(57)【要約】【課題】末端アミノ化核酸の定量方法を提供する。本発明の定量方法を採用することにより、プローブとして用いる核酸の量を一定にでき、検出再現性及び定量精度を高めたＤＮＡマイクロアレイの製造が可能となる。【解決手段】末端アミノ化核酸を誘導体化した後、分析手段に供することにより、末端アミノ化核酸の純度を正確に算出できる。具体的には、末端アミノ化核酸をビニル化剤で誘導体化することにより、末端アミノ化核酸の定量が可能となる。それによりプローブとして用いる核酸の量を一定にし、検出再現性及び定量精度を高めることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端アミノ化核酸を誘導体化試薬により修飾することを含む末端アミノ化核酸の定量方法。
【請求項２】
誘導体化試薬がビニル化剤である請求項１記載の定量方法。
【請求項３】
ビニル化剤がアクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド及びＮ−メタクリロイルオキシスクシンイミドの群から選択される少なくとも１種である請求項２記載の定量方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの方法により定量した末端アミノ化核酸を固定した支持体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、末端アミノ化核酸の定量方法に関する。本発明の定量方法を採用することにより、プローブとして用いる核酸の量を一定にでき、検出再現性及び定量精度を高めたＤＮＡマイクロアレイの製造が可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種生物におけるゲノムプロジェクトが急速に進められ、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列が明らかにされつつある。その有力な方法の一つとして、ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発されている。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイの作製方法としては、支持体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法、予め調製したＤＮＡ断片を支持体表面に固定する方法等が知られている。
【０００４】
上記のＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子発現解析等のツールとして使用される。具体的には、発現遺伝子等を蛍光色素等で標識した微量のサンプルを、マイクロアレイ上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）同士を結合させた後、蛍光色素を励起させ、高解像度解析装置で高速に読みとることにより発現解析が実施される。
【０００５】
このようなＤＮＡマイクロアレイを作成する際、重要な一工程として、キャプチャープローブ（以下、プローブ）の支持体への固定が挙げられる。通常、プローブは、化学修飾することにより支持体に固定される。
【０００６】
例えば、反応活性基で修飾した核酸を合成し、表面処理した支持体表面に該オリゴヌクレオチドを点着し共有結合させる方法が挙げられる。中でも、反応活性基で修飾した核酸として、末端をアミノ化修飾した核酸（以下、末端アミノ化核酸）は、化学的又は物理的に表面を修飾したガラス、樹脂、ゲル状物等の支持体に容易に固定化することが可能であるため、キャプチャープローブ固定化の一手法として広く利用されている（例えば特許文献１）。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００１−１７８４６６号公報
しかし、末端アミノ化核酸の調製の際、核酸合成の途中停止、末端アミノ化修飾反応の未進行等により副生物が生成する。従って、検出再現性及び定量精度を高めるには目的とする末端アミノ化核酸の純度を定量する必要が生じる。
【０００８】
定量方法としては、吸光度を測定して純度を算出及び定量する方法が広く用いられている。また高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ゲル電気泳動及びキャピラリー電気泳動などの分離手段を用いた方法も広く用いられている。
【０００９】
これら手法は明らかに疎水性や塩基鎖長が異なる核酸を分析、精製するのに有効な手段である（非特許文献１）。
【００１０】
【非特許文献１】
基礎生化学実験法  核酸・遺伝子実験  Ｉ．基礎編、  日本生化学会編、第４巻、東京化学同人  （２０００）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、末端アミノ化核酸の合成の際に生成する副生物のうち、合成目的物と塩基配列は同じであるが末端がアミノ化修飾されなかった核酸、又はＤＮＡ合成の途中段階で反応が停止したもののうち、塩基鎖長が合成目的物と近い核酸は、疎水性や分子の大きさ等の性質が合成目的物のそれと酷似している。
【００１２】
