(57)【要約】【目的】養殖仔稚魚の生残率と活力を向上させる為に、安価で効率的な給餌方法を提供する。【解決手段】カロテノイドとｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を同時に生産するラビリンチュラを仔稚魚の餌となるワムシやアルテミア等の動物プランクトンに摂食させることによって、両有効成分の安定且つ効率的移行を可能ならしめる仔稚魚用飼料を提供する。また、従来の脂肪酸、色素の劣化、飼料の保存安定性を大幅に改善可能な飼料及びそれを用いた養殖方法を提供する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド及び高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を含有してなる飼料。
【請求項２】
カロテノイドが、カロテン、β−カロテン、ルテイン、アドニルビン、カンタキサンチン及びアスタキサンチンから選ばれる少なくとも１つ以上の色素であり、ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から選ばれる少なくとも１つ以上のｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸である請求項１項記載の飼料。
【請求項３】
カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物がラビリンチュラである請求項１〜２記載の飼料。
【請求項４】
カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有するラビリンチュラが、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属又はヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する微生物である請求項１〜３項記載の飼料。
【請求項５】
請求項１〜４項記載の飼料の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜４項記載の飼料を摂食した動物プランクトン。
【請求項７】
動物プランクトンに請求項１〜４項記載の飼料を給餌することを特徴とする動物プランクトンの栄養強化方法。
【請求項８】
請求項１〜４項記載の飼料及び／又は請求項６記載の動物プランクトンを使用してなる養殖方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カロテノイド色素並びに／若しくはキサントフィル色素を含むカロテノイド及び高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を含有する飼料に関する。
また、本発明は、カロテノイド及び高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を含有する飼料の製造方法に関する。
さらに、本発明は、カロテノイド及び高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を含有する飼料を使用した水産仔稚魚の養殖方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
海産魚はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等のｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を必須脂肪酸として要求し、その種苗生産では生物餌料であるワムシ（Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓ　ｓｐ．）やアルテミア（Ａｒｔｅｍｉａ　ｓｐ．）等の動物プランクトンへこれら脂肪酸を栄養強化することによって、仔稚魚の成長、生残率及び活力の向上が図られている。
このようなｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を栄養強化したワムシ、又はアルテミアを得る方法としていくつかの技術が開示されている。代表的なものとして、ワムシの水槽に乳化した魚介油を直接添加する方法が知られている。これは魚介油をワムシに摂食させるというよりもむしろワムシに付着させ、そのままの状態で仔稚魚に摂食させることを期待した方法であるが、培養槽・水質の汚染や効果に問題がある。また、油脂酵母又は酵母マイクロカプセルと呼ばれるｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を菌体内に生産する、又は外部から添加して菌体内に取り込ませた酵母が、ワムシの栄養強化用飼料として開発されている。例えば、酵母等の微生物の培養中にｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸もしくはエステルを添加し、培養することにより、微生物にｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を含有させる方法（特許文献１〜４参照）、ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を生産する能力を有する微生物を利用した方法（特許文献５〜７参照）、酵母菌体内の水溶成分をｐＨ処理や酵素処理によって、菌体外に溶出させた酵母残渣を使用し、ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸等の疎水性物質と混合接触させることにより、ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を菌体内に含有させる方法（特許文献８〜９参照）が開発されている。しかしながら、これら方法では、水質悪化やワムシへの脂質蓄積性の不足等の問題点が有った。最近これを解決する手法としてｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸のみを含有するラビリンチュラをワムシやアルテミア等の動物プランクトンに給餌し、仔稚魚に摂食させる方法が提案された（非特許文献１参照）。この中で、林らは、ラビリンチュラ類の多くの株では水中分散性に問題があり、ワムシやアルテミアが摂食すると斃死することを指摘している。
