(57)【要約】【課題】ミトコンドリア遺伝子の変異抑制剤あるいは変異軽減剤の提供。【解決手段】インターフェロンを有効成分とする、ミトコンドリア遺伝子の変異抑制剤あるいは変異軽減剤。さらには、これら変異抑制剤あるいは変異軽減剤を用いることにより、発ガンあるいはガン再発の抑制剤または予防剤を提供できる。【選択図】　　　なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンを有効成分とする、ミトコンドリアＤＮＡの変異抑制又は変異軽減剤。
【請求項２】
ミトコンドリアＤＮＡの変異が、慢性炎症によって加速されるものである、請求項１記載の変異抑制又は変異軽減剤。
【請求項３】
ミトコンドリアＤＮＡの変異が、ウイルス傷害性ガン化細胞、白血病細胞あるいは悪性リンパ腫のものである、請求項１記載の変異抑制又は変異軽減剤。
【請求項４】
慢性炎症が、Ｃ型あるいはＢ型慢性肝炎、潰瘍性大腸炎である、請求項１記載の変異抑制又は変異軽減剤。
【請求項５】
ウイルス傷害性ガン化細胞がＣ型あるいはＢ型慢性肝炎ウイルスに感染しガン化した肝細胞である、請求項１記載の変異抑制又は変異軽減剤。
【請求項６】
インターフェロンがインターフェロン−αあるいはβである、請求項１記載の変異抑制又は変異軽減剤。
【請求項７】
ミトコンドリアＤＮＡの変異箇所がＤ−ｌｏｏｐ領域である、請求項１記載の変異抑制又は変異軽減剤。
【請求項８】
インターフェロンを有効成分とする、ミトコンドリアＤＮＡの変異によって加速される発癌の発癌抑制剤又は発癌予防剤。
【請求項９】
ミトコンドリアＤＮＡの変異によって加速される発癌が、慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、白血病細胞あるいは悪性リンパ腫による発癌である、請求項８記載の発癌抑制剤又は発癌予防剤。
【請求項１０】
インターフェロンがインターフェロン−αあるいはβである、請求項８又は９記載の発癌抑制剤又は発癌予防剤。
【請求項１１】
インターフェロンを発癌抑制剤又は発癌予防剤として投与するために、ミトコンドリアＤＮＡの変異が正常細胞と比較して少なくとも１２個以上の患者を選択することからなる、投与適格患者の選択方法。
【請求項１２】
ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の変異が正常細胞と比較して少なくとも３個以上である患者を選択することからなる、請求項１１記載の投与適格患者の選択方法。
【請求項１３】
請求項１１又は１２記載の方法で選択された患者に対し、発癌抑制剤又は発癌予防剤として、インターフェロンを有効成分として投与することを特徴とする、制ガン剤、ガン再発予防剤又は慢性肝炎治療剤。
【請求項１４】
患者がＣ型あるいはＢ型慢性肝炎ウイルス感染に由来する慢性肝炎、肝硬変、肝臓ガンの患者であり、インターフェロンがインターフェロン−αあるいはβである、請求項１３記載の慢性肝炎治療剤またはガン再発予防剤。
【請求項１５】
ガン摘出手術を受けた患者に、ミトコンドリアＤＮＡの変異抑制又は変異軽減剤として、インターフェロンを有効成分として投与することを特徴とする、ガン再発予防剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターフェロンを有効成分とする、ミトコンドリアＤＮＡの変異抑制又は変異軽減剤に関するものである。これにより、肝炎ウイルスの感染に起因し、慢性肝炎または肝硬変を発症した患者に対し、発癌抑制効果を十分に発揮させるための新たな肝炎治療方法を提供するものである。具体的には、肝炎ウイルスに感染した患者ミトコンドリアＤＮＡの塩基配列の決定から、ミトコンドリアＤＮＡ変異の高い症例を選別し、インターフェロンαまたはインターフェロンβを主剤とする肝炎治療剤投与に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染によって発症するＢ型及びＣ型慢性肝炎は、肝硬変、肝細胞癌へと高率に移行する重篤なウイルス性疾患である。Ｂ型肝炎ウイルスキャリアは本邦で約１００万人、Ｃ型慢性肝炎ウイルスキャリアは１３０−２００万人ともいわれ、世界的にも広範に伝播している。フラビウイルス科に属する一本鎖ＲＮＡウイルスであるＨＣＶは、遺伝子の変異による免疫機構からの回避等のウイルス側の要因、免疫能やウイルス排除能低下等の宿主側の要因により慢性化するものと考えられる。一方、ヘパドナウイルス科に属するＨＢＶは、二本鎖ＤＮＡウイルスであるため、ＨＣＶほどウイルスゲノムに変異は生じないが、Ｃ型慢性肝炎より高率ではないものの同じく慢性化する。また、ＨＢＶ感染においては一部配列が宿主染色体ＤＮＡ中に取り込まれ、肝細胞発癌に係わることが知られている。また、ウイルス遺伝子の変異による免疫機構からの回避による劇症化が認められる。
【０００３】
