(57)【要約】【課題】微細流路内でのＤＮＡの電気泳動において、ＤＮＡ定量性の再現性の向上及び検出感度の向上を図る。【解決手段】基板上に設けた微細流路中で行なう核酸鎖の電気泳動において、電気泳動を行なう電気泳動用流路と交差する試料供給用流路に機械的な圧力により核酸鎖を含む試料液を流通させて、該電気泳動用流路へ核酸鎖を含む試料液を供給する核酸鎖の電気泳動方法であり、更に前記電気泳動方法により核酸鎖を分離した後、電気泳動用流路に交わる別の微細流路から核酸鎖を標識する蛍光試薬を含有する溶液を機械的圧力によって流入接触させて核酸鎖に蛍光試薬を標識して蛍光強度を測定することにより核酸鎖の定量を行なう核酸鎖の定量方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に設けた微細流路中で行なう核酸鎖の電気泳動において、電気泳動を行なう電気泳動用流路と交差する試料供給用流路に機械的な圧力により核酸鎖を含む試料液を流通させて、該電気泳動用流路へ核酸鎖を含む試料液を供給することを特徴とする核酸鎖の電気泳動方法。
【請求項２】
電気泳動用流路内の電気的圧力による泳動液の動きを補助的に機械的圧力を加えることにより制御し、電気泳動用流路内への試料液の流通を行なう請求項１記載の核酸鎖の電気泳動方法。
【請求項３】
機械的な圧力の発生がマイクロポンプにより行なわれる請求項１又は２記載の核酸鎖の電気泳動方法。
【請求項４】
核酸鎖がＤＮＡである請求項１〜３何れか記載の核酸鎖の電気泳動方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載の核酸鎖の電気泳動方法により核酸鎖を分離した後、電気泳動用流路に交わる別の微細流路から核酸鎖を標識する蛍光試薬を含有する溶液を機械的圧力によって流入接触させて核酸鎖に蛍光試薬を標識して蛍光強度を測定することにより核酸鎖の定量を行なうことを特徴とする核酸鎖の定量方法。
【請求項６】
電気泳動用流路内の電気的圧力による泳動液の動きを補助的に機械的圧力を加えることにより制御し、電気泳動用流路内への蛍光色素の流入を行なう請求項５記載の核酸鎖の定量方法。
【請求項７】
機械的な圧力の発生がマイクロポンプにより行なわれる請求項５又は６記載の核酸鎖の定量方法。
【請求項８】
核酸鎖がＤＮＡである請求項５〜７何れか記載の核酸鎖の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸鎖特にＤＮＡの電気泳動の方法及び定量方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞機能の発現状況や各種ストレスへの応答性をみる場合、各々の機能またはストレス応答に係る遺伝子の発現状況をみることが広く行なわれている。
遺伝子の発現をみる一つの方法として、ＰＣＲと電気泳動を組み合わせた方法が広く実施されている。この手順を簡単に記載する。まず、細胞より遺伝子の発現形態であるｍＲＮＡを抽出する。抽出液には様々なｍＲＮＡを含んでいるが、ｍＲＮＡは不安定であり、ｍＲＮＡを鋳型にして各々のｍＲＮＡに対応する安定なｃＤＮＡを合成する。この種々の遺伝子に対するｃＤＮＡを含んだ混合溶液の中から、測定目的となる遺伝子について、特異な塩基配列をもつプライマーを用いＰＣＲ法でＤＮＡを増幅合成する。この増幅合成したＤＮＡ量をみることにより目的とする遺伝子の発現の度合いをみることができる。
【０００３】
ＤＮＡ量の確認には、上記ＰＣＲで特定のＤＮＡを増幅した溶液を、アガロースなどのゲル中で電気泳動を行い、ＤＮＡを構成するの塩基の長さに応じてアガロースゲル内でＤＮＡを濃縮分離し、目的とするＤＮＡのバンドを形成し、このバンドの強さを比較することにより、目的とするＤＮＡの同定および定量を行なう。
【０００４】
