(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、ポリヌクレオチドの固体支持体上へのスポッティングにおいて、むらなく均一なスポット形状で、ポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化する方法を提供することである。【解決手段】  ポリエーテル又はグリコールとポリヌクレオチドとを含む溶液を固体支持体上にスポッティングすることにより、該ポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化する方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエーテル又はグリコールとポリヌクレオチドとを含む溶液を固体支持体上にスポッティングすることにより、該ポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化する方法。
【請求項２】
固体支持体が、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固体支持体が、基板上にポリヌクレオチドを静電的に引き寄せるための静電層を有するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ポリエーテル又はグリコールが、ジエチレングリコール又はポリエチレングリコールである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によってポリヌクレオチドが固定化されてなる固体支持体。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって固体支持体上に固定化したポリヌクレオチドに、標識したポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、標識したポリヌクレオチドに由来するシグナルを読みとることを含む、標的ポリヌクレオチドの検出方法。
【請求項８】
ポリエーテル又はグリコールを含有することを特徴とするポリヌクレオチド固定化用溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡチップ等の作製に有用な、固体支持体へのポリヌクレオチドの固定化方法に関する。また、本発明は、該方法で作成されたポリヌクレオチド固定化固体支持体、これを用いるポリヌクレオチドの検出方法、およびポリヌクレオチド固定化溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な生物の遺伝子構造を明らかにするのみならず、その遺伝子機能をゲノムスケールで解明しようとする試みが行われつつあり、遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発も急速に進んでいる。ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップともいう）は、スライドガラス等の基板に多数のＤＮＡ分子を所定の領域毎に整列固定させた高密度のアレイであり、核酸の塩基配列の決定、並びに遺伝子の発現、変異、多型性などの同時解析に非常に有用である。このＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子情報の解析は、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発などに極めて有用であるため、ＤＮＡマイクロアレイの作製技術及び得られたデータの解析システムのより一層の開発が望まれている。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイを用いたＤＮＡ等の核酸の検出に際しては、まず固体支持体表面に高密度に整列したＤＮＡ断片などのプローブに対して、ラジオアイソトープ（ＲＩ）や蛍光で標識した核酸断片試料（標的核酸資料）をハイブリダイズさせる。このとき、標的核酸中の、プローブと相補的な塩基配列をもつ分子は、プローブと相補的にハイブリダイズする。次いで、このハイブリダイズしている標識した標的分子のシグナルを測定し、ハイブリダイズされたプローブポリヌクレオチドを同定する。具体的には、ＲＩや蛍光イメージスキャナーでマイクロアレイ上の放射線強度又は蛍光強度を測定し、そして得られた画像データを解析処理する。従って、ＤＮＡマイクロアレイによれば、数千〜数万個の分子を同時にハイブリダイズさせて検出することができ、微量の試料で短時間のうちに大量の遺伝子情報を得ることができる。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイを作製するには、固体支持体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（「オン・チップ法」という）と、予め調製したＤＮＡ断片を固体支持体表面に固定する方法などがある。前者のオン・チップ法は、光照射で選択的に除去される保護基を使用し、半導体製造に用いられるフォトリソグラフィ技術と固相合成技術を利用して、固体支持体上の多数の微小なマトリックスで、組合せ反応（コンビナトリアル・シンセシス）を行うことにより、多種類のオリゴヌクレオチドを同時に合成する方法である（非特許文献１参照）。
【０００５】
