(57)【要約】【課題】ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する新規遺伝子群、およびその利用方法を提供する。【解決手段】本発明に係る新規遺伝子群は、カタユウレイボヤから単離された遺伝子群であって、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する新規遺伝子群である。これらホヤ由来の新規遺伝子群は、特に各組織及び器官の発生機構の解明に有用であり、さらに、こうした研究を通じて、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患の原因究明、さらにはその診断法や治療法の開発に有用である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードし、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する遺伝子。
（ａ）２以上５２２以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）２以上５２２以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
１以上５２１以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列のオープンリーディングフレーム領域を有する請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
ホヤの尾芽胚の間充織、筋肉、脊索、内胚葉、又は表皮のいずれかの組織若しくは器官において特異的に発現する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項４】
ホヤの幼生の間充織、筋肉、脊索、内胚葉、又は表皮のいずれかの組織若しくは器官において特異的に発現する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項５】
ホヤの幼若体の胃、筋肉、食道、心臓、神経複合体、内柱、表皮、又は鰓裂のいずれかの組織若しくは器官において特異的に発現する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いた遺伝子検出器具。
【請求項７】
２以上５２２以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなり、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現するタンパク質。
【請求項８】
２以上５２２以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現するタンパク質。
【請求項９】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１１】
請求項７又は８に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホヤの発生段階において組織特異的に発現する新規遺伝子群、およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、生物の発生についての研究が急速に進んでおり、このような発生の研究では種々の生物材料が使用されている。発生の研究は主として遺伝子を解析することにより行われるが、とりわけ、ヒトを含む脊椎動物、さらにはホヤ等の脊索動物の発生段階において特異的に発現する遺伝子を解析することは、単に発生のメカニズムの解明のみならず、細胞の増殖・分化・再生のメカニズムの解明にも資するものである。さらに、このような解析により得られた知見は、医学上及び産業上への応用も期待されている。具体的には、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患の原因究明、さらにはその診断法や治療法の開発に貢献すること等が期待されている。
【０００３】
発生段階において特異的に発現する遺伝子には、組織又は器官特異的に発現する遺伝子があり、このような遺伝子は、その特異的に発現する組織又は器官の形成および機能に何らかの役割を担っているものと考えられる。
【０００４】
上述のように、生物の発生についての研究対象となっている生物の１つにホヤが挙げられる。ホヤは、世界中の海に広く分布しており、岩やブイに付着して生活する生物である。ホヤの成体は、入水口及び出水口という２つの開口部を有しており、この開口部を通過する海水から栄養物を濾過摂食する。ホヤはすべて雌雄同体であり、ホヤの受精卵は、比較的短時間に胞胚、嚢胚、神経胚、尾芽胚を経て、オタマジャクシ型幼生へと変態する。ホヤの幼生は、しばらく遊泳したのち変態して成体となる。ホヤの形態形成パターンは、予定神経細胞が巻きあがって神経管を形成するなど、脊椎動物の発生様式とよく似ている。
【０００５】
ホヤは尾索動物群に属し、ナメクジウオを含む頭索動物、カエルやヒトを含む脊椎動物とともに脊索動物門を構成する。尾索動物は尾に脊索を持ち、頭索動物は脊索が頭部の先端まで延びており、脊椎動物は発生に伴って脊索が椎骨に置き換わる。これらの３つの動物群には、脊索、脊側の中空の神経管、咽頭の裂け目である鰓裂など、いくつかの共通した形質がある。脊索動物は、今から約５億年以上昔に、上述した脊索動物に特有の性質を獲得することによって、新口動物から進化してきたものと考えられている。新口動物とは、脊索動物、半索動物、及び棘皮動物を含む動物群である。半索動物の例としてはギボシムシが、棘皮動物の例としては、ウニ、ヒトデなどが挙げられる。
【０００６】
ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制（ボディプラン）は、両生類のオタマジャクシ幼生のミニチュア版ともいうべきものであり、脊椎動物の体制の最も単純な型（原型）を表している。そのため、脊椎動物の体制を研究する上で、ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制を調べることは、極めて重要な意味をもつ。ホヤの受精卵がどのように分裂して、胚を構成する各割球がどのような位置を占めて、最終的に何個のどのような細胞を生みだすのかというホヤの細胞系譜は、ほぼ完全に調べられている。
【０００７】
ホヤのオタマジャクシ型幼生を構成する細胞の数は少なく、２６５０個に満たない。しかしながら、これらの細胞は、表皮、中枢神経系、内胚葉（消化器系）、間充織、筋肉、および脊索などの組織又は器官を構成しており、このホヤのオタマジャクシ型幼生の体制は、我々ヒトの体における初期の発生段階の基本的な体制と全く同一である。
【０００８】
ホヤのオタマジャクシ型幼生の頭部の背側には、耳に相当する平衡器と眼に相当する眼点とを含む中枢神経系が存在する。この中枢神経系を構成する細胞数は約３５０個であり、そのうち神経細胞は約８０個と見積もられている。上記中枢神経系の腹側には消化器系をつくりだす約５００個の細胞からなる内胚葉、首の部分には約９００個の細胞からなる間充織が存在する。上記間充織は、主として成体の中胚葉を形成する。
【０００９】