したがって、上述の分離手段では直接分離することはできず、純度の測定ができない。
【００１３】
目的とする末端アミノ化核酸の純度が不明なまま、例えば、それをＤＮＡマイクロアレイのプローブとして使用した場合、マイクロアレイの所定の区画に固定されたアミノ化核酸の量が一定でないため、区画毎又はマイクロアレイ毎にプローブの固定量にばらつきが生じることとなり、信頼性のあるデータを取得することが困難となる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、アミノ化核酸を誘導体化し、上記分析手段に供することにより、末端アミノ化核酸の純度を正確に算出できることを見出した。
【００１５】
また、その方法を使用することで、プローブとして用いる核酸量を一定にし、信頼性の高いＤＮＡマイクロアレイを製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち、本発明は、末端アミノ化核酸を誘導体化試薬により修飾することを含む末端アミノ化核酸の定量方法、である。誘導体化試薬は、ビニル化剤であることが好ましく、さらには、アクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド及びＮ−メタクリロイルオキシスクシンイミドの群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。このように定量した末端アミノ化核酸は支持体に固定され、その支持体は核酸検出に使用される。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明において、末端アミノ化核酸とは、いかなる方法で合成されたものでも構わない。例えば、アミダイト試薬を用いてＤＮＡ自動合成装置により、適当な塩基数の核酸を合成した後、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）のようなアミノ化試薬を反応させ、脱保護操作をすることにより末端アミノ化核酸を合成することができる。また、末端アミノ化核酸をプライマーとし、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ）を行うことで長鎖の末端アミノ化核酸を合成することもできる。
【００１９】
次に末端アミノ化核酸の誘導体を合成する。ここで「誘導体化」とは核酸に付されているアミノ基が反応試薬と反応することにより、反応前の該核酸と物理的、化学的に性質を異とする核酸を合成することを意味する。
【００２０】
誘導体化試薬としては、アミノ基と反応する試薬であれば任意に用いることができるが、短時間で効率よく誘導体化反応が終了し、精製することなくそのまま純度測定分析に供することができるものが好ましい。
【００２１】
そのような誘導体化試薬としては、ビニル化剤が好ましい。ここでビニル化剤とは、アクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド又はＮ−メタクリロイルオキシスクシンイミドのように分子内にビニル基を有し、且つ核酸に付されているアミノ基と適度な反応性を有する試薬であって、アミノ化核酸の良溶媒である極性溶媒中で速やかに反応する試薬を意味する。
【００２２】
また誘導体化することにより、末端アミノ化核酸の吸光度係数を変化させることなく、水に溶解するものであることが好ましい。
【００２３】
以上から、誘導体化試薬としては、アクリル酸無水物、メタクリル酸無水物、Ｎ−アクリロイルオキシスクシンイミド又はＮ−メタクリロイルオキシスクシンイミドをさらに好ましい。
【００２４】
誘導体化試薬の使用量は、反応率を考慮して設定すればよいが、末端アミノ化核酸に対して０．１倍モル〜５０倍モル、さらには０．１倍モル〜５倍モルが好ましい。
【００２５】
また、誘導体化試薬として、ビニル化剤を使用した際は、反応速度、反応収率等の向上を目的に、塩基性化合物を使用することが好ましい。
【００２６】
塩基性化合物は、いかなるものでも構わないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ（土類）金属、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等のアルカリ（土類）金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ（土類）金属炭酸化合物、ナトリウムメチラート、マグネシウムメチラート等のアルカリ（土類）金属アルコキシ化合物、水素化ナトリウム、水素化カルシウム等のアルカリ（土類）金属水素化物、トリエチルアミン、ジアザビシクロウンデセン等の有機３級アミンが挙げられる。
【００２７】
また、それらを組み合わせて用いることも可能である。
【００２８】
好ましくは、安価な炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムを挙げることができる。
【００２９】
また、塩基化合物の使用量に制限はないが、末端アミノ化核酸に対して０．１倍モル〜１００倍モル、さらには０．１倍モル〜１０倍モルの範囲が好ましい。
【００３０】
