(57)【要約】【目的】カラムの種類を問わず、水を主成分とする移動相を使用可能とする逆相液体クロマトグラフィーを提供する。【解決手段】水１００％の移動相を用いる逆相液体クロマトグラフィーであって、移動相の通液を一旦停止した後、移動相の通液を再開した後の測定において、カラム出口と検出器との間に設けた背圧装置によりカラム出口に所定の背圧を加えた状態で測定を行う。移動相の通液を一旦停止した後、その移動相の通液を再開した後の測定であっても、カラム出口に所定の背圧を加えた状態で測定を行えば、保持時間の減少が抑制されることから、水を主成分とする移動相を用いることができる。【選択図】                        図２
2004198136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水を主成分とする移動相を用いる逆相液体クロマトグラフィーであって、
前記移動相の通液を一旦停止した後、その移動相の通液を再開した後の測定において、カラム出口と検出器との間に設けた背圧装置によりカラム出口に背圧を加えることを特徴とする逆相液体クロマトグラフィー。
【請求項２】
水を主成分とする移動相を用いる逆相液体クロマトグラフィーであって、
前記移動相の通液を一旦停止した後、その移動相の通液を再開した後の測定において、カラム出口に、５ＭＰａ以上の背圧を加えることを特徴とする逆相液体クロマトグラフィー。
【請求項３】
水を主成分とする移動相を用いる逆相液体クロマトグラフィーであって、
前記移動相の通液を一旦停止した後、その移動相の通液を再開した後の測定において、カラム出口に、再通液開始時には５ＭＰａ以上の初期背圧を加え、試料注入後は、その初期背圧よりも低い背圧を加えることを特徴とする記載の逆相液体クロマトグラフィー。
【請求項４】
カラムと検出器との間に設けられた背圧装置により、カラム出口に背圧を加えることを特徴とする請求項２乃至３に記載の逆相液体クロマトグラフィー。
【請求項５】
前記移動相が水１００％であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の逆相液体クロマトグラフィー。
【請求項６】
前記カラムに充填される充填剤は、固定相のアルキル基換算主鎖炭素数をｘとし、その固定相を担持した後の充填剤の細孔径をｙ（ｎｍ）としたときに、以下の式を満たすものであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の逆相液体クロマトグラフィー。
ｙ＜１．８３ｘ＋８．１７  （１≦ｘ≦８、ｙ≦１００）
ｙ＜−０．３３ｘ＋２５．４  （８≦ｘ≦１８、ｙ≦１００）
ｙ＜−０．９３ｘ＋３６．２  （１８≦ｘ≦３０、ｙ≦１００）
【請求項７】
固定相結合後のカラム充填剤の細孔径が１０ｎｍ以上である場合には、再通液開始時に前記カラム出口に加える背圧を１５ＭＰａ以上とすることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の逆相液体クロマトグラフィー。
【請求項８】
固定相結合後のカラム充填剤の細孔径が８ｎｍ以上である場合には、再通液開始時に前記カラム出口に加える背圧を２０ＭＰａ以上とすることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の逆相液体クロマトグラフィー。
【請求項９】
カラムと検出器とを接続するための接続管に、カラム出口に背圧をかけるための背圧装置が設けられていることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項１０】
水を主成分とする移動相を用いる逆相液体クロマトグラフィーに用いるカラムであって、
充填剤が充填されている分離部の下流に、その分離部の内径の１／２０以下の内径を有する配管が接続されていることを特徴とするカラム。
【請求項１１】
水を主成分とする移動相を用いる逆相液体クロマトグラフィーに用いるカラムであって、
分離用カラムの下流側に、その分離用カラムよりも内径および充填剤の粒子径の少なくとも一方が小さい背圧用カラムが接続されていることを特徴とするカラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水を主成分とする移動相を用いた逆相液体クロマトグラフィー、およびその逆相液体クロマトグラフィーのための液体クロマトグラフ装置およびカラムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
水溶性化合物を分離するために、分離対象試料を溶解する溶媒である移動相に水を主成分とした移動相を用い、カラムに充填される充填剤（すなわち担体）に担持された液体または固体である固定相に炭素鎖を有する化合物を用いた逆相液体クロマトグラフィーが知られている。なお、水を主成分とする移動相とは、水１００％、あるいは水に緩衝液調整用試薬を加えて調整した緩衝液の移動相（以下、本明細書においては特に区別する場合を除いて、水１００％というときは上記緩衝液も含む。）、それに塩・酸（たとえばリン酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸、トリエチルアミン、過塩素酸ナトリウム）などを加えた溶液、もしくはそれらに有機溶媒（アセトニトリルなど）を１％〜５％程度混合した移動相をいう。
