミノ酸残基（配列番号２１５）をコードする塩基配列（配列番号２２５）と、１９８塩基（終止コドンを含む）からなり６５アミノ酸残基（配列番号２４５）をコードする塩基配列（配列番号２５５）とが含まれた。配列番号２２５で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２１５）からなる蛋白質の分子量は、４６０１３Ｄａと計算された。配列番号２５５で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２４５）からなる蛋白質の分子量は、６７６８Ｄａと計算された。
実施例４９　本発明蛋白質（Ａ１６）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１６）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例４８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＧｅｎｅＡｍｐハイフィデリティーＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムジャパン社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号２６９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２８６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合わせを用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを５０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．０ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を５．０μｌ、１０×バッファー（ＭｇＣｌ２含有）を５．０μｌ、およびＧｅｎｅＡｍｐ　ＨＦ酵素ミックスを０．５μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量５０μｌとした。保温条件は、９７℃で１分間保温した後、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを１０サイクル繰り返し、続いて、９７℃で１５秒間次いで６０℃で３０秒間さらに７２℃で９０秒間（７２℃での保温は１サイクル毎に５秒間ずつ増加させる）の保温を１サイクルとしてこれを１５サイクル行い、さらに７２℃で７分間保温した。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、２６７、２８６、２８８で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２３５で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ４５２Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ４５２Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２３５で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１６）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ４５２Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４５２Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ１６）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４５２ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ４５２Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４５２Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例４９（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４５２Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４５２Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例５０　本発明ＤＮＡ（Ａ１７）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７の染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１７）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例５０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７の染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２２６で示される塩基配列の塩基番号３４３〜１０６９で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例５０（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２７０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２７１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３６で示される塩基配列の塩基番号１〜３６１で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例５０（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２７３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３６で示される塩基配列の塩基番号１０３５〜１４５４で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１７）の塩基配列解析
実施例５０（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２３６で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２５１塩基（終止コドンを含む）からなり４１６アミノ酸残基（配列番号２１６）をコードする塩基配列（配列番号２２６）と、１９８塩基（終止コドンを含む）からなり６５アミノ酸残基（配列番号２４６）をコードする塩基配列（配列番号２５６）とが含まれた。配列番号２２６で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２１６）からなる蛋白質の分子量は、４６０８２Ｄａと計算された。配列番号２５６で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２４６）からなる蛋白質の分子量は、６７６８Ｄａと計算された。配列番号２５６で示される塩基配列は、配列番号２５５で示される塩基配列と１００％同一であり、配列番号２４６で示されるアミノ酸配列は、配列番号２４５で示されるアミノ酸配列と１００％同一であった。
実施例５１　本発明蛋白質（Ａ１７）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１７）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例５０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２７５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、２７４、２７６、２７７で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２３６で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６０８Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ６０８Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２３６で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１７）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ６０８Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６０８Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ１７）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６０８ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６０８Ｆ　から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６０８Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例５１（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６０８Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６０８Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例５２　本発明ＤＮＡ（Ａ１８）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１８）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例５２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１７を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２２７で示される塩基配列の塩基番号５２６〜１０４８で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例５２（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２７８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３７で示される塩基配列の塩基番号１〜６００で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例５２（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｌＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号１６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号１６４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３７で示される塩基配列の塩基番号９８３〜１４４９で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１８）の塩基配列解析
実施例５２（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２３７で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３０塩基（終止コドンを含む）からなり４０９アミノ酸残基（配列番号２１７）をコードする塩基配列（配列番号２２７）と、２０７塩基（終止コドンを含む）からなり６８アミノ酸残基（配列番号２４７）をコードする塩基配列（配列番号２５７）とが含まれた。配列番号２２７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２１７）からなる蛋白質の分子量は、４５０９９Ｄａと計算された。配列番号２５７で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２４７）からなる蛋白質の分子量は、７１９３Ｄａと計算された。
実施例５３　本発明蛋白質（Ａ１８）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１８）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例５２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２８０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、１６３、２７９、２８１で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２３７で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ６４６ＢＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ６４６ＢＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２３７で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１８）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ６４６ＢＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６ＢＦとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ１８）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６ＢＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ６４６ＢＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６ＢＦ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例５３（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６ＢＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６ＢＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例５４　本発明ＤＮＡ（Ａ１９）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ１９）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例５４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２２８で示される塩基配列の塩基番号３４３〜１０６９で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例５４（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２８２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３８で示される塩基配列の塩基番号１〜３５８で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例５４（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２８５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３８で示される塩基配列の塩基番号１００５〜１４５４で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ１９）の塩基配列解析
実施例５４（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２３８で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２５１塩基（終止コドンを含む）からなり４１６アミノ酸残基（配列番号２１８）をコードする塩基配列（配列番号２２８）と、１５６塩基（終止コドンを含む）からなり５１アミノ酸残基（配列番号２４８）をコードする塩基配列（配列番号２５８）とが含まれた。配列番号２２８で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２１８）からなる蛋白質の分子量は、４５９０３Ｄａと計算された。配列番号２５８で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２４８）からなる蛋白質の分子量は、５１７５Ｄａと計算された。