この電気泳動は古くより用いられており、操作は簡単で広く用いられているが、一連の電気泳動の操作を行なうにはかなりの時間を要する。電気泳動だけをみた場合でも、ＤＮＡ分離に数時間の時間を要す。その他ゲルの調製時間を含めると多大な時間を要することになる。また、一般の電気泳動ではかなりの量のＤＮＡを流す必要があり、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅において多くのサイクルでＰＣＲをおこなう必要があり、ＰＣＲに費やす時間も長時間必要となってくる。
【０００５】
近年、電気泳動における泳動時間の短縮とサンプル量の削減の目的で、微細な流路を基板等上に設け、その流路の中にゲルを詰め電気的に泳動を行なう電気泳動法が使用されるようになってきた（特許文献１参照）。この方法では使用するサンプル量は少なくてよく、従って上記ＰＣＲでのＤＮＡの増幅も多くのサイクルを必要とせず、また電気泳動に要する時間も短くて済む。しかし、この微細流路中の電気泳動法でのＤＮＡの分離には予め、ＤＮＡに蛍光色素を標識した後泳動を行なう方法や、ゲル中に蛍光色素を含有させて電気泳動を行なう方法がとられている。このように電気泳動前又は途中でＤＮＡに蛍光標識を行なうとＤＮＡの状態が変化しＤＮＡの分離が低下し正確な定量を妨げることになる。
【０００６】
微細加工基板上での電気泳動は、電気泳動用の微細流路と、サンプル供給用の微細流路が交差した構造をとり、この試料用溝の試料供給用のリザーバーから電圧をかけ電気的駆動力によりＤＮＡ試料を交差した電気泳動用流路まで供給する方法がとられている。電気泳動用流路へのＤＮＡ試料の供給は一定量を正確に行なうことが重要であり、試料供給量が正確でないと、電気泳動により分離されたＤＮＡの定量値も不正確になる。しかし、ＤＮＡ試料の電気的駆動による供給は、試料供給量の制御が難しく、上記のような理由から電気泳動後のＤＮＡの定量結果がばらつく要因となっている。
以上のように、電気泳動によるＤＮＡの同定および定量について、信頼性の向上と分離能の向上が切望されていた。
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−１６０７０５号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、溶液中のＤＮＡの定量を行なうにあたり、サンプルに必要なＤＮＡ量を少なくし、かつ定量における信頼性を高めた、ＤＮＡの同定および定量方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、基板に微細な流路を構築し、この中でＤＮＡ試料液の電気泳動を行い、ＤＮＡを分離した後、蛍光色素と接触させＤＮＡに蛍光色素を標識し、蛍光量を測定することによりＤＮＡ量を正確に同定できることおよび、マイクロポンプにより電気泳動溝へ試料溶液を供給することにより、再現良く正確に試料を供給できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１０】
即ち本発明は、
（１）基板上に設けた微細流路中で行なう核酸鎖の電気泳動において、電気泳動を行なう電気泳動用流路と交差する試料供給用流路に機械的な圧力により核酸鎖を含む試料液を流通させて、該電気泳動用流路へ核酸鎖を含む試料液を供給する核酸鎖の電気泳動方法、
（２）電気泳動用流路内の電気的圧力による泳動液の動きを補助的に機械的圧力を加えることにより制御し、電気泳動用流路内への試料液の流通を行なう第（１）項記載の核酸鎖の電気泳動方法、
（３）機械的な圧力の発生がマイクロポンプにより行なわれる第（１）項又は（２）項記載の核酸鎖の電気泳動方法、
（４）核酸鎖がＤＮＡである第（１）〜（３）項何れか記載の核酸鎖の電気泳動方法、