【０００３】
一方、β−カロテン、カンタキサンチン、アスタキサンチン等のカロテノイドは、免疫抵抗の増強作用や活性酸素の消去剤として健食素材としてばかりではなく水産分野の飼料、魚類の色調改善剤としても注目されている。これら色素を水産飼料として仔稚魚に与えるには、上述したｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の場合と同様に、ワムシやアルテミア等の動物プランクトンに摂食させて移行させる方法が一般的である。例えば、ファフィア・ロドチーマ酵母を使用する方法（特許文献１０〜１３参照）、ヘマトコッカス属藻類を使用する方法（特許文献１４参照）、ラビリンチュラを利用する方法（特許文献１５参照）等が開示されている。
【０００４】
ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸とアスタキサンチン等のカロテノイドを同時にワムシやアルテミア等の動物プランクトンに摂食させて仔稚魚に与えれば、上記それぞれの成分に由来する両方の効果が期待できるとし、ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸とカロテノイドを同時に栄養強化した動物プランクトンの作成方法として、主に以下のような３つの方法が考えられる。▲１▼ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を含有する飼料（酵母等）とカロテノイドを含有する飼料（酵母や藻類、魚介油等）を動物性プランクトンに摂食させる方法。▲２▼ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を含有する飼料（酵母）にカロテノイドを吸着もしくは内包させて動物性プランクトンに摂食させる方法。▲３▼カロテノイドを含有する飼料（酵母や藻類）にｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を吸着もしくは内包させて動物性プランクトンに摂食させる方法である。しかし、▲１▼の方法は、最も簡便ではあるが、２種の飼料を準備しなければならないことと、両成分の強化度合いのコントロールが難しい等の問題があった。▲２▼の方法は、カロテノイドの退色劣化、保存安定性、培養液の汚染、カロテノイドの強化不足の問題があった。▲３▼の方法は、ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の酸化劣化、保存安定性、培養液の汚染、ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の栄養強化不足という問題があった。更に▲２▼及び▲３▼の方法には、他方の成分を追加して吸着又は内包させるための工程、調製技術が必要であり、結果的に飼料価格が高くなり、実用化されるには至らなかった。
【０００５】
また一般的に、ＤＨＡやＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸は、非常に酸化されやすいことが知られており、この酸化された油を魚に与えた場合、筋萎縮症を引き起こすことが淡水魚、海水魚で観察されたり、ＤＨＡを高含有させたワムシ区で浮上魚や水腫魚等のが多発し、この原因の一つとして抗酸化剤の含量が係わっている可能性等が示唆され、魚に対するＤＨＡを含む高度不飽和脂肪酸の過酸化脂質の影響が問題となっている（非特許文献２参照）。しかしながら、従来のワムシ、アルテミアのＤＨＡやＥＰＡを強化する栄養剤では、ＤＨＡやＥＰＡ等の高度不飽和脂肪酸の酸化を抑制する抗酸化物質を豊富に含むものは無く、ＤＨＡやＥＰＡの酸化を抑制したワムシ、アルテミアの栄養強化用飼料は、いまだ開発されていない。
【０００６】
【特許文献１】特開昭５４−１０５０８１号
【特許文献２】特開平３−２２８６５２号
【特許文献３】特開平４−８８９５４号
【特許文献４】特開平１１−９８９６５号
【特許文献５】特開平４−３４６７６０号
【特許文献６】特開平８−１６３９９０号
【特許文献７】特開平９−１９１８９０号
【特許文献８】特開平０４−４０３３号
【特許文献９】特開平０８−２４３３７８号
【特許文献１０】特願平１１−６９９６９号
【特許文献１１】特願平０７−６１８９７号
【特許文献１２】特願平０６−１６０７１３号
【特許文献１３】特願平０６−１５９６２９号
【特許文献１４】特願平０６−２３９２８２号
【特許文献１５】ＷＯ０１／６２８９４
【非特許文献１】２００１年、ラビリンチュラシンポジウム、林　雅弘らの発表
【非特許文献２】日本水産学会誌，６３，７１−８４（１９９７）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このような現状に鑑み、水産系仔稚魚の餌となる動物プランクトンに、仔稚魚に必須のＤＨＡ等のｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸と、抗酸化性が高く、仔稚魚の活力増進・色調改善に効果のあるカロテノイドを同時に、効率よく、脂肪酸の酸化を防ぎながら、しかも低コストで摂食・移行させる方法の提供を課題とする。これら有効成分をそれぞれ別々に動物プランクトンの餌として与えたり（上記▲１▼）、どちらか一方を含む飼料に他方の有効成分を追加した飼料を動物プランクトンの餌として与える方法（上記▲２▼▲３▼）ではなく、はじめからｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸とカロテノイドを同時に内包する（カプセル化した）飼料の提供にある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題を解決するために動物プランクトンの栄養強化方法を鋭意研究した結果、ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸と、カロテノイドを菌体内に同時に生成蓄積するラビリンチュラが、水中で適度に分散し、ワムシやアルテミア等の動物プランクトンの好適な餌となり、それらの両有効成分が同時に、安定に（脂肪酸の劣化を防ぎ）、効率よく動物プランクトンに移行することを初めて見出し、更にはそれを餌として与えた仔稚魚の生育にも好影響を及ぼすことを確認して、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、水産用の栄養強化用飼料の提供に関するものであって、ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸と、カロテノイドを同時に菌体内に生産蓄積するラビリンチュラを培養し、それをそのまま、もしくは添加剤との混合、乾燥、凍結、粉末化、凍結乾燥、加熱、殺菌等の加工処理を行った後に、ワムシやアルテミア等の動物プランクトンに摂食させ、それを養殖又は放流用水産系仔稚魚（海産系、淡水系）に与えることによって実施される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