実施例５５　本発明蛋白質（Ａ１９）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ１９）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例５４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２８６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２８７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、２８４、２８６、２８８で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２３８で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５０２Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５０２Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２３８で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ１９）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５０２Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５０２Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ１９）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５０２ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５０２Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５０２Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例５５（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５０２Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５０２Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例５６　本発明ＤＮＡ（Ａ２０）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２０）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例５６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２２９で示される塩基配列の塩基番号３０４〜１０３６で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例５６（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｍａｃＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２７８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２８９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３９で示される塩基配列の塩基番号１〜３１８で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例５６（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｔｕＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２９０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２９１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２３９で示される塩基配列の塩基番号９６９〜１４６１で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２０）の塩基配列解析
実施例５６（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２３９で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２１８塩基（終止コドンを含む）からなり４０５アミノ酸残基（配列番号２１９）をコードする塩基配列（配列番号２２９）と、２３１塩基（終止コドンを含む）からなり７６アミノ酸残基（配列番号２４９）をコードする塩基配列（配列番号２５９）とが含まれた。配列番号２２９で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２１９）からなる蛋白質の分子量は、４５０７１Ｄａと計算された。配列番号２５９で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２４９）からなる蛋白質の分子量は、７８１６Ｄａと計算された。
実施例５７　本発明蛋白質（Ａ２０）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２０）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例５６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２９２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２９３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、１８８、２７８、２９０で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２３９で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５２５Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５２５Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２３９で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２０）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５２５Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５２５Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２０）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５２５ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５２５Ｆ　から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５２５Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例５７（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５２５Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５２５Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例５８　本発明ＤＮＡ（Ａ２１）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２１）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例５８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２３０で示される塩基配列の塩基番号３２８〜１０６３で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例５８（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２９４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２９５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４０で示される塩基配列の塩基番号１〜３４１で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例５８（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号２９６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号２９７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４０で示される塩基配列の塩基番号１０１７〜１４５８で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２１）の塩基配列解析
実施例５８（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２４０で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２４５塩基（終止コドンを含む）からなり４１４アミノ酸残基（配列番号２２０）をコードする塩基配列（配列番号２３０）と、２０１塩基（終止コドンを含む）からなり６６アミノ酸残基（配列番号２５０）をコードする塩基配列（配列番号２６０）とが含まれた。配列番号２３０で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２２０）からなる蛋白質の分子量は、４５８０６Ｄａと計算された。配列番号２６０で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２５０）からなる蛋白質の分子量は、６７１２Ｄａと計算された。
実施例５９　本発明蛋白質（Ａ２１）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２１）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例５８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２９８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２９９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号５７、５９、２９６、２９８、３００で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２４０で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５４３ＢＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５４３ＢＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２４０で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２１）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５４３ＢＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５４３ＢＦとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２１）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５４３ＢＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５４３ＢＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５４３ＢＦ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例５９（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５４３ＢＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５４３ＢＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例６０　本発明ＤＮＡ（Ａ２２）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２２）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例６０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１５を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２３１で示される塩基配列の塩基番号４８３〜１０４８で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例６０（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３０１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３０２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４１で示される塩基配列の塩基番号６８〜５１６で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例６０（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３０２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３０３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４１で示される塩基配列の塩基番号１〜２７０で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例６０（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３０４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３０５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４１で示される塩基配列の塩基番号９８２〜１４４８で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２２）の塩基配列解析
実施例６０（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２４１で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２３０塩基（終止コドンを含む）からなり４０９アミノ酸残基（配列番号２２１）をコードする塩基配列（配列番号２３１）と、１９５塩基（終止コドンを含む）からなり６４アミノ酸残基（配列番号２５１）をコードする塩基配列（配列番号２６１）とが含まれた。配列番号２３１で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２２１）からなる蛋白質の分子量は、４５０５０Ｄａと計算された。配列番号２６１で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２５１）からなる蛋白質の分子量は、６９１４Ｄａと計算された。
実施例６１　本発明蛋白質（Ａ２２）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２２）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３０６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３０７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例３２（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、３０８で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２４１で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５５８ＢＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５５８ＢＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２４１で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２２）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５５８ＢＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５８ＢＦとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２２）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５８ＢＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５５８ＢＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５８ＢＦ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例６１（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５８ＢＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５８ＢＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例６２　本発明ＤＮＡ（Ａ２３）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例６２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２３２で示される塩基配列の塩基番号２８９〜１０１５で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例６２（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３０９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３１０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４２で示される塩基配列の塩基番号１〜３５４で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例６２（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４２で示される塩基配列の塩基番号９６６〜１４１１で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）の塩基配列解析
実施例６２（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２４２で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１１９７塩基（終止コドンを含む）からなり３９８アミノ酸残基（配列番号２２２）をコードする塩基配列（配列番号２３２）と、２０１塩基（終止コドンを含む）からなり６６アミノ酸残基（配列番号２５２）をコードする塩基配列（配列番号２６２）とが含まれた。配列番号２３２で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２２２）からなる蛋白質の分子量は、４３６２４Ｄａと計算された。配列番号２６２で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２５２）からなる蛋白質の分子量は、６７９７Ｄａと計算された。