一方、後者の方法は、予め調製したＤＮＡ断片試料などのプローブポリヌクレオチドを固体支持体表面にスポッティングすることにより共有結合又はイオン結合を利用して結合固定する方法である。このような方法としては、プローブポリヌクレオチドをＤＮＡマイクロアレイ作製装置に備えられたスポット装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した固体支持体表面にスポッティングし、ポリヌクレオチド試料の荷電を利用して固体支持体に静電結合させて固定化する方法（非特許文献２参照）、予め反応活性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、これらを表面処理した固体支持体表面にスポット装置を用いてスポッティングし、共有結合を介して固定化させる方法（非特許文献３〜５参照）、ならびに固体支持体表面に、ポリヌクレオチドと共有結合を形成する活性エステル基等の反応活性基を導入して、ポリヌクレオチドを共有結合を介して固定化させる方法（特許文献１〜３参照）などが挙げられる。
【０００６】
固体支持体表面にプローブポリヌクレオチドを固定化して多数のスポットを形成するには、ピン先端を固体支持体表面に機械的に接触させるピン方式や、インクジェットプリンタの原理を利用したインクジェット方式などによる各種のスポット装置が用いられている。このように固定化されたスポットは形状にばらつきが多い。例えば、スポットが三日月状やドーナツ状になっていたり、又はスポットが流れてしまっているものなどである。スポットの形が一定でないとシグナルの強度にもばらつきが出てしまい、信頼性の低いデータとなってしまう。従って、検出対象の核酸断片試料の検出精度を少しでも高めてマイクロアレイによる解析精度を向上させるためには、いずれの装置を用いた場合であっても、固体支持体上に形成されたスポットにおいて、プローブ分子が固体支持体表面にしっかりと固定化されるとともに、その形状や大きさができるだけ揃っていて、再現性が良いことが望まれていた。
【特許文献１】ＷＯ００／２２１０８
【特許文献２】ＷＯ０１／７５４４７
【特許文献３】ＷＯ０２／１２８９１
【非特許文献１】Fodor, S.P.A. et al, Science, 251, 767-773 (1991)
【非特許文献２】Schena, M. et al, Science, 270, 467-470 (1995)
【非特許文献３】「蛋白質・核酸・酵素」、43、2004-2011 (1998)
【非特許文献４】Lamture, J.B. et al., Nucl. Acids Res., 22, 2121-2125 (1994)
【非特許文献５】Guo, Z. et al., Nucl. Acids Res., 22, 5456-5465 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ポリヌクレオチドの固体支持体上へのスポッティングにおいて、むらなく均一なスポット形状で、ポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、ポリヌクレオチドをポリエーテル又はグリコールを含む溶液に溶解し、得られた溶液を固体支持体上にスポッティングすることによって、むらなく均一なスポットが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ポリエーテル又はグリコールとポリヌクレオチドとを含む溶液を固体支持体上にスポッティングすることにより、該ポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化する方法。
（２）固体支持体が、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を有するものである、（１）に記載の方法。
（３）固体支持体が、基板上にポリヌクレオチドを静電的に引き寄せるための静電層を有するものである、（２）に記載の方法。
（４）ポリヌクレオチドがＤＮＡである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）ポリエーテル又はグリコールが、ジエチレングリコール又はポリエチレングリコールである（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の方法によってポリヌクレオチドが固定化されてなる固体支持体。
（７）（１）〜（５）のいずれかに記載の方法によって固体支持体上に固定化したポリヌクレオチドに、標識したポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、標識したポリヌクレオチドに由来するシグナルを読みとることを含む、標的ポリヌクレオチドの検出方法。
（８）ポリエーテル又はグリコールを含有することを特徴とするポリヌクレオチド固定化用溶液。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、ポリヌクレオチドを固体支持体上に、円形かつ中抜けすることなく、むらなく均一なスポット形状でスポッティングし、固定化することができるため、マイクロアレイによるポリヌクレオチドの検出において、シグナル強度にばらつきのない、信頼性の高いデータを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明における、ＤＮＡ断片などのプローブポリヌクレオチドの固体支持体への固定化方法について説明する。
本発明において、ポリヌクレオチドを固定化する固体支持体としては、特に限定されないが、基板上にポリヌクレオチドを静電的に引き寄せるための静電層、及びポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を有するものが好ましい。