ホヤのオタマジャクシ型幼生の尾部の中央には、４０個の細胞からなる脊索、その両側には単核で横紋をもった筋肉が、また背側にはグリア細胞からなる神経索、腹側には内胚葉索が存在し、幼生全体は１層の表皮によって覆われている。上記脊索は、上記内胚葉の誘導作用を受けて形成され、脊索動物の個体発生において重要な役割を果たす。形成された脊索は、その背側の外胚葉に働きかけて神経系形成を誘導するばかりでなく、脊索の両側における筋肉のパターン形成、及び消化器系の形成にも重要な働きをする。
【００１０】
本発明者は以前、カタユウレイボヤの尾芽胚における遺伝子発現プロファイルを報告している（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２８，２８９３−２９０４（２００１））。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、脊椎動物などを用いて発生段階に発現する遺伝子（発生遺伝子）の解析が急速に進められているが、脊椎動物において、発生遺伝子の機能の解析を行なうには次の問題点がある。
【００１２】
脊椎動物は、進化にともなって、ゲノムレベルで２回の遺伝子重複が起こったと考えられており、この遺伝子重複が遺伝子機能のリダンダンシー（冗長性）を引き起こし、脊椎動物の遺伝子機能の解析を難しくしている。最近の研究では、脊索動物の共通の祖先から脊椎動物への進化のルートをたどった動物は、その進化の間に遺伝子の全体的な重複が２回おこったことが明らかになっている。
【００１３】
上記のように進化の間に遺伝子の全体的な重複が２回起こり、無脊椎動物の遺伝子数を約１万５千と仮定した場合、ヒトを含む脊椎動物の遺伝子数は、６万程度存在することになる。一般的に、Ａという親遺伝子が重複してＡ＋Ａ’になった場合、Ａはもともとの機能を保持し、Ａ’にはＡと異なった新しい機能が付加されると考えられている。
【００１４】
しかしながら、脊椎動物の進化時におこった発生遺伝子の重複は、ＡがＡ＋Ａ’＋Ａ’’＋Ａ’’’となっても、４つの遺伝子の機能は基本的に同じであるが、微妙にその空間的・時間的発現パターンを変えている。これによって、原型的な脊索動物には認められないような量的にも質的にも異なった器官及び組織をつくり出し、巧妙な遺伝子の相互作用によって機能を増し、現存する非常に複雑な体制を、脊椎動物は得たと考えられている。
【００１５】
上述のように、遺伝子重複による遺伝子機能のリダンダンシー（冗長性）が存在しているため、脊椎動物の遺伝子機能の解析は難しいという問題点がある。
【００１６】
最近の研究では、ハエ、線虫、カエル、哺乳類などの様々な動物の体づくりが、基本的には同じ遺伝子や分子を使ってなされているということが明らかになっている。このような体づくりに関与している遺伝子としては、例えば、体の前後軸の確立にたずさわるホメオボックス遺伝子群、心臓の発生に関与するｔｉｎｍａｎ遺伝子、動物の目の発生に関与しているＰａｘ６遺伝子などが挙げられる。
【００１７】
脊索動物であるホヤの遺伝子は、上述のような、脊椎動物における遺伝子の重複がなく、遺伝子重複前の脊索動物の基本型を保っている。また、ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制は、脊索動物の体制の最も単純な型（原型）を表している。したがって、脊索動物であるホヤは、ヒトを含む脊椎動物全般の発生メカニズムの解明に非常に適したモデル動物であり、ホヤにおいて発生段階に発現する遺伝子、とりわけ組織又は器官特異的に発現する遺伝子は、発生の研究を進める上において有用であるのみならず、遺伝子治療や再生医療等の医療分野、さらには環境分野・食品分野などへの応用も期待されるものである。
【００１８】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する新規遺伝子群、およびその利用方法を提供することにある。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前述のように、ホヤの遺伝子には脊椎動物における遺伝子の重複がないこと、ホヤの発生遺伝子は遺伝子重複前の脊索動物の基本型を保っていること、及び、ホヤの発生遺伝子は脊索動物のボディプランの最も単純な型（原型）の形成に関与していることに着目した。
【００２０】
そこで、本発明者は、ホヤの発生遺伝子の時間的・空間的発現機構を解析することによって、脊椎動物の複雑な発生遺伝子の時間的・空間的発現機構の解明に重要な貢献をもたらすものと考えた。本発明者は、ホヤにおける発生遺伝子の時間的・空間的発現機構を解析する上で、特に、ホヤの発生段階において組織及び器官特異的に発現する遺伝子の機能を明らかにすることが重要であると考えた。
【００２１】
本発明者は、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）の受精卵・卵割期胚・尾芽胚・幼生・幼若体・精巣で発現する遺伝子のｍＲＮＡに対して、３’側７６，９２０及び５’側７６，２５０のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ：発現配列タグ）解析を行った。これらの中から約５，０００の遺伝子を選びｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってその発現を調べたところ、約５００の遺伝子がホヤの尾芽胚、幼生、または幼若体の組織あるいは器官において特異的に発現することを見出した。本発明者は、それらの中から２６１の遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の全塩基配列を決定して、本発明を完成させるに至った。
【００２２】
本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードし、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する遺伝子である。
（ａ）２以上５２２以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）２以上５２２以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００２３】
ここで言う「ホヤの発生段階」とは、ホヤの受精卵、卵割期胚、尾芽胚、幼生、及び幼若体を含むものとする。
【００２４】
なお、「２以上５２２以下の偶数の配列番号」とは、具体的に言うと、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００、４０２、４０４、４０６、４０８、４１０、４１２、４１４、４１６、４１８、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、及び５２２のことである。
【００２５】
本発明の「遺伝子」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えば、クローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせにより得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる。なお、「遺伝子」がＲＮＡを意味するときは、塩基配列の「Ｔ（チミン）」を「Ｕ（ウラシル）」と読み替えて解釈するものとする。
【００２６】
本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２７】
本発明の遺伝子は、１以上５２１以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を有する。
