(57)【要約】本発明は、液体クロマトグラフィ系中の支持体上に固定化されたＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）を提供する。本発明による方法は、レセプターに対する因子の結合を評価する手段を提供し、以下の工程：（ａ）カラム中の人工膜支持体上にＧＰＣＲレセプターを固定化する工程、（ｂ）ＧＰＣＲレセプターを有するこの支持体を、液体クロマトグラフィ系において変化する濃度の試験因子に曝す工程、（ｃ）カラムから試験因子を溶出させる工程、及び（ｄ）カラムからの試験物質の溶出プロフィールを評価する工程を含む。この方法を用いて、ＧＰＣＲ膜レセプターとの試験因子の相互作用を評価することが可能である。溶出に続いて、溶出物に質量分光計のような他の分析試験装置を通過させることによって、分子の含量及び構造を直接決定することが可能である。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
その上に固定化された少なくとも１つのＧタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）を有する人工膜支持体であって、前記ＧＰＣＲが、その固定化後の三次構造がインビボで前記少なくとも１つのＧＰＣＲによって結合されるリガンドへの結合を可能にするように固定化されている、人工膜支持体。
【請求項２】
前記ＧＰＣＲが、前記人工膜支持体との非共有結合付着手段を用いてその上に固定化されている、請求項１記載の人工膜支持体。
【請求項３】
前記ＧＰＣＲが、前記人工膜支持体との共有結合付着手段を用いてその上に固定化されている、請求項１記載の人工膜支持体。
【請求項４】
前記ＧＰＣＲが、リン脂質層を含む固定化人工膜（ＩＡＭ）液体クロマトグラフィ（ＬＣ）定常相を用いて固定化されており、固定化ＧＰＣＲの三次構造がインビボで前記ＧＰＣＲによって結合されるリガンドへの結合を可能にするようにＧＰＣＲが前記ＩＡＭ‐ＬＣ定常相のリン脂質層に固定化されるようになる条件下で、前記ＩＡＭＬＣ定常相が、前記ＧＰＣＲと組み合わされている、請求項１記載の人工膜支持体。
【請求項５】
前記リン脂質層が一重層である、請求項４記載の人工膜支持体。
【請求項６】
前記ＧＰＣＲが、以下：Ａ１及びＡ２アデノシンレセプター；ｃ−ＡＭＰレセプター；ヒスタミンレセプター；ＧＡＢＡレセプター；Ｍ１〜Ｍ５ムスカリン性レセプター；５ＨＴ１及び５ＨＴ２レセプター；アドレノコルチコトロピックホルモンレセプター；オピオイドレセプター；胸腺刺激ホルモンレセプター；ＧＨレセプター；Ｎｍｋ　ＳＫ及びＳＰレセプター；Ａ２レセプター；ロドプシン及び円錐体レセプター；及びＢ又はＴ細胞レセプター；
のものからなる群から選択される部材である、請求項１記載の人工膜支持体。
【請求項７】
前記ＧＰＣＲが、オピオイドレセプターである、請求項６記載の人工膜支持体。
【請求項８】
前記人工膜支持体が以下の工程：
リン脂質層を含む固定化人工膜（ＩＡＭ）液体クロマトグラフィ（ＬＣ）定常相を得る工程；及び
固定化ＧＰＣＲの三次構造がインビボでＧＰＣＲによって結合される前記リガンドへの結合を可能にするようにＧＰＣＲが前記ＩＡＭＬＣ定常相のリン脂質層に固定化されるようになる条件下で、前記ＩＡＭＬＣ定常相を、前記少なくとも１つのＧＰＣＲと接触させる工程；
によって製造される、請求項１記載の人工膜支持体。
【請求項９】
以下の工程：
リン脂質層を含む固定化人工膜（ＩＡＭ）液体クロマトグラフィ（ＬＣ）定常相を得る工程；及び
ＧＰＣＲが前記ＩＡＭＬＣ定常相のリン脂質層に固定化されるようになる条件下で、前記ＩＡＭＬＣ定常相を、前記ＧＰＣＲと接触させる工程；
を含む、人工膜支持体を製造する方法。
【請求項１０】
固定化ＧＰＣＲの三次構造がインビボでＧＰＣＲによって結合されるリガンドへの結合を可能にするように、ＧＰＣＲが、前記ＩＡＭＬＣ定常相のリン脂質に固定化されるようになる、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