誘導体化反応における反応温度は、反応速度、反応率等を考慮した上で任意に設定することができるが、なかでも１０℃〜３０℃の室温が好ましい。
【００３１】
反応液のｐＨは、反応効率、誘導体化反応物の安定性を考慮した上で任意に設定することができるが、なかでも中性〜アルカリ性の水溶液中で行うことが望ましい。
【００３２】
誘導体化に要する時間は、反応速度、反応率等を考慮した上で任意に設定することができるが、１０分〜１２０分、３０分〜６０分で完結する条件を設定することが好ましい。
【００３３】
以上のように、合成された誘導体には、目的とするアミノ化核酸誘導体の他に、アミノ化核酸と塩基配列は同じであるがアミノ化修飾されなかった核酸や合成する途中段階において反応が停止した核酸の誘導体が含まれる。
【００３４】
それらを分離し、定量する手段として、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動などの電気泳動法が使用される。
【００３５】
高速液体クロマトグラフィーを用いる場合、カラムとして、シリカゲルのシラノール基をオクタデシル化剤やオクチル化剤で修飾した逆相系カラムなどを用いること好ましい。
【００３６】
分離時の温度は、その分離手段に通常用いられる温度であれば任意に設定することができるが、上述の高速液体クロマトグラフィーにおいて逆相系カラムを用いる場合は２０℃〜８０℃の一定温度に維持することが好ましい。
【００３７】
また逆相系カラムに流す移動相はトリエチルアミンと酢酸で調製されたものを使用することが望ましい。
【００３８】
移動相に使用される有機溶媒としてメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトニトリルなどが挙げられる。また、それらを組み合わせて用いることも可能である。有機溶媒の濃度を連続的に変えるためグラジェント装置が用いられる。
【００３９】
純度が測定された末端アミノ化核酸は、適当な支持体に固定され、一般にＤＮＡマイクロアレイと称される遺伝子検出用のデバイスとして使用される。
【００４０】
本発明において、「支持体」は、いかなる形態のものでも構わない。例えば、平面基盤、球体、管状体、溝等が挙げられる。また支持体は、固相、多孔質相、ゲル状物等、いずれでも良い。
【００４１】
固定化方法は、上記末端アミノ化核酸が支持体に物理的又は化学的に固定されていれば良い。
【００４２】
例えば、末端アミノ化核酸のアミノ基をカルボン酸基やイミノ結合によって結合したトリアジン基を導入した支持体に供することにより固定化する方法、アルデヒド官能基とシッフ塩基を形成させて固定化する方法等が挙げられる。
【００４３】
また、アミノ化核酸をさらに修飾した修飾物を固定しても良い。例えば末端アミノ化核酸のアミノ基に共重合可能な不飽和結合を導入し、アクリルアミドなどの重合性モノマーと共重合により固定化する方法などが挙げられる。
【００４４】
末端アミノ化核酸は、支持体のいずれの場所に固定されていても良い。また同一支持体内に複数の異なる末端アミノ化核酸が固定されていても良い。好ましくは支持体に、複数の所定位置が整然と配置されていおり、それらの所定位置に異なる末端アミノ化核酸が固定されていることである。
【００４５】
上記支持体の所定位置に末端アミノ化核酸を配列する方法としては、例えば、少量のプローブ溶液を先端に保持したピンをスライドグラスの表面にスポットする、スポッティング法や、高性能シリンジポンプとマイクロソレノイドバブル技術を組み合わせたシリンジソレノイド技術又は圧電式分注技術を利用した、インクジェット法が挙げられる。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００４７】
＜実施例１＞
オリゴＤＮＡ受託合成メーカー（以下、「Ａ社」と称す）にて合成した５０塩基対から成る５’末端がアミノ化された修飾核酸（配列番号１）を１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度になるよう滅菌水にて調製した。
【００４８】
〔配列番号１〕
ｇｃｔｇｃｇａａａｔｃａｃｔｃｔａｔｃｃｔｔｃｃｃａｔｇｇａｃｔｔａｃｃｔｇｃｃｇｇｔａｔａｇｃｇｔ
その核酸水溶液５μｌに２５ｍＭ炭酸１水素ナトリウム−２５ｍＭ炭酸２水素ナトリウム水溶液を２．５μｌ及び１０ｍＭのメタクリル酸無水物溶液（ＤＭＳＯに溶解）２．５μｌを混合し、室温で３０分間反応を行った。
【００４９】
反応終了後、直ちに４０μｌの滅菌水を加え、残存するメタクリル酸無水物を十分に加水分解させて、ビニル基で修飾された５’末端アミノ化核酸の混合液を得た。
【００５０】
得られた核酸混合液を、それぞれ液体クロマトグラフィーを使用して分析し、ピーク面積比からビニル化核酸を測定し、末端アミノ化核酸の純度を算出した。
【００５１】
〔液体クロマトグラフィー分析条件〕
カラム：カプセルパックＣ１８−ＭＧ  （資生堂社製２．０ｍｍｉ．ｄ．ｘ７５ｍｍ，３μｍ）
移動相：Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアミン（ｐＨ７．０）
Ｂ：８０％アセトニトリル−１００ｍＭ酢酸トリエチルアミン（ｐＨ７．０）
０→１０％（１５ｍｉｎ）
検出：ＵＶ２６０ｎｍ