【００２８】
なお、「１以上５２１以下の奇数の配列番号」とは、具体的に言うと、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９、４０１、４０３、４０５、４０７、４０９、４１１、４１３、４１５、４１７、４１９、４２１、４２３、４２５、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３、４６５、４６７、４６９、４７１、４７３、４７５、４７７、４７９、４８１、４８３、４８５、４８７、４８９、４９１、４９３、４９５、４９７、４９９、５０１、５０３、５０５、５０７、５０９、５１１、５１３、５１５、５１７、５１９、及び５２１のことである。
【００２９】
本発明の遺伝子は、１以上５２１以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有するものであってもよい。
【００３０】
ここで、「１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列」とは、公知のＤＮＡ組換え技術、変異導入方法により欠失、置換、挿入、及び／又は付加できる程度の数の塩基が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を意味する。
【００３１】
本発明の遺伝子は、ホヤ由来の遺伝子である。ここで言うホヤとは、ホヤ類に属する動物を指し、例えば、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｓａｖｉｇｎｙｉ）、マボヤ（Ｈａｌｏｃｙｎｔｈｉａ　ｒｏｒｅｔｚｉ）が挙げられる。
【００３２】
本発明の遺伝子は、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する遺伝子であるが、さらに、下記ｃ）〜ｅ）のいずれかの特徴によって特定されるものであってもよい。
ｃ）ホヤの尾芽胚の間充織、筋肉、脊索、内胚葉、又は表皮のいずれかの組織若しくは器官において特異的に発現する。
ｄ）ホヤの幼生の間充織、筋肉、脊索、内胚葉、又は表皮のいずれかの組織若しくは器官において特異的に発現する。
ｅ）ホヤの幼若体の胃、筋肉、食道、心臓、神経複合体、内柱、表皮、又は鰓裂のいずれかの組織若しくは器官において特異的に発現する。
【００３３】
本発明の遺伝子検出器具は、上記に記載の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いている。
【００３４】
上記遺伝子検出器具は、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する遺伝子の発現パターンのモニタリングを行なうことができる。本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子を基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。
【００３５】
本発明のタンパク質は、２以上５２２以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなり、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する上記（ａ）のタンパク質である。
【００３６】
本発明に係るタンパク質は、細胞などから単離精製された状態であってもよいし、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよい。また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨＡやＭｙｃ、ｆｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００３７】
本発明に係るタンパク質は、２以上５２２以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する上記（ｂ）のタンパク質であってもよい。
【００３８】
ここで、「１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法などの公知の変異タンパク質作製法により欠失、置換、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたことを意味する。
【００３９】
このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質である。ここにいう「変異」は、主として、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００４０】
上記変異タンパク質の性質は特に限定されるものではなく、もとの野生型のタンパク質と同様の機能を有するものであってもよいし、野生型のタンパク質の機能を担う領域に変異を生じさせることにより、もとの野生型のタンパク質が有していた機能を増強したもの、その機能が弱まったもの、あるいはその機能が失われたものであってもよい。
【００４１】
本発明の組換え発現ベクターは、上記に記載の遺伝子を含んでいる。このベクターを用いると、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、形質転換体を得ることができる。さらに、そのベクターに含まれる遺伝子がコードする遺伝子を対象細胞（宿主細胞）内で発現させることにより、目的とするタンパク質を生産することができる。
【００４２】
本発明に係る形質転換体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（ホヤ、海洋生物、魚類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、ホヤは現在、実験動物・モデル動物として広く用いられており、本発明に係る遺伝子やタンパク質を用いた発生や再生等の研究に利用できるだけでなく、本発明に係る遺伝子やタンパク質のヒトホモログの関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などにも有用である。
【００４３】
本発明の抗体は、上記に記載のホヤの発生段階において組織特異的に発現する遺伝子がコードするタンパク質およびその改変タンパク質に対する抗体である。
【００４４】
なお、本発明に係るタンパク質に対する抗体の生産方法は、特に限定されるものではない。例えば、本発明に係るタンパク質に対する抗体は、本発明に係るタンパク質それ自体、又はそのタンパク質の部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法により、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００４５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。尚、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４６】
（１）ホヤについて