本発明のカロテノイドは、α−カロテン、β−カロテン、リコピン等の炭化水素カロテノイドであるカロチン及び、ルテイン、クリプトキサンチン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン等のキサントフィル等の色素が挙げられ、該色素から選ばれる１種又はそれ以上の色素であれば良い。
本発明の高度不飽和脂肪酸は、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、オクタデカテトラエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の脂肪酸群が挙げられ、該脂肪酸群から選ばれる１種又はそれ以上の脂質混合物であれば良い。
【００１１】
本発明に用いる微生物は、特に限定はないが、カロテノイド及び高度不飽和脂肪酸を生成せしめる能力を有する微生物であればよい。さらに、シオミズツボワムシワムシやアルテミア等の生物餌料である動物プランクトンが摂食可能であるか、動物プランクトンの生体内へ蓄積する微生物であればよい。言いかえれば、カロテノイド及び高度不飽和脂肪酸を微生物菌体内に生成、蓄積せしめた後、保持能力が高い微生物であればよい。カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を生成する微生物としては、例えば、ラビリンチュラが挙げられる。
本発明のラビリンチュラは、ラビリンチュラ網（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）、ラビリンチュラ目（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄａ）のラビリンチュラ科（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｉｄａｅ）、ヤブレツボカビ科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｉｄａｅ）の海洋微生物を指し、更に具体的にはシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）やヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に属する海洋微生物をいう。特に、ラビリンチュラは、カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を菌体内に生成し蓄積することが望ましい。本発明のラビリンチュラは、乾燥菌体基準で０．０１％以上のカロテノイドを生成し、かつ総脂質中１％以上ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を生成せしめる能力を有する。より好ましくは、乾燥菌体基準で０．１％以上のカロテノイドを生成し、かつ総脂質中１０％以上ｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を生成せしめる能力を有するラビリンチュラである。前記のようにカロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を菌体内に同時生成、蓄積せしめる能力を有するラビリンチュラであれば全て使用することができる。例えば、２００１年７月２５日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４３１として特許寄託された微生物であるシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＫＨ１０５株は、カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生成能、蓄積量の面等の点から好ましい。本発明の性能を有する微生物は、受託番号でＩＦＯやＡＴＣＣに寄託されており、全て公知の分譲　機関、法人より入手可能である。
【００１２】
本発明の飼料は、上述したカロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を含有する飼料であり、該栄養強化用飼料を用いた飼料、生物餌料の栄養強化方法に関する。本発明の飼料は、少なくともカロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を含有し、カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物単独の意味も有する。つまり、本発明の飼料は、カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物そのまま、もしくは添加剤との混合物であってもよく、乾燥、凍結、粉末化、凍結乾燥、加熱、殺菌等の加工を行ってもよく、使用形態、使用方法、使用時期等は、目的とする家畜動物や養殖魚、飼育方法、成長時期等により適宜変更すればよい。また、本発明の飼料は、カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を、乾燥菌体重量基準で０．０１％以上、好ましくは０．１％以上のカロテノイド及び総脂質量中１％以上、好ましくは１０％以上のｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を５重量％以上、好ましくは５０重量％以上含有するものが好ましい。
【００１３】