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
次に上記測定結果を元に、末端アミノ化核酸の濃度が１ｐｍｏｌ／μｌになるようにＳＳＣ（ＳＳＣ濃度は５×ＳＳＣとなるように調製）を加えて調製した。
【００５２】
表面をアルデヒド化したスライドグラス（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社製ＳｕｐｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ）上に、調製した末端アミノ化核酸溶液をスポッター装置（ＣａｒｔｅｓｉａｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＭｉｃｒｏＳｙｓＴＭＳＱＳｅｒｉｅｓ）を用いて１スポット当たり０．１μｌずつ、１００ｆｍｏｌ／スポットとなるよう点着した。
【００５３】
点着後、直ちに加湿チャンバーにて４時間放置し、０．２％ＳＤＳで２分間洗浄する操作を２回、蒸留水で２分間洗浄、沸騰させた蒸留水中に３分間浸漬する操作を順次行い、乾燥空気を吹き付けて乾燥させた。
【００５４】
次いで、水素化ホウ素ナトリウム溶液（ＮａＢＨ４０．６ｇを２５％エタノール／ＰＢＳ溶液３０ｍｌに溶かしたもの）に５分間浸漬し、０．２％ＳＤＳで１分間洗浄する操作を２回、蒸留水で１分間洗浄、沸騰させた蒸留水中に５秒間浸漬する操作を順次行い、乾燥空気を吹き付けて乾燥させて、末端アミノ化核酸が固定化されたスライドグラスＡを得た。
【００５５】
以下、Ａ社とは異なるオリゴＤＮＡ受託合成メーカー（以下、「Ｂ社」「Ｃ社」と称す）にて合成したオリゴＤＮＡに関しても、上記と同様の方法でスライドガラスを作成した（スライドガラスＢ及びスライドガラスＣ）。
【００５６】
スライドグラス（Ａ、Ｂ及びＣ）にＳｙｂｒＧｏｌｄＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒｐｒｏｂｅｓ社製）を１万倍希釈したものを２０μｌ滴下し、１５分以上室温で放置した後、蛍光検出器（ｇｅｎｏｍｉｃｓｏｌｕｔｉｏｎＴＡＣＬＳＩＶ）にて検出した。
【００５７】
その結果、いずれのスライドガラスでも末端アミノ化核酸を含んでいるスポットのみ蛍光が検出された。また、各スライドガラスのスポットの蛍光強度は、ほぼ同じであった。
【００５８】
従って、ほぼ同じ量の末端アミノ化核酸がスライドグラスに固定化されていることを確認した。
【００５９】
＜比較例１＞
ＨＰＬＣによる純度測定を行わず、Ａ社、Ｂ社及びＣ社の各合成メーカーにて示された末端アミノ化核酸の合成量を基にして、プローブとして用いる末端アミノ化核酸溶液を調製した以外は、実施例１と同様にして、スライドグラスを作成した。
【００６０】
その結果、いずれのスライドガラスでも末端アミノ化核酸を含んでいるスポットのみ蛍光が検出された。しかし、その蛍光強度はＡ社、Ｂ社及びＣ社でそれぞれ異なることを確認した。
【００６１】
従って、スライドグラスに固定化されている末端アミノ化核酸の量が、グラスアレイごとに異なることを確認した。
【００６２】
＜実施例２＞
５’末端にＣｙ５が結合した５０ｍｅｒの核酸（配列番号２、以下「試料ＤＮＡ」と称す）をハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳの混合溶液）に分散し、５０ｐｍｏｌ／１００μｌに調製した。
【００６３】
〔配列番号２〕
ａｃｇｃｔａｔａｃｃｇｇｃａｇｇｔａａｇｔｃｃａｔｇｇｇａａｇｇａｔａｇａｇｔｇａｔｔｔｃｇｃａｇｃ
その試料ＤＮＡ含む溶液を実施例１で作成したグラスアレイＡ、Ｂ及びＣ上に供し、カバーガラスをかぶせ６７℃で１６時間放置することによりハイブリダイゼーションを実施した。
【００６４】
次いでカバーガラスを外し、１×ＳＳＣと０．０３％ＳＤＳ混合溶液、０．２×ＳＳＣ溶液、０．０５×ＳＳＣ溶液で順次各２分間洗浄し、乾燥空気を吹き付けて乾燥させた。
【００６５】
ハイブリダイズしている試料ＤＮＡを蛍光検出器にて検出したところ、末端アミノ化核酸を含んでいるいずれのスポットでも蛍光が検出された。また、スライドガラス間のスポット強度は、ほぼ同程度であることを確認した。
【００６６】
従って、定量精度が高いＤＮＡチップであることを確認した。
【００６７】
＜比較例２＞
実施例２と同様に試料ＤＮＡを調製し、比較例１で作成したスライドガラスを利用して、ハイブリダイゼーションを実施した。
【００６８】
ハイブリダイズしている試料ＤＮＡを蛍光検出器にて検出したところ、末端アミノ化核酸を含んでいるいずれのスポットで蛍光が検出された。しかし、その蛍光強度はスライドガラス間で異なることを確認した。
【００６９】
従って、定量精度が低いＤＮＡチップであることを確認した。
【００７０】
【発明の効果】
本発明により、プローブとして用いる核酸の量を一定にし、検出再現性及び定量精度を高めたＤＮＡマイクロアレイを製造することができる。
【００７１】
【配列表】
2004283136.tif 000002
2004283136.tif 000003
【００７２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：人工ＤＮＡ
配列番号２：人工ＤＮＡ