(57)【要約】【課題】本発明は、腸炎ビブリオのみを呈色させたコロニーを形成させるものであり、他のビブリオ属は無色のコロニーを形成させるため、識別性をより高めると共に、抗菌剤を必ずしも必要としない、より安価な腸炎ビブリオ検出用培地を提供する。【解決手段】培地中にアルカリフォスファターゼ発色酵素基質を含有することを特徴とする腸炎ビブリオ検出用培地。【選択図】  無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中にアルカリフォスファターゼ発色酵素基質を含有することを特徴とする腸炎ビブリオ検出用培地。
【請求項２】
発色酵素基質の含有量が０．０１〜１ｇ／Ｌの範囲である請求項１記載の腸炎ビブリオ検出用培地。
【請求項３】
発色酵素基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−フォスフェート、６−クロロ−３−インドリル−フォスフェート、および３−インドリル−フォスフェートから成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類である請求項１または２記載の腸炎ビブリオ検出用培地。
【請求項４】
培地のｐＨが８．０〜９．５の範囲に調整されている請求項１〜３記載の腸炎ビブリオ検出用培地。
【請求項５】
培地１Ｌあたり、発色酵素基質０．０１〜１ｇ、ペプトン１〜３０ｇ、酵母エキス１〜１０ｇ、チオ硫酸ナトリウム５〜２０ｇ、クエン酸ナトリウム５〜２０ｇ、塩化ナトリウム１５〜４０ｇ、胆汁末１〜１０ｇ、および寒天５〜２０ｇを含有する請求項１〜４記載の腸炎ビブリオ検出用培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食中毒原因菌として重要な腸炎ビブリオを簡易かつ正確に検出することができる腸炎ビブリオ検出用培地に関する。
【０００２】
【従来技術】
腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）は、細菌性食中毒の原因菌として高い頻度で検出される病原細菌の一種である。本菌は広く海洋中に分布し、海産物を多量に接種する我が国では重要な病原菌の一つであり、特に夏期に本菌が原因の食中毒が多発している。この食中毒は、急性胃腸炎であり、発熱、嘔吐、腹痛、下痢を伴うことを特徴としている（島田  俊雄．食品衛生研究  ２００１年、５１巻、ｐ．７−１８  ）。
【０００３】
従来、食品中のビブリオ属細菌の検出方法としては、例えば寒天平板塗沫法が挙げられる。この方法は、食塩およびポリミキシンＢを含む寒天平板培地上に一定量の検体を塗沫し、培養した細菌を肉眼で判定していた。
【０００４】
しかしながら、寒天平板塗沫法では、結果が判明するまでに時間がかかりすぎ、特に鮮度が商品価値として重要な水産品などの食品の検査方法としては、不適当と言わざるを得なかった。
【０００５】
このため、現在では、このような食中毒原因菌である腸炎ビブリオの検出培地として、ＴＣＢＳ（Ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｉｌｅ  ｓａｌｔｓ  ｓｕｃｒｏｓｅ）寒天培地が広く用いられている。このＴＣＢＳ寒天培地は、白糖とｐＨ指示薬を含むものである。腸炎ビブリオが白糖を利用しないのに対し、ビブリオ属に属し、かつ食中毒の原因菌であるビブリオ・アルギノリティカスやビブリオ・コレラが白糖を利用して酸を生成するという性質を利用したものである（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
発育してきた菌は、菌体中にｐＨ指示薬を取り込む。白糖を利用しない腸炎ビブリオは、ｐＨ指示薬の色調変化がないため、緑色のコロニーを形成するが、白糖を利用し酸を生成する菌は、ｐＨ指示薬が黄色に変色するため黄色のコロニーを形成する。
【０００７】
しかしながら、ＴＣＢＳ寒天培地においては、検体中に腸炎ビブリオと類縁菌が共存した場合、腸炎ビブリオの緑色のコロニーが他の色に変色してしまうため、正確な検出ができないという問題があった。
【０００８】
このため、腸炎ビブリオと同じビブリオ属に属する類縁菌が共存しても色の変化を生じずに、正確かつ簡便に腸炎ビブリオを検出することができる培地が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００９】
この培地は、検出可能な遊離性基を有するβ−グルコシダーゼ基質とグラム陽性菌抗菌物質とを含有するため、グラム陽性菌は生育せず、かつビブリオ・アルギノリティカスやビブリオ・コレラは白色のコロニーを形成し、腸炎ビブリオが選択的にβ−グルコシダーゼ基質由来の特性を有するコロニーを形成するので、腸炎ビブリオが正確かつ簡便に検出できるというものである。
【００１０】
しかしながら、この培地は、腸炎ビブリオのみを呈色させたコロニーを形成させるものではないため、未だ腸炎ビブリオのみを発色させるに至らず、識別性に劣ると共に、抗菌剤を使用するため、高価なものであった。
