(57)【要約】【課題】抗凝固剤であるＥＤＴＡなどのキレート試薬によって構造変化したＣａ欠損型ＣＲＰに対しても特異的に反応することが可能な抗ＣＲＰ抗体及びその抗体作製方法と、それを用いた高感度・高性能なバイオセンサと免疫測定方法を提供する。【解決手段】抗体を得るための免疫時に、免疫原としてＥＤＴＡ・２Ｋによる前処理を行ったＣａ欠損型ＣＲＰを接種する。ＥＤＴＡ・２Ｋを添加した状態でスクリーニング作業を行い、Ｃａ欠損型ＣＲＰと特異的に反応する抗体を選択することで、精製ＣＲＰ及び、Ｃａ欠損型ＣＲＰのいずれにも特異的に反応することが可能な抗ＣＲＰ抗体を取得することができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ反応性タンパク質と特異的に反応する抗体であって、
前記抗体は、キレート試薬にて予め前処理されカルシウム欠損型となったＣ反応性タンパク質を免疫原として接種することによって得られたことを特徴とする抗Ｃ反応性タンパク質抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗Ｃ反応性タンパク質抗体において、
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、抗Ｃ反応性タンパク質抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の抗Ｃ反応性タンパク質抗体において、
前記キレート試薬が、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムあるいはエチレンジアミン四酢酸二カリウムであることを特徴とする、抗Ｃ反応性タンパク質抗体。
【請求項４】
抗Ｃ反応性タンパク質抗体は、
前記抗体を含む溶液にＣ反応性タンパク質を加え、所定の時間反応させた後に、Ｃ反応性タンパク質の添加量に応じて光散乱強度が変化することを特徴とする、請求項１〜３記載の抗Ｃ反応性タンパク質抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗Ｃ反応性タンパク質抗体を利用して血液中のＣ反応性タンパク質を測定するためのバイオセンサであって、
乾燥多孔質担体上に、溶解し移動可能な標識試薬が保持されている標識試薬保持部と、特異的タンパク質が流出しないように固定化されている固定化部とが構成されており、前記標識試薬と前記特異的タンパク質のいずれか一方、あるいは双方が前記抗体から作られていることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項６】
請求項５に記載のバイオセンサにおいて、
前記バイオセンサが乾式分析素子であることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項７】
請求項５に記載のバイオセンサにおいて、
前記バイオセンサが免疫クロマトセンサであることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項８】
請求項５に記載のバイオセンサにおいて、
前記血液が、全血または血漿あるいは血清の何れかであることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項９】
Ｃ反応性タンパク質に特異的に反応する抗体作製方法であって、
前記抗体は、キレート試薬にて予め前処理されカルシウム欠損型となったＣ反応性タンパク質を免疫原として接種することによって、抗体を得ることを特徴とする、抗体作製方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の抗体作製方法において、
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、抗体作製方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の抗体作製方法において、
前記キレート試薬が、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムあるいはエチレンジアミン四酢酸二カリウムであることを特徴とする、抗体作製方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の抗体作製方法によって得られた抗体を利用して血液中のＣ反応性タンパク質を測定することを特徴とする、免疫測定方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の免疫測定方法において、
前記免疫測定方法が乾式分析素子を用いることを特徴とする、免疫測定方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の免疫測定方法において、
前記免疫測定方法が免疫クロマトセンサを利用することを特徴とする、免疫測定方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の免疫測定方法において、
前記血液が、全血または血漿あるいは血清の何れかであることを特徴とする、免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃ反応性タンパク質と特異的に反応する新規抗体、その新規抗体を作製する抗体作製方法、及びその抗体を用いたバイオセンサと免疫測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ反応性タンパク質（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＣＲＰと記す）は、血漿タンパク質成分の１種である。通常、正常人血液中には微量（１μｇ／ｍｌ以下）しか認められないのに対して、細菌感染やウイルス感染のような炎症性疾患、又は心筋梗塞などの組織崩壊性疾患の際に血中濃度が急増することが知られている。この現象を利用して、ＣＲＰ検査は炎症性疾患又は組織崩壊性疾患の診断及び、その重傷度の判定や経過の観察及び予後の判定に有用とされている。
