(57)【要約】【解決手段】ナイスタチン耐性株を選択することによるＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）高蓄積微生物の取得方法が提供される。具体的には、ナイスタチンを含有する選択培地で生育してくる菌株を取得すればよく、ポジティブスクリーニングによるため、効率的且つ正確に目的とする変異株を取得することができる。【効果】本取得方法は、酵母、特に清酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のほか各種微生物に広く適用することができ、本法によって育種分離された変異株を大量培養することにより、ＳＡＭの大量生産が可能となる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイスタチン耐性株を選択すること、を特徴とするＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）高蓄積微生物の取得方法。
【請求項２】
ナイスタチンを含有する選択培地で生育してくる菌株を取得すること、を特徴とするＳＡＭ高蓄積微生物の取得方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法で取得してなるＳＡＭ高蓄積微生物。
【請求項４】
該微生物が酵母であること、を特徴とする請求項３に記載のＳＡＭ高蓄積微生物。
【請求項５】
該酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属又はＣａｎｄｉｄａ属に属する酵母であること、を特徴とする請求項４に記載のＳＡＭ高蓄積微生物。
【請求項６】
ＳＡＭ高蓄積酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＵＮ−２２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２５５）。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の微生物を培養し、培養物からＳＡＭを取得すること、を特徴とするＳＡＭの大量取得方法。
【請求項８】
培養に際し、メチオニン含有培地を使用すること、を特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ナイスタチンを含有してなること、を特徴とするＳＡＭ高蓄積酵母選択培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：以下、ＳＡＭということもある）高蓄積微生物の取得に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）は、生体内の様々なメチル化反応のメチル基供与体として機能する。臨床的には、肝臓機能を高め、有害物質を体内から排出するのを助ける作用があり、従来から肝血症、過度脂血症、動脈硬化症などに対する治療効果があるといわれる。また、神経伝達物質の生成に関わり、集中力を高める働き、炎症・痛みを緩和させる機能を持った物質であり、近年では欧米などでうつ病、老人痴呆症、関節炎の治療に使われている。例えば、ヨーロッパでは処方箋薬として利用され、またアメリカではサプリメントとして利用されている。
【０００３】
このＳＡＭは幅広い調査の結果、あらゆる微生物の中で特に酵母でその生産能力の高いことが明らかとなっており、現在、世界的にＳＡＭの工業的生産は酵母を使用することで行われている。酵母など微生物によるＳＡＭの生産は、従来より、既存の菌株をそのまま用い、その菌での生産培地組成を検討することにより生産性の向上が計られてきた（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。
【０００４】
一方、ＳＡＭ生産性微生物の中から、さらに生産性が向上した変異株を取得できれば大幅な生産性向上が計られるのであるが、そうした努力はほとんどなされていない。なぜなら、微生物の自然的に発生する自然変異、及び変異剤による処理により得られる何億分の１や何十万分の１の割合で存在するであろうＳＡＭ高生産変異株を、膨大な数の菌株の中から単離することが事実上不可能であったからである。
【０００５】
【特許文献１】
特開昭５８−１４６２７４号公報
【０００６】
【非特許文献１】
「アグリカルチュラル  アンド  バイオロジカル  ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」、第４８巻（第９号）、ｐ．２２９３〜２３００、１９８４年
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＳＡＭの大量生産のため、従来主として行われていたＳＡＭ生産菌の培養システムの検討ではなく、微生物自体に着目し、非常に困難であったＳＡＭ高生産菌の取得にあえて挑戦したものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、ＳＡＭ高生産菌を新たに育種するにあたり、変異処理のみではなく、変異処理した後の変異株の選択処理に着目し、そこで本発明者らは、ＳＡＭ高蓄積変異株を容易に濃縮、取得できる方法、つまり効率的なスクリーニング方法を開発するため鋭意研究し、その方法を開発するに至ったものである。
