(57)【要約】      （修正有）【課題】体細胞クローン作出等に有用な体細胞核初期化因子を解明し、提供する。【解決手段】ウシの未受精卵細胞質由来の、二次元電気泳動による蛋白質マーカーを用いる分子量測定における分子量が２０〜２５ＫＤａの、リン酸化された酸性蛋白質である体細胞質初期化因子、特に、特定のアミノ酸配列を有するペプチド鎖を併せ持つ蛋白質を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシの未受精卵細胞質由来の、二次元電気泳動による蛋白質マーカーを用いる分子量測定における分子量が２０〜２５ＫＤａの、リン酸化された酸性蛋白質である体細胞質初期化因子。
【請求項２】
蛋白質が、配列表の配列番号２および３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖を併せ持つ請求項１記載の因子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、体細胞クローン作出等に有用な、体細胞核初期化因子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
体細胞核をＭ期未受精卵に核移植すると、核が変化を受け、個体への発生能を獲得する場合がある。これを核の初期化と称し、初期化した核を有する核移植卵の一部は個体へ発生する。これがいわゆる体細胞クローンの作出である。
このことから、卵細胞質中には体細胞核を初期化する因子が存在することがこれまでから推察されている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、哺乳動物の未受精卵に含まれる蛋白質量は極微量のため、どのような物質が初期化に関与するか全く不明であり、その因子の実体は明らかになっていない。後に説明するＭＰＦが初期化に関わっているのではないかともいわれている。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｔａｎｉ，Ｔ．，  Ｋａｔｏ，Ｙ．  ａｎｄ  Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｙ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｔｏ  ｎｏｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｏｖｕｍ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｉｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ６４，  ３２４−３３０，  ２００１
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、体細胞クローン作出等に有用な体細胞核初期化因子を解明し、提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、体細胞クローンウシの作出について研究を重ねる間に、ウシの未受精卵細胞質中に存在する体細胞核初期化因子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）ウシの未受精卵細胞質由来の、二次元電気泳動による蛋白質マーカーを用いる分子量測定における分子量が２０〜２５ＫＤａの、リン酸化された酸性蛋白質である体細胞質初期化因子、および
（２）蛋白質が、配列表の配列番号２および３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖を併せ持つ上記（１）記載の因子を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、Ｍ期ならびに活性化刺激後１〜６時間目のウシ未受精卵へウシ体細胞を核移植して発生能を調べるとともに、ＭＰＦとＭＡＰＫ活性ならびに蛋白質の変化を調べた。
その結果、核の初期化は卵細胞質中に存在するＭＰＦならびにＭＡＰＫによって支配されていないことが判明した。また、活性化刺激後６時間目の卵細胞質に、二次元電気泳動による蛋白質マーカーを用いる分子量測定における分子量が２０〜２５ＫＤａ、特に、２３ＫＤａの、核の初期化と関連する蛋白質スポットを１個検出した。この蛋白質が体細胞核初期化因子であることが推定された。
【０００８】
すなわち、ＭＰＦ（Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）は、卵成熟促進因子またはＭ期促進因子（Ｍ−ｐｈａｓｅ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）と称され、Ｃｄｃ２キナーゼとサイクリンＢから構成されている。卵巣の中の卵子は、減数分裂の第一分裂前期で停止していおり（未成熟卵子あるいは卵胞卵と称される）、排卵される前に、減数分裂を再開して成熟するが、ＭＰＦはこの再開を誘起する最終因子と考えられ、上記のとおり、哺乳動物においては、これが初期化に関わっているのではないかともいわれてきた。