【０００３】
また、ＣＲＰは５つのサブユニット（分子量約２１，０００）から構成される５量体である。
【０００４】
このＣＲＰを測定する方法としては、定性法としての毛細管法や定量法としての一元免疫拡散法が主に用いられていたが、これらはいずれも判定までに非常に長時間を要する。そこで最近では、迅速性及び定量性の高いラテックス法や免疫比濁法を用いた自動分析機によるＣＲＰ測定方法が広く用いられるようになった。
【０００５】
従来の技術としては、この免疫比濁法における測定感度向上のために、ＣＲＰの５つのサブユニットの側面に特異的に結合する抗体を用いて不溶性担体に固定化させた抗体とＣＲＰとの間で生じる凝集反応を測定する方法が知られている。（特許文献１参照。）
また、ＣＲＰと特異的に反応する抗体の作製方法として鶏卵由来の抗体を用いる方法が知られている。（特許文献２参照。）
これらの方法を含む従来の抗体作製方法としては、免疫原を免疫動物に数週間の期間をあけて数回接種する。十分に免疫されたことを確認した後に、免疫動物から取り出された脾臓細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマ細胞を作製する。こうして得られた抗体をそのスクリーニングの状態に応じて、ポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体と呼んでいる。この際、免疫する免疫原は測定したい対象物そのままを接種するのが常識とされている。あるいは、近年ではペプチド合成された抗原決定部位のみを接種して得る抗体作製方法が広く知られている。
【０００６】
【特許文献１】
特許第２８４０８５２号公報
【特許文献２】
特開平５−３４３４４号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
近年、医療診断現場では、ＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ  Ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ；以下ＰＯＣＴと記す）が次第に普及している。ＰＯＣＴにおいては、特に、迅速、簡便、正確に測定できる装置が望まれており、一般的に用いられる測定装置として、免疫クロマトセンサがある。この免疫クロマトセンサの代表例としては、抗体が固定化され、そのクロマト上流側に標識抗体が担持された展開層の一方の端に被検査溶液を添加する添加部分を、他方の端に流れてきた被検査溶液を吸収するための吸水部を具備して構成されており、添加部分に被検査溶液を必要量添加すると前記展開層を浸透して測定が開始され、抗体固定化部分に結合した標識抗体により測定結果は検出される。
【０００８】
通常、生体内に存在するＣＲＰは、一般的にカルシウム結合タンパク質と呼ばれ、そのタンパク質の立体構造中にカルシウム（以下、Ｃａと記す。）を含んでいる。しかしながら、この構造中のＣａは、キレート試薬と反応することによって奪われてしまう。例えば、採血時に用いられる抗凝固剤であるエチレンジアミン四酢酸二カリウム（以下、ＥＤＴＡ・２Ｋと記す。）の作用によってＣａ基はキレート化される為に、ＥＤＴＡ・２Ｋを抗凝固剤とした保存血液中に含まれるＣＲＰの立体構造は、本来生体内に存在するものとは異なる構造となってしまう。その為、ＣＲＰを測定するためには、Ｃａ欠損型ＣＲＰと特異的結合反応することのできる抗体が必要とされていた。
【０００９】
一般的に、ＣＲＰを抗原として認識するためのエピトープはこのＣａ結合部位に多く存在すると言われており、市販されている人体から抽出・精製されて得られたＣＲＰ、あるいは遺伝子操作にて得られたリコンビナントＣＲＰを抗原として動物に免疫して得られた抗体は、ＣＲＰに対しては特異的結合反応をするのに対し、Ｃａ欠損型ＣＲＰに対してはそのほとんどが反応しないと言う結果が生じていた。すなわち、抗凝固剤であるＥＤＴＡ・２Ｋの影響を受けたＣＲＰは、構造変化を生じるため、通常のＣＲＰに特異的に反応する抗体を用いてＣＲＰの検出をしようとしても、ＥＤＴＡ・２Ｋを含む血液検体中のＣＲＰに対しては特異的な反応がでないために、ＣＲＰの存在を正確に検出できず、誤判定を生じる結果となっていた。
【００１０】
また、仮にＣａを取り除いたＣａ欠損型ＣＲＰを免疫原として免疫動物に接種したとしても、生体内中に含まれるＣａイオンがＣａ欠損型ＣＲＰに吸収され、本来のＣａが補われた構造となり、本来のＣＲＰの立体構造に対する抗ＣＲＰ抗体が作製されると考えられていた。その為、Ｃａ欠損型ＣＲＰに対する抗体は、ＣＲＰを免疫原として接種して得られる抗体の中からＣａ欠損型ＣＲＰにも結合する抗体を選別して得る他に方法はないと予測されていた。
【００１１】
更に、例えそうしてＣａ欠損型ＣＲＰに対する抗体が得られたとしても、Ｃａ欠損型ＣＲＰを認識する為のエピトープは非常に限られており、免疫比濁法に見られるような溶液中でＣＲＰと抗体とを反応させて生じる反応度合を計測することには何ら差し障りはないものの、その抗体を免疫クロマトセンサ上に組み込む場合、ＣＲＰがもつ５量体の性質から、抗原抗体反応の際に立体障害を生じてしまい、反応性が上がらない、すなわち免疫クロマトセンサ上でのＣＲＰの存在度合の計測は不可能であると言われてきた。
【００１２】
本発明は、かかる問題点を解消するためになされたものであり、より好ましい抗ＣＲＰ抗体を得るべく鋭意研究を重ねた結果、通常ＣＲＰにも、Ｃａ欠損型ＣＲＰに対しても特異的結合反応を示し、かつ免疫クロマトセンサ上でも十分な反応性を示す抗体とその作製方法、及びその抗体を用いたバイオセンサと免疫測定方法を提供することを目的とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１に係る抗ＣＲＰ抗体は、ＣＲＰと特異的に反応する抗体であって、前記抗体は、キレート試薬にて予め前処理されＣａ欠損型となったＣＲＰを免疫原として接種することによって得られた抗ＣＲＰ抗体であることを特徴とするものである。