本発明の飼料は、該飼料そのまま、該飼料を蓄積した生物餌料である動物プランクトンとして、及び／又は該栄養強化用飼料を含有する飼料として、ニワトリ、七面鳥、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜動物、海産系及び淡水系の養殖魚、ペット等の餌料及び餌料として使用可能である。また、該餌料及び飼料として飼育も可能である。
本発明の飼料を含有する飼料は、カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を含む飼料を配合飼料と共に添加、混合した飼料でよく、魚粉、大豆粕、小麦グルテン、澱粉等のいずれの配合飼料原料を用いることができ、特に限定されるものではない。本発明の飼料を含有する飼料の製造方法についても任意の飼料製造工程でよく、カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を含む飼料の添加時期は特に限定されない。モイストペレットの場合には、例えば生餌との混合の時点で必要量添加すればよく、ドライペレットの場合には押出し機による成形前の原料混合の工程で必要量添加すればよい。また、ペレットにアルギン酸ソーダ等の添着剤を使用し表面に付着させる方法でもよい。
【００１４】
本発明のカロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を含む飼料を蓄積させた動物プラントンとしては、本発明の飼料を蓄積したシオミズツボワムシ等のワムシ類、アルテミア、チグリオパス、モイナ、カキ幼生、ミジンコ等の生物餌料が挙げられる。本発明のカロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を含む飼料を蓄積させた動物プラントンの製造方法は、すなわち本発明の飼料の添加方法、添加量等は特に制約なく、常法に従い、動物プランクトンの成育状況を見ながら実施すればよい。該動物プランクトンの培養時に海産クロレラと、本発明のカロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物を含む飼料の併用培養、もしくは、カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物培養、動物プランクトンの高密度培養後でのカロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物における二次培養等通常の養殖方法による製造方法が適用される。さらに、本発明の飼料及び動物プランクトンを用いた養殖魚の給餌、飼育方法は、本発明の動物プランクトンを養殖又は放流用水産系仔稚魚（海産系：マダイ、クロダイ、ヒラメ、トラフグ、エビ、タコ、ブリ等、淡水系：アユ、ヤマメ、イワナ、アマゴ、ウナギ、ワカサギ等）に与えることによって実施される。なお、本発明の目的は、カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有するラビリンチュラ等に属する微生物を動物プランクトンに蓄積させ、仔稚魚の生存率、活力を向上させる動物プランクトンの栄養強化に関することであり、栄養強化方法を限定するものではない。
【００１５】
本発明のカロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産能を有する微生物の培養条件及び生産方法は、カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産、該生産を有する微生物の生育条件等により適宜選択し使用することが好ましい。例えば、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＫＨ１０５株（受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４３１）の培養に使用する培地は、この菌株が良好に生育するものであれば良く、いかなる組成の培地であっても良い。また、菌体増殖用と物質生産用にそれぞれ異なる２種類の培地を用いても良い。培地は液体培地又は固体培地を使用することができ、培地成分として、炭素源の他に、窒素源及び無機イオン等を含有していても良い。また、培地の海水濃度は５０％以上とすることが好ましい。菌体増殖用の培地における炭素源は特に制限はなく、公知の炭素源を使用することができ、酢酸、リンゴ酸、コハク酸、プロピオン酸、バルミチン酸等の低級脂肪酸、デンプン、ショ糖等が好ましい。これらの炭素源は、単独又は混合して培地に添加することができる。一方、カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸の生産用の培地には、炭素源として、グルコース、グリセロール、酢酸ナトリウムの１種又はそれ以上を添加することが好ましい。また、この炭素源の濃度を６〜１２％とすることが好ましい。また、窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合物、及びペプトン、酵母エキス等の有機窒素源が利用できる。カロテノイド系物質及び／又は高度不飽和脂肪酸の生産用の培地には、ペプトン、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムの１種又はそれ以上を使用することが好ましい。さらに、無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、銅イオン、マンガンイオン等が挙げられ、これら無機イオンを培地に無機塩等の形で使用しても良い。
【００１６】
本発明の微生物の培養方法としては、振盪培養法等の液体培地による培養法及び寒天培地等の固体培地による培養法等が利用できる。カロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を生産する場合には、培養温度は例えば２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃であり、培養時間は、菌体量及び物質生産量等に応じて決めることができるが、０．５日〜５日間、より好ましくは１日〜３日間程度であることが好ましい。