【０００９】
本発明は、１）酵母のエルゴステロール生合成経路において、チモステロール（Ｚｙｍｏｓｔｅｒｏｌ）からフェコステロール（Ｆｅｃｏｓｔｅｒｏｌ）へのメチル化にＳＡＭが関与し、消費されていること、２）ポリエン・マクロライド系抗真菌性抗生物質ナイスタチンは細胞膜中のエルゴステロールにくっつくことで膜構造に変化を与え、膜の透過性障害を起こし菌を死滅させる、との両知見にはじめて着目し、更に研究の結果、遂に完成に至ったものである。
【００１０】
すなわち本発明は、正常な株が生育できないナイスタチンを含有する培地において生育可能となった株を取得することで、その中に高頻度でエルゴステロール生合成系に欠損を持ち、ＳＡＭを高蓄積する株を容易にポジティブスクリーニングすることができる、との新規着想に基づくものであって、この新規着想に基づき、実験をくり返し行った結果、この新規着想には再現性があることを確認し、本発明の完成に至ったものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、人工変異株、野生株その他の非人工変異株ないし天然の変異株を問わず、ナイスタチンに耐性を有する株を選択することによって、ＳＡＭ高含有株を効率的に取得するものである。
【００１２】
なお、本発明に係るナイスタチン耐性株選択によるＳＡＭ高含有株の効率的取得のメカニズムの詳細は今後の研究にまたねばならないが、現時点においては次のように考えられる、すなわちナイスタチンの酵母等真菌への抗菌性には、エルゴステロール（またはそれに近傍のステロール）を必要とするが、ステロール合成系に支障を持ちエルゴステロールを合成できなくなった株では、ナイスタチンの抗菌的機能に必要とされるエルゴステロールが無いか、または十分な量がないため、ナイスタチンに抵抗性を示すようになることが考えられる。また、エルゴステロール生合成系に欠損のある株においては、ＳＡＭがエルゴスデロールの合成に消費されることがないか少ないため、結果として菌体内にＳＡＭを高蓄積することが考えられている。
【００１３】
本発明によれば、突然変異処理した株、非突然変異処理株（人工的突然変異処理によることなく自然に突然変異した株）を問わず、ナイスタチン耐性株を選択すれば、目的とするＳＡＭ高生産株を効率的に取得することができる。
【００１４】
突然変異は定法が適宜利用され、物理的方法及び化学的方法のいずれもが使用可能である。物理的方法としては、紫外線照射、放射線（例えばγ線）照射などがあり、化学的方法としては、例えば、亜硝酸、ナイトロジェンマスタード、アクリジン系色素、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤の溶液に菌体を懸濁させる方法などがある。これらの方法は、適宜組み合わせて行うこともできる。
【００１５】
本発明によれば、ナイスタチン耐性株を選択すれば、酵母、細菌、放線菌、糸状菌、担子菌、乳酸菌その他各種の微生物において、ＳＡＭ高蓄積（又はＳＡＭ高含有）微生物を取得することができ、また、ＳＡＭを高濃度に菌体内に蓄積及び／又は菌体外に分泌する微生物も取得することができる。なお、これらの微生物を総称してＳＡＭ高蓄積微生物ということもある。
【００１６】
糸状菌としては、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｍｕｃｏｒ属に属する微生物が例示され、酵母としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ等のＣａｎｄｉｄａ属やＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母等が例示される。後者においては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｒｏｕｘｉｉ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ、Ｓ．ｂａｉｌｌｉ等が例示される。
【００１７】
また、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する各種の市販酵母、実用酵母、実験室酵母等も本発明の対象微生物であって、その非限定例として下記の微生物が挙げられる：清酒酵母（協会７号酵母、協会９号酵母、協会１０号酵母等）、焼酎酵母（日本醸造協会焼酎用２号酵母等）、ワイン酵母（ブドウ酒１号酵母（日本醸造協会ブドウ酒１号酵母）、ブドウ酒３号酵母、ブドウ酒４号酵母等）、ビール酵母、パン酵母等。
【００１８】
本発明においては、変異微生物の内、ナイスタチン耐性株を選択する点を重要な特色のひとつとして有するものであって、例えば選択培地としてナイスタチン含有培地を用い、生育してくる菌株を選別すればよい。このように本発明におけるスクリーニングは、ポジティブスクリーニングであるので、操作がシンプルでしかも結果判定が正確に行われるため、きわめて効率的である。ナイスタチンの添加は、固体培養、液体培養のいずれでもよく、清酒酵母の場合、１ｍｌあたり５〜５０μｇ、好ましくは１０〜１００μｇ、更に好ましくは例えば４０〜６０μｇ含有したＹＰＤプレートが例示される。他の酵母、他の微生物については、上記数値範囲に基づき適宜定めればよい。