【００１４】
本発明の請求項２に係る抗ＣＲＰ抗体は、請求項１に記載の抗ＣＲＰ抗体において、前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とするものである。
【００１５】
本発明の請求項３に係る抗ＣＲＰ抗体は、請求項１に記載の抗ＣＲＰ抗体において、前記キレート試薬が、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムあるいはエチレンジアミン四酢酸二カリウムであることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明の請求項４に係る抗ＣＲＰ抗体は、請求項１〜３に記載の抗ＣＲＰ抗体において、前記抗体を含む溶液にＣ反応性タンパク質を加え、所定の時間反応させた後に、Ｃ反応性タンパク質の添加量に応じて光散乱強度が変化することを特徴とするものである。
【００１７】
本発明の請求項５に係るバイオセンサは、請求項１に記載の抗Ｃ反応性タンパク質抗体を利用して血液中のＣ反応性タンパク質を測定するためのバイオセンサであって、乾燥多孔質担体上に、溶解し移動可能な標識試薬が保持されている標識試薬保持部と、特異的タンパク質が流出しないように固定化されている固定化部とが構成されており、前記標識試薬と前記特異的タンパク質のいずれか一方、あるいは双方が前記抗体から作られていることを特徴とするものである。
【００１８】
本発明の請求項６に係るバイオセンサは、請求項５に記載のバイオセンサにおいて、前記バイオセンサが乾式分析素子であることを特徴とするものである。
【００１９】
本発明の請求項７に係るバイオセンサは、請求項５に記載のバイオセンサにおいて、前記バイオセンサが免疫クロマトセンサであることを特徴とするものである。
【００２０】
本発明の請求項８に係るバイオセンサは、請求項５に記載のバイオセンサにおいて、前記血液が、全血または血漿あるいは血清の何れかであることを特徴とするものである。
【００２１】
本発明の請求項９に係る抗体作製方法は、Ｃ反応性タンパク質に特異的に反応する抗体において、前記抗体は、キレート試薬にて予め前処理されＣａ欠損型となったＣＲＰを免疫原として接種することによって、抗体を得ることを特徴とするものである。
【００２２】
本発明の請求項１０に係る抗体作製方法は、請求項９に記載の抗体作製方法において、前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とするものである。
【００２３】
本発明の請求項１１に係る抗体作製方法は、請求項９に記載の抗体作製方法において、前記キレート試薬が、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムあるいはエチレンジアミン四酢酸二カリウムであることを特徴とするものである。
【００２４】
本発明の請求項１２に係る免疫測定方法は、請求項９に記載の抗体作製方法において、前記抗体作製方法によって得られた抗体を利用して血液中のＣＲＰを測定することを特徴とするものである。
【００２５】
本発明の請求項１３に係る免疫測定方法は、請求項１３に記載の免疫測定方法において、前記免疫測定方法が乾式分析素子を用いることを特徴とするものである。
【００２６】
本発明の請求項１４に係る免疫測定方法は、請求項１３に記載の免疫測定方法において、前記免疫測定方法が免疫クロマトセンサを利用することを特徴とするものである。
【００２７】
本発明の請求項１５に係る免疫測定方法は、請求項１３に記載の免疫測定方法において、前記血液が、全血または血漿あるいは血清の何れかであることを特徴とするものである。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、ここで示す実施の形態はあくまでも一例であって、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではない。
【００２９】
（実施の形態１）
本発明によるＣＲＰに対する抗ＣＲＰ抗体は、新規マウス・ハイブリドーマ細胞を培地中などのイン・ビトロ、またはマウス腹腔内などのイン・ビボで培養することによって製造することができる。
【００３０】
まず、精製ヒトＣＲＰにキレート試薬を添加した後、しばらくインキュベートすることによってＣＲＰ中のＣａが奪われたＣａ欠損型ＣＲＰが作製できる。これを免疫原として、マウスに接種する。数回の免疫を繰り返したマウスから脾臓細胞を取りだし、ハイブリドーマ細胞を作製する。
【００３１】
ここで用いるマウス・ハイブリドーマ細胞は、一般的にはマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞とを細胞融合することで製造することができる。
【００３２】
このマウス・ハイブリドーマ細胞を培養して得られた培養液あるいはマウスの腹水から抗体を分離・精製する場合には、硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィーなどの方法が用いられる。こうして得られた抗ＣＲＰ抗体は、ＣＲＰとのみ特異的に結合反応する能力を有する。しかも、この発明による抗ＣＲＰ抗体は、通常のＣＲＰのみならず、Ｃａ欠損型ＣＲＰとも特異的に反応することが可能である。更に、この抗ＣＲＰ抗体を標識物に標識した標識試薬として免疫クロマトセンサに組み込んだ場合、通常の抗ＣＲＰ抗体を用いた免疫クロマトセンサと比較して、呈色反応が著しく上昇することが確認されている。
【００３３】
その確認方法としては、標識物に抗体を結合させた標識抗体に対して濃度の異なるＣＲＰを添加し、その光散乱強度を測定する。この方法によって確認された抗体であり、ＣＲＰの濃度上昇に応じて光散乱強度も上昇する抗体であれば、クロマトセンサ上で標識試薬として用いた場合、呈色反応が著しく上昇することが確認されている。
【００３４】
（実施の形態２）
図５（Ａ）（Ｂ）は、本実施の形態２によるクロマトグラフィーを利用したバイオセンサを示す図である。