実施例６３　本発明蛋白質（Ａ２３）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、３０９、３１１、３１５で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２４２で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５８４Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５８４Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２４２で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２３）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５８４Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２３）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４Ｆ　から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例６３（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例６４　本発明ＤＮＡ（Ａ２４）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２４）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例６４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２３３で示される塩基配列の塩基番号３２２〜１０５７で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例６４（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４３で示される塩基配列の塩基番号１〜３８４で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例６４（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＮａｅＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４３で示される塩基配列の塩基番号９９２〜１４６６で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２４）の塩基配列解析
実施例６４（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２４３で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１２４５塩基（終止コドンを含む）からなり４１４アミノ酸残基（配列番号２２３）をコードする塩基配列（配列番号２３３）と、１９８塩基（終止コドンを含む）からなり６５アミノ酸残基（配列番号２５３）をコードする塩基配列（配列番号２６３）とが含まれた。配列番号２３３で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２２３）からなる蛋白質の分子量は、４５８３０Ｄａと計算された。配列番号２６３で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２５３）からなる蛋白質の分子量は、７０３４Ｄａと計算された。
実施例６５　本発明蛋白質（Ａ２４）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２４）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３２１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、３２２で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２４３で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１５８９ＢＦとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１５８９ＢＦを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２４３で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２４）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５８９ＢＦと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８９ＢＦとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２４）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８９ＢＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８９ＢＦから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８９ＢＦ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例６５（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８９ＢＦまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８９ＢＦを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例６６　本発明ＤＮＡ（Ａ２５）の取得
（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔ染色体ＤＮＡの調製
実施例３１（１）に記載の方法にて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）の部分塩基配列を有するＤＮＡの単離
実施例６６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型としプライマー対１４を用いて、実施例２９に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。実施例３１（２）と同様にして、増幅されたＤＮＡをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした後、その塩基配列を解析した。その結果、配列番号２３４で示される塩基配列の塩基番号２８９〜１０１５で示される塩基配列が読み取られた。
また、実施例６６（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３２３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４４で示される塩基配列の塩基番号１〜３０３で示される塩基配列が読み取られた。
さらに、実施例６６（１）で調製された染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｍａｃＩで消化した。得られたＤＮＡを用いて実施例２６（３）に記載の方法にてＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒライブラリーを作製した。得られたライブラリーを鋳型とし、配列番号３１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ１とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行い、一次ＰＣＲ産物を得た。次いで、一次ＰＣＲ産物を鋳型とし、配列番号３２５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとプライマーＡＰ２とを用いて、実施例２６（３）に記載の条件にてＰＣＲを行った。得られたＤＮＡの塩基配列を解析した。配列番号２４４で示される塩基配列の塩基番号９６６〜１４１１で示される塩基配列が読み取られた。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）の塩基配列解析
実施例６６（２）で得られたＤＮＡから読み取られた塩基配列を連結することにより、配列番号２４４で示される塩基配列が得られた。該塩基配列には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在した。すなわち、１１９７塩基（終止コドンを含む）からなり３９８アミノ酸残基（配列番号２２４）をコードする塩基配列（配列番号２３４）と、２０１塩基（終止コドンを含む）からなり６６アミノ酸残基（配列番号２５４）をコードする塩基配列（配列番号２６４）とが含まれた。配列番号２３４で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２２４）からなる蛋白質の分子量は、４４１７５Ｄａと計算された。配列番号２６４で示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号２５４）からなる蛋白質の分子量は、６６８５Ｄａと計算された。
実施例６７　本発明蛋白質（Ａ２５）の大腸菌での発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）を有する形質転換大腸菌の作製
実施例６６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３２６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３２７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いる以外は実施例４９（１）と同様にしてＰＣＲを行った。該ＰＣＲ反応液から、実施例３２（１）と同様にしてＤＮＡを精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）にクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡの塩基配列を、配列番号６７、６８、３１１、３１５、３２３で示される塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて解析した。得られた結果に基づき、配列番号２４４で示される塩基配列を有するプラスミドをｐＣＲ１６０９Ｆとした。実施例３２（１）と同様にして、ｐＣＲ１６０９Ｆを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化物から約１．５ｋｂｐのＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号２４４で示される塩基配列を含有し本発明蛋白質（Ａ２５）をコードするＤＮＡが、ｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１６０９Ｆと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９Ｆとした。
（２）本発明蛋白質（Ａ２５）の大腸菌での発現および蛋白質の回収
実施例４（２）と同様にして、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ＦおよびＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２をそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９Ｆ　から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ２から得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２と記す。）を調製した。
（３）化合物（ＩＩ）を化合物（ＩＩＩ）に変換する能力の検定
実施例３２（３）と同様にして反応液３０μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。ただし、上清画分としては、実施例６７（２）で回収された上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆまたは大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２）を用いた。保温後の各反応液を酢酸エチル抽出し、得られた抽出物をＴＬＣ分析した。展開した後のＴＬＣプレート上の１４Ｃで標識された化合物（ＩＩＩ）に相当するスポット（Ｒｆ値０．２４および０．２９）の有無を調べた。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆを含む反応液から、化合物（ＩＩＩ）に相当するスポットが検出された。一方、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２を含む反応液においては、当該スポットは検出されなかった。
実施例６８　本発明蛋白質（Ａ１６）、（Ａ１７）、（Ａ１８）、（Ａ１９）、（Ａ２０）、（Ａ２１）、（Ａ２２）、（Ａ２３）、（Ａ２４）または（Ａ２５）による化合物の代謝
本発明蛋白質（Ａ１６）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
１２．５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）、３ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（Ａ成分、オリエンタル酵母社製）、１ｍｇ／ｍｌホウレンソウ由来のフェレドキシン（Ｂ成分、ＳＩＧＭＡ社製）、０．１５Ｕ／ｍｌフェレドキシン還元酵素（Ｃ成分、ＳＩＧＭＡ社製）および実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液１００μｌを調製し、３０℃で１０分間保温した。また、前記の反応液組成中のＡ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４９（２）で回収された上清画分を含まない５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）からなる反応液１００μｌを調製し、同様に保温した。保温後の各反応液に、５μｌの２Ｎ塩酸および１００μｌのエタノールを加えて攪拌し、８０００×ｇで遠心分離した上清をウルトラフリー−ＭＣ　０．２２μｍフィルターユニット（ミリポア社製）を用いて濾過した。得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４９（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１６）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例４９（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１６）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１６）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１６）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１６）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１６）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（２）本発明蛋白質（Ａ１７）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５１（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１７）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５１（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１７）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１７）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１７）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１７）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１７）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（３）本発明蛋白質（Ａ１８）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５３（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５３（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１８）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５３（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１８）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１８）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１８）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１８）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１８）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（４）本発明蛋白質（Ａ１９）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５５（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５５（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１９）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５５（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１９）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１９）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