【００１２】
本発明に用いる基板の材料としては、例えば、シリコン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂(Acrylonitrile Butadiene Styrene 樹脂)、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）が挙げられる。
【００１３】
基板の材料として前記のものを用いる場合には、表面処理層を施さなくてもよいが、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入するための化合物を基板上に強固に固定化するために、表面処理を施すことがより好ましい。
【００１４】
表面処理には、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。
【００１５】
表面処理された基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。
表面処理層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
【００１６】
基板の表面処理層の形成は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ(Chemical Vapor Deposit)法、ＥＣＲＣＶＤ(Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit)法、ＩＣＰ(Inductive Coupled Plasma)法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ(Electric Cyclotron Resonance)スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ(Electron Beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。
【００１７】
本発明に用いる基板としては、前記のように表面処理層を形成した構造だけでなく、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン；金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）；前記金属粉末、セラミック粉末等に、前記樹脂をバインダーとして混合、結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられ、また、前記の材料の積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体、（例えば２相体））であってもよい。
【００１８】
基板の形状及びサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００１９】
また、基板の表面又は裏面に、反射層としてＴｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、Ｃｒ、ＴｉＣ、ＴｉＮ等の単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であることが必要なため、好ましくは１０ｎｍ以上、更に好ましくは１００ｎｍ以上である。
【００２０】
本発明の固体支持体には、ポリヌクレオチドを静電的に引き寄せるために静電層が設けられていることが好ましい。
【００２１】
静電層としては、ポリヌクレオチドを静電的に引き寄せ、ポリヌクレオチドの固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００２２】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００２３】
静電層は、基板又は表面処理層と共有結合させずに形成してもよく、基板又は表面処理層と共有結合させて形成してもよい。
【００２４】
静電層を基板又は表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、表面処理層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。
【００２５】
また、静電層を基板又は表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板又は表面処理層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００２６】
静電層を基板又は表面処理層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板又は表面処理層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４"-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。基板表面を塩素化した後、アンモニアガス中でＵＶ照射することにより、アミノ基を導入してもよい。
【００２７】
また、静電層が施された基板にポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、基板を、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。