現在、ウイルスを排除する唯一の治療方法は、インターフェロン療法であるが、最終的にウイルスが排除される割合はＨＣＶで４０％程度、ＨＢＶで２０％程度である。特に、ＨＣＶの場合のインターフェロン療法では、ＨＣＶの血清型、ウイルス量、組織学的な進行度等の患者背景により、その治療効果に差が生じる。特に本邦で多く見られるジェノタイプ１ｂ型や高ウイルス血症の症例において、その改善効果は低く、ウイルスの排除率も低いことが知られている。
【０００４】
インターフェロンの作用は、感染細胞に直接働く抗ウイルス作用と宿主免疫の賦活化作用に大別される。インターフェロンによる抗ウイルス作用は、インターフェロンレセプターを介したシグナル伝達によって生じ、抗ウイルス因子の産生を誘導することによって、ＨＣＶのＲＮＡの分解や翻訳阻害等を促進する。通常、Ｃ型慢性肝炎に対するインターフェロン治療では、投与２日後に著効例の７３．８％で血清中のＨＣＶ　ＲＮＡが検出限界外となることから、ＨＣＶはインターフェロン投与後速やかに排除されると考えられる（Ｓａｉｔｏ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｋｅｉｏ　Ｊ．　Ｍｅｄ．　１９９７；　４６：　７４−８０）。しかしながら、これらのウイルスが消失した症例の内、かなりの症例でインターフェロン投与終了時にウイルスの再燃が認められるようになる。これらの結果は、インターフェロン投与期間中にウイルスＲＮＡが血中に検出されていなくても、肝臓内や抹消血細胞（ＰＢＭＣ）中にはウイルスが多く存在していることを意味している。これらの再燃症例は、長期間のインターフェロン再投与やリバビリンとインターフェロンの併用療法によって、一部完全治癒に導くことが可能である。しかし、投与期間中にウイルスが陰性化しない症例は、インターフェロン療法で２０−３０％存在する。これら症例では、インターフェロン再投与やリバビリンとインターフェロンの併用投与によって完全治癒がもたらされる確率は、初回投与症例や再燃症例と比較して低い。これらインターフェロン抵抗性症例群の中で、ＡＬＴ値が持続的に高値となる症例は、極めて肝細胞発癌率が高い症例と考えられている。
【０００５】
肝細胞癌発症に関しても、症例数も多く観察期間も長い大規模調査の結果が報告されるようになってきた。厚生省非Ａ非Ｂ型肝炎研究班の統一研究として実施されたインターフェロン治療後の長期追跡例についてのアンケート調査の結果では、インターフェロン投与によって肝細胞癌発生は減少し、ＨＣＶの排除によるというより、ＡＬＴ値に対する改善効果に依存して低下すると結論されている。また、肝癌の発生率を低下させるには、ＨＣＶが根絶されなくとも、ＩＦＮ治療中または治療後のＡＬＴを正常化させることが重要であると報告されている（Ｋａｓａｈａｒａ　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１９９８；　２７：　１３９４−１４０２、　Ｉｍａｉ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎｎ．　Ｉｎｔｅｒｎ．　Ｍｅｄ．　１９９８；　１２９：　９４−９９、　Ｉｋｅｄａ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１９９９；　２９：　１１２４−１１３０、　Ｏｋａｎｏｕｅ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｈｅｐａｔｏｌ．　１９９９；　３０：　６５３−６５９）。従って、インターフェロン療法に対して無効であった症例の中でＡＬＴ値の高い症例をインターフェロンの長期投与を施すことによって、不完全著効に導くことが肝要と考えられる。しかしながら、ＡＬＴ値は変動しやすい肝障害マーカーであり、どの患者において発癌リスクが顕著に高まっているかを予期することができない。
【０００６】
肝障害が高度に生じている疾患では、炎症に伴って肝臓のクッパー細胞が活性化されていると考えられる。クッパー細胞や肝細胞はＮＯラジカルの発生源であり（Ｓｔｏｌｚ　ＤＢ．　Ｅｔ　ａｌ．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２００２；　３６：　８１−９３）、肝臓における炎症の増悪に関与すると考えられている。ＮＯラジカルは、ミトコンドリアの電子伝達系において終末のシトクロームＣオキシダーゼを可逆的に阻害することにより電子伝達系を阻害し、その結果ミトコンドリアから電子が漏出しやすくなる（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１９９６；　５６：　４５３５−４５４０）。漏出した電子は酸素と結合してスーパーオキシドラジカルに変化し、スーパーオキシドディスムターゼの存在のもと、また、不均化反応により過酸化水素にとなる。過酸化水素は、鉄などの遷移金属の存在下にヒドロキシラジカルとなる。
【０００７】
ヒドロキシラジカルは、またＮＯラジカルとスーパーオキシドラジカルが直接反応しても産生される。ヒドロキシラジカルは遺伝子変異を引き起こす強いＤＮＡ傷害分子である。