【００１１】
一方、発色酵素基質または蛍光酵素基質を含有させた、低温で長期間保存しても結晶の析出がなく安定な大腸菌群発育用生培地が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
また、細菌の生育を確認するための発色剤として酵素、例えば、フォスファターゼ、エステラーゼ、リパーゼなどの発色酵素基質を含有する一般生菌検出用シート状培地が提案されている（例えば、特許文献３参照）。
しかしながら、これらの培地は、確かに細菌の検出に発色酵素基質などを用いているものの、腸炎ビブリオの検出に関しては、全く示唆されていない。
【００１２】
【特許文献１】
特開２００２−３５５０９１号公報
【特許文献２】
特開平８−３１７７８７号公報
【特許文献３】
特開２００１−２４５６９３号公報
【００１３】
【非特許文献１】
小林俊一  他．日細誌  １９６３年、１８巻、ｐ．３８７
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、腸炎ビブリオのみを呈色させたコロニーを形成させるものであり、他のビブリオ属は無色のコロニーを形成させるため、識別性をより高めると共に、抗菌剤を必ずしも必要としない、より安価な腸炎ビブリオ検出用培地を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、培地中にアルカリフォスファターゼ発色酵素基質を含有させることにより、腸炎ビブリオのみを呈色させたコロニーを形成させることに成功し、本発明を完成した。
【００１６】
即ち、本発明は、下記のような構成からなるものである。
（１）培地中にアルカリフォスファターゼ発色酵素基質を含有することを特徴とする腸炎ビブリオ検出用培地。
（２）発色酵素基質の含有量が０．０１〜１ｇ／Ｌの範囲である（１）記載の腸炎ビブリオ検出用培地。
（３）発色酵素基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−フォスフェート、６−クロロ−３−インドリル−フォスフェート、および３−インドリル−フォスフェートから成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類である（１）または（２）記載の腸炎ビブリオ検出用培地。
（４）培地のｐＨが８．０〜９．５の範囲に調整されている（１）〜（３）記載の腸炎ビブリオ検出用培地。
（５）培地１Ｌあたり、発色酵素基質０．０１〜１ｇ、ペプトン１〜３０ｇ、酵母エキス１〜１０ｇ、チオ硫酸ナトリウム５〜２０ｇ、クエン酸ナトリウム５〜２０ｇ、塩化ナトリウム１５〜４０ｇ、胆汁末１〜１０ｇ、および寒天５〜２０ｇを含有する（１）〜（４）記載の腸炎ビブリオ検出用培地。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の腸炎ビブリオ検出用培地の特徴は、培地中にアルカリフォスファターゼ発色酵素基質を含有させることにある。この発色酵素基質は、腸炎ビブリオが産生するアルカリフォスファターゼによって分解されて、培地中で呈色する。従って腸炎ビブリオが培地上で増殖すると、肉眼（目視）により呈色したコロニーが観察される。
【００１８】
この発色酵素基質の含有量は、０．０１〜１ｇ／Ｌの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．５ｇ／Ｌの範囲である。基質の含有量が０．０１ｇ／Ｌ未満になると、コロニーの呈色に時間を要し、検出感度が低下する。逆に、１ｇ／Ｌを超えると、生育しない腸炎ビブリオも存在する。
【００１９】
本発明で使用する発色酵素基質としては、アルカリフォスファターゼによって分解されて培地中で呈色する限り、公知の基質の中から適宜選択することができる。その具体例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−フォスフェート、６−クロロ−３−インドリル−フォスフェート、および３−インドリル−フォスフェートから成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類が挙げられる。
【００２０】
本発明においては、培地のｐＨは８．０〜９．５、好ましくは８．５〜９．０の範囲に調整する。アルカリフォスファターゼの至適ｐＨ付近で反応させることが望ましく、この範囲外のｐＨになると、酵素活性が著しく低下してしまうため、反応に長時間を要することになる。従って培地のｐＨを上記の範囲に調整するため緩衝剤を用いることが好ましい。この緩衝剤としては、ｐＨを上記範囲に維持できるものであれば、特に制限されず、公知の緩衝液の中から適宜選択することができるが、中でもグッド緩衝液やリン酸緩衝液などが好ましい。
【００２１】