ある化合物が少なくとも１つのＧＰＣＲのリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを同定する方法であって、（１）その上に固定化された前記ＧＰＣＲを有する人工膜支持体を、前記化合物を含む液体フロー系と接触させる工程、及び（２）前記化合物がこの支持体に結合されるようになるかどうかを決定する工程、を含む方法。
【請求項１２】
前記リガンド、アゴニスト又はアンタゴニストが、ファージディスプレイライブラリーから得られる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記リガンド、アゴニスト又はアンタゴニストが、コンビナトリアルケミストリーライブラリーから得られる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＰＣＲが、その固定化後の立体配座構造が、そのネイティブな細胞環境に含まれている場合の前記ＧＰＣＲによって結合されるリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストへの結合を可能にするように固定化されており、前記人工膜支持体が、液体フロー系に含まれており；かつ、前記人工膜支持体が以下の工程：
（ｉ）リン脂質層を含む固定化人工膜（ＩＡＭ）液体クロマトグラフィ（ＬＣ）定常相を得る工程；
（ｉｉ）前記少なくとも１つの固定化ＧＰＣＲの三次構造が、そのネイティブな細胞環境に含まれている場合の前記少なくとも１つのＧＰＣＲによって結合されるリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストへの結合を可能にするように、前記少なくとも１つのＧＰＣＲが前記ＩＡＭＬＣ定常相のリン脂質層に固定化されるようになる条件下で、前記ＩＡＭＬＣ定常相を、少なくとも１つのＧＰＣＲと接触させる工程；及び
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つの固定化ＧＰＣＲを含む人工膜支持体を、液体フロー系に接触させる工程；
によって製造される、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記人工膜支持体を、前記少なくとも１つのＧＰＣＲへの前記第一の化合物の結合に推測上影響する第二の化合物を含有する液体フロー系に接触させる工程；及び前記化合物が、前記第一の化合物の前記人工膜支持体に対する結合に影響するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
以下の工程：
その上に固定化された少なくとも１つのＧＰＣＲを有し、前記少なくとも１つのＧＰＣＲがそれ自身リガンドに特異的に結合している人工膜支持体を、前記固定化ＧＰＣＲに結合する前記リガンドの結合に潜在的に影響する少なくとも１つの化合物を含有する液体フロー系に接触させる工程；
を含む、ある化合物によって結合されるＧＰＣＲに対するリガンドの結合に影響するその化合物の同定、精製又は単離方法。
【請求項１７】
前記化合物がファージディスプレイライブラリーから得られる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物がコンビナトリアルケミストリーライブラリーから得られる、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの化合物を、前記固定化ＧＰＣＲへの前記リガンドの結合に影響するその能力に基づいて同定、精製又は単離する工程をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
固定化後にそれがインビボにある場合に前記少なくとも１つのＧＰＣＲによって結合されるリガンドにＧＰＣＲが結合するように、前記固定化ＧＰＣＲが前記人工膜支持体に固定化されている、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記人工膜支持体が液体フロー系に含有されている、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記人工膜支持体が、以下の工程：