【０００８】
ヒドロキシラジカルの産生により、ＤＮＡの対合にミスペアを起こす８−ヒドロキシグアニンや２−ヒドロキシアデニン等の修飾塩基が蓄積し、染色体ＤＮＡに変異をもたらすことによって細胞が癌化の過程を辿るようになると考えられる（Ｋａｍｉｙａ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９５；　２７０：　１９４４６−１９４５０、Ｉｎｏｕｅ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　ＪＢｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９８；　２７３：　１１０６９−１１０７４）。Ｃ型慢性肝炎における患者肝生検試料の検討から、慢性肝炎における肝細胞の染色体ＤＮＡ中には８−ヒドロキシグアニンが多量に含まれていることが知られ、その量はＡＬＴ値と相関することが知られている（Ｓｈｉｍｏｄａ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１９９４；　５４：　３１７１−３１７２）。また、Ｂ型慢性肝炎においても８−ヒドロキシグアニンが肝細胞発癌に関与する可能性が示唆されている（Ｈａｇｅｎ　ＴＭ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　１９９４；　９１：１２８０８−１２８１２）。この様な修飾塩基を測定することによっても、染色体中の変異の蓄積度を予想することができるが、多量の肝生検試料が必要であるばかりでなく、運動後や喫煙後に８−ヒドロキシグアニン量が変動する等（Ｋａｓａｉ　Ｈ．　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ．　１９９７；　３８７：　１４７−１６３）、発癌リスクを正しく判定することは難しい。
【０００９】
以上のように種々のメカニズムと可能性が想定されるものの、決定的なものではなく、従来から治療方法としては、例えば、Ｃ型慢性肝炎に対しては、ＨＣＶの排除及び肝機能改善を主体とした治療が進められている。特にその中で、ＨＣＶの排除及び肝機能改善作用を併せ持つインターフェロンによるＣ型慢性肝炎治療は、ウイルスを排除する唯一の治療法であるが、ＨＣＶの完全排除効率は４０％程度と低く、近年ではリバビリンによるインターフェロン併用療法が第一選択とされているものの、依然として有効性は低い。特に、ジェノタイプ１ｂ型感染症例や高ウイルス症例に対するリバビリン併用を含む現行のインターフェロン療法による治療効果は低い。インターフェロンに対して抵抗性を示す患者に対しては、肝細胞発癌予防を目的としたグリチルリチン、ウルソデオキシコール酸等による肝機能改善が行われるが、投与終了後は速やかに肝機能が悪化する。
【００１０】
インターフェロン投与の場合、ウイルスを排除できなくても、肝機能が改善されることが知られている。Ｃ型慢性肝炎に対しては、特にインターフェロン治療が普及しているが、ジェノタイプ１ｂ型のＨＣＶ感染者で血中のウイルス量が高い場合は、ウイルスが消失し、肝機能改善が認められる完全著効にはなり難いと考えられている。しかしながら、この様な患者群の中でもウイルス消失は認められないが、明らかに肝機能改善が認められる不完全著効例；ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ（または生物学的応答例；ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）なる患者層が存在する。これらの患者層は、ウイルスを保持したままであっても肝細胞発癌のリスクが低下することが知られており、その発生の臨床的意義は大きい。また、グリチルリチンやウルソデオキシコール酸等の肝機能改善薬と異なり、投与終了後も肝機能改善が持続する特徴を備えている点で、インターフェロン投与の臨床上の有用性は高い。
【００１１】
９ＭＵ以上のインターフェロンを用いた強化療法においても、２０〜３０％程度の症例が投与期間中にウイルスが消失しないことが知られている。これらの症例は、インターフェロンに対する応答性が低く、再投与をもってしても容易に完全著効に導くことは困難であると考えられる。
【００１２】
Ｃ型慢性肝炎ウイルス感染では、感染後の高頻度慢性感染化を経て、慢性肝炎、肝硬変へと移行し、最終的に肝細胞発癌に至る重篤なウイルス性慢性疾患である。インターフェロン療法は高額医療ではあるが、発癌リスクの高い症例でも持続的に肝機能を改善させることが可能と考えられる。肝機能障害の持続が、発癌リスクを高めることが考えられているが、ＡＬＴ値は変動の大きい肝障害マーカーであり、その患者がどの程度の発癌リスクを有しているかについて明確に判断することは困難である。
【００１３】
また、Ｂ型慢性肝炎では、慢性化の段階でも発癌が高頻度に認められる点で、Ｃ型慢性肝炎とは異なるが、Ｃ型慢性肝炎と同様に発癌リスクの明確化は困難である。