本発明の腸炎ビブリオ検出用培地は、少なくとも培地１Ｌあたり、発色酵素基質０．０１〜１ｇ、ペプトン１〜３０ｇ、酵母エキス１〜１０ｇ、チオ硫酸ナトリウム５〜２０ｇ、クエン酸ナトリウム５〜２０ｇ、塩化ナトリウム１５〜４０ｇ、胆汁末１〜１０ｇ、および寒天５〜２０ｇを含有することが好ましい。これらの他に、腸炎ビブリオの発育を促進する栄養源として、硫酸アンモニウムなどの窒素源、マルトースやスクロースなどの糖類、さらに必要に応じてミネラルやビタミンなどの任意のものを含めることができる。
【００２２】
本発明では、特に必要とされないが、雑菌の繁殖を抑制するための抗菌剤として、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシンなどのアミノグリコキシド系抗生物質、クロラムフェニコール、テトラサイクリンなどの広範囲抗生物質、広範囲の抗菌スペクトルを有するペニシリン、セファロスポリンを含有させることができる。
【００２３】
本発明の培地は、液体、半流動、固形のいずれの形態もとりうるが、検出のし易さ等の観点から、固形培地が好ましく、より好ましくは平板固形培地の形態である。
固形培地の固化剤としては、寒天、カラギーナン、アガロースなど通常使用されているものが挙げられる。
【００２４】
【発明の効果】
本発明は、腸炎ビブリオのみを呈色させたコロニーを形成させるものであり、他のビブリオ属は無色のコロニーを形成させるため、食中毒原因菌として重要な腸炎ビブリオを簡易かつ正確に検出できる腸炎ビブリオ検出用培地を提供することができる。従って本発明によれば、腸炎ビブリオのみを特異的に検出できるので、臨床的にもその意義は大きいと考えられる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００２６】
実施例１．
表１に示した培地成分８１．１ｇを秤量し、１０００ｍＬの精製水に溶解した。振盪した後、ｐＨを８．８±０．２に調整し、１００℃で２０分間加熱滅菌した。５０℃に冷却後、２０ｍＬシャーレに分注して固化した。固化後、３０分間乾燥した。
菌株を一晩培養し、その菌株をマクファーランド＃１（３×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）となるように滅菌生理食塩水に添加した。この菌株をエーゼで培地に画線し、３７℃で１８時間培養した。
表２の結果に示すように、本発明の培地上では、腸炎ビブリオは緑色のコロニーを形成し、他のビブリオ属は無色のコロニーを形成し、ビブリオ以外の菌は、発育を阻止されているか、無色のコロニーを形成した。従って本発明の培地を用いれば、腸炎ビブリオが正確かつ簡易に検出できることが判る。
【００２７】
2004321058.tif 000002
【００２８】
2004321058.tif 000003
【００２９】
実施例２
実施例１で用いた５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート・ｐ−トルイジン塩に代えて５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−フォスフェート・ｐ−トルイジン塩を用いた以外は、実施例１と同様な方法により腸炎ビブリオのコロニーの呈色を調べた。
表３の結果に示すように、本発明の培地上では、腸炎ビブリオはオレンジ色のコロニーを形成し、他のビブリオ属は無色のコロニーを形成し、ビブリオ以外の菌は、発育を阻止されているか、無色のコロニーを形成した。従って本発明の培地を用いれば、腸炎ビブリオが正確かつ簡易に検出できることが判る。
【００３０】
2004321058.tif 000004
【００３１】
実施例３
実施例１で用いた５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート・ｐ−トルイジン塩に代えて６−クロロ−３−インドリル−フォスフェート・ｐ−トルイジン塩を用いた以外は、実施例１と同様な方法により腸炎ビブリオのコロニーの呈色を調べた。
表４の結果に示すように、本発明の培地上では、腸炎ビブリオはピンク色のコロニーを形成し、他のビブリオ属は無色のコロニーを形成し、ビブリオ以外の菌は、発育を阻止されているか、無色のコロニーを形成した。従って本発明の培地を用いれば、腸炎ビブリオが正確かつ簡易に検出できることが判る。
【００３２】
2004321058.tif 000005
【００３３】
実施例４
実施例１で用いた５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−フォスフェート・ｐ−トルイジン塩に代えて３−インドリル−フォスフェート・ｐ−トルイジン塩を用いた以外は、実施例１と同様な方法により腸炎ビブリオのコロニーの呈色を調べた。
表５の結果に示すように、本発明の培地上では、腸炎ビブリオは青色のコロニーを形成し、他のビブリオ属は無色のコロニーを形成し、ビブリオ以外の菌は、発育を阻止されているか、無色のコロニーを形成した。従って本発明の培地を用いれば、腸炎ビブリオが正確かつ簡易に検出できることが判る。
【００３４】
2004321058.tif 000006