１９）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１９）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ１９）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（５）本発明蛋白質（Ａ２０）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５７（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５７（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２０）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２０）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２０）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２０）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２０）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２０）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（６）本発明蛋白質（Ａ２１）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５９（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５９（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５９（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２１）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２１）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２１）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（７）本発明蛋白質（Ａ２２）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６１（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６１（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２２）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６１（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２２）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２２）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２２）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２２）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（８）本発明蛋白質（Ａ２３）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６３（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６３（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６３（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２３）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２３）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２３）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２３）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（９）本発明蛋白質（Ａ２４）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６５（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６５（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２４）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６５（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２４）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２４）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２４）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２４）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２４）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１０）本発明蛋白質（Ａ２５）による化合物（ＸＩＩ）の代謝
実施例４９（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６７（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６７（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２５）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２５）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２５）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２５）から検出された化合物（ＸＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩ）代謝液（Ａ２５）から、（ＸＩＩ）コントロール液（Ａ２５）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（２）で（ＸＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１１）　本発明蛋白質（Ａ１７）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
１２．５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩ）の代わりに１２．５ｐｐｍの化合物（ＸＩＩＩ）を用い、実施例６８（２）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５１（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１７）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５１（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１７）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１７）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１７）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１７）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１７）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１２）　本発明蛋白質（Ａ１８）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５３（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５３（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１８）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５３（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１８）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１８）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１８）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１８）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１８）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１３）　本発明蛋白質（Ａ１９）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５５（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５５（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１９）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５５（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１９）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１９）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１９）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１９）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ１９）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１４）　本発明蛋白質（Ａ２０）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５７（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５７（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２０）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２０）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２０）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２０）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２０）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２０）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１５）　本発明蛋白質（Ａ２１）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例５９（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５９（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２１）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例５９（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２１）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２１）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２１）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２１）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１６）　本発明蛋白質（Ａ２３）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６３（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６３（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２３）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６３（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２３）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２３）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２３）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２３）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
（１７）　本発明蛋白質（Ａ２５）による化合物（ＸＩＩＩ）の代謝
実施例５１（２）で回収された上清画分２０μｌの代わりに実施例６７（２）で回収された上清画分２０μｌを用い、実施例６８（１１）に記載した方法に従って、反応液を調製し保温した。保温後の各反応液を、実施例６８（１）と同様にして調製し、得られた濾液［以下、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６７（２）で回収された上清画分を含む反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２５）と記す。また、Ａ成分、Ｂ成分、Ｃ成分および実施例６７（２）で回収された上清画分を含まない反応液由来の該濾液を（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２５）と記す。］のうち４０μｌを上記ＨＰＬＣ分析条件１にてＨＰＬＣ分析した。（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２５）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度と比較して、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２５）から検出された化合物（ＸＩＩＩ）の濃度は低かった。また、（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ２５）から、（ＸＩＩＩ）コントロール液（Ａ２５）では検出されないピークが検出された。該ピークのＨＰＬＣでの溶出時間は、実施例４１（３）で（ＸＩＩＩ）代謝液（Ａ１）から検出された、化合物（ＸＩＩＩ）よりも質量が１４小さい化合物のピークの溶出時間と、一致した。
実施例６９　本発明ＤＮＡ（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）または（Ａ４）をプローブとしたハイブリダイゼーション
（１）プローブの調製
実施例３０（１）に記載した方法に従ってＰＣＲを行った。ただし鋳型として、実施例３（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ１２８９８の染色体ＤＮＡ　５０ｎｇの代わりに、実施例２６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡ　１０ｎｇを用いた。プライマーとしては、配列番号３２８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。該ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを回収し、配列番号１０９で示される塩基配列を有しジゴキシゲニンで標識されたＤＮＡプローブ（以下、ＤＩＧ標識プローブ（Ａ４）と記す。）を作製した。
（２）プラスミド溶液の調製
実施例３１（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｎｏｇａｌａｔｏｒ　ＩＦＯ１３４４５の染色体ＤＮＡを鋳型に用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）によるＰＣＲを行った。プライマーとしては、配列番号３３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを用いた。ＰＣＲ反応液には、２種類のプライマーをそれぞれ２００ｎＭとなるよう添加し、染色体ＤＮＡを１０ｎｇ、ｄＮＴＰミックス（それぞれ２．５ｍＭの４種類のｄＮＴＰの混合物）を４．０μｌ、５×ＧＣバッファーを１０．０μｌ、２５ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２を２．２μｌ、５Ｍ　ＧＣ−Ｍｅｌｔを１０．０μｌ、およびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣゲノミックポリメラーゼミックス（クロンテック社製）を１．０μｌ添加し、さらに蒸留水を添加して全量を５０μｌにした。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で１分間保温した後、９４℃で１０秒間次いで７２℃で３分間の保温を１サイクルとしてこれを７サイクル繰り返し、続いて、９４℃で１０秒間次いで６７℃で３分間の保温を１サイクルとしてこれを３６サイクル繰り返し、さらに６７℃で７分間保温した。該ＰＣＲ反応液から、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属の取扱説明書に従ってＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に、該ベクターに付属の取扱説明書に従いライゲーションして、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）に導入した。得られた大腸菌形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、本発明ＤＮＡ（Ａ１１）を含むプラスミド溶液を得た。