【０００３】
水を主成分とする移動相を、逆相液体クロマトグラフィーの固定相として広く用いられている炭素数８〜１８のアルキル基が結合した逆相固定相に用いた場合、試料の保持時間が一定せず、通液時間の経過とともに保持時間が減少してしまうこと、すなわち、試料の保持時間の再現性が得られないことが知られている。特に、一旦停止した通液を再開した後は、保持時間の減少が著しいことが知られている（たとえば、特許文献１の図２、図３、図５参照）。クロマトグラフィーでは保持時間に基づいて分離化合物を同定することから、保持時間の再現性が低い場合には、使用不可能であることを意味する。
【０００４】
以前は、保持時間の再現性が得られないのは、水を主成分とする移動相を通液すると、炭素鎖の疎水性により次第に炭素鎖が寝込んだ状態になり、固定相と溶質との相互作用が減少する、いわゆる「すべり現象」が起きるためであると考えられていた。そのため、保持時間が経時的に短くなるという問題点を解決するために、極性基を含んだ固定相を持つカラム充填剤、アルキル基の結合密度を下げることにより固定相の疎水性を低くしたカラム充填剤、物理的に炭素鎖の寝込みが生じないトリメチルシリル基などを固定相としたカラム充填剤などが用いられることがある。上記極性基を含んだ固定相としては、たとえば、極性の高いアミド基やカルバメート基を炭素鎖に結合させた化合物を固定相として担体（シリカ、ポリマー等）に結合させた充填剤や、炭化水素固定相として広く用いられているステアリル基（炭素数１８）をシリカ担体に結合した後、シリカ担体に残る残存シラノール基を減少させるために行なうエンドキャッピング処理に極性基を用いた充填剤などが知られている。
【０００５】
また、本出願人は、上記すべり現象から予想される結論に反して、炭素鎖の長いアルキル基（たとえば炭素数３０）を固定相として用いても、水１００％移動相が使用可能であることを示した（特許文献２）。
【０００６】
さらに、本出願人は、固定相を担持した後の充填剤の細孔径が大きい場合や、温度を低く維持すると、炭素鎖が長いアルキル基を固定相として用いた場合はもちろんのこと、炭素数が２２以下であるような短い炭素鎖の固定相でも、水を主成分とする移動相が使用可能であることを示した（特許文献１）。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００２−１４０８６号公報
【特許文献２】
特開２０００−１９３６４８号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このように、逆相液体クロマトグラフィーにおいて、水を主成分とする移動相を用いる場合には、その移動相が使用可能な特別な固定相を備えたカラムを使用するか、温度を低く維持する必要があった。しかし、温度を低く維持するには、冷却装置が必要となることから、装置の費用が高額となり、また、測定毎のコストも上昇してしまうという問題がある。また、温度を低く維持しない場合には、特別な固定相を備えたカラムを使用する必要があるため、疎水性が高く保持が大きい等の特徴を有していることから、逆相液体クロマトグラフィーの逆相カラムとして最も広く使用されているオクタデシル基（炭素数１８）など、逆相液体クロマトグラフィーに広く使用されている逆相カラムが使用できないという問題がある。
【０００９】
本発明は以上の事情を背景として為されたもので、その目的とするところは、カラムの種類を問わず、水を主成分とする移動相を使用可能とする逆相液体クロマトグラフィー、およびその逆相液体クロマトグラフィーに使用する液体クロマトグラフ装置およびカラムを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために種々検討を重ねた結果、移動相の通液を一旦停止した後、通液を再開して測定する場合であっても、カラム出口の背圧が高いと保持時間の減少の程度が少なくなり、カラム出口の背圧が所定の圧力以上となると、保持時間はほとんど減少しないことを見いだした。また、特に高い背圧が必要なのは再通液開始時であり、その後は再通液開始時ほど高い背圧でなくても、保持時間の減少が抑制されることを見いだした。本発明は、このような知見に基づいて成されたものである。
【００１１】
【課題を解決するための第１の手段】
すなわち、上記目的を達成するための第１発明は、水を主成分とする移動相を用いる逆相液体クロマトグラフィーであって、前記移動相の通液を一旦停止した後、その移動相の通液を再開した後の測定において、カラム出口と検出器との間に設けた背圧装置によりカラム出口に背圧を加えることを特徴とする。
【００１２】
【第１発明の効果】