【００１４】
この様に、慢性肝炎から肝細胞癌発症に至るＢ型及びＣ型慢性肝炎に対して真に有効なインターフェロンを主剤とした発癌抑制法は、これらウイルスが世界中に広く分布し、キャリア率が人口の１％程度またはそれ以上存在するにもかかわらず確立されていないのが現状である。
【００１５】
また、癌治療において、Ｓｔａｇｅ　Ｉ−ＩＩＩ期の場合は主に手術による癌の摘出がおこなわれるが、術後の再発が頻繁に生じることが大きな問題となっている。手術の場合、その侵襲性の強さから、術後直後に強力な化学療法剤によるアジュバント療法は行いにくく、その結果、転移癌や局所に遺残した癌による再発が生じる。アジュバント療法により再発抑制が奏功する場合もあるが、まだまだ完全とは言えないのが実状である。
【００１６】
【特許文献１】
西川　学　等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，１８４３−１８４５，２００１
【非特許文献１】
Ｓ．Ｎｏｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ，　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８，４８１−４８７，２００２
【非特許文献２】
Ｓ．Ｋｕｂｏ　ｅｔ　ａｌ，　Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１３４，９６３−９６７，２００１
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前記の従来の課題を鑑みてなされたものであり、本発明の第１の目的は、ミトコンドリアＤＮＡの変異抑制又は変異軽減剤としてインターフェロンを提供することである。特にガン細胞のＤ−ｌｏｏｐ領域に着目したミトコンドリアＤＮＡの塩基配列の決定により高頻度の変異が認められた症例に対し、インターフェロンを投与することにより、特に高発癌リスクのＣ型慢性肝炎患者及びＢ型慢性肝炎患者の肝細胞発癌リスク、または癌摘出手術後の再発リスクを軽減し、あるいは血液診断可能な白血病や悪性リンパ腫に対する治療方法を提供することにある。本発明の第２の目的は、ミトコンドリアＤＮＡの塩基配列の決定による発癌リスクの高い患者の選別及び診断方法を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
炎症が進んだ細胞においては、ＮＯラジカルとスーパーオキシドラジカル、ヒドロキシラジカルが産生されると想定されており、このヒドロキシラジカルは遺伝子変異を引き起こす強いＤＮＡ傷害分子であることが示されている。
ヒドロキシラジカルの産生により、ＤＮＡの対合にミスペアを起こす８−ヒドロキシグアニンや２−ヒドロキシアデニン等の修飾塩基が蓄積し、染色体ＤＮＡに変異をもたらすことによって細胞が癌化の過程を辿るようになると考えられている（Ｋａｍｉｙａ　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９５；　２７０：　１９４４６−１９４５０、Ｉｎｏｕｅ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９８；　２７３：　１１０６９−１１０７４）。
【００１９】
また、種々の癌組織において、ミトコンドリアの高変異が認められる報告があるが、その変異の原因が上記のようにヒドロキシラジカルが多量に発生していることであると明確に言えるものではないが、慢性肝炎の場合には癌が発生した局所ではヒドロキシラジカルが多量に発生していることが示されている（Ｐｏｌｙａｋ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．　１９９８；　２０：　２９１−２９３、　Ｂｕｒｇａｒｔ　ＬＪ．　ｅｔ　ａｌ．　Ａｍ．　Ｊ．　Ｐａｔｈｏｌ．　１９９５；　１４７：　１１０５−１１１１、Ｊｅｒｏｎｉｍｏ　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　２００１；　２０：　５１９５−５１９８、Ｙｅｈ　ＪＪ．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　２０００；　１９：　２０６０−２０６６）。さらに、慢性肝炎に由来する肝細胞癌でもミトコンドリアＤＮＡの変異頻度が高く、非癌部でも既に多数の変異が蓄積していることが報告されているが（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２００１；　６１　：１８４３−１８４５）、他の癌と同様に炎症とそれに基づくヒドロキシラジカルとの相関性は不明であった。
【００２０】
そこで、以上の関連を明確にすべく鋭意検討を行ったところ、発明者等はＮＯラジカルの発生がミトコンドリアＤＮＡの変異の発生に直接関与するとの知見を得た。さらに、インターフェロン投与によってミトコンドリアＤＮＡの変異数が減少するとの知見を得た。