また、ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ）は、卵内に含まれ卵成熟に関与する物質で、例えば、１０個の未受精卵を溶解し、煮沸後、アクリルアミゲルで電気泳動を行い、ついで、特異的な抗体を用いて活性ウエスタンブロッティングでその活性が測定できる。ＭＡＰＫはカスケードになっているので、ｐ９０ＲＳＫ１、ＭＥＫ１／２、ＭＥＫ１／２の活性を測定する。
上記蛋白質の消長は、ＭＰＦ、ＭＡＰＫ活性とは一致しなかった。
【０００９】
また、脱リン酸化作用のあるアルカリホスファターゼで未受精卵を処置すると、上記蛋白が消失することが二次元電気泳動で確認できること等から、上記蛋白質は、リン酸化されている酸性蛋白であることが判明した。また、卵子に活性化刺激を与えると、例えば、活性化刺激後約６時間で消失することも判明した。
【００１０】
さらに、約２０００個の未受精卵を二次元電気泳動して、目的の蛋白質スポットを切り取り、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ解析に付し、データベースから相同性を検索したところ、上記蛋白質はｆｏｒｔｉｌｉｎ  （ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と類似することが判明した。
ｆｏｒｔｉｌｉｎは、
【化１】
１        ＭＩＩＹＲＤＬＩＳＨ  ＤＥＭＦＳＤＩＹＫＩ  ＲＥＩＡＤＧＬＣＬＥ  ＶＥＧＫＭＶＳＲＴＥ  ＧＮＩＤＤＳＬＩＧＧ
５１      ＮＡＳＡＥＧＰＥＧＥ  ＧＴＥＳＴＶＩＴＧＶ  ＤＩＶＭＮＨＨＬＱＥ  ＴＳＦＴＫＥＡＹＫＫ  ＹＩＫＤＹＭＫＳＩＫ
１０１    ＧＫＬＥＥＱＲＰＥＲ  ＶＫＰＦＭＴＧＡＡＥ  ＱＩＫＨＩＬＡＮＦＫ  ＮＹＱＦＦＩＧＥＮＭ  ＮＰＤＧＭＶＡＬＬＤ
１５１    ＹＲＥＤＧＶＴＰＹＭ  ＩＦＦＫＤＧＬＥＭＥ  ＫＣ
で表される１７２個のアミノ酸からなるアミノ酸配列、すなわち、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するヒトの蛋白で、アポトシスを阻害する作用のある蛋白質であり、上記蛋白質、すなわち、本発明の体細胞核初期化因子はｆｏｒｔｉｌｉｎの配列中、第６番目のアミノ酸から第１９番目のアミノ酸までと、第１１１番目のアミノ酸から第１２３番目のアミノ酸までの配列に相当する、配列表の配列番号２および３で示されるアミノ酸配列のペプチド鎖を併せ持つことが判明した。
【００１１】
かくして、作用機序は明らかではないが、未受精卵に体細胞を核移植した時に、本発明の体細胞核初期化因子が核染色体に結合して、分化した核を初期化する働きを持つと推定され、例えば、以下のような用途に利用できる。
▲１▼体細胞クローン動物の作出に有効に使用できる。
現在の核移植法では、体細胞クローンが作出される割合は低く、また得られた個体に異常などが頻発している。この最も大きい原因として、核の初期化が不十分であることが考えられる。
そこで本発明の体細胞核初期化因子を、核移植前の体細胞にあらかじめ取り込ませて初期化されやすくするか、核移植卵に注入して初期化を促進することによって、クローン個体作出効率の向上や異常な個体の出現頻度を低下させることが可能となる。これは、家畜の育種、改良、増殖を目指して行われているクローンウシやブタの作出に大きく貢献できる。また、トランスジェニック家畜や実験動物の作出にも貢献できる。
【００１２】
▲２▼再生医療に貢献できる。
本発明の体細胞核初期化因子を、体細胞に取り込ませて初期化し、培養をくり返してＥＳ細胞様の状態にできる可能性がある。そうなれば、特定の患者の体細胞を初期化し、特定の組織に分化誘導させ、免疫拒絶反応を心配することなく治療に使用できる。
▲３▼基礎生物学分野の多くの研究に使用できる。
分化した核が初期化される機構の解明、老化と若返り機構の解明、癌細胞を正常細胞にもどす可能性の検討等に利用できる。
【００１３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
卵丘細胞の採取および培養