同様に、実施例３３（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３７８２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１２）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例３５（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｓ　ＩＦＯ１４２７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１３）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例３７（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｌｏｍｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１３６７３ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１４）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例３９（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２４４４の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１５）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例４８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｒｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１３０６９ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１６）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例５０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＡＴＣＣ　１０１３７の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１７）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例５２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　ＩＦＯ　１２７３５の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１８）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例５４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　ＩＦＯ　１３８４９Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ１９）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例５６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎａｔｕｓ　ＩＦＯ　１２７８７Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２０）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例５８（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍｉｓａｗａｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３８５５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２１）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例６２（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｏｒｕｂｅｎｓ　ＩＦＯ　１３６８２Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２３）を含むプラスミド液を得た。
同様に、実施例６６（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｅｆｆｉｓｂｕｒｇｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１３４４６Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３３９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲで得られたＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換した。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２５）を含むプラスミド液を得た。
また同様に、実施例６０（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐａｌｌｉｄｕｓ　ＩＦＯ　１３４３４Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３４０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３４１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行う。該ＰＣＲで得られるＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換する。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２２）を含むプラスミド液を得る。
同様に、実施例６４（１）で調製されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｔｇｅｒｓｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ　１５８７５Ｔの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３４２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３４３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行う。該ＰＣＲで得られるＤＮＡを、上記と同様にベクターとライゲーションした後、大腸菌に形質転換する。得られた大腸菌形質転換体からプラスミドを調製して、本発明ＤＮＡ（Ａ２４）を含むプラスミド液を得る。
（３）ドットブロットハイブリダイゼーション
実施例６９（２）で調製された、本発明ＤＮＡ（Ａ１１）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１２）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１３）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１４）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１５）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１６）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１７）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１８）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ１９）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ２０）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ２１）を含むプラスミドＤＮＡ、本発明ＤＮＡ（Ａ２３）を含むプラスミドＤＮＡおよび本発明ＤＮＡ（Ａ２５）を含むプラスミドＤＮＡを、それぞれ１００ｎｇおよび１０ｎｇ相当量ずつナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ　Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）にブロットした。得られたメンブレンにトランスイルミネーターで５分間紫外線を照射した。
ハイブリダイゼーションと検出は、実施例３０（２）に記載の方法に従って行った。プローブとしては、実施例３０（１）で作製された配列番号６で示される塩基配列を有しジゴキシゲニンで標識されたＤＮＡ（ＤＩＧ標識プローブ（Ａ１））、配列番号７で示される塩基配列を有しジゴキシゲニンで標識されたＤＮＡ（ＤＩＧ標識プローブ（Ａ２））、配列番号８で示される塩基配列を有しジゴキシゲニンで標識されたＤＮＡ（ＤＩＧ標識プローブ（Ａ３））または実施例６９（１）で作製されたＤＩＧ標識プローブ（Ａ４）を、それぞれ１００℃で５分間保温した後、氷上で急冷したものを用いた。ＤＩＧ標識プローブ（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）または（Ａ４）のいずれを用いてハイブリダイゼーションを行った場合でも、上記のプラスミドＤＮＡのそれぞれ１００ｎｇおよび１０ｎｇのいずれの試料についてもシグナルが検出された。
また同様に、実施例６９（２）で調製される本発明ＤＮＡ（Ａ２２）を含むプラスミドＤＮＡおよび本発明ＤＮＡ（Ａ２４）を含むプラスミドＤＮＡを、それぞれ１００ｎｇおよび１０ｎｇ相当量ずつナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ　Ｎ＋（アマシャムバイオサイエンス社製）にブロットする。実施例３０（２）に記載した方法に従ってハイブリダイゼーションと検出を行う。
実施例７０　ダイズでの発現用にコドン使用率が調整された本発明ＤＮＡ（Ａ２３）［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓと記す。］の作製
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓの作製
配列番号３４６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３４５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液１とした。
また、配列番号３４９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３４８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３４７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液２とした。
また、配列番号３５２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３５１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３５０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３５９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液３とした。
また、配列番号３５５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３５８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３５４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３５７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３５３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３５６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液４とした。
上記のようにして得られた反応液１〜４を混合しその一部を鋳型として、配列番号３４４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３５６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡの塩基配列を確認し、配列番号３６８で示される塩基配列の５’末端上流に塩基配列５’−ｃａｔ−３’が、また３’末端下流に塩基配列５’−ａａｇｃｔｔ−３’がそれぞれ連結されてなる配列を有するＤＮＡを得た。
配列番号２３２で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２３）のコドン使用率（ＧＣ含量７３．１０％）を表２８および表２９に、ダイズのコドン使用率（ＧＣ含量４６．１２％）を表２４および表２５に、配列番号３６８で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓのコドン使用率（ＧＣ含量５２．３８％）を表３０および表３１に、それぞれ示す。
【表２８】
2004057194.tif 000036
【表２９】
2004057194.tif 000037
【表３０】
2004057194.tif 000038
【表３１】
2004057194.tif 000039
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓを有する形質転換大腸菌の作製
実施例７０（１）で得られた配列番号３６８で示される塩基配列を含むＤＮＡを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。該ＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号３６８で示される塩基配列を有するＤＮＡがｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙとした。
（３）本発明蛋白質（Ａ２３）の大腸菌での発現と蛋白質の回収
実施例７０（２）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙおよび実施例６３（１）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４Ｆを、実施例４（２）と同様にしてそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１５８４Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆと記す。）を調製した。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙに含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量は、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆに含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量と比較して多かった。
実施例７１　ダイズでの発現用にコドン使用率が調整された本発明ＤＮＡ（Ａ２５）［以下、本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓと記す。］の作製と発現
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓの作製
配列番号３７１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３９２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３９１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３６９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３９０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液１とした。
また、配列番号３７４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液２とした。
また、配列番号３７７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液３とした。
また、配列番号３８０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて、同様にＰＣＲを行った。さらに、このＰＣＲ産物の一部を鋳型とし、配列番号３７８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて同様にＰＣＲを行い、得られた反応液を反応液４とした。
上記のようにして得られた反応液１〜４を混合しその一部を鋳型として、配列番号３６９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用いて付属の取扱い説明書に従ってＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡの塩基配列を確認し、配列番号３９３で示される塩基配列の５’末端上流に塩基配列５’−ｃａｔ−３’が、また３’末端下流に塩基配列５’−ａａｇｃｔｔ−３’がそれぞれ連結されてなる配列を有するＤＮＡを得た。
配列番号２３４で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２５）のコドン使用率（ＧＣ含量７１．９３％）を表３２および表３３に、ダイズのコドン使用率（ＧＣ含量４６．１２％）を表２４および表２５に、配列番号３９３で示される塩基配列を有する本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓのコドン使用率（ＧＣ含量５２．０５％）を表３４および表３５に、それぞれ示す。
【表３２】
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【表３３】
2004057194.tif 000041
【表３４】
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【表３５】
