(57)【要約】【課題】３０〜５５℃の適度な高温条件下で効率的に酸化反応を促進する酵素をもつ細菌を分離し、これよりＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素を分離し、この酵素をコードする遺伝子を単離する。【解決手段】高温脱硫細菌バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株又は高温脱硫細菌マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株からＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する酵素をコードする遺伝子。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項３】
請求項２記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
【請求項５】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
【請求項６】
請求項５記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項８】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質。
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
【請求項９】
インジゴの発色を利用することを特徴とするＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質又は細胞内においてＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を増強するタンパク質をコードする遺伝子の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を利用するチオフェン系化合物、すなわちベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン（以下「ＤＢＴ」という）およびこれらの置換体、又はそれらの誘導体を分解する機能を有する酵素と共役して、ＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有する酵素およびそれをコードする遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−３６８５９号公報
【特許文献２】特開２０００−２４５４７８号公報
【特許文献３】特開２０００−１３９４５０号公報
【特許文献４】特開２００１−２３１５４６号公報
【特許文献５】特開平１１−３４１９８７号公報
【特許文献６】特開２００２−２５３２４７号公報
【特許文献７】米国特許第６１３３０１６号公報
【特許文献８】米国特許第５８０４４３３号公報
【特許文献９】米国特許第５８１１２８５号公報
【特許文献１０】特開２０００−２２４９９１号公報
【非特許文献１】Ｈｏｕａｌｌａ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｃａｔａｌｔ．，  ６１，  ５２３−５２７（１９８０）
【非特許文献２】Ｋａｇｅ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｄ．  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，  ３１，  １５７７−１５８０（１９９２）
【非特許文献３】Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  ７３，  ３９−４５（１９９４）
【非特許文献４】Ｌｅｅ，  Ｍ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ，．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  １５６４１４ｄ  ｖｏｌ．  ８５  （１９７６）
【非特許文献５】Ｉｓｂｉｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏａｌ，  ｉｎ  Ｃｏａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｒ．  ９，  ｐ．  ６２７（１９８５）
【非特許文献６】Ｋｉｌｂａｎｅ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，  Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，  ３，  ６９−７０（１９９０）
【非特許文献７】Ｄｅｎｏｍｅ，  Ｓ．，  Ｏｌｄｆｌｅｌｄ．，  Ｃ．，  Ｎａｓｈ，  Ｌ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，  Ｋ．Ｄ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７６：６７０７−６７１６，  １９９４
【非特許文献８】Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｋｏｖａｃｅｖｉｃｈ，  Ｂ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｒａｍｂｏｓｅｋ，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６１：４６８−４７５，  １９９５
【非特許文献９】Ｇｒａｙ，  Ｋ．Ａ．，  Ｐｏｇｒｅｂｉｎｓｈｙ，  Ｏ．Ｓ．，  Ｍｒａｃｈｋｏ，  Ｇ．Ｔ．，  Ｘｉ，  Ｌ．  Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，  Ｄ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｑｕｉｒｅｓ，  Ｃ．Ｈ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：１７０５−１７０９，  １９９６
【非特許文献１０】Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，  Ｃ．，  Ｐｏｇｒｅｂｉｎｓｋｙ，  Ｏ．，  Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，  Ｊ．，  Ｏｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｕｌｐａ，  Ｃ．Ｆ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １４３：２９６１−２９７３，  １９９７
【非特許文献１１】Ｘｉ，  Ｌ．  Ｓｑｕｉｒｅｓ，  Ｃ．Ｈ．，  Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，  Ｄ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｃｈｉｄｓ，  Ｊ．Ｄ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２３０：７３−７６，  １９９７
【非特許文献１２】Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０  ６４８７−６５００，  １９８２
【非特許文献１３】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．
【非特許文献１４】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  １９８９．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．
【０００４】
石油のような炭化水素燃料から硫黄を除去する方法としては、現在水素化脱硫法が主流である。水素化脱硫は、石油留分中の硫黄化合物を金属触媒等の存在下で水素と反応させ、硫黄を硫化水素として除去する極めて完成度の高い脱硫プロセスである。
【０００５】
しかし、金属触媒は、基質特異性が低いため多様な硫黄化合物を分解し、化石燃料全体の硫黄含量を低下させる目的には適しているが、複素環式有機硫黄化合物などの特定の硫黄化合物に対してはその脱硫効果が不十分となる。その原因の一つは、複素環式有機硫黄化合物中の硫黄原子の周囲に存在する置換基による立体障害であり（Ｈｏｕａｌｌａ，Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｃａｔａｌｔ．，  ６１，  ５２３−５２７（１９８０））、実際、水素化脱硫後の軽油中にはベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン類の種々のアルキル化誘導体が著量残存することが知られている（Ｋａｇｅ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｄ．  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，  ３１，  １５７７−１５８０（１９９２））。そして、水素化脱硫により、これらの複素環硫黄化合物を完全に脱硫しようとすると、より高い反応温度や圧力、水素添加量の増大が必要となり、多くの設備投資とコストが必要となる。