【００２１】
さらにこのことから、肝細胞発癌の発癌リスクの高い、即ちミトコンドリアＤＮＡの変異数が多い症例に対する肝発癌予防として、及び癌切除術後の癌部ミトコンドリアＤＮＡの変異数が多い症例に対する再発予防として、またミトコンドリアＤＮＡの変異数が多い白血病や悪性リンパ腫に対する制癌剤としてインターフェロン投与が有効との知見を得て、本発明を完成するに至った。
【００２２】
即ち、本発明の要旨は、
（１）インターフェロンを有効成分とする、ミトコンドリアＤＮＡの変異抑制又は変異軽減剤、
（２）ミトコンドリアＤＮＡの変異が、慢性炎症によって加速されるものである、上記（１）記載の変異抑制又は変異軽減剤、
（３）ミトコンドリアＤＮＡの変異が、ウイルス傷害性ガン化細胞、白血病細胞あるいは悪性リンパ腫のものである、上記（１）記載の変異抑制又は変異軽減剤、
（４）慢性炎症が、Ｃ型あるいはＢ型慢性肝炎、潰瘍性大腸炎である、上記（１）記載の変異抑制又は変異軽減剤、
（５）ウイルス傷害性ガン化細胞がＣ型あるいはＢ型慢性肝炎ウイルスに感染しガン化した肝細胞である、上記（１）記載の変異抑制又は変異軽減剤、
（６）インターフェロンがインターフェロン−αあるいはβである、上記（１）記載の変異抑制又は変異軽減剤、
（７）ミトコンドリアＤＮＡの変異箇所がＤ−ｌｏｏｐ領域である、上記（１）記載の変異抑制又は変異軽減剤、
（８）インターフェロンを有効成分とする、ミトコンドリアＤＮＡの変異によって加速される発癌の発癌抑制剤又は発癌予防剤、
（９）ミトコンドリアＤＮＡの変異によって加速される発癌が、慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、白血病細胞あるいは悪性リンパ腫による発癌である、上記（８）記載の発癌抑制剤又は発癌予防剤、
（１０）インターフェロンがインターフェロン−αあるいはβである、上記（８）又は（９）記載の発癌抑制剤又は発癌予防剤、
（１１）インターフェロンを発癌抑制剤又は発癌予防剤として投与するために、ミトコンドリアＤＮＡの変異が正常細胞と比較して少なくとも１２個以上の患者を選択することからなる、投与適格患者の選択方法、
（１２）ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の変異が正常細胞と比較して少なくとも３個以上である患者を選択することからなる、上記（１１）記載の投与適格患者の選択方法、
（１３）上記（１１）又は（１２）記載の方法で選択された患者に対し、発癌抑制剤又は発癌予防剤として、インターフェロンを有効成分として投与することを特徴とする、制ガン剤、ガン再発予防剤又は慢性肝炎治療剤、
（１４）患者がＣ型あるいはＢ型慢性肝炎ウイルス感染に由来する慢性肝炎、肝硬変、肝臓ガンの患者であり、インターフェロンがインターフェロン−αあるいはβである、上記（１３）記載の慢性肝炎治療剤またはガン再発予防剤、
（１５）ガン摘出手術を受けた患者に、ミトコンドリアＤＮＡの変異抑制又は変異軽減剤として、インターフェロンを有効成分として投与することを特徴とする、ガン再発予防剤、に関する。
【００２３】
更に、本発明の要旨は、別の態様として、以下のように示すことができる。
（１７）インターフェロンを有効成分とする、ミトコンドリアＤＮＡが高頻度に変異しているガン細胞のアポトーシス促進剤、
（１８）ミトコンドリアＤＮＡが高頻度に変異しているガン細胞がウイルス傷害性ガン化細胞、白血病細胞あるいは悪性リンパ腫である、上記（１７）記載のアポトーシス促進剤、
（１９）ウイルス傷害性ガン化細胞がＣ型あるいはＢ型慢性肝炎ウイルスに感染しガン化した肝細胞である、上記（１７）あるいは（１８）記載のアポトーシス促進剤、
（２０）インターフェロンがインターフェロン−αあるいはβである、上記（１７）から（１９）のいずれかに記載のアポトーシス促進剤、
（２１）ミトコンドリアＤＮＡが高頻度に変異している箇所がＤ−ｌｏｏｐ領域である、上記（１７）〜（２０）のいずれかに記載のアポトーシス促進剤、
（２２）ミトコンドリアＤＮＡの変異が、正常細胞と比較して少なくとも１２個以上である、上記（１７）〜（２０）のいずれかに記載のアポトーシス促進剤、
（２３）ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の変異が正常細胞と比較して少なくとも３個以上である、上記（２１）記載のアポトーシス促進剤、
（２４）上記（１７）記載のアポトーシス促進剤であって、インターフェロンαを有効成分とする、ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の変異が正常細胞と比較して少なくとも３個以上である肝臓ガン細胞のアポトーシス促進剤。
【００２４】
また、本発明の要旨は、別の態様として、以下のように示すことができる。
