(57)【要約】【課題】大腸菌を検出するための新規な方法の提供。【解決手段】大腸菌の検出方法において、標識された外殻蛋白質を有するＴ系バクテリオファージを試料と接触せしめ、そして細胞表面に当該標識が結合した細菌等が該試料中に存在するか否かを判定することを特徴とする方法、並びに大腸菌の細胞表面に特異的に吸着する、標識された外殻蛋白質を有するＴ系バクテリオファージを含んでなる、大腸菌検出試薬。本発明によれば、大腸菌の細胞の表面に特異的に吸着したバクテリオファージの外殻蛋白質に結合した標識を直接検出するので、大腸菌を、短時間で、簡単に、高感度に、正確に検出する事が出来る。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌の検出方法において、標識された外殻蛋白質を有するＴ系バクテリオファージを試料と接触せしめ、そして細胞表面に当該標識が結合した細菌が該試料中に存在するか否かを判定することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記Ｔ系バクテリオファージの中に病原性大腸菌特異的ファージであるＰＰ０１株を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記外殻蛋白質が、ＳＯＣ（Ｓｍａｌｌ  Ｏｕｔｅｒ  Ｃａｐｓｉｄ）蛋白質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識が、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）であり、このＧＦＰが前記ＳＯＣ蛋白質にペプチド結合により連結されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＯＣ（Ｓｍａｌｌ  Ｏｕｔｅｒ  Ｃａｐｓｉｄ）蛋白質が、配列番号：２又は配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
大腸菌の細胞表面に特異的に吸着する、標識された外殻蛋白質を有するＴ系バクテリオファージを含んでなる、大腸菌検出試薬。
【請求項７】
前記Ｔ系バクテリオファージの中にＰＰ０１株を含む、請求項６記載の試薬。
【請求項８】
前記外殻蛋白質が、ＳＯＣ（Ｓｍａｌｌ  Ｏｕｔｅｒ  Ｃａｐｓｉｄ）蛋白質である、請求項６又は７に記載の試薬。
【請求項９】
前記標識が、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）であり、このＧＦＰが前記ＳＯＣ蛋白質にペプチド結合により連結されている、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＯＣ（Ｓｍａｌｌ  Ｏｕｔｅｒ  Ｃａｐｓｉｄ）蛋白質が、配列番号：２又は配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する、請求項８又は９に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、大腸菌の検出方法に関する。更に詳しくは、本発明は、宿主に対するバクテリオファージの特異性を利用した、大腸菌の検出方法及びそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
衛生指標細菌として用いられている大腸菌群の中には、大腸菌以外の細菌が多く含まれ、必ずしもヒト由来糞便性大腸菌濃度を反映していない。また、大腸菌群の検出は培養法で行うため、通常検出までに１日以上を要する。
わが国における病原性大腸菌Ｏ１５７の検出件数は毎年増加しており、感染による死亡者も報告されている。この感染症による被害を最小限に抑えるためには、感染が疑われる患者の糞便中からの病原菌の迅速な検出と、感染源の迅速な特定が必要である。このため、従来から、病原性大腸菌Ｏ１５７の検出のための種々の方法が開発されている。
【０００３】
例えば、病原性大腸菌固有の抗原に対する抗体を用いる方法が知られているが、精度の点で問題がある。また、病原性大腸菌のＤＮＡ中の、当該大腸菌に特異的な特定の領域、具体的にはベロ毒素（Ｖｔ１，Ｖｔ２）をコードする遺伝子領域をＰＣＲにより増幅して、その存在を検出する方法が知られているが、この方法の実施には高度の技術が必要である上、死菌と、検出したい生菌とが区別できないという欠点がある。
【０００４】