移動相の通液を一旦停止した後、その移動相の通液を再開した後の測定であっても、カラム出口に背圧を加えれば、保持時間の減少が抑制されることから、水を主成分とする移動相を用いることができる。また、このように、カラム出口と検出器との間に設けた背圧装置によりカラム出口に背圧を加える場合には、検出器には背圧装置による背圧が加わらないので、検出器の耐圧を考慮する必要がないという利点もある。
【００１３】
【課題を解決するための第２の手段】
また、前記目的を達成するための第２発明は、水を主成分とする移動相を用いる逆相液体クロマトグラフィーであって、前記移動相の通液を一旦停止した後、その移動相の通液を再開した後の測定において、カラム出口に、５ＭＰａ以上の背圧を加えることを特徴とする。
【００１４】
【第２発明の効果】
このように、移動相の通液を一旦停止した後、その移動相の通液を再開した後の測定であっても、カラム出口に５ＭＰａ以上の背圧を加えれば、保持時間の減少が抑制されることから、水を主成分とする移動相を用いることができる。なお、検出器に気泡が入るのを防ぐため、および、気泡の発生自体を防止するために、従来から、検出器の下流に背圧かけられることがあり、結果としてカラム出口にも背圧がかかっていることがあるが、その背圧は高くても１〜３ＭＰａほどであり、その程度の背圧では、保持時間の減少を十分に防止することはできない。
【００１５】
【課題を解決するための第３の手段】
また、前記目的を達成するための第３発明は、水を主成分とする移動相を用いる逆相液体クロマトグラフィーであって、前記移動相の通液を一旦停止した後、その移動相の通液を再開した後の測定において、カラム出口に、再通液開始時には５ＭＰａ以上の初期背圧を加え、試料注入後は、その初期背圧よりも低い背圧を加えることを特徴とする。
【００１６】
【第３発明の効果】
このように、移動相の通液を一旦停止した後、その移動相の通液を再開した後の測定であっても、再通液開始時にカラム出口に５ＭＰａ以上の初期背圧を加え、試料注入後も、初期背圧よりも低くはするが背圧をゼロにはしないで加え続ければ、保持時間の減少が抑制されることから、水を主成分とする移動相を用いることができる。また、試料注入後の背圧を通液開始時の初期背圧よりも低くすると、装置の負荷が軽減されることから、液体クロマトグラフ装置やカラムの寿命が長くなる利点がある。
【００１７】
【第１乃至第３発明の態様】
第２乃至第３発明において、背圧を加える場所は、検出器の下流であってもよいし、カラム出口と検出器との間であってもよいが、通常の検出器の耐圧はそれほど高くないので、カラムと検出器との間に設けられた背圧装置により、カラム出口に背圧を加えることが好ましい。
【００１８】
また、第１乃至第３発明に用いる移動相は、前述した水を主成分とする移動相であればよい。特に、従来の手法では、水１００％移動相は保持時間の減少の問題が大きかったが、本発明は、水１００％移動相であっても好適に用いることができる。また、固定相にも特に制限はなく、疎水性の大きい炭化水素基や、炭素鎖にアミド基が結合したものを用いることもできる。上記炭化水素基としては、たとえば、直鎖アルキル基、枝分かれを有するアルキル基、主鎖中或いは側鎖にフェニル基を有する炭化水素基などを用いることができる。
【００１９】
また、第１乃至第３発明に用いるカラムに充填される充填剤にも特に限定はないが、前述した特許文献１にも記載されているように、固定相結合後の充填剤の細孔径が所定の大きさ以上である場合には、カラム出口に背圧を加えなくても、保持時間の減少は少ない。従って、第１乃至第３発明は、特許文献１において使用できないとされていた充填剤を用いる逆相液体クロマトグラフィーにとって特に有効である。すなわち、前記カラムに充填される充填剤が、固定相のアルキル基換算主鎖炭素数をｘとし、その固定相を担持した後の充填剤の細孔径をｙ（ｎｍ）としたときに、以下の式を満たすものである場合に、第１乃至第３発明は有効である。
ｙ＜１．８３ｘ＋８．１７  （１≦ｘ≦８、ｙ≦１００）
ｙ＜−０．３３ｘ＋２５．４  （８≦ｘ≦１８、ｙ≦１００）
ｙ＜−０．９３ｘ＋３６．２  （１８≦ｘ≦３０、ｙ≦１００）
なお、アルキル基換算主鎖炭素数とは、固定相の主鎖の炭素数であって、その主鎖にフェニル基が含まれている場合には、そのフェニル基の炭素数を３とし、他の炭素についてはそのままその炭素数を計数した炭素数を意味する。
【００２０】
また、カラム出口に加える背圧は、カラム充填剤の細孔径が小さいほど高いことが好ましい。たとえば、固定相結合後のカラム充填剤の細孔径が１０ｎｍである場合には、再通液開始時には１５ＭＰａ以上の背圧を加えることが好ましく、固定相結合後のカラム充填剤の細孔径が８ｎｍである場合には、再通液開始時には２０ＭＰａ以上の背圧を加えることが好ましい。
【００２１】
【課題を解決するための第４の手段】
また、前記目的を達成するための第４発明は、第１乃至第３発明に好適に用いることができる液体クロマトグラフ装置である。すなわち、第４発明は、カラムと検出器とを接続するための接続管に、カラム出口に背圧をかけるための背圧装置が設けられていることを特徴とする液体クロマトグラフ装置である。