（２５）ミトコンドリアＤＮＡの塩基配列の決定により高頻度の変異が認められた症例に対し、投与されるインターフェロンを有効成分とする慢性肝炎治療剤及び癌再発予防剤、
（２６）慢性肝炎がＣ型及びＢ型慢性肝炎ウイルス感染に由来するウイルス性慢性肝炎であり、癌再発が癌摘出手術後の再発であり、インターフェロンがインターフェロンαまたはβである、上記（２５）記載の慢性肝炎治療剤及び癌再発予防剤。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明の第一の態様は、インターフェロンを有効成分とする、ミトコンドリアＤＮＡの変異抑制又は変異軽減剤に関するものである。
【００２６】
本発明の「インターフェロン」とは、インターフェロン−αあるいはβのことであり、インターフェロン−αとして、例えばスミフェロンのような天然型インターフェロンα、例えばロフェロン、キャンフェロンあるいはコンセンサスインターフェロンを含む組換え型インターフェロンαを挙げることができる。インターフェロン−βとして、天然型インターフェロンβ、組換え型インターフェロンβを挙げることができる。好ましいものとしてはインターフェロン−αを挙げることができる。
【００２７】
さらに本発明のインターフェロンにはインターフェロン−αあるいはβに関する各種のインターフェロン製剤が含まれ、例えば、ペグ化インターフェロン製剤やミニペレットあるいはナノスフェアー等による持続性あるいは徐放性インターフェロン製剤や埋め込み型のインプラント製剤、経口製剤経肺製剤も含まれる。
【００２８】
本発明のインターフェロンの投与方法は、皮下注、筋注、静脈注、局部注、経口投与、経肺投与等の何れでも良く、各インターフェロン製剤の特性と疾患あるいは患者の状況に応じて使い分けることができる。
【００２９】
本発明のインターフェロンの投与量は、一般のインターフェロンα製剤やインターフェロンβ製剤のごとく、１〜９ＭＵの投与で良いが、副作用及びミトコンドリアＤＮＡの変異率に応じて、適宜増減することができる。
【００３０】
本発明の「ミトコンドリアＤＮＡの変異」とは、慢性炎症部分、ウイルス傷害性ガン化細胞、白血病細胞あるいは悪性リンパ腫におけるミトコンドリアＤＮＡと正常組織細胞のミトコンドリアＤＮＡを比較して、遺伝子に生じている変異のことである。比較するミトコンドリアＤＮＡとしては、ＤＮＡ全体でもよくその一部でも良い。例えば、細胞からＤＮＡを抽出し、ミトコンドリアＤＮＡに対して特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲにて増幅し、ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法にてＰＣＲ産物の塩基配列を決定する。それぞれガン細胞と正常細胞の塩基配列の決定結果を比較し、遺伝子の変異の数を計算する。ミトコンドリアＤＮＡの一部の塩基配列としては、Ｄ−ｌｏｏｐ領域が好適なものとして挙げられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００３１】
例えば、Ｃ型慢性肝炎患者の場合、肝組織からＤＮＡを抽出し、ミトコンドリアＤＮＡの全配列を解析したところ、炎症部分の前癌状態の細胞と正常細胞の塩基配列の対比により、２３個の変異が確認された。インターフェロン投与直後には、塩基配列の変異は１１個に低下したことが認められた。ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列の変異は４個であり、インターフェロン投与直後には、塩基配列の変異は２個に低下した。いずれも、インターフェロン投与前後を比較すると、塩基変異の箇所は共通しており、新たな変異の蓄積は認められなかった。
【００３２】
本発明の「慢性炎症」とは、例えばＣ型あるいはＢ型のウイルス性慢性肝炎が挙げられ、さらには肝硬変に進行したものも含むものである。また、それ以外にも、潰瘍性大腸炎等のウイルス性感染症に起因するような慢性炎症を挙げることができる。
【００３３】
本発明の「ウイルス傷害性ガン化細胞」とは、ウイルスに感染し、慢性の炎症が悪化した前癌状態を含む癌化した細胞のことである。例えば、Ｃ型あるいはＢ型肝炎ウイルスに感染し、傷害を受けた肝細胞または傷害を受けてガン化した肝細胞を挙げることができる。
【００３４】
更に、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、直腸癌、膵癌、肝細胞癌、腎癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、骨肉腫、脳腫瘍、神経芽細胞腫等の固形腫瘍を形成するガン細胞の中で、ウイルスに起因するガン細胞があげられる。また、固形腫瘍を形成しないガンとして、白血病や悪性リンパ腫を挙げることができ、その中でも、ウイルスに起因する白血病や悪性リンパ腫であればいずれでもよく、急性及び慢性骨髄性白血病、急性及び慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病、骨髄異形性症候群等のウイルス起因性のものがあげられる。また、悪性リンパ腫の中で、高分化型リンパ腫や低分化型リンパ腫の内のウイルス起因性のものがあげられる。