（５）第（１）〜（４）項いずれか記載の核酸鎖の電気泳動方法により核酸鎖を分離した後、電気泳動用流路に交わる別の微細流路から核酸鎖を標識する蛍光試薬を含有する溶液を機械的圧力によって流入接触させて核酸鎖に蛍光試薬を標識して蛍光強度を測定することにより核酸鎖の定量を行なう核酸鎖の定量方法、
（６）電気泳動用流路内の電気的圧力による泳動液の動きを補助的に機械的圧力を加えることにより制御し、電気泳動用流路内への蛍光色素の流入を行なう第（５）項記載の核酸鎖の定量方法、
（７）機械的な圧力の発生がマイクロポンプにより行なわれる第（５）項又は（６）項記載の核酸鎖の定量方法、
（８）核酸鎖がＤＮＡである第（５）〜（７）項何れか記載の核酸鎖の定量方法、である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の溶液中のＤＮＡの同定および定量方法について、図１の基板の模式図に従って詳細に説明する。
本発明に使用する基板の材質であるが、耐水性および蛍光を発しないものであれば特に制限はない、さらに微細な流路の加工が可能であることを加味すると、ガラスおよびプラスチックが好適であり、種々の蛍光物質を使用することを加味すると、石英ガラスを用いるのが最も好適である。
【００１２】
本発明に用いる基板上には本流となるＤＮＡの分離と検出を行なう電気泳動用流路（４）、ＤＮＡ試料液を注入する試料注入用流路（９）、及び蛍光色素を導入する蛍光色素注入用流路（６）よりなる。
【００１３】
本流となる電気泳動用流路（４）の幅および深さであるが、それぞれ１０μｍ〜１００μｍが好適である。１０μｍ未満ではバラツキの少ない流路の形成が難しくかつ、電気泳動時、電圧の精度の影響を受けやすくなる他、電気泳動用流路中への泳動液の充填も困難となる。
【００１４】
試料液注入用流路（９）および蛍光色素注入用流路（６）については、特に制限はないが本流となる電気泳動用流路（４）と等しい方が、ＤＮＡ溶液の注入および蛍光色素の注入を行なう際の注入量の制御が容易となるため適切である。
【００１５】
流路の設け方であるが、泳動液注入口（１）から泳動液排出口（８）の間に電気泳動用流路（４）を設け、この流路においてＤＮＡの分離およびＤＮＡの検出を行なう。この流路に十字に交わるかたちで試料液注入口（２）から試料液排出口（３）に至るＤＮＡ試料液を注入するための試料液注入用流路（９）を設ける。さらに上記泳動液注入口（１）から泳動液排出口（８）までの間に交差した形で蛍光色素注入用流路（６）を設ける。
【００１６】
各注入口（１）（２）（５）にはマイクロポンプを接続しマイクロポンプを駆動することにより各溶液の注入および流通を行なう。
さらに、泳動液注入口（１）と泳動液排出口（８）には電極をとりつけ、電気泳動用流路（４）で電気泳動を行なう。
【００１７】
次に、本発明の実施手順について記載する。まず準備について記載する。
まず泳動液を泳動液注入口（１）より泳動液排出口（８）に向かって流す、このとき試料液注入口（２）に接続したマイクロポンプは停止させ、試料液排出口（３）を閉じ、蛍光色素注入口（５）に接続したマイクロポンプを停止した状態で行なう。これにより泳動液注入口（１）から泳動液排出口（８）の間の電気泳動用流路（４）に泳動液を満たすことができる。
【００１８】
次に蛍光色素注入口（５）から蛍光色素を注入する、このときは、泳動液注入口（１）と試料液注入口（２）に接続したポンプを停止し、試料液排出口（３）を閉じ、蛍光色素排出口（１０）を開き、蛍光色素注入口（５）に接続したマイクロポンプを駆動させ蛍光色素を蛍光色素注入用流路（６）内に満たす。
【００１９】
次に、サンプルとなるＤＮＡ試料溶液を試料液注入口（２）から試料液排出口（３）間の流路内に満たす。泳動液注入口（１）、蛍光色素注入口（５）に接続したポンプは停止し、排出口（８）を閉じて、試料液排出口（３）を開き、試料液注入口（２）に接続したマイクロポンプを駆動し、試料液注入用流路（９）内にＤＮＡ試料液を満たす。