更に、特開２０００−３０８４８６号公報、及び特開２００２−４５１８３号公報には、特定の細菌に対して特異的なバクテリオファージの遺伝子に標識を組みこんでおき、このファージを細菌細胞に感染させて、細菌細胞中で増加する標識を検出する方法が記載されている。しかしながら、この方法においては、バクテリオファージを細菌に感染させ、細菌の菌体内の標識を検出しなければならず、このために時間を要し、また検出すべきシグナル（蛍光）が微弱であって、感度が十分でないなどの問題点がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、細菌に対するバクテリオファージの特異性を利用しながら、迅速で且つ高感度で大腸菌を検出できる方法を提供しようとするものである。
【０００６】
本発明者は、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、大腸菌に対して特異的に感染するバクテリオファージの外殻蛋白質を標識しておき、このバクテリオファージを当該大腸菌の細胞表面に吸着させれば、細胞内の標識を検出する必要がなく、迅速に且つ高感度に大腸菌を検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
従って本発明は、大腸菌の検出方法において、標識された外殻蛋白質を有するＴ系バクテリオファージを試料と接触せしめ、そして細胞表面に当該標識が結合した細菌当該試料中に存在するか否かを判定することを特徴とする方法を提供する。
本発明はまた、大腸菌の細胞表面に特異的に吸着する、標識された外殻蛋白質を有するＴ系バクテリオファージを含んでなる、大腸菌検出試薬を提供する。
【０００８】
上記のＴ系バクテリオファージの具体例としては、Ｔ４ファージ又は本発明者らがブタの糞便から単離したＰＰ０１株が挙げられる。また、前記外殻蛋白質としてはＳＯＣ（Ｓｍａｌｌ  Ｏｕｔｅｒ  Ｃａｐｓｉｄ）蛋白質が挙げられる。上記標識としては、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）を、前記外殻蛋白質、例えばＳＯＣ蛋白質にペプチド結合により連結して使用するのが好ましい。このＳＯＣ蛋白質は、例えば配列番号：２又は配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
細菌のみに感染するウイルスであるバクテリオファージは、特定の細菌にのみ感染するという高い宿主特異性を有している。この感染に当たっては、バクテリオファージは大腸菌の表面抗原に特異的に吸着し、しかる後に、バクテリオファージ中のＤＮＡが菌体内に注入され、菌体内ではバクテリオファージのＤＮＡが複製されるとともに、バクテリオファージの外殻蛋白質など、ファージ粒子の形成に必要な蛋白質が合成され、それらが集合してファージ粒子が形成され、細菌細胞が溶菌して多数のファージ粒子が放出されて、新たな感染サイクルが始まる。本発明は、上記のファージ感染サイクルの内、初期の、バクテリオファージが大腸菌の細胞表面に特異的に吸着される段階を利用する。
【００１０】
本発明の方法に用いるバクテリオファージとしては、大腸菌に特徴的な抗原を認識して当該大腸菌に特異的に吸着するバクテリオファージであれば特に限定されないが、Ｔ４ファージ又は本発明者らが、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株に感染するファージを環境中からスクリーニングした結果、ブタの糞便から単離した、ＰＰ０１株が具体例として挙げられる。
【００１１】
本発明の方法においては、大腸菌の細胞表面に吸着されたバクテリオファージを、外部から検出する必要があるので、ファージの外殻蛋白質を標識しておく必要があり、この外殻蛋白質として、Ｓｍａｌｌ  Ｏｕｔｅｒ  Ｃａｐｓｉｄ（ＳＯＣ）蛋白質を修飾するのが好ましい。バクテリオファージＰＰ０１株のＳＯＣ蛋白質は配列番号：２にＴ４ファージのＳＯＣ蛋白質は配列番号：６に、それぞれ示す。なお、ＰＰ０１−ＳＯＣのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号：１にＴ４−ＳＯＣのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号：５に、それぞれ示す。
【００１２】