【０００６】
一方、微生物による酵素反応を利用して比較的穏和な条件下で脱硫を行う方法としてバイオ脱硫法がある（Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，  ７３，  ３９−４５（１９９４））。バイオ脱硫法では、酵素の高い基質特異性により、水素化脱硫では脱硫できなかった複素環有機硫黄化合物中の硫黄分も比較的穏和な条件で除去することが可能である。
【０００７】
バイオ脱硫としては、まずＣ−Ｃ結合攻撃型の細菌による脱硫反応が報告されたが（Ｌｅｅ，  Ｍ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ，．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  １５６４１４ｄ  ｖｏｌ．  ８５  （１９７６））、これらは原油の脱硫においては、１）化石燃料中に多く存在する２位および３位が置換されたジベンゾチオフェン類を分解できない、２）炭素骨格破壊経路が燃料のエネルギー含量を低下させる、３）炭素骨格破壊経路の主要産物が３−ヒドロキシ−２−ホルミルベンゾチオフェンのため十分な脱硫ができない、といった問題点があった。
【０００８】
次いで、硫黄化合物中のＣ−Ｓ結合を特異的に切断して、硫黄を硫酸塩の形で遊離し脱硫する細菌が報告された。Ｃ−Ｓ結合切断型の反応はエネルギーロスにつながるＣ−Ｃ結合の切断を行わないため、硫黄原子のみを硫黄化合物から除去でき、脱硫反応としては理想的である。例えば、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＣＢ１、アシネトバクター・エスピー（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＣＢ２がチオフェンの硫黄を硫酸塩に変換すること（Ｉｓｂｉｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏａｌ，  ｉｎ  Ｃｏａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｒ．  ９，  ｐ．  ６２７（１９８５））や、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ５３９６８がジベンゾチオフェンをヒドロキシビフェニルと硫酸塩に変換させること（Ｋｉｌｂａｎｅ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，  Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，  ３，  ６９−７０（１９９０））などの報告がある。
【０００９】
一方、Ｃ−Ｓ結合切断型高温菌としては、パエニバチルス・エスピー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ａ１１−２（特開平１０−３６８５９号公報）、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ（特開２０００−１３９４５０号公報）およびマイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１（特開２００１−２３１５４６号公報）が報告されている。これらは、Ｃ−Ｓ結合を特異的に切断するが、Ｃ−Ｃ結合は切断しないでそのまま残すタイプの有機硫黄化合物の分解反応で、上述したように、実際の石油の脱硫方法として望ましい。すなわち、高温でＤＢＴおよびそのアルキル置換体、又はそれらの誘導体分子中のＣ−Ｓ結合を切断する活性を示し、水溶性の物質の形で、脱硫産物を生じる微生物を利用するのがバイオ脱硫プロセスとして最も望ましい。
【００１０】
この菌株の有する高温脱硫活性に関与する遺伝子を単離すれば、組換えＤＮＡ技術のような遺伝子操作技術を利用して、他の生物にその遺伝子を導入し発現させることにより、広範囲の生物に高温脱硫能を賦与することができることになる。
【００１１】
Ｃ−Ｓ結合切断型の脱硫反応を起こすことが知らされている細菌で、そのＤＢＴ分解反応に関与する酵素活性をコードする遺伝子が同定され、その塩基配列が決定されているのは、本発明者らの知る限りでは、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＩＧＴＳ８のｄｓｚ遺伝子（Ｄｅｎｏｍｅ，  Ｓ．，  Ｏｌｄｆｌｅｌｄ．，  Ｃ．，  Ｎａｓｈ，  Ｌ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，  Ｋ．Ｄ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７６：６７０７−６７１６，  １９９４；  Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｋｏｖａｃｅｖｉｃｈ，  Ｂ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｒａｍｂｏｓｅｋ，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６１：４６８−４７５，  １９９５）、パエニバチルス・エスピー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ａ１１−２のｔｄｓ遺伝子（特開平１１−３４１９８７号公報）、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂのｂｄｓ遺伝子（特開２００２−２５３２４７号公報）およびスフィンゴモナス・エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＡＤ１０９のｄｓｚ遺伝子（米国特許第６１３３０１６号公報）である。ＩＧＴＳ８によるＤＢＴ脱硫反応は、ＤＢＴからＤＢＴＯを経てＤＢＴＯ２への変換を触媒するＤｓｚＣ、ＤＢＴＯ２から２−（２‘−ヒドロキシフェニル）ベンゼンスルフィン酸への変換を触媒するＤｓｚＡおよび２−（２’−ヒドロキシフェニル）ベンゼンスルフィン酸から２−ＨＢＰへの変換を触媒するＤｓｚＢの３つの酵素により触媒される（Ｄｅｎｏｍｅ，  Ｓ．，  Ｏｌｄｆｉｅｌｄ．，  Ｃ．，  Ｎａｓｈ，  Ｌ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．Ｄ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：６７０７−６７１６，  １９９４；  Ｇｒａｙ，  Ｋ．Ａ．，  Ｐｏｇｒｅｂｉｎｓｈｙ，  Ｏ．Ｓ．，  Ｍｒａｃｈｋｏ，  Ｇ．Ｔ．，  Ｘｉ，  Ｌ．  Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，  Ｄ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｑｕｉｒｅｓ，  Ｃ．Ｈ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：１７０５−１７０９，  １９９６；  Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，  Ｃ．，  Ｐｏｇｒｅｂｉｎｓｋｙ，  Ｏ．，  Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，  Ｊ．，  Ｏｌｓｏｎ，  Ｅ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｕｌｐａ，  Ｃ．Ｆ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １４３：２９６１−２９７３，  １９９７）。それぞれ対応する遺伝子はｄｓｚＣ、ｄｓｚＡ、ｄｓｚＢと呼ばれている。
【００１２】
また、Ａ１１−２においても、同様の経路でＴｄｓＣ、ＴｄｓＡおよびＴｄｓＢによりＤＢＴの脱硫が行われ、それぞれに対応する遺伝子はｔｄｓＣ、ｔｄｓＡおよびｔｄｓＢと呼ばれている。さらに、ＷＵ−Ｓ２Ｂにおいても、同様の経路でＢｄｓＣ、ＢｄｓＡおよびＢｄｓＢによりＤＢＴの脱硫が行われ、それぞれに対応する遺伝子はｂｄｓＣ、ｂｄｓＡおよびｂｄｓＢと呼ばれている。
【００１３】
ＤｓｚＣとＤｓｚＡはモノオキシゲナーゼで、両者ともその酸素添加反応にはＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素活性の共存を必要とすることが知られている（Ｇｒａｙ，  Ｋ．Ａ．，  Ｐｏｇｒｅｂｉｎｓｋｙ，  Ｏ．Ｓ．，  Ｍｒａｃｈｋｏ，  Ｇ．Ｔ．，  Ｘｉ，  Ｌ．  Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，  Ｄ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｑｕｉｒｅｓ，  Ｃ．Ｈ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：１７０５−１７０９，  １９９６；  Ｘｉ，  Ｌ．  Ｓｑｕｉｒｅｓ，  Ｃ．Ｈ．，  Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，  Ｄ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｃｈｉｄｓ，  Ｊ．Ｄ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２３０：７３−７６，  １９９７）。このＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素活性を有する酵素はＤｓｚＤと呼ばれ、その遺伝子配列がＧｒａｙ，  Ｋ．Ａ．らにより報告されている（米国特許第５８０４４３３号公報又は米国特許第５８１１２８５号公報）。