【００２８】
静電層が施された基板に、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応をＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類の存在下に行うことが好ましい。
【００２９】
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、ポリヌクレオチドの固定化量がより向上する。
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
【００３０】
前記のようにして、静電層を施した基板表面には、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入するため、化学修飾を施す。
前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、水酸基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、アミノ基が挙げられる。
【００３１】
官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ１は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ２は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ３−ＣＯ−Ｒ４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ５は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
【００３２】
前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することができる。
【００３３】
官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ６−ＣＯ−Ｘ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ６は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジハライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。
【００３４】
官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：ＨＯ−Ｒ７−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ７は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸又はフェノール酸が挙げられる。
官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。
【００３５】
前記の化合物は、そのカルボキシル基が静電層のアミノ基と縮合してアミド結合を形成する。
前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。
【００３６】
上記の工程において、アミノ基含有化合物による処理、官能基導入処理、活性エステル化処理は、数回繰り返して行うことが好ましい。
【００３７】
本発明において固体支持体に固定化されてプローブとなるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドも含まれ、これらにはＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖でも二本鎖でもよい。遺伝子の発現を調べるためには、一般に、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のＤＮＡ断片（ポリヌクレオチド）を使用する。これらのポリヌクレオチドは、配列や機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にして、ｃＤＮＡやゲノムのライブラリー、あるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下、「ＰＣＲ産物」という）。ＰＣＲ法によって増幅していないものも使用することができる。
【００３８】
一方、遺伝子の変異や多型を調べるためには一般に、標準となる既知の配列を基にして変異や多型に対応する種々のポリヌクレオチドを合成して使用することもできる。さらに、塩基配列決定の場合には、４ｎ（ｎは、塩基の長さ）種のポリヌクレオチドを合成して使用する。使用するポリヌクレオチドの塩基配列は既知であることが好ましい。固定化されるポリヌクレオチドは、通常、２〜２００ｍｅｒであることが好ましく、特に好ましくは１０〜１２０ｍｅｒである。
【００３９】
また、本発明において、ポリヌクレオチドには、ＤＮＡのホスホジエステル結合をペプチド結合に変換した人工核酸、すなわちペプチド核酸（ＰＮＡ）も含まれる。
【００４０】
上記のプローブポリヌクレオチドを、ポリエーテル又はグリコールを含む溶媒に溶解又は分散して、ポリヌクレオチド固定化用溶液を調製する。ポリエーテル又はグリコールを含む溶媒には、ポリエーテル又はグリコールのいずれかを含む溶媒、ならびにポリエーテル及びグリコールの双方を含む溶媒の双方が包含される。
【００４１】