本実施の形態においては、ホヤの１種であるカタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）を用いた。カタユウレイボヤは、ホヤの中でも世界で広く研究されている種である。また、カタユウレイボヤのゲノムサイズは約１６０Ｍｂ（Ｍｂ＝１００万塩基）であり、カタユウレイボヤの遺伝子数は約１５，５００と見積もられている。これは、ショウジョウバエのゲノムサイズ及び遺伝子数にほぼ匹敵する。さらに、カタユウレイボヤの発生遺伝子の時間的・空間的発現を調節する配列（基本的プロモーター及びエンハンサー）のほとんどは、転写開始点の上流約１ｋｂ以内、場合によっては約２００塩基対以内におさまっている。したがって、カタユウレイボヤのゲノムは、多くの遺伝子が比較的コンパクトにつまった型のゲノムであることが予想される。
【００４７】
（２）遺伝子及びタンパク質について
次に、本実施の形態における遺伝子及びタンパク質について説明する。本実施の形態における遺伝子は、ホヤから単離され、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する遺伝子である。本実施の形態における遺伝子は、２以上５２２以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であって、より具体的には、１以上５２１以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を有している。
【００４８】
上記オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域は、配列表の数字見出し＜２２２＞、および下記の表１〜表６の「翻訳領域」の項目に示している。例えば、配列番号１に示される塩基配列は、９８８〜２１１２番目の塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有するが、この場合、配列表の数字見出し＜２２２＞の項においては「＜２２２＞　（９８８）．．（２１１２）」のように示され、下記の表１〜表６の「翻訳領域」の項においては「９８８〜２１１２」のように示される。
【００４９】
本実施の形態の遺伝子は、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する遺伝子であるが、具体的には、ホヤの尾芽胚の間充織、筋肉、脊索、内胚葉、又は表皮のいずれかの組織若しくは器官において特異的に発現する遺伝子、あるいは、ホヤの幼生の間充織、筋肉、脊索、内胚葉、又は表皮のいずれかの組織若しくは器官において特異的に発現する遺伝子、あるいは、ホヤの幼若体の胃、筋肉、食道、心臓、神経複合体、内柱、表皮、又は鰓裂のいずれかの組織若しくは器官において特異的に発現する遺伝子である。
【００５０】
本発明者は、カタユウレイボヤの発生段階における遺伝子の発現プロファイルを解析する目的で、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）の受精卵・卵割期胚・尾芽胚・幼生・幼若体・精巣で発現する遺伝子のｍＲＮＡに対して、３’側７６，９２０及び５’側７６，２５０のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ：発現配列タグ）解析を行った。
【００５１】
上記ＥＳＴ解析により得られた配列情報の中から、約５，０００の遺伝子を選びｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってその発現を調べたところ、約５００の遺伝子がホヤの尾芽胚、幼生、または幼若体の組織あるいは器官において特異的に発現することを見出した。本発明者は、この中から２６１の遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の全塩基配列を決定して、本発明を完成させるに至った。
【００５２】
上記ホヤの尾芽胚、幼生、または幼若体の組織若しくは器官において特異的に発現する遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列は、１以上５２１以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される。また、上記ホヤの尾芽胚、幼生、または幼若体の組織若しくは器官で特異的に発現する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、２以上５２２以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される。以下では、これらの遺伝子及びタンパク質について、表１〜表２３に基づいて説明する。
【００５３】
【表１】
2004057129.tif 000002
【００５４】
【表２】
2004057129.tif 000003
【００５５】
【表３】
2004057129.tif 000004
【００５６】
【表４】
2004057129.tif 000005
【００５７】
【表５】
2004057129.tif 000006
【００５８】
【表６】
2004057129.tif 000007
【００５９】
上記表１〜表６の各項目について説明する。「配列ＩＤ」の項目には、本発明者によって見出されたホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する２６１の各遺伝子に付された番号を記している。後述の表７〜表１２、及び表１４〜表２３中の「配列ＩＤ」の項目も同様である。
【００６０】
「配列番号」の項目の左側の列には、本実施の形態における遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列と該ｃＤＮＡ配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列とが併記された配列の配列番号を記している。「配列番号」の項目の右側の列には、本実施の形態におけるタンパク質のアミノ酸配列の配列番号を記している。すなわち、「配列番号」の項目の右側の列に記載の配列番号に示されるアミノ酸配列は、「配列番号」の項目の左側の列に記載の配列番号に示されるｃＤＮＡ配列とアミノ酸配列とが併記されている配列におけるアミノ酸配列のみを単独で表わした配列である。
【００６１】
表１〜表６の「ｃＤＮＡの長さ」の項目には、本実施の形態における遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列の総塩基数を記載している。「アミノ酸残基の数」の項目には、本実施の形態におけるタンパク質のアミノ酸残基数を記載している。
【００６２】
表１〜表６の「翻訳領域」の項目における左側の数値は、アミノ酸翻訳開始位置を示しており、右側の数値はアミノ酸翻訳停止位置を示している。上記アミノ酸翻訳停止位置は、終止コドンを含まないものとする。すなわち、「翻訳領域」の項目は、本実施の形態における遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域を示している。なお、「翻訳領域」の項目における右側の数値に「［　　］」を付しているものは、ＯＲＦの３’側がストップコドンで終わっていない可能性があると判定されたものである。
【００６３】
【表７】
2004057129.tif 000008
【００６４】
【表８】
2004057129.tif 000009
【００６５】
【表９】
2004057129.tif 000010
【００６６】
【表１０】
2004057129.tif 000011