【００３５】
本発明の第二の態様としては、インターフェロンを用いて発癌抑制剤あるいは発癌予防剤として投与することが適切な患者の選択方法であって、ミトコンドリアＤＮＡの変異が高頻度で生じていることを評価する選択方法に関するものである。
【００３６】
本発明の「選択方法」とは、バイオプシー等の手段により対象患部の細胞と患部以外の正常細胞を入手し、ミトコンドリアＤＮＡに対して特異的なプライマーを用いてＰＣＲを使用して増殖し、ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ法にてＰＣＲ産物の塩基配列を決定する。そして、両者の塩基配列を比較し、変異数の多い患者を選択する方法である。また、場合によっては、正常細胞のバイオプシーを行うことなく、一般的な標準のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列と対比することができる。
【００３７】
変異数の多い患者としては、ミトコンドリアＤＮＡの変異が正常細胞と比較して少なくとも１２個以上の患者を選択することが望ましい。また、ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の変異においては正常細胞と比較して少なくとも３個以上である患者を選択することが望ましい。
【００３８】
本発明の第三の態様としては、本発明のミトコンドリアＤＮＡの変異抑制剤あるいは変異軽減剤を用いることを特徴とする制ガン剤あるいはガン再発予防剤に関するものである。
【００３９】
本発明の「制ガン剤あるいはガン再発予防剤」とは、ミトコンドリアＤＮＡ変異の蓄積の高い担ガン患者において、癌切除前後に対してインターフェロンを投与し、ガン細胞の抑制を図ると共に、ガンの再発予防効果を期待する、インターフェロン製剤のことである。例えば慢性肝炎あるいは肝臓ガン等の患者において、各々の肝組織あるいは切除癌のミトコンドリアＤＮＡ変異の蓄積を遺伝子解析し、肝細胞発癌抑制あるいは再発予防効果を高めるためにインターフェロンが投与されることである。
【００４０】
本発明の第四の態様は、インターフェロンを有効成分とする、ガン細胞のアポトーシス促進剤に関するものである。
【００４１】
本発明の「ガン細胞」とは、慢性の炎症が悪化した前癌状態を含む癌化した細胞のことである。ガン細胞の種類としては、肝細胞癌、腎癌等の固形腫瘍を形成するものがあげられる。また、固形腫瘍を形成しないものとして、白血病や悪性リンパ腫を挙げることができる。
【００４２】
本発明の「ミトコンドリアＤＮＡが高頻度に変異している」とは、ガン細胞のミトコンドリアＤＮＡと正常組織細胞のミトコンドリアＤＮＡを比較して、遺伝子の変異が高頻度に生じていることを言う。
【００４３】
本発明の「高頻度の変異」とは、ミトコンドリアＤＮＡの全配列においては、非癌部分の正常細胞と対比して、また、インターフェロン投与直後の塩基配列の変異を考慮すれば、本発明のアポトーシス促進剤に適切な塩基配列の変異は、少なくとも１２個の変異を有するものであると言える。一方、ミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列の変異は、インターフェロン投与直後に２個変異したものが存在していることから見て、少なくとも３個以上の変異を持つものが本発明のアポトーシス促進剤に適切な塩基配列の変異であると考えられる。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００４５】
実施例１
インターフェロン投与前後におけるミトコンドリアＤＮＡ変異の変化
Ｃ型慢性肝炎患者２６例に対してインターフェロン治療を行うと共に、投与前後に経皮的肝生検を実施した。常法に従い、肝組織よりＤＮＡを抽出し、ミトコンドリアＤＮＡに対する特異的なプライマー（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，１８４３−１８４５，２００１）を用いてＰＣＲにて増幅し、ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ法にてＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
インターフェロン治療で著効を示した１症例に関して、投与前と治療直後、３年後におけるミトコンドリアＤＮＡの全配列を決定した。その他の２５症例については投与前と治療直後でのミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列を解析した。
【００４６】