【００１４】
同様に、ＴｄｓＣとＴｄｓＡもモノオキシゲナーゼで、両者ともその酸素添加反応にはＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素活性の共存を必要とすることが知られており、このＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素活性を有する酵素はＴｄｓＤと呼ばれ、その遺伝子配列が石井らにより報告されている（特開２０００−２２４９９１号公報）。
【００１５】
また、パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）Ａ−１の酸化還元酵素Ｆｌｖは、ＮＡＤＨのほかにＮＡＤＰＨも補酵素として使用でき、その遺伝子配列が報告されている（特開２０００−２４５４７８号公報）。
【００１６】
さらに、一般的に、目的とする酵素をコードする遺伝子の取得は、１）その酵素の活性発現を指標とした発現スクリーニング、２）酵素のアミノ酸配列情報あるいは既知の類似遺伝子の塩基配列情報を指標としたスクリーニングによって行われる。このため、活性発現を確認する手段あるいはアミノ酸・塩基配列情報がない場合には、目的の酵素をコードする遺伝子を取得できない。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
バイオ脱硫において、例えば、３０〜５５℃という広い反応温度範囲で高い脱硫活性を維持することは、バイオ脱硫プラントの温度設定を簡略化できるので有利となる。
【００１８】
この点、ＩＧＴＳ８のＤｓｚ酵素は脱硫反応温度が３０〜４２℃で高い脱硫活性を示し、５０℃付近においては脱硫活性が大きく減少する。そのため、脱硫反応の温度が高くなった場合には、冷却する必要が生じ、バイオ脱硫プラントの温度を低く維持する必要があり、エネルギーの損失にもなる。一方、Ａ１１−２のＴｄｓ酵素は好熱性であり、脱硫反応温度が５０〜６０℃で高い脱硫活性を示す。しかし、３０℃付近においては脱硫活性が大きく減少する。そのため、脱硫反応の温度が低くなった場合には、加熱する必要が生じ、バイオ脱硫プラントの温度を高く維持する必要があり、エネルギーの損失にもなる。
【００１９】
そこで、本発明は、バイオ脱硫プラントの温度設定を簡略化でき、冷却や加熱によるエネルギーの損失を伴わない３０〜５５℃の適度な高温条件下で効率的に酸化反応を促進するタンパク質である酵素をもつ細菌を分離し、これよりＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素を分離し、この酵素をコードする遺伝子を単離し、その構造、特に塩基配列を特定するものである。
【００２０】
また、これらの遺伝子をそれが単離されたのとは異なる微生物に導入し、脱硫能を賦与することにより、新規な脱硫微生物を創製することである。
【００２１】
さらに、ＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素をコードする遺伝子の効率的な取得方法を確立することである。
【００２２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、高温脱硫細菌バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株又は高温脱硫細菌マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株からＤＢＴ酸化反応を促進する酸化還元酵素をコードする遺伝子の単離に成功し、本発明を完成するに至った。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
本発明の請求項２は、請求項１記載の遺伝子を含むベクターである。
【００２４】
本発明の請求項３は、請求項２記載のベクターを含有する形質転換体である。
【００２５】
本発明の請求項４は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
本発明の請求項５は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
本発明の請求項６は、請求項５記載の遺伝子を含むベクターである。
【００２６】
本発明の請求項７は、請求項６記載のベクターを含有する形質転換体である。
【００２７】
本発明の請求項８は、以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質である。
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
本発明の請求項９は、インジゴの発色を利用することを特徴とするＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質又は細胞内においてＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を増強するタンパク質をコードする遺伝子の取得方法である。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の第１の実施の形態を詳細に説明する。
【００２９】
（１）脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質をコードする遺伝子
請求項１記載の遺伝子は、（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質又は（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質をコードするものである。（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、ＤＢＴＯ２を２−（２’−ヒドロキシフェニル）ベンゼンスルフィン酸に変換する酵素およびＤＢＴをＤＢＴＯを経てＤＢＴＯ２に変換する酵素と共役する。
【００３０】
請求項１記載の遺伝子のうち、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子については、後述する実施例１に記載された方法により得ることができる。また、これらの遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示すように、既に決定されているので、これらの配列を基に適当なプライマーを合成し、たとえば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株から調製されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことによっても得ることができる。なお、このバチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０４１として寄託されている（寄託日：平成１０年１１月４日）。
【００３１】
配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子は、本願の出願時において常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０  ６４８７−６５００，  １９８２）により配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を改変することにより単離することができる。
【００３２】
請求項１記載の遺伝子は、ＤＢＴの分解に関与する酵素をコードするので、３０〜５５℃の適度な高温条件下で石油の脱硫に利用することができる。
【００３３】
（２）脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター
請求項２記載の脱硫微生物であるベクターは、上記（１）の遺伝子を含む。このようなベクターは、請求項１記載の遺伝子を含むＤＮＡ断片を、公知のベクターに挿入することにより作製することができる。
【００３４】
ＤＮＡ断片を挿入するベクターは、形質転換する宿主に応じて決めればよく、宿主として大腸菌を使用するのであれば、以下のようなベクターを使用するのが好ましい。強力なプロモーターとして、例えば、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、λｐＬ、Ｔ７、ｒｒｎＢなどを含むｐＵＲ系、ｐＧＥＸ系、ｐＵＣ系、ｐＥＴ系、ｐＴ７系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＫＫ系、ｐＢＳ系、ｐＢＣ系、ｐＣＡＬ系などのベクターを使用するのが好ましい。
【００３５】
（３）脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有する形質転換体