【００３５】
図５（Ａ）に示されるように、本実施の形態２によるバイオセンサは、ニトロセルロース等からなる反応層２上に、ＣＲＰと反応する抗体Ａが標識された標識試薬が溶解可能に保持された標識試薬保持部位３と、特異的タンパク質である抗ＣＲＰ抗体Ｂが固定化された抗体固定化部４が形成されており、その反応層２と、液体試料を毛細管現象により一定量だけ吸引するためのキャビティ部７と液体試料を最終的に吸収する吸水部５とがプラスチック等からなる担体支持体１の上部に形成されている。また、キャビティ部７の先端は液体試料を吸引するための入口である試料吸引部９があり、キャビティ部７と反応層２との間には、赤血球などの細胞成分を収縮させる働きがある細胞収縮剤が溶解可能に保持された収縮剤保持部位６があり、反応層２の表面及び側面は液体不透過性シート８で覆われている。
【００３６】
なお、ここで示す特異的タンパク質とは、特異的に結合反応するタンパク質を指し、分析対象物に対する抗体あるいは、標識試薬に対する抗体などが挙げられる。
【００３７】
収縮剤保持部位６が保持する細胞収縮剤は、例えば、無機塩、アミノ酸、及び糖類等である。なお、ここで無機塩とは、塩化ナトリウムや塩化カリウム、リン酸ナトリウム等、塩を含む無機化合物を示す。また、ここでアミノ酸とは、グリシンやグルタミン酸等同一分子内にカルボキシル基とアミノ基とを有する化合物を示し、プロリンやヒドロキシルプロリンのようなイミノ酸も含む。また、ここで糖類とは、グルコースやスクロース、トレハロース等の糖質や、グルシトール等の糖アルコールを示す。
【００３８】
ここで用いている抗体Ａと抗体Ｂは、本発明による抗体であり、免疫原としてＣａ欠損型ＣＲＰを用いることで得られた抗体であり、好ましくは光散乱強度が添加するＣＲＰの量に応じて上昇するものであるのがよい。
【００３９】
また、標識試薬保持部位３が保持する標識試薬は、金コロイド等の金属ゾルや、非金属ゾル、染料ゾル、着色粒子、色素、酵素、タンパク質等を示す。
【００４０】
次に、本実施の形態２によるバイオセンサを用いた免疫測定方法について説明する。
【００４１】
まず、血液などの液体試料が試料吸入部９に添加されると、キャビティ部７による毛細管現象によって一定量の液体試料が吸引される。液体試料が吸引されると、収縮剤保持部位６に保持されている収縮剤が、液体試料の浸透により溶解され、細胞成分を収縮させる。これにより液体試料は、細胞成分が混在下状態でも、目詰まりを起こすことなく反応層２をクロマト下流側に浸透していく。
【００４２】
次いで、収縮された細胞成分が混在する液体試料が、標識試薬保持部位３に達すると、標識試薬保持部位３に保持された標識試薬が、液体試料の浸透により溶解され、反応層２上に浸透・展開する。このとき、液体試料中に分析対象物であるＣＲＰが存在すれば、標識試薬に標識されている抗ＣＲＰ抗体Ａとの結合反応が行われる。
【００４３】
そして、反応層２の領域上の抗体固定化部４に標識試薬が到達する。このとき、液体試料中に分析対象物が存在すれば、抗体固定化部４の抗ＣＲＰ抗体ＢとＣＲＰとの結合反応が行われる。液体試料中のＣＲＰは、反応層２上を展開する過程で既に標識試薬と結合反応しており、抗体固定化部４に何らかの呈色反応が見られる。もし、液体試料中に分析対象物が存在しなければ、標識試薬と固定化抗体においては何ら特異的結合反応は行われないために、呈色反応は生じない。
【００４４】
最終的に、液体試料は吸水部５に吸収され反応は終了する。
【００４５】
このように、本実施の形態２によるバイオセンサ、及び免疫測定方法によれば、収縮剤保持部位に保持された細胞収縮剤が、液体試料中の細胞成分を収縮させるようにしたので、細胞成分が混在した状態でも液体試料が目詰まりを起こすことなくクロマト下流側に浸透するようになり、抗凝固剤を含まない全血あるいは、抗凝固剤によって処理された血液のいずれを検体としてもＣＲＰの測定が可能で、簡便かつ迅速な高精度の免疫測定を行うことができる。
【００４６】
なお、上記実施の形態２によるバイオセンサは、その吸水部を省いた反応層のみからなる単層の構成にしてもよい。
【００４７】
また、ここでは標識試薬は抗ＣＲＰ抗体Ａが標識されたものとし、固定化部にも特異的タンパク質である抗ＣＲＰ抗体Ｂが固定化されている免疫反応のうちサンドイッチ反応の一つを例に挙げ記しているが、ＣＲＰを予め標識した標識試薬を利用し、液体試料中のＣＲＰとの固定化抗体に対する競争反応による競合反応を用いても何ら問題はなく、本発明により作製された抗体を少なくとも１つ使用した抗原抗体反応の原理を利用したものであれば、前記１例であるサンドイッチ反応または競合反応などの反応系は、前記の形態以外を用いても何ら差し障りはない。
【００４８】
【実施例】
以下の実施例により、本発明を実施する方法をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例になんら制約されるものではない。
実施例１．
（抗体の採取）
マウスへ調整した免疫原を接種し、その後細胞融合及び培養とスクリーニングをくり返して抗ＣＲＰモノクローナル抗体を作製した。
【００４９】
ａ）免疫原の調製
精製ヒトＣＲＰ（ＡＤＶＹケミカル社製）１０ｍｇに対して、ＥＤＴＡ・２Ｋを１００ｍｇ添加し、溶解させる。十分に反応させた後に、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）にて透析しながらセントリプラス遠心式フィルターユニット（アミコン社製）を用いて濃縮、最終濃度１ｍｇ／ｍｌにしたＣａ欠損型ＣＲＰを調製する。
【００５０】
１ｍｇ／ｍｌに調整した上記Ｃａ欠損型ＣＲＰ溶液１ｍｌに対して、アジュバントを１ｍｌを加え、混合溶液が乳化するまで混合して免疫原を調整する。
【００５１】
ｂ）マウスへの免疫
ヌードマウスを準備し、上記調整された免疫原をマウス腹腔内に２００μｌ接種する（第１回免疫）。接種から２週間経過後に再び免疫原を接種して免疫を行い、２週間毎の免疫を４回以上くり返した。
【００５２】
ｃ）細胞融合および培養