【００１９】
このようにして、目的とするＳＡＭ高蓄積微生物を取得することができ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋ−９（協会９号酵母）及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−Ａ（実験室酵母）を親株として、それぞれ、目的変異株を取得するのに成功した。それらの内のひとつをＫＵＮ−２２と命名し、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９２５５として寄託した。
【００２０】
このようにして分離育種したＳＡＭ高蓄積株を培養することによって培養物からＳＡＭを大量に取得することができる。例えばＫ−９菌から選別された変異株は、酵母細胞乾物重量１ｇあたり、２０ｍｇ以上、好ましくは３５〜４０ｍｇ以上のＳＡＭを高蓄積し、５０ｍｇ以上蓄積する可能性も充分に認められる。また、Ｘ２１８０−Ａ由来の変異株は、同じく１０ｍｇ以上、好ましくは１２〜１４ｍｇ以上のＳＡＭを高蓄積し、２０ｍｇ以上蓄積する可能性も充分に認められる。なお、本実施例によれば、親株の２〜６倍程度のＳＡＭの蓄積が確認されたが、１０倍以上の蓄積も充分可能である。
【００２１】
本発明によれば、ＳＡＭ高蓄積微生物（ナイスタチン耐性株）を培養して該微生物を増殖せしめ、増殖した微生物の培養物からＳＡＭを抽出、取得することによってＳＡＭを大量に取得することがはじめて可能となったのであるが、培養は常法にしたがって行えばよく、その際、親株と変異株との間の増殖特性には格別の相違は認められず、変異株の生育、増殖には親株に比して大きな遅れは認められなかった。なお、培養にあたり、メチオニン添加培地を使用すると更に有利であって、更なるＳＡＭの大量取得が可能となる。メチオニンの添加量は、適宜でよいが、０．０１％以上、好ましくは０．０５％以上、０．１〜０．３％の範囲内が好適である。
【００２２】
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２３】
【実施例１】
実験室酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−１Ａ）及び清酒酵母Ｋ−９（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋ−９：協会９号酵母）を親株とし、常法に基づき紫外線照射で変異処理を行った。生存率はおよそ４％であった。処理菌株を、ナイスタチン５０マイクログラム／ｍｌ含有ＹＰＤプレートに塗布し、３０℃で３日間培養し、生育してきたコロニーをピックアップして、ナイスタチン耐性株を選択、取得した。
【００２４】
このようにしてナイスタチン耐性株として選択した株を、下記組成を有するメチオニン０．１５％添加培地を５ｍｌ用いて、Ｌ−チューブ内で、３８℃にて４８時間振とう培養した。培養した菌体を、１０％過塩素酸を用いてＳＡＭを抽出し（室温、１時間）、上清を希釈し、キャピラリー電気泳動にてＳＡＭ蓄積量の分析を行った。
【００２５】
（培地組成）
グルコース                ５．０％
ペプトン                  １．０％
イーストエキストラクト    ０．５％
ＫＨ２ＰＯ４                ０．４％
Ｋ２ＨＰＯ４                ０．２％
ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ          ０．０５％
Ｌ−メチオニン            ０．１５％
ｐＨ６
【００２６】
このようにして、菌体中に蓄積されたＳＡＭを抽出し、そのＳＡＭ蓄積量をキャピラリー電気泳動によって測定した。キャピラリー電気泳動は下記の条件にて行った。
【００２７】
（分析装置）
キャピラリーイオンアナライザー（Ｗａｔｅｒｓ）
（分析条件）
キャピラリー：  ７５μｍ×６０ｃｍ  Ａｃｃｕｓｅｐ  ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ
バッファー：    ４０ｍＭ  Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ２．５）
ｖｏｌｔａｇｅ：ｐｏｓｉｔｉｖｅ、２０ｋＶ
ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ、３０ｓｅｃ
検出：  ２５４  ｎｍ
温度：  ２５℃
【００２８】
その結果、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ−２１８０−１Ａにおいてはナイスタチン耐性株１００株中８株で、また、清酒酵母Ｋ−９においては３４株中３株で、親株より有意にＳＡＭ高蓄積の株が得られた。
【００２９】
図１にＸ−２１８０  １Ａ株より取得した５株（ＸＵＮ２、ＸＵＮ１２、ＸＵＮ１５、ＸＵＮ４９、ＸＵＮ８９）、図２に清酒酵母Ｋ−９より取得した３株（ＫＵＮ１４、ＫＵＮ１８、ＫＵＮ２２）の菌体内ＳＡＭ量をそれぞれ親株とともに示した。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ−２１８０  １Ａにおいては、それぞれ４．２から５．５倍、清酒酵母Ｋ−９においては１．７から３倍のＳＡＭが蓄積していた。なお、清酒酵母はもともとＳＡＭ蓄積量の極めて多い株として知られているが、さらにその３倍量を高蓄積する株が得られた。