【００２２】
【第４発明の効果】
このクロマトグラフ装置のように、カラムと検出器とを接続するための接続管に背圧装置が設けられていると、検出器には背圧装置による背圧が加わらないので、検出器には耐圧性が要求されない。
【００２３】
【課題を解決するための第５および第６の手段】
また、カラム自体の構造によりそのカラムに背圧を加えることもできる。すなわち、前記目的を達成するための第５発明は、水を主成分とする移動相を用いる逆相液体クロマトグラフィーに用いるカラムであって、充填剤が充填されている分離部の下流に、その分離部の内径の１／２０以下の内径を有する配管が接続されていることを特徴とするカラムである。また、前記目的を達成するための第６発明は、水を主成分とする移動相を用いる逆相液体クロマトグラフィーに用いるカラムであって、分離用カラムの下流側に、その分離用カラムよりも内径および充填剤の粒子径の少なくとも一方が小さい背圧用カラムが接続されていることを特徴とするカラムである。
【００２４】
【第５発明および第６発明の効果】
第５発明によれば、分離部の下流の細い配管が流路抵抗となって、分離部には背圧が加わる。また、第６発明によれば、背圧用カラムが流通抵抗となって分離用カラムに背圧が加わる。このようにカラム自体の構造によりカラムに背圧が加わるようになっていると、一般的な液体クロマトグラフ装置にそのカラムを取り付けるだけで、水を主成分とする移動相が使用できる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、発明の実施の形態を説明する。図１は、本発明が適用された高速液体クロマトグラフ装置１０を含む逆相液体クロマトグラフィーのための装置構成を示す図である。
【００２６】
図１において、溶媒槽１２に移動相として予め蓄えられた移動相溶媒（溶離液）は、ポンプ１４により、所定の速度、たとえば１．０ｍｌ／ｍｉｎ程度で、カラム１６に導入される。移動相溶媒には、たとえば、水１００％など、水を主成分とする溶媒を用いる。カラム１６の入り口圧は、圧力計１８によって測定されている。注入部２０では、図示しない注射器により、水に溶解させられた分離用試料がカラム１６に注入される。
【００２７】
カラム１６は、高速液体クロマトグラフ装置１０の一部ではなく、分離対象試料に適したものが適宜選択されて、高速液体クロマトグラフ装置１０のカラムオーブン２２内に配置される。このカラム１６は、たとえばステンレス管であり、たとえば内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍとされる一般的な分析用のカラムや、セミミクロカラムと呼ばれる内径１〜２ｍｍのカラムなどの分析用のカラム、たとえば内径２０ｍｍ×長さ２５０ｍｍとされる分取用のカラムなど、種々の内径および長さのカラムを用いることができる。そのカラム１６の内部には、予め固定相を担持した担体すなわちカラム充填剤が充填されている。担体には、たとえば、シリカ（シリカゲル）が用いられる。そして、その担体表面のシラノール基に固定相が予め結合されている。
【００２８】
カラム１６の出口は接続管２４に接続されており、接続管２４の他端は検出器２６に導入されている。接続管２４には、カラム１６の内径に応じて異なる内径のものが用いられ、カラム１６の内径が４．６ｍｍである場合には、たとえば内径０．１３ｍｍのものを用いる。また、接続管２４の長さは、たとえば、５０ｃｍ〜３ｍ程度とされる。
【００２９】
図１の高速液体クロマトグラフ装置１０では、接続管２４の途中に、背圧装置として機能する制御弁２８が設けられている。この制御弁２８は、カラム１６の出口に背圧をかけるためのものであり、減圧弁などの圧力制御弁や、絞り弁などの流量制御弁が用いられる。制御弁２８によりカラム１６の出口に加えられる背圧は、制御弁２８よりも上流側において接続管２４に接続されている圧力計３０により測定される。
【００３０】
注入部１８から注入された試料は、カラム１６により分離されて、検出器２６へ導入される。検出器２６には、対象試料を検出するために、たとえばＵＶ検出器、示差屈折検出器等が用いられる。検出器２６を通過した溶離液（移動相）は、廃液槽３２に貯蔵される。また、検出器２６から廃液槽３２までの配管には、流量計３４が接続されている。検出器２６で検出された結果は、データ処理機能を備えた記録装置３６に記録される。
【００３１】
次に、ポンプを一旦停止させた後、通液を再開して測定するときに、カラム出口に背圧を加えることによって保持時間の減少が抑制されることを示す。
【００３２】
図２は、ポンプ停止後、再度通液した時の相対保持時間（％）を、カラム出口の背圧を変化させて測定した結果を示す図である。
【００３３】
実験条件は、以下の通りである。
カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ
カラム入り口圧：カラム出口圧に７ＭＰａを加えた圧力