（１）リン脂質層を含む固定化人工膜（ＩＡＭ）液体クロマトグラフィ（ＬＣ）定常相を得る工程；
（２）それがインビボにある場合にＧＰＣＲによって結合されるリガンドに対する結合を固定化ＧＰＣＲが可能にするように、前記少なくとも１つのＧＰＣＲ又はＧＰＣＲ−リガンド複合体が、前記ＩＡＭＬＣ定常相のリン脂質層に非共有結合的に固定化されるようになる条件下で、前記ＩＡＭＬＣ定常相を、少なくとも１つのＧＰＣＲ又はＧＰＣＲ−リガンド複合体と接触させる工程；及び
（３）場合によっては、前記リガンドが前記支持体に固定化されているＧＰＣＲに結合するようになることをもたらす条件下で、ＧＰＣＲが固定化されている前記人工膜支持体を、固定化ＧＰＣＲと結合する少なくとも１つのリガンドと接触させる工程；
によって製造される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物が、前記固定化ＧＰＣＲへの結合について前記リガンドと競合する、請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、コンビナトリアルケミストリーライブラリーから得られる、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が、ファージディスプレイライブラリーから得られる、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物を、前記固定化ＧＰＣＲ／リガンド複合体を含む前記人工膜支持体と、変化する濃度の前記化合物を含む液体クロマトグラフィ系を用いて接触させる、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
化合物が、支持体に結合するようになり、前記化合物の溶出プロフィールが、支持体からの前記化合物の溶出の際に評価される、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、係属中の２００２年５月１３日に出願された出願番号第１０／１４２，７８５の部分継続出願であり、それは現在米国特許第６，３８７，２６８号となっている２０００年７月１９日に出願された出願番号第０９／６１９，５０５の係属出願であり、それは現在米国特許第６，１３９，７３５号となっている１９９９年２月２３日に出願された出願番号第０９／２５５，８８１号の分割出願であり、それは１９９８年２月２３日に出願された仮出願番号第６０／０７５，７４５号からの優先権を主張している。これらの各々の全体は、すべての目的のために参照によりここに取り込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、液体クロマトグラフィ系における支持体上へのＧタンパク質共役膜貫通レセプターの固定化、及びオンラインスクリーニングの方法におけるその用途に関する。ここで引用するすべての参考文献は、すべての目的のために参照により取り込まれる。
【０００３】
技術の背景
ケミカルライブラリーのコンビナトリアル合成は、可能な新薬候補の膨大なプールを創り出している。ファージディスプレイ調製物を含む、合成方法の能力は、相当する生物学的活性を決定する能力を凌駕している。この問題を解決する最初のステップは、固定化されたレセプター／抗体を含有するマイクロタイタープレートの開発であった。これらのプレートの使用は、コンビナトリアルプール中の可能性のある候補の数を、数千から数百に迅速に減少させることができる。しかし、減少した化合物プール内での相対活性の割り当ては、遅い繰り返し作業のままである。
【０００４】
基本的な薬理学的プロセスと液体クロマトグラフィ（ＬＣ）研究との間の関係は、クロマトグラフィ系の活性成分としての生体分子の包含によって強調されてきた。非常に多彩な固定化バイオポリマーベースのＬＣ定常相（ＢＰ−ＳＰｓ）が、タンパク質、酵素、セルロース及びアミロース、巨大環状抗体及びリポソームを用いて開発されてきた。ＢＰ−ＳＰｓのクロマトグラフィ保持及び選択性が、非固定化バイオポリマーの特性に関連していることが明らかになってきた。例えば、固定化されたヒト血清アルブミンを含有するＳＰカラム上での化合物の保持は、タンパク質に対するこれらの化合物の結合特性を評価するために使用されている。