請求項３記載の形質転換体は、上記（２）のベクターを含有する。形質転換体の宿主とする細胞は、植物細胞や動物細胞などであってもよいが、大腸菌などの微生物が好ましい。代表的な菌株としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．に記載されている、７１／１８、ＢＢ４、ＢＨＢ２６６８、ＢＨＢ２６９０、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＮＮｌ０２（Ｃ６００ｈｆｌＡ）、Ｃ−１ａ、Ｃ６００（ＢＮＮ９３）、ＣＥＳ２００、ＣＥＳ２０１、ＣＪ２３６、ＣＳＨ１８、ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ５α、ＤＰ５０ｓｕｐＦ、ＥＤ８６５４、ＥＤ８７６７、ＨＢ１０１、ＨＭＳ１７４、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０７、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、Ｋ８０２、ＫＫ２１８６、ＬＥ３９２、ＬＧ９０、Ｍ５２１９、ＭＢＭ７０１４．５、ＭＣ１０６１、ＭＭ２９４、ＭＶ１１８４、ＭＶ１１９３、ＭＺ−１、ＮＭ５３１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、Ｑ３５８、Ｑ３５９、Ｒ５９４、ＲＢ７９１、ＲＲ１、ＳＭＲ１０、ＴＡＰ９０、ＴＧ１、ＴＧ２、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＳ１０１、ＸＳ１２７、Ｙ１０８９、Ｙ１０９０ｈｓｄＲ、ＹＫ５３７などが挙げられる。
【００３６】
（４）脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質
請求項４記載の脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質には、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が含まれる。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
上記請求項４記載の酵素であるタンパク質は、脱硫酵素と共役してＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＩＧＴＳ８由来の酵素ＤｓｚＤあるいはパエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）Ａ−１由来のＦｌｖとはほとんど相同性はなく、また、酵素としての作用は同一であるが、以下の点で明確に相違する。ＤｓｚＤあるいはＦｌｖは、３０〜４２℃の温度領域で脱硫活性を示すが、本発明の酵素であるタンパク質は３０〜５５℃の温度領域でより高い脱硫活性を示す。さらに、上記請求項４記載の酵素であるタンパク質は、脱硫酵素と共役してＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するパエニバチルス・エスピー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ａ１１−２由来の酵素ＴｄｓＤとはほとんど相同性はなく、また、酵素としての作用は同一であるが、以下の点で明確に相違する。ＤＢＴおよびＤＢＴＯ２酸化反応において、酸化還元酵素としての比活性（１分間に１ｍｇのタンパク質が酸化するＤＢＴのμモル数）がＴｄｓＤに比べて数倍高いうえ、補酵素としてＮＡＤＨ以外にＮＡＤＰＨも使用できる。
【００３７】
上記請求項４記載の脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質は、上記請求項４記載の脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を利用して製造することができる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列により表される脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質は、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株から常法に従って調製することも可能である。
【００３８】
したがって、本発明の第１の実施の形態の酵素および遺伝子を利用することにより、３０〜５５℃の適度な高温条件下で効率的に酸化反応を促進して、石油等の化石燃料中に含まれるベンゾチオフェンやＤＢＴおよびこれらの置換体、又はそれらの誘導体中のＣ−Ｓ結合を切断することができる。そして、これにより硫黄を遊離させることができるので、石油・石炭等の化石燃料の燃焼により空気中に拡散する硫黄を、化石燃料中から容易に除去することができるようになる。
【００３９】
次に、本発明の第２実施の形態を詳細に説明する。
【００４０】
（１）脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質をコードする遺伝子
請求項５記載の遺伝子は、（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質又は（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質をコードするものである。（ｃ）および（ｄ）のタンパク質は、ＤＢＴＯ２を２−（２‘−ヒドロキシフェニル）ベンゼンスルフィン酸に変換する酵素およびＤＢＴをＤＢＴＯを経てＤＢＴＯ２に変換する酵素と共役する。
【００４１】
請求項５記載の遺伝子のうち、配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子については、本明細書の実施例２に記載された方法により得ることができる。また、これらの遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示すように、既に決定されているので、これらの配列を基に適当なプライマーを合成し、たとえば、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株から調製されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことによっても得ることができる。
【００４２】
配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子は、本願の出願時において常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０  ６４８７−６５００，  １９８２）により配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を改変することにより単離することができる。
【００４３】
請求項５記載の遺伝子は、ＤＢＴの分解に関与する酵素をコードするので、３０〜５５℃の適度な高温条件下で石油の脱硫に利用することができる。
【００４４】
（２）脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター
請求項６記載の脱硫微生物であるベクターは、上記（１）の遺伝子を含む。このようなベクターは、請求項５記載の遺伝子を含むＤＮＡ断片を、公知のベクターに挿入することにより作製することができる。
【００４５】
ＤＮＡ断片を挿入するベクターは、形質転換する宿主に応じて決めればよく、宿主として大腸菌を使用するのであれば、以下のようなベクターを使用するのが好ましい。強力なプロモーターとして、例えば、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、λｐＬ、Ｔ７、ｒｒｎＢなどを含むｐＵＲ系、ｐＧＥＸ系、ｐＵＣ系、ｐＥＴ系、ｐＴ７系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＫＫ系、ｐＢＳ系、ｐＢＣ系、ｐＣＡＬ系などのベクターを使用するのが好ましい。
【００４６】
（３）脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含有する形質転換体
請求項７記載の形質転換体は、上記（２）のベクターを含有する。形質転換体の宿主とする細胞は、植物細胞や動物細胞などであってもよいが、大腸菌などの微生物が好ましい。代表的な菌株としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．に記載されている、７１／１８、ＢＢ４、ＢＨＢ２６６８、ＢＨＢ２６９０、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＮＮｌ０２（Ｃ６００ｈｆｌＡ）、Ｃ−１ａ、Ｃ６００（ＢＮＮ９３）、ＣＥＳ２００、ＣＥＳ２０１、ＣＪ２３６、ＣＳＨ１８、ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ５α、ＤＰ５０ｓｕｐＦ、ＥＤ８６５４、ＥＤ８７６７、ＨＢ１０１、ＨＭＳ１７４、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０７、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、Ｋ８０２、ＫＫ２１８６、ＬＥ３９２、ＬＧ９０、Ｍ５２１９、ＭＢＭ７０１４．５、ＭＣ１０６１、ＭＭ２９４、ＭＶ１１８４、ＭＶ１１９３、ＭＺ−１、ＮＭ５３１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、Ｑ３５８、Ｑ３５９、Ｒ５９４、ＲＢ７９１、ＲＲ１、ＳＭＲ１０、ＴＡＰ９０、ＴＧ１、ＴＧ２、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＳ１０１、ＸＳ１２７、Ｙ１０８９、Ｙ１０９０ｈｓｄＲ、ＹＫ５３７などが挙げられる。