充填剤：オクタデシルシリル基結合シリカ
充填剤の粒子径：５μｍ
充填剤および固定相のその他の物性値：表１参照
移動相：水１００％（緩衝液調整用試薬含まず）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４０℃
検出器：示差屈折率計
試料：２−プロパノール
2004198136.tif 000003
【００３４】
また、通液・停止操作は以下の通りである。まず、アセトニトリルと水との混合液（７：３）を１時間通液した後、カラム出口の背圧を３０ＭＰａとした状態で徐々に水の割合を高めていって水１００％移動相に置換した。図２の相対保持時間は、水１００％への置換が終了した直後の測定における試料の保持時間を１００％とした値である。そして、上記測定終了後にポンプを１時間停止し、その後、カラム出口に所定の背圧が加わっている状態で、水１００％移動相を通液し、１時間後に、再度、試料を注入して保持時間を測定した。
【００３５】
図２に示されるように、固定相としてＯＤＳ１またはＯＤＳ２を用いた場合には、ポンプを停止した後、従来のようにカラム出口に背圧をかけないで通液を再開すると、保持時間が著しく減少してしまうことが分かる。なお、このように保持時間が著しく低下するのは、前述の特許文献１において考察したように、充填剤の細孔から移動相が抜け出てしまうためであると考えられる。
【００３６】
しかし、固定相としてＯＤＳ１を用いた場合には、背圧が１２ＭＰａ〜１８ＭＰａの間で相対保持時間が急速に立ち上がっており、背圧が２０ＭＰａで相対保持時間がほぼ９０％となっていることから、ＯＤＳ１の場合には、背圧が２０ＭＰａ以上であれば使用可能であるといえる。また、固定相としてＯＤＳ２を用いた場合には、背圧が１１ＭＰａ〜１４ＭＰａの間で相対保持時間が急速に立ち上がっており、背圧が１５ＭＰａで相対保持時間がほぼ９０％となっていることから、ＯＤＳ２の場合には、背圧が１５ＭＰａ以上であれば使用可能であるといえる。
【００３７】
前述のように、保持時間が低下するのは充填剤の細孔から移動相が抜け出してしまうためと考えられるので、このように、カラム出口に所定の背圧をかけることによって保持時間の減少が抑制されるのは、充填剤の細孔から抜け出てしまった移動相が、カラム出口に背圧が加えられることによって再度その細孔に入り込むためと考えられる。また、ＯＤＳ１とＯＤＳ２の物性値を比較すると、両者の実質的な相違は固定相結合後の充填剤の細孔径だけであるので、十分な再現性を得るために必要なカラム出口の背圧は充填剤の細孔径によって定まり、固定相結合後の充填剤の細孔径が小さいほど、高い背圧が必要であることが分かる。
【００３８】
ＯＤＳ１とＯＤＳ２が固定相としてオクタデシル基のみを充填剤に結合させているのに対して、ＯＤＳ３は、オクタデシル基の結合密度を低下させ、代わりにトリメチルシリル基を結合させている。トリメチルシリル基は水素結合性が高いので、ＯＤＳ３は水１００％移動相に用いても保持時間がそれほど低下しない。しかし、図２を見ると、ポンプを停止した後、従来のようにカラム出口に背圧をかけないで通液を再開すると、１０％程度は保持時間が減少することが分かる。また、図２を見ると、ＯＤＳ３も背圧が１７ＭＰａ〜２０ＭＰａの間で保持時間が回復している。このことから、保持時間の減少の程度に拘わらず、保持時間を回復させるためのカラム出口の背圧は、固定相結合後の充填剤の細孔径に依存することが分かる。
【００３９】
次に、保持時間の減少を抑制するために、カラム出口の背圧を高くすることが特に効果的である充填剤の細孔径の範囲を決定した実験を、図３および図４に基づいて説明する。なお、図３および図４は、前述の特許文献１にも示したものである。
【００４０】
図３は、固定相結合後の平均細孔径が異なる種々の充填剤を合成し、充填剤の平均細孔径と相対保持時間との関係を求めた実験の結果を示す図である。実験条件は以下の通りである。
2004198136.tif 000004
【００４１】
この実験において、充填剤の合成は、固定相用の各試薬を大過剰に加えて無水条件で反応させており、全て高結合密度の充填剤である。また、固定相をトリアコンチル基、オクタデシル基、オクチル基とした充填剤は、残存シラノール基を減少させるためにトリメチルシリル基によるエンドキャッピングを行った。また、図３における相対保持時間は、細孔内が水１００％移動相に切り換わった直後すなわち移動相置換操作後１時間の時点における保持時間を基準とし、１２時間通液を停止し、通液再開後１時間後に測定した保持時間の相対値である。なお、特許文献１にも記載したように、通液停止時間が１０時間以上になるとその後は保持がほとんど減少しないことから、後者の保持時間は最も短くなった保持時間と言える。
【００４２】