ウシ卵巣を、屠畜場で採取し、３０〜３５℃に保温した生理的食塩水に入れ、研究室に持ち帰り、卵巣表面にある直径１〜５ｍｍの小卵胞から２１ゲージ針を用いて、３ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ）加ＴＣＭ−１９９（Ｇｉｂｃｏ）中に卵胞液を吸引して採取した。採取した卵胞液を実体顕微鏡下で検査して、卵胞卵を採取した。緊密に卵丘細胞が付着した卵胞卵を選抜して、１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ｇｉｂｃｏ）を含むＴＣＭ−１９９で３回洗浄した。ついで、１０％ＦＢＳ添加修正Ｄ−ＭＥＭで２回洗浄後、１％ゼラチン溶液で表面処理した４穴マルチディシュ（Ｎｕｎｃ）  に１穴あたり５〜１０個の卵胞卵を移し、７日間培養した。なお、培養ディシュの底面を７０〜８０％占める程度まで増殖した細胞は、０．１％トリプシン、０．０５％ＥＤＴＡを含みカルシウムとマグネシウムを含まないＰＢＳ（−）（トリプシン溶液）を培養ディシュに加えて細胞を培養ディシュ表面から浮遊させた。細胞浮遊液は、１５ｍＬ遠心管（Ｆａｌｃｏｎ）に回収して、１２００ｒｐｍで５分間遠心後、上澄を捨て、少量の培養液を加えて細胞数を計測した。ついで、細胞数が７．５×１０４〜３．６×１０５個／ｍＬになるように培養液を加えて、これを４穴マルチディシュにまいた（これを継代回数１とした）。このような方法で、培養細胞が培養ディシュ底面の７０〜８０％を占めるまで増殖した時点で継代を繰り返した。核移植実験には、継代回数が７〜１０回目の細胞を用いて、３９℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気相条件下で細胞培養を行った。
【００１４】
Ｇ０／Ｇ１期ならびにＭ期への同調
Ｇ０／Ｇ１期への卵丘細胞の同調は、培養液中のウシ血清濃度を０．５％に低下させて３日間以上培養することによって行った。またＭ期への同調は、細胞培養中の培地に最終濃度が３μｇ／ｍＬとなるように、ノコダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して２０〜２４時間培養した。細胞周期がＭ期になると細胞の形態が丸くなるという特性を利用して、ノコダゾール処理によって培養ディシュ底面より剥がれてきた細胞をピペッティングにより回収した。
【００１５】
レシピエント卵細胞質
レシピエント卵細胞質には、屠畜場由来卵巣の小卵胞から吸引採取した緊密に卵丘細胞の付着した卵胞卵を、１０％ＦＢＳを含むＴＣＭ−１９９で３回洗浄後、７５０μＬあたり約５０個の割合で４穴ディッシュに移して３９℃にて、５％ＣＯ２、９５％空気の気相条件下で２２〜２４時間成熟培養したものを用いた。成熟培養後、ヒアルロニダーゼ（３００ＩＵ／ｍＬ：Ｓｉｇｍａ）  を用いてピペッティング操作により卵丘細胞を除去し、第一極体を放出している卵子を成熟の指標として選抜した。そして、それらの卵子から第２減数分裂中期の染色体を除去し、残りの卵細胞質をレシピエント卵細胞質として用いた。すなわち、第一極体を放出した卵子を７．５μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を含む胚操作培地（２０％ＦＢＳを含むＴＣＭ−１９９）に移し、倒立顕微鏡下でマイクロマニプレーターに取り付けたガラス針を用いて極体付近の透明帯を１０〜２０％切開し、切開部分が上部になるようにマイクロマニプレーターに取り付けたホールディングピペットに卵子を固定し、そのままガラス針を用いて上から押さえつけることによって、切り口部分から卵細胞質の一部（１０〜２０％）を第一極体とともに押し出した。押し出した細胞質は１μｇ／ｍＬのヘキスト３３３４２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）液で２〜３分間染色後、蛍光顕微鏡下で染色体の有無を検査した。染色体が確認できた場合のみ、残りの卵細胞質をレシピエント卵細胞質として用いた（Ｍ期卵細胞質）。また、活性化卵細胞を用いる場合は、除核卵細胞質を５μＭイオノマイシンで５分間培養後、１０μｇ／ｍＬシクロヘキシミド（ＣＨＹ）または１０μｇ／ｍＬクロヘキシミド＋１０μＭ  Ｕ０１２６で１〜６時間処置後、または２ｍＭ  ６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ）で１〜４時間処置を行った後用いた。
【００１６】
核移植および核移植卵の体外発生能
核移植は、あらかじめ準備したドナー細胞とレシピエント卵細胞質をそれぞれ注入用培地の小滴へ移し、インジェクションピペットにドナー細胞を１個吸引し、レシピエント卵細胞質の囲卵腔に注入した。注入卵は、直ちにＺｉｍｍｅｒｍａｎ液に移して電気融合処理を施した。すなわち、１ｍｍ幅で２本のワイヤー型電極を貼り付けたスライドガラスを１０ｃｍシャーレに入れて、融合液を満たし、電極間へ注入卵子を移した。ついで、倒立顕微鏡下でマニプレータに取り付けたガラス針を用いてドナー細胞とレシピエント卵細胞質の接着面が電極と平行となるように動かした後、電気融合装置（ＢＥＸ）を用いて１５０ｖ／ｍｍ、２５μｓｅｃの直流電流を２回与えて膜融合を誘起した。Ｍ期卵細胞質を用いた場合はさらに、２０ｖ／ｍｍ、２０μｓｅｃの電気刺激を１５分間隔で２回与えて活性化処理を施した。融合がみられた卵子は、１０μｇ／ｍＬ  ＣＨＹを添加した発生培地（ＣＲ１ａａ液）で６時間培養後、５％Ｏ２、５％ＣＯ２、９０％Ｎ２の低酸素条件下のＢＳＡを含むＣＲ１ａａ液で３日間培養した。ついで、マイトマイシン処理したマウス胎子繊維芽細胞とともに１０％ＦＢＳを添加したＣＲ１ａａ液でさらに３日間、１０％ＦＢＳを添加した修正Ｄ−ＭＥＭで２日間共培養して体外発生能を検討した。また、活性化卵細胞質を用いた場合は、ＣＨＹあるいはＣＨＹ＋Ｕ０１２６処置が６時間、または６−ＤＭＡＰ処置が４時間となるようにそれぞれ追加培養を行った。