【０００５】
Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）ファミリーは、生化学的及び薬理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす膜貫通レセプターの広範な収集物である。これらのレセプターは、新薬発見のための鍵となる標的であり、医薬品市場の有意なシェアを表す。固定化ＧＰＣＲ技術は、レセプターのこのファミリーのための新規な治療剤の開発への、迅速かつ直接的なアプローチを表す。
【０００６】
さらに、特徴付けされたＧＰＣＲのゲノムの研究は、多数のＧＰＣＲの同定をもたらしたが、それらの機能はしばしば未知である。既知の機能を持たないこれらのレセプターは、別名オーファンレセプターとして知られている。医薬品産業の鍵となるゴールは、これらのオーファンレセプターについてのアゴニスト又はアンタゴニストを同定し、可能な治療標的としてのそれらの機能を解明することである。
【０００７】
本発明は、これらのＧＰＣＲオーファンレセプターの固定化及びこれらのレセプターに対する多数の化合物の迅速スクリーニングを可能にする。本発明によれば、これらのＧＰＣＲレセプターに結合する活性リガンドを同定し、それらを特定のＧＰＣＲファミリーに分類し、続いてその特定のＧＰＣＲ又はそのファミリーと関連する疾患の治療のための第一及びその後の世代の薬剤を得ることが可能である。
【０００８】
本発明は、マイクロタイターウェルの利用に基づく現在利用可能なハイスループットスクリーニング法の、改良された代替法を提供する。さらに、オンラインスクリーニングは、ケミカルライブラリー由来のものに加えてファージライブラリー由来のリガンドのスクリーニングにも適している。
【０００９】
Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、シリカベースのクロマトグラフィ定常相上に固定化し、ガラス又はポリマーチューブに詰めて、液体クロマトグラフィカラムを作製することができ、又はガラスチューブの表面に直接固定化することができる。得られる系は、固定化ＧＰＣＲに結合する化合物のオンライン決定による薬剤発見及び薬剤開発プログラムにおいて使用することができる。これらの化合物は、単純又は複雑のいずれかであることができる化学的又は生物学的混合物から単離することができる。化学プロセス起源のこれらの化合物は、コンビナトリアルケミストリーを利用して得ることができる。生物学的起源の混合物は、ファージディスプレイを用いて得ることができる。この系は、ＧＰＣＲに対するアゴニスト及びアンタゴニストの単離、同定及び特徴づけにも用いることができる。
【００１０】
固定化ＧＰＣＲ液体クロマトグラフィカラムの開発は、米国特許第６，３８７，２６８号又は第６，１３９，７３５号に記載された、以前報告されたレセプターベースの液体クロマトグラフィカラムと比較して、有意な発展を表す。レセプターのＧＰＣＲクラスの固定化においては、固定化ＧＰＣＲ液体クロマトグラフィ定常相が成功裡に作製されることを確実にするために、固定化手順において有意な変更をしなければならなかった。
【００１１】
ＧＰＣＲの固定化のための方法論は、固定化オピオイドレセプターカラムの作製を用いて説明される。しかし、この方法は、ＧＰＣＲファミリーの任意のメンバーについて適用可能である。
【００１２】
発明の概要
本発明は、液体クロマトグラフィ系における支持体上の固定化Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）を提供する。本発明の方法を用いて、ＧＰＣＲを支持体上に固定化し、次にレセプターをＧＰＣＲに結合する可能性のある因子（薬剤）に曝すことが可能である。次に、その因子の結合が起こったかどうかを決定することが可能である。