図３において、点ａ，ｂ，ｃ，ｄは、同じ固定相について得られた相対保持時間を結んだ４つの曲線と、相対保持時間９０％の線との交点である。図４は、図３に示す実験値を表す各点、および上記４つの交点ａ，ｂ，ｃ，ｄを、アルキル基換算主鎖炭素数と細孔径との二次元座標系にプロットしたグラフである。また、実験値を示す点の横の数値は相対保持時間である。図４において、線分Ｌ1 は点ａ，ｂを結ぶ線分、線分Ｌ2 は点ｂ，ｃを結ぶ線分、線分Ｌ3 は点ｃ，ｄを結ぶ線分であり、アルキル基換算主鎖炭素数をｘとし細孔径（ｎｍ）をｙとすると、線分Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３はそれぞれ以下の式で表される。
線分Ｌ1 ：ｙ＝１．８３ｘ＋８．１７  （１≦ｘ≦８）
線分Ｌ2 ：ｙ＝−０．３３ｘ＋２５．４  （８≦ｘ≦１８）
線分Ｌ3 ：ｙ＝−０．９３ｘ＋３６．２  （１８≦ｘ≦３０）
【００４３】
点ａ，ｂ，ｃ，ｄは相対保持時間が９０％の点であり、線分Ｌ1 、Ｌ2 、Ｌ3 はその点ａ，ｂ，ｃ，ｄを結ぶ線分であるので、アルキル基換算主鎖炭素数と細孔径との関係が図４の線分Ｌ1 、Ｌ2 、Ｌ3 よりも上側にある充填剤は、相対保持時間が９０％以上であることから、カラム出口に背圧をかけなくても、水１００％移動相が使用可能な充填剤であることを意味する。従って、カラム出口に背圧をかける意義が特に大きいのは、アルキル基換算主鎖炭素数と細孔径との関係が図４の線分Ｌ1 、Ｌ2 、Ｌ3 よりも下側にある充填剤、すなわち、以下の式を満たす充填剤を、水１００％移動相に使用する場合であることが分かる。
ｙ＜１．８３ｘ＋８．１７  （１≦ｘ≦８）
ｙ＜−０．３３ｘ＋２５．４  （８≦ｘ≦１８）
ｙ＜−０．９３ｘ＋３６．２  （１８≦ｘ≦３０）
【００４４】
次に、通液停止後の再通液において、再通液開始時の初期背圧さえ高くしておけば、試料注入後は、その初期背圧に比べて低い圧力に背圧を低下させても保持時間の減少は抑制されることを示す。
【００４５】
図５の曲線Ｃ１は、再通液開始時のカラム出口の背圧（すなわち初期背圧）を３０ＭＰａとした後、通液を停止せずに、その背圧を低下させたときの相対保持時間（％）を測定した結果を示す曲線であり、曲線Ｃ２は、比較のために示す図２のＯＤＳ２の曲線である。
【００４６】
曲線Ｃ１の実験条件は、通液条件以外は、図２のＯＤＳ２の場合と同じである。なお、曲線Ｃ１における相対保持時間は、カラム出口の背圧を３０ＭＰａとしたときの保持時間を１００％とした値である。従って、図２の相対保持時間とは定義が異なるが、後で述べるように、実質的には同じ意味である。通液条件は、以下の通りである。まず、カラム出口の背圧を３０ＭＰａとした状態で水１００％移動相を数分程度流した。続いて、移動相の通液を続けたまま背圧を図５あるいは以下の表２に示す圧力まで低下させ、さらに移動相の通液を続け、１時間経過後に保持時間を測定した。図２に示されているように、カラム出口の背圧を３０ＭＰａとすれば、保持時間は移動相を水１００％移動相に切り替えた直後とほぼ同じになる。従って、図５の相対保持時間は図２の相対保持時間と実質的に同じ意味であり、図５の相対保持時間も、水１００％移動相に切り替えた直後の保持時間に対する値と考えることができる。
【００４７】
なお、この実験では、初期背圧を３０ＭＰａとした状態で移動相を数分程度流しているが、これは念のために十分に長い時間高い圧力を維持しているのであり、移動相が充填剤の細孔内に入るには数秒もあれば十分と考えられる。また、この実験では初期背圧を３０ＭＰａとしているが、図２にも示されるように、背圧が１５ＭＰａ以上であれば保持時間はほぼ回復するので、初期背圧は１５ＭＰａ以上（たとえば１７ＭＰａ、１８ＭＰａ、２０ＭＰａ）であればよい。
【００４８】
表２は、図５の曲線Ｃ１上の各測定点の値を示す表であり、表３は図５の曲線Ｃ２上の各測定点の値を示す表である。
（表２）
─────────────────────
背圧（ＭＰａ）    相対保持時間（％）
─────────────────────
0.2                  89.3
1.5                  95.1
2.3                  96.1
3                    98.1
3.8                  98.4
4.5                  99
5.3                  99.3
6.1                  99.6
7.6                 100
30                   100
─────────────────────
（表３）
─────────────────────
背圧（ＭＰａ）    相対保持時間（％）
─────────────────────
3                    10
7.38                 10.4
11                    16.8
15                    86.1
18.4                  94.9
22                    97.2
29.5                  99
─────────────────────