十分に免疫され、ＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｇｌｏｂｕｌｉｎｅ  Ｇ）が産生されていることをＥＬＩＳＡ法によって確認した後に、最終免疫を行い、その３日後、マウスより脾臓細胞を取り出す。このマウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合し、ＣＲＰに特異的に反応する抗体を分泌することを特徴とするハイブリドーマ細胞を作製する。
【００５３】
ハイブリドーマ細胞の増殖状態を確認しながら、１０日目にＥＬＩＳＡ法によってＣＲＰ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
【００５４】
こうして得られたハイブリドーマ細胞を培養し、限界希釈法によるクローニングの作業をくり返すことで、Ｃａ欠損型ＣＲＰとの反応性の好ましい、増殖の良い、抗体分泌能の高い安定なモノクローナル抗体産生細胞株を選択する。このクローニング作業を行わないハイブリドーマ細胞を用いることでポリクローナル抗体を得ることもできる。
【００５５】
上記で得られた細胞株を、イン・ビトロ（例えば培地中）またはイン・ビボ（例えばマウスの腹腔内）で培養することによって、抗ＣＲＰモノクローナル抗体を製造することができる。イン・ビトロの場合には例えば培地中で５％ＣＯ２濃度及び３７℃で約３日間の経代培養を繰り返し、またイン・ビボ例えばマウスの腹腔内で培養する場合には最低１×１０５Ｃｅｌｌ／ｍｌに培養された細胞を接種した後に約１４日間培養する。
【００５６】
ｄ）抗体の精製
このようにして製造された培養液又はマウスの腹水からアフィニティカラムクロマトグラフィーを利用してモノクローナル抗体を分離・精製する。
【００５７】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ファルマシア製）を充填したカラムに培養液を浸透させ、モノクローナル抗体とＰｒｏｔｅｉｎＡとを十分に結合反応させる。展開用Ｂｕｆｆｅｒ（３Ｍ  ＮａＣｌ−１．５Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｐＨ８．９）を用いてＰｒｏｔｅｉｎＡと結合していない余分なタンパク質を除去した後に、ｐＨ４の溶出Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍクエン酸Ｂｕｆｆｅｒ）を用いて、抗体を溶出させる。こうして単離・精製されたモノクローナル抗体溶液をＰＢＳ・Ａｚを用いて透析し、限外濾過装置を用いて濃縮し、モノクローナル抗体溶液として保管する。
実施例２．
（モノクローナル抗体の光散乱強度の確認）
金コロイドにモノクローナル抗体を標識し、標識試薬である標識抗体を作製した後、この標識抗体溶液にＣＲＰ溶液を加え、その光散乱強度を測定した。
【００５８】
ａ）金コロイドの調製
金コロイドは、０．０１％塩化金酸の還流中の１００℃溶液に１％クエン酸３ナトリウム溶液を加えることによって調製した。還流を１５分間続けた後に、室温放置にて冷却した。０．２Ｍの炭酸カリウム溶液によって、ｐＨ９に調製した前記金コロイド溶液に、上記方法によって得られた抗ＣＲＰ抗体を加えて数分間攪拌した後に、ｐＨ９の１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗体−金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。前記標識抗体溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離することによって、標識抗体を単離して、それを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ・リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行って、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を洗浄緩衝液で懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾過した後に、当初の金コロイド溶液量の１０分の１に調製して、４℃で貯蔵した。
【００５９】
ｂ）光散乱強度の測定
免疫比ろう法を用いて、抗原抗体反応に伴う凝集複合体量を光散乱強度で測定し、抗原量に伴う凝集反応による変化の確認を行った。ＣＲＰの場合、多価抗原（５量体）であるから標識に用いられる抗体がポリクローナル抗体でない、すなわちモノクローナル抗体であっても凝集複合体を形成するので、抗原量に応じて光散乱強度に上昇変化が生じる。ここでは蛍光分光計（ＲＦ−５３００ＰＣ；島津製作所製）をもちいて、分光器条件を励起側、蛍光側、いずれも７００ｎｍに設定して計測を行った。
【００６０】
反応セルにＰＢＳ・４％ＰＥＧ（Ｍｗ６０００）溶液８９０μｌ、及び数種類の濃度に調整されたＣＲＰ溶液（ＰＢＳ）をそれぞれ４５μｌ加えて攪拌させた。その後、測定を開始してから、１０秒後に１ｍｇ／ｍｌに調整された選別対象抗体を３５μｌ添加して、さらに２０秒間攪拌させた後に、攪拌を停止し引き続き測定を行い、５分後の光散乱強度を測定した。なお、ここで示す反応時間は一例であって、上記以外の時間であっても何ら差し障りない。
【００６１】
図１、２は、本発明の実施例２による添加するＣＲＰ濃度の変化による光散乱強度の変化を示す図である。図１は、免疫原として精製ヒトＣＲＰをそのまま接種して得られた抗Ｃａ欠損型ＣＲＰ抗体の光散乱強度を、図２は、免疫原として精製ヒトＣＲＰにＥＤＴＡを加え予めＣａ欠損型ＣＲＰとして調整されたＣＲＰを接種して得られた抗Ｃａ欠損型ＣＲＰ抗体の光散乱強度を示す。図１では、４種類の抗体全てが添加されたＣＲＰの濃度変化に対して光散乱強度に変化は見られないが、図２では３種類の抗体全てが、添加されるＣＲＰ濃度が上昇するのに比例して光散乱強度も上昇していることがわかる。抗原抗体反応は、本来、濃度依存性であるため、図２のような、濃度に応じた上昇変化から、通常の確実な抗原抗体反応が起こったことが明白である。