【００１３】
また、支持体上のＧＰＣＲを、ＧＰＣＲと相互作用することが公知の因子との間の相互作用を阻害又は促進し得る物質に曝し、次に、ＧＰＣＲを有する支持体をその因子に曝して、提案された阻害剤／促進剤が実際にＧＰＣＲの結合に影響するかどうかを決定することも可能である。したがって、本発明の手段を用いて、固定化ＧＰＣＲを用いて潜在的な薬剤の相互作用を試験し、可能性のある候補をＧＰＣＲ相互作用の阻害又は促進について評価することが可能である。
【００１４】
発明の詳細な説明
液体クロマトグラフィ（ＬＣ）技術を利用してリガンド‐レセプター相互作用を研究するために、Ｇタンパク質共役膜レセプターの固定化のための手段を提供することは、本発明の目的である。薬剤の作用、吸収、分布及びレセプター活性化の基本的プロセスは、すべて動的な性質のものであり、クロマトグラフィの分布に関与する基本的メカニズムと多くにおいて共通する。同じ基本的分子間相互作用（疎水性、静電気的及び水素結合）が、ネイティブな生物学的環境及び液体クロマトグラフィにおいて作られる人工的環境の両方において化学化合物の挙動を決定する。
【００１５】
ＧＰＣＲは、薬剤活性において重要な役割を果たし、コンビナトリアルケミストリースクリーニング試験において鍵となる標的であるが、それらは従来はＬＣ系に包含されていなかった。これは、一部は、固体ＬＣ支持体上のＧＰＣＲの共有結合的固定化によって作られるレセプターの三次構造の破壊のためであった。この問題に対する１つの解決策は、固定化人工膜（ＩＡＭ）ＬＣ定常相のリン脂質層中のＧＰＣＲ膜レセプターの固定化である。
【００１６】
本発明による方法は、レセプターに対する因子の結合を評価する手段を提供し、以下の工程を含む：
（ａ）カラム中の人工膜支持体上にＧＰＣＲレセプターを固定化する工程、
（ｂ）ＧＰＣＲレセプターを有するこの支持体を、液体クロマトグラフィ系において変化する濃度の試験因子に曝す工程、
（ｃ）カラムから試験因子を溶出させる工程、及び
（ｄ）カラムからの試験物質の溶出プロフィールを評価する工程。
【００１７】
この方法を用いて、ＧＰＣＲ膜レセプターとの試験因子の相互作用を評価することが可能である。溶出に続いて、溶出物に質量分光計のような他の分析試験装置を通過させることによって、分子の含量及び構造を直接決定することが可能である。
【００１８】
【実施例】
以下の実施例は、当業者に、本発明をどのように実行するかの充分な開示及び説明を提供するが、本発明者らが発明であるとして認めるものの範囲を制限することを意図していない。本発明者らは、以下の実験がすべての又は唯一の行われた実験であることを表し又は暗示することも、意図していない。用いられた値（例えば量、温度等）に関して正確性を確保する努力が為されているが、いくつかの実験的誤差及び偏りは説明されるべきである。
【００１９】
実施例１
アヘン剤類は、無痛覚及び幸福感のような種々の行動及び効果を媒介するレセプター作用性化合物の大きなクラスである。ＧＰＣＲレセプターのオピオイドファミリーは、そのダウンレギュレーションを媒介するＧタンパク質に共役した７つの膜貫通らせんを特徴とする。広範な研究により、これらのレセプターについてμ、δ及びκサブタイプの存在が示されている。これらのサブタイプについての主要なリガンドは、エンケファリン類、エンドルフィン類及びダイノルフィン類のような内在性ペプチド及びホルモンであることが知られている。固定化は、固定化人工膜（ＩＡＭ（商標））クロマトグラフィ定常相のリン脂質一重層上で行った。
【００２０】
オピオイドＧＰＣＲレセプター及びそれらのリガンドの研究において、ＣＨＯ−ＭＯＲ、ＫＯＲ、ＤＯＲ及びＨＥＫ−２９３−ＭＯＲ細胞を培養し、収穫し、−７０℃で保存した。固定化手順のためには、約５０×１０６細胞膜ペレットを、緩衝液中でソニケーターを用いて、５×１０秒間ホモジナイズした。大きい細胞粒子及びオルガネラの除去のため、懸濁液を１８０×ｇで１０分間遠心した。細胞膜を分離するために、上記の上清を５５，０００×ｇで２５分間遠心した。得られたペレットを、２％コール酸ナトリウム界面活性剤を含有する可溶化緩衝液に４℃で一晩懸濁した。この懸濁液を、１００，０００×ｇで３５分間遠心した。