【００４７】
（４）脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質
請求項８記載の脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素には、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質が含まれる。
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
上記請求項８記載の酵素であるタンパク質は、脱硫酵素と共役してＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＩＧＴＳ８株由来の酵素ＤｓｚＤとは３３％の低い相同性を示し、非脱硫細菌パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）Ａ−１由来のＦｌｖおよび高温脱硫細菌パエニバチルス・エスピー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ａ１１−２の由来のＴｄｓＤとは相同性が確認されなかったので、これらとは明確に相違する。
【００４８】
請求項８記載の脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素は、上述の請求項８記載の脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素をコードする遺伝子を利用して製造することができる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列により表される脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素は、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株から常法に従って調製することも可能である。
【００４９】
したがって、本発明の第２の実施の形態の酵素および遺伝子を利用することにより、３０〜５５℃の適度な高温条件下で効率的に酸化反応を促進して、石油等の化石燃料中に含まれるベンゾチオフェンやＤＢＴおよびこれらの置換体、又はそれらの誘導体中のＣ−Ｓ結合を切断することができる。そして、これにより硫黄を遊離させることができるので、石油・石炭等の化石燃料の燃焼により空気中に拡散する硫黄を、化石燃料中から容易に除去することができるようになる。
【００５０】
次に、本発明の第３の発明の形態を詳細に説明する。
【００５１】
インジゴの発色を利用したＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の取得方法は、大腸菌内でインドールを酸化する能力を有するモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子が利用できる。代表的な遺伝子としてはバチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株のｂｄｓ遺伝子（特開２００２−２５３２４７号公報）が挙げられるが、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＩＧＴＳ８のｄｓｚ遺伝子、パエニバチルス・エスピー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ａ１１−２のｔｄｓ遺伝子（特開平１１−３４１９８７号公報）、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株のｂｄｓ遺伝子（特開２００２−２５３２４７号公報）およびスフィンゴモナス・エスピー（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＡＤ１０９のｄｓｚ遺伝子（米国特許第６１３３０１６号公報）などのモノオキシゲナーゼであれば利用可能である。これらの遺伝子にコードされているモノオキシゲナーゼは、図１に示すように、インドールを酸化し、青色色素のインジゴを生産する。このとき、当該モノオキシゲナーゼはＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質との共役が必要である。このため、モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を保有する大腸菌に対してショットガンクローニングを行うことにより、効率的にＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が取得することが可能である。モノオキシゲナーゼの大腸菌内での発現やショットガンクローニングは常法に従って調製することが可能である。
【００５２】
したがって、本発明の第３の実施の形態の遺伝子の取得方法によれば、容易にＮＡＤＨ−ＦＭＮを酸化還元することができる酵素であるタンパク質をコードする遺伝子を取得することができる。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００５４】
実施例中の遺伝子操作に関連した実験は、主にＭａｎｉａｔｉｓらの成書（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  １９８９．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．）に詳述されている方法に従って行った。
【００５５】
（実施例１）
（１）脱硫酵素をコードする遺伝子の発現用プラスミドの作製
請求項１記載の脱硫酵素と共役し脱硫反応に関与する酵素であるタンパク質をコードする遺伝子の発現プラスミドとして、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株からの高温脱硫遺伝子ｂｄｓＡＢＣ（特開２００２−２５３２４７号公報）を利用して作製した。バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株のｂｄｓＡＢＣ遺伝子のｂｄｓＡの５’末端塩基配列およびｂｄｓＣの３’末端配列をもとに以下に示すようなＰＣＲ用プライマーを作製した。
【００５６】
センスプライマー  ５’−  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＧＴＡ  ＡＣＴ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  −３’
アンチセンスプライマー  ５’−  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＧＧＧ  ＴＡＴ−３’
これらのセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株からのＤＮＡの調製は以下のように行った。
【００５７】
表１に示すような組成のＤＢＴを含むＡ培地で４５℃で４８時間培養したバチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株を、新鮮なＤＢＴを含むＡ培地で４５℃で４８時間培養して、菌体を回収した。得られた菌体を１ｍｌのＢ１緩衝液（５０ｍＭのＥＤＴＡ，５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．２ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ，ｐＨ８．０）に懸濁させた。この懸濁液に、１００ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を２０μｌと２０ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液を４５μｌ添加して、３７℃で１０分間反応させた。反応液に０．３５ｍｌのＢ２緩衝液（８００ｍＭのＧｕＨＣｌ，２０％のＴｗｅｅｎ−２０，ｐＨ５．５）を添加、攪拌混合して、５０℃で３０分間反応させ、５秒間ミキサーで攪拌して、菌体反応液を調製した。陰イオン交換樹脂が充填されたＱＩＡＧＥＮ  ＧＥＮＯＭＩＣ−ＴＩＰ２０／Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ社製）カラムを２ｍｌのＱＢＴ緩衝液（７５０ｍＭのＮａＣｌ，５０ｍＭのＭＯＰＳ，１５％のｅｔｈａｎｏｌ，０．１５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ７．０）で平衡化して、菌体反応液をカラムに注入した。カラムを３ｍｌのＱＣ緩衝液（１．０ＭのＮａＣｌ，５０ｍＭのＭＯＰＳ，１５％のｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ７．０）で洗浄したのち、２ｍｌのＱＦ緩衝液（１．２５ＭのＮａＣｌ，５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５％のｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ８．５）でゲノムＤＮＡ溶液を溶出した。ゲノムＤＮＡ溶液に１．４ｍｌのイソプロパノールを添加してＤＮＡを沈殿させたのち、ガラス棒で巻きとり回収した。回収したＤＮＡを５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解してゲノムＤＮＡ溶液を調製した。