【００４９】
図５の曲線Ｃ２および表３に示されるように、再通液開始時には高い背圧を加えないと良好な再現性が得られないが、図５および表２に示されるように、一旦高い背圧を加えれば、その後は背圧を低下させても、保持時間はそれほど減少しないことが分かる。なお、背圧が０．２ＭＰａの場合には、２０時間後の相対保持時間は更に１５％減少したが、背圧が５ＭＰａの場合には、２０時間経過後も相対保持時間に変化はなかった。従って、どこまで背圧を低下させてもよいかは、連続通液する時間や必要とされる再現性の精度によるが、少なくとも５ＭＰａまでは低下させることができるといえる。
【００５０】
次に、背圧装置の態様について説明する。図１に示した高速液体クロマトグラフ装置１０では、制御弁２８が背圧装置として備えられていたが、図６に示す背圧装置３８を用いてもよい。
【００５１】
図６に示す背圧装置３８は、複数の流路からいずれかの流路を選択するための流路切替弁として機能する１つまたは複数（図６では２つ）の六方バルブ４０と、その六方バルブ４０に接続された長さや内径の異なる（すなわち流通抵抗の異なる）種々の配管により構成される。
【００５２】
図７および図８は、六方バルブ４０の構造および作動を説明する図である。六方バルブ４０は、配管が接続される６つのポートａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆを備えたハウジング４２と、そのハウジング４２に収容され、ハウジング４２に対して相対回転可能な回転弁子４４とを備えている。回転弁子４４には、互いに隣接するポート同士を連結するための流路４６が３つ形成されており、回転弁子４４を回転させることにより、ポートａとｂ、ポートｃとｄ、ポートｅとｆがそれぞれ接続されている図７の状態と、ポートａとｆ、ポートｂとｃ、ポートｄとｅがそれぞれ接続されている図８の状態とに切り替えることができる。
【００５３】
従って、図６の背圧装置３８では、流路を、配管Ａ−Ｃを経由する流路、配管Ａ−Ｄを経由する流路、配管Ｂ−Ｃを経由する流路、配管Ｂ−Ｄを経由する流路の４つに切り替えることができる。そこで、たとえば、配管Ａが５ＭＰａの背圧を加えることができる配管、配管Ｂが１５ＭＰａの背圧を加えることができる配管、配管Ｃが１ＭＰａの背圧を加えることができる配管、配管Ｄが１５ＭＰａの背圧を加えることができる配管とすれば、流路を配管Ｂ−Ｄとすることにより３０ＭＰａ、流路を配管Ａ−Ｄとすることにより２０ＭＰａ、流路をＢ−Ｃとすることにより１６ＭＰａ、流路を配管Ａ−Ｃとすることにより６ＭＰａの背圧をそれぞれ加えることができる。なお、このように背圧を変化させることができる背圧装置３８は、再通液開始時の初期背圧は高くして、試料注入後は背圧を低くする測定方法に好適に用いることができる。
【００５４】
また、図９に示す背圧装置４８を用いることもできる。図９に示す背圧装置４８は、図６の六方バルブ４０に代えて四方バルブ５０を１つまたは複数（図９では４つ）備えたものである。この四方バルブ５０は、ポートおよび流路の数が異なる以外は前述の六方バルブ４０と同様の構成である。すなわち、四方バルブ５０は、ポートａとｂ、ポートｃとｄがそれぞれ接続されている状態（最もカラム側の四方バルブの状態）と、ポートａとｄ、ポートｂとｃがそれぞれ接続されている状態（カラム側から二番目の四方バルブ５０の状態）とに切り替えることができる。この背圧装置４８も、それぞれの四方バルブ５０の流路を切り替えることにより、複数の背圧を加えることができる。
【００５５】
また、図１０に示す背圧装置５２を用いることもできる。背圧装置５２は、回転弁子５６を回転させることにより、ポートａを、ポートｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇのいずれか１つのポートと連通させることができる流路切替弁５４と、ポートｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇに接続された互いに流通抵抗の異なる配管により構成される。
【００５６】
また、接続管２４自体が背圧装置として機能してもよい。すなわち、接続管２４の径や長さを調整することによって、カラム１６の出口に背圧をかけてもよい。
【００５７】
また、図１１に示す、充填剤が充填されている分離部５８（通常のカラムに相当する部分）の下流に細い配管６０を予め結合させたカラム５６を用いると、そのカラム５６を一般的な液体クロマトグラフ装置に取り付けるだけで、分離部５８に背圧を加えることができる。なお、６２は分離部５８と配管６０とを接続するための接続部材である。従来の測定では、カラム内径の１／１０程度の配管が用いられる（たとえば、内径４．６ｍｍのカラムには内径０．５０ｍｍの配管）が、分離部５８の下流に結合させる配管６０は、そのような従来の配管の半分以下、すなわちカラム内径の１／２０以下、より好ましくは、１／４０以下、特に好ましくは１／５０以下の内径を有する配管とする。分離部５８に加わる背圧は、ポアズイユの法則により、配管６０の内径の４乗に反比例する。従って、配管６０の内径を小さくすると、短い配管６０でも十分に分離部５８に背圧を加えることができ、たとえば、分離部５８の内径を４．６ｍｍとし、移動相の流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎとする場合、配管６０は内径を０．０５ｍｍとすれば、長さ７ｃｍで分離部５８に十分な背圧を加えることが可能である。