2004057194.tif 000043
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓを有する形質転換大腸菌の作製
実施例７１（１）で得られた配列番号３９３で示される塩基配列を含むＤＮＡを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。該ＤＮＡと、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＳＮ２とをライゲーションすることにより、配列番号３９３で示される塩基配列を有するＤＮＡがｐＫＳＮ２のＮｄｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入されてなるプラスミド（以下、ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙと記す。）を得た。該プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、得られた大腸菌形質転換体をＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙとした。
（３）本発明蛋白質（Ａ２５）の大腸菌での発現と蛋白質の回収
実施例７１（２）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙおよび実施例６７（１）で得られた大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９Ｆを、実施例４（２）と同様にしてそれぞれ培養した後、菌体を回収し、菌体破砕液を調製した。得られた破砕液から、実施例４（２）に記載の方法で、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙ、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９Ｆから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆと記す。）を調製した。大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙに含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量は、大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆに含まれる蛋白質量あたりのＰ４５０量と比較して多かった。
実施例７２　本発明蛋白質（Ａ２５）を認識する本発明抗体（Ａ）［以下、本発明抗体（Ａ２５）と記す。］の調製
（１）本発明蛋白質（Ａ２５）を発現する大腸菌抽出液の調製
実施例４（２）に記載した方法に従い、実施例７１（２）で作製された本発明蛋白質（Ａ２５）を発現する大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙを一晩前培養した後、得られた培養液を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地１Ｌに植菌して２６℃で培養し、最終濃度５００μＭの５−アミノレブリン酸、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを同様に添加してさらに培養した。培養液から菌体を回収し、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄した後、１ｍＭ　ＰＭＳＦを含む前記バッファー１００ｍｌに懸濁した。得られた菌体培養液を、超音波破砕機ＳＯＮＩＦＩＥＲ（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｃ　Ｐｏｗｅｒ社登録商標）を用いて、ｏｕｔ　ｐｕｔ　５、ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ　３０％の条件で１０分間ずつ３回超音波処理して菌体破砕液を得た。得られた破砕液を、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）した後、上清を回収してこれを遠心分離（２００，０００×ｇ、７０分間）し、上清画分（以下、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙから得られた該上清画分を大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙと記す。）を回収した。
（２）本発明蛋白質（Ａ２５）の精製
実施例７２（１）で得られた上清画分（大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙ）をＨｉＬｏａｄ　１６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）に注入した。次いで前記カラムに４０ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００１２５Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲０Ｍから０．３７５Ｍ、流速３ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．０８８Ｍ〜０．１００Ｍにて溶出された画分１０ｍｌを分取した。
分取した画分をＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に供し、２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で溶出させ、蛋白質を含む画分を回収した。次いで、該画分をＭｏｎｏＱ　ＨＲ　１０／１０（アマシャムバイオサイエンス社製）に注入し、該カラムに１６ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した。次いで、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００１０４２Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲０Ｍから０．２５Ｍ、流速４ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．０６０Ｍ〜０．０６９Ｍにて溶出された画分８ｍｌを分取した。
分取した画分を２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）で２．５倍に希釈し、ＭｏｎｏＱ　ＨＲ　５／５（アマシャムバイオサイエンス社製）に注入した。次いで、該カラムに２ｍｌの２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流した後、塩化ナトリウム直線濃度勾配を付して２０ｍＭビストリスプロパンバッファー（ｐＨ７．０）を流し（塩化ナトリウム濃度勾配０．００８３３３Ｍ／分、塩化ナトリウム濃度範囲０Ｍから０．２５Ｍ、流速１ｍｌ／分）、塩化ナトリウム濃度０．０７３Ｍ〜０．０７７Ｍにて溶出された画分０．５ｍｌを分取した。
上記のように精製された画分を、ＰＡＧミニ「第一」１０／２０（第一化学薬品社製）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析し、本発明蛋白質（Ａ２５）を主要に含む画分であることを確認した。
（３）本発明抗体（Ａ２５）の調製
実施例４４（３）に記載した方法に従って本発明抗体（Ａ２５）の調製を行った。ただし、本発明蛋白質（Ａ１）を用いる代わりに、実施例７２（２）で得られた本発明蛋白質（Ａ２５）を用い、本発明抗体（Ａ２５）を含む抗血清を得た。
実施例７３　本発明抗体（Ａ２５）による本発明蛋白質の検出
各種大腸菌抽出液に対し、実施例７２（３）で得られた本発明抗体（Ａ２５）を用いてイムノブロッティングを行った。実施例４９（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ４５２Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１６）を含む）、実施例５１（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６０８Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１７）を含む）、実施例５３（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ６４６ＢＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１８）を含む）、実施例５５（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５０２Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ１９）を含む）、実施例５７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５２５Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２０）を含む）、実施例５９（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５４３ＢＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２１）を含む）、実施例６１（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５５８ＢＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２２）を含む）、実施例６３（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４Ｆ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２３）を含む）、実施例６５（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８９ＢＦ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２４）を含む）、実施例６７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９Ｆ（約０．５ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２５）を含む）、実施例７０（３）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙ（約２ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２３）を含む）、実施例７１（３）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙ（約０．５ｐｍｏｌの本発明蛋白質（Ａ２５）を含む）および実施例６７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２（約０．８ｍｇの蛋白質を含む）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動（４０ｍＡ、１時間）した。このゲル中の蛋白質を、実施例４５に記載した方法に従ってＰＶＤＦ膜に転写した。実施例４５で得られたＰＶＤＦ膜（以下、ＰＶＤＦ膜（Ａ）と記す。）、および上記の方法で得られるＰＶＤＦ膜（以下、ＰＶＤＦ膜（Ｂ）と記す。）を、実施例４５に記載した方法に従って、実施例７２（３）で得られた抗血清と反応させた。その後、実施例４５に記載した方法に従って、二次抗体との反応、洗浄、発色を行った。ＰＶＤＦ膜（Ａ）には、本発明蛋白質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ１１）、（Ａ１２）、（Ａ１３）、（Ａ１４）および（Ａ１５）、ならびに本蛋白質（Ａ９）および（Ａ１０）に相当するバンドの発色が検出された。ＰＶＤＦ膜（Ｂ）には、本発明蛋白質（Ａ１６）、（Ａ１７）、（Ａ１８）、（Ａ１９）、（Ａ２０）、（Ａ２１）、（Ａ２２）、（Ａ２３）、（Ａ２４）および（Ａ２５）に相当するバンドの発色が検出された。ＰＶＤＦ膜（Ａ）の実施例４（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２（約０．７８ｍｇの蛋白質を含む）の試料、ＰＶＤＦ膜（Ｂ）の実施例６７（２）で得られた大腸菌抽出液ｐＫＳＮ２（約０．８ｍｇの蛋白質を含む）の試料では、発色バンドが検出されなかった。
実施例７４　本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓの植物への導入
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（１）
本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓをパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。
まず、実施例７０（２）で得たｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙを鋳型にして、配列番号３９７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３９８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９４℃にて２分間の保温を１回行った後、９４℃にて３０秒間次いで５３℃にて３０秒間次いで６８℃にて９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２０回実施し、最後に６８℃にて３分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ−Ｃｌｅａｎ　ｕｐ−（東洋紡績社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行うことにより回収精製した。得られたＤＮＡを、ＴａＫａＲａ　ＢＫＬＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて付属のマニュアルに従って処理することにより該ＤＮＡの末端平滑化および５’末端のリン酸化を行った後、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。一方、プラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）をＳｍａＩ消化した後、仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）を用いて５’末端の脱リン酸化処理を行った。得られた脱リン酸化ＤＮＡと、上記の配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることによりプラスミドを作製した。得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化した後、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７を制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化した後、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列およびベクタープラスミドｐＵＣ１９由来の塩基配列を含む約２．９　ｋｂｐのＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡと上記の配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ１５８４ｓｏｙ（図５４）を得た。
得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ１５８４ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙ（図５５）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙは配列番号３６８で示される塩基配列を有することが確認された。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（２）
本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓをパーティクルガン法で植物に導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。まず、実施例７０で得たｐＫＳＮ１５８４ｓｏｙを鋳型にして、配列番号３９９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３９８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９４℃にて２分間の保温を１回行った後、９４℃にて３０秒間次いで４６℃にて３０秒間次いで６８℃にて９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２５回実施し、最後に６８℃にて３分間の保温を１回行った。増幅されたＤＮＡを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ−Ｃｌｅａｎ　ｕｐ−（東洋紡績社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行うことにより回収精製した。得られたＤＮＡを、ＴａＫａＲａ　ＢＫＬＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて付属のマニュアルに従って処理することにより該ＤＮＡの末端平滑化および５’末端のりん酸化を行った後、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。一方、実施例１５（３）で得られたプラスミドｐＫＦ１９ΔＢｓをＳｍａＩ消化した後、仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）でを用いて５’末端の脱リン酸化処理を行った。得られた脱リン酸化ＤＮＡと上記の配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることによりプラスミドを作製した。得られたプラスミドを制限酵素ＢｓｐＨＩとＳａｃＩとで消化した後、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。次に、実施例１６の（３）で得たプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７を制限酵素ＢｓｐＨＩとＳａｃＩとで消化して、プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２由来のＤＮＡを単離した。このＤＮＡと、上記の配列番号３６８で示される塩基配列を含有する両端が制限酵素ＢｓｐＨＩとＳａｃＩで切断されたＤＮＡとをライゲーションすることにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙ（図５６）を得た。
得られたプラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号３６８で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙ（図５７）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙは配列番号３６８で示される塩基配列を有することが確認された。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓのダイズへの導入
実施例４７（３）に記載した方法に従って、ダイズ（品種；ＦａｙｅｔｔｅおよびＪａｃｋ）の球状型胚を調製した。
得られた球状型胚を新しい不定胚増殖培地に移植し、２〜３日培養した。この球状型胚に、実施例７４（１）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙまたは実施例７４（２）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙを、実施例１７（２）に記載の方法に従って導入した。
（４）不定胚のハイグロマイシンによる選抜
実施例４７（４）に記載した方法に従って、実施例７４（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚のハイグロマイシンによる選抜を行なう。
（５）不定胚の化合物（ＩＩ）による選抜
実施例４７（５）に記載した方法に従って、実施例７４（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚の化合物（ＩＩ）による選抜を行なう。
（６）不定胚からの個体再生、順化および栽培
実施例４７（６）に記載の方法に従って、実施例７４（４）または（５）で選抜された球状型胚からの個体再生を行なう。
本葉を展開し発根した個体について、実施例１７（６）に記載の方法に従って、順化および栽培を行い、採種する。
（７）雑草防除活性を有する化合物（ＩＩ）に対する耐性の評価
実施例１７（４）に記載した方法に従って、実施例７４（６）で得られた再生植物個体の化合物（ＩＩ）に対する耐性度を評価する。
（８）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓを有するアグロバクテリウム導入用葉緑体発現プラスミドの構築
本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓをアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、実施例１８で得られたバイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１Ｓの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙ（図５８）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを上記バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１Ｓの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙ（図５９）を得た。
（９）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓのタバコへの導入
実施例７４（８）で得られたプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙおよびプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙ　を用いて本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓをアグロバクテリウム法でタバコへ導入した。
まず、実施例１９に記載の方法に従って、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙおよびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙをそれぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　社製）に導入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙを持つ組換えアグロバクテリウム株をそれぞれ単離した。
次いで、上記のプラスミドを持つ組換えアグロバクテリウム株を用いて、実施例４７（９）に記載の方法に従って、タバコへの遺伝子導入を行い、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙの　Ｔ−ＤＮＡ　領域が組み込まれた組換えタバコ個体をそれぞれ取得する。
（１０）本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓ組換えタバコの葉片を用いた耐性の評価
実施例７４（９）で取得された組換えタバコ３５個体から葉を切除して、一片　５〜７ｍｍ　の葉片を採取する。それぞれの葉片を化合物（ＩＩ）または化合物（ＸＩＩ）を添加したＭＳ寒天培地に植え込み、明所・室温で培養し、数日経過後にそれぞれの葉片の薬害の程度を観察する。コントロールとしては野生型タバコの葉片を用い、継続的に生存する葉片、薬害の認められる半枯死の葉片、白化して枯死した葉片をスコアリングし、組換えタバコの耐性を評価する。
実施例７５　本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓの植物への導入
（１）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（１）
本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓをパーティクルガン法で植物へ導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。
まず、実施例７１（２）で得たｐＫＳＮ１６０９ｓｏｙを鋳型にして、配列番号４００で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４０１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使ってＰＣＲを行い、配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９４℃にて２分間の保温を１回行った後、９４℃にて３０秒間次いで５３℃にて３０秒間次いで６８℃にて９０秒間の保温を１サイクルとしてこれを２０回実施し、最後に６８℃にて３分間の保温を１回行った。増幅された該ＤＮＡを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ　＆　Ｇｅｌ−Ｃｌｅａｎ　ｕｐ−（東洋紡績社製）を用いて付属のマニュアルに従って操作を行うことにより回収精製した。得られたＤＮＡを、ＴａＫａＲａ　ＢＫＬＫｉｔ（宝酒造社製）を用いて付属のマニュアルに従って処理することにより該ＤＮＡの末端平滑化および５’末端のりん酸化を行った後、配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。一方、プラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）をＳｍａＩ消化した後、仔牛小腸由来のＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）を用いて５’末端の脱リン酸化処理を行った。得られた脱リン酸化ＤＮＡと、上記の配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることによりプラスミドを作製した。得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化した後、配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡを回収した。実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７を制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩとＳａｃＩとで消化した後、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列およびベクタープラスミドｐＵＣ１９由来の塩基配列を含む約２．９　ｋｂｐのＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡと上記の配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡとをライゲーションすることにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ１６０９ｓｏｙ（図６０）を得た。
得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ１６０９ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙ（図６１）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。さらに、選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙは配列番号３９３で示される塩基配列を有することが確認された。
（２）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓを有する直接導入用葉緑体発現プラスミドの構築（２）
本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓをパーティクルガン法で植物に導入するためのプラスミドとして、ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドを構築した。まず、実施例７５（１）で得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ１６０９ｓｏｙの制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ切断部位に、配列番号４０２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４０３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをアニールさせることで得られるリンカーＥｃｏＴ２２Ｉ−１２ａａ−ＥｃｏＴ２２Ｉ（図６２）を挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙ（図６３）を得た。
得られたプラスミドｐＵＣｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩとで消化し、配列番号３９３で示される塩基配列を含有するＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、実施例１６（２）で得られたプラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴのＢｇｌＩＩ切断部位とＳａｃＩ切断部位との間に挿入することにより、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく該ＤＮＡが連結されてなるキメラＤＮＡがＣＲ１６Ｇ６プロモーターの下流に結合されてなるプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙ（図６４）を得た。
次いで、該プラスミドを大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（宝酒造社製）に導入し、アンピシリン耐性株を選抜した。選抜されたアンピシリン耐性株に含まれるプラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖ３．０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）およびＤＮＡシークエンサー３１００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙは配列番号３９３で示される塩基配列を有することが確認された。
（３）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓのダイズへの導入
実施例４７（３）に記載した方法に従って、ダイズ（品種；ＦａｙｅｔｔｅおよびＪａｃｋ）の球状型胚を調製した。
得られた球状型胚を新しい不定胚増殖培地に移植し、２〜３日培養した。この球状型胚に、実施例７５（１）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙまたは実施例７５（２）で作製されたプラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙを、実施例１７（２）に記載の方法に従って導入した。
（４）不定胚のハイグロマイシンによる選抜
実施例４７（４）に記載した方法に従って、実施例７５（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚のハイグロマイシンによる選抜を行なう。
（５）不定胚の化合物（ＩＩ）による選抜
実施例４７（５）に記載した方法に従って、実施例７５（３）で得られた遺伝子導入後の球状型胚の化合物（ＩＩ）による選抜を行なう。
（６）不定胚からの個体再生、順化および栽培
実施例４７（６）に記載の方法に従って、実施例７５（４）または（５）で選抜された球状型胚からの個体再生を行なう。
本葉を展開し発根した個体について、実施例１７（６）に記載の方法に従って、順化および栽培を行い、採種する。
（７）雑草防除活性を有する化合物（ＩＩ）に対する耐性の評価
実施例１７（４）に記載した方法に従って、実施例７５（６）で得られた再生植物個体の化合物（ＩＩ）に対する耐性度を評価する。
（８）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓを有するアグロバクテリウム導入用葉緑体発現プラスミドの構築
本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓをアグロバクテリウム法で植物へ導入するためのプラスミドを構築した。上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドコード配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを、実施例１８で得られたバイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１Ｓの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙ（図６５）を得た。また、上記プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、ダイズ（ｃｖ．　Ｊａｃｋ）のＲｕＢＰＣ小サブユニットの葉緑体トランジットペプチドとそれに続く成熟タンパク質１２アミノ酸分をコードする塩基配列の直下にコドンのフレームが変わることなく本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓが連結されてなるキメラＤＮＡを含むＤＮＡを単離した。このＤＮＡを上記バイナリーベクタープラスミドｐＢＩ１２１Ｓの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位との間に挿入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙ（図６６）を得た。
（９）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓのタバコへの導入
実施例７５（８）で得たプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙおよびプラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙ　を用いて本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓをアグロバクテリウム法でタバコへ導入した。
まず、実施例１９に記載の方法に従って、プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙおよびｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙをそれぞれ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　社製）に導入し、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙを持つ組換えアグロバクテリウム株をそれぞれ単離した。
次いで、上記のプラスミドを持つ組換えアグロバクテリウム株を用いて、実施例４７（９）に記載の方法に従って、タバコへの遺伝子導入を行い、ｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙまたはｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙのＴ−ＤＮＡ　領域が組み込まれた組換えタバコ個体をそれぞれ取得する。
（１０）本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓ組換えタバコの葉片を用いた耐性の評価
実施例７５（９）で取得された組換えタバコ個体から葉片を採取し、これを用いて実施例７４（１０）と同様の方法で、組換えタバコの化合物（ＩＩ）または化合物（ＸＩＩ）に対する耐性を評価する。
【０２３７】
【発明の効果】
本発明により、ＰＰＯ阻害型雑草防除活性化合物を代謝し該化合物を防除活性のより低い化合物に変換する能力を有する蛋白質、前記蛋白質をコードするＤＮＡ、前記蛋白質を発現する雑草防除活性化合物耐性植物等が提供可能となる。
【０２３８】
［配列表フリーテキスト］
配列番号３５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８９
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号９０
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号９１
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号９２
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号９３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９８
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号９９