【００２０】
上記準備の後、電気泳動を行いＤＮＡの分離を行なう。以下その手順を記載する。
試料液注入口（２）および蛍光色素注入口（５）に接続するポンプは停止し、試料液排出口（３）を閉じ、泳動液排出口（８）を開き、泳動液注入口（１）に接続したマイクロポンプを駆動し泳動液を電気泳動による泳動液の動きに同調させながら流す。
【００２１】
この操作により試料注入用流路（９）と電気泳動用流路（４）が交わった部分の一定量のＤＮＡ溶液が電気泳動用流路（４）に移動することになる。泳動液注入口（１）からマイクロポンプによって電気泳動による泳動液の動きに同調させ泳動液を送液することにより、電気泳動用流路への試料の供給を正確に行なうことができることとなり、試料量のばらつきを抑えることができる。
【００２２】
泳動液注入口（１）から泳動液排出口（８）にそれぞれ電極を設け、泳動液注入口（１）側を＋、泳動液排出口（８）側を−に接続する。
電圧をかけることにより、泳動液が＋にチャージしており、泳動液全体が泳動液排出口（８）に移動し、ＤＮＡは全体が−にチャージしており泳動液全体の動きに逆らい、ＤＮＡの塩基数に応じて移動度が異なるためＤＮＡが分離される。
【００２３】
電気泳動により、塩基数に応じてＤＮＡが分離された後、電気泳動用流路の途中の蛍光色素注入口（５）からは、蛍光色素溶液を連続的に流入させる。電気泳動速度と蛍光色素の注入速度のバランスがＤＮＡの蛍光標識効率に関わっており、電気泳動速度が１〜１０００ｍｍ／秒において、マイクロポンプによる蛍光色素液の送液速度は１〜１００ｍｍ／分が適切である。
【００２４】
ＤＮＡ標識用蛍光色素としてはＤＮＡと親和性が高く従来からＤＮＡ検出に持いるエチジュームブロマイドや近年使用されるようになってきたサイバーグリーンなどを用いるのが好適である。
【００２５】
流入した蛍光色素は、蛍光色素反応部（７）内でＤＮＡに標識され、分離されたＤＮＡは蛍光色素を取り込むため蛍光色素はＤＮＡ中に濃縮されることになる。さらに蛍光色素反応流路（７）内を流通させることにより、蛍光色素を取り込んだＤＮＡは移動が遅く、フリーの蛍光色素は速やかに電気泳動用流路内を移動する、このようにして蛍光色素溶液と蛍光色素で標識されたＤＮＡとの蛍光コントラストを高めることにより、正確なＤＮＡの定量が可能となる。
ＤＮＡの定量は蛍光をチップ上でレーザー励起法などにより検出し、単位濃度あたりの蛍光強度をもとにＤＮＡ量を算出することができる。
【００２６】
本発明の特徴は、微小な流路を利用してのＤＮＡの電気泳動による分離及び定量において、マイクロポンプにより電気泳動用流路への試料液および蛍光色素液の供給を行なうことにあり、電気泳動用流路内への各溶液の移動を正確に行なうことができる。電気泳動用流路へのＤＮＡ試料液の供給が正確に行なわれることにより、再現性が確保できる。又、蛍光色素による標識を電気泳動によるＤＮＡの分離の後に行なうことにより、ＤＮＡの分離能を向上させることができる。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の核酸鎖の電気泳動方法に従うと、微細流路中での電気泳動におけるＤＮＡ試料の供給精度の向上による泳動後の結果の再現性の向上、及びＤＮＡの分離能の向上による検出感度の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸鎖の同定に用いる基板の模式平面図である。
【符号の説明】
１  泳動液注入口
２  試料液注入口
３  試料液排出口
４  電気泳動用流路
５  蛍光色素注入口
６  蛍光色素注入用流路
７  蛍光色素反応部
８  泳動液排出口
９  試料液注入用流路
１０  蛍光色素排出口
【図１】
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