【００６２】
このように、免疫原として予め処理したＣＲＰを接種したものとそうでないものとでは、得られた抗体の反応性が異なることがこの結果から判断することができる。
【００６３】
図３は、我々が作製した抗体を免疫原別に光散乱強度の上昇有無をまとめたものである。この表からは、ＥＤＴＡによる前処理をしていない抗体２０種類全てに関し、光散乱強度が上昇変化しないのに対して、驚くべきことにＥＤＴＡによる前処理を行ったＣａ欠損型ＣＲＰを免疫原として得られた抗体３種類については、すべて光散乱強度の上昇変化が見られた。このことからも、免疫原の前処理によって明らかに性状の異なる抗体が得られると判断することが可能である。
実施例３．
（クロマトグラフィーを利用したバイオセンサによる性能確認）
ニトロセルロース膜上に抗ＣＲＰ抗体Ｂ固定化ライン、及び抗ＣＲＰ抗体Ａと金コロイドとの複合体の含浸部を含むバイオセンサを製造した。このバイオセンサは、図５に示されるような形状の免疫クロマトセンサであり、次のようにして製造した。
【００６４】
ａ）バイオセンサの調製
リン酸緩衝溶液にて希釈して濃度調整をした抗ＣＲＰ抗体Ｂ溶液を準備した。この抗体溶液を、溶液吐出装置を用いてニトロセルロース膜上に塗布した。これにより、ニトロセルロース膜上に検出用の抗体固定化ラインが得られた。このニトロセルロース膜を乾燥後、１％スキムミルクを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中に浸漬して３０分間緩やかに振った。３０分後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽に膜を移動し、１０分間緩やかに振った後に、別のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液槽にて更に１０分間緩やかに振り、膜の洗浄を行った。２度洗浄を行った後に、膜を液槽から取り出して、水気を切り室温で乾燥させた。
【００６５】
金コロイドは、０．０１％塩化金酸の還流中の１００℃溶液に１％クエン酸３ナトリウム溶液を加えることによって調製した。還流を１５分間続けた後に、室温放置にて冷却した。０．２Ｍの炭酸カリウム溶液によって、ｐＨ９に調製した前記金コロイド溶液に、抗ＣＲＰ抗体Ａを加えて数分間攪拌した後に、ｐＨ９の１０％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）溶液を最終１％になる量だけ加えて攪拌することで、抗体−金コロイド複合体（標識抗体）を調製した。前記標識抗体溶液を４℃、２００００Ｇで５０分間遠心分離することによって、標識抗体を単離して、それを洗浄緩衝液（１％ＢＳＡ・リン酸緩衝液）中に懸濁した後に、前記遠心分離を行って、標識抗体を洗浄単離した。この標識抗体を洗浄緩衝液で懸濁して、０．８μｍのフィルタにて濾過した後に、当初の金コロイド溶液量の１０分の１に調製して、４℃で貯蔵した。
【００６６】
前記標識抗体溶液を溶液吐出装置にセットして、抗ＣＲＰ抗体Ｂ固定化乾燥膜上の抗体固定化位置から離れた位置に塗布した後に、膜を乾燥させた。これによって、固定化膜上に標識試薬保持部位を持つ反応層担体が得られた。
【００６７】
次に、上記のように調製された標識試薬を含む反応層担体を、厚さ０．２５ｍｍの白色ＰＥＴ（Ｐｏｌｙ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｔｅｌｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）からなる基板上に貼り付け、更にこの反応層担体上部の標識試薬保持部分から終端部分にかけて、標識試薬保持部分の一部と終端部の一部を解放した状態で厚さ１００μｍの透明ＰＥＴからなる液体不透過性シートを貼り付け、その後、２．５ｍｍの幅でＣＯ２レーザーを用いて裁断した。この反応層担体の液体不透過性シートを貼り付けていない始端部分上に、幅２ｍｍ×長さ７ｍｍ×厚さ０．２ｍｍのキャビティ部を形成し、これを試料吸入部とした。前記キャビティ部には予め、１．５Ｍに調製された塩化カリウム水溶液を点着した後に、液体窒素にて直ちに凍結し、凍結乾燥を行い、これによって、塩化カリウムが乾燥状態で保持された細胞収縮剤保持部を持つキャビティ部として作製されているものを用いる。こうしてバイオセンサを製造した。
【００６８】
こうして調製された標識試薬保持部位を含む反応層を、担体支持体上に貼付け、試料吸入部として収縮剤保持部を含むキャビティ部を、ガラス繊維濾紙を吸水部として、付け加えてから０．５ｃｍ幅の細片に切断して、バイオセンサを作製した。
【００６９】
ｂ）試料の調製
抗凝固剤としてＥＤＴＡ・２Ｋを加えた人の血液を、ヘマトクリット値４５％になるように調製した。この血液に既知濃度のＣＲＰ溶液を加えることにより、さまざまな既知濃度のＣＲＰ溶液を調製した。
【００７０】
ｃ）バイオセンサ上の呈色度合の測定
バイオセンサ上の試料導入部にＣＲＰを含む全血を５μｌ程度添加して、終端部方向へと展開処理して、抗原抗体反応をさせて抗体固定化部における呈色反応を行った。このバイオセンサへの試料添加から５分後の呈色状況を反射吸光度測定器にて計測した。さらに、この際の呈色部と反応層部分のバックグラウンド値とを計測しそのＳ／Ｎ比を比較した。
【００７１】
図４は、本発明の実施例３によるバイオセンサの、反応部である抗体固定化部における呈色状況を示す図である。標識抗体としては、ＥＤＴＡ・２Ｋによる前処理を行ったＣａ欠損型ＣＲＰを免疫して得られた抗体と、ＥＤＴＡ・２Ｋによる前処理をしていない精製ヒトＣＲＰを免疫して得られた抗体２種類をそれぞれ金コロイドに標識したものであり、固定化抗体にはいずれも同じ抗体を使用している。また、この３種類の抗体はアフィニティが同程度のものを選択し、標識抗体とした。この図４の結果から明らかなように、ＥＤＴＡ・２Ｋによる前処理を行ったＣａ欠損型ＣＲＰを免疫原として得られた抗体を標識抗体とした場合、ＥＤＴＡ・２Ｋによる前処理を行っていない精製ヒトＣＲＰを免疫原として得られた抗体２種類の標識抗体による性能と比べ、驚くべきことに、呈色強度が明らかに高く、ＣＲＰ高濃度領域においても十分に反応していることがうかがえる。また、直線領域が広く、この抗体を用いたバイオセンサであれば、測定レンジの広い高性能なＣＲＰ測定用バイオセンサを提供することが可能となる。