【００５８】
また、配管に代えて、図１２に示すように、分離部すなわち分離用カラム６６の下流に、さらに背圧用カラム６８を結合させたカラム６４を用いても、分離用カラム６６に背圧を加えることができる。なお、７０は分離用カラム６６と背圧用カラム６８とを接続するための接続部材である。背圧用カラム６８は、内径および充填剤の粒子径の少なくとも一方が、分離用カラム６６のそれよりも小さければ分離用カラム６６に背圧を加えることができるが、図１２に示すカラム６４は、分離用カラム６６の内径は背圧用カラム６８の内径と同じとし、図示しない充填剤の粒子径を分離用カラム６６の充填剤の粒子径よりも小さくした例である。分離用カラム６６は、たとえば、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍであり、充填剤の粒子径は５μｍとされ、その場合、背圧用カラム６８は、内径４．６ｍｍ、長さ１０ｍｍとし、充填剤の粒子径を１μｍとすれば、通常よく用いられる測定条件である１．０ｍｌ／ｍｉｎで移動相を流す場合に、十分な背圧を分離用カラム６６に加えることができる。
【００５９】
また、図示はしないが、背圧用カラムの内径を分離用カラムの内径よりも小さくする場合、たとえば、分離用カラムの内径が４．６ｍｍである場合には、背圧用カラムの内径を１ｍｍとすれば、充填剤の粒子径を分離用カラムと同じとしても、充填剤の粒子径を小さくした場合と同じく長さ１０ｍｍの背圧用カラムで十分な背圧を分離用カラムに加えることができる。なお、このように、背圧用カラムは、内径を小さくした場合も充填剤の粒子径を小さくした場合も、その長さは比較的短くて済む。従って、背圧用カラムに充填する充填剤は多孔質であっても分離に与える影響は少ないが、より分離に影響を与えないようにするために、非多孔質の充填剤を用いることが好ましい。
【００６０】
以上、本発明の態様を種々説明したが、本発明は上述の態様に限定されるものではなく、本発明は当業者の知識に基づいて種々の変更、改良を加えた態様で実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明が適用された高速液体クロマトグラフ装置を含む逆相液体クロマトグラフィーのための装置構成を示す図である。
【図２】ポンプ停止後、再度通液した時の相対保持時間（％）を、カラム出口の背圧を変化させて測定した結果を示す図である。
【図３】固定相結合後の平均細孔径が異なる種々の充填剤を合成し、充填剤の平均細孔径と相対保持時間との関係を求めた実験の結果を示す図である。
【図４】図３に示す実験値を表す各点、および４つの交点ａ，ｂ，ｃ，ｄを、アルキル基換算主鎖炭素数と細孔径との二次元座標系にプロットしたグラフである。
【図５】再通液開始時のカラム出口の背圧を３０ＭＰａとした後、通液を停止せずに、その背圧を低下させたときの相対保持時間を測定した結果を示す図である。
【図６】図１の液体クロマトグラフ装置に備えられた背圧装置（制御弁）とは別の背圧装置を示す図である。
【図７】図６の背圧装置に備えられている六方バルブの構造および作動を説明する図である。
【図８】図６の背圧装置に備えられている六方バルブの構造および作動を説明する図である。
【図９】図１および図６の背圧装置とは別の背圧装置を示す図である。
【図１０】図１、図６および図９の背圧装置とは別の背圧装置を示す図である。
【図１１】充填剤が充填されている分離部の下流に細い配管を予め結合させたカラムを示す図である。
【図１２】分離用カラムの下流にさらに背圧用カラムを結合させたカラムを示す図である。
【符号の説明】
１０：高速液体クロマトグラフ装置
２８：制御弁（背圧装置）
３８：背圧装置
４８：背圧装置
５２：背圧装置
５６：カラム
５８：分離部
６０：配管
６４：カラム
６６：分離用カラム
６８：背圧用カラム
【図１】
2004198136.tif 000005
【図２】
2004198136.tif 000006
【図３】
2004198136.tif 000007
【図４】
2004198136.tif 000008
【図５】
2004198136.tif 000009
【図６】
2004198136.tif 000010
【図７】
2004198136.tif 000011
【図８】
2004198136.tif 000012
【図９】
2004198136.tif 000013
【図１０】
2004198136.tif 000014
【図１１】
2004198136.tif 000015
【図１２】
2004198136.tif 000016