本発明の微生物の培養液等は、そのまま本発明の飼料として用いてもよいが、残存する培地の成分が養殖場等を汚してしまうおそれがある場合は、濾過法、遠心分離法、フィルター濾過等の常法によりカロテノイド及びｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸を蓄積した微生物の菌体を回収し、さらに、水、界面活性剤を含む水溶液、エタノール等で菌体表面を洗浄したものを使用してもよい。さらに、必要に応じて凍結乾燥、風乾等の方法により菌体の乾燥処理を行い、乾燥菌体でも利用が可能である。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって限定されるものではない。
【００１８】
【実施例１】
＜シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の培養＞
グルコース９％、酵母エキス１％、ペプトン２％、人工海水５０％を含む培地（ｐＨ７．０）２リットルを３リットルのジャーファーメンター槽に入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。保存してあるシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＫＨ１０５株（受託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８４３１）を一白金耳を取り、２００ｍｌ容のエルレンマイヤーフラスコに入れた５０ｍｌの上記培地に植菌し、レシプロシェーカー（１６０ｒｐｍ）により２８℃で２日間培養した。これを上記２リットル培地に植菌し、２８℃、攪拌速度１００ｒｐｍ、通気量２リットル／ｍｉｎで７日間培養した。培養中及び培養後の培養液を１０ｍｌずつ採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ，１０分）により菌体を回収した。
【００１９】
【実施例２】
＜動物プランクトンの栄養強化＞
実施例１で得たシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＫＨ１０５細胞を用いて、生物餌料であるワムシ（Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓ　ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｒｍｉｓ）の栄養強化を行った。濃縮淡水クロレラで予め培養したワムシを用い、ワムシの密度を８×１０６個／１０Ｌに調製した。ワムシ密度を調製した水槽にシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＫＨ１０５細胞を０ｐｐｍ（○）、１００ｐｐｍ（△）又は２００ｐｐｍ（□）及び基本飼料として海産クロレラ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）を１０の１０乗個／Ｌとなるように入れて、ワムシを２５℃で経時的に（０〜２４時間）培養を行い栄養強化を行った。各時間栄養強化したワムシをプランクトンネットで回収後、流水で洗浄し分析サンプルとした。
【００２０】
採取したワムシを顕微鏡で観察したところ、アスタキサンチンの赤色色素がワムシ中に移行していることが確認された。このことはシゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＫＨ１０５細胞が凝集することなく、ワムシが摂食できることを示しており、分散性に関して問題無いことがわかった。ろ過物の一部をそのままクロロホルム−メタノール（２：１）に懸濁して脂質を抽出した。クロロホルム相に１０％塩酸−メタノール液を等量加えて６０℃、３時間処理してメチルエステル化した。蒸発乾固後、少量のヘキサンに溶解してガスクロマトグラフィー解析を行い脂肪酸分析した。ろ過物の一部はまた、アセトン−メタノール（７：３）に懸濁して色素を抽出した。減圧乾固したのち、アセトンに溶解して吸光度（４７８ｎｍ）を測定した。カロテノイド１％液の吸光度が２，５００（アスタキサンチン基準）であるとして換算することにより全カロテノイド量の定量を行った。
図１に示す通り経時的にワムシ中のＤＨＡ及びカロテノイド含量は増加し、栄養強化されたことが示された。また、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＫＨ１０５細胞の添加量の増加（○＜△＜□）に応じて、ワムシ体内のＤＨＡ含量及びカロテノイド含量は増加した。
【００２１】
【実施例３】
＜仔稚魚の養殖＞
全長４ｍｍ程度のふ化マダイ仔稚魚を５００Ｌパンライト水槽に１０，０００尾ずつ収容し、２５日間の飼育実験を行った。給餌は１日１回行い、試験開始後２日目から前述の方法で栄養強化したワムシを１日６０万個体、その後除々に増加し、終了時には１日２４０万個体を与えた。なお、飼育期間中、海産クロレラ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）を毎日飼育水中に１００万細胞／ｍｌになるように添加した。マダラやヒラメの仔稚魚についても同様に行った。その結果、通常の栄養強化していない動物プランクトンを用いた場合と同様に摂食が確認され、すべての試験区で、活力テスト（供試魚を手網で６０秒間空中露出し、再び水中に戻した後、２４時間後の生存率を調べる）の結果、生存率が３０％以上向上していることが確認された。
【００２２】
【発明の効果】
養殖仔稚魚の生育に必須のｎ−３系列の高度不飽和脂肪酸（エイコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸等）と、活力向上に有効なカロテノイドの色素を同時に給餌可能とする飼料及びそれによって栄養強化された動物プランクトン飼料を提供できる。従来の有効成分の混ぜ込み方式や、吸着方式に伴う水質汚染、有効成分の不安定化、コストアップ等の問題を解決し、仔稚魚の活力向上、生残率アップにつながり、養殖の生産性を向上させることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の飼料を用いたワムシの栄養強化の状態を示し、（Ａ）はカロテノイドの蓄積量を示した図であり、（Ｂ）はＤＨＡの蓄積量を示した図である。
【図１】
2004057206.tif 000002