【００７２】
以上の結果から、本実施例３によるバイオセンサに使用された抗Ｃａ欠損型ＣＲＰ抗体は、血液中のＣＲＰの免疫測定において、その性能及び、測定可能領域の向上に大きく寄与していることがわかる。
【００７３】
なお、上記実施例３によるバイオセンサには、ニトロセルロースやガラス繊維濾紙のような、任意の多孔質性担体で構成されたクロマトグラフィー材料が用いられており、一般に、このような材料からなるバイオセンサは、抗原抗体反応の測定原理を用いて、ある特定物質を分析検出し、定性または定量する機能を持っている。ここで、上記実施例３では、反射吸光度測定器を用いて呈色強度を測定し、全血中のＣＲＰ濃度を定量する方法について説明を行ったが、このバイオセンサを用いて反射吸光度測定器を用いずに定性判断を行うに関しても何ら問題はなく、ＥＤＴＡ・２Ｋを抗凝固剤として採血された血液を用いての性能評価を例に出したが、ＥＤＴＡ・２Ｋ以外の抗凝固剤、例えばヘパリンなどで採血された血液や、抗凝固剤を用いずに採血された血液を検体として評価しても何ら問題はない。
【００７４】
また、サンドイッチ反応を用いたバイオセンサの構成及びそれを用いての反応測定について述べたが、の反応形態としては競合反応を用いてもよく、抗原抗体反応を用いて、その反応系の中に本発明にて作製された抗体を少なくとも一つ用いているものであれば何を用いてもかまわない。
【００７５】
【発明の効果】
本発明の請求項１に係る抗ＣＲＰ抗体は、ＣＲＰと特異的に反応する抗体であって、前記抗体は、キレート試薬にて予め前処理されＣａ欠損型となったＣＲＰを免疫原として接種することによって得られた抗体であり、かつＣＲＰ及びＣａ欠損型ＣＲＰのいずれにも特異的に反応することを特徴とする。その抗体は、Ｃａ欠損型ＣＲＰ、Ｃａを含むＣＲＰ、Ｃａ欠損型ＣＲＰにＣａを加え補った状態のＣＲＰ、のいずれに対しても特異的に反応することが可能であり、ＣＲＰが本来の立体構造をしていても、Ｃａ欠損型の構造をしていても確実に特異的結合反応を行うことができる。
【００７６】
なおここで示すキレート試薬とは、不対電子をもち金属イオンと配位結合を生じる二つ以上の電子供与性基をもつ多座配位子の事をいい、例えばＥＤＴＡのようなポリアミノカルボン酸類や、クエン酸のようなオキシカルボン酸類、ジメチルグリオキシム、オキシンなどがある。
【００７７】
本発明の請求項２に係る抗ＣＲＰ抗体は、請求項１に記載の抗ＣＲＰ抗体において、前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする。その抗体は、Ｃａ欠損型ＣＲＰ、Ｃａを含むＣＲＰ、Ｃａ欠損型ＣＲＰにＣａを加え補った状態のＣＲＰ、のいずれに対しても特異的に反応することが可能であり、ＣＲＰが本来の立体構造をしていても、Ｃａ欠損型の構造をしていても確実に特異的結合反応を行うことができる。また、モノクローナル抗体であるため、特異的結合反応を行う性能の安定が可能となる。
【００７８】
本発明の請求項３に係る抗ＣＲＰ抗体は、請求項１に記載の抗ＣＲＰ抗体において、前記キレート試薬が、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムあるいはエチレンジアミン四酢酸二カリウムであることを特徴とし、抗凝固剤として用いられる試薬によってＣａ欠損型ＣＲＰを調製していることから、生体内血液中に存在するＣＲＰに対しても、抗凝固剤が添加されている採血済血液中のＣＲＰに対しても、確実に結合することが可能となる。
【００７９】
本発明の請求項４に係る抗ＣＲＰ抗体は、請求項１〜３に記載の抗ＣＲＰ抗体において、抗Ｃ反応性タンパク質抗体は、
前記抗体を含む溶液にＣ反応性タンパク質を加え、所定の時間反応させた後に、Ｃ反応性タンパク質の添加量に応じて光散乱強度が変化することを特徴とする。その抗体は、Ｃａ欠損型ＣＲＰ、Ｃａを含むＣＲＰ、Ｃａ欠損型ＣＲＰにＣａを加え補った状態のＣＲＰ、のいずれに対しても特異的に反応することが可能であり、ＣＲＰが本来の立体構造をしていても、Ｃａ欠損型の構造をしていても確実に特異的結合反応を行うことができる。また、その抗体は、ＣＲＰの濃度に応じて散乱強度が変化することから、その抗体を用いることで、ＣＲＰを定量的に、高感度かつ高性能に測定することが可能となる。
【００８０】
なお、ここで示す光散乱強度とは、単色光を入射し溶液中を通過させた際に観測される光の直進方向以外において放射された光である散乱光の強度を示す。
【００８１】
本発明の請求項５に係るバイオセンサは、請求項１に記載の抗Ｃ反応性タンパク質抗体を利用して血液中のＣ反応性タンパク質を測定するためのバイオセンサであって、乾燥多孔質担体上に、溶解し移動可能な標識試薬が保持されている標識試薬保持部と、特異的タンパク質が流出しないように固定化されている固定化部とが構成されており、前記標識試薬と前記特異的タンパク質のいずれか一方、あるいは双方が前記抗体から作られていることを特徴とし、Ｃａ欠損型ＣＲＰ、Ｃａを含むＣＲＰ、Ｃａ欠損型ＣＲＰにＣａを加え補った状態のＣＲＰ、のいずれに対しても特異的に反応することが可能である。その為、その抗体を用いればＣＲＰが本来の立体構造をしていても、Ｃａ欠損型の構造をしていても確実に特異的結合反応を行うことができ、血液中のＣＲＰを測定する際に、血液の抗凝固剤の影響を受けずにＣＲＰを検出することが可能であり、高感度かつ高性能なバイオセンサを提供することができる。
【００８２】
なお、ここで示す特異的タンパク質とは、分析対象物であるＣＲＰと特異的に反応することが可能なタンパク質を示す。
【００８３】