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号１００
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３４
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号１３５
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号１６１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８６
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８７
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８８
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８９
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２００
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１４
配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする設計されたポリヌクレオチド
配列番号２６５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７６
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７７
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８１
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８８
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３００
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０８
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１５
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２２
ＤＮＡ塩基配列決定のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６８
配列番号２２２で示されるアミノ酸配列をコードする設計されたポリヌクレオチド
配列番号３６９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９３
配列番号２２４で示されるアミノ酸配列をコードする設計されたポリヌクレオチド
配列番号３９４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３９９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４００
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４０１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４０２
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
配列番号４０３
発現ベクター構築のために設計されたオリゴヌクレオチドリンカー
【０２３９】
【配列表】
2004057194.tif 000044
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2004057194.tif 000121
2004057194.tif 000122
2004057194.tif 000123
2004057194.tif 000124
2004057194.tif 000125
2004057194.tif 000126
2004057194.tif 000127
2004057194.tif 000128
2004057194.tif 000129
2004057194.tif 000130
2004057194.tif 000131
2004057194.tif 000132
2004057194.tif 000133
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明ＤＮＡ（Ａ１）および本発明ＤＮＡ（Ｂ１）の取得に用いたＰＣＲプライマーのアニーリング位置を示す図である。各数字はプライマーの塩基配列を示す配列番号を示す。矢印はその配列番号で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング位置および該プライマーからのＤＮＡポリメラーゼ反応の伸長方向を示し、点線は前記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを表す。太線は染色体ＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍領域を表す。
【図２】本発明ＤＮＡ（Ａ２）および本発明ＤＮＡ（Ｂ２）の取得に用いたＰＣＲプライマーのアニーリング位置を示す図である。各数字はプライマーの塩基配列を示す配列番号を示す。矢印はその配列番号で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング位置および該プライマーからのＤＮＡポリメラーゼ反応の伸長方向を示し、点線は前記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを表す。太線は染色体ＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍領域を表す。
【図３】本発明ＤＮＡ（Ａ４）および本発明ＤＮＡ（Ｂ４）の取得に用いたＰＣＲプライマーのアニーリング位置を示す図である。各数字はプライマーの塩基配列を示す配列番号を示す。矢印はその配列番号で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング位置および該プライマーからのＤＮＡポリメラーゼ反応の伸長方向を示し、点線は前記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを表す。太線は染色体ＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍領域を表す。ただし、５７で示されるオリゴヌクレオチドプライマーは、染色体ＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍領域にアニーリングするプライマーであり、本発明ＤＮＡ（Ａ４）にアニーリングするものではない。
【図４】プラスミドｐＫＳＮ２の制限酵素地図を示す図である。
【図５】プラスミドｐＣＲｒＳｔ１２の制限酵素地図を示す図である。
【図６】プラスミドｐＣＲ６５７ＥＴの制限酵素地図を示す図である。
【図７】プラスミドｐＣＲ６５７ＦＥＴの制限酵素地図を示す図である。
【図８】プラスミドｐＣＲ６５７Ｂｓの制限酵素地図を示す図である。
【図９】プラスミドｐＣＲ６５７ＦＢｓの制限酵素地図を示す図である。
【図１０】プラスミドｐＵＣｒＳｔ１２の制限酵素地図を示す図である。
【図１１】プラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図１２】プラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図１３】プラスミドｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔの制限酵素地図を示す図である。
【図１４】配列番号８９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとがアニールしてなるリンカーＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩの構造を示す図である。
【図１５】プラスミドｐＵＣＣＲ１６Ｇ６−ｐ／ｔΔの制限酵素地図を示す図である。
【図１６】配列番号９１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとがアニールしてなるリンカーＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩの構造を示す図である。
【図１７】プラスミドｐＮｄＧ６−ΔＴの制限酵素地図を示す図である。
【図１８】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図１９】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図２０】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２の制限酵素地図を示す図である。
【図２１】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図２２】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図２３】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図２４】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図２５】配列番号９８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号９９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとがアニールしてなるリンカーＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩの構造を示す図である。
【図２６】プラスミドｐＢＩ１２１Ｓの制限酵素地図を示す図である。
【図２７】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図２８】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図２９】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７の制限酵素地図を示す図である。
【図３０】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７Ｆの制限酵素地図を示す図である。
【図３１】プラスミドｐＣＲ９２３Ｓｐの制限酵素地図を示す図である。
【図３２】プラスミドｐＮｄＧ６−ｒＳｔ１２の制限酵素地図を示す図である。
【図３３】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図３４】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図３５】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図３６】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図３７】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−９２３の制限酵素地図を示す図である。
【図３８】プラスミドｐＣＲ６７１ＥＴの制限酵素地図を示す図である。
【図３９】プラスミドｐＣＲ６７１Ｂｓの制限酵素地図を示す図である。
【図４０】プラスミドｐＵＣｒＳｔ６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４１】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４２】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４３】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４４】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４５】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６７１の制限酵素地図を示す図である。
【図４６】本発明ＤＮＡ（Ａ）の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲにより増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で検出した結果を示す図面代用写真である。レーン１、７、８、１２、１９、２６、２７、３２、３７、４２、および４７にはＤＮＡマーカー（φ１７４／ＨａｅＩＩＩ分解物）が泳動された。その他のレーンには、表２０および表２１に示される試料が泳動された。
【図４７】配列番号１３４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１３５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとがアニールしてなるリンカーの構造を示す図である。
【図４８】プラスミドｐＵＣｒＳｔ６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図４９】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５０】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５１】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５２】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５３】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−６５７ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５４】プラスミドｐＵＣｒＳｔ１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５５】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５６】プラスミドｐＫＦｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５７】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５８】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図５９】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１５８４ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６０】プラスミドｐＵＣｒＳｔ１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６１】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６２】配列番号４０２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４０３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとがアニールしてなるリンカーＥｃｏＴ２２Ｉ−１２ａａ−ＥｃｏＴ２２Ｉの構造を示す図である。
【図６３】プラスミドｐＵＣｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６４】プラスミドｐＳＵＭ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６５】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ−１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【図６６】プラスミドｐＢＩ−ＮｄＧ６−ｒＳｔ１２−１６０９ｓｏｙの制限酵素地図を示す図である。
【符号の説明】
ＤＮＡ　Ａ１：本発明ＤＮＡ（Ａ１）
ＤＮＡ　Ａ２：本発明ＤＮＡ（Ａ２）
ＤＮＡ　Ａ３：本発明ＤＮＡ（Ａ３）
ＤＮＡ　Ａ４：本発明ＤＮＡ（Ａ４）
ＤＮＡ　Ｂ１：本発明ＤＮＡ（Ｂ１）
ＤＮＡ　Ｂ２：本発明ＤＮＡ（Ｂ２）
ＤＮＡ　Ｂ４：本発明ＤＮＡ（Ｂ４）
ＤＮＡ　Ａ１Ｓ：本発明ＤＮＡ（Ａ１）Ｓ
ＤＮＡ　Ａ２３Ｓ：本発明ＤＮＡ（Ａ２３）Ｓ
ＤＮＡ　Ａ２５Ｓ：本発明ＤＮＡ（Ａ２５）Ｓ
ｔａｃ　ｐ：ｔａｃ　プロモーター
ｒｒｎＢ　ｔ：ｒｒｎＢ　ターミネーター
ＣｏｌＥ１　ｏｒｉ：プラスミドＣｏｌＥ１の複製開始点
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
ダイズＲｕＢＰＣｓｓＣＴＰ：ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のｒｉｂｕｌｏｓｅ−１，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ小サブユニットの葉緑体移行ペプチドをコードする塩基配列
１２ａａ：ダイズ（ｃｖ．Ｊａｃｋ）のｒｉｂｕｌｏｓｅ−１，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ小サブユニットの葉緑体移行ペプチドに続く成熟蛋白質の１２アミノ酸をコードする塩基配列
Ｋｍｒ：カナマイシン耐性遺伝子
Ｆ１　ｏｒｉ：プラスミドＦ１の複製開始点
ＣＲ１６Ｇ６ｐ：ＣＲ１６Ｇ６プロモーター
ＣＲ１６ｔ：ＣＲ１６ターミネーター
ＣＲ１６ｔΔ：制限酵素ＳｃａＩ切断部位より下流の塩基配列がＣＲ１６ターミネーターから除去されてなるＤＮＡ
ＣＲ１６Ｇ６ｐΔ：制限酵素ＮｄｅＩ切断部位より上流の塩基配列がＣＲ１６Ｇ６プロモーターから除去されてなるＤＮＡ
ＮＯＳｐ：ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター
ＮＰＴＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子
ＮＯＳｔ：ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター
ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼ遺伝子
ＲＢ：Ｔ−ＤＮＡの右境界配列
ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡの左境界配列
ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＴ２２１、ＳｐｈＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＳｃａＩ：各々の制限酵素の切断部位
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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