本発明においてグリコールとは、水酸基を２個有する２価アルコールを意味する。本発明においてグリコールとしては、２価の直鎖アルコールが好ましく、主鎖に１〜３００００００個の酸素原子を有する２価の直鎖アルコールがより好ましく、主鎖に１〜３００００個のエーテル結合を有する２価の直鎖アルコールが特に好ましい。
【００４２】
グリコールは、基板上の官能基と固定化物質（ＤＮＡ等）との反応を阻害せず、固定化を目的としたときに良好な溶媒になるものと考えられる。
【００４３】
グリコールの具体例としては、アルキレングリコール、ジアルキレングリコール及びトリアルキレングリコールが挙げられ、ジアルキレングリコールが好ましい。ここでアルキレン基は、炭素数２〜６００００００、好ましくは炭素数２〜６００００のアルキレン基、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレンなどである。本発明においては、グリコールとして、ジエチレングリコールを使用するのが特に好ましい。上記グリコールは、単独で使用してもよいし、複数種を混合して使用してもよい。
【００４４】
この溶液におけるグリコールの濃度は、通常、５〜３０重量％、好ましくは５〜２０重量％、より好ましくは５〜１５重量％である。このグリコール溶液は、通常、ｐＨ４〜１２、好ましくはｐＨ６〜８である。
【００４５】
本発明においてポリエーテルとは、主鎖にエーテル結合をもつ線状高分子ポリエーテルを意味する。ポリエーテルとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリトリメチレンオキシド、ポリブテンオキシド及びポリペンテンオキシドなどのポリアルキレンオキシド、ならびにポリオキシメチレンが挙げられ、ポリアルキレンオキシドが好ましく、ポリエチレングリコールが特に好ましい。また、平均分子量１００〜２００００００のポリエーテルが好ましく、平均分子量２００〜２００００のポリエーテルがより好ましい。特に、平均分子量２００〜２０００のポリエチレングリコールが好ましく、平均分子量２００〜４００のポリエチレングリコールがより好ましい。本明細書において、平均分子量とは、重量平均分子量を意味する。
【００４６】
ポリエーテルは、基板上の官能基と固定化物質（ＤＮＡ等）との反応を阻害せず、固定化を目的としたときに良好な溶媒になると考えられる。
【００４７】
本発明において、ポリエチレングリコールには、ポリエチレングリコールと炭素数１〜５０のアルキル基とのモノアルキルエーテル、例えば、ポリエチレングリコールモノデシルエーテル及びポリエチレングリコールモノオクチルエーテルなども包含される。また、本発明において、モノアルキルエーテルの形態でなく両末端に水酸基が存在するポリエチレングリコールは、上記グリコールにも包含される。これらのポリエーテルは、単独で使用してもよいし、複数種を混合して使用してもよい。
【００４８】
具体的には、ポリエチレングリコール２００（平均分子量１９０〜２００）、ポリエチレングリコール３００（平均分子量２８５〜３１５）、ポリエチレングリコール４００（平均分子量３８０〜４２０）、ポリエチレングリコール６００（平均分子量５７０〜６３０）、ポリエチレングリコール１０００（平均分子量９５０〜１０５０）、ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ３００とＰＥＧ１５４０の等量混合物、平均分子量５００〜６００）、ポリエチレングリコール１５４０（平均分子量１３００〜１６００）、ポリエチレングリコール２０００（平均分子量１８００〜２２００）、ポリエチレングリコール４０００（平均分子量２７００〜３４００）、ポリエチレングリコール６０００（平均分子量７４００〜９０００）、ポリエチレングリコール２００００（平均分子量１８０００〜２５０００）、ポリエチレングリコール３００モノデシルエーテル、ポリエチレングリコール６００モノオクチルエーテル及びこれらの混合物が挙げられる。平均分子量１５０〜４５０のポリエチレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００及びこれらの混合物は、室温で液体であり、スポット後、目視又はＣＣＤ（Charge Coupled Device）及び冷却ＣＣＤなどによる検出が可能であるため簡便にスポット漏れ等の欠陥を見つけることができ、有利である。
【００４９】
この溶液におけるポリエーテルの濃度は、通常、１〜１００重量％、好ましくは１〜８０重量％、より好ましくは５〜４０重量％である。このポリエーテル溶液は、通常ｐＨ２〜１３、好ましくはｐＨ５〜９である。
【００５０】
ポリエーテル又はグリコールを溶解させる溶媒としては、特に限定されないが、水性溶媒、例えば、蒸留水、ＳＳＣ（saline-sodium citrate）など、及びＤＮＡ等を溶解できる極性有機溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、トリフルオロ酢酸、トリエチルアミン、１−メチル−２−ピロリドン、ジオキサン、酢酸エチルなどから選ばれる１以上の溶媒を使用できる。ジメチルスルホキシドを共存させると、スポット形状及びＤＮＡなどの生体関連物質の固体支持体に対する固定化力を保ったまま溶液粘度を調節できるため有利である。
【００５１】
この溶液は、さらに、アルコール類、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールなどの１価アルコール、その他、エチレングリコールモノエチルエーテル及びトリプロピレングリコールモノメチルエーテルなどを含んでいてもよい。