【００２１】
今や界面活性剤中に可溶化された膜タンパクを含有する上清に、０．２ｍｇのＩＡＭビーズ及び５０ｕｌ、ｍｌ又はμｌのホスファチジルコリンリポソームを添加して、総濃度７０μＭとした。この混合物を、室温で約３時間攪拌した。界面活性剤の除去は、４℃で２×１Ｌの透析緩衝液中で２〜３日間の透析によって達成した。
【００２２】
界面活性剤の除去に際し、脂質及びタンパク質は再構成され、ＩＡＭ（商標）ビーズの炭化水素鎖とともに層を形成し、マトリックスに固定化される。固定化された膜のフラグメント及びレセプターを含むＩＡＭ（商標）支持体を遠心した。固体を集めてＨＲ５／２クロマトグラフィガラスカラムに詰め、０．４ｍｌのゲルベッドを得た。このカラムを、ＨＰＬＣポンプに接続し、リガンドを別個に注入して、ラジオフロー検出器によってゾーン及びフロントの両方のクロマトグラフィモードでオンライン検出した。
【００２３】
実施例２
μ及びκサブタイプに対するいくつかのアゴニスト及びアンタゴニストについての予備的な結合研究により、レセプターに対する相対親和性が示される。フロントクロマトグラフィゾーンにおいて、κアゴニストであるＵ６９５９３についての親和性研究におけるブレークスルーは、結合部位の１４７ｐｍｏｌｅについて初期Ｋｄ＝８４ｎＭを示した。この化合物についてのＫｄ値は、他の報告された値であるＫｄ＝１ｎＭと一致する。
【００２４】
周知のＧＰＣＲのいくつか及びそれらの関連リガンドの一覧表を表１に表す。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
本発明の方法を用いて、ＧＰＣＲレセプターを有する支持体を化合物に曝し、次にクロマトグラフィ手段によってこの化合物の存在のクロマトグラフィ評価を行って、この化合物が支持体上に存在するかどうかを決定することができる。本発明の１つの手段を用いて、ＧＰＣＲレセプターを有する支持体を提案された候補促進剤又は阻害剤に曝し、次にこの化合物に曝し、続いて支持体のクロマトグラフィ評価を行って、考慮中の候補促進剤又は阻害剤によってＧＰＣＲレセプターへの結合がこの化合物によって強化又は阻害されたかどうかを決定することによって、提案された化合物‐レセプター相互作用の阻害剤又は促進剤が実際にその相互作用を阻害又は促進するかどうかを決定することも可能である。
【００２７】
本発明は、ある種のオピオイドＧＰＣＲレセプターを用いて例示されているが、あらゆるＧＰＣＲレセプター系を用いることができる。他のＧＰＣＲレセプターを、ここで例示されたものと同様の方式でそれらが機能するかどうかを決定するために試験することができる。他のＧＰＣＲレセプターの例は、上記の表１に列挙されている。
【００２８】
当業界で公知の、ＨＰＬＣタイプの支持体である例示されたもの以外の他の支持体を用いることもできる。ハイドロゲルビーズ又は親水性バーティクル（ｖｅｒｔｉｃｌｅ）支持体系のような支持体も、本発明の方法において用いることができる。本発明の方法は、研究の最後に充分に溶出される試験物質を用いる比較溶出容量プロフィールの評価のみを必要とするので、ＧＰＣＲレセプター結合カラムは繰り返し再使用することができる。
【００２９】
先の具体的態様は、本発明の実施の説明である。本発明は、この明細書に具体的に記載されていない任意の要素又はアイテムの不存在下で好適に実施することができる。ここで同定されたすべての特許、特許出願及び刊行物の完全な開示は、それらが個別に全体で取り込まれているかのように、参照によってこの明細書中に取り込まれる。
【００３０】
本発明の範囲を逸脱しない本発明の種々の改変及び変更は、当業者には明らかであろうし、また、本発明はここに記載された説明的な態様に不当に限定されないものであり、特許請求の範囲に記載された限定及びこれらの限定のあらゆる等価物によって制御されるべきことは理解されるべきである。
【外国語明細書】
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