インターフェロンの治療結果とミトコンドリアＤＮＡの変異数の変化は図１に示される。即ち、インターフェロンの投与により、肝組織における炎症の活動度（ＨＡＩ　ｓｃｏｒｅのｇｒａｄｉｎｇ）が低下する（図１の縦軸参照）と共に、ミトコンドリアの変異数が減少していた（図１の横軸参照）。このようにインターフェロン投与により、ミトコンドリアの塩基変異数が減少することが見出された。また、それと共にこの変異数の減少が肝組織の炎症の活動度の低下と相関することが示された。
【００４７】
ＣＲの１例について、ミトコンドリアＤＮＡの全配列を解析したところ、図２に示されるようにインターフェロン投与の前では、ミトコンドリアに２６箇所存在した変異がインターフェロン治療後には１４箇所に減少した。
【００４８】
３年後に解析したところ、変異数が若干増加していた。本症例においてはＨＣＶが消失した著効例であるが、インターフェロン治療終了後も、３合以上の飲酒の継続による、ＡＴＬ異常が継続している症例であるためと考えられる。
【００４９】
慢性肝炎等のように、炎症の継続によりミトコンドリアＤＮＡに塩基変異が蓄積すると推測されている。本実施例の知見により、インターフェロンの投与により塩基変異数が減少すると共に組織学的な炎症の活動度の低下と相関することが判明した。そして、インターフェロンの投与により比較的短期間に変化することが明らかとなった。
【００５０】
参考例１
ＮＯによるミトコンドリアＤＮＡ変異の蓄積
発癌過程とミトコンドリアＤＮＡの変異の関与は非常に興味深く、炎症局所ではＮＯラジカルをはじめとする大量の活性酸素種が産生されている。ミトコンドリアＤＮＡは、核ＤＮＡと異なりヒストンをもたず修復機構も不完全であるため、この様な場では傷害を受けやすいと考えられる。そこで、活性酸素種によるミトコンドリアＤＮＡの変化を解析するため、培養細胞にＮＯラジカルを作用させて培養細胞のミトコンドリアＤＮＡに塩基配列が生じるかを検討した。
【００５１】
ＤＭＥＭにて肝癌細胞ＨｅｐＧ２を培養し、ＮＯラジカル供与体であるＮＯＣ１８を１ｍＭを添加し、７２時間培養を行い、培養後細胞を回収した。ＮＯラジカル供与体前後での細胞からＤＮＡを抽出し、実施例１と同様にして、ミトコンドリアのＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列を決定した。
【００５２】
その結果、図３に示されるように、ＮＯ１８の投与前には４箇所であったミトコンドリアＤＮＡの変異に対して、新たな変異が４箇所加わり、計８箇所の変異となった。また、図４で示されるように、変異個所は全てシトシン（Ｃ）であり、Ｃ→ＴあるいはＣ→Ｇの変異であった。
【００５３】
本参考例に示されるように、ＮＯラジカルがミトコンドリア遺伝子変異を引き起こすことが判明した。炎症局所では、炎症性細胞により大量のＮＯラジカルが産生されているため、慢性肝炎では肝組織で同様の反応が起こっていると考えられる。傷害されたミトコンドリアＤＮＡから合成される電子伝達系タンパク質は、その機能が不完全であるため、さらに電子を漏出しやすくなり、前述のような反応を経てより強くＤＮＡを傷つけることになる。以上のように、ミトコンドリア遺伝子が傷害されると、そのミトコンドリア自身が活性酸素種の発生源となってしまうため、細胞内の酸化ストレスが増強して核ＤＮＡをも傷害してしまうものと考えられる。炎症によるミトコンドリアＤＮＡの変異により、細胞内酸化ストレスを増強してＤＮＡ傷害をさらに増悪することが判明した。
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、インターフェロンを有効成分として含有するミトコンドリアＤＮＡの塩基配列変異の抑制剤製剤あるいは変異軽減剤が提供される。本発明のインターフェロン製剤の投与により、ミトコンドリアＤＮＡの変異に起因する発ガンを抑制することができ、ガン切除後の患者に本発明製剤を投与することにより、ガンの再発予防として使用できることが示された。
さらに本発明では、肝炎または肝硬変の患者における、ミトコンドリアＤＮＡの高変異な患者を選別する方法を提供し、これら患者にインターフェロン治療を行うことにより発ガンを予防し、ミトコンドリアの変異軽減が促されることを示した。
このように、本発明のインターフェロン製剤は、慢性肝炎患者の治療に非常に有益であるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】インターフェロン投与前後の組織学的活動性の変化とミトコンドリアＤＮＡの変異数（Ｄ−ｌｏｏｐ領域）の変化の関係。
【図２】インターフェロン投与によるミトコンドリアＤＮＡ変異の変化。
【図３】ＮＯＣ１８添加培養によるＨｅｐＧ２のミトコンドリアＤＮＡの変異の蓄積。
【図４】一酸化窒素によるミトコンドリアＤＮＡ塩基の変化。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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