【００５２】
このポリヌクレオチド溶液を、９６穴又は３８４穴等のプラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポット装置等を用いて固体支持体上に滴下してスポッティングを行う。スポット装置としては通常は、ピンにプローブポリヌクレオチド溶液を保持させ、そのピンを固体支持体表面に接触させ、そして溶液を固体支持体表面に移行させてスポットを形成するピン方式による装置が用いられる。ピンの先端の形状には、ソリッドピンタイプ（特に、溝が切られていないもの）、クイルピンタイプ（万年筆のように溝が切られているもの）など様々なタイプがあり、いずれであっても使用することができる。好ましくは、クイルピンタイプである。また、ピン方式以外にも、インクジェットプリンタの原理を利用したインクジェット方式や、毛細管によるキャピラリ方式などを利用したスポット装置も用いることができる。
【００５３】
スポッティングするポリヌクレオチドは、固体支持体表面に対して１０２〜１０５種類／ｃｍ２の範囲にあることが好ましい。プローブポリヌクレオチドの量は、１〜１０−１５モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。スポッティングによって、プローブポリヌクレオチドは、固体支持体表面にスポットとして固定化される。本発明の方法を使用することにより、各スポットの形状は、ほぼ円形かつほぼ同じ大きさであり、また、中抜けすることもなく均一なスポットとなる。形状や大きさに変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。
【００５４】
スポット当たりの溶液のスポッティング量は、通常、１ｐＬ〜１μＬの範囲にあり、好ましくは１００ｐＬ〜１００ｎＬの範囲にある。スポットの大きさは、通常、直径が５０〜３００μｍの範囲にある。そして、スポット間の距離は、通常、１．５ｍｍ以下の範囲にあり、好ましくは１００〜７００μｍの範囲にある。
【００５５】
ポリヌクレオチド溶液のスポッティング後、固体支持体を、通常、室温〜１２０℃、好ましくは６０〜１００℃にて、通常、７２時間以下、好ましくは１〜３時間インキュベートとすることが好ましい。このような後処理を施すことにより、ポリヌクレオチドと固体支持体との間に安定な共有結合が形成される。
【００５６】
ポリヌクレオチドを固体支持体に固定化した後、固定化されていないポリヌクレオチド等を除去するため、固体支持体を洗浄する。洗浄液としては、当技術分野で通常用いられているものを使用することができ、例えば、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む水溶液を使用することができる。
【００５７】
上記のポリヌクレオチドの固定化方法により作製された本発明のポリヌクレオチド固定化固体支持体は、多数のプローブポリヌクレオチドが共有結合により固定化された領域からなるスポットを多数個（通常は、数百〜数万個）有する。
【００５８】
上記のポリヌクレオチドの固定化方法に従って作製されたマイクロアレイの寿命は、通常、ｃＤＮＡが固定化されてなるｃＤＮＡ分析用マイクロアレイでは２〜６ヶ月、オリゴＤＮＡが固定化されてなるオリゴＤＮＡ分析用マイクロアレイでは２〜６ヶ月である。これらのＤＮＡ分析用マイクロアレイは、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。
【００５９】
次に、本発明の固体支持体を用いたポリヌクレオチド試料の検出方法について説明する。まず、標識したポリヌクレオチド試料を用意する。ポリヌクレオチド試料（標的ポリヌクレオチド）としては通常、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片が用いられる。
【００６０】
標識したポリヌクレオチド試料は、遺伝子発現を調べる目的では一般に、真核生物であればその細胞や組織サンプルからｍＲＮＡを抽出した後、逆転写反応により、標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する）を取り込ませながら、ｃＤＮＡとすることにより得られる。細菌などの原核生物であれば、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難であるので全ＲＮＡを抽出する。ゲノムを試料とする場合には、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することができる。赤血球を除く任意の組織は、例えば抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等である。１回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によっても異なるが、通常は数μｇ以下である。なお、ｍＲＮＡをアンチセンスＲＮＡとして用いる方法もある。標識ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性の点から、標識ｄＣＴＰを用いることが好ましい。また、固体支持体上に固定化したプローブとしてのポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである場合には、ポリヌクレオチド試料を低分子化しておくことが望ましい。
【００６１】