【００６７】
【表１１】
2004057129.tif 000012
【００６８】
【表１２】
2004057129.tif 000013
【００６９】
次に、上記表７〜表１２の各項目について説明する。表７〜表１２には、「配列ＩＤ」、「機能的分類」、「尾芽胚」、「幼生」、「幼若体」、及び「Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ」の項目がある。
【００７０】
「機能的分類」の項目には、各遺伝子がコードするタンパク質の機能に関する情報を示している。機能的分類の最初の文字がＡのもの（ＡＩ〜ＡＩＸ）は、多種の細胞で一般的に使われている機能にかかわることを示し、最初の文字がＢのもの（ＢＩ〜ＢＩＩＩ）は、細胞間コミュニケーションにかかわることを示し、最初の文字がＣのもの（ＣＩ〜ＣＩＩＩ）は、転写因子及び遺伝子発現の制御にかかわることを示し、最初の文字がＤのもの（ＤＩ〜ＤＩＩ）は、十分な類似性検索情報がないことを示している。また、「機能的分類」に記した各記号の意味について、以下の表１３に示す。
【００７１】
【表１３】
2004057129.tif 000014
【００７２】
上記「機能的分類」は、基本的に、文献（Ｌｅｅ，　Ｙ．−Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　１２６，　３８５７−３８６７（１９９９））に記載の分類法に従ったものである。
【００７３】
上記表７〜表１２の「尾芽胚」、「幼生」、及び「幼若体」の項目は、ホヤの尾芽胚、幼生、又は幼若体の各発生段階において、１〜２６１の配列ＩＤにて示される各遺伝子が特異的に発現する組織若しくは器官を示している。例えば、配列ＩＤ１に示される遺伝子は、幼若体の鰓裂において特異的に発現する。例えば、配列ＩＤ３９に示される遺伝子は、尾芽胚の間充織、及び幼生の内胚葉において特異的に発現する。
【００７４】
ここで、ホヤの尾芽胚における各組織および器官について図１に基づいて説明する。図１（ａ）はホヤの尾芽胚の正中断面を示す模式図であり、（ｂ）はホヤの尾芽胚の矢状断面を示す模式図である。図１（ａ）及び（ｂ）に示すように、尾部の中央には、脊索、その両側には筋肉が存在し、背側には神経索、腹側には内胚葉索が存在する。また体幹部（頭部）の中央には内胚葉が、首の部分には間充織が存在し、全体は１層の表皮によって覆われている。
【００７５】
上記表７〜表１２の「尾芽胚」、「幼生」、及び「幼若体」の項目に記載の組織及び器官は、ホールマウントｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果から判断したものである。上記ホールマウントｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果の例を図２に示す。
【００７６】
図２（ａ）は尾芽胚の表皮において特異的に発現する遺伝子のホールマウントｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果の例であり、以下同様に、（ｂ）及び（ｃ）は尾芽胚の間充織、（ｄ）及び（ｅ）は尾芽胚の筋肉、（ｆ）は尾芽胚の脊索、（ｇ）は幼生の脊索、（ｈ）及び（ｉ）は尾芽胚の内胚葉、（ｊ）は幼生の内胚葉において発現する遺伝子のホールマウントｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果の例である。図２（ａ）〜（ｊ）に示すように、各組織又は器官特異的なシグナルが検出されており、各組織又は器官において特異的に発現する遺伝子であることが確認できる。
【００７７】
尾芽胚の時期においては、ホヤ幼生を構成する組織や器官の分化が始まるときであり、それぞれの組織形成にかかわる遺伝子が働いていると考えられる。幼生の時期においては、ある意味では完全に分化し独特な機能をもった細胞の集まりからなるといえる。特に、神経系などの機能にかかわっている遺伝子の発現が期待される。幼若体の時期においては、既に多くの成体器官の形成が進んでおり、幼生とは異なった遺伝子の発現が期待される。
【００７８】
上記表７〜表１２の「Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ」には、相同性検索の結果挙げられた各既知クローンとの相同性の程度を示す確率（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）が記される。
【００７９】
【表１４】
2004057129.tif 000015
【００８０】
【表１５】
2004057129.tif 000016
【００８１】
【表１６】
2004057129.tif 000017
【００８２】
【表１７】
2004057129.tif 000018
【００８３】
【表１８】
2004057129.tif 000019
【００８４】
【表１９】
2004057129.tif 000020
【００８５】
【表２０】
2004057129.tif 000021
【００８６】
【表２１】
2004057129.tif 000022
【００８７】
【表２２】
2004057129.tif 000023
【００８８】
【表２３】
2004057129.tif 000024
【００８９】
上記表１４〜表２３の「相同性検索結果」の項目には、ＢＬＡＳＴ（ブラスト）による相同性検索の結果を記載している。本実施の形態における遺伝子において、ＢＬＡＳＴ検索により結果が得られているものは、その検索結果である既知遺伝子と同様の機能を有する可能性が高い。
【００９０】
なお、同項目が空白であるものは、ＢＬＡＳＴ検索の結果、あらかじめ設定した基準以上の相同性を示す既知の配列が得られなかったもの（上記表１３のＤＩＩにあたる）である。
【００９１】
なお、本実施の形態におけるタンパク質は、２以上５２２以下の偶数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現するタンパク質であってもよい。
【００９２】
また、本実施の形態における遺伝子は、１以上５２１以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示される塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有する遺伝子であってもよい。
【００９３】
（３）遺伝子の取得方法
次に、本発明の遺伝子の取得方法について説明する。本発明の遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記各遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
【００９４】
例えば、上記各ｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ホヤのゲノムＤＮＡライブラリやｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各ｃＤＮＡ配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００９５】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００９６】