【００３０】
これらの変異株の内、ＫＵＮ−２２株をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＵＮ−２２と命名し、ＫＵＮ−２２の記号表示にて（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９２５５として寄託した。
【００３１】
【実施例２】
上記によって取得したナイスタチン耐性のＳＡＭ高蓄積株がエルゴステロール合成に何らかの欠損があるか否かを確認するため、以下によりエルゴステロール合成の分析を行った。
【００３２】
ＹＮＢ培地（イーストナイトロジェンベース０．６７％、グルコース２．０％）を用い、３０℃で４８時間振とう培養し、得られた菌体からエルゴステロールを抽出し、ＨＰＬＣにて測定した。
【００３３】
エルゴステロールの抽出は次のようにして行った。まず、菌体に、水１ｍｌ、２０％ＫＯＨ含有メタノール３ｍｌ、ピロガロール（酸化防止剤）０．１ｍｇを加えて、Ｎ２置換後、８５℃で２時間、加水分解・抽出した。ステロールを石油エーテルで抽出し（２ｍｌ石油エーテルで２回抽出）、石油エーテル層を乾固した。クロロホルムで再溶解した後、ＨＰＬＣにてエルゴステロールを分析、定量した。
【００３４】
得られた結果を図３及び図４に示した。図３は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ−２１８０  １Ａ株より取得した５株（ＸＵＮ２、ＸＵＮ１２、ＸＵＮ１５、ＸＵＮ４９、ＸＵＭ８９）、図４は清酒酵母Ｋ−９より取得した３株（ＫＵＮ１４、ＫＵＮ１８、ＫＵＮ２２）のエルゴステロール量をそれぞれ親株とともに示したものである。
【００３５】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｘ−２１８０  １Ａ株由来の株では菌体よりエルゴステロールは検出されず、清酒酵母Ｋ−９ではエルゴステロールは存在するものの、親株よりエルゴステロール量が大幅に減少していた。なお、清酒酵母Ｋ−９の変異株においてはエルゴステロールがＸ−２１８０  １Ａ株変異株のように完全に消失していない。これはＸ−２１８０  １Ａ株が染色体数が１倍体であるのに対し、清酒酵母Ｋ−９は染色体数が２倍体であることで、Ｘ−２１８０  １Ａ株では遺伝子の変異による形質変化が明確に出るのに対し、清酒酵母Ｋ−９など２倍体株では、多くの場合もう一対の遺伝子が健全であることで、変異による形質変化が明瞭でないことによるものと考えられる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明により、ナイスタチン耐性という選択方法を新たに開発し、これによって、エルゴステロール合成系に変異を持ち、ＳＡＭを高蓄積する親株を取得することが可能となった。このようにして育種したＳＡＭ高蓄積株を大量培養することによって、ＳＡＭを大量に且つ効率的に生産することが可能となった。また、その際、親株と変異株との間には、培養特性上格別の相違は認められず、変異株も親株に遅れることなく、親株と同時に生育していくことも確認された。
【００３７】
本発明は、ナイスタチン耐性微生物はＳＡＭ高蓄積する微生物となり得るという新知見に基づくものである故、本発明は各種の微生物に広く適用することが可能である。
【００３８】
酵母の場合における本発明の効果の１例を示すと次のとおりである。
（１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋ−９、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−１Ａからナイスタチン耐性によりＳＡＭ高蓄積株を取得した。
（２）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋ−９より取得したＳＡＭ高蓄積株は、親株と比較して１．７から３倍のＳＡＭを蓄積した。
（３）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−１Ａより取得したＳＡＭ高蓄積株は親株に比較して、４．２から５．５倍のＳＡＭを蓄積した。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−１Ａより取得したナイスタチン耐性株のＳＡＭ蓄積量を示す。
【図２】同Ｋ−９より取得したナイスタチン耐性株のＳＡＭ蓄積量を示す。
【図３】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−１Ａより取得したＳＡＭ高蓄積酵母のエルゴステロール量を示す。
【図４】同Ｋ−９より取得したＳＡＭ高蓄積酵母のエルゴステロール量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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