本発明の請求項６に係るバイオセンサは、請求項５に記載のバイオセンサにおいて、前記バイオセンサが乾式分析素子であることを特徴としたので、バイオセンサ全体が乾燥担体であることから持ち運びが容易であるばかりでなく、保存環境や保存状態を厳密にする必要性がなく、取り扱いが容易で、簡便かつ迅速に、より高い精度のバイオセンサを提供することが可能となる。
【００８４】
本発明の請求項７に係るバイオセンサは、請求項５に記載のバイオセンサにおいて、前記バイオセンサが免疫クロマトセンサであることを特徴としたので、特別な測定機器を利用しなくとも、検体を添加することで、いつでも・何処でも・誰でも測定することが可能で、簡便かつ迅速に、より高い精度のバイオセンサを提供することが可能となる。
【００８５】
なお、ここで示す免疫クロマトセンサとは、吸水性に優れたクロマトデバイス上に液体試料を展開しながら抗原抗体反応を利用して分析対象物の検出を行う方法を示し、サンドイッチ反応及び競合反応のいずれの方法を用いてもよい。
【００８６】
本発明の請求項８に係るバイオセンサは、請求項５に記載のバイオセンサにおいて、前記血液が、全血または血漿あるいは血清の何れかであることを特徴としたので、検体がいかなる状態のものであっても、いかなる抗凝固剤を用いていても測定することが可能で、簡便かつ迅速に、より高い精度のバイオセンサを提供することが可能となる。
【００８７】
本発明の請求項９に係る抗体作製方法によれば、ＣＲＰに特異的に反応する抗体において、キレート試薬にて予め前処理されＣａ欠損型となったＣＲＰを免疫原として接種することによって、Ｃａ欠損型ＣＲＰ、Ｃａを含むＣＲＰ、Ｃａ欠損型ＣＲＰにＣａを加え補った状態のＣＲＰ、のいずれに対しても特異的に反応することが可能である。その為、ＣＲＰが本来の立体構造をしていても、Ｃａ欠損型の構造をしていても確実に特異的結合反応を行う抗体を作製することができる。
【００８８】
本発明の請求項１０に係る抗体作製方法によれば、請求項９に記載の抗体作製方法において、前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴としたので、Ｃａ欠損型ＣＲＰ、Ｃａを含むＣＲＰ、Ｃａ欠損型ＣＲＰにＣａを加え補った状態のＣＲＰ、のいずれに対しても特異的に反応することが可能である。その為、ＣＲＰが本来の立体構造をしていても、Ｃａ欠損型の構造をしていても確実に特異的結合反応を行う抗体が入手できる。また、モノクローナル抗体であるため、特異的結合反応を行う性能の安定した抗体を常に維持し続けることが可能となる。
【００８９】
本発明の請求項１１に係る抗体作製方法によれば、請求項９に記載の抗体作製方法において、前記キレート試薬が、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムあるいはエチレンジアミン四酢酸二カリウムであることを特徴とし、抗凝固剤として用いられる試薬によってＣａ欠損型ＣＲＰを調製していることから、生体内血液中に存在するＣＲＰに対しても、抗凝固剤が添加されている採血済血液中のＣＲＰの対しても確実に結合することの可能な抗ＣＲＰ抗体を作製することが可能となる。
【００９０】
本発明の請求項１２に係る免疫測定方法によれば、請求項９に記載の抗体作製方法において、前記抗体作製方法によって得られた抗体を利用して血液中のＣＲＰを測定すること特徴とし、Ｃａ欠損型ＣＲＰ、Ｃａを含むＣＲＰ、Ｃａ欠損型ＣＲＰにＣａを加え補った状態のＣＲＰ、のいずれに対しても特異的に反応することが可能である。その為、その抗体を用いればＣＲＰが本来の立体構造をしていても、Ｃａ欠損型の構造をしていても確実に特異的結合反応を行うことができることから、血液中のＣＲＰを測定する際に、血液の抗凝固剤の影響を受けない免疫測定を行うことができる。
【００９１】
本発明の請求項１３に係る免疫測定方法によれば、請求項１２に記載の免疫測定方法において、前記免疫測定方法が乾式分析素子を用いることを特徴とし、バイオセンサ全体が乾燥担体であることから持ち運びが容易であるばかりでなく、保存環境や保存状態を厳密にする必要性がなく、取り扱いが容易で簡便かつ迅速に、より高い精度の免疫測定を行うことが可能となる。
【００９２】
本発明の請求項１４に係る免疫測定方法によれば、請求項１２に記載の免疫測定方法において、前記免疫測定方法が免疫クロマトセンサを利用することを特徴とし、特別な測定機器を利用しなくとも、検体を添加することでいつでも・何処でも・誰でも測定することが可能で、簡便かつ迅速に、より高い精度の免疫測定を行うことが可能となる。
【００９３】
本発明の請求項１５によれば、請求項１２に記載の免疫測定方法において、前記血液が、全血または血漿あるいは血清の何れかであることを特徴とし、検体がいかなる状態のものであっても、いかなる抗凝固剤を用いていても測定することが可能で、簡便かつ迅速に、より高い精度の免疫測定を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】免疫原として、ＥＤＴＡ・２Ｋによる前処理を行っていない精製ヒトＣＲＰを用いて得られた抗体の光散乱強度を示す図
【図２】免疫原として、ＥＤＴＡ・２Ｋによる前処理を行ったＣａ欠損型精製ヒトＣＲＰ用いて得られた抗体の光散乱強度を示す図
【図３】免疫原別に得られた抗体の光散乱強度の上昇の有無をまとめた図
【図４】本発明の実施の形態２によるバイオセンサ上に、免疫原別に得られた抗体を標識抗体として使用した際の測定結果を示す図
【図５】（Ａ）本発明の実施の形態２によるバイオセンサを示す分解斜視図
（Ｂ）本発明のバイオセンサの液体不透過性シート８を透かして示す斜視図
【符号の説明】
１  担体支持体
２  反応層
３  標識試薬保持部位
４  抗体固定化部
５  吸水部
６  収縮剤保持部位
７  キャビティ部
８  液体不透過性シート
９  試料吸入部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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