本発明において使用する標識としては、バクテリオファージの外殻蛋白質を標識できるものであればよいが、簡単に検出でき、且つバクテリオファージの外殻蛋白質に簡単に結合させることができるものとして、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）が挙げられる。この前記標識が、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）は、前記ＳＯＣ蛋白質の、例えばＮ−末端又はＣ−末端ペプチド結合により連結される。このためには、バクテリオファージにＳＯＣ蛋白質をコードするＤＮＡとＧＦＰをコードするＤＮＡとを読み枠を合わせて連結すればよい。なお、ＧＦＰをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：３に示し、そしてＧＦＰのアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
【００１３】
本発明の方法を実施するに当たっては、糞便、食品、又はその他の検体から、常法に従って細菌を分離する。細菌の分離、培養は本発明の特徴を構成するものではなく、任意の方法を用いることが出来る。
【００１４】
本発明に使用するバクテリオファージは、常法に従って調製することが出来る。例えば、バクテリオファージＰＰ０１株など、病原性大腸菌Ｏ１５７の細胞表面に特異的に吸着するファージを、その宿主、例えば大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株（ＡＴＣＣ  ４３８８８）の培養物に添加した後、その大腸菌を常法に従って培養することにより溶菌し、溶菌物を遠心分離して不溶物を除去すれば、バクテリオファージ粒子を含む液が得られる。
【００１５】
検出試験は、例えば次のようにして行う事が出来る。被験細菌を、ファージを吸着させるのに適した、例えばＬＢ培地に懸濁し、その少量、例えは５０μＬを取る。次に、適当に希釈したファージ液を、例えば１：１の容量比で前記菌体懸濁液に加え、混合する。この混合液を約２５℃にて、例えば約１０分間放置し、ファージを培養菌体の表面に吸着させる。この操作において、被懸細菌中に大腸菌Ｏ１５７が含まれておれば、その細胞表面に、標識されたバクテリオファージが吸着する。
【００１６】
次に、上記の細菌懸濁液を遠心分離して、細菌細胞を得る事により、未吸着バクテリオファージを除去し、さらに細胞を洗浄することにより、非特異的に付着しているバクテリオファージを除去する。
【００１７】
バクテリオファージの吸着を介して細菌表面に固定された標識は、標識の種類に応じて選択された検出方法により検出される。標識が緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）である場合、４６０〜４９０ｎｍの波長の励起紫外線を細菌細胞に照射し、その際発生する５１０〜５５０ｎｍの波長の紫外線を検出又は測定する。この検出・測定は、例えば蛍光顕微鏡での観察、フローサイトメトリーなど、定法に従って行う事ができる。
【００１８】
【実施例】
次に実施例により、本発明を更に具体的に説明する。
実施例１．ＧＦＰ導入ファージ液の調製
ＧＦＰ導入ファージを大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７  ＡＴＣＣ４３８８８  に感染させ、感染菌体を  ＬＢ  培地中で振盪培養（２８℃，  １２０ｒｐｍ）することにより、ＧＦＰ  導入ファージを増殖させた。ファージの感染は、対数増殖期前期の大腸菌培養液に  ＧＦＰ  導入ファージを  ＭＯＩ  （Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）  ＝  ０．０１  ［ＰＦＵ／ＣＦＵ］  となるように添加することで行った。
【００１９】
ファージ添加から約６時間の振盪培養後、クロロホルム２．５ｍｌ  を添加し、４℃恒温下に１時間放置することで、未溶菌菌体を溶菌させた。クロロホルム処理後、菌体破砕物の除去を目的に、遠心分離（９５００ｘｇ，  １０ｍｉｎ，  ４℃）を行い、ファージを含む遠心上清を回収した。この遠心上清２５０ｍｌ  に  ＰＥＧ６０００  ２５ｇ  および  ＮａＣｌ  １０ｇ  を溶解させた後に、４℃恒温下に一晩放置した。一晩静置後、遠心分離（１６０００ｘｇ，  ６０ｍｉｎ，  ４℃）を行い、沈殿としてファージを収集した。
【００２０】