また、上記プローブの配列を機能上重要と考えられる領域や進化上よく保存されている領域の中から選択し、ホヤやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリをスクリーニングすれば、上記各遺伝子と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００９７】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記各ｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてホヤのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００９８】
（４）タンパク質の取得方法
本発明に係るタンパク質の取得方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上記各ｃＤＮＡ配列を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
【００９９】
なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の組換え領域に宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター、及び、宿主には様々なものがある。そのため、それら発現ベクター及び宿主は、目的に応じて選択すればよい。また、生産したタンパク質は、用いた宿主と、タンパク質の性質とに応じて、適切な条件下で精製及び取得すればよい。
【０１００】
上記タンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上記各ｃＤＮＡの塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【０１０１】
（５）遺伝子検出器具
次に、本実施の形態における遺伝子検出器具について説明する。本実施の形態の遺伝子検出器具は、例えば、本発明の遺伝子における少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いたものである。
【０１０２】
本実施の形態における遺伝子検出器具としては、例えば、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチド（プローブ）を固定化して作るＤＮＡチップが挙げられる。なお、ここで言う「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味する。しかし、ここで言う「ＤＮＡチップ」とは、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
【０１０３】
上記基盤上に固定化するオリゴヌクレオチドは、１以上５２１以下の奇数の配列番号のうち、いずれか任意の配列番号に示されるＤＮＡ配列であって、そのＤＮＡ配列にあるコード領域内の７ヌクレオチド以上の連続したＤＮＡ配列、又はその連続したＤＮＡ配列の相補配列からなることがより好ましい。
【０１０４】
プローブとして用いる配列は、調製したｃＤＮＡのそれぞれについて、個々を識別することが可能な特徴的な配列を特定する従来公知の方法によって決定することができる。例えば、ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７６：１２６８，　１９９７；　Ｃｅｌｌ　８８：２４３，　１９９７；　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：４８４，　１９９５；　Ｎａｔｕｒｅ　３８９：３００，　１９９７；　米国特許第５，６９５，９３７　号）により、プローブとして用いる配列を決定することができる。
【０１０５】
ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フォトリソグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基盤上で該オリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合には、アレイ機を用いて基盤上に貼り付ければよい。
【０１０６】
一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置して遺伝子の検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なる遺伝子を並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基盤上に固定してＤＮＡチップを構成してもよい。
【０１０７】
（６）組換え発現ベクター及び形質転換体
次に、本実施の形態における組換え発現ベクター及び形質転換体について説明する。本実施の形態における組換え発現ベクターは、本発明の遺伝子の少なくとも１つを含むものである。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、遺伝子を発現可能となるようなプロモーター配列を適宜選択し、これと本発明に係る遺伝子とを各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【０１０８】
本実施の形態の形質転換体は、本発明の遺伝子の少なくとも１つを含有する組換えベクターを含むものである。本発明の遺伝子を発現する形質転換体は、従来公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、上記組換え発現ベクターを対象細胞（宿主細胞）内に発現可能となるように導入することによって生産することができる。
【０１０９】
上記の遺伝子工学的手法も特に限定されるものではなく、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。これら遺伝子工学的手法は、対象細胞（宿主細胞）の種類に応じて最適なものを選択すればよい。
【０１１０】
（７）抗体
次に、本実施の形態における抗体について説明する。本実施の形態における抗体は、本発明のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８））」、岩崎らの「単クローン抗体　ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」）に記載の方法が挙げられる。
【０１１１】
（８）有用性
上記のように、本発明に係る遺伝子は、本発明者によって初めて明らかにされた、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する新規遺伝子である。したがって、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は以下の有用性を有する。
【０１１２】
前述のように、ハエ、線虫、カエル、哺乳類など、様々な動物の体づくりは、基本的には同じ遺伝子及び分子を使ってなされていることが明らかになっている。また、脊索動物であるホヤの遺伝子は、前述のように、脊椎動物における遺伝子の重複がなく、遺伝子重複前の脊索動物の基本型を保っている。
【０１１３】