【００１７】
ＭＰＦならびにＭＡＰＫ活性の測定
染色体が存在するあるいは染色体を除去したＭ期未受精卵、またはそれぞれの方法で活性化刺激を与えた未受精卵を用いて卵成熟促進因子（ＭＰＦ）ならびにＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）  活性を測定した。
ＭＰＦ活性は、ｃｄｃ２キナーゼ活性を測定することによって、またＭＡＰＫ活性はウエスタンブロッティング法によってそれぞれ測定した。
卵細胞質の蛋白質解析
Ｍ期未受精卵ならびにそれぞれの方法で活性化刺激を与えた未受精卵の二次元電気泳動を行い、発現している蛋白質の解析を行った。また、得られた特異蛋白質はＬＣ  ＭＳ／ＭＳ解析を行い、データベースから相同性を検索した。
測定結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
2004161682.tif 000002
【００１９】
表１に示すように、核膜の存在するＧ０／Ｇ１期の細胞を用いた場合と存在しないＭ期の細胞を用いた場合とでは核移植卵の胚盤胞への発生状況は相異した。すなわち、Ｇ０／Ｇ１期の細胞では活性化刺激後１時間目の未受精卵を用いた場合、Ｍ期の未受精卵を用いた場合に比べて発生率は有意に低下した。しかしながら、Ｍ期の細胞を用いると、活性化刺激後５時間目の未受精卵を用いた場合でも低下せず、６時間目の未受精卵を用いた場合に低下した。活性化刺激に伴うＭＰＦ活性の変化の代表的事例を図１に示した。ＭＰＦ活性は１時間目ですでに最低レベルに低下しており、このためＧ０／Ｇ１期の細胞を用いた場合核膜がこわれず体細胞の染色体が卵細胞質にさらされなかった為核の初期化が生じなかったと考えられた。このことから、核の初期化はＭＰＦによって直接支配されず、活性化刺激後６時間目に消失する因子によって制御されていることが明らかとなった。
表２に活性化刺激方法と刺激後の経過時間が、ウシ体細胞核移植卵の発生率に及ぼす影響を示す。
【００２０】
【表２】
2004161682.tif 000003
【００２１】
表２に示すように、胚盤胞への発生率は、活性化方法によって相異し、ＣＨＹ＋Ｕ０１２６を用いた場合は活性化後５時間目の卵子で、６−ＤＭＡＰを用いた場合は４時間目の卵子で発生率が低下した。図２にＭＡＰＫカスケードの変化を示した。ＣＨＹ＋Ｕ０１２６処置で活性化刺激を与えた場合、胚盤胞への発生率が低下する５時間目の卵細胞質中のｐ９０ＲＳＫ１、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２はいずれも脱リン酸化されていないこと、６−ＤＭＡＰ処置で発生が見られない４時間目の未受精卵でも同様に脱リン酸化されていないこと、から核の初期化はＭＡＰＫによって直接制御されていないことが明らかとなった。
活性化前の未受精卵をイオノマイシンとシクロヘキシミドで活性化刺激を与えてから６時間目の未受精卵を用いて二次元電気泳動法を行い、発現している蛋白質の違いを検討した結果、前者には、後者には存在しない２３ＫＤａの蛋白質がみられた。この蛋白質は、卵成熟過程の卵核胞崩壊期から第１減数分裂中期に出現し、アルカリホスファターゼ処置によって消失することが判明した。
また、図３に示すように、この蛋白質は核移植卵が発生する活性化後１〜５時間目の未受精卵には存在し、発生しない６時間後の未受精卵では存在しないことが明らかとなった。このことから、この蛋白質は核の初期化を制御する因子であると考えられた。
また、多数の卵子を用いて電気泳動後、２３ＫＤａのスポットを切り取り、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ解析を行った結果、アポトーシスを阻害すると考えられるｆｏｒｔｉｌｉｎと類似することが明らかとなった。
【００２２】
【発明の効果】
以上のべたごとく、本発明により、体細胞核初期化因子が解明、提供でき、体細胞クローン動物の作出に有効に使用でき、また、再生医療や基礎生物学分野の多くの研究に貢献できる。
【００２３】
【配列表】
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【配列表フリーテキスト】
2004161682.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】活性化刺激に伴うＭＰＦ活性の変化の代表的事例を示すグラフである。
【図２】ＭＡＰＫカスケードの変化を示す図面代用写真である。
【図３】活性化前の未受精卵と活性化刺激を与えてから６時間目の未受精卵における蛋白質の消長を示す図面代用写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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