【００５８】
【表１】
2004283120.tif 000002
【００５９】
調製したバチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株のＤＮＡを鋳型として用いて、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュ・ダイアグノスティック社製）により当該断片の増幅を行い、当該ＰＣＲ増幅断片を高発現ベクターｐＫＫ２２３−３に連結し、脱硫酵素発現プラスミドｐＫＢＤＳを作製した。なお、ＰＣＲ条件は、同Ｓｙｓｔｅｍの実験操作法に従った。
【００６０】
（２）部分ＤＮＡライブラリーの作製
バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株の部分ＤＮＡライブラリーは以下のようにして作製した。上記（１）の脱硫酵素をコードする遺伝子の発現用プラスミドの作製方法と同様に調製したバチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＷＵ−Ｓ２Ｂ株のＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化してアガロースゲル電気泳動を行った後、２〜４ｋｂの遺伝子断片領域を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて精製した。この遺伝子断片をｐＳＴＶ２８のＢａｍＨＩサイトに連結し、部分ＤＮＡライブラリーを作製した。
【００６１】
（３）脱硫酵素発現プラスミドｐＫＢＤＳを保持する大腸菌の産生する青色色素の同定
脱硫酵素発現プラスミドｐＫＢＤＳを保持する大腸菌をＬＢ培地にて終夜培養すると水に不溶性の弱い青色色素を産生した。当該青色色素を酢酸エチルで抽出後、ロータリーエバポレーターで濃縮し、ＴＬＣおよびＦＡＢ−ＭＳで青色色素を分析した。その結果、当該青色色素は市販のインジゴ標品とＴＬＣにおけるＲｆ値およびＦＡＢ−ＭＳのフラグメントパターンが一致した。このことから当該青色色素がインジゴであることが確認された。
【００６２】
（４）フラビンレダクターゼ遺伝子ｂｄｓＤのクローニング
上記（１）の脱硫酵素をコードする遺伝子の発現用プラスミドの作製で作製した脱硫酵素発現プラスミドｐＫＢＤＳを保持する大腸菌に対して、上記（２）部分ＤＮＡライブラリーの作製で作製した部分ＤＮＡライブラリーを用いて形質転換を行った。その結果、約１１００個のクローンから青色色素であるインジゴを生成するコロニーを取得した。当該陽性クローンに保持されているプラスミドの挿入断片（約１．４ｋ）の塩基配列を決定したところ、当該挿入断片は脱硫酵素と予想される５２２ｂｐのＯＲＦとｇｌｕｃａｒａｔｅ  ｐｅｒｍｉａｓｅと相同性を示すＯＲＦの一部を含んでいた。５２２ｂｐから成るＯＲＦは脱硫酵素遺伝子と推定され、当該遺伝子をｂｄｓＤと命名した。当該遺伝子ｂｄｓＤは５２２ｂｐから成り、１７４残基のアミノ酸から成る分子量１９６６３のタンパク質をコードしていることが推定された。また、当該酵素のアミノ酸配列は、既知の遺伝子およびタンパク質データベースに対して相同性検索を行ったところ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  のニトロレダクターゼと６５％の高い相同性を示した。また、ゲノムプロジェクトにより全塩基配列が決定されているＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＥ．  ｃｏｌｉの推定上のフラビンレダクターゼともそれぞれ５５％、４２％の相同性を示した。次に、当該遺伝子ｂｄｓＤである５２２ｂｐのＯＲＦをｐＳＴＶ２８にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、ＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元活性を測定検討した。
【００６３】
ＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元活性の測定は、以下のように行った。まず、３７℃で終夜培養した本酵素遺伝子を含む組換え大腸菌を、１００ｍｌアンピシリンおよびＩＰＴＧを含む新鮮なＬＢ培地に接種して、３７℃で１２時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離により集菌、リン酸緩衝液により洗菌を行った後、リン酸緩衝液に懸濁した。菌体懸濁液を１０分間超音波破砕して、１００００ｒｐｍで６０分の遠心処理により菌体残査を除去して、得られた上清を無細胞抽出液とした。リン酸緩衝液に無細胞抽出液および１０μＭのＦＭＮを含む反応液１ｍｌを２５℃において３分間保持して等温平衡化を行ったのち、３００μＭのＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨを添加して、２５℃にて３分間反応を行い、５００μｌのアセトニトリルで反応を停止した。反応停止後の反応液を、３４０ｎｍで吸光度を測定し、比活性を決定した。対照として本酵素遺伝子ｂｄｓＤを含まないベクターのみの無細胞抽出液を使用した活性測定も行った。その結果を表２に示す。本酵素はＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを酸化し、本酵素遺伝子ｂｄｓＤを含まないベクターのみの場合よりその活性は約３〜６倍に上昇した。このことから本酵素はＦＭＮを電子受容体として利用してＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを酸化することが確認された。
【００６４】
【表２】
2004283120.tif 000003
【００６５】
以上から、当該脱硫酵素遺伝子ｂｄｓＤがフラビンレダクターゼをコードしていることが明らかとなった。
【００６６】
（５）脱硫酵素遺伝子ｂｄｓＤにコードされるタンパク質による脱硫関連活性の証明
クローニングした当該遺伝子ｂｄｓＤのプロモーターおよびＯＲＦを含む領域をｐＫＢＤＳ中のｂｄｓＡＢＣ下流に順方向にライゲーションして共発現株を以下のように作製した。ｐＳＴＶ２８ｂｄｓＤを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片をｐＫＢＤＳ中のｂｄｓＡＢＣ下流にライゲーションした。構築したｐＫＢＤＳ−ｂｄｓＤ組換えプラスミドをエレクトロポレーション法によりＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ固体培地上で培養した。
【００６７】
共発現株のＤＢＴ脱硫活性の測定は以下のように行った。ｐＫＢＤＳ−ｂｄｓＤを保持するＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を０．５４ｍＭのＤＢＴおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃、１８時間培養した後、酢酸エチルで抽出してＨＰＬＣを用いて測定した。
【００６８】
【表３】
2004283120.tif 000004
【００６９】
表３に示すように、共発現株はｂｄｓＤを含まない株の約６倍のＤＢＴ分解活性を示した。このことから、当該ｂｄｓＤ遺伝子が脱硫活性を向上させる脱硫関連酵素遺伝子であることが明らかとなった。
【００７０】
（６）休止菌体反応による高温条件下での脱硫活性の向上
上記（５）脱硫酵素遺伝子ｂｄｓＤにコードされるタンパク質による脱硫関連活性の証明で作製した共発現株について、高温条件下でのＤＢＴ脱硫活性の測定を以下のように行った。ｐＫＢＤＳ−ｂｄｓＤを保持するＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地で２５℃、１２時間培養し、０．２ｍＭのＩＰＴＧを添加してさらに１２時間培養した。集菌、洗菌後、得られた湿菌体をｐＨ７．０、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液に懸濁し、ＯＤ６６０を２０に調整した。反応は０．６ｍｌの菌体懸濁液に１０ｇ／ｌのＤＢＴ／トリデカン溶液を終濃度０．５ｍＭになるように添加し、５０℃で３０分間、５０ｒｐｍで振とうした。反応後、酢酸エチルで抽出してＨＰＬＣを用いて測定した。
【００７１】
【表４】
2004283120.tif 000005
【００７２】
表４に示すように、共発現株は５０℃の高温条件下でｂｄｓＤを含まない株の約３倍のＤＢＴ分解活性を示した。このことから、当該遺伝子ｂｄｓＤが脱硫活性を向上させる脱硫関連酵素遺伝子であることが明らかとなった。
【００７３】
（実施例２）
（１）脱硫関連酵素をコードする遺伝子断片のクローニング
マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株から精製されたＦＭＮ−ＮＡＤＨ酸化還元活性を有するタンパク質のアミノ末端および内部のアミノ酸配列を決定した。それらの配列を以下に示す。