したがって、脊索動物であるホヤの発生段階に発現する遺伝子の解析により得られた知見は、単にホヤにおける発生のメカニズムの解明のみならず、ヒトを含む脊椎動物の発生のメカニズムの解明に資するものである。とりわけ、本発明の遺伝子は、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する遺伝子であるため、脊椎動物における各組織および器官の発生機構の解明に資するものである。
【０１１４】
例えば、すでに機能が判っている遺伝子であっても、それらが発生段階の組織や器官において特異的に発現することから、その組織や器官においてこれまで知られていなかった新しい機能が解明される可能性は高い。こうして得られた知見は、脊椎動物における各組織および器官の発生機構の解明に資するものである。
【０１１５】
前記表の「機能的分類」の項においてＤＩクラスのタンパク質をコードする遺伝子は、その相同遺伝子がヒトなどに存在するにもかかわらず、その相同遺伝子の機能は未だ十分に解明されていない。本発明の遺伝子は、このような相同遺伝子の機能解明に資するものである。
【０１１６】
前記表の「機能的分類」の項においてＤＩＩクラスのタンパク質をコードする遺伝子についても、それらが発生段階の組織や器官において特異的に発現することから、今後ヒトを含む脊椎動物において、その相同遺伝子の存在が明らかになる可能性は高く、本発明の遺伝子は、このような相同遺伝子の機能解明に資するものである。
【０１１７】
さらに、このような解析により得られた知見は、細胞の増殖・分化・再生のメカニズムの解明にも資するものであり、また、医学上及び産業上へ有効利用できるものである。具体的には、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患の原因究明、さらにはその診断法や治療法の開発などに有効利用できるものである。
【０１１８】
また、画期的治療法として注目されている再生医療、遺伝子治療の実現にも、本発明の遺伝子、タンパク質等を利用できる可能性がある。例えば、上記のような各組織および器官の発生機構を調べる基礎研究を通じて、再生医療、遺伝子治療に直接役立つ知見が得られる可能性があり、これを利用し、形態形成異常等の各種遺伝子疾患に対して、新たな組織又は器官の再生技術の開発、新たな遺伝子治療法の開発、各種遺伝子疾患の病態機序の研究、その治療薬の開発、さらには、組織および器官の新たな人為的生産技術の開発、といった種々の応用面・臨床面での利用が期待できる。
【０１１９】
本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、細胞の増殖・分化・再生のメカニズムを研究解析するための研究材料としても有用であり、こうした研究を通じて、幹細胞の分化の誘導、及び分化した細胞の増殖を促す等の新たな技術の開発にも有用である。
【０１２０】
上述のように、本発明の遺伝子は、発生段階に組織又は器官特異的に発現するので、例えば、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患においては、その疾患の原因となる遺伝子の発現を調節する等の治療法及び治療薬の開発に利用できる。例えば、発生段階において、ある遺伝子の発現が微量なために起こる疾患では、その疾患の原因となる遺伝子の発現を促す等の治療法及び治療薬の開発に、本発明に係る遺伝子を利用することができる。
【０１２１】
発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患においては、その疾患の原因となる遺伝子に変異が生じている。本発明に係る遺伝子検出器具、及び本発明に係る抗体は、上記のように各組織又は器官特異的に発現する遺伝子に生じた変異が関わる遺伝子疾患の診断及び診断薬に利用できる。
【０１２２】
本発明に係る遺伝子は、環境測定、特に海水などの水質調査に利用できる。例えば、発生段階の生物への影響を調べたい物質を加えて、人為的に調整した海水環境下で発生段階のホヤを飼育し、そのホヤにおける発生遺伝子の発現を本発明に係る遺伝子検出器具を用いて測定する。この場合、調査したい地域の海水を採取して、その採取した海水を用いて発生段階のホヤを飼育してもよい。
【０１２３】
上記のような環境測定により、種々の環境因子に対してそれぞれ感受性を示す遺伝子を特定することができる。例えば、ある地域の海水を用いて飼育したホヤのみが特別な遺伝子発現パターンを示した場合、その海水をさらに詳しく分析することにより、生物の発生に影響を与える環境因子を特定することができる。このような環境測定は、環境浄化や養殖など産業上広く利用できるものである。
【０１２４】
さらに、本発明の遺伝子は、ホヤの形質転換体の作製に利用できる。例えば、食用のホヤの改良に、本発明の遺伝子を利用できる。食用としてのホヤには、例えば、マボヤ（Ｈａｌｏｃｙｎｔｈｉａ　ｒｏｒｅｔｚｉ）が挙げられる。
【０１２５】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１２６】
本発明の各遺伝子の配列（全長ｃＤＮＡ）と、各遺伝子がコードするタンパク質とを次の方法により決定した。
【０１２７】
（１）使用したホヤ
ホヤは、京都大学の舞鶴Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｔａｔｉｏｎ及び東北大学のＥｄｕｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂｉｏ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓで培養したカタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）を使用した。このホヤの成体を一定の光のもとで保持することにより、卵母細胞（ｏｏｃｙｔｅ）の成熟を促した。
【０１２８】
ホヤの卵子及び精子（精巣）は、生殖輸管から外科的に採取した。必要に応じて、受精後、１．３％チオグリコール酸ナトリウム（Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）と、０．０６５％アクチナーゼＥ（Ｋａｋｅｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）とを含んだ海水に卵子を浸すことによって、受精卵からコリオンを除いた。洗浄後、寒天で覆われたシャーレ内で、５０μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンを含んでいるミリポア−フィルタでろ過された海水（ＭＦＳＷ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ　ｓｅａｗａｔｅｒ）とともに、室温（１８℃〜２０℃）下に受精卵を保持した。そのような環境に受精卵を保つことによって、ホヤの卵割期胚、尾芽胚、幼生、及び幼若体を得た。
【０１２９】
（２）ｃＤＮＡライブラリの作製
まず、上記カタユウレイボヤを用いて、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、ホヤの受精卵（受精直後）、卵割期胚、尾芽胚、幼生、及び幼若体から抽出した。また、酸グアニジウムチオシアネイト−フェノール−クロロホルム法（ＡＧＰＣ法）（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１６２，　１５６−１５９（１９８７））により、上記ＲＮＡを抽出した。
【０１３０】