この沈殿を  ＳＭ  １０ｍｌ  中に懸濁した後、クロロホルム２０ｍｌ  を加え、４℃恒温下に６時間静置した後に遠心分離（１００００ｘｇ，  ２０ｍｉｎ，  ４℃）を行い、ＰＥＧ６０００  を除去した。遠心分離後回収した水層について、セシウムクロライド密度勾配（１．７，  １．５  および  １．４５ｇ／ｃｍ３）中で遠心分離（１１１０００ｘｇ，  ２ｈｒ，  ４℃）を行い、ファージを濃縮した。回収したファージ濃縮液について、ＳＭ  中で一晩透析を行い、ＣｓＣｌ  を除去した。
【００２１】
実施例２．病原性大腸菌Ｏ１５７の検出
大腸菌  Ｏ１５７：Ｈ７  （ＡＴＣＣ４３８８８）  および大腸菌  Ｋ−１２  （Ｗ３１１０）  を、それぞれ  ＬＢ  培地  ２ｍｌ  に播種し、振盪培養（３７℃，  １２０ｒｐｍ）を行った。１．５時間の振盪培養後、培養液（１０７  ＣＦＵ／ｍｌ）１００μｌを採取し、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７  のみの懸濁液、大腸菌Ｋ−１２  のみの懸濁液、および両者を体積比  １：１  で混合した大腸菌懸濁液を調製した。それぞれの懸濁液について、遠心分離（１７４００ｘｇ，  １ｍｉｎ，  ４℃）を行い、集菌した。集菌した菌体ペレットを  ＬＢ中に懸濁させた。
【００２２】
懸濁後、室温下に１０分間静置した後、ＭＯＩ  が  １００  ［ＰＦＵ／ＣＦＵ］となるように、ＧＦＰ  導入ファージライセイト（１０９  ＰＦＵ／ｍｌ）１００μｌ  を添加した。ファージ添加後、室温にて１０分間反応させた後、遠心分離（１７４００ｘｇ，  １ｍｉｎ，  ４℃）を行い、未吸着ファージを含む上清を除去した。遠心後の菌体ペレットをＬＢ  の５倍希釈液１００μｌ  で洗浄した後、ＰＢＳ液１０μｌ  に懸濁した。この懸濁液について、落射型蛍光顕微鏡を用い、ＧＦＰ  蛍光（励起波長：４６０−４９０ｎｍ、蛍光波長：５１０−５５０ｎｍ）を観察した。
【００２３】
結果を、図１のＡ〜Ｃに示す。この図において、上段は通常の光学観察した結果を示し、下段は蛍光検出した結果を示す。Ａは、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７  のみの懸濁液の結果を示し、Ｃは、大腸菌Ｋ−１２  のみの懸濁液の結果を示し、そしてＢは、両大腸菌懸濁液を体積比５６：４４で混合した混合大腸菌懸濁液の結果をしめす。Ａ及びＢにおいては、蛍光染色された細胞が観察されるのに対して、Ｃにおいては、蛍光染色された細菌が観察されず、本発明の方法で病原性大腸菌Ｏ１５７が特異的に検出される事が確認された。
実施例３．大腸菌Ｋ１２（Ｗ３１１０）の検出
図２はＴ４ファージのＳＯＣ蛋白質にＧＦＰを融合し、大腸菌Ｋ１２（Ｗ３１１０）に感染させたときの光学顕微鏡写真（Ａ）と蛍光顕微鏡写真（Ｂ）である。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７  同様、本組換えファージにより、ヒト由来大腸菌Ｋ１２株を蛍光顕微鏡で検出できることが確認できた。
【００２４】
【発明の効果】
本発明によれば、大腸菌を、短時間で、簡単に、高感度に、正確に検出する事が出来る。
【００２５】
【配列表】
2004283003.tif 000002
2004283003.tif 000003
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2004283003.tif 000005
2004283003.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例２の結果を示し、Ａは、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７  のみの懸濁液中の細菌を本発明の方法により検出した結果を示す、生物の形態を示す図面代用写真である。Ｂは、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７及び大腸菌Ｋ−１２の両者を含む懸濁液中の細菌を本発明の方法により検出した結果を示す、生物の形態を示す図面代用写真である。Ｃは、大腸菌Ｋ−１２  のみの懸濁液中の細菌を本発明の方法により検出した結果を示す、生物の形態を示す図面代用写真である。
【図２】図２は実施例３の結果を示す、生物の形態を示す図面代用写真である。
【図１】
2004283003.tif 000007
【図２】
2004283003.tif 000008