標識したポリヌクレオチド試料は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、一般に標識プライマー又は標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰＣＲを行うことにより得られる。
【００６２】
標識としては、ＲＩ標識と非ＲＩ標識（蛍光法、ビオチン法、化学発光法等）が知られているが、蛍光標識を用いることが好ましい。蛍光標識としては、Ｃｙ３及びＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなどが挙げられ、放射能標識としては、α−３２Ｐ、γ−３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。
【００６３】
次いで、上記の標識ポリヌクレオチド試料をＳＳＣ（saline-sodium citrate）などの水性媒体に溶解又は分散して、試料の水溶液を調製する。この水溶液を、ポリヌクレオチドを固定化した固体支持体上にスポッティングした後インキュベートして、ハイブリダイゼーションを行う。スポッティングは、９６穴又は３８４穴等のプラスチックプレートに試料の水溶液を分注し、スポット装置を用いて滴下することにより実施できる。水溶液のスポッティング量は、スポット当たり１００ｐＬ〜１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。インキュベーションは、室温〜１００℃の範囲の温度で、１〜２４時間の範囲の時間で実施することが好ましい。
【００６４】
ＤＮＡ分析用マイクロアレイの場合、使用するＤＮＡ断片試料の量が非常に少なくて済む半面、ハイブリダイゼーションに際して固体支持体に固定化されたプローブポリヌクレオチドの鎖長や試料の種類に応じて、その最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子をも十分に検出できるように、ハイブリダイゼーションを長時間かけて行うことが好ましい。一方、一塩基変異の検出には、ハイブリダイゼーションを短時間で行うことが好ましい。これにより、固体支持体上のプローブポリヌクレオチドと、標識した核酸断片試料中の、該プローブと相補的な塩基配列をもつ分子とがハイブリダイズして、ハイブリッドを形成する。
【００６５】
ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤の溶液と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応のポリヌクレオチド試料を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウムを用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、又はグッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００６６】
次に、固体支持体上に形成されたハイブリッドからの蛍光シグナルを検出器により検出する。検出器としては、例えば蛍光レーザー顕微鏡、冷却ＣＣＤカメラ及びコンピュータを連結した蛍光スキャニング装置が用いられ、固体支持体上の蛍光強度を自動的に測定することができる。ＣＣＤカメラの代わりに共焦点型又は非焦点型のレーザーを用いてもよい。これにより、画像データが得られる。得られたデータから、固体支持体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドに対して相補性を有する標的ポリヌクレオチドを同定することができ、これに基づいて遺伝子発現プロファイルを作成したり、ポリヌクレオチド試料の塩基配列を決定することができる。さらに、データ解析ソフトや外部データベースを利用することにより、遺伝子の変異や多型などのより複雑な解析を行うことも可能である。あるいは、試料として互いに異なる蛍光物質によって標識したポリヌクレオチド試料を複数種類用意し、これらを同時に用いることにより、一個の固体支持体上で発現量の比較や定量を行うことも可能である。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）固体支持体の作成
２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドガラスを、ポリアリルアミン水溶液（０．１ｇ／ｌ）に浸漬することにより、静電層を形成した。その後、静電層のアミノ基に、多価カルボン酸としてのポリアクリル酸を、０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドの存在下で縮合した。そして、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド・塩酸塩と２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化した。
【００６８】
（実施例２）ＤＮＡ固定化用溶液のスポッティング
以下の（ａ）〜（ｅ）の組成を有するＣｙ３標識ＤＮＡ水溶液をそれぞれ作成し、スポッター装置（日立ソフトウエアーエンジニアリング社製、ＳＰＢＩＯ２０００）を用いて、実施例１で作成した固体支持体上にスポッティングした。
（ａ）Ｃｙ３蛍光標識ＤＮＡ ０．５μｇ/μｌ、1×Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＴＴＭ（タカラバイオ社製）、１０％グリセロール
（ｂ）Ｃｙ３蛍光標識ＤＮＡ ０．５μｇ/μｌ、０．０５Ｍ ＮａＯＨ、１０％グリセロール