【００７４】
アミノ末端  ＮＨ２−ＳＡＩＤＬＳＰＳＴＬＲＥＡＦＧＨＦＰＳＧＶ−−−−−−−ＣＯＯＨ
内部        ＮＨ２−−−−−−−ＬＲＤＬＰＡＬＧＩＳＶＬＧＥＡＨＤＶＡＡＲＴ−−−−−−−ＣＯＯＨ
上記のアミノ酸配列をもとに以下に示すようなＰＣＲ用プライマーを作製した。
【００７５】
センスプライマー  ５’−  ＧＣＩ  ＴＴＹ  ＧＧＩ  ＣＡＹ  ＴＴＹ  ＣＣ  −３’
アンチセンスプライマー  ５’−  ＧＣ  ＩＡＣ  ＲＴＣ  ＲＴＧ  ＩＧＣ  ＹＴＣ  −３’
これらのセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株からのＤＮＡの調製は以下のように行った。
【００７６】
表５に示すＬＢ培地の組成で５０℃で４８時間培養したマイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株を、新鮮なＬＢ培地で５０℃で４８時間培養して、菌体を回収した。得られた菌体を１ｍｌのＢ１緩衝液（５０ｍＭのＥＤＴＡ，  ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，  ０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．２ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ，  ｐＨ８．０）に懸濁させた。この懸濁液に、１００ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を２０μｌと２０ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液を４５μｌ添加して、３７℃で１時間反応させた。反応液に０．３５ｍｌのＢ２緩衝液（８００ｍＭのＧｕＨＣｌ，  ２０％のＴｗｅｅｎ−２０，  ｐＨ５．５  ）を添加、攪拌混合して、５０℃で３０分間反応させ、さらに５秒間ミキサーで攪拌して、菌体反応液を調製した。そして、陰イオン交換樹脂が充填されたＱＩＡＧＥＮ  ＧＥＮＯＭＩＣ−ＴＩＰ２０／Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ社製）カラムを２ｍｌのＱＢＴ緩衝液（７５０ｍＭのＮａＣｌ，  ５０ｍＭのＭＯＰＳ，  １５％のｅｔｈａｎｏｌ，  ０．１５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ｐＨ７．０  ）で平衡化して、菌体反応液をカラムに注入した。カラムを３ｍｌのＱＣ緩衝液（１．０ＭのＮａＣｌ，  ５０ｍＭのＭＯＰＳ，  １５％のｅｔｈａｎｏｌ，  ｐＨ７．０）で洗浄したのち、２ｍｌのＱＦ緩衝液（１．２５ＭのＮａＣｌ，  ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，  １５％のｅｔｈａｎｏｌ，  ｐＨ８．５）でゲノムＤＮＡ溶液を溶出した。このゲノムＤＮＡ溶液に１．４ｍｌのイソプロパノールを添加してＤＮＡを沈殿させたのち、ガラス棒で巻きとり回収した。回収したＤＮＡを５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭのＥＤＴＡ，  ｐＨ８．０）に溶解してゲノムＤＮＡ溶液を調製した。
【００７７】
【表５】
2004283120.tif 000006
【００７８】
調製したマイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株のＤＮＡを鋳型として用いて行った。ＰＣＲの条件を表６に示す。なお、アニーリング温度は、４４℃から５８℃までの間で２℃間隔で温度を変えてＰＣＲを行い、ＤＮＡ増幅機は、ＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒＴＭＧＲＡＤＩＥＮＴ９６温度サイクラー（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いた。
【００７９】
【表６】
2004283120.tif 000007
【００８０】
上記表６の条件でＰＣＲを行った結果、アニーリング温度が５６〜５８℃の時、約２００ｂｐの増幅フラグメントを与えることが確認された。この約２００ｂｐのＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株にクローン化した。クローン化ＤＮＡフラグメントをシークエンシングした結果、この配列から予想されるアミノ酸配列の一部は、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株より精製したＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素のアミノ末端および内部配列と完全に一致した。従って、この塩基配列をＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素の一部と考え、この塩基配列をもとにＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブを作製した。
【００８１】
（２）逆ＰＣＲ法による脱硫関連酵素をコードする遺伝子断片のクローニング次に、同定されたＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素のアミノ末端および内部配列の塩基配列を基に、以下のプライマーを作製して、逆ＰＣＲ法より本配列の前後の断片のクローニングを行った。
【００８２】
（逆ＰＣＲ用プライマー）
センスプライマー  ５’−  ＧＧＣ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＧＣＣ  −３’
アンチセンスプライマー  ５’−  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＣＴＣ  −３’
マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株のゲノムＤＮＡを各制限酵素で消化した断片に対して、逆ＰＣＲを行った結果、ＰｓｔＩの断片で、約１．２ｋｂの断片が増幅された。ＰＣＲ断片について、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングを行い、シーケンスを決定した結果、ＰｓｔＩサイトがＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素をコードする遺伝子領域の外側に位置することを確認した。
【００８３】
（３）部分ＤＮＡライブラリーの作製
マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株の部分ＤＮＡライブラリーは以下のようにして作製した。マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株の全ＤＮＡ標品約２μｇを調製した。ＤＮＡの調製方法は、ＰＣＲの鋳型として用いたＤＮＡの調製方法と同じである。この全ＤＮＡをＰｓｔＩで消化した後、電気泳動により２ｋｂ弱の遺伝子断片を切り出してｐＵＣ１１８にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、部分ＤＮＡライブラリーを作製した。
【００８４】
（４）部分ＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素をコードする遺伝子を取得するためのプラスミドライブラリーのスクリーニングに用いるＤＮＡプローブとしては、ＰＣＲにより得られた約２００ｂｐの断片を鋳型として用いてマルチプライム法の一種であるランダムプライム法により作製したＤＩＧ標識プローブを使用した。ランダムプライム法によるＤＩＧ標識プローブの調製法は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社のプロトコールに従った。ＤＩＧ標識プローブの調製方法を以下に示す。
【００８５】
得られたＰＣＲ産物５μｌに相当する１μｇを沸騰した熱湯中で１０分間熱変性させ、塩を含んだ氷上で冷却した。得られた変性ＤＮＡ溶液に、１０μｌのヘキサヌクレオチド混合液（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，  ０．１ＭのＭｇＣｌ２，  １ｍＭのＤｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉｏｌ，  ２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ，  ３．１４３ｍｇ／ｍｌのＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ，  ｐＨ７．２）、１０μｌのｄＮＴＰ標識混合液（１ｍＭのｄＡＴＰ，  １ｍＭのｄＣＴＰ，  １ｍＭのｄＧＴＰ，  ０．６５ｍＭのｄＴＴＰ，  ０．３５ｍＭのＤＩＧ−ｄＵＴＰ，  ｐＨ７．５）、７０μｌの滅菌蒸留水および５μｌのＫｌｅｎｏｗ酵素（１０ｕｎｉｔｓ）を添加して、３７℃で１８時間反応させた。反応液に、５μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  溶液を添加して反応を停止させた。次に５μｌの８Ｍ  ＬｉＣｌ４と２７５μｌの−２０℃の冷エタノールを添加して、−８０℃で３０分間放置したのち、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心を行い、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを７０ｗ／ｖ％の冷エタノールで洗浄後、吸引乾燥したのち、５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解して、ＤＩＧ標識プローブを調製した。