上記ＡＧＰＣ法で抽出したＲＮＡを精製して、ｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を得た。なお、オリゴテクスビーズ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた２回の精製により、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを得た。
【０１３１】
上記精製されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、ＥｃｏＲＩ部位を５’末端に有し、ＸｈｏＩ部位を３’末端に有する２本鎖のｃＤＮＡに変換した。その変換には、ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。
【０１３２】
次に、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで処理されたベクター（ｐＢＳＩＩ−ＳＫ（−））に、上記ｃＤＮＡを結合させた。上記ｃＤＮＡが結合したベクターを、エレクトロポレーションにより、ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に導入して、ｃＤＮＡライブラリを得た。
【０１３３】
上記ライブラリは、Ｇｅｎｅｔｉｘ　Ｑ−Ｐｉｘロボットを使って３８４ウェルプレートに整列した。なお、上記ライブラリは、得られたＲＮＡの由来（受精卵、卵割期胚、尾芽胚、幼生、及び幼若体の由来）が分かるように作製されている。
【０１３４】
（３）塩基配列のシークエンス
塩基配列のシークエンスは、下記の方法で行った。まず、３８４ウェルプレートからクローンを取り出し、ｃＤＮＡ挿入断片をＰＣＲにより増幅した。その増幅は、アガロース電気泳動法を用いて、良好な増幅であることを確認した。
【０１３５】
上記ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を精製した後、オートシークエンサーを用いて、そのＰＣＲ産物の塩基配列を従来の手法で決定した。なお、オートシークエンサーは、Ａｃａｄｅｍｉａ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊａｐａｎのオートシークエンサー（ＡＢＩ３７００）を用いた。塩基配列の決定には、上記のオートシークエンサーとともに、ビッグダイターミネータ（ｔｈｅ　ｂｉｇ−ｄｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）も用いた。なお、シークエンスにおいて、３’配列用のプライマーに固着オリゴｄＴプライマー（５’−（Ｔ）１７−Ｖ−３’）を、５’配列用のプライマーにＢＳ７４０（５’−ＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧ−３’）を用いた。
【０１３６】
（４）クラスタリング及び相同性検索
３’末端配列タグを用いてクローンの重複を調べ、クローンをクラスタに分類した。上記クラスタの分類には、ＦＡＳＴＡプログラムを用いた。それぞれのクラスタは、同一の遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンを含んでいる。
【０１３７】
次に、３’側７６，９２０のＥＳＴ及び５’側７６，２５０のＥＳＴの塩基配列について、相同性検索を行った。相同性検索には、データベースとして、遺伝子データベース（ＤＤＢＪ　ＤＮＡデータベース）と、タンパク質データベース（ＤＡＤ）とを用いた。相同性検索には、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ）を用いた。
【０１３８】
上記相同性検索により、遺伝子がコードするタンパク質の情報を得て、そのタンパク質の情報を、文献（Ｌｅｅ，　Ｙ．−Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　１２６，　３８５７−３８６７（１９９９））に記載の分類法に基本的に従って分類した。その結果を、表７〜表１２における「機能的分類」に示す。
【０１３９】
（５）ｃＤＮＡ全長の決定
次に、上記相同性検索の結果（ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸの結果）を考慮して、約５，０００の遺伝子を選び出し、その約５，０００の遺伝子について、ホールマウントｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）によって、その発現を調べた。上記ホールマウントｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションは、Ｋｕｓａｋａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．（２００２），Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．２４２：１８８−２０３に記載の方法に基づいて行った。
【０１４０】
上記ホールマウントｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーションの結果、約５００の遺伝子が発生段階のホヤの各組織又は器官において特異的に発現することが明らかになった。そこで、それらの中から、２６１の遺伝子（ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ））の全塩基配列を決定した。なお、決定したｃＤＮＡの全塩基配列（全長ｃＤＮＡ配列）は、本発明に係る上記タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域のほか、５’末端側と３’末端側とにそれぞれ非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むものが大半であるが、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含まないものも含まれている。
【０１４１】
【発明の効果】
以上のように、本発明の遺伝子は、ホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する遺伝子であり、各組織及び器官の形成ならびに機能に重要な役割を担っているものと考えられる。それゆえ、本発明は、特に各組織及び器官の発生機構の解明に極めて有用である。さらに、本発明は、このような研究を通じて、医学上及び産業上への応用も期待されており、具体的には、発生段階の異常に起因する種々の遺伝子疾患の原因究明、さらにはその診断法や治療法の開発に有用であるという効果を奏する。
【０１４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）はホヤの尾芽胚の組織及び器官を示す正中断面の模式図であり、（ｂ）はホヤの尾芽胚の組織及び器官を示す矢状断面の模式図である。
【図２】（ａ）〜（ｊ）はホヤの発生段階において組織又は器官特異的に発現する遺伝子のホールマウントｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの実験結果の例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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