（ｃ）Ｃｙ３蛍光標識ＤＮＡ ０．５μｇ/μｌ、１０％イソプロパノール
（ｄ）Ｃｙ３蛍光標識ＤＮＡ ０．５μｇ/μｌ、1×ＡｒｒａｙＩｔ（商標；
TeleChem International社製）
（ｅ）Ｃｙ３蛍光標識ＤＮＡ ０．５μｇ/μｌ、１０％ジエチレングリコール
【００６９】
スポッティング後以下の処理を行った。
（１）８０℃に設定したオーブンにＤＮＡをスポッティングした固体支持体を入れ、１時間乾燥させた。
（２）固体支持体を保持具にセットした。
（３）５００ｍｌ ビーカーに洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ、室温）を入れ、保持具にセットした固体支持体を浸漬して、スターラーで攪拌しながら１５分間洗浄した。
（４）同様に９０℃に加熱した洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ、９０℃）を入れ、保持具にセットした固体支持体を浸漬して、スターラーで攪拌しながら５分間洗浄した。
（５）滅菌水で固体支持体をリンスした。
（６）遠心機で固体支持体表面の溶液を吹き飛ばした。
（７）ＦＬＡ８０００（富士フィルム社製）を用い、固体支持体に固定化されたＣｙ３蛍光標識ＤＮＡに由来する蛍光を測定した。
【００７０】
結果を図１に示す。
図１に示した結果から、（ａ）〜（ｄ）の組成のＤＮＡ溶液をスポッティングした場合には、スポットサイズが広がったり、不均一にスポットされたり、スポット形状が円形にならなかったり、あるいはスポットが中抜けしてドーナツ状になるなど、スポットにむらがあるとともに、スポット形状も均一ではなかった。これに対し、ジエチレングリコールを含む水溶液にＤＮＡを溶解し、これを固体支持体にスポッティングした場合は、スポット形状は円形で、かつ中抜けすることなくむらなく均一なスポット形状でスポッティングできることが明らかとなった。また、蛍光強度の値から、本発明の方法でスポッティングした場合は、スポットあたりの総シグナル強度が高いとともに、ピクセルあたりのシグナル強度も高いことがわかる。以上の結果から、本発明のポリヌクレオチドの固定化方法により、ポリヌクレオチドが固体支持体上に強固かつ均一に固定化されることが明らかとなった。
【００７１】
（実施例３）
以下の（ｆ）〜（ｉ）の組成を有するＣｙ３標識ＤＮＡ水溶液をそれぞれ作成し、スポッター装置（日立ソフトウエアーエンジニアリング社製、ＳＰＢＩＯ２０００）を用いて、実施例１で作成した固体支持体上にスポッティングした。
（ｆ）Ｃｙ３蛍光標識ＤＮＡ ５μｍｏｌ／ｌ、２０％ポリエチレングリコール（分子量３００）
（ｇ）Ｃｙ３蛍光標識ＤＮＡ ５μｍｏｌ／ｌ、１０％ジメチルスルホキシド、１％ポリエチレングリコール（分子量３００）
（ｈ）Ｃｙ３蛍光標識ＤＮＡ ５μｍｏｌ／ｌ、１×Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（商標；ＴａＫａＲａ製）
（ｉ）Ｃｙ３蛍光標識ＤＮＡ ５μｍｏｌ／ｌ、３×ＳＳＣ（３倍濃縮生理食塩水）
【００７２】
スポッティング後以下の処理を行った。
（１）８０℃に設定したオーブンにＤＮＡをスポッティングした固体支持体を入れ、１時間乾燥させた。
（２）固体支持体を保持具にセットした。
（３）５００ｍｌビーカーに洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ、室温）を入れ、保持具にセットした固体支持体を浸漬して、スターラーで攪拌しながら１５分間洗浄した。
（４）同様に９０℃に加熱した洗浄液（２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ、９０℃）を入れ、保持具にセットした固体支持体を浸漬して、スターラーで攪拌しながら５分間洗浄した。
（５）滅菌水で固体支持体をリンスした。
（６）遠心機で固体支持体表面の溶液を吹き飛ばした。
（７）ＦＬＡ８０００（富士フィルム社製）を用い、固体支持体に固定化されたＣｙ３蛍光標識ＤＮＡに由来する蛍光を測定した。
【００７３】
結果を図２に示す。
図２に示した結果から、ｈ及びｉの組成のＤＮＡ溶液をスポッティングした場合には、スポットサイズが広がったり、不均一にスポットされたり、スポット形状が円形にならなかったり、あるいはスポットが中抜けしてドーナツ状になるなど、スポットにむらがあるとともに、スポット形状も均一ではなかった。これに対し、ポリエチレングリコール（分子量３００）を２０％又は１％含む水溶液にＤＮＡを溶解し、これを固体支持体にスポッティングした場合（ｆ又はｇ）は、スポット形状は円形で、かつ中抜けすることなくむらなく均一なスポット形状でスポッティングできることが明らかとなった。また、蛍光強度の値から、本発明の方法でスポッティングした場合は、スポットあたりの総シグナル強度が高いとともに、ピクセルあたりのシグナル強度も高いことがわかる。以上の結果から、本発明のポリヌクレオチドの固定化方法により、ポリヌクレオチドが固体支持体上に強固かつ均一に固定化されることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】固体支持体に様々な組成の蛍光標識ＤＮＡ溶液をスポッティングしてインキュベートした後、ＦＬＡ８０００を用いて蛍光画像を撮影したものである。
【図２】固体支持体に様々な組成の蛍光標識ＤＮＡ溶液をスポッティングしてインキュベートした後、ＦＬＡ８０００を用いて蛍光画像を撮影したものである。
【図１】
2004198406.tif 000003
【図２】
2004198406.tif 000004