【００８６】
遺伝子のスクリーニングは上述の方法で調製したＤＩＧ標識プローブを使用して、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋  メンブレンに転写されたコロニーに対するコロニーハイブリダイゼーションにより行った。ハイブリダイズするクローンの検出にはＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いた。部分ゲノムライブラリーより約１２００個のにプラスミドコロニーついてスクリーニングを行った結果、計６コロニーの陽性コロニーが得られた。これら６つのコロニーを純化して、再度コロニーハイブリダイゼーションを行った。この結果、３個の陽性コロニーが確認された。この、陽性コロニーより得た遺伝子をＭｄｓＤと命名した。次に、当該遺伝子ＭｄｓＤである４８６ｂｐのＯＲＦをｐＫＫ２２３−３にライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、ＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元活性を測定検討した。
【００８７】
ＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元活性の測定は、以下のように行った。まず、３７℃で終夜培養した本酵素遺伝子ＭｄｓＤを含む組換え大腸菌を、１００ｍｌアンピシリンおよびＩＰＴＧを含む新鮮なＬＢ培地に接種して、３７℃で１２時間培養を行った。得られた菌体を遠心分離により集菌、リン酸緩衝液により洗菌を行った後、リン酸緩衝液に懸濁した。菌体懸濁液を１０分間超音波破砕して、１００００ｒｐｍで６０分の遠心処理により菌体残査を除去して、得られた上清を無細胞抽出液とした。リン酸緩衝液に無細胞抽出液および１０μＭのＦＭＮを含む反応液１ｍｌを４５℃において３分間保持して等温平衡化を行ったのち、３００μＭのＮＡＤＨを添加して、４５℃にて３分間反応を行い、５００μｌのアセトニトリルで反応を停止した。反応停止後の反応液を、３４０ｎｍで吸光度を測定し、比活性を決定した。対照として本酵素遺伝子ＭｄｓＤを含まないベクターのみの無細胞抽出液を使用した活性測定も行った。その結果を表７に示す。本酵素はＮＡＤＨを酸化し、本酵素遺伝子ＭｄｓＤを含まないベクターのみよりその活性は約５倍に上昇した。このことから本酵素はＦＭＮを電子受容体として利用してＮＡＤＨを酸化することが確認された。
【００８８】
【表７】
2004283120.tif 000008
【００８９】
次に、クローン化されたマイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）ＷＵ−Ｆ１株由来のＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素の塩基配列を決定した。決定された配列中のＯＲＦを探索した結果、４８６ｂｐのＯＲＦが見つかった。このＯＲＦは１６２個のアミノ酸をコードし推定分子量は１７ｋＤａであった。このＯＲＦを含む塩基配列を配列番号３に、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。相同性検索の結果、このＯＲＦの塩基配列は、常温脱硫菌ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＩＧＴＳ８のＮＡＤＨ−ＦＭＮ酸化還元酵素ＤｓｚＤとは全域で３３％の低い相同性を示し、高温脱硫細菌パエニバチルス・エスピー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ａ１１−２のＴｄｓＤとは相同性が確認されなかった。また、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の機能未知の推定タンパク質と７６〜７９％の高い相同性を示した。
【００９０】
（５）組換えＤＮＡ中のＯＲＦによりコードされるタンパク質による脱硫関連活性の証明
上記（４）部分ＤＮＡライブラリーのスクリーニングで作製した無細胞抽出液を使用して、高温脱硫酵素との共役反応活性の検討を行った。本酵素遺伝子ＭｄｓＤを含む組換え大腸菌の無細胞抽出液の調製は、上記（４）部分ＤＮＡライブラリーのスクリーニングと同様の方法で行った。高温脱硫酵素を含む無細胞抽出液の調製は以下のように行った。５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍｌに同培地を用いて作製した１ｍｌの高温脱硫遺伝子を保有する大腸菌の終夜培養液を接種して、３７℃で６時間培養した。培養菌体を集菌・洗浄した後、リン酸緩衝液に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機で１０分間２回処理し、得られた菌体破砕液を１１０００ｒｐｍで、６０分遠心分離し、無細胞抽出液を調製した。調製した無細胞抽出液０．５ｍｌに本酵素遺伝子ＭｄｓＤを含む組換え大腸菌の無細胞抽出液０．５ｍｌ、３ｍＭのＮＡＤＨ、１０μＭのＦＭＮ、約５０ｐｐｍのＤＢＴを添加して、４０℃で１時間往復振盪を行うことにより反応を行った。対照実験として、本酵素遺伝子ＭｄｓＤを含まないベクターのみの無細胞抽出液を使用した活性測定も行った。これらの条件を表８にまとめた。その結果を表９に示す。本酵素はＤＢＴ脱硫に関与し、本酵素遺伝子ＭｄｓＤを含まないベクターのみよりもその活性は約２．５倍に上昇した。以上から本酵素は高温脱硫酵素と共役することにより脱硫活性を発揮することが確認された。
【００９１】
【表８】
2004283120.tif 000009
【００９２】
【表９】
2004283120.tif 000010
【００９３】
【発明の効果】
本発明の請求項１は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
ので、この遺伝子を利用することにより硫黄を化石燃料から容易に除去することができる。
【００９４】
本発明の請求項２は、請求項１に記載の遺伝子を含むベクターであるので、このベクターを利用することにより硫黄を化石燃料から容易に除去することができる。
【００９５】
本発明の請求項３は、請求項２記載のベクターを含有する形質転換体であるので、この形質転換体を利用することにより硫黄を化石燃料から容易に除去することができる。
【００９６】
本発明の請求項４は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質であるので、（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
ので、このタンパク質である酵素を利用することにより硫黄を化石燃料から容易に除去することができる。
【００９７】
本発明の請求項５は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子である
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
ので、この遺伝子を利用することにより硫黄を化石燃料から容易に除去することができる。
【００９８】
本発明の請求項６は、請求項５に記載の遺伝子を含むベクターであるので、このベクターを利用することにより硫黄を化石燃料から容易に除去することができる。
【００９９】
本発明の請求項７は、請求項６記載のベクターを含有する形質転換体であるので、この形質転換体を利用することにより硫黄を化石燃料から容易に除去することができる。
【０１００】
本発明の請求項８は、以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質である
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質
（ｄ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表され、かつＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質
ので、このタンパク質である酵素を利用することにより硫黄を化石燃料から容易に除去することができる。
【０１０１】
本発明の請求項９は、インジゴの発色を利用することを特徴とするＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を有するタンパク質又は細胞内においてＮＡＤＨを酸化しＦＭＮを還元する機能を増強するタンパク質をコードする遺伝子の取得方法であるので、容易にＮＡＤＨ−ＦＭＮを酸化還元することができるタンパク質をコードする遺伝子を取得することができる。
【０１０２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態におけるインジゴの